hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重要海産動物稚仔の消化管内容物ゲノムタイピングによる餌生物の解明

胃内容物の検討にはそのホスト生物の種判別も重要であることからDNAを用いた重要水産動物稚仔の種同定についても継続した。イカ類の種判別に基づいた研究成果を利用し、系群及びイカ類の資源変動やイカ類を利用する魚類資源の動態についての研究を行った。また、まぐろ類については新規核遺伝子マーカーを用いた系統類縁関係についても検討した.イカ類幼生、ウナギ類幼生及びイセエビ類幼生について胃内容物ゲノム解析を継続するとともに、結果の取り纏めを行った。イカ類(アカイカ)とウナギ類(ウナギ、ハモ、アナゴ)については真菌類と微細真核生物に一致するDNAが多く検出されるとともに、ホスト自体の変異型も多く検出されたが、餌生物由来と考えられるDNA分子は検出できなかった。イセエビ科(Palinuridae)、セミエビ科(Scyllaridae)幼生からも同様な生物群とホスト変異型が検出されたが、尾索動物や刺胞動物といったゼラチナスプランクトンのDNAが共通して検出され、これらが餌生物として利用されていることが示された。イセエビ(Panulius japonicus)の近縁種であるカノコイセエビ(Panulirus longipes bispinosus)と大西洋の種(Panulirus echinatus)は秋季に採集された標本であり、これらのゼラチナスプランクトンが検出されたが、春季に採集されたイセエビからはこれらの生物が検出されず、硬骨魚類のDNAが検出された。この違いが季節や海域、あるいは種によるものかどうかは今後の検討課題である。アルテミア幼生もしくはイガイ卵巣のみを餌として与えたイセエビ飼育幼生の消化管内容物からDNAを抽出し18SrDNAを標的としたPCR増幅、クローニング及び制限酵素処理によるスクリーニングを経て塩基配列分析を行ったところ、それぞれのDNAを検出することができた。このことにより、稚仔の胃内容から餌生物由来DNAを検出できることが示された。本手法をイセエビ類とウナギ類天然幼生標本に応用したところ、大西洋産イセエビ(Panulirus echinatus)幼生の胃内容からサルパ(Thalia democratica)、太平洋産のイセエビ属(Panulirus)の2個体からサバ科魚類、卵菌類(ツボカビ)及びウロコイタチムシ(Lepidoderma sp.)、太平洋産のセミエビ類幼生2個体からクラゲ類、サルパ、オタマボヤの18SrDNAを検出することができた。大西洋産ウナギ類仔魚からはデータベースに登録されていない魚類のDNAが検出された。胃内容物の検討にはそのホスト生物の種判別も重要であることからDNAを用いた重要水産動物稚仔の種同定についても検討した。西部太平洋海域におけるマグロ類及びその近縁種、さらにアカイカ類の種判別手法を開発した。九州南東沿岸域における調査船の大型フレームネットで採集したマアジ稚魚(体長1051m)の消化管内容物の種類別サイズ組成と同じ海域におけるネットサンプリングで採集した動物プランクトンの種類別サイズ組成を比較した結果、マアジ稚魚が体長により異なるサイズの動物プランクトンへの選好性を示し、稚魚の成長による捕食行動の発達とともにより大きなサイズフラクションの動物プランクトンを捕食することが明らかとなった。西部太平洋海域におけるイセエビ類フィロソーマ幼生及びハワイ諸島周辺に出現するアカイカ科イカ類幼生の種判別手法を開発した。秋季に水産総合研究センター調査船俊鷹丸によって南西諸島周辺海域において重要海産動物稚仔調査を行い、ウナギ後期幼生及びイセエビ類幼生を大量に採取することができイセエビ類標本については種の判別がほぼ終了した。ウナギの近縁種としてハモ、イセエビ類の近縁種としてセミエビ科の幼生について胃内容ゲノム解析を行った。

その結果、ハモからは真菌類と微細真核生物と一致するDNAのみが得られたが、セミエビ科幼生からは渦虫類、鉢虫類、サルパ類、ヒドロ虫類、尾虫類といった多様な生物のDNAが得られた。胃内容物の検討にはそのホスト生物の種判別も重要であることからDNAを用いた重要水産動物稚仔の種同定についても継続した。イカ類の種判別に基づいた研究成果を利用し、系群及びイカ類の資源変動やイカ類を利用する魚類資源の動態についての研究を行った。また、まぐろ類については新規核遺伝子マーカーを用いた系統類縁関係についても検討した。イカ類幼生、ウナギ類幼生及びイセエビ類幼生について胃内容物ゲノム解析を継続するとともに、結果の取り纏めを行った。イカ類(アカイカ)とウナギ類(ウナギ、ハモ、アナゴ)については真菌類と微細真核生物に一致するDNAが多く検出されるとともに、ホスト自体の変異型も多く検出されたが、餌生物由来と考えられるDNA分子は検出できなかった。イセエビ科(Palinuridae)、セミエビ科(Scyllaridae)幼生からも同様な生物群とホスト変異型が検出されたが、尾索動物や刺胞動物といったゼラチナスプランクトンのDNAが共通して検出され、これらが餌生物として利用されていることが示された。イセエビ(Panulirus japonicus)の近縁種であるカノコイセエビ(Panulirus longipes bispinosus)と大西洋の種(Panulirus echinatus)は秋季に採集された標本であり、これらのゼラチナスプランクトンが検出されたが、春季に採集されたイセエビからはこれらの生物が検出されず、硬骨魚類のDNAが検出された。この違いが季節や海域、あるいは種によるものかどうかは今後の検討課題である。
分子標的性リポソームを用いた不安定プラークイメージング法の開発

分子標的性気泡含有リポソームを用いて、不安定プラークの超音波イメージングが体表面または血管内から可能か検討した。(1)RGDペプチド、抗ICAM-1抗体、抗酸化LDL抗体を気泡含有リポソームの表面に付着させて分子標的性のある気泡含有リボソームを作成した。(2)動脈硬化を自然発症するWatanabe heritable hyperlipidemic(WHHL)rabbitに、上記の3種類の分子標的性気泡含有リボソームを静脈内投与して、体表面からリニアプローブを用いて総腸骨動脈から大動脈にかけての動脈硬化巣の超音波イメージングを実施した。同時に、血管内超音波カテーテルを用いて、同部位のイメージングを行い、分子標的性気泡含有リポソームによる超音波画像の増強効果を評価した。体表からのイメージングでは、動脈硬化巣の増強効果は、RGDペプチド、抗ICAM-1抗体、抗酸化LDL抗体の順に大であった。血管内からのイメージングにおいても、動脈硬化巣の増強効果は、RGDペプチド、抗ICAM-1抗体、抗酸化LDL抗体の順に大であった。体表面および血管内からのいずれのイメージングにおいても、画像の増強効果はプラークサイズの大きい部位でより著明であった。分子標的性リポソームを用いて不安定プラークのイメージングが可能か検討した。(2)WHHLrabbitを用い、上記抗脂質抗体を付着させたパーフルオロカーボンガス封入リポソーム(バブルリポソーム)の投与前後において、体表面からリニアプローブを用いて総腸骨動脈から大動脈にかけての動脈硬化巣の超音波イメージングを実施した。超音波画像の増強効果が得られた部位と摘出した動脈標本を比較したところ、動脈硬化巣の検出に関してその感度、特異度ともに約70%であった。(3)同様にWHHL rabbitを用い、RGDペプチドを付着させたバブルリポソームの投与前後において、体表面からリニアプローブを用いて総腸骨動脈から大動脈にかけての動脈硬化巣の超音波イメージングを実施した。この動脈標本を病理学的に検討したところ、バブルリポソームの付着している部位は主として通常の動脈硬化性プラークであり、必ずしも不安定プラークではなかった。
超弾性型ニッケル・チタン合金の口腔外科臨床応用の基礎的研究

われわれは、平成3年度から4年度にかけて、超弾性型ニッケル・チタン合金と軟性レンジを組み合わせる口腔床の軟組織維持装置を開発するための基礎研究および、臨床応用に即した材質、製作法を検討した。維持装置の状態は断面がY字型で口腔の底部に固定し、先端の膨隆部が口腔内欠損のアンダーカット部に入り、維持力を発揮するものである。維持装置は核に単純屈曲した超弾性型ニッケル・チタン合金製ワイヤー(矯正用ワイヤー0.2×0.2mm、トミー社製)二本をY字状に配列したものを維持装置の長さにより複数組使用するもので、その周囲を軟性レンジ(モロシル、デンタルエコー社)で被覆した。この形状記憶効果を有する超弾性型ニッケル・チタン合金性ワイヤーは、変態温度010〓である。従って、口腔床を脱着時に氷水等で冷却することにより容易に維持装置を変形することができ、室温または体温でものと形態に戻すことができた。一方、臨床応用では、現段階では、この維持装置を装着した臨床応用可能と思われる床装置を作製したが、維持装置の生体に対する応力の調整に難渋し、今後はその適正応力についての研究が必要と思われる。また、唇顎口蓋裂患者1685名のデータベースを作成した。データーベースには患者の住所、治療歴、顎態模型などの臨床資料、唇顎口蓋裂専門外来の受診状況等を登録し、これにより患者個々の臨床状態の把握、治療計画の立案が容易となった。本年度は当初の研究計画に従い、超弾性型ニッケル・チタン合金と軟性レジンを組み合わせる口腔床の軟組織維持装置を開発するための基礎研究を行った。すなわち、維持装置の軟性レジン部に埋没させる超弾性型ニッケル・チタン合金維持装置の形態決定および最適軟性レジンの選択をした。これまでの結果では、同合金の三次元的変態についての解析には不明な点が多く、また熱処理用金型に適合させ熱処理を行い形状付与を行なう際の操作の簡便性から維持装置には同合金製ワイヤ-の単純屈曲による二次元的変態を利用することにした。さらに床維持装置とにて同合金ワイヤ-を利用する際に最適な軟性レジンとしてシリコンラバ-系軟性レジン(モロジル、モロプラスト社製)を選択した。当初、この超弾性型ニッケル・チタン合金ワイヤ-とシリコンラバ-系軟性レジンを維持装置内で接着することを試みたが、基礎実験段階で繰り返し使用すると、弾性率の差から両者が剥離してしまうことが判明した。そこでわれわれは、同合金ワイヤ-を既成のシリコンチュ-ブで被覆し、両者を接着させずに維持装置を作製することで、この問題を解決した。現在、この維持装置を装着した臨床応用可能と思われる床装置を作製し、その予後を観察中である。また、コンピュ-タ-により1600余名の唇顎口蓋裂患者のデ-タベ-スを作製した。このデ-タベ-スを利用することで、個々の患者の臨床状態の把握することが可能となり、平成4年度の同装置の臨床応用に利用する予定である。本年度は、超弾性型ニッケル・チタン合金と軟性レジンを組み合わせる口腔床の軟組織維持装置を開発するための基礎研究および、維持装置の製作法を検討した。その結果、現段階では以下の材料、条件で維持装置を作製することにした。維持装置に利用する超弾性型ニッケル・チタン合金型ワイヤーは矯正用0.2mm径のものを用いた。形態付与はステンレスチューブを用い同合金ワイヤーを二次元的に屈曲し、これを440°Cソルトバス中で熱処理する。得られた屈曲線は変態温度が010°C形状記憶能を有し、氷水中で容易に塑性変形させることができ、口腔内温度で形状を回復し、しかも超弾性の性質を有する。これを維持装置に必要な長さに応じ複数本並列させ、維持装置の核とする。この核の周囲に軟性レジンとしてシリコンラバー系軟性レジン(モロジル、モロプラスト社製)を流し込み法により埋没する。

このとき、直接ワイヤーを軟性レジンを接触させず、ワイヤー周囲にシリコンラバーを介し接触させるようにする。こうして作製した軟性レジン超弾性型ニッケル・チタン合金ワイヤー複合症維持装置は、ホッツ床などのような床装置にレジンで固定し、口蓋裂などの口腔欠損部でアンダーカットの存在する部位に床維持力を求めるようにした。一方、臨床応用では、現段階では、この維持装置を装着した臨床応用可能と思われる床装置を作製し、その予後を観察中であるが、短期的には維持装置の生体に対する応力の調整に難渋し、今後のその適正応力についての研究が必要と思われる。また、前年度作製した1600余名の唇顎口蓋裂患者のデータベースは、当料における唇顎口蓋裂専門外来の患者呼び出しや、診療の際の患者病歴の照会など、患者個々の臨床状態の把握に現在稼働中である。
表象過程に関する生理心理学的研究

本研究ではいくつかの表象が同時に保持されうるような事態でサルを訓練し、前頭連合野のニューロン活動を調べることにより、表象過程、特に同時に複数の表象を脳内に保持するメカニズムを明らかにしようとした。(1)サルにある餌、あるいはその餌と結びついた中性刺激(又は空の餌箱あるいは餌と結び付かない中性刺激)を見せた後、遅延期間をおいてサルがパネル押し反応をすると、(餌のある場合には)その餌を与えるという「連合課題」の訓練をする。次にサルに右か左の餌箱のどちらかランダムにりんごとかレーズンなどの餌、あるいはそれと結びついた中性刺激を提示し、一定の遅延期間後にその刺激の提示された側にサルが反応すればその餌を報酬として与えるという「遅延反応課題」を訓練する。(2)サルがこれらの課題に十分習熟した後、ニューロン活動記録のための手術を行なう。手術から回復後、サルの頭を固定した状態で課題を行なわせながら前頭連合野からニューロン活動を記録する。(3)連合課題で異なった報酬が期待される場合、その期待を反映して、遅延期間中に異なった活動を示すニューロンが見出された。さらに報酬が期待出来ない場合でも、そのブロックで提示され続けた(本来あるべきなのに、その試行ではない)種類の報酬の違いをその遅延期間中に表象するニューロンも見出された。(4)報酬を実際にサルに見せた場合と、特定の報酬を意味する中性刺激を出した場合では、その違いも反映した活動を示すニューロンも見いだされた。(5)遅延反応の遅延期間中に左右の試行で異なった活動を示すニューロンの中には、期待される報酬の違いも反映するという、異なった種類の表象を2重に保持しているものが見出された。
DBDプラズマアクチュエータの実環境利用に向けた性能実証に関する研究

本課題ではDBDプラズマアクチュエータを用いた流れ制御を実流れに適用する事を目的として,乱れた流れ(乱流)を含む小さなスケール流れ(低レイノルズ数流れ)及び乱流へと容易に遷移する大きなスケール流れ(高レイノルズ数流れ)において,効果的である剥離制御手法を非定常解析が可能なラージエディシミュレーション(LES)を用いて明らかにする.現状DBDプラズマアクチュエータの有用性が示されているのは乱れを含まない理想的な低レイノルズ数流れに限られており,本デバイスの実用化には実際の航空機が飛行する乱れを含むような流れ環境下での性能実証が不可欠である.H30年度は当課題の最終年度であるために成果発表に注力し,共著を含めて国際ジャーナル1本,国際学会1件の発表を行った.国際ジャーナルでは乱流の壁面モデル構築のためにコード長と一様流基準のレイノルズ数で2.1×10^6の翼流れ解析を行い,モデル構築に必要な高レイノルズ数流れの物理現象を明らかにした.特に,剥離を生ずる前後では圧力勾配項が支配的であり,従来多くの壁面モデルでは省略されていた同項が剥離を生じる翼流れにおいて重要である事を示した.また,国際学会においては,平板流れに対して人工乱流を付加したシミュレーションを行い,平板上に形成される剥離泡への影響を検証した.乱れのない理想的なシミュレーションでは遷移・再付着が実験に比べて下流で発生するのに対して,人工乱流を伴うケースでは流れの再付着が実験とほぼ同等の位置で生じること示すとともに,乱流遷移を促進する乱流スケールを明らかにした.当課題の最終目的である実流れに効果的な流体制御手法を提案するまでは至らなかったが,得られた知見や開発したシミュレーション技術はDBDプラズマアクチュエータの実用化に役立つものである.本課題ではDBDプラズマアクチュエータを用いた流れ制御を実流れに適用する事を目的として,乱れた流れ(乱流)を含む小さなスケール流れ(低レイノルズ数流れ)及び乱流へと容易に遷移する大きなスケール流れ(高レイノルズ数流れ)において,効果的である剥離制御手法を非定常解析が可能なラージエディシミュレーション(LES)を用いて明らかにする.現状DBDプラズマアクチュエータの有用性が示されているのは乱れを含まない低レイノルズ数環境下に限られており,実際の航空機が飛行する高レイノルズ数環境下での性能実証が不可欠である.しかしながら高レイノルズ数条件下でのLESは莫大な計算資源が必要となるために最も計算コストの集中する物体壁面乱流のモデル化が必要となる.そこで本年度は乱流の壁面モデル構築のためにコード長と一様流基準のレイノルズ数で2.1×10^6の翼流れ解析を行い,モデル構築に必要な高レイノルズ数流れの物理を明らかにした.対象とした流れは翼前縁近傍で層流剥離・乱流遷移・乱流再付着し,翼後縁で再度剥離する.流れ場の可視化及び周波数解析により,翼前縁付近の層流剥離剪断層からスパン方向に軸を持つ渦がコード長に基づく無次元周波数でSt130の周期で放出された後に乱流へと遷移する過程を明らかにした.更に,運動量方程式の応力バランスの解析によって剥離を生ずる前後では圧力勾配項が支配的になり,従来多くの壁面モデルでは省略されていた同項が剥離を生じる翼流れにおいて重要である事を示した.また,計算格子解像度とスパン長を変化させた流れの比較により,層流剥離剪断層から放出される渦及び乱流境界層を解像する解像度,後縁剥離領域と同程度のスパン長が必要であることを明らかにした.これらの結果は高レイノルズ数流れのLESを行う上で重要な知見であり,得られた成果は国内外の学会で発表済みである.当初の予定では一様流に乱流を含む低レイノルズ数流れの剥離制御を本年度は主に行う予定であったが,高レイノルズ数乱流の大規模データベースが利用可能であり,高レイノルズ数流れのシミュレーションの方が多くの時間を要するためにそちらを優先した.本年度は低レイノルズ数流れのシミュレーションに関しての進捗は少ないものの,代わりに高レイノルズ数流れのシミュレーションを推進した形となる.現在,低高レイノルズ数両者にDBDプラズマアクチュエータを加えたシミュレーションの準備を行っている.本課題ではDBDプラズマアクチュエータを用いた流れ制御を実流れに適用する事を目的として,乱れた流れ(乱流)を含む小さなスケール流れ(低レイノルズ数流れ)及び乱流へと容易に遷移する大きなスケール流れ(高レイノルズ数流れ)において,効果的である剥離制御手法を非定常解析が可能なラージエディシミュレーション(LES)を用いて明らかにする.現状DBDプラズマアクチュエータの有用性が示されているのは乱れを含まない理想的な低レイノルズ数流れに限られており,本デバイスの実用化には実際の航空機が飛行する乱れを含むような流れ環境下での性能実証が不可欠である.本年度は低レイノルズ数において乱れを含む流れを人工的に作成するプログラムを流体解析ソルバーに実装し,基本的な性能特性の評価,テスト計算の実施を行った.一様流中に人工的に生成した乱流(人工乱流)を付加した流体シミュレーションを行い,周波数特性や変動量の2点相関が実際の乱流に近い特性をもつことを確認した.続いて,テスト計算として,平板流れに対して人工乱流を付加したシミュレーションを行い,平板上に形成される剥離泡への影響を検証した.

その結果,人工乱流を伴わない理想的なシミュレーションでは遷移・再付着が実験に比べて下流で発生するのに対して,人工乱流を伴うケースでは流れの再付着が実験とほぼ同等の位置で生じることを確認し,今回実装した人工乱流生成プログラムによって実流れの特性を再現できることを確認した.現在は格子解像度や乱流パラメータの影響を検証しつつ,DBDプラズマアクチュエータによる制御流れに対して人工乱流を付加したシミュレーションの準備を行っている.ここまで得られた結果は学会発表に向けて準備中である.また,昨年度行った高レイノルズ数流れ解析によって得られた成果はジャーナルに投稿中である.当初の予定では,2年計画で本研究を遂行する予定であったが,高レイノルズ数流れのデータ解析の進捗が良くジャーナルとして成果をまとめることを優先したこと,人工乱流生成プログラムの実装に時間がかかったことの理由により,研究期間を1年延長することとした.今年度,人工乱流生成プログラムの実装,性能評価がおおよそ完了したため,次年度に本来の目的である制御流れの解析を進める予定である本課題ではDBDプラズマアクチュエータを用いた流れ制御を実流れに適用する事を目的として,乱れた流れ(乱流)を含む小さなスケール流れ(低レイノルズ数流れ)及び乱流へと容易に遷移する大きなスケール流れ(高レイノルズ数流れ)において,効果的である剥離制御手法を非定常解析が可能なラージエディシミュレーション(LES)を用いて明らかにする.現状DBDプラズマアクチュエータの有用性が示されているのは乱れを含まない理想的な低レイノルズ数流れに限られており,本デバイスの実用化には実際の航空機が飛行する乱れを含むような流れ環境下での性能実証が不可欠である.H30年度は当課題の最終年度であるために成果発表に注力し,共著を含めて国際ジャーナル1本,国際学会1件の発表を行った.国際ジャーナルでは乱流の壁面モデル構築のためにコード長と一様流基準のレイノルズ数で2.1×10^6の翼流れ解析を行い,モデル構築に必要な高レイノルズ数流れの物理現象を明らかにした.特に,剥離を生ずる前後では圧力勾配項が支配的であり,従来多くの壁面モデルでは省略されていた同項が剥離を生じる翼流れにおいて重要である事を示した.また,国際学会においては,平板流れに対して人工乱流を付加したシミュレーションを行い,平板上に形成される剥離泡への影響を検証した.乱れのない理想的なシミュレーションでは遷移・再付着が実験に比べて下流で発生するのに対して,人工乱流を伴うケースでは流れの再付着が実験とほぼ同等の位置で生じること示すとともに,乱流遷移を促進する乱流スケールを明らかにした.当課題の最終目的である実流れに効果的な流体制御手法を提案するまでは至らなかったが,得られた知見や開発したシミュレーション技術はDBDプラズマアクチュエータの実用化に役立つものである.次年度は一様流に乱流を含む低レイノルズ数流れ及び,壁面モデルを用いた高レイノルズ数流れの剥離制御流れのシミュレーションを行う.高レイノルズ数流れのシミュレーションは本年度得た知見を基に壁面モデルを用いたLESを行う.現在,本年度見送った低レイノルズ数流れのシミュレーションを行うために一様流乱流を導入するプログラムを流体解析プログラムに組み込み中である.準備ができ次第,前期中に低レイノルズ数のシミュレーションを実施し,計算の待ち時間を利用しながら壁面乱流モデルを用いた高レイノルズ数流れシミュレーションの準備を進める.後期に高レイノルズ数のシミュレーションを実施し,本課題の目的を達成する予定である.
クライン群、タイヒミュラー空間および関連する多様体の研究

研究代表者および各研究分担者別にまとめる。佐々木は2つの生成元で生成されたクライン群の変形空間の研究を推進した。以前にOsaka J.Math.に発表した,離散群になる為の十分条件を与える不等式とKeenのモジュライ不等式との比較検討を行い,両者の拡張になっている定理を得た。成果は発表準備中である。更に研究を進め,変形空間の複素余次元1の部分空間でモジュライ等式xy=zを満すものを調べ,良く知られたフックス群では起りえない事実を発見し,論文としてまとめの段階にある。松本は局所的にケーラー多様体に共形な多様体の部分多様体の研究を進めた。そしてその研究成果を局所共形概コシンプレティック多様体とその部分多様体という題目で雑誌テンソルに発表した。現在もなお超曲面の微分幾何学的性質の研究を精力的に推進している。安井は可微分多様体の中にコンパクトな可微分多様体がいかに実現されるかという問題を調べた。そしてm次元多様体の2m+1次元多様体の中へのイニューメレイトなうめ込みという題目で論文にまとめ,山形大学紀要に発表した。現在もなおうめ込みの存在性とその分類に意欲的に取り組んでいる。八木は整数論を研究する立場から,整数論とクライン群,整数論とフックス群はいかに関連しているかを研究した。研究は継続中で,成果は次元度以後になる見込みである。
ボルデテラ属細菌の産生するネクローシス誘導因子 BopC の作用機序の 解析

百日咳菌を含むボルデテラ属細菌の病原因子であるタンパク質BopCがどのように宿主細胞に細胞死を惹起するのかを解析した。ボルデテラ属細菌を感染させた哺乳類細胞の形態を経時的に観察した結果,BopC依存的に哺乳類細胞は収縮した後に伸展し,細胞膜が破壊されることが明らかになった。またBopC依存的なネクローシスはプロテインキナーゼCの阻害剤などで特異的に抑制されることを明らかにした。他のグループからの報告により,BtcAはBopCを菌体内で安定させるシャペロンとしてはたらくことが示唆された。我々はBtcAが菌体内にとどまらずに,III型分泌装置から分泌されることを見出し,BtcAがBopCのネクローシス誘導活性を補助する機能をもっているという仮説を立てた。BopCをコードする遺伝子を哺乳類細胞内発現用ベクターにクローニングし,そのプラスミドをHeLa細胞などの培養細胞内に導入し,BopCの産生を誘導した。その結果,HeLa細胞にネクローシスが誘導され,細胞膜破壊にともなってラクトースデヒドロゲナーゼの培地への遊離が認められた。もしBtcAがBopCのネクローシス活性を補助する作用をもっているなら,BopCとBtcAを同時にHeLa細胞に産生させた場合,BopCを単独で産生させた場合よりも,培地中へ遊離するラクトースデヒドロゲナーゼの量が多くなると考えられる。BopCとBtcAを同時にHeLa細胞に産生させたところ,ラクトースデヒドロゲナーゼの遊離量はBopCのみを産生させた場合と有意な差が認められなかった。この結果より,BtcAはBopCのネクローシス誘導活性を補助するのではなく,他の未知の機能をもっていることが示唆された。BopCに依存した宿主応答の詳細を明らかにするために,気管支敗血症菌の野生株を感染させた上皮細胞の形態変化をタイムラプス撮影が可能な顕微鏡システムをもちいて解析した。以前までは感染細胞を固定した後に,BopC依存的な細胞の収縮および剥離が観察されたが,経時的に観察した結果,感染した細胞は剥離する前に一旦収縮し,その後に細胞は伸展し,そしてblebとよばれる水疱を突出させた後に剥離することがわかった。現在,その形態変化に重要な因子を同定している段階である。【1】BopCの分子内・分子間相互作用の解析BopCは658アミノ酸からなるタンパク質であるが、BopCのN末半分(1-312a.a.; N-moiety)とBopCのC末半分(313-658a.a.; C-moiety)を哺乳類培養細胞内で発現させると、BopC全長を発現させた場合とほぼ同様の細胞傷害活性を示す。平成23年度は、N-moietyとC-moietyをそれぞれFLAG-HaloタグとHis-Strepタグを付与した組換え型タンパク質として、別々に大腸菌から精製した。精製したN-moietyとC-moietyを混合し、ストレプトタクチンビースを用いたプルダウンアッセイにより、N-moietyとC-moietyが共沈することが示唆された。現在は特異的な相互作用を示す実験条件を検討している。【2】BopCとBtcAの宿主細胞内における相互作用の解析(1)BopCのC-moietyとBtcAをCOS-7細胞に共発現させ、免疫蛍光染色を行なうとどちらのタンパク質も核周辺にパッチ状に染色される、(2)組換え型のBopCと組換え型のBtcAが結合することが報告されている、(3)BtcAの欠損株の細胞傷害活性は野生株より有意に低い、という3つのことからBtcAが宿主細胞内でBopCと相互作用し、細胞傷害活性に補助的な役割を果たしていることが示唆された。平成23年度,FLAGタグを付与したBopCのC-moietyとBtcAを培養細胞内で共発現させ、細胞溶解液を調製し、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行った結果,BtcAが共沈してくることが明らかとなった。分子間相互作用の解析についてはいくつかの条件を試みた。当初はグラム陽性菌であるBrevibacillus属細菌の発現系を用いて組換型蛋白質の精製を試みたが,産生量が少ないこと,ニッケル樹脂への目的蛋白質の結合性が低いなどの問題があり,計画したような精製度とタンパク質量が得られなかった。そこでコールドショックプロモーターを有する遺伝子発現用プラスミドベクターを用いて,再度蛋白質の精製を試みた。その結果,目的の精製度および蛋白質を達成することに成功した。また一方でグルタチオン-S-トランスフェラーゼと融合させたBopCあるいはBtcAの精製を試みたが,蛋白質の産生量が少ないという問題があった。そこでハロタグと融合させた蛋白質を大腸菌内で産生させる系を導入した。その結果,相互作用解析に用いるのに十分な精製度の組み換え蛋白質を十分量得ることに成功した。

BopC全長をコードするプラスミドとBtcAをコードするプラスミドを混合し,Cos-7細胞あるいはHeLa細胞にトランスフェクションした。その結果,2つのプラスミドを同時にトランスフェクションした後に培地中に遊離してきたラクトースデヒドロゲナーゼ(LDH)の量は,BopC全長をコードするプラスミドを単独でトランスフェクションした後に培地中に遊離するLDHの量と有意な差が認められなかった。この結果は,BtcAとBopCの相互作用がBopCの細胞傷害活性を増強するという当初の仮説が間違っていることを示唆した。今後はBtcAの機能についてBopCの活性の補助を行なうという予想に固執せずに,BopC-BtcA間の相互作用が病原性に貢献しているのか否か熟慮しながら研究を進めていく。【1】BopCの宿主細胞内の局在の解析BopCのC-moietyをHeLa細胞に共発現させて免疫蛍光染色を行った場合、これら二つのタンパク質は共に核周辺に蛍光シグナルが認められることから、何らかの細胞小器官に局在している可能性が考えられた。そこで、BopCのC-moietyあるいはBtcAを発現させたHeLa細胞を抗EEA1抗体(初期エンドソーム)、抗カルレティキュリン抗体(小胞体)、抗Mannosidase II抗体(ゴルジ体)、抗ERAB抗体(ミトコンドリア)等のマーカー抗体と抗BopC抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、いずれかの細胞小器官に局在しているかを調べる。この解析を行った場合,どの細胞小器官の蛍光シグナルとも局在が一致しないことが考えられる。その場合は宿主細胞の種類をA549細胞に変えて、同じ実験を行なうとともに、Subcellular Protein Fractionation Kit (Thermo Scientific社)を用いて、細胞質画分、膜画分、各画分、細胞骨格画分に分画し、いずれの画分にこれらのタンパク質が含まれているのか調べる。【2】BopCあるいはBopC-BtcA複合体と結合する宿主側因子の同定FLAGタグもしくはStrepタグを付与可能な哺乳類細胞用発現ベクターpCAGを用いて、BopCと相互作用する宿主側因子を取得する。pCAGベクターを用いてBopCのN-moietyあるいはC-moietyを培養細胞内で発現させる。その後、細胞溶解液を調製し、抗FLAG抗体もしくはStrep-TactinビーズでBopCに結合するタンパク質を回収し、そのサンプルをTOF-MSで解析する。BtcAについても同様の方法を試み、相互作用する宿主側因子の同定を試みる。研究を行なうための安全キャビネット、CO2インキュベーター、冷却遠心機、冷蔵庫、冷凍庫などの機器は既に配備されているため,50万円を超える機器を購入する予定はない。BopCと相互作用する宿主側因子が同定された後に,その因子をノックアウトされたマウスを試用して実験を行なうことを考えており,実験動物代として80万円の予算をとっている。また老朽化した卓上遠心機の更新のために20万円の予算をとっている。クローニング後の配列確認は時間の節約を考慮し,外部委託することを考えており,予算として10万円ほど予定している。ピペットやチューブなどのプラスチック消耗品,フラスコなどのガラス機器,および試薬・キット(抗体,制限酵素,プラスミド精製キット,ゲル抽出キット,siRNA作製費,トランスフェクション試薬,細胞培養用培地,組み換えタンパク質精製用樹脂,一般試薬等)に100万円ほどの予算をとっている。
学習指導力を高める教師集団の組織―日本の授業研究の蓄積をふまえて

これからの学校教育に求められる「主体的・対話的で深い学び」の実現にむけて、日本の授業研究の財産をふまえ、教師の学習指導力向上を促す研究集団のあり方と組織の道筋を示す研究である。子どもの学力を高めた、島小学校(群馬県)と巨摩中学校(山梨県)の事例を検討し、学習の事実をとらえる目と教材の追求を深める力が教師に培われるよう、質の高い授業研究を推進できる教師集団の具体像を示す。本研究の成果は、教職の専門性の高度化に寄与し、教師の指導力の向上につながることが期待できる。
枯草菌への全ゲノム輸送機構解明とタンパク質ナノ輸送への発展

枯草菌形質転換で新規な性質を見いだしている:1)枯草菌全ゲノム二本鎖DNAの細胞内輸送;2)Bacillus halodurans菌DNAによる形質転換(DNA相同性が低い、組換わった長さ150kb以上)。この長い距離の組換え機構の解明を第一の目的とした。また、ナノ輸送解析を第二の目的とした。Bacillus halodurans菌DNAによる枯草菌形質転換が高頻度で生じる突然変異体を分離した。その遺伝子機能を解析するために、異種菌DNAを数百kb持つ枯草菌を供与DNA源として用いた形質転換体の解析を行い、ゲノムのほとんどが供与菌由来である株などを見出した。従って、組換えの様式は、相同的組換えではなく、相同的組み換えから複製を行う機構であることが強く示唆された。少なくとも2個の変異があり、一方は、D-ループ形成が促進されること、他方は、その後の複製に向かいやすいことが示唆された。LP形質転換に対するComFAやEcsBの役割を調べた。ComFAは、キネティックスと同時連鎖解析から単なるヘリカーゼではなく、その他の機能(例えば、ブラウン運動の歯止め)を行い、かつDNAを一方向に取り込む機能を持つと推定できた。EcsBは精製DNAによる形質転換に必須のタンパク質の輸送に直接的もしくは間接的に掛かり合っていることが示唆された。酵母と枯草菌とで生産量の異なるタンパク質をPAGEで確認した。そのタンパク質は、形質転換で輸送されるのではないかと示唆される結果が得られた。枯草菌形質転換の新規な性質を見いだしている。1)枯草菌の全ゲノムDNAが二本鎖DNAとして取り込まれる。2)相同性が低いBacillus halodurans菌DNAによる形質転換では、長さが150kb以上も組換わる。この長い距離の組換え機構解明を第一の目的とする。また、ナノ輸送解析を第二の目的とする。そのために、Bacillus halodurans菌DNAによる枯草菌形質転換が高頻度で生じる数多くの突然変異体を分離し、その遺伝子機能を明らかにする。次に、従来の形質転換に掛かり合う遺伝子産物とLP形質転換系と比較解析する。また、枯草菌形質転換機構の統一的理論を構築する。DNAともにタンパクが細胞内にナノ輸送されるかどうかを調べる。[高頻度で異種間形質転換を生じさせる突然変異体の分離:突然変異体の濃縮と分離](1)枯草菌AYG11(cysA metC trpC leuB argl aroG)株をN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンで突然変異処理した。(2)変異処理した培養液からコンピテント細胞を調製し、Bacillus halodurans CR1(rpsL)DNAによる形質転換を行った。(3)混合培養し、形質転換を行い、変異体を濃縮した。[既知のDNA取り込みに掛かり合う遺伝子産物のLP形質転換に対する掛かり合い]:ComFAのLP形質転換に対する掛かり合いを調べたところ、形質転換能とともに同時連鎖率が低下することを認めた。従って、ComFAのへリカーゼ活性が取り込みに強く掛かり合っていると推定できた。組換えに掛かり合うAddA欠損株のLP形質転換に対する影響を調べたところ、強い依存性を認めた。従って、DNAは従来考えられている一本鎖として細胞内に取り込まれるのではなく、二本鎖DNAとして細胞内に取り込まれると推定できた。
膜結合型ATP依存性FtsHプロテアーゼの細胞機能

σ32を特異的に分解するFtsHプロテアーゼについて以下の点を明らかにした。(1)σ32の分解反応系においてシャペロン蛋白DnaK、DnaJ、GrpEが果たす役割を解析し、これらのシャペロンを加えてもσ32の分解促進は起らず、むしろDnaK,DnaJの添加によって分解は有意に阻害された。それにGrpEを追加するとその阻害効果は消失した。(2)RNAポリメラーゼを分解系に添加するとσ32の分解は強く阻害され、これにシャペロンを加えても阻害効果は変化しなかった。(3)In vivoの結果より、σ32の安定性に関与するC領域を欠失した変異σ32の分解をin vitroの系で調べたところ、予想に反してかなり効率よく分解された。(4)ftsH欠損変異による致死を抑制するサプレッサー変異を同定し、この遺伝子はリポ多糖の合成を制御するfabZ遺伝子であること、ftsH変異株ではリポ多糖の合成量が上昇し、異常な膜構造が出現することを明らかにした。サプレッサー変異によって細胞内のσ32の量や安定性が変化するということはない。(1)、(2)の結果よりσ32分解反応におけるシャペロンの働きはDnaK-DnaJのσ32への結合により、σ32がRNAポリメラーゼに再結合(して安定化)するのを防ぎ、それにGrpEが作用してシャペロンから遊離したσ32をFtsHプロテアーゼが分解するというモデルが考えられる。もちろん、それ以外の可能性もあり今後さらに検討したい。(3)の結果は、FtsHプロテアーゼによる基質認識はσ32のC領域以外が重要であることを示唆するものである。C領域はシャペロンの結合に重要であることを示唆するin vivoのデータがある。今後FtsHの認識に必要な領域を詳細に検討していく。(4)の結果によりσ32以外に膜の生合成に関連する新たなFtsHプロテアーゼの基質発見の可能性が示唆された。
EAP教育の開発とその評価―バイリンガリズム理論におけるCALP発達の観点から

2018年度はまず文献研究としてEAPに関してJACET Journal, Cognition. The Modern Language Journal, Computers & Education等に掲載されたバイリンガリズムやEAP関係論文を輪読した。特に語彙習得やライティングに関する論文は先行研究として精読した。また、Andersonのタキソノミー(2001)を再読し、認知面と知識面の両領域カテゴリーについて確認した。ニーズ分析プロジェクトは2017年度に実施したパイロット調査の結果を受けて調査項目を修正し、オンライン調査を実施した。JACETバイリンガリズム研究会のメンバーの協力を得て、全国9大学においてPretestを実施した。約500名余の回答を分析し、日本の大学生の高校における言語活動経験と、英語学習動機について考察した。これら文献調査とニーズ調査を基に、バイリンガリズムの視点をとりいれたEAPプログラムを設計し試行した。ある医療系大学では新入生の2,3年次以降の英語教育を鑑みて、いかに学びの足場掛けをするかに主眼をおき、ショートリサーチなどを中心とした授業を行った。ある理数系学部では、1年次のリーディング題材を用いて、認知面、知識面の段階的足場掛けを取り入れながら発展活動を実施した。ライティングでは論理の流れを追う指導法を実施して学習者の変化を記録した。これら2つの大学では、学期終了時に事後アンケートを実施し、プログラムの効果を分析しJACETやJASELE等の学会において成果を公表した。また、国内外のCALPを育む教育について調査を行った。国際バカロレア教育とその教師教育について講師を招いて公開講演会を行った。海外(台湾)の高等学校の教科書調査を行い、論理的思考力養成のために必要な発問や、教材として文学作品の使用方法などを考察した。本課題の2年目として研究の中核としてのニーズ分析を実施することができた。オンラインでのニーズ調査は研究者間で綿密な内あわせを行い、倫理手続きや調査方法の共通理解を確立した上で実施したため、問題なくデータ収集を実施することができた。分析にあたっては量的および質的分析の両面で研修を受け、専門家のアドバイスも受けながら研究をすすめた。EAPプログラム設計と試行は年度後半に実施した。その際には、該当する大学や学部から研究に対する理解と協力を得ていたため、問題なく遂行することができた。学会や学術集会でも幸い論文や口頭発表プロポーザルが採択され、途中経過を報告して出席者との情報交換の機会があり、今後の示唆を得られた。2019年度は本課題の最終年度である。まず文献研究と国内外のEAP教育についての情報収集は引き続き行う。関連学術誌Journal of English for Academic PurposesやEAPカリキュラム、語彙習得、評価などに関する文献や先行研究を輪読し調査研究者間での共通理解を構築したい。国内外の現地調査も予定している。2019年4月にはイギリスのEAP教育の視察調査を予定している。また年度後半にはアメリカの大学におけるライティング教育に焦点をあて調査を実施する予定である。2018年度に引き続き入学後のニーズ分析調査を実施する。昨年度との比較により調査方法と項目の有効性を検証する。その上で、2018年度に試行したアプローチも取り入れながら、大学3年次以降の専門課程につながる英語力養成プログラムを、研究参加者のそれぞれの教育現場の中で実施する。数理系学部では規定のシラバスの中でアンダーソンのタキソノミーを考慮に入れた活動を取り入れて展開させながら、1年次の英語教育プログラムの在り方を検討する。医療系学部では、前度末に行った学習者調査や、授業中の評価方法の改善を行い、授業設計をした試行授業の結果、学生がどの程度、どの点で、英語の能力が向上したかを把握できるようにする。前年度に1年次で行った授業を2年次まで積み上げ、1年次の授業終了時の調査結果と3年次教育内容を鑑みて、医学部2年次の授業の授業設計を行い、試行授業をする。そして、前年度同様に授業終了時調査を行い、結果を集計、分析する。これらの研究結果を総合的に検討して学会や学術誌にて口頭発表や論文発表を行う。プロジェクトとしては前年度までの検定教科書の設問分析の結果をふまえ、大学入学時の学習者を対象としたアンケート項目の設計およびパイロット・スタディを行った。英語力(検定試験結果)、英語使用経験(例、留学等)多様なタイプの言語・コミュニケーション活動の経験、学び方および英語学習に対する認識の4項目、合計27問のオンライン・アンケート調査を設定し、調査を試行して回答システムの仕様を検討した。その中間報告を学会発表し参加者から分析方法について情報交換を行った。一方、国内外の教育視察は3件行った。台湾の英語教育を参考にすべく、台湾の高校英語の実態調査と教科書研究を継続し行い、学会発表や論文発表を行った。また国際バカロレアの教育について研究を行い視察見学を行った。国内では玉川大学を訪問し、国外ではアメリカ合衆国ワシントンD.C.のBethesda市の公立学校のIBプログラムの授業を見学した。また、研究者それぞれの勤務校において効果的なEAP教育を目指しながらプログラム構築や教授法の研究や実践を行った。その1つとして、医療系私立大学にてグローバル社会に向けての医学部2年次、3年次の医学英語のカリキュラム策定を行った。また理系私立大学にて1年生対象のパラグラフライティング教授法について入学時の調査を行い、論理展開に焦点を置いた指導のアプローチ開発を行い試行した。平成29年度は3か年にわたる研究の1年目であり、EAP(English for Academic Purposes)をとりまく背景と先行研究の大きな流れに関して文献研究を予定通り行い理解を深めることができた。

また、小規模のライティングや医療英語についてのパイロットスタディも行った。国内外の大学準備教育や大学教育の調査についても実施することができた。ただし予定していたColumbia大学Teachers Collegeの36th Second Language Research Forumについては場所がオハイオ州になり日程も都合がつかなくなったため参加を見送った。しかし他の学校や大学を訪問することができた。EAPプログラム開発に向けたニーズ分析調査を設計してパイロットスタディを行い、調査方法と項目の検証を行った。またテキストマイニングの方法についても研修を受け、有効性と妥当性のあるミックス・メソードを用いた研究手法についても研究を行った。2018年度はまず文献研究としてEAPに関してJACET Journal, Cognition. The Modern Language Journal, Computers & Education等に掲載されたバイリンガリズムやEAP関係論文を輪読した。特に語彙習得やライティングに関する論文は先行研究として精読した。また、Andersonのタキソノミー(2001)を再読し、認知面と知識面の両領域カテゴリーについて確認した。ニーズ分析プロジェクトは2017年度に実施したパイロット調査の結果を受けて調査項目を修正し、オンライン調査を実施した。JACETバイリンガリズム研究会のメンバーの協力を得て、全国9大学においてPretestを実施した。約500名余の回答を分析し、日本の大学生の高校における言語活動経験と、英語学習動機について考察した。これら文献調査とニーズ調査を基に、バイリンガリズムの視点をとりいれたEAPプログラムを設計し試行した。ある医療系大学では新入生の2,3年次以降の英語教育を鑑みて、いかに学びの足場掛けをするかに主眼をおき、ショートリサーチなどを中心とした授業を行った。ある理数系学部では、1年次のリーディング題材を用いて、認知面、知識面の段階的足場掛けを取り入れながら発展活動を実施した。ライティングでは論理の流れを追う指導法を実施して学習者の変化を記録した。これら2つの大学では、学期終了時に事後アンケートを実施し、プログラムの効果を分析しJACETやJASELE等の学会において成果を公表した。また、国内外のCALPを育む教育について調査を行った。国際バカロレア教育とその教師教育について講師を招いて公開講演会を行った。海外(台湾)の高等学校の教科書調査を行い、論理的思考力養成のために必要な発問や、教材として文学作品の使用方法などを考察した。本課題の2年目として研究の中核としてのニーズ分析を実施することができた。オンラインでのニーズ
左心耳における脳塞栓発生の危険因子同定と閉鎖術の術前治療計画システムの開発・検証

この補助事業を活用し、先行研究をさらに発展させ、1心原性脳塞栓発症患者の左心耳の形態学的特徴の検討を通じ解剖学的危険因子を同定し、2左心耳閉鎖術の術前治療計画・術中支援ソフトウエアの開発し、さらに3多施設前向き試験で開発ソフトウエアを検証します。これらは来る臨床現場で実際に活用できる指標及びソフトウエアに相当し、国内の医療者へ提供し、本邦の治療成績の向上に寄与することを目指します。
ＧＧＣＴを標的とした低分子阻害物質による泌尿器癌治療の開発

GGCT(γ-グルタミルシクロトランスフェラーゼ)は癌進行に関わるタンパク質として知られている.当該研究では癌増殖におけるGGCTの機能を阻害する低分子化合物の開発を計画した.われわれが設計した40種の化合物のうちでGA(N-グルタリル-L-アラニン)が最も高いGGCT阻害効率を示した.しかしながら,GAは細胞膜透過性が低かったため,透過性を高める目的でジエステル化したpro-GAを作製した.Pro-GAは、MCF7細胞、PC3細胞およびHL-60白血病細胞における細胞増殖阻害を示した。Pro-GAの腹腔内投与はMCF7およびPC3移植マウスにおいて腫瘍増殖阻害を示した。1.GGCT阻害低分子リード化合物の設計・合成:GGCTの反応機構にもとづき,重要な触媒残基であるGlu98を標的に,この残基と強い静電的相互作用をすると予測される環状アミジン1a(分子量314.22,構造非表示)を設計した.また,GGCTが細胞内酵素であることを考慮し,1aのプロドラッグである細胞透過性にすぐれたエステル型誘導体1d(分子量256.30,構造非表示)も設計した.現在,同化合物の合成に着手している.一方で,リコンビナントGGCTからペプチド型阻害物質をスクリーニングする検討も行った.数十種類のペプチドからN-glutaryl-L-alanine(GA)がリコンビナントGGCT活性を強く阻害することが判明した.これらをGGCT阻害薬のリード化合物候補とした.2.同化合物のGGCT酵素活性阻害作用の検証:リコンビナントGGCTタンパクでの酵素活性阻害が乳がん細胞MCF7(予備検討でGGCT高発現を確認済み)の内因性GGCTにおいても再現されるか検討する目的で,われわれが(株)ペプチド研究所と開発したGGCT活性蛍光基質LISA-101を用いて測定した.すると,MCF7の可溶化液に0.1mMGAを添加すると有意に蛍光が減じ,GAが細胞質由来のGGCT活性を阻害することが示された.しかしながら,細胞を破壊せずにGAを添加しても,GGCT阻害作用は認められず,GAの細胞内移行不良が示唆された.化合物1a,1dについては合成が未完成なため,GGCT酵素活性阻害の検討は出来ていない.リード化合物の設計,合成およびスクリーニングが遅れたため.GGCT阻害リード化合物誘導体の作製:そこで,細胞膜透過性を高める目的で,分子にエステル基を付加した誘導体を各種作製した.また,蛍光標識もGAに行い,細胞内への到達の有無を可視化した.すると,GAにメチル基およびアセトキシメチル基を付加したジエステル体が最も効率よく細胞内に到達することが判明した.この分子は細胞内エステラーゼにより,両エステル基が加水分解を受け,GAとなる.よってこの分子をGAのプロドラッグ,pro-GAと命名した.Pro-GAを用いて,MCF7をはじめとする各種癌細胞株で明らかな殺細胞効果を認め,GGCTを標的とした新規抗がん剤としての基本分子が完成したものと考えられた.GGCTを標的とした分子標的抗癌剤の基本分子が得られたため.また,我々はGGCT機能阻害による増殖抑制メカニズムについても検討を行った.培養細胞におけるGGCTノックダウン(KD)が細胞老化に特徴的な形態変化を呈することに着目した.MCF7を試料として検討し,GGCT-KDで老化マーカーであるSA-β-gal染色の陽性細胞が著明に増加すること,G0/1期細胞が著増することを明らかにした.また,CKDインヒビターの発現を検討するとp21およびp16がGGCT-KDにより発現誘導されることを認めた.さらにはGGCTとp21のダブルKDで,細胞老化および細胞周期の変化が打ち消されることも示した.また,Pro-GA処理においても同様にp21発現誘導を認めた.以上からGGCT発現または機能阻害による増殖抑制機構は細胞老化を介すると推察した.GGCT(γ-グルタミルシクロトランスフェラーゼ)は癌進行に関わるタンパク質として知られている.当該研究では癌増殖におけるGGCTの機能を阻害する低分子化合物の開発を計画した.われわれが設計した40種の化合物のうちでGA(N-グルタリル-L-アラニン)が最も高いGGCT阻害効率を示した.しかしながら,GAは細胞膜透過性が低かったため,透過性を高める目的でジエステル化したpro-GAを作製した.Pro-GAは、MCF7細胞、PC3細胞およびHL-60白血病細胞における細胞増殖阻害を示した。進捗が遅れているものの,リード化合物の選別や作成は予定通り行っている.したがって,今後も当初計画通りの方針で,酵素活性阻害の検討,in vitroおよびin vivoにおける抗癌作用につき,検討を行っていく予定である.In vitroレベルでは正常組織由来初代継代細胞を試料とし,正常細胞における傷害性を確認する.In vivoにおいては担癌マウスを用いて抗腫瘍効果を検討するとともに,血液毒性,肝腎毒性など安全性の検討も重ねる.泌尿器腫瘍研究の根幹を成すリード化合物の設計・合成・スクリーニングに遅滞が生じたため,研究費の残額が生じた.今年度はほぼ計画通りの研究遂行が得られ,使用額もほとんど予定通りであり,残額は適正範囲内であると考える.研究計画自体は変更することなく進める計画であり,当初予定の研究総額を使用する予定である.残額については次年度の使用分として必要であり,最終年度においては予定配分額のすべての適正使用を見込んでいる.