hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1型糖尿病における膵β細胞障害性Tリンパ球と標的抗原

抗原-インスリンペプチド4量体を合成した。この4量体をもちいたインスリンペプチド特異的リンパ球の検索を発症早期1型糖尿病患者の末梢血中から行った。合計4名の発症早期1型糖尿病患者の末梢血リンパ球をこのA24抗原-ペプチド4量体を用いてフローサイトメトリーで解析したが陽性細胞を認めなかった。3.今年度はA Multiple Peptide Synthesis Systemをもちいたインスリン自己抗体、インスリン抗体、インスリン反応性リンパ球のEpitope Mappingを予定している。1型糖尿病の病因は、膵β細胞の自己リンパ球による破壊であり1型糖尿病患者の末梢血中には、膵β細胞特異抗原を認識するリンパ球が存在する。本研究は発症早期の1型糖尿病患者の末梢血中リンパ球をもちいた機能に関する研究である。今回の研究ではHLA class I抗原とインスリン抗原ペプチドのcomplexを合成し患者末梢血リンパ球中のペプチド特異的リンパ球の頻度をフローサイトメーターにて解析したが、陽性細胞は低頻度であり診断には不適であることを解明した。そこで、インスリンのoverlapping peptidesを作成し、それらを抗原としたELISPOT ASSAYシステムを構築した。CD4+T cell用の抗原として15アミノ酸からなるA鎖より7種類、B鎖より16種類のペプチド、CD8+Tcell用の抗原として8-11アミノ酸によるA鎖より11種類、B鎖より20種類のペプチドを作成して、患者末梢血リンパ球を用いた各種抗原に対するELISPOT assay法おこなった。その結果、発症早期の患者19名中、13名に陽性ペプチドが同定できた。一方健常人17名においては有意な陽性ペプチドは認めなかった。したがって、インスリンペプチドを用いたELISPOT法は1型糖尿病の診断に有用である可能性があることがわかった。またELISPOTで陽性を示したペプチドは1型糖尿病の発症機序に重要な関連を持っている可能性がありその役割について今後さらなる研究をすることが必要であることがわかった。
大規模映像コーパスの高次解析を実現するためのマルチメディアデータベース高速化技術

近年の計算機技術の進歩は目覚しいものがあり、大量の映像を映像アーカイブとしてデジタル記録することが可能になっている。映像アーカイブの重要な活用方法は、それをコーパス(データの集積)として利用することにある。ところが、映像アーカイブをコーパスとして利用するためには映像解析処理の複雑な系を安定かつ効率的に稼働させることが必要であり、そのための高速化ならびに最適化技術を実現することが本研究の目的である。そこで本研究では、ニュース映像を対象とする検索実験を行い、データベース技術の有効性と改良法について検討した。2001年より蓄積してきたニュース番組2,391日分(およそ1,200時間分)について、ショット分割ならびに各ショットの代表フレームの抽出を行い、約55万枚の画像データを生成した。55万枚の画像というのは、画像データのテストコレクションとしては規模の大きいものであり、しかも、7年分のニュース映像から生成しているため、多様な画像が含まれている。このデータを用いて画像検索を実施し、映像コーパスを活用するための基盤技術として多次元索引が有効であること、最近傍点探索処理においては最近傍点の示差性が探索コストに大きな影響を与えるものの探索法の改良で高速化できること、フレーム中のオブジェクト単位での検索を行うためには更に1桁以上の高速化が必要になることなどの知見を得た。これらの知見は1,200時間という規模の大きい映像コレクションを対象に得られたものであり、今後、映像コーパス解析処理の更なる高速化を進めていく上で基本的な指針を与えるものである。本年度は高次解析システムの試作を行った。映像データとしては、研究代表者の所属機関が所内での実験利用の目的で収集している約10,000時間分の放送映像アーカイブを使用した。この映像アーカイブに対して、本研究専用のサーバ計算機を付設し、高次解析処理を実行させるシステムを構築した。プロトタイプで使用する計算機としては、DELL社が製造しているDual Core CPU(AMD Opteron)を4台装備するものを購入した。映像の高次解析処理では、低次の解析処理から高次のものまでパイプライン状に処理が行われるため、マルチプロセッサ計算機が有効である。また、実験対象となっている映像アーカイブが7チャンネルの放送映像を並行して蓄積するものであることから、本研究では、十分な計算スループットならびに並列度を確保できるように8並列の計算機を選択した。理想的には並列度が高ければ高いほどよいが、実験規模が大きくなり過ぎて計算機の管理に払うコストが肥大する心配があるため、本研究では8並列の計算機で対応可能であると考えている。この高次解析サーバでは、これまで個別に研究してきた映像解析処理がひとつの高次解析システムとしてまとまっており、本研究が実現を目指している大規模映像コーパスの高次解析を試行するためのプラットホームとなっている。本年度は昨年度構築した実験環境を用いてニュース映像を対象とする検索実験を行い、データベース技術の有効性と改良法について検討を進めた。

55万枚の画像というのは、画像データのテストコレクションとしては規模の大きいものであり、しかも、7年分のニュース映像から生成しているため、多様な画像が含まれている。このデータを用いて画像検索を実施し、映像コーパスを活用するための基盤技術として多次元索引が有効であること、最近傍点探索処理においては最近傍点の示差性が探索コストに大きな影響を与えるものの探索法の改良で高速化できること、フレーム中のオブジェクト単位での検索を行うためには更に1桁以上の高速化が必要になることなどの知見を得た。これらの知見は1,200時間という規模の大きい映像コレクションを対象に得られたものであり、今後、映像コーパス解析処理の更なる高速化を進めていく上で基本的な指針を与えるものである。
階層化生成モデルとマルチタスク深層学習の融合に基づく次世代音声合成技術

本研究では従来の隠れマルコフモデルに基づく音声合成と近年の深層学習に基づくEnd-to-End音声合成を融合した次世代音声合成技術の開発を目的とする。「統計的生成モデルに基づくニューラルネットワークの構造化」および「音声合成のための中間的特徴を利用した半教師有り学習の枠組み」という2つのアイデアを核として、現状の深層学習に基づくEnd-to-End音声合成における3つの問題点、1.従来手法に比べ学習に大量のデータが必要、2.直感的に理解しやすい音声特徴に基づいた合成音声のコントロールが困難、3.入力と出力を繋ぐ中間的な特徴表現や不完全なデータを利用する枠組みが未確立、の解決を目指す。
ガラス飛跡検出器(BP-1)に対する多量処理システムの開発

この研究の成果は、次の4点に絞られる。(1)初めに、飛跡検出器BP-1を用いて、貫通孔の位置をすばやく読み取るための装置の開発を行った。従来のECCO計画では、アンモニアの蒸気を使用した方法がとられていたが、我々は、それを光学的な方法に置き換え、素早く孔の位置を検出する方法を複数考案氏、それらのテスト装置を製作した。その結果は、2年ほどで予期以上の成果を収めた。データの多量処理という点では、従来のアンモニア法の10倍以上の速度で貫通工の位置を決定できることが示された。(2)多量のデータ処理に当って、自動解析のスピード・アップが問題である。これまで1視野毎にデータ処理していたものを、ライン上に並べられたCCDを使用し、一挙に2次元的スキャンニングを行うことによって、読み取り速度を50倍近く上げることに成功した。これは極めて画期的なことで、これまで多量のデータ処理のためには、多数の自動スキャンニング装置が必要と考えられてきたが、僅か数台で事足りるようになった。既に、この方式は実用化されている。(3)最終年度(平成17年度>の課題であったデータ処理の自動化は、本年度になってやっと全体が整い、自動化のテストが開始された。一応の自動化のテストには成功したものの、未だ、細かい操作には問題が残されているが、それらの解決は、時間の問題のように思われる。(4)この4年間の間に、CR-39及びBP-1を用いた同位元素弁別能のテストが繰り返された。それは、米国のECCO計画のように、元素の弁別だけでは研究上の自由度を著しく狭めることになるからである。その結果、最近のCR-39では鉄付近で0.2amuの分解能を持ち、それによって、こう原子番号を持つI, Xe当たりで、1つおきに同位元素が並んでいる場合の同位元素弁別に十分使用できることが分かった。BP-1の性能はこれよりやや落ちるものと思われる。ただ、CR-39は軽い粒子に対してもかなり良い感度があり、多数のバックグラウンドを生むので、高原子番号の粒子に対しては現在の質量弁別能を維持し、かつ低原子番号の粒子に対しては感度の低いCR-39を作るためにDAPの混入が試みられている。今年度の研究では、BP-1飛跡解析システムの全自動化と光学的飛跡孔検出装置の開発に重点が置かれた。前者では、予定に従がってKEKに大型オートステージ装置が購入された。来年度購入予定の画像処理装置用入力光学系とオートフォーカス装置とでBP-1飛跡解析システムの一応の完成を見ることになる。この研究課題での今年度の大きな進歩は、放医研を中心として行われて来た、スキャンニングにラインセンサーを導入することによるスキャンスピードのアップである。その結果、スキャンのスピードを50倍以上に高めることに成功した。当然この方式は現在のシステムに採用される事になるが、此れは、そもそも基盤研究の申請時の構想に既に含まれており、全体の計画には影響は無い。ただ、この成果は、HNK-計画の日本側の仕事の分担にはかなりの影響を及ぼすこととなろう。

次の光学的飛跡孔検出装置は、可視光に対して透明なガラスでも真空紫外光に対しては不透明になることを利用して、光学的に貫通孔を検出できる装置で、これも申請時に既に構想があり、今年度はそのプロトタイプとしての装置を試作して、BP-1ガラス板を使用してどの程度の大きさの穴まで検出できるかのテストを行った。この研究は横浜国大を中心におこなわれたが、まだ、装置が完成してから幾ばくも無いので、現在検出できる貫通孔の最小径は4050μmと言うことに留まっているが、今後、光源の強度を高めたり、デジタルカメラの性能の向上によって更に小さな径の貫通孔が検出されるものと確信している。更に、今後は、斜め入射の貫通孔の検出の問題に入って行きたいと考えている。最後の原子核乾板用自動解析装置のBP-1飛跡解析装置への応用は、今年度はその可能性を議論するに留まった。今年度の研究実施の経過は、次の通りである。(1)昨年度から継続の真空紫外光を使用した貫通孔検出装置は一応完成し、その検出感度の限界は、実際のBP-1ガラスを使用して50μm以下と確認された。ガラス表面を科学的に銀メッキすることによって、真空紫外光方式より遥かに容易な可視光を使用した貫通孔検出法が考案され、簡単なテストで30μmの穴も容易に検出されえることが分かった。この可視光方式は、製作も容易で安価なため、現在、そのための貫通孔検出器が製作されつつある。(2)自動飛跡解析装置は、一応、今年度で完成し、漸く、そのテストが開始された。近くその結果が明らかになるはずである。(3)今年度は、BP-1ガラスの貫通孔検出実験の外、CR-39を使用した鉄の同位元素弁別の実験に大きな進歩があった。まだ、質量分解能が0.3amu前後と十分ではないにしろ目標の0.2amuとかなりそれに近く、更に、近い内に、その目標値に近い値が得られるものと期待されている。そのため、このグループでは、米国グループの計画がうまく行かない場合にも、日本だけでも独自の中規模実験が可能なように、この方式を利用した次に述べるようなECCO計画に準ずる計画を立てつつある。そのため、今後、この種の技術開発もこのグループで取り上げてゆく予定である。(4)原子核乾板用飛跡検出器が、現在考えられている飛跡検出法に適用されるかどうかは、この3月から組織的に検討を始めたいと考えている。米国におけるHNX衛星計画は、現在、ECCOとENTICEとが完全に切り離され、それぞれ独自に飛翔計画を立てていると言うのが実情である。我々は勿論ECCO側に属しているが、いざと言う場合を考えCR-39を用いた同位元素弁別法を使用して、より僅かな露出面積で同様の成果を示せる方法を確立し、そのためのわが国独自の衛星計画樹立することを望んでいる。今年度の研究成果は、次の通りである。(1)真空紫外光を用いた貫通孔検出器は、完成し、その検出限界は、BP-1ガラスに対して50μm以下と確認された。更に、ガラス表面に化学的に銀メッキすることによって、可視光を使用して貫通孔を検出する方法が開発され30μm程度の貫通孔も検出されることが分かった。更に、この方法は、CR-39にも適用できることが分かった。この可視光方式は、安価で簡便なため、今後その実用化を計りたい。(2)自動解析装置の高スピード化は、昨年終了し、今年度は、解析装置のオートー・フォーカス等を含めた完全な自動化が開発の対象となった。
究極の可視光検出器(裏面照射大型薄膜CCD)の試作

本研究は、光検出器としてのCCD(電荷結合素子)の性能をその理論的限界にまで高め、高感度、低雑音、大規模CCDを製作するための技術開発要素について、試作に基づく具体的な開発研究を行い、天体観測の効率を大幅に向上させる道を拓くことをその目的として企画した。1991年度から9年計画でハワイ島に建設中の口径8mの大型光学赤外線望遠鏡「すばる」など次世代の最先端望遠鏡に取り付ける光学観測装置には、画素数800万画素、画素サイズ15um角、3方向モザイク化可能、紫外高感度の裏面照射型、読出雑音3電子相当以下(スロースキャン時)、150K冷却時に無暗電流、画素欠陥無し、など厳しい要求仕様の大型CCDを開発し使用する計画である。本研究により得られた具体的成果としては、次の4点が挙げられる。1)エッチング処理法や表面のアキュムレーション法について具体的な検討が進み、裏面照射型CCD素子の製作法の基本的道筋を確立することができた。2)反射防止膜形成法の検討により、CCDの量子効率を実質的な理論限界に近いレベルにまで向上させることに見通しが得られた。これらの工夫により量子効率が国際的にみても第一級のCCDを試作することに成功した。特に紫外線領域の量子効率の高さは海外で実線のあるCCDに比べても群を抜いたものとなった。3)大型モザイクCCD素子の制作法についても問題点を明らかにすることができた。4)CCD素子の性能評価システムを完成し、さまざまな工程でできあがったCCDの評価を迅速に行えるようになった。以上のように、小型ではあるが裏面照射薄型で世界最高の量子効率を持つCCDの製作と、表面照射型大型CCDの製作に成功したことにより、裏面照射大型薄膜CCD素子の製作に向けての基本的課題をクリアすることができた。本研究は、光検出器としてのCCD(電荷結合素子)の性能をその理論限界にまで高め、高感度・低雑音・大規模CCDを製作するための技術的開発要素について、試作に基づく具体的な開発研究を行い、天体観測の効率を大幅に向上させる道を開くことを目的としている。平成七年度はほぼ当初計画に沿って、1)素子の保護の仕方の検討、2)電極の取り出し方の検討、3)薄膜化の方法の具体的比較検討、4)アキュミュレーション法の試作検討、5)および反射防止膜の付加法の検討を進め、これらの検討成果を盛り込んだ試作CCD素子を村松を中心に作成し、国立天文台グループを中心にその性能評価を行った。評価結果を考慮して、製作工程を改善した改良型のCCDを再度製作し、その評価をハワイ大学天文学研究所の協力を得て、行った。低温環境での評価測定に必要なデュワ-を調達の予定であったが、既存の冷却用デュワ-を改造し転用することができた。これらの評価試験の結果、紫外線感度に改善の余地があるものの、反射防止膜を付加していない素子としては、波長感度特性については、ほぼ満足のゆくレベルのものができる見通しが得られた。今後の改善すべき問題点とその解決法についても、一定の見通しが得られつつあり、次年度にはさらに改善を加えて試作を進める予定である。本研究は、光検出器としてのCCD(電荷結合素子)の性能をその理論限界にまで高め、高感度、低雑音、大規模CCDを製作するための技術的開発要素について、試作に基づく具体的な開発研究を行い、天体観測の効率を大幅に向上させる道を開くことをその目的としている。

平成8年度は平成7年度の試作研究の成果に基づき、1)薄膜化・アキュミュレーション法の改良、2)反射防止膜の付加法、3)CCD素子の薄膜化、4)大型化への基礎研究を行い、改良型CCD素子試作を村松を中心に行い、試作した素子を国立天文台で測定評価するというサイクルを、何度か行った。その結果、極めて紫外線感度の良好な薄膜化素子の製作法の基礎が確立し、素過程の加工法についてはほぼ見通しが得られるところまで近づいた。本研究の到達目標として揚げたCCD素子の仕様は、日本の8mすばる望遠鏡をはじめとする大型光学赤外線望遠鏡の光学観測装置にほぼ共通なものであり、海外でも同様な試みが始められた。ハワイ大学に留学していた宮崎が、海外で試作されたいくつかのCCDについても、比較のための測定評価を行ったところ、本研究で試作されたCCDの性能が海外で試作されたものに比べても遜色は無く、むしろ特に紫外感度においては抜きんでていることなどが示された。本研究は、光検出器としてのCCD(電荷結合素子)の性能をその理論的限界にまで高め、高感度、低雑音、大規模CCDを製作するための技術開発要素について、試作に基づく具体的な開発研究を行い、天体観測の効率を大幅に向上させる道を拓くことをその目的として企画した。1991年度から9年計画でハワイ島に建設中の口径8mの大型光学赤外線望遠鏡「すばる」など次世代の最先端望遠鏡に取り付ける光学観測装置には、画素数800万画素、画素サイズ15um角、3方向モザイク化可能、紫外高感度の裏面照射型、読出雑音3電子相当以下(スロースキャン時)、150K冷却時に無暗電流、画素欠陥無し、など厳しい要求仕様の大型CCDを開発し使用する計画である。本年度は本研究の最終年度にあたり、最終段階の試作を行った。この結果、本研究により得られた具体的成果としては、次の4点が挙げられる。1)エッチング処理法や表面のアキュムレーション法について具体的な検討が進み、裏面照射型CCD素子の製作法の基本的道筋を確立することができた。2)反射防止膜形成法の検討により、CCDの量子効率を実質的な理論限界に近いレベルまで向上させることに見通しが得られた。これらの工夫により量子効率が国際的にみても第一級のCCDを試作することに成功した。特に紫外線領域の量子効率の高さは海外で実績のあるCCDに比べても群を抜いたものとなった。3)大型モザイクCCD素子の制作法についても問題点を明らかにすることができた。4)CCD素子の性能評価システムを完成し、さまざまな工程でできあがったCCDの評価を迅速に行えるようになった。以上のように、小型ではあるが裏面照射薄型で世界最高の量子効率を持つCCDの製作と、裏面照射型大型CCDの製作に成功したことにより、裏面照射大型薄膜CCD素子の製作に向けての基本的課題をクリアすることができた。
非モデル魚における集団特異的適応遺伝子の検出:網羅的遺伝子発現解析と自然選択解析

自然集団の適応的分化に関与した候補遺伝子群を検出する研究において、比較トランスクリプトーム解析は重要な研究手法の一つである。本研究では、ゲノミックリソースが乏しいde novo生物においても利用可能とされる網羅的遺伝子発現解析法(cDNA-AFLP法の一種であるHiCEP法)の適用可能性について、遡河回遊魚シロウオをモデル系として検討した。日本列島に広く分布するシロウオには2つの地理的系統が存在し、日本海系統と太平洋系統の間に対照的な表現型分化が存在するが、HiCEP法によって両系統の間に有意な発現量変異を示す多数の遺伝子群が存在することが明らかとなった。また、コイ科魚類であるタモロコ属ペア種において同様の解析を行い、非モデル生物における網羅的遺伝子発現解析法としてHiCEP法が有効であることも示した。日本海側が太平洋側とは、現在と過去の気候やその変動パターンが大きく異なることは広く知られた現象である。日本海は過表の氷期・間氷期サイクルによる気候変動の影響を顕著に受けた代表的な水域であり、特に、最終氷期の最盛期(LGM)には極端な海水準の低下による外側海域との分断化が生じ、低水温化・低塩分化などの大きな環境変動を経験したとされている。それでは、このような氷期の寒冷化を含む変動環境の中で水圏生物の日本海集団固有の適応進化は生じたのだろうか?筆者は、水圏、特に海洋の自然集団の適応的分化にアプローチする絶好のモデル系として、日本海-太平洋間の遺伝的変異に注目し、シロウオに見られる日本海型と太平洋型をモデルとして研究を進めてきた。本研究は、シロウオのような典型的な非モデル生物において、効果的な手法であると考えた網羅的遺伝子発現解析のアプローチ(HiCEP法":放射線医学総合研究所が開発したトランスクリプトーム解析のためのcDNA-AFLP法の一種)の適用可能性を詳細に検討し、その手法を用いて日本海型の適応進化と関連した候補遺伝子群の網羅的探索を目的としている。シロウオ日本海型(福井県敦賀産)、太平洋型(和歌山県那智勝浦産)のそれぞれの筋肉組織からRNAを抽出し、mRNAの調整後、制限酵素処理、アダプターライゲーションを行い、得られたprePCR産物を用いて、選択的PCRを実施した。一個体あたりHiCEP解析をduplicatesで行ったところ、すべての選択的PCRプライマーセットで非常に高い再現性が得られた。さらに、それぞれの集団内におけるピークの出現パターンは類似していた。従って、HiCEP解析は、本種の組織から得たRNAを用いた場合でも、有効な網羅的遺伝子発現解析法であることが明らかとなった。日本海は過去の気候変動の影響を顕著に受けた代表的な水域であり、特に、最終氷期の最盛期には、低水温化・低塩分化などの大きな環境変動を経験したとされている。それでは、このような氷期の寒冷化を含む変動環境の中で水圏生物の日本海集団固有の適応進化は生じたのだろうか?研究代表者は、海洋の自然集団の適応的分化にアプローチする絶好のモデル系として、日本海-太平洋間の遺伝的変異に注目し、シロウオに見られる日本海型と太平洋型をモデルとして研究を進めてきた。本研究では、シロウオのような非モデル生物において、効果的な手法であると考えた網羅的遺伝子発現解析のアプローチ(HiCEP法)の適用可能性を詳細に検討し、その手法を用いて日本海型の適応進化と関連した候補遺伝子群の網羅的探索を目的とした。日本海型と太平洋型の筋肉組織からmRNAを抽出し、得られたprePCR産物から、数多くのバンドが得られたプライマーセットを用い、選択的PCRを実施した。得られたフラグメントをアラインメント後、発現量の指標となるフラグメントのピーク高を両型間で比較した。各型8個体の解析の結果、約8%のフラグメントに有意なピーク高の差異が認められ、日本海型で高発現の遺伝子群と太平洋型で高発現の遺伝子群の頻度には有意な差は認められなかった。これらの一部のフラグメントに関しては、高分解能を有するゲルを用いて分離し、塩基配列情報を得たが、相同性のある既知遺伝子を見出すことはできなかった。しかし、これらの配列情報を用いてqRT-PCR解析を行ったところ、その発現量変異はHiCEPの結果と一致し、本手法の精度の高さが明らかとなった。今後、HiCEPのprePCR産物の塩基配列情報を次世代シーケンサーを用いて網羅的に得ることによって、日本海環塊への適応遺伝子の候補を網羅的に探索できるものと期待される。
ショウジョウバエにおける情報化学物質の感覚受容:味覚と嗅覚の相互理解

セイシェルショウジョウバエDrosophila sechelliaは、雑食性のキイロショウジョウバエとは対照的で、特異的な寄主植物(ヤエヤマアオキ果実)に産卵する。寄主植物主成分であるヘキサン酸は産卵及び誘引をひきおこし、かつ、ふ節に発現しているにおい結合タンパク質の遺伝子がヘキサン酸の味覚受容に関与していることが知られている。申請者は、ヘキサン酸及びその他の植物成分に対する神経応答性を明らかにするために、味覚感覚子の電気生理学的応答を調べた。前肢ふ節に存在する複数の味覚感覚子には、塩、糖、水、苦味成分それぞれに対して応答を示す神経が存在した。一方、ヘキサン酸に対してはふ節の特定の感覚子が応答を示した。ヘキサン酸のナトリウム塩や他の植物成分に対しても同一の感覚子で応答が見られた。しかし、その他の感覚子は、ヘキサン酸に対する応答を示さなかった。以上の結果から、本種はヘキサン酸とその他の寄主植物成分をふ節の味覚感覚子で受容し、産卵選択をおこなうと考えられる。ヘキサン酸は本種の触角でも受容されることが昨年度までに明らかになっており、種特異的な寄主選択は嗅覚受容と味覚受容が段階的におこることにより、誘引と産卵がひきおこされると考察された。ヤエヤマアオキ果実をホストとするセイシェルショウジョウバエと雑食性のキイロショウジョウバエにおいて、化学受容ニューロンが情報化学物質を受容しているかを調べた。固定したショウジョウバエの触角や小顎鬚にガラス電極を付着させ、情報化学物質に対する受容器電位を測定したところ、ショウジョウバエ2種において、ヤエヤマアオキ果実の成分であるヘキサン酸やその他のにおい成分に対して嗅覚応答が観察された。同様の手法にて、クワズイモ花をホストとするクワズイモショウジョウバエにおいても、花の成分であるサリチル酸メチルやヘキサン酸メチル、青葉成分である青葉アルデヒドに対して嗅覚応答が観測された。酵母抽出物溶液中のヘキサン酸に対して、セイシェルショウジョウバエは誘引され、キイロショウジョウバエ忌避することがわかっているが、これらの行動の違いが味覚応答によるものか、味覚応答を調べた。固定した前肢の味覚感覚毛先端にガラス電極を付着させ、電極中の刺激液に対するインパルスの集合電位を感覚子中のニューロンより測定した。酵母抽出物単体に対して複数のニューロンの応答があった。ヘキサン酸を含んだ酵母抽出物にも複数のニューロンの応答があり、ヘキサン酸によるインパルスの増加・減少が両種において見られることがわかった。ヤエヤマアオキ果実に含まれる情報化学物質(ヘキサン酸等)に、ヤエヤマアオキをホストとするセイシェルショウジョウバエは誘引、雑食性のキイロショウジョウバエは忌避することが報告されている。情報化学物質に対する化学感覚受容は、ニューロンが入った感覚子の外部形態や、情報化学物質への接触あるいは誘引の有無等により、おおよそ味覚受容と嗅覚受容に分けられる。しかし、行動反応の定量評価や物質の特性等を考慮すると、両者の識別は困難である。本研究はショウジョウバエにおける情報化学物質の味覚受容と嗅覚受容に着目する。化学受容ニューロンが情報化学物質をどのように受容しているか、味覚刺激及び嗅覚刺激を与えた場合の神経応答特性を明らかにすることを目的とする。本年度は、ヘキサン酸に対する味覚神経の応答が苦味物質に対する応答と同じかどうか、セイシェルショウジョウバエにおいて調べた。固定した前肢の味覚感覚毛先端にガラス電極を付着させ、電極中の刺激液に対するインパルスの集合電位を感覚子中のニューロンより測定した(チップレコーディング法)。ヘキサン酸単独、苦味物質単独、両者の混合物を刺激液として与えた結果、ヘキサン酸に応答する神経は苦味物質にも応答することが明らかになった。
ゼラチン多孔体による新規慢性期脳梗塞再生治療

脳梗塞では、急性期を過ぎるとその病巣部において多くの細胞が壊死に陥り、非可逆的な機能障害を残すため、慢性期の脳梗塞治療では、組織再構築の見地からの検討が求められる。そのためには組織を構築するための細胞、足場、栄養因子の供給が必要となる。これまでの検討で、多孔質生体材料であるゼラチン-GPSMを脳損傷部位に埋入した際に、孔内にアストロサイト、血管内皮、ミクログリアによる新生組織の形成を確認したが、神経細胞は認められず、軸索伸長も限られていた。脳梗塞病変周囲に発現する軸索伸長関連因子の関与が考えられたため、昨年度はラット脳梗塞モデルにおいて、tPAならびにedaravone投与も含めてその因子の発現について検索した。脳梗塞発症4日後に軸索伸長関連因子であるneurocan、semaphoring 3A、Nogo receptor、GAP43、DCCの発現を免疫染色とウエスタンブロットで検討し、edaravone投与群において梗塞巣周囲に今回検討した全ての軸索伸長関連因子の発現の増強を認め、tPA群で低下した。これらの因子は、軸索伸長阻害もしくは促進作用だけでなく、梗塞後組織修復への関与が示唆され、さらにtPAによる神経毒性ならびにedaravoneによる梗塞後脳の軸索再生の関与が推定された。ゼラチン多孔体による慢性期脳梗塞再生医療を行う上で、各種因子の発現のコントロールのタイミングをさらに検討する必要があると考えられた。本年度は、脳組織新生に欠かせない血管新生について、ペリサイト(血管周囲細胞)に注目して、tPAならびにedaravone投与も含めてラット脳梗塞モデルで検討した。edaravone投与によりペリサイトは増加し、tPA投与により減少し、ペリサイトは血液脳関門の機能の維持ならびに血管新生の活性化に関与していることが推定された。脳梗塞病変周囲に発現する軸索伸長関連因子の関与が考えられたため、今回、ラット脳梗塞モデルにおいて、tPAならびにedaravone投与も含めてその因子の発現について検索した。平成23年度は、多孔質生体材料であるゼラチン-GPSMを脳損傷部位に埋入した際に推定される病変周囲に発現する軸索伸長関連因子の関与について、詳細に検討をすることができた。現時点で、実際に多孔体を埋入することによる組織新生について検討ができていないので、予定通りに進んでいるとは言えないが、多孔体を埋入して新生する組織が周囲の組織と統合される可能性についてさらに検討を進めるための基礎的な知見は得られたので、おおむね順調に研究は進展していると考えている。当初の予定通り、ゼラチン多孔体を脳梗塞部位の脳病変に埋入し、脳組織新生について検討する。多孔体周囲で、軸索伸長がどのように制御されるかにも注目して、主に組織学的な検討を進めていく。主に、実験動物購入、組織学的な検討のための抗体購入、多孔体へ付加する各種栄養因子の購入などに使用する予定である。
ＣＮＰを用いた顎顔面領域におけるトランスレーショナルリサーチ

顎顔面の成長は、膜性骨化、内軟骨性骨化が複雑に混在して成長することが知られており、軟骨無形成症をはじめとする骨系統疾患においては、上顎骨の劣成長などの顎変形症が随伴することが報告されている。これまで強力な内軟骨骨化促進作用を有するCNP/GC-B系の顎顔面形態における影響についての報告はなく、今回我々は、CNPの顎顔面形態への作用を、遺伝子改変マウスを用いて解析を行った。CNPの欠失により上下顎の劣成長を呈し、CNPの過剰発現は上顎の矢状方向への過成長を認めた。CNPは内軟骨骨化を促進することにより、顎顔面形態に強く影響をおよぼすことが明らかとなった。我々は、CNPノックアウト(CNP-KO)マウスは、上下顎の矢状方向への劣成長を認め、軟骨特異的CNPトランスジェニック(CNP-Tg)マウスでは上顎の矢状方向への過成長を認めたことを報告し、CNPが顎顔面形態に重要な因子であることを明らかとしてきた。今回この強力な内軟骨骨化促進作用を有するCNPを用いた新たな顎変形症治療の開発を目的に研究を行った。μCTによる顎顔面骨の形態解析にて、3か月齢のCNPノックアウト(CNP-KO)マウスとSAPプロモータを用い血中濃度上昇型CNPトランスジェニック(CNP-Tg)マウスを交配させたところ、CNP-KOマウスにおいて認めた上下顎の劣成長は野生型のマウスと同程度の顔面形態まで改善することができた。上下顎骨の劣成長を改善することができたメカニズムを解析するためにCNP-KOマウスから頭蓋底および下顎骨を採取し器官培養を行ったところ、CNP-KOから採取した頭蓋底および下顎頭は野生型マウスから採取したものに比べ、劣成長を呈していたが、CNPの添加により頭蓋底の軟骨結合部および下顎頭軟骨は有意に伸長し、頭蓋底および下顎骨の長軸方向への成長が促されることが示された。組織学的解析を行ったところ、特に肥大化層の細胞の肥大化が促進されていた。以上のことからCNPの全身投与は中顔面の劣成長の新たな治療となりうる可能性が示唆された。μCTによる顎顔面骨の形態解析にて、3か月齢のCNPノックアウト(CNP-KO)マウスは、上下顎の矢状方向への劣成長を認め、軟骨特異的CNPトランスジェニック(CNP-Tg)マウスでは上顎の矢状方向への過成長を認めた。上下顎の内軟骨性骨化に対するCNPの直接作用を解析するために頭蓋底および下顎骨の器官培養を行ったところ、CNPの添加により頭蓋底の軟骨結合部および下顎頭軟骨は有意に伸長し、頭蓋底および下顎骨の長軸方向への成長が促されることが示された。CNP-KOマウスにおいて認められた上下顎の劣成長は、蝶後頭軟骨縫合部を中心とした頭蓋底の軟骨縫合部および下顎頭軟骨の内軟骨骨化の抑制により生じており、反対にCNP-Tgマウスにおいて認められた上顎の過成長は蝶後頭軟骨縫合部を中心とした頭蓋底の軟骨縫合部の内軟骨骨化の促進により生じていたことが明らかとなった。現時点で、CNP遺伝子改変マウスの解析は順調に進んでおり、CNPの顎顔面形態への重要性が明らかとなった。CNPは顔面を構成する軟骨組織に作用することにより、内軟骨骨化を促進し、顔面形態に強く作用することが明らかとなった。今後は軟骨無形性症モデルマウスを使用し、顎顔面形態の解析およびCNPを用いた新たな顎変形症の治療の可能性の研究を行っていく。1軟骨形成不全症モデルへの軟骨特異的CNP-Tgマウスとの交配による顔面形態のレスキュー実験2軟骨形成不全症モデルへの血中濃度上昇型CNP-

Tgマウスとの交配による顔面形態のレスキュー実験マウスの飼育費および種々の遺伝子解析や必要となる分子生物学実験試薬や形態学的評価に必要な組織化学用試薬などの消耗品に使用予定
抗リン脂質抗体症候群の新たな検査診断法の確立と病態発症機序の解明

抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗リン脂質抗体の出現に伴い、動静脈血栓症を発症する疾患である。本研究では、APS患者の血中が高度の酸化ストレス状態であることを明らかにし、抗リン脂質抗体や酸化ストレスが血管内皮細胞や単核球の組織因子発現やケモカイン・炎症性サイトカインの産生を増加させ、一酸化窒素合成酵素の産生を抑制することを見出した。これにより、抗動脈硬化作用を有する一酸化窒素の産生が低下し、血管壁の炎症や動脈硬化が進展することで、APS患者に易血栓性がもたらされると考えられる。また、APS診断において測定すべき抗リン脂質抗体の種類について提唱した。抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗リン脂質抗体の出現に伴い、動脈血栓症や静脈血栓症、習慣流産などを発症する自己免疫疾患である。中でも動脈血栓症は死因となりうる重篤な疾患であるが、APS患者における発症機序の詳細はまだ解明されていない。そこで、APS患者における動脈血栓症発症機序の解明に向け、平成26年度は、抗リン脂質抗体が血管内皮細胞や末梢血単核球に及ぼす作用を検討した。検討には、APSの基礎疾患である全身性エリテマトーデスの患者血漿より精製した、抗リン脂質抗体陽性IgG(APS-IgG)および抗リン脂質抗体陰性IgG、また、健常人IgGを用いた。さらに、近年、血栓症との関連が注目される抗リン脂質抗体の一つ、抗ホスファチジルセリン/プロトロンビン抗体(aPS/PT)のモノクローナル抗体(231D【MBL】)も使用した。ヒト大動脈由来血管内皮細胞(HAEC)または健常人末梢血単核球(PBMC)に各種抗体を添加した結果、APS-IgGはPBMCのMCP-1、IL-8、TNF-α産生を促進し、231DはPBMCのMCP-1産生ならびに組織因子の発現を促進した。また、231DはHAECのMCP-1産生も促進することを確認した。今回、抗リン脂質抗体がケモカイン(MCP-1)や炎症性サイトカイン(TNF-α)の産生を促すことを明らかにした。MCP-1、TNF-αともに、抗リン脂質抗体陽性の患者において血中濃度が高いことも確認しており、抗リン脂質抗体がケモカインや炎症性サイトカインの産生を促進することで、血管内皮への単球の遊走・集積を促し、血管内腔に易血栓性の状態を形成する可能性が示唆される。また、aPS/PTは、これまであまり研究が進められていない抗体であるが、統計学的に解析した結果、患者の抗体価と動脈血栓症発症には強い関連が認められた。今後、本抗体の作用を詳細に解明していくことで、APS患者における動脈血栓症の発症リスク予測や発症予防につながる知見が得られると期待できる。抗リン脂質抗体症候群(APS)は、抗リン脂質抗体の出現に伴い、動脈血栓症や静脈血栓症、習慣流産などを発症する自己免疫疾患である。中でも動脈血栓症は死因となりうる重篤な疾患であるが、APS患者におけるその発症機序の詳細はまだ解明されていない。本研究では、APS患者における動脈血栓症発症機序の解明に向け、平成27年度は抗リン脂質抗体症候群と酸化ストレスの関連について検討を行った。まず、APS患者63症例を対象に、血清中の酸化ストレス値(dROMsテスト)と抗酸化力値(BAPテスト)を測定し、健常人312名の測定値と比較した。結果、健常人に比べAPS患者では、酸化ストレス値が有意に高く、抗酸化力値は著しく低下していることが明らかとなった。そこで、酸化ストレスがAPSの病態にどう関与するのかを検討するため、血管内皮細胞への酸化ストレス負荷実験を行った。酸化ストレス負荷は過酸化水素100μMにて実施した。その結果、酸化ストレスは血管内皮細胞の組織因子(TF)mRNA発現を促進し、eNOS-mRNA発現を抑制することを見出した。TFは血栓形成のトリガーとなる細胞表面因子であり、抗リン脂質抗体による直接的な作用によって単球表面TFの発現も亢進することから、APSでは、酸化ストレスと抗リン脂質抗体によるTF発現の増加が血栓症の発症を惹起する可能性が考えられる。また、eNOSは血管内皮細胞が持つ一酸化窒素合成酵素であり、eNOSの発現抑制はNOの産生低下を招く。NOは酸素ラジカルの不活化や、単球などの血管内皮細胞下への浸潤抑制、血管拡張作用などの抗動脈硬化性作用を有しており、NOの産生低下は動脈硬化の進展を促進する可能性がある。今後、抗リン脂質抗体と酸化ストレスとの関連や、酸化ストレス条件下の血管内皮細胞と単核球の相互作用について検討を進めることで、APS患者における種々の病態発症機序を明らかにし、発症の予防につながる知見を得たい。平成27年度は、抗リン脂質抗体症候群(APS)における酸化ストレスに関する検討を中心に進めた。酸化ストレスは、当初の研究計画に組み込まれていない検討項目であったが、APS患者の血中酸化ストレス度を評価したところ、健常人に比し、著しく酸化ストレスが高い状態であることが明らかとなり、非常に興味深い結果であった。このことから、酸化ストレスがAPSの病態にどのように関与するのか検討を行うことにした。

新たな検討項目であったため、基礎的検討からのスタートであったが、血管内皮細胞の酸化ストレス負荷モデルを確立し、酸化ストレスが動脈硬化や血栓症の発症に関与することを示唆する成果が得られている。次年度も本検討をより発展的に進める予定である。抗リン脂質抗体症候群(APS)は、抗リン脂質抗体の出現に伴い、動脈血栓症や静脈血栓症を繰返し発症する自己免疫疾患である。本研究ではAPS患者における血栓症発症機序の解明ならびにAPSの検査診断精度向上に向けた検討を行った。まず、抗リン脂質抗体陽性患者由来IgGや抗リン脂質抗体のモノクローナル抗体が、ヒト大動脈由来血管内皮細胞(HAEC)や健常人末梢血単核球のケモカイン(MCP-1、IL-8)や炎症性サイトカイン(TNF-α)の産生を促進することを確認した。次に、APSと酸化ストレスの関連を検討した。APS患者と健常人の酸化ストレス状態を、血清中の酸化ストレス値と抗酸化力値にて評価した結果、APS患者において酸化ストレス値が有意に高く、抗酸化力値は著しく低下していることが明らかとなった。そこで酸化ストレスの影響を検討した結果、酸化ストレス(過酸化水素負荷)は、HAECの組織因子の発現、炎症性サイトカインやケモカインの産生を促進し、一酸化窒素合成酵素(eNOS)の産生を抑制することを見出した。eNOSの低下が招く一酸化窒素(NO)の産生低下は、NOの有する血小板凝集抑制や血管拡張作用、血管内皮細胞下への細胞の浸潤抑制等の抗動脈硬化性作用を減ずる可能性があり、加えて、抗リン脂質抗体や酸化ストレスによるケモカインや炎症性サイトカインの産生増加により血管壁の炎症や動脈硬化が進展し、APS患者に易血栓性をもたらすと考えられる。また、APSの検査診断について、種々の抗リン脂質抗体測定試薬を対象に、効率よく抗リン脂質抗体を検出し、APS診断を行うことのできる検査を検討した。これまでの結果から、抗カルジオリピン抗体IgGを第一検査項目とし、加えて抗カルジオリピン抗体IgMおよび抗ホスファチジルセリン/プロトロンビン抗体IgGを測定することにより、APS検査診断の精度向上が期待される。抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗リン脂質抗体の出現に伴い、動静脈血栓症を発症する疾患である。本研究では、APS患者の血中が高度の酸化ストレス状態であることを明らかにし、抗リン脂質抗体や酸化ストレスが血管内皮細胞や単核球の組織因子発現やケモカイン・炎症性サイトカインの産生を増加させ、一酸化窒素合成酵素の産生を抑制することを見出した。これにより、抗動脈硬化作用を有する一酸化窒素の産生が低下し、血管壁の炎症や動脈硬化が進展することで、APS患者に易血栓性がもたらされると考えられる。また、APS診断において測定すべき抗リン脂質抗体の種類について提唱した。平成26年度は、患者由来の抗リン脂質抗体とモノクローナル抗リン脂質抗体の血栓形成作用および炎症促進作用についての検討を中心に進めた。当初、認識エピトープ別抗リン脂質抗体測定ELISAの開発から進める予定であったが、培養実験環境が想定していたよりも早く整い、血管内皮細胞の培養実験モデルを早期に確立できたため、細胞実験による抗リン脂質抗体の作用解析に着手した。血管内皮細胞と単核球の各単培養モデルについての基礎的な検討は順調に進展し、成果が得られている。抗リン脂質抗体測定ELISAに関しては、現在までに、本邦での取り扱いのある各種キットを使用し、SLE患者を対象とした抗体価測定を実施して、APSを診断する上で重要な抗体の種類および抗体のクラスを検討した。今後、他施設の測定結果もふまえた解析を進めるとともに、本邦での取り扱いの無い抗体の測定ELISAについては測定系の確立に取り組む予定である。
ブルー銅タンパク質における分子内電子伝達過程

酸性から塩基性までさまざまのブルー銅タンパク質(プラストシアニン、アズリン、シュードアズリン、プランタシアン、ステラシアニン、ウメシアニン)の直接電気化学を、カチオン性、アニオン性、疎水性などさまざまのプロモーターで修飾した金電極を用いて行った。活性中心近傍の疎水的な領域を電極方向に配向させるには、プロモーターとタンパク表面との相互作用を調整することによって、すべてのブルー銅タンパク質の直接電気化学を実現できることがわかった。すなわち、等電点が中性付近のタンパクの場合は静電相互作用がタンパク分子の電極表面へのアクセスをアシストするが、等電点が著しく酸性または塩基性に偏っている場合は、むしろ静電反発させたほうが直接電気化学を実現できる可能性が高いことがわかった。以上の知見をもとにして、電子移動速度や熱力学的パラメータをポテンシャルステップ法で求めた。これらの結果は平成8年度に発表済みまたは投稿中である。また、分子量14万のアスコルビン酸オキシダーゼのタイプ1銅(ブルー銅)サイトへの電子の出入りも実現できることを見いだし、これについても、速報として投稿中である。タイプ1銅から、ロングレンジの分子内電子移動反応によって電子を受け取るタイプ2、3銅からなる三核銅センターについては、阻害剤を用いた検討によって、異常な磁気的相互作用していることを見いだした。この知見は将来の分子内電子移動過程の研究に生かすことができるものである。しかし、当初、計画していた、ブルー銅タンパク質にRu錯体を結合して分子内電子移動を行わせる研究は、タンパクの修飾に難航した末、電気化学を試みたが、CuとRuサイトはそれぞれ独立に電極と電子移動を行うことがわかり、現在のところ電気化学レベルで分子内電子移動反応は実現されていないようである。
脊柱後端部における形態進化の分子メカニズム

脊柱後端部の形態は脊椎動物の進化の過程においてダイナミックに変化しており、脊椎動物の進化を理解する上で非常に重要な形質である。特に真骨魚類では脊柱後端部が背側に屈曲することで尾鰭の機動性を上げ、水中での生活に適応していると考えられている。しかし、どのようにして脊柱後端部が屈曲するか、その発生過程における形態形成の分子メカニズムは解明されていなかった。そこで、本研究では脊柱後端部が背側に屈曲せず、尾部骨格の形態が変化するメダカ自然突然変異体Double anal fin(Da)を手掛かりとして脊柱後端部における形態形成、形態進化の分子メカニズムを解明することを目的とした。今年度の主な成果は以下の二点である。1.尾部骨格を形成する組織"Caudal skeletonforming mesenchyme(CSM)"の同定:メダカ胚の発生過程を詳細に観察した結果、尾部の屈曲に先立って後方体節が融合し、組織が変化していることを発見した。この組織は硬節細胞に富む、特殊な組織構造となっていた。発生が進むとこの領域から尾部骨格が形成されることから、この領域を"Caudal skeleton forming mesenchyme(CSM)"と名付けた。Daの原因遺伝子であるzic1/zic4を調べたところ、背側CSMで強く発現していることが明らかとなった。DaではCSMは形成されるものの、zic1/zic4の背側CSMにおける発現は消失していた。以上から、zic1/zic4の背側CSMでの発現が尾部の屈曲を制御していることが示唆された。2.他の脊椎動物種におけるCSMの形成とzic1/zic4発現パターンの解析:メダカと同様に真骨魚類で脊柱後端部が背側に屈曲するゼブラフィッシュではCSMが形成されzic1/zic4が背側CSMで強く発現していること、最も古くに分岐した条鰭類であり脊柱後端部が屈曲しないポリプテルスではCSMは形成されず、zic1/zic4の尾部末端背側における強い発現もみられなかった。以上から、脊椎動物の進化の過程の真骨魚類に至る系統において、尾部骨格を形成する特殊な組織CSMの獲得とzic1/zic4の背側CSMへのco-optionによって脊柱後端部が屈曲する尾部骨格が獲得されたということが示唆された。当初の計画、目標を達成し、論文にまとめることができた。今後の展望としては、zic1/zic4のCSMエンハンサーの同定が挙げられる。zic1/zic4のCSMエンハンサーを同定し、各種脊椎動物における相同領域の配列を比較することで、脊柱後端部に関するゲノム進化と表現型進化を結び付けることが可能となる。また、サメなどの軟骨魚類における尾部の発生、zic1/zic4の発現パターンとその調節領域を調べることで、脊椎動物だけでなく顎口類の尾部形態の進化を考察することができる。特に真骨魚類では脊柱後端部が背側に屈曲することで尾鰭の機動性を上げ、水中での生活に適応していると考えられる。しかし、脊柱後端部に関しては形態学的な理解は進んでいるものの、その発生過程における形態形成の分子メカニズムは全く解明されていなかった。そこで、本研究では脊柱後端部が背側に屈曲せず、尾部骨格の形態が変化するメダカ自然突然変異体Double anal fin(Da)を解析することによって脊柱後端部における形態形成、形態進化の分子メカニズムを解明することを目的とした。1.Daの原因遺伝子の確定:BAC transgenic法によるDa系統のレスキュー実験を行い、Daの原因遺伝子がzic1, zic4であることを証明した。このことから、メダカにおいて、脊柱後端部の背側への屈曲にはzic1, zic4が必要であることが示された。2.zic1, zic4の発現パターンの詳細な解析:zic1, zic4の発現パターンを詳細に調べたところ、発生過程において脊索後端が背側に屈曲するタイミングに先立ってzic1, zic4が尾部後端背側の硬節、間充織において強く発現することを明らかにした。Daではzic1, zic4のこの領域の発現が消失しており、尾部後端背側の硬節、間充織におけるzic1,zic4の発現と脊索後端の背側への屈曲の相関関係が示唆される。以上のように、本研究の成果はこれまで全く知見の得られていなかった脊柱後端部における形態形成の分子メカニズムの一端を明らかにしたものであり、脊椎動物の発生・進化を理解する上で重要な知見の一つであると言える。

そこで、本研究では脊柱後端部が背側に屈曲せず、尾部骨格の形態が変化するメダカ自然突然変異体Double anal fin(Da)を手掛かりとして脊柱後端部における形態形成、形態進化の分子メカニズムを解明することを目的とした。今年度の主な成果は以下の二点である。1.尾部骨格を形成する組織"Caudal skeletonforming mesenchyme(CSM)"の同定:メダカ胚の発生過程を詳細に観察した結果、尾部の屈曲に先立って後方体節が融合し、組織が変化していることを発見した。この組織は硬節細胞に富む、特殊な組織構造となっていた。発生が進むとこの領域から尾部骨格が形成されることから、この領域を"Caudal skeleton forming mesenchyme(CSM)"と名付けた。Daの原因遺伝子であるzic1/zic4を調べたところ、背側CSMで強く発現していることが明らかとなった。DaではCSMは形成されるものの、zic1/zic4の背側CSMにおける発現は消失していた。以上から、zic1/zic4の背側CSMでの発現が尾部の屈曲を制御していることが示唆された。2.他の脊椎動物種におけるCSMの形成とzic1/zic4発現パターンの解析:メダカと同様に真骨魚類で脊柱後端部が背側に屈曲するゼブラフィッシュではCSMが形成されzic1/zic4が背側CSMで強く発現していること、最も古くに分岐した条鰭類であり脊柱後端部が屈曲しないポリプテルスではCSMは形成されず、zic1/zic4の尾部末端背側における強い発現もみられなかった。以上から、脊椎動物の進化の過程の真骨魚類に至る系統において、尾部骨格を形成する特殊な組織CSMの獲得とzic1/zic4の背側CSMへのco-optionによって脊柱後端部が屈曲する尾部骨格が獲得されたということが示唆された。当初の計画、目標を達成し、論文にまとめることができた。今後の展望としては、zic1/zic4のCSMエンハンサーの同定が挙げられる。zic1/zic4のCSMエンハンサーを同定し、各種脊椎動物における相同領域の配列を比較することで、脊柱後端部に関するゲノム進化と表現型進化を結び付けることが可能となる。また、サメなどの軟骨魚類における尾部の発生、zic1/zic4の発現パターンとその調節領域を調べることで、脊椎動物だけでなく顎口類の尾部形態の進化を考察することができる。
象牙質形成における歯髄組織中の基質蛋白および遺伝子発現の組織学的研究

歯髄組織による象牙質を含む硬組織形成の制御には、骨代謝での役割が示唆されているいくつかの基質蛋白の関与が考えられている。象牙質の形成について検討するうえで、歯髄組織中に形成されることのある歯髄結石の基質蛋白を調べることは、歯髄組織の硬組織形成能の解明に関与するものと思われる。そこで今回報告者は、抜髄時に採取した歯髄結石を試料として、その基質蛋白について検討を加えた。基質蛋白として、Ca-結合能を有するオステオポンティン(OPN)、オステオカルシン(OCN)、オステオネクチン(ON)およびI型コラーゲンを選択した。まず、試料を4%パラホルムアルデヒド溶液にて浸漬固定し、19%EDTA溶液にて脱灰後、通法に従ってパラフィン包埋した。その後厚さ5μmのパラフィン切片を作成し、各基質蛋白の特異的抗体を用いてABC法により免疫染色を行った。その結果、歯髄結石中の基質蛋白としてI型コラーゲンとOPNを同定し、その局在はI型コラーゲンは結石の全域に渡って均一に分布し、OPNは結石の表層に発現しているのが観察された。一方、OCNとONに関しては発現が観察されなかった。また、ラット歯髄細胞培養系を用いて、歯髄細胞が合成分泌する蛋白のうち石灰化に関与するリン酸化蛋白を免疫沈澱法にて同定したところ、合成分泌される主要なリン酸化蛋白質はOPNであることが明らかとなった。以上の結果から、歯髄結石の形成にI型コラーゲンとOPNが関与していること、特に歯髄組織の石灰化には歯髄細胞から分泌されるOPNが強く関与している可能性が示唆された。その結果、歯髄結石中の基質蛋白としてI型コラーゲンとOPNを同定し、その局在は、I型コラーゲンは結石の全域に渡って均一に分布し、OPNは結石の表層に発現しているのが観察された。以上のことから、歯髄結石の形成にI型コラーゲンとOPNが関与していること、特に歯髄組織の石灰化にOPNが強く関与していることが示唆された。