hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線維化における単球の役割

強皮症(SSc)などでみられる線維化病態における単球の役割について追究した。単球の浸潤に引き続いて肺間質の線維化・肺血管系の異常を来すトランスジェニック(TG)マウスについて組織学的に検討した。肺・肺動脈の病理像はSScでみられる間質性肺疾患(ILD)や肺動脈性肺高血圧症(PAH)と類似していた。一方ヒト疾患であるSScでは、末梢血単球でFra1遺伝子および蛋白の発現上昇を認め、組織ではFra1陽性単球が病変部に浸潤していた。以上より単球の組織への浸潤が線維化のトリガーとなっている可能性が示唆された。本研究は線維化における単球の役割を追究することである。これまで肺間質の線維化および肺血管系の異常を来す新規モデルマウス(Fra-1トランスジェニック(TG)マウス)を用いて解析を行ってきた。このTGマウスでは、組織学的な詳細な解析の結果、強皮症でみられる間質性肺疾患(non-specific interstitial pneumonia (NSIP)様)や肺動脈性肺高血圧症(Heath & Edwards classification: Grade I, II, III)ときわめて類似した組織所見を認めたことから、かかる臓器病変を同時発症する新規モデル動物として位置づけられる可能性がある。さらにこのTGマウスは、単球の浸潤が線維化病変に先立って認められたことから、線維化における単核球の役割を追究する上で格好のマウスと考えられ、組織に浸潤する単核球の特徴についてさらに解析を進めた。Fra-1 TGマウスの肺組織を用いた蛍光染色の検討では、Fra-1 TGマウスでは野生型と比較し、単球系細胞の浸潤が増加していた。さらに浸潤する単球のフェノタイプはM2マクロファージ様であった。さらにこれまで検討してきたモデル動物における変化がヒト疾患である強皮症でも同様に認められるか検討した。その結果、強皮症では健常人と比較し、単球におけるFra-1 mRNAおよびタンパクの発現上昇を認めていた。さらに強皮症および健常部肺組織を用いた免疫組織化学の検討でFra-1の発現を検討した。強皮症肺組織に認められる単核球はFra-1を高発現しており、マウス同様M2マクロファージ様であった。以上より、M2マクロファージ様に分化した単球系細胞が肺組織に浸潤することが、後に引き続いて起きる線維化機転のトリガーとなっている可能性があり、単球系細胞が重要な役割を果たしている可能性がある。本研究は新規線維化モデル動物を用いて線維化における単球の役割を追究することである。本年はまず新規モデルマウスのフェノタイプの解析を詳細に行った。本研究で用いた動物は、転写因子AP-1を構成するFra-1のトランスジェニック(TG)マウスで、先行する単球の浸潤を認め、肺間質の線維化および肺血管系の異常を来すことが特徴とされている。そこで5-16週齢のFra-1 TGマウスを対象とし、同週齢の野生型マウス(WT)と比較した。方法は、組織染色により経時的に肺および肺動脈について評価した。肺の線維化はAshcroft scoreで定量化した。CD31およびalpha smooth muscle actin (αSMA)の発現を免疫組織化学で検出し、肺動脈病変、特に血管内皮および非筋性動脈のmusculizationについてそれぞれ評価した。機能的な右心負荷は心エコーおよび組織での心筋厚で評価した。Fra-1 TGマウスではWTと比較し、有意にびまん性に肺間質の線維化が進行し、その組織像はNSIPに合致していた。肺動脈は血管周囲の炎症性細胞浸潤と線維化、内膜の増殖・内腔の狭窄、さらに中膜筋層の肥厚を認める一方、叢状変化や血管腫様変化、壊死性血管炎は認めなかった。内膜では血管内皮細胞の増殖は認められず、αSMA陽性細胞が多く検出された。非筋性動脈でのmusculizationは10週から存在した。以上をまとめると肺動脈の組織変化はHeath & Edwards分類のGrade IからIIIと合致していた。機能的には心エコーでFra-1 TGマウスで明らかな三尖弁逆流が検出され、また組織学的に右室壁の肥厚も認めていた。これらの変化は強皮症でみられる間質性肺疾患や肺動脈性肺高血圧症の組織所見ときわめて類似し、これらを同時発症する新規モデル動物として治療開発に応用できる可能性がある。本年度はFra-1とトランスジェニックマウスのフェノタイプを組織学的に詳細に解析した。当初の予定と比較し、肺組織由来の遺伝子発現解析、タンパク発現および線維化の定量化を行う予定であったが、マウスの繁殖が十分でなく、ここまで至らなかった。

しかし一方で特殊染色や免疫染色による血管病変などの経時的変化の評価や、Fra-1トランスジェニックマウスの機能的な評価が予想外に進行した。進行の達成度としてはおおむね良好と考えるものの、若干の進行の遅れがあると考えている。単球系細胞に発現する転写因子Fra-1を遺伝子導入したマウスにおいて強皮症患者でみられる肺線維症、肺高血圧症に類似した組織像が自然発症することを示してきた。このマウスでは、これら病理像形成に先立って多数の単球が肺間質に浸潤することから、本マウスは単球が病的線維化を誘導する機序の追究に適したモデルと考えている。今後の予定として1)モデルマウスにおける単球浸潤から線維化に至るメカニズムの解明:Fra-1遺伝子導入および野生型マウスから経時的に摘出した肺組織を用い、既に進行しつつあるが、浸潤細胞の種類と程度、線維化に関わるサイトカイン、ケモカイン、成長因子の発現を組織染色、遺伝子・蛋白発現解析により評価する。特に筋線維芽細胞への分化、EMT、単球自身の線維芽細胞への分化に着目してin vitroの解析も組み合わせる。2) Fra-1遺伝子導入マウスで生じる線維化における単球およびFra-1の役割の解明:モデルマウスにおける肺線維化が単球によるかを検討するため、Fra-1遺伝子導入マウスを生後4週で放射線照射後、Fra-1遺伝子導入マウスから得られた単球と単球以外の細胞を移植したマウスを作成し、線維化の程度を比較する。また同様の実験を野生型マウスから得られた単球を移植することにより、Fra-1の高発現が重要かどうかについても検討する。3)線維化誘導における単球の役割の検討:モデルマウスにおける肺線維化および肺高血圧症に対し、上記で得られた情報を元に決定した治療標的に対する薬剤を投与し、線維化フェノタイプの変化を追跡する。まずは単球に焦点をあて、これらの細胞のリクルートの抑制が奏功する可能性を考え、ケモカインやケモカインレセプターに対する抗体の投与を検討しているが、上記で新たな標的が明らかとなれば、それらを標的に治療介入する。昨年同様、物品費が中心となり、以前申請した通り、内訳は物品費1,500,000円、旅費250,000円、その他として50,000円を予定している。昨年度より繰り越しとなった金額は458,711円は上記の通り、繁殖がうまく行かなかった影響によるもので、本年度の物品費に加えて使用したいと考えている。物品費は主に動物繁殖、研究に使われる試薬、消耗品に主に当てられる予定である。旅費としては11月に行われるアメリカリウマチ学会への参加を予定している。またその他としては論文校正、投稿の費用に充てる予定としている。
人工関節置換術後に生じる骨破壊の成因と病態に関する実験的研究

人工股関節及び人工膝関節再置換術時に得た人工関節周囲膜様組織をパパインで処理し、抽出した人工関節摩耗粉(骨セメント、金属粒子、及びポリエチレン粒子)の大きさ、形、成分を蛍光X線解析、走査型及び透過型電子顕微鏡を用いて分析した。その結果人体内で生じる摩耗粉の大きさは1マイクロン以下のものが約90%を占めていた。さらに平均サイズでは人工股関節周囲膜様組織より抽出した摩耗粉(平均:0.6-0.7マイクロン)が人工膝関節周囲膜様組織より抽出した摩耗粉(平均:0.9-1.0マイクロン)より小さい傾向にあった。これらの摩耗粉はマクロプァージ及び滑膜細胞に貧食されたが、両細胞ともに粗面小胞体が著明に増大していた。一方、ビ-グル犬の膝関節内に挿入したインプラント(5mm×20mmの円柱棒)に加え、これらの摩耗粉を膝関節内に注入したところ、インプラント周囲に骨吸収が生じた。採取した軟骨細胞及び滑膜細胞を生化学的、組織学的、及び免疫組織学的に検索したところ、生化学的には、軟骨細胞及び滑膜細胞培養上清中に高濃度のIL-1,IL-6,TNF-αと低濃度のTGF-β,BMPが検出され、免疫組織学的には、マクロファージ、滑膜細胞、及び血管内皮細胞がサイトカイン産生細胞(IL-1,IL-6,TNF-α)であったことを明確にした。
機械的刺激による軸索ガイダンスの分子・力学基盤

中枢神経系の神経回路形成過程で、ニューロンの軸索は標的細胞や周辺細胞から発せられる誘引・忌避分子の誘導を受けて遠隔の標的に投射することが明らかになっている。一方脳組織の構造的性質や形態形成運動に伴う引張・圧縮などの応力分布の動的変化も軸索伸長に影響すると考えられる。本研究では、小脳顆粒細胞が双極性の軸索を小脳の左右両方向に伸長する現象が、組織内の物理的刺激による軸索ガイダンス機構によるものと仮説を立て検証を行った。基質の構造に依存するガイダンス機構の探索のため、ナノインプリント法を用いて様々な幅・深さのline & spaceを加工した培養基質を作成し、小脳顆粒細胞と海馬錐体ニューロンを分散培養して分化させ、軸索走行を観察した。その結果顆粒細胞は溝の幅に関わらず平行に軸索を伸長したが、錐体ニューロンは溝の幅200nm程度を境に垂直から平行に軸索伸長する方向を変えることが明らかになった。高解像ライブ観察技術を用いて成長円錐上の接着複合体の大きさと分布の解析を行ったが、基質の屈折率の問題で蛍光観察ができなかったため、走査電子顕微鏡解析を行い、成長円錐の超微形態を詳細に解析した。その結果、成長円錐の糸状仮足はパターン幅200nm以下だとlineの尾根上を伸びていることがわかった。一方成長円錐中心部のアクチン骨格配向には極性は見られず、成長円錐中心部で網目状に分布していた。さらに小脳形態形成運動に伴う組織伸展の機械的刺激が軸索伸長に及ぼす影響を検証するため、小脳顆粒細胞を弾性膜上に培養して引張刺激を負荷し、双極性軸索の伸長方向に及ぼす影響を解析したが、引張刺激に対し軸索伸長方向に有意な変化は見られなかった。一方押圧刺激で弾性膜にシワを寄らせ、細胞の運動性変化をライブ観察する実験を行い、シワの方向を変えるとアクチン再編成が起こり、細胞極性が変化することを明らかにし、論文発表した。一方脳組織の構造的性質や形態形成運動に伴う引張・圧縮などの応力分布の動的変化も軸索伸長に強く影響すると考えられる。本研究では、小脳顆粒細胞が双極性の軸索を小脳長軸の左右両方向に軸索伸長する現象が組織内の物理的刺激による軸索ガイダンス機構によるものと仮説を立て検証を行う。平成29年度はナノインプリント法を用いて様々な幅・深さのline & spaceを加工した培養基質を作成し、小脳顆粒細胞と海馬錐体ニューロンを分散培養して分化させ、軸索走行を観察した。その結果顆粒細胞は溝の幅に関わらず平行に軸索を伸長したが、錐体ニューロンは溝の幅により平行または垂直に軸索伸長することが明らかになった。高解像ライブ観察技術を用いて成長円錐上の接着複合体の大きさと分布を解析したところ、基質の屈折率の問題で蛍光観察ができないことがわかった。そこで走査電子顕微鏡解析を行い、成長円錐の形態を詳細に解析した結果、成長円錐の糸状仮足がパターンの山に沿って伸びていることがわかったが、アクチン骨格配向には極性は見られなかった。小脳形態形成運動に伴う組織伸展の機械的刺激が軸索伸長に及ぼす影響を検証するため、小脳顆粒細胞を弾性膜(シリコーンシート)上に培養して引張刺激を負荷し、双極性軸索の伸長方向に及ぼす影響を解析した。強い引張刺激を加えても軸索伸長方向に有意な変化は見られず、組織伸展による軸索ガイダンス制御の可能性は支持されなかった。軸索ガイダンスにおける組織の物理的環境の影響を検証するため、ナノインプリント加工による異方性マイクロパターン培養基質の作成、および弾性膜培養基質に引張負荷しながらリアルタイム観察する実験系を立ち上げ、基質の形態および機械的刺激の影響を解析する計画を予定通りに遂行した。ガラスの屈折率に近い基質を選択したが、マイクロパターンエッチングのために厚みがあり、蛍光観察には不向きであるという問題が生じたが、専門家に協力を仰いで走査電顕により超微形態を観察する実験系を新たに構築した。以上のように計画は概ね順調に進展している。

高解像ライブ観察技術を用いて成長円錐上の接着複合体の大きさと分布の解析を行ったが、基質の屈折率の問題で蛍光観察ができなかったため、走査電子顕微鏡解析を行い、成長円錐の超微形態を詳細に解析した。その結果、成長円錐の糸状仮足はパターン幅200nm以下だとlineの尾根上を伸びていることがわかった。一方成長円錐中心部のアクチン骨格配向には極性は見られず、成長円錐中心部で網目状に分布していた。さらに小脳形態形成運動に伴う組織伸展の機械的刺激が軸索伸長に及ぼす影響を検証するため、小脳顆粒細胞を弾性膜上に培養して引張刺激を負荷し、双極性軸索の伸長方向に及ぼす影響を解析したが、引張刺激に対し軸索伸長方向に有意な変化は見られなかった。一方押圧刺激で弾性膜にシワを寄らせ、細胞の運動性変化をライブ観察する実験を行い、シワの方向を変えるとアクチン再編成が起こり、細胞極性が変化することを明らかにし、論文発表した。作成したナノインプリント基質が蛍光観察できないため、樹脂の種類を変えて問題を解決できるか検討する。現在まで機械刺激による軸索ガイダンスは見られていないが、さらに条件検討を行い評価する。軸索ガイダンスに有効な物理的環境が特定されたら、伸長する成長円錐におけるCa2+シグナルの発生を検証し、刺激の向きとの相関を明らかにする。相関が見られた場合、Ca2+シグナル発生の分子機構を、特に軸索伸長への関与が示されているメカノセンサーTRPチャネルに注目して明らかにする。以上の実験により機械的刺激による軸索ガイダンスの分子機構と生理的意義を明らかにする29年度に異方性マイクロパターン基質上のニューロンを用い、蛍光免疫法で多くの成長円錐を観察する予定であったが、基質の屈折率が問題で観察を行えなかったため、消耗品の使用が予定より抑えられた。本年度は樹脂の種類を変えて問題を解決する予定である。
ニューロフィードバックを用いた革新的前庭リハビリテーションシステムの開発

平成30年度では、回転椅子を用いた水平回転加速度刺激中に視覚と前庭覚に感覚混乱を生じた際の大脳皮質の血流応答を、ポータブル光脳機能イメージング装置(LIGHTNIRS&reg;、島津製作所)2台を用いて計測した。被験者16名に対して実験を行い、体動ノイズや両側前庭機能低下が判明した3名を除いた計13名のデータをNIRS-SPMを用いて解析した。結果、回転刺激(前庭刺激)と視覚刺激が一致する条件では、両側一次体性感覚野(BA3,1,2野)にごくわずかな血流増加を認めるのみであったが、視覚条件が不一致な条件では、両側縁上回腹側、右上側頭回尾側の賦活化を認めた。さらに右方向の回転時に右MST野、左回転時に両側MST野の活動増加を認め、新たな知見が得られた。さらに我々は、前庭神経炎を中心とした一側性急性前庭障害によるめまい患者を対象とし、急性めまい症状が改善する過程の大脳皮質血流応答を経時的に計測解析する研究を開始した。めまいの自覚症状(VAS、DHI、VSS等のめまいの主観的な評価指標)や重心動揺検査などの他覚的指標の改善と関連する大脳領域を解析する事を目的とする。本年度は2名の患者をエントリーし計測を開始した。また、ニューロフィードバックを応用した前庭リハビリテーションシステムの開発の基盤となる、脳血流のリアルタイムフィードバック装置を導入した。本装置では携帯型NIRS計測装置(LIGHTNIRS)を用いて、特定の脳領域の脳血流変化をほぼリアルタイムで視覚的な信号(モニター上の円の大きさもしくはバーの長さ)で呈示することが出来るものである。まずは正常被験者でシステム動作確認を行い、その後慢性めまい患者への導入を検討する予定である。平成30年度では、急性一側前庭機能障害患者10名に対して脳血流計測を行う予定であったが、前年度での携帯型NIRS計測装置導入の遅れたことにより、研究開始時期が大幅に遅れたことと、対象となる一側前庭障害患者の入院が予想よりも少なく、2名のエントリーのみとなったことが考えられる。適応となる一側急性前庭障害患者が入院した際には、随時研究へのご協力を御願いしていく。これまでの研究成果から得られたいくつかの大脳皮質領野をターゲットとした脳血流応答のリアルタイムフィードバック訓練を正常被験者および前庭障害患者を用いて行う予定である。H29年度は、一側前庭障害患者が日常生活においてめまいを誘発する状況を想定し、直立不安定刺激中の大脳皮質活動と姿勢制御運動の同時測定システムの確立を目指した。直立不安定刺激として、日本光電製EquiTest (MPS-3102)システムの感覚統合テスト(Sensory Organization Task: SOT)を使用し、その最中の重心動揺のデータを採取を行うこととした。同刺激中の大脳活動の計測のため、近赤外線分光法(NIRS)計測装置(島津製作所OMM-3000)2台(既存設備)を用い、送光・受光プローブを計64個頭皮上に装着し、計102チャンネル部位から脳血流を計測した。正常ボランティア18名および一側高度前庭機能障害患者4名に対して、計測を行い、内、正常10名、患者3名のデータを解析し、SOT課題中の姿勢調節に伴う大脳皮質機能部位を検証した。結果、直立不安定刺激中の広範な大脳皮質血流応答の計測が可能であり、重心動揺データも記録できることが確認できた。また、正常被験者群において補足運動野、運動前野、前頭弁蓋部、頭頂弁蓋部、上側頭回、縁状回、上頭頂小葉が、両側大脳半球において賦活化することが確認された。また、感覚混乱による動揺が強くなる(SOT4,5,6)と補足運動野が賦活化し、感覚混乱が最も強いSOT6において、両側の上頭頂小葉が賦活化することが明らかとなった。一方、一側前庭機能障害患者においては、正常被験者よりも感覚混乱の少ないSOT2,3,4の条件で、補足運動野、上頭頂小葉が賦活化する傾向を認めた。このことから、一側前庭障害患者では、正常被験者に比べ、より大脳皮質を用いた空間認知と姿勢制御が必要となっている可能性が示唆され、新たな知見が得られた。平成29年度では、直立不安定刺激以外に回転刺激中や歩行中の大脳皮質活動の計測も行う予定であった。両刺激中の大脳皮質血流応答の記録のために、携帯可能な小型NIRS計測装置(LIGHTNIRS、島津製作所製)(購入物品)を購入したが、購入機器が受注生産であり、納入が予定よりも遅れたため、予定していた計測システムの確立が遅れ、他の刺激を用いた計測が出来なかった事があげられる。

さらに右方向の回転時に右MST野、左回転時に両側MST野の活動増加を認め、新たな知見が得られた。さらに我々は、前庭神経炎を中心とした一側性急性前庭障害によるめまい患者を対象とし、急性めまい症状が改善する過程の大脳皮質血流応答を経時的に計測解析する研究を開始した。めまいの自覚症状(VAS、DHI、VSS等のめまいの主観的な評価指標)や重心動揺検査などの他覚的指標の改善と関連する大脳領域を解析する事を目的とする。本年度は2名の患者をエントリーし計測を開始した。また、ニューロフィードバックを応用した前庭リハビリテーションシステムの開発の基盤となる、脳血流のリアルタイムフィードバック装置を導入した。本装置では携帯型NIRS計測装置(LIGHTNIRS)を用いて、特定の脳領域の脳血流変化をほぼリアルタイムで視覚的な信号(モニター上の円の大きさもしくはバーの長さ)で呈示することが出来るものである。まずは正常被験者でシステム動作確認を行い、その後慢性めまい患者への導入を検討する予定である。平成30年度では、急性一側前庭機能障害患者10名に対して脳血流計測を行う予定であったが、前年度での携帯型NIRS計測装置導入の遅れたことにより、研究開始時期が大幅に遅れたことと、対象となる一側前庭障害患者の入院が予想よりも少なく、2名のエントリーのみとなったことが考えられる。平成30年度では、納入された携帯型NIRS測定装置を用いて、早急に計測システムを確立し、回転刺激等の刺激条件下での計測とデータ解析を行う予定である。また、同時に一側前庭障害による急性期めまい患者に対し、同携帯型記録システムを用いてベッドサイドやめまい回復期の大脳皮質活動の経時的記録を試みる予定である。適応となる一側急性前庭障害患者が入院した際には、随時研究へのご協力を御願いしていく。これまでの研究成果から得られたいくつかの大脳皮質領野をターゲットとした脳血流応答のリアルタイムフィードバック訓練を正常被験者および前庭障害患者を用いて行う予定である。
霊長類領野特異的発現遺伝子のエピジェネテイック制御機構の解明

霊長類大脳皮質の代表的領野特異的発現遺伝子の網羅的解析から、特定の領野で発現が多い遺伝子に、視覚野特異的発現遺伝子と連合野特異的発現遺伝子の2群あることを報告してきた。これらの2群の遺伝子の転写を制御するプロモーターのCpG領域のメチル化を調べたところ連合野特異的発現遺伝子では、高く、視覚特異的発現遺伝子では低い事が分かった。更に、メチル化結合蛋白質の一つMBD4の発現は連合野で高く視覚野では低くその発現を操作することによって、連合野特異的遺伝子PNMA5とRBP4の発現を制御できることを示した。研究代表者等は、霊長類大脳皮質領野で発現に顕著な差のある遺伝子は、連合野特異的なもの(RBP4, PNMA5, SLIT1)と視覚野特異的なもの(FSTL1/OCC1, HTR1B, HTR2A)の2群に分かれることをことを明らかにしてきた。これら2群の遺伝子のプロモーター領域のCpG領域を調べると連合野特異的な遺伝子は、メチル化のレベルが高く、一方視覚野特異的な発現遺伝子では、メチル化が殆どされていないことが判った。これらのメチル化領域に結合する古典的なメチル化結合蛋白質(MBD)ファミリーを調べたところ、MBD4の発現のみが領野特異的な発現をすることが判った。そこで、MDB4の発現を低下(loss of functin)、又は、増加することによって(gain of function)、in vitroおよび、生体脳において、視覚野特異的発現遺伝子と連合野特異的発現遺伝子の発現を調べたところ、連合野特異的遺伝子のうち、RBP4とPNMA5がMBD4の発現によって正の発現制御を受けていることが明らかになった。即ち、培養神経芽細胞(SH-SY5Y)を用いて、先ず、連合野特異的発現遺伝子PNMA5のプロモーターのCpG領域が高度にメチル化されていることを確認し、このメチル化をメチル化阻害剤投与によって阻害やSH-RNAによるMBD4のノックダウンによって、PNMA5の発現の低下や阻害が見られることを示した。更に、AAVベクターにより、視覚野領域にMBD4を強制発現した場合には、RBP4とPNMA5の発現増加、前頭葉にMBD4のSh-RNAを注入した場合には、発現低下を観察した。研究代表者等は、霊長類大脳皮質領野で発現に顕著な差のある遺伝子は、連合野特異的なものと視覚野特異的なもの2群に分かれることを明らかにしてきた。これらのメチル化領域に結合するMBDファミリーを調べたところ、MBD4の発現のみが領野特異的な発現をすることが判った。そこで、MDB4の発現を低下、又は、増加することによって、in vitroおよび、生体脳において、視覚野特異的発現遺伝子と連合野特異的発現遺伝子の発現を調べたところ、連合野特異的遺伝子のうち、RBP4とPNMA5がMBD4の発現によって正の発現制御を受けていることが明らかになった。この研究を発展させる為、一次視覚野における領野選択的な発現遺伝子を含む活動依存的遺伝子発現制御機構の解明を現在行っている。代表者の研究室では、霊長類(マカカザル)大脳皮質領野選択的に顕著に発現する遺伝子は、連合野特異的なものと視覚野特異的なものの2つの群に分けられることを見出した(Yamamori, T, 2011)。これら2群の中、連合野特異的に発現する遺伝子(PNMA5, RBP4, SLIT1)のプロモーター部のCpG領域は、高度にメチル化されている一方、視覚野特異的に発現する遺伝子(5HT1B, 5HT2A, OCC1/FSTL1)のプロモーター(CpG領域)のメチル化は低い事を報告した。更に、古典的なメチル結合領域を含むMBD結合タンパクファミーリーの中、MBD4が、in vitro及び、in vivoで、PNMA5とRBP4の発現制御を制御していることを証明した(Hata et al., 2013)。当該年度は、これらのメチル化の変化が、マカカザルの大脳皮質発達のどの段階で起こるのかを調べた。マカカザルの大脳皮質発達で、最も劇的な変化があるのは、視床からの投射が始まる胎生(E)80日と外界からの入力が一気に増大する誕生時である。そこで、マカカE78と誕生時(P0)、及び、成熟ザルの前部(前頭葉)と後部(視覚野)組織を採取し、連合野特異的発現遺伝子(PNと視覚野特異的発現遺伝子遺伝子のプロモーター(CpG領域)メチル化レベルを調べた。

その結果、前頭葉特異的遺伝子では、高メチル化がE78, P0,成熟ザルで、前頭葉、視覚野いずれも高く、一方、視覚野特異的遺伝子では、低メチル化は、E78,P0,成熟サルを通して観察される。これらの結果は、メチル化は、少なくとも視床投射や外界入力以前に、前頭葉特異的遺伝子と視覚野特異的遺伝子の内在的プログラムとして決定されていることを示している。霊長類大脳皮質の代表的領野特異的発現遺伝子の網羅的解析から、特定の領野で発現が多い遺伝子に、視覚野特異的発現遺伝子と連合野特異的発現遺伝子の2群あることを報告してきた。これらの2群の遺伝子の転写を制御するプロモーターのCpG領域のメチル化を調べたところ連合野特異的発現遺伝子では、高く、視覚特異的発現遺伝子では低い事が分かった。更に、メチル化結合蛋白質の一つMBD4の発現は連合野で高く視覚野では低くその発現を操作することによって、連合野特異的遺伝子PNMA5とRBP4の発現を制御できることを示した。当初目標として考えていた大脳皮質領野特異的に発現する遺伝子の制御機構については、上述のように、連合野特異的発現遺伝子群と視覚野特異的発現遺伝子群のメチル化レベルが前者では高く後者では低いことを見出し、更に、メチル化結合蛋白質MBD4が連合野特異的発現遺伝子(RBP4, PNMA5)を制御していることを報告した(Hateet al., J. Neurosci., 33, 19704-19714)。研究代表者等は、霊長類大脳皮質領野で発現に顕著な差のある遺伝子は、連合野特異的なもの(RBP4, PNMA5, SLIT1)と視覚野特異的なもの(FSTL1/OCC1, 5-HT1B, 5-HT2A)の2群に分かれることを明らかにしてきたが、平成25年度でこれらの発現が遺伝子レベルのメチル化の差とメチル基結合蛋白質の大脳皮質分布の差という2段階の機構で制御されていることを報告した(Hata et al. J. Neurosci, 2013)。この研究の中で、視覚野及び連合野特異的発現遺伝子群のメチル化の差異が発生のどの段階で生じるのかという新たなテーマが生じた。最終年度でこれを明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子脳科学我々は、これまでの研究で、霊長類の連合野に強く発現遺伝子として同定した分子のプロモーターのCpG領域は高度にメチル化しているのに対し、視覚野に強く発現する遺伝子として同定した分子のそれは殆どメチル化されていないことを明らかにしてきた。この成果を踏まえて、本年度は、胎生期、新生児、及び成体のマカクザル大脳皮質における領野差遺伝子プロモーターのメチル化及び大脳皮質におけるDNAメチル基転移酵素(DNMT1, DNMT3a, DNMA3b)の発現を調査し、この領野差遺伝子間のメチル化の差異は大脳皮質発生のどの時期に起こるのかを明らかにする。それと平行して、マカクザルES細胞を用い、未分化の状態から大脳皮質マーカーを発現するそれぞれの過程でDNAを抽出し、どの段階で領野差遺伝子のメチル化(または脱メチル化)の差異が生ずるかを調査する。本研究によって、霊長類連合野特異的発現遺伝子のプロモーター領域(CpG領域)の高度なメチル化とそれに結合するMBD4の連合野特異的な発現による正の発現機構が始めて明らかになってきた。このことは、従来の発生や発ガンにおけるメチル化とメチル化結合蛋白質によるエピジェネテイク制御が、霊長類に固有な様式で大脳皮質領野の形成と機能制御に重要な役割を果たす可能性を直接的に示すものである。前述したように、研究の進捗に伴い、新たに発生期のメチル化状態を検討する必要がでてきた。
癌抑制遺伝子産物の生理機能

RB蛋白質をリン酸化するRBキナーゼについては、サイクリンD1-Cdk4が、他のサイクリンEやA依存性キナーゼとは異なったアミノ酸配列の所をリン酸化することを初めて明らかにした。さらに、RB蛋白質上にはサイクリンD1-Cdk4でリン酸化されるけれども他のサイクリンEやA依存性キナーゼではリン酸化されない部位が存在することも見い出した。サイクリンD1は癌遺伝子にもなるサイクリンであるので、この発見によって、サイクリンD1が細胞癌化に関与するメカニズムの解明が大きく進展すると期待できる。一方では、以前に開発したリン酸化ペプチドの化学合成法を用いて、RB蛋白質上の3ヵ所のリン酸化部位をそれぞれ認識する抗体の作製に成功した。これには、上述のサイクリンD1-Cdk4特異的なリン酸化部位も含まれる。また、接触阻止においてはサイクリンD依存性キナーゼ活性が阻害されるが、その際、サイクリンDとCdk4は複合体を形成しているのに、Cdk4の活性化には必須であるThr^<172>がリン酸化されていないことを見い出した。しかし、この部位をリン酸化する酵素であるCdk活性化キナーゼ(CAK)の活性には大きな変化はなかった。一方、_p27^<kip1>が多量に存在することで、CAKがCdk4を基質として認識するのを阻害し、結果として、接触阻止ではサイクリンD依存性キナーゼの活性化が阻害されていることを明らかにした。p53については、ヒトのp53温度感受性変異株(バリン138)を作製した。この変異株をラット胎児繊維芽細胞に活性化rasとともに導入した細胞では、waf1発現の上昇を経ずにG1停止が起きること、Saos-2に導入した細胞ではG1とG2/Mの2つの時期で停止が起きることが示唆された。また、ショウジョウバエの癌抑制遺伝子の1(2)glのマウスホモログmgl-1遺伝子の機能をジーンターゲッティングにより解析した結果、mgl-1を欠損したマウスでは胎生期の神経上皮細胞の異常増殖が起きることが判明したが、腫瘍の発生は見られなかった。
公共料金の価格弾力性に関する実証的研究

公共料金の価格弾力性についての定量的な分析を進めるために、198世帯の電力消費実態に関するアンケート調査と日本・イギリス・アメリカの家計消費実態調査を時系列データが収集された。更に、電話の価格弾力性を求めるために、市内通話、市外通話の39年間の時系列データにより計量モデルが構築され、弾性値が推定された。上水道事業については、昭和55年以降に料金改定を実施した自治体に絞って(自治体数:31団体)データを収集し、料金改定前と料金改定後の使用量データを用いて価格弾性値が推定された。ゴミ収集処理の有料化に伴う、弾性値を求めるために、近年、ゴミ有料化に踏み切った自治体(自治体数:6市)のゴミ有料化前と有料化実施後の有料化水準とゴミ排出量データを中心にして、弾性値が計測された。バス運賃の価格弾力性を計測するために、主要都市6市の平均利用回数と運賃水準のデータを中心として、バスの弾性値が推定された。報告書は(1)はじめに、(2)公共料金の負担感、(3)公共サービスの変革を支える三つの条件、(4)公共料金に対する消費者意識、(5)内外価格差から見た公共料金、(6)公共料金について、(7)公共料金と価格弾力性、でまとめられた。公共料金の多くは総括原価方式で算定されているため、従来は料金体系に関する研究が多かった。そのため、公共料金と家計消費の関連が問題にされることは少なかった。そして、公共料金であるが故に価格弾力性も問題にされなかった。しかし、日本社会の成熟化と共に、多くの公共サービスが選択性の要素を持つようになり、部分的に価格弾力性が問題にされるようになってきた。本研究では公共料金の問題を「家計消費」の実態調査データを基礎データとして分析している。日本とイギリスとアメリカの家計消費調査データを収集し、各種のカテゴリー別に経年的に比較することにより分析している。特に、公共料金の内、電気料金、上下水道料金、ガス料金、交通料金、電気通信費、郵便代に絞っている。地域差を見るために全国を810地域に区分し、それぞれの公共料金が、全収入、全支出に占める割合から価格弾力性を検討している。更に、世帯の収入区分を1015区分に分け、それらの収入区分の家計調査データを基に、価格弾力性を検討している。イギリスとアメリカでは家族構成データ区分がなされているため、それぞれの家族構成毎の消費実態が計測可能であるため、家族構成毎の価格弾力性が検討された。日本も高齢社会に入っており、高齢世帯での公共料金問題が重要な社会問題になっている。高齢世帯の内、年金生活世帯に絞った公共料金の支払実態がイギリスとアメリカでは入手できたので、日本の年金生活世帯の消費実態データと比較することにより、高齢世帯での主要な公共料金の価格弾力性が検討できた。本研究では公共料金の問題を「家計消費」の実態調査データを収集し、各種のカテゴリー別に経年的に比較することにより分析している。特に、公共料金の内、電気料金、上下水道料金、ガス料金、交通料金、電気通信費、郵便代に絞って支出弾力性を検討し、アメリカとイギリスの支出弾力性値と比較している。電気料金と家族属性の関係を把握するために、全国の191世帯に対して詳しいアンケート調査がなされた。それらのデータ分析を(1)家族構成、(2)在宅時間、(3)住居構造、(4)所得、(5)所有する電気器具等の要因でなされた。公平性の観点から、現行の料金が評価された。更に、選択的料金制度の可能性を公平性向上の視点から評価された。
新たな動物モデルを用いた難治性感染症とがんに対する革新的免疫遺伝子治療

最近、免疫細胞を用いたがんならびに難治性感染症に対する養子免疫療法が注目されている。抗原特異的養子免疫療法における最大の課題は、high affinityのT細胞レセプター(TCR)を発現しているCTLを大量に誘導することである。我々は、すでに樹立したがん関連抗原由来ベプチド特異的CTLクローンからTCR遺云子を単離し、その発現レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを構築した。さらに、末梢血リンパ球ならびに造血幹細胞に遺伝子導入し、TCR発現細胞機能を解析した。健常人末梢血CD4およびCD8陽性T細胞にTCR遺伝子導入したところ、効率よく遺伝子導入したTCRの発現が確認された。TCR遺伝子導入CD8陽性T細胞はもとのCTLクローン同様に、HLA拘束性に腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示したが、正常細胞には全く影響を与えなかった。他方、このTCR遺伝子を臍帯血CD34陽性造血幹細胞に遺伝子導入した後、新たな免疫不全マウスであるNOD/SCID/commonγ^<rull>マウスに移植した。約3ヶ月後に遺伝子導入したTCRを発現するヒトT細胞が分化、増殖することが確認された。これらのT細胞は、ペプチド刺激時異的にIFN-γを産生したことから、機能的にもペプチド特異牲を有していることが確認された。これらの結果は、がんならびにウイルス特異的CTL由来TCR遺伝子導入による新たな治療法開発が可能であることを示すものである。現在さらに、ヒトサイトメガロウイルスならびにEBウイルス特異的CTLクローンを樹立し、それらからTCR遺伝子をクローニングし、そのベクターの構築を行っている。T細胞はT細胞レセプター(TCR)を介して、抗原由来ペプチドとHLAとの複合体を特異的に認識する。従ってTCR遺伝子をT細胞に遺伝子導入することによって抗原特異性が獲得できることが期待される。他方、ヒトを対象とした免疫学的研究、特にワクチン開発は、HLA拘束性という種特異性が存在するため、動物モデルを用いた解析が困難であった。しかし最近、新たな免疫不全マウスの開発によって、マウス体内でヒト細胞・組織を構築しうることが可能となり、難治性疾患の治療開発モデルとして大きな期待が寄せられている。この"ヒト化"マウスはヒトワクチン開発にもきわめて有用な実験系を提供ずることが期待されており、本研究では、この動物モデルを用いて、新たな発想に基づく革新的免疫遺伝子治療の開発を計画し、本年度は下記の研究成果が得られた。1)われわれがすでに報告した方法によってHSV-1、EBVおよびWT1特異的CTLクローンを樹立した。2)これらのT細胞クローンから、RT-PCR法によって完全長TCR-αおよびTCR-β鎖cDNAを単離した。TCR遺伝子をレンチウイルス発現ベクターCSII-EF-MCS-IRES-hrGFPに組み込み、TCR発現ベクターを作製した。3)末梢血CD4およびCD8陽性T細胞を分離し、WT1特異的CD8陽性CTLクローン由来TCR遺伝子を遺伝子導入した。TCR遺伝子導入細胞の特異性とHLA拘束性を調べたところ、CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞はともに、HLAクラスI拘束性にWT1特異性を獲得できることが明らかとなった。現在、これらTCR遺伝子導入T細胞を、新たな免疫不全マウスであるNOD/SCID/IL2 receptor γchain^<null>マウスに移植し、ヒト免疫系を再構築した"ヒト化"マウスの作成を計画している。2)これらのT細胞クローンから、RT-PCR法によって完全長TCR-αおよびTCR-β鎖cDNAを単離した、TCR遺伝子をレンチウイルス発現ベクターCSII-EF-MCS-IRES-hrGFPに組み込み、TCR発現ベクターを作製した。約3ヶ月後に遺伝子導入したTCRを発現するヒト

T細胞が分化、増殖することが確認された。これらのT細胞は、ペプチド刺激時異的にIFN-γを産生したことから、機能的にもペプチド特異牲を有していることが確認された。これらの結果は、がんならびにウイルス特異的CTL由来TCR遺伝子導入による新たな治療法開発が可能であることを示すものである。現在さらに、ヒトサイトメガロウイルスならびにEBウイルス特異的CTLクローンを樹立し、それらからTCR遺伝子をクローニングし、そのベクターの構築を行っている。
表面粗さのインライン全数検査を実現する高速インプロセス測定システムの開発

今年度は,本研究で提案した新しい表面粗さ測定法の測定精度の向上と円筒研削におけるインプロセス表面粗さ測定技術の確立を達成することができた.まず,測定精度の向上に関しては,これまで測定時間が長くなると熱電対線の取り付け部や緩んだり,センサ荷重が大きい場合などは熱電対線に軽度のクリープが発生し,測定特性が徐々に変化していたが,熱電対線とセンサボディの間に低弾性ゴムシートを挿入することによって,熱電対線と測定面との接触を常に同じ状態に維持することが可能となり,累計測定時間に対する測定結果の安定性をかなり向上させることができた.また,センサに2種類の熱電対(4本の熱電対線)を設置し,それぞれの熱電対から得られる起電力をPC内で演算することにより,研削中に研削熱の影響によって工作物表面の温度が変化してもその影響をキャンセルすることによって,研削中の表面粗さの変化のみを反映する出力成分を得ることを試みた.当初は,出力特性の異なる2種類の熱電対により検討していたが,測定精度を劣化させる致命的な現象が明らかになった.ところが,2種類の熱電対それぞれのセンサ荷重を異なる条件に設定することによっても測定特性が変化することが実験によって明らかになり,これを利用することによって円筒プランジ研削における表面粗さのインプロセス測定を試みた.2種類の熱電対とも同一のセンサボディに設置しているため,片方の熱電対の線を2本にする方式で,各熱電対の接触圧力に差を与えた.その結果,研削開始からスパークアウト研削終了までの表面粗さの変動を明確に捉えることが確認された.さらに,熱電対線を2本にしたものは,測定面との擦過によって発生するノイズが著しく低減されることが明らかになった.以上のように,本研究は世界に先駆けて研削加工における実用的な表面粗さのインプロセス測定に成功した.今年度は,本研究で提案した新しい表面粗さ測定法の測定精度の向上と円筒研削におけるインプロセス表面粗さ測定技術の確立を達成することができた.まず,測定精度の向上に関しては,これまで測定時間が長くなると熱電対線の取り付け部や緩んだり,センサ荷重が大きい場合などは熱電対線に軽度のクリープが発生し,測定特性が徐々に変化していたが,熱電対線とセンサボディの間に低弾性ゴムシートを挿入することによって,熱電対線と測定面との接触を常に同じ状態に維持することが可能となり,累計測定時間に対する測定結果の安定性をかなり向上させることができた.また,センサに2種類の熱電対(4本の熱電対線)を設置し,それぞれの熱電対から得られる起電力をPC内で演算することにより,研削中に研削熱の影響によって工作物表面の温度が変化してもその影響をキャンセルすることによって,研削中の表面粗さの変化のみを反映する出力成分を得ることを試みた.当初は,出力特性の異なる2種類の熱電対により検討していたが,測定精度を劣化させる致命的な現象が明らかになった.ところが,2種類の熱電対それぞれのセンサ荷重を異なる条件に設定することによっても測定特性が変化することが実験によって明らかになり,これを利用することによって円筒プランジ研削における表面粗さのインプロセス測定を試みた.2種類の熱電対とも同一のセンサボディに設置しているため,片方の熱電対の線を2本にする方式で,各熱電対の接触圧力に差を与えた.その結果,研削開始からスパークアウト研削終了までの表面粗さの変動を明確に捉えることが確認された.さらに,熱電対線を2本にしたものは,測定面との擦過によって発生するノイズが著しく低減されることが明らかになった.以上のように,本研究は世界に先駆けて研削加工における実用的な表面粗さのインプロセス測定に成功した.本研究の初年となる今年度は,研削加工における工作物表面の表面粗さのインプロセス測定の目途を付けることを目的に実験的検討を行った。まず,一対の熱電対線を離間した状態で,導電性を有する工作物表面に接触させ擦過させると,工作物の表面粗さに対して線形関係を有する起電力が検出されることが明らかになった。このことにより,生産ラインにおいて研削終了後に工作物の温度が定常になった状態で,本研究で提案する表面粗さ測定法を適用することで,ポストプロセスながら全数検査を実施できる目途が立った。研削加工における表面粗さのインプロセス測定の障壁となっているのは,研削熱によって工作物表面の温度が上昇し,その影響が熱電対線を使用した表面粗さ測定出力に影響を及ぼすため,表面粗さを正確に反映した出力が得られないことである。一方で,熱電対線の種類が異なると,温度変化に対する起電力も異なるものの,表面粗さの変化に対する起電力の出力特性も変化することが明らかになった。すなわち,本研究で提案する表面粗さ測定法における起電力(センサ出力)は,測定面の温度変化による出力成分と表面粗さによる出力成分の和であることが明らかになった。この結果を踏まえて,2種類の熱電対を用いて測定することで,それぞれの起電力特性式を連立することによって,測定面の温度変化による出力成分をキャンセルし,表面粗さのみの出力成分が得られることを実験的理論的に立証することができた。この解析結果を基に,2種類の熱電対を用いた表面粗さセンサを試作し,研削中の工作物の表面粗さ測定を試み,研削過程の各時点において触針式表面粗さ計で測定した結果と比較検討した。

その結果,提案した表面粗さ測定法は,研削過程における表面粗さの変化を細かく定性的に追従することが明らかになったが,検出値は実際の表面粗さを大幅に上回り,この測定値の相違の原因解明と対策を今後の課題とした。今年度は,本研究で提案した新しい表面粗さ測定法の測定精度の向上と円筒研削におけるインプロセス表面粗さ測定技術の確立を達成することができた.まず,測定精度の向上に関しては,これまで測定時間が長くなると熱電対線の取り付け部や緩んだり,センサ荷重が大きい場合などは熱電対線に軽度のクリープが発生し,測定特性が徐々に変化していたが,熱電対線とセンサボディの間に低弾性ゴムシートを挿入することによって,熱電対線と測定面との接触を常に同じ状態に維持することが可能となり,累計測定時間に対する測定結果の安定性をかなり向上させることができた.また,センサに2種類の熱電対(4本の熱電対線)を設置し,それぞれの熱電対から得られる起電力をPC内で演算することにより,研削中に研削熱の影響によって工作物表面の温度が変化してもその影響をキャンセルすることによって,研削中の表面粗さの変化のみを反映する出力成分を得ることを試みた.当初は,出力特性の異なる2種類の熱電対により検討していたが,測定精度を劣化させる致命的な現象が明らかになった.ところが,2種類の熱電対それぞれのセンサ荷重を異なる条件に設定することによっても測定特性が変化することが実験によって明らかになり,これを利用することによって円筒プランジ研削における表面粗さのインプロセス測定を試みた.2種類の熱電対とも同一のセンサボディに設置しているため,片方の熱電対の線を2本にする方式で,各熱電対の接触圧力に差を与えた.その結果,研削開始からスパークアウト研削終了までの表面粗さの変動を明確に捉えることが確認された.さらに,熱電対線を2本にしたものは,測定面との擦過によって発生するノイズが著しく低減されることが明らかになった.以上のように,本研究は世界に先駆けて研削加工における実用的な表面粗さのインプロセス測定に成功した.
テトラヒドロビオプテリンによる褐色脂肪分化および糖・エネルギー代謝制御機構の解明

褐色脂肪組織(BAT)は、エネルギー消費を促進する臓器であり、肥満・糖尿病の治療標的として注目されている。研究代表者らは、nitric oxide (NO)およびノルアドレナリン(NA)の合成の補酵素として作用するテトラヒドロビオプテリン(BH4)がBATを介して糖・エネルギー代謝を制御する所見をBH4欠乏マウスを用いた検討により明らかにした。また、BH4欠乏マウスに対するバックグラウンドマウスのBATの移植実験により、高脂肪食による体重増加、内臓脂肪蓄積の抑制、血糖値の低下を認め、BH4が制御するBATが糖・エネルギー代謝に中心的な役割を果たしている重要な所見を得た。褐色脂肪組織(Brown adipose tissue; BAT)は、エネルギー消費を促進することにより糖・脂質代謝を制御する臓器として注目されている。テトラヒドロビオプテリン(BH4)は、eNOSやチロシン水酸化酵素などカテコラミン合成の補酵素として作用する。我々は、BH4による褐色脂肪分化および糖・エネルギー代謝制御機構を明らかにするために、BH4合成量が低下しているhph-1 mutantマウスを用いた検討を行った。hph-1 mutantマウスに高脂肪食を負荷すると、コントロールマウスに比べ顕著な体重増加が誘発された。このマウスは、血糖値の上昇、耐糖能障害およびインスリン抵抗性を認めた。さらに、このマウスでは直腸温の低下を認め、食事誘導性の熱産生の低下を認めた。光学顕微鏡ではBAT内の脂肪滴の増加を認め、電子顕微鏡ではミトコンドリア濃度の減少および形態異常を認めた。hph-1 mutantマウスではBATのUCP1, PGC1a, Dio2の遺伝子発現レベルの低下を認めた。これらの所見により、BH4が欠乏すると褐色脂肪機能が低下することが確認された。hph-1 mutantマウスでは、各臓器においてノルエピネフリンおよびnitric oxide(NO)量の低下が確認された。次に、我々はBH4が褐色脂肪細胞の直接的な刺激作用を有しているかどうかについて検討した。マウス由来の褐色脂肪細胞を用いた実験において、BH4の直接曝露はBAT関連遺伝子のうちUCP1,PGC1a,Dio2の活性化作用を認め、UCP1の蛋白発現の増加を認めた。生理学的な検討において、BH4は酸素消費速度(OCR:Oxygen Consumption Rate)、プロトンリークの増加を認めた。BH4を曝露すると褐色脂肪細胞においてNO産生の増加を認めた。NOS阻害薬投与下では、これらの作用は消失しており、BH4はeNOSによるNO産生を介したBATの直接刺激作用を有することが示唆された。BH4の直接作用について、単離した褐色脂肪細胞を用いた酸素消費速度の測定により生理的に証明することができた。Nitric oxide(NO)を介した作用機序の解明など、研究課題の進展がみられた。テトラヒドロビオプテリン(BH4)はチロシン水酸化酵素(TH)や一酸化窒素合成酵素(NOS)の酵素反応の補酵素として働く必須の共因子である。THが合成に関与するノルアドレナリン(NA)やNOは褐色脂肪組織(BAT)の主要な制御因子である。しかしながら、BH4がBAT機能および全身の糖・エネルギー代謝制御機構に与える影響について検討した報告はない。本研究では、BH4産生量の減少が確認されているhph-1マウスおよびそのバックグラウンドマウスに通常食または高脂肪食負荷を行い、BAT機能および糖・エネルギー代謝への影響について検討した。高脂肪食負荷によりhph-1マウスでは体重ならびに脂肪量の顕著な増加が観察された。hph-1マウスは深部体温の低下を認め、耐糖能異常、インスリン抵抗性を呈していた。hph-1マウスではBATにおけるUCP1等のBAT関連遺伝子の発現および寒冷誘発性熱産生の減弱が認められ、BATの機能障害が示唆された。BH4を10日間連続で投与することにより、BAT機能の活性化が確認され、深部体温の上昇ならびに耐糖能異常の改善が示された。BH4の欠乏したhph-1マウスに対し、バックグラウンドマウス(BH4正常)由来のBATを移植したところ、熱産生能ならびに耐糖能の改善を認め、脂肪蓄積の減弱を観察した。BH4欠乏マウス由来のBAT移植ではこれらの効果が乏しかったことから、BH4による糖・エネルギー代謝制御機構にはBATが中心的に関与していることが示された。hph-1マウスではNA、NO量の低下を認めた。単離褐色脂肪細胞にBH4を曝露すると、UCP1等の遺伝子発現が増加し、酸素消費速度(OCR)の増大が観察された。BH4によるUCP1発現の増大はNOS阻害剤により消失したことから、BH4の褐色脂肪細胞への直接作用はNO依存性であることが示された。これらの結果から、BH4はBAT機能を介して、全身のエネルギー・糖代謝を制御すると考えられた。BH4は肥満症および糖尿病の治療標的となる可能性が示された。

また、BH4欠乏マウスに対するバックグラウンドマウスのBATの移植実験により、高脂肪食による体重増加、内臓脂肪蓄積の抑制、血糖値の低下を認め、BH4が制御するBATが糖・エネルギー代謝に中心的な役割を果たしている重要な所見を得た。モデル動物や単離褐色脂肪細胞を用いることにより、BH4による褐色脂肪脂肪の分化・増殖機序についてさらに詳細を検討する。褐色脂肪組織機能の活性化を介した糖尿病・肥満への治療効果についての評価を行う。糖尿病
東京における外国出身の老人のニーズ・アセスメント

平成5年6月現在、東京都特別区内には約23万人の外国人が住んでいる。国籍別では、韓国・朝鮮約8万2千人、中国約7万1千人、アメリカ約1万4千人、フィリピン約1万3千人、イギリス約6千人であった。特に、外国人の多い区としては、新宿区19,291人、豊島区16,251人、足立区15,782人が挙げられた。新宿区、豊島区、足立区の各区役所に外国籍の高齢者について電話調査したところ、新宿区だけは年齢別の外国人の人口統計を出していたが、他の区については全く情報がなかった。また、新宿区、豊島区の外国籍の高齢者への具体的サービスや訪問対象について、各保健所、訪問看護ステーション各3ヶ所に電話での調査では、外国人の高齢者についてはわからないという回答が多く、特に多いと思われる韓国・朝鮮籍の高齢者については、長く住んでいれば日本人と同じで問題はないとのことであった。足立区の2ヶ所の保健所訪問では、外国人の高齢者について知られていない、また保健所は自己申告で動くことが多く把握しにくく、プライバシー保護の問題があるため難しいとのことであった。このように、公的機関からの外国籍の高齢者の把握は非常に困難であり、また重視されていないことがわかった。外国籍の高齢者と直接話す機会を得るには、実際そのコミュニテイの中に入ることが必要となった。最も人口の多い韓国籍の高齢者を知人を通して紹介してもらうことになったが、その調整に3ヶ月以上かかった。現在7組の高齢者夫婦を紹介され、職場や自宅に訪問したり、また自宅に近い喫茶店で会い、13時間の半構成的面接を実施している。面接内容は了解を得て逐語的に記録し、各ケースごとにニューマンの理論を使って分析した。しかし、面接人数が少ないため一般化できない状態であり、できれば目標の50人に達するまで、あと1年以上かけて面接を行っていきたいと考えている。今後、中国籍の高齢者や他の外国籍の高齢者へも面接を実施し比較してみたいと考えている・平成5年6月現在、東京都特別区内には約23万人の外国人が住んでいる。今後、中国籍の高齢者や他の外国籍の高齢者へも面接を実施し比較してみたいと考えている・
小学校の体育授業における教科書使用の有効性の検討

1研究目的本研究は、教科書としての資料を使用したクラスと使用しないクラスとを比較することによって、小学校の体育授業での子どもたちの学習成果の差を検証し、体育授業において教科書を使用することの有効性を検討することを目的とした。2研究方法小学校第2学年の児童を対象とし,技能,知識・理解,情意,協力的学習の4つの成果について検証した。技能成果については,DVビデオ分析を行った。知識・理解成果については,児童の自己評価及び認知テストを行った。情意,協力的学習成果については,児童の自己評価に基づいて検証した。3研究成果その結果,教科書としての資料を使用したクラス(統制クラス)も教科書としての資料を使用しないクラス(非統制クラス)も単元終了時における技能成果(できる)については,非常に高い成果を得たものの大きな差異は認められなかった。しかし,単元過程における技能成果の差異について見てみると,非統制クラスに比べ,統制クラスの方が単元前半においてできるようになる子が多いことが明らかになった。また,同一教師による授業展開であったにも関わらず知識・理解成果(わかる)については,非統制クラスに比べ統制クラスは明らかに多くの知識・理解を得ることができることが明らかになった。なお,情意成果(楽しい)と協力的学習成果(関わる)については,統制クラス・非統制クラスともに非常に高い結果を得たものの明確な差異を認めることはできなかった。これらのことから、小学校の体育授業において教科書を使用することの有効性が2点明らかになった。技能成果(できる)について比較的短い時間で保証できるという点と,知識・理解成果(わかる)についてより確実に多くの成果を保証できるという点である。
海洋微生物由来の糖質分解酵素に特徴的なダブル吸着ドメイン構造の1分子機能解析

生物は生息環境に適応した機能を持ち、特に陸上と海洋では主要な微生物は異なっている。一方で両方の微生物に共通する性質の一つとして、昆虫や甲殻類の外骨格の構成糖であるキチンの分解能がある。これまでの研究では採取及び培養しやすい陸上微生物を中心としたキチン分解系の解析が行われてきた。しかしキチンは海洋中にも豊富であり、むしろ栄養源の限られる海洋では非常に重要な物質である。キチン分解は加水分解酵素や酸化還元酵素により行われる。海洋微生物の酵素では吸着ドメインの数が陸上微生物の酵素よりも多く、1分子観察によりキチンへの吸脱着及び分解運動を調べることで、そのドメイン構成差の理由を明らかにする。