hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顎顔面骨のリモデリング時におけるサイトカインGas6の破骨細胞に対する作用の解析

マウス卵巣摘出モデルを用いたTyro3,Gas6の検討:8週令雌ddyマウスを偽手術群と卵巣摘出群(n=6)にわけあわせてエストロゲンの効果も検討する為、手術直後に卵巣摘出群にエストロゲン(3-week-release;0.01mg/p)とプラセボを、偽手術群にプラセボの錠剤を皮下に埋入し、3週後に子宮及び脛骨を摘出した。脛骨は、骨髄と残りの骨とにわけ、それぞれ、mRNAレベルにおけるTyro3とGas6の発現をNorthern blotで検討した。また、破骨細胞の分化や活性、延命に深くかかわっていることが明らかになっている他の受容体型チロシンキナーゼとそのリガンド(FGFR1 & FdF-2,c-Fms & M-CSF)についても骨髄細胞と骨における発現をNorthern blotで検討した。骨髄細胞におけるGas6のm-RNAレベルでの発現は、卵巣摘出群で偽手術群よりも増加していたが、エストロゲン投与によってその増加は抑制された。一方Tyro3発現は、脛骨と骨髄細胞ともに見られなかった。しかし、同じRNAを用いてRT-PCRを行った結果、脛骨では卵巣摘出群、偽手術群のいずれにおいてもTyro3の発現が見られた。このことから、今回回収されたRNAが微量なために、Northern blotではTyro3が検出できなかったと考えられる。いずれにしても今回の検討から、卵巣摘出による骨粗鬆症の病態にGas6の発現が関与している可能性が示唆された。破骨細胞は、8週令マウス脛骨より抽出した骨髄細胞と新生児マウス頭蓋冠から採取した骨芽細胞をV_D(10^<-8>M)とPGE_2(10^<-6>M)存在下で共存培養する事によって得られるTRAP陽性成熟多核破骨細胞様細胞を用いた。(1)骨系細胞におけるGas6とTyro3の発現の検討:破骨細胞をはじめとする骨系細胞でのGas6とTyro3の発現を検討した。蛋白レベルでは、骨芽細胞及び成熟破骨細胞より蛋白を抽出してWestern blotにより検討をおこなった。その結果、Tyro3はマウス成熟破骨細胞で発現が見られたが、骨芽細胞においでは発現が見られなかった。mRNAレベルにおいては、骨芽細胞、骨髄細胞、脾細胞、成熟破骨細胞よりtotal RNAを抽出し、RT-PCRを用いて発現を検討した。Gas6はすべての細胞において発現が認められたが、一方でTyro3は成熟破骨細胞にしか発現が見られなかった。また、破骨細胞の分化段階においてTyro3の発現を検討したところ、成熟破骨細胞の出現と一致して発現がみとめられた。(2)Tyro3を介するGas6のマウス破骨細胞に対する検討:破骨細胞に対するGas6の作用を、破骨細胞形成、骨吸収活性、破骨細胞への延命作用の3つの点から検討した。破骨細胞形成と延命作用はTRAP染色により、骨吸収活性は象牙片上での培養による吸収窩形成を骨形態計測専用画像処理システムで測定し評価した。その結果、Gas6は破骨細胞の形成及び延命には影響を与えなかったが、10^<-9>M<の濃度において、成熟破骨細胞の骨吸収活性を約2.4倍に促進した。以上よりTyro3は成熟破骨細胞に特異的に発現すること、Gas6は成熟破骨細胞に直接作用して骨吸収を促進することが明らかになった。
hMLH1メチル化陽性大腸癌高危険群早期拾い上げ診断マーカーの開発にむけて

本年度は研究期間の最終年度として、前年度の実験を引き続き行い、今までに得られた結果の現時点でのまとめを報告します。研究の進行についてはMSI陽性大腸癌の前癌病変と考えられている鋸歯状ポリープのrhMLH1-93のSNPの関与を明らかにするために、当院外科において大腸内視鏡を行った患者からポリープの採取を行い15例両者およびにメチル化の関係を検討したがあきらかな関与は証明できなかった。しかし、鋸歯状ポリープの発生頻度が低く、蓄積した症例が少ないため明確な結論は出来ず、今後さらに症例を増やし解析を行う計画である。基礎的実験の結果としてはrhMLH1-93にAアリルとGアリルをもつオリゴを作成し、遺伝子型により結合する転写因子や蛋白の違いの解析を行いメチル化に対する感受性の違いを明らかにする研究を各種施行したが、何らかの蛋白がGアリルに結合しメチル化を阻害することまで見出せたが、特定の蛋白の同定には至らなかった。rhMLH1-93の周囲のSNPとメチル化の関係やハプロタイプとメチル化の関係ではメチル化と関連性の深いハプロタイプが候補としてあげられている。以上から、MSI陽性大腸癌に対する早期診断マーカーとしての可能性は未だあり未解決の研究を継続中である。本年度には、申請した物品GeneGenius2 Systemを購入し、研究内容を遂行する為の研究室設備の整備を行った。また、研究に使用する物品の購入を行った。物品の購入後研究を開始した。研究の進行についてはMSI陽性大腸癌の前癌病変と考えられている鋸歯状ポリープのrhMLH1-93のSNPの関与を明らかにするために、当院外科において大腸内視鏡を行った患者からポリープの一部を採取した。これはすでに倫理委員会に承認された研究計画に従い、インフォームドコンセントをおこない承諾を得た上で、治療によって切除されたポリープの一部を採取、ポリープよりDNAを抽出した。現在まで約10症例の鋸歯状ポリープを採取した。今後さらに症例数を増加させる予定である。さらに、このDNAよりSNP、メチル化解析を行う予定である。また、過去に採取された鋸歯状ポリープに対して、パラフィン包埋ブロックよりDNA解析を行うために、現在、倫理委員会に研究内容の承認を得る書類を作成中である。これらは個人情報を保護するために検体を連結不可能匿名化後行う予定である。基礎的実験ではrhMLH1-93にAアリルとGアリルをもつオリゴを作成し、遺伝子型により結合する転写因子や蛋白の違いの解析を行いメチル化に対する感受性の違いを明らかにする研究を施行中である。現在までに、Gアリルに特異的に結合する蛋白の一群を見い出している。これらの蛋白群を個々に同定中である。本年度には、前年度の実験を引き続き行っている。研究の進行についてはMSI陽性大腸癌の前癌病変と考えられている鋸歯状ポリーブのrhMLHl-93のSNPの関与を明らかにするために、当院外科において大腸内視鏡を行った患者からポリープの採取数を徐々に増加させている。これはすでに倫理委員会に承認された研究計画に。従い、インフォームドコンセントをおこない承諾を得た上で、治療によって切除されたポリープの一部を採取、ポリープよりDNAを抽出した。現在まで約15症例の鋸歯状ポリープを採取した。また、過去に採取された鋸歯状ポリープに対しては症例の集積中である。基礎的実験ではrhMLHl-93にAアリルとGアリルをもつオリゴを作成し、遺伝子型により結合する転写因子や蛋白の違いの解析を行いメチル化に対する感受性の違いを明らかにする研究を施行中である。さらにrhMLH1-93の周囲のSNPとメチル化の関係やハプロタイプとメチル化の関係を解折中であるがメチル化と関連性の深いハプロタイプも徐々に明らかになっている5。
Cdk6が制御するmicroRNAの探索による骨代謝機構の解明と再生医療への応用

口腔外科の臨床においては、顎顔面骨骨折など、骨再生が必要とされる状況が多いが、骨代謝メカニズムの正確な理解に基づいた骨再生治療法が開発されれば、骨再生が必要な疾患の治療において安全で優れた効果が期待できる可能性が高い。われわれは、細胞周期関連分子Cdk6の骨軟骨代謝における機能解析において世界をリードする研究成果を挙げてきたものと自負しているが、本研究はこれまでの研究成果の発展形として、Cdk6に制御されるmicroRNAの中で骨代謝・骨格形成において重要な機能を有するものを網羅的に探索することを通して、骨代謝制御メカニズムのさらなる理解を深めるとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として企画された。本年度は、前年度の研究に引き続き、骨芽細胞分化において重要な機能を果たすと同時にCdk6によって、その発現が制御されると想定されるmicroRNAの同定を試みた。具体的な方法としては、複数のmicroRNAアレイならびにクロマチン免疫沈降シークエンスの結果をバイオインフォマティクス解析に供し、既知の論文報告やシグナルネットワークも考慮して、Cdk6によって発現が誘導されるmicroRNA(約150個)の中から、骨芽細胞分化において重要な機能を果たしている可能性の高いmicroRNAを35個選択した。同様にCdk6によって発現が抑制されるmicroRNA(約160個)の中から、骨芽細胞分化において重要な機能を果たしている可能性の高いmicroRNAを20個選択した。さらに、それらのmicroRNAがターゲットとしている遺伝子の検索と候補の絞込みを行った。Cdk6によって発現が誘導されるmicroRNAとして35個を、Cdk6によって発現が抑制されるmicroRNAとして20個を選択し、それらのターゲット分子の同定まで行うことが出来たため。今後はこれまでに選択された分子の臨床応用可能性を探る研究も実施し、より一層の研究進展を図る。骨代謝メカニズムの解明は、口腔外科学分野において非常に重要な課題である。本研究は研究代表者のこれまでの研究成果の発展形として、Cdk6に制御されるmicroRNAの中で骨代謝・骨格形成において重要な機能を有するものを網羅的に探索することによって、骨代謝制御メカニズムのさらなる理解を深めるとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として企画された。まず、Cdk6ノックアウトマウス(Malumbres, Barbacid etal. Cell2004)由来のプライマリー骨芽細胞を用いたDNAマイクロアレイを複数セット行い、骨芽細胞ではCdk6欠損によって様々な遺伝子発現が変化することを確認した。次に同細胞を用いて抗Cdk6抗体によるクロマチン免疫沈降と次世代シーケンサーによる超高速シーケンス(クロマチン免疫沈降シーケンス)を実施し、1000種類程度のmicroRNA発現制御にCdk6が関与している可能性を見出した。さらに、Cdk6ノックアウトマウス由来のプライマリー骨芽細胞を用いてmicroRNAアレイを実施し、骨芽細胞内のCdk6欠損に対応して発現変動する可能性のあるmicroRNAを網羅的に検索した。DNAマイクロアレイ、microRNAアレイで得られたデータとクロマチン免疫沈降シークエンスの結果をバイオインフォマティクス解析に供し、既知の報告やシグナルネットワークも考慮して、Cdk6に制御されると同時に骨系統細胞分化に関与する可能性のあるmicroRNA群の選択を進め、今後の解析候補分子リストがおおむね完成した。骨芽細胞を用いたmicroRNAアレイと次世代シーケンサーを利用したクロマチン免疫沈降シーケンスの結果を統合して、今後の解析候補となる分子リストが完成したため。本年度は、前年度までに行ったCdk6ノックアウトマウス(Malumbres, Barbacid et al. Cell 2004)由来のプライマリー骨芽細胞を用いたmicroRNAアレイとクロマチン免疫沈降シーケンスに引き続き、骨芽細胞においてCdk6の発現・機能制御機構において重要な役割を果たしているBMPに着目し、BMP刺激に対応して骨芽細胞内でその発現が変動するmicroRNAの同定を試みた。本項目については、BMP処理を行ったマウス骨芽細胞からトータルRNAを抽出し、そのRNAを用いたmicroRNAアレイを行った(コントロールにはBMP未処理のマウス骨芽細胞を用いた)。microRNAアレイの結果では、約100個の解析候補分子が上がってきたため、このデータと前年度までに施行したmicroRNAアレイおよびクロマチン免疫沈降シークエンスの結果をバイオインフォマティクス解析に供し、既知の報告やシグナルネットワークも考慮して、Cdk6に制御されると同時に骨芽細胞分化に関与する可能性のあるmicroRNA群の絞込みを進めた。分化刺激条件については、ChIPシーケンスから得られたデータが膨大であることを背景に、さらなる解析対象とすべきmicroRNAの絞込みが若干遅れているため口腔外科の臨床においては、顎顔面骨骨折など、骨再生が必要とされる状況が多いが、骨代謝メカニズムの正確な理解に基づいた骨再生治療法が開発されれば、骨再生が必要な疾患の治療において安全で優れた効果が期待できる可能性が高い。

われわれは、細胞周期関連分子Cdk6の骨軟骨代謝における機能解析において世界をリードする研究成果を挙げてきたものと自負しているが、本研究はこれまでの研究成果の発展形として、Cdk6に制御されるmicroRNAの中で骨代謝・骨格形成において重要な機能を有するものを網羅的に探索することを通して、骨代謝制御メカニズムのさらなる理解を深めるとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として企画された。本年度は、前年度の研究に引き続き、骨芽細胞分化において重要な機能を果たすと同時にCdk6によって、その発現が制御されると想定されるmicroRNAの同定を試みた。具体的な方法としては、複数のmicroRNAアレイならびにクロマチン免疫沈降シークエンスの結果をバイオインフォマティクス解析に供し、既知の論文報告やシグナルネットワークも考慮して、Cdk6によって発現が誘導されるmicroRNA(約150個)の中から、骨芽細胞分化において重要な機能を果たしている可能性の高いmicroRNAを35個選択した。同様にCdk6によって発現が抑制されるmicroRNA(約160個)の中から、骨芽細胞分化において重要な機能を果たしている可能性の高いmicroRNAを20個選択した。さらに、それらのmicroRNAがターゲットとしている遺伝子の検索と候補の絞込みを行った。Cdk6によって発現が誘導されるmicroRNAとして35個を、Cdk6によって発現が抑制されるmicroRNAとして20個を選択し、それらのターゲット分子の同定まで行うことが出来たため。基本となるカタログが出来たので、今後は機能解析を中心に分子の絞込み作業を進め、より一層の研究進展を図るバイオインフォマティクスを駆使して対象とする分子の効率的な絞込みを進める今後はこれまでに選択された分子の臨床応用可能性を探る研究も実施し、より一層の研究進展を図る。
計算食料科学へ向けた牛肉脂肪の3次元幾何・位相解析

本年度は牛肉品質評価の調査結果に基づく実験及び幾何特徴抽出法の開発を行った。本研究では、実際の牛肉試料を破壊検査により大規模3次元画像として計測する。牛脂肪の正確な幾何・位相情報処理のためには計測した画像から脂肪交雑の領域を抽出・認識する必要がある。我々のデータは物理メモリには乗らない大規模な画像であり、昨年度開発した大規模3次元画像の脂肪交雑領域抽出法を用いて抽出実験を実施した。また、ロバストな主成分計算法などの幾何特徴、及びオイラー数など位相幾何特徴の抽出法を開発した。開発した主成分分析法は、ランダムサンプリングとトリミング法と呼ばれるロバスト回帰の枠組みを効率的に幾何中央値共分散行列へ導入することで、外れ値に堅牢な線形回帰の結果を得る。RANSACやLMedSなど幅広く用いられているロバスト回帰法と比べて、数値的に精度が高い結果を得た。さらに、品質評価のためには一般の格付けと同じ部位を同じ方法で切り取った試料が必要である。それゆえ、農研機構の専門家に協力を得て実際のリブロースブロックから格付けに用いる部位を切り取る実験を実施した。切り取り実験では生化学解析の実験時に考慮が必要とされる余分な脂肪部位の除去なども実施した。現在、切り取った試料の計測及びさらに高度な位相幾何特徴計算法の開発を行っている。試料選定が困難であったことや計測装置の不具合などにより、当初の計画通りには進まなかったが研究目的の計算法開発は成功している。本年度は、牛肉試料選定及び脂肪生化学実験の調査、3次元計測の予備実験と条件の選定、3次元画像の可視化、3次元画像のノイズ除去法及び領域抽出法の検討、幾何特徴抽出法の調査を実施した。その結果、新しいノイズ除去計算法を考案し学術発表を実施した。本研究では、実際の牛肉試料を破壊検査により3次元画像として計測する。牛脂肪の正確な幾何・位相情報処理のためには計測時に撮影される切りくずや凍結包埋剤等を除去する必要がある。我々は3次元スライス画像に対してノイズを除去する新しい計算法を提案した。我々の方法は、断面間にノイズの相関が無い知見を用いて、ノイズ画素を極値として特定し、幾何中央値へ置き換える。提案法は、切りくず等を除去し元の幾何・位相構造を復元する。他の既存法と比較して、隣接する3画素しか用いないため、非常に高速に大規模3次元画像に適用可能である。また、極値として検出されたノイズ画素しか処理しないため、ノイズ以外の箇所では元の画素が保存され、元データに近い結果を得られる。さらに、処理中の断面を挟む前後断面が同じ色の場合には、処理中の断面にどの様なノイズが撮影されていても、提案法が完全に幾何・位相構造を復元することを数学的に証明した。本研究成果により、理研シンポジウム光量子工学研究2016のベストポスター賞を受賞した。牛肉試料の3次元計測条件の選定及び正確な領域抽出のためのノイズ除去計算法の考案に時間が必要だったため、実際の大規模な牛肉試料の購入・計測が遅れている。しかしながら、予備計測実験によるデータを用いて計測条件及び領域抽出計算までの計算フレームワークは実装しており、今後の研究実施には支障がない。本年度は牛肉品質評価の調査、3次元画像のノイズ除去法及び領域抽出法の開発、幾何特徴抽出法の調査を実施した。その結果、新しい牛肉脂肪交雑の抽出計算法を考案し学術発表を実施した。我々のデータは物理メモリには乗らない大規模な画像であり、既存の領域抽出・ラベリングの計算法では扱えない。我々は大規模な3次元牛肉画像に対して脂肪交雑の領域を抽出する新しい計算法を提案した。我々の方法は、再帰的な判別分析法と3次元グラフ上での領域拡張法に基づくことで、物理メモリ以上の大規模3次元画像を処理する。初めに、2次元断面毎に牛肉領域を抽出し、ラベリングする。次に各連結領域を頂点、断面前後で重なっている連結領域への辺を持つ3次元グラフを構築する。3次元グラフ上で領域拡張を行うことで、3次元画像の領域抽出を行い牛肉領域を決定する。最後に赤身と脂肪の色を再帰的な判別分析で分離し脂肪交雑領域を得る。3次元グラフに必要なデータ構造の容量は画像に比べて非常に小さいため、メモリ上での実行が可能である。我々の方法で大規模な3次元牛肉画像の複雑な脂肪形状を抽出することに成功した。また、中央畜産会・格付け協会などで牛肉品質評価の現状に関する打ち合わせ、文献による既存の脂肪交雑抽出・評価方法の調査を実施した。さらに、位相幾何学の不変量に関する既存の計算法を調査し、現在大規模な画像に適応する新しい計算法を開発中である。牛肉試料選定及び購入が当初の予測より困難であったため、本研究の期間を1年延長して実施予定である。スーパーで購入した予備実験試料により、計測条件の選定、各種計算法の開発は予定どおり進んでいる。

また、ロバストな主成分計算法などの幾何特徴、及びオイラー数など位相幾何特徴の抽出法を開発した。開発した主成分分析法は、ランダムサンプリングとトリミング法と呼ばれるロバスト回帰の枠組みを効率的に幾何中央値共分散行列へ導入することで、外れ値に堅牢な線形回帰の結果を得る。RANSACやLMedSなど幅広く用いられているロバスト回帰法と比べて、数値的に精度が高い結果を得た。さらに、品質評価のためには一般の格付けと同じ部位を同じ方法で切り取った試料が必要である。それゆえ、農研機構の専門家に協力を得て実際のリブロースブロックから格付けに用いる部位を切り取る実験を実施した。切り取り実験では生化学解析の実験時に考慮が必要とされる余分な脂肪部位の除去なども実施した。現在、切り取った試料の計測及びさらに高度な位相幾何特徴計算法の開発を行っている。試料選定が困難であったことや計測装置の不具合などにより、当初の計画通りには進まなかったが研究目的の計算法開発は成功している。今後は、3次元画像からの牛脂肪領域抽出法の開発、大規模牛試料の購入・計測とその生化学実験、幾何・位相解析法の開発を実施する。領域抽出法は既にいくつかの方法を実装し、検討を行っている。また、生化学実験の外部業者と幾何・位相解析法は選定を行っている。大規模な試料の購入と計測には時間がかかるため、適切な実施時期を計画している。現在開発中の位相計算法の完了、牛肉試料の購入・3次元計測と生化学実験の実施、開発した計算フレームワークによる処理と相関解析を実施予定である。生化学実験・試料の購入に関しては、農研機構の関係部署の協力を得る予定である。牛肉試料の3次元計測条件の選定及び正確な領域抽出のためのノイズ除去計算法の考案に時間が必要だったため、実際の大規模な牛肉試料の購入と外部検査機関での生化学分析が遅れており、次年度使用額が生じている。牛肉試料購入・生化学実験が遅れているため、その費用と研究成果発表費用に用いる予定である。既に生化学実験の外部機関選定は終えており、大規模な牛肉試料購入のための準備を進めている。本研究補助金の大部分は試料購入費とその生化学実験費であり、次年度に適切に使用する予定である。
副腎髄質細胞膜リン脂質の代謝促進とホルモン分泌との関連

(1)ヤギおよびブタ副腎潅流標本では,アセチルコリン(Ach)刺激によるカテコールアミン(CA)分泌にはニコチン(N)受容体が関与していた.一方,イヌ,ネコ及びモルモットの場合には,ムスカリン(M)受容体とN受容体が関与していた.低濃度Ach刺激ではM受容体を介する反応が優勢であった.(2)N受容体刺激によるCA分泌は細胞膜の脱分極と外液Ca^<2+>濃度に依存しているのに対し, M受容体刺激は必らずしもそれらを必要とせず,細胞内に貯蔵されたCa^<2+>の動員によって発現すると推察された.(3)カフェインはM受容体刺激と同様,外液Ca^<2+>不在下でもCA放出を起こし,これらはともに細胞内Ca拮抗薬であるTMB-8によって抑制された.(4)イヌ副腎髄質切片では, AchはM受容体を介してCA放出を起こした.この標本にCa^<2+>蛍光指示薬であるFuraIIAMを取り込ませた後, Achを投与すると細胞内Ca^<2+>濃度が増加した.(5)リン脂質代謝を抑制し,イノントール・三リン酸(IP_3)を増加させるLiイオンは, M受容体刺激によるCA放出を増加させた.これはM受容体刺激がIP_3を増加させ, IP_3が細胞内Ca^<2+>の増加を起こし分泌反応を惹起させるという仮説と一致している.(6)M受容体刺激によるIP_3の役割をさらに調べる目的で,イヌ副腎からの髄質細胞の分離精製を行った.その結果,髄質切片をコラゲナーゼ処理することにより得られた粗製分離細胞の30%が髄質細胞であったが,パーコール直線密度匂配遠心法を用いることにより,分離細胞の80%が髄質細胞となった.(7)これらの精製副腎髄質細胞はAch刺激によりCA放出を起こし,その放出量は粗製分離細胞の最大放出よりも約2倍に増加した.(8)分離細胞の純化精製に伴い,潅流標本で得られた外液Ca^<2+>に依存しないAChによる放出反応は消失した.(9)現在さらに,細胞分離法の検討や培養等を行い,生理的放出機構を保持した細胞系を得るための実験を行っている.(1)ヤギおよびブタ副腎潅流標本では,アセチルコリン(Ach)刺激によるカテコールアミン(CA)分泌にはニコチン(N)受容体が関与していた.一方,イヌ,ネコ及びモルモットの場合には,ムスカリン(M)受容体とN受容体が関与していた.低濃度Ach刺激ではM受容体を介する反応が優勢であった.(2)N受容体刺激によるCA分泌は細胞膜の脱分極と外液Ca^<2+>濃度に依存しているのに対し, M受容体刺激は必らずしもそれらを必要とせず,細胞内に貯蔵されたCa^<2+>の動員によって発現すると推察された.(3)カフェインはM受容体刺激と同様,外液Ca^<2+>不在下でもCA放出を起こし,これらはともに細胞内Ca拮抗薬であるTMB-8によって抑制された.(4)イヌ副腎髄質切片では, AchはM受容体を介してCA放出を起こした.この標本にCa^<2+>蛍光指示薬であるFuraIIAMを取り込ませた後, Achを投与すると細胞内Ca^<2+>濃度が増加した.(5)リン脂質代謝を抑制し,イノントール・三リン酸(IP_3)を増加させるLiイオンは, M受容体刺激によるCA放出を増加させた.これはM受容体刺激がIP_3を増加させ, IP_3が細胞内Ca^<2+>の増加を起こし分泌反応を惹起させるという仮説と一致している.(6)M受容体刺激によるIP_3の役割をさらに調べる目的で,イヌ副腎からの髄質細胞の分離精製を行った.その結果,髄質切片をコラゲナーゼ処理することにより得られた粗製分離細胞の30%が髄質細胞であったが,パーコール直線密度匂配遠心法を用いることにより,分離細胞の80%が髄質細胞となった.(7)これらの精製副腎髄質細胞はAch刺激によりCA放出を起こし,その放出量は粗製分離細胞の最大放出よりも約2倍に増加した.(8)分離細胞の純化精製に伴い,潅流標本で得られた外液Ca^<2+>に依存しないAChによる放出反応は消失した.(9)現在さらに,細胞分離法の検討や培養等を行い,生理的放出機構を保持した細胞系を得るための実験を行っている.1.ネコ及びモルモット灌流副腎を用いての実験:(1).モルモット灌流副腎では、ニコチン(N)受容体刺激によるカテコールアミン(CA)分泌は、外液【Ca^(2+)】に依存し、等張KClによる脱分極下では消失するが、ムスカリン(M)受容体刺激による分泌は、外液【Ca^(2+)】に依存せず等張KCl下でも観察された。(2).MあるいはN受容体遮断薬存在下でアセチルコリン(Ach)による濃度反応曲線を描記した結果、生理的と考えられる低濃度AChによるCA分泌はM受容体を介する反応であった。(3).ネコ灌流副腎では、N受容体刺激では反応は外液【Ca^(2+)】に依存し、M受容体刺激では外液【Ca^(2+)】に依存していなかったが、両者の反応は等張KCl下では全て抑制された。

(4).N受容体を介する分泌は、ホルボールエステル(TPA)により増強されたが、M受容体を介する反応はTPAで影響を受けなかった。2.分離髄質細胞からのCA放出に対するイノシトールリン脂質代謝生成物関与の薬理学的検討:(1).M受容体刺激による分泌とリン脂質代謝亢進との関連を分析するために、モルモット副腎から髄質細胞を分離した。(2).分離細胞は灌流副腎の分泌反応と定性的に同様な反応を示した。M受容体を介するAChの反応は、Ca除去下(0.1mM,EGTA下)でも観察された。(3).現在、細胞内にイノシトール・ミリン酸を導入する目的で、ジギトニンを用いて分泌反応を保持した状態で細胞膜に穴を開ける条件を検討している。3.髄質細胞内Ca濃度測定に関する至適条件の検討:(1).Fra【II】(1uM)を用いてCa濃度と蛍光強度との関連を調べた結果、蛍光強度は【10^(-8)】から2×【10^(-7)】MCaまで直線的に増加した。Fra【II】の濃度を増加(510uM)すると蛍光強度は増加したが、Ca濃度と蛍光強度との関係は変化しなかった。(2).分離髄質細胞をFra【II】を含む溶液に浮遊し、細胞からのCa流出量を、また細胞内にFra【II】AMを取り込ませることにより細胞内Ca濃度を測定し、これらと分泌との関連を検討し始めている。
薬物代謝酵素活性の簡便な評価方法を用いたニコチン製剤の禁煙治療設計

本研究は、尿中に排泄されたニコチンの代謝物であるcotinineと3'-hydroxycotinine濃度比よりニコチン製剤の適正投与量を推定することを目的としておこなった。我々は薄層クロマトグラフによる代謝物の分離とnicotine骨格の発色作用を組み合わせることで、クリニックや薬局にてもcotinine濃度を簡便に推定できるツールを考案し、ラット尿にてcotinineと3'-hydroxycotinineを検出した。しかし、ヒトの尿ではニコチン濃度が低く、夾雑物も存在したため、十分な検出が行えなかった。今後、尿の代わりに、非侵襲的な検体である唾液を用いて、検討を行う予定である。近年、喫煙と様々な疾病との関連性が報告され、禁煙への取り組みがなされている。禁煙補助剤の成分であるNicotineは、Cytochrome P-450 2A6 (CYP2A6)によって5'-hydroxynicotineに代謝され、さらに、aldehyde oxidase (AO)によってcotinineへ代謝される。これら酵素活性には、大きな個体差が存在している。従って、これら代謝酵素活性を考慮したニコチン製剤の投与設計が望まれる。本研究はこれら代謝酵素活性とnicotineおよびその代謝物の関係を検討する。今年度、尿中および血中nicotine, 3'-hydroxynicotine, cotinine測定システムの確立を行った。すなわち、各nicotine誘導体添加したを尿サンプルにInternal Standard (5-aminoquinoline)を添加後、6N NaOH添加した。その後、ジクロロメタン:アセトン(3:1)で抽出後、その溶液を乾固した。その後、逆相カラムを用いて分離定量をおこなった。その結果、500ng/mL濃度まで定量が可能となった。コチン製剤を販売している薬局でも、簡便にnicotine濃度評価を行える手段としてTLCが有用である。昨年度、TLCを用いて尿中nicotine, 3-hydroxynicotine, cotinine濃度の半定量方法を検討した。高濃度領域において半定量は可能な傾向であったが、臨床濃度において検出できなかった。本年度は発色方法を考慮しながら、評価方法の改良を検討する。コチン製剤を販売している薬局でも、簡便にnicotine濃度評価を行える手段としてTLCや安価なペーパークロマトがある。TCLはnicotineおよびその誘導体の分離が可能であったが、発色試薬を染み込ませることが困難であり、半定量の感度に問題があった。一方、ペーパークロマトは発色試薬を染み込ませることが可能でありnicotine誘導体の呈色(半定量)が可能であったものの、nicotineおよびその誘導体の分離が困難であった。その結果、分離ができ、発色試薬を染み込ませることのできる分取用クロマトを用いて検討を行った。その結果、分離・発色とも可能になった。本年度は確立したこれらのシステムおよび既に確立しているHPLCシステムを用いてin vivoの検討を行う予定である。本研究は、尿中に排泄されたニコチンの代謝物であるcotinineと3'-hydrocotinine濃度比よりニコチン製剤の適正投与量を推定することを目的としておこなった。これまで、nicotineおよびその代謝物の濃度測定の多くはHPLCやLC-MS等を使用した方法が報告されている。しかし、これら機器は、クリニックやニコチン製剤を販売している薬局にはない。加えて、尿中nicotineおよびその代謝物の濃度を測定するためには尿中に含まれる夾雑物を取り除く等の煩雑な作業を行う必要もある。我々は薄層クロマトグラフによる代謝物の分離とnicotine骨格の発色作用を組み合わせることで、クリニックや薬局にてもcotinine濃度を簡便に推定できるツールを考案し、ラットにて、その有用性を検討した。雄性ラットにnicotine(0.05 mg/kg)を尾静脈より単回投与し、尿中(12時間蓄尿)排泄されたnicotineとその代謝物を検出した。ビリルビン等の黄色を呈する夾雑物が測定感度に影響を及ぼすものの、nicotine, cotinine, 3'-hydroxycotinineとも半定量が可能であった。一方、喫煙者のスポット尿を用いた検討においては、尿着色の影響が大きく、尿中nicotine代謝物の十分な半定量が行えなかった。今後、尿の代わりに、非侵襲的な検体で、着色のない唾液を用いて、検討を行う予定である。

今後、尿の代わりに、非侵襲的な検体である唾液を用いて、検討を行う予定である。本研究を遂行する上でこれら定量法を確立することがキーポイントとなる。これまで、HPLCを用いて、尿中nicotine, 5'-hydroxynicotine, cotinine濃度測定システムを確立している。さらに、尿中代謝物より簡便にnicotineおよびその誘導体を検出する方法も確立した。従って、おおむね順調に研究が遂行していると考える。これら定量方法が確立した後、今年度予定をしているin vivoの検討を行う。医療薬学これまで、HPLCを用いて、尿中nicotine, 5'-hydroxynicotine, cotinine濃度測定システムの確立できた。加えて、HPLCは設置されていない薬局にて、半定量的にnicotineおよびその誘導体の濃度を測定できるシステムを確立した。本年度は、確立したnicotineおよびその代謝物の測定システムを活用し、aldehyde oxidaseやCYP2A6活性の異なる系統のラットを用いて、nicotineおよびその代謝物の体内動態を検討する予定である。加えて、ヒト肝臓を肝不全マウスに移植したヒト型キメラマウスを用いて、同様の検討を行う予定である。昨年度、HPLCを用いて、尿中nicotine, 5'-hydroxynicotine, cotinine濃度測定システムの確立できた。また、臨床濃度よりは高値であるが、TLCを用いた半定量方法も確立しつつある。昨年度は、in vovoの検討も行う予定だあったが、nicotineとその誘導物の定量システム法の確立を優先した。そのため、定量に必要な試薬を中心に購入した。HPLCは病院や一部のクリニックに設置してあるため、それらの医療機関においても本測定方法を活用できる。しかし、ニコチン製剤を販売している薬局の多くにはHPLCは設置されていない。今年度は、いずれの薬局においても、尿中nicotine, 5'-hydroxynicotine, cotinine濃度を推定できるように、TLCを用いたニコチン誘導体の測定方法を改良・確立させていく。さらに、確立したnicotineおよびその代謝物の測定システムを活用し、aldehyde oxidaseやCYP2A6活性の異なる系統のラットを用いて、nicotineおよびその代謝物の体内動態を検討する予定である。
福島県沖生物中の微弱放射性銀/セシウム比精密定量法開発と移行過程解明への応用

Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発:HPGeで9核種混合標準線源と放射性銀の標準線源の計数効率を測定し,全効率曲線をエネルギーの関数として求め,サム効果のある核種のピーク効率推定法を開発した。サム効果のある放射性銀の本推定法と実測値はほぼ一致し,有効性が実証された。II由来と生態系への移行・蓄積の原因の解明:海生生物試料,海水・懸濁物・海底土を採取し前処理後,極微弱放射線測定を行った。放射性セシウムは全試料から検出され,極微弱放射性銀は一部の生物試料,海底土の有機物分画部分から検出したが,他からは検出されなかった。放射性銀の海生生物への移行は有機物分画部分の摂取によると推定された。Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発標準混合密封放射線源を用い,0から2MeVのエネルギー範囲でサム効果のある標準核種のピーク効率を測定し,全効率曲線をエネルギーの関数として求めた。全効率曲線がエネルギーの関数として求まると,全ての,サム効果のある複雑な壊変様式を持つ核種のガンマ線の計数効率が推定可能となる。これより本研究目的のサム効果のある放射性銀のピーク効率を推定した。一方,放射性銀の放射能実測のため,標準放射性銀の体積線源を購入し,そのピーク効率を精密に求めた。全効率曲線及びピーク効率曲線から推定した放射性銀の計数効率と放射性銀の体積線源から求めた実測値はほぼ一致した。従って本研究課題Iの全効率曲線及びピーク効率曲線からのサム効果のある複雑な壊変様式を持つ核種のガンマ線の計数効率推定方法は,充分実用的であることが確認された。II由来と生態系への移行・蓄積の原因の解明海生生物試料を採取し前処理後,極微弱放射線測定を行った。放射性セシウムはどの試料からも検出された。一部の生物試料から極微弱放射性銀を観測した。放射性銀の移行解明のため,海水・懸濁物・海底土中の放射性銀の放射能測定を行った。海底土の有機物分画部分からは,極微弱放射性銀を観測したが,海水,及び,海底土の無機物分画部分からは放射性銀は検出されなかった。Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発購入済のアイソトープ協会製の9核種混合体積線源密封放射線源を用い,0から2MeVのエネルギー範囲で,サム効果のある比較的簡単な壊変様式を持つ複数個の核種のガンマ線の計数効率を測定し,全効率及びピーク効率を求め,全効率曲線をエネルギーの関数として求めた。本研究目的のサム効果のある放射性銀のピーク効率を推定した。実験値との比較のためのため,ドイツ製の放射性銀の体積標準線源を購入し,その効率を精密に求めた。従って本研究課題Iのサム効果のある複雑な壊変様式を持つ核種のガンマ線の計数効率推定方法は,充分実用的であることが確認された。II由来と生態系への移行・蓄積の原因の解明海生生物試料を採取し前処理後,金沢大学尾小屋地下実験室で極微弱放射線測定を行った。由来解明のため,海水・懸濁物・海底土等の試料を採取,前処理後,同様に極微弱放射線測定を行った。海水,及び,海底土の無機物分画部分からは現時点では放射性銀は検出されなかった。海底土の有機物分画部分からは,極微弱放射性銀を観測した。放射性銀が検出された海生生物は,有機物分画部分のみを捕食しているのか,海水・海底土の無機分画部分にはなぜ放射性銀が存在しないのか,あるいは行った前処理が不十分なため確認できないのかは次年度以降検討する。以上から平成27年度の計画は,Iはほぼ計画通り終了,IIも放射性銀を確認し計画通り進展している。Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発9核種混合放射能標準ガンマ体積線源を用い,0から2MeVのエネルギー範囲で,測定に使用するHPGeの計数効率を再測定した。9核種の中で,典型的なサム効果の認められる標準核種のピーク効率を測定し,計数効率との関係から全効率曲線をエネルギーの関数として求めた。全効率曲線がエネルギーの関数として求まると,サム効果のある複雑な壊変様式を持つ全ての核種のガンマ線の計数効率が推定可能となる。一方,放射性銀の放射能実測のため,標準放射性銀の体積線源を購入し,そのピーク効率を求めた。昨年度の測定では,線源の放射能強度が強く,偶然の同時計数の可能性があったが,全効率曲線及びピーク効率曲線から推定した放射性銀の計数効率と放射性銀の体積線源から求めた実測値はほぼ一致した。本法による計数効率推定方法は,充分実用的であることが確認された。今後,標準放射性銀の体積線源の減衰を待って精度の検討を行う。

II由来と生態系への移行・蓄積の原因の解明昨年度は,海生生物試料を採取し前処理後,極微弱放射線測定を行った。放射性セシウムはどの試料からも検出された。また一部の生物試料から極微弱放射性銀を検出した。本年度は放射性銀の移行解明のため,主に海水・懸濁物・海底土中の放射性銀の放射能測定を行った。海底土の有機物分画部分から,昨年度は極微弱放射性銀を観測したが,海水,及び,海底土の無機物分画部分からは放射性銀は検出されなかった。本年度は,放射性銀はいずれの試料からも検出されなかった。放射性銀の半減期は250日と短く,これまで必ず検出されていた半減期約2年の放射性セシウム134さえも検出が困難な状況になっている。このため,試料の選択と,前処理法,濃縮法の検討が必要となる。Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発購入済のアイソトープ協会製の9核種混合放射能標準ガンマ体積線源を用い,測定に使用する井戸型HPGeの計数効率を再測定した。サム効果のある比較的簡単な壊変様式を持つ複数個の核種のガンマ線のみかけの計数効率を測定し,そのピーク効率から,全効率曲線をエネルギーの関数として求めた。実験値との比較のためのため,ドイツ製の放射性銀の体積標準線源を購入し,その効率を精密に求めた。全効率曲線及びピーク効率曲線から推定した放射性銀の計数効率と放射性銀の体積線源から求めた実測値はほぼ一致した。昨年度は,放射性銀線源の放射能強度が強く,偶然の同時計数の可能性があると判明したため,精度確認のため,減衰を待って再測定を行う。II由来と生態系への移行・蓄積の原因の解明海生生物試料を採取し前処理後,金沢大学尾小屋地下実験室で極微弱放射線測定を行った。本年度も放射性セシウムはどの試料からも検出された。海生生物への放射性銀の移行解明のため,本年度は主に,海水・懸濁物・海底土等の試料を採取し,前処理後,同様に極微弱放射線測定を行った。海水,及び,海底土の無機物分画部分からは本年度も放射性銀は検出されなかった。海底土の有機物分画部分から昨年度は,極微弱放射性銀を観測したが,本年度は検出されなかった。放射性銀の半減期は250日と半減期約2年の放射性セシウム134よりかなり短く,尾小屋地下実験施設の検出器でも検出が困難な状況になっている。このため,試料の選択と試料量,前処理法,濃縮法の検討が必要となる。放射性銀の化学形,存在状態も再検討し,前処理・濃縮手順の変更を検討する必要がある。以上から平成28年度の計画は,Iはほぼ計画通り進展,IIは放射性銀の減衰のため効率的な濃縮処理手順に一部変更し検出を目指す。Iサム効果を持つ放射性元素の精密定量法の開発9核種混合放射能標準ガンマ体積線源を用い,0から2MeVの範囲で,HPGeの計数効率を測定した。9核種の中で,典型的なサム効果の認められる標準核種のピーク効率を測定し,サム効果の無い核種の計数効率との関係から全効率曲線をエネルギーの関数として求めた。全効率曲線がエネルギーの関数として求まると,サム効果のある複雑な壊変様式を持つ全ての核種のガンマ線の計数効率が推定可能となる。この結果を用い,本研究目的のサム効果のある放射性銀のピーク効率推定法を開発した。一方,放射性銀の放射能実測のため,標準放射性銀の体積線源を購入し,そのピーク効率を求めた。放射性銀の658keVピークの効率はサム効果の無い場合の21%となり,本研究で開発したピーク効率推定法で求めた放射性銀の計数効率と放射性銀の体積線源から求めた実測値はほぼ一致した。本法による計数効率推定方法は,充分実用的であることが実証された。
半導体光触媒を用いるＣＯ２と有機化合物との炭素ー炭素結合形成反応の開発

光エネルギーによって活性化された固体触媒の有機合成におけるポテンシャルは未知数であり、CO2と有機化合物との炭素-炭素結合形成反応における基盤的な触媒的方法論はほぼ皆無に等しい。半導体光触媒の触媒表面において有機化合物がどのような反応性を示すかの系統的な研究を行い、これらの点を明らかにすることを目的に研究を行った。実際には可視光によって活性化されるRe錯体触媒と犠牲アミン反応財および、Pd/TiO2-In2O3やその他の半導体と2級アミンやフェノール、ハロゲン化芳香族化合物をCO2と共存させることで可視光照射下、三成分連結反応が起こり、芳香族アミド、芳香族エステル、および芳香族ジケトンがわずかな反応条件の違いによってが得られることを見出した。この反応は1室1反応容器で最初に見出されたが、即座に2室1反応容器に変えて反応を行った。2室のうち、1室にはRe錯体触媒と犠牲反応剤を混入させCO源とした。もう1室はPd/TiO2-In2O3と2級アミンやフェノール誘導体、およびハロゲン化芳香族で満たした。2級アミンは反応基質としても犠牲反応剤としても機能する可能性がある。まずは第1室でCO2からCOへの変換を行い、その結果生じる低濃度のCOが同一反応容器の中で、第2室へと気体として拡散移動する。この第2室でハロゲン化芳香族と各種成分が室温で反応し芳香環のアミノカルボニル化、アルコシキシカルボニル化、およびアリール化が起こった。13CO2を用いる反応によって、COが実際の反応基質であることが明らかとなった。また、第2室のより高原子価のPd種はCO自体が還元剤として働きPd(0)種を誘導したことが示唆された。2室1反応容器の条件を1室1反応容器へと最後にフィードバックさせ、同様な反応が進行することも見出した。今後はH2OとCO2からCOを発生冴える方法へと展開する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。目標として「半導体光触媒表面における有機化合物の活性化法とCO2との反応性を明らかにする」を掲げてH28年度の約8ヶ月の間、検討を行ってきた。熱エネルギーによって活性化される固体触媒は特に、枯渇資源利用に基づく基幹原料生産にこれまで大きく貢献してきた。しかしながら光エネルギーによって活性化された固体触媒の有機合成におけるポテンシャルは未知数であり、特にCO2と有機化合物との炭素-炭素結合形成反応における基盤的な触媒的方法論はこれまで皆無に等しい。その理由のひとつは半導体光触媒の触媒表面において有機化合物がどのような反応性を示すかの系統的な研究に欠けてきたためである。これらの点を明らかにできれば,半導体光触媒の活躍できる範囲は精密有機合成やCO2変換だけに留まらない。例えば不活性分子や不活性結合の官能基化などを「室温」で可能にし実用化レベルにまで押し上げることができる。H28年度は2種類の異なる半導体光触媒を同一反応容器内で混合し、役割分担をさせた。すなわち一つ目の半導体光触媒はCO2からCOへの変換を意図したPt/CuO2/TiO2を用いた。二つ目の半導体光触媒は、一つ目の半導体光触媒によって生成するCOを有機化合物と反応させるためにPd/TiO2とした。反応容器内にはハロゲン化アリール、アリールボロン酸、3級アミンを共存させて、COとこれら化合物との反応を検討した。その結果、ジアリールケトンとアリールカルボン酸アミドの両者が形成されることを見出した。CO2からCOを効果的に発生させるための半導体光触媒や分子光触媒/半導体光触媒ハイブリッドの選択が難しいが、現時点でわずかにCO2から生成したCOでさえも様々な有機化合物と異種金属担持半導体光触媒の混合系を用いれば様々な有機化合物と反応しうることを明確に証明した。本発見をさらに「CO2からCOをより効果的に発生させる方法」へと発展させることができれば合成化学的にも魅力的な、もっとスケーラブルな方法へと進展していくことが見込まれる。H29年度までの研究で、可視光によって活性化されるRe錯体触媒と犠牲反応剤および、Pd/TiO2-In2O3と2級アミン、ハロゲン化芳香族化合物をCO2と共存させることで可視光照射下、三成分連結反応が起こり、芳香族アミド化合物が得られることを見出した。ハロゲン化芳香族化合物以外にもジアゾ芳香族化合物も使用できる。またこの方法で2級アミンをアルコールに変えることで芳香族エステルも得られることからCO2を有機骨格に一般的に固定化できる方法へとさらに進展させることができよう。この反応は1室1反応容器で最初見出されたが、2室1反応容器に変えて行い、更なる生成物の収率の向上へと繋がりつつある。2室のうち、第1室にはRe錯体触媒と犠牲反応剤を混入させた。第2室はPd/TiO2-In2O3と2級アミン、ハロゲン化芳香族化合物で満たした。第2室の2級アミンは反応基質としても犠牲反応剤としても機能したと考えている。まずは第1室を可視光照射した結果(プレ活性化操作)、励起され活性化されたRe錯体触媒とCO2からCOが生成したと思われる。

このCOが第2室に気体として移動しそこで形成されたPdn-Ar種と反応のうえOC-Pdn-Ar種へと変換された後、OC(Ar)-Pdn種のカルボニル炭素に対してアミンやアルコール(もしくはアミン窒素ラジカルやアルコキシラジカル)が攻撃し、芳香族アミドや芳香族エステルを形成すると考えられる。可視光照射下の1室1反応容器においても、金属錯体((bpy)Re)触媒およびPd(II)/TiO2-In2O3触媒の両者を光で活性化でき、それぞれが重要な役割を演じてCO2を炭素骨格に導入できたことは注目に値する。また前者の励起錯体触媒によって形成されるCOは反応容器内の分圧が非常に低い状況(非常に低濃度)であるにも関わらず、効率良く光活性化されたPd(II)/TiO2-In2O3触媒と反応している点も特筆すべきである。これまで熱エネルギーを使ったアミノカルボニル化反応では一般的に、高圧COを必要としたことと比較しても、COを効果的に反応させることができた。可視光照射下されたPd(II)/TiO2-In2O3触媒がCOの捕捉と変換において極めて優れていることを見出した。光エネルギーによって活性化された固体触媒の有機合成におけるポテンシャルは未知数であり、CO2と有機化合物との炭素-炭素結合形成反応における基盤的な触媒的方法論はほぼ皆無に等しい。半導体光触媒の触媒表面において有機化合物がどのような反応性を示すかの系統的な研究を行い、これらの点を明らかにすることを目的に研究を行った。実際には可視光によって活性化されるRe錯体触媒と犠牲アミン反応財および、Pd/TiO2-In2O3やその他の半導体と2級アミンやフェノール、ハロゲン化芳香族化合物をCO2と共存させることで可視光照射下、三成分連結反応が起こり、芳香族アミド、芳香族エステル、および芳香族ジケトンがわずかな反応条件の違いによってが得られることを見出した。この反応は1室1反応容器で最初に見出されたが、即座に2室1反応容器に変えて反応を行った。2室のうち、1室にはRe錯体触媒と犠牲反応剤を混入させCO源とした。もう1室はPd/TiO2-In2O3と2級アミンやフェノール誘導体、およびハロゲン化芳香族で満たした。2級アミンは反応基質としても犠牲反応剤としても機能する可能性がある。まずは第1室でCO2からCOへの変換を行い、その結果生じる低濃度のCOが同一反応容器の中で、第2室へと気体として拡散移動する。この第2室でハロゲン化芳香族と各種成分が室温で反応し芳香環のアミノカルボニル化、アルコシキシカルボニル化、およびアリール化が起こった。13CO2を用いる反応によって、COが実際の反応基質であることが明らかとなった。また、第2室のより高原子価のPd種はCO自体が還元剤として働きPd(0)種を誘導したことが示唆された。2室1反応容器の条件を1室1反応容器へと最後にフィードバックさせ、同様な反応が進行することも見出した。今後はH2OとCO2からCOを発生冴える方法へと展開する。CO2からCOを効果的に発生させるための半導体光触媒や分子光触媒/半導体光触媒ハイブリッドを見出す。またハロゲン化アリールではなく、ハロゲン化されていないアリール化合物でC-H結合を直接活性化できる系を見出し、ハロゲンフリーの方法を開発する。より共役系が伸びたアリール化合物がいいのではないかと判断している。光照射下還元されて得られるラジカル種(ラジカルアニオン種)の寿命を少し延ばす目的がある。
膝関節靭帯再建術評価装置の開発

本研究では膝関節靭帯再建術評価装置を開発した.本装置は材料試験機に設置された膝関節固定用治具,6軸力センサと慣性センサから構成される.膝の全6自由度を本装置で制御可能とした.実験は人工樹脂膝関節及びブタ後膝関節モデルを作成した.これらモデルを用いで異なる膝靭帯再建術法及び異なる人工靭帯材料が膝の支持力と可動範囲に及ぼす影響を測定した.結果,人工靭帯に用いられている材料の荷重変位曲線は生体内の靭帯のものとは異なった.また本装置で特定の線維束が膝の回転運動と6軸支持力に及ぼす影響を明らかにした.本研究では異なる靭帯束には異なる機能を有することが確認され,膝靭帯二重束再建術手法の有効性が示された.本年度,本研究では膝関節靭帯再建術及び人工靭帯を評価するための装置を開発した.まず,万能材料試験機(島津製作所製)と膝関節固定用治具からなる実験装置を設計・開発・製作した.万能材料試験機の先端と関節固定用治具間には力覚センサ(株式会社ワコーテック製)を介し荷重を測定できるようにした.関節固定用治具には回転ベアリングとリニアベアリングを内蔵し,膝関節の5自由度を任意に固定・解放することを可能とした.この治具の機構により万能材料試験機によって与えられる垂直変位により,膝関節の屈曲伸展動作を実装することに成功した.さらに,膝関節モデルの大腿骨固定部と脛骨固定部には加速度/角速度センサ(株式会社ATR-Promotions製)を取り付け,それぞれの相対的な位置姿勢を計測可能とした.この装置の完成により研究計画記述の「膝関節靭帯再建術評価装置の作成」の目標を達成した.本年度は上記の装置を用いて実験を実施した.実験では膝関節の代替モデルとして医療用樹脂膝関節モデル及び豚膝モデルを用いた.代替モデルは北海道大学付属病院の整形外科の協力・指導の元で作成した.このモデルを用いて,研究計画記述の「異なる膝関節靭帯再建術が膝関節可動範囲に及ぼす影響及び支持力の測定」を実施した.膝十字靭帯を構成する前十字靭帯(ACL)と後十字靭帯(PCL)には異なる機能を備えた帯束(Bundle)が存在する.したがって,本研究では代替モデルに特定の靭帯束欠損状態を再現し,膝関節靭帯再建術評価装置に設置して実験を実施することで,特定の靭帯束が膝の可動範囲と支持力に及ぼす影響の解明を試みた.結果,靭帯束の状態により5自由度の可動範囲及び6軸の支持力に差異が確認された.来年度は,本年度得られた成果を国内外の学術会議で発表すると共に研究計画に記述されている残りの項目を計画的に進めて行くものである.本申請の研究期間2年間で膝関節靭帯再建術及び人工靭帯を評価するための装置開発した.まず,万能材料試験機(島津製作所製)と膝関節固定用治具からなる実験装置の設計・制作した.開発した治具にはベアリングとリニアベアリングが内蔵され,膝運動再現に必要な6自由度の内5自由度を任意に開放と固定することが可能である.この治具と垂直変位を与える万能材料試験機と組合せることにより,膝運動の全自由度(3並進自由度,3回転自由度)が制御可能である.さらに,万能材料試験機の先端と治具間には力覚センサ(株式会社ワコーテック製)を介し荷重を測定可能とした.また,治具には小型慣性センサ(株式会社ATR-Promotions製)が設置され,位置と姿勢を計測可能とした.次に,実験ではヒト膝関節の代替モデルとして人工靭帯再建術を再現した医療用樹脂膝関節モデルと膝関節靭帯再建術状態(単一束,二重束)を再現したブタ後膝モデルを用いた.代替モデルは北海道大学付属病院の整形外科の協力・指導の基で作成した.これらのモデルを用いて異なる膝関節靭帯再建術及び異なる靭帯材料が膝関節可動範囲と支持力に及ぼす影響を測定した.樹脂膝関節モデルには骨孔を開け,そこに人工靭帯を通して単一束・二重束の再建術を再現した.人工靭帯は変位に対して支持力は線形的に変化し,生体材料に見られる支持力の弛緩は現れなかった.また,骨孔の位置及び靭帯を固定する際のプレテンションによって支持力の差異が確認された.膝十字靭帯を構成する前十字靭帯と後十字靭帯には異なる機能を備えた線維束が存在する.そこで,本研究では特定の線維束欠損状態を膝代替モデルで再現し,膝関節靭帯再建術評価装置に設置して実験を実施することで,特定の線維束が膝の可動範囲と支持力に及ぼす影響の解明を試みた.結果,靭帯束の状態により5自由度の可動範囲及び6軸の支持力に差異が確認された.本研究では膝関節靭帯再建術評価装置を開発した.本装置は材料試験機に設置された膝関節固定用治具,6軸力センサと慣性センサから構成される.膝の全6自由度を本装置で制御可能とした.実験は人工樹脂膝関節及びブタ後膝関節モデルを作成した.これらモデルを用いで異なる膝靭帯再建術法及び異なる人工靭帯材料が膝の支持力と可動範囲に及ぼす影響を測定した.結果,人工靭帯に用いられている材料の荷重変位曲線は生体内の靭帯のものとは異なった.また本装置で特定の線維束が膝の回転運動と6軸支持力に及ぼす影響を明らかにした.本研究では異なる靭帯束には異なる機能を有することが確認され,膝靭帯二重束再建術手法の有効性が示された.本研究の目的は「膝関節靭帯再建術評価装置の開発」である.この研究目的を達成するため「研究計画・方法」では以下の4項目を挙げた:(A)膝関節靭帯再建術評価装置の作成,(B)異なる膝