hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内分泌細胞の機能亢進と腫瘍化におけるcaveolinの役割

今年度の研究では,caveolin-1,-2が大部分の細胞質で陽性を示すことを確認した甲状腺,副甲状腺,副腎皮質の中から,甲状腺の正常,過形成,腫瘍について症例数を増やしてcaveolin-1、-2の発現状態を検索した。しかし,その発現頻度および強度は症例によってばらつきが大きく,有意な統計結果を得ることが出来なかった。形態的な変化よりも機能との直接的な関連が示唆され,患者の血中ホルモン値との比あ較やISHなどを用いてホルモンの産生状態との相関を検討する必要があり,現在準備中である。一方,下垂体過形成状態においてはcaveolin-1が多数の核が陽性で他臓器と解離する結果を得ていた。この原因は,技術的な問題点を含めて解明中であるが,一部の膜蛋白が核に存在(移動)するという報告もありシグナル伝達において有意な現象である可能性を否定できない。人体例では材料が限定されるため下垂体腫瘍株GH3を用いて蛋白の存在とその局在を種々の条件で検索している。caveolin-3については検索したすべての内分泌細胞で陰性であったが,これまでに報告されていた骨格筋・心筋以外に、中枢神経白質においても陽性を示した。その局在を部位別に抽出したラット脳を用いてウエスタンブロットを施行したところcaveolin-3タンパクの存在を嗅脳と橋に確認した。なお,1998年1999年にグリア細胞やシュワン細胞にcaveolinの存在が報告されているが,局在についての報告はない。剖検または生検で得られたホルマリン固定パラフィン包埋切片に対して,抗ヒトcaveolin-1ポリクロナール抗体および抗ヒトcaveolin-2、-3モノクロナール抗体(Transduction Laboratories社)を第一抗体に用いてABC法を行った。線維芽細胞,血管内皮,平滑筋,脂肪細胞がcaveolin-1、-2に対して強陽性を示し、培養細胞でのこれまでの報告と矛盾しない良好な染色結果を得た。caveolin-3については骨格筋・心筋に陽性で、中枢神経白質においても陽性を示したが、今回検索したすべての内分泌細胞で陰性であった。内分泌臓器におけるcaveolin-1、-2の発現は以下の通り。甲状腺:扁平化した濾胞上皮はCaveolin-1,-2とも大部分の細胞が陽性であったが,結節性甲状腺腫で濾胞内に吸収空胞が出現した立方状の濾胞上皮ではCaveolin-1は陽性で,Caveolin-2は陰性を示した。副甲状腺、副腎皮質:大部分の細胞でcaveolin-1、-2に対して陽性を示した。下垂体前葉、膵臓ランゲルハンス島:一部の細胞が陽性を示すのみであった。また下垂体前葉細胞では多数の核が陽性を示した。以上の結果を踏まえて臓器を甲状腺にしぼり、正常と病的状態のcaveolin-1、-2の発現状態の変化を検索中である。Cavcolin-1は培養細胞のoncogernic transformationに際して減少するがCaveolin-2は変化しないという報告があるが,これまでに検索した範囲では過形成状態に置いてはむしろCaveolin-2が減少しており,Caveolin-1,-2の発現の検討が,過形成状態と腫瘍の鑑別に有用である可能性が示唆された。
イソギンチャク-褐虫藻共生実験系の確立：サンゴ共生のモデル化を目指して

イソギンチャクと褐虫藻の共生のメカニズムを解明するために、それらへの遺伝子導入法の確立を目指した。セイタカイソギンチャクの育成条件(成熟度、光周期)を調整することなどにより放卵放精を人為的に誘導することが可能となった。この放出された卵へDNAコンストラクトの注入を試みたが、その後、発生が進まず死滅してしまった為、遺伝子導入の成否を確認することができなかった。一方で、エレクトロポレーション法においては、イソギンチャク個体全体を覆う粘液を取り除き、同時に、麻酔状態にして遺伝子導入を行った。至適導入条件(緩衝液、電圧、電気容量)を検討し進めたが、残念ながら今のところポジティブな結果を得られていない。サンゴを含む刺胞動物のモデル生物としてのセイタカイソギンチャク(Aiptasia pallida)を飼育・繁殖し、研究に用いるために十分な個体数を確保するための条件検討を行った。水質、水温などの条件検討を行った結果、無性生殖によって実験室内で効率良く増殖させることが可能になった。餌についても検討し、小型魚類の飼育に用いられているブラインシュリンプ(アルテミア)が適当であるとの結論に至った。遺伝子導入については、電気窄孔法(エレクトロポレーション)を試みているがまだ成功に至っていない。遺伝子発現を制御するプロモーターを脊椎動物由来のものから、刺胞動物由来のものに入れ替えるなどの検討を行っているところであり、また、イソギンチャクの褐虫藻の取り込み(共生)、離脱誘導(白化)を人為的に再現することが可能になった。これら共生株、白化株を用いて、トランスクリプトーム解析とメタボローム解析を実施しており、環境(温度)変化による白化に伴うイソギンチャクの遺伝子発現、代謝状態について興味深い結果を得つつある。また、トランスクリプトーム解析から得られたvasa、nanosなど生殖細胞特異的遺伝子のイソギンチャクにおける局所的発現パターンについてはwhole-mount in situ hybridization(WISH)や個体の凍結切片を用いたin situ hybridizationを行っており、とくにvasaについては生殖細胞以外の広い領域での発現を確認しており、同遺伝子の今後の機能解析に興味が持たれる。刺胞動物(サンゴ、イソギンチャ)と褐虫藻の共生のメカニズムを解明するために、それらへの遺伝子導入法の確立を目指して研究を進めた。コユビミドリイシの卵あるいは受精卵へ、このサンゴの遺伝子由来のプロモーターを組み込んだプラスミドをマイクロインジェクションした。その結果、プラヌラ幼生期に導入した遺伝子由来の発現が確認できた。また、セイタカイソギンチャクへの遺伝子導入法として、マイクロインジェクション法とエレクトロポレーション法を予定していた。残念ながら、現在までこのイソギンチャクの卵は得られておらず、マイクロインジェクション法を進めることはできていない。一方で、エレクトロポレーション法においては、前処理を工夫することで結果が得られ始めている。イソギンチャク個体全体を覆う粘液(ムコ多糖)をブロムヘキシン塩酸塩の作用により取り除き、同時に、実験操作などの外部刺激によって新たに粘液が産生されるのを防ぐために塩化マグネシウムの作用により麻酔状態にして遺伝子導入を行った。その結果、イソギンチャク個体への遺伝子導入が確認された。また、イソギンチャク底部に存在する足盤から切離して生じる全能性をもった細胞塊に直接遺伝子導入を行うことも試みている。しかし、エレクトロポレーション後のこの細胞塊の生存率が非常に低く、これを改善するさらなる条件検討が必須であると考えている。また、ゲノム解析の結果から、褐虫藻と共生しない刺胞動物に比べ、ミドリイシ属のサンゴは複雑な自然免疫系の遺伝子を持つことが報告されている。これに着目し、褐虫藻との共生と自然免疫系の関係を調べるため、これらに対する阻害剤を用いた実験を行った。その結果、NF-kBの転写活性の阻害が、コユビミドリイシ、セイタカイソギンチャク共に、褐虫藻との共生維持に影響するという結果が得られた。刺胞動物(サンゴ、イソギンチャク)と褐虫藻の共生のメカニズムを解明するために、それらへの遺伝子導入法の確立を目指して研究を進めた。セイタカイソギンチャクへの遺伝子導入法として、マイクロインジェクション法あるいはエレクトロポレーション法を試みた。前年度までは当研究室でこのイソギンチャクの放卵放精を誘導することはできなかったが、体を一定以上の大きさに育てて十分な成熟状態にすることや雌雄を同一環境で飼育すること、また光周期を調整することなどにより研究室で放卵放精を人為的に誘導することが可能となった。この放出されたイソギンチャクの卵へDNAコンストラクトの注入を試みた。しかし、その後、発生が進まず死滅してしまった為、遺伝子導入の成否を確認することができなかった。これはインジェクション操作時に卵が強いダーメージを受けてしまった、あるいは使用した卵が未受精の状態であり、インジェクション操作後にあらためて受精することができなかったなどが原因と考えている。これを解消するために、受精後少し発生が進んだ胚(2細胞胚)にマイクロインジェクションを行うことを考えている。

また、イソギンチャク底部に存在する足盤から切離して生じる全能性をもった細胞塊に直接遺伝子導入を行うことも試みた。これらを材料として至適導入条件(緩衝液、電圧、電気容量)を検討し進めたが、ポジティブな結果を得ることはできなかった。イソギンチャクと褐虫藻の共生のメカニズムを解明するために、それらへの遺伝子導入法の確立を目指した。セイタカイソギンチャクの育成条件(成熟度、光周期)を調整することなどにより放卵放精を人為的に誘導することが可能となった。この放出された卵へDNAコンストラクトの注入を試みたが、その後、発生が進まず死滅してしまった為、遺伝子導入の成否を確認することができなかった。一方で、エレクトロポレーション法においては、イソギンチャク個体全体を覆う粘液を取り除き、同時に、麻酔状態にして遺伝子導入を行った。至適導入条件(緩衝液、電圧、電気容量)を検討し進めたが、残念ながら今のところポジティブな結果を得られていない。昨年同様に、1)飼育・繁殖、2)遺伝子導入方法、3)環境変動誘導実験の確立、4)トランスクリプトーム及びメタボローム解析、5)in situ hybridizationによる遺伝子発現解析、それぞれの確立を目指して研究を進めた。昨年進捗が滞っていた遺伝子導入方法についても、エレクトロポレーション(電気窄孔)法の条件検討を行うことにより、LacZ遺伝子導入に成功した。他のすべての目標についても計画どおり進展したといえる。飼育・繁殖については概ね順調に進んでおり、現在基礎生物学研究所に新たに設置した環境制御可能な海水水生動物の循環水槽を用いた同イソギンチャクの大量培養に加えて、白化株の作製にも成功している。また、ゲノム解析の結果から、褐虫藻と共生しない刺胞動物に比べ、ミドリイシ属のサンゴは複雑な自然免疫系の遺伝子を持つことが報告されている。これに着目し、褐虫藻との共生と自然免疫系の関係を調べるため、これらに対する阻害剤を用いた実験を行った。その結果、NF-kBの転写活性の阻害が、コユビミドリイシ、セイタカイソギンチャク共に、褐虫藻との共生維持に影響するという結果が得られた。発生生物学順調に進んでいる実験1)、2)、3)、4)、5)については、予定どおり研究を進める。一方、唯一計画より遅れている研究計画が、また、飼育時の光周期を調節することで、無性生殖を有性生殖に切り替えることができるという未発表データを検証し、卵を得ることができた。したがって受精卵・胚を得ることを目標に、現在、有性生殖化したオスの同定を含めた再現実験を行っている。この有性生殖化が確立すると、卵、受精卵、胚を得ることが可能になり、様々な実験操作の適応範囲が大きく広がることが期待される。1)飼育・繁殖、2)遺伝子導入方法、3)環境変動誘導実験の確立、4)トランスクリプトーム及びメタボローム解析、5)in situ hybridizationによる遺伝子発現解析、それぞれの確立を目指して研究を進めた。遺伝子導入方法についてはいまだに確立に至っていないが、他のすべての目標については計画どおり、あるいは計画以上に進展したといえる。
国際連携によるハイブリッドエクソソーム創製に向けたコンバージェンス研究の展開

本国際共同研究では、日本・オランダ・シンガポールの各研究グループが独自に有するマイクロ・ナノテクノロジー、デバイス技術、エクソソーム分離・解析、エクソソーム高機能化、単一細胞アッセイ、細胞スフェロイドアッセイの各要素技術を結集して融合することで、再生医療やがん免疫療法に応用可能な高機能ハイブリッドエクソソームを創製する。
Piezo1による抗腫瘍効果を活用した次世代型口腔癌治療薬の開発を目指して

腫瘍は、腫瘍細胞からなる実質とその周囲の間質から構成されている。近年、微小環境、特に間質の硬さが実質の腫瘍形成を促進することが報告されているが、その詳細な分子機構は不明である。口腔癌では癌周囲に硬結を触れることがある。つまり、間質に機械的変化が生じており、この機械ストレスを機械侵害受容器Piezo1が感知し、腫瘍形成に関与していると推察した。そこで、本研究では、Piezo1の腫瘍実質への影響を解明すると共に、Piezo1が機械ストレスを受容しその下流シグナル経路による腫瘍形成に与える影響を解明し、腫瘍実質と間質の両方を標的とした次世代型口腔癌治療薬の開発を目的とした。複数の口腔扁平上皮癌細胞株を用いてPiezo1の発現を解析し、これらの細胞株でPiezo1が高発現していることを確認した。Piezo1高発現株において、Piezo1アゴニストを作用させると、Piezo1発現量依存的およびアゴニスト濃度依存的に細胞内のイオン流入を変動させた。加えて、Piezo1アゴニストの濃度および時間依存的にERKのリン酸化が変動した。Piezo1に対するsiRNAを設計し、その効果をmRNA、タンパクおよび細胞内イオン流入により確認した。このsiRNAによるPiezo1の発現抑制下にて口腔扁平上皮癌細胞株の増殖の変動が認められた。以上の結果より、Piezo1の発現が口腔扁平上皮癌の細胞増殖を制御する可能性が示唆された。腫瘍は腫瘍細胞からなる実質とその周囲の間質からなる。近年、間質の硬さが悪性腫瘍の進行を促進するという報告がなされ、微小環境が腫瘍形成に与える影響のメカニズムの解明が期待されている。しかし、その詳細な分子機構は不明である。そこで、癌周囲組織に硬結を触れることがある口腔癌において、機械受容器がこの癌微小環境に生じる機械的ストレスを感知し、腫瘍形成に関与していると推察した。すなわち、機械受容器が腫瘍実質で機能するだけでなく、硬さを感知しその腫瘍形成を促進していると予想されるため、本研究では、腫瘍実質と間質の両方を標的とした新規の口腔癌治療薬の開発を目指している。平成29年度は口腔扁平上皮癌細胞株における機械受容器の関与をin vitroにて解析した。まず、口腔扁平上皮癌細胞株を含む各種癌細胞株における機械受容器のmRNAおよびタンパクの発現量を解析し、高発現株を選定した。この高発現株において機械受容器のアゴニストを作用させると細胞内のイオン濃度が上昇した。次に機械受容器の発現を抑制するsiRNAを作製し、効果的にノックダウンできた。また、機械受容器の発現抑制下にて細胞増殖の変動が認められ、現在細胞内シグナル伝達経路を解析している。今後は、機械受容器が口腔扁平上皮癌細胞株の浸潤、遊走能に与える影響を2次元および3次元培養にて解析する。また、ヌードマウスを用いた腫瘍形成への影響をin vivoにて解析する。効率よくノックダウンできるsiRNAの設計に時間を要したため。機械受容器の口腔扁平上皮癌細胞における関与をin vitroにて解析したのち、shRNAを用いた恒常的に機械受容器の発現を抑制した口腔扁平上皮癌細胞株をヌードマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いてvivoにおける腫瘍形成への影響を検討する。ヌードマウスを用いたin vivo実験に用いる実験動物やその他物品、試薬等の購入を予定している。また、研究成果発表のため学会への参加や論文発表に必要な経費に充てる予定である。
スギ花粉抗原特異的IgE産生に関与する細胞・分子の同定

アレルギー性鼻炎を引き起こす免疫応答は、アレルゲン特異的IgE抗体の産生とよく相関している。しかし、抗原特異的IgEが産生されるまでの初期の免疫反応には不明な点が多い。我々は、i)マウスの鼻粘膜下や皮下等に、23回スギ花粉抗原(Crj)を投与すると血清中のCrj特異的IgEが上昇し、12回のCrj刺激では非特異的IgEが血清中で増加すること、ii)Crjを鼻粘膜下に投与すると、主として顎下リンパ節が所属リンパ節として反応し、bulkのリンパ節細胞を培養すると非特異的IgEが産生されたが、リンパ球単独では産生されず、マクロファージの共存が必要であることを明らかにした。顎下リンパ節中のどの細胞でIL-4が産生され、どの細胞がIL-4の産生量と抗体のクラスを決めているのかを明らかにする目的で、IL-4KOおよび野生型マウスにCrjを鼻粘膜下投与し、10日後に顎下リンパ節細胞を採取した。全リンパ節細胞を蛍光標識した抗マウスMac-1抗体で標識し、セルソーター(FACSAria)でMac-1^+細胞とMac-1-細胞を採取した。IL-4KOマウスと野生型マウスのMac-1^+細胞とMac-1-細胞を種々の組み合わせで6日間培養し、培養液中の非特異的IgEとIL-4の産生量をELISAで測定した。IL-4KOマウスのMac-1^+分画と野生型マウスのMac-1-分画を培養すると、非特異的IgEとIL-4が産生されたが、IL-4KOマウスのMac-1^-分画と野生型マウスのMac-1^+分画との共培養では、IL-4も非特異的IgEも産生されなかった。マウスへのCrjの鼻粘膜下投与による非特異的IgEの産生は、IL-4産生により制御され、Mac-1^+細胞(マクロファージ)がIL-4の産生とIgのクラスを決めていることが示唆された。血中のIgE量と末梢血中のIgE^+細胞数が相関することから、血中および脾臓のIgE^+な細胞種と、鼻粘膜下へスギ花粉抗原投与後IgE^+細胞がどこで誘導されるか調べた。その結果、末梢血中でのIgE^+細胞は好塩基球で、脾臓のIgE^+細胞はB細胞と同定した。また、鼻粘膜下へのスギ花粉投与後、IgE^+細胞が顎下リンパ節で誘導され、脾臓や顎下リンパ節のIgE^+細胞はスギ花粉特異的IgEの産生に関与する可能性が示唆された。

スギ花粉症は、国民の25%以上が罹患すると推測される疾患であり、さらなる増加が懸念されている。特に若年層では、スギ花粉特異的IgE抗体の保有率が増加傾向にあり、抗原特異的IgEの産生をコントロールすることが、花粉症の罹患率低下につながると考えられるが、この産生機序の詳細は未だ明らかではない。本研究課題では、動物モデルを用い、スギ花粉の鼻粘膜曝露後の抗原応答部位を検索するとともに、抗原認識機構およびB細胞から形質細胞への成熟過程を細胞および分子レベルで検討する。平成21年度、以下の結果を得た。(1)BALB/cマウスの鼻粘膜下にスギ花粉抗原を投与後、鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)および顎下リンパ節を経時的に採取し、それぞれの総細胞数を測定したところ、スギ花粉抗原投与後、NALTでは、細胞数にほとんど経時的変化は見られなかったが、顎下リンパ節では経時的に増加し、710日後には約3倍に増加し、2週間後にはほぼ元のレベルに復帰した。(2)顎下リンパ節細胞では、B細胞数が増加した。(3)得られたリンパ節細胞を6日間培養し、培養上清中のIgE産生量をELISA法で測定したところ、顎下リンパ節細胞では、非特異的IgE産生量が細胞数の経時的変化と同様に抗原投与後約10日にピークに達し、その後低下した。しかし、NALT細胞では、スギ花粉抗原投与後2週間のどの時点でも、非特異的IgEはまったく産生されなかった。(4)その他のリンパ節でも、細胞数や培養後の非特異的IgE産生量に大きな変化は見られなかった。以上の結果は、抗原特異的IgEが産生される前に、抗原非特異的IgEが産生されること、鼻粘膜下に投与されたスギ花粉に対する所属リンパ節が顎下リンパ節であることを示唆しており、今後、非特異的IgE産生に関与する細胞や分子の同定が可能になった。スギ花粉症は、国民の25%以上が罹患していると推測される疾患であり、さらなる増加が懸念されている。特に若年層では、スギ花粉特異的IgE抗体の保有率が増加傾向にあり、抗原特異的IgEの産生をコントロールすることが、花粉症の罹患率低下につながると考えられる。が、抗原特異的IgEの産生機構の詳細は未だ明らかではない。平成21年度、抗原特異的IgEが産生される前に、抗原非特異的IgEが産生されること、鼻粘膜下に投与されたスギ花粉に対する所属リンパ節が顎下リンパ節であることなどを明らかにした。これらの成果に基づき、平成22年度、以下の結果を得た。(1)BALB/cマウスの鼻粘膜下にスギ花粉抗原を投与後、経時的に顎下リンパ節細胞を採取し、6日間培養して、培養液中の非特異的IgE量を定量したところ、スギ花粉投与後510日後に非特異的IgEが産生された。(2)スギ花粉投与10日後の顎下リンパ節細胞を、Percoll密度勾配遠心法により、マクロファージ分画、リンパ球分画、顆粒球分画への分離に成功した。(3)驚いたことに、リンパ球分画だけでは非特異的IgEは産生されず、勿論、マクロファージ分画だけでも非特異的IgEは産生されなかったが、両者の共存によって非特異的IgEが産生されることが判明した。以上の結果より、スギ花粉への応答部位(顎下リンパ節)で、非特異的IgE産生に関与する細胞が明らかになった。
唾液ペルオキシダーゼ活性と齲蝕ならびにヒポチオシアン酸の関係

我々の研究では唾液ペルオキシダーゼ(SPX)により触媒される反応は弱酸性に調整することで反応を休止することが可能であるが、この1年間の研究で様々な条件を変えて測定したにもかかわらず、ヒポチオシアン酸を測定するための吸光度はSPXによる反応を停止させた後でも変化し続けていることがわかった。これは反応を停止させた後でも持続的にヒポチオシアン酸が生成されていることを示している。それはチオシアン酸を酸化する物質が持続的に産生されていると考えられるので、今後我々はSPXやミエロペルオキシダーゼのような唾液酵素以外の酸化物の存在を検討することになった。またSPXにより触媒されるこの反応により過酸化水素と反応するチオシアン酸は減少する。このチオシアン酸の減少量を測定することで我々は新しい可能性を見出すことができた。それはう蝕をもたない人の刺激唾液を用いるとチオシアン酸の減少量は多く、修復歯の多い人の刺激唾液を用いるとチオシアン酸の減少量は少なくなる。さらに修復歯を持ちかつ少しでもう蝕を有するヒトの刺激唾液を用いるとチオシアン酸の変化量、この場合は減少量であるがその量が増加することがわかった。この結果はう蝕を持つとチオシアン酸を酸化する物質が増加している可能性を示唆するものである。このことから我々はチオシアン酸の変化量とう蝕になんらかの関係があると考えている。また前段に示されるように何らかの酸化物質と関連性もあるように思える。今後の更なる研究が必要である。今年度の研究の目標である6歳前後の小児と成人からの刺激唾液、無刺激唾液の採取と同時に口腔内状態の記録などの試料の採取を行ってきた。今後も計測と同時に試料の採取を行う予定である。採取された無刺激唾液と刺激唾液の差は今のところ無刺激唾液と刺激唾液ではそれほど大きな差は見られないことや個人差が大きいことがわかり、今後の研究では刺激唾液を検索することで十分であるとの結論を得た。さらに唾液ペルオキシダーゼ活性とう蝕さらには生産されるヒポチオシアン酸濃度に関しては相関関係があることがわかったが(小児歯科学会九州地方会、小児歯科学会などで発表)それほど大きな相関関係ではない。また同じサンプルでも実験ごとの誤差が大きいのもこうした相関関係に影響を与えているが、誤差の原因として考えられるのは、実験に全唾液を使用しているためその中に含まれている多くの還元剤の存在である。というのも実験の中でヒポチオシアン酸の濃度測定には5-thiobis-nitrobenzoic酸を使用しているが、これは生成されるヒポチオシアン酸だけでなく唾液に含まれる還元剤とも反応してしまうのが問題である。さらに成人では問題ではないが、小児においては無刺激唾液の採取において絶対量の不足がある。病院に来院している小児も対象にしているが、無刺激唾液の採取は時間がかかるので困難を極めている現状がある。またこの問題は先ほど挙げた還元剤の存在とも関係があり、還元剤の影響を抑えるには透析を行うのが一般的であると思われるのだが、絶対量が少ない場合には透析膜内より試料を取り出す際にその多くが失われてしまう可能性がある。テクニックの問題でもあるが現在、2つの方法が現在考えられており一つは凍結乾燥をおこなう、もしくは遠心ろ過による濃縮を行う方法を考えており、現在、後者の方法にて検索を行っており、様々な条件を変え最適な方法を模索している。
応力拡大係数制御下における腐食疲労強度に関する研究

海水を模擬した3%塩水中での鋼の疲労亀裂伝播挙動を調べるため,亀裂伝播速度に依存する応力拡大係数制御の疲労試験を行った.特に,腐食疲労亀裂伝播寿命に及ぼす応力繰返し速度と海水温度の影響について検討した.その結果を要約すると次のようになる.1)塩水中における疲労亀裂進展の減速または停滞現象が生じたが,その時に腐食生成物によるくさび効果に起因すると思われる亀裂開口荷重の上昇(ΔKepp)の減少がみられた.そのため, ΔKを一定に保っても亀裂伝播速度は一定とならず,見かけ上, Parid則は成立しない.疲労亀裂伝播にParis則を適用するにはΔkではなく,時々刻々のΔkeppを用いねばならない.2)応力比を高くする(SS41では0.4以上, SM50B材では0.5以上)ことによって, ΔkeffをΔkとみなしうる.3)応力繰返し速度と温度の影響は顕著であり,たとえば, SS41材ではΔk=24.8MMa√<m>,f=0.5Hg, T=60°Cの条件で,大気中の伝播速度の7倍も早くなることが観察された.海水を模擬した3%塩水中での鋼の疲労亀裂伝播挙動を調べるため,亀裂伝播速度に依存する応力拡大係数制御の疲労試験を行った.特に,腐食疲労亀裂伝播寿命に及ぼす応力繰返し速度と海水温度の影響について検討した.その結果を要約すると次のようになる.1)塩水中における疲労亀裂進展の減速または停滞現象が生じたが,その時に腐食生成物によるくさび効果に起因すると思われる亀裂開口荷重の上昇(ΔKepp)の減少がみられた.そのため, ΔKを一定に保っても亀裂伝播速度は一定とならず,見かけ上, Parid則は成立しない.疲労亀裂伝播にParis則を適用するにはΔkではなく,時々刻々のΔkeppを用いねばならない.2)応力比を高くする(SS41では0.4以上, SM50B材では0.5以上)ことによって, ΔkeffをΔkとみなしうる.3)応力繰返し速度と温度の影響は顕著であり,たとえば, SS41材ではΔk=24.8MMa√<m>,f=0.5Hg, T=60°Cの条件で,大気中の伝播速度の7倍も早くなることが観察された.船舶や海洋構造物は海水等の腐食環境中で繰返し荷重を受けるため亀裂の発生ととも伝播に大きく影響する。これらのことを考慮して、本研究では海水を模擬した3%塩水中での鋼(SS41材およびSM50B材)の疲労亀裂伝播に伴う亀裂開閉口挙動ならびに応力繰返し速度と温度の亀裂伝播への影響について、マイクロコンピュータ制御による応力拡大係数(ΔK)一定試験および定荷重試験をおこなって検討した。その結果を要約すると次のようになる。(1)塩水中における疲労亀裂進展の減速または停滞現象が生じたが、その時に腐食生成物によるくさび効果に起因すると思われる亀裂開閉に荷重の上昇(ΔKeff)の減少がみられた。そのため、ΔKを一定に保ってもda/dNは一定とならず、見かけ上Paris則は成立しない。疲労亀裂伝播にParis則を適用するにはΔKではなく、時々刻々のΔKeffを用いねばならない。(2)応力比を高くする(SS41材では0.4以上,SM50B材では0.5以上)ことによってΔKeffをΔKとみなしうる。(3)応力繰返し速度と温度の影響は顕著であり、たとえばSS41材でΔK=24.8MPa【√!m】,f=0.5Hg,T=60°Cの条件で、大気中の伝播速度が約7倍も大きくなることが観察された。(4)繰返し速度と温度との等価性についてはさらに詳しいデータが必要であるが、本研究ではSS41材でΔK=24.8MPa【√!m】の条件で亀裂伝播速度が60°C,5Hgでの場合と30°Cでおよそ1Hgでの結果と一致することが予測出来た。
内生的経済成長モデルによる成長メカニズムの理論的研究

今回の研究では,2部門内生成長モデルの一般化および長期均衡径路の特性に関する研究を中心に行った.この研究に関連するものとして,Journal of Economic Theory, Vol. 63 (1994)での,一般的2部門内生成長モデルにおける長期均衡径路の不定性の議論があるが,そこで展開されたモデル分析を基礎に,長期均衡径路の存在性,安定性,一意性,および不定性の考察,さらには一般的2部門モデルでの経済厚生分析などを試みた.これらの研究の過程において参考となるのは,新古典派2部門モデルから今日の内生的成長モデルに至る数々の議論であり,これらは内生的経済成長関連図書の購入によってサポートすることができた.これらの研究の中で成果が得られたものとしては,均衡が不定となる可能性のあるパラメータ集合のもとで,厚生分析を行った点が挙げられる.特に,知識の外部性を導入した一般的2部門モデルにおいて,知識の外部効果の大きさと長期均衡径路の経済厚生の関係を,ある程度明らかにすることができた.それは,社会厚生を最大にするような,最適な外部性の大きさが存在するというものである.これは,均衡が不定である場合でも,真に最適な経済成長径路が1つだけ存在する可能性を示唆するものである.また,公共資本と民間資本からなる2部門内生成長モデルに関する厚生分析も試みた.中でも,公共資本の利用が有料化されているような内生的成長モデルのもとで,政府の成長政策と最適租税政策に関する研究を行った.その結果,初期の経済の状態に対応して,成長政策と最適租税政策が一致する場合と,そうでない場合があることが明らかになった.今回の研究では,2部門内生成長モデルの一般化および長期均衡径路の特性に関する研究を中心に行った.この研究に関連するものとして,Journal of Economic Theory, Vol. 63 (1994)での,一般的2部門内生成長モデルにおける長期均衡径路の不定性の議論があるが,そこで展開されたモデル分析を基礎に,長期均衡径路の存在性,安定性,一意性,および不定性の考察,さらには一般的2部門モデルでの経済厚生分析などを試みた.これらの研究の過程において参考となるのは,新古典派2部門モデルから今日の内生的成長モデルに至る数々の議論であり,これらは内生的経済成長関連図書の購入によってサポートすることができた.これらの研究の中で成果が得られたものとしては,均衡が不定となる可能性のあるパラメータ集合のもとで,厚生分析を行った点が挙げられる.特に,知識の外部性を導入した一般的2部門モデルにおいて,知識の外部効果の大きさと長期均衡径路の経済厚生の関係を,ある程度明らかにすることができた.それは,社会厚生を最大にするような,最適な外部性の大きさが存在するというものである.これは,均衡が不定である場合でも,真に最適な経済成長径路が1つだけ存在する可能性を示唆するものである.また,公共資本と民間資本からなる2部門内生成長モデルに関する厚生分析も試みた.中でも,公共資本の利用が有料化されているような内生的成長モデルのもとで,政府の成長政策と最適租税政策に関する研究を行った.その結果,初期の経済の状態に対応して,成長政策と最適租税政策が一致する場合と,そうでない場合があることが明らかになった.
種子食動物の食文化:自己学習と社会学習の相対的効果

オニグルミは堅い殻に包まれているが、ニホンリスは効率的な採食技術で、短時間に中身を取り出すことができる。しかし、オニグルミを食べたことが無い個体群では、クルミを割ることができない。オニグルミがない亜高山帯針葉樹林で捕獲したニホンリスに、繰り返しクルミを与えたところ、14%の個体が学習した。学習に関わる年齢の効果を知るため、オニグルミを食べたことがない動物園個体で実験を行ったところ、1歳未満の個体は全て学習できたたが、3歳以上の個体はいずれも学習することが出来なかった。ニホンリスがオニグルミを食べるためには、若い時期の頻繁な採食機会が必要であることが明らかになった。ニホンリスの主要な餌であるオニグルミ種子は堅い殻に包まれているので、それを削り、中身を食べるために時間がかかる。しかし、リスは効率的な採食技術を習得することによって、短い採食時間で中身を取り出すことができるようになる。オニグルミを食べたことが無い個体群では、この採食技術を習得していないため、クルミを上手く割ることができない。本年度は、オニグルミが自生していない亜高山帯針葉樹林で捕獲したニホンリスを対象に、オニグルミ採食技術が学習によってどのように習得されるのかを調査した。野外からの捕獲個体を個別ケージで飼育し、毎日オニグルミ3個ずつを50日間給餌し続けた結果、12個体中1個体のみが、効率的な採食技術を習得し、5個体は効率的な採食技術をまれに示した。一方、オニグルミの採食技術をすでに習得した個体と隣接してケージを置き、その行動を見ることができる環境で飼育した結果、10個体中2個体が技術を習得し、1個体はまれに効率的な採食技術を示した。以上より、上手にクルミを割ることができるモデル個体の存在が、オニグルミ採食技術の学習効果に大きな影響を与えているという結果にはならなかった。全体的に40%の個体が採食技術獲得の手がかりをつかんだものの、それが定着した個体はわずか、14%と低い値であった。野外で捕獲してきた個体は年齢が不明である。次年度は、飼育個体を用いて、学習効果と年齢との関わりを解析する予定である。オニグルミが自生していない亜高山帯針葉樹林で捕獲したニホンリスを対象に、繰り返しクルミ割りを経験する事によって、最適なオニグルミ採食技術が習得されるのかを調査したところ、全体的に40%の個体が採食技術獲得の手がかりをつかんだものの、それが定着した個体はわずか、14%と低い値であった。そこで、今年度は年齢が分かっている動物園飼育個体を用いて、学習効果と年齢との関わりを解析した。オニグルミを餌として利用したことが無い動物園飼育個体について、2ヶ月間にわたって、オニグルミ種子の提示を継続した結果、1歳未満の個体は全て採食技術を獲得したが、1歳以上3歳未満では半数の個体が採食技術を獲得することができた。しかし、3歳以上の個体はいずれも採食技術を学習することが出来なかった。したがって、ニホンリスが堅い殻をもつオニグルミ種子を効率的に食べるためには、若い時期の頻繁な採食機会が必要であることが明らかになった。植物の種子は、動物にとって栄養価が高い食物であるが、同時にタンニンなどの忌避物質、堅い殻などによって採食効率が下げられ、簡単に利用できる食物となっているわけではない。種子を主食とする動物は、採食効率をより高めるために、それぞれが生息する地域に分布する種子の防御機構に対応した生理的あるいは行動的な適応を進化させていると考えられる。その結果、種子食動物は地域ごとに異なる採食生態を示す可能性がある。本研究では、日本における種子食動物の代表であるニホンリスを調査対象とし、堅い殻によって防御されているオニグルミ種子を主食とするための行動適応とその学習過程について調査した。最終年度である今年度は、タンニンを多く含むコナラ属堅果を食物として利用するかどうか、生息環境が異なる7か所の調査地で給餌試験を行った。野外に給餌台を10か所ずつ置き、リスが餌として利用するアカマツ球果、オニグルミ核果、コナラ堅果、ミズナラ堅果を各10粒ずつ提示した。オニグルミや多様な樹種が混在する低地林の調査地では、リスはオニグルミを持ち去ったが、アカマツやコナラはほとんど利用しなかった。

アカマツとミズナラなどが優占する標高1000m付近の山地林では、アカマツ、コナラ、ミズナラを利用した。標高2000m以上の亜高山帯針葉樹林では、ゴヨウマツが豊作の今年は、コナラやミズナラを利用しない傾向が見られたが、不作の前年度はすべての種子を利用した。以上のように、タンニンを多く含むコナラ属堅果の利用頻度には地域差があることが明らかになった。生息環境にドングリが多く生育する山地林では、ドングリを利用する頻度がほかの地域よりも高かった。ドングリに含まれるタンニンへの生理的な適応が獲得されているためであると考えられる。本研究期間を通して、種子食動物リスが生息環境によって利用できる種子の種類に応じて、効率的な採食生態を進化させていることが明らかになった。こうした生態的な適応によって、種子食動物は同種でありながら異なる食文化をもつものと考えられる。
皮質電位、機能画像融合による表情認知ネットワークの解明

顔認知課題には側頭葉底部の関与が大きいことが指摘されている。我々はてんかん患者において診断目的に硬膜下電極を留置した際に顔、文字、ストライプなどの視覚提示を行い、顔・文字認知に関連した脳皮質電位変化を捉えた。本年度は従来型の半分の直径(1.5mm)、倍密度を有する高密度電極を作成して両側側頭葉底部に留置した。視覚認知課題はひらがな、図形、顔、ストライプを提示した。ECoG生データは周波数成分変化をPermutation testによる統計検定を行い、特に高周波成分である80-120Hzの周波数成分(high-Gamma band)に着目すると側頭葉底部では顔刺激では前方外側、ストライプでは後方正中部が有意に活動領域の違いがあった。この所見は5症例で同様の傾向を認めた。ECoG生データを時間-周波数解析と統計学的処理をすることなく、自動判別ソフトウエアの開発と応用をおこなった。このためにMatlab上で動作するSupport vector machine (SVM)とSparse logistic regression (SLR)法を応用した。ECoGデータは取得したMatlabで読み込める形式に変換した。この2つの自動判別ソフトウエアでは15回のトレーニングセッション後にはほぼ100%で誘発ECoGから視覚刺激を予測することが可能になった。30症例のECoG電極位置を標準座標に変換し、標準脳上に計3000点ECoGの表示を行う。これによる典型的なヒトにおける視覚認知のダイナミクスを把握することができる顔認知に関わる脳部位として紡錘状回、上側頭溝などが報告されているが、脳部位間の関係を調べるには、時間分解能と空間分解能がともに高い皮質電位(Electrocorticography ; ECoG)や脳磁図(Manetoencephalography ; MEG)が有用である。本研究では顔認知と表情認知を対象とする顔認知の際にECoG、MEG、機能的MRI(functional MRI ; fMRI)を用いて脳活動領域の局在などを解析した。さらに、海馬近傍部の活動に着目して記憶機能との関連性を検討した。男性と女性、familiarとunfamiliarな顔、表情顔と中性顔からなる標準化された顔画像データベース(Eckman and Friesen, Facial Action Coding System, 1978)を用いる。1ブロックでは男女の表情顔と中性顔をランダムに提示して性別に対してボタン押しをさせる。2ブロックでは1ブロックと同じ顔画像を提示して表情の有無に対してボタン押しをさせて、ECoG、MEG、fMRIの計測を行う。その他3,具象語/抽象語クラス分け(文字読み)、4,物品名称,5,記憶課題、に加え、6,familiarとunfamiliarな顔認知課題を行う。サンプリング周波数1kHzで海馬を含む脳全体のECoGを計測し、100回ほどの刺激提示を行う。顔呈示(1)と文字呈示(3)加算平均結果では顔刺激呈示後170-200msecに右紡錘回優位に電位変化を認めた。顔刺激で誘発される反応は文字呈示課題と比較して統計学的に有意な電位変化であった。さらにfamiliarとunfamiliarな顔呈示(6)ECoGのsubtractionを行うと600msec付近で海馬近傍に統計学的に優位な陰性波を認めた。顔呈示ECoGに対して時間-周波数解析を行うと170-200msec付近にβおよびγ帯域成分の増加を認めた。さらに400-800msecの潜時ではγ帯域のみの持続する活動を認めた。しかし、電気刺激マッピングにより相貌失認等の顔認知機能の障害は誘発されなかった。症例数を増やすとともに、さらに詳細なデータ解析を行う予定である。これによる典型的なヒトにおける視覚認知のダイナミクスを把握することができる
栄養による骨代謝制御機構の解明

日本では、過食による肥満や糖尿病が社会的な問題となっており、これらは骨代謝にも影響を及ぼすことが知られている。従って、糖尿病が骨代謝にどのように影響するのかを検討し、骨折リスク上昇などの予防策を探ることは医療費の削減という点においても重要な課題である。そこで本研究では、当初2年の計画で、2型糖尿病と骨代謝について2つの研究目的を設定した。1つ目は、《糖尿病による骨脆弱化の真の要因とメカニズムの解明》である。加重・高血糖・インスリン濃度など、糖尿病による骨脆弱化の要因が様々に議論されている。モデルラットを用いたvivo試験、骨髄細胞の培養実験を組み合わせてその因子を特定し、骨代謝のバランスを崩壊させるメカニズムの解明を行った。2つ目は、《食品成分による骨脆弱化予防の可能性》と設定したが、これは次年度の計画としていたため、今回の研究では行っていない。本研究では、糖尿病モデルラット、およびコントロールラットを血糖値が同レベルの5週齢の時点から、血糖値を5週間ごとに測定しながら20週間飼育した。血液や尿、肝臓、脂肪組織、頸骨、大腿骨を採取し、血漿および尿サンプルから酸化ストレスマーカーや炎症性サイトカインの濃度をELISA法で測定した。頸骨と大腿骨から骨髄細胞を採取し、破骨細胞前駆体の割合を測定した。また、近位頸骨を用いて、破骨細胞形成や炎症、抗酸化、糖化に関わる諸因子のmRNAレベルを測定した。OGTT2時間値から20週齢で糖尿病型となり、その時点で破骨細胞形成の亢進が起こっていることを確認した。血中及び尿中の酸化ストレスマーカー、炎症性サイトカイン濃度は増加した。また、骨髄細胞において過酸化水素の添加によりTNFaの発現が上昇し、破骨細胞前駆体の割合が増加した。よって、糖尿病による骨脆弱化には、酸化ストレスの上昇およびそれに伴う炎症の増大が大きく寄与することが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
高リュードベリ状態におけるレーザー誘起自然放射増幅過程の研究

NOのE状態の単一振動回転準位(v=0,N_E)をA状態経由で励起すると、E,D状態間には反転分布が成立しASE発振を起こす。この時回転遷移としてはR枝およびP枝が許容であり、D状態ではN_D=N_E±が分布される。R枝およびP枝の遷移強度に大きな差異はなく、見かけ上上記二つのチャンネルの強度はほぼ等しい。いまはN_D=N_E-1をもう一台のレーザーによってあらかじめpopulateしておくと、N_EとN_D=N_E-1の間の反転分布は形成されない。したがってR枝によるASE緩和は禁止される。実験では、実際にR枝がほぼ完全に消失することが確認され、その強度減少分を補うようにP枝の強度が増加した。以上の観測結果は、競合する二つのASE緩和チャンネルのどちらか一方を反転分布を操作することによって封鎖し、populationの移動が制御できることを示すものである。NOのK状態の単一振動回転準位(V=0,N_K)をA状態経由で励起すると、K→EおよびK→Fに相当するASE発振が起こる。波長領域はそれぞれ2.92μmおよび4.46μmある。このときあらかじめ励起レーザー光を二つに分け、二つのセル(シード光発生用セルとメインセル)に入射する。フィルターによってレーザー光を遮断し、石英板によってK→E遷移に対応する2.92μmのみを取り出しシード光としてメインセルに導入する。メインセルからのASEは、シード光を導入しないとき二つの遷移がほぼ同等の強度で観測された。この条件でメインセルにシード光を導入すると、K→Eには変化がなく、K→E遷移のみが増幅された。またK→Eに引き続いて起こるE→D遷移のASEも倍数に増幅されたが、K→F経路のうち一つの経路の寄与のみを選択的に増幅した証拠となる。本研究の結果は、シード光の波長を選択することによってpopulationの流れを操作できる可能性を示唆している。(1) NOの4s,4p,4d,5s,5pRydberg状態をA状態を中間状態とする二段階励起によって量子状態選択的に生成し、自然放射増幅光(ASE)の帰属を行うことによってこれら準位からの放射緩和過程の道筋についての知見を得た。(2) ASE発振がレーザーパルス幅内で完了し、ある準位に集中的に遷移する光学過程であることを利用し、ASEによって緩和した準位を中間状態とする新規なレーザー分光法を開発した。具体的には、基底状態からA状態を経由する二段階励起によってE状態を生成する。E状態は、ASE緩和によって自動的にそのpopulationの一部をD状態に移動する。D状態から第三のレーザーによって高Rydberg状態(6s,7s)への励起を行い、上準位からのASEを解析することにより、前期解離準位からの放射緩和過程の道筋について詳細に検討することができた。(3) ASE発振には反転分布が不可欠であることを利用し、ASE遷移の下準位にpopulationを置くことにより、つまり反転分布をON/OFFすることにより励起状態からの発光を制御する方法を開発した。具体的にはM状態の単一回転単位を二段階励起法によって生成すると、E状態へPおよびR枝でASE緩和する。この際、P枝での行き先準位をあらかじめレーザーによってPopulateしておくと、反転分布が形成されずP枝のみが消失することが予想される。実際、P枝はほぼ完全に消失し、またR枝の強度がP枝の減少を補う程度に増大することが確かめられた。

本実験は、二つの競合するASE遷移のうち一方のみを優先的に起こすことができることを実証している。一酸化窒素の高Rydberg状態からの自然放射増幅光の特牲について詳細に研究した。3dおよびnf(n=4,5,6)Rydberg状態をA状態を中間状態とする二重共鳴法によって励起後、レーザー同軸上に発生する自然放射増幅光(ASE)を赤外領域で分光し、緩和過程、偏光特性、および検出感度などについて考察した。1 3dHH'状態からC,D状態へのASEの回転解析を完了した。またこのASEの偏光特牲を測定した。一方、二重共鳴法によって到達する上準位のanisotoropyを計算したところ、実測値を矛眉なく説明できた。2 4f,5f(v=0)からの主要なASE緩和経路は、それぞれ3d,4d(v=0)Rydberg状態である。6f(v=0)からは5dへの遷移に加えて、5g(v=0)ヘの新しい経路が開けていることがわかった。イオン化限界より上に位置する自動イオン化状態である7f(v=1)からのASEを観測することに成功した。また蛍光量子収率が10^<-3>程度であれば本分光法が応用可能であることが示された。一酸化炭素のB(v=0)からのASEを、同じ波長のASEをシード光として導入することによって増幅することに成功した。二つのセル(メインセルとシードセル)を直列に並べ、それぞれに230nmの紫外レーザー光を集光するとB(v=0)を生成し、A(v=2)および(v=3)へASE緩和する。B-A(0,3)に対応する560nmだけをシードセルから取り出し、メインセル中に導入する。このときB-A(0,2)に対応する520nmの出力光強度には変化がないのに対し、560nmの出力光は約十倍に増幅された。この事実はメインセルが外部信号に対する増幅器として作用し、微弱なシード光によって励起状態間のpopulationの流れを操作できたことに対応している。
自然言語の意味表現のための新しい論理体系の研究

自然言語文の意味表現のための論理的枠組みとして新しく提案した「タプル論理」は、述語論理のように文を述語(真理値関数)と引数(個体)に分けずに、文を数学的に同質な項目の「組」として表現する体系である。これにより、高階風の概念を含むような文の意味を述語論理よりも簡潔に記述できる。今年度の研究では、タプル論理に基く日本語文の具体的な意味表現法を与えると共に、『ある』や『すべて』のような限量表現に対する推論法として、アリストテレスのSyllogism(いわゆる三段論法)を現代的に形式化したLukasiewiczの体系を組み込む方法を研究し、以下の成果を得た。1.タプル論理の枠組みの中で、日本語文の意味を規格化された形式で表現し、推論するための方法として、文タプルと呼ぶ表現法を定めた。2.限量表現に対する推論を述語論理よりも自然な形で行わせるために、Syllogismに基く推論を日本語の文タプルに適用する方法を与えた。3.LukasiewiczによるSyllogism論理式の妥当性判定法を改良して、推論を効率的に実行する方法を与えた。この効率化により、前提命題の個数の線形関数の時間で推論が実行できる。4.古来のSyllogismで扱えるのは、名詞文(述部が『名詞+断定辞』であるような文)だけであり、また基本概念である名辞も単独でしか使用できない。ここではSyllogism体系をより一般的な文に適用できるようにするため、1)『用言文』(述部が用言である文)2)いくつかの名辞の共通概念を表す『連言名辞』(ある種の連体修飾構造に対応する),などへ拡張する方法を考察し、これらの公理的形式化と解釈,および完全性の証明を与えた。5.以上の方法を基礎とする、簡単な日本語質問応答システムを試作した。これは、入力された日本語文(漢字かな混じり文)を文タプルに翻訳し、質問に対して推論を行うシステムである。
増殖刺激とのバランスによる造血細胞の分化・成熟制御機構の解明-白血病の分化誘導療法への臨床応用を踏まえて

造血細胞の分化・成熟が増殖刺激との均衡の上で制御されていることを立証し,その知見を基に白血病細胞の分化誘導療法への検討を行った。造血因子依存性巨核球系細胞株M07eにおいて,Steel Factor(SLF)+thrombopoietin(TPO)との同時刺激により,細胞増殖能を最大限に誘導することで,巨核球系分化抗原の発現がTPO単独刺激に比べて有意に低下した。逆に,低濃度のcyotsine arabinoside(Ara-C)+TPOとの同時添加培養によりTPOによる増殖刺激効果を緩徐に抑えることで,巨核球系への分化・成熟はTPO単独に比べて増強した。同様の現象は,正常マウス骨髄単核球をin vitroで培養した巨核球形成においても再現できた。さらに,マウス急性骨髄性白血病細胞株WEHI-3Bにおいても,G-CSF+Ara-Cとの同時添加培養により,G-CSF単独刺激に比較して顆粒球系への分化・成熟効果の増強が認められた。そこで,実際の急性骨髄性白血病20症例の末梢血ならびに骨髄より白血病細胞を分離し,in vitroにてG-CSF(50ng/ml)または低濃度のAra-C(5-10ng/ml)およびG-CSF+Ara-C同時添加培養を行った。20症例中4例にG-CSFにより増殖刺激効果が得られ,興味深いことに,この4例全例がAra-Cを同時に作用させることで,細胞形態およびCD13,CD33等の分化抗原の発現増強が観察された。以上の一連の結果より,G-CSF,TPO等の細胞系列特異性のサイトカイン刺激に低濃度のAra-Cを組み合わせ細胞増殖をマイルドに抑制する状況をつくり出すことで,白血病細胞の分化・成熟がより効率良く誘導されることが判明した。また,この効果は実際の白血病の分化誘導療法に応用できることが示唆された。今回の研究課題の1年目の目標はほぼ達成されたと考える。血球細胞の分化と成熟が増殖刺激とのバランスの上で制御されていることを立証し,その知見を基に白血病に分化誘導療法の至適条件を確立することが本研究の主眼である。まず,造血因子依存性細胞株MO7eを用いた実験系で,Steel Factor(SLF)+TPOまたはSLF+EPOとの同時刺激により,著しい細胞増殖刺激が得られるのに反して,巨核球系への分化は逆に抑制されることを発見した。また,マウス骨髄細胞の液体培養系においても,SLFとTPOを同時に同時添加により最終的な巨核球産生は増加するものの,巨核球への分化・成熟スピードがTPO単独と比較して有意に遅れ,また,ploidyの増加も遷延することが観察された。一方,低濃度のAra-Cで細胞増殖をmildに抑制すると,TPO単独刺激に比較して,巨核球系の分化がより増強する結果が得られた。全く同様に,顆粒球の系でも,我々は,急性骨髄性白血病(AML)患者由来の芽球に,in vitroでG-CSFと低濃度のAra-Cとを同時に作用させることにより,G-CSF或いはAra-C単独と比較して顆粒球系への分化がより強力に誘導できることが観察し得た。この現象はマウスの白血病細胞株WEHI-3B細胞においても再現された。これらの結果も低濃度のAra-Cにより芽球の増殖を穏やかに抑えることで(高濃度ではアポトーシスを誘導する),G-CSFの増殖と分化のシグナルの内,前者が抑制された結果,相対的に分化刺激が優位となったためと説明できる(投稿準備中)。

以上の結果を踏まえて,次年度は細胞周期ならびに細胞内情報伝達分子の観点から検討を進める予定である。研究課題の2年目の目標はほぼ達成されたと考える。造血細胞の分化と成熟が増殖刺激とのバランスの上で制御されていることを立証し,その知見を基に白血病細胞の分化誘導療法に応用することが本研究の主眼である。一昨年度の研究成果として,造血因子依存性巨核球系細胞株MO7eにおいて,Steel Factor(SLF)+thrombopoie-lin(TPO)との同時刺激により,細胞増殖刺激能を最大限に誘導することで,巨核球系分化抗原の発現がTPO単独刺激に比べて有意に低下した。逆に,低濃度のcyotsine arabinoside(Ara-C)+TPOとの同時添加培養によりTPOによる増殖刺激効果を抑えることで,巨核球系への分化成熟はTPO単独に比べて増強する効果を報告した。この現象は,正常マウスの骨髄単核球をin vitroで培養した巨核球形成においても再現できた。そこで,実際の急性骨髄性白血病20症例の末梢血ならびに骨髄より白血病細胞を分離し,in vitroにてG-CSF(50ng/ml)または低濃度のAra-C(5-10ng/ml)およびG-CSF+Ara-C同時添加培養を行った。20症例中4例にG-CSFにより増殖刺激効果が得られ,興味深いことに,この4例全例が,Ara-Cを同時に作用させることで,細胞形態およびCD13,CD33等の分化抗原の発現増強が観察された。また,マウス白血病細胞株WEHI-3Bにおいても,G-CSF+Ara-Cとの同時添加培養により,G-CSF単独に比較して分化増強効果が認められた。以上の一連の結果より,G-CSF,TPO等の細胞系列特異性のサイトカイン刺激に低濃度の,Ara-Cを組み合わせ,細胞増殖をマイルドに抑制する状況をつくり出すことで,白血病細胞の分化,成熟が効率良く誘導されることが判明した。また,この効果は実際の白血病の分化誘導療法に応用できると考えられる。