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熊本地震において2度の震度7を経験した庁舎建築の被災シミュレーション解析

平成30年度は、解体工事が当該年度に実施されたことから、これに合わせて杭の被災状況を確認するための現地調査を行った。具体的には、杭頭の目視調査の他、杭体6本に対してIT試験(杭の健全性試験)を、2本に対してボアホールカメラによる杭体内部の撮影を行った。この際、各試験方法の結果の妥当性を確認するため、自治体が事前に実施対象とした杭と同じ杭を選定するとともに、1本の杭について、IT試験とボアホールカメラによる2つの調査を行った。その結果、調査した対象杭のほとんどで杭頭、及び地中部で、全断面にわたる大きな損傷があることが分かった。また、両試験方法は、この程度の破壊に至った場合は、同様の結果が推定できることが確認できた。次に、これまでの調査結果や設計図書等を用いて、3次元の地震応答解析モデルを構築し、被災シミュレーション解析を実施することにより、各杭の応答評価を試みた。本研究開始当初は、建設地における地震動が観測されていることが前提であったが、諸般の事情により信頼性がない波形であることが判明したことから、サイトの地震動評価についても検討する必要が生じた。そこで、Kik-net益城の観測記録や当該地点に地盤条件、あるいは益城町役場における地盤調査結果を用いて、益城町役場における地表地震動の推定をまず行い、その結果を用いて、シミュレーション解析を実施した。その結果を震度計の加速度記録や建物・杭の被災状況と比較したところ、未だ大きな乖離があり、解析モデルや入力地震動に、改良すべき課題があることが確認できた。また、非線形動的相互作用効果を考慮して、アウトフレームによる柱と杭の応答結果の違いについて分析したが、今後は建物強度や非線形性が実際の地震時応答に与える影響の程度について検討する予定である。研究対象建物敷地内で観測された地震観測記録が活用できない状況となり、地震動評価がやや難しい状況になったため、被害を十分に説明可能な解析モデル作成にまでは到達出来ていないがその基礎となるモデルは完成したことから(2)と判断した。今後は、被災状況に説明向上を目指して、解析モデルの改良を行う。その後、構築した解析モデルをベースに、当該建物の耐震補強前のモデルを作成し、地震応答解析を実施することにより、耐震補強が上部構造と下部構造の被害に与える影響について明らかにする。当該建物では、耐震診断が実施されており、耐震補強前の状態も再現できることから、このような検討が可能となる。また、4月14日、16日の地震を連続して入力することにより、2度の震度7が当該建物応答に与えた影響についても分析を加える。さらに、軟弱地盤に立地する同種の中低層RC建物は日本全国に存在することから、本研究成果の他地域展開を目的として、ここでは特に南海トラフ地震に着目し、濃尾平野の軟弱地盤に立地する杭基礎建物を想定した地震応答解析を実施して、既往の被害想定では十分に考慮されてこなかった、動的相互作用を考慮した場合に起こりうる被害様相について明らかにする予定である。本研究は、2016年熊本地震における庁舎建物の強震時応答を、被災状況等の詳細な情報や調査結果に基づいた被災シミュレーション解析により明らかにするものである。なお、本建物は、耐震補強後、震度7を2回経験していることから、耐震補強効果や2回の地震動の影響等についても分析を加える。さらに、得られた検討成果を展開し、南海トラフ地震や首都直下地震など、近い将来の発生が危惧される大地震に対する庁舎建物等、同種の中低層RC建物の地盤ー基礎ー建物連成系での被害推定を試みることを目的としている。このため、平成29年度は以下の項目を実施した。(1)建物・周辺地盤関連の資料収集と現地調査分析対象建物に関する設計図書や耐震診断・耐震補強報告書に加えて、被災度判定調査書類を収集し、解析に必要な情報を整理した。また34日かけて、当該建物の被害調査と建物内、及び周辺地盤の常備微動計測を行った。具体的には、周辺地盤のみ、周辺地盤と建物、建物内の3ケースで実施し、地盤、建物の振動特性、及び有効入力動など地盤と建物の動的相互作用についての分析を行った。さらに、周辺地盤において、浅層レーリー波探査を4測実施し、表層地盤の物性を推定した。これらの成果は、被災シミュレーション解析モデルの作成に有効活用する。また、入力地震波の推定のため、KiK-net益城から当該建物を結ぶ測線について、単点の常時微動計測を実施し、2点間の地盤振動特性を把握した。(2)地震応答解析モデルの構築と表層地盤応答評価の準備(1)で収集・整理した情報をもとに、KiK-net益城で観測された地震波から入力地震波を推定するための地盤モデルを構築することを目的として、地盤物性値のパラメータの同定を試みた。これらについては現在継続中である。当初の計画をほぼ達成していることから、おおむね順調と判断した。ただし、活用予定の地震波に疑義が生じたため、これを使わずに解析を行っていくための検討が必要となっている。建物解体終了が今年度となるため、杭の被災調査を今年度実施することにしている。

この際、各試験方法の結果の妥当性を確認するため、自治体が事前に実施対象とした杭と同じ杭を選定するとともに、1本の杭について、IT試験とボアホールカメラによる2つの調査を行った。その結果、調査した対象杭のほとんどで杭頭、及び地中部で、全断面にわたる大きな損傷があることが分かった。また、両試験方法は、この程度の破壊に至った場合は、同様の結果が推定できることが確認できた。次に、これまでの調査結果や設計図書等を用いて、3次元の地震応答解析モデルを構築し、被災シミュレーション解析を実施することにより、各杭の応答評価を試みた。本研究開始当初は、建設地における地震動が観測されていることが前提であったが、諸般の事情により信頼性がない波形であることが判明したことから、サイトの地震動評価についても検討する必要が生じた。そこで、Kik-net益城の観測記録や当該地点に地盤条件、あるいは益城町役場における地盤調査結果を用いて、益城町役場における地表地震動の推定をまず行い、その結果を用いて、シミュレーション解析を実施した。その結果を震度計の加速度記録や建物・杭の被災状況と比較したところ、未だ大きな乖離があり、解析モデルや入力地震動に、改良すべき課題があることが確認できた。また、非線形動的相互作用効果を考慮して、アウトフレームによる柱と杭の応答結果の違いについて分析したが、今後は建物強度や非線形性が実際の地震時応答に与える影響の程度について検討する予定である。研究対象建物敷地内で観測された地震観測記録が活用できない状況となり、地震動評価がやや難しい状況になったため、被害を十分に説明可能な解析モデル作成にまでは到達出来ていないがその基礎となるモデルは完成したことから(2)と判断した。杭の被災調査を今年度実施する。これらの結果を踏まえて、今後、以下を実施する予定である。(2)地震応答解析モデル構築と表層地盤応答評価を継続する。(3)被災シミュレーション解析の実施:(2)の検討結果を基に、解析モデルを改良する。これを用いた解析より、当該建物の被災メカニズムを明らかにする。これを通じて、既往の杭基礎建物に対する被災シミュレーション解析におけるモデル化の妥当性や課題が抽出される。なお、本検討でも被災状況の説明が困難な場合は、(4)構築した解析モデルによるパラメトリックスタディの実施を先送りとし、研究協力者との協働により、3次元有限要素法による解析を実施することも視野に入れる。(4)構築した解析モデルによるパラメトリックスタディ:(3)で構築した解析モデルをベースに、当該建物の耐震補強前のモデルを作成し、地震応答解析を実施することにより、耐震補強が上部構造と下部構造の被害に与える影響について明らかにする。当該建物では、耐震診断が実施されており、耐震補強前の状態も再現できることから、このような検討が可能となる。また、4月14日、16日の地震を連続して入力することにより、2度の震度7が当該建物応答に与えた影響についても分析を加える。
CD163遺伝子欠損マウスを用いたCOPD肺病変部のM2マクロファージ解析

M2マクロファージは慢性炎症の病態に深く関わっていることが知られている。今回、慢性閉塞性肺疾患(COPD)におけるM2マクロファージの役割について検討した。野生型マウスに豚膵臓エラスターゼ(PPE)を気管内投与しCOPDマウスモデルを作製した。PPE投与7日目、14日目、21日目、35日目に肺組織を取り出し、免疫染色を用いて検討したが、浸潤細胞数が少数であり解析できていない。次にCD163遺伝子欠損(KO)マウスを用いて同様の実験を行った。野生型B6マウス及びCD163KOマウスにPPEを投与し、肺組織を採取し検討したが、ほとんど差を認めなかった。まだ少数例の検討であり、実験継続中である。野生型C57BL/6(B6)マウスに各種濃度(0.25U、0.125U、0.0625U)の豚膵臓エラスターゼ(PPE)をマイクロスプレーを用いて気管内投与し肺気腫ができるのを確認した。0.0625Uで十分な肺気腫ができるのを確認したため、以降、この濃度で実験を行った。B6マウスに生理的食塩水あるいはPPEを気管内投与し、7日目、14日目、21日目、35日目で肺を摘出した。マクロファージのフェノタイプを見るためlba1、CD163にて免疫染色を行った。現在、病理学的に気腫化を定量化し、また併せてマクロファージの数や、CD163陽性マクロファージの割合などを評価している。これにより気腫化の各段階におけるマクロファージのフェノタイプやその役割について明らかにしようと考えている。また野生型マウス及びCD163遺伝子欠損マウスにPPEを投与し21日目に肺の摘出を行った。現在気腫化の程度を定量化を行っている。野生型マウスとCD163遺伝子欠損マウスで騎手化の程度に差があるかを評価していく。マウスの週数により実験計画を立てる必要があるが、スケジュールの都合がつかないことがあるため。野生型C57BL/6(B6)マウスに0.0625Uの豚膵臓エラスターゼ(PPE)をマイクロスプレーを用いて気管内投与し肺気腫ができるのを確認した。B6マウスに生理的食塩水あるいは0.0625UのPPEを気管内投与し、7日目、14日目、21日目、35日目に肺を摘出した。急性期から慢性期にかけてのマクロファージのフェノタイプの動向を見るために、各時系列においてM2マクロファージの表面マーカーであるCD163で免疫染色を行った。PPE投与で肺気腫はできていたが、肺胞マクロファージの数が少なかったためか、各時系列で肺胞マクロファージの数やCD163陽性細胞の割合に有意な違いは認めなかった。以前の検討では肺胞マクロファージを多数認めたことから、PPEの容量変更や手技の再確認が必要と思われた。M2様マクロファージは慢性炎症においてアポトーシス細胞貪食能の低下やVEGFなどの組織修復因子産生の低下などが報告されている。COPDの肺局所において、このようなM2様マクロファージが増加することで炎症の遷延、組織修復の抑制に関与している可能性が考えられた。そこでCD163遺伝子欠損マウスを用いて、PPE投与での肺気腫の程度を検討した。B6マウス及びCD163遺伝子欠損マウスにPPEを気管内投与し21日目に肺を摘出した。気腫化の程度を肺胞間距離を測定し客観的に検討しているが、まだ症例数が少なく統計学的な検討まで至っていない。もう少し数を増やして検討する必要があると思われる。経時的に採取した肺組織について、気腫化の定量化及びマクロファージの数、CD163陽性マクロファージの割合などを評価する。野生型マウスにPPEを投与したモデルについて肺組織の炎症性サイトカインやキチナーゼ様蛋白の免疫染色及び気管支肺胞洗浄液のフローサイトメトリーや炎症性サイトカインの測定を行い、マクロファージの機能を評価する。また野生型及びCD163欠損マウスにPPEを気管内投与し採取した肺組織において気腫化の程度を定量化し比較する。また同肺組織を用いて上記の免疫染色を行い、マクロファージの機能を検討する。同プロトコールを用いて気管支肺胞洗浄を行い評価する。呼吸器学会への参加ができなかったため。本年度は学会への参加を計画している。またマウス実験の追加のため、マウス購入資金や免疫染色やフローサイトメトリーのための抗体の購入を検討している。
内耳発生におけるSIX1遺伝子とSLC26A4遺伝子の相互作用

本研究の目的は,前庭水管拡大症の原因として知られているSLC26A4遺伝子とSIX1遺伝子の関連を調べることにより,前庭水管拡大症発症の詳細なメカニズムを究明することにある。このために,SIX1遣伝子とSLC24A遺伝子の相互作用についてノックアウトマウスを用いて内耳での発現を中心に聴覚の評価と免疫学的考察および内耳形態学的考察を試みる。まず,類似したphenotypeを呈するSIX1遺伝子とSLC26A4遺伝子間のprotein-protein interactionの存在を確認する。その際,どちらの遺伝子がより上流から他方の遺伝子の発現を制御しているかを検討する。本年度(平成20年3月30日)の研究実施計画は,内耳内のPendrinの局在についての確認を計画した。まず,老人医療センター病理部とともに剖検で得たヒト側頭骨をもちいて,Pendr加の内耳局在を調べた。剖検時に採取した側頭骨を20%ホルマリシで固定し,中性EDTA液で脱灰し,パラフィン包埋切片を作成した。切片を免疫染色を施行。使用した抗体はPendrinの他,内耳内外有毛細胞の細胞内に局在するPrestin,その他内耳に広く存在するNa-K-ATPaseα-1サブユニット,NeuroNamentを用いた。染色の結果,Prestinはヒト外有毛細胞に強い染色を認めた。Na、K'ATPaseα、1サブユニットは血管条に染色を認め,Neurofilamentは神経線維およびコルチ器内の有毛細胞神経末端にも染色を確認した。Pendrin似ついての結果は次年度に報告予定である。研究の目的は、前庭水管拡大症の原因として知られているSLC26A4遺伝子とSIX1遺伝子の関連を調べることにより、前庭水管拡大症発症の詳細なメカニズムを究明することにある。このために、SIX1遺伝子とSLC24A遺伝子の相互作用についてノックアウトマウスを用いて内耳での発現を中心に聴覚の評価と免疫学的考察および内耳形態学的考察を試みる。まず、類似したphenotypeを呈するSIX1遺伝子とSLC26A4遺伝子間のprotein-protein interactionの存在を確認する。その際、どちらの遺伝子がより上流から他方の遺伝子の発現を制御しているかを検討する。〓年度(平成19年3月31日)の研究実施計画は、SIX1遺伝子のノックアウトマウスにおいて、SLC26A4遺伝子によって発現する蛋白であるPendrinの発現を、免疫染色法により走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。同様に、SLC26A4遺伝子のノックアウトマウスにおいて、Six1の発現を観察する。Pendrinに対する抗体でwild typeのマウスで過去の報告(Royauxら、JARO 2003)の追試を行う。すなわち、蝸牛のコルチ器外側部位、内リンパ管、内リンパ嚢のsurface preparationで、Pendrinの発現を確認する。Six1に対する抗体も使用し同様に発現を観察する。また、コントロールとしてPrestinを用いた。Prestinは蝸牛内の有毛細胞に発現し非症候群性遺伝性難聴の原因蛋白と考えられている蛋白である。免疫染色法により走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した結果、Prestinの染色は確認できたものの、Pendrinの明らかな染色は確認できなかった。原因として、1次抗体の質が考えられ、今後はすでに内耳〓染色が確認されている米国立衛生研究所聴覚部門で作成した抗Pendrin抗体の譲渡を受けることを予定し、染色を確認する。また、Six1に関しても同様に染色を行う予定である。
日本における最終氷期と後氷期の古環境変遷に関する研究

1.奥羽山脈南部の会津駒ケ岳山頂と鶏頂山枯木沼湿原をボ-リング調査し、ヒラ-型および、シンウォ-ル型サンプラ-で乱されていないボ-リングコアを採取した。また、このコアには何枚かの広域テフラが含まれており、調査地域ので泥炭層の年代決定および対比をより詳細に行うことができるものと思われる。したがって前年度の調査のボ-リングコアと合わせて、最終氷期の約3万年以降の東北地方の古植生の変遷を連続的に明らかにすることができると考えられる。2.聖岳北方高野付近において、後期更新世に堆積盆地内に形成されたと考えられる沼沢地性の堆積物の調査を行った。この堆積物中には、下位から、Dpm、KーTz、潟町軽石、EPm、ATなどの示標テフラが認められ、これらの示標テフラによって、泥炭質堆積物が最終間氷期後半から最終氷期末にかけての連続した堆積物であることが明確になった。これらの試料について、花粉分析を行ない、後期更新世における中部日本の古植生を復元し気候変化を解明するための作業を継続中である。3.立山では、昨年度に引き続いて、室堂平周辺一帯で、最終氷期の氷河堆積物の分布と、それを直接覆う立山火山第3期火砕流堆積物、および氷河堆積物に覆われた同火山第2期火砕流堆積物の層序関係を調査した。その結果、氷河堆積物が室堂平と称名川の谷をへだてた大日尾根にも分布していることが明らかになった。これまで知られているより古いと見られる氷河堆積物が新たに発見され、その時代について現在検討中である。
三叉神経損傷による神経因性疼痛発症メカニズムの研究

三叉神経の末梢神経は痛みの認識に関連する侵害情報を三叉神経系の吻側亜核と尾側亜核に伝達する。末梢神経切断により、吻側亜核の神経細胞は非侵害性の刺激に対しても痛み刺激に対すると同様の反応を示すようになる。一方尾側亜核や脊髄後角では末梢神経切断によって、侵害刺激に反応する神経細胞の数が増加する。末梢神経系にアデノシンA1受容体のアゴニストを投与すると、脊髄後角の神経細胞の過剰反応と神経障害性の痛覚過敏が抑制される。三叉神経知覚核群のうち脊髄路核尾側亜核では、末梢神経損傷後に2次ニューロンの興奮性が変化し、神経因性疼痛の発症に関与する可能性が示唆されている。一方、三叉神経の他の部位においては、末梢神経損傷後にどのような変化が起こっているかはほとんど知られていない。今年度の研究は、舌神経もしくは下歯槽神経損傷後、舌神経に電気刺激を加え、c-Fosタンパクの免疫活性の発現を指標に三叉神経知覚核群各部のニューロンの興奮性の変化を調べたものである。舌神経損傷後に同神経に電気刺激を行うと、非損傷群と比較して、三叉神経脊髄路核の吻側亜核においてc-Fos陽性細胞数が有意に増加した。一方、下歯槽神経損傷後に舌神経に電気刺激を行うと、非損傷群と比較して、三叉神経脊髄路核の尾側亜核においてc-Fos陽性細胞数が有意に増加した。また舌神経切断後の吻側亜核におけるc-Fos応答の増強は、有髄神経線維のみを興奮させるとされる弱い刺激(0.1mA)に対応するものであったが、下歯槽神経切断後の尾側亜核でのc-Fos応答の増強は無髄神経線維をも興奮させる強い刺激(10mA)に対応するものであった。また、中位亜核や主知覚核では、神経切断の有無にかかわらず陽性細胞はほとんどみられなかった。以上の結果は、神経損傷後の神経因性疼痛の発症において、三叉神経系の侵害情報の1次中継核として知られる尾側亜核のみならず、吻側亜核のニューロンの興奮性の変化が重要な役割を果たしていることを示唆するものであり、これらふたつの部位が異なる種類の刺激に対して異常な興奮を起こすことを示している。脛骨神経切断により、ラット後肢足部の部分的除神経を行った。3日後に足部に侵害性熱刺激を加え、2時間後に第5腰髄の組織切片にc-Fosタンパクの免疫組織化学染色を施すと、正常ラットの刺激と比較して後角表層に誘発されるc-Fos陽性ニューロンの数が減少した。切断2週間後に同様の刺激を行うと、3日後と比較してc-Fos陽性ニューロンの数が大幅に増加したことから、この時期には脊髄後角の侵害受容2次ニューロンが、総腓骨神経を経由する侵害情報に対し、c-Fosの過剰応答を現すことが示された。切断2週間後、刺激の直前に腓骨頭付近の皮下にCCPA溶液を投与した場合、後角2次ニューロンにおけるc-Fosの誘発が有意に抑制された。この効果が生理食塩水投与によって得られなかったことから、CCPAはその生理活性によってc-Fosの過剰応答を抑制したと考えられる。またこの効果はCCPA投与側にみられたものであり、血行を介しての全身的な拡散によるものではなく、CCPA投与部位付近の局所的な作用によるものと考えられる。本研究でCCPAの皮下注射を行った腓骨頭の前下方は、後肢足部皮膚を支配領域に含む総腓骨神経が皮下の浅層を通過する部位に相当するため、CCPAは総腓骨神経に含まれる1次侵害受容ニューロンの興奮性を低下させることによって、侵害性熱刺激に対する応答を抑制したものと推測された。前年度の成果として、ラットの脛骨神経を切断して後肢足部からの侵害情報伝達を総腓骨神経と伏在神経によるものに制限すると、1切断2週間後に切断側の後肢足部への侵害性熱刺激によって脊髄後角内の2次ニューロンにc-Fosタンパクの過剰誘発が起こること、および2総腓骨神経の通過部位である腓骨頭付近の皮下にアデノシンA1受容体のアゴニストであるchlorocyclic pentyladenosine (CCPA)を投与することによってc-Fosの過剰応答が抑制されることを明らかにした。平成24年度には、年度計画に従ってこの研究にデータを追加すること以外に、同実験系で後肢足部への刺激によって誘発される痛覚関連行動の分析を行った。von Frey hairを用いた機械的刺激に対する逃避行動の誘発閾値は脛骨神経切断により上昇したが、切断2週間後には切断前の値を下回るまでに低下した。また侵害性の輻射熱刺激に対する逃避行動の潜時も同様に一過性の延長と、2週間後の短縮がみられた。

このモデルに対してc-Fosの誘発実験と同様の方法でCCPAを投与したところ、機械的刺激に対する反応にはなんら影響がみられなかったが、侵害性熱刺激に対する逃避行動の潜時は切断2週間後にCCPA投与側に反対側と比較して有意の短縮が認められた。以上の結果を総合すると、1脛骨神経切断後のc-Fosの過剰応答が神経障害性疼痛を反映するものであること、および2同神経切断後の熱刺激に対する痛覚過敏が末梢神経系のアデノシンA1受容体の活性化によって抑制されることが示唆される。現在印刷中であるため、2011年度の論文発表には記載しないが、2010年度に実施した研究の成果のとりまとめが完了し、すでに学術論文として受理された。一方、脛骨神経の切断実験を行った結果、三叉神経系の神経損傷による三叉神経尾側亜核での変化に類似した結果がえられたため、CCPAの効果を検証するために適切な動物実験モデルを確立することができた。また、このモデルを用いてCCPA投与の実験を開始することができ、その結果、CCPAが脊髄後角でのc-Fosの過剰応答を抑制する傾向が確認された。24年度が最終年度であるため、記入しない。脛骨神経切断後のCCPA投与が脊髄後角でのc-Fosの過剰応答を抑制するとの、今年度の予備実験に対し、実験例数の追加を行う。また、この実験に対する種々の対照実験を行う。また、これらの結果を取りまとめ、公表する。計画の遂行にあたって大きな障碍はなく、研究計画の大幅な変更はない。
自己組織化二分子膜における電子－プロトン相関物性の探求

分子間のプロトン移動は、プロトンのドナー分子/アクセプター分子の双方の電子状態に大きな変化を与える。本研究では、自己組織化的に成膜可能な異種二分子膜において、分子膜間に電場を印加し、プロトン移動を能動的に誘起することに挑戦する。これによって、電子ープロトン相関物性の制御に向けた物理化学的な理解を深め、「プロトン移動を誘起するための要素」と「プロトン移動に伴う分子の物性変化」の解明を行なう。
人の体型を考慮したＣＴ診断時臓器線量の個人差を評価できるＷＥＢシステムの開発

CT診断からの臓器線量計算を行うWebシステムWAZA-ARIにおいて、年齢と体型の個人差を考慮できるシステムに拡張したWAZA-ARI 2を開発した。未成年はフロリダ大学で開発した年齢別ファントムを用いた。成人体型の違いを計算するために、日本人の標準体型からBMIで2倍の標準偏差だけ外れるやせ型、2倍と5倍の標準偏差だけ外れる肥満型のファントムを皮下軟組織のみを変形することでファントムを構築した。また、実際の臨床で得られたCT画像をもとにボクセルファントムを構築し、臓器線量の個人差を実際の体型ごとに計算し、体型と臓器線量の関係を導いた。有効直径が体格の指数として利用できることがわかった。(1)体型の異なる患者のCT画像データからボクセルファントムを作成し、PHITSコードを用いたシミュレーション計算を実施した。BMIで18.5から30.3の体型を対象にした。この結果から、体型が大きくなることで標準体型に比べて臓器線量が低くなる。この傾向を定量的に把握するために、体型を患者の胸部有効直径をAP長とLAT長から計算し、臓器線量との関係式を求め、WAZA-ARI2に組み込んだ。(2)ポリゴン技術を用いて日本人成人男女ファントムをスケーリングによって任意の体型をもったボクセルファントムを構築する方法を昨年までに整備してきたが、この手法と臨床での患者体型調査結果を基礎にした成人体型モデルの類型化を行い、標準体型以外に、標準体型から2σ、5σ、-2σの離れたボクセルファントムを男女別に構築した。これらのボクセルファントムでPHITSコードを用いたシミュレーション計算を実施し、臓器線量係数のデータベースを作成した。(3)WAZA-ARIを改良し、体型の異なるファントムを組込み、CT検査からの体型ごとの臓器線量を計算できるシステムに変更した(WAZA-ARI2)。WAZA-ARI2は、あらかじめ用意した体型のファントムの選択と、標準体型からの胸部有効直径の違いを利用した臓器線量の間接的推定を行うことのできるWeb計算システムに発展した。本研究の成果は、臨床現場でのCT検査に伴う線量計算をWeb上で簡単に行うことのできるシステムを構築することができた。(1)体型の異なる患者のCT画像データから作成したボクセルファントムによるモンテカルロシミュレーションを詳細に再解析を行った。臓器体積は、体型(周囲長、身長、体重など)との関係なく、個人差としてバラツキをもっていた。個人差は胆嚢の変動係数が51.2%と大きく、その他の臓器は30%以下であった。単位mAsあたりの臓器線量と周囲長との関係は負の傾きの直線関係にあった。標準日本人のボクセルファントムで計算される臓器線量と被験者の周囲長データを用いて推定される体型の異なる被験者の臓器線量は、肝臓と膀胱は20%を超える差を認めたが、その他の臓器では10%以内の誤差で推定できることがわかった。(2)平均的体型と異なる成人患者のボクセルファントムのモデルを構築し、線量係数(管電流当たりの臓器線量)のデータ整備を行った。評価した線量係数は、平均値ー2σの体型の男性患者モデルにおける膀胱線量はJM-103と比較して約9%高く、平均値+5σの体型では、JM-103と比較して約33%低い。女性モデルを用いた計算においても、体型に依存した膀胱線量の変動が見られた。生殖腺については、女性の卵巣は体内の比較的深い位置にあるため、その線量は膀胱のケースと同様に体型に依存した変動が確認され、JF-103による解析値と比較して、平均値ー2σの体型の患者モデルでは約8%高く、平均値+5σの患者モデルでは約36%低くなった。一方、男性の生殖腺である精巣は、体表面に存在するため、体型による線量の変動は小さく、JM-103と比較しても平均値+5σの患者モデルでは約12%の減少であった。(3)WAZA-ARI2は、英語版を基本として、体型および年齢(フロリダ大学で開発された年齢別(0才、1才、5才、10才、15才)の患者モデル)の異なる患者のCT検査からの線量を評価するWebシステムとして構築した。(1)CT診断の対象となる患者の体型に関する実態調査臨床でのCT画像データから、AP長、LAT長、胴体周囲長などの体型データを採取した。この体型データをパターン化するために、CT画像データから胴体の周囲長の計測、臓器の面積および体積の計測、ボクセルファントム用データ出力できる体格調査プログラムを作成した。ボクセルファントムを用いて、PHITSコードを用いたモンテカルロシミュレーションにより計算を行い、患者の臓器線量の推定を行うコード整備を行った。このコードの計算結果をもとに、X線CT診断によって体型に違いが臓器線量にどの程度で影響するかを把握するためのシミュレーションを行った。

(2)体型調査を基礎にした任意の成人モデル化に関する研究開発身長、体重、体格指標(BMI)に応じた各部位(頭部、胴体、四肢)の相対的な大きさの違いを正確に把握する手法として、ポリゴン技術に用いて日本人成人男女ファントムをスケーリングによって任意の体格のボクセルファントムを構築する方法を整備した。成人日本人の体格は、JIS規格及び人間生活工学研究センターのデータの範囲を評価可能になるよう検討した。体格変形手法として、指定したチェスト、ウエスト、ヒップのサイズを担保した体格変形モデルを試作した。オリジナルモデルのチェスト、ウエスト、ヒップと胴体の周囲長を実寸単位に変換し、チェスト、ウエスト、ヒップの値を指定して任意の体格を記述して、オリジナルモデルからの周囲長の変動率を評価した。限られた時間内で複数のモデルを作成・利用可能にするために、ファントム作成用プロシージャの作成を行った。臨床の患者体型データの統計分析を基礎にした体型の異なるボクセルファントムの開発と、標準体型の異なる体型を持った患者に対する線量推定法の両者の結果をWAZA-ARI2に反映することができた。(1)CT診断の対象となる患者の体型に関する実態調査は、臨床データを取得し分析を予定通り行っている。(2)体型調査を基礎にした任意の成人モデル化に関する研究開発は、体格変形手法の検討が終わり、任意の体型をモデル化することができる段階である。順調に進展している。Webシステム(WAZA-ARI2)が構築できたので、このシステムでの計算を実施し、臨床での検証を行っていく。これによって、改良点や今後の研究課題を明らかにしていく必要がある。任意の体格をもつボクセルファントムの作成が可能なところまできているので、今後は、臨床データから得た画像をもとにシミュレーションを行い、臓器線量の違いを分析していく予定である。皮下脂肪の増減および内蔵脂肪の付加による体格変形に対応できるようにするために、臓器組織および内容物質量の変化を考慮した体格処理方法の検討を進める。一方で、成人の体格のパターン化を経て、Webシステム(WAZA-ARI)に組み込むための設計を行い、そのWebプログラムを作成する予定である。共同研究者が集まって会議を行うための旅費が中心であり、各担当が最終年度としてシステムの検証を行う。24年度は、Webシステム(WAZA-ARI)に組み込むためのWebプログラムを作成を計画しているため、予定としている予算では不足する事態を想定して、23年度の予算を節約し24年度の予算にまわすことを行った。
Th1免疫応答におけるMTK1活性制御機構の解明と自己免疫疾患治療への応用

p38MAPK情報伝達系は免疫応答の制御に不可欠なシグナル伝達システムであることが知られている。我々はこれまでに、p38経路の主要なMAPKKKであるMTK1を単離し、さらにMTK1の制御領域に結合して活性化因子として機能するGADD45関連分子を同定してきた。本研究ではさらに、MTK1遺伝子欠損マウスを作成しGADD45-MTK1経路がTh1細胞からのIFN-γ産生に極めて重要なシグナル伝達システムであることを明らかにした。次に、GADD45分子によるMTK1活性化機構の詳細を解明するため、まずGADD45β分子全体に渡って約10アミノ酸ずつの欠失を有する系統的な変異体を作製した。これらの変異型GADD45β遺伝子をそれぞれ細胞に導入して生化学的解析を行い、GADD45β分子内でMTK1との結合に必要な領域、及びMTK1活性化に必須のアミノ酸残基を同定した。次に、アラニン置換変異体を作成して詳細な解析を行い、MTK1との結合能は保たれているものの、MTK1活性化能を喪失した変異体を得た。このような変異型GADD45β分子を細胞内に強制発現させると、ドミナント・ネガティブに作用し、正常のGADD45関連分子によるMTK1の活性化が有意に抑制されることを見出した。一方、MTK1側の機能ドメインの解析も並行して行い、GADD45結合ドメイン、自己抑制ドメイン、多量体化ドメイン、及び活性化に必須の自己リン酸化サイトをそれぞれ同定した。以上の解析の結果、GADD45関連分子によるMTK1活性化機構として、GADD45分子がMTK1に結合すると、MTK1分子内の制御ドメインとキナーゼドメイン間の抑制的相互作用が解除され、その結果、MTK1分子同士の多量体化が誘導されること、さらにキナーゼドメイン内の自己リン酸化が起きてMTK1のキナーゼ活性が亢進することを明らかにした。ストレス応答p38MAPK情報伝達系は免疫応答を制御する極めて重要なシグナル伝達システムであるが、その制御機構の詳細には不明な点が多い。我々はこれまでに、ヒトp38経路の主要なMAPKKKであるMTK1を単離し、さらにMTK1の制御領域に結合し、活性化因子として機能するGADD45関連分子を同定してきた。最近、GADD45-MTK1-p38を介するシグナル伝達システムがTh1細胞からのIFN-γ産生に必須であることが明らかにされている。本研究において、我々はストレス応答シグナル伝達におけるGADD45の機能ドメインを解明するため、GADD45分子全体に渡る系統的な欠失変異体を作製し、これらの変異型GADD45遺伝子を細胞に導入してMTK1との結合能およびMTK1活性化能を検討した。その結果、MTK1結合能を喪失したGADD45変異体はすべてMTK1活性化能をも失っていたが、興味深いことにMTK1への結合力は保ちながらMTK1活性化能のみを喪失した変異体が得られた。このような変異体の詳細な解析を行い、GADD45分子内でMTK1活性化に必須のアミノ酸を同定した。また、これらの変異型GADD45分子を細胞内に強制発現させると、ドミナントネガティブに機能し、正常のGADD45によるp38経路の活性化が強く抑制されることを見出した。以上の結果から、変異型GADD45分子を利用することで、Th1免疫応答を制御することが可能であると考えられた。また、TGFβによるp38経路の活性化にもGADD45β-MTK1経路が必須であることを明らかにした。さらにMTK1に結合する分子の同定を行い、MTK1のキナーゼドメインに特異的に結合する幾つかの分子を単離した。ストレス応答p38MAPK情報伝達系は免疫応答の制御に不可欠なシグナル伝達システムであるが、その制御機構の詳細には不明な点が多い。本研究において我々は、GADD45分子全体に渡る系統的な欠失変異体を作製し、ストレス応答シグナル伝達におけるGADD45の機能ドメインの解明を試みた。その結果、GADD45分子内でMTK1活性化に必須のアミノ酸モチーフを同定した。また、このアミノ酸モチーフに変異を持つGADD45分子を細胞内に強制発現させると、ドミナントネガティブに機能し、正常のGADD45によるp38経路の活性化が強く抑制されることを見出した。また、MTK1ノックアウトマウスを作製し、GADD45-MTK1経路がTh1細胞からのIFN-γ産生に必須であることを明らかにした。さらに、MTK1の酵母ホモログであるSSK2とMAPKK(PBS2)、の特異的な分子間結合を規定するドッキングドメインを同定した。我々はこれまでに、p38経路の主要なMAPKKKであるMTK1を単離し、さらにMTK1の制御領域に結合して活性化因子として機能するGADD45

関連分子を同定してきた。本研究ではさらに、MTK1遺伝子欠損マウスを作成しGADD45-MTK1経路がTh1細胞からのIFN-γ産生に極めて重要なシグナル伝達システムであることを明らかにした。次に、GADD45分子によるMTK1活性化機構の詳細を解明するため、まずGADD45β分子全体に渡って約10アミノ酸ずつの欠失を有する系統的な変異体を作製した。これらの変異型GADD45β遺伝子をそれぞれ細胞に導入して生化学的解析を行い、GADD45β分子内でMTK1との結合に必要な領域、及びMTK1活性化に必須のアミノ酸残基を同定した。次に、アラニン置換変異体を作成して詳細な解析を行い、MTK1との結合能は保たれているものの、MTK1活性化能を喪失した変異体を得た。このような変異型GADD45β分子を細胞内に強制発現させると、ドミナント・ネガティブに作用し、正常のGADD45関連分子によるMTK1の活性化が有意に抑制されることを見出した。一方、MTK1側の機能ドメインの解析も並行して行い、GADD45結合ドメイン、自己抑制ドメイン、多量体化ドメイン、及び活性化に必須の自己リン酸化サイトをそれぞれ同定した。以上の解析の結果、GADD45関連分子によるMTK1活性化機構として、GADD45分子がMTK1に結合すると、MTK1分子内の制御ドメインとキナーゼドメイン間の抑制的相互作用が解除され、その結果、MTK1分子同士の多量体化が誘導されること、さらにキナーゼドメイン内の自己リン酸化が起きてMTK1のキナーゼ活性が亢進することを明らかにした。
遺伝子・環境因子からの尿路結石症予防の研究-メタボリックシンドロームとの関連-

私たちの最近の研究から、尿路結石症はメタボリックシンドロームの発症機序と似ていることがわかってきた。そこで、本研究ではその観点からみた尿路結石症予防法の確立をめざし、遺伝因子と環境因子の両面から基礎研究を行った。遺伝因子の研究として、OPN遺伝子のSNPs解析を行い、その結果と患者の背景・結石成分を比較し、再発リスクマーカーとなり得るSNPsを見つけ出した。環境因子の研究として、ストレス感受性シグナルであるNFκB,が増加し、ミトコンドリアが酸化ストレスにより傷害を受けたことを確認した。私達はこれまでに、尿路結石形成において、オステオポンチン(OPN)などの結石関連物質の相互作用をしているかを調べる目的で、結石モデルマウス、OPNノックアウトマウス、OPN上流領域配列組み込みトランスジェニックマウスを用い、結石を形成させ、DNAマイクロアレイ解析を用い、結石形成時の発現遺伝子群と転写因子を同定し、各遺伝子の機能解析をRNA interference (RNAi)を用いて行った。これらの同定した結石患者に特異的なexon7にSNPsをもつOPN遺伝子を結石モデルマウスの腎尿細管細胞にOPN遺伝子導入し、OPN遺伝子の発現様式、OPN蛋白の細胞内局在、蓚酸による細胞障害作用および結石抑制効果を調べた。すでにラット腎尿細管細胞への遺伝子導入法を開発している。これらの成果をもとに、結石モデルラットを用いた動物実験で遺伝子治療を開始する。遺伝子治療の効率と安全性についても確認した。またOPNのプロモーター領域で発見した結石患者に特異的なhaplotype遺伝子をクローニングし、蓚酸カルシウム結晶接着によるOPN発現のプロモーター活性を調べた。OPN以外の結石関連蛋白遺伝子のSNPs解析をし、SNPsの結果を患者の背景(家族歴、食生活など)、結石成分を比較し、再発リスクマーカーとなり得るSNPsを見つけ出した。本研究ではこれらSNPsを用い、結石形成の危険度を予知するゲノムスクリーニング検査を開発しゲノム創薬に結びつけた。私達はこれまでに、尿路結石形成において、オステオポンチン(OPN)などの結石関連物質の相互作用をしているかを調べる目的で、結石モデルマウス、OPNノックアウトマウス、OPN上流領域配列組み込みトランスジェニックマウスを用い、結石を形成させ、DNAマイクロアレイ解析を用い、結石形成時の発現遺伝子群と転写因子を同定し、各遺伝子の機能解析をRNA interference(RNAi)を用いて行った。私達はこれまでに、尿路結石形成においてオステオポンチン(OPN)などの結石関連物質の相互作用をしているかを調べる目的で、結石モデルマウス、OPNノックアウトマウス、OPN上流領域配列組み込みトランスジェニックマウスを用い、結石を形成させ、DNAマイクロアレイ解析を用い、結石形成時の発現遺伝子群と転写因子を同定し、各遺伝子の機能解析をRNA interference(RNAi)を用いて行った。
パターン認識分子フィコリンの自然免疫における役割

フィコリン(Ficolin)の生理的役割を明らかにするために、フィコリン欠損マウスを作製し、細菌感染に対する抵抗性などの表現型を解析した。その結果、フィコリンAは、セリンプロテアーゼMASPと複合体を形成し、補体レクチン経路を活性化して、細菌など非自己の補体によるオプソニン化とその排除に寄与していることが明らかになった。とくに、肺炎の主な原因細菌である肺炎球菌の感染防御に関してはフィコリンが中心的役割を持つことが判明した。自然免疫における自己と非自己の識別は、細菌やウィルスの表面の特異的な分子パターンを認識することによる。フィコリン(Ficolin)は、マンノース結合レクチン(MBL)と同様に、微生物表面の分子パターンを認識し、補体レクチン経路を活性化して、生体防御に働くと考えられている。本研究は、フィコリン欠損マウスを作成し、その表現型解析と再構成実験から、生体内におけるフィコリンの真の標的とその作用機序を明らかにすることを目的としている。本年度は、以下の点を明らかにした。(1)血清型フィコリン(フィコリンA)欠損マウスは、フィコリンA/MASP/sMAP複合体の不形成のために、フィコリンAを介するレクチン経路の活性が低下していた。その血清に組換えフィコリンAを添加することにより、フィコリンA/MASP/sMAP複合体が再構築され活性が回復しとことより、フィコリンAは補体レクチン経路を介して働くことが示された。(2)フィコリンA欠損マウスの生体防御能力を調べるために、マウス全血に細菌(Staphylococcus aureus)を加え、細菌の増殖速度を測定した。その結果、フィコリン欠損マウスは、有意にその抑制活性が低下しており、組換えフィコリンAの添加により、抑制活性は回復することがわかった。フィコリンAの細菌に対する防御作用が明らかになった。(3)一方、フィコリンBはレクチン経路を介さず、強い細菌凝集作用によってマクロファージによる食食を増強することが明らかになった。以上から、フィコリンAはレクチン経路を介して作用し、フィコリンBは原始的な凝集によって作用することが判明し、フィコリンは二つの異なるルートで細菌感染防御に働くことが明らかになった。一方で、生体防御の1つである血液凝固にもフィコリンが関連することを示唆するデータが得られており、解析を進めている。また、フィコリンが胚発生の初期から産生されているデータを以前に得ており、これに関連して、フィコリンA欠損マウスおよびフィコリンB欠損マウスの組織の解析を進めている。フィコリン(Ficolin)は動物レクチンであり、異物表面の糖鎖のパターンを認識することによって生体防御に働くと考えられている。(1)フィコリンは、セリンプロテアーゼMASPと複合体を形成し補体レクチン経路を介して補体系を活性化するが、この作用はフィブリノーゲンあるいはフィブリンの共存によって亢進することが判明した。また、細菌表面へのC3b沈着も亢進し、補体レクチン経路を介するフィコリンの作用が、凝固系と深く関連していることを明らかになった。(2)昨年度、フィコリンA欠損マウスの表現について補体レクチン経路の低下や細菌に対する増殖抑制能の低下などを明らかにした。本年度は、フィコリンB欠損マウスの表現型解析を進めてきたが、骨髄を含む各種組織、末梢血の血球数および血液像に明らかな異常は見いだされなかった。一方、骨髄から得られる微量のフィコリンBが解析できるようになり、その構造を明らかにした。これまで、フィコリンBのリコンビナントは昆虫細胞で作成したものを用いてきたが、天然のフィコリンBの性質と異なることが判明した。CHO細胞で作成したリコンビナントを解析した結果、他のフィコリン同様、フィコリンBの作用も補体レクチン経路を介する可能性が示された。(3)フィコリンAとフィコリンBの遺伝子はごく近い位置に存在し、2つの遺伝子間での組換えは極めてまれであるが、ヘテロマウス同士の繰り返しの交配によりダブルヘテロマウスが得られ、フィコリンA/Bダブル欠損マウスの作成に成功した。次年度は、その表現を解析する。フィコリンは、フィブリノーゲン様ドメインを機能ドメインとするレクチンであり、細菌などの表面糖鎖を認識して生体防御に働くと考えられている。本研究は、フィコリン欠損マウスの表現型を解析して、フィコリンの生理学的役割を明らかにすることを目的としている。本年度は以下の点を明らかにした。(1)フィコリンB欠損マウスは、レクチン経路は正常であり、組織にもはっきりした異常は見られなかった。

また、末梢血の血液像や血球数にも異常はみられなかった。現在、骨髄に存在する天然フィコリンBの解析と昆虫細胞で作製したリコンビナントフィコリンBの解析を進めている。(2)フィコリンA/Bダブル欠損マウスは、組織に異常は見られなかったが、フィコリンA欠損マウスと同様に、フィコリンAを介するレクチン経路が欠損しており、C4活性化で測定した補体活性化能が有意に低下していた。リコンビナントフィコリンAの添加により活性は回復した。フィコリンA/Bダブル欠損マウスでは、レクチン経路の活性低下、とくにC3bによるオプソニン化の低下に伴い、血中におけるS. aureusの増殖阻止能力が減弱していた。これらの結果は、これまでのフィコリンA欠損マウスの解析結果とともに、血液中でフィコリンAがレクチン経路を介して,感染防御に働いていることを示している。
C型慢性肝炎活動化とT細胞免疫応答

「血清ALTが持続低値を示した後ALT高値に転じたC型慢性肝炎患者」を対象として解析を行った。平成9年度HCVゲノムの変異解析と比較(田中、木村)経時変化を追いALT低値時期とALT高値時期の血清中のHCV-RNA(core領域)のSSCP-RT-PCRを行い、quasispiciesを解析した。ALT高値(肝炎活性化)時期に出現したクローンをクローニングしHCVゲノムを解析比較し、高値時期のみに認められる変異が存在する症例を発見した。5症例について解析し、ALT上昇と、変異がcore領域に認められたのは3例であった。平成10年度細胞の障害実験(田中、山本)このうちALT変化とHCV-RNAのCORE領域の変異の消退が密接に関係する一例について変異の場所を解析し、アミノ酸置換を伴うものであることを確認し、さらに変異により変異を含む領域が抗原提示された場合MHC class Iとの親和性が増加することを解析し確認した。これらの変異を含むペプチドを合成し、患者末梢血より採取しEBウイルスを感染させ不死化させたBリンパ球(EB-virus transformedcell line)に添加、患者末梢血リンパ球と混合培養しペプチド特異Tリンパ球を誘導した。さらに、変異を有するペプチドと変異を有しないペプチドをそれぞれ樹立した細胞株へ添加し、誘導したTリンパ球を添加することにより起こる細胞障害を検討してた。その結果、変異を有するペプチドを添加した系では有意に高度な細胞障害が認められた。結論C型慢性肝炎が活動化する以前、即ち血清ALT値が上昇する前に出現し、その後肝炎の軽快、ALT値の下降に伴って消失する変異がMHC class Iのaffinityの変化に関係する場合、細胞障害を引き起こす可能性が示唆された。HCVゲノムのMHCclass1-motif領域におこる変異と抗原提示の関連の検討「血清ALTが持続低値を示唆した後ALT高値に転じたC型慢性肝炎患者」を対象として解析を行った。i)HCVゲノムの変異解析と比較(田中、木村)経時変化を追いALT低値時期とALT高値時期の血清中のHCV-RNA(core領域)のSSCP-RT-PCRを行い、quasispiciesを解析した。これらの症例については、この変異を含む領域がMHC-classlにより提示され、免疫応答を引き起こしたという仮説に基づいて以下の実験を進めている。MHC-classlにより提示されるぺプチドは主として9merであることから、上記変異を含む9merのぺプチドを9種合成し、各々の合成ぺプチドを用いて実験を施行中である。即ち、上記HCVを有する患者末梢血からTリンパ球を分画採取し、これらの合成ぺプチドを添加、培養中である。iii)B細胞の株化と細胞障害性の検討(田中、山本)上記患者末梢血よりBリンパ球を採取し、EBウイルスを感染させ不死化させた。(EB-virus transformedcell line)。この細胞株をCr^<51>で標識後、上記合成ぺプチドを添加培養、Cr^<51>遊離率を調べ、細胞障害が成立するぺプチドを決定する予定である。

5症例について解析し、ALT上昇と、変異がcore領域に認められたのは3例であった。平成10年度細胞の刺激実験(田中)このうちALT変化とHCV-RNAのCORE領域の変異の消退が密接に関係する一例について変異の場所を解析し、アミノ酸置換を伴うものであることを確認し、さらに変異により変異を含む領域が抗原提示された場合MHC class Iとの親和性が減少することを解析し確認した。これらの変異を含むHCVクローンを含むプラスミドを構築し、患者末梢血より採取し、EBウイルスを感染させ不死化させたBリンパ球(EB-virus transformed cellline)に導入するべく実験を行った。さらに、変異を有するHCVクローンと変異を有しないクローンをそれぞれ樹立した細胞株へ導入、発現させ患者より採取した末梢血より特異Tリンパ球を誘導した。樹立した細胞株をCr51で標識後、上記誘導Tリンパ球を添加培養、Cr51遊離率を調べ、変異の有無により細胞障害が差が認められるかを検証した。
時間管理能力の発達過程と促進要因の検討ー時間管理の3側面に着目してー

「将来の予測が困難な時代」において,自分の時間をコントロールし,様々な課題に対処していくことのできる力が子どもたちには求められる。本研究では,時間管理能力の発達過程と,その促進要因に関する一連の研究を通して,「児童生徒の時間管理能力を育む方法」を提案することを目的とする。この目的を達成するために,本研究では以下の2点を明らかにする。(1)時間管理能力の発達過程について,「時間アセスメント」,「プランニング」,「モニタリング」という3側面から明らかにする。(2)時間管理能力の促進要因として,「ワーキングメモリ」,「時間管理支援ツール」,「マインドセット」の影響を明らかにする。
爆発的種分化した隠蔽種：幼形進化的シラスウオ科魚類の多様化プロセスの解明

インドー太平洋のサンゴ礁域に広く分布するハゼ亜目シラスウオ類は,幼形進化的な小さな脊椎動物(体長20mm,重さ2mg以下)であり,最も早熟でもある(最短成熟齢23日).これらの多様化プロセスを明らかにするために,ハゼ亜目を網羅したスーパーマトリクス法による500種近くの大規模系統解析,分岐年代推定および多様化速度とハビタットの変遷の推定をおこなった.これらの結果から,シラスウオ類は3000万年前頃に海で遊泳性のタンザクハゼ類と分岐したと考えられた.多様化速度の変化は他のハゼ類と比較して急激な上昇などは検出されず,分岐が古いことからハゼ類全体の多様化速度と同程度であることが推定された.本課題は極端な幼形進化を示すシラスウオ類の多様化プロセスを明らかにするために,(1)インドー太平洋産標本を収集して分布域全域をカバー,(2) Supermatrix解析による隠蔽種の探索と次世代シーケンサーを利用したミトゲノムによる系統樹構築,(3)核ゲノムを併用した交雑の検出,(4)分岐年代推定および分岐パターン解析と進める.上述の計画のうち,平成24年度は(1) (3)をメインに進める予定であったが,そのうちの(1)では,ニューカレドニア(南太平洋)とモーリシャス(インド洋)およびドバイ(インド洋)での採集を試み,前2箇所での採集に成功した.ニューカレドニアでの採集成功により,太平洋の主な分布域を網羅できたことになる.また,モーリシャスの採集成功により,はじめてDNA解析可能な標本をインド洋より入手が出来たことになる.それらの(2)である分子系統解析したところ,各地点での複数種の存在が確認できた.この結果,シラスウオ類の種多様性を明らかにするためには,さらなるサンプリングの必要性が示唆された.次に(2)のうちの次世代シーケンサーを利用した研究では,本課題申請後から新しい手法が次々と発表され,それら最新の技術を導入するために研究協力者らと検討・予備実験を進めており,この結果は平成25年度の実施に反映される予定である.また,シラスウオ類を含めたハゼ亜目の分子系統解析は,前年度に引き続き採集とサンガー法を用いた方法でも並行して進めている.(3)の核ゲノムマーカーによる実験は,引き続き試みている最中である.(4)の分岐パターン解析では,特異的なシラスウオ類との比較のために,「普通魚」であるタカサゴ類や隠蔽種の存在が推定されるスナハゼ類などの分子系統解析を進め,その成果を学会にて発表した.本課題は極端な幼形進化を示すシラスウオ類の多様化プロセスを明らかにするために,(1)インドー太平洋産標本を収集して分布域全域をカバー,(2)スーパーマトリックス解析による隠蔽種の探索と次世代シーケンサーを利用したミトゲノムによる系統樹構築,(3)核ゲノムを併用した交雑の検出,(4)分岐年代推定および分岐パターン解析と研究を進めていく計画である.研究期間の最終年度であった平成25年度は,(1)のインド洋でのサンプリングを終了して,(4)までを一挙に進める予定であったが,予定していた紅海でのサンプリングがエジプトの政情不安により延期となったため,最終的な解析も延期した.しかしながら,その間のシラスウオ類を含むハゼ亜目全体の系統解析をミトゲノム全長配列+核遺伝子の部分塩基配列を用いて行い,ハゼ亜目魚類の主要な系統を網羅する120種による信頼度の高い頑健な系統樹を構築することに成功した.また,スーパーマトリックス法によって,DNAデータベースに登録された膨大な塩基配列データをこの系統樹に統合することにより,ハゼ亜目の全約2100種の3分の1に達する750種の巨大な系統樹も構築することが出来た.これらを基に分岐年代推定と分岐パターン解析を行った結果,シラスウオ類の系統的位置と起源が明らかになり,これらを含むハゼ亜目全体の進化プロセスの大枠も明らかになった.これらの成果は日本魚類学会の年会にて発表した.インドー太平洋のサンゴ礁域に広く分布するハゼ亜目シラスウオ類は,幼形進化的な小さな脊椎動物(体長20mm,重さ2mg以下)であり,最も早熟でもある(最短成熟齢23日).これらの多様化プロセスを明らかにするために,ハゼ亜目を網羅したスーパーマトリクス法による500種近くの大規模系統解析,分岐年代推定および多様化速度とハビタットの変遷の推定をおこなった.これらの結果から,シラスウオ類は3000万年前頃に海で遊泳性のタンザクハゼ類と分岐したと考えられた.多様化速度の変化は他のハゼ類と比較して急激な上昇などは検出されず,分岐が古いことからハゼ類全体の多様化速度と同程度であることが推定された.本課題は極端な幼形進化を示すシラスウオ類の多様化プロセスを明らかにするために,(1)インド-太平洋産標本を収集して分布域全域をカバー,(2) Supermatrix解析による隠蔽種の探索と次世代シーケンサーを利用したミトゲノムによる系統樹構築,(3)核ゲノムを併用した交雑の検出,(4)分岐年代推定および分岐パターン解析と進める.上述の計画のうち,平成23年度は(1)と(2)をメインに進める予定であったが,そのうちの(1)では,マーシャル諸島,グアム,タイ王国プーケットでの採集を試み,前2箇所での採集に成功した.