hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キャッシュ・フロー情報の実証分析

研究期間の2年間,(1)キャッシュフロー情報の追加的な情報内容,(2)キャッシュフローとアクルーアル(accruals)の価値関連性について実証研究を行った.まず,実証分析するためのデータベースを構築・完成した.データベースは,東京証券取引所,大阪証券取引所および名古屋証券取引所に上場している企業の22年間(1978年-1999年)のデータからなっており,27,307社・年で構成されている.(1)キャッシュ・フロー情報の追加的な情報内容に関する研究会計利益の構成項目-キャッシュフロー(CFO),短期アクルーアル,および長期アクルーアル-それぞれ項目の予測能力を調べた上で,3つの構成項目による予測モデル開発した.この予測モデルを用いて求めた,期待外会計利益(UEBXI),期待外営業運転資本(UWCFO)および期待外営業キャッシュフロー(UCFO)は,ともに価値関連性を有していることが確認された.特に,期待外営業キャッシュフローは,期待外会計利益および期待外運転資本を考慮に入れても,追加的な情報内容が認められた.また,各会計変数を「穏やかな変化」と「激しい変化」に識別するためのダミー変数を加えて分析することによって,同様な傾向のよりクリアな結果が得られた.(2)キャッシュフローとアクルーアルの価値関連性に関する研究キャッシュフローの情報内容を分析するには,会計利益とアクルーアルを一緒に分析する必要があるため,Ohlsonモデルの一般化したバージョン(Ohlson1999)を用いた.分析モデルは,それぞれ4つの方程式からなるアクルーアル・システムとキャッシュフロー・システムで構成される.分析に際して,超過利益の計算には分析期間の平均ROEを用い,年度別および業種別のダミーを追加した上で,見かけ上無関係な回帰(seemingly unrelated regression)で各システムのパラメータを同時に推定した.分析結果,(1)両システムともに加重決定係数が高く(アクルーアル・システムが0.795,キャッシュフロー・システムが0.794),(2)キャッシュフローとアクルーアルは,超過利益の予測に追加的な情報価値をもち,(3)両方ともに予測関連性(forecasting relevance)と価値関連性(value relevance)をもつことが確認された.研究期間の2年間,(1)キャッシュフロー情報の追加的な情報内容,(2)キャッシュフローとアクルーアル(accruals)の価値関連性について実証研究を行った.まず,実証分析するためのデータベースを構築・完成した.データベースは,東京証券取引所,大阪証券取引所および名古屋証券取引所に上場している企業の22年間(1978年-1999年)のデータからなっており,27,307社・年で構成されている.(1)キャッシュ・フロー情報の追加的な情報内容に関する研究会計利益の構成項目-キャッシュフロー(CFO),短期アクルーアル,および長期アクルーアル-それぞれ項目の予測能力を調べた上で,3つの構成項目による予測モデル開発した.この予測モデルを用いて求めた,期待外会計利益(UEBXI),期待外営業運転資本(UWCFO)および期待外営業キャッシュフロー(UCFO)は,ともに価値関連性を有していることが確認された.特に,期待外営業キャッシュフローは,期待外会計利益および期待外運転資本を考慮に入れても,追加的な情報内容が認められた.また,各会計変数を「穏やかな変化」と「激しい変化」に識別するためのダミー変数を加えて分析することによって,同様な傾向のよりクリアな結果が得られた.(2)キャッシュフローとアクルーアルの価値関連性に関する研究キャッシュフローの情報内容を分析するには,会計利益とアクルーアルを一緒に分析する必要があるため,Ohlsonモデルの一般化したバージョン(Ohlson1999)を用いた.分析モデルは,それぞれ4つの方程式からなるアクルーアル・システムとキャッシュフロー・システムで構成される.分析に際して,超過利益の計算には分析期間の平均ROEを用い,年度別および業種別のダミーを追加した上で,見かけ上無関係な回帰(seemingly unrelated regression)で各システムのパラメータを同時に推定した.分析結果,(1)両システムともに加重決定係数が高く(アクルーアル・システムが0.795,キャッシュフロー・システムが0.794),(2)キャッシュフローとアクルーアルは,超過利益の予測に追加的な情報価値をもち,(3)両方ともに予測関連性(forecasting relevance)と価値関連性(value relevance)をもつことが確認された.本年度は,キャッシュ・フロー情報の追加的な情報内容を実証的に分析した.分析対象期間は1999年3月までの25年間で,サンプルは東京証券取引所,大阪証券取引所および名古屋証券取引所に上場している企業のうち分析に必要なデータを具備している23,733社・年である.本研究では,会計利益の構成項目-キャッシュ・フロー(CFO),短期の発生項目(STAcc),および長期の発生項目(LTAcc)-それぞれ項目の予測能力を調べた上で,3つの構成項目による予測モデル開発した.この系列依存予測モデル(SD)は,ベンチマークとしてのランダム・ウォークモデル(RW)より予測精度が高いという結果が得られた(MSPE[SD]=0.0157,MSPE[RW]=0.0311).この予測モデルで求めた,期待外会計利益(UEBXI),期待外営業運転資本(UWCFO),および期待外営業キャッシュ・フロー(UCFO)はともに価値関連性を有意に有していることが確認された.特に,期待外営業キャッシュ・フローは,期待外会計利益および期待外運転資本を考慮に入れても,追加的な情報内容が認められた(b_3=0.11,t=7.25).

また,各会計変数を「穏やかな変化」と「激しい変化」に識別するためのダミー変数を加えた分析においても,同様な結果で,より大きいパラメータ推定値が得られた(b_<31>=0.55,t=5.78,b_<32>=-0.46,t=-4.71).本年度は,前年度につづき,実証分析するためのデータベースを構築・完成した.データベースは東京証券取引所,大阪証券取引所および名古屋証券取引所に上場している企業の22年間(1978年-1999年)分からなっており,27,307社・年で構成されている.キャッシュフローの情報内容を分析するには,会計利益とアクルアル(accruals)を一緒に分析する必要があるため,本研究ではOhlsonモデルの一般化したバージョン(Ohlson1999)を用いた.分析モデルは,それぞれ4つの方程式からなるアクルアル・システムとキャッシュフロー・システムからなっている.分析に際して,超過利益の計算には分析期間の業種別平均ROEを用い,年度別および業種別のダミーを追加した上で,見かけ上無関係な回帰(seemingly unrelated regression)で各システムのパラメータを推定した.分析結果は次の通りである.アクルアル・システムの加重決定係数は0.763で,ω_<11>は0.453(t=109.11),ω_<12>は-0.028(t=-21.14),ω_<22>は0.185(t=37.48)であり,ω_<11>+ω_<12>は0.01%水準で有意であった(F>10308.32).キャッシュフロー・システムの加重決定係数は0.765,ω_<11>は0.429(t=103.92),ω_<12>は0.020(t=16.00),ω_<22>は0.216(t=43.12)であり,ω_<11>十ω_<12>は0.01%水準で有意であった(F>11920.24).以上の結果から,キャッシュフローとアクルアルは異常利益を予測する上で関連性をもつことが明らかとなった.
シロイヌナズナを用いたDNAメチル化制御機構の解析

今年度はRNAiとDNAメチル化異常をもつrdr1rdr2rdr6ddm1 4重変異体の解析を引き続き行った。昨年度までに、5番染色体セントロメア周縁部が不稔と形態異常を引きおこす原因領域であり、トランスポゾンの発現異常が原因である可能性が高いことが示されてきた。原因領域がセントロメアで組換え率が低いことから、遺伝子マッピングは不可能と判断し、そこで今年度は5番染色体セントロメアに相当するBACライブラリー56cloneをrdr1rdr2rdr6変異体に形質転換し、表現型を示す個体を単離することで原因領域の同定を試みた。BACライブラリーには形質転換に必要なDNA配列を含まないため、まずrecombineeringの技術を用いて必要な配列を導入し形質転換した結果、効率よく形質転換体を獲得できた。現在までに獲得した形質転換体の中には4重変異体と類似の表現型を示すものは見つかっていないが、トランスポゾンのみ含まれる、あるBACcloneを導入したところ、ほとんどの形質転換体で葉の上方湾曲が認められた。これは、トランスポゾンが宿主の発生に影響を与えていることを示す非常に興味深い結果であり、今後引き続きこの原因遺伝子の決定も試みる。またrdr1rdr2rdr6DDM1/ddm1 3重変異体に対し変異誘発剤であるEMSを処理し、M2世代でddm1/ddm1個体を選抜して4重変異体の表現型を抑圧する変異体スクリーニングを行った。現在までに表現型を抑圧するものが3個体獲得でき、2つは中程度、うち一つは完全に異常を抑圧していた。このサプレッサー個体の発見は、原因遺伝子の決定とその発生異常のしくみを解明する大きな手がかりとなり、PTGSとDNAメチル化との関係性を明らかにできるであろう。今後これらの個体を次世代シークエンサーにて配列解析し、変異部位を決定する。22年度は逆遺伝学的アプローチによるシロイヌナズナにおけるDNAメチル化の制御機構の解析を行った。遺伝子サイレンシングには大別してDNAメチル化による転写抑制(TGS)とRNAi経路によるRNA分解(PTGS)が存在する。この両方の経路に異常をもつ4重変異体ddm1rdr1rdr2rdr6株では葉の発生異常、稔性の低下など著しい表現型を示す。まず遺伝子マッピングによりこの原因遺伝子が2番染色体と5番染色体に存在することを同定し、次にデータベース情報を用いてDNAメチル化によって遺伝子サイレンシングを受けていると思われる因子を絞り込み、その発現解析を行った。その結果、2番染色体に関してはF-boxタンパク質をコードする遺伝子SDCの発現上昇が原因であることがわかった。SDCは本来、胚乳のみにおいて発現するインプリンティング遺伝子であることが知られており、SDCが異所的に発現することで発生異常を引き起こすと考えられる。実際にsdc遺伝子破壊を4重変異体に導入することで表現型の異常が緩和された。興味深いことに、TGS経路の異常によって発現したSDC転写産物を、PTGS経路によって再度抑制していることがわかり、不必要な遺伝子を抑える植物の防御機構の新たな一面が明らかとなった。DNAメチル化機構とRNAi経路は高等動物においてもよく保存されていることから、これらの成果は生物全般の遺伝子サイレンシングの機構を解明にする大きな手掛かりとなるであろう。本年度はDNAメチル化制御因子とRNAi因子rdr1,2,6,ddm14重変異体における発生異常の原因遺伝子の同定を行った。前年度の結果から、二番染色体、五番染色体のセントロメア周縁部の低メチル化状態と表現型が連鎖おり、発現上昇によるものである可能性が高いことが分かっていた。二番染色体については、連鎖領域内にインプリンティング遺伝子SDCが存在し、4重変異体ではプロモーターのDNAメチル化が失われ、発現上昇していた。SDC変異を4重変異体に導入すると、葉の歪曲や背丈の低下が緩和され、実際にSDCが原因遺伝子の一つであることが明らかとなった。しかし稔性や花弁構造の異常、背丈異常も完全には回復せず、SDCと5番染色体の原因遺伝子は独立に表現型に寄与していることがわかった。5番染色体の原因領域を絞り込むために、上記の個体群約400個体について遺伝子マッピングを行った結果、遺伝子番号AT5g27940-AT5G36220の区間に存在することが明らかとなった。そこで4重変異体で発現上昇している遺伝子、DNAメチル化近傍に存在する遺伝子を優先的に、領域内の遺伝子高発現株を網羅的に作成し、4重変異体と類似の表現型を示す高発現株の同定を試みた。結果、いくつかの株は表現型を示したが、4重変異体のものとはすべて異なっていた。この予想外の結果から推察されることは、発生異常の原因が機能遺伝子ではないということである。セントロメア周縁部はトランスポゾンが多く存在し、4重変異体で上昇しているトランスポゾンも多いことから、トランスポゾンの発現異常が原因である可能性を検討する必要がでてきた。

原因領域がセントロメアで組換え率が低いことから、遺伝子マッピングは不可能と判断し、そこで今年度は5番染色体セントロメアに相当するBACライブラリー56cloneをrdr1rdr2rdr6変異体に形質転換し、表現型を示す個体を単離することで原因領域の同定を試みた。BACライブラリーには形質転換に必要なDNA配列を含まないため、まずrecombineeringの技術を用いて必要な配列を導入し形質転換した結果、効率よく形質転換体を獲得できた。現在までに獲得した形質転換体の中には4重変異体と類似の表現型を示すものは見つかっていないが、トランスポゾンのみ含まれる、あるBACcloneを導入したところ、ほとんどの形質転換体で葉の上方湾曲が認められた。これは、トランスポゾンが宿主の発生に影響を与えていることを示す非常に興味深い結果であり、今後引き続きこの原因遺伝子の決定も試みる。またrdr1rdr2rdr6DDM1/ddm1 3重変異体に対し変異誘発剤であるEMSを処理し、M2世代でddm1/ddm1個体を選抜して4重変異体の表現型を抑圧する変異体スクリーニングを行った。現在までに表現型を抑圧するものが3個体獲得でき、2つは中程度、うち一つは完全に異常を抑圧していた。このサプレッサー個体の発見は、原因遺伝子の決定とその発生異常のしくみを解明する大きな手がかりとなり、PTGSとDNAメチル化との関係性を明らかにできるであろう。今後これらの個体を次世代シークエンサーにて配列解析し、変異部位を決定する。DNAメチル化異常による発生異常のひとつの原因がセントロメア周縁部にあり、また機能的遺伝子が原因遺伝子ではない可能性が非常に高いことを突き止めた。これは原因因子がトランスポゾンである可能性を示唆し、これまでの報告にはない新規な現象である。ひきつづき原因遺伝子の決定を行うことで、エピジェネティクスの分野に新展開をもたらすことが強く期待される。本研究課題を推進させるには、発生異常をひきおこしている原因遺伝子の同定が必要不可欠である。発生異常の原因領域がセントロメア周縁部に存在するため、組み換え効率が低く通常の遺伝子マッピングでは遺伝子の決定が非常に困難である。そこで現在はゲノムライブラリーを用いた形質転換にて、その解決を試みている。絞り込んだ原因領域に対応するゲノムライブラリーを取り寄せ、その挿入DNAを形質転換用ベクターに移し替え、新規の遺伝子サイレンシングが起こらない植物体に導入する。表現型を示す個体に導入されたDNAを詳細に解析して原因遺伝子の決定を行う。またこの発生異常は発現上昇によるものであると考えられるため、変異導入により発生異常を抑圧する変異体の取得も予定している。
先天性徐脈発症機構の分子生物学的解明とこれに基づくバイオペースメーカー開発の研究

先天性と考えられた徐脈症例58例のgenome DNAおよび臨床データを集積した。56症例中26例(45%)に家族歴が認められ、ペースメーカー植込み症例は24例(41%)であった。遺伝子解析の結果、58症例中7症例(12%)で遺伝子変異が認められ、これらの症例ではQT延長、心房細動、筋ジストロフィなどの合併が認められた。4種類のイオンチャネル遺伝子変異に対してパッチクランプ法による電気生理学的検討を行ったところ、3種類の変異で機能異常が認められた。マウス新生仔心筋より心筋前駆細胞の培養を行ったところ、一部の細胞で自己拍動が認められ、遅延整流K電流および内向き整流K電流の発現が認められた。(1)若年発症および家族性徐脈症例のサンプル収集先天性徐脈の発症機構を分子生物学的に解明するため、金沢大学病院を拠点として家族歴のある、あるいは若年発症(60歳未満)の先天性徐脈(洞不全症候群および心臓刺激伝導障害)症例53例のgenome DNAおよび臨床データを集積した。(2)先天性徐脈の遺伝子変異検索および臨床像の把握集積した先天性徐脈患者の末梢白血球よりリンパ球ゲノムDNAを抽出し、各々の遺伝子のエクソンをゲノムDNAからPCR法にて増幅し、SSCP法、またはHi-Res Melting法による遺伝子変異解析装置LightScanner(Idaho Technology社)でスクリーニングを行い、異常パターンを認めたサンプルについては、オートシーケンサーを用いて塩基配列異常を同定した。遺伝子解析の結果、4症例より5種類の遺伝子変異を同定した。これらのうち、イオンチャネル遺伝子に変異が認められた2種類の遺伝子変異(KCNH2 R269WおよびSCN5A P1824A)について、動物培養細胞を用いてパッチクランプ法による電気生理学的検討を行った。新生仔ラット心筋細胞より心筋前駆細胞の単離・培養を試みた。培養細胞の中に一部自己拍動性の細胞群を認めた。また、心筋前駆細胞に対してパッチクランプ法を用いて細胞に発現しているイオン電流の計測を行った。(1)若年発症および家族性徐脈症例のサンプル収集先天性徐脈の発症機構を分子生物学的に解明するため、金沢大学病院を拠点として家族歴のある、あるいは若年発症(60歳未満)の先天性徐脈(洞不全症候群および心臓刺激伝導障害)症例56例のgenome DNAおよび臨床データを集積した。(2)先天性徐脈の遺伝子変異検索および臨床像の把握集積した先天性徐脈患者の末梢白血球よりリンパ球ゲノムDNAを抽出し、遺伝子解析を行った。遺伝子解析の結果、56症例中6症例(11%)より6種類の遺伝子変異を同定した。4症例に家族歴を認め、いずれも徐脈性不整脈以外の合併症を有していた。さらに、コンピューターシミュレーションによる洞結節周囲細胞のペースメーカー活動の検討を行い、患者モデルにおいてギャップ結合コンダクタンスの上昇によりペースメーカー活動の停止を確認した。38細胞中18細胞に遅延整流K電流および時間非依存性外向き電流を、31細胞中18細胞に内向き整流K電流を認めた。RT-PCRを行うと、Kv1.1とKv1.2の存在が確認され、これらは遅延整流K電流の原因遺伝子と考えられた。(1)若年発症および家族性徐脈症例のサンプル収集:先天性徐脈の発症機構を分子生物学的に解明するため、家族歴のある、あるいは若年発症(60歳未満)の先天性徐脈(洞不全症候群および心臓刺激伝導障害)症例を新たに2例追加し合計58例のgenome DNAおよび臨床データを集積した。(2)先天性徐脈の遺伝子変異検索および機能解析:集積した先天性徐脈患者に対し、KCNQ1, KCNH2, SCN5A, SCN1B, MinK, MiRP1, KCNJ2, KCNJ3, KCNJ5, HCN4, ANK, GJA5, LMNAの遺伝子解析を行った。遺伝子解析の結果、58症例中7症例(12%)より7種類の遺伝子変異あるいは稀な遺伝子多型を、16症例(28%)より遺伝子多型を同定した。これらのうち、KCNA5 T527M遺伝子変異およびSCN1B T189M遺伝子多型に対してパッチクランプ法による機能解析を行った。

KCNA5は超迅速活性化K電流をコードし、過去の検討では本変異により発現電流の有意な低下が認められていたが、我々の検討では発現電流に有意差は認められなかった。SCN1Bは心筋Naチャネルのβサブユニットであり、T189M多型の発現電流は野生型に対して有意に大であり、その活性化曲線は過分極側に偏移していた。(3)心筋前駆細胞(Cardiac progenitor cell, CPC)の単離・培養:新生仔ラット心筋細胞より引き続き心筋前駆細胞の単離・培養を試みた。培養細胞の中に一部自己拍動性の細胞群を認めた。心筋前駆細胞のみを単離・培養することは実際には困難であり、線維芽細胞などが混在するため、MACSを使用することにより磁気ビーズを用いてC-Kit陽性の心筋前駆細胞のみを分離し、パッチクランプ法を用いてイオン電流の計測を行った。5細胞中4細胞に遅延整流K電流を認めた。先天性徐脈の遺伝子変異の同定、パッチクランプ法による電気生理学的検討、シミュレーションについては計画通り進展していると思われる。心筋前駆細胞を用いた研究については、心筋前駆細胞を純粋に単離し、効率的に増殖させる方法、さらに洞結節様細胞に効率的に分化させる画期的な方法の開発が必要と思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。先天性徐脈100症例以上を目標に網羅的に集積し、遺伝子解析を行い、同定された遺伝子変異に対してパッチクランプ法による電気生理学的検討およびシミュレーション解析を継続して行う。新生仔ラット心筋組織、もしくは金沢大学附属病院にて診断のために実施された心筋生検より心筋前駆細胞を単離・培養し、機能的な心筋細胞に分化させる。分化の方法として、新生仔ラット心筋細胞と共培養させたり、洞結節様細胞に選択的に分化させると報告されているsuraminなどを利用する。さらに、この洞結節様細胞をミニ豚の洞不全症候群モデルに移植し、ペースメーカーとしての作用を示すかどうか検討する。心筋前駆細胞を用いた生物学的ペースメーカーの作成については、心筋前駆細胞から洞結節様細胞に大量に分化させる方法の確立など、解決すべき問題点がある。
コミュニケーション時の運動リズム同期から推定する発達障害と定型発達の関係性

発達障害者はコミュニケーションが苦手であることが知られているが、その原因については不明な点が多い。本研究では京都大学医学部と共同研究することで、定型発達との比較脳波研究を行った。これまでに計測した協調コミュニケーション課題時の脳波解析より、発達障害者は他者との協調で前頭葉に認知負荷がかかることを示し、論文発表した(Kawasaki, Funabiki, et al., Cogn. Neurodyn. 2014)。これらの脳活動は発達障害の特徴の中でも特に「こだわり傾向」と関係することがわかった。さらにこれまでに定型発達者を対象として交互発話中に発話リズムが同期する2者間では脳波リズムが同期することを示してきた(Kawasaki, et al., Sci. Rep. 2013)。この解析方法を用いて、定型発達者と発達障害者の2者間の脳波リズム同期を比較した結果、発達障害者は脳波リズムが同期が少ないことがわかった。さらに位相振動子モデルおよび情報理論を用いて2者間の関係性を推定する研究を行っている。この成果について現在論文執筆中である。また発達障害者と定型発達者に対して、運動模倣課題を行った結果、発達障害者の多くは心的回転を、定型発達者の多くは視点取得の戦略を用いることが分かった。さらに発展研究として、視覚・聴覚記憶課題時の脳波、fMRI実験を実施し、発達障害者の注意の偏りに起因した脳活動や、うつ病患者の脳ネットワークの障害の検証を行っている。上記の研究は将来的に脳メカニズムから精神疾患を判断する診断法の開発に貢献する。28年度が最終年度であるため、記入しない。発達障害の一つにコミュニケーション時における他者との協調の困難さがあげられる。本研究では発達障害者がどのような関係性をもって他者とコミュニケーションしているか、それは定型発達者とどのように異なるのか、について他者と協調し合う行動リズムおよび脳波リズムから客観的に評価した。本研究は、協調コミュニケーション課題時の行動リズム、脳波リズムを計測および同期分析した。この課題では、2被験者が交互または同時にタッピングし、リズムを合わせることが教示される。行動リズムはタッピング間隔で、脳波の周波数位相同期で、評価した。発達障害者に対する実験は京都大学医学部付属病院の協力のもと行った。課題は定型発達者を相手にする条件と様々なリズム変動をするPC(一定のリズム、徐々に変動するリズム、人間の行動リズムを模倣したリズム、極端に変動するリズムなど)を相手に行われた。本年度は2者間の関係性を示す同期現象に注目して、2者脳波同時計測で他者のリズムに合わせるのがうまい人同士で脳波リズムが同期することを示し、現在論文投稿中である。また、発達障害者を対象にした研究では、2者間の行動リズム同期が異なること、脳波リズムの同期も定型発達者と発達障害者で異なること、コミュニケーション時には発達障害者が認知負荷を抱えていることを示し、これらを論文としてまとめ現在論文投稿中である。また定型発達者を対象にした行動リズム同期および脳波リズム同期に関する研究結果をまとめ現在論文投稿中である。これらの研究は来年度のコミュニケーション時の2者間の関係性を情報理論を用いた数理モデルとして分析し、定型発達者と発達障害者で比較研究を行ううえで重要な基盤となる。コミュニケーション時の2者間の関係性を解析するための実験データは計測し終わっている。それぞれのデータに対してトランスファーエントロピーを用いた2者間のリーダー・フォロワーの関係性を特定する解析に必要なプログラムはすでに完成済みであるため、すぐに解析に取り掛かれる準備が完了している。さらに本研究の基盤となる2研究の論文投稿済みであり、本研究の問題点の把握に貢献する。昨年度計測済みである実験データに対してトランスファーエントロピーを用いた2者間のリーダー・フォロワーの関係性を特定する解析を行う。

さらに同期現象に着目した解析を適用する、ほかの因果性に関する解析を適用するなど、別手法との比較も行う予定である。そうすることでうまくいかなかった場合の対応策にもなりうる。これらの研究結果をまとめ、学会発表を行い多くの研究者と議論をすることで結果のブラッシュアップを試みる、そのうえで英文論文として投稿する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
超音波を利用した浄水処理

この研究では昨年度より、活性炭による吸着と超音波による分解の併用システムを考え、問題物質を活性炭によって吸着、その使用済み活性炭に吸着した汚染物質を超音波によって処理することを目的にしていた。初年度(昨年度)に得られた具体吋な結果としては、粒状活性炭(GAC)を用いた吸着TCE (20mgTCE/g)に対して、アルゴン溶液中での20kHz、16Wの超音波処理によって、最適な溶出が可能であることがわかった。その値は、一時間後の脱着量で比較すると、通常はほとんど溶出しないTCEが50%程度溶出していた。しかしながら、このように脱着は確認できたものの、分解は起こっていなかった。本年度の具体的な研究実績としては、以下のことが挙げられる。○この溶出のメカニズムの検討を行った結果、超音波処理が活性炭表面上のTCEの吸着状態を変化させることにより周りの水と吸着しているTCEの吸着平衡を変化させ、溶出を起こしていると予想された。○この技術を重金属などの有害物質を多く含む焼却施設からでる飛灰の安定化処理などに用いることを検討した結果、ほとんどの重金属の溶出量を増加させることが出来た。メカニズム等の詳しい検討は行っていないため、TCEの脱着と同じ原理で溶出が増加しているかはわからないが、溶出の増加は飛灰の洗浄、安定化に超音波処理を用いることが出来る事がわかった。また、この過程で鉛に関しては溶出量の減少が起こっており、そのメカニズム等を調べた結界、超音波処理によって鉛のアパタイトが形成していることがわかった。よって鉛に関しての溶出量は減少したが、このアパタイトの形成によって、鉛が飛灰表面で安定化されることがわかり、結果として鉛に関しても環境中での溶出量の減少、飛灰の安定化が起こっていた。以上の結果は既に論文2本にまとめており、そのうち1本は投稿中であるが、時間の都合により発表予定を含む雑誌論文、図書、特許としては現在のところはない。
BおよびC型肝炎ウイルス受容体の解明と感染制御

本研究の目的は,1)ヒト肝癌発症の原因ウイルスと考えられるB型およびC型肝炎ウイルスの機能的受容体の構造と性質を解明し、ウイルス性肝癌の発症機構における宿主受容体の役割を明らかし,2)これにより肝癌発症の予防、診断、治療への基礎的情報を得ることである。今年度の研究において,上記の目的をほぼ達成できた.すなわち,(1)ヒト肝臓からB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)と特異的に結合する糖タンパク質の部分精製に成功し,これに対するモノクローナル抗体の作成も達成した。(2)ウイルス表面抗原(HBsAg)に対する受容体は,ヒト肝臓においてはシヌソイドに局在することを見出した.また,この結合にはシアル酸が関与することが示唆された.(3)この糖タンパク質は,Neu5Acα2-6Gal、Neu5Acα2-3Galおよび、Galβ1-3GalNAcを含有するムチン型糖鎖からなることを見い出した。(4)ヒト膵癌細胞から得たムチン画分にもウイルス表面抗原(HBsAg)が結合することを見出し,B型肝炎ウイルス受容体物質の構造解析に有用な系口が得られた.(5)C型肝炎ウイルスの膜表面抗原を発現する細胞からこれらを特異的かつ効果的に遊離させる界面活性剤を見出した.これによりC型肝炎の受容体をアッセイできる可能性が開けた.以上,B型肝炎の受容体についてはかなり分子レベルの情報が得られ,ヒト肝臓からウイルス抗原と結合できる糖タンパク質を実際に分離することが出来,その組織特異性も明らかに出来た.今後,この糖タンパク質の完全精製,遺伝子のクローニング,発現系の構築などにより,感染制御に結びつく成果が期待される.また,C型肝炎ウイルス受容体についても,今まで不可能であった受容体アッセイ系が可能となり,ウイルス膜抗原の十分な量が確保出来れば,受容体分離も可能であると思われる.本研究の目的は,1)ヒト肝癌発症の原因ウイルスと考えられるB型およびC型肝炎ウイルスの機能的受容体の構造と性質を解明し、ウイルス性肝癌の発症機構における宿主受容体の役割を明らかし,2)これにより肝癌発症の予防、診断、治療への基礎的情報を得ることである。(4)ヒト膵癌細胞から得たムチン画分にもウイルス表面抗原(HBsAg)が結合することを見出し,B型肝炎ウイルス受容体物質の構造解析に有用な系口が得られた.(5)C型肝炎ウイルスの膜表面抗原を発現する細胞からこれらを特異的かつ効果的に遊離させる界面活性剤を見出した.これによりC型肝炎の受容体をアッセイできる可能性が開けた.以上,B型肝炎の受容体についてはかなり分子レベルの情報が得られ,ヒト肝臓からウイルス抗原と結合できる糖タンパク質を実際に分離することが出来,その組織特異性も明らかに出来た.今後,この糖タンパク質の完全精製,遺伝子のクローニング,発現系の構築などにより,感染制御に結びつく成果が期待される.また,C型肝炎ウイルス受容体についても,今まで不可能であった受容体アッセイ系が可能となり,ウイルス膜抗原の十分な量が確保出来れば,受容体分離も可能であると思われる.
高分子の結晶化におけるメゾスコピックな秩序形成と動的構造

高分子物質を非結晶状態から結晶化させると、ランダムに絡み合った一次元の高分子鎖が,秩序だった格子を組み始めるいわゆる、結晶核形成過程が観察される。この結晶核形成には系が結晶化条件に達してから実際に結晶化が開始するまでに誘導期間と呼ばれる過渡的な時間の経過が必要となる。我々は、従来殆ど解明されていなっかた結晶化誘導期に着目して研究を進め、この結晶化が開始する以前の段階においてメゾスコピックスケール(10nm)で密度と配向のゆらぎによる新しい秩序化過程を見い出した。当該年度においては、このメゾスコピックスケールでの新しい秩序形成と原子オーダーのミクロスコピックスケールでの構造形成を対応させるため、赤外吸収分光測定および広範囲中性子弾性散乱測定を行った。特に赤外吸収分光測定は同時DSC(示差熱分析)測定できる装置を用いマクロスコピックな結晶化誘導期を捉えながらin-situで分子鎖のゴ-シュ形からトランス形へのコンフォメーション変化を時間発展的に追跡した。その結果トランスコンフォメーションが結晶化によるパッキングが開始する前の誘導期において増大していることを直接的に明らかにした。この結果を小角X線散乱、小角中性子散乱、偏光解消光散乱の結果と併せると、誘導期におけるゴ-シュ形からトランス形へのコンフォメーション変化を引き金にして分子鎖の持続長が増大し、これが排除体積効果による分子鎖の平行配向化を進めて、上述のメゾスコピックスケールでの密度と配向のゆらぎをもたらすという我々のモデルを裏付けることができた。さらに、広範囲中性子弾性散乱測定により、このように形成されるメゾスコピックスケールでの密度ゆらぎが結晶化による分子鎖のパッキングよりかなり前の段階で形成されることも直接的に示された。
長期不妊治療中カップルのパートナーシップを向上させるための支援モデルの開発

長期不妊治療を受けている夫婦またはカップル(以後、長期不妊治療中カップル)は、本邦の施策や夫婦以外に相談することが難しいという風潮もあり、孤立化、否定的感情の増強、カップル関係維持の難しさ、経済的負担を抱えながら治療を継続している。このような問題を改善するためには、カップル単位で共同して取り組む必要がある。しかし、それに対する具体的支援が明確化されていない。さらに、不妊治療を実施している施設だけでなく、厚生労働省の指定した「不妊専門相談センター事業」でも支援を実施しており、一貫した支援がなされていない。本研究では、このような状況を改善するための支援モデルを作成する。
羊水塞栓症の原因究明と羊水塞栓症からDICを発症する機序に関する血清学的研究

我々が開発した新規合成法で合成したコプロポルフィリン-I亜鉛(ZnCPI)の純度を、ICP(高周波誘導結合プラズマ)発行分光分析法で明らかにした。このことにより、羊水塞栓症患者血清中のZnCPI濃度を正確に求めることを可能にした。羊水塞栓症の発症機序として、破水後羊水中の異種抗原が母体にアナフィラキシーショックを起こすことが示唆されている。破水は母体免疫系が羊水に曝露される状態と考えられるが、破水が母体免疫系にどのような変化を与えるかについてはほとんど検討されていない。破水が母体の免疫系、血液凝固系に与える影響について研究した。[方法]インフォームドコンセントが得られた65例の妊婦について検討を行った。自然経腟分娩39例、吸引分娩5例、選択的帝王切開13例、緊急帝王切開8例であった。これらの症例に対して入院時、破水直後、分娩後に血清および血漿を採取した。採取された検体のC3、C4及び血液凝固XII因子活性(XII因子)について測定した。[成績]C3は破水前と比較し破水後に65例中42例に低下し、分娩時には65例中62例が低下した。平均の下降率は破水後4.25±9.0%、分娩時14.8±8.9%であった。C4も同様な変化を示した。XII因子は破水前と比較し分娩時に65例中51例低下した。ハイリスク分娩ではその変化が顕著に見られた。C3、C4の低下が著しい症例程XII因子活性の低下も高度であった。[結論]破水により母体の補体系とXII因子が活性化することが明らかになった。補体の活性化がXII因子を活性化する「接触系による血液凝固活性化」が知られている。破水がこの系を作動させることが初めて示された。羊水による接触系の活性化は羊水塞栓症によるDICの発生と関連する可能性がある。また過去に浜松医科大学に送付された羊水塞栓症の血清中のC3,C4の平均値はそれぞれ74±39mg/dl(正常値80140mg/dl)、15±9mg/dl(正常値1134mg/dl)であり正常値を下回っていることが判明した。破水時に活性化される補体系が羊水塞栓症では強度に活性化している可能性が示唆された。平成20年度に我々が新たに開発した亜鉛コプロポルフィリン(ZnCP-)の大量合成法(特願2008-520532「ポルフィリン(Y)の多価金属化合物の新規製造方法」)を用いて研究成果をあげた。(1)これまで量が少なくて正確に求めることの出来なかった合成ZnCP-Iの純度を、(株)東レリサーチセンターに外注することによって決定した。これによって、従来は推定値でしかなかった、全国医療機関から送られてくる、羊水塞栓症、あるいは羊水塞栓症疑い患者血清中のZnCP-I濃度が、より正確に求めることが可能になった。(2)新規大量合成方法で得られたZnCP-Iを用いて抗体の作成を試みたところ、ZnCP-Iに対する抗体を産生するいくつかのクローンを得ることができた。この結果は、羊水塞栓症などの血清学的研究に、新たな手法を提供する可能性が示唆される。(3)平成15年8月から、日本産婦人科医会からの委託を受け開始した羊水塞栓症血清検査全国登録事業により測定した、羊水塞栓症あるいは羊水塞栓症疑い患者血清中の数は、平成21年度は130検体で、平成15年の開始時からの総計は333検体になった。(4)羊水塞栓症血清検査全国登録事業で送られてきた血清には様々症例が見られ、それらのSTN、Zn-CPI、IL-8、C3、C4等の検査データが蓄積されつつある。これにより、羊水塞栓症をはじめとした、産科領域での種々疾患のリスクファクターを抽出することか出来る可能性が示唆される。平成20年度に我々が新たに開発した亜鉛コブロボルフィリン(ZnCP-I)の大量合成法を用いて得た合成ZnCP-Iについて抗体の作成を試みたところ、ZnCP-Iに対する抗体を産生するいくつかのクローンを得ることができた。これらクローンより得た抗体で、ヒト卵膜などの血清学的研究により、新たな情報を得つつある。平成15年8月から、日本産婦人科医会からの委託を受け開始した羊水塞栓症血清検査全国登録事業により測定した、羊水塞栓症あるいは羊水塞栓疑い患者血清中の数は、平成22年度は138検体で、平成15年の開始時からの総計は471検体になった。羊水塞栓症血清検査全国登録事業で送られてきた血清には様々症例が見られ、それらのSTN、ZnーCPI、IL-8、C3、C4等の検査データが蓄積されつつある。これにより、羊水塞栓症をはじめとした、産科領域での種々疾患のリスクファクターを抽出することが可能になり始めている。

血清中のZnCP-Iの測定で、ウォーターズ社のμbondapak C18Radial-Pakを用いてきたが、すでに製造中止になっており、在庫がなくなる時点で測定が不可能になる。そこで新規測定法の検討を開始した。ZnCPーIは、酸素の共存下、光があると一重項酸素を放出し、極めとを明らかにした。羊水塞栓症血清検査全国登録事業のためにも、血清中のZnCP-Iの新規測定法の開発が急がれる。
大学における研究支援体制の機能強化に資するURAの能力向上及び最適配置について

大学教員の研究力を高めるため、URAに必要な能力やURAの最適配置について、URAや米国のリサーチ・アドミニストレーター(RA)の事例を参考にしつつ調査研究を行った。URA調査では、リサーチ・アドミニストレーター協議会年次大会に出席し、参加大学のURAと意見交換を行った。また、東京大学、金沢大学、京都大学、関西大学、広島大学の5大学を訪問し、各大学のURA等と意見交換を行った。URAの能力における特記事項として、関西大学では広告業界やウェブデザイン業界等ノンアカデミック出身のURAが研究広報をサポートしていること、奈良先端科学技術大学院大学では同大学で博士号を取得後に外資系企業で海外事務所の設置等に従事したURAが大学の海外事務所開設に深く関与していたことが挙げられた。配置における特記事項として、東京大学は部局URAを重視していること、東京大学、金沢大学、関西大学、広島大学は事務職員と同じオフィス内にURAを配置し事務職員との交流を意識していることが挙げられた。アメリカのRA調査では、スタンフォード大学のRAと意見交換を行った。また、アメリカのRA向けの研修会"Basics of Research Administrationmeeting"に参加し、RAのキャリアパスやバックグラウンドについて参加者と意見交換を行った。RAは日本の大学における研究担当事務職員もしくは研究室秘書のような位置づけであり、日本のURAのような業務は外部コンサルタントやリサーチ・アソシエイト(いわゆるポスドク)が担っているとのことであった。
ｉＰＳ細胞を用いた急性呼吸窮迫症候群治療への挑戦

iPS細胞から2型肺胞上皮細胞への分化誘導実験にとりくみ、フローサイトメトリー(FACS)による分析を経時的に行いながら分化の過程を観察した。形態学的には上皮様細胞の出現が認められ、FACSでも細胞の分化の過程をとらえる事が出来た。Real Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)によって細胞内のmRNAの発現量を測定したところ、2型肺胞上皮細胞の前駆細胞に発現するとされるnkx2-1の発現が認められた。現在のところ、より効率的、安価で迅速にnkx2-1陽性細胞への分化が誘導されるプロトコルを調整中である。<研究の目的>ARDS患者、特に重篤な転帰を迎える患者を救命しうる最終的手段は現在のところ存在せず、急速に進行する肺障害をいかに阻止するかが論点となっている。本研究は現在のところ不可逆的と考えられているARDSによる障害肺から、Induced Pluripotent Stem Cell(iPSC)を用いて健常肺を再生することを最終の目的とする。<研究実施計画>iPS細胞から2型肺胞上皮細胞への分化誘導実験にとりくみ、フローサイトメトリー(FACS)による分析を経時的に行いながら分化の過程を観察した。<研究実施計画><研究実績>上記の通りmiPSCの培養を行った。結果、Feeder細胞の培養とmiPSCの培養を両立してゆくためにはかなり複雑な実験予定を組まなくてはならず困難であった。培養は予定した通りに終える事ができたもののmiPSCの未分化能が維持できておらず分化している細胞が散見され、かつ、得られた細胞数も期待した数には満たなかったため実験方法を改良する必要性があると考えられた。その経験をふまえて培養方法をより簡潔にすることに主眼を置き、中でもFeeder細胞を使用しないFeeder less培養を培養法として採用することに決定した。現在Feederless培養法を取り入れたプロトコールを作成中であり、早期に実行予定である。<研究実施計画>再生医療平成24年度を初年度とし、iPS細胞の培養に取り組んだ。当初マウスiPS細胞(miPSC)の培養に難渋し、培養プロトコルの改良を行った。同年度の末より岡山大学医学部臨床研究棟の耐震化工事のため一時的に実験の中断を余儀なくされたが、平成25年8月より実験を再開し計画よりは遅れたものの、培地とプロトコルの改良により当初予定していたmiPSCのフィーダーレス培養が確実に行えるようになっている。現在はFluorescence activated cell sorting(FACS)およびRT-PCRによるmiPSCの多能性の確認を行うと同時に、miPSCの肺胞上皮2型細胞への分化誘導実験を施行中であるが、耐震化工事の終了に伴い元の研究室へ移転中であり若干研究の中断を余儀なくされている。平成26年4月10日前後には再開できる見込みである。現在の研究が遅れている理由は率直に言って実験の失敗にある。失敗の理由はプロトコールが複雑であった事に加え、自分がその実験系に不慣れであった事が挙げられる。実験を実際に行ったことによって実験系細部の問題点も明らかになってきており、プロトコールを簡潔なものに改良することで今後はより効率的な細胞培養を行うことができると考えている。Fluorescence activated cell sorting(FACS)およびRT-PCRによるmiPSCの多能性の確認を行うと同時に、miPSCの肺胞上皮2型細胞への分化誘導実験を施行する。現在FACSによるcell sortingを試験的に行っており、cell sortingが確実にできることを確認した後、細胞の分化誘導実験を開始する。実験途上にてsortingした細胞を培養する必要があり、その後それらの細胞をモデルマウスに投与することによりひとまず実験は完結する予定であり、結果の発表、論文の作成および次の実験を計画する予定である。現在作成中のプロトコールではFeeder less培養法を取り入れることによりFeeder細胞を培養する手間と時間を削減できるだけでなく、Feeder細胞培養→miPSC培養を交互に繰り返すことによる人為的ミスを回避できるものと考えている。さらに、現在ではFeeder less培養法にも2種類あり、浮遊培養法という方法が操作も簡潔であり、細胞増殖効率も非常に良いため注目している。この方法の問題点は凍結細胞の融解直後と再凍結時に使用できない事であり、そこには従来の接着型Feeder less培養法を用いることで解決できると考えている。このプロトコールを使用することでより効率的にmiPSCを培養し、次の2型肺胞上皮細胞へ分化させるプロトコールへと早期に進んでゆく考えである。

平成24年度を初年度としてマウスiPS細胞(miPSC)の培養に取り組んだが当初培養に難渋したことと、同年度末より平成25年度にかけて当研究室の耐震化工事のため仮研究室への移転を余儀なくされたことにより遅れが生じた。仮研究室への移転当初は実験スペースを確保する事が困難であったが、平成25年8月より実験を再開することができた。こうしてiPS細胞の継代培養が計画よりも大幅に遅れたため以後の実験計画にも遅れが生じ未使用額が発生した。平成26年4月現在は耐震化工事の終了に伴い元の実験室へ移転中であり、若干の遅れが生じている。現在残っている資金でFluorescence activated cell sorting(FACS)およびRT-PCRによるmiPSCの多能性の確認およびmiPSCの肺胞上皮2型細胞への分化誘導実験に必要な抗体及び試薬を購入する。また、分化誘導後の細胞をマウスに投与する必要があり、マウスを購入する。その後結果の発表、論文の作成に残りの資金を充てる。尚、前年度の金額に余りが生じているが、これは研究の遅れによるものであり、前年度に購入予定であったものも研究の進行度合いに応じて前年度会計の余りより支出予定である。
金属射出成形(MIM)における充填、脱脂、焼結プロセスの究明

金属粉末射出成形(MIM)における充填、脱脂、焼結プロセスの究明を行った。特に充填時問題となる粉末スラリーのレオロジとグリーン体の脱脂特性を検討した結果、次のような結果が得られた。スラリーのレオロジ射出成形機を用いてスラリーの粘度測定を行うことにより、実際の射出時と近い条件での粘度が得られた。粘度をせん断速度の関数で表すことにより、本実験で使用したスラリーは非ニュートン流体であることが分かった。配合率ごとの粘度パワーロ-モデルにアレニウスの式を組み合わせて表すことができた。また、粉末の配合率はせん断速度依存を表す係数に大きく依存すると考えられ、粉末の体積配合率V_fを用いて上式を再構成するとSUS304粉末の粘度は温度とせん断速度と体積配合率で表され、以下の式が得られた。また本実験で得られたスラリーの物性データを用いてコンピュータシミュレーションを行うことによりこれまでよりもさらに正確な充填時の予想ができた。グリーン体の脱脂特性熱重量分析による、バインダのみとグリーン体内のバインダの熱分解曲線を比較、検討した結果、違う状態にあるバインダの分散挙動はほぼ一致していることがわかった。これにより脱脂プロセスにはグリーン体内部の拡散ではなく、表面からの脱脂成分の拡散が重要であることがわかる。バインダ(ガス体)の拡散はグリーン体表面から上方向への一方向拡散と仮定して、Fickの法則により求めた拡散係数はD=1.4×10^<-4>exp(-1800/T)であった。この拡散係数を用いて計算した脱脂肪率と実測脱脂肪率はほぼ一致した。以上の結果により、MIMにおける加熱脱脂プロセスを支配する過程は脱脂体表面からのガス体拡散であると結論づけられた。本研究では、射出プロセスにおけるグリーン体形成の最適化を目指すためのコンピュータシミュレーションを構築するための基礎データとなる、スラリーの物性値の測定を行った。測定材料として成形プロセスによく用いられるSUS304粉末を選び、そのスラリーの熱伝導度、密度、粘度を測定した。測定条件はできるだけ射出時に近い条件にし、実際に使われるときのデータを求めた。また、得られたデータをコンピュータシミュレーションに適用し、その有用性を調べた。結果を以下に述べる。(1)射出成形機を用いて測定を行うことでスラリーの状態での密度測定が可能となった。グリーン体の密度測定を行い、スラリー状態のときのデータと比較することにより、グリーン体とスラリーとの体積変化を求めることができた。これはキャビティ内での凝固収縮等の予測に役立つ知見となる。(2)スラリーの熱伝導率測定を行い、室温から射出温度付近までのデータが得られた。1の結果とあわせるとSUS304粉末スラリーの物性データはバインダの影響を大きく受けることが分かった。(3)射出成形機を用いてスラリーの粘度測定を行うことにより、実際の射出時と近い条件での粘度が得られた。配合率ごとの粘度はパワーロ-モデルにアレニウスの式を組み合わせて表すことができた。(4)本実験で得られたスラリーの物性データを用いてコンピュータシミュレーションを行うことによりこれまでよりもさらに正確な充てん時の予想ができた。

金属粉末射出成形法(MIM)における脱脂工程時の問題点として寸法精度、形状変形、脱脂時間の長さの問題があげられる。脱脂挙動を把握することは、これらの問題を解決するために重要である。平成8年度本研究では、熱重量分析により成形体からの脱脂成分の除去挙動を調べて、SEMで脱脂体組織を観察した。これらにより脱脂のメカニズムの考察を行った。実験方法本研究では、まずステンレス鋼SUS304微粉末92.6mass%と熱可塑性樹脂及び油脂それぞれ3.7mass%を熱間で混練したペレットを50×10×6mmの長方形に射出成形した。熱重量測定装置を用いて、グリーン体加熱時の熱重量分析を行った。それにより、脱脂時のバインダ(ガス体)の拡散挙動を調べた。また低温で脱脂してバインダの流動現象を調査した。結果熱重量分析による、バインダのみとグリーン体内のバインダの熱分解曲線を比較、検討した結果、違う状態にあるバインダの分散挙動はほぼ一致していることがわかった。これにより脱脂プロセスにはグリーン体内部の拡散ではなく、表面からの脱脂成分の拡散が重要であることがわかる。これは脱脂初期(熱分解前)において、バインダが溶融して試料表面に流出することによっても説明できる。さらに、バインダ(ガス体)の拡散はグリーン体表面から上方向への一方向拡散と仮定して、Fickの法則により求めた拡散係数はD=1.4×10^<-4>exp(-1800/T)であった。この拡散係数を用いて計算した脱脂率と実測脱脂率はほぼ一致した。なおSEMで脱脂体組織を観察した結果、試料表面から内部まで残留バインダ量の差は認められなかった。以上の結果により、MIMにおける加熱脱脂プロセスを支配する過程は脱脂体表面からのガス体拡散であると結論づけられた。
麦類うどんこ病菌の染色体構造の解析

イネ科植物うどんこ病菌:Erysiphegraminisには、寄生性の分化型が知られている。各分化型は、通常、各々の原寄主と同属の植物以外には寄生性を示さないが、分化型間で交配可能な組合せと交配が不可能な組合せが存在し、分化型には、生物学的に同種と考えられるものと、別種と考えられるものが存在する可能性がある。そこで、E.graminisの分化型間での交配の組合せについて詳細に検討した。その結果、各分化型は子のう殻および子のう胞子の形成の有無により、5群に類別された。即ち、1:tritici-secalis-agropyri、2:hordei、3:bromi、4:dactylidis、5:poaeである。このうち、4および5群では群内でも子のう殻形成は起こらなかったが、他の群内交配では子のう殻が形成された。4と5を除く各群および1群内の分化型間での交配は比較的容易であり、子のう胞子が得られ、病原性遺伝子の解析が可能であった。一方、群間交配で子のう殻が全く形成されないのは、3×4、3×5、および4×5の交配組合せであった。このことから、E.graminisの生殖には子のう殻形成と子のう胞子形成に関する少なくとも2遺伝子に変異が存在することが示され、5群の間には種分化が起こっていることが示唆された。このため、各群の分化型の染色体構造には変異が存在する可能性があり、パルスフィールド電気泳動での1群(triticiおよびsecalis)および2群(hordei)の染色体の分離法について検討した。各群の分生子を集め、直ちに細胞壁分解酵素Novozyme234で処理後、低融点アガロースに酵素処理分生子を包埋し、プロテアーゼK処理して試料を得、電圧150V、パルス時間70秒・15時間、次に120秒・12時間の泳動を0.5×TBE bufferで行った。2群(hordei)では不明瞭なバンドの他、明瞭な2本のバンドが特異的に検出されたが、1群(tritici、secalis)では不明瞭なバンドのみが観察され、染色体の分離には今だ技術的な問題が残された。