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肺炎球菌による急性肺障害におけるロイコトリエン受容体の役割

また、肺中でロイコトリエンを産生する細胞も不明であることから、以下の解析を行った。1)PLY依存的な上皮細胞障害をBLT2が抑制している可能性を調べるため、肺胞上皮細胞にBLT2を過剰発現する細胞を樹立した。LDHの放出を指標にPLYに対する感受性を調べたところ、BLT2過剰発現がPLYによる細胞障害を抑制することを見いだした。また、内因性BLT2の役割を調べる目的で、野性型およびBLT2欠損マウスより皮膚表皮角化細胞を単離・培養し、PLYに対する感受性を調べた。BLT2の欠損がPLYによる細胞障害を著しく上昇させることを明らかにした。2)野性型およびマスト細胞を欠損するKitW-shマウスにPLYを気道内投与して、肺胞洗浄液に含まれるロイコトリエンC4, D4, E4の量をLC-MS/MSにて測定した。KitW-shマウスは、野性型マウスと同等量のロイコトリエンを産生したことから、PLY依存性のロイコトリエン産生はマスト細胞以外の細胞が行っていることが明らかとなった。昨年度、BLT2がPLYによる上皮細胞の細胞死を回避させることを、LDHの放出・WST細胞障害性アッセイ・DAPIによる核染色・細胞の形態変化を指標に、様々な角度から明らかにしてきた。また、各種阻害剤を用いた予備的検討から、BLT2が細胞死を抑制するメカズムを掴みかけている。今後、BLT2のPLY依存性上皮細胞死抑制のメカニズムを明らかにすることが、肺炎患者の予後改善に繋がると考えている。また、PLYが肺中で大量のロイコトリエンを産生させて気管支収縮や血管透過性の亢進を引き起こすことは明らかになっていたものの、ロイコトリエン産生のメカニズムについては不明であった。ロイコトリエン産生により重度の喘息様の症状を引き起こしていたことから、マスト細胞がロイコトリエン産生の原因細胞ではないかと予想されたが、本研究によりPLY依存性のロイコトリエン産生は、マスト細胞以外の細胞が行っていることが明らかとなった。今後、マクロファージや好中球をはじめとした他の細胞の寄与を調べ、PLYによるロイコトリエン産生のメカニズムを解明する。これは、既に喘息治療薬で認可されているロイコトリエン受容体拮抗薬の肺炎患者へのドラッグリポジショニングの可能性に繋がると考えている。今後は、以下の4点について解析を行う予定である。1)上皮細胞の細胞死におけるBLT2の役割: BLT2による細胞死回避のメカニズムを、細胞内シグナル分子に対する阻害剤を用いることで明らかにする。また、BLT2がPLYの細胞膜孔形成に与える影響を、走査型電子顕微鏡を用いて明らかにする。2)PLY投与時のロイコトリエン産生細胞の同定: Gr-1抗体や、クロドロネートリポソームを投与し、それぞれ好中球、マクロファージを消失させたマウスにPLYを気道内投与し、肺胞洗浄液をLC-MS/MS解析して、ロイコトリエンをはじめとした生理活性脂質の一斉定量を行う。産生細胞候補が決まれば、その細胞にPLY刺激を行い、ロイコトリエン産生を観察する。3)BLT2とCysLT1受容体シグナルのクロストーク:BLT2のCysLT1シグナルに与える影響を観察する。BLT2とCysLT1受容体シグナルのクロストークの有無、CysLT1 mRNAの安定性に与える影響を調べる。4)ヒト肺炎球菌肺炎患者におけるNSAIDs、CysLT1拮抗薬服用の影響
新奇多環状トポロジー高分子の精密設計に基づくブレークスルー機能の創出

新奇多環状高分子構造、特に3種の三環状2重縮合型(β、γおよびδグラフ図形)、さらに四環状3重縮合型(正四面体の展開図と同等図形)トポロジーの構築を達成した。また、環状・多環状高分子の「かたち」に基づくブレークスルー機能の創出を目的として、両親媒性環状・多環状ブロック共重合体によるミセル・ベシクル特性、および分子ねじれ単位を含む環状高分子によるメカノケミカル特性、についても検討した。これらを合わせて、高分子の「かたち」(トポロジー効果)に基づく新規な特性・機能を実現する「高分子トポロジー化学」の体系化を進めた。この成果は、ナノテクノロジーによる新材料創製を推進する基盤技術としても期待される。申請者らはこれまでに、環状オニウム塩基を有する末端官能性高分子前駆体(テレケリクス)の高分子間静電相互作用による自己組織化と選択的共有結合変換を組み合わせた効率的合成システム(ESA-CF法)を基礎に、右のスキームに示す多環状トポロジー高分子およびこれらと直鎖状高分子セグメントを組み合わせたハイブリッド・トポロジー高分子の精密設計を進めてきた。本研究では、さらにこれを発展させるとともに、広範な環状トポロジー高分子による画期的ブレークスルー機能を創出することを目指した。これによって、今後この分野の研究を基礎・応用両面で牽引する技術基盤を確立する。本研究では、高分子合成化学の到達点を大きく前進させる新奇多環状高分子の効率的・実用的合成プロセスを開発した。具体的には、(1)三環状高分子トポロジーのうち二重縮合型、および(2)四環状高分子トポロジーのうち、「非平面グラフ」としてのユニークなトポロジー幾何学的性質を持つ、三重縮合型トポロジーに焦点を絞り研究を推進した。これらはいずれも世界に先駆けての合成となるもので、高分子材料化学を超えて、ナノテクノロジーによる新材料創製を推進する基盤技術としても期待される。加えて本研究では、高分子の「かたち」に基づくブレークスルー機能の創出を目指し、(1)環状ブロック共重合体のトポロジー効果に基づく新奇ミセル・ベシクル特性の創出、(2)分子ねじれ単位を含む環状高分子の合成とメカノケミカル特性評価、および(3)アミノ酸、糖、核酸などのバイオ機能単位、および金属配位子、フォト、エレクトロ、マグネト機能単位を含む環状および多環状高分子(Functional Rings)の設計・合成についても検討を進めた。これらを統合し、高分子の「かたち」(トポロジー効果)に基づく新規な特性・機能を実現する「高分子トポロジー化学」体系を構築する。具体的には、1三環状高分子トポロジーのうち二重縮合型4種、および2四環状高分子トポロジーのうち、「非平面グラフ」としてのユニークなトポロジー幾何学的性質を持つ、三重縮合型トポロジー、に焦点を絞り研究を推進した。加えて、高分子の「かたち」に基づくブレークスルー機能の創出を目指し、1環状ブロック共重合体のトポロジー効果に基づく新奇ミセル・ベシクル特性の創出、2分子ねじれ単位を含む環状高分子の合成とメカノケミカル特性評価、および3アミノ酸、糖、核酸などのバイオ機能単位、および金属配位子、フォト、エレクトロ、マグネト機能単位を含む環状および多環状高分子(Functional Rings)の設計・合成についても検討を行った。これらを統合し、高分子の「かたち」(トポロジー効果)に基づく新規な特性・機能を実現する「高分子トポロジー化学」体系を構築した。さらに、末端官能性高分子前駆体(テレケリクス)の高分子間静電相互作用による自己組織化とその選択的共有結合変換(ESA-CF法)を基礎とし、新しい有機合成化学手法(Click法、Metathesis = Clip法)を統合して、単環状および多環状トポロジー高分子を効率的に合成するプロセスを開発した。また、高分子の自己組織化集合体(ミセル、ベシクル等)に着目し、高分子のトポロジー効果に基づくブレークスルー機能を創出した。K3,3グラフは4環が3重に縮合した構造の特殊なトポロジーとして知られ、幾何学的視点から興味深い構造である。また、自然界には類似した構造の環状ペプチドが存在し、そのトポロジーが熱的耐性の向上に影響していると考えられている。このようなトポロジーとそれに起因する物性の差異との関係の解明のために、その構築法を確立することは重要である。今回、K3,3グラフ構築のため、6分岐テレケリクスを原料とした合成スキームを考案した。しかし、環化反応において反応点の増加による多量体の形成などにより、分離や解析が困難となることが予想される。

そこで、本研究では、単一サイズの分岐高分子の末端官能基化により分岐テレケリクスを合成し、静電相互作用による自己組織化と共有結合化により、K3,3グラフを初めとする多環縮合型トポロジーの構築を行った。また、トポロジーの異なる高分子の流体力学的体積の違いに注目し、分取SECによる分離を検討した。まず、主鎖にエイコサンジオールを用いて、保護、エステル化、脱保護やエーテル化の一連の反応により、末端にOH基を有する6分岐単一サイズ高分子を合成した。次に、無水トリフルオロメタンスルホン酸により、トリフラートエステル末端へと変換した後、N-フェニルピロリジンを反応させ、N-フェニルピロリジニウム塩末端を有する単一サイズ6分岐テレケリクスを合成した。そして、6分岐テレケリクスをジカルボキシレートやトリカルボキシレートとともに加熱還流することで末端イオン性部位を共有結合へと変換し、6分岐デンドリティックトポロジー、αグラフを含むトリサイクリックトポロジー、さらにK3,3グラフを含むテトラサイクリックトポロジーを得た。また、分取SECにより各トポロジー異性体生成物の単離を試みた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要中に示したの高分子トポロジーの構築は1H NMR、MALDI-TOF MSにより確認された。SEC測定によりピークトップ分子量が減少したことから環化の進行が示された。そこで、リサイクル分取SECを行ったところ、始めは明確に分離していなかった生成物が、15から20サイクル後にそれぞれ3、および、2成分のピークに分離した。各フラクションの1H NMR、MALDI-TOF MS解析結果から、トポロジー異性体の関係にあることが確認された。現在、本成果の論文発表準備を行っている。これらの成果を踏まえ、さらに3種(α、β、およびγグラフ図形)の高分子トポロジー設計に挑戦する。このうちγグラフ高分子は、これまでに申請者らが確立したESA-CF法およびclick法を適用し、双環状手錠型高分子の特定の位置にアリル基を導入した高分子前駆体を合成し、さらにメタセシス縮合環化反応することによって合成できる。また同様に、アリル基を導入したスピロ型3環状高分子前駆体を合成し、さらにこれをメタセシス縮合環化すると、これまで例のない4環3重縮合高分子トポロジー構築も実現できると思われる。これらの成果を踏まえ、さらに複雑なの高分子トポロジー設計に挑戦する。そのひとつであるγグラフ高分子は、これまでに確立した静電相互作用による自己組織化と共有結合化およびクリックケミストリーを適用し、双環状手錠型高分子の特定の位置にアリル基を導入した高分子前駆体を合成し、さらにメタセシス縮合環化反応することによって合成できる。また同様に、アリル基を導入したスピロ型3環状高分子前駆体を合成し、さらにこれをメタセシス縮合環化すると、これまで高分子では例の無いK3,3グラフを含む4環3重縮合トポロジーの構築も実現できると考えられる。
固体電解質を利用した閉じ込め型単分子接合の作製および機能探索

本研究の目的は原子スイッチを利用して固体電解質の内部に単分子接合を作製することである。単分子接合を作製するために金属フィラメントの破断によるナノギャップの構築と構造制御が重要となる。本年度は電解質内部でフィラメント構造を制御する手法を開発し、またフィラメント構造を分光計測によって分析するための実験環境を整備した。第一に固体電解質中に構築されたフィラメントの原子種を評価する目的で、極低温条件での分光計測装置を構築し、その運用を行った。銀、硫化銀、白金の三層構造からなる原子スイッチをチャンバー内で動作させることで金属フィラメントを形成し、極低温条件で分光計測を行った。振動スペクトルを解析することで金属種ごとに固有の振動モードが励起したことを観測し、フィラメントの原子種が銀であることを明らかにした。加えて、電極および固体電解質に銅、硫化銅を用いた原子スイッチも作製し、スイッチの種類ごとにフィラメントの種類を識別することができた。第二に原子スイッチの伝導度を原子スケールで制御するためにソースメジャーユニットを用いた計測システムを構築した。タンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチに対する印加電圧を制御することにより金属単原子接合に特徴的な伝導度の量子化が観測された。以上、固体電解質の内部に金属フィラメントが形成されていることを明らかにし、原子スケールで構造を制御することに成功した。従来の単分子接合作製プロセスと同様に金属フィラメントを破断させ、分子を架橋させる手法を固体電解質内部において再現することが可能となった。今年度は固体電解質を用いた原子スイッチについて、スイッチ内部に形成されたフィラメント構造を制御する手法と分光分析によってフィラメントの原子種を解明する手法を開発した。ソースメジャーユニットと電流値のフィードバック機構を組み合わせた印加電圧の制御によってフィラメント構造を原子スケールで制御することに成功した。また、低温チャンバー内に原子スイッチを設置することでスイッチを凍結することができた。凍結した原子スイッチにIV計測を行った結果から、動作電圧が増大したことが示された。動作電圧の増大によって原子スイッチを高伝導度状態で保存しながらスペクトル測定を行うことを可能とした。開発した手法を用いて原子スケールの金属フィラメントを固体電解質の内部に構築し、スペクトル測定の結果からフィラメントを構成する原子種を明らかにすることができた。加えて、同じ手法を金属電極、固体電解質の組成が異なる種々の原子スイッチに適用し、結果を比較することでフィラメントを構成する金属原子が電解質からも供給されうることを示した。以上、これまで不明であった固体電解質に埋もれた金属フィラメントの組成を明らかにし、原子スイッチの動作機構に関して重要な知見を得た。加えて、固体電解質としてタンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチについても研究を発展させてきている。ナノ多孔質構造を持ち、分子を吸蔵しうるタンタル酸化物薄膜を利用することで閉じ込め型単分子接合の開発に向け前進したといえる。以上の成果は国内外の複数の学会にて発表を行い、講演賞を受賞するなどの評価を得た。また内容をまとめた原著論文も出版されており計画通りに研究を進展させてきたといえる。今年度開発した一原子スケールでフィラメント構造を制御する手法を用いて単分子接合を作製する。まずはタンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチを水やアセチレンなどの気体化した分子の雰囲気において動作させ、金属フィラメントを構築する。フィードバック機構を用いてフィラメントを一原子のスケールでおだやかに破断させ、ナノ多孔質構造に吸蔵された分子による架橋構造を構築する。破断過程における伝導度の分布を真空中に原子スイッチを置いた場合と比較し、分子雰囲気で伝導度分布に変化が生じたか分析する。真空中では分布が見られない伝導度に分布が見られれば、IV計測および今年度に構築した手法を用いてスペクトル測定を行う。相当する伝導度を示す状態に原子スイッチを調節し、原子スイッチを凍結することで状態を保存したままIV計測、スペクトル測定を可能とする。スペクトル計測から架橋分子の化学状態、IV計測から電子状態を明らかにし、単分子接合の形成を確認する。加えて、分子の導入手法についても検討を行う。ナノ多孔質構造内に気体分子を吸蔵させる手法の他、固体電解質と電極との界面に分子膜を挟み込む手法についても実験を行い、気体分子を吸蔵させた場合と単分子接合の歩留まりなどを比較する。また、形成された単分子接合の安定性を接合の寿命計測や伝導度のゆらぎから評価し、同時に従来のブレークジャンクション法による単分子接合と比較を行う。以上を持って固体電解質中での単分子接合作製プロセスを確立することを今後の研究の第一目標とする。

加えて、電極および固体電解質に銅、硫化銅を用いた原子スイッチも作製し、スイッチの種類ごとにフィラメントの種類を識別することができた。第二に原子スイッチの伝導度を原子スケールで制御するためにソースメジャーユニットを用いた計測システムを構築した。タンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチに対する印加電圧を制御することにより金属単原子接合に特徴的な伝導度の量子化が観測された。以上、固体電解質の内部に金属フィラメントが形成されていることを明らかにし、原子スケールで構造を制御することに成功した。従来の単分子接合作製プロセスと同様に金属フィラメントを破断させ、分子を架橋させる手法を固体電解質内部において再現することが可能となった。今年度は固体電解質を用いた原子スイッチについて、スイッチ内部に形成されたフィラメント構造を制御する手法と分光分析によってフィラメントの原子種を解明する手法を開発した。ソースメジャーユニットと電流値のフィードバック機構を組み合わせた印加電圧の制御によってフィラメント構造を原子スケールで制御することに成功した。また、低温チャンバー内に原子スイッチを設置することでスイッチを凍結することができた。凍結した原子スイッチにIV計測を行った結果から、動作電圧が増大したことが示された。動作電圧の増大によって原子スイッチを高伝導度状態で保存しながらスペクトル測定を行うことを可能とした。開発した手法を用いて原子スケールの金属フィラメントを固体電解質の内部に構築し、スペクトル測定の結果からフィラメントを構成する原子種を明らかにすることができた。加えて、同じ手法を金属電極、固体電解質の組成が異なる種々の原子スイッチに適用し、結果を比較することでフィラメントを構成する金属原子が電解質からも供給されうることを示した。以上、これまで不明であった固体電解質に埋もれた金属フィラメントの組成を明らかにし、原子スイッチの動作機構に関して重要な知見を得た。加えて、固体電解質としてタンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチについても研究を発展させてきている。ナノ多孔質構造を持ち、分子を吸蔵しうるタンタル酸化物薄膜を利用することで閉じ込め型単分子接合の開発に向け前進したといえる。以上の成果は国内外の複数の学会にて発表を行い、講演賞を受賞するなどの評価を得た。また内容をまとめた原著論文も出版されており計画通りに研究を進展させてきたといえる。今年度開発した一原子スケールでフィラメント構造を制御する手法を用いて単分子接合を作製する。まずはタンタル酸化物薄膜を用いた原子スイッチを水やアセチレンなどの気体化した分子の雰囲気において動作させ、金属フィラメントを構築する。フィードバック機構を用いてフィラメントを一原子のスケールでおだやかに破断させ、ナノ多孔質構造に吸蔵された分子による架橋構造を構築する。破断過程における伝導度の分布を真空中に原子スイッチを置いた場合と比較し、分子雰囲気で伝導度分布に変化が生じたか分析する。真空中では分布が見られない伝導度に分布が見られれば、IV計測および今年度に構築した手法を用いてスペクトル測定を行う。
センサ・信号処理を同一素子で可能な能動素子を用いた半導体集積化圧力センサの研究

本研究では、センサ検出と信号処理を同一回路で行えるひずみ検出素子の実現に向けた基礎研究として、MEMS技術によるSi加工が比較的簡単に実現できるSOI基板を用い、SOI基板上に試作したSOI-MOSFETを用いたひずみ検出素子を試作し、評価を行なった。その結果、以下のように結論できる。(1)チャネル直下の反転層のピエゾ抵抗効果を利用し、MOSFET2段にして一定方向のひずみを検出する回路として構成した結果、応力印加方向に対して選択的に検出することが可能であることが示せた。まず、チャネルに対し垂直に応力を加えた場合、2つのMOSFETに同じ応力を加えているため、応力を増加させても出力が変化しないことが確認できた。次にチャネルに平行に応力を加えた場合、2つのMOSFETに応力の差が生じるため、応力をかけない場合と比べて出力の傾きが変化した。よって、応力の有無を検出できることが確認できた。しかし、応力の大きさに応じた定量的な検出については、素子特性の不安定さから検証することができなかった。これについては、今後、安定的に検出が可能な素子構造の見直しを行い、定量的に測定できるようにする予定である。(2)チャネル直下の反転層に対してせん断応力を印加することでひずみを検出する素子を試作した。せん断応力を検出していることを検証するために、作製した素子の応力印加方向を[110]方向に印加することでせん断応力が最大になり、[010]方向に印加することでせん断応力が最小となる。[010]方向に応力を印加すると、出力電圧変化は0となるが、素子自体の形状の非対称性からくるオフセットに起因した出力変化が見られた。しかし、[110]方向に印加した場合と比べて出力電圧変化が小さいことから、せん断応力を検知できていると結論できる。また、せん断応力に比例した電圧出力が得られ、その出力はMOSFETの動作領域に依存する形で動作することが明らかとなった。(3) (1)や(2)を支える周辺回路技術として、弱反転層動作を用いたアナログ増幅回路や、アナログ情報を長期的に保持が可能なアナログ情報記憶保持回路の設計と評価を行い、有効性を確認した。【研究実績】本研究では、圧力センサの高機能高集積化を目指し、周辺回路を含んだ圧力センサをすべて同一のトランジスタ等の能動素子のみで構成し、その回路で複数の機能(センシングと信号処理)を実現し、外界の温度や製造時のばらつきといった環境の変化に非依存で、かつ自律的に修正する機構を備えた半導体集積化圧力センサの試作研究を目的とする。平成18年度では、半導体圧力センサを構成するひずみ検出素子の検討とひずみ特性の評価、周辺回路の低電圧化に対する動作解析を行なった。まず、半導体圧力センサを構成するひずみ検出素子の検討とひずみ特性の評価であるが、抵抗値のばらつきを電圧によって調整可能な素子として、チャネル抵抗をゲート電圧で制御できるMOSFETを用いた。またMEMS構造を容易に製作可能な基板としてSOI (Silicon On Insulator)基板を用い、SOI基板上にSOI-nMOSFETを試作した。ひずみ特性を検証するために、片持ち梁曲げ試験を、試作したSOI-nMOSFETに対して行なった。そして、SOI-nMOSFETの応力印加による電子移動度の変化を測定することでひずみ特性を評価した。その結果、引張応力に対して増加し、圧縮応力に対して減少した。また、チャネルに対して平行に応力を印加した場合(変化率:139TPa^<-1>)のほうが、垂直に応力を印加した場合(変化率:82TPa^<-1>)よりも移動度の変化が大きいことを確認できた。次に、周辺回路の低電圧化に対する動作解析であるが、今後の微細化に伴う低電圧化により、センサを含めたアナログ回路の動作がどのように変化するのか、簡単な構成のオペアンプを設計し、集積回路として試作した。その結果、構成するMOSFETを強反転領域で動作させると、MOSFETのもつ閾値によりアナログ回路の動作範囲が制限されるが、弱反転領域にまで電源電圧を減少させると、強反転と同じように動作するが、動作範囲については緩和されることが明らかになった。また消費電力においては、強反転領域動作では、数μWであるが、弱反転領域で動作させると、その100分の一以下にまで減少させることができるため、半年以上のバッテリー駆動で稼動できるセンサとして利用可能であることがわかった。今後は、これらを踏まえ、実際に低電圧化した圧力センサとしての評価を行ないたい。【研究発表(口頭発表)】能動型ひずみ素子の理論的考察と周辺回路の低電圧化の検証が現在も一部引き続いて行なっている関係で雑誌論文投稿までのレベルに達していないが、口頭発表においては2件行なった。

次にチャネルに平行に応力を加えた場合、2つのMOSFETに応力の差が生じるため、応力をかけない場合と比べて出力の傾きが変化した。よって、応力の有無を検出できることが確認できた。しかし、応力の大きさに応じた定量的な検出については、素子特性の不安定さから検証することができなかった。これについては、今後、安定的に検出が可能な素子構造の見直しを行い、定量的に測定できるようにする予定である。(2)チャネル直下の反転層に対してせん断応力を印加することでひずみを検出する素子を試作した。せん断応力を検出していることを検証するために、作製した素子の応力印加方向を[110]方向に印加することでせん断応力が最大になり、[010]方向に印加することでせん断応力が最小となる。[010]方向に応力を印加すると、出力電圧変化は0となるが、素子自体の形状の非対称性からくるオフセットに起因した出力変化が見られた。しかし、[110]方向に印加した場合と比べて出力電圧変化が小さいことから、せん断応力を検知できていると結論できる。また、せん断応力に比例した電圧出力が得られ、その出力はMOSFETの動作領域に依存する形で動作することが明らかとなった。(3) (1)や(2)を支える周辺回路技術として、弱反転層動作を用いたアナログ増幅回路や、アナログ情報を長期的に保持が可能なアナログ情報記憶保持回路の設計と評価を行い、有効性を確認した。
発作性夜間血色素尿症の分子病態学

発作性夜間血色素尿症(PNH)は、異常造血幹細胞クローンが拡大し多数のGPIアンカー欠損血球を末梢に供給することにより発症する。PIG-Aのミュータントが正常細胞を圧倒して拡大するメカニズムを解明するためマウスの相同遺伝子Pig-aをコンディショナルにノックアウトしたPNHモデルマウスを作製した。X染色体上のPig-a遺伝子のエクソン6をはさむようにloxP配列を挿入したES細胞を確立した。(以下loxPを含むPig-aをPig-a^<flox>と記す)。このES細胞を用いてPig-a^<flox>を持つマウスの系を確立した。ヒトサイトメガロウイルスプロモーターでCreを発現するトランスジェニックマウスの雌とPig-a^<flox>マウスの雄をを交配し胎児を得た。Creトランスジーンを持つ雌胎児はPig-a^<flox>をヘテロにもっている。胎児全DNAを解析すると、ほぼ完全にPig-a^<flox>遺伝子内でのリコンビネーションにより遺伝子破壊が起こっていた。すなわち全身の細胞で父由来のPig-aが欠損、母由来のPig-aが正常のヘテロになっていた。これにX染色体の不活化が加わっているので全身でGPIアンカー欠損細胞と正常細胞のモザイクとなっていると予想された。14日目の胎児肝の赤血球上のGPIアンカー型タンパク質の発現を見ると半数以上の赤血球が欠損細胞であった。この肝細胞からTER陰性細胞を集め、致死量照射した成体マウスに移植した。移植後6週毎に末梢血細胞上のGPIアンカー型タンパク質の発現を調べた。6週から36週にわたって、赤血球、単球、顆粒球、CD4、CD8リンパ球、Bリンパ球にGPIアンカー型タンパク質欠損の細胞集団が存在した。すなわちこれらのマウスはGPIアンカー型タンパク質欠損の多能性造血幹細胞を持っていることがわかった。観察中にGPIアンカー型タンパク質欠損細胞の割合が増加した個体は出現しなかった。以上から、この手法によりPNH発症の第一ステップを備えたモデルマウスを安定に多数作製できることがわかった。
新しいアプローチによるリンパ球系腫瘍細胞の排除に関する研究

MHCクラスI様分子と反応する抗体(RE2)による細胞死は補体非依存性に、apoptosisや壊死とは異なる形態の細胞死を引き起こすこと、リンパ球以外の細胞を瘍害しないこと、リンパ球系の細胞でも、正常細胞を瘍害しないこと、造血系細胞や成熟リンパ球の供給源となる胸腺細胞を瘍害しないで、持続的に増殖しているT細胞クローンやマイトゲンによって増殖を誘導したリンパ球のみが瘍害されることが明らかになった。今年度は、RE2抗体による細胞死の機序に重点をおいて基礎的な解析を行なった。その結果、(1)RE2抗体が細胞表面分子に結合するだけでは細胞死は誘導されず、表面分子を架橋することによって細胞死が誘導されること、(2)細胞死はサイトカラシンによって完全に阻止されること、(3)MHCクラスI分子欠損細胞株では細胞死が誘導されないこと、が明らかになった。これらの解析と並行して、RE2分子の遺伝子クローニングの準備を行なった。細胞死が活性化リンパ球でのみ認められることから、活性化リンパ球のcDNAライブラリーの作製を行なった。また、活性化リンパ球からのRE2抗体沈降物を用いてRE2抗体と同様に細胞死を誘導する抗体(S27)を新しく作製した。このS27抗体は、インムノブロッティングに使用できなかったRE2とは違って、ブロッティングに使用できるので、今後予定しているcDNAライブラリーのクローニングにきわめて有効な抗体になると思われる。
大都市圏の集合住宅建て替えにともなう自然環境再生・復元に関するデザイン論的研究

平成16年度は、主に近畿圏における集合住宅立て替え事例について、以下の手順にしたがって調査・分析・検討を実施した。(1)緑の環境ストック形成のプロセス分析、(2)緑の立地環境の評価、(3)影響の回避と軽減のためのモデルの検討。成果として、豊かな緑の環境ストックが形成されている空間の単位を抽出し、その中における植生の構造と構成を詳細に調査分析することにより、それらの空間が立地している環境の、住宅地内における相対的な価値を評価した。また、事業の実施に伴う緑の環境ストックへの影響を回避もしくは軽減することのできる住棟の配置計画、動線計画、施設配置計画等の代替案を提案した。さらにそれらの比較検討を行うことによって、影響の回避、軽減を実現するための条件を抽出したうえで、それらをモデルとして構築した。平成17年度は前年度に実施した作業を通じて得られた成果から、自然環境再生・復元のしくみとプロセスを、視覚をはじめとする人間の五感を通じて認識されるものに置き換えるデザイン手法を検討し、いくつかのデザインモデルの代替案として提示した。この過程においてパーソナルコンピュータを利用した三次元の空間モデリングと模型の作成を行っている。同時にミティゲーションに関する学術的な基礎理論、知識の整理と既往研究・デザイン事例の収集・整理を行った。この際、対象範囲を首都圏まで拡大することや、住宅造成以前の原地形が造成手法や緑環境の基盤形成にもたらす影響など、検討内容の一般化を目指した検討に重点を置いた。(1)緑の環境ストック形成のプロセス分析集合住宅竣工時の植栽図をベースとして、対象地における緑の現況(事業が進行している場合には、事業開始時点における状況)を調査し、両者を比較検討することによって、緑の環境ストックが形成されてきたプロセスと住宅地の空間計画の関係を明らかにした。(2)緑の立地環境の評価豊かな緑の環境ストックが形成されている空間の単位を抽出し、その中における植生の構造と構成を詳細に調査分析することにより、それらの空間が立地している環境の、住宅地内における相対的な価値を評価した。なお、この場合の価値には植生の自然科学的な価値に加え、それらを媒介として成立する居住者・地域コミュニティにとっての社会的な価値が含まれる。この段階において大型の出力機器と地理情報システムの活用が極めて効果的であった。(3)影響の回避と軽減のためのモデルの検討計画されている建て替え事業のプログラムを前提として、事業の実施に伴う緑の環境ストックへの影響を回避もしくは軽減することのできる住棟の配置計画、動線計画、施設配置計画等の代替案を提案した。さらにそれらの比較検討を行うことによって、影響の回避、軽減を実現するための条件を抽出したうえで、それらのモデルとして構築した。平成17年度はデザインモデルの構築を目的とし、事例調査結果から実際にデザインを実施した。平成16年度に実施した作業を通じて得られた成果から、自然環境再生・復元のしくみとプロセスを、視覚をはじめとする人間の五感を通じて認識されるものに置き換えるデザイン手法を検討し、いくつかのデザインモデルの代替案として提示した。上記の活動の集大成として、一般化されたデザインモデルと論理的骨子の提案を含む「集合住宅立て替えにおける自然環境再生・復元に関するデザインデータベース」の実働を目標としたが、今年度はその基本的な構造を構築するにとどまっている。このデータベースは、前年度の活動経過およびその過程で蓄積された情報の公開を縦軸に、それに関連して入手した諸資料の整理・分析を横軸とするものになる予定であり、継続して研究をすすめるための展望が得られたものと考えられる。
視覚表象における「リアル」の研究

本研究は、日本、英米圏、フランス、ロシア(ソ連)等で蓄積されてきた記号論的分析の成果をもとに、視覚表象が優越する芸術諸ジャンル(絵画、写真、映画、マンガほか)とその周辺領域における「リアル」の意義と機能を明らかにすることを目的として実施された。その目的を達成するため、山形大学人文学部人間文化学科の、特に芸術、表象文化論、視覚表象の理論に関わる研究に携わっている6人の研究者がそれぞれの課題にしたがって分担しつつ、共同で研究をすすめた。その中で、阿部宏慈は主としてドキュメンタリー映画における表象不可能性の問題と「リアル」の概念をめぐる理論的研究と分析をおこなった。中村三春は、映画と文学における「リアル」の表象の問題をむしろフィクション映画を対象として研究した。大河内昌は、英国十八世紀におけるピクチャレスクの美学とリアルの問題の理論的研究をおこなった。清塚邦彦は、写真における「リアル」の問題を、ウォルトンの哲学的分析を中心に研究した。阿部成樹は、ダヴィッドの「マラーの死」をはじめとする新古典主義絵画における「リアル」の表象を研究した。さらに、中村唯史はマンガにおける「リアル」の問題を、特に最新の理論的成果をもとに研究した。如上の研究を通じて、「リアル」の表象に対する基盤を異にするアプローチを突き合わせることによって、表象をめぐる学際的な研究の可能性が開かれたことが何よりも大きな成果である。表象文化論のアプローチを絶えず純理論的な枠組と芸術史に基づく正確な理解に照らしつつ検証することで、分析の精度を高めることができた。平成16年度は、研究の第一年次にあたり、視覚表象における「リアル」の問題を研究するための資料(日本映画およびドキュメンタリー映画を中心とするヴィジュアル・ソースおよび絵画、写真、マンガに関する理論的研究文献資料)を収集した。また、研究分担者のうち三名が、それぞれ関係の研究会等に参加し、発表をおこなうなどして、理論的考察を深めた。研究分担者は、それぞれの課題に関して研究をおこなった。その成果は、スケジュールに基づいて、下記の研究会において報告され、共同討議に供せられた。研究会は、第一回(4月22日)、第二回(12月7日)、第三回(3月8日)と三回にわたり開催された。第一回の研究会においては、各研究分担者の研究対象となる領域に関する研究実施の具体的なスケジュールを決定し、「リアル」の問題にかかわる基本的な研究の方向について議論をおこなった。第二回の研究会では、大河内昌が、「趣味の基準について-デイヴィド・ヒュームの美学イデオロギー」のタイトルで報告をおこない、引き続いて討論をおこなった。また、阿部宏慈が、「表象不可能性」と「リアルなるもの」の問題について:ディディ=ユベルマンImages malgre toutをめぐる論争を中心に」と題して報告をおこない、ひきつづき討議をおこなった。3月8日には中村唯史が「日本のマンガにおける視覚表象・言語表象」と題して報告をおこない、討議をおこなった。大河内が主としてヒュームの美学イデオロギーに関して理論的研究を進めた成果を提示したのに対して、阿部および中村は、それぞれドキュメンタリー映画とマンガの理論的研究の問題点と可能性を検討した。さらに、次年度に向けて、他の研究分担者の提示した課題や、問題について引き続いて研究を進行することとなった。本年度は、それぞれの研究分担領域において関係資料の収集と各分担主題ごとの研究をおこなった。阿部宏慈は、ドキュメンタリー映画に関する理論的研究を進めるとともに、10月に開催された山形国際ドキュメンタリー映画祭に参加し作品研究をおこなうとともに、映画作家、研究者らとの討議を通して、試料および情報の収集をおこなった。中村三春は、宮澤賢治その他の言語テクストとそれを原作とした映画との対比研究を行うとともに、賢治の「風〔の〕又三郎」についての研究を収録した単著を刊行した。

大河内昌は、この間の研究成果に基づき、日本ジョンソン協会第38回大会シンポジウム「18世紀イギリス文学におけるスコットランド問題-国家と小説の確立」(5月23日)において「リチャードソンと道徳哲学」と題して報告をおこなった。清塚邦彦は、絵画作品の分析を行なう場合に虚構概念がどのような意味と役割を持ちうるかについての予備的な分析を継続し、6月の研究会において「絵画と虚構」と題して報告をおこなった。阿部成樹は、同研究会で画家にとっての「リアリティーの変容」としての旅というテーマで報告をおこない、その成果は「横断と遡行-18世紀フランスの画家たちとイタリア」小佐野重利編著『芸術家の糧としての旅』(仮題)として三元社より刊行予定である。中村唯史はロトマン・バフチン・ヴィゴツキイなどのソ連記号学の継承者・同伴者の理論を、マンガ・ジャンルの分析に適用する試みを中心に研究を行った。また、この間、4月21日に昨年度の研究の総括と、全般的な討議をおこない、今年度の研究計画を策定するための研究会を開催した。さらに6月8日、12月27日に、本年度第二回、三回の研究会を開催し、清塚邦彦、阿部成樹、中村三春が研究報告をおこない、引き続きそれにもとづいて討議をおこなった。平成18年度は、研究の第三年次にあたり、前半期(4月9月)は引き続き資料、(ヴィジュアルソース、文献資料など)収集をおこない、関係学会などにおいて、理論的な探究に関する情報の収集を行うなど基盤整備をおこなった。そして、9月13日には、研究会を開催し、各領域における成果の発表と、現在までの研究のまとめ、今後の展開のための討議をおこなった。その討議と検討の過程で、新たな研究課題としての「アクチュアル」という論点が浮かび上がってきた。しかし、その検討は、本研究費の枠組の中では十分に展開をなし得ないものであることが確認されたので、これについては、さらにあらたな研究計画に基づいて研究を進めることとなった。さらに、この研究費で得た資料等の整理と共同使用のための整備をおこなった。研究代表者および研究分担者のうち三名が、それぞれ関係の研究会等に参加し、発表をおこなうなどして、研究の成果の公表と、他の研究者グループとの討議などをおこなった。阿部宏慈は、日本フランス語フランス文学会東北支部大会においてディディ=ユベルマンのle visuelの概念を中心に表象の禁止と表象不可能性の問題をめぐって特別発表をおこなった。中村三春は、立命館大学で開催された日本文学シンポジウムで視覚性と日本文学の問題をめぐって発表をおこなった。清塚邦彦は、東北哲学会においおて、ウォルトンの写真論をめぐって、「写真とメディア」と題する提題をおこない、本研究の成果の一端を公表した。これらの成果は、現在編纂中の研究成果報告書として公開する予定である。
日本版ガイドスター作成によるNPO外部評価指標作成に関わる実証研究

中間支援組織が持つNPOの活動実態のデータをもとに、NPOの外部評価指標を作成することを検討した。この目的を達成するために、全国の中間支援組織260団体に対してアンケート調査を実施し、同時に数団体に対してインタビュー調査を実施した。その結果、中間支援組織が持つNPOの活動実態データをNPOの外部評価指標として活用することには問題があるという結論が得られた。その代替の提案として、中間支援組織が自ら構築できる、NPO外部評価シートのひな型を作成し、全国の中間支援組織に対して提案を行った。新しいNPOの外部評価指標の検討に向けて、本年度は以下のような内容を検討した。まずは、日本のNPO評価に関して第一人者的立場で活動してきたNPO法人コミュニティ・シンクタンク「評価みえ」のメンバーと、今回検討している中間支援組織の把握するアクティビティデータを用いた外部評価の考え方についてディスカッションを行った。おおむね、内容については賛同を得たが、中間支援組織の把握する活動だけがNPOの活動の大部分でないことから、団体間で適切な評価が受け入れられるか否かについてムラが出る点が指摘された。また、藤沢市市民活動推進センターのデータを精査した上で、同等のデータ収集が行われているか否かについて、実際にNPO支援を行うセンターに足を運び、状況の把握を行った。その結果、センターの運営形態(官設民営、官設官営、民設民営)によっても情報の把握状況に差があり、また現場の担当者によって得られているデータの内容にも差があることが分かった。一方、具体的な内容を示すことで、被調査者に外部評価指標のイメージを共有してもらいやすくするため、「NPO活動活性化情報シート(案)」を作成した。これは、藤沢市市民活動推進センターの収集データから、個別団体のアクティビティを定量化するのに容易な項目を選び出し作成したものである。この内容と、検討の過程については、2009年3月に名古屋大学で行われた日本NPO学会第H回大会にて発表を行った。発表に対し、コーディネーターであった法政大学の山岡義典氏や、討論者である静岡大学の日詰一幸氏から、個別の中間支援組織の情報収集の状況と、その負荷の状況を把握した上で指標設定を行う必要があるであろうとの示唆を受けた。また、これとは別途に、NPOの外部評価結果を金銭的な数値に換算する試みについても試案を2008年11月に行われたNPO活動推進自治体フォーラムにて発表を行った。21年度は、20年度のデータを踏まえ、中間支援組織の団体活動データ蓄積の状況を定量的に把握するとともに、アメリカにおけるNPO支援の状況と照らし合わせ、より実効性のある外部評価指標の作成を本格化させる。前年度研究計画に基づき、日本国内のNPOセンターと呼ばれる中間支援組織250に対して、アンケート調査を実施し、個別NPOの活動の把握状況等の実態について把握を行った。同時に、複数の中間支援組織に対してはヒアリング調査も行い、アンケート調査の内容を補足した。これらの結果は、日本NPO学会の第12回大会において発表を行っているが、基本的には中間支援組織は受動的に得られるNPOの情報については、きちんとした記録を残しているが、それらを活用する視点はあまり見られず、とくに公開して利用する、あるいは評価指標として活用するという点については懸念を抱いている実態が理解できた。また、米国のNPO先進地であるサンフランシスコベイエリアにおいて、一般市民、NPOのディレクターあるいはアウトリーチ担当者、また中間支援組織に対してヒアリング調査を行ったが、ガイドスターに代表される客観的外部評価に活用できる情報データベース等の活用が、日本で紹介されている実態とはやや異なり、あまり有効に機能しているわけではない実態が明らかになった。とくに、一般の市民はその寄付行動や、ボランティア行動の動機付けにおいて、こうした情報システムを使うことは非常に稀であり、NPO関係者においてさえ、認知度は非常に低いものであったという点は、日本のNPO研究者に広く知られるべき情報であるといえよう。これらの知見は、本研究のスキームを大きく揺るがすものであり、22年度の最終的な研究の成果の方向性を考える上で非常に重要な意味をもつものとなった。前年度までの研究の流れを受けて、22年度については、得られた結果をどのような形で社会的な財産で残すか、という点に力点をおき研究活動を行った。まず、前年度までの基本的な方向性として、中間支援組織の持つ個別NPO団体の情報について、これをそのまま個別NPOの外部評価に活用することは難しいという考え方が得られていたが、こちらについて、再度アンケート結果を精査し直し、別の分析ソフトウェア等も活用することで、再検証を行った。結果、同様の問題があることが確認された。しかし一方で、地域においてもっともNPOに関する専門性を持っていると考えられる中間支援組織が、NPOの外部評価においてなんら役割を果たさないということは不自然であり、そのことはつまりNPOの外部評価を行い、NPOの社会的信頼性を向上させようというスキームそのものを否定することにもつながってしまうため、どのような形で中間支援組織がNPOの外部評価を行うべきか、ということに焦点を当てて検討を行った。

その結果、中間支援組織が自発的にNPOの外部評価指標を検討し、NPOの評価方法について理解を深めるとともに、外部評価者としての主体性の醸成を行うことが望ましいという結論を得た。そこで、本研究3年間の集大成として、「NPOの組織評価づくりのためのワークシート」を作成し、報告書の付録資料として添付することとした。同時に、こうしたワークシートを利用するために不可欠な、NPO外部評価指標の整理のための参考資料として、継続的に協力関係にあるNPO法人コミュニティ・シンクタンク「評価みえ」より「NPO組織評価システム2001」の提供を受け、こちらも付録資料として添付した。こうして作成された報告書については、全国の中間支援組織240か所に送付を行い、NPOの外部評価に関する啓発に努めた。
グルコセレブロシダーゼ変異が誘導するα-シヌクレイン細胞毒性に関する研究

グルコセレブロシダーゼはパーキンソン病のリスク遺伝子であるものの、その変異が神経変性に及ぼす役割はいまだわかっていない。グルコセレブロシダーゼ変異型fibroblastではグルコセレブロシダーゼ活性が著しく低下していた。さらに、変異型fibroblastにミトコンドリア複合体I阻害薬を暴露するとアポトーシスが誘導され、同時にカテプシンBの活性が抑制された。カテプシンBがαシヌクレインの分解に関わっているとすれば神経変性との関わりがあるものと思われたが、αシヌクレインがカテプシンBの基質である事を証明する事は出来なかった。αシヌクレインはパーキンソン病に分子病態においてもっとも重要な役割を果たしているタンパクである。グルコセレブロシダーゼがα-シヌクレインの上流で神経変性に関わっている可能性を考え研究を発案した。【平成23年度】グルコセレブロシダーゼ変異型fibroblast(wt/wt、R120W/L444P、RecNciI/L444P, N370S/N370S, L444P/L444P)を用い、4-methylumbelliferyl-beta-D-glucopyranoside (4-MUG)を基質として測定し、変異型ではグルコセレブロシダーゼ活性が著しく低下している事を確認した。野生型と変異型グルコセレブロシダーゼfibroblastではミトコンドリア複合体I阻害薬に対する反応が異なっており、野生型がオートファジーを生じるのに対し、変異型では、オートファジー誘導が野生型ほど強くなく、アポトーシスが認められた。【平成24年度】変異型fibroblastにおいて、オートファジー誘導を試みると、rapamycinではcaspase-3のcleavageが減弱し細胞保護的に働いた。変異型fibroblastではカテプシンBの発現・活性ともに誘導が抑制されていた。さらに、免疫沈降法によってグルコセレブロシダーゼとカテプシンBとのinteractionがみられた。以上の結果より、グルコセレブロシダーゼの変異はカテプシンBの活性を減弱させる事によって細胞毒性を発揮するものと考えられた。グルコセレブロシダーゼ変異型fibroblast(wt/wt、R120W/L444P、RecNciI/L444P, N370S/N370S, L444P/L444P)に、ミトコンドリア複合体I阻害薬であるrotenone, MPP+を暴露したところ、変異型ではより強くcaspase-3依存性の細胞死が誘導された。一方で、培地からブドウ糖・fetal bovine serumを除くことによりstarvation負荷をかけたところ、変異型においてより強いLCIII-2がウェスタンブロットで確認された。このことからオートファジーが誘導されているものと考えられた。グルコセレブロシダーゼはライソゾームで機能するタンパクであることから、他のライソゾーム関連タンパクについても同時に検討を行った。カテプシンD, Lではそれぞれ断片化がみられたものの、野生型と変異型では差がなかった。しかし、カテプシンBの断片化(=活性化)は変異型において有意に強くみられた。カテプシンB基質を用いた酵素活性測定においても同様の結果が得られた。さらに、カテプシンBの断片化は、オートファジー阻害薬で抑制することが可能であった。これらの結果より、グルコセレブロシダーゼ変異を持つ細胞はオートファジーにおいて脆弱性を持つ事、さらにこの過程においてカテプシンBが関与することが明らかとなった。今後、カテプシンBの機能をより詳細に解析する事によりグルコセレブロシダーゼ変異のもたらす細胞毒性が明らかになると思われる。当初の予想とは異なる実験結果が得られたが、実験方法の一部変更によっておおむね順調に進んできているため。カテプシンBとα-シヌクレインをHEK293TおよびSH-SY5Yに共発現させる。このとき、α-シヌクレインのセリン129のリン酸化が生じる事をウェスタンブロットにてWAKO社およびEPITOMICS社の抗リン酸化シヌクレイン抗体にて確認。さらに長期間(5-7日間)の培養を行い、細胞内凝集体が出現することを免疫組織化学法にて、細胞死が生じる事をcleaved caspase-3抗体などを用いたウェスタンブロットにて確認する。また、グルコセレブロシダーゼ-カテプシン経路はグルコセレブロシダーゼを始点として考えているが、カテプシンBの活性化が他のリスク遺伝子(LRRK2、BST1など)によっても生じるかどうかをこれら細胞に発現させ同様の検討を行う。

次いでカテプシンBに対する阻害剤およびsiRNAを用い、グルコセレブロシダーゼ-カテプシン経路を抑制する実験を試みる。このときにα-シヌクレインのリン酸化、および細胞内凝集体形成が減弱するかを確認。さらに細胞死が抑制される条件を見出していく。以上から、グルコセレブロシダーゼ-カテプシン経路が神経変性に関わっており、さらに本経路の抑制が細胞保護的に作用することを証明する。ウェスタンブロットに必要となる試薬一式、各種抗体等の消耗品の購入、学会発表への旅費、さらに論文投稿料として使用する。
蛋白質の立体構造形成反応の分子機構に関する共同研究

蛋白質の立体構造形成の機構を明らかにすることは、蛋白質の構造や機能を理解する上で最も基本的かつ重要な課題である。更に最近では、蛋白質の機能自体、あるいは病気(例えばプリオン病)が蛋白質のフォールディングに密接に関連した例も明らかとなってきており、その重要性は一層高まっている。本研究では、同問題に関して独創的な研究を展開しているKim教授を中心として、さらに数名の著名な国外研究分担者を加え、多面的かつ相捕的な共同研究を実施した。各自が独自の手法で研究を行なうと共に、相互訪問して共同実験や討論を行った。更に、国内外の学会などを通じて積極的に交流した。次の成果を得た。1.モルテン・グロビュール(MG)状態はコンパクトで多くの二次構造を含む中間的構造であり、構造形成反応の主要な中間状態と考えられている。しかし、詳細は明らかではない。MG状態の構造安定性とその役割は、研究分担者の共通の課題である。X線溶液散乱や、核磁気共鳴、熱測定をはじめとするさまざまな物理化学的手法を用いて、MG状態の構造と安定化機構や、構造形成反応における役割を研究した。その結果、現在、MGと呼ばれる構造は3種類に分類できることを示した。すなわち、1)シトクロムcに代表されるMGでは、分子の慣性半径は30%程度も増加しているが、全体としては球状である。2)アポミオグロビンに代表されるMGは、規則的な構造をとるコアの領域と、よりほどけた領域の2つから構成される。3)αラクトアルブミンに代表されるMGでは、ジスルフィド結合によって分子の慣性半径はネイティブ構造に比べて10%程度しか増加しておらず、球状性も保たれている。いずれのタイプのMGにおいても、疎水的相互作用が構造安定化に重要であるが、その程度はさまざまであり、ネイティブ構造に比べると弱い。これらの結果から、従来、MGとしてまとめて取り扱われていたものの実態は、最初に提案されたMGの定義とかなり異なるだけでなく、お互いにも、相当に多様であることが明らかとなった。2.βラクトグロブリンは、ネイティブ構造が主にβシートからなるにもかかわらず、αヘリックス形成傾向の強い蛋白質である。すなわち、蛋白質の立体構造の安定化には、局所的相互作用と、非局所的相互作用が働くが、βラクトグロブリンは、両者の二次構造傾向が大きく異なる興味深い例である。遠紫外領域ストップトフローCDを用いて、βラクトグロブリンのフォールディング反応を調べた。その結果、フォールディング反応の途中に、ネイティブ構造には存在しないαヘリックスを含む中間体が過渡的に蓄積することを示した。更に、変性平衡実験を行い、速度論的実験で観測されたαヘリックス中間体が、平衡論的にも蓄積することを示した。これらより、フォールディングの途中で、まず、局所的相互作用によってαヘリックス中間体が形成され、最終的には非局所的な相互作用によってβシート構造が安定化される、「非階層的構造形成反応」の存在することを提唱した。βラクトグロブリンで見られたαヘリックスからβシートへの転移と同様な現象が、プラズミノゲン活性化因子インヒビターやプリオン蛋白質などでも見つかっている。βラクトグロブリンのフォールディング機構の詳細を明らかにすることは、より一般的な構造形成原理を理解する上で重要を考えて、現在も継続して研究を行っている。3.分子シャペロンの作用機構を明らかにすることは、現在、蛋白質のフォールディング反応研究の重要な課題となっている。シトクロムcいくつかの構造状態を基質として、大腸菌の分子シャペロンGroELの基質認識機構を研究した。その結果、GroELは、基質蛋白質に存在する「水に露出した疎水性基クラスター」を認識して結合することを示した。また、疎水的相互作用が結合の駆動力であるが、静電的相互作用によって大きく影響されることを示した。更に、このような結合様式が、リン脂質膜と蛋白質との相互作用に類似していることを提案した。次の成果を得た。