hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎盤バリア制御機構の解明を目指したマイクロ流体システムの構築

ヒト胎盤バリアの構造・機能をマイクロ流路内に再構築するため、適した細胞および足場材料について検討を行った。その結果、ヒト栄養膜細胞株であるBeWo細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮(HUVEC)およびガラス化コラーゲン薄膜(ビトリゲル)を用いることで、極性のあるバリア構造を2つのマイクロ流路間に安定して構築することができた。作製したデバイスを用いて潅流培養を行うと、構築したバリア構造において微絨毛が誘導され、流路間での物質移行量も変化した。さらにこれらの現象は、流体シェアストレスによって活性化されるカルシウムイオンチャネルの作用を介して制御されていることを分子レベルで明らかにした。母体と胎児の循環系を隔てる血液ー胎盤関門(胎盤バリア)は、胎児の生育に必要な栄養因子の供給や代謝産物の排出を担う透過障壁として重要な役割を果たしている。この胎盤バリアは、母体血流による流体せん断力に晒されているにもかかわらず、胎盤における物質透過性は、現在主にトランズウェルなどを用いた静置培養系により評価されている。本研究では、マイクロ流路内に胎盤バリア様構造を再構築し、流体シェアがこれらの構造や機能にどのような影響を与えるかを解析することを目的とする。初年度は主に流体デバイスの作製とその評価について取り組んだ。母体および胎児循環系を模した2つのマイクロ流路間に厚さ10umのガラス化コラーゲン薄膜を配置し、ヒト胎盤由来栄養膜細胞株BeWo細胞を単層培養することにより、物質透過アッセイが可能な胎盤オンチップデバイスを作成した。流体シェア存在下で培養した細胞コンストラクトの胎盤バリアとしての構造・機能評価を行うため、走査型電子顕微鏡観察、villinやグルコーストランスポーターGLUT1等の免疫染色およびグルコース取込みアッセイを行った。その結果、潅流培養環境下においては生体内と同様に著しい微絨毛の形成、GLUT1の微絨毛側への局在化が観察され、それにともなってグルコースの胎児チャネル側への輸送が増大していた。これらの現象は、静置培養系では全く認められないことから、胎盤バリア構造および機能は母体血流によるせん断力により制御されている可能性が示唆された。また、従来の評価系で用いられていたポリエステル細孔膜を足場材料として用いた場合、GLUT1の局在化は認められず、流体シェアによるグルコース輸送量増加も観察されなかった。これらの結果から、本システムは、妊婦における薬物の胎盤通過性を流体シェアの観点から評価可能な新たなプラットホームとして有用であることが示唆された。本研究では、初年度において、胎盤由来細胞株BeWo細胞とマイクロ流路を組合せて胎盤バリア機能を模倣したマイクロ流路デバイスを作製した。作製したデバイスを用いて流体シェアストレスをBeWo細胞に負荷しながら培養すると、構築したバリアにおいてグルコースの透過性向上や微絨毛の誘導が起こることを見出した。そこで最終年度は、流体シェアストレスによる微絨毛誘導のメカニズムついて分子レベルでの解析を行った。Fura2-AMを用いたカルシウムイメージングを行い、流体シェアストレス負荷前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を調べたところ、フローによる顕著なカルシウムイオン濃度の上昇を認めた。流体シェアによる微絨毛の形成は、カルシウムキレート剤であるEGTAやBAPTA-AM存在下では著しく阻害されることから、微絨毛の誘導には流体シェアストレス応答性のカルシウムイオンチャネルが関与していると考えられた。胎盤バリアを形成する合胞体栄養膜細胞は、種々のカルシウムイオンチャネルを発現するが、なかでもカルシウムイオンに高い親和性を有するTRPV6(Transient receptor potential, vanilloid family type 6)は、BeWo細胞においても発現が認められた。そこで、siRNAによりTRPV6をノックダウンしたところ、流体シェア応答性の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が有意に抑制され、微絨毛関連因子であるEzrinやEBP-50の発現レベルがそれぞれ、54%、60%にまで低下した。以上の結果から、TRPV6が流体シェアストレスによる微絨毛形成に関与していることが示唆された。本研究で考案したorgan-on-a-chipデバイスにより、胎盤バリアの流体シェアに対する応答性を初めて明らかにし、その分子レベルの一端を突き止めることができた。細胞生物学、分子生物学本年度予定していたデバイスの作製・評価については予定通り終了した。また、次年度に予定していた機能評価実験についても、一部すでに結果を得ている。なかでも、流体シェアによる微絨毛の誘導についてはこれまでに報告例がなく、非常に興味深い現象である。これまでの研究成果は、2014年3月に京都で開催された日本再生医療学会にて口頭発表を行った。流体シェアに反応してBeWo細胞が微絨毛を誘導するという初年度の知見は、胎盤輸送機構を理解するうえで新たな視点を与えることが予想される。

胎盤バリア細胞は微絨毛に様々なトランスポーターを局在化させることにより物質の取り込みや輸送を行っているため、微絨毛誘導または微絨毛へのトランスポーターの局在化の分子機構の解明は、胎盤バリア制御機構の理解に大きく貢献できると思われる。したがって、胎盤バリアデバイスを用いて様々な刺激に対するバリア細胞の応答解析を中心に行う当初の計画を一部変更し、流体シェアによる微絨毛誘導の分子メカニズムに焦点を絞って、今後の研究を展開していく。次年度(最終年度)に予定していた低酸素状況下での培養実験に備え、CO2/O2インキュベーターを備品費として計上し支払い請求を行ったが、当初の計画を変更し、流体シェアによる微絨毛形成機構の解析を中心に計画を進めることにした。そのため、予定していた備品の購入を見送ることになり次年度使用額が生じた。これまで灌流培養をするために必要なポンプなどは代表者が所属する研究室に既に配備されているものが使用可能であった。しかしながら、次年度からの所属機関変更にともない、ポンプ類の購入が必要となったため、当該助成金はそれらの購入に当てる予定である。
重金属化合物負荷を認識する蛋白の同定と機能の解析

平成4年度にウシ脳よりセレノプロテインPに類似性を示すクローンを得たと報告したが、配列解析の結果、セレノシステインを12個含む他、ホメオボックス蛋白のような形態形成を司る蛋白に認められるproline-hisitidineの繰り返し配列を含んでいることが明かとなり、従来報告されていたセレノプロテインPとは異なる新たな蛋白をコードしていた。しかもmRNAの発現は嗅脳、海馬、小脳皮質に局在しており、この新しい蛋白も形態形成に関与している可能性が考えられたので、神経の形態発生との関与について検討中である。又、小脳に局在することから、有機水銀の神経毒性に拮抗作用を示すセレンの作用点である可能性も考えられたので、現在遺伝子発現制御について検討中である。遺伝子制御の研究では他にも、脳におけるメタロチオネイン遺伝子制御について報告した。引き続き、脳の部位毎に発現が異なるか否かについて検討中であり、少なくともCd負荷で脳幹部では発現が惹起されないことを見いだしている。また、オステオネクチンmRNAの発現が、Cd負荷により臓器ごとに異なることを見いだし、現在量一反応関係を検討している。一方、骨芽細胞化することでカルシトニン応答性が細胞に生じ、分化、増殖の方向に遺伝子制御されることを報告した。さらに、がんの分化度に応じてオンコジーン蛋白mRNAの発現が変化することを見いだし、症例を集め、さらに検討中である。
医療行為や食品等によるアルツハイマー病の伝播あるいは発症促進に関する研究

アミロイドβ蛋白(Aβ)あるいはそれ以外のアミロイド蛋白凝集体を投与することによってAβ凝集が促進されるかを検討した。Aβばかりでなく、αシヌクレイン蛋白、フィブロイン、セリシン、アクチン、カゼイン等の線維断片は試験管内でAβ40及びAβ42凝集を促進した(cross-seeding効果)。これらの蛋白凝集体はアルツハイマー病発症を促進する可能性があり、モデル動物への投与実験が進行中である。本年度は、アミロイドβ蛋白(Aβ)以外の蛋白として主にαシヌクレイン(αS)を用い、αS凝集体がAβ凝集に及ぼすin vitroの効果についてAβ凝集体を対照として検討した。Aβ40、Aβ42およびαSの凝集体を試験管内で作成し、超音波破砕してシーズとして用いた。それらのAβ凝集に対するseedingあるいはcross-seeding効果をチオフラビンT蛍光法(ThT)および電子顕微鏡等を用いて試験管内Aβ凝集系で検討した。その結果、Aβ40、Aβ42のみをpH7.5、37°Cでインキュベートしたところ、ThTの蛍光値はラグタイムを伴うシグモイドカーブを描いて増加した(重合核依存性重合反応)。超音波破砕されたAβ40、Aβ42線維(シーズ)を加えた所、ThTの蛍光値は、ラグタイムなく、速やかに増加した(seeding効果)。一方、超音波破砕されたαS線維をシーズとして加えた所、ThTの蛍光値は、Aβ40、Aβ42線維シーズを加えた反応以上に速く増加した(cross-seeding効果)。本研究により、Aβ凝集体によるseeding効果ばかりでなく、αS凝集体がcross-seeding効果を発揮してAβ凝集を促進することが明らかになった。医療行為等によってレビー小体病(パーキンソン病やレビー小体型認知症)患者等に由来するαS凝集体が侵入した場合、Aβ凝集を促進することによってアルツハイマー病の発症を促進する可能性がある。来年度は、現在検討中の食品や化粧品として吸収される可能性がある蛋白凝集体のcross-seeding効果についてのin vitroの実験をさらに進展させる。さらに、これらのin vitro実験の結果に基づき、in vitro実験の計画をプロトコール作成から進行させる。本年度は、アミロイドβ蛋白(Aβ)蓄積を特徴とするAlzheimer病(AD)において、プリオン病と同様に、微量のAβあるいはAβ以外のアミロイド蛋白凝集体が外来性に投与されることによってAβ凝集が促進されるか否かを検証することを目的に以下の研究に取り組んだ。成果は以下の通りである:(1)試験管内Aβ凝集系を用いた研究:Aβ(Aβ40、Aβ42)、Aβ以外の蛋白(α-シヌクレイン蛋白(αS)、シルク)の凝集体のseeding効果を検討した。本年度は、シーズとしてAβ及びαSオリゴマーと超音波破砕されたシルク(フィブロイン)線維を用いた。Aβ40、Aβ42のみをpH7.5、37°Cでインキュベートしたところ、チオフラビンT(ThT)の蛍光値はラグタイムを伴うシグモイドカーブを描いて増加した(重合核依存性重合反応)。一方、超音波破砕されたAβ40、Aβ42およびαSのオリゴマーを加えた所、ThTの蛍光値はラグタイムなく速やかに増加した。オリゴマーのseeding効果は、AβおよびαS線維に比べると弱かった。また、超音波破砕されたシルク線維もcross-seeding効果を示した。昨年度及び本年度の研究によって、Aβ線維形成において、Aβ線維・オリゴマーばかりでなく、Aβ以外の蛋白凝集体(αSの線維・オリゴマー、シルク線維)もシーズとして作用することが明らかになった。(2)ADモデルマウスを用いた研究:ADモデルマウスにシルク線維を中枢神経系及び末梢より投与し、Aβ蓄積促進効果を検討する研究プロトコールを作成し、マウスの定位脳手術の実験装置を設置するなどの準備を進めた。In vitro実験のデータは、AD以外の蛋白凝集性疾患、あるいは食品、化粧品などに含まれる凝集性蛋白によってAD発症過程が促進される可能性を示唆する重要な成果である。脳のアミロイトβ蛋白(Aβ)蓄積を特徴とするAlzheimer病(AD)はプリオン病と同様のメカニズムによって伝播する可能性がある。微量のAβあるいはAβ以外のアミロイト蛋白凝集体を外来性に投与することによってAβ凝集が促進されるか否かを、ADモデルを用いて検討した。(1)試験管内Aβ凝集系モデルを用いた研究(山田/小野):平成24年度はセリシン、アクチン、カゼイン、膵ラ島アミロイド蛋白(IAPP)の凝集体のAβ凝集に対するseedingあるいはcross-seeding効果をチオフラビンT蛍光法(ThT)および電子顕微鏡等を用いて試験管内Aβ凝集系で検討した。

シーズとして、試験管内で形成させた各蛋白線維を超音波破砕したものを用いて、それらのAβ40およびAβ42線維形成促進効果(seeding効果)を評価した。超音波破砕されたセリシン、アクチン、カゼイン、IAPPの線維を加えた所、ThTの蛍光値は、ラグタイムなく、速やかに増加した。Seeding効果の強さは、Aβ40、Aβ42ともにアクチン>セリシン≒カゼイン≒IAPPであった。以上の結果から、セリシン、アクチン、カゼイン、IAPPといった蛋白由来のアミロイド線維がAβ40およびAβ42凝集系においてシーズとして作用することが明らかになった。(2) ADモテルマウスを用いた研究(山田) :外来性に投与されるシルク蛋白などがAD発症を促進するか否かを明らかにするために、Aβ、フィブロイン、カゼイン等の蛋白凝集体を複数のルートからADモデルマウスへ投与する実験を開始した。海外共同研究者のチュービンゲン大学のJucker教授と共同で、R1.40マウスをブリードしホモ接合体マウスを準備した。2013年3月、金沢大学動物実験委員会及び遺伝子組換え実験安全委員会から本実験に関する承認を得て実験を開始した。試験管内Aβ凝集系を用いた研究は順調に進展し、論文投稿段階に至った。ADモデルマウスを用いた研究は、試験管内Aβ凝集系の研究結果に基づき実験計画を立てるため開始までに時間を要しているが、試験管内でcross-seeding効果を確認できた外来性の蛋白凝集体を用いるインパクトのあるプロトコールを作成することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、試験管内Aβ凝集系では、他の外来性の蛋白として、セリン、アクチン、カゼイン等の凝集体のcross-seeding効果を検討する。また、遺伝子改変AD動物においてcross-seeding効果を調べる研究を推進する。
パノスコピック形態制御された希土類物質の高圧力誘起電磁物性

本研究は希土類元素が持つf電子の特異な性質に着目し、圧力、磁場、低温(および高温)を同時に印加したいわゆる複合極限環境を実現する事によって固体の持つ電子相関の大きさを制御し、新奇物質及び物性の探索を行うことを目的とした。本研究によって層状希土類化合物における圧力誘起超伝導の発見、特異な磁気秩序の圧力依存性の解明、新しい希土類化合物の高圧合成および希土類を含んだナノ層状多層膜の巨大磁気抵抗の物性を明らかにした。本研究は希土類元素が持つf電子の特異な性質に着目し,圧力,磁場,低温(および高温)を同時に印加した,いわゆる複合極限環境を実現する事によって電子相関の大きさを制御し,新奇物質及び物性の探索を行うことを目的とした.得られた主な成果を以下に示す.1)反強磁性層状化合物CeTM_2(T :遷移金属, M : Si, Ge)の電子物性は圧力によって制御され量子臨界点や巨大磁気抵抗の存在を明らかにした.またT=Pt, M=Siにおいては圧力誘起伝導相を発見した.2)反強磁性層状体心正方晶CeAu_2Si_2のT_N(反強磁性転移温度)の圧力変化量は小さく,その磁性の機構解明が困難であった.詳細な輸送現象,熱物性の測定結果を解析することによって1GPa程度の圧力までT_Nは上昇し,それ以上で減少する事を明らかにした,この反強磁性の圧力効果は,磁気秩序にともなった異方的な線熱膨張に起因することを示した.3)立方晶CeIn_3の高圧相の探索を行った.常圧下で合成されたCeIn_3(γ-CeIn_3)では, Ceは+3価の状態でInに固溶するが,高圧下では+4価の状態で固溶する可能性があり,高圧下(3GPa)での溶融によってCeIn_3の高圧相(α-CeIn_3)を作成した.作成したα-CeIn_3はT_Nが消失するなど,その物性がγ-CeIn_3とは異なる事が明らかにした.4)巨大磁気抵抗効果を利用した技術は、現代の高密度磁気ストレージを支える基盤技術である.ナノレイヤー構造を持つFe/Tb人工格子に注目した. Fe/Tbの電気抵抗は磁場によって単調に減少し, 9Tでも飽和せず,また高圧下でもその傾向は同じであった.また,常圧で9.5%だった磁気抵抗効果の大きさは圧力によってわずかに減少し, 3 GPaで10%ほど減少しFe/Cr人工格子のような磁気抵抗の圧力による増加はなかった.本研究は希土類元素が持つf電子の特異な性質に着目し、圧力、磁場、低温(および高温)を同時に印加したいわゆる複合極限環境を実現する事によって固体の持つ電子相関の大きさを制御し、新奇物質及び物性の探索を行うことを目的とした。
自己組織化単分子層を用いた多様な分子-電極接合の構築と単一分子電気伝導測定

再現性の高い単一分子の電気伝導測定を可能とすることを目的とし、金上のチオール、シリコン上Si-C結合を介した単分子層等の自己組織化単分子層(SAM)上に、合成化学的手法を用いて金属層を析出させ、構造のよく規制された金属層-SAM-金属(または半導体)基板からなる接合構造の作成法を確立した。また実際に電気伝導測定を行って電荷移動機構を明らかにした。さらにフェルミ準位付近に分子軌道を有し、多電子酸化還元能を示すルテニウム二核錯体を骨格に含むSAMを金表面上に形成し、電気化学走査型トンネル顕微鏡を用いて、分子一個ずつを識別しながら電気伝導性の評価を行った。分子の像輝度(トンネル電流の流れやすさ)は、探針、基板、分子軌道のエネルギーレベルの相対位置により変化し、軌道を介した共鳴トンネリングによる電子伝導パスが存在すると解釈した。本年度は,種々の金属-分子結合様式を有する金属層-自己組織化単分子層-金属基板からなる接合構造をウェットプロセスにより作成し、電気伝導測定を行った。具体的には以下の通りである。1.自己組織化単分子層(SAM)を用いた金属層-分子-金属基板接合の形成SAMの表面官能基への選択的な金属錯体イオンの吸着及び還元による金属層析出に成功した。具体的には、まずAu(111)上にジチオール自己組織化単分子層を形成し、その後塩化白金酸イオン([PtCl_4]∧<2->)を吸させた。続いて電気化学的に還原することでPt層を析出させた。錯体吸着時及び還元後の構造を原子間力顕微鏡によって評価したところ、明瞭な粒子形状は観察されなかったため、一様な層を形成していると期待でさる。また同様に塩化金酸イオン([AuCl_4-)を用いることで、自己組織化単分子層上にAu層の形成を行った。2.電気伝導性における分子と電極の結合状態の効果上記で作製した、Pt/自己組織化単分子層/Au(111)、Au/自己組織化単分子層/Au(111)、さらに金属層を導入していない自己組織化単分子層/Au(111)に関して、電流検出型原子間力顕微鏡による電気伝導度測定を行った。結果、金属層を導入した場合の方が伝導性は高かった。高い伝導性は金属層とチオールとの共有結合によるものと考えられる。またPt/自己組織化単分子層/Au(111)、Au/自己組織化単分子層/Au(111)を比べるとAuの方が若干伝導性が高いことを示唆する結果が得られた。これは結合の強さ(軌道の重なり)が伝導性に大きく影響することを示している。本年度は最終年度であり、当初の予定であった分子軌道が電気伝導性に与える影響を調べるため、Au(111)単結晶麺上に多電子酸化還元能を示すRu二核錯体を骨格に含む自己組織化単分子層(SAM)を構築し、電気化学走査型トンネル顕微鏡を用いて、分子一個ずつを識別しながら電気伝導性の評価を行った。基板及び探針の電極電位を変化させ、Ru錯体の酸化状態を制御しながら(Ru(III, III)、Ru(II, III)、Ru(II, II))観察を行ったところ、軌道の占有状態やトンネルバイアスの大きさ等により像輝度は大きく変化した。酸化状態の差によるRu錯体の構造変化はそれほど大きくないと考えられるため、像輝度の変化は凹凸由来ではなく、探針、基板、分子軌道のエネルギーレベルの相対位置によるものと考えられる。分子軌道が電子で占有されていないときにRu錯体は明るく見えることから軌道を介した共鳴トンネリングによる電子伝導パスが存在すると示唆される。また昨年度、Au(111)表面上にジチオール自己組織化単分子層を形成し、その後塩化白金酸イオン([PtCl_4]^<2->)を吸着・還元させることでPt/SAM/Au(111)接合構造を構築したが、基板とSAMの結合による電気伝導性の変化をみるため、Si(111)表面上にSi-C共有結合を介した分子層を構築後、同様にPt層を形成して接合構造を作成し、電気伝導測定を行った。さらにその形成過程を偏光全反射蛍光XAFSにより追跡し、錯体の吸着構造や還元後のPt層の詳細な構造を決定した。
レーザー分光法によるII-VI族化合物の格子欠陥の評価と抑制の研究

希土類イオンを添加したCaS,SrS(IIa-VIb族化合物)はカラー薄膜エレクトロルミネッセンス(EL)材料の有力な候補の1つである.しかし, CaS,SrSはイオン性結晶であり,イオウ抜け等による格子欠陥が生じ易い.本研究の目的は, CaS,SrSを用いた薄膜EL素子の性能を高めるために,レーザー分光法を用いて格子欠陥の評価を行い, CaS,SrSの薄膜成長法の確立と格子欠陥の制御の方法を見いだすことである.本年度の研究では薄膜作製方法の最適化,薄膜成長機構, EL発光機構および格子欠陥がEL特性に与える影響について検討を行った.また,レーザー分光法による格子欠陥の評価についても準備を進めた.得られた結果を以下に記す.1.高輝度ELを示す良質の薄膜を得るためには蒸着時の基板温度を400°C以上に上げ,さらにイオウの共蒸着を行う必要がある.得られた薄膜は強い配向性をもち,配向面は基板温度の上昇によって変化する.2.核成長のモデルを用いて薄膜成長機構を検討した結果,表面エネルギーの小さな面が成長し,基板温度が高くなると活性化状態にある電子数密度の小さな面では吸着原子の離脱が進み配向性が変化することを見いだした.3.CaS:Eu,SrS:Ce,K薄膜EL素子の輝度-電圧特性にヒステリシス(メモリー効果)を見いだした.メモリー効果は母体の格子欠陥が原因になっているものと考えられ,良質のCaS,SrS薄膜を得るための格子欠陥の制御と併せて検討を行う必要がある.4.CaS,SrS薄膜EL素子の励起機構は母体の格子欠陥に強く依存していると考えられる.種々の実験結果を検討し次のような励起機構を見いだした.電界によってイオン化した発光中心が伝導電子を捕獲したときに内殻電子の励起状態を生じ,その後発光する.希土類イオンを添加したCaS,SrS(IIa-VIb族化合物)はカラー薄膜エレクトロルミネッセンス(EL)材料の有力な候補の1つである.しかし, CaS,SrSはイオン性結晶であり,イオウ抜け等による格子欠陥が生じ易い.本研究の目的は, CaS,SrSを用いた薄膜EL素子の性能を高めるために,レーザー分光法を用いて格子欠陥の評価を行い, CaS,SrSの薄膜成長法の確立と格子欠陥の制御の方法を見いだすことである.本年度の研究では薄膜作製方法の最適化,薄膜成長機構, EL発光機構および格子欠陥がEL特性に与える影響について検討を行った.また,レーザー分光法による格子欠陥の評価についても準備を進めた.得られた結果を以下に記す.1.高輝度ELを示す良質の薄膜を得るためには蒸着時の基板温度を400°C以上に上げ,さらにイオウの共蒸着を行う必要がある.得られた薄膜は強い配向性をもち,配向面は基板温度の上昇によって変化する.2.核成長のモデルを用いて薄膜成長機構を検討した結果,表面エネルギーの小さな面が成長し,基板温度が高くなると活性化状態にある電子数密度の小さな面では吸着原子の離脱が進み配向性が変化することを見いだした.3.CaS:Eu,SrS:Ce,K薄膜EL素子の輝度-電圧特性にヒステリシス(メモリー効果)を見いだした.メモリー効果は母体の格子欠陥が原因になっているものと考えられ,良質のCaS,SrS薄膜を得るための格子欠陥の制御と併せて検討を行う必要がある.4.CaS,SrS薄膜EL素子の励起機構は母体の格子欠陥に強く依存していると考えられる.種々の実験結果を検討し次のような励起機構を見いだした.電界によってイオン化した発光中心が伝導電子を捕獲したときに内殻電子の励起状態を生じ,その後発光する.
IL-4 による NK 細胞を介した自然アレルギー抑制機構の解明

本研究では、申請者が先行研究で見出したIL-4誘導性NK細胞(IL4-NK)のアレルギー病態における生理的役割を解明することを目的とした。獲得免疫系、自然免疫系それぞれに起因するアレルギー性炎症において中心的な役割を果たす2種の細胞、濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)と2型自然リンパ球(ILC2)に着目し、喘息マウスモデルを用いてこれらの細胞とIL4-NKとの相互作用を解析した。TFHとの相互作用については、NK細胞に対する除去抗体を喘息マウスに注射したところ、TFHの産生するIL-4に依存することが知られている血清中のIgE量が優位に減少したことから、NK細胞が喘息病態においてTFHを抑制していることが強く示唆された。ILC2との相互作用については、IL-4過剰発現マウスから単離したIL4-NKと定常状態のマウスから単離した肺のILC2を共培養したところ、ILC2単独の場合と比較してILC2の増殖活性やサイトカイン産生が減少することが明らかになったことから、IL4-NKがILC2を直接抑制できることを明らかにした。最終年度はIL4-NKの特異的マーカーの探索を目的とし、多数の表面マーカーや転写因子の発現を通常のNK細胞とIL4-NKとで比較したところ、新たなマーカーとしてNFIL3をIL4-NKが高発現することを見出した。また、IL4-NKによるILC2の抑制作用が細胞障害性によるものであるかを明らかにするため、共培養後のILC2の生存率をPI染色により解析したところ、IL4-NKとの共培養によってPI陽性率に変化は生じないことが明らかになったため、IL4-NKによるILC2の抑制作用はIFNgなどのILC2を抑制するサイトカインを介した機構であることが示唆された。本研究は、研究代表者が見出した、代表的な2型サイトカインであるIL-4により誘導される活性化NK細胞であるIL4-NKの生理的役割の解明を目的としている。これまでの解析から、IL4-NKは過剰な2型免疫応答の抑制機構に関わることが示唆されている。そこで本年度は、IL4-NKによる抑制機構の標的細胞の候補として2型サイトカインの主要な産生細胞として知られるILC2に着目し、主にin vitroの培養実験を用いてIL4-NKとの相互作用について解析を行った。研究代表者の所属する研究室において過去に行われたRNAシークエンス解析結果から、ILC2はIL-33刺激によって、NK細胞の活性化レセプター2B4のリガンドであるCD48の発現が上昇することが示唆されていた。そこで、単離したnaive ILC2をin vitroで様々なサイトカイン刺激に供し、CD48のタンパク質レベルでの発現量を比較した。すると、IL-2単独刺激に比べてIl-33を加えることでCD48の発現が上昇し、さらにIL-33とIL-4を同時に加えることでより発現量が増加することが明らかになった。しかしながら、IL-4過剰発現マウスから単離したIL4-NKと各種サイトカイン刺激に供したILC2を共培養したところ、単純な共培養ではIL4-NKによって傷害されたILC2は検出できず、IL4-NKの細胞傷害活性の引き金としてCD48の発現上昇だけでは不十分であることが確かめられた。そこで、IL4-NKを予めIL-12で刺激し活性化させた後ILC2と共培養したところ、同刺激に供した定常状態に存在するNK細胞の場合に比べて傷害されるILC2が顕著に増加することが明らかになった。以上の結果から、IL4-NKがIL-12刺激を受け取ることでILC2の機能を抑制し、2型免疫応答の抑制に寄与する可能性が示唆された。In vitroの共培養実験によって、IL4-NKがILC2に対して直接的な抑制効果を発揮することが明らかになったことから、IL4-NKの2型免疫応答抑制機構の標的がILC2である可能性が強く示唆された。この抑制機構の詳細なメカニズムは不明であるため、次年度での詳細な解析が求められる。また、ILC2は様々なサイトカイン刺激に応じてNK細胞活性化レセプターのリガンド発現を上昇させることが明らかになった。このリガンド発現上昇の生理的意義については未解明であるが、IL4-NKは各種NK細胞活性化レセプターを高発現することが明らかになっており、ILC2抑制機構においてILC2側のNK細胞感受性亢進が重要である可能性は十分に考えられる。以上のように、in vitroの解析から、IL4-NKとILC2の相互作用について一定の知見が得られたと考えている。一方、in vivoの解析については、本年度はいくつかの喘息モデルマウスにおけるIL4-NKの誘導の有無を確かめるに留まった。寄生虫感染のように強力にIL4-NKが誘導されるアレルギー性疾患モデルマウスは見つかっていないため、次年度では喘息モデル以外にも、アトピー性皮膚炎モデルや食物アレルギーモデルなど他のアレルギー性疾患モデルを解析するとともに、1型免疫応答有意なマウスであるC57/B6系統のマウスと、2型免疫応答有意なマウスであるBalb/c系統のマウスとの違いに着目し解析するなどして、IL4-NKが誘導されるのに必要な生理的条件を明らかにしていく。また、ILC2と並んでIL4-NKの重要な抑制標的であると予想しているTfh細胞については、IL4-NKが出現する寄生虫感染マウスの腸間膜リンパ節や肺縦隔リンパ節において増加することが明らかになった。次年度はIL4-NKとの相互作用をより詳細に解析する。本研究では、申請者が先行研究で見出したIL-4誘導性

NK細胞(IL4-NK)のアレルギー病態における生理的役割を解明することを目的とした。獲得免疫系、自然免疫系それぞれに起因するアレルギー性炎症において中心的な役割を果たす2種の細胞、濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)と2型自然リンパ球(ILC2)に着目し、喘息マウスモデルを用いてこれらの細胞とIL4-NKとの相互作用を解析した。TFHとの相互作用については、NK細胞に対する除去抗体を喘息マウスに注射したところ、TFHの産生するIL-4に依存することが知られている血清中のIgE量が優位に減少したことから、NK細胞が喘息病態においてTFHを抑制していることが強く示唆された。ILC2との相互作用については、IL-4過剰発現マウスから単離したIL4-NKと定常状態のマウスから単離した肺のILC2を共培養したところ、ILC2単独の場合と比較してILC2の増殖活性やサイトカイン産生が減少することが明らかになったことから、IL4-NKがILC2を直接抑制できることを明らかにした。最終年度はIL4-NKの特異的マーカーの探索を目的とし、多数の表面マーカーや転写因子の発現を通常のNK細胞とIL4-NKとで比較したところ、新たなマーカーとしてNFIL3をIL4-NKが高発現することを見出した。また、IL4-NKによるILC2の抑制作用が細胞障害性によるものであるかを明らかにするため、共培養後のILC2の生存率をPI染色により解析したところ、IL4-NKとの共培養によってPI陽性率に変化は生じないことが明らかになったため、IL4-NKによるILC2の抑制作用はIFNgなどのILC2を抑制するサイトカインを介した機構であることが示唆された。IL4-NKとILC2の相互作用について、確認されている抑制効果がどういった因子によるものか明らかにするため、まず最も関与する可能性が高いIFNgについてその重要性を確認する。その方法として、IFNg欠損マウスにIL-4を過剰発現させ誘導したIL4-NKをILC2と共培養し、野生型に誘導したIL4-NKと比べてILC2抑制作用に違いがあるか検証する。また、IL-12以外にIL4-NKを活性化させることが明らかになっているIL-21や活性化レセプターを介した刺激を与えた場合にIL4-NKがILC2抑制作用を発揮するか否か検証し、どういった生理的条件下でIL4-NKがILC2を抑制するか明らかにする。さらに、IL-10などの他の抑制因子候補についても、ILC2抑制効果の確認できている共培養系において中和抗体を添加する実験を行い、その重要性を評価する。In vivoにおけるIL4-NKによるILC2やTfhに対する抑制効果を評価するため、IL4-NKを除去した場合にILC2およびTfhにどういった影響が出るか検証する。寄生虫感染マウスやアレルギー性疾患モデルマウスに対し、抗NK1.1抗体をIL4-NKが出現する時期に投与し、ILC2やTfhの細胞数やサイトカイン産生を定量するとともに、ムチン産生やIgE産生など両細胞による主要な表現型が亢進するかどうか確認する。また、現在取り組んでいる免疫組織染色によるILC2の検出法を確立させ、IL4-NK, ILC2, Tfhそれぞれの位置関係を明確にすることで、in vivoでの相互作用の存在を確認する。
電流および光による磁化操作の理論的研究

本研究の主な目的は,主として応用の観点より近年盛んに研究されている「電流による磁壁移動」やそれに関連した現象について,基礎物理学の観点から微視的な理論を定式化し発展させることであり、以下の成果を得た。(1)電流に駆動された磁壁のダイナミクスを,磁壁の運動方程式に基づいて詳細に解析した。2つの駆動機構である「スピン移行」と「運動量移行(=カ)」がともに働き,しかもピン止めが存在する場合を詳しく調べ,電流によるピン止め外れの機構を分類し,電流閾値や磁壁の移動速度を求め、実験と比較検討した。(2)電流が磁化に及ぼす種々のスピントルクを,一般の磁化配置に対して,伝導電子系のスピン緩和の効果をも考慮して微視的に計算する手法を開発した。具体的には,磁化の一様決態からのずれ(変位)が微小な場合に限られる方法(微小振幅の方法)と有限の場合にも適用できる方法(ゲージ場の方法)の定式化を行った。後者は,その単純な適用では減衰項が出てこないという困難があったが,本研究では,電子系のスピン緩和の効果を注意深く扱うことにより正しい結果(少なくとも,微小振幅の方法と一致する結果)が得られることを見出した。その副産物として,磁化の減衰機構について新しい物理的描像を得た。(3)円盤状の磁性体に形成される磁気渦の,電流に駆動された運動を調べた。また,実験家(京都大学化学研究所小野グループ)およびシミュレーションの専門家(電気通信大学仲谷栄伸教授)との共同研究において,交流電流による磁気渦コアの共鳴励起やコアの反転などを理論的に見出し実験的に観測した。(4)一様な強磁性状態は大電流のもとで不安定化し,磁壁や磁気渦の自発的生成が起こることを,数値的・解析的に見出した。また,生成した磁気渦対の運動を解析的に調べ,シミュレーションで見られる振る舞いが定性的に理解できることを示した。1.電流に駆動された磁壁のダイナミクスを、既に導いた磁壁の運動方程式について数値計算も交えて詳しく調べた。特に、「スピン・トランスファー機構による場合は、磁壁を動かすのに必要な電流密度はピン止めポテンシャルには依存せず、磁気異方性のみで決まる」という結果を数値的にも確認した(河野)。更に、交流電流によるピン止めはずれを調べ、論文にまとめた(多々良;現在投稿中)。2.電流密度が閾値以下でも、有限温度においては熱活性により磁壁の移動が可能であるが、スピン・トランスファー機構の場合には、移動速度の電流への依存性がユニバーサルな形をもつことを見出した(多々良;現在投稿中)。これは、磁壁の移動機構の同定に有用であると思われる。3.スピン・トランスファー機構に対するスピン散逸の効果を調べるため、Rashba型のスピン軌道相互作用の場合に摂動的に調べた(河野、多々良、柴田;現在進行中)。4.一様な強磁性状態に電流を流すと、ある電流密度以上で一様な強磁性状態は不安定化することが、海外のグループの研究により知られていたが、その結果どういう状態が実現するのか不明であった。我々は、磁壁が存在する状態は同様の不安定性が起きにくいことを見出し、電流により磁壁の生成が起こるというシナリオを提出した(柴田、多々良、河野;Physical ReviewLettersに掲載済)。5.電流による磁壁運動の理論について、基礎的なところから説明した解説を執筆した(河野、多々良)。これは、IoP Publishingより、大学院生向けの教科書として出版される予定。

6.磁壁の駆動機構を、より一般の磁化パターンに適用できるLandau-Lifshitz-Gilbert方程式の観点より見直し、電流が磁化に与えるトルクのうち「力」とみなせる部分を抽出し、新しい効果を発見した(河野、多々良、柴田;現在進行中)。1.強磁性ドットには磁気渦構造が実現することが知られているが、この磁気渦を電流により操作することの基礎理論を定式化した。具体的には、電流の下での運動を記述する運動方程式を導き、特に直流電流の下での運動を解析した(柴田、仲谷、多々良、河野、大谷:Physical ReviewBに掲載済)。2.細線における磁壁の電流駆動について、外的ピニングおよびbeta項の効果を含めて、詳細に解析した。係数betaの大きさ、ピン止めの強さ、困難軸磁気異方性の相対的な値により、電流によるピン止め外れの機構に数種類存在することを見出し、それぞれの場合に電流閾値と(ピン止めから外れた場合の)磁壁の移動速度を求めた(多々良、他:Journal of the Physical Society of Japanに投稿中)。3.電流が磁化に及ぼすスピントルクを、伝導電子系に非磁性および磁性不純物の存在する場合に微視的に計算した。非磁性不純物のみの場合はbeta項は生じず、磁性不純物の存在により有限のbeta項が生じることが分かった。これは、今まで現象論的に議論されてきたbeta項に対して、初めて微視的な計算を与えるものである。(論文準備中)。2.電流が磁化に及ぼす種々のスピントルクを、伝導電子系のスピン緩和を磁性不純物によりモデル化した簡単な場合に微視的に計算した。これは、今まで現象論的に議論されてきたbeta項に対して、初めて微視的な計算を与えたものである。(H.Kohno, G.Tatara and J.Shibata, J.Phys.Soc.Japan 75(2006)113706)。1.電流が磁化に及ぼす種々のスピントルクを、伝導電子系のスピン緩和を磁性不純物によりモデル化した簡単な場合に微視的に計算した。昨年度の仕事(微小振幅の方法)を拡張して、今年度は任意の磁化配置(変位)を扱うことのできる方法(ゲージ場の方法)を開発した。磁化の減衰機構(摩擦)について新しい物理的描像を得た。(H. Kohno and J. Shibata, J. Phys. Soc. Japan 76(2007)063710 1-4)。3.スピン移行機構に基づいたナノ・モーターを提唱した。4.京都大学化学研究所の小野グループで行われている、強磁性ドット中の磁気渦のコアを電流で駆動する実験について、代表者はその理論的側面からのアプローチを行った。
運動時体温調節への脳内プロスタグランジンの関与

運動時の体温上昇機構を解明するために、我々はこれまでにラットを用いて実験を行ない、いくつかの興味深い結果を得てきた。例えば運動時に発熱物質を投与すると、運動による体温上昇と発熱による体温上昇が加算される。また、発熱物質であるプロスタグランジン(PGE2)の合成阻害剤であるインドメタシンを脳室内あるいは皮下に投与して運動を行なわせたところ、脳室内投与時のみ運動による体温上昇が抑えられた。これらの結果は、運動時には体温の調節レベルが新たな値にリセットされること、またこれには血液-脳関門の脳側でのPGE2合成が関与していることを示唆する。今回我々は実際に運動中に脳内でPGE2が合成されているか否かを検討した。ラットに30分間の運動で直腸温が0.8°C-1.0°C上昇するような強度のトレッドミル走を行なわせ、運動終了後ネンブタール麻酔下で脳脊髄液を採取し、凍結、-80°Cで保存した。ラジオイムノアッセイキットにより脳脊髄液中のPGE2を測定した。対象群として30分間トレッドミル内で安静にしているラットからも脳脊髄液を採取し、同様にPGE2を測定した。今回の実験では、運動終了直後のラット脳脊髄液中のPGE2レベルは、運動していないラットのそれと差がなかった。脳脊髄液中においてPGE2レベルの上昇が見られなかったことから、脳組織、特に体温調節中枢である視床下部、また最近発熱に関与していると注目されている脳室周囲器官などで、PGE2レベルが上昇している可能性が考えられる。今回の実験では脳組織でのPGE2レベルを測定するには至らなかったが、今後引き続き検討していく予定である。
海藻細胞壁多糖フコイダンの生合成メカニズムの解明研究

フコイダンは褐藻類に含まれる細胞壁多糖であり、主鎖にフコース残基、側鎖にグルクロン酸残基などを有する。フコイダンの生合成機構は未だ明らかでないが、基質としてGDP-フコース、アクセプターとしてフコイダンオリゴ糖、およびフコース転移酵素が必要であると考えられる。本研究では基質であるGDP-フコースの生合成に着目して研究を行っている。平成30年度は、オキナワモズクのゲノムよりGDP-フコースの合成に関与する酵素(フコースキナーゼ/GDP-フコースピロホスホリラーゼ;FKGP)の候補遺伝子を単離し、大腸菌にて組換え酵素の作成を行った。その結果、組換え酵素の作成には成功したものの、酵素活性を検出できなかった。そこで、オキナワモズクのゲノム情報を詳細に再解析したところ、FKGPの候補遺伝子として単離した遺伝子配列は、FKGPとしてアノテーションされていたものの完全長ではなく部分配列の可能性が高いことがわかった。新たな候補遺伝子の配列はフコース結合部位やピロホスホリラーゼに必要なATP結合部位を有しており、真の遺伝子である可能性が高かった。また、フコイダンの生合成にはアクセプターであるフコイダンオリゴ糖が必要であるが、フコイダンオリゴ糖は市販されていないため自ら調製しなければならず、オキナワモズク由来フコイダンのオリゴ糖調製を行った。その結果、オキナワモズク由来フコイダンをTFAで部分加水分解し、分解物をゲルろ過クロマトグラフィーに供した結果、数種のオリゴ糖画分を得た。そのうちの一つをNMRで解析したところ、フコビオースにグルクロン酸が1つ付加された三糖であることがわかった。また、その他にフコース1モルに対し2モルの硫酸基が付加されたフコース単糖も得られることがわかった。GDP-フコース合成に関与する酵素(フコースキナーゼ/GDP-フコースピロホスホリラーゼ;FKGP)の候補遺伝子を単離し、大腸菌による組換え酵素の作成には成功したものの、酵素活性を検出できなかった。オキナワモズクのゲノム情報では、FKGPとしてアノテーションされた遺伝子は2種類存在し、その2つの遺伝子はゲノム上では連続して並んでおり、その連続した2つの遺伝子から成るものがFKGPの完全長の配列である可能性が高く、現在はFKGP候補遺伝子の完全長を新たにクローニングし、組換え酵素を作成している。GDP-フコース合成に関連する酵素の解析としてはクローニングし直したものの、ほぼ予定通り進んでいる。しかし一方で、[14C]グルコース、[14C]マンノース、または[14C]フコースのフコイダンへの取込み実験は今年度も実施出来なかった。これは、オキナワモズク藻体の培養が成功せず、同条件で生育したオキナワモズクを得られなかったことが原因である。また、オキナワモズク養殖の現場においても、H30年度は不凶作であり、実験に用いるオキナワモズクを十分に確保できなかった。以上のことから、進捗状況を「やや遅れている」と判断した。今年度はオキナワモズクの水槽での培養法を確立し、オキナワモズク藻体を常時確保できる状態とした。そのため、[14C]グルコース、[14C]マンノース、または[14C]フコースのフコイダンへの取り込み実験を行うことが可能となり、オキナワモズク細胞内におけるGDP-フコースの合成経路を明らかにできる見込みである。もしオキナワモズク藻体が確保できなかった場合は、オキナワモズクの盤状体の培養は確実に行えることから、糸状体の代わりに盤状体を用いた取り込み実験を行う予定である。また、GDP-フコースの合成酵素に関与する酵素については、既にフコースキナーゼ/GDP-フコースピロホスホリラーゼ遺伝子のクローニングを行い、大腸菌で組換え酵素を作成するためのコンストラクトを構築済みである。今後は、得られた組換え酵素を精製し、酵素活性試験を行う予定である。H29年度の計画では[14C]グルコース、[14C]マンノース、または[14C]フコースのフコイダンへの取込み実験を行う予定であったが、試験に用いるオキナワモズクの培養株が無菌ではなく、多くのバクテリアが付着していることが判明した。実験におけるバクテリアの影響を排除するためには、無菌株が必要であり、現在は無菌株の作成を行っている。取り込み実験については無菌株を得てから行う予定である。そのため、H29年度はH30年度以降の計画を前倒しし、GDP-フコースの合成に関与する酵素であるGDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼ(GM4,6D)およびGDP-フコースシンターゼ(GFS)、フコキナーゼ/GDP-フコースピロフォスフォリラーゼ(FKGP)の3種類の酵素について研究を行った。オキナワモズク藻体からRNAを抽出しcDNAの調製後RT-PCR法によりこれらの遺伝子を単離した。得られた遺伝子はGM4,6Dが0.8 kb、GFSが1.0 kb、FKGPが3.4kbであった。これら遺伝子をそれぞれ大腸菌用発現ベクターpET24aに組込み、大腸菌にて組換え酵素を作成した。得られた組換え酵素をHisカラムにて精製後、酵素活性試験を行った。その結果、GM4,6Dにおいては酵素活性が確認できたものの、GFSおよびFKGPについては酵素活性が確認できなかった。

また、フコイダンの生合成試験(次々年度実施予定)に必須のフコイダンオリゴ糖は市販されていないため、自ら調製する必要がある。そこで、オキナワモズク藻体からフコイダンを抽出・精製し、酸による部分加水分解を行った。加水分解物をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、オリゴ糖を分画・精製した。本条件にて部分加水分解を行った結果、種として8糖に相当する画分が得られた。現在、8糖に相当するオリゴ糖を調製し、構造解析を行っているところである。オキナワモズクに多くのバクテリアの付着が確認され、オキナワモズクの無菌株の獲得に時間を要することとなった。そのため、H29年度に予定していた糖の取り込み実験についてはH30年度以降に検討することとした。オキナワモズクは3月5月に収穫時期のピークを迎え、単子嚢を有する藻体を獲得できる機会は一年にこの時期の一度しかないことから、この時期は無菌株の獲得に時間を割くこととし、無菌株が得られて以降に取り込み実験を行う予定である。当初の計画ではオキナワモズクの無菌株の培養は組み込まれていなかったものの、H30年度の計画として新たに追加する。GDP-フコース合成に関与する酵素については、既にオキナワモズクから遺伝子を単離しており、大腸菌用発現ベクターの構築までを終えた。酵素活性が検出できるかが次の課題であるが、今のところGDP-フコースシンターゼ(GFS)、フコキナーゼ/GDP-フコースピロフォスフォリラーゼ(FKGP)の2種については組換えタンパク質の発現は成功しているものの酵素活性が検出出来ない状況である。そのため、発現系を変えるなど工夫し、引き続き組換え酵素の活性について検討を行う。また、フコイダンオリゴ糖の調製法についてはH29年度にある程度の進捗が見られた。フコイダンを酸で処理することで一定の決まったオリゴ糖を得ることに成功している。得られたオリゴ糖の精製まで済ませており、H30年度はそのオリゴ糖の構造を決定する予定である。これによりH30年度中にはオキナワモズク由来のフコイダンオリゴ糖の調製方法を確立出来る見込みである。得られたフコイダンオリゴ糖を用いてフコイダンの生合成試験を検討する予定である。フコイダンは褐藻類に含まれる細胞壁多糖であり、主鎖にフコース残基、側鎖にグルクロン酸残基などを有する。フコイダンの生合成機構は未だ明らかでないが、基質としてGDP-フコース、アクセプターとしてフコイダンオリゴ糖、およびフコース転移酵素が必要であると考えられる。本研究では基質であるGDP-フコースの生合成に着目して研究を行っている。平成30年度は、オキナワモズクのゲノムよりGDP-フコースの合成に関与する酵素(フコースキナーゼ/GDP-フコースピロホスホリラーゼ;FKGP)の候補遺伝子を単離し、大腸菌にて組換え酵素の作成を行った。その結果、組換え酵素の作成には成功したものの、酵素活性を検出できなかった。そこで、オキナワモズクのゲノム情報を詳細に再解析したところ、FKGPの候補遺伝子として単離した遺伝子配列は、FKGPとしてアノテーションされていたものの完全長ではなく部分配列の可能性が高いことがわかった。新たな候補遺伝子の配列はフコース結合部位やピロホスホリラーゼに必要なATP結合部位を有しており、真の遺伝子である可能性が高かった。
足場材料、成長因子及びiPS細胞を利用した術後声帯瘢痕に関する再生医学研究

喉頭組織の再生に有用な移植材料、および移植細胞・組織の実用化に向けて研究を行う。生体適合性のInjectableなゲルを骨格とし細胞の進入・生着に適した足場材料(スキャフォールド)を作製、研究する。次に、声帯の損傷後の再生促進を意図し、iPS細胞の培養法を確立する。今回は声帯損傷モデルに生体適合性足場材料および成長因子を投与し、効果を喉頭内視鏡検査を用いて観察する。不十分であると判定した場合は、iPS細胞を移植し、声帯組織を再生する技術を開発する。損傷した声帯へを移植し再生効果を評価:全身麻酔下に開口器を使用して、ウサギの声帯を露出させ、声帯損傷モデルを作成する。生体適合性の足場材料および成長因子を損傷部及び正常声帯に移植し、損傷部位における治療効果を比較した。観察期間(2週間)ののちに安楽死を施し、喉頭を摘出した。その際に、ハイスピードカメラを用いて、摘出した声帯の粘膜波動を録画し、デジタル解析を行った。解析を行った上で、音声診療に従事している医師に動画を評価させ、声帯瘢痕へ対する効果を臨床的・肉眼的にも検証した。検証の結果、生体適合性の足場材料および成長因子を投与した損傷声帯において、粘膜波動および肉眼所見の改善が確認された。更に組織像、蛋白質に関して、移植されていない正常部位とで比較し評価を行った。HE染色、トリクローム染色、EVG染色等各種染色を施行し、損傷声帯に比較し、声帯上皮の上皮化、粘膜下組織におけるコラーゲンの沈着等、著明な改善が得られた。結果として、足場材料および成長因子の投与により、声帯瘢痕の予防が確認された喉頭組織の再生に有用な移植材料、およびiPS細胞を中心とした移植細胞・組織の実用化に向けて研究を行う。今年度の実績、成果1iPS細胞中心とした細胞培養:理化学研究所バイオリソースセンターより購入したiPS細胞をフィーダー細胞上またはフィーダー細胞フリーでの状態で培養し、最も実験に適した培養方法を確認した。2足場材料の開発:生体適合性の足場材料として、Injectableなゲルを数種類準備し比較を行った。術後声帯の再生を行う上で、成長因子や細胞の保持性、声帯の局注に適した最適な条件を研究した。3声帯瘢痕モデルの開発:全身麻酔下に開口器を使用して、ラット、ヌードラットもしくはウサギの声帯を露出させ、内視鏡観察下に声帯損傷モデルを作成した。前項で得られた足場材料または成長因子を損傷部及び正常声帯に移植し、損傷部位における足場材料の適合性、異物反応の有無や、成長因子の効果を損傷組織と正常組織で比較した。結果、足場材料および成長因子の投与により、声帯瘢痕の予防が確認された。綿密に研究計画を立てているため、当初の予定通り研究は順調に伸展している。結果として、足場材料および成長因子の投与により、声帯瘢痕の予防が確認された綿密に研究計画立て、さらに研究の実行力を有しているため、研究を推進するに当たって大きな課題は認めず、当初の予定通り研究を推進する予定である。(理由)今年度は、適切に研究を遂行するため、海外含めた学術集会で知識を得ることおよび、基礎的な実験を行うことを主たる目的としたため、物品費を予定より使用しない結果となった。

そのため少額ながら、次年度使用額が生じた。(使用計画)今年度の基礎的な準備や結果を踏まえて、データの解析、必要時は更なる追加実験の実施、および研究成果を英文誌に投稿することを計画している。