hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顔面骨格の形態パターンニングを制御する分子機構

顎顔面は、胎生期に顔面突起の増殖と癒合により形成される。様々な転写因子やシグナル分子が正確かつダイナミックに伝達され、顔面突起の成長をコントロールしている。LIM homeoboxは、個体発生のボディプランとされる遺伝子群で、そのうちLhx8遺伝子は、上唇の癒合時に上顎突起と前頭鼻突起に特異的に発現することが明らかとなっている。今回われわれは、上顎突起におけるLhx8遺伝子発現のメカニズムをchick embryoを用いて、in situ hybridizationとRT-PCRを用いた遺伝子定量を行って検討した。その結果、Lhx8遺伝子は、上顎の形成に関与し、Retinoic acidやFGFを介した経路によって発現制御されていることが明らかとなった。LIM homeoboxは、個体発生のボディプランとされる遺伝子群で、そのうちL3/Lhx8遺伝子は、上唇の癒合時に上顎突起と前頭鼻突起に特異的に発現することが明らかとなっている。今回われわれは、上顎突起におけるL3/Lhx8遺伝子発現のメカニズムをchick embryoを用いて検討した。上顎突起と前頭鼻突起が癒合する前(Stage 20HH)のchick embryoの上顎突起に、各種の転写因子やシグナル蛋白を浸潤させたbeadsを埋入した。24時間後にembryoを摘出し、L3/Lhx8プローブを用いてWholemount in situ hybridizationを行った。また上顎突起からtotal RNAを抽出しRT-PCRによる定量解析を行った。Retinoic acid(RA)はビタミンA代謝物で、胎生期組織の位置決定と発育をコントロールするが、過剰投与により口唇裂口蓋裂を発症することが知られている。今年度は、上顎突起におけるL3/Lhx8遺伝子発現とRA投与による影響についてchick embryoを用いて検討した。上顎突起と前頭鼻突起が癒合する前(Stage 20HH)のchick embryoの上顎突起に、各種の因子を浸潤させたbeadsを埋入した。6,24時間後にembryoを摘出し、L3/Lhx8プローブを用いてin situ hybridizationを行った。またStage38まで発育させたembryoにAlcian BlueとAlizarin Red染色を行って、顎顔面骨格および骨形成を観察した。上顎突起にRAあるいはCitral(RA合成阻害剤)を投与すると、どちらもbeads周辺のL3/Lhx8発現が減少し上顎の劣成長と唇裂を発症した。RA、Citral投与群は、ともに上顎突起由来の骨(上顎骨、頬骨弓)の欠損もしくは形成不全を生じた。また、FGF-8bを投与するとbeads周辺にL3/Lhx8発現が増加し、SU5402(FGF inhibitor)を投与するとL3/Lhx8発現は有意に減少し、唇裂を発症した。L3/Lhx8遺伝子は、上顎の形成に関与し、RAやFGFを介した経路により発現制御されていることが示唆された。その結果、RAとCitralを作用させた上顎突起ではControl(DMSO)に比べ有意にLhx8発現量が減少した。一方、上皮由来の成長因子Fgf-8bを作用させると上顎突起でのLhx8発現量は有意に増加したが、Fgf拮抗剤SU5402を作用させると有意に減少した。なお、Beads埋入操作および上記因子による器械的な細胞障害の有無を調べるため、Nile Blue sulfhte染色、およびLyso Tracker Red(LTR)染色を行った。Beads周囲に明らかな細胞死は観察されず、Lhx8遺伝子発現の減少は、上記因子のシグナル阻害によるものと考えられた。以上の結果、上顎突起のLhx8発現は、RAもしくはFGFシグナルによってコントロールされていることが明らかになった。また、RAの至適局所濃度によってLhx8の発現が制御されていることが示唆された。
反射光が断続しても動作し続けるハイブリッドレーザ干渉型変位計

本研究では、ナノメートルオーダの相対変位計測にマイクロメートルオーダの絶対距離計測を組み合わせた、「ハイブリッドレーザ変位計」を開発する。このハイブリッド方式によって、一般のレーザ干渉変位計(相対変位計)では計測不能な「反射光が障害物に断続的に遮られる状態」においても、絶対距離計測が情報を補間することにより、高分解能を保ちつつ、計測の連続性を確保することができる。すなわち、計測器にとって重要な性能である「ロバスト性」を飛躍的に向上させることを狙う。昨年度(2017年度)までの成果として、研究開始当初にくらべシステムの設計を変更し、設計性能が向上した。本年度は、それをふまえ、システムの組み上げを試みた。しかしながら、研究途中において新たな競合する先行研究を発見した(Lay et al. Optics Letters [28] 890, 2003)。この先行研究は宇宙機のあいだにおける高ダイナミックレンジ絶対距離計測の基礎実験であり、その光学系の動作原理は、本研究におけるそれと非常に似通っており、本研究のオリジナリティが著しく損なわれることになった。そのため、研究戦略の練り直しを余儀なくされ、予定よりも研究が遅れることになった。検討した結果、本研究ではデジタル位相計を用いることで高速高精度な位相読み出しを行えることが特徴であるから、その利点を生かすよう方針転換を行うことにした。また、ロバスト性を担保することも特徴であるから、それをより強調するような実験を行うことと計画した。以上より、実験結果を得ることは来年度以降へと先送りとなった。資金を使用しないため本研究課題は本年度で一旦区切りをつけるが、来年度以降に成果へと結びつくよう、引き続き取り組む予定である。本年度は、研究計画に基づき、1絶対距離計の構築、2相対変位計の構築をすすめた。研究開始時には、LN型強度変調器による絶対距離計と、AOM周波数シフタを用いた相対変位計が分離したコンフィギュレーションであった。しかし、装置の詳細設計を進める中で、外乱の影響をより低減する必要があることがわかった。そのため、装置の耐雑音性をより高める構成を考案した。具体的には、例えば絶対距離計の信号読み出し部をスーパーヘテロダイン方式から光領域でのダウンコンバートに変更することで、RF位相変動に対する耐性をより高めることとした。その他にも、干渉計光学系部や、光源の強度変調・位相変調の方式の変更など、設計を見直した。さらに、本研究で鍵となる、デジタル位相計の研究開発も進めた。具体的には、信号同期精度を高めたり、高周波ノイズ低減のために初段のアンチエイリアシングデジタルフィルタを導入するなどした。要素部品の納期が予想より長くかかることが判明したため、装置全体としての完成は来年度に持ち越しとなったが、以上のように、設計性能を計画段階より向上させることができたという成果が得られた。要素部品の納期が想定よりも長かったため、装置全体としての完成は来年度へと持ち越しとなった。一方で、装置の詳細設計を時間をかけて見直すことにより、設計性能を高めることができた。これらより、おおむね順調に進展していると判断できる。今後は、要素部品が到着し次第、設計にそって装置を完成させる。その後、取得データの評価および2年目として計画している研究を順次実施する。
Ｊ波症候群の病態と遺伝基盤の解明および治療法の確立

J波症候群患者60名において左室心外膜側電位を記録し、その性質を検討した。また対象患者10名においても左室心外膜側電位を記録し、J波症候群患者との比較を行った。この結果、症候性のJ波症候群患者では、著明なJ波あるいはST上昇が高率に記録された。著明なJ波は体表心電図でのJ波と時相が一致し、心房ペーシングにて減高し、pilsicainideの投与で増大した。左室心外膜側電位の記録が、心電図でJ波を認める患者群での心事故発生の予測因子となる可能性が示唆された。データの蓄積に伴いこれらの研究結果を元に致死的心室性不整脈を発症した患者群と発症していない患者群との相違点を検討し、さらに検討した患者群を前向きにフォローして多形性心室頻拍・心室細動出現の予測因子を電気生理学的にそして遺伝子学的検討から同定する。またJ波症候群における多形性心室頻拍・心室細動発生の機序を解明する。J波の成因として再分極異常説および脱分極異常説がこれまで提唱されており、この観点からもJ波症候群患者を分類し、リスク層別化を検討する。そして無症状のJ波症候群において、植え込み型除細動器が必要と考えられる患者の層別化を試みた。心臓電気生理検査では、左室心外膜側・左室心内膜側を含む詳細な心室内多点同時マッピングを行い、異常電位の有無を調べ、J波の局在を検討、特に左室心外膜側電位の記録は冠静脈から逆行性に多極電極を左室心外膜側に挿入して記録し、薬物負荷、ペーシングによる心拍数の変動に対するJ波を含む局所電位の変化を検討。さらに心室細動を誘発しその発生機序に関して心外膜側心筋および心内膜側心筋から同時に電位を記録することにより検討した。心臓MRIでは、シネMRIにて壁運動低下や瘤形成などの形態的異常の有無、左右心室のサイズや機能の評価を行い、ガドリニウム遅延造影の有無により心筋傷害の有無やその部位を検討。遅延造影部位とJ波の局在部や異常電位との関連についても検討した。加算平均心電図では、fQRS、LAS40、RMS40値を測定し、心室遅延電位の有無を検討。心室遅延電位が存在する場合は、その時相の電位が心臓電気生理検査での心室マッピングで記録が可能か検討。遺伝子解析では、一過性外向きKチャネルItoやCaチャネル、Gap junction等これまでに全く報告されていない遺伝子変異の解析を行った。また採取した心筋組織については心筋炎の有無等の通常の解析に加えて、酸化ストレスの亢進やapoptosis等の有無について検討し、さらにウイルスゲノムの有無をPCR法によって同定した。またこれらの検討結果を元に致死的心室性不整脈を発症している患者群と発症していない患者群との相違点を検討し、さらに検討した患者群を前向きにフォローすることにより心室細動出現の予測因子を電気生理学的検討および遺伝子学的検討から判定した。これまでに60人以上のJ波症候群患者および10人以上の対象患者において左室心外膜側電位を記録し検討を行ってきた。致死的不整脈発生の予測因子、致死的不整脈を発生するJ波の成因・機序、心外膜側電位の特徴と心電図との関係を検討し、結果を論文や学会、研究会、招待講演などで報告している。またさらに引き続き結果を論文として現在投稿中である。またJ波症候群のみならず特発性心室細動においても同様の方法で現在不整脈基質の解明を進めている。循環器内科学現在、計60人の左室心外膜側の電位を記録し、データを解析し、一部は既に論文となっている。また現在、投稿中の論文もある。また学会等での発表、そして招待講演での発表も行っている。心臓電気生理検査は当院での既存の特殊撮影室にて行い、当院では年間150例以上の心臓電気生理学検査を行っており、また当院でのBrugada症候群に対する心臓電気生理検査は既に180例以上、そしてJ波症候群も含めれば200例以上で施行されている。また通常のmolecular biologyに必要な種々の検査、遺伝子解析、遺伝子導入とパッチクランプ法によるチャネル機能解析に必要な器材は概ね準備できている。このため研究を行う環境については十分に整っている状況である。電気生理検査の結果の解析、心筋生検組織の解析、遺伝子解析をさらに進めていく。また検討を行った患者群を前向きにフォローすることにより、致死的不整脈発生の危険因子を検討していく。

データの蓄積に伴いこれらの研究結果を元に致死的心室性不整脈を発症した患者群と発症していない患者群との相違点を検討し、さらに検討した患者群を前向きにフォローして多形性心室頻拍・心室細動出現の予測因子を電気生理学的にそして遺伝子学的検討から同定する。またJ波症候群における多形性心室頻拍・心室細動発生の機序を解明する。J波の成因として再分極異常説および脱分極異常説がこれまで提唱されており、この観点からもJ波症候群患者を分類し、リスク層別化を検討する。そして無症状のJ波症候群において、植え込み型除細動器が必要と考えられる患者の層別化を試みる。データの解析が進めば学会あるいは論文等での報告を随時行っていく。心臓電気生理検査は当院での既存の特殊撮影室にて行い、電気生理検査時に使用する心内電位記録用のシステムは既に導入されている。また通常のmolecular biologyに必要な種々の検査、遺伝子解析、遺伝子導入とパッチクランプ法によるチャネル機能解析に必要な器材は概ね準備できている。従って、今回申請する費用は電気生理検査時に使用する電極カテーテルや遺伝子解析の実験試薬などの消耗品、データ解析に必要なソフトで十分である。
妊娠高血圧腎症に起因する出生後脳障害の解明に向けた研究

1.妊娠高血圧腎症(Preeclampsia: PE)マウスモデルを施行し、その胎仔・新生仔脳における組織的変化を明らかにし、PE表現型を呈する母獣から出生した新生仔マウスにおける行動表現型についても検討する2.PE表現型マウスから出生した新生仔脳におけるミクログリアの活性化状態および機能に着目し、PEによる脳障害発生機序について明らかとする3.薬剤投与による神経細胞死の改善、および組織学的・行動学的改善効果を評価する4.PE患者の炎症性サイトカイン濃度を測定し、児の神経学的予後との相関を検証する1.妊娠高血圧腎症(Preeclampsia: PE)マウスモデルを施行し、その胎仔・新生仔脳における組織的変化を明らかにし、PE表現型を呈する母獣から出生した新生仔マウスにおける行動表現型についても検討する2.PE表現型マウスから出生した新生仔脳におけるミクログリアの活性化状態および機能に着目し、PEによる脳障害発生機序について明らかとする3.薬剤投与による神経細胞死の改善、および組織学的・行動学的改善効果を評価する4.PE患者の炎症性サイトカイン濃度を測定し、児の神経学的予後との相関を検証する
がん治療用RI多量製造及びBNCT用熱中性子高強度化のためのハーモニック加速研究

転移がんや浸潤がんなどの進行がんの治療を可能にするため、アルファ線放出核種を合成した標的剤を投与し、がん細胞に直接取り込ませて、細胞サイズと同程度の短い飛程と100keV/μm前後の高LETを有するアルファ粒子で周りの正常細胞を傷つけずにがん細胞だけをピンポイントで死滅させるアルファ線核医学治療の実用化を目指した数百μA級のヘリウムイオンビーム加速などを目的とした高強度小型加速器の要素開発研究を実施した。H30年度は、高強度イオンビームがサイクロトロンに入射した際の空間電荷効果によって生じる進行方向のビームの発散(ビーム位相幅の拡大)とエネルギー幅の増大を中心領域における位相バンチング法によって抑制するために必要とされる初期加速電圧波形の最適な勾配を明らかにすると共に、それを実現するための複数のハーモニック加速電圧成分を組み合わせた加速電圧発生用モデル共振器の設計を引き続き進めた。その結果、第1と第2加速ギャップでのエネルギー利得の差が大きくなるように基本波に重畳する第3及び第5高調波の電圧比を最適化することにより、空間電荷効果の影響を最小化できることを幾何学的軌道解析モデルによって明らかにした。これを基に試験用共振器モデルの仕様を見直し、λ/4で励振する基本波共振空洞に対して、λ×3/4及びλ×5/4モードの定在波を励振する高調波共振空洞を結合させることによって初期加速用電極にハーモニック電圧を発生しうることを示した。従来技術では、サイクロトロン内部でビーム進行方向の集束効果を生み出す方法はなかったが、本技術は初期加速におけるエネルギー利得分布の最適化により横方向と進行方向の位相空間内のカップリング効果によって進行方向の空間電荷効果によるビーム発散を抑制するユニークな手法であり、サイクロトロンにおける大強度化を実現するユニークな要素技術として価値は極めて高い。転移がんや浸潤がんなどの進行がんの治療を可能にするため、アルファ線放出核種を合成した内用薬を投与し、がん細胞に直接取り込ませて、細胞サイズと同程度の短い飛程と100keV/μm前後の高LETを有するアルファ粒子で周りの正常細胞を傷つけずにがん細胞だけをピンポイントで死滅させるアルファ線内用療法の実用化を目指した高強度小型加速器の要素開発研究を実施する。これにより、従来、数十分1時間程度かかる中性子捕捉療法の治療時間も10分以下に大幅に短縮する。H28年度は、10mA級の高強度イオンビームがサイクロトロンに入射した際に問題となる、進行方向の空間電荷力によるビーム発散を抑制するため、加速電圧波形の勾配を大きくして初期加速段階で加減速する新しい位相バンチングシステムの設計を実施した。具体的には、90°ディー電極を2台向かい合わせた条件において幾何学的な軌道解析手法を用いて位相圧縮が最小になるような中心領域の電極配置を検討し、加速ハーモニクスH=2の場合には容易に位相バンチングが実現できるものの、H=3の場合には周回する間に位相の圧縮と拡大が繰り返され、限定された電極の位置とサイズの条件でのみ最終的に位相バンチングが達成できることを示した。また、3倍波・5倍波などのハーモニック加速電圧を発生させる電極のサイズ・形状、基本波用加速電極との位置関係を変化させ、共振空洞のQ値と高調波電場が最大になる条件についても3次元高周波電場解析コードHFSSを用いて検討し、より大きな加速電圧勾配を形成するためには基本波電圧振幅の5070%の大きなハーモニック電圧を発生させる必要があることも明らかにした。サイクロトロン内部での位相バンチングは、他では実現されていない極めてユニークな手法であり、進行方向の空間電荷効果を抑制する要素技術として、ビームの大強度化には欠かせない重要な技術である。幾何学的軌道解析モデルをベースに位相バンチングの度合いを見極めながら、基本波加速電極から分離した形でサイクロトロン中心側に配置したハーモニック加速電極に大きな勾配を有する加速電圧を発生させる励振モードの解析が進んでおり、H29年度に予定しているモデル電極の製作に向けて仕様がほぼ決まりつつある。

従来技術では、サイクロトロン内部でビーム進行方向の集束効果を生み出す方法はなかったが、本技術は初期加速におけるエネルギー利得分布の最適化により横方向と進行方向の位相空間内のカップリング効果によって進行方向の空間電荷効果によるビーム発散を抑制するユニークな手法であり、サイクロトロンにおける大強度化を実現するユニークな要素技術として価値は極めて高い。基本波加速電極にパワーを供給して基本波電圧を発生させる共振空洞を製作する。設計に当たっては、加速に必要とされる加速周波数帯域をカバーできる基本波励振モード確認すると共に、加速電極のサイズに依存した寄生励振モードも注意深くチェックして最適な空洞形状・サイズ・結合位置などを決定する。製作した共振空洞を加速電極に結合させ、ネットワークアナライザーを用いてローレベル信号での励振特性を調べる。得られた結果をハーモニック加速電極用の共振空洞の設計にもフィードバックし、2つの電極、さらに対向する電極間の干渉などを検討する。位相バンチングを実現する電極サイズや形状は、サイクロトロンの加速電極の数や加速ハーモニクス、加速周波数帯域などの仕様に応じて変えなければならないことが明らかになったため、異なる条件でモデルテストを実施できるように仕様を見直し、ベースとなる共振空洞(内筒、外筒)や加速電極などの共通化を図ったことから、ローレベルテストベンチと基本は共振空洞を一括して製作することにしたため。ハーモニック加速電極ローレベルテストベンチ(加速電極、加速箱、架台など) 400千円基本波共振空洞(内筒、外筒、ショート板など)1,000千円
iPS細胞とヒト人工染色体ベクターを用いた毛細血管拡張性運動失調症の遺伝子治療

毛細血管拡張性運動失調症(Ataxia-Telangiectasia:AT)はヒト11番染色体上に存在するATM遺伝子の機能欠損により引き起こされる常染色体劣性の疾患であり、小脳失調に伴う神経変性,免疫不全や放射線感受性など多彩な表現型を示す。これまでに巨大な遺伝子を染色体レベルで搭載可能なヒト人工染色体(HAC)ベクターの開発を行い、HACベクターにATM遺伝子全長をクローニングすることで治療用ATM-HACベクターを作製してきた。本研究の目的はAT患者の死亡原因のトップを占める造血系表現型を対象とした、自己iPS細胞による遺伝子治療を行うこと、である。本研究においては、まず、ATM患者由来の培養細胞にレトロウイルスを用いてiPS細胞を誘導するため、まずSlc7a1遺伝子をレトロウイルスによりATM繊維芽細胞に導入した。次に、iPS化に重要とされる4つの転写因子(cMYC,OCT4,SOX2,KLF4)をレトロウイルスにより、上記Slc7a1導入ATM繊維芽細胞に導入した。ATM繊維芽細胞から作製できたiPS細胞(ATM-iPS細胞)をピックアップし、以下の解析を行った。1)各クローンにおいてES様の未分化マーカー(NANOG,OCT4,REX1,SOX2)が発現しているかをRT-PCR法、により確認した。2)3胚葉への分化能があるかを検討するために、SCIDマウスの精巣へATM-iPS細胞を移植し、テラトーマを形成させた。HE染色により分化能を検討したところ、3クローン中、2クローンで3胚葉への分化が確認された。来年度以降は上記ATM-iPS細胞へATM-HACを導入することで、自己iPS細胞による遺伝子治療モデル構築を目指す。
生体リズムと気分調節における機能障害の分子メカニズム

睡眠-覚醒相後退障害患者の末梢時計周期は、健常者の周期と比べて違いは認められなかった。一方、非24時間睡眠-覚醒リズム障害患者の末梢時計周期は健常者と比べて有意に延長していることが明らかになった。また、各患者の時間療法に対する反応性を調べた結果、睡眠-覚醒相後退障害患者では治療反応群の末梢時計周期と治療非反応群の周期に違いは認められなかったが、非24時間睡眠-覚醒リズム障害患者では治療非反応群の周期は治療反応群の周期よりも有意に長いことが判明した。これらの結果は、末梢時計周期は概日リズム睡眠-覚醒障害の診断や治療反応性を予測する有用なバイオマーカーとなることを示している。概日リズム睡眠障害は睡眠覚醒リズムの異常を主徴とし、うつ状態など気分障害を併発する。また、双極性障害は躁状態とうつ状態の繰り返しが主徴であるが、生体リズムの異常も高頻度に併発する。ヒトの皮膚切片から培養した細胞内で時計遺伝子の発現リズム(末梢時計リズム)を測定し、末梢時計リズムの周期が概日リズムや睡眠の個人特性と関連する可能性を明らかにした。事実、概日リズム睡眠障害患者を対象として末梢時計リズムを測定したところ、概日リズム睡眠障害の睡眠相後退型患者群では健常者群と変わらないリズム周期長を示したが、フリーラン型の患者群では有意に長いリズム周期を示している。本研究では、双極性障害患者をはじめとする気分障害患者を対象に末梢時計リズムの測定を行った。リズム長に有意な違いは認められなかったため、周期長は主要な原因ではないかもしれない。気分障害患者での皮膚生検由来培養細胞内の時計遺伝子発現リズムの測定を行い、生物時計機能の評価を行ったが、気分障害患者では末梢時計リズム長に有意な違いは認められなかった。リズム周期長が病因と考えられている概日リズム睡眠障害患者では健常者群とは異なる末梢時計リズム周期長を示したことから、気分障害ではリズム周期長は主要な病因ではないかもしれないことを明らかにした。概日リズム睡眠覚醒障害患者として16歳以上の睡眠覚醒相後退障害(DSWPD)41名および非24時間睡眠覚醒リズム障害(N24SWD)26名、また、対照群として標準的な睡眠時間を示す健常者50名を対象とした。患者群、対照群から採取した皮膚由来初代線維芽培養細胞に概日リポーター遺伝子Bmal1-lucを導入し、培養細胞内の発光リズムを測定した(末梢時計リズム評価系)。さらに、患者群の治療反応性の有無を、DSWPDについては睡眠時間帯の中点、N24SWDについては睡眠覚醒リズム周期を産出し、それらを指標として決定した。N24SWD患者群では、半数は対照群と変わらない末梢時計リズム周期であったが、全体的には対照群より有意に長いリズム周期を示した。また、N24SWD患者において、治療無反応群の末梢時計リズム周期は治療反応群より長かった。一方、DSWPD患者群では周期長の違いや治療反応性との関係は認められなかった。N24SWDの発症にはリズム周期の延長が関わっていること、しかし他の発症要因(光同調能、位相反応性など)も存在すること、さらに、周期長が治療反応性を予測する上で有用なバイオマーカーとなる可能性が示された。また、気分調整薬リチウムをはじめとする種々の薬物が生物時計に及ぼす影響を調べるために、不死化培養細胞U2OSに3種類の異なる概日リポーター遺伝子をそれぞれ導入した数種類の培養細胞安定株を作成した。概日リズム睡眠覚醒障害の生物時計機能を評価し、N24SWDの発症にはリズム周期の延長が関わっていること、他の発症要因(光同調能、位相反応性など)も存在すること、周期長が治療反応性の有用なマーカーとなる可能性を明らかにした。このことから、末梢時計リズム評価系を活用することで、睡眠覚醒リズム異常の発症機序解明や新たな治療薬の探索・同定、治療反応性の推定につながることが期待される。また、生物時計と気分調節の関係を調べるために有用な概日リポーター遺伝子安定導入培養細胞株を作成した。概日リズム睡眠障害患者では生物時計の調節障害に加えて気分調節の異常が併存していることが明らかにされている。Wntシグナルは、胚発生とガン化に関わる非常に重要なシグナル伝達経路であり、胚性幹細胞(ES細胞)や神経幹細胞から神経へ分化する上でも必要なシグナルであることが示唆されている。気分安定薬として用いられるリチウムは、脳内ではGSK3を阻害すること、βカテニン量を増すこと、Wntシグナル・βカテニン経路を介する遺伝子発現を活発にすることが知られている。さらに、GSK3βを過剰発現させたトランスジェニック(Tg)動物では躁病様の行動異常を示すこと、βカテニンを過剰発現させたTg動物では抑うつ行動や不安様行動が減少することが報告されている。これらの知見から、リチウムの作用メカニズムにWntシグナル系が介在していると考えられている。前年度作成した不死化細胞に概日リポーター遺伝子を導入した培養細胞安定株を用いて、リチウムとWntシグナルが生物時計に与える影響を調べた。概日リポーター培養細胞安定株に異なる濃度のリチウムを添加し遺伝子発現リズムの変化を経時的に測定した。また、Wntシグナル系コアクチベーターを添加し、時計遺伝子発現リズムの変化を経時的に測定した。さらに、リチウムとWntシグナル系コアクチベーターを組み合わせて、Wntシグナル系コアクチベーターはリチウムが時計遺伝子に与える影響に変化を及ぼすかどうか比較、検証を行った。

睡眠-覚醒相後退障害患者の末梢時計周期は、健常者の周期と比べて違いは認められなかった。一方、非24時間睡眠-覚醒リズム障害患者の末梢時計周期は健常者と比べて有意に延長していることが明らかになった。また、各患者の時間療法に対する反応性を調べた結果、睡眠-覚醒相後退障害患者では治療反応群の末梢時計周期と治療非反応群の周期に違いは認められなかったが、非24時間睡眠-覚醒リズム障害患者では治療非反応群の周期は治療反応群の周期よりも有意に長いことが判明した。これらの結果は、末梢時計周期は概日リズム睡眠-覚醒障害の診断や治療反応性を予測する有用なバイオマーカーとなることを示している。培養細胞系においてリポーター遺伝子を用いたリアルタイムモニタリングアッセイを行う。さまざまな薬物が時計遺伝子発現リズムの周期、位相、振幅などのリズム特性に与える影響を調べ、生物時計と気分調節の両システムに関わるシグナルパスウェイを明らかにし、生物時計と気分調節の両システムの機能障害に関わる分子メカニズムの解明を目指す。末梢時計リズムの周期長が疾患発症、治療反応性など臨床病態を予測するマーカーとなるか検証を進める。また、末梢時計リズム評価系を用いて、治療候補物質のスクリーニングシステムの構築を目指す。概日リポーター遺伝子安定導入培養細胞株を用いて気分調整薬をはじめとする種々の薬物が生物時計機能に作用するシグナルパスウェイを明らかにする。時間生物学実験業務の遂行のため必要な消耗品類や派遣委託費を支出したが、成果発表は国内学会のみで旅費は少額であったため。前年度に収集した実験データの処理および解析を行ったため、人件費が必要となったが物品費は減少した。成果発表の機会が増えると見込まれるため、論文投稿時の英文校正・投稿料や国際国内学会へ参加するための旅費などに計上する。新しい試薬類や機器の購入、また、成果発表のため学会参加費、旅費、さらに、論文発表のため英文校正や出版料に使用する予定である。
官能基間距離認識を基盤とする触媒的位置選択的官能基化及び遠隔位不斉識別反応の開発

σ-対称長鎖ジオールの非対称化に関する反応機構解析に取り組んだ。温度効果による変化をプロットすることでギブスエネルギー差を求めた。その結果ΔΔH ǂ= -3.03 (kcal/mol)となり、およそ水素結合1つ分の相互作用の差が見られた。またΔΔS ǂ= -5.5 (cal/mol・K)となり、プロS側の水酸基アシル化の遷移状態がプロR側のそれと比べて、よりエントロピーの要請が大きい。これはプロS側の水酸基アシル化の遷移状態では水素結合の組み合わせにより、より強固な配座をとることを示唆している。またDFT計算から(S)-モノアシル体に至る遷移状態が最安定構造とわかり、4点の水素結合により遷移状態を安定化していた。これらの知見はこれまで想定していたπ-π相互作用に比べてより強い相互作用が関与しており、また反応の選択性をよく反映している。次に四置換アレンジオールの非対称化についても検討を行った。四置換目置換基はiPrを用い、NsNHに高い認識能を有するβーナフチルアラニン誘導体を側鎖に持つ触媒を用いて反応を確認したところ、中程度ながら立体選択的にモノアシル体が得られた。一方1,4ーアミノアルコール構造とは異なる距離の認識をどのように適応させていくのかが当面の課題となった。本研究室の触媒は認識側鎖部位にアミノ酸誘導体を用いており、認識パターンの微細な変更が容易である。一方距離認識の肝は基質認識部位から反応点までの距離が、触媒認識部位から触媒活性部位までの距離とよい一致を示す必要があることが経験的に理解されている。新規基本骨格の合成は完成に至らなかったが、合成に至る土台を作ったと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はσ-対称長鎖ジオールの非対称化に関してより広範な基質を合成し、基質認識型触媒の認識能の限界に挑戦している。特に、これまでの成功で極めて重要な基質である四置換プロキラル炭素含有1,7-ジオール1において、置換基Rの嵩高さや官能基許容性及び類似構造をどこまで正確に識別するかは、今後の発展研究を行う上で重要な知見である。そこで置換基にR=TBDPSO(CH_2)_2、MeO(CH_2)_3を有する基質をそれぞれ合成し、触媒反応を行った。その結果、高収率と高立体選択性を保持していることが分かった。特にR=MeO(CH_2)_3のジオール体においては、四置換プロキラル炭素から伸びる3本の炭素鎖の違いは殆どなく、立体障害を利用する反応ではこの違いを見分けることはほぼ不可能であるが、基質認識型触媒ではそれぞれの炭素鎖を明確に識別し、プロS側の水酸基を高度に識別していることが結果から分かる。また、NHNsの酸性プロトンがMe化された基質では大きく立体選択性が低下することからも、NHNs基は本反応に重要な置換基であり、基質-触媒間の水素結合がこの結果からも示唆される。一方、立体選択性が完全に消失しない理由としては、触媒が基質の1,4アミノアルコール構造だけではなく、1,7-ジオール構造、もしくはNs基と触媒ナフタレン部位との弱い相互作用の働きが影響しているものと考えている。これらの結果から、基質一般性の拡大もさることながらノシルアミド構造による精密な基質ー触媒間相互作用、また1,4-アミノアルコール構造に由来したプロキラル炭素不斉識別に関する多くの情報が得られた。

新型触媒の合成に関しては現在進行中の課題ではあるが、不斉非対称化の研究を通して遠隔位プロキラル炭素不斉識別の重要な知見が得られた。触媒の選択性は立体障害を基盤とした排他的選択性ではなく、分子認識を用いた加速度的な反応によることはこれまでの研究から示唆されているが、今回の成果は新たな基質認識型触媒を合成する上で核となる重要な知見となった。得られた知見から、炭素鎖の異なるアミノアルコールを基質とした竸争実験を行い、仮説である加速度的反応を支持する実験データを集めたい。また、官能基許容性の精査のため別の基質の合成も進めており、必要なデータをまとめた後に学術雑誌へ投稿する予定である。同時に新たな骨格を持つ基質認識型触媒の合成にも取り組んでおり、徐々に骨格が形となりつつあるため、そちらに関しても合成を完了し、多くの遠隔位認識型反応へ適応していく予定である。
交通システムの時間信頼性評価値に関する理論・実証研究

近年,経済活動が発展し,ビジネストリップなどにおける定刻性の重要度が高まり,旅行時間信頼性に対する経済便益計測の必要性が高まっている.本研究は,選好意識調査から得られた行動データを,旅行者のスケジューリング行動を記述する統合モデルに適用して所要時間信頼性価値の推計を行うことを目的とする.調査対象は,普段の通勤に自動車を用いている20代から50代までの男女であり,サンプリングはインターネットを介したWEB調査の形態で行った.パネル効果や観測/非観測異質性を考慮した離散選択モデルを用いた推定結果は,信頼性価値と時間価値の比である信頼性比の平均値が2.40と言う結果であり,旅行時間信頼性の向上便益が所要時間短縮便益と比較しても無視できない大きさである可能性が実証的に示された.また,性別・年収・普段の通勤時間などの被験者特性によっても,旅行時間変動価値が有意に異なる可能性が示唆された.近年,経済活動が発展し,ビジネストリップなどにおける定刻性の重要度が高まり,旅行時間信頼性に対する経済便益計測の必要性が高まっている.本研究は,選好意識調査から得られた行動データを,旅行者のスケジューリング行動を記述する統合モデルに適用して所要時間信頼性価値の推計を行うことを目的とする.調査対象は,普段の通勤に自動車を用いている20代から50代までの男女であり,サンプリングはインターネットを介したWEB調査の形態で行った.パネル効果や観測/非観測異質性を考慮した離散選択モデルを用いた推定結果は,信頼性価値と時間価値の比である信頼性比の平均値が2.40と言う結果であり,旅行時間信頼性の向上便益が所要時間短縮便益と比較しても無視できない大きさである可能性が実証的に示された.また,性別・年収・普段の通勤時間などの被験者特性によっても,旅行時間変動価値が有意に異なる可能性が示唆された.本研究では,自動車交通における所要時間定刻性向上の経済評価に必要とされる時間信頼性価値(VTTV : Value of Travel Time Variability)の推計方法の開発を行った.まず,所要時間が出発時刻に応じてランダムに変動する不確実性下でのドライバーの出発時刻選択行動を記述するミクロ経済学モデルを構築した.次に,開発した手法の実適用可能性を検証するため,高速道路のETC(Electronic Toll Collection)システムから得られた所要時間のデータを用いて,理論モデルの実適用に必要となる前提条件が成立しているかどうかを検証すると共に,節約時間価値(VTT : Value of Travel Time)に対するVTTVの比率(Reliability Ratio)を算出した.最後に,提案した方法を用いてドライバーの総コストの変化値を算出し,施策実施前後における所要時間定刻性向上の経済便益の試算を行った.1点目の具体成果として,正規化所要時間分布等の確率線が時刻に対して概ねなだらかな並行に近い曲線となっており,基準化所要時間と出発時刻の独立性の仮定が成立する事が確認された.2点目に,所要時間の平均と標準偏差は似た形状を示し,両者には正の相関関係を持つことが示唆された.これより, 3点目に,所要時間の平均的な長さやその変動は,交通インフラの整備や施策の実施,あるいは交通量そのものの変化に応じて変わり得るが,その所要時問を正規化した基準化所要時間の分布形状は比較的安定しており,その分布形状の特性は,右側の裾が厚く,左側の裾には下限値が存在する.すなわち,実際の基準化所要時間分布は,従来の多くの研究が想定してきた正規分布のような左右対称の分布とは形状が大きく異なり非対称の分布である,という知見が得られた.まず,通勤者の出発時刻選択行動に関する計量経済モデルを構築した.間接効用関数の特定化は,Mean-Varianceタイプを更に発展させたものとした.具体的には,間接効用関数に含まれるランダム係数が安定分布に従うような特定化を行った.次に,時間信頼性に対する選好情報取得のためのアンケート調査とモデル推計を行った.本研究では,通勤者の出発時刻選択行動を想定した選好意識調査を実施し,仮想的な状況下での代替案選択を行う選好表明実験のデータを得た.これを上述の計量経済モデルに当てはめ,モデルの未知パラメータ推定を行った.実証分析の結果より,既往の研究と同程度の信頼性比が得られたことが確認されたまた,個人属性別に見た時間信頼性価値の傾向についても考察を行い,本研究の分析結果に一定量の妥当性があることが示唆された.
顎関節再生医療に向けた線維軟骨の遺伝子および蛋白発現パターンの解明

顎関節の再生医療は口腔外科分野における最重要課題のひとつである。本研究では、近い将来での臨床応用を目的として、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行った。内容は(1)再生軟骨組織作成のための基礎的研究、ならびに(2)骨軟骨細胞の分化制御メカニズムの解明とに大別される。(1)については、使用する細胞として、鼻中隔軟骨細胞と耳介軟骨細胞とを選択した。それは、口腔外科の主要な対象疾患である口唇口蓋裂をはじめとする先天奇形に対する手術の際に入手可能であることや、間葉系幹細胞を効率良く軟骨細胞に分化させることが現時点では困難なため、早期の臨床応用には軟骨細胞による再生を目指す方がより現実的である、等の理由による。まず、(1)安全性の面からFBSは用いない、(2)軟骨細胞の特性を維持した状態で1000倍以上の増殖を獲得する、(3)すでに臨床応用実績のある増殖因子を使用する、という三つの基準をもって、増殖因子の組み合わせの最適化を図り、FGF-2、insulinあるいはIGF-Iの組み合わせが最適であることを明らかとした。ついで、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索し、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモンの組合せが理想的であることを見出した。また、いくつかのハイドロゲルについて、軟骨再生における足場素材としての特性を検討した。なお、上記の実験で用いた細胞は、顎顔面領域における先天異常の手術に伴い、廃棄される予定だった軟骨細胞を患者の同意に基づき使用させていただいた。また、(2)については、分子細胞生物学的手法により、CGKIIが軟骨分化に重要な機能を有すること、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞の分化においてCdk6が分化抑制因子として重要であることなどを報告し、骨軟骨再生医療の発展に不可欠な骨軟骨細胞の分化増殖メカニズムの解明を行った。本研究の目的は近い将来での臨床応用を見据えた、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行うことだが、これまでの研究進行状況を以下に報告する。(1)間葉系幹細胞ならびに軟骨細胞を用いてin vitroで新生軟骨を作成するための基礎検討として、組織幹細胞を用いた骨軟骨再生技術開発を行い、骨髄、皮膚、脂肪由来の幹細胞培養技術を確立しつつある。細胞培養方法としては、従来一般的に行われてきた二次元培養だけでなく、コラーゲンゲルを用いた三次元培養、特殊装置を用いた三次元高密度培養技術開発も行っている。実際に体積10mlの再生組織を構築するためには10の9乗近くの細胞数を必要とするが、現在のところ、三次元培養装置を用いて体積5mlの容器一個で細胞を10の8乗まで増殖可能だという結果を得ており、効率を上げるために装置の改良を続けている。(2)細胞増殖を促進する、あるいは細胞分化を促進する因子を検索するため、FGFs、TGF-βs、IGFs、BMPsなどを様々な種類の組み合わせで添加した培養実験で、細胞増殖、細胞分化の最適条件を検討している。また、軟骨再生のためには、幹細胞だけではなく、軟骨細胞自体が再生組織の重要なSourceであるとの考えから、軟骨細胞の培養条件検討を行い、細胞の脱分化を抑制しながら増殖を可能にする培養技術開発に成功した(未発表)。本研究の目的は近い将来での臨床応用を見据えた、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行うことであるが、昨年度の研究進行状況を以下に報告する。(1)現実に採取可能な量の組織から得られる細胞数には限りがある(約10^6個)が、その細胞を培養し、再生軟骨を作製するために必要な細胞数(約10^9個)まで増殖させる技術を開発した。

具体的には、統計的手法に基づき、さまざまな液性因子の組み合わせの効果を分析し、FGF-2、Insulin(IGF-1)の組み合わせが軟骨増殖に有効であることを報告した(Takahashi, Ogasawara, Hoshi et al. Cell Transplant.:2005)。(2)in vitroで軟骨細胞を培養する際に必発する、細胞の脱分化現象を克服するために、脱分化した軟骨細胞をin vitroで再分化させる技術を開発した(未発表)。この研究においても、統計的手法に基づき、さまざまな液性因子の組み合わせの効果を解析した。なお、上記(1)(2)の実験で用いた細胞は、顎顔面領域における先天異常の手術に伴い、術的理由により廃棄される予定だった軟骨細胞を患者の同意に基づき研究材料として使用させていただいたものである。(3)骨軟骨再生医療の発展に不可欠である、骨軟骨細胞の分化増殖メカニズムの解明を目的に、分子細胞生物学的手法を駆使し、CGK IIが軟骨分化に重要な機能を有すること、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞といった骨系統細胞の分化においてCdk6が分化抑制因子として非常に重要な機能を果たしていることなどを報告した。(660文字)顎関節の線維軟骨を含めた再生医療は口腔外科分野における最重要課題のひとつである。本研究では、近い将来での臨床応用を目的として、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行った。17年度については再生軟骨組織作成のための基礎的研究を主として実行した。使用する細胞として、鼻中隔軟骨細胞と耳介軟骨細胞とを選択した。それは、口腔外科の主要な対象疾患である口唇口蓋裂をはじめとする先天奇形に対する手術の際に入手可能であることや、間葉系幹細胞を効率良く軟骨細胞に分化させることが現時点では困難なため、早期の臨床応用には軟骨細胞による再生を目指す方がより現実的である、等の理由による。まず、(1)安全性の面からFBSは用いない、(2)軟骨細胞の特性を維持した状態で1000倍以上の増殖を獲得する、(3)すでに臨床応用実績のある増殖因子を使用する、という三つの基準をもって、増殖因子の組み合わせの最適化を図り、FGF-2、insulinあるいはIGF-Iの組み合わせが最適であることを明らかとした。ついで、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索し、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモンの組合せが理想的であることを見出した。また、いくつかのハイドロゲルについて、軟骨再生における足場素材としての特性を検討した。なお、上記の実験で用いた細胞は、顎顔面領域における先天異常の手術に伴い、廃棄される予定だった軟骨細胞を患者の同意に基づき使用させていただいた。
地域エネルギー自立を推進する「クオリティ・マネジメント」制度提案のための調査研究

地域エネルギー自立に向けた自治体や市民の取り組みを推進する「クオリティ・マネジメント」制度を確立することを目的に、自治体、市民レベルにおける地域エネルギー自立の進捗状況を比較分析するための調査を実施した。H25年度は特に市民・地域による再生可能エネルギーの取り組みを対象として、全国120団体の取り組み動向を把握するためのアンケート調査を実施した。その結果、市民・地域の主体が中心となり再生可能エネルギー発電事業を行う「市民・地域共同発電所」が全国で458基存在していることを把握した。また、その実施形態も多様化しており、特に2012年7月の再生可能エネルギー固定価格買取制度の成立以降、市民や地域主体による再生可能エネルギーの取り組みが加速していることが確認された。筆者らが実施した2007年の全国調査以降、こうした全体動向を把握する調査は行われていなかったことからも、今回の調査でその動向を把握できたことの意義は大きい。また、これらの調査の成果として「市民・地域共同発電所全国調査報告書2013」としてまとめるとともに、2013年9月に京都市内で開催された「市民・地域共同発電所全国フォーラム2013」(参加者約530名)で報告を行った。さらに、これらの調査結果や同フォーラムの報告内容などをもとにした書籍『市民・地域共同発電所のつくり方』の出版に向けた執筆を進めた(2014年6月かもがわ出版から発行予定)。
不完全麻痺者の歩行訓練システム構築のための基礎研究

不完全対麻痺患者のための歩行訓練システムは,歩行訓練中の下肢の状態を計測し,歩行改善に有用な情報を麻痺者に呈示して,歩行訓練をサポートするシステムである.本研究では,それら歩行訓練システムを構成するセンサシステムの構築および波形処理方法の確立を目的として,健常者における歩行動作を測定し,脚部に取り付けた各センサから得られるデータを解析した.歩行動作を計測するセンサシステムは,下腿に装着した1個の2軸加速度計(ワコー,PRG高感度用),大腿,下腿,足背に装着した3個の1軸圧電式ジャイロスコープ(村田製作所,ENC-03J),踵付近に装着した1個の衝撃センサ(村田製作所,PKS1-4A1)から構成される.また,参照データを得るため,ゴニオメータにより膝と足関節の角度を,爪先と踵に装着したアルミ箔と床上のアルミ板との接触状態により足の接地のタイミングを計測した.3名の健常者においてアルミ板上での歩行実験を行い,各センサから得られたデータを解析した.その結果,ジャイロスコープ間の出力の差分により得られる関節角速度を数値積分し,膝と足関節の関節角度を求めたところ,ゴニオメータの出力を高い精度の近似が得られた.さらに,ジャイロスコープの装着位置を変化させ得られたデータの定量的な評価を行ったところ,適切にセンサを装着することにより高い精度で膝と足関節角度を計測できることが分かった.また,加速度計や衝撃センサを用いることにより,立脚期と遊脚期の識別や,立脚期における足底の接地状態を認識することが可能であり,床に非接触で安定して歩行期を識別できる小型センサを構築できることが分かった.さらに,ジャイロスコープや加速度計にみられるパルス状の出力波形の振幅値や発生タイミングを解析することにより,歩行能力を評価し,歩行訓練に有用な情報を呈示できることが分かった.不完全対麻痺患者のための歩行訓練システムは,歩行訓練中の下肢の状態を計測し,歩行改善に有用な情報を麻痺者に呈示して,歩行訓練をサポートするシステムである.本研究では,歩行中の下肢の状態を計測するセンサシステムの構築および波形処理方法の確立を目的として,健常者における歩行動作を測定し,各センサから得られたデータを解析した.歩行動作を計測するセンサシステムは,1個の2軸加速度計(ワコー,PRG高感度用),3個の1軸圧電式ジャイロスコープ(村田製作所,ENC-03J),1個の衝撃センサ(村田製作所,PKS1-4A1)から構成され,左側下肢に取り付けられた.また,参照データを得るため,ゴニオメータ(Penny&Gilles, ADU301A)により膝と足関節の角度を計測し,足の接地のタイミングを計測するために爪先と踵に装着したアルミ箔と床上のアルミ板との接触状態を計測した.3名の健常者において,幅1m,長さ6mのアルミ板上で異なる歩行速度での歩行動作を測定した.ジャイロ間の出力の差分により得られる関節角速度を数値積分し,膝と足関節の関節角度を求めたところ,ゴニオメータの出力と似た波形が得られた.また,衝撃センサの出力にデジタル微分を施すことにより,アルミ箔により検出される接触状態と同様に,立脚期と遊脚期を分離できる可能性があると考えられる.一般的に歩行動作の計測に用いられるゴニオメータやフットスイッチは,装着の仕方により出力がばらつき破損し易い欠点を有する.本研究で用いたセンサはいずれも小型軽量で装着が容易であり,装着の仕方による出力のばらつきが少なく,また床と非接触で破損し難いので有用性が高いと思われる.これらの歩行実験の結果から,ジャイロや衝撃センサを用いることにより立脚期の開始のタイミングや関節角度など歩行訓練に有用な情報を得られる可能性があることを確認した.不完全対麻痺患者のための歩行訓練システムは,歩行訓練中の下肢の状態を計測し,歩行改善に有用な情報を麻痺者に呈示して,歩行訓練をサポートするシステムである.本研究では,それら歩行訓練システムを構成するセンサシステムの構築および波形処理方法の確立を目的として,健常者における歩行動作を測定し,脚部に取り付けた各センサから得られるデータを解析した.歩行動作を計測するセンサシステムは,下腿に装着した1個の2軸加速度計(ワコー,PRG高感度用),大腿,下腿,足背に装着した3個の1軸圧電式ジャイロスコープ(村田製作所,ENC-03J),踵付近に装着した1個の衝撃センサ(村田製作所,PKS1-4A1)から構成される.また,参照データを得るため,ゴニオメータにより膝と足関節の角度を,爪先と踵に装着したアルミ箔と床上のアルミ板との接触状態により足の接地のタイミングを計測した.3名の健常者においてアルミ板上での歩行実験を行い,各センサから得られたデータを解析した.その結果,ジャイロスコープ間の出力の差分により得られる関節角速度を数値積分し,膝と足関節の関節角度を求めたところ,ゴニオメータの出力を高い精度の近似が得られた.さらに,ジャイロスコープの装着位置を変化させ得られたデータの定量的な評価を行ったところ,適切にセンサを装着することにより高い精度で膝と足関節角度を計測できることが分かった.また,加速度計や衝撃センサを用いることにより,立脚期と遊脚期の識別や,立脚期における足底の接地状態を認識することが可能であり,床に非接触で安定して歩行期を識別できる小型センサを構築できることが分かった.さらに,ジャイロスコープや加速度計にみられるパルス状の出力波形の振幅値や発生タイミングを解析することにより,歩行能力を評価し,歩行訓練に有用な情報を呈示できることが分かった.
ネフロン形成・再生の分子基盤

本研究の目的は、マウスネフロン形成再生機構をHepatocyte nuclear factor 4α(Hnf4α)に着目して解析し、獣医療・医療への貢献を果たすことである。本因子はプロモーター(P1、P2)の選択によりサブタイプが存在し、それぞれの組織特異性や転写効率が異なる。また、Hnf4α遺伝子の上流因子として、Hnflα/OclおよびHnflβ/Gata6がある。昨年度の研究で、成体腎臓のHnf4αはP1タイプであるが、胎子期に一過性にP2タイプが発現することを明らかにした。また、RNAiを用いた発現抑制実験により、Hnf4αが後腎間葉凝集体(CM)の分化・生存に関わることを明らかにした。今年度は、その関与を直接的に証明するためレーザーマイクロダイセクション法(LMD法)を用い、ネフロン形成過程の各部位のHnf4α遺伝子発現を解析した。C57BL/6胎齢13.5および15.5日胎子からLMD法により各パーツ(MM :後腎間葉組織、CM、CSB :コンマ・S字体)を回収し、nested RT-PCR法により各種遺伝子発現を解析した。Hnf4α遺伝子の発現をサブタイプごとに調べた結果、P1タイプはMMでは認められず、CM・CSBと発生が進行するにつれて発現量が増加した。それに対してP2タイプはCMに一過性に発現した。また、CM領域においてはHnf1α/Ocl遺伝子の発現は認められず、Hnf1β/Gata6遺伝子の発現のみが認められた。なお、成体の腎臓では両上流因子の発現が認められた。これらの結果からHnf4α遺伝子(特にP2)はCMのステージから発現を開始することが明らかとなった。すなわち、本因子がネフロンの初期発生(間葉の上皮化)と深く関わることが強く示唆される。さらに、上流因子はHnf1β/Gata6-Hnf4α経路である可能性が高い。腎臓、とくに後腎は同じ中間中胚葉由来であるにも関わらず、中腎管より派生する尿管芽と間葉凝集がもたらす後腎原組織との相互的作用で形成される。この初期発生に関与する遺伝子群については近年徐々に明らかにされてきているものの、中期以降の発生すなわちネフロンの形成過程に関与する遺伝子の詳細については未だ不明のままである。本研究の目的は、ネフロンをin vitroで作り出し、移植医療・獣医療に貢献することにある。HNF4aは核内ホルモンレセプターファミリーに属す転写因子で、内胚葉由来組織の一部に発現し主として肝細胞の分化、機能維持に重要な働きを担う。また、HNF4aは2種類のプロモーター(p1,P2)を有し、少なくとも9種類のスプライスバリアントの存在が報告されている。HNF4aノックアウトマウスは原腸胚形成期に胚外内胚葉の形成不全のため死亡し、その後に分化する腎臓においてHNF4aが如何なる機能を有するかは未だ不明である。今年度は腎臓におけるHNF4aの役割を解明する目的で、まず同因子の組織学的局在を中心に検討した。成マウス(C57BL/6)を用いたRT-PCR法で、P1は主に小腸、大腸、肝臓、腎臓、P2は主に胃、小腸、大腸、肝臓、膵臓で発現していた。免疫染色では、胃、小腸、大腸、肝臓、腎臓に陽性細胞が検出された。腎臓ではすべての近位尿細管上皮細胞の核に陽性反応が出現した。胎子腎臓のHNF4a蛋白は後腎原組織内のコンマ字体で初めて検出され、ネフロン形成途上恒常的に検出された。肝臓のHNF4aはtransthyretin, apolipoprotein CIII, HNF1aのプロモーターに結合し肝細胞の分化と機能維持に働くことから、腎臓でも類似の機能を有しているものと推察され、ターゲット因子の同定が急がれる。

これらの結果からHnf4α遺伝子(特にP2)はCMのステージから発現を開始することが明らかとなった。すなわち、本因子がネフロンの初期発生(間葉の上皮化)と深く関わることが強く示唆される。さらに、上流因子はHnf1β/Gata6-Hnf4α経路である可能性が高い。