hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アディポネクチンのエクソソーム産生制御とFavineの血管・血栓制御機構の解明

糖尿病学会、肥満学会、内分泌学会の3つのYIAを受賞し、製薬企業との共同研究締結をもたらし、またKeystone symposiaでは口頭演題に採択された。さらに、新聞報道を含め、プレスリリース等で広く紹介された。骨格筋の再生をAPNは促進し、この促進作用発現にはT-cadを必要とする事を見出した。興味深い事に、骨格筋細胞では特にその再生筋においてAPNはExo産生オルガネラであるMVBに集積し、培養筋細胞でも分化に伴ってT-cadの発現とAPNによるExo産生が惹起される事を見出した(田中、喜多ら、Sci Rep.2019)。以上で見出したAPNのT-cadを介したExo産生促進作用を応用し、各種臓器傷害の新しい治療方法を開発し、AMED橋渡しB研究に採択される研究に成長している。また、Favine/ApoEダブルノックアウト(DKO)マウスの血管の組織病理学的評価と大動脈の各種遺伝子発現量解析を開始した。培養血管内皮細胞を用いてFavineの添加実験におけるFavine添加濃度、炎症惹起因子の至適濃度、培養条件の検討を行った。A)APNによるExo生合成促進の意義と機序:培養内皮細胞を用いて、アディポネクチン(APN)によって促進されるエクソソーム(Exo)産生によって、変化する脂質を超臨界クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた手法で検討し、セラミド類が特異的に細胞で減少し、かつExo画分で増加することを見出した。APNによるExo産生は、血管内皮に限定されず、骨格筋細胞でも認められ、その作用はT-カドヘリンに依存することを見出した。骨格筋をカルジオトキシン投与によって傷害すると再生反応を認めるが、本筋再生時にはAPNが再生筋細胞の内部、CD63陽性のエンドソーム(MVB)に集積すること、培養筋細胞では分化刺激によって同様の細胞内MVBへの集積とExo産生が惹起されることを見出した。またAPNは上記の機序で筋再生を促進し、老化によって低下する組織再生に対して保護的に機能していることが示唆された。本研究はScientific Reports 2019に掲載された。B)T-cad制御機構の解明とAPN作用ミメティクスの開発:培養内皮細胞のモデルとしてF2細胞という微小血管内皮腫瘍細胞をモデルに、T-カドヘリンがADAM12によって切断制御を受けることを見出していた。その後の研究から、ADAM12は主に脂肪に発現し、血管や心臓には少量が発現していることが分った。また、ADAM12の欠損マウスの心血管ではT-カドヘリンのタンパク発現レベルに差異は無かった。しかしながら興味深いことに、ADAM12欠損マウスでは圧負荷心全によって、線維化や心筋細胞の肥大が進み、心機能低下が著しく進行した。本結果も投稿準備中である。Favineの血管保護作用の解明においては、マウスの繁殖および飼育に時間を要するため、Favine/ApoEダブルノックアウトマウスの大動脈の解析はやや遅れている。Exoは上記のような産生細胞の不要物や余剰物を排出する機構の一つと捉えられる一方で、生理活性タンパクや核酸、脂質を転送する細胞間シグナル装置としての役割が注目されている。特に、近年急速に臨床応用試験が進む間葉系幹細胞にはT-カドヘリンが発現しており、APNによってExo産生が促進されることを見出した。
治療的アセスメント短縮版の開発と適用に関する実証的研究ー複数施設における効果検証

本研究の目的は,Finn(1997,2007)が考案した欧米で臨床的有効性が確認され普及が進んでいる治療的アセスメントの本邦導入に際し,本邦の医療体制や心理臨床業務の現状に合った短縮版を作成し,その効果検証を行うことである。本邦においてRCT(Randomized Controlled Trial;無作為化比較対照試験)研究が行われていない領域であり,本研究ではRCT研究を行い実証的な知見を提示する。また対象者の愛着スタイルに応じた治療的アセスメントの適用と効果についても明らかにする。本研究は,研究1から研究4までの4つの研究で構成されており,そのうち平成30年度では,初年度に準備を進めていた研究1,2の実施と統計解析を行う計画であった。実際には,まず治療的アセスメント群,伝統的アセスメント群両群の実施マニュアルを整備し,必要な心理尺度,検査道具等を完備して,各群ごとに予備調査を行い,マニュアルと手続きを修正した。その上で,第三者評価を受けてさらにマニュアルと手続きを修正し,完成させた。次に,治療的アセスメント群,伝統的アセスメント群の研究実施協力者を確定し,研究実施の質の均一化を図るために,各群の実施マニュアル作成者が各群ごとに事前トレーニングを2回実施した。さらに,研究参加協力者を募集し,研究スケジュールを組んで,研究を開始した。平成30年度では,目標としているデータ数に達しておらず統計解析までには至らなかったが,研究を開始することができ,順調に研究を進められた。平成30年度は,研究1,2の実施を完了し,統計解析に移るところまでには至らなかったが,研究1,2の準備を完了し,開始することができた。4年間の本科学研究費助成事業のうち,半分経過したところで研究1,2を実施してデータ収集を着実に行うことができており,研究がおおむね順調に進展していると言える。今後は,令和元年度内に研究1,2の実施を完了して統計解析に移り,その研究成果のまとめに着手する。令和2年度には,その研究成果を国際学会や国内学会,学術論文等で公表する。研究3,4は,研究1,2で治療的アセスメント短縮版の効果が実証され,より効果的な治療的アセスメント短縮版と実施マニュアルを完成させた後,それを用いて行うため,研究1,2の研究成果をみながら準備を進める。本研究の目的は,Finn(1997,2007)が考案した欧米で臨床的有効性が確認され普及が進んでいる治療的アセスメント(Therapeutic Assessment;TA)の本邦導入に際し,本邦の医療体制や心理臨床業務の現状に合った短縮版を作成し,その効果検証を行うことである。また,対象者の愛着スタイルに応じた治療的アセスメントの適用と効果についても明らかにする。本研究は,研究1から研究4までの4つの研究で構成されているが,そのうち平成29年度は治療的アセスメント短縮版を作成して従来の伝統的アセスメントとの効果の違いを検証する研究1の準備と実施までを行う計画であった。実際には,平成29年度内に,まず先行研究やFinnの研修受講等により研究準備に必要な情報取集を行った。その情報に基づいて,治療的アセスメント短縮版の作成,実施マニュアルの作成,被検者提示用の研究説明書・事前確認事項・同意書等の書類作成,使用する心理検査やビデオカメラ・ICレコーダー等の備品準備まで終了した。また,研究実施を担当する研究分担者・研究協力者が複数いるため,打ち合わせを重ねながら研究準備を行い,研究実施スケジュールを決め,平成29年度には実施までには至らなかったが,平成30年度からの研究実施にすぐに着手可能なところまで準備を進めることができた。上述のように,平成29年度は研究1の準備と実施を行う計画であった。実際には,平成29年度内に準備を整えることはできたが,研究実施には至らなかった。しかし,平成30年度の計画は,治療的アセスメントと従来の伝統的アセスメントの介入プロセスの違いを検討する研究2の実施であるが,これは研究1で実施したデータを用いて質的研究を行うものであり,研究1と研究2は実質同時に行うことになる。したがって,平成29年度で研究1,2の準備は完了したため,平成30年度に研究1,2を同時に実施し,その後統計解析を並行して行うことも可能であるため,研究は遅れているわけではなく,おおむね順調に進展していると考えられる。

実際には,まず治療的アセスメント群,伝統的アセスメント群両群の実施マニュアルを整備し,必要な心理尺度,検査道具等を完備して,各群ごとに予備調査を行い,マニュアルと手続きを修正した。その上で,第三者評価を受けてさらにマニュアルと手続きを修正し,完成させた。次に,治療的アセスメント群,伝統的アセスメント群の研究実施協力者を確定し,研究実施の質の均一化を図るために,各群の実施マニュアル作成者が各群ごとに事前トレーニングを2回実施した。さらに,研究参加協力者を募集し,研究スケジュールを組んで,研究を開始した。平成30年度では,目標としているデータ数に達しておらず統計解析までには至らなかったが,研究を開始することができ,順調に研究を進められた。平成30年度は,研究1,2の実施を完了し,統計解析に移るところまでには至らなかったが,研究1,2の準備を完了し,開始することができた。4年間の本科学研究費助成事業のうち,半分経過したところで研究1,2を実施してデータ収集を着実に行うことができており,研究がおおむね順調に進展していると言える。今後は、まず平成30年度内に研究1,2の実施を完了し,統計解析に移る。その研究成果を平成31年度に入ってから,国内学会や学術論文等で公表する。さらに,平成31年度内に研究3,4の準備を進め,平成31年度と平成32年度にわたって実施する。最終年度の平成32年度内に研究3,4の統計解析を行い,研究成果をまとめる。以上,本研究計画通りに4つの研究の実施,統計解析,成果をまとめるところまで進める。本研究の利点である研究分担者・研究協力者の人数の多さを活かして,分担しながら研究をやり遂げる予定である。今後は,令和元年度内に研究1,2の実施を完了して統計解析に移り,その研究成果のまとめに着手する。令和2年度には,その研究成果を国際学会や国内学会,学術論文等で公表する。研究3,4は,研究1,2で治療的アセスメント短縮版の効果が実証され,より効果的な治療的アセスメント短縮版と実施マニュアルを完成させた後,それを用いて行うため,研究1,2の研究成果をみながら準備を進める。当該年度内に研究1を実施する計画であったが実施に至らなかったため,予算に計上していた研究協力者への謝金・人件費の支出が無く,謝金・人件費を次年度に回し,次年度に研究を実施した際に支出する予定のため。当初の計画よりも謝金・人件費が多く必要になる見込みのため,研究分担者と協議の上,計画的に次年度に経費を回した。初年度は研究実施に至らなかったため,初年度予算の謝金・人件費を計画的に当該年度に回し,研究1,2の実施に備えていた。予定通り,当該年度に研究を開始することができたが,研究参加協力者への謝金(図書カード)は数回に分けて行われる研究の終了後に渡すことになり,その研究終了は次年度になるため,当該年度には支出が無かった。さらに,研究実施協力者への謝金も,全ての研究実施終了後に支払うため,当該年度内は研究が継続中であり,次年度の支出となる。したがって,研究分担者と協議の上,計画的に次年度に謝金・人件費分の経費を回し,研究終了後の支出に備えるため,次年度使用額が生じた。
非平衡測度の解析・特徴付け

我々が非平衡系として考えたのは、Burgers方程式と呼ばれる偏微分方程式により時間発展が記述される1次元の系である。この方程式は自然科学の様々な分野で現れる、最も基本的な非線形偏微分方程式の1つである。この研究では、粘性零のBurgers方程式の解に生ずるショックについて論じた。このショックの問題は、応用の観点からも重要視される物で、また数学的にも解のショックについてある程度解析できる数少ないケースとして興味深い。実際、初期条件がランダムであるが滑らかさを持つ場合には、Burgersらによりショックの大きさ・生じる位置の分布等についてかなり多くの結果が知られている。これに対し我々が念頭においたのは、ブラウン運動の見本関数のように、滑らかさを持たない初期条件の場合である。ある物理学者は分数巾ブラウン運動と呼ばれる、ある種の統計的自己相似性を持った初期条件の場合に、ショックを与える点が稠密に存在することや小さなショックの大きさの分布に巾法則が成立するという結果を数値計算により得た。これが実際に成り立っていることの状況証拠として、「ラグランジュ・ショック点の集合のハウスドルフ次元が初期条件の自己相似性の指数Hに等しい」という事が予想されるが、Sinaiは最近の論文でH=1/2の場合、すなわち初期条件がブラウン運動の場合に、これに対する厳密な証明を与えた。彼の証明は非常に複雑であるが、我々は次元の下からの評価がランダムネスの仮定なしに初期条件のヘルダー連続性のみから導ける事を簡潔に証明した。この結果は分数巾ブラウン運動などに対しても適用できる他、初期条件の持つ巾法則とショックの大きさの分布の間に予想される上述の関係の成立を支持する物である。
聴覚と触覚の拡張現実感を用いた次世代鼻副鼻腔手術支援システムの開発

前年度の本研究は主に聴覚や触覚による拡張現実感を手術支援機器として臨床応用する上で最も重要となるナビゲーションシステムの精度検証につき、3Dプリンター頭蓋骨樹脂モデルを用いた検証を行ってきた。具体的には実際に手術で使用する内視鏡に光学式センサを装着し、複数の術者による模擬手術を行い、内視鏡先端と樹脂モデルの位置関係を詳細に解析していった。その過程で、この手法を用いることにより術者毎の内視鏡操作におけるブレや動きの特徴を客観的に評価できることが分かり、本手法を術者の技量を客観的に評価可能とするシステムとして応用できる可能性を研究成果の副産物として見出した。本年度の研究は、上述の経過を踏まえ、内視鏡下鼻副鼻腔手術における術者の技量や特徴を客観的に評価可能とするシステム開発を目指すことにシフトした。一つ目の研究実績としては前年度の樹脂モデルを使用した内視鏡操作を、本術式の熟練者と経験の浅いレジデント医師に分け解析を行った結果、内視鏡のブレや無駄な動き等が若手医師において多く認められる傾向を見出した。この実験ではあくまで樹脂モデルを使用した単純なタスクであるにも関わらずこのように内視鏡操作の差を認めたことは、実際の手術においてはさらに大きな差として反映されると予想した。そして2つめの研究実績として、本システムを本学倫理委員会申請の上で臨床に応用することに成功した。現在、結果を解析中である。本研究が、内視鏡手術熟練度を客観的に評価できるシステム開発につながることが期待される。本研究では聴覚と触覚に関する拡張現実感を耳鼻咽喉科の内視鏡下鼻副鼻腔手術へ応用することにより、従来の視覚的支援のみによるナビゲーションシステムでは不十分であった危険回避機能をより充実させた新しい手術支援システムの開発を目的としている。本研究の開始にあたり、初年度は聴覚の拡張現実感の応用を目指して計画を立てた。将来的に目標としている手術のイメージとしては、手術前に症例の画像情報を元にして予め危険対象領域を設定し、実際の手術時に手術器具や内視鏡が接近した際に音声等による警告を受けることで副損傷を未然に防ぐことを目的としたものである。実際、これを応用した検討として危険領域の接近時にその距離に応じてアラームの性質を変化させることで、より直感的なナビゲーション効果が期待されたという報告も実験レベルで存在している。このような音声提示を実際に臨床応用していく上で最も重要な点は、危険対象領域を感知する高度な精度と正確性の維持であるため、まずは精度の検証を行う基盤研究から始めていった。初年度の研究実績としては、まず3Dプリンターによって作成された頭蓋骨樹脂モデルを作成し、実際に我々が手術で使用する内視鏡や手術器具に光学式センサを装着し、複数の術者の協力を得て頭蓋骨解剖モデルでの擬似手術を行い、光学式センサの装着による操作への影響を評価した。その作業工程の中で、術者ごとに内視鏡の動きや向き、鉗子を使用する際のブレ等に特徴があることを見出した。この結果は、ナビゲーション効果とは別に術者の手術熟練度の客観的な指標を定量化できるツールにもなり得るのではと考えている。本研究計画で初年度に予定していた音声提示による聴覚の拡張現実感を用いた手術支援システムの開発に先立ち、まず内視鏡や手術器具に光学式センサを装着して精度の検証を行っていたが、その過程の中で内視鏡操作や手術器具操作における術者ごとの特徴を表せる可能性を見出し、それを教育ツールとして実際の臨床に応用できるのではと考え、その計画や立案、実験データの解析のためにある程度の時間を費やしたため。本研究における今後の計画として、聴覚の拡張現実感の内視鏡下実験モデルを確立することを目指す。また、それと並行して初年度の実験から得られた模擬手術中の内視鏡や手術器具の術者ごとの動きの特徴を解析し、上級者と初心者による相違等を定量化することを試みる。当該年度は他の施設の現有機器である3Dプリンターを使用することが想定外で可能になったため、科研費を使用する必要がなくなり次年度使用額へと変更した。

また学会に関する旅費を自費で支出できる部分が多かったことも要因の一つである。画像解析編集ソフトや解析編集に使用するコンピュータの購入、さらには学会発表の際の旅費を中心に使用計画を立てている。
調理過程における旨味調味料の挙動と呈味特性との関係

核酸系旨味調味料(イノシン酸、IMP:グアニル酸、GMP)の食品加工、調理過程における加熱分解挙動および他の食品成分との相互作用を解析した。まず、モデル水溶液系を用いてIMP,GMPの加熱分解機構を、反応速度論的な立場から以下のように明らかにした。両者は一次反応に従って分解し、反応速度定数はpH、温度により大きな影響を受け、両者ともPHが低いほど、温度が高いほど大きかった。100°Cにおける半減期は、IMPの場合は8.7時間(pH4.0)、13.1時間(pH7.0)、46.2時間(pH9.0)で、GMPの場合は6.4時間(pH4.0)、8.2時間(pH7.0)、38.5時間(pH9.0)であった。IMPとGMPの加熱分解様式を解析したところ、リン酸エステルの加水分解とグリコシル結合(NーC結合)が起こるが、加熱分解過程で起こる主要な分解反応はリン酸エステル加水分解であることが判明した。次に市販の即席だしの素を用いて「だし汁」を調製し(IMPのみ含有)、実際の調理加熱過程におけるIMPの加熱分解を検討したところ、IMPはpH4とpH7では一次反応的に分解した。その反応速度定数は、PHが低いほど、また温度が高いほど大きかった。これは、先で述べたIMP単独溶液(モデル系)の場合の結果とほぼ同じであった。しかし、pH9でのIMPの分解は一次反応的な挙動をとらなかった。このことは、IMPがだしの素中の他の食品成分と何らかの相互作用をしたことを示唆する。また、だしの素粉末を水分活性0ー0.8,60°Cで貯蔵したところ、IMPは水分活性0ー0.5ではほとんど分解しなかったが、水分活性0.8ではかなり分解が進み、他の成分との間に何らかの化学変化が起こったことが示唆された。核酸系旨味調味料と他の成分との相互作用で明らかになったことは、IMP、GMPが脂質の過酸化反応に対して抗酸化能を有することであった。この抗酸化作用の機構は、IMP、GMPが金属イオンにキレ-ト作用をすることによって起こることが明らかになった。核酸系旨味調味料(イノシン酸、IMP;グアニル酸、GMP)は、グルタミン酸ナトリウムと共に、料理のみならず加工食品の味つけに広く利用されている。本旨味物質は、食品加工や調理における過熱過程で分解を受け風味に大きな影響を及ぼす。本年度では、IMP、GMPの加熱分解機構を、反応速度論的な立場から、以下の様に明らかにした。IMP、GMPをそれそれph4.0、100°Cで加熱したところ、両者は一次反応に従って分解した。それぞれの分解生成物は、IMPからはイノシンとヒポキサンチンが、GMPからは、グアノシンとグアニンであった。このことは、両者の分解反応は、リン酸エステルの加水分解とグルコシド結合(N-C結合)の開裂であることを示している。次に、IMPとGMPに対する反応速度定数および活性化エネルギーを測定した。その結果、反応速度定数はpH、温度により大きな影響を受け、両者ともpHが低いほど、温度が高いほど分解が促進された。

反応速度定数から計算した100°Cにおける半減期は、IMPの場合、8.7時間(pH4.0)、13.1時間(pH7.0)46.2時間(pH9.0)で、GMPの場合は、6,4時間(pH4.0)、8.2時間(pH7.0)、38.5時間(pH9.0)であった。IMP、GMPの活性化エネルギーは、いずれのphの加熱分解に対しても同じであった。さらに、種々のリン酸エステル化合物(リーボス5′リン酸、Oーホスホリルエタノールアミン、B-グリセロリン酸)の加熱分解に対する反応速度定数および活性化エネルギーはIMP、GMPとほとんど同じ結果であった。以上の結果から、IMP、GMPの加熱過程で起こる主要な分解反応は、ヌクレオチド中のリン酸エステル結合の加水分解であると結論することができる。核酸系旨味調味料(IMP,GMP)は、グルタミン酸ナトリウムと共に料理のみならず加工食品の味付けに広く利用されている。本旨味調味料は、食品加工や調理における加熱過程で分解を受け風味に大きな影響を及ぼす。前年度(昭和63年度)では、モデル系を用いて、IMP,GMPの加熱分解機構を反応速度論的な立場から解析したところ、IMP,GMPは、酸性状態で分解されやすく、両者の加熱分解の主経路は、ヌクレオチド中のリン酸エステルの加水分解であることを明らかにした。本年度は、この研究成果を受け、市販の即席だしの素を用いて、実際の調理加熱過程におけるIMP,GMPの加熱分解を検討した。また、だしの素粉末の貯蔵中におけるIMP,GMPの安定性及び多の食品成分との相互作用についても検討した。その結果、即席だしの素には、IMPのみが含まれ、その水抽出液(だし汁)を加熱すると、IMPはpH4とpH7では一次反応的に分解した。その反応速度定数は、pHが低いほど、また温度が高いほど大きかった。これは、前年度で明らかにしたIMP単独溶液(モデル系)の場合の反応速度パラメ-タ-と顕著な差はみられなかった。しかし、pH9でのIMPの分解は一次反応的な挙動をとらなかった。このことは、IMPがだしの素中の他の食品成分と何らかの相互作用をしたことを示唆する。また、水分活性0ー0.8,60°Cで貯蔵しただしの素粉末中のIMPは、水分活性0ー0.5ではほとんど分解しなかったが、水分活性0.8ではかなりの分解が進み、他のだしの素成分との間に何らかの変化が起ったことが示唆された。核酸系旨味調味料と他の成分との相互作用で明らかになったことは、IMP,GMPが脂質の過酸化反応に対して抗酸化能を有することであった。この抗酸化作用の機構は、IMP,GMPが金属イオンにキレ-ト作用をすることによって起こることが明らかになった。
胃癌におけるProx1の役割と分子機構

ヒト胃癌細胞MKN45において、PROX1の発現を確認し、siRNAを用いてPROX1を抑制する系を確立させた。PROX1を抑制した胃癌細胞では、細胞の形態に異常は認めなかったが、浸潤能・増殖能・遊走能ともに低下していた。臨床研究においても胃癌に対し根治手術を施行した99例をPROX1で免疫染色を行い、強陽性群(n=43)と弱陽性群(n=56)に分類し、後方視的に検討し予後の解析を行った。PROX1強陽性群では弱陽性群に比べて、リンパ節転移・癌進行度・脈管浸潤の有無に有意差をもって高かった。また、生存期間の分析では生存率、無再発生存期間において、強陽性群で有意に低い傾向であった。Prox1はリンパ管内皮細胞の発生・分化に必須の転写制御因子であるが、食道癌や大腸癌の予後と相関することが近年分かってきた。本研究ではヒト胃癌細胞株におけるProx1の発現の有無や、その癌細胞の増殖能との関連性を明らかにすることを目的とした。ヒト胃癌細胞におけるProx1の発現を確認し、siRNAを用いてProx1を抑制する系を確立させた。リンパ節転移した胃癌細胞においてはProx1の発現は微小であったが、原発の胃癌細胞においてはProx1の発現を確認できた。Prox1を抑制した胃癌細胞と浸潤能、増殖能を比較したところ、細胞に形態的な相違は認めなかったが、Prox1抑制胃癌細胞で浸潤能、増殖能ともに低下していることが証明された。また、ヒトProx1とマウスProx1のプラスミドを作成し、胃癌細胞に導入することで強発現させることも可能となった。また、胃癌細胞の培養上清を用いて、ヒトリンパ管細胞と共培養させることで、Prox1の発現の強弱が細胞の遊走能、増殖能に関連するかどうかを検討中である。遊走能、増殖能に相違を認めれば、癌細胞の培養上清中でRNA-seq解析を用いて網羅的に解析する予定である。臨床研究においてはヒト胃癌細胞をProx1で免疫染色を行い、発現の強弱で分類し、現在悪性度や生存期間において解析中である。臨床分野においても上記を証明することで、Prox1が及ぼすがんの浸潤・転移の分子機構での解明と、Prox1が新たな腫瘍マーカーや治療戦略の標的分子となり得る可能性を検証することが可能と考えられる。当初、胃癌細胞(LMSU)におけるProx1の発現が確認できず、難渋した。また、胃癌細胞においてsiRNAによりProx1を抑制させていたが、細胞が安定せず、別の細胞株(MKN45)に変更し実験を継続した。その他にProx1のプラスミドを作成したが、その確認作業に時間を要したため。PROX1はリンパ管内皮細胞の発生・分化に必須の転写制御因子であるが、食道癌や大腸癌の予後と相関することが近年分かってきた。本研究ではヒト胃癌細胞株におけるPROX1の発現の有無や、その癌細胞の増殖能との関連性を明らかにすることを目的とした。前年度にヒト胃癌細胞のセルラインであるMKN45細胞において、PROX1の発現を確認し、siRNAを用いてProx1を抑制する系を確立させた。PROX1を抑制した胃癌細胞では、細胞の形態に相違は認めなかったが、浸潤能・増殖能・遊走能ともに低下していた。臨床研究において、2011年1月から2012年12月までに神戸大学病院で、胃癌に対し根治手術を施行した99例をPROX1で免疫染色を行った。PROX1の発現強弱を細胞数で振り分け、強陽性群(n=43)と弱陽性群(n=56)に分類し、後方視的に検討し臨床病理学的因子による予後の解析を行った。PROX1強陽性群では弱陽性群に比べて、リンパ節転移・癌進行度・脈管浸潤の有無に有意差をもってそれぞれ高かった。また、生存期間の分析では5年生存率、5年無病生存期間において、強陽性群で有意に低い傾向であった。これらのことから、PROX1の強陽性であることが胃癌細胞の悪性度、特にリンパ節転移の有無や脈管浸潤の有無に大きく関与し、予後と相関することが分かった。PROX1はリンパ管内皮細胞の発生に必須であることから、癌の微小環境においてリンパ管や血管の新生にPROX1の発現の有無が関係しているのではないかと考えられた。今後、どの微小環境下でよりPROX1が関与するのかを検討していく必要があると考える。また、PROX1の発現を簡易的に調べることができれば、Prox1が新たな胃癌の腫瘍マーカーや治療戦略の標的分子となり得る可能性が考えられた。

また、生存期間の分析では生存率、無再発生存期間において、強陽性群で有意に低い傾向であった。胃癌細胞でのsiRNAによるProx1の抑制が安定して可能になったことで、実験が順調に進むようになった。今後は臨床における胃癌細胞のProx1を染色中であり、その悪性度の評価と、in vitroではProx1の下流因子の同定ならびに培養上清によるHLECの遊走能、増殖能の変化を確認する。食道胃腸外科実験が遅延しており、昨年度内で行う予定の実験が行えなかったため。今後の実験とともに平成29年度の予算と統合し使用する予定。
酵素タンパク質合成の異常昂進を伴う遺伝病に関する研究

1.ヌクレオチドピロホスファターゼ(NPPase)遺伝子の転写量の測定----ノーザンブロット法により、正常ヒトおよびLowe症候群患者皮膚繊維芽細胞中に存在するNPPaseのmRNA量を測定した。初年度の測定では、患者細胞中では本酵素の恬性上昇ににほぼ比例してmRNA量が上昇しているとの結果を得たが、その後、例数を増して測定した結果、NPPase恬性が上昇しているにもかかわらずmRNA量が正常細胞に近いものも存在することが判明した。2.ヌクレオチドピロホスファターゼ遺伝子の染色体上での位置の決定----NPPaseのcDNAの断片を用いて,in situハイブリダイゼイション法により,本酵素の遺伝子がのっている染色体の種類と位置を調べた結果,第6染色体のq22-q23であることが明らかとなった。Lowe症候群はX染色体に連関した疾病であることから、この結果はNPPaseがLowe症候群の直接の原因遺伝子ではないことを示している。3.NPPase遺伝子のクローニング----ゲノムDNA断片をEMBL,pWE15またはSacBIIに組み込み,NPPaseのcDNA由来のプローブを用いて,NPPase遺伝子のスクリーニングを行ったが,5'-非翻訳領域または5'-隣接領域を含むクローンだけは、いずれのライブラリーからも拾うことができなかった。4.動物細胞でのNPPaseの発現----NPPaseの二つのcDNAを連結してフルレングスのcDNAを作製し,動物細胞発現ベクターであるpMSGに組み込み,CHO細胞に導入した。この細胞をクローン化したところ、NPPase活性が著しく上昇したいくつかのクローンが得られた。この活性はデキサメタゾン存在下で細胞を培養することにより,さらに大きく上昇することから、pMSGに挿入されたヒトのNPPase cDNAに由来するものと思われる。発現したNPPaseは分子量で約13万で,ヒトのNPPaseに対して作製した抗体と反応した。1.ヌクレオチドピロホスファタ-ゼ遺伝子の転写量の測定ーrun on分析法による転写量の測定に先立ち、ノ-ザンブロット法により、Lowe症候群患者ならびに正常ヒト繊維芽細胞中に存在する本酵素のmRNA量の測定を行った。その結果、Lowe症候群細胞中では、本酵素の活性上昇にほぼ比例してmRNAの量が上昇していることが明らかとなった。run on分析については現在実施中である。2.ヌクレオチドピホスファタ-ゼ遺伝子のクロ-ニングーヒトのゲノムDNAをSau 3Aで断片化し、EMBLに組込んで本遺伝子のクロ-ニングを行なった。これまでにcDNAの約80%をカバ-するゲノムDNAのクロ-ンをとることに成功しているが、cDNAの5'末端付近、5'非翻訳領域、およびその5'隣接領域をカバ-するクロ-ンは、何回かスクリ-ニングを繰返したにもかかわらず拾うことができなかった。現在、ゲノムDNAを切断する制限酵素とそれを組込むベクタ-をほかのものにかえてスクリ-ニングを行なっている。3.ヌクレオチドピホスファタ-ゼ遺伝子の染色体上での位置の決定ーヌクレオチドピロホスファタ-ゼのcDNAの断片を用いて、in situハイブリダイゼ-ジョン法により、本酵子素の遺伝子が乗っている染色体の種類とその位置を調べた結果、第6染色体のq22ーq23の位置であることが明らかとなった。

Lowe症候群はX染色体に連関した疾病であるため、この疾患と強い相関を示す本酵素の遺伝子はX染体上にあるものと予想していたが、得られた結果はこれとは異なるものであった。こうしたことから、Lowe症候群における本酵素の異常昂進の機構については、X染色体上にあるLowe遺伝子の産物が間接的に本酵素に発現を制御するといった新しい考えを導入する必要があるものと考えられる。1.ヌクレオチドピロホスファターゼのゲノム遺伝子のクローニング----クローニングベクターとしてEMBLを用いたときは、目的の遺伝子の5'非翻訳領域、およびその隣接領域を含むクローンを拾うことができなかった。そこで今回はゲノムDNAをBamHIで消化し、COSMIDベクター(pME15)またはP1ファージベクターSacBII組み込んで、この未同定部分のクローニングを試みた。しかし、cDNA由来のプローブを用いたスクリーニングによっても、また遺伝子歩行の手法を用いることによっても、この部分を含むクローンを拾うことができなかった。現在、ゲノムDNAを消化する制限酵素をほかのものに換え、クローニングを続けている。2.転写におよぼす5'非翻訳領域、5'隣接領域の影響----ヌクレオチドピロホスファターゼの5'非翻訳領域、5'隣接領域のクローニングができなかったため、本実験は中止し、cDNAを用いたヌクレオチドピロホスファターゼの発現実験を行った。これは、第一には得られているcDNAが間違いなく本酵素のものであるかどうかを確認するためであり、第二には開始コドンの確定を行うためである。まず二つのcDNAクローンを連結し、フルレングスのcDNAを作成した。これを動物細胞発現ベクターであるPMSGに取り込み、ポリブレンを用いてCHO細胞にトランスフェクトした。細胞をクローン化したのち、おのおののクローンについてp-ニトロフェニルチミジル酸を基質としてヌクレオチドピロホスファターゼを測定したところ、活性が著しく高いクローンがいくつか得られた。この活性はデキメタゾン存在下で細胞を培養することによりさらに大きく上昇することからPMSGの挿入したcDNAによるものと思われる。SDS-PAGEでも分子量約13万のヌクレオチドピロホスファターゼが発現していることが確認された。
化学反応知識ベースによる次世代燃焼技術支援ツールの開発

予混合圧縮自着火燃焼に代表される次世代の燃焼技術開発においては,詳細化学反応モデルが不可欠とされている.本研究では,詳細化学反応モデルを任意の飽和炭化水素およびその混合物について自動生成する,技術支援ツールを開発した.数千から数万におよぶ素反応過程は,単なるデータベースからの構築は困難であり,類似の化学反応に関する知識を元に,経験則として整理された知識ベースの構築によって成されなければならない.これらの化学反応の知識は,既存の実験結果に加えて,本研究において得られた実験結果・本研究で行われた量子化学計算の結果を活用することによって得られた.特に自着火現象において支配的な役割を果たすアルキルペルオキシラジカルの競合する異性化・分解過程については,本研究によって得られた量子化学計算の結果が不可欠であった.開発された詳細化学反応モデルの自動生成ツールは,以下の点について検証を行った.第1として,オクタン価の基準燃料であるノルマルヘプタン,イソオクタンの自着火遅れ時間の実験値をよく再現した.第2には,飽和炭化水素に限っても多種・多様な燃料分子について,その着火性の傾向を再現することを確認する必要があった.これは,0次元圧縮自着火における着火限界圧縮比を,RON(リサーチ法オクタン価)の実験値が既知である,50種類の飽和炭化水素について計算することによって行った.その結果,本研究で開発した自動生成ツールによって生成した詳細化学反応機構による着火限界圧縮比とRONとの間には,良い相関関係が見出された.このことは,本研究による詳細反応モデルが,多くの炭化水素について,その着火性の傾向を少なくとも半定量的に予測可能であることを示している。この他に,着火性に関して,個々の燃料分子は従来から知られているオクタン価などの指標のみでは記述しきれない,いくつかの性質を示すことが見出された.予混合圧縮自着火燃焼に代表される次世代の燃焼技術開発においては,詳細化学反応モデルが不可欠とされている.本研究では,詳細化学反応モデルを任意の飽和炭化水素およびその混合物について自動生成する,技術支援ツールを開発した.数千から数万におよぶ素反応過程は,単なるデータベースからの構築は困難であり,類似の化学反応に関する知識を元に,経験則として整理された知識ベースの構築によって成されなければならない.これらの化学反応の知識は,既存の実験結果に加えて,本研究において得られた実験結果・本研究で行われた量子化学計算の結果を活用することによって得られた.特に自着火現象において支配的な役割を果たすアルキルペルオキシラジカルの競合する異性化・分解過程については,本研究によって得られた量子化学計算の結果が不可欠であった.開発された詳細化学反応モデルの自動生成ツールは,以下の点について検証を行った.第1として,オクタン価の基準燃料であるノルマルヘプタン,イソオクタンの自着火遅れ時間の実験値をよく再現した.第2には,飽和炭化水素に限っても多種・多様な燃料分子について,その着火性の傾向を再現することを確認する必要があった.これは,0次元圧縮自着火における着火限界圧縮比を,RON(リサーチ法オクタン価)の実験値が既知である,50種類の飽和炭化水素について計算することによって行った.その結果,本研究で開発した自動生成ツールによって生成した詳細化学反応機構による着火限界圧縮比とRONとの間には,良い相関関係が見出された.このことは,本研究による詳細反応モデルが,多くの炭化水素について,その着火性の傾向を少なくとも半定量的に予測可能であることを示している。この他に,着火性に関して,個々の燃料分子は従来から知られているオクタン価などの指標のみでは記述しきれない,いくつかの性質を示すことが見出された.平成15年度は,本研究の最終目標とする、燃焼技術開発支援ツールの骨格をなすソフトウェアとなる、燃焼詳細反応モデルの自動生成ツールの原型を計算機プログラムとして実装することを目標とした。化学反応知識ベースの階層構造(分子構造・分子の属性情報-原子団寄与による推定法-化学反応における類似性と原子団寄与法など)を詳細に検討し実装を行った。必要に応じて下位モジュールを継承しながらツールの改善を図るため,オブジェクト指向による実装形態の検討し、設計を行った。移植性の観点から言語にはANSI C++を、ライブラリにはC++STLを用いた。システム全体は、KUCRS (Knowledgebasing Utility for Complex Reaction Systems)としてベータ運用を試用を開始した。システム中核をなすライブラリの中でも、moleculeクラスはその仕様を慎重に検討し、実装を行った。このライブラリはほぼ、任意のC/H/O/N化学種に対応するように作成された。システム全体は、任意の構造の飽和炭化水素(環状構造を除く)に汎用的に対応できるものが作成された。さらに既存のツールも利用しながら,知識ベースの基盤となる,a)素反応データベースb)素反応研究c)量子化学計算とのインターフェースとなる幾つかのツールを開発した。また素反応研究の実験的情報として、主に流通型反応器を用いた、低温酸化過程の検討を行った。さらに、量子化学計算を用いて、低温酸化過程の中の主要な連鎖分岐反応を系統的に検討した。反応機構自動生成ツールの試験運用の結果として、従来の燃料の燃焼着火指標(オクタン価・セタン価)のみでは記述しきれない、特性が存在することが明らかになりつつあり、これを新たな設計指標として提案することを次年度の目標とする。予混合圧縮自着火燃焼に代表される次世代の燃焼技術開発においては,詳細化学反応モデルが不可欠とされている.

本研究では,詳細化学反応モデルを任意の飽和炭化水素およびその混合物について自動生成する,技術支援ツールを開発した.数千から数万におよぶ素反応過程は,単なるデータベースからの構築は困難であり,類似の化学反応に関する知識を元に,経験則として整理された知識ベースの構築によって成されなければならない.これらの化学反応の知識は,既存の実験結果に加えて,本研究において得られた実験結果・本研究で行われた量子化学計算の結果を活用することによって得られた.特に自着火現象において支配的な役割を果たすアルキルペルオキシラジカルの競合する異性化・分解過程については.本研究によって得られた量子化学計算の結果が不可欠であった.開発された詳細化学反応モデルの自動生成ツールは,以下の点について検証を行った.第1として,オクタン価の基準燃料であるノルマルヘプタン,イソオクタンの自着火遅れ時間の実験値をよく再現した.第2には,飽和炭化水素に限っても多種・多用な燃料分子について,その着火性の傾向を再現することを確認する必要があった.これは.0次元圧縮自着火における着火限界圧縮比を,RON(リサーチ法オクタン価)の実験値が既知である,50種類の飽和炭化水素について計算することによって行った.その結果,本研究で開発した自動生成ツールによって生成した詳細化学反応機構による着火限界圧縮比とRONとの問には,良い相関関係が見出された.このことは,本研究による詳細反応モデルが,多くの炭化水素について,その着火性の傾向を少なくとも半定量的に予測可能であることを示している.この他に,着火性に関して,個々の燃料分子は従来から知られているオクタン価などの指標のみでは記述しきれない,いくつかの性質を示すことが見出された.
地域における事業化を支える社会基盤としての「場」とネットワークの研究

本研究では、地域コミュニティにおける事業化を支える基盤としての「場」および人的ネットワークの構築と再構築のプロセスの解明と、「場」と人的ネットワークに関する理論の精緻化を目的としている。2018年度に実施した理論研究(場の理論の精緻化)と現地調査(フィールドワーク、アクションリサーチ)について以下に記述する。理論研究:場の理論の精緻化については、従前より取り組んでいる東洋大学名誉教授の山口一郎先生と出版事業「職場の現象学」の初稿を2018年末に完成させた。本書は、フッサールが提唱した受動的綜合の概念を用いて、それを職場で起こる様々な現象に適用し、場における共創の可能性に言及した著作である。書籍の構成は理論編、事例編、対談形式による事例の理論的解釈とし、具体的な事例には、駿河湾桜えび漁業の事例、知的障害者施設こころみ学園における仕事と身体性の事例、さらに企業事例((株)前川製作所における顧客との場の共創、巣鴨信用金庫におけるホスピタリティの実践)を取り上げて、あとは数回の校正・編集作業をするところまで来ている(出版は2019年年度内予定)。2018年度9月よりウィーン大学哲学部にての在外研究の一環として、ゲオルグ・ステンガー教授の研究室に所属しながら、同教授の専門とする間文化哲学についてゼミや授業への参加、博士課程の学生などとのディスカッション、ワークショップなどを行った。場の理論研究では、西田哲学の場所論と現象学の受動的綜合の理論を統合した理論構成を目指しており、西田の場所論を始めたとした京都学派に造詣の深い同研究室での議論は、理論の精緻化に大いに役立った。フィールドワーク:フィールドワークとしては、4月8日までは継続調査をしている由比港漁協の桜えび漁業の事例について、訪問調査等を数回行った。ウィーンでは同地域内のインキュベータ等への訪問を行った。理論研究においては、当初より予定していたウィーン大学の在外研究が順調にスタートし、同研究室や同学部における様々な新しい知見に触れることができ、理論の精緻化ならびに理論的発展の可能性(西欧世界における場の理論の適応可能性)に手ごたえを感じた。ウィーン大学哲学部は、教授陣もEU圏からトップクラスの人材が集まるドイツ語圏の哲学研究の拠点の一つである。間文化哲学を専門とするゲオルグ・ステンガー教授の研究室では、西田哲学を専攻する学生も多く、場所論についても活発な議論が行われている。さらに、フッサールのみならずハイデガー、メルロ=ポンティなどの現象学者についての研究も幅広く行われており、それら研究者との交流は、当該研究においても大きな収穫となった。また、ウィーン大学のみならず、ウィーン経済大学のアレクサンダー・カイザー教授の研究室では、知識経営論やU理論(経営学と現象学の融合)を研究しており、同教授との議論や研究室での講演などで、欧州での場の理論の発展可能性手ごたえを感じた。フィールドワークにおいては、2018年度前半は国内のフィールドワークを中心に行った。由比港漁協における桜えび漁業の調査は、従来と同じく継続的に現地を訪問しており、2018年度においても、ほぼ毎月1回程度訪問している。また、一時帰国した2月にも訪問した。桜えび漁は資源量の減少により、長年続けてきたプール制の在り方を含めた従来の漁業の方法の見直し、地域の産地仲買との関係の再構築等、環境変化に応じた対応を迫れており、現地訪問調査では仲買組織の代表等からもヒアリングを行う等、地域再生へ向けての動きをフォローしている。また、漁協幹部の再選がありかなり若返りがなされたが、ほとんどの幹部とは既知の仲であり、常に最新の情報を得られる状況にある。2019年度は、代表研究者は同9月まで在外研究のためオーストリアのウィーンに滞在する予定で、欧州にての研究を推進する予定である。フィールドワークについては、ウィーンならびにドイツの企業のヒアリングを2019年3月より開始した。特にウィーンの企業は200年続く老舗のピアノメーカーであり、地域の文化や伝統に根差した企業である。音楽や芸術の街としてのウィーンという地域コミュニティと楽器メーカーとの関係は、地域創生という観点からも興味深い事例であり、今後も継続調査を行う。欧州における企業や事業化については、ウィーンならびにイタリアのインキュベータの訪問、さらにはスタートアップへのヒアリングを計画している。場の理論の公表として、ウィーン大学哲学部での講演とワークショップを計画している。2017年度に実施した理論研究(場の理論の精緻化)と現地調査(フィールドワーク、アクションリサーチ)について以下に記述する。理論研究:場の理論の精緻化については、「職場の現象学」というテーマを設定して東洋大学名誉教授の山口一郎先生と出版事業に取り組んでいる。特に現象学を応用した場の理論の精緻化とその職場への応用について、月1回のペースで対話を進めてきた。書籍の構成は第1部(理論)、第2部(事例)、第3部(事例の理論的解釈)の予定である。事例としては、桜えび漁業の事例、企業事例((株)前川製作所における顧客との場の創造、巣鴨信用金庫におけるホスピタリティの実践、知的障害者施設こころみ学園における仕事と身体性等)を取り上げる予定である(出版は2018年度内を予定)。フィールドワーク:フィールドワークとしては、由比港漁協の桜えび漁業の事例については、継続調査を行っている。

また2017年度から広島県北広島町芸北地区の限界集落における高校生(広島県立加計高校芸北分校)によるリンゴ栽培と販売活動について、地域活性化の事例として取り上げ、アクションリサーチを行っている。具体的には高校生への起業教育(生産、販売等の計画づくり、目標設定、アウトカムの測定)と地域における事業化(地域創生)への取り組みのヒアリングを行っている。理論研究においては、東洋大学名誉教授との月1回のミーティングならびに文献調査などを進め、理論研究の一つのアウトカムとしての書籍の出版のめどがついた(2018年度内に出版予定)。フィールド調査については、由比港漁協の桜えび漁業の調査を継続しており、順調に推移している。地域活性化への取り組み(広島県北広島町芸北地区、加計高校芸北分校におけるりんごの生産と販売活動)への支援と調査も順調に推移し、芸北分校×CBSイノベーションプロジェクトを立ち上げ、2017年度には現地へ6回訪問し、調査と指導を行った。本研究では、地域コミュニティにおける事業化を支える基盤としての「場」および人的ネットワークの構築と再構築のプロセスの解明と、「場」と人的ネットワークに関する理論の精緻化を目的としている。2018年度に実施した理論研究(場の理論の精緻化)と現地調査(フィールドワーク、アクションリサーチ)について以下に記述する。理論研究:場の理論の精緻化については、従前より取り組んでいる東洋大学名誉教授の山口一郎先生と出版事業「職場の現象学」の初稿を2018年末に完成させた。本書は、フッサールが提唱した受動的綜合の概念を用いて、それを職場で起こる様々な現象に適用し、場における共創の可能性に言及した著作である。書籍の構成は理論編、事例編、対談形式による事例の理論的解釈とし、具体的な事例には、駿河湾桜えび漁業の事例、知的障害者施設こころみ学園における仕事と身体性の事例、さらに企業事例((株)前川製作所における顧客との場の共創、巣鴨信用金庫におけるホスピタリティの実践)を取り上げて、あとは数回の校正・編集作業をするところまで来ている(出版は2019年年度内予定)。2018年度9月よりウィーン大学哲学部にての在外研究の一環として、ゲオルグ・ステンガー教授の研究室に所属しながら、同教授の専門とする間文化哲学についてゼミや授業への参加、博士課程の学生などとのディスカッション、ワークショップなどを行った。場の理論研究では、西田哲学の場所論と現象学の受動的綜合の理論を統合した理論構成を目指しており、西田の場所論を始めたとした京都学派に造詣の深い同研究室での議論は、理論の精緻化に大いに役立った。フィールドワーク:フィールドワークとしては、4月8日までは継続調査をしている由比港漁協の桜えび漁業の事例について、訪問調査等を数回行った。ウィーンでは同地域内のインキュベータ等への訪問を行った。理論研究においては、当初より予定していたウィーン大学の在外研究が順調にスタートし、同研究室や同学部における様々な新しい知見に触れることができ、理論の精緻化ならびに理論的発展の可能性(西欧世界における場の理論の適応可能性)に手ごたえを感じた。ウィーン大学哲学部は、教授陣もEU圏からトップクラスの人材が集まるドイツ語圏の哲学研究の拠点の一つである。
バイオガスを介した生物的物質生産プロセスの構築

1.エタノール高生産株の育種Moorella sp. HUC22-1株のエタノール生産性を向上させる手段の一つと考えられる分子生物学的育種に必要な遺伝子導入系の開発を行った。その結果、相同性組換えとエレクトロポレーション法を用いたゲノムDNAへの組み込みによる形質転換法を用いて、ウラシル合成に必要なdihydroorotate dehydrogenaseとorotate phosphoribosyltransferaseをコードする遺伝子(pyrD、pyrE)を欠損したウラシル要求性株を作製できた。現在、この要求性株をホストに、pyrDとpyrEを選択マーカーに用いて遺伝子導入系の開発を進めている。2.代謝特性の解析HU22-1株を様々な有機酸を基質として回分培養を行い、各基質における代謝特性の解析を行うとともに、代謝経路上の酵素活性を測定した。その結果、どの基質でもエタノールを生成する事はなかったが、マリルCoA経路を介したグリオキシル酸及びグリコール酸の異化代謝に伴う基質レベルのリン酸化によってATPを生成できる事が示唆された。3.培養系でのエタノール生産これまで、H_2/CO_2ガス基質を用いたが、本年度は合成ガスの主成分であるCOを用いた。当初20%COガスまでしか培養できなかったが、20%COガス基質で増殖した菌はさらに60,80%COでも増殖可能となり、このような高COガス下での馴養を繰り返す事により、100%COガス下でも増殖可能となった。COガス下での増殖は最終的に、H2/CO2の場合に比べて8倍となった。また、酢酸/エタノール生成比も低下し、エタノール生産系へシフトした。最終的に、加圧型撹拌型発酵槽を用いてpH制御下での高濃度培養の可能性が開けた。本研究では、我々が単離した酢酸・エタノール生産好熱性偏性嫌気性菌Moorella sp.HUC22-1株を用いて、バイオガスからの有用物質生産(酢酸、エタノール)を目的とした代謝工学的、培養工学的基盤研究を行った。1)水素資化嫌気性菌培養モデリングHUC22-1株の酢酸、エタノール生産向上を目的とし、酢酸による増殖阻害モデルを構築した。その結果に基づき、H_2-CO_2を電子供与体、炭素源とし、菌体リサイクルを伴う連続培養システムを構築し、酢酸濃度が菌体増殖を阻害するレベルに達しないように培養を行なったところ、pH6.3で培養した場合に酢酸840mmol/l、pH5.8で制御することによりエタノール15mmol/lの生産が可能となった。2)エタノール生成経路の解析HUC22-1株の近縁種、Moorella thermoaceticaのゲノム情報に基づき、HUC22-1株のアルコール脱水素酵素(ADH)及びアルデヒド脱水素酵素(ALDH)をクローニングした。これら遺伝子をE.coliに導入して酵素を発現させ、抽出、精製し、その特性を解析したところ、これらの酵素群は、アセチルCo-Aを基質としてエタノールを生産する機能を有することが分かった。3)ガス資化嫌気性菌の探索・単離新規バイオガス資化嫌気性微生物を単離するために、温泉土壌、地下水、大学周辺土壌など様々なサンプルをH_2-CO_2をそれぞれ電子供与体、炭素源とし、さらに硫酸、硝酸、鉄(II)イオンなどの電子受容体を添加し、回分培養により集積培養し、増殖の早い菌株を中心にコロニー単離を試みたが、現状までに、醋酸生成菌以外の有力な株は単離できていない。以上のような結果を踏まえ、来年度はさらに、22-1株のエタノール生産酵素系の解析及びエタノール高生産株の育種方針の策定を行うとともに、新規微生物菌株の単離を引き続き行う。本年度は、バヒオガスを介した生物的物質生産プロセスの構築の研究をさらに進める目的で以下のとおり実施した。(1)エタノール

高生産株の育種Moorella sp.HUC22-1株のゲノムDNAからエタノール生産関与遺伝子を取り出し、コードする酵素を大腸菌で大量発現させ、その機能を解析したところ、これらの酵素はいずれもエタノールを生産する方向に強い活性を有していることが分かった。また、逆転写反応とリアルタイムPCRを用いて、これらの遺伝子のHUC22-1株菌体内での発現レベルの測定を行ったところ、エタノール生産経路の入り口にあたるアセトアルデヒド脱水素酵素の発現量がH_2-CO_2ガスを基質に培養した場合に、フルクトースを基質とした場合の約3倍に増大することが分かった。これらの結果から、これまでに考えられていたH_2-CO_2ガスからのエタノール生産代謝経路の仮説の裏付けを得ることが出来た。さらに、相同性組換えを用いたゲノムDNAへの組込みによる形質転換系の開発を試みた。その結果、相同性組換えによりウラシル合成に必要な遺伝子pyrEを欠損したウラシル要求性HUC22-1株を作製することに成功した。現在は、このウラシル要求性株をホストに、pyrEを選択マーカーに用いた形質転換系の確立と、その形質転換系によるアルコール脱水素酵素遺伝子などのHUC22-1株への導入、及びそれによるエタノール生産性の向上を試みている。(2)培養系でのエタノール生産Clostridium Ijungdahliiを用いて、培養系によるエタノール生産を検討した。その結果、まずH_2・CO_2で培養し、その後CO40%をガス相に入れる事により、最大エタノール生産濃度50mMを得る事ができた。また、CO濃度を制御すればエタノールは増加すると考えられるので、次年度はCO制御培養を行なう予定である。(3)休止菌体での酢酸のエタノール変換Moorella sp.Huc22-1株のH_2・CO_2培養菌体を用い、休止菌体系での酢酸からのエタノール生産を試みた。電子供与体としてCOを用い、反応温度40°Cで菌体1当たりのエタノール生産量147g/kg dry cellを得る事ができた。(4)エタノール生成に関与する酵素系Clostridium Ijungdahliiを用いて、エタノール生成に関与する酵素活性を測定した。その結果、アルコール脱水素酵素およびアルデヒド脱水素酵素灘が検出され、且つアルコール生成側にシフトしている事、および補酵素は両者ともNADHあるいはNADPH依存であることが判明した。この点、Moorella sp.Huc22-1では、アルコール脱水素酵素はNDAH,アルデヒド脱水素酵素はNADPHであるのと異なっていた。本年度は最終年度にあたり、バイオマスを介した生物的物質生産プロセスの構築の研究をさらに進めた。1.エタノール高生産株の育種Moorella sp. HUC22-1株のエタノール生産性を向上させる手段の一つと考えられる分子生物学的育種に必要な遺伝子導入系の開発を行った。