hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体反応の高次構造認識における糖鎖コドンの化学的解明

今日ではポストゲノム研究としてプロテオーム研究が活発に行われているが、プロテオーム研究の究極は、結合している糖鎖の機能の如何に関わっている。生体で作られる多くのタンパク質に糖鎖は結合しており、糖鎖との関係を明確にしないとタンパク質の機能解析はできないと考えられる。本研究班では、タンパク質と糖鎖の分子内および分子問の相互作用系に焦点をあてて、タンパク質や脂質に結合した糖鎖がタンパク質とどのような相互作用でタンパク質の機能を制御しているかを、分子レベルで解明する研究グループを立ち上げるための準備を行うことにある。そこで全体会議、国際シンポジウムと数回の幹事会を開催し、本研究分野の現状と各班員の準備状況を報告し確認した。さらにこれらの会議を通して、今後の研究対象とすべきバイオシステムを選択し、分子内相互作用系としてはマトリックスタンパク質のレセプターであるインテグリンとこれに結合した糖鎖の機能を、また分子間相互作用系としては、N-アセチルグルコサミンと結合するNa^+/K^+-ATPase β1-サブユニットや、シアル酸クラスターと結合する白血球表面のCD38を扱うこととした。これらのバイオシステムで、1)糖鎖がタンパク質と相互作用をする時は、まず糖鎖とタンパク質が電気的相互作用で特異的に認識し、2)これに糖の持つ豊富な水酸基による水素結合が加わり、タンパク質とより安定な複合体を形成することで、特異的認識と動的柔軟性をそなえた高次認識が完成するという作業仮説を設定し、NMR, X線結晶構造解析,計算化学などの手法を用いて、認識の化学的実体を明らかにするため、特定領域研究を申請した。またこうしたアプローチの妥当性をNADase活性をもつCD38に関して共同研究を開始し、分子軌道法などの計算化学により、NADとシアル酸クラスターが類似した分子構造をとり得ることを明らかした。
生物毒や毒性物質に対するマスト細胞による生体防御調節機構の解明

マスト細胞のクモ毒やフグ毒に対する生体防御の働きは示されなかったため、次に「全身性強皮症におけるマスト細胞および生理活性物質の役割」について検討した。エンドセリン-1やヒスタミンの血中濃度は強皮症患者において健常者より高い傾向が見られ、ヒスタミン値は間質性肺炎合併例で特に高く、肺機能との相関が認められた。強皮症皮膚組織にもマスト細胞の数の増加や活性化が認められた。強皮症モデルマウスの解析ではマスト細胞欠損マウスで強皮症病態がより軽微であった。以上より強皮症病態形成におけるマスト細胞の役割が示唆された。マスト細胞の生物毒に対する生体防御の役割を明らかにする目的で、2種類のクモ毒およびフグ毒(テトロドトキシン)投与時の野生型マウス(C57BL/6J)とKit遺伝子変異をもつマスト細胞欠損マウス(C57BL/6-KitW-sh/W-sh)での生体反応(体温変化や致死性)の比較を行った。2種のクモ毒ではいずれも野生型マウスとマスト細胞欠損マウスの間には明らかな生体反応の差は認められなかったが、フグ毒投与によりマスト細胞欠損マウスは野生型マウスに比べ有意に高い致死性を示した。またフグ毒投与下での胃内マスト細胞の脱顆粒も認められた。次に野生型とKit遺伝子変異マウスとの間のフグ毒に対する反応性の違いがマスト細胞自体に関連するものかどうかを明らかにするため、マスト細胞移入マウス(野生型マウス由来の培養マスト細胞を移入したマスト細胞欠損マウス)におけるフグ毒への反応性を比較したところマスト細胞欠損マウスとの明らかな差は認められず、フグ毒に対する生体防御におけるマスト細胞自体の明らかな関与を示唆する結果は得られなかった。さらに野生型マウスにおけるフグ毒の毒性減弱効果が、マスト細胞由来のプロテアーゼを介した機序によるものかどうかを確かめるため、マスト細胞特異的プロテアーゼ欠損/不活化マウスにおけるフグ毒に対する反応性を野生型と比較したが、両者の間でも明らかな差は認められなかった。以上、今回の我々の解析により、1クモ毒の一部に対してはマスト細胞の生体防御の働きは示されず、また、2Kit遺伝子変異マウスは、マスト細胞非依存的にフグ毒に対する抵抗性・防御反応が低下している可能性が示唆された。前年度に行った、マスト細胞の生物毒に対する生体防御機構の役割についての解析はポジティブな結果が得られなかったため、本年度は、動物由来トキシンと相同性が高く、これまでマスト細胞による分解調節作用が明らかとなっている内因性生理活性ペプチドであるエンドセリン-1(ET-1)やアンギオテンシンII(AT II)などに着目し、関連するヒト疾患である全身性強皮症を対象に解析を行った。まず所属機関である九州大学病院において倫理審査委員会の審査を経て実施許可を取得後、同院免疫・膠原病・感染症内科でフォロー中の全身性強皮症および他の膠原病患者のサンプル収集を開始した。収集した患者血液サンプルを用いて、強皮症の病態形成との関わりが強く示唆されているET-1、AT II、またマスト細胞の活性化マーカーであるヒスタミンの血液中の濃度測定をELISA法により行った。強皮症患者の血中ET-1、AT II、ヒスタミン値いずれも健常者、他の膠原病と比較し上昇傾向が認められた。血清ヒスタミン値については強皮症患者、とくに間質性肺炎合併例で高い傾向がみられ、血中ヒスタミン値と肺機能や間質性肺炎マーカーとの相関が認められた。現在、症例数を増やして解析中である。また強皮症診断のため施行した皮膚生検サンプルを用いて、皮膚生検組織におけるマスト細胞の質的量的評価も行っているが、従来の報告通り、強皮症皮膚組織でのマスト細胞の発現亢進・活性化が認められた。さらにブレオマイシン誘導性強皮症モデルマウスを用いた解析も開始しており、同モデルにおける上記生理活性ペプチドの評価、また野生型とマスト細胞欠損マウスとの比較を行うことでマスト細胞やその調節を受ける生理活性ペプチドの強皮症病態形成における役割について検討予定である。「マスト細胞の生物毒に対する生体防御機構の役割」についての解析の結果、1クモ毒の一部に対してはマスト細胞の生体防御の働きは示されず、また、2Kit遺伝子変異マウスは、マスト細胞非依存的にフグ毒に対する抵抗性・防御反応が低下している可能性が示唆された。次に、動物由来トキシンと相同性が高くこれまでマスト細胞による分解調節作用が明らかとなっている内因性生理活性物質であるエンドセリン-1(ET-1)やアンギオテンシンII(AT II)に着目し、これらが病態形成において重要とされる疾患である全身性強皮症を解析対象とした。「強皮症病態形成におけるマスト細胞および生理活性物質の役割」を検討するため、当施設(九州大学病院)でフォロー中の全身性強皮症および膠原病患者の血液サンプルを用いてET-1、AT II、またマスト細胞の活性化マーカーであるヒスタミンの血中濃度測定をELISA法で行ったところ、いずれも強皮症患者において健常者や他の膠原病患者より高い傾向が認められた。血清ヒスタミン値については強皮症患者、とくに間質性肺炎合併例で高い傾向がみられ、血中ヒスタミン値と肺機能・間質性肺炎マーカーとの相関が認められた。また強皮症診断のため施行した皮膚生検サンプルを用いて、生検組織におけるマスト細胞の質的量的評価を行ったところ、強皮症皮膚組織でのマスト細胞の発現亢進・活性化が認められた。

さらに代表的な強皮症モデルであるブレオマイシン誘導強皮症モデルを用いて、野生型とマスト細胞欠損マウスとの比較を行ったところマスト細胞欠損マウスで強皮症病態がより軽微であった。以上より強皮症病態形成における種々の生理活性物質の調節を介したマスト細胞の関与が示唆された。マスト細胞のクモ毒やフグ毒に対する生体防御の働きは示されなかったため、次に「全身性強皮症におけるマスト細胞および生理活性物質の役割」について検討した。エンドセリン-1やヒスタミンの血中濃度は強皮症患者において健常者より高い傾向が見られ、ヒスタミン値は間質性肺炎合併例で特に高く、肺機能との相関が認められた。強皮症皮膚組織にもマスト細胞の数の増加や活性化が認められた。強皮症モデルマウスの解析ではマスト細胞欠損マウスで強皮症病態がより軽微であった。以上より強皮症病態形成におけるマスト細胞の役割が示唆された。マウスを用いた、生物毒に対するマスト細胞の防御反応の役割についての検討についてはポジティブな結果が得られなかったが、当初より予定していた免疫アレルギー疾患モデルでの解析に研究主眼をシフトさせ、「強皮症病態形成におけるマスト細胞および生理活性物質の役割についての検討」というテーマでヒト強皮症サンプルや強皮症モデルマウスを用いた解析を進行させており、概ね当初の研究計画から逸れることなく実行できていると考えられるため。リウマチ膠原病学今後も強皮症患者からのサンプル収集を増やし、ET-1、AT II、さらにVIPといった強皮症および肺高血圧症の病態に関連した生理活性ペプチドの測定を行う。また強皮症患者皮膚組織のマスト細胞数・脱顆粒の程度を評価し、同時にヒスタミン・トリプターゼ等のマスト細胞活性化マーカーの測定を行う。上記血清マーカー、マスト細胞活性化マーカー、皮膚マスト細胞数と強皮症の臨床病態(皮膚硬化の程度、臓器合併症、免疫パラメーター)との関連を解析し、マスト細胞、各生理活性ペプチドと強皮症病態との関連を評価する。また、Tight skinマウスやブレオマイシン誘導性の強皮症モデルマウスを用いて、ヒトと同様に血清マーカーや組織標本を評価し、さらにマスト細胞欠損マウスやプロテアーゼ欠損マウスを用いた検討を加えて強皮症病態形成におけるマスト細胞およびその関連ペプチドの関与を評価する予定である。当初予想していたようなポジティブな結果は得られなかったが、科研費申請時に研究計画・方法(概要)に示した平成25年度分の内容はおおむね実行できたと思われるため。臨床研修を行うに際しての倫理審査委員会の審査およびサンプル収集に時間を要し、生化学的解析の開始・進行の遅れが生じたため。またマウスを用いた解析も研究方針の修正により本格的な解析は今後に予定しており、マウス購入も先送りになっていたため。これまで未解析の生物毒を数種類用いてマスト細胞の防御反応の有無を検討したが、その中ではマスト細胞が防御的に働いている結果を示唆するデータは得られなかった。そのため、本実験系を用いた解析はこれ以上の発展性が望めないと判断し、平行して平成26年度から行う予定としていた「強皮症の病態形成における生理活性物質およびマスト細胞の意義」という内容で今後の研究を進めていきたいと考えている。
数理計画法における離散凸性の研究

1.付値マトロイドの公理を拡張することにより,整数格子点上で定義され整数値をとる関数に対して,離散凸関数とでも呼ぶべき概念が得られることが,本研究の開始時に明らかになっていたが,連続世界の凸解析におけるルジャンドル変換の離散版を導入することによって,整数格子点上で定義された整数値関数に対して共役関数の概念を導入した.これによって,離散凸関数は,いわば表と裏(数理計画の用語では,primalとdual)の姿をもつことになった.離散凸関数の表の姿をM凸性,裏の姿をL凸性と名付け,M凸性を交換公理を拡張することにより特徴付け,L凸性を劣モジュラ性を拡張することにより特徴付けた.2.M凸関数の実効定義域は基多面体であるが,これを,一般化ポリマトロイドの場合に定式化し直した.基多面体と一般化ポリマトロイドは,ある意味で等価な概念であることは知られている事実であるから,これは一種の翻訳作業ということになるが,これによって,Camerini-Conforti-NaddefやFavati-Tardellaなどによる従来の関連研究との関係が明らかとなった.3.離散凸関数の最小化のアルゴリズムについて,ある程度の進展があった.L凸関数がFavati-Tardellaの考察した関数の族に含まれることが分かり,彼らのアルゴリズムによってL凸関数が最小化できる.ただし,これは楕円体法を基礎としているので,純粋に組合せ的とは言い難いアルゴリズムである.一方,M凸関数の最小化については,その性質を巧みに使った組合せ的なアルゴリズムを開発できた.このアルゴリズムの計算量や有効性については、今後,直ちに調べる予定である.1.付値マトロイドの公理を拡張することにより,整数格子点上で定義され整数値をとる関数に対して,離散凸関数とでも呼ぶべき概念が得られることが,本研究の開始時に明らかになっていたが,連続世界の凸解析におけるルジャンドル変換の離散版を導入することによって,整数格子点上で定義された整数値関数に対して共役関数の概念を導入した.これによって,離散凸関数は,いわば表と裏(数理計画の用語では,primalとdual)の姿をもつことになった.離散凸関数の表の姿をM凸性,裏の姿をL凸性と名付け,M凸性を交換公理を拡張することにより特徴付け,L凸性を劣モジュラ性を拡張することにより特徴付けた.2.M凸関数の実効定義域は基多面体であるが,これを,一般化ポリマトロイドの場合に定式化し直した.基多面体と一般化ポリマトロイドは,ある意味で等価な概念であることは知られている事実であるから,これは一種の翻訳作業ということになるが,これによって,Camerini-Conforti-NaddefやFavati-Tardellaなどによる従来の関連研究との関係が明らかとなった.3.離散凸関数の最小化のアルゴリズムについて,ある程度の進展があった.L凸関数がFavati-Tardellaの考察した関数の族に含まれることが分かり,彼らのアルゴリズムによってL凸関数が最小化できる.ただし,これは楕円体法を基礎としているので,純粋に組合せ的とは言い難いアルゴリズムである.一方,M凸関数の最小化については,その性質を巧みに使った組合せ的なアルゴリズムを開発できた.このアルゴリズムの計算量や有効性については、今後,直ちに調べる予定である.
バイオリアクターを中核とする化学発光FIA法による糖尿病関連微量物質の高感度分析

平成8年度は主に化学発光反応の高感度化とバイオリアクターを用いた化学発光FIA法による血清3-ヒドロキシ酪酸(3-HBA)測定法に関する研究を行った。無脈流ポンプの採用,フローセルの改良,光がチューブを伝わって外部から入らないようにする工夫などにより,過酸化水素の検出感度を約0.1μmol/μl(試料)まで上昇させることができた。3-HBA測定に関しては,3-HBA脱水素酵素(3-HBADH)とNADHオキシダーゼ(NOX)の固定化時の重量比が5:1のカラムが3-HBA測定において最も有効に作用した。同時固定化3-HBADH/NOXカラムは1.5mMまでのNADHと3-HBAをほとんどすべて分解し,3-HBAの検量線も直線性を示し,さらに重層や混合HBADH/NOXカラムと比べて約2倍の発光強度を示した。この原因は同時固定化カラムだと,3-HBADHとNOXが非常に近接して存在しているために,それら2つの酵素反応が非常に効率よく進行したためであると考えられる。平成9年度は同法を用いて1,5-アンヒドログルシトール(1,5-AG)の迅速高感度分析法の開発に関する研究を行った。ピラノースオキシダーゼ(PROD)は1,5-AGのみでなくグルコースも酸化分解して過酸化水素を生成する。PRODの1,5-AGに対する反応速度はグルコースに対するよりも非常に遅いが、カラムだと非常に多くのPRODを含むため、1,5-AGの分解率はグルコースの分解率の約70%まで大きく上昇した。血清グルコース除去のために同時固定化グルコキナーゼ(GK)/ピルビン酸キナーゼ(PK)カラムを用いると、GKはグルコースのみでなく1,5-AGをも、その反応速度はグルコースに比べると非常に遅いが、リン酸化した。血清1,5-AG測定に最も有用なカラムは、GK1000U、PK0.28mlを固定化して作製された同時固定化GK/PKカラムで、これに試料1μlを注入すると、試料中のグルコースの99.99%が除去された。このカラムによる血清1,5-AGの測定結果も良好であった。平成8年度は主に化学発光反応の高感度化とバイオリアクターを用いた化学発光FIA法による血清3-ヒドロキシ酪酸(3-HBA)測定法に関する研究を行い,さらに血清1,5-AG測定法に関する研究も少し行った。化学発光の高感度化に関しては,無脈流ポンプの採用,フローセルの改良,光がチューブを伝わって外部から発光検出器内に入らないようにする工夫などにより,ノイズを少なくすることが可能になり,その結果,過酸化水素の検出感度を約0.1μmol/μ1(試料)まで上昇させることができた。3-HBA測定に関しては,バイオリアクター(同時固定化酸素カラム)を構成する3-HBA脱水素酵素(3-HBADH)とNADHオキシダーゼ(NOX)の重量比を5.5:0.5,5:1,4:2と変化させて,3-HBAに対して最も強い活性を示すカラムリアクターを検討した結果,5:1の重量比を持つカラムが3-HBA測定において最も有効に作用した。

また,5:1の重量比をもつ3つの違ったタイプの同じ大きさのカラム,すなわち,同時固定化HBADH/NOXカラム,重層HBADH/NOXカラム,混合HBADH/NOXカラムにNADHと3-HBAをそれぞれインジェクションして,3種のカラムの性能を比較検討した。その結果,同時固定化3-HBADH/NOXカラムは1.5mMまでのNADHと3-HBAをほとんどすべて分解し,3-HBAの検量線も直線性を示し,さらに他の2種のカラムと比べて約2倍の発光強度を示した。重層HBADH/NOXカラムや混合HBADH/NOXカラムはNADHに対しては同時固定化カラムとほとんど同じ分解率を示したが,3-HBAの分解率は悪く直線性を示さなかった。この原因は同時固定化カラムだと,3-HBADHとNOXが非常に近接して存在しているために,それら2つの酵素反応が非常に効率よく進行したためであると考えられる。平成9年度はバイオリアクターを用いた化学発光FIA法による血清1,5-アンヒドログルシトール(1,5-AG)の迅速高感度分析法の開発に関する研究を行った。血清1,5-AGは固定化ピラノースオキシダーゼ(PROD)カラム(2×20mm)内で酸化分解され、生成された過酸化水素をルミノール化学発光法で測定することにより、1,5-AG濃度を求めることができる。PRODは1,5-AGのみでなくグルコースも酸化分解して過酸化水素を生成する。PRODの1,5-AGに対する反応速度はグルコースに対する反応速度よりも非常に遅いが、2×20mmの大きさのPRODカラムを使用すると、非常に多くのPRODを含むため、1,5-AGの分解率はグルコースの分解率の約70%まで大きく上昇した。血清1,5-AGがPRODカラムに導入される前に、血清中のグルコースをいろいろなバイオリアクターを用いて除去する方法を試みた。同時固定化グルコキナーゼ(GK)/ピルビン酸キナーゼ(PK)カラム(3×24mm)を用いると、GKはグルコースのみでなく、1,5-AGをも、その反応速度はグルコースのそれに比べると非常に遅いが、リン酸化することが判明した。溶液状GKでは、GK量を多くすると1,5-AGのリン酸化が起こるが、少量のGKを用いて反応時間を長くすると、グルコースを除去し、しかも1,5-AGのリン酸化が起こりにくいことが判明した。1,5-AGのリン酸化をできるだけ無くし、しかもグルコースの除去率を低下させないバイオリアクターはGK 1000U(1.7mg pro.)、PK 0.28ml(2.8mg pro.)を固定化して作製された同時固定化GK/PKカラムであった。試料1μlが注入されると、このカラムは試料中のグルコースの99.99%を除去することができ、1,5-AGも大きい発光ピークを示した。このカラムによる血清1,5-AGの結果も良好であった。
生殖細胞の成立と分化における分子基盤

PGC7/Stellaは、初期胚、始原生殖細胞、卵細胞で特異的に発現し、受精後に細胞内局在が細胞質から核へと変化する。また、遺伝子改変マウスを用いた解析から、PGC7/Stellaは、卵子に存在する初期発生に必要な「母性因子」であることが明らかにされている。我々は、PGC7/Stellaの機能を解析するために、結合因子の探索を行い、タンパク質の核内輸送に関与するRanBP5(Rallbinding protein 5)を同定した。培養細胞を用いた実験から、RanBP5はPGC7/Stellaの核移行を促進することが明らかになった。次に、RanBPSとエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインを融合させることにより、核に移行することができない細胞質局在型RanBP5を作製した。細胞質局在型RanBPSを受精卵に発現させると、PGC7/Stellaの核移行を阻害しただけではなく、PGC7/Stellaを欠損する卵子とほぼ同様の発生異常を示した。この発生異常は、核局在型PGC7/Stellaを同時に発現させることにより正常化することができた。PGC7/Stellaが受精直後の核内で機能することから、受精卵おけるゲノムのメチル化状態を検討した。その結果、PGC7/Stella欠損の受精卵において、DNA複製が開始される前に雌性ゲノムの脱メチル化が生じていることが明らかとなった。また、PGC7/Stella欠損の受精卵において、いくつかのインプリント遺伝子のメチル化が低下していた。以上のことから、PGC7/Stellaは受精卵におけるエピジェネティック不均等性の成立および初期発生におけるインプリントの維持という、ゲノムの不均等性維持に重要な機能を有することが明らかとなった。生殖細胞の成立・分化機構を解析するために、がん抑制遺伝子PTENとショウジョウバエで生殖細胞の発生に必須な遺伝子であるgerm cell lessのマウスホモログであるmouse germ cell less(mGCL-1)の機能解析をおこなった。PTENはフォスファチヂールイノシトール3リン酸(PIP3)をPIP2に脱リン酸化する脂質フォスファターゼであり、PI3キナーゼ(PIP3)のシグナルを負に制御する。始原生殖細胞特異的にPTENを欠損するマウスを作製したところ、オスでは新生仔において奇形腫が必発であった。オス胎仔における生殖細胞の発生・分化を解析したところ、生殖細胞系列へと運命付けは生じているが、以後の分化が正常に進行せず、未分化な多能性幹細胞へと「脱分化」が生じていることが明らかとなった。また、始原生殖細胞をLIF、bFGF、SCFの存在下で培養したところ、胚性生殖細胞(EG細胞)の樹立効率が著しく向上した。これらの結果から、PTEN/PI3Kのシグナルは、生殖細胞の分化に必須であることが明らかとなった。mGCL-1は核膜に存在するタンパクをコードしており、精巣において高い発現を認める。そのノックアウトマウスは、肝臓や膵臓の細胞において核の形態異常が認められたが、個体発生は正常であった。オスマウスでは妊孕性が有意に低下していた。ノックアウトマウスの精子は、頭部のみのもの、多頭多尾のものなど、いろいろな形態異常が認められた。また、精子形成過程においても、著しい核の形態異常が認められた。哺乳類の生殖細胞の成立・分化機構を解析するために、ショウジョウバエにおいて生殖幹細胞の維持に必須な遺伝子であるpiwiのマウスホモログであるmiliの機能解析をおこなった。mili遺伝子を欠損するマウスを作成したところ、精子形成がパキテン期において停止し、精子が全く産生されないことが明らかとなった。この表現型は、マウスの精子形成において必須なMVH(mouse vasa homologue)ノックアウトマウスとほぼ同じであったため、miliタンパクとMVHタンパクが結合するかどうかを調べたところ、miliタンパクとMVHタンパクが結合することが明らかとなった。piwi遺伝子ファミリーがRNAのプロセシングに関与していること、また、MVHがRNAヘリケースをコードしていることから、miliがRNA干渉を介して精子形成に寄与しているものと考えられる。PGC7/Stellaは、始原生殖細胞の発生初期に発現する遺伝子である。このタンパクの機能を知るため、PGC7に結合するタンパクの解析をおこなった。その結果、RanBP5という、核移行に関与するタンパクが結合することが明らかとなった。また、PGC7を欠損するマウスを作成したところ、PGC7欠損マウスにおいても生殖細胞は正常に発生するが、初期胚の発生に異常が生じることが明らかとなった。RanBP5、PGC7の変異体を作成し解析したところ、PGC7の初期胚発生における機能には、その核移行が必須であることが明らかとなった。Piwi遺伝子は、ショウジョウバエの生殖幹細胞の維持に必須な遺伝子として単離された遺伝子である。その後の解析により、PiwiファミリーのメンバーはRNA干渉(RNA interference、RNAi)のコンポーネントとして機能することが明らかになりつつある。また、RNAiの一つとして.ヘテロクロマチン化やDNAのメチル化を通じて遺伝子発現を抑制するTGS(transcriptional gene silencing)と呼ばれる現象が知られている。しかし、哺乳類においては、どのような機構でTGSがおこなわれているかは不明のまま残されている。我々は、マウスのPiwiファミリー遺伝子の一つであるMni遺伝子を欠損するマウスの精巣において、IAPとLine-1という二つのレトロトランスポゾンの発現が上昇していることを見いだした。

さらに、このレトロトランスポゾンの発現上昇は、その制御領域のメチル化が低下していることによって生じていることを明らかにした。また、Miliと結合し,MILIと同様に精子形成に必須な遺伝子であるMVH(mouse vasa homologue)を欠損するマウスでも,同様にレトロトランスポゾンの発現上昇が認められた。もう一つのマウスPiwiファミリー遺伝子であるMisti(miwi-2)を欠損するマウスでは、Mni欠損マウスと同様に精子形成の異常が認められた。Misti欠損マウスの精巣において、IAPの発現上昇は認められなかったが、Line-1の発現上昇が認められ,Line-1遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の低下も認められた。以上のことから、マウスPiwiファミリー遺伝子であるMiliとMistiは、DNAのメチル化によりレトロトランスポゾンの発現を抑制していることが明らかとなった。幹細胞の維持に関与するPiwiファミリー遺伝子のうち、マウス精巣において特異的に発現するMILIおよびMISTIについて、以下の成果を得た。1)MILIターゲティングマウスにおけるDNAメチル化と遺伝子発現制御MILIターゲティングマウスにおいて、レトロトランスポゾンの遺伝子発現が上昇していたことから、レトロトランスポゾンの制御領域のDNAメチル化状態を解析した。その結果、MILIターゲティングマウスでは、レトロトランスポゾンの制御坂城におけるDNAメチル化が低下していることが明らかになった。また、このメチル化の低下は、精巣の発生過程において非常に早い段階から見いだされたことから、MILIはDNAのde novoメチル化において機能していると考えられた。また、MILIターゲティングマウスでは、レトロトランスポゾン遺伝子だけでなく、インプリンティング遺伝子のいくつかにもDNAメチル化の低下が認められた。下記のpiRNAのデータとあわせて、MILIは精巣において、Small RNAを介してDNAのメチル化を制御していると考えられた。2)MILIおよびMIWIに結合するsmallRNAの同定米国の二つのグループと共同で、MILIおよびMISTIに結合するsmall RNAを解析したところ、これまでに知られていたsmall RNAよりもサイズの大きなsmallRNAがMILIおよびMISTIに結合することが明らかとなった。この比較的大きなsmall RNAはpiRNA(piwi-interacting RNA)と名付けられ、MILIおよびMISTIが、その産生あるいは安定性の維持に関与していると考えられる。PGC7/Stellaは、初期胚、始原生殖細胞、卵細胞で特異的に発現し、受精後に細胞内局在が細胞質から核へと変化する。また、遺伝子改変マウスを用いた解析から、PGC7/Stellaは、卵子に存在する初期発生に必要な「母性因子」であることが明らかにされている。
細胞内　ＤＮＡ　センサーの同定と機能解析

DNase II遺伝子ノックアウトマウスでは、未分解の内在性DNAがマクロファージ細胞内に大量に蓄積し、自然免疫応答の慢性的な活性化により関節リウマチを発症する。この自然免疫応答にはSTINGタンパク質が必須であるが、その分子機構は不明であった。そこで、STINGに注目して研究を行ったところ、細胞にDNAを導入するとSTINGが二量体化することを見出した。また、DNAを細胞内に導入した後の細胞抽出液を用意し、STINGタンパク質と試験管内で混合すると、STINGタンパク質の二量体化が誘導されることを発見した。これはDNA刺激後の細胞抽出液中にSTINGの二w量体化を誘導する因子が存在することを意味していた。この因子の性質を調べた結果、DNAやRNA、タンパク質でもない低分子の化合物であることが判明した。イオン交換カラムや疎水性カラムなどを用いてSTINGの二量体化因子を精製後LC-MSMS解析を行った結果、新規低分子化合物cGAMP (cyclic GMP-AMP)を同定することに成功した。cGAMPは、STINGに直接結合し二量体化を促すことで、下流の自然免疫応答を誘導するセカンドメッセンジャーであることが明らかとなった。さらにcGAMPを特異的かつ高感度に検出するアッセイ系を構築し、DNase IIノックアウトマウス組織中にcGAMPが存在する事を明らかにした。本研究は、新規セカンドメッセンジャーcGAMPが哺乳類の生体内において自己のDNAによって産生されることをを明らかにしたものであり、今後この新しい分子の生理作用を詳細に解析することにより自己免疫疾患等の病態解明や治療薬の開発につながることが期待される。(抄録なし)DNase II遺伝子ノックアウトマウスでは、未分解の内在性DNAがマクロファージ細胞内に大量に蓄積し、自然免疫応答の慢性的な活性化により関節リウマチを発症する。(抄録なし)
流域特性のメッシュ集中化によるマクロ水文モデルの開発

本研究は、特に陸面での水の水平方向の移動に関する現象について、マクロスケールでモデル化するための新たな手法を構築することを目的として行なわれたものであり、最終年度にあたって、以下の4項目が実施された。1.詳細な数値地形データを利用した分布型流出シミュレーションモデルの開発:陸面水文過程の特徴である空間スケールの小さな現象を大きなスケールでとらえる場合、すなわち、集中化メッシュを構成する場合に、地形・土地利用など流域場を構成する諸量をどのように平均するかを検討しておく必要がある。この検討のために、流域の地形・土地利用を忠実に取り込むことができる詳細な分布型流出シュミレーションモデルを開発した。2.流域地形の流出ハイドログラフに対する影響に関する検討:上記の流出シミュレーションモデルを利用して、空間スケールを大きくとることによって、流域地形が流量ハイドログラフにどのような影響を及ぼすかを調査した。この調査によって、流域地形を集中化する上での基本的な流域スケールを把握することが可能となった。3.メッシュ集中化による流出系モデルのスケールアップ:現実の樹枝状構造をした河道網を、任意の流域単位に分割し、流域単位ごとに河道流れを集中化する手法を構築した。流域単位として、任意の大きさのメッシュを取ることも当然、可能であり、このモデルの枠組がメッシュ集中化によるマクロモデル構築の中核となる。4.流域情報データベースの開発:上述のモデルの開発と実証のために必要となる水文・気象観測データ、地形や地質、土地利用などの地理的データ、地球観測衛星による画像データを総合的に整理し利用するために、淀川流域を対象として、リレーショナルデータベース、地理情報システム、衛星画像処理システムを組み合わせた水文・気象データ検索・処理システムを構築した。本年度の研究成果を以下に列挙する。・流域地形に即した詳細な分布型洪水流出シミュレーションモデルをワークステーション上で開発した。これらは,従来,パーソナルコンピュータ上で実現していたものを,広域でのシミュレーションを可能とするために,ワークステーションに移植したものである。これによって,空間スケールの変動によって流域地形がどの程度,流出に影響を及ぼすかを大きな流域においても調査することが可能となった。・グリッドごとに集中化した流域場・流れのモデルを構築するために,グリッド内部での河道網における河道流れを集中化する手法を開発した。これによって,メッシュ集中化によるマクロ水文モデル構築のための上台が構築された。・衛星リモートセンシングデータを利用して,広域での蒸発散量を推定することを目的として,琵琶湖流域において,大気の流れと結合した蒸発散量推定モデルを開発した。・土壌水分量の時間空間的変動と降水現象の関係を明らかにするために,土壌からのフラックスを考慮し得る降水シミュレーションモデルを開発した。・広域での流域場情報を衛星リモートセンシンデータから取得する可能性および方法について検討した。・広域での水循環モデルを構築するためには,膨大なデータを必要とする。データを効率よく管理するために,水文データ・気象データ等の数値データはリレーショナルデータベース化して管理する手法を開発した。次年度は,これらの個々の研究を継続するとともに,これらの成果を結合して,マクロ水文モデルの枠組を構成することを目的とする。気象系との相互作用を考慮に入れて流出系の分析を行う場合、相互の時間・空間スケールをどのように調整するかが重要な課題となってくる。一般には、我が国での従来の流出系の分析スケールは、一河川流域規模を超えるものではなく、気象系の分析スケールと歩調を合わせるには、流出系モデルのスケールアップが必要となってくる。本研究では、流域特性をメッシュ単位で集中化し、それらの結合体としてマクロ水文モデルを構築するために、一般的な河道網のモデルをスケールアップする方法について検討し、二つの河道網モデルを構成した。一つは流れの状態をkinematic waveモデルで記述するもの、もう一つは流れの状態をdynamic waveモデルで記述するものである。

前者は急峻な上流域など河川流量の低減の少なく、また分流やループがなく、構造が比較的単純な河道網に対して適用されることを想定している。後者は低平な下流域など、河川流量の低減が大きい河道網に対して適用されることを想定している。また対象河道網内に分流やループが存在していてもかまわない。河道網内の流量の分布が線形性の仮定を設けて、集中化されたkinematic waveモデルを構築し、仮想的な河道網に本手法を適用した。その結果、集中化しない場合とほとんどかわらない結果が得られ、本手法の有効性を確認した。また、河道網内の状態量の分布に線形性の仮定を設けて、集中化されたdynamic waveモデルを構築した。仮想河道網に本手法を適用した結果、集中化されたkinematic waveモデルほど、よい結果をだすことができないことが判明し、その原因が、合流点の水深の推定方法にあることを明らかにした。次年度で、この点を改良することにより、精度の高い集中型のdynamic waveモデルを構築する見通しがついた。本研究は、特に陸面での水の水平方向の移動に関する現象について、マクロスケールでモデル化するための新たな手法を構築することを目的として行なわれたものであり、最終年度にあたって、以下の4項目が実施された。1.詳細な数値地形データを利用した分布型流出シミュレーションモデルの開発:陸面水文過程の特徴である空間スケールの小さな現象を大きなスケールでとらえる場合、すなわち、集中化メッシュを構成する場合に、地形・土地利用など流域場を構成する諸量をどのように平均するかを検討しておく必要がある。この検討のために、流域の地形・土地利用を忠実に取り込むことができる詳細な分布型流出シミュレーションモデルを開発した。2.流域地形の流出ハイドログラフに対する影響に関する検討:上記の流出シミュレーションモデルを利用して、空間スケールを大きくとることによって、流域地形が流量ハイドログラフにどのような影響を及ぼすかを調査した。この調査によって、地域地形を集中化する上での基本的な流域スケールを把握することが可能となった。3.メッシュ集中化による流出系モデルのスケールアップ:現実の樹枝状構造をした河道網を、任意の流域単位に分割し、流域単位ごとに河道流れを集中化する手法を構築した。流域単位として、任意の大きさのメッシュを取ることも当然、可能であり、このモデルの枠組がメッシュ集中化によるマクロモデル構築の中核となる。4.流域情報データベースの開発:上述のモデルの開発と実証のために必要となる水文・気象観測データ、地形や地質、土地利用などの地理的データ、地球観測衛星による画像データを総合的に整理し利用するために、淀川流域を対象として、リレーショナルデータベース、地理情報システム、衛星画像処理システムを組み合わせた水文・気象データ検索・処理システムを構築した。
DNAグアニン四重鎖構造体を分子認識素子として利用したプロテインチップの創製研究

(1)「プロテインチップ適合型グアニン四重鎖構造体核酸ライブラリーの創製」ランダムな塩基配列を作成するコンピューターアルゴリズムを用いて設計したグアニン塩基に富む核酸配列のグアニン四重鎖形成能を、様々な塩条件での安定性を調べることにより詳細に評価した。(2)「グアニン塩基比率を高めた核酸配列ライブラリー創製法の検討」タンパク質と様々な結合特性(選択性、親和性)を示すグアニンRNA四重鎖核酸構造体を作製するために、多様な構造、配列のグアニン四重鎖構造体ライブラリー構築法を確立した。具体的には、DNA化学合成、遺伝子工学的手法を融合することにより、配列多様性、構造的多様性を有するグアニンRNA四重鎖構造ライブラリーの簡便で効率的な合成方法を確立した。(最終年度実施内容)これまでに確立した塩基配列に偏りのあるライブラリーを用いて、グアニン四重鎖構造体の分子認識の有用性を明らかにするためにin vitroセレクション法を行った。標的分子としてはストレプトアビジンを選択した。セレクションサイクルの増加に伴い、タンパク質結合RNA画分の割合の顕著な増加が認められた。選択したRNAをDNAへと変換し、大腸菌にクローニングし配列解析を行ったところ、期待通りグアニン塩基に富む配列が確認されたことから、グアニン四重鎖ライブラリーの有用性が示唆された。各クローンごとの結合評価を行うことにより、グアニン四重鎖構造体の分子認識能を明らかにすることができると期待される。「プロテインチップ適合型グアニン四重鎖構造体核酸ライブラリーの創製」タンパク質と様々な結合特性(選択性、親和性)を示すグアニン四重鎖核酸構造体を作製するために必要な、多様な構造、配列のグアニン四重鎖構造体ライブラリー構築法を確立する。本研究提案では、チップにおける分子素子の化学的安定性を考慮しDNA型の分子素子設計のために以下の2つのアプローチ、(1)ランダムな塩基配列を作成するコンピューターアルゴリズムを用いて、一定のグアニン塩基含有量を設定したDNA配列をランダムに設計する。あるいは(2)グアニン四重鎖構造形成に必要な、グアニンが3個連続した5'-GGG-3'ブロック配列を塩基配列設計に組み込み配列を設計する、を計画した。特定の塩基のみから形成されるトロンビン結合性DNAアプタマー(5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3')が、グアニン四重鎖構造を形成し、高い親和性で標的分子に結合するという報告に基づいて、本年度は30塩基長からなる(70%グアニン塩基、残り30%をチミン塩基)核酸をランダムな配列を生成するアルゴリズムを用いて設計した。設計したDNAを化学合成しグアニン四重鎖形成能を、UV融解曲線解析、円偏光二色性分析等により評価した。設計したグアニン塩基に富むDNAは295 nmにおける紫外可視光吸収スペクトル変化、およびグアニン四重鎖に特徴的円偏光二色性スペクトルからカリウム塩存在条件下グアニン四重鎖構造を形成していることがわかった。本研究成果は、コンピューターアルゴリズムを用いた簡便な手法により多数の分子センサーが構築できる可能性を示すものであった。DNAの分子設計等、当初計画した内容はおおむね遂行できたと考えているが、本研究の内定通知が10月、研究費の使用が12月中旬からであったため当初の年次計画よりは若干であるが遅れてしまった。具体的には、DNA化学合成、遺伝子工学的手法を融合することにより、配列多様性、構造的多様性を有するグアニンRNA四重鎖構造ライブラリーの簡便で効率的な合成方法を確立を目指した。(実施内容)DNAの化学合成時に塩基混合比率を変化させることにより、特定の塩基混合比を高めた核酸ライブラリーを合成することが出来る。本研究では、グアニンの塩基混合比を高めた、40塩基長の領域をランダムな基質結合領域として有するライブラリー配列をタンパク質捕捉領域として設計した。グアニン四重鎖のような安定な高次構造を形成する領域ではDNAポリメラーゼ反応は強く阻害されることから、シトシン塩基に富む核酸ライブラリーを鋳型として用い、DNAポリメラーゼを利用して二重鎖DNAへと変換した後、プラスミドDNA、大腸菌を利用してクローニングを行った。得られた大量のコロニーの中から32種類のクローンの配列解析を行ったところ、DNA化学合成時のシトシン塩基の混合比をよく反映していた。配列解析を行ったクローンは、T7RNAポリメラーゼにより容易にグアニン塩基に富む領域を有するRNAへと変換できることがわかった。コンピューターアルゴリズムを用いて設計したグアニン四重鎖型DNA素子の構造特性を調べた結果、いずれも期待通りのグアニン四重鎖構造を形成していることを明らかにできた。また、この手法とは全く異なる酵素化学的なグアニン四重鎖配列素子創成手法が確立できた点から、順調に進展していると考えている。(1)「プロテインチップ適合型グアニン四重鎖構造体核酸ライブラリーの創製」

ランダムな塩基配列を作成するコンピューターアルゴリズムを用いて設計したグアニン塩基に富む核酸配列のグアニン四重鎖形成能を、様々な塩条件での安定性を調べることにより詳細に評価した。(2)「グアニン塩基比率を高めた核酸配列ライブラリー創製法の検討」タンパク質と様々な結合特性(選択性、親和性)を示すグアニンRNA四重鎖核酸構造体を作製するために、多様な構造、配列のグアニン四重鎖構造体ライブラリー構築法を確立した。具体的には、DNA化学合成、遺伝子工学的手法を融合することにより、配列多様性、構造的多様性を有するグアニンRNA四重鎖構造ライブラリーの簡便で効率的な合成方法を確立した。(最終年度実施内容)これまでに確立した塩基配列に偏りのあるライブラリーを用いて、グアニン四重鎖構造体の分子認識の有用性を明らかにするためにin vitroセレクション法を行った。標的分子としてはストレプトアビジンを選択した。セレクションサイクルの増加に伴い、タンパク質結合RNA画分の割合の顕著な増加が認められた。選択したRNAをDNAへと変換し、大腸菌にクローニングし配列解析を行ったところ、期待通りグアニン塩基に富む配列が確認されたことから、グアニン四重鎖ライブラリーの有用性が示唆された。各クローンごとの結合評価を行うことにより、グアニン四重鎖構造体の分子認識能を明らかにすることができると期待される。「グアニン四重鎖構造体DNAライブラリーのタンパク質結合能評価」本年度結果により得られた知見をもとに作成した四重鎖型素子ライブラリーと対象分子との結合能を、表面プラズモン共鳴分光(SPR)を利用した相互作用解析法により評価する。SPRチップ上に固定したDNA素子単体あるいは素子ライブラリーと、解析対象とするタンパク質との相互作用様式を、結合に伴うSPR変化を指標に解析する。SPRチップ上へのDNA素子の固定は、ビオチン-アビジンの特異的な分子間相互作用、あるいは基板上に固定化したDNAオリゴマーとの相補的な二重鎖形成、を利用する。DNA素子とタンパク質との相互作用解析結果に基づいて、DNA素子の塩基長、塩基組成検討にフィードバックする。期待通りの分子センサーとしての活性がグアニン、チミン塩基のみからなるDNAでは達成できなかった場合は、チミンだけではなく他のアデニン、シトシン塩基も含めた配列ライブラリーを構築し、本年度同様グアニン四重鎖形成活性を多様な手法で解析したのち、センサー活性を評価していきたい。個別のDNA素子の評価結合ではDNA素子の評価が十分には行えないと判断した場合には、次年度以降に計画しているセンサーアレイによる評価へと移行する。「グアニン四重鎖センサーアレイの創製」今年度までに作成できたグアニン四重鎖構造体をチップ上に固定化し、タンパク質との結合評価を行う。具体的には、DNA素子についての評価を第一段階に予定している。チップ上のDNA素子とタンパク質との結合は、タンパク質結合に伴うチップ表面での電気化学特性の変化を利用する手法、あるいは表面プラズモン分光法により評価する。
合金/溶融塩界面での酸化皮膜形成過程に関する研究-ひずみ電極法による検討-

本研究は高温溶融塩環境でのひずみ電極法測定システムを確立し,溶融塩中における材料表面の酸化皮膜の破壊・修復過程を追跡し,その機構を明らかにすることを目的としている.溶融塩系でのひずみ電極計測システムはほぼ完成し,300°CのKNO_3-NaNO_3溶融塩中でSUS304ステンレス鋼を試料として計測を行った.具体的にはSUS304鋼を不働態化電位に定電位分極した状態で,定ひずみ速度での引っ張り試験を行い,そのときの荷重と電流の変化を記録計測した結果,次のことがわかった.ひずみ電極の電気化学的な挙動は,一般的に,試料極の変形状態により,大きく3つ領域に分かれた.(I)弾性変形領域では試料極の弾性的な伸びによる酸化皮膜の膜厚の減少あるいは皮膜破壊による電流の増加が観察された.(II)塑性変形領域ではすべり変形の結果生じる新生面の出現による電流の急激な増加が観察された.また,変形に対する電流の増加速度は弾性領域より小さくなることがわかった.(III)破断変形領域では破断面の出現による電流増加とその後の破断面の不働態化のための急激な電流減少が観察された.また,塩化物イオンを50mol%まで添加した硝酸塩浴で,引っ張り速度(10mm/minと1mm/min)を変えて伸びに対する応力と電流応答を調べた結果,引っ張り速度が速くなるほど新生面の生成速度が大きくなり,それに再不働態化が追いつけなくなるため,短時間に多くの電流が流れることが分かった.以上,述べたように現時点では,溶融塩中での金属材料の変形に対しての酸化皮膜の破壊・修復過程を開発したひずみ電極システムにより追跡可能であることを明らかにした.今後,このシステムを使ってデータを蓄積することにより酸化皮膜の破壊.修復過程が明らかにされるものと期待される.本研究は高温溶融塩環境でのひずみ電極法測定システムを確立し,溶融塩中における材料表面の酸化皮膜の破壊・修復過程を追跡し,その機構を明らかにすることを目的としている.溶融塩系でのひずみ電極計測システムはほぼ完成し,300°CのKNO_3-NaNO_3溶融塩中でSUS304ステンレス鋼を試料として計測を行った.具体的にはSUS304鋼を不働態化電位に定電位分極した状態で,定ひずみ速度での引っ張り試験を行い,そのときの荷重と電流の変化を記録計測した結果,次のことがわかった.ひずみ電極の電気化学的な挙動は,一般的に,試料極の変形状態により,大きく3つ領域に分かれた.(I)弾性変形領域では試料極の弾性的な伸びによる酸化皮膜の膜厚の減少あるいは皮膜破壊による電流の増加が観察された.(II)塑性変形領域ではすべり変形の結果生じる新生面の出現による電流の急激な増加が観察された.また,変形に対する電流の増加速度は弾性領域より小さくなることがわかった.(III)破断変形領域では破断面の出現による電流増加とその後の破断面の不働態化のための急激な電流減少が観察された.また,塩化物イオンを50mol%まで添加した硝酸塩浴で,引っ張り速度(10mm/minと1mm/min)を変えて伸びに対する応力と電流応答を調べた結果,引っ張り速度が速くなるほど新生面の生成速度が大きくなり,それに再不働態化が追いつけなくなるため,短時間に多くの電流が流れることが分かった.以上,述べたように現時点では,溶融塩中での金属材料の変形に対しての酸化皮膜の破壊・修復過程を開発したひずみ電極システムにより追跡可能であることを明らかにした.今後,このシステムを使ってデータを蓄積することにより酸化皮膜の破壊.修復過程が明らかにされるものと期待される.1.高温溶融塩用ひずみ電極装置の試作高温用のひずみ電極の場合,るつぼ底部に穴をあけ電極を通したときの電極/るつぼ界面のシールドが当初から大きな問題であったが,アルミナセメントを用いることによりほぼ解決できた.まず,電極としてSUS304ステンレス鋼,溶融塩として融点が低く,化学的に安定な硝酸塩(等モルNaNO_3-KNO_3)を用い,温度400°Cで試作した高温溶融塩用ひずみ電極の予備試験を行った.その結果,るつぼ底部のアルミナセメントによるシールド部からの溶融塩の洩れもそれほど激しくなく,計測可能であることが確認された.2.硝酸塩でのSUS304ステンレス鋼ひずみ電極での測定結果定電位にアノード分極し,ひずみ速度10mm/minで変形させながら電流の変化を計測したところ,変形に起因した電流変化挙動は3つの領域に分類された.第1領域は弾性変形領域で,電流の増加はわずかであり,これは不働態皮膜の厚さの変化による電流変化と考えられる.第2領域は,塑性変形領域で,すべり変形による新生面が表面にあらわれるため急激な電流増加が観察される.第3領域は破壊直前で割の進行が始まり,これにともなう新生面ができるため,最も大きな電流増加が観察される.また,溶融硝酸塩に10mol%の塩化物イオンを添加することにより,変形による電流変化は,溶融硝酸塩だけのときに比べて数倍大きくなり,塩化物イオンにより新生面の再不働態化が遅れることがわかった.以上述べたように,現在のところ,高温溶融塩用ひずみ電極システムはほぼ確立し,今後,さらに高温腐食が問題となる,溶融塩化物あるいは溶融硫酸塩系へ適用する予定である.本研究は高温溶融塩環境でのひずみ電極法測定システムを確立し、溶融塩中における材料表面の酸化皮膜の破壊・修復過程を追跡し、その機構を明らかにすることを目的としている。

溶融塩系でのひずみ電極計測システムはほぼ完成し、300°CのKNO_3-NaNO_3溶融塩中でSUS304ステンレス鋼を試料として計測を行った。具体的にはSUS304鋼を不働態化電位に定電位分極した状態で、定ひずみ速度での引っ張り試験を行い、そのときの荷重と電流の変化を記録計測した結果、次のことがわかった。ひずみ電極の電気化学的な挙動は、一般的に、試料極の変形状態により、大きく3つの領域に分かれた。(I)弾性変形領域では試料極の弾性的な伸びによる酸化皮膜の膜厚の減少あるいは皮膜破壊による電流の増加が観察された。(II)塑性変形領域ではすべり変形の結果生じる新生面の出現による電流の急激な増加が観察された。また、変形に対する電流の増加速度は弾性領域より小さくなることがわかった。(III)破断変形領域では破断面の出現による電流増加とその後の破断面の不働態化のための急激な電流減少が観察された。また、塩化物イオンを50mol%まで添加した硝酸塩浴で、引っ張り速度(10mm/minと1mm/min)を変えて伸びに対する応力と電流応答を調べた結果、引っ張り速度が速くなるほど新生面の生成速度が大きくなり、それに再不働態化が追いつけなくなるため、短時間に多くの電流が流れることが分かった。以上、延べたように現時点では溶融塩中での金属材料の変形に対しての酸化皮膜の破壊・修復過程が、開発したひずみ電極システムにより追跡可能であることがはじめて示された。今後、このシステムを使ってデータを蓄積することにより酸化皮膜の破壊・修復過程が明らかにされるものと期待される。