hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重水素交換と高圧NMRによる蛋白質構造のゆらぎに関する共同研究

本共同研究では、蛋白質ウシ脾臓トリブシンインヒビターBPTIを主たる対象に、神戸大学で開発されたオンライン超高分解能高圧NMR装置(750MHz)を用い、12000barの任意の圧力下で、加圧による蛋白質の構造及びダイナミクスの変化について初めて原子レベルの分解能で研究した。通常のBPTI試料はシグマ社製から購入し、15N標識BPTI試料はC.Woodward教授(ミネソタ大学)が作成、また13C標識BPTIはG.Montelione教授(Rutgers大学)から提供していただいた。その成果は以下の通りまとめられる。なお以下の実験の成功に鑑み、多大の時間を要する重水素交換反応に対する圧力効果の測定は中断した。1.軽水中のプロトン二次元NMR測定及び15N/1H二次元NMR測定で、主鎖アミドの1H,15Nの信号がともに圧力に対して強い低磁場シフト(それぞれ平均0.075ppm/2kbar,0.47ppm/2kbar)を示すことから、加圧による主鎖アミドの水素結合距離の短縮が明かとなった。2. 15N信号の圧力シフトはアミノ酸毎に顕著なバリエーション(01.5ppm/2kbar)を示すことから、加圧により二面角φとΨも変化すると考えられる。特にヘリックスとループがβ-シートに比べその変化が大きいことが明かとなった。3.プロトン核オーバーハウザー(NOE)の測定から、加圧によるBPTIの三次構造変化を測定し、特に酵素との結合セグメントが圧縮され易いことが明かとなった。4. 15Nスピン緩和の測定から、加圧による主鎖のnsecpsec程度の速い内部運動の変化について研究したところ、部位により若干の変化が認められ、詳細を解析中である。5.ミリ秒程度の時間域での遅い運動については、プロトンNMRスペクトルから、加圧により一部のTyr,Pheの環回転が遅くなることが判明し、その原因が残基間距離の短縮によることが明かとなった6. 13C信号の化学シフトの加圧に伴うシフトの測定に成功し、結果を解析中である。超高磁場下(17.6T)の高感度高分解能で、1-2000気圧の範囲で圧力を自由に制御して、二次元NMR測定を行い、蛋白質牛脾臓トリプシンインヒビター(アミノ酸58残基)の原子一つ一つからの信号の化学シフト変化を検出した。その結果、アミド水素の化学シフトは加圧によりほとんどが低磁場シフトをすることを発見した。そのシフトは圧力に対して直線的で、且つ可逆的である。この現象はアミド水素の関与する水素結合が、加圧下で短縮することにあると結論された。蛋白質内部での28個の水素結合について、シフトの大きさから2000気圧での短縮度を見積もると、短縮度は場所によってまちまちであり、二次構造内部では比較的小さく、二次構造の末端では比較的大きい傾向を示した。また、N-15標識した牛脾臓トリプシンインヒビターについて加圧下でのN-15信号のシフトを測定した。N-15信号も大きく低磁場シフトを示し、水素結合の短縮を示すとともに、主鎖のφ,Ψ角も、特にヘリックスやループ領域で変化していることが推察された。これらの水素結合の短縮度は、重水素交換速度とかなりの対応を示した。

以上の結果、加圧によって、牛脾臓トリプシンインヒビターの分子全体の構造が、少しではあるが変化することが明らかになり、且つその変化の仕方が規則性をもつことも明らかになってきた。これらの構造変化は構造の揺らぎに対応するもので、超高磁場高圧二次元NMRは、蛋白質構造の揺らぎ研究の新しい方法となり得ることを示した。蛋白質うし牌臓トリブシンインヒビターBPTIを主たる対象に、神戸大学で開発したオンライン超高分解能高圧NMR装置を用い、加圧による蛋白質の構造変化について原子レベルの分解能で研究した。1。N-15標識BPTI試料(Woodward教授が準備)について、軽水(90%H20/10%D20)中12000barの圧力範囲で、15N/1H核二次元NMR測定を行った。15Nの信号の圧力に対する強い低磁場シフトの傾向(平均値0.47ppm/2kbar)は加圧によるNH---O=CまたはNH---OHのN---O水素結合距離の短縮に由来し、加圧による残基毎の15Nシフトの顕著なバリエーション(01.5ppm/2kbar)は主鎖二面角φとΨの残基毎の変化(β-シート領域で、Ψは2kbarで12度程度減少)を反映していると解釈される。また圧カシフトの平均値が、ヘリックス及びループ領域で大きく(それぞれ0.553ppm/2kbar及び0.519ppml2kbar)、β-シート領域で小さい(0.295ppm/2kbar)ことから、前者が後者に比べより大きい圧縮性を持つと考えられる。2。BPTIのアミド水素と溶媒の水との交換速度の圧力依存性の測定を行った。また、26アミノ酸よりなるメリチンの酸性水溶液中でのランダムコイル状態について、アミド水素の圧力シフトを測定し、加圧による水との水素結合の短縮を明らかにした。3。N-15標識BPTlについて、12000barの圧力範囲で15Nスピン緩和の測定を行い、加圧による内部運動の変化について、研究の端緒を開いた。4。加圧下での二次構造変化をより正確に知るため、C-13標識BPTI(Rutgers大、Dr.Montlioneより供給)について、加圧に伴う13C化学シフトの変化を初めて測定した。
情報検索用プロトコルZ39.50を用いた図書館目録相互検索

現在の分散処理環境において、多数の情報検索システムが存在しているが、これらの統一のインターフェースで利用できるようにすることが多年にわたり課題となっていた。Z39.50はこの目的のために開発された情報検索用のプロトコルである。1980年代からANSIとして開発されたこの検索用プロトコルは、ISOのファストトラックとして処理され、1999年に国際規格となった。Z39.50を国内規格とするための翻訳作業を行い、1999年にJIS23950として出版された。現在、データベースサービスは、メインフレームによる検索システムからWWWによる提供へと移行しつつある。しかしながらWWWでは、情報検索過程に特有であるステートフルな検索、すなわち利用者ごとの検索集合の保持と操作とができない仕組み(ステートレス)である。被験者に課題を与えて従来のオンライン検索システムとWWWの両者で検索させ、その結果を検索戦術の観点から分析した。WWWにおける検索は、」検索の積み重ねができない上に、制限された数の検索語を使用して検索を行わなければならないため、語単位の検索になり、その限られた範囲内で、より適合性の高い文献を探し出そうとする試行錯誤的な検索戦術が多く存在することを明らかにした。これによりステートフルとステートレスな検索は、情報検索戦術の面から説明できることが明らかになった。また、日本国内の大学図書館で使われている15種のOPACで書名と著者名の検索を行い、Z39.50の適用の前提条件となる、検索方法の標準化の問題を明らかにした。なお、Z39.50メーリングリストを運営し、研究上の意見交換とともに普及活動を行った。次代の情報検索プロトコルであるZ39.50の適用に伴う問題の解決を図り,これを実装した実験システムを奈良県内の図書館を対象として実験,評価することが本研究の目的である。わが国において,多数の情報検索システムが実用化されているが,これらを統一したインターフェースで利用できるようにすることが多年にわたり課題となっていた。しかしながらWWWでは,情報検索過程に特有であるステートフル,すなわち利用者ごとの検索集合の保持と操作ができないが,Z39.50はこの問題を解決するものである。Z39.50は米国の大学図書館を中心として欧州でも普及しつつあるが,日本語の対応の問題点があり国内での対応は遅れている。まず,Z39.50を国内規格とするため,翻訳作業を行うとともに,Z39.50用語の確定を行った。また,Z39.50の国内適用にあたって問題となる多文字処理,検索タイプ,データ項目を検討した。さらに実験システムを構築するために奈良県立図書館および橿原市立図書館とともに計画立案を立案した。なお,Z39.50メーリングリストを運営し,研究上の意見交換とともに普及活動を行っている。分散処理環境の進展により,ネットワーク上には多数のデータベースとその検索システムが存在しているが,これらを統一したインターフェースで利用できるようにすることが課題となっている。WWWでは,情報検索過程に特有である利用者ごとの検索集合の保持と操作機能を持たないという問題がある。情報検索用のプロトコルとして米国で1980年代から開発されてきたZ39.50は,クライアント/サーバー型の環境で統一した検索インターフェースを提供し,かつステートフルな検索を可能とする。Z39.50の応用範囲として,図書館のOPACの相互検索が考えられてきた。しかしながら,日本語への対応の問題などがあり国内での対応は遅れている。昨年のZ39.50を国内規格とするための作業は完了し,本年度にJISとして出版されている。これに基づいて,Z39.50の実験システムを構築し,評価を行うことが本研究の目的である。実験対象となる公共図書館と大学図書館で使われている,図書館機械化システムを調査した。

データベースとしての蔵書ファイルの構造および,各システムの外部インターフェースを検討した。外部インターフェースでは大きな改造を必要とすることがわかった。パーソナルコンピュータのUNIX上でIndex Data社のZebraを動作させ実験システムを構築した。なお,Z39.50メーリングリストを運営し,研究上の意見交換と普及活動を行っている。現在の分散処理環境において,多数の情報検索システムが存在しているが,これらを統一したインターフェースで利用できるようにすることが多年にわたり課題となっていた。まず,Z39.50を国内規格とするための作業は終了し,1999年にJIS23950として出版された。現在,データベースサービスは,メインフレームによる検索システムからWWWによる提供へと移行しつつある。しかしながらWWでは,情報検索過程に特有であるステートフル,すなわち利用者ごとの検索集合の保持と操作ができない仕組み(ステートレス)である。被験者に課題を与えて両者について検索させ,その結果を検索戦術の観点から分析した。その結果,のWWWにおける検索は,検索の積み重ねができない上に,さらに制限された数の検索語を使用して検索を行わなければならないため,語単位の検索になり,WWW検索ではその限られた範囲内で,より適合性の高い文献をなんとか探しだそうとする試行錯誤的な検索戦術が多く存在することを明らかにした。また,日本国内の大学図書館で使われている15種のOPACで書名と著者名の検索実験を行い,Z39.50の適用の前提条件を明らかにした。なお,Z39.50メーリングリストを運営し,研究上の意見交換とともに普及活動を行った。
全ゲノム連鎖解析による精神分裂病の発症にかかわる遺伝子の同定

連鎖の情報に基づいた位置的候補遺伝子法により統合失調症の発症にかかわる遺伝子の同定を目指し、全ゲノムを対象としたゲノム解析を行なってきた。位置的候補領域を特定するためにこれまでにマイクロサテライトマーカーを用いた2つの全ゲノム連鎖解析を行なった。1つは日本全国の共同研究グループであるJapanese Schizophrenia Sib-pair Linkage Group (JSSLG)による罹患同胞対法を用いた連鎖解析で、もう1つは統合失調症の生理学的マーカーとして考えられている探索眼球運動のスコアを量的形質とした量的形質遺伝子座(Quantitative Trait Loci : QTL)連鎖解析である。JSSLGによる一次スクリーニングの結果、全ゲノムを基準とする有意水準、もしくは示唆水準を超える座位は検出されなかったが、1q23.3,2q36.3,3q23,4q23,5q32,8p12,9q21.1-q21.2,9q21.31,14q23.1,17q12,20q11.2の11ヵ所でp<0.05となった。QTL連鎖解析では22qで有意な連鎖を示した。現在、JSSLGの罹患同胞対法を用いた連鎖解析の二次スクリーニングとして、さらに追加したサンプルを含めて、single nucleotide polymorphism (SNP)を用いた全ゲノム連鎖解析を行なっており、解析がほぼ終了している。またJSSLGの一次スクリーニングで関連が見られたマーカー付近に存在する遺伝子について解析を行ない、その遺伝子の中に存在する1つのSNPとの関連が見られた。連鎖の情報に基づいた位置的候補遺伝子法により、統合失調症の発症にかかわる遺伝子の同定を目指している。位置的候補領域を特定するために2つの全ゲノム連鎖解析を行なった。1つは日本全国の共同研究グループであるJapanese Schizophrenia Sib-pair Linkage Group(JSSLG)による罹患同胞対法を用いた連鎖解析で、もう1つは統合失調症の生理学的マーカーとして考えられている探索眼球運動のスコアを量的形質とした量的形質遺伝子座(Quantitative Trait Loci : QTL)連鎖解析である。QTL連鎖解析で22qの広範囲にわたって連鎖が示唆されたことなどから、22q11.2,22q12.1,22q12.3の3ヵ所について高密度なマーカーを用いた関連解析を行なった。22q11.2では特に統合失調症と関連する領域は検出されなかったが、PRODH遺伝子を含む少なくとも100kbの欠失が日本人において約250人に1人の頻度で検出された。22q12.1では、SEZ6L遺伝子の第1イントロンに存在しているD22S310で有意な関連が見られた。22q12.3では、遺伝子との関連は見られなかったが、遺伝子付近に位置するマイクロサテライトマーカーと有意な関連が見られた。関連が見られるマーカーや領域が検出されており、さらなら解析により関連遺伝子が同定されると期待される。
多孔構造体における熱電変換の躍進現象に関する研究

多孔構造素子の製作について関係者の協力を得て改良を進め,その性能評価のための測定を行った.その多孔構造体として用いたもののうち,(1)格子状セラミックス体に熱電対を配列したもの(2)フォイル状の材料を用い,電子絶縁シートを組み込んだ素子(50mm×50mm,200対)については予想通りの出力を得ることができた.多孔構造体の核心をなす(3)アルメル-クロメルを用いた焼結体(4)鉄-シリコンを用いた焼結体に関し,素子の集積化の試作を種々試み,燃焼実験と併せて研究を進めた.温度差起電力の基礎データは既に取得したが,電極部,リ-ド線の接触抵抗の問題が生じ一部は当初の予定した性能は得られなかった.燃焼実験としては,類似の多孔構造体をステンレスにて製作して並行して実施し,可燃限界の拡大を中心に操作方法の習熟,装置の改良等を進め,大きな収穫を得た.理論解析は多孔構造体内の定常燃焼系に熱電現象を考慮した数値計算を着火機構に新しい方法を取り入れたより複雑な系へ展開し成果を国際会議で発表した.さらに,多孔構造熱電素子を冷却・加熱目的として動作させた場合の理論解析として往復流動系を対象に研究を進め,素子単体としてではなく,冷却・加熱システムとしての成績係数(COP)として高い値が得れることを明らかにし,逆変換についても優れた特性を有することを示した.多孔構造素子の製作について関係者の協力を得て改良を進め,その性能評価のための測定を行った.その多孔構造体として用いたもののうち,(1)格子状セラミックス体に熱電対を配列したもの(2)フォイル状の材料を用い,電子絶縁シートを組み込んだ素子(50mm×50mm,200対)については予想通りの出力を得ることができた.多孔構造体の核心をなす(3)アルメル-クロメルを用いた焼結体(4)鉄-シリコンを用いた焼結体に関し,素子の集積化の試作を種々試み,燃焼実験と併せて研究を進めた.温度差起電力の基礎データは既に取得したが,電極部,リ-ド線の接触抵抗の問題が生じ一部は当初の予定した性能は得られなかった.燃焼実験としては,類似の多孔構造体をステンレスにて製作して並行して実施し,可燃限界の拡大を中心に操作方法の習熟,装置の改良等を進め,大きな収穫を得た.理論解析は多孔構造体内の定常燃焼系に熱電現象を考慮した数値計算を着火機構に新しい方法を取り入れたより複雑な系へ展開し成果を国際会議で発表した.さらに,多孔構造熱電素子を冷却・加熱目的として動作させた場合の理論解析として往復流動系を対象に研究を進め,素子単体としてではなく,冷却・加熱システムとしての成績係数(COP)として高い値が得れることを明らかにし,逆変換についても優れた特性を有することを示した.本年度は本研究の初年度にあたり,熱電材料を用いた多孔構造素子を関係者の協力を得て試作し,その性能評価のための測定を行った.まず熱電材料としては金属系としてアルメル-クロメル,半導体として鉄-シリコンを選定した.多孔構造の形態としては(1)格子状セラミックス体に熱電対を配列したもの(2)フォイル状の材料を用い,電気絶縁シートを組み込んだ素子(50×50mm^2,200対)(3)アルメル-クロメルを用いた焼結体鉄-シリコンを用いた焼結体の4種類である.(1)と(2)に関しては燃焼実験により電気出力の測定まで行い,温度差との関係においても信頼できるデータであることが確認できた.(3),(4)に関しては温度差超電力の基礎データの取得に留まっていて,燃焼実験は次年度に予定している.ただ(3)に関しては米国Hi-Z社の協力により温度差300°Cまでの電気出力の値が得られ,中実材料と比較して約1/3程度で,非常に期待できる.理論解析は多孔構造体内の定常燃焼系に熱電現象を考慮した数値計算を行った火炎の形成される場所とか材料の有効熱伝導率によって多孔構造熱電素子の両端部の温度差が大きく変化すること,両端部でのペルチェ熱の影響等を明らかにし,成果の一部は既に公表した.本年度は本研究の2年目にあたり,多孔構造素子の製作について引き続き関係者の協力を得て改良し,その性能評価のための測定を行った.その多孔構造体とし用いたもののうち,(1)格子状セラミックス体に熱電対を配列したもの(2)フォイル状の材料を用い,電気絶縁シートを組み込んだ素子(50mm x 50mm,200対)については予想通りの出力を得ることができ評価を終了した.多孔構造体の中心は,(3)アルメル-クロメルを用いた焼結体(4)鉄-シリコンを用いた焼結体に移し,燃焼実験と併せて研究を進めた.温度差起電力の基礎データーは既に取得したが,電極部,リ-ド線の接触抵抗の問題が生じた.燃焼実験としては,類似の多孔構造体をステンレスにて製作して併行して実施し,可燃限界の拡大を中心に操作方法の習熟,装置の改良等を進め,大きな収穫を得た.理論解析は多孔構造体内の定常燃焼系に熱電現象を考慮した数値計算を着火機構に新しい方法を取り入れたより複雑な系へ展開し成果を国際会議で発表すべく準備を進めている.多孔構造素子の製作について関係者の協力を得て改良を進め、その性能評価のための測定を行った.その多孔構造体として用いたもののうち,

(1)格子状セラミックス体に熱電対を配列したもの(2)フォイル状の材料を用い,電気絶縁シートを組み込んだ素子(50mm×50mm、200対)については予想通りの出力を得ることができた.多孔構造体の核心をなす(3)アルメル-クロメルを用いた焼結体(4)鉄-シリコンを用いた焼結体に関し,素子の集積化の試作を種々試み,燃焼実験と併せて研究を進めた.温度差起電力の基礎データは既に取得したが,電極部,リ-ド線の接触抵抗の問題が生じ一部は当初の予定した性能は得られなかった.燃焼実験としては,類似の多孔構造体をステンレスにて製作して並行して実施し,可燃限界の拡大を中心に操作方法の習熟,装置の改良等を進め,大きな収穫を得た.理論解析は多孔構造体内の定常燃焼系に熱電現象を考慮した数値計算を着火機構に新しい方法を取り入れたより複雑な系へ展開し成果を国際会議で発表した.さらに,多孔構造熱電素子を冷却・加熱目的として動作させた場合の理論解析として往復流動系を対象に研究を進め,素子単体としてではなく,冷却・加熱システムとしての成績係数(COP)として高い値が得れることを明らかにし,逆変換についても優れた特性を有することを示した.
血管内皮プロテオヘパラン硫酸の単離とその抗体作製

血管内皮細胞ヘパラン硫酸プロテオグリカンの分離精製および構造解析の研究過程で,血管内皮細胞のグリコサミノグリカン代謝をB-D-キシロシドおよびn-酪酸で変化させることにより,血管内皮細胞のヘパラン硫酸が量的および質的に(特にアンチトロンビンIIIとの親和性が)変化することを見出した.グリコサミノグリカン代謝過程の脱アセチル化を阻害するn-酪酸で内皮細胞を処置すると,アンチトロンビンIIIの結合は対照に比し増大し,陰性荷電の減少が認められたが,その細胞毒性のために単離精製の目的には不適と考えられた.一方,内皮細胞を4メチルウンベリフェリルB-D-キシロシドで処置すると,アンチトロンビンIII最大結合能が約60%減少した.この時,細胞表面のヘパラン硫酸は,分子サイズには変化を認めなかったが,わずかではあるが陰性荷電の有意の減少が観察された.アンチトロンビンIIIに対して高親和性のヘパラン硫酸の比率も,キシロシド処置の内皮細胞では有意に減少していた.これらの事実は,ヘパラン硫酸分子内微小構造が変化したことを示唆している.一方,培養液中には大量の遊離コンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸が著明に増加していた.キシロシドにより遊離のグリコサミノグリカン合成が刺激された結果であろうと推定される.このメディウム中に大量に放出されるヘパラン硫酸は,内皮細胞ヘパラン硫酸の単離の目的に極めて適している可能性がある.現在,本物質の分子的特性を検討中であるが,さらに規模を拡大して本物質の精製を行なう予定である.以上,本研究の過程で,現在までに,内皮細胞のプロテオヘパラン硫酸の代謝は,種々の物質により修飾され得ること,それが内皮と凝固関連因子の相互反応を変化させて内皮の抗凝固性に影響を与えること,およびプロテオグリカン代謝修飾因子により培養液中に増加したヘパラン硫酸は,本物質の単離に極めて有用な材料を提供しうることを見出した.血管内皮細胞ヘパラン硫酸プロテオグリカンの分離精製および構造解析の研究過程で,血管内皮細胞のグリコサミノグリカン代謝をB-D-キシロシドおよびn-酪酸で変化させることにより,血管内皮細胞のヘパラン硫酸が量的および質的に(特にアンチトロンビンIIIとの親和性が)変化することを見出した.グリコサミノグリカン代謝過程の脱アセチル化を阻害するn-酪酸で内皮細胞を処置すると,アンチトロンビンIIIの結合は対照に比し増大し,陰性荷電の減少が認められたが,その細胞毒性のために単離精製の目的には不適と考えられた.一方,内皮細胞を4メチルウンベリフェリルB-D-キシロシドで処置すると,アンチトロンビンIII最大結合能が約60%減少した.この時,細胞表面のヘパラン硫酸は,分子サイズには変化を認めなかったが,わずかではあるが陰性荷電の有意の減少が観察された.アンチトロンビンIIIに対して高親和性のヘパラン硫酸の比率も,キシロシド処置の内皮細胞では有意に減少していた.これらの事実は,ヘパラン硫酸分子内微小構造が変化したことを示唆している.一方,培養液中には大量の遊離コンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸が著明に増加していた.キシロシドにより遊離のグリコサミノグリカン合成が刺激された結果であろうと推定される.このメディウム中に大量に放出されるヘパラン硫酸は,内皮細胞ヘパラン硫酸の単離の目的に極めて適している可能性がある.現在,本物質の分子的特性を検討中であるが,さらに規模を拡大して本物質の精製を行なう予定である.以上,本研究の過程で,現在までに,内皮細胞のプロテオヘパラン硫酸の代謝は,種々の物質により修飾され得ること,それが内皮と凝固関連因子の相互反応を変化させて内皮の抗凝固性に影響を与えること,およびプロテオグリカン代謝修飾因子により培養液中に増加したヘパラン硫酸は,本物質の単離に極めて有用な材料を提供しうることを見出した.血管内皮細胞ヘパラン硫酸プロテオグリカンの分離精製および構造解析の為に使用する高速液体クロマトグラフィー装置を購入した。培養豚血管内皮細胞の産生するプロテオヘパラン硫酸を単離する研究の過程で、血管内皮細胞のグリコサミノグリカン代謝をβ-D-キシロシドおよびn-酪酸で変化させることにより、血管内皮細胞のヘパラン硫酸が量的および質的に(特にアンチトロンビン【III】との親和性が)変化することを見出した。すなわち、内皮細胞を4メチルウンベリフェリルβ-D-キシロシドで処置すると、アンチトロンビン【III】最大結合能が約60%減少した。しかし、結合親和性には変化がなかった。キシロシドの濃度を変えると、【^3H】グルコサミン及び【^(35)S】硫酸の血管内皮細胞表面ヘパラン硫酸へのとりこみが濃度依存的に減少し、それと並行してアンチトロンビン【III】の血管内皮細胞表面への結合が抑制された。細胞表面のヘパラン硫酸は、キシロシド処置によりその分子量や電荷密度に変化を生じなかった。一方、培養液中には大量の遊離コンドロイチン硫酸(およびデルマタン硫酸)が放出された。これらの成積は、キシロシドが内皮細胞でのプロテオグリカン合成を阻害する結果、内皮細胞表面ヘパラン硫酸を減少せしめ、アンチトロンビン【III】の結合を抑制したものと解釈される。

逆に、グリコサミノグリカン代謝過程の脱アセチル化を阻害するn-酪酸で内皮細胞を処置すると、アンチトロンビン【III】の結合は対照に比し増大した。この時、内皮細胞表面ヘパラン硫酸分子のサイズには変化がなかったが、陰性荷電の減少が認められた。これらの結果は、n-酪酸で処置された内皮細胞表面のヘパラン硫酸が質的に変化し、アンチトロンビン【III】に対する親和性が増大したものと推定される。この様に本物質のレベルで内皮細胞の抗血栓機序が調節される可能性が示された。これらの結果より、本物質の単離解析法につき重要な示唆が与えられた。
マメ科イソフラボノイド系をモデルとした生合成酵素ネットワークの分子生物学的解析

植物は,多様な天然物を生産する.それらは多段階の酵素反応により生合成されるので,細胞内での効率的な生合成の仕組みが推定される.イソフラボノイドはマメ科植物に集中して分布し,ファイトアレキシンや窒素固定細菌との共生における化学シグナルとして環境中での生育に重要な役割を果たしている,本研究では,イソフラボノイド系の生合成酵素・遺伝子の全貌を明らかにし,効率的な生合成の機構を解析した.酵素活性を指標にしてcDNAライブラリーから標的酵素cDNAを持つクローンを単離する「機能発現分画スクリーニング」や,コンセンサス配列に基づくRT-PCR,さらにEST情報を利用し,マメ科カンゾウ,ミヤコグサ,ダイズからイソフラボン合成系の2-ヒドロキシイソフラバノン4'O-メチル基転移酵素(HI4'OMT)や脱水酵素(HID),ファイトアレキシン骨格の構築に必須なプテロカルパン還元酵素(PTR)をコードするcDNAをはじめて同定した.これによりファイトアレキシン生合成系の酵素の全貌が明らかになり,主要な酵素cDNAのクローニングが達成された.6'-デオキシカルコン生合成に関与するポリケチド還元酵素が,レトロカルコン生合成の後期段階の反応も触媒することを大腸菌発現系を用いて現らかにした.同一経路上の離れた段階の反応を一つのタンパク質が触媒し,酵素の再利用により生合成反応が行われている可能性が示唆された.OMTに特異的なアフィニティカラムを用いてカンゾウHI4'OMTの部分精製を行った.HIDがHI4'OMTと同一フラクションに溶出され,HI4'OMTとHIDの間でタンパク質間相互作用が示唆された.さらにイソフラボン骨格合成酵素(IFS)とHIDを酵母で共発現させ,異種細胞でのイソフラボン合成能を格段に向上させた.IFS, HID反応の共役により含量が増加した可能性が示唆された.植物は,多様な天然物を生産する.それらは多段階の酵素反応により生合成されるので,細胞内での効率的な生合成の仕組みが推定される.イソフラボノイドはマメ科植物に集中して分布し,ファイトアレキシンや窒素固定細菌との共生における化学シグナルとして環境中での生育に重要な役割を果たしている,本研究では,イソフラボノイド系の生合成酵素・遺伝子の全貌を明らかにし,効率的な生合成の機構を解析した.酵素活性を指標にしてcDNAライブラリーから標的酵素cDNAを持つクローンを単離する「機能発現分画スクリーニング」や,コンセンサス配列に基づくRT-PCR,さらにEST情報を利用し,マメ科カンゾウ,ミヤコグサ,ダイズからイソフラボン合成系の2-ヒドロキシイソフラバノン4'O-メチル基転移酵素(HI4'OMT)や脱水酵素(HID),ファイトアレキシン骨格の構築に必須なプテロカルパン還元酵素(PTR)をコードするcDNAをはじめて同定した.これによりファイトアレキシン生合成系の酵素の全貌が明らかになり,主要な酵素cDNAのクローニングが達成された.6'-デオキシカルコン生合成に関与するポリケチド還元酵素が,レトロカルコン生合成の後期段階の反応も触媒することを大腸菌発現系を用いて現らかにした.同一経路上の離れた段階の反応を一つのタンパク質が触媒し,酵素の再利用により生合成反応が行われている可能性が示唆された.OMTに特異的なアフィニティカラムを用いてカンゾウHI4'OMTの部分精製を行った.HIDがHI4'OMTと同一フラクションに溶出され,HI4'OMTとHIDの間でタンパク質間相互作用が示唆された.さらにイソフラボン骨格合成酵素(IFS)とHIDを酵母で共発現させ,異種細胞でのイソフラボン合成能を格段に向上させた.IFS, HID反応の共役により含量が増加した可能性が示唆された.植物は,遺伝子数から予想される以上の天然物を生産し,自らの生存に役立てている.それらは多段階酵素反応により合成されるので,細胞内での酵素ネットワークなどの効率的な生合成の仕組みが推定される.その機構を,マメ科植物のイソフラボノイド系をモデルとして解析する.本年度は,イソフラボン系酵素のcDNAをすべてクローニングし,in vitroで相互作用を調べるための材料を得た.1.酵素cDNAクローニングと機能解析:マメ科カンゾウのcDNA機能発現ライブラリーを分画しながら酵素活性を指標にしてスクリーニングし,4'-メトキシ型イソフラボン系の2-ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素(HID) cDNAを取得した.さらにカンゾウHID配列情報に基づくPCRと,大腸菌系でのアッセイにより,ダイズの4'-ヒドロキシ型イソフラボン系のHID cDNAを同定した.これによりイソフラボン生合成系の一連の酵素の同定が達成された.2.既知生合成酵素の未同定機能の解析:カンゾウ2-ヒドロキシイソフラバノン4'-O-メチル基転酵素(HI4'OMT)とエンドウマメの(+)-6a-ヒドロキシマーキアイン3-O-メチル基転移酵素(HM30MT)の活性は,同一タンパク質に起因している可能性があった.両タンパク質の触媒機能を,2-ヒドロキシイソフラバノンとピサチン前駆体を用いてアッセイし,そのことを証明した.エンドウマメでは一連の生合成系の複数段階を同一タンパク質が担っている可能性が示唆された.エンドウマメHM030MTのパラログについても,アッセイを行う予定である.3.イソフラボン系酵素タンパク質の発現:カルコン合成酵素,ポリケチド還元酵素,HI4'OMTとHIDを大腸菌で発現させる系を確立した.今後リコンビナントタンパク質を大腸菌より精製し,共クロマト,共電気泳動による相互作用の直接検出を試みる.

植物は,遺伝子数から予想される以上の天然物を生産する.それらは多段階の酵素反応で合成されるので,細胞内での酵素ネットワークなどの効率的な生合成の仕組みが推定される.その機構をマメ科のイソフラボノイド系をモデルとして解析する.本年度は,大腸菌系で発現させた酵素の機能解析を行うとともに酵母系でイソフラボン生合成系の再構築を行った.1.5-デオキシ型フラボノイドの前駆体である6'-デオキシカルコンは,カルコン合成酵素(CHS)とカルコンポリケチド還元酵素(PKR)の共同作用でつくられる.リコンビナント系でのアッセイにより,PKRはレトロカルコン系の後期段階でも働くことが明らかになった.PKRが同一系の複数の反応を担うことは効率的な生合成の機構を考える上で興味深い.またCHS, PKRを用いたアッセイではジケタイドアナログ化合物が6'-デオキシカルコンに変換されることが示された(静岡県立大学阿部先生との共同研究).2.エンドウマメのファイトアレキシン(ピサチン)系O-メチル基転移酵素(HM3OMT)はホルモノネチン系の2-ヒドロキシイソフラバノン(2HI)4'OMT活性も示す.HM3OMTパラログ(HMM1,HMM2)の基質特異性を解析すると,HMM1は2HIに,HMM2はピサチン前駆体に対し高い活性を示すことがわかった(アリゾナ大学VanEtten教授との共同研究).両タンパク質は効率的に生合成反応を進めるために,特定の基質に対し高い活性を持つように進化したことが示唆された.3.カンゾウの2HI合成酵素(IFS)とダイズの2HI脱水酵素(HID)を組み込んだ酵母細胞を作成し,前駆体(ナリンゲニン)存在下で培養して生成物を解析した.IFS, HID共発現株では,IFS単独発現株と比べて総イソフラボノイド含量が増加した.IFS, HIDの相互作用により含量が増加した可能性が示唆された.植物成分は多段階の酵素反応で合成される.植物細胞内では酵素ネットワークなどの効率的な生合成の仕組みが推定される.その機構をマメ科のイソフラボノイド系をモデルとして解析する.マメ科ファイトアレキシン系酵素cDNAのクローニングと機能解析:イソフラバン型ファイトアレキシン生合成系の酵素・遺伝子の殆ど全てが同定されたが,イソフラバン骨格の生合成機構は未知であった.ジヒドロフラン環を開裂するリグナン系の還元酵素のホモログをミヤコグサから得て,ベスティトール生合成の最終酵素プテロカルパン還元酵素(PTR)cDNAを同定した.アルファルファやミヤコグサから,生合成系後半のイソフラボン還元酵素(IFR),ベスティトン還元酵素(VR)cDNAを取得し,大腸菌系で触媒機能を確認した.VRとプテロカルパン合成系脱水酵素(DMID)の間ではタンパク質間相互作用が示唆されており,DMIDとPTRは反応中間体を共有するので,DMID cDNAをクローニングし,これらの相互作用を,タンパク質の共クロマトや酵母2-hybrid系を用いて検討する.非マメ科でのイソフラボン生産:2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素(IFS)と脱水酵素(HID)を共発現した組換え
ＡＬＳの病態解明に向けたＲＮＡ結合蛋白質ＴＤＰ－４３及びＦＵＳの網羅的機能解析

本研究では、ALSの病態と深く関連する二つのRNA結合蛋白質TDP-43とFUSそれぞれが持つRNA制御機能全体と、連携して果たす機能についての分子基盤情報を構築し、ALS病態の統合的解明へ役立てることを目的として研究を開始した。昨年度までに両タンパク質に結合するRNAを網羅的に同定するためのPAR-CLIP法の樹立を目指し、cDNAライブラリー作製のための様々な条件検討を行った。その後、本年度は、3回のdeep sequenceを行い、研究室内でその後の情報解析ができる体制を構築してきた。その結果、RNaseの濃度やRNA断片長などさらに条件を変更する必要があることが判明し、ライブラリー作製を繰り返した。最終的には、TDP-43やFUS両方のライブラリーにて、予想される結合モチーフが検出されるなど、PAR-CLIP法によるライブラリー構築から情報解析までを研究室内で一貫してできる体制が樹立できた。現在、TDP-43とFUSそれぞれが、どのようなRNAのどのような部位に結合しているのか、詳細な情報解析を進めている。更には、TDP-43とFUSに共通する遺伝子の絞り込みを行っている。また、ALSで同定されている遺伝子変異の入ったTDP-43についても、PAR-CLIP法でdeep sequenceし、変異型TDP-43が野生型と比較してどのようにターゲット認識に差異があるのかも解析中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。その結果、本年度は、下記のような成果を得た。すなわち、タグ付きのTDP-43及びFUSの二重安定発現細胞株を樹立した。この細胞を大量培養し、PAR-CLIP法を用いた免疫沈降法により、TDP-43およびFUSそれぞれに結合するRNA断片を回収した。また超大量培養後に両者に対する二重免疫沈降も行い、TDP-43/FUS複合体に結合するRNA断片も回収できるようになった。PAR-CLIP法は、微量なRNA断片をターゲットとするため、UVクロスリンクの強度、酵素中に含まれる微量な外因性RNAの混入、リンカーの精製精度など、樹立中様々な困難に直面したが、すべてを解決し安定的にライブラリーが構築できるようになった。その後、これらのRNA断片を用いてcDNAライブラリーを構築し、TAクローニング法により品質に問題がないことを確認した。現在、次世代シーケンサを用いたdeep sequenceを開始したところであり、来年度はその結果をもとに、両蛋白質に結合する転写産物の種類や数、結合部位、さらにはTからCへの置換部位を抽出することによって、それぞれの蛋白質が認識する配列を解析する予定である。PAR-CLIP法を用いたTDP-43及びFUSに結合するRNA断片の安定的な回収法の樹立に時間を要したが、この手法の樹立には時間がかかることをあらかじめ想定していた。現在は、シーケンスという次の段階に移行しており、ほぼ順調に進展していると考えている。来年度はdeep sequenceによって得られた結果をもとに、TDP-43及びFUSそれぞれに結合する転写産物の種類や数、結合部位、さらにはTからCへの置換部位を抽出することによって、それぞれの蛋白質が認識する配列を解析する予定である。さらにこれらの分子基盤情報をもとに、スプライシング部位近傍に結合していないかどうか、非翻訳領域のどの位置に結合しているかといった二次解析を行い、TDP-43とFUSそれぞれがどのようなRNA制御に関与するのか、その機能を予測する。更には、幾つかのターゲットを抽出して実験的検証を行う。
自然炎症・免疫軸に係る糖尿病性血管障害の分子動態の臨床意義の解明

動脈硬化誘発飼料(F2HFD1)を負荷した動脈硬化モデルマウス(ApoE KOマウス)において、Group1,2,3 ILC (ILC1,2,3)の比率は組織ごとに異なっていた。動脈硬化巣を含む大動脈及び血液ではILC1が優位、精巣上体周囲脂肪組織ではILC2が優位であった。多施設多目的前向きコホート(KAMOGAWA cohort)に参加している2型糖尿病患者及び正常耐糖能者の末梢血におけるILC比率を比較検討した。2型糖尿病患者においてILC2の比率が高い傾向にあった。また、正常耐糖能者に比し2型糖尿病患者ではILC2/ILC1比及びILC2/ILC3比は高く、個体間でばらつきがあった。【具体的内容】平成28年度研究計画である、動脈硬化巣における自然免疫リンパ系細胞(Innate Lymphoid cell, ILC)動態の網羅的解析及び、動物モデルにおける病巣ILCと末梢血ILCの対応付けによる末梢血診断法の開発にむけ、動脈硬化モデルマウス(ApoEノックアウトマウス)の繁殖を行い、特殊試料を給仕、動脈硬化巣を採取している。現在は動脈硬化巣からのリンパ系細胞採取の予備実験を実施している。マルチカラーフローサイトメーターFACS CANT2を用いて、ヒトILC3の同定に成功した。平成29年度研究計画である、糖尿病大型コホートを活用したヒト末梢血ILCが動脈硬化評価マーカーとなりうるか、について検討を行っている。【意義】動脈硬化の病態進展におけるILCの関与と内臓脂肪組織の慢性炎症におけるILCの関与を対比することにより、肥満・インスリン抵抗性という生活習慣病の基盤病態と動脈硬化という合併症の病態形成との連動を自然免疫の関与という視点から解明していく。また、糖尿病コホート研究と連関させることで、動物モデルの知見が実際の臨床にて応用できるかについても評価していく。ヒト末梢血ILCを評価し、動脈硬化症病巣局所の病態をモニターできるバイオマーカー開発につなげる。【重要性】動脈硬化の病態進展・内臓脂肪組織の慢性炎症では免疫学的恒常性が破綻していると推定されているが、病態解明が不十分である。最近、自然免疫/自然炎症を担うILCの循環器・血管系疾患における役割の重要性が注目されている。申請者の検討は、肥満・インスリン抵抗性という生活習慣病の基盤病態と動脈硬化という合併症の病態形成との連動を明らかにするうえで重要である。さらにヒト末梢血ILCがヒトの動脈硬化のバイオマーカーとなりうるかについての検討は、病態の理解と臨床応用を直結させる試みである。平成28年度研究計画である、動脈硬化巣における自然免疫リンパ系細胞(Innate Lymphoid cell, ILC)動態の網羅的解析及び、動物モデルにおける病巣ILCと末梢血ILCの対応付けによる末梢血診断法の開発にむけ、動脈硬化モデルマウス(ApoEノックアウトマウス)の繁殖を行い、特殊試料を給仕、動脈硬化想を採取している。【具体的内容】動脈硬化モデルマウス(ApoEノックアウトマウス)に特殊試料を給仕、動脈硬化を発症させ、動脈硬化巣における自然免疫リンパ系細胞(Innate Lymphoid cell, ILC)の動態をマルチカラーフローサイトメーターにより検討した。多施設多目的前向きコホート研究(KAMOGAWAコホート研究)において、2型糖尿病患者から末梢血を30mL採取し、密度勾配遠心により単核球分画を分離した。Lineage, CD45, CD127, CRTH2, c-kit, Nkp44などを含む表面抗原を染色し、マルチカラーフローサイトメーターによりILC分画(ILC1、ILC2、ILC3)の解析を行った。こうすることによって、糖尿病の基盤病態と合併症進展の共通基盤としての慢性炎症におけるILCの役割を明らかにする。もって、ILCを標的として糖尿病合併症進展を抑制させる新規治療法の開発につなげる。また、糖尿病コホート研究と連関させることで、動物モデルの知見が実際の臨床にて応用できるかについても評価する。具体的にはヒト末梢血ILCを評価し、動脈硬化症病巣局所の病態を抹消でモニターできるバイオマーカー開発につなげる。【重要性】動脈硬化の病態進展では免疫学的恒常性が破綻していると推定されているが、病態解明が不十分である。本研究は、肥満・インスリン抵抗性という生活習慣病の基盤病態と動脈硬化という合併症の病態形成との連動を明らかにするうえで重要である。

多施設多目的前向きコホート(KAMOGAWA cohort)に参加している2型糖尿病患者及び正常耐糖能者の末梢血におけるILC比率を比較検討した。2型糖尿病患者においてILC2の比率が高い傾向にあった。また、正常耐糖能者に比し2型糖尿病患者ではILC2/ILC1比及びILC2/ILC3比は高く、個体間でばらつきがあった。本研究課題の今後の推進方策として下記の工夫を実施、継続する。1.動脈硬化の動物モデルとして広く使用されているApoEノックアウトマウスを用い、免疫細胞の採取組織として動脈硬化巣を十分に採取できるよう工夫する。実際、動脈硬化巣におけるILCは存在比率が低く、組織を十分にとれる体制を整えていることは、本試験実施のために大変重要な工夫となる。さらに、糖尿病発症と動脈硬化の関連も検討するためDb/DbマウスやDb/Db ApoEノックアウトマウスも用いる。2.マルチカラーフローサイトメーターFACS CANT2、セルソーターSONY SH800を用いる。ILCはその存在を確認するためにフローサイトメーターの活用が必須となる。また、ILCの指摘だけでもLineage, Thy1と2色検出する必要があり、ILC1-3の分類ではSCA1・Nkp46・IL7R・Rorγtの4色、さらにはサイトカイン産生能の違いと少なくとも7重染色の必要があるが、我々はすでに8カラー解析を実施しており、解析の実施に問題はない。また、6カラーセルソートもすでに実施しており、表面染色でのILCのセルソートも行えるよう工夫している。糖尿病
クローン病の大腸炎症局所湿潤T細胞の抗原受容体β鎖可変領域遺伝子再構成の検討

1.クローン病患者の回腸末端病変部および大腸病変部より上皮細胞間リンパ球(IEL)、粘膜固有層内リンパ球(LPL)を分離を試み、回腸末端病変部のIEL、大腸病変部のLPLの細胞株を樹立した。2.クローン病患者の回腸末端病変部のIELを28週から56週培養するとT細胞受容体のうちVβ5.2を有するT細胞が有意に増加していた。3.これらのVβ5.2陽性細胞を多く含むT細胞株は高γインターフェロン産生能とredirected cytotoxicity assayにおける高い細胞障害活性を有しており、局所の活性化したIELがγインターフェロンを介してマクロファージの集族、活性化をおこしていることが示唆された。5.大腸病変部のLPLでVβ1Vβ20のプライマーを用いてRT-PCR法によりT細胞受容体のVβの偏りを検討すると、特定のVβに偏った発現は認められず、むしろ23個のVβで発現が認められないほかはすべてのVβが発現していた。6.大腸病変部のLPLの細胞株よりLPLのT細胞クローンの作製を試みたが、今回の系ではクローン化に成功し得なかった。現在抗CD3交代などで刺激してLPLのT細胞クローンを作製中で、これを用いて各クローンでのVβの発現、および各種super antigenを用いた増殖能の検討とVβの発現との関連を検討中である。
不斉転写されたナノ空孔を階層的に持つ高分子膜の創製と超分離機能の開発

酵素やDNAなど生体に含まれ生命に必須な働きをする高分子に類似の規則的な一方向巻きのらせんの形態を持つ高分子を人工的に合成し、その高分子溶液をキャストすることで規則的な一方向巻きらせん高分子からなる膜を作った。らせん構造主鎖に沿って階層的に配列した不斉な置換基を膜状態で取り除くことで、不斉情報が転写された置換基サイズ(ナノサイズ)な空孔を階層的に持つ高分子膜を合成した。またそれらの膜が薬剤開発などに利用可能な光学異性体分離能を示すことを明らかにした。階層的な片巻きらせん構造をとる高分子を合成する方法として、(1)光学活性基を導入したモノマーの重合、(2)キラル触媒系を用いるアキラルモノマーの重合、(3)アキラル高分子のキラル溶媒中での加熱による片巻きらせん構造の誘起、の方法を、ポリ置換アセチレンまたはポリ(1,3-フェニレンエチニレン)について検討し、それぞれの方法により片巻きらせん構造を持つ高分子の合成に成功した。特に、置換ポリアセチレンに関しては立体障害あるいは水素結合により安定維持された片巻きらせん構造を持つ高分子の合成に成功した。水素結合によりらせん構造を安定化できるポリ置換アセチレン類としては側鎖に二つのアミド基を有するものを見出した。また、立体障害によりらせん構造を安定化できるポリ置換アセチレン類としてイミン結合により平面性の置換基を導入したものを新たに見出した。イミン結合は動的共有結合であるため合成が容易で種々のグループの導入が可能である。また、製膜後の除去も容易であるため不斉ナノ空孔の生成に有用である。(最終年度に実施した研究の成果)溶液状態、膜状態での円偏光二色性スペクトルの測定により、得られた高分子が溶液状態、固体の膜状態ともに片巻き優先らせん構造を持つことが明らかとなった。また、高分子溶液をキャストすることで自己支持性の膜が容易に得られた。光学活性基を持つポリ(1,3-フェニレンエチニレン)では製膜時の溶媒に応じて片巻きらせん構造の状態の高分子膜またはランダム構造の状態の高分子膜を作り分けることが可能であることが明らかとなった。製膜後、膜状態での反応により置換基を除去することに成功した。また、光学活性基の除去により、主鎖の片巻きらせん構造のみに不斉を有する高分子膜の合成に成功した。生成した膜は2ーブタノールのパーベーパレーションにより光学分割能を示すことが明らかとなった。階層的な一方向巻きらせん構造をとる高分子を合成するために、光学活性基を導入したモノマーを種々合成した。らせん構造をとり得る高分子として、ポリフェニルアセチレン候補として選び、光学活性基として、メンチル基、ピナニルシリル基などを用い、それぞれを導入したフェニルアセチレンモノマーを合成した。次に重合条件の最適化を行い、製膜可能な高重合体を合成した。[Rh(nbd)Cl]2触媒を用いた重合により、高収率で高分子量体のポリマーを得たこれらポリマーの中で主鎖により近い位置に光学活性な置換基を有するものほどより大きなコットン効果、比旋光度を示した。これらのことから、溶液状態、固体膜状態での主鎖への一方向巻きらせん構造の誘起についての知見が得られた。得られたポリマーは有機溶媒に対して優れた溶解性を示した。また優れた成膜性も示した.得られた各種高分子の主鎖の一方向巻きらせん構造の溶媒依存性についての知見が円偏光二色性(CD)測定により得られ、一方向巻きらせん構造が側鎖の水酸基間により固定されている場合、極性溶媒を用いることで一方向巻きらせん構造をオフにすることができた。またその変化は測定溶媒の極性を調節することで可逆的に行うことができた。また得られた一方向巻きらせんポリマーからソルベントキャスト法により調製した膜もCD測定でコットン効果を示すことから固体膜状態においても階層的な一方向巻きらせん構造を維持していることが明らかになった。初年度の計画として、(1)階層的な片巻きらせん高分子の合成:光学活性基を導入したモノマー類の合成、およびそれらの重合による製膜可能な高重合体の一方向巻きらせん高分子の合成を掲げたがこれらの課題は順当に達成することができた。また、2つめの課題である(2)階層的に配列制御した高分子自立膜の合成:については(1)で得られた高分子からソルベントキャスト法により合成した膜が円偏光二色性(CD)測定においてコットン効果を示したことから確認できた。また複数種の一方向巻きらせん構造を持つ高分子よりの自立膜が得られている。以上のことから、当初の計画について概ね順調に達成できていると判断できる。初年度に得られた階層的に配列制御された各種の高分子自立膜を用いて膜状態での光学活性基の除去を行う。

最適な除去反応の条件を見出すために、各種溶媒に対する膨潤度についての知見と膨潤状態での主鎖の一方向巻きらせん構造、光学活性基の階層的配列、および高分子鎖の集合状態についての知見を円偏光二色性分光光度計、分子間力顕微鏡および分光蛍光光度計を用いて明らかにする。最適溶媒を用いた膨潤状態での光学活性基の除去を行う。光学活性基を導入した結合性基に応じて酸性条件、塩基性条件での加水分解、加溶媒分解、光ラジカル開裂など種々の反応条件を用いての光学活性基の除去を行う。また得られたナノ空孔を階層的に持つ高分子多孔膜の機能として光学異性体分離を行う。2ーブタノールのパーベーパレーションによる分離、各種アミノ酸水溶液の透過分離などを行う。また、除去した光学活性基に類似の化合物について不斉吸着実験および不斉透過実験を行い、生成したナノ空孔の不斉情報の維持、転写についての知見を得る。ブランク実験として一方向巻きらせん構造を持たない高分子自立膜を用いて同様にナノ孔を生成させた膜を調製し、光学異性体分離を行い、透過速度、選択性について比較し、階層的なナノ空孔を持つ高分子膜の超分離機能について明らかにする。また、初年度に引き続き階層的な片巻きらせん高分子の合成についてもポリフェニレンエチニレンなどポリアセチレン以外のポリマーについても検討する。本研究課題は2年目も1年目に引き続き、合成、反応が多いため合成用試薬および精製のためのシリカゲル、溶媒などの消耗品の購入に使用する予定である。特に素材となる高分子の合成を行うために、モノマー合成のための原料化合物、溶媒、実験ガラス器具などの消耗品として必要である。また、特に2年目は固体膜のキャラクタリゼーションの一環として、固体NMR、反射UV測定などの機器分析の実施を計画している。それら測定に必要となる測定用溶媒、記録用紙などの消耗品の購入も予定している。また、研究成果を学会で発表するための学会参加旅費としての支出も計画している。
脂質二重層におけるカテキン類の状態分析

1.カテキン類の脂質二重層への親和性に影響する諸因子の解明リポソームを用いたカテキン類の脂質二重層への取り込み量を測定することにより、その親和性に影響する以下のような構造上の特徴や外部因子を明らかにした。(1)ガロイル基の存在、(2)B環の水酸基の数、(3)C環の立体構造、(4)外部水相の塩濃度、(5)脂質二重層の陰電荷、(6)他のカテキン類の存在。さらにカテキン類は二重層の表面に存在することも明らかになった。2.カテキン類のin vitro系での生理活性にはその自動酸化過程で生成する過酸化水素が影響する場合があることを明らかにした。3.姫路工業大学のNMR装置を用い、カテキン類の添加によりリン脂質中のリンの状態に変化が起こることをリンをプローブとした固体高分解能NMRにより明らかにした。次に重水素ラベルしたEGCgの重水素をプローブとして固体高分解能NMRを測定したところ、EGCgがリポソームの脂質二重層に取り込まれ、少なくとも一種類の配向状態をとることが明らかなった。4.炭素数の異なるカテキン誘導体(アルキルチオエーテル誘導体)の比較(1)リポソームに取り込まれる量、(2)膜構造の破壊、(3)抗菌活性をそれぞれ調べたところ、すべてアルキル基の炭素数と密接な関連があり、抗菌活性は膜への取り込み量と膜の破壊程度に左右されることが示唆された。我々はすでに、カテキン類の脂質二重層への取り込み量を測定する方法を開発し、カテキン類の脂質二重層内での位置や膜の物性に対する影響を一部調べてきた。しかし、脂質二重層内でどのような状態で存在しているのかという点と、抗菌性をはじめとした報告されている生理活性と取り込み量との定量的な関連は依然不明のままであった。そこで研究初年度において、以下の項目を調べた。1.D-ラベルしたEGCgの調製原料のEGCgから3段階の反応を経て、一つの水素が重水素に置き換わったラベル化合物を約100mg調製した。また置換した重水素の絶対立体配置をNMRで決定した。2.姫路工業大学のNMR装置を用い、カテキン類の添加によりリン脂質中のリンの状態に変化が起こることをリンをプローブとした固体高分解能NMRにより明らかにした。次に重水素ラベルしたEGCgの重水素をプローブとして固体高分解能NMRを測定したところ、EGCgがリポソームの脂質二重層に取り込まれ、少なくとも二種類の配向状態をとることが明らかなった。3.EGCgの脂質二重層に対する親和性を左右する要因として、膜の電荷や他のカテキン類(特にエピカテキン)の影響があることを見いだした。4.カテキン誘導体(アルキルチオエーテル類)の脂質二重層に対する親和性の数値化カテキン誘導体のアルキル基の炭素数、さらにリポソームに取り込まれる量と抗菌活性の関連を調べた。1.固体NMRによるEGCgと脂質二重層との相互作用の解析リポソーム中のリンのNMRを測定し、脂質二重層の状態変化を調べた。EGCg添加による線幅の減少は、脂質のリンが変化したことを示している。また、MAS(Magic Angle Spinning)測定により得られるσ_<iso>の値も、EGCg添加により高磁場シフトした。以上の結果より、EGCgは膜表面付近に存在して、リンの運動性に影響を及ぼしていることが明らかとなった。^2HラベルしたEGCgをプローブにして^2H-NMRを測定すると、^2H-EGCgの分裂幅はリポソームに組み込まれた時に小さくなった。これはEGCgが確実に膜に作用していること示している。2.カテキン誘導体(アルキルチオエーテル誘導体)の脂質二重層への取り込み量と抗菌活性との関連(+)カテキンと各種アルキル鎖長のアルデヒドから10種類のカテキン誘導体を合成し、細菌類に対する抗菌活性を調べた。