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湿式混練法による機能性粉末作成に関する工学的研究

1.セルフクリーニング型混練機を用いて、湿式(低含水率域)で油性物質とシクロデキストリン(CD)及び粉末化剤を直接混練することより、乾燥工程のエネルギーを低減するばかりでなく、CDと油性物質(d-リモネン等)の任意の包接率の包接複合体を作成する混練法を開発した。β-CDとd-リモネンの包接複合体形成におよぼす各種アルコールの影響を、微水系包接実験系を用いて検討するとともに、混練法による包接複合体形成量について検討し、混練法での包接複合体形成に機械的エネルギーを考慮した包接複合体量推算モデルを構築した。不飽和脂肪酸EPAエチルエステル(EPA)を、α-CD、β-CDと低加水率域で混練することにより、CDに包接させ、酸化安定性の良い粉末の作成法について検討した。α-CDに包接させた場合、非常に酸化安定性の良い粉末を作成することができた。α-CD、β-CDの表面オイルが存在する場合はEPAの酸化速度は速く、EPAがCDに包接することにより酸化反応が阻止され、EPAの酸化安定性が向上することが示酸された。2.無水結晶マルトースに水を1-4モル倍添加後、二軸混練機で混練した場合の結晶変換速度について検討した。結晶変換速度は、混練後乾燥した粉末のX線デイフラクトグラム測定、ガスクロマトグラムによるアノマー量測定により測定した。無水結晶マルトース(純度92%)の場合は、結晶変換速度はAvramiらの提案した結晶変換速度式で相関できた。無水結晶マルトースに対して水の添加モル比が1-2モル倍の場合が結晶変換速度が速く、無水結晶マルトースの純度が結晶変換速度に最も影響した。1.セルフクリーニング型混練機を用いて、湿式(低含水率域)で油性物質とシクロデキストリン(CD)および粉末化剤(多糖)を直接混練することにより、乾燥工程のエネルギーを低減できるばかりでなく、CDと油性物質(d-リモネン等)の任意の包接率の包接複合体を作成する混練法を開発した。β-CDとd-リモネンの包接複合体作成において、エタノール添加が包接率増大をもたらすとともに、必要最低包接水量を低減することを明らかにした。また、β-、γ-CDのd-リモネン包接複合体量と加水率の関係が、水を触媒とした自己触媒反応式と類似の式で良好に相関されることを示した。この相関式を用いて、β-CD、d-リモネン包接複合体量に及ぼす各種アルコールの影響を、相関式のパラメーター変化で統一的にまとめることができた。低加水率域での混練において、機械的エネルギーにより包接が促進される現象があること、α-CDへのd-リモネン包接がメタノールにより促進されることを明らかにした。これらの実験結果を基礎に、α-CDへの各種脂肪酸およびEPA、DHAの包接複合体の最適複合体作成法について検討を開始した。2.無水結晶マルトースと親油性液体物質または生理活性蛋白質水溶液とを混練することにより粉末化するための基礎研究として、無水結晶マルトースと水の混練操作による含水結晶マルトースへの結晶変換速度について検討した。無水結晶マルトースより含水結晶マルトースへの結晶変換過程を、X線ディフラクトグラムの測定とともに作成粉体の旋光度、融点等の測定を行った。無水結晶マルトースの消失と含水結晶マルトースの生成の関係を調べ、無水結晶マルトースが非晶質マルトースのような中間体を経て含水結晶マルトースに変換することを明らかにした。

1.セルフクリーニング型混練機を用いて、湿式(低含水率域)で油性物質とシクロデキストリン(CD)及び粉末化剤を直接混練することより、乾燥工程のエネルギーを低減するばかりでなく、CDと油性物質(d-リモネン等)の任意の包接率の包接複合体を作成する混練法を開発した。beta-CDとd-リモネンの包接複合体形成におよぼす各種アルコールの影響を、微水系包接実験系を用いて検討するとともに、混練法による包接複合体形成量について検討し、混練法での包接複合体形成に機械的エネルギーを考慮した包接複合体量推算モデルを構築した。不飽和脂肪酸EPAエチルエステル(EPA)を、alpha-CD、beta-CDと低加水率域で混練することにより、CDに包接させ、酸化安定性の良い粉末の作成法について検討した。alpha-CDに包接させた場合、非常に酸化安定性の良い粉末を作成することができた。alpha-CD、beta-CDの表面オイルが存在する場合はEPAの酸化速度は速く、EPAがCDに包接することにより酸化反応が阻止され、EPAの酸化安定性が向上することが示唆された。2.無水結晶マルトースに水を1-4モル倍添加後、二軸混練機で混練した場合の結晶変換速度について検討した。結晶変換速度は、混練後乾燥した粉末のX-線ディフラクトグラム測定、ガスグロマトグラムによるアノマー量測定により測定した。無水結晶マルトース(純度92%)の場合は、結晶変換速度はAvramiらの提案した結晶変換速度式で相関できた。無水結晶マルトースに対して水の添加モル比が1-2モル倍の場合が結晶変換速度が速く、無水結晶マルトースの純度が結晶変換速度に最も影響した。
感情の制御技法とその社会規範にかんする理論的・実証的研究

研究成果報告書(冊子体)に記された本研究の成果は、以下の3点に要約される。第一は、「感情の社会学」をめぐる既存の理論枠組みの検討である。関係のなかで相互監視による感情制御が高まる「文明化の過程」をとらえたノルベルト・エリアスと、微細な権力装置による規律・訓練による感情制御を「文明化の強制」ととらえたミシェル・フーコーの議論の相違、ヨーロッパ諸社会で「異質なもの」への感情にどう対処するかを、家族類型という「人類学的基底」に遡ってとらえたエマニュエル・トッドの議論が、本研究では検討された。第二は、「モダニティ」とその変容のなかで「感情制御」がどのような様相を見せるか、についての理論的解明である。ここでは、近代における「距離化」(エリアス)や「再帰性」(アンソニー・ギデンズ)と呼ばれる自己の存在様式が「没頭の喪失」と「不安」を帰結することが指摘されるとともに、無媒介的に人々がつながる「同情」による社会形成が発生することの問題性が検討された。そして、孤立して自己反省・自己観察する自己でもなく、無媒介性による共同体の達成でもない、「媒介性の空間」を作る技法が検討課題として示された。第三の、感情制御をめぐる実証的研究は、この第二の論点への回答に接近する。これは若手社会学者との研究会で検討されたが、大正期の「理想主義」と「煩悶」を論じた小倉敏彦は再帰的な青年の自己が孕む神経症の、日本の近代化過程における対人感覚の変容を論じた櫻井龍彦は対人恐怖の発生を指摘しながら、ともに「型」の存在の重要性を指摘する。また、現代の生活保護ケースワーカーにインタビュー調査を行った小村由香は、共感と距離化という矛盾する規範が存在することを指摘する。ここから示唆される、近代の変容のなかで「媒介性の空間」を可能にする感情の制御様式を構想することが、今後の研究課題として残されたといえるだろう。本年度の研究は、主に「感情の社会学」をめぐる理論枠組みの検討に向けられた。本補助金の助成以前に行ったノルベルト・エリアスの感情や暴力についての社会理論を検討した成果を、著書『エリアス・暴力への問い』(勁草書房)として5月に刊行したが、ドイツでの暴力を主題に再整理して「「自己意識」の世代間連鎖と市民層の位置-『文明化の過程』から『ドイツ人論』へ」という学会報告を行った(日本社会学史学会、6月23日、岡山県立大学)。また、エリアスの弟子エリック・ダニング教授(レスター大学)の来日時、講演「エリアス、ホロコースト、文明化の過程」(7月24日、千葉大学)を企画するとともに、彼との意見交換を行った。この過程で、理論的検討が必要な論点として、「異質な他者」にどう対処するか、という問題が浮上し、これを考察する作業を行った。ルソー、ゴフマン、アーレントが「同質性・異質性」をどう考え、いかなるコミュニケーションを構想したかを論じた「社会を剥ぎ取られた地点-「無媒介性の夢」をめぐるノート」(『社会学評論』52巻4号)、ヨーロッパ社会での異質性への対応の多様性を人類学者エマニュエル・トッドに依拠して整理した「家族・民族・異質性-エマニュエル・トッドのヨーロッパ」(『親密圏の現代的変容-家族関係を中心にして』千葉大学大学院社会文化科学研究科研究プロジェクト報告書・第41集)、がその成果である。

こうした理論研究の一方で、感情のマナーにかかわる本や雑誌の実証的研究は、現在のところ大宅壮一文庫において記事を収集し、整理する段階に留まっている。また、感情経験についてのインタビューは、千葉大学文学部の授業「社会調査実習」と連動しながら、国際結婚カップルへのインタビューを行った。これも分析が進んでおらず、実証的研究の進展は、次年度以降の課題となる。14年度の研究では、昨年度から行ってきた「感情の社会学」をめぐる理論枠組みの検討を続けることが中心的な課題となった。とくに、これまで研究の基盤としてきたノルベルト・エリアスの感情制御をめぐる社会学と他の論者を比較し、より広範な枠組みを提示する作業を行った。その成果として、「文明化の過程」を論じたエリアスと「文明化の強制」を論じたミシェル・フーコーを対比した論文「「自己抑制」へのふたつの視線-エリアスとフーコーをめぐるノート」、感情制御の解体=暴力の発現への経路を「文明化」の進む国家内空間と国家間空間のあいだの矛盾に見出すエリアスと国民国家内での「国家」と「国民」の矛盾に見出すハンナ・アーレントを対比した論文「暴力から護られた場所-エリアスとアーレント」を作成した。前者は奥村を代表とする千葉大学大学院社会文化科学研究科研究プロジェクト報告書・第108集『感情と社会』に発表したが、この研究プロジェクトでは、呪術の衰退と感情の制御、インターネット・コミュニケーションでの感情処理、男性の恋愛、などを研究する千葉大学大学院、早稲田大学大学院の大学院生との意見交換を行い、共同の成果を報告書としてまとめた。また、何人かの研究者との意見交換を行った。うち、毛利嘉孝氏(九州大学)からは文化研究によるアプローチについて教示を受け(6月)、エリック・ダニング氏(レスター大学)にはフーリガニズム、テロリズム、多文化状況と感情制御の関係などについてイギリスでインタビューを行った(2月)。いずれにおいても「異質な他者」との関係が、議論の焦点となった。こうした理論枠組みをめぐる研究はいくらかの進展を見せたが、実証的研究については昨年度に引き続き雑誌資料を収集するにとどまり、まとまった成果をあげるにはいたっていない。15年度の研究における大きな課題である。最終年度(15年度)の研究では、13・14年度に行ってきた「感情の社会学」をめぐる理論的研究をさらに進めるとともに、感情の制御様式の変容と多様性の実証的研究を若手研究者との研究会で検討し、それぞれ成果をまとめた。第一の理論的研究については、とくに「距離化」(ノルベルト・エリアス)や「再帰性」(アンソニー・ギデンズ)など「モダニティ」特有とされる機制と感情の関係、およびこれらの現象とこれを解明する社会学(とくに「感情社会学」)との関係について検討を行い、論文「没頭を喪失した社会--「社会学」の位置をめぐって」としてまとめた。ここでは、「笑い」の変化を入り口として、「没頭」を喪失したように見える現代社会における「不安」と、それを再帰的に観察する自己(そこには社会学をする自己も含まれる)との関係が論じられ、距離化や再帰性が不安を生み出す経路とそうした不安から自由になる可能性についての考察が行われた。第二の実証的研究については、3名の若手研究者と共同研究会を行い、各自の研究テーマについて資料収集と分析に基づく成果を議論した。うち、小倉敏彦は、明治末期の「煩悶青年」と大正期の教養主義をめぐる言説を分析し、この時期の青年文化の生真面目さや理想主義を、とくに森田療法を事例として抽出した。
元素分離に用いられる抽出剤分子の直接放射線分解過程の解明

本研究では、放射性核種の分離における放射線作用の把握を目指して、抽出剤分子の放射線による直接的な分解過程を明らかにする。そのために、本年度は抽出剤として有望なtetraoctyldiglycolamide(TODGA)およびhexaoctylnitrilotriacetamide(HONTA)の放射線分解で生じる生成物を調べた。TODGA、HONTAおよびそのドデカン溶液をガンマ線で照射し、照射後の試料を高速液体クロマトグラフタンデム四重極質量分析装置(LC-MSMS)により分析した。その結果、TODGAとHONTAのどちらの抽出剤についても、ドデカン溶液中に比べて、希釈せずに照射した場合により分解が進むことが分かった。また、ドデカン溶液中と無希釈の抽出剤との間で放射線分解生成物を比較すると、それぞれに特有な生成物が観測された。そのため、ドデカン溶液中でドデカンの放射線分解から始まる間接的な抽出剤の分解過程と、抽出剤分子自体に放射線のエネルギーが付与される直接の分解過程とでは、反応経路が異なることが明らかになった。一方で、抽出剤分子の中で、窒素や酸素を含む官能基部が開裂する分解反応は、ドデカン溶液の照射においても無希釈抽出剤の照射においても、共通して観測された。開裂箇所の選択性は放射線のイオン化・励起による電子的な損傷が移動したことを示すものである。ドデカン溶液中では、ドデカンのカチオンラジカルや励起分子、余剰電子の反応によって、抽出剤の官能基部の開裂に至ると考えられている。そのため、直接分解過程においても、イオン化・励起で抽出剤のアルキル基に生じたラジカルが近傍の抽出剤官能基部と反応することが推測される。次年度は、酸化還元試薬を用いた中間体の反応試験および電子スピン共鳴法によるラジカル種の分析により、直接分解過程の反応を調べる予定である。本年度に予定していたガンマラジオリスによる生成物分析は当初計画通りに進んでおり、進捗状況はおおむね順調である。申請時には本研究課題でX線照射装置を購入する予定であったが、運営費交付金により同種装置を導入することができた。このため、本課題の研究費により電子スピン共鳴(ESR)装置の制御部を購入した。これにより、放射線分解によって生じるラジカルの分析が可能となった。そのため、本研究課題で当初予定していた、照射試料のLC-MS/MS分析とパルスラジオリシス法による過渡生成物の紫外可視吸光分析に加えて、ラジカル生成物のESR分析を実施することとした。これにより、抽出剤分子の直接分解過程をより明確に解明できると期待できる。申請時にはX線照射装置の購入を予定していたが、運営費交付金により同種装置が導入されたため、ESR装置制御部の購入に変更し、このため差額が生じた。差額は次年度、当初申請内容に加えて実施するESR分析用の試薬・消耗品等の購入に充てる。
ファジイ論理による頭部MRA画像からの脳動脈瘤検出法の提案

本研究では、MRI(magnetic resonance imaging)装置上でMRA(MR angiography)撮影法により得られた画像を用い、医師、医療技術者を対象とした未破裂脳動脈瘤の発見支援システムを提案した。同システムは、(1)動脈瘤の発症が多い箇所の検出と、(2)動脈上の異常変形を検出し、その形状、MR信号値からパターン認識技術により動脈瘤である度合いを算出し、度合いが高い順に、ユーザに提示するシステムかち構成される。以下にその各項目の内容を示す。(1)疫学研究により、脳動脈瘤の約80%がウィリス環(脳内の血管が構造上環状になった場所)に発症することがわかっており、実際の診断においてもウィリス環を精査することで、脳動脈瘤が発見できる場合が多い。しかし、脳血管構造は複雑で、個人差も大きいため、構造的解析に基く、ウィリス環発見は難しい。本研究では、ウィリス環を構成する脳血管と分岐部の位置及び構造をファジィ知識表現し、ファジィ知識を評価関数に用いた遺伝的アルゴリズムにより、脳内の血管よりウィリス環に相当する血管分岐点の組みを探索する手法を提案した。(2)MRA撮影法の原理上、動脈硬化などによる血管の形状異常や、渦流や撮影アーチファクトなどに起因し、動脈瘤描出の特異度には限界がある。そこで、実際の診断においては患者の症状や病歴などを基に動脈瘤疑いの箇所を検出し、必要な場合CT装置やAngiography装置などを用いて、確定診断を行う。そこで、本研究では動脈瘤を全自動で検出するのではなく、動脈瘤疑いの高い箇所を自動検出し、ユーザに提示することで、動脈瘤の検出漏れを減少させるシステムを構築した。本システムは形状、信号値を属性値としたパターン認識により、動脈瘤の度合いを算出するものである。本研究では、破裂すると脳梗塞などの重篤な症状となる脳動脈瘤を、破裂前に自動検出する計算機システムの開発を目指している。本研究で用いる画像は、脳内部を非侵襲に画像化できるMRI装置を用いたMRA撮影法により得られたMRA画像とする。MRA画像は脳動脈を高いコントラストで画像化できる。本年度の研究では、(1)脳動脈瘤の約80%が発症する脳血管が集中した場所であるウィリス環と呼ばれる部位の発見法と、(2)「脳動脈瘤らしさ」の概念を導入した動脈瘤検出法の検討を行った。以下にその詳細を示す。(1)ウィリス環とは脳内の血管が、構造上環状になった場所である。本研究では能動脈と分岐部の位置及び構造をファジィ知識表現し、ファジィ知識を評価関数に用いた遺伝的アルゴリズムにより、脳内の血管よりウィリス環に相当する血管分岐点の組みを探索する手法を提案した。本手法の有効性は、計算機シミュレーション及び3名の被験者への適用により確認された。(2)脳内の脳動脈瘤は位置、形状、信号値が様々であり、一意に規定することは困難である。そこで本研究では既に検出した動脈瘤を教師データとした事例ベースシステムを構築し、未知の被験者より抽出した脳動脈瘤候補群に対し、そのそれぞれと教師データとの類似度を算出し、それを「脳動脈瘤らしさ」と定義した。本システムを用いることで、4 fold cross validationテストによりROCカーブ以下の面積(ROC-index)が平均0.95と非常に高い検出率が得られた。
小胞体膜から核へ移行するbZIP型転写因子のタンパク質切断機構の解明

植物の小胞体ストレス応答で機能する転写因子AtbZIP60は通常は小胞体膜に局在し、小胞体ストレスにより、タンパク質レベルで切断され核へ移行する。AtbZIP60欠損変異体ではAtBiP3の誘導は殆ど起こらない。AtBip3プロモーターで制御されるGUS遺伝子を導入したシロイヌナズナではツニカマイシン処理により100から1000倍のGUS活性の誘導が確認された。この植物を用いてGUS活性を指標とし、ツニカマイシン処理によりGUS活性の誘導が起こらない変異体を単離すれば、その原因遺伝子はAtbZIP60タンパク質の切断に関与する可能性が高い。このようなアイデアのもとAtBiP3 :: GUSをホモに持つシロイヌナズナの種子にガンマ線及びEMSにより変異処理を行いそれぞれ約1000、5000のM2種子を収穫した。これらのM2種子から生じたM2植物を用いて変異体のスクリーニングを行った。これらの成果は植物で初めての膜切断型プロテアーゼの同定につながると期待される。AtbZIP60の誘導やタンパク質切断を引き起こす物質として、ポリアミン、サリチル酸に加えてプログラム細胞死を引き起こすフモニシンB1(FB1)を同定した。FB1はAtbZIP60の転写誘導を引き起こすとともにタンパク質レベルの切断も誘導した。少なくともBiPの顕著な転写誘導がFB1により起こらないことからFB1による効果は小胞体ストレス応答とは独立の情報伝達系により制御されていると考えられた。AtbZIP60の遺伝子破壊株ではFB1によるプログラム細胞死がより起こりやすくなっていた。この原因を調べるために野生型とAtbZIP60の遺伝子破壊株を用いてFB1処理における遺伝子発現のパターンをマイクロアレイ解析により調べた。これらの成果は植物における小胞体ストレスの生理意義の解明につながると期待できる。植物の小胞体ストレス応答で機能する転写因子AtbZIP60は通常は小胞体膜に局在し,小胞体ストレスにより,タンパク質レベルで切断され核へ移行する。このタンパク質切断機構を明らかにすることを主たる目的に研究をおこなった。膜タンパク質の切断に関与するRIPプロテアーゼのシロイヌナズホモログ12個の遺伝子破壊株についてホモ接合体を単離したが解析の結果これらのRIPプロテアーゼはAtbZIP60の切断には関与しないと考えられた。AtbZIP60欠損変異体ではAtBiP3の誘導は殆ど起こらないことから,AtBiP3プロモーターで制御されるGUS遺伝子(AtBiP3 : : GUS)を導入したシロイヌナズナを作成した。この植物はではツニカマイシン処理により100から1000倍のGUS活性の誘導が確認された。GUS活性を指標としたスクリーニングのためにAtBiP3::GUSをホモに持つシロイヌナズナの種子を約5万粒採取した。さらに小胞体ストレス応答の制御に関わると考えられるAtbZIP28を単離した。GFPとAtbZIP28の融合タンパク質は,ツニカマイシン処理により小胞体から核の移行が観察され,AtbZIP28もAtbZIP60と同様に小胞体から核へ移行して機能する転写因子であると考えられた。また,AtbZIP60は通常条件下で生育したシロイヌナズナでは,主として葯で発現し,切断されることを明らかとした。ツニカマイシンにより強く誘導される遺伝子TINl(Tunicamycin induced 1)は,植物特異的な配列を有し,その発現誘導にはAtbZIP60が関与していた。TINlは,ストレス非存在下では,花粉で非常に強い発現を示し,TIN1の遺伝子欠損株は花粉の形態異常示した。
専門家による知の伝達ー双方向的な解説手法の確立と検証

本研究は、専門家が一般の人達に知識や経験を伝え科学的認識形成を目指す際に、伝えるべき内容・解説手法をどう作り上げているかを成功事例をもとに明らかにし、科学コミュニケーションを目指す専門家が共有できる内容構成・伝達手段のモデル化を目的として行った。成功事例として、10年以上多くの小学校から継続して授業依頼を受ける野生鳥獣保護に従事する獣医師の出前授業を取り上げ、受講児童への授業前後のアンケート調査と獣医師へのインタビューによって学習者の認識変化と専門家側の内容構成プロセスを調べた。小学校2校3ー4年生7クラス198名の児童の回答を得て、アンケート設問の単一自由連想法(糸山2011)および自由記述を質的にコード化すると同時に連想エントロピー、テキストマイニングを用いて量的分析を行った。インタビューは質的コード化を行った。両方の結果から、授業前後での野鳥のイメージ変化や、認識の拡大、授業の主目的である野鳥の特徴や種類、野鳥の事故原因と防止方法が児童に伝わっていること、従って獣医師の目指す認識変化が生じていることが見出せた。このような学びの構築を可能にした要因として、獣医師へのインタビューから、1)伝えることへの明確な動機・使命感がある、2)聞いた人が後日アウトプットできることを行動目標と設定し内容を最小限にしぼる、3)既存知識の再確認と新しい気づきを組み合わせる、4)児童の認知状態の差が影響しないよう教材を準備するの4点が明らかになり、使命感が授業の目的を、目的が内容を、内容が伝える工夫を決めるという一貫したプロセスによって構成された授業が学びにつながることを見出した。専門知識を解説・授業などで伝えるとき、何をどう伝えるかの側面に傾注することが多いが、なぜそれを伝えるのか、伝えることで何を目指すのかへの明確な視点が科学コミュニケーションの成功につながることを示唆できた。平成28年度は、専門家による知の伝達と聴衆の学びや効果に関する研究の一環として、専門家の側から見た伝える工夫を明らかにすることを目的として、環境省の野生鳥獣保護センターやネイチャーセンターなどに所属する獣医師・ネイチャーガイド(以下専門家と呼ぶ)を対象として、一般の人々に自らの知識を伝えるときに意識していることや課題などを聞き取り調査した。聞き取り内容として、1担当したプログラムを構成する際の留意点や構成原理2一般参加者に最も伝えたいことや学びとして持ち帰ってほしいと思うこと3プログラム構成の際に苦労したことや課題4プログラムや講演、解説などを行った際に感じた課題や聴衆の反応5今後どのような工夫が必要と考えているか、を含めた。また実際の解説場面や小学校に出向いての授業の様子を見学し、さらに聴衆から寄せられた感想を分析した。聞き取り調査の内容と授業見学、感想の分析から、伝えたい内容を厳選し焦点を絞ることが聞き手の理解に非常に有効であること、専門家の側にこれを伝えたいという明確な目標が定まっていないと内容が詰め込まれすぎること、焦点が絞られていれば、伝える内容がネガティブなものであっても(野生動物の死など)聞き手は事実・正しい知識として受けとめることができることが確認できた。また今年度の調査は、次年度に予定している、知識を受け取る側の期待や知りたい内容と、専門家として伝えたい内容やその順序の一致・不一致をみる調査の前提としても位置づくものになった。次年度もできるだけ多様な分野の専門家を対象として聞き取り調査を継続し、専門家が思い描く知の形成プロセスやわかりやすいと考えている伝達方法を見出すとともに、聞き手を対象に理解の内容や深度について調べ、伝わる科学コミュニケーションを作り上げるプロトコール創出の基盤とする。一般の人を対象とした専門家の解説や小中学生を対象にした授業はひんぱんに実施されているわけではなく、調査協力を表明してくれている専門家によっては年1回から2回程度の場合もある。より多くのデータを収集するには1年では難しいこともあり、その点でデータ収集が遅れることもあるが、現在のところはおおむね順調に進展していると考えている。平成29年度は、博物館諸施設の専門家が地域の小学校へ出向いて行う授業(以下出前授業)を調査対象とし、どのような知が伝えられ受けとめられたか、またどのような展開のとき知の形成が生じるかを明らかにすることを試みた。専門家が行う出前授業の内容については、多くの実践報告を見ても、質の高いものが提供されていることは間違いない。しかしその授業により学習者の認識や意識がどのように変化したかを評価する方法については、自由記述など質的なデータの場合が多く、分析・評価方法の客観性、妥当性に検討の余地が残されている。そこで今年度は、単一自由連想法(糸山2011)という手法を用いて得られた質的データを量的に評価すること、そして自由記述を併用することで、量的、質的側面から出前授業前後の学習者の認識変化を捉えることを試みた。単一自由連想法は、被験者が連想反応によって想起する反応語が被験者がもつ認識、知識、イメージの表出であると考え(糸山2011)、その変化を見ることにより認識の変化を測ることを目的とする手法である。また認識変化を引き起こす解説の仕方を抽出する目的で、同一出前授業を複数回見学し、当該授業の展開を確認した上で、授業のどの部分で受講者は高揚感を感じるかを3段階尺度で調べ、高揚感の度合いと連想法の反応語の変化との関連をみた。

小学校1校の協力を得て77名の児童から得られた反応語(授業前405、授業後519)の授業前後の変化を反応語数、反応語種数、連想エントロピーを計算して調べた結果、反応語数はさほど変わらなくとも連想エントロピーの増加が見られ、授業後は授業のテーマに関連した認識の広がりを確認することができた。また授業後の反応語と自由記述の内容を授業場面の展開に応じて分類することで認識の質的な変化を把握し、連想法では反応語として表れない認識の変化が自由記述の方法では表現されることも見出した。出前授業を調査対象としているため、調査時期が、出前授業が実施される時期や調査受入の学校の影響をうけ、平成29年度下半期での調査実施となった。そのため成果発表に間に合わせることができず、研究成果の公表は報告書の作成のみとなった。本研究は、専門家が一般の人達に知識や経験を伝え科学的認識形成を目指す際に、伝えるべき内容・解説手法をどう作り上げているかを成功事例をもとに明らかにし、科学コミュニケーションを目指す専門家が共有できる内容構成・伝達手段のモデル化を目的として行った。成功事例として、10年以上多くの小学校から継続して授業依頼を受ける野生鳥獣保護に従事する獣医師の出前授業を取り上げ、受講児童への授業前後のアンケート調査と獣医師へのインタビューによって学習者の認識変化と専門家側の内容構成プロセスを調べた。小学校2校3ー4年生7クラス198名の児童の回答を得て、アンケート設問の単一自由連想法(糸山2011)および自由記述を質的にコード化すると同時に連想エントロピー、テキストマイニングを用いて量的分析を行った。インタビューは質的コード化を行った。両方の結果から、授業前後での野鳥のイメージ変化や、認識の拡大、授業の主目的である野鳥の特徴や種類、野鳥の事故原因と防止方法が児童に伝わっていること、従って獣医師の目指す認識変化が生じていることが見出せた。このような学びの構築を可能にした要因として、獣医師へのインタビューから、1)伝えることへの明確な動機・使命感がある、2)聞いた人が後日アウトプットできることを行動目標と設定し内容を最小限にしぼる、3)既存知識の再確認と新しい気づきを組み合わせる、4)児童の認知状態の差が影響しないよう教材を準備するの4点が明らかになり、使命感が授業の目的を、目的が内容を、内容が伝える工夫を決めるという一貫したプロセスによって構成された授業が学びにつながることを見出した。専門知識を解説・授業などで伝えるとき、何をどう伝えるかの側面に傾注することが多いが、なぜそれを伝えるのか、伝えることで何を目指すのかへの明確な視点が科学コミュニケーションの成功につながることを示唆できた。平成29年度は、専門家の解説を聞く側、すなわち知識を受け取る側の期待や知りたい内容と、専門家として伝えたい内容やその順序の一致・不一致をみる調査を行う。そのために、専門家に対しては解説内容の構成についてさらに詳細に聞き取りをすること、また解説の聞き手に対しては何に関心があるかの調査を開始する。平成28年度でのインタビュー調査、平成29年度の出前授業前後の受講者の認識変化調査成果から、教育者ではない、他分野の専門家が自らの領域の知を一般の人々に伝えることを成功させるためには、何を伝えたいのか、どこまで伝えたいのか、言い換えれば何を目的として知の伝達を行うのかを専門家自身が明確に把握していることが絶対的な条件であることを確認できた。
環状シロキサンを元素ブロックとしたハイブリッドネットワークポリマー薄膜の構築

環状シロキサンの官能基をビニル基とした2,4,6,8-Tetramethyl-2,4,6,8-tetravinylcyclotetrasiloxane(TMVS)を用いて、ハイブリッドネットワークポリマー薄膜の検討を行った。ヒドロシリル化反応における触媒量をできるだけ少量とし、TMVSと二官能性モノマー1,1,3,3-tetramethyldisiloxane (TMS)の総モノマー濃度と混合比を調整し、トルエン溶媒中にてヒドロシリル化反応を行ったところ、混合比1:1にて、総モノマー濃度6mol/L以下の場合、トルエン、THF、クロロホルムなどの汎用性溶媒可溶なハイブリッドポリマー(TMVS-TMS)を得ることができた(収率90%)。混合比1:2の場合ではゲル化が生じた。昨年度報告したTMCS環状シロキサンモノマーと比較すると、混合比の条件は同じであり、ポリマー合成条件の許容総モノマー濃度がTMVSの方で増加した。得られたハイブリッドポリマーについてSECにより分子量は高濃度条件で約4.5×10^6(ポリスチレン換算)と求められ、TMCS系よりも高分子量のものを得ることができた。1H NMRと29Si NMRにより未反応のCH2=CH-基が4.3(mmol/g)であり、TMVSがTMSと1:1で反応したと仮定した場合の計算値とほぼ一致すること、TMVSモノマー中の反応部位と未反応部位の割合がほぼ等しいことが分かった。以上よりTMVS-TMSは直鎖状をとったハイブリッドポリマーであると考えられる。このポリマーは、無色透明で液体状のハイブリッドポリマーであり、THFやクロロホルムなどの汎用溶媒に可溶であることからハンドリングが容易である。さらにCH2=CH-基の未反応部位がポリマー中に残存しており、薄膜の高性能化・高機能化に利用することが可能である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では複数の官能基を有する環状シロキサンモノマーを元素ブロックとしたハイブリッドネットワークポリマー薄膜の作製を目的としている。薄膜作製を可能とするために、環状シロキサンモノマーを含む溶媒可溶なハイブリッドポリマーを合成し、そのポリマーを前駆体として製膜・多官能性ゆえの未反応部位を利用したハイブリッドネットワーク化によるハイブリッドネットワークポリマー薄膜の作製について検討した。ハイブリッドネットワークポリマーの合成について、4つのSi-H基を有する環状シロキサン(1,3,5,7-tetramethlycyclotetrasiloxane)(TMCS)と二官能性ビニルモノマーとのヒドロシリル化反応を利用した逐次重合によりハイブリッドポリマーを合成した。薄膜形成可能なハイブリッドポリマーを得るための合成条件について、二種のモノマー混合比および溶液濃度の調整が重要であることをつきとめた。1H NMRや29Si NMR測定により、ハイブリッドポリマーが直鎖状を有していることが示唆された。ドクターブレード法により製膜、200°C以上での熱的架橋反応を利用することでハイブリッドネットワークポリマー薄膜を得た。得られた薄膜は、300°C近くの耐熱性を有し、可視光領域で90%以上の透過率を示す透明な薄膜であることを明らかにした。ヒドロシリル化反応を利用した環状シロキサンモノマーの逐次重合を制御し、溶媒可溶かつ架橋反応可能なハイブリッドポリマーを作製する条件、およびハイブリッドネットワークポリマー薄膜の作製に関する基礎的知見を得た。環状シロキサン化合物1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane(TMCS)を元素ブロックとして、ヒドロシリル化反応を制御することで溶媒可溶なハイブリッドポリマーの作製方法を確立することができた。

特に反応時の総モノマー濃度や二種類のモノマー混合比に注意することが重要であるということを実証することができた。この方法論をもとにドクターブレード法により薄膜を作製し、熱処理を行うことで未反応の官能基間の架橋反応によるネットワークポリマー薄膜が得られることを見出した。このことは、新たな架橋剤を使用せずともネットワーク化が可能であることを意味し、従来の架橋剤による化学的架橋以外の選択肢としてハイブリッドネットワークポリマーを得る方法になり得る。より多くの環状シロキサンモノマーへの応用が可能となり、研究展開が順調に進むものと思われる。環状シロキサンモノマーは官能基だけでなく、元素ブロックとしての構造もハイブリッドネットワークポリマーの形成に影響を及ぼすことが予想される。4官能性環状シロキサンモノマーに対してだけでなく、2官能性モノマーの種類を変えていくことで、元素ブロック構造のプレポリマー形成への影響を明らかにすることができる。また、薄膜作製における架橋ネットワーク過程についても、熱架橋や化学的架橋の両方を検討することで、機能と構造関係の観点からハイブリッドネットワークポリマー薄膜の特徴を明らかにしたい。
クルマエビの生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）の同定と機能解析

クルマエビの生殖腺刺激ホルモン(GnRH)を探索するために、次世代シークエンサーを用いたRNA-seq解析を行った。相同性検索の結果、解析したデータの中にはアメリカザリガニGnRHと相同性を有するコンティグは存在しなかった。しかし、GnRHスーパーファミリーのメンバーであるコラゾニン、赤色色素凝集ホルモン(RPCH)、脂質動員ホルモン・コラゾニン関連ペプチド(ACP)の配列が存在した。それら3種類のペプチドを化学合成し、クルマエビに投与したところ、11個体中の2個体で成熟した卵母細胞が観察された。この結果より、コラゾニン、RPCH、ACPのいずれかがクルマエビのGnRHではないかと考えられた。クルマエビの脳900個をアセトン:1N HCl(100:3)中でホモジナイズし、ドライアイスで冷却しながら3時間攪拌した。その後、遠心分離により上清と沈殿に分けた。沈殿にアセトン:0.01N HCl(80:20)を加えて攪拌し、遠心分離した。得られた2回分の上清を合わせ、石油エーテルを加えて攪拌して上層を除いた後、下層に再び石油エーテルを加えた。この操作を5回繰り返して残った下層を脳抽出物とした。逆相カートリッジを用いて粗精製した後、精製産物をナノフロー型の逆相HPLCを用いて分画し、40秒毎に溶出産物をサンプルプレートにスポットした。このサンプルを全てMALDI-TOF型質量分析装置で測定し、GnRHと考えられた質量電荷比(m/z)が1369.68のピークをプリカーサーイオンとして選択し、CID法で断片化したフラグメントイオンを測定した。その結果、複数のアミノ酸由来のインモニウムイオンが検出され、それらの中に無脊椎動物のGnRHに特徴的に保存されているトリプトファン由来のインモニウムイオンが含まれていた。次いで、PSD法で断片化したフラグメントイオンを測定した結果、アミノ酸6残基分の情報が得られた(FSEGWF)。このアミノ酸配列と、既知のGnRHで保存されているアミノ酸配列、検出されたインモニウムイオンの情報を組み合わせて推測した結果、クルマエビGnRHのアミノ酸配列はpQRPHFSEGWFP-NH2またはpQPRHFSEGWFP-NH2であると考えられた。このアミノ酸配列から計算した理論値[M+H]+は1369.65であり、プリカーサーイオンの測定値m/z=1369.68とほぼ一致していた。これらの結果より、クルマエビGnRHは脳に存在する11残基からなるペプチドであり、既知GnRHの配列とは異なる新しい構造であることが明らかになった。昨年度、クルマエビの脳抽出物をナノフロー型の逆相HPLCを用いて分画した。そして、分画した産物をMALDI-TOFを用いてMS/MS解析することにより、クルマエビ生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)のアミノ酸配列は「pQRPHFSEGWFP-NH2」または「pQPRHFSEGWFP-NH2」と決定した。本年度は、クルマエビGnRHの局在を明らかにすることを目的として、クルマエビの脳、胸部神経節、卵巣を出発材料として、同様の解析を行った。その結果、クルマエビGnRHは脳および胸部神経節には存在した。一方、卵巣にはクルマエビGnRHは存在しなかった。アメリカザリガニGnRHは卵巣から精製されていることから、種によってGnRHの産生部位が異なると考えられた。今年度の解析では、新たなクルマエビGnRH様の分子(クルマエビGnRH2)が存在することが明らかとなった。クルマエビGnRH2のアミノ酸配列はpQAHFSRGWTYP-NH2であると考えられ、C末端側のアミノ酸配列がこれまでの既知GnRHとは異なっていた。現在、クルマエビGnRHとクルマエビGnRH2のアミノ酸配列が正しいことを確認するために、次世代シークエンサーを用いたRNA-seq解析の準備をすすめている。天然の雌のクルマエビから卵巣と脳を摘出し、卵巣はDavidson液を用いて固定し、脳は凍結した。卵巣をパラフィンに包埋して、薄切し、ヘマトキシリン・エオシン染色に供した。卵巣の成熟ステージから判断して、RNA-seq解析にかけるクルマエビを選別した。2016年度の初旬にクルマエビ脳を用いてRNA-seq解析する予定である。今年度はクルマエビGnRHを化学合成し、それを用いてin vivoの投与実験とin vitroの生物検定を実施する予定であった。しかし、今年度はクルマエビGnRH以外の新たなGnRH様の分子(クルマエビGnRH2)が発見されたため、それら予定していた実験ができなかった。昨年度と一昨年度、クルマエビの脳抽出物をナノフロー型の逆相HPLCを用いて分画した。そして、分画した産物をMALDI-TOFを用いてMS/MS解析することにより、2種類の生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)様の分子のアミノ酸を推定した。今年度は、これら2種類のGnRH様分子のアミノ酸配列が正しいことを確認するために、次世代シークエンサーを用いたRNA-seq解析を行った。天然の雌のクルマエビから卵巣と脳を摘出し、それらからtotal RNAを抽出した。各サンプルのライブラリーを調製した後、75 bpのシングルエンド法で1000万リードずつ解析し、得られた塩基配列をアセンブルしてコンティグを作製した。

そして、重複を除いたコンティグの塩基配列を遺伝子解析ソフトに取り込んだ。2種類のGnRH様分子のアミノ酸配列をクエリーとしてBlast解析を行った結果、それら2種類のGnRH様分子と同一のアミノ酸配列を持つコンティグは存在しなかった。これは、MALDI-TOFを用いたMS/MS解析によるアミノ酸配列決定の精度が低いためと考えられた。しかし、RNA-Seqデータ中には、GnRHスーパーファミリーのメンバーであるコラゾニン、赤色色素凝集ホルモン(RPCH)、脂質動員ホルモン・コラゾニン関連ペプチド(ACP)の配列が存在した。それら3種類のペプチドを化学合成し、それらをクルマエビに投与したところ、11個体中の2個体で成熟した卵母細胞が観察された。この結果より、コラゾニン、RPCH、ACPのいずれかがクルマエビのGnRHではないかと考えられた。クルマエビの生殖腺刺激ホルモン(GnRH)を探索するために、次世代シークエンサーを用いたRNA-seq解析を行った。相同性検索の結果、解析したデータの中にはアメリカザリガニGnRHと相同性を有するコンティグは存在しなかった。しかし、GnRHスーパーファミリーのメンバーであるコラゾニン、赤色色素凝集ホルモン(RPCH)、脂質動員ホルモン・コラゾニン関連ペプチド(ACP)の配列が存在した。それら3種類のペプチドを化学合成し、クルマエビに投与したところ、11個体中の2個体で成熟した卵母細胞が観察された。本課題で主要な目的としていたクルマエビGnRHの一次構造を世界に先駆けて決定した。これにより、クルマエビGnRHを化学合成することが可能となり、それを用いて生物活性を測定することが可能となった。これらのことから、本課題は概ね順調に進展していると思われる。本研究で明らかにしたクルマエビGnRHとクルマエビGnRH2を化学合成し、in vivoの投与実験とin vitroの生物検定を実施する。また、RNA干渉によるGnRHの合成抑制実験を実施する。甲殻類生理学研究計画通り、化学合成クルマエビGnRHを用いてin vivoの投与実験とin vitroの生物検定を実施する。また、生物活性を高めるために、脊椎動物のGnRHを参考にしてクルマエビGnRHアナログの化学合成を実施する。残金は711円のみであり、ほぼ予定通り支出できた。残額は51円のみであり、ほぼ予定どおり支出できた。繰越額は711円であることから、当初予定していた使用計画通り支出する。繰越額は51円であることから、当初予定していた使用計画通り支出する。
転写因子Olig2下流因子の同定とその遺伝子導入に基づく神経膠芽腫治療法の開発

神経幹細胞(NSC)は、自己複製を行いながら非対称性分裂を行うことでニューロンやグリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイト)を生み出すとされているが、どのようなメカニズムによって分化・誘導されているか解明されていない。bHLH型転写因子であるOlig2は、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OLP)と運動ニューロン(MN)の発生に必須の因子であり、ニューロン/グリア分化制御機構の鍵を握る因子であると考えられている。Olig2は抑制型の転写因子で、下流因子を抑制することによりOLP/MNの発生を誘導すると考えられているが、いまだ直接的な下流因子は同定されていない。オリゴデンドロサイトは、胎生12.5日(E12.5)頃より前脳ではganglionic eminence(GE)、脊髄では腹側のpMNドメインの脳室下層から生じることが証明されている。そこで、E12.5のOlig2ノックアウトマウスと野生型マウスから前脳のGE、および脊髄を採取し、cDNA subtraction法により野生型で発現されているが、ノックアウトマウスで発現しなくなった因子、すなわちOlig2の下流因子を現在も懸命に探索し続けている。一方、最も悪性度の高い神経膠芽腫(GBM)はOlig2転写因子を高率に発現しているとの報告もなされている。そこで我々は、各種グリオーマ細胞株に対し、DNAマイクロアレイを用いて転写因子発現差異について網羅的解析を続けており、現在英文投稿の準備中である。今後とも本研究を継続する事で、腫瘍化に至る過程でのOlig2の役割を解明すると共に、首尾よくOlig2下流因子が同定できれば、パッケージング細胞を改変する事で得られた高力価レトロウイルスベクターを用いて、Olig2下流因子をGBM細胞に導入することで高分化しうるかどうか検証する計画である。神経幹細胞(NSC)は自己複製を行いながら非対称性分裂を行うことでニューロン、グリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイト)を生み出すとされているが、そのメカニズムは未だ解明されていない。bHLH型転写因子であるolig2は、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OLP)と運動ニューロン(MN)の発生に必須の因子であり、ニューロン/グリア分化制御機構の鍵を握る因子であると考えられている。また、最も悪性度の高い神経膠芽腫(GBM)はOlig2転写因子を高率に発現しており、GBMは、Olig2以降の分化制御カスケードが障害された病態とも解釈できる。それ故、未だ確定していないOlig2下流因子を同定し、GBMにおける障害された分化過程を修復することで、非常に未分化なGBMをより分化した悪性度の低い病態に転化させ得る新たな治療法の開発を目指している。オリゴデンドロサイトは、胎生12.5日(E12.5)頃より前脳ではganglionic eminence(GE)、脊髄では腹側のpMNドメインの脳室下層から生じる。そこで、E12.5のolig2ノックアウトマウスと野生型マウスから前脳のGE、および脊髄を採取し、cDNA subtraction法により野生型では発現がみられるが、ノックアウトマウスでは発現がなくなった因子、つまりOlig2の下流因子の同定を懸命に続けている状況である。
細胞内共生現象の分子生物学的・細胞生物学的研究

本年度はアブラムシ細胞内共生系において共生体が唯一合成するタンパク質、シンビオニンの分離・精製に成功するとともに、その諸性質を明らかにし、多くの知見が得られたので、本研究全体の当初の目的をほぼ達成できたものと思う。以下にその概要を項目別に項目別に記す。1.硫安沈でんを出発とし、アブラムシ組織から種々のカラム操作を経て、シンビオニンを2次元電気泳動的に単一のスポットになるまで精製した。この結果、シンビオニンは63Kの単位1214個からなる分子量約800Kの巨大分子であることが明らかとなった。2.陰染色による電顕観察からは、シンビオニンは7個の単位からなるディスクが2層に重なった構造をもつことが示唆された。3.精製したシンビオニンをウサギに注射して得た抗血清によるイムノブロッティングからは、生体内にはシンビオニンの他に、多種類のその分離産物の存在することが示唆された。同分子が精製の過程で分解されやすいことも考え併せると、その生体内での役割が推測される。4.抗シンビオニン抗血清と交差反応を示すタンパク質はアブラムシ類だけでなく、原核細胞に広く分布することが明らかとなった。これらのタンパク質はSDS-PAGEによると何れも63Kの分子量を示す。5.2に述べたシンビオニンの電顕像は大腸菌groelタンパク質の像と酷似しており、そのアミノ酸組成ならびにN末端近傍のアミノ酸配列の比較もこの結果を支持した。また、精製したgroelタンパク質は抗シンビオニン抗血清と交差反応を示すことも明らかになった。以上の結果はシンビニオンがgroelタンパク質と相同であることを強く示唆する。6.抗シンビオニン抗血清を用いた免疫組織化学的技法によって、共生体を含むアブラムシ菌細胞が強く染め分けられることがわかった。本年度は細胞内共生微生物のリボソームRNAとの関係を調べる目的で、ホストであるアブラムシ自身のリボソームRNA遺伝子(rDNA)の構造を解析するとともに、共生微生物が細胞内で唯一合成するタンパク質、シンビオニンの分離・精製に着手した。以下にその結果を項目別に示す。1.アブラムシ全ゲノムDNAをEcoRIで限定分解し、ショ糖密度勾配遠心によって平均20kbpの断片を得、これをファージベクターEMBL4へつなぐことによってゲノムライブラリーを作製した。先に得られていたカイコrDNA断片をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行ない、このライブラリーより13KbpのアブラムシrDNA断片を検出した。これをさらにEcoRI-BamHIにより3kbpと10kbpの断片に切断し、前者をプラスミドベクターを用いてサブクローン化することにより、制限酵素地図を作製した。また、この3kbp断片をプローブとして用いることにより、アブラムシのrDNA単位には13kbpと7kbpのものが2:3の比率で存在し、それらのコピー数はハプロイドゲノム当り、合わせて約50と推定された。2.上と同じ3kbpの断片をプローブとして共生微生物の全ゲノム断片をサザーンの方法で探ったところ、ほとんど全てのサイズクラスの断片にシグナルがみられた。この結果は共生微生物のゲノム中にはホストのrDNAまたはその一部と類似の配列が多数、分散して存在する可能性を示唆するもので、きわめて興味深い。この結果をさらに確かめる目的で、共生微生物のゲノムライブラリーを目下、鋭意作製中である。3.アブラムシ全組織からタンパク質を抽出したところ、シンビオニンは硫安の40-50%飽和で沈でんする分画に存在することがわかった。この分画にシンビオニンは10%近かく含まれるので、今後イオン交換等による分離・精製の可能性が拓かれた。本年度は細胞内共生系のホストであるアブラムシのrRNAの構造上の特徴を明かにするとともに,共生体ゲノム中に繰返し配列の存在を指摘した.さらに共生体が細胞内で唯一合成するタンパク質,シンビオニンの分離・精製をほぼ達成した.以下にそれらの主な結果を項目別に示す.1.ファージベクターεMBL4を用いて作製したアブラムシ・ゲノムライブラリーからカイコrDNA断片をプローブとしてrDNA繰返し配列のクローンを得, 28S rRNAコード配列の中間点近傍の塩基配列を決定した.この結果,アブラムシ28S rRNAが他の昆虫類の分子と異なり,中間点近傍にhidden breakをもたないのは,この部分の塩基配列が後口動物などの分子と同様にGCに富むことと密接に関連していることが明かになった.2.同じくεMBL4を用いて作製した共生体ゲノムライブラリーを上記アブラムシrDNA断片をプローブとして検索したところ,その一部と95%以上の相同性をもつ配列が数十回以上繰返して存在することが明かになった.塩基配列の検討によって,共生体ゲノム中のこれらの配列はホストrDNAの一部が進化を通じて転移されて生じたものと推察された.3.アブラムシ

全組織からタンパク質を抽出し,硫安40ー50%飽和で沈でんする分画を出発材料としてシンビオニンの分離・精製を行なった.ハイドロキシアパタイト, DEAEセルロース,さらにゲル濾過の操作を経ることによって,シンビオニンを電気泳動的にほぼ単一のバンドにまで精製することに成功した.ゲル濾過の過程で明かになったのは,生体内でシンビオニンは分子量約800Kのホモポリマーとして存在することで,従来, SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されてきた63K分子はそのサブユニットであることが強く示唆された.本年度はアブラムシ細胞内共生系において共生体が唯一合成するタンパク質、シンビオニンの分離・精製に成功するとともに、その諸性質を明らかにし、多くの知見が得られたので、本研究全体の当初の目的をほぼ達成できたものと思う。以下にその概要を項目別に項目別に記す。1.硫安沈でんを出発とし、アブラムシ組織から種々のカラム操作を経て、シンビオニンを2次元電気泳動的に単一のスポットになるまで精製した。この結果、シンビオニンは63Kの単位1214個からなる分子量約800Kの巨大分子であることが明らかとなった。2.陰染色による電顕観察からは、シンビオニンは7個の単位からなるディスクが2層に重なった構造をもつことが示唆された。3.精製したシンビオニンをウサギに注射して得た抗血清によるイムノブロッティングからは、生体内にはシンビオニンの他に、多種類のその分離産物の存在することが示唆された。同分子が精製の過程で分解されやすいことも考え併せると、その生体内での役割が推測される。4.抗シンビオニン抗血清と交差反応を示すタンパク質はアブラムシ類だけでなく、原核細胞に広く分布することが明らかとなった。これらのタンパク質はSDS-PAGEによると何れも63Kの分子量を示す。5.2に述べたシンビオニンの電顕像は大腸菌groelタンパク質の像と酷似しており、そのアミノ酸組成ならびにN末端近傍のアミノ酸配列の比較もこの結果を支持した。また、精製したgroelタンパク質は抗シンビオニン抗血清と交差反応を示すことも明らかになった。以上の結果はシンビニオンがgroelタンパク質と相同であることを強く示唆する。6.抗シンビオニン抗血清を用いた免疫組織化学的技法によって、共生体を含むアブラムシ菌細胞が強く染め分けられることがわかった。