hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広告表現が広告に対する態度に及ぼす影響

ともにモデルの妥当性が認められたために、2群で「視聴印象」の因子平均を比較した。その結果、5ケース中4ケースでは、情報的価値の高いケースは低いケースと比べて何らかの「視聴印象」特性の評価が高かった。つまり「情報的価値が高い→視聴印象の評価が高くなる」という反応プロセスが想定された。他方、1ケースでは、2群(情報的価値が高いケースと低いケース)でいずれの「視聴印象」特性の評価にも有意差がなかった。ただし、モデルが当てはまらないケース、視聴印象特性の評価に有意差がなかったケースでも、「Aad」の評価は情報的価値が高いケースが低いケースと比べて有意に高かった。以上のことから、情報的価値と「Aad」との間には、(1)CMの伝達内容が視聴者の「食品選択基準」に一致していると、「視聴印象」評価が高くなり、その結果「Aad」の評価も高くなるというルート(情報的価値→視聴印象→Aad)の他に、(2)「視聴印象」を介さないルート(情報的価値→Aad)があることが推察された。
Pー450_<11β>による反応の多様性と多段階反応

本研究はブタ副腎皮質ミトコンドリアの精製Pー450_<11β>を用い、触媒する反応の多様性と多段階反応の機構をすべて精製酵素タンパク質(アドレノドキシン、アドレノドキシン還元酵素)による再構成系によって酵素次元で解析したものである。Pー450_<11β>はC_<21>ーステロイドであるデオキシコルチコステロン、11ーデオキシコルチゾ-ルの11βー位を水酸化し、グルココルチコイドであるコルチコステロンとコルチゾ-ル生成するが、コルチコステロンの18位をさらに水酸化、酸化しミネラロコルチコイドであるアルドステロンを生成することが明らかになっている。このことから、Pー450_<11β>は、コルチゾ-ルの18位の水酸化、酸化も触媒し18ーヒドロキシンーおよび18ーオキシ体を生成することが予想される。そこで、精製Pー450_<11β>を用いてこれらのステロイドの生合成機構を調べることを目的とした。11ーデオキシコルチゾ-ルまたはコルチゾ-ルを基質としてPー450_<11β>と反応系を再構成し、一定時間反応させ抽出したステロイドをHPLC、TLCで分析した。得られた2つの未知の生成物はNMR、GCーMSにより18ーヒドロキシーおよび18ーオキソコルチゾ-ルと同定された。さらに、11ーデオキシコルチゾ-ルからは、18ーヒドロキシー11ーデオキシコルチゾ-ルも同定され、11ーデオキシコルチゾ-ルを出発としたPー450_<11β>の多段階反応による代謝経路が明らかになった。これらのステロイドは原発性アルドステロン症の要因ステロイドとして注目され、18ーオキソコルチゾ-ルはアルドステロンの1%のミネラロコルチコイド活性、コルチゾ-ルの3%のグルココルチコイド活性をもつstructural hybrid steroidといわれている。組織スライスを用いた実験により副腎で合成されることが示唆されていたが、本研究はPー450_<11β>がこれらのステロイドの生合成反応に関与していることを明らかした。
長期存続企業の事業変革に関する比較研究

最近、老舗を研究対象とした経営に関する研究が頓に増えている。長引く不況による倒産企業の増大を背景として、長期的な存続ないしは永続を可能とさせる経営の在り方に関心が高まっているからである。とはいえ老舗研究の多くは、老舗だけを研究対象とした事例研究に基づいて、そこから経営のエッセンを導き出している。そのため、導き出された仮説が老舗全般に妥当する一般的なものなのであるのか、また老舗に特有の特質を示しているのか、それとも老舗以外の企業にも妥当するのかを判定できないものとなっている。本稿は、こうした研究方法論上の限界を克服することを目的として、老舗経営の特質の一般理論化を試みる。事例研究に基づいて導き出された仮説を、老舗と非老舗の両者を対象とした質問票調査を実施することにより検証することで、老舗経営全般に妥当する永続経営の理論を構築することを試みている。長期存続企業における事業変革の実態を明らかにするために、機械工業業界のミシン企業3社(ブラザー工業、蛇の目、ジューキ)と化学業界の合繊繊維2社(東レ、帝人)の歴史的な事業変革の奇跡を辿り、同じ経営資源をもって始まった企業が、その後、事業内容が異なる展開を見せている背景にある理論的な仮説を導き出した。また、東京都中央区の商工会議所中央支部との協力により、中央区に存在する中小・中堅老舗企業の事例研究を実施した。事例企業は16社あり、本業を守り抜いてきた本業維持強化型の企業行動と、本業を緩やかに変革してきた本業拡大型、さらには創業時の事業とは完全に異なる事業を展開している本業離脱型の企業行動、経営スタイルの比較研究も実施した。その共通する経営の強さの秘訣を明らかにした。事例のほとんどが本業維持強化型であったことから、相違に関する仮説を導き出すにはさらなる研究が必要となる。引き続き、継続して研究する予定である。加えて、中小企業総合研究機構と共同研究を実施して、全国の中小企業およそ400社を対象とした質問票調査、および代表的な地方老舗企業の事例研究を行った。事業継続および変革に関する理論的な仮説を強化するためのデータを収集した。米国の老舗企業の調査に関しては、研究協力者の協力により、シカゴを中心とした中小老舗企業の事例に関する情報を収集し、分析を始めた。国際的な比較研究の基礎データを確保した。長期存続企業の事業変革に関して、中小企業総合研究機構との協力で実施した調査データをさらに詳しく分析して、危機管理という視点から長期存続企業がどのような管理態勢を構築してきたのかを明らかにした。それによって、持続的な競争優位性を構築するためのマネジメントの在り方を、一般理論化に向けて整理できた。また、長期存続企業が集積している東京都中央区の企業に対して実施したインタビュー調査を精査して、そこからマネジメントのエッセンスを、「らしさ」を創り出す、「つながり」をつくる、「商い」を創り込む、「人を育てる」さらには、「地域と関わる」といった要素に分類し、それぞれについて作業仮説を整理した。こうした研究成果は、次年度に実施する予定である質問票による大量サンプルに基づく仮説検証の調査によって一般理論へとまとめられる。これによって、事業変革も含めた長期存続企業のマネジメントの一般理論構築に向けて進むことになる。長期存続企業の経営に関しては、従来、老舗企業のみを研究対象として議論されることが多かった。老舗企業の実態から経営のエッセンスを導き出そうという試みである。しかし、この試みは、そうした経営のエッセンスが長期存続している企業以外にも妥当するのか否かに関する検証が欠けているという欠点を持つ。従来のこうした研究での短所を考慮して、長期存続企業(老舗)と非長期存続企業(非老舗)とをサンプルとした質問票調査を実施した。老舗企業の事例研究を約20社、インテンシヴに実施して、そこから導き出された作業仮説に基づいて、質問票を作成し、東京都商工会議所中央支部の協力を得て、7000社に質問票を発送した。およそ1400社の回答を得た。老舗10%、非老舗90%の構成からなり、両者の比較が可能となった。平均値の比較研究から、統計的に有意な相違を明らかにすることができ、比較から老舗長期存続企業の経営のエッセンスを確認できた。さらに、因子分析を実施することで、個々の仮説の妥当性を越えて、それらの仮説の間の関連性に関しても、また仮説間での経営行動の優先順位も確認できた。これによって、従来の老舗経営に関して述べられてきた一般的な仮説の妥当性、およびその限界も確認でき、さらに企業が長期存続するために経営に関して、どのような経営行動がより重要性が高く、長期存続、ひいては持続的競争力の構築に有効であるのかを明らかにすることができた。

事業変革に関しては、経時的な分析を不可欠することから、事例を積み上げることで対応している。事業変革では経営資源の活用によっていくつかパターンが存在する。例えば技術資源(ハード、ソフト)、販売チャネル資源、さらにはブランド(暖簾・知名度)資産などがその代表例である。資源の相違に関するいくつかの仮説は確認した。さらにこうした資源に応じて、事業変革のダイナミックな変革パターンが異なることから、これらのパターンをいくつか分類化できた。
高等教育におけるジェネリック・スキルを高める野外教育プログラムの実践

大学生の全人的な成長を支援する有効な教育手段として、自然体験や直接体験をベースに学びを深める「野外教育プログラム」が存在する。本研究では高等教育における野外教育プログラムに着目し、その教育効果を検証する。また、教育効果を高めるプログラム実践に向けたガイドラインを開発し、質の高い野外教育プログラムを広く高等教育機関に普及させることを目指す。本研究の目的を達成するため、1高等教育機関における野外教育プログラムの実態調査、2野外教育プログラムが大学生に与える影響の測定と要因分析、3国内外の事例のヒアリング調査、4ガイドライン作成と検証、の4つの課題に取り組む。
固相抽出を利用する環境試料水の迅速・簡便なオンサイト分析法の開発に関する研究

固相抽出の固相にメンブランフィルター(MF)を利用する際の基本原理であるイオン対抽出が,solvophobic theoryによって理論的に説明できることを示した。また,固相抽出を利用する環境試料水の迅速・簡便な分析法として以下の定量法を開発した。1.陽イオン界面活性剤は、河川水中ではこれに比べ多量に存在する陰イオン界面活性剤の妨害を受けるため、また懸濁物質や底泥に吸着しやすいため、その定量は非常に困難であったが,各種の固相抽出や対イオンを選択することによって,河川水や底質中の陽イオン界面活性剤が定量できる分析法を開発した。2.大量に使用されている陰イオン界面活性剤の多くは,スルホン酸基や硫酸基をもつタイプのものである。これらのものを選択的にMF上に捕集し,その中に含まれる硫黄濃度を蛍光X線法で測定することによって合成洗剤の全濃度を測定できることを示した。3.シックハウス症候群の原因物質とされる、大気中のホルムアルデヒドを吸収液に吸わせた後、これを4-アミノ-3-ヒドラジノ-5-メルカプト-1,2,4-トリアゾール(AHMT)と反応させて色素に化学変換し、疎水性の大きな有機陽イオンとのイオン会合体としてMFに捕集する。このMF上の色素の色差からホルムアルデヒドの濃度を簡便に測定できることを見出した。オンサイト分析を行うには測定装置を現場において使用できる必要がある。いろいろ工夫することによって小型・軽量の分光光度計も利用可能であったが,現場で吸光度を測定するにはセルに入れるためにMFを溶液にする必要があり,セルの共洗い・乾燥などの操作は煩雑である。その点,色彩色差計でMFの色を測定する方法は検量線がその測定原理の理由から湾曲するものの,高感度である,廃有機溶媒が出ない,測定が瞬時にできるなどといった利点が多いことがわかった。オンサイト(現場)で直ちに分析結果がわかる迅速な計測法として、色を数値で表示できる、小型軽量、可搬型の色彩色差計を用いる方法について基礎的な検討を行った。濃度と色彩色差計の数値の間の定量的な関係については、十分に解明されておらず不明な点も多いので、分光測色計を用いて反射率などを調べた。その結果、以下のことが明らかになった。1.目的成分を着色したイオンとし、これをイオン会合体として捕集する際の参考になる、基礎研究として、一価の陽イオンと陰イオンが1:1のイオン対を形成し、各種の溶媒に抽出されるときの平衡がある。この現象が、solvophobic thoryで説明できることを示した。2.水中の銅を還元した後、バソクプロインと反応させると橙色の錯イオンとなる。これを、水中の塩化物イオンとのイオン会合体として、ろ過によってメンブランフィルター(MF)上に捕集できる。このMFの色差を色彩色差計で測定すれば、濃度と色差の関係から検量線を作成できる。この定量法によってμg/Lレベルの銅を簡便に測定することが可能である。この方法は、有害な有機溶媒を使用しないので、環境に優しい分析法である。3.これまでの研究から、濃度と色差の数値の間に、ある数式で表される関係が成立することが明らかになっている。さらに、分光測色計によって分光反射率を測定すると、濃度変化に対応した分光グラフを描くことができた。4.N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline(EEDQ)を用いて、液相合成用樹脂(ポリスチレンにスペーサーを介してトリスアミノ基をもつ)に、8-キノリノールを固定した前濃縮用吸着剤を合成を試みたところ、十分に8-キノリノールを結合できることがわかった。

その点,色彩色差計でMFの色を測定する方法は検量線がその測定原理の理由から湾曲するものの,高感度である,廃有機溶媒が出ない,測定が瞬時にできるなどといった利点が多いことがわかった。固相抽出の固相にメンブランフィルター(MF)を利用する簡易分析法として、以下の定量法を開発した。1.陽イオン界面活性剤は、河川水中ではこれに比べ多量に存在する陰イオン界面活性剤の妨害を受けるため、また懸濁物質や底泥に吸着しやすいため、その定量は非常に困難であった。しかし、各種の固相抽出や対イオンを選択することによってこの問題点を克服し、河川水や底質中の陽イオン界面活性剤の定量法を開発した。2.一般的に陰イオン界面活性剤として大量に使用されているのは、スルホン酸基や硫酸基をもつタイプのものである。したがって、これらのものを選択的にMF上に捕集しその中に含まれる硫黄濃度を蛍光X線法で測定することによって合成洗剤の全濃度を測定できることを示した。3.シックハウス症候群の原因物質とされる、大気中のホルムアルデヒドを吸収液に吸わせた後、これを4-アミノ-3-ヒドラジノ-5-メルカプト-1,2,4-トリアゾール(AHMT)と反応させて色素に化学変換し、疎水性の大きな有機陽イオンとのイオン会合体としてMFに捕集する。このMF上の色素の色差からホルムアルデヒドの濃度を簡便に測定できることを見出した。さらに、オンサイト分析を行うには、測定装置を現場において使用できる必要がある。近年、自動車のバッテリー(直流)から交流に変換できるインバーターが市販されるようになり、これを利用して実験室用の小型分光光度計を使用できた。また、充電式バッテリー駆動の小型・軽量の分光光度計も利用可能であった。しかし、現場で吸光度を測定するには、セルに入れるためにMFを溶液にする必要があり、セルの共洗い・乾燥などの操作は煩雑である。その点、色彩色差計でMFの色を測定する方法は、検量線がその測定原理の理由から湾曲するものの、高感度である、廃有機溶媒が出ない、測定が瞬時にできるなどといった利点が多いことがわかった。
凝固直後の鋼材の緩冷却用のスプレ-ノズルの冷却能とその評価法

本研究グル-プは、これまでの二相流に関する基礎的な知識に基づき、二相流の流れ場を求めるためのアルゴリズムを構築した。すなわち、ガスと液滴粒子相からなる混相流のノズル内流れの流動特性を厳密に理解できる理論の構成、およびミスト・スプレ-冷却の操業条件に最適となるノズルの幾何学的形状の設計手順を実用化した。つぎに、二相流のノズルからの自由噴流領域の理論解析を行った。得られた数値結果においては単相流の場合の自由噴流と二相流の場合のそれを対比し、その結果を物理的に解釈するとともに二相流を構成する液滴径の相違が流れ場に及ぼす効度を詳細に研究した。さらに、ノズルから噴出する二相流が固体壁面と衝突するときの流動特性を理論解析した。この問題において、重要なことは粒子が固体壁面と衝突したときの粒子・壁面の接触の挙動の取り扱いである。本研究の主目的である連続鋳造工程の二次冷却帯に見られるように、凝固直後の1000°C以上の高温表面をもつ鋳片をスプレ-やミストで冷却するとき液滴が表面に接触すると同時に、液滴の衝突面に蒸気が生成され、不完全ながら弾性的な衝突を起こす。よって、平板に衝突した粒子は完全弾性的に跳ね返るものと仮定して、二相流が固体壁と衝突するときの数値解析を行った。最後に、ノズルから噴出するラミナ-水流が高温鋼板表面上に衝突すると同時に水膜が形成され、鋼板上を流れ水温が上昇し、膜沸騰が起こるまでのプロセスを理論解析し、数学モデル化した。噴霧による冷却特性はラミナ-冷却のそれとは異なるが、膜沸騰の発生機構はほぼ同様と考え、その詳細な研究は今後の課題として残している。以上述べたように、本研究の所期の目的はほぼ達成されたと考えているが、末解決のまま残された問題も多く、特に実験的な観点から今後ともこの研究を継続していくことが重要と考えている。本研究の目的を達成するためには3つの段階を経て解決される。1つはガス相と粒子相からなる2相流のノズル内流れの流動特性を厳密に把握することのできる理論を確立すること、およびノズル幾何学的形状の設計手順とその最適操業条件の設定を可能にすることである。2つ目の問題はノズルから流出する自由噴流領域での粒子相とガス相の流れ場の理論解析を可能にすることである。また、この2相ジェットが被冷却物体と相互作用するときの複雑な流動特性が解明されることが重要である。なぜなら、ミスト中に含まれる極微細な液滴粒子は気相への追従性が機敏であるため被冷却物体表面に到達せず、その面と平行な流れ場を形成して冷却効果に寄与しないケ-スが起こるからである。3つ目は、ミスト中の液滴粒子が高温の物体表面と衝突する際の伝熱現象の解析である。これは伝熱面過熱度と衝突液滴のウェ-バ数に依存して、冷却能量敵に評価する手順を確立する。本年度は、上記の最初の2つの段階の課題がほぼ完了しつつある。冷却の強弱に応じたノズルの幾何学的形状が唯一的に設計でき、その流動特性の理論的な把握も可能である。また、自由噴流領域での粒子相とガス相の流れ場および固体表面との相互作用による流動特性の変化が計算可能となっている。具体的には、2相流のノズル内流れは両相間の熱と運動量の伝達収支を考慮した非平衡流として取り扱われ、粒子径分布がある場合に対しても、理論解析への対応は可能である。

ノズルを出てからの両相の流動特性の解析では、粒子群の挙動は離散的な有限かつ多数の小粒子群の集合体として把握され、ガス相と熱、仕事および運動量の収支によって相互作用の効果が導入されている。また、固体表面との衝突のある複雑な流れ場の解析もなされている。本研究は2年計画のものであり,前年度に続き,平成2年度の研究成果を述べる。まず,ノズルから噴出する自由噴流の理論解析を行った。この解析結果によると,気体の流れ場や境界壁との干渉により粒子相は分解,集積,交差などの出現が容易に起こり,完全な連続体とせず,粒子相に離散性をもたせる必要を提案した。また,二相流の自由噴流の流れ場は実験的にも検討された。実験では,貯気槽に直接取り付けられた直径2mmのストレ-ト・ノズルから噴出するジェット軸に沿う粒子速度をレ-ザ・ドップラ-・アネモメ-タによって計測した。また,実験とほぼ同一の条件下で,流れ場の数値解析を行った結果,ジェット軸に沿う粒子速度の数値結果は計測した粒子速度と良好な一致を示した。写真撮影されたノズル出口から噴出する噴流の幾何学的模様は計算結果と非常によく合うことを確認した。つぎに,水平に流れる空気と水滴群からなる二相流の自由噴流が平板に衝突する時の二相流の流れ場の数値解析を行った。その結果,粒子径に依存して,流れ場の挙動が変化することを明らかにした。粒子径が非常に小さいと粒子群はガスの流れに非常によい追従性を示し,平板表面に達したときほぼその速度がゼロになるので、完全弾性反発を許容しても,上流へ跳ね返らず平板上を半径方向に移動するので,伝熱効果が強化される。粒子径が大きくなると,慣性効果のために衝突後の粒子は上流へかなりの距離跳ね返され,表面付近から遠ざかる粒子群が増大し,伝熱効果が低下することを示した。さらに,水ジェットの衝突と高温物体の表面付近の熱移動との相互作用が解析された。空気と水滴群からなる二相流の高温表面上の膜沸騰機構は水ジェットのそれと類似した挙動特性をもつことを示した。現在,その研究成果に基づいて,高温表面のスプレ-冷却機構の解析を行っている。近い将来,この熱解析結果をどこかの学会誌に投稿予定である。
重力崩壊現象とブラックホール時空の基礎研究

本研究の目的は、物質等が自己重力で重力崩壊した結果どのような時空が実現され、またその時空の性質を明らかにすることである。本年度は以前から試みていた、運動方程式が2階になる最も一般的な複数スカラー場+重力理論の構築を完成させた。そしてその理論でのブラックホール時空の基本的な性質、特に因果構造やショックの形成についての研究を行った。結果としては、因果構造は一般相対性理論のものとは大きく異なり、またショックも一般的に形成される事を明かにした。重力崩壊の終状態であるブラックホール時空の研究としては、高次元重力理論であるLovelock重力理論での厳密解を構成し、動的な性質の研究も行った。結果として、一般相対性理論では見られないような解の静的・動的な性質を明らかにし、かつ時空を特徴付ける量の定義も行った。重力崩壊の最終状態のもう一つの候補である裸の特異点に関する研究としては、5次元時空で形成される特異点の可視性についての研究も行った。結果としては、裸の特異点の形成されるパラメータ範囲・ブラックホールが形成されるパラメータ範囲、それぞれの特定に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、物質が自己重力で崩壊をした結果どのような時空が実現され、またその時空の性質を明らかにすることである。本年度の研究テーマは主に以下の2つある。1裸の特異点形成の安定性解析:重力崩壊の結果生じる時空としては主に、ブラックホール時空と裸の特異点を持つ時空の2つが考えられる。特異点とは時空の曲率が無限大に発散し、重力理論の困難が生じるところである。時空が高い対称性を持つ場合は、広い初期条件の下で裸の特異点が生じてしまうことが知られているが、対称性が低い場合に、特異点が安定に形成されるかに関してあまり知られていなかった。そこで本研究では、時空が球対称で自己相似的な、裸の特異点が生じる重力崩壊時空に摂動を加え、特異点が安定に形成されるかを調べた。結果として、特異点は安定に形成されることを明らかにした。さらにこの結果は時空の次元によらない、一般的な性質であることも明らかにした。2一般的な重力理論の構築:現在宇宙は、その初期にインフレーション期と呼ばれる指数関数的な膨張期を経験したと考えられている。現在までに様々なインフレーション機構が提唱・研究されてきた。近年、運動方程式が二階になる最も一般的な単一スカラー場の重力理論が、インフレーション理論を統一的に記述する理論として盛んに研究されている。また、この理論の枠組みの中でのブラックホール解の研究もすすんできている。そこで、本研究ではインフレーション理論やブラックホール解への応用を念頭に、さらに広い枠組みである、運動方程式が二階になる最も一般的な複数スカラー場を持つ重力理論の構築を試みた。結果として、最も一般的な2のスカラー場を持つ重力理論の運動方程式の導出に成功した。また、まだ未完成ではあるが部分的に系を記述するラグランジアンの構成にも成功している。昨年度は最も一般的な複数スカラー場+重力理論の完成を目指すとともに、その理論の範疇でブラックホール時空の基本的な性質であるブラックホールの時空の無毛定理・唯一性定理が成立する条件や、その定理の適応範囲外での厳密解構成を主に行った。最も一般的な重力理論に関しては、宇宙初期に起きたとされるインフレーション期を実現するモデルのほとんどが幾つかのスカラー場を含んでいるが、これらを統一的に扱うモデルを構築し理解を得ることが一つの目的であった。これまでにいくつかの理論が最も一般的な理論として提唱されたがことごとく失敗しているが、本研究で二つのスカラー場を含む最も一般的な重力理論の構築に成功した。さらにその理論の部分系でのブラックホール時空の基本的性質である、ブラックホールの唯一性定理・無毛定理の研究も行った。結果として重力場のエネルギーが定義できる部分系においては、時空が動的でなければ無毛定理・唯一性定理が成立することを明らかにした。さらにその反例として、定理の適応できない系に関して厳密解が構成できることを示した。

インフレーションモデルを統一的に記述する理論として、スカラー場を含む最も一般的な重力理論の構成を目指していたが、今年度2つのスカラー場を持つ場合に関してはその構成に成功した。この理論は非常に幅広い応用を含んでおり、本研究は成功したといえる。さらに一つの応用例として、本理論の部分系である理論でのブラックホール時空の基本的性質の研究も行った。この研究は、この理論の理解を得る上で有意義で研究はおおむね順調に進展していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は昨年度までに構成したスカラー場+重力理論の更なる理解を得る事を目指す。それに加えて、重力崩壊現象における特異点形成を数学的手法を用いて明らかにする事を目指す。最も一般的な二階の複数スカラー場+重力理論に関しては、技術的な観点から2個のスカラー場の拡張にとどまっているが、様々な応用の観点から任意個のスカラー場の理論への拡張可能性を吟味する。また理論をブラックホール時空と宇宙論へ応用し理論のさらなる理解を得る。ブラックホール時空に関しては、通常のアインシュタイン重力理論と比べて時空を歪めるか、歪めるならどのように歪めるかを中心に研究する。宇宙論に関しては様々のインフレーション理論を統一的に扱うモデルとして、種々の物理量を計算するテンプレートの提供を行いたい。重力崩壊現象における特異点形成に関しては、高次元時空での重力崩壊で形成された特異点が無限遠方の観測者から見えるかについて議論したい。特異点が観測できる場合、その理論の破綻を意味するためこの点を明らかにすることは理論の妥当性を保証する上で非常に有意義である。この研究に関しては数学的曖昧さなく、厳密な証明を与えることを目指す。特異点の形成の安定性に関しては、次元によらず安定という結果をだした。また、スカラー場を含む最も一般的な重力理論に関しては、ラグランジアンに関しては現在模索中であるが、運動方程式までは導出を完了している。このように着実に結果がでてきている点から、おおむね順調に進展していると評価できる。今後は、最も一般的なスカラー場を含む重力理論を完成させることと、その理論に含まれるブラックホール解等の理論の性質の精査をすることを目標とする。それと同時に、現在盛んに議論されている負の宇宙項を持つ時空でのブラックホールの性質、特に熱力学的性質と時空の不安定性などの動的性質との関係性に着目して研究を進めていく。
過疎地からの集落移転に関する基礎的研究

過疎集落の維持と荒廃の「分水嶺」を求めた。既往の文献から一応の「分水嶺」を明らかにした。さらに、将来の推計が可能であることを明らかにした。ただし、調査を進めるうちに、分水嶺は単純ではなく、四段階(農業共同体機能、生活共同体機能、生活基盤、リーダーの存在)で構成されるという仮説に至った。「分水嶺」を超えた集落に対して、集落移転が有力な候補であることがわかった。(1)過疎地集落の維持と荒廃の分水嶺についての文献調査を行った。五つの文献を取り上げて,それぞれの問題点を検討した結果,維持の条件として,戸数5戸以上(橋詰氏の文献より)が有力と考えた。(2)集落単位の人口推計について検討を行い(コーホート変化率法における仮定値など),それが可能だということを明らかにした。(3)過疎地集落の状況と現在の対策について,農水省,兵庫県,兵庫県養父市の担当者から話を聞いた。過疎地の状況は深刻だが,現時点において,いずれも集落移転には消極的だということがわかった。(4)兵庫県養父市の過疎集落について現地視察を行った。がけ崩れや家屋の状況などを確認した。(5)集落移転以外の過疎地対策として,二地域居住と定年帰農を取り上げ,それらが「つなぎ」にしかならないことを明らかにした。前者は長くても,50年程度しか持続せず,後者には高齢化が早まるという副作用がある(京都府)。(6)集落の移転先について,京都府北端部の北近畿タンゴ鉄道沿線を事例として,現地踏査などを行い,(移転に)適した場所が五つ存在することを明らかにした。(7)これまでの集落移転事業の効果と問題点について明らかにした。(8)集落移転以外の過疎地対策として,都市住民のボランティアによる維持を取り上げ,その効果が限定的なものということを明らかにした。(9)行政(財政)へのメリットとして,道路縮退による維持費軽減効果を取り上げ,京都府旧M町を事例に(金額の)試算を行った。(10)過疎地の医療について調べて,その状況の深刻さを明らかにした。(1)過疎集落の維持と荒廃の分水嶺を探るために、石川県輪島市旧門前町において、限界集落の調査を行った。その結果、病院への移動手段の喪失(自動車が利用不能になる)が、離村の決定的な要因である可能性が高いことを明らかにした。また、道路などの管理が集落の力に応じて縮小していることを明らかにした。農業の個人化が進んでいることがわかった。さらに、既往の研究では戸数を重視しているが、戸数だけで集落の力を測定することはできないことがわかった。集落の力は、戸数ではなく、人数、しかも元気な人の人数で測定すべきである.(2)鹿児島県阿久根市において、集落移転の成功事例を調べた.集落移転が住民には好評であることを明らかにした。また、集落移転を実施するためには、強力なリーダーが必要である可能性が高いことがわかった.(3)兵庫県養父市において、無人化集落の調査を行った.無人化後に集落とは、あまり関係がないと思われる施設ができていることがわかった。集落の特徴や伝統が生かきれているわけではない。(4)滋賀県多賀町で無人化集落の調査を行った。家屋が非常に荒廃していることがわかった。また、養父市同様、趣味的な家屋ができていた。これらと文献調査の結果などから、分水嶺が四つ存在するという仮説を立てた。農業集落としての分水嶺、集落としての分水嶺、生活基盤の分水嶺、さらに、集落改善の分水嶺(強力なリーダーの有無)の四つである。ただし、現時点でこれらをセンサスなどの既存のデータにつなげることには至っていない。
甲殻類尿中の成熟脱皮関連バイオマーカーの普遍性を探る

本研究はブルークラブの尿中で脱皮前に高濃度となる脱皮前バイオマーカー且つフェロモン候補物質であるNAGLが、他の甲殻類(十脚目)でも尿中脱皮前バイオマーカーであるのかどうかを検証した。同じカニ類であり、ブルークラブ同様にメスの脱皮後に交尾を行うクリガニのメスの尿を調べた結果、NAGLは尿中に存在し脱皮前に濃度が最大となった。一方、脱皮と関係なく交尾を行うイセエビの尿中にはNAGLは検出されなかった。また、NAGLをモデル化合物として超高極性のフェロモンを精製するための方法の構築も行った。本研究の結果は脱皮の予測とフェロモンを用いた交尾行動の制御法の開発の基礎となるものである。26年度は北海道で申請者らが自ら捕獲、実験が可能なクリガニの尿中にNAGLが含まれるかどうかを検証した。延べ370個体の脱皮前後のメスのクリガニを用い、脱皮前17日目から脱皮後12日までの個体から尿を採集し、1次元NMRにより、それぞれの試料中のNAGLの濃度を測定したところ、クリガニの尿中にもNAGLが含まれることが明らかとなった。NAGLの濃度は脱皮前一週間以内で最大となり、脱皮後、徐々に減衰し、脱皮から遠い個体では検出限界以下となった。一方、採集可能な尿量は脱皮前一週間以内で最低となり、脱皮後増加した。この濃度と尿量のデータをもとに、メスが尿中に放出しているNAGLの量を算出したところ、放出総量が最大になるのは脱皮後一週間以内であることが明らかとなった。また、脱皮から遠い個体から採集された尿にはNAGLが含まれていなかった。これらの成果はブルークラブ以外の甲殻類の尿中でもNAGLが脱皮前バイオマーカーとして存在することを初めて示す意義のあるものであり、種を超えた普遍性を示唆するものである。クリガニもブルークラブと同様に成熟メスの脱皮の前にオスがメスを抱える交尾前ガードを行い、脱皮直後に交尾を行う種であり、脱皮前後のメスの尿がオスの抱きつき行動をひきおこすことが明らかとなっている。これらのことから、クリガニのメス尿中の性フェロモンの構成成分の一つとして、NAGLが含まれると推測され、本種のフェロモン研究上も重要な結果である。27年度は昨年の尿のデータを再解析し、クリガニ尿中に含まれるNAGL濃度を明らかにした。NAGLのクリガニ尿中の濃度は脱皮直前で最大となり、20μMであった、これはブルークラブで計測された最大濃度の約75%であり、同等である。この結果はクリガニとブルークラブが脱皮前に同じようにNAGLの濃度を上昇させていることを明らかにした。この結果はWoods Hole海洋研究所か発行する国際誌Biological Bulletinに発表した。次に、NAGLがクリガニの血中にどの程度の濃度で含まれるのかを、NMRを用いて調べたところ、全く検出されなかった。このことから、NAGLは血中から選択的に尿中に濃縮されて放出されるか、または膀胱や尿道に開口する分泌腺から分泌されると考えられる。よって、NAGLはいずれにせよ尿中に漏れ出てくるのではなく、積極的に放出されており、NAGLがフェロモンの構成成分であるという仮説を支持する。昨年度ブルークラブに加えクリガニの尿中でもNAGLが脱皮前バイオマーカーとして存在していることを確認し、NAGLが甲殻類で普遍的な脱皮前バイオマーカーとして存在する可能性を示した。今年度はこの濃度を明らかにし、主目的を達成した。今年度は、さらにクリガニ血中にはNAGLが存在しないことを明らかにし、NAGLは積極的に尿中に放出されてるいることを示した。現在までカニ類のみを対象に脱皮前後の尿中のNAGL濃度の検証を行ってきたので、その他の甲殻類の代表として水産学上の重要種であるイセエビの脱皮前後の尿中のNAGLの濃度の測定を行った結果、検出されなかった。この結果から考えられる一つの仮説は、NAGLがカニ類の脱皮前後の尿中にのみ高濃度で存在することである。このことはNAGLがフェロモン成分である可能性を支持するものであるが、しかしながら、脱皮直前と考えられる個体からは尿が採集しにくかったため、今後、試料の数を増やすなどして慎重に再確認を行う必要がある。NAGLの他の組織中での濃度はNMR法の感度の問題もあり、達成できなかった。今後LCーMSを用いた高感度測定法の開発し、各組織中の濃度を測定する必要がある。また、NAGLグラファイトカーボンカラムにフェロモン活性の一部が保持されていることを行動実験で確認した。グラファイトカーボンでの保持、溶出条件の検討は逆相カラムに保持されないNAGLをモデル化合物として行ったが、その過程でNAGLがクロマトグラム上で互変異体の混合物として存在することが示唆された。そこで、NAGLの尿中での存在状態の検証を行った。各種水溶液中のNAGL標準試料と尿中のNAGLに相当する天然物の存在状態を核磁気共鳴装置と質量分析器で検証した結果、尿中ではNAGLのラクトン環が加水分解されて開環し、カルボン酸の状態で存在することが示唆された。この知見は、受容体タンパク質とNAGLの結合状態を考察する上で重要である。本研究はブルークラブの尿中で脱皮前に

高濃度となる脱皮前バイオマーカー且つフェロモン候補物質であるNAGLが、他の甲殻類(十脚目)でも尿中脱皮前バイオマーカーであるのかどうかを検証した。同じカニ類であり、ブルークラブ同様にメスの脱皮後に交尾を行うクリガニのメスの尿を調べた結果、NAGLは尿中に存在し脱皮前に濃度が最大となった。一方、脱皮と関係なく交尾を行うイセエビの尿中にはNAGLは検出されなかった。また、NAGLをモデル化合物として超高極性のフェロモンを精製するための方法の構築も行った。本研究の結果は脱皮の予測とフェロモンを用いた交尾行動の制御法の開発の基礎となるものである。クリガニの尿中でもNAGLが脱皮前バイオマーカーとして存在していることを確認した。この発見は、ブルークラブ以外の甲殻類でこのことを確認する初めての例であり、NAGLがカニ類で普遍的な脱皮前バイオマーカーとして存在する可能性を支持する。以上、本研究課題の主目的を達成した。今後は他の種と化合物について検証を進める。今後も計画に沿って進めていく。イセエビ、ケガニ、オオバウチワエビの脱皮前の尿を採取しNAGLの存在の検証を進めるとともに、ブルークラブ尿中の未同定成熟メス特異的分子の同定を行う。また、各バイオマーカーの産生器官を特定するために触角腺、皮膚組織、脱皮液などの試料を採取しバイオマーカーの定量を行う。最後にバイオマーカーにフェロモン活性があるかどうかを行動試験で検証する。これと並行して、グラファイトカーボンを用いたクリガニ脱皮前メスの尿の分画を行い、その分画のNMRによる分析と行動実験によるフェロモン活性の試験を行う。水圏生命科学今後も計画に沿って進めていく。イセエビ、ケガニ、オオバウチワエビの脱皮前の尿を採取しNAGLの存在の検証をを進めるとともに、ブルークラブ尿中の未同定成熟メス特異的分子の同定を行う。在庫のあった試薬等を使用して研究を進めたために次年度使用額が生じた。次年度使用額を利用して、遠隔地への訪問回数を増やすなどして効率的に研究を進める。
縮小拡大管内混相流の流動構造と微粒化機構の解明

本研究の目的は縮小拡大管を微粒化装置として確立することにある。縮小拡大管内に気液二相流や気相単相流を流すことで、その特異な流路形状により著しいせん断流動場や超音速流動場が生じる。目指すものは、このような流動場により引き起こされる力を用いて気・液・固体を粉砕し微粒化する装置の実用化である。その実現のため、相変化を加味した縮小拡大管内の混相流動場に働く静的および動的な力の変動を定量的に解明する。本装置の確立は、単純な管路で自在に用途に応じた微小気泡、微細粒子、微小液滴の生成が可能となり、環境問題を見据えた利活用において世界規模でのグリーンイノベーションに貢献することができる。
ヒト人工染色体保有マウスを用いたダウン症原因遺伝子の解明

本研究においては、申請者等が10数年来磨き抜いたヒト21番染色体の遺伝子地図と細菌人工染色体(BAC)クローンを基盤とし、近年開発されたヒト人工染色体(HAC : Human Artificial Chromosome)ベクターを駆使して、新規ダウン症モデルマウスの作製を試みた。本研究においては、申請者等が10数年来磨き抜いた21番染色体の遺伝子地図と染色体をカバーする細菌人工染色体(BAC)クローンを基盤とし、近年開発されたヒト人工染色体(HAC)ベクターを駆使して、新規ダウン症モデルマウスを作製することを試みた。1.ヒト21_q22.3領域と相同なマウスBACクローンの選定工藤等はヒト21番染色体に相当するマウス17番、10番染色体領域の候補遺伝子(Cbs、Cryaa等)を丸ごと含む様に22クローンのマウスBACクローンを選択し、BACのDNAを精製し、ゲノムシーケンスと比較して、欠失・挿入の有無等を精査してから、研究分担者の池野に送った。2.HACの作製池野等は、独自に開発したHAC基本ベクターの特異的挿入部位に任意のBACを部位特異的組換えを利用して導入するシステムを用いてBACクローンを含むHACを保有するマウスES細胞を作製した。すなわちRed/ET相同組み換えを利用して、大腸菌内のBACベクターに10x66組換え部位配列を組み入れた後、BACのDNAを精製し、マウスES細胞TT2F(B6/CBA1)に保持させたHAC基本ベクターの10x71組換え部位配列にCre/lox配列特異的組換えを利用して導入した。3.HAC保有マウスの作製堺等は常法に従い、このHACを保有するマウスES細胞を8細胞期のマウス胚と融合させてキメラマウスの作出を試みている。今後、純系マウスとの戻し交配を行い、HAC保有マウス株として確立する予定である。本研究においては、申請者等が10数年来磨き抜いたヒト21番染色体の遺伝子地図と、近年開発されたヒト人工染色体(HAC)ベクターを駆使して、新規ダウン症モデルマウスを作製することを試みた。1.ヒト21番染色と相同なマス16番染色由来BACクローンの選定工藤等は候補遺伝子の全長を含むBACクローンをデータベースの情報から選択し、BACのDNAを精製し、ゲノムシーケンスと比較して、欠失・挿入の有無等を精査してから、研究分担者の池野に渡した。2.ヒト人工染色体(HAC)の作製池野は、独自に開発したHAC基本ベクターの特異的挿入部位に任意のBACを部位特異的組換えを利用して導入するシステムを用いてBACクローンを含むHACを保有するマウスES細胞を作製した。すなわちRed/ET相同組み換えを利用して、大腸菌内のBACベクターにlox66組換え部位配列を組み入れた後、BACのDNAを精製し、マウスES細胞TT2F (B6/CBA1)に保持させたHAC基本ベクターのlox71組換え部位配列にCre/lox配列特異的組換えを利用して導入した。3.HAC保有マウスの作製堺等は常法に従い、このHACを保有するマウスES細胞を8細胞期のマウス胚と融合させてキメラマウスの作製を試みた。また、作出したHAC保有マウスは純系マウスとの戻し交配を行った。4.HAC顕微注入法の開発池野・堺等はHACをショ糖密度勾配遠心法等を用いて通常の染色体と分画し、マウス受精卵の前核への顕微注入を試みたが、精製度が足りず、まだ個体の作出には成功していない。本研究においては、申請者等が10数年来磨きあげたヒト21番染色体の遺伝子地図と、近年開発されたヒト人工染色体(HAC)ベクターを駆使して、新規ダウン症モデルマウスを作製することを試みた。1.ヒト人工染色体(HAC)の作製池野は、独自に開発したHAC基本ベクターの特異的挿入部位に任意のBACを部位特異的組換えを利用して導入するシステムを用いてヒト21番染色体と相同なマウス染色体の遺伝子を含むBACクローンを導入したHACを保有するマウスES細胞を作製した。すなわちRed/ET相同組み換えを利用して、大腸菌内のBACベクターにlox66組換え部位配列を組み入れた後、BACのDNAを精製し、マウスES細胞TT2F(B6/CBA1)に保持させたHAC基本ベクターのlox71組換え部位配列にCre/lox配列特異的組換えを利用して導入した。さらに得られたHACに欠失等がないかどうか、マウスEC細胞の染色体の核型に異常がないかどうかを精査した。2.HAC保有マウスの作製堺・工藤は、池野が作製したHACを保有するマウスES細胞を培養し、マウス受精卵から調製した8細胞期のマウス胚と融合させて、キメラマウスを作製した。また、作出したHAC保有マウスは純系マウスとの戻し交配を行いつつ維持を行った。3.HAC保有マウスの表現型の解析
クロマチン修飾によるリンパ球抗原受容体遺伝子座の組換え制御

本研究の目的は、胸腺T細胞がプレTCRからの刺激を受けた後にIL-7Rの発現が低下する分子機構を解明することにある。リンパ系前駆細胞の生成過程におけるIL-7Rの機能を明らかにするために、IL-7R遺伝子の発現制御機構を解析した。まず、胸腺におけるIL-7Rの発現を解析すると、CD4(-) CD8(-) DN分画とSP分画で発現していたが、DP分画ではまったく発現が見られなかった。次に、各分画のIL-7Rα鎖mRNAを解析したところ、DP分画で顕著に低下していた。以上の結果から、IL-7Rの発現が転写レベルで制御されることが明らかとなった。次に、マウスIL-7Rα鎖遺伝子のプロモーター領域を解析した。まず、転写が翻訳開始点の上流51bpと126bpの2カ所から開始することを確認した。マウスとヒトを比較すると、転写開始点の上流200bpの領域が高度に保存されており、Ikaros、PU.1、Runxの結合モチーフが存在した。また、マウスにはグルココルチコイド受容体(GR)の結合モチーフも存在した。次に、これらの領域をプロB細胞株38B9に導入し、レポーター法により解析すると、特異的な転写活性化能が検出された。この時、PU.1モチーフを破壊すると10%、GRモチーフを破壊すると44%減少し、両者を変異すると活性が完全に失われた。さらに、ゲルシフト法にて、38B9細胞の核抽出物の中にGRモチーフに結合する活性が検出され、この活性は抗GR抗体により消失した。一方、プロT細胞株KKFでは、グルココルチコイド処理によりIL-7Rの発現が増強した。リンパ球抗原受容体遺伝子は分化段階特異的にV(D)J組換えをおこすが、これはクロマチンの開閉状態により制御されている。我々は、インターロイキン7レセプターにより活性化されたStat5が、TCRγ遺伝子座に転写共役因子をリクルートし、ヒストンのアセチル化により転写とDNA組換えを誘導することを示した。最近、ヒストンH3Lys9のメチル化が種々の遺伝子座のサイレンシングを誘導することが報告されているので、TCRγ遺伝子座が閉じた状態とヒストンのメチル化との関連について解析した。BaF3/pim-1細胞ではIL-3刺激によりTCRγ遺伝子座においてヒストンのアセチル化が誘導される。この実験系を用いて、サイトカイン刺激後のTCRγ遺伝子座全域のヒストン修飾の経時的な変化を、抗アセチル化ヒストンH3Lys9抗体と抗メチル化ヒストンH3Lys9抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法にて解析した。その結果、サイトカイン非刺激の状態でJγ遺伝子やエンハンサー領域が高レベルでメチル化されていたが、刺激後数日間でそのメチル化レベルが徐々に低下し、代わりにアセチル化レベルが上昇した。この時、Jγ領域のgermline転写の誘導をノザン法で、クロマチンの開閉状態を制限酵素accessibility法にて解析すると、サイトカイン刺激後数日間をかけて転写とaccessibilityが除々に上昇した。一方、Cγ遺伝子においては、ヒストン修飾のこのような変化は見られなかった。以上の結果から、TCRγ遺伝子座におけるヒストンH3Lys9の修飾は調節領域に特異的に誘導され、クロマチンの閉じた状態とヒストンのメチル化が良く相関するごとが示された。

最近、ヒストンH3Lys9のメチル化が種々の遺伝子座のサイレンシングを誘導することが報告されているので、TCRγ遺伝子座が閉じた状態とヒストンのメチル化との関連について解析した。BaF3/pim-1細胞ではIL-3刺激によりTCRγ遺伝子座においてヒストンのアセチル化が誘導される。この実験系を用いて、サイトカイン刺激後のTCRγ遺伝子座全域のヒストン修飾の経時的な変化を、抗アセチル化ヒストンH3Lys9抗体と抗メチル化ヒストンH3Lys9抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法にて解析した。その結果、サイトカイン非刺激の状態でJγgermlineプロモーター、エンハンサー領域、HsA領域(V領域の中に存在する調節領域)が高レベルでメチル化されていたが、刺激後数日間でそのメチル化レベルが徐々に低下し、代わりにアセチル化レベルが上昇した。この時、Jγ領域のgermline転写の誘導をノザン法で、クロマチンの開閉状態を制限酵素accessibility法にて解析すると、サイトカイン刺激後数日間をかけて転写とaccessibilityが除々に上昇した。一方、Cγ遺伝子においては、ヒストン修飾のこのような変化は見られなかった。以上の結果から、TCRγ遺伝子座におけるヒストンH3Lys9の修飾は調節領域に特異的に誘導され、クロマチンの閉じた状態とヒストンH3Lys9のメチル化が良く相関することが示された。一方、ヒストンH3Lys9のアセチル化とクロマチンの開いた状態が良く相関することが示された。
消化管がんの末梢循環腫瘍細胞を用いた精密医療

【研究目的】消化管がんの個別化医療の確立を目的に消化管がんの末梢循環腫瘍細胞(circulating tumor cells, CTCs)の生物学的特性を理解し、有用な病態診断法を開発する。【研究目標】I.胃がんCTCsを用いたゲノム解析をはじめとしたオミクス解析技術を創出し、免疫チェックポイント阻害薬に対する精密医療を確立する。II.消化管がんCTCsを用いた細胞培養技術を創出する。
高度好塩菌の膜インターフェースにおける物質輸送の分子論的義盤

平成18年度は光イオンポンプの光化学サイクルを測定するための時間分解分光測定の調整などを行い,レーザーパルスの後2μ秒からのデータの取得が可能になった(以前は10μ秒).一方,海洋細菌が産出するレチナールタンパクでプロトンポンプを行うプロテオロドプシン(PR)の発現系を,北海道大学薬学部の加茂直樹博士から恵与していただき,これをもとにPCR法で210E, N220E変異体を作成した.これらの残基はバクテリオロドプシン(bR)のプロトン放出団(E194,E204)に対応するが,この変異導入によって蛋白内部の水環境の変化がおこり,シッフ塩基からプロトンをうけとるD97のpKaにも影響が出る可能性を期待している.大腸菌での発現は順調に成功し,現在,光化学サイクルとプロトンの出入りを測定するための準備を行っている.また昨年度,野生型のpRでpH3でも中性付近の約10%の起電性を持つことを我々の電気測定系で検出して,PRではD97と別のプロトン受容基が酸性領域で働いている可能性を指摘していたが,本年度は加茂博士から恵与していただいたD97N変異体の起電性についても検討した.その結果,中性からpH5付近でも起電性が確認された.我々の測定系では蛋白内部での電荷移動と膜の表から裏への正味の輸送の区別が付かないという難点があるが,シッフ塩基から最初にプロトンを受け取る役目をするD97の変異でも起電性が出ていると言うことは,プロトンの経路について何か他の残基が関与している可能性を強く示唆する.また,東京大学分子細胞研究所の杉田博士(現理研)の多大なる協力を得て,分子動力学計算のシステムを立ち上げた.現在比較的小さな蛋白質であるATP合成酵素のεサブユニットについてその構造変化を探るための計算を行っている.平成17年度の研究計画では高度好塩菌の光イオンポンプの光化学サイクルを測定するための時間分解分光測定と遺伝子操作系の立ち上げとを目指すことになっていた.本年度の進捗状況としては,まず東京工業大学生命理工学科の大谷弘之博士の懇切丁寧なご指導のもとに測定用光学系がほぼ完成し,今後は信号出力を高速ADコンバーターを装備したPCに導いて記録し,光路や電気系の調整に取りかかる予定である.遺伝子操作系に関しては残念ながら進捗していない.一方で北海道大学薬学部の加茂直樹博士との共同研究でプロテオロドプシン(PR)についての研究を開始した.PRは海洋細菌が産出するレチナールタンパクで,高度好塩菌のレチナール蛋白とよく似た位置づけにある.加茂博士との共同研究に用いているPRは大腸菌で発現したものであり,高度好塩菌のバクテリオロドプシン(bR)と同じくプロトンを輸送するが,その機構を考える上で非常に興味深い特徴がある.それはPRもbRに対応してシッフ塩基の対イオンとしてプロトンを受け取る役目をするアスパラギン酸を持つが,このpKaが7.6から7.1付近にあり,酸性条件下ではプロトン化してプロトン受容基として働かない可能性が強いと言うことである.この点についてドイツのグループ,アメリカのグループ加茂博士の研究室で得られた結果の結果が食い違っている.現在,我々の研究室の電気測定系で得られている結果は加茂博士の研究室で得られているものに近く,pH3でも中性付近の約10%の起電性を示している.もしこの結果が本当であればPRでは別のプロトン受容基が酸性領域で働いている可能性があり,非常に興味深いものとなる.今後,時間分解能の高い電圧測定を行い,現在構築している時間分解分光測定系と併せて詳細な知見を得る予定である.平成18年度は光イオンポンプの光化学サイクルを測定するための時間分解分光測定の調整などを行い,レーザーパルスの後2μ秒からのデータの取得が可能になった(以前は10μ秒).一方,海洋細菌が産出するレチナールタンパクでプロトンポンプを行うプロテオロドプシン(PR)の発現系を,北海道大学薬学部の加茂直樹博士から恵与していただき,これをもとにPCR法で210E, N220E変異体を作成した.これらの残基はバクテリオロドプシン(bR)のプロトン放出団(E194,E204)に対応するが,この変異導入によって蛋白内部の水環境の変化がおこり,シッフ塩基からプロトンをうけとるD97のpKaにも影響が出る可能性を期待している.大腸菌での発現は順調に成功し,現在,光化学サイクルとプロトンの出入りを測定するための準備を行っている.また昨年度,野生型のpRでpH3でも中性付近の約10%の起電性を持つことを我々の電気測定系で検出して,PRではD97と別のプロトン受容基が酸性領域で働いている可能性を指摘していたが,本年度は加茂博士から恵与していただいたD97N変異体の起電性についても検討した.その結果,中性からpH5付近でも起電性が確認された.我々の測定系では蛋白内部での電荷移動と膜の表から裏への正味の輸送の区別が付かないという難点があるが,シッフ塩基から最初にプロトンを受け取る役目をするD97の変異でも起電性が出ていると言うことは,プロトンの経路について何か他の残基が関与している可能性を強く示唆する.また,東京大学分子細胞研究所の杉田博士(現理研)の多大なる協力を得て,分子動力学計算のシステムを立ち上げた.現在比較的小さな蛋白質であるATP合成酵素のεサブユニットについてその構造変化を探るための計算を行っている.
白血病細胞の分化と病型に特徴的なユビキチン化蛋白質の解析

本年度の成果は以下の3点である。1.マルチユビキチン化蛋白質の生成速度の解析白血病細胞の分化が細胞内蛋白質のユビキチン化に与える影響を解析するため、対数増殖期および酪酸等で分化したK562細胞におけるマルチユビキチン鎖生成速度を求めた。その際、プロテアソーム阻害剤でマルチユビキチン化蛋白質の分解を抑え、その濃度の経時的変化を特異的ELISAで追跡した。結果、分化に伴い『細胞質の水溶性蛋白質』に対する同速度は有意に増加し、『細胞質と核の難溶性蛋白質』に対する同速度は激減した。また、対数増殖期の場合、後者の速度は熱ショックによって増加するが、分化に伴いこの性質も消失した。以上の結果から、ユビキチン化される主要な蛋白質群が分化と共に大きく変わると推定される。今後、分化や増殖に特徴的なマルチユビキチン化蛋白質を精製し、標的蛋白質を同定することで、その生物学的意義を明確にする。2.マルチユビキチン化蛋白質の精製の検討結合型ユビキチンに特異的なモノクローナル抗体FK2をアガロースゲルに導入しアフィニティーカラムを作成した。K562細胞抽出液(>10mg protein)のマルチユビキチン化蛋白質は、同カラム(1ml)にほぼ完全に吸着し、大半の夾雑蛋白質から分離された。また、これを3.5 M MgCl_2で溶出した画分には、常に元の40-50%のマルチユビキチン鎖が回収された。今後、精製標品から標的蛋白質を含む断片を得るための条件設定を進める。急性骨髄性白血病の患者細胞とOCI/AML-la細胞の核分画から、9kDaと13kDaのユビキチン抗体陽性蛋白質を見出した。他の株化白血病細胞(HL-60、K562等)における両蛋白質の量は極めて少なかった。大量のOCI/AML-la細胞から抽出・精製を進める計画である。