hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＭｉＲー２２４：肝癌を標的とした新たながん克服医療への展開

本研究では、miR-224を標的とした、新たな肝癌分子標的薬の開発および新しいバイオマーカーへの応用展開を目指した。肝がん患者において血中mir-224のレベルを検討したところ、miR-224は肝癌転移の診断マーカーとしての展開可能性は低いと考えられた。ヒト肝癌細胞株のマウス皮下移植モデルを用いてantagomir-224の抗腫瘍効果を検討したところ、in vitroでantagomir-224を導入した肝癌細胞の腫瘍形成能が低下すること、また、in vivoにおいてはantagomir-224がモデル腫瘍に対して成長阻害効果があることが示された。当初の本研究計画では、主に、miR-224を標的とした分子標的肝癌治療薬の開発、およびmiR-224の肝癌転移におけるバイオマーカーへの応用を目指していた。昨年度、転移のある肝癌患者と転移のない患者において血中mir-224のレベルを比較したところ、血中miR-224はどちらとも極めて低いレベルであり、肝癌転移の診断マーカーとしての展開可能性は低いと考えられた。その結果を受けて、本年度は、miR-224を標的とした分子標的肝癌治療薬の開発を重点的に検討した。癌浸潤転移モデルを作製するために、miR-224を高発現するヒト肝癌細胞株HLFをヌードマウスの皮下あるいは腹腔内に接種し、マウスモデルの作製を試みた。まだ進行中であるが、HLF肝癌細胞の転移性の不確定性が示唆されたため、今後マウスの皮下腫瘍モデルを用いてantagomir-224の癌浸潤抑制効果を評価する。さらに、miR-224の肝細胞癌の浸潤抑制のメカニズムを解析したことにより、HGF/c-MET経路がmiR-224の機能維持に深く関連することが判明した。今後、そのシグナル伝達系である一つの分子標的を阻害し、さらにmiR-224の癌浸潤抑制効果を促進させることを検討する。肝癌の発症、進展におけるmicroRNAの果たす役割は明らかにされつつあるが、その成果を臨床に応用するためのトランスレーショナル研究はまだ少数に過ぎない。我々はこれまでに、mir-224が肝細胞癌の浸潤及び転移に重要な役割を果たしていることを見出した。本研究では、miR-224の診断マーカー及び分子標的としての核酸新薬候補を創出することによる、肝癌転移の新たな診断・治療の開発基盤の確立を目指す。本年度は、これまでの研究において遺伝子解析に関する同意を得られた本院受診歴のある肝癌患者から、転移がある者とない者それぞれ25人ずつの血漿を採取した。Real-time TaqMan法を用いて血中miR-224を定量測定したところ、両群共に血中において極めて低いレベルであることが明らかになった。この結果より、血中miR-224が肝癌転移の診断マーカーとなる可能性は低いと考えられた。一方で、antagomir-224の癌転移抑制効果を評価するためのマウス癌浸潤転移モデルの作製条件を検討したところ、計画内で我々が樹立したmiR-224を恒常的に高発現する肝癌細胞株Huh7-GFP-R224の使用が、細胞増殖速度などの要因でHLF肝癌細胞株の利用に変更された。In vitro実験の結果、HLF細胞株を用いたantagomir-224が癌転移プロセスに影響を及ぼすことが確認された。また、HLF細胞株を用いた最適なantagomir-224を検討したところ、mirVana miR-224 inhibitorがanti-mir-224より、細胞のmiR-224のサイレンシング及び細胞浸潤能に及ぼす影響が有意に大きいことが明らかになった。今後、さらにもう一種類のantagomir-224を候補として検討し、その結果から効率的かつ安定的なantagomir-224を決定する。これまでに我々はmiR-224が肝癌細胞株に異常発現すること、また肝癌細胞の浸潤能を顕著に亢進させることを明らかにしてきた。昨年度までに、転移のある肝癌患者と転移のない患者において、血中mir-224のレベルを比較検討したところ、miR-224は肝癌転移の診断マーカーとしての展開可能性は低いと考えられた。最終年度である本年度は、miR-224を標的とした分子標的肝癌治療薬の開発可能性を検討するために、ヒト肝癌細胞株HLFのマウス皮下移植モデルを用いてantagomir-224の抗腫瘍効果を評価した。その結果、in vitroでantagomir-224を導入したヒト肝癌細胞の腫瘍形成能が低下していることが明らかとなった。

また、予めヒト肝癌細胞の皮下移植により腫瘍を形成させたヌードマウスにantagomir-224を皮下投与したところ、antagomir-224がin vivoにおいて腫瘍の転移に対する影響は観察されなかったが、一方でモデル腫瘍に対する成長阻害効果は認められた。さらに、免疫染色を行った結果、antagomir-224は腫瘍血管新生を阻害することが示された。従って、antagomir-224が新たな肝癌分子標的薬として有力な候補であることを示唆している。肝臓学1)計画通りに、転移のある肝癌患者と転移のない患者において血中mir-224のレベルを比較・検討した。2)癌浸潤転移モデルを作製するために、miR-224を高発現するヒト肝癌細胞株HLFをヌードマウスの皮下あるいは腹腔内に接種したが、HLF肝癌細胞の転移性の不確定性や観察評価の困難があったため、マウスモデルの作製が計画により遅れている。そのため、モデルを用いたantagomir-224の生体への最適な導入条件の検討も年度内に行えなかった。3)研究の進捗・結果を踏まえて、新たにmiR-224の肝細胞癌の浸潤抑制のメカニズムを追加解析したところ、HGF/c-MET経路がmiR-224の機能維持に深く関連することが明らかになった。1)計画通りにreal-time PCR法を用いた血中miR-224の定量測定方法を確立し、転移性肝癌の患者と非転移性肝癌の患者において血中mir-224のレベルを比較した。検討の結果、血中miR-224はどちらとも極めて低いレベルであり、肝癌転移の診断マーカーとしての展開可能性は低いと考えられた。2)肝癌細胞株を用いたマウス癌浸潤転移モデルの作製が、利用細胞株の変更で計画によりやや遅れた。マウスモデルを作製するために、我々のこれまでの研究で樹立したmiR-224を恒常的に高発現する肝癌細胞株Huh7-GFP-R224を利用する予定であったが、細胞増殖が非常に遅いため、HLF肝癌細胞株の利用に変更となった。そのため、HLF細胞株においてmir-224の高発現及びantagomir-224が癌転移プロセスに影響を及ぼすことは確認されたが、マウス癌浸潤転移モデルの作製を年度内に実現することはできなかった。3)25年度に予定していた培養細胞を用いた最適なantagomir-224の選択が計画によりやや早く進展された。その結果、mirVana miR-224 inhibitorが有力なantagomir-224であることが示唆された。マウスの皮下腫瘍モデルを用いてantagomir-224の癌浸潤抑制効果を評価する。in vitroでの導入によるantagomir-224の抗腫瘍効果の評価:ヌードマウス30匹を3群に分け、naive及びmiR-224inhibitor, control inhibitorを導入したHLFをマウスの頸背部皮下に移植する。8週間経過したら、腫瘍のサイズを測定、及び転移の有無を観察し、antagomir-224の腫瘍抑制効果を確認・評価する。in vivoでの導入によるantagomir-224の抗腫瘍効果の評価: HLF細胞をヌードマウス(60匹)の頸背部皮下に移植する。
中世厳島神社における神仏習合観の変容

厳島神社の社殿が建つところは、オオナムチ・スクナヒコナの神の故地と伝えられる。熊野修験の支援でこの地に熊野本宮の写しが創られ、新たな来世往生の霊場が生まれることになった。中世前期の厳島大明神は、来世往生の願いを叶える神として信仰を集めた。ところが、厳島大明神は室町時代後期頃には、新たに現世利益の神へとしての神格を持つようになっていた。さらに、戦国時代初頭には、福徳の願いを叶える弁財天の評判を得ていた。しかし、厳島神社の神仏習合観が大きく変容しても、その基底には海の神龍神への信仰が伏流していたことが知られる。海上社殿にちなむ厳島神社信仰の本質は、神仏習合観が大きく変容しても変わるものではなかった。平成22年度は厳島神社の社殿がなぜ危険な海浜に設けられたのか、厳島神社を取り巻いていた宗教空間構造がどのようなものであったか、この二つの課題について主に検討を行った。まず、第一の課題に関して、次のような見通しが得られた。厳島神社の社殿は御霊川・滝川の河口の海浜に建つが、これは熊野修験が厳島に熊野三山のミニチュアを作ろうとしたことに由来する。御霊川・滝川の河口に両川に挟まれたように立地する厳島神社は熊野本宮、白糸の滝のしたに設けられた滝宮は熊野那智大社、地主神大元神社は熊野新宮に比定できる。厳島神社が観音菩薩の霊場となったのも、熊野修験とのこのような関わりを前提とすれば首肯できる。なお、厳島では滝宮と厳島神社の本社のみ「御前」という尊称が用いられ、いずれも「乾」の方角を向いている。滝宮は厳島神社の前身と考えられる。ただ、厳島神社の社殿が建てられた海浜は、スクナヒコナとオオナムチの故地であり、この両神との関わりはのちのちまで続くことになった。第二の課題については、「ケガレ」の忌避を手掛かりとして、厳島門前町における宗教的空間構造を明らかにした。厳島の住人の生活空間は島の北側の二つの谷にほぼ限られる。しかし、「ケガレ」を厳しく規制したのは西町と呼ばれる、経の尾と塔の岡のあいだに広がる谷であった。西町で「ケガレ」に触れた人は奥山を通り、この谷の外に一時的に身を置かねばならなかった。厳島門前町は江戸時代前期にかけて、塔の岡から宮の尾のあいだの谷にも広がった。この谷はのちに東町と総称されるが、「ケガレ」を忌避する意識は西町より弱かった。東町は厳島神社との距離、「ケガレ」を忌避する意識の強弱により、三つの区分が認められる。東端の新町には江戸時代前期に、広島城下から「ケガレ」と関わる遊廓が移された。このように厳島門前町では幾つかの区分を設け、厳島神社の聖域性を守ろうとしていた。しかし、厳島神社の後方に広がる山岳部の場合、その聖域性を守る企てとは無縁であった。厳島大明神は中世前期までは菩提心を付与し、極楽往隼の願いを叶えることで著名であったが、室町時代後半には福徳の願いに答える神として知られるようになった。つまり、厳島神社が新たに弁財天信仰の霊場としての性格を持つようになったのである。本年度は、厳島大明神が福徳の願いに答える神へと転換した背景について、厳島における高野山流の真言宗の優勢化や吉田神道の広がりに手掛かりを求め、「厳島の本地」などの厳島縁起が成立した要因を探ることをとおして検討した。このことについて、前年度に得られた成果をも踏まえると、以下のような四つの見通しを得ることができた。(1)「流れよった神」である厳島大明神は、大鳥居の前面の海に想定されていた竜宮と密接に関わる。(2)厳島大明神が「龍女」であるとの理解が、龍灯現象をも伴いながらすでに中世前期から見られた。(3)早くから厳島神社に見られた龍女信仰が、中世後期になると楽天的な弁財天信仰に読み替えられた。、(4)熊野修験が「厳島の本地」の成立だけでなく、弁財天信仰とも深い関わりがあると考えられる。なお、高野山流の真言宗は中世後期になると厳島で優勢になるが厳島神社の弁財天信仰の広がりについても側面的に支援した可能性が考えられる(高野山の弁財天信仰については未調査であるけれども、厳島神社の弁才天信仰に関わる文献が同所に伝わっている)。

吉田神道の場合、厳島神社の社家と深い関わりを持つのは戦国時代後期であり、同神社の弁才天信仰の定着とは直接的な関わりはない。ただし、吉田神道も弁財天信仰を受け入れているし、室町時代後期には隣国の守護大名大内氏と交わりがあるから、厳島神社の弁才天信仰と無関係とはいえないだろう。以上の厳島神社の弁財天信仰に関するものだけでなく、神仏習合の進展に関わるその他の見通しについても、明年度前半には発表したいと考え準備を進めている。本年は「厳島神社の神仏習合観の変容」と題する研究の最終年度である。厳島神社の神仏習合観の変容を見通すため,厳島神社における弁財天信仰の成立,厳島神社と弥山との関わりという,二つのテーマについて検討した。まず,厳島神社は室町時代の前期になると,菩提心祈請の霊場から福徳の願いを叶える霊場へと,性格を大きく転換させたことを確認することができた。厳島神社が福徳を叶える霊場,つまり弁財天信仰の霊場となる魁は,鎌倉時代後期の天台宗教団に見出すことができる。だが,その前提とも考えられる龍神信仰さえも,室町時代の前期までは表面化しなかった。厳島神社が室町時代後期から戦国時代初頭にかけて,弁財天信仰の霊場の装いを持つようになった背景として二つの要件が考えられる。室町時代後期の瀬戸内海交易の高まりのなかで,厳島は東西交易の分岐点となった。また,瀬戸内海交易の高まりのなかで,畿内から弁財天信仰など福徳信仰の波が当地域に押し寄せてきた。厳島神社はこのような社会的な変革のなかで,戦国時代初頭には弁財天のみならず毘沙門天・大黒天をも祀る,福徳信仰の霊場として全国的に知られるようになった。しかし,厳島神社が弁財天信仰の霊場として知られるようになっても,このことが神事・祭礼に反映した事実は認められない。厳島神社の神仏習合,その変容というのも,観念的・表層的なものにとどまると考えてよいであろう。次に,厳島神社とその背後に聳える弥山の関わりであるが,通説のような山宮・里宮の関係にないことも分かった。厳島の島民のあいだでは江戸時代後期になると,弥山は厳島神社の奥の院と考えられたことは事実である。また,明治初年の神仏分離後に頂上部が瘤のように描かれ,厳島神社の後苑と本社が一体のごとく描かれた。しかし,厳島神社は神仏分離後に弥山の権益をほぼ放棄しているから,これもまた観念的なものといわざるをえない。高野山の教線が戦国時代になると優勢になるが、これが厳島神社の弁財天信仰とどのような関わりがあったのか、その手掛かりを容易に見出すことができなかった。しかし、吉田神道と高野山との関わりの深さを知り、両者の教線が室町時代後期から厳島に延びていたことを考え合わせると、この問題を解く糸口をようやく見つけることができたように思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。高野山大学図書館などで弁財天信仰を含めた、厳島に関する調査を推し進めることによって、厳島神社の神仏習合観の変容について展望が得られるとの確信を持つようになった。本年度の前半は厳島神社と熊野信仰との関わりだけでなく、高野山・吉田神道との関わりをも調査・研究し、所期の成果をえるための努力をしたいと考えている。
糖尿病スクリーニングと高齢者転倒リスク評価のための足底感覚検査装置の有効性の検証

本課題最終年度には、検査値再現性の高い足底感覚計を用いて高齢者転倒リスク因子としての足底感覚機能低下の寄与を明らかにする課題が残されていた。介護保険の通所介護施設を利用する高齢者110名を対象として、運動機能(筋力、関節可動域、歩行・バランス能力など)、認知機能(ミニメンタルステート検査、Trail makingテスト)など先行研究で転倒事象との関連が指摘されている諸因子に加えて、足底感覚計を用いた足底感覚機能を測定した。後方視的研究として、測定時点から過去1年間の転倒の有無により群分けしたところ、転倒群55名、非転倒群55名に分けられた。転倒の有無を目的変数、上記の測定項目を説明変数としてステップワイズ法による重回帰分析で抽出された因子を基にロジスティック回帰分析を行ったところ、足底感覚の低下が過去の転倒事象を説明する最も優れた指標であることが明らかとなった(投稿中)。また、上記の測定後1年後までに発生した転倒事象の調査を行い(前方視的研究)、現在までにおよそ8割の対象者でデータを採取している。現時点で上記と同様の分析を行ったところ後方視的研究と同じく足底感覚低下が転倒事象をもっとも強く説明する因子である結果が得られている。転倒リスク判定での足底感覚機能の重要性が示唆された。体性感覚検査は、検査刺激を手作業で加える方法が一般的で、測定の労力と再現性に問題を抱えており、転倒リスク因子としての寄与に関する知見の蓄積は乏しかった。本研究課題の結果は、これまで転倒リスク因子として知られていた筋力や運動機能検査より、足底感覚検査が転倒リスク判定への寄与が大きいことを明らかにした。足底面の機械的受容器は下肢の運動ニューロンと強いシナプス結合を有することが近年明らかとなっている。今後は足底感覚低下と転倒の強い関連を身体運動分析的手法で裏付ける研究に発展させ、転倒予測の根拠をより確かにする予定である。足底面の触覚検査は高齢者の転倒リスク判定や足部に初発する糖尿病性神経障害の症状検出で重要な役割を果たすが、従来の足部感覚検査は煩雑な手順を要するため、多忙な外来診療や地域健診の場ではほとんど実施されてこなかった。本課題の研究代表者らは、専門知識に乏しい者でも簡易に扱えて信頼性の高い検査を可能とする足底感覚検査装置を開発している。これまでに、本機器と既存機器の検査値は高い相関を有することを確認している。本研究課題は、この装置の糖尿病性神経障害に対する検出感度を検証し、その有効性を明確にするとともに、高齢者転倒リスク判定への寄与や、転倒予防事業の効果判定に利用可能かどうかについて検証することを目的としている。本装置は、検査台の所定の位置に足底を載せると、刺激プローブが足底面に振幅の異なる微小なずれ刺激を自動で提示し、被検者は刺激を感知した際にボタンで応答するという、従来機器より簡易な測定原理を採用している。平成27年度は、本装置の2次試作機を用いて、その検査値妥当性を検証するためのデータ採取を実施した。まず、糖尿病患者を対象とした足底面5ヶ所の感覚閾値を本装置と既存機器を用いて測定した。昨年度より先行実施していた被検者を含めて約80名のデータを採取し、その解析を行った。また、年代別の標準値を確認するために、20-70歳代の神経学的疾患の既往をもたない健常者を対象に、本装置による足底感覚閾値データを採取した。さらに、本装置の検査値妥当性を検証するために、本装置で設定されている平滑面と凹凸面の2種類のプローブ形状で感覚閾値に差が生じるかどうかと、検査姿勢(座位・立位)で測定される感覚閾値に差が生じるかどうかを検証するデータ採取を実施した。本研究課題のもうひとつのテーマである高齢者の転倒リスク判定に関しては、要介護高齢者の研究参加に適した介護保険の通所介護施設の選定を行った。足底感覚検査装置が足部に初発する糖尿病性神経障害の初期症状を従来機器よりも高感度で検出できるかどうかを検証するために、糖尿病で入院加療中の患者から、本装置と既存機器で、足底面5ヶ所の感覚閾値を測定した。昨年度より先行実施していた被検者を含めて80名、160肢前後のデータを採取し、その解析を行った。本装置による検査値は、既存機器(SWモノフィラメント)と比較すると、糖尿病性神経障害の重症度分類で最軽度もしくは2番目の軽度に相当する患者の足底面感覚閾値の差をより適切に検出できることが明らかとなった。神経障害重症度分類の他に、神経伝導速度検査や振動覚検査、腱反射等の神経学的検査値や、糖代謝検査値(HbA1c等)、他の糖尿病合併症の有無等と、本装置による検査値との関連についての検証も行った。また健常者の標準データを採取するため、20-70歳代の健常者50名から(協力施設測定分を含む)本装置による足底感覚閾値データを採取した。さらに、本装置(2次試作機)の検査条件の違いによる検査値の妥当性を確認する試験を実施した。具体的には、健常者被検者12名24肢より、本装置の感覚刺激提示部であるプローブの表面形状の違いによる検査値の差を検証し、健常者から軽度感覚

障害者までの閾値に相当する移動刺激10-200μmの範囲において、2種類のプローブによる感覚閾値に有意な差はないことを確認した。加えて、検査姿勢(座位・立位)によって検査値に差が生じるかどうかの検証も同じ被検者で行い、本装置による検査を立位で行うと、座位よりも低い感覚閾値を検出することが明らかとなったほか、一度検知した感覚刺激よりも大きな刺激の見落とす事例が座位よりも多くなることが確認された。これは立位では姿勢保持がより難しくなるためと考えられ、次年度以降の要介護高齢者を対象とした転倒リスク判定のデータ採取の指針となった。本研究課題は、検査刺激の自動提示機能によって信頼性が高く簡便な検査を可能とする足底感覚検査装置を開発し、糖尿病性神経障害の重症度、特に初発症状の検出力を検証することと、高齢者の転倒リスクに対する足底感覚低下の寄与を明らかにすることで、これまでほとんど行われてこなかった転倒リスク判定への足底感覚検査の有効性を他の転倒誘因要因と比較して検証することの2点を目的としている。本年度の糖尿病性神経障害関連の研究実績として、昨年度から引き続いて糖尿病患者から本装置と既存機器を用いた感覚閾値測定を、特にこれまでで不足していた中等度の神経障害の患者を対象に実施した。さらに、これまでと併せた総計125名、250肢の足底面5ヶ所の本装置と既存機器の感覚閾値データ、および糖代謝検査値等のカルテ情報を含めた分析を行った結果、本装置は既存機器よりも神経障害の初発症状を検出する能力が高かったが、1回の検査値だけで神経障害の発症を判定することは困難であり、本装置は糖尿病患者に継続して使用することで、神経障害発症のスクリーニングに貢献できる可能性が示唆された。また、本機器は年度中に国内、ロシア、中国での特許登録に至った。転倒リスク判定への有効性を検証するデータ採取に関しては、要介護・要支援高齢者を対象として本装置のほか筋力・筋量、歩行能力、バランス能力、注意力といった転倒関連要因の検査と、検査時までの転倒事象の有無との関連(後向き)、および検査後に生じた転倒事象の有無との関連(前向き)の検証する研究デザインを策定した。東京都と神奈川県内の6ヶ所の通所介護施設での実施承認を得た後、研究計画書、被験者への説明書・同意書等の書式を作成し、研究代表者が所属する施設の倫理審査委員会にて承認を取得した。当初計画では本年度から開始する予定だった当該研究を次年度初頭から実施できる体制を整えた。本研究課題の実施項目のうち、足部に初発する糖尿病性神経障害の初期症状を足底感覚検査装置が従来機器よりも高感度で検出できるかどうかを検証するテーマに関しては、当初の計画で予定していた数の糖尿病加療中の被検者からの足底面5ヶ所の本装置と既存機器(モノフィラメント、音叉、神経伝導速度検査)で測定した感覚閾値データと、糖代謝検査値や糖尿病合併症の有無等のカルテ情報の採取が概ね完了した。さらにこれらのデータを分析し、既存機器に対する本装置の優位性、および糖尿病性神経障害の初発症状の検出能力の検証も概ね終了した。また、本装置に関連する特許の取得や、本装置を医療機器として承認を得るための準備作業といった本課題申請時には計画に含めていなかった事項を実施することができた。以上より、糖尿病性神経障害に関連した研究課題に関しては、順調に進捗していると言って差し支えない。本研究課題のもうひとつの実施項目である、本装置を用いて高齢者の転倒を招く要因としての足底感覚の寄与を明確にすることで、転倒リスク判定に対する足底感覚検査の有効性を検証するテーマに関しては、平成28年度中に高齢者を対象とした検査測定データ収集を開始する計画となっていた。
獣脚類を中心とした二足歩行性の主竜類における足の接地・把握機能の進化過程の解明

前年度は現生主竜類(鳥類・ワニ類)を解剖したが、本年度はそれらに最も近縁な外群である爬虫類(カメ類・トカゲ類)を観察し比較した。その結果、とくに筋の両端がどちらも足部内で付着しているような筋を新たに細分したことで、ワニ類で知られていた詳細な足部筋の分類と、ほぼ全て対応づけることができた。さらに、それらの大半について骨格上の付着痕を確認することができた。これらの結果から、ワニ類が主竜類の祖先に近い状態を保持している一方で、鳥類は数・形態の上で他の爬虫類と大きく異なっており、主竜類の共通祖先から鳥に至るまでに顕著な変化が起こったと推定された。化石主竜類に関して、昨年度は国内外で、主に主竜類および恐竜類の基盤的な分類群について調査したが、本年度は国外において、より派生的な恐竜類を中心に調査した。その結果、これまで観察してきたものを含めて、多くの筋痕が残されていることが明らかになった。各筋痕の出現や欠失のタイミングを系統樹上で明らかにすることで、足部の筋が進化史上いつ、どのように変化したかを推測できる。これに適した祖先形質復元解析を行うために、各形質の状態を数字で表すコーディングという作業を行い、データマトリクスを作成した。また、複数の先行研究の成果から解析に用いる系統樹の形を設定し、各クレードの初出年代から枝の長さを設定した。その結果、足部の筋の変化は特定の時点で急激に起こったのではなく、鳥に至る系統の中で徐々に進んでいったことが判明した。特に、足部の筋が減少し、その機能を脛腓骨や大腿骨から起始する筋が代替していく傾向が見られ、後肢の末端を軽量化し歩行や走行を効率化するよう、時間をかけて変化していたことが判明した。鳥類に至る系統では体の他の部位(股関節や尾など)でも運動機能に関わる様々な変化が起こっていたが、足部はそうした変化に影響は受けず、独自に変化していったことが判明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、1鳥類およびワニ類の解剖、2足部に付着する筋の相同性の推定、3恐竜類の筋復元、4基盤的主竜類・恐竜類の化石標本の調査を行った。まず、鳥類およびワニ類の遺体を解剖し、足部を動かすそれぞれの筋が付着する位置を観察した。その後、解剖した個体の軟組織を取り除いて骨格標本を作製し、各筋の付着していた痕跡の有無を確認した。その結果、鳥類では大半の、ワニ類でも約半数の筋の痕跡を骨格上で確認することができた。先行研究で相同性が確認されていない足部の筋については、付着位置とはたらきに基づき、新たに相同関係を推定することを試みた。その結果、一部は推定できたものの、鳥類ではワニ類よりも筋の数が少なく、鳥類に至る系統で失われたか、逆にワニ類に至る系統で筋が新たに獲得された可能性が考えられた。そのため、両者に最も近縁な現生動物であるトカゲ類およびカメ類の解剖を行い、鳥類とワニ類のどちらがより祖先的な状態を反映しているかを検証するプロセスに入っている。また、この時点までの解剖の結果を、過去に調査した恐竜類の足部骨格化石のスケッチに反映することで、部分的な筋復元を試みた。その結果、ワニ類と鳥類に見られる足部の筋の違いの多くは、獣脚類と呼ばれる二足歩行性が確立した系統の中で生じた可能性が示唆された。この成果は、後述する国内学会においてすでに公表されている。2015年2月から3月にかけてアルゼンチンに渡り、複数の博物館に所蔵されている基盤的主竜類および基盤的恐竜類の化石標本を横断的に調査した。後肢骨格が残された標本をあわせて21個体観察し、写真の撮影やスケッチによって筋痕と考えられる微細な形態を記録した。

その結果、足部の筋の変化は特定の時点で急激に起こったのではなく、鳥に至る系統の中で徐々に進んでいったことが判明した。特に、足部の筋が減少し、その機能を脛腓骨や大腿骨から起始する筋が代替していく傾向が見られ、後肢の末端を軽量化し歩行や走行を効率化するよう、時間をかけて変化していたことが判明した。鳥類に至る系統では体の他の部位(股関節や尾など)でも運動機能に関わる様々な変化が起こっていたが、足部はそうした変化に影響は受けず、独自に変化していったことが判明した。アルゼンチンへの渡航費用が当初の予定よりも嵩んだため、予定していた他の諸外国における調査を終えていない。また、鳥類の中で生態ごとの筋形態の比較を行う予定であったが、遺体を入手できていないため解剖を終えていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず、アルゼンチンで収集した基盤的主竜類の化石骨格の形態データを精査し、筋の復元がどの程度可能であるかを検討する。その上で、残された期間・予算内で可能な限り多様な分類群のデータを収集できるように調査先を決定し、博物館と標本利用の交渉を行い、旅程を組む。海外調査までの期間にカメ類および多様な鳥類の解剖を行う予定である。調査後は、得られた化石形態データに解剖学的知見を反映して筋復元を進め、その結果を系統樹上にマッピングしていくことで進化シークエンスを復元する。
機械学習とOCRを用いた植物標本画像からのラベル情報自動取得プログラムの開発

植物標本画像からラベル部分を認識し、OCRでテキスト抽出するプログラムと、テキストの属性を判断してDBの各項目へデータ振り分けを行うプログラムの開発を行う。それら2つのプログラムをオープンソースのデジタルアーカイブ管理システム「Survey Data Collector」へ実装する。実装が完了した段階で、植物標本の高速画像撮影法と合わせて国内各地でデジタルアーカイブシステムの使用説明会を開催し、希望する自然史系博物館には無償配布し、日本国内の植物標本デジタル化と整理の促進を目指す。
東北地方における方言文法の研究

東北方言の文法事象のうち、テンス・アスペクトとそれに深く関わるムード形式・受身・可能表現をとりたて、調査結果および先行研究から特に注目すべき地点を選び出して、それぞれに特徴的な形式のための調査票を作成し、年代差を調査した結果、主に以下のことがらを明らかにした。テンス・アスペクトにおいては、山形県山形市方言では高年層と若年層に大差はないが、次のような年代差が確認された。高年層は形容詞の過去の反復性に-ガッタを用いるが、若年層は用いない。文末のケの用法では、高年層は反復する出来事を一般化して恒常的な出来事として表す用法をもつ一方、若年層はケを過去のテンスマーカーとして積極的に使用する範囲が高年層より広く、恒常的な出来事や未来の出来事の例文を非文とする傾向が強い。若年層は未来をタで表す場合もあり、タは過去のマーカーとしての地位をケに追われつつあるとみられる。これは、本研究で明らかにした他の東北諸方言の若年層では方言形式の不使用傾向が強く、共通語化が進んでいるのに対して、山形市方言における独自の特徴であり、他の東北諸方言に分布する-タッタを使用せず体系が異なっていることに影響を受けて形成された特徴であることを指摘した。受身・可能表現においては、宮城県南部の白石市方言の高年層と若年層を調査した結果、高年層は受身文の動作主マーカーにカラやニが多く用いられ、サが用いられにくく、若年層も同様であるとの結果を得た。同じ宮城県内中部の仙台市・石巻市や北東北地方の方言では、主に若年層において、サが動作主マーカーなどの用法を獲得していることが報告されているが、宮城県南部ではそれとは異なる結果が得られたことになる。また、可能表現では、高年層では助動詞レルと動詞+ニイーが用いられる範囲が広いのに対し、若年層では可能動詞が使用される範囲が広く、この点については他の東北諸方言と同傾向を示すことが明らかになった。東北地方の方言における文法事象について,特にヴォイスのうち,可能表現,受身表現,自発表現の特徴の解明を目的とし,以下の研究を行った。1.東北地方の方言を対象とした調査研究ならびに可能表現,自発表現,受身表現に関わる研究を収集。2.東北地方に特徴的な形式の分布から,3地点(岩手県盛岡市,宮城県石巻市,.山形県山形市)を代表に定めて調査票を作成。3.生え抜きの高年層を中心に臨地面接調査を実施。これと並行して石巻市において多人数調査を実施。4.昭和15年頃の東北方言を対象にした資料(小林好日氏による)を調査し,60年後の現代東北方言と比較。5.以上の調査で得られたデータに基づく考察から,以下の事柄を明らかにした。(1)東北方言における可能表現の主な形式には,助動詞レル,動詞終止形+ニイー/イ,いわゆる可能動詞の3種がある。これらの形式は可能の条件や文の肯否によって使い分けられており,能力に起因する場合は可能動詞,状況に起因する場合は肯定文で動詞終止形+ニイー/イ,否定文で助動詞レルを用いる体系が一般的だが,北東北では自発の助動詞サルも用いられるなど,詳細は地域によって異なる。史的には,昭和15年頃の可能表現肯定文では動詞終止形+ニイー/イと助動詞レルが主流だったが,60年後の現代東北方言では可能動詞が優勢で,年代差が目立つ。(2)受身文の動作主マーカーにはニ,カラ,サ等があり,直接受身ではカラ・ニ,間接受身のいわゆる迷惑の受身ではニ,持ち主の受身ではカラが主流であるなど,文によって使い分ける傾向が見られる。なお,サは若い世代で使用率が高い。(3)自発表現では,盛岡市の助動詞サル,山形市の助動詞ルについて比較を行い,特に助動詞サルが可能表現の体系に組み込まれる用法を有するのに対し,助動詞ルは可能表現に関わる用法を持たないことを明らかにした。

同じ宮城県内中部の仙台市・石巻市や北東北地方の方言では、主に若年層において、サが動作主マーカーなどの用法を獲得していることが報告されているが、宮城県南部ではそれとは異なる結果が得られたことになる。また、可能表現では、高年層では助動詞レルと動詞+ニイーが用いられる範囲が広いのに対し、若年層では可能動詞が使用される範囲が広く、この点については他の東北諸方言と同傾向を示すことが明らかになった。
更新拒絶法理と締約強制論－－契約締結の自由とその限界

近年、裁判例において、期間満了による契約の終了を認めず、更新契約の締結に対する事実上の強制がなされている。しかし、このような形で契約締結の自由を制限する根拠は不明確であった。本研究は、この問題について、契約の締結を強制する法理である「締約強制論」の観点から分析及び検討を行った。その結果、「依存性」・「代替可能性」を軸に強制の可否を判断すべきであることが明らかとなった。本研究は、「更新拒絶法理と締約強制論ー契約締結の自由とその限界」について、比較法的観点からの研究(主にドイツ法)、日本法における裁判例・学説に着目した研究を行うものである。第1の目標は、前段に述べた研究を通して、「契約締結の自由」に対する制限がどのような場合に容認され、いかなる基準のもとで制限を根拠づけることができるのかを明らかにすることにある。そして、第2の目標は、締約強制論のひとつである更新拒絶法理の理論枠組みを構築することにある。2012年度には、1ドイツ法における締約強制論に関する検討、2ドイツ法における締約強制論の到達点および課題の明確化を中心に研究を進めていった。具体的には、日独における更新拒絶法理を検討する前提問題として、締約強制論の法的位置づけを明確にするため、2011年度に公表した論文(「放送法64条1項違反の私法上の効力ー締約強制論および取締法規違反の私法上の効力論を中心としてー」東海法学45号〔2011年〕49頁以下)を踏まえ、放送受信契約をめぐる裁判例につき、日本法・ドイツ法を対象とした詳細な検討を行った(谷江陽介「放送受信契約をめぐる裁判例の動向と論点」現代消費者法16号〔2012年〕104頁以下)。これらの検討は、契約締結の自由に対する制限がどのような場合に容認されるのかを明らかにするために必要不可欠なものであるといえる。本研究は、「更新拒絶法理と締約強制論ー契約締結の自由とその限界」について、比較法的観点からの研究(ドイツ法)、日本法における判例(裁判例)・学説に着目した研究を行うものである。この研究の目標は、以下の通りである。そして、第2の目標は、締約強制論のひとつとして位置づけられる「更新拒絶法理」の理論枠組みを構築することにある。具体的には、日独における更新拒絶法理を検討する前提問題として、締約強制論の法的位置づけを明確にするため、2011年度に公表した論文(「放送法64条1項違反の私法上の効力ー締約強制論および取締法規違反の私法上の効力論を中心としてー」東海法学45号〔2011年〕49頁以下)を踏まえ、放送受信契約をめぐる裁判例につき、日本法・ドイツ法を対象とした詳細な検討を行った(「放送受信契約をめぐる裁判例の動向と論点」現代消費者法16号〔2012年〕104頁以下)。研究最終年度の2013年度には、締約強制論のひとつとして位置づけられる「更新拒絶法理」の理論枠組みを構築するための研究を行い、この成果を公表した(「更新拒絶と締約強制法理」民事研修678号〔2013年〕2頁以下)。これらの研究の結果、「依存性・代替可能性」というメルクマールのもとで、締約強制という形で契約締結の自由に対する制限が根拠づけることができることが明らかとなった。本研究は、「更新拒絶法理と締約強制論ー契約締結の自由とその限界」を研究することにより、契約締結の自由に対する制限がどのような場合に容認され、いかなる基準のもとで制限を根拠づけることができるのかを明らかにしたうえで、更新拒絶に対する制限の理論枠組みを構築することにある。2011年度には、交付申請書に記載した「研究目的」、「研究計画・方法」の内容に即した形で研究を進めてきた。具体的には、(1)日本法における締約強制論に関する検討、(2)日本法における更新拒絶法理に関する検討、(3)日本法における締約強制論・更新拒絶法理の到達点および課題の明確化である。まず、(1)および(3)については、更新拒絶法理を検討する前提問題として、締約強制論の法的位置づけを明確にするため、近時日本で問題となっている放送受信契約を素材として、締約強制法理の具体的検討を行った(谷江陽介「放送法64条1項違反の私法上の効力ー締約強制論および取締法規違反の私法上の効力論を中心としてー」

東海法学45号〔2011年〕49頁以下、同「妻が夫名義で行った放送受信契約の締結行為につき、民法761条の『日常の家事』に該当するとされた事例」東海法学45号〔2011年〕115頁以下)。これらの検討は、更新拒絶法理を具体化するために必要不可欠なものであるといえる。次に、(2)については、更新拒絶をめぐる日本法の裁判例を収集し、包括的な検討を行っているところである。更新拒絶に関する裁判例については、谷江陽介「最新判例情報」現代消費者法14号(2011年)117頁以下で紹介を行っている。2012年度には、2011年度に公表した論文を踏まえ、さらに日本法・ドイツ法をも踏まえた形で具体的な裁判例の状況、外国の状況に着目した研究を行うことができた。前段に述べた研究を通して、1ドイツ法における締約強制論に関する検討、2ドイツ法における締約強制論の到達点および課題を明確にした。これらを踏まえ、最後の1年で締約強制論のひとつである更新拒絶法理の具体的理論枠組みを構築することができると考えている。以上の理由から、本研究は、当初の計画以上に進展しているといえる。2011年度は、「研究目的」「研究計画・方法」と密接な関係のある問題につき、以下に示したように、3つの論稿にまとめて公表することができた。そのため、本研究は、当初の計画以上に進展しているといえる。具体的には、、2011年度の研究目標である、(1)日本法における締約強制論に関する検討、(2)日本法における更新拒絶法理に関する検討、(3)日本法における締約強制論・更新拒絶法理の到達点および課題の明確化、という3点を着実に進行していると考えている。2013年度には、3年間の本研究の3年目として、2年間で行ってきた日本法・ドイツ法の研究を整理し、本研究から得られた視座をまとめ、締約強制論のひとつである更新拒絶法理の理論枠組みを構築することとしたい。第1に、日本法・ドイツ法における締約強制論の整理・検討を行う。第2に、日本法・ドイツ法における更新拒絶法理の整理・検討を行う。以上の点を着実に進行させていくために、各種研究会で積極的に報告を行い、その成果を公表していきたいと考えている2012年度には、3年間の本研究の2年目として、次の3点につき、研究を進行させていきたいと考えている。第1に、ドイツ法における締約強制論に関する判例、学説の調査および検討である。第2に、ドイツ法における更新拒絶法理に関する判例、学説の調査および検討である。第3に、ドイツ法の議論の整理を行うことにより、日本法への示唆を得ることである。以上の3点を着実に進行させていくために、各種研究会で積極的に報告を行い、その成果を公表させていきたいと考えている。それに加え、ドイツ法の状況を具体的に把握するために、ドイツの大学における資料収集を予定している。本研究を着実に進展させていくために、日本法・ドイツ法の図書・雑誌の購入が欠かせない。また、資料整理のために学生アルバイトを用い、2年間の研究の整理を行うことも必要となる。また、上記「今後の研究の推進方策」でも述べたところであるが、研究成果を積極的に発表していくことが重要であると考えている。そこで、東京、名古屋等で開催される各種研究会、実務上問題となっている裁判の状況を知るための弁護士との討論会に積極的に参加する予定であり、そのための旅費が必要となる。以上のように、本研究を遂行する上で、資料収集費用、学生アルバイトの費用、研究会・討論会に参加するための旅費が必要となるため、これらに研究費を使用したいと考えている。平成24年度の研究費に残額が生じた理由は、以下の通りである。
超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の開発

印刷可能な塗布用圧電高分子センサ・アクチュエータの開発に向けて、以下のことを行った。(1)圧電高分子液滴の乾燥後に形成される圧電高分子フィルムの結晶構造解析を行った。(2)圧電高分子液滴の乾燥後に形成される圧電高分子フィルムの形状計測を行った。(3)圧電高分子フィルムの点描画が可能なプリンターを開発し、幾つかの形状のプリンテッド圧電高分子フィルムを作成した。1.液滴の乾燥過程での対流場・形状計測およびX線構造解析カバーガラス上に高分子ピエゾ溶液(PVDF粉末をN,N-ジメチルホルムアミドに溶かした溶液)を滴下・乾燥し、得られたPVDFフィルムのPVDF分子鎖配向を学内設備のX線構造解析装置により計測した。pリットルからmリットルまでの1液滴量に対して計測を行った結果、今回の実験条件全てでPVDFフィルム中にベータ型結晶構造を確認することができた。PVDF溶液の構成条件(PVDF濃度、液滴量等)のPVDF液滴の対流状態評価・形状評価・分子鎖配向評価を通して、その自己ベータ相化・自己分極化・分子鎖配向メカニズムを探った。結果として、当初の自己ベータ相化メカニズムの主因であると考えたマランゴニ対流以外に、溶媒乾燥による自己分極化・分子鎖配向の可能性を見出した。今後、さらに実験を重ね、PVDFフィルムの高性能化を目指す予定である。2.圧電高分子素子が描画・積層構造化可能なプリンターの開発26年度の予定を前倒しし、デシケータ中にx、y、z軸精密自動ステージとシリンジポンプを組込んだ高分子溶液の滴下・乾燥制御装置を作成した。これら装置は全て、オリジナルソフトウェアにより外部PCから制御可能となっている。1.圧電高分子素子が描画・積層構造化可能なプリンターの開発新提案の「PVDFを描画・積層構造化可能なプリンターシステム」を開発した。これにより、μオーダでの滴下位置制御、μリットル単位の滴下量制御、乾燥液滴形状制御が可能となった。さらに、CADにより作成された図面と本システムをリンクさせることで、様々な構造の圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の創成が可能となった。そこで、四角・丸・三角・星型などの形状でPVDFをプリントアウトするとともに、それら素子の構造解析を行った。2.超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の実用化作成された超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子に対して、±10V程度の振幅電圧で誘起された振動を計測するために、レーザドップラ振動計を基盤とした多点振動評価システムを構築した。1.超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の実用化平成26年度までに面描画・積層構造化可能なPVDFフィルムプリンター(P-pプリンタ)が完成した。平成27年度では、P-pプリンタによりPVDF液滴の面描画を行うことによって、超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の創成を行った。また、PCのお絵描きソフトにより作成された図面と本システムをリンクさせるプログラムを新規開発することで、様々な構造の圧電高分子センサ・アクチュエータフィルムの創成が可能となった。PVDF液滴の条件を設定することで、膜厚5μm30μm程度の任意形状のフィルム素子を作成した。さらに、作成された円形、四角形、三角形、星形のPVDFフィルムに対して、形状精度評価(形の精度評価)およびX線構造解析による結晶構造評価を行った。また、3次元形状計測機によりPVDFフィルムの厚さ分布の評価も行った。結果として、圧電高分子センサ・アクチュエータ素子として十分な任意形状PVDFフィルムを作成することが可能となった。一方で、任意形状PVDFフィルムのセンサ・アクチュエータ性能を評価することに向けて、オリジナル振動計測システムの開発を着手し始めた。システムは、ドップラー振動計、オシロスコープ、xyz自動ステージから構成され、これにより面の振動分布が計測可能となる。xyz自動ステージは、RS232CによりPCから制御され、ドップラー振動計との組合せにより任意位置での振動計測や多点計測を可能にしている。また、立体物の振動計測に対応するために、レーザーの自動焦点合わせ機能も開発した。ドップラー振動計から計測された速度データはオシロスコープを通してPCに保存される。また、オリジナルソフトウェアにより、速度データは変位データに計算され、各種振動解析(FFT解析等)を行うことができる。上記の制御・計測・解析ソフトウェアは全てLabVIEWにより開発された。平成27年度に行う予定の「CADの図面とプリントシステムのリンク」および「レーザドップラ振動計を基盤とした多点振動評価システムの構築」を前倒しで本年度中に終了させたため。機械材料・材料力学様々な構造にプリントアウトされた圧電高分子センサ・アクチュエータ素子を作成する。素子上に電極作成後、素子のインピーダンスを計測するとともに電圧入力のインピーダンスとのマッチングを試みる。その後、平成26年度に構築された多点振動評価システムにより電圧により誘起される振動の計測を行う。

25年度に行う予定だったPVDF液滴の乾燥に関する研究が予想よりも著しく早く進行したため、26年度行う予定だった圧電高分子素子の描画プリンター(デシケータ中にx、y、z軸精密自動ステージとシリンジポンプを組込んだ高分子溶液の滴下・乾燥制御装置)の開発を前倒しで着手し始めた.平成26年度におけるプリンターシステムの開発において、装置部品を既製品でなく自作により行ったため、次年度繰越金が発生した。CADにより作成された図面と圧電高分子素子の描画プリンターをリンクさせることで、様々な構造の圧電高分子センサ・アクチュエータ素子の創成が可能となる。膜厚5μm30μm程度の任意形状のフィルム素子を作成する。また、作成された超高性能プリンタブル圧電高分子センサ・アクチュエータ素子に対して、±10V程度の振幅電圧で100kHz30MHzの周波数範囲の正弦波を印可し、誘起された振動をレーザドップラ振動計で計測する。素子性能の目標値は、これまでに得られた残留分極・誘起振動振幅・感度値の50%上昇を目指す。平成27年度で行う予定のインピーダンスマッチング回路作成に使用する予定である。当初の予定よりも大きく研究が進展したため、26年度の予定であった装置開発予算を25年度に前借り申請し、装置開発を始めた。結果として、消耗品分程度の予算が残った。26年度に消耗品分予算として使用する予定である。
振動体に搭載されたコンピュータ内の磁気ディスクの挙動に関する研究

シャフトを中心に回転し、同時に軸方向およびひとつの直径まわりにピッチング加振される磁気ディスクを取り上げ、その定常強制振動特性を解明した。解析では、始めに磁気ヘッドを有する回転円板に対して運動方程式を組み立てた。式の誘導に際しては円板は薄肉であるとし、磁気ヘッドはばね、質量系で置き換え、両者の連成式を導いた。解を求めるにあたっては、円板に固定した座標系から空間に固定した座標系に座標交換し、板の変位をモード関数の和で仮定、ガラーキン法を用いて核モードに対する応答振幅を決定した。さらにそれらをたし合わせ変位の最終解を求めた。得られた解より、大形コンピュータを用いて上記2種類の入力に対するディスクの応答を計算した。具体例として300rpmで回転する5.25インチ・フロピーディスクを取り上げ、円板の変位振幅を種々の加振振動数に対して求めた。得られた結果を要約すると以下のようになる。(1)磁気ヘッドをあてないで回転している円板を軸方向に加振した場合は節直径を持たない振動モードだけが加振される。一方、ピッチング加振した場合は、節直径を1個持つモードだけが加振される。この円板に磁気ヘッドをあてると、いずれの入力に対しても全ての円板の振動モードが板上で加振される。(2)軸方向加振の場合はヘッドがディスク外周に移動するに従い、フロピーディスクに大きい応答振幅をもたらす加振領域は振動数の低い領域へ集中していく。一方、ピッチング加振の場合はヘッドが円周方向にピッチングノードに近づくに従い全体として振幅が小さくなり、特に高い加振振動数域における変位振幅が小さくなる。これよりピッチング入力の大きい状況下では、ディスクヘッドがピッチングノードにくるようにディスク装置を設置すべきであると考える。
細胞の増殖・生存を保証するRNA結合タンパク質RBM42の解析

RNA結合タンパク質によるmRNA安定性制御、翻訳調節といった転写後制御は、生命活動において重要な役割を果たす。本研究では、相互作用する2つのRNA結合タンパク質RBM42とhnRNPKの細胞増殖における機能を解析した。RBM42ノックダウン細胞とhnRNPKノックダウン細胞では、細胞周期のG1期からS期への移行に遅れがみられ、また、S期への移行に重要な働きをもつ転写因子E2Fの標的遺伝子の発現量の低下が観察された。さらに、我々は、hnRNPKがE2FのmRNAに結合し、mRNAの安定化に関与することを見いだした。以上の結果から、hnRNPKは、転写因子E2FのmRNA安定性制御を介して、細胞周期を正に制御すると考えられる。RNA結合タンパク質による転写後制御は、生命活動において重要な役割を果たす。本研究では、2つのRNA結合タンパク質RBM42とhnRNPKの細胞増殖における機能を解析した。前年度の解析結果から、RBM42ノックダウン細胞とhnRNPKノックダウン細胞では、細胞周期のG1期からS期への移行に遅れがみられることが明らかになっていた。今年度、S期への移行に重要な働きをもつ転写因子E2Fに着目して解析を行った。マイクロアレイと定量PCRによる解析の結果、hnRNPKノックダウン細胞では、E2F、および、E2Fの標的遺伝子の発現量の低下が確認できた。E2F mRNAの半減期を測定した結果、hnRNPKノックダウン細胞では、E2F mRNAの分解が早く起きることが明らかになった。さらに、E2Fの3'UTRとルシフェラーゼの融合遺伝子を用いて解析した結果、細胞内在性のE2Fと同様に、hnRNPKノックダウン細胞では、E2F 3'UTRをもつmRNAは発現量が低下した。また、hnRNPKとE2F mRNAとの結合も確認できた。E2F mRNAの3'UTRには、mRNA分解に関与するARE配列が存在することから、hnRNPKは、E2F mRNAに結合して、ARE配列依存的なmRNA分解からE2F mRNAを保護することにより、細胞周期のG1期からS期への移行に関与すると考えられる。RBM42ノックダウン細胞では、部分的にしかE2Fの標的遺伝子の発現量の低下は確認できず、また、E2Fの発現低下もほとんど観察されなかった。S期で機能する遺伝子のいくつかに発現低下は見られたこと、RBM42のRNA結合ドメインは細胞増殖に必要であることから、E2F以外の標的mRNAの制御を介して細胞周期の進行に必要な役割を果たすと考えられる。RBM42は、RNA結合ドメインをもつタンパク質である。RBM42ノックダウン細胞の細胞増殖に欠陥を示すが、RBM42の作用機序は不明であった。本年度、RBM42ノックダウン細胞の細胞周期への関与を検討した結果、BM42ノックダウン細胞は、G1期からS期への進行に欠陥を示すことが明らかになった。RBM42ノックダウン細胞では、G1期の初期に働くサイクリンDの発現に変化は見られなかったが、S期の進行に必要なサイクリンEの発現低下が確認されたことから、RBM42は、G1後期に機能することが予想された。RBM42がサイクリンE mRNAの安定性制御を介して、細胞周期制御する可能性を検討したが、サイクリンE mRNAの半減期の変化はみられなかった。次に、サイクリンEの転写に関与する因子についてRBM42ノックダウンの影響を検討したところ、サイクリンEの転写を活性化するE2Fの発現がRBM42ノックダウン細胞において顕著に低下することが明らかになった。さらに、RBM42ノックダウン細胞では、E2Fの標的遺伝子であるヌクレオチド代謝系酵素(DHFR, TYMS, TK1)やDNA複製制御因子(ORC1, CDC6)の発現も低下することが明らかになった。従って、RBM42は、E2Fの制御を介してG1後期からS期へかけて機能すると考えられる。hnRNPKは、RBM42と結合するRNA結合タンパク質である。RBM42と同様にhnRNPKの細胞増殖への関与を検討した結果、hnRNPKノックダウン細胞も細胞周期の進行に欠陥を示すこと、E2F、及び、E2Fの標的遺伝子の発現が低下することが明らかになった。これらの結果から、2つのRNA結合タンパク質、RBM42とhnRNPKが、mRNA制御を介して細胞周期のG1期からS期への進行を制御することが考えられる。本年度は、RBM42の細胞周期調節における作用点の解析に時間を費やしたために、RBM42によるアポトーシス制御の解析がやや遅れている。細胞増殖におけるRBM42の機能については、E2Fの制御について、当初の計画どおり、mRNAの制御に着目して、分子メカニズムの解析を行う。

また、RBM42自身の制御に関して、G1期からS期へかけて、細胞内局在の変化やリン酸化などの修飾に着目して解析を進める。また、昨年度の解析では、RBM42と結合するhnRNPKの細胞増殖への関与も明らかになったので、RBM42と同様に作用機序の解析を進める。RBM42によるアポトーシス制御については、XIAP mRNAの制御について詳細を解析するとともに、RBM42自身の制御に関して、アポトーシスが引き起こされるようなストレス存在下におけるRBM42の細胞内局在の変化やリン酸化などの修飾に着目して解析を進める。細胞増殖におけるRBM42の機能解析については、細胞培養のための器具、試薬、siRNA関連試薬、生化学的解析や局在解析に用いる抗体、mRNAの結合解析用in vitro RNA関連試薬に研究費を使用する。前年度に予定していたアポトーシス制御の解析を本年度行うため、細胞培養のための器具、試薬、siRNA関連試薬、アポトーシス検出試薬、カスパーゼ阻害剤などの試薬、mRNAの結合解析用in vitroRNA関連試薬に、繰り越した研究費を使用する。