hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EXiLE法と質量分析法とを用いたアレルゲンエピトープの網羅的解析技術の開発

本研究では、我々が近年開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression(EXiLE)法に基づき、新しいアレルゲンエピトープの網羅的解析技術を開発することを目指した。卵白アルブミン(OVA)をモデル抗原とし、OVAが液相と固相にある時である種のIgEの架橋活性が異なることを示すとともに、ペプチドをキャリアタンパク質に結合させることにより、極めて微量(数十pM)のエピトープペプチドをEXiLE法で検出できることを示した。今後、本エピトープ解析技術は、低アレルゲン化食品の開発や、より安全なバイオロジクス医薬品の開発等への貢献が期待される。我々は、ラット培養マスト細胞株に、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を安定的に発現させたRBL-SX38細胞をさらに改変し、転写因子NF-ATの活性化によりルシフェラーゼ発現を誘導できる新しい細胞株、RS-ATL8細胞を樹立した。この細胞株は、IgEを介する特異抗原の刺激によりルシフェラーゼ発現を誘導する。この試験法を我々はIgE crosslinking-induced luciferase expression(EXiLE)法と読んでいる。RS-ATL8細胞は、ヒトFcεRIを介してヒトのIgEにより感作できる他、内在性のラットFcεRIによりラットおよびマウスのIgEによっても感作することができる。そこで、Chondrex社から市販されているFcεRI架橋を誘導できるとされるマウス抗卵白アルブミン(OVA)-IgEモノクローナル抗体(E-C1)と、誘導できないとされる抗OVA-IgE抗体(E-G5)によりこの細胞を感作し、液相中および固相化した抗原(OVAおよびその消化断片)へのEXiLE応答を定量的に評価した。その結果、E-C1抗体により感作されたRS-ATL8細胞は液相中のOVAに応答して刺激前の6倍程度のルシフェラーゼ発現を誘導した。OVAを固相化した場合も同様であったが、この場合、ルシフェラーゼ発現は刺激前の50倍以上まで上昇した。抗原を固相化前に70°Cまたは90°Cで加熱すると、応答は劇的に向上し、約1/1000の抗原濃度で非加熱抗原と同程度の応答が誘導できた。一方、E-G5抗体で感作した場合は、液相中の抗原には全く応答しなかったが、抗原を固相化することにより刺激前の50倍以上という明瞭な応答が観察されるようになった。加熱の影響はほとんどなかった。消化断片への応答性も基本的に同様であったが、E-G5の応答性の方がやや消化に弱かった。我々が開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression(EXiLE)法は、ラット培養マスト細胞株に、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)遺伝子、および、転写因子NF-AT依存的ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入した細胞株、RS-ATL8細胞を用いる新しいアレルギー試験法である。この細胞はヒトのFcεRIのほか、内在性のラットFcεRIを発現することから、FcεRI架橋を誘導できるとされるマウス抗卵白アルブミン(OVA)-IgEモノクローナル抗体(E-C1)と、誘導できないとされる抗OVA-IgE抗体(E-G5)によりこの細胞を感作し、液相中および固相化した加熱処理OVA抗原へのEXiLE応答を定量的に評価したところ、E-C1抗体は溶液中のOVAに強く応答し、加熱処理OVAにはさらに強く応答することが分かった。一方、E-G5抗体は溶液中のOVAには全く応答しなかったが、これを固相化すると応答が見られるようになった。この結果は、E-G5抗体のOVAとの親和性が低いために溶液中のOVAではFcεRIを架橋できず、avidityの高まった固相化抗原でのみ応答が認められたものと推察された。そこでE-C1抗体とE-G5抗体のOVAとの結合性を表面プラズモン共鳴を用いて測定したところ、予想とは異なり、両者にはほとんど違いがないことが明らかになった。そこで、非還元下のSDS-PAGEによりOVAを分離し、両抗体によるウェスタンブロッティングを行なったところ、E-C1は加熱変性した凝固体を含むすべての分子量のOVAに結合したが、E-G5はほぼ二量体に相当するOVAにのみ結合し、加熱後には結合性が著しく減弱していることが分かった。この結果は、IgEの結合性と架橋活性が全く異なる現象であることを改めて明瞭に示したものと考えられる。本研究では、我々が近年開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression(EXiLE)法を土台にした、新しいアレルゲンエピトープの網羅的解析技術を開発することを目的に掲げる。EXiLE法は、ラット培養マスト細胞株に、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)遺伝子、および、転写因子NF-AT依存的ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入した細胞株である、RS-ATL8細胞を用いる。この細胞はヒトのFcεRIのほか、内在性のラットFcεRIを発現することから、FcεRI架橋を誘導できるとされるマウス抗卵白アルブミン(OVA)-IgEモノクローナル抗体(E-C1)と、誘導できないとされる抗OVA-IgE抗体(E-G5)を用いて、液相・固相中の抗原への応答性を比較した。最終年度は、これらのIgEの抗体のエピトープ解析に本手法が応用できるかどうかを調べた。

その結果、E-C1については、既報にある通りOVA中の6168番目のアミノ酸配列と強く反応したが、E-G5はやはり既報にある363374番目のアミノ酸配列とは全く反応しないことが分かった。昨年度までの結果と合わせると、E-G5のエピトープは、おそらくOVAが二量体を形成したときにのみ存在する構造であり、上記配列はその構造に類似する可能性はあるものの、実際のエピトープとは異なることが考えられた。また、E-C1のエピトープペプチドへの反応性は、従来法では数百nMのペプチド濃度を必要としたが、本手法では、わずか数十pMで十分であった。このように、本研究は当初の目的をほぼ達成し、極めて微量のエピトープペプチドを検出することができることを示すことができた。今後、本手法を発展させることで、低アレルゲン化食品の開発や、より抗原性の少ないバイオロジクス医薬品の開発などへの貢献が期待される。本研究では、我々が近年開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression(EXiLE)法に基づき、新しいアレルゲンエピトープの網羅的解析技術を開発することを目指した。卵白アルブミン(OVA)をモデル抗原とし、OVAが液相と固相にある時である種のIgEの架橋活性が異なることを示すとともに、ペプチドをキャリアタンパク質に結合させることにより、極めて微量(数十pM)のエピトープペプチドをEXiLE法で検出できることを示した。今後、本エピトープ解析技術は、低アレルゲン化食品の開発や、より安全なバイオロジクス医薬品の開発等への貢献が期待される。脱顆粒誘導活性の異なる2種のIgEの反応性の違いを、本研究によって開発した新しい技術によって明瞭に区別することができた。また、これらの反応性の違いが親和性(affinity)の違いによるものであるかどうかを物理化学的に解析した。さらに、それらの結果とウェスタンブロッティングの結果とを総合し、両抗体のエピトープの物理化学的特性を概ね明らかにすることができた。これらの結果を通じ、IgEと抗原との結合性と架橋誘導能の違いを区別することの重要性を示すことができた。医歯薬学本年度までに、当初予定していた固相EXiLE法を手法的に確立することにほぼ成功した。この手法は、貴重な患者血清を節約して超高感度アレルゲン測定ができるだけでなく、抗原側の物理化学的変化をマスト細胞の応答性という生理学的なエンドポイントによって再現性高く評価できる画期的な技術となるであろうことが期待される。最終年度に当たる来年度は、人工合成ペプチド等を用いて、実際にこの手法がアレルゲンのエピトープ同定に利用できるかどうかを評価する。研究代表者の異動および研究分担者の離職により、LC/MS/MSの条件検討が当初計画よりやや遅れている。EXiLE法に関する進捗は順調である。培養細胞株そのものや実験のプロトコルを改良し、アレルギー試験法としての利用法を確立するため、当初の研究計画より多くの条件検討が必要になり、研究補助員を短期採用してこれに取り組むこととしたため。次年度以降は、各種酵素処理により断片化した固相化抗原への応答性を解析し、エピトープ探索を行なう。なお、離職した研究分担者が遂行する予定であったLC/MS/MSに関する実験は、研究分担者が所属していた部署より研究協力者を得ることができ、全体としての研究の遂行には大きな問題はないものと考えている。
次世代高性能アナログ集積回路の総合設計システム

本研究では,アナログ・ディジタル混載システムLSIの鍵を握るアナログ回路を,回路設計からレイアウト設計までを含めた総合設計システムの構築を目的としている.レイアウトの微細化とともに,アナログ回路も高速な動作が可能となるが,一方で素子の耐圧が下がるため,高速性を享受するためには,低電源電圧動作不可欠となる.そこで,電源電圧間にトランジスタを2個しか縦積みにしない基本機能回路ブロックを提案し,その応用として,A-D変換回路を提案の回路ブロックを用いて構成し,その動作を確認している.次に,スイッチトキャパシタ回路における最大の問題点であるクロックフィードスルーを取り除く手法について,増幅回路を例として説明し,その有効性を計算機シミュレーションにより確認している.必要な機能を自動的に合成し,アナログ回路設計者不足を補う目的から,遺伝的アルゴリズムに基づいたアナログ回路の自動合成手法も提案し,2乗回路や3乗回路,絶対値回路などの非線形演算回路を容易に合成することができたことを確認している.最後に,ディジタル回路から基板を介した雑音がアナログ回路の性能を劣化させる.そこで,ディジタル回路から基板を介した雑音を低減するための手法を提案し,その有効性を計算機シミュレーションにより,確認している.以上を要するに,本研究では,計算機によるアナログ回路の統合設計環境の構築を目指し,アナログ回路の基本機能ブロックやアナログ回路の自動合成手法について検討を行った.また,アナログ・ディジタル混載LSIを実現する際に,ディジタル回路からの雑音の低減手法も併せて示した.アナログ回路設計手法からレイアウト設計への橋渡しに関しては,十分な成果が得られなかったものの,アナログ回路で必要となる基本機能を低電源電圧の下で構成することができるようになり,その他必要な機能回路もある程度自動的に合成できる見通しが得られた.今後,レイアウト設計に関しても十分な検討を行い,これらを有機的に結びつけ,アナログ集積回路の総合設計システムを実際に構築することが課題である.本研究では,アナログ・ディジタル混載システムLSIの鍵を握るアナログ回路を,回路設計からレイアウト設計までを含めた総合設計システムの構築を目的としている.レイアウトの微細化とともに,アナログ回路も高速な動作が可能となるが,一方で素子の耐圧が下がるため,高速性を享受するためには,低電源電圧動作不可欠となる.そこで,電源電圧間にトランジスタを2個しか縦積みにしない基本機能回路ブロックを提案し,その応用として,A-D変換回路を提案の回路ブロックを用いて構成し,その動作を確認している.次に,スイッチトキャパシタ回路における最大の問題点であるクロックフィードスルーを取り除く手法について,増幅回路を例として説明し,その有効性を計算機シミュレーションにより確認している.必要な機能を自動的に合成し,アナログ回路設計者不足を補う目的から,遺伝的アルゴリズムに基づいたアナログ回路の自動合成手法も提案し,2乗回路や3乗回路,絶対値回路などの非線形演算回路を容易に合成することができたことを確認している.最後に,ディジタル回路から基板を介した雑音がアナログ回路の性能を劣化させる.そこで,ディジタル回路から基板を介した雑音を低減するための手法を提案し,その有効性を計算機シミュレーションにより,確認している.以上を要するに,本研究では,計算機によるアナログ回路の統合設計環境の構築を目指し,アナログ回路の基本機能ブロックやアナログ回路の自動合成手法について検討を行った.また,アナログ・ディジタル混載LSIを実現する際に,ディジタル回路からの雑音の低減手法も併せて示した.アナログ回路設計手法からレイアウト設計への橋渡しに関しては,十分な成果が得られなかったものの,アナログ回路で必要となる基本機能を低電源電圧の下で構成することができるようになり,その他必要な機能回路もある程度自動的に合成できる見通しが得られた.今後,レイアウト設計に関しても十分な検討を行い,これらを有機的に結びつけ,アナログ集積回路の総合設計システムを実際に構築することが課題である.次世代高性能アナログ集積回路の実現を目指し、今年度は基本回路の構成について検討を行った.まず,低電源電圧化の要求に応えるため,電源電圧と接地間にトランジスタが2個しか存在しない回路構造に限定し,アナログ演算で必要な電圧平均回路を構成した.電源電圧が1Vであっても約0.75Vという広い入力信号範囲が得られた.また,今後実用化が期待されるスイッチトカレント回路のバイアス電流を入力信号に応じて制御することにより消費電力を低減する手法を提案した.提案手法を用いてスイッチトカレント回路の基本回路であるサンプルホールド回路を構成し,この回路が構造的に最小と考えられる電力程度しか必要とせず,従来回路と比較して大幅に消費電力を低減できることを示した.最後に,アナログ・ディジタル混載集積回路に適したプロセスであるCMOSプロセスによりアナログ集積回路を構成する際に最大の問題となる特性の歪みについて,MOSFETのバックゲート端子に適切なバイアス電圧を加えることにより,大幅に歪みを低減できる手法を提案した.増幅器やフィルタなど様々なアナログ回路の基本ビルディングブロックとなるOperational Transconductance Amplifierを提案手法を用いて構成し,従来問題となっていた基板効果やキャリアの移動度の変化の影響も受けず,低歪みであることを確認した.今後はこれらの連続時間系,離散時間系のアナログ基本回路の研究を基に,より大規模な回路を設計並びに集積化し,集積化した際の寄生素子の影響やその影響を受けにくいレイアウト手法の検討を進めていく.次世代高性能アナログ集積回路の実現を目標として,昨年度に引き続き,今年度もアナログ回路の基本構成要素の検討を中心に行った.集積回路プロセス技術の進歩により素子は微細化し,低消費電力で高速に動作する.しかし,素子の微細化による素子耐圧の低下のため電源電圧が低下してきている.

これに対応するため,3V以下の低電源電圧でも動作可能なアナログ基本構成要素を各種提案した.まず,電源電圧間にトランジスタを2個しか縦積みとしない構成により,1V電源電圧で1V出力電圧の得られる電圧フォロワの構成方法を提案し,提案回路をMOSトランジスタスイッチの特性改善に応用した.また,フィルタなどの構成に重要な積分器について,内部の積分容量に加わる電圧を圧縮できるCompanding積分器を少数のMOSFETで構成する手法についても提案し,3V電源電圧での動作を確認した.さらに,同一種類のMOSFETを用いて,電圧制御電流源の一種であるOTAに加えることのできる入力電圧範囲を電源電圧まで拡大する手法を提案し,3V電源電圧の下で目標の入力電圧範囲を実現できることを確認した.以上の基本構成要素の検討の他に,今年度はアナログ集積回路に加わる雑音の低減手法についても検討を行った.より柔軟な汎用性のあるシステムを構築するために,しばしばアナログ回路とディジタル回路を同一チップ上に構成する.この場合,ディジタル回路からのスイッチング雑音がアナログ回路に混入し,アナログ回路の特性を劣化させる.この雑音を低減するために,雑音と同じ大きさで符号が反転した信号を加えて雑音を打ち消す手法を提案した.この手法の有効性を確認するためにシミュレーションを行い,100MHzという高い周波数においても15dB程度雑音を低減できることを確認した.今後は,これらの成果を基に,より大規模なアナログ集積回路の構成について検討し,集積回路化に不可欠なレイアウト手法についても検討を進めていく.次世代高性能アナログ集積回路の実現を目標として,アナログ回路の基本構成要素及ぴアナログ回路の自動合成手法の検討を中心に研究を行った.集積回路プロセス技術の進歩により素子は微細化し,低消費電力で高速に動作する.しかし,素子の微細化による素子耐圧の低下のため電源電圧が低下してきている.これに対応するため,3V以下の低電源電圧で動作可能で,しかも回路中の最も低い電位から最も高い電位までの範囲の入力を許容できるアナログ基本構成要素を各種提案した.まず,MOSFETには電流が流れない遮断領域と呼ばれる領域があり,この遮断領域のため入力電圧範囲が限定されていることに着目し,遮断領域を持たない等価MOSFET回路を提案した.さらに,別の方法として,仕様から定まる最大入力電圧範囲を回路の入力範囲に一致させる変換回路を提案し,広い入力電圧範囲を持った回路を容易に実現できることを示した.また,従来から良く集積回路で用いられているスイッチトキャパシタ回路を少ない素子数で,しかも特性を損なわずに実現する手法についても提案した.以上のアナログ回路の基本構成要素の設計手法を基に,今年度はアナログ回路を自動合成する手法についても検討を行った.
流体流動電磁法による地下流体のモニタリングシステムの高度化

流体流動電磁法は石油・天然ガス・地熱流体・地下水などの資源流体のリアルタイムモニタリングを目的とした物理探査法である。地下の資源流体が流動すると、界面動電現象によって、固液の境界付近に流動方向に沿った流動電流が発生する。この電流の発生によって、地表面では電場と磁場の変化が生じる。流体流動電磁法は、このような資源流体の動的挙動に着目した、研究代表者らが考案したモニタリング探査法である。流体流動電磁法では、地下の資源流体に関連した電磁場変化を観測するために、地表面での電場と磁場の同時測定が不可欠である。本年度は、流体流動電磁法のプロトタイプ測定機を設計して試作した。このプロトタイプ測定機を用いて、地熱地帯やダムの漏水現場で試験調査を実施した。地熱地帯の試験調査では、地下の地熱流体の流れに関連した電磁場変化を測定できた。なお、漏水現場の調査については測定データが膨大なため、現在解析の途中である。流体流動電磁法のプロトタイプ試作機を用いた試験調査では、複数配置した測点での電場2成分と磁場3成分の同時測定を実施することができた。また、地熱地帯での試験調査では、地熱流体の生産/停止に伴う地下流体の流動に同期するような電磁場変化が測定できたため。今後は試作した測定基板を改良して、さらに高性能の計測機器の開発を行なう。また、この高性能の改良機を用いて地下水の可視化実験を行う予定である。地下水の可視化実験は、自然湧水が観察された地域や、地すべりの危険箇所などから試験候補地を選択して実施する。さらにフィールド実験と並行して、流体流動電磁法データの解析法や解析結果の効果的な表示法などについても研究する。
超解像単一分子イメージングによって明らかにする高分子ゲルのナノ構造・ダイナミクス

ゲルは高分子鎖が三次元的に架橋した溶媒を含んだネットワーク構造をとっているが、そのネットワーク構造は不均一であり、架橋点の分布や鎖セグメント濃度には粗密が存在していることが知られている。本研究は、超解像蛍光イメージングに基づく手法を高分子ゲルの計測に新たに導入し、ゲルに内在する網目鎖構造と力学特性の不均一性について実空間で直接評価する方法論を確立し、ゲルの不均一性について明らかにすることを目的としている。単一分子局在化顕微鏡によるナノ光学イメージングとマイクロレオロジー法を用いることで、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)ゲル中に存在するネットワーク鎖の構造と局所粘弾性の定量解析に成功した。本年度においては、高分子ネットワークの内部構造を直接的に高分解能観察することを実現する、超解像光学顕微鏡の開発を中心に行った。超解像顕微鏡観察法としては様々な方法論が提案されているが、ここではdSTORM(direct stochastic optical reconstruction microscopy)と呼ばれる手法を採用する。この超解像顕微鏡では、励起光強度によって蛍光状態と非蛍光状態を制御することのできる色素分子を用いることが必要となる。本研究では色素分子としてローダミンBの利用を検討した結果、dSTORM観察に有用であることが分かった。ローダミンBは、一般的にdSTORMで用いられているAlexa系色素に対して発光強度や寿命の点で劣るものの、価格や高分子試料への導入の面で有利であるため、今後の実験でこちらを中心に利用することとした。一方、超解像光学顕微鏡のハードウェア面からの改良についても検討した。本年度では、最新の高量子収率のsCMOS(科学計測用相補型金属酸化膜半導体)カメラを導入することで、高い感度での蛍光シグナル検出と高速イメージングを目指した。これに併せて光強度のレーザー光源を導入するとともに、顕微鏡光学系における光学素子を最適化することで高感度・高速イメージングを目指した。その結果、単一蛍光分子を8 msの露光時間で検出し、ゲルの高速なdSTORM計測を実現した。年度当初に計画していた、超解像顕微鏡の高感度・高速化および試料のラベルに用いる色素の選定を行い、ほぼ計画通りの進捗となっている。本研究は光を用いながらナノメートルスケールの空間分解能を示す超解像蛍光顕微鏡の開発を行い、これを用いて高分子ゲルの内部における網目構造の不均一性および力学特性の分布を明らかにすることを目的としている。前年度において超解像蛍光顕微鏡の基本的なシステム構築とゲルの内部構造の高分解能観察を実現したことを受けて、本年度においてはマイクロレオロジー法による局所的な動的粘弾性評価の実現に力点をおいて研究を遂行した。ゲル内部に50 - 100 nmの蛍光性ポリスチレン粒子を分散した試料を作製し、そのブラウン運動を超解像顕微鏡で追跡した。粒子の位置は超解像法によって20 nmの空間分解能、10 msの時間分解能で取得可能であり、そのブラウン運動の軌跡から複素粘弾性率を評価するソフトウェアの開発もあわせて行った。まずグリセリンを用いた試験測定を行い、角周波数範囲0.1100 Hzにおいて従来のマクロスコピックなレオメーターと同じ結果が得られ、定量的な評価を行うことができることを確認した。このようなマイクロレオロジー測定システムの構築によって、ポリN-イソプロピルアクリルアミドのハイドロゲルに対して、局所粘弾性の評価を行った。その結果、アクリルアミドゲルの内部は位置によって複素粘弾性率が異なることが示され、最も弾性率の低い領域と最も高い領域では、20倍以上の弾性率の差があることが明らかにした。またこのような粘弾性の空間不均一性はゲルの作製条件に依存することを示した。代表者の所属機関移籍にともなう実験設備移設によって一定期間の研究遂行の中断を余儀なくされたため、一部の計画に遅れが生じている。最終年度においては、単一分子局在化法による超解像光学顕微鏡観察によるアクリルアミドゲルのネットワーク鎖構造の直接観察に臨んだ。高分子鎖観察のためにローダミン誘導体で蛍光ラベルされたアクリルアミドモノマーを合成し、これを重合することで蛍光ラベルされたゲル試料の作製を試みたが、通常のアクリルアミドとは色素分子による影響のためか、通常のアクリルアミドゲルとは異なる物性を有するものであった。この際、ローダミン系の色素分子以外にもフルオレセインやカルボシアニンなど幾つかの分子構造の異なる色素でラベルされた試料合成を行ったが、いずれについてもゲルの合成に至ることはできなかった。そのため、蛍光ラベルしていないゲル試料に対してローダミン色素分子を含浸し、溶媒相が明るく観察されるよう試料作製を行うことで、ゲルの内部構造の可視化に成功した。超解像顕微鏡によって、40 nmの空間分解能での構造観察に成功し、ゲル内部に存在する溶媒相の構造を明瞭に画像化することができた。さらに、超解像蛍光顕微鏡観察を行いながら、同時に粒子トラッキング型マイクロレオロジーを行うことで、ゲル内部の不均一構造に相関した局所粘弾性測定を実現することを目指した。しかしながら上述のアクリルアミドの蛍光ラベルに時間を要したこととレーザー機器使用のための許可手続き(所属機関の規程による)から十分な時間をとることができず、観察システムの構築までは行うことができたものの、参照試料の観察にとどまり、本来目指していたハイドロゲルの局所ネットワーク構造と局所力学特性の評価には至らなかった。しかし、上記のように構造-物性相関を直接評価可能なシステム開発はほぼ完成したため、期間終了後も同システムを用いて継続して研究を行う。

ゲルは高分子鎖が三次元的に架橋した溶媒を含んだネットワーク構造をとっているが、そのネットワーク構造は不均一であり、架橋点の分布や鎖セグメント濃度には粗密が存在していることが知られている。本研究は、超解像蛍光イメージングに基づく手法を高分子ゲルの計測に新たに導入し、ゲルに内在する網目鎖構造と力学特性の不均一性について実空間で直接評価する方法論を確立し、ゲルの不均一性について明らかにすることを目的としている。単一分子局在化顕微鏡によるナノ光学イメージングとマイクロレオロジー法を用いることで、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)ゲル中に存在するネットワーク鎖の構造と局所粘弾性の定量解析に成功した。今年度で改良した計測系を用いてゲルのネットワーク鎖の直接イメージングを試みるとともに、マイクロレオロジーによるゲル内の局所的な複素弾性率の定量的な評価を実現することを目指す。ゲル試料内部に分散したナノメートルスケールの微小粒子のブラウン運動の軌跡を超解像顕微鏡によって記録することには前年度までに成功しているため、この軌跡データから一般化Einstein-Stokesの関係式に基づいて周波数依存複素弾性率を見積もるソフトウェア開発を行う。角周波数範囲0.01100 Hzにおける局所粘弾性評価を実現する。一方、ゲルの内部構造評価においては、蛍光プローブ分子の導入に課題が生じたため、使用する蛍光プローブにおいても、キサンテン系分子やカルボシアニン系分子について広く試用することで、より高解像度の超解像イメージングを実現するための条件検討を行う。また側鎖に蛍光性色素分子をラベルしたアクリルアミド系モノマー分子を合成し、ネットワーク鎖を直接的に蛍光観察することを試みる。最終的には、超解像イメージングとマイクロレオロジー法を融合し、ゲル内部のネットワーク構造と、その局所力学特性のin situ計測を実現する測定システムを完成させることを目指す。今年度においては、試料内部の局所領域に対して定量性の高い複素粘弾性測定が可能なマイクロレオロジーシステムを構築することができた。次年度においては、前年度の広視野超解像蛍光顕微鏡との統合的な測定を実現し、ハイドロゲルの網目構造と、局所粘弾性の同時評価を行うことが可能なシステムを完成させることを目指し、これを用いてアクリルアミド系ゲルに内在する空間不均一性について明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。高分子物性29年度が最終年度であるため、記入しない。
担癌生体末梢血中の樹状細胞の抗原提示機能の評価方法の開発

リンパ球に抗原を提示して癌に対する免疫応答カスケードを活性化させる樹状細胞の癌組織内への浸潤程度が予後や生体の癌に対する免疫応答能を予測できる有用な因子となることを明らかにした。また,樹状細胞を癌細胞の凍結・融解処理操作にて作製した癌抗原で刺激すると,主要組織適合抗原クラスIIに拘束性の特異的キラー細胞が誘導されることも証明した。さらに、低用量の抗癌剤(フルオロウラシルとシスプラチン)にて癌細胞にアポトーシスが誘導されることを通常の病理組織染色(HE染色),免疫組織染色(Hoechst染色),透過型電子顕微鏡所見による形態的観察のみならず,蛋白および遺伝子のレベルからも証明した。一方,樹状細胞をパルスする際に用いる癌抗原に関して、野生型p53を発現している癌細胞では抗癌剤処理によりアポトーシスを誘導したものを、逆に変異型p53を有している癌細胞では凍結融解処理をして得られた癌抗原を用いた方が高いキラー活性を持つTリンパ球が誘導される可能性を示唆するデータが得られた。このような基礎的研究結果に基づき,倫理委員会の承認を得た後,十分なインフォームド・コンセントのもとに、3年間の研究期間内に10症例(乳癌、大腸癌、膵癌など)に対して樹状細胞でパルスした得られた自己の活性化リンパ球の移入療法を実施した。皮膚転移巣の縮小や胸水の消失など、臨床的には比較的良好な治療効果が得られたことから、『活性化自己リンパ球移入療法』として高度先進医療の承認を申請し、現在審査中である。進行癌あるいは再発癌の6症例(胃癌:2例、乳癌:2例、食道癌、大腸癌:各1例)を対象として、末梢血より単核球を比重遠心法にて分離後、プラスチック付着細胞を採取し、IL-4(1ng/ml)とGM-CSF(50ng/ml)の存在下に樹状細胞(DC)を誘導した。そして、このDCと胸水あるいは局所再発病巣より採取した自己の癌細胞をmitomycin Cにて処理したものとを混合培養し、monocyte conditioned mediumを加えてDCを活性化した。そして、活性化されたDCのプロフェッショナルな抗体呈示機能を臨床的に検討する目的で、当該症例の末梢血単核球(PBMC)1×10^7個とIL2添加培地で混合培養し、7日後あるいは14日後に得られたエフェクター細胞を経静脈的あるいは局所的に投与して抗腫瘍効果を調べた。なお、PBMC培養24時間後から4日目まではCD3抗体固層化dish上で培養した。乳癌胸腔内転移例では、胸水と胸腔内病変の消失がみられ、食道癌縦隔再発と皮膚転移例ではエフェクター細胞を局注した部位での皮膚転移巣の消失が観察された。治療に伴う副作用として全例に発熱がみられたが、重篤ではなかった。また、発熱以外の有害事象は認められなかった。以上から、進行した担癌生体においても、末梢血から誘導した樹状細胞に抗原呈示能を賦与できる可能性が判明したため、今後、胃癌、大腸癌症例を対象として、末梢血中の樹状細胞の抗原呈示機能を評価する予定である。【今年度の研究成果】1.平成12年度は2症例(癌性胸・腹膜炎を伴った進行膵頭部癌症例と肛門管癌の局所再発症例)に対して、末梢血由来の単球にIL-4とGM-CSFを添加して得られた樹状細胞をMMC処理自己腫瘍細胞でパルスして得られた成熟樹状細胞と、当該患者由来のLAK細胞を各々胸腔内あるいは再発局所に投与した。胸腔内投与症例では胸水の消失が認められたが、局所投与例では抗腫瘍効果は判然としなかった。2.樹状細胞をパルスする抗原として、MMC処理腫瘍細胞の他に、低用量抗癌剤でアポトーシスをきたした癌細胞、凍結・融解処理により得られたcell lysateなどを用いて比較検討したが、三者間ではパルス原としての貢献度に有意差は認められなかった。【平成13年度の研究展開】1.各種抗原で未成熟樹状細胞をパルスする際に、非特異的免疫賦活剤を添加することにより、樹状細胞の抗原提示能の増強が可能か否かを検討する。2.樹状細胞移入療法を実施予定症例に対して、あらかじめ非特異的免疫賦活剤を投与しておき、その後末梢血を採取して単球由来の未成熟樹状細胞を誘導し、腫瘍抗原にてパルスする際に、さらに当該症例に投与したものと同一の免疫賦活剤をin vitroで添加してboostした場合の抗原提示機能について検索する。3.樹状細胞移入療法実施症例を集計・分析し、本療法の適応症例選択のためのパラメーターの有無を調べる。

一方,樹状細胞をパルスする際に用いる癌抗原に関して、野生型p53を発現している癌細胞では抗癌剤処理によりアポトーシスを誘導したものを、逆に変異型p53を有している癌細胞では凍結融解処理をして得られた癌抗原を用いた方が高いキラー活性を持つTリンパ球が誘導される可能性を示唆するデータが得られた。このような基礎的研究結果に基づき,倫理委員会の承認を得た後,十分なインフォームド・コンセントのもとに、3年間の研究期間内に10症例(乳癌、大腸癌、膵癌など)に対して樹状細胞でパルスした得られた自己の活性化リンパ球の移入療法を実施した。皮膚転移巣の縮小や胸水の消失など、臨床的には比較的良好な治療効果が得られたことから、『活性化自己リンパ球移入療法』として高度先進医療の承認を申請し、現在審査中である。
グラフ数え上げ法によるスピン系の表面臨界挙動に関する1/d展開法

自己回避酔歩(スピン成分→0)の枚挙(数え上げ)法を東北大計算センターS3900で実行した。そのデータをもとに1/d展開法を行い,普遍的臨界挙動を検討した。特に,表面臨界指数を推定し,スケーリング理論の検証を行った。1.界面の存在しない場合自己相互作用を考慮して,d次元超立方格子空間(d=2-6)上のnステップSAW(自己回避酔歩)の総数Cn及び末端間距離Rnをn=11まで求めた。これより,非整数次元も含む任意次元について,自由エネルギーとその振幅,広がりの振幅等の1/d展開を5次項まで求めた。Coherent-Anomaly法を適用し,SAW,θ鎖(θ状態の高分子鎖),NAW(隣接自己回避酔歩)について,γ(磁化率の指数),ν(広がりの指数)を推定し,この方法の有効性を確認した。2.表面臨界挙動(1)少なくとも一端が界面上にある場合C^<(1)>_n,R^<(1)>_nをd=2ではn=24,d=3ではn=15まで求めた。まず補正項指数△とその係数Bを推定し,原級数を(1+Bn^<-△>)で割ることにより特異点を消去した。変換級数よりNeville表を利用する外挿法で推定した磁化率指数は,γ_1=0.9465±0.0005(d=2),0.715±0.002(d=3),ν_1=0.7525±0.0015(d=2),0.611±0.003(d=3)である。(2)両端が界面上にある場合C^<(11)>_n(n≦26,d=2),R^<(11)>_n(n≦16,d=3)より,(1)と同様にして,γ_<11>=-0.192±0.008(d=2),-0.39±0.01(d=3),ν_<11>=0.750±0.001(d=2),0.586±0.004(d=3)。スケーリング関係式2γ_1-γ_<11>=γ+ν(1)及びγ_<11>=ν-1 (2)が提案されている。本推定値より2γ_1-γ_<11>=2.085±0.0009(d=2),1.82±0.04(d=3)。既知の値よりγ+ν=2.093(d=2),1.749(d=3)であるから,(1)式の成立が確認された。それに反して,本推定値は(2)式を支持しない。またν=ν_1=ν_<11>の関係も確認された。

本推定値より2γ_1-γ_<11>=2.085±0.0009(d=2),1.82±0.04(d=3)。既知の値よりγ+ν=2.093(d=2),1.749(d=3)であるから,(1)式の成立が確認された。それに反して,本推定値は(2)式を支持しない。またν=ν_1=ν_<11>の関係も確認された。
地域の中核的人材育成プロセスのDEAによる効率性評価

本研究の目的は、現在、生産や経済を維持できないほど人口の減少が著しい多くの自治体において、それでもなお地域に根付きつつ、地域再生を担う中核的人材を効率的に生みだす育成プロセスを定量的に明らかにするため、動的ネットワーク包絡分析法を導入することにより、各教育機関の評価と同時に、育成プロセスの全体を評価する新しい概念・手法を導入することである。研究計画・方法としては、(1)各教育プロセスにおける基礎データの洗い出し、(2)地域の各教育プロセス主体(小学校、中学校、高等学校、職業高校、大学、専門学校等)をノード化したネットワーク構造のモデル化、(3)実態調査をもとにするベンチマーク用参照モデルの探索およびキャリブレーション、(4)動的ネットワークDEA分析による効率化比較実験、(5)政策課題抽出手法の一般化、(6)効率性の決定要因分析、という一連ネットワークDEAおよび回帰分析を用いた「教育プロセスの総合的評価」に関する研究と、並行して行われる、現在も発展を遂げつつある動的ネットワークDEA分析手法の当該対象への適用についての「理論的・手法的開発」の研究、および、「実態調査」に分かれるが、いずれも相互に関連を持つ。平成30年度には、上記の研究計画・方法の「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、(1)各教育プロセスのための基礎データの収集を行った。同時にネットワークモデルのノードとなる主体、およびそれへのインプット、アウトプットの整理を再検討した。さらにネットワークDEAをはじめとする数理計画的分析手法の研究とともに実態調査準備で候補化される現実の小地域からの情報の取集を行うことができた。本年度は「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、各教育プロセスのための基礎データの収集を行い、またネットワークモデルのノードとなる主体、およびそれへのインプット、アウトプットを整理することができ、数理計画的分析手法の研究とともに実態調査として候補化された現実の小地域からある程度の情報をもとに、モデル化を行うことができたが、さらに広い複数の地域の効率性比較分析まで行えていない。予定では政策手法として提言可能な手法として整理を行うとともに実務家も利用可能なツール化の検討を開始するとしているが、それらの開始が遅れている状況である。今後は、理論研究、およびモデル化手法の開発については、引き続き最近までの研究成果をサーベイし、実態調査については複数の地域の効率性分析を行うために、複数のより広い地域の情報を収集したい。次に地域間比較実験について、動的ネットワークDEA分析による複数地域の教育プロセス効率性比較分析に取りかかり、政策手法として提言可能な手法として整理を行うとともに実務家も利用可能なツール化の検討を開始したい。本研究の目的は、現在、生産や経済を維持できないほど人口の減少が著しい多くの自治体において、それでもなお地域に根付きつつ、地域再生を担う中核的人材を効率的に生みだす育成プロセス(教育のパス)を定量的に明らかにするため、近年急速にその理論的発展および応用分野の拡大が注目されている、動的ネットワーク包絡分析法(Dynamic Network Data Envelopment Analysis)を導入することにより、各教育機関(初等教育機関、高等教育機関)の評価と同時に、育成プロセスの全体を評価する新しい概念・手法を導入することである。研究計画・方法としては、(1)各教育プロセスにおける基礎データの洗い出し、(2)地域の各教育プロセス主体(小学校、中学校、高等学校、職業高校、大学、専門学校等)をノード化したネットワーク構造のモデル化、(3)実態調査をもとにするベンチマーク用参照モデルの探索およびキャリブレーション、(4)動的ネットワークDEA分析による効率化比較実験、(5)政策課題抽出手法の一般化、(6)効率性の決定要因分析、という一連のネットワークDEAおよび回帰分析を用いた「教育プロセスの総合的評価」に関する研究と、並行して行われる、現在も発展を遂げつつある動的ネットワークDEA分析手法の当該対象への適用についての「理論的・手法的開発」の研究、および、「実態調査」に分かれるが、いずれも相互に関連を持つ。平成28年度には、上記の研究計画・方法の「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、(1)各教育プロセスのための基礎データの洗い出し、および「理論的・手法的開発」の研究に関する理論的予備研究を集中的に行った。本年度は「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、各教育プロセスのための基礎データの洗い出し、および「理論的・手法的開発」の研究に関する理論的予備研究についておおむね順調に進展させることができた。平成29年度には、上記の研究計画・方法の「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、

(1)各教育プロセスのための基礎データの洗い出しおよびネットワークモデルの構築実験、すなわち各層の基礎データを引き続き収集を続け、またネットワークモデルのノードとなる主体、およびそれへのインプット、アウトプットの整理を行った。次にネットワークDEAをはじめとする数理計画的分析手法の研究とともに実態調査準備で候補化される現実の小地域から得られる情報をもとに、モデル化の準備を行った。本年度は「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、各教育プロセスのための基礎データの洗い出しおよびネットワークモデルの構築実験、すなわち各層の基礎データを引き続き収集を続けることができ、またネットワークモデルのノードとなる主体、およびそれへのインプット、アウトプットを整理することができた。また、数理計画的分析手法の研究とともに実態調査準備で候補化される現実の小地域から得られる情報をもとに、モデル化の準備についておおむね順調に進展させることができた。本研究の目的は、現在、生産や経済を維持できないほど人口の減少が著しい多くの自治体において、それでもなお地域に根付きつつ、地域再生を担う中核的人材を効率的に生みだす育成プロセスを定量的に明らかにするため、動的ネットワーク包絡分析法を導入することにより、各教育機関の評価と同時に、育成プロセスの全体を評価する新しい概念・手法を導入することである。研究計画・方法としては、(1)各教育プロセスにおける基礎データの洗い出し、(2)地域の各教育プロセス主体(小学校、中学校、高等学校、職業高校、大学、専門学校等)をノード化したネットワーク構造のモデル化、(3)実態調査をもとにするベンチマーク用参照モデルの探索およびキャリブレーション、(4)動的ネットワークDEA分析による効率化比較実験、(5)政策課題抽出手法の一般化、(6)効率性の決定要因分析、という一連ネットワークDEAおよび回帰分析を用いた「教育プロセスの総合的評価」に関する研究と、並行して行われる、現在も発展を遂げつつある動的ネットワークDEA分析手法の当該対象への適用についての「理論的・手法的開発」の研究、および、「実態調査」に分かれるが、いずれも相互に関連を持つ。平成30年度には、上記の研究計画・方法の「教育プロセスの総合的評価」に関する研究の内、(1)各教育プロセスのための基礎データの収集を行った。同時にネットワークモデルのノードとなる主体、およびそれへのインプット、アウトプットの整理を再検討した。さらにネットワークDEAをはじめとする数理計画的分析手法の研究とともに実態調査準備で候補化される現実の小地域からの情報の取集を行うことができた。
シアノバクテリアの持つロドプシンの機能解析：彼らは光をどう使い分けるのか？

シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC 7509)から未知ロドプシンを見出しSyHRと命名した。異種発現系を用いた機能解析の結果、SyHRは光でCl-やSO42-を細胞内に輸送することが示された。また分光解析の結果、SyHRは緑色(約540 nm)の光を利用することが分かった。本研究で、シアノバクテリアの持つSyHRがクロロフィルが利用しない緑色の光を利用し、陰イオンを能動的に細胞内に輸送することが明らかになった。また、これまでに二価の陰イオンを輸送するロドプシンは見つかっておらず、本研究で初めてその存在が示された。生物は太陽光エネルギーをどのような機構で化学エネルギーに変換しているのか?次世代シーケンサーの登場により機能未知光受容体配列(ロドプシン)が爆発的なスピードで蓄積する近年において、その利用機構はこれまで考えられていた以上に多様であることが分かってきた。本研究では、シアノバクテリアの持つ機能未知ロドプシンの機能と生理的役割を解き明かすことで、これまで考えられてこなかったクロロフィルとロドプシンの2つの光エネルギー利用機構がどのように「機能」および「光の色」の使い分けを行っているのかを明らかにすることを目的としている。H27年度は、昨年度までの研究で見出したシアノバクテリアの持つ機能未知ロドプシンの機能解析を大腸菌による異種発現系を用いて実施した。その結果、これまでに知られていない系統群に属する光駆動型の陰イオン輸送ポンプであることが明らかになった。H27年度の研究で、シアノバクテリアの持つ機能未知ロドプシン1配列の機能を明らかにすることに成功したため。具体的には、分子系統解析及びアミノ酸配列などから機能が推定できないロドプシン遺伝子の異種発現解析を実施し、シアノバクテリアの持つ新規ロドプシンが光駆動型の陰イオンポンプであることを明らかにした。本研究では、シアノバクテリアの持つ機能未知ロドプシンの機能と生理的役割を、最新の情報科学および全遺伝子合成技術を駆使し多角的に解き明かすことで、これまで考えられてこなかった2つの光エネルギー利用機構がどのように「機能」および「光の色」の使い分けを行っているのかを明らかにする挑戦的な試みである。平成28年度は、淡水性シアノバクテリアであるSynechocystis属の細菌が持つ未知ロドプシンの機能解析を実施し、光で塩化物イオンを細胞外から細胞内に輸送するロドプシンであることを明らかにした。またイオン輸送特性を調べた結果、塩化物イオンの他に硫酸イオンも輸送することが分かった。これまで二価の陰イオンを運ぶイオン輸送型ロドプシンは見つかっておらず、本研究で初めてその存在が示された。さらに、本研究で発見したロドプシンと同じ機能を持つと予想されるロドプシンが淡水性シアノバクテリアゲノム上に幅広く分布することが徐々に分かってきた。しかしながら、淡水に生息するこれらのシアノバクテリアが実際に生息する環境で光エネルギーを利用してどのイオンを輸送しているかは不明である。今後の研究では、遺伝子欠損シアノバクテリア株などを用いることでシアノバクテリアの光エネルギーの使い分けを明らかにしたい。淡水性シアノバクテリアから新規の一価及び二価陰イオン輸送ロドプシンを発見し、論文として報告した。淡水環境は、海洋より遥かに溶存イオンが少ないことが知られている、そのため陰イオン輸送ロドプシンは存在しないと考えられていたが本研究でその存在が明らかとなった。本研究では、シアノバクテリアの持つ機能未知ロドプシンの機能と生理的役割を、情報科学および全遺伝子合成技術を駆使し多角的に解き明かすことで、これまで考えられてこなかった2つの光エネルギー利用機構がどのように「機能」および「光の色」の使い分けを行っているのかを明らかにすることを目的として行った。平成28年度に、淡水性シアノバクテリアであるSynechocystis属の細菌が持つ未知ロドプシンの機能解析を大腸菌を用いた異種発現系で実施した。その結果、光で塩化物イオンや硫酸イオンを細胞外から細胞内に輸送するロドプシンであることが明らかになり、SyHRと命名した。本年度は、SyHRの生理的役割を調べるため、シアノバクテリアSynechocystis PCC 6803株に自然形質転換法を用いてSyHRの相同組み換えを行った。その結果、PCC 6803株のゲノム上にSyHRを組み替えることに成功した、今後得られた変異株を用いてSyHRの生理的役割の解明を行う予定である。また、シアノバクテリアSyHRと類似した配列を持つ海洋細菌を見出し、機能および分光的特徴を報告した。今後、これまでの研究で得られた株を用いて、クロロフィルとロドプシンの使い分けの詳細を明らかにしたい。

シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC 7509)から未知ロドプシンを見出しSyHRと命名した。異種発現系を用いた機能解析の結果、SyHRは光でCl-やSO42-を細胞内に輸送することが示された。また分光解析の結果、SyHRは緑色(約540 nm)の光を利用することが分かった。本研究で、シアノバクテリアの持つSyHRがクロロフィルが利用しない緑色の光を利用し、陰イオンを能動的に細胞内に輸送することが明らかになった。また、これまでに二価の陰イオンを輸送するロドプシンは見つかっておらず、本研究で初めてその存在が示された。次年度以降は、複数のシアノバクテリアロドプシン遺伝子の機能解析を進めるとともに、精製したロドプシンタンパク質の詳細な分光解析を行う予定である。またシアノバクテリア野生株のロドプシン遺伝子欠損株の作成を試み、ロドプシンがシアノバクテリア生理性状に与える影響の解明も試みる。最終年度は、これまでの研究で見つけたシアノバクテリアロドプシンの生理的役割を明らかにするため、ロドプシン遺伝子欠損シアノバクテリア株やロドプシン遺伝子導入シアノバクテリア株の作成を試みる。これらの株を作成することで、シアノバクテリアロドプシンの細胞内での生理的役割を解明し、その生態学的な意義を考察したい。海洋微生物学実験補助作業を行う研究員の雇用が当初予定よりも大幅に遅れたため。本年度から実施予定であった遺伝子欠損株や遺伝子導入株の作成は、特殊な技術を要するため、実験作業を行う研究員の雇用が当初予定よりも大幅に遅れたため。繰越費用は、次年度以降の人件費に使用する予定である。繰越費用は、次年度の人件費に使用する予定である。
高校生を対象とした援助行動を抑制する要因の援助要請行動モデルにおける影響の検討

本研究では,高校生を対象に,悩みの経験から学校適応に至るモデルの中で,援助要請行動を抑制する要因(以下:援助要請抑制要因)が,どのように影響しているかを検討することを目的とした。援助要請行動を抑制する項目群は,援助要請行動抑制要因を測定する目的で作成された。大谷(平成23年度奨励研究課題番号23906005)が収集した項目や先行研究(e.g.永井・新井,2007;加茂田・秋光,2012)の項目を参考に,臨床心理学を専門とする大学教員1名,高校教員1名で高校生に適用できるよう検討し52項目を作成した。調査は,A県の高等学校計2校に在籍する高校1年生から高校3年生までの生徒227名を対象とした。悩んでいることについて先生に話をする場合,各項目内容に示す事柄について,どの程度思うかについて5件法で回答を求めた。援助要請行動を抑制する項目群の52項目の得点について,主因子法,プロマックス回転による因子分析を行った。最終的に32項目を削除し,5因子20項目(各因子4項目)が抽出された(回転〓の説明率は51.80%)。第1因子を「相手への配慮」因子,第2因子を「表現への不安」因子,第3因子を「理解への不信」因子,第4因子を「評価への懸念」因子,第5因子を「秘密保持への懸念」因子と命名した。信頼性係数(Cronbachのα係数)はそれぞれ.910,.913,.912,.865,.930であり,内的一貫性が確認されたため,各下位尺度の項目得点の合計をそれぞれの下位尺度の得点として使用した。次に,先行研究(本田・新井・石隈,2010)のモデルに,援助要請抑制要因を組み込んで,共分散構造分析によるモデルの検討を行った。モデルは,第1水準に「悩みの経験」を設定し,第2水準に先行研究の「援助要請行動スキル」に加えて本研究で作成した「相手への配慮」「表現への不安」「理解への不信」「評価への懸念」「秘密保持への懸念」を設定した。第3水準に「実行されたサポート」,第4水準に「ポジティブな評価」「ネガティブな評価」,第5水準に「学校生活享受感」を設定した。その結果,モデルの適合度は,x^2=44.05(p<.005),df=26,GFI=.968,AGFI=.918,CFI=.985,RMSEA=.055,AIC=124.05であった。先行研究のモデルの第2水準に,援助要請抑制要因を設定することで,先行研究と違うパスが見られた。このことから,生徒の援助要請行動を促進するための支援を考える場合,援助要請行動スキルのみを考慮するのではなく,援助要請抑制要因にも注目する必要性が示唆された。

先行研究のモデルの第2水準に,援助要請抑制要因を設定することで,先行研究と違うパスが見られた。このことから,生徒の援助要請行動を促進するための支援を考える場合,援助要請行動スキルのみを考慮するのではなく,援助要請抑制要因にも注目する必要性が示唆された。