hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所麻酔薬の神経組織での局在部位を電子顕微鏡で確認する方策

従来、我々は局所麻酔薬は神経細胞膜表面で結合し、その作用を発現することを証明してきた。現在までのところ、局所麻酔薬は重金属と結合させることが難しいことから、局所麻酔薬の神経組織内での局在部位を電子顕微鏡などを用いても、視覚的に特定することは不可能であった。そこで本研究では二重結合を持つ局所麻酔薬を合成し、電子顕微鏡の染色剤である四酸化オスミウムと反応させ、電子顕微鏡で観察可能にする事を目的にした。2-6キシリジンにクロールアセチルクロイドを作用させて作った中間物質にジアリルアミンを作用させ、リドカインのジアリル誘導体を合成した。このジアリルリドカイン誘導体は二重結合を持つため、電子顕微鏡の染色剤である四酸化オスミウムと作用させると、リドカイン1分子に四酸化オスミウム2分子を結合させることが可能である。まず、ウサギ摘出迷走神経にジアリルリドカインを作用させて、その局所麻酔作用をリドカインと比較した。この結果ジアリルリドカインの局所麻酔作用は最小有効濃度は0.1%であり、効果発現時間、効果持続時間もリドカインと類似していることがわかった。次に、ウサギ摘出迷走神経に1%リドカインを作用させた後、0.01%の四酸化オスミウムを加えて染色固定した。さらに、無髄神経細胞膜の黒化度曲線(density curve)から神経細胞膜での結合部位を確認した。この結果、リドカインのジアリル誘導体は神経細胞膜、特に外側の膜と結合し、細胞膜内には浸潤していない事が確かめられた。この結果は、従来我々が主張しているように、局所麻酔薬は神経細胞膜表面で結合し、その作用を発現するとした仮説に合致していた。
生成語彙意味論に基づく語彙情報と事象構造の融合的研究

本研究は、語彙意味論モデルと構文研究を基に語彙情報と事象構造の融合に関する日英語の比較対照研究を行うものである。中心課題は次の3つに集約される。(1)生成語彙意味論によるレキシコン研究の推進。生成語彙意味論モデルのクオリア(語彙情報)が事象構造の解釈をどのように決定するかという問題の解決を目指す。(2)言語における主観性(subjectivity)問題の解明。主観性が事象構造の解釈(例えば、心理状態述語など)にどのように影響するか。そして、構文選択にどのように影響するか。(3)語彙化・文法化における語彙情報と構文の融合についての新たな提案。語彙情報が構文に融合しさらに文法化していく過程には、類型論的に捉えるべき普遍性があることを示す。本研究の目的は、(1)生成語彙意味論によるレキシコン研究の推進、(2)言語における主観性(subjectivity)問題の解明、(3)語彙化・文法化における語彙情報と構文の融合についての新たな提案の3つであるが、研究計画の初年度である平成20年度は、研究分担者がそれぞれに研究テーマの理論的基盤を固めるため、先行研究の検討をおこない、解決すべき問題の洗い出しをおこなった。当初の研究実施計画に即して、研究代表者は国内の学会や研究会に参加し、研究テーマについての情報を積極的に集めるとともに、国外の学会にも参加し、海外の研究者との情報交換を積極的に進めた。今年度、研究代表者は韓国ソウルで開催された世界言語学者会議(2008年7月)において、生成語彙意味論モデルを用いた研究を最初の成果として発表した。また、2009年2月にはベルギーのゲント大学で開催された動詞の類型論に関する国際ワークショップで動詞意味と構文の問題に関する発表をおこなった。これは今年度進めた基礎的な研究の成果報告に当たるものである。研究グループは、文献・資料の収集作業と平行して、本研究の中心的なテーマである「生成語彙意味論モデル」「主観性・証拠性の問題」「文法化の過程」についての検討を共同で進めた。この検証作業を進めることによって、英語や日本語をはじめとする様々の言語において、構文と動詞の意味の関係について多くの問題点を浮き彫りにすることができた。次の段階としては、このようにして現れた問題点を個別言語的な問題と普遍的な問題に選り分け、検討課題としてまとめることになる。当初の研究実施計画に即して、研究代表者は国内の学会や研究会に参加し、研究テーマについての情報を積極的に集めるとともに、研究者との情報交換を積極的に進めた。今年度、研究代表者は日本英文学会大会(東京大学、2009年5月開催)のシンポジウムで、「名詞の項選択」と題する発表を行い、研究成果を公開した。研究グループは、本研究の中心的なテーマである「生成語彙意味論モデル」「主観性・証拠性の問題」「文法化の過程」についての研究状況を広く社会に公開するためワークショップを開催した(2010年2月)。このワークショップで、研究代表者である小野は、「結果構文のタイポロジー」と題する発表を行い、堀江と上原はそれぞれ「認知類型論の観点から見た「主節現象」と「定形性(finiteness)」」、「主観性についての言語対照-認知言語学と類型論のコラボ」と題する発表を行った。これらの発表に対しナロックはコメントを呈し、議論を深めた。このワークショップは今後のプロジェクトの方向性を定めるためにも有益であった。

本研究の目的は、(1)生成語彙意味論によるレキシコン研究の推進、(2)言語における主観性(subjectivity)問題の解明、(3)語彙化・文法化における語彙情報と構文の融合についての新たな提案の3つであるが、平成22年度は、当初の研究実施計画に即して、それぞれの研究課題を深めるとともに研究成果の発表を積極的に行った。本年度は、名詞化および結果構文についての研究(小野)、対照研究のアプローチからの研究(堀江)、名詞および連体形式についての研究(上原)が主な研究成果として上げられる。さらに意味図の研究も進んだ(Narrog)。また、本研究プロジェクトでは、特に研究の国際的な発信に力を入れたことを強調しておきたい。本年度は、タイ(チュラロンコーン大学)、米国(サンフランシスコ州立大学)、英国(オクスフォード大学)、オランダ(アムステルダム大学)などで開催された国際学会で研究成果を発表した。また、22年度には、アリゾナ大学(米国)から研究者を招き、国立国語研究所において研究課題に関連したワークショップ(Motion Constructions and Related Phenomena)を開催した。このように、国際的な研究交流活動を活発に行い、国際的なレベルでの研究成果の発信を進めた。本研究の目的は、(1)生成語彙意味論によるレキシコン研究の推進、(2)言語における主観性(subjectivity)問題の解明、(3)語彙化・文法化における語彙情報と構文の融合についての新たな提案の3つであるが、平成23年度は、当初の研究実施計画に即して、それぞれの研究課題を深めるとともに研究成果の発表を積極的に行った。研究代表者である小野は、「サテライト・フレーム言語と動詞フレーム言語」と題する論文を刊行した。これは本研究の事象構造分析の研究成果である。また、Two modes of argument selection in nominalsと題する論文を国際的な学術誌に発表した。論文以外の成果では、日本で開催されたThe 6th International Global Wordnet Conferenceにおいて招待講演を行った。この国際会議は自然言語処理関連の世界的な研究会議であり、代表者はそこで本研究プロジェクトの成果を踏まえた講演を行った。研究分担者の堀江は、「言語類型論」と題する論文を発表し、1件の招待講演と1件の学会発表を行った。同じく分担者の上原は、The socio-cultural motivation of referent honorifics in Korean and Japanese、および「主観性に関する言語の対照と類型」という論文を刊行した。また、分担者のNarrogは、The Oxford Handbook of Grammaticalizationと題する論集をオクスフォード大学出版局より共編で出版した。このように、今年度研究代表者と分担者は国際的な研究交流活動を活発に行い、世界的なレベルでの研究成果の発信を進めた。
光合成能力の最適化を制御するmiRNAの動態解明

1.LHCSR3の発現誘導経路上流のPHOTに着目し、ノーザンブロットによるmRNA解析と、ウエスタンブロットによるタンパク解析を行った結果、DUS16遺伝子変異体で上昇、相補株で野生型のレベルまで戻っていた。同じくmiRNAの生合成ができないDCL3遺伝子変異体を2系統解析すると、同様にPHOTタンパクが増加していた。また、PHOTタンパク質が増加する事で、弱い光でもLHCSR3の発現が誘導されることも確認できた。こうしてmiRNA変異体でPHOTタンパクの増加が確認されたことから、PHOT遺伝子がmiRNAによって抑制されていると結論づけた。2.small RNA-seq解析によってクラミドモナスから検出されたmiRNAの種類は2000を超え、そのうち90%以上はdus16変異体で作られていない。この膨大な種類のmiRNAのうち、どのmiRNAがPHOTを制御するのかin silico標的予測を行った結果、19候補が得られ、それらは14のmiRNA遺伝子にコードされていた。興味深いことに、ある1つのmiRNA遺伝子に、19のmiRNAのうちの5つがコードされており、いかにもPHOTを制御するためにあるmiRNA遺伝子に見えた。そこでCas9でそのmiRNA遺伝子の転写を止めるように破壊し、このmiRNA遺伝子から作られるmiRNAだけを止めた。破壊した位置が異なる2つの系統の変異株を解析した所、PHOTタンパク量が上がっていることを確認した。これにより、PHOTを制御するmiRNA遺伝子を突き止めた。3.ミトコンドリアのエネルギー生産に使われる酢酸を含む培地(従属栄養)と、含まない培地(独立栄養)では、PHOTの抑制度合に違いが見られた。環境シグナルによってmiRNAの活性が変わることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。LHCSR3遺伝子の発現は、光受容体Phototropin(PHOT)がうけた強光がシグナルとなり、下流の転写因子が活性化されて誘導される。この体系に照らし合わせて様々な実験を行い、その中から以下の新しい知見を得た。1.miRNA変異株でPHOTが2倍程度多く発現している。:iRNAの生合成が出来ない2種類のmiRNA変異株を用い、PHOT遺伝子のqRT-PCR解析、抗体を作製してのウエスタンブロット解析から、2倍程度発現量が多いことが分かった。miRNAがPHOT遺伝子の発現を負に制御しており、miRNA変異株ではPHOTの発現量が高くなっている可能性が示唆された。2.PHOTを標的とする可能性の高いmiRNAを複数発見した。:small RNA-seqを行い、3476種のクラミドモナスmiRNAオリジナルリストを作成した。このリストとPHOT mRNA塩基配列を用いたコンピューター予測から、PHOTに作用する可能性の高い19種類のmiRNAを見つけ出した。興味深いことに、19種類中5種類が同じ転写単位から同時に作り出されており、これら5種のmiRNAが同時にPHOTの発現に作用している事が示唆された。3.miRNAがチューニングする光合成関連遺伝子を発見した。:miRNAに結合するmRNAを網羅的に検出するRIP-seq解析を行い、光化学系2の集光タンパクであるLHCB4(CP29)遺伝子がmiRNAに翻訳抑制のチューニングを受けている可能性が示唆された。LHCB4タンパク質の量を調べたところ、miRNA変異株でLHCB4タンパクが1.5倍程度増加していた。またポリA鎖長解析の結果、LHCB4 mRNAがmiRNA変異株でわずかに短く、miRNA変異株でLHCB4遺伝子の翻訳効率が高い事が示唆された。研究開始時は、応募時に描いたmiRNAが直接LHCSR3をチューニングしているモデルをベースに、当初計画通りRNAオミクス解析の統合解析を進めた。途中、LHCSR3発現誘導カスケード考慮して実験を行った結果、LHCSR3の発現チューニングは、カスケード最上流にあるPHOTにチューニングによるモデルが正しい可能性が高くなった。新しいモデルに基づいて再解析を行った結果、PHOTを制御する可能性の高いmiRNAが発見され、当初計画通り、LHCSR3の発現を、PHOTの制御を介してチューニングする役割を持つ可能性が高いmiRNAを発見する事に成功した。また、RNAオミクス統合解析、ウエスタンブロット解析、ポリA鎖長解析の結果から、新たにLHCB4遺伝子がmiRNAによって発現チューニングされている事が強く示唆さされた。PHOTと同様に、LHCB4遺伝子を制御する可能性の高いmiRNAをコンピューター予測により発見する事に成功している。上記のように、LHCSR3が直接miRNAによってチューニングされているというモデルは誤りであったという問題点があった。しかしPHOTの発現チューニングを介したLHCSR3の発現チューニングという新しいモデルに基づき、PHOTを制御する可能性の高いmiRNAを発見するに至った。同時に光合成関連遺伝子(LHCB4)がmiRNAによってチューニングされている可能性も見出しており、平成29年度は当初計画の目的が達成され、おおむね順調に進展していると判断した。

また、PHOTタンパク質が増加する事で、弱い光でもLHCSR3の発現が誘導されることも確認できた。こうしてmiRNA変異体でPHOTタンパクの増加が確認されたことから、PHOT遺伝子がmiRNAによって抑制されていると結論づけた。2.small RNA-seq解析によってクラミドモナスから検出されたmiRNAの種類は2000を超え、そのうち90%以上はdus16変異体で作られていない。この膨大な種類のmiRNAのうち、どのmiRNAがPHOTを制御するのかin silico標的予測を行った結果、19候補が得られ、それらは14のmiRNA遺伝子にコードされていた。興味深いことに、ある1つのmiRNA遺伝子に、19のmiRNAのうちの5つがコードされており、いかにもPHOTを制御するためにあるmiRNA遺伝子に見えた。そこでCas9でそのmiRNA遺伝子の転写を止めるように破壊し、このmiRNA遺伝子から作られるmiRNAだけを止めた。破壊した位置が異なる2つの系統の変異株を解析した所、PHOTタンパク量が上がっていることを確認した。これにより、PHOTを制御するmiRNA遺伝子を突き止めた。3.ミトコンドリアのエネルギー生産に使われる酢酸を含む培地(従属栄養)と、含まない培地(独立栄養)では、PHOTの抑制度合に違いが見られた。環境シグナルによってmiRNAの活性が変わることが示唆された。平成30年度は、PHOT、並びにLHCB4の発現をチューニングしている可能性の高いmiRNAをCRISPR/Cas9によって個別に複数個破壊し、それに伴うそれぞれの遺伝子発現の変化、光合成活性の変化、光防御の変化の解析を行う。この実験により、どのmiRNAがPHOT、LHCB4の発現をチューニングし、そのチューニングによってどのような生理的変化が現れるかを明らかにすることで、miRNAによる光合成能力の最適化分子メカニズム解明に迫る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。国際シンポジウム「ファイトジーンの可能性と未来IX」にて、招待講演を“microRNA biogenesis and function in Chlamydomonas reinhardtii"というタイトルで行った。平成29年10月20日平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子改変前脂肪細胞を用いた乳癌抗体療法の開発

本研究の目的は患者から取り出した脂肪細胞にex vivoで遺伝子改変を行い、再び体内に戻し、長期的に持続可能な抗HER2抗体療法開発するための基礎的検討を行うことである。そのために、まず抗HER2抗体産生が可能なウイルスベクターを作成した。具体的には抗HER2抗体重鎖、軽鎖遺伝子を挿入されたプラスミドを作製、パッケージング細胞にトランスフェクションを行い、抗体遺伝子の発現が可能なレンチウイルスベクターを作製した。これらをヒト前駆脂肪細胞へ複数回導入することにより、治療で用いるのに十分と思われる量の抗体産生がELISAで確認された。産生された抗体は、HER2陽性細胞への結合が免疫染色で証明され、HER2への特異性が確認されている。また、Western Blot Analysisにおいては非還元条件下及び還元条件下で目的とする抗体全体及びH鎖、L鎖に相当する半量体の検出が確認された。今後は産生された抗体の抗腫瘍効果を確認していく予定である。まずはHER2陽性細胞株を用いて、In vitroにおける細胞増殖抑制効果の確認を行う。抗腫瘍効果にはHER2への結合による直接的抗腫瘍効果と抗体依存性細胞傷害活性を介した間接的抗腫瘍効果の二つが考えられるため、両方について確認を行う。これらが確認できれば、抗体産生前脂肪細胞移植のin vivoモデルにおける抗体血中濃度などの確認を経た後、HER2発現乳癌細胞担癌マウスモデルを用いた治療実験へと進む予定である。また、抗体産生前脂肪細胞の分化・成熟が抗体発現に及ぼす影響についても検討予定である。In vitroでは抗HER2抗体の産生が確認でき、HER2蛋白に対する特異的結合も確認された。今後の抗腫瘍効果確認のために必要なin vitro実験系もほぼ確立できているため、抗腫瘍効果を確認すべく、引き続き実験を行っていく。抗腫瘍効果にはHER2への結合による直接的抗腫瘍効果と抗体依存性細胞傷害活性を介した間接的抗腫瘍効果の二つが考えられるため、それぞれについて確認を行う。これらが確認できれば、抗体産生前脂肪細胞移植のin vivoモデルにおける抗体血中濃度などの条件検討を経た後、HER2発現乳癌細胞株ゼノグラフトを用いた治療実験へと進む予定である。(次年度使用が生じた理由)当初は抗HER2抗体産生脂肪前駆細胞移植マウスにおける血中への抗体分泌能の観察を予定していた。しかしながら、in vivoで治療実験が可能と予想される量の抗体産生能がin vitroですぐには確認できず、動物実験が次年度よりの開始となったため。(次年度使用計画)抗HER2抗体産生脂肪前駆細胞移植マウスにおける血中への抗体分泌能の評価を行う。その後、HER2発現乳癌細胞株担癌マウスモデルを用いて、同脂肪前駆細胞による抗腫瘍効果の確認を行う予定である。
膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

平成18年度は、平成17年度に引き続き原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討する一方で、新たに真核生物の膜タンパク質を酵母を宿主として発現させる系について検討した。原核生物の膜タンパク質については、好熱細菌Thermusthermophilusと好熱古細菌Aeropyrumpernix岳の膜タンパク質、各53個、計106個について、pBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込むことを計画したが、一部の膜タンパク質遺伝子のベクターへの導入に難航し、結局pBADベクターに27個の膜タンパク質遺伝子を組み込み、その発現確認実験を行った。その結果、Flagタグ抗体を用いたWestern blotで、27個のうち15個の膜タンパク質について発現が確認された。特に、複数の輸送体膜タンパク質の発現量が非常に高いことが示され、結晶化用試料の調製が可能になった。真核生物の膜タンパク質については、ヒト、カイコガ、線虫、シロイヌナズナ、酵母の膜タンパク質、約50個を対象とした。膜タンパク質発現量の確認を効率のよく行うため、[α-mating factorのシグナル配列]-[膜タンパク質]-[GFP]を酵母S.cerevisiaeで発現させるベクターを構築した。現在、上記真核生物の膜タンパク質の発現確認を進めている。平成17年度は、原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討を行った。最初、グラム陰性細菌である大腸菌(Escherichia coli)、グラム陽性細菌である腸球菌(Enterococcus faecalis)、好熱真正細菌(グラム陰性)であるThermus thermophilus、好熱古細菌Aeropyrum pernixの4種の原核生物から膜タンパク質を選択する予定であったが、立体構造データベース(Protein Data Bank, PDB)の調査から、好熱菌由来の膜タンパク質の立体構造が数多く登録されていることが明らかになったため、好熱菌Thermus thermophilusとAeropyrum pernixの膜タンパク質を対象とすることにした。T.thermophilusのゲノム中1973個のORFから、SOSUIプログラムを用いて465個の膜タンパク質遺伝子を見出し、その後、推定膜貫通領域数3以上でかつ機能が解明または推定されているもの53個を選択した。同様に、A.pernixのゲノム中1841個のORFから、447個の膜タンパク質遺伝子を見出し、その中から53個を選択した。このようにして選択した計106個の膜タンパク質遺伝子は、受容体、輸送体、イオンチャネルまたはポンプとして機能すると解明・推測されている。これらの遺伝子を、当研究室でE.faecalisの7回膜貫通型膜タンパク質の高発現に利用しているpBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込み、現在、発現検定を進めている。
デスモイド型線維腫症の病態に基づく診断、新規治療開発への学際的・国際的共同研究

(i)NG2特異的Ctnnb1ex3 conditional knockout miceを作製し、条件を変更するなど試行したがデスモイドの形成がみられなかった。研究協力者(Alman教授)との間でtroubleshootingを行い、雄のApc1638N変異マウス(ヘテロ)は6ヶ月までに45カ所ものデスモイドを形成するため、契約後譲渡。報告通り、雌よりも雄においてデスモイド腫瘍が多く自然発症することを肉眼的、組織学的に確認した。Meflin-CreマウスとCTNNB1exon3のloxPマウスを交配し、Meflin細胞特異的CTNNB1exon3欠損マウスを作製している。(ii)培養する基質の硬さが細胞増殖に影響するとの仮説で、培養プレートを種々の硬さ(0.5, 2, 8, 16, 32, 64kPa)にして培養したところ、硬くなるほど細胞増殖は上昇し、a-SMA発現も上昇した。(iii) βカテニン免疫染色のデスモイド病理診断における意義の解析:多施設共同および中央病理診断を実施して、104例のデスモイドを解析し、βカテニンの核内濃染を認めない症例でも少なからずデスモイドであることを示した。(iv)ゲノムワイド関連解析によるデスモイド発症感受性遺伝子の同定、メロキシカムへの薬剤応答性との関連解析:疾患感受性variantの候補があり、症例数を増やす必要があり、次年度に引き続き検体採取・解析を進めることとした。(v)drug repositioningによる新規治療薬剤の検出と薬効評価:デスモイドマウスモデルがCTNNB1 exon3の欠損マウスではできなかったため、Apc1638Nマウスで薬効の評価を開始した。(vi)国際的共同研究:NIHの作成した患者報告型のアウトカム評価の和訳についいて作成者、翻訳業者との契約が完了し、翻訳が開始された。デスモイド自然発症モデルであるApc1638Nのノックアウトマウスについて米国からの移送に時間を要したため、このマウスを使用して実施する研究の開始が遅れた。患者報告型アウトカムの和訳を扱う研究協力者がcopy right transferの承認を得るのに時間がかかり、また、NIHから修正の要請があり、それを待ったため和訳業務の開始が遅れた。(i) Meflin-CreマウスとCTNNB1exon3のloxPマウスを交配し、作製されたMeflin細胞特異的CTNNB1exon3欠損マウスにおける腫瘍形成能を評価する。(ii)デスモイド細胞が培養プレートの硬さ(0.5, 2, 8, 16, 32, 64kPa)によって細胞増殖度、βカテニンやa-SMAの発現が変化することについてメカノレセプターであるTRPV4の発現、阻害剤を使用してメカニズムを解析する。(iii)ゲノムワイド関連解析によるデスモイド発症感受性遺伝子の同定、メロキシカムへの薬剤応答性との関連解析:疾患感受性variantの候補が挙がれば、症例数を増やして解析を続ける。(iv)東大医科研と進めているデスモイドにおけるwhole exome sequence解析によってクラスタリングされた各群におけるGSEA解析を実施する。術後再発したvs再発しなかった群、self regressionなしvsself regressionあり群、CTNNB1 S45F vs T41A群についても同様に解析を行う。(v) drug repositioningによる新規治療薬剤の非臨床安全性評価と医師主導治験準備:Apc1638Nマウスを用いてin vivoでの薬効を評価するとともに安全性評価を行う。薬剤Xについては薬剤メーカーと話し合い、薬剤提供、PMDA相談についての方策を練る。(vi)国際的共同研究:NIHの作成した患者報告型のアウトカム評価の和訳を完成させ、各種薬剤、手術による患者評価によるアウトカム解析を実施する。

(vi)国際的共同研究:NIHの作成した患者報告型のアウトカム評価の和訳についいて作成者、翻訳業者との契約が完了し、翻訳が開始された。デスモイド自然発症モデルであるApc1638Nのノックアウトマウスについて米国からの移送に時間を要したため、このマウスを使用して実施する研究の開始が遅れた。患者報告型アウトカムの和訳を扱う研究協力者がcopy right transferの承認を得るのに時間がかかり、また、NIHから修正の要請があり、それを待ったため和訳業務の開始が遅れた。(i)NG2発現細胞にCTNNB1エクソン3の変異を導入したデスモイド発生マウスモデルの作製:Ctnnb1のエクソン3をloxPで挟んだマウスが研究協力者(武藤)の施設から分与された。NG2-CreERをCtnnb1エクソン3のloxPマウスと交配させることでNG2特異的Ctnnb1ex3 conditional knockout miceを作製した。今後、デスモイド腫瘍の形成の有無を評価する。(ii)CTNNB1変異型別の培養細胞に対するストレッチ刺激による影響:変異型WT, 41A, 45Fの細胞を用いてuniaxial stretch(10, 20%)をFrequency: 1, 10, 30, 60 cycles/minで加えた。予想に反していずれの条件でも細胞増殖は抑制される傾向にあった。ウエスタンブロットにより非リン酸化βカテニンの発現もstretch刺激で抑制された。(iii) βカテニン非リン酸化抗体による免疫染色の臨床的意義の解明:デスモイドの薬剤への応答性、CTNNB1の変異型と非リン酸化抗体による染色性との有意な関連を示した。臨床において予後予測に適用できる可能性が示された。(iv)ゲノムワイド関連解析によるデスモイド発症感受性遺伝子の同定、メロキシカムへの薬剤応答性との関連解析:血液検体を理科研に送付、研究分担者が解析を開始。(v)drug repositioningによる新規治療薬剤の検出と薬効評価:薬剤Xをin vitroの評価で抽出した。またこの薬剤XがWnt/βcatenin経路の下流遺伝子を抑制することを示した。(vi)国際的共同研究:NIHの作成した患者報告型のアウトカム評価の和訳についいて作成者と打ち合わせし、実際に進めることが決定したが、和訳の実施については和訳業者の理由から遅延が生じた。患者報告型アウトカムの和訳を扱う研究協力者がcopy right transferの承認を得るのに時間がかかり、和訳業務の開始が遅れた。(i) Meflin-CreマウスとCTNNB1exon3のloxPマウスを交配し、作製されたMeflin細胞特異的CTNNB1exon3欠損マウスにおける腫瘍形成能を評価する。
低欠陥高精度単結晶電極表面の調整法の研究

本年度は火炎溶融法及び火炎帯溶融法で作製した(111)ファセット面及び(100)ファセット面の評価を行った。火炎溶融法火炎溶融法で作製した白金単結晶の(111)ファセット面は0.25mm^2以下と小さいがSTM、AFMで観察には十分な大きさである。しかし、(100)ファセット面は作製した多くの白金単結晶で出現しない。希に形成されても0.02mm^2以下と小さくSTM、AFMでの観察は困難である。どの単結晶の(111)ファセット面にも欠陥は見あたらず、STM、AFM観察により、原子状にフラットな面であることが分かった。(100)ファセット面が出現しない単結晶をエッチングすると(100)付近の欠陥密度は10^8/cm^2と大きな値を示す。(100)ファセット面が出現した単結晶をエッチングすると(100)ファセット面の周辺にエッチピットが見られるが内部には見いだせなかった。帯溶融法帯溶融法で作製した白金単結晶の(111)ファセット面は1mm^2と大きくSTM、AFMで観察には十分な大きさである。しかも、(100)ファセット面は作製した全ての白金単結晶に形成され、0.25mm^2以上と大きくSTM、AFMで観察するのに十分な大きさである。これらの白金単結晶を王水でエッチングしてSEMにより欠陥密度数とそれぞれのファセット面の状態を観察した。どの単結晶の(111),(100)ファセット面にも欠陥は見あたらず、STM、AFM観察により原子状にフラットな面であることが確認された。結論として、球状白金単結晶の(111)ファセット面は作製方法によらず結晶欠陥もなく原子状に平滑であるのでSTM、AFM観察には問題なく使用できる。しかし、(100)ファセット面を得るため、大きな(111)ファセット面を作製するためには帯溶融法を使用する必要があることを明らかにした。
慢性前立腺炎におけるクラミジア、ウレアプラズマの病原的意義および治療法の検討

1.慢性前立腺炎における前立腺液(EPS)の変化をpH、亜鉛濃度、IgA、リゾチームについて検討を行なっている。EPSのpHは感染を有する症例で正常群の7.2に比較して明らかに高く、亜鉛濃度は正常群の平均570μg/mlに比べて著しく低下していた。特に亜鉛濃度の推移は治療効果に良く反応し、症状の改善と共に増加を示している。IgA、リゾチーム濃度は感染を有する症例で増加する傾向であったが、その程度はpH、亜鉛濃度ほど明らかでなく、治療効果との相関も低かった。また前立腺マッサージ後初期尿(VB3)の慢性前立腺炎における診断的価値の検討を続けているが、尿中白血球数においてEPSと一定の相関を認め有用であるが、pH、亜鉛濃度は膀胱尿による希釈の影響を強く受け、診断的価値は低いものであった。2.非細菌性前立腺炎と診断された患者のEPSからのクラミジア、ウレアプラズマの検出率はそれぞれ5.3%、23.9%の成績を得ている。このなかで尿道由来のcontaminationが否定され、明らかに原因微生物と判断される症例はクラミジアで4.0%、ウレアプラズマで7.5%のみであった。この検討のためEPS採取用のカテーテルを試作し、臨床に用いている。カテーテルの診断的有用性は高いが、患者の疼痛、血液の混入等の問題もあり、今後さらに改良の必要がある。3.前立腺液pHの上昇に伴い、アルカリ環境下での各種薬剤の抗菌力の変化を検討した。ニューキノロン剤は全体に強い抗菌力を示した。erythromycinはアルカリ環境下で抗菌力が増強し、minocyclineは低下した。しかしerythromycinの有効性は臨床上では不十分なものであり、重曹等の併用薬剤についてさらに検討が必要と思われる。1.前立腺炎患者をDrachらの方法で分類し、前立腺液(EPS)の抗菌因子として重要な亜鉛、IgA、リゾチームおよびpHを前立腺肥大症患者を対照として比較検討した。(1)EPSの亜鉛濃度は慢性細菌性前立腺炎(平均291μg/ml)と非細菌性前立腺炎(平均277μg/ml)がプロスタトディニア(平均585μg/ml)、コントロール(平均565μg/ml)に比べて有意に低下していた。(2)pHは慢性細菌性前立腺炎(平均7.7)、非細菌性前立腺炎(平均7.5)が他の2群に比べてアルカリ側に傾いていた。(3)IgAは慢性細菌性前立腺炎(平均37.3mg/dl)が他の3群に比べて有意に高く、同様にリゾチームも慢性細菌性前立腺炎(平均85.6μg/ml)が他群に比べて高い傾向を認めた。2.慢性前立腺炎においてEPSのpHは高いことが示唆されたことにもとづき、原因菌として多いE.coli,P.mirabilis、E.faecalisに対する抗菌力を各種pH下におけるMICにて検討した。(1)アルカリ環境下において抗菌力の増強が認められた薬剤はマクロライド系の抗生剤、とくにerythromycinであり、元来グラム陰性桿菌に対して抗菌力を示さないerythromycinがアルカリ下では抗菌力を示し、さらにE.faecalisに対しても作用が増強されることが確認された。(2)同様の条件でST合剤では抗菌力は変化せず、テトラサイクリン系、セフェム系抗生剤ではアルカリ側でむしろ抗菌力が減弱した。キノロン系抗生剤はアルカリ環境下でも元来のすぐれた抗菌力は変化しないことが確認された。3.EPS中の抗生剤濃度をST、erythromycinについて検討し、STにおいては対血清濃度比が3以上と高い濃度が得られ、erythromycinにおいては、血清濃度とほぼ同等の濃度が得られた。4.前立腺液採取困難例を対象に3way baloom catheterを改良し、充分量のEPSを得る方法を考案した。これらの知見、成果は第74回日本泌尿器科学会総会第34回日本化学療法学会総会において発表し、さらに第75回日本泌尿器科学会総会にて発表予定である。1.前立腺の炎症に伴う前立腺液の生化学的性状の変化について,初年度より引続いて,亜鉛, ph, IgA,リゾチームを対象に検討を続けている.特に亜鉛濃度は治療効果に良く相関し,治療により前立腺液中の白血球数が正常化し,臨床症状の改善が認められた症例においては亜鉛濃度の上昇が認められた.また前立腺液採取困難例について前立腺マッサージ後の尿(VB3)を正確に採取することにより,ある程度前立腺液の生化学的変化を類推することは可能であり,本疾患の診断に有用と思われた.2.また一方の知見である前立腺炎に伴う,前立腺液pHのアルカリ化については,すでにアルカリ環境下で抗菌力が低下しない薬剤をいくつか選択し(erythromycin, new quinolones, etc),従来から頻用されている薬剤とその薬剤を比較している.しかし現在までのerythromycinによる臨床検討では必ずしも,高い有効立は得られず,併用薬剤(重曹等)を使用することも検討中である.3.いわゆる非細菌性前立腺炎の原因微生物と考えられるクラミジア,ウレアプラズマの前立腺液からの検出は当初より検討している.しかし各種の前処理を行ってもその検出率は低く,また検出例でも経尿道的に採取する方法では尿道由来の一般細菌やクラミジア,ウレアプラズマのcontaminationが大きな問題となって来る.このため側溝を前立腺部に一致させ直接前立腺液を採取する3way ballon catheterを試作して検討した.

このカテーテルは使用方法がやや煩雑であるが,一般細菌を含めてクラミジア,ウレアプラズマのcontaminationは大幅に減少し,また前立腺液の採取率も向上した.今後さらに改良を加えていく予定である.1.慢性前立腺炎における前立腺液(EPS)の変化をpH、亜鉛濃度、IgA、リゾチームについて検討を行なっている。EPSのpHは感染を有する症例で正常群の7.2に比較して明らかに高く、亜鉛濃度は正常群の平均570μg/mlに比べて著しく低下していた。特に亜鉛濃度の推移は治療効果に良く反応し、症状の改善と共に増加を示している。IgA、リゾチーム濃度は感染を有する症例で増加する傾向であったが、その程度はpH、亜鉛濃度ほど明らかでなく、治療効果との相関も低かった。また前立腺マッサージ後初期尿(VB3)の慢性前立腺炎における診断的価値の検討を続けているが、尿中白血球数においてEPSと一定の相関を認め有用であるが、pH、亜鉛濃度は膀胱尿による希釈の影響を強く受け、診断的価値は低いものであった。2.非細菌性前立腺炎と診断された患者のEPSからのクラミジア、ウレアプラズマの検出率はそれぞれ5.3%、23.9%の成績を得ている。このなかで尿道由来のcontaminationが否定され、明らかに原因微生物と判断される症例はクラミジアで4.0%、ウレアプラズマで7.5%のみであった。この検討のためEPS採取用のカテーテルを試作し、臨床に用いている。カテーテルの診断的有用性は高いが、患者の疼痛、血液の混入等の問題もあり、今後さらに改良の必要がある。3.前立腺液pHの上昇に伴い、アルカリ環境下での各種薬剤の抗菌力の変化を検討した。ニューキノロン剤は全体に強い抗菌力を示した。erythromycinはアルカリ環境下で抗菌力が増強し、minocyclineは低下した。しかしerythromycinの有効性は臨床上では不十分なものであり、重曹等の併用薬剤についてさらに検討が必要と思われる。
発生における周囲環境の探索から導くiPS細胞自己組織化による歯胚エンジニアリング

多能性幹細胞であるiPS細胞は,自発的に三次元的な組織・器官を形成する自己組織化能をもつと考えられているが,歯胚への自己組織化誘導は未だ達成されていない。本研究の目的は,iPS細胞の“自己組織化"を利用した歯胚のバイオエンジニアリングである。本研究では,iPS細胞に潜在する歯胚への自己組織化誘導技術として,細胞が発生の過程で周囲環境として認識するであろう「空間サイズ」,「力学的特性」,「細胞シグナル因子」を模倣するアプローチを提案する。これを実現するため,培養基材に任意の培養空間サイズおよび力学的特性を付与することで歯胚としての極性を引き出す方法を試みる。平成30年度は,これまでに確立してきた歯胚発生に関与する遺伝子発現を制御可能なマウスiPS細胞の3次元培養法の検討および,iPS細胞の胚様体を歯原性細胞に分化誘導するための細胞シグナル因子の探索を行った。歯原性上皮細胞への誘導について,各種小分子化合物および細胞シグナル因子を組み合わせた段階的分化誘導(非神経外胚葉系誘導,歯原性上皮誘導,エナメル芽細胞誘導)を試みた結果,マウスiPS細胞からCK14,ameloblastin,amelogenin,enamelin,tuftelin遺伝子を高発現する細胞への分化誘導プロトコルが確立された。今後,このプロトコルおよび歯胚発生関連遺伝子の発現制御iPS細胞株を用い,培養空間サイズ,細胞培養基材の硬さ,培養基材への細胞シグナル蛋白質の固定化が歯胚の自己組織化に及ぼす影響を検討していく予定である。当初平成30年度には,分化誘導法の検討に加え,細胞培養ハイドロゲル基材を用いて培養空間サイズ,硬さ,細胞シグナルタンパク質の固定化がiPS細胞に及ぼす影響の検討に着手する予定であったが,ゲル基材を滅菌するために必要なプラズマ滅菌器の整備に遅れが生じ,ゲルを用いた細胞培養実験を実施することができなかった。ただし,現在までに,歯胚発生に重要な役割をする遺伝子の発現制御マウスiPS細胞株が樹立できており,さらに各種小分子化合物および細胞シグナル因子を組み合わせることで,マウスiPS細胞の胚様体から段階的に成熟したエナメル芽細胞への分化誘導が可能なプロトコルを確立できている。これらの独自技術が得られたことに加え,現在はプラズマ滅菌器の整備が完了していることから,次の研究段階に進むことが可能な状況にある。したがって,この遅れは次年度に取り戻すことが可能と考えている。前年度までに得られたプロトコルから,iPS細胞を歯原性細胞へ誘導する小分子化合物および細胞シグナルタンパク質の候補が得られたため,本年度は,これら因子の細胞培養ハイドロゲル基材への固定化を試みるとともに,異なるサイズあるいは硬さのゲル基材を用意することで,培養空間サイズ,細胞培養基材の硬さ,培養基材への細胞シグナル蛋白質の固定化がiPS細胞の胚葉体から歯胚への自己組織化に及ぼす影響を検討していく。また,これらの検討で得られる試適条件を用いて動物実験で再生歯の形成を試みる。

前年度までに得られたプロトコルから,iPS細胞を歯原性細胞へ誘導する小分子化合物および細胞シグナルタンパク質の候補が得られたため,本年度は,これら因子の細胞培養ハイドロゲル基材への固定化を試みるとともに,異なるサイズあるいは硬さのゲル基材を用意することで,培養空間サイズ,細胞培養基材の硬さ,培養基材への細胞シグナル蛋白質の固定化がiPS細胞の胚葉体から歯胚への自己組織化に及ぼす影響を検討していく。また,これらの検討で得られる試適条件を用いて動物実験で再生歯の形成を試みる。当初平成30年度に着手を予定していた,細胞培養ハイドロゲル基材を用いた空間サイズ,力学的特性がiPS細胞の歯原性細胞への分化に及ぼす影響について,細胞培養ゲルの滅菌に要するプラズマ滅菌器の整備が遅れたことに加え,iPS細胞から歯原性細胞に分化誘導する培養条件をさらに検討して確実なものにしてから行うよう研究を進めているため,ゲル基材を用いる実験に要する費用を翌年度分として請求することとした。したがって,次年度使用額は,ゲル基材空間サイズ,硬さ,細胞シグナル蛋白質の固定化が歯胚の自己組織化に及ぼす影響を分子生物学的に検討し,得られる試適条件を用いて動物実験で再生歯の形成の検討に要する費用に使用する。また、従来予定していた分子生物学的検討や動物実験を効率よく実験を進めるために、この程度の使用額は次年度に必要であると考えている。
原始的染色体及び核膜の構造・機能・動態から探る真核細胞の起源

これまでの研究期間において、原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(以下シゾンと呼ぶ)のセントロメアの動態と比較的安定な構造を伴う核膜の分配の過程を捉えることに成功した(丸山ら、投稿予定)。今年度は、さらにこのシゾン染色体の分配様式に関する知見を得るべく、上流のシグナル伝達経路に着目して解析を行った。ゲノム解析の結果、シゾンは光受容体をコードする遺伝子としては青色光受容体クリプトクロムしか持たないことが明らかとなった。単細胞生物におけるこれらの遺伝子の機能が殆ど未知であることや、明暗周期により細胞分裂同調が容易な光合成生物であるシゾンにおいて、光が同調化に重要な要素であることなどを考えると、これらの光受容体を介したシグナル伝達系の解析は植物細胞の進化を解析する上で重要な視点であると考えられたことから、シゾンのゲノム情報を十二分に活かし、光依存的、特に青色光依存的遺伝子発現変化を探索すべく、マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、青色光特異的な発現変化を示すと思われる遺伝子を複数同定し、それがシロイヌナズナ等の高等植物で知られている青色光応答性遺伝子群と類似した傾向を持つ事を示した。このことは青色光シグナル伝達システムの枠組みが植物進化の非常に初期の段階で既に確立されていた可能性を示唆している。今後はこうしたシグナル伝達系への青色光受容体の関与、さらに下流に存在する転写調節系へのシグナル伝達経路の解明などが期待される。以上のように、細胞核の構造、機能、動態に加え、さらに光シグナル伝達経路の進化という視点を加えることにより、真核生物の進化の非常に初期の段階で現行のシステムの多くの枠組みが既に確立されていたことが示唆されたことは、進化研究における新視点の提供という点において非常に意義深い成果であると考える。真核生物の起源に関しては未だ謎が多く、特に宿主となる細胞の細胞核の成立の機構は全く明らかになっていない。私は原始紅藻Cyanidioschyzon merolae (以下シゾンと呼ぶ)を材料とし、比較生物学的かつ比較ゲノミクス的な方法論に則り真核生物の起源を解明することを最終目的として研究を進めてきた。15年度の研究の間に、シゾンゲノムシーケンスプロジェクトが飛躍的に進展し、全ゲノム配列の解読がほぼ完了した(松崎ら、Nature in press)が、その成果に関しても本研究代表者の研究は非常に大きな貢献を果たした。具体的には、慶応大清水研究室との共同研究によりゲノム21倍相当のBACライブラリーを作製し、シゾンのrRNA遺伝子はゲノム中に散在しており)、コピー数が真核生物最少であることを明らかにした。さらにそれらの遺伝子はコピー間で協調進化を遂げてきたことを示した(丸山ら、投稿中)。また、このライブラリーを用い、3番染色体特異的BACクローンの単離・配列解読に成功、3番染色体にはセントロメア様反復配列が存在しないことも明らかにしただけでなく、テロメア様リピート配列を同定することに成功し、シゾンは特殊な配列を持つテロメアによって「染色体末端問題」を解決していることが示唆された(丸山ら、投稿準備中)。これは配列と機能との(共)進化を考える上で非常に重要な事例であり、今後テロメラーゼ活性の検出なども含め、染色体一次構造の詳細な構造を明らかにしていく予定である。この他に、セントロメアに関する解析も進めており、セントロメア特異的ヒストン様タンパク質を同定し、特異的抗体を作製した。光同調という薬剤を用いない穏和な条件下で高度に同調させた細胞集団を用い、センドロメアの細胞内局在を明らかにし、セントロメアの周期依存的且つダイナミックな動態を捉えることに成功した(丸山ら、投稿中)。私は原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(以下シゾンと呼ぶ)を材料とし、比較ゲノミクス的及び広義のシステム生物学的な方法論に則り真核生物の起源を解明することを最終目的として研究を進めてきた。16年度の研究期間において、シゾンのセントロメア構造、動態に関する解析は飛躍的に進展した。昨年度までの解析をより詳細に、より広範に進めた結果、セントロメアの細胞内局在をさらに詳細に解析し、セントロメアの周期依存的且つダイナミックな動態を電子顕微鏡レベルにおいても捉えることに成功した(丸山ら、投稿中)。具体的には、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルでの抗体染色法を用いた結果、間期においては核膜と共局在するような形で静的な動態を示す一方で、S期からM期にかけてダイナミックな局在変化が起こり、セントロメアの再構築が起こるだけでなく、さらにはそれが紡錘体形成とリンクしながら細胞核染色体の分配が起こることを見出した。しかもその過程において核膜の再構築は起こらないことから、全て核内での反応であり、核膜崩壊に伴う受動的、間接的な現象ではないことが示唆された。これらは以前に報告された藻類の細胞周期に関する知見をより深く分析する証左を与えるものである。また、セントロメア領域とそれ以外の染色体領域、さらに核膜構造の動態変化は他の高等生物とは大きく異なることが明らかとなったことから、全ての真核生物に普遍的な染色体分配様式を知る上でも重要であると考えられる。また、国立環境研との共同研究により、ゲノム解析に用いられたシゾン10D株の凍結保存に本属では世界で初めて成功し、ゲノム標準株を安定に供給するシステムを確立することが出来た。

この結果は国際的にも重要なリソース拠点を整備する上でも重要な貢献であると考えられる。これまでの研究期間において、原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(以下シゾンと呼ぶ)のセントロメアの動態と比較的安定な構造を伴う核膜の分配の過程を捉えることに成功した(丸山ら、投稿予定)。今年度は、さらにこのシゾン染色体の分配様式に関する知見を得るべく、上流のシグナル伝達経路に着目して解析を行った。ゲノム解析の結果、シゾンは光受容体をコードする遺伝子としては青色光受容体クリプトクロムしか持たないことが明らかとなった。単細胞生物におけるこれらの遺伝子の機能が殆ど未知であることや、明暗周期により細胞分裂同調が容易な光合成生物であるシゾンにおいて、光が同調化に重要な要素であることなどを考えると、これらの光受容体を介したシグナル伝達系の解析は植物細胞の進化を解析する上で重要な視点であると考えられたことから、シゾンのゲノム情報を十二分に活かし、光依存的、特に青色光依存的遺伝子発現変化を探索すべく、マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、青色光特異的な発現変化を示すと思われる遺伝子を複数同定し、それがシロイヌナズナ等の高等植物で知られている青色光応答性遺伝子群と類似した傾向を持つ事を示した。このことは青色光シグナル伝達システムの枠組みが植物進化の非常に初期の段階で既に確立されていた可能性を示唆している。今後はこうしたシグナル伝達系への青色光受容体の関与、さらに下流に存在する転写調節系へのシグナル伝達経路の解明などが期待される。以上のように、細胞核の構造、機能、動態に加え、さらに光シグナル伝達経路の進化という視点を加えることにより、真核生物の進化の非常に初期の段階で現行のシステムの多くの枠組みが既に確立されていたことが示唆されたことは、進化研究における新視点の提供という点において非常に意義深い成果であると考える。
心疾患におけるカリクレイン・キニン系の役割に関する研究

本研究は、心臓・血管系疾患でのレニン・アンジオテンシン系(RA系)とカリクレイン・キニン系(KK系)の接点を明らかにする目的で行われた。腹部大動脈狭窄後の高血圧負荷による心肥大が顕在化する前段階で、心筋のbradykinin B2受容体発現低下を認め、その発現低下がangiotensin II(Ang II)AT1受容体遮断薬で解除された。高血圧負荷に置かれた心筋細胞でのB2受容体発現は、RA系活性化により非心筋細胞のAT1受容体を介して遊離する何らかの液性因子の仲介により、抑制的に制御されると考えられた。一方、血管での機能的KK系の存在についてヒト血管内皮細胞での組織カリクレイン産生を検討した結果、組織カリクレインの産生分泌を遺伝子、酵素活性、酵素蛋白の各レベルで証明し、更に内皮細胞へのACE阻害薬作用による細胞内cGMP増加が、内皮細胞由来の組織カリクレインにより産生されたキニンの分解阻止に基づくことを明らかにした。ラットの腹部大動脈狭窄モデルにおける胸部大動脈への圧負荷と、それによるRA系応答を調べた結果、Ang IIの2型受容体(AT2)発現が高血圧負荷に平行して胸部大動脈で増大することを認めた。このAT2受容体発現亢進は循環血中に増加したAng IIの大動脈AT1受容体への作用によることを証明するとともに、AT2受容体発現が亢進した大動脈では、Ang IIへの収縮応答に低下がみられ、このようなAT1受容体応答性低下が増加したAT2受容体を介した一酸化窒素/cGMP系活性化に基づくことを明らかにした。また、マウスの同様の狭窄モデルにおいて、高血圧負荷への代償的な血管AT2受容体発現亢進と、それによるKK系を介したNO/cGMP系亢進を証明した。以上の結果は、RA系とKK系が心血管系疾患の病態において、密接に連携していることを示す。アンジオテンシン変換酵素阻害薬の血管系への作用は、血管局所でのアンジオテンシンII産生阻害に加え、ブラジキニン分解の阻害につづく内皮NO系の亢進に基づくと考えられている。しかし血管局所でのキニン産生がどのように行われているかについての詳細は明らかではない。本研究はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて、内皮細胞が組織カリクレインを産生分泌するか否かにつき詳細に検討した。】HUVECの培養上清を透析・濃縮し、合成ペプチド基質を用いてカリクレイン活性を測定したところ、培養時間に依存して培地中に活性の増加を認めた。このカリクレイン様活性はカリクレインインヒビターであるaprotininで完全に阻害されたが、血漿カリクレイン阻害作用のあるsoybean trypsin inhibitorで影響を受けないことから、組織カリクレインと考えられた。HUVEC培養上清を抗ヒト組織カリクレイン抗体でWestern blotを行ったところ、標準カリクレインに一致したサイズの抗原の存在を認めた。HUVEC培養上清をウシ低分子キニノゲンと反応させた結果、キニンの産生活性をもつことが確認された。また、35S-メチオニン存在下で培養したHUVEC培養上清を抗ヒトカリクレイン抗体で免疫沈降し、その沈降物のSDS-PAGEを行った結果、組織カリクレインに一致したバンドが認められ、組織カリクレインはHUVECによりde novo合成されていることを確認した。