hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミロイドとミクログリアの生体画像化による抗アミロイド療法の機構解明と評価法確立

1.生体アミロイドイメージングのシグナルをもたらす分子種の同定平成19年度は、これまでに確立した陽電子断層撮影(PET)による老人斑モデルマウス(アミロイド前駆体トランスジェニックマウス:APP Tgマウス)脳アミロイドイメージングにおける知見に基づき、AD患者に比してモデルマウスのアミロイドイメージングがなぜ困難であるのかを追究した。その結果、アミロイドβペプチド(Aβ)のN末端が切断されピログルタミル化されたAβN3pEがAD患者脳では多量に蓄積するのに対し、APP Tgマウスでは蓄積量がはるかに少なく、しかもアミロイドに対するPETプローブ([^<11>C]PIB)の結合部位はAβN3pEの蓄積部位ときわめてよく一致することが確認された。従って、PETプローブが認識する"AD患者型"アミロイドは、"APP Tgマウス型"アミロイドよりもAβN3pEの含有量が多く、このAβN3pEが増加するメカニズムを理解する際にPETイメージングが有用な指標をもたらし、AD発症機序解明や治療的制御に結びつくと考えられた。これら一連の研究に関する論文は、Journal of Neuroscienceに掲載された。2.グリア細胞機能の指標となるイメージングバイオマーカーの探索PETイメージングが可能な末梢性ベンゾジアゼピン受容体(PBR)が、神経細胞死が少ないAPP Tgマウスではアストロサイト主体で増加するのに対し、神経細胞死が顕著なタウTgではミクログリア主体で増加することが分かり、アストロサイトとミクログリアのPBRは、それぞれ神経保護的なグリア活動と神経傷害的なグリア活動を反映することが示唆された。このPBRの発現特性はADモデルマウスのみならず、様々な神経変性モデルでも当てはまり、PBRがミクログリアとアストロサイトのどちらで増加するかをあらかじめ各疾患の動物モデルで検証しておけば、その疾患の発症過程や治療過程でグリアがいかなる役割を持つのかが明らかになり、それを踏まえて生体でモニタリングが可能になると見込まれる。これらの研究に関する論文は現在投稿中である。1.アミロイドワクチン療法による脳アミロイドの減少とミクログリア活性化の可視化小動物用ポジトロン断層撮影装置(マイクロPET)とポジトロン核種標識アミロイドプローブ[^<11>C]Pittsburgh Compound-B(PIB)を用いて、アミロイド前駆体蛋白トランスジェニックマウス(APP23マウス)における脳アミロイド蓄積の加齢変化を可視化することに成功した。さらにAβワクチン療法の評価として、抗Aβ抗体を注入したAPP23マウス海馬におけるアミロイド減少を、[^<11>C]PIBにより経時的にモニタリングすることができた。その際に、活性化ミクログリアのPETプローブである[^<18>F]fluoroethyl-DAA1106を用いて、アミロイド減少と並行して抗体によるミクログリアの活性化をマイクロPET可視化し定量しえた。この結果、治療前のアミロイド量が多い個体ほど治療後のミクログリア活性化が強いことが明らかとなり、アミロイド蓄積量が多い場合はワクチン療法でミクログリアの過剰な活性化が起こりうることが示唆された。2.抗アミロイド療法の神経原線維変化に対する効果の可視化変異型タウ蛋白トランスジェニックマウス(P301Sマウス)におけるミクログリア活性化と神経変性の因果関係を検討した。MRIで脳萎縮が観察されるのが生後9ヶ月頃であるのに対して、ミクログリアプローブDAA1106で見出されるグリア活性化は生後3ヶ月前後に始まることが分かり、さらにミクログリア活性化を免疫抑制剤FK506により抑止したところ、神経変性も顕著に軽減されることが判明した(Neuron 2007)。このことより、ミクログリア活性化がタウ蛋白異常に基づく神経変性を加速することが明らかになり、アミロイドワクチン療法でミクログリアの過剰な活性化をきたした際の危険性が示唆された。

このPBRの発現特性はADモデルマウスのみならず、様々な神経変性モデルでも当てはまり、PBRがミクログリアとアストロサイトのどちらで増加するかをあらかじめ各疾患の動物モデルで検証しておけば、その疾患の発症過程や治療過程でグリアがいかなる役割を持つのかが明らかになり、それを踏まえて生体でモニタリングが可能になると見込まれる。これらの研究に関する論文は現在投稿中である。
ヒト胎児の学習能を用いた中枢神経系機能評価方法の開発と応用

本研究では、定位反応を用いて胎児学習能を評価することを目的に、ヒト胎児に振動や各種の音響による刺激を行い、これに対する胎児心拍数、胎動の変化を、記録システムの作成と刺激条件の設定を行ったうえで、胎児の馴化について検討した。対象は妊婦から同意を得た妊娠32-34週の胎児9例と妊娠35-37週の胎児12例である。音響刺激には2種類の白色雑音(85dB):A刺激(250ms、無音期間250ms、4.75秒間反復)、B刺激(500ms、無音期間500ms、4.5秒間反復)を用いた。胎児の無眼球運動期に母体腹壁より15cm離れたスピーカからA刺激を5回呈示した後にB刺激を1回行った。解析には刺激後の胎児心拍数変化を用いた。妊娠32-34週、妊娠35-37週の各群およびコントロール群(無刺激)で、初回刺激に対する反応の大きさ、繰り返し刺激に対する反応の大きさの変化、A-5試行とB-1試行の反応の大きさを検討した。初回刺激に対する心拍数変化は、35-37週群では-3.6bpm(絶対値:4.3bpm)と有意であった。32-34週群では0.29bpm(絶対値:3.6bpm)であり絶対値のみ有意であった。繰り返し刺激、B刺激に対して、35-37週群では反応が漸減しB刺激により回復したが、妊娠32-34週の胎児では心拍数変化に一定の傾向は見られなかった。同意を得て同様の刺激をおこなった妊娠32週未満の胎児5例では反応を生じない例が4例存在していた。これにより、妊娠35週以降のヒト胎児では定位反応の馴化が心拍数変動として認められ、驚愕反応を利用した場合と同様の結果を得た。一般的には、ほぼ妊娠28週前後で低酸素症に対する心拍数変動の表現力が完成するとされ、同時期、延髄レベルの心拍制御はより高次中枢の影響下にあることも知られている。ここに、馴化の視点に立てば生理的な状況においては妊娠35週前後に心拍数変動に対するより高次の制御が完成するものと考えられる。これは、これまでに著してきたノンレム睡眠の完成と期を一にするものである。この成果は心拍数観察による胎児評価の臨床に一石を投じるものであるとともに、観察手殺としてより容易な心拍数変動を健常な胎児の高次神経機能の評価に応用する論理的根拠を導くものでもある。本年度は胎児の学習能の評価として、振動や各種の音刺激を用いた刺激-応答記録システムの開発のため、ヒト胎児に振動や各種の音を用いた刺激を行い、これに対する胎児心拍数、胎動の変化を記録可能なシステムの開発および刺激条件の設定を行った。

われわれは先行研究により、妊娠32週以降の胎児に馴化が認められること、さらに、延髄橋まで発達している胎児に比べ、橋より上位の中枢が機能を開始している胎児では反応の減弱が早期に生じておりより早く馴化していること、すなわち胎児中枢神経系機能の発達レベルが異なる症例では馴化の形成様式が異なっていることを明らかにしていた。この刺激方法では妊娠32週以前の胎児の反応のばらつきが大きいこと、また反応の指標として胎動を用いたため定量的な評価が困難であることが問題点として抽出された。本研究ではこの過去の研究の成果を根拠に、この問題点を解決し、安定した刺激方法を用いた胎児上位中枢神経系機能評価方法を開発することを目的として、定位反応を用いた馴化の評価方法の試行を行った。母体より同意をえた、母児に合併症を有さない妊娠36週38週の胎児3例において、それぞれ無眼球運動期であることを確認の上、母体腹壁より500Hz,1sec,90dBの純音刺激を加え胎児心拍数陣痛図を用いて、胎動ならびに心拍数変化を記録した。その結果、正常胎児3例のうち1例では刺激に引き続き心拍数の有意な低下が認められた。潜時は2.2-3.8秒、振幅は12-8bpmであった。刺激によって胎動は誘発されなかった。つまり妊娠36週以降、音刺激に反応し心拍数変動を示す胎児が存在することがわかった。本刺激は定位反応を誘発するため、認知の要素をとりいれたより高次の学習能についての解析が可能となると考えられる。次年度はより多くの症例において反応を得ることができる至適刺激条件を検討するとともに、リファレンスとしての他の行動指標による発達評価との連関の有無を解析する。驚愕反応を利用した検討から妊娠32週以降の胎児に馴化が認められること、中枢神経系機能の発達レベルが異なる症例では馴化の形成様式が異なっていることを示してきた。刺激に対する反応は大きく驚愕反応と定位反応に分けられる。定位反応は未知の刺激に対する注意反応であり驚愕反応に比し上位中枢の関与が必要とされ、その馴化には海馬が関与すると報告されている。本年度は胎児の学習能の評価として定位反応を用いた馴化について検討を行った。対象は母体から研究参加への同意を得た妊娠32-34週の胎児9例と妊娠35-37週の胎児12例である。刺激には2種類の白色雑音(85dB)、A刺激(250ms、無音期間250ms、4.75秒間反復)、B刺激(500ms、無音期間500ms、4.5秒間反復」を用いた。胎児の無眼球運動期に母体腹壁より15cm離れたスピーカからA刺激を5回呈示した後にB刺激を1回行った。解析には刺激後の胎児心拍数変化を用いた。妊娠32-34週、妊娠35-37週の各群およびコントロール群(無刺激)で、初回刺激に対する反応の大きさ、繰り返し刺激に対する反応の大きさの変化、A-5試行とB試行の反応の大きさをそれぞれMcNemar test、ANOVA、paired t-testを用いて検討した。初回刺激に対する心拍数変化は、35-37週群では-3.6bpm(絶対値:4.3bpm)と有意であった。32-34週群では0.29bpm(絶対値:3.6bpm)であり絶対値のみ有意であった。繰り返し刺激、B刺激に対して、35-37週群では反応が漸減しB刺激により回復したが、妊娠32-34週の胎児では心拍数変化に一定の傾向は見られなかった。以上より妊娠35週以降のヒト胎児では定位反応の馴化が認められることが分かった。これらの胎児では海馬を中心とした大脳辺縁系が機能開始していると考えられた。本研究では、定位反応を用いて胎児学習能を評価することを目的に、ヒト胎児に振動や各種の音を用いた刺激を行い、これに対する胎児心拍数、胎動の変化を記録可能なシステムを作成し刺激条件を設定し胎児の馴化について検討を行ってきた。
遺伝子組換えによらない、幅広い植物種に適用できる新奇な形質転換系の開発

遺伝子サイレンシング・シグナル(siRNA)を産生する宿主植物に対して、宿主特異性の低い寄生植物ネナシカズラを寄生させ、宿主から異種植物へのsiRNA輸送実験系を構築した。siRNAの長距離輸送と輸送されたsiRNAによる異種間遺伝子サイレンシングが、宿主とネナシカズラの間で、あるいは、ネナシカズラ寄生を介した別々の宿主個体間で、起こるかどうか調べた。その結果、宿主からネナシカズラへのsiRNA輸送系、ネナシカズラを介した宿主個体間におけるsiRNA輸送系のいずれにおいても、移動したsiRNAのレベルは検出限界以下であり、移動したsiRNAによる遺伝子サイレンシングは観察されなかった。宿主からネナシカズラへのRNA・タンパク質の長距離移動と移動後の機能を検証するための系を確立することに取り組んだ。(1)タンパク質の移動と機能:1ネナシカズラの花成誘導因子遺伝子FTにタグ配列コード配列を連結した標識FT遺伝子を作製した。タグ標識FT遺伝子を師管伴細胞特異的プロモーターあるいは35Sプロモーターに連結し、それぞれをシロイヌナズナに導入し、形質転換体を得た。(2)siRNAの移動と機能:1師管伴細胞特異的プロモーターにネナシカズラFTのへアピン遺伝子を連結し、シロイヌナズナに導入し、形質転換体を得た。FTのへアピン遺伝子導入植物にネナシカズラを寄生させ、siRNAの異種植物間移動およびネナシカズラ花成の阻害が起きるか検証中である。2ネナシカズラの寄生根形成関連遺伝子もしくはカルコン合成酵素遺伝子CHSのへアピン遺伝子を師管伴細胞特異的プロモーターに連結し、それぞれシロイヌナズナに導入し、形質転換体を選抜中である。(3)mRNAの移動と機能:1シロイヌナズナにネナシカズラを寄生させた時、宿主mRNAのネナシカズラへの移動するかどうか、長距離移動が既知となっているGAI遺伝子に着目して検定した。その結果、シロイヌナズナからネナシカズラへのGAImRNAの移動は確認できなかった。2ネナシカズラのGAI相同遺伝子が単離できたので、そのmRNAが宿主植物へ移動するかについても調べた。その結果、ネナシカズラからシロイヌナズナへのGAImRNAの移動は確認できなかった。ネナシカズラを介した宿主植物間におけるsiRNAの長距離輸送と機能を検証する系を確立するために、師管伴細胞特異的プロモーターに連結したゴマの遺伝子(CHIおよびYAB2)のへアピン遺伝子をそれぞれ別々に導入した形質転換シロイヌナズナを作出した。最終年度は、ネナシカズラによる寄生を介したsiRNA輸送の検証のための実験系を2種構築し、解析した。(1)宿主からネナシカズラへのsiRNA移動とネナシカズラでの遺伝子発現抑制の調査:ネナシカズラの花成誘導遺伝子(CjFT)のsiRNAを師管伴細胞特異的に発現するシロイヌナズナ形質転換体を作製した。その花茎にネナシカズラを寄生させ、CjFTsiRNAが宿主からネナシカズラへ移動するか、ネナシカズラ自身のCjFT遺伝子の発現が抑制されるか否か調べた。その結果、宿主に生じたCjFTsiRNAのシグナルは、ネナシカズラからは検出できず、またネナシカズラCjFT遺伝子の発現レベルも、野生型シロイヌナズナを宿主にした場合と顕著な差は認められなかった。(2)ネナシカズラにより連結された2個体の宿主の間でのsiRNA輸送と遺伝子発現抑制の調査:ネナシカズラをまず第1宿主(GFP遺伝子のsiRNAを発現する形質転換シロイヌナズナ)に寄生させ、続いて第2宿主(GFP遺伝子が発現する形質転換シロイヌナズナ)にも寄生させた。第1から第2へと宿主間をネナシカズラ維管束を経由してGFPsiRNAが移動するか、第2宿主でのGFP遺伝子の発現が抑制されるか否か調べた。その結果、第1宿主に生じたGFPsiRNAのシグナルはネナシカズラと第2宿主のどの組織からも得られず、また、第2宿主のGFP遺伝子の発現レベルは、野生型シロイヌナズナを第1宿主にした場合と顕著な差は見出せなかった。本研究で用いたいずれの実験系でも、宿主からネナシカズラにsiRNAが移動しない、もしくは検出限界以下の量しか移動せず、結果として標的遺伝子の異種間サイレンシングは観察されなかった。今後は、シロイヌナズナ以外の宿主植物を用いることも含め、宿主体内でsiRNAが高発現される条件を検討しなければならないことが明らかになった。植物分子生物学現在までに、タグ標識したFTタンパク質遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナ、ネナシカズラ遺伝子をサイレンシングするためのヘアピン遺伝子を導入した遺伝子導入シロイヌナズナなど、当初計画のとおりの遺伝子を導入したシロイヌナズナ形質転換体を作出することがほぼできている。

すなわち、宿主植物(シロイヌナズナ)からネナシカズラへのRNA・タンパク質の長距離移動と移動後の機能を検証する系を確立することができたのである。この系によって、平成26年度に予定していた、宿主へ長距離移動したsiRNA・タンパク質の機能を検証することが可能なので、当初計画は「おおむね順調に進展している」と判断した。ただし、シロイヌナズナからネナシカズラへのmRNAの長距離移動については、RNAの移動量は非常に少ないということを示唆するデータが得られたので、宿主植物からネナシカズラへの効率的なRNA移動ができるような実験系を実現する必要がある。そのために実験計画の一部変更を行なっている。平成25年度に作出した各種の遺伝子導入シロイヌナズナを用い、異種植物間を長距離移動したタンパク質やRNAが機能するかを調べるため、次の実験を行なう。(1)シロイヌナズナからネナシカズラに長距離移動するタンパク質の機能解析:タグ標識FTを発現する遺伝子導入シロイヌナズナに対してネナシカズラを寄生させる。蛍光観察やウエスタンプロットにより、タンパク質の移動を確かめつつ、ネナシカズラに花成が誘導されるかどうかを観察する。(2)シロイヌナズナからネナシカズラに長距離移動するsiRNAの機能解析:ネナシカズラ遺伝子に対するへアピン遺伝子を師管伴細胞特異的に発現するシロイヌナズナに、ネナシカズラを寄生させる。へアピン遺伝子から作られるsiRNAの異種植物間の移動について調べるとともに、ネナシカズラの遺伝子発現がRNAiによって抑制されるかどうか検討する。(3)シロイヌナズナからネナシカズラに長距離移動するRNAの機能検定:GAIのドミナントネガティプ変異遺伝子を発現するシロイヌナズナ形質転換体を作製し、それに対してネナシカズラを寄生させる。宿主から移動した変異GAIのRNA・タンパク質がネナシカズラの中で機能するかどうかを調べる。(4)ネナシカズラを介した異種植物聞におけるsiRNAの長距離移動と機能:まず、ゴマのCHIもしくはYAB2のへアピン遺伝子を発現する遺伝子導入シロイヌナズナに対してネナシカズラを寄生させる。次に、寄生中のネナシカズラを第2の宿主であるゴマに寄生させ、ネナシカズラを介してsiRNAがシロイヌナズナからゴマに移動したかどうかを調べ、移動後のsiRNAによりゴマ遺伝子の発現が抑制されるかどうか検討する。以上のような形質転換シロイヌナズナの系のほかに、実験の簡便性やRNAの移動効率を改善するためにウイルス誘導性の遺伝子サイレンシング法の導入についても進める。(1)タンパク質の長距離移動を検出するためのタグ標識タンパク質発現植物の作製において、タグ配列の種類を当初計画よりも増やしたため、タグ配列の検出を次年度にまとめて行なうように計画を変更した。そのため、タグ配列検出用の試薬類を次年度に購入することとした。(2)siRNAを発現する形質転換シロイヌナズナの作製において、当初計画よりも多くの種類の形質転換植物を作製したため、siRNAの検出を次年度にまとめて行なうように計画を変更した。そのため、siRNAの検出用の試薬類の購入を次年度に回した。
水圧破砕によって誘発される地震のメカニズムの解明

シェールガス開発における誘発地震のメカニズム解明のために剪断破壊を仮定した発震機構解析と見かけ応力解析を組み合わせ,体積変化の有無について調べる手法を開発した.その手法を米国・テキサス州における水圧破砕により誘発された微小地震に適用した結果,見かけ応力は貯留層内の最大水平応力軸に低角な走行を持つ地震について低く見積もられる事が明らかになった.これより誘発地震のメカニズムは既存の断層方向と貯留層内の応力の状態によって剪断破壊となるかTCとなるかが決まる可能性が示唆された.さらに,より直接的に震源解析を行うために水圧破砕の地震に特化して,解を制約し,安定したメカニズムを得る手法を開発した.現在シェールガス開発などの資源開発現場において水圧破砕はルーチン的に観測され,微小地震の広がりをリアルタイムで観察する事が可能である.しかし,これらの地震が貯留槽内でガスの流路となるフラクチャーの形成,成長とどのような関係があるのかは誘発地震のメカニズムがわからないために,詳細は不明である.誘発地震のメカニズムは,その発生理由から主に以下の二つであると考えられる.1.体積変化を伴う、2.剪断破壊ともしくはその両方であると考えられる。体積変化が伴う場合は体積増加(減少)により孔隙率の上昇(低下)を伴う.これは流体の流れをリアルタイムで把握することができ,フラクチャーの進行を制御する事が可能である.剪断破壊の場合は間隙水圧の上昇により既存の小断層がすべった結果で,発震機構から貯留層内の応力軸の変化や,断層同士の相互関係を調べる事が可能である.昨年度はアメリカ、テキサス州のCotton Valleyの水圧破砕データを用い、微小地震の応力降下量を見積もる事によりこれらのメカニズムを明らかにすることを試みた。見積もられた応力降下量は流体により誘発された自然地震同様に比較的低く見積もられが、目立った特徴として応力降下量が同じマグニチュードでも断層の走行方向によって異なっていた。最大水平応力軸に低角な走行を持つ地震は特に低く見積もられた。これは水圧破砕により貯留層の応力状態が変化すると共に、流体が既存の断層に流れ込み有効応力を下げ、破壊にいたるというモデルで説明できる可能性が考えられる。また、より多くのデータを得るためにニューラルネットワークを用いた誘発地震(微小地震、低周波地震)を検出方法を開発し、現在数値テストが終了し、観測データ(Newberry, Cotton Vally)で検証しているところである。平成26年度では昨年度より引続きアメリカ、テキサス州Cotton Valleyにおける水圧破砕実験により誘発された微小地震についての解析を行った。昨年度は応力降下量について時空間分布を求めその解釈を行ったが本年度はそれに加え、見かけ応力についても検討を行った。その結果見かけ応力についても地域の最大水平応力に低角な走行を持つ地震について低く見積もられる事が明らかになった。本年度はこの研究結果をまとめ、米地震学会誌、Bulletin of seismological society americaに投稿し、受理されている。この結果から、水圧破砕による微小地震は単純に剪断破壊のみで説明されるわけではなく、亀裂とバックグラウンドの応力の状態によって変化することが示唆される。そこでより詳細なメカニズムを理解するために次のステップとして発震機構解を推定を試みている。通常の地震の解析と違い、本研究で解析するような水圧破砕による誘発微小地震観測では観測井は1ー2個であることが多々あるため観測方位を十分にとることが難しい。そのような場合発震機構に体積変化の項を加える事は非常に難しいが、本研究ではそれを克服するためにフルモーメントテンソルを求めるのではなく、剪断破壊とテンサイルクラックのメカニズムで解を制約し、モデルパラメターを削減した。また、クラスターごとのメカニズムを同じと仮定することで、観測点と震源の位置を逆転することで十分な観測方位を取ることを目指した。具体的にはクラスター内の地震が方位角と射出角の関数であるSV/P, SH/P, SH/SV振幅比を満たすようなメカニズムをグリッドサーチにより探すという手法である。平成27年度ではこれまでに引続きアメリカ、テキサス州Cotton Valleyにおける水圧破砕によって誘発された微小地震についての解析を進め、これらの地震の震源解析をより直接的に行うために,剪断破壊とテンサイル(TC)のメカニズムで制約することにより解の安定を得る手法を開発した.また水圧破砕においては観測方位が1、2個と限られる場合が多いため、クラスターごとのメカニズムを同じと仮定し、観測点と震源を逆転させることで観測方位の確保を可能にした。これらの手法を数値実験を繰り返し妥当性を検証した結果,半無限媒質を仮定し,P波,SH波,SV波の振幅比を使用できる条件下においてCotton Valleyの観測条件に適用した場合,TC成分20%までならば解析可能であるという結果が得られた.Cotton Valleyの観測条件ではTC成分が30%を超過するとP波はすべて押しになることが示されているが、観測されたP波は引きも多数見られるため整合しない。

故にCotton Valleyの微小地震ではTC成分は多くとも20%程度であると考えられ,本研究で開発した手法によりTC成分を検出できる可能性が示された.また27年度はより多くの水圧破砕データを解析するために共同研究も活発に行った.主たるものとしてカナダアルバータ大学との共同研究があり, 1. 2011年から2012年にかけてアルバータ州で発生した微小地震のメカニズム解析, 2. 2015年6月13日に発生した最大規模の誘発地震であるM4の地震に焦点をあててその発生過程を詳しく解析して発生原因の解明を試みた.これら2つの共同研究の成果をまとめた論文も受理されている.シェールガス開発における誘発地震のメカニズム解明のために剪断破壊を仮定した発震機構解析と見かけ応力解析を組み合わせ,体積変化の有無について調べる手法を開発した.その手法を米国・テキサス州における水圧破砕により誘発された微小地震に適用した結果,見かけ応力は貯留層内の最大水平応力軸に低角な走行を持つ地震について低く見積もられる事が明らかになった.これより誘発地震のメカニズムは既存の断層方向と貯留層内の応力の状態によって剪断破壊となるかTCとなるかが決まる可能性が示唆された.さらに,より直接的に震源解析を行うために水圧破砕の地震に特化して,解を制約し,安定したメカニズムを得る手法を開発した.25年度の成果をまとめ論文投稿受理まで進み、26年度の目標としての震源メカニズム解析のプログラムを作成し解析を実施中であるため。また、地震波検出のためのプログラム開発も数値テストをクリアしその有用性が示されたため。地球物理学現在解析中のCotton Valleyのデータを用いて様々な解析が可能なため、他のデータを手広く解析する前に本データで水圧破砕による微小地震の応力降下量、震源メカニズム、発生メカニズムの解釈を行う予定である。その後順次他のデータにもあてはめ、共通点や相違点を見つけ包括的な解釈をしたいと考える。低周波地震の検出については現在連続波形を入手するまでには至っていないのでその有無は確認できないが、ニューラルネットワークを用いた地震波検出のプログラムは完成しているので、数値データを用いてそれらの有用性をまとめようと考えている。25年度の研究計画としては1.多段階フラクチャリングで観測されたデータの入手,整理,震源再決定, 2.連続波形データから低周波地震の検出を試みる, 3.経験的グリーン関数を用いた震源スペクトル解析としていたが、1については先方(Schlumberger)の権利の関係上データを入手することが困難となった.その代わりLivermor National LabolatoryのDennise Templeton博士よりNewberryの水圧誘発地震の観測データを提供していただけることとなった.それらはすでに詳細な震源再決定がされており、低周波地震と思われる地震もいくつか観測した.3についてはCotton Valleyの水圧破砕データを持ちい、応力降下量を見積もり誘発地震のメカニズムに関する一つのモデルを提案することができ、現在成果をまとめて論文を執筆中である.当該年度では海外の学会で発表を予定していたが、研究の進捗状況を鑑み次年度に繰り越すため。また、論文をもう一本投稿する予定であったが現在共著者との議論中でまだ投稿にはいたっていないため次年度に繰り越す。今後は本年度提案したモデルを裏付ける検証をしたいと考える。異常に低い応力降下量が推定されたことは貯留槽内の差応力が一旦小さくなったあと、有効応力が低下したと考えられる。この場合は最小応力軸が、負となり体積の増加が示唆される。
がん治療後のリンパ浮腫における画像評価に基づく弾性着衣の選択と圧迫療法の定量評価

乳がん術後の続発性上肢リンパ浮腫で、保存療法とLymphatic Venous Anastomosis(LVA)を実施した患者の術前後の患側上肢の体積とBMI、術後の圧迫療法を調査した。【方法】対象は、2011-2016年にLVAを受け、定期受診する患者で調査への同意が得られた45症例とした。【結果】リンパシンチグラフィーによる重症度は、Maegawa分類においてType IIIーVであり、LVA手術回数は平均1.7回、吻合数は平均4.2吻合であった。術前、術後1年における患側上肢の平均体積は減少したが、群間の有意差は認めなかった。術前、術後1年におけるBMIは、ほとんど変化はなく、群間の有意差を認めなかった。術後6ヶ月後のICG以後、日中にスリーブ、グローブの着用を中止した症例(中止群)は32名(71.1%)、継続する症例(継続群)は13名(28.9%)であり、中止例の割合が高く有意差を認めた。弾性着衣は圧迫圧15-25mmHgの丸編み、平編みが使用されていた。両群とも術前の浮腫で患側上肢は緊満していたが、LVA後は緊満が軽減し、やわらかさを自覚しており、蜂窩織炎の発症例はなかった。【考察】上肢は下肢よりも繊細な動きや水仕事などで弾性着衣を着脱する機会も多く、我が国のような高温多湿な気候条件では皮膚トラブルが発生する患者も多い。LVA後、日中の圧迫療法を中止できることで、患者の生活動作やストレスが改善することが示唆された。今後は、圧迫療法中止後のセルフケア指導、術前後におけるQOLの定量評価を行う必要がある。圧迫療法を継続する症例では、重症度と生活背景をふまえた弾性着衣の選択、着圧による定量評価、乳がん治療が圧迫療法へどのような影響を与えているかについての検討が必要と考える。当該年度の研究予定内容で順調に伸展している。本年度は、乳がん治療の内容がLVA後の圧迫療法に及ぼす影響や、続発性下肢リンパ浮腫における弾性着衣の効果を検証するため、圧迫圧と体積の変化について分析する予定である乳がん術後の続発性上肢リンパ浮腫で、保存療法とLymphatic Venous Anastomosis(LVA)を実施した患者の術前後の患側上肢の体積とBMI、術後の圧迫療法を調査した。本年度は、乳がん治療の内容がLVA後の圧迫療法に及ぼす影響や、続発性下肢リンパ浮腫における弾性着衣の効果を検証するため、圧迫圧と体積の変化について分析する予定である本年度、患者用リーフレットを作成する予定であったが、内容の更なる検討が必要となり次年度に印刷することとなった。
画像意味理解のためのクラスタリングによる特徴抽出

本年度(平成21年3月31日)の研究実施計画本研究では、一般画像認識において、学習画像群から対象物体を適切に識別できる特徴量を精密に求める手法について検討する。学習画像群から得た特徴量は、精密に求めた適切なパラメータに基づいて算出されていれば、特徴空間中で対象物体を特徴付ける構造に対応するクラスタを構成すると考えられる。そこで、より識別性能を高めるようなクラスタを形作るように特徴量算出のパラメータを調整することにより、一般画像認識に有効な特徴量を抽出することを考えている。そのため、本研究では、従来比較的独立に研究されてきた、統計解析・データ工学に基づくクラスタ解析と、画像解析との研究領域間の密な結合に基づいて取り組む。平成20年度は、TRECVIDデータを対象として映像/画像の概念カテゴリへの分類について検討を行った。局所特徴量に基づく方法により、上記の考え方に従い、識別性能を最適化するように局所特徴量のクラスタリングを修正する実験を行った。その結果、分類性能は確かに高くなることが分かったが、過学習に陥りやすいという問題点があることも分かった。一方、別途検討した大局特徴量に基づく概念分類手法では、過学習の問題も少なく、かつ性質の異なるデータで学習しても識別性能が落ちにくい(cross-domain特性がよい)ことも分かった。一方、顔画像の識別問題について上記と同様のアプローチを取り、Webから取得した大量の顔画像に対して、顔類似度の点でより良いクラスタを検出するように顔検出器を学習させることにより、有名人を主たる対象とした特定人物の検出器を自動学習するアルゴリズムを考案した。
マイクロマシンによる頭蓋内血管用能動カテーテルの開発

クモ膜化出血などの脳血管性病変に羅患する人々が増加しており、このような疾患に対して経皮的にカテーテルをもちいる血管内治療法が行われるようになり、成果をあげつつある。しかしながら、血管内治療法の施行しうる疾患は現在の所は限られている。その理由として頭蓋内血管の複雑な屈曲や脆弱性によるカテーテル誘導の困難さがあげられている。本研究はこれを解決するために、最近工業分野で注目されつつあるマイクロマシンの技術を応用し、頭蓋内血管用のマイクロカテーテルを開発することを目的としている。今年度は能動カテーテルの誘導に必要な遠隔操作について基礎研究を行った。シリコンゲルを用いたマイクロ力覚センサーをカテーテル先端に装着し、まず静特性の評価を行った。センサーと被接触体の接触角度を変化させる実験を行い、90度から60度までの間では正確な力覚の測定がえられ、測定誤差34%であった。これによりマイクロ力覚センサーは実用上使用可能であることが判明した。この力覚センサーとカテーテル基部にはミリ単位の動作制御を可能とするサーボモーターを使用した駆動装置を用いて遠隔操作実験を行った。シュミレーション実験によると血管壁に接触したカテーテルは自動的に動作を停止した。これによりカテーテルを能動化し遠隔操作することが可能であることが判明した。実用化への障壁はなくなったと考えられる。人口の高齢化に伴い、蜘蛛膜下出血などの脳血管性病変に罹患する人々が増加しており、従来行われてきた脳神経外科的手法では治療不可能な疾患も増加してきている。このような疾患に対して経皮的にカテーテルをもちいる血管内治療法が頭蓋内疾患に対しても行われるようになり、成果をあげつつある。その理由として頭蓋内血管の複雑な屈曲や脆弱性によるカテーテル誘導の困難さが挙げられている。本研究はこれを解決するために、最近工業分野で注目されつつあるマイクロマシンの技術を応用し、頭蓋内血管用のマイクロカテーテルを開発すること目的としている。型状記憶合金(SMA wire)(100-150micron)は通電量の調節により、収縮量を設定可能であり、高分子電解膜であるICPF(Ionic Conducting Polymer Film Actuator)は低電圧の通電により電気分解が生じ陰極側に湾曲する能力を有する。これら両者をカテーテル先端に装着することにより、外部からのカテーテル誘導可能となった。また生理食塩水を用いたsimulator内で懆作可能であった。この方式を生体内でも可能にすべく研究中である。今年度は能動カテーテルの開発に不可欠の力覚センサーについて基礎的研究を行った。これは力覚センサーをカテーテル先端に装着することにより血管壁に接触したカテーテル先端が直ちにその力覚を感知し、駆動システムにフィードバックすることにより制御する方法を開発する基礎となる。これをさらに小型化し生体内でも可能にすべく研究中である。

型状記憶合金(SMA wire)(100-150 micron)は通電量の調節により、収縮量を設定可能であり、高分子電解膜であるICPF (Ionic Conducting Polymer Film Actuator)は低電圧の通電により電気分解が生じ陰極側に湾曲する能力を有する。これら両者をカテーテル先端に装着することにより、外部からのカテーテル誘導可能となった。生理食塩水下のシュミレーション(in vitro実験)では外部からの通電によりカテーテルの誘導は可能であった。一方犬を用いた(in vivo実験)では、1)は体温の影響を受け、誘導は生理食塩水下のシュミレーションと比較し良好でないことと、発生する熱が体組織に影響を与える可能性があることが判明した。2)は通電量が大きく全体の心機能に与える可能性があることが判明した。2.能動カテーテルの開発に必要な力覚センサーについても研究を行った。これは力覚センサーをカテーテル先端に装着することにより血管壁に接触したカテーテル先端が直ちにその力覚を感知し、駆動システムにフィードバックすることにより制御する方法を開発する基礎となる。シリコンゲルを用いたマイクロ力覚センサーをカテーテル先端に装着し、まず静特性の評価を行った。センサーと被接触体の接触角度を変化させる実験を行い、90度から60度までの間では正確な力覚の測定がえられ、測定誤差34%であった。これによりマイクロ力覚センサーは実用上使用可能であることが判明した。
植物病原糸状菌のメラニン合成を制御する細胞内銅イオン輸送機構の解明

植物病原糸状菌は巧みな感染戦略を駆使することで、宿主植物への感染を確立する。モデル植物病原糸状菌であるウリ炭疽病菌は付着器と呼ばれる感染器官を形成し、同器官の細胞壁にはメラニン色素が蓄積する。適切なメラニン合成を行うにはメラニン合成酵素遺伝子の発現制御とメラニン合成酵素の活性を制御する必要がある。これまでに、幾つかの転写因子が同定されているが、どのような因子が酵素活性を制御するのかは未解明である。本研究では、ラッカーゼの活性を制御する細胞内銅イオン輸送機構に焦点をあて、メラニン合成制御機構の解明を目指す。
ウイルスタンパク質とミトコンドリアとの相互作用解析

細胞内のエネルギー工場であるミトコンドリアは、流動性に富んだ動的なオルガネラであり、抗ウイルス自然免疫の拠点としても機能している。この免疫系では、ウイルス感染に伴う一連のシグナル伝達反応がミトコンドリア膜上で行われるものと考えられている。本研究では、前年度に引き続き、感染宿主内でのミトコンドリアとウイルスタンパク質との攻防を中心に研究を展開し、ミトコンドリア動態と自然免疫がどのように?また何故関係するのかを関連する宿主側のタンパク質群の分子基盤解析を行った。該当年度における研究の成果として、以下の点を明らかにした。1ミトコンドリア依存的な免疫応答の解析を行うために、新たな実験系の構築を行い、培養細胞のミトコンドリア呼吸活性によるエネルギー産生条件を確立した。2RNAウイルス感染時に、ミトコンドリアに局在する複数のタンパク質で複合体形成の違いを確認した。3上記、複合体構造の差異は、ミトコンドリア膜の動的特性の変化にもたらされている可能性を見出した。4酸化的リン酸化活性とRNAウイルスに対する自然免疫応答との間には相関性があることを見出し、ミトコンドリア阻害剤等を用いた実験によりその事実を明らかにした。以上の実験的な結果により、哺乳動物における抗ウイルス自然免疫におけるミトコンドリアの生理的な役割の一端を理解することが出来き、今後の新たなミトコンドリア像の確立を期待したい。28年度が最終年度であるため、記入しない。ミトコンドリアは主としてアデノシン三リン酸(ATP)産生の場として知られているが、その代謝における機能以外にもさまざまな細胞応答ともリンクし、各種シグナル伝達過程における中継地点としての役割をもつ。例えばアポトーシス時には、細胞外からの刺激が受容体を介して細胞内の各種シグナル伝達因子に伝わり、その情報がミトコンドリアに集約する、まさに情報伝達のハブとしての機能を担っている。また、RNAウイルスに対する細胞内自然免疫においても、宿主細胞内に移行したウイルス由来の核酸は、細胞内RNAセンサー分子(RIG-I/MDA-5)により感染初期に認識され、その情報がミトコンドリア外膜上に局在する膜蛋白質MAVSへと伝達される。これら一連のシグナル伝達過程は、その後のミトコンドリア下流の各転写因子やリン酸化酵素の活性化、最終的に転写産物の発現へと導かれる。このように、ミトコンドリアは細胞内シグナルソームの中継地点として細胞の運命をコントロールしている重要なオルガネラである。そこで該当年度は、感染細胞内でのミトコンドリアの役割を明らかにすることを目指した。特に、ウイルス感染による細胞負荷のミトコンドリアへの影響を、ウイルス産生蛋白質と宿主・ミトコンドリアタンパク質の両者の挙動を調べ、細胞生物学的な実験を中心として興味深い実験知見を得ることが出来た。本研究は、その当初目的である抗RNAウイルス自然免疫応答時におけるミトコンドリアの役割を明らかにするものであり、現在までにおいて、予備的な実験結果から興味深い知見を得ることができた。今後の継続的な実験の遂行により、次年度の明確な研究方針が立てられているために順調な推移と考えている。今後の研究方針として以下のような課題を予定している。1.ウイルス感染時における細胞内のミトコンドリア依存的なエネルギー代謝をATPプローブを用いて、細胞レベルで調べる。2.酸化的リン酸化活性と抗ウイルス免疫応答との関連性を、ミトコンドリア阻害剤を用いた実験により明らかにする。
カイコガを利用した体内受精型動物の精子成熟機構の解明

(1)精子成熟に関与する6つの候補タンパク質を見出した。これらのタンパク質は、共通してArg-Arg延長配列を含んでおり,精子成熟の進行とともに段階的な分解が見出された。これらの知見は、精子成熟誘発因子Initoatorinによって,主にArg-Argモチーフを特異的切断することで引き起こされているものと考えられる。(2)カイコガにおいても,精子の鞭毛運動形体変化は,ヒト精子の運動性の開始および調節における調節因子として注目されているCa2+,cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)活性およびチロシンリン酸化が深く関係している可能性が見出された。課題1:Initiatorin (BmIni)基質タンパク質としてのカルボキシペプチダーゼB (BnCPB)の同定貯精のうで特異的に発現するBmCPB遺伝子から得た大腸菌組換えタンパク質は,BmIniで活性化され,この時,BmCPBからは2つのペプチドが生じており,その分子質量は,既知の昆虫CPB等との相同性から予想されるpro-mature切断候補領域内で切断された場合に生じるものに相当していた。そこで,当該領域のArgを改変した組換えタンパク質を作成し,活性化への影響を調査したところ,不活性なBmCPBは,3つの連続するアルギニン(Arg)残基のC末端で特異的に切断され,活性化することが明らかになった。BmIniは連続した2つのArg残基のC末端を切断しやすい性質を持つが,BmCPBを含む基質タンパク質中のArg-Arg配列を特異的に認識することで活性調節されていることが明らかとなった。課題2:精子内シグナル伝達の解析哺乳動物や棘皮動物において精子成熟の初期誘発段階で関係するカルシウムイオンに注目し,未成熟カイコガ精子に対して,精子成熟誘発剤としてのトリプシン処理を行なう前に,カルシウムイオン透過担体Calcium ionophore A23187を添加し、その後細胞内キレート剤BAPTA-AMをさらに添加することで今までよりも高い割合で,in vitroで精包と同じような変化を再現出来るようになった。また,精子内のPKA活性を評価により,成熟反応開始の伴う,活性の上昇と,精子を構成するタンパク質のチロシンリン酸化の変化が精子成熟の開始に伴い,生じていることが明らかとなった。Initiatorin基質タンパク質として,カルボキシペプチダーゼBの同定がほぼ完了し,かつ平成28年度に計画していた新たなInitiatorin基質タンパク質の探索方法確立ならびに一部同定に持ち筋が立った点は、当初予定以上の進捗である。これにより,次年度への費用面での適切な対応も可能となった。一方、精子成熟に係わるシグナル伝達系に係わるカルシウムイオンの存在を明らかにした点については,ほぼ予定通りの進捗である。しかし,これを人工授精に供して,その意義を解析するまでには至らなかった点は,多少の遅延と考える。しかし,現在、速やかに検討に入る準備は整いつつある。課題1:in vitroでの精子成熟再現系に含まれるタンパク質を二次元電気泳動により解析することで,7つの候補タンパク質を見出した。そして,これらのタンパク質のN末端を決定し,これに基づき,コードする遺伝子の単離を行った。予想される配列からは,切断部位がInitiatorinの切断特異性と一致していることが確認できた。これにより,基質タンパク質としての可能性を強く確認できた。単離された遺伝子は生殖腺での発現解析ならびに大腸菌でのタンパク質発現を行ない,後者は,抗体作成の供した。それぞれのタンパク質に対して特異性をもつ抗体は,タンパク質の動態解析に用いた。なお,これらのタンパク質はオス生殖腺の分泌物であるので,精漿に存在するタンパク質と予想されたが,2種類は,未成熟な精子に吸着して存在しており,精子成熟によりInitiatroinの作用を受け,分解されると精子から放れ,精漿へと移動することを見出した。また,4種類については,お互いに相互関係を持ちながら精漿に存在している可能性を見出した。課題2:精子内シグナル伝達の解析in vitro精子成熟再現系において,反応開始に伴い精子を構成するタンパク質のチロシンリン酸化が変化する。今回,in vivoにおいても同様な変化が起きていることを確認するために,精包内精子を単離する方法を構築し,単離された精子のリン酸化を調査し,確認した。次に,リン酸化タンパク質の種類,リン酸化部位を同定するために,二次元電気泳動により当該タンパク質が分離できるように検討した。Initiatorin候補基質タンパク質を複数見出すことに成功し,予定よりも早い進捗であった。しかし,配列からは機能予測ができなかったので,研究方針を変更する必要が生じ,後半,来年度以降の実験展開のための探索に時間を必要とし,同時に,予算使用の工夫が生じた。一方、精子成熟に係わるチロシンリン酸化解析については、確実な進捗である。また,人工授精に関しても,現時点では顕著な結果は得られていないものの,実験系としては進行している。課題1:in vitro,in vivoでの精子成熟時のタンパク質変化を二次元電気泳動,逆相クロマトグラフィーにより解析し,遺伝子単離,作製抗体によるWesternblottingにより6つのイニシャトリン基質候補タンパク質を見出した。しかし,これらは全てデータベースとの照合により,公知のタンパク質や機能推測が可能なタンパク質ではなかった。そこで,それぞれのタンパク質をコードする遺伝子をTALENによるゲノム編集によりノックアウトされた系統を作製し,これを用いた機能解析を目指した。現在,2系統についてホモノックアウト系統が作製でき,1系統については,ノックアウト遺伝子座が固定できた状況にある。

課題2:精子内シグナル伝達の解析in vitro精子成熟再現系において反応進行に伴い,Phospho-PKA Substrate抗体陽性タンパク質,精子構成するタンパク質のチロシンリン酸化の増加を見出した。チロシンリン酸化タンパク質の種類,リン酸化部位を同定するために,二次元電気泳動により当該タンパク質が分離し,PMF法により同定を試みたができなかった。しかし,N末端の配列解析からタンパク質情報が得られ,課題1の過程で,すでに明らかとなっていた生殖腺分泌タンパク質であることが判り,これが精子に強固に付着していることが判った。また,このタンパク質は精子成熟に伴い,プロテアーゼにより特異的な分解を受け,N末端側は精子から放れるが,C末端側は精子に付着している状態が維持され,この領域に存在するチロシン残基がリン酸化しているものと予測された。なお,このタンパク質についても現在,機能が予測出来ないので,ノックアウト系統を作製している。(1)精子成熟に関与する6つの候補タンパク質を見出した。これらのタンパク質は、共通してArg-Arg延長配列を含んでおり,精子成熟の進行とともに段階的な分解が見出された。これらの知見は、精子成熟誘発因子Initoatorinによって,主にArg-Argモチーフを特異的切断することで引き起こされているものと考えられる。(2)カイコガにおいても,精子の鞭毛運動形体変化は,ヒト精子の運動性の開始および調節における調節因子として注目されているCa2+,cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)活性およびチロシンリン酸化が深く関係している可能性が見出された。課題1:精漿・精子に存在する未知なInitiatorin基質タンパク質の同定と機能解析平成27年度に確立したin vitro精子成熟反応再現系を用いた、Initiatorin基質タンパク質解析系をさらに改良する。その上で、成熟が進むにつれて出現するものについてcDNAの単離・発現解析を進める。また,同定されたタンパク質に対する抗体の作成ならびにノックダウンにより機能解析を進める。課題2:精子内シグナル伝達の解析精子運動の獲得には、NOの関与が予想される。一般的にNOの作用は細胞膜を通過し、細胞質内に存在する可溶型グアニル酸シクラーゼを活性化する。また、合成されたcGMPは、Gキナーゼを活性化して、Ca2+濃度の調節に関与する。これらの情報を踏まえ、1精漿・精子におけるcGMPの定量と精子成熟に伴う変動を検討する。2グアニル酸シクラーゼが精漿または精子のいずれに存在するか検討する。3精漿・精子内のCa2+の定量と精子成熟に伴う変動を検討する。4NO作用によって生じるS-ニトロシル化される精漿・精子タンパク質の探索を行なう。課題1:精漿・精子に存在する未知なInitiatorin基質タンパク質の同定と機能解析Initiatorin
高温気流中における微粉炭混合鉄鉱石の高速還元に関する速度論的研究

本研究では、気流層型反応器を用いた石炭を炭素源とする鉄鉱石の高速還元プロセスの開発を目的として、以下の点につき実験ならびに検討を行った。(1)高温場における鉄鉱石の還元速度の決定と微粉炭混合の影響新規に購入した超高温赤外線ランプ加熱装置を用いて、ガス流通式固定層型反応器を製作し、3001500°Cの広い温度範囲における鉄鉱石の還元挙動を追跡した。試料として、-200+250meshのオーストラリア産ハマスレー粉鉱石を使用した。窒素気流中で鉄鉱石を加熱すると、300°Cから1300°CまでFeOの生成が比較的穏やかに進行するが、1300°CからFeOの生成速度が急激に増大する様子が観察された。次に1000°Cの水素気流中では、FeOの生成速度は大きく、また反応途中FeO量は最大値を示した後急減し、FeOがさらに還元され金属鉄が急激に生成していることがわかった。ちなみに本還元反応は、化学反応律速であることが確かめられた。さらにカーボンブラックや石炭粒子、揮発分モデル化合物と鉄鉱石をそれぞれ混合したときの鉄鉱石の還元挙動を、現在詳細に追跡中である。(2)急速昇温かつ高温における石炭の急速熱分解特性2x10^4Cs^<-1>の急速昇温が可能で最終到達温度が10001500°Cのentrained flow型反応器を試作し、炭化度の異なる石炭ならびに比重分離した石炭試料について、揮発分放出挙動を追跡した。揮発分放出速度は、炭種に依存し、とくに炭種ごとに異なる組織成分の含有割合に大きく依存することが分かった。また揮発分中のガス状成分は主にC_1からC_3成分であるが、組成の分布は温度と組織成分に依存した。さらに組織成分量と熱分解条件を利用して、鉄鉱石還元に最適な雰囲気を調製する実験を行う予定である。
mtROSの血管内皮細胞-Mφ相互作用への関与とその制御による糖尿病性腎症の抑制

申請者らはミトコンドリア由来活性酸素(mtROS)が糖尿病血管合併症発症の主要因子であることを報告している。今回の研究ではmtROSの糖尿病性腎症発症への関与について、培養血管内皮細胞およびmtROSの特異的除去酵素であるManganese superoxide dismutase(MnSOD)の血管内皮特異的発現トランスジェニックマウスを用い、in vitro、in vivoの両面から解析を行った。申請者らは糖尿病血管合併症発症機序として「高グルコースによるミトコンドリア由来活性酸素(mtROS)過剰産生」の意義を提唱している。またmtROSの特異的除去酵素であるMnSODを内皮細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスを新規作成した。本年度は主に、以下の14を行った。1.コントロールマウスに糖尿病を導入すると、腎組織で8-OHdGの増加を認めた。また8-OHdGの増加は細胞質が中心であった。8-OHdGはDNAの酸化修飾を検出するマーカーであり、糖尿病マウス腎において、核ではなく細胞質に8-OHdGの増加を認めたことは糖尿病によるmtROS増加誘導を示唆するものと思われた。2.MnSODトランスジェニックマウスに糖尿病を導入すると、腎組織での8-OHdGの増加は認められなかった。糖尿病がmtROS増加を引き起こし、本マウスのMnSODがこのmtROSを抑制することが確認された。3,コントロールマウスに高酸素負荷(未熟児網膜症モデル)を行い、網膜組織切片を作成したところ、網膜より硝子体側に突出する細胞群(新生血管)が認められた。一方MnSODトランスジェニックマウスではこの現象は約73%抑制されていた。4.mtROSを標的とした糖尿病合併症新規治療法開発のため、培養血管内皮細胞を用い、ピオグリタゾンによるmtROS抑制作用を検討した。ピオグリタゾンは高ググルコースによるROS産生を濃度依存的に抑制すること、またmtROSを抑制すること、PGC-1α、MnSOD mRNA増加を誘導することを確認した。以上より、本年度はmtROSと糖尿病腎症・未熟児網膜症の関連をMnSODトランスジエニックマウスにて検討し、明らかにするとともに、ピオグリタゾンによるmtROS抑制作用を培養血管内皮細胞を用い、検討し、明らかにした。またmtROSの特異的除去酵素であるMnSODを内皮細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスを新規作成している。本年度は主に、以下の12を行った。1.ワイルドタイプマウスおよびMnSODトランスジェニックマウスより、腎臓を単離した後、mesh sieving法とfine mince法を利用して、腎糸球体内皮細胞の培養系を確立した。2.上記、培養腎糸球体内皮細胞を高グルコース下で培養し、高グルコース培養でVEGF発現増加が認められること、またMnSODの過剰発現がVEGF発現を抑制することを確認した。さらに、申請者らはメタボリックシンドローム因子に対する生活習慣介入効果の検討とメタボリックシンドロームの発現におけるmtROSの関連も検討し、本年度は、以下の12を明らかにした。1. 4ヶ月間の生活習慣改善介入によりメタボリックシンドローム因子の改善効果が認められ、その効果がインスリン抵抗性の改善効果に依存していることを確認した。2.メタボリックシンドローム予備群において、インスリン抵抗性の発現のみならず、インスリン初期分泌低下の発現が加わると、より動脈硬化症の進展が著明であり、これらの対象者ではmtROSが増加していることを確認した。申請者らは糖尿病血管合併症発症機序として「高グルコースによるミトコンドリア由来活性酸素過剰産生」の意義を提唱している。本年度はこの仮説をさらに発展させたものとして、主に以下の15の実験を行った。1.培養血管内皮細胞において、低酸素濃度環境下では、3時間および24時間の25mMグルコース培養で5.5mMグルコース培養に比し、HIF-1αの発現量が増加することを確認した。2.通常酸素濃度環境下に比し、低酸素濃度環境下においては5.5mMグルコースおよび25mMグルコースのいずれににおいても細胞内低酸素状態およびミトコンドリア由来活性酸素産生が増強することを確認した。3.低酸素濃度および通常酸素濃度環境下において、5.5mMグルコース培養に比し、25mMグルコース培養において、細胞内低酸素状態およびミトコンドリア由来活性酸素産生のさらなる増強が確認された。4.コントロールマウスではSTZ腹腔内投与による糖尿病導入により、腎糸球体でミトコンドリア由来活性酸素産生増加、低酸素領域増加、HIF-1α発現増加が認められた。5.ミトコンドリア由来活性酸素の特異的除去酵素であるMnSODを内皮細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウス(eMnSOD-Tgマウス)では、糖尿病導入による腎糸球体でミトコンドリア由来活性酸素産生増加、低酸素領域増加、HIF-1α発現増加が抑制された。

これらの結果より、高血糖によるmtROS増加を介して組織内低酸素状態が誘導され、このことが糖尿病合併症発症に関与している可能性が示された。