hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表面重合した新規ナノ炭素細線の分子レベル電子計測

新規化学気相成長法を用いるアセン型GNRの表面合成を目指した。我々が開発した2ゾーン型ラジカル重合化学気相成長法(Adv.Mater., 26, 4134 (2014))を用い、分子設計した原料分子(ポリフェニレン化合物)を、高い反応性を持つ気固界面で重合・脱水素縮環することにより、従来困難であった、分子幅を制御した「アセン型GNR」の合成と機能探索を目的とした。また、走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて、金属表面上に合成したアセン型GNRの分子レベルでの可視化や走査トンネル分光による電子状態(バンドギャップ)計測、ナノギャップ電極を電子線微細加工装置により作製しアセン型GNRの末端に電極接合した素子を作成し、電気物性(電導度やキャリア移動度)を探索することを目的とした。今年度は、幅の異なるアセン型GNRの表面合成に必要な前駆体分子であるZ型構造を持つ4個のベンゼン環を持つDBQP分子と6個のベンゼン環を持つポリフェニレン化合物を有機合成した。これらを用いて我々が開発した2ゾーン方化学気相成長法により、金(111)基板上に幅の異なるアセン型GNRを合成した。走査トンネル顕微鏡を用いて、分子構造を測定した結果、予想通りの分子幅でアセン型GNRが合成できたことを確認した。更にトンネル分光測定により、幅の異なるアセン型GNRの電子状態(バンドギャップ)を明らかにした。また、金(111)上に作成したアセン型GNRをシリコン基板上に転写し、間隔が500nm程度のナノギャップ電極を電子線微細加工装置により作製し、トランジスタ特性を計測した。その結果、キャリア移動度が0.26 cm2V-1s-1、オンオフ値約100となり、アセン型GNRが優れた半導体特性を持つことを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。グラフェンナノリボン(GNR)は、“有限幅を持つグラフェン"すなわち一次元量子構造であり、分子幅やエッジ構造に依存した優れた半導体的性質を持つことが理論的に予測され、高性能デバイスとして期待される新物質である。本提案では、我々が開発した2ゾーン型ラジカル重合化学気相成長法を用い、分子設計した原料分子を、高い反応性を持つ気固界面(原料分子ー金属表面)で重合・脱水素縮環することにより、従来困難であったジグザグエッジ型などの新しい構造を持つGNRの合成を目指す。また、走査トンネル顕微鏡を用いた化学構造の可視化・電子状態計測やナノギャップ電極を用いた分子電導計測を目指す。我々が分子設計したZ型前駆体分子を用いると、表面分子変形、ホモキラル重合、高効率分子内縮環反応が表面上を起こり、非常に高い効率でアセン型グラフェンナノリボンを表面合成することが明らかになった。その起源を探索し、Z型分子が表面上で非対称に変形して、立体識別的に表面重合を起こすことがこのような高効率反応の引き金となっていることを明らかにした。我々が分子設計したZ型前駆体分子を用いると、表面分子変形、ホモキラル重合、高効率分子内縮環反応など、従来に無い新しい表面反応を見出すことができた。今年度得られた知見を基にして、非対称構造を持つZ型前駆体分子を設計し、効率の良い表面分子変形を起こすと共に、表面重合や分子内脱水素縮環反応を目指す。
光化学系I反応中心複合体の構造と機能

ホウレンソウの光化学系I(系I)複合体で次のような結果を得た。1.Triton X-100を用いて調整した系I粒子(Chl/P700=200)を強光で照射すると、電子伝達活性の阻害が見られた。この光阻害は酸素に依存し、阻害部位の少なくとも1つは、系Iの第二次電子受容体、A1であるということを明らかにした(論文投稿中)。この系Iの光阻害に伴って、系I反応中心タンパク質、PSI-AとPSI-Bの分解が見られ、それらの分解にも活性酸素が関与していると考えられる(論文準備中)。2.プラストシアニン(PC)は系IのサブユニットであるPSI-Fと結合することにより、P700に容易に電子を供与できると考えられている。系I粒子とPCとの架橋産物のN-末端アミノ酸シークエンスの分析により、このPSI-Fには2つのPCを結合する部位があるということ明らかにした(論文投稿予定)。3.系Iコア複合体を閃光照射し、数百フェムト秒ピコ秒後の吸光度変化を解析し、緑藻やラン色細菌の系Iコア複合体のものと比較した(論文投稿中)。4.熱/エチレングリコール処理で得た系I反応中心複合体(PSI-A,-Bと-Kの3つのタンパク質より達成され、P700→→FXまでの反応を行う)をリポソームを再構成した。電子伝達活性の測定により、複合体の90%以上は本来のチラコイド膜の方向性と逆、即ち、P700が外側、受容体FXが内側を向いた反転構造になっていた。この再構成膜をタンパク質分解酵素、トリプシンで処理した後、電気泳動で得られた12のペプチド断片のN-末端アミノ酸シークエンスを調べ、系Iの構造について検討した。PSI-AとPSI-B両サブユニットはHydropathy plotより11カ所のチラコイド膜貫通α-へリックス領域を持つと考えられている。ところが、本研究では、膜貫通領域は8カ所と考えた方が妥当であるという結果を得た。これはラン色細菌の系I複合体のX-線結晶構造解析(まだ解像力は十分でない)で得られたものと一致する(論文準備中)。ホウレンソウより分離した光化学系I(系I)複合体で次のような結果を得た。1.系I粒子を熱/エチレングリコールで処理し、超遠心分離とカラムクロマトグラフィーで得た、LHCIを含まない系I反応中心複合体、PSI-100とPSI-60のフェムト秒閃光による時間分解分光測定を行なった。これらの複合体でのエネルギー伝達について解析を進めている(アリゾナ州立大・R.E.Blankenship教授との共同研究)。2.熱/エチレングリコール処理で得た系I反応中心複合体を大豆のフォスファチジィルコリンのリポソームに再構成し、トリプシンで処理した。このように処理したものを穏和なSDS-PAGEで分離すると、未処理のものより分子量の小さくなった3つの緑色のクロロフィル-蛋白質複合体のバンドが得られたが、各バンドには十数本のペプチドフラグメントが含まれていた。

等電点電気泳動でも3つのバンドが得られ、これらは数本のペプチドフラグメントで構成されていた。現在後者で得られたバンドの性質について調べている。3.Triton X-100を用いて調製した系I粒子(chl/P700=200)を強光で照射すると、電子伝達活性の阻害が見られた(光阻害)。系I粒子ではエネルギー伝達が出来なくなったクロロフィルが存在するものと考えられ、このクロロフィルにより吸収された光のエネルギーは酸素を活性化し、この活性酸素により系Iの第二次電子受容体であるA1が破壊され、系I粒子の光阻害が起こるものと考えられる(論文準備中)。4.プラストシアニン(PC)は系IのサブユニットであるPSI-Fと結合することにより、効率よくP700に電子を供与することができると考えられている。系I粒子とPCの架橋実験により、このPSI-FにはPCを結合する部位が2つあるであろうということを明らかにした(論文準備中)。ホウレンソウの光化学系I(系I)複合体で次のような結果を得た。1.Triton X-100を用いて調整した系I粒子(Chl/P700=200)を強光で照射すると、電子伝達活性の阻害が見られた。この光阻害は酸素に依存し、阻害部位の少なくとも1つは、系Iの第二次電子受容体、A1であるということを明らかにした。また、ラン色細菌の系II欠損変異種から表面活性剤を用いずに調製した。系I膜標品でも光阻害が観察された(論文投稿中)。この系Iの光阻害に伴って、系I反応中心タンパク質、PSI-AとPSI-Bの分解が見られ、それらの分解にも活性酸素が関与していると考えられる(論文準備中)。2.熱/エチレングリコール処理で得た系I反応中心複合体(PSI-A,-Bと-Kの3つのタンパク質より構成され、P700→→FXまでの反応を行う)を大豆のフォスファチジィルコリンのリポソームに再構成した。電子伝達活性の測定により、複合体の方向性は本来のチラコイド膜とは逆、即ち、初期電子供与体であるP700が外側、受容体FXが内側を向いた反転構造になっていると考えられるものが90%以上存在していた。そこで、この再構成膜をタンパク質分解酵素、トリプシンで処理しした後、電気泳動で得られた12のペプチド断片のN-末端アミノ酸シークエンスを調べ、系Iの構造について検討した。PSI-AとPSI-B両サブユニットはHydropathy plotより11カ所のチラコイド膜貫通α-ヘリックス領域を持つと考えられている。ところが、本研究では、膜貫通領域は8カ所と考えた方が妥当であるという結果を得た。これはラン色細菌の系I複合体のX-線結晶構造解析(まだ解像力は十分でない)で得られたものと一致する(論文準備中)。プラストシアニン(PC)は系IのサブユニットであるPSI-Fと結合することにより、P700に容易に電子を供与する事ができると考えられている。系I粒子とPCとの架橋産物のN-末端アミノ酸シークエンスの分析により、このPSI-Fには2つのPCを結合する部位があるということを明らかにした(論文準備中)。
針葉樹(裸子植物亜門球果植物綱)のDNA分類・系統学的研究-DNA塩基配列情報に基づく分類体系の再構築-

葉緑体DNA上のDNA塩基配列情報もしくは核DNA上の18SrDNA遺伝子塩基配列情報を利用し、針葉.樹類の系統進化解明を行った。主な成果は次の通りである。1.針葉樹全体の系統進化の解明:針葉樹類を構成する8科のatpA、petA、rbcLの葉緑体DNA上の3遺伝子(約3,000bps)の塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報を最尤法等で解析した結果、従来の仮説とは異なる知見が得られた。2.ヒノキ科における系統進化の解明:11属を対象として、上記3遺伝子のDNA塩基配列を決定した。これまでヒノキ属に含められていたアラスカヒノキ(Chamaecyparis nootkatensis)は、イトスギ属(Cupressus)に分類するのが妥当であることが判明した。さらに、ヒノキ属6種の18SrDNAの塩基配列(1,694bps)を決定した。各樹種は、種特異的な塩基配列を保有しており、これを利用することにより樹種識別が可能であることが明らかとなった。3.マツ科における系統進化の解明:マツ科を構成する9属を対象として、葉緑体DNA上の6遺伝子領域(上記3遺伝子とrpoA、rps2、rps3)の塩基配列を決定し、塩基配列情報に基づく系統解析を行った。マツ科は、4亜科に分類されることが判明した。4.マツ属の新たな分類体系の構築:針葉樹中最大の分類群であるマツ属において、葉緑体DNA塩基配列情報を利用し、系統進化に基づく分類体系の再構築を行った。葉緑体DNA上の3遺伝子(atpA、rbcL、rpoA)の塩基配列情報から分子系統樹を作成し、この系統樹を基に、従来の分類体系とは大きく異なる新たな分類体系を提唱した。新分類体系の4節、11亜節は、分布地域が近い種群で構成され、マツ属の系統進化に地理的要因が大きく影響していた。葉緑体DNA上の複数遺伝子のDNA塩基配列情報を用いて、針葉樹類の系統進化解明を行った。1.針葉樹全体の系統進化の解明:供試樹種として、イチイ科、マキ科、イヌガヤ科、マツ科、コウヤマキ科、スギ科、ヒノキ科、ナンヨウスギ科の8科21属21種を用いた。また、outgroupとしてソテツ(ソテツ綱)とイチョウ(イチョウ綱)を使用した。これらの樹種のatpA、petA、rbcLの3遺伝子(約3,000bps)の塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報を最尤法等で解析した結果、従来考えられてきた系統進化説とは異なる新知見が得られた。その主な点は、(1)針葉樹類をマツ目とイチイ目に分ける従来の分類体系には誤りのあること、(2)針葉樹類の中で、マツ科が最も早い時期に分岐したこと、(3)ヒノキ科は、スギ科の一部(スギのグループ)から分岐しており、両科を一つの科とすべきことである。2.ヒノキ科における系統進化の解明:11属23種を対象として、上記3遺伝子のDNA塩基配列を決定した。データ解析の結果、これまでヒノキ属に含められていたアラスカヒノキ(Chamaecyparis nootkatensis)は、イトスギ属(Cupressus)に分類するのが妥当であることが判明した。

また、レイランドサイプレス(Cupressocyparis leylandii)はアラスカヒノキとモントレーサイプレス(Cupressus macrocarpa)との属間雑種とされていた。DNA解析の結果、レイランドサイプレスは、両種の雑種であることが確認されたが、前述の結果から、属間雑種ではなく、単なる種間雑種であることが明らかとなった。3.マツ科における系統進化の解明:マツ科を構成する9属(19種)を対象として、葉緑体DNA上の6遺伝子領域(上記3遺伝子とrpoA、rps2、rps3)の塩基配列を決定した。葉緑体DNA上の複数遺伝子のDNA塩基配列情報を用いて、マツ科、マツ属の系統進化解明を行った。また、核DNAの18SrDNA遺伝子塩基配列情報を利用したヒノキ属植物の同定法について検討した。1.マツ科における系統進化の解明:マツ科を構成する8属(18種)を対象として、葉緑体DNA上の6遺伝子領域(atpA、petA、rbcL、rpoA、rps2、rps3)の塩基配列を決定し、塩基配列情報に基づく系統解析を行った。マツ科は、マツ亜科(マツ属、トウヒ属)、カラマツ亜科(カラマツ属、トガサワラ属)、ヒマラヤスギ亜科(ヒマラヤスギ属)、モミ亜科(モミ属、アブラスギ属、ツガ属)の4亜科に分類されることが判明した。この結果は、従来の分類体系とは異なるものであった。2.マツ属の新たな分類体系の構築:針葉樹中最大の分類群であるマツ属において、葉緑体DNA塩基配列情報を利用し、系統進化に基づく分類体系の再構築を行った。この属の約80%に当たる78種を対象とし、葉緑体DNA上の3遺伝子(atpA、rbcL、rpoA)の塩基配列情報から分子系統樹を作成し、この系統樹を基に、従来の分類体系とは大きく異なる新たな分類体系を提唱した。この分類体系における4節、11亜節は、それぞれ、分布地域が近い種群で構成され、マツ属の系統進化において地理的要因が大きく影響していたことを明らかにした。3. 18SrDNA遺伝子を用いたヒノキ属の分類:ヒノキ属は世界で6種分布している。これらの18SrDNAの塩基配列(1,694bps)を決定した。その結果、各樹種は種特異的な塩基配列を保有しており、これを利用することにより樹種識別が可能であることが明らかとなった。さらに、BESS(base excision sequence scanning)T-Scan分析を導入し、簡便な樹種同定法を開発した。
C型肝炎におけるウイルス排除後の発癌リスクに関する分子病理学的解析

慢性C型肝炎/肝硬変ではC型肝炎ウイルスを排除(SVR)することが可能になった。ただし、SVR後でも種々の確率で肝発癌がみられ、SVR後の適切な診療アルゴリズムの構築が議論されている。本研究は、SVR後に肝発癌を認めた53症例を病理学的に解析し、SVR後の発癌リスク予測へ応用するための研究基盤の確立を目的とした。免疫組織化学及び遺伝子解析を進め、(1)SVR後も非腫瘍部肝組織に線維化が残存する症例は発癌のリスクがあり、線維化の残存に類洞壁細胞におけるCD34及びαSMAの発現が寄与している可能性があることを見いだした。また(2)対象から14例のHBV既往感染症例を見いだした。C型肝炎ウイルス(HCV)持続感染による慢性肝炎・肝硬変では、抗ウイルス治療によりウイルス学的著効(sustained virological response: SVR)が得られHCV排除に成功すると、肝細胞癌の発生リスクが減少する。近年、新規で直接作用型抗ウイルス剤が開発され、多くのHCV感染者がSVRを得られるようになっている。しかし、C型肝炎SVR後においても、種々の確率で肝発癌のリスクが残存することがわかっており、SVR後の発癌高リスク群の絞り込みが大きな課題となっている。本研究では、C型肝炎でSVR後に肝発癌を認めた症例について、(1)肝星細胞の形質変化はSVR後に改善するか、(2)潜在性B型肝炎ウイルス(HBV)感染の有無、を解明することで、C型肝炎SVR後の発癌リスク予測へ応用するための研究基盤の確立を目的とする。研究計画では、平成28年度までに対象としてC型肝炎SVR後に肝細胞癌で外科的肝切除された症例30例の集積を目指したが、それ以上の53例の対象症例を集積することができた。対象症例に対し、(1)免疫組織化学を用いて肝星細胞の形質について検討を行い、現在までに、SVR後の肝線維化の残存に類洞壁細胞におけるCD34およびαSMAの発現が寄与している可能性があること、C型肝炎SVR後も非腫瘍部肝組織に線維化が残存する症例は発癌のリスクがあることを見いだし、国際学会で報告し、その結果は高く評価された(Single Topic Conference of APASL, Young Investigator award受賞)。また、(2)Taqman法PCRによる血中HBV DNAの解析、血中HBc抗体の検索、肝組織における免疫組織化学を行い、潜在性HBV感染の検索を行っている。現在までに、6例の潜在性HBV感染症例がみられている。対象症例の集積および(1)肝星細胞の形質変化に関する検討、(2)潜在性HBV感染に関する検討とも、おおむね順調に伸展している。ただし、論文発表までには至っていない。研究実施計画では、C型肝炎SVR後に肝細胞癌で肝切除された症例を30例集積する計画であったが、平成28年度までに対象症例を53例集積することができた。平成28年度から平成29年度にかけて、対象症例に対して免疫組織化学及び遺伝子解析を進め、現在までに、(1)免疫組織化学を用いて肝星細胞の形質について検討を行い、SVR後の肝線維化の残存に類洞壁細胞におけるCD34及びαSMAの発現が寄与している可能性があること、SVR後も非腫瘍部肝組織に線維化が残存する症例は発癌のリスクがあることを見いだし、国内及び国際学会で報告し、その結果は高く評価された(Single Topic Conference of APASL, Young Investigator award受賞)。また(2)Taqman法PCRによる血中HBV DNAの解析、血中HBc抗体の検索、肝組織における免疫組織化学を行い、14例のHBV既往感染症例を見いだし、HBV既往感染がSVR後の肝発癌へ関与するか臨床病理学的に検討し、国内学会において報告した。(1)肝星細胞の形質変化に関する検討は、国際学会で評価が得られる程度の結果が、現在までに得られている。今後は論文を執筆し、論文発表を行って行く予定である。(2)潜在性HBV感染に関する検討は、現在までに6例のみの検出となっている。まだ、対象全例の評価ができていないため、未評価の症例の検討を進める。人体病理
糖尿病を合併した虚血性心不全に対する治療戦略

糖尿病では、冠動脈結紮後の血中EPC数、梗塞周囲のcapillary density、骨髄由来血管内皮細胞数、心筋梗塞サイズにHMGB1-TGマウスとWTマウスで差を認めなかった。糖尿病マウスでDPP4活性が上昇しており、心筋梗塞後のHMGB1濃度の上昇は見られなかった。DPP4阻害薬を投与した糖尿病HMGB1-TGマウスでは、投与しない糖尿病HMGB1-TGマウスに比し、血管新生とVEGF発現の増加が認められた。DPP4阻害薬投与によりHMGB1による骨髄からのEPCの虚血部位への誘導と血管新生が心筋梗塞サイズの縮小に関与したと考えられた。心筋にのみ選択的にHMGB1遺伝子を高発現したトランスジェニックマウス(HMGB1-TG)と野生型マウス(WT)にストレプトゾトシンを腹腔内に投与した。2週後に血糖値を測定し、血糖値が400500 mg/dLを越え、糖尿病が発症していることを確認した。次いで、両群のマウスの冠動脈左前下行枝を結紮し、心筋梗塞を作成した。心筋梗塞作成1週後に採血し、フローサイトメトリーで末梢血中のGFP陽性の骨髄由来血管内皮前駆細胞(EPC)数をカウントした。2週後に心エコーで心機能評価を行った後、マウスをサクリファイスし心重量、肺重量、心筋梗塞サイズ、梗塞周囲部(border zone)のcapillary density、GFP陽性の骨髄由来血管内皮細胞数を測定した。HMGB1による骨髄由来血管内皮細胞数の増加と血管新生の促進が糖尿病マウスでは認められなかったため、血中のdipeptidyl peptidase-IV (DPP4)活性とHMGB1濃度を測定した。DPP4活性は糖尿病マウスで上昇しており、心筋梗塞後のHMGB1濃度の上昇は見られなかった。糖尿病状態で心筋梗塞を作成し、心筋梗塞サイズ、border zoneのcapillary density、骨髄由来血管内皮細胞数をHMGB1-TGとWTマウスで比較検討できた。血中のDPP4活性は糖尿病マウスで上昇しており、心筋梗塞作成後の血中HMGB1濃度の上昇は見られなかった。この結果から、stromal cell-derived factor-1といった造血幹細胞因子と同様に、HMGB1がDPP4の基質となり分解され、その作用が減弱されたことが示唆された。心筋にのみ選択的にHMGB1遺伝子を高発現したトランスジェニックマウス(HMGB1-TG)と野生型マウスにストレプトゾトシンを腹腔内投与し糖尿病状態とし、冠動脈左前下行枝を結紮し、心筋梗塞を作成した。糖尿病状態では、非糖尿病状態と異なり、GFP陽性の骨髄由来EPC数、心重量、肺重量、心筋梗塞サイズ、梗塞周囲部のcapillary densityとGFP陽性の骨髄由来血管内皮細胞数に差異を認めなかった。糖尿病マウスではDPP4活性が上昇しており、心筋梗塞後のHMGB1濃度の上昇は見られなかった。そこで、糖尿病マウスにDPP4阻害薬を投与した。ストレプトゾトシン投与は1型糖尿病モデルのため、DPP4阻害薬投与では血糖の低下は認められなかったが、DPP4活性は十分に抑制されたことを確認した。冠動脈左前下行枝を結紮し、同様に心筋梗塞を作成したところ、心筋梗塞後のHMGB1濃度の上昇が認められた。DPP4阻害薬を投与した糖尿病HMGB1-TGマウスでは、DPP4阻害薬を投与しない糖尿病HMGB1-TGマウスに比較し、心筋梗塞サイズの縮小効果が認められた。糖尿病でDPP4活性が上昇し、血中のHMGB1濃度は低下したが、DPP4阻害薬を投与することで血中のHMGB1濃度が上昇したのを確認できた。また、DPP4阻害薬投与により、糖尿病HMGB1-TGマウスで心筋梗塞サイズの縮小効果が認められた。HMGB1-TGマウスとWTマウスに放射線照射後、GFPマウスの骨髄を移植した。骨髄が生着したのを確認した後、ストレプトゾトシンを腹腔内投与した。24週後に採血して血糖を測定し、高血糖が持続し糖尿病となっていることを確認した。その後、冠動脈左前下行枝を結紮し、心筋梗塞を作成した。糖尿病マウスでは血中のDPP4活性が上昇しており、心筋梗塞後の血中HMGB1濃度の上昇は見られなかった。また、糖尿病マウスではHMGB1-TGマウスとWTマウスの間に骨髄由来EPC数、心筋梗塞サイズ、梗塞周囲のcapillary density、骨髄由来血管内皮細胞数に差異を認めなかった。次に糖尿病マウスにDPP4阻害薬を投与した。DPP4阻害薬投与により、血中のDPP4活性が十分に抑制されたことを確認した。DPP4阻害薬投与下では、心筋梗塞後の血中HMGB1濃度が上昇したことから、HMGB1がDPP4の基質であることが示唆された。DPP4阻害薬を投与した糖尿病HMGB1-TGマウスでは、DPP4阻害薬を投与しない糖尿病HMGB1-TGマウスに比較し、心筋梗塞サイズの縮小が認められた。また、血中の骨髄由来EPC数の増加、梗塞周囲のcapillary densityの増加、梗塞周囲の骨髄由来血管内皮細胞数の増加、VEGFの発現増加が認められた。

糖尿病では、活性化したDPP4によりHMGB1が分解され、その作用が減弱していたが、DPP4阻害薬投与により、HMGB1による骨髄からのEPCの虚血部位への誘導と集積、血管新生効果が心筋梗塞サイズの縮小に関与したと考えられた。糖尿病では、冠動脈結紮後の血中EPC数、梗塞周囲のcapillary density、骨髄由来血管内皮細胞数、心筋梗塞サイズにHMGB1-TGマウスとWTマウスで差を認めなかった。糖尿病マウスでDPP4活性が上昇しており、心筋梗塞後のHMGB1濃度の上昇は見られなかった。DPP4阻害薬を投与した糖尿病HMGB1-TGマウスでは、投与しない糖尿病HMGB1-TGマウスに比し、血管新生とVEGF発現の増加が認められた。DPP4阻害薬投与によりHMGB1による骨髄からのEPCの虚血部位への誘導と血管新生が心筋梗塞サイズの縮小に関与したと考えられた。DPP4阻害薬を投与下に、HMGB1-TGとWTマウスにストレプトゾトシンを投与し、心筋梗塞を作成する。DPP4阻害薬投与により、血中HMGB1濃度が回復し、border zoneのcapillary density、骨髄由来血管内皮細胞数の増加と心筋梗塞サイズの縮小が認められるかを検討する。DPP4阻害薬による心筋梗塞サイズ抑制効果に関して、詳細なメカニズムを解明していく。循環器内科学
エリシターの受容とオキシダティブバーストの分子機構とその機能

イネ培養細胞において、エリシター活性をもつイネいもち病菌のキチンオリゴ糖、β-グルカン断片、グラム陰性細菌のリポ多糖などを単離し、その認識に関わる受容体、分離・分析し、認識の分子機構を明らかにするとともに、その下流において発生するオキシダティブバーストのにホスホリーパーゼDの活性化がNADPH酸化酵素を介した即時型の活性酸素応答制御に主要な役割を果たし、その上流および下流にそれぞれタンパクキナーゼを介した制御過程が存在することを明らかにした。ジャガイモ疫病菌の非親和性菌感染時には、複数のエリシター分子の認識に伴い、一つはC^<2+>、タンパク質リン酸化酵素依存のO_2生成NADPH酸化酵素(rbohA)による早期に起こる第1相のオキシダティブバースト(OXB)とMAPキナーゼカスケードの制御下で遺伝子の発現制御を受け、第1相のOXBとの関連で活性化する第2相のOXBの分子基盤と制御機構を明らかにした。またMAPキナーゼカスケードの制御下で発現するセスキテルペノイドファイトアレキシン生合成系酵素系も第1相のOXBとの関連で活性化ことを明らかにした。後者のMAPキナーゼカスケードと転写発現は、OXB発生もファイトアレキシン生成も起こらない親和性レースの感染でも発現することが判明し、MAPKKのStMEK1の常時活性型に変換したStMEK1^<DD>を一過性に発現させると、StrbohB依存のOXBとHR反応が誘導されることが判明した。このことを利用し、親和性レース菌の感染でも発現するファイトアレキシン生合成系の遺伝子PVS3のプロモーターを連結したStMEK1DDを作成し、これを形質転換させたジャガイモが、親和性レースの感染に対してもOXBの発生がおこり過敏感反応型防御応答が起こることを明らかにし、耐病性ジャガイモの作出に成功し、植物の耐病性強化に関する理論的根拠を与えた。植物細胞・組織が寄生菌等の成分を異物認識し、その情報を感染に対する防御応答の発現につなげるシグナル伝達とシグナル増幅の意義をもつ急速な活性酸素生成反応(オキシダティブバースト:OXB)の分子機構と機能の解明の一貫としてエリシターと受容体の分子相互作用とOXBシステムの分子基盤とその活性制御機構を調べた。イネグルカン系エリシターの受容体解析に利用するため、高活性を示す新規のグルカンオリゴ糖エリシターを探索した。イモチ病菌細胞壁グルカンの酵素分解物から、新規のグルコ5糖エリシターを単離精製し、この5糖がこれまでに特性を明らかにしたものと異なる新規かつ高活性なイネ細胞に対するエリシターであり、受容体解析での有用性を示した。イネ細胞におけるエリシターにより誘導される活性酸素生成の制御機構について検討し、エリシターによるホスホリパーゼDの活性化がNADPHオキシダーゼを介した即時型の活性酸素応答制御に主要な役割を果たし、また、この上流および下流にそれぞれ蛋白キナーゼを介した制御過程が存在していることを示唆した。植物細胞のインタクトな状態の組織・細胞ではOXB応答能はなく、感染菌の分泌物や傷害刺激により10数細胞の範囲でde novoに獲得され、その獲得過程には、OXBを担う原形質膜内酵素のNADPH酸化酵素の活性化に関わるカルシウムーカルモジュリン依存、蛋白キナーゼの活性レベルの上昇があることを示唆し、応答能を獲得した細胞ではリン酸化-脱リン酸化反応の回転状態で応答待機状態にあることを示唆した。OXBを担う酵素の活性中心となるタンパク質(gp91phoxホモログ)の遺伝子Strboh AおよびStrboh Bをクローニングし、推定アミノ酸配列からタンパク質の性質を推定した。

これをプローブとしたノーザン解析の結果、StrbohAの常時発現、StarbohBのエリシター応答発現が判明した。また、局部的OXBの発生により発信する細胞間情報伝達においてカルシウムインフラクスの細胞間連鎖反応の存在を示唆した。本年度の研究は、エリシターの受容の分子機構およびその受容に伴い活性化するキシダティブバースト(OXB)系の分子基盤と制御機構と機能の解明を目的とした研究課題の中で、次の研究成果を挙げた。1)キチンエリシター受容体からの情報発信の機構におけるエリシター結合直後に起こる受容体分子の挙動の変化を、高活性キチンオリゴ糖エリシターから合成した様々な親和性試薬を利用した親和性標識実験により調べ、イネ培養細胞原形質膜に存在するエリシター結合タンパク質(受容体候補分子)がエリシターの結合によって膜上で2量体を形成することを示唆した。2)この2量体がエリシター結合タンパク質2分子からなるホモ2量体であることも示唆し、キチンオリゴ糖エリシター受容体の性格および受容体活性化機構に関して重要な示唆を与えた。3)エリシター認識に伴うOXB系の分子基盤の解明の一環として、ジャガイモに次いで、タバコ植物(Nicotiana benthamiana)のgp91phoxホモログとしてNtrbohAとNtrbohBの二種のcDNAをクローニングし、前者は常時発現、後者はエリシター誘導性であることを明らかにした。4)タバコ植物で、それぞれの特異的なN末端領域および共通性の高いC末端領域をPVXベクターに組み込んだものを接種し、ジーンシレンシングを行った結果、それぞれの遺伝子の発現低下を確認し、非親和性疫病菌に対する感染抵抗性と感染およびエリシターに対するOXB応答が低下することを示し、OXBが局部的防御応答に決定的な機能をもつことを示唆した。5)局部的OXBの誘導が全身的シグナル発進と伝達を制御し、全身OXBと全身獲得抵抗性を誘導する機構の解明の一環として、OXBの発生に伴い二次的全身シグナル発進因子が存在し、サリチル酸やBTHがその発進作用をもち、細胞間情報伝達はカルシウムのインフラックスの連鎖反応により起こることを示した。植物組織・細胞のエリシター認識に伴う活性酸素生成反応(オキシダティブバースト:OXB)の活性化と機能に関する機構について解析した。イネ培養細胞では、キチンオリゴ糖エリシターによるホスホリパーゼの活性化と二相性を示すOXBとの関係とホスホリパーゼ系を介するシグナル伝達とエリシター応答性遺伝子の発現誘導およびファイトアレキシン誘導との関連について検討した。その結果、エリシター処理によりPI-PLCおよびPC-PLDが活性化され、中でもPC-PLDの活性化と膜移行が二相性を示す活性酸素生成の制御において重要であること、また、このホスホリパーゼ系の活性化がエリシター誘導性遺伝子の発現やファイトアレキシン合成誘導においても重要であることを示した。エリシター処理ジャガイモ塊茎組織において、二相性のOXB誘導と呼応して、それぞれの活性を担うStrbohAとStrbohBのN末端をリン酸化する36kDaプロテインキナーゼの活性が増加すること、また、その酵素によりStrbohBの二カ所のセリン残基がリン酸化されることを示した。局部的OXBの発生に伴い、全身的に情報が発信され離れた組織で再びOXBが起こるが、その全身的伝達は個々の細胞における連鎖的なH^+-ATPase依存のCa^<2+>インフラクスによることを示した。
インターフェロン遺伝子発現の増強・持続化による新規癌治療戦略

癌を対象としたインターフェロン(IFN)遺伝子治療効果の増強を目的に、インターフェロンγ(IFN-γ)遺伝子発現の増強・持続化に取り組んだ。昨年度までの検討から、プラスミド中のCpGモチーフが遺伝子発現が短期間であることの一因である可能性が示された。そこで、投与したプラスミド中のCpGモチーフのメチル化について検討したところ、CpGモチーフの多いプラスミドを投与した際に遺伝子発現の急激な低下が観測される投与後数日の時点では、プラスミドのCpGモチーフはメチル化されないことが明らかとなった。また、予めメチル化処理を行ったプラスミドを投与した場合にも、レベルは低いものの遺伝子発現が認められたことから、メチル化修飾は遺伝子発現レベルには影響を及ぼすものの、遺伝子導入時の急速な発現低下の要因ではないことが強く示唆された。一方、担癌マウスやアレルギー疾患モデルマウスでの長期発現実験において、投与量を増大させた場合には、遺伝子導入直後に観察された高いIFNレベルに起因すると考えられる有害作用が認められた。そこで、この一過性ピークの原因を明らかにするために、プロモータ/エンハンサの組み合わせを種々変更したIFN発現プラスミドを構築し、マウスに遺伝子導入後の血清中濃度プロファイルを解析した。その結果、導入直後の一過性ピークにはCMVエンハンサの関与が指摘された。一方、ROSA26プロモータを含むプラスミドからの遺伝子発現は、エンハンサの有無や種類に関わらず一定となることが示され、副作用の軽減に繋がることが期待された。一方、遺伝子発現後のIFNタンパク質の体内動態制御による治療効果増強にも取り組み、アルブミンとの融合タンパク質を設計することで、IFN-γの速やかな血中消失を抑制可能であることも明らかとなった。以上本研究では、プラスミドベクター並びにIFNタンパク質を新たにデザインすることで、IFN遺伝子発現の増強・持続化に成功した。癌を対象としたインターフェロン(IFN)遺伝子治療効果の増強を目的に、まずCpGモチーフをほぼ完全に除去したIFN発現プラスミドベクターの開発による発現の持続化に取り組んだ。ベクター骨格中に全くCpGモチーフを含まないpCpG-mcsに、マウスIFN-γcDNAを挿入することで、pCpG-Muγを構築した。得られたベクターをマウスにハイドロダイナミクス法により投与したところ、血清中IFN-γ濃度が90日以上検出可能であった。このときの血清中濃度-時間曲線に対して薬動学解析をしたところ、今回開発したベクターは、従来型ベクターと比較してAUCで約180倍、MRTで約4倍もの発現増強・持続を示すことが明らかとなった。そこでマウス結腸癌細胞株CT26、colon26/lucを尾静脈内投与することで作成した肺転移モデルマウスを用い、癌転移抑制効果を評価したところ、新規IFN-γ発現ベクターが最も高い抑制効果を示し、癌治療を目的としたIFN-γ遺伝子治療において持続的発現の重要性が実証された。癌細胞にIFNが作用すると、IFNシグナル伝達によりsupressor of cytokine signaling(SOCS)発現が亢進することが知られている。SOCS発現によりIFNの作用が減弱されることで、IFNの抗腫瘍効果が減弱する可能性が考えられる。そこで、colon26及びマウスメラノーマB16-BL6細胞を用い、IFNの細胞増殖抑制効果に及ぼすSOCS-1、SOCS-3遺伝子ノックダウンの影響を判定した。RNA干渉を使用して細胞でのSOCS遺伝子発現を抑制したところ、特にSOCS-1遺伝子をノックダウンすることでIFN-γの効果が有意に増強された。従って、持続的にIFNを発現することにより癌細胞増殖が顕著に抑制可能であること、IFNに対する耐性が懸念される場合には癌細胞でのSOCS-1発現をノックダウンすることで耐性を克服できる可能性が示された。

一方、遺伝子発現後のIFNタンパク質の体内動態制御による治療効果増強にも取り組み、アルブミンとの融合タンパク質を設計することで、IFN-γの速やかな血中消失を抑制可能であることも明らかとなった。以上本研究では、プラスミドベクター並びにIFNタンパク質を新たにデザインすることで、IFN遺伝子発現の増強・持続化に成功した。
抗腫瘍性抗生物質ネオカルチノスタチンの蛋白質とクロモフォアの相互作用

平成6年度より3年間にわたり本重点領域研究"動的蛋白質結晶解析"に採択され、70個のアミノ酸からなるインスリン様成長因子IGF-Iの溶液構造を決定し、IGF-Iのジスルフィド結合の結合様式を変えたアイソマ-の構造活性相関を検討した。さらに遺伝子工学的手法により^<15>Nで標識したIGF-Iを大量に合成し、多核多次元NMR法により、その溶液構造を精密化した。また^<15>N、^<13>Cの二重標識したIGF-Iとその調節蛋白質IGF-BPの複合体の多核多次元NMRによる構造解析を行ってきた。この研究と並行して、本重点研究の課題により適した系として唯一の蛋白性の抗腫瘍剤であるネオカルチノスタチン(NCS)の細胞増殖阻害を示すクロモフォア(Chr)の放出のメカニズムを、同位体ラベルした蛋白質とChrを用いて多次元NMR法と分子動力学法により解析した。先ず、NCSを産出する放線菌を培養し同位体ラベルされたNCSのアポ蛋白質を大量に得る系を確立した。すでに600MHzの装置を用いて二次元NMRの解析を終えていたが、同位体ラベルされたNCSを、750MHzの測定装置を用いて三次元、四次元NMR法による解析を行った結果、先の二次元NMRでは得られなかった側鎖に関する距離情報や、回転角の情報を得ることが出来た。このデータより、アポ状態の構造の精密化を行った。さらに^<15>N核の緩和速度と重水素交換速度の測定を行った。現在、これらの結果を用いて分子動力学計算を用いて、ペプチド骨格ならびに側鎖の分子運動を解析している。大量生産系が確立出来たので、ホロ状態のNCSの水溶液のpHの滴定、アルコールやジオキサン等の有機溶媒の添加、さらに塩強度の変化などを行い、Chrの放出のトリガーを調べている。またNMR法と相補的にラウエ法による反応機構の解析が行えないか検討するため結晶かに努力している。
シュレ-ディンガー作用素のスペクトル理論

ゾンマーフェルトの放射条件はヘルムホルツ方程式の解の一意性を導くための条件としてよく知られており、理論的のみならず電磁気学さらにシュレ-ヂンガー方程式の散乱問題の数値解析においても用いられ応用上も重要である。しかし多体問題におけるシュレ-ヂンガー方程式に対しては、多くのチャネルが存在するために古典的なゾンマーフェルトの条件が適用できず、多体シュレ-ヂンガー方程式の解の一意性は未解決の問題であった。擬微分作用素を用いる方法により多体シュレ-ヂンガー方程式に放射条件を導入することが可能になった。この条件は二体問題におけるゾンマーフェルトの条件を包含する一般なものであり、また擬微分作用素のみならず、それを含む更に広い作用素の代数を用いることが特徴である。この方法は広い応用をもっており、これまで放射条件の知られていなかった方程式に適用することが可能である。また作用素の代数を用いる方法によりレゾルベントの超局所的評価がえられるが、それはS行列の性質の解析に有効であり、いくつかの興味深い性質を導くことができた。多体系におけるS行列はその重要性にもかかわらず理論的研究はほとんど行なわれていなかった状況を考えるとこの研究方向は非常に重要である。多次元逆問題の研究に着手した。この問題は極めて多くの困難を含んでいるが、ファデ-エフ、ニュートン等の仕事により次第に解明されつつある。特に有限なエネルギーからのポテンシャルの再構成、積分表示等を研究の主要なテーマとしている。
サルコペニア/フレイルにおける脳KATPチャネルの関与と治療基盤の確立

今年度は完成した変異型KATPチャネルを実際にマウスの脳内に発現させ、変異型KATPチャネル発現ニューロンの電気生理学的特性の変化ならびにマウスの生体そのものに表現型として与える影響について検討している。まず、変異型KATPチャネル(Kir6.2/R50P)をウィルスベクターを用いてマウスの脳視床下部腹内側核に注入し、マウスの床下部腹内側核に発現していることを確認した(変異型KATPチャネルの発現の有無はRFPの発現において確認できるように設定した)。現在、発現した変異型KATPチャネルを有するニューロンにおいて活性化能が低下していることを電気生理学的検討(RFP発現ニューロンに対する脳スライスパッチクランプ法)において確認している。またKATPチャネル電流そのものも変異型KATPチャネル発現ニューロンにおいて増大していることも穿孔パッチクランプ法を用いた検討で確認している。同時に変異型KATPチャネル発現マウスにおいてその表現型(血糖・体重・飲水脳、筋肉量)の変化について計測している。またサルコペニア・フレイルの病態におけるKATPチャネルの影響をさらに検討するために脳KATPチャネルの関与から独立した骨格筋KATPチャネルの貢献を調べるために骨格筋培養細胞(C2C12細胞)に変異型KATPチャネルを発現させて、細胞形態や電気生理学的特性に与える影響について検討を行っている。現時点では変異型KATPチャネル(Kir6.2/R50P)を発現したC2C12細胞において形態異常と膜電位の低下を確認している。変異型KATPチャネルを発現したマウスにおいて体重など表現型に変化が認められることが確認され、現在体重変化の原因についての検討を行っている。当初の予定通り変異型KATPチャネル発現マウスの表現型についての検討が順調に行われている。また筋肉そのものに変異型KATPチャネルが与える影響も明らかになってきており、サルコペニア・フレイルにKATPチャネルが果たす役割が明らかになりつつある。本年度までの研究成果で脳および筋肉に変異型KATPチャネルが発現したマウスでの機能解析が進行しているため、今後はこれらの変化した機能の発症病態機序を明らかにし、サルコペニア・フレイル発症にKATPチャネルの果たす役割を明確化する。さらに明らかとなった病態機序から治療標的を明確化し、治療方法の検討を行う。若齢ラットと加齢ラットを用いて黒質ニューロンの投射元として視床下部領域ニューロンの電気活動を脳スライスパッチクランプ法を用いて検討を行った。その結果、若齢ラットにおいては活動電位の発生が少ないのに対し、40週令を境にニューロンの電気活動が盛んになっており、膜電位の上昇も確認できた。加齢に伴いニューロンの電気生理学的特徴の変化が確認でき、投射先である黒質においてもその影響があることが強く示唆された。また組織学的にも視床下部ニューロンの大きさなども加齢に伴って変化していることも確認された。同様に高脂肪食負荷によって若齢ラットにおいて肥満/糖代謝異常の状態を作成し、同様に電気生理学的検討を行った結果、加齢ラットと同様の活動電位の発生と膜電位の上昇が確認された。生活習慣病(肥満・糖代謝異常)モデルでは加齢と同じ現象が視床下部において発生していることが強く示唆された。また変異型KATPチャネルをAAVベクターを用いて脳の黒質に注入し、変異型KATPチャネルを発現させることに成功した。変異型KATPチャネルを発現させたラットの黒質においてαーシヌクレインなどのパーキンソン氏病における運動状態の変化を引き起こす因子の発現に変化が起きていないかを病理組織学的に検討したが、とくにコントロール群と差はなく、今回のモデルではKATPチャネルがパーキンソン氏病などとは異なる機序によって運動機能をコントロールしている可能性が示唆された。黒質の投射元において加齢ならびに高脂肪食負荷がニューロンの特性を変化させていることを確認できた。さらに投射先において変異型KATPチャネルを発現させることに成功したため。当初の予定通り変異型KATP

チャネル発現マウスの表現型についての検討が順調に行われている。また筋肉そのものに変異型KATPチャネルが与える影響も明らかになってきており、サルコペニア・フレイルにKATPチャネルが果たす役割が明らかになりつつある。加齢や高脂肪食負荷に伴う生活習慣病(肥満・糖代謝異常)モデルのラットにおいて確認できた視床下部の電気生理学的特性の変化に対するKATPチャネルの寄与を確認するためにKATPチャネルの阻害剤を用いて検討を行う。さらに投射先の黒質におけるニューロンの電気生理学的特徴の変化を加齢・高脂肪食負荷ラットにおいて行う。具体的には活動電位の発生頻度(frequency)と膜電位の変化さらにはEPSC、IPSC測定による黒質ニューロンへの入力信号の変化を測定する。また黒質に変異型KATPチャネルを発現したラットにおいて運動機能・筋力などの機能解析さらには筋肉の組織学的変化を検討する。本年度までの研究成果で脳および筋肉に変異型KATPチャネルが発現したマウスでの機能解析が進行しているため、今後はこれらの変化した機能の発症病態機序を明らかにし、サルコペニア・フレイル発症にKATPチャネルの果たす役割を明確化する。さらに明らかとなった病態機序から治療標的を明確化し、治療方法の検討を行う。想定していた以上に研究が円滑に行われた結果です。翌年度使用計画に関しましては翌年度の研究は技術的にも困難な部分があるため、必ずしも円滑に実験が進まなかった場合に使用します。当初の予定より安価にて試薬を購入できたために生じた。翌年に試薬の購入費として使用する計画である。
正弦波状波長走査光干渉法によるナノオーダ精度での3次元膜形状計測

厚さ0.001mm程度の非常に薄い膜の3次元形状を測定することは、微細構造をもつ電子デバイスの製造において重要なことあるが、容易に測定する方法がなかった。そこで、本研究では、光の波長が時間的に正弦波状に変化するレーザ光源を構築し、この波長走査光源を用いた干渉計で得られる干渉信号をコンピュータ内に取り込み、複雑な反復的演算処理を行うことによって、0.000001mm(ナノメータ)の正確さで膜形状を3次元的に測定することができた。2つの反射面を有する測定物体の形状測定を行うための信号推定処理法を確立した。すなわち、検出された干渉信号と干渉信号の理論式との差の二乗和を誤差関数とし、この誤差関数を最小にすることによって2つの反射面の位置に対応する2つの光路差を求めることができることを確証した。推定すべき変数としては、光路差に比例する波長走査から生じる変調振幅位相、干渉位相、そして複数の干渉信号の振幅比であり、正しい推定解が得られるための初期値と真値の差について明らかにした。実験では、シリコンウェハー上にコーティングされた厚さ1μmと4μmのSiO_2膜を測定対象とした。スーパールミネッセントダイオードと音響光学波長可変フィルターを組み合わせた波長走査光源を構成し、最大60nm程度の波長走査幅を得た。この光源のスペクトル半値幅は4nmと広いためコヒーレンス長を考慮する必要があることが分かった。また、SiO_2薄膜で生じる多重反射光による干渉信号も理論式に取り入れる必要があることが明らかとなり、そこで、波長を直線状に走査することによって得られる干渉信号から多重反射光による複数の干渉信号の振幅比を求める方法を提案し、この測定値を初期値として用いた。以上の方法による正弦波状および直線状波長走査干渉計を用いて測定した結果、厚さの薄い領域では平均膜厚1062nm、厚い領域では4109nmの膜厚であり、繰り返し誤差は3nm以下となった。広いスペクトル帯域を持つ白色光源であるハロゲンランプを用い、音響光学波長可変フィルター(AOTF)によって数nmのスペクトル幅で1波長だけを切り出した。このとき、切り出された波長がAOTFの入力信号と正確に比例しないため、AOTFの入力信号に電子回路で作り出した補正信号を加えて、正確な比例関係を得た。その結果、240nm程度の大きな波長走査幅で正確に正弦波状あるいは直線状に波長走査される光源を得た。ハロゲンランプからの光は直径5mmの光ファイバで取り出され、レンズでほぼ平行光とした後、AOTFに入射した。AOTFから出射された1次回折光の波面をアフォーカル結像系で測定物体表面上と参照鏡表面上に形成した。これらの表面上からの反射光をCCDイメージセンサ上に結像することによって干渉信号を得た。測定物体を平面鏡として位置および表面形状の測定を行った結果、3.6mm×1.8mmの測定範囲での測定誤差を数nm以下とするように干渉光学系を構成できた。薄膜としての測定物体はCr上にコーティングされたSiN膜であった。検出干渉信号の値と理論式の値との差の2乗和を誤差関数とし、誤差関数を最小にするように多次元検索を行う信号処理では、薄膜の2つの反射面からの反射光の振幅比が重要であるため、直線状波長走査干渉法を用いることによって、測定物体の位置の微調整を行うと同時に反射光の振幅比を求めた。以上の測定方法を用いた走査幅210nmの正弦波状波長走査干渉計によって、厚さ340nmと470nmのSiN膜の表面と裏面の形状および厚さ分布を4nm以下の誤差で測定できた。
分裂酵母における環境識別と性的分化制御の分子機構

分裂酵母は炭素源や窒素源の状態を感知・判別し、新たな細胞分裂周期を開始するか、接合・減数分裂への性的分化を開始するかを決定する。接合の際には、接合フェロモンを受容することで相手型細胞の存在を認識する。このような性的分化開始の決定に至る一連の分子機構を解明することは、細胞の環境認識、細胞周期の制御、あるいは細胞機能分化など、細胞生物学の基本問題の理解に大きな貢献をもたらすと考えられる。本研究により当該年度に得られた新知見は以下の通りである。1.分裂酵母の有性生殖開始に必要な遺伝子群が窒素源飢餓により転写誘導されること、さの際にcAMPが栄養状態を反映し、情報伝達を仲介することを、cAMP依存性タンパク質リン酸化酵素(A-キナーゼ)の触媒サブユニットの遺伝子を単離してより確実なものとした。2.減数分裂開始に関わる重要な因子であるmei2遺伝子産物がRNA結合タンパク質であることを証明し、Mei2タンパク質の機能が、従来から知られている減数分裂前DNA合成開始のみならず、減数第一分裂にも必須であることを示した。さらに、減数第一分裂を推し進める際にMei2タンパク質と複合体を作って機能する、長さが約0.5-kbでPoly(A)tailをもつmeiRNAを同定した。meiRNAは減数分裂に特異的に必要とされることが明瞭に証明された初めてのRNA分子種である。3.分裂酵母の様々な有性生殖関連突然変異株につき、その欠損を相補することができる遺伝子を高等植物のシロイヌナズナから数多く単離し、酵母を宿主とする機能相補の手法が、高等生物からの遺伝子クローニングの有力な戦略であるということを示した。ただし、得られた遺伝子が植物体で有性生殖過程に関わっているか否かの証明は今後の課題である。同様な手法で、高等動物から有性生殖関連の遺伝子をクローニングする試みも推進した。分裂酵母細胞は栄養源、特に窒素源の飢餓を認識して栄養増殖の細胞周期を離脱し、有性生殖環へ入っていく。この過程を制御している機構を探究し、また接合に際して細胞間相互作用の仲介をする接合フェロモンの受容機構について解析を進めた。新しく得られた知見は大きくまとめて次の二点である。1.分裂酵母では窒素源飢餓に応じて細胞内cAMPレベルが低下し、mei2などの有性生殖関連遺伝子が転写誘導される。この転写誘導に必須なstell遺伝子の産物を解析し、それが動物の雄性決定因子などに見られるHMGモチ-フをもつDNA結合タンパク質であり、その標的はmei2などの上流域に共通に見いだされるTTCTTTGTTYという配列であることを明らかにした。また、mei2の転写誘導にこの配列が必須であることも証明し、stell遺伝子産物は転写調節因子であると結論した。さらに、stell遺伝子自身が窒素源飢餓で転写誘導され、cAMPでその誘導が抑制されることを明示するとともに、その機構としてstellの転写の自己制御の可能性があることを指摘した。また一方、二重鎖RNA分解酵素をコ-ドするpacl遺伝子の過剰発現で分裂酵母は有性生殖不能になり、その際窒素源飢餓下でもstell遺伝子の転写物が見られないことを示し、RNAレベルでの性的分化制御の存在の可能性を提起した。2.分裂酵母より2種類のGタンパク質αサブユニットの遺伝子を分離し、それらの産物のうち片方が接合フェロモンの受容体と共役していることを同定し、もう一方については細胞内cAMPレベルの決定に関与していることを示唆するデ-タを得た。

前者を人為的に改変した細胞を調べた結果、分裂酵母においては接合フェロモン受容系が活性化されることが、接合のみならず、減数分裂開始にも必須な条件であることが明らかになった。分裂酵母は炭素源や窒素源の状態を感知・判別し、新たな細胞分裂周期を開始するか、接合・減数分裂への性的分化を開始するか、を決定する。接合の際には、接合フェロモンを受容することで相手型細胞の存在を認識する。このような性的分化開始の決定に至る一連の分子機構を解明することにより、細胞の環境認識、細胞周期の制御、あるいは細胞機能分化などの細胞生物学の基本問題の理解に寄与をもたらすのが本研究の目的である。我々は先に、分裂酵母の有性生殖開始に必要な遺伝子群が窒素源飢餓による転写誘導されること、その際cAMPが栄養状態を反映し、情報伝達を仲介すること、また接合フェロモン受容に応じて転写誘導される遺伝子があることを明らかにした。本年度は細胞性粘菌のGα遺伝子をプローブにして単離した分裂酵母gpa2遺伝子の産物の機能につき検討を加えた結果、このGαタンパク質は栄養源を識別してcAMPレベルを調節する過程に関与していることが明らかになった。また分子遺伝学的解析から、その標的はアデニル酸シクラーゼと考えられた。この結果は、分裂酵母と類似したアデニル酸シクラーゼをもつ出芽酵母ではアデニル酸シクラーゼはRASタンパク質による制御されており、一方、大きく異なるアデニル酸シクラーゼをもつ動物細胞ではGタンパク質がその制御にあたっている、という事実と興味深い対照をなすものである。こうした分子進化上の問題と、いかなる機構がこのGタンパク質の上流で栄養源識別に関わっているかという問題が、今後解明さるべき大きな問題である。一方また、接合フェロモン受容に関わる情報伝達経路のついては、接合フェロモンM-ファクターの受容体遺伝子を単離・解析し、この受容体が7回膜貫通性型のものであることを示した。さらに、M-ファクター・P-ファクターいずれの受容シグナルも、細胞内では同一経路で伝達されることを明らかにしている。我々はすでに、分裂酵母の有性生殖開始に必要な遺伝子群が窒素源飢餓により転写誘導されること、その際にcAMPが栄養状態を反映し、情報伝達を仲介すること、また接合フェロモン受容に応じて転写誘導される遺伝子があることを明らかにした。本年度は接合フェロモン受容に関わる情報伝達経路について2つの重要な進展があった。分裂酵母の接合に際して、h^+型細胞はP-ファクター、h^-型細胞はM-ファクターと呼ばれる接合フェロモンを分泌し、相手型細胞とコミュニケーションを図る。成果の1つは、接合フェロモンM-ファクターの受容体遺伝子を単離・解析してこの受容体が7回膜貫通性型のものであることを示し、さらに、M-ファクター・P-ファクターいずれの受容シグナルも細胞内では同一経路で伝達され、そのシグナルが接合のみならず減数分裂開始にも必須なものであることを明らかにしたことである。