hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌の分子生物学的特徴に基づく、小線源療法を主軸とした個別化治療戦略

腺癌と1種の高分化腺癌)に対する小線源療法の増殖抑制効果を調べるため、proliferation assayを行ったところ、いずれも有意差をもって増殖が抑制された。この増殖抑制におけるアポトーシスの関与を調べるため、annexin Vとpropidium iodideによる二重染色、アポトーシスの主要なmediatorであるcaspase-3の活性を調べた。その結果、小線源療法は、アポトーシスを誘導することによって、分化度を問わず、胃癌細胞の増殖を、in vitroで抑制したことを証明した。そこで本年度は、マウスに形成した腫瘍に対する、小線源療法の安全性と増殖抑制効果についてのin vivoでの実験を開始した。まず、実験プロトコール決定のための予備実験を繰り返した後、ヌードマウスを用いた胃癌細胞播種モデルを構築した。次に、cold seedの安全性をno seed群と比べて、確認できた。hot(125I)のseedをアプリケーターを用いて腫瘍内部に打ち込み、主腫瘍量や生存率、合併症の有無、ならびにsacrifice後解剖し、転移巣の数や大きさを基に、その治療効果を調べている。今年度の当初の予定は、in vivoでの、各種の胃癌細胞株に対する、125Iによる小線源療法の安全性と増殖抑制効果の検討であった。まず、ヌードマウスに形成した各種胃癌細胞株由来の腫瘤の中に、前立腺癌の治療に実際に用いているアプリケーターを用いて、cold seedを投与した。seedを投与しない観察群と比べ、体重など全身状態や、腫瘍径、および、播種後2、4週にsacrificeして解剖した転移巣の数や大きさ、生存率、合併症には有意な差を認めなかった。但し、cold seed群では、seedに近接して、壊死したと思われる組織が観察された。マウスの全身状態を考慮して、播種する腫瘍量とseedを打ち込む時期の設定のため、予備実験を繰り返し、プロトコールを決定した。次に、noseed群、cold seed群をコントロールして、小線源療法(hot群)の各種胃癌培養細胞に対する腫瘍抑制効果を調べた。投与2週後までは、3群で腫瘍量に差を認めなかったものの、以後の経過でhot群は、他の2群より優位に腫瘍量が少なく、定常状態となった。一方、体重は3群とも減少したが、差を認めなかった。驚くべきことに、使用した胃癌細胞株全て(高分化型、低分化型、びまん型)に、すなわち、分化度に関係なく、いずれのタイプにも同様に観察された。以上より、胃癌の分化度と無関係に、125Iによる小線源療法の安全性と腫瘍抑制効果がin vivoで確認できた。根治切除困難な進行胃癌では、化学放射線療法が適応となる。前立腺腫瘍に使用される125Iを用いた小線源療法では、通常の外部照射より高線量が安全に投与可能である。そこで、胃癌における小線源療法の安全性と有効性について検討した。胃癌細胞株(2種の低分化腺癌と1種の高分化腺癌)に対する小線源療法の増殖抑制効果を調べるため、proliferation assayを行ったところ、いずれも有意差をもって増殖が抑制された。
環境・行動情報に基づくジュゴンの経時的コアエリアマップの作成及び混獲回避策の提言

ジュゴン鳴音と人工音のプレイバック実験に関してアメリカ音響学会誌に原著論文として発表した。タイ国でのジュゴン研究により、ジュゴンが鳴音を発する海域は特定狭小海域に限定されることが分かった。このような海域はジュゴンの生態上、重要な海域であることが予想される。オーストラリア・モートン湾内において曳航式のハイドロホンを用いて、音響・目視調査を実施した。延べ12日間、391.5kmのトランセクト調査によって14件の鳴音シーケンスが得られ、12回の目視が得られた。ジュゴンはトランセクトライン上に散見されたが、ジュゴン鳴音はごく限られた海域においてのみ観察された。このことはタイ国での先行研究に矛盾しない。ジュゴンが飼育されているSydney Aquariumにおいて延べ7日間(1日×2と連続5日間)のジュゴン鳴音録音を実施した。録音の結果、ジュゴン鳴音が記録されていることが確認された。ジュゴンの群れ近辺で船舶音のプレイバックと鳴音の録音を実施して船舶音の影響評価を行った。ジュゴンは船舶音に対して大きな反応は示さなかった。ジュゴンの捕獲調査に同行し、合計50頭のジュゴンを捕獲し、200頭近いジュゴンの皮膚サンプルを収集した。今後、他海域でのジュゴン研究に適用する。ジュゴンの空間的分布状況を調査した。タイ国トラン県のタリボン島周辺海域において、水中音モニタリング用ハイドロホンを曳航し、ジュゴンの鳴音を収録した。同時に標準的な目視調査を行った。音響検出位置及び目視検出位置の空間分布の分布様式を、Iδインデックスを用いて評価した。Iδインデックスは分布の集中度を指数化したもので、その値が1より大きければ集中分布、1なら一様分布、1より小さければランダム分布である。音響検出と目視検出の分布に関するIδインデックスはそれぞれ3.53(p>0.01)と0.97(p>0.05)であった。すなわち、ジュゴンは調査線上にほぼ一様に近い状態でランダムに分布していたが、鳴音を発する海域は特定海域に限定されることが分かった。頻繁な発声が認められる海域は、海草場の周辺に存在する砂地に認められた。ジュゴンの摂餌場への来遊周期を調査した。タイ国トラン県タリボン島周辺の干潟の海草藻場において音響観察を実施し、摂餌音を録音した。延べ1446時間の音響データが得られた。ジュゴンの来遊時刻は満潮時刻の2時間前にピークを示し、上げ潮時に有意に偏っていた(p<0.001)。タリボン島周辺海域に生息するジュゴンは上げ潮時に摂餌場へ来遊することが示唆された。ジュゴンの鳴音を用いた情報伝達に関する調査の結果、ジュゴンは他個体の鳴音に対して鳴き返しを行い、個体間の距離に応じて鳴き返しの鳴音の長さを変化させていることが分かった。このことから、ジュゴンの個体間で個体間距離の情報が伝達されている可能性がある。上記の結果を投稿論文として執筆・投稿した。ジュゴンの音響観察によるジュゴン捕捉率に関してアメリカ音響学会誌および海洋理工学会誌に原著論文として発表した。音響観察によってジュゴンの摂餌回遊様式について海洋理工学会誌に共著論文として発表した。干潟にある海草藻場とそれ以外の海草藻場を比較した場合、干潟の藻場の方がジュゴンによる利用度が高いことが分かった。特に、水深1.5m程度になると最も多くの摂餌が観察されたことから、ジュゴンは摂餌に最も適した水深帯を選択的に移動していることが示唆された。また、海草自体の化学成分(窒素、炭素など)は季節的に変化しないが、繁茂量に変化がみられ、ジュゴンの摂餌行動も季節的な変化を示すことが示唆された。この結果を海洋理工学会誌に発表した。これまでに水族館において収集したジュゴン鳴音の卓越周波数と持続時間について精査した。対象としたジュゴンの年齢は0歳、7歳、19歳、27歳である。27歳の個体を除いてすべてメス個体であった。各個体について持続時間と卓越周波数それぞれ分散を比較した。年齢があがるにつれて、持続時間の平均は長く、分散は大きくなり、卓越周波数の平均は低く、分散は小さくなつた。ジュゴンの鳴音発声機構はいまだ明らかにされていないが、卓越周波数は主に頭部付近の筒状組織の長さや太さに規定されると考えられる。また周波数の分散が少ない分、鳴音の持続時間に機能的な情報が含まれることが予想される。ジュゴン鳴音の機能を推定する上で、重要な知見を得られた。

ジュゴンが飼育されているSydney Aquariumにおいて延べ7日間(1日×2と連続5日間)のジュゴン鳴音録音を実施した。録音の結果、ジュゴン鳴音が記録されていることが確認された。ジュゴンの群れ近辺で船舶音のプレイバックと鳴音の録音を実施して船舶音の影響評価を行った。ジュゴンは船舶音に対して大きな反応は示さなかった。ジュゴンの捕獲調査に同行し、合計50頭のジュゴンを捕獲し、200頭近いジュゴンの皮膚サンプルを収集した。今後、他海域でのジュゴン研究に適用する。
テルビウムをドープした培養実験による珪藻が利用するケイ素の形態についての研究

珪藻は海洋において第一次生産の約70%を担い、さらに深層あるいは中層に珪酸質の殻に閉じ込め効果的に有機炭素を移送するため、大気の二酸化炭素にとって生物ポンプとして機能するものとして注目されている。珪藻のブルームの原因について明解な説明がなされておらず、珪藻が利用するケイ素の形態を本研究では培養実験で調査した。本年度実施計画の下記の5項目について以下の成果が得られている。1)培養および分析石英粒子系でも珪藻の繁殖が起き、テルビウムをドープした石英でも同様な繁殖が確認された。フィルター上に回収された、石英粒子および珪藻について、少量のアルカリ溶液中で加熱することで、ケイ素の再現性の良い分析が可能であった。2)培養装置東京農工大において波の発生装置を作成し、自然の環境に近い状態で培養を行う装置を作成した。3)ケイ素の分析ブランク値の低減ケイ素の低濃度下での対照実験が必要であるが、使用器具の選択、洗浄によって、低濃度のブランク値が得られた。4)珪藻の繁殖時期、繁殖条件Skeletonemaの繁殖は波の存在下で抑えられることが分かった。静置下では二週間から一か月の範囲で繁殖が確認された。5)テルビウムの存在珪藻中に分析可能なテルビウムの量が含まれることが分かった。珪藻はケイ酸塩を粒子の形態で吸収していることが示唆されたが、やや再現性に難があり、追加実験が必要であることも分かった。珪藻のブルームの原因について明解な説明がなされておらず、申請者は珪藻が利用するケイ素の形態のうち粒子態ケイ酸を評価することを目的としている。そのために、本年度は主に次の二点について研究を行った。テルビウムをドープしたケイ酸塩粒子の作成石英、酸化テルビウムを均一に混ぜ、炭酸ガスレーザーで局所的に加熱することにより、混合粉末からテルビウムのドープされたケイ酸ビーズを作ることに成功した。これを乳鉢で細粉することで粒径5μm以下の均一な微粒子を調整した。珪藻と粒子状ケイ酸との分離条件の検討珪藻と粒子状ケイ酸の分離法を各種試みた。メンブレンフィルター、遠心分離法等を試みたが、良好に分離することができなかった。ナイロンフィルターを用いる方法が両者を最も良好に分離することがわかった。さらに細かくろ過条件を検討したところ、20μmナイロンフィルターで圧力をかけずにゆっくりとろ過を行うことで、珪藻の破壊を抑えつつ、ほとんどの珪酸塩粒子のみをフィルターを通過させることに成功した。培養実験珪藻を溶液ケイ酸ではなく、粒子状ケイ酸を用いて培養した所、約一週間後に実際に増殖することを確認した。以上、本研究に必要な基礎を全て確立したので、次年度に対照培養実験を行うことが可能になった。珪藻のブルームの原因について明解な説明がなされておらず、珪操が利用するケイ素の形態を本研究では培養実験で調査した。珪藻および添加ケイ酸塩粒子の相互分離はナイロンフィルターを用いて、圧力をかけずに行うのが最も良好であることが判明した。この方法を用いて、各種の系で培養した珪藻の分離と硅素、テルビウムの測定を行った。培養は東京大学海洋研究所の研究室において行い、温度と日照条件がコントロールされた培養室において対照実験を行った。また、同様な培養装置を東京農工大においても自作し、設置した。珪藻には、球形(Thalassiosira)のものと線状(Skeletonema)のものとの二種類を用いた。

期間は一つの実験につき、2から3週間とした。各々の実験において、一定時間ごとに珪藻と培養液のサンプリングを行い、培養液(溶存、粒子態)の希土類元素、ケイ素組成、珪藻の希土類元素、ケイ素組成の比較を行った。希土類元素の測定は、ICP-MS、ケイ素の測定はモリブデンブルー法による比色法を採用した。並列に行われた各々の対照実験の結果を比較することにより、粒子状ケイ酸の取込みの寄与をテルビウムを指標にして、計算する予定であったが、残念ながら、十分にICP-MSの測定時間が確保できず、十分なデータを得ることができなかった。
コンクート用補修材の経時変化ならびに接合部の制御に着目した補修部材の性能改善

高靭性セメント複合材料を用いた表面保護工法の設計法の提案中性化抑止ならびに疲労に対する抵抗性の向上を目的とし,従来からの塗料系の表面被覆材ではなく,高靭性セメント複合材料を用いた表面保護工の適用について基礎的な検討を行い,以下の結論を得た.・厚さ10mm程度の高靭性セメント材料を吹付ける施工方法による施工が可能であることを確認した.・補修された部材の静的な載荷試験を実施し,母材コンクリート中の主ひび割れを微細な表面ひび割れに分散させる機構を利用した補修方法の効果を確認した.断面修復材の寸法安定性の試験方法の提案と数値解析的検討断面修復材の硬化に伴って生じる自己収縮や乾燥収縮などの寸法変化は,補修部にひび割れを誘発するため,断面修復材の寸法安定性の評価方法に関する基礎的な検討を行い,以下の結論を得た.・材料選定を目的として,埋込み型のひずみゲージを用いて寸法安定性を評価する試験方法を提案した.・材料の力学特性の発現や膨張あるいは収縮の経時変化の違いなどを簡易的にモデル化した数値解析により,断面修復材の寸法安定性がひび割れ性状に及ぼす影響について検討した.弾性係数の発現が緩やかなほど,膨張材による膨張量が大きいほどひび割れの低減が可能である結果となった.劣化したコンクリート構造物にはひび割れが存在する場合があり,部材の変形もそのひび割れ部の開口に伴って大きくなる。断面修復材にとっては,ゼロスパンにおけるひび割れ追従性が要求されることになるものと考えられる。本研究では,高靭性な断面修復材を対象とし,ゼロスパンにおけるひび割れ追従性の評価をモデル化した供試体を作製し,変形能,ひび割れ性状について検討した。本実験にて得られた結論を以下に示す。(1)断面修復材として使用したECCの引張試験の結果によると,ひずみ硬化挙動を示しながらも試験区間内に一様にひび割れが生じず,引張応力-ひずみ曲線の結果も検長に依存していることが明らかとなった。このような断面修復材の靭性の評価を行う場合には,ひび割れの発生領域を勘案し,適切に行う必要がある。(2)模擬ひび割れの有無は荷重一変位曲線よりも,むしろパイ型変位計にて計測される荷重-ひずみ曲線に影響を及ぼした。模擬ひび割れ有り供試体では,模擬ひび割れ部付近の断面修復材が破断する場合が多く,パイ型変位計にてその挙動が計測可能であった。(3)付着損失領域の有無は,パイ型変位計による荷重-ひずみ関係に大きく影響を及ぼした。付着損失領域を設けた供試体では,母材コンクリート部に拘束されず,変形に寄与できる領域(断面修復材)が大きかったことによるものと考えられる。(4)模擬ひび割れの有無によらず,コンクリート下段のひび割れ部を起点として供試体下面に向けて三角形状に広がるひび割れが発生した。ひび割れ発生領域の大きさは,ダンベル型供試体の引張試験にて得られたひび割れ発生領域とほぽ同程度であった。このことは,補修供試体内においてひび割れの発生しうる領域の大きさに合わせた断面修復材の性能評価が必要であることを示している。本研究では,現在市販されている断面修復材の靭性を確認するため試験方法を提案し,各材料の性能評価を行った。(1)対象とした断面修復材の破壊は,最大荷重以降に急激に荷重が低下した後,繊維の架橋効果により荷重を持続しながら開口していくものと,架橋効果の少ないもの2種類に分類できた。(2)得られた曲げタフネスの値には,普通コンクリートのそれと同程度かそれ以下のものがあった。その理由は,繊維の混入量が少ないこと,モルタルベースの断面修復材では,粗骨材による靭性向上が期待できないことによるものと考えられる。(3)曲げタフネスの計算に用いるひび割れ幅を小さくすると,たとえ靭性が小さくても最大荷重の大きな断面修復材において曲げタフネスが大きく評価されてしまうことが分かった。また,高靭性セメント複合材料(DFRCC)を断面修復材として用いることを想定し,断面修復材の靭性の違いや,模擬ひび割れの有無ならびに付着損失領域の有無をモデル化した数値解析により,以下の結論が得られた。(4)本解析にて対象としたDFRCCの場合,断面修復材の靭性が補修部材の荷重-変位曲線に及ぼす影響は,付着損失領域を設けた場合に顕著であった。(5)補修供試体下面にて計測(計算)されたひずみ(検長50mm)によると,模擬ひび割れが有る場合,断面修復材の引張強度時ひずみε_uの入力値よりも小さなひずみ時に部材が終局状態となっていた。このことは,模擬ひび割れが破壊の局所化を誘発しているものと考えられる。(6)付着損失領域を設けたところ,DFRCCモデルでは荷重-変位曲線の終局変位が大きくなり,ひび割れもより広い範囲で分散した。一方,FRCモデルでは,付着損失領域の有無が荷重-変位曲線ならびにひび割れ性状に及ぼす影響は小さかった。高靭性セメント複合材料を用いた表面保護工法の設計法の提案中性化抑止ならびに疲労に対する抵抗性の向上を目的とし,従来からの塗料系の表面被覆材ではなく,高靭性セメント複合材料を用いた表面保護工の適用について基礎的な検討を行い,以下の結論を得た.

・厚さ10mm程度の高靭性セメント材料を吹付ける施工方法による施工が可能であることを確認した.・補修された部材の静的な載荷試験を実施し,母材コンクリート中の主ひび割れを微細な表面ひび割れに分散させる機構を利用した補修方法の効果を確認した.断面修復材の寸法安定性の試験方法の提案と数値解析的検討断面修復材の硬化に伴って生じる自己収縮や乾燥収縮などの寸法変化は,補修部にひび割れを誘発するため,断面修復材の寸法安定性の評価方法に関する基礎的な検討を行い,以下の結論を得た.・材料選定を目的として,埋込み型のひずみゲージを用いて寸法安定性を評価する試験方法を提案した.・材料の力学特性の発現や膨張あるいは収縮の経時変化の違いなどを簡易的にモデル化した数値解析により,断面修復材の寸法安定性がひび割れ性状に及ぼす影響について検討した.弾性係数の発現が緩やかなほど,膨張材による膨張量が大きいほどひび割れの低減が可能である結果となった.
近世武家集団の居住形態「陣小屋」に関する研究

本研究の目的は、近世初期の将軍上洛時における諸藩の滞在先を素材として、武家集団の居住施設の一類型「陣小屋」の構成原理を明らかにすることにあった。そして、その方法として、これまでの研究をまとめるとともに、(1)藩政史料、(2)町方史料、(3)幕府史料、の3方向からの検討と、(4)一般の近世武家他・武家屋敷との比較、を想定していた。このうち、今年度の研究は、(1)(4)の検討に力点を置くこととなった。中心となったのは山口県立文書館の史料調査である。同館には、陣小屋に関わる史料以外にも、江戸藩邸に関わる絵図・造営関係史料が多数収蔵されており、これらを閲覧・複写・整理・分析することに全力を注いだ。したがって、当初に予定していた京都におけるあり方の解明というよりも、「陣小屋」に関する一般的な理論の検討に比重が傾くこととなった。検討の結果明らかになったのは以下のとおり。1「陣小屋」の構成は、中心となる書院などの上層住宅の系譜に属するものと、小屋として庶民住宅の系譜に属するもの、の二つの建築類型から構成されている。これは、江戸藩邸などの大規模な武家住宅や、さらに城下町の城郭と武家地を含めた領域における建築構成、と共通する性格を持つ。2「陣小屋」を建設するための建築材料は、「家道具」・「小屋道具」の二元的な構成を有しており、これは1の知見と対応するものである。しかも、これらの材料はリサイクルされており、武家集団の居住施設として集団にとっては恒常的な建築的ストックと呼べるものであった。
世界の長期発展に係る鋼材のダイナミックマテリアルフロー分析

本研究では、世界全体での鋼材のダイナミックMFAを実施した。具体的には、鋼材の最終用途(自動車、土木、建築、機械など)に関して2050年までのストック量を推計するとともに、需要量、使用済み製品からのスクラップ発生量を推計した。統計データ等ダイナミックMFAを実施するためのデータが得られない地域に関しては、夜間光衛星画像やGISを用いて、ストック量を推計した。さらには、国際貿易に伴う取引量(グローバルマテリアルフロー)を推計するとともに、途上国でのスクラップの回収状況を調査、推計することで、将来需要を鑑みたスクラップの利用に関して提言を得た。VIIRSデータによる夜間光画像を用い、世界各域の建築、土木鋼材ストック量を推計した。統計データ等により解析可能な国に関して、ダイナミックMFAにより鋼材ストック量を推計し、夜間光強度との相関を解析し、他の地域のストック推計へ適用した。また、これまであまり検討されてこなかった機械に関して、統計データを用い現在までの国毎の鋼材ストック量の推計、および2050年までの需要の推計を行った。合成開口レーダ(PALSAR)データを用い、国内主要都市における建築鋼材ストック量を推計した。各都市のストック量に関しては、統計データやGIS等を用いて推計した既存研究結果を活用し、PALSARデータを用いて推計した結果との相関を求めた。鋼材の用途の中でも建築はストック量が大きく、国毎の経済発展や地震頻度等により鋼材使用原単位の差異が大きい。それらの要因を反映した今後100年の鋼材需要・ストック量の推計のために,過去100年に及ぶ建築鋼材原単位データベースを整備した。GDP/人が2,000 USD以下のバングラデシュ等の途上国では、高炉や大規模電炉の設備が無く、使用済み製品の手解体による部品再利用、小型電気炉やキュポラ等による鋼材リサイクルが主なフローになる。これらの途上国における使用済み製品からの鋼材スクラップ回収、利用および銅の混入状況を調査し、これらの国での鋼材利用のモデル化を行った。鋼材は、自動車および産業機械、輸送機械(鉄道)、建設機械など機械類としての国際取引量が大きくマテリアルフローとストックへの影響が大きい。また、中古製品としての取引量が多いことも知られているが、実態が正確に把握されていないのが現状である。そこで、国際貿易統計(UN-Comtradeなど)および廃棄物産業連関に基づくマテリアルフロー分析(WIO-MFA)モデルなどから得られる組成情報をもとに、鉄鋼材料および鉄含有製品(おもに自動車・機械)を介した国際取引量の同定を行った。VIIRSデータが利用可能な直近年の夜間光衛星画像、およびDMSP-OLSデータを用いた夜間光衛星画像を用いて、各国の建築、土木鋼材ストック量の経年変化の検証と結果の精緻化を行った。異なる人工衛星により撮影された画像を用いて経年変化を検討するので、201113年の期間、鋼材のストック量がほぼ一定な日本等の国・地域のストック量と夜間光強度の相関から他の国のストック量を推計した。自動車、土木、建築、機械類等の鋼材用途に関して、2050年までの需要量およびストック量の推計を行った。土木用途の鋼材の中でも道路に利用されているものが多く、上下水道インフラとも密接な関係がある。そこで道路GISを用い、国内の道路インフラに使用されている鋼材ストック量を推計した。そして、研究代表者が作成した夜間光生成画像を用い、国内地域別の夜間光強度と道路鋼材ストックとの相関を求め、それを世界に適用することで、世界の道路インフラに使用される鋼材量を推計した。用途別使用量の多い土木鋼材の中で、鋼材の回収が困難な下水道インフラの鋼材ストック量を推計した。上下水道インフラの敷設距離に関しては、統計データ(OECD)等を収集するとともに鋼材使用原単位(ton/km)を調査した。下水道インフラの鋼材回収性評価のために,補修・改修工法を分類・把握した。平均GDP/人が10,000 USD以下でありながら自動車普及台数が多く、高炉、電炉などを保有する中国、インドにおける使用済み製品からの鋼材スクラップ回収、利用および銅の混入現況を調査し、これらの国での鋼材利用現況のモデル化を行った。WIO-MFAモデルを用いて、自動車、土木、建築、機械などの最終製品単位生産量あたり鋼材スクラップがどれだけ使用されているかを解析した。さらに、将来の鋼材の各最終需要において鋼材スクラップがどれだけ利用できるか推計した。世界全体での鋼材のダイナミックマテリアルフロー分析(MFA)を実施し、様々なシナリオのもとスクラップ発生量と利用可能量を推計した。これまでに鋼材スクラップの主な受け皿になっていた建築・土木の、世界におけるストック量は2013年度で130億t、2050年には560億t程度に達することが推計された。現在の利用率で推移した場合、スクラップの発生量は2040年頃に需要を超えることが予想され、今後、精緻解体等による銅などの混入を減らし、スクラップ利用を促進する必要が浮き彫りになった。また、詳細な物質ストックデータの推計結果がある1都4県を対象に衛星夜間光と物質ストックの関係性について分析を行い、その結果に基づき世界大でのストック推計を行った。夜間光情報は直接的に物質ストックを表すものではないが、物質ストックとの相関は高く、物質ストック推計に利用できることが明らかになった。土木インフラの一つである下水道管渠に蓄積される鋼材量および将来的な飽和量を世界全球で推計した。

過去100年にわたる調査から建築物鋼材原単位の地域的・社会的な差異を定量的に把握した。その結果、耐震法規,経済状況,人口の高密度化による高層化の要因が支配的であることを明らかにした。途上国での鋼材のマテリアルフロー解析に関しては、経済成長レベルの高いインドでの調査を実施した。そこでは、使用済製品の発生量の多さや多様なリサイクル産業の存在故に、逆に混入の可能性が高まっていることを確認した。国際貿易に伴う鉄の取引量(グローバルマテリアルフロー)の時系列推計および精緻化を実施した。解析の結果、中国の需要拡大を受けて、アジア地域の見掛け消費量が拡大している事、今後の人口増加や経済発展に伴い需要の拡大が予想されるアフリカ地域は、いずれの年においてもそのシェアは3%程度にとどまる事などが得られた。本研究では、世界全体での鋼材のダイナミックMFAを実施した。具体的には、鋼材の最終用途(自動車、土木、建築、機械など)に関して2050年までのストック量を推計するとともに、需要量、使用済み製品からのスクラップ発生量を推計した。統計データ等ダイナミックMFAを実施するためのデータが得られない地域に関しては、夜間光衛星画像やGISを用いて、ストック量を推計した。さらには、国際貿易に伴う取引量(グローバルマテリアルフロー)を推計するとともに、途上国でのスクラップの回収状況を調査、推計することで、将来需要を鑑みたスクラップの利用に関して提言を得た。研究計画に従い順調に進めた。米国海洋気象研究所(NOAA)に大学院生を2カ月派遣し、VIIRSデータによる夜間光画像の解析を実施することができた。その成果を活用して、夜間光と鋼材ストック量の相関を解析できた。当初の計画通り概ね進捗している。平成25年度は繰越申請したことにより、VIIRS夜間光衛星画像のデータが多く入手できたので、それを活用した解析ができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。リサイクル工学研究計画に従って進めて行く。計画に従い、順次進めて行くものとする。
次世代の粒子加速研究を支える中間エネルギーイオン分析器の開発

人工衛星による粒子の直接観測は、宇宙における粒子加速機構の解明に不可欠である。本課題ではこれまで技術的に困難であった中間エネルギーイオン観測実現に向け、キーテクノロジーのひとつである質量分析器の開発を行った。数値シミュレーションを行って構造を決定し,それに基づいて製作した分析の性能を,実験室で確かめる事ができた.人工衛星による粒子の直接観測は、宇宙における粒子加速機構の解明に不可欠である。数値シミュレーションを行って構造を決定し,それに基づいて製作した分析の性能を,実験室で確かめる事ができた.磁気圏プラズマ研究において,中間エネルギー荷電粒子(10-200keV/q)の観測はエネルギー輸送の観点から非常に重要である.ところが過去の探査では技術的困難のため,このエネルギー帯の詳細な観測は少ない.この点に着目した申請者はこれまで,新たな粒子計測の要素技術開発に取り組んできた.本研究では申請者が培ってきた要素技術を活かし,衛星搭載可能な中間エネルギーイオン分析器を試作する.各要素技術を統合した実証試験は,近い将来の放射線帯探査(ERG衛星計画)に向けた急務であり,磁気圏尾部探査(SCOPE計画)や外惑星探査(EJSM/JMO衛星計画など)のためにも必要な布石である.本研究では,2年間で中間エネルギーイオン分析器のERG衛星搭載モデルを製作・試験できるよう作業を進めている.その一年目である22年度は,静電分析器と質量分析器,及び半導体検出器の詳細設計を行った.特に質量分析器の性能向上のため,新たに3次元(非軸対称)構造を取り入れた.そして,数値シミュレーションにより質量分析器における信号・雑音比を一桁程度向上させる設計を得た.これらの作業は当初の計画通りのスケジュールで進行している.さらに,上記の結果に基づき,質量分析器の製作を前倒しして開始した.静電分析器の製作は他の財源で賄うこととしており,2年目で静電分析器・質量分析器を組み合せた総合試験を行う目処が立った.なお,質量分析器の設計過程では独自の3次元電位・粒子軌道計算コードも開発した.このようなシミュレーションコード及び信号・雑音比向上のためのアイデアは今後のプラズマ計測器開発にも応用できる.磁気圏プラズマ研究において,中間エネルギー荷電粒子(10-200keV/q)の観測はエネルギー輸送の観点から非常に重要である.ところが過去の探査では技術的困難のため,このエネルギー帯の詳細な観測は少ない.この点に着目した申請者はこれまで,新たな粒子計測の要素技術開発に取り組んできた.本研究では申請者が培ってきた要素技術を活かし,衛星搭載可能な中間エネルギーイオン分析器を試作する事とした.各要素技術を統合した実証試験は,近い将来の放射線帯探査(ERG衛星計画)に向けた急務であり,磁気圏尾部探査(SCOPE計画)や外惑星探査(EJSM/JMO衛星計画など)のためにも必要な布石である.本研究では,2年間で中間エネルギーイオン分析器のERG衛星搭載モデルを製作・試験できるよう作業を進めた.この分析器では,time-of-flight(TOF)すなわちイオンの飛行時間を計測する事で,イオンの質量(イオン種)を同定する.また,この分析器は単純にイオン種を同定する機能だけでなく,放射線帯領域での激しいバックグラウンドノイズに耐えられる性能が必要であり,そのような設計を施した.1年目に数値シミュレーションを用いて行った形状設計に基づき,今年度はイオン質量分析器を製作した.この分析器に実験室で10-120keV/qのイオンビームを照射して性能を試験したところ,シミュレーション通りの性能を確認する事が出来た.すなわち,設計要求通りのイオン質量弁別機能(H+,He++,He+,O+等の分離機能)を有する事がわかった.実際のデータ取得に際しては,シミュレーションに取り込まれていない電気信号処理に起因する時間分解能劣化(ひいては質量分解能劣化)が懸念されたが,実験結果は期待以上のものであった.
新規の抗痴呆薬となるwithanoside類を用いたシナプス形成機序の解明

Amyloidβ(25-35)を脳室内投与したAlzheimerモデルマウスにwithanoside IVを経口投与すると、空間記憶障害の顕著な改善が認められた。また、amyloidβ(25-35)投与による脳内の軸索、樹状突起、シナプスの密度の減少が、withanoside IV投与群では正常群レベルにまで改善された。また、Withanoside IVを正常マウスに経口投与すると、物体認識記憶が有意に向上した。脊髄損傷に対するwithanoside IVの効果としては、損傷1時間後よりwithanoside IVを経口投与したところ、後肢運動機能が有意に改善した。またwithanoside IV投与群では、損傷部位に軸索が伸展し、脱落した中枢性ミエリンの代わりに末梢性ミエリンが増加していた。加えて、astrocyteが損傷中心部位に浸潤するように移動し、それによって凝集されたかのようにmicrogliaの集積部位が縮小した。また、軸索とミエリンの相互作用に関わる軸索上の分子であるneuregulin-Iが損傷中心部で減少したが、withanoside IV投与群では有意に増加した。Withanoside lV経口投与後のマウスの血清中の代謝物を分析したところ、経口投与後すみやかにC3位の糖鎖が加水分解されたsominoneへと代謝されることが示された。Sominoneには神経突起伸展、シナプス形成作用があることが判り、経口投与したwithanoside IVの活性本体がsominoneであることが示唆された。Tyrosineリン酸化受容体抗体アレイを用いた解析を行った結果、sominoneで刺激により神経細胞およびmicroglia上のRETと、神経細胞上のACK1が速やかにリン酸化されることと、両分子ともにsominoneによる樹状突起伸展活性に関与している結果が得られた。これまで記憶改善作用との関連ではRETやACK1はあまり着目されてこなかった。本成果により、神経回路網再構築による記憶改善作用の鍵分子としてRET、ACK1の役割が明らかになる可能性が示された。本研究は、インド生薬Ashwagandhaから単離した化合物であるwithanolide A(WL-A), withanoside IV(WS-4),withanoside VI(WS-6)が、障害を受けた脳内において、軸索と樹状突起を伸展させシナプス密度を正常レベルにまで回復させるという、これまでの発見に基づき、WL-A, WS-4,WS-6が神経回路網を再形成する抗痴呆薬であることをさらに検証することとと、その作用機序を分子的に明らかにすることを目的としている。本年度は、まずWS-4をマウスに経口投与した場合の活性本体を同定した。WS-4の構造を考えた場合、腸内細菌によりdeglycosylationされたものが活性本体として脳内に作用する可能性が考えられたため、WS-4経口投与後のマウスの血清中のWS-4の代謝物をHPLCで検出しさらにLC/MS分析を行った。その結果、経口投与10分後からすでに血清中にWS-4そのものは検出されず、3位の糖鎖が加水分解されたsominoneと、未同定ではあるがsominoneのmonohydroxyl体と推測される1つの化合物が検出された。Sominoneの活性を検討するため、amyloid β(25-35)(=Aβ(25-35))を処置して軸索および樹状突起を萎縮させたラット大脳皮質神経細胞にsominoneを処置した。Sominone処置により用量依存的に、軸索と樹状突起の再伸展作用が認められた。

また、Aβ(25-35)処置によって減少したシナプス密度が、sominone処置により正常レベル程度に回復したことから、経口投与時のWS-4の活性本体がsominoneであることが示された。当初の計画では、培養ラット大脳皮質神経細胞を用いて、被リン酸化タンパク質を網羅的に同定することで細胞内シグナル伝達系をたどる方法により化合物の作用機序を探る方針であった。しかし、本年度同時に進行中の脊髄損傷マウスにおけるWS-4の作用に関する研究結果により、WS-4(つまりはsominone)が神経細胞だけでなく、ミエリンを形成するグリア系の細胞にも作用し、神経細胞とミエリンのinteractionを調節している可能性が示唆された。この結果により、本研究の化合物に関しては、胎児の培養細胞を用いた検討ではミエリン化や神経回路構造が生体の状態を必ずしも再現はしておらず作用機序の解析が一面的になってしまう可能性がありため、作用の多面性を本質的に解明するためには動物レベルでの検討がより適していることが示唆された。次年度からの本研究では、特に活性本体が明らかとなったWS-4に関して、中枢神経系の回路網再形成における作用機序を、行動学的、組織的なアプローチが可能な動物レベルで分子的に明らかにする方針で、目的を達成する予定である。脊髄損傷に対するwithanoside IV経口投与の効果を検討した。脊髄を圧挫したマウス(ddY,6週齢,オス)に、損傷1時間後よりwithanoside IV(10μmol/kg/day)を20日間経口投与したところ、後肢運動機能のスコアであるBBB scaleや後肢での立ち上がり回数が、溶媒投与群と比較して有意に増加した。脊髄切片を各種マーカータンパク質の抗体により免疫染色したところ、損傷群では軸索が断裂し、中枢性ミエリンが脱落した空洞部にmicrogliaの増加が見られた。一方、withanoside IV投与マウスでは、損傷部位に軸索が有意に伸展し、脱落した中枢性ミエリンの代わりに末梢性ミエリンが増加していた。加えて、astrocyteが損傷中心部位に浸潤するように移動し、それによって凝集されたかのようにmicrogliaの集積部位が縮小した。Axonとmyelinのinteractionに関わる、軸索上の分子であるneuregulin-Iは、損傷中心部で減少したが、withanoside IVによって有意に増加した。以上、withanoside IVは、損傷部位の軸索を伸展し、かつ中枢神経のaxon伸展に対して促進的にサポートすると考えられている末梢性ミエリンを増加させ、炎症部位の収束も導くという多面的な作用を示した。さらに、withanoside IVの分子レベルでの作用機序は、PI3 kinaseとestrogen受容体を介したものであることが示唆された。アルツハイマー病モデルマウスの脳内でも、axonやsynapseを増加させ抗認知症作用を示すwithanoside IVであるが、そのメカニズムにもestrogen受容体やphosphoinositide-
ナノバブルを用いた超選択的疼痛管理法の開発

本研究は、ナノバブルおよび超音波エコーを用いて非ウィルス的に疼痛関連遺伝子をリンパ球を含む免疫系細胞に導入し、超局所的に鎮痛物質を発現させることによって、全身性副作用の少ない疼痛管理法を開発することを目的とした。現段階においては物理的手法による免疫細胞系への遺伝子導入は導入効率および施行後細胞生存率の点で問題があり、動物実験において治療効果に有意差が認められなかった。このため新たに培養リンパ球を用いた活性化自己リンパ球移入法を応用し、同様の治療効果を狙った。現段階ではまだ最終的結論には至っていないが、今後条件設定をさらに検討することで非常に有効な治療法となりうる可能性が示唆された。本年度は、ナノバブルを用いてリンパ球にβエンドルフィンを発現させるための条件設定を行うことであった。がしかし、細胞の死滅や導入効率が芳しくないことなどにより、現段階では疼痛管理法としては不十分である可能性が高まった。当初の実験計画にも記載してあるが、目的はリンパ球にβエンドルフィンを積極的に発現させ、それを集中的に炎症疼痛部位に集簇させて鎮痛を図ることである。であるならば、予め炎症を生じているモデルからリンパ球を採取し、培養・活性化した後体内に戻せば、炎症部位を特異的に標的としたリンパ球が大量に同部位に集簇し、鎮痛効果を発揮するであろうと仮説を立てた。予備実験として、足アジュバントモデルにおいて所属リンパ節のβエンドルフィン活性をPCRで確認したところ、健側には認められなかったPOMC遺伝子(βエンドルフィン前駆体)の発現が患側には強く認められ、炎症部位においてリンパ球を通したβエンドルフィンの発現があることが強く予測された。このことから、癌治療において応用されている活性化自己リンパ球移入療法を疼痛治療に応用できる可能性が強く期待できる。場合によっては、遺伝子導入が困難であると言われている免疫細胞に対する方法としてはむしろ有効かもしれない。現在、リンパ球を採取・培養したものを炎症疼痛モデルに移入し、疼痛の緩和が図れるか検討中であるが、炎症中期における疼痛制御の可能性が示唆されつつあり、今年度の検討で良い結果が期待される。これまで我々はより質の高い安全で効果的な疼痛管理法の開発を目標に研究を進めてきた。末梢免疫細胞、特にリンパ球におけるβエンドルフィンの発現、分泌機構に着目し、このタンパク質を強制的に発現させ、疼痛部位に集簇させることで、より選択的に全身的副作用の少ない疼痛管理法を開発することを目指している。本年度は炎症性疼痛に対して活性化リンパ球が鎮痛効果を発現することができるかを検討した。これは癌治療に用いられている活性化自己リンパ球療法をペインコントロールに応用するものであり、まだ報告されていない。1)マウスリンパ節、脾臓、末梢血液からリンパ球を分離・培養することができた。2)β-endorphinの前駆体であるPOMC mRNAがアジュバントモデル患側の所属リンパ節(鼠径リンパ節)に発現していることが確認できた。これは、炎症巣にリンパ球が浸潤、β-endorphinを放出、リンパ節にてβ-endorphinを産生の後、再び炎症巣へ向かうというリンパ球の炎症巣における役割を強く推測させる。また、リンパ球をアジュバントモデルマウスに移入し、疼痛テストを行った。von Freyテスト、Paw flickテストにより評価した。リンパ球の培養日数、細胞数、アジュバント接種後の移入のタイミングなどを様々に検計しだが、コントロール群に比べ、リンパ球移入群に鎮痛傾向は見られるものの有意差を得るまでには至らなかった。理由として、個体差が大きいこと、リンパ球の活性化の測定が難しいこと、移入のタイミングなどがあげられた。今後、術後痛モデルを使用することで、急性期における鎮痛効果を狙っていく予定である。
EBウイルス関連皮膚リンパ球増殖性疾患の病態と予後に関する研究

EBウイルス関連NK/T細胞増多症の病態解明と治療法確立を目的に,疾患のスペクトラムと予後解析,ウイルス感染様式とウイルス抗原発現の解析,樹立細胞クローン解析,宿主免疫応答,潜伏感染ウイルス排除の試みについての研究を実施した.1.臨床的解析:EBウイルス関連疾患のスペクトラムを明確にとらえることができた.予後調査から,EBウイルス関連NK/T細胞リンパ腫や血球貪食症候群へ進行する患者群の特徴が明らかになってきた.NK細胞腫瘍研究会(代表,押味和夫教授,順天堂大学内科学)との共同で,NK細胞腫瘍の全国調査結果を報告した.2.樹立細胞におけるEBウイルス遺伝子の発現様式:患者末梢血からEBウイルス感染NK/T細胞株を樹立した.多くの細胞はEBNA遺伝子のQpプロモーターを使用してEBNA1を発現し,EBNA-1とLMPを発現している(Latency II型)が,クローンによってはI型も認められた.3.EBウイルス感染細胞クローンの解析:慢性活動性EBV感染症や蚊刺過敏症では末梢血に優位なNK/T細胞クローンが検出されるが,優位のクローンのほかにNK, T, B細胞にもウイルスが感染したオリゴクローンのプールを形成していることが明らかになった.4.臨床病型の決定要因:種痘様水疱症ではT細胞浸潤,蚊刺部ではNK細胞浸潤が特徴的であり,患者末梢血のEBウイルス感染T,NK,B細胞のプールから,紫外線,蚊刺などの刺激で,特定の細胞が選択的に病変部に浸潤し,細胞傷害性T細胞の反応を介して,特有の臨床像を形成する.本研究によって病変部での再活性化の証拠が得られ,病態の仮説が裏付けられた(論文準備中).5.潜伏感染関連遺伝子発現制御を用いた治療への試み:mutant EBNA-1を細胞導入することによって,EBウイルスエピトープを排除できた(今井章介教授,高知大学感染分子病態学との共同研究).潜伏感染ウイルス排除療法のプロトタイプになり得る.6.新規の臨床診断法の開発:EBウイルスDNAを定量的にモニターできるrealtime PCR法の臨床応用を可能にし,病気の悪性化や進行を予見するために重要な検査になっている.さらに,皮膚病変の痂皮を用いた新規診断法を考案した(特許申請中,論文準備中).これによって,生検などの侵襲的検査を回避でき,全国から送付される検体を検査することが可能になった.EBウイルス関連NK/T細胞増多症の病態解明と治療法確立を目的に,疾患のスペクトラムと予後解析,ウイルス感染様式とウイルス抗原発現の解析,樹立細胞クローン解析,宿主免疫応答,潜伏感染ウイルス排除の試みについての研究を実施した.1.臨床的解析:EBウイルス関連疾患のスペクトラムを明確にとらえることができた.予後調査から,EBウイルス関連NK/T細胞リンパ腫や血球貪食症候群へ進行する患者群の特徴が明らかになってきた.NK細胞腫瘍研究会(代表,押味和夫教授,順天堂大学内科学)との共同で,NK細胞腫瘍の全国調査結果を報告した.2.樹立細胞におけるEBウイルス遺伝子の発現様式:患者末梢血からEBウイルス感染NK/T細胞株を樹立した.多くの細胞はEBNA遺伝子のQpプロモーターを使用してEBNA1を発現し,EBNA-1とLMPを発現している(Latency II型)が,クローンによってはI型も認められた.3.EBウイルス感染細胞クローンの解析:慢性活動性EBV感染症や蚊刺過敏症では末梢血に優位なNK/T細胞クローンが検出されるが,優位のクローンのほかにNK, T, B細胞にもウイルスが感染したオリゴクローンのプールを形成していることが明らかになった.4.臨床病型の決定要因:種痘様水疱症ではT細胞浸潤,蚊刺部ではNK細胞浸潤が特徴的であり,患者末梢血のEBウイルス感染T,NK,B細胞のプールから,紫外線,蚊刺などの刺激で,特定の細胞が選択的に病変部に浸潤し,細胞傷害性T細胞の反応を介して,特有の臨床像を形成する.本研究によって病変部での再活性化の証拠が得られ,病態の仮説が裏付けられた(論文準備中).5.潜伏感染関連遺伝子発現制御を用いた治療への試み:mutant EBNA-1を細胞導入することによって,EBウイルスエピトープを排除できた(今井章介教授,高知大学感染分子病態学との共同研究).潜伏感染ウイルス排除療法のプロトタイプになり得る.6.新規の臨床診断法の開発:EBウイルスDNAを定量的にモニターできるrealtime PCR法の臨床応用を可能にし,病気の悪性化や進行を予見するために重要な検査になっている.さらに,皮膚病変の痂皮を用いた新規診断法を考案した(特許申請中,論文準備中).これによって,生検などの侵襲的検査を回避でき,全国から送付される検体を検査することが可能になった.EBウイルス感染リンパ球におけるウイルス感染様式,細胞増殖様式,ウイルス抗原発現様式および宿主免疫応答についての研究を実施した.1.潜伏関連ウイルス遺伝子の発現様式:皮膚NK/T細胞リンパ腫および慢性活動性EBウイルス感染症におけるウイルス感染NK/T細胞は,EBNA遺伝子の/Qpプロモーターを使用してEBNA1を発現し,EBNA-1とLMPを発現しているが,そのほかのウイルス抗原の発現は制限されていた(Latency II型).2.EBウイルスDNAコピー数解析と臨床的意義:EBウイルスのEBNA1遺伝子領域を組み込んだプラスミドを作製し,EBウイルスDNAを定量的に測定できるPCR法を実施した.

種痘様水庖症やNK細胞リンパ腫や蚊刺過敏症患者の末梢血におけるEBウイルス感染細胞を定量的に解析することが可能である.そのコピー数をモニターすることによって病状の進展を予測できるかどうかを検討している.4.EBウイルス感染細胞クローンの解析:慢性活動性EBV感染症や蚊刺過敏症では末梢血にNK細胞増多症には優位なクローンが存在することがしばしばあるが,その他のNK,T,B細胞にもウイルスが感染していると考えられた.EBウイルス潜伏感染にともなうT/NK細胞増多症の病態解明のため,ウイルス感染様式,樹立細胞クローン解析,ウイルス抗原発現様式についての研究を実施した.1.樹立細胞におけるEBウイルス遺伝子の発現様式:患者末梢血からEBウイルス感染NK細胞株(NOY-1,NOY-2)とT細胞株(TOY-03)を樹立した.いずれの細胞株とも,EBNA遺伝子のQpプロモーターを使用してEBNA1を発現し,EBNA-1とLMPを発現しているが、そのほかのウイルス抗原の発現は制限されていた(Latency II型).2.EBウイルス感染細胞クローンの解析:患者末梢血のサザンブロット法,樹立細胞の性状から,慢性活動性EBV感染症や蚊刺過敏症では末梢血に優位なNK/T細胞クローンが検出される症例とされない症例がみられたが,いずれの症例においても他のNK, T, B細胞にもウイルスが感染したオリゴクローンの状態であることが明らかになった(論文準備中).3.臨床病型の決定要因:種痘様水疱症ではT細胞浸潤,蚊刺部ではNK細胞浸潤が特徴的であり,患者末梢血のEBウイルス感染T、NK, B細胞のプールから,紫外線,蚊刺などの刺激で,特定の細胞が選択的に病変部に浸潤し,活性化を受け,特有の臨床像を形成すると考えられた.4.潜伏感染関連遺伝子発現制御の試み:mutantEBNA-1を細胞導入することによって,wtEBNA-1発現が低下した(高知大学医学部微生物学教室との共同研究,論文投稿中).潜伏感染ウイルス排除の新治療法のプロトタイプになり得る.5.EBウイルスDNAコピー数解析と臨床的意義:EBウイルスのEBNA1遺伝子領域を組み込んだプラスミドを作製し,EBウイルスDNAを定量的に測定できるrealtime PCR法を実施し,そのコピー数をモニターすることによって病状の進展を予測できるかどうかを検討している.EBウイルス関連T/NK細胞増多症の病態解明と治療法確立を目的に,ウイルス感染様式,樹立細胞クローン解析,ウイルス抗原発現様式,ウイルス排除についての研究を実施した.1.樹立細胞におけるEBウイルス遺伝子の発現様式:患者末梢血からEBウイルス感染NK細胞株とT細胞株を樹立した、多くの細胞はEBNA遺伝子のQpプロモーターを使用してEBNA1を発現し,EBNA-1とLMPを発現している(Latency II型)が,クローンによってはI型も認められた.2.EBウイルス感染細胞クローンの解析:慢性活動性
排卵酵素遺伝子のトランスジェニックRNAiメダカ作製への挑戦

昨年度の解析から、哺乳類型siRNAがメダカにおいては効率の良いノックダウン効果を示さないことが示唆されたため、始めにこの点についてより詳細な解析を行った。メダカ培養細胞を用いて強制発現させたMT2-MMPおよびuPAのノックダウン効率を調査したところ、化学合成したsiRNA、miRNA発現ベクターを用いて発現させたsiRNAともにほとんど効果がないことが判明した。これらの結果から,メダカ細胞においては、哺乳類型siRNAが作用し難いことが考えられる。この理由として、メダカで作用するsiRNAの長さが哺乳類型とは異なることが考えられる。そこで、この点に焦点を絞って解析を行った。siRNA産生において重要な因子であるDicerのリコンビンナントタンパク質を用いてdsRNAの切断実験を試みたところ、20-30塩基付近に切断産物が得られたため、現在この産物の配列情報を解析中である。また、RISCの主要構成因子であるArgonaute-2のメダカ特異的抗体を作製、この抗体を用いて免疫沈降を行い、共沈してきたsmall RNA分子の長さを解析中である。これらの解析結果から、メダカで作用するsiRNAの長さを明らかにし、効率良くノックダウン可能な発現ベクター構築へと移行していく予定である。さらに、Droshaに関しても全長配列のクローニングが終了し、リコンビナントタンパク質および抗体作製へと移行した。今後は、こちらに関しても、リコンビナントタンパク質の準備ができ次第、詳細な解析を行う予定である。マウスではトランスジェニックRNAi技術はすでに確立され、標的とする遺伝子/タンパク質の個体レベルでの解析研究が著しい進展を見せている。本研究は、マウス以外の脊椎動物でも同様の技術を確立することを目指し、メダカを実験材料に2年間の研究計画を提案した。本研究により、マウスとは異なるメカニズムがあることが明らかになったので、これを基盤としてトランスジェニックRNAiメダカの確立に向けてさらに研究を進める予定である。本研究は、メダカの排卵に必須の酵素遺伝子について、トランスジェニックRNAiメダカを作製することを目的にしている。具体的には、MT2-MMP遺伝子およびuPA遺伝子のトランスジェニックRNAiメダカの作製と解析を最終目標としている。本年度においては、以下のことを実施した。(1)uPA遺伝子のトランスジェニックRNAiメダカ作製の試みとして、生体外においてプロモーター活性を有するuPAの遺伝子上流2kbp程度が、体内においてもプロモーターとして機能するかどうか、またこの領域のみで内在の発現パターンを再現できるかどうかを解析するために、この領域を導入したトランスジェニックメダカを作製中である。現在、F0の解析およびF1のスクリーニングを行っている。(2)生体内においてRNAiが産生される際、DicerとDroshaとよばれる二本鎖RNA特異的切断酵素が重要な働きを担っていると考えられている。トランスジェニックメダカの体内において導入配列から効率よくRNAiを生産するためには、メダカDicerとDroshaの働きが重要なポイントとなる。そこで、本年度はこれら2つの酵素について、その基礎的な性質について解析を行った。まず初めに、配列情報が断片的にしか公開されていなかったことから、cDNAクローニングを行い、全長配列を決定した。次にこれらの配列を基にリコンビナントタンパク質を作製した。現在、これらの酵素学的性質を解析中である。Dicerに関しては、Nativeタンパク質を検出可能な特異的抗体の作製にも成功した。(3)MT2-MMP遺伝子のトランスジェニックRNAiメダカ作製には着手していない。その理由は、メダカのDicerとDroshaの解析結果を踏まえた上で実施すべきと判断したからであり、上記(2)で得られる知見を基盤にして実施する予定である。

本研究により、マウスとは異なるメカニズムがあることが明らかになったので、これを基盤としてトランスジェニックRNAiメダカの確立に向けてさらに研究を進める予定である。