hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安定同位元素比分析の身元不明遺体の出身地域の推定への応用

ヒト硬組織中に含まれる炭素、酸素及びストロンチウムの各安定同位体比は、遺骨の身元確認の前段階におけるスクリーニング法として有効な情報を提供できる。本研究では、戦没者遺骨鑑定への適応を想定しパプアニューギニア人と日本人の歯牙エナメル質中の炭素、酸素及びストロンチウム同位体比を計測し、先行研究である米国人データを参照し、判別分析による統計学的検討をおこなった。これらの3群から米国人の分別は高精度に可能であった。パプアニューギニア人と日本人については一部地域では正確な分別が可能であった。安定同位体比分析は、ニューギニア戦線におけるこれら3群の遺骨を分別する方法として有効となる可能性が示された。平成25年度における研究業績としては、研究の基礎データを得るため、地域別、時代別の試料(抜去歯牙)の収集、分析を行った。地域別としては、学会等の会合や研究紹介ウェブページを通じて、広く国内外の歯科医療機関に研究協力を呼びかけ、賛同を得られた機関から歯科治療上の理由で抜去となった歯牙を収集する体制を構築し現在分析を進めているところである。国内に関しては、地域別の偏りのないよう全国の歯科医療施設9カ所から収集を行っている。国外については、現在フィリピン、サウジアラビアの2か国からの収集を行っている。今後の課題としては、国内では空白地域をなくすこと、国外に関しては対象国を増やすことが挙げられる。また、この臨床の場からの抜去歯牙の収集に関しては、防衛医科大学会研究倫理審査委員会による研究計画の審査承認を経て臨床研究倫理および個人情報の保護に十分配慮して実施している。時代試料として、明治期、大正期、昭和30年代までのものとして、東京歯科大学所蔵の日本人歯牙コレクションを、昭和30年代以降試料としては上記臨床の場から提供された抜去歯牙を試料として分析検討を行っている。これら分析に関してはは、東京大学総合科学博物館及び国立科学博物館筑波研究施設の同位体比分析装置を用いて分析を進めている。分析結果を、他地域の先行研究者報告データと比較したところ、酸素及び炭素同位体比でアメリカ本土出身者とのの分布域に違いが認められ、同位体比分析により戦没者遺骨鑑定において両者の分別が出来る可能性が示唆された。時代別の検討では一部元素同位体比で時代推移が認められ出身地域推定に関して時代別補正の必要性が示唆される結果となった。平成26年度も引き続き、地域別リファレンスの作成として地域別の試料収集、分析、統計学的検討を行った。試料収集状況としては、歯科臨床の場からの試料(抜去歯牙)の収集は、国内では既に600以上の検体が収集されている。国外についてはサウジアラビア60本、パプアニューギニア60本の2か国である。分析として先ず東京歯科大学解剖学講座所蔵の1878年生まれから1970年生まれまでの連続した日本人歯牙標本集(N=161)を用いて、エナメル質中の炭酸塩に含まれる炭素及び酸素の同位体比を計測した。気候の違いを反映する酸素同位体比では時代を通じて有意な変化は認められなかったが、食性変化を反映するといわれている炭素同位体比では1945年を境に有意に戦前生まれ日本人(N=97)に比して戦後生まれ日本人(N=64)が高いことが認められた。これは戦前戦後の日本人集団の食習慣の変化を反映するものと考えられた。このことから、日本出身者集団についての炭素同位体比による地域推定を行うには、戦前あるいは戦後生まれかについて考慮する必要があるといえる。実際、先の大戦の日米戦没者の分別への適応を想定して、日米両者の分別が可能かについてロジスティツク回帰分析による検証を行ったところ、1945年以前誕生の日本出身者(N=97)とアメリカ出身者(1960年以降生まれ, N=202)では正答率100%、1946年以降誕生の日本出身者(N=64)との判別では正答率76%が得られ、正答率に違いが見られた。結果としては、少なくとも海外戦域での日米没者の遺骨判別には高い成績が得られることがわかった。以上の内容は2014.11.01第68回日本人類学会で発表した。本研究では、世界各地における人体硬組織(ヒト抜去歯牙)に含まれる各種元素の同位体比を計測し、出身地域推定のための統計学的検討を行っている。試料の収集は、順調に進んでいる。国内試料に関しては既に全国各地域の自衛隊の病院、医務室歯科から抜去歯牙の収集を行う体制を確立している。国外試料においても、既に、フィリピン共和国、パプアニューギニア独立国、サウジアラビア王国において、それぞれ試料収集済みとなっている。上記試料の分析についても、東京大学総合研究博物館、総合地球環境学研究所、国立科学博物館の質量分析計を用いて計測を順次進めているところである。これら得られた分析結果をもとに、先の大戦の戦没者遺骨鑑定を想定し、現地住民、米国出身者及び日本出身者の3群間の鑑別について検討を行っている。エナメル質中の炭素、酸素の安定同位体比を引数としたロジスティック回帰分析の結果では、戦前生れ日本出身者と米国出身者の判別で100%の正答率が得られたのに対し、戦後生れ日本出身者との分別正答率は73.7%に止まった。この差は、戦前・戦後の日本人の食習慣の急激な変化により炭素同位体比の上昇が起ったことによるものと考えられる。

戦没者世代では日米の分別は高精度に行えるものの、国内の現代人遺骨の安定同位体比分析による出身地域推定を行う場合、その年代情報を勘案する必要性があることが示された。また、現地住民と日本人戦没者の分別に関しては、エナメル質中の炭素及び酸素同位体比での分別は難しいものの、亜鉛、カドミウム、ウラン等の元素濃度分析の値でパプアニューギニア、フィリピン、日本間でそれぞれ有意な差を認め、当該地域で収容される遺骨の分別を行う際の多変量解析の因子として有効となる可能性が示された。以上のように、研究は順調であり多くの知見がえられている。今後さらなる進展が期待できる状況である。ヒト硬組織中に含まれる炭素、酸素及びストロンチウムの各安定同位体比は、遺骨の身元確認の前段階におけるスクリーニング法として有効な情報を提供できる。本研究では、戦没者遺骨鑑定への適応を想定しパプアニューギニア人と日本人の歯牙エナメル質中の炭素、酸素及びストロンチウム同位体比を計測し、先行研究である米国人データを参照し、判別分析による統計学的検討をおこなった。これらの3群から米国人の分別は高精度に可能であった。パプアニューギニア人と日本人については一部地域では正確な分別が可能であった。安定同位体比分析は、ニューギニア戦線におけるこれら3群の遺骨を分別する方法として有効となる可能性が示された。同位体比分析による出身地域推定に用いる基礎試料としては概ね日本国内の試料収集は、おおむね順調に推移している。分析に関しては、予算的、時間的な制約でやや遅れがみられる。法人類学現時点では、歯牙エナメル質中の炭酸塩の炭素及び酸素元素の同位体比の計測をおこなっているのみである。27年度はこれに鉛、ストロンチユウムの重元素の分析と歯牙象牙質中のコラーゲン繊維に含まれる炭素、窒素の元素の分析を進める予定である。また、研究協力者の協力のもと出来るだけ多くの国内外の地域から数多く歯を集め、分析を進める。得られた成果は学会等での発表で広報するとともに、専門学術誌への論文投稿を図る。臨床研究倫理及び個人情報保護の社会的問題意識の高まりに伴い、研究計画の立案と審査に要するエフォートが増大していることが一因として考えられる。試料の分析行程の若干の遅れにより、当該年度執行予定分が次年度となったため。今後、比較対象となる海外における調査地域を増やすとともに、同分野の研究グループとの連携により出来るだけ調査空白地域を減らし、世界的規模での出身地域推定に関する検討を推進する。予算の許す範囲内で、出来るだけ多くの試料の分析を行うとともに、論文作成等の研究成果のとりまとめを進める。当初予定していた平成25年度内の海外共同研究者との研究会への出席が先方の都合により26年度内へ変更となったため。26年度7月を目途にフィリピンにおける試料収集に関する研究会(計画中)に参加予定である。
四肢の分化メカニズムに関する発生学的・分子細胞生物学的研究

我々はこれまでの研究で、哺乳類胎児の指間部に起こるいわゆる「プログラム細胞死」(PCD)がDNA断片化を伴うアポトーシスであり、部位特異的・時期特異的な細胞死が四肢の形態形成に重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。しかし、どの細胞が死滅するのか、また指の分離の際にどのような機序で細胞間基質が壊れるかは不明であった。我々は胎児指間部の毛細血管網の変化に着目し、指間部アポトーシスとの関連を調べたところ、死細胞がPECAM1/CD31陽性の血管内皮細胞と一致することを見出した。また、whole-mount in situ hybridization法とNorthern blot法により、血管のリモデリングが活発に起こっている部位にgelatinase/MMP-2が強く発現していた。指が分離しないHammertoeミュータントマウス胎児の指間部では、血管網のリモデリングもアポトーシスも起こっていなかった。この結果は、胎児指間部に起こるアポトーシスが血管内皮の細胞死であり、gelatinase/MMP-2が指の分離に重要な役割を果たすことを初めて明らかにしたものである。次に、指の軟骨が形成される際のパターン形成のメカニズムを明らかにするため、マウス四肢原基細胞のmicromass培養法を用いてin vitroでの軟骨形成を解析した。軟骨細胞によるパターンの周期性はin vitroでも再現され、そのパターン形成は「反応・拡散モデル」によく合っていた。さらに、TGFβ2が反応・拡散系の"activator"としての作用を有し、細胞選別にも関与していることが明らかになった。1)マウス胎児の四肢形成過程におけるプログラム細胞死をナイルブルーによる生体染色ならびにTUNEL法によるDNA断片化の検出法によって調べた。遺伝性の多指をもつミュータントマウスFdn(Folydactyly Nagoya)の胎児四肢原基におけるアポトーシスの発現様式とその経時的変化を調べ、野生型マウス胎児における所見と比較したところ、胎児四肢で起るプログラム細胞死は、指を分離させる役割のほかに、指の長さを規定し、軸前部および軸後部における過剰指(多指)の発現を抑制するという役割を担っていることが明らかになった。また、Pdnマウス胎児四肢原基におけるアポトーシスの発現様式がヒト胚子の多指初期像に類似していることから、Fdnマウスの多指がヒトの多指のモデルになりうることがわかった。2)マウス胎児四肢原基において、FGF受容体を指標として血管の変化と指の分離について検討した。その結果、指間部の細胞死の一部がその部分の血管の細胞死であることが確認されたことから、指の血管の形成にもプログラム細胞死が関与していることが明かになった。現在、更に詳しいメカニズムを解析している。3)マウス四肢原基における基底膜分解酵素メタロプロテアーゼ(MMP)の発現と局在を免疫組織化学的ならびに分子生物学的に調べたところ、胎児の指が分離する際にある種のMMPが時期特異的に発現していることが確認され、指が分離する際の指間部の基底膜の変化にMMPが関与していると考えられた。4)マウス胎児口蓋の培養系で、アポトーシスの発現に関与するCasoaseの阻害薬(YVAD-CHO,DEVD-CHOなど)を培地に添加してプログラム細胞死を阻害しても、口蓋の癒合ほ正常に起こった。このことから、口蓋の癒合にプログラム細胞死が必須ではないと考えられた。同様の実験を、四肢原基の器官培養系で継続中である。指の分離過程における細胞死と血管リモデリングの役割を解析するため、胎齢1115日(膣栓日=0日)のICR系とHammer-toe(Hm)ミュータントマウスの胎児四肢を免疫組織化学、ナイルブルー染色、およびTUNEL法によって調べた。ICRマウス胎児の四肢においては、12日から指間部で細胞死が起こり、また1214日にかけて指間部で微小血管の再構成が起こることが確認された。

In situ hybridizationによって、血管リモデリングの部位に一致してgelatinase A/MMP-2のmRNAが発現していることが確認された。これに対してHmマウス胎児の指間部では細胞死の量が有意に少なく、このことが指の分離とその際に起こる血管リモデリングを阻害して指奇形を生じさせると考えられた。この結果から、指が分離する際には細胞死が必須であること、また血管リモデリングとgelatinase A/MMP-2の発現が密接に関連していることが明かになった。指の分離メカニズムをin vitroで解析するため、72時間にわたってマウス胎児の四肢原基を培養し、in vivoに準ずる指の形成を観察し得る新しい器官培養法を確立した。また、細胞死をin vitroで抑制してその影響を解析するため、いくつかのcaspase inhibitorsを合成し、これらが細胞培養系およびマウス胎児口蓋の器官培養系で細胞死をほとんど抑制することを確認した。現在、四肢原基の器官培養系において細胞死抑制実験を行っている。哺乳類胎児の指が分離する際に指間予定域でプログラム細胞死が起こることから、指が分離するためにはプログラム細胞死が必須であると考えられている。本研究では、指間予定域におこる毛細血管網の変化と細胞死の消長との関連に着目し、C57BL/6Jマウスおよび先天性合指症のモデル動物であるHammertoe(Hm)マウスの胎児を用いて指間予定域の変化を経時的に観察して、マウス胎児の指の形成過程におけるプログラム細胞死と血管リモデリングならびにマトリックス分解酵素の発現を調べ、それら相互の関連について検討を加えた。C57BL/6Jマウス胎児では胎齢1115日に指間部に細胞死が出現し、そのパターンは一定の部位特異的、時期特異的な変化を示した。Hmマウス胎児では、指間部のプログラム細胞死が極端に少なく、そのために指の分離が障害されると考えられた。指の分離過程における指間予定域の毛細血管網の変化を調べると、C57BL/6Jマウスでは胎齢とともに毛細血管網が退縮していくのに対し、Hmマウス胎児では血管の退縮がほとんど起こっていなかった。なお、C57BL/6Jマウスでは死細胞と毛細血管内皮の消失の部位がよく一致しており、指の分離が完了する胎齢15日には血管の退縮も完了し、細胞死もほとんど観察されなかった。また、毛細血管のリモデリングが活発に起こっている部位でゼラチナーゼ/MMP-2が強く発現していた。この結果から、マウス胎児の指が分離する際には、指間予定域の毛細血管のリモデリングとマトリックス分解酵素群の働きが重要であり、それらの異常が遺伝性合指、多指の発症原因の一つになっていると推定された。
構音の聴覚帰還制御特性の解明と脳内機構の研究

本研究では、開ループで音声の聴覚帰還制御特性を測定する方法を開発し、数百ms以上の潜時の応答も正確に測定することが可能になった。早い応答の利得は基本周波数F0に依存して上昇したが、吃音者では上昇しない者が多かった。F0の聴覚帰還制御は3つの異なる潜時の応答の合成でほぼ説明でき、注意の影響が成分ごとに違っていた。第1ホルマントの周波数ステップへの応答は、追従方向と補償方向に分かれた。応答の最も早い潜時は数百msであるが、2秒以上後にも応答が認められ、開ループによる解析が必要であることが示された。単語発話時の脳機能計測では、fMRIだけでなく、NIRSによっても吃音者と非吃音者で差が認められた。発話は動的かつ正確な時間同期を要する運動によって実現され、発話中の誤りは帰還制御によって意識的・無意識的に修正される。自己音声の聴覚帰還制御はほぼ即時に働くものと、長時間かかって学習・適応するものがあるが、先行研究では数十分にわたる学習の結果としての制御特性を示したものが多い。この提案では、学習をほぼ含まないと思われる、自己音声の比較的速い聴覚帰還制御(数秒以内)の特性を定量的に明らかにし、これを脳機能計測と照合して、比較的速い聴覚帰還制御にかかわる神経基盤を解明し、従来の発話モデルを検証することを目的とする。具体的には、(A)聴覚帰還音声の修飾を行って構音の制御応答を測定する系を構築し、反応特性を調べる。(B)脳機能計測で前項の制御特性と相関する部位を抽出し、既存の発話モデルを検証・修正する。(C)同様の実験を吃音者にも実施し、構音の帰還制御が吃音の病態に関与する度合いを求める。刺激としては、あらかじめ録音した本人の母音持続発声に、ホルマントのステップ変調をかけた音を作成しておき、持続母音の発声中に聞かせた。これは従来の研究とは異なり、オープンループ特性の測定を行っている。(A)については、発話毎の変異が大きいため、周波数領域でフィルターをかけるなどの工夫を追加したところ、500 ms以下の潜時での応答が見えるようになったが、個人差も大きい。(B)については、単語発話で吃音者の脳活動部位が非吃音者と異なることが判明したので、持続母音と単語発声中の脳活動を記録した。(C)持続母音の基本周波数の聴覚帰還制御においては、発声音声の基本周波数に依存する部分があることが分かってきた(男女差として検出された)。吃音者と非吃音者では遅い応答(ただしピーク潜時は600 ms以下)に振幅の差があったが、基本周波数にも差があり、その影響を除く必要がある。発声の聴覚フィードバック(帰還)による制御の特性を求める方法として,閉ループで測定すると,最も早い潜時の応答以外は解析することが困難なため,ステップ刺激を開ループで聴覚に加え,音声の応答を求める方法を採用した。音声基本周波数F0の聴覚帰還応答について調べると,平均では刺激を補償するような応答が見られた。主成分分析を用いて解析すると,F0応答は変化の早い,中間,遅いの3成分に分かれ,音声への注意によって,主に遅い方の成分の利得が減弱ないて反転した(OkazakiらJASA, 2014, 136: 334-340)。データを詳細に見ると男女差があり,また,一部の吃音者では制御特性が異なっているようであった。男女差については,F0が高いことによる影響もあると考えられる。聴取する音声のホルマントに周波数変調を掛けて聴覚帰還応答の特性を測定する実験では,応答が出る割合が少ないという問題があったため,方法を見直した。シミュレーション波形を合成して分析したところ,一般的なホルマント分析方法であるLPC分析では,第2ホルマントF2を第1ホルマントF1と独立に分析することが困難で,検出したい周波数程度の変化が,F1を変化させただけでもF2に出てしまうことが判明した。F2の変調がF1の分析結果及ぼす影響は,F1からF2への影響ほどは大きくはなかった。そのため,F1の応答のみを測定することとした。その結果、F1のステップ刺激に対して、発声したF1が同じ方向に動く被験者と、逆方向に動く被験者がいることが分かった。fMRIで単語発話時の脳機能を測定してきたが,近赤外分光法NIRSによって同様の実験ができるようにした。これにより,単語を読む部分と発話する部分を分離して記録することができるようになる。吃音者では聴覚野の活動低下や,Broca野,運動前野が非吃音者と異なるという結果が得られた。

単語発話時の脳機能計測では、fMRIだけでなく、NIRSによっても吃音者と非吃音者で差が認められた。発話は動的かつ正確な時間同期を要する運動によって実現され、発話中の誤りは帰還制御によって意識的・無意識的に修正される。自己音声の聴覚帰還制御はほぼ即時に働くものと、長時間かかって適応するものがあるが、この提案では、構音に関する自己音声の速い聴覚帰還制御の特性を定量的に明らかにし、これを脳機能計測と照合して、構音の速い帰還制御にかかわる神経基盤を解明し、従来の発話モデルとの整合性を検証することを目的とする。このために、速い帰還制御特性を解析する手法を改良・開発する。さらに、音声の基本周波数の聴覚帰還制御が異常である発達性吃音者で、この構音制御特性が異常かどうかを検証し、吃音の病態の解明に役立てる。このため以下の3目標を定め、ほぼ年度毎に実施する。(A)聴覚帰還音声の修飾を行って構音の制御応答を測定する系を構築し、反応特性を調べる。(B)脳機能計測で前項の制御特性と相関する部位を抽出し、既存の発話モデルを検証・修正する。(C)同様の実験を吃音者にも実施し、構音の帰還制御が吃音の病態に関与する度合いを求める。平成23年度は聴覚帰還すべき音声の変調方法と刺激パラダイムの開発を行い、被験者の音声分析(持続母音)により、母音構音の特徴を決める第1・第2ホルマント周波数抽出→ホルマント周波数を修飾加工して音声を合成→発声時に合成音声の聴覚帰還、同時に発声を録音→音声分析(ホルマント周波数抽出)→音声の反応、すなわち、帰還制御の継時的特性を計算、という聴覚帰還制御の計測システムを構築した。これにより、持続母音の発声中にホルマントの変調を聴取することで、音声のホルマントが変化することを確認した。聴覚帰還音声の修飾を行って構音の制御応答を測定する系を構築してきたが、毎回の発話の変異が大きく、加算しても応答がよく見えないことが多かったため、方法に改良を加えた。これまで使ったモーフィングによる音声加工では、ホルマント周波数だけを変化させても加工音声は目標のホルマントに達しないことが判明したため、ホルマントの裾野の周波数についてもモーフィング対象として、目標通りのホルマント変調がかかるようになった。また、ホルマント変調が急峻なために応答が減少している可能性に鑑み、自然性を出すために立ち上がりに適切なローパス特性を付加した。また、応答音声から抽出したホルマントデータの加算回数を増やした。それによる発声回数の増加を相殺するために、刺激の持続時間を2種類に減らした。さらに抽出されたホルマントの時系列データに周波数領域でフィルターをかけて整形した。これらの処理を順次追加したため、やや計画より遅れている。ここまでの修正により、500 ms以内にホルマント周波数の応答ピークが見られるようになった。ただし、被験者によってはこの早い応答が見えない者もいた。聴覚帰還音声の修飾を行って構音の制御応答を測定する系を構築し、反応特性を若干名について調べた。音声の加工をこれまでは音声モーフィングソフトによって行って来たが、加工に時間がかかるために被験者を長時間待たせる必要があることと、自然発話の揺れが刺激音声に残存するために、応答の検出感度が低いないし応答の出現確率が低くなっている可能性を排除するため、自然性には劣るが音声の揺れを少なくした刺激を別の合成方法(ホルマントの分析・合成)を使いて作成し、結果を比較する。さらに多変量解析を利用したデータ処理を試みる。
慢性炎症-発癌系における上皮・間質細胞のクロストーク不全:疾患モデルによる解明

慢性臓器炎-癌連関の疾患モデルとして潰瘍性大腸炎-大腸癌系を選び、大腸粘膜のリモデリングに加えて大腸陰窩上皮細胞と間質細胞とのクロストーク不全が発癌に関与していることを、上皮下筋線維芽細胞の減少及び間質筋線維芽細胞のゲノム不安定性亢進から示した。慢性炎症-発癌系のモデルとして潰瘍性大腸炎(UC)-大腸癌を選び、大腸粘膜上皮・間質細胞間相互作用及びその不全状態を解析するために、1.UC患者(3名)及び健常者(3名)の直腸生検材料からmRNA及び蛋白質を抽出し、cDNA microarray及びプロテオーム解析の準備を行った。1)cDNAmicroarray解析では、UC, active / UC, remission /Normal間で遺伝子発現が有意に違いのあるものが多数得られ、これらから選択してその解析を行っている。2)プロテオーム解析では、生検材料から得られる少量の蛋白質での検索条件を二次元電気泳動法で検証し、その条件を決定した。生検材料を使用しての解析を始めている。2.UCにおける炎症に伴う大腸粘膜の組織、細胞及び分子レベルでのリモデリングを間質細胞の面から解析し、pericryptal myofibroblasts及びcrypt間のstromal cellsのheterogenous haplotypesに着目して検索を行った。その結果、UCの炎症期間に相関して、これら粘膜間質細胞のheterogeneityに有意な差が生じることが判明した(投稿中)。さらにこれらのheterogeneous stromal cellsがどのような蛋白質を産生して上皮細胞との相互作用を行っているか、1.の検索をとおして検証していく予定である。[研究の目的と計画の要旨]潰瘍性大腸炎(UC)を初めとして、各疾患グループの大腸生検材料から、mRNA発現,蛋白質発現をcDNA microarray及びプロテオームで網羅的に解析して、有意な増減の認められる遺伝子、蛋白質を探索するとともに、臨床病理学的に意義のあるものを同定する。1. H20年度に加えて、さらに症例を増加してゲノミクス、プロテオミクスの検索を行った。その結果、プロテオーム解析からは、活動性UCで有意に上昇していた蛋白質は12、有意に減少していた蛋白質を14種得た。さらにゲノミックス解析からは、活動性潰瘍性大腸炎(ActiveUC)で有意に上昇していたmRNAは9、減少して3mRNAを得た。後者は定量real timePCRにてmRNAの増減を確認した。2.プロテオーム解析では、1蛋白,ゲノミックス解析からは、olfactomedin4を選択して、病理検体を使用して、蛋白の発現を免疫組織染色で検索し、その発現の増減がUCの炎症の程度と関連するかをしちべた。前者は炎症に伴う酸化的ストレスに関連しており、これを発現する間質細胞がActive UCで増加していた。またolfactomedin4はアポトーシスを抑制する蛋白質であり、これを発現する上皮細胞がやはり、Active UCで増加していることが判明した。今後はこの2種の蛋白質発現の作用を病理検体、及び細胞株を使った実験で明らかにする予定である。慢性臓器炎一癌連関のモデルとして、潰瘍性大腸炎(UC)一大腸発癌系を選び、上皮と間質細胞のクロストーク不全に伴う、上皮細胞の癌化という視点で検索を行った。UC患者大腸粘膜の生検材料のプロテオーム、cDNA microarray解析により得られた、01factomedin-4(OLM4),Peroxiredoxin-1(PRDX-1)をマーカーとして、UC患者大腸粘膜の上皮細胞におけるこれらの蛋白質の発現を免疫組織化学的に観察した。その結果、OLM4はUCの炎症の強さに相関して大腸粘膜上皮細胞の発現が増強し、pNF-kB,GRIM-19の発現とも相関していた。さらに、OLM4はNF-kBによって活性化されて、GRIM-19のアポトーシス効果を抑制しており、これが腫瘍化の1因子になっていることが明らかになった。さらに、GRIM-19はレチノール酸(Vit A)とInterferon一βにより活性化することから、大腸粘膜のVit A貯蔵subepithelialmyofibroblasts(肝臓の星細胞と同等の細胞と同定した)が上皮細胞をコントロールしている可能性が指摘される。一方、PRDX-1は炎症に伴う酸化的ストレスに対応する蛋白質であり、やはり炎症の程度に連関して、UC大腸粘膜上皮細胞における発現の増強がみとめられた。すなわち持続する炎症による酸化的ストレスが加わることにより、上皮細胞のDNA傷害が生じて、p53 check point機構に負荷がかかり、さらにはp53の変異が生じてDNA修復、アポトーシス誘導機序が破綻して、腫瘍にむかう経路が示された。
地震動情報と光学センサ画像情報の統合処理による建物被害推定モデルの構築

本研究では,地震前後に撮影された高分解能光学センサ画像に対して,非線形写像法による幾何補正,ヒストグラム平坦化による画素値補正,テクスチャ解析を応用した変化検出により,倒壊建物を判別する指標を開発した.さらに,2016年熊本地震の航空写真データ,建物被害データおよび震度データから,画像テクスチャ指標と震度情報の統合処理により,倒壊建物の発生確率を推定するモデルを構築した.本研究では,リモートセンシング画像による建物被害抽出手法と地震動予測手法の統合処理による高精度な建物被害推定方法の構築を目指している.当該年度は,非線形なひずみや位置ずれを有する画像ペアに対して,精度よく画像の重ね合わせを実現するための画像処理手法として,非線形写像法の処理アルゴリズムの構築を行った.非線形写像法は,2枚の画像を小領域に分割し,小領域ごとに画像の相関を基に探索を行うものである.特に本研究で採用した方法は,小領域の大きさを多段的に変化させることで,大局的・局所的な位置ずれを補正するものであり,求められた移動量に対して選択的な協調処理を施すことで,高精度な補正を実現する方法となっている.構築した処理アルゴリズムを撮影時期の異なる都市域画像に適用した結果,建物に変化のない地域はもちろん建物の変化が著しい地域に対しても,精度よく位置ずれを補正できることを確認した.さらに,地震による被害が甚大であった,2010年ハイチ地震での被災地(首都ポルトープランスの市街地)を撮影した高分解能衛星画像に対して本手法を適用した結果,地震前後の画像の位置ずれを簡便かつ短時間に補正できることを確認した.さらに,補正後の画像を利用して,画像の相関値と個々の建物の被害レベルの関係について検討した結果,被害が軽微な建物を画像から自動的に判別することは困難であったものの,倒壊した建物については比較的精度よく検出できることを示し,その精度を定量的に評価した.本研究では,リモートセンシング画像による建物被害抽出手法と地震動予測手法の統合処理による高精度な建物被害推定方法の構築を目指している.当該年度は,昨年度に有効性を検証した非線形写像法を二時期に撮影された数値地形データの幾何補正に応用することを試みた.具体的には,2014年8月に発生した広島豪雨災害地域において,災害前後に計測された高分解能数値地形データに非線形写像法を適用し,標高差分を求めることで土石流による土砂崩壊量を定量的に把握した.このことにより,本研究で検討した手法が,リモートセンシング画像のみならず数値地形データに対しても有効であることが示された.さらに,災害前後の画像を非線形写像法による幾何補正を施した上で,テクスチャ解析によってより高精度に建物被害を検出する手法を検討した.1995年兵庫県南部地震の前後に撮影された航空写真データを用いて検討したところ,テクスチャ解析により建物被害を精度良く判別できることを示し,その精度を定量的に評価した.当該年度は非線形写像法と画像テクスチャ解析の適用を目標としており,当初の予定通りこれらの目標が達成できた.また,本研究により検討した解析手法が,2014年に発生した広島豪雨災害での数値地形データにも適用可能なことが示され,当初の研究対象であったリモートセンシング画像以外にも適用できることが確認されたことから,当初の計画以上に進展しているものと判断した.本研究では,地震被災地における高分解能光学センサ画像に対して非線形写像法を適用し,撮影条件の異なる画像間にも適用可能な建物被害の自動検出手法を開発するとともに,地震動強さ情報との統合処理により,建物被害率を推定するモデルの構築を目指して研究を実施した.非線形写像法において,災害前後の画像の相関が最小となる移動ベクトルを探索し,それらを協調処理することで,精度の高い幾何補正を試みた.この非線形写像法は地震災害前後の画像データだけでなく,数値標高モデル(DEM)の幾何補正にも利用可能であり,2014年広島土砂災害での異なる分解能をもつDEMの幾何補正にも有効であることを示した.また,画像データ処理として,災害前後の画像に対してヒストグラム平坦化を施すことにより,日照条件などの違いによる画像間の明るさの違いを補正することを試みた.さらに,画像のテクスチャ指標として,同時生起行列に基づく異質度を利用して,倒壊建物を判別する手法を開発した.この手法では災害前後の異質度を正規化した指標および災害後の異質度の値を用いて,両指標が高い値を示す建物を倒壊建物として判別するものである.1995年兵庫県南部地震や2016年熊本地震での建物被害データを基に,倒壊建物を判別するモデルを構築した.さらに,震度の異なる地域での災害前後画像の異質度の特徴を整理することで,震度の大きさによって異質度の判別式を変化させるモデルを構築した.これらのモデルを熊本地震での被災地に適用した結果,実際の倒壊建物の7580%を正しく判別できることを示した.本研究では,地震前後に撮影された高分解能光学センサ画像に対して,非線形写像法による幾何補正,ヒストグラム平坦化による画素値補正,テクスチャ解析を応用した変化検出により,倒壊建物を判別する指標を開発した.さらに,2016年熊本地震の航空写真データ,建物被害データおよび震度データから,画像テクスチャ指標と震度情報の統合処理により,倒壊建物の発生確率を推定するモデルを構築した.

当該年度は非線形写像法の処理アルゴリズムの構築と都市域画像ペアへの適用を目標としており,当初予定の通りこれらの目標が達成できた.今後は,リモートセンシング画像からの被害抽出結果に加えて,地震動予測結果との統合処理方法について検討し,高精度な建物被害検出手法の確立を目指す.地震工学,防災リモートセンシング今後は,リモートセンシング画像からの被害抽出に関しては,建物被害と相関の高い画像特徴量を検討するとともに,画像解析結果と地震動予測結果の統合処理による高精度な建物被害検出手法を検討する.
民俗芸能の伝承を実践する場としての小中学校の役割についての調査研究

本研究では、宮城県石巻市桃生町寺崎地区に伝わる寺崎のはねこ踊、仙台市秋保町に伝わる秋保の田植踊を主たる対象として、民俗芸能の伝習活動に於ける小中学校の関わりのあり方について実証的な調査研究を行った。この結果、芸能を伝える集落などよりも広い範囲に学区を持つ学校での伝習活動は、民俗芸能の「民俗」としての側面において大きな変容をもたらし、集落の芸能といった側面が弱められることが確認された。逆に、元来集落よりもより大きい範囲で伝承されてきた芸能などは学校での伝習活動を通して伝承が活性化するといった面も見てとることができた。問題が生じているとみられる事例を観察すると、大きく二つのパターンに分類された。一つは、伝承する集落の枠を外すことにすることで、集落の民俗世界から離れて芸能として活性化する場合で、もう一つは伝習する芸能と集落で伝えられる芸能に差異化を持たせる場合である。後者は民俗芸能の芸能性と民俗性を分けることで成立するものである。こうした動きは寺崎のはねこ踊で観察され、一見すると集落と切り離された民俗芸能が隆盛しているように見える。しかしながら、実際の展開過程や地域社会での位置づけを見ると、芸能を隆盛させることによって、その本家本元としての寺崎集落という意識を高める結果となっている面を見いだすことができた。芸能は本質的にその舞手の属性が問われないものである。一方民俗芸能は地域社会などの民俗性が与えられることにより価値付けされるものである。それゆえに、寺崎のはねこ踊の伝習活動の展開と、地域の中でのはねこ踊の価値付けの変化は、民俗性を持たせながら芸能を伝えていくという面で大きな方向性を投げかけているといえる。
超伝導トンネル接合-超伝導コイル一体構造型X線検出器の開発

本研究は、半導体X線検出器の約10倍のエネルギー分解能を有する超伝導トンネル接合(STJ)アレイX線検出器の有感面積を大幅に拡大させるため、X線検出部(STJ部)とSTJの動作に必要な磁場を発生させるコイル部を同一基板上に配置した構造を開発することである。昨年度整備した有限要素法による3次元磁場シミュレーションを行うための計算システムを用いて、ヘルムホルツコイル中に金属体がある場合の磁場シミュレーションを行った。STJアレイX線検出器の素子設計としては、昨年度は、1つのSTJに1つのヘルムホルツコイルを配置した構造を設計したが、今年度は、このような構造を縦横5個ずつに配置した25素子アレイ構造を設計した。設計した構造のフォトマスクを作製し、素子の作製を行った。作製した素子を用いたX線検出器が、既に開発済みの超伝導SEM-EDX分析装置への適応が可能なことを実証した。その際、従来の目的である有感面積の拡大に加え、本検出器が、従来の半導体X線検出器と同様のICF70相当のポートへの導入も可能となることが判明し、本構造の優位性が高まった。来年度は、今年度までの結果をもとに、100素子アレイのSTJ素子に対して、最適なコイルを配置した構造を設計、作製する。その後、X線に対する応答特性を評価し、従来型構造との比較を実施する。更に、開発済みのSEM-EDX分析装置に搭載し、今後の応用での問題点などを明らかにする。有限要素法のシミュレーション結果をもとにした設計、素子作製、作製した素子の特性評価を実施できる環境を構築し、それらを相互的に研究を進めており、当初計画した研究の進め方が実施出来ている。また、成果発信としても2年目までに4件の国際会議での発表(内1件が招待講演)を行っており、おおむね順調に進展していると思われる。これまでと同様に、設計-作製-評価のサイクルで研究を進め、最終年度である来年度は実際の分析装置で使える100素子のアレイ構造を開発する。また、成果も国際会議および論文にて積極的に公開していく。本研究は、半導体X線検出器の約10倍のエネルギー分解能を有する超伝導トンネル接合(STJ)アレイX線検出器の有感面積を大幅に拡大させるため、X線検出部(STJ部)と動作に必要な磁場を発生させるコイル部を同一基板上に配置した構造を開発することである。有限要素法による3次元磁場シミュレーションを行うため、計算機と計算ソフトの調達を行った。計算機は、CPUが3.1GHz/10コアのデュアル、メモリが8GB×8枚のトータル64GBのシステムとした。計算ソフトは、連立方程式を有限要素法で解くことが可能なFlexPDEとした。これらを用いて、ヘルムホルツコイルの磁場シミュレーションを行い、ヘルムホルツコイル内部での磁場分布を計算することに成功した。実際の素子設計としては、1つのSTJに1つのヘルムホルツコイルを配置した構造を設計した。STJの形状は、ひし形形状とガウシアン形状の2種類とした。コイル形状は、ヘルムホルツコイルとSTJの距離を変えた4種類の形状を設計した。10mm角のデバイス上に、STJの形状2種類、コイルの形状4種類、計8種類の構造を、10個ずつ配置した。この構造のフォトマスクを作製し、素子の作製を行った。作製した素子の室温での電流電圧特性評価を行い、オープン、ショートなどの問題がないことを確認した。平成30年度に低温特性評価、X線照射実験を行う予定である。また、シミュレーションと実際の結果がどの程度正しいかを評価し、その結果をシミュレーションにフィードバックし、再度設計を行う。本研究で重要な有限要素法のシミュレーション装置を構築し、計算を開始した。更に、STJとコイルを同一基板上に配置した構造の試作を開始し、1設計目のデバイスを作製するところまで進んでいる。低温特性評価も、5月末ごろに実施可能であり、おおむね順調に進展している思われる。

有限要素法のシミュレーション結果をもとにした設計、素子作製、作製した素子の特性評価を実施できる環境を構築し、それらを相互的に研究を進めており、当初計画した研究の進め方が実施出来ている。また、成果発信としても2年目までに4件の国際会議での発表(内1件が招待講演)を行っており、おおむね順調に進展していると思われる。当初の計画通り、低温での評価結果を設計にフィードバックし、設計-作製-評価を年間2サイクル程度行い、最適構造の開発を進めていく。また、成果を国際会議および論文にて積極的に公開していく。これまでと同様に、設計-作製-評価のサイクルで研究を進め、最終年度である来年度は実際の分析装置で使える100素子のアレイ構造を開発する。また、成果も国際会議および論文にて積極的に公開していく。研究費を効率的に使用したために残額が発生した。研究計画遂行のための消耗品費として使用する。
陽極接合の原理を応用した導体/ガラスの新接合法の開発

はんだとのぬれ性が乏しいガラスの,メタライジングや特殊なはんだを用いないはんだづけの手法を開発するため,陽極接合の原理をはんだづけに応用すること(陽極はんだづけ)を試みた.ガラスと金属をはんだづけする際に,はんだを溶融させてから金属側の接合試片を通じてはんだとガラスの間に直流高電圧を加え,電圧印加時間による得られる継手の強度の変化を観察した.純スズをはんだに用いた継手では電圧の印加によって継手強度は上昇し,はんだづけ中の電圧印加がはんだとガラスの密着を改善したと考えられた.電圧印加時間が過長になると,得られる継手の強度は逆に低下した.破断後のはんだ/ガラス界面には白い反応生成物が付着しており,長時間の電圧印加で界面にスズ酸化物が過剰に生成して継手強度を低下させたと考えられた.はんだの合金元素が接合に与える影響を観察するため,実用合金のSn-3.5%AgとSn-3%Sbを用いて同様の実験を行うと,Sn-3%Sbはんだでは純スズ同様に電圧印加による継手強度の上昇が観察されたが,ガラス中で高い移動度を持つため,陽極接合に用いると電圧印加中にガラスに侵入して接合の進行に悪影響を与えるとされるAgを含むSn-3.5%Agはんだでは,継手強度は低いままであった.自然酸化によってスズの表面を覆っており,スズやその合金の接合に悪影響を及ぼすというスズの酸化物の,陽極はんだづけへの影響を低減させるため,スズ酸化物の結合力を弱めるハロゲン化処理をはんだ表面に加えて効果を観察した.HC1蒸気への曝露によって,はんだのガラスへのぬれは著しく向上した.陽極はんだづけにHC1蒸気で処理したはんだを用いると,接合界面へのはんだのぬれ広がりが著しく改善し,継手強度も上昇した.はんだとのぬれ性が乏しいガラスの,メタライジングや特殊なはんだを用いないはんだづけの手法を開発するため,陽極接合の原理をはんだづけに応用すること(陽極はんだづけ)を試みた.ガラスと金属をはんだづけする際に,はんだを溶融させてから金属側の接合試片を通じてはんだとガラスの間に直流高電圧を加え,電圧印加時間による得られる継手の強度の変化を観察した.純スズをはんだに用いた継手では電圧の印加によって継手強度は上昇し,はんだづけ中の電圧印加がはんだとガラスの密着を改善したと考えられた.電圧印加時間が過長になると,得られる継手の強度は逆に低下した.破断後のはんだ/ガラス界面には白い反応生成物が付着しており,長時間の電圧印加で界面にスズ酸化物が過剰に生成して継手強度を低下させたと考えられた.はんだの合金元素が接合に与える影響を観察するため,実用合金のSn-3.5%AgとSn-3%Sbを用いて同様の実験を行うと,Sn-3%Sbはんだでは純スズ同様に電圧印加による継手強度の上昇が観察されたが,ガラス中で高い移動度を持つため,陽極接合に用いると電圧印加中にガラスに侵入して接合の進行に悪影響を与えるとされるAgを含むSn-3.5%Agはんだでは,継手強度は低いままであった.自然酸化によってスズの表面を覆っており,スズやその合金の接合に悪影響を及ぼすというスズの酸化物の,陽極はんだづけへの影響を低減させるため,スズ酸化物の結合力を弱めるハロゲン化処理をはんだ表面に加えて効果を観察した.HC1蒸気への曝露によって,はんだのガラスへのぬれは著しく向上した.陽極はんだづけにHC1蒸気で処理したはんだを用いると,接合界面へのはんだのぬれ広がりが著しく改善し,継手強度も上昇した.ガラスのろうづけ(はんだづけ)中のろう材/ガラス間への電圧印加の効果を調べるため,Kovar合金と,ホウケイ酸ガラスCorning7056のあいだに亜鉛箔・スズ箔をはさみ,アルゴンガス雰囲気中ではさんだ金属箔の融点以上に加熱してからKovar合金側を陽極として電圧を加えて,加熱温度と電圧の印加時間による接合状態の変化を観察した.結果,亜鉛箔を用いた場合,温度・電圧印加時間にかかわらず継手は得られなかった.スズ箔を用いた場合,接合温度673Kでは電圧を印加しない場合スズ/ガラス界面は室温に冷却後炉から取り出した時点で剥離していたが,電圧を印加することで界面が密着した継手が得られた.接合温度623Kでは電圧を印加しないでも界面が密着した継手が得られたが,継手界面の剪断強さを測ると電圧を印加した継手がより高強度であった.いずれの温度でも,過長な電圧印加時間ではかえってスズ/ガラス界面の剥離,せん断強さの低下が生じた.

この原因としては,電圧印加に伴うスズ/ガラス界面におけるスズ酸化物の成長が考えられた.電圧を印加しながらのガラスのはんだづけにはんだの合金元素が与える影響を明らかにするため,Kovar合金とホウケイ酸ガラスMatsunami#700を純スズ・Sn-3.5mass%Ag合金(Sn-3.5Ag),Sn-3mass%Sb合金(Sn-3Sb)合金の3種のはんだを用いてはんだづけした.接合温度は623Kとして,接合中に500Vの電圧を幾通りかに時間を変えて印加した.純スズとSn-3Sbを用いた継手では,はんだ/ガラス界面全面が密着した継手が得られたが,Sn-3.5Agを用いた継手では電圧印加時間によらず健全な継手が得られなかった.これはSn-3.5Ag中の銀が電圧印加中にガラス中に侵入し,はんだとガラスの界面で両者の密着を促進する電気二重層の形成を妨げるためと考えられた.昨年度の研究によって,鉛フリーはんだの成分として一般的な銀,銅の,電圧印加によるガラスへの侵入が,陽極はんだづけで得られるガラス/金属継手の性能に影響を与えることが明らかになった.そこで,陽極接合の手法を応用して,これらの元素のガラス中での移動度の測定を行った.結果,銀の移動度は銅の移動度と比べ大幅に大きいこと,いずれの移動度も温度上昇と共に増加するが,銅の移動度の温度変化の割合は銀のそれと比べて大きいことが明らかになった.同じく昨年度の研究によって,接合前からはんだ表面に存在する,また接合中に接合界面に形成されるスズ酸化物が得られる継手の性能に大きく影響していることが示唆された.スズの酸化物は強固な被膜を形成するが,それと比べてスズのハロゲン化物は融点が低く被膜の形成能が低い.そこで,接合前にはんだ表面をハロゲン化水素にさらして,表面酸化物をハロゲン化して被膜を破壊することによる陽極はんだづけへの影響を調査した.純スズのはんだを接合前に常温で180s塩化水素にさらすと,ガラス/金属界面でのはんだの濡れ広がりは著しく改善された.加熱のみで電圧を加えなかった継手のせん断強度は極めて低かったが,高温下ではんだ/ガラス間に電圧を加えると得られた継手の強度は大幅に向上した.しかし,いずれの継手でも破断ははんだ/ガラス界面で進行した.はんだを塩化水素で処理し,接合中に電圧を加えた継手のせん断試験後のガラス側破面上には,白い反応生成物が付着しているのが観察された.これは,塩化水素処理で密着が促進されたはんだ/ガラス界面に,電圧印加によって新たに形成されたスズ酸化物がガラス表面に残存したものと考えられる.
磁性超薄膜の表面・界面ナノ構造の制御と表面磁性

本研究では我々が開発中の新しいエピタクシーの技術を磁性超薄膜に適用し、モフォロジーが精緻に規定された1・2原子層の極薄膜を固体表面上に製作し、その磁気的電気的性質を研究する。薄膜生成における新しいモニター手法としては我々が新たに開発中のELS-LEED装置(エネルギー分析型低速電子回析装置)を用い、測定手段としては表面磁気光学Kerr効果(SMOKE)測定装置および走査トンネル電位差計(STP)を用いる。これらの手法を用いて以下のような研究を計画した。(1)まず、平坦な非磁性物質単結晶上に均一な金属単原子層をエピタクシャル成長させ、下地との結合状態や表面配列など原子レベルの構造・伝子状態に由来する磁気モーメントや磁気構造を調べる。また、表面特有の原子配列構造(2次元合金など)や電子状態に起因する特異な磁気特性の発現の可能性を探る。(2)続いて、ステップ密度・高さファセットなどがよく規定された下地表面を用意し、その上に1、2原子層の極薄膜を成長させ、そのナノスケールでの形態が表面磁気特性に及ぼす影響をさぐる。例えば例えば薄膜中のステップ密度・高さ、ドメインやアイランドなどのサイズ平均距離などをいろいろと変化させ足り、アイランド同士のパーコレイション相転移前後の等における磁気的特性の振る舞いを調べる。本年度は表面磁気光学Kerr効果(SMOKE)測定装置の一部を購入した。また、可能性のある測定対象のRHEED観察、STM観察を行なうなどの、予備実験を行なった。
多角的解析法により明らかにするTBCタンパク質を介した細胞性免疫制御機構

本年度はYeast two hybridスクリーニングにより得られたTBC1D10Bの結合蛋白質候補について、培養細胞を用いた免疫沈降実験による結合偽陽性クローンの排除と真の結合蛋白の同定を行った。その結果、低分子量GTPaseであるARF類似蛋白質をTBC1D10Bの新規結合蛋白質として同定した。この蛋白質は哺乳類では3種類のアイソフォーム(A, C, D)が知られていることから、これらのマウスcDNAをクローニングし、RAW264細胞を用いてTBC1D10Bとの細胞内局在をコンフォーカル顕微鏡により比較検討した。その結果、アイソフォームCがTBC1D10Bと最もよく共局在を示し、次いでアイソフォームA, Dの順でTBC蛋白と細胞内局在が一致することが明らかとなった。次に、アイソフォームCに対する特異的な抗体を用いて、RAW264細胞を含めた様々な培養細胞株における蛋白質の発現量を比較したところ、アイソフォームCは上皮系細胞において高いレベルの発現が認められる一方で、マクロファージ系細胞において、極めて発現量が低いことが判明した。このことから、アイソフォームCはマクロファージにおいて、重要な役割を担っている可能性が低いものと考えた。現在、アイソフォームAについてRAW264細胞における機能解析を進めている。アイソフォームA, Dについては、ファゴサイトーシス経路における関与が全く報告されていないことから、貪食への関与が明らかになれば極めて新規性の高い研究であるといえる。Yeast two hybridスクリーニングにより得られたTBC1D10Bの結合蛋白質候補について、結合偽陽性クローンの排除に多くの時間を要したことから、著しい研究計画の遅れを生じた。低分子量GTPaseアイソフォームCについて、GTP結合型やGDP結合型の変異体発現ベクターを構築し、RAW264細胞に過剰発現させ、Fcγレセプター介在性ファゴサイトーシス過程における貪食への影響について検討を行う予定である。また、抗体を用いた内在性蛋白質の検出やRNAiによる機能阻害実験なども実施する。ファゴゾーム形成時におけるTBC1D10B蛋白内の形質膜局在化領域や貪食抑制に重要なドメインは不明である。そこで、全長798aaのTBC1D10Bの様々な欠失変異体発現ベクターを構築した。具体的には、TBC1D10AやTBC1D10Cとアミノ酸配列の相同性がないTBC1D10Bにユニークな領域(1-227aa)、TBCドメインを含んだ領域(228-631aa)、TBC1D10BのC末端領域(632-798aa)、さらにこれらの領域の組み合わせからなる1-631aa、228-798aaのGFP融合欠失変異体(野生型、並びにRab GTPaseに対するGAP活性変異体)を作成し、これらの細胞内局在をコンフォーカル観察した。その結果、TBCドメインを含んだ228-631aaの領域が形質膜への局在に重要であることが明らかとなった。また、このGFP融合欠失変異体は形質膜に加えて核への局在化を示したが、TBC1D10Bの1-227aaの領域付与により、核への移行が消失し、形質膜と細胞質へ局在を変化させることがわかった(1-227aaの領域は核外移行シグナルを有するものと考えられる)。次に、これらの変異体をマクロファージに過剰発現させ、貪食活性の定量化を行ったところ、TBC1D10B蛋白の228-631aaの領域が低分子量GTPaseに対するGAP活性非依存的に貪食抑制を示すことがわかった。以上の結果は、TBC1D10BのTBCドメイン領域近傍がファゴサイティックメンブレンへの局在化と貪食抑制に重要であることを示唆するものである。昨年度の解析からTBC1D10Bの228-631aaの領域がファゴサイティックメンブレンへの局在化と低分子量GTPaseに対するGAP活性非依存的な貪食抑制に重要であることがわかっている。H29年度はこの領域を用いてTBC1D10B結合タンパク質のYeast two hybridスクリーニングを行った。均一化処理されたマウスcDNAライブラリーを対象に探索を行ったところ、約80のTBC1D10B結合タンパク質候補を得た。現在、これらのタンパク質についてTBC1D10Bとの免疫沈降実験や貪食過程における各クローンの細胞内局在を検討している。<低分子量GTPaseの機能解析>本年度はYeast two hybridスクリーニングと並行して、機能解析が十分に行われていない低分子量Gタンパク質の幾つかをクローニングし、各因子の貪食過程における局在動態をライブセル観察した。その中でもRho family memberに属するRhoCはFcγR介在性ファゴサイトーシス過程において、一過性にファゴサイティックカップに集積することが明らかとなった。このファゴサイティックカップへの集積はRhoCと相同性が高いRhoAでは認められず、RhoCに特異的であったことから、当因子の機能解析を進めたところ、内在性RhoCは貪食ターゲットの取り込みに重要であり、アクチン繊維形成タンパク質mDia1を介してファゴゾーム形成を調節していることが明らかとなった。以上の成果は2017年のJournal of Cell Science誌に掲載された。更に、Ras family memberに属するM-Rasの貪食過程における局在・機能解析も行った(2018年のMicroscopy誌に掲載)。本年度はYeast two hybridスクリーニングにより得られたTBC1D10Bの結合蛋白質候補について、培養細胞を用いた免疫沈降実験による結合