hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
施設高齢者の排尿コントロール感を高めるための排尿援助に関する研究

施設入所高齢者の排尿援助の実態や排尿援助場面での援助者のかかわりを明らかにするために調査を行った。援助者は排尿援助時に高齢者の尿意を確認していたが、高齢者の尿意が排尿誘導に反映されているとはいえなかった。高齢者は尿意の有無に関する反応や誘導への(「同意」・「不同意」)を示すこともあったが、「排尿に関する反応が不明瞭」の反応が約50%と最も多かった。援助者は高齢者の尿意の有無の反応にかかわらず決められた時間に排尿誘導を実施しており、対象者の失禁率は約70%と実施されている排尿援助によって失禁率は改善されていなかった。研究目的(1)施設高齢者の尿意の表出に関連する要因を調査し、尿意の表出が困難となる高齢者の特性を明らかにすること、(2)施設での排尿援助において、尿意の表出を促進する援助者との相互作用の特徴を明らかにするために、平成22年度は、研究計画の見直しや研究フィールドの選定を行った。研究フィールドの選定のために、申請者が世話人を務める、えひめ排泄ケア研究会の定期的に開催されている定例の勉強会や今年度からの取り組みである地区別の事例検討会に参加し、まずは、参加している施設(介護老人福祉施設、介護老人保健施設、病院など)の排泄ケアの現状を把握したり、施設での高齢者ケアの文化や風土などの特徴を理解したりすることでフィールドに入るための環境調整を行った。また、研究を開始する前段階として、様々な事例の中から、尿意の表出が困難になる高齢者の特徴を明らかにするための調査項目の検討を行った。事例検討会に参加した施設のスタッフが排泄に関して問題に感じている事例は、14事例中8例と頻尿が多く、尿意がないことを問題にしている事例は2事例と少なかった。高齢者自身が尿意を訴えられない高齢者に対しては問題として捉えられていない現状があることが推察された。事例を検討した結果、尿意を確認しない援助者の認識を知る必要性、さらには、尿意を問われると答えることができる高齢者の能力は行動観察だけでは明らかにすることは容易ではないことが予測された。そのため、来年度の研究では、高齢者自身の排泄ケアに対する思い、援助者の高齢者に対する排泄ケアの思いや判断の根拠など、高齢者・援助者双方の思いを聴取することと尿意を問いかけた場合の高齢者の変化もデータとして収集することとした。事例報告の内容から来年度の研究のための重要な示唆を得ることができた。平成23年度は尿意の表出を促進するための施設高齢者と援助者の相互作用の特徴を明らかにし、高齢者の排尿コントロール感を高める排尿援助方法を考案するための示唆を得ることを目的とし調査した。方法:本研究の参加に同意が得られた、介護老人福祉施設入所中の排尿誘導が実施されている認知症高齢者および同施設の職員で対象者の排尿援助にかかわる介護職を対象とした。排尿誘導時の高齢者の反応、排尿誘導の実施状況、高齢者の排尿状態(1回排尿量および失禁量、排尿時刻)、排尿誘導時の援助者の判断、高齢者・援助者の特性について調査した。調査結果から、排尿誘導場面での高齢者の反応の特性について類似性を考慮し分類した。また、対象者ごとに高齢者の反応の特性、誘導の実施状況、排尿状態を集計し分析した。結果:対象となった高齢者は8名、平均年齢は88.8歳、NMスケールは平均8.3点であった。援助者は17名で、介護福祉士の有資格者は8名であった。対象者8名に実施されていた誘導方法は、観察された60場面のうち、随時誘導が7場面(11.7%)、定時誘導が53場面(88.3%)で、援助者の判断は、決められた時間だから誘導するなど、18場面(30.0%)で援助者の時間に捉われた認識が影響していた。排尿誘導時の高齢者の反応の特性は、1)「同意する」、2)「不同意」、3)「排尿に関する反応が不明瞭」の3パターンに分類され、「排尿に関する反応が不明瞭」(53.3%)が最も多く、尿意の有無を訴えることもあったが反応に関わらず定時誘導が実施されていた。対象者の失禁率は70.6±18.9%、トイレで排尿できた割合は38.5±26.1%であった。考察:認知症高齢者の排尿誘導は、尿意の確認が困難で反応に関わらず定時誘導が実施されていたことからも、高齢者の排尿のコントロール感を高めるためには、尿意を尊重した排尿誘導方法を検討していくことが必要である。
ゲノム情報と発現プロファイルを用いた転座関連遺伝子による腫瘍化の分子機構の解析

MLLの相手遺伝子としてt(X;11)からSEPT遺伝子を、t(10;11)からLCX遺伝子を、t(2;11)からLAF4遺伝子を単離し、MLL-SEPT6キメラ融合遺伝子につきマウスを用いて解析を行った。またNUP98遺伝子の相手としてt(11;12)よりHDXC11遺伝子を、t(2;11)よりHOXD11遺伝子を、t(7;11)よりHOXA13遺伝子を単離した。さらに転座型急性リンパ性白血病(ALL)の新鮮検体を用いて、転座の相手による発現の相違をDNA Chipを用いて検索し、t(4;11)15検体、t(11,19)6検体、t(5;11)2検体および対照としてt(12;21)6検体、t(1;19)3検体からRNAを抽出し、Affymetrix社のDNA Chip (12,600個)により発現プロファイルの解析を行い、t(4;11)とt(11;19)の両方に共通して発現がみられる遺伝子がFLT3,HOXA9,HOXA10等50種にみられた。MLL再構成のある21検体中予後による発現パターンの相違がみられ、CBF2遺伝子が予後良好群で、CDP遺伝子が予後不良群で高発現を示した。また21例で共通して発現が高かったFLT3遺伝子の変異を調べたところ、乳児ALL 44例中8例で変異がみられ、小児ALL 112例では、高2倍体ALL 19例中4例に変異がみられたが、TEL-AML1、E2A-PBX1、BCR-ABLでは変異はみられなかった。DNA Chipで抽出された遺伝子の発現を定量reverse transcriptase (RT)-PCRで検索したところ、ほぼアレイの発現と一致していた。MLL再構成例の共通の標的遺伝子および転座相手の相違によるMLLのキメラ遺伝子の下流の標的遺伝子の相違を探索するため、これらの遺伝子を詳細に検討し、共通する下流遺伝子をしぼる作業を進めている。転座型急性リンパ性白血病(ALL)の新鮮検体を用いて、転座の相手による発現の相違をDNA Chipを用いて検索し、下流の標的遺伝子を探索した。t(4;11)15検体、t(11,19)6検体、t(5;11)2検体および対照としてt(12;21)6検体、t(1;19)3検体からRNAを抽出し、Affymetrix社のDNA Chip(12,000個)により発現プロファイルの解析を行った。t(4;11)のみ発現している遺伝子が10種、t(11;19)のみに発現している遺伝子が12種みられ、両方に共通して発現がみられる遺伝子がFLT3,HOXA9,HOXA10等15種にみられた。興味あることにMLL再構成のある21検体中予後による発現パターンの相違がみられ(P=0.01)、転写因子のRUNX2が予後良好群で、CDP遺伝子が予後不良群で高発現を示した。また21例で共通して発現が高かったFLT3遺伝子の変異を調べたところ、4例(18%)で変異がみられた。これらの遺伝子の発現を定量reverse transcriptase (RT)-PCRでチェツクしたところ、ほぼアレイの発現と一致していた。

MLL再構成例の共通の標的遺伝子および転座相手の相違によるMLLのキメラ遺伝子の下流の標的遺伝子の相違を探索するため、これらの遺伝子を詳細に検討し、共通する下流遺伝子をしぼる作業を進めている。今年度は2qの相手遺伝子とNUP98の新しい転座相手遺伝子HDXC11を単離した。さらに転座型急性リンパ性白血病(ALL)の新鮮検体を用いて、転座の相手による発現の相違をDNA Chipを用いて検索し、下流の標的遺伝子を探索した。t(4;11) 15検体、t(11,19)6検体、t(5;11)2検体および対照としてt(12;21)6検体、t(1;19)3検体からRNAを抽出し、Affymetrix社のDNA Chip (12,000個)により発現プロファイルの解析を行った。t(4;11)とt(11;19)の両方に共通して発現がみられる遺伝子がFLT3, HOXA9, HOXA10等50種にみられた。興味あることにMLL再構成のある21検体中予後による発現パターンの相違がみられ(p=0.01)、CBF2遺伝子が予後良好群で、CDP遺伝子が予後不良群で高発現を示した。また21例で共通して発現が高かったFLT3遺伝子の変異を調べたところ、乳児ALL 44例中8例(18%)で変異がみられた。また小児ALL 112例で検討したところ、高2倍体ALL 19例中4例(21.5%)に変異がみられたが、TEL-AML1 11例、E2A-PBX1 4例、BCR-ABL 6例では変異はみられなかった。DNA Chipで抽出された遺伝子の発現を定量reverse transcliptase (RT)-PCRでチェックしたところ、ほぼアレイの発現と一致していた。また昨年単離したMLL-SEPT6融合cDNAを導入した細胞をマウスに移植し、増殖や造腫瘍性の検討も行っている。今年度はMLLの新しい転座相手遺伝子としてMYO1F(染色体19p13)を単離した。この遺伝子は28のexonからなり1098アミノ酸をコードしており、N末にはATP結合シークエンスとアクチンシークエンスからできていた。4kbの転写産物がヒトのほとんどの組織でみられたが、22白血病細胞株中3株でしか発現がみられなかった。以上より、MLLの転座相手としては興味深い相手であり、今後詳細な解析を行う予定である。さらに転座型急性リンパ性白血病(ALL)の新鮮検体を用いて、転座の相手による発現の相違をAffymetrix社のDNA Chip(12,600プローブ)により解析を行い、t(1;19)、t(12;21)、11q23転座が発現プロファイルによって鑑別可能であった。MLL再構成のある21検体中予後による発現パターンの相違がみられ(p=0.01)、CBF2遺伝子が予後良好群で、CDP遺伝子が予後不良群で高発現を示した。また21例で共通して発現が高かったFLT3遺伝子の異常を小児急性骨髄性白血病150例で検討したところ、15%に変異がみられ、予後と相関しており、今後予後因子になりうることが判明した。また昨年単離したMLL-SEPT6融合cDNAを導入した細胞をマウスに移植したところ、骨髄増殖性症候群がみられたが、白血病はみられず、これに加えてFLT3 duplicationを導入すると増殖が著明になり白血病化した。白血病化するには転座に加えてさらにもう一つヒットが必要であることが判明した。
Vector Flow Mapping法を用いた非侵襲的心内渦流可視化の臨床応用

健常者においては心内の渦は心臓の基部に限局し、僧帽弁前尖側で左室流入から流出まで停留する傾向にあった。また僧帽弁後尖でも同様に渦流を認めるが、高血圧症例においては後尖側の渦流が描出されないことが多く、拡張機能との関連が示唆された。心臓再同期療法機能付きペースメーカーの症例では心尖部に長時間停留する流速の遅い渦を認めた。健常者と比べ、心拡大の症例では1つの渦のみが観察され、拡張早期から収縮末期まで渦が持続が観察された。心臓再同期療法機能付きペースメーカーの設定では心房・心室の同期タイミングの調整において有意なサイズ・流速の差は見いだせなかった。解析ソフトの時間分解能の改善が期待される本年度は院内への解析装置の導入ならびに心臓超音波検査装置の導入を予定した。2015.12月に心臓超音波装置が院内に導入され、院内における倫理委員会での申請を経て、当院での研究が了承されている。試験的なデータ集積において、集積すべき渦流のパラメーターを検討している段階である。研究対象として、外来通院中、ないしは入院中の症例において、糖尿病ないしは高血圧を有する症例のうち明らかな器質的心疾患のない患者(40歳以上80歳未満)を対象としているが、当院での研究遂行に於いて、予定していた超音波検査装置の設置場所に問題があり、予定していたデータの集積が開始できていない。2016年度の循環器学会でのデータ報告を予定している。本研究に必要な研究機材の院内への導入を終えており、試験的に数例の症例でデータの取得を行っている。研究に適した症例を集積するに当たり、院内心臓超音波検査室の都合上、常設が困難なため、本格的なデータ集積が開始できていない状況である。開始以降は30例/月程度の集積が見込まれる。本研究では造影剤を用いることなく、非侵襲的に心内渦流を可視化する心臓超音波Vector Flow Mapping法を用いて、心臓拡張能障害の早期診断指標を第一目的としている。そのため拡張障害を有すると見込まれる高血圧症例及び糖尿病の症例を対象に症例を蓄積する必要があるが、除外基準とした心臓の器質的疾患を有する症例が多く、症例の集積が不十分である。軽症の心機能障害を有する症例を除外せずに対象と含めることを考慮している。拡張機能障害指標と渦指標の比較のため、対照群となる健常者データの集積を現在行っており、少数例の拡張障害を有する症例の集積と年齢・性別をマッチした症例の集積を行う。そのうえで、渦指標の解析を行うと見込まれる。渦の指標に関しては仮説としていた渦のサイズが先行研究により必ずしも血行動態へ悪影響を及ぼさないことが示唆されており、渦のサイズの他に形態や渦流の衝突によるエネルギー消費(energy loss)に関して解析をする必要がある。また、心室再同期機能付きペースメーカー(CRT)植込み症例に関しては、本施設の倫理委員会との調整ののち、症例の集積を行ない報告を行うが、拡張障害例の集積を優先する。CRT症例に関してCRT有効症例の予測を目的としているが、従来有効症例の定義であった左室容積の縮小以外にも、CRTの有効性を示唆する指標が提唱されており、左室の収縮の差異で評価が困難であった場合、新規指標との比較を試みたい。院内での装置設置箇所、検査システムへの組み込みが困難であり、安定したデータ集積ができない状態。本研究における主眼であった心内渦流に関して、健常者における心内渦のサイズに関する検討を行った。健常者において、心尖部長軸像では心内の渦は心臓の基部に限局し、僧帽弁前尖側(左室流出路側むけて時計回転)で左室流入から流出まで停留する傾向にあった。また僧帽弁後尖でも同様に渦流(後壁側に向けて反時計回転)を認めるが、高血圧症例においては後尖側の渦流が描出されないことが多く、拡張機能との関連が示唆された。健常者において左室流入血流を中心として時計回転・反時計回転の二種類の渦が描出されるのに比べ、心拡大の症例では1つの渦のみが観察され、拡張早期から収縮末期まで渦が持続が観察された。心臓再同期療法機能着きペースメーカーの設定では心房・心室の同期タイミングの調整に当たり早期波(Early Wave: E波)と心房収縮波(Atrial Wave:A波)の比であるE/Aが良好に分離して描出される設定が至適とされているが、E/Aが最も良好に分離する設定とそれ以外の設定では心内渦流のサイズに有意な違いを描出することはできなかった。主に形態は左室の形状に依存しているものと推定された。右室、左室の同期不全に関しても左室流出路のVelocity Time Integralを用いた心拍出量の評価において最大心拍出量を得た状態での渦流を評価したが有意なサイズ・流速の差は見いだせなかった。可能性として設定変更直後では心内の充満圧や静脈還流量の変化が十分でなく、設定後一定の観察時間が必要であったかもしれない。使用した解析ソフトウェアの限界から時間分解能が乏しく、得られた結果の精度から統計的な有意差は得られなかったが、これらの改善により今後臨床応用可能なデータが得られるものと期待される。

健常者においては心内の渦は心臓の基部に限局し、僧帽弁前尖側で左室流入から流出まで停留する傾向にあった。また僧帽弁後尖でも同様に渦流を認めるが、高血圧症例においては後尖側の渦流が描出されないことが多く、拡張機能との関連が示唆された。心臓再同期療法機能付きペースメーカーの症例では心尖部に長時間停留する流速の遅い渦を認めた。健常者と比べ、心拡大の症例では1つの渦のみが観察され、拡張早期から収縮末期まで渦が持続が観察された。心臓再同期療法機能付きペースメーカーの設定では心房・心室の同期タイミングの調整において有意なサイズ・流速の差は見いだせなかった。解析ソフトの時間分解能の改善が期待される院内で通常臨床検査とは別枠での検査オーダーとなるため、十分に検査・データ集積を行うことができていない。当該部門と折衝し、速やかなデータ集積を開始したい。30例程度のデータで、日本循環器学会での演題発表のほか、心内血流に関する研究会での講演を経て、論文化を予定している。8.9月で健常者データの集積を終えて、データを解析にうつる。心臓研究延長により、前年学会不参加となったため。平成29年度循環器学会参加
北海道産天然多孔質材料を利用した人間生活環境の環境負荷低減技術に関する研究

開発・試作した稚内層珪質頁岩を用いたデシカント吸着材フィルターについて、除湿性能評価、および数値解析(シミュレーション)による最適運転条件の検討を行った。はじめに担持させる塩化物の種類による除湿性能の比較、またローターの回転数を変化させながら想定外気条件を変化させた場合、通風量を変化させた場合、再生温度を変化させた場合についての外気潜熱負荷除去性能の評価を行った。その結果、回転数が大きいほど除湿量は増加する傾向にあるが、4rpm以上に回転数を高めると除湿量は再生温度に依存せずほぼ一定であることがわかった。0.5-1rpmの低回転時には、再生温度が1°C上がるごとに除湿量は0.12g/kg_DA増加する結果となった。1rpmの珪質頁岩ローターで潜熱を除去した後、交換効率90%の顕熱交換器を併用した場合、従来の冷却除湿と比べると冷房負荷を38%削減できる結果が得られた。さらに26°Cの室内空気を加熱せずに再生側に通風させた場合の性能も同様に評価した結果、回転数が4rpm以上であれば外気の潜熱負荷が低減できていることがわかり、全熱交換器としての機能も見出した。次に開発したローターの吸放湿を再現する数値計算プログラムを熱物質同時移動現象モデルをもとに作成し、熱伝達係数および総括物質移動係数を実測から求め、回転数をパラメータとした関数としてプログラムに反映させ、実験結果の高い再現性を確認した。そのモデルを用いて導入空気条件や形状が除湿性能に与える影響を計算により明らかにした。その結果から最適形状を提案し、デシカント空調ユニットに適用した場合の除湿効果の算定を行った。東京に本提案デシカントユニットを導入する場合、夏季外気潜熱負荷を従来の冷却除湿方式の36%に削減できることを示した。
生体防御系における歯周病原性細菌への応答とその制御

P.gingivalisは、歯周病原性細菌のひとつであり、糖発酵能を持たず、強力な分解活性を示すプロテアーゼ産生する。なかでもジンジパインは本菌の示す総タンパク質分解活性のうち80%を占める主要なプロテアーゼであり、広範な生体タンパク質を分解・不活性化することから歯周病の病態に深く関与すると考えられている。ジンジパインには基質切断部位の異なるRgpおよびKgpの2つが存在するが、本研究においてジンジパインの膜結合型分子を抽出精製し、それがRgpとKgpの両触媒サブユニットを含み血球凝集素やヘモグロビン結合蛋白質とともに約670kDaの複合体を形成していることを見出した。この複合体は単量体酵素よりも、コラーゲンやエラスチンなど不溶性生体タンパク質を著しくよく分解し、歯肉線維芽細胞や血管内皮細胞に対して強力な傷害性を示した。また、この複合体はLPSをその構成要素として含んでいるにもかかわらず、マクロファージ活性化能が低いが、この複合体を熱処理やプロテアーゼ処理したものはサイトカイン産生を誘導した。この複合体を形成することによって免疫機構から回避していると考えられる。また、我々はRgpおよびKgpの基質切断部位の特異性を基にこれらに対する合成阻害剤を開発した。KYT-1,36はそれぞれRgpならびにKgpに対して強い阻害活性を示し、KYT-41は両者を阻害するデュアルインヒビターである。KYT-1を作用させた細菌は細胞傷害性や血球凝集活性が顕著に低下し、KYT-36は細菌の増殖を抑制した。KYT-1と36の併用ではP.gingivalis培養上清中のタンパク質分解活性がほぼ完全に阻害され、多形核白血球による殺菌作用の障害や血管透過性の亢進も認められなくなった。KYT-41は単独で、1と36の併用と同様の効果を示した。P.gingivalis感染はアポリポプロテインE(Apo E)欠損マウスにおいてアテローム性動脈硬化症進行を促進するが、ジンジパイン欠損株ではこのような動脈硬化促進作用が認められなかった。また、前述のKYT化合物を投与したマウスにおいても動脈硬化促進が抑制された。すなわち、P.gingivalisはジンジパイン(特にRgp)の作用を介して、全身性に影響を与え、虚血性心疾患の発症・進行に関与しているものと考えられた。さらに、これらのジンジパイン阻害剤を巧みに組み合わせて利用することによって、歯周病だけでなくこれに関連した全身性疾患の予防と治療に応用できる可能性が示唆された。歯周病は口腔内にとどまらず、全身性に生体機能の低下をもたらし、心内膜炎・冠状動脈性心疾患、肺炎、早産・低体重児出産といった疾患と関与していることが指摘されている。Porphyromonas gingivalis(ジンジバリス菌)は歯周病の最有力病原性細菌と目され、強力なプロテアーゼであるジンジパインを産生・分泌する。

本研究はジンジバリス菌感染に対する生体応答と病態との関連を解明し、その制御によって関連疾患の予防・治療方法の確立の基盤を築くことを目的としている。ジンジパインの80%以上は膜結合型として菌体表面に存在するが、その分離精製が困難なことから、これまでの研究では分泌型単量体に関する報告が中心であった。今回、我々は界面活性剤を用いて膜結合型ジンジパインを抽出精製し、それが血球凝集素やヘモグロビン結合蛋白質とともに約670kDaの複合体を形成していることを見出した。この複合体は単量体酵素と比較すると、コラーゲンやエラスチンなど不溶性生体タンパク質を著しくよく分解し、歯肉線維芽細胞や臍帯静脈血管内皮細胞に対して強力な傷害生を示した。また、この複合体は脂質成分やLPSをその構成要素として含んでいるにもかかわらず、マクロファージ活性化能が低いことが分かった。しかしながら、この複合体を熱処理やプロテアーゼ処理すると、マクロファージを刺激してサイトカインの産生を誘導した。すなわち、この複合体ではプロテアーゼや血球凝集素ドメインが結合することによってLPSが免疫担当細胞に認識されることから回避させていると考えられる。また、このようなサイトカインの産生はToll-like receptor(TLR)4変異マウス由来のマクロファージでは誘導されなかったことから、ジンジバリス菌のLPSも大腸菌と同様、TLR4を介した自然免疫機構に認識されるものと考えられる。P.gingivalisは、歯周病原性細菌のひとつであり、糖発酵能を持たず、強力な分解活性を示すプロテアーゼ産生する。なかでもジンジパインは本菌の示す総タンパク質分解活性のうち80%を占める主要なプロテアーゼであり、広範な生体タンパク質を分解・不活性化することから歯周病の病態に深く関与すると考えられている。ジンジパインには基質切断部位の異なるRgpおよびKgpの2つが存在する。我々はRgpおよびKgpの基質切断部位の特異性を基にこれらに対する合成阻害剤を開発してきた。KYT-1,36はそれぞれRgpならびにKgpに対して強い阻害活性を示し、KYT-41は両者を阻害するデュアルインヒビターである。KYT-1を作用させた細菌は細胞傷害性や血球凝集活性が顕著に低下し、KYT-36は細菌の増殖を抑制した。KYT-1と36の併用ではP.gingivalis培養上清中のコラーゲン、免疫グロブリンなどのタンパク質分解活性がほぼ完全に阻害され、多形核白血球による殺菌作用の障害や血管透過性の亢進も認められなくなった。KYT-41は単独で、1と36の併用と同様の効果を示した。放線菌の培養上清から精製された天然の強力なRgp阻害剤であるFA-70C1もKYT-1と同様の作用を示し、さらにマウスへin vivo投与するとP.gingivalis感染による歯肉炎の発症を有意に抑制した。最近では歯周病が心疾患などの全身疾患のリスクファクターになっていることが指摘されており、P.gingivalisの感染はアポリポプロテインE(Apo E)欠損マウスにおいてアテローム性動脈硬化発症を促進することが報告されている。我々が行った今回の研究では、確かに野生株のP.gingivalisは動脈硬化症病巣の拡大を亢進させるのに対してジンジパイン欠損株ではこのような動脈硬化促進作用が認められなかった。
一次求心系ニューロンの電気生理学的特性と化学受容性:一次求心路の機能構築とその関連

昨年度に引き続いて、求心性神経回路の機能構築を解明することを目的として求心性ニューロンの電気生理学的特性と化学受容性に関する研究を実施した。1.ウシ蛙後根神経節と家兎節状神経節のCニューロンおよびモルモット腸神経のAHニューロンなど一群の求心系ニューロンの細胞体は類似した電気的特性を示し、何れも時間経過の長い顕著な活動電位後電位(SAH)を発生する。細胞内微小電極による電気生理学的研究を行って、これら求心系ニューロンのSAHおよび外向き後電流(l_<SAH>)はカルシウム依存性カリウム・コンダクタント(gK-Ca)の増大によって発生することを確認した。2.痛覚に関連する内因性活性物質であるサブスタンスPによって膜抵抗の増大を伴う脱分極を起こす。AHニューロンのgK-Caに対するサブスタンスPの作用を解析して次のような結果を得た。サブスタンスPはSAHおよびl_<SAH>を抑制した。SAHあるいはl_<SAH>の発生直後に与えたサブスタンスPの作用は抑制されたが、回復期に与えるとサブスタンスPの作用は逆に促進された。同様な関係がカルシウム・イオノフォアとサブスタンスPの作用の間でも観察された。ダントローレンは静止膜抵抗を増大し、一過性にサブスタンスPの作用を増強させた後に抑制した。サブスタンスPによる脱分極は通常細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を伴ったが、膜電位固定条件下ではカルシウムイオン濃度に有意な変化は観察されなかった。3.昨年度実施した研究から、ウシ蛙後根神経節細胞でテトロドトキシンに感受性の活動電位を持つAs細胞に対するTEAの作用に関する研究成果をまとめてJ.Neurophysiologyに投稿している。
新規蛋白質標識技術を用いたPETおよび蛍光イメージング

L/F-転移酵素による酵素反応を、蛋白質またはペプチドの蛍光修飾およびPETプローブ修飾へと応用した。さらに、非天然アミノ酸をN末端に導入した目的蛋白質を、大量・高効率・迅速かつ簡便に作製するため、反応系の改良を行った。具体的には、3つの触媒分子(アミノアシルtRNA合成酵素変異体(PheRS)、L/F-転移酵素、tRNA)を、目的蛋白質またはペプチドと同じ混合液中に共存させておくことで、これを達成した。これをN-terminal EXtention with Transferase and ARS (NEXT-A)反応と名付けた。●申請者が新規開発した有機化学-酵素化学的手法を応用し、以下の16の手順に従って実験し、ペプチドのN末端特異的にPETプローブを導入することに成功した。1. D. Trirrellらにより報告されている、非天然アミノ酸を認識してtRNAの3'末端に結合する変異アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)を大腸菌を用いて作製した。2.フッ素原子の入ったPETプローブ(非放射)型アミノ酸を有機合成した。3. 2の非放射型アミノ酸を用い、1にて作製した変異ARSの存在下にて、アミノ酸-tRNA結合体(アミノアシルtRNA)を作製した。4. N末端にリジンを持つモデルペプチドを大腸菌を用いて作製した。5. 3にて作製したアミノアシルtRNAと特別な酵素(L/F-転移酵素)と、4にて作製したペプチドとを混合し、蛋白質を非放射型アミノ酸で標識してTOF-MSおよびEdman分解法で同定した。6.変異ARSによるアミノアシル化反応(上記1)とL/F-転移酵素による非天然アミノ酸の目的ペプチドへの転移反応(上記5)を1つの試験管内で行った。この場合、tRNAはリサイクルされ触媒として働くため、標識反応の効率化および反応スケールが大幅に向上した。以上を特許出願し、またシンポジウム発表(招待講演)を行った。●以下の13の手順に従って実験し、蛋白質のN末端特異的蛍光標識に成功し、論文発表を行い、学会講演賞を受賞した。1.化学的アミノアシル化法にて蛍光プローブによってアミノアシル化されたtRNAを作製した。2.変異L/F転移酵素(計4種類)を作製した。3. 1にて作製したアミノアシルtRNAと、2にて作製した変異転移酵素とを混合し、目的蛋白質N末端に蛍光性アミノ酸を付与させた。これをTOF-MSやゲルイメージャー、アミノ酸配列解析等で同定した。●申請者が新規開発した有機化学-酵素化学的手法を応用し、以下の16の手順に従って実験し、ペプチドのN末端特異的にPETプローブを導入することに前年度成功している。1. D.Tirrellらにより報告されている、非天然アミノ酸を認識してtRNAの3'末端に結合する変異アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)を大腸菌を用いて作製した。本年度は以上の内容の追試実験を行い、特にPETプローブ標識の速度論的解析を行った(論文準備中)。また、上記6については速報にて論文発表を行った。●蛍光修飾については、前年度までにほぼ完成しており、本年度は変異L/F転移酵素がなぜ新規蛍光性アミノ酸を認識できるのか、計算機を用いて転移酵素とアミノ酸とのドッキングモデルを作ることで、理論的考察を行った。
軸索ジストロフィーモデルマウスを用いた神経軸索障害の成因に関する研究

神経軸索ジストロフィーの成因を検討するため、gad(gracile axonal dystrophy)mouse(ポリユビキチン化に関連したUCHL-1遺伝子の異常)の後根神経節細胞を用いた培養実験を行った。免疫学的、化学的、分析学的手法を用いて検討したが、病理像の再現には至らなかった。しかし、タンパク質分解機構を再検討したところ、既報のポリユビキチン化異常に加えて、オートファジーによるタンパク質分解異常が新たに確認された。ユビキチン・プロテオソーム障害がオートファジーのタンパク質分解機構にも影響している事象であり、これらの破綻による未消化物質の蓄積が軸索障害の原因であることが示唆される。軸索ジストロフィーの成因を調べる為、胎生期14日前後のマウスより後根神経節(Dorsal root ganglion:DRG)を取り出し培養を行い、いくつかの条件の元で検証を行った。【control及びgad mouseの比較】control及びジストロフィーを引き起こすgad mouseにおいてDRGを10日及び30日培養を行い、伸長した軸索の形態を顕微鏡により観察したが、両者に顕著な差は見られなかった。【軸索流阻害剤を用いた軸索ジストロフィーの再現】control mouseのDRG培養細胞に対し、軸索の順行性又は逆行性輸送に関連するKIF5及びDynein抗体を投与し顕微鏡で観察したが、投与群及び非投与群で差は見られなかった。【培養細胞の質量分析】control mouseのDRGを10日培養した組織をそのまま洗浄、乾燥及びマトリックスを噴霧し、質量分析装置で観察した。質量のピークは低めであったが脂質と思われるピークは確認されたため、質量分析を用いた解析が可能であることを確認できた。DRG培養においていくつか安定性に問題が生じた為、解決の為の検証と、昨年度に引き続き軸索流に関する実験を行った。【質量分析用マトリックスの選定】DRG培養細胞は検体の存在質量が通常の組織切片より少ないことから、より脂質を検出しやすいマトリックス(DHB:2,5-Dihydroxybenzoic acid、THAP:2,4,6-Trihydroxy-acetophenone)の2種類から検証し、THAPで判別しやすい結果が得られた。【ITOスライドガラスの培養細胞接着】質量分析に用いるITOコーティングスライドガラスでDRG細胞の非接着が目立ったため、一般に用いられる接着コーティング素材(フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、poly-L-lysine)の4種類を検証した。いずれの場合も接着率が50%以下であり、それぞれに有意な差は見られなかった。【軸索流阻害剤の使用】昨年度の免疫的な阻害剤の代わりに化学物質(コルヒチン、パクリタキセル)を用いてDRG培養細胞に使用した。検証の結果1nmol以上の濃度ではDRG細胞が段階的に死滅したため、それ以下の濃度を用いて生存したDRGのみをcontrol群と比較を行ったところ形態的な差は見られなかった。【共培養】軸索障害の別のアプローチとしてDRGと別の神経細胞(Neuro2a及び新生児海馬)と共培養を行い、pre及びpostシナプスの代謝障害によるジストロフィーの検証を行ったが、培養方法の違いもあり検証には至らなかった。実験の根幹であるDRG培養の安定性に問題が生じた為、それを解決するための基礎実験に時間を必要とした。根本的な解決には至らなかったが、いくつかの安定したDRG培養群を用いて軸索阻害関連の実験を行うことはできた。新規軸索流阻害剤の検証、DRG培養群の質量分析、共培養及びシナプス小胞関連物質の検証を行い、さらに新たな視点からオートファジー関連物質の検討を行った。【DRG培養群の質量分析】control及びhomo間において有意な結果は得られなかったが、ピーク値は低かった為、正確な事象を捉えられなかった可能性はある。【共培養・シナプス小胞関連物質の検証】Neuro2a、小脳、大脳及び海馬神経細胞との共培養を行ったが、技術的な問題により断念した。また生体組織(脊髄、延髄)に対してsynasinI等による免疫染色を行ったがcontrolとhomoに違いは見られなかった。【オートファジー関連物質の検証】LAMP1(リソソーム関連物質)、LC3(オートファジー関連物質)、p62(オートファジーにより分解)を用い、延髄薄束核で免疫染色を行った。結果、controlに比べてhomoにおいてLAMP1及びp62で強い染色像が得られた。以上の検証によりオートファジー不全によるジストロフィーの可能性が示唆された。【総評】DRG培養組織を用いた種々の試みでは、生体に見られたジストロフィー様の病理像を再現することはできなかった。一方でオートファジーによる分解不全が生体組織で確認された。これはポリユビキチン化に関連するUCHL-1遺伝子の異常がオートファジーを制御する機構に直接的又は間接的に作用している可能性が示唆される。

ユビキチン・プロテオソーム障害がオートファジーのタンパク質分解機構にも影響している事象であり、これらの破綻による未消化物質の蓄積が軸索障害の原因であることが示唆される。初年度に計画した生体マウスを用いた免疫染色等の実験は繁殖等の問題により実験に必要な量の病態マウスを手に入れることができず持ち越すことになったが、DRG培養方法の向上化により、安定性が上がり長期培養が可能となり、当初の予定より精度の高い実験を行うことができた。その為、次年度以降に予定していた培養細胞に対する軸索流阻害剤の投与と質量分析による解析の一部を先行して行った。昨年および今年度に行った軸索流の免疫及び化学的阻害剤の投与による変化は見られなかったことから、DRG培養単独での変化は難しい結果となった。今後はgad mouseのcontrolとhomoのDRG培養細胞で質量分析を用いた脂質の検証、引き続き共培養の検証、生体の延髄薄束核におけるシナプス小胞関連物質の検証を行い、軸索ジストロフィーの成因を探る。遺伝性末梢神経障害、末梢神経病理病態マウスのDRGを用いた培養でcontrolとの差が見られなかったため、DRG単独培養では軸索ジストロフィーを再現できない可能性がある。その為、より生体に近い状況(ミエリン形成、他神経細胞との共培養等)を作ることで変化が見られるかを検討する必要がある。また並行して未使用の軸索輸送に関連した阻害剤を用い、controlでもジストロフィー様病理像が見られるかを検討する。さらに初年度に予定していた生体マウスへのアプローチも必要なマウスが確保でき次第行うこととする。旅費として300,000円の予算を考えていたが、次年度の学会発表にて使用する予定のため。次年度の学会発表にて使用。
Gibberella fujikuroiの交配関連遺伝子のクローニングと機能解析

交配型遺伝子産物の機能をさらに調査するため、大腸菌およびバキュロウイルス発現系を用い、交配型遺伝子産物の精製を試みた。すべての交配型遺伝子を発現させることに成功したが、いずれのタンパク質も不溶性であった。また、MAT1-1-1およびMAT1-1-2の発現量は極めて少なかった。現在、他の発現系の利用等を検討している。交配機構に関与していることが他の糸状子のう菌で確認されているMAPキナーゼおよび三量体GTP結合タンパク質βサブユニットの遺伝子クローニングを行った。それぞれFusarium solani、Cryphonectria parasitica由来の相同遺伝子の塩基配列からプライマーを設計し、PCRにより獲得した。両遺伝子の塩基配列を明らかにした結果、本菌のMAPキナーゼは、近縁の交配不完全性菌であるF.oxysporumとアミノ酸配列が完全に一致していた。また、GTP結合タンパク質βサブユニットはC.parasiticaと最も高い相同性を示し、93.6%のアミノ酸が一致していた。現在、両遺伝子の本菌の交配機構への関与を調査するため、遺伝子破壊株の獲得とそれらの調査を行っている。
膜型メタロプロテイナーゼ(MFMMP)と乳癌の転移

1、MT1-MMPが様々な癌組織(肺癌、胃癌、上咽頭癌、大腸癌、乳癌、グリオブラストーマなど)で発現しており、gelatinase A活性化と相関し、リンパ節転移とも相関した。2、大腸菌で発現させた酵素を用いることにより、MT1-MMPがプロテアーゼを介することなく直接ゼラチナーゼAの活性化を行うことを明らかにした。3、胃癌組織を免疫染色する事により、癌細胞でMT1-MMPとgelatinase Aが共に強陽性であった。また、周辺の線維芽細胞にも両者の発現が認められた。4、大腸癌組織のin situ hybridizationによる検索でMT1-MMPは癌細胞自身と周辺の線維芽細胞で発現しており、ゼラチナーゼAは維線芽細胞だけで発現していた。5、MT1-MMPと近縁のMT2-MMP,MT3-MMPについての検討も浸潤性乳癌に20例に対して加えた。Nor thern biottingによるmRNA発現がMT1-MMPでは前例で認められたのに対して、MT2-MMPは25%また、MT3-MMPは認められなかった。6、細胞表層でのゼラチナーゼA活性化に対するTIMP-2の役割をインビトロの実験モデルを構築して調べることにより、TIMP-2がMT1-MMPにゼラチナーゼAを結合させるアダプター分子として機能し、MT1-MMPが存在する部位へとゼラチナーゼAを濃縮する役割を担っていることを明らかにした。7、MT2-MMPおよびMT3-MMPもMT1-MMPと同様にゼラチナーゼAを活性化することをトランスフェクション実験によって明らかにした。日本側の成果1、MT-MMPは免疫染色によって肺がん、胃がん、大腸がん、乳がん、グリオプラストーマなどでの発現が確認されている。2、胃がん、肺がん組織でのgelatinase A活性化とMT-MMPの発現が相関することから組織レベルでもMT-MMPがpro-gelatinase Aの活性化因子として働いていることが推察された。また、がん組織でのgelatinase A活性化率はリンパ節転移例で有意に高値を示した。3、胃がん組織での免疫染色によってがん細胞でMT-MMPとgelatinase Aが共に強陽性であった。この染色像と一致して、gelatinase Aの活性化はがん細胞巣の中で起こっていることが組織のmicro disectionとそれに続くゼラチンザイモグラフィーで示された。外国との共同研究の成果1、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231をコンカナバリンAで処理するとgelatinaseAの活性化が誘導される。この時にMT-MMPの発現が誘導されることを蛋白質およびmRNAのレベルで確認した。また、一部は新たなMT-MMP合成を必要とはせず、未知な経路も存在する可能性が示された。2、培養線維芽細胞におけるgelatinase Aの活性化がMT-MMPが関与するステップとgelatinaseA自身の活性が必要なステップの2段階で起こることが明らかになった。細胞外マトリックスは多細胞生物の組織構造を維持する為の物理的な骨組みであると同時に細胞増殖・機能制御にも重要な役割を果たす。組織の機能維持、損傷の修復や発生過程での組織改編を伴う器官形成時には細胞外マトリックス成分の合成と分解が必要であり、厳密に制御されている。がんではその両方に異常が有り、細胞外マトリックスの分解の亢進と不完全な産生が認められ、がんの浸潤・転移を容易にする。本研究では特に細胞外マトリックス分解系の亢進によるがん浸潤の実体を明らかにし、その制御法を開発することを目指している。

本研究では特に、膜貫通構造を持つ新しいマトリックスメタロプロテアーゼ(MT-MMP)による潜在型マトリックスメタロプロテアーゼの細胞の表層での活性化機構に着目してヒトがん組織に於ける酵素の発現、基質となるゼラチナーゼAの活性化と悪性度との相関を調べた。MT1-MMPと近縁のMT2-MMP、MT3-MMPについての検討も浸潤性乳癌に20例に対して始めて加えられた。Northern blottingによるmRNA発現がMT1-MMPでは前例で認められたのに対して、MT2-MMPは25%また、MT3-MMPは認められなかった。単クローン抗体による免疫染色に於てもMT1-MMPはがん細胞を中心に周辺の線維芽細胞の染色像が前例で認められたのに対してMT2-MMPは38%の症例で癌細胞中に認められたのみであった。また、様々なグループとの共同研究によって脳腫瘍、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌でのMT1-MMPの発現が確認された。in situ hybridyzationによる発現細胞は大腸癌、胃癌では癌細胞自身と周辺の線維芽細胞であった。しかし、乳癌では癌細胞に於けるシグナルは弱く、境界面の間質での強発現が認められた。乳癌細胞は基底膜分解酵素のセラチナーゼAを細胞表面で活性化するために膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT-MMPs)を発現している。昨年度の研究により、MT1,MT2,MT-3-MMTの中でもMT1-MMPが最も高頻度に乳癌細胞に発現しており、セラチネ-ゼAの活性化に関係していると結論した。一方で、G.l.Goldbergらはヒト線維芽細胞株を用いた実験ら、細胞表層でもゼラチナーゼAの活性化にはMT1-MMPに加えてインヒビターであるTIMP-2が必要であるいことを明らかにしていた。インヒビターが酵素作用に必須であるという知見は大きな自己矛盾を含むために、この点を解析するために、G.l.Goldbergとの共同研究によって、ビーズに固定化したMT1-MMPを用いるインビトロのモデル系を構築して解析することにより、以下の成果を得た。1、ビーズに固定化したMT1-MMPはゼラチナーゼAの活性化能を弱いながら持っていた。2、TIMP-2を加えることによって活性化を促進された。3、活性化の促進効果はゼラチナーゼAがTIMP-2を介してMT-1MMPと結合すること(3分子複合体)と相関していた。4、促進効果は3分子複合体とフリーのMT1-MMPが共存する条件下のみ観察された。以上のことから、細胞表層ではTIMP-2はMT1-MMPと複合体を形成し、周辺のゼラチナーゼAをMT1-MMP存在部位へと濃縮する役割を負っていると結論された。
細胞周期の調節におけるプロテインキナーゼの役割

細胞周期の調節には蛋白質燐酸化反応が深く関わっており、プロテインキナーゼC(Cキナーゼ)の活性化もアフリカツメガエル卵母細胞の成熟を促す因子の一つといわれている。私どもはその反応機構を解析するため本酵素の直接の作用点である基質蛋白質の解析を試みた。その結果偶然にも細胞質画分の分子量25,000蛋白質(25KDa蛋白質)が試験管内における反応において、CキナーゼやカゼインキナーゼIIなど蛋白質セリン/スレオニン燐酸化酵素のよい基質であることが明らかになった。そこでこの蛋白質の構造と機能を解析するためまず精製方法を検討した。本蛋白質が熱安定性であることを利用し、熱処理後の可溶画分を陰イオン交換カラムで精製したところほぼ均一な標品を得ることができた。この標品を基質として解析するとkm値はいずれの酵素を用いた場合も0.51.0μMときわめて低く親和性の高い基質であることが確認された。経時的に燐酸化反応を解析するとどちらの酵素によっても25KDa蛋白質1モルにつき約2モルの燐酸が取り込まれた。Cキナーゼによる燐酸化部位は25KDa蛋白質のN末端に位置する二つのセリン残基であることも示された。またこの蛋白質の細胞内分布を調べると卵黄画分に潜在的に最も高い活性が検出され、界面活性剤を含む緩衡液で抽出することにより初めて検出可能となった。次いで順に細胞質、ミクロゾーム、細胞膜の各画分にも存在が認められた。しかしながら25KDa蛋白質の機能と燐酸化反応の意義は依然として不明であり今後の課題として残されている。その他細胞周期の調節におけるCキナーゼの役割を解明する研究の一環として次の点が明らかにされた。まず、細胞増殖時に認められるH_2AヒストンのN末端セリン残基の燐酸化反応にCキナーゼが関与する可能性があること、さらに抗腫瘍性抗生物質ミトキサントロンの作用点の一つとしてCキナーゼが考えられることなどの点が示された。プロテインキナーゼC(Cキナーゼ)は外来刺激に呼応した多彩な細胞の応答反応に関与しているが細胞周期の調節や細胞増殖とも関係の深い酵素である。例えばアフリカツメガエル卵母細胞の成熟はプロゲステロンのみならず発癌プロモーターホルボールエステルによっても誘発されることからCキナーゼによる蛋白質燐酸化反応がこの過程で重要な役割を演じていることが予想される。そこで私共が卵母細胞の細胞質に見い出した本酵素の基質である分子量25,000の蛋白質(25kDa蛋白質)の構造と機能の解析を進めるためまずこの蛋白質の単離精製を試みた。種々のクロマトグラフィーを組み合わせほぼ純品を得ることができた。また25KDa蛋白質は熱安定性蛋白質であることも判明しホモジネートを熱処理しその上清を利用することにより簡便かつ大量の精製が可能となった。この蛋白質のアミノ末端付近の一次構造を決定しその配列をコンピューターで解析したところこれまで報告の無い蛋白質であることが明らかになった。またこの25KDa蛋白質の制御機構を明らかにするため各種蛋白質燐酸化酵素による燐酸化反応を試みた。Cキナーゼによって25KDa蛋白質1モル当たり2モルの燐酸が取り込まれ燐酸化アミノ酸はセリンと同定された。またこの反応のKm値は0.5μMときわめて低くCキナーゼのよい基質であることが確認された。

このように25KDa蛋白質の構造や制御機構についての研究が進み細胞周期の調節において果たす本蛋白質の役割を生理学的な立場から解明する段階に来ている。また細胞増殖時に認められる細胞核H2AヒストンのN末端セリン残基の燐酸化反応を解析した結果Cキナーゼが有力な候補であることを明らかにした。さらに抗腫瘍性抗生物質ミトキサントロンがCキナーゼの強力な阻害剤であるHL60細胞の増殖を阻害する際この物質の作用点の一つがCキナーゼある可能性を示した。プロテインキナーゼC(Cキナーゼ)は細胞周期の調節をはじめ分泌・放出など多彩な生命現象に深く関わっており、その直接の作用点である基質蛋白質の解析はきわめて重要な課題である。私どもはアフリカツメガエル卵母細胞を材料に細胞周期の調節機構を解析中、偶然にも細胞質に存在する分子量25,000の蛋白質(25kDa蛋白質)が試験管内での反応でCキナーゼやカゼインキナーゼIIのきわめてよい基質であることを見いだした。そこでこの蛋白質の構造と機能を解析する目的で、まず精製方法の確立を試みた。当初種々のカラムクロマトグラフィーを組み合わせた方法を用いていたが、途中で蛋白質分解酵素の作用と思われる低分子量の燐酸受容蛋白質が検出されたため精製方法の改良を試みた。本蛋白質が熱安定性であることを利用し熱処理後の可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフフィーで精製したところほぼ均一な標品を得ることができた。収率は60%以上と非常に高く、きわめて簡単な操作で多量の精製蛋白質を得ることが可能となった。またゲル濾過カラムによる解析から25kDa蛋白質は単量体として存在していることが示され、ストークス半径は24.5Aと計算された。一方この蛋白質の細胞内分布を検討した結果卵黄画分に最も多いが、この活性は界面活性剤で抽出することによって初めて検出可能であった。次いで細胞質、ミクロゾーム、細胞膜画分の順に量的に多く分布していることが示された。今後この25kDa蛋白質の機能と燐酸化反応の意義についてさらに解析する必要がある。またCキナーゼの分解反応(ダウンレギュレーション)は細胞増殖の異常時に認められる現象であるが、この反応には細胞内Na^+流入が重要であることがホルボールエステルで刺激したHL60細胞で証明された。
光照射によるカンピロバクター侵入性制御を目指した新規鶏肉保存システムの開発

本研究では近年明らかとなった、酸化傷害によるカンピロバクターの病原性(運動性、侵入性)抑制機構を参考に、UVA照射による酸化傷害も、菌の病原性を抑制し、食肉への拡散・侵入防止に役立つと考えその有用性について検討した。(1)カンピロバクターはUVA紫外線に強い感受性を示し、強い殺菌効果を示すことが明らかとなった。(2)またUVA紫外線照射により酸化傷害が引き起こされており、さらに(3)菌の宿主細胞への侵入性が低下することも明らかとなった。以上の結果からUVA紫外線照射は、その殺菌効果に留まらず、酸化傷害を介した病原性低下も引き起こすため、食中毒予防の新しいシステムとして有効性が示された。平成26年度は主にカンピロバクターに対する紫外線照射ストレスの影響について解析を行った。カンピロバクターは他の食中毒起因菌(大腸菌、サルモネラ、腸炎ビブリオ)に比べてUVA(365nm)-LEDに対して感受性が高く、より低エネルギーで殺菌が行えることが明らかとなった。さらにDNA酸化損傷マーカーである8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8OHdG)産生量が他菌より多いことから、カンピロバクターはUVA-LED照射によって酸化ストレスを受けやすいことが示唆された。また本研究から、UVA-LED照射によってカンピロバクターの腸管上皮培養細胞(Caco-2細胞)に対する侵入性が低下することが明らかとなり、UVA-LEDの効果は殺菌能力だけではなく、菌の病原性を低下させる可能性を示す、良好なデータを得ることが出来た。現在材料を培養細胞から市販食肉に置き換え、UVA-LED照射によるカンピロバクターの侵入性の評価を進行している。実用に向け、UVA-LED照射が出来る保管システムのモデル機材を用いて殺菌試験も開始している。モデル機では菌液に対して有効な殺菌効果を示しているが、鶏肉に塗抹した菌に対しては有効な殺菌効果が得られておらず、UVA-LED照射角度、光源からの距離、エネルギー量の変更を行い、現在機器の最適化を目指している。平成27年度は平成26年度に得られたin vitro近紫外線UVA-LED照射実験によるカンピロバクターの殺菌結果をもとに、鶏肉に付着したカンピロバクター対するUVA-LED照射の有効性を検討した。UVA-LED照射は鶏肉(ササミ)に塗抹したカンピロバクターに対して30%程度菌を減らすことが出来るものの、in vitro実験程有効な殺菌効果を示すことができなかった。しかしながら鶏肉懸濁液を作成し、鶏肉と同様のUVA-LED照射実験を行った結果、懸濁液中のカンピロバクターに対して有効な殺菌効果を得ることが出来た。これらの結果は鶏肉の形状や表面の凹凸が、殺菌の効果に大きな影響を与えていることを示唆しており、光の当て方に殺菌効率を高めるヒントがあると考えている。今後光の当て方に焦点をしぼり鶏肉の表面殺菌に有効な光殺菌システムの検討を行っている。本研究ではカンピロバクターに対するUVA-LED照射の有効性について多くの科学的根拠を蓄積することに成功した。得られた基礎データについては科学雑誌への投稿を予定しており、実用に向けた応用研究については、期間内に全ての検討を収めることは出来なかったものの、光の当て方に焦点を絞った最終検討まで進めることが出来、今後さらなる発展が期待できる。平成26年度の研究では、UVA-LEDによる殺菌実験について良好なデータ得ることができ、殺菌のメカニズム解析も順調に進行している。さらに培養細胞を用いた病原性の評価についても良好なデータを得ることが出来ているため、研究計画は順調に進行していると言える。平成26年度の研究計画に掲げていた、「紫外線照射による食肉の変敗評価」については、紫外線の波長、光源からの距離、エネルギー量が決定出来ていないため、平成27平成に改めて実施をする予定としているが、平成27年度に計画していた「紫外線照射モデル型ショーケースを用いた紫外線照射の有用性評価」の研究項目を平成26年度に繰り上げて研究を実施しているため、研究の遅れはない。さらに26年度に得られた研究結果は、当該分野において大きな進展を示す実験結果であり、現在科学雑誌への論文投稿も予定している。食品衛生UVA-LED照射によるカンピロバクター侵入性の低下は、培養細胞に対して良好なデータが得られているが、より実用的な評価が必要となるため、今後は食肉に対しても有効性を評価する。さらにUVA-LEDの病原性に対する影響が、紫外線の波長によって変化するのか、UVB、UVCの波長を用いて比較検討を行いたいと考えている。波長の特性による侵入性の違いを明らかにしより病原性の低減効果が期待出来る光の波長を決定出来ると考えている。さらに27年度には病原因子の遺伝子発現を解析し、侵入抑制のメカニズムについても解析をおこなっていく。実用に向け、UVA-LED照射機能付き保管システムのモデル機材の改良を進めている。

UVA-LED照射角度、光源からの距離、エネルギー量を再検討し、機器の最適化を目指す。年度末分の物品で、納品が遅れた物品があったため、次年度使用額が生じた。差額は4月分の収支に計上予定。既に物品として使用されており、差額分は4月の収支に計上される。