hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光生体イメージング技術による関節リウマチの病態解明と新規薬効評価系の開発

関節リウマチは、炎症性骨破壊を来す難治性の自己免疫疾患である。近年、様々な生物学的製剤が関節リウマチ治療において臨床応用され、その骨破壊抑制効果が示されているが、生体内における各種薬剤の作用機序の差異についてはよく分かっていない。本研究では、骨・関節破壊の現場をin vivoで可視化する蛍光生体イメージング系を確立し、炎症性骨破壊における生きた細胞の動態を明らかにした。さらに、本技術を用いて、各種生物学的製剤が炎症によって誘導された破骨細胞に及ぼす効果を解析し、薬剤間の薬効の差異を解明した。関節リウマチは、日本の人口の約0.5%の患者を有する最も頻度の高い自己免疫疾患の一つであり、滑膜の炎症に伴う進行性の骨破壊を生じるため、患者の運動機能が著しく制限される。そのため、骨破壊による関節機能障害の制御が、リウマチ治療の最大の課題である。関節リウマチにおける関節破壊は、関節を包む滑膜の炎症から始まり、滑膜の増殖、パンヌスの形成、骨・軟骨破壊へと進行していく。その病態形成には、破骨細胞、マクロファージ、T細胞が複雑に関与すると考えられている。しかしながら、「それぞれの細胞が、いつどのようにして関節内に遊走してきて、関節炎が発症するのか」という関節破壊に関わる細胞の遊走制御や動態については、これまでほとんど解明されていなかった。本研究では、これまで独自に開発・応用してきた生体関節内の二光子励起イメージング系を活用して、関節炎・関節破壊に関わる炎症細胞(破骨細胞・マクロファージ・リンパ球)の遊走動態を可視化し、関節炎の発症メカニズムを明らかにするとともに、関節リウマチ治療において臨床応用されている分子標的治療薬の生体内動態をin vivoで可視化し、分子標的治療薬が標的細胞に及ぼす効果や薬効発現の機序を実体的に解明する。平成27年度は、関節炎を誘導した動物の生きた関節内における破骨細胞やマクロファージの動態を経時的に可視化し解析を行った。平成28年度以降は、これらの成果をもとに、関節リウマチの発症・増悪メカニズムの解明および分子標的治療薬の薬効評価を行う。蛍光生体イメージング技術を駆使して、個体を生かしたまま炎症関節内における生きた細胞動態の可視化に成功しており、平成27年度終了時としては順調に経過している。その病態形成には、破骨細胞、マクロファージ、T細胞などが複雑に関与すると考えられている。本研究では、これまで独自に開発・応用してきた生体二光子励起イメージング技術を駆使して、関節リウマチの病態に関わる炎症細胞(破骨細胞・マクロファージ・T細胞)の動態を可視化することにより、関節リウマチの発症・増悪メカニズムを明らかにするとともに、関節リウマチ治療において臨床応用されている分子標的治療薬の生体内の薬物動態をin vivoで可視化し、分子標的治療薬が標的細胞に及ぼす効果や薬効発現の機序を実体的に解明する。平成28年度は、関節炎モデルマウスの生きた関節内における破骨細胞やマクロファージを経時的に可視化し動態の解析を行った。さらに、分子標的治療薬(抗IL-6受容体抗体、抗TNFα抗体、T細胞選択的共刺激調節剤)が、炎症によって誘導された破骨細胞の動きや機能に及ぼす影響を評価した。平成29年度は、これらの成果をもとに、関節リウマチの発症・増悪メカニズムの解明および分子標的治療薬の薬効発現の機序解明を行う。蛍光生体イメージング技術を駆使して、分子標的治療薬のin vivoでの薬効評価を行うことができ、平成28年度終了時としては順調に経過している。近年、生物学的製剤の登場により、従来の治療法では疾患活動性をコントロールできなかった症例においても、関節破壊の進行を強力に阻止し、病状を寛解に持ち込むことが可能となった。現在、抗TNFα抗体や抗IL-6受容体抗体、T細胞選択的共刺激調節剤(CTLA4-Ig)など様々な生物学的製剤が、関節リウマチ治療において臨床応用され、その骨破壊抑制効果が示されているが、生体内における各種薬剤の破骨細胞に対する作用機序の差異については不明な点が多い。本研究では、二光子励起顕微鏡を駆使して、個体を生かしたまま生体骨組織内をリアルタイムで観察し、生物学的製剤が炎症によって誘導された破骨細胞の動態に及ぼす効果を解析した。その結果、抗TNFα抗体治療群および抗IL-6受容体抗体治療群では、成熟破骨細胞の骨吸収活性の低下が認められた。一方、CTLA4-Ig治療群では、成熟破骨細胞の骨吸収活性に変化を認めなかったが、破骨前駆細胞の運動能が亢進し、血中へ還流していく様子が観察された。さらに、CTLA4-Igの標的分子CD80/86は、成熟破骨細胞よりも破骨前駆細胞に強く発現していることが分かった。以上より、抗TNFα抗体および抗IL-6受容体抗体は主に成熟破骨細胞、CTLA4-Igは破骨前駆細胞に強く作用し、それぞれ異なる作用機序で骨破壊を抑制し得ることが明らかとなった。

本研究で確立した生体イメージング技術は、生きた骨・関節組織内の様々な細胞の挙動や機能を時空間的に解析することができるため、今後、関節リウマチの病態解明や新規治療薬の開発において強力な手段となることが強く期待される。関節リウマチは、炎症性骨破壊を来す難治性の自己免疫疾患である。近年、様々な生物学的製剤が関節リウマチ治療において臨床応用され、その骨破壊抑制効果が示されているが、生体内における各種薬剤の作用機序の差異についてはよく分かっていない。本研究では、骨・関節破壊の現場をin vivoで可視化する蛍光生体イメージング系を確立し、炎症性骨破壊における生きた細胞の動態を明らかにした。さらに、本技術を用いて、各種生物学的製剤が炎症によって誘導された破骨細胞に及ぼす効果を解析し、薬剤間の薬効の差異を解明した。現在、分子標的治療薬として、炎症性サイトカインを標的とする生物学的製剤や、T細胞の活性化を阻害する生物学的製剤、JAKを標的とした低分子量化合物が本邦のRA治療において臨床応用され、「早期の診断と治療介入により寛解を目指す」というのが主な指針となっている。一方で、患者によって薬剤の効果にはばらつきがあり、「関節炎の発症過程において、“どのタイミングで(どれほど早期に)"、“どの薬剤"を選択して使えばいいのか」を判断する明確な基準がない。また、生体内に投与した分子標的治療薬が“実際に"関節炎局所に運ばれて効いていることを確認した報告はなく、「分子標的治療薬が生体内で“いつ"、“どこで"、“どのようにして"効果を発揮するのか」、その薬理作用の詳細についても未解明な点が多い。今後、本研究で確立した蛍光生体イメージング技術を駆使して、炎症関節内における各種薬剤の体内動態や標的細胞に及ぼす効果など、薬効発現の機序を実体的に解明する。現在、様々な分子標的治療薬がRA治療において臨床応用されているが、「分子標的治療薬が生体内で“いつ"、“どこで"、“どのようにして"効果を発揮するのか」、その薬理作用の詳細については不明な点が多い。今後、本研究で確立した蛍光生体イメージング技術を駆使して、作用機序の異なる分子標的治療薬が、病態の“どの時期"の“どの細胞"に“どのような効果"を及ぼしているのか時系列を追って解析し、薬剤間の薬効の差異を評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学29年度が最終年度であるため、記入しない。
組換え乳酸菌・酵母菌を用いたジカウイルス経口粘膜ワクチン開発の基礎的研究

当初の計画では、乳酸菌発現系に用いるベクターはMoBiTec社NICE Expression System for Lactococcus lactisのpNZ8149を、また酵母菌発現系のそれはInvitrogen社pYD1 Yeast Display Vector KitのpYD1を予定していたが、前者は菌体表面に蛋白質を発現させるモチーフであるLPXTG型細胞壁アンカー遺伝子が含まれないため、それをC末端側に含んだ融合蛋白質として発現させるpSGANC332(ヤクルト中央研究所により開発)を、また後者は既に販売終了となっていることが判明したため、酵母菌EBY100株菌体表面にGAL1プロモーター活性化により蛋白質を発現させるpYES3_Aga2P_SacB_AGIA_Aga2m(Invitrogen社pYES3/CTをベースに富山大学大学院医学薬学研究部免疫学部門により作成)を用いるように計画変更した。それぞれのベクターに、ジカウイルス(ZIKV)(strain PRVABC59)のエンベロープ(E)蛋白質N末端80%部分(E蛋白質アミノ酸残基1-409番目)をコードする遺伝子部分を挿入したpSGANC332_ZIKVE(N80%)及びpYES3_Aga2P_ZIKVE(N80%)_AGIA_Aga2mの構築を計画したが、ジカウイルスは2種告示において未認定のため、組換え実験には拡散防止措置の大臣確認申請を要し、現在大臣確認申請中であるが、未だ認可されていない。よって今年度は、ワクチン抗原のコントロールとして用いる予定のGFPを乳酸菌もしくは酵母菌の菌体表面に発現させる発現ベクターであるpSGANC332_GFP及びpYES3_Aga2P_GFP_AGIA_Aga2mの構築を行ない、前者についてはほぼ完成した。遺伝子組換え実験の大臣確認申請が遅れ、それが未認可のため。遺伝子組換え実験の大臣確認申請が未認可のため、ジカウイルスE蛋白質を菌体表面に発現させた乳酸菌株及び酵母菌株の作製が出来ず、それらの経口免疫による免疫反応の検討が出来なかったが、現在申請中の大臣申請が認可され次第、乳酸菌や酵母菌及びマウスリンパ球培養用の培地・培養器具、マウス及びその飼料、ELISA用のELISAプレートや標識抗体及び発色基質、エピトープ合成ペプチド、ELISPOTアッセイキット、XTTアッセイキット、マウスIL-2等のサイトカイン、ウエスタンブロットに用いる電源装置などを購入する予定である。
遺伝性脱髄疾患モデルにおける末梢神経病態の解明と治療法の開発

<研究の目的>申請者は遺伝性脱髄疾患Krabbe病の現在唯一の治療法である、骨髄移植が中枢神経病変に対しては有効であるにも関わらず、末梢神経病変が改善しない、あるいは骨髄移植後さらに進行することに着目し、この病態解明を目的とした。<研究成果>Krabbe病のモデルマウスであるTwitcher(TW)の末梢神経での脱髄後の再髄鞘化においてはシュワン細胞と軸索の相互関係に変化が見られた。すなわち、脱髄によってミエリンの脱落と跳躍伝導に必要なRanvier絞輪の構造は失われる。髄鞘形成細胞である、シュワン細胞は再び、軸索にミエリンを巻こうとするのであるが、その際、脱髄に伴う炎症性サイトカインによって増殖したシュワン細胞は過剰発現し、それらが、正常の髄鞘形成を妨げてしまう。(1)骨髄移植後のTWの坐骨神経の電子顕微鏡において脱髄によって不完全になったRanvier絞輪構造の上に余剰のシュワン細胞の突起が重なり、機能的に回復しえない像を見いだした。<研究の意義>これらの結果は脱髄の程度を抑えることのみならず、炎症性サイトカインによってシュワン細胞が異常増殖することを防ぐことが末梢神経の機能的回復には不可欠であることを示すものであり、今後の治療戦略の鍵となる。申請者はKrabbe病(GLD)のモデルマウスであるtwitcher (TW)の末梢神経において脱髄が中枢神経の病変の始まりに進行しておこっていること、脱髄の進行した末梢神経では異常な太さを持ち、シュワン細胞と細胞外マトリックス(ECM)が増加していることを見いだしている。1)末梢神経の切片の作成と免疫染色日齢45のTWの坐骨神経、三叉神経の免疫染色においては未熟なシュワン細胞のマーカー(GFAP)が増大し、蓄積したECMはAlucian blueで陽性に染色され、laminin, fibronectin, collagenIVなどの成分が増加していた。2)治療による末梢神経病変の変化エストロゲン治療を行ったTWでは末梢神経症状の軽減は認めず、組織においてもシュワン細胞の増殖やECMの蓄積の軽減は得られなかった。3)脱髄-再髄鞘化による末梢神経の機能的変化Na^+チャンネル,K^+チャンネル,NCPの免疫染色を行い、Ranvier絞輪の構造的変化を観察した。余剰なSchはonion-bulb (OB)を形成し、その突起はRanvier絞輪を覆っていた。さらにNa^+チャンネルはRanvier絞輪に限局することなく、axonに沿って広範に分布を認めた。またBMT後のTWにおいてもECMの蓄積は残存し、OBの形成も認め、さらにはNa^+チャンネルの異常分布も存在した。上記の結果よりKrabbe病において骨髄移植(BMT)による改善の違いは中枢神経における髄鞘形成細胞であるオリゴデンドロサイトが脱髄の際に減少する一方、末梢神経における増殖するシュワン細胞の性質の違いによると考えられる。これらの末梢神経の特徴は遺伝性肥大性ニューロパチーの病理所見と類似し、BMT後にも残存した。H19年では再髄鞘化によるRanvier絞輪の変化について検討していく予定である。
海洋環境モニタリングを目的とした高次捕食者の環境応答特性の解明

本研究では、海洋生物が環境に対して応答する過程を明らかにすることを目的として、海洋生態系の高次捕食者を対象に、餌環境情報の収集と生物の行動モニタリングを行った.本年度は、今までに得られたデータの解析を進めた.キタゾウアザラシは,摂餌回遊中,一度も陸に上がることなく深い潜水を繰り返している.このため,アザラシがどのように休息するのかは,長い間注目されてきた.潜水深度と潜水速度から得られたデータでは,採餌行動を連続的に行ったあと,「ドリフト潜水」と呼ばれる特徴的な潜水行動を行うことが知られている.この潜水では,150mの深さまでは毎秒1.5mほどの速さで潜降するものの,150m以深になると遊泳速度および鉛直速度が極端に遅くなる.先行研究では,その鉛直速度が個体の体脂肪率,つまり個体が持つ浮力によって変化することから,この潜水中は,アザラシがただ「漂流(drift)」していると考えられており,休息および餌消化のための潜水であることが示唆されている.しかしながら,このドリフト潜水中に,実際どのような行動をとっているのかは明らかではなかった.そこで,キタゾウアザラシに装着した地磁気・加速度データロガーによって得られた情報から,キタゾウアザラシの三次元潜水行動を再構築し,休息中の行動モニタリングを行った.この結果,休息潜水では,アザラシがほとんどヒレを動かさず,エネルギーを節約していることが明らかとなった.これは,他の潜水においてヒレを動かすことにより,水平および鉛直移動速度を上昇させているのと対照的であった.また,再構築した三次元潜水経路,およびアザラシの体軸角度から,「漂流」しているとされている時には,アザラシが仰向けになって落ち葉のように揺れながら,大きく旋回して海の中を落ちていくことが明らかとなった.この成果はBiology Lettersに投稿中である.本研究では、海洋生物が環境に対して応答する過程を明らかにすることを目的として、海洋生態系の高次捕食者を対象に、餌環境情報の収集と生物の行動モニタリングを行う.本年度は、キタゾウアザラシ、キタオットセイを対象として調査を行った。2006年5月,アメリカ、カリフォルニアに上陸したキタゾウアザラシの成熟メスから加速度データロガー、胃内温度データロガー、および衛生発信器を回収した.また、79月、ロシア、北千島列島にて、繁殖期のキタオットセイ成熟メスに地磁気・加速度データロガー、胃内温度データロガー、GPSデータロガーの装着・回収を行った。この結果、キタゾウアザラシは摂餌の際には急角度で潜降し,さらにヒレを多く動かすことによって,鉛直速度を速めていることが明らかとなり,エネルギー節約よりも,移動時間の節約を優先させていることが考えられた.また,移動の際には浅い角度で潜降して水平移動速度を速めていることが明らかとなった.休息では,ほとんどヒレを動かさないかわりに,鉛直・水平移動速度が遅く,エネルギー節約を優先していることが明らかとなった.以上より,キタゾウアザラシは,潜水の機能によって行動を変化させていることが示唆された.潜水の機能は餌環境によって変化することが予測されることから、今後は、胃内温度、GPSによる回遊経路によって得られた行動情報・海洋環境情報とあわせて解析することによって、環境に対する高次捕食者の応答特性を明らかにする。以上の成果の一部は、学会および投稿論文にて発表した。また、残りの結果も学術雑誌への投稿を準備中である。本研究では、海洋生物が環境に対して応答する過程を明らかにすることを目的として、海洋生態系の高次捕食者を対象に、餌環境情報の収集と生物の行動モニタリングを行う.本年度は、今までに得られたデータの解析を進めた.回遊中のキタゾウアザラシは,採餌行動を連続的に行ったあと,「ドリフト潜水」と呼ばれる特徴的な潜水行動を行うことが知られている.この潜水では,遊泳速度および鉛直速度が極端に遅くなること,その鉛直速度は個体の体脂肪率、つまり個体が持つ浮力によって変化することから,この潜水中は,アザラシがただ「漂流(drift)」していると考えられており,休息および餌消化のための潜水であることが示唆されている.しかしながら,このドリフト潜水中に,実際どのような行動をとっているのかは明らかではなかった.そこで,キタゾウアザラシに装着した地磁気・加速度データロガーによって得られた情報から,キタゾウアザラシの三次元潜水行動を再構築し,休息中の行動モニタリングを行った.この結果,休息潜水では,アザラシがほとんどヒレを動かさず,エネルギーを節約していることが明らかとなった.また,「漂流」しているとされている時には,アザラシが仰向けになって落ち葉のように円を描いて海の中を落ちていくことが明らかとなった.摂餌潜水が回遊中の「動」であるとすると,このような休息潜水は「静」であると言える.休息行動もあわせて考えることは回遊全体におけるエネルギー収支を考える上で非常に重要である.今後は、海洋環境情報とあわせて解析することによって、環境に対する高次捕食者の応答特性を明らかにする。以上の成果の一部は、学会にて発表した。本研究では、海洋生物が環境に対して応答する過程を明らかにすることを目的として、海洋生態系の高次捕食者を対象に、餌環境情報の収集と生物の行動モニタリングを行った.

本年度は、今までに得られたデータの解析を進めた.キタゾウアザラシは,摂餌回遊中,一度も陸に上がることなく深い潜水を繰り返している.このため,アザラシがどのように休息するのかは,長い間注目されてきた.潜水深度と潜水速度から得られたデータでは,採餌行動を連続的に行ったあと,「ドリフト潜水」と呼ばれる特徴的な潜水行動を行うことが知られている.この潜水では,150mの深さまでは毎秒1.5mほどの速さで潜降するものの,150m以深になると遊泳速度および鉛直速度が極端に遅くなる.先行研究では,その鉛直速度が個体の体脂肪率,つまり個体が持つ浮力によって変化することから,この潜水中は,アザラシがただ「漂流(drift)」していると考えられており,休息および餌消化のための潜水であることが示唆されている.しかしながら,このドリフト潜水中に,実際どのような行動をとっているのかは明らかではなかった.そこで,キタゾウアザラシに装着した地磁気・加速度データロガーによって得られた情報から,キタゾウアザラシの三次元潜水行動を再構築し,休息中の行動モニタリングを行った.この結果,休息潜水では,アザラシがほとんどヒレを動かさず,エネルギーを節約していることが明らかとなった.これは,他の潜水においてヒレを動かすことにより,水平および鉛直移動速度を上昇させているのと対照的であった.また,再構築した三次元潜水経路,およびアザラシの体軸角度から,「漂流」しているとされている時には,アザラシが仰向けになって落ち葉のように揺れながら,大きく旋回して海の中を落ちていくことが明らかとなった.この成果はBiology Lettersに投稿中である.
未利用熱を中心とした広域熱交換ネットワークの空間計画と評価

地下熱、産業排熱等未利用エネルギーは都市域にも豊富に存在し、それを最大限活用することは持続可能な低炭素社会への転換に対して重要な手段である。本研究では、次世代地域熱供給、高効率ヒートポンプ、大規模蓄熱等技術開発の進捗を把握しながら、地域エネルギー需給の時空間分布に応じた広域熱交換ネットワークの計画と評価モデルを開発することで、経済性と環境性両方を考慮して未利用熱を最大限活用する地域エネルギー計画方法を提示する。
脳梗塞部位における低分子G蛋白の活性化機序と病態形成への関与に関する研究

1.ラットの脳炎症モデルによる、mPGES-1の発現誘導の検討:以降の研究の前実験として行った。リポポリサッカライド(LPS)を黒質に投与すると、mPGES-1の発現誘導が観察され、発現細胞は、神経細胞、ミクログリヤ、脳血管内皮細胞であった(J.Neurochem.(2005)94(6):1546-1558)2.ラット、マウス脳梗塞モデル(中大脳動脈閉塞-再灌流)による梗塞巣拡大・憎悪菌子の検討:再灌流後、結紮中大脳動脈支配領域の梗塞巣では、mPGES-1の顕著な発環誘導が見られた(ラットモデルの場合、PGE2の含有最は対象半球の約10倍)。mPGES-1欠損マウスでは、野生型ラットで見られたPGE2産生の増加が、消失するだけでなく、神経障害も改善された。さらに、このmPGES-1欠損型マウス脳室内にPGE2を投与すると、虚血障害は野生型と同程度まで増悪した(投稿中)。上記よりmPGES-1が虚血・再灌流に伴う脳梗塞の形成・拡大・憎悪因子の一つであると結論付けた。3.炎症物質リゾフォスファチジン酸(LPA)によるラット由来アストロサイトの活性化とRho-kinaseの関与に関する検討:LPAによるアストロサイトの形態変化はRho-kinaseによるMLCリン酸化の亢進と細胞骨格変化によることを明らかとした(投稿準備中)。4.炎症関連物質ブラジキニン(BK)、LPAによる新規なタンパク質リン酸化経路の活性化の検討:神経細胞をBK刺激したとき、もしくは活性化したPKCはMARCKSをリン酸化し、このリン酸化経路の一部は低分子Gタンパク質RhoAおよびRho-kinaseを介することを明らかとした(Tanabe et al. (2006)BBRC345 156-161、一部継続中)。5.カルシウム/カルモデュリン依存性キナーゼIβ2(CaMKIβ2)の活性制御メカニズムの解析:CaMK1β2がCaMKKによりThr171がリン酸化されることにより活性化され、Thr304,Ser305の自己リン酸化により不活性化されることを明らかとした。この現象はCaMKIβ2特有である(継続中)。1.炎症性メディエータにより活性化される低分子G蛋白とそのエフェクター(蛋白リン酸化酵素)の探索、および標的蛋白のリン酸化経路確認。(2)リゾフォスファチジン酸(LPA)刺激による、RhoK活性化機序の探索(Rhoキナーゼ経路とPKC経路のクロストーク):リゾフォスファチジン酸(LPA)刺激によるMARCKSのリン酸化経路をRho-kinase阻害薬が阻害した。現在、RhoA/Rho-kinase系とGq/PKC経路との相互活性化機構を分子レベルで確認中(継続)2.ラット脳梗塞(MCAO)モデルを用いた、梗塞巣における蛋白誘導の確認と梗塞巣拡大因子(誘導発現蛋白、及び低分子増悪因子)の探索(1)ラットMCAO・再灌流モデルにて、mPGES-1の有意な誘導発現(mRNAと蛋白レベル)が梗塞側の線条体と皮質で見られ、皮質のPGES活性の上昇とPGE_2含量の増加が見られた。

更に、梗塞側の皮質にてmPGES-1を誘導発現する細胞が、ミクログリアであることを組織染色にて確認した。3.梗塞巣拡大候補因子(mPGES-1およびPGE_2)の機能確認:拡大因子欠損マウスを用いた確認(1)mPGES-1欠損マウス(KOマウス)MCAO・再灌流マウスモデルにて、梗塞巣領域(殊に、皮質)が、正常マウスのそれよりも有意に小さかった。現在、梗塞関連項目、及び神経症状について、KOマウスと正常マウスとで比較検討している(継続中)。平成17年度研究実績の概要1.ラット脳梗塞モデル(中大動脈閉塞-再灌流)による梗塞巣拡大・増悪因子の検討。再灌流6時間後の梗塞巣(皮質)では、mPGES-1のmRNAと蛋白の顕著な発現誘導が見られ、PGE_2の含有量は対照半球の皮質のそれに比して約10倍高かった。また、誘導されたmPGES-1は、主として、梗塞周辺部では神経細胞に、梗塞中心部ではミクログリアに発現していた(投稿中)。2.マウス脳梗塞モデル、およびmPGES-1欠損マウス脳梗塞モデルによるmPGES-1発現誘導の検討。上記ラット脳梗塞モデルの結果と同様の結果が、マウス脳梗塞モデルにおいても得られた。更に、mPGES-1欠損マウスでは、これら虚血・再灌流に伴う反応が抑制されることを確認した。さらに、この欠損マウスにPGE_2を脳室内投与し、梗塞巣形成と神経障害・運動障害の復帰が見られることを確認した(投稿中)。我々は、上記のことより、mPGES-1が虚血・再灌流にて生ずる脳梗塞の形成、拡大・増悪因子の1つと結論づけた。3.炎症物質リゾフォスファチジン酸(LPA)によるラット由来アストロサイトの活性化とRho-kinaseの関与に関する検討。LPAによるアストロサイトの形態変化(活性化)は、Rho-kinaseの活性化による、ミオシン軽鎖のリン酸化の亢進と細胞骨格変化よることを、ミオシン軽鎖変異体とRho-kinase阻害薬を用いて明らかにした(投稿準備中)。4.炎症関連物質、ブラジキニン(BK)、LPAによる新規な蛋白リン酸化経路の活性化の検討。神経培養細胞をBKにて刺激すると、MARCKSのリン酸化がみられ、このリン酸化がsmall G-protein Cdc42/PAKによる可能性を示した(継続中)。また、PKC活性化因子PDBuによるMARCKSのリン酸化には、RhoA/Rho-kinase系の活性化が関わっていることを、薬理学的に、分子生化学的に示した(投稿中)。5.脳神経細胞特異カルモデュリン依存性キナーゼ1β2(CaMK1β2)の活性化機序の検討。CaMKII、と異なり、CaMK1β2は、CaMKKによるThr171のリン酸化により活性化され、直ちに、Thr304,Ser305が自己リン酸化され、その活性が低下することを見出した。その後、脱リン酸化によって、もとの不活性化体に戻ると考えられる。この活性制御機序は、従来型のCaMKIIのそれとは全く異なる(継続中)
高度好熱細菌カルジオリピン合成酵素系遺伝子の大腸菌でのクローニングと発現的異性の解明

生体膜構成成分として不可欠なリン脂質、特に酸性リン脂質カルジオリピン(CL)、その前駆体ホスファチジルグリセロール(PG)の機能発現および制御過程を解明のため、高度好熱菌CL合成系遺伝子をクローニングし、リン脂質を安定に大腸菌で大量に合成することを目的とした。[1]高度好熱菌(Thermus thermophilus)HB8株染色体DNA断片をクローニングベクタpNS582tet14Ad(Dupont)を用いてin vitroでP1 phage粒子にまたはプラスミドpWSK129のBamHI部位へパッケージングし、得られた染色体DNA断片を挿入したプラスミドにより、大腸菌ホスファチジルグリセロリン酸(PGP)シンターゼ遺伝子(pgsA)の欠損変異pgsA3株、またCLシンターゼ遺伝子(cls)欠失変異(cls::kan)とホスファチジルセリンシンターゼ温度感受性変異(pssA1^<ts>)を同時に保持した株を形質転換し、変異を相補する株を選択した。この結果、ampicillin耐性でpgsA3変異に関わる低浸透圧NBY培地で生育する株が9株、また運動性が回復した株が5株分離された。すべての形質転換株においてはPGまたはCL合成の回復が認められなかった。[2]我々で構築した大腸菌における膜リン脂質の生合成、組成を改変するリン脂質合成酵素遺伝子の増幅あるいは欠損、欠失変異株が標題細菌遺伝子クローニングの際、変異相補の選択指標になりうるかどうかを調べ、有用な指標を上記クローニングに用いた。1)大腸菌のCL合成は生育定常期に増大し、CL合成酵素活性も約10倍に増加した。一方、CL合成酵素欠失変異(cls::kan)株では定常期以降で菌の生存率が1万分の1に低下した。CLが生育定常期に必須で、細胞周期依存的にCLが機能と推察した。2)酸性リン脂質合成開始過程のPGPシンターゼの点突然変異でその合成が大幅に低下したpgssA3変異株では野生株に比べ低浸透圧培地(NBY)で生育せず、菌の運動性が低下し、鞭毛蛋白質の合成が欠損し、鞭毛合成制御遺伝子flhDの転写発現低下と対応していた。これらの結果は大腸菌でも未知の酸性リン脂質合成の制御に関わる遺伝的要因を増幅という条件で好熱細菌で見いだした可能性もあり、好熱細菌を含めて他の生物でのカルジオリピン合成系遺伝子の本格的クローニングのためにきわめて有用な知見と言える。B)クローニングすべき大腸菌変異株の構築と性質の解析1)上記で作成した,標題細菌染色体遺伝子ライブラリーより構築したプラスミドによる形質転換でCLおよびPGPシンターゼ活性が増大した株を選択するために,適切な大腸菌の酸性リン脂質合成欠損変異株の選択と培養条件の設定を試みた。PGなど酸性リン脂質合成欠損株として取得されているpgsA3変異株にPGを消費する系としてlppまたはcls保持プラスミドで形質転換した株の構築を試みた。

CLシンターゼ遺伝子のクローニングにはCLシンターゼ遺伝子欠損株に同時にPSシンターゼの温度感受性変異を保持した株を用いた。3)標題細菌のPGPまたはCLシンターゼの比活性が大腸菌のと著しく異なることも予想されるので,モデル系として,大腸菌のPGPシンターゼ保持の低コピープラスミドpPG2による形質転換,PGPシンターゼ遺伝子pgsAをP1ファージにより酸性リン脂質合成欠損変異株pgsA3へ形質導入し,酵素活性が検出できるかどうかコロニーラジオオートグラフィーにより調べた結果,1コピーまたは低コピーのpgsA遺伝子の導入で,PGPシンターゼ活性またPG合成の回復が検出可能である事を明らかにした。1.高度好熱菌(Thermus thermophilus)酸性リン脂質合成酵素遺伝子のクローニングの継続。1)標題細菌染色体遺伝子ライブラリーを染色体DNAのSau3A部分分解物の,サブクローニングに用いるプラスミドpWSK29のBam HI部位へのパッケージングにより作成した。得られた約5kbに切断した染色体DNAを挿入したプラスミドにより,大腸菌ホスファチジルグリセロリン酸(PGP)シンターゼ遺伝子(pgsA)の欠損変異pgsA3株,またカルジオリピン(CL)シンターゼ遺伝子(cls)欠失変異(cls::kan)とホスファチジルセリンシンターゼ温度感受性変異(pssAl^<ts>)を同時に保持した株を形質転換した。2)プラスミドの保持するampicillin耐性と酸性リン脂質が大幅に欠損したpgsA3変異株が低浸透圧寒天培地(NBY)で生育不能な性質並びに菌の運動性が低下する性質を利用して,クローニングした遺伝子の発現で変異が抑制され,生育または運動能の回復が認められる株を選択した。3)この結果,ampicillin耐性で低浸透圧培地で生育する株が9株,また運動性が回復した株が5株分離された。これらの株を培養し,その総リン脂質組成を調べたが,すべて酸性リン脂質pgsA3変異株においてはPG及びCL,他方cls:kan,pssAl^<ts>変異株においてはPGまたはCLの合成の増大がいずれも野生株レベルでは認められなかった。4)これらの結果はクローニングされたのがカルジオリピン合成系遺伝子の完全型でないか,好熱性細菌の遺伝子のため異種の大腸菌では膜での存在状態の違いにより発現不全を示すのか,大腸菌での酸性リン脂質欠損による表現型の変異が酸性リン脂質合成に非依存的に相補抑制されるなどの可能性が推察される。2.カルジオリピン合成酵素系遺伝子のクローニングに用いた大腸菌リン脂質合成欠損変異株の性質の解析リン脂質生合成の増幅あるいは欠損,欠失改変系を構築し,それらを用いて大腸菌における膜リン脂質の機能を検索している。これら解析した機能の関連性が標題遺伝子クローニングの際,変異相補抑制の選択指標になりうるかどうかを調べ,きわめて興味ある結果を得た。1)大腸菌のカルジオリピン合成は生育定常期に増大するが,CL合成酵素活性もこの時期に約10倍に増加した。一方,CL合成酵素欠失変異(cls::kan)株では定常期以降で菌の生存率が1万分の1に低下した。このことはCLが生育定常期に必須であり,細胞周期依存的にCLが機能していることを示唆した。2)酸性リン脂質合成開始過程のPGP synthaseの点突然変異でその合成が大幅に低下したpgsA3変異株では野生株に比べて菌の運動性が低下し,鞭毛蛋白質の合成が欠損していた。これは鞭毛合成制御遺伝子の転写低下と対応していた。
超微細構造化されたプローブによるエバネッセント波の形成とその応用

本年度は、まず、先端の大きさが光の波長以下まで微細構造化された金属針によって形成されるエバネッセント場の分布、およびそのプローブを用いて得られるニアフィールド顕微鏡像を数値計算によって求めた。解析法には、有限差分時間領域法(FD-TD法)を用い、3次元解析を行った。解析モデルとしては、プリズム表面に金属針を配置し、プリブム側から全反射角以上の角度で平面波を入射する場合を考えた。その計算結果から、金属針の先端のλ/10程度の領域に、入射させたエバネッセント波の数10倍程度の強いエバネッセント場を形成できることがわかった。さらに、微細構造によって形成されたエバネッセント波を、プローブによって散乱させたときに得られる散乱場から、ニアフィールド顕微鏡によって得られる光学像を解析した。解析したモデルにおいては、試料は、幅および高さがλ/5の微小な立方体であり、入射波は平面波であった。このとき、試料表面上に形成されたエバネッセント場を、幅λ/10の微小開口プローブを走査するとによって検出した。その結果、プローブが存在しないときには、試料である微小立方体の周辺部に、強度の大きなエバネッセント場が形成されいるにも関わらず、その表面に沿ってプローブを走査したときに得られる光学像は、微小立方体の中心部が盛り上がった形状となることがわかった。これは、プローブが存在しない場合に、凸部のエッジ部分にエバネッセント波が強く存在するのとは、逆の結果になっている。このような比較は、今回のようにセルフコンシステントな相互作用を取り入れた理論解析によって初めて明らかになったものである。効率よくエバネッセント波を形成するための微細プローブ作製法として、2光子吸収を利用した3次元微細加工技術に関する基礎実験を行った。実験では、モードロックTi:Sapphireレーザーを紫外線硬化樹脂中に集光し、集光スポット部分で2光子吸収を起こし、スポット部分の紫外線硬化樹脂のみを選択的に硬化させた。集光スポットを樹脂中で走査することにより、3次元微小構造体を形成した。3次元微小構造体の例として、直径6μm、奥行き方向の間隔8.7μmのらせん構造体を形成した。試作したシステムの加工分解能は、レーザー光を1点に集光した際に硬化する樹脂の領域によって決定される。我々は、現在、面内方向、光軸方向ともに、約1μmの加工分解能を達成している。
コロイドナノ粒子の新しい成形指針の確立

以下の実験結果に基づきコロイドナノ粒子の新しい成形指針が確立された。(1-1)低分子量アミノ酸を含むナノ粒子サスペンションの定速加圧ろ過及び定圧ろ過、(1-2)サスペンションの固化に及ぼすろ過圧及び温度の影響、(1-3)サスペンションの交流電場下における加圧鋳込み、(2-1)サスペンションおよび成形体の粘弾性特性評価、(2-2)アルミナサスペンションの粘弾性特性に及ぼすフェニルアラニンの影響、(3-1)二粒子系炭化ケイ素サスペンションの流動性と加圧ろ過特性、(3-2)アルミナ多孔体の圧縮強度、(3-3)アルミナ多孔体のガス透過性、(3-4)炭化ケイ素多孔体のガス透過性。粒径の異なる3種類の粒子(800nmと30nm SiC粒子、150nm Al_2O_3粒子)に2種類の分散剤(フェニルアラニンとポリアクリル酸アンモニウム)を添加し、加圧ろ過プロセスおよび成形体密度を調査した。これらの粒子に対して、低分子量分散剤(フェニルアラニン)は脱水圧の低下および高密度化に効果的であった。また、フェニルアラニンは二官能基を有するため粒子表面の電荷によらず吸着し、成形体密度を増加させた。pH7の負に帯電した800nm SiCに対して高分子量分散剤(ポリアクリル酸アンモニウム)は高密度化に効果的であった。pH3の正に帯電したアルミナに対しては、ポリアクリル酸は解離していないため、大きな影響を与えなかった。一方、交流電場を印加した加圧ろ過では帯電した粒子と隣の粒子の電気二重層が相互作用し凝集構造をとり、ろ過圧力を減少させた。交流電場下では電気二重層の変形のためにろ過時間が短縮されることがわかった。Voigtモデルによる固化挙動解析により、Al_2O_3サスペンションのろ過プロセスは、ろ過の初期から中期は液体を押した時の変形挙動、後期は固体を押した時の変形挙動と等価であると解釈できた。1MPaの定圧ろ過においては初期の構造が緩やかに変形するが、10MPaの定圧ろ過においては凝集構造が速やかに分散粒子へ相転移することがわかった。アルミナサスペンションの定圧ろ過プロセスに及ぼす直流及び交流電場の影響を調べた。ろ過中に直流電場を印加すると、粒子より液中のイオンが電極へ早く移動する。その結果、帯電粒子間の静電反発エネルギーが高くなり、ろ過圧の上昇が引き起こされることがわかった。一方、交流電場下では、粒子をとり囲む電気二重層内のイオンの周期的変動が起こる。その結果、静電引力エネルギーにより粒子の凝集が起こり、ろ過圧の低下が引き起こされることがわかった。次に、pH、体積濃度が異なるアルミナサスペンションとこれを固化した加圧ろ過成形体の動的粘弾性特性を測定した。粘弾性体では負荷する応力と検出される歪みの間に位相差が生じる。この位相差により、貯蔵弾性率(E')、損失弾性率(E")および損失正接(E"/E'=tanδ)を算出した。本実験では-100°C100°Cでサスペンションの粘弾性粘弾性を測定した。10vol%アルミナサスペンションのE'は、氷の融解にともない0°Cで大きく低下した。さらに、20-50°C付近にE'のピークが観察された。これはサスペンション中の粒子充填構造の変化を反映していると推察される。また、アルミナサスペンションの固体量を増加させるとアルミナ成形体の粘弾性特性に類似することがわかった。すなわち粒子間の溶液の固化、融解にともなうE'の変化はほとんど観察されなくなる。(1)pH 3.0ー9.0の10ー30vol%アルミナサスペンション(粒径200 nm)の粘度と加圧ろ過プロセスに及ぼす温度の影響を調査した。20ー60 °Cでのコロイド粒子間の静電反発エネルギー(Er)をDLVO理論で計算したところ、温度効果は小さいことが分かった。理論から予想されたように、25ー40 °Cでのサスペンションの見かけ粘度の温度変化は小さかった。よく分散したpH 3.0のサスペンションでは、温度の上昇に伴い低圧でろ過が進行した。等電点に近いサスペンションは温度上昇に伴い、ポーラスなケーキが生成した。しかしながら、仮焼後の密度はサスペンション温度に依存しないことが分かった。(2)メディアン径800 nmの炭化ケイ素に焼結助剤の200 nmアルミナ粒子と80 nmイットリア粒子を計4 mass%加えたサスペンションを作製した。これをろ過法で成形し、成形体を39 MPaの圧力下で焼結させた。

焼結温度1400、1500、1700 °CでのSiCの相対密度はそれぞれ61, 69, 75%で、1900 °Cでは相対密度99.8%の緻密体が得られた。これらの多孔体において、N2, CO2, O2ガスの流束はある臨界圧以上において圧力に比例して増加した。ガスの透過係数をPoiseuilleの式に基づき計算した。計算値と実測値の透過係数αの桁は一致した。1メデイアン径310 nmのアルミナ粒子を含む水性サスペンションの粘弾性特性、2加圧ろ過法で作製したアルミナ仮焼体の圧縮変形挙動、3アルミナ仮焼体のガス透過性、4二粒子系炭化ケイ素サスペンションのレオロジーと加圧ろ過特性、について実験を行った。主たる結果を示す。1については、アルミナに対して分散剤のフェニルアラニンを0-8 mass %添加した。フェニルアラニンの量が増加すると高温まで粒子の分散性が維持され、粒子の凝集が阻害されることがわかった。2については、空隙率40%程度の仮焼体の粒界面積が増加すると、圧縮強度が増加することが実験的にまた理論的に明らかとなった。3のアルミナ多孔体の水素透過係数は二酸化炭素や窒素の透過係数よりも高いことがわかった。細孔のサイズ/ガス分子の平均自由行程の比が小さいと透過係数は増加する傾向が見られた。4については、30 nm炭化ケイ素粒子を800 nm炭化ケイ素粒子へ混合すると、(1)サスペンションのレオロジーがニュートン流動からビンガム流動へ変化すること、(2)加圧下での粒子の分散状態から凝集状態への相転移が低圧で起こること、(3)成形体密度が低下すること、が明らかとなった。アルミナサスペンションの加圧ろ過プロセスに及ぼす直流電場及び交流電場の影響を明らかにすることができた。また、アルミナサスペンションの粘弾性特性については-100°C10°Cの広い温度範囲で情報を収集できた。今後、その解析を進める。25年度が最終年度であるため、記入しない。分散剤を含むアルミナサスペンション及び成形体の粘弾性の測定と解析、2作製した成形体の圧縮強度とガス透過性の測定、3二粒子系炭化ケイ素サスペンションの流動性とろ過特性について、情報を収集できた。(1)分散剤を含むアルミナサスペンション及び成形体の粘弾性特性の測定と解析をすすめる。(2)作製した成形体の圧縮強度とガス透過性を測定する。(3)二粒子系サスペンションの流動性と固化特性を調べる。平成25年度は最終年度となる。当初の計画のとおり、より実際的な炭化ケイ素ーアルミナーイットリア三成分系のセラミックスをコロイドプロセスとホットプレス法で作製する。その微構造とガス透過性の関係を明らかにする予定である。
コンテンツの創作・流通・利用主体の利害と著作権法の役割

創作・流通・利用をめぐる環境の変化に対して現行著作権法の規定は、著作物に関わる多種多様な利害を適切に調整するためには硬直的に過ぎるとの視点にたち、著作権・著作者人格権の内容と制限に係る解釈論・立法論上の提言と、制度設計の基礎となるべき実証的・理論的な分析手法を提示した(これらの成果を論文集『しなやかな著作権制度に向けて」として刊行する予定である)。また出版者の権利のあり方に関する政策提言、著作権と刑事罰の運用に関する共同声明、シンポジウムの開催等、社会に対する情報発信・提言を積極的に行った。研究計画に従い、創作・流通・利用に関する様々な主体の活動実態について把握、分析する作業を中心に行った。また法制度の点では、権利制限の一般条項、出版社の権利等を巡る議論等を中心に検討した。今年度の特筆すべき研究成果としては以下のものがある。(1)研究会の開催計画に従い、今年度は計10回の研究会を開催した。研究会では、動画投稿サイト、ファンサブ(海外のファンが無断で日本のアニメ等に翻訳字幕を付してネットにアップするもの)、同人誌即売会・販売店の関係者、出版社の法務担当者などを招聘し、各活動の実態と利害、著作権法の役割について意見交換を行った。また出版社の権利や、後述のアンケートの調査結果についてメンバーの間で議論も行った。(2)著作権に関する意識調査の実施日本・米国・中国のクリエイター、パブリッシャー、ユーザーを対象に、著作権に関する意識調査(著作権保護の必要性など)を実施した。これらについて相互の対比を行う調査・分析は従前にはなく、現在暫定的な分析の段階でも興味深い相違点を示している。またファイル交換ソフトや動画投稿サイトの利用による損害(ユーザーにとっての利益)の評価という点でも大きな意義を有する。(詳細な分析結果は2012年中に公表予定)。(3)その他(海外でのセミナーの開催等)ロンドン大学クインメアリ校との共催により、日本の権利制限巡る議論状況についてのセミナーをロンドンで開催し(金子、連携研究者の小島・上野が報告)、同人や権利制限の一般条項等のテーマにつき英国の研究者と意見交換を行った。また、アメリカ・中国・ベトナムにおける現地調査を行い(藤本)、電子海賊版の現状、正規版出版物の提供が海賊版の減少をもたらした例等につき調査をした。さらに、白田を中心として、同人と二次創作を巡るサブ研究会を5回開催している。平成25年度の研究では、著作権の限界と制限、同人作品の実態と創作環境、出版者の権利とナショナルアーカイブ構想、TPP交渉の著作権制度に与える影響等の検討を重点的に行った。また、田中辰雄による人格的利益に関するクリエイターの意識調査、藤本由香里によるスペイン語圏での正規版・海賊版の流通状況等についての調査を行った。特筆すべき成果として以下のものがある。著作権の限界と制限については、私的複製・公衆送信に関する研究成果を学会報告・雑誌論文の形で公表するとともに、権利制限の一般条項についての論考を公表した。同人作品の実態と創作環境については、二次創作同人誌について、作者が積極的に許容する意思表示を行う「同人マーク」の策定への協力等を行ったほか、昨年度の予備調査を踏まえて白田秀彰がキャラクター性と類似性判断についての調査を実施した。著作権法に関する知識との関係等について平成26年度も継続して調査を行う予定である。出版者の権利・ナショナルアーカイブに関しては、中山信弘ら6名が明治大学知的財産法政策研究所のホームページ上で、2013年4月4日に「出版者の権利のあり方に関する提言」・「ナショナル・アーカイブと権利情報に関するビジョン」を公表し、その後も登録制度・図書館とアーカイブ化、孤児作品対策についての検討を行った。出版権については、2014年4月28日に著作権法の改正法案が成立したが、上記の提言は文化審議会著作権分科会出版関連小委員会での議論等の土台の一つとなった。実証分析に関しては、著作者の人格的利益に関するクリエイターの意識調査を行い、金銭的利益と権利論的な思考、氏名表示・改変に対するクリエイターの属性(プロかアマか)、日米の相違についての調査を行った(なおその調査結果と分析は2014年4月19日の著作権法学会で報告されている)。昨年度に引き続き、創作・流通・利用に関する様々な主体の活動実態について把握、分析する作業を進めた。平成24年度は特に、白田秀彰准教授を中心とする同人誌の実態の予備調査(類似性判断の再検討)、藤本由香里准教授によるタイでの正規版・海賊版の流通状況の実態と、めざましい成果をあげた海賊版対策の実際についての調査、及び日本マンガ学会での二次創作に関するシンポジウムの企画・司会、田中辰雄准教授を中心とする著作者の人格的利益に関するアンケート調査、私的複製についての検討(その成果は2013年4月の著作権法学会での報告の一内容となっている)、出版者の権利を巡る検討・シンポジウム開催・政策提言において重要な成果を得た。また本研究成果の一環として平成24年3月20日にロンドン大学IALSにて、日本の著作権を取り巻く議論状況についての報告を行った。特に出版者の権利については、「印刷文化・電子文化の基盤整備に関する勉強会」から隣接権を創設すべきとの案が公表されたことに鑑み、平成24年11月25日に公開セミナー「出版者の権利とその役割」を開催した。

また、議論状況から速やかな政策提言が望ましいと判断し、本研究会やセミナーでの議論を踏まえ、平成24年度末から、研究代表者の中山信弘を中心に6人のメンバー(金子講師、連携研究者の上野達弘教授、研究協力者の福井健策弁護士を含む)により、出版者の権利に関する政策提言(「出版者の権利のあり方についての提言」「ナショナル・アーカイブと権利情報に関するビジョン」)を取りまとめ、平成25年4月4日に公表した。この提言は同日「印刷文化・電子文化の基盤整備に関する勉強会」に提出され、同勉強会の方針とすることが決議されている。2014年度の活動では、私的複製、大学・図書館での教材利用や平成26年改正による出版権制度の拡充の評価、アーカイブ制度と著作権の検討の他、著作者の人格的利益についての意識調査に基づく実証分析や、台湾等でのフェアユースの導入の経済効果、中国でのマンガの正規版・海賊版の流通をめぐる現状の検討を行った。アーカイブ制度と著作権に関しては、権利者不明著作物を巡る裁定制度やイギリス等での拡大集中管理制度を参考に、日本による立法・解釈のあり方についての検討を進めている。私的複製については2013年の著作権法学会での報告と議論に基づく論考を公表した。大学・図書館での教材利用については、現行著作権法35条の制限規定の下での運用が、教材資料等のオンラインでの提供に対応していない一方、権利者・利用者による自発的な利用許諾のシステムの形成を阻害してきた側面もあることを指摘し、今後の制限規定と利用許諾のシステムの在り方についての検討を進めた。この検討成果をもとに、2015年中に大学での教材利用と著作権を巡るシンポジウムを開催する予定である。実証分析については、前年度までの調査内容を踏まえて、クリエイターの著作権保護に対する意識についての学会報告を行うとともに、人格的利益やフェアユースの点を重点的に検討し考察を行った。本科研費の検討テーマの一つである二次創作活動に対し、ハイスコアガール事件やTPP交渉による著作権侵害罪の非親告罪化の及ぼす影響を検討し、これらの問題について、私立大学戦略的研究基盤形成支援事業との共同シンポジウム「著作権・表現の自由・刑事罰」を開催したこのほか、二次創作同人誌に関連して、キャラクターの類似性について、特にイラストに関する裁判例の動向を知る前後での変化などに着目して意識調査を行っている。個別の研究テーマのうち、特に教育目的での著作物の利用と著作権制度のあり方について、初等・中等教育と高等教育にわけて、今村哲也を中心に企画し、文化庁の後援を得て2回のシンポジウムを開催した。「教育機関における著作物の複製等に関する著作権処理の現状と課題1ー初等中等教育機関の場合を中心としてー」(2015年11月26日)では、初等中等教育におけるICTの利活用について、現状と著作権をめぐる問題状況、諸外国の状況についての基調講演が行われ、パネル討論が行われた。また「教育機関における著作物の複製等に関する著作権処理の現状と課題2ー高等教育機関の場合を中心としてー」(2015年12月23日)では、明治大学におけるICTの活用事例等も踏まえて、大学における著作権問題についての活発な議論が行われた。また5年間の研究成果のまとめとして、著作権の制限と利用許諾を中心とした論文集(『しなやかな著作権制度に向けて』(信山社より、2016年秋に刊行予定)の出版に向けて、掲載予定の論文の執筆と、各論文について議論する研究会を開催した。
免疫栄養（エイコサペンタエン酸）を用いた口腔癌転移抑制の実験動物における研究

これまでに申請者らはGFPを導入したOSCCを用いて高転移株・肺転移株(OSCCN5)を樹立することに成功た。さらに、OSCCの頸部リンパ節転移に関わる因子について、樹立した高転移株を用いて、NF-κBの発現が高くなっていることを明らかにし、NF-κBの阻害剤であるNBD peptideを用いてin vivoの実験で口腔癌では、初めてリンパ節転移を抑制することに成功した(Cancer Science 103(3):455-63,2012)。本研究では、上記OSCC高転移性株を用いて、全ての癌種において初めてin vivoでの免疫栄養(EPA;エイコサペンタエン酸)を用いた転移抑制療法の開発とその分子メカニズムの解析を行う事により、これまであまり重要視されてこなかった免疫栄養(immunonutrition)の見地より傷害性の少ない新たな転移抑制療法の開発を目指している。当初の予定では、摂食が障害されない様に、GFPを導入したOSCCN5細胞をヌードマウスの皮膚に移植し、EPA含有の食餌とEPA非含有の食餌を経口から投与を行う。経口投与は摂食状態のばらつきが出ないように強制等とし、一ヶ月間、EPA投与群と、コントロール群間で体重測定、血清学的解析を行う。その後、剖検し、転移の状態を肉眼的、顕微的に評価を行うという予定であった。平成25年度の実験は予定より若干遅れているが、EPA含有の食餌とEPA非含有の食餌(コントロール群)を経口から投与している2群のヌードマウスの皮下に、GFPを導入した高転移株OSCCN5細胞を移植し、その後、経時的にマウスの全身状態、移植部(原発巣)の状態を、近々観察予定である。また3ヶ月後に剖検し、転移の状態を肉眼的、顕微的に評価を行い、EPAの腫瘍転移抑制能を評価解析予定としている。我が国における死因の第1位は、癌であり,特に癌の浸潤・転移は、癌死亡の直接な原因となるためその抑制は、重要な課題となっている。近年EPA投与によるサイトカインストームの抑制効果が報告されており、他の癌腫で癌の転移抑制効果も報告されているRose DP, Connolly JM, Coleman M. Clin Cancer Res 1996Oct;2(10):1751-6。今回我々は、口腔扁平上皮癌におけるEPA(エイコサペンタンエン酸)の癌の転移抑制効果について検討した。口腔癌細胞株を用いてin vivo selectionで高転移株の樹立に成功した。その高転移株(OSCC)をヌードマウスの舌に移植し、通常の餌と餌+EPA添加を与えたマウス群で、頸部リンパ節転移の状態の解析を行っている。これまでにEPA添加群の方が、EPA非添加群に比べ転移が抑制されている傾向が認められた。現在、EPA投与総投与量と転移抑制の関係を解析中である。今後実験を繰り返し統計的に検討を行っていく予定である。また、サイトカインは、NF-κBを介して産生されるが、高転移株においてもNF-κBの活性は確認されており、EPA投与により移植した細胞においてNF-κBの抑制を認めるか、マウスに移植したがん細胞を摘出し、原発巣の検体を免疫組織学的検討を現在行っているところである。また、今後EPA投与による細胞の遊走能・浸潤能のついても浸潤アッセイ・傷つけアッセイを行い検討予定である。現在、確立した転移細胞を用い舌から肺への転移実験を行っているが、EPAの総投与量での転移抑制の差異を、詳細に解析中である。歯科口腔外科EPA総投与量量の違いにおいての、転移抑制のデータが整えば、今後は転移制御のメカニズムの解明予定である。当科でGFPを導入したOSCCを用いて、舌癌の高転移株(OSCCN5)を樹立することに成功している。しかし、この高転移株は舌に移植した場合、高頻度に転移を来すが、皮下に移植した場合の転移の頻度はそれほど高くない。舌に移植するとEPAの経口強制投与が困難となり、EPAの摂取量と転移の状態の評価が難しくなる。そのため、実験条件の設定に手間取っている。消耗品等が節約できたため。EPAの摂取量と転移状態の評価が可能な、EPAの摂取方法と、転移株の移植方法を改善し、実験条件を設定し、予定している実験を遂行する。次年度に一緒に使用する。実験の進捗状態の変化のため。主に実験消耗品購入費、実験動物購入費として使用予定である。