hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形作用素論と相転移現象の数学的研究

本研究は、相転移現象の解析を目的として(a)非核形作用素論の研究(b)非線形偏微分方程式系への応用(c)相転移現象のモデリング(d)数値解析とシュミレーションを細項目として進められた。長期間を必要とする研究テーマであるが、本研究では、具体究では、具体的な一つの問題として、「相転移・相分離を伴う現象」の数理科学的考察がとりあげられた。まず、熱力学のギルツブルグ・ランダウ理論を基礎に、相転移現象の数学モデルを設定した。その表現には。凸関数の劣微分作用素が用いられ、従来のモデルよりも現実的なものと考えられる。さらに、このモデルあ単独の方程式ではなく、非線形発展方程式のシステムである。このモデルに関して1.解の存在.-意性及び正則性2.定常解の構造3.時刻t→+∞のとき解の漸近安定性・アトラクターの構成等の結果が得られた。より工学的な問題として、上記のモデルにさらに、時間遅れやメモリー効果を考慮したモデルが考えられるが、これらについても上記13についての研究が進められている。得られた結果の一部はすでに発表されており、その他はプレプリントとして公表される段階である。その表現には。
日台韓の空き家の実態と発生エリアのマネジメントに関する国際比較研究

本研究は、空き家ストックの流通や利活用を鈍化させている主要因とされる不動産の個人所有の仕組みが我が国と共通する台湾や韓国が、人口減少や高齢化に伴い我が国同様、空き家問題に直面し独自の取り組みを進めていることに着目し、3か国の空き家の発生実態と解決のための関係法制度やプログラムを体系的に整理するとともに、具体的な空き家発生地区の現地調査とヒアリングをもとに各国の空き家の都市的、社会的、経済的立地特性や課題等を明らかにし、加えて、都市計画的観点より解決策の探求を試み比較分析より我が国はもとより両国の空き家問題の解決への貢献をも視野に入れた空き家発生エリアのマネジメント手法を探るものである。
単球走化活性化因子(MCAF/MCP-1)の病態生理作用の解明

単球走化活性化因子(MCAF/MCP-1)を始めとする、いわゆるケモカインの病態生理作用について検討し、以下の実験結果を得た。1)尿中MCAF/MCP-1濃度がループス腎炎の活動性に応じて、変化していることを明らかにした。2)この上昇の病態生理的意義を検討するために、抗基底膜抗体投与によって起きる腎硬化症を伴う腎不全モデルを作成した。このモデルでは腎局所でのMCAF/MCP-1産生が認められるとともに、MCAF/MCP-1に対する中和抗体の投与によって、腎硬化症ならびに腎不全の発症が予防された。このことは、MCAF/MCP-1がこの病態の成立に本質的に関与していることを示唆しているとともに、MCAF/MCP-1を標的とした慢性腎不全の治療あるいは予防薬の開発の可能性も示唆している。3)MCAF/MCP-1を持続発現しているトランスジェニック・マウスの骨髄幹細胞にて骨髄キメラを作成すると、マクロファージでの接着因子の過剰発現が認められることを明らかにした。現在この現象の病態生理学的意義の解析を行っている。4)インターロイキン8(IL-8)に対する中和抗体投与によって、OK-432に引き続くリポ多糖類投与によって起きる急性呼吸窮迫症候群(ARDS)様の肺障害が完全に抑制された。このことは、肺血症に伴うARDSの発症にIL-8が関与しており、抗IL-8抗体はARDSの治療薬となるうることを示している。5)急性喘息発作ならびに慢性好酸球性肺炎などの肺局所への好酸球浸潤が認めれる疾患での、局所でのケモカイン濃度を測定した。その結果、急性喘息発作の晩期増悪の時にMCAF/MCP-1・MIP-1αなどのケモカインが局所で産生されているのに対して、好酸球性肺炎の時には別のケモカインであるRANTESが産生される可能性を示唆する結果を得た。
新疲労測定法としてのVRTとポケットフリッカ-に関する基礎的研究

本研究は、VRT装置およびポケットフリッカ-について、まだ実施していない基礎的な検討を行うことを目的とした。すなわち、VRT装置の測定における室内照度と画面輝度との影響、ポケットフリッカ-測定時の室内照度および目と視標間の距離ならびに年齢による測定値の差異を検討した。これらの成績より以下のことが明かとなった。1.VRT値は輝度による有意な々変動を示すが、照度による変動は認められなかった。したがって、VRT値は輝度を一定にすれば、周囲の照度が変化しても、その影響を受けないことが明かとなった。2.ポケットフリッカ-によるCFF値は、目と視標との距離により有意な変動が認められたが、照度による変動は認められなかった。これより、ポケットフリッカ-によるCFF値は輝度を一定にしておけば、周囲の照度が変化しても、その影響を受けないことが明かとなった。3.ポケットフリッカ-によるCFF値は中高年女子のほうが若年女子よりも有意に低いことが認められ、年齢による測定値の違いを考慮する必要のあることが示唆された。4.VRT値は十分に練習を実施した後、測定すれば、年齢差は認められないことが明かとなった。視覚系および手腕系も介した中枢性及び末消性疲労を測定するために新たに考案されたVRTとポケットフリッカー(以下、PCFF)に関する基礎的研究として、年齢による測定値の差異を検討した。従来の装置によるフリッカー値(以下、CFF)には年齢による変化が報告されているが、VRTとPCFFでは報告されていない。被験者は中高年女子10名と若年女子10名であり、いずれもVRTとPCFF使用の経験はない健常者である。中高年グループの平均年齢は48.1才(4254)、若年女子グループの平均年齢は19.5才(1820)であった。日内変化の影響を除外するために実験はすべて午後1時から行い、習熟効果を除くために10回の練習を行った後に測定を実施した。測定装置としてはVRT、PCFF、およびCFF(柴田科学工業、FL-10)を用いた。以上の実験についてt-testによる平均値の差の検定を行ったところ、VRT値(VRT-MおよびVRT-D)には2グループ間に有意な変動は認められなかった。しかし、初めてVRTの測定を行った場合には有意な変動が認められ(VRT-MおよびVRT-D)には2グループ間に有意な変動が認められ(VRT-MおよびVRT-DともにP〈0.01)、練習を重ねるとともに年齢による差異が減少することが示唆された。同様な検定により、PCFF値(P〈0.01)およびCFF値(P〈0.05)はいずれも2グループ間に有意な差が認められ、その平均値は若年者の方が中高年者に比較して、PCFFでは4.51Hz、CFFでは2.02Hz高い値を示した。これらの成績より次の知見が得られた。(1)VRT値の年齢による差異は認められない。ただし、十分な事前の練習が必要である。(2)過去の研究で知られているようにPCFF値ならびにCFF値は年齢による差異があり、加齢とともに値は減少することが示された。したがってVRTの測定においては十分な練習が、PCFFの測定に際しては年齢による差異を考慮することが必要であることが明かとなった。本研究は、VRT装置およびポケットフリッカ-について、基礎的な検討を行うことを目的とした。すなわち、初年度はVTR装置の測定における室内照度と画面輝度との影響、ポケットフリッカ-測定時の室内照度および目と視標間の距離の影響を、2年度は年齢による測定値の差異についての検討を行った。最終年度はこれらの成績を総括を行った。その結果、以下のことが明かとなった。1.VRT値は輝度による有意な変動を示すが、照度による変動は認められない。したがって、VRT値は輝度を一定にすれば、周囲の照度が変化しても、その影響を受けないことが明かになった。

これにより、ポケットフリッカ-によるCFF値は輝度を一定にしておけば、周囲の照度が変化しても、その影響を受けないことが明かとなった。3.ポケットフリッカ-によるCFF値は中高年女子のほうが若年女子よりも有意に低いことが認められ、年齢による測定値の違いを考慮する必要のあることが示唆された。4.VRT値は十分に練習をさせた後、測定すれば、年齢差は生じないことが明かとなった。
冠動脈プラーク破綻発症機序の解明：コレステロール結晶の重要性

冠動脈プラークでのコレステロールの結晶化が急性冠症候群の発症に寄与している可能性が示唆されている。急性冠症候群の既往と冠動脈プラーク内のコレステロール結晶との関連を調査した。急性冠症候群の既往がある42名とその既往がない40名の冠動脈をOCTで観察した。52名(63.2%)の患者で冠動脈の少なくともどこか1つコレステロール結晶が存在した。急性冠症候群あるいは急性冠症候群の既往がある患者では既往がない患者に比べコレステロール結晶が多く観察された(78.6% vs.47.5% p<0.05)。本研究は冠動脈のプラーク内のコレステロール結晶と急性冠症候群の既往と関連があることを明らかにした。急性冠症候群発症の多くは冠動脈プラークの破綻が契機となる。これまで病理学、血管内画像診断法により破綻しやすいプラーク(不安定プラーク)の特徴が明らかにされてきた。しかし冠動脈のプラークが破綻する機序は十分に明らかにされていない。最近、冠動脈プラークに存在するコレステロールが結晶し膨張することで冠動脈プラークの形態が変化し炎症が惹起され冠動脈プラークが破綻するという仮説が唱えられている。この仮説が正しければ急性冠症候群あるいはその既往のある患者の冠動脈プラークには安定狭心症の患者に比較し多くのコレステロール結晶が存在するはずである。コレステロール結晶は光干渉断層装置で線状の高輝度病変として描出される。本研究では急性冠症候群の既往のある患者とその既往がない安定狭心症患者の冠動脈を光干渉断層装置で観察しコレステロール結晶の存在するプラークの頻度を比較し、急性冠症候群でコレステロール結晶の頻度が高いことを証明する。対象は待機的冠動脈造影検査および冠動脈インターベンション治療(PCI)が実施される急性冠症候群の既往がある症例とその既往がない症例である。目標症例はそれぞれ50例ずつで計100例。本研究は日本医科大学付属病院倫理委員会、国際医療福祉大学倫理委員会で審議承認され、臨床研究保険に加入後に開始された。平成25年度は試験開始が遅れ少数例の登録にとどまってしまったため、平成26年度、平成27年度に登録目標症例数を修正する。心疾患は本邦の死因統計で悪性新生物に次いで2位を占め、その中でとくに急性冠症候群は食生活の欧米化に伴い本邦でも増加傾向にある。急性冠症候群は急性心筋梗塞、不安定狭心症、突然死を含む症候群であり、冠動脈の動脈硬化を基盤とする。その多くは冠動脈の内膜に存在するプラークが破綻することで内膜に血栓が付着し冠動脈血流が傷害され発症すると考えられている。これまでに病理学、血管内画像診断法により破綻しやすい冠動脈のプラークの特徴を明らかにする試みがなされ、その線維性被膜が薄いこと、脂質コアが大きいこと、炎症細胞の浸潤、平滑筋細胞が少ないことなどが明らかにされた。一方でプラークが破綻する機序は不明である。最近コレステロールの結晶化がプラークに形態的変化、炎症を生じさせプラークを破綻させる機序が提唱された。本研究では急性冠症候群の既往のある患者とその既往がない安定狭心症患者の冠動脈を光干渉断層装置で観察しコレステロール結晶の存在するプラークの頻度を比較した。現在まで6名の登録にとどまっており現時点で中間解析は行っていない。次年度症例登録目標を訂正する。症例登録が遅延している原因として倫理委員会承認、臨床研究保険への加入へ時間を要し研究開始の時期が遅れたこと、一時的に本研究の実施施設での光干渉断層装置の使用が制限されてしまったことがあげられる。心疾患は本邦の死因統計で悪性新生物に次いで2位を占めその中で急性冠症候群は食生活の欧米化に伴い本邦でも増加傾向にある。急性冠症候群は急性心筋梗塞、不安定狭心症、突然死を含む症候群で動脈硬化を基盤とした冠動脈の突然の途絶により生じる。急性冠症候群の多くは冠動脈プラークが破綻し血栓が付着し血流が途絶することで発症する。これまでの病理学、血管内画像診断法により破綻しやすいプラーク(不安定プラーク)の特徴が明らかにされてきた。不安定プラークはその線維性被膜が薄い、脂質コアが大きい、炎症細胞の浸潤、平滑筋細胞が少ないなどの特徴を有する。しかしこれらの特徴は破綻しやすいプラークの特徴でありこれまでプラークを破綻させる直接の原因は明らかにされていなかった。最近、冠動脈プラークに存在するコレステロールが結晶し膨張することで冠動脈プラークの形態が変化し炎症が惹起され冠動脈プラークが破綻するという仮説が唱えられた。本研究は急性冠症候群の既往のある患者とその既往がない安定狭心症患者の冠動脈を光干渉断層装置で観察しコレステロール結晶の存在するプラークの頻度を比較しさらにコレステロール結晶の存在と炎症との関連を明らかにすることが目的である。本研究開始後これまで計48例の症例が登録されたが目標症例数は100例であり遅延している。そのため平成28年度も研究期間延長し引き続き症例登録を行う。

研究代表者の転勤に伴い倫理委員会承認、臨床保険への加入に時間を要し研究開始の時期が遅れてしまったこと、一時的に実施施設での光干渉断層装置の使用が制限されてしまったこと、国際医療福祉大学塩谷病院での心臓カテーテル件数が少ないことがあげられる。<背景・目的>急性心筋梗塞、不安定狭心症、突然死を含む症候群である急性冠症候群の多くは破綻した冠動脈プラークに血栓が付着し血流が途絶することで発症する。これまでの病理学、血管内画像診断法により破綻しやすいプラーク(不安定プラーク)の特徴が明らかにされてきたが、プラークを破綻させる直接の原因は明らかにされていなかった。最近コレステロールの結晶化がプラークに形態的変化、炎症を生じさせプラークを破綻させる機序が提唱された。この仮説が正しければ急性冠症候群あるいはその既往のある患者の冠動脈プラークにはその既往のない患者に比較し多くのコレステロール結晶が存在するはずである。<方法>本研究では急性冠症候群の既往のある患者とその既往がない患者の冠動脈を光干渉断層装置で可能な限り3枝すべて観察しコレステロール結晶の存在頻度を比較検討した。<結果>急性冠症候群の既往のある患者群で既往のない患者群に比較し有意にコレステロール結晶の頻度が高かった。なお両群間で年齢、性別、高血圧・脂質異常症・糖尿病の合併頻度、脂質・糖尿病のコントロール状況などの患者背景に差はなかった。光干渉断層装置で観察されたコレステリン結晶が急性冠症候群発症に寄与している可能性が示唆された。冠動脈プラークでのコレステロールの結晶化が急性冠症候群の発症に寄与している可能性が示唆されている。急性冠症候群の既往と冠動脈プラーク内のコレステロール結晶との関連を調査した。急性冠症候群の既往がある42名とその既往がない40名の冠動脈をOCTで観察した。52名(63.2%)の患者で冠動脈の少なくともどこか1つコレステロール結晶が存在した。急性冠症候群あるいは急性冠症候群の既往がある患者では既往がない患者に比べコレステロール結晶が多く観察された(78.6% vs.47.5% p<0.05)。本研究は冠動脈のプラーク内のコレステロール結晶と急性冠症候群の既往と関連があることを明らかにした。倫理委員会承認、臨床研究保険への加入へ時間を要し研究開始の時期が遅れたこと、一時的に本研究の実施施設での光干渉断層装置の使用が制限されてしまったことがあげられる。昨年度は症例登録が進んだ。今年度も昨年度と同様に行えば目標症例の登録ができると考える。循環器内科学国際医療福祉大学塩谷病院に加えて日本医科大学付属病院での症例登録を増やす。倫理委員会の承認、臨床研究保険の加入に予想以上に時間を要してしまったこと、研究代表者の転勤が重なり本研究の継続が困難になる可能性があったため試験の開始が大変遅れてしまったことなどが原因である。症例登録が遅れており、使用物品が少ないこと、また左右冠動脈の両用のガイディングカテーテルを用いてカテーテルの使用本数を節約したことによります。症例登録が順調に進まず、消耗品の購入が少なかったことが原因である。本研究の目標症例数を達成するため本年度に約50例の登録を予定している。現在国際医療福祉大学塩谷病院で約10例/月の心臓カテーテルを行っており、次年度の目標症例数を増やし症例登録が順次可能と考えられる。
メカニカルストレスセンサーを分子標的とした大動脈瘤新規治療法の開発

大動脈瘤病態の特徴は慢性炎症である。従来から、メカニカルストレスが大動脈瘤病態に重要であることは示唆されてきたが、その分子機序は不明のままであった。本研究において、大動脈瘤壁のマクロファージがメカニカルストレス刺激に応答して炎症シグナルを活性化し、炎症性サイトカインの分泌を亢進することが明らかとなった。また、メカニカルストレスと炎症応答を繋ぐセンサー分子として、ASCが重要な役割を果たす可能性が示唆された。大動脈瘤は破裂死に至る臨床上重要な疾患であるが、発症原因は未だ不明である。大動脈瘤罹患率は本邦においても増加傾向にあるが、外科手術が唯一の治療法である現状では、破裂死亡数の大幅な減少は期待できないため、病態解明と、より理想的な治療法開発が急務である。本研究の目的は、大動脈瘤壁へのメカニカルストレスによって炎症と細胞死が惹起され大動脈瘤が進展するという独自の病態仮説を実証し、それに基づく新たな大動脈瘤治療法を開発することである。そのために本年度は以下の3つの研究計画を実施した。ヒト大動脈瘤壁におけるASCの発現を証明するために、手術時にヒトサンプルを収集した。現在、ASC蛋白発現をウエスタンブロット法と免疫染色法で解析中である。【研究2.メカニカルストレスセンサーとしてのASCの役割と分子機序解明】大動脈瘤病態で重要なマクロファージと平滑筋細胞をマウスより初代培養し、メカニカルストレスとして培養細胞伸展システム(STREX社製)を用いて一軸方向の周期的伸展刺激を与えた。ストレス応答としての炎症惹起に着目し、培養上清中へのIL-1β分泌をELISA法で定量した。その結果、マクロファージが伸展性のストレス刺激に応答して、IL-1β分泌を亢進した。ASCKO(ノックアウト)マウス由来細胞だと、この応答が抑制されたことから、仮説どおりASCお関与が示された。【研究3.大動脈瘤におけるASCの役割解明-予防実験-】マウス大動脈瘤の形成・伸展にASCが不可欠な役割を果たすことを実証するために、高濃度カルシウム局所刺激による動脈瘤モデルをASC KOマウスと野生型マウスで作製した。現在、大動脈瘤径ならびに組織所見を解析中である。そのために本年度実施した実験計画は、以下の3点であった。手術時に採取したヒト大動脈瘤壁を用いた組織培養系を確立した。今後Caspase-1阻害実験を実施し、ヒト瘤壁組織におけるASC/Caspase-1の役割を解明する為に不可欠である。【メカニカルストレスセンサーとしてのASCの役割と分子機序解明】大動脈瘤病態で重要なマクロファージをマウスより初代培養し、培養細胞伸展システム(STREX社製)を用いて一軸方向の周期的伸展刺激を与えた。野生型マウス由来のマクロファージでは、伸展性のストレス刺激後に炎症性サイトカインIL-1β分泌が亢進し、炎症性シグナル分子JNKが活性化された。一方、ASC KO(ノックアウト)マウス由来細胞だと、IL-1β分泌亢進とJNK活性化のいずれも抑制された。【マウス大動脈瘤におけるASC抑制実験】マウス大動脈瘤の形成・伸展にASCが不可欠な役割を果たすことを実証するために、高濃度カルシウム局所刺激による動脈瘤モデルをASC KOマウスと野生型マウスで作製した。野生型マウスでは処置後6週目で瘤径が拡大し、組織学的には炎症細胞の浸潤と弾性線維の破壊が認められた。ASC KOマウスでは処置後6週目の瘤径で野生型と統計学的な有意差は認められなかったが、ばらつきが大きかっため、現在再現性を確認中である。本研究の目的は、大動脈瘤壁へめメカニカルストレスによって炎症と細胞死が惹起され大動脈瘤が進展するという独自の病態仮説を実証し、それに基づく新たな大動脈瘤治療法を開発することである。

手術時に採取したヒト大動脈瘤壁を用いた組織培養実験系において、Caspase-1阻害剤を添加処置し、処置後の培養上清と組織をサンプルとして回収した。サンプル中の炎症関連分子の解析中である。【メカニカルストレスセンサーとしてのASCの役割ど分子機序解明】大動脈瘤病態で重要なマクロファージをマウスより初代培養し、培養細胞伸展システム(STREX社製)を用いて一軸方向の周期的伸展刺激を与えた。野生型マウス由来のマクロファージでは、伸展性のストレス刺激後に炎症性サイトカインIL-1β分泌が亢進し、炎症性シグナル分子JNKが活性化されるが、ASCKO(ノツクアウト)マウス由来細胞だと、IL-1β分泌亢進とJNK活性化のいずれもが有意に抑制された。またさらに、Caspase-1阻害剤の添加処置によってもJL-1β分泌亢進とJNK活性化のいずれもが抑制された。【マウス大動脈瘤におけるASC抑制実験】マウス大動脈瘤の形成・伸展にASCが不可欠な役割を果たすことを実証するために、高濃度カルシウム局所刺激による動脈瘤モデルをASCKOマゥスと野生型マウスで作製した。野生型マウスでは処置後6週目で瘤径が拡大し、組織学的には炎症細胞の浸潤と弾性線維の破壊が認められた。ASCKOマウスでは処置後6週目の瘤径で野生型と統計学的な有意差は認められなかった。組織学的な炎症細胞の浸潤と弾性線維の破壊についても、野生型マウスとASCKOマウスとの間で有意な差は認められなかった。
液-液界面反応における非平衡状態の計測と選択的分配挙動の解析

液-液界面反応の計測法として共鳴第二高調波(SH)分光法及び時間分解全反射蛍光分光法による液-液界面吸着分子の状態解析,液滴電極ポーラログラフィー測定系の構成と液-液界面における錯生成反応の解析を主として研究を進め,全体のまとめを行った。液-液界面状態の評価法として前年度に引き続き共鳴SHスペクトル法の確立を図った。水-ヘプタン界面に吸着したロ-ダミンB分子はバルク濃度の増大とともにSH光強度が増大するが界面吸着配向角は一定であり,高い濃度ではSH光を弱めあう会合体を形成する可能性が示された。共鳴SHスペクトルにより会合体形成などの電子状態変化,吸着量変化,配向性変化等の界面吸着化学種にのみ感度を有する計測法を確立しえた。また,蛍光プローブ分子を用いて液-液界面状態を全反射蛍光寿命解析したところ,分子によっては界面で平行に達するのに一昼夜程度要するもがあることが分かった。液-液界面反応として2価の金属イオンと長鎖アルキル基を有する8-キノリノール(Hocqn)との錯生成を取り上げ,動的界面張力測定並びに界面イオン移動の測定により界面錯生成反応の機構解析を検討した。Hocqnは酸性条件下で界面吸着性を示し,バルク溶液中とは異なり対イオンの効果また有機相の溶媒の種類によって吸着性が異なった。これらの依存性はイオン対生成定数,並びに試薬の分配係数によるものと考えられた。また,キレート試薬の液-液界面イオン移動の測定からHocqnと金属イオンとの錯生成反応は長鎖のないキレート試薬の場合に比較し有機相に近い側の界面領域で進行していると推論できた。液-液界面反応における化学種の界面濃度分布解析の基礎を確立するため,深き方向分析が可能な全反射を利用した時間分解レーザー蛍光測定系の試作構成を行った。測定に及ぼす種々の要因の基礎的検討を行い,水-ヘキサン界面近傍に存在する化学種の蛍光寿命測定がサブn秒で可能となった。また、界面吸着単分子層レベルの情報収得のため,非線形効果(第二高調波発生:SHG)を利用する測定系の試作開発を行った。液-液界面よりも界面状態を規程しやすい石英-水の界面を対象として測定系の検討とデータ解析法の確立を図った。従来SHGの測定は固定波長で行われていたが,励起光を波長可変とすることで,界面吸着分子のみの電子スペクトルをバルクの影響を受けることなく測定することに成功した。この共鳴SHGスペクトルを用いて,石英表面に吸着するロ-ダミンBの状態解析を溶液のpHをパラメータとして行った結果,シラノール基の解離増大と共にロ-ダミンBの吸着量が増大すること,また,高pHでのスペクトルから,シラノール基の解離が進むと,ロ-ダミンが二量体として界面に吸着することが示唆された。以上の新たに試作した測定系については次年度以降実際的測定・解析へ展開する予定である。液-液界面における特異的錯生成反応について,長鎖を有する8-キノリノール誘導体を配位子とする錯生成について,ヘプタン水界面でNi^<2+>とZn^<2+>の反応をとりあげ,速度論的解析を動的滴溶法により行った。界面張力の経時変化を測定することにより配位子は拡散支配によって界面に吸着すること,またZn^<2+>との錯生成は拡散支配であるが,Ni^<2+>では界面への吸着速度が界面での錯生成に支配されていることを明らかにした。この他ミセルへの選択的分配を利用した分離法の基礎的検討や応用研究などを進めた。本年度は,液-液界面反応の新たな計測法の確立,液-液界面における分配挙動,液-液界面における錯生成反応の解析を行った。

液-液界面状態の新しい評価法として共鳴SHGスペクトル法の確立を図った。定量的議論を行うために,石英基板上をロ-ダミンB色素で化学修飾し空気,水,ヘプタン溶液中での色素の配向特性を検討した。前2者での配向角はほぼ同一であったがヘプタン中では配向角に大きな変化が認められ,スペクトルによる電子状態,配向性など界面吸着分子の状態解析法としてSHG法は有効であった。さらに,水-ヘプタン界面に吸着した分子の会合体形成や配向状態についても検討し,液-液界面状態解析の基礎を確立した。また,蛍光分子をプローブとして液-液界面状態を全反射蛍光法で蛍光寿命解析を行ったところ,バルク溶液中とは異なる2種の状態が存在し,0.5nm及び200nm程度の厚さの階層構造が界面に存在すると示唆されなど新たな知見が得られた。液-液界面のモデルの一つとしてマイクロエマルション(ME)における物質分配特性を動電クロマトグラフィーを用いて解析した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)/1-ブタノール/n-ヘプタン/ほう酸バッファーの系でMEを調製し検討した結果,従来分配の場としてMEのコア部分が考えられたのに対し,1-ブタノールが分配を支配するという新しい知見が得られた。液-液界面反応として2価の金属イオンと長鎖アルキル基を有するキレート試薬との錯生成をバルク溶液系並びに水-ヘプタン系で検討した結果,後者が43倍生成速度が大きく,界面では中和反応が促進されること,及びこの事実は界面の誘電率勾配やキレート試薬の配向性に起因すると考えられた。本年度は,液-液界面反応の計測法として共鳴第二高調波(SH)分光法及び時間分解全反射蛍光分光法による液-液界面吸着分子の状態解析,液適電極ポーラログラフィー測定系の構成と液-液界面における錯生成反応の解析を主として研究を進め,全体のまとめを行った。液-液界面状態の評価法として前年度に引き続き共鳴SHスペクトル法の確立を図った。水-ヘプタン界面に吸着したロ-ダミンB分子はバルク濃度の増大とともにSH光強度が増大するが界面吸着配向角は一定であり,高い濃度ではSH光を弱めあう会合体を形成する可能性が示された。非鳴SHスペクトルにより会合体形成などの電子状態変化,吸着量変化,配向性変化等の界面吸着化学種にのみ感度を有する計測法を確立しえた。また,蛍光プローブ分子を用いて液-液界面状態を全反射蛍光寿命解析したところ,分子によっては界面で平行に達するのに一昼夜程度要するもがあることが分かった。液-液界面反応として2価の金属イオンと長鎖アルキル基を有する8-キノリノール(Hocqn)との錯生成を取り上げ,動的界面張力測定並びに界面イオン移動の測定により界面錯生成反応の機構解析を検討した。Hocqnは酸性条件下で界面吸着性を示し,バルク溶液中とは異なり対イオンの効果また有機相の溶媒の種類によって吸着性が異なった。これらの依存性はイオン対生成定数,並びに試薬の分配係数によるものと考えられた。また,キレート試薬の液-液界面イオン移動の測定からHocqnと金属イオンとの錯生成反応は長鎖のないキレート試薬の場合に比較し有機相に近い側の界面領域で進行していると推論できた。
リン酸化・脱リン酸化によるインスリン分泌顆粒エンドサイトーシス制御機構の解明

本研究により以下のことを明らかにした。1.これまで神経細胞に特異的に発現していると考えられていたCdk5活性化因子p35が膵臓β細胞に強く発現し、単離したβ細胞内のCdk5の活性は、脳と同レベルであった。2.Cdk5の活性阻害剤は、低グルコース時のβ細胞、膵ラ氏島からのインスリン分泌に影響を及ぼさないが、高グルコース時のインスリン分泌を有意に促進した。3.Cdk5活性阻害は、グルコース刺激によるLタイプ電位依存性Ca^<2+>チャネル(L-VDCC)からのCa^<2+>流入を促進した。そのメカニズムは、Cdk5が同チャネルのセリン783番をリン酸化し、Syntaxin等結合蛋白の同チャネルへの結合を阻害することであった。4.p35ノックアウトマウスから単離した膵ラ氏島からのインスリン分泌は、低グルコース時では野生型マウスのそれと同程度であるが、高グルコース時では野生型マウスと比較して有意に促進した。6.p35ノックアウトマウスに糖負荷試験を実施すると、野生型マウスと比較してインスリン分泌は促進し、血中グルコース濃度は有意に低かった。7.Cdk5の活性は、細胞内Ca^<2+>濃度により制御されており、細胞内Ca^<2+>が上昇するとp35のユビキチンープロテアソームによる分解が促進されることを明らかにした。8.以上のことより、Cdk5阻害剤が、低血糖を誘発しない全く新しいタイプの高血糖治療薬になる可能性が示唆された。1.膵臓β細胞におけるCdk5活性化因子および基質の探索。ラットよりラ氏島を単離し、ホモジナイズした。遠心後、その上清とCdk5抗体を反応させ、免疫沈降を行った。その後、Cdk5結合蛋白について、質量分析法にて同定を行った。その結果、p35がCdk5の活性化因子として見つけ出された。また、基質としてL型電位依存性Ca^<2+>チャネル(L-VDCC)が見いだされた2.膵臓β細胞におけるCdk5新規活性化因子および基質の同定。1でスクリーニングされたp35ならびにL-VDCCが実際に細胞内において活性化因子あるいは基質であるか検討した。p35をバキュロシステムで発現させ、Histone HIを基質としてCdk5活性化能および結合能についてin vitroで検討した。その結果、p35はCdk5活性化能を有し、また同酵素に結合することが明らかになった。さらにL-VDCCのCdk5によるリン酸化部位について検討した。その結果、Cdk5は、L-VDCCのループ2-3内のセリン783番をリン酸化することが明らかになった。3.Cdk5のインスリン分泌顆粒エンドサイトーシス・エクソサイトーシスに及ぼす影響MIN6細胞、マウスから単離したラ氏島とCdk5阻害剤をインキュベーションし、細胞内のCdk5活性を阻害した後、グルコース刺激によるインスリン分泌について検討した。その結果、Cdk5を阻害すると、β細胞からのインスリン分泌が促進されることが明らかになった。
λコンピューティング環境における光共有メモリ構成手法に関する研究

グリッド環境においては、分散した計算機間でのデータ転送やメモリ転送は一般的にTCP/IPを利用して転送されるため、パケット生成やパケット損失によるオーバヘッドが大きく、結果として計算機内のバスアクセス速度に比べ、非常に低速なアクセス速度しか提供できない。そこで、光ファイバなどで構成されたグリッド環境において、ある接続されたグループ間で光ネットワークの波長パスを利用し、高速なアクセスを可能とするλコンピューティング環境を提案している。本研究では、λコンピューティング環境において、高速な大規模計算を行うための新たな光共有メモリ構成手法を提案する。本年度は、昨年度の成果を踏まえ、1.プロトタイプシステムの構築と実アプリケーションによる評価、2.共有メモリアーキテクチャのモデル化による定量評価、の2つの課題に取り組んだ。1.では、NITフォトニクス研究所が開発している情報共有システム(AWG-STARシステム)を用いてλコンピューティング環境のプロトタイプを構築し、共有メモリ型プログラミング環境OpenMPを実装した。さらに、その上でマンデルブロー集合計算を実行し、性能を評価した。その結果、並列化の効果は得られるものの、AWG-STARの共有メモリボードとCPU間のデータ転送能力が低いため、十分な計算性能が得られないことがわかった。2.では、実装環境に依存した性能評価ではネットワーク特性やキャッシュプロトコルの違いによる性能への影響を明らかにすることができないため、単一波長を用いてアクセスを行う共有メモリアーキテクチャならびにその制御手法をモデル化することにより、定量的な評価を行った。その結果、リング長や計算ノード数が性能に与える影響を定量的に明らかにした。特にキャッシュー貫性制御が性能に影響を与え、共有するデータの割合が小さい場合には影響はかなり小さくなることがわかった。そこで、光ファイバなどで構成されたグリッド環境において、ある接続されたグループ間で光ネットワークの波長パスを利用し、高速なアクセスを可能とするアーキテクチャを提案した。この計算環境をλコンピューティング環境と呼んでいる。本年度における研究は大きく分けて、(1)広域分散環境での光共有メモリアーキテクチャの検討、(2)データ共有手法の検討と評価を実施した。(1)においては、共有メモリの構成方法、計算機間の通信形態について分析し、実現可能な光共有メモリアーキテクチャを検討した。その結果、波長パス自体を共有メモリとして利用する共有メモリ型アーキテクチャ、各ノードの共有メモリを高速に接続する高速チャネル型アーキテクチャを対象とすることとした。次に(2)においては、それぞれの共有メモリアーキテクチャに応じたデータ共有手法を考え、そめ評価を行った。共有メモリ型アーキテクチャでは、メモリアクセスタイミングの制約とキャッシュの整合性を考慮し、光リングネットワークの特性を考慮した無効化型ライトバックプロトコルを提案した。アプリケーションを想定して評価した結果、あるノード数までは並列化の効果が得られることが分かった。高速チャネル型アーキテクチャでは、AWG-STARシステムを用いて実装したが、PCIバスを経由した共有メモリボードへのアクセス時間が大きく、大きな効果は得られなかった。そのため、アクセス数を減らすソフトウェア改善により性能向上を図り、効果を得た。
杭基礎のための液状化と地盤流動対策に関する模型振動台実験

当該研究室で保有している振動実験設備及び2メートル平方の大型土槽を用い、液状化と地盤流動が×6あるいは9×9本の群杭模型に及ぼす影響の実験を行った。模型地盤はゆる詰め砂で構成され、緩傾斜を持つので、液状化すると下り方向へ流動する。同様の実験は前年度にも行った。しかし流動する地盤が杭に及ぼす力が予想より小さかったため、使用した杭模型の剛性が大きすぎることになり、詳しい分析に耐える精度の変形や流動地盤荷重値を得ることが出来なかった。そこで杭模型をすべて作り直し、再度実験を行った。その結果、地盤の流動圧力は群杭の内部で最小、側部でやや大きく、地盤流動の上流側と下流側とで最大になることがわかった。このことは、既存の群杭基礎を地盤流動の影響から防護するためには、群杭の上流と下流側に捨て杭を設置すればよい、との従来からの主張を裏付けるものである。また、個々の杭に作用する圧力を合計して群杭作用土圧を算定したところ、現行の設計基準値と整合することが見出された。成果は4月に国際会議へ向けて投稿し、さらに欧文学術雑誌へも投稿する予定である。長さ2メートル、幅50センチ、深さ60センチの土槽の中に斜面模型を造成し、これを振動台によって加振し、液状化と横方向への流動とを発生させた。この模型地盤の中には3×3、合計9本の杭からなる構造物基礎模型が埋設されており、杭にはひずみゲージを多数貼り付け、地盤流動によって杭基礎が受ける横荷重を測定できるようにした。実験は、振動を斜面並行、直交方向に変えつつ、また地盤の密度や地層構成を変化させ、繰り返し行った。実験結果によれば、9本の群杭の中で、中央部の杭に作用する荷重が小さいことが見出された。次に2メートル四方の大型斜面模型を振動台上に造成し、これを加振・液状化させ、横方向への流動を起こさせた。この模型地盤中には6×6ないしは11×11の多数杭からなる基礎模型を埋設した。実験結果によれば、地盤の流動に影響されている群杭の中では、最上流側および最下流側の杭には大きな荷重が作用しうるものの、これらに挟まれた杭に作用する横荷重は小さいことがわかった。上流側の杭には、流動する地盤が直接衝突するので、荷重が大きくなる。これに対して下流側の杭は、群杭に守られているので荷重が小さいものと予測していたが、結果は逆であった。その理由としては、群杭よりさらに下流側の地盤が早く流失するため、杭基礎周りに地盤の段差が生じ、これが最下流側の杭へ横荷重となって現れるもの、と結論した。これらの結果から、液状化と地盤流動の被害から杭基礎を守る一技術として、既存の杭基礎周辺に捨て杭を設置し、地盤流動に起因する荷重はこれらにすべて負担させて、上部構造を支えている重要な杭に害が及ばないようにすることを、発想している当該研究室で保有している振動実験設備及び2メートル平方の大型土槽を用い、液状化と地盤流動が×6あるいは9×9本の群杭模型に及ぼす影響の実験を行った。
中枢神経系におけるアトラクチン局在部位の同定

昨年度までに、膜型アトラクチンのN末、中央部、C末をそれぞれ認識する抗ラットアトラクチン抗体を作製した。N末、中央部を認識する抗体は膜型、分泌型両者を、C末を認識する抗体は膜型のみを認識することを、組み換えアトラクチンを発現する細胞株を用いたウエスタンブロットにより確認した。今年度は、作製した抗アトラクチン抗体を用いたラット脳の免疫組織学的解析を行った。8週齢の雄WTCラットの脳をホルマリン固定後、切片を作製した。0.5%過ヨウ素酸により内因性ペルオキシダーゼを失活させた。3種類の抗アトラクチン抗体を1%ヤギ血清で、それぞれ、500倍、1000倍、2000倍、8000倍希釈し、一次抗体として用いた。抗ウサギIgG(VECTOR社)を二次抗体として用い、VECTASTAIN Elite ABC(VECTOR社)により染色した。中央部を認識する抗体(膜型アトラクチンの678番目から693番目のポリペプチドを抗原として得られた抗体)を用いたときのみに、抗体特異的な染色を観察した。従って、以後この抗体を用いてラット脳でアトラクチンを発現している細胞の種類、細胞内分布を光学顕微鏡で検討した。その結果、多くの神経細胞で陽性所見を観察した。小脳では、プルキンエ細胞、顆粒細胞、分子層の神経細胞(星細胞、かご細胞)に染色性を認めた。また、プルキンエ細胞の樹状突起や、大脳皮質の神経突起にも陽性所見を認めた。プルキンエ細胞や他の大型の神経細胞を対象にして、細胞内の染色性を観察した。これらの細胞では、細胞膜よりもむしろ細胞質にびまん性に陽性所見を認めた。一方、染色性は弱いものの、白質のオリゴデンドロサイトと思われるグリア細胞にも陽性所見を認めた。これらの結果から、アトラクチンは主に神経細胞に発現していることが示された。ヒト及びラットAttractin(Atrn)遺伝子は、alternative splicingにより、膜型と分泌型のアトラクチンをコードしている。膜型と分泌型はそのC末のみが異なる。Atrn変異zitterラットの研究から、膜型アトラクチンは中枢神経系のミエリン形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。本研究では、膜型アトラクチンのミエリン形成における役割をより詳細に検討するために、膜型アトラクチンを発現している細胞の種類・細胞内分布を特定する。今年度は、組み換えアトラクチンを発現する細胞株の樹立とペプチドを抗原とした抗アトラクチン抗体の作製を目的とした。・組み換えアトラクチンを発現する細胞株の樹立ラット分泌型、膜型型の全コーディング配列をそれぞれ、pEBVHisベクター(Invitrogen)にクローニングし、コンストラクトを作製した。各コンストラクトをヒト腎臓細胞株293-EBNAにトランスフェクトし、形質転換した細胞をクローニングした。各細胞株におけるAtrnのmRNA発現量をRT-PCRで検討し、組み換え分泌型アトラクチンを発現する細胞株を3株、膜型アトラクチンを発現する細胞株を4株樹立した。・ペプチドを抗原とした抗アトラクチン抗体の作製ラット膜型アトラクチンのN末、中央部、C末に由来するペプチドを抗原としてウサギに免疫した。得られた抗体を用いて、本研究で樹立した細胞株の抽出タンパクに対するウエスタン・ブロット解析を行った。その結果、N末、中央部からの抗体は、分泌型・膜型アトラクチンを、C末の抗体は膜型アトラクチンのみを認識し、今後の研究に利用可能であることが判明した。来年度は、抗膜型アトラクチン抗体を用いた免疫組織学的解析を行い、ラット脳における膜型アトラクチンの存在部位を同定する。

一方、染色性は弱いものの、白質のオリゴデンドロサイトと思われるグリア細胞にも陽性所見を認めた。これらの結果から、アトラクチンは主に神経細胞に発現していることが示された。
胃癌に特徴的なユビキチン化蛋白質の精製と同定

胃癌におけるユビキチン化蛋白質に関する研究を行った。手術検体15例分のヒト胃癌、および正常胃粘膜を採取し、採取後即座に-80°Cにて凍結保存した。実験の際、これらを解凍した後プロテアーゼ阻害剤存在下でホモジネートし、遠心分離した上清にCDRを加え再度遠心分離、さらに超遠心分離した上清を水溶性画分として抽出した。これら水溶性画分の他に尿素を用いた難溶性画分も作成した。以上から、癌組織、正常組織および水溶性画分、難溶性画分の合計60種類の実験材料を作成した。これらの材料を各々、当施設で開発したERISAを用いた定量法によりユビキチン化蛋白質を定量し比較検討したところ、正常組織に比べ有意に癌組織におけるユビキチン化蛋白質は多かった。次に、予備実験としてこれら60種類を抗ユビキチン抗体であるFK2を用いたWestern blottingで分析し、癌と正常組織で差のあるユビキチン化蛋白質を探索した結果、癌で特徴的な数個のバンドが認められた。この中から48KDaのバンドに注目して、FK2抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ユビキチン化蛋白質を精製マルチユビキチン化蛋白質を分離した。精製された同蛋白質を限定分解酵素で消化し、ユビキチン化タグペプチドに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで標的蛋白質由来のペプチド断片のみを精製した後、このペプチド混合標品を逆相HPLCで分離し、精製ペプチドのアミノ酸配列をプロテインシーケンサーを用いて解析中である。また、一方、大腸癌で特徴的なユビキチン化蛋白質と同定されたモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが胃癌においても認められるかを検討する目的でホスホグリセリン酸ムターゼB(PGM-B)抗体を用いたWestern blottingを施行したところ、癌と正常組織で有意に差のあるバンドが認められ、胃癌においてもモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが蓄積する可能性が示唆された。胃癌におけるユビキチン化蛋白質に関する研究を開始した。これらの材料を各々、当施設で開発したERISAを用いた定量法によりユビキチン化蛋白質を定量し比較検討したところ、正常組識に比べ有意に癌組織におけるユビキチン化蛋白質は多かった。次に、予備実験としてこれら60種類を抗ユビキチン抗体であるFK2を用いたWestern blottingで分析し,癌と正常組織で差のあるユビキチン化蛋白質を探索した結果、癌で特徴的な数個のバンドが認められた。一方、大腸癌で特徴的なユビキチン化蛋白質と同定されたモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが胃癌においても認められるかを検討する目的でホスホグリセリン酸ムターゼB(PGM-B)抗体を用いたWestern blottingを施行したところ、癌と正常組織で有意に差のあるバンドが認められ、胃癌においてもモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが蓄積する可能性が示唆された。現在、胃癌に特徴的なユビキチン化蛋白質としてどのバンドを精製・同定するかを検討中であり、来年度はFK2抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ユビキチン化蛋白質を精製する予定である。

また、一方、大腸癌で特徴的なユビキチン化蛋白質と同定されたモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが胃癌においても認められるかを検討する目的でホスホグリセリン酸ムターゼB(PGM-B)抗体を用いたWestern blottingを施行したところ、癌と正常組織で有意に差のあるバンドが認められ、胃癌においてもモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが蓄積する可能性が示唆された。
歯根上皮鞘細胞の運命〜器官培養系を用いた上皮-間葉形質変換の解析〜

歯根上皮鞘は歯根象牙質形成及び歯周組織の発生に大きく関与していることが知られている。この歯根上皮鞘の運命については2つの考え方が提唱され、1つは、アポトーシスによって消滅するという考え方であり、もう1つは、上皮-間葉形質変換によって、セメント芽細胞に変異するという考え方である。上皮細胞の間葉系細胞への形質転換は発生段階のミュラー管、二次口蓋の正中縫合部において報告され、また病的環境ではガン細胞の侵襲性転移性細胞への変換において認められる。これまでの歯根上皮鞘に関する報告では、(1)上皮細胞の細胞内小器官が変化すること、(2)セメント芽細胞に象牙芽細胞のような段階的な分化途上の細胞が認められない。また、近年、培養ヘルトビッヒ上皮鞘の上皮細胞が表現型を変化させ、間葉系細胞特有の遺伝子発現をするように形質転換することを報告されている。これらの所見は、いずれも歯根上皮鞘細胞がセメント芽細胞に分化するという上皮-間葉形質転換説を支持する。しかしながら、上皮鞘細胞の時空間的挙動については全く理解されておらず、現在のところ、上皮-間葉形質転換説は仮説にすぎず、そのメカニズムも全く不明である。これに関連して、様々なタンパクについて切歯歯根膜舌側上皮鞘とセメント芽細胞での発現を免疫組織化学的に検索した結果、ある種のヒートショックタンパク質が歯根象牙質に接触する、上皮細胞からセメント芽細胞まで連続的に発現する像が観察され、また、ラット切歯舌側セメント芽細胞に、これまで報告されていない、アクアポリン、S100タンパクが発現していることを明らかにした。この免疫染色結果は歯根上皮鞘上皮がセメント芽細胞に直接分化することを示唆するとともに、これらの新しく発現が明らかにされたタンパク質がセメント質の形成に重要な働きをすることが明らかにされた。1.ラット切歯歯胚培養条件の確立及びマイクロインジェクション法の技術確立。生後13日齢のラットから切歯歯胚を摘出し、100μg/mlアスコルビン酸、100単位/mlペニシリンストレプトマイシン含有DMEM培地中、ミリポアフィルター上で切歯歯胚を培養した、本培養条件下で、最大10日間器官培養行った。本培養条件下での、培養条件の検討に当たり、歯式切片を作成し形態学的に検討した。形態学的な検討の結果、切歯歯根上皮鞘に、形態学的な大きな異常は観察されなかった。これらのことより、本培養条件下で、歯根上皮鞘は正常に生育することを示すことより、本実験遂行上の基本的な培養条件を確立した。2.マイクロインジェクション技術の確立。本実験遂行上のコア技術となる、特殊色素のマイクロインジェクション技術について、現在、様々な方法を試み開発中である。3.ホールマウントインサイチュウハイブリダイゼーション、セクションインサイチュウハイブリダイゼーション用プローブの作成。上皮-間葉形質変換に関与するといわれる遺伝子、α5βインテグリン、v-src、c-fos、v-ras、v-nos、TGFβ1-3、MIF、TGFα、プローブの作成中である。4.本実験に関連して歯根上皮鞘からセメント芽細胞に連続して発現がみられるこれまでに報告のないタンパク質について免疫組織学的に検索中である。

本タンパク質の発現様式の解析により、歯根上皮鞘がセメント芽細胞に直接分化することを示唆する若干の所見を得ている。歯根上皮鞘は歯根象牙質形成及び歯周組織の発生に大きく関与していることが知られている。この歯根上皮鞘の運命については2つの考え方が提唱され、1つは、アポトーシスによって消滅するという考え方であり、もう1つは、上皮-間葉形質変換によって、セメント芽細胞に変異するという考え方である。上皮細胞の間葉系細胞への形質転換は発生段階のミュラー管、二次口蓋の正中縫合部において報告され、また病的環境ではガン細胞の侵襲性転移性細胞への変換において認められる。これまでの歯根上皮鞘に関する報告では、(1)上皮細胞の細胞内小器官が変化すること、(2)セメント芽細胞に象牙芽細胞のような段階的な分化途上の細胞が認められない。また、近年、培養ヘルトビッヒ上皮鞘の上皮細胞が表現型を変化させ、間葉系細胞特有の遺伝子発現をするように形質転換することを報告されている。これらの所見は、いずれも歯根上皮鞘細胞がセメント芽細胞に分化するという上皮-間葉形質転換説を支持する。しかしながら、上皮鞘細胞の時空間的挙動については全く理解されておらず、現在のところ、上皮-間葉形質転換説は仮説にすぎず、そのメカニズムも全く不明である。これに関連して、様々なタンパクについて切歯歯根膜舌側上皮鞘とセメント芽細胞での発現を免疫組織化学的に検索した結果、ある種のヒートショックタンパク質が歯根象牙質に接触する、上皮細胞からセメント芽細胞まで連続的に発現する像が観察され、また、ラット切歯舌側セメント芽細胞に、これまで報告されていない、アクアポリン、S100タンパクが発現していることを明らかにした。この免疫染色結果は歯根上皮鞘上皮がセメント芽細胞に直接分化することを示唆するとともに、これらの新しく発現が明らかにされたタンパク質がセメント質の形成に重要な働きをすることが明らかにされた。
気管支喘息患者の5-リポキシゲナーゼ活性化蛋白(FLAP)遺伝子多型の検討

平成13年度は、平成11年度の結果のFLAP-promoter遺伝子多型AAA(+/+),(+/-),(-/-)の頻度と喘息との関連性がみられたことより、平成12年度の結果のロイコトリエンの受容体のCys-LT1Receptor(Cys-LT1R)の遺伝子多型927T/T, T/C, C/Cとの遺伝子多型のとの関連性を検討した。結果は、FLAP-promoter遺伝子多型AAA(+/+),(+/-)、(-/-)で分類し、さらにCys-LT1Rの遺伝子多型927T/T, T/C, C/Cで分類したところ、これらの遺伝子型の頻度は健常人(71例)と気管支喘息患者(71例)との頻度の関連性には統計学的に有意差は見られなかった。また平成13年度には、さらに気管支喘息に重要なT細胞の活性化作用のあるInterleukin 16(IL-16)のpromoter領域の遺伝子多型を健常人75例と気管支喘息患者78例で検討した。IL-16のpromoter領域の-295にTからCへの変異が見られた。そのアレル出現頻度は、健常人77.3%,C22.7%喘息患者T81.4%,C18.6%で統計学的には有意差は見られなかった。喘息患者71例と健常人71例の末梢血白血球よりDNAを抽出し、FLAPのpromoter領域(-170+46b)をPCRで増幅しPCR産物をsequenceした。またABI model 310を用いてGene Scanを行いその多型性(PCR産物のsize)を検討した。FLAPのpromoter領域(-95-73b)には、モノヌクレオチド反復配列(A repeats)が見られ、21塩基AAA(+/+)と18塩基AAA(-/-)の多型が見られた。今回ペプチド性ロイコトリエンの生成に必須の分子であるFLAP遺伝子のpromoter領域の遺伝子多型と喘息の発症との関わりがはじめて明らかになった。喘息患者にはAAA(+/+)遺伝子多型が有意に多く、また健常人にはAAA(-/-)遺伝子多型が多い傾向が見られた。本研究によりFLAP-promoterの遺伝子多型が喘息の発症に関与していることが明らかとなった。今後このような疾患に関連する遺伝子マーカーを更に発見し、多因子性疾患である喘息発症の予知への道を開きたい。平成12年度は、ロイコトリエンの受容体のCys-LT1Receptor(Cys-LT1R)の遺伝子多型をSSCP法で気管支喘息患音132例と健常人141例で検討を行った。【結果】Cys-LT1Rには翻訳部位から927にT to CのSNPがみられた。Cys-LT1Rは、男性ではTまたC、女性ではT/T,T/C.C/Cの遺伝子型があり、これらの遺伝子型の頻度は健常人とアスピリン喘息または非アスピリン喘息のいずれも統計学的には有意差が見られなかった。また、翻訳部位から492にA to GのSNPが見つかったが、健常人50例中1例のみにみられ喘息患者132例中1例もみられなかった。927T to Cと492A to Gのいずれもアミノ酸変異を伴わないSNPsであった。また平成11年度の結果のFLAP-promoter遺伝子多型と喘息の関係をさらに発展させて小児喘息の寛解例37例でFLAP-promoter遺伝子多型を調べた。FLAP-promoter遺伝子多型AAA(+/+),(+/-),(-/-)の頻度はそれぞれ、喘息群73.2%、20.8%、5.6%寛解群64.9%、27.0%、8.1%健常人群54.9%、31.0%、14.1%で統計学的にはAAA(+/+)において喘息群は健常人より頻度が高かった(p=0.035)。統計学的な有意差はみられなかったが、寛解群は、喘息群と健常人群の間の値だった。

今後症例を増やして検討したい。平成13年度は、平成11年度のの結果のFLAP-promoter遺伝子多型AAA(+/+), (+/-), (-/-)の頻度(喘息:AAA(+/+)73.2 %AAA(+/-)20.8%AAA(-/-)5.6%vs健常人:AAA(+/+)54.9%AAA(+/-)31.0%AAA(-/-)14.1%と喘息との関連性がみられたことより、平成12年度の結果のロイコトリエンの受容体のCys-LT1Receptor (Cys-LT1R)の遺伝子多型927T/T, T/C, C/Cとの遺伝子多型のとの関連性を検討した。結果は、FLAP-promoter遺伝子多型AAA(+/+), (+/-), (-/-)で分類し、さらにCys-LT1Rの遺伝子多型927T/T, T/C, C/Cで分類したところ、これらの遺伝子型の頻度は健常人(71例)と気管支喘息患者(71例)との頻度の関連性には統計学的に有意差は見られなかった。また平成13年度には、さらに気管支喘息に重要なT細胞の活性化作用のあるInterleukin 16(IL-16)のpromoter領域の遺伝子多型を健常人75例と気管支喘息患者78例で検討した。IL-16のpromoter領域の_-295にTからCへの変異が見られた。そのアレル出現頻度は、健常人T77.3%, C22.7%喘息患者T81.4%, C18.6%で統計学的には有意差は見られなかった。