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マラリア原虫伝搬阻止単クローン抗体の標的蛋白の発現様式と伝搬阻止機構の解析

マラリア原虫の伝搬阻止に関与する標的蛋白のうち,融合体とオ-キネートの表面に特異的なものとしてPlasmodium falciparum,P.galinaceumでは分子量25kD,P.bergheiでは21kDの蛋白が報告されている。我々はネズミマラリア(P.Yoelii)を用いて融合体・オ-キネートに対する単クローン抗体を作成し,分子量22kD(Pys22)または28kD(Pys28)の2種の蛋白を認識する複数の抗体を得た。間接蛍光抗体法および共焦点レザー顕微鏡を用いてPys22とPys28の発現を観察した結果,これらの抗体の標的蛋白は融合体およびオ-キネートの虫体表面に存在することが明らかになった。ウェスタンブロティングと間接蛍光抗体法によって標的蛋白の発現を経時的に観察すると,Pys28は生殖母体の細胞質に反応が認められた。また,Pys28は吸血後12時間で融合体およびオ-キネートの表面に発現し,Pys22は24時間で融合体およびオ-キネートの虫体表面へ発現した。受動免疫したマウスと蚊の系を用いて単クローン抗体による伝搬阻止作用をみると,抗Pys28抗体,抗Pys22抗体ともに量反応関係が認められ,最終的には前者が100%,後者が95%のオーシスト形成阻害が示した。C5を欠損するDBA/2マウスと抗Pys28,抗Pys22単クローン抗体のF(ab,)_2およびのFab分画を用いた実験においてもオーシスト形成阻害が認められた。以上の結果から。単クローン抗体によるオーシスト形成阻害には補体系や抗体依存性細胞障害作用の関与なしに,抗体の結合のみで起きることを明らかにすることができた。以上の結果から。我々はネズミマラリア(P.yoelii)を用いて融合体・オ-キネートに対する単クローン抗体を作成し,分子量22kD(Pys22)または28kD(Pys28)の蛋白を認識する2種の抗体を作成した。共焦点レーザー顕微鏡および免疫電子顕微鏡による観察の結果,これらの抗体の標的蛋白は融合体およびオ-キネートの虫体表面に存在することが明らかになった。標的蛋白の発現を経時的に観察すると,Pys28は吸血後12時間で,Pys22は24時間で虫体表面へ発現していた。受動免疫したマウスと蚊の系を用いて単クローン抗体による伝搬阻止作用をみると,抗Pys28抗体,抗Pys22抗体ともに量反応関係が認められ,最終的には前者が100%,後者が95%のオーシスト形成阻害を示した。マウスを2種の抗体で受動免疫すると相加的なオーシスト形成阻害がみられた。C5欠損DBA/2マウスと抗Pys28抗体のFab分画を用いた実験においても90%以上のオーシスト形成阻害が認められ,伝搬阻止には補体系の関与がないことが示唆された。抗Pys28抗体を用いた蛍光抗体法とWestern blotting法によって,分子量28kDの蛋白がP.bergheiの融合体およびオ-キネートの表面にも発現することが判明した。また,抗Pys28抗体はP.bergheiのオーシスト形成を阻害することが明らかになった。

以上の結果より,既知の2125kDの蛋白の他にマラリアの伝搬阻止に関与する28kDの蛋白が存在することを初めて明らかにすることができた。マラリア原虫の伝搬阻止に関与する標的蛋白のうち,融合体とオ-キネートの表面に特異的なものとしてPlasmodium falciparum,P.galinaceumでは分子量25kD,P.bergheiでは21kDの蛋白が報告されている。我々はネズミマラリア(P.yoelii)を用いて融合体・オートネートに対する単クローン抗体を作成し,分子量22kD(Pys22)または28kD(Pys28)の2種の蛋白を認識する複数の抗体を得た。間接蛍光抗体法および共焦点レーザー顕微鏡を用いてPys22とPys28の発現を観察した結果,これらの抗体の標的蛋白は融合体およびオ-キネートの虫体表面に存在することが明らかになった。ウエスタンブロティングと間接蛍光抗体法によって標的蛋白の発現を経時的に観測すると,Pys28は生殖母体の細胞質に反応が認められた。また,Pys28は吸血後12時間で融合体およびオ-キネートの表面に発現し,Pys22は24時間で融合体およびオ-キネートの虫体表面へ発現した。受動免疫したマウスと蚊の系を用いて単クローン抗体による伝搬阻止作用をみると,抗Pys28抗体,Pys22抗体ともに量反応関係が認められ,最終的には前者が100%、後者が95%のオーシスト形成阻害を示した。C5を欠損するDBA/2マウスと抗Pys28,抗Pys22単クローン抗体のF(ab')_2およびFab分画を用いた実験においてもオーシスト形成阻害が認められた。以上の結果から。単クローン抗体によるオーシスト形成阻害には補体系や抗体依存性細胞障害作用の関与なしに,抗体の結合のみで起きることを明らかにすることができた。
有機ナノマテリアルの吸蔵に伴う新しい物性変化

テレフタル酸亜鉛錯体([Zn_4O(OOCC_6H_4COO)_3])はベンゼンを架橋配位子とする均一な細孔を持っており,気体の吸蔵・脱離、分子ふるい、化学反応の場、触媒などの様々な分野での応用が期待されている.これまでに私は,トランス-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸銅(II)(Cu_2(OOC-C_6H_10-COO);Cuchdと略す.)について,トルエン,四塩化炭素などを吸蔵あるいは脱離させた試料について熱的および磁性的挙動を研究してきた.本研究では,新たにZnphdを合成し,種々の量のベンゼン分子を吸蔵させた試料について,断熱型熱量計により低温熱容量測定を行い,粉末X線回折測定の結果と合わせて,Znphdの分子吸蔵特性について熱的性質および結晶構造から検討した.その結果,分子を吸蔵していないZnphdでは,測定全温度領域で熱異常は観測されなかった.一方,40%ベンゼン吸蔵試料では,140Kおよび210Kに熱異常が観測された.210Kの熱異常は140Kよりも大きい.これらの2つの熱異常は過冷却現象を示し,1次相転移であることが確認できた.飽和吸蔵量の11%,28%および40%のベンゼンを吸蔵させた試料では210Kに観測される熱異常は,吸蔵量の増加にともなって,転移エントロピーが増加するが,転移温度は変化しないことがわかった.一方,低温側の熱異常は,吸蔵量の増加に伴って,低温側に移動しながら転移エントロピーが増加することがわかった.このためこれらの相転移は別の原因によるものではないかと考えられる.また,これらの試料を真空排気して吸蔵されたベンゼンを脱離させると,熱容量は吸蔵する前の試料と完全に一致したことから,吸蔵-脱離が可逆的であることがわかった.テレフタル酸亜鉛錯体([Zn_4O(OOCC_6H_4COO)_3],以下Znphdと略す)はベンゼン環を架橋配位子とする均一な細孔を持っており,気体の吸蔵・脱離,分子ふるい,化学反応の場,触媒などの様々な分野での応用が期待されている[1].私はこれまでに,トランス-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸銅(II)(Cu_2(OOC-C_6H_<10>-COO); Cuchdと略す.)について,トルエン,四塩化炭素などを吸蔵あるいは脱離させた試料について熱的および磁性的挙動を研究してきた.本研究では,新たにZnphdを合成し,種々の量のベンゼン分子を吸蔵させた試料について,断熱型熱量計により低温熱容量測定を行い,粉末X線回折測定の結果と合わせて,Znphdの分子吸蔵特性について熱的性質および結晶構造から検討した.Znphd試料は,硝酸亜鉛・六水和物とテレフタル酸のN, N'-ジメチルホルムアミド溶液を攪拌しながら,少量のトリエチルアミンをゆっくり滴下することによって得られた白色の微結晶を,180°Cで24時間真空加熱して得た.得られた試料は粉末X線回折および元素分析により同定した。熱容量測定には,真空蒸留したベンゼンを大気に触れさせることなく吸収させた試料を用いた.熱容量測定は研究室既設の断熱型熱量計を使用して13Kから320Kの温度範囲で行った.その結果,分子を吸蔵していないZnphdでは,測定全温度領域で熱異常は観測されなかった.一方,40%ベンゼン吸蔵試料では,140Kおよび210Kに熱異常が観測された.210Kの熱異常は140Kよりも大きい.これらの2つの熱異常は過冷却現象を示し,1次相転移であることが確認できた.飽和吸蔵量の11%,28%および40%のベンゼンを吸蔵させた試料での相転移に伴う過剰熱容量から,これらは熱異常の高温側と低温側の熱容量をなめらかに結ぶベースラインを引き,その差として求めた.約210Kに観測される熱異常は,吸蔵量の増加にともなって,転移エントロピーが増加するが,転移温度は変化しないことがわかった.一方,低温側の熱異常は,吸蔵量の増加に伴って,低温側に移動しながら転移エントロピーが増加することがわかった.このためこれらの相転移は別の原因によるものではないかと考えられる.また,これらの試料を真空排気して吸蔵されたベンゼンを脱離させると,熱容量は吸蔵する前の試料と完全に一致したことから,吸蔵・脱離が可逆的であることがわかった.一方,室温での構造解析によりベンゼン吸蔵前のZnphdの格子は立方晶で,a=25.644Åであることがわかった.また,ベンゼンを100%吸蔵させた試料ではa=25.796Åとなり,ベンゼン吸蔵によりわずかに格子が膨張することがわかった.テレフタル酸亜鉛錯体([Zn_4O(OOCC_6H_4COO)_3])はベンゼンを架橋配位子とする均一な細孔を持っており,気体の吸蔵・脱離、分子ふるい、化学反応の場、触媒などの様々な分野での応用が期待されている.

これまでに私は,トランス-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸銅(II)(Cu_2(OOC-C_6H_10-COO);Cuchdと略す.)について,トルエン,四塩化炭素などを吸蔵あるいは脱離させた試料について熱的および磁性的挙動を研究してきた.本研究では,新たにZnphdを合成し,種々の量のベンゼン分子を吸蔵させた試料について,断熱型熱量計により低温熱容量測定を行い,粉末X線回折測定の結果と合わせて,Znphdの分子吸蔵特性について熱的性質および結晶構造から検討した.その結果,分子を吸蔵していないZnphdでは,測定全温度領域で熱異常は観測されなかった.一方,40%ベンゼン吸蔵試料では,140Kおよび210Kに熱異常が観測された.210Kの熱異常は140Kよりも大きい.これらの2つの熱異常は過冷却現象を示し,1次相転移であることが確認できた.飽和吸蔵量の11%,28%および40%のベンゼンを吸蔵させた試料では210Kに観測される熱異常は,吸蔵量の増加にともなって,転移エントロピーが増加するが,転移温度は変化しないことがわかった.一方,低温側の熱異常は,吸蔵量の増加に伴って,低温側に移動しながら転移エントロピーが増加することがわかった.このためこれらの相転移は別の原因によるものではないかと考えられる.また,これらの試料を真空排気して吸蔵されたベンゼンを脱離させると,熱容量は吸蔵する前の試料と完全に一致したことから,吸蔵-脱離が可逆的であることがわかった.
安定な固相担持性金属触媒の開発とタルーシン誘導体合成への応用

報告書らはシラボンドフェニル^[○!R](表面上の水酸基がフェニル基に置換されたシリカゲル)に140度のマクロウェーブ照射下,水銀アセテートを作用させると,フェニル水銀アセテートとしてシリカゲル表面上に水銀塩が担持できることを見出し,世界に先駆けて,再利用可能な固相担持性水銀反応剤:シラフェニル水銀トリフラートの調製に成功した.この固相水銀試薬は,アルキニルアミンからのインドール合成や,フラノイン環化反応,アリールイン環化反応,タンデム型多重環化反応,アリルアミノ化反応に対して高い触媒活性を示し,種々の多置換多環性化合物をフロー反応で合成することができた.また,タンデム環化反応によって調製した二,三環性ラクトンを藻類葉状体形成促進因子タルーシンの合成研究に活用することで,計10種の類縁体合成を達成した.また,マキヒトエ(緑藻類の一種)を用いた活性評価を行うことで,活性発現に不可欠な構造単位の特定や活性発現メカニズムの解明に迫る重要な知見を得ることに成功した.報告書らはシラボンドフェニル^[○!R](表面上の水酸基がフェニル基に置換されたシリカゲル)に140度のマクロウェーブ照射下,水銀アセテートを作用させると,フェニル水銀アセテートとしてシリカゲル表面上に水銀塩が担持できることを見出し,世界に先駆けて,再利用可能な固相担持性水銀反応剤:シラフェニル水銀トリフラートの調製に成功した.この固相水銀試薬は,アルキニルアミンからのインドール合成や,フラノイン環化反応,アリールイン環化反応,タンデム型多重環化反応,アリルアミノ化反応に対して高い触媒活性を示し,種々の多置換多環性化合物をフロー反応で合成することができた.また,タンデム環化反応によって調製した二,三環性ラクトンを藻類葉状体形成促進因子タルーシンの合成研究に活用することで,計10種の類縁体合成を達成した.また,マキヒトエ(緑藻類の一種)を用いた活性評価を行うことで,活性発現に不可欠な構造単位の特定や活性発現メカニズムの解明に迫る重要な知見を得ることに成功した.今回,水銀が炭素と共有結合性の高い安定なσ結合を形成する性質に着目し,固体ポリマー(固相担体)にフェニル水銀トリフラートを直接導入した環境調和型水銀触媒(固相担持性水銀触媒)を開発し,葉状態形成誘導活性化因子であるタルーシンの誘導体合成に利用することを目的とした.平成20年度(平成21年3月31日)の研究実施計画では新規固相担持性水銀触媒の調製法確立と,それを用いた反応効率や触媒安定性の確認を行うと共に基質適用制限を明確にすることに重点を置いた.先ず,固相触媒の基盤となる最適な担体の探索としてポリスチレンやデンドリマー型の有機性担体やシリカゲル系無機性担体を用いて10種を超える固相水銀触媒を合成した.そして触媒安定性や反応性を総括的に評価し,シラサイクル社のシラフェニル担体を用いて,酢酸溶媒中マイクロウェーブ照射する手法で効果的な固相担持性水銀触媒(シラフェニル水銀トリフラート)の調製に成功した.この固相触媒は67回の再利用が可能であると同時に,固系触媒の特性を活用してカラム充填することでフロー反応システムに応用することが出来た.又,基質適用性を確認するため,アルキニルアニリン誘導体からのインドール触媒合成反応,フリーデル・クラフツ型アリールイン環化反応やフラノイン環化反応,インエンアリールを組み込んだ生合成類似多重環化反応に利用したところ,極めて効果的に反応を触媒し幅広く利用出来ることを確認した.又,葉状態形成誘導活性因子タルーシン誘導体合成への応用を見据えて,インエンカルボン酸型タンデム環化反応についても検討したが,単離収率72%で目的とする二環性ラクトンをジアステレオ選択的に一挙に合成できることも確認出来た.今回調製することに成功した固相担持性水銀触媒の開発は水銀試薬として初めてのリサイクル触媒の開発であると共に近年深刻な社会問題としてクローズアップされる貴元素の枯渇問題を解決するための新たな代用法の構築として極めて重要な成果であると考えられる.平成21年度(平成22年3月31日)の研究実施計画に沿って,今年度は固相担持性性水銀触媒を活用した藻類成長促進因子タルーシンの誘導体合成を行った,構造活性相関研究を見据えて,まずタルーシンに特徴的な連続炭素環骨格に着目した誘導体合成に着手した.そして,新たに開発した固相担持性水銀触媒を用いたポリエンカルボン酸のタンデム環化反応を鍵段階とする簡便な誘導体合成法を確立し,計5種類の誘導体合成を達成した.また,確立した合成手法を天然型タルーシンの全合成に応用することで,13段階,総収率21%のグラム合成を達成することも出来た.さらには,合成したタルーシン誘導体の活性評価を並行して行うことで,その中から天然型タルーシンとは逆の性質(藻類生長抑制作用)を示す誘導体を見出すことも出来た.一般的に世界各地の海洋を生息域とした膨大な数量の大型緑藻類は,海水の浄化と水質を維持する上で極めて重要な役割を担い,海洋生態系の主要な歯車として機能している.そのため,時には人的な海水汚染や海流異常が引き金となって,ある海域や沿岸では藻類が異常増殖し,他の生物を死滅させる赤潮や緑潮(グリーンタイド)を引き起こす.

このような背景を踏まえれば,今回タルーシンの誘導体合成を通じて見出すことができた藻類生長抑物質は赤潮や緑潮の原因となる海産性藻類の新たな過剰発生防止剤として応用できると考えている.平成22年度(平成23年3月31日)の研究実施計画に準じて,サルーシンA環部のアキシャルメチル基が,藻類の葉状体形成誘導活性に不可欠な置換基であることを確認するため,エカトリアル型β-ノルサルーシンの合成研究を展開した.そして,障壁効果を利用したメチル基の異性化を鍵反応とすることで,目的としたβ-ノルサルーシンの合成(21段階,総収率4.8%)を達成した.β-ノルサルーシンは予想通り完全に活性が消失することから,作用発現におけるアキシャルメチル基の重要性を実験化学で初めて立証することができた.また,現象として確認されてきた藻類-サルーシン関連系によって引き起こされる一連のカスケードを分子生物学的見地から解き明かすため,そのツールとなるサルーシン蛍光標識体合成を指向してジピコリン酸部位に着目した誘導体合成を行った.計三種の誘導体を合成し,活性試験を行うことで,その中の一つから強力な葉状体形成誘導活性を確認した.今回得られた一連の知見により,報告者が次に目指すサルーシン標識体合成の糸口を確実に捕らえることができた。一方で,固相担持性水銀触媒を活用した新たな分子構築法の探索を展開した.そして,新たにアリルアルコールとスルファメートから固相担持性水銀触媒存在下,効果的に炭素-窒素結合形成反応が進行し,アリルアミン(付加体)が高収率に生成することを見出した.本手法は基質適応性も極めて高く,アルコールの活性化を必要としない辻-Trost型のアリルアミノ化反応として今後の合成研究に高い汎用性が期待される.
B型慢性肝炎とHLA class II遺伝子との関連の包括的理解を目指す研究

H29年度にB型肝炎ワクチン(HBワクチン)の応答性にHLA class II遺伝子が関わることを明らかとした。H30年度はHBワクチン反応群(HBs抗体価が10 mIU/ml超)と低反応群(HBs抗体価が10 mIU/ml以下)の2群を比較するGWASを実施した。その結果、BTNL2遺伝子上のSNP(rs4248166)が最も低いP値を示した。さらにHBワクチン高反応群(HBs抗体価が100 mIU/ml超)を低反応群と比較すると、rs4248166のオッズ比が強まる傾向が見られた。この結果から、ワクチン中反応群は、ワクチン低反応群や高反応群に入るべき人が一部混在した集団であることが示唆された。そこでワクチン低反応群をワクチン反応群およびワクチン高反応群と比較するGWASを実施し、得られたORがより強まる(もしくは弱まる)SNPを選択することで新たなホスト因子の同定を試みた。ワクチン低反応群をワクチン応答群およびワクチン高反応群と比較するGWASの結果、P値が0.05以下となったSNP数はそれぞれ23,012 SNPs、23,769 SNPsとなった。これらの中でORがより強まった(もしくは弱まった)SNPを絞り込むと計11,704 SNPsが選択され、6番染色体を除いてもっとも低いP値を示したのはrs2732977(P=5.95×10-6、OR=0.49)であった。続いて、選択された11,704 SNPsの中でP <0.0001となった301 SNPsを対象として、IPAソフトウェアを用いてパスウェイ解析および上流因子解析を実施した。パスウェイ解析、上流因子解析により、HBワクチン応答性にはHLA分子によるHBV由来ペプチド抗原の認識やT細胞上のBTNL2分子などの副刺激分子を介した抗原提示細胞からの共刺激シグナルの伝達が重要な役割を果たしていることが示された。日本人B型肝炎患者1,033例、日本人健常対象者942例のゲノムワイドSNPタイピングデータを用いてGWASを実施した。加えて、ゲノムワイドSNPタイピングデータを用いてHLA imputationを実施し、HLAアリルの推定を実施した。HLA関連解析の結果、3つのB型慢性肝炎になりにくいHLAタイプ(DPB1*02:01, DPB1*04:02, DRB1*13:02-DQB1*06:04)と2つのB型慢性肝炎になりやすいHLAタイプ(DPB1*05:01, DRB1*15:02-DQB1*06:01)が存在することを明らかとした(Nishida et al. Sci. Rep. 2016)。上記の5つのHLAタイプの有無を説明変数に入れたHLA層別化GWASを実施したところ、ゲノムワイド有意水準に達する新たな遺伝子領域を同定することはできなかったものの、複数の候補遺伝子領域を検出した。現在も継続して、日本全国の共同研究施設からB型肝炎患者由来の生体試料(ゲノムDNA、血清)を収集しており、今後Replication解析を実施する予定である。B型慢性肝炎に関連するHLA class II遺伝子の解析を進めることで、慢性肝炎になりやすいHLAタイプとなりにくいHLAタイプを同定することができた。また、B型慢性肝炎患者群を肝発がんの有無で2群に分けたGWASを実施したところ、HLA class I遺伝子の関連を新たに同定した(論文投稿中)。肝発がんになりにくいHLAタイプを有するにもかかわらず、肝がんを発症した症例を選択することが可能となった。これまでに日本全国から収集したB型肝炎患者1,033例の中で、肝発がんになりにくいHLAタイプをホモで有するにもかかわらず肝がんを発症した11症例を選択した。同じHLAタイプを有する肝発がんのない症例11例と共に、HBV-DNA塩基配列を比較したところ、肝発がん症例に共通する特徴的なアミノ酸配列を同定した(投稿論文準備中)。B型肝炎ワクチン接種者のうちの約10%はその中和抗体であるHBs抗体を獲得できないという問題があり、その原因は分かっていなかった。そこでB型肝炎ワクチンに対する応答性に関連するホスト側遺伝要因の同定を目指して、成人日本人1,193例を対象としたゲノムワイド関連解析(GWAS)を実施した。ワクチン低反応群(107例)、ワクチン中反応群(351例)、ワクチン高反応群(735例)の3群に分けて比較をした結果、HLA class II領域に存在するDRB1-DQB1遺伝子とDPB1遺伝子がそれぞれワクチン応答性に関連することを明らかにした。また、ワクチン低反応群と高反応群を比較した結果、HLA class III領域に存在するBTNL2遺伝子が有意な関連を示した。続いて、ゲノムワイドSNPタイピングデータを用いてHLA imputation法によるHLA遺伝子型の推定を行い、HLAアリルおよびハプロタイプとB型肝炎ワクチン効果との関連を詳細に解析した。HLAアリルおよびハプロタイプの頻度をワクチン低反応群とB型慢性肝炎患者群で比較した結果、B型肝炎ワクチンの応答性に特異的に関わるDRB1-DQB1ハプロタイプが存在することを見出した。さらにワクチン高反応群と健常対照群について同様の比較を行った結果、HLA class II遺伝子(DRB1-DQB1、DPB1)はワクチン高反応に関連を示さなかった。

ワクチン高反応群と低反応群のGWASでBTNL2遺伝子が検出されたことから、BTNL2遺伝子はワクチン高反応に関わっていることが示唆された。この研究の成果をもとに、国際共同研究を進めることで、ユニバーサルワクチネーションが行われている日本やその他の国において、B型肝炎ワクチンの適正かつ効率的な使用方法の確立が期待できる。研究実績の概要に記載したB型肝炎ワクチン応答性に関するGWASの成果を論文報告した(Nishida et al. Hepatology, 2018)。また、日本人B型慢性肝炎患者群を肝発がんの有無で2群に分けたGWAS、香港人とタイ人のB型肝炎患者群を対象としたReplication解析を実施した結果、HLA class I遺伝子領域に存在するSNPが有意な関連を示すことを見出し、論文報告した(Sawai, Nishida, et al. Sci. Rep., 2018)。さらにHLA-DPB1アリルの頻度を肝がんを有するB型肝炎患者群、肝がんを有さないB型肝炎患者群、健常対照群の3群で比較した結果、特定のDPB1アリルが肝発がんの抑制因子であることを見出した(投稿論文準備中)。特定のDPB1アリルをホモで有する肝がん症例および肝がんを有さない慢性肝炎症例を対象としてHBV-DNA塩基配列決定を行い、肝発がんに関連するウイルス因子の探索を行った。その結果、肝発がんに関連する特徴的なアミノ酸配列を同定した(投稿論文準備中)。H29年度にB型肝炎ワクチン(HBワクチン)の応答性にHLA class II遺伝子が関わることを明らかとした。H30年度はHBワクチン反応群(HBs抗体価が10 mIU/ml超)と低反応群(HBs抗体価が10 mIU/ml以下)の2群を比較するGWASを実施した。その結果、BTNL2遺伝子上のSNP(rs4248166)が最も低いP値を示した。さらにHBワクチン高反応群(HBs抗体価が100 mIU/ml超)を低反応群と比較すると、rs4248166のオッズ比が強まる傾向が見られた。この結果から、ワクチン中反応群は、ワクチン低反応群や高反応群に入るべき人が一部混在した集団であることが示唆された。そこでワクチン低反応群をワクチン反応群およびワクチン高反応群と比較するGWASを実施し、得られたORがより強まる(もしくは弱まる)SNPを選択することで新たなホスト因子の同定を試みた。ワクチン低反応群をワクチン応答群およびワクチン高反応群と比較するGWASの結果、P値が0.05以下となったSNP数はそれぞれ23,012 SNPs、23,769 SNPsとなった。これらの中でORがより強まった(もしくは弱まった)SNPを絞り込むと計11,704 SNPsが選択され、6番染色体を除いてもっとも低いP値を示したのはrs2732977(P=5.95×10-6、OR=0.49)であった。続いて、選択された11,704 SNPsの中でP <0.0001となった301 SNPsを対象として、IPAソフトウェアを用いてパスウェイ解析および上流因子解析を実施した。パスウェイ解析、上流因子解析により、HBワクチン応答性にはHLA分子によるHBV由来ペプチド抗原の認識やT細胞上のBTNL2分子などの副刺激分子を介した抗原提示細胞からの共刺激シグナルの伝達が重要な役割を果たしていることが示された。【ホスト因子の探索】HBワクチン接種症例を対象としたGWASを実施する。
「学歴身分制度」の変容・廃止と「日本的雇用制度」の運用実態の関係の歴史実証的研究

教育資格が雇用制度に与えた影響を問う視角から、1950年代から1970年代にかけての日本企業の人事制度の運用実態および雇用制度の在り方とその変化を実証的に解明し、日本企業の雇用制度に関する認識を再構成する。その際、各教育資格保有者の職能・職務配置の差異・同一性のあり方とそれに規定された彼らの職務昇進・賃金の格差の実態に止まらず、彼らの間の職務上の分業関係とそれを規定した職務能力の差異を、彼らの実際の職務行動に即して把握する。
中世貴族社会における鷹狩故実の相伝

持明院家が鷹道を相伝する「鷹の家」とされてきた根拠は、13世紀末に持明院基盛が著した鷹書として知られてきた『基盛朝臣鷹狩記』である。しかし、諸本の調査、内容の考証の結果、同書は本来、西園寺家の鷹書であったこと、著者は西園寺実兼であったと考えられることが判明した。持明院家が「鷹の家」と化したのは、16世紀の持明院基春以降のことであったと考えられる。持明院家文書を分析した結果、基春は美濃に下向した際、和歌の書様と鷹道を伝授して誓詞を受け取っていたことがあきらかになった。基春は、それ以前から貴族社会で行われていた歌道伝授の影響をうけて、書や鷹の秘説を伝授して誓詞をとることを始めたと考えられる。近世には、持明院と西園寺の両家が「鷹道」を「家業」にしていたと考えられており、現在知られている鷹書には、その両家にかかわるものが少なくない。本研究は、両家と鷹狩とのかかわりを軸に、中世の貴族社会における鷹狩の実態とその家業化の過程について探ろうとするもので、本年度は持明院家の歴史とその鷹書について調査した。持明院家が中世前期から鷹の家だったとされてきた根拠は、『尊卑分脈』のなかに持明院家の祖「基家」に「鷹」を「家業」としたという注記を付した本があることと、永仁年間に持明院基盛が著した鷹書として知られている『基盛朝臣鷹狩記』(『続群書類従』第19輯中所収「基成朝臣鷹狩記」)である。しかし、『尊卑分脈』の家業に関する注記は、後世(何らかの意図により)付されたもので、「基家」の家業に関する注記も16世紀以降に加筆されたものである可能性が高く、持明院家が中世初期から鷹を家業としていたことを証する史料にはならない。また、『基盛朝臣鷹狩記』も基盛の著作とするには不審な点が多い。同書の原本は知られていないが、『九条家記録』「九条満家引付」のなかに永享2年(1430年)書写の同内容部分があり、今のところこれが最古写本とみられる。そこには「持明院」の家名も「基盛」の署名も見えない。他の諸本の調査結果からも、この『鷹狩記』の成立と持明院家は一旦切り離して考えなければならないことがあきらかになり、あらためて『鷹狩記』本文に登場する人物などを調べた結果、本来持明院家の鷹書ではなく西園寺家の鷹書であったこと、著者は西園寺実兼であったと考えられることが判明した。では、持明院家はいつどのようにして鷹の家になったのか。注目すべきは、16世紀前半の持明院基春とその子基規である。今後は、この父子の著述・書写活動のなかに鷹書を位置づけ、その成果が子孫にどのように継承されたかを探る必要がある。これまでの研究によって、戦国時代を生きた持明院基春・基規父子が西園寺家や美濃土岐家などの鷹書を書写・収集していたこと、基春は美濃、基規は周防山口に頻繁に下向していたことなどがあきらかになっている。今年度は、当時の古記録を渉猟して彼らの事蹟を確認する作業を継続するとともに、懸案だった持明院家文書の調査・分析をおこなった。持明院家文書は、戦前、京都大学国史研究室によって影写され、「持明院子爵家所蔵文書」全4冊にまとめられている。同影写本の写真が東京大学史料編纂所に架蔵されており、その写真帳を閲覧・解読した。同文書の多くは近世持明院家から入木道(書道)を伝授された者が、秘伝を他言しない旨を持明院家に対して誓った起請文(誓詞)であるが、鷹道伝授に対して提出された誓詞も15通ほど含まれている。また、近世の誓詞だけでなく、16世紀前半にさかのぼる誓詞が5通ある。それらを分析した結果、基規は周防山口へ下向した際、大内氏の家臣に鷹道や入木道を伝授して誓詞を受け取っていたこと、基春は美濃に下向した際、能書・入木道と鷹道を伝授して誓詞を受け取っていたことがあきらかになった。持明院家が書や鷹の秘説を伝授して誓詞をとることは、それ以前から貴族社会で行われていた歌道伝授の影響のもと、永正年間頃、基春が始めたと考えられる。

また、基春は『尊卑分脈』の原本と思しき「諸家系図」を所持していたことが知られており、『尊卑分脈』と基春の関係も探った。持明院家の祖とされる「基家」に付された「馬藝鷹生小弓等為家業」や土岐「頼忠」に付された「鷹一流相伝」といった『尊卑分脈』の注記は、土岐家の鷹書をも書写し、鷹道を「家業」にしようとした基春か基春にきわめて近い人物が施したもので、中世における鷹狩故実の相伝を考える際に留意すべき史料であることをあきらかにした。本年度は、16世紀に鷹書を書写・著述した持明院基春・基規父子について調査・研究を続けた。基春は持明院流入木道の祖とされる人物だが、彼は鷹書の書写・著述にも積極的で、文亀3年(1503)に『鷹経辨疑論』、永正3年(1506)には『責鷹似鳩拙抄』という鷹書を著しており、同13年には『鷹秘抄』を書写した。尊経閣文庫所蔵の『西園寺家鷹口傅』は最奧に「従三位基春」とあり、基春が所持していたと考えられ、同『西園寺家鷹之書』にも「従三位藤(花押)」とあって、基春書写(または所持)本の写本とみられる。『鷹秘抄』の最奥には、「この鷹譜は〈土岐〉禅蔵寺殿より西郷殿参るを大巣殿御相伝、それより写おわんぬ」とある。「禅蔵寺殿」は美濃の土岐頼忠で、『土岐系図』によれば、頼忠の子頼音が西郷(岐阜市)に居住して「西郷」を称し、頼忠の子頼兼が本巣郡大須(根尾村)に居住して「大須三郎」を称したというから、『鷹秘抄』は土岐氏相伝の鷹書だったとみてよいだろう。『実隆公記』などの記録によれば、基春は何度も美濃国へ下向しており、基春と土岐氏との関係は密接であった。所謂『基盛朝臣鷹狩記』康応系諸本の奧書には「基規」の名がみえ、なかでも尊経閣文庫所蔵『鷹狩之事』は基規書写(または所持)本にかなり近い写本とみられる。また、同文庫所蔵の『西園寺家鷹之書』は元禄3年の写しだが、その本奥書には「防州正□□於旅館書之/天文第十四暦十二月下旬左金吾藤(花押)」とあり、親本は基規が周防滞在中の天文14年(1545)に書写した本であったことがわかる。『言継卿記』などによれば、基規は晩年、大内義隆と親密に交流し、周防山口にしばしば下向・滞在していた。西園寺家の鷹書を含むいくつもの鷹書の収集・書写をしていた基春・基規だが、彼らは都だけでなく地方の大名との交流のなかでも、鷹書を収集・書写していたことがあきらかになってきた。25年度が最終年度であるため、記入しない。この研究のひとつめの柱であった『基盛朝臣鷹狩記』について、それが従来信じられてきた持明院基盛の著作ではなく、少なくともその前三分の二は西園寺実兼の著作であったとみられることをあきらかにした。これは大きな成果である。また、ふたつめの柱である、持明院基春・基規父子の事跡に関する調査・研究も進んでおり、基春と美濃・土岐氏、基規と周防・大内氏との関係についてあきらかになりつつある。しかし、校務が予想以上に繁忙になり、文書や故実書類の写本調査の実施回数は予定よりも少なくなっている。いまだに持明院子爵家所蔵文書の調査は実施できずにいることから、中世・近世移行期の持明院家についての考察はほとんど進んでいない。また、諏訪氏と公家たちとの交流などについても今後の課題である。持明院基春・基規父子の事跡をさらに解明したい。基春と美濃国および土岐一族との関係については、『実隆公記』や『御湯殿上日記』などにみられる関連記事を再検討する。また、基春書写の『鷹秘抄』については、静嘉堂文庫、宮内庁書陵部、陽明文庫などに所蔵されている古写本を確認したい。基規と大内義隆との関係についても、古記録と故実書類の知見を総合して考察を深めたい。持明院家は中世・近世移行期をいかに乗り越え、鷹道を相承したのかについても探る。『言経卿記』『御湯殿上日記』など、この時期の古記録のなかから、持明院家の人々に関する記述を抽出し、考察する。また、持明院子爵家所蔵文書には、入木道・鷹・郢曲に関する文書が含まれていることが知られているから、ぜひ調査したい。それらから得られた情報と、近世の故実書類や家譜などの記述とを対照し、実像に迫る。
新規ヘテロ原子置換ポルフィリン類縁体の合成と機能開拓

ポルフィリンは機能性色素として重要な分子群である。本研究では、ジピリン金属錯体を前駆体として用いて、様々なヘテロ原子導入反応を適用することにより、外周部炭素をヘテロ原子で置換した新規ポルフィリン類縁体の合成法を開拓することに成功した。具体的にはポルフィリンの外周部に硫黄、酸素、ケイ素、リンの導入し成功し、それら新規ポルフィリン類縁体の構造・物性・反応性を明らかにした。得られた新規ポルフィリン類縁体は近赤外吸収特性や優れた電気化学特性を示し、機能性色素として期待できる性質をもつことが分かった。DMF中、ジクロロジピリン錯体と硫化ナトリウムを反応させたところ、ニッケル錯体からはチアコロールニッケル錯体、亜鉛錯体からはジチアポルフィリンがそれぞれ生成することを見いだした。チアコロールニッケル錯体は、高い平面性をもち、硫黄上の非共有電子対を含む18π共役系に由来する明確な芳香族性を示す。この結果は、3p軌道の非共有電子対が18πという大きな芳香族π電子系に含まれる例として興味深い。一方。ジチアポルフィリン金属錯体は硫黄を中心に折れ曲がった構造をもつことを明らかにした。特に、ニッケル錯体をトルエン中加熱すると、脱硫反応が進行しチアコロールニッケル錯体となることを見いだした。亜鉛、パラジウムおよび白金の錯体では、全く脱硫反応は進行しなかった。これは、この脱硫反応が金属のイオン半径に依存することを示唆する。そこで、小さなイオン半径をもつアルミニウムをもつジチアポルフィリン錯体を合成したところ、同様に脱硫が収率よく進行した。小さなイオン半径をもつ金属イオンが中心に配位すると、ジチアポルフィリンは大きく折れ曲がる。このため、反応するα炭素同士が接近し、脱硫が進行しやすくなったものと考えられる。さらに、DFT法を用いた理論計算により脱硫反応のメカニズムを解析し、ジチアポルフィリン金属錯体の歪が鍵となっていることを明らかにした。また、反芳香族性ポルフィリノイドであるノルコロールをmCPBAまたは酸素で酸化すると、芳香族性をもつオキサコロールが生成することも明らかにした。これにより、メゾ位のヘテロ原子が酸素の場合よりも硫黄の場合の方が、ヘテロコロールの芳香族性は強くなることが分かった。さらに、ジチアポルフィリンおよびチアコロールの硫黄の酸化にも成功した。環縮小ポルフィリンの一種であるノルコロールは、ひずみのため従来合成困難と考えられてきた。しかし、我々はジピリンニッケル錯体の還元的環化を試みたところ、ノルコロールニッケル錯体が90%以上という高収率で生成し、安定な化合物として大量に合成できることを見いだした。さらに、ノルコロールが明確な反芳香族性をもつこと初めて実証した。今回、この反芳香族性ノルコロールに対して二価化学種であるシリレンを反応させることを試みた。高い反応性をもつ反芳香族性π電子系へのケイ素の挿入により興味深い物性をもつ新規π電子系が得られるのではないかと考えたからである。嵩高い置換基によって安定化されたシリレンをノルコロールニッケル錯体と反応させたところ、室温という穏和な条件で瞬時に反応することが分かった。分析の結果、高い位置選択性でケイ素の挿入反応が進行し、パイ共役系上にケイ素を含む新規ポルフィリノイドが生成した。興味深いことにこのポルフィリノイドはケイ素の効果により近赤外領域に強い吸収をもつことがわかった。一方、メゾ位にシリルエチニル基をもつポルフィリンに界面活性剤の存在下酸を作用させると、アルキニル基が除去され置換基を持たないポルフィリンが生成することを発見した。シリルエチニル基がポルフィリンの保護基として利用できる可能性を示す結果である。実際、この方法を用いて従来の方法で合成困難であった非対称型ポルフィリンを効率的に合成することに成功した。高いエネルギー変換効率をもつ色素増感太陽電池の色素の創成に利用できる可能性がある。ルテニウムトリス(ビピリジン)錯体やレニウムクロロトリカルボニル錯体のような、遷移金属ポリピリジル錯体は、可視光を吸収することにより長寿命の三重項励起種が発生することから、光触媒反応への応用が盛んに研究されている。本研究では、ジアザポルフィリンとビピリジンの機能をハイブリッドすることを目指し、ピリジルジアザポルフィリンを新規二座配位子として設計し、クロスカップリング反応を用いることにより、その合成を達成した。さらに、ピリジルジアザポルフィリンに白金、ルテニウム、レニウムなどの遷移金属塩を作用させると、対応する金属錯体が収率よく生成することを見いだした。これらの錯体の構造については、NMRおよび単結晶X線構造解析から明らかにした。また、これらの金属錯体が可視光部から近赤外部に幅広い吸収をもつことを見いだし、その吸収がMLCT遷移に由来することを分子軌道計算から明らかにした。我々は以前ジピリン金属錯体を前駆体とした、メゾ位に窒素や硫黄を含むヘテロポルフィリノイドの合成を報告している。今回、ジピリン金属錯体をケイ素やリンのソースと反応させることによりメゾ位にケイ素およびリンを含む新規ポルフィリノイドであるシラコロールおよびホスファコロールを合成することに成功した。得られた化合物の構造はX線結晶構造解析により明らかにした。シラコロールの吸収スペクトルを測定したところ、ポルフィリンに比べてQ帯の吸収が大きく長波長シフトしていた。

また、電気化学測定の結果からシラコロールのLUMOがポルフィリンに比べて大きく低下していることが明らかになった。これは、シロールなどの含ケイ素π電子系に見られるσ*-π*共役によるもとの考えられ、実際に分子軌道計算からもその寄与が確認された。一方、ホスファコロールにおいてもQ帯の大幅な長波長シフトが観察された。また、ホスファコロールにおいてはリンを酸化することにより、その物性を劇的に変化させることができることも明らかにした。ポルフィリンは機能性色素として重要な分子群である。本研究では、ジピリン金属錯体を前駆体として用いて、様々なヘテロ原子導入反応を適用することにより、外周部炭素をヘテロ原子で置換した新規ポルフィリン類縁体の合成法を開拓することに成功した。具体的にはポルフィリンの外周部に硫黄、酸素、ケイ素、リンの導入し成功し、それら新規ポルフィリン類縁体の構造・物性・反応性を明らかにした。得られた新規ポルフィリン類縁体は近赤外吸収特性や優れた電気化学特性を示し、機能性色素として期待できる性質をもつことが分かった。ジアザポルフィリンの金属錯体の合成に成功し、メゾ位の窒素原子と遷移金属との配位結合を単結晶X線構造解析によって明らかにするなど大きな成果が得られた。27年度が最終年度であるため、記入しない。有機構造化学今年度得られた錯体の光反応性を明らかにし、光触媒反応への利用を目指す。また、ジアザポルフィリンに磁性金属を配位させ、その磁気物性について探求する。平成24年度には、ジピリン金属錯体を出発物質とするメゾ位に硫黄原子をもつポルフィリン誘導体の合成を計画していたが、この合成を順調に達成し、得られたジチアポルフィリンの反応性を明らかにすることができた。それに加えて、当初予定していなかったメゾ位に酸素原子をもつポルフィリン誘導体であるオキサコロールの合成を達成することができた。また、含硫黄ポルフィリンの硫黄の酸化についても予備的知見が得られた。シリレンと反芳香族化合物の反応によりケイ素の挿入反応が起こることを世界ではじめて発見し、新たな含ケイ素パイ電子化合物の創成に実際につながることを示した。さらに、新規含ケイ素ポルフィリンが強い近赤外吸収をもつことを見いだした。一方、ポルフィリン上のエチニル基が簡単に除去できることを見いだし、太陽電池の増感剤の合成などに利用できる可能性を示すことができた。残額が少額であり無理に使用しなかったため。平成24年度に合成できた含硫黄ポルフィリンの置換基を変えることにより結晶構造を制御し、その固体物性を明らかにする。また、予備的知見が得られた含硫黄ポルフィリンの酸化について詳細に検討し、その構造や基本物性ならびに金属錯化挙動を明らかにする。反芳香族性ポルフィリンとヘテロ原子活性種との反応によりさらに多様なヘテロ原子をもつポルフィリンを合成する。また、シリルエチニル基をポルフィリンの保護基として利用して新規非対称型ポルフィリンを合成し、実際に色素増感太陽電池を作成して性能の評価を行い、高い発電性能をもつ色素の合成に挑戦する。消耗品に使用する。
X線を利用した脳損傷の法医病理学的研究

法に触れる多くの傷害事件や複雑な交通事故を扱う法医学の領域では外力によって惹き起こされた脳の損傷を検索するに当たり、その損傷の部位・広がり・程度・新旧の別などを的確につかみ、その結果を高齢者に多く認められる内因性疾患による脳病変と対比して鑑別し、損傷そのものの形態とその位置から損傷の成立ちを考えて外因との関連において捕らえながら鑑定していくことが要求される。しかし、脳は骨組織に包まれているために外力によって複数の部位に多彩な変化を生じ易く、また複雑な立体的構造を示す損傷が多いと言う特性を有する。従って脳損傷の検索には単に外表及び組織のスライスによる観察では不十分であり、いろいろな角度からの検討が必要である。私たちはこれらの問題を解決するために、従来行われていた脳の肉眼的・組織学的観察に加えて、剖検例の開頭前に総頚動脈から硫酸バリウムを主剤とする造影剤を注入して血管造影を行うという方法をとって脳損傷の検索を進めてきた。その結果、頭部外表の観察や脳スライスの検討に当たり、これまでは見落としがちであった微細な損傷もその損傷部の血管破綻による造影剤の漏出を肉眼的にまた組織学的に追うことにより損傷を発見し易くすることができた。また開頭前に頭部X線撮影を併用することにより、臨床検査データも既往歴も共に不明な多くの例において脳内の出血部および虚血部を明確なコントラストによって同定し、その部分の血管の断端部に注目して病変の種類・広がりとその程度を推定し、内因性の疾患を鑑別し得た。これまでに経験し得た80例あまりの症例についての中間報告を本年ベルリンで開催される日独法医学シンポジウムに「脳実質内の出血」の標題で報告を予定し、またデュッセルドルフで開かれる国際法科学会議において「損傷と成傷器」についても報告する予定である。法医学の領域では、外力による脳の損傷を内因性疾患による脳病変と区別し、その成立ちを外因との関連において考えながら的確に鑑定していくことが要求される。しかし、脳の損傷は、それらが立体的な広がりを示すばかりでなく、脳の複数の部位に特有な変化を生ずるために表面からの観察や臓器の薄片による検討によってもなお十分には全体像を把握しがたい。これらの問題を解決するために、従来行われていた脳の肉眼的・組織学的観察に加えて、剖検例の開頭前に総頸動脈から硫酸バリウムを主剤とする造影剤を注入して血管造影を行う方法をとった。その結果、外表の観察により、これまでは見落としがちであった頭皮の微細な損傷も容易に発見することができる。また開頭前の頭部X線撮影により、臨床検査と同様に出血部及び虚血部を同定し、その部分の病変の広がりとその程度を推定することが可能となった。取り出された脳については、外表及び割面を観察し、カラ-写真撮影とX線写真の撮影を行い損傷部位を同定してその広がりを確かめ、その領域の組織標本を作って組織学的に損傷の構築を検討した。造影剤は動脈から毛細血管に至る領域をみたしており、静脈には入っていない。このことは動脈から毛細血管に至る血管の破綻はその破綻部に造影剤が漏出し、静脈系の出血では造影剤の漏出を伴わないことが示された。即ち動脈系の出血を明確に鑑別できる。また、血管破綻部から出血した血液は周辺に向かって広がってしまうので通常の肉眼所見において血管破綻部を特定することは不可能に近いが本法では血管破綻部から造影剤の漏出を見るので破綻部を見いだすことが容易である。

このように正常の血圧変動域の圧力で総頸動脈から造影剤を注入し血管造影を行うと、脳損傷の検索に有用なデ-タをうることができる。私たちは本法が脳損傷の研究に新しい道を開いてくれると考え、更に検討を進めている。多くの傷害事件や複雑な交通事故を扱う法医学の領域では、外力によって惹き起こされた脳の損傷を検索するに当たり、その損傷の部位・広がり・程度・新旧の別などを的確につかみ、高齢者に多い内因性疾患による脳病変と区別し、その成り立ちを外因との関連において考えながら鑑定していくことが要求される。しかし、脳の損傷は、それらが立体的な広がりを示すばかりではなく、脳の複数の部位に多彩な変化を生ずるために表面からの観察や脳の薄片による検討によってもなお十分に全体像を把握するのは困難である。これらの問題を解決するために私たちは従来行われていた脳の肉眼的・組織学的観察に加えて、剖検例の開頭前に総頚動脈から硫酸バリウムを主剤とする造影剤を注入して血管造影を行うという方法をとってきた。その結果以下のような有用性が示された。1.外表の観察により、これまでは見落としがちであった頭皮の微細な損傷も容易に発見することができる。2.開頭前の頭部X線撮影により、臨床検査と同様に既往歴の不明な多くの例において脳内の出血部および虚血部を明確なコントラストによって同定し、その部分の病変の種類・広がりとその程度を推定しながら剖検を進めていくことが可能となる。3.取り出された脳については、外表及び割面を観察し、そのカラ-写真撮影とX線写真の撮影を行い損傷部位をさらに詳細に検討してその広がりを確かめるが、広範な出血を示す部位においては従来は多量の出血のためにその領域における検索が困難であったが、ときには複数の出血源をも肉眼的にまた組織学的に検討することができる。4.造影剤は動脈側から注入すると動脈から毛細血管に至る領域を満たすし、また逆に静脈側から注入すると静脈から毛細血管に至る範囲を満たして損傷の部位から漏出するので、動脈性の出血と静脈性の出血を区別できる。法に触れる多くの傷害事件や複雑な交通事故を扱う法医学の領域では外力によって惹き起こされた脳の損傷を検索するに当たり、その損傷の部位・広がり・程度・新旧の別などを的確につかみ、その結果を高齢者に多く認められる内因性疾患による脳病変と対比して鑑別し、損傷そのものの形態とその位置から考えて損傷の成立ちを外因との関連において捕らえながら鑑定していくことが要求される。しかし、脳は硬い骨組織に包まれているために外力によって複数の部位に多彩な変化を生じ易く、また複雑な立体的構造を示す損傷が多いと言う特性を有する。従って脳損傷の検索には単に外表及び組織のスライスによる観察では不十分であり、いろいろな角度からの検討が必要である。私たちはこれらの問題を解決するために、従来行われていた脳の肉眼的・組織学的観察に加えて、剖検例の開頭前に総頚動脈から硫酸バリウムを主剤とする造影剤を注入して血管造影を行うという方法をとって脳損傷の検索を進めてきた。その結果、外表の観察や脳スライスの検討にあたり、これまでは見落としがちであった微細な損傷も造影剤の漏出を肉眼的にまた組織学的に追うことにより発見を容易にすることができた。また開頭前に頭部X線撮影を併用することにより、臨床検査のデータと同様に既往歴の不明な多くの例において脳内の出血部および虚血部を明確なコントラストによって同定し、その部分の病変の種類・広がりとその程度を推定しながら剖検を進めていくことが可能となった。
グリシン開裂酵素複合体の構造と機能に関する研究

グリシン開裂酵素系の構造と機能に関して以下の研究成果を得た。1.ヒトT蛋白質cDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。1209bpの翻訳領域を持ち、27残基のミトコンドリア延長ペプチドと375残基の成熟蛋白質をコードしていた。成熟蛋白質の一次構造をこれまでに明らかにした鶏,牛および大腸菌T蛋白質のそれと比較すると、動物酵素とのホモロジーは高い(ヒトと牛は90%,ヒトと鶏は68%)が、大腸菌とは28%と低く、4種に共通して保存された領域は限られていた。2.ヒトT蛋白質の遺伝子をクローニングし遺伝子座を決定した(3p21.2-p21.1)。3.T蛋白質活性欠損に起因する非ケトーシス型高グリシン血症の生存患者2例のT蛋白質遺伝子を分析し、Gly19,Gly241,Arg292がそれぞれArg,Asp,Hisに変異していることを明らかにした。Gly241は上記の4種で保存されているが、他の二ヶ所は大腸菌で異なっており、それらの変異が三次構造に影響している可能性が考えられる。4.大腸菌のグリシン開裂酵素遺伝子オペロンの発現実験において、N末端16残基を欠いたT蛋白質が殆ど活性を示さないという結果を得たので,活性発現におけるN末端の役割を検討した。N末端に種々の長さの欠失を導入した大腸菌T蛋白質クローンを構築し、発現ベクターpET3aに挿入して大腸菌中で発現させた。そのうち7残基の欠失をもつ蛋白質(ETΔ7)をほぼ単一に精製し、CD spectra,kineticsなどについて全長T蛋白質(ET)と比較した。大腸菌中で発現されたT蛋白質の比活性は全長酵素に対し、4残基欠失で約20%、7残基以上の欠失で約5%であった。ET及びETΔ7は同じステップでほぼ単一に精製されたが、DEAE-Sepharoseからの溶出位置がわずかに異なった。両者のCD spectraに大きな差は見られなかったが、ETΔ7では還元H蛋白質に対する親和性の低下が顕著であった。これらの結果はT蛋白質N末端残基の欠失は全体の構造変化を来たすのではなく、基質、特にH蛋白質との相互作用に影響していることを示唆する。現在、大腸菌T蛋白質とH蛋白質の架橋部位を同定中である。グリシン開裂酵素系(P,H,TおよびL蛋白質で構成される)のT蛋白質について以下の研究成果を得た.1.ヒトT蛋白質cDNAをクローニングし,塩基配列を決定した.1209bpの翻訳領域を持ち,27残基のミトコンドリア延長ペプチドと375残基の成熟蛋白質をコードしていた.推定される一次構造をこれまでに明らかにした鶏,牛および大腸菌T蛋白質のそれと比較すると,動物酵素とのホモロジーは高い(ヒトと牛は90%,ヒトと鶏は68%)が,大腸菌とは28%と低く,4種に共通して保存された領域は限られていた.

2.ヒトT蛋白質の遺伝子座を決定(3p21.2-p21.1)すると共に,T蛋白質活性欠損に起因する非ケトーシス型高グリシン血症患者のT蛋白質変異部位を3例調べ,Gly19,Gly241,Arg292がそれぞれArg,Asp,Hisに変異していることを明らかにした.Gly241は上記の4種で保存されているが,他の二ケ所は大腸菌で異なっており,それらの変異が三次構造に影響している可能性が考えられる.3.大腸菌のグリシン開裂酵素遺伝子オペロンの発現実験において,N末端16残基を欠いたT蛋白質が殆ど活性を示さないという結果を得た.そこでN末端に種々の長さの欠失を持つ大腸菌T蛋白質遺伝子を構築してT7プロモーター下に組み込んで,大腸菌中で発現させたところ,N末端より4残基の欠失で約80%,7残基の欠失で約95%の活性の低下が認められた.N末端は動物と大腸菌で共通に保存されたアミノ酸が比較的多い領域であり,活性に重要な役割を果たしていることが示唆された.今後,N末端が欠失したT蛋白質および高グリシン血症患者に見られる変異を導入したT蛋白質を発現,精製し,ネイティブな酵素との酵素学的な差異を検討して活性発現におけるこれら部位の役割を同定すると共に,結晶化を試みて結晶構造解析を行なう予定である.大腸菌のグリシン開裂酵素遺伝子オペロンの発現実験において、N末端16残基を欠いたT蛋白質が殆ど活性を示さないという結果を得たので,活性発現におけるN末端の役割を検討した。N末端に種々の長さの欠失を導入した大腸菌T蛋白質クローンを構築し、発現ベクターpET3aに挿入して大腸菌中で発現させた。そのうち7残基の欠失をもつ蛋白質(ETΔ7)をほぼ単一に精製し、CD spectra,kineticsなどについて全長T蛋白質(ET)と比較した。大腸菌中で発現されたT蛋白質の比活性は全長酵素に対し、4残基欠失で約20%、7残基以上の欠失で約5%であった。ET及びETΔ7は同じステップ(DEAE-Sepharose CL-6B,hydroxyapatite,Sephadex G-100の各カラムクロマトグラフィーを順次行なった)でSDS電気泳動的にほぼ単一に精製されたが、ETΔ7はDEAE-SepharoseからETよりもわずかに高塩濃度で溶出された。両者のCDspectraおよび熱安定性に大きな差は見られなかったが、ETΔ7では還元H蛋白質に対するKmがETの約20倍で親和性の低下が顕著であった。一方、N末端に9および12残基の欠失を持つ鶏T蛋白質をやはり大腸菌中で発現させたところ、全長蛋白質と同程度に発現されるが、不溶性となった。これらの結果はT蛋白質N末端数残基の欠失は全体の構造変化を来たすのではなく、基質、特にH蛋白質との相互作用に影響していることを示唆する。また鶏酵素の場合、正しくfoldingされる上でもN末端が重要と考えられる。現在、大腸菌T蛋白質とH蛋白質との架橋産物を得ており、架橋部位を同定中である。また結晶化も準備中である。