hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎ウイルス関連蛋白および遺伝子の肝細胞内における検出に関する研究

1.肝組織中におけるC型肝炎ウイルス関連抗原の検出(1)C型肝炎ウイルス(HCV)コア抗原の検出HCV構造遺伝子領域のうちコア領域を大腸菌で発現させて得た220kD(191アミノ酸)のコア蛋白を家兎に免疫してHCVコア抗体を作成した。この抗体を用いて、PLP固定を施したHCV感染患者生検肝組織をPAP法を中心に検索した。その結果、一部の慢性C型肝炎例の肝細胞内にコア抗原の局在を認めた。しかし、この抗原の局在と肝炎の活動性やリンパ球浸潤との間には一定の関連を見出すことはできなかった。(2)肝組織中のHCVコア抗原と血中HCVサブタイプ肝組織中におけるコア抗原の局在の有無を検索した12例について、PCR法によりHCVサブタイプを決定し、抗原の局在との関連を検討したが一定の傾向を認めなかった。2.肝組織中のC型肝炎ウイルスRNAの検出肝組織中のHCV RNAを検出する目的で、C型慢性肝炎例の生検肝組織を凍結し、digoxigenin標識cDNAプローブを用いたin situ hybridization法を施行した。その結果、C型慢性肝炎例ではアルカリホスファターゼ染色の反応産物が肝小葉内に散在性に、あるいはクラスターをなして観察された。これらの反応産物は肝細胞の主として細胞質内に局在しており、本法によって肝細胞内のHCV遺伝子の検出が可能であることが明らかとなった。なお、cDNAプローブと反応させなかった組織やB型慢性肝炎例ではこの反応産物は認められず、特異的反応と考えられた。1.肝組織中におけるC型肝炎ウイルスの関連蛋白の検出(1)C型肝炎ウイルス(HCV)コア蛋白の検出HVC関連蛋白の一つであるコア蛋白の肝組織中において検出する目的で,最初にHCVコア抗体の作製を行った。HCV構造遺伝子領域にうちコア領域を大腸菌で発現させて得た220KD(191アミノ酸)のコア蛋白を家兎に免疫してHCVコア抗体を作製した。この抗体を用いて,PLP固定を施したHCV感染患者生検肝組織をPAP法を中心に検索した。その結果,一部の慢性C型肝炎例の肝細胞内にコア抗原の局在を認めた。しかし,この抗原の局在と肝炎の活動度やリンパ球浸潤との間には一定の関連を見出すことはできなかった。(2)肝組織中のHCVコア蛋白と血中HCVサブタイプ肝組織中におけるコア抗原蛋白の局在の有無を検索した12例について,PCR法によりHVCサブタイプを決定し,抗原の局在との関連を検討したが一定の傾向を認めなかった。今後血中のHCVRNA量を測定して,抗原の局在との関連性を検討する計画である。(3)HCVエンベロープ蛋白の検出HCVエンベロープ蛋白の検出に必要な抗体作製の目的で、HCV遺伝子のエンベロープ領域のコードするアミノ酸配列を合成ペプチドの形で抗原として合成を進めている。抗原としての応用の可否を検討した後に免疫して抗体を作製する計画である。2.肝細胞中におけるHCVRNAの検出1.方法C型慢性肝炎の肝組織中におけるHCV RNAの動態ならびに局在を明らかにするため、digoxigenin標識cDNAプローブを用いたin situ hybridization法を施行した。C型慢性肝炎患者血清より総RNAを抽出し、cDNAプールを作成した。このcDNAプールをテンプレートとしてHCVコア領域の部分配列cDNAを得た。このcDNAクローンを用いてPCRを行なう際に、digoxigenin-11-dUTPを一定の割合でdNTP mix中に加えることにより、digoxigenin標識cDNAを得る。C型慢性肝炎患者の肝生検組織標本を急速凍結しクリオスタットで10μ切片作成後、固定し洗滌、脱水後3ng/μlのcDNA濃度で42°C、1416時間ハイブリダイゼーションを行なった。洗滌後ブロックを施し、抗digoxigenin抗体で反応させ、NBTとBCIPにて発色反応を行なった。

なお内因性のアルカリフォスファターゼはレバミゾールで阻止した。B型慢性肝炎例を対照として検討した。2.成績c型慢性肝炎例ではアルカリフォスファターゼ染色の反応産物が肝小葉内に散在性に、あるいはクラスターをなして観察された。高倍率で観察すると、これらの反応産物は肝細胞の主として細胞質内に局在していた。肝細胞以外の細胞内にはかかる反応産物は認められなかった。cDNAプローブと反応させなかった組織切片上にはこれらの反応産物は認めなかった。またB型慢性肝炎例の肝組織にもこれらの反応産物は見られなかった。肝組織をあらかじめ20μg/mlのRNase Hで処理しておくと陽性の反応産物がみられなくなった。
心室筋細胞におけるナトリウム・トランジェントの検出と、病態生理学的役割の研究

心筋細胞の興奮収縮連関において中心的な役割を果たしているCa^<2+>transient(CaT)は、細胞膜のL型Ca^<2+>channelを介するCa^<2+>流入と、筋小胞体(SR)からのCa^<2+>放出により決定される。これまでの興奮収縮連関の研究は、Ca^<2+>channelとSRの機能連関を中心に進められてきた。しかし心筋細胞では、細胞膜のNa^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)が発達し、NCXは細胞膜電位と[Na^+]_iの変化によりCa^<2+>流入、排出の両方向に働くため、[Na^+]_iは、CaTの振幅や動態に重要な影響を及ぼす。従って、種々の刺激による[Na^+]_iの変化を捕らえて、CaT、活動電位との関係を検討することは、興奮収縮連関を理解する上で非常に重要である。I群抗不整脈薬の中には、陰性変力作用が強いものがあり、心筋梗塞患者の予後をかえって悪化させる。陰性変力作用の機序としては、Na^+ channelとの解離が遅い薬剤では、[Na^+]_i低下作用が重要と思われるが、現在まで解明されていない。平成15年度は、蛍光色素法を用いて、モルモット心室筋細胞の細胞収縮とCaTを測定し、(1)I群抗不整脈薬のPilsicainide(Pil)が0.52Hzの刺激頻度で用量依存性に細胞収縮とCaTを低下させること、(2)NCXのCa^<2+>流入モードの阻害薬であるKB-R7943は、2Hzでの刺激時のみ細胞収縮とCaTを低下させること、(3)KB-R7943を作用させた後では、Pilの陰性変力作用は消失することを示した。さらに、レーザー顕微鏡とNa^+感受性色素のsodium-greenを用いて[Na^+]_iの数ミリ秒での変化の可視化に成功した。結果、(1)[Na^+]_iは、高頻度刺激でのみ増加すること、(2)[Na^+]_iの増加は、ジギタリス剤により増強し、Pilにより用量依存性に低下することが示された。平成16年度は、一心拍ごとの[Na^+]_iの変化を捕らえることを試みたが、有意な変化は認めなかった。しかし、ラットの心筋細胞にアルドステロンを灌流すると、用量依存性に[Na^+]_iのわずかな上昇が数分以内におこり、bumetanideにより抑制されることから、アルドステロンのnon-genomic作用として、Na^+-K^+-2Cl^-チャネルを介するNa^+流入が証明された。今後、CaTや細胞容積への影響を検討する予定である。

今後、CaTや細胞容積への影響を検討する予定である。心筋細胞の興奮収縮連関において中心的な役割を果たしているCa^<2+>transient(CaT)は、細胞膜のL型Ca^<2+>channelを介するCa^<2+>流入と、筋小胞体(SR)からのCa^<2+>放出により決定される。これまでの興奮収縮連関の研究は、Ca^<2+>channelとSRの機能連関、すなわちCa^<2+>-indnced Ca^<2+> releaseを中心に進められてきた。しかし、心筋細胞では、細胞膜のNa^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)が発達しており、NCXは細胞膜電位と[Na^+]_iの変化によりCa^<2+>流入、排出の両方向に働くため、[Na^+]_iは、CaTの振幅や動態に影響する重要な要素である。従って、心拍ごとの[Na^+]_iの変化(Na^+ transient : NaT)を捕らえて、CaT、活動電位との関係を検討することは、興奮収縮連関を理解する上で非常に重要である。NCXは心拍中にCa^<2+>流入、排出の両方向のモードが、細胞膜電位と[Na^+]_iにより入れ替わることが推測されているが、その詳細は不明である。I群抗不整脈薬の中には、陰性変力作用が強いものがあり、CASTで示されたように心筋梗塞患者の予後をかえって悪化させる。陰性変力作用の機序としては、Ca^<2+>電流の抑制に加えて、Na^+ channelとの解離が遅い薬剤では、Natへの抑制作用が重要と思われるが、現在まで解明されていない。平成15年度は、蛍光色素法(indo-1,fluo-3)を用いて、モルモット心室筋細胞の細胞収縮とCaTを測定し、(1)I群抗不整脈薬のPilsicainide(Pil)が0.52Hzの刺激頻度で用量依存性に細胞収縮とCaTを低下させること、(2)NCXのCa流入モードの阻害薬であるKB-R7943(1μM)は、2Hzでの刺激時のみ細胞収縮とCaTを低下させること、(3)KB-R7943を作用させた後では、Pilの陰性変力作用は消失することを示した。さらに、我々は、レーザー顕微鏡とNa感受性色素のsodium-greenを用いて細胞内Na濃度の数ミリ秒での変化の可視化に成功した。結果、(1)細胞内Na濃度は、高頻度刺激でのみ増加すること、(2)Na濃度の増加は、ジギタリス剤により増強し、Pilにより用量依存性に低下することが示された。平成16年度には、一心拍ごとのNa濃度の変化を捕らえ、細胞内Na transientを同定すること、Na transientの、Pilやジギタリス剤による変化、Dahl ratなど心不全モデルでの変化を検討する予定である。心筋細胞の興奮収縮連関において中心的な役割を果たしているCa^<2+>transient(CaT)は、細胞膜のL型Ca^<2+>channe1を介するCa^<2+>流入と、筋小胞体(SR)からのCa^<2+>放出により決定される。これまでの興奮収縮連関の研究は、Ca^<2+>channelとSRの機能連関を中心に進められてきた。しかし心筋細胞では、細胞膜のNa^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)が発達し、NCXは細胞膜電位と[Na^+]_iの変化によりCa^<2+>流入、排出の両方向に働くため、[Na^+]_iは、CaTの振幅や動態に重要な影響を及ぼす。従って、種々の刺激による[Na^+]_iの変化を捕らえて、CaT、活動電位との関係を検討することは、興奮収縮連関を理解する上で非常に重要である。
出芽酵母の新規寿命決定因子の探索と機能解析

S-アデノシルホモシステイン水解酵棄の変異株sah1-1は、野生株と比較して許容温度においても増殖遅延が観察され、著しい寿命の短縮を示す。また、細胞内にS-アデノシルメチオニン(SAM)およびS-アデノシルホモシステイン(SAH)が高蓄積していることが明らかとなっている。我々は、これまでsah1-1変異株の増殖遅延抑圧を指標とし、寿命が延長した変異株のスクリーニングを行い、長寿変異株SSG1の取得に成功している。本研究では、SSG1株における寿命延長の詳細なメカニズムを明らかにすることを目的に解析を行った。解析の結果、SSG1株ではSAM、SAH両物質が高蓄積しており、Ssg1は液胞でこれらの物質の濃度調節に関与することが示唆された。また、Ssg1の機能を解析するために銅処理法により液胞、細胞質におけるSAM、SAHを分画し解析を行った。その結果、SSG1変異により、特にSAHが有意に液胞側に蓄積されることが明らかとなった。さらに、SSG1株はラバマイシン感受性を示し、TORC1経路と遺伝的関係を示すことが予想された。そこで、TORC1経路が制御する生理機能について解析を行った。解析から、特にSSG1△tor1株において、増殖の遅延、ストレス耐性の向上、オートファジーの促進、翻訳の減少といった表現型が観察された。さらに、TORC1経路の下流で機能するSch9、Rps6両タンパク質のリン酸化レベルを解析したところ、有意に下がっていることが明らかとなった。以上の結果から、SSG1変異はSAM、SAHによるTORC1経路の制御を介して寿命を延長することが示唆された。現在、SAM、SAHの蓄積によるTORC1制御に注目し、さらに解析を進めている。(抄録なし)寿命制御機構の全容解明を目指し、出芽酵母を用いて新規寿命制御因子の取得、解析を行った。特に本年度は、取得したssg変異株における以下の知見を得た。1)ssg変異により経時的寿命が延長する定常期における生存率を計測することにより、ssg変異株の経時的寿命を測定した。その結果、野生株よりも寿命が延長することが明らかとなった。また、寿命延長との密接な関係が報告されている各種環境ストレス耐性について調べたところ、ssg変異株は野生株と比べて酸化ストレス、熱ショックストレスに対して耐性を示すことが明らかとなった。これらの結果より、Ssg1が期待通り新規な寿命制御因子であることが示唆された。2)ssg変異により細胞内AdoMetおよびAdoHcyが蓄積する取得したssg変異株におけるAdoMetおよびAdoHcyの細胞内含量をキャピラリー電気泳動により計測した。その結果、両物質とも高蓄積していることが明らかとなり、Ssg1がこれらの物質の濃度調節に関与していることが示唆された。3)Ssg1は液胞膜に安定して局在するSsg1の機能を明らかにするためにN末にGFPタグを付加し、その細胞内局在を観察した。その結果、Ssg1は液胞膜に強く局在することが明らかとなった。一方、野生型のタンパク質(Erc1)ははっきりとした局在が観察できなかった。また、ウエスタン解析の結果より、Erc1と比較してSsg1は発現量が高く、Ssg1はより安定に液胞に局在できるタンパク質であることが示唆された。4)既知の寿命制御経路との遺伝的関係を示すssg1変異株における寿命延長のメカニズムを明らかにするために、既知の寿命制御経路との関係を調べた。その結果、Ssg1との関係性を示す興味深い知見が得られた。現在、その詳細な関係を解析中である。現在、SAM、SAHの蓄積によるTORC

1制御に注目し、さらに解析を進めている。本年度の解析より、ssg1変異と既知の寿命制御経路との関係性を見出すことができた。また、マイクロアレイ解析、メタボローム解析を行い、これらのアレイ解析からも大変興味深い知見を得ることに成功している。これらの結果より、ssg1変異、ならびにAdoMetの蓄積による寿命延長のメカニズム解明に大きく近づいたため。引き続き、ssg1変異による寿命延長のメカニズムについて解析を行う。具体的には、既知の寿命制御経路がどのように関与するのか調べ、AdoMetの添加によってその模倣が可能か検討する。また、前述のマイクロアレイ解析、メタボローム解析より、AdoMetがグルコース代謝に関与することが示唆された。そこで、まずssg1変異株において細胞内へのグルコースの取り込みに異常があるかどうか調べる。また、グルコーストランスポーターとの関係も調べる予定である。これらの解析により得られた知見をつなぎ、ssg1変異による寿命延長の理由を導きだしたい。(抄録なし)
職域における発達障害の認識に関する研究

宮崎県内における産業看護職を対象にインタビュー調査を行い、職域における発達障害を抱える労働者について、実態が明らかとなった。発達障害と診断されていないがその疑いがある労働者が多いこと、また、その相談先として医療機関の受診が容易でないことが課題であると語られた。医療機関については、成人期の発達障害を専門とする医師の少なさ、また医療機関を受診すること自体の困難さが語られた。さらに、発達障害を抱える労働者自身の困り感がないことも、支援につながらない理由の一つであった。支援する産業看護職の認識としては、対応の仕方も含め各々で学んでおり、知識を得ているが、産業看護職自身が相談できる機関について情報が不足していることから、産業看護職間での情報の共有や事例の共有、研修の必要性が語られた。人事・労務担当者を対象とする調査については未実施であるが、労働者にとって身近な専門職である産業看護職はこの課題の重要性を認識しており、さらに支援の困難感があることから、人事・労務担当者の認識についても、困難感があると考えられる。また、産業看護職の語りの中で、職場における理解不足があり、職場内での研修の必要性も語られたことから、職域全体で取り組んでいく必要があると考えられる。以上のことから、成人期における発達障害を抱える労働者を支援するための専門機関と職域との連携も必要であり、今後も検討が必要であると考える。平成25年度は、研究の目的に沿って、まず、職域でのメンタルヘルス不調に関する復職支援に焦点をあてて、産業看護職の役割及び連携について研究結果をまとめた。その結果から産業看護職が感じている復職支援の困難感や地域で求められる社会資源とその役割が示唆された。本研究の中心となる課題は、職域でのメンタルヘルス不調、その中でも発達障がいが疑われる事例への職域での認知度や支援の在り方を検討することである。平成25年度は、メンタルヘルス不調全般の復職支援について焦点を当てて研究したが、そのなかからも本研究の目的である発達障がいが疑われる事例への対応の困難感が導かれ、そのような事例への復職支援に対しても、産業看護職は地域の様々な資源をとらえ、連携して支援していく必要性が示唆された。地域における資源とは、具体的に「職場復帰を目指す意思を持った本人」「本人の支えとなる身近な支援者」「地域でつながりあえる専門職・専門機関」「適切な治療とその継続を行う精神科主治医」「事業場内メンタルヘルス対策の支援システム」「的確な対象把握と継続的な支援を行う産業看護職」の6つであった。さらに発達障害に焦点を当てて、文献検討を行い、「大人の発達障がい」に当てはまると考えている労働者が多いこと、そしてそれを理解する必要があると考えている精神科医も多いことが判明した。しかしそれに関するテキストもなく、多様な発達障がいの就労相談があること、そして、発達障がいの診断を受けていない人が過半数を超えることが現状としてあることが分かった。平成26年度は、職域における発達障害の認識について、産業看護職を対象にグループインタビューを行った。それにより、職域における発達障害を抱える労働者の現状や、産業看護職の認識、支援の現状が見いだされた。また、その中で支援の困難感もあることがわかった。具体的には、相談先がわからないといった困難感が挙げられた。今後、この研究課題について、人事・労務担当者側の現状をとらえさらに分析を進めていく必要がある。平成27年度は産後休暇及び育児休業のため、研究を進めておりません。産前産後休暇および育児休業を取得したため。本年度は産業看護職を対象に調査を実施したが、人事・労務担当者への調査を実施しあわせて分析する必要があるため次年度以降の課題とする。来年度が課題の最終年度となるため、来年度はデータをまとめ、学会発表する。そのための、データ整理などを本年度中に進め、さらに必要なデータについては、本年度中に対象を確保する。宮崎県内の企業の協力を得て人事・労務担当者を対象に質問紙調査を実施する。その後産業看護職を対象に行った面接調査の結果とあわせて分析を行う。

初年度は、産業看護職や人事労務担当者を対象に調査票を用いて職域の発達障がいに関する認識について質問紙調査を行うとしていたが、まずは職域のメンタルヘルス不調について全体像を把握するため復職支援に焦点を当てて産業看護職を対象に、発達障がいが疑われる事例への困難感や支援の在り方を示した。そのため人事労務担当者や産業看護職を対象に発達障がいへの認識については焦点を当てて調査をしていないので、次年度の課題とする。産後休暇および育児休業を取得したため本研究を中断したため。本年度は面接調査のみの実施となったため、次年度使用額が生じた。来年度はデータの整理における人件費及び学会の旅費等で使用する。成人期の発達障がいについて、統計的背景を理解し質問紙調査の項目を検討したため、それをもとに、人事労務担当者に対して認識を調査し面接調査を行う。また、同時に産業看護職に対しても同様に質問紙にて調査を行った後面接調査を行う。次年度以降質問紙調査を実施する際に、使用する用紙や封筒、郵送費および解答用紙の入力に際し人件費として使用する。質問紙調査を実施する予定であったが面接調査のみであったため、次年度使用額が生じた。次年度質問紙調査にて用紙、封筒、切手及び調査項目の入力に人件費として支出する。
加齢に伴う心筋リプログラミング抵抗性の分子機序解明と治療薬剤の開発

これまで加齢に伴う心筋リプログラミング抵抗性の分子機序を明らかにした報告は皆無であり、本研究は独創性・新規性の高い基礎研究であるだけでなく、心臓再生治療への応用という点で臨床的にも重要な研究である。我々はこれまで世界に先駆けて線維芽細胞の心筋リプログラミングに成功し、さらに加齢に伴う心筋リプログラミング抵抗性という現象を見出している。本研究はこれまで自らが積み上げてきた心筋リプログラミング研究の多くの知見や材料を利用するため、他より圧倒的に優位な立場で研究を進められる。また本研究成果は加齢に伴う線維化亢進の分子機構や抗線維化治療など他臓器にも一般化できる内容であり、大きな波及効果を期待できる。
蛋白寿命タイマーによる小児期遺伝性疾患の治療薬開発

遺伝子変異により、アミノ酸変異によりコードされる蛋白が構造不全(折れたたみ不全)を生じ小胞体分解を受け、細胞内の適切な部位にターゲットできないために病原性を発揮する場合がある。その場合には、折れたたみ不全の解消により蛋白機能を改善させる化合物(薬理学的シャペロン)の開発が可能である。シャペロン分子のスクリーニング法としては受容体や酵素の場合には、受容体活性や、酵素活性上昇などの機能評価を指標に用いることが可能である。しかし多くの疾患の原因蛋白では簡便な機能評価系がなく、対応する薬理学的シャペロンスクリーニング法も確立していない。折れたたみ不全による変異蛋白の中には本来局在する細胞膜や細胞内小器官に到達できないものがあり、細胞内局在変化を指標にシャペロン分子をスクリーニングした。ペリツェウス・メルツバッハ病(Pelizaeus-Merzbacher disease; PMD)は、原因遺伝子であるproteolipid protein 1(PLP1,)のアミノ酸変異によって生じる蛋白の局在変化が病態に関連する代表的な遺伝性神経疾患である、本研究では、PLP1蛋白の発現量、細胞内局在、および小胞体ストレスを指標とした、PMDに対する薬理学シャペロンのスクリーニングを行った。結果、PLP1A243Vの蛋白発現および細胞内局在を改善させるpiracetamを見出した。piracetamはまた、PLP1A243Vの小胞体ストレスを軽減させた。piracetamは正常型からPLP1A243Vへの変化に伴う遺伝子発現変化を逆転させる遺伝子変化を示した。特に、変異によって発現増加する遺伝子を抑制する方向に発現変化をきたし、これらは変異蛋白による、局在変化や小胞体ストレスへの抑制効果をもたらした可能性がある。IPA解析では、piracetamによって発現が変化した経路のいくつかは、小胞体ストレスに関連していた平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1)蛍光タンパクの決定-正常型および変異PLP1-EGFPの下流に更に赤色系の蛍光タンパクを直列につないだPLP1-tandem timerおよび正常型PLP1および変異PLP1の下流にDsRED1を直列につないだPLP1-RED1 timerを作成した。ウエスタンブロッティング法; PLP1-tandem timerでは生成された多くの蛋白が分解を受けることが判明した。PLP1-RED1 timerでは、ウエスタンブロッティングでは、目的に相当する部位にシグナルが検出されたが、COSあるいはHEK細胞の一過性発現による検出では異常型がシグナル強度が検出限界であった。変異体および正常PLP1の蛋白寿命の変化を、蛍光変化としてMultilabel Plate Readersにて峻別できる構築をこの2種の構築で作成することは現在まで困難である。2)膜局在の定量化-以上と平行して正常型および変異PLP1-EGFPの膜局在を定量化することを試みた。まず正常型および変異PLP1-EGFPの安定発現株を作成し、核を染色し(N)、膜をdyeで赤色に染色し(M)、蛍光顕微鏡にて蛍光画像を96well formatで高速に所得した。細胞全体の蛍光強度をWCとしWCの細胞あたりの平均値とM/C(核以外の細胞質の蛍光強度をCとしC =WC-Nとして算出)した。その結果、WTと変異体A241VではWC; WT/A241V>5であった。また細胞局在ではM/C wt>2, M/C A241V<1であった。3)化合物スクリーニング-上記のスクリーニング系のうち、局在定量化法を先行して行った。まず150種類からなる化合物ライブラリーでスクリーニングを行ったところWC; A241Vを上昇させ、M/C A241V<1⇒M/C A241V>1と膜移行を促進する化合物を6種類見出した。蛋白分解時間に依存した構築は感度が低く、スクリーニング系の構築ができていないが、平行して行った膜局在の定量化系を作成し、スクリーニングを開始することができた。小児期遺伝性神経疾患のおよそ半分は、アミノ酸変異による蛋白構造不全が原因となる。正常な構造が獲得されないため(折れたたみ不全)、小胞体・ゴルジ品質管理機構により小胞体にとどまり、細胞膜や、ライソゾームなどの細胞内小器官に到達できず、蛋白が機能を失い発症する疾患が多い。折れたたみ不全を解消し、小器官への輸送を促す化合物を見出すことができれば、小胞体に変異蛋白がとどまることにより惹起される小胞体ストレスも減じることから、有力な薬物候補となる。近年、原因蛋白のアミノ酸変異による折れたたみ不全を解消し、小器官への輸送を促す化合物あるいは薬理学シャペロンの概念が生まれ、研究が進み一部は臨床治験にまで進んでいる。原因蛋白が受容体(vasopressin type 2受容体、gonadotoropin releasing hormone受容体など)や、酵素の場合、膜に出現した変異蛋白に対して、放射性同位元素でラベルしたアゴニストに対する競合阻害や、細胞質あるいはライソゾーム内酵素活性上昇を指標による薬物スクリーニング方法が開発されてきた。しかしながら多くの蛋白は、受容体や酵素のように特定の結合部位を持たず、またチャネル活性や酵素活性のような機能を測定する方法がない。現在Pelizaeus-Merzbacher disease(PMD)の原因であるPLP1蛋白の構造不全による、不安定性あるいは小胞体関連分解と蛋白構造変化による局在変化に着目し、スクリーニング系を確立し、小児期遺伝性神経疾患の治療薬を開発している。

Pelizaeus-Merzbacher diseaseの原因であるPLP1蛋白の正常型と変異型での発現様式をCOS, HEK, SHSY5Y細胞で検討したCOS細胞では細胞内分布の差異(正常型;びまん性分布、変異型;核周囲)の差異が見やすかったが、蛋白発現量が少ない。またSHSY5Y細胞は蛋白発現が少ないためHEK細胞を用いることにした。PLP1-A242V安定発現細胞株を作成し、それぞれでの蛋白発現を確認したのち、最も蛋白発現量の大きなクローンを選択、96ウェルフォーマットを用いて薬剤を反応させ、得られた蛍光強度および局在の変化をIn Cell Analyzerで比較解析した。現在までに数種類の薬剤について添加後の蛍光強度上昇が得られ、再現性も確認された。細胞局在変化に関しては、In Cell Analyzerでは、解析精度が充分でないため、共焦点光学顕微鏡を用い画像を取得したのち、局在評価を行っている。次世代シークエンス解析により、多くの小児期発症遺伝性難病の遺伝学的診断が可能になってきた。しかしながら診断確定後も多くの疾患で治療法がない。現在遺伝子診断からどの様に、治療薬開発につなげるかが課題となっている。遺伝子変異の内、アミノ酸置換等による蛋白立体構造折れたたみ不全により細胞内局在が変化することがある。細胞内局在変化を指標として、変異による立体構造不全を解消する薬剤(シャペロン分子)を見出す計画を立てた。先天性白質形成不全症のうち、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)にまず着目した。この疾患においては、患者の約3割においてproteolipid protein 1 (PLP1)遺伝子変異が見出される。PLP1の変異蛋白は構造不全を生じた異常タンパク質が小胞体に蓄積され、シャペロンタンパク質の発現誘導、タンパク質合成低下及び小胞体関連分解等の小胞体ストレス応答が起こる。これらの応答によっても異常タンパク質が処理できない場合、細胞はアポトーシスを起こすと考えられる。変異型PLP1をGFPとの融合タンパク質として、細胞内に発現させ、細胞全体の蛍光量、および細胞膜局在の2つのパラメータを指標として、薬物スクリーンングを行い、複数の候補薬物を得た。この方法を更に多くの小児期発症の遺伝性難病に適応するため、脊髄小脳変性症において、蛋白の局在変化を定量化して、薬剤スクリーニングを行っている。薬理学的シャペロンのスクリーニング法としてアゴニストに対する競合阻害や、酵素活性上昇が指標に用いられてきているが、多くの疾患原因蛋白は受容体や酵素ではないため簡便な機能評価系がなかったが、我々の研究により細胞内局在を指標にした薬理学的シャペロンスクリーニング法により多くの遺伝性疾患の薬物スクリーニングを可能とする。PLP1遺伝子については、MO3.13細胞のPLP1A242V安定発現株に、薬剤の添加前後におけるGFP蛍光強度及び細胞内局在の変化をIn Cell Analyzerによる解析において、変異蛋白の蛋白発現量および共焦点顕微鏡による細胞膜局在蛋白を指標にして、薬物スクリーニングを行った。
複雑形状まわりの高レイノルズ数流数値計算法に関する研究

航空機の空力設計において計算流体力学は既に設計解析ツールとしての重要な位置を占めているが,計算機能力が高まるに従い,機体三次元形態のまわりの流れを実飛行状態で精度良くシミュレートすることの要求が高まっている.その場合に問題となるのが,複雑形状に対する空間離散化,すなわち格子形成である.従来は構造格子を用いて行われて来たが,その格子形成には長い経験と多大な労力が要求された.この問題に対するブレークスルーとして非構造格子の研究が80年代後半から盛んになってきた.しかし,高レイノルズ数流れの計算には非構造性ゆえに多大な計算時間を必要とし,実用化は未だになされていない.本研究では,航空機等の複雑形状まわりの流れの数値計算法として,プリズム状の格子を用いた新しいコンセプトを提案し,プリズム格子の自動形成法および有限体積法に基づいた流れ計算法を開発した.この手法を用いてボ-イング747型機モデルまわりの遷音速高レイノルズ数流れの数値計算を行い,翼面上圧力分布の計算結果を風洞実験値と比較して本方法の有効性を実証している.本研究で提案したプリズム格子法は,従来の構造格子法と非構造格子法との良い折衷案であり,非構造格子によるナビエ・ストークス方程式の数値解析でも,物体近くの粘性領域ではプリズム格子を用いるべきとの考えが世界的に一般的になりつつある.今後,より複雑な形状問題に対しての計算法として,プリズムと四面体による準非構造格子法が有望であり,そのためには物体面の定義,表面格子形成,空間プリズム・四面体格子形成,陰的時間積分による数値計算法,解適合細分割法等の研究・開発・コード整備が必要である.航空機の空力設計において計算流体力学は既に設計解析ツールとしての重要な位置を占めているが,計算機能力が高まるに従い,機体三次元形態のまわりの流れを実飛行状態で精度良くシミュレートすることの要求が高まっている.その場合に問題となるのが,複雑形状に対する空間離散化,すなわち格子形成である.従来は構造格子を用いて行われて来たが,その格子形成には長い経験と多大な労力が要求された.この問題に対するブレークスルーとして非構造格子の研究が80年代後半から盛んになってきた.しかし,高レイノルズ数流れの計算には非構造性ゆえに多大な計算時間を必要とし,実用化は未だになされていない.本研究では,航空機等の複雑形状まわりの流れの数値計算法として,プリズム状の格子を用いた新しいコンセプトを提案し,プリズム格子の自動形成法および有限体積法に基づいた流れ計算法を開発した.この手法を用いてボ-イング747型機モデルまわりの遷音速高レイノルズ数流れの数値計算を行い,翼面上圧力分布の計算結果を風洞実験値と比較して本方法の有効性を実証している.本研究で提案したプリズム格子法は,従来の構造格子法と非構造格子法との良い折衷案であり,非構造格子によるナビエ・ストークス方程式の数値解析でも,物体近くの粘性領域ではプリズム格子を用いるべきとの考えが世界的に一般的になりつつある.今後,より複雑な形状問題に対しての計算法として,プリズムと四面体による準非構造格子法が有望であり,そのためには物体面の定義,表面格子形成,空間プリズム・四面体格子形成,陰的時間積分による数値計算法,解適合細分割法等の研究・開発・コード整備が必要である.本研究では、三次元ナビエ・ストークス方程式数値計算の航空機設計等への工学的実用化を目指して、総合的に効率よい複数の数値計算法の構築を目的としている。一つの方法は準非構造格子(プリズム状格子)を用いた方法で、航空機等のまわりの高レイノルズ数流れに対して格子形成を大幅に簡単化するアプローチである。本年度は、最適化手法で用いられる極値問題を利用したプリズム状格子形成法に関しての論文を投稿した。また、この準非構造格子上で三次元ナビエ・ストークス方程式を解く計算コードの検証として、航空機の翼胴モデルまわりの流れ計算結果を実験値と比較してその精度を確認した。更にこの計算法の実証のために、エンジンナセル等も含んだ航空機全機まわりの高レイノルズ数流れの計算結果の検証を進めている。また、準非構造格子の利点を利用して解適合格子細分化との組み合わせを行い、衝撃波等の解像をより高度にする計算法の研究も進めている。航空機まわりの流れのもう一つの計算法として、超音速航空機まわりの流れ場を空間前進法により効率よく解くための計算コードを構築し、次世代超音速旅客機のソニックブーム伝搬に関する解析も進めている。計算結果から、クランクアロー型の翼形状ではかなりソニックブームの低減が計れる反面、ソニックブームの影響範囲は広がることも明らかになった。高レイノルズ数流れの数値計算に不可欠な乱流モデルに関しても、既存のいくつかのモデルを翼列流れに適用して検証を進めている。衝撃波と境界層干渉の強い流れ場では、最も一般的に用いられるBaldwin-Lomaxモデルに対しJohnson-Kingモデルの優位性が確認された。しかし、翼端もれ流れや空気噴き出し等の複雑な場では高次方程式モデルあるいはRNGモデル等の検討が必要となる。航空機等の複雑形状まわりの空気流数値計算法として、プリズム状の格子を用いた新しい計算法の精度検証および高精度解法の研究を進めた。具体的にはボーイング747型機の翼胴モデルまわりの遷音速高レイノルズ数流れをプリズム格子法で数値計算し、翼面上の圧力分布を風洞実験値と比較して精度検証を行った。

結果は本研究で提案した計算法が、比較的少ない格子点数でもおおむね妥当な精度を持つことを示したが、翼後縁近くにおいては計算値と実験値とのずれが大きくなることも明らかになった。これは、プリズム格子法では後縁を包む形で覆うために後縁からの伴流を十分捕らえていないことが主な原因と思われ、翼後縁部の格子密度及び翼伴流部の数値計算上の取り扱い方法を検討する必要があることが明らかになった。また衝撃波や境界層剥離等の解像度を上げる方法として、プリズム格子における表面非構造格子の利点を利用した解適合格子細分化を組み入れる方法を学会発表にて提案した。この解適合格子の導入により、精度上も計算効率上も優れた計算法が構築できよう。準非構造格子法とともに従来の構造格子法でもって複雑形状を扱う方法として、領域分割法を発展させた「粗い格子」による計算法の概念検討を行った。これは、粗い格子の各セル内の精度を計算結果に応じて上げる計算方法で、複雑形状に対応しやすい利点とベクトル化や並列化での不利な点について検討した。航空機等の複雑形状まわりの空気流数値計算法として提案したプリズム格子法について,本年度はその方法をより実用化するための研究を進めた.一つは,三次元複雑形状物体まわりの数値解析をより容易にかつ精度良く行うために,三次元物体表面上に非構造格子を形成する方法についてである.従来,表面非構造格子の形成には,写像関係を用いて三次元表面を二次元平面に写像し,平面上で格子形成を実行してきたが,複雑形状問題では物体面定義や格子密度制御の点で実用的ではない.ここで提案する方法は,物体面に逐次前進法で直接格子を生成する手法で,複雑な形状に対して表面の曲率をモニターして格子の密度を制御し,かつ様々な物体面定義を取り込めるようにしたものである.このことにより,より正確に複雑物体形状を表現でき,このことは高い精度を要求される航空機まわりの数値解析には重要である.この成果は米国航空宇宙学会CFD会議にて発表する.高精度解法の研究については,プリズム格子に有限体積法に基づいて流束差分割法を適用した計算法を構築した.これを用いてボ-イング747型機の翼胴モデルまわりの遷音速流れを数値解析し,翼面上の圧力分布を風洞実験値と比較して計算法の精度検証を行った.この計算手法は,格子セルの辺を基準にして流束を計算するため任意の格子セル形状に対応が可能であり,より複雑な形状問題におけるプリズムと四面体の2種類のセルを用いる計算法への拡張が可能である.四面体による完全非構造計算法については,最も重要な点は三次元空間に非構造格子を如何に形成するかであり,その研究にも着手した.ここでは格子形成の効率よさからデロ-ニ分割と空間前進法とを組み合わせた手法を考案し,平成8年に行われる国際学会(第6回ISCFD)に講演投稿をしている.
高磁場NMR法を用いた化学シフトイメ-ジングシステムによる筋疲労の研究

本研究の目的は、筋の運動負荷による経時的な筋のエネルギ-代謝動態および筋内乳酸濃度より、筋疲労時の代謝状態を明らかにすることである。このため、まず一定の負荷を与えるための等張性運動負荷装置を作成した。今回使用したNMR装置は、明治鍼灸大学所有の磁場の強さ4.7Tesla、有効口径25.4cmの高磁場、大口径NMR装置(CSI2、GE社製)であり、まずNMR信号検出用のリンおよびプロトン用表面コイルを必要とするためこれを自作した。この装置を用いてヒトの腓膜筋の安静時を負荷時のエネルギ-代謝をリンNMRスペクトロスコピ-法を用いて無浸襲的に経時的に測定した。その結果は諸家の報告にあるように、負荷をかけるとクレアチンリン酸のピ-クは減少し、無機リンのピ-クの上昇が認められ、またpHの低下が認められた。負荷中止後は約10分程度で安静時のスペクトルに回復し、負荷量が増加するほどその回復には時間を要した。また、プロトンのスペクトロスコピ-法を用いて水のプロトン信号を消失する方法を利用し、運動負荷時の筋内の乳酸に含まれるメチル基プロトンの測定を試みた。乳酸と脂肪のメチル基プロトンの分離に手間取り、今年度中に十分なデ-タ-を得ることができなかったが、それも可能となり今後デ-タ-蓄積し、筋内の乳酸濃度より無浸襲的に筋疲労時の代謝状態を明らかにしたい。今年度は結果を発表するまでに至らなかったが、今後この結果をNMR学会、体力医学会などで発表していきたい。
サービス、営業、販売職に就く人々のパフォーマンスを向上する組織のダイナミクス

この研究は、サービス、営業、販売職に就く人々のパフォーマンスを向上するための組織施策を検討するものである。より優秀な人々が長期に勤続する意志をもち、顧客に対するサービス品質を向上しようと努めるために必要な要因を探索した。産業横断的な大規模サンプルに対する調査とフードサービス業に就くサンプルに対する調査をおこない、定量的な分析をおこなったところ、ビジョン共有の効果や様々なタイプのリーダーシップの効果(と逆効果)が明らかになった。組織や従業員、顧客が志向するオペレーション(標準的なものを求めるか、個別的なものか)によって、これらの効果も変容することも検証した。ここでいうパフォーマンスとは、優秀な従業員の長期勤続意志、顧客志向、サービス水準などのことである。これらに影響する要因として、組織のビジョン、リーダーシップや公正性に注目した。実務的な視点に基づくと、これらの要因はコントロール可能と考えたからである。大規模なサンプルを収集して定量的分析をおこない、パフォーマンスを高める要因を探った。研究計画に基づき、約2,500票のサンプルは前年度後期に収集済みであり、当年度(最終年度)は主に産業横断的な大規模サンプル(1,500票以上)とフードサービス業に就くサンプル(500票以上)を用いた定量的な分析をおこない、成果を発表した。産業横断的なサンプルは、金融業や教育サービス業などの構成比が(日本の構成比および調査会社のモニター構成比よりも)大きく、最終顧客に対するオペレーションにも従事していないサンプルが多かったのに対し、フードサービス業のサンプルは6割以上がフロントラインのオペレーションに就く。サンプルにはこのような違いがあるにも関わらず、いくつかの結論を導くことができた。たとえば、組織的なビジョン共有の効果や様々なタイプのリーダーシップの効果(と逆効果)が明らかにされた。組織や従業員、顧客が志向するオペレーション(標準的なものを求めるか、個別的なものか)によって、これらの効果が変容することも検証した。リーダーの役割と比較した準拠集団の役割の重要性を検証したもの、組織的なビジョンの共有の重要性に対してリーダーによるビジョン提示がもつ逆機能を明らかにしたもの、営業職に就く人たちの組織内意思決定におけるパワーがもつ危うさ、などについて、6回の学会発表(うち海外4回)、2篇の論文発表をおこなった(共著を含む)。顧客と直に接する立場にあるフロントラインの従業員のパフォーマンスを向上するメカニズムを解明する、という研究計画に基づき、数度の調査を実施し、従業員個人のデータを合計で2,500サンプルほど収集し、定量的な分析をおこなった。また、調査項目の精緻化や調査協力者との関係構築などを目的に、販売やサービスの事業者を対象として、定性的な比較研究・事例研究をおこなった。これまでは、複数回実施された調査を個別に、また、注目する変数を特定して分析をおこなっている。たとえば、2,500サンプルのうち、第1回調査によって集められた550以上のフロントライン従業員のデータを用いた分析結果を取り上げると、個人の変革を促すリーダーと組織内における準拠集団の影響力を比較したところ、従業員の販売・サービス提供活動に望ましい影響をもつのは準拠集団のうち、組織内のロールモデルであることを検証した。また、この550サンプルを含む、販売やサービス事業者に勤める従業員、およそ1,500サンプルを対象に組織内のコンフリクトと組織に対するロイヤルティの分析をおこなうなどした。分析結果の一例として、向かうべき将来を説明するリーダーよりも、実行する姿やロールモデルとしての姿が、従業員のロイヤルティに対して有意な影響力をもつことが挙げられる。これらの成果の発表について。当年度、海外学会において七度(個人の研究成果として二度、共同での成果発表に参画するかたちで五度)、国内学会において共同の名義による三度の成果発表をおこなった。また、英文の紀要を1篇、共著書を2冊上梓した。当年度の計画では、事業者からの調査協力と調査会社の送付先リストを用いて、合計400サンプルの収集を目標にしていた。幸いなことに実際は、複数の事業者からの協力が得られ、またそれが全社的に取り組みとなったことや、本研究成果を発表する機会を他の研究者や実務家から得られたことにより、量だけを見れば、計画を大幅に上回るデータを収集することができた。ただし、断片的に収集されたデータを断片的に分析をしているのが現状であり、質的には計画通りの進行といえる。計画どおり、複数回の調査結果を統合・比較するプロセスに今後着手する。成果の発表についても、計画時には海外発表を二度予定しているだけであったが、投稿した論文や要旨が無事にアクセプトされ、予想以上の実績を達成することができた。これまでに複数回実施された調査の統合と比較のプロセスに移る。また、調査結果のフィードバックを次年度始めに予定しているので、調査協力者とのディスカッションによって、実務的にもより有意義な研究となるよう、分析項目の選別をおこなう。

統合と比較においては、既に業種分類や職務内容、デモグラフィクスによる分類が可能な状態にあるので、特定の仮説をプロフィールの異なるサンプルを対象に検証することによって、外的妥当性を高めることが基本的な作業である。予算に基づき、次年度は新たにデータを収集することよりも、既に収集されたデータの整理と成果発表(およびそのための論文や要旨の執筆)に注力したい。該当なし
地震動の性質と建物の被害の関係に関する研究-1993年釧路沖地震の被害に鑑みて-

1993年釧路沖地震は,釧路で震度6を記録し,強震記録によると,釧路地方気象台の地動水平加速度の最大値は気象庁強震計で922cm/s^2,建設省建築研究所の強震計で711cm/^2と非常に大きな値を記録した.以上の情報から,釧路では当初かなりの被害が生じたと予想されたが,実際には大きな被害を受けた建物はわずかであり,過去の大きな被害地震に比べて建物の被害は少なかった.そこで,1993年釧路沖地震について,記録された非常に大きな最大加速度の割りに,建物の被害が小さかった原因を究明することを目的とし,地震動の性質と建物の被害の関係を把握するための解析的研究を行なった.まず,実際に存在する建物にかんするデータとして,静岡県で昭和48年以降に建設された鉄筋コンクリート造建物のデータから耐力分布を求め,これに基づいて,一自由度系弾塑性地震応答解析を行ない,建物の被害度を計算した.入力地震動は,本研究の対象とする釧路(1993年釧路沖地震)の他に,大きな加速度を記録したTarzana(1994年Northridge地震),広尾(1962年広尾沖地震),乙部町(1993年北海道南西沖地震(余震))(以下大加速度地震動と呼ぶ),更にこれを比較するために,地震応答解析によく用いられる1940年El-Centro,八戸(1968年十勝沖地震),東北大学(1978年宮城県沖地震)(以下一般地震動と呼ぶ)とした.その結果,(1)建物の弾塑性性状を考慮すれば,建物は塑性化することによって周期が伸びること,(2)大加速度地震動は短周期成分には非常に大きなパワーがあるが,周期が長くなるに従いそのパワーは急激に低下すること,(3)建物の耐力は低層のものほど大きいこと,の3つの理由により,大加速度地震動による建物の被害度は,建物に被害が生じるような建物の耐力が平均値より小さいレベルでは,一般地震動よりむしろ小さくなることがわかった.1993年釧路沖地震は,釧路で震度6を記録し,強震記録によると,釧路地方気象台の地動水平加速度の最大値は気象庁強震計で922cm/s^2,建設省建築研究所の強震計で711cm/^2と非常に大きな値を記録した.以上の情報から,釧路では当初かなりの被害が生じたと予想されたが,実際には大きな被害を受けた建物はわずかであり,過去の大きな被害地震に比べて建物の被害は少なかった.そこで,1993年釧路沖地震について,記録された非常に大きな最大加速度の割りに,建物の被害が小さかった原因を究明することを目的とし,地震動の性質と建物の被害の関係を把握するための解析的研究を行なった.まず,実際に存在する建物にかんするデータとして,静岡県で昭和48年以降に建設された鉄筋コンクリート造建物のデータから耐力分布を求め,これに基づいて,一自由度系弾塑性地震応答解析を行ない,建物の被害度を計算した.入力地震動は,本研究の対象とする釧路(1993年釧路沖地震)の他に,大きな加速度を記録したTarzana(1994年Northridge地震),広尾(1962年広尾沖地震),乙部町(1993年北海道南西沖地震(余震))(以下大加速度地震動と呼ぶ),更にこれを比較するために,地震応答解析によく用いられる1940年El-Centro,八戸(1968年十勝沖地震),東北大学(1978年宮城県沖地震)(以下一般地震動と呼ぶ)とした.その結果,(1)建物の弾塑性性状を考慮すれば,建物は塑性化することによって周期が伸びること,(2)大加速度地震動は短周期成分には非常に大きなパワーがあるが,周期が長くなるに従いそのパワーは急激に低下すること,(3)建物の耐力は低層のものほど大きいこと,の3つの理由により,大加速度地震動による建物の被害度は,建物に被害が生じるような建物の耐力が平均値より小さいレベルでは,一般地震動よりむしろ小さくなることがわかった.
骨形成因子BMPシグナルによる造血微小環境のホメオスタシスの制御

本研究は、硬組織のホメオスタシスにおける骨形成因子(BMP)シグナルの生理機能を理解することを最終的な目的とした。研究期間では、骨髄造血微小環境(HSCniche)のホメオスタシスにおけるBMP4及びBMP7の生理機能の解析、並びに、関節軟骨代謝におけるBMP7の生理機能の解析を行った。骨髄特異的BMP4及びBMP7のコンディショナルノックアウトマウスの解析を行った結果、造血幹細胞数の維持にBMP4が必須であることを示した。また、四肢特異的BMP7ノックアウトマウスの膝関節の表現型の解析を行った結果、BMP7は、関節組織の形成過程には必須ではないが、関節軟骨の維持に必要であることを示した。骨芽細胞は、骨髄造血微小環境(HSC niche)の重要な構成要素であることが示されている。本研究では、骨芽細胞の増殖分化に必須であるBMPシグナルの、随内造血のホメオスタシスにおける生理機能を明らかとするために、骨髄特異的BMP4およびBMP7のコンディショナルノックアウトマウスを作成し、それらの造血系の異常を、骨髄細胞の表面抗原解析により検討する事を目的としている。本年度は、骨髄特異的BMP4、BMP7のコンディショナルノックアウトマウスの作成をおこない、骨髄細胞においてBMP4および7の遺伝子座のリコンビネーションならびに遺伝子発現量が5%以下に減少している事を確認した。またそれらコンディショナルノックアウトマウスの骨髄細胞の系譜の解析をFACSにて行った結果、BMP4を骨髄で欠損したマウスでは赤芽球、T細胞、B細胞、単球の表面抗原を発現する細胞集団のポピュレーションに有為な変化は見られなかったが、Lin^-Scal^+c-Kit^+で表される造血幹細胞のポピュレーションが有意に減少している事を見いだした。これに対して、BMP7の欠損マウスでは各細胞系譜ならびに造血幹細胞のポピュレーションに大きな変化は見られなかった。この知見は、随内造血において、BMP4がHSC nicheのサイズの制御に機能している事を示唆している。骨芽細胞は、骨髄における造血微小環境(HSCniche)の重要な構成要素であることが示されている。本研究では、骨芽細胞の増殖分化に必須である骨形成因子(BMP)シグナルの、骨髄内造血のホメオスタシスにおける生理機能を明らかとすることを目的とする。本研究期間内では以下の項目について検討を行っている。(1)骨髄特異的BMP2,4,7コンディショナルノックアウトマウスを作成し、それらの造血系の異常を解析することで、造血系のホメオスタシスにおける個々のBMP分子の生理機能を評価する。(2)BMPシグナルを介したHSCniche、間葉系幹細胞微小環境(MSCniche)の相互作用の分子メカズムの解析を行うことを最終目標として、BMP2,4,7分子とそれらの受容体(Alk2,Alk3,Alk6,ActRIIa,ActRIIb,BMPRII)の骨髄内における局在を明らかとする。本研究期間内において、骨髄特異的BMP4またはBMP7のコンディショナルノックアウトマウス、及びBMP4とBMP7のダブルコンディショナルノックアウトマウスの作成を行い、骨髄細胞の表面マーカーの解析を行ってきた。その結果、BMP4コンディショナルノックアウトマウス、BMP7コンディショナルノックアウトマウスともに、血液細胞(赤血球、T細胞、B細胞、単球/マクロファージ)のポピュレーションに変化は見られなかった。ところが、BMP4コンディショナルノックアウトマウスにおいて造血幹細胞(LSK細胞)の数はコントロールマウスに比して有意に低下した。造血幹細胞のポピュレーションは、BMP7コンディショナルノックアウトマウスでは変化が見られず、BMP4とBMP7のダブルコンディショナルノックアウトマウスの表現型はBMP4コンディショナルノックアウトマウスのものと同等であったことから、骨髄内造血幹細胞の維持においてBMP4がユニークな生理機能を有していることを示唆した。本研究は、硬組織のホメオスタシスにおける骨形成因子(BMP)シグナルの生理機能を理解することを最終的な目的としている。HSC nicheのホメオスタシスにおけるBMP4及びBMP7の生理機能の解析本研究期間内において、骨髄特異的BMP4またはBMP7のコンディショナルノックアウトマウス(4CKO, 7CKO)、及びBMP4とBMP7のダブルコンディショナルノックアウトマウス(47DCKO)の作成を行い、骨髄細胞の表面マーカーの解析を行った。その結果、4CKO、7CKOともに、血液細胞(赤血球、T細胞、B細胞、単球/マクロファージ)のポピュレーションに変化は見られなかった。ところが、4CKOにおいて造血幹細胞(LSK細胞)の数はコントロールマウスに比して有意に低下した。

造血幹細胞のポピュレーションは、7CKOでは変化が見られず、47DCKOの表現型は4CKOのものと同等であったことから、骨髄内造血幹細胞の維持においてはBMP4がユニークな生理機能を有していることを示唆した。更に、BMP4によるHSC nicheの制御には性差が存在することを明らかとした。これらの結果は、BMP4と性ホルモンが独立してHSC nicheのホメオスタシスに関与している可能性を示唆している。本研究結果は、現在論文投稿準備中である。関節軟骨のホメオスタシスにおけるBMP7の生理機能変形性関節症の発症原因である関節軟骨の退行変性のプロセスにおけるBMP7の生理機能を検討するため、四肢特異的BMP7ノックアウトマウスの作成を行い、膝関節の表現型の解析を行った。その結果、BMP7の活性は、関節組織の形成過程には必須ではないが、関節軟骨の維持に欠くことができないことを明らかとした。また、そのメカニズムとして、BMP7は関節内において滑膜炎及びMMPの発現を抑制してる可能性を示した。研究概要(1)に示したBMP分子の骨随特異的ノックアウトマウスの骨髄の表現型の解析はおおむね順調に進行している。やや遅れているとの自己評価は、未だ論文投稿が完了していない点である。本年度は、概要の項目(2)の実験並びに論文作成に注力を行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題のこれまでの実験結果及び私の過去の研究成果より、同一の受容体を認識する各BMP分子(特にBMP2,BMP4,BMP7)は、異なる臓器のホメオスタシスにおいて異なる生理機能を有していることがあきらかとなった。今後の方策の重要な柱の一つは、各BMP分子がそれぞれユニークな生理活性を持つ分子メカニズムを解析することである。この目的で、本年度は研究概要項目(2)に示した、各分子の時空間特異的分布の解析及び遺伝子発現の定量的解析を行うことを試みる。