hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
睡眠時無呼吸症候群動物モデルにおける交感神経と高血圧発症のメカニズム

睡眠時無呼吸症候群(SAS)患者は、SASでない人と比べて高血圧症の罹患が約2倍と合併率が高い。しかし、高血圧の発症のメカニズムについては未解明のことが多い。本研究はSAS患者の高血圧症のメカニズムを特に、間欠的低酸素による持続的交感神経活性化および腎臓でのNa再吸収の変化から明らかにすることを目的として実験を行った。間欠的低酸素時の血圧の上昇は明らかではなかったが、高食塩の負荷により血圧の上昇は顕著となった。また臓器のカテコラミン産生も増加していた。以上から間欠的低酸素の負荷により交換神経活動が亢進し、食塩感受性高血圧を引き起こす可能性が示唆された睡眠時無呼吸症候群(SAS)の罹患率は、一般人口の約4%という報告があり、広く心血管病変の独立した危険因子と認識されている。SAS患者は、SASでない人と比べて高血圧症の罹患が約2倍と合併率が高い。本研究はSAS患者の高血圧症のメカニズムを特に、低酸素血症による持続的交感神経活性化および食塩による血圧の変化から明らかにすることを目的とした。長期間欠的低酸素暴露中の血圧および心拍数の変化の有無をテレメトリー装置にて、継時的に測定した。間欠的低酸素時(light cycle:8hour)と常酸素時(dark cycle :16hour)では心拍数・血圧変化するという日内変動がみとめられた。さらに食塩(8%)食餌を間欠的低酸素暴露中に負荷すると、収縮期・拡張期ともに血圧の上昇がみとめられ、このことから間欠的低酸素のラットにおいては食塩感受性が亢進し、血圧上昇を引き起こす可能性が示唆された。また間欠的低酸素後に取り出した組織カテコラミン(norepinephrine)の産生は増加しており、このことからも長期間欠的低酸素暴露では全身組織での交感神経の活動が亢進していることが明らかとなった。本研究はSAS患者の高血圧症のメカニズムを特に、低酸素血症による持続的交感神経活性化および腎臓でのNa再吸収の変化から明らかにすることを目的とする。長期間欠的低酸素暴露中の心拍数の変化の有無をテレメトリー装置にて、継時的に測定した。また腎臓でのNa再吸収の変化について腎臓でのキナーゼ発現の変化・チャンネル・トランスポーターの活性の変化を分子生物学的手法を用いて解析した。長期間欠的低酸素暴露(睡眠時無呼吸モデルラット群)では一日のカテコラミン産生が増加しており、これは間欠的低酸素負荷後も持続していた。心拍数は間欠的低酸素時において増加がみとめられ、これは間欠的低酸素時に交感神経活動が亢進していることを示唆する所見と考えられた。また腎臓でのキナーゼの発現は長期間欠的低酸素の暴露によって低下していた。しかし再吸収にかかわるトランスポーターやチャンネルの発現については変化が認められなかった。膜への移行やリン酸化など活性化については未確認である。これらの所見をもとに、次年度は交感神経活動による血圧上昇・日内変動についてNa排泄の変化との相関およびチャンネル・トランスポーターの機能との関連を解析する。間欠的低酸素チャンバーは順調に作動している。心拍数の変化および分子メカニズムの解明については大まか順調である。しかし血圧テレメトリーの購入が機械メーカーの不具合により大幅に遅れている。そのため血圧テレメトリーでの測定がまだ十分に行えていない。血圧テレメトリー装置を用いて交感神経活動と血圧変化のかかわりについてさらに詳細に解析を行う。また臓器障害の有無についても確認を行う。睡眠時無呼吸症候群では糖尿病・肥満とのかかわりが強いことから、糖尿病モデル(streptozotosin投与)・肥満モデルについても同様血圧および腎臓でのNa排泄の変化の解析を行う。主に分子生物学的メカニズムの解明のための試薬・機器の購入に使用する。
線虫ces-1相同転写因子であるSlugの白血病細胞の細胞死制御における意義

白血病細胞の発症に、アポトーシス(プログラムされた細胞死)の抑制が関与している可能性について検討を進めてきた。その結果、白血病細胞で認められる染色体異常のうち17番染色体と19番染色体の相互転座(それぞれの染色体が途中で切断されて、入れ替わって再結合する変化)によって形成される異常遺伝子が、放射線照射によって誘導されるアポトーシスをコントロールする遺伝子に影響してアポトーシスを抑制する可能性を明らかにした。『17;19転座型ALL細胞ではE2A-HLFが放射線照射に際してSlugの誘導を介してPumaの発現抑制に働き細胞死を抑制する』という作業仮説を分子生物学的に認証することを第一の目的に、以下の検討を行った。(A)17;19転座型ALL細胞での放射線照射によるSlug誘導の解析17;19転座型ALL細胞株4株に対して放射線照射を行ない、SlugとともにBH-3 only型の細胞死誘導因子としてPuma、Noxa、Bimの発現レベルの経時的な変化をreal time RT-PCRで解析して、Slugが一過性に発現誘導されるとともにPumaの発現が低下することを確認した。(B)ヒトSlug遺伝子のプロモーター解析転写開始点の上流約1kbにあるp53とHLFの結合配列を含む領域を中心に約4kbをクローニングして、様々な断片を含むルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドの作製を終えて、レポーター・アッセイの最適化を行なっている。tagを標識したE2A-HLFを組み込んだ発現ベクターをZn-inducible vectorにサブ・クローニングして遺伝子導入細胞の樹立をはかっているが、今のところ得られていないため、一過性発現の実験系での評価も検討中である。加えて、Slug familyと関連した転写抑制因子であるGfi-1が、E2A-HLFの標的遺伝子の1つである可能性について、Slugとの関連性も含めて解析を進めている。(A)17;19転座型ALL細胞での放射線照射によるSlug誘導の解析昨年の本研究で、17;19転座型ALL細胞株4株に対する放射線照射において、SlugとともにBH-3 only型の細胞死誘導因子としてPumaの発現が低下することを確認したが、E2A-HLFに対するドミナント・ネガティブ変異体を細胞に遺伝子導入すると放射線照射によるSlug遺伝子発現が抑制されるとともに、Pumaの発現が誘導される事を確認した。さらに17;19転座以外の転座を有する株についても、放射線照射によるSlugとPumaの遺伝子発現を検討したが、17;19転座型ALL細胞株のような変化は検出できなかった。(B)ヒトSlug遺伝子のプロモーター解析昨年度の研究で、HLFの結合配列を含む領域を中心に約4kbをクローニングして、様々な断片を含むルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドの作製を終えた。そこで本年度はレポーター・アッセイの最適化を行ない、17;19転座型ALL細胞株のうち1株で高い導入効率を得た。現在、本株を用いてプロモーター解析が進行中である。また、E2A-HLFの一過性発現の実験系での解析も平行して進行している。(C)ヒトSlug遺伝子のメチル化状態の解析ヒトSlug遺伝子のHLF結合領域にはCG配列の集簇を認めて、メチル化による発現制御の可能性が示唆され、同領域に対するbisulfite処理によるメチル化状態の評価のための実験系を樹立した。現在は17;19転座型ALL細胞株を含む各種ALL細胞株において、Slug遺伝子の発現レベルとメチル化状態の相関に関する解析が進行中である。
口腔先天異常疾患関連遺伝子解析研究

最も高頻度の先天異常である口唇口蓋裂でもその頻度は0.015%であり、ましてや症候群の場合、症例数が少ないため1施設でこれを行うことは困難である。1.本学においては、愛知学院大学ヒト細胞組織遺伝子疫学情報倫理委員会へ申請を行い、承認を得た。また各分担施設においても申請を行い、可及的に承認を得た。2.初年度に研究分担者と打ち合わせ会議を行い確認した研究実施方法に従い、遺伝子試料の収集ならびに研究を引き続き実施した。研究分担施設へ送付した血液採取ならびデータ入力のための物品を使用し、遺伝子試料の収集を実施した。3.平成16年度中に口唇口蓋裂の候補遺伝子の解析を開始するとともに、平成17年よりは全国の施設と協力して他の口腔先天異常症候群についても症例の収集も行った。4.得られた試料は、匿名化システム、大型超低温フリーザー、特注遺伝子試料保管庫に、指紋認証システムなどを配した口腔先天異常疾患関連遺伝子共同研究機構の口腔疾患関連遺伝子バンキングルームにて、患者のプライバシーに十分留意するとともに安全に保管した。5.平成16年度は日本のみでは十分な数が取集できないことから、遺伝子試料の提供を受け得るようにするため、海外の協力者への説明を行い、血液採取用濾紙やシリンジ等の必要な消耗品を送付した。6.これまでに収集された血液試料より、日本人のみならずベトナム人、モンゴル人、ミャンマー人の試料についてDNAを抽出し、遺伝子解析研究に使用した。口唇口蓋裂に関しては、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子のC677T多型とA1298C多型について解析を実施し、この多型と口唇・口蓋裂との関連姓について、検討を行った。1.研究分担者との打ち合わせ会議を2004年5月26日、鹿児島県民交流センターにて開催し、本研究の実施方法、特に個人情報保護の方法、各施設において倫理委員会へ申請することなどを確認した。2.本学においては、愛知学院大学ヒト細胞組織遺伝子疫学情報倫理委員会へ申請を行い、承認を得た。3.研究分担施設へ血液採取ならびデータ入力のための物品を送付して、遺伝子試料の収集を開始した。4.得られた試料は、これまでの本研究成果として平成15年度文部科学省ハイテクリサーチ拠点補助金で設置した匿名化システム、大型超低温フリーザー、特注遺伝子試料保管庫に、指紋認証システムなどを配した口腔先天異常疾患関連遺伝子共同研究機構の遺伝子試料保管室(バンキングセンター)にて、患者のプライバシーに十分留意するとともに安全に保管した。5.日本人の口唇口蓋裂を伴う基底細胞母斑症候群の二家系の解析を行い、第44回日本先天異常学会学術集会(佐賀、2004.7.15-17)にて報告を行った。これまでにバンキングされているモンゴル人の試料よりDNAを抽出した。現在、101家族(患者とその両親)303名ならびに対照群195名分のDNA抽出が完了している。前回の平成1415年度基盤研究B(豊田哲郎)「口唇・口蓋裂患者における主に葉酸代謝関連遺伝子を中心とした解析」においてベトナム人口唇口蓋裂患者170名ならびに対象群129名について解析したMTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase)のC677T多型について、モンゴル人についても同様に解析を進め、口唇・口蓋裂との関連について解析を進めている。1.昨年度中に倫理委員会への申請を行い得なかった研究分担施設においては、準備を進め今年度に申請を行い、可及的に各施設での承認を得た。2.前年度に研究分担者と打ち合わせ会議を行い確認した研究実施方法に従い、研究を引き続き実施した。研究分担施設へ送付した血液採取ならびデータ入力のための物品を使用し、遺伝子試料の収集を開始した。

3.得られた試料は、匿名化システム、大型超低温フリーザー、特注遺伝子試料保管庫に、指紋認証システムなどを配した口腔先天異常疾患関連遺伝子共同研究機構の口腔疾患関連遺伝子バンキングルームにて、患者のプライバシーに十分留意するとともに安全に保管した。4.これまでにバンキングされているミャンマー人試料のうち、口唇・口蓋裂患者181名とその父親49名、母親74名の試料を用い、葉酸代謝関連酵素、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子のC677T多型について解析し、この多型と口唇・口蓋裂との関連性について、検討を行った。患者や両親は、本症の裂型、性別で分けた群を設定し、詳細な検討を行った。この途中経過は、第29回日本口蓋裂学会学術集会(東京、2005.5.25-26)にて報告を行った。また、同様に、ベトナム人試料、患者331名とその父親171名、母親191名を用い解析を行ったデータについては、第45回日本先天異常学会学術集会(東京、2005.7.14-16)にて発表を行うとともに、愛知学院大学歯学会誌において報告した。ミャンマー人ならびにベトナム人については、これまで危険要因と考えられていた変異型のTT型が、疾患群において少ないという、大変興味深い結果が得られた。5.さらに、モンゴル人の試料、患者307名とその父親158名、母親220名についても同様に解析を進め、口唇・口蓋裂との関連について解析を進めた。その結果モンゴル人では、先述のミャンマー人やベトナム人と異なり、TT型が疾患群で少ないという結果は得られず、民族間の本症発生率の違いも含め、さらなる検討を行っている。1)これまでに倫理委員会への申請を行い得なかった研究分担施設においては、準備を進め申請を行い、可及的に各施設での承認を得た。2)初年度に研究分担者と打ち合わせ会議を行い確認した研究実施方法に従い、遺伝子試料の収集ならびに研究を引き続き実施した。研究分担施設へ送付した血液採取ならびデータ入力のための物品を使用し、遺伝子試料の収集を実施した。3)得られた試料は、匿名化システム、大型超低温フリーザー、特注遺伝子試料保管庫に、指紋認証システムなどを配した口腔先天異常疾患関連遺伝子共同研究機構の口腔疾患関連遺伝子バンキングルームにて、患者のプライバシーに十分留意するとともに安全に保管した。4)これまでにバンキングされ、遺伝子解析に使用しているベトナム人、モンゴル人、ミャンマー人試料に加え、日本人試料についても本格的にDNA抽出を開始した。まず本人の他に家族歴を有しない孤発家系の非症候群性の症例について、葉酸代謝関連酵素、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子のC677T多型とA1298C多型について解析を実施し、この多型と口唇・口蓋裂との関連性について、検討を行った。5)研究成果を平成18年6月25日からイギリスにて行われた第4回国際口唇口蓋裂学会(ICPF)において発表した。6)ベトナム、ラオス、ミャンマーにおいて、継続して遺伝子試料の提供を受け得るようにするため、現地の協力者への説明を行い、血液採取用濾紙やシリンジ等の必要な消耗品を送付した。
殺虫剤抵抗性害虫の機能解析と害虫管理への利用に関する総合的基礎研究

1殺虫剤抵抗性機構の解明・抵抗性害虫の機能解析殺虫剤抵抗性機構の一要因である薬剤低感受性アセチルコリンエステラーゼ(AChE)について、ツマグロヨコバイ、コガタアカイエカなど各種害虫のcDNAをクローニングし、そのアミノ酸配列を明らかにした。その結果、殺虫剤抵抗性はポイントミューテーションノのみではなく、後修飾要因が関与していることが明らかとなった。ツマグロヨコバイのAChEの薬剤感受性を指標に、逆相関交差抵抗性を示す薬剤の組み合わせをスクリーニングし、逆相関交差抵抗性を示す殺虫剤の組み合わせを発見した。イエバエの有機リン剤抵抗性系統では、グルタチオン転移酵素(GST)活性が雄では雌に比べ著しく高く、雄決定因子が常染色体(第2)上に存在していること、またこの原因はGST遺伝子のコピー数が何らかの理由により増加したためと考えられた。また、シロイチモジョトウのピレスロイド抵抗性では、酸化酵素の関与が明らかとなり、CYP9A属のP450遺伝子が抵抗性に関わっていることが示された。2殺虫剤抵抗性に機能を利用した害虫管理に関する基礎研究殺虫剤の抵抗性の簡易モニタリング法の開発は、野外個体群の薬剤感受性をリアルタイムで把握し、抵抗性対策を考える上で最重要課題である。殺虫剤抵抗性と関係のあるエステラーゼ、AChE, GSTを指標に、あるいはそれらの薬剤感受性を指標に、個体毎に薬剤感受性を測定する方法を考案した(イネウンカヨコバイ、イエバエ、イネミズゾウムシなど)。また、生化学的な手法が使えないような場合には、実用濃度による簡易な生物検定法を開発した(コナガ、ミカンキイロアザミウマ)。逆相関交差抵抗性を示す殺虫剤の利用の他、殺虫剤抵抗性天敵、あるいは選択制殺虫剤の利用による天敵の保護、あるいは、核多角体病ウイルスの利用などにより、有機合成殺虫剤による選択圧を減らし、抵抗性発達を遅延または抑制できることを示した。コナガのアセタミプリド抵抗性について、感受性系統と比べ野外採集系統の薬剤感受性は数分の1から十分の1に低下していることを発見した。これらの野外系統をさらに室内淘汰実験を行い、より高度に抵抗性を示す系統を育成中である。イネウンカヨコバイ類の薬剤感受性について、日本での飛来虫に対する永年の感受性試験のデータと、中国での本年度のデータを比較した。おおよその傾向については、日本のデータと大きな違いは認められなかったが、一部の薬剤については大きな違いがあり、さらに次年度以降も継続して調査する予定である。ミカンキイロアザミウマの薬剤抵抗性については、野外個体群を室内に持ち帰り、感受性検定を行うと共に室内での淘汰実験を実施中である。殺虫剤抵抗性機構については、シロイチモジヨトウのチトクロムP450遺伝子を分離し、抵抗性における役割を調査中である。AChEの殺虫剤抵抗性への関与については、ネッタイイエカおよびツマグロヨコバイで研究を行い、AChEの簡易検定法の開発、AChE遺伝子の塩基配列の解明などを行い、抵抗性機構について検討した。その結果、ツマグロヨコバイのカーバメート抵抗性機構には、AChEの薬剤低感受性の他に、AChEの遺伝子重複が関与しているのではないかと考えられた。また、グルタチオンエストランスフェラーゼ(GSST)と殺虫剤抵抗性に関しては、イエバエの雌雄でGSSTの遺伝の仕方が異なっているのではないかと考えられた。また、有機塩素系殺虫剤の作用点と考えられるGABAレセプターへの有機塩素系殺虫剤の作用について、パッチクランプ法により解明を行いつつある。

また、害虫防除への天敵ウイルス開発を目指し、細胞質核多核体ウイルスの遺伝子分析を行っている。(1)ケナガカブリダニをメチダチオンで室内淘汰し、メチダチオンに対し300倍程度の抵抗性系統を育成した。この抵抗性系統は他の有機リン剤には交差抵抗性を示したが、他系統のハダニ剤に対しては交差抵抗性を示さなかった。また、抵抗性機構についてしら別途ころ、酸化酵素による解毒分解が主要因と考えられた。(2)モモアカアブラムシとナミハダニの殺虫剤感受性低下について、アセチルコリンエステラーゼのアミノ酸置換について調べたところ、モモアカアブラムシではアミノ酸配列に違いは認められなかった。しかし、ナミハダニではF439Cのアミノ酸置換が認められた。ツマグロヨコバイの場合と同様、翻訳後修飾によりアセチルコリンエステラーゼの感受性が低下している場合の多いことが考えられた。(3)。有機リン剤抵抗性イエバエにおけるグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の異常性差と性決定機構異常の関係について、GST活性およびGST発現量は雄で有意に高かった。雄の高活性を支配する印紙は第2染色体上に存在し、雄の性決定因子も第2染色体に転座していた。(4)新規殺虫剤のdihydropyrazole系RH-3421の昆虫および哺乳類の電位依存性ナトリウムチャンネルに対する作用について調べた。Rh-3421の抑制作用は、チャンネルの不活化と密接に連関していると考えられた。(5)中国・マレーシア・九州でのトビイロウンカ・セジロウンカの薬剤感受性を検定し、飛来経路等を考察した。(1)コナガをニコチニル系殺虫剤の1種のアセタミプリドで40世代にわたり淘汰し、200倍の抵抗性を示す抵抗性系統を育成した。両者の交尾競争力を比べたところ、抵抗性系統の方が強かった。また、産卵数は抵抗性系統で多かったが、孵化率は感受性で高かった。(2)イエバエAChE遺伝子の培養細胞での発現を行い、抵抗性および感受性の形質を保存していることを確認した。コガタアカイエカの有機リン剤抵抗性におけるAChEの薬剤感受性の低下は、AChE構造遺伝子にはなく、蛋白が高次構造を形成する間に働く修飾要因が感受性低下を決定していると考えられた。AChE酵素の精製を試みたが、感受性系統は精製可能であったが、抵抗性系統では不可能であった。リガンドに殺虫剤を利用するなどの工夫が必要と考えられた。(3)有機リン剤抵抗性イエバエでは雄は雌にくらべGST(グルタチオン転移酵素)活性が高いことについて、ゲノムレベルの遺伝子の重複が起こり、mRNAへの転写量の増大、GST蛋白の発現量の増大、有機リン剤に対する抵抗性に連なっていることを明らかにした。(4)新規殺虫剤のdihydropyrazole系のイエバエにおける抵抗性機構について、表皮透過性および代謝が関与していることが明らかとなった。(5)中国・マレーシア・ベトナムでのトビイロウンカ・セジロウンカの薬剤感受性モニタリング体系を確立した。各国の薬剤感受性には大きな違いが認められなかった。(6)卵および幼虫寄生蜂の各種殺虫剤に対する薬剤感受性検定法を確立し、天敵に影響のない薬剤のスクリーニングを行うとともに選択制殺虫剤の重要性を指摘した。
近世私家集ならびに私撰集の研究

2011年度から2015年度までの4年間にわたった本研究は、江戸時代における私家集と私撰集について、刊本・写本を問わずその全体像(総量)を把握するとともに、未紹介私家集を発掘・翻印紹介し、さらには主要作品の注釈的研究にも道筋をつけるものであった。未紹介私家集としては、美濃岐阜の地下歌人賀島有一(かしま・ゆういち)の『砂長集』を翻印紹介し、注釈的研究としては、香川景樹の家集『桂園一枝』の注釈を整え終えた。本年度は、前年度の研究成果を踏まえつつ、江戸時代における私家集と私撰集について、その研究の円滑な推進に努めた。すなわち、近世私家集および私撰集伝本書目の編纂を強力に進める一方で、未紹介私家集の翻印ならびに主要作品の注釈的研究にも周到な目配りを行った。具体的にはまず、質量ともに私家集・私撰集の写本・刊本に恵まれた諸機関において関係文献を調査した。また、勤務先である人間文化研究機構国文学研究資料館には多量の関係文献のマイクロフィルムもしくは紙焼写真が収蔵されているので、鋭意それらを調査し、伝本データの増補に努めた。私家集は特に写本での伝存が少なくないので、さらに情報を収集し、精力的に調査を継続させる予定である。文献調査の過程で見出した美濃岐阜の地下歌人賀島有一(かしま・ゆういち)の家集『砂長集』(さちょうしゅう)については、詳細な解題と初句索引を添えた翻印を発表した。神作研一「賀島有一家集『砂長集』ー享保美濃和歌史の一資料ー」(『東海近世』20号、東海近世文学会、2012・7)。日本大学総合学術情報センターに所蔵されている貴重な私家集(江戸前期大坂の地下歌人浅井忠能の家集)については、翻印の申請を済ませ、現在翻印の許可待ちの状態にあることを添記しておく。注釈的研究として、江戸後期の地下歌人香川景樹の家集『桂園一枝』の注釈を開始すべく、関係資料の収集と整理に努めてその研究基盤を固めた。近世私家集および私撰集に関する諸論考を収めた論文集(神作研一『近世和歌史の研究』角川学芸出版、2013・1)を公刊した。本年度は、前年度までの研究成果を踏まえつつ、江戸時代における私家集と私撰集について、研究の円滑な推進に努めた。すなわち、近世私家集および私撰集伝本書目の編纂を進める一方で、未紹介私家集の翻印ならびに主要作品の注釈的研究にも周到な目配りを行った。具体的作業は前年度と同じである。すなわち、質量ともに私家集・私撰集の写本・刊本に恵まれた諸機関において関係文献を調査するとともに、勤務先である人間文化研究機構国文学研究資料館に所蔵されている関係文献(マイクロフィルムないし紙焼写真)を鋭意調査して、伝本データの増補に努めた。文献調査の過程で逢着した『百人一首像讃抄』の諸問題については、刊・印・修を総合的に検討し、論文を発表した。神作研一「歌書の刊・印・修ー『百人一首像讃抄』の場合ー」(中野三敏監修・河野実編『詩歌とイメージ江戸の版本・一枚摺にみる夢』所収、勉誠出版、2013年5月)。また、小沢蘆庵の私家集『六帖詠藻』について、新日吉神宮蘆庵文庫に所蔵される写本47冊を全文翻字した(共編『近世上方文壇における人的交流の研究』所収、2014年3月)。近世私家集および私撰集に関する私見を交えた近世和歌史全般について、英文による論文を発表した。神作研一「An Outline of the History of Waka in the Edo Period」(『国文学研究資料館紀要(文学研究篇)』40号、2014年3月)。本年度は、江戸時代における私家集と私撰集について、その研究基盤の整備に重点を置いて取り組んだ。すなわち、近世私家集および私撰集伝本書目の編纂を強力に推進する一方で、未紹介私家集の翻印ならびに主要作品の注釈的研究にも周到な目配りを行った。具体的にはまず、既刊の各種研究文献に登載された伝本情報データを網羅的に収集・蓄積し、その上で、質量ともに私家集・私撰集の写本刊本に恵まれた諸機関において関係文献を調査した。幸いにも、勤務先である人間文化研究機構国文学研究資料館には多量の関係文献のマイクロフィルムもしくは紙焼写真が収蔵されているので、適宜それらを調査し、伝本データの増補に努めた。私家集は特に写本での伝存が少なくないので、さらに精力的に調査を継続したい。なお、大阪市立大学学術情報総合センターの森文庫に、未紹介の近世私家集・私撰集が多く収蔵されていることが判明したのも収穫であった。

日本大学総合学術情報センター、刈谷市中央図書館村上文庫等々にも貴重な私家集が眠っていることを確認し得たので、これから優先順位をつけて適宜紹介していきたい。また、文献調査の過程で見出し得た美濃岐阜の地下歌人賀島有一(かしま・ゆういち)の家集『砂長集』について、詳細な解題と初句索引を添えた翻印を発表した。神作研一「賀島有一家集『砂長集』ー享保美濃和歌史の一資料ー」(『東海近世』20号、東海近世文学会、2012・6刊予定)参照。本年度は、前年度までの研究成果を踏まえつつ、江戸時代における私家集と私撰集についてその研究の円滑な推進に努めるとともに、最終年度としての研究の総括を行って今後のさらなる研究の進展に備えた。具体的作業は前年度までと同じであり、諸機関において関係文献を調査し、また勤務先である人間文化研究機構国文学研究資料館に所蔵されている関係文献(マイクロフィルムないし紙焼写真)を鋭意調査した。文献調査の過程で逢着した、シーボルト旧蔵の『三十六歌仙』(オランダ・ライデン大学図書館所蔵)については論文を発表、所蔵者の許可を得て翻字も収載した。神作研一「ライデンの田舎版付)田舎版『三十六歌仙』翻印」(国文学研究資料館編『シーボルト日本書籍コレクション現存書目録と研究』所収、勉誠出版、2014年12月刊)。また、多くの関係資料を収載する「売立目録」(うりたてもくろく)に関して、金城学院大学図書館(名古屋市守山区)に所蔵されている大量のそれを縦覧調査し、一般向けの文章として新聞に寄稿した。神作研一「魅惑の売立目録ー落ち穂拾いの悦楽ー」(中日新聞名古屋本社版、2014年10月17日付夕刊)。『和歌文学大辞典』(和歌文学大辞典編集委員会編、古典ライブラリー、2014年12月刊)には、『水雲集』や『愚詠草稿』、『和歌古語深秘抄』や『真字百人一首』など、近世の私家集や私撰集に関する多くの項目を執筆、寄稿した。人文学関係文献の調査に基づくデータの蓄積も、国文学研究資料館におけるマイクロフィルムもしくは紙焼写真調査によるデータの増補作業も、それぞれに順調であるから。関係文献の調査も、国文学研究資料館におけるマイクロフィルムないし紙焼写真調査によるデータの蓄積も、ともに順調だから。関係文献の書誌調査によるデータの蓄積も、国文学研究資料館におけるマイクロフィルムもしくは紙焼写真調査によるデータの増補作業も、それぞれに順調であり、今後も同様のペースで研究を進める所存である。交付申請書にしたためた「研究実施計画」(平成25年度・同26年度)に沿って、着実に研究を進める予定である。交付申請書にしたためた「研究実施計画」(平成26年度)に沿って、着実に研究を進める予定である。交付申請書にしたためた「研究実施計画」(平成24年度・同25年度・同26年度)に沿って、研究を進める予定である。交付申請書にしたためた通り、使用していく予定である。
金表面上のホモキラル一次元鎖を利用した単一キラル分子センシング

本研究では、新規な信号増幅原理に基づく分子センサーを開発することを目指したものである。本年度は、リガンドに長鎖アルキル基を有する六配位八面体型金属錯体を合成して、分子のC3軸方向に沿って分子が積み重なったようなカラムナー液晶相の構築をめざした。このようなoctahedral metallomesogenにおいては、もっとも興味ある点として、カラム内あるいはカラム間の分子パッキングに錯体のΔΛ異性がどのように影響するかという問題がある。さらに、これらカラムナー液晶性分子のキラリティの効果は3次元的な液晶相のみならず、2次元的な分子膜においても発現すると期待される。従来長鎖アルキル基を有する金属錯体はその光学分割が困難であるために研究はラセミ混合物を用いたものに留まっており,上記で述べたキラリティー効果について十分な知見が得られていなかった。そこで本研究では、Cr(III)のトリスキレート錯体(以下[Cr(5C8)_3]と略記)の合成及び光学分割を試みた。得られた錯体の分子膜をラングミュア・ブロジェット法によって作製し、膜構造に対するキラリティの影響を調べた。[Cr(5C_8)_3]のラセミ混合物(Δε=0 at 400nm)、Δ(-25)及びΛ(+29)体をクロロホルムに溶解し水面上に展開した。何れの錯体を用いた場合も、π-A曲線は表面積0.25nm^2/molecule付近から立ち上がり、水面に分子膜が形成されている事が明らかとなった。また、曲線の二段目の立ち上がりを示す圧力や表面積には錯体の光学純度が大きく影響していることがわかった。これらの錯体をHOPG基盤上に積層した2次元分子膜について、STM観察を実施した。その結果、当初本研究のテーマに沿って期待されたような、1次元的に連なりあったホモキラル分子が、より合わさってさらに2次元的な分子膜を形成していることが確認された。このようなキラル分子鎖は、これに光応答等を付与すれば新たな光信号増幅系として機能を発現できると期待される。これらの結果は2005年米国でおこなわれた国際メタルメソゲン学会で発表した。本研究では、外部分子の吸着によって分子配列の規則性が乱され、それを信号として取り出し高感度、高選択的な微小デバイスを開発することをめざした。特に光学活性分子が規則配列した薄膜を製造して、不斉分子の検出を試みた。そのためにまず、粘土粒子が水中で無限膨潤することを利用したラングミュア・ブロジェット法による粘土単一層超薄膜および人工積層した粘土多層膜の製造を行った。つぎに、そのようにして製造された構造規則性を有する粘土層積膜を用いて、電気化学測定によって電流値の大きさからキラルな有機分子の同定を行った。行った実験は以下のとおりである。有機長鎖アルキルアンモニウムの単分子膜を水相上に形成した。水相中には、単層剥離したナトリウムモンモリロナイトが含まれる。気液界面において粘土粒子とアルキルアンモニウム分子膜との複合化が起こった。これをシリコン基板にZ膜として積層した後、メタノール中に浸し有機層を取り除いた。その後新たに、水溶性のRu(II)錯体([Ru(phen)_3](ClO_4)_2)を含む水溶液に基板を浸漬し水溶性Ru(II)錯体を粘土膜に吸着させた。これら各段階で得られた薄膜をAFM、外部反射赤外分光法、in-plane XRDおよび鏡面X線反射法によって解析した。その結果、シリコン酸化膜上に形成されたモンモリロナイト単一層膜の上に水溶性の金属錯体が吸着し単分子層を形成することが確認された。また、同様な修飾電極を光照射し、得られた光電流の大きさによってキラル分子の検出を試みた。その結果、Ru(II)ポリピリジル錯体と粘土薄膜との複合膜で修飾したITO電極はキラル分子として1,1'-ビナフトールの絶対配置を含めて検出できることが解った。本予算で、錯体の精製のためのHPLC用高圧ポンプを購入した。本研究では、固体表面に形成された分子膜に対して外場を加えることによって層中の分子配列に乱れを起こし、それを信号として取り出すことをめざしている。そのためにまず、光応答するキラルな液晶性金属錯体を合成した。具体的には長鎖アルキル基を有するトリスアセチルアセトナト型錯体である。従来この中の錯体は3次元系においてカラムナー液晶性を示すことが知られている。我々は、得られた錯体を光学分割することに成功し、それを用いたラングミュア・ブロジェット法を製造して単分子膜の構造に対するキラリティの影響を明らかにした。今後はこの錯体の分子膜の分子レベルにおける構造と光照射による構造変化を明らかにしていく予定ある。これと平行して、雲母を基盤にもちいてキラル錯体の分子膜形成をAFM(原子間力顕微鏡)によって明らかにした。雲母は原子レベルで平坦であり、この表面にキラルな分子を規則的に並べることができれば、この面を用いて外部下での配列の乱れを利用することができると予想している。錯体としては[Ru(phen)_3]^<2+>および[Ru(bpy)_3]^<2+>を用いた。

この結果、[Ru(phen)_3]^<2+>は平坦な2分子膜、[Ru(bpy)_3]^<2+>は凹凸の顕著な1分子膜と1分子膜の混合状態を形成することがわかった。このようにキラル錯体のわずかな構造の違いが大きな膜構造の変化を引き起こすことが見出された。本研究では、新規な信号増幅原理に基づく分子センサーを開発することを目指したものである。本年度は、リガンドに長鎖アルキル基を有する六配位八面体型金属錯体を合成して、分子のC3軸方向に沿って分子が積み重なったようなカラムナー液晶相の構築をめざした。このようなoctahedral metallomesogenにおいては、もっとも興味ある点として、カラム内あるいはカラム間の分子パッキングに錯体のΔΛ異性がどのように影響するかという問題がある。さらに、これらカラムナー液晶性分子のキラリティの効果は3次元的な液晶相のみならず、2次元的な分子膜においても発現すると期待される。従来長鎖アルキル基を有する金属錯体はその光学分割が困難であるために研究はラセミ混合物を用いたものに留まっており,上記で述べたキラリティー効果について十分な知見が得られていなかった。そこで本研究では、Cr(III)のトリスキレート錯体(以下[Cr(5C8)_3]と略記)の合成及び光学分割を試みた。得られた錯体の分子膜をラングミュア・ブロジェット法によって作製し、膜構造に対するキラリティの影響を調べた。[Cr(5C_8)_3]のラセミ混合物(Δε=0 at 400nm)、Δ(-25)及びΛ(+29)体をクロロホルムに溶解し水面上に展開した。何れの錯体を用いた場合も、π-A曲線は表面積0.25nm^2/molecule付近から立ち上がり、水面に分子膜が形成されている事が明らかとなった。また、曲線の二段目の立ち上がりを示す圧力や表面積には錯体の光学純度が大きく影響していることがわかった。これらの錯体をHOPG基盤上に積層した2次元分子膜について、STM観察を実施した。その結果、当初本研究のテーマに沿って期待されたような、1次元的に連なりあったホモキラル分子が、より合わさってさらに2次元的な分子膜を形成していることが確認された。このようなキラル分子鎖は、これに光応答等を付与すれば新たな光信号増幅系として機能を発現できると期待される。これらの結果は2005年米国でおこなわれた国際メタルメソゲン学会で発表した。
高発現酵母宿主の構築とその遺伝的基盤の解析

1)酵母遺伝子の基礎発現量制御機構の解析と高発現宿主構築への応用酸性ホスファターゼをコードするPH05遺伝子をレポーターとして、転写活性化因子の不在下でも生産量が上昇した多くの変異株(be1変異と命名)を分離した。bel変異株の解析から、bel変異が染色体の高次構造の変化を介して多くの遺伝子の転写に影響を及ぼす可能性を示唆した。bel変異を宿主として使えば、プロモーターの強さをさらに増強させることができると提案した。2)酵母の接合型制御機構の解明と温度制御可能な宿主・ベクター系の開発への応用酵母の接合型の新しい制御遺伝子、AAR1、を見いだした。AAR1遺伝子は、様々な制御系で遺伝子特異的な転写抑制因子と相互作用して転写を抑制するglobalリプレッサーであることを明らかにした。接合型情報のレプレッサーSIR3遺伝子の温度感受性変異、sir3-8^<ts>、と接合型制御タンパクの変異、hmlα2-102、を組み合わせ、温度による制御が可能な宿主・ベクター系を構築した。3)高発現プロモーターを持つ酵母のリン酸取り込み系遺伝子PH084の解析酵母のリン酸のトランスポーターコードしているPH084遺伝子のプロモータが強力であることを見いだした。PH084の転写に必要なPH081遺伝子の温度感受性変異とPH084遺伝子のプロモータを組み合わせ、温度による制御が可能な宿主・ベクター系を構築した。これを、イネα-アミラーゼの分泌生産に応用したところ、期待通りの有用性が確認された。4)遺伝工学的物質生産の宿主としての利用を目指した醸造酵母形質転換系の開発旺盛な増殖力、長年に渡って醸造や食品製造に用いられてきた安全性などの有用な特性を持っている醸造酵母を遺伝子工学的物質生産の宿主として用いることができるような基盤を整えるため、セルレニン耐性を利用して醸造酵母に効率よく組換えDNAを導入する条件を確立した。本研究の目的は、宿主ベクタ-系を用いた遺伝子工学的物質生産において、高い生産性を付与する変異を持つ高発現酵母宿主を構築するための基礎的知的を得る事である。この目的のため、その生産量がコロニ-レベルで視覚的に検知でき、しかも活性測定が容易な酵母の酸性ホスファタ-ゼ(APase)をコ-ドする<PHO5>___ー遺伝子の構造部に、酵母のヒスチジン合成系遺伝子<HIS5>___ーのプロモ-タ-部(<HIS5p>___ー)を連結して、<HIS5p>___ー::<PHO5>___ー融合遺伝子を構築し、宿主酵母の<ura3>___ー遺伝子座に組み込んだ。平成2年度では、これよりAPase活性が上昇した変異株(<bel>___ー変異と命名)約300株分離し、これらの変異株間の相補性試験離により4つの相補群(<BEL1>___ー、<BEL2>___ー、<BEL3>___ー、<BEL4>___ー)を同定した。<bel>___ー変異はいずれも単一の核性変異で、<bel>___ー変異株のあるものはコロニ-が粗野であり、著しい細胞凝集能(Flo^+)と増殖の温度感受性(Tsm^-)表現型を示すことを見いだした。<BEL2>___ー遺伝子をクロ-ン化し、塩基配列を決定したところ、2022塩基対(674アミノ酸残基)からなるタンパク質コ-ド可能領域が存在した。クロ-ン化<BEL2>___ーDNAを利用して作成した<bel2>___ー遺伝子

破壊株も変異株と同様、<HIS5p>___ー::<PHO5>___ー融合遺伝子よりのAPase活性が上昇し、Flo^+、Tsm^-表現型を示す事を認めた。これらのことより、<BEL2>___ー遺伝子は37°Cでの増殖に重要な遺伝子であることが示唆された。染色体の<ura3>___ー遺伝子座に組込んだ<PHO5>___ー遺伝子からのAPase活性も、野生型株に比べ<bel>___ー変異株では上昇する事を認め、<bel2>___ー変異の効果は、少なくともホスファタ-ゼ生産に関する限り、プロモ-タ-に依らない事を明らかにした。本研究の目的は、宿主・ベクタ-系を用いた遺伝子工学的物質生産に有用な高発現酵母宿主を構築するための基礎的知見を得る事である。この目的のため、酵母の酸性ホスファタ-ゼ(APase)をコ-ドするPHO5遺伝子の構造部に、酵母のヒスチジン合成系遺伝子HIS5のプロモ-タ-部(HIS5p)を連結してHIS5pーPHO5融合遺伝子を構築した。この融合遺伝子を染色体に組み込み、これよりAPase生産量の上昇した多数の変異株(bel変異と命名)を分離した。平成2年度までに、i)bel変異株は劣性核性の単一変異からなる4つの相補群(bel1,bel2,bel3,bel4)を構成する、ii)bel変異株は多面表現型を示す、iii)bel変異の効果は転写段階である、iv)bel2,bel3変異はPHO5遺伝子よりのAPaseの生産量も上昇させることを明らかにし、さらに、v)BEL2遺伝子のクロ-ン化と塩基配列も決定した。平成3年度では、まず、i)PHO5遺伝子からのAPase生産の上昇も転写段階で起こっていること、ii)これはPHO5遺伝子の発現に必須の転写活性化因子PHO4を破壊しても影響されないことを見いだし、bel変異株では、転写活性化因子とは独立に転写の上昇が起こっていることを明らかにした。また、iii)HIS5pーPHO5融合遺伝子よりのAPaseの上昇を指標に新たなbel変異を分離し、これが二重変異(bel5 bel6変異と命名)によること、iv)bel5 bel6二重変異株においても、PHO5遺伝子の転写が上昇することを認めた。さらに、v)bel2変異の抑圧変異を分離し、これがbel2遺伝子破壊アレルも抑圧する事を明らかにした。応用的見地からは、vi)bel2遺伝子破壊株では、PHO5遺伝子よりのAPaseの生産量が正常な脱抑制レベルよりもさらに上昇することを見いだし、bel変異を応用すれば、転写活性化因子による通常の誘導以上に有用物質の生産量を上昇させ得る可能性を示した。本研究の目的は、酵母の高発現宿主構築のための遺伝的基盤を明らかにすることである。この目的のため、生産物の量が容易に測定できる酸性ホスファターゼ(APase)遺伝子(PHO5)をレポーターとして、ヒスチジン合成系遺伝子HIS5やPHO5遺伝子プロモーターによるAPaseの生産が転写レベルで上昇する多数の変異株(bel)を分離し、その分子生物学的解析を行ってきた。本年度は、まず、BEL2遺伝子が、異なる表現型を指標として分離、同定されていたTFS3、SIN4と同じ遺伝子であることがわかった。sin4変異はHO遺伝子の、また、tsf3変異は、GAL系遺伝子の発現上昇や、CST1遺伝子の転写の低下を引き起こす。
独立後インドの消費変動:農村社会経済構造の長期変動との関連に注目して

タミルナード州、パンジャーブ州の村落調査および産業調査、現地語の新聞・雑誌や自叙伝等の分析、及び全国標本調査の分析を行い、耐久消費財は農村貧困階層にも相当程度普及し、教育や家族関係などに構造的な変動が起っていることを明らかにした。さらに、農村下層階層の安価な工業製品への消費拡大が、零細企業による工業生産の拡大を支えていることや、地域の消費変動が工業発展の重要な基礎となっていることを明らかにした。1.パンジャーブ州の都市では、鉄鋼業とメリヤス業の中小企業から聞取り調査をおこなった。さらに、同州の農村2か村で聞取り調査を行い、パンジャーブ州農村部の消費動向全般に関するデータを収集した。また、南インドでは、チェンナイ南部の都市化の拡大にともなう漁村の変化、チェンナイ北部における外国企業工場誘致による周辺農村と織物産地の変化について調査し、中間層の拡大と消費行動の変化および労働移動の範囲拡大に関するデータを収集した。以上の現地調査に加えて、南インド村落調査の収集データをデジタル化した。3.1983年、1993年、2004年に実施された全国標本調査の個票データを使用して、インドの地域ごとの食料消費パターンについて分析を行った。この研究については、より詳細な地域区分を行うことによって分析の精緻化を図っている。4.これらの調査から、インドの経済発展に関して、地域とくに農村地域の消費の変動が工業発展の重要な基礎となっていることが明らかとなった。「緑の革命」を経た農村地域とその周辺都市における家屋の改築や建設ブームによって鋼材への需要が拡大し、その需要に対して安価・低質な鉄鋼を供給する地域密着型の中小の鉄鋼業が発展している。繊維産業においても、地域需要の拡大に対応して発展した中小企業が積極的に海外進出を図っていることなどの点が、明らかになった。1.タミルナードゥ州タンジャーウール県村落の現地調査を行った。また、同州テイルチラーパッリ県の調査データを分析し、過去30年間の変化を検討した。この結果、12年目の修学を境に社会階層間で学歴の格差が拡大している可能性が示唆された。2. 2010年に社会経済調査を実施したパンジャーブ州村落について、調査結果の分析を進めるとともに追加調査を行い、消費生活の実態を明らかにした。そこから、冷蔵庫、テレビ、携帯電話などの耐久消費財が相対的に貧困な階層にも相当程度普及していることなどが明らかになった。3.タミル語の雑誌KumudamとAnanda Vikatanの広告頁について、人物・家族・衣服などの分析を行った。また、マラヤーラム語ジャーナルの広告分析を1950年代から80年代までに拡大した。その結果、しばしば「破廉恥」として非難された、「万能薬」、「強壮剤」の広告は予想以上にのちのちまで形を変えながらも残ること、大衆消費財の広告は1960年代以降、その数とバラエティを増すことが確認された。4.ムンバイのインド繊維省市場調査部やデリーの国立応用経済学研究所などで資料収集を行った。それらの資料から、1990年以降の非綿糸繊維品や既製服・メリヤス製品などの需要の増大は、農村市場で顕著であること、急速に発展した小規模織布工場パワールームは農村市場を基盤としたことなどが明らかとなり、農村市場とくに農村の下層階層の安価な工業製品への消費拡大が、インドの小規模・零細規模企業による工業生産の拡大を支えていることが明らかとなった。1.タミルナードゥ州タンジャーウール県内の農村において人類学的調査を実施し、1990年に行った現地調査によって得られた資料と突き合わせながら、消費行動の変化について検討した。とくに、21世紀に入って州政府主導のバラマキ政治が加速し、耐久消費財が広く行き渡るとともに、教育、家族関係などに構造的な変動が起っていることが実証された。2.収集したタミル語雑誌広告(KumudamとAnanda Vikatanの2誌の創刊号から1989年まで)のデータをまとめ、雑誌別平均広告数、業種別品目数、業種別広告数、特徴的な13品目広告数、国内外企業総広告数、国内外企業5業種商品数、業種別人物画数、業種別人物画組合わせの側面から分析した。3.マラヤーラム語よる自伝(男女を含む)や女性が書いた自伝(英語翻訳)から消費活動の実態、および消費をめぐる感性の変容を探る作業を継続しておこなった。また、ミドルクラスの消費動向に関する近年の研究を批判的に検討することによって、ミドルクラスと総称される階層内部に少なからぬ亀裂があること、消費文化の謳歌と同時にジェンダー関係の変容への不安が存在することを確認した。一方、下層と位置づけられる女性の一部が示す消費行動に、ある種の自己主張を読み取ることが可能であることも確認された。4.全国標本調査機構(NSSO)が1983年、1993年、2004年に実施した家計調査の結果を、NSS Region別に集計し、これまで行われてこなかった食料消費パターンのNSS Regionレベルの時系列分析を行った。

NSS Regionレベルのデータを使用することにより、地域別の食料消費パターンをきめ細かく明らかにすることが可能となり、例えば沿岸部や山岳地帯における魚食の重要性など、これまで利用されてきた州レベルのデータでは確認できなかった事実を定量的に確認することができた。村落での世帯聴取り調査、現地語の新聞・雑誌の広告などの分析、National Sample Surveyの個票データの統計的分析は、順調に進行しており、農村社会経済構造の長期の歴史的変容こそが現代インド経済成長の原動力の最重要要因の一つであることを説得的に実証する見通しができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.広告の分析から、消費の実際の変化をどう推定してゆくか、検討する必要がある。2.旅行や結婚式など、非日常的な消費について、一層のデータ収集の必要がある。3.教育と消費の関連を分析する必要がある。30年前の村落調査のデータと比較することで、変化を追跡してゆく。4.成果の公表について、検討する。
内在性ガレクチン9による血管内皮細胞のインターフェロン感受性調節作用

siRNAを利用したガレクチン9ノックダウンの結果から、ヒト血管内皮細胞において内在性ガレクチン9がインターフェロン作用を調節(抑制)している可能性が示唆された。しかし、低濃度で効果を示す新世代siRNAを用いた確認実験から、当初の結果はsiRNAのオフターゲット効果によるものであることが分かった。最終年度に行った実験結果は、ガレクチン9が血管内皮細胞における小胞体ストレスと何らかの関連性を持つことを示唆していおり、現在、その分子的実態を明らかにするために研究を継続している。血管内皮細胞における内在性ガレクチン9の役割を検討する目的で、siRNAによるノックダウンを行った結果、無刺激状態におけるStat1のリン酸化が亢進するとともに、典型的なIFN応答遺伝子産物であるCXCL10/IP-10の産生が増加した。この効果は抗IFN-β抗体によりほぼ完全に抑制されること、また対照siRNAや他のガレクチン(ガレクチン1,3)に対するsiRNAはこのような効果を示さないことから、短鎖RNAによる非特異的な作用ではないと判断した。しかし、ガレクチン9のノックダウンに使用したsiRNAmixture(4種類のsiRNA[siG9-5,-6,-7,-8]の混合物)の各成分の効果を個別に検討した結果、siG9-6はStat1リン酸化の亢進とCXCL10産生を誘導したが、ガレクチン9に対するノックダウン効果を示さなかった。一方、SiG9-5,-7,-8はガレクチン9に対するノックダウン効果を示したが、Stat1リン酸化やCXCL10産生に影響を与えなかった。このデータは、これまでに得られた結果がsiG9-6のオフターゲット効果によるものであることを示している。このため、低濃度で十分なノックダウン効果が得られる新世代のsiRNA (Ambion社製)を用いて、データの取り直しを進めている。予備的な実験から、オフターゲット効果の現れない濃度において、ガレクチン9に対する十分なノックダウン効果を示すことが分かった。昨年度の研究成果から、ガレクチン9のノックダウンに伴うケモカインの発現変化が、使用したsiRNAmixture(4種類のsiRNA[siG9-5,-6,-7,-8]の混合物;Dharmacon社製)のうち、siG9-6のオフターゲット効果によるものであることが明らかになった。siG9-6を除く3種類のsiRNA混合物(siG9-5,-7,-8)を用いて、IFN-γによるケモカイン(CXCL9とCXCL10)産生誘導に対するGal-9のノックダウン効果を再検討した結果、CXCL9の産生はsiRNA処理によって約1/5に減少したがCXCL10の産生は影響を受けなかった。Dharmacon社のsiRNAの使用濃度は100nMであるが、siRNAの濃度が10nMを越えるとIFN様作用が現れやすくなることが知られている。このため、低濃度で十分なノックダウン効果が得られる新世代のsiRNA(Ambion社製)を用いて、ガレクチン9のノックダウンを行った。その結果、三種類のsiRNAがオフターゲット効果の現れない低濃度(1nM以下)において、十分なノックダウン効果を示した。しかし、これらのsiRNAは血管内皮細胞におけるIFN-γによるCXCL9の発現誘導に対して抑制効果を示さなかった。今年度の研究結果からは、血管内皮細胞におけるガレクチン9の機能を推察する手掛かりは得られなかった。siRNAによるノックダウンは極めて有用な手法であるが、非特異的な応答を引き起こす可能性があり、結果の解釈には注意が必要である。血管内皮細胞における内在性ガレクチン9の機能を明らかにするために、プロテオーム/グライコーム解析等の手法とノックダウンを組み合わせて検討を進める必要があると考えられるため、来年度はガレクチン-9と相互作用する血管内皮細胞の細胞内タンパク質の同定を目標として研究を継続する予定である。新世代のsiRNAを用いた昨年度の研究成果から、旧タイプのsiRNAによって得られた実験結果が、オフターゲット効果によるものであることが判明し、本研究の基盤としてきた手掛かりが失われた。このため、本年度は研究の方針を変更し、ガレクチン9を含むガレクチンファミリーに共通する重要な問題である分泌メカニズム(ガレクチンは非古典的分泌経路を介して分泌されるがその詳細は不明)を血管内皮細胞/インターフェロン刺激の系を用いて検討した。ガレクチン9の定量にはサンドイッチELISA法を用いた。インターフェロンで刺激した血管内皮細胞を様々な薬剤(PMA,forskolin,A23187,histamine,TNF-α,IL-1α,staurosporin,SB203580,LY294002)で処理し、細胞内と培地中のガレクチン9を測定した。その結果、A23187処理により細胞内ガレクチン9の減少(対照の約40%に減少)と、培地中の濃度増加が再現性良く観察された。

しかし、培地中に検出される量は刺激後24時間で0.5ng/ml以下であり、細胞内減少分の5%程度であった。さらに、古典的分泌経路の阻害剤であるbrefeldin Aを添加すると、細胞内ガレクチン9は10%以下に低下し、培地中ではほとんど検出されなかった。この細胞内ガレクチン9の減少は、bafilomycin A1(リソゾームにおける蛋白質分解阻害剤)により阻害されることから、brefeldin Aはガレクチン9の分解を促進したものと考えられる(シクロヘキシミドやピューマイシンで蛋白質合成を阻害しても、24時間では細胞内ガレクチン9の減少は認められない)。brefeldin AやA23187はERストレスを引き起こすことから、細胞内ガレクチン9の減少とERストレスの関連が示唆された。