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ランダムグラフを用いたモデル理論の研究

本研究の目的は,ランダムグラフの一般化としてのジェネリック構造の研究,さらにはジェネリック構造を用いたLachlan予想(可算モデルの個数に関する予想)の解決にあった.ジェネリック構造の研究に関しては,Baldwinの問題(すべてのジェネリック構造は真に安定かω安定か)を否定的に解決することができた.Lachlan予想に関しては,ジェネリック構造を用いてLachlan予想の反例を構成することは難しいことを証明した.本研究の目的は,ランダムグラフの一般化としてのジェネリック構造の研究,さらにはジェネリック構造を用いたLachlan予想(可算モデルの個数に関する予想)の解決にあった.ジェネリック構造の研究に関しては,Baldwinの問題(すべてのジェネリック構造は真に安定かω安定か)を否定的に解決することができた.Lachlan予想に関しては,ジェネリック構造を用いてLachlan予想の反例を構成することは難しいことを証明した.本年度の目標は,モデル理論がランダムグラフの諸性質を解析する際に,どの程度,有効であるかを確認することにあった.そこでランダムグラフに関連が深い,モデル理論の一分野であるgeneric構造に関する研究発表を,2007年7月に海外の研究集会(Logic Colloquium 2007,ポーランド)で行い,Generic構造とランダムグラフの関連牲について海外のモデル理論研究者と意見交換を行った.そしてこれらの意見を踏まえ,8月に筑波大学で開催された研究集会Model Theory Summer Meeting in Tsukuba 2007においてGenericモデルに関する研究発表を行い,筑波大学の坪井明人氏,神戸大学の桔梗宏孝氏などの国内のモデル理論研究者に,この研究の方向性について意見を求めた。その後,以上の研究成果をまとめ,東北大学で開催された日本数学会秋季総合分科会でその成果を発表し,さらに京都大学数理解析研究所で開催されたRIMS共同研究「モデル理論の手法による無限構造の構成法」においても講演を行った(講演内容は論文にまとめられ,京都大学数理解析研究所講究録に掲載される予定である)。また,この研究集会において,同時に,クリプケ構造とランダムグラフとの関係に関する研究発表も2件行った。この研究は産業総合研究所の岡本圭史氏との共同研究である。数学基礎論の一分野であるモデル理論において有名な未解決予想としてLachlan予想がある。この予想は理論の可算モデルの個数に関する予想であるが、もし反例が存在するならば、その反例はジェネリック構成法で作られるのではないかと多くのモデル理論研究者は考えている。そこでまずジェネリック構造における独立性などの概念を解析し、その結果を数理解析研究所講究録にまとめた。また、筑波大の坪井氏、神戸大の桔梗氏と強い融合性をもつジェネリック構造の研究をまとめ、その結果はJournal of Symbolic Logicに掲載予定である。一方、非常に強い条件の下ではジェネリック構造においてLachlan予想は正しいことがわかり、その結果を2008年8月に開催されたModel Theory Summer Meetingで発表した。その際、筑波大の坪井氏、神戸大の桔梗氏を含む国内のモデル理論研究者とこの結果について研究打ち合わせをおこなった。その後、仮定していた強い条件をわかりやすい形に整理し、その結果は2008年9月に開催されたThe10^<th> Asian Logic Conferenceで発表された。その際、この集会の参加者であった延世大学のByunghan Kim氏から有益なコメントを得た。そしてこの結果をさらに改良し、二つの条件、「部分グラフに関して閉」と「自由融合性」の仮定の下、ジェネリック構造においてLachlan予想は正しい、という結果を得た。この結果は2008年11月に開催されたRIMS研究集会で発表され、それをまとめたものは数理解析研究所講究録に掲載予定である。この結果は、ジェネリック構造における可算モデルの個数に関する結果が存在しない現時点では、ある一定の意義があると思われる。また、2009年2月に開催されたモデル論研究集会では先の結果とは違う仮定のもとでジェネリック構造においてLachlan予想が成り立つことがわかり、現在その方向での研究が進行中である。本研究の目的は,グラフ理論の概念であるランダムグラフと,モデル理論の概念であるジェネリック構造の関係をあきらかにすることにある.その際に研究代表者が目標としていた問題のひとつに「超安定であるがω安定なジェネリック構造が存在しない」ことを主張するBaldwin予想があった.この予想を本研究期間において解決することができたので,その経緯を報告する.まず,筑波大学の安保氏との共同研究により,Baldwin予想の部分的結果を得ることができたので,その結果に関連する内容を2009年7月に開催された研究集会「Model Theory Afternoon with John Baldwin」において発表した.(安保氏との共同研究の論文はMathematical Logic Quarterlyに掲載が確定している.)その際に,集会に参加していたBaldwin氏との議論から新たな着想を得ることができた.そこでその結果をまとめ,2009年8月に開催された研究集会「モデル理論サマースクール」および9月に開催された日本数学会総合分科会においてそれぞれ発表した.さらに,2009年11月に開催された研究集会「モデル理論とその周辺」において,連携研究者である筑波大学の坪井氏,神戸大学の桔梗氏と研究打ち合わせを行い研究は大きく進展し,Baldwin予想の反例があることがわかった.そしてその結果を2010年に開催された国際研究集会「Model Theory Kirishima 2010」において発表した.論文は現在準備中である.
ヘリコバクターピロリCagAの分子立体構造と病原生物活性の相関

全長CagAのプロテアーゼ限定分解などの解析結果から、CagAはN末端側およびC末端側それぞれにドメイン構造を有し、個々のドメインを構成するフラグメントは分子内で相互作用を示すことをこれまでに明らかにしてきた。そこで、CagA分子内相互作用に関わる構造基盤の解明を目的として、CagA分子内相互作用に分子機構に関する解析を行った。1)In vitro再構成実験の結果から、CagAのN末側領域(アミノ酸1-876)におけるアミノ酸配列554-617及び708-821の双方が、CagAC末側領域(アミノ酸877-1186)との分子内相互作用に必要であった。一方、CagAC末側領域配列を基に合成されたペプチドによる競合阻害実験から、CagAアミノ酸配列977-1077に相当するペプチドの存在により、CagAN末側及びCagAC末側フラグメント間の結合が抑制された。アミノ酸配列977-1077領域における一連の欠失変異体を用いた解析から、アミノ酸配列1027-1038に相当する11個のアミノ酸が、CagAC末側領域の分子内相互作用に関わる責任部位であることが明らかとなった。2)アミノ酸配列998-1038を欠失させた変異型CagAを胃上皮AGS細胞に発現させたところ、野生型CagAに較べ細胞形態変化を示した細胞数及び細胞の伸長率が大きく減少した。この時、変異型CagAのチロシンリン酸化レベルは野生型CagAと差は見られなかったが、リン酸化型CagAの細胞内標的分子であるSHP-2との複合体形成量が低下していた。これらのことから、CagAにおける分子内相互作用は構造的にSHP-2複合体形成に深く関与し、SHP-2の異常活性化を必要とするCagAの癌タンパク質としての機能発現に深く関わっているものと推察される。申請者は昨年までに、ヘリコバクターピロリCagA組換えタンパク質を用いた構造解析結果からCagAが二つのドメインで構成され、CagA生物活性に重要なC末端領域においては高次構造の存在する一方で、自由度の高い不規則構造も併せて存在していることを明らかにした。また、全長CagAが示す細胞形態変化誘導活性を指標に組換えC末端フラグメントの生物活性を検討し、不規則構造から構成されているC末端フラグメントは細胞形態変化活性を示したことから、CagAは主要な生物活性に重要なEPIYA領域周辺を不定形構造として持つ内因性不規則構造タンパク質であることが強く示唆されていた。そこでNMR法によるC末端フラグメントとCagAの標的分子であるPAR1分子間相互作用の解析を進めた。その結果、PAR1によるMR分子滴定により、CagA C末端フラグメントは標的分子と相互作用することで一定の構造を維持する内因性不規則構造タンパク質であることが明らかとなった。現在、N15/C13ラベルCagA分子を用いたNMR滴定解析を行い、PAR1との相互作用に関わるアミノ酸残基の同定を進めている。一方、CagA N末端フラグメントの結晶構造解析を行い約3.5Aの解析像を得たが、分子構造の詳細を明らかにするには至らなかった。そこで現在、N末端フラグメントのさらなるドメイン構造解析を進め、ドメイン構造情報に基づいた複数の欠失変異体を作成し結晶化に成功した。個々の欠失変異体フラグメントのX線構造解析を進めている。
大自由度モデルに基づくデータ同化のための革新的４次元変分法の開発

数値モデルと観測データをベイズ統計学の枠組みで融合するための計算技術「データ同化」を主題とし,大自由度数値モデルを取り扱う地震学・気象学の実問題にも適用可能な「次世代型4次元変分法」の開発に着手した。提案手法は,研究代表者が最近開発した「最新型4次元変分法」にレプリカ交換モンテカルロ法をプラグインし,大自由度数値モデルの場合であっても,現実的な計算時間および計算機資源の範囲内で,初期解依存性の無い推定解およびその不確実性評価の両者を一挙に計算可能な革新的なものとする。本研究の参画者を理論班,実装班,応用班に分け,各班が以下の研究を実施した。[理論班]研究代表者の長尾が中心となって,Metropolis-adjusted Langevinアルゴリズムを参考に,次世代型4次元変分法の理論設計に着手した。長尾らが開発した最新型4次元変分法にプラグイン可能なレプリカ交換モンテカルロ法を,研究分担者の永田が中心となって考案した。[実装班]理論班による次世代型4次元変分法のアルゴリズム考案中に,LorenzモデルやPhase fieldモデルに基づく双子実験の準備を開始した。その際,計算実行時間および計算機資源使用量を計測できるようにした。実装班は,若手研究員および大学院生で構成されているため,実装にあたってはデータ同化手法の開発と実装に豊かな経験を持つ長尾から指導を受けた。[応用班]次世代型4次元変分法を適用する地震学の実問題を選定に着手した。次世代型4次元変分法を用いれば,広域最適化と同時に不確実性評価も可能となり,信頼性のある摩擦パラメータの分布関数が得られるものと期待される。[研究総括]平成29年度中に全体ミーティングを複数回開催し,また学会セッションを企画する等,参画者間の緊密な連携を取ることに努めた。本研究で開発する「次世代型4次元変分法」の理論設計や実装は極めて順調に進んでいるものの,本手法を応用する実問題の選定がやや遅れている。しかしながら,これは次年度以降に十分に挽回可能であるため,本研究の進捗状況は,おおむね順調に進展していると言える。本研究で開発する「次世代型4次元変分法」を将来的に応用する実問題の選定を急ぎ,進捗状況を回復することに努める。また,理論班と実装班のコミュニケーションを頻繁に取り,手法としての完成度や汎用性を高める。全体ミーティングの開催を通じて,参画者間の意思疎通をより一層図る。また,本研究の成果を広く周知するため,統計関連学会連合大会や日本地球惑星科学連合大会を始めとする国内学会,アジア・オセアニア地球科学協会といった国際会議において特別セッションを企画し,本研究を広く周知する。さらには,本研究の成果を数編の英語論文にまとめ,国際誌に投稿する。

また,本研究の成果を広く周知するため,統計関連学会連合大会や日本地球惑星科学連合大会を始めとする国内学会,アジア・オセアニア地球科学協会といった国際会議において特別セッションを企画し,本研究を広く周知する。さらには,本研究の成果を数編の英語論文にまとめ,国際誌に投稿する。
皮膚筋炎の病態解析=筋・肺組織における免疫応答と増殖因子・サイトカイン

皮膚筋炎・多発性筋炎は特発性炎症性ミオパチーに分類され、病因として自己免疫機序とともに遺伝要因やウィルス等環境因子の関与も示唆されているがなお不明である。近年両者の差違が知られてきているが特に皮膚筋炎では重篤な間質性肺炎や悪性腫瘍の合併率が高く病態の解明は重要である。本研究は生検筋組織を、特に増殖因子・サイトカインに着目して解析し、皮膚筋炎に特異的な病態・免疫応答異常の解明を目的とした。方法は筋炎患者生検組織を用い免疫組織化学的染色法を中心にbasic FGF,TGF-β,PDGF-AA,PDGF-BBなどの増殖因子およびIFN-γ,IL-1β,TNF-αなどのサイトカインの発現を検索した。その結果、増殖因子では、b-FGFは筋線維表面および核に局在しPMではDMより強く,またCPK高値で筋傷害の強い例でより強い発現を認め、b-FGFは特にPMにおける筋傷害・再生との関連が示唆された。TGF-βに関しては、PMでは筋内鞘および同部への浸潤細胞、DMでは筋周鞘血管周囲の浸潤細胞に著明な局在を認め、ともに細胞浸潤部における活性化が示唆された。PDGF-AA,PDGF-BBは広汎に認められたが特異的ではなく特定の傾向は認められなかった。サイトカインでは、IFN-γはPM/DMともに細胞浸潤の強い部位の筋表面全周性および血管周囲浸潤細胞、血管内皮等に認めた。TNF-α,IL-1βは浸潤単核球の多くで発現を認めたが筋線維には認められなかった。またICAM-Iの発現はPMでは浸潤細胞および接する筋線維に認められたが、血管内皮での発現はDMのみに認められた。以上の結果からDMではPMと異なり筋周鞘部血管内皮細胞を中心とする免疫応答の重要性が示唆された。DMの筋病変における増殖因子の特異的関与は明らかではなかったが、b-FGF,TGF-βはPM/DMともに筋炎の病態への関連が示唆された。本研究は、皮膚筋炎(DM)の筋病変および肺病変の病態を明らかにする目的で、病変局所における免疫応答に関与する因子を解析するものである。各筋炎症例(DMおよび多発性筋炎(PM)の生検筋組織におけるサイトカイン、増殖因子の局在・発現を血管内皮、浸潤単核球における接着因子等と共に解析した。その結果、1.basic FGFは、PM/DMでは筋線維表面・および核に局在しPMではDMより強く、またCPK高値で筋傷害の強い例では、より強い発現を認めた。2.TGF-βに関しては、PMでは筋内鞘および同部への浸潤細胞、DMでは筋周鞘血管周囲の浸潤細胞に著明な局在を認めた。3.PDGF-AA,PDGF-BBに関しては広汎に認められたが、特異的な所見ではなかった。4.IFNγはPM/DMともに、細胞浸潤の強い部位の筋表面全周性および血管周囲浸潤細胞、血管内皮等に局在を認めた。5.TNF-α,IL-1βは浸潤単核球の多くで発現を認めたが筋線維には認められなかった。増殖因子に関しては、basic FGFは特にPMにおける筋傷害・再生との関連、TGF-βもPMで細胞浸潤部における活性化が示唆されたが、PDGFには特定の傾向は認められなかった。

またサイトカインに関しては、TNF-α,IL-1βの発現は浸潤細胞に限局していたが、IFNγはPM/DMともに浸潤細胞および周囲の筋線維にも認められた。またICAM-Iの発現はPMでは浸潤細胞および接する筋線維に認められたが、血管内皮での発現はDMのみに認められ、DMではPMと異なり筋周鞘部血管を中心とする免疫応答が重要であることが示唆された。皮膚筋炎・多発性筋炎は特発性炎症性ミオパチーに分類され、病因として自己免疫機序とともに遺伝要因やウィルス等環境因子の関与も示唆されているがなお不明である。近年両者の差違が知られてきているが特に皮膚筋炎では重篤な間質性肺炎や悪性腫瘍の合併率が高く病態の解明は重要である。本研究は生検筋組織を、特に増殖因子・サイトカインに着目して解析し、皮膚筋炎に特異的な病態・免疫応答異常の解明を目的とした。方法は筋炎患者生検組織を用い免疫組織化学的染色法を中心にbasic FGF,TGF-β,PDGF-AA,PDGF-BBなどの増殖因子およびIFN-γ,IL-1β,TNF-αなどのサイトカインの発現を検索した。その結果、増殖因子では、b-FGFは筋線維表面および核に局在しPMではDMより強く、またCPK高値で筋傷害の強い例でより強い発現を認め、b-FGFは特にPMにおける筋傷害・再生との関連が示唆された。TGF-βに関しては、PMでは筋内鞘および同部への浸潤細胞、DMでは筋周鞘血管周囲の浸潤細胞に著明な局在を認め、ともに細胞浸潤部における活性化が示唆された。PDGF-AA,PDGF-BBは広汎に認められたが特異的ではなく特定の傾向は認められなかった。サイトカインでは、IFN-γはPM/DMともに細胞浸潤の強い部位の筋表面全周性および血管周囲浸潤細胞、血管内皮等に認めた。TNF-α,IL-1βは浸潤単核球の多くで発現を認めたが筋線維には認められなかった。またICAM-Iの発現はPMでは浸潤細胞および接する筋線維に認められたが、血管内皮での発現はDMのみに認められた。以上の結果からDMではPMと異なり筋周鞘部血管内皮細胞を中心とする免疫応答の重要性が示唆された。DMの筋病変における増殖因子の特異的関与は明らかではなかったが、b-FGF,TGF-βはPM/DMともに筋炎の病態への関連が示唆された。
中学校理科における形成的な自己評価の実践-コンセプトマップ法による一枚ポートフォリオ評価を通して-

本研究では、中学校理科に単元を通したコンセプトマップ法(注1)による一枚ポートフォリオ評価(注2)(自己評価表)を導入し、その成果を分析する。その自己評価表の有効性を検討するために、次の3つの調査を行う。(1)「コンセプトマップ法による一枚ポートフォリオ評価を通した形成的な自己評価」についての質問紙調査を行い、実践研究の成果を明らかにする。(2)(1)で明らかにした実践研究の成果に該当する自己評価の事実を、学習前、学習中、学習後における自己評価の記述の分析から検証する。(3)単元を通したコンセプトマップ法による一枚ポートフォリオ評価を通した形成的な自己評価の分析を行う。自己評価表を理科学習に導入すると、子どもの自己評価と教師による評価を容易に導入することができた。特に、形成的な自己評価及び形成的な評価、つまり、学習と評価の一体化及び指導と評価の一体化を具現化することができた。そして,生徒は学習によって変容する自分を容易にとらえることができ、「わかった自分」「できるようになった自分」をとらえ、これまで学習してきた内容やその意味を実感することができた。それは、これまでの理科学習を価値付けることになり、あらためて理科のおもしろさを認識することに寄与した。注2堀哲夫編著:『一枚ポートフォリオ評価理科子どもと先生がつくる「学びのあしあと」』,日本標準,2004本研究では、中学校理科に単元を通したコンセプトマップ法(注1)による一枚ポートフォリオ評価(注2)(自己評価表)を導入し、その成果を分析する。注2堀哲夫編著:『一枚ポートフォリオ評価理科子どもと先生がつくる「学びのあしあと」』,日本標準,2004
褐藻類にみられる有用物質の代謝関連酵素の同定と高度変換技術の開発

褐藻のカロテノイド生合成酵素については、リコペンをβ-カロテンへと変換するワカメのリコペンβ-シクラーゼを褐藻では初めて同定した。リコペン生合成能をもつ組換え大腸菌に本酵素の遺伝子を組み込み、蓄積したカロテノイドをHPLCおよびAPCI-MS法により調べ、反応産物がβ-カロテンであることを明らかにした。さらに、褐藻ではβ-カロテンはゼアキサンチンへと変換される可能性が考えられるため、この反応を触媒するβ-カロテン水酸化酵素の同定を試みた。2つの候補遺伝子をワカメ・トランスクリプトームデータベースから見出し、各遺伝子をβ-カロテン生合成能をもつ大腸菌に導入したが、β-カロテン以外の成分は検出されなかった。これは、目的タンパク質の発現量がいずれも低く、酵素活性の検出が困難なためと考えられた。多糖類については、褐藻の主要多糖であるアルギン酸の代謝について、新しい知見を得た。先に本研究ではマコンブがアルギン酸分解酵素をもつことを見出しており、本年度は、その反応産物を詳細に解析した。その結果、本酵素はアルギン酸のマンヌロン酸が連続した配列を分解し、最小分解物として不飽和単糖(DEH)を生じることが分かった。DEHは、アルギン酸資化生物ではアルギン酸代謝における中間代謝物であり、これを基質とするDEH還元酵素の存在が知られているが、褐藻ではこれに相当する酵素の知見は無い。そのため、既知の同酵素と有意な配列相同性をもつタンパク質の遺伝子をマコンブ・トランスクリプトームデータベースを用いて調べ、4つの候補タンパク質に着目した。各組換えタンパク質の酵素活性を調べた結果、1つのタンパク質がNADPHを補酵素として、DEHを還元し、2-ケト-3-デオキシ-D-グルコン酸へと変換することを明らかにした。これは、アルギン酸分解物を代謝する酵素がアルギン酸生合成生物で見出された初めての例である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、褐藻類にみられるユニークかつ有用な糖質とカロテノイドの生合成や代謝機構を明らかにするために、これらに関わる酵素の探索を進め、生化学的手法を用いて機能解析を進めるものである。本年度は、褐藻類に多量に含有されている酸性多糖類アルギン酸の合成および代謝とカロテノイドの合成関連酵素に着目し、以下の成果を得た。アルギン酸に関しては、その合成の最終段階で作用するマンヌロン酸C5-エピメラーゼの遺伝子を得て、昆虫細胞発現系により組換えタンパク質の生産に成功した。得られた組換えタンパク質は、ポリマンヌロン酸を基質としてエピメラーゼ活性を示した。この酵素のエピマー化パターンは、マンヌロン酸が連続する領域に対して、1つ置きにグルロン酸へとエピマー化し、最終産物として約50%のグルロン酸含量からなるアルギン酸を生じることが分かった。さらに、マコンブ胞子体のトランスクリプトーム解析の結果、同酵素には少なくとも13個のアイソフォームが発現している可能性が明らかになった。現在までに褐藻類中にアルギン酸を分解する酵素の存在は示唆されていないが、トランスクリプトームデータより3つのアルギン酸分解酵素様タンパク質の存在が示唆された。これらの候補タンパク質については、各cDNAのクローニングを行い、それらのうち1つについては組換えタンパク質を発現し、実際にアルギン酸分解能をもつことを確認した。カロテノイド合成関連酵素については、一般的にこれらは膜タンパク質であるため、試験管内での反応は困難と考えられた。そのため、マコンブのカロテノイド合成酵素探索のためのプラットフォームとして用いるために、フラボバクテリウム属UMI-01株から4つの酵素遺伝子をクローニングし、これらを大腸菌に導入することでβ-カロテン合成能をもつ組換え大腸菌を作出した。真核生物では初めて活性をもつマンヌロン酸C5-エピメラーゼの発現方法を確立することに成功し、機能を解析することに成功した。本発現方法は、同酵素の他のアイソフォームの発現生産にも有効と考えられ、褐藻類が多様な配列をもつアルギン酸を合成する機構を酵素分子レベルで明らかにするための基盤技術となると考えている。シオミドロなど他の褐藻類のゲノム情報が蓄積しつつあるが、未だに褐藻類ではアルギン酸分解酵素の存在は確認されていない。しかしながら本研究では、3つのアルギン酸分解酵素候補遺伝子に着目し、少なくともそれらのうち1つのものについては分解活性をもつことが分かった。今後、詳細に本酵素の機能解析を進めることで、褐藻類のアルギン酸分解機構を明らかにすることが可能となった。カロテノイド合成関連酵素については、カロテノイドが水に不溶性であることや酵素が膜タンパク質と考えられることから、その活性評価が困難と予測されたが、β-カロテン合成能をもつ大腸菌を作成することでこの問題を克服することが可能となった。褐藻類の多糖類代謝関連酵素について、昨年度に見出したマコンブのアルギン酸の分解と生合成に関わる各酵素について昆虫細胞分泌発現系の構築を進めた。アルギン酸分解酵素(SjAly)については、組換えタンパク質の分泌発現に成功し、1 Lの培養液から1.5 mgの収率で精製することができた。SjAlyはアルギン酸を脱離反応によって分解するアルギン酸リアーゼであり、アルギン酸のマンヌロン酸連続領域を分解し、その最小分解物は不飽和単糖であった。

また、SjAlyに対する抗体を作成し、マコンブの各部位におけるSjAlyの発現を調べた結果、葉状部で良く発現していたが、仮根部では発現が認められなかった。また、褐藻類がアルギン酸を構成するマンヌロン酸とグルロン酸の配列を制御する酵素のマンヌロン酸C5-エピメラーゼについて2つの候補遺伝子を前年度にクローニングした。本年度はそれらのタンパク質(SjC5-Aおよび同-B)に着目し、分泌発現系の構築を試みた。しかしながら、いずれのタンパク質も培地中への分泌は確認されず、発現したタンパク質は細胞内に留まっていることが確認された。これらのうち、発現量が高かったSjC5-Bについて細胞を回収、破砕し、組換えタンパク質の精製を行った。大部分が不溶性画分として得られたが、可溶性画分に含まれたタンパク質のエピメラーゼ活性を調べたところ、有意な活性を検出することはできなかった。カロテノイド生合成関連酵素については、ワカメのリコペンβ-シクラーゼについてタンパク質レベルで同定することができた。すなわち、前年度に構築したリコペン生合成能をもつ大腸菌をプラットフォームとして、候補タンパク質(UpLbCyc)遺伝子を導入し、培養後のカロテノイド成分を調べた結果、リコペンがUpLbCycによりβ-カロテンへと変換されたことが分かった。自然界における主要なアルギン酸生産者である褐藻類自身が、アルギン酸分解活性を示す酵素をもつことを初めてタンパク質レベルで実証することができた。これまでにいくつかの褐藻類で大規模な遺伝子解析が進められてきたがアルギン酸分解酵素候補タンパク質の存在は予測されておらず、褐藻類がアルギン酸を分解する能力をもつのかについては不明なままであった。本研究は、この疑問を解決したものであり、褐藻類はアルギン酸を生合成するだけでなく、自ら分解する能力をもつことを示した初めての成果である。アルギン酸修飾酵素であるマンヌロン酸C5-エピメラーゼについては、各候補遺伝子のクローニングは順調に進んだものの組換えタンパク質を可溶性画分に得ることができず、活性をもつ酵素を生産することができなかった。発現条件やシグナルペプチドと成熟タンパク質のジャンクション配列などの検討を進めたが、この問題を解決するには至らなかった。また、褐藻類では初めてタンパク質レベルでカロテノイド生合成に関わる酵素のひとつであるリコペンβ-シクラーゼの同定に成功した。一方、細菌由来の同酵素に比べて大腸菌細胞内でのUpLbCycの活性は低く反応生成物であるβ-カロテンの検出が困難であったため、培養条件や組換えタンパク質発現法などの検討に時間を要した。そのため、β-カロテン以降のカロテノイド合成を触媒する酵素の研究については、当初の予定と比べてやや遅れている状況にあるが、褐藻類のUpLbCycで確立した最適条件を他の褐藻類の酵素についても適用することで、β-カロテンを基質する酵素の同定を進めることが可能と考えられる。褐藻のカロテノイド生合成酵素については、リコペンをβ-カロテンへと変換するワカメのリコペンβ-シクラーゼを褐藻では初めて同定した。リコペン生合成能をもつ組換え大腸菌に本酵素の遺伝子を組み込み、蓄積したカロテノイドをHPLCおよびAPCI-MS法により調べ、反応産物がβ-カロテンであることを明らかにした。
メゾスコピックジョセフソン接合超格子における量子トンネル現象の研究

本研究は,層状酸化物高温超伝導体(Bi_<1-x>Pb_x)_2Sr_2CaCu_2O_y(BPSCCO)(x=0,0.15,0.2)単結晶に内在する固有ジョセフソントンネル接合超格子の量子トンネル現象を明らかにするとともに,同超格子を用いた新機能デバイスを創出することを目的として実施した.以下に得られた成果をまとめる.1.電子ビームリソグラフィを用いた微小固有ジョセブソン接合素子作製技術を開発した.これにより,数ミクロンサイズからサブミクロンサイズまでの素子を精度良く作製できるようになり,再現性のある電流-電圧特性の観察が可能となった.2.接合面積の微小化に伴い,サブミクロン領域においては固有ジョセブソン接合特性に対するクーロンブロッケード効果の影響が見られた.また,臨界電流の温度依存性が接合面積に依存した系統的は,熱ゆらぎの影響によりジョセフソン効果が抑圧されることに起因していることを明らかにした.3.固有ジョセフソン接合で観測される超伝導エネルギーギャップの温度依存性は,d波オーダーパラメータを基本とする電子間引力を導入することにより良く説明できることがわかった.4.超伝導状態から電圧状態昏のスィッチング機構は,基本的には熱活性過程であるが,低温になるほど多数接合のスイッチングモードに依存したスイッチング確率が生ずることがわかった.5.固有ジョセフソン接合におけるボルテックスダイナミックスに対する熱ゆらぎの影響をシミュレーションにより検討した結果,有限温度においてバイアス電流が低い場合,ランダムな熱活性ボルテックスフローが生じ,多数接合の同期現象が観測されないことがわかった.6.固有ジョセフソン接合を痢いた量子干渉素子を作製し,その動作特性を評価した.その結果,対称性の良い明瞭な量子午渉現象の観測に成功した.7.Fe(あるいはCo)/BSCCO固有ジョセフソン接合からなるハイブリッド素子を作製し,固有ジョセフソン接合特性に対するズピン注入の影響について評価した.その結果,スピン偏極電子の注入効果による臨界電流の減少が確認され,同素子のスピン注入デバイス応用への足掛かりを得ることができた.本研究は,層状酸化物高温超伝導体(Bi_<1-x>Pb_x)_2Sr_2CaCu_2O_y(BPSCCO)(x=0,0.15,0.2)単結晶に内在する固有ジョセフソントンネル接合超格子の量子トンネル現象を明らかにするとともに,同超格子を用いた新機能デバイスを創出することを目的として実施した.以下に得られた成果をまとめる.1.電子ビームリソグラフィを用いた微小固有ジョセブソン接合素子作製技術を開発した.これにより,数ミクロンサイズからサブミクロンサイズまでの素子を精度良く作製できるようになり,再現性のある電流-電圧特性の観察が可能となった.2.接合面積の微小化に伴い,サブミクロン領域においては固有ジョセブソン接合特性に対するクーロンブロッケード効果の影響が見られた.また,臨界電流の温度依存性が接合面積に依存した系統的は,熱ゆらぎの影響によりジョセフソン効果が抑圧されることに起因していることを明らかにした.3.固有ジョセフソン接合で観測される超伝導エネルギーギャップの温度依存性は,d波オーダーパラメータを基本とする電子間引力を導入することにより良く説明できることがわかった.4.超伝導状態から電圧状態昏のスィッチング機構は,基本的には熱活性過程であるが,低温になるほど多数接合のスイッチングモードに依存したスイッチング確率が生ずることがわかった.5.固有ジョセフソン接合におけるボルテックスダイナミックスに対する熱ゆらぎの影響をシミュレーションにより検討した結果,有限温度においてバイアス電流が低い場合,ランダムな熱活性ボルテックスフローが生じ,多数接合の同期現象が観測されないことがわかった.6.固有ジョセフソン接合を痢いた量子干渉素子を作製し,その動作特性を評価した.その結果,対称性の良い明瞭な量子午渉現象の観測に成功した.7.Fe(あるいはCo)/BSCCO固有ジョセフソン接合からなるハイブリッド素子を作製し,固有ジョセフソン接合特性に対するズピン注入の影響について評価した.その結果,スピン偏極電子の注入効果による臨界電流の減少が確認され,同素子のスピン注入デバイス応用への足掛かりを得ることができた.本研究は,層状酸化物高温超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_y(BSCCO)単結晶(転移温度:85K)に内在する固有ジョセフソントンネル接合超格子(超伝導を担うCuO_2層(厚さ0.3nm)とその他の非超伝導層(厚さ1.2nm)が交互に自然積層した構造において,CuO_2超伝導層がその他の層を介してジョセフソン結合することにより形成されたジョセフソン接合超格子)をサブミクロン領域まで微小化することにより,同超格子のメゾスコピック現象に関する新たな機能を創出することを目指すのもであり,本年度は以下の成果を得た.(1)サブミクロン固有ジョセフソン接合の作製並びにその電流-電圧特性の評価BSCCO単結晶を電子ビームリソグラフィによりサブミクロンサイズのメサ型素子(接合面積:0.49μm^2)に加工し,その電流-電圧特性を評価した.その結果,サブミクロン固有ジョセフソン接合の電流-電圧特性はヒステリシスを伴うブランチ構造を示し,概ね接合面積の大きい素子のそれと同様であるが,その臨界電流密度は12桁小さくなることがわかった.これはジョセフソン効果と帯電効果が競合することに起因するものであり,固有ジョセフソン接合におけるメゾスコピック現象の一つとして捉えることができる.(2)サブミクロン固有ジョセフソン接合アレーにおける臨界電流揺らぎの評価

多数の接合が積層した固有ジョセフソン接合アレーにおける零電圧状態から電圧状態へのスイッチング電流分布を評価した.観測されたスイッチング電流分布を熱活性モデル理論により解析したところ,接合面積が大きい場合は,等価温度は2000Kとバス温度(4.2K)に比し極めて大きいのに対し,サブミクロン試料のそれは18Kとバス温度(4.2K)に近く,サブミクロン固有ジョセフソン接合アレーにおけるスイッチング電流は熱ゆらぎにより,決定されていることがわかった.本研究は,層状酸化物高温超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_y(BSCCO)単結晶に内在する固有ジョセフソントンネル接合超格子をサブミクロン領域まで微小化することにより,同超格子のメゾスコピック現象に関する新たな機能を創出することを目指すのもであり,本年度は以下の成果を得た.1.サブミクロン固有ジョセフソン接合の作製並びにその電流-電圧特性の評価昨年度に引き続きBSCCO単結晶を電子ビームリソグラフィによりサブミクロンサイズのメサ型素子(接合面積:0.49μm^2)に加工し,その電流-電圧特性を評価した.また,臨界電流ゆらぎを評価したところ,サブミクロン試料の電圧超体へのスイッチング電流は熱ゆらぎにより決定されていることがわかった.2.固有ジョセフソン接合を用いた量子干渉素子の作製固有ジョセフソン接合を用いた量子干渉素子の作製に成功し,臨界電流の磁場依存性を評価した.その結果,臨界電流は,磁束量子の周期で変化し,明瞭な量子干渉現象を観測することができた.3.固有ジョセフソン接合におけるボルテックスダイナミックスの解明固有ジョセフソン接合に磁場を印加し,ボルテックスフロー現象を評価した.その結果,通常電流-電圧特性において現れるボルテックスフローブランチに加え,多数のサブブランチ構造の観測に成功した.また,観測されたサブブランチ構造は,フローモードの変化に起因することを明らかにした.4.固有ジョセフソン接合特性の理論的解明固有ジョセフソン接合で観測される超伝導ギャップ,並びにその温度依存性について理論的に考察した.その結果,超伝導ギャップはd波オーダーパラメータを基本とする電子間引力を導入することにより実験結果を良く説明できることがわかった.5.磁性体/超伝導体ハイブリッド素子の試作超伝導体へのスピン注入効果を検討することを目的として,Fe/BSCCO固有ジョセフソン接合を試作した.本研究は,層状酸化物高温超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_y(BSCCO)単結晶に内在する固有ジョセフソントンネル接合超格子のメゾスコピック現象に関する新たな機能を創出することを目指すのもであり,本年度は以下の成果を得た.1.固有ジョセフソン接合における発熱効果の評価昨年度に引き続きBSCCO単結晶を電子ビームリソグラフィにより数ミクロンからサブミクロンサイズのメサ型素子(接合面積:160.49μm^2)に加工し,その電流-電圧特性を評価した.接合面積が大きい試料では発熱効果により電流-電圧特性上に負性抵抗が現れ,4.2Kにおいても発熱により試料の等価温度が約60K程度上昇することがわかった.
酸化鉛を含まないビスマス系低融点ガラスの実用化

酸化ビスマス系低融点ガラスにおけるガラス化範囲、熱的性質および耐水性評価を行い、以下のことを明らかにすることが出来た。(1)ガラス化範囲Bi_2O_3-B_2O_3系を基礎組成としたガラスを検討する場合は、アルカリ金属酸化物ではLi_2O、アルカリ土類金属酸化物ではBaO、中間酸化物ではZnO成分の添加が、ガラス化範囲を広げる効果があることが分かった。また、前述した成分ほどガラス化範囲を広げる効果はないが、中間酸化物であるAl_2O_3、TiO_2やZrO_2を添加してもガラス化することが分かった。(2)ガラス転移温度本研究で検討したBi_2O_3-B_2O_3系に第3成分を添加したガラスのガラス転移温度は、約270547°Cであり、電子部品等に応用されている低融点ガラスのガラス転移温度は、300400°C程度であることから、電子部品用低融点ガラスとして十分応用可能であることが分かった。また、Al_2O_3やTiO_2成分は、その含有量によってガラス転移温度がほとんど変化しないことから、これらの成分を添加することにより、ガラス転移温度を高くすることなく化学的耐久性の高いガラスを作ることが可能であることを見出した。(3)耐水性Bi_2O_3-B_2O_3系に第3成分として中間酸化物を添加することにより、耐水性を上げる効果があることが分かった。中間酸化物の中でもZnO、TiO_2やZrO_2成分が特に効果があり、その効果は、50SiO_2-50PbOガラスと同等であることが分かった。その結果、これらの成分を添加したBi_2O_3系ガラスは、実用化可能な耐水性を持った電子部品用低融点ガラスとして応用可能であることを見出した。1.ガラス化範囲および熱的性質Bi_2O_3-B_2O_3-R'O(R=Ca, Sr, Ba)系、Bi_2O_3-B_2O_3-ZnO系、Bi_2O_3-B_2O_3-Al_2O_3系のガラス化範囲および熱的性質を調べた。ガラス化範囲は、Bi_2O_3-B_2O_3-ZnO系が最も広く、次にBi_2O_3-B_2O_3-BaO系であった。これらのガラス転移温度(Tg)は、第3成分がR'O, ZnOのときは、第3成分の増加に伴いガラス転移温度が低くなる傾向が見られたが、Al_2O_3の場合は、Al_2O_3が増加してもガラス転移温度の変化はほとんど見られなかった。どの組成においても、{Bi_2O_3+第3成分(R'O, ZnO, Al_2O_3)}=30mo1%となるとき、Tgが最も高くなることがわかった。これは、ガラス中のB^<3+>イオンの3配位から4配位への配位数変化によるものと考えられBi_2O_3系ガラスにおいてもホウ酸異常が見られることがわかった。2.密度測定Bi_2O_3-B_2O_3-Li_2O系、Bi_2O_3-B_2O_3-ZnO系およびBi_2O_3-B_2O_3-Al_2O_3系の密度測定を行った。いずれのガラスにおいても、Bi_2O_3含有量が増加するに伴い密度は本きくなった。ガラス中の各イオンを剛体球として各ガラスの充填率を求めた。

その結果、いずれのガラスにおいても、{Bi_2O_3+第3成分(Li_2O, ZnO, Al_2O_3)}=30mo1%の関係を満足するとき、充填率が最大となった。これは、Tgの場合と同様柄市中のB^<3+>イオンの配位数変化によるものであると考えられる。3.化学的耐久性1.実用化試験評価60Bi_2O_3-30B_2O_3-1OX(X=Li_2O,Na_20,CaO,SrO,BaO,ZnO,Al_2O_3,TiO_2,ZrO_2)系ガラスの耐水性評価を行った。その結果、耐水性は、TiO_2=ZrO_2>ZnO>Al_2O_3>Li_2O>CaO>SrO>Na_2O>BaOの順に高くなることが分かった。酸化ビスマス系ガラスにおいても、ケイ酸塩ガラスと同様に中間酸化物を添加することは、耐水性に対し効果があることが分かった。また、中間酸化物の中でもAl_2O_3を含んだガラスが最も耐水性が悪いことが分かった。この原因については、まだ、よく分かっていない。2.基礎研究(1)ガラス化範囲および熱的性質Bi_2O3-B_2O3-TiO_2系およびBi_2O_3-B_2O_3-ZrO2系のガラス化範囲および熱的性質を調べた。ガラス化範囲は、Bi_2O_3-Bi_2O_3-ZrO_2系に比べBi_2O_3-Bi_2O_3-TiO_2系の方がかなり広いことが分かった。これらガラスのガラス転移温度(Tg)は、約350450°Cであり、含有量が同じ場合、ZrO_2とTiO_2では差がなくほとんど同じであった。(2)熱膨張係数3.界面反応機構解明耐水試験後における60Bi_2O_3-30B_2O_3-10Na_2Oガラスの表面をEPMAを用いて分析した。その結果、ガラス表面にBi_2O_3が多い結晶が析出していることが観察された。また、粉末X線回折法による耐水試験後の反応生成物分析結果でも、Bi_2O_3結晶によるパターンが測定された。以上の結果より、酸化ビスマス系ガラスと水との反応では、水に不溶なが反応生成物としてガラス表面に析出することが分かった。1.実用化試験評価我々は、これまでに60Bi_2O_3-3OB_2O_3-10X(X=Li_2O,Na_2O,CaO,SrO,BaO,ZnO,Al_2O_3,TiO_2,ZrO2)系ガラスの耐水性評価を行ってきた。これらのデータを整理したところ、Bi_2O_3-B_2O_3-X系ガラスの耐水性は、第3成分である酸化物の陽イオンが作る電場強度と関係があり、電場強度が強いほど耐水性を向上させる効果があることがわかった。また、60Bi_2O_3-30B_2O_3-10Li_2Oを基礎ガラス組成とし、Bi_2O_3とB_2O_3の含有量を変えたところ、10mol%Bi_2O_3含有量が増加しても耐水性はほとんど変わらないが、B_2O_3が10mol%増加すると耐水性の向上が見られることが分かった。2.基礎研究(1)ガラス化範囲および熱的性質Bi_2O_3-B_2O_3-NiO系のガラス化範囲および熱的性質を調べた。NiO含有量が約30mol%までガラス化することが分かった。このガラスのガラス転移温度(Tg)は、約330530°Cであった。(2)熱膨張係数Bi_2O_3-B_2O_3-R'O(R=Ca,Sr,Ba)系ガラスの熱膨張係数を測定した。その値は、約75135×10^<-7>(1/deg)の範囲であった。Bi_2O_3の増加に伴い、熱膨張係数はケイ酸塩ガラスの場合と同様に直線的に増加化することが分かった。また、R'O成分が増加すると熱膨張係数が大きくなることが分かった。(3)密度測定Bi_2O_3-B_2O_3-NiO系ガラスの密度を測定したところ、Bi_2O_3の増加に伴い密度が増加することが分かった。また、NiOが増加すると密度が増加することも分かった。
動物モデルを用いたストレスによる慢性腰痛発症機序の解明

ラットの腰椎椎間関節切除は、歩行異常を伴う椎間板変性を誘発し、さらに反復寒冷(SART)ストレスの負荷は、腰痛関連歩行異常を増加する。本年度は、ストレスの違いによる反応性を検討した。SARTストレスは椎間関節切除13日後以降、拘束ストレスは椎間関節切除41日後以降より、それぞれストレス負荷による影響(体重増加抑制)が認められたが、ラット椎間関節切除11週間後に検討した結果、拘束ストレスによる更なる歩行異常の誘発は認められなかった。今年度は、ノイロトロピン(NTP)の有用性を検討した。SDラットを使用し、傍脊柱筋を剥離したSham群、SARTストレス負荷したS群、L4-5椎間関節を切除したF群、L4-5椎間関節切除にSARTストレスを負荷したFS群、L4-5椎間関節切除ラットにSARTストレスを負荷すると同時にNTPの100、200又は300 NU/kgを経口投与し、切除の10週後に痛覚過敏(von Frey test)と歩行解析(CatWalk法)、11週後に脊椎を摘出し、L4-5椎間板切片の病理組織(HE、ALB染色)及びTNF-α、NGF、CGRPの発現(免疫染色)を評価した。Sham群と比べ、F群とFS群は線維輪の腹側外側で不規則な組織増生と線維の肥厚と層間の拡大、断裂が認められ、その強度はSham群<S群<F群<FS群の順であった。TNF-α、NGF、CGRP発現は、Sham群とS群は同程程で、Sham群と比べF群とFS群は共に線維輪外側部に増生した細胞で染色強度が有意に増強した。FS群と比較して、NTP-300群の腰痛関連歩行異常及び痛覚過敏は有意に改善した。更に、NPT-100、200又は300群のTNF-α、NGF、CGRP染色強度は有意に減弱し、特にCGRPの明瞭な陽性細胞は認められなかった。拘束ストレス負荷モデルでの組織学的検討が行えていない。痛覚過敏、疼痛関連行動が薬物の組み合わせでどのように変化するかを観察し、さらにストレスの違いが何故疼痛行動に影響するのかを検討する。ラット腰椎椎間関節切除を行い、椎間板組織に直接侵襲を加えない、椎間板変性モデルを作成し、寒冷反復ストレスを加え、経時的に痛覚過敏、疼痛関連行動を定量的に計測した。処置後、7ー8週で、痛覚過敏ならびに腰痛モデルで報告されている歩行異常が、CatWalk法を用いた歩行解析で認められた。視床下部・下垂体・副腎軸の反応性を副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)およびコルチコステロンの分泌パターンをみるとこのモデルでは血中副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)およびコルチコステロンは低値であった。このモデルの腰髄後根神経節のDNA arrayの結果ではInflammatory response, G-protein coupled receptor, α6β4 Integrin signalのパスウェイに特異的な遺伝子が多く含まれていた。GalR1, 5-HT7, 5-HT4, GPR44は発現量が減少し、GPR84は増加していた。GalR1や5HT-7の投与はそれぞれ坐骨神経損傷やorofacial painに対し鎮痛効果を示し、5HT-4はノルアドレナリン系の下降性疼痛抑制系を賦活化させる報告がある。本モデルの疼痛発現には炎症とミエリン障害が関与し、GalR1, 5-HT7, 5HT-4の遺伝子発現の低下により、その程度が増幅が寄与している可能性を示した。ストレスの種類の違いによる検討がまだ行えていません。

更に、NPT-100、200又は300群のTNF-α、NGF、CGRP染色強度は有意に減弱し、特にCGRPの明瞭な陽性細胞は認められなかった。拘束ストレス負荷モデルでの組織学的検討が行えていない。拘束ストレスと反復寒冷ストレスとの関係を明確にするとともにストレス解除が疼痛行動にどのように影響するかをこのモデルで検討する。腰椎椎間関節切除による椎間板変性モデルへのストレス負荷が腰椎そのものに影響しないかどうかをX線学的、組織学的に検討する。さらに各種薬物投与で、痛覚過敏、疼痛関連行動がどのように変化するかを観察し、ストレスと椎間板変性の両者に有効な薬物療法の組み合わせを検討する。痛覚過敏、疼痛関連行動が薬物の組み合わせでどのように変化するかを観察し、さらにストレスの違いが何故疼痛行動に影響するのかを検討する。今年度の研究結果はこれまでに採取していたサンプルの解析のため今年度の経費を使用することなく可能でした。拘束ストレスモデルでの椎間板組織検査が行えなかったため次年度使用額が生じました。次年度にはこの検討も含める予定です。
魚類レプチンが持つ有用機能を解明する（国際共同研究強化）

効率的に魚類養殖を推進するには,魚類の摂食・栄養素利用の調節機構に着目した技術開発が有効と考えられる。レプチンはほ乳類において摂食や代謝に重要な役割を果たすことが知られている。効率的な魚類養殖を進める上で,レプチンは魚類においても有望な標的になると考えられるが,その基礎情報は依然として不足している。本課題では,水産養殖分野にて先進的な研究を行うノルウェーとの研究協力体制を強化することも目的の一つとし,また効率的な養殖技術開発へ向けた基盤研究として,ベルゲン大学にてレプチン受容体欠損魚(ゼブラフィッシュ)を作出しその表現型を解析した。昨年度までにノルウェー・ベルゲン大学での長期在外研究によってレプチン受容体欠損ゼブラフィッシュを作出し,その変異検出系を確立している。今年度は作出したレプチン受容体欠損魚の栄養応答を明らかにするため,再度ベルゲン大学に短期滞在し,遺伝子欠損魚稚魚への栄養素(タンパク質:ラクトアルブミン加水分解物)投与実験を実施した(チューブ・フィーディング法)。その結果,レプチン受容体欠損ゼブラフィッシュにおける腸管でのペプチド輸送体(pept1aおよびb)や栄養素受容体(casr,t1r1, t1r2-2およびt1r3)の遺伝子発現はタンパク質の投与によって野生型と比較して増大した。これまでにゼブラフィッシュではレプチン受容体の欠損体の成長に関する表現型について異なる結果が報告されているものの(高成長表現型の有無),栄養素(タンパク質)の認知・吸収が効率的に行われていることが示唆された。また上記成果に加えて,本国際共同研究をきっかけとして,ノルウェーでの共同研究プロジェクトの獲得やさらなる人的交流も推進しており,継続的な研究協力体制も構築された。内定年度:2015平成29年度からの渡航・現地での研究実施に向け,受入研究者らと入念な協議を行い,研究計画に沿った動物実験計画書を作成し,現地の審査機関へ提出した。また,研究遂行に必要なプライマーについても現時点で可能な限り設計を済ませており,着実・スムーズに研究着手が行える状況を整えた。作成・提出した動物実験計画書も現地審査機関によって受理されており,平成29年度からの渡航・研究着手がスムーズに行えるように状況を整えた。レプチンは食欲調節と栄養素の利用効率に重大な役割を果たす内分泌因子として知られている。しかし,魚類ではレプチンがどのようなメカニズムで栄養代謝を調節するのか等は不明である。そこで基課題では,効率的な養殖技術開発へ向けた基盤研究として,メダカをモデルに魚類レプチンの機能解析を行っている。本課題は基課題を発展させるものとして,メダカとの比較研究に適したゼブラフィッシュにおけるレプチンの機能解析を主な目的としている。H28年度は,ノルウェーでの研究準備として,動物実験計画書を作成し現地での実験承認を得た。H29年度は研究準備が整ったことから,ノルウェーへ渡航しベルゲン大学での在外研究を開始した。本在外研究では,まず魚類全体のレプチン機能を明らかにするための研究ツールとして,CRISPR/Cas9システムを用いてレプチン受容体が欠損したゼブラフィッシュの作出を試みた。データベースより入手した配列を基に3種のsgRNAを作製し,Cas9 mRNAと共に1細胞期の受精卵へ顕微注入することで変異導入を試みた。HRM(High Resolution Melting)法によって変異導入の効率を確認し,最も効率よく変異が導入されたsgRNAを用いてF0変異導入個体を作出した(変異導入効率:97%)。ここで作出した変異導入個体はモザイク様に複数の変異を持つことから,野生型と掛け合わせたF1の標的ゲノム配列を読むことで,機能欠損が予想される単一の変異をヘテロに有する個体を単離した(変異の生殖細胞系伝達率:91 %)。さらに単離したヘテロ変異個体同士を掛け合わせることで変異遺伝子をホモに持つ個体を作出した。本研究によって作出した変異体は,16塩基挿入によるフレームシフト変異によってリガンド結合領域以後が翻訳されないものであり,完全な機能欠損が引き起こされると考えられる。これまでにレプチン受容体が欠損したゼブラフィッシュを作出し重要な実験材料を得ており,研究は順調に進展している。

その結果,レプチン受容体欠損ゼブラフィッシュにおける腸管でのペプチド輸送体(pept1aおよびb)や栄養素受容体(casr,t1r1, t1r2-2およびt1r3)の遺伝子発現はタンパク質の投与によって野生型と比較して増大した。これまでにゼブラフィッシュではレプチン受容体の欠損体の成長に関する表現型について異なる結果が報告されているものの(高成長表現型の有無),栄養素(タンパク質)の認知・吸収が効率的に行われていることが示唆された。また上記成果に加えて,本国際共同研究をきっかけとして,ノルウェーでの共同研究プロジェクトの獲得やさらなる人的交流も推進しており,継続的な研究協力体制も構築された。ゼブラフィッシュを用いてレプチン受容体欠損魚を作成し,その表現型を解析する。今年度はベルゲン大学への3週間程度の滞在を計画しており,作出した変異体における栄養素利用や代謝調節に関する表現型を解析する予定である。詳細な日程や試験設定については,受入先研究者と協議の上決定する。