hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フレ-ムレス原子吸光におけるモル感度の周期性と原子化機構に関する基礎的研究

この理由はタングステン炉はボ-ト型でオ-プン炉であり、原子化時に拡散して、生成した原子が逃げやすいこと、および多孔性でないため試料の保持能力が弱いことがあげられる。このことからも黒鉛炉の多孔性は意外にもその高感度に貢献していると考えられる。2.メタル炉ではなく、黒鉛チュ-ブにタンタルおよびタングステンをコ-ティングした炉について検討した。タンタルコ-ティング炉ではGeとAsに対して約24倍の感度向上がみられるが、他の元素に対しては効果がない。GeとAsの原子化律速段階は酸化物の解離であり、非コ-ティング炉と同じである。感度向上は炉面がスポンジ状になり、生成原子の保持力向上のためと考えられる。一方タングステンコ-ティングは単にNa_2WO_4溶液を原子化サイクルで焼き付けるだけで充分効果があることを見い出した。この炉はSn、Ta、Siの感度を高め、とくにSnではダブルピ-クの生成を完全に押え、Siでは有機ケイ素に有効であることを見い出した。フレ-ムレス原子吸光においては目的元素と炭素との反応性,多孔質な炉壁への試料溶液の浸透や生成原子の拡散が原子化機構に大きく関与している。本課題の研究では炉材中に試料溶液や生成原子が浸透しないメタル炉やメタルコ-ディング炉の感度の周期性および原子化機構を速度論的に考察し,黒鉛炉と比較しながら,原子吸光の絶体定量法へのアプロ-チを目標とすると共に,メタルコ-ティング炉の環境試料及び生体試料への応用を試みた。得られた結果は次の通りである。1.黒鉛炉にタングステンをコ-ティング(Wー)した炉について感度を比較した。Wーコ-ティングは従来浸漬法が用いられていたが,当研究では単にNa_2WO_4水溶液を100μl炉に注入し,原子化サイクルで焼き付けるだけで充分増感効果があることを見い出した。この炉はSn,Ta,Siに有効で,とくにSnに対しては有機溶媒マトリックスで生じるダブルピ-クの発生を完全に押え,Siに対しては有機ケイ素に有効であった。2.単純なマトリックスからなる標準溶液中のSnに対しては,パイログラファィト炉(PG)にWーコ-ティングしたWーPGがPG炉に比べて5.8倍の増感を示して最良であるのに対して,スズの生体試料に対しては非パイログラファイト炉(NPG)にコ-ティングしたWーNPGが最良で,複雑なマトリックスに対して有効であった。これはNPGの表面の多孔性により保持性がよく,充分灰化が出来るためと考えられる。3.海水中のスズについては前処理なしでは定量が不可能であったが,WーNPG炉とマトリックス修飾剤としてPd(II)を用いると,灰化温度1700°Cで1%吸収感度が0.028ngで定量が可能となった。4.Wーコ-ティング炉を用いれば液状以外の有機ケイ素と無機ケイ素の高感度定量が可能となった。いずれの場合にもSiO_<2(S)>→SiO_<(S)>→SiO_<(g)>→Si_<(g)>の原子化機構を取ることを明らかにした。
非化学量論的鉄ラーベス相金属間化合物の磁性

まず、すでに作成してあるNb_<1-y>Fe_<2+y>(y=0.002、0、-0.002、-0.004、-0.006、-0.008)について、T_N10Kの反強磁性と考えられるy=0と常磁性であるy=-0.008の試料について、Nb核の核磁気緩和T_1の測定を行なった。その結果、y=0の試料では、30K以下の低温では緩和の回復カーブが単一の指数関数では表せず、T_1が分布することが分った。y=-0.008の試料についても低温ですこしT_1が分布する。前者については、内部磁場が広い分布を持っていることと関係しているとを考えられる。T_1の分布はネール温度付近でのスピンのゆらぎを調べるのにたいへん不都合であり、NbFe_2の反強磁性の詳細な研究のためにはまず、内部磁場、T_1の分布のない、あるいは、小さい試料を用意する必要がある。そこで、上の測定に使った試料(1000°Cで1週間焼鈍)をさらに3週間焼鈍した。しかし、そのNMRスペクトルは、やはり内部磁場の広い分布を示していた。より高純度の原料を使って再度、いくつか試料を作ったが、結果は同様であった。これらの結果はNbFe_2の反強磁性が組成比に対しても、磁場に対してもたいへん敏感であるために、普通は無視できるようなわずかな組成比のずれ、ひずみなどが大きく影響するためと考えられる。そしてこれは、この反強磁性が非常に弱く、不安定な状態にあるためと考えられる。そこで、角度を変え、NbFe_2中の元素の一部を他の元素で置き換えて、反強磁性を安定化させることを試みた。Feを少量のCr、Co、Ni、Cuで置き換えた試料を作り、磁化測定、NMRスペクトルの測定を行った。その結果、いずれの場合も反強磁性は消えてしまうことが分った。現在、NbをMo、Taで置き換えた系についても研究している。
剖検脳における免疫組織化学的及び分子生物学的解析による覚醒剤中毒の診断

また、覚醒剤中毒死群では、ミクログリアは側坐核、被殻及び尾状核において、コントロール群より約2倍の有意な増加を認めたが、形態学的変化をほとんど認めなかった。アストロサイトは、覚醒剤中毒死群において増加傾向であったが、コントロール群との有意差を認めず、反応性アストロサイをほとんど認めなかった。覚醒剤中毒死例の線条体における、神経栄養因子であるbrain-derived neurotrophic factorを免疫組織化学的に観察した。その結果、コントロール群では細胞体に加え線維にも免疫活性が認められたが、覚醒剤中毒死例では、免疫活性は線維においてほとんど消失し、細胞体に強い陽性像が認められた。覚醒剤中毒死例の線条体におけるミトコンドリアDNA (mtDNA)欠失について検討しているが、いくつかのプローブの組み合わせによるPCRにより、ミトコンドリアDNA欠失を検出する方法を確立しつつある。この実験系では、覚醒剤中毒死例におけるmtDNA欠失を示す所見が得られたが、さらにreal-time PCRによりコントロール群との詳細な比較・検討を行っているところである。1.覚醒剤使用者の線条体におけるドパミン作動性神経終末マーカーの変化とcaspase-3活性化について11例の覚醒剤中毒死例と11例のコントロール例について、線条体(側坐核、被殻、尾状核)におけるドパミン作動性神経終末マーカーであるtyrosine hydroxylase (TH)、dopaminetransporter (DAT)、vesicular monoamine transporter-2 (VMAT2)の変化とcaspase-3の活性化を免疫組織学化学的染色により、統計的に比較検討した。覚醒剤中毒死群では、THが側坐核において53%、DATが側坐核と被殻において、それぞれ60%及び59%の減少していた。覚醒剤中毒死群では、VMAT2の統計的に有意な減少は認めなかったが、2例については、TH及びDATの著明な減少と共に、90%以上のVMAT2の減少が認められた。これは、致死的な覚醒剤の服用から24時間以上生存を示唆するかもしれない。覚醒剤中毒死群におけるCaspase-3活性化は明らかではなかった。免疫組織学的染色によるドパミン作動性神経終末マーカーを評価することは、覚醒剤中毒事例、特に中毒学的分析による評価が困難な場合の診断に有用であろうと考える>2.覚醒剤使用者の線条体におけるドパミン作動性神経終末マーカーの変化とグリア細胞の反応12例の覚醒剤中毒死例と13例のコントロール例について、線条体)におけるTH、DAT及びVMAT2の変化とアストロサイト及びミクログリアの増殖及ぶ反応性の形態学的変化について免疫組織学的に検討した。覚醒剤中毒死群では、ミクログリアは側坐核、被殻及び尾状核において、コントロール群より約2倍の有意な増加を認めたが、形態学的変化を伴わなかった。アストロサイトは、覚醒剤中毒死群において増加傾向であったが、有意差を認めず、形態学的変化を伴わなかった。これらの変化は、TH、DAT及びVMAT2の減少とは明らかな関係は認められなかった。12例の覚醒剤中毒死例と13例のコントロール例について、線条体におけるダリア細胞であるアストロサイト及びミクロダリアの増殖及び反応性の形態学的変化について免疫組織学的に検討した。アストロサイトのマーカーには、glial fibrillary acidic protein (GFAP)及びvimentinを用い、ミクロダリアのマーカーには、human glucose transporter5(hGLUT5)及びCR3.43を用いて観察した。その結果、覚醒剤中毒死群では、hGLUT陽性ミクロダリアは側坐核、被殻及び尾状核において、コントロール群より約2倍の有意な増加を認めたが、CR3.43陽性で形態学的変化を示す細胞を認めなかった。アストロサイトは、覚醒剤中毒死群において増加傾向であったが、コントロール群との有意差を認めず、vimentin陽性細胞(反応性アストロサイト)をほとんど認めなかった。覚醒剤中毒死例の線条体における、神経栄養因子であるbrain-derived neurotrophic factor (BDNF)を免疫組織化学的に観察した。これは、BDNFが線条体の神経細胞において、覚醒剤による障害に対する防御的な役割を果たしている可能性が考えられる。さらに、覚醒剤中毒死例の線条体におけるミトコンドリアDNA (mtDNA)

欠失について検討しているが、いくつかのプローブの組み合わせによるPCRにより、ミトコンドリアDNA欠失を検出する方法を確立しつつある。この実験系では、覚醒剤中毒死例におけるmtDNA欠失を示す所見が得られたが、さらにreal-time PCRによりコントロール群との詳細な比較・検討を行っているところである。
内側視索前野-腹側被蓋野神経回路のシナプス特性と養育行動表出機構の解明

これまでに内側視索前野から腹側被蓋野および中脳中心灰白質への入力を活性化することで交尾未経験オスマウスの仔マウスに対する攻撃行動が阻害されることを示している。本年度は内側視索前野からの投射先領域における神経活動を評価するためにc-Fosタンパク質の免疫染色を試みたが、定量解析レベルの染色像を得ることができなかった。また内側視索前野から投射する細胞に対する選択性の有無について検討を加えた。vGAT-IRES-Creマウスの内側視索前野に光感受性イオンチャネル・チャネルロドプシン(および蛍光タンパク質)、中脳中心灰白質へ蛍光タンパク質をCre依存的に発現させた。待機期間後に脳スライスを作成し、蛍光タンパク質を発現する細胞体からパッチクランプ法による記録を行った。青色光照射を行うことで、内側視索前野由来のシナプス末端を興奮させることが可能である。その結果、中脳中心灰白質のGABA作動性細胞が内側視索前野からGABA作動性入力を受けていることが示唆された。またこのようなGABA作動性細胞はregular型またはburst型の活動電位発火パターンを示していた。さらに腹側被蓋野の下流神経回路の解析を行った。トレーサー実験結果から、仔マウスに対する攻撃行動に関与する分界条床核菱形核へ腹側被蓋野からチロシン水酸化酵素陽性神経が高密度に投射することが示された。in vivoマイクロダイアリシス法による検討により分界条床核菱形核ではドパミン遊離は確認された一方でノルアドレナリンの遊離はほとんど見られなかった。次に分界条床核菱形核細胞からパッチクランプ記録を行い、ドパミン10μMを付加したところ、sag陰性細胞で特異的に興奮性シナプス伝達効率が低下することがわかった。メカニズムを調べたところ、シナプス前におけるグルタミン酸放出確率がα2受容体の活性化を介して抑制されている可能性が示された。げっ歯類動物では新生児に対して養育などの利他的行動と喰殺と呼ばれる攻撃行動が認められる。C57BL/6J系雄マウスの場合、離乳期以前では養育行動が認められるが、7週齢以降ではほとんどが攻撃行動を示す(Amano, 2017)。内側視索前野は養育行動に対して中心的な役割を果たしていることが報告されてきた。これまでに内側視索前野の活性化を促す人為的処置を雄マウスに加えた時には、攻撃行動が停止すること、および養育行動が一部で出現することを見出されてきた。しかし内側視索前野は養育行動以外にも様々な種類の行動に関与することが知られており、さらにトレーサー実験から投射先は多様であることも見出されている。その中でもMichael Numanらのグループは内側視索前野の下流にある腹側被蓋野、およびさらに下流の側坐核が養育行動に対して重要である可能性を報告している(Numan, 2006)。そこで本研究では雄マウス内側視索前野から腹側被蓋野、側坐核へとつながる神経回路の特性と行動との相関を明らかにすることを目的としている、。我々は去勢マウスの側坐核においてin vivoマイクロダイアリシス法による経時的なドパミン遊離レベルの測定を行った。仔マウスを提示し、巣への連れ戻し行動を示したマウスにおいてドパミン遊離レベルの変化は認められなかった。次にアデノ随伴ウイルスを用いて光感受性イオンチャネル・チャネルロドプシンを内側視索前野に発現させ、腹側被蓋野からパッチクランプ法による単一細胞記録を行った。一部の神経細胞で光刺激に依存して起こるGABA作動性シナプス電流が観察された。さらに内側視索前野からの投射繊維を青色光照射によりin vivo行動中に刺激する実験系を立ち上げた。光遺伝学的手法によりin vivo行動試験中に内側視索前野からの投射繊維を特異的に刺激する実験系を確立した。すでに内側視索前野から腹側被蓋野周辺への入力を経路特異的活性操作することによって、一部のマウスが行動変化することを観察している。内側視索前野は養育行動に重要な脳領域であるが、その下流神経回路の機能は不明な点が多い。内側視索前野には様々な細胞種が存在するが、養育行動時に神経活動マーカーc-Fosを発現するGABA作動性神経に焦点を当て、GABA作動性神経にCre遺伝子を発現するvGAT-IRES-Creマウスを用いて検討を行った。まず内側視索前野のGABA作動性神経細胞に蛍光タンパク質を発現させ、投射先である脳領域を観察した。その結果、以前から養育神経回路に重要と考えられていた腹側被蓋野への投射が見られた。しかし、その投射繊維は腹側被蓋野で収束するよりも寧ろ、その先の中脳中心灰白質腹側部の方向へ投射していた。そこで光感受性イオンチャネルであるチャネルロドプシン(ChR2)を内側視索前野細胞のGABA作動性神経に発現させた後に脳スライスを作成した。パッチクランプ法記録下で青色光を照射したところ、抑制性シナプス後電流が腹側被蓋野および中脳中心灰白質腹側部の細胞において観察された。さらにナトリウム・カリウムイオンチャネル阻害薬を用いた検討から、内側視索前野GABA作動性神経細胞から腹側被蓋野および中脳中心灰白質腹側部へ直接的なシナプス入力が存在することが分かった。次に、交尾未経験雄マウスの内側視索前野GABA

作動性神経細胞から腹側被蓋野および中脳中心灰白質腹側部への神経投射を光刺激した時の子マウスへの行動パターンを観察した。行動試験中の青色光刺激は脳内へ挿入した光ファイバーを介して行った。対照群では子マウスへの攻撃行動が多く見られたが、腹側被蓋野および中脳中心灰白質腹側部いずれの経路の入力繊維を刺激した場合も子マウスへの攻撃行動は大幅に抑制された。以上の結果は内側視索前野GABA作動性神経が下流神経回路へ神経伝達を行うことで攻撃行動を抑制する機能を持つことを示している。内側視索前野GABA作動性神経から下流への入力するシナプスについて、研究開始前に計画した腹側被蓋野への投射に加え、実験開始後に明らかになった中脳中心灰白質腹側部への投射についても検討を行った。電気生理学実験によりシナプス入力の機能を確認するとともに、行動試験が順調に推移し、光遺伝学的手法を用いることで内側視索前野から発する神経投射を特異的に活性化させたときの行動変化の観察がほぼ完了した。これまでに内側視索前野から腹側被蓋野および中脳中心灰白質への入力を活性化することで交尾未経験オスマウスの仔マウスに対する攻撃行動が阻害されることを示している。本年度は内側視索前野からの投射先領域における神経活動を評価するためにc-Fosタンパク質の免疫染色を試みたが、定量解析レベルの染色像を得ることができなかった。また内側視索前野から投射する細胞に対する選択性の有無について検討を加えた。vGAT-IRES-Creマウスの内側視索前野に光感受性イオンチャネル・チャネルロドプシン(および蛍光タンパク質)、中脳中心灰白質へ蛍光タンパク質をCre依存的に発現させた。待機期間後に脳スライスを作成し、蛍光タンパク質を発現する細胞体からパッチクランプ法による記録を行った。青色光照射を行うことで、内側視索前野由来のシナプス末端を興奮させることが可能である。その結果、中脳中心灰白質のGABA作動性細胞が内側視索前野からGABA作動性入力を受けていることが示唆された。またこのようなGABA作動性細胞はregular型またはburst型の活動電位発火パターンを示していた。さらに腹側被蓋野の下流神経回路の解析を行った。トレーサー実験結果から、仔マウスに対する攻撃行動に関与する分界条床核菱形核へ腹側被蓋野からチロシン水酸化酵素陽性神経が高密度に投射することが示された。in vivoマイクロダイアリシス法による検討により分界条床核菱形核ではドパミン遊離は確認された一方でノルアドレナリンの遊離はほとんど見られなかった。次に分界条床核菱形核細胞からパッチクランプ記録を行い、ドパミン10μMを付加したところ、sag陰性細胞で特異的に興奮性シナプス伝達効率が低下することがわかった。メカニズムを調べたところ、シナプス前におけるグルタミン酸放出確率がα2受容体の活性化を介して抑制されている可能性が示された。内側視索前野から腹側被蓋野への入力繊維をin vivo行動試験中に刺激し、仔マウスに対する行動様式の観察を引き続き行い、DREADDs法により腹側被蓋野神経細胞の活動を操作した時の行動様式と比較する。
減数分裂期の染色体動態とゲノムアダプテーション

減数分裂では組換えにより、親由来のゲノム情報の混ぜ合せが起こるだけでなく、"新規のゲノム変動"が生じ、それが次世代の表現型に影響を与える“ゲノムアダプテーション"が起きる。本研究ではゲノムアダプテーションとしての減数分裂期相同組換えの分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。本研究によりエピジェネティクなヒストンの修飾と転写伸張因子、染色体の動態には核膜タンパク質の修飾により変化し組換えに重要な役割を果たすこと、組換えに関与する複合体の新規の構造を取ること、などを明らかにした。本研究により配偶子ゲノムの安定化の新しい仕組みが判明し、ヒトの流産の原因に関しての理解が進むことが期待できる。減数分裂期の組換えは、体細胞分裂期の組換えと大きく異なり,交叉型組換え体を生じること,姉妹染色体間より相同染色体間で高頻度起きること,その数と分布が染色体あたりで制御を受けているといった様々な特徴がある。組換えが高頻度で起こるばかりでなく、減数分裂期の組換え反応は染色体構造、染色体配置の劇的な変化を伴う。相同染色体が対合した減数分裂期特異的染色体構造、シナプトネマ複合体,あるいはテロメアが中心体の近傍にクラスタリングしたブーケ構造がその代表である。このような染色体構造、配置の機能についても不明な点が多い。出芽酵母をモデル生物として,減数分裂期のおける染色体構造と組換え反応の関係について解析を行った。体細胞分裂期の細胞周期の制御因子であり、SCF(Skip,Cullin,F-box)E3ユビキチンリガーゼの構成要素の1つCdc53によるユビキチン化がシナプトネマ複合体形成、つまり高次な染色体構造形成を制御することを見出した。ユビキチン化が染色体形成に関わることをさらに検討するため、プロテアソームの温度感受性株の減数分裂期の表現型を解析したところ、シナプトネマ複合体形成ばかりでなく、減数分裂の組換えに関わることも分かった。タンパク質のユビキチン化が細胞周期の進行の制御ばかりでなく、減数分裂期の染色体反応に働くことが明らかにできた。さらに、SCFと一緒に働く因子を探索したところ、減数分裂期特異的舶AAA+ATPaseであるPch2を同定できた。Pch2はSCFユビキチンリガーゼの機能を負に制御することでシナプトネマ複合体形成を制御するという新しい染色体形成制御の概念を提唱した。体細胞分裂期の組換えと大きく異なり,減数分裂期に起きる組換えは、染色体分配に必須機能を有しているため、交叉型組換え体を生じること,姉妹染色体間より相同染色体間で高頻度起きること,その数と分布が染色体あたりで制御を受けていると制御を受けている。このような制御は染色体構造や核構造が大切な役割を果たしている。染色体構造としては、相同染色体が対合した減数分裂期特異的染色体構造、シナプトネマ複合体,核内の染色体配置としてテロメアが中心体の近傍にクラスタリングしたブーケ構造が知られている。このような染色体構造、配置の機能、特に組換えとの関連などについて不明な点が多い。出芽酵母をモデル生物として,減数分裂期のおける染色体構造と組換え反応の制御の仕組を知るために、核膜のタンパク質の動態にについて解析を行った。減数分裂期のテロメアを介した染色体の運動の分子機構を知るために、細胞周期の調節に関わる2つのキナーゼcyclin-dependet kinase, Dbf4-dependent kinaseがテロメア運動に関わる核膜構成因子の1つMps3をリン酸化することで、このタンパク質の核膜への局在を促進することを明らかにした。実際に、リン酸化が出来なくなるMps3の変異株は減数分裂期の染色体運動に欠損を持つ。さらに、Mps3のリン酸化がテロメア結合タンパク質やDbf4-dependent kinaseとの結合に大切であることを示した。本年度はさらにMps3の核膜への局在と運動には染色体構成要素であるコヒーシンが重要であることを明らかにできた。これらの結果から、細胞周期特異的なリン酸化制御と染色体構造により核膜の動的状態を変え、染色体の動きを制御すると言う減数分裂期特異的染色体の運動の新しいモデルを提唱した。減数分裂では組換えにより、親由来のゲノム情報の混ぜ合せが起こるだけでなく、"新規のゲノム変動"が生じ、それが次世代の表現型に影響を与えること(ゲノムアダプテーション)が近年知られつつある。本研究は生殖細胞のゲノムの変動に関して2つの大きな目的をおいた。減数分裂期に生じる"新規のゲノム変化(突然変異)"や“新規エピゲノム情報"を正確に記載し、その分子レベルでの仕組みを酵母(やマウス)の系を用いて解析する。"新規のゲノム変化

"はDNAチップや次世代DNAシークエンサを用いたゲノムワイドの解析を中心に行うことで、ゲノム全体や染色体ごとでのゲノムアダプテーションの俯瞰図を作成する。2つ目の目的はゲノムアダプテーションの原動力となる染色体運動の仕組みを理解することである。酵母で染色体を可視化する系を使い、染色体の動きと核膜の関係を捉え、その分子メカニズムとゲノム変動への影響を解明についての研究を実施している。本年度は減数分裂期のエピジェネテックマーカーであるヒストンH3K4のメチル化は減数分裂期の組換えの開始反応であるDNA2重鎖切断形成に関わることを新たに見出した。特にヒストンH3K4のメチル化に加えて、ヒストンH3K79のメチル化もDNA2重鎖切断形成に関わることを明らかにした。このヒストン修飾が減数分裂の組換えの分布の制御に重要であると考えている。また、減数分裂期では染色体の構造変化や運動が起こることが知られているが、その運動は染色体末端であるテロメアと核膜との結合とそこに形成されるタンパク質複合体が大切な役目を果たす。この過程では核膜に再局在するSUNドメインタンパク質のMps3が鍵を担う分子として知られている。Mps3がリン酸化を受けることで核膜のリモデリングを促進し、それにより染色体の機能に影響を与えることを示した。この結果は核膜の新しい機能を明らかにした点で意義が高い。減数分裂では組換えにより、親由来のゲノム情報の混ぜ合せが起こるだけでなく、"新規のゲノム変動"が生じ、それが次世代の表現型に影響を与えること(ゲノムアダプテーション)が近年知られつつある。本研究は生殖細胞のゲノムの変動に関して2つの大きな目的をおく。減数分裂期に生じる"新規のゲノム変化(突然変異)"や“新規エピゲノム情報"を正確に記載し、その分子レベルでの仕組みを酵母の系を用いて解析する。"新規のゲノム変化"はDNAチップや次世代DNAシークエンサを用いたゲノムワイドの解析を中心に行うことで、ゲノム全体や染色体ごとでのゲノムアダプテーションの俯瞰図を作成する。本年度は減数分裂期のエピジェネテックマーカーであるヒストンH3K4のメチル化とは独立して、減数分裂期の組換えの開始反応であるDNA2重鎖切断形成を制御する因子を新たに見出した。特にヒストンH3K4のメチル化とヒストンH3K79のメチル化に関わる転写伸長因子PAF1C(RNA polymerase II association Factor I complex)複合体がDNA2重鎖切断形成に関わることを明らかにした。転写の伸長と組換えの開始が共役していることを明らかにした点で興味深い。また、減数分裂期では染色体の運動が起こることが知られているが、その運動は染色体末端であるテロメアと核膜との結合とそこに形成されるタンパク質複合体が大切な役目を果たす。Mps3が染色体構成要素であるコヒーシンと結合することで核膜のリモデリングを促進し、それにより染色体の機能に影響を与えることを示した。この結果は核膜の新しい機能制御を明らかにした点で意義が高い。
血管新生病の分子基盤の解明:動物モデルとヒトの病変解析の統合研究

本研究計画では、「生理的・病的血管新生プロセス」というキー・ワードを中心に据え、動物モデルとヒト疾患との融合的解析を試みた。特に生理的・病的血管新生時に、多段階的に下流関連遺伝子群発現が誘導されるというこれまでの成績を、さらに分子種を広げて詳細な検討を加えた。本年度の研究成果として、以下の点が明らかになった。(2)内因性サイトカインシグナル阻害分子Spred-1およびSpred-2のdouble knockoutマウスでは、胎生期13.5日頃より多量の出血を来たして胎生致死となる。これにはVEGF-Cシグナル伝達の過剰亢進と、それによるリンパ管の分化異常が原因である(Mol Cell Biol 2007)。(3)FGF-2依存性血管新生の血流再開作用に内因性胎盤増殖因子(PIGF)発現が必須であり、これはVEGF-Aシグナルを補完的に制御することにより発動されている(Atherosclerosis 2007)。(4)FGF-2過剰発現はVEGF-Cの発現を増強し、リンパ管新生を促進すると共に、誘導されたVEGF-CはPDGF-Bの発現を増強し、新生毛細血管の構築に関与する(投稿中)(5)糖尿病性血管障害をスタチン系薬剤は抑制するが、それにはPDGF-BB/周皮細胞は関与せず、内皮におけるNOS系の活性化が重要である(投稿中)。このように各種病態において血管新生過程における重要な分子メカニズムが明らかになった。(714字)本研究計画では、「生理的・病的血管新生プロセス」というキー・ワードを中心に据え、動物モデルとヒト疾患との融合的解析を試みた。(714字)本研究では我々が専門とする「病理学」的手法、すなわち形態学的解析の特徴をフルに生かし、これまでの知見とコンセプトをヒト病変で裏付け、さらに実験動物へフィードバックするという、融合的研究手法を確立し、生体内における生理的・病的血管新生の本態に迫ることを目的とする。具体的には動脈硬化とがんへ焦点を絞り、特に血管新生因子群および炎症反応の相互連関を中心に解析し、全く新しいコンセプトに基づく治療系構築のための基礎情報を得ることを目指す。本年度の研究成果として、(1)糖尿病マウス重症虚血肢において各種血管新生因子の発現と刺激による発現誘導システムは維持されているが、PDGF-BBの発現のみが低下していること、これはPKCの慢性的活性化に依存している(Circ Res 2006)、(2)FGF-2過剰発現はVEGF-Cの発現を増強し、リンパ管新生を促進すると共に、誘導されたVEGF-CはPDGF-Bの発現を増強し、新生毛細血管の構築に関与する(投稿中)、(4)FGF-2依存性血管新生の血流再開作用にVEGFファミリーであるPIGFが積極的役割を果たしている(投稿中)、(5)PKCetaのSNPsが高血圧の発症に重要であり、剖検症例を利用してその発現が実際に生体内に存在することを裏付けた(Nature Genet 2007,共同研究)ことを証明した。このように各種病態において血管新生とリンパ管新生そして炎症反応は不可分の現象、かつ病勢を決定する重要な生理システムであること、さらにそのプロセスにおいて間葉系細胞が必須かつ多彩な機能を持つことが明らかになった。(786字)本研究計画では,「生理的、病的血管新生プロセス」というキー・ワードを中心に据え,動物モデルとヒト疾患との融合的解析を試みた。特に生理的、病的血管新生時に,多段階的に下流関連遺伝子群発現が誘導されるというこれまでの成績を,さらに分子種を広げて詳細な検討を加えた。本年度の研究成果として,以下の点が明らかになった。(2)内因性サイトカインシグナル阻害分子Spred-1およびSpred-2のdoubleknockoutマウスでは,胎生期13.5日頃より多量の出血を来たして胎生致死となる。これにはVEGF-Cシグナル伝達の過剰亢進と,それによるリンパ管の分化異常が原因である(MolCellBiol2007)。(4)FGF-2過剰発現はVEGF-Cの発現を増強し,リンパ管新生を促進すると共に,誘導されたVEGF-CはPDGF-Bの発現を増強し,新生毛細血管の構築に関与する(投稿中)

(5)糖尿病性血管障害をスタチン系薬剤は抑制するが,それにはPDGF-BB/周皮細胞は関与せず,内皮におけるNOS系の活性化が重要である(投稿中)。このように各種病態において血管新生過程における重要な分子メカニズムが明らかになった。(714字)
ショーペンハウアー哲学における中世キリスト教思想の受容と展開

本研究の課題は、ショーペンハウアーの哲学、特にその救済思想(「意志の否定」論)を中世キリスト教思想の受容と展開という点から明らかにし、従来的な仏教思想寄りの解釈とは異なる新たなショーペンハウアー像を打ち立てることにある。その課題の達成のために本研究は、(1)意志と無底、(2)普遍と特殊、(3)自由意志と恩恵、という問題圏に焦点を当て、キリスト教思想の隠れた地下水脈としてショーペンハウアー哲学を捉える試みを行う。1年目である本年度は、まず上記の(1)を中心に研究を行った。ショーペンハウアーの意志形而上学のうちにドイツの神秘思想家ヤーコプ・ベーメのキリスト教神智学からの多大な影響が認められることを、初期の草稿や主著『意志と表象としての世界』初版のみに見出される「意志の魔術」という思想に基づきながら考察し、ショーペンハウアーがベーメの「世界創造論」から大きな示唆を得ながら自らの哲学的基盤を構築していた可能性があることを明らかにした。またショーペンハウアーの救済思想(「意志の否定」論)との関連では、「意志の否定」の体現者であるキリスト教の聖人たちを描いた「聖人画」が、彼の美学において芸術と宗教を架橋する極めて特異な位置を占めており、普通の芸術よりもさらに一歩進んだ宗教による苦悩からの救済の念を起こさせるものであること、さらに日本におけるショーペンハウアー哲学の受容史という観点から、日本哲学の黎明期にあたる明治・大正期にキリスト教系の一部の人々が、ショーペンハウアーの「意志の否定」を仏教的な「涅槃(ニルヴァーナ)」でなく、キリスト教神秘主義的な「忘我(エクスターゼ)」の文脈で理解していたことなどを明らかにした。なおこれらの研究の遂行にあたって、2018年9月に約3週間ドイツのフランクフルトへ渡航し、現地で資料の収集・調査を行った。当初の年次計画は、上記の(1)についての研究を中心に遂行し、それと並行しながら(2)(3)に関しても考察を進めていくというものであった。ショーペンハウアーの意志形而上学のうちにベーメのキリスト教神智学からの具体的な影響を見出せたことは、(1)の考察において極めて意義のある進展であったと言える。またその研究の過程で、ベーメの『鍵』(Clavis)という未邦訳文献の綿密な読解作業を行い最終的にそれを抄訳のかたちで発表できたこと、さらにショーペンハウアーの「意志の魔術」思想のうちに(2)の個体に関する問題への手掛かりを発見できたことは、今後の研究遂行にとっても貴重な成果であると評価できる。またショーペンハウアーの救済思想に「聖人画」という芸術と宗教との媒介物や、キリスト教神秘主義の「忘我」との接点を見出せたことは、今後(3)の問題を掘り下げて考察していくにあたって大きな基盤になり得ると予想される。以上より、本年度は当初の年次計画通りの研究成果を得られたと評価して差し支えないと思われる。次年度は当初の年次計画に従い、(2)(3)を中心に研究を進めていく。具体的には、(2)に関してショーペンハウアーの「個体化の原理」に着目し、「一者」としての意志(普遍)とその現象である個体(特殊)との問題を検討すること、また(3)に関して本年度の研究によって獲得されたキリスト教の神秘主義や聖人論とショーペンハウアーの「意志の否定」論との関連性をさらに掘り下げて考察し、その救済思想を新たに捉え直すことが目標となる。そのためにも、次年度以降も継続して資料の収集と読解作業に努めると同時に、国内外の学会において積極的に発表の機会を設けることで、研究のより一層の拡充を図っていく予定である。

当初の年次計画は、上記の(1)についての研究を中心に遂行し、それと並行しながら(2)(3)に関しても考察を進めていくというものであった。ショーペンハウアーの意志形而上学のうちにベーメのキリスト教神智学からの具体的な影響を見出せたことは、(1)の考察において極めて意義のある進展であったと言える。またその研究の過程で、ベーメの『鍵』(Clavis)という未邦訳文献の綿密な読解作業を行い最終的にそれを抄訳のかたちで発表できたこと、さらにショーペンハウアーの「意志の魔術」思想のうちに(2)の個体に関する問題への手掛かりを発見できたことは、今後の研究遂行にとっても貴重な成果であると評価できる。またショーペンハウアーの救済思想に「聖人画」という芸術と宗教との媒介物や、キリスト教神秘主義の「忘我」との接点を見出せたことは、今後(3)の問題を掘り下げて考察していくにあたって大きな基盤になり得ると予想される。以上より、本年度は当初の年次計画通りの研究成果を得られたと評価して差し支えないと思われる。次年度は当初の年次計画に従い、(2)(3)を中心に研究を進めていく。具体的には、(2)に関してショーペンハウアーの「個体化の原理」に着目し、「一者」としての意志(普遍)とその現象である個体(特殊)との問題を検討すること、また(3)に関して本年度の研究によって獲得されたキリスト教の神秘主義や聖人論とショーペンハウアーの「意志の否定」論との関連性をさらに掘り下げて考察し、その救済思想を新たに捉え直すことが目標となる。そのためにも、次年度以降も継続して資料の収集と読解作業に努めると同時に、国内外の学会において積極的に発表の機会を設けることで、研究のより一層の拡充を図っていく予定である。
細胞内情報伝達ネットワーク研究のための2光子励起法適用可能な機能探索分子

1)2光子励起イメージングの目的のために、適当なCa感受性色素の探索を行った。超短パルスレーザー光波長を適当にかえて、各種Ca感受性色素の励起波長特性を測定したところ、Oregon Green BAPTA-1を750-760nmで励起すると励起効率が良いことが分かった。この蛍光色素のモデル液を760nmで励起して、Ca濃度に対応する蛍光強度を測定したところ、1光子励起で報告されている解離定数とほぼ等しい値を得た。この色素のEmission spectrumは、1光子励起で得られたものと同等であった。通常、Ratiometric Ca濃度測定に用いられるIndo-1を700nmの超短パルスレーザー光で2光子励起したところ、蛍光は得られたが、Ca濃度の変化に対応するような蛍光強度比の変化は得られなかった。この色素のEmission Spectrumを測定したところ、高Ca濃度のSpectrumは蛍光強度が低く、1光子励起において長波長の励起光を用いたのと同等の効果であった。700nmは現実的に、この超短パルスレーザー装置の短波長限界なので、現時点でのIndo-1使用は不適切であると結論した。そこでRatiometric Ca濃度測定のために、Calcium Green-1とTexas RedのDextran結合物を用いた。Emission spectrumを測定したところ、この色素の蛍光強度比は、Ca濃度上昇に対応して変化した。2)超短パルスレーザー光を試料面に照射して、Caged Ca化合物(DM-nitrophen)を2光子励起により光解除した。この結果起こる局所Ca濃度上昇を、共焦点装置を用いてモニターした。このCaイメージングは、Fluo-3をアルゴンレーザーで通常の1光子励起することによって行った。Fluo-3は2光子励起効率が低いため、このような2光子励起でのCaged Ca化合物解除実験でCa濃度変化を(1光子励起法で)モニターする目的に適した色素であった。Patch clamp法を用いて、カエル交感神経節細胞にも、DM-nitrophenとFluo-3を注入した。モデル液の実験と同様に局所でのCa濃度上昇が観察された。1) 2光子励起イメージングの目的のために、適当なCa感受性色素の探索を行った。
水銀耐性細菌を指標にする「細菌の分散と環境による選択」の検証

細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,3年目となる本年度は以下の項目について研究を進めた.2年目までの研究成果にて,研究協力者のSilver教授が持つ世界の土壌サンプルを対象に,水銀耐性細菌Bacillus megaterium MB1が持つ水銀還元酵素遺伝子(merA)と有機水銀分解酵素遺伝子(merB1)の分布をPCR法にて検証し,"everything is everywhere"仮説が成り立っていることを示した.しかし多くの土壌サンプルに含まれる水銀耐性細菌数は,土壌1g中に1000個以下と少ない事も明らかになった.そこで本年は,土壌中の水銀耐性細菌が,選択的に増加するかどうかについて検証した.塩化水銀を含めた選択培地と水銀を含まない非選択培地を用いて土壌を培養し,土壌中に含まれる細菌数を定量PCR法にて追跡した.いずれの培地においても,検出された総細菌数に差は見られなかった.しかし水銀を含む選択培地では総細菌数とほぼ同数のmerAが検出されたのに対して,非選択培地におけるmerAの数は総細菌数の10%未満の場合が多かった.このように水銀を含む培地においては,水銀耐性細菌が選択的に増加していることが明らかになった.また検出されるmerB1の数は,merAの数とほぼ同数の場合と,merAよりも明らかに低い数になる場合の2パターンが見られた.このことから,細菌が持つ水銀耐性トランスポゾン構造が多様であることを予想してサザンハイブリダイゼーション法を用いた検証を行い,大きさの異なる複数のトランスポゾンが各土壌中に存在することを示した.細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,1年目となる本年度は以下の項目について研究をすすめた.申請者と研究協力者のSilver教授の持つ土壌サンプルを対象に,バチラス属水銀耐性細菌が持つ水銀耐性トランスポゾンの分類と分布調査をおこなった.65株のバチラス属水銀耐性細菌を分離して調べたところ,12株が既知の水銀耐性トランスポゾン(TnMERI1)と類似の,水銀耐性トランスポゾンを保持していた.これらのトランスポゾンはさらに4タイプに区分され,そのうちの2タイプはこれまでに報告例の無いトランスポゾン構造であった.新しく見つかったトランスポゾンの1つであるTn6294は,これまで知られていたTnMERI1の原型(プロトタイプ)であると考えられた.遺伝子配列の比較から,TnMERI1はTn6294に複数の有機水銀分解酵素遺伝子(merB)が組み込まれて構築されたと予想される.またTn6294は,台湾で分離されたBacillus属細菌と,南極土壌より分離されたPaenibacillus属の間で共有されていることも,今回明らかになった.このように,同一の水銀耐性トランスポゾンが地理的に隔離された別種の細菌間で共有されている実例を,いくつか示す事が出来た.今回の発見は,細菌の遺伝子が遺伝子の水平伝播などを介して広く分布していることを示しており,細菌があらゆる場所に分散した結果,遺伝子が水平伝播した事を示唆している.尚,今年度の成果の一部は論文として取りまとめ,FEMS Microbiology Lettersに報告した.細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,1年目の主目的である「細菌はあらゆる場所に分散しているのか?"everything is everywhere"仮説の検証」については,おおむね順調な成果を得られた.本年度は,申請者と研究協力者のSilver教授の持つ土壌サンプルを活用して,13カ国19箇所の土壌バチラス属水銀耐性細菌が持つ水銀耐性トランスポゾンの分類と分布調査を実施できた.Silver教授の研究室を訪問し,共に細菌の分離作業を進められたことが大きい.また細菌の水銀耐性トランスポゾンを調べたところ,2つの新しいタイプのトランスポゾンが見つかったこと.さらに新しく見つかったトランスポゾンの1つであるTn6294が,台湾で分離されたBacillus属細菌と,南極土壌より分離されたPaenibacillus属の間で共有されていることは,今回の幸運であった.この発見より,"everything is everywhere"仮説の一例を示す事が出来,成果の一部は論文として取りまとめることも出来たため,本年度の予定はおおむね達成できたと考えている.細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,2年目となる本年度は以下の項目について研究を進めた.1年目の研究成果を拡大して,申請者と研究協力者のSilver教授の持つ土壌サンプルを対象に,水銀耐性細菌Bacillus megaterium MB1が持つ水銀還元酵素遺伝子(merA)と有機水銀分解酵素遺伝子(merB1)の分布について,PCR法による検証をおこなった.まずはじめにmerAおよびmerB1を特異的に定量評価するための定量PCRプライマーとTaq-Manプローブをいくつか設計し,その特異性と検出感度を比較評価した.結果として,1000遺伝子コピー以上/土壌1gの感度で特異的な定量を可能とする方法を確立した.次に土壌状態の違いが検出感度に及ぼす影響について比較評価し,植栽地などの土壌では遺伝子の検出が阻害される可能性があることを示した.最後に,確立した方法を用いて世界70箇所の土壌サンプルを対象とした定量評価をおこない,merAおよびmerB1を持つ土壌が7地点あることを明らかにした.

この結果は,多くの土壌サンプルに含まれる水銀耐性細菌数は,土壌1g中に1000個以下と少ない事を示している.また本法は検出限界値以上の細菌がいる場合は簡便かつ有効な手法だが,細菌数が少ない場合は培養法の方が有効であることを示す結果にもなった.上記1)の結果を踏まえて,土壌中の水銀耐性細菌が選択的に増加するかどうかを,同じ70箇所の土壌を対象に,選択培地と非選択培地を用いた増殖実験よる検討を開始している.細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,2年目までの主目的である「細菌はあらゆる場所に分散しているのか?"everything is everywhere"仮説の検証」にておおむね順調な成果を得られた.1年目に13カ国19箇所の土壌を用いておこなった研究を,2年目は新しく確立した定量PCR法を用いて,70箇所を対象に検証をすすめた.地理的に離れた数地点より同じ水銀耐性遺伝子が見つかったことより,同じ細菌遺伝子が異なる大陸間に分布していることがわかる.また最終年度の課題である「移入した細菌とその機能は環境中で選択されるのか?"but theenvironment selects"仮説の検証」にも着手できた.また本研究を水銀浄化に応用することを想定したin situ molecular breeding法についても論文として取りまとめることが出来たため,本年度の予定はおおむね達成できたと考えている.細菌の「地理的分布」と「環境による選択」の実態を3年間で実験的に検証するにあたり,3年目となる本年度は以下の項目について研究を進めた.2年目までの研究成果にて,研究協力者のSilver教授が持つ世界の土壌サンプルを対象に,水銀耐性細菌Bacillus megaterium MB1が持つ水銀還元酵素遺伝子(merA)と有機水銀分解酵素遺伝子(merB1)の分布をPCR法にて検証し,"everything is everywhere"仮説が成り立っていることを示した.しかし多くの土壌サンプルに含まれる水銀耐性細菌数は,土壌1g中に1000個以下と少ない事も明らかになった.そこで本年は,土壌中の水銀耐性細菌が,選択的に増加するかどうかについて検証した.塩化水銀を含めた選択培地と水銀を含まない非選択培地を用いて土壌を培養し,土壌中に含まれる細菌数を定量PCR法にて追跡した.いずれの培地においても,検出された総細菌数に差は見られなかった.しかし水銀を含む選択培地では総細菌数とほぼ同数のmerAが検出されたのに対して,非選択培地におけるmerAの数は総細菌数の10%未満の場合が多かった.このように水銀を含む培地においては,水銀耐性細菌が選択的に増加していることが明らかになった.また検出されるmerB1の数は,merAの数とほぼ同数の場合と,merAよりも明らかに低い数になる場合の2パターンが見られた.このことから,細菌が持つ水銀耐性トランスポゾン構造が多様であることを予想してサザンハイブリダイゼーション法を用いた検証を行い,大きさの異なる複数のトランスポゾンが各土壌中に存在することを示した."but theenvironment selects"仮説の検証:移入先の微生物群集にバチラス属水銀耐性細菌が定着できるかどうかについて,実験生態系を用いた検証をおこなう.
中国における大規模企業データを利用した研究開発活動の実証分析

研究期間の二年目であり、本年は昨年度同様、研究資料の整理やデータベースの構築を継続しながら、実証分析に取り組んだ。そして、本年は二年目でありなおかつ最終年度であるため、得られた知見をもとに、研究の取りまとめを進めた。本研究は、中国のイノベーションについて「制度」「イノベーション」、そして、それらを複合した「制度とイノベーションの連関」という3つの視点から考察することを目的に取り組んできた。「イノベーション」に関する研究実績としては、本研究の研究成果の一部を、まずは三竝(2019)(著書(共著))という形で発信したほか、招待を受けたシンポジウムなどにおいても対外発信をすることが出来た。また、研究から得られた知見の社会への還元を目的の一つとして執筆した著書(共著)も2018年に刊行された。また、本研究におけるイノベーションに関する研究で得られた知見をもとに、日本におけるイノベーションの事例に注目して執筆した論文もMitsunami and Nakai(2018)という形で英文雑誌(査読付き)に掲載できたため、それも併せて記しておきたい。「制度とイノベーションの連関」に関する研究については、本研究期間終了後に国内外の査読付き雑誌への投稿を目指して研究を取りまとめてゆきたいと考えている。二年間という研究期間の中で、上記のような研究成果を残せたことは、特筆すべき点として挙げておきたい。研究期間の初年度であるため、本年は研究資料の収集と整理、データベースの構築と基礎的な分析の実施および研究論文の執筆を行った。具体的には、本研究の目的は、中国におけるイノベーションと制度の連関関係について、データベースをもとに実証的に明らかにすることにあるため、本年度は主に、中国鉱工業企業データベース(HUAMEI)および中国国家統計局が出版している各種統計資料をもとに、データベースの構築・整備作業に取り組んだ。あわせて、北京において中国語文献(統計データ)の収集も実施した。本研究は「制度」に関する研究と「イノベーション」に関する研究で構成されている。前者については、これまで実施していた共同研究者である中兼和津次(東京大学名誉教授)との研究を継続実施し、国際学会であるAPEA(Asia Pacific Economic Association)にて発表した(共同研究者)ほか、国内学会(中国経済経営学会および比較経済体制学会)にて発表した(研究代表者)。後者については、本年度は主にデータベースの構築・整備作業が中心であったが、イノベーションに関連する研究として、共同研究者である榊原雄一郎(関西大学教授)との共著論文(英語)を発表することができた。これまで、イノベーションに関する研究は非常に多くなされてきたが、中国において重要である「制度」との連関という視点は優れて独創的であり、二年間という短い研究期間の中で、その初年度にある程度の学術的成果を発表できたことは、特筆すべき点として挙げておきたい。上記のとおり、本研究は中国における「制度」と「イノベーション」の連関関係という視点から、中国の持続可能な経済発展について考察することを目的としている。したがって、本研究は「制度」と「イノベーション」の二つの研究をそれぞれ並行実施している。2年間という限られた分析期間の中で、その一年目として、英語論文を発表し、複数回の学会発表を実施できたことから、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。ただし、「イノベーション」分野のデータベースの構築は、1年間で30万社程度を収録する大規模企業データベースを利用していることから、そのデータクリーニングに時間がかかった。その作業については、次年度も継続実施することにしたい。第二年度(最終年度)においては、一年目に実施したデータベースの整備作業を継続しつつ、本格的な実証分析に取り組むこと、そして、研究期間を通じて実施した各種研究を取りまとめ、成果として対外的に公表することが目標である。後者についてはすでに、国内での学会発表に加え、米国ロサンゼルスで開催予定の国際学会にて研究成果を発表することが内定している。あわせて、査読付き英文誌への投稿作業も並行して進めている。引き続き、様々な形で研究成果の公表を模索したい。本研究は研究期間が二年間(予定)であり、厳しい時間的制約のもとで研究実施およびその成果の対外公表が求められる。

したがって、研究成果がまとまったものから順次発表する必要から、資金的余裕をもたせるため、平成29年度において二度の前倒し支払請求を実施した。ただし、研究を遂行してゆくなかで、その一部については平成29年度中には公表できなかったため、次年度使用額が発生した。ただし、研究自体については適切かつ順調に進んでいるため、次年度使用額が生じたとしても何ら研究遂行の支障にはならない。平成30年度(最終年度)も引き続き、適切に研究を実施してゆきたいと考えている。
アメロジェニンスプライスアイソフォームの間葉系細胞分化に与える影響に関する研究

本研究では、2つのアメロジェニンアイソフォーム、M180とLRAPが、軟骨細胞株(ATDC5)における軟骨分化に対してどのような影響をもたらすか、比較検討した。その結果、2つのアメロジェニンアイソフォームM180、LRAPは、軟骨細胞株ATDC5細胞のALP活性の上昇と、軟骨基質の分泌を促進させ、軟骨細胞の分化を促進させることが示唆された。本研究は、エナメル質の主要なタンパク質であるアメロジェニンが、間葉系細胞の分化にどのような影響を与えるかを解析することによって、アメロジェニンタンパクの細胞間のシグナル伝達物質としての役割を解明し、アメロジェニンの2つの主要なアイソフォームであるM180、LRAPの機能の違いを検証することを目的としている。平成24年度は、マウスM180およびLRAPタンパク発現ベクターを作製後、FreeStyle293-F細胞にトランスフェクションを行い、10日間振盪培養を行った。得られたアメロジェニンタンパク含有培地を濃縮し、これを分化培地に一定の割合で添加した培地を用いてMC3T3-E1細胞、ATDC5細胞の培養を行い、アルカリフォスファターゼ(ALP)活性、石灰化ノジュール形成、骨芽細胞および軟骨細胞分化マーカーの遺伝子発現変化について解析した。以上のことから、2つのアメロジェニンアイソフォームM180、LRAPは、軟骨細胞株ATDC5細胞のALP活性の上昇と、軟骨基質の分泌を促進させ、軟骨細胞の分化を促進させることが示唆された。23年度は、アメロジェニンタンパクを回収することを目的として、アメロジェニンタンパクの発現ベクターを哺乳類細胞であるFree Style293細胞にトランスフェクションし、得られた培地上にアメロジェニンタンパクが発現していることをWestern blotteing法にて確認した。その後、培地を濃縮して、さらに精製を試みたが、タンパク精製はうまくいくことができなかった。次に、MC3T3-E1、ATDC5、C2C12細胞をアメロジェニンを添加して培養し、アメロジェニン存在下での分化を観察した。アメロジェニンタンパクは、濃縮培地のまま使用し、M180、LRAP、controlの3つに分けて添加した。培養後、MC3T3-E1細胞は10日目、20日目にALP染色とAlizarin red染色を、ATDC5細胞は14日目、21日目、28日目にALP染色とAlcian blue染色を、C2C12細胞は3日目、5日目、9日目、12日目でOil red染色を行い、分化の違いを確認したが、日数によってはcontrolとの間に若干の差が見られたものの、M180とLRAPの間には明確な差は肉眼では確認することができなかった。ATDC5細胞に関しては、さらに分化段階を評価する日数を増やして、染色に加えて骨や軟骨への分化段階に応じて発現するとされる指標遺伝子の発現レベルをQ-PCR法によって確認した。研究の遂行がやや遅れている理由としては、アメロジェニンタンパクの発現、回収に手間取ったことがあげられる。タンパク発現ベクターをトランスフェクションし、得られた培地をWestern blotting法にて確認すると、必ず予測されたバンドの位置の少し上方にもう一本のバンドが現れ、何度やってもこのバンドを消すことが出来なかった。考察としては、タンパクが糖鎖修飾を受けたのであろうということで実験を次に進めることとしたが、つぎにタンパクの精製がうまくいかず、これはまだ課題として残っている。今回使用したベクターには、MycとHisの2つのタグがついているため、これらのタグを利用してMycビーズやHisビーズで精製を試みたが、うまくいかず、結局濃縮培地をそのまま使用することとした。今後の研究の推進方策としては、前年度から残っている課題であるタンパク精製について他の方法を考えて再度試みてみる一方で、タンパクを濃縮培地のまま使用して、研究をさらに進めていく予定である。今後、3つの細胞それぞれにおいて、さらに日数を増やして解析し、染色やQ-PCR法にて指標遺伝子の発現レベルを確認する。それを統計学的に考察し、有意差の検証を行っていく予定である。研究費は、細胞の培養に関する培地やdishの他、Q-PCRに使用するプライマー等の試薬に主に使用される。