hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ルテニウム錯体を用いる接触的Pauson-Khand反応の開発

新しい基本的、かつ汎用性の高い高選択的炭素骨格構築反応の開発は、有機合成化学、有機工業化学の鍵反応となりうる極めて大きな意義を持つ。本研究では、アセチレンとオレフィンとの酸化的環化反応により生成するルテナシクロペンテン錯体およびルテニウムを含むいくつかのメタラサイクル錯体を鍵中間体とする新規炭素骨格構築反応を開発することを目的として検討を行い、以下の成果を得た。まず、1)種々の生理活性物質の基本骨格として重要なシクロペンテノン環構築法として、ルテニウム錯体を用いるエンイン類の接触的分子内Pauson-Khand反応を開発した。例えば、Ru_3(CO)_<12>触媒存在下、8-nonen-3-yne-6,6-dicarboxylateの分子内環化カルボニル化反応が、極性アミド溶媒中、良好に進行し、対応する双環シクロペンテノン、dimethy1 2-ethy1-3-oxobicyclo[3.3.0]oct-1-ene-7,7-dicarboxylate,が収率75%で得られた。本反応には種々のエンイン類が適用可能であり、アセチレン末端、およびオレフィン上の末端および内部に置換基を有するエンイン類、いずれを用いた場合にも対応するシクロペンテノン誘導体が高収率で得られた。本反応は、接触的Pauson-Khand反応としては、Co,Ti触媒についで3例目、ルテニウム触媒としては最初の例であり、ルテナシクロペンテン中間体を経由して進行していると考えられる。さらに、2)本環化カルボニル化反応を分子間反応に拡張する過程において、一酸化炭素が2分子取り込まれたアセチレン類とオレフィン類との新規交差カルボニル化反応が進行し、対応するヒドロキノン誘導体が高収率で得られることを見い出した。例えば、Ru_3(CO)_<12>触媒存在下、N-メチルピペリジン中、4-オクチンと2-ノルボルネンとの交差カルボニル化反応により、対応するヒドロキノン誘導体、4,5-dipropyltricyclo-[6.2.1.0^<2,7>]-undeca-2(7),3,5-triene-3,6-diol,が収率85%で得られた。本反応はアセチレンと一酸化炭素2分子から生成する(マレオイル)Ru錯体を鍵中間体として進行していると考えられる。新しい基本的な、かつ汎用性の高い選択的炭素骨格形成反応の開発は、有機合成化学、有機工業化学の鍵反応となりうる極めて大きな意義を持つ。本研究では、我々が既に見い出し報告しているアセチレンとオレフィンとの[2+2]付加環化反応における鍵中間体と考えられるルテナシクロペンテン錯体を有機合成反応に利用することを目的とし、種々の生理活性物質の基本骨格となりうるシクロペンテノン骨格の高効率構築法として、エンイン類の接触的分子内Pauson-Khand反応の開発を行った。

その結果、例えばRu_3(CO)_<12>触媒存在下、8-nonen-3-yne-6,6-dicarboxylate(1a)の分子内環化カルボニル化反応が、極性アミド溶媒中、良好に進行し、対応する双環シクロペンテノン,Dimethyl 2-ethyl-3-oxobicyclo[3.3.0]oct-1-ene-7,7-dicarboxylate(2a),が収率75%で得られた。本反応においては、アセチレンとオレフィンとの[2+2]付加環化反応に高い触媒活性を示したCp^*RuCl(cod)[cod:1,5-cyclooctadiene]錯体は全く触媒活性を示さず、[RuCl_2(CO)_3]_2錯体を用いた場合には、カルボニル化反応が進行する前にルテナシクロペンテン中間体からβ-水素脱離/異性化が進行し生成したと考えられるDimethyl 2-methyl-1-(1-propenyl)cyclopenten-4,4-dicarboxylate(3a)が副生成物として得られた。さらに、触媒としてRu(cod)(cot)[cot:1,3,5-cyclooctatriene]を用い、160°Cで反応を行った場合には、2aが脱モノメトキシカルボニル化を受けたMethyl 2-ethyl-3-oxobicyclo[3.3.0]oct-1-ene-7-carboxylate(4a)が収率64%で得られた。溶媒としてはN,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)、DMF等の極性アミド溶媒が最適であり、THF、トルエンを用いた場合には、副生成物3aの生成量が増加した。本反応には種々のエンイン類が適用可能であり、アセチレン末端にメチル、エチル、n-プロピル、n-ブチルおよびTMS基を有するエンイン類、およびオレフィン上の末端および内部に置換基を有するエンイン類、いずれを用いた場合にも、対応するシクロペンテノン誘導体が高収率で得られた。本反応は、接触的Pauson-Khand反応としては、コバルト、チタン触媒についで3例目、ルテニウム触媒としては最初の例であり、ルテナシクロペンテン中間体を経由して進行する極めて興味深い反応と考えられる。今後、本反応を分子間反応へ拡張すると共に、ルテナシクロペンテン、さらには(マレオイル)ルテニウム中産体を経由する新規炭素骨格形成反応の開発を目指し、シクロブテンジオン類とオレフィンとのカップリング反応等についても検討する予定である。平成9年度の研究により、ルテニウム錯体触媒を用いるエンイン類の接触的分子内Pauson-Khand反応の最初の例を見い出し報告したが、本年度は、さらに接触的分子間Pauson-Khand反応を開発することを目的とし、ルテニウム錯体触媒存在下、アセチレン類とオレフィン類との交差力ルボニル化反応について検討を行った。その結果、予想されたPauson-Khand反応生成物であるシクロペンテノン誘導体は全く得られず、一酸化炭素が2分子取り込まれたアセチレン類とオレフィン類との新規交差カルボニル化反応が進行し、対応するヒドロキノン誘導体が高収率で得られることを見い出した。例えば、RU@@S23@@E2(CO)@@S212@@E2触媒存在下、N-メチルピペリジン中、4-オクチンと2-ノルボルネンとの交差力ルボニル化反応が良好に進行し、一酸化炭素初圧60気圧
固体前駆体を導入したグライディングアーク噴流層による粒子の高速導電性コーティング

この研究では、グライディングアークを導入した噴流層を用いて、粒子の高速導電性コーティングを行う新しい粉体プロセッシングの開発を行った。特にここでは、噴流層内に2種類の粒子を導入し、固体前駆体として機能する導電性粒子をグライディングアークで蒸発させて他方の粒子にコーティングさせ、導電性を付与することを試みた。実験の結果、導電性コーティングに成功すると共に、粒子や放電に関する実験条件を変えてコーティングへの影響を調べ、その機構を提案した。そして、本提案は革新的な粒子コーティング方法として十分に可能性があると結論された。今年度の主な活動は、これまでの予備実験を基にグライディングアーク導入型噴流層を作成するとともに、コーティング実験を進めた。2枚の平板で電極をはさんだグライディングアーク導入型噴流層反応器を作成し、この反応器にポリメタクリル酸メチル樹脂(PMMA)粒子と亜鉛(Zn)粒子を導入して、アルゴンガスにて噴流させると共に高電圧を印加してグライディングアークを発生させ、PMMA粒子に導電性Zn膜のコーティングを試みた。実験パラメータは、コーティング時間、各種粒子の粒径、粒子量比率、そして印加電圧である。実験の結果、Zn膜のコーティングに成功し、PMMA粒子に導電性を付加することができた。コーティング時間を変化させたところ、付着量は増加するが時間と共に徐々に頭打ちになる傾向が見られた。その一方で、粒子の表面積に対するコーティング面積の比率は時間に対してほぼ変化せず、すなわちコーティング膜の厚さが増加するというという結果となった。PMMA粒子に対するZn粒子の導入比率を増加させると、面積比率や膜厚は共にともに増加した。また、放電電圧を下げるとコーティング量が増えるが、電子顕微鏡観察からこれは、コーティングが膜状ではなく微粒子の付着のためと考えられた。これらの結果を基に、コーティング機構を検討し、コーティングは、気相蒸着と液相付着が存在すること、また粒子間の衝突が膜の引きはがしを引き起こすことが考えられた。さらに銅(Cu)粒子を用いた実験では、コーティング膜がほとんど作製されず、これはCuが高沸点を持つためと考えられた。当初の計画では、放電や粒子挙動の計測やシミュレーションにも取りかかる予定であったが、コーティング機構を検討するために粒子の大きさや材質などを変えたコーティング実験を先に進めることとしたため、これらは次年度に行う予定である。今年度の主な活動は、昨年度の実験を継続すると共に、コーティングされるポリメタクリル酸メチル樹脂(PMMA)の粒子サイズを変えたり、放電電極の角度を変えてコーティング実験を進めた。これに加えて噴流層内の放電特性を調べるため、高速度カメラによるアークの挙動を観察し、アークが粒子の存在でどう影響されるかを調べた。その結果、粒子サイズを変えた実験では、気相蒸着が主となる高電圧下の放電条件において、サイズを変えても膜生成挙動は変化しない一方で、液相付着の関与が大きくなる低電圧放電条件では、サイズが大きいと亜鉛(Zn)粒子との終末速度比が小さくなるため、粒子間の衝突が減り、そのため成膜量が低下する結果が得られた。電極の角度を変えた実験では、30°、40°はあまり変化がなかったが、50°では成膜量の低下が見られた。これは、高速度カメラの観察により、50°の場合に放電領域が狭まるためと推測された。アークの挙動観察では、粒子を入れることにより、アークの通過面積が減少すること、個々のアークの放電持続時間が長くなること、そしてアークがガスと共に移動しなくなることがわかった。さらに、電極角度を変えたときのアークの通過面積と接触した粒子個数には関係性が見られなかった。これらの結果を踏まえ、昨年度提案した成膜機構を改めて考察し、コーティングは、気相蒸着と液相付着が存在すること、また粒子間の衝突が成膜に影響することに矛盾がないことが確認された。当初の計画では、粒子挙動の計測やシミュレーションにも取りかかる予定であったが、計測は順調に解析できているものの、2種の粒子の識別が明確でない点が懸案事項である。一方、シミュレーションは条件設定を模索中で、これらは引き続き行う予定である。実験は順調に進んでいる。この研究では、グライディングアークを導入した噴流層を用いて、粒子の高速導電性コーティングを行う新しい粉体プロセッシングについて研究を行った。最終年度である平成29年度は高速度カメラなどによる噴流層内での放電挙動と粒子の挙動の解析を行った。その結果、粒子の存在によりアーク形状が変化すると共にアークの通過面積が減ること、放電持続時間は粒子の存在に影響を受けないこと、そしてアークと粒子の接触個数は電極角度30°が最も多いことが明らかになった。特に、この角度で成膜量が一番多いことから、電極角度30°の形状が成膜には最適であることが裏付けられた。一方、固体前駆体にCu粒子を用いたPMMA粒子へのコーティングおよび固体前駆体にZn粒子を用いた酸化ケイ素粒子へのコーティングを試み、前者の場合にはCuの融点や沸点が高いためにCu膜の生成はほとんど見られなかったが、酸化ケイ素粒子上へのZn膜コーティングには成功し、セラミックなどの粒子にもこのコーティング方法が適用できることを示した。

以上の結果やこれまで得られた成膜に対する放電電圧の影響とPMMA粒子の大きさによる衝突頻度の影響の実験結果などから、本方法のコーティング機構として、平滑な膜はZn蒸気による蒸着、粗い膜は一部融解したZn粒子の接触により生成し、一方、膜の引き剥がしは、粒子同士の衝突とアーク放電によるスパッタ効果であることを提案し、実験条件を変えることでこれらの効果をコントロールすることが可能であり、これにより、より良い膜を生成できると推測された。この研究では、グライディングアークを導入した噴流層を用いて、粒子の高速導電性コーティングを行う新しい粉体プロセッシングの開発を行った。特にここでは、噴流層内に2種類の粒子を導入し、固体前駆体として機能する導電性粒子をグライディングアークで蒸発させて他方の粒子にコーティングさせ、導電性を付与することを試みた。実験の結果、導電性コーティングに成功すると共に、粒子や放電に関する実験条件を変えてコーティングへの影響を調べ、その機構を提案した。そして、本提案は革新的な粒子コーティング方法として十分に可能性があると結論された。平成28年度は、27年度に引き続き、実験では粒子や放電に関するパラメータを変えたコーティング実験を進め、これに加えて噴流層内の放電特性および粒子挙動の計測と)噴流層内の流体・粒子挙動シミュレーションに着手する。そして、それぞれの結果を踏まえ、コーティング機構の解明とそれを基にした噴流層の改善を施し、コーティングに対して最適な処理条件を決定する。平成29年度は、実験では、引き続き前年度の条件で行うと共に、新たに放電ガスを変えたり、コーティングする粒子を変えた実験を進め、ここで提案したコーティング法の拡張性を検証する。高速度カメラによる観察も引き続き進め、これに加えて噴流層内の流体・粒子挙動シミュレーションを行う。そして、それぞれの結果を踏まえ、コーティング機構を確定し、コーティングに対して最適な処理条件および反応器形状を提案し、本研究を総括する。29年度が最終年度であるため、記入しない。化学工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
放射線療法及び化学療法の新規バイオマーカーの開発

放射線療法及び化学療法の効果モニタリングに適したマーカーは殆どない。ポリADP-リボシル化反応はDNA損傷後活性化し、ポリ(ADP-リボース)は細胞死に伴い血中に漏出しうる。そこで本研究では、ポリ(ADP-リボース)代謝物の動態を調べ、特異的代謝物の定量系を確立し、その動態を細胞及びマウスモデルで調べた。ポリ(ADP-リボース)はマウスに静注後、血流において速やかに代謝され、蓄積が防がれていることが示唆された。LC-MS法による検出条件と感度の至適化を進め、良好な条件の確立が達成できた。ガンマ線照射後のポリ(ADP-リボース)の特異的代謝物の解析を行い、血中で代謝物の検出が行えた。腫瘍の放射線療法及び化学療法の効果モニタリングに適した腫瘍細胞死を反映するマーカーは殆どない。ポリADP-リボシル化反応はDNA損傷後活性化し、ポリ(ADP-リボース)は細胞死に伴い血中に漏出する。以前に申請者らはポリ(ADP-リボース)の特異的代謝物としてリボシルアデノシン及びリボシルイノシンを血中、及び尿中において同定した。これらは抗がん剤や放射線療法の効果モニタリングのマーカーとなる可能性が高い。そこで本研究では、LC-MS法を用いたマウス血液、尿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンの分析条件の検討を進め、分析工程を至適化する。マウスモデルでのリボシルアデノシン、リボシルイノシンの動態について放射線照射やDNA損傷剤投与後、血漿検体及び尿検体についての検討を行う。昨年度の検討を踏まえて、マウス血漿及び尿サンプルの前処理法を改良し、LC-MS法によるリボシルイノシンの検出条件と感度の至適化が達成できた。ガンマ線照射後のリボシルアデノシン、リボシルイノシンの血中、尿中での変動の解析を行った。ガンマ線照射後、血中のリボシルアデノシン、及びリボシルイノシンの線量依存性の増加が経時的に検出され、これらが細胞応答のマーカーとなる可能性が示唆された。さらにリボシルアデノシン、リボシルイノシンがPARP活性により生じるかどうかを調べるために、PARP阻害剤処理後のマウスの血漿と尿の調製も行い、測定準備を進めた。質量分析法による測定系の至適化のために、まず以前作成した方法(Shimokawa, et al.,2009)で大腸菌を用いてヒトpoly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1)のリコンビナントタンパク質を調製し、カラムクロマトグラフィーを用いてポリ(ADP-リボース)の大量調製を行った。これを用いてポリ(ADP-リボース)からリボシルアデノシン及びリボシルイノシンの標準物質を調製し、HPLC及びLC-MSで分析条件の検討を進めた。リン酸残基を放射能ラベルしたポリ(ADP-リボース)を調製した。マウス尾静脈から放射能ラベルしたポリ(ADP-リボース)を静脈注射後、代謝物の組織分布と分解を経時的に分析した。静注5分後には血液、肝臓、腎臓において酸可溶性の低分子画分に放射能の約50%が移行した。上記の放射能標識の場合、大部分の放射能はリン酸として検出された。Poly(ADP-ribose)glycohydrolaseによる分解産物ADP-リボースやpyrophosphataseによる分解産物phosphoribosyl-AMP及びAMPは検出されなかった。投与1時間後には尿中に代謝物としてリン酸が検出されることを見いだした。従ってポリ(ADP-リボース)は血流において速やかに代謝され蓄積が防がれていると考えられる。マウス血漿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンのLC-MSによる分析の条件検討を行った。回収率をモニターできる内部標準物質を選定して、ほぼ至適化された方法を確立した。マウス尿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンの分析条件の至適化も進めている。リボシルアデノシン、リボシルイノシンの大量調製と質量分析法による測定系の至適化は大部分達成できた。マウス血漿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンのLC-MSによる分析の条件検討を行い、ほぼ至適化された方法を確立した。回収率をモニターできる内部標準物質を合わせて選定できた。マウス尿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンの分析条件の検討を進め、分析工程を決定する。マウスモデルでのリボシルアデノシン、リボシルイノシンの動態について放射線やDNA損傷後、血漿検体及び尿検体についての検討を行う。

次年度はマウス尿検体からのリボシルアデノシン及びリボシルイノシンの分析条件の検討を進め、分析工程を決定し、まずマウスモデルでのリボシルアデノシン、リボシルイノシンの動態について放射線やDNA損傷後、血漿検体及び尿検体についての検討を行う。このために必要な消耗品と分析機器の部品、検体の収集と成果発表、論文作成に研究費を使用する予定である。
線毛上皮への分化誘導による気道杯細胞増生の治療法の開発

1.高分化杯細胞培養系を用いたin vitroの検討;モルモット気管上皮をプロテアーゼ処理にて単離し、Transwell上に細胞をまき、DMEM/HamF12培地で培養した。コンフルエンスの後、Air-interface法とし、IL-13を添加し杯細胞系を作成した。10日後、IL-13を除去した培地への切り替え、またはIL-13の中和抗体を加えて、継続培養した。経時的に細胞の光顕標本、電顕標本を作製し、杯細胞、線毛細胞などの各細胞数、線毛と粘液顆粒を有するTransition phenotypeの細胞を算定した。また粘液の面積を画像解析ソフトで求めた。粘液量の定量評価は抗MUC5AC抗体を用いたELISAで測定した。さらに細胞増殖はBrdUの取り込みで、アポトーシスはssDNAアッセイで解析した。IL-13除去2日後、PAS陽性領域およびMUC5ACのレベルは急速に減少し、除去4日後には杯細胞の数は著明に減少した。一方、線毛細胞は相補的に増加した。また、線毛と粘液顆粒の両方を有するTransition phenotypeがIL-13除去後に多く出現した。経過中、総細胞数は変化せず、またBrdUの取り込みはIL-13除去後には減少していた。アポトーシスの関与は軽度であった。IL-13中和抗体の添加後も同様に杯細胞の減少と線毛細胞の増加を認めた。2.抗原感作喘息リモデリング動物を用いたin vivoの検討;Hartley系雄モルモットに卵白アルブミンを腹腔内に1週間毎に4回反復投与し、著明な杯細胞増生モデルを作製した。また抗原投与時に、Th2阻害薬、抗IL-13抗体、ステロイドを投与し、杯細胞増生の抑制効果を検討した。取り出した気管、気管支をホルマリン固定し、PAS/Alcian blueで染色し、画像解析ソフトにて粘液の面積を測定した。Th2阻害薬、IL-13抗体、ステロイドにより粘液の面積の低下を認め、杯細胞増生の抑制が観察された。また透過型電顕にて粘液顆粒と線毛の両方を有するTransition phenotypeの出現を認めた。3.気道上皮細胞は可塑性を有し、喘息リモデリングによる杯細胞増生に対して抗IL-13療法などにより杯細胞から線毛細胞への変換を促す可能性が示唆された。過分泌治療に対する新しい治療法の確立に寄与すると期待される。目的:慢性喘息では気道のリモデリングが生じ、気道上皮においては著明な杯細胞増生が観察される。その結果、引き起こされる過分泌は閉塞性換気障害や喘息死をもたらすが、現在まで有効な治療方法は確立していない。本研究では、杯細胞増生は気道上皮の分化異常と考え、杯細胞増生を正常な線毛上皮に分化誘導する新しい治療法の確立を目指すことを目的とした。

18年度はIL-13による高分化杯細胞培養系を作成後、培地よりIL-13を除去して杯細胞から線毛細胞への細胞転換(Transition)が生ずるか検討した。方法:モルモット気管上皮をプロテアーゼ処理にて単離し、Transwell上に細胞をまき、DMEM/HamF12培地で培養した。コンフルエンスの後、Air-interface法とし、IL-13を添加し杯細胞系を作成した。10日後、IL-13を除去した培地への切り替え、またはIL-13の中和抗体を加えて、継続培養した。経時的に細胞の光顕標本、電顕標本を作製し、杯細胞、線毛細胞などの各細胞数、線毛と粘液顆粒を有するTransition phenotypeの細胞を算定した。また粘液の面積を画像解析ソフトで求めた。粘液量の定量評価は抗MUC5AC抗体を用いたELISAで測定した。さらに細胞増殖はBrdUの取り込みで解析した。結果:IL-13除去2日後、PAS陽性領域およびMUC5ACのレベルは急速に減少し、除去4日後には杯細胞の数は著明に減少した。一方、線毛細胞は相補的に増加した。また、線毛と粘液顆粒の両方を有するTransition phenotypeがIL-13除去後に多く出現した。経過中、総細胞数は変化せず、またBrdUの取り込みはIL-13除去後には減少していた。IL-13中和抗体の添加1後も同様に杯細胞の減少と線毛細胞の増加を認めた。本年度までの結論:IL-13の除去により杯細胞増生は線毛上皮へと置き換わった。この変化には細胞増殖による未分化な細胞からの線毛細胞への分化よりも杯細胞から線毛細胞へのTransitionが関係している可能性が示された。1.抗原感作喘息リモデリングの抑制効果の検討;Hartlev系雄モルモットに卵白アルブミンを腹腔内に1週間毎に4回反復投与し、著明な杯細胞増生モデルを作製した。また抗原投与時に、Th2阻害薬、抗IL-13抗体、ステロイドを投与し、杯細胞増生の抑制効果を検討した。取り出した気管、気管支をホルマリン固定し、PAS/Alcian blueで染色し、コンピューター画像解析装置にて粘液の面積を測定した。Th2阻害薬、IL-13抗体、ステロイドにより粘液の面積の低下を認め、杯細胞増生の抑制が観察された。また透過型電顕にて粘液顆粒と線毛の両方を有するTransition phenotypeの出現を認めた。2.培養細胞を用いた検討;モルモット気道上皮細胞をIL-13下でair-interface法で培養し、著明な杯細胞系を作成した。その後、IL-13を除去、またはIL-13抗体を添加し、杯細胞と線毛細胞の数の推移を観察した。その結果、杯細胞が減少し線毛細胞が増加し、ELISA法によって測定したMUC5ACの産生量も低下した。電顕、免疫染色にて粘液顆粒と線毛の両方を有するTransition phenotypeの出現をみた。さらにBrDUのよる取り込みが増加していないことから増殖の関与は乏しく、また形態学的にアポトーシスの関与も軽度で、杯細胞から線毛細胞へのTransitionが推測された。3.気道上皮細胞は可塑性を有し、喘息リモデリングによる杯細胞増生に対して抗IL-13療法は杯細胞から線毛細飽への変換を促す可能性が示唆された。
家族内介護が介護者の精神的・身体的健康に与える影響の検討

平成30年度の前半は、まずこもいせコホートデータを確認・成型および先行研究の確認を行った。また、若手研究者海外挑戦プログラムの助成も利用し、ハーバード公衆衛生大学院のProf. Kawachiのもとで研究手法や文脈についても議論し、解析を開始した。その結果をもとに、Bostonで11月に行われた、GSAにてポスター発表を行った(学会発表1)。介護者が非介護者とくらべ、平均すると死亡率が高いわけではないこと、しかし、低い社会経済的ステータスにあるものでは、介護することが死亡リスクを上げる可能性があることを示した。この結果は、Robustness checkを行った後でも変わらなかった。また、その死亡率の上昇は、冠動脈疾患により死亡率上昇で説明できる可能性が示された。これらの結果は最近の米英の先行研究における介護の死亡率低下の関連とは異なる結果であった。これらの結果をもとに、論文を執筆し、出版に至った(論文1)。また、付随的な共同研究として、同じコホートを用いて、相対的剥奪感が死亡に与える影響(査読中)、退職前後での社会経済的因子・社会的サポートが死亡に与える影響(論文2)、感覚障害が死亡に与える影響(論文3)についても検討した。論文2では相対的貧困と不十分なsocial engagementが特に退職後の男性において死亡のリスクとなっていることを示した。論文3においては、自己申告した聴覚喪失が死亡率の上昇と関連し、うつ・社会的参加・移動能力の低下によってはその関連が十分に説明できなかったことを示した。本年度は、こもいせコホートデータの解析を首都する予定であり、研究実績に記載の通り、予定通り解析を行った。また、派生した論文も含め4本の論文を執筆、うち3本は国際誌にすでに掲載された。故にこの点では計画以上に進展していると考える。しかし、研究計画で使う予定であった政府統計(国民生活基礎調査・中高年者縦断調査)については、予定よりやや遅れて平成31年2月にデータ利用可能となったため、データクリーニング・解析を開始したところであり、この点ではやや遅れているが、致命的な遅れとはなっていない。故に、自己評価としては、(2)概ね順調に進展、とした。H31(R1)年度は政府統計(国民生活基礎調査・中高年者縦断調査)のデータクリーニングを行った上で、介護と健康アウトカムの関連をさらに検討する。当初予定では中高年者縦断調査のみであったが、国民生活基礎調査を用いることで、外生的な家族介護の変化を観察することができ(介護保険の導入・改正に伴う)統計学的によりバイアスの少ない推定を行うことが可能となる。外生的な家族介護の利用がなされた研究はほとんどないことから、介護の健康アウトカムのトピックにおけるさらなる進展に繋がりうるため、国民生活基礎調査をメインで使うこととした。

外生的な家族介護の利用がなされた研究はほとんどないことから、介護の健康アウトカムのトピックにおけるさらなる進展に繋がりうるため、国民生活基礎調査をメインで使うこととした。
都市イメージ構成要素に基づく認知地図の構造の脳磁計測による解明

本研究の目的は、人間の認知地図が、リンチが提唱する都市のイメージの構成要素に対応したものから成り立つという仮説にもとづき、認知地図における環境の表現様式を明らかにすることであり、先験情報による形成される認知地図への影響、現実の都市環境をシミュレートした人工現実感環境の探索によって形成される認知地図の構造を明らかにするための心理物理学的実験と脳磁図計測実験をおこなった。1.心理物理学的実験により、人工現実感環境における経路検索の直前にあたえた音声によるパス・ノード情報の経路探索時間への影響について検討した。自己中心座標的なパス・ノード情報と環境中心座標的なパス・ノード情報による経路探索時間の違いを比較したところ、環境の構造が複雑でランドマークが存在しない場合において、後者の方が経路探索時間が有意に短いという結果が得られた。この結果は、環境が複雑な場合においては、環境中心座標的なパス・ノード情報によって認知地図が形成されることを示す。2.心理物理学的実験により、人工現実感環境における経路検索の直前にあたえた地図によるパス・ランドマーク情報の経路探索時間への影響について検討した。地図による先験経路情報においてパスもしくはランドマークに偽りがある場合に、経路探索時間が有意に長くなるという結果が得られた。とくに、ランドマークに偽りがある場合には、そのランドマークから離れた場所においても経路選択の誤りが増加し、これは地図におけるランドマークと環境におけるランドマークの間の不一致が、環境全体の認知地図の形成を妨げることを示す。3.都市イメージの五つの構成要素のうち、ランドマーク情報とディストリクト情報のうちのいずれか、または両方が欠落した人工現実感映像を制作して、心理物理学実験と脳磁図計測実験をおこない、それぞれの情報に応じて、その欠落による認知地図の構造とその脳内部位への影響が異なるという傾向を見いだした。4.これらの実験結果にもとづいて、認知地図形成に関わる神経ネットワークを解明し、都市環境や高度情報社会メディアにおける「迷子問題」を根本的に解決するための提案をすることを今後の課題としたい。本研究の目的は、人間の認知地図がリンチが提唱する都市のイメージの構成要素に対応したものから成り立つという仮説にもとづき、認知地図における環境の表現様式を明らかにすることである。本年度は、先験情報による形成される認知地図への影響について、心理物理学的実験をおこなうとともに、脳磁図計測実験を開始した。3.これらの心理物理学的方法によって判明した認知地図の構造と、その脳内活動部位の時間的変化の関係をもとめるための脳磁図計測実験を開始した。

今後さらに被験者を増やして実験を継続する。本研究の目的は、人間の認知地図が、リンチが提唱する都市のイメージの構成要素に対応したものから成り立つという仮説にもとづき、認知地図における環境の表現様式を明らかにすることであり、本年度は、現実の都市環境をシミュレートした人工現実感映像を制作して、環境の探索によって形成される認知地図の構造を明らかにするための心理物理学的実験と脳磁図計測実験をおこなった。1.平成14年度より開始した、人工現実感環境における経路検索の直前にあたえた音声によるパス・ノード情報の経路探索時間への影響、および人工現実感環境における経路検索の直前にあたえた地図によるパス・ランドマーク情報の経路探索時間への影響について、被験者を増やして心理物理学的実験と脳磁図計測実験をおこなった結果、環境が複雑な場合においては環境中心座標的なパス・ノード情報によって認知地図が形成される、また地図におけるランドマークと環境におけるランドマークの間の不一致が環境全体の認知地図の形成を妨げるという、平成14年度の主要な結果が再現された。2.平成14年度においては、都市イメージの五つの構成要素の全てを含むように現実の都市環境をそのままシミュレートした映像を使用したが、平成15年度においては、ランドマーク情報とディストリクト情報のうちのいずれか、または両方が欠落した人工現実感映像を制作して、心理物理学実験と脳磁図計測実験をおこない、それぞれの情報に応じて、その欠落による認知地図の構造とその脳内部位への影響が異なるという傾向を見いだした。3.これらの実験結果にもとづいて、認知地図形成に関わる神経ネットワークを解明し、都市環境や高度情報社会メディアにおける「迷子問題」を根本的に解決するための提案をすることを今後の課題としたい。
極性溶媒のキノン類分子に及ぼす電場効果と光反応ダイナミックスへの影響

液相溶媒中の局所電場は、外部Stark電場に比べて桁違いに大きいと予想される。単結晶や混晶中のp-ベンゾキノン(PBQ)やp-アントラキノン(AQ)の場合は異方性のある微細構造スペクトルが得られるが、液相溶媒の中では分子の揺動を反映して、ゲスト分子の周りの場は極めて不均一である。これらキノンの可視領域の二つの近接した^1nπ^*←S_0電子スペクトルは共に禁制であるが、Stark電場摂動によって混じり合う。これらは溶媒Stark効果という立場から論じることが可能である。無極性溶媒中におけるPBQの可視領域の吸収スペクトルはいくつかの有力な振動構造が現れてるが、これは大きい双極子モーメントをもつアセトニトリル中では殆ど消えてしまう。このバンド広がりの効果は他のいくつかの有極性溶媒を使って調べてみた結果、かなり一般化できる。これら有極性溶媒中でのPBQゲスト分子に対する有効な局所電場は、少なく見積もっても10^6V/cmはあり、現実的な意味で到達できる無極性液相中の電場の大きさの10倍以上は高い値である。現在までに到達出来たヘキサン中の電場は45KV/cm程度であり、この程度では明確なバンドbroadeningは検出されなかった。バンド広がりモデル実験検出のためには少なくともこの5-6倍の電場が実際上必要だろう。液相溶媒中のスペクトルからは有・無極性溶媒中のスペクトル比較法により、局所的な情報が得られるという利点がある。PBQは対象性も高く、格好のホスト分子である。AQも全く同様の議論が可能であるが、近接した強い吸収スペクトルの存在のため、PBQほど明確な結論は示せなかった。溶媒摂動による電子準位間のlevel tangling化は、高エネルギー域にある光化学反応に活性な電子準位の間でも予想され、状態密度の広がりとして光反応ダイナミックスへ寄与してくると考えられる。
内耳再生および内耳における超常磁性体酸化鉄ラべリング移植細胞の追跡法の検討

1、研究目的従来、治すことは出来ないと考えられてきた感音難聴に対し、内耳感覚細胞の再生によって内耳機能の回復を目指す再生医療は非常に期待されるものである。今回、我々は骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell;以下MSC)を用いた移植による内耳有毛細胞の再生を目指した研究を開始するにあたり、再生後の臨床応用には移植細胞のモニタリング方法の確立は必要不可欠であると考えた。ところが、有毛細胞の再生に関する報告は他にも散見されるものの、内耳における移植細胞のモニタリング方法についての報告は未だない。そのため、本研究では内耳におけるモニタリング方法の確立を目的として、すでに臨床で用いられている超常磁性体酸化鉄(Super Paramagnetic Iron Oxide;SPIO)を成分とするMRIの造影剤をMSCにラベルし、内耳に移植、MRI画像において移植細胞の追跡、生体内動態の把握は可能であるかについて検討を行うこととした。本研究の目指すモニタリング方法の確立は内耳再生の臨床応用において非常に有意義であり、これにより内耳再生の研究は飛躍的に発展するものと考えている。2、研究方法SPIOをラベルしたMSCをモルモット内耳に移植し、移植直後、2週後、4週後とMRI撮影を行い移植部位の信号強度測定による定量的な画像評価を行った。加えて、各々の経過において蝸牛を摘出し組織評価(HE染色、ベルリンブルー染色)を行った。3、研究成果信号強度測定による比較検討において移植部位は非移植部位と比べて有意差をもって確認可能であった。また組織所見においても鼓室階を中心にSPIOの存在を示すベルリンブルー陽性細胞を認め、画像所見と矛盾しない結果であった。更に、移植4週後には蝸牛軸やらせん神経節領域に一部の陽性細胞の存在が確認され、移植細胞の移動、生着を期待させる所見も得られた。以上の結果は現在、論文投稿準備中の段階である。
HIV感染の成立に必要なCD4以外の分子のクローニング

HIVの感染成立に必要な分子はCD4以外に一つだけであるとすれば、マウスの3T3細胞にヒトCD4を発現させ、これにヒト高分子DNAをトランスフェクトさせた後、HIV粒子中にネオマイシン耐性遺伝子を有するレトロウイルス(日医大、島田教授との共同研究)を感染させ,G418存在下で培養して生き残る細胞があればHIVの感染が成立したことを強く示唆すると考えられる。本年度は、この実験を繰り返し行ったが、再現性をもってG418に耐性なクローンを得ることができなかった。この原因として、1)HIV感染成立にはCD4以外に2つ以上の分子が必要である、2)目的とする分子をコードする遺伝子が非常に大きい等の原因が考えられる。最近、CD26分子がHIV感染に関与している可能性が報告された。次年度はCD4とCD26を発現させた3T3細胞で上記の実験を行う予定である。またFDG(Fluorescein b-D-galactopyranoside)がb-galactosidaseによって加水分解を受けて蛍光を発する性質を利用し、HIVLTRの下流に1acZ遺伝子を組み込んだ遺伝子を作製してマウスCOP細胞、COS細胞等にトランスフェクトした。得られた細胞にTNFを作用させ実際にb-galactosidase活性が上がり、蛍光を発するかどうかを解析した。その結果、TNFによって蛍光強度が上がるが、その程度は微弱でライブラリーのスクリーニングに耐え得るかどうかは微妙なところであった。現在HIVLTRのtat responsive elementを複数リピートさせるにことにより、もっと鋭敏にtatに反応できるような系を作ることを検討している。
全方向移動車椅子の親和性および安全性の向上に関する研究

乗り心地が良く,段差乗り越え可能な全方向移動機構を設計・製作し,その基本動作を確認した.次に,全方向移動車椅子を用いて,計測した環境計測データに基づいて,ジョイスティックのインピーダンスを変化させる半自律制御を実現するとともに,介助者の操作入力から車椅子への入力(介助者の意図)を推定し,駆動モータの入力を変化させるパワーアシスト制御において,様々な介助者に対応可能なシステムを実現した.乗り心地が良く,段差乗り越え可能な全方向移動機構を設計・製作し,その基本動作を確認した.次に,全方向移動車椅子を用いて,計測した環境計測データに基づいて,ジョイスティックのインピーダンスを変化させる半自律制御を実現するとともに,介助者の操作入力から車椅子への入力(介助者の意図)を推定し,駆動モータの入力を変化させるパワーアシスト制御において,様々な介助者に対応可能なシステムを実現した.超高齢社会では,日常生活で介護を必要とする高齢者及び加齢による障害者の一層の増加が不可避である.申請者らは,狭い屋内環境での移動,ベッドへの幅寄せ,作業を行いながらの横移動等に有効な全方向移動車椅子に関する研究を行っているが,今年度は従来問題となっていた以下の各技術を開発した.まず,乗り心地が良く,段差乗り越え可能な全方向移動機構の開発を目的として,従来のオムにホイールに変わる遊星歯車機構利用のアクティブキャスタを設計し,その車輪を試作した.本機構は通常のゴムタイヤに近い車輪を使用するため,走行性能の飛躍的な向上が期待され,さらにモータの運用率を向上させることが可能な構造になっている.次に,全方向環壌認識の高精度化による半自律障害物回避機能の改良を目的として,レーザレンジファインダ(測域センサ)を2台車椅子に搭載して,全方向の高精度障害物検出を可能とし,この障害物情報を利用した衝突回避を実現した.本方式はジョイスティックへのハプティックフィードバックを行っているため,搭乗者に違和感のない減速,停止が可能になっている.また,この機能を用いたナビゲーションについて検討した.さらに,介助者用全方向パワーアシストのためのオートチューニングシステムの開発を目的として,介助者の操作意思を推定するニューロファジィシステムによって,介助者の癖の学習を可能とするシステムを構築した.タッチパネルを利用した個々の介助者の癖を教示するシステムの開発により,介助者が変わってもスムーズなパワーアシストが可能となった.乗り心地が良く,段差乗り越え可能な全方向移動機構の開発を目的として,遊星機構を用いたアクティブキャスタ式全方向移動ユニットを設計・製作し,その基本動作を確認した.次に,全方向移動車椅子を用いて,以下の各種実験を実施した.全方向環境認識の高精度化による半自律障害物回避機能の改良を目的として,新たに測域センサを追加して,全方向の距離情報を獲得することにより,これまで検出困難であった後方領域もカバーできるようになった.計測した環境計測データに基づいて,製作したジョイスティックのインピーダンスを変化させた.搭乗者がジョイスティックを倒そうとした瞬間にその方向を検出して,移動方向の車椅子の速度成分及び障害物との距離から,ジョイスティックのインピーダンスを決定し,モータに指令を与えた(これにより,障害物のある方向に対しては移動指令を出すことが困難になる).実験によりインピーダンスの調整方法を検討した.さらに,介助者用全方向パワーアシストのためのオートチューニングシステムの開発を目的として,介助者の操作入力を車椅子のハンドグリップに設置した6軸力覚センサで計測し,実際に車椅子で横方向並進,定点転回の動作を行い,加えられた力及びモーメントを学習させた.計測したハンドグリップ入力に応じて,ニューロファジィシステムにより介助者が意図する動作を求め,その運動を実現するよう車椅子の駆動モータ入力を生成した.介助者の癖を読み取って,それぞれの介助者に応じて自動チューニングを行うシステムを構築した.
アディクションを重複する発達障害者への支援ツールの開発

2018年度は、アディクションを重複する発達障害者の実態と支援の現状を明らかにし、発達障害とアディクションの種類の特徴に応じた介入方法を検討することを目的とし、インタビュー調査を行った。対象は医療機関やアディクション回復・相談施設のスタッフであり、6名から調査への協力が得られた。調査内容は、1)これまで対応した対象者のうち、対応に苦慮した対象者の有無と特徴、2)好事例と困難事例へ行った支援内容、3)手ごたえと困難感、4)対象者を支援する上での課題、であり、これらの内容について自由に語っていただいた。データの分析に際し、音声データから逐語録を作成した。その後、語られた文脈を重視して単独で理解可能な最小単位の言葉や文節を取り出しコードとした。このコードを類似性と関連性の観点から継続的に比較し、サブカテゴリ、カテゴリを抽出した。インタビューから、【対象の背景】に関する5サブカテゴリ、【対象の特徴】に関する27サブカテゴリ、【スタッフの意識】に関する9サブカテゴリ、【周囲への支援】に関する8サブカテゴリ、【当事者への支援】に関する28サブカテゴリ、【支援する上での課題】に関する21サブカテゴリが抽出された。アディクションを重複する者のうち、<発達障害を持つ人の割合>は半数程で年齢や性別による違いはない。元々この特徴を持っていたけれども<依存症が発達障害を際立たせる>こととなっている。<情動の動きがない>、<言葉だけでは理解が難しい>こと等からスタッフとしては<従来の考えが当てはまらない>状況に直面しており、<類型を念頭に話を聞く>ことで対象理解をしたり、<具体的なかかわりをする>等の工夫をしている。この様な工夫は<手探りの対応>の側面も併せ持つため、対象を支援するためのツールやわかりやすい媒体、支援のためのネットワークの構築等を求めていることが示された。今年度の計画はアディクションを重複する当事者への支援の実態と課題の明確化であり、そのために支援を行うスタッフにインタビュー調査をすることであった。当初の計画よりもインタビュー対象者の人数は少なかったものの、支援の実態と課題を明らかにすることができたことから、概ね順調に進展していると考える。研究計画に沿って、今年度の成果を基に質問紙を作成し、当事者の割合と特徴を把握するための調査を行う。これと並行して当事者にもインタビュー調査を行い、当事者の抱える困難感とアディクションに陥った要因、求める支援を検討する。今年度は、当初計画より少ないインタビューの実施で成果が得られたため、調査に伴い生じる謝金、旅費、テープ起こしのための業者委託費が計画より少ない費用となった。次年度は、当事者の割合と特徴に関する実態調査を行う。これに加えて、当事者へのインタビュー調査も実施する。次年度使用額は、実態調査のための調査票の発送・データ入力の業者委託費、及び当事者へのインタビュー調査を行うための旅費、謝金、テープ起こしの業者委託費と、データ収集・分析のための物品購入費に用いる。また、今年度の成果発表のための費用とする。
胃上皮分化制御の分子調節機構の解析とその応用

本研究では各種胃粘膜上皮細胞株ならびに胃組織標本を用い、胃腺管の形態形成ならびに分化に関与する因子に検討を加えた。まずretinoic acids、短鎖脂肪酸等の分化誘導・形質転換能について検討したところ、前者には有意な形質転換作用は見られなかったが、短鎖脂肪酸にはRGM1細胞に対する分化誘導作用があり細胞形態の変化とともに粘膜顆粒の発生をみた。GSM細胞においてはこれに加え細胞がアポトーシスに陥った。そこで短鎖脂肪酸を周期的に負荷し分化した細胞のクローニングを試みたが、これらの細胞は短期間の培養後に死滅することが判明した。現在この細胞死の機構について検討を加えつつある。短鎖脂肪酸の分化誘導能はCOX-2の過剰発現により解除される。ヒト胃癌切除組織を用いた検討ではCOX-2の過剰発現が全体の約8割に見られ、このCOX-2の過剰発現が癌の発展度に有意に関連した。一方、癌周辺の背景胃粘膜ではほぼ全例にCOX-2の発現が検出され、この発現はH.pylori感染または腸上皮化生に関連していた。健常者胃粘膜生検組織においてはH.pylori感染者では感染胃粘膜に、非感染者では腸上皮化生部にCOX-2の発現がみられることから、本因子が胃にかける分化誘導異常に関与する可能性が示唆された。そこで三次元培養系を用い胃上皮細胞の腺管形成能に対するCOX-2の役割に検討を加えた。本モデルではTGFα、HGFにより管腔を有する腺管形成がおこり、これはCOX-2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやCOX-2阻害剤により制御されるが、COX-1アンチセンスでは制御されない。これらの結果より胃上皮の形態形成には本因子が重要な調節因子として機能していることが明らかにされた。現在ガストリンやある種の抗潰瘍剤に本因子を誘導する作用があることが判明したおり、これらの薬剤の効果について検討しつつある。初年度は胃粘膜モデル細胞として主にラット由来のRGM1を、また一部にはマウス由来のGSM06、GSM10を用い、分化誘導物質であるRetinoic acid、Sodium butyrate等を負荷し、細胞の形成変化について検討を加えた。その結果RGM1ではSodium butyrateの負荷に伴い細胞の巨大化と分泌螺粒の増大が観察されたが、GSM系細胞ではapoptosisが誘導された。一方、ヒト胃粘膜生検組織を用いた検討ではH.pylori感染者にCOX-2の発現がみられた(Prostagland Leulotr Ess Fatty Acids 1998)。また胃癌症例の切除胃を用いた検討では腫瘍組織にCOX-2の過剰発現が見られる症例では高率にリンパ節転位や組織内リンパ管への腫瘍細胞浸潤が観察されることを見いだした(Am J Gastroenterol 1998)。現在腸上皮化生粘膜におけるCOX-2の発現について検討を加え、本遺伝子の発現が胃上皮細胞の化生化にどのように関連するか明らかにしつつある。ヒト由来の胃上皮ならびに腸上皮由来の細胞としてMKN28、MKN45、Kato-IIIなど、Caco-2、HCT116などの細胞株をそれぞれ用い、細胞形質に及ぼすcox-2過剰発現の影響ならびにCOX-2阻害(特異的阻害剤ならびにanti-sense oligonucleotideによった)を検討したところ、bFGF、VEGFその他の血管新生物質の産生と組織血管構築が事実上本遺伝子によって強力調節されていることを見いだした(Cell 1998)。

COX-2過剰発現に伴う胃由来細胞の腫瘍形成はCOX-2特異的阻害剤によるbFGF、VEGFの発現抑制に伴い抑制された(Am J Physiol 1998)。NOSの発現についても一部COX-2が関与していることを見いだしつつある。本研究では各種胃粘膜上皮細胞株ならびに胃組織標本を用い、胃腺管の形態形成ならびに分化に関与する因子に検討を加えた。まずretinoic acids、短鎖脂肪酸等の分化誘導・形質転換能について検討したところ、前者には有意な形質転換作用は見られなかったが、短鎖脂肪酸にはRGM1細胞に対する分化誘導作用があり細胞形態の変化とともに粘液顆粒の発生をみた。GSM細胞においてはこれに加え細胞がアポトーシスに陥った。そこで短鎖脂肪酸を周期的に負荷し分化した細胞のクローニングを試みたが、これらの細胞は短期間の培養後に死滅することが判明した。現在この細胞死の機構について検討を加えつつある。短鎖脂肪酸の分化誘導能はCOX-2の過剰発現により解除される。ヒト胃癌切除組織を用いた検討ではCOX-2の過剰発現が全体の約8割に見られ、このCOX-2の過剰発現が癌の進展度に有意に関連した。一方、癌周辺の背景胃粘膜ではほぼ全例にCOX-2の発現が検出され、この発現はH.pylori感染または腸上皮化生に関連していた。健常者胃粘膜生検組織においてはH.pylori感染者では感染胃粘膜に、非感染者では腸上皮化生部にCOX-2の発現がみられることから、本因子が胃における分化誘導異常に関与する可能性が示唆された。そこで三次元培養系を用い胃上皮細胞の腺管形成能に対するCOX-2の役割に検討を加えた。本モデルではTGFα、HGFにより管腔を有する腺管形成がおこり、これはCOX-2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやCOX-2阻害剤により抑制されるが、COX-1アンチセンスでは抑制されない。これらの結果より胃上皮の形態形成には本因子が重要な調節因子として機能していることが明らかにされた。現在ガストリンやある種の抗潰瘍剤に本因子を誘導する作用があることが判明しており、これらの薬剤の効果について検討しつつある。
ダイオキシンのラット性機能に及ぼす毒性とテストステロン投与の予防効果に関する研究

胎生期におけるdioxinの暴露は催奇形性、発癌性を誘発することが明らかとなっており、特に泌尿生殖器領域においては性機能低下、尿道下裂、精巣腫瘍の原因となりうることが示唆されている。aryl hydrocarbon recepter(AhR)はdioxinをリガンドとし、催奇形性、発癌性に関与していると考えられている。しかし、胎生期における泌尿生殖器でのAhRの発現パターンやその催奇形性における詳細な機序について今だ不明な点が多い。そこで、dioxin/AhRの泌尿生殖器における催奇形性誘導の意義について研究するため、家兎の各成長段階での泌尿生殖器におけるAhRおよびAhR nuclear translocator(ARNT)の発現量について検討することにした。正常雄家兎を生後0日齢、8週齢、40週齢の3群に分け、副腎、腎、前立腺、陰茎および精巣を摘出。組織を細切して、mRNAを抽出、cDNAを合成し、判定量的PCRを施行した。PCR産物をagarose gel泳動し、エチジウム・ブロマイド染色後にNIH imageを用いてbandの蛍光強度を定量化し、各組織でのAhRおよびARNTの発現量を測定した。AhR発現量は以下の通りであった。0日齢では精巣、陰茎、副腎、腎の順であり、前立腺はmRNAの抽出ができなかった。8週齢では前立腺、精巣、副腎、腎、陰茎の順。40週齢では腎、副腎、精巣、陰茎、前立腺の順。奇形や発癌の点でdioxinの影響を強く受けるとされる精巣や陰茎は胎生期に近い0日齢ではAhR発現量が多く、その後減少することがわかった。ARNT発現量は以下の通りであった。0日齢では精巣、副腎、腎、陰茎の順。8週齢では副腎、前立腺、腎、精巣、陰茎の順。40週齢では副腎、腎、精巣、陰茎、前立腺の順。精巣は胎生期に近い0日齢でARNT発現量が多かったが、陰茎0日齢よりARNT発現量は少なかった。また、副腎では時期に関係なくARNT発現量が多かった。胎生期におけるdioxinの曝露は催奇形性、発癌性を誘発することが明らかになっており、特に泌尿生殖器領域においては性機能低下、尿道下裂、精巣腫瘍の原因となりうることが示唆されてぃる。aryl hydrocarbon recepter(AhR)はdioxinをリガンドとする核内レセプター型の転写因子であり、Cytochrome P450やグルタチオンS転移酵素などの標的遺伝子の発現を介してdioxinによる、催奇形性、発癌性に関与していることが考えられている。最近、AhRノックアウトマウスでは2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCCD)曝露による催奇形性が認められないことが報告され、AhRはdioxinの催奇形性の誘導において必須であることが明らかとなったが、胎生期における泌尿生殖器でのAhRの発現パターンやその催奇形性における詳細な機序について今だ不明な点が多い。そこで、dioxin/AhRの泌尿生殖器における催奇形性誘導の意義について研究するため、まず家兎胎児の各発生段階での泌尿生殖器におけるAhRおよびAhR nuclear translocator(ARNT)の発現量と、組織レベルでの局在について検討することにした。AhRおよびARNT発現量は半定量的RT-PCR法およびwestern blotting法によって転写および蛋白レベルで評価し、さらに同分子の局在については免疫組織化学染色法によって評価する予定である。現在はHela細胞などの培養細胞株を用いてこれらのアッセイの詳細な至適条件について検討中である。

奇形や発癌の点でdioxinの影響を強く受けるとされる精巣や陰茎は胎生期に近い0日齢ではAhR発現量が多く、その後減少することがわかった。ARNT発現量は以下の通りであった。0日齢では精巣、副腎、腎、陰茎の順。8週齢では副腎、前立腺、腎、精巣、陰茎の順。40週齢では副腎、腎、精巣、陰茎、前立腺の順。精巣は胎生期に近い0日齢でARNT発現量が多かったが、陰茎0日齢よりARNT発現量は少なかった。また、副腎では時期に関係なくARNT発現量が多かった。