hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境負荷の少ない都市空間の創造に資するエコマテリアルの開発と設計指針

緑化による熱環境緩和効果の指標として,ヒートアイランドポテンシャルを採用した.顕熱輸送量の減少の評価に繋がると考えられる.異なる樹種による植被された大規模屋上庭園,大学キャンパスを対象にした.ヒートアイランドポテンシャルを用いて緑化の熱環境緩和効果を定量的に評価し,樹種による差異も明らかにした.昨年度までに実施した屋外人体温熱評価法を活用して,従来の空間と比較すべくいくつかの環境改善素材により形成される空間において実証を試みた.温熱負荷を計測し熱負荷が低減することが分かった.同時に,滞在者の官能評価において,環境改善素材の快適性を改善できることを確認した.都市域におけるヒートアイランド現象の対策技術として、従来にない機能性を付加した都市表面の構成材料(エコマテリアル)の開発を目指し、材料構造の熱的な最適設計について検討した。日射高反射率材料に関しては、その反射特性の予測手法を確立した。保水性材料に関しては、内部の微細構造と熱・水分移動の関係を考察し、持続性の高い水分蒸発特性を明らかにした。木装材料に関しては、優れた熱特性を生かした建物内外の熱負荷低減の効果を評価した。植物キャノピーに関しては、ふく射特性など熱輸送特性を検討し、人体熱負荷の低減効果を実証した。屋外温冷感指標について検討し、これらの材料を導入した都市表面の設計指針を作成した。エコマテリアルとして取り上げた日射高反射率材料、保水性材料、木装材料および植物葉群について、当初予定していた当該年度の研究課題については概ね達成されたと考えている。これらのエコマテリアルの物理的な熱性能に加えて、温熱ストレスの改善に関する評価に基礎的な知見が得られている状況であり、この点に関しても概ね当該年度の目標を達成したと考えている。エコマテリアルとして取り上げた日射高反射材料,保水性材料,木製外装および植物葉群について,物理的な熱性能に関して更なる理解を深めることを予定している.また温熱ストレス改善に関する評価に関しても,異なるふく射環境下での評価,非定常変化があるより現実的な状況で取り組みをしていく予定である.全体の取りまとめについても検討している.28年度が最終年度であるため、記入しない。環境熱工学エコマテリアルとして取り上げた日射高反射率材料、保水性材料、木装材料および植物葉群について、物理的な熱性能に関して更なる理解を深めることを予定している。また温熱ストレスの改善に関する評価に関しても、非定常変化があるより現実的な状況で取り組みをしていく予定である。被験者実験および木製外装の進捗状況の関係で,平成27年度に購入予定の物品費を繰り延べしたため,物品費が研究計画を下回っています。研究成果の発表および関連研究の情報収集のため,海外を含めた学術講演会に参加したので,旅費の予定金額を上回っています.気象観測装置の修理,国際会議参加費などへの出費のため,その他の項目が予定金額を上回っています.28年度が最終年度であるため、記入しない。被験者実験の進捗状況の関係で、平成26年度に購入予定の生理量測定装置を次年度の物品費として繰り延べしたため、物品費が計画金額を下回っています。研究成果を海外を含めた学術講演会で発表したため、旅費の予定金額を上回っています。繰り延べした物品費については,購入の方向で検討しています.旅費に関しては,今年度も予定通り執行していく予定です.
都市直下の地震による災害の防止に関する基礎研究

1995年兵庫県南部地震は6000余の人命を奪い、直接被害額が10兆円、間接被害額を含めると20兆円に達する被害を生ぜしめた。しかしながら、地震自体は日本周辺では平均して1年間に1回程度は発生している地震であった。したがって、被害を大きくしたのはその地震が阪神間の都市圏で起こったためである。こうした都市直下の地震の経験を後世に残し、問題解決を目標として特別領域研究が1996年に重点領域研究としで発足した。期間は4年であり、2000年3月に終了した。この研究は、8課題の計画研究と公募研究とから構成されており,計画研究には総計84名が参画した。また、公募研究には述べ194名が採択された。これらの研究費を受けた研究者は、毎年総括班により開催された総合シンポジュウムにおいて成果の発表を行うとともに,研究成果として和文ならびに英文による報告集を刊行し,関係方面に配布した。また、広報活動のひとつとして,ニュースレターを毎年3-4回発行し,全国の災害関係の研究者や防災事業担当者に配布した。さらに研究成果に対する広報活動の一環として,海外における報告会を開催した。すなわち,2000年2月28,29の両日にわたって台湾の台北市において,国家地震工学研究センターと連携してワークショップを開催し,4年間の研究成果の概要を領域代表者ならびに計画研究代表者から報告し、熱心な討論が行われた。また,2000年3月20、21,の両日にサンフランシスコにおいて、PEER(太平洋地震工学研究センター)、ATC(応用技術協議会)、ならびにNSFとの共催により,計画研究を中心とした報告会が開催され,熱心な討論が行われた。また、海外への広報活動として,英文による報告書を刊行し,海外の関係者に送付した。本研究は、平成8年度に発足した重点領域研究「都市直下の地震による災害の防止に関する基礎研究」(領域略称名:都市直下地震、領域番号:279、、領域代表者:土岐憲三)の総括班の活動を行ったものである。本総括班は本領域研究のもとにおかれた8件の計画研究を強力に推進する一方、公募研究の公募も行った。さらに総括班のもとに連絡委員会や幹事会そして総合シンポジウム実行委員会、広報委員会、国際委員会等の専門委員会を設置し、本領域研究の強力な推進を図った。総括班独自の主な活動は次のとおりである。1.総括班会議の開催総括班会議は平成8年9月25日、同年11月28日、平成9年3月1日と計3回開催した。主な討議内容は、各々の計画研究の進捗状況の報告および総合シンポジウム開催や国際的な研究協力のあり方、「都市直下地震」ニュースの掲載記事等に関するものであった。2.第1回都市直下地震災害総合シンポジウム開催と同論文集の刊行総括班の主催で1996年11月27日28日、京都市のルビノ京都堀川に於てシンポジウムを開催した。このシンポジウムは、8件の計画研究の研究報告と83編の一般講演があった。参加者は延べ143名で活発な討論がなされた。また、論文集を刊行し配布、郵送した。3.重点領域研究「都市直下地震」ニュースの発行と配布計画研究、公募研究の採択状況やシンポジウムの案内、総括班会議の報告、最新のニュース等を関係機関、研究者に広報するため、計3号のニュースを発行し郵送した。4.英文研究紹介冊子刊行と海外の研究者への郵送特に計画研究の内容を英文化し、広く海外の研究者に郵送し、本領域研究が国際的に評価されるよう計った。

さらに年度末には、計画研究や公募研究の研究業績等をとりまとめた研究成果報告書を刊行した。本研究は、平成8年度に発足した重点領域研究「都市直下の地震による災害の防止に関する基礎研究」(領域略称名:都市直下地震、領域番号:279、領域代表者:土岐憲三)の総括班の活動を行ったものである。本総括班は、平成8年度に引き続き本領域研究の下におかれた8件の計画研究を強力に推進する一方、公募研究の公募も行った。さらに総括班のもとに連絡委員会や幹事会そして総合シンポジウム実行委員会、広報委員会、国際委員会等の専門委員会を設置し、本領域研究の強力な推進を図った。総括班が今年度行った主な活動は次のとおりである。1).総括班会議は平成9年5月7日、同年9月3日、同年11月19日、平成10年3月11日と計4回開催し、各々の計画研究の推進および総合シンポジウム開催や国際的な本領域研究の紹介、「都市直下地震」ニュースの掲載記事等について討議した。2).総括班の主催で1997年11月18日19日、東京都のスクワール麹町に於て第2回都市直下地震災害総合シンポジウムを開催した。このシンポジウムには、8件の計画研究の研究発表と105編の研究発表があった。参加者総数は350名で活発な研究討論がなされた。また、論文集を刊行し同シンポジウムでの配布および関係者に送付した。3).昨年度に引き続き今年度も本領域研究の下で実施されている活動全般を、大学研究者のみならず、行政関係者や技術者にも知ってもらうため、毎号約1000名宛に「都市直下地震」ニュースを発行送付して、研究成果の社会への還元の一環とした。今年度は計3回発行した。4).本領域研究の英文研究紹介冊子刊行して、海外の研究者260人に送付し、本領域研究が国際的にも理解・評価されるよう計った。本研究は、平成8年度に発足した重点領域研究(平成10年度より特定領域研究(A))「都市直下の地震による災害の防止に関する基礎研究」(領域略称名:都市直下地震、領域番号:279、領域代表者:土岐憲三)の総括班の活動を行ったものである。本総括班は、平成8,9年度に引き続き本領域研究のもとにおかれた8件の計画研究を強力に推進する一方、公募研究の公募も行った。総括班が今年度に実施した主な活動は次のとおりである。1.総括班会議の開催総括班会議は平成10年5月13日、同年9月17日、同年10月25日、平成11年3月15日の計4回開催した。主な討議内容は、各々の計画研究の推進および総合シンポジウム開催や国際的な本領域研究の紹介、「都市直下地震」ニュースの掲載記事等に関するものであった。2.第3回都市直下地震災害総合シンポジウム開催と同論文集の刊行総括班の主催で平成10年10月24日25日、北海道大学学術交流会館において第2回都市直下地震災害総合シンポジウムを開催した。この第2回シンポジウムは、8件の計画研究の研究発表と143編の研究発表があった。参加者総数は260名で活発な研究討論がなされた。また、論文集を刊行し同シンポジウム参加者への配布と関係機関、研究者に送付した。
マルチモールド連鋳による異種材料から成る複合ロータス金属の創製

多数の一方向に伸びた孔をもつロータス金属は,今後輸送機などの軽量材料として使用することが期待されている。本研究では,Al-Si, Al-Cu, Al-Si-Mg等のアルミニウム合金を用いて一方向凝固によりロータス金属を作製し,凝固組織と気孔形状の関係を調べた結果,気孔はデンドライト枝間の共晶相に生成し,気孔の形状や寸法が周囲のデンドライトの形状やデンドライト間隔と一致することを明らかにした。また,マグネシウムを水素雰囲気中で一つの側面の上部と底部に銅冷却盤を取り付けた鋳型に鋳込み,二方向からの冷却により凝固させ,ロータス型ポーラスマグネシウムを作製した。凝固方向に平行な断面には,それぞれの冷却面から垂直に伸びた気孔が途中で合流し,最終凝固部へ成長しているのが観察された。本研究では,気孔成長方向の実験値と有限差分法による二次元伝熱凝固解析で得られた温度分布との比較により,気孔は固液界面にほぼ垂直に,温度勾配にほぼ平行に成長することを明らかにした。また,固液界面同士の衝突部で観察される,気孔成長の停止,二つの界面から成長してきた気孔同士の合体,湾曲した成長,粗大気孔生成のメカニズムを明らかにした。加圧ガス雰囲気中で金属を一方向凝固させることにより一方向に並んた円柱状気孔を有するロータス金属の作製が可能であるが、本研究課題ではこの原理を応用し、内型・外型から成る鋳型を有する連続鋳造法を用いて、表層部と内部で異なる組成及び気孔特性を有する複合ロータスアルミニウム合金を創製することを目的としている。これにより内部に気孔率の高い材料を、表層部に強度の高い材料を配置することができれば軽量構造材料を創製が可能であると期待できる。しかし、これまで合金元素量が気孔に及ぼす影響は明らかになっていないため、初年度は研究の第1段階として、アルミニウム合金の組成が気孔生成・成長に与える影響を明らかにした。水素雰囲気中で連続鋳造法によりロータスAl-Si合金を作成した結果、Si濃度の増加に従って気孔率、気孔径は増加した。気孔は主にデンドライト間の共晶相領域に観察されることから、凝固する際に主に共晶相から共晶界面に排出された水素ガスが気孔生成に寄与していると考えられる。A6061および純アルミニウムで希釈したA6061を用いて、鋳型鋳造法によりロータスAl-Mg-Si合金を試みた。A6061試料の断面には主に等軸晶が観察され、気孔は長く伸びていなかった。凝固温度範囲が広く組成的過冷却により等軸晶が晶出する場合、固液界面の移動に明確な方向性がなく、生成した気孔は特定の方向を持たずに成長すると考えられる。A6061を希釈した試料においては、初晶α相は柱状晶でその間に方向性のある気孔が観察された。また、温度勾配の増加あるいは凝固速度の現象により柱状晶および方向性のある気孔を生成しやすいことも明らかとなった。以上から、アルミニウム合金の組成及び作成条件と気孔形態の関係を明らかにした。次年度以降、これらの知見を内型・外型から成る鋳型を有する連続鋳造法に応用し、複合ロータスアルミニウム合金の創製を行う。加圧ガス雰囲気甲で金属を一方向凝固させることにより一方向に並んだ円柱状気孔を有するロータス金属の作製が可能である。本研究課題では,この原理を各種ロータスアルミニウム合金の作製に応用する場合に凝固組織が気孔形成に与える影響を明らかにすることを第一の目的とし,これらの知見を基にして表層部と内部で異なる組成及び気孔形態を有する複合ロータスアルミニウム合金を創製することを第二の目的としている。本年度は,水素雰囲気中で連続鋳造法によりロータスAl-Cu合金の作製を行った。気孔は引出方向に平行に成長した初晶αデンドライトに囲まれた共晶相領域に形成し,デンドライトの成長に沿って一方向に成長しており,気孔率、気孔径はCu濃度の増加に従って増加した。平均気孔径は平均デンドライトー次枝間隔より数十μm小さく,いずれも引出速度の減少に従い増加した。これらの結果から,亜共晶Al-Cu合金が凝固する際に主に共晶相から共晶界面に排出された水素ガスが気孔生成に寄与していることが明らかとなった。

また,減圧Ar雰囲気でAl-Si溶湯にCa(OH)_2ペレットを添加し,溶湯の熱によりCa(OH)2から分解,生成した水素を利用して連続鋳造法によりロータスAl-Si合金の作製を行い,気孔生成メカニズムを明らかにした。これらの代表的な共晶系アルミニウム合金における凝固組織と気孔形成の関係を明らかにすることにより得られた知見は,新たな軽量構造材料の創製プロセスを構築するための基礎となるとともに,他の共晶系合金を用いたロータス金属の作製を行う場合にも応用することができる。次年度は、これらの知見を内型・外型から成る鋳型を有する連続鋳造法に応用し、複合ロータスアルミニウム合金の創製を行う。加圧ガス雰囲気中で金属を一方向凝固させることにより一方向に並んだ円柱状気孔を有するロータス金属の作製が可能である。本研究課題では,この原理を各種ロータスアルミニウム合金の作製に応用する場合に凝固組織が気孔形成に与える影響を明らかにすることを第一の目的とし,これらの知見を基にして場所により異なる気孔形態を有するロータス金属を創製することを第二の目的とした。本年度は,水素雰囲気中で連続鋳造法によりロータスAl-Cu合金およびAl-Ti合金の作製を行った。気孔は引出方向に平行に成長した初晶αデンドライトに囲まれた共晶相領域に形成し,デンドライトの成長に沿って一方向に成長した。平均気孔径は平均デンドライト一次枝間隔より数十μm小さく,いずれも引出速度の減少に従い増加した。また,共晶組成を有するAl-33wt.%Cuを用いて作製したロータス金属には,円柱状の気孔が共晶相の成長方向と同様の方向に一方向に成長していることが観察された。さらに、包晶系合金であるAl-Tiを用いて作製したロータス金属には,α相と平行に一方向に成長した気孔が観察された。また,場所により異なる気孔形態を有するロータス金属を創製するための基礎的な研究として,水素雰囲気で鋳型鋳造法により二方向から指向性凝固を行わせ,異なる方向性をもつ気孔を有するロータスマグネシウムを作製し,凝固過程での鋳塊の温度変化と気孔成長方向の関係を調べた。伝熱・凝固解析の結果と実験から得られた気孔成長方向との比較から,気孔は温度勾配および固液界面の法線方向におおよそ平行に成長していることがわかった。また一方向凝固の場合と異なり,鋳塊内の気孔の中には湾曲した形状を持つ気孔も観察された。これは凝固中の鋳塊内において,固液界面にて成長途中であった気孔が,固液界面前方の温度勾配の方向の変化に沿うように成長したからであることが明らかになった。
レニン活性化とプロレニンの受容体に関する研究

レニン活性化機構については不明の点が多いが、細胞内でのレニンの活性化はレニン顆粒内で生ずる可能性が示唆されている。我々はレニン活性化酵素の局在と性状を明らかにするために本研究を行った。〈方法〉イヌ賢のレニン顆粒は密度勾配超遠心法により単離した。ヒト不活性型レニンはヒト羊水より得た。ヒト不活性レニン濃度は特異的レニンRIAキットにより測定した。ヒトのプロレニンをcDNAをCOS細胞に発現させた〔^<35>S〕ープロレニンを基質としてレニン顆粒成分とともにインキュベ-トし、SDS電気泳動で分子量の変化を調べた。〈結果〉(1)ヒト羊水不活性型レニンを、賢レニン顆粒インキュベ-トした。レニン顆粒画分は、トリプシンと同等の活性化能を有していた。至適pHは56であった。なおレニン活性化はNーエチルマレイミドにより部分阻害を受けた。(2)レニン顆粒膜とインキュベ-トしたものでは分子量約48,000(プロレニン)と約45,000(レニン)の2本のバンドから得られた。なおEDTA,セリンプロテア-ゼ阻害剤によってはプロセシングは抑制されず、Nーエチルマレイミド、Eー64、ロイペプチン存在下ではプロレニンのバンドのみ得られプロセシングは抑制された。〈考察〉インスリンや他のホルモンの中には分泌顆粒中ではプロセシングを受けるものも報告されており、レニンの活性化に関しては、レニン顆粒中で生ずる可能性を示唆する報告がある、(1)我々は今回、ヒト羊水不活性型レニンをイヌ賢レニン顆粒膜成分とインキュベ-トすることにより、レニンの活性化を認めた。(2)ヒトレコンビナントプロレニンを用いて、レニンのプロセシングがレニン顆粒膜成分によりなされる結果を得た。以上のことはレニン活性化がレニン顆粒に存在する酵素により生じる可能性を示唆するものと考えられる。その酵素としての性状はシステインプロテア-ゼであると考えられるが更に今後の検討を要する。本年度はレニン顆粒によるレニン活性化を中心に研究を遂行した。レニン活性化機構については不明の点が多いが、細胞内でのレニンの活性化は分泌顆粒(レニン顆粒)が成熟していく過程で分泌顆粒内で生ずる可能性が示唆されている。我々は細胞内小器管でのレニン活性化酵素の局在を明らかにするため本研究を行った。<方法>イヌ腎のレニン顆粒は不連続密度勾配超遠心法により単離した。レニン顆粒膜は凍結、融解を繰り返し単離した。ヒト不活性型レニンはヒト羊水より流安分画により得た。ヒト活性型レニン濃度はヒト活性型レニンのみに特異性を有するレニンRIAキットにより測定した。<結果>ヒト羊水より得た不活性型レニンを、イヌ腎より得たレニン顆粒又はレニン顆粒膜成分(100μg)存在下に200μ1の0.1M MES緩衝液、pH6(含0.1%ルプロ-ル)中で2時間インキュベ-ション後、ヒト活性型レニン濃度を測定した。

不活性型レニンのみを同一緩衝液中でインキュ-ベ-トしたものをコントロ-ルとした。またトリプシンによる活性化も行った。レニン顆粒画分は、トリプシンと同等の活性化能を有し、同膜成分も84%の活性化能を保持していた。このレニン顆粒膜成分によるレニン活性化はインキュベ-ション時間及び膜成分量に依存した増加を示し、至適pHは56であった。なおレニン活性はNーエチルマレイミドにより部分阻害を受けたがEDTAにより阻害されなかった。<考按>インスリンや他のホルモンの中には分泌顆粒中でプロセシングを受けるものも報告されており、レニンの活性化に関しては、レニン顆粒中で生ずる可能性を示唆する報告がある。我々は今回、ヒト羊水不活性型レニンをイヌ腎レニン顆粒膜成分とインキュベ-トすることにより、レニンの活性化を認めた。このことはレニン活性化がレニン顆粒に存在する酵素により生じる可能性を示唆するものと考えられる。初年度はヒト羊水の不活性レニンが腎臓のレニン顆粒膜により活性化される知見を得た。本年度はヒトのレコンビナントプロレニンを基質としてレニン顆粒膜によりプロセシングが生ずるか否かの検討を行った。〈方法〉ヒトのプロレニン_cDNAをCOS細胞に発現させ放射標識された[ ^<35>S]ープロレニンを得た。[ ^<35>S]ープロレニンを基質としてショ糖密度勾配超遠心法にて得たイヌ・レニン顆粒成分とともに50μlの0.1M MES緩衝液、pH6(含0.1%ルブロ-ル)中で3時間インキュベ-ション(37°C)し,SDS存在下に電気泳動を行ない、分子量を算定し、その変化を調べた。[ ^<35>S]ープロレニンのみを同一緩衝液中でインキュベ-トしたものおよびトリプシン処理したものをそれぞれコントロ-ルした。〈結果〉[ ^<35>S]ープロレニンのみのコントロ-ルの電気泳動では分子量約48,000(プロレニン)に単一バンドとして出現した。一方トリプシン処理したものでは分子量約48,000と約45,000(活性型レニン)の2本のバンドを得た。レニン顆粒膜又はその膜成分とインキュベ-トしたものでは分子量約48,000と約45,000の2本のバンドから得られた。なお[ ^<35>S]ープロレニン顆粒膜とのインキュベ-ションに際し、酵素阻害薬の影響をも検討した。その結果、EDTA,セリンプロテア-ゼ阻害薬によってはプロレニンのプロセシングは抑制されず,Nーエチルマレイミド,Eー64,ロイペプチン存在下ではプロレニンのバンドのみ得られプロセシングは抑制された。〈考察〉我々は従来の研究でレニン活性化がレニン顆粒により生ずる可能性を示唆する結果を得ている。今回はヒトレコンビナントプロレニンを用いて、レニンのプロセシングがレニン顆粒膜成分によりなされる結果を得た。その酵素としての性状はシステインプロテア-ゼであると考えられるが更に今後の検討を要する。
ＡＤＨＤ動物の不注意脳波と不注意オペラント行動への環境調整と治療薬の有効性の原理

てんかんモデルELマウスについて,筆者らはADHDモデルとしての妥当性を示してきた。行動分析学における衝動性研究パラダイムの一つとして,遅延価値割引がある。これは,即時小報酬(SS)と遅延大報酬(LL)の選択肢を設ける事態であり,前者の選択が衝動的選択とされる。これまでLL選択肢の遅延時間を変数として衝動性を解明してきたのに加えて,本研究ではSS選択肢の遅延時間を変数とした。その結果,DDYマウス(対照系統)では2価値の心理的等価点が0秒と7.5秒の間に存在する可能性が示唆され,先行研究を支持した(Kubo et al., 2014)。ELはSSの遅延時間が0秒の場合に有意に多くの反応をSSに割り当てており,即時強化を選好する衝動的選択を示し,ADHDモデルとしての妥当性が高まった。ミスマッチ陰性電位(MMN)様反応は,標準刺激に混入した逸脱刺激に対して出現する陰性方向の事象関連電位であり,前注意過程を反映する。ADHD児ではMMN振幅が健常児に比べて有意に低いという知見がある(Kemner et al., 1996)。本年度は,WKY(対照ラット)とSHR(モデルラット)における標準的なオドボール刺激に対するMMN様反応を計測し,さらにmethylphenidate投与効果を検討した。その結果,大脳皮質表面で,WKYでは無投与時に出現していたMMN様反応が投与により消失し,一方SHRでは無投与時には出現しなかったMMN様反応が出現するというMPHの逆説的効果が確認された。ADHDが注意のみならず前注意過程を含んだ不全である可能性がモデル動物において示唆された。またADHDの臨床的知見と治療薬効果がモデル動物で表現可能であることが示唆された。本研究の骨子であるモデル動物を用いた脳波研究と行動分析学的研究の両面について,それぞれ必要な知見を得られたこと。このうち,脳波研究においては,標準的オドボール刺激に対するMMN様反応によって注意表出以前の認知過程からADHDの不全が生じることと,methilphenidateの逆説的効果がモデル動物において表出した意義は小さくなく,行動分析学的研究においては,SS選択肢の遅延時間を変数とすることで,時間と報酬量の2価値の関係を幅広く捉えることができた。ひきつづき,脳波研究と行動分析学・行動薬理学的研究の双方からADHDモデル動物を用いてADHDの不注意と衝動性の原理を探るとともに,応用行動分析をより精緻化するための行動原理を究明する。そのために,ELマウスの他種の割引課題による衝動性や潜在制止学習による不注意を検討し,また,ラットに続いてマウスのミスマッチ陰性電位を指標とした前注意機能を検討する。これらをまとめて,本研究課題全体で得られた体系的知見を総合考察する。てんかんモデルELマウスについて、筆者らはADHDモデルとしての妥当性を示してきた。これは,即時小報酬と遅延大報酬の選択肢を設ける事態であり,前者の選択が衝動的選択とされる。これまでに筆者らは離散試行課題による遅延価値割引を用いて,ELマウスの衝動的選択を報告してきた。本研究では,よりフリーオペラントに近い並立連鎖スケジュールを用いて,ELマウスと対照系統DDYマウスの選択行動を検討し、離散試行課題での結果と比較した。その結果、異なる手続きの間で差がみられなかったことより、ELマウスの衝動性についての議論をより一般化できると考えられる。ADHD児の脳波学的知見として健常児に比べてθ波領域が強く、β/θ値が高いことがある(Fox et al.,2005)。最近ではθ/β値が診断基準の一つとしての可能性が議論されており、ADHD児においてこの値を低下させるバイオフィードバック訓練も試みられている(Van Doren et al., 2017)。そこでADHDモデル動物として検討されている高血圧自然発症ラット(SHR)およびその対照系統であるWKYの硬膜上および海馬CA1において、安静時の脳波を測定し、周波数分析を行い6つの周波数帯(δ,θ,α1,α1,β1,β1)に分類した。また、ADHD治療薬methylphenidate投与による効果も検討した。その結果、θ/β値には系統間に違いや薬効は認められなかった。SHRはこの脳波学的指標においてはヒトADHDとは異なるのかもしれない。一方で、さらに詳細に周波数分析を行うことで新たな知見が見出される可能性もある。また、無投与時にSHRの海馬β1が対照系統よりも強く、これがMPH投与により減弱する傾向を示した。本研究の骨子であるモデル動物を用いた脳波研究と行動分析学・行動薬理学的研究の両面について、それぞれ必要な知見を得られたこと。このうち、脳波研究においては、近年、ヒトADHDにおいてθ/β値を診断指標とする可能性や治療法の開発が進展しており、この観点での知見を売ることができた。また、行動分析学・行動薬理学的研究においては、筆者らがこれまでに明らかにしてきた離散試行での遅延価値割引課題における衝動性と並立連鎖スケジュールにおける衝動性が同様であることを明らかにできた。

これまでLL選択肢の遅延時間を変数として衝動性を解明してきたのに加えて,本研究ではSS選択肢の遅延時間を変数とした。その結果,DDYマウス(対照系統)では2価値の心理的等価点が0秒と7.5秒の間に存在する可能性が示唆され,先行研究を支持した(Kubo et al., 2014)。ELはSSの遅延時間が0秒の場合に有意に多くの反応をSSに割り当てており,即時強化を選好する衝動的選択を示し,ADHDモデルとしての妥当性が高まった。ミスマッチ陰性電位(MMN)様反応は,標準刺激に混入した逸脱刺激に対して出現する陰性方向の事象関連電位であり,前注意過程を反映する。ADHD児ではMMN振幅が健常児に比べて有意に低いという知見がある(Kemner et al., 1996)。本年度は,WKY(対照ラット)とSHR(モデルラット)における標準的なオドボール刺激に対するMMN様反応を計測し,さらにmethylphenidate投与効果を検討した。その結果,大脳皮質表面で,WKYでは無投与時に出現していたMMN様反応が投与により消失し,一方SHRでは無投与時には出現しなかったMMN様反応が出現するというMPHの逆説的効果が確認された。ADHDが注意のみならず前注意過程を含んだ不全である可能性がモデル動物において示唆された。またADHDの臨床的知見と治療薬効果がモデル動物で表現可能であることが示唆された。本研究の骨子であるモデル動物を用いた脳波研究と行動分析学的研究の両面について,それぞれ必要な知見を得られたこと。このうち,脳波研究においては,標準的オドボール刺激に対するMMN様反応によって注意表出以前の認知過程からADHDの不全が生じることと,methilphenidateの逆説的効果がモデル動物において表出した意義は小さくなく,行動分析学的研究においては,SS選択肢の遅延時間を変数とすることで,時間と報酬量の2価値の関係を幅広く捉えることができた。今後もひきつづき、脳波研究と行動分析学・行動薬理学的研究の双方からADHDモデル動物を用いてADHDの不注意と衝動性の原理を探るとともに、応用行動分析をより精緻化するための行動原理を究明できるよう推進する。そのために、ELマウスの確率割引課題における衝動性や、潜在制止学習による不注意や、ミスマッチ陰性電位を指標とした前注意機能などを検討していく計画である。ひきつづき,脳波研究と行動分析学・行動薬理学的研究の双方からADHDモデル動物を用いてADHDの不注意と衝動性の原理を探るとともに,応用行動分析をより精緻化するための行動原理を究明する。そのために,ELマウスの他種の割引課題による衝動性や潜在制止学習による不注意を検討し,また,ラットに続いてマウスのミスマッチ陰性電位を指標とした前注意機能を検討する。これらをまとめて,本研究課題全体で得られた体系的知見を総合考察する。ADHDモデルマウスの衝動性を検討するため、オペラント装置を用いた遅延割引課題に加えて、新たに確率割引課題を実施して、衝動性の特性を総合的に検討する予定である。そのため、次年度にオペラント装置の制御装置に組み込まれたソフトウェアを改良する必要がある。この改良を制御装置の製造元に依頼する。
肝免疫の恒常性維持と破綻に及ぼす腸内環境因子の同定

肝臓は免疫寛容を特徴とする臓器である.肝免疫寛容における自然免疫の役割を腸内細菌の関与という観点から明らかにすることを目的とした.肝臓の免疫担当細胞における抗原提示能が他臓器の免疫細胞に比較して低下していると共に,自然免疫応答に関わる受容体の発現も低下しており,自然免疫と獲得免疫への活性化の両側面において機能が抑制されていることが分かった.肝免疫寛容への腸内細菌の関わりを明らかにするために脂肪負荷による肝臓の炎症モデルマウスを作成し門脈血の代謝産物を網羅的に解析したが,水溶性代謝物および血清短鎖脂肪酸の濃度に有意な差は見られなかった.脂溶性代謝産物を含めたさらなる解析が今後の課題である.肝臓は門脈を介して腸管から吸収された外来抗原に常に暴露され,自然免疫が活性化しているにもかかわらず,免疫寛容が働いている特殊な臓器である.本研究の目的は,肝免疫寛容や肝炎症に影響をあたえる腸内環境の役割について,分子レベルで解明することである.既知の肝炎症モデルマウスを準備した.これから,腸内細菌叢と腸管から門脈を通って流入する物質に着目し,詳細な検討をすすめる予定である.本年度は,まず超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料をマウスに負荷して非アルコール性脂肪性肝炎モデルを作成し肝臓の炎症,線維化を評価した.コントロールとして用いたコリン欠乏メチオニン減量飼料投与マウスでは,脂肪肝,肝の腫大化が見られ,一部に発癌したマウスが存在したが,超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を投与したマウスでは8週後に肝の腫大と脾腫が見られ,さらに8-12か月後には肝臓に癌を伴うマウスが増加した(一部では黄疸が見られた).この結果より,アミノ酸置換負荷下において高脂肪食が発癌を促進することが分かった.なお,TLR2,TLR4,TLR9各ノックアウトマウスでも超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の投与によってC57BL/6Jマウスと同様に線維化,発癌が見られた.TLR4はグラム陰性の細菌構成成分のLPSやパルミチン酸などの飽和脂肪酸を認識して炎症を引き起こすことが知られているが,このモデルにおいて各自然免疫応答受容体のリガンドである菌体成分や脂肪酸などが門脈を経由して肝臓流入し,単独で肝臓内の細胞を刺激して線維化,発癌を誘起することは否定的と考えられた.高脂肪食により腸内細菌叢が変化することは知られている.そこで,肝臓に炎症と発癌を引き起こす因子として,高脂肪食により変化した腸内細菌叢が産生する代謝産物に着目し,どのような腸内細菌による代謝産物が門脈を経由して肝臓に流入するか,門脈血の血清を用いて網羅的にメタボローム解析を行った.今後は,各負荷マウスの腸内細菌叢の変化も解析することが必要と考えている.肝臓は免疫寛容を特徴とする臓器である.肝免疫寛容における自然免疫の役割を腸内細菌の関与という観点から明らかにすることを目的とした.肝臓の免疫担当細胞における抗原提示能が他臓器の免疫細胞に比較して低下していると共に,自然免疫応答に関わる受容体の発現も低下しており,自然免疫と獲得免疫への活性化の両側面において機能が抑制されていることが分かった.肝免疫寛容への腸内細菌の関わりを明らかにするために脂肪負荷による肝臓の炎症モデルマウスを作成し門脈血の代謝産物を網羅的に解析したが,水溶性代謝物および血清短鎖脂肪酸の濃度に有意な差は見られなかった.脂溶性代謝産物を含めたさらなる解析が今後の課題である.自然免疫担当細胞における免疫寛容が働いていることを分子レベルで確認した.肝炎症モデルマウスにおける腸内細菌叢と門脈より流入する物質の検討を今後行っていく予定である.医歯薬学腸内細菌叢の変化をメタゲノムに手解析し,門脈に流入する物質をメタボローム解析にて検討し,相互の関係,および肝臓の自然免疫担当細胞への影響を検討する.初年度に行う予定であったメタボローム解析が,マウスの準備に時間を要し,次年度となったためである.繰り越し分は予定通り,メタボローム解析や腸内細菌叢の解析に使用する予定である.
低血糖脳症の治療介入に向けたヒトにおけるグルコース再灌流障害の解明

老年医学の大きな問題「エイジングドミノ」を進行させうる低血糖脳症は、治療介入により食い止めれる病態である。応募者は、1臨床研究では、多施設調査にて低血糖脳症の予後因子を同定し、2基礎研究では、2010年から開発した、従来より簡便な動物モデル「低血糖短時間昏睡モデル」を確立、神経細胞障害を軽減する薬剤を検討した。以上より、低血糖脳症の治療標的を「グルコース再灌流障害で発生する酸化ストレス」と考え、臨床での検証を計画した。低血糖補正時のグルコース再灌流で酸化ストレスがヒトでも発生、血糖変化と酸化ストレスが相関、予後や後遺症、MRIやSPECT(IMP・IMZ)を検討することが本研究の概要である。
シナプス伝達系でのアストロサイトの役割

「ニューロン・ニューロン間のシグナル伝達を支えるのはグリアである」といっても過言ではない。有髄神経のミエリン鞘(オリゴデンドロサイト、シュワン細胞)やアストロサイト上のニューロトランスミッター受容体刺激に伴う、アストロサイト間のギャップジャンクションを介したCa^<2+>の伝播など、アストロサイトの役割を無視してシグナル伝達の研究は成立しない。われわれは、これまでニューロン性細胞の増殖・分化機構を追求するなかで、ニューロンとアストロサイトの共存培養系でニューロンは著明な分化(神経突起伸長とシナプス形成)をとげることを見いだし、これらの作用はアストロサイトが産生するタンパク質性因子であることを確認した[Brain Res.622(1933)299-302,659(1994)169-178]。昨年度の本重点研究の成果として、(1)細胞内カルシウムシグナリング法を用いたシナプス形成モデル系において、大脳皮質、海馬、中隔野、線条体より調製したニューロンとアストロサイトを同系、異系の組み合わせで共培養しそれぞれのシナプス形成能を測定したところ、脳の同じ部位から調製したアストロサイトとニューロンの共培養系でのシナプス形成が一番良くシナプス形成することを見いだした。さらに(2)アストロサイト細胞内のCa^<2+>の動きを修飾する薬剤(IP_3レセプター拮抗薬やアストロサイトのギャップジャンクションの阻止薬)を用いて、短期と長期薬剤刺激によるシナプス形成の変化を検討した結果、シナプス形成にあずかるニューロンの細胞内Ca^<2+>の同期にはIP_3レセプターを介した細胞内Ca^<2+>の変動と、フィーダーアストロサイト間のギャップジャンクションを介したCa^<2+>の伝播が重要であることを確認した。またこの薬剤の長期投与によりシナプス形成能も阻害されることがわかった。
シアリダーゼの局所イメージング新技術を利用したインフルエンザNA研究の新展開

A型およびB型インフルエンザウイルスの表面などに見られる酵素ノイラミニダーゼ(NA)のシアリダーゼ活性を蛍光イメージングする新技術の応用法の開発と高性能化を行うことで、ウイルスおよびNAの研究を新展開させるツールの開発をめざす。疎水性の蛍光物質ベンゾチアゾリルフェノール誘導体(BTP3)にシアル酸(N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac)を結合させて蛍光性をオフ制御したシアリダーゼ蛍光イメージング剤BTP3-Neu5Acはシアリダーゼ活性の存在位置を蛍光染色できる。さらに、BTP3-Neu5Acと抗インフルエンザ薬(NA阻害薬)を併用することで、NAの薬剤耐性を検出することができる。この原理とタンパク質濃縮フィルターを利用して、簡単な操作で短時間に薬剤耐性を検出する方法を開発した。その感度は市販のインフルエンザ診断薬の検出感度と同等以上であった。また、インフルエンザウイルスのNAのシアリダーゼ活性が、一般的な酵素で最適とされる37°Cよりも高い温度に適していることが分かった。多検体の薬剤耐性を短時間に高感度で調査できることで、薬剤耐性インフルエンザウイルスの監視や疫学情報の取得に貢献するものと期待される。本研究成果はオープンジャーナル誌に報告した。BTP3-Neu5AcをウイルスのNA機能解析に応用するには、性能的にやや不十分なところがあった。そこで、インフルエンザウイルス感染細胞(内)のシアリダーゼ活性を高精度に蛍光イメージングするためのイメージング剤の高性能化を行った。シアリダーゼ活性の存在位置を高精度に蛍光染色する、あるいは蛍光化の感度を向上させるための構造改良基盤を確立した。高性能化したイメージング剤は、NAのシアリダーゼ活性の挙動解析などの基礎研究に貢献するものと期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。水に不溶性の蛍光物質であるベンゾチアゾリルフェノール誘導体(BTP3)にシアル酸(Neu5Ac)を付加したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を開発した。シアリダーゼを発現するインフルエンザA型及びB型ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることができ、蛍光化された細胞からはウイルス株の単離もできる。本研究はシアリダーゼ蛍光イメージング剤を利用して、ウイルスシアリダーゼの機能解析と抗インフルエンザ薬(シアリダーゼ阻害剤)の耐性化検出法の開発を行う。BTP3-Neu5Acがシアリダーゼを持つパラインフルエンザウイルスである、ヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルス、さらにこれらの感染細胞に発現するシアリダーゼ活性を蛍光イメージングすることに成功した。バキュロウイルス-タンパク質発現システムによりインフルエンザA型ウイルスの膜糖タンパク質であるノイラミニダーゼ(NA、シアリダーゼ)を分泌型タンパク質に改変し、精製した。細胞内への取り込まれる様子をBTP3-Neu5Acによりイメージングすることを試みるため、このシアリダーゼにエンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAを作製した。また、抗インフルエンザ薬(シアリダーゼ阻害剤)に耐性化したインフルエンザA型ウイルスやその感染細胞あるいは薬剤耐性化変異を導入したシアリダーゼ発現細胞を選択的に蛍光イメージングする方法を確立した。薬剤耐性ウイルスの感染細胞集団を選択的に蛍光イメージングし、薬剤耐性株を高効率に単離することにも成功した。シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」が、シアリダーゼを持つヒト病原ウイルスであるヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルスとそれらの感染細胞の蛍光イメージングに利用できることを報告した。これらのウイルスの蛍光化された感染細胞集団から、ウイルス株の単離も可能である。バキュロウイルス-タンパク質発現システムにより酵素活性を有するNAを生産することに成功した。また、インフルエンザA型ウイルスのNAは膜糖タンパク質であるため、溶液中では可溶化せずに凝集する。タンパク質を回収するとき細胞を破砕する必要があるため、細胞内在性のタンパク質の混在や精製操作の煩雑さなどの問題がある。そこで、シアリダーゼの膜貫通領域を除去し、分泌型タンパク質に改変した分泌型NAの生産及び精製に成功した。また、エンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAも作製した。これらのNAのシアリダーゼ活性を確認した。BTP3-Neu5Acと抗インフルエンザ薬(NA阻害剤)を併用することで、簡便、迅速に薬剤耐性インフルエンザウイルスやその感染細胞を選択的に蛍光イメージングすることに成功した。薬剤耐性ウイルスと感受性ウイルスの混合液の感染細胞から、薬剤耐性ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることで、薬剤耐性ウイルス株の極めて高効率な単離に成功したことは予想以上の結果であった。水に不溶性の蛍光物質であるベンゾチアゾリルフェノール誘導体(BTP3)にシアル酸(N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac)を付加したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を開発してきた。BTP3-Neu5Acは、シアリダーゼ活性を介してインフルエンザA型およびB型ウイルスや一部のパラミクソウイルス(センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス)の感染細胞を蛍光イメージングする。生きた状態で感染細胞を蛍光可視化することで、ウイルス株を単離できる。本研究はシアリダーゼ活性の蛍光イメージング技術を利用して、ウイルスシアリダーゼ活性の機能解析と抗インフルエンザ薬(シアリダーゼ阻害剤)の耐性化検出法の開発および耐性化機構の解析を目的とする。抗インフルエンザ薬(シアリダーゼ阻害剤)に耐性化したインフルエンザA型ウイルスと薬剤感受性ウイルス株を混合感染させた細胞において、薬剤耐性ウイルス感染細胞を選択的に蛍光イメージングし、薬剤耐性株を高効率に単離する方法を報告した。

各薬剤に対する耐性化変異を導入したシアリダーゼ発現細胞においても、各薬剤に対する耐性化を選択的に蛍光イメージングできた。薬剤耐性化変異を導入したシアリダーゼ発現細胞を選択的に蛍光イメージングする方法を確立した。また、シアリダーゼ活性のシアル酸分子種に対する基質特異性を簡便に測定する蛍光基質により、ウマとヒトのインフルエンザA型ウイルスのシアリダーゼの基質特異性を迅速に測定する方法を確立した。ネイティブのシアリダーゼがホモ四量体であることから、バキュロウイルスタンパク質発現システムを使用して、四量体化シグナルを挿入した分泌型シアリダーゼタンパク質四量体を作製した。抗インフルエンザ薬(シアリダーゼ阻害剤)とBTP3-Neu5Acを同時に反応させることで、薬剤耐性インフルエンザウイルスと感受性ウイルスを混合感染させた細胞から、薬剤耐性ウイルス感染細胞を選択的に蛍光イメージングできた。さらに蛍光化細胞から単離したウイルス株の遺伝子を抽出し、シアリダーゼ遺伝子の薬剤耐性変異を検出することで、薬剤耐性ウイルス株を高効率に単離できることが分かった。特定の抗インフルエンザ薬に耐性化する既知変異を導入したシアリダーゼ遺伝子を哺乳動物細胞に発現させた。別々の薬剤に対して、各薬剤の耐性化シアリダーゼ発現細胞を選択的に蛍光イメージングすることができた。これらの結果を論文や総説で報告した。シアリダーゼ活性を簡便迅速に蛍光検出する技術確立の一環として、シアル酸分子種に対する基質特異性を簡便に測定できる方法を確立した。ウマインフルエンザウイルスとヒトインフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性において、シアル酸分子種に対する基質特異性が異なることを明らかにし、論文に報告した。バキュロウイルスタンパク質発現システムにより酵素活性を有する分泌型シアリダーゼを生産することに成功した。さらに四量体化シグナルを挿入し、ネイティブのシアリダーゼと同様なホモ四量体構造を有する分泌タンパク質として生産できるようにした。しかし、四量体化シアリダーゼの生産量は、実験に適用するには十分ではなかった。上記のように研究方策が多岐にわたってきたが、各方策ともに進展している。また、論文や総説として成果を報告できたことから、本研究は当初の計画以上に進展していると判断した。水に不溶性の蛍光物質であるベンゾチアゾリルフェノール誘導体(BTP3)にシアル酸(N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac)を付加したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を開発し、シアリダーゼ活性を有するインフルエンザA型およびB型ウイルスや一部のパラミクソウイルス(センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス)の感染細胞を蛍光イメージングする手法を確立してきた。
免疫抑制受容体による抗原特異的T細胞の免疫応答制御の解明と細胞療法への応用

K562細胞株に、HLAクラスI分子及びCD80/86、PD-L1を遺伝子導入して作成した人工抗原提示細胞を用いることで、健常人の末梢血T細胞から腫瘍抗原であるWT1特異的細胞傷害性T細胞を効率よく誘導することが可能であることを示した。また、白血病患者の末梢血中に存在するCD8陽性PD-1陽性細胞分画に自己の白血病細胞に反応性を示すT細胞が存在していることを確認し、PD-1の発現が白血病細胞特異的T細胞を分離するマーカーの一つとなる可能性を示した。以上の成果は、今後の細胞療法への応用が期待される。1.抗原提示細胞上に発現するPD-L1の抗原特異的CTL誘導における促進的作用メカニズムの検討CD80/86とPD-L1とを様々な組み合わせで遺伝子導入したK562人工抗原提示細胞に、CMVpp65抗原由来エピトープペプチドをパルスして、CMV既感染健常ドナーの末梢血より分離したCD3陽性T細胞を刺激したのち、テトラマー法を用いてCMV-CTLを染色し、セルソーターを用いてCMV-CTLの分離が可能か検討を行った。CMV既感染健常ドナー中に存在するCMV-CTLは非常に少数であるが検出可能であることが確認できたため、mRNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析に向けて検討を開始した。2. K562にCD80/86とPD-L1を遺伝子導入した人工抗原提示細胞の有効性の検討腫瘍抗原であるWT1およびNY-ESO1のエピトープペプチドを、CD80/86およびPD-L1を様々な組み合わせで遺伝子導入したK562人工抗原提示細胞にパルスして、健常人末梢血から分離したT細胞と共培養を行うことで腫瘍抗原特異的CTLの誘導を行った。どちらの腫瘍抗原においても、CD80/86とPD-L1の両方を遺伝子導入した人工抗原提示細胞を用いた場合にCTLの誘導が可能であることを確認した。3. PD-1の発現を目印にした腫瘍抗原特異的CTLの分離ならびに新たな腫瘍抗原同定の検討急性骨髄性白血病患者の末梢血中に存在するCD8陽性T細胞のうち、PD-1を高発現する分画の分離を行った。この分画にはWT1特異的CTLがより多く含まれており、さらには腫瘍細胞に対する細胞傷害活性をより高く示すことを確認した。抗原提示細胞上に発現するPD-L1の抗原特異的CTL誘導における促進的作用メカニズムの検討に関しては、当初計画していたmRNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析までは実施することが出来なかったが、実施に向けての検討を行い、解析を開始する準備は整ってきている。K562にCD80/86とPD-L1を遺伝子導入した人工抗原提示細胞によって、健常人末梢血から腫瘍抗原特異的CTLを誘導することが可能であることを複数の腫瘍抗原で確認できたため、さらなる検討を行う予定である。急性骨髄性白血病患者の末梢血中のCD8陽性T細胞のうち、PD-1を高発現する分画において腫瘍細胞と反応するCTLの検出が可能であることが確認できたため、今後は腫瘍抗原特異的CTLの分離へと進める予定である。1)抗原提示細胞上に発現するPD-L1の抗原特異的CTL誘導における促進的作用メカニズムの検討CD80/86およびPD-L1を様々な組み合わせで遺伝子導入したK562人工抗原提示細胞に、CMVpp65抗原由来エピトープペプチドをパルスして、CMV既感染健常ドナーの末梢血より分離したCD3陽性T細胞を刺激したのち、テトラマー法を用いてCMV-CTLを染色し、セルソーターでCMV-CTLの分離が可能か複数の健常ドナーで検討した。CMV-CTLは検出可能であったが非常に少数であり、mRNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析が可能となるような分離の手順を検討している。2) K562にCD80/86とPD-L1を遺伝子導入した人工抗原提示細胞の有効性の検討腫瘍抗原であるWT1ペプチドを、CD80/86およびPD-L1を遺伝子導入したK562人工抗原提示細胞にパルスして、健常人末梢血から分離したT細胞と共培養を行ったところ、複数の健常ドナーからWT1-CTLを誘導することが可能であった。また、T細胞全体を刺激してCTLを誘導するよりも、CD8陽性T細胞のみを分離して刺激した場合に、より効率よくCTLを誘導可能であった。そこで、ヒト臍帯血からの抗原特異的CTLの誘導に向けた検討も開始した。3) PD-1の発現を目印にした腫瘍抗原特異的CTLの分離ならびに新たな腫瘍抗原同定の検討白血病患者の末梢血中に存在するCD8陽性T細胞のうち、PD-1陽性分画と陰性分画とをセルソーターを用いて分離・増殖させ、増殖したT細胞を患者由来白血病細胞と共培養し反応性を比較した。その結果、増殖後もPD-1の発現が維持されていた症例においては、PD-1陽性分画から増殖させたT細胞でより高い細胞増殖反応と細胞傷害活性を認め、PD-1陽性分画中に腫瘍抗原特異的CTLが存在していることが示唆された。K562細胞株に、HLAクラスI分子及びCD80/86、PD-L1を遺伝子導入して作成した人工抗原提示細胞を用いることで、健常人の末梢血T細胞から腫瘍抗原であるWT

1特異的細胞傷害性T細胞を効率よく誘導することが可能であることを示した。また、白血病患者の末梢血中に存在するCD8陽性PD-1陽性細胞分画に自己の白血病細胞に反応性を示すT細胞が存在していることを確認し、PD-1の発現が白血病細胞特異的T細胞を分離するマーカーの一つとなる可能性を示した。以上の成果は、今後の細胞療法への応用が期待される。CD80/86とPD-L1とを様々な組み合わせで遺伝子導入したK562人工抗原提示細胞を用いて、CMV既感染健常ドナーの末梢血中に含まれるCMV-CTLを刺激し、刺激後のCMV-CTLをセルソーターを用いて分離して、mRNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析を実施し、さらにはその後の検討を進める。K562にCD80/86とPD-L1を遺伝子導入した人工抗原提示細胞を用いて、他の腫瘍抗原特異的T細胞の誘導を試みる。また、臍帯血を入手して、臍帯血中のT細胞からもK562人工抗原提示細胞を用いて腫瘍抗原特異的CTLの誘導を試みる。その際に、今まではIL-2を用いて誘導を行っていたが、IL-7、IL-12、IL-15などのサイトカインを添加することによる誘導効率の向上に関しても検討を行う。造血器腫瘍患者の検体を引き続き採取し、CD8陽性T細胞のうちPD-1を高発現する分画から腫瘍抗原特異的CTLの分離を進める。その後に、5' RACE PCR法を用いたT細胞受容体の同定や、腫瘍細胞由来のcDNAライブラリーを用いた標的抗原の同定を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。血液内科学29年度が最終年度であるため、記入しない。