hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
赤芽球におけるＬＭＯ２を介した転写制御機構の解明

細胞分化における遺伝子発現の調節には細胞系列特異的な転写因子が関与していると考えられており、このうち赤血球の分化においては、GATA-1転写因子が重要な役割を果たしている。GATA-1は、Scl/TAL1、LMO2、LDB1、ETO2などの転写因子もしくは共役因子と複合体を形成していることが明らかとなっており、これらの因子がGATA-1による遺伝子発現制御に影響を及ぼしていることが予想される。このうち非DNA結合蛋白質であるLMO2は、赤芽球におけるその強制発現により分化が抑制される報告があるものの、赤芽球系遺伝子発現への影響および赤芽球エピゲノム形成への寄与など、その分子学的メカニズムは明らかとなっていない。本研究においては、LMO2の赤芽球遺伝子の発現制御の詳細な発現プロファイル及び発現抑制に寄与する分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。具体的にはヒトCD34陽性細胞からの赤芽球分化系を用い、LMO2のノックダウンを行った後の遺伝子発現変化についてのマイクロアレイ解析とともに、免疫沈降シーケンス法を施行する予定である。平成23年度は、まず赤芽球系細胞であるK562細胞におけるLMO2の意義について解析を行った。K562細胞において、LMO2のノックダウンを行うことにより、以前に我々がG1E細胞で行った結果と同様に多くの遺伝子が発現上昇を認めたが、一方でグロビン遺伝子をはじめとした赤血球特異的遺伝子の発現低下を認めたことを明らかとした。今年度は、CD34陽性細胞由来の赤芽球分化系において同様にLMO2のノックダウンを行うことにより、同様にグロビン遺伝子の発現低下を認め、その成果を雑誌に投稿中である。今後これらの実験系を用いて、LMO2を介した転写抑制メカニズムについて明らかにしていく。24年度が最終年度であるため、記入しない。GATA-1は、Sc1/TAL1、LMO2、LDB1、ETO2などの転写因子もしくは共役因子と複合体を形成していることが明らかとなっており、これらの因子がGATA-1による遺伝子発現制御に影響を及ぼしていることが予想される。今年度は、まず赤芽球系細胞であるK562細胞におけるLMO2の意義について解析を行った。K562細胞において、LMO2のノックダウンを行うことにより、以前に我々がGlE細胞で行った結果と同様に多くの遺伝子が発現上昇を認めたが、一方でグロビン遺伝子をはじめとした赤血球特異的遺伝子の発現低下を認めたことを明らかとした。さらに、CD34陽性細胞由来の赤芽球分化系において同様にLMO2のノックダウンを行うことにより、同様にグロビン遺伝子の発現低下を認めた。ヒト赤芽球分化系の確立及び変動遺伝子の同定まで施行済みであるため。

24年度が最終年度であるため、記入しない。変動遺伝子群のヒストン修飾の変化についてクロマチン免疫沈降法などを用いて明らかとするとともに、その結果をもとに転写抑制に寄与しうる分子メカニズムを予測・検証する。
ナノ空間における水素のオルト-パラ転換と分子形成

本研究では,ナノ空間を有する試料を作製し,その空間への水素分子吸着を調べた.平坦面とは異なり,ナノ空間では大きな吸着エネルギーを持つことを明らかにした.アモルファス氷表面では,核スピン異性体であるオルト水素からパラ水素へのオルトーパラ転換が起こることを初めて見いだし,その転換時間を実験的に決定した.オルトーパラ転換の理論モデルとして,あらたに電場誘起モデルを提案した.本研究では,イオン性物質である氷やイオン結晶および炭素系物質表面における水素分子の吸着状態を詳細に明らかにするとともに,水素分子オルトーパラ転換と分子形成機構の解明を行う.特にアモルファス氷やカーボンナノチューブに存在するナノ細孔に焦点を当てて研究を進める.ナノサイズの細孔内では,分子の回転運動が制限を受け,さらに電気双極子場の影響で強い四重極相互作用が働く.これらの制限空間効果の影響を明らかにすることでナノ空間の果たす役割を解明する本研究では,ナノ空間を有する試料を作製し,その空間への水素分子吸着を調べた.平坦面とは異なり,ナノ空間では大きな吸着エネルギーを持つことを明らかにした.アモルファス氷表面では,核スピン異性体であるオルト水素からパラ水素へのオルトーパラ転換が起こることを初めて見いだし,その転換時間を実験的に決定した.オルトーパラ転換の理論モデルとして,あらたに電場誘起モデルを提案した.本年度は,ナノ空間を有する試料として,カーボンナノチューブとアモルファス氷の作製を行い,この表面における水素の吸着エネルギーを熱脱離分光法を用いて測定し,さらに赤外吸収分光を用いた振動解析,共鳴イオン化法を用いた核スヒン状態弁別測定を行った.カーボンナノチューブに水素分子を吸着させ熱脱離スペクトルを測定したところ,2つの特徴的なピークが観測された.径の大きな分子との共吸着を調べることで,2つのピークがチューブ内部とチューブ外部に吸着した状態に対応することを明らかにした.清浄なAg(111)表面に13KでH_2OおよびD_2Oを60L曝露し,氷試料を作製した.水の熱脱離スペクトルを測定し,水分子が非解離で吸着していることを確認した.さらに低速電子線回折の測定を行い,氷が周期構造を持たないアモルファス状態にあることを明らかにした.この表面に10KでH_2およびD_2を吸着させ,熱脱離スペクトルを測定したところ,14-28Kにかけてブロードな脱離ピークが観測された.共鳴イオン化法を用いて,脱離水素分子の内部状態を測定し,H_2ではオルトーパラ転換が,D_2ではパラーオルト転換が生じていることを見いだした.ナノ空間に束縛された水素分子を分光する手法として,誘導双極子に起因した赤外吸収に着目し,測定系の開発を行った.NaCl表面で吸着H_2の測定を行ったところ2種類の吸収ピークが観測されることがわかった.分子の吸着配向を調べるため,偏光特性が顕著なB状態を利用した共鳴イオン化法の開発を行い,105nmの真空紫外光を用いて回転状態を分光できることを明らかにした.本研究では,イオン性物質である氷やイオン結晶お王び炭素系物質表面における水素分子の吸着状態を詳細に明らかにするとをもに,水素分子オルトーパラ転換機構の解明をめざしている.特にアモルファス氷やカーボンナノチューブに存在する細孔に焦点を当てて研究を進めている.ナノサイズの細孔内では,分子の回転運動が制限を受け,さらに電気双極子場の影響で強い四重極相互作用が働く.本年度は,まず前年度に行ったアモルファス氷上での水素のオルトーパラ転換時間測定実験の高精度化を行い,H2分子の転換時間が370(+340,-140)s,D2の転換時間1220(+2980,-580)sであることを明らかにした.さらに,転換機構として,氷表面の電場効果を考慮した理論モデルの構築を進めた.また,イオン結晶試料としてNaCl蒸着膜への水素分子吸着の実験を行い,赤外吸収分光を用いて水素分子の伸縮振動に起因する吸収ピークを観測した.水素分子は赤外不活性であるが,イオン結晶表面の電場により誘導双極子が誘起され,これにより赤外活性になったと考えられる.さらに炭素ナノチューブへの水素分子吸着について極低温熱脱離分光を用いて調べた.窒素分子との共吸着効果を調べることで,ナノチューブグルーブサイトとナノチューブ内側サイトへの吸着を弁別できることを示した.水素分子の内部状態を観測する実験手法であるレーザー誘起蛍光法の圧力依存性を調べ,蛍光強度と蛍光寿命が分子の回転状態に依存することを見いだした.本研究では,氷やイオン結晶および炭素系物質表面における水素分子の吸着状態を詳細に明らかにするとともに,水素分子オルトーパラ転換機構の解明をめざしている.本年度は,水素分子形成実験のために,新たにマイクロ波を用いた原子状水素源の開発を行った.石英放電管を設置し,3段の差動排気システムを構築した.冷却機構を取り付け放電管の長寿命化を試みた.質量分析器で水素原子強度をモニターしながら導入水素圧力・放電パワーを最適化した。また発生する水素の角度分布を測定し,チューブ内の散乱シミュレーションと比較検討を行った.

熱脱離分光と赤外吸収分光を用いて炭素ナノチューブへの一酸化炭素吸着実験を行い,2種類の吸着サイトに相当する吸収スペクトルを観測し,熱脱離の結果と対応させ,炭素ナノチューブのグループと内側に吸着した一酸化に対応することを明らかにした.前年度までに行った氷表面でのオルトーパラ転換の解析を行い,表面不均一電場によりスピン一軌道相互作用が増強されるモデルの提案を行った.前年度に行ったレーザー誘起蛍光法の圧力依存性から得られた衝突誘起電子遷移確率を,ボルン近似に基づく理論計算を行い,実験結果と一致する結果を得た.オルトーパラ転換時間の理論考察として,酸素が吸着した銀表面における水素分子の系に関する研究を進めた.第一原理電子状態計算の手法を用いて,銀表面上での酸素分子の最安定吸着状態を求めた.分子状吸着および解離吸着した場合の安定な吸着構造と,そのときの磁気状態を計算し,分子状吸着では酸素がスピン偏極すること,酸素分子に誘起され基盤銀原子もスピン偏極することを明らかにした.さらに、その磁気構造が水素分子のオルソ・パラ転換を加速させることを示した.また、金属表面電子と水素分子を含んだモデルハミルトニアンを用いて、ダイナミクスの定式化を行った.本研究では,氷やイオン結晶および炭素系物質表面における水素分子の吸着状態を詳細に明らかにするとともに,水素分子の形成とオルトーパラ転換機構の解明を目的として研究を行った.これまで研究を進めてきたAg表面での水素分子の吸着状態とそれが核スピン転換に与える影響に関して,実験と理論考察を行った.水素分子は質量が小さいため,物理吸着状態では回転運動を保持し,量子回転子として振る舞い,さらに表面ポテンシャルの影響で回転状態の縮退が解ける.回転状態を弁別した熱脱離スペクトルを測定し,エネルギー分裂幅が7.5meVであることを明らかにした.一方,磁気量子数が0の状態は,カートホイール回転に相当し,核スピン転換に有効であることが理論的に示されている.吸着水素分子が安定化したJz=0の状態を占有することで,スピン転換が促進されることを理論的に示した.ナノ孔を持つNaClに,水素分子を吸着させると誘導双極子の影響で赤外吸収が観測されることを見いだしてきた.今回,新たに酸素分子および二酸化炭素分子の誘導双極子効果を実験的に調べ,水素分子と比較検討を行った.水素分子では誘導吸収強度が小さいにもかかわらず,振動数シフトが大きいことを明らかにし,その原因について考察した.またナノチューブに吸着した二酸化炭素については,スペクトルが非対称な反吸収様の形状を示すことを新たに発見した.分子形成実験を行い,その内部状態を共鳴イオン化法を用いて測定し,反応温度に比較して回転状態が強く励起されていることを見いだした.共鳴イオン化法と相補的なレーザー誘起蛍光法について,新たにHD分子での実験を行い,緩和寿命の回転状態依存性を実験的に明らかにした.23年度が最終年度であるため、記入しない。23年度が最終年度であるため、記入しない。
光学的計測法による聴覚皮質の音声特徴抽出初期過程の研究

聴覚の役割の一つは外界にある様々音の中から特定の音を抽出することにある。そのためには、多くの音の中から必要な音のみを取り出して聞くという処理が必要であり、多くの音の中でどの音どうしはつながっていてどの音は切れているということ(音のグループ化や補完)や、どの方向から何の音が聞こえてくるかを検知する必要がある。この研究では、このような処理が聴覚皮質でどのように行われるのかに関して、特に(1)無音区間(gap)の検知と雑音による音の補完への一次聴覚皮質(AI)の関与、(2)AIにおける複合音処理、(3)高次聴覚野の両耳性活動特の3つテーマについて生理学的に調べた。動物はモルモットを用い、聴覚皮質活動を光学的計測法を用いて計測した。無音区間(gap)を含む純音に対しては、最初の音に対する活動(R1)とgap後の音に対する活動(R2)が現れた。gap後の活動R2を指標にすると、R2はgapが5ms以下では現れず5-10ms以上で現れることから、AIは5ms以下のgapを検知していないと考えられる。また、雑音を挿入するとR2が抑制されることが分かった。R2の活動がgap検知を示しているとすると、雑音によるR2抑制が音の補完に関係する可能性が示された。複合音処理に関して、音声に含まれる各成分の時間的ズレや周波数間隔の処理について、音の成分を単純化して2つの純音で調べると。AIは周波数が近く(0.6-0.8オクターブ以内)時間的に近い(10-15ms以下)音をグループ化し、周波数的・時間的に遠い音を分離する傾向にあることが分かった。これらの結果は音の補完・分離・統合に関係するAIの時間的および周波数的興奮・抑制機構を示していると考えられる。一方両耳性活動は、AIとAIIの周辺に位置するベルト帯中のPとVP野で強く現れ、これらの領域が音源定位に関係することが分かってきた。一次聴覚皮質(AI)では周波数が空間的に表示されていることがこれまでの研究から分かっている。しかし、この空間的表示が音の特徴抽出にどうかかわるのか、また音の時間経過が聴覚皮質でどう処理されるのかについては分かっていない。この研究では、純音、FM音、gapを含む音に対する聴覚皮質活動を光学的計測法を用いて計測し、聴覚皮質がこれらの音の検出にどう関わるかについて調べた。ネンブタール麻酔下でモルモットの聴覚皮質を露出し、電位感受性色素RH795で染色し、12x12チャンネルのフォトダイオードアレイを用いて神経活動を記録した。装置の計測範囲は3x3mmであるので、計測場所をずらして数回の計測を行い、聴覚皮質全体の活動をコンピュータで合成した。純音に対する活動は、一次聴覚皮質の周波数バンドにそって活動スポットが移動する形で現れる。FM音に対する活動は、活動開始部は純音の場合と同じであるが、その後FM音の瞬時周波数に従った活動スポットが周波数バンドを横切って移動する。無音区間(gap)を含む純音に対しては、最初の音に対する活動(R1)とgap後の音に対する活動(R2)が現れる。純音に対してはR1のみが現れる。AIとその後方に位置するAIIの周辺にはベルト帯と呼ばれる高次聴覚皮質が存在している。光学的計測で調べた結果、7個の領域(D、DP、P、VP、VM、V、VA)が確認された。これらの高次聴覚野では異なる周波数が同一の場所に重なって表示される傾向にあり、音が周波数-時間パターンとして表示されていないようである。P野とVP野では音の方向に依存する活動が光学的に計測されており、音源定位関係することが分かってきた。AIは周波数が近く(0.6-0.8オクターブ以内)時間的に近い(10-15ms以下)

音をグループ化し、周波数的・時間的に遠い音を分離する傾向にあることが分かった。これらの結果は音の補完・分離・統合に関係するAIの時間的および周波数的興奮・抑制機構を示していると考えられる。一方両耳性活動は、AIとAIIの周辺に位置するベルト帯中のPとVP野で強く現れ、これらの領域が音源定位に関係することが分かってきた。
DNAシーケンスと導電性の関係の理論化学的研究

当グループで開発してきた超高精度高速オーダーN法を用いるとともに、有限系オリゴマーの電子状態からエネルギーバンドを抽出する方法を構築し、DNAの塩基配列データと導電性の関係が得られるように開発した。例えばA-type,B-typeのGC-DNAおよびAT-DNAのNa対イオンがある場合とない場合などに適用し、導電性と構造の関係を議論した。量子化学計算は小さな分子に対して成功を遂げたものの、ランダム高分子やアモルファス固体等の、非周期的な巨大系に対しては無力である。よって、不規則凝集系でも、その電子状態を超効率的にしかも精度良く計算できる計算プログラムを完成させ、生体機能をミクロな立場から機能設計できる方法を構築する。現在開発段階にあるElongation法をさらに発展させ、電子論的な立場からミクロな視点で機能メカニズムを明らかにし、新規機能性バイオポリマーの設計を行う。そのために、まず高精度で電子状態を記述するために電子相関効果をElongation法導入するとともに、蛋白質のアミノ酸配列、DNAの塩基配列データと関連情報、立体構造、機能データを体系的に処理し、解析するための機能設計プログラムを構築し応用を行う。一方で、高分子の導電性を議論するためには、有限系オリゴマーの電子状態からエネルギーバンドを抽出する方法の構築が必要である。そのための基礎方法論の構築と、高分子系への応用を行い、導電性を解析するためのツールを構築する。本研究の目的は、Elongation法によって種々のDNA鎖とその一部修飾された系の局所的バンド構造や修飾部の周囲の塩基対の効果を高精度で効率よく算出することであり、DNAシーケンスおよびその分子構造と電気伝導性の可能性の関係、およびメカニズム解析を行うことである。そのために、まず領域局在化軌道を基底として局所状態密度を、DNAにおける任意の場所において効率的に抽出する方法を完成させた。今回はDNAにおける元も簡単な系B-Poly(dG)・Poly(dC)に対して本方法を用いた計算を行い、まず全状態密度を調べた。その結果、HOMOおよびLUMO付近に孤立的なピークが現れた。これらのピークの原因を、DNA上の各部位を局所状態密度から系統的に調べた結果、HOMOへの寄与はグアニン(G)であり、LUMOへの寄与はシトシン(C)であった。つまり、G-C塩基対のエネルギーギャップ<糖・リン酸鎖のエネルギーギャップとなり、G-C塩基対をスルースペース的に伝導していることが示された。さらに糖・リン酸鎖のバンドはグアニンとの相互作用によってリフトアップしでいることもわかった。これらの結果は他の論文で論じちれている内容と一致するものである。今後、種々のシーケンスによる性質の違いを最適な構造を用いて検討するために、本方法に構造最適化手法を導入することが次の目標である。そこで、DNAの一部が別のシーケンスに置き換わった場合に、その場所に集まった領域局在化軌道基底で局所的に構造最適化ができる局所エネルギー勾配法の開発を開始しているところである。そのために、有限鎖から無限鎖のエネルギーバンド構造を抽出する方法を完成させるとともに、不純物や欠陥が含まれる系に対しても適用可能かどうか詳細にチェックを行った。まだDNAには応用できていないが、その前段階として、導電性高分子系やナノチューブに対してその有効性を確認した。DNAの電気伝導性と分子構造の関連をさぐるために、まず現在のプログラムを並列化させたあと、種々のDNA鎖とその一部修飾された系の局所的バンド構造、および修飾部の周囲の塩基対の効果を高精度で効率よく算出する予定である。一方、実験との比較においては溶媒効果の重要性がわかったため、分極連続体(PCM)法をElongation法に導入し、水中でのDNA計算が可能となるように発展させた。実際にB-DNA(Poly(dG)・Poly(dC))の20残基に対して本方法を用いた計算を行い、溶媒のない真空中での計算と同様、極めて高精度で計算可能であることを確認した。さらに、NLO特性を調べるためにFinite-Field法によるElongation法によってB-DNAを計算したところ、DNAの分極率および超分極率を得ることができた。余りにも系が膨大であるため従来法との詳細な一致を確認できていないが、クラスターサイズの小さい部分では良好な一致を確認した。当初はMultiple expansion法と基底カットオフ法を組み合わせたQFMM-AO-cutoff法を開発する予定であったが、三次元系に対するGeneralized Elongation法のプログラム開発が順調に進んだため、方針を変更して今後はGeneralized Elongation法を用いて開発・応用計算を行うことにしている。本方法によると、DNAの螺旋に沿って伸長する際に、らせんが戻ってきた場合にも一度凍結したLMOを再度解凍して相互作用に含めることができるため、自由自在にDNAを変形することが可能となる。

応用を行う前に、本方法のアルゴリズム完成させることを優先した方がよいと考え、応用計算よりもむしろプログラム開発に取り組んでいる段階である。溶媒の下でDNAの電子状態の理論的重合が可能となるよう、まずは分極連続体(PCM)法をElongation法に導入し、水中でのDNA計算が可能となるように発展させた。PCM法による水中でも、Elongation法の全エネルギーの従来法との誤差が10^<-8>au/atomと、極めて高い精度を達成していることを確認した。さらに電場の効果が導入できるようにプログラムを開発し、電場下でのDNAの分極率、超分極率の計算を行った。また、Elongation法による各シーケンス上における局所状態密度の算出、不純物や欠陥が含まれる系に対しても適用可能かどうか詳細にチェックを行った。その前段階として、ナノチューブなどのπ電子が非局在化している大規模系に対して、局在化の悪い幾つかの軌道をActive領域に導入することにより、計算精度を2桁も上げることが出来た。DNAの電気伝導性を論じるためには、非局在化した軌道の扱いが必須であるが、本方法により、導電性を有する場合でも、本方法により高精度で効率よく電子状態を算出することができると期待できる。現在のElongation法では、各ステップごとにそれぞれの座標を用意する必要があったが、全系の座標をひとつ用意すると、必要なパラメータさえ入力すれば、あとは自動的にシーケンスを伸長していけるようにプログラムの改良を行った。実際にB-DNA (Poly(dG)・Poly(dC))の20残基に対して本方法を用いた計算を行い、本方法により溶媒のない真空中での計算と同様、溶媒中でも極めて高精度で計算可能であることを確認するとともに、手軽にDNAの計算が出来るようになった。さらに、NLO特性を調べるためにFinite-Field法によるElongation法によってB-DNAを計算したところ、DNAの分極率および超分極率を得ることができた。しかし、γ(2次の超分極率)において、電場とともに負で増大するという現象をおきたため、現在その原因を調べている。またMultiple expansion法と基底カットオフ法を組み合わせたQFMM-AO-cutoff法を開発し、さらにオーダーNに向けて計算効率がアップしたため現在種々の系に適用している。DNAを認識するためのタンパク質構造の設計は重要である。その前段階としてまず、2重らせん、3重らせんの巨大タンパク質の電子状態を高精度に計算できるように開発した。これまで主としてG-C塩基配列からなるB-DNAについてはいろいろ検討してきたが、A-DNAとの比較においても、溶媒効果や種々の塩基配列に対して構造と機能の関係についてさらなる解析を行なった。また、A-T塩基配列からなるDNAについても、A-typeおよびB-Typeともに計算し、さらにアルカリ金属をドープした系について系統的に調べ、エネルギーバンドや局所状態密度との関係を解析した。
心的ストレスと選好：バイオマーカーを併用した経済実験

2017年度末に実施したパイロット実験(被験者150人)の解析を行った。この実験ではストレス課題の前後に唾液を採取することで、ストレスの影響をコルチゾールなどの生理データから検出している。2018年度は、本実験の設計に備えて、生理データから検出されたこららのストレス値が主観ストレスや選好(割引率や危険回避度)の変動とどのような相関を持つかを解析した。解析の結果、第1に、われわれが開発したストレス課題(PC上での暗算タスク)が、予想通りに被験者の主観ストレスを高めると同時に、コルチゾールなどストレスホルモンで計測されるストレス強度を実際に高めることが明らかになった。第2に、その一方で、選好を推定する選択課題(割引課題、リスク選択課題)の設計に問題があったために、ストレスと選好の関係が実験からうまく計測できないことがわかった。パイロット実験のデータ解析に時間を要したうえに、上記「研究実績の概要」で述べたように、選好を推定する選択課題(割引課題、リスク選択課題)のデザインを改善する必要性が確認された。そのため、当初、2018年度中に本実験を行う予定であったが、2019年度内にさらなる予備実験を行うことで、今少し時間をかけて本実験を設計していくことに予定を変更した。2019年度中に、予備実験を行い、ストレスが選好に与える影響をうまく検出できる選択実験を設計していく。その結果を見たうえで唾液などの試料を調べる本実験を設計・実施し、解析を行っていく。2017年度末に実施したパイロット実験(被験者150人)の解析を行った結果、ストレス課題の設計には問題がない一方で、選好を計測する選択実験に改善の必要があることがわかった。そのため、2018年度に実施する予定であった本実験をさらに時間をかけて設計することにしたため、その実施が2019年度以降となり、未使用額が生じた。未使用分は、2019年度に、本実験の設計のために追加的に行うパイロット実験と本実験を実施するために使用する計画である。
光合成光阻害回避機構の緯度間・標高間種内変異の生理生態学的メカニズム

強すぎる光は光合成器官に傷害をもたらし、光阻害と呼ばれる光合成活性や成長速度の低下を引き起こす。これまで、植物が持つ光阻害回避機構について多くの研究が成され、葉緑体移動、熱放散、光化学系I/II均衡化(ステート遷移)、光化学系修復など、多様な回避機構に関する知見が蓄積されて来た。植物がこれだけ多くの光阻害回避機構を進化させてきたことは、光阻害耐性にそれだけ強い淘汰圧がかかってきたことを示唆するが、光阻害が種の分化・分布にどのように影響してきたかという知見は乏しい。本研究では、光阻害回避機構のうち、温度依存性があり、近年急速に研究が進んできた、光化学系I循環的電子伝達およびステート遷移能力の温度依存性にエコタイプ間で生育地の気温との相関が見られると仮説を立て、検証を行っている。世界各地で集められたシロイヌナズナエコタイプの種子をシロイヌナズナリソースセンター(ABRC)から取得し、共通圃場で生育した植物を、温度制御が可能なチャンバー内に入れ、複数の葉温で光化学系I循環的電子伝達および光化学系I/IIステート遷移能力を測定している。オーストラリア国立大学のChow教授に受入研究者となっていただき、材料の生育と測定について協力頂いている。これまでのところ、実験システムの立ち上げが終了し、38エコタイプでの測定を行った。既に、低温での光化学系I循環的電子伝達速度およびステート遷移応答速度とエコタイプの由来地の気温との相関が観察されており、これらの光阻害回避機構についても低温で高い活性を保つ能力を獲得できたかどうかが集団の分化・分布に影響したことを示す初めての結果になると期待される。残り2年間でエコタイプ数を120エコタイプまで増やす予定であり、光阻害耐性機構のうちどの能力がどの程度、光阻害耐性の種内変異に貢献しているかを明らかにできると考える。3年間を通して120エコタイプでの測定を予定している中で、1年目で実験システムの立ち上げと38エコタイプでの測定が遂行できたこと、さらに、期待していたエコタイプの由来地の環境との相関が見られたことから、順調に進展していると言える。これまで、順調に進展しているため、当初の予定通り今後も測定を行い、測定エコタイプ数を増やしていく方針である。内定年度:2017強すぎる光は光合成器官に傷害をもたらし、光阻害と呼ばれる光合成活性や成長速度の低下を引き起こす。
電位依存性カリウムイオンチャネルによる神経活動依存的なシナプス形成機構の解明

本研究では申請者が新たに細胞接着活性を持つ分子として見出した電位依存性カリウムチャネル、KCNXのシナプス形成における役割を明らかにすることを目的として、GFPーKCNXノックインマウスを作成し、抗GFP抗体による免疫染色を行い、外来性のKCNXの局在を検討したところ、海馬CA3領域透明層に発現することを確認した。また、KCNXの機能を解明するために、KCNX結合蛋白質を探索し、微小管関連タンパク質CLIP115とエンドサイトーシス関連タンパク質Dynaminを同定した。これらのことから、KCNXはイオンチャネルとして機能するのみならず細胞骨格や小胞輸送にも関与することが示唆された。本研究では神経活動に依存したシナプス形成の分子メカニズムを解明することを最終目標として、申請者が新たに細胞接着活性を持つ分子として見出した電位依存性カリウムチャネル、KCNXのシナプス形成における役割を明らかにする。本年度は、KCNXの詳細な発現時期や局在部位を組織や培養神経細胞を用いて、免疫電顕により解析するために、さまざまな抗体を作成し、検討したが、特異的な抗体が作成できず、内在性KCNXの局在を明らかにすることはできなかった。そのため、GFPーKCNXノックインマウスを作成し、抗GFP抗体による免疫染色を行い、外来性のKCNXの局在を検討したところ、海馬シナプス領域に発現することを確認した。現在、更なる局在解析を進めているところである。次にKCNXがどのような生理機能(シナプス形成や神経回路形成)を発揮するのかを神経活動電位とシナプス形成の関係に着目して、明らかにするために、KCNXのノックアウトマウスを作成した。現在、ノックアウトマウスにおける、脳の形態学的解析を行っているところである。さらに、KCNXを恒常的に発現する線維芽細胞を作成し、KCNXに依存した弱い細胞間相互作用を検出できるアッセイを構築し、KCNXによる細胞間相互作用が細胞外領域に依存し、ホモフィリックな活性であることを確認している。現在、この線維芽細胞と初代培養神経細胞の共培養によって、人工シナプスが形成されるかどうかを検討しているところである。本研究では神経活動に依存したシナプス形成の分子メカニズムを解明することを最終目標として、申請者が新たに細胞接着活性を持つ分子として見出した電位依存性カリウムチャネル、KCNXのシナプス形成における役割を明らかにすることを目的とした。まず、KCNXの詳細な発現時期や局在部位を組織や培養神経細胞を用いて、免疫電顕により解析するために、さまざまな抗体を作成し、検討したが、特異的な抗体が作成できず、内在性KCNXの局在を明らかにすることはできなかった。そのため、GFPーKCNXノックインマウスを作成し、抗GFP抗体による免疫染色を行い、外来性のKCNXの局在を検討したところ、海馬CA3領域透明層(歯状回顆粒細胞軸索がシナプスを形成する領域)に発現することを確認した。現在、電子顕微鏡レベルでの局在解析を進めているところである。次に、KCNXを恒常的に発現する線維芽細胞を用いて、KCNXに依存した弱い細胞間相互作用を検出できるアッセイを構築し、KCNXによる細胞間相互作用がその細胞外領域に依存し、ホモフィリックな活性であることを確認した。現在、その詳細なメカニズムの解析を進めている。さらには、現在、KCNXノックアウトマウスにおける、脳の形態学的解析を行っているところである。神経細胞生物学KCNXの機能を解明する第一歩として脳内発現部位や神経細胞内の局在をタンパク質レベルで明らかにする必要があるが、この目的に適した抗KCNX抗体の作成が非常に困難であったため、目的の達成が遅れている。そのため、次善の策としてGFPーKCNXノックインマウスを作成することにより、現在局在解析を進めている。次に、KCNXによる細胞間相互作用が非常に弱いため、その活性を検出するアッセイの構築に時間を要した。また、KCNXを恒常的に発現する線維芽細胞の作成も困難であったため、目的の達成に遅れが生じた。しかし、現在、この問題は解決している。1)KCNXのタンパク質レベルでの脳内局在と神経細胞ない局在を詳細に明らかにする。GFPーKCNXノックインマウスにおいて海馬シナプス領域に発現することを確認しているが、脳の他の領域についても明らかにするとともに、電子顕微鏡レベルでシナプスに局在するのかどうか検討する。さらには発生段階における局在も明らかにする。2)電位依存的にKCNXが細胞接着活性を示すのかどうかを検討する。KCNXを恒常的に発現する線維芽細胞を用いて、いつどのようにしてKCNXは細胞接着活性を発揮するのかを明らかにする。3)シナプス形成におけるKCNXの役割を明らかにする。

KCNXを恒常的に発現する線維芽細胞と初代培養神経細胞の共培養によって、人工シナプスが形成されるかどうかを検討する。さらにはその形成過程が活動電位や細胞外シグナルに依存するものであるかどうかを検討する。4)KCNXノックアウトマウスの形態学的解析を行う。標準的な中枢神経系の形態学的解析のみならず、神経軸索の走行も解析する。研究遂行のために必要な物品購入において、年度末に購入したものが割引価格で納品されたため。また、研究遂行に必要な物品などで1126円で処理可能のものがなかったため。次年度に購入予定の物品費の一部に当て、研究遂行に必要な物品購入に当てる。
磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムの構築

本課題では、磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築することを目的とした。開発したデバイスは、様々な大きさのセルクラスターを一度の播種操作で効率よく作製することに成功した。さらに、市販MRI造影剤、開発した磁性ナノ粒子(MRI造影剤)を用いて、デバイス上で作製したコンビナトリアル・肝細胞クラスターによる毒性・機能評価を行った。結果、得られたクラスターによる生死判定、増殖解析、機能毒性解析とともに、タンパク質レベルでの機能発現も評価することができた。また、他の細胞種(脂肪由来幹細胞など)でも毒性・機能評価による再現性・有効性も確認できている。磁性ナノ粒子を初めとするナノマテリアルの毒性を評価するために、コンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築する。具体的には、11つのマイクロデバイス内で、様々なサイズの移植細胞・組織体を一度に作製する(コンビナトリアル・セルクラスター)。2様々な細胞から作製した移植細胞に、磁性ナノ粒子を添加・標識して、その毒性を評価する。三次元培養技術、特に、セルクラスター作製技術は、創薬および医療分野での応用が期待されている。我々は、一度の細胞播種操作で、均一かつ大量のセルクラスターを形成できる、培養デバイス"TASCL"を作製した。1年目は、8mm四方の基板上に、256マイクロウェル(1マイクロウェルあたり、500×500μmの正方形、直径300μmの貫通孔を有する基板(同径TASCLデバイス)、もしくは、貫通孔の上部正方形の一辺が、400μm、600μm、800μmの3通り、下部正方形の一辺が、40μm、80μm、160μmの3通りとし、合計9種類の組み合わせの貫通孔を密に配置した基板(コンビナトリアルTASCLデバイス)を作製した。細胞培養皿上に親水化処理済みのTASCLデバイスを設置し、HepG2(ヒト肝ガン由来細胞株)、初代肝細胞、および脂肪由来幹細胞を播種し、37°C、5%CO2下で培養した。そして、TASCLデバイス内で、得られたセルクラスターのサイズおよびその形成率を評価した。結果、同径TASCLデバイス上への細胞の接着は見られず、培養48時間後には、細胞播種数に比例して大きなセルクラスターが観察された。また、各マイクロウェル間では、均一な大きさのセルクラスターが高効率で確認できた。同様に、コンビナトリアルTASCLデバイス上でも、細胞の接着は見られず、培養48時間後には、様々なサイズのコンビナトリアル・セルクラスターを一度操作で作製することに成功した。本研究では、磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築することを目的とする。具体的には、1デバイス内で、様々なサイズの移植細胞・組織体を一度に作製する。2作製した移植細胞・組織体に対して、磁性ナノ粒子を添加・標識時における毒性を評価する。1年目、PDMSから成るデバイスTASCLを作製した。特徴として、1一度の細胞播種操作で、均一かつ大量のクラスターを形成できる、2TASCL底面の培養皿を自由に選択できるなどが挙げられる。本研究では、コンビナトリアル型、同型TASCLの2種類を用いた。本年度は、引き続き、コンビナトリアル型を用いて、1底面の培養皿の選定、2クラスター形成、3クラスター機能、4実験の再現性を評価した。マウス初代肝細胞で検証した結果、1ポリスチレン培養皿上でクラスター形成が可能である、2φ100-200μmサイズのコンビナトリアル・クラスターが創製できる、3各々のクラスターで生細胞が観察され、アルブミン値も測定可能範囲である、4再現性を示すことが確認できた。さらに、クラスター形成率を向上するために、非接着性培養皿上にデバイスを設置し、HepG2細胞による検証を行った。クラスター形成率、回収率ともに100%に近く、初期播種密度の増加に伴い、ウェル内のクラスターサイズも増加した。さらに、走査電子顕微鏡より、クラスターは球状構造(φ223μm)を有し、肝機能としてアルブミン値も測定可能範囲内であるため、本システムの有効性を示せた。また、同型TASCLを用いて、磁性ナノ粒子を添加・標識したセルクラスターを創製した。結果、TASCL内でのクラスター形成が確認でき、クラスターの生細胞が観察され、肝機能を有することが確認できた。また、in vivoにおける磁性ナノ粒子投与実験を行った結果、非投与群と比べて、有意な差は見られなかった。【研究目的】近年、磁性ナノ粒子を初めとするナノマテリアルの品質評価と共に、その安全性、人体への影響を検証しなければならない。そこで、本研究では、磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築し、ナノマテリアルの毒性、安全性について評価した。【研究成果】1年目は、1デバイスの作製、2デバイス内でのセルクラスターの形成、2年目は、デバイス内でのセルクラスターの形成率・回収率の再現性、機能を評価した(Cell Medicine, 2015)。3年目は、磁性ナノ粒子に対して、コンビナトリアル・セルクラスターによる毒性・機能評価を検討した。

本実験では、10mm四方の基板上に、1ウェルあたり、上部正方形の一辺が400、600、800μmの3通り、下部φ100、200、300μmの3通りの貫通孔を密に配置したPDMSから成る`コンビナトリアルTASCLデバイス'を作製し、様々なサイズの肝細胞クラスターを作製した。磁性ナノ粒子として、超常磁性酸化鉄微粒子(アニオン性,市販MRI造影剤)、および開発したカチオン性磁性ナノ粒子を用いた。2種類の磁性ナノ粒子を肝細胞クラスターに添加し、細胞生死判定(Calcein-AM)、細胞増殖解析(EdU)、細胞機能毒性解析(グルタチオン、ミトコンドリア膜電位、ROSなど)について評価した。結果、本実験において、2D培養と同様に、3D培養(クラスター)でも有意な差は見られず、他の細胞種によるさらなる再現性・有効性を検証してゆく。また、様々なサイズのヒト脂肪由来幹細胞クラスターの構築にも成功した(Cell Medicine, accepted)。【要約】本研究では、コンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムの構築に成功した。本システムは、磁性ナノ粒子だけでなく、様々な薬剤等への応用が期待される。本課題では、磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築することを目的とした。開発したデバイスは、様々な大きさのセルクラスターを一度の播種操作で効率よく作製することに成功した。さらに、市販MRI造影剤、開発した磁性ナノ粒子(MRI造影剤)を用いて、デバイス上で作製したコンビナトリアル・肝細胞クラスターによる毒性・機能評価を行った。結果、得られたクラスターによる生死判定、増殖解析、機能毒性解析とともに、タンパク質レベルでの機能発現も評価することができた。また、他の細胞種(脂肪由来幹細胞など)でも毒性・機能評価による再現性・有効性も確認できている。本研究課題は、磁性ナノ粒子を用いたコンビナトリアル・セルクラスターによる評価システムを構築することを目的とする。1年目は、1デバイスの作製、2デバイス内でのセルクラスター形成について検証した。2年目は、作製したデバイスを用いて、セルクラスターを用いた評価システムの有効性、および、本システムの再現性について検証した。結果、作製したデバイス内での、1セルクラスター形成率および回収率の再現性、2デバイス内の培養液より、肝機能としてアルブミン値の測定が可能範囲内であることが確認できた(Miyamoto Y, Ikeuchi M, etal. Cell Medicine, 2015; Cell Medicine accepted)。また、セルクラスター評価システムを用いて、磁性ナノ粒子の添加・標識実験を行い、クラスター形成率、回収率、生死判定について、有益な結果が得られた。3年目は、当初の予定通り、磁性ナノ粒子を添加・標識したセルクラスターによる毒性・機能評価、および実験の有効性・再現性を確認して、セルクラスターによる評価システムの構築を行う。複合領域、再生・移植医療、細胞・組織工学、医療技術評価3年目の研究の推進方策として、磁性ナノ粒子を添加・標識したセルクラスターによる評価システムの有効性、および、再現性を基本方策として研究を推進する。具体的には、1-2年目で得られた結果をもとに、セルクラスターの毒性・機能評価項目(生死判定、肝機能(アルブミン分泌能、テストステロン6β位水酸化活性(CYP3A4活性)等)から実験の有効性・再現性を検証し、医療技術として有益かどうか評価する。本研究は、連携研究者、研究協力者に参画いただき、相互に協力・連携しながら検証を進める。
アレロパシーの生態学的解析とその効果を組み込んだ藻場生態系の富栄養化抑制機能評価

1,海藻アカモクのアレロパシー物質の分析海藻アカモクの珪藻Skeletonema costatumに対するアレロパシー効果はアカモクが放出するアレロパシー物質により生じる.しかし,アカモクのアレロパシー物質は同定されていない.アレロパシー物質を同定することにより,生態系モデルへのアレロパシー効果のモデル化のみならず,増殖抑制メカニズムや種特異性(種により増殖抑制効果が異なる)の解明に役立つと考えられる.そこでアカモク抽出物の分画物について評価した結果,アカモクのアレロパシー物質は分子量9,00015,000Da程度の水溶性の物質である可能性が高いことが示された.本成果は同定への大きな足がかりとなるものであり,今後はNMR分析等により同定を行う予定である.2,アレロパシーを考慮した富栄養化抑制に関するモデル評価1年目に構築したアレロパシー物質生産性モデル及び微細藻類に対するアレロパシー効果モデルよりアカモク培養実験・S.costatumによるバイオアッセイをシミュレーションした結果,実験値とシミュレーション値はほぼ一致した.そのモデルにより,仮想の湾をワンボックスモデルとしてアカモクの栄養塩吸収とアレロパシー効果が定常状態でのS.costatumの細胞濃度に及ぼす影響を評価した.結果として栄養塩吸収はほとんど影響を与えないが,アレロパシー効果が作用することによって細胞濃度が低下することが明らかになった.藻場内側海水で抑制効果が見られたという以前の本研究成果と同様に,実海域においてアカモクのアレロパシーによりS.costatumの増殖を抑制できる可能性がモデルからも示唆され,藻場機能の活用による富栄養化抑制の可能性を示すことができた.1,アレロパシー物質生産性モデル構築分子量分画膜で海藻アカモクのアレロパシー物質の分画を試みたが,分画膜からSkeletonema costatumの増殖を阻害する物質が溶出するためバイオアッセイができなかった.一方,ポリビニルポリピロリドン(PVPP)をアカモク培養液に入れて反応させるとアレロパシー効果が低下した.よってPVPPによりアレロパシー物質を吸着・除去できることが分かり,吸着した物質を同定し,指標として活用できるか評価する予定である.アレロパシー物質生産に及ぼすアカモク培養時の光の照射と窒素・リン吸収の影響をS.costatumに対するアレロバシー効果で評価したところ,窒素・リン吸収はアレロパシー効果に影響せず光の照射がアレロパシー効果を増大させることが分かった.アカモクに対して培養時の光強度を4段階に設定して得た培養液をバイオアッセイした結果から,アカモク培養時の光強度とアレロパシー効果(生産として評価)との関係をモデル化することができた.2,微細藻類に対するアレロパシー効果モデル構築本研究で実施しているバイオアッセイ手法では栄養塩に関係なく最大比増殖速度を示すS.costatum細胞を用いていることから,メカニズムは栄養塩摂取阻害ではなくS.costatumの細胞に直接作用する生理的異常によると推定される.アレロパシー物質の同定と併せ今後さらに追及していく.アカモク培養液を希釈したものをS.costatumによりバイオアッセイした結果,アカモクのアレロパシー物質濃度とアレロパシー効果は比例的関係にあることが分かった.また,S.costatum細胞濃度を変えたバイオアッセイから,アレロパシー効果は細胞濃度に反比例することが明らかになった.これらの結果をもとにアレロパシー効果によるS.costatumの増殖抑制モデルを構築することができた.1,海藻アカモクのアレロパシー物質の分析海藻アカモクの珪藻Skeletonema costatumに対するアレロパシー効果はアカモクが放出するアレロパシー物質により生じる.しかし,アカモクのアレロパシー物質は同定されていない.アレロパシー物質を同定することにより,生態系モデルへのアレロパシー効果のモデル化のみならず,増殖抑制メカニズムや種特異性(種により増殖抑制効果が異なる)の解明に役立つと考えられる.そこでアカモク抽出物の分画物について評価した結果,アカモクのアレロパシー物質は分子量9,00015,000Da程度の水溶性の物質である可能性が高いことが示された.本成果は同定への大きな足がかりとなるものであり,今後はNMR分析等により同定を行う予定である.2,アレロパシーを考慮した富栄養化抑制に関するモデル評価1年目に構築したアレロパシー物質生産性モデル及び微細藻類に対するアレロパシー効果モデルよりアカモク培養実験・S.costatumによるバイオアッセイをシミュレーションした結果,実験値とシミュレーション値はほぼ一致した.そのモデルにより,仮想の湾をワンボックスモデルとしてアカモクの栄養塩吸収とアレロパシー効果が定常状態でのS.costatumの細胞濃度に及ぼす影響を評価した.結果として栄養塩吸収はほとんど影響を与えないが,アレロパシー効果が作用することによって細胞濃度が低下することが明らかになった.藻場内側海水で抑制効果が見られたという以前の本研究成果と同様に,実海域においてアカモクのアレロパシーによりS.costatumの増殖を抑制できる可能性がモデルからも示唆され,藻場機能の活用による富栄養化抑制の可能性を示すことができた.
活性型低分子量GTPaseの細胞内局在の網羅的定量解析技術の開発とその応用

本年度は、これまでに我々が確立した内在性Rac1およびRap1の活性化の可視化技術を応用して、これらの分子が担う生理機能の解析を推進した。まず、昨年度に引き続き、骨格筋細胞におけるインスリン刺激に応答した糖取り込み誘導のシグナル伝達系におけるRac1の機能解析を行った。具体的には、骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスとコントロールマウスにおいて、蛍光標識したGLUT4レポーターを用いたインスリン応答性のアッセイを行った。その結果、骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスにおいては、インスリンを尾静注することによって誘導されるGLUT4の細胞膜移行が完全に抑制されたが、活性型変異体Rac1による移行は阻害されなかった。本年度は別の種類の(遺伝子型が異なる)コントロールマウスにおいてもインスリン応答性に異常のないことを確認した。これらの結果より、インスリン刺激した際のマウス骨格筋での糖取込みの誘導において、Rac1の活性化が必要十分であることが強く示唆された。また、rac1ノックアウトマウスでは、インスリン応答性のAktやAS160のリン酸化には異常は認められず、この経路はRac1を介する系とは独立であることが示唆された。さらに、Rac1の活性化部位の可視化技術をマウスの骨格筋に応用し、インスリン応答性のRac1活性化部位を同定する手法の開発も進めた。一方、RhoAに対するGEFであるARHGEF10の細胞周期調節系における役割の検討も進めた。siRNAによってこの分子をノックダウンすると、中心体の複製に異常が生じ、分裂装置が多極化することが明らかとなった。したがって、ARHGEF10は、RhoAを介して、中心体の過剰な複製を抑制していると考えられる。本年度は、これまでに我々が確立した内在性RaclおよびRaplの活性化部位の可視化技術の組織への応用を目指して研究を推進した。まず、骨格筋細胞におけるインスリン刺激に応答した糖取り込み誘導のシグナル伝達系におけるRaclの機能解析を進めた。これまでに筋細胞株L6を用いて解析を進めてきたが、今年度はマウス骨格筋を用いて解析を進めた。骨格筋特異的raclノックアウトマウスとコントロールマウスにおいて、蛍光標識したGLUT4インディケーターを用いたインスリン応答性のアッセイを行った。その結果、骨格筋特異的raclノックアウトマウスにおいては、インスリンを尾静注することによって誘導されるGLUT4の細胞膜移行が完全に抑制されたが、活性型変異体Raclによる移行は阻害されなかった。したがって、インスリン刺激した際のマウス骨格筋での糖取込みの誘導において、Raclの活性化が必要十分であることが強く示唆された。次に、Raclの活性化部位の可視化技術をこれらのマウスの骨格筋に応用し、インスリン応答性のRacl活性化部位を同定するための条件検討を行った。一方、Raplに対するGEFであるRA-GEF-1が胎生期の血管形成に関与する可能性がこれまでの我々の研究から示唆されてきたが、今年度は、RA-GEF-1ノックアウトマウスと野生型マウスの尿膜におけるRaplの活性化状態を比較、検討した。その結果、ノックアウトマウスの尿膜の血管内皮細胞においては、Raplの活性化が有意に低下していることが明らかとなり、RaplがRA-GEF-1の下流で胎生期の血管形成を制御している可能性が示唆された。
光線力学的療法とクロフィブリン酸を用いた卵巣癌播種病巣に対する治療戦略

光線力学的療法(PDT)が卵巣癌の微小病巣で抗腫瘍効果を発揮するためには細胞内に取り込まれた5-アミノレブリン酸メチルエステル(Methyl-ALA)から変換されるプロトポルフィリンIX(PpIX)量が重要であり、細胞内のPpIX量によって抗腫瘍効果が違うこと、ヘム合成・分解とも活発な細胞では外因性のアミノ酸誘導体を取り込んでもPpIXが細胞内に蓄積されにくいことを示した。一方でMethyl-ALA-PDTは癌性腹膜炎の有力な治療法の一つになることが示唆され、PDTの治療効果を高めるには細胞内PpIX量の維持が重要になる。in vitro卵巣癌細胞でのCR発現量はクロフィブリン酸の濃度依存性に増加した。クロフィブリン酸投与群の腫瘍内でのCR発現量は著明に増加していた。腫瘍内のmPGES発現量はクロフィブリン酸投与により約半分に減少、血中ならびに腹水中のPGE2濃度は約25%まで減少した。腫瘍内の血管密度はクロフィブリン酸投与により約50%減少し、VEGFの発現強度も半減した。腹水中のVEGF量はコントロールに比べ30%まで減少した。クロフィブリン酸投与により腫瘍内のアポトーシス細胞は2.5倍増加した。MCR導入細胞において、CRは強発現するとともにVEGFの発現は低下した。TOV21G細胞、MCAS細胞ともコントロール群は観察した5週間腫瘍体積が増加した。一方、pTreCR導入TOV21G細胞、pTreCR導入MCAS細胞は2週目をピークとし、それ以降5週目まで腫瘍体積は減少した。コントロールとpTreCR導入群間で腫瘍増殖曲線に有意差を認めた。pTreCR導入群の腫瘍はネクローシスと炎症性細胞浸潤が顕著であった。pTreCR導入群の腫瘍組織内のVEGF発現と血管密度はコントロール群に比べ有意に減少していた。pTreCR導入群の腫瘍ではCaspase-3の活性化が起こっておりアポトーシス細胞の出現頻度はコントロール群に比べ有意に増加していた。MFG-E8蛋白発現はpTreCR導入群で有意に増加していた。MFG-E8はpTreCR導入群の腫瘍細胞質内と間質細胞内に広く分布しており、MFG-E8発現箇所でマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食像が観察された。pTreCR導入群の腫瘍が自然退縮する機序は、血管新生の抑制とアポトーシス細胞の増加、それらに加え増加したMFG-E8に誘導されたマクロファージとアポトーシス細胞間のphagocytosisによる壊死の増加によると考えられた。1Methyl-ALA-PDTとクロフィブリン酸(CA)の併用により相加効果以上の効果が得られるか、2GSTO1導入細胞による癌性腹膜炎に対する治療ではコントロールに比べ生存期間が延長するか、3開腹によるハロゲンランプの照射と腹腔鏡によるレーザー光照射では生存期間に差が生じるのかどうか、を検討するための実験を行う年度あったが、GSTO1の細胞導入が成功せず、実験に遅れをきたしている。平成23年度の研究成果では、PDTの卵巣癌での抗腫瘍効果の違いは、ヘム合成・分解とも活発な細胞では外因性のアミノ酸誘導体を取り込んでもPpIXが細胞内に蓄積されにくいことが原因であることが判明した。一方でMethyl-ALA-PDTはPCの有力な治療法の一つになることが示唆され、PDTの治療効果を高めるには細胞内PpIX量の維持が重要になるという研究成果も得られた。しかしPpIXからヘムへの分化を抑制するGSTO1を細胞内に導入しMethyl-ALA-PDTの効果をin vitro、in vivoの両面から検証する研究計画が次年度へ繰り越しとなった。1GSTO1プラミドDNAを増やし、アデノウィルスベクター作製キット(AdMax TM Kit)を用いてGSTO1を組み込む。アデノウィルスベクター(AD)を取り込むことがすでに報告されているHRT細胞を用いる(Gene Ther 8; 1450, 2001)。2In vivo法で行うため、HRT細胞で皮下担癌マウス、癌性腹膜炎マウスを作製する。3GSTO1 DNAを組み込んだアデノウィルスベクター(GSTO1-AD)の投与法として腹腔内投与、静脈内投与、腫瘍局注、いずれの方法が腫瘍内にGSTO1-ADの取り込みが良好か調べる。GSTO1の腫瘍内取り込み量の定量はSouthern blot法で比較する。4最適なin vivo法が決定されれば、DISS、MCAS、TOV21G等の細胞由来腫瘍にも、決められたin vivo法でGSTO1-ADを導入してみる。取り込みが不良な場合、p53抗体、HER2抗体等で取り込み量をアシストする方法を構築する。GSTO1を細胞内に導入しMethyl-ALA-PDTの効果をin vitro、in vivoの両面から検証する研究計画を推進するためには、(1) GSTO