hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組換えタンパク質を用いたカロテノプロテインの色彩多様性に関する研究

甲殻類は見た目に緑青食から赤燈色まで様々な色を呈するが、これは外骨格中に含まれる色素タンパクであるクラスタシアニン(CRCN)によるものである。CRCNはアポタンパク質とアスタキサンチン(Asx)が結合した複合体としての色を本来呈するが、加熱などで変性するとタンパク質の変性によりAsxが放出され、赤色を呈する。エビ・カニがゆでると赤くなるのはこのためである。本研究では組換え発現系によってクルマエビCRCNアポタンパク質を調製し、Asxと再結合することによりその色彩多様性の解析を試みた。甲殻類は緑青色から赤橙色まで様々な体色を呈するが、これは外骨格中に含まれるクラスタシアニン(CRCN)と呼ばれる色素タンパク質によるものである。本タンパク質はCRCN-A、およびCRCN-Cと呼ばれる2種類のサブユニットが2分子のカロテノイドと非共有結合した基本構造を有し、加熱するとタンパク質の変性により放出されたカロテノイド本来の色が呈される。報告者は報告されてきたタンパク質に結合するカロテノイドがアスタキサンチンのみであることに着目し(それ故甲殻類はゆでると皆赤くなる)CRCNの色彩多様性が色素部分のAsxではなく、アポタンパク質側の構造に依存したものであると推察している。それ故、CRCNを組み替え体として発現させ、Asxとして再結合させる系を確立できれば、アポタンパク質側に点変異を起こすことで多様なCRCNを人為的に作り出すことができると考えられる。このような背景のもと昨年度までに我々はクルマエビを用いてCRCN-A、およびCRCN-Cの大腸菌による組み換えタンパク質の作出に成功している。しかしながら、これらを用いたカロテノイドとの再構成には至っていない。ヨーロピアンロブスターCRCN-A、およびCRCN-Cには過去にタンパク質の電気泳動によって各々3種のパラログの存在が知られている。また、同種では基本構造を形成する上で組み合わせに特異性があることも知られているものの、そもそもすべての甲殻類において両サブユニットで何種類のパラログが存在するかさえ明らかになっていない。今年度はCRCN組み替えた体とAsxの再構成条件を検討する過程で、このCRCNパラログの種類数に関し本研究推進にあたり重要かつ新規な情報を得たので、そちらに重点をおいた考察を行った。甲殻類は緑青色から赤燈色まで様々な体色を呈するが、これは外骨格中に含まれるクラスタシアニン(CRCN)と呼ばれる色素タンパク質によるものである。本タンパク質はCRCNAおよびCと呼ばれる異なる2分子のサブユニットが2分子のカロテノイドと非共有結合した基本構造を有し(このため別名カロテノプロテインとも呼ばれる)、加熱するとタンパク質の変性により放出されたカロテノイド本来の色が呈される。この変色は一般にBathochromic Shift(BS)と呼ばれている。CRCNは良く知られたタンパク質であるが、その知見はヨーロピアンロブスターを中心とした数種のものに限られている。しかも多くの報告がX線結晶解析やNMRを用いた物理化学的な立体構造解析に関するものであり、CRCNの最も特徴的な性質である色そのものの多様性やBSに主眼を置いたものは驚くほど少ない。また、同種での報告は外骨格より精製されたNativeなタンパク質が用いられており、組み換え体での研究例はこれまでになかった。報告者は研究対象とされてきたCRCNに結合するカロテノイドがアスタキサンチン(Asx)のみであることに着目している(それゆえ甲殻類はゆでると全て赤くなる)。この事実はCRCNの色彩多様性は色素部位であるAsxではなく、アポタンパク質側の構造に依存したものである可能性を意味する。以上からCRCNを組み換えタンパク質として発現させ、Asxと再結合させる系を確立できれば、アポタンパク質側に点変異を起こすことで多様な色彩を有するCRCNを人為的に作り出すことができると考えられる。本年度はクルマエビを用いてCRCNの粗精製、そのcDNA全長配列の入手、組み換えタンパク質発現系の構築、およびAsxとの結合条件の検討を行った。甲殻類は様々な体色を呈するが、これは外骨格中に含まれるクラスタシアニン(CRCN)と呼ばれる色素タンパク質によるものである。本タンパク質はCRCN-AおよびCRCN-Cと呼ばれる異なる2分子のサブユニット構造が2分子のカロテノイドと非共有結合した基本構造を有している。甲殻類をゆでると一般に赤くなるが、これはCRCNのアポタンパク質からアスタキサンチンが放出されるためであると考えられている。我々はこれまでに報告されてきた甲殻類の体色が多様性を示すのに対し、CRCNの色素部位が主にアスタキサンチン(Asx)であることに着目し、この色彩多様性の由来は色素部位ではなくアポタンパク質側にと推察している。昨年度までに「CRCN-AおよびCRCN-Cのタンパク質発現系の構築」に成功し、「CRCN-Cに我々の想定よりもはるかに多くのパラログ遺伝子が含まれる可能性」を示唆するデータを得ている。今年度はCRCN-AにおいてもCと同様に多くのパラログ遺伝子が存在すること、上述の発現系より高発現が期待できるベクターの作成を行った。甲殻類は様々な体色を呈するが、これは外骨格中にクラスタシアニン(CRCN)と呼ばれる色素タンパク質によるものである。本タンパク質はCRCN-A、CRCN-Cと呼ばれる2分子のサブユニットが2分子のカロテノイドと非共有結合し、基本構造をとっている。甲殻類をゆでると一様に赤くなるが、これはCRCNのアポタンパク質からアスタキサンチンが放出されるためである。

この事実から甲殻類の色彩多様性は色素部位ではなく、アポタンパク質側に起因すると推察される。昨年度までに両サブユニットの組替えタンパク質発現系の確立に加えて、両サブユニットが想定より多くのパラログ遺伝子を有している可能性を示してきた。今年度はより効率の高い発現系の確立およびアスタキサンチンとの再結合条件の確立、およびパラログ遺伝子のNGSを用いた解析を行った。甲殻類は見た目に緑青食から赤燈色まで様々な色を呈するが、これは外骨格中に含まれる色素タンパクであるクラスタシアニン(CRCN)によるものである。CRCNはアポタンパク質とアスタキサンチン(Asx)が結合した複合体としての色を本来呈するが、加熱などで変性するとタンパク質の変性によりAsxが放出され、赤色を呈する。エビ・カニがゆでると赤くなるのはこのためである。本研究では組換え発現系によってクルマエビCRCNアポタンパク質を調製し、Asxと再結合することによりその色彩多様性の解析を試みた。PCRによりほぼ全長CRCN-Aを含むと推察される配列が19クローン得られた。このうち4クローンが同一配列で合計15種類のcDNA配列が得られた。複数のパラログ遺伝子は同義置換を起こしており、翻訳すると合計12種類のアミノ酸配列が得られた。ヨーロッパロブスターで確認されている同分子のAsx結合部位(His,Tyr)は全てのパラログ遺伝子に保存されていた。以上からクルマエビCRCN-Aも昨年度解析を行ったCRCN-Cと同様にパラログ遺伝子が想定よりもはるかに数多く存在する可能性が示唆された。申請時の予定では本年度は最終年度であり、組換えタンパク質の発現系を構築後、Asxとの再構成条件まで確立する予定であったが、候補遺伝子の多様性という想定外の事実を得たため、計画通りに進めることは出来なかった。しかしながら新たな知見や技術的な基盤は得ており、計画を1年延長して遂行することにした。水圏生物工学これまでの研究成果によってCRCN-AおよびCサブユニット両方が想定よりも多くのパラログ遺伝子によってコードされる可能性がある。そこで申請時の研究計画では1年間計画を延長し、このパラログ遺伝子の多様性につきNGSを用いて更なる解析を行う。加えてこれまでに作成した種々の組換えタンパク質発現系の至適条件を確立し、Asxとの結合実験を行う。PCRによりCRCN-Cと推察される配列が45クローン得られた。このうち4種8クローンが同一配列で合計41種類のcDNA配列が得られ、34種が予想される全長を含み、Splicing variantと推察される配列が2種類、1塩基のみ欠失している配列が5種類確認された。全長を含む複数のパラログ遺伝子は同義置換を起こしており、翻訳すると合計23種類のアミノ酸配列が得られた。ヨーロッパロブスターで確認されている同分子のAsx結合部位(TyrおよびHis)は全長を含む全てのパラログ遺伝子に保存されていた。以上からクルマエビCRCN-Cパラログ遺伝子が想定よりはるかに数多く存在することが示唆された。CRCN-
大学生の政治不信形成に及ぼす政治的関心,態度および個人差要因の影響

本研究は,政治不信が形成される過程で,政治的関心や態度,さらにはパーソナリティ・認知特性のような個人差変数がどのように関与しているのかを大学生を対象として明らかにすることを目的としている.平成16年度においては,まず第1に,個人差変数として注目される政治的自己効力感の概念整理および測定尺度の開発を行った.さらに,第2に,政治不信と政治的自己効力感との関連性について検討したところ,政治的自己効力感のうちで"正当性"因子が政治不信の"政治過程の不透明性"因子に正の有意な影響を,"影響力"因子が"担い手の役割期待違反"因子に負の有意な影響を,また,"無力感"因子は政治不信の構成要素いずれにも負の有意な影響を与えていることが明らかにされた.平成17年度においては,まず第1に,先に作成された政治的自己効力感尺度の整備を行うための質問紙調査を実施し因子分析を行ったところ,"内的効力感"および"外的効力感"と命名可能な因子が抽出され,類似概念である政治的有効性感覚と一致する構造が得られた.また,第2に,政治的自己効力感の特徴を明らかにするために認知的閉鎖欲求との関連性について検討したところ,"内的効力感"は"決断性"とは正の,"予測可能性への好み"とは負の有意な相関が見られ,内的な政治的自己効力感が高い者の認知様式の特徴の一端が明らかにされた.さらに,第3に改訂された政治的自己効力感尺度を用いて政治不信との関連性についてあらためて検討したところ,外的政治的自己効力感の低さが全般的な政治不信感情を生み出しているとともに,内的政治的自己効力感の高さが"情報の隠蔽"を内容とする政治不信の発生に寄与していることが明らかにされた.政治不信を強く持つ者は,内的効力感が高く,外的効力感が低いグループであり,内的-外的自己効力感がともに高いグループは,政治不信のレベルはそれほど高くはなく,また,政治的関心が最も高かった.以上から,政治不信の構成要素の相違に応じて政治的自己効力感が寄与する役割が異なることが示され,大学生の政治不信は個人の認知的特性によって影響されていることが明らかとなった.本研究は,政治不信が形成される過程で,政治的関心や態度,さらにはパーソナリティ・認知特性のような個人差変数がどのように関与しているのかを大学生を対象として明らかにすることを目的としている.平成16年度においては,まず第1に,個人差変数として注目される政治的自己効力感の概念整理および測定尺度の開発を行った.さらに,第2に,政治不信と政治的自己効力感との関連性について検討したところ,政治的自己効力感のうちで"正当性"因子が政治不信の"政治過程の不透明性"因子に正の有意な影響を,"影響力"因子が"担い手の役割期待違反"因子に負の有意な影響を,また,"無力感"因子は政治不信の構成要素いずれにも負の有意な影響を与えていることが明らかにされた.平成17年度においては,まず第1に,先に作成された政治的自己効力感尺度の整備を行うための質問紙調査を実施し因子分析を行ったところ,"内的効力感"および"外的効力感"と命名可能な因子が抽出され,類似概念である政治的有効性感覚と一致する構造が得られた.また,第2に,政治的自己効力感の特徴を明らかにするために認知的閉鎖欲求との関連性について検討したところ,"内的効力感"は"決断性"とは正の,"予測可能性への好み"とは負の有意な相関が見られ,内的な政治的自己効力感が高い者の認知様式の特徴の一端が明らかにされた.さらに,第3に改訂された政治的自己効力感尺度を用いて政治不信との関連性についてあらためて検討したところ,外的政治的自己効力感の低さが全般的な政治不信感情を生み出しているとともに,内的政治的自己効力感の高さが"情報の隠蔽"を内容とする政治不信の発生に寄与していることが明らかにされた.政治不信を強く持つ者は,内的効力感が高く,外的効力感が低いグループであり,内的-外的自己効力感がともに高いグループは,政治不信のレベルはそれほど高くはなく,また,政治的関心が最も高かった.以上から,政治不信の構成要素の相違に応じて政治的自己効力感が寄与する役割が異なることが示され,大学生の政治不信は個人の認知的特性によって影響されていることが明らかとなった.本研究は,政治不信が形成される過程で,政治的関心や態度,さらには政治的自己効力感や無力感のような個人内変数がどのように関与しているのかを大学生を対象として明らかにすることを目的としている.本年度においては,まず,個人差要因の一つとして注目される政治的自己効力感について概念整理を行うとともに,政治的自己効力感の測定尺度の作成を目的として調査Iを実施した.その結果,政治的自己効力感は"判断力"や"知識","正当性"など自らが政治的見解を持つことに関わる自信や肯定感という内的な側面と,一般的政治的有効性感覚に代表される市民として政治過程に影響を与えることができるという信念という側面から構成されていることが明らかにされた.作成された政治的自己効力感尺度は政治的関心と正の,政治に対する主観的距離感とは負のそれぞれ有意な相関を示し,信頼性・妥当性ともに十分な値が得られた.さらに,本年度においては,大学生の政治不信感情の構造と実態及び政治不信形成の過程に影響を及ぼす要因の効果について検討するために調査IIを実施した.

その結果,大学生の政治不信は"担い手の役割期待違反"と"政治過程の不透明感"の2因子から構成されることがあらためて確認されるとともに,これら政治不信の質的相違に応じて関連要因の効果の方向性と大きさが異なることが示唆された.すなわち,政治的自己効力感は"政治過程の不透明感"のみに有意な正の効果を持つ一方で,一般的政治的有効感の欠如と政治との主観的距離感は"担い手の役割期待違反"にのみ正の有意な効果を示していた.また,政治的無力感は政治不信のどちらの因子にも正の有意な効果を持っていた.以上から,無力感の大きさが大学生の政治不信をより包括的・直接的に説明していること,政治不信は質的に相違する2つの側面に区別可能であること,さらに,それぞれの政治不信の形成には政治的自己効力感など個人差を説明する要因が独自に機能している可能性があることなどが明らかにされた.本研究は,政治不信が形成される過程で,政治的関心や態度,さらには政治的自己効力感のような個人内変数がどのように関与しているのかを大学生を対象として明らかにすることを目的としている.本年度においては,まず第1に,昨年度開発された政治的自己効力感尺度の改訂版を作成することを目的として調査Iを行った.その結果,"内的自己効力感","外的自己効力感"および"個人的有能感"と命名される3つの因子からなる政治的自己効力感尺度が新たに構成され,従来の政治的有効性感覚の構造に関する知見と一貫する要素を持つ測定尺度が開発された.第2に,個人差変数として新たに認知的閉鎖欲求に注目し,適切な測定尺度を作成するために調査IIを実施した.その結果,"決断性","予測可能性への好み","あいまいさに対する不寛容"および"秩序への好み"と命名される4因子構造からなる認知的閉鎖欲求尺度が開発された.政治的自己効力感との間の相関を求めたところ,"決断性"と"内的自己効力感"との間には正の,"予測可能性への好み"との間には負の相関が見られたことから,認知的閉鎖欲求は質的に異なる2つの側面から構成されることが示唆された.第3に,個人差変数として政治的自己効力感および認知的閉鎖欲求を取り上げ,さらに政治的関心を加えてこれらの諸変数と政治不信との間の関連性を明らかにすることを目的として,大学生を対象とする調査IIIを行った.その結果,政治的関心はいずれの政治不信の要素に対しても有意な相関を示さなかったこと,政治不信のうちで"情報占有・隠蔽"に対しては認知的閉鎖欲求の"決断性"が正の,"予測可能性への好み"が負の有意な相関を示したこと,政治的自己効力感のうちで内的有効感は"情報占有・隠蔽"に起因する政治不信に正の相関を示し,外的有効感の低さが多くの政治不信要素と正の相関を持つことなどが明らかにされた.以上から,政治不信の構成要素の相違に応じて認知的閉鎖欲求や政治的自己効力感などの個人内要因の効果が異なることが示唆され,大学生段階における政治不信は自己効力感や認知的特性の相違に応じて異なる様式で出現することが示唆された.
知識の外化を教育的に支援する知的インタフェイスに関する研究

本研究では,情報処理用語を記述したテキストを教材として,その理解内容の外化(知識外化)を促し,教材に対する理解を深めさせる方法を検討している.特に,外化しようとする内容を可視化するユーザインタフェイスを開発するとともに,外化にかかる学習者の心的作業(認知負荷)を予測した上で理解内容の断片を提示して,負荷を効果的に軽減するメカニズムを開発している.本年度は,平成9年度に開発した知識外化インタフェイスおよび負荷制御メカニズムを用いて,提案した外化支援手法の有効性を評価する実験を行った.評価実験では,知識外化インタフェイスを用いて,認知負荷を制御するグループと制御しないグループに被験者をわけて教材の理解を行わせ,一定時間後理解内容の想起テストを行った.その結果,負荷制御した方が有意にテストの成績が良く,本支援手法の有効性を確認することができた.また,新たにプログラムの理解支援を対象として本手法を適用した.ここでは,プログラム中に空欄を設けること(プログラムの断片を提示することに対応する)で,プログラム理解の外化を促す方法を検討し,学習者による空欄の補充がプログラムの理解に貢献することを実験的に調べた.このことからも,様々な教材に対して本手法を応用できる可能性があることを確認することができた.以上の研究成果については,まとめて,学習支援システム関連の国際会議,人工知能学会および教育システム情報学会において公表した.本年度は,まず,情報処理用語を記述したテキストを教材として,その理解内容を外化させるグラフィカルユーザインタフェイスを開発した.本インタフェイスでは,学習者による理解内容の外化(知識外化)を促進するために,理解内容を可視化する表現としてダイアグラムを提供しており,このダイアグラムを用いて理解した内容を記述する過程を外化過程と捉えている.また,学習者にかかる外化の負荷は,ダイアグラムの記述作業とみなされる.次に,個々の学習者に応じて外化の負荷を制御するために,最終的に外化されうるダイアグラムの断片をあらかじめインタフェイス上に提示するメカニズムを開発した.これにより,学習者は,提示されていないダイアグラムの部分だけを記述すればよいことになる.本制御メカニズムの特徴は,学習者の既有知識と下化能力に応じて,外化にかかる負荷を見積もり,負荷が大きければダイアグラムのどこをどれくらい断片として提示すべきかを決めることにある.このような断片提示制御によって,適用的な外化支援が可能になっている.本研究では,こうした断片提示が,外化の効果(教材について理解した内容が知識として定着すること)を引き出すのに貢献するかどうかを調べる予備的な実験を行った.その結果,有意に貢献するという知見を得た.以上の成果については,国内の関連学会で発表するとともに,国際会議において公表した.また,これらの研究成果をまとめ,人工知能学会に論文を投稿した.本研究では,情報処理用語を記述したテキストを教材として,その理解内容の外化(知識外化)を促し,教材に対する理解を深めさせる方法を検討している.特に,外化しようとする内容を可視化するユーザインタフェイスを開発するとともに,外化にかかる学習者の心的作業(認知負荷)を予測した上で理解内容の断片を提示して,負荷を効果的に軽減するメカニズムを開発している.本年度は,平成9年度に開発した知識外化インタフェイスおよび負荷制御メカニズムを用いて,提案した外化支援手法の有効性を評価する実験を行った.評価実験では,知識外化インタフェイスを用いて,認知負荷を制御するグループと制御しないグループに被験者をわけて教材の理解を行わせ,一定時間後理解内容の想起テストを行った.その結果,負荷制御した方が有意にテストの成績が良く,本支援手法の有効性を確認することができた.また,新たにプログラムの理解支援を対象として本手法を適用した.ここでは,プログラム中に空欄を設けること(プログラムの断片を提示することに対応する)で,プログラム理解の外化を促す方法を検討し,学習者による空欄の補充がプログラムの理解に貢献することを実験的に調べた.このことからも,様々な教材に対して本手法を応用できる可能性があることを確認することができた.以上の研究成果については,まとめて,学習支援システム関連の国際会議,人工知能学会および教育システム情報学会において公表した.
超新星・爆発のシミュレーションとニュートリノ放出の研究

重力崩壊型超新星の爆発機構を解明し、放出されるニュートリノのスペクトル・時間発展等を研究するため、数値シミュレーションの開発を進めている。超新星爆発のシミュレーションのためには、物質の運動方程式と共にニュートリノの輸送を解くことが不可欠であり、今年度はその第1段階として、ニュートリノ輸送のプログラムを開発した。超新星コア内部では、ニュートリノ相互作用のエネルギー依存性が非常に高く、ニュートリノのエネルギー別にその輸送を解かねばならない。そのためMultienergy Flux Limited Diffusion方式を用いてプログラムを作成した。このプログラムを用いて、まず物質の運動を解く必要のない原始中性子星の冷却段階のシミュレーションを行った。超新星爆発の引金となるコアの重力崩壊の結果生まれた原始中性子星は、10秒くらいの時間でニュートリノを放出して冷却し、中性子星となるが、KAMIOKA等で検出されたニュートリノベーストのほとんどは、この時期に対応するものである。その結果次の結果が得られた。1.初期における収縮に伴って、ニュートリノの温度は急速に高くなる。しかし数値シミュレーションの結果は観測の値より(1秒)よりやや早い時期におこる。2.ニュートリノのスペクトルは、フェルミ分布に比べて高エネルギーが切り取られ、又低エネルギー側においては、高エネルギーニュートリノが下方散乱されたものをかぶっている。3.全体的冷却の速さは、Burrows等によってなされた簡単なフェルミ分布近似したものと、だいたい一致するが、J.Wilson等のグループによる結果とは一致しない。
ドイツ近代自然抒情詩による動植物の形象に関する研究

1)データベース「ドイツ近代詩にあらわれる動植物のインデックス」を作成した。調査の対象としたのは、二十世紀以前の詩人からゲーテ、へルダーリン、アイヒェンドルフ、ドロステ、シュトルムの5人、二十世紀の詩人からレルケ、レ-マン、アイヒ、バッハマン、ツェラーン、フ-へル、ボブロフスキーの7人である。このインデックスにより、どの動植物がどの詩人に好んで扱われているか、またどれがどの詩に出てくるか、などを調べることができる。2)上記インデックスにもとづく調査研究の成果は論文「ドイツの近代詩における動植物のあらわれ」にまとめた。ドイツの近代詩人はおしなべて自然と深いつながりをもっているが、ゲーテやへルダーリンなど古典期の詩人たちは、神の創造した自然を崇拝する気持ちがつよく、それを表現するために詩のなかに登場する動植物は、古典古代から受け継がれたごく限られた種類のものだった。女性詩人ドロステは、身近にある動植物を観察し、それを詩のなかで記述するというかたちで自然を詩のなかに取り込んだ最初の詩人である。二十世紀になってレルケから姶まるドイツ自然抒情詩派は、ドロステの詩精神を受け継ぎ、動植物の精細な観察を基盤とする詩作に徹する。そのうえでレルケやレ-マンはナチ時代に国内亡命の立場をとりつつ、ナチズムへの反感をカモフラージュして表現するのに活用した。フ-へルは故郷ブランデンブルクの自然を軸としながら、異郷の自然に漂泊の身を嘆き、ボブロフスキーは彼のいわゆるサルマチアの自然を描き出すことにより、この地域におけるドイツ人の過去の罪過をあぶり出している。しかしバッハマンとツェラーンはこの系譜には属さず、自然の扱いに関する限り、へルダーリンら古典期の詩人のうたいかたに近いことが明らかになった。1.「ドイツ近代抒情詩における動植物のインデックス」の作成作業は順調に進んだ。予定していたオスカー・レルケ、ヴィルヘルム・レ-マン、ペーター・フ-ヘル、ヨハネス・ポプロフスキーのほか、パウル・ツェラン、インゲボルグ・バッハマン、ギュンター・アイヒにも調査の手を伸ばして、作業をほぼ完了した。すなわち平成7年度は二十世紀の詩人たちに絞ったうえで、調査の範囲を広げたことになる。当初予定していたドロステ=ヒュルスホフは、他の十九世紀の詩人たちと共に8年度の調査対象にすることとした。2.作成されているインデックスのデータにもとづくレルケとポプロフスキー、さらにその他の詩人たちとの比較研究が進行中であるが、すでに興味ぶかい事実が明らかになっている。詩集の一定ページ数内における動植物の出てくる頻度数は各詩人によって実にまちまちであるが、いわゆる自然詩人といわれている人たちの作品における頻度数はやはりめだって高く、自ら自然派であることを否定しているポプロフフスキーもデータの上では自然詩人であることが歴然としている。フ-ヘル、レルケ、ポプロフスキーはいずれも北東ヨーロッパの出身であるが、生まれ育った地域が少しずつ違っていることが動植物の選択の違いとなって現われている。3.ボプロフスキー研究もテクスト分析や文献調査の面で着実に進展した。また特記したいのは、ポプロフスキーの川の形象についてドイツ語による論文を完成させたことである。川は詩人にとって動植物の活動する格好の場であり、この論文でも当然動植物のことに言及している。掲載される論文集(全巻ドイツ語)の刊行が遅れているが、この論文が自然詩研究の面での国際交流の足掛かりとなることを期待している。1)「ドイツ近代詩における動植物のインデックス」の作成は予定通りに進捗した。平成7年度に二十世紀の詩人の調査を実施したのを受けて、本年度は十九世紀の詩人を取り上げ、ゲーテ、ヘルダーリン、ドロステ・ヒュルスホフ、シュトルムの全詩作品に登場する動植物を調査し、コンピュータに入力した。

十九世紀と二十世紀の比較調査の資料としてはこれで十分であるが、さらにメ-リケ、リルケなどを加えるのがベタ-であることも判明した。2)十九世紀の詩人たちは自然を人間の生活環境として見ている面がつよく、特別な科学知識にもとづく分析や異境の自然の探究などは少ない。詩に好んで用いられる自然の形象が、まだトポスとして生きていることが認められる。その点ドロステ・ヒュルスホフはその微細な自然観察によって、二十世紀の自然詩人の先駆というべき詩作をしている。3)ゲーテ、ヘルダーリンは南独、ドロステ・ヒュルスホフ、シュトルムは北独の詩人なので、南北の比較も可能となり、歌われる動植物の種類に違いがあることが明らかになった。生態系の違い、生活感情の違いとの関係を考慮しつつ、このテーマも引続き掘り下げたい。4)平成8年5月、日本独文学会の研究発表会でシンポジウム「ドイツ現代詩における自然」を主宰し、自らも十九世紀から二十世紀にわたる自然抒情詩の変遷について発表した。ドイツ文学史のなかに独特の自然詩の系譜の存在することが学会レベルで確認された。5)ボブロフスキー研究については、平成8年夏にリトアニアの自然の現地調査を行なったことによって大きな進展があった。この詩人の全体像を描き上げる仕事は、動植物についての研究成果を活用しながら徐々に進められている。
東アジアの「遅れてきた福祉国家」に関する国際比較研究

近年,比較福祉国家研究の分野においては,東アジア諸国・地域への関心が高まり,多様な議論が活発に行われてきている。しかしながら,それらの議論は,「後発福祉国家」としての東アジア諸国の歴史的文脈を軽視しており,そのため,理論研究においても現状・歴史分析においても多くの限界を露呈している。本研究においては,「後発」という時間軸の視点を用いて,東アジアにおける福祉国家の歴史と現状を分析することによって,既存研究にみられる限界を乗り越える新しい視座を確保することができた。本研究の目的は,東アジア諸国・地域(主に日本,韓国,中国,台湾)における福祉諸制度・政策を,「遅れてきた福祉国家」という視点から比較分析し,比較福祉国家研究の新しい理論構築を目指すものである.そのため, 2008年度は,大きく理論研究と現状分析とに分けて研究を実施してきた.(1)理論研究においては,比較福祉国家研究の新しいアプローチとして「遅れてきた福祉国家」について検討を行った.その結果,論文として「日本における福祉国家研究-2つの潮流とその合流」,学会などでの口述発表として,「東アジア福祉国家研究と日本の役割-『先発国のなかの後発国』・『後発国のなかの先発国』」とLate-coming Welfare States : a NewPerspective from Koreaを発表し,また以前からの日韓比較研究の成果を含むかたちで単書として『後発福祉国家論-比較のなかの韓国と東アジア』を出版した.(2)現状分析においては,日本,韓国,中国,台湾の福祉諸制度・政策の現状と歴史的展開過程についての研究を行った.その結果,論文として「李明博政権の福祉政策-方向転換か変わらぬ道か」,「日本,韓国,台湾における若者貧困と社会保障-福祉国家体制への示唆」を発表し,そして翻訳書(韓国語)として『日本の社会保障-理論と分析』と『日本の介護保険制度-導入と改革』を出版した。本研究の目的は,東アジア諸国・地域(主に日本,韓国,中国,台湾)における福祉諸制度・政策を,「遅れてきた福祉国家」という視点から比較分析し,比較福祉国家研究の新しい理論構築を目指すものである.そのため,2009年度は大きく理論研究と現状分析とに分けて研究を実施してきた.(1)理論研究においては,比較福祉国家研究の新しいアプローチとして「遅れてきた福祉国家」について検討を行った.その結果,論文として「〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓'〓〓〓〓-〓〓〓〓':〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓」(日本における福祉国家研究の系譜と「武川一田多論争」-東アジア比較研究の課題),「〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓'〓〓〓'〓'〓〓〓':〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓」(福祉国家展開における「先発国」と「後発国」-時間軸の導入による比較研究に向けて),そして学会報告として,新しい「福祉国家の多様性」論にむけて-東アジア発の視点」を発表した。(3)さらに以上の理論研究と現状分析との統合の試みとして,日中韓の研究者を集めて東アジア福祉国家の国際比較のための共同研究を行い,その結果,『現代の比較福祉国家論-東アジア発の新しい理論構築に向けて』という本を出版した。本研究の目的は,東アジア諸国・地域(主に日本,韓国,中国,台湾)における福祉諸制度・政策を,「遅れてきた福祉国家」という視点から比較分析し,従来の比較福祉国家研究の限界を乗り越えるための新しい理論構築を目指すものである.本研究の最終年度である2010年度には,いままでの理論研究と現状分析の成果を総括するとともに,それをふまえて,新しい課題に取り組んだ。(1)いままでの研究成果の総括としては,3年間行ってきた日本・韓国・中国・台湾の歴史・現状分析と比較福祉国家研究の新しいアプローチについての検討をまとめ,学会報告として,「比較福祉国家研究における類型論と段階論-新しい分析枠組みの模索」を発表した。本論文は,2011年度に正式に刊行される予定である。(2)新しい課題としては,いままでの比較福祉国家研究から論点を絞って,若者の雇用/失業・貧困問題とその対策について,日本・韓国・中国・台湾を中心とする国際比較分析に取り組んだ。その結果,「日本と韓国における失業・貧困対策--二層体制の歴史的・構造的特徴」「韓国における若者の生活困難と社会保障」「若者の貧困と社会保障--日本・韓国・台湾の福祉国家体制への示唆」などの論文を発表した。また,近年注目を集めているディーセント・ワーク論の立場から,近年の若者問題に対する政策論的な課題を見出す論文として「社会保障からみるディーセント・ワークの課題--日本の現状と今後」を発表した。
過冷却状態を利用した新規凍結保存技術の基礎的研究

本研究は過冷却状態を含む各種凍結方法の違いにより、小型水生節足動物であるアルテミアの水和凍結胚の孵化率がどのように変動するかを測定し、細胞や組織レベルでの凍結障害の評価を実施した。その結果、電磁場エネルギー下による凍結では有意な孵化率の変動を認めなかったが、過冷却凍結を含む凍結速度の違いにより、孵化率の大きな変動を確認した。特にアルテミアシストの場合は、-0.5°C/min程度の比較的緩慢な凍結速度により、十分な水和処理を行った場合でも孵化率は高く保持される、トレハロースやDMSO処理で孵化率の上昇が認められる、クライオ対応走査型電顕による観察で胚組織の損傷が抑えられていることなどを確認した。本年度は電磁場エネルギー付与の過冷却凍結による凍害評価及び、過冷却専用庫で作り出した過冷却温度別の植氷凍結による凍害評価実験を行った。変動磁場を付与した過冷却凍結による成績については、CASフリーザー庫内の磁場分布が一定でないことが判明し、実験に先立って庫内の磁場強度分布マップを作成した。その結果、微弱な変動磁場が下段手前より上段奥にかけて分布し、各変動磁場強度ごとに検討を行ったが、いずれも通常の過冷却凍結を上回る成績は得られなかった。この件について、製造元のアビー社はCASフリーザーによる変動磁場は当初唱えていた過冷却状態の実現より、水分子の氷核成長抑制の効果にあることを説明している。この説明を受けて、CASフリーザー庫内の仕様を変更し、ネオジム磁石を用いた定常磁場付与による凍害評価実験を重点的に行った。その結果、微弱な定常磁場群と、比較的強い定常磁場群で僅かな孵化率上昇が認められた。しかしながら、統計的な有意性を示すには追加実験が必要であること、有効な磁場群が2群に分かれるなど、なお不明瞭な点も残るため、引き続き検討していく予定である。本年度はさらに磁場凍結を行わず過冷却専用庫で作り出した過冷却温度別の植氷凍結による凍害評価実験を行い、詳細な条件を精査した。その結果、アルテミアの水和胚を凍結させることなく、過冷却状態を保ったまま植氷により強制的に凍結させたところ、過冷却保持温度に応じた孵化率の有意な変化が認められた。同時に、凍結速度ごとに示差走査熱量測定を行い、過冷却凍結による水和凍結胚内部の明瞭な相転移エンタルピーの減少を確認した。これらの熱学的データを加味すれば、少なくとも凍結速度によりアルテミア水和胚内部の氷晶状態が異なる可能性を示しており、従来の凍結方法と比べ過冷却凍結の優位性を示唆するものと考えられる。最終年度となる本年度は、ネオジム磁石をフリーザー庫内に配置させた定常磁場下での凍害評価を行い、本研究課題における磁場下凍結に対する凍害評価で保留にしていた部分の追加実験と、過冷却凍結を利用した瞬間的凍結や異なる凍結速度による明確なアルテミアの孵化率変化を裏付ける検証実験を行った。磁場下凍結に対するアルテミア孵化率変化については、本年度はさらに多くの個体処理を行ったが、明確な有意性を得ることが出来なかった。アルテミア水和胚の孵化率は凍結障害を中立かつ正確に反映したものであると考えており、本年度までに精力的に行ったCASを含む変動磁場や様々な定常磁場によって孵化率の有意な差を認められなかったことは、少なくともアルテミアを指標としたバイオアッセイでは磁場下凍結の有効性は確認出来なかったことを意味する。ただし、CASフリーザーが冷凍食品を対象としており、食品の品質評価は食感など多くの官能指標に基づくため、磁場下凍結が食品凍結に対する有効性を必ずしも否定するものではない。これまでの研究により、凍結速度の違いによるアルテミア孵化率変化は有意性を備えた明確な成果であると考えられるため、最終年度ではアルテミア耐性胚(シスト)を脱殻した水和凍結胚を用い、各種凍害防御剤による効果を検討したところ、トレハロース処理やDMSO処理によって孵化率の改善が認められた。なおアルテミアシストの脱殻状態は、クライオ対応走査型電子顕微鏡(Cryo-SEM)で確認を行った。さらに凍結速度による水和凍結胚内部の状態を調べるため、Cryo-SEMで胚割断面を観察したところ、凍結速度の違いにより細胞質内の微細構造の違いが認められ、孵化率の違いに対する合理的な説明が得られた。以上より、様々な凍害防御剤や不凍タンパク質などを今後検討していく凍害評価手段として、脱殻したアルテミアの水和凍結胚の有用性が示された。本年度は、A. franciscanaの乾燥シストの水和時間を調節することによって様々な凍結感受性胚の作製を行い、水和凍結胚の凍結解凍後の孵化率を測定することによって正確な凍害評価法を確立した。

また、この評価法を用いて各種凍結法による凍害評価実験の本年度計画を実施した。具体的には、平成23年度の研究実施計画にもある通り、乾燥シストの水和時間を調節することで様々な凍害感受性胚を作成した。水和凍結胚の孵化率は、凍結耐性が速やかに失われるため、従来法である急速凍結の場合は0%であった。しかし、きわめて緩やかな緩速凍結により過冷却状態を作り出した場合は、ほぼ100%の孵化率を維持した。次に、水和時間を延長して過冷却凍結を行ったところ、6時間にわたる水和時間で孵化率60%、自然孵化時間に相当する24時間にわたる水和時間でも、孵化率は40%程度を示すことが分かった。これらの成果は、凍結速度により細胞が受ける凍結障害に大きな差が認められることを示す明瞭な成果である。一方、CASフリーザーによる磁場を印加した過冷却凍結法では、急速凍結より若干高い孵化率が得られているものの、緩速凍結による過冷却凍結を超える孵化率は今のところ得られていない。交付申請書にもある通り、電磁場印加による過冷却凍結については適正な条件設定が必須であり、今後はこれらのデータを受けて、定常磁場や過冷却専用庫を用いた凍結保存実験に取り組んでいく方針である。本年度に得られた研究より、過冷却凍結を実現する極めて緩速な凍結速度による孵化率の大幅な改善が認められた。これらの成果は、A. franciscanaの水和凍結胚において、細胞もしくは組織レベルでの凍結障害が著しく軽減されたと考えられるため、今後は予定通り過冷却凍結の優位性を立証していく方針である。2年目にあたる本年度の研究計画では、昨年度までに報告した凍害評価法の確立を受けて、具体的にCASフリーザーによる変動磁場凍結、ネオジム磁石による定常磁場凍結、過冷却専用庫で作り出した磁場付与を行わない過冷却凍結法による孵化率を調査し、本年度報告書通りの成果進捗が認められたため、現在までの達成度をおおむね順調と判断した。これらの成果の一部は国内学会で口頭発表し、国内専門雑誌にて論文報告を行った。アルテミア水和凍結胚の孵化率による凍害評価法の目的は、凍害モデル系による中立的な評価にあり、既存の過冷却凍結法との比較から磁場凍結効果を調べられることが大きな利点である。本年度は変動磁場付与と定常磁場付与の2つの方向から詳細に検討したが、調べた限りにおいて、定常磁場仕様でのみ若干の改善が認められた。ただし、アッセイ実験はまだ進行中であり、最終的な結論は次年度に持ち越される予定である。なお、アルテミア水和凍結胚を用いた本研究は、食感などの多くの質的要因が考慮される冷凍食品に対する変動磁場自体を否定するものではなく、冷凍食品の直接的な評価は別途行われるべきであろう。本年度はこれらの磁場凍結法のほか、過冷却専用庫による植氷凍結温度によるアルテミア孵化率の評価実験も行った。植氷温度別の過冷却凍結に応じた孵化率データが得られたことは、過冷却凍結に関する優位性をさらに裏づける重要な成果の一つであると考えられる。本研究は、従来の凍結手段で生じる氷晶形成や凍結脱水による凍結障害を減じるための、新規過冷却凍結保存技術の確立を目指した基礎研究を行うものである。初年度は、本研究の全体の遂行に必須な凍害評価法の確立が必須であったが、これについては、申請前からの入念な準備と必要な研究機器の導入も手伝い、無事に達成することが出来た。これらの成果は取りまとめ、欧文の雑誌論文(平成23年度研究成果参照)で発表し、国内においても学会発表(平成23年度研究成果参照)にて報告した。
遺伝子全領域同時SSCP法を用いたヒト癌における変異遺伝子の総合的検索

【緒言】本研究では、新規に創案した全領域マルチSSCP法とゲノムスキャン法とを用いて、個々の癌における遺伝子異常を広範に検索し、併せてその原因を追及することを目的とした。【方法】1,研究検体を確保するために、岡山大学腫瘍バンクを設立し、これまでに約800例の腫瘍-正常組織対を収集した。2,マクロな遺伝子異常検出法としてInter-Alu Long-PCR法によるゲノムスキャンを開発した。3,ミクロな遺伝子異常検出法として蛍光標識を用いた長鎖(RT)-PCRによる遺伝子全領域マルチSSCP法を開発し、点突然変異などの微小な異常を検索した。【結果】2の方法により複数の腎癌において共通にLOHが見られた領域はRadiation Hybrid法によってヒト染色体14長腕にマップされ、腎癌における新しいLOH領域の発見となった。3の方法によっては、結腸癌の1例でK-ras第22コドンにGln→Lysの新しい癌特異的点突然変異を見い出した。同じ方法によって、大腸癌でマイクロサテライトの不安定性(MI+)と転写因子E2F4遺伝子の変異を検索し、MI+の癌にのみ特異的なE2F4エクソン内の(CAG)13反復配列のコピー数変化を発見した。この変異はE2F4蛋白質の転写活性化領域内のポリセリンの数を減少させ活性化させる。これまでに200例以上の癌を検索し、MI+の胃癌と大腸癌の約37%にE2F4の変異を見い出した。更に我々はE2F4の変異は高頻度のMI+表現型を示す大腸癌では60%以上の頻度で見られ、また興味深いことにE2F4変異を持つ癌の80%以上が修復遺伝子であるhMSH3のエクソン内に1塩基フレームシフト変異を持つことを明らかにした。以上のように、これらの癌ではE2F4遺伝子がhMSH3遺伝子の関与するミスマッチ修復機構の欠損の標的であることを初めて解明した。上記のほか、E2F4タンパク質と相互作用するp107遺伝子の初めての異常を2例のリンパ球系腫瘍細胞株と1例のリンパ性白血病患者から発見し、そのうち1例は遺伝子内のエキソン5個を含む15kbpの領域の欠失であることを発見した。また、頭頸部癌における遺伝子増幅を伴わないCyclin D1遺伝子の発現増強を競合的RT-PCR法によって証明した。また極めて最近、ヒト染色体3p21領域に局在する新たな癌抑制遺伝子候補を発見し、遺伝子全体構造を解明すると共に、肺小細胞癌細胞株における1遺伝子座位の欠失と残っている遺伝子上の点突然変異を発見した。[目的]本研究では、新たな遺伝子解析法を用いてヒトがんにおける遺伝子異常を広範に検索することを目的とした。[方法]

1、マクロな遺伝子異常検出法としてInter-Alu Long-PCR法によるゲノムスキャンを同一患者のがん部、非がん部のDNAについて行い、特にがん部における欠失領域を中心に検索した。2、ミクロな遺伝子異常検出法として長鎖RT-PCRによる遺伝子全領域マルチSSCP法を開発し、点突然変異などの微小な異常を検索した。[結果]1の方法により複数の腎癌において欠失が共通に見られた約1.6kbpのPCR産物をクローニングし、ユニーク配列部分をシーケンスしたところ、cDNAデータベース中の未知のESTと同じ配列を発見した。このほか、胃がん、肝がんなどからも欠失を示唆するPCR断片が約10人の症例から見い出されている。2の方法によって、結腸がんの1例からK-ras第22コドンにGln→Lysの新しいがん特異的点突然変異を見い出した。このK-ras22KcDNAをNIH3T3細胞で発現させたところ、顕著な形態的トランスフォーメーションとヌードマウスにおける明らかな造腫瘍性が確認された(佃和憲ほか、投稿準備中)。同じく2方法により、大腸がん20例につきマイクロサテライトの不安定性(RER^+)と転写因子で癌遺伝子ともなるE2F-4遺伝子の変異とを検索したところ、RER^+のがん2例にのみ特異的に、E2F-4エキソン内の(CAG)_<13>反復配列のコピー数が変化した遺伝子を発見した(文献2)。このE2F-4遺伝子の変異はミスマッチ修復系の標的遺伝子として、TGFβ受容体II型遺伝子に次ぐ第2のものである。また、RB遺伝子類縁で癌抑制遺伝子候補であったp107遺伝子およびその産物の初めての異常を3例の造血器腫瘍から発見した(滝本秀隆他、投稿中)。本年度の特筆すべき研究成果は前年度に発見した大腸がんにおけるE2F4プロトがん遺伝子エキソン内CAGリピート数のがん特異的変異に関するものである。まず米国のS.Meltzer博士らとの共同研究により,E2F4の変異がマイクロサイライト不安定性(MI^+)を示す大腸がんや胃がんのうち約38%に起きていることが確認された。更に我々は木村彰方(東京医歯大),島田隆(日本医大)両教授の支援を受け,約30例のMI^+大腸がんを解析して次のような知見を得た。(1)E2F4の変異は顕著なMI^+表現型を示すがんにのみ60%以上見られ,特に(CAG)の減少が多い。(2)E2F4変異を持つがんの80%以上が同時にミスマッチ修復遺伝子hMSH3のエキソン7に1塩基フレームソフト変異を起こして失活している。多重がんの例で,これらの変異はがんの進行度に伴って出現する。これらのMI^+がんで他のCAGリピート配列の変異は低く,E2F4の変異と随伴しない。酵母においてMSH3の欠損は3-4塩基の変異を起こすことが知られており,以上の知見はヒトがんにおいてもMSH3の欠損が新しく発見された標的遺伝子E2F4の3塩基変異をひきおこすことを示している。これまでMI^+のがんにおいてはMSH2,MLH1などのミスマッチ修復遺伝子の欠損がTGFβII受容体などの1塩基変異を起こすことが報告されていたが,MSH3遺伝子欠損の標的は不明であった。本研究によりその標的の最初の例が発見され,しかもそれががん遺伝子にもなり得る転写調節遺伝子であったことは重要な知見である。なお,変異したE4F4遺伝子はc-mycなどの遺伝子発現を亢進させるという知見(未発表)を得ており,E2F4の変異がこれらの大腸がんの進展に促進的に作用していると考えられる。
潜伏HIV再活性化シグナルによる脱メチル化制御

抗ウイルス剤併用用法によって、AIDS発症抑制に成功したが、同時にこの治療では、潜伏感染細胞の除去は不可能であることも明らかとなった。HIV感染症の根治を考える場合、潜伏感染細胞の除去は不可欠の問題である、研究代表者は、HIV潜伏感染の分子機構を解析し、HIV感染症の根治に向けた基礎的な研究を行った。潜伏感染モデル細胞株を用い、プロウイルスLTRのCpGメチル化がHIVの潜伏に重要な役割をはたしていること、DNAのメチル化はLTRを強固なヌクレオソーム構造とすることにより、転写が恒常的に抑制されていること、この強固な構造は、LTRのメチル化だけでなく、ヒストンの化学修飾によっても制御されること等を明らかにした。また、LTRのメチル化は5'-LTRに選択的に起きていることも見いだした。この分子機構については、解析途中であるが、潜伏感染細胞の除去に向けた、最初の一歩を成し遂げたと思われる。今後は、モデル実験動物等を用い、実際のin vivoの状態を明らかにし、またより詳細な分子機構の解明を目指したい。慢性持続感染細胞株及びLPS刺激によりHIV発現が誘導されるHIVトランスジェニックマウス(HIV-Tg)の脾臓細胞を材料に、LPS,TNF-a等による刺激を加え、HIVの再活性化を経時的に解析するとともに、染色体DNAを抽出してbisulfite genomic sequence法を用いてCpGの脱メチル化部位を詳細に解析した。更に脱メチル化部位を含む塩基配列のOligoプローブと抗体をを用いたElectrophoresis mobility shift analysis(EMSA)およびsuper-shift assayにて結合タンパク質の解析を行った。その結果、1)慢性感染細胞においてLTRのCpGメチル化のレベルとウイルス遺伝子発現レベルは逆相関すること、2)TNF-a等の刺激でウイルス遺伝子発現を誘導すると発現誘導に伴いCpGの脱メチル化が進行すること、3)LPS刺激によるHIVの発現誘導は細胞周期依存的であること、4)その際LTR上の部位特異的CpG脱メチル化が伴うこと、5)2ケ所の特異的脱メチル化部位がCREB/ATFファミリーの結合配列に相同性を有していること、6)これらの配列にはCpGのメチル化の有無に関わらず結合する共通のタンパク質が存在し、それは既知のCREB/ATFファミリー転写因子とは異なること、7)この部位には非メチル化配列特異的に複数の核内因子が結合しうること、を明らかにした。なお、本研究結果は現在論文投稿中である。平成13年度研究実績の概要本年度の研究で明らかになったことは以下の通りである。1,HIV潜伏感染モデル細胞株OM10.1は、LTR内CpG sitesにメチル化が全く認められない細胞株である。2,OM10.1をTNFaで再活性化を誘導するとウイルス発現が誘導される。このとき、LTRのCpGメチル化は認められない。遺伝子のダイナミックな発現制御の形態としてのクロマチン構造の制御がヒストンの化学修飾(これをヒストンに書き込まれた暗号:Histone Codeと呼ぶ)によって決定されるという事実が明らかにされ、遺伝子発現の抑制に関わるヒストンの化学修飾をRepressive Histone Codeと呼ぶようになったが、OM10.1でのHIVはヒストンの化学修飾によって転写が抑制されていることが明らかになった、AIDSを発症し亡くなった患者検体を用いたLTRのメチル化状態の解析、京都大学ウイルス研究所速見教授の研究グループから提供されたSHIV感染ザルの末梢血検体のLTRの解析では、いずれもメチル化が認められない結果が得られており、HIV患者感染細胞中のHIV、特に潜伏感染しているHIVはおそらくRepressive Histone Codeによって転写が抑制されいていることが推測された。本研究で明らかにされた結果は、前年度で明らかにされた結果と合わせ、全3報の論文として現在投稿中である。
C型肝炎の病態増悪に関わる腸内細菌叢由来因子の同定

C型慢性肝疾患(CHC)患者の腸内細菌叢を、健常人と比較した。腸内細菌叢の変化は病初期から見られ、多様性が失われていた。無症候性キャリアでは一時的にBacteroidesやEnterobacteriaceaeが増加し、病期が進むにつれストレプトコッカス・サリバリウスなどが持つウレアーゼ遺伝子が増加した。慢性肝炎・肝硬変患者の便ではpHの上昇が見られ、ストレプトコッカス・サリバリウスなどのアンモニア生産菌が便中アンモニアの増加に関与していると考えられた。CHCは病初期から腸内細菌叢の破綻を引き起こし、アンモニア生産菌の異常な増加がCHCで見られる高アンモニア血症の一因と考えられる。本研究の目的は、C型慢性肝炎の病態進展度による腸内細菌叢の特徴を明らかにし、腸内細菌由来の肝病態増悪因子を同定し、その作用機序を解明することである。研究期間開始前に得られた結果から、肝硬変症例と無症候性キャリア症例で腸内細菌叢構成菌種の相違が見いだされた。本年度は1.肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢の比較、2.メタボローム解析の計画立案と着手を行った。1.肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢の比較:名古屋市立大学病院および研究協力機関に通院中のHCV感染症例で、糞便提供に同意した患者を対象とした。名古屋市立大学で糞便から腸内細菌ゲノムDNAを抽出し、細菌ゲノムDNAを鋳型に16S ribosomal RNA遺伝子を網羅的に増幅させるPCRを行った。その後研究協力機関で、次世代型超高速DNAシーケンサーIllumina MiSeq 2000を用いて塩基配列を決定した。得られた塩基配列は菌叢データに変換し、比較解析に用いた。細菌叢データを統計学的に検討した結果、C型肝炎の病態進展(肝線維化の増悪、肝硬変への移行)に関連する菌種を同定した。当初肝硬変と無症候性キャリア症例のみを研究対象としたが、両者の移行病態として慢性肝炎症例も対象に含め解析を行った。2.メタボローム解析の計画立案と着手:腸内細菌叢データから典型的な10サンプルを選択した。現在、島津有機酸分析システムを用いた高速液体クロマトグラフィ(HPLC)で、糞便中のコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、iso-酪酸、n-酪酸、iso-吉草酸、n-吉草酸の定量分析を施行している。これまでに肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢を比較し、典型的な症例のメタボローム解析の計画立案と着手を行った。1.肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢比較: HCV感染症例で糞便提供に同意した患者170例(肝硬変61例うち肝癌合併21例、慢性肝炎91例うち肝癌合併3例、無症候性キャリア18例)を対象とした。名古屋市立大学で腸内細菌ゲノムDNAを抽出し、細菌ゲノムDNAを鋳型に16S ribosomal RNA遺伝子を網羅的に増幅させるPCRを行った。研究協力機関で次世代型超高速DNAシーケンサーを用いて腸内細菌叢の塩基配列を決定し、得られた塩基配列を菌叢データに変換し比較解析を行った。統計学的検討の結果、C型肝炎の病態進展すなわち肝硬変と関連する菌種としてOtu40が同定された。HCV感染症例を肝硬変・慢性肝炎・無症候性キャリアの3病期に分けた比較検討で、Otu40は肝硬変症例で有意に増加していた。また肝線維化の客観的な指標としてFib4-indexを用いた解析では、Fib4-index 3.25以上の肝線維化進展症例でOtu40が高頻度に検出された。なお、肝癌と関連する菌種は同定されていない。2.メタボローム解析の計画立案と着手:腸内細菌叢データからOtu40を菌叢に持つ7サンプルと、持たない3サンプルをパイロットスタディとして選択した。Otu40は酪酸産生菌である。現在島津有機酸分析システムを用いた高速液体クロマトグラフィ(HPLC)で、糞便中のコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、iso-酪酸、n-酪酸、iso-吉草酸、n-吉草酸の定量分析を行っている。本研究期間開始以前に得られた結果から、肝硬変症例と無症候性キャリア症例で腸内細菌叢構成菌種の相違が見いだされた。本年度は1.健常人とHCV感染者の腸内細菌叢の比較、2.HCV感染者で顕著に見られる腸内細菌の病原性の解明に向けた計画立案、を行った。1.健常人とHCV感染者の腸内細菌叢の比較:HCV感染者は名古屋市立大学病院および研究協力機関に通院中のC型慢性肝疾患患者で、糞便提供に同意し、書面で同意書を提出した患者を対象とした。健常人は研究協力機関に書面で同意書を提出したボランティアである。糞便から腸内細菌ゲノムDNAを抽出し、細菌ゲノムDNAを鋳型に16S ribosomal RNA遺伝子を網羅的に増幅させるPCRを行った。