hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
暖温帯林におけるブナ科樹種の構成割合の変化が種子生産の年変動に与える影響の解明

温帯域の森林の主要構成種であるブナ科樹種の種子(堅果)は、開花直後から結実に至るまで多くの昆虫に加害され、それが種子生産に大きな影響を与えることが知られている。西日本の暖温帯域では、遷移の進行などにより林分におけるブナ科樹種の構成割合が変化しており、それが種子を加害する昆虫の密度や加害パターンを変化させ、各ブナ科樹種の種子生産の年変動に影響している可能性がある。本研究では、このような散布前の種子への加害といった生物的要因の着目し、それが種子生産量の変動に及ぼす影響を定量的に明らかにすることを目的としている。2019年度の研究成果は以下の通りである。1.西日本の二次林の代表種であるコナラについて、アベマキ・アラカシといった多種のコナラ属が混交している林と、コナラが優占している林において、コナラの散布前種子の加害に大きく関わっていることが明らかになってきたハイイロチョッキリの個体密度を推定したところ、多種のコナラ属が混交している林においてその個体密度が高く、コナラの種子生産が大きく制限されている可能性が示唆された。2.京都盆地周辺で分布が拡大しているコジイについて、最近コジイが優占してきた林(宝ヶ池)、京都でも古くからコジイが優占している林(東山)、自然状態の照葉樹林が残存する林(宮崎県綾)において種子生産や種子食昆虫の加害の影響を調べたところ、「東山」と「綾」では、種子食昆虫の影響が大きく、それにより種子生産が大きく年変動していることが明らかとなった。一方で、最近コジイが優占してきた「宝ヶ池」では種子食昆虫の影響はとても小さく、毎年多くの種子が生産されていた。林分の古さが種子加害者の密度に影響し、それが種子生産に影響している可能性が示唆された。2018年度は、台風21号の影響により、京都盆地周辺の5ヶ所の調査林分のうち、2林分で殆どの木が倒れ、これらの林分での研究の継続が困難となった。しかしながら、コナラについてこれまで種子加害者として重要であることが明らかになってきたハイイロチョッキリについて、飼育していた多数の個体が羽化してきたため、各個体がどのくらいのコナラ堅果を加害するのかということをかなり正確に計測することができた。これにより、コナラの個体レベルでのハイイロチョッキリの個体密度を推定する手法を確立することができ、これまで取ってきたデータを含めて、コナラの種子生産に対する生物的要因の経年的な影響について定量的に求めることが可能となった。またコジイの種子加害者について、詳細な観察、DNA分析、飼育実験により、まったく新しいブナ科堅果の加害者であることが明らかとなってきている。このように、これまでデータを蓄積してきた各樹種について定量化に関わる詳細な研究を行うことができた。これまで研究を行ってきた京都盆地周辺の5林分のうち2林分は多くの木の倒壊のため、研究を継続することが困難になってしまった側面もあるが、コナラとコジイについては、詳細な種子食昆虫の動態などの解明を元に、生物的要因の定量化を行い、論文の作成を行う。また樹木個体と種子食昆虫の相互作用をさらに明らかにするため、倒壊を免れた個体とともに、新たな調査個体の選定も行い、継続的な種子生産の年次変動の調査を行っていく。さらに、コジイと並んで暖温帯林のブナ科構成種として重要なアラカシ、スダジイを新たに調査対象として加え、種子生産に関わる生物的要因の大きさの評価や年次変動に与える影響について調べていく。またコナラとアラカシについては、樹体内の資源変動が個体の繁殖量にどのように関わっていくかについても評価していく。

2018年度は、台風21号の影響により、京都盆地周辺の5ヶ所の調査林分のうち、2林分で殆どの木が倒れ、これらの林分での研究の継続が困難となった。しかしながら、コナラについてこれまで種子加害者として重要であることが明らかになってきたハイイロチョッキリについて、飼育していた多数の個体が羽化してきたため、各個体がどのくらいのコナラ堅果を加害するのかということをかなり正確に計測することができた。これにより、コナラの個体レベルでのハイイロチョッキリの個体密度を推定する手法を確立することができ、これまで取ってきたデータを含めて、コナラの種子生産に対する生物的要因の経年的な影響について定量的に求めることが可能となった。またコジイの種子加害者について、詳細な観察、DNA分析、飼育実験により、まったく新しいブナ科堅果の加害者であることが明らかとなってきている。このように、これまでデータを蓄積してきた各樹種について定量化に関わる詳細な研究を行うことができた。これまで研究を行ってきた京都盆地周辺の5林分のうち2林分は多くの木の倒壊のため、研究を継続することが困難になってしまった側面もあるが、コナラとコジイについては、詳細な種子食昆虫の動態などの解明を元に、生物的要因の定量化を行い、論文の作成を行う。また樹木個体と種子食昆虫の相互作用をさらに明らかにするため、倒壊を免れた個体とともに、新たな調査個体の選定も行い、継続的な種子生産の年次変動の調査を行っていく。さらに、コジイと並んで暖温帯林のブナ科構成種として重要なアラカシ、スダジイを新たに調査対象として加え、種子生産に関わる生物的要因の大きさの評価や年次変動に与える影響について調べていく。またコナラとアラカシについては、樹体内の資源変動が個体の繁殖量にどのように関わっていくかについても評価していく。次年度は、2018年度の調査地の倒壊に伴って、新しい調査地、調査木などの設定について、費用がかかる。また消費税も上がるため、物品費の購入費が予想よりも大きくなる可能性ある。また樹体内の資源量についてより詳しく調べるため、サンプル数、対象樹種数を増やすす予定にしている。このため予算を確保した。
酸化ストレスに着目した膝前十字靱帯再建術後にみられる骨格筋萎縮の予防戦略の開発

本研究の目的は膝前十字靭帯(ACL)再建術後に生じる筋萎縮に対するα-リポ酸摂取の影響を検討することである.ACL再建術を行う被験者を無作為にα-リポ酸摂取群(10名)とプラセボ摂取群(10名)に割り付けた.被験者には手術の1日前から4週間に渡り1日2回サプリメントを摂取させた.大腿四頭筋の筋体積はMRIにより測定した.大腿四頭筋の筋萎縮は両群に認められた.しかしながら,α-リポ酸摂取による筋萎縮の抑制効果は認められなかった.ACL再建術後に炎症や筋損傷が認められた.本研究の目的は,酸化ストレスを軽減する抗酸化物質の投与がACL再建術後の骨格筋萎縮を抑制することができるかを検討することである.本研究は可能な限り早期に研究成果を社会に還元すること考慮し,すでに薬局等で健康補助食品(サプリメント)として市販されているα-リポ酸を抗酸化物質として用い,手術後4週間の大腿部の骨格筋萎縮率の差をα-リポ酸摂取群とプラセボ摂取群で比較する研究である.本研究計画に関しては,臨床研究という研究の特性を考慮し,病院に設置されている倫理審査委員会にて研究計画内容の倫理審査を受け,研究計画の承認を得て実施している.さらに,その臨床試験に関する研究計画を日本医師会治験促進センターの臨床試験登録システムに登録している(日医治促ID:JMA-IIA00112,試験標題:膝前十字靱帯再建術後の骨格筋萎縮に対するαーリポ酸投与の影響ー無作為化比較試験).研究の2年目にあたる平成25年度は,倫理審査委員会にて承認を得た研究計画に基づき平成24年度に引き続き研究対象者のリクルートを実施した.そして,研究への参加同意の得られた対象者の方から随時研究調査を実施した.採取した血液サンプルについては,ある程度の検体数が得られるまで,凍結保存しており,今後各種指標の測定を実施していく予定である.また,現在,得られた大腿部のMRI画像のデータから骨格筋の萎縮率の算出を実施している段階である.本研究の目的は,酸化ストレスを軽減する抗酸化物質の投与がACL再建術後の骨格筋萎縮を抑制することができるかを検討することである.本研究は可能な限り早期に研究成果を社会に還元すること考慮し,すでに薬局等で健康補助食品(サプリメント)として市販されているα-リポ酸を抗酸化物質として用い,手術後4週間の大腿部の骨格筋萎縮率の差をα-リポ酸摂取群とプラセボ摂取群で比較する研究である.研究の初年度にあたる平成24年度は,研究を実施する病院に勤務する研究協力者である医師や理学療法士,臨床検査技師との意思疎通をはかった.また,他の研究協力者とも検体の測定協力のお願いに加え,研究の具体的な実施方法と今後の課題についての意見交換および協議を行い具体的な研究計画を構築した.そして,本研究計画に関しては当初研究代表者の勤務校に設置されている倫理審査委員会に申請する予定であったが,臨床研究という研究の特性を考慮し,予定を変更し研究を実施する病院に設置されている倫理審査委員会にて研究計画内容の倫理審査を実施し,研究計画の修正等を経て承認を得た.さらに,その臨床試験に関する研究計画を日本医師会治験促進センターの臨床試験登録システムに登録した(日医治促ID:JMA-IIA00112,試験標題:膝前十字靱帯再建術後の骨格筋萎縮に対するαーリポ酸投与の影響ー無作為化比較試験).現在,その研究計画に基づき,研究対象者のリクルートを開始している段階である.本研究の目的は,酸化ストレスを軽減することが可能である抗酸化物質α-リポ酸の経口摂取がACL再建術後の骨格筋萎縮を抑制することができるかを検討することである.具体的にはACL再建術後4週間の大腿部の骨格筋体積(大腿四頭筋の体積)の変化(萎縮率)の差をα-リポ酸摂取群とプラセボ摂取群で比較する研究である.今年度は,先行研究に基づき骨格筋の体積を算出する方法の確立を進めた.その中で分析者の違いによる算出結果の違いの影響を極力少なくする骨格筋の体積の算出方法を確立した.また,今年度も,昨年度と同様に対象者のリクルートを進め,研究を遂行した.しかしながら,年度途中の研究対象者のリクルート状況から平成26年度末までに十分な数の対象者をリクルートすることが困難であると考えられたため,1年間の研究期間延長を見込み,研究対象者をリクルートできる新たな医療機関の確保を進めた.その結果,他施設において研究対象者をリクルートできることとなり,研究期間延長申請をすると共に新たな協力施設において医師等との打ち合わせ等を実施し研究実施方法の確立を進めた.また,新たに研究対象者のリクルートを進める病院に設置されている倫理審査委員会において研究計画内容および同意書の倫理審査を実施し,承認を得た.今後,新たにその臨床試験に関する研究計画を臨床試験登録システムに登録し,7月初旬を目途に研究対象者のリクルートを開始する予定である.本研究の目的は,抗酸化物質であるα-リポ酸の経口摂取が膝前十字靭帯(ACL)再建術後に生じる骨格筋萎縮を抑制することができるか否かを検討することである.

対象者は,膝ACL再建術を受ける者で同意の得られた20名とした.対象者をブロックランダム割り付け法によりα-リポ酸摂取群とプラセボ摂取群の2群に分け,二重盲検ランダム化比較試験を実施した.本研究では市販のα-リポ酸の錠剤を用い,摂取期間は前十字靭帯再建術前夜から術後4週間とした.また対照群には,同期間プラセボを摂取させた.採血は手術前日,手術直前,手術直後,手術翌朝,手術3日後,手術7日後,手術4週間後に実施した.また,手術前日と手術4週間後に大腿部をMR撮像し,得られた画像から大腿四頭筋の筋体積を算出した.結果として,酸化ストレス指標である血清d-ROMs値は手術前日に比較し,手術3日後,7日後に有意に増加することが示されたが,群間での差は認められなかった.また,抗酸化指標である血清BAP値は手術前日に比較し,手術直後,手術翌朝に有意に低値を示したが,群間差は認められなかった.さらに,血清の高感度CRPやクレアチンキナーゼ活性も手術前日に比し手術翌日から有意に増加することが示されたが,群による違いは認められなかった.本研究のメインアウトカムである患側の大腿四頭筋の筋体積は,4週間で平均して約15%低下したが,群間での差は認められなかった.したがって,本研究で用いたα-リポ酸の摂取量では膝ACL再建術後の炎症反応や筋萎縮を軽減する効果は期待できないことが示された.本研究の目的は膝前十字靭帯(ACL)再建術後に生じる筋萎縮に対するα-リポ酸摂取の影響を検討することである.ACL再建術を行う被験者を無作為にα-リポ酸摂取群(10名)とプラセボ摂取群(10名)に割り付けた.被験者には手術の1日前から4週間に渡り1日2回サプリメントを摂取させた.大腿四頭筋の筋体積はMRIにより測定した.大腿四頭筋の筋萎縮は両群に認められた.しかしながら,α-リポ酸摂取による筋萎縮の抑制効果は認められなかった.ACL再建術後に炎症や筋損傷が認められた.臨床研究という研究の性格上,研究対象者をリクルートする段階で,研究対象となる治療を受ける方が存在し,さらにその中で研究参加の同意を得られた方を研究対象者にする必要がある.現在,研究の進行状況が遅れている理由として,そのリクルートの段階で研究対象となる方の人数が当初の予想を下回っていることが挙げられる.複合領域平成24年度に構築した研究計画に基づき研究を遂行していく.今後は,目標とする対象者数の確保をさらに進めるため,新たな医療機関において研究対象者のリクルートを進めていく予定である.臨床研究という研究の性格上,研究対象者をリクルートする段階で,研究対象となる治療を受ける方が存在し,さらにその中で研究参加の同意を得られた方を研究対象者にする必要がある.現在,研究の進行状況が遅れている最も大きな理由として,そのリクルートの段階で研究対象となる方の人数が当初の予想を大幅に下回っていることがあげられる.予想を下回っている理由として,受傷者数が例年より下回ったこと及び,手術日程の関係から他の関連病院で手術を受ける例も見受けられることが考えられる.臨床研究という研究の性格上,研究対象者をリクルートする段階で,研究対象となる治療を受ける方が存在し,さらにその中で研究参加の同意を得られた方を研究対象者にする必要がある.現在,研究の進行状況が遅れている一番大きな理由として,そのリクルートの段階で研究対象となる方の人数が当初の予想を下回っていることが挙げられる.また,担当医師の判断で研究へのリクルートを見合わせることもある.さらに,研究計画に関する具体的な方法を構築していく中で様々な部署との調整が必要となり,最終的な研究計画の構築が当初計画より遅れてしまったことも1つの理由である.次年度使用額が生じた理由は,研究対象者の確保が十分にできていないためである.そのため,介入研究実施に必要な消耗品や血液検体の測定に必要な消耗品の購入ができない状況であった.平成24年度に構築した研究計画に基づき研究を遂行していく.
膵島細胞マスプロダクション技術の開発

本研究では、ヒトES/iPS細胞からの均一な品質の膵島細胞の大量分化・産生(マスプロダクション)法の開発・技術革新を目的とします。具体的には、我々が開発した簡便で均一なヒトES/iPS細胞を閉鎖系で大量培養可能な新規の3次元スフェア浮遊培養法と、我々が作製した膵前駆細胞特異的な新規の糖鎖マーカー抗体による膵島分化過程の詳細な解析を用いて膵島細胞分化法を検証・最適化します。昨年度は、我々の3次元スフェア浮遊培養法を用い、我々の抗体によるモニタリングを行いながら膵島細胞の誘導法の開発・最適化を行いました。その結果、ヒトES/iPS細胞の拡大培養から分化誘導、膵島細胞作製まで一貫して3次元浮遊培養系で効率よく行う方法を確立できました。この培養法で作製した膵島スフェアにおいて、殆どのスフェアでインスリン(Cペプチド)やグルカゴンの発現も確認できました。しかし開発した誘導方法では、スフェアの大きさが不均一であったり、インスリンやグルカゴンの発現もスフェアごとに異なっていたり等、改良すべき点が見つかりました。特に大きなスフェアではインスリン等の成熟マーカーの発現が弱いことがわかりました。そこで、スフェアの大きさを一定に保つために、3次元化のために加えているポリマーの濃度の最適化を開始しました。また膵前駆細胞の分化までは、我々の抗体でモニタリング可能でいたが、それ以降の分化・成熟過程では生きた細胞でモニタリングが難しいので、インスリンプロモーター下に蛍光タンパク質遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞株の作製に着手しました。昨年度度は、我々の3次元スフェア浮遊培養法を用い、我々の抗体によるモニタリングを行いながら閉鎖系での大量産生を可能とする膵島細胞の誘導法の開発・最適化を計画していました。計画に従って研究を進め、マーカー遺伝子やタンパク質の発現をヒト膵臓発生と比較しながら条件を検討していくことを繰り返し、効率よくヒトES/iPS細胞の拡大培養から分化誘導、膵島細胞作製まで一貫して行える基本となる3次元浮遊培養方法を確立できました。この培養法で作製した膵島スフェアにおいて、殆どのスフェアで膵島の分泌細胞であるβ細胞を示すインスリン(Cペプチド)やα細胞を示すグルカゴンの発現も確認できました。昨年度の研究ではまた、計画していた通り、成熟して均一な膵島細胞を誘導するための問題の洗い出しにも成功しました。分化誘導開始から膵前駆細胞までは、効率よく分化誘導可能なのですが、それ以降の段階で成熟度や均一性が担保されないことがわかりました。予測どおり、分化誘導後半の成熟化の検討が重要だとわかりましたので、これを生細胞でモニター可能なインスリンプロモーター下に蛍光タンパク質遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞株の作製を開始しました。昨年度の研究で、成熟して均一な膵島細胞を誘導するためには、膵前駆細胞分化以降の誘導過程を改良する必要がわかりましたので、インスリンプロモーター蛍光タンパク質遺伝子を導入した細胞株を作製します。今年度はまた、いくつかの方法で成熟化に挑戦します。昨年度までの結果から実際の膵島と同じ程度の大きさの小さいスフェアの方が内分泌マーカーの発現が高かったので、小さいスフェアを均一に大量に作製するため、分化誘導開始スフェアのサイズの検討、3次元浮遊化のためのポリマーのスフェアの大きさに応じた最適化などを行います。一方で、大きいスフェアに応じた分化誘導因子の処理濃度や処理時間を最適化し、膵臓オルガノイドとして成熟を検討します。また、小さいスフェアで分化誘導したものを集合させオルガノイドを形成させることによる成熟化も検討します。これらでも成熟化が見込めない場合は、他の細胞種(内皮細胞など)との共培養による成熟化も行う予定です。

計画に従って研究を進め、マーカー遺伝子やタンパク質の発現をヒト膵臓発生と比較しながら条件を検討していくことを繰り返し、効率よくヒトES/iPS細胞の拡大培養から分化誘導、膵島細胞作製まで一貫して行える基本となる3次元浮遊培養方法を確立できました。この培養法で作製した膵島スフェアにおいて、殆どのスフェアで膵島の分泌細胞であるβ細胞を示すインスリン(Cペプチド)やα細胞を示すグルカゴンの発現も確認できました。昨年度の研究ではまた、計画していた通り、成熟して均一な膵島細胞を誘導するための問題の洗い出しにも成功しました。分化誘導開始から膵前駆細胞までは、効率よく分化誘導可能なのですが、それ以降の段階で成熟度や均一性が担保されないことがわかりました。予測どおり、分化誘導後半の成熟化の検討が重要だとわかりましたので、これを生細胞でモニター可能なインスリンプロモーター下に蛍光タンパク質遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞株の作製を開始しました。昨年度の研究で、成熟して均一な膵島細胞を誘導するためには、膵前駆細胞分化以降の誘導過程を改良する必要がわかりましたので、インスリンプロモーター蛍光タンパク質遺伝子を導入した細胞株を作製します。今年度はまた、いくつかの方法で成熟化に挑戦します。昨年度までの結果から実際の膵島と同じ程度の大きさの小さいスフェアの方が内分泌マーカーの発現が高かったので、小さいスフェアを均一に大量に作製するため、分化誘導開始スフェアのサイズの検討、3次元浮遊化のためのポリマーのスフェアの大きさに応じた最適化などを行います。一方で、大きいスフェアに応じた分化誘導因子の処理濃度や処理時間を最適化し、膵臓オルガノイドとして成熟を検討します。また、小さいスフェアで分化誘導したものを集合させオルガノイドを形成させることによる成熟化も検討します。これらでも成熟化が見込めない場合は、他の細胞種(内皮細胞など)との共培養による成熟化も行う予定です。見込んでいた海外共同研究者との打ち合わせのための渡航ができませんでした。また、今年度で必要となる時間雇用の研究補助員を雇用するために一部研究の順番を前後して、計画を変更して研究を行った。
アクチンに形成される場で無生物は走るか?

1.アクリルアミドビーズの運動ミオシンVの頭部に蛍光ラベルすることができ、そのラベルはミオシンVの活性に影響しない。カルシウム存在下では、このラベルされたミオシンVは運動しない。しかし、その系に蛍光性アクリルアミドビーズ(正電荷をもつ)を加えると、そのビーズはアクチンフィラメントに沿って一方向に長距離運動する。この発見は非常に意外なものであったので、間違いない現象であることを確認するために多くの観察を重ねた。その結果、運動速度はミオシンVの数分の1であるものの、間違いなく一方向の運動が起こることを確認できた。ミオシンVとビーズを別の蛍光色素で染色し、それらを同時に観察するために、光学顕微鏡の改造を現在進めている。この顕微鏡観察で、ミオシンVはやはり運動せず、ビーズのみが運動することがはっきりした段階で論文にまとめる。2.ミオシンVのカルシウム制御本来の目的とは異なるが、上記の研究に関連してミオシンVの運動活性のカルシウム制御機構についても研究を行った。ミオシンVにカルシウムを加えると、1重鎖当たり1個のカルモジュリンが解離する。従って、6つのIQモチーフのうちこの解離するカルモジュリンを結合する特異的なIQモチーフが存在するはずである。その同定を行った。ミオシンVをプロテナーゼKで消化すると、±カルシウムで異なる部位に切断が起こることを見出した。+カルシウムによりカルモジュリンが解離し、むき出しになったIQモチーフで切断が起こるように思われた。詳しい解析の結果、特異的なIQモチーフと次のIQモチーフの境界付近で切断が起こることが判明した。この現象を利用して特異的IQモチーフが同定でき、2番目のIQモチーフからカルモジュリンが解離することが結論付けられた。この成果はBiochemistry誌に投稿した。1.ミオシンV重鎖への蛍光色素の導入Ca^<2+>を加えるとミオシンVの頚部に結合していたカルモジュリン分子が1頚部当たり1分子解離し、ミオシンVの運動能力がなくなると言われている。まず、そのことを1分子アッセイ系で確認することを検討した。我々が以前開発した1分子アッセイ法では、この解離しうるカルモジュリンに蛍光色素を導入しており、Ca^<2+>存在下でのミオシンVの運動は観察できない。そこで、ミオシンVの重鎖に蛍光色素を導入できるかどうかを検討したところ、幸い反応性の高いCys残基が1重鎖当たり1つあることが判明した。ここに蛍光色素を導入したミオシンVをProteinaseKで消化したところ、蛍光色素は65kDaフラグメントに含まれていた。このフラグメントはN端側の重鎖部分であることが既に知られており、且つ、そこにはひとつのCysしか存在しない。アミノ酸配列からこのCysがCys51であることがはっきりした。蛍光色素をCys51に導入しても運動活性は正常に保たれていた。この系を利用してCa^<2+>存在下でのミオシンVの運動(基板に固定したアクチン上)を調べたところ、やはり運動は起こらなかった。2.無生物の運動基板に固定したアクチンフィラメント上を個々のミオシンV分子は長距離連続的に一方向に運動するが、ここにプラス電荷をもつアクリルアミドビーズを加えるとそれも一方向に同様の速さで運動することを我々は既に見出している。本研究では、ここにCa^<2+>を加えると何が起こるかを調べた。驚いたことにCa^<2+>存在下でも、ビーズがアクチンフィラメントに沿って一方向に連続的に運動するのが観察された。(1)の研究でミオシンV分子はCa^<2+>存在下で運動しないことが明らかである。従って、ビーズがミオシンVに押されて運動しているのでないとほぼ断定できる。この点を次年度で明確にしたい。それが明確化されれば、アクトミオシン系の運動メカニズムにこれまで考えられていないメカニズムが存在することを示すことになる。その同定を行った。

詳しい解析の結果、特異的なIQモチーフと次のIQモチーフの境界付近で切断が起こることが判明した。この現象を利用して特異的IQモチーフが同定でき、2番目のIQモチーフからカルモジュリンが解離することが結論付けられた。この成果はBiochemistry誌に投稿した。
膜抽出法による希土類元素の高効率リサイクルシステムの構築

希土類金属は情報、エネルギー、環境などあらゆる領域で不可欠の機能性材料として需要が拡大している。希土類産業の先進国であるにもかかわらず資源を全て海外に依存している我が国にとって、原料の安定確保のために資源の有効利用を促進すること、並びに環境保全の立場から廃棄物を削減することは今後の重要な課題である。これらを解決する重要な要素の一つが分離に多大のエネルギーとコストを要している希土類金属の高効率分離プロセスの開発である。本研究では、省エネルギー型の膜分離プロセスを希土生産、再生工程に応用するために1.希土類金属を高度に分離する抽出系の開発、2.新しい膜抽出法の開発、3.希土類各元素のマテリアルフローとエミッションの現状の分析を行い、希土類産業におけるゼロエミッション化を検討した.種々の抽出系について各種金属の抽出平衡および抽出速度を測定することにより、希土類金属を高効率で分離する抽出系の開発を行った。なかでも新規合成のカリックスアレーン誘導体は隣接希土の分離性能を向上させ、しかも高い抽出能力を保持することができた。また、膜抽出法は従来の溶媒抽出法における相分離が不要であり、大きな膜面積を持つコンパクトな装置が設計できるため、プロセスの大幅なコストダウンとゼロエミッション化が可能であることを解析結果に基づいて示した.希土類金属のゼロエミッション化においては、1)再資源化技術の確立、2)廃棄物回収システムの確立、3)経済性などが、重要であることが明らかとなった.希土類金属は情報、エネルギー、環境などあらゆる領域で不可欠の機能性材料として需要が拡大している。また、膜抽出法は従来の溶媒抽出法における相分離が不要であり、大きな膜面積を持つコンパクトな装置が設計できるため、プロセスの大幅なコストダウンとゼロエミッション化が可能であることを解析結果に基づいて示した.希土類金属のゼロエミッション化においては、1)再資源化技術の確立、2)廃棄物回収システムの確立、3)経済性などが、重要であることが明らかとなった.
自転車競技選手における臀部の筋量評価と筋バランスがペダリング動作に及ぼす影響

初年度は、研究機器の納品が遅れたため、実験を実施することができなかった。今年度は上半期では実験に向けて準備を行い、下半期から実験を行うことができた。すべての対象者に対して、ペダリング動作とMRIデータの収集を行うことができた。ペダリング動作の収集は、鹿屋体育大学スポーツトレーニング教育研究センターを使用して、2018年10月と2019年2月の2回に分けて実施した。どちらも約1週間弱の滞在で、10人以上のデータを収集することができた。数日間は、機器トラブルなどもあったが、期間中にトラブルに対応することができた。滞在期間中に、実験を完了することができた。MRI装置による下肢および体幹の筋断面積の撮像は、国立スポーツ科学センターの施設を利用して、2019年1月と3月に実施した。2日間で対象者全員のデータを収集することができた。MRIの撮像に関しては、トラブルもなく計測することができた。ペダリング動作のラベリング作業は、2019年2月の時点で、すべての対象者が完了している。MRIデータの解析作業に関しては、2019年3月に実験が完了したため、今年度中には解析は完了しなかった。最終年度では、MRIデータの解析作業を進めて行く。平行して、身体座標とペダル力計測システムで収集したデータを用いて、ペダリング動作の解析を進めて行く予定である。動作解析とMRIのデータがそろった時点で、研究成果としてまとめて、国内の学会で発表する予定である。同時に、論文投稿に向けて、執筆作業を進めて行く予定である。予定通り、すべての実験を遂行することができた。モーションキャプチャーによるラベリングは完了している。一方、MRIデータの解析は、次年度に持ち越しになった。これは、測定スケジュールが3月になったことが影響している。しかし、次年度の上半期には解決できると考えている。次年度では、上半期中にMRIの解析を進める。平行して、身体座標データとペダル力データを用いて、動作解析を進める予定である。下半期に、研究成果の発表や投稿にに向けて、論文の執筆を進めて行く予定である。初年度は,科研費で購入を予定していた「ペダル力計測システム」の生産が,一時的に中止になっていた.そのため,他のペダル計測システムの購入を検討していた.年度途中に機器の生産が再開されたため,予定通りに機器の発注をすることができた.年度末に,なんとか機器を入手することができた.ペダル力計測システムは,予想していたより軽量であり,ペダルに対する取り付けも容易であった.測定精度の検証や,モーションキャプチャーとの同期は,MRIによる大殿筋の評価方法は,次年度に実施する予定である.今年度は,予定していた実験を実施することはできなかった.その代わりに,文献研究を中心に行った.筋形態とペダリング(技術)に関して検討している研究はほとんどなく,現時点でも,研究のオリジナリティは高いことを確認することができた.対象者の筋バランスを評価するために,どのような指標を用いて分類することが有効か検討している.多くの研究では,大腿部の前部と後部の筋バランスを評価している.本研究では大殿筋の筋量も評価することから,大腿前部,大腿後部,大殿筋の3部位を用いて評価することが,自転車選手の特性を評価する上では適切ではないかと検討している.次年度は,初年度に計画していた実験を上半期に実施できるように,ペダル力計測システムとモーションキャプチャーの同期や分析方法を構築していく.また,MRIによる大殿筋の測定方法を再検証する.下半期から実験を実施していく予定である.研究機器の納品が遅れたため,初年度に行う予定であった,測定方法の確立や実験の実施が遅れている.初年度は、研究機器の納品が遅れたため、実験を実施することができなかった。

一方、MRIデータの解析は、次年度に持ち越しになった。これは、測定スケジュールが3月になったことが影響している。しかし、次年度の上半期には解決できると考えている。上半期に,ペダル力計測システムとモーションキャプチャーの同期や分析方法を構築していく.また,MRIによる大殿筋の測定方法を再検証する.測定方法の確立を行う.下半期に,初年度に予定していた実験を実施する.それから,データ解析および統計処理まで完了させる.次年度では、上半期中にMRIの解析を進める。平行して、身体座標データとペダル力データを用いて、動作解析を進める予定である。下半期に、研究成果の発表や投稿にに向けて、論文の執筆を進めて行く予定である。研究機器の購入が遅れたため,実験を行うことができなかったため,次年度使用額が生じた.実験の対象者において、キャンセルが発生したことや、測定補助者の費用を抑えることができたため、次年度使用額が生じた。次年度では、今年度保留になった分析を行うための出張費として使用する予定である。残りの費用は、論文投稿の英文校正費や学会発表に使用する予定である。
ＲＮＡシークエンシングを用いた進行型多発性硬化症に対するバイオマーカーの同定

多発性硬化症(MS)は病勢の違いにより進行型と再発寛解型に分けられ,再発寛解型の多くの症例はのちに進行型へと移行する。再発寛解型MSの治療や病態の解明が進んでいる一方、進行型MSの病態は不明な点が多く,治療薬の開発も遅れている。近年,MS患者および動物モデルの遺伝子発現解析を網羅的に行う手段としてマイクロアレイやRNAシーケンシングが頻用されている。しかしながら,得られたビッグデータ・多変量の解析手法としては目的変数あり(教師あり)の群間比較に留まっていることが多い。そこで本研究では,我々がこれまでに確立した二つの進行型MS動物モデルを使用し,目的変数なし(教師なし)の多変量解析手法の一つである主成分分析(PCA)を中心に用い,病態を解明する。平成29年度においては,二つの進行型MSマウスモデルより,MS病勢の進行は病変部位である中枢神経(CNS)において個々の患者により異なる免疫因子に依存しており,その事が進行型MSに対する有効な治療薬の欠如に繋がっていることを示唆してきた。そこで平成30年度においては,末梢免疫組織の役割を検討するため二つの進行型MS動物モデルの末梢リンパ組織である脾臓の網羅的遺伝子発現の解析を行い,そのデータをPCAにて多変量解析することで進行型MS動物モデルに共通する末梢バイオマーカーの同定を試みた。その結果,脾臓サンプルにおいてこれまでに報告したカテプシン阻害物質として働くStfa2l1,トリプシン遺伝子Try5とTry10などの遺伝子発現の増加に加えて,Gypa,Kel,Rhd,Cldn13などの赤血球関連遺伝子の減少が両モデルの病態に共通して関わる因子であることを見出した。つまり,これらの遺伝子発現の増減が進行型MSに共通する末梢バイオマーカーとなる可能性を示した。二つの病態の異なる進行型MS動物モデルを比較検討した研究は本研究が世界で初めてであり,またヒト進行型MSのバイオマーカーとなる可能性がある候補因子の探索を行った研究も極めて少ない。平成30年度には病態の異なる二つの進行型MS動物モデルにおいていくつかの遺伝子発現が末梢において共通して増減することを見出し,それらの遺伝子発現が進行型MSの末梢バイオマーカーとなり得ることを示唆した。またCNSサンプルと脾臓サンプルのパターンマッチング解析を行った結果,カテプシン阻害物質として働くStfa2l1は正に、赤血球関連遺伝子のKelは負に強く相関することも見出した。本研究成果は平成30年度に論文として発表されたことから,研究達成度としてはおおむね順調と評価している。平成30年度までに行ってきた実験を継続するとともに,これまでに得られた結果の補強を行う。特に,進行型MS末梢バイオマーカー候補の強化を行うために,異なる病期におけるCNSおよび血液サンプルを採取するとともに,異なるバイオインフォマティクス的手法も用いてCNSならびに末梢バイオマーカーの同定を試みる。また平成30年度には、本研究にて用いた二つの進行型MS動物モデル以外にももう一つ進行型MS動物モデルの作製に成功したので、新たな進行型MS動物もでるから得られたデータをこれまでの成果と比較することにより、病態の違いを反映する遺伝子を明らかにする。さらに,投稿中の論文も完了する予定である。多発性硬化症(MS)は、病勢の違いにより再発寛解型と進行型に分類される。MS患者の多くは再発寛解型から始まり、そののち進行型へと移行する。再発寛解型MSの病態解明および治療薬開発は進んでいる一方、進行型MSの病態は不明な点が多い。我々はこれまでに進行型MS病態は個々の患者によって異なる因子に依存しており、その事が進行型MSの病態解明ならびに治療薬開発の遅延に繋がっている可能性があることを示してきた。そこで本研究では、当研究室で確立した病態の異なる二つの進行型MSマウスモデルを用い、中枢神経系における網羅的遺伝子発現解析データをバイオインフォマティクス的手法により多変量解析する。本研究により、中枢神経系における二つの進行型MSマウスモデルの病勢に共通するバイオマーカーおよび病態の違いを判別するバイオマーカーを同定することで、ヒト進行型MSの病態解明へと繋がることが期待される。平成29年度においては、二つの進行型MSマウスモデルそれぞれの対照群(正常マウス)に比べて、実験群(MS様症状を発症したマウス)の中枢神経系においてLcn2、Cxcl13、Igkv8-28などの免疫関連遺伝子発現が共通して増加することを見出した。一方、それぞれの対照群に比べて、実験群の脾臓においてStfa2l1、Dmbt1、Try5などの遺伝子発現が共通して増加することを見出した。これらの遺伝子発現の増加が進行型MSに共通するバイオマーカーとなる可能性を示した。二つの病態の異なる進行型MSマウスモデルを比較検討した研究は本研究が世界で初めてであり、またヒト進行型MSのバイオマーカーとなる可能性がある候補因子の探索を行った研究も極めて少ない。平成29年度には病態の異なる二つの進行型MSモデルにおいていくつかの遺伝子発現が共通して増加することを見出し、それらの遺伝子発現が進行型MSのバイオマーカーとなり得ることを示唆した。本研究成果を平成29年度に学会にて発表を行うとともに、論文としても投稿中である。研究達成度としてはおおむね順調と評価している。

近年,MS患者および動物モデルの遺伝子発現解析を網羅的に行う手段としてマイクロアレイやRNAシーケンシングが頻用されている。しかしながら,得られたビッグデータ・多変量の解析手法としては目的変数あり(教師あり)の群間比較に留まっていることが多い。そこで本研究では,我々がこれまでに確立した二つの進行型MS動物モデルを使用し,目的変数なし(教師なし)の多変量解析手法の一つである主成分分析(PCA)を中心に用い,病態を解明する。平成29年度においては,二つの進行型MSマウスモデルより,MS病勢の進行は病変部位である中枢神経(CNS)において個々の患者により異なる免疫因子に依存しており,その事が進行型MSに対する有効な治療薬の欠如に繋がっていることを示唆してきた。そこで平成30年度においては,末梢免疫組織の役割を検討するため二つの進行型MS動物モデルの末梢リンパ組織である脾臓の網羅的遺伝子発現の解析を行い,そのデータをPCAにて多変量解析することで進行型MS動物モデルに共通する末梢バイオマーカーの同定を試みた。その結果,脾臓サンプルにおいてこれまでに報告したカテプシン阻害物質として働くStfa2l1,トリプシン遺伝子Try5とTry10などの遺伝子発現の増加に加えて,Gypa,Kel,Rhd,Cldn13などの赤血球関連遺伝子の減少が両モデルの病態に共通して関わる因子であることを見出した。つまり,これらの遺伝子発現の増減が進行型MSに共通する末梢バイオマーカーとなる可能性を示した。二つの病態の異なる進行型MS動物モデルを比較検討した研究は本研究が世界で初めてであり,またヒト進行型MSのバイオマーカーとなる可能性がある候補因子の探索を行った研究も極めて少ない。平成30年度には病態の異なる二つの進行型MS動物モデルにおいていくつかの遺伝子発現が末梢において共通して増減することを見出し,それらの遺伝子発現が進行型MSの末梢バイオマーカーとなり得ることを示唆した。またCNSサンプルと脾臓サンプルのパターンマッチング解析を行った結果,カテプシン阻害物質として働くStfa2l1は正に、赤血球関連遺伝子のKelは負に強く相関することも見出した。本研究成果は平成30年度に論文として発表されたことから,研究達成度としてはおおむね順調と評価している。平成29年度までに行ってきた実験を継続するとともに、これまでに得られた結果の再確認および補強を行う。特に、進行型MSバイオマーカー候補の強化を行うために、異なる病期における中枢神経系、脾臓、血液サンプルを採取し、バイオインフォマティクス的手法にてバイオマーカーの同定を試みる。また、本研究にて用いた二つの進行型MSモデルより得られたデータを比較することにより、病態の違いを反映する遺伝子を明らかにする。さらに、投稿中の論文も完了する予定である。平成30年度までに行ってきた実験を継続するとともに,これまでに得られた結果の補強を行う。特に,進行型MS末梢バイオマーカー候補の強化を行うために,異なる病期におけるCNSおよび血液サンプルを採取するとともに,異なるバイオインフォマティクス的手法も用いてCNSならびに末梢バイオマーカーの同定を試みる。
日本語の先端的な動向と日本語母語話者の誤用問題に関する通時的研究

日本語母語話者の誤用例の「ら抜き言葉」は多くの言語研究者たちによって合理的な言語変化であると擁護されてきた。しかし、近年のインターネット上の言説や刊行物の書き言葉の中に「ら抜き言葉」の進行した形態の〈れれる言葉〉や〈ら入れ言葉〉など、現代日本語の先端的な動向を示す例が観察されるようになった。また、「ら抜き言葉」には可能の意味以外に受身・尊敬の用法が発生している。過去の言語研究者たちが「ら抜き言葉」を可能表現専用であると擁護した根拠は消滅したのである。本研究は、現代日本語の先端的な動向を捉え、現代日本語にいま起きている母語話者の誤用を体系化し、日本語の言語史の中に位置づけるものである。
同位体比測定に基づく環境硫黄の動態解析

本研究では、これまで当研究室での科研費による研究成果をさらに発展させた。酸性化の起因物質ともなる環境中の硫黄化合物の発生源を識別し、その動態を解析するための基礎的研究として、主な人為発生源である石炭と石油の硫黄同位体比測定を行った。さらに、硫黄の発生源を識別する一助として、セレンの定量も行った。大気中浮遊粒子状物質および大気中二酸化硫黄に、発生源の硫黄がどのように反映されているかを見るために、これら環境試料の硫黄同位体比と発生源である石炭・石油および自然発生源の多くを占める海水硫酸塩の硫黄同位体比との照合を行い、石炭・石油・海水硫酸塩由来の識別の可能性を見出だした。つまり大気中硫黄は石油由来、大気粉塵中の硫黄は石炭由来であることが観測された。これまで大気中二酸化硫黄の同位体比測定には、エアサンプラーを通した空気を吸収液に吸収していたが、約50日のサンプリング期間には吸収液の補充、寒冷期の凍結などを招き改良が必要と思われた。短期間に効率よくサンプリングを行うために、活性炭素繊維などを用いた捕集法を開発した。また浮遊粒子状物質の元素分析に赤外分光分析を応用し、硫酸イオン・アンモニウムイオンなど数種の無機イオンを同定した。今後はさらに発生源として硫化力ルボニル、硫化ジメチルの発生機構の解明および硫黄同位体比について詳細な研究を行い、環境における硫黄の動態解析を発展させるとともに、環境の「酸性化」の原因を明確にして行く計画である。酸性雨発生の主因となる大気中硫黄の主な人為発生源は、石炭・石油などの化石燃料と考えられる。環境大気中の硫黄化合物が果たして化石燃料に由来するものか、海水硫酸塩を主とする自然発生源に由来するものか、これら硫黄化合物の環境における動態を解析する手段として同位体比測定を考えてきた。今年度はその基礎として、産地に異にする世界各国の石灰と石油の硫黄同位体比の測定を行い、その時徴を明らかにした。石炭については21試料のδ^<34>S‰値は-2.4+24.9‰、20試料の石油については-10.7+20.2‰であったが、平均値はともに海水硫酸塩の20.2‰より小さかった。特に石油については、マイナスのδ^<34>S‰値を示すものが多く見られた。石炭の平均は、およそ10‰であった。環境大気中では、種々の発生源に由来する硫黄が混じっていると考えられるので、環境試料の同位体比測定から発生源を特定するのは難しいが、おおよその推定は可能と思われる。そこで、東京都文京区と新潟市の大気および浮遊粒子状物質をエアサンプラーを用いて夏期と冬期に50日ずつ捕集し、これらの試料中の硫黄同位体比の測定を行った。その結果、浮遊粒子状物質については両地域とも季節による変動はみられなかったが、新潟市のほうが若干大きなδ^<34>S‰値を示した。東京で3.7、新潟で4.7‰で、いずれも化石燃料の影響が大きいことが実証された。さらに大気については-1.0‰とさらに小さい値を示すのはほとんどが石油由来のものであり、浮遊粒子状物質には石炭から発生するフライアッシュの寄与が反映されていることが推測された。環境中の硫黄の動態を追跡する手段として、同位体比に注目し、各種環境試料中の硫黄同位体比の測定を行ってきた。本研究では、人為発生源の主因である石炭および石油中の硫黄同位体比の測定を行い、大気環境にどのように反映されているかを考察するために、東京および新潟市の夏と冬の同時期に大気のサンプリングを行い、浮遊粒子状物質および大気について、硫黄同位体比の測定を行った。以下その結果について述べる。

1石炭における硫黄同位体比:試料は日本、中国、インドネシア、米国、オーストラリアなど産地のことなる21種類を用いた。硫黄同位体比はデルタ値で+24.9-0.1パミルに分布していたが、2種類を除いてプラスの値を示し、概して日本および中国にデルタ値の大きいものが多く、オーストラリアにデルタ値の小さいものが見られた。2石油における硫黄同位体比:試料は日本、中近東、米国、サウジアラビア、マレーシア、中国、インドネシア、メキシコなど世界各地で産出した20種類を用いた。そのデルタ値は+20.2-10.7パミルであったが、デルタ値の多くはマイナスの値を示しており、石炭に比べてデルタ値は小さかった。3大気環境における硫黄同位体比:東京の夏と冬のデルタ値は、(1)浮遊粒子状物質および(2)大気がそれぞれ(1)+3.7,+3.8パミルおよび(2)-1.0,-1.3パミルであった。両者とも季節の影響は見られなかったが、大気の硫黄は石油に由来することが反映されている。一方浮遊粒子状物質のデルタ値が大気に比べて大きいのは、石炭のフライアッシュが取り込まれているためと思われる。新潟市の夏と冬の浮遊粒子状物質は+4.7,+5.9パミルで東京に比べてやや大きいのと、冬にさらに大きくなっているのは、大陸からの石炭燃焼生成物の移動で冬は特に季節風の影響が強く現れているものと推察される。以上、硫黄同位体比のデルタ値からみて、現在大気中の硫黄の発生源の多くは石油に由来するが、日本海側での石炭の影響も観察された。
粉体に代表される巨視的な離散系の動力学とジャミング現象

粉体の運動が流動状態から固体状態に移るのは、外力によって不規則で高密度な状態となり、運動が制限されるジャミング現象であると考えられている。この特徴的な振舞いを理解するため、(1)高密度な乾燥粉体のレオロジー、及び(2)湿った粉体の動力学について研究を行った。(1)粉体系は、非弾性衝突するため、粒子間の相対速度が小さくなり、空間的な速度相関が生じる。この速度相関は、一様冷却状態でのエネルギー減衰に大きく寄与することが知られており、流れのある系のレオロジーにも大きく影響する可能性がある。しかし一方で、せん断があると、相関は発達しにくいとも考えられるが、せん断流中の速度相関はよく調べられていない。我々は、三次元非弾性剛体球系の単純せん断流について、数値実験と速度相関を考慮しない運動論を比較しながら、速度相関が構成関係式に与える影響を調べた。その結果、エネルギー散逸率が、高密度側や運動論の構成関係式の見積りよりも小さい値になった。圧力やせん断応力についても、高密度側である程度の不一致が見られた。多重衝突前の相対速度の分布を調べることで、この散逸の低下には、同じペアの粒子が短時間に複数回非弾性衝突することによる、法線方向の相対速度の低下が寄与していることがわかった。また、この相対速度の低下により、高密度側での圧力の低下も説明できた。(2)湿った粉体では、毛管力のために粉体粒子間に凝集力が働く。すると粒子が自由に動きにくくなるため、ジャミング状態になりやすくなると予想される。我々は、湿った粉体の研究の現状についてまとめ、レビュー論文として発表した。.また、湿った粉体において液体の量を増加させると、2体の液体架橋による凝集力だけでなく、複数の粒子が一つの液体の固まりを通じて相互作用する多体効果が現れると考えられているが、この多体効果の単純なモデルを提案し、動的振舞いについて解析した。
ショートパルス網膜光凝固における遺伝子発現プロファイル

マウスを2群に分類し、それぞれに従来のパルスとショートパルスを用いて網膜光凝固術を施行する。全てのマウス網膜から網膜光凝固術後、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間、3日、7日において網膜からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ(Whole mouse)を用いて各タイムポイントでの2群間の遺伝子発現を比較する。発現差のある遺伝子を選択しRT-PCRで確認のうえ、実際のマウス組織にて免疫染色で発現部位を調べる。
微小血管網及び胆管構造を有するヒト型高次肝組織の生体内での再構築

iPS細胞から作製した肝前駆細胞と、血管内皮細胞、間葉系幹細胞を共培養し作製したヒト型肝芽をマウス頭部観察窓内や腹腔内に移植し、構築された肝組織内での微小血管、胆管の構造を観察した。構築された肝組織内ではHNF4a陽性の肝細胞索様構造と、SOX9陽性の胆管様構造が観察された。肝細胞索様構造内には毛細胆管様の形態が認められたが胆汁産生は明らかでなかった。組織内の微小血管はEphB4陽性の静脈として観察され、門脈、動脈への分化は明らかでなかった。ラット肝硬変モデルにこの肝芽を移植し、肝線維化の予防効果を検討したところ、ラット血清内にヒトアルブミンの分泌が確認され、若干の線維化改善効果が確認された。次に、hiPSより文献情報を基にCD31陽性の血管内皮細胞の分化誘導を試みた。するとCD31陽性細胞の出現は確認できるものの、文献で報告されているものに較べ、CD31陽性率は極めて低いことが明らかとなった。このため、播種細胞密度などを検討しながら複数回試行したがCD31陽性細胞数は低かった。得られた細胞についていくつかの血管内皮細胞マーカーの発現を検討したところ発現が確認された。今後肝芽形成に充分な量の血管内皮細胞の分化誘導を得るために、他の文献情報なども参考にしつつ、プロトコルの改良を試みる。するとCD31陽性細胞は確認できるものの、文献で報告されているものに比べ、CD31陽性率は極めて低いことが明らかとなった。このため播種細胞密度などを検討しながら複数回試行したがCD31陽性細胞数は低かった。現在、肝芽形成に十分な量の血管内皮細胞の分化誘導を得るために、他の文献情報なども参考にしつつ、プロトコルの改良中である。また、高次肝組織内で今後構築を目指している動静脈、門脈、胆管のマーカーとなる分子の免疫染色を試みた。胆管のマーカーとしてCK19、動脈のマーカーとしてEphrin B2、静脈のマーカーとしてEph B4、門脈のマーカーとしてJagged-1、血管壁細胞のマーカーとしてSMA等を用いた。これまで染色方法が確立されていなかった静脈マーカーEph B4は凍結、パラフィン切片上でほぼ使用可能となった。しかし、門脈、動脈マーカーに関してはパラフィン切片での染色不良や、高バックグラウンドの問題等で、まだ、プロトコルの改善が必要である。本研究では最終的に動静脈や、門脈、胆汁分泌が可能な胆管構造を有するヒト型高次肝組織の構築を目指している。そのために、Nature誌で発表した肝組織の基となる肝芽のソースとしてiPS-Hepを用いるのみならず、血管内皮細胞もiPSより誘導することを目指している。そこでまず、ヒトiPS細胞から内皮細胞を誘導することを試みた。検討の結果、報告されているいくつかの血管内皮細胞の分化誘導法では効率よく増殖性の高い血管内皮細胞を分化誘導することが困難であることが明らかとなった。これを改善するためには、論文に記載されていない細かな諸条件などを最適化する必要があること、ヒトiPS細胞のクローンを変更すること、未分化細胞の維持培養方法を検討することなどが考えられ、肝芽形成実験に利用するためには、今後、安定的に分化誘導可能な改良法の確立が必須であることが明らかとなった。また、動静脈、門脈、胆管等の構造を有する高次肝組織を構築するにあたり、血管系のマーカーの確立が予想より困難であることが明らかとなった。高次肝組織構造を確認するために、凍結切片のみならず、より、微小構造が詳細に観察できるパラフィン切片での観察も目指しており、ヒト型高次肝組織の構築の達成に向けた新たな課題が明らかとなり順調な進捗であると考えられる。ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)、ヒト骨髄由来間葉系細胞(hMSC)、hiPS細胞から作製した肝前駆細胞hiPS-Hepを共培養し、vitroで肝芽を作製した。その後、この肝芽をクラニアルウインドウ(CW)内に移植し、その成長過程を生体顕微鏡で経時的に観察した。hiPSより文献情報を基にCD31陽性の血管内皮細胞、hMSCが作成された。しかし、門脈血流のない頭蓋内では腹腔内に比べ、構築された肝組織の機能が低く、形態的にも不完全であることが事予測された。したがって、本研究の課題であった、all iPSの肝芽を基にした高次肝組織内で構築される胆管、微小血管網の組織評価は、CW内ではなく、肝内、及び腎被膜下に移植した肝芽から構築された肝組織の標本にて行った。高次肝組織内で構築を目指している動静脈、門脈、胆管のマーカーとなる分子の免疫染色法が確立し、肝細胞マーカーのアルブミン、HNF4a、胆管のマーカーCK19、CK8、SOX9、CD10、動脈のマーカーEphrin B2、静脈のマーカーEph B4、門脈のマーカーJagged-1、血管内皮及び壁細胞のマーカーCD31、SMA等を用いて、高次肝組織の形態形成を確認した。構築された肝組織ではHNF4a陽性の肝細胞索様の構造と、CK19、SOX9陽性の胆管様の腺管構造を呈する部分が観察された。