hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
泌尿生殖器腫瘍における患者の個別化を目指した分子診断法の開発と標準化に関する研究

本研究は、泌尿生殖器癌の早期診断、浸潤能、転移能の予知、抗癌剤や放射線治療に対する感受性の予測などのための分子診断法の開発と標準化を目的として計画された。その結果、1.早期診断として、(1)膀胱癌患者尿中剥離細胞におけるCD44v8-10とCD44 standard formのmRNA量の比が尿を用いた分子診断法として十分有用であることを明らかにした。(2)表在性膀胱癌の膀胱内再発の予知では、MMP-9およびTIMP-2の発現は再発の独立した予後予測因子であることを証明した。2.予後予測の分子診断では、(1)CD44v8-10とCD44standard formのmRNA量の比やplasminogen activatorが膀胱癌の浸潤性と相関した。(2)Microarrayを用いた腎細胞癌の遺伝子発現プロファイル解析から予後予測を可能にするpowerfulなgene setを発見した。(3)血清VEGF、HGF、エンドスタチン濃度は腎細胞癌の腫瘍マーカーとしての有用性があることをつきとめた。(4)転移の分子診断を目的に尿路上皮特異的分子であるUroplakin IIを標的にしたnested RT-PCRに関して至適条件の設定を行い,異なった2施設で種々の病期の膀胱癌患者血中Uroplakin IIの陽性率を比較した所、極めて類似した結果が得られた。3.抗癌剤感受性予測のための分子診断の開発では,(1)膀胱癌組織におけるがん抑制遺伝子p53のyeastでのfunctional assayによるp53の機能異常の有無と多剤耐性遺伝子MRP1の発現が相関することを発見し、p53に関しては免疫組織学的診断よりも優れている可能性が示唆された。(2)膀胱癌の化学療法では多剤耐性関連遺伝子MDR1,MRP1,2,3の発現が上昇しアドリアマイシンの耐性度とMDR1,MRP1,3のmRNAレベルは相関を示した。自然排泄尿サンプルにおけるRT-PCR法を利用した分子診断の標準化の一環として、CD44のalternative splicing variantで尿路上皮癌において強発現しているCD44v8-10のCD44sに対する相対的発現比率を算出し,同比が表在性尿路上皮癌の再発および浸潤性尿路上皮癌の転移に対する予知マーカーとして有用であることを明らかにした。また,表在性膀胱癌組織におけるMMP-9およびTIMP-2 mRNAの強発現が膀胱内再発の有用なマーカーとなることを明らかにした.一方、泌尿器癌の予後因子として信頼性のある新たな分子マーカーの開発・検討を進めた。その結果、腎細胞癌におけるactive MMP-2の発現量、MMP-2のactivation ratio、腎癌患者の血清HGF値、膀胱癌の悪性進展におけるPDECGFおよびSPARCの高発現、VEGF isoformの特徴的なdistributionなどが、予測マーカーとして有望であることが判明した。また、膀胱癌における膀胱内注入療法後の再発の予後因子として、MDR1遺伝子のプロモーター領域のメチル化の程度が関連することを明らかにした。膀胱癌などの尿路上皮癌では癌抑制遺伝子p53の機能喪失は悪性進展や抗癌剤耐性と関連する可能性が高いが、半減期延長を指標とした蛋白レベルでの解析結果と遺伝子変異を指標とした解析結果に不一致が見られ、また遺伝子変異の位置によっては本来の機能が維持される可能性も指摘されていた。この問題を克服するため、膀胱癌組織由来RNAを材料とした、酵母を使ったp53のfunctional assayを確立した。日本人の前立腺癌のなり易さとステロイド合成に重要な酵素であるCYP17aの一塩基多型との関連性を明らかにした。尿路上皮癌患者血中のウロプラキン2陽性細胞を指標とした転移診断法を確立し、その臨床的意義を検討した。

(2)膀胱癌の化学療法では多剤耐性関連遺伝子MDR1,MRP1,2,3の発現が上昇しアドリアマイシンの耐性度とMDR1,MRP1,3のmRNAレベルは相関を示した。本研究は、泌尿生殖器癌の早期診断・浸潤能、転移能の予知・抗癌剤や放射線治療に対する感受性の予測などのための分子診断法の開発と標準化を目的として計画された。その結果、1)早期診断として、膀胱癌患者尿中剥離細胞におけるCD44v8-10とCD44 standard formのmRNA量の比が尿を用いた分子診断法として十分有用であることを明らかにした。2)表在性膀胱癌の膀胱内再発の予知では、MMP-9およびTIMP-2の発現は再発の独立した予後予測因子であることを証明した。2)予後予測の分子診断ではCD44v8-10とCD44 stanndard formのmRNA量の比やplasminogen activatorが膀胱癌の浸潤性と相関した。一方Microarrayを用いた腎細胞癌の遺伝子発現プロファイル解析から予後予測を可能にするpowerful gene setを発見した。また、血清VEGF、HGF、エンドスタチン濃度は腎細胞癌の腫瘍マーカーとしての有用性があることをつきとめた。3)転移の分子診断を目的に尿路上皮特異的分子であるUroplakin IIを標的にしたnested RT-PCRに関して至適条件の設定を行い、異なった2施設で種々の病期の膀胱癌患者の血中Uroplakin II陽性率を比較した所、極めて類似した結果が得られた。4)抗癌剤感受性予測のための分子診断の開発では、膀胱癌組織におけるがん抑制遺伝子p53のyeastでのfunctional assayによるp53の機能異常の有無と多剤耐性遺伝子MRPの発現が相関することを発見し、p53に関しては免疫組織学的診断よりも優れている可能性が示唆された。膀胱癌の化学療法では多剤耐性関運遺伝子MDR1,MRP1,2,3の発現が上昇し、アドリアマイシシの耐性度とMDR1,MRP1,3のmRNAレベルは相関を示した。
IgG4関連疾患のIgGの病原性と標的抗原の同定

自己免疫性膵炎患者IgGのマウスへの投与により同患者の罹患臓器と同一のマウス組織に病変ができることをサンプル数を増やし確認した。また、用量依存性、時間依存性についても検証できた。また、患者IgGと結合するマウス抗原をスクリーニングし、候補タンパク質がラミニン511であることを同定した。現在、自己免疫性膵炎患者における自己抗体の定量法を開発し、臨床応用を目指し、企業と共同で抗ラミニン511抗体の測定が実臨床に有用であるか開発中である。1患者IgGのマウスへの皮下注射による病原性の評価本実験系は尋常性天疱瘡の病態解明において確立されたマウスモデルを応用した。AIP(IgG4-RD)患者10例、および年齢・性別をマッチさせたコントロール10例(健常人5例、膵癌患者3例、原発性硬化性胆管炎患者2例)の血清よりIgGを抽出した。マウスに投与する患者IgGとコントロールIgGは同量とした。この結果、患者IgGのマウスへの投与により同患者の罹患臓器と同一のマウス組織に病変ができることを見出し、本研究ではサンプル数を増やし、用量依存性、時間依存性も認めた。2患者IgGの各サブクラスにおける病原性の評価AIP(IgG4-RD)患者IgGをIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のサブクラスに分画した。各分画の病原性について、1において確立したマウス実験系を用いて評価し、IgG1とIgG4に病原性があることを確認した。3自己抗原の同定免疫沈降法を使用した同定患者あるいはコントロールIgGをカラムに結合させ、免疫沈降法によりマウス膵組織からIgGに反応する蛋白を抽出する。これを電気泳動することにより患者IgGに特異的なバンドを切り出したうえで質量分析を行い1と同様に抗原の候補を同定した。4自己抗原のvalidation 3で同定した候補抗原から、細胞外ドメインを持ち、患者IgGの結合部位に合致する発現を示すマウス蛋白質を選択した。このマウスrecombinant proteinをサンプルとし、患者およびコントロールIgGを一次抗体として用いたELISA法を行った。患者IgGを用いた場合のみに反応する、タンパクを同定した。上記の理由から、14までの解析がほぼ予定通り終了した。1AIP(IgG4-RD)患者IgGをマウスへ投与し、病原性について評価する。数を増やしてvalidation患者IgGのマウスへの投与により同患者の罹患臓器と同一のマウス組織に病変ができることをサンプル数を増やし確認した。2IgG4を含む各IgGサブクラスの病原性について、上記マウス実験系においてIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のサブクラスに分画する。各分画の病原性について、1において確立したマウス実験系を用いて評価する。申請者らはIgG1とIgG4に病原性があることを確認した。更に興味深いことに、IgG4はIgG1の病原性を抑制することが分かった。3病原性をもつIgGとその標的組織について、マウスと患者組織間で比較検討する。12で明らかとなったマウス膵における患者IgG、IgG1、IgG4の結合部位と、ヒトAIP組織におけるIgG、IgG1、IgG4の結合部位との相同性について、免疫組織化学法を用いて検討した。この結果、マウス・ヒトの両者において、IgG・IgG1・IgG4とも細胞外マトリックスに沈着があることを確認した。4患者IgGと結合するマウス抗原をスクリーニングし、質量分析によりこれを同定する。抗原に対する患者自己抗体を抽出し、1の実験系でその病原性を確認する。同定した抗原をカラムに結合させ、免疫沈降法により患者血清から反応する自己抗体のみを抽出する。抗原に反応する自己抗体と、反応しない患者IgGについて、1において確立したマウス実験系で評価し、前者のみが病原性を示すか確認する。申請者は候補タンパク質がラミニン511であることを同定した。5AIP患者における自己抗体の定量法を開発し、臨床応用を目指す。現在、企業と共同で抗ラミニン511抗体の測定が実臨床に有用であるか開発中である。ヒト自己抗原に対する定量法の開発と臨床応用同定した候補マウスタンパク質をヒト蛋白に変更し、IgG4-RD(n=10)で自己抗体陽性で、ステロイド治療後に反応が減弱し、コントロールでは(n=10)反応しない蛋白を同定する。同定できたIgG4-RDのみに反応するヒト蛋白について、診断や治療反応性、再発などとの関連について更に症例数を増やし、かつ詳しく検討し、臨床応用の可能性を探ることを目的に下記を行う。

申請者らは、難治性疾患克服研究事業(厚生労働科学研究費補助金)「IgG4関連疾患に関する調査研究」班(研究代表者:京都大学千葉勉)においてIgG4-RDのGenome Wide Association Study (GWAS)を行っており、約900人分のリンパ球DNA、血清と臨床データを保持している。また、当院外来フォロー中のAIP40例の経時的な血清を保存しており、診断時、寛解期、再燃時の上記の自己抗体の解析も可能である。さらに、コントロールには当院外来フォロー中の他の自己免疫疾患の患者血清を多数保存しており、かつ京都大学医学部附属病院でバイオバンクに登録された膵癌、胆道癌を含めた癌患者の血清も保持している。どちらも倫理委員会において、本研究に使用する承認をうけている。これらの血清を用いて、IgG4-RD診断能、病勢の把握における、ELISA法による自己抗原定量法と血清IgG4値との比較を行い診断や病勢の把握における有用性について解析する。消化器内科昨年度だけでは、すべての実験が終わらなかったため。ヒト自己抗原に対する定量法の開発と臨床応用昨年度同定した候補マウスタンパク質をヒト蛋白に変更し、IgG4-RD(n=10)で自己抗体陽性で、ステロイド治療後に反応が減弱し、コントロールでは(n=10)反応しない蛋白を同定する。同定できたIgG4-RDのみに反応するヒト蛋白について、診断や治療反応性、再発などとの関連について更に症例数を増やし、かつ詳しく検討し、臨床応用の可能性を探ることを目的に下記を行う。診断時、寛解期、再燃時の上記の自己抗体の解析、さらに、IgG4-RD診断能、病勢の把握における、ELISA法による自己抗原定量法と血清IgG4値との比較を行い診断や病勢の把握における有用性について解析する。
難治性根尖性歯周炎の細菌学的研究

5回以上根管治療を続けても、臨床症状が改善しない症例や2回以上根充填されたにもかかわらず再発を繰り返すような症例を、その臨床経過から難治性根尖性歯周炎と診断した。この条件に適合した32症例を対象とし「チェアーサイド嫌気培養システム」で根管内細菌検査を行った。分離細菌は、API-systemを用いて同定した。その結果、すべての難治性根尖性歯周炎から微生物が培養陽性であった。このことは難治性根尖性歯周炎が感染症であることを示している。いくつかの症例では、偏性嫌気性菌のPeptostreptococcus,Actinomycesが優勢に認められた。しかし、多くの症例では通性嫌気性菌のEnterococcus,Staphylococcus,Enterobactorあるいは真菌のCandidaが非常に優勢かあるいはpure cultureで認められた。これらの微生物による感染が難治性根尖性歯周炎の成立に大きな役割を果たしていることが示唆された。感染細菌と臨床症状との間に相関が認められた。強い自発痛、明瞭な腫脹や激しい排膿などの、急性症状の発現や膿瘍形成にはPeptostreptococcus,Actinomycesなどを中心とした偏性嫌気性菌の増殖が関与している。一方、Candidaによる感染は、激しい打診痛と圧痛の発現に関与している。これら難治性根尖性歯周炎の治療にあたっては、「チェアーサイド嫌気培養システム」に基づいた、抗生剤局所投与が有効であることが明らかになっている。今回、難治性根尖性歯周炎の原因微生物については明らかにできた。しかし、その病態、成立機序については、いまだ明らかではない。今後、難治化に関与する微生物の病原性状について研究を行うべきであると考えている。臨床では,特に治療を困難にする要因が認められないにもかかわらず,自発痛,打診痛,圧痛あるいは浸出液などがとまらない症例に遭遇することがある.これらの難治性根尖性歯周炎については,多くの症例報告がなされており,そのいくつかは原因菌に言及している.しかし,難治性根尖性歯周炎症例を対象に系統だった細菌学的研究は行われていない.本研究の目的は,難治性根尖性歯周炎の成立に関与する細菌を明らかにするために,難治性根尖性歯周炎症例を臨床症状に基づいて分類し,根管を介して採取した細菌種との相関を検討することである.本年度の計画に基づいて,難治性根尖性歯周炎症例を臨床症状で分類しつつ,根管を介して試料を採取した後,直ちにチェア-サイド嫌気培養システムを用いて嫌気培養し,その後研究室にて分離,二次培養,グラム染色と菌株の-80°Cでの凍結保存を行った.現在,8症例の難治性根尖性歯周炎症例に対して細菌学的検査を行っている.症例は,持続的鈍痛,打診痛を主訴とする5症例と瘻孔の再発を主訴とする3症例からなっていたが,すべての症例から細菌が検出され,難治性根尖性歯周炎が細菌感染によって引き起こされることが確認された.分離細菌は,いずれも通性嫌気性グラム陽性球菌と通性嫌気性グラム陽性桿菌が優勢であった.難治性根尖性歯周炎症例の臨床症状と原因菌との相関を検討するには,さらに多くの症例に対する検討が必要と考えるので,次年度からの研究計画に基づいて,引き続き試料の採取を行うとともに,保存細菌の同定を進めていく予定である.5回以上根管治療を続けても、臨床症状が改善しない症例や2回以上根充填されたにもかかわらず再発を繰り返すような症例を、その臨床経過から難治性根尖性歯周炎と診断した。約40症例の難治性根尖性歯周炎を対象に、各治療時における臨床症状を記録し、根管から細菌検査用試料を採取、「チェアーサイド嫌気培養システム」を用いて細菌検査した。

培地上に見とめられたコロニーを採取し、1000株以上をグラム染色後、-80°Cで凍結保存した。難治性根尖性歯周炎症例は多岐にわたり、疼痛と排膿が止らない症例、瘻孔形成を繰り返す症例、根管充填後腫脹を生じた症例および打診痛、違和感が消失しない症例などを含んでいる。初回細菌検査試料の採取時は、難治性根尖性歯周炎として依頼された症例が多いことから、ほとんどの症例では根管の機械的・化学的清掃が終了して以降とされた。しかし、いくつかの症例では、急性症状再発時に採取することができた。初回細菌検査の結果、ほとんどの症例からは通性嫌気性グラム陽性菌が優勢に検出された。球菌と桿菌の比率は相半ばしていた。また、10%以上の症例から真菌が優勢に分離された。腫脹を繰り返した症例や排膿が止らない症例からは、偏性嫌気性グラム陰性桿菌を含む偏性嫌気性菌が認められた。初回細菌検査の結果はYoshidaらの報告と同様に、試料採取時の臨床症状とよく相関していた。しかし治療が進むとともに細菌種、細菌量は減少する傾向を示し、通性嫌気性グラム陽性球菌、桿菌あるいは真菌が長期に亘り残留することが多かった。以上のことから、難治性根尖性歯周炎では、増殖した細菌種の病原性により臨床症状は修飾され様々な症状を呈するものの、難治性根尖性歯周炎を難治性感染症たらしめているのは、残留しやすい通性嫌気性グラム陽性球菌、桿菌あるいは真菌の存在である可能性が示唆された。今後、保存菌株を同定し、難治性根尖性歯周炎の発生に関与する細菌を明確にする予定である。難治性根尖性歯周炎の定義は明確ではない。私たちは歯根破折や辺縁性歯周病変など根管以外からの感染は無いが、根管の機械的・化学的清掃、洗浄、根管貼薬などを含む通常の根管治療では細菌を排除できない難治性感染症であると考えている。今回、根管治療回数が5回を越えて施されたものの臨床症状の改善が認められない症例、あるいは過去に2回以上根管充填を施されたにもかかわらず根尖性歯周炎を再発した42症例を対象とし、細菌学的研究を行った。難治性根尖性歯周炎の臨床像は様々であり、疼痛と排膿が止らない症例、瘻孔形成を繰り返す症例および打診痛、違和感が消失しない症例などを含んでいる。難治性根尖性歯周炎症例の内、打診痛、違和感を主訴とする症例では通性嫌気性グラム陽性菌が優勢に検出された。また、腫脹を繰り返した症例や排膿が止らない症例では偏性嫌気性菌が優性であった。このような臨床症状と分離細菌との相関はYoshidaらの根尖性歯周炎を伴う既根管充填歯とよく一致しており、分離菌では通常ほとんど検出されない真菌やStaphylococcusが10%以上の症例から優勢に分離されたこと以外は特徴的ではなかった。しかし、試みに根管治療ごとに細菌検査を行ったところ、治療が進むとともに偏性嫌気性菌は速やかに消失し、特定の通性嫌気性グラム陽性球菌、桿菌あるいは真菌が長期に亘り残留することが多かった。このことから根尖性歯周炎が難治化するには、偏性嫌気性菌などよりも、これら特定の通性嫌気性グラム陽性球菌、桿菌あるいは真菌の存在が大きな役割を果たしている可能性が示唆された。残留細菌に対し詳細に検討する必要性があると考え、当初予定の初回採取した保存菌株に加えて治療ごとに採取した分離菌に対してもAPI-systemで同定している。このことにより、難治性根尖性歯周炎の発生に関与する細菌をより明確にできると考えている。
IL-1シグナル伝達におけるIκBαキナーゼ群の役割の解析

我々は炎症性サイトカインであるIL-1,TNFやLPS刺激時におけるIL-8遺伝子発現機構を明らかにする目的で、同遺伝子発現に重要なNFκBの活性化機構を調べている。我々はヒト単球系細胞株THP-1の細胞抽出液中にIκBαに会合してリン酸化するIκBα会合キナーゼを同定し,そのリン酸化部位がIκBαのC末端領域酸性ドメインのSer/Thr残基であることを見い出した(Kuno et al.J.Biol.Chem.1995)。その後Barroga C.F.(PRONAS,1995),Lin R.(Mol.Cell.Biol,1996),McElhinny J.A.(Mol.Cell.Biol.,1996)らの複数のグループにより、カゼインキナーゼIIがIκBαのC末端領域の酸性ドメインのSer/Thr残基を構成的にリン酸化すると報告された。一方我々はこれまでTHP-1細胞由来のIκBα会合キナーゼをRedセファロース、DEAEカラム等を用いて部分精製を行ってきたが、今回IκBα会合キナーゼ活性がヘパリンHPLCカラムで2つのピークに分離されることを見い出した。また抗カゼインキナーゼII抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果から、ヘパリンカラムの低塩濃度で溶出されるピークはカゼインキナーゼIIであるが、高塩濃度で溶出されるピークはカゼインキナーゼIIとは異なるIκBα会合C末端キナーゼであることがわかった。THP-1細胞粗抽出液におけるIκBα会合キナーゼ活性は、無刺激である程度検出されるものの、LPS刺激時に顕著に増加する。これは構成的な活性を示すカゼインキナーゼIIと、LPS刺激によりその活性が誘導される我々の同定したIκBα会合C末端キナーゼの総和と考えられる。IκBα会合C末端キナーゼについては現在さらに精製を進めており,今後そのcDNAのクローニングとアンチセンス法等による不活性化を行い、NFκBの活性化における役割を調べる予定である。
緑藻スジアオノリのヘテロ接合型無性生殖個体に関する進化生態学的研究

これまでの研究により、スジアオノリは遺伝的な多様化が進んでおり、地域によって固有の遺伝子型が分布していることが明らかとなった。特に太平洋側と日本海側では遺伝的差異が顕著であった。太平洋側では満潮と干潮で1m1.5mの潮位差があるが、日本海側では0.2mほどしかないため、同じ潮位でも干出時間、水温、光強度などの環境が異なり、それがスジアオノリの地域差に影響している可能性がある。しかし、海藻の生理特性と生育環境の関連性についての研究は進んでおらず、太平洋側と日本海側に分布する海藻の生理的分化を研究した例はほとんどない。そこで、太平洋側(宮城県石巻市、茨城県茨城町、兵庫県加古川市)と日本海側(福井県坂井市、福井県小浜市、兵庫県豊岡市)から単離したスジアオノリ培養株を用いて、乾燥耐性を比較した。藻体を3mm長に切断し、0、5、10、20分の乾燥処理を行った後、57日間培養して藻体の生死を行った。福井県小浜市の株は10分間の乾燥後も死なずに成長し続けたが、他の株は5分間の乾燥でも培養3日以内に白化した。スジアオノリが生育する汽水域は沿岸域よりも干出時間が短いため、太平洋側でも乾燥耐性は必要ないのかもしれない。日本海側では、冬季における低照度や高波が淘汰圧として働いている可能性があり、乾燥耐性以外の環境要因についても検証すべきであろう。今後、スジアオノリ以外でも、全国に分布する海藻類を太平洋側と日本海側から採集し、種内で生理特性を比較することにより、生理的分化の観点から「地域による遺伝的差異」を検証できると期待される。これまでの研究により、福井県の三方五湖と南川河口域に生育するスジアオノリは遺伝的に分化していること、分布パターンによって4つのエコタイプ(三方五湖全域に分布するI型、三方五湖高塩濃度域のみに分布するII型、三方五湖高塩濃度域と南川河口域に分布するエコタイプIII型、南川河口域のみに分布するエコタイプIV型)に分けられることが示された。本研究では、エコタイプ間で生理的分化が生じている可能性を検証するため、培養株を用いて異なる培養条件における成長率と成熟率を比較した。異なる水温(530°C)または塩濃度(035)で7日間培養したところ、エコタイプ間で至適条件に違いは見られず、塩濃度0ではいずれのエコタイプも成長を停止した。そこで淡水耐性を比較するために、塩濃度0で010日間培養した後に塩濃度17.5で5日間培養したところ、エコタイプI型では成長率の低下は小さかったが、他のエコタイプでは淡水暴露4日目以降に成長率が有意に低下した。次に、2日に1回(3、6、9時間)淡水にさらしながら1週間培養したところ、エコタイプII型では成長率の低下は小さかったが、他のエコタイプでは成長率が有意に低下した。さらに、異なる塩濃度(0、1.8、7、17.5、35)で藻体の成熟率を比較したところ、塩濃度7ではエコタイプIV型以外はすべて成熟した。塩濃度17.5以上ではいずれのエコタイプも成熟し、塩濃度1.8以下ではいずれも成熟しなかった。以上の結果から、スジアオノリのエコタイプは生理的に分化していることが明らかとなった。また、各エコタイプは生育環境(平均塩濃度、淡水にさらされる時間や頻度)に適応した生理特性をもつことが示唆された。本研究により、海藻の種分化を促す環境要因について新たな知見が得られた。当初予定していた無性生殖株の生理実験はすべて完了し、妥当な結果が得られた。異なる遺伝子型間の交雑により無性生殖化するかどうかを検証するために、日本各地でサンプリングを行い、様々な遺伝子型の有性生殖株を確立したが、まだ交雑実験の結果は得られていない。また、三方五湖と似た環境である茨城県涸沼と島根県宍道湖でスジアオノリを採集し、遺伝子型や遊走細胞の走光性について解析中である。陸上植物や一部の紅藻類では、遺伝的に異なる個体間の交雑によって無性生殖化することが知られているため、スジアオノリでも同様の現象が起こるかを検証した。有性生殖型の場合、交雑によって生じた複相の第一世代(ヘテロ型胞子体)は、減数分裂して単相の生殖細胞を放出するため、その生殖細胞から発生した第二世代(ホモ型配偶体)はどちらか片方の対立遺伝子のみを受け継ぐはずである。もしヘテロ型の第二世代が得られれば、減数分裂が行われずに無性生殖化したと見なすことができる。北海道厚岸湖、新潟県三面川、兵庫県円山川、高知県四万十川、宮崎県加江田川から有性生殖型のスジアオノリを採取した。hsp90の部分配列を調べたところ8つの対立遺伝子が検出されたため、それらの培養株を確立し、6株の配偶体を用いて交雑実験を行った。交雑を行ったすべての組み合わせで接合反応が起こり、接合子と思われる生殖細胞が得られた。その発芽体の遺伝子型を解析したところ、20個体中18個体が両親の対立遺伝子を受け継いでいたことから、18組では正常に交配したことが確認された。次に、この18組の第一世代培養株から放出された生殖細胞を単離し、得られた第二世代の遺伝子型解析を行った結果、すべてホモ型のみであった。第一世代(胞子体)で検出された2種類の対立

遺伝子が第二世代で分離されたことから、今回得られた交雑体はすべて通常の有性生殖型であると考えられる。天然で検出された無性スジアオノリの12遺伝子型のうち、A0/B0とB0/C0は今回の交雑実験で作出されたが、無性生殖化しなかった。hsp90遺伝子座では同じ遺伝子型でも、他の遺伝子座では配列が異なっている可能性があるため、この結果をもって交雑による無性生殖化を否定することはできない。さらに多様な有性生殖個体を集め、数多くの交雑体を作出することにより、この仮説を検証する必要がある。当初予定していた交雑実験は予定通り実施できたが、残念ながら交雑体が無性生殖化することはなかった。無性型スジアオノリで検出されるヘテロ接合型は12種類にのぼるが、そのうち今回の交雑実験によって作出できた遺伝子型は2つだけだった。これは様々な遺伝子型の有性生殖株の入手が困難だったことに加え、多数の培養株を一度に成熟誘導して交雑させるのが容易ではないこと、得られた全ての交雑体について生活環をまわして無性生殖化を確認する作業が煩雑で相当な時間を要することも原因である。これまでの研究により、三方五湖に生育するスジアオノリは、塩濃度環境が異なる水域間でhsp90遺伝子型の遺伝子頻度が明確に異なっていること、遺伝子型にかかわらず、上流域(塩濃度は3psu以下)で採集される藻体は生殖細胞が正の走光性を示し、下流域(塩濃度は0psuから30psuまで大きく変動)で採集される藻体は負の走光性を示す傾向があることが明らかとなった。今年度は、水域間で見られる遺伝子頻度の違いが生殖細胞の分散能力や走光性の違いと関連しているのかを明らかにするため、三方五湖の上流域と下流域に3日間連続でスライドガラスを設置・回収し、そこに付着した生殖細胞の遺伝子型を調べ、各水域の各遺伝子型の供給の有無を調べた。その結果、下流域において、88サンプルの遺伝子型を特定でき、藻体が検出されていたB0/C0型・B6/C0型が78.4%を占めたが、上流域でしか検出されていない遺伝子型(A0/B0型・B0/B7型・B0/E0型)が20.5%検出されていたことから、上流域に特有の遺伝子型の生殖細胞も下流域まで拡散してくることが明らかとなった。下流域において、母藻の解析では全く検出されなかった遺伝子型が生殖細胞の解析で検出されたことから、生殖細胞が着底後、成体に成長する過程で淘汰されている可能性が示唆された。スジアオノリ種内で遺伝子型間の成長特性が分化し、各水域の塩濃度環境に合った個体が生き残り、遺伝子型組成の違いが生じている可能性が高いと考えられる。今年度は、本研究をサポートしてきた大学院生の中途退学、申請者の異動等が重なり、計画通りサンプリングを施行できなかったため。これまでの研究により、スジアオノリは遺伝的な多様化が進んでおり、地域によって固有の遺伝子型が分布していることが明らかとなった。特に太平洋側と日本海側では遺伝的差異が顕著であった。太平洋側では満潮と干潮で1m1.5mの潮位差があるが、日本海側では0.2mほどしかないため、同じ潮位でも干出時間、水温、光強度などの環境が異なり、それがスジアオノリの地域差に影響している可能性がある。しかし、海藻の生理特性と生育環境の関連性についての研究は進んでおらず、太平洋側と日本海側に分布する海藻の生理的分化を研究した例はほとんどない。そこで、太平洋側(宮城県石巻市、茨城県茨城町、兵庫県加古川市)と日本海側(福井県坂井市、福井県小浜市、兵庫県豊岡市)から単離したスジアオノリ培養株を用いて、乾燥耐性を比較した。藻体を3mm長に切断し、0、5、10、20分の乾燥処理を行った後、57日間培養して藻体の生死を行った。
物理的要因による脳発生異常の発現機序に関する分子細胞生物学的研究

発育途上のヒトや実験動物の胚子が放射線や高温に曝露されると種々な発生異常が誘発され、胚子の中枢神経系や中軸骨格が最も高い感受性を示す。本研究においては、ヒト胚子の正常及び異常神経管閉鎖過程を詳細に調べると共に、マウスを用いた実験的研究を行い次記の結果を得た。1.ヒト胚子においては、従来神経管閉鎖の開始部位とされていた頚部の高さの他に、中脳-菱脳移行部、神経溝前端部からも閉鎖が始まることが明らかになった。また、第一の閉鎖が尾部下端まで伸びて、そこで尾神経孔が閉鎖することがわかった。これらの所見によって、多くの神経管奇形(無脳症、二分脊椎)の病理発生が説明できた。2.妊娠1314日の妊娠マウスに4243°Cの高温を負荷すると、神経前駆細胞の増殖と遊走が有意に抑制され、大脳原基に細胞死が増加した。3.妊娠1416日の妊娠マウスに高温を負荷すると、顔面神経核の形成が有意に遅延した。4.妊娠79日の妊娠マウスに高温を負荷すると、胚子の体節におけるHox遺伝子の発現が変化し、それに対応した脊柱の分化異常(トランスフォーメーション)が誘発された。5.妊娠マウスに妊娠初期から葉酸(3mg/kg)を毎日投与し、妊娠8日に高温を負荷したところ、高温の催奇形性が有意に抑制された。以上の結果から、妊娠初期の高体温が遺伝子の発現、細胞の増殖・分化・遊走を障害することによって中枢神経系などの発生異常を誘発すること、また、その催奇形作用が葉酸によって抑制されることが明らかになった。妊娠初期に熱性疾患やサウナなどによって高体温が持続すると、その児に神経管奇形、小眼球症、精神発達遅滞などの中枢神経系の発生異常が起るリスクが高くなる。本研究では、ニューロンの分化時期における高温負荷がニューロンの発生・分化と大脳皮質の構築に及ぼす影響について形態学的に調べるとともに、Hox遺伝子の発現と中軸骨格の発生に対する高温の影響を分子生物学的に調べた。1.妊娠1214日に毎日1回42または43°Cの高温を10分負荷された母マウスから生まれたマウスの脳重量は対照群に比べて有意に低く、その影響は温度上昇と相関した。2.妊娠13または14日に高温負荷を受けたマウス胎児では、2448時間後の大脳組織の厚さが対照群よりも有意に薄く、皮質板の厚さも薄かった。3.妊娠13.5日の高温負荷により、胎児大脳のマトリックス細胞層における細胞増殖が48時間にわたって有意に抑制された。4.妊娠14.5日の高温負荷により、マトリックス細胞層から皮質原基に向かう細胞の遊走が高温負荷後72時間にわたって抑制された。5.胎児大脳、特にマトリックス細胞層におけるアポトーシス(細胞死)が高温負荷群で有意に増加した。6.高温負荷をうけた胎児においてHox遺伝子の発現に異常が見られ、脊柱、肋骨など中軸骨格の形態的特徴がシフトするトランスフォーメーションが誘発された。以上の結果から、ニューロンの増殖と遊走が活発な時期に胎児が一過性の高温ストレスを受けると、ニューロン前駆細胞の増殖と遊走が障害され、さらに細胞死が起ることによって脳の発育と組織構築に異常が起こると考えられた。また、高温は重要な形態形成遺伝子の発現を修飾することによって形態異常を誘発するととも確かめられた。ヒト胎児における高温による脳障害のリスク推定とその予防のために本研究組織で検討を続けている。

1)大脳皮質を構成するニューロンの発生、遊走、分化に対する熱ショックの影響を調べるため、胎児脳でニューロンの発生が活発な時期に当たる妊娠13日のマウス(膣栓日=0日)に43°Cの高温を15分間負荷し、その後経時的にBrdU免疫組織化学法によって細胞動態を調べるとともに、TUNEL法によってアポトーシス細胞を同定し、誘発細胞死と皮質構築異常との関連を解析した。その結果、72時間後における胎児の脳重量が有意に低下した。また、24時間後におけるマトリックス細胞層の細胞増殖が有意に抑制され、皮質原基に向かうニューロンの遊走が72時間にわたって抑制された。更に、高温処理群の胎児の脳においてアポトーシスが増加した。これらの結果から、ニューロンの増殖と遊走が活発な時期に一過性の高温ストレスが負荷されると、ニューロン前駆細胞の増殖と遊走が障害され、細胞死が増えることによって、脳の発達障害が起きると考えられた。2)次に末梢神経の分化に及ぼす熱ショックの影響を調べるため、妊娠1113日のマウスに1日1回、43°C10分間の高温を負荷し、その後経時的に胎児を取り出してその顔面神経核の発生を組織学的に調べた。その結果、高温を負荷された胎児においては、顔面神経核を形成するニューロンの遊走を遅延させ、また神経核の細胞数を減少させることが明らかになった。3)妊娠マウスに高温を負荷すると、その児に脊柱の異常(トランスフォーメーション)が誘発される。様々な時期に高温を負荷して異常の型を解析したところ、高温負荷を受けた時期に分化しつつあった高さの椎骨の分化がシフトしてトランスフォーメーション奇形が生じることが明らかになった。また。それに対応してHox遺伝子の発現の高さをも同様にシフトすることが確認された。4)妊娠初期に高温を経験した母親から流産ヒト胚子の脳を組織学的に調べ、神経細胞の異常増殖、ロゼット形成、皮質構築異常などを認めた。
窒化物半導体への低損傷選択ドーピング技術の確立

窒化ガリウム(GaN)は高い絶縁破壊電界と高い電子飽和速度を有しており、高効率電力変換デバイスや高速・高密度ワイヤレス情報通信用デバイスを実現する最適の材料である。しかし、GaN系デバイスプロセスでは、選択ドーピングに用いられるイオン注入法において、注入キャリアの活性化のためにGaNの結晶成長温度を超える高温の熱処理が必要とされる。このような高温の熱処理においては、ガリウムや窒素の脱離といったGaNの表面変性や、炭素や酸素といった意図しない不純物の混入が生じる可能性がある。特に炭素は、GaN中において両極性を有する不純物であり、高温熱処理によりGaN中へと混入した場合にどのような影響を及ぼすか不明である。本研究では、低損傷選択ドーピング技術への応用も視野に入れ、高温熱処理によりGaN中へと混入した炭素が与える影響について検討した。まず、GaN上に炭素源として窒化炭素(CN_x)、および保護膜として窒化シリコン(SiN_x)膜を電子サイクロトロン共鳴化学気相堆積法により連続的に堆積したSiN_x/CN_x/GaN構造を形成し、その後窒素雰囲気中において1000°Cで2時間の熱処理を行ない、最後にフッ酸処理および窒素プラズマ処理によりSiN_x/CN_xを除去した。X線光電子分光法および2次イオン質量分析法の結果から、本研究で用いたプロセスにより炭素がGaN中へと混入していること、高温熱処理によりGaN中からガリウムが外方拡散していること、および混入した炭素がC-N結合を形成している可能性を確認した。また、ショットキーダイオードを作製し、その電流-電圧特性を検討した結果、混入した炭素がGaN中で浅いドナーとして振る舞い、ショットキーポテンシャルを薄層化させることで電子トンネリングによる電流リークの原因となることが確認できた。
心および心肺移植における患者管理と臓器機能維持に関する総合的研究

本研究は心および心肺移植における患者管理と臓器機能維持に関して総合的な検討を行うことにある。臓器機能保存について:平・森山はドナー心機能評価モデルの作成・移植心虚血再灌流障害時好中球エラスターゼ阻害剤基礎研究を行った。安井はsuperoxideによる移植心障害の制御について、OPC-6535およびAcorbyl Radicalの効果を検討した。この値と再灌流後の左室機能が相関し、保存心の機能評価への有用性を示した。藤村・近藤は肺移植後虚血再灌流傷害による肺水腫に関し、イオントランスポートの検討ならびに培養細胞株によるIL-8分泌、NF-kBの核内移行、p65およびF-actin再重合を示した。拒絶反応制御について:磯部は慢性心拒絶拒絶反応時のサイトカイン発現度を検討、およびE2F-decoy遺伝子導入・レシピエント由来の活性化T細胞を培養平滑筋細胞に加え、平滑筋細胞増殖を誘導させた。この増殖はEgr-1 antisense ODNによって抑制された。Egr-1遺伝子が慢性拒絶に関与することを示した。松田はHVJ liposome法を用いた移植心への遺伝子導入による拒絶反応制御をbcl-2遺伝子、NF-kBの結合部位に対するcis-element"decoy", ODNに行った。移植術後管理について:高本はニホンザル同種異所心移植における慢性拒絶病態・遺伝子導入による拒絶制御ならびにで急性拒絶早期診断法を検討した。田林は心臓移植後急性拒絶時のマクロファージ浸潤の核医学診断法・心臓超音波検査法を検討した。小柳は過小ドナー心の際、Ischemic preconditioningが術後右心機能改善に寄与する可能性を示唆した。臨床における問題点について:許は補助人工心臓による循環補助治療の臨床研究を18例に行い、平均補助期間は150日であり、補助開始後2ヶ月で心臓移植可能な状態まで回復する事を示した。北村は、臓器移植法下に施行した心臓移植5例に関する臨床的研究を行った。全例DCM。4例はLVAS装着し待機した。免疫抑制法はCyA, Mycophenolate mofetil, steroidの3剤を使用した。いずれも術後経過良好であることを報告した。全例DCM。本年は初年度であるので、平成10年7月3日(金)に第一回班会議を開催し、研究分担事項の確認、各自がこれまでに行ってきて研究内容の紹介、これかの具体的な研究内容について発表を行った。そして、平成11年2月5日(金)には第2回班会議を開催し、本年度の各自の研究実績の報告と来年度以降の研究予定について発表を行った。許は多臓器不全を伴った末期的拡張型心筋症8例の補助人工心臓治療経験から、2例に於いて補助人工心臓から再度離脱が可能であり、1例はそのご心臓移植を受けたが、1例は自己心臓で退院できたこと、つまり補助人工心臓装着が末期的拡張型心筋症の心不全の治療手段となりうる症例かあることを報告した。小柳、安井は良好な心保存法の検討を行い、ishchemic preconnditioningの右心機能保護効果、好中球スーパーオキサイド産制阻害剤の未熟心筋保護効果を報告した。平は異所性心臓移植における心機能評価法を、田林は移植心臓拒絶のNO産制を会したメカニズムを検討した。

磯部、高本は慢性心拒絶反応の病態と遺伝子治療の実験的検討を行いHVJ-liposome法のE2Fdekoy遺伝子導入による移植心冠状動脈内膜肥厚抑制効果を報告した。藤村は肺移植後の再潅流障害に関する実験的検討を行い、グルココルチコイドの効果と作用機所の検討を報告した。異種移植における検討では、高本は異種移植心拒絶反応におけるapoptosis関与の可能性の検討を、松田はconcordant異種移植心に対するBcl-2遺伝子の導入による拒絶反応抑制効果の実験的検討を報告した。心および心肺移植における患者管理と臓器機能維持に関して基礎的ならびに臨床的研究を各班員が行った。異種移植心における転写因子および血管新生因子の発現の経時的変化について免疫組織染色を用いて検討し、Egr・2,BTEB2は移植後40分で発現、VEGFは25日後発現、MMP2は5・6日後,TIMP2は11日後発現する事が示された(高本)。肺移植における低温保存時、glucocorticoid投与によってIL・8産生が抑制される事を培養細胞株で示した(藤村)。臨床心臓移植国内再開例の治療経過に関する検討を行った(北村)。好中球peroxidase阻害薬のドナー心虚再灌流障害抑制に対する効果の検討を動物実験灌流モデルで検討し、心拍出量・心筋ATP量等から有用であることを示した(安井)。過小ドナー心移植後の右心不全の病態ならびに予防策に関して動物実験で検討し、Ischemicpreconditioningがドナー心機能維持に有用であることを示した(小柳)。異種心移植における拒絶反応の抑制のためのbcl・2遺伝子導入効果を動物実験で検討し、移植心冠動脈病変が導入後軽度なことを示した(松田)。心移植における免疫抑制およびiNOS抑制剤の効果を3・L・nitrotyrosineをマーカーとして動物実験にて検討し、有用性を示した(田林)。心不全末期における補助人工心臓適応について臨床例における検討を行った(許)。同種心臓移植後拒絶反応抑制のためのE2F,NK・kappa Bデコイ遺伝子の効果について動物実験を行い、移植心生着延長、新生内膜血管内膜占拠率、VEGF発現度から有効性を示した(磯部)。ドナー心虚血再灌流障害における好中球エラスターゼの関与ならびにそれの阻害による効果を動物実験で検討し、心調律、ATP・水分含有量から有効性を示した(森山)。本研究は心および心肺移植における患者管理と臓器機能維持に関して総合的な検討を行うことにある。臓器機能保存について:森山は移植心虚血再灌流障害時好中球エラスターゼ阻害剤(ONO-5046-Na)の基礎研究を行い、本剤が保存・移植心の機能保存に対する有効性を示した。安井はAscorbyl Radicalの虚血再灌流後の冠動静脈血中濃度差を検討した。この値と再灌流後の左室機能が相関し、保存心の機能評価への有用性を示した。近藤は肺移植後虚血再灌流傷害による肺水腫に関し、肺胞細胞内刺激伝達の培養細胞株から、低温保存後再加温によるIL-8分泌、NF-kBの核内移行、p65およびF-actin再重合を示した。
新規シナプス可視化システムを用いたショウジョウバエの意思決定神経回路網の探索

動物が特定の行動を起こす意思決定は中枢神経系内で具体的にどう実現されているのか?この問いにアプローチするため、本研究では申請者が新規に開発中のシナプス可視化システムを用い、キイロショウジョウバエ雄の脳内で、求愛行動の引き金を引くP1ニューロンに接続するニューロン群を網羅的に同定することにより、求愛行動開始の意思決定の場となる神経回路網をニューロンレベルで解剖学的に同定することを目的としている。研究代表者は、二つに分割された緑色蛍光タンパク質(spGFP)の再構成による蛍光を指標としてシナプス接続を可視化するGRASP技術を利用した新規システムを開発中である。GRASPでは、二つのspGFPを、どちらも膜結合タンパク質として、それぞれ異なったニューロンに発現させる。それらニューロン同士がシナプスを形成していると、シナプスにおいて再構成されたGFPの蛍光が観察される。研究代表者は、GRASPの膜結合型spGFPにエピトープタグを付加し、シナプス可視化と同時にニューロンの形態を可視化する改良を行った。さらに、それぞれのspGFPをトランスジーン内の部位特異的組換えにより相互排他的に発現させるシステムを導入した。P1ニューロンに接続するニューロン群を同定するため、このシステムを用い、P1を含むfruitless遺伝子発現ニューロン間のシナプス接続を探索するスクリーニングを行い、いくつかの接続を検出した。今後、スクリーニングの規模を拡大しつつ継続し、神経回路網を同定する研究計画であったが、予定研究期間の初期に研究代表者が転職により科研費応募資格を喪失したため、研究は中途で廃止された。
日本近世・近代における村落生活史の基礎的研究

本年度は,研究実施計画にしたがって,本研究の基礎となる「宗門人別御改帳」「宗門送り状」などの史料の調査・収集とその「家族カード」化という作業を行い,これとは別に集中的な収集と解読とをすすめた村方一件文書とつき合わせて考察し,報告書をまとめ上げることができた。まず、長野県東筑摩郡朝日村の旧西洗馬村については,かつて村役人を勤めたことのある4軒の家に所蔵されてきた「宗門人別御改帳」を漏れなく朝日村の公民館へ借用し,適宜ここへ通って筆写・収集をすすめた。旧西洗馬村は,戸数200軒に近く,村内は上組・下組に分けられており,「宗門人別御改帳」の残存状態も異なっており,上組は文政6年(1823)から43年分,下組は天保4年(1833)から35年分を筆写し,さらにこれを「家族カード」の形にまとめ上げた。長野県東筑摩郡明科町の旧大足村については,すでに昨年度に「宗門人別御改帳」の収集・筆写を行い,いわゆる「家族カード」の作成まで行って,家数で108軒,人数で2500人弱の家族・個人情報をまとめてあったが,加えて本年度は集中して村方係争関係を中心に「一件文書」(一紙文書)の採集・筆写をすすめた。この成果を含めて,本学部の紀要(人文科学論集)に「近世後期村方騒動の背景」と題した論文を発表した。さらに,この論文を含めた別冊の報告書『日本近世・近代における村落生活史の基礎的研究』を刊行した。本年度は,研究実施計画にしたがって,本研究の基礎となる史料の調査・収集と,その整理(とくにカード化)を徹底的に行なった。まず,長野県東筑摩郡明科町の旧村大足村の「宗門人別改帳」の収集筆写から始めた。大部分が同町の越博太郎家所蔵であったこと,借用の便が得られたことにより,大学の研究室において日常的に筆写作業を続けることができた。越家の欠年分については,滝沢家で18冊,明南小学校で8冊補充調査をして収集した。旧大足村については,現在する82年分の「宗門人別改帳」すべての筆写を終えることができた。この筆写史料を家族ごとにまとめて整理を施し,いわゆる「家族カード」の作成の入り,その結果全部で108軒,2500人弱の個人別データをまとめ上げた。さらにこれを簡略化しパソコンに入力した。これらは予想をこえる作業量であったが,旧大足村についてデータ集積を果たしたことは,本研究の最大の成果である。旧大足村関係の作業と平行し,すでに一応の筆写収集をしてあった愛知県北設楽郡稲武町の旧稲橋村の「宗門人別改帳」についても,「家族カード」的整理を行ない,比較検討できるように作業をすすめ,疑問点の再調査・収集を施した。旧大足村の整理のモデルにしようと,途中から旧稲橋村の作業を優先し,「家族カード」的整理を完了したので,それを本学部の紀要に,データ段階のものを発表してみた。また,長野県東筑摩郡朝日村の旧西洗馬村に関しても,村役人を経験した4軒から「宗門人別改帳」を借用して筆写収集につとめている。各年度200軒近い村であるため,予想以上に時間を費しているが,他方に残されている旧大足村の村方係争文書の収集と解説とあわせて,作業を継続している。いずれ,「家族カード」と村方一件文書とを関連させた検討に入るつもりである。

本年度は,研究実施計画にしたがって,本研究の基礎となる「宗門人別御改帳」・「宗門送り状」などの史料の調査・収集とその「家族カード」化という作業を行ない,これとは別に集中的な収集と解読とをすすめた村方一件文書とつき合わせて考察し,報告書をまとめ上げることができた。まず,長野県東筑摩郡朝日村の旧西洗馬村については,かつて村役人を勤めたことのある4軒の家に所蔵されてきた「宗門人別御改帳」を漏れなく朝日村の公民館へ借用し,適宜ここへ通って筆写・収集をすすめた。旧西洗馬村は,戸数は200軒に近く,村内は上組・下組に分けられており,「宗門人別御改帳」の残存状態も異なっており,上組は文政6年(1823)から43年分,下組は天保4年(1833)から35年分を筆写し,さらにこれを「家族カード」の形にまとめ上げた。長野県東筑摩郡明科町の旧大足村については,すでに昨年度に「宗門人別御改帳」の収集・筆写を行ない,いわゆる「家族カード」の作成まで行なって,家数で108軒,人数で2500人弱の家族・個人情報をまとめてあったが,加えて本年度は集中して村方係争関係を中心に「一件文書」(一紙文書)の採集・筆写をすすめた。この成果を含めて,本学部の紀要(人文科学論集)に「近世後期村方騒動の背景」と題した論文を発表した。さらに,この論文を含めた別冊の報告書『日本近世・近代における村落生活史の基礎的研究』を刊行した。
ポリケタイド合成酵素の基質受け渡し機構の解明を目指した高分解能構造解析

I型ポリケタイド合成酵素は、多数のドメインから構成され、ドメイン間で基質を受け渡しながら複雑なポリケタイド骨格をつくる。基質を運ぶドメインの動きは、基質結合や各ドメインによる反応・動きと連動すると予想されるが、その機構は不明である。本研究では、全ドメインが揃ったポリケタイド合成酵素の立体構造を、基質を観測可能な高分解能で観測することで、基質受け渡し機構の解明を目指す。変異導入と基質結合によってドメインの動きを止めた酵素を用意し、それぞれの結晶を作製する。結晶を様々な溶液に段階的に浸す結晶工学的処理や複数結晶からの回折データの合算により、基質を観測できる分解能での構造決定を目指す。
MRIを用いた温熱療法システム

今回、インプラント温熱療法の加温方法として、コイルとコンデンサから構成される共振回路を用い、これをMRIが通常、画像取得時に発するRFパルスにて励磁させ発熱させるシステムを開発した。共振回路、MRIパルスシークエンスの最適化を行い、治療へ応用するための基礎的な検討を行った。昨年度の基礎実験にて得られた実験結果に基づき、共振回路の最適化や問題点を改善した。共振回路に用いるコイルの適正化を行い、MRIの発する微弱なRFパルスにて最高約40度の温度上昇が得られた。MRIのパルスシークエンスに関しては、共振回路との周波数を一致させるため、スライス幅を狭くし、短時間あたりのパスルを多く出すものを使用した。回路は比較的小さなものを使用し、肉中に置いた場合の画質を評価した。金属なので回路局所での画像アーチファクトは生じるものの、回路周囲の画像評価は可能であった。小型な回路を用い、広く病院に普及しているMRI機にてインプラント温熱療法を行える可能性が確認できた。一方、寒天、肉中では共振周波数がずれる現象が確認された。周波数のずれに関してはMRIのシークエンスのパラメータを変えることにより、対応可能であった。今後、この点をさらに検討する必要がある。現有のMRI装置を用いた基礎実験を行い治療に適したMRIでのシークエンスの開発、温度分布の調査を行った。(1)MRIシークエンスの検討開発したインプラント用に使用可能な小型共振回路を用いて、現有のMRI装置におけるイメージング用シークエンスにおいて発熱の状態を調べた。回路は光ファイバー温度計とともにMRIの寝台にセットし、画像診断のシークエンスであるT1強調像、FastLow Angle Shot(FLASH)、Rapid Acquisition with Refocused Echoes(RARE)、diffusion-weighted image(DWI)等にて共振回路の温度上昇を調べた。また、スライス厚、スライス枚数、バンド幅などのパラメータを変え、温度上昇の特性を調べた。シークエンスでは短時間に多数のパルスがでるRARE、FLASHで温度上昇が良好であった。また、パラメータでは磁場中心(共振周波数)からのずれが少ない、スライス厚が少ない、バンド幅が少ないものが温度上昇が良好であった。(2)共振回路の特性の検討共振回路のコンデンサを固定値のもの、可変式のものに変え、温度上昇の違いを調べた。可変式ものでは温度上昇の程度が低い結果であった。共振周波数を少しずつ変えた回路を用い、共振周波数からのずれの違いにおける温度上昇の程度を調べた。(3)温度分布の調査寒天に共振回路を入れ、温度分布を調べた。共振回路自体を寒天に入れたもの、および共振回路をラップした状態で寒天に入れたものでの温度上昇の違いの調べた。(4)画像撮像時のアーチファクトの検討共振回路を市販の肉塊中にいれ、MRI画像を撮像した。共振回路および辺縁にartifactが認められたが、周囲の画像の取得は可能であった。