hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新教徒移民が初期近代英国文学に与えた文化的社会的影響に関する総合的研究

また調査地についての基礎研究文献についても、大英図書館での調査及び現地調達などによりほぼ必要なものをそろえることができ、次年度に成果をまとめ、発表する準備ができた。論文については今年度内にまとめ上げて投稿するまでには至らなかったので、次年度にさらに発展させて投稿することとする。平成30年度は9月にロンドンを中心に英国の調査地に3週間ほど滞在し、必要な研究資料を収集し、また研究協力者にも助力を得て研究をすすめる予定である。前年度の遅れを取り戻すために当初の計画より若干多めに時間を配分して資料の調査・分析に従事する段取りとなっている。また、イギリスでは、最終年度に研究成果を発表するセミナーを日本で開催するための打ち合わせを、招聘予定の研究協力者と行う予定である。前年度に調査することができなかった英国南東部都市ノリッジについては、今年度に必要な調査を行うこととする。また新たに必要となる研究文献を購入して、その成果を学会や研究会で発表し、論文としてまとめて投稿する。所属先大学が異動することになったことに伴う事前の引っ越しや事務処理の増加等により予定していた海外での追加調査が難しくなり、旅費の使用が当初より減少したことに伴い生じた次年度使用額について、平成30年度において主に海外での研究調査費用に追加して使用し、滞在期間を延長することにより、やや遅れの生じた研究調査を埋め合わせる予定である。英国における現地調査が時間的都合で次年度に繰り越されため、その分の使用は次年度の調査費用に繰り越される。
ベーチェット病の病因HLAと病因ペプチドの結合を阻害する医薬分子の特定

ベーチェット病は全身の諸臓器に急性の炎症を繰り返す原因不明の難治性疾患である。ベーチェット病は人種を越えてHLA(human leukocyte antigen)-B遺伝子のHLA-B*51アリルと顕著に相関することが知られている。また、近年の遺伝子解析により、HLA-A遺伝子のHLA-A*26アリルもまたベーチェット病の発症に強固に関与することが報告されている。HLAは、病原体由来のペプチドと結合し、生体防御の最前線で、抗原特異的免疫応答を制御する一方、自己ペプチドと結合して難治性の免疫関連疾患を誘導する。したがって、疾患発症の病因となるペプチドを同定することは、疾患の発症機序の解明に繋がるとともに、病因HLAおよび病因ペプチドを標的とした新規治療薬の開発を可能にする。本研究では、ベーチェット病の病因HLAと結合する病因ペプチドの特定を行うとともに、病因HLAと病因ペプチドの結合を阻害する低分子化合物の特定を試みる。平成30年度は、複数のオンラインデータベースを用いてベーチェット病の病因HLAアリル(HLA-B*51、HLA-A*26)に特異的に結合する病因ペプチドの予測を実行し、HLA-B*51またはHLA-A*26に特異的に結合するペプチドの候補を網羅的にスクリーニングした。さらに、質量分析計を用いた病因HLA結合ペプチドの探索も実行し、HLA-B*51またはHLA-A*26に結合するペプチドの追加候補を複数検出した。また、ベーチェット病特異的な自己抗体の網羅的なプロファイリングデータも取得した。現在までに、データベースおよび質量分析計を用いた解析により、ベーチェット病の病因HLAアリル(HLA-B*51、HLA-A*26)に特異的に結合する病因ペプチドの候補を網羅的に検出している。したがって、本研究は当初の研究計画のとおり、「おおむね順調に進展している。」といえる。今後引き続き研究を進めることで、当初の目標を達成できると考えている。平成30年度に引き続き、1データベースおよび2質量分析計を用いた解析を行うとともに、3ベーチェット病特異的な自己抗体の網羅的なプロファイリングデータのバイオインフォマティクス解析も実行し、自己抗体が特異的に認識する抗原タンパク質を網羅的にスクリーニングする。その後、「1」、「2」および「3」で得られる結果を結合して総合的な評価を実行し、ベーチェット病の病因HLAであるHLA-B*51またはHLA-A*26に特異的に結合する病因ペプチドを特定する。」といえる。
非侵襲的電気刺激を歩行中に付加することでの神経路興奮性に対する効果

神経科学の研究進歩により、歩行機能障害者の歩行再獲得に向けて積極的なリハビリテーションが実施されている。歩行機能障害者では遊脚開始時に前脛骨筋の活動が弱く、足関節が十分に背屈されないことでつまずきが生じえる。そこで、歩行中の遊脚期に前脛骨筋へ経皮的に電気刺激を与え、足関節の背屈をサポートする目的で、電気刺激装置を併用した歩行トレーニングが行われている。本研究課題では歩行中の非侵襲的な電気刺激を付加することで、歩行中の筋活動や神経路の興奮性にどのような変化が生じるのか明らかにする目的で実験を行っている。本年度は、健常者のトレッドミル歩行中に前脛骨筋に対して非侵襲的な電気刺激を6分間持続的に与え、その前後での筋活動変化から短期の適応変化を調べた。電気刺激の強度は刺激によって筋収縮が生じ始める運動閾値の1.2倍とした。前脛骨筋の近位部と遠位部の2か所に貼付した2つの電極から計測した筋活動をコヒーレンス解析し、脊髄運動ニューロンに対する共通入力の強さが歩行中の外部刺激によって変化するのかに着目した。電気刺激前に比べて、電気刺激直後では遊脚後期における15-30 Hzの周波数帯域でのコヒーレンスは増加傾向を示し、30-45 Hzの周波数帯域では減少となり、低周波帯域へとシフトする結果となった。電気刺激終了後から通常歩行を6分間継続した時点で、15-30 Hzの帯域では電気刺激前の値へと戻っていたが、30-45 Hzでは電気刺激前よりも低値であった。これらの結果から、歩行中に与えた前脛骨筋に対する電気刺激は運動ニューロンに対する共通入力に影響する可能性が示唆された。神経リハビリテーション領域における研究進歩により、歩行機能障害者に対して歩行の再獲得を目指した積極的なトレーニングが実施されている。近年、動物実験では体重を免荷した歩行トレーニングに加えて、脊髄神経細胞などの神経系に対して電気刺激を与えることで、可塑的変化をより促そうとする研究が進み、その効果が示されている。ヒトへの応用に向けてはヒト被験者による研究が必要となることから、本研究では、ヒトの歩行時に非侵襲的な電気・磁気刺激を運動野、感覚神経、筋のいずれかに付加し、神経路の興奮性に及ぼす効果を調べることを目的としている。そのため、歩行時に刺激を付加し、その前後で、大脳の運動野から脊髄運動ニューロンへつながる皮質脊髄路の興奮性や脊髄反射経路の興奮性を調べ、神経路の興奮性変化を評価することで可塑的変化を推察する。本年度は、健常成人を対象とし、外部刺激として前脛骨筋の支配神経である総腓骨神経に対して、経皮的に電気刺激を与えた。運動閾値以上の刺激では背屈動作が引き起こされることから、歩行動作を支援する刺激タイミングとして、遊脚初期もしくは接地直前に刺激を与えた。刺激強度は安静時にわずかな筋収縮が生じる程度とし、歩行の前後で前脛骨筋に対する皮質脊髄路の興奮性やヒラメ筋のH反射変化を調べた。その結果、総腓骨神経への刺激によって歩行後に経頭蓋磁気刺激(TMS)による誘発電位の増大が数名の被験者で観察され、皮質脊髄路の興奮性増加が推察された。本年度は健常成人にて、総腓骨神経への単発電気刺激を歩行中に与え、神経路の興奮性を歩行の前後で比較し、予定した研究はおおむね順調に進展した。また、空気圧による浮力で体重を免荷できるトレッドミルを用いた歩行でも計測を行い、外部刺激付加とは逆に、荷重関連の感覚情報が低下した場合に生じる筋活動変化についても検討を行った。神経科学の研究進歩により、神経疾患や筋萎縮による歩行機能障害者に対して歩行の再獲得を目指した積極的なリハビリテーションが実施されている。歩行中の遊脚期に前脛骨筋へ経皮的に電気刺激を与えることで足関節の背屈を促し、つま先の下垂によるつまずきを防ぐ目的で、電気刺激装置を併用した歩行トレーニングが臨床現場で行われている。このような非侵襲的な電気刺激を与えることで、神経系での適応変化が生じえるのかに関して現在研究を行っている。本年度は、健常成人を対象に、トレッドミル歩行中の遊脚期の全期間に、前脛骨筋へ非侵襲的な電気刺激を与え、電気刺激によって前脛骨筋の収縮をアシストすることで生じる歩容および筋活動の適応変化を調べた。前脛骨筋への電気刺激は、安静時に収縮を目視できる最小の電流強度とした。周波数は50 Hzで、パルス幅は200 μsで固定した。歩行中に被験者に教示することなく、電気刺激を与えないcatch trialを実施し、電気刺激ありとなしでの歩行パターンの比較から適応変化を調べた。その結果、通常歩行時に比べて、catch trialでの筋活動は遊脚期に減少がみられ、筋への電気刺激に対する適応が観察された。こうした適応は刺激の付加から比較的早期に生じていた。遊脚期における足関節の動きについては、計測の初期段階では刺激により過剰な背屈が生じていたが、学習がなされ、中盤以降は通常歩行と同様の角度変化パターンへと移行していった。遊脚期中に持続的に刺激するため刺激付加の時間が長いことから、前年度実施した末梢神経刺激に比較して強い効果が生じえるようであった。本年度は健常成人にて、前脛骨筋への経皮的な電気刺激を歩行中の遊脚期に与え、筋活動パターンや歩容の変化を調べ、おおむね順調に進展した。

今回の実験プロトコルで、歩行後の皮質脊髄路や脊髄反射の興奮性変化を調べるまでには至らなかったが、筋電図データの詳細な解析にも着手した。神経科学の研究進歩により、歩行機能障害者の歩行再獲得に向けて積極的なリハビリテーションが実施されている。歩行機能障害者では遊脚開始時に前脛骨筋の活動が弱く、足関節が十分に背屈されないことでつまずきが生じえる。そこで、歩行中の遊脚期に前脛骨筋へ経皮的に電気刺激を与え、足関節の背屈をサポートする目的で、電気刺激装置を併用した歩行トレーニングが行われている。本研究課題では歩行中の非侵襲的な電気刺激を付加することで、歩行中の筋活動、下肢の動き、神経路の興奮性にどのような変化が生じるのか明らかにする目的で実験を行っている。本年度は、健常成人を対象とし、トレッドミル歩行中の遊脚期に、前脛骨筋へ非侵襲的な電気刺激を与え、その際に経皮的な電気刺激の強度や刺激を付加する時間を変えることで筋活動や下肢の動きに対する影響の大きさを検証した。歩行中に被験者に教示することなく、電気刺激を与えないcatch trialを実施し、電気刺激ありとなしでの歩行パターンの比較から適応変化を調べた。刺激強度の増加によってより短い歩行時間で歩容や筋活動の変化を生じさせることが可能であった。しかしながら、電気刺激による筋収縮が強く生じる場合には急激な背屈が歩行の外乱となりえることから、刺激強度の設定が重要であった。また、下半身への空気圧で体重免荷を免荷することで荷重関連の感覚情報を減弱させた状態で歩行を行い、体重を60%以上免荷することで歩容に大きな影響が生じ、より早期に立脚期から遊脚期へ移行することが明らかとなった。非侵襲的な電気刺激による前脛骨筋への活動のアシストが歩容や筋活動量に与える影響について、計画していた刺激強度の増加による効果量との関連について検証することができたことからおおむね順調に進んでいるものと思われる。本研究課題では歩行中の非侵襲的な電気刺激を付加することで、歩行中の筋活動や神経路の興奮性にどのような変化が生じるのか明らかにする目的で実験を行っている。本年度は、健常者のトレッドミル歩行中に前脛骨筋に対して非侵襲的な電気刺激を6分間持続的に与え、その前後での筋活動変化から短期の適応変化を調べた。電気刺激の強度は刺激によって筋収縮が生じ始める運動閾値の1.2倍とした。前脛骨筋の近位部と遠位部の2か所に貼付した2つの電極から計測した筋活動をコヒーレンス解析し、脊髄運動ニューロンに対する共通入力の強さが歩行中の外部刺激によって変化するのかに着目した。電気刺激前に比べて、電気刺激直後では遊脚後期における15-30 Hzの周波数帯域でのコヒーレンスは増加傾向を示し、30-45 Hzの周波数帯域では減少となり、低周波帯域へとシフトする結果となった。電気刺激終了後から通常歩行を6分間継続した時点で、15-30 Hzの帯域では電気刺激前の値へと戻っていたが、30-45 Hzでは電気刺激前よりも低値であった。これらの結果から、歩行中に与えた前脛骨筋に対する電気刺激は運動ニューロンに対する共通入力に影響する可能性が示唆された。
戦後歴史教育におけるナショナル・アイデンティティ形成論に関する研究

本研究は,歴史教育を通じた「日本人」としてのナショナル・アイデンティティ(国民意識)形成の論理を,1945年を画期とする戦後の学校教育,とりわけ小学校の歴史教育を主な分析対象として明らかにしたものである。戦後歴史教育は,一貫して子ども達に国民意識を植え付けるための装置として機能してきており,それゆえ抜本的な改革が行われてきていないにもかかわらず,今日に至るまで教育課程上に確固たる地位を築いてきている。平成20年度については、以下のような形で研究を遂行した。1.平成20年4月から7月・・・学習指導要領の分析及び研究方法の省察昭和22年版、昭和26年版、昭和33年版、昭和43年版、昭和52年版、平成元年版、平成10年版の学習指導要領における小学校の歴史学習について、(1)どのような歴史認識を形成しようとするものになっていたのか、(2)形成しようとする歴史認識とナショナル・アイデンティティの形成とは、どのような関係になっていたのか、という2点を中心に分析を行った。また、平成20年6月22日(日)大分市において開催された、「全国社会科教育学会研究プロジェクト『社会科教育史研究の体系化と新たな研究方法を探る』第1回中間発表会」において、「認識形成の論理を視点とした社会科教科書史研究の方法論」と題して、本研究の研究方法についての提案を行い、諸氏の批判を得ることで、今後の研究方法の省察を行った。2.平成20年8月から12月・・・教科書収集とそのデータベース化国立教育政策研究所教育図書館において、本研究の分析対象となる歴史教科書(第II期第VII期)の収集を行い、それらのデータベース化を進めた。3.平成21年1月から3月・・・第I期教科書の分析すでに入手していた文部省著作教科書である『くにのあゆみ』及び『日本のむかしと今』とを分析し、戦前の国定国史教科書と比較するなどして、ナショナル・アイデンティティの形成論を観点とした、戦前と戦後の断絶性と連続性を明らかにし、その後の教科書分析の指標を得た。なぜわが国においては「社会認識を通して市民的資質を育成する」教科としての社会科の機能と目的を達成するための「手段」として,歴史教育が位置付けられてこなかったのか。それにもかかわらず,なぜ今日においても,歴史教育は教育課程上に確固たる地位を占め続けているのか。本研究はこの問いに対して「ナショナル・アイデンティティ形成」,「集合的記憶(国民的統合の物語)の創出と忘却」を視点として仮説的に設定しアプローチしていこうとするものである。わが国の戦後歴史教育において,戦前の歴史教育に見られた国民的統合の物語の創出と忘却の機能はいかなる論理によって維持されてきたのか。本研究は,各期の学習指導要領及びそれらに基づいて執筆された教科書の分析から,その問いの解明を試みようとするものであった。平成21年度については,以下のような形で研究を遂行した。(1)平成21年3月から8月・・・第II-VII期教科書の分析収集した教科書を分析・検討した。分析は,帰納的に行うのではなく,各時期の指導要領が形成しようとする歴史認識の特徴が明確になるように,共通の単元を設定し,戦前の歴史教科書分析,第1期の教科書分析から明らかになったナショナル・アイデンティティ形成のストラテジーを視点に演繹的に分析した。(2)平成21年9月から平成22年3月・・・分析結果の総合・研究成果の発信これまでの分析結果を総合し,戦後各期の特徴とナショナル・アイデンティティ形成のストラテジーを明確にし,各期の特殊性と戦後に一貫する共通性を抽出した。研究成果の一部を全国社会科教育学会第58回全国研究大会(弘前大学,10月)において報告し批判を得た。また,学術的な評価を得るとともに社会に向けて広く発信するため,学術論文の形にまとめ,学会誌へ投稿するための準備を行った。
侵略的外来種ソウシチョウと在来生物群集の関係はシカ密度増加でどのように変化するか

外来種ソウシチョウの在来鳥類群集へ及ぼす影響がニホンジカの密度増加でどのように変化するかを明らかにするために、ソウシチョウの侵入後の年数およびニホンジカの密度増加の時期の異なる地域でソウシチョウと在来鳥類の調査を行い、ニホンジカによる下層植生の衰退との関係と検討した。下層植生の衰退が顕著な場所ではソウシチョウだけでなく、在来の低木層利用種も密度が低下するが、下層植生が成育している場所ではソウシチョウが高密度で生息して、在来種のウグイスの密度が低下するものと結論づけた。外来種ソウシチョウの侵入が在来鳥類群集へ及ぼす影響がニホンジカの密度増加でどのように変化するか明らかにするために、2000年ごろにソウシチョウが定着し、その数年後にシカの密度が急激に増加した四国剣山系の天然林でソウシチョウと在来鳥類群集の調査を行った。ソウシチョウの密度はシカの増加前に比べて減少していたが、ソウシチョウと営巣ニッチェが重複する在来種ウグイスは密度が大きく低下していた。低木層で優占していたスズタケは、2000年代半ばから著しく衰退して、代わってコバイケイソウ、シコクブシなどのシカの不嗜好植物の増加が認められた。一方、ヒガラ、ゴジュウカラなど、一部の樹洞営巣種は密度が増加していた。こうした鳥類群集の変化はシカの密度増加による植生改変の影響によるものと考えられた。1990年代前半に鳥類群集を調査した履歴がある熊本県の雁俣山と菊池水源において、鳥類群集の調査を行った。雁俣山ではソウシチョウは20年前とほぼ変わらずに高い密度であり、シカによる植生改変の影響は限定的であった。菊池水源ではソウシチョウは20年前には低密度であったが、今回の調査では密度が高くなっていた。菊池水源ではシカの生息痕は確認されなかった。中国山地東部の氷ノ山で鳥類群集の調査を行った、氷ノ山では2000年代後半からニホンジカの密度増加に伴い、コルリ、クロジ、ウグイスなど低木層を利用する在来種が減少すると同時に、一時は増えていたソウシチョウも少なくなっていることが明らかになった。外来種ソウシチョウの在来鳥類群集へ及ぼす影響がニホンジカの密度増加でどのように変化するかを明らかにするために、四国剣山系の西熊山国有林でソウシチョウと在来鳥類群集の調査を行った。ソウシチョウの密度はシカの増加が顕著になる前の2006-2008年にきわめて高く、その後、減少した。ソウシチョウと営巣ニッチェが重複する在来種ウグイスは同じ期間に密度が大きく低下した。一方、周辺地域においては、ソウシチョウの確認頻度が増加しており、ソウシチョウの高密度生息地がシカによる植生改変のために生息地として不適になり、ソウシチョウが周辺に分散した可能性が考えられた。東中国山地の氷ノ山においては、シカによる下層植生の貧弱化の進んだ地点ではソウシチョウを含む低木層依存型の鳥類の密度が低くなり、鳥類群集全体の種数、個体数ともに減少する傾向がみられた。ソウシチョウが侵入して30年以上経過した九州山地において鳥類群集が長期的にどのように変化したか明らかにするために、3か所の調査地で1990年代と2010年代の鳥類群集を比較した。菊池渓谷では1990年代にはソウシチョウは侵入初期で低密度だったが、2010年代には大きく増加したのに対し、在来種のウグイスは減少していた。雁俣山では1990年代にソウシチョウはすでに優占度が高かったが、2010年代にはさらに高くなり、一方、ウグイスは密度が低下していた。国見岳では1990年代に比べてソウシチョウの密度は2010年代には低下していたが、同時に在来種のウグイス、コマドリも低下していた。これはこの間にシカの密度が増加し、下層植生が衰退したことによるものと考えられた。これらの結果から、過去20年間でシカの密度増加による植生改変が顕著な場所とそうでない場所とで、ソウシチョウの在来種への影響の表れ方が異なるものと考えられた。外来種であるソウシチョウの侵入によって在来鳥類群集へ及ぼされる影響がニホンジカの密度増加でどのように変化するか明らかにするために、当年度は近年シカの密度が増加した場所でソウシチョウと在来鳥類群集の生息密度調査を行うとともに、中国・四国・九州地方におけるソウシチョウの分布の現状について情報を収集してとりまとめた。2000年ごろにソウシチョウが定着し、その数年後にシカの密度が急激に増加した四国剣山系の天然林でソウシチョウと在来鳥類群集の調査を行った。

2000年代後半にソウシチョウが侵入した四国石鎚山系の天然林でソウシチョウの生息状況の調査をした結果、ソウシチョウの密度が高い複数の場所が確認され、ソウシチョウがこの山系に定着したものと判断した。1990年代にソウシチョウが定着した九州の山岳地において、シカ採食圧による下層植生衰退が顕著な地域と下層植生が残存する地域とでソウシチョウの生息密度調査を行った。その結果、下層植生衰退が顕著な地域ではソウシチョウでは生息密度が低めとなる傾向はあったものの、ルートによる差が大きかった。下層植生以外の林床環境の変化、下層植生衰退後の時間経過や、シカの不嗜好性植物の増加が影響している可能性が考えられ、今後、その要因を検討する予定である。当初予定していた四国地区の剣山山系、九州地区の雁俣山、菊池渓谷での調査データが取得できて、経時的な解析も進めているほか、中国地区の氷ノ山でも調査を進めている。これらの状況から、おおむね予定通り進展していると判断した。当初の計画通り、順調に研究を進めている。中国・四国・九州地方でのソウシチョウの現在の分布状況の概略を明らかにした。また、四国地方と九州地方のそれぞれ複数の箇所において、ソウシチョウの定着状況と在来鳥類群集の構造、およびニホンジカの生息状況を調査した。これらのことから、研究計画は順調に進展していると判断した。25年度は最終年度となるため、これまで調査データに加えて補足的調査を行い、それらを取りまとめて、外来種ソウシチョウと在来鳥類群集との関係が、ニホンジカの密度増加によってどのような影響を受けるかについて解析する。ニホンジカの密度増加の前後でソウシチョウと在来鳥類群集との関係を評価するために、過去の調査履歴があるソウシチョウ生息地で近年シカが増加した場所においてソウシチョウと在来鳥類の密度調査を行う。特に平成24年度は、20年前にシカが低密度でソウシチョウがすでに定着していた九州山地において、ソウシチョウおよび在来鳥類群集について生息状況調査を実施して、過去から現在への変化の実態を把握する。物品費として、調査に伴う消耗品等を購入する。旅費として、現地調査旅費および学会発表のための旅費を支出する。人件費として、データ入力・資料整理等の研究補助者への賃金を支出する。その他として、現地調査のためのレンタカー借り上げ料、高速道路通行料、ガソリン代等を支出する。野外調査のための消耗品や記録媒体を購入する。野外調査旅費、成果発表のための学会出席旅費を支出する。資料整理やデータ入力のため、研究補助者を雇用し、賃金を支払う。野外調査のために高速道路代やガソリン代を支出するほか、在勤地から遠方の野外調査ではレンタカーを利用するため、借用を支払う。
定常流補助人工心臓のモータ電流を生体情報センサとして応用した自己心機能評価法

定常流補助人工心臓の長期使用を目指し、特殊なセンサを排除し、血液ポンプのモータ電流の変化をバイオシグナルとして解析し、モータ自体によるセンサ応用の可能性について検討中である。現在までの検討にて、モータ電流の解析により、定常流補助人工心臓の補助状態を推定可能であることを利用して、大動脈弁を通らず、補助人工心臓経由にて血液を駆出するようになる完全補助移行点でのポンプ回転数とモータ電流振幅の比較から自己心機能の回復の評価への可能性を示した。本研究では、新しい自己心機能評価法として、定常流補助人工心臓のモータ電流解析法を応用するために、模擬回路試験と動物実験による検討を行った。模擬回路試験では、2つのリザーバ(体循環血管床,左心房に相当)、空気駆動拍動流ポンプ(自然心左室)、定常流ポンプによる閉鎖式回路を使用し、心機能の三要素(後負荷、前負荷、心収縮力)をそれぞれ変化させ、ポンプ回転数を02500rpmまで変えて、血行動態パラメータおよびモータ電流をモニタし検討した。動物実験では、成山羊を用い七、左心室心尖脱血,下行大動脈送血による定常流左心バイパスモデルを作製し検討を行った。パラメータとして動脈圧、左心室圧、上行大動脈流量、ポンプ補助流量をモニタし、ポンプ回転数を20003100rpmまで変化させて、モータ電流の振幅変化と各種血行動態パラメータとの関係を検討した。われわれの電流振幅指数(ICA)法は、モータ電流波形の振幅の変化を明確にするために、電流振幅をその平均値で除して算出する簡易な手法である。模擬循環回路試験では、後負荷増加でICAの最大値が増加し、心収縮力増加でICAが最大となる回転数が増加、前負荷変化ではいずれも変化しないことにより、心機能三要素の変化を判別することが可能であった。動物実験では、定常流補助人工心臓のポンプ回転数に対する左心室内圧の変化とモータ電流ICA値の変化との間に高い相関を認められ、また、術後の全身状態の変化に伴う左心機能変化により、ICA値も変化することが認められた。本研究により、定常流補助人工心臓装着患者において、特殊なセンサを使用せずにモータ電流をバイオシグナルとして解析することによって、自己心機能の評価法としての可能性が示された。本研究では、定常流補助人工心臓のモータ電流による自己心機能評価の可能性を、模擬回路試験および動物実験にて検討を行った。2つのリザーバ(体循環血管床,左心房に相当)、空気駆動拍動流ポンプ(自然心左室)、定常流ポンプによる閉鎖式回路を使用し、心機能の三要素(後負荷、前負荷、心収縮力)をそれぞれ変化させ、ポンプ回転数を02500rpmまで変えて血行動態パラメータおよびモータ電流をモニタし、モータ電流の振幅変化と各種血行動態パラメータとの関係を検討した。モータ電流波形の振幅の変化として、波形の変化を明確にするために、電流振幅をその平均値で除して電流振幅指数(ICA)を算出し使用した。成山羊に左開胸にて左心室心尖脱血,下行大動脈送血による定常流左心バイパスを行った。パラメータとして動脈圧、左心室圧、上行大動脈流量、ポンプ補助流量をモニタした。ポンプ回転数を20003100rpmまで変化させて同様に検討した。動物実験では、大動脈弁が開かなくなる完全補助移行点とICAの最大となる点が一致し、また非補助下での心機能の差によりICAの最大値とその時の回転数が異なり、主として左心室圧を良く反映していた。これらの結果より、モータ電流の解析により、完全補助移行点でのポンプ回転数とICA値の比較から自己心機能の回復の評価への可能性が示された。

パラメータとして動脈圧、左心室圧、上行大動脈流量、ポンプ補助流量をモニタし、ポンプ回転数を20003100rpmまで変化させて、モータ電流の振幅変化と各種血行動態パラメータとの関係を検討した。われわれの電流振幅指数(ICA)法は、モータ電流波形の振幅の変化を明確にするために、電流振幅をその平均値で除して算出する簡易な手法である。模擬循環回路試験では、後負荷増加でICAの最大値が増加し、心収縮力増加でICAが最大となる回転数が増加、前負荷変化ではいずれも変化しないことにより、心機能三要素の変化を判別することが可能であった。動物実験では、定常流補助人工心臓のポンプ回転数に対する左心室内圧の変化とモータ電流ICA値の変化との間に高い相関を認められ、また、術後の全身状態の変化に伴う左心機能変化により、ICA値も変化することが認められた。本研究により、定常流補助人工心臓装着患者において、特殊なセンサを使用せずにモータ電流をバイオシグナルとして解析することによって、自己心機能の評価法としての可能性が示された。
東南アジア産キュウリモザイクウィルスの分子的多様性と環境適応の出現に関する研究

キュウリモザイクウイルス(CMV)は宿主域が広く農業上の重要ウイルスの一つである。しかし、CMVの研究は、日本をはじめとする温帯地域の分離林を用いた例が多く、熱帯産CMVについては少ない。本研究では、東南アジア産のCMVを中心に、Cucumis meloにおけるCMV抵抗性品種の探索、バナナから分離したインドネシア産CMVの解析、インドネシア産CMVサテライトウイルスの解析、さらには、フィリピンとインドネシアに合わせて日本産のCMVの系統解析を行った。その結果、CMVに対する抵抗性遺伝子の研究例は少ないが、Cucumis meloでインドネシア産CMVおよび日本産のCMVに抵抗性を示す品種を得ることができ、CMV抵抗性遺伝子検出マーカーの開発を行った。また、CMV宿主の中から単子葉植物としてバナナあるいはMusa属植物に、双子葉植物としてトマトに着目してCMVの収集を行った。バナナにおいては異なる病徴を示す複数のCMVを得てそのゲノムの塩基配列の一部を解析した他、バナナ品種による反応を比較した。また、東南アジアでは研究例が無いと思われるCMVサテライトを、インドネシアのトマトから得て塩基配列を明らかにし、その特徴を示した。また、日本ではCMV発生の報告が無いレースフラワーから分解した。一方、収集したCMV分離類を中心に系統分類を試みたところ、血清学的にはSubgroup IIに分類される5分離株を得た。また、3分離株は、PalkaitisらによるAsian strainsに属すると考えられた。分離株や地域による傾向を考察するだけの分離株は収集できなかったが、東南アジア産CMVの多様性を示すとともに、宿主側からは抵抗性品種の選抜、あるいは、病原性の異なるCMVの獲得について、これら東南アジア産あるいは熱帯産CMVの探索が有用であることを示した。1)インドネシア産バナナから分離したキュウリモザイクウイルス2分離株(B1およびB2)について、主としてRNA3の塩基配列を明らかにし、既報の温帯産CMVと比較した。その結果、外被タンパク質のアミノ酸配列は、台湾産CMVを含めた温帯産CMV4分離株との相同性が96%以上と高いが、全塩基配列では、インドネシア産CMV分離株相互の相同性は高いものの、他の分離株との相同性はやや低かった。しかし、Cucumovirus用ユニバーサルプライマー(Chol et al, 1999)を作成してRT-PCRを試みたところ、いずれも単一のバンドとして検出された。また、B2は、タバコなどでの病徴は常に激しいが、トマトでは品種によって感染性に強弱があった。また、タバコでの病徴発現と温度との関係では、18度、25度での病徴に明確な相違は認められなかった。また、サテライトRNAも検出されなかった。2)サテライトRNAを含み、日本産CMVの防除に実用化されている複数の弱毒ウイルス(日本テルモンテ社提供)をトマトに接種し、インドネシア産CMV(B2)を二次接種したところ、干渉効果が認められ発病が抑制された。3)フィリピンではフィリピン大学のN.Bajet博士の協力を得て7月26日から8月1日にルソン島を中心に調査を行った。CMVに感染している可能性の有るバナナ、アバカ、トマト、チャヨーテなどのモザイク症状株を採集し、農林水産省の特別許可を得て輸入し、ELISA法あるいはウエスタンブロット法でCMVの検出を試みた。その結果、ELISA法によってアバカからのみCMVが分離されたが、アバカでのCMVの報告例は見当たらないため接種試験を実施中である。なお、その他の試料では、キュウリ緑斑モザイクウイルス、ズッキーニ黄斑ウイルスあるいはその近縁Potyvirus属ウイルスが検出された。昨年度の海外調査に引き続きて行ったタイ国でのキュウリモザイクウイルス発生調査は、コンケン大学農学部の協力を得て平成14年9月に実施した。

トマト、バナナ、カボチャ、キュウリ、ヘチマ、スイカなどの各種ウリ科作物を中心にウイルス病様の症状を呈する株を採集して、農林水産省の輸入特別許可を得て輸入し、これを主としてELISA法によって病原の同定を行った。今回の採集では調査地の水害により予定していたトマトのウイルスはほとんど採集できなかったが、ウリ科については複数のウイルス株を分離し、その中に当初の目的であるキュウリモザイクウイルスも含まれていた。しかし、調査した範囲ではそれらの宿主域や病徴で特異な点は認められなかった。なお、合わせてタイ国で未報告のキュウリ緑斑モザイクウイルスを検出した。また、昨年度来継続しているインドネシア産同ウイルスについては、ジャワ島およびバリ島で主としてトマトから採集した合計50株以上の同ウイルスについて、とくに病徴の穏やかな分離株を選択してそれらの二本鎖RNAの解析からサテライトRNAを有する株の検出を行い、一部についてはインドネシアで接種試験を実施中である。一方、比較のために検討した壊疽症状のレースフラワーとモザイク症状株のコリウスのからは日本で未記録の同ウイルスの発生を認めたが、宿主域の特異性はなくいずれも血清型はIであった。これらの採集株の一部について、同ウイルスグループを検出しうるプライマーセットを用いた検出をおこなった。また一部についてCP領域の解析を進めたが、今後は変異の集積の可能性が高い領域に着目して塩基配列の解析を行う必要があることが理解された。昨年度の海外調査に引き続いて行ったインドネシア共和国でのキュウリモザイクウイルス発生調査は、ボゴール農科大学の協力を得て平成15年9月に実施した。トマト、バナナに加えカボチャ、キュウリ、ズッキーニなどの各種ウリ科についてウイルス病様の症状を呈する株を採集して、農林水産省の輸入特別許可を得て輸入し、これを主としてELISA法によって病原の同定を行った。今回の採集では、ボゴール農科大学のDr.G.Suastikaの協力によりキュウリモザイクウイルス感染トマト株の予備調査が行われ、共同してそのサテライトウイルスの分離と塩基配列の解明を行った。一方、ウリ科作物ではキュウリモザイクウイルスの検出例が少なく、逆に同国では未報告のズッキーニのTobamovirus属ウイルスを検出した。一昨年のフィリピン調査以来着目しているアバカ・キュウリモザイクウイルスについてはその塩基配列の一部の解析が終了した。また、国産CMVとしてあらたにヤブミョウガ、およびクワからキュウリモザイクウイルスの検出を行い、一部の塩基配列について解析した。今年度までの調査研究で、単子葉植物からのキュウリモザイクウイルス分離株が多く集積されたが、当初の目的である地域的な差異は認められなかった。しかし、分離株ごとに、既往の同ウイルスの分類型、血清型との関連を解析した。また、東南アジア諸国における同ウイルスの報告例について文献検討も行った。
三次元マルチスケール操作を用いたオンチップ限定空間における細胞計測

細胞の機能とその仕組みを解明するため,細胞が環境中の外部刺激に対してどう反応し,どう状態を変化させるのかを計測するためのシステムの基盤技術に関して研究を行った.(1)三次元レーザマニピュレーション:対象物を三次元空間で探索し,目標物を高速に操作するための三次元レーザマニピュレーションを実現した.従来のガルバノミラーの二次元走査に加えて,対物レンズを上下方向に駆動することで,レーザの焦点位置を三次元的に制御した.このとき,CCDカメラの撮影タイミングを対物レンズの駆動タイミングと連動することで,画面のブレをなくすことに成功した.(2)マイクロツールによる三次元操作:温度変化によってゾル・ゲル相転移をおこす熱ゲル化物質を用い,細胞の操作手法を確立した.脂質ナノチューブの三次元操作が可能となった.また,微細加工により製作したマイクロツールを用いた間接マニピュレーションにより,細胞などの搬送制御を行い,細胞操作における安定条件を実験により明らかにした.(3)オンチップ限定空間形成:マイクロチャネル内にフォトリソグラフィによってパタンニングした限定空間を形成し,その内部で細胞の特性を評価することが可能な実験系を構築した.光硬化性樹脂を用いてマイクロチャネル内に垂直半透膜を形成し,マイクロチャネル内に限定空間をその場形成した.また,オンチップpH計測センサを実現して,評価した.(4)三次元マルチスケール操作を用いたオンチップ限定空間における細胞計測:フォトリソグラフィ技術により,任意形状の流路を製作した.このチップを用いて,細胞の長距離搬送や三次元操作を行った.また,限定空間に細胞を搬送しオンチップ細胞分離・培養実験を行うための環境を構築し,オンチップ細胞分離・反応・培養実験を行った.細胞の機能とその仕組みを解明するため,細胞が環境中の外部刺激に対してどう反応し,どう状態を変化させるのかを計測するためのシステムの基盤技術に関して研究を行った.(1)三次元レーザマニピュレーション:対象物を三次元空間で探索し,目標物を高速に操作するための三次元レーザマニピュレーションを実現した.従来のガルバノミラーの二次元走査に加えて,対物レンズを上下方向に駆動することで,レーザの焦点位置を三次元的に制御した.このとき,CCDカメラの撮影タイミングを対物レンズの駆動タイミングと連動することで,画面のブレをなくすことに成功した.(2)マイクロツールによる三次元操作:温度変化によってゾル・ゲル相転移をおこす熱ゲル化物質を用い,細胞の操作手法を確立した.脂質ナノチューブの三次元操作が可能となった.また,微細加工により製作したマイクロツールを用いた間接マニピュレーションにより,細胞などの搬送制御を行い,細胞操作における安定条件を実験により明らかにした.(3)オンチップ限定空間形成:マイクロチャネル内にフォトリソグラフィによってパタンニングした限定空間を形成し,その内部で細胞の特性を評価することが可能な実験系を構築した.光硬化性樹脂を用いてマイクロチャネル内に垂直半透膜を形成し,マイクロチャネル内に限定空間をその場形成した.また,オンチップpH計測センサを実現して,評価した.(4)三次元マルチスケール操作を用いたオンチップ限定空間における細胞計測:フォトリソグラフィ技術により,任意形状の流路を製作した.このチップを用いて,細胞の長距離搬送や三次元操作を行った.また,限定空間に細胞を搬送しオンチップ細胞分離・培養実験を行うための環境を構築し,オンチップ細胞分離・反応・培養実験を行った.細胞の機能とその仕組みを解明するため,細胞が環境中の外部刺激に対してどう反応し,どう状態を変化させるのかを計測するためのシステムの基盤技術に関して研究を行った.以下に,研究項目ごとに研究実績をまとめる.1.三次元レーザマニピュレーション:三次元レーザマニピュレーションの制御系の設計と基礎実験を行った.対象物を三次元空間で探索し,目標物を高速で操作するための三次元レーザマニピュレーション技術の基礎を確立した.2.熱ゲルツールの三次元操作:温度変化によってゾル・ゲル相転移をおこす熱ゲル化物質を用い,三次元軌道制御手法を確立した.これを利用して,棒状のマイクロ構造物である脂質ナノチューブの姿勢制御に成功した.3.オンチップ限定空間形成:光硬化性樹脂を用いてマイクロチャネル内に垂直半透膜を形成し,マイクロチャネル内に限定空間をその場形成した.これにより,オンチップで限定空間をその場造形できるようになった.また,この空間内に外部から色素(コンゴレッド)や蛍光試薬(5(and 6)-carboxyfluorescein diacetate)を投入して限定空間内に浸透することを確認した.オンチップ限定空間にイースト菌を搬送できた.4.三次元マルチスケール操作を用いたオンチップ限定空間における細胞計測:三次元レーザ操作とバイオチップ内部の流体制御を組み合わせて,細胞の三次元操作を行った.また,限定空間に細胞を搬送しオンチップ細胞分離・培養実験を行い,細胞の変化を計測した.細胞の機能とその仕組みを解明するため,細胞が環境中の外部刺激に対してどう反応し,どう状態を変化させるのかを計測するためのシステムの基盤技術に関して研究を行った.主な研究項目を以下にまとめる.(1)三次元レーザマニピュレーション:対象物を三次元空間で探索し,目標物を高速に操作するための三次元レーザマニピュレーションを実現した.従来のガルバノミラーの二次元走査に加えて,対物レンズを上下方向に駆動することで,レーザの焦点位置を三次元的に制御した.このとき,CCDカメラの撮影タイミングを対物レンズの駆動タイミングと連動することで,画面のプレをなくすことに成功した.

(2)熱ゲルツールの三次元操作:温度変化によってゾル・ゲル相転移をおこす熱ゲル化物質を用い,三次元軌道制御手法を確立した.脂質ナノチューブの三次元操作が可能となった.(3)オンチップ限定空間形成:光硬化性樹脂を用いてマイクロチャネル内に垂直半透膜を形成し,マイクロチャネル内に限定空間をその場形成した.(4)三次元マルチスケール操作を用いたオンチップ限定空間における細胞計測:三次元レーザ操作とバイオチップ内部の流体制御を組み合わせて,mmスケールからnmスケールにわたるマルチスケール操作システムの基礎技術として,流路の作成を行った.フォトリソグラフィ技術により,任意形状の流路を製作した.シリコン基板をDRIEで加工して型にする方法と,厚膜レジストを露光して型にする方法が利用できる.型からPDMS(ポリマー)で流路をかたどり,ガラス基板を張り合わせることで流路を製作した.このチップを用いて,細胞の長距離搬送やサブセルラーレベルの三次元操作を行った.また,限定空間に細胞を搬送しオンチップ細胞分離・培養実験を行うための環境を構築した.細胞の機能とその仕組みを解明するため,細胞が環境中の外部刺激に対してどう反応し,どう状態を変化させるのかを計測するためのシステムの基盤技術に関して研究を行った.(1)三次元レーザマニピュレーション超高速レーザスキャニングにより,対象物を三次元空間で高速に操作するための三次元レーザマニピュレーションを改良し,制御システムの改善を行った.・三次元高速レーザ操作デバイスの改良:光学ユニットの改良を行った.・三次元レーザマニピュレーションの制御システムの改良を行った.・三次元レーザマニピュレーションの操作性の改善を行った.(2)マイクロツールを用いた間接レーザマニピュレーション微細加工により製作したマイクロツールを用いた間接マニピュレーションにより,細胞などの搬送制御を行い,細胞操作における安定条件を実験により明らかにした.・フォトリソグラフィによりマイクロツールを製作し,遠心分離により濃縮し,マイクロチップ内部で誘電泳動力により固定することで局所投入し,利用する方法を実現した.・レーザマニピュレーションを用いてマイクロツールのマルチスケール操作を行った.・レーザマニピュレーションによりマイクロツールを操作して,細胞の操作を行った.(3)オンチップ限定空間形成マイクロチャネル内にフォトリソグラフィによってパターンニングした限定空間を形成し,その内部で細胞の特性を評価することが可能な実験系を構築した.・バイオチップの基本設計・製作とオンチップ限定空間の形成を行った.・オンチップpH計測センサを実現して,評価した.・オンチップ細胞分離・反応・培養実験を行った.レーザによる細胞へのダメージを評価した.・オンチップ環境応答計測・評価実験を行い,有用性を確認した.
敗血症時のストレス応答に関する研究

ストレス応答に関与するメジエーターを転写因子レベルで調整することは、車症感染症に対する新たな治療戦略と考えられる。本研究の焦点を以下の3点に絞り実施した。1)重症感染症時の白血球核内NF-κBとステロイドレセプター(GR)の両バランスに基づいた治療戦略の確立。2)重症感染症時の白血球機能に関する研究。3)ストレス応答遺伝子の発現に関する研究。まず白血球核内NF-κBならびにGRの定量法をフローサイトメトリを用いて確立し、侵襲時の両者の関係について検討した。29例の外傷や敗血症の患者と15例の健常人でNF-κBならびにGRを測定した結果、患者群ではNF-κB値ならびにGRが有意に上昇していた。両転写因子には有意な正の相関を認めたが、特に侵襲後第3病日以降で著明であった。NF-κBの上昇に相まって炎症性サイトカインは上昇した。またGRの上昇に相まって血中コルチゾールは増加した。以上より侵襲には炎症を誘導する転写因子NF-κBの増加に対応して、抗炎症作用を誘導するGRが増加し、両者でバランスを保ちながら侵襲反応が進んでいることが明らかとなった。また敗血症時のG-CSF投与時、ならびに重症呼吸不全患者に対するステロイド投与時のNF-κBの発現とGR値の関係(バランス)について検討した。その結果、G-CSF投与ではNF-κBもGRもともにバランスを保った状態で上昇した。またステロイド投与時はGRが上昇し、反対にNF-κBは低下し炎症反応が抑制されることが明らかとなった。重症感染症時の白血球機能に関する研究では、白血球から産生される熱ショック蛋白やマイクロパーテイクルの機能について検討した。これらの産生がストレス下に増大し、侵襲に対して防御あるいは組織障害因子として機能していることを明らかにした。さらにストレス下における遺伝子発現についてNa/K ATPaseの発現やInsulin-like growthfactorなどの増殖因子の関与を明らかにした。重症感染症の新たなる治療戦略を確立するために、本研究の焦点を以下の3点に絞り実施している。1)重症感染症時の白血球核内NF-κBとステロイドレセプター(GR)の定量法の確立。2)NF-κBとGRバランスに基づいた治療戦略の確立。3)重症感染症時の応答遺伝子の発現に関する研究。感染症時のストレス応答にはサイトカインをはじめ、多くのメジエーターが関与する。最近これらの発現を遺伝子レベルで調節している転写因子が注目されている。なかでもNF-κBは、各種サイトカインや接着分子などの炎症や免疫応答にかかわる遺伝子の発現に関与し、炎症局所で活性化されていることが報告されている。一方、グルココルチコイドはIκBを誘導しNF-κBの核移行を阻害する。またNF-κBのDNAへの結合を抑制することが知られており、グルココルチコイドの抗炎症作用の一部はNF-κBの抑制によるものと考えられる。従って、ストレス応答に関与するメジエーターを転写因子レベルで調整することは、重症感染症に対する新たな治療戦略と考えられる。本年度はまず白血球核内NF-κBならびにGRの定量法をフローサイトメトリを用いて確立した。31例の外傷や敗血症の患者と24例の健常人でNF-κBを測定した結果、患者群ではNF-kB値が有意に上昇していた。同時に白血球の活性化の指標である活性酸素産生能も上昇しており、NF-κB値とは有意な正の相関を認めた。

以上より侵襲に伴い生じる炎症反応に白血球核内NF-κBが関与することが示唆された。現在NF-κBの発現とGR値の関係(バランス)について解析中である。動物実験では、腹腔内zymosan投与多臓器障害モデルを作成し、各臓器における遺伝子発現についてDNAチップを用いて解析した。その結果、多臓器不全の病態にInsulin-like growthfactorやC-kitなどの遺伝子が関与することが明らかとなった。現在引き続きこれらの遺伝子の機能解析を行っている。重症感染症の新たなる治療戦略を確立するために、本研究の焦点を以下の3点に絞り実施している。1)重症感染症時の白血球核内NF-κBとステロイドレセプター(GR)の定量法の確立。2)NF-κBとGRバランスに基づいた治療戦略の確立。3)重症感染症時の応答遺伝子の発現に関する研究。NF-κBは、各種サイトカインや接着分子などの炎症や免疫応答にかかわる遺伝子の発現に関与し、炎症局所で活性化されていることが報告されている。一方、グルココルチコイドはIκBを誘導しNF-κBの核移行を阻害する。またNF-κBのDNAへの結合を抑制することが知られており、グルココルチコイドの抗炎症作用の一部はNF-κBの抑制によるものと考えられる。従って、ストレス応答に関与するメジエーターを転写因子レベルで調整することは、重症感染症に対する新たな治療戦略と考えられる。昨年度は白血球核内NF-κBならびにGRの定量法をフローサイトメトリを用いて確立した。本年度は侵襲時の両者の関係について検討した。29例の外傷や敗血症の患者と15例の健常人でNF-κBならびにGRを測定した結果、患者群ではNF-κB値ならびにGRが有意に上昇していた。両転写因子には有意な正の相関を認めたが、特に侵襲後第3病日以降で著明であった。NF-κBの上昇に相まって炎症性サイトカインは上昇した。またGRの上昇に相まって血中コルチゾールは増加した。以上より侵襲には炎症を誘導する転写因子NF-κBの増加に対応して、抗炎症作用を誘導するGRが増加し、両者でバランスを保ちながら侵襲反応が進んでいることが明らかとなった。現在敗血症時のG-CSF投与時、ならびに重症呼吸不全患者に対するステロイド投与時のNF-κBの発現とGR値の関係(バランス)について解析中である。動物実験では多臓器障害モデルを作成し、各臓器における遺伝子発現についてInsulin-like growth factorなどのgrowth factorの関与を明らかにした。現在同モデルを用いて各臓器におけるgrowth factorの局在や機能解析を引き続き行っている。重症感染症の新たなる治療戦略を確立するために、本研究の焦点を以下の3点に絞り実施した。ストレス応答に関与するメジエーターを転写因子レベルで調整することは、重症感染症に対する新たな治療戦略と考えられる。
スフィンゴシン一リン酸を用いた骨培養効率化

本研究の目的は、間葉系幹細胞から骨形成する際に、細胞レベルでS1Pが具体的にどのように機能しているかを明らかにすることである。RT-PCRにより、ヒト間葉系幹細胞においてS1PR1受容体が発現されていることを明らかにした。S1P投与により間葉系幹細胞の細胞増殖が促進されることを確認した。また細胞遊走はS1Pの濃度依存性に促進された。間葉系幹細胞を骨芽細胞分化培地で培養し、培地にS1Pを添加した群、しない群を比較した。骨芽細胞への分化はS1Pを添加した群、添加しない群の間に差はなかった。骨欠損の再建に対し、幹細胞を用いた人工骨の作成が研究されつつある。しかしいまだ大きな骨組織を得るまでには至っておらず、より効率的な培養系の開発が必要である。骨代謝において、破骨細胞による骨吸収と、骨芽細胞による骨形成はそれぞれが独立して行われているのではなく、バランスを保つべく破骨細胞、骨芽細胞の双方がシグナルを出してクロストークを行っていることが示唆されている。その因子の一つとしてsphingosine 1-phosphate(以下S1P)に注目した。本研究の目的は、間葉系幹細胞から骨芽細胞が分化し、骨形成を行う過程におけるS1Pの機能と、そのシグナル伝達経路を解明すること、さらに骨培養へ応用することである。平成22年度は間葉系幹細胞におけるS1P受容体の発現をRNA、タンパクレベルでの解析を行った。また、S1Pは化学遊走因子としての機能を持ち、Tリンパ球などの細胞がS1Pの濃度勾配にしたがって移動することが知られているが、この機能が間葉系幹細胞に対しても働くか検証するため、S1P濃度が段階的に異なる培地を準備し、間葉系幹細胞のchemotaxisが濃度依存性になっているか確認する。さらに受容体の下流のシグナルを解析し、それぞれの受容体がどのような機能を担うか検討した。リンパ球など他の細胞においては、S1P受容体の下流にp43/44MAPキナーゼ、PI3K/Akt、Ras/ERK、NF-κBなどのシグナルがあり、これらを介して細胞の分化、増殖、アポトーシス抑制、細胞遊走などを生じることが知られている。これらの各シグナルの阻害剤を用い、間葉系幹細胞におけるS1P受容体の下流のシグナル伝達とそれぞれの受容体の機能を解析した。最近、破骨細胞がsphingosine1-phosphate(以下S1P)を放出し、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させ骨の再生を促すことを示唆する知見が得られた。過去にS1Pを骨培養に応用した報告はない。本研究期間内に、(1)間葉系幹細胞から骨形成する際に、細胞レベルでS1Pが具体的にどのように機能しているかを明らかにすること。(2)S1Pの生体内での骨形成にどのように機能するかin vivoで解析すること(3)S1Pを使用し、より効率的に大量の骨組織の培養を行う系を確立することを目標とする。本年度は昨年度の分子生物学的検討をさらに進め、S1Pの具体的な機能が何であるか検討することを目的とし研究を行った。具体的には間葉系幹細胞にS1P受容体S1P1-S1P5のどのサブタイプが発現しているかウエスタンブロットで確認した。またS1Pが間葉系幹細胞の増殖を促進することをMTTアッセイにて解析した。さらにS1Pが間葉系細胞の遊走を促進するか、また骨芽細胞への分化を促し、骨芽細胞マーカーを発現させるかを解析した。並行してアルカリフォスファターゼの生成、石灰化の有無を特殊染色にて検討を行っている。また骨分化を促すうえでの条件の最適化を目指して、各種の条件を変えて実験を行っている。スフィンゴシン1リン酸(以下S1P)の受容体発現の解析:S1Pの受容体にはS1PR1-5の5種類あることが知られており、RT-PCR,ウエスタンブロット法により、ヒト間葉系幹細胞においてS1PR1が発現されていることを前年度までに明らかにした。今年度はS1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5の5種類の受容体に対し、RT-PCR,ウエスタンブロット法にて検出を試みたがいずれも検出されなかった。

S1P受容体の下流のシグナル伝達の解析:昨年までにS1P投与により間葉系幹細胞の細胞増殖が促進されることを確認しているが、S1P受容体の下流のシグナル伝達を解析した。まずp43/44MAPK経路について、選択的MEK阻害剤U-0126、PIK3/Akt経路について選択的PI3K阻害剤wortmanninを添加してS1Pによる細胞増殖作用が抑制されるかを解析した。いずれの阻害剤でも細胞増殖抑制機能は明らかでなかった。S1Pは間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を促進するか:間葉系幹細胞を細胞懸濁液とし、デキザメサゾン・グリセロリン酸・ビタミンCを含んだ骨芽細胞分化培地で培養した。培地にS1Pを添加した群、しない群を比較した。骨芽細胞への分化は石灰化染色、アルカリフォスファターゼ染色で確認した。S1Pを添加した群、添加しない群の間で染色の結果に差はなかった。S1Pによる間葉系幹細胞の遺伝子発現の網羅的解析:S1Pを添加した培地と添加しない培地で間葉系幹細胞を48時間培養し、それぞれの細胞からtotal RNAを採取しDNAマイクロアレイによる網羅的解析を行った。現在データ解析を行っている。予備実験ではデータにややばらつきがあったものの、実験を繰り返すことで良いデータが得られた。また実験手技も習熟し、効率的に実験が進められている。その結果、本年度までの目標であった細胞レベルでの実験はほぼ完了しつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の方針として間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を効率化させることを目標とし条件の最適化を図る。その後、S1Pを阻害することによるin vivoでの影響を検討する。具体的にはマウスにS1P阻害剤を全身投与し、骨組織に対する影響について考察する。骨組織の解析には高分化能マイクロフォーカスX線CTスキャナーを用いて骨構造解析を行う。さらにSingle-Energy Xray Absorptiometry(SXA)法により骨密度測定を行う。さらにマウスの頭蓋骨欠損モデルを作成し、骨欠損部へ培養骨を移植し、骨形成が促進されるか検討する予定である。