hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝発癌過程におけるアポトーシスとオートファジーの統合解析と新規治療法の開発

肝細胞株にパルミチン酸を投与するとRubiconの発現上昇を伴うオートファジー抑制を認めた。Rubiconを抑制するとパルミチン酸投与によるアポトーシスと脂肪蓄積は軽減した。Rubiconの発現増加はパルミチン酸投与によるRubiconの分解抑制が生じることによるものであった。高脂肪食摂取マウスにおいてもRubiconの発現増加を伴うオートファジーの亢進を認めた。肝細胞特異的Rubicon欠損マウスでは高脂肪食によるオートファジー抑制が改善し、肝脂肪化とアポトーシスが抑制された。ヒトの脂肪肝検体においてもRubiconの発現増加が確認された。肝細胞株にパルミチン酸(PA)を投与すると、LC3-II及びP62蛋白の蓄積を認め、PAはオートファジー後期段階を抑制した。オートファゴソームとライソゾームの融合を負に制御するRubiconの蛋白量は増加した。またPA投与によりIRE1-JNK及びPERK-CHOP経路を含む小胞体(ER)ストレス蛋白の活性化を伴ってCaspase-3/7活性は上昇し、アポトーシスが誘導された。PA投与時にAtg7を抑制しオートファジーを強力に抑制するとアポトーシスは亢進した。更に、PA投与時にRubiconを抑制するとオートファジーの抑制は解除され、ERストレス蛋白活性化及びアポトーシスは抑制された。野生型(WT)マウスに高脂肪食を投与すると、1ヶ月後から肝臓でRubicon発現増加を伴うオートファジー抑制を認めた。また、3ヶ月以降でERストレス蛋白活性化、肝細胞アポトーシス亢進及びALT値の上昇を認めた。高脂肪食を1ヶ月摂取させた遺伝子改変マウスに薬剤誘導にてAtg7遺伝子を欠損させオートファジーを抑制すると、肝細胞アポトーシスは亢進し、肝障害が増悪した。また、肝細胞特異的Rubicon欠損マウスを作成し高脂肪食を投与すると、4ヶ月の時点でも同腹のWTマウスに比して肝脂肪滴蓄積は減少しており、肝臓におけるオートファジー抑制及び小胞体ストレス応答は軽減し、肝細胞アポトーシスは抑制され、血清ALT値は有意に低下した。以上より、過剰脂肪酸はRubicon発現を増加させてオートファジーを抑制し、ERストレス応答活性化を介して肝細胞アポトーシスを誘導した。脂肪酸の負荷に伴って上昇するRubiconによって、オートファジーが抑制され、非アルコール性脂肪肝炎の病態進展に寄与すると考えられた。昨年度までに、過剰脂肪酸はRubicon発現を増加させてオートファジーを抑制し、ERストレス応答活性化を介して肝細胞アポトーシスを誘導することを明らかにしている。そこで平成27年度は主にRubiconの発現上昇機構に着目して検討を行った。肝細胞株にパルミチン酸(PA)を投与すると、Rubiconの発現上昇を介してオートファジーが抑制された。PAを投与してもmRNAレベルでは変化なく、Halo-Tagを用いたパルス・チェイスアッセイにて分解が遅延していることから、PA投与によるRubiconの上昇は分解遅延に依存していると考えられた。また、PA投与によりWBによるRubiconのバンドは上方にシフトした。このシフトはλPPaseを投与すると認められなくなったことから、PA投与によるRubiconのバンドシフトにはリン酸化が関与しており、このリン酸化が分解遅延に影響している可能性が示唆された。野生型(WT)マウスに高脂肪食を投与しても、1ヶ月後から肝臓でRubicon発現増加を伴うオートファジー抑制を認めた。また、in vitroの実験結果と同様にRubiconは転写レベルで上昇は認めず、分解遅延によるものと考えられた。B型慢性肝炎及びC型慢性肝炎、アルコール性肝障害患者を除いたヒト肝臓切除検体を用いて、Rubiconの発現について検討した。HE染色にて5%以上の脂肪化が認められたサンプルを脂肪肝サンプルとして扱った。RubiconのWBでの発現レベルは、脂肪肝で増強しており、ヒトにおいても非アルコール性脂肪性肝疾患におけるRubiconの発現上昇を確認した。過剰脂肪酸によるRubiconの発現上昇機構に、リン酸化が関与している可能性が解明された。また、ヒトでも脂肪肝ではRubiconが上昇していることが確認できた。非アルコール性脂肪性肝疾患から非アルコール性脂肪肝炎への進展にRubiconの発現上昇によるオートファジー抑制が関与していることが示唆された。脂肪肝から脂肪肝炎への進展を抑制する治療標的にもなり得ることから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度はまず、マウスから採取した初代培養肝細胞に対するPA投与を行い、本細胞においてもRuicon蛋白発現増加を伴うオートファジー抑制が生じることを確認した。次に、肝細胞特異的Rubicon欠損マウスに高脂肪食摂取をさせた際の脂肪滴蓄積軽減の機序を検討した。Rubicon欠損マウスはコントロールと比較して、脂肪酸トランスポーター、脂質合成酵素、脂質輸送、β酸化に関わる遺伝子発現には差を認めなかった。そこで肝組織の電子顕微鏡像を詳細に検討したところ、脂肪滴周囲を多数のオートファゴソームが取り囲み脂肪滴を分解する像が観察され、オートファジー亢進に伴う脂肪滴分解が生じている可能性が示唆された。また、本マウスは高脂肪食摂取により肝重量が低下する一方で内臓脂肪重量が有意に増加しており、肝臓において分解された脂肪滴内の脂質が肝外に放出され内臓脂肪蓄積に至っている可能性が示唆された。次に、PAによるRubiconの分解遅延機序につき検討した。まず肝細胞株にPAを投与した際のプロテオソーム活性を測定したところ、有意に減少していることがわかった。

そこでプロテオソーム阻害剤であるMG132を肝細胞株に投与してRubicon蛋白の発現を見たところ時間依存的に発現増加を認めたが、PA投与時にはMG132を投与してもRubiconの増加が見られなかった。高脂肪食摂取マウスにおけるプロテオソーム活性も有意に抑制されていた。また、コントロールマウスではMG132によりRubiconの発現増加が見られたのに対し、高脂肪食群では増加が見られなかった。以上の結果から、Rubicon蛋白はプロテオソームによる分解を受けており、過剰脂肪酸がプロテオソーム活性を阻害することによりRubiconの蓄積増加の要因となっている可能性が示唆された。肝細胞特異的Rubicon欠損マウスは高脂肪食摂取時にオートファジーによる肝内の脂肪滴分解を促進していることが解明された。また、高脂肪食摂取時のRubicon増加には脂肪酸によるプロテオソーム分解活性低下が関わっていることが判明した。脂肪肝に対する新規治療標的としての有用性を示しており、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。高脂肪食負荷時には肝細胞のRubiconの発現は増加し、オートファジーは抑制されるが、このRubiconの発現増加が脂肪性肝疾患の病態に与える影響を検討した。肝細胞特異的Rubicon欠損マウスを作成し、高脂肪食摂取をさせて接取4ケ月後に解析を行った。肝細胞特異的Rubicon欠損マウスは同腹コントロールの野生型マウスと比較して、肝細胞内脂肪滴蓄積量の低下、肝内中性脂肪量の低下、肝重量の減少、TUNEL陽性肝細胞数の減少、血清ALT値の低下を認めた。さらに、col1a2発現も有意に低下した。高脂肪食負荷による肝細胞のRubicon発現増加は、肝脂肪蓄積および肝障害の増悪、肝線維化進展に寄与している可能性が示唆された。肝細胞に対してパルミチン酸を投与することによりRubiconの発現は増加するが、オートファジーは抑制される。このパルミチン酸投与によるRubicon増加が、インスリン感受性に与える影響を検討した。パルミチン酸投与および非投与のHepG2細胞に、インスリンを添加し、リン酸化Akt発現の変化を検討した。インスリン投与により増加するリン酸化Akt発現はパルミチン酸投与により減弱した。一方、高脂肪食摂取時の肝細胞特異的Rubicon欠損マウスでは明らかな耐糖能の改善は確認されなかった。パルミチン酸投与による肝細胞におけるRubicon増加がインスリン感受性に与える影響は、生体内では限定的であると考えられた。肝細胞株にパルミチン酸を投与するとRubiconの発現上昇を伴うオートファジー抑制を認めた。Rubiconを抑制するとパルミチン酸投与によるアポトーシスと脂肪蓄積は軽減した。Rubiconの発現増加はパルミチン酸投与によるRubiconの分解抑制が生じることによるものであった。高脂肪食摂取マウスにおいてもRubiconの発現増加を伴うオートファジーの亢進を認めた。肝細胞特異的Rubicon
ジオキシランによる立体選択的エポキシ化反応および不斉エポキシ化反応の開発

酸化剤potassium peroxomonosulfate(KHSO_5)は、アセトンの存在下、ジメチルジオキシランを中間体としてオレフィンをエポキシ化する。この反応においてアセトン以外のケトンを用いれば立体選択的なエポキシ化を行うことが出来ると考えられる。しかし、アセトン以外のケトンを用いたエポキシ化の報告は少なく、ケトンの構造とエポキシ化の関係については不明な点が多い、そこでこの点を明らかにし、立体選択的なエポキシ化を検討した。以下、研究成果を示す。(1)種々の構造のケトンより生成するジオキシランの構造と反応性の関係を明らかにする。通常の条件である中性条件では、立体障害のあるケトンではジオキシランによるエポキシ化が進行しにくいことがわかった。そこで、様々な構造のケトンより生成するジオキシランが効率良くオレフィンをエポキシ化する反応条件の検討を行なった。その結果、ケトンとKHSO_5(OXONE)とを用いて、相関移動触媒存在下、塩化メチレン-メタノール-緩衝液系溶媒、pH11の条件で、ジオキシランを生成させると、種々の構造のケトン由来のジオキシランでオレフィンのエポキシ化が効率的に進行することを見いだした。(2)オレフィンの立体選択的エポキシ化を検討する。2位、6位に置換基を有するシクロヘキサノン由来のジオキシランを用いて、立体選択的エポキシ化を検討した。オレフィンとしては、シクロヘキサノール類、シクロヘキセン類を用いた。その結果、上記の条件でエポキシ化を行ったところ、シクロヘキセノール、1.3-ジメチルシクロヘキセン等で高いトランス選択性でエポキシ化が達成することを見いだした。また、嵩高いケトンほどよい選択性を示すことが明かとなった。
肝臓の特定部位への薬物送達を目的とした肝臓組織表面への直接投与に関する基礎的研究

肝臓へ直接もしくはその近傍へ投与する方法は、肝臓内局所へ薬物を浸透できると考えられるため、有用性が高いと思われるが、報告例がない。そこで、新規投与形態の開発の一環として、有機アニオン系薬物であるphenol red、bromphenol blue、bromosulphonphthaleinをモデル薬物として選び、まずin vivoの実験解析系を確立し、さらに肝臓表面へ投与した場合のモデル薬物の肝臓移行動態を速度論的に解析した。Pentobarbital麻酔下(50mg/kg,i.p.)、Wistar系雄性ラット(250g)の肝臓表面(左葉)に円筒状のガラスセル(半径:4.5mm,7mm)を外科用アロンアルファを用いて装着した。緩衝液(pH7.4)に溶解させた薬物(330mg/ml X 0.1ml)をセル内に投与し、経時的に血液および胆汁を採取した。投与6時間後、膀胱より尿を採取し、さらにセル内に残存する薬液を回収した。薬物の定量は吸光度法により行った。半径4.5mmのガラスセルを用いてラットの肝臓表面へ投与したところ、いずれのモデル薬物も投与量の50%以上が6時間の実験終了時までの肝臓表面から吸収され、血中への出現および胆汁中への高率な排泄が観察された。また、これらの血漿中濃度曲線および胆汁排泄速度曲線は薬物間で大きく異なり、静脈内投与時と比較してかなり後ろへずれたような形となった。さらに、肝臓表面からの吸収率が投与に用いるセルの面積に大きく依存していることから、肝臓表面からの薬物吸収が確認された。このように肝臓表面からの薬物吸収性が比較的良好であること、そして投与部位近傍における薬物濃度の持続化が期待できることから、肝臓内特定部位への薬物の集積を目指した新規投与法として有用であると思われる。
地域型高精度測位インフラストラクチャの構築

これまでに(a1)(b2)については概ね成果が出ているため,本年度は「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」および「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」を中心に研究を進めた.「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」について,基準局と移動局の受信信号強度の差を考慮した使用衛星の取捨選択アルゴリズムなどについての検証を行った.草の根の基準局網や様々な移動局デバイスなどが登場するとそれぞれの受信局の性能にばらつきがある.そのような場合でも安定した測位ができるような考慮を入れた.この結果は昨年度に提出した特許に追加して出願した.上記の成果では測位衛星が可視であるか障害物に遮られているかの判断も可能となる.これを利用することで「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」に応用できる.ここでは,既存の航空測量により得られた3次元建物地図を国土交通省の河川事務所から提供を受けてそれをベースにし,測位端末からのフィードバック情報から3次元建物地図のアップデートを行った.使用した航空測量データは10年程度前のものであり,現在の建物との相違があったが,信号強度によりその存在を更新できることが確認できた.「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」については,昨年度までの高精度測位演算結果の得やすさを求めるアルゴリズムを更新し,これまでは6段階の指標の値と実際の高精度測位結果の得られやすさに不整合が起きることがあったが,本年度の成果により不整合をなくすことができた.これらの研究成果については,技術雑誌に1件,国際会議録に1件,国内研究会録に4件採録され,国際会議での招待講演1件,口頭発表2件を行った.予定していた分の「(a1)ユーザ側の高精度衛星測位端末の測位状況フィードバック機能」「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」は完了し,(a2)についてはさらなる検討を進めている.「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」については昨年度は遅れ気味であったが,本年度では順調に手法の構成が完了し,検証も進んできている.「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」についても順調に推移している.以上より,総合的に順調と判断する.申請書の計画から大きく外れるような内容はない.以下の申請書の内容に沿って計画を遂行していく.今年度は「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」について,非可視衛星選別アルゴリズムのブラッシュアップとそれを利用してより安定した高精度測位を実現する測位アルゴリズムのブラッシュアップを行う.「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」については(a1)で得られたフィードバック情報を元にした3次元地図の構成を実データを用いて検証する.本年度は「(a1)ユーザ側の高精度衛星測位端末」を設計・製作した.研究計画では,計測値は機器ローカルへの保存としていたが,翌年度以降の内容を先取りし,得られるデータを携帯電話網を通じてクラウド側に集約するシステムを試作した.これに関連する内容については特許を1件出願した.また,このシステムを使って倒立振子型二輪車の位置を計測した観光社会実験,また,学園祭イベント等で人間の位置を計測した実験については,技術雑誌への寄稿3編,および,国内研究会予稿へ2件投稿し発表した.また,(b1)「フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」について,フィードバックされた情報から受信機近くの測位障害物3D地図を作成するところまで実現したかったが,そちらについてはまだ未実装である.ただし,受信機が得た情報から測位を予測する「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予測情報の生成」の一部として,計測値と実際の高精度測位演算結果の得やすさの関連について解析した.その結果については国内研究会予稿ね2件投稿した発表した.予定していた(a1)ユーザ側の高精度衛星測位端末は完了した.来年度以降に予定していた携帯電話網を通じたクラウドへの情報収集も実現できたため,この部分については予定より早く進行している.予定していた(b1)「フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」については手法の設計がまだ十分ではない.しかし,(b2)「対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」については一部を先に解析できているので,ここはトータルとして順調と判断する.研究分担者での大型機材の納入が,仕入れ先の問題により年度末にずれ込んだため,今年度はその機材を利用した実験検証ができていない.ただし研究期間全体としては遅れは軽微であると考える.以上より,総合的に順調と判断する.これまでに(a1)(b2)については概ね成果が出ているため,本年度は「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」および「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」を中心に研究を進めた.「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」について,基準局と移動局の受信信号強度の差を考慮した使用衛星の取捨選択アルゴリズムなどについての検証を行った.草の根の基準局網や様々な移動局デバイスなどが登場するとそれぞれの受信局の性能にばらつきがある.

そのような場合でも安定した測位ができるような考慮を入れた.この結果は昨年度に提出した特許に追加して出願した.上記の成果では測位衛星が可視であるか障害物に遮られているかの判断も可能となる.これを利用することで「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」に応用できる.ここでは,既存の航空測量により得られた3次元建物地図を国土交通省の河川事務所から提供を受けてそれをベースにし,測位端末からのフィードバック情報から3次元建物地図のアップデートを行った.使用した航空測量データは10年程度前のものであり,現在の建物との相違があったが,信号強度によりその存在を更新できることが確認できた.「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」については,昨年度までの高精度測位演算結果の得やすさを求めるアルゴリズムを更新し,これまでは6段階の指標の値と実際の高精度測位結果の得られやすさに不整合が起きることがあったが,本年度の成果により不整合をなくすことができた.これらの研究成果については,技術雑誌に1件,国際会議録に1件,国内研究会録に4件採録され,国際会議での招待講演1件,口頭発表2件を行った.予定していた分の「(a1)ユーザ側の高精度衛星測位端末の測位状況フィードバック機能」「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」は完了し,(a2)についてはさらなる検討を進めている.「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」については昨年度は遅れ気味であったが,本年度では順調に手法の構成が完了し,検証も進んできている.「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」についても順調に推移している.以上より,総合的に順調と判断する.申請書の計画から大きく外れるような内容はない.(a)ユーザ側高精度測位端末の開発について,(a1)測位状況フィードバック機能の実装,(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズムの考案,および(b)地域型次世代高精度測位環境の構築についての(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成について,申請書の内容に沿って計画を遂行していく.申請書の計画から大きく外れるような内容はない.以下の申請書の内容に沿って計画を遂行していく.今年度は「(a2)追加補正情報を利用した高精度測位アルゴリズム」について,非可視衛星選別アルゴリズムのブラッシュアップとそれを利用してより安定した高精度測位を実現する測位アルゴリズムのブラッシュアップを行う.「(b1)フィードバック情報からの測位障害物3次元地図の生成」「(b2)対象地域の追加補正情報・測位精度予報情報の生成」については(a1)で得られたフィードバック情報を元にした3次元地図の構成を実データを用いて検証する.
環状ビームを用いたレーザー誘起収束圧力波による遺伝子導入法の開発

本研究の目的は,単一の生細胞への安全で高効率な外部遺伝子導入法の開発である.その目的を実現するために,時間・空間制御性が高く,非接触で安全に遺伝子導入を行えるレーザを用いた手法を検討した.特に,環状のビームパターンを有するレーザー照射により誘起される収束圧力波を用いることで,従来と比べて高効率な遺伝子導入手法の開発を目指した.環状ビームの生成には,計算機ホログラムを用いたビーム整形技術を用いた.計算機ホログラムは,環状ビームの径や焦点位置を任意に調節することを可能にした.また,設計した計算機ホログラムの実験系への実装のし易さを考慮して,空間光変調素子を用いた.計算機に接続された空間光変調素子上の計算機ホログラムは,容易に書き換え可能であるため実験の効率化に寄与した.実験を進める中で,環状ビームの周囲に現れる不要なサイドローブが問題となった.そのサイドローブは,集光されたレーザービーム強度の空間的な密度を低下させるため,レーザー誘起衝撃波による機械的な応力の低下を引き起こす要因となった.その問題を解決するために,サイドローブが抑制された環状ビームを生成する計算ホログラムの設計手法を新たに開発した.その手法は,計算機ホログラムを構成するバイナリ格子の位相シフトにもとづいた.環状ビームのサイドローブの低減について,提案手法の有効性を有機薄膜フィルムのフェムト秒レーザー加工の効率化により,実験的に実証した.環状ビームにより生成された収束衝撃波を生細胞に確実に作用させるためには,レーザー照射前に細胞の表面位置を予め知っておく必要がある.このことは,安全で正確な遺伝子導入につながる.細胞の表面位置を検出するために,レーザー照射系にレーザー共焦点顕微鏡から構成される表面位置検出のための光学系を導入した.実験結果より,昆虫の培養細胞(Sf9)の表面位置を検出できることを確認した.初年度の研究計画において,環状ビームの設計や光計測系の構築に関して,おおむね順調に進捗している.一方で,細胞培養の環境構築に関して,遺伝子組み替え実験の申請や,培養細胞を安全に扱うための実験室の整備を含む事前準備により,当初の計画よりも後ろにずれ込んだ.そのため現状では,培養細胞を保管できる環境は整っているが,培養細胞を準備する環境は整っていないため,宇都宮大学農学部の協力により実験サンプルを提供頂いている.上記のように計画に一部遅れが出ているが,培養細胞に対して表面位置を検出し,環状ビームを照射するための基本的な実験系は構築できた.前年度末に引き続き,細胞培養のための環境構築を行うことで,実験サンプルを簡便で素早く準備できるようにする.このことは,2年目の研究計画にある遺伝子導入を効率化するレーザー照射パラメーター(光エネルギー,パルス幅,収束応力波の焦点位置)の探索の様な繰り返し実験に必須となる.また,音響センサープローブを用いた収束応力波の強度の定量評価や遺伝子導入効率を指標として,そのレーザー照射パラーメーターの探索にフィードバックする.遺伝子導入効率の具体的な評価について,標的細胞への外部遺伝子の導入の有無を可視化するために,緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子をコードしたプラスミドDNAを用いる.導入が成功すれば,細胞が緑色に蛍光発色する.また,レーザー照射による細胞生存の有無を可視化するために,核染色液を用いる.核染色液は,生細胞の細胞膜は透過せず死細胞にのみ入り込み赤色に蛍光発色する.これらの蛍光試薬を用いた可視化技術により,遺伝子導入効率と細胞生存率を評価し,従来の単一集光ビームを用いた手法と比較する.本研究の目的は,単一の生細胞への安全で高効率な外部遺伝子導入法の開発である.その目的を実現するために,時間・空間制御性が高く,非接触で安全に遺伝子導入を行えるレーザを用いた手法を検討した.特に,環状のビームパターンを有するレーザー照射により誘起される収束圧力波を用いることで,従来と比べて高効率な遺伝子導入手法の開発を目指した.環状ビームの生成には,計算機ホログラムを用いたビーム整形技術を用いた.計算機ホログラムは,環状ビームの径や焦点位置を任意に調節することを可能にした.また,設計した計算機ホログラムの実験系への実装のし易さを考慮して,空間光変調素子を用いた.計算機に接続された空間光変調素子上の計算機ホログラムは,容易に書き換え可能であるため実験の効率化に寄与した.実験を進める中で,環状ビームの周囲に現れる不要なサイドローブが問題となった.そのサイドローブは,集光されたレーザービーム強度の空間的な密度を低下させるため,レーザー誘起衝撃波による機械的な応力の低下を引き起こす要因となった.その問題を解決するために,サイドローブが抑制された環状ビームを生成する計算ホログラムの設計手法を新たに開発した.その手法は,計算機ホログラムを構成するバイナリ格子の位相シフトにもとづいた.環状ビームのサイドローブの低減について,提案手法の有効性を有機薄膜フィルムのフェムト秒レーザー加工の効率化により,実験的に実証した.環状ビームにより生成された収束衝撃波を生細胞に確実に作用させるためには,レーザー照射前に細胞の表面位置を予め知っておく必要がある.このことは,安全で正確な遺伝子導入につながる.細胞の表面位置を検出するために,レーザー照射系にレーザー共焦点顕微鏡から構成される表面位置検出のための光学系を導入した.実験結果より,昆虫の培養細胞(Sf9)の表面位置を検出できることを確認した.初年度の研究計画において,環状ビームの設計や光計測系の構築に関して,おおむね順調に進捗している.

一方で,細胞培養の環境構築に関して,遺伝子組み替え実験の申請や,培養細胞を安全に扱うための実験室の整備を含む事前準備により,当初の計画よりも後ろにずれ込んだ.そのため現状では,培養細胞を保管できる環境は整っているが,培養細胞を準備する環境は整っていないため,宇都宮大学農学部の協力により実験サンプルを提供頂いている.上記のように計画に一部遅れが出ているが,培養細胞に対して表面位置を検出し,環状ビームを照射するための基本的な実験系は構築できた.前年度末に引き続き,細胞培養のための環境構築を行うことで,実験サンプルを簡便で素早く準備できるようにする.このことは,2年目の研究計画にある遺伝子導入を効率化するレーザー照射パラメーター(光エネルギー,パルス幅,収束応力波の焦点位置)の探索の様な繰り返し実験に必須となる.また,音響センサープローブを用いた収束応力波の強度の定量評価や遺伝子導入効率を指標として,そのレーザー照射パラーメーターの探索にフィードバックする.遺伝子導入効率の具体的な評価について,標的細胞への外部遺伝子の導入の有無を可視化するために,緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子をコードしたプラスミドDNAを用いる.導入が成功すれば,細胞が緑色に蛍光発色する.また,レーザー照射による細胞生存の有無を可視化するために,核染色液を用いる.核染色液は,生細胞の細胞膜は透過せず死細胞にのみ入り込み赤色に蛍光発色する.これらの蛍光試薬を用いた可視化技術により,遺伝子導入効率と細胞生存率を評価し,従来の単一集光ビームを用いた手法と比較する.
スマートアンテナを利用するアドホックネットワーク通信プロトコルに関する研究

近年ユビキタス情報通信のための基盤技術として,無線端末だけで構築されるアドホックネットワークが注目されている.電子制御によりアンテナの指向性制御が可能なスマートアンテナを利用することでネットワークの性能を向上させることが期待されているが,そのためには様々の課題の解決が必要である.また,端末間でマルチホッフルートの構築・維持を行うルーチングプロトコルが必要である.本研究の目的は,アドホックネットワークにおいてスマートアンテナを利用メディアアクセス制御プロトコル(以降,指向性MACプロトコル)およびルーチングプロトコルの諸問題を解決し,ネットワーク全体の性能を向上することである.具体的には以下の2つの研究課題に取り組んだ.1.指向性MACプロトコルの問題の解決及びの性能評価2.スマートアンテナを利用するルーチングプロトコルの提案及びその性能評価本年度は研究課題1に関して,指向性MACプロトコル後論解析を行った.これまで指向性MACプロトコルの評価には主にシミュレーションが用いられており,数学的な解析による評価はほとんどなされていなたった.報告者はまず,無線LANのモデルでの指向性MACプロトコルの理論解析を行った.そして,従来の解析では考慮されていなかったdeafness問題がスループット性能を低下させることを示した.つぎに,マルチホップのモデルで理論解析を行った.まず,スマートアンテナを利用することによる同時通信数の増加の効果を解析した.これを基にマルチホップアドホックネットワークにおける指向性MACプロトコルのスループット性能を解析可能な階段である.研究課題2に対して,スマートアンテナを利用することでネットワークの負荷を分散させる方式を提案した.シミュレーションによる性能評価を行い,従来方式と比較してパケット到達率が最大300%改善することを示した.近年,ユビキタス情報通信のための基盤技術として,無線端末だけで構築されるアドホックネットワークが注目されている.従来の無指向性アンテナを利用するメディアアクセス制御(MAC)プロトコルでは,共有媒体を効率的に利用できない問題がある.一方,電子制御によりアンテナの指向性制御が可能なスマートアンテナを利用することで共有媒体を効率的に利用することが期待できるが,そのためには様々の課題の解決が必要である.報告者は,これまでにスマートアンテナを利用する指向性MACプロトコルの課題を明らかにし、それらがネットワークの性能に与える影響を考察している.本年度は,指向性MACプロトコルにおいて大きなネットワーク性能の劣化をもたらすdeafness問題の解決を行った.Deafness問題とは,指向性で特定の方向のみで送受信が行われるために,通信相手がビジーであるかアイドルであるかを判断できないために生じる問題である.そのため,無駄な再送によるチャネルの浪費の問題を引き起こす.この問題に対して,これから行う通信を近隣の端末へ知らせることでdeafness問題を解決するDMAC/DA (Directional MAC with Deafness Avoidance), deafnessの状態にある端末に対してポーリングを行うRI-DMAC (Receiver-Initiated Directional MAC)の2つの解決法を提案した.これらのプロトコルのシミュレーションによる性能評価を行い,既存方式と比較して低オーバヘッドでdeafness問題を解決できることによる提案プロトコルの有効性を示した.さらに,これらの適用領域を示した.また,指向性MACプロトコルの理論解析による評価を行うための基礎検討を進めた.近年ユビキタス情報通信のための基盤技術として,無線端末だけで構築されるアドホックネットワークが注目されている.電子制御によりアンテナの指向性制御が可能なスマートアンテナを利用することでネットワークの性能を向上させることが期待されているが,そのためには様々の課題の解決が必要である.また,端末間でマルチホッフルートの構築・維持を行うルーチングプロトコルが必要である.本研究の目的は,アドホックネットワークにおいてスマートアンテナを利用メディアアクセス制御プロトコル(以降,指向性MACプロトコル)およびルーチングプロトコルの諸問題を解決し,ネットワーク全体の性能を向上することである.具体的には以下の2つの研究課題に取り組んだ.1.指向性MACプロトコルの問題の解決及びの性能評価2.スマートアンテナを利用するルーチングプロトコルの提案及びその性能評価本年度は研究課題1に関して,指向性MACプロトコル後論解析を行った.これまで指向性MACプロトコルの評価には主にシミュレーションが用いられており,数学的な解析による評価はほとんどなされていなたった.報告者はまず,無線LANのモデルでの指向性MACプロトコルの理論解析を行った.そして,従来の解析では考慮されていなかったdeafness問題がスループット性能を低下させることを示した.つぎに,マルチホップのモデルで理論解析を行った.まず,スマートアンテナを利用することによる同時通信数の増加の効果を解析した.これを基にマルチホップアドホックネットワークにおける指向性MACプロトコルのスループット性能を解析可能な階段である.研究課題2に対して,スマートアンテナを利用することでネットワークの負荷を分散させる方式を提案した.シミュレーションによる性能評価を行い,従来方式と比較してパケット到達率が最大300%改善することを示した.
生命起源必須分子の鉱物への吸着挙動を網羅的に解明する

『吸着』とは地球表層における元素の循環を支配する最も重要な化学プロセスの一つである.しかし,この現象に与える環境因子は体系的に理解されておらず,元素の動的挙動を扱う地球化学モデルには一般的に考慮されていない.本研究では先端的吸着理論であるExtende Tryple Layer Model (ETLM)を利用し,生命活動に関わりの深い無機元素(硫酸,リン酸,炭酸など)の吸着挙動を,全ての酸化鉱物,幅広い水質条件において予測可能とするパラメータの導出を目指している.これら元素の水環境における分配が定量的に予測できるようになることで,地球上の生命はどこで・どのように誕生したのか,という根源的問いに対し,より実証的な観点から解に迫ることが可能となる.これまでの取り組みにより,まず硫酸の吸着挙動の予測モデルが国際誌に掲載された(Kitadai et al. (2018) Geochim Cosmochim Acta).その他の無機イオン(リン酸や炭酸)についても吸着実験データを収集し,また関連する文献データを取りまとめ,全ての結果を包括的に説明するモデルの作成を行った.現在は投稿論文の準備を進めているところである.また,硫化水素については,硫化金属(FeSやNiS)に吸着することで容易に酸化還元反応を起こし,同時に吸着している炭素化合物の還元・縮合などの化学反応を促進することが見出されてきている.この成果は当初予想していなかったものであり,地球環境問題など,新たな学術分野へ発展できる可能性がある.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。『吸着』とは地球表層における元素の循環を支配する最も重要な化学プロセスの一つである.しかし,この現象に与える環境因子は体系的に理解されておらず,元素の動的挙動を扱う地球化学モデルには一般的に考慮されていない.本研究では先端的吸着理論であるExtended Triple Layer Model (ETLM)を利用し,硫酸,リン酸,炭酸,アンモニアなどの吸着挙動を,すべての酸化鉱物,幅広い水質条件において予測可能とするパラメータの導出を目指している.これにより生命必須元素(H,C,O,N,S,P)の水環境における分配を定量的に予測できるようになる.地球上の生命はどこで・どのように誕生したのか,という根源的問いに対し,より定量的な観点から解に迫ることが可能となる.初年度はまず,吸着のモデル化に必要な実験データを得る体制を整えると共に,主に硫酸を対象とした実験とデータ解析を行った.吸着実験では,硫酸を含む水溶液と鉱物粉末を混合し,吸着平衡となるまで攪拌を続けた.平衡後,遠心分離により固液分離し,上澄み液のろ過を行った.ろ過液中に含まれる残存イオンの濃度を高速液体クロマトグラフィーで定量し,吸着実験前との差分から吸着量を算出した.以上の実験はpH3-10,イオン強度0.01-0.1,硫酸濃度0.1-1mMの範囲で行った.滴定実験では硫酸水溶液と鉱物粉末の混合物を用意し,酸又はアルカリを少量添加し,pHが安定するまで攪拌を続けた.pHの変動が無くなれば再び酸又はアルカリを加え,pHの安定を待った.この作業をpH3-10の範囲で行い,加えた酸又はアルカリの量とpHの変化量から各pHにおける鉱物の表面電荷を算出した.以上の実験から得られた結果をもとに,ETLM理論によって吸着反応式及び平衡定数を決定した.鉱物粉末サンプルの選定等に時間がかかり,実験データの収集に多少の遅れが生じたが,精度の高いデータの獲得や解析の手順が確立しており,今後のスピードアップが見込まれるため.『吸着』とは地球表層における元素の循環を支配する最も重要な化学プロセスの一つである.しかし,この現象に与える環境因子は体系的に理解されておらず,元素の動的挙動を扱う地球化学モデルには一般的に考慮されていない.本研究では先端的吸着理論であるExtende Tryple Layer Model (ETLM)を利用し,ギ酸,炭酸,硫酸,リン酸,アンモニア,硫化水素イオン等の吸着挙動を,全ての酸化鉱物,幅広い水質条件において予測可能とするパラメータの導出を目指している.これにより,生命必須元素(H,C,O,N,S,P)の水環境における分配を定量的に予測できるようになる.地球上の生命はどこで・どのように誕生したのか,という根源的問いに対し,より定量的な観点から解に迫ることが可能となる.本年度は,まず昨年度までに得られた硫酸の吸着実験データを論文としてまとめ,学術誌に投稿した(現在査読を経て小修整中).また,同様の方法論を用い,炭酸とリン酸の吸着挙動についての評価も行った.リン酸については論文作成に必要なほぼ全てのデータがそろい,投稿に向けた準備を進めている.炭酸については予備実験等で作業工程が確認され,本格的な実験を進めているところである.他のイオンについても順次,実験データの収集と理論解析の準備を進めている.各イオンに対し,実験データの収集と理論解析が済み次第,論文への整理と投稿を速やかに行っていく.イオンの鉱物への吸着挙動を評価するための実験,理論解析の手順や方法論が確立し,大きな問題なくデータの収集が進められているため.『吸着』とは地球表層における元素の循環を支配する最も重要な化学プロセスの一つである.しかし,この現象に与える環境因子は体系的に理解されておらず,元素の動的挙動を扱う地球化学モデルには一般的に考慮されていない.

本研究では先端的吸着理論であるExtende Tryple Layer Model (ETLM)を利用し,生命活動に関わりの深い無機元素(硫酸,リン酸,炭酸など)の吸着挙動を,全ての酸化鉱物,幅広い水質条件において予測可能とするパラメータの導出を目指している.これら元素の水環境における分配が定量的に予測できるようになることで,地球上の生命はどこで・どのように誕生したのか,という根源的問いに対し,より実証的な観点から解に迫ることが可能となる.これまでの取り組みにより,まず硫酸の吸着挙動の予測モデルが国際誌に掲載された(Kitadai et al. (2018) Geochim Cosmochim Acta).その他の無機イオン(リン酸や炭酸)についても吸着実験データを収集し,また関連する文献データを取りまとめ,全ての結果を包括的に説明するモデルの作成を行った.現在は投稿論文の準備を進めているところである.また,硫化水素については,硫化金属(FeSやNiS)に吸着することで容易に酸化還元反応を起こし,同時に吸着している炭素化合物の還元・縮合などの化学反応を促進することが見出されてきている.この成果は当初予想していなかったものであり,地球環境問題など,新たな学術分野へ発展できる可能性がある.硫酸の吸着についてはほぼ十分な実験データが収集され,解析まで進んでいる.これを速やかに論文としてまとめ,学術誌へ投稿する予定である.他のイオンについても,これまでに確立した手順に沿ってデータ収集と解析を進めていく.これまでに確立した方法論を用い,イオンの鉱物への吸着挙動を順次評価していく.実験データの収集と解析が済み次第,論文への整理と投稿を進めていく.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
スフィンゴ糖脂質のシグナル制御機能における分子構造・機能連関の統合的理解

細胞膜に発現するスフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の機構解明のため、糖脂質の糖鎖と脂質部位を含む全体の構造を検討した。糖鎖改変癌細胞とEMARS/MS法によって、糖脂質の会合膜分子を同定し、糖脂質と特異的に結合して癌細胞の悪性形質増強に働くことを示した。一方、糖脂質のシグナル制御における脂質部位の関与の解析のため、GD3発現大腸癌細胞に対し長鎖塩基C4の水酸化に働くDES2遺伝子ノックアウトを行い、シグレック7の結合回復を認めた。脂肪酸2Cの水酸化酵素FA2H遺伝子もノックアウトし、シグレック7の結合が脂質の水酸基にて阻害されることを示した。また、NK様細胞に対する感受性の増強を認めた。スフィンゴ糖脂質が、細胞の癌化あるいは神経系組織の形成・機能において、細胞膜ミクロドメインに局在してシグナル制御に働くことで、細胞の形質と運命を決定している。これらの糖脂質糖鎖の作用メカニズムの解明のために、スフィンゴ糖脂質の分子全体と膜近傍で相互作用する分子群を同定するとともに、脂質部位を含めた糖脂質プロフィールのリモデリング細胞を用いて、リガンド分子との結合性、細胞内局在、脂質raftの形成、シグナルの変化、細胞外からの膜への取り込みと再発現等につき解析を行った。シグレック7の認識糖鎖を発現しないDLD-1細胞株にGD3合成酵素cDNAを導入して、GD3安定発現株を樹立したが、シグレック7の膜への結合は認められなかった。そこで、GD3の分子構造の解析を行い、GD3の大部分がphytoceramide含有型であることが判明した。そこで、DES2遺伝子のサイレンシングを行って、phytoceramideをセラミドに転換したところ、シグレック7の結合性が認められるようになった。スフィンゴ糖脂質が、細胞膜近傍において膜分子と相互作用することで、シグナルの制御に働くと考えられている。そこで、細胞膜の外層に発現する糖脂質の機能メカニズムを解明するために、enzyme-mediated activation of radicalsources (EMARS)反応を行い、標識された膜分子をMSにより同定した。メラノーマ細胞では、GD3を標的にしたEMARS-MSによりNeogeninを同定して、そのGD3との会合や、シグナル制御のメカニズムを解析した。また、マウスグリオーマ細胞では、GD3を標的にして、PDGF受容体alphaを同定して、GD3との特異的会合を示すとともに、GD3、PDGFRalpha、Yesの3者複合体の形成が、グリオーマの浸潤性を増強することを示した。これまで、主に以下のような成果が得られつつあり、概ね順調に進展している。スフィンゴ糖脂質の全体的構造が機能に及ぼす効果を明らかにすべく、脂質セラミドの修飾酵素の人為的操作を行い、DLD-1細胞で、DES2サイレンシング、さらにノックアウト細胞の樹立に成功した。また、脂肪酸のC2の水酸化にはたらくFA2H酵素の機能抑制も試みて、そのノックアウト細胞の樹立に成功した。現在、ダブルで両遺伝子を欠損する細胞株を作成して、細胞形質の比較検討を行おうとしている。ガングリオシドの膜近傍における会合分子同定のために、メラノーマにおけるNeogenin、マウスグリオーマにおけるPDGFRalphaの同定に成功したが、小細胞性肺癌、ヒトグリオーマ等においては、十分に有望な分子の同定はまだである。これらの系においても、GD2を標的にした新規の膜分子を同定して、機能の解明を目指す必要がある。0-シリーズガングリオシドは、マウスリンパ腫の肝転移や、ヒト乳癌の脳転移において重要な役割を担うとの報告がある。今回、2種の糖転移酵素遺伝子ノックアウトマウスを組み合わせて用い、0-シリーズガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体の作成に成功した。これまで、抗体を用いてのヒト細胞株における0-シリーズ糖脂質の発現を網羅的に検討し、少数の細胞株で高発現が認められた。概して、0-シリーズガングリオシドの発現細胞は、細胞増殖、浸潤において、非発現細胞よりも低下傾向があることが分かった。現在、GD1alphaの抽出・精製を行い、細胞膜への取込みによる細胞機能の変化を観察中であり、それらの機能の全容が明らかになるのには、もう暫く時間が必要である。本研究の最後の年度となるので、結論に迫る実験を遂行するように努めた。まず、スフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の解明において重要な、糖脂質の発現と、その膜上での膜分子との会合による協働作用の解析を試みた。そのために、メラノーマ、グリオーマ、小細胞肺癌の細胞株を用いて糖脂質のリモデリングを行い、各々の形質変化と細胞シグナルを解析した。

さらに、スフィンゴ糖脂質のシグナル制御機構を明らかにするために、糖脂質と相互作用する膜分子の同定を目指して、EMARS/MS解析を行い、メラノーマではネオジェニンを、マウスグリオーマではPDGF受容体alphaを、小細胞肺癌ではASCT-2を同定した。これらの膜分子は、標的のガングリオシドと特異的に結合することを、免疫共沈降とTLC免疫染色により示した。また、各々の受容体またはアミノ酸トランスポーター機能の発現により、各癌細胞の悪性形質の発現に関与することが示された。一方、スフィンゴ糖脂質のシグナル制御機能の解明において、その脂質部位を含めた分子全体の化学構造の解析が不可避と考えられ、質量分析による脂質部位の構造解析を進めた。この点で非常に有用だったのが、GD3を発現させた大腸癌細胞株DLD-1である。この細胞はシアル酸を認識するシグレック7に認識されなかったが、CRISPR/Cas9による遺伝子ノックアウトによって、長鎖塩基に結合するC4位の水酸基を除去すると、シグレックの結合が認められた。また、Des2遺伝子ノックアウトに加えて、脂肪酸の2C部位に水酸基を転移するFA2H遺伝子も、同様にノックアウトし、最終的に単独遺伝子ノックアウトと両者のダブルノックアウト株を樹立し、シグレック7の結合性が脂質部位の水酸基の数によって阻害されることが明らかになった。現在、NK様細胞と癌細胞の相互作用によるシグナル変化を解析し、興味深い結果を得ている。スフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の基盤にある糖脂質の分子構造のリモデリング細胞の作成とその方法の確立および検証について、前年度から引き続いて基礎的検討を行い、種々の問題点の解決に努めた。とくに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム遺伝子のノックアウトの完遂にとって、ガードRNAの選択およびノックアウト細胞の選別法と確認アプローチが、未経験の分野として課題となった。コントロール細胞株で、ターゲット配列を組み込んだベクターとCas9および候補のガードRNA発現ベクターを発現させ、蛍光発色が明らかに上昇した細胞クローンの取得に難儀したが、遺伝子導入法、導入ベクターの量などの最適化によって条件設定に成功した。また、最初目標としたDes2遺伝子に加えて、脂肪酸の2C部位に水酸基を転移するFA2H遺伝子に関しても、同様にCRISPR/Cas9法によるノックアウトを行い、最終的に単独遺伝子ノックアウトと両者のダブルノックアウト細胞株を樹立するのに成功した。これらを用いて、セラミド修飾細胞株の形式変化、シグレック7の結合性の変化、NK様細胞との相互作用時のNK様細胞側、GD3発現がん細胞側のシグナル変化につき詳細に解析を進めた。これらの糖脂質リモデリング細胞の糖脂質化学構造の変化に関して、名古屋大学医学部の分子構造解析室の協力を得て、QTRAP6500による質量分析解析を行い、ここで目指した脂質部位の修飾の修正に成功していることを証明できた。本課題で最も重要なスフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の基盤にある糖脂質の全体の分子構造のリモデリング細胞の作成法と実際の樹立およびそれらを用いた機能解析について、前年度から引き続いて詳細な基礎的検討を行い、研究法の確立、とくに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム遺伝子のノックアウトの細胞レベルでの実施が容易になった点は、今後の実験の遂行において非常に意義が大きい。
プラスミノゲンモジュレーターの生理機能解析

1.新規エキスパート分子の単離とin vitro活性評価:SMTPは、トリプレニルフェノール単位およびアミン側鎖部分の2つの部分から構成される。生産菌Stachyobotrysmicrosporaの培養に適切なアミンを添加することにより選択的に目的の化合物を生産できる。この方法により、34種の側鎖アミン化合物を導入した新規誘導体を単離した。In vitroプラスミノゲン活性化測定系および断片化測定系を用いてこれら誘導体を評価した。特徴的な活性を示す同属体6種について、in vitroでのプラスミノゲンのフィブリン結合および血栓溶解促進、in vitroでのプラスミン生成の促進活性について更に検討し、プロテオリシスの促進に特化した化合物、プラスミン断片生成に特化した化合物、両者を併せ持つ化合物をそれぞれ同定した。2.SMTPの生理機能メカニズムの解析:SMTP-7(側鎖にオルニチンを導入した化合物;プラスミン産生促進活性とプラスミノゲンフラグメント生成を併せ持つ)の抗がん作用の詳細なメカニズムを明らかにした。すなわち、(1)SMTP-7の腹腔内投与の1時間後に血中薬剤濃度がピークとなり、それに伴いプラスミン生成の指標(プラスミン-α_2アンチプラスミン複合体)が増加、(2)薬剤投与の2時間後には、がん組織で血管新生阻害プラスミノゲン断片が増加、(3)薬剤の投与により、マウス背部皮下に移植したがんに誘導される血管新生が抑制され、(4)がんの増殖が抑えられる、という一連の機序を解明した。また、抗糸球体抗体によるラット腎炎の改善効果についても検討し、特に脂質レベルの改善効果を確認した。SMTP-7は、食餌誘導高脂血症モデルで脂質低下作用を示さないため、これは腎機能改善と関連していると判断できる。更に、慢性肝炎モデルでの改善効果には、肝実質細胞の再生が関わることも明らかとなった。生産菌Stachybotrys microsporaの培養に適切なアミンを添加することにより選択的に目的の化合物を生産できる。これまでに得た構造活性相関情報を基礎として、30種の側鎖アミン化合物を導入した新規誘導体を作成した。In vitroプラスミノゲン活性化測定系および断片化測定系を用いてこれら誘導体を評価し、活性の強い8種の誘導体を選択した。その内2種はプラスミン断片生成が弱いプロテオリシスに特化した特性を示した。2.SMTPの生理機能メカニズムの解析:SMTP-7(側鎖にオルニチンを導入した化合物;プラスミン産生促進活性とプラスミノゲンフラグメント生成を併せ持つ)は固形がんの増殖阻害作用および慢性腎炎、慢性肝炎などの慢性臓器障害の治癒促進作用を示す。この作用メカニズムを解明するため、以下の実験を行った。移植がんモデル:血漿およびがん組織のプラスミノゲンレベル(ELISA、イムノブロット)およびプラスミノゲンフラグメントレベル(イムノブロット)の測定。慢性肝炎モデル:四塩化炭素の長期投与による慢性肝炎モデルを用い、血漿および肝組織のプラスミノゲンレベルおよびプラスミノゲンフラグメントレベルの測定、肝組織のプラスミン、プラスミノゲンアクチベーター、MMPレベルの測定、肝機能パラメーター(血清)の測定、中心静脈を主とした組織像の解析(HE染色、アザン染色)、増殖細胞(免疫組織染色)の観察を行った。1.新規エキスパート分子の単離とin vitro活性評価:初年度に引き続き新規誘導体の作成を進め、新たに4種の新規同属体を単離した。昨年度単離した30種の新規同属体とあわせて、in vitroプラスミノゲン活性化測定系および断片化測定系を用いてこれら誘導体を評価した。

特徴的な活性を示す同属体6種について、in vitroでのプラスミノゲンのフィブリン結合および血栓溶解促進、in vivoでのプラスミン生成の促進活性について更に検討し、プロテオリシスの促進に特化した化合物、プラスミン断片生成に特化した化合物、両者を併せ持つ化合物をそれぞれ同定した。2.SMTPの生理機能メカニズムの解析:SMTP-7(側鎖にオルニチンを導入した化合物;プラスミン産生促進活性とプラスミノゲンフラグメント生成を併せ持つ)の抗がん作用の詳細なメカニズムを明らかにした。すなわち、(1)SMTP-7の腹腔内投与の1時間後に血中薬剤濃度がピークとなり、それに伴いプラスミン生成の指標(プラスミン-α2アンチプラスミン複合体)が増加、(2)薬剤投与の2時間後には、がん組織で血管新生阻害プラスミノゲン断片が増加、(3)薬剤の投与により、マウス背部皮下に移植したがんに誘導される血管新生が抑制され、(4)がんの増殖が抑えられる、という一連の機序を解明した。また、抗糸球体抗体によるラット腎炎の改善効果についても検討し、特に脂質レベルの改善効果を確認した。SMTP-7は、食餌誘導高脂血症モデルで脂質低下作用を示さないため、これは腎機能改善と関連していると判断できる。更に、慢性肝炎モデルでの改善効果には、肝実質細胞の再生が関わることも明らかとなった。
I型糖尿病における膵外分泌腺細胞抗体の免疫化学的性状に関する研究

(目的)我々はI型糖尿病においては膵外分泌部の障害も起こしうる成績を発表してきた。今回膵外泌腺細胞と反応する自己抗体の免疫化学的特徴につき検討した。(対象および方法)対象は、107例のI型糖尿病患者(IDDM)347例のII型糖尿病患者(NIDDM)、34例のアルコール性膵炎、26例のRA、さらに107例の正常者である。ヒト膵無固定切片を用い、蛍光抗体法により、膵外分泌腺細胞と反応する免疫グロブリンの検討を行ない、さらにimmunoblotting analysisによりその抗原の検索も行なった。(成績)IDDM例の21%((23)/(107))に膵外分泌腺無胞質の"finefibrillar"な構成成分と反応する自己抗体をみとめた。IDDM発症3ヶ月以内では、39%が陽性を示したが罹病期間とともにこの陽性率は低下する傾向をみとめた。そのIgクラスは発症直後がIgMであり、以後IgGの比率が高くなる傾向をみとめた。NIDDM例では0.9%(3/(347))に同様な膵細胞質との反応をみとめたが、アルコール膵炎、RA、正常者には反応はみられなかった。各種のモノクロナール抗体と患者血清を用いて、同一に膵切片を二重染色したところ、膵cytokeratinのそれと完全に一致した。immunoblotting analysisではこの自己抗体は40kdの分子サイズを有するcytokeratinと反応することが明らかとなった。(結論)IDDM患者の血中には高頻度で膵外分泌腺細胞のcytokeratinと反応する自己抗体が検出されることが明らかになった。この自己抗体の細胞障害性の機序に関して今後検討を行ないたい。なおこの成果は欧文論文として投稿中であり、1989年5月の第32回日本糖尿病学会総会、同年6月のアメリカ糖尿病学会において発表される予定である。