hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィリピン・インドネシア島嶼におけるマメヤギの遺伝学的調査研究

しかし、近年インド品種の遺伝子流入により東南アジア大陸全域で交雑型が浸透し、古来系統のマメヤギが姿を消しつつある。フィリピンとインドネシアは東南アジアの島嶼からなる国々で、地理的にインド品種導入の影響を受けにくく、大陸の在来家畜とは一線を画す遺伝的多様性・構造を有すると考えられる。そこで本研究では、フィリピンとインドネシアに対して在来ヤギの調査を実施し、両国における在来ヤギの形態学的調査からマメヤギの飼育保全状態を把握し、加えて遺伝学的調査から遺伝的多様性や構造を明らかにする。その成果は、マメヤギの遺伝資源保全施策に加え、ヤギの起源・伝播に新仮説を提起できる。本年度は以下の調査地を対象とした。1ルソン島(ラグナ)、2ミンドロ島(サンジョセ)、3パナイ島(イロイロ、アンチケ、アクラン)である。ルソン島では64頭(雄25頭、雌39頭)、ミンドロ島では26頭(雄23頭、雌3頭)、パナイ島(雄21頭、雌5頭)では26頭、合計116頭に対する血液試料収集を実施した。これらはすべて共同研究先であるUPLBにおいてDNA精製を実施し、日本に持ち帰り神戸大学および東京農業大学で保存している。また、これら試料収集した個体に対しては、聞き取り調査、外部形質の調査を実施している。調査外部形質の調査では、性、毛色(色、班)、顔面の形状(ローマンの有無)、耳の形状(直、垂)、角、肉髯、毛髯、体高を記載している。調査外部形質の調査では、性、毛色(色、班)、顔面の形状(ローマンの有無)、耳の形状(直、垂)、角、肉髯、毛髯、体高を記載した。平成29年度の予定通り、フィリピンの3島に対する在来ヤギ、マメヤギの聞き取り調査と血液試料採取を実施している。また、分析対象となるY染色体の多型調査を行うために雄個体の頭数も十分に確保することができた。平成29年度のフィリピン調査は平成30年2月22日3月14日の間で実施したため、DNA分析の実施は平成30年度を予定しているが、現在その解析のための準備を進めているところである。加えて平成31年度のインドネシア調査を実施するために、カウンターパートとなるハサヌディン大学の教員と日本・神戸で会合を開催し、MoUの締結準備、在来ヤギ・マメヤギの飼育状態の聞き取り調査を行うことができ、予備調査のために平成30年5-7月頃にハサヌディン大学を訪問することでも合意を得ている。古来、東南アジアではマメヤギと呼ばれる在来ヤギが飼育され、これは東南アジアの気候・環境に良く適応した貴重な遺伝資源である。
地域環境リテラシーと社会人基礎力を高める環境調査手法の開発・活用に関する実践研究

岩井海岸を地先に有する千葉県富山町の現状,船橋三番瀬干潟の生物種のPKJ法調査を実施した.富山町の結果に申請前の4つの調査結果(お台場観光資源,習志野市観光ルート,御宿町地域資源,印旛沼岸水辺環境)を加えることで地域環境分析のデータが整備できた.また,PKJ法の新たな利用方法として,生物種調査を試みた.年度末より,前者については感性工学の視点を取り入れた階層的フォルダー命名方法の開発を,後者については結果の分析を進めている.生物生態への理解を深める手法として,保全生物学の講義を利用してケーススタディに取り上げた生物種,生物群集(ウミガメ,ニホンウナギ,ニホンカワウソ,オオクチバス,カブトガニ,サンゴ礁)の生物模型製作を実施し,再現性などの分析を進めている.生態系保全技術の講義を利用し,アマモ場再生の箱庭生態系模型作成を演習として実施し,合意形成手法としての方法論を検討している.また,地域環境の将来像を検討するために南房総市の事業とも連携し,岩井海岸地区の箱庭コンテンツの情報収集・分析をPKJ法の結果利用およびヒアリングにより実施した.千葉県のマスコットキャラクター「チーバくん」を用いることで,環境問題の現状把握や解決,環境に対する親しみや理解に繋がる新たな環境学習コンテンツの提供の可能性を検討した先行研究を受け,環境と生命の用語等の対応や健康の定義付けの曖昧さ,診断項目の不足などの課題を抽出,整理し,千葉県の環境情報を利用した診断法とその結果を利用した環境学習プログラムを検討した.プログラムの試行例として,チャーノフの顔を応用した「チーバくんのエコ笑い」や「チーバくんの診療所」,「カルテづくり」等を考案した.なお,最終的な統合化のための各手法関連付けの最初の取り組み,岩井海岸のPKJ法調査結果を箱庭コンテンツ検討に利用した.提案した3つの手法について,それぞれデータ,実施例,分析例を積み重ねることができた.新しい方法とそれらの実践結果をふまえ,理論的な考察と論文としての取りまとめは年度をまたがることになった.PKJ法,箱庭生態系模型については,南房総市との連携も含めての展開ができたこともあり,今後の環境教育の実践,具体的な合意形成への利用などのプロセスも準備が進んだものと評価した.PKJ法については,階層的フォルダー命名方法(例えば,形容詞+名詞など)を導入した上での検証的,発展的な実践と生物種調査の繰り返し実施による手法としての精緻化をめざす.本年度結果について,次年度前期に2編の論文投稿を行う.箱庭生態系模型については,南房総市の事業とも連携させ,実際問題への適用,環境教育の実施をめざす.チーバくんの健康診断については,一定の成果が出たことから,次年度前期に1編の論文投稿を行うとともに,PKJ法を使ったチーバくんの健康診断を検討する.本年度の実践結果をふまえ,各方法のプロセスに対して,習得が期待される地域環境リテラシー,社会人基礎力の対応整理表の作成を開始し,効果の評価の枠組みを構築する.岩井海岸を地先に有する千葉県富山町の現状,船橋三番瀬干潟の生物種のPKJ法調査を実施した.富山町の結果に申請前の4つの調査結果(お台場観光資源,習志野市観光ルート,御宿町地域資源,印旛沼岸水辺環境)を加えることで地域環境分析のデータが整備できた.また,PKJ法の新たな利用方法として,生物種調査を試みた.年度末より,前者については感性工学の視点を取り入れた階層的フォルダー命名方法の開発を,後者については結果の分析を進めている.

生物生態への理解を深める手法として,保全生物学の講義を利用してケーススタディに取り上げた生物種,生物群集(ウミガメ,ニホンウナギ,ニホンカワウソ,オオクチバス,カブトガニ,サンゴ礁)の生物模型製作を実施し,再現性などの分析を進めている.生態系保全技術の講義を利用し,アマモ場再生の箱庭生態系模型作成を演習として実施し,合意形成手法としての方法論を検討している.また,地域環境の将来像を検討するために南房総市の事業とも連携し,岩井海岸地区の箱庭コンテンツの情報収集・分析をPKJ法の結果利用およびヒアリングにより実施した.千葉県のマスコットキャラクター「チーバくん」を用いることで,環境問題の現状把握や解決,環境に対する親しみや理解に繋がる新たな環境学習コンテンツの提供の可能性を検討した先行研究を受け,環境と生命の用語等の対応や健康の定義付けの曖昧さ,診断項目の不足などの課題を抽出,整理し,千葉県の環境情報を利用した診断法とその結果を利用した環境学習プログラムを検討した.プログラムの試行例として,チャーノフの顔を応用した「チーバくんのエコ笑い」や「チーバくんの診療所」,「カルテづくり」等を考案した.なお,最終的な統合化のための各手法関連付けの最初の取り組み,岩井海岸のPKJ法調査結果を箱庭コンテンツ検討に利用した.提案した3つの手法について,それぞれデータ,実施例,分析例を積み重ねることができた.新しい方法とそれらの実践結果をふまえ,理論的な考察と論文としての取りまとめは年度をまたがることになった.PKJ法,箱庭生態系模型については,南房総市との連携も含めての展開ができたこともあり,今後の環境教育の実践,具体的な合意形成への利用などのプロセスも準備が進んだものと評価した.PKJ法については,階層的フォルダー命名方法(例えば,形容詞+名詞など)を導入した上での検証的,発展的な実践と生物種調査の繰り返し実施による手法としての精緻化をめざす.本年度結果について,次年度前期に2編の論文投稿を行う.箱庭生態系模型については,南房総市の事業とも連携させ,実際問題への適用,環境教育の実施をめざす.チーバくんの健康診断については,一定の成果が出たことから,次年度前期に1編の論文投稿を行うとともに,PKJ法を使ったチーバくんの健康診断を検討する.本年度の実践結果をふまえ,各方法のプロセスに対して,習得が期待される地域環境リテラシー,社会人基礎力の対応整理表の作成を開始し,効果の評価の枠組みを構築する.理由としては,PKJ法の実施にあたり,現段階では保有の防水カメラを使用したこと,PKJ法の実施回数が少なく,旅費等が進捗しなかったこと,論文投稿を次年度に繰り越したこと,箱庭生態系模型手法の検討に試行的な部分が多く,箱庭コンテンツの購入をひかえたことがあげられる.使用計画としては,年度前半での論文投稿,研究2年目での集中的なPKJ法調査の実施,箱庭生態系模型手法検討の進捗にあわせたコンテンツ消耗品,道具の購入があげられる.
生殖細胞品質診断を実現する超高精度ミトコンドリア呼吸機能解析システムの開発

本研究では、電気化学計測技術を基盤とする医療応用可能な超高精度細胞呼吸測定システムの開発を目的とした。単一細胞非侵襲呼吸計測システムを開発するために、(1)超高感度マイクロ電極と単一細胞呼吸測定技術の開発、(2)ミトコンドリア呼吸機能解析による生殖細胞品質評価法の開発を行った。その結果、単一卵子および胚の酸素消費量を安定的に測定できるマイクロ電極と非侵襲呼吸測定液の開発に成功した。また、ミトコンドリア呼吸機能解析により生殖細胞品質評価法の有効性を明らかにすることができた。本研究では、電気化学計測技術を応用した高精度生殖細胞品質診断のための基盤技術を確立することができた。ミトコンドリアは、機能分化した細胞においてはエネルギー産生やアポトーシスなどの重要な生命現象に関わっている。したがって、高精度の呼吸計測技術は細胞の代謝活動やクオリティーの評価、アポトーシス解析やミトコンドリアの機能異常に関連した疾患の診断に極めて有効な方法となる。本研究では、電気化学計測技術を基盤とする医療応用可能な超高精度細胞呼吸測定システムの開発を目的とする。研究期間内に、卵子や受精卵の品質(クオリティー)を高精度で診断できる生殖細胞クオリティー診断システムを確立し、詳細なミトコンドリアの呼吸機能解析により、この診断システムの有効性と安全性を調べ、生殖医療において細胞や受精卵の品質を高精度で診断できる画期的な生殖細胞品質診断システムへと発展させる。平成25年度は、単一細胞非侵襲呼吸計測システムを開発するために、(1)超高感度マイクロ電極の開発、(2)単一細胞呼吸測定技術の開発、および(3)非侵襲呼吸測定液の開発を行った。(1)では、酸素の還元条件下ー0.6 V、計測レンジ1 nA、電流値ー0.2ー0.5 nAの感度を可能とするマイクロ電極を作製することができた。(2)では、単一細胞呼吸測定において計測精度に影響する(a)マクロ電極先端径、(b)マイクロ電極ー試料間の距離(電極先端位置)、(c)マイクロ電極の走査速度および走査距離を決定することができた。(3)では、マイクロ電極を汚染せず、超微弱(pAレベル)の還元電流の検出に影響しない計測液の基本組成を明らかにした。したがって、精度の高い呼吸計測技術は細胞の代謝活動やクオリティーの評価、アポトーシスの解析やミトコンドリアの機能異常に関連した疾患の診断に極めて有効な方法となる。平成26年度は、前年度に引き続き、単一細胞非侵襲呼吸計測システムを開発するために、(1)超高感度マイクロ電極の開発、(2)単一細胞呼吸測定技術の開発、(3)非侵襲呼吸測定液の開発、(4)極微量試料を用いたミトコンドリア呼吸機能解析技術の開発、以上の4項目の研究を行った。(1)では、酸素の還元条件下ー0.6 V、計測レンジ1 nA、電流値ー0.2ー0.5 nAの感度を有するマイクロ電極の安定した作製システムを確立し、マウス卵子及び胚の呼吸測定により性能評価を行った。(2)では、測定精度に影響するマクロ電極先端径、マイクロ電極ー試料間の距離(電極先端位置)、マイクロ電極の走査速度及び走査距離などの基本条件を決定することができた。(3)では、受精卵培養液をベースに、マイクロ電極を汚染せず、超微弱(pAレベル)電流の検出にも影響しない計測液を作製することができた。(4)では、呼吸測定システムにより非侵襲的に呼吸量を測定したマウスの単一卵子及び胚を用いて、JC-1等の蛍光染色によりミトコンドリアの局在を検出することができた。また、呼吸測定後の単一卵子及び胚の微量試料におけるATP量の定量化に成功した。ミトコンドリアは、細胞活動に必須のエネルギーの産生やアポトーシスなど重要な生命現象に関わっている。精度の高い細胞呼吸計測技術は、細胞の代謝活動や品質の評価、アポトーシスの検出やミトコンドリアの機能異常に関連した疾患の診断に極めて有効な方法となる。本研究では、電気化学計測技術を応用した高精度細胞呼吸測定システムを開発し、医療応用可能な細胞診断システムへの発展を目的とした。平成27年度は、前年度までに確立した(1)単一細胞非侵襲呼吸測定システムの有用性を検証するとともに、(2)極微量試料を用いたミトコンドリア呼吸機能解析技術の開発を行った。(1)では、単一のマウス及びウシの卵子と胚の呼吸活性を安定的に測定できる技術を開発した。(2)では、呼吸測定システムにより非侵襲的に測定したマウス及びウシの単一卵子及び胚において、ミトコンドリア検出試薬であるJC-10を用いることでミトコンドリアの膜電位と細胞内局在を検出することができた。さらに、呼吸測定胚を用いてATP量の定量化と酵素複合体チトクロームc酸化酵素(COX)の遺伝子発現解析に成功した。以上、本研究では電気化学計測技術を応用した高精度ミトコンドリア呼吸機能解析システムの開発に成功し、ミトコンドリア機能を指標とする生殖細胞品質診断技術の基盤を確立できた。単一細胞非侵襲呼吸計測システムを開発するために、(1)超高感度

マイクロ電極と単一細胞呼吸測定技術の開発、(2)ミトコンドリア呼吸機能解析による生殖細胞品質評価法の開発を行った。その結果、単一卵子および胚の酸素消費量を安定的に測定できるマイクロ電極と非侵襲呼吸測定液の開発に成功した。また、ミトコンドリア呼吸機能解析により生殖細胞品質評価法の有効性を明らかにすることができた。本研究では、電気化学計測技術を応用した高精度生殖細胞品質診断のための基盤技術を確立することができた。研究期間(4年間)の前半において、最も重要であった単一細胞(卵子・胚)の非侵襲呼吸測定システムを開発することができた。平成26年度では、新たに開発した呼吸測定システムを用いて呼吸測定した卵子及び胚のミトコンドリア呼吸機能解析の可能性示すことができ、本研究の最終目標である医療対応型細胞診断システムの開発に大きく前進した。したがって、当初の研究計画は順調に進んでいると判断する。27年度が最終年度であるため、記入しない。生殖生物学平成26年度までに得られた成果を検証・総括し、「単一細胞呼吸測定システム」を完成させる。平成27年度では、前年度までに研究項目(3)として設定していた「極微量試料を用いたミトコンドリア呼吸機能解析技術の開発」を重点的に行う。具体的には、単一の卵子や培養細胞から得られる極微量試料でのミトコンドリア呼吸機能解析技術を確立するために、1非侵襲ミトコンドリア局在解析、2高精度ATP定量解析、3酵素複合体チトクロームc酸化酵素(COX)の遺伝子発現解析を行う。この研究項目は、技術的にも高い難度が予想されることから、共同研究者と密に連携し、単一試料からの微量試料を用いた解析を実施する。細胞呼吸活性を指標とする新しい細胞機能診断システムのキーテクノロジーとなる単一細胞呼吸測定システムの基盤技術を確立することができた。この成果により、次年度に予定している「単一細胞呼吸測定システム」の開発に速やかに取りかかることができる。本研究事業では、(1)単一細胞呼吸計測システムの開発と(2)ミトコンドリア呼吸機能解析を研究の柱としている。平成26年度は、(1)の単一細胞呼吸計測システムの検証実験と(2)のミトコンドリア呼吸機能の生物学的解析を行った。(2)における遺伝子発現解析は予備実験の段階で終了したため、学術研究助成基金助成金の一部使用で研究の目的を達成することができた。平成25年度に得られた成果を検証・総括し、「単一細胞呼吸測定システム」を完成させる。平成26年度では、研究項目(4)として極微量試料を用いたミトコンドリア呼吸機能解析技術の開発を行う。具体的には、単一の卵子や培養細胞から得られる極微量試料でのミトコンドリア呼吸機能解析技術を確立するために、1非侵襲ミトコンドリア局在解析、2高精度ATP定量、3酵素複合体チトクロームc酸化酵素(COX)の発現解析を行う。単一試料からの微量試料を用いた解析の有効性を検証し、遺伝子から細胞呼吸までのミトコンドリア呼吸機能に関連する生物学的解析を、単一細胞レベルで安定的に実現するための解析システムを完成させる。平成27年度では、平成26年度までの結果を検証し、極微量試料を用いたミトコンドリア呼吸機能解析技術の開発を重点的に行う。
カイコ前胸腺刺激ホルモンのNMRによる立体構造解析と機能相関

カイコ前胸腺刺激ホルモン(PTTH)の分子量は活性に不要な糖鎖を除いて約25kDaであり、多次元NMR法を用いても立体構造決定が容易でないこと、および、現在までの決定されているシスチンノットファミリーの立体構造はすべてX線結晶解析法により解かれていることから、PTTHの立体構造解析法としてX線結晶解析法の方が妥当であると判断し、PTTHの結晶化の条件検討を散在行列(sparse matrix)法により進めた。結晶化条件検討キットCrystal Screen (Hampton Research)を用いて50種類の塩緩衝液・沈殿剤の組み合わせのもとで初期スクリーニングを行い、いくつかの条件下で微結晶を得ることができた。特に、緩衝液としてNaHepes pH7.5、沈殿剤としてPEG4000あるいはNa citrateを用いた場合に最良の結果が得られた。今後、結晶化条件を精密化することにより、構造解析に用いる質の高い結晶が得られると期待される。また、結晶化に用いる試料タンパク質の安定供給のために、新たに発現系を構築した。6xHis融合カイコPTTHを大腸菌で発現し、封入体を6M尿素で可溶化後、Ni^<2+>固定化樹脂で精製した。この特異的親和性を利用する簡便な精製により大量の組み換えPTTHを安定して調製できるようになった。この方法により得られた組み換えPTTHを用いて、従来よりも効率良く結晶化の条件の精密化を進めることが可能になった。
シンビオジェネシスにおける共生者ゲノムの縮小進化に関する研究

本研究では、二次共生由来の生物であり、葉緑体の祖先真核藻の痕跡核であるヌクレオモルフ(Nm)を有するクロララクニオン藻について、Nmゲノムサイズの多様性を明らかにし、その進化傾向を推察することを目的とした。これまでNmゲノムサイズの調査がされていない主要系統群を代表する3株:BC52、CCMP2058(Lotharella amoebiformis)、CCMP2057(Gymnochlora stellata)を含む合計5株について、パルスフィールド電気泳動法を用いNm染色体を分離し、各Nm染色体に必ず存在する18SrDNAをプローブにサザンハイブリダイゼーションを行ない、各Nm染色体の数とサイズを推定した。その結果、5株のうち4株は、以前の報告と同様3本の直鎖状Nm染色体をもつことがわかった。残る1株(L.amoebiformis)は4本の染色体を持つ可能性が示唆された。Nm染色体の数は必ず3本であるとされており、もし4本の染色体が本当だとしたら、今後のNmゲノム進化の研究の発展において重要な知見となる。いずれにせよ本藻群全体のNmゲノムサイズは、約350405(あるいは455)kbの範囲となり、クロララクニオン藻内でゲノムサイズに多様性があることが再確認された。また核コード18SrDNAの分子系統樹をもとにNmゲノムサイズの進化を考えると、1)Nmゲノムは、本藻群の分岐以前に現存のサイズと同程度まで縮小し、その後非コード領域等でサイズの増減がおこった、2)Nmゲノムは、常に減少傾向にあり、全ての系統群で独立にサイズの減少がおこった、のどちらかである可能性が示唆された。なお、本研究成果は、第15回国際進化原生生物学会大会(2005年1月、メルボルン・オーストラリア)および第29回日本藻類学会大会(2005年3月、京都)で口頭発表を行なった。
アミロイドβ蛋白の脳関門輸送

本研究は、アミロイドβ蛋白(Aβ)の脳内消失過程における各消失過程の寄与率をin vivo実験系(Brain Efflux Index (BEI)法)を用いて明らかにすることを目的とした。Human Aβ(1-40)(hAβ(1-40))はラット大脳皮質から1.6x10^<-2>(min^<-1>)の速度定数で消失した。脳スライスに対する定常状態取り込み量からhAβ(1-40)の脳分布容積として0.69mL/g brainが得られ、脳消失クリアランスは11μL/(min g brain)となり、既報の血液から脳方向血液脳関門influxクリアランスの4.5-17倍大きかった。hAβ(1-40)の脳消失速度はhAβ(1-42)で阻害されたが、hAβ(1-43)hAβ(40-1)では阻害されなかった。hAβ(1-40)の脳消失速度をthiorphan(1mM),phosporamidon(10mM)が各々16,21%阻害したことから、大脳皮質におけるhAβ(1-40)の消失にNeprilysinは一部関与することが示唆された。hAβ(1-40)の脳消失速度をhumanRAPが20%阻害したことからLRP-1を介した排出輸送は20%寄与していることが示唆された。一方、hAβ(1-40)の脳消失速度をquinidine(5mM),verapamil(4mM)は全く阻害しなかったことから、P-gp/MDR1の寄与は無視できることが示された。アミロイドβ蛋白の脳消失経路として、Aβ(1-40)を認識する血液脳関門排出輸送系が働いており、大脳皮質からの消失過程の約80%を担っており、その経路におけるP-糖蛋白の寄与は無視出来、LRP-1の寄与も約20%しか見られないことが示唆された。未知の経路の関与は50%以上あることが示唆された。
固体電解層の開発を目指した新領域の柔粘性結晶の研究

柔粘性結晶は、柔らかい性質を持った結晶である。結晶が柔らかい性質を示すのは、結晶中で構成粒子が自己拡散運動を起こしているためである。つまり、イオン結晶で柔粘性を示す物質は,固体イオン伝導体材料に応用することができる。しかし、イオン結晶の場合、イオン間相互作用が大きいため分子性結晶に比べ柔粘性結晶があまり多くは発見されていない。そこで、本研究では、電荷中心を離したイオンをデザインし、イオン結晶でありながら分子性結晶に近い相互作用を持つ新領域の柔粘性イオン結晶の開発に取り組んだ。その結果、16種類の新規柔粘性イオン結晶を得た。また、約10-3 S cm-1の大きな伝導度を持つことも示した。新領域で新規柔粘性イオン結晶を発見した。これまで、柔粘性イオン結晶は、平面状イオンと球状イオンの組み合わせが多く、分子性結晶は球状分子に柔粘性が見られていた。そこで、本研究ではイオン間の距離を大きくすることで、イオン性が弱まり球状イオンの組み合わせでも、柔粘性イオン結晶になると予想し、この新領域での柔粘性結晶の開発に取り組んだ。23年度は陽イオンにテトラアルキルアンモニウム、陰イオンにテトラアルキルホウ酸を用い、新規柔粘性イオン結晶を得たが、大きな陽イオンでは、柔粘性イオン結晶が得られなかった。これは、アルキル鎖が長くなることにより、アルキル鎖の間に、陰イオンが入り込んでしまうことが原因と考えられる。そこで、24年度は、籠形の陽イオンである1-alkyl-4-aza-1-azoniabicyclo[2,2,2]octaneを用いたところ、新規柔粘性イオン結晶が得られた。さらに、イオンの運動状態を固体NMR等で調べたところ、アルキルアンモニウムより、低いエネルギーで等方回転運動していることが明らかになった。得られた新規柔粘性イオン結晶のX線構造解析を行ったところ、アルキルアンモニウム塩と同様にCsCl型の立方晶をとり、伝導度もアルキルアンモニウム塩と同程度の者が得られた。また、2次元柔粘性イオン結晶であるRotator結晶では、n-アルキルカルボン酸リチウム塩とカリウム塩を混合することにより、大きなイオン伝導度を得ることができた。この結果は、国際学会で発表し、論文として発表した。さらに、陽イオンとして籠形の物質(1-alkyl-4-aza-1-azoniabicyclo[2,2,2]octane以下N-R DABCO (R=Me, Et)と略す)でも陰イオンにBEt3MeやBBu4を用いて新規柔粘性イオン結晶を発見した。また、陰イオンにBEt4を用いたNRxR'4-xBEt4塩でも新規柔粘性イオン結晶を発見した。上記の塩に関しては、現在論文作成中である。また、これまで1価の陽イオンと陰イオンの組み合わせで新規柔粘性イオン結晶を発見してきたので、2価のイオンを含む塩を作成し、その物性評価も行ったが、現時点では柔粘性結晶は得られていない。新領域で柔粘性イオン結晶の発見に成功した。陽イオンにテトラアルキルアンモニウム、陰イオンにテトラアルキルホウ酸を用いた塩を合成し、その物性測定を行った。陰イオンは、合成原料の関係で、テトラブチルホウ酸とトリエチルメチルホウ酸の2種類しか合成できなかったが、陽イオンはアルキル基がメチル基からブチル基まで、NR4タイプで4種類、NR3R'で12種類、NR2R2'で12種類の合計28種類合成した。DSC、固体NMR、粉末X線回折測定、伝導度測定を行い調べたところ、陰イオンがテトラブチルホウ酸の場合、陽イオンがテトラエチルアンモニウムなど合計5種類が柔粘性イオン結晶になることが分かった。当初、中心電荷間の距離を大きくすることを考えていたが、テトラブチルホウ酸のアルキル基が直鎖のため、陽イオンのアルキル郷絡み合い、等方回転運動が阻害されていることが分かった。そこで、アルキル鎖を短くした、トリエチルメチルホウ酸を合成した。その結果、トリエチルメチルホウ酸を陰イオンにするとテトラメチルアンモニウムからトリプロピルエチルアンモニウムまで、8種類の塩が柔粘性イオン結晶であることが明らかになった。

結晶が柔らかい性質を示すのは、結晶中で構成粒子が自己拡散運動を起こしているためである。つまり、イオン結晶で柔粘性を示す物質は,固体イオン伝導体材料に応用することができる。しかし、イオン結晶の場合、イオン間相互作用が大きいため分子性結晶に比べ柔粘性結晶があまり多くは発見されていない。また、分子結晶が室温近傍で柔粘性を示すのに比べ、柔粘性イオン結晶は高温領域に存在することが多い。これは、固体電解層への応用する際の大きな課題であった。本研究では、陽イオンと陰イオンの電荷を離すことで、相互作用がイオン性から分子性に近づくと考え、アルキルアンモニウムとアルキルボレートイオンからなる塩を研究対象とした。その結果、新たに16種類の新規柔粘性イオン結晶を発見した。さらに、これらすべてが室温で柔粘性を示し、約10-3 S cm-1と大きな伝導度を持つことも示した。つまり、イオン間の相互作用が分子性に近づけた、柔粘性イオン結晶の新領域の開拓に成功し、多くの新規柔粘性イオン結晶を短期間で発見することができた。なお、柔粘性を示さない物質でも、イオン伝導度を持つことも明らかになったので、今後のイオン伝導度研究の方向性を示すことに貢献できた。なお、この研究を通して球状イオンが柔粘性を示し、大きなイオン伝導度を示すことも明らかとなったので、本研究では、新領域をさらに発展させ、籠形イオンからなるイオン結晶の研究を行った。その結果、さらに6種類の柔粘性イオン結晶の発見につながった。これらの結果をリチウム塩に応用したところ、アルキル硫酸エステルのリチウム塩でリチウムイオン伝導体を発見した。本研究は1価のイオンを用いたが、新領域を用いることで、まだ発見されていない2価の柔粘性イオン結晶への応用が期待できる成果が得られた。物性物理化学概要の部分に記したが、新領域で柔粘性イオン結晶の発見に成功している。また、アルキルアンモニウム塩で、課題となっていた点が、籠形の陽イオンを用いることにより、等方回転運動の活性化エネルギーが小さくなった上、イオン伝導度も大きかった。つまり、新領域で、多くの柔粘性イオン結晶が得られるだけでなく、イオン伝導性の大きな物質を見いだすことが可能であることを示すことができた。また、Rotator結晶の研究も進み、n-アルキルカルボン酸リチウムは抵抗が大きく、伝導度測定ができなかったが、カリウム塩と混合することにより、大きな電気伝導度が得られ、国際学会で発表し、論文としても発表できた。新領域を提案し、その領域に新規柔粘性イオン結晶が数多く発見できている。また、柔粘性を示さない化合物もこの領域の物質は大きな電気伝導度を持つので、固体電解質として、非常に興味深い領域であることが判明したので。概要の部分に記したが、新領域で柔粘性イオン結晶の発見に成功している。また、これまで、陽イオンと陰イオンの大きさの比が0.81.1の平面状イオンであったのに対し、今回柔粘性結晶であったイオンの比は、0.51.3と広範囲であった。この結果は、当初予定していなかった結果なので、新領域で新たに13個の柔粘性イオン結晶が発見できたことは、予想を大きく上回る数である。
亜急性硬化性全脳炎の発症過程の解明-ウイルスの細胞融合誘導能の役割

これまでの研究により、Kobe-1株のFおよびH蛋白質内の各変異が融合活性に及ぼす影響については、検討済みである。本研究では、まず1FおよびH蛋白質の融合活性を低下させる変異が、持続感染を成立させるか検討する。次に2持続感染を成立させたFおよびH蛋白質変異体に、融合活性を上昇させる変異を加えることで、神経病原性発現段階への移行に必要な変異を同定する。最後に3各段階において融合活性を調節する変異の作用機序を解明する。
人的損害に対する保険制度の日韓比較

人的損害に対処する保険制度には、健康保険・年金・自動車保険・労災保険・介護保険等がある。これらの保険制度は、それぞれ独立した制度であり、その目的も異なっている。しかし、これらの制度が目的とすることは、人的損害に対する対処であることから多く面で、その機能が重複している。従って、世界の中で一番類似している人的損害に対する日韓の保険制度を比較することによって、人的損害に対する保険制度における諸問題に対する方策を提示することを目的とした。研究の方法は、文献調査、それに関連した機関の訪問調査、対象者に対する実態調査を行った。日本と韓国における人的損害に対する保険制度の研究について具体的な内容は次のとおりである。最初に、日韓両国の労災保険制度の比較通じた問題点及び改選案、二つ、各種制度における障害等級の基準と内容の日韓比較を通じて、日韓両国における障害等級の判定及び利用実態とそれに関する問題点及び改選案、三つ、日韓における診療費の処理の実態について日韓比較を行い、とそれに関する問題点及び改選案を提示した。四つ、労働災害者に対するリハビリテーションの制度と実態に対する日韓比較を行い、日韓両国におけるリハビリテーションの問題点及び改選案を提示した。最後に、労災保険の場合、事業主の災害補償責任の履行手段であり、障害者の生活の質の低下に対する対策が講じられるべきである。従って、本研究では、労働災害による障害者の生活の質に対する実態と問題点について日韓の取組みを比較し、対策を提示した。本研究では、次の2つのテーマについて、重点的に研究を行うため、資料の収集などを行った。(1)保険制度における診療費の報酬体系に関する日韓比較研究公的医療保険と自動車保険では、それぞれ異なった基準による診療費が病院などに対して支払われている。さらに、その支払機関も異なっているため、患者と病院の両方が混乱している状況である。従って、本研究では、保険制度における診療費の処理について日韓比較を行い、日韓における診療費の処理の実態とそれに関する問題点を明らかにする予定である。(2)保険制度におけるリハビリテーションに関する日韓比較研究自動車事故または労働災害による障害者は、リハビリテーションによって職場に復帰することが望まれる。このことは、人的損害を最小限に押さえ、各種保険からの給付金も減らすことになる。しかし、現在行われている被災者に対するリハビリテーションは、必ずしも十分とは言えない。従って、本研究では、これから労働災害者に対するリハビリテーションの制度と実態に対する日韓比較を行い、日韓両国におけるリハビリテーションの問題点を明らかにする予定である。これらの保険制度は、それぞれが独立した制度であるが、その目的が人的損害に対する対処であるため、それぞれの機能が重複している。本研究では、これらの人的損害に対する日本の保険制度を、世界の中で一番類似している韓国のそれと比較することによって、人的損害に対する保険制度における諸問題の解決策を提示することを目的とした。これらの保険制度に関する文献調査、関連機関の訪問調査、対象者に対する実態調査を通じて行った研究の具体的な内容は、次のとおりである。(1)日韓両国の各種保険制度における障害等級の基準、障害等級の判定及び利用実態とそれに関する問題点を明らかにした。(2)日韓両国における診療費支払の実態の比較を行い、それに関する問題点及び解決策を提示した。(3)労働災害者に対するリハビリテーション制度と実態の日韓比較を行い、日韓両国におけるリハビリテーションの問題点及び解決策を提示した。(4)労働災害による障害者の生活の質について日韓の取組みを比較し、対策を提示した。
電子状態の3次元測定

本研究の目的は、我々が開発した2次元表示型の球面鏡エネルギー分析器を改良して、固体内電子のエネルギーバンドを3次元的に測定し、電気的性質を始めとする物性を迅速に研究することであった。この分析器は、特定のエネルギーの電子の放出角度分布を2次元的に表示することができるので、バンドの断面図を直接観測でき、またフェルミ準位からの光電子を観測するとフェルミ面の2次元的な形が実際に目で見えるようなる。装置の改良としては従来使用してきた試作品の分析器を、バンドの2次元測定に適するように、取り出し立体角を±60°と大きくした。また、検出器も、カウント数が多くても使えるCCDカメラシステムに切り替えた。また、種々の試料が効率よく測定できるような、超高真空槽を設計して作成した。また、従来の分析器では、エネルギー分解能を高めると角度分解能が悪くなるという欠点があったので、その克服のための特殊グリッドをセラミックで製作した。電子状態の研究も大いに進んだ。単結晶グラファイトのバンド構造の断面およびフェルミ面の形の研究においてはπバンドの様子がきれいに観測された。励起源に直線偏光を用いたので軌道の対称性まで判った。また、異なるブリルアンゾーンが等価でなく、対称性が破れているのが観測された。強結合近似による計算を行った結果、「光電子の構造因子」という新しい概念を用いて説明できる事が明らかになった。このような対称性の議論は従来の角度分解型の測定では極めて難しく、2次元角度分解同時測定の有効性が明らかになった。また、いくつかの遷移金属カルコゲナイドについても測定を行った。IT-TaS2での実験を、内殻共鳴エネルギーの光で行ったところ、強度分布が全く異なるという現象を発見した。これは、共鳴光電子放出の角度分布を測定した初めての例であり、共鳴過程に関するより詳しい議論が可能になる道を開いた。本研究の目的は、我々が開発した2次元表示型の球面鏡エネルギー分析器を用いて、固体内電子のエネルギーバンドを2次元的に迅速に測定し、3次元のバンドマッピングを行うことである。特にフェルミ面の形などが可視化でき、電気的性質を始めとする物性とバンド構造との関連が明らかになると思われる。平成4年度は、バンドの2次元測定に適した分析器および測定システムを購入し、画質の良いデータを得るのが目的であった。そのために、阻止電位モードでも測定がうまく行くようなグリッドの配置にし、かつ取り出し立体角が±60°程度ある球面鏡分析器のグリッドシステムを設計し、購入した。また、検出器も、従来の2次元光子検出器(浜松ホトニクスPIAS)ではカウント数が非常に多いときには処理速度が追いつかないので測定効率が悪く画質も悪いので、カウント数が多くても使えるCCDカメラシステムに切り替えた。また、それらの制御電源も購入した。これらの購入物品を現有の真空槽に据え付けて実験を進めている。本年度の実験としては、単結晶グラファイントでバンド構造の断面およびフェルミ面の形の測定を行った(文献1)。その結果、πバンドがバンド底ではΓ点に有るものが、フェルミ準位に近づくにしたがって広がっていき、Κ点のところで点状の正6角形のフェルミ面になる様子がきれいに観測された。これまで、このような測定は、IBMのHimpsel等の実験があるが、彼らの結果よりも広い範囲にわたって歪み無く測定できており、電子状態がよく解る。また、励起源に直線偏光を用いたので、軌道の対称性まで判った。

これは、Himpsel等は観測しておらず、今回はじめて得られた重要な結果である。このような対称性の議論は従来の角度分解型の測定では極めて難しく、2次元角度分解同時測定の有効性がさらに示された。本研究の目的は、我々が開発した2次元表示型の球面鏡エネルギー分析器を用いて紫外光電子分光を行い、固体内電子のエネルギーバンドの等エネルギー断面を2次元的に迅速に測定し、エネルギー軸を加えて3次元的なバンドマッピングを行うことである。特にこの方法ではフェルミ面の形などが可視化できるので、物性とバンド構造との関連についての研究が大いに進展するものと期待される。平成5年度は、種々の試料が効率よく測定できるような、超高真空槽を設計して作成し、測定データの質を上げるとともに、種々の試料を測定するのが目的であった。真空槽は、現在、立ち上げが終わった段階である。実験は、いくつかの遷移金属カルコゲナイドについて行った。これらの物質は、電荷密度波(CDW)や超伝導の出現などフェルミ面の形が物性と直接関係していると言われている物質群であるが、実験的なフェルミ面はほとんど得られていないといってよい。1T-TaS2、2H-TaSe2、2H-NbSe2についていくつかのエネルギー値でのバンドの断面図を得る事に成功した。励起源に直線偏光を用いたので、軌道の対称性まで判った。これは、昨年度に行ったグラファイトと同様の結果である。また、測定装置の改良として、角度分解能とエネルギー分解能を同時に高めた実験を可能にするための特殊グリッドを製作した。これは、セラミックを半径40mm厚さ1mmの球形に加工し、0.3mmの穴を0.1mmの間隔で中心に向けて数万個開けるという、現代の加工技術の最先端の技術を必要とする難しい加工である。やっと一つ完成したので、これから電極を上下に付けてテストしていく予定である。本研究の目的は、我々が開発した2次元表示型の球面鏡エネルギー分析器を用いて紫外光電子分光を行い、固体内電子のエネルギーバンドを2次元的に迅速に測定し、エネルギー軸を加えて3次元的な測定を行うことである。しかし、従来の分析器を、エネルギー分解能を高めると角度分解能が悪くなるという欠点があったので、その克服も本研究での大きな課題である。平成6年度は、一昨年に作成した新しい「グリッドシステム」を昨年度に作成した「超高真空槽」に組み込み、立ち上げを完了し、田無の放射光施設(INS-SOR)のビームライン4に接続した。現在、放射光の分光器を明るくする調整が終わり、データを取り始める段階にきている。また、昨年度に製作した「特殊グリット」のテストを行った。このグリットも、角度分解能とエネルギ一分解能を同時に高めた実験を可能にするためのもので、セラミックを半径40mm厚さ1mmの球形に加工し、これの上下に電極を付け、穴の中にグラファイトを塗布し数MΩの抵抗にし、真空槽に入れてテストした。その結果、LEED(低エネルギー電子回析)の実験においては、阻止電位をかけてもスポットがぼけないという成果が得られた。
腎癌肺転移成立におけるエピゲノムを介した細胞集団運動制御機構の解明

転移性腎癌の完治を目指した治療戦略の確立及び転移機構の解明は、国内外の泌尿器科が抱える共通のホットトピックの一つである。現在の転移機構の概念として、細胞集団運動およびprotrusion形成を介した転移が知られている。これまでに申請者らが樹立した腎癌肺高転移細胞株において細胞集団運動およびprotrusion形成の亢進が見出されている。先行研究にて高転移株特異的miRNAをノックアウトした結果、高転移株でprotrusion形成の抑制がみられた。しかし、低転移性の親株に同じmiRNAを強制発現させた際にはprotrusion形成はみられないものの細胞集団形成能が増大した。平成28年度の研究実績として、1:これまでに樹立した第5世代肺転移株を用いて親株と高転移株の網羅的遺伝子発現解析を行い、発現変動がみられたmiRNAの絞り込みを行った。2:1で得られたmiRNAリストより、文献検索などで転移および浸潤に関連するだろうmiRNAを絞り込み、それらmiRNAをKOするためのCRISPRライブラリを構築した。3:CRISPRライブラリを構築するにあたりCas9 Nucleaseおよび変異型Cas9 Nickaseそれぞれを用いて、最もmiRNAをKOした際のoff target効果について検討し、Nickaseベースの標的miRNA KO細胞株を構築した。以上3点が挙げられる。詳細について以降に記す。1について、親株と比較して高転移株2種と共通して発現変動が2倍以上みられたmiRNAは23個みられており、これらmiRNAを標的としてKOする2:CRISPRライブラリの構築を開始した。ライブラリ構築にあたり、最終目的であるstable KO細胞株を構築するためにCRISPRによるゲノム編集とHR TargetingによるRFP発現遺伝子カセットの導入を行い、CRISPRおよびHRベクターの遺伝子導入後、フローサイトメーターによるRFP発現細胞をソーティングした。その後、CRISPR標的領域のシークエンシングおよび標的遺伝子の発現量解析を行った。KO株の構築の際、明らかな細胞形質の変化がみられたため、3:CRISPR nucleaseおよびCRISPR nickaseそれぞれを用いてそのoff target効果および細胞形質の変化について検討し、miRNAを標的とした本研究においてはnickaseを用いることが適当であることが確認できた。以上の結果を踏まえ、CRISPRnickaseおよびHRベクターによるKO構築系を本試験では選択し、3つのmiRNAをKOした細胞株をそれぞれ構築することができた。これらの研究成果は概ね計画通り順調に進んでおり、平成29年度の研究によりKO細胞株のin vitroにおける評価、さらに動物移殖系によるin vivo評価まで研究を進めたいと考えている。これまでに、我々が樹立した腎原発肺高転移癌細胞株において親株と比較して高い発現を示すmiRNAを同定し、それらを特異的にKOするCRISPRライブラリの構築、KO細胞株の樹立まで順調に進行できている。おおむね、当初の計画・目標通りに進行できており、順調に進展しているといえる。腎癌では癌悪性化及び遠隔転移が臨床上問題になっており、転移の分子機序解明及び転移制御楽の開発が強く望まれている。これまでに我々はラット腎発がん物質EHENを用いたラット腎発がんモデルにおける発がん機序について明らかにしている。そこで本研究ではEHEN誘発ラット腎腫瘍より樹立した細胞株(d5p)および肺への高転移能を示すd5p由来高転移株(krm3及び7)を用いて、遠隔転移を視野に入れた癌悪性化の機序解明を目的し、研究を行った。in vitroにおいて、d5pに対し、PI3K/mTOR dual InhibitorであるBEZ235投与によるWST-8assayおよびタンパク発現解析の結果、低用量から用量依存的な増殖抑制作用が認められた。さらに投与1時間後より、pS6及びp4EBP1タンパク発現減少が認められ、d5pはmTOR Inhibitorに交感受性であることが明らかとなった。しかしながら、高転移株であるkrm3およびkrm7のいずれにおいても親株であるd5pに比較して、mTOR Inhibitorに対する薬剤感受性が減少していることが明らかとなった。また興味深いことに、VEGF-TKIに対する薬剤感受性についても高転移株では親株に比較して著しい減少がみられた。また、網羅的遺伝子発現解析の結果、Ca非依存的細胞接着因子IgSF CAMsが高転移株特異的に発現していることが明らかとなった。また、CAMsの発現増加は2次元平面培養よりも3次元培養にてより顕著に遺伝子発現が増大することが明らかとなった。さらに、高転移株において、CAMs knockdownによりcell growthおよびprotrusion形成、リン酸化シグナルが阻害された。以上の結果から、IgSF CAMsの発現が細胞集団形成およびprotrusion形成に重要な役割を演ずることが明らかとなった。今後、本モデルを用いて腎癌肺転移抑制物質を検討するとともに、肺転移機序における責任分子を同定したい転移性腎癌の完治を目指した治療戦略の確立及び転移機構の解明は、国内外の泌尿器科が抱える共通のホットトピックの一つである。

平成28年度に構築したKO細胞株を用いたin vitroにおける細胞集団形成およびprotrusion lengthの評価を野生株と比較して行う。さらに、in vitroで野生株と比較して明らかな変化がみられたKO細胞株について、ラット腎被膜下への移植を行い、腎被膜下への生着能および肺への転移能について比較・検討をおこなう。泌尿器科学
tRNAおよびその関連蛋白に対する自己抗体の臨床的,病因的意義

平成8年度はtRNAおよびtRNA関連蛋白に対する抗体の検出とその臨床的意義を検討した。1.患者血清1472例を免疫沈降法でスクリーニングし,tRNAを沈降する血清を40例見出した。2.抗原蛋白成分を分析した結果,14例は抗アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)抗体であった。3.40例の血清について,脱蛋白RNAを用いた免疫沈降法を行ない、tRNA自身を認識する15血清を認めた。4.抗tRNA抗体陽性患者15例のうち、抗PLー12抗体陽性の2例はいずれも筋炎を伴わない間質性肺炎例であった。この2例を除く13例では全身性エリテマトーデスおよびシェ-グレン症候群が、臨床症状では発熱、レイノ-現象、関節炎、白血球減少、環状紅斑が高頻度に認められたが、筋症状の頻度は少なかった。平成9年度はかかる抗体が認識する自己抗原dエピトープの解析を行った。1.患者WSの抗tRNA抗体はTψCーとDーloopにより成る特異的3次構造(L字構造)を認識していた。2.RNAフットプリンティング法でこの抗体はRNAの3'末端より10-40塩基に結合していた。4.かかる3例の抗tRNA抗体が認識するtRNAの構造は互いに異なっていた。抗tRNA抗体の一部は大腸菌からヒトtRNAまで種を超えて反応した。かかる抗体が認識するtRNAの構造は単一ではなかったが、これまで報告のない膠原病の特定の病型、病像と関連することが示された。今年度はtRNAおよびtRNA関連蛋白に対する抗体の検出とその臨床的意義を検討した。1,膠原病が疑われ抗核抗体検索を依頼された患者血清1472例を^<32>P-標識HeLa細胞抽出物を用いた免疫沈降法でスクリーニングした。その結果,tRNAを沈降する血清を40例見い出した。2,^<35>Sメチオニン標識HeLa細胞抽出物を用いた免疫沈降法とHeLa細胞成分を用いた免疫ブロット法で抗原蛋白成分を分析した。その結果,14例は抗アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)抗体陽性(抗Jo-1;4例,抗PL-7;1例,抗PL-12;3例,抗EJ;4例,抗OJ;2例)であった。3,1で確認された40例の血清について,^<32>Pで標識後,フェノール抽出で脱蛋白したHeLa細胞tRNAを用いて免疫沈降法を行なった。その結果,tRNA自身を認識する血清を8例認めた。4,(1)抗ARS抗体陽性患者は全例,多発性筋炎または肺線維症患者だった。(2)抗ARS抗体以外の26例中19例は全身性エリテマトーデス(SLE)またはシェ-グレン症候群(SjS)で,ともに再発を繰り返す環状紅斑が特徴的であった。またSLEは非腎症が特徴的であった。(3)tRNA自身に対する抗体が陽性である患者は全例,環状紅斑を呈するSLEまたはSjSであった。以上,膠原病におけるtRNA沈降抗体はtRNA自身,ARSおよびその他のtRNA関連蛋白に対して多彩な反応性を示し,それぞれ特定の病像と関連することが示された。今年度はtRNAおよびtRNA関連蛋白に対する抗体が認識する自己抗原の構造(エピトープ)の解析を行った。1)WS患者血清中の抗tRNA抗体はtRNAのTψC-およびD-loopにより構成される特異的3次構造(L字構造)を認識していた。2)RNAフットプリンティング法ではこの抗体の結合部位はRNAの3'末端より10-40塩基であることが示された。3)脱蛋白HeLaRNAを抗原に用いた免疫沈降法ではこれら41例中15例(37%)がtRNAを沈降し、抗tRNA抗体陽性と考えられた。

4)大腸菌より抽出したtRNAを抗原とする免疫沈降法では、脱蛋白したtRNAを沈降した15例中、3例(KuK、KoK、WS)が大腸菌tRNAを認識した。5)かかる3例の抗tRNA抗体により認識されるtRNAの構造は互いに異なっていた。6)抗tRNA抗体陽性患者15例のうち、抗PL-12抗体陽性の2例はいずれも筋炎を伴わない間質性肺炎例であった。この2例を除く13例では全身性エリテマトーデスおよびシェ-グレン症候群またはその合併例が大部分を占めた。さらに臨床症状では発熱、レイノ-現象、関節炎、白血球減少、環状紅斑が高頻度に認められたが、筋症状の頻度は少なかった。以上の結果より、抗tRNA抗体の一部は大腸菌tRNAからヒトtRNAまで種を越えて反応することが示された。抗tRNA抗体が認識するtRNAの構造は単一ではなかったが、抗tRNA抗体がこれまで報告のない、膠原病の特定の病型または病像と関連することが示唆された。
新生児ヘモクロマトーシスの胎児肝細胞抗原蛋白の特定と母体IgG抗体測定方法の開発

希少重症疾患である新生児ヘモクロマトーシス(NH)の胎児肝細胞抗原蛋白の特定と病因母体IgG抗体の測定法の開発へ向け,以下の3つを実施した.1本邦における全国調査を通じた疾患発症率の推定と家系収集,2罹患患者血清を用いた原因蛋白の同定実験,3罹患家系のエクソーム解析を通じた原因遺伝子の絞込みである.まず,20102014年の全国調査を行い発症率は対100万出生45例と推定された.患者血清を用いた免疫染色やウエスタンブロット法による原因蛋白同定は困難であった.エクソーム解析では事前に想定していた単一遺伝子によりコードされる蛋白抗原に対する同種免疫病としての候補遺伝子は絞り込めなかった.新生児ヘモクロマトーシス(以下NH)は胎児期・新生児期から重篤な肝障害を来す極めて稀な難病であり、疾患の機序として母体から移行する抗胎児肝細胞蛋白IgG抗体が胎児肝細胞を傷害すると言われている。初年度の平成27年度は、疾患母体血清を一次抗体とし、マウス組織・cell lineに発現する蛋白を標的としたwestern blotting、免疫染色を実施した。しかし、同定には至らず、上記方法で原因蛋白を同定することは困難と判断した。遺伝子解析からのアプローチとしてのExome解析、またその後の確認のための母体血清収集のためには複数家系の把握が必要である。しかしNHは稀少疾患で、発症頻度含め本邦における実態が不明であるため、年間発症数・発症率を推定するための全国調査(新生児ヘモクロマトーシスに対する実態調査)を自施設の倫理委員会の承認を得て行った。一次調査は、全国の総合周産期母子医療センター(産婦人科、新生児科)、臓器移植センターに対して全数調査を行った。それにより、平成22年から26年の5年間における該当症例数と、該当症例がある場合の二次調査への参加の可否につき回答を得た。回収率は71.2%(275施設中196施設)であった。一次調査で二次調査に参加可能と返信のあった施設を対象に、各症例の臨床情報を収集し、同時に本研究への患者検体提供が可能かを調査した。調査期間外の症例を含め35例の本邦のNH症例の集積が可能であった。また、文献調査として、最近20年における国内のNHに対する論文・症例報告を収集し、86報告を確認した。以上のことから、NHは本邦において年間100万出生中、45例発症していることが推測された。今後、このデータを患者検体を本研究や、海外で行われている胎内治療の実施へ向けての基礎資料とする。Western blotting、免疫染色による同定を行ったが原因蛋白の同定につながらなかったため、in vitroの研究で方針の転換が必要となった。先行させることとしたExome解析に関しては、独立2家系においてゲノムDNAを収集し、ライブラリー調整とシーケンシングを行った。さらに、今後の解析のための更なる検体収集につながる全国調査を実施し、希少症例における複数独立家系の収集の足がかりとした。新生児ヘモクロマトーシスは原因不明の極めて稀な難病である。発症頻度含め本邦における実態が不明であるため,年間発症数・発症率を推定するための全国一次調査・二次調査である「新生児ヘモクロマトーシスに対する実態調査」研究を,自施設の倫理委員会の承認を得て昨年度行った.この調査にて知り得た全35例の本邦の新生児ヘモクロマトーシス症例のうち,20102014年の5年間の症例について詳細な三次調査を行い,各症例の臨床経過についてデータ収集を行った.現在,収集した症例データについて解析・検討を行い論文執筆準備中である.さらに,この中の1家系(合計3家系目)において同意を得て家系のゲノムDNAを収集し,エクソーム解析を開始した.同時に蛋白同定に必要な母体血清の収集も行った.一方,新生児ヘモクロマトーシスに対する本邦での肝移植の実施数を調査するため,上記二次調査・三次調査に加え,日本肝移植研究会の協力を得た.2008年2015年における移植数が15例であることを把握した.これらの症例の一部に対しては,摘出肝臓標本につき当該研究へ検体提供へのご協力を依頼した.また,本邦における新生児ヘモクロマトーシスに対する胎内IVIG療法の既実施8例の詳細についても全国調査を行い,投与期間中の血中IgG濃度の薬物動態について解析を行った.この成果は第69回日本産科婦人科学会学術集会で発表した.同内容は現在,論文執筆中である.研究申請時の計画であった,平成28年度の「エクソーム解析による候補遺伝子絞込み」に関しては3家系目におけるゲノムDNAを収集し,ライブラリー調整とシーケンシングを行った.また,今後の解析のための更なる検体収集につながる全国調査(三次調査)を実施し,希少症例における複数独立家系の収集の足がかりとした.最終年度である平成29年度は,本研究にて平成27-28年度に実施した全国調査「新生児ヘモクロマトーシスの対する実態調査(承認番号934)」にて収集した症例を対象に,「新生児ヘモクロマトーシスの病因解析を診断方法の開発(承認番号747)」研究への検体提供を募った.