hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムに関する研究

鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムを実験と有限要素法による数値シュミレーションによって調査、検討した。実験は、1)軸方向力とせん断破壊耐力の関係、2)部材圧縮領域の状態とせん断耐力の関係、3)初期ひび割れの影響、4)繰り返しせん断を受ける部材の挙動等、について行い、それぞれ軸方向力やせん断スパン比、腹鉄筋量、部材断面形状等をパラメータとした。軸方向力とせん断耐力の関係に着目した実験では、斜めひび割れの発生に対する軸方向力の影響と、斜めひび割れ後の二次的は耐荷機構に対する軸方向力の影響を考慮する必要があることが明らかになった。このことは、せん断耐力が部材圧縮領域の状態や初期ひび割れの状態にも影響されることとも深く関連することを説明することにも繋がった。解析においては、梁、柱部材の曲げ、せん断破壊モードについて、軸力、せん断スパン比、主鉄筋量、帯筋量、そして、段落としの位置等をパラメータとしてシュミレートし、また、応用研究として開発したプログラムによって耐震補強を施した柱部材のモデル化を試みた。耐荷シェル要素を用いたI型梁の解析では、斜めひび割れ後の部材のアーチ的な耐荷機構が表現でき、有限要素法を用いて各荷重段階での部材の要素レベルでの応力状態を知ることが、破壊メカニズムを説明するのに有効な手段であることが確認できた。柱の解析のために用いた3次元ソリッド要素は、耐震補強した部材の挙動を良く表現し、補強により部材の靭性が向上することが確かめられた。得られた成果から報告書をまとめたが、現在なお、これらの成果より鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムを幾何学的に説明するべくモデル化を検討している。しかし、限られた条件のもとでのモデル化となり、せん断問題全般を説明するまでには至っていない。今後、載荷速度や初期不整の影響、繰り返しの影響等を調査する必要性を感じている。鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムを解明する目的で、実験と数値シュミレーション解析を展開した。鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊については、斜めひび割れの発生がこれまでの研究の主要テーマであったが、その破壊を考えるとき、斜めひび割れ発生後の部材の破壊までの状態を考えることが重要な視点であると考え、この点に研究のポイントをおいた。多くのパラメータを考慮する必要であるテーマであるため、本年度は、これまで行った研究の成果にさらにI型断面の部材の実験のデータを積み重ね、また、繰り返し載荷した梁の場合についても実験を重ねた。実験については、ほぼ年度当初の計画通りにI型梁の実験を遂行でき、解析においてもこれも当初の計画通りに、これまでの有限要素法に用いていた退化シェル要素を用いて繰り返し載荷を受ける梁の解析を行い、さらにもう一つの目的としていた3次元ソリッド要素の用いた解析手法の開発も、この手法の整合性を実験結果と比較するに至った。これらの、成果については、「21th Conf.on Our World in Concrete & Structure :シンガポール」、「The Third Asian-Pacific Conferrence on Computational Mechanics :韓国」といった国際学会で発表し、国内においては、土木学会中国支部にてこれに関わる報告を3件、学内の研究紀要に4件行った。継続的なテーマでもあり、これから調査しなければならない部分も多数あることは前にも記したが、それゆえ今年度の研究は通過点に過ぎないという認識であり、現在は来年度の研究計画を見直し、次の実験供試体の準備にとりかかっている状況である。昨年度に引き続き、鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムを解明するために、実験と数値シミュレーション解析を行った。

本年行った実験は、1)軸方向引張力を受ける複鉄筋長方形梁の両振り繰り返し載荷試験(供試体9体)、2)圧縮鉄筋量をパラメータとした長方形梁の実験(供試体12体)、3)フランジ断面形状をパラメータとしたI型梁の実験(供試体30体)、そして、4)初期ひび割れを有する複鉄筋長方形梁の実験(供試体28体)である。一方解析では、実験で取り扱った各シリーズについて解析プログラムの整合性を確認して行くと同時に、実験結果のみでは見いだすことの出来ない複雑な破壊機構を説明するためにさらにパラメトリックな展開を行った。また、解析では、標準設計された実構造物にこれを適用し、構造物がさまざまな過酷環境に置かれた場合について解析的な立場から検討した。これらの結果については、平成8年9月に土木学会で報告すると共に、8月にソウル、11月にメルボルン、平成9年1月には台北における国際学会で報告した。しかし、鉄筋コンクリート棒部材のせん断破壊メカニズムを体系的に説明するためには、一層幅広い状況についての研究が必要であり、現在も実験供試体を作成している。現在、これまでの結果からコンクリート工学協会へ論文投稿中であるが、今後の研究成果を併せて、来年度、土木学会へ成果を報告する予定である。実験、解析ともこれまでの研究を発展させる形で計画し、実行した。実験は、1)ひび割れを有する矩形梁12体、2)複鉄筋を配置したI型梁20体、3)繰り返しせん断を受ける矩形梁12体、について行い、それぞれ軸方向力やせん断スパン比、腹鉄筋量等をパラメータとして行った。ひび割れを有する部材のせん断破壊メカニズムは、ひび割れの無い部材の破壊メカニズムと異なることが明らかになり、I型梁の実験からは、部材圧縮領域の状態が終局せん断耐力に影響することが示された。また、繰り返しせん断を受ける部材では、特に軸方向引張力を受ける場合に耐荷力が低下することが確認されたが、いっそうのパラメトリックな実験の必要性も感じた。解析においては、柱部材の曲げ、せん断破壊モードについて、軸力、高さ、主鉄筋量、帯筋量、そして、段落としの位置等をパラメータとしてシュミレートし、また開発したプログラムによって、耐震補強を施した柱部材のモデル化を試みた。耐荷シェル要素を用いたI型梁の解析では、斜めひび割れ後の部材のアーチ的な耐荷機構が表現でき、有限要素法を用いて各荷重段階での部材の要素レベルでの応力状態を知ることが、破壊メカニズムを説明するのに有効な手段であることが確認できた。柱の解析のために用いた3次元ソリッド要素は、耐震補強した部材の挙動を良く表現し、補強により部材の靭性が向上することが確かめられた。成果に関する発表は、平成10年6月にCONSEC(ノルウェー)、7月にコンクリート工学(日本)、11月にIWC(インド)、そして、平成11年3月CIBW99(アメリカ)で行った。
胃癌発生メカニズムの解析を可能にする胃粘膜特異的な遺伝子変異導入マウスの作成

胃癌発生機序を生体内で明らかにするために、胃において特定の遺伝子を変異させるマウスの系統を樹立した。このマウスを用いて癌遺伝子の導入、癌抑制遺伝子を不活化することでマウス胃腫瘍の発生に成功した。発癌機序を分子生物学的に検討したところ、種々のサイトカインの発現が上昇しており、それらに関与する細胞内リン酸化酵素の活性が増加していた。これらの分子の機能を阻害することにより発癌の抑制や発生した癌の縮小がみられた。本研究によって癌の発生解明や新規治療の確立に有用な知見が得られた。まず、胃粘膜に特異的に発現するTFF1遺伝子のプロモーターを用いたTFF1-Creトランスジェニックマウスの作成を行った。既報のごとくC57B6マウスのゲノムよりTFF1のプロモーター領域をPCR法で増幅、ルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングを行った。このTFF1-lucをマウス細胞株へ遺伝子導入し、コントロールルシフェラーゼベクターに比べ約5倍の活性をもつことを確認した。ルシフェラーゼ遺伝子をCreリコンビナーゼに置換したTFF1-Creプラスミドを構築し、レポータールシフェラーゼベクターLSL-creとの共発現により胃由来の細胞株で約100倍の活性をもつことを確認した。これらの結果からTFF1プロモーター領域がマウス胃粘膜で働くことが示唆された。続いてこのTFF1-Creプラスミドをマウス受精卵にマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを作成した。ゲノムのPCRにて二系統(TFF1Cre-L1,TFF1Cre-L2)にTFF1-Cre遺伝子が存在することを確認し、その二系統をレポーターマウスであるRosa26レポーターマウスと交配した。これらの仔を3週から12週まで飼育し、胃粘膜の病理標本を作成し、ガラクトシダーゼ染色施行した。野生型マウスに比べ、TFF1Cre-L1:Rosa26マウスでもTFF2Cre-L2:Rosa26マウスでも有意な染色細胞が見られなかった。現在さらに飼育を継続し、トランスジーンの発現解析を試みている。また上記と並行して、化学発癌モデルとヘリコバクター感染マウスモデルを用いて、腸上皮化生の進展、胃固有腺の変化などに関与する遺伝子について免疫染色法で検討した。その結果ASK1遺伝子が粘膜上皮細胞の細胞増殖に関与していることを明らかにした。胃粘膜特異的な遺伝子変異を可能とするために、TFF1プロモーター下にCreリコンビナーゼを発現するTFF1-Creトランスジェニックマウスを二系統(TFFICre-L1,TFFICre-L2)作成し、レポーターマウスであるRosa26レポーターマウスと交配した。12週以降の週齢の個体も含め胃粘膜のβ-galactosidase活性を認めなかった。そのため、胃粘膜を含む消化管で誘導性に遺伝子変異を起こすマウス(K19-Cre ERTトランスジェニックマウス)での検討を開始した。K19-Cre ERTトランスジェニックマウスとRosa26-EYFPレポーターマウスを交配し、タモキシフェンの投与による遺伝子誘導を検討した。タモキシフェン4mg腹腔内投与3日間、4mg経口投与3日間と0.75mg腹腔内投与7日間で1週間後の胃粘膜におけるEYFP発現を免疫染色法で調べたところ、いずれの方法でも遺伝子変異によるEYFP発現を認めた(いずれも20%程度の胃上皮細胞において)。この遺伝子変異モデルを用いてタモキシフェン誘導性胃粘膜特異的なKras変異、TGFbII型受容体ノックアウトマウスを作成している。現在TGFbII型受容体のヘテロ接合マウスを得て、タモキシフェン投与を行った。投与後12週の胃粘膜は著明に肥厚し、化生性変化がみられた。今後Kras変異、TGFbII型受容体のホモノックアウトマウスを作成し、タモキシフェン投与による胃粘膜の腫瘍性変化について検討を進める。また化学発癌モデルで明らかにした胃癌関連遺伝子であるASK1が、マウスの炎症発癌に与える影響を検討するために、野生型マウスとASK1ノックアウトマウスにヘリコバクターピロリを感染させている。今後、胃粘膜の変化を検討し、胃炎および胃の化生性変化、アポトーシスの違いなどを検討し、炎症発癌におけるASK1の役割についても解析を行う。K19-Cre ERTトランスジェニックマウスを用いて、タモキシフェン誘導性に胃上皮細胞の遺伝子改変モデルを樹立した。Kras変異、TGFbII型受容体ノックアウトマウスとの交配によって胃粘膜とくに腺窩上皮細胞において著明な過形成がおこり、化生性変化、壁細胞の消失などヒト胃癌の発生母地となる萎縮性胃炎に類似した変化が認められた。過形成細胞は免疫染色による検討ではサイクリンD1、PCNAなど細胞増殖マーカーが陽性であった。これらの細胞増殖マーカーは化学発癌によるマウス胃癌でも発現が増加しており、ASK1のノックアウトマウスでは減少していた。

続いてヒト胃癌の重要な病因となっているヘリコバクターピロリが胃粘膜の増殖や化生性変化に与える影響を検討するため野生型マウスとASK1ノックアウトマウスにヘリコバクターピロリを感染させた。ヘリコバクター感染野生型マウスでは化生性変化と壁細胞の消失を認めたが、ASK1ノックアウトマウスではおれらの変化が増悪していた。この変化における胃粘膜の役割を検討するため骨髄移植によるキメラマウスを作成した。ASK1ノックアウト胃粘膜と野生型骨髄細胞(免疫細胞)を持つマウスでは化生性変化は野生型マウスと変化なく上皮の増殖反応はやや減弱していた。一方野生型上皮とASK1ノックアウト骨髄細胞のキメラマウスでは、胃炎の悪化と化生性変化の増悪がみられた。最後にASK1を標的とした胃癌治療について、培養細胞と胃癌移植マウスを用いて検討した。ASK1阻害薬は容量依存性に胃癌の増殖を抑制し、さらに50mg/kgの投与によってマウスに対する毒性はみられなかった。本研究によって胃癌における上皮細胞増殖シグナルに重要な分子の同定と標的治療を開発しえた。TFF1-Creマウスの系統樹立はできていないが、K19-CreERTマウスの代用によって胃粘膜での遺伝子変異法が確立できた。さらに目的であるKras変異、TGFbII型受容体ノックアウトマウスの樹立が順調にすすんでおり、ヘテロ接合マウスでの胃粘膜の化生性変化も確認できているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記マウスのタモキシフェン投与による経時的な胃粘膜の変化および発癌について病理学的検討を行い、免疫染色とmRNA発現解析によって、粘膜変化に関与する遺伝子発現変化を明らかにする。またASK1の機能解析のために、ASK1胃粘膜特異的ノックアウトを作成するために、野生型マウスの骨髄移植を行い、胃炎発癌への役割を病理学的に検討する。またこれらの研究で発癌に関与する細胞内シグナルに関して、阻害剤を用いることで、発癌や増殖の抑制効果がみられるか検討する。
近代日本における代替知運動と宗教運動の相互関係に関する研究

近現代日本の代替知運動のいくつかについて、訪問や参与観察、文献調査を進める一方、関連する宗教運動についての調査研究をも進め、代替知運動と宗教運動の相互関係を捉えるための基礎的な資料を得るとともに、今後の研究の枠組みについて考察した。島本酵素農法や森田療法については文献資料による研究を進めた上で、森田療法の代表的な集団である「生活の発見」会について、訪問調査を行った。また、気功の運動の先駆的事例である野口整体や、自然食運動の先駆的事例であるマクロバイオティック(日本CI協会)についても、訪問調査を行い、インタビューや資料の収集を行った。さらに、代替知運動と関連が深い現代的な宗教運動、「精神世界」の運動について癒しの運動を中心に資料の収集を進めた。宗教教団の中では、世界救世教やワールドメイトやGLAなどの教団について、代替知運動との関連を調べた。これらの調査研究によって、代替知運動の中でもっとも大きな力をもつ癒しの運動の広がりのおおよそをつかむとともに、その他の代替知運動や宗教運動が癒しの運動とどのように関わっているか、ある程度の知見を得ることができた。特に70年代以降、「自助グループ」としての自覚をもつ運動の発展が著しいことに気付き、こうしたタイプの運動の歴史についても、新たに調査研究を開始した。一方、カナダのケベック市で開かれた国際宗教社会大会において、代替知運動研究の必要について論じたが、欧米とともにアジアの研究者から共鳴を得ることができた。その他にもこのテーマについて論議する機械を多くもつことができ、理論的な枠組みについてある程度の練り直しを行うことができた。
新規視床下部ペプチド グレリン,オレキシンおよびニューロメジンUによる中枢性摂食調節機構の研究

【1】オーファン受容体であった成長ホルモン分泌促進因子受容体の内因性リガンドとして、ヒトとラットの胃からグレリンを発見し、その細胞局在を示した。グレリンは、脳内では視床下部弓状核に産生ニューロンが存在する。【2】グレリンは強力な成長ホルモン分泌活性に加え、脂肪蓄積、摂食亢進や体重増加、消化管機能調節などエネルギー代謝調節に重要な作用を持つ。グレリンは視床下部内で、摂食亢進に機能しているneuropeptide Y系やAgRP系を活性化して、摂食亢進作用を発現する。さらにグレリンは脂肪細胞から分泌される摂食抑制ホルモンレプチンと脳内で拮抗的に作用している。【3】ヒトと多くの哺乳類におけるグレリン産生細胞の形態的特徴を詳細に解析した。グレリン細胞は、既知の消化管ホルモン産生細胞とは異なる新たな内分泌細胞で、胃で2番目に多い内分泌細胞であることを報告した。グレリン分泌顆粒は基底膜側に存在し、グレリンは血管内に分泌される。【4】グレリンは膵α細胞でグルカゴンと共存している。膵β細胞にはグレリン受容体が存在し、グレリンはCa2+系を介してβ細胞からのインスリン分泌を促進する。【5】グレリンの産生と分泌は、絶食やインスリンおよびレプチン投与で促進され、摂食やグルコース負荷で抑制された。【6】ヒトとラットの定量系を開発した。ヒト血漿グレリン濃度は体格比(BMI)と逆相関し、神経性食思不振症のようなやせで高く、肥満者で低い。またヒトでの概日リズムの研究により、グレリンが各食前に増加し、末梢から脳へ空腹情報を伝える液性因子である可能性を指摘した。【7】グレリン投与により延髄の迷走神経運動路核が活性化され、副交感神経である迷走神経遠心性線維を介して、胃酸分泌や消化管運動が亢進される。【8】グレリンは脳室内投与によりGHRH系を活性化して、成長ホルモンの産生と分泌を促進する。オーファン受容体GPR66の内在性リガンドがニューロメジンUであることを示した。ニューロメジンUの脳内分布と摂食抑制作用およびエネルギー代謝亢進作用を明らかにした。ニューロメジンUの脳室内投与によりストレス反応が惹起された。【9】ニューロメジンUはCRHニューロンを活性化し、ニューロメジンUのストレス反応は、CRHの拮抗物質やCRHノックアウトマウスでは消失することから、CRHを介して作動することを示した。ニューロメジンは胃酸分泌と胃運動を抑制した。またオキシトシンとバゾプレシンニューロンを活性化し、これらのニューロンからのホルモン分泌を促進することも明らかにした。
高度難聴の聴覚中枢の可塑性に及ぼす影響

人工内耳を埋め込んだ言語習得前失聴者、言語習得後失聴者および聴力正常者を対象に、言語音、雑音刺激を行った時の脳神経活動を、ポジトロン断層法(PET)を用いて調べ、三群の聴覚野の活動を比較した。正常人及び言語習得後失聴者はともに、雑音および言語音により、一次聴覚野では神経活動の増加を意味する約10%の血流の増加が認められたが、聴覚連合野では、言語音のみで血流増加が見られた(雑音刺激では2%程度であるのに対し、言語音刺激では916%の血流増加が見られた)。このことから、聴覚連合野は語音の認知に深く関わっていること、言語習得後失聴者が人工内耳を使用する場合、聴皮質においては正常の語音認知機構がそのまま働いていることが示唆された。一方、言語取得前失聴者では、一次聴覚野の血流増加は雑音言語音ともに36%と正常人や言語習得後失聴者よりも低く、また、言語刺激時の聴覚連合野の血流増加も13%と極端に悪かった。生後音刺激が無かった場合、聴覚中枢の神経回路網は正常とは異なる発達をするかあるいは十分に発達しない可能性が示唆された。また、言語の分析、認知機構も十分に発達していないか、長期に渡る高度難聴のために退化したものと推測されるが、正常な言語発達のためには、4歳までのいわゆる言語習得期における外界からの音刺激が重要とされており、今回の言語習得前失聴者の人工内耳使用がこの時期を過ぎてから開始されていることを考え合わせると、認知機構の退化というよりは、同機構の未発達が原因と考えられた。言語習得前失聴者で、言語習得期以前すなわち2、3歳時に人工内耳を使用し始めた場合、良好な言語認知が得られるとの報告がある。このような症例で正常の語音認知が発達するかどうかは、今後解明しなければならない課題である。(1)言語習得後および言語習得前失聴者において人工内耳を介して言語音刺激を行い、15-Oを使用したポジトロン断層法で大脳皮質の聴覚、言語関連領域の賦活状況を観察した。言語習得後失聴者では人工内耳を介した言語音刺激で一次聴覚野、聴覚連合野、運動言語野が賦活され、その程度は正常人に匹敵するものであった。一方、言語習得前失聴者では人工内耳を介した言語音刺激でも聴覚連合野の賦活化が見られなかった。今回の研究により高度難聴によって言語習得過程に外界からの言語音刺激が得られなかった場合には聴覚連合野の語音処理のための神経回路網が殆ど発達しない事が客観的方法によって初めて明らかにされた。(2)純音及び言語音刺激を正常人、一側高度難聴者及び耳鳴患者に行い、聴覚野の反応を122チャンネル脳磁図計を用いて観察した。一側高度難聴がある場合、正常で見られた反対側の聴覚野の反応の優位性が消失して行く傾向が観察され、耳鳴患者でも聴覚中枢の音への反応性が変化する事が確認された。一側難聴や耳鳴により聴覚中枢における神経回路の再編成が起こり、成人でも中枢神経系に可塑性がある事がわかった。(3)神経細胞の酸素代謝の主要酵素であるシトクロムオキシダーゼを指標として神経軸索切断の第8脳神経の一次神経機能に及ぼす影響を動物実験で観察した。軸索損傷により一次神経細胞は小型化するが、その代謝は低下しつつもある程度保持される事が明らかになった。

また、HRPを用いて一次神経の脳幹への投射を解剖学的に確認する方法を前庭神経で確立した。これらは脳代謝画像、脳磁図で得られた所見の神経細胞レベルでの解釈の基礎データを形成する。人工内耳を埋め込んだ言語習得前失聴者、言語習得後失聴者および聴力正常者を対象に、言語音、雑音刺激を行った時の脳神経活動を、ポジトロン断層法(PET)を用いて調べ、三群の聴覚野の活動を比較した。正常人及び言語習得後失聴者はともに、雑音および言語音により、一次聴覚野では神経活動の増加を意味する約10%の血流の増加が認められたが、聴覚連合野では、言語音のみで血流増加が見られた(雑音刺激では2%程度であるのに対し、言語音刺激では916%の血流増加が見られた)。このことから、聴覚連合野は語音の認知に深く関わっていること、言語習得後失聴者が人工内耳を使用する場合、聴皮質においては正常の語音認知機構がそのまま働いていることが示唆された。一方、言語取得前失聴者では、一次聴覚野の血流増加は雑音言語音ともに36%と正常人や言語習得後失聴者よりも低く、また、言語刺激時の聴覚連合野の血流増加も13%と極端に悪かった。生後音刺激が無かった場合、聴覚中枢の神経回路網は正常とは異なる発達をするかあるいは十分に発達しない可能性が示唆された。また、言語の分析、認知機構も十分に発達していないか、長期に渡る高度難聴のために退化したものと推測されるが、正常な言語発達のためには、4歳までのいわゆる言語習得期における外界からの音刺激が重要とされており、今回の言語習得前失聴者の人工内耳使用がこの時期を過ぎてから開始されていることを考え合わせると、認知機構の退化というよりは、同機構の未発達が原因と考えられた。言語習得前失聴者で、言語習得期以前すなわち2、3歳時に人工内耳を使用し始めた場合、良好な言語認知が得られるとの報告がある。このような症例で正常の語音認知が発達するかどうかは、今後解明しなければならない課題である。
食品因子による特異的な脱SUMO化酵素の阻害を介した高血糖予防効果の解明

本研究課題において、膵臓における食品因子の脱SUMO化を介した高血糖予防効果の検証を行った。平成29年度は、マウス膵β細胞由来細胞株MIN6を用いて、メチルキサンチン類の脱SUMO化酵素発現量およびインスリン分泌について検討した。脱SUMO化酵素の発現を変化させる複数のメチルキサンチン類を見出した。また、培養液中のグルコース濃度がインスリン分泌に大きく影響を与え、食品因子による影響を変化させることが明らかとなった。平成30年度は、マウスから単離した膵島を用いて、食品因子による効果について検討を行ったところ、膵島を用いた実験においても培養細胞と同様の現象が観察された。また、マウス膵β細胞および膵島を用いた脱SUMO化酵素の阻害を介したインスリン分泌の作用機序を評価する予定であったが、使用を予定していた研究試薬の販売停止により、詳細な検討を行うことができなかった。そこで、膵臓の機能破綻の一因として、ストレスによるアポトーシスがあげられるため、食品因子が脱SUMO化酵素の阻害を介してアポトーシスを抑制するかを検証することとした。強力に脱SUMO化酵素を阻害するvialinin Aは、MIN6細胞において、酸化ストレスによるアポトーシスを抑制することが明らかとなった。また、vialinin Aは、Nrf2の安定化を介して、抗酸化タンパク質であるHO-1の発現量を増加させる傾向が観察された。Nrf2はSUMO化されることで安定化することが知られていることから、vialinin Aは、脱SUMO化酵素の酵素活性を阻害することでNrf2を安定化させ、抗酸化タンパク質の発現上昇を介してアポトーシスを抑制していることが予想された。これらのことから、膵臓における脱SUMO化酵素の阻害は、アポトーシスの抑制につながり、高血糖の予防に寄与することが予想される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年の「国民健康・栄養調査」の結果によると、糖尿病が強く疑われる者(糖尿病有病者)、糖尿病の可能性を否定できない者(糖尿病予備群)はいずれも約1,000万人と推計されることがわかった。高血糖および糖尿病を防ぐには血糖値を正常に制御することが重要である。膵臓から分泌されるインスリンは、抹消組織である筋肉や脂肪組織に糖を取り込ませることで血糖の制御を行っている。本研究では、脱SUMO化酵素に着目し、膵島からのインスリン分泌機構の解明および有効な食品因子の探索について検討することを目的としている。平成29年度は、マウス膵β細胞由来細胞株MIN6を用いて、食品因子の脱SUMO化酵素SENP1およびSENP2の発現量に与える影響について検討した。MIN6細胞は、グルコースに応答し、SENP1を活性化させてインスリンを分泌することが知られている細胞株であることから、異なるグルコース濃度の培養条件で検討した。また、食品因子の処理時間はタンパク質の発現を考慮し、24時間前処理とした。低グルコース濃度培養条件下において、テオフィリンの処理は、SENP1の発現量を有意に上昇させ、SENP2の発現量を上昇させた。一方で、カフェインの処理は、SENP1の発現量を減少させ、SENP2の発現量に影響は与えなかった。高グルコース濃度培養条件下において、テオブロミン処理は、SENP1の発現量を上昇させ、SENP2の発現量を有意に上昇させた。一方で、アデノシン処理は、SENP1の発現量を有意に減少させ、SENP2の発現量に影響を与えなかった。これらのことから、グルコース濃度の培養条件の違いが、食品因子の脱SUMO化酵素の発現に与える影響に差異が生じることが明らかとなった。今後は、脱SUMO化酵素を介したインスリン分泌機構を解明し、食品因子による効果を検討する予定である。平成29年度は、上記の結果の通り、グルコース濃度の培養条件により、食品因子の効果が異なることが明らかになったことから、インスリン分泌機構にも違いが生じていることが示唆された。そこで、それぞれの条件下におけるインスリン分泌機構を詳細に解明することが必要である。また、マウスより単離された膵島における検討が進んでいないことから、当初の計画よりはやや遅れていると判断した。

また、vialinin Aは、Nrf2の安定化を介して、抗酸化タンパク質であるHO-1の発現量を増加させる傾向が観察された。Nrf2はSUMO化されることで安定化することが知られていることから、vialinin Aは、脱SUMO化酵素の酵素活性を阻害することでNrf2を安定化させ、抗酸化タンパク質の発現上昇を介してアポトーシスを抑制していることが予想された。これらのことから、膵臓における脱SUMO化酵素の阻害は、アポトーシスの抑制につながり、高血糖の予防に寄与することが予想される。当初の計画では、正常のグルコース濃度のみの条件で検討する予定であった。しかしながら、グルコース濃度の条件により結果に差異が生じたことを受け、それぞれのモデルにおいてインスリン分泌機構を詳細に検討することとした。また、マウスより単離した膵島においても検討する予定である。さらに、インスリン分泌を促進させる食品因子を用いて、マウスにおける高血糖予防効果を検証する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
海洋性好熱古細菌からの水素エネルギーに応用可能な次世代型ヒドロゲナーゼの研究

(1)小笠原水曜海山の深海熱水孔環境から分離されたAeropyrum caminiを供試菌として、85°Cで好気環境下において旋回培養を行い、高い細胞収量が得られる条件を確立した。そのため海水培地の詳細な検討を行なった。本培養条件下で得られた菌体を、フレンチプレスを用いて細胞破砕し、遠心分離後の上清画分を各種カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを精製した。本酵素は85°Cにおいて最大活性を示し、また極めて高い耐熱性を有していた。酵素活性は、生産された水素をガスクロマトグラフィーを用いて定量して確認した。(2)精製した本酵素を交互積層法にて炭素電極に固定化した。密閉バイアルビンにbufferを入れ窒素でバブリング後、本酵素固定化炭素電極にて1.5V印加し、ガスクロマトグラフィーにて水素量を測定した。その結果本酵素固定化電極では、生産された水素量は印加開始から50時間後も増加を続けたことから、本酵素の利用に向けた可能性が明らかになった。1.多くの分離株から効率的なヒドロゲナーゼ活性の検索を行なうために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いた活性染色法を検討して、70°C以上の高温下で効率的な活性染色法を可能にする方法を開発し、ゲル濃度をスキャニングして定量化する解析ソフトを用いて活性の定量的な測定法を確立した。2.鹿児島県山川町の海岸熱水環境から、8090°Cで増殖する好気性超好熱菌を種々の培地を用いて分離し、単離後16S rDNAの部分配列により簡便な種の同定を行なった後、性状解析を行い培養後にヒドロゲナーゼ活性の検索を行なうための分離株の条件を設定した。3.今回分離した多くの絶対好気性超好熱古細菌Aeropyrum pernix株や、既に申請者が小笠原トラフ水曜海山の深海熱水孔から分離した同属種のA.camini株を90°Cで培養し、菌体を超音波で破砕し上記で確立した手法で本酵素の検索を行なった。その結果、.A.caminiからは本酵素活性が明確に認められたが、A.Pernix株においては活性が認められる株を殆ど活性を検出できない株が存在した。4.A.camini株を大量に培養して、菌体をフレンチプレスにて破砕し細胞画分からヒドロゲナーゼ活性を各種カラムクロマトグラフィーにより部分精製を行った。(1)小笠原水曜海山の深海熱水孔から我々によって分離された超好熱古細菌Aeropyrum caminiを、85°Cにて好気的に大量培養し、本菌体をフレンチプレスにて細胞破砕し、遠心分画した上清をQ Sepharoseやゲルろ過にかけヒドロゲナーゼを精製し、本酵素を触媒として水素生産系の構築をなった。まず還元剤を用いた水素生産系は、MESbuffer系にMethl viologen (MV)を加えてバイアル瓶に入れ、窒素ガス置換して確立した。酵素添加後80°Cで反応し比色法により測定した結果6分後還元剤MVは全て酸化され、39nmol/mlの水素ガスが生産された。次に炭素電極を用いた水素生産系はMESbuffer系にMVを加えバイアル瓶に入れた後ブチルゴムに炭素電極を固定し、窒素ガス置換して確立した。酵素添加後80°Cで反応させガスクロマトグラフィーにて水素生産量を測定した。その結果、電極水素生産系では、3.4nmol/mlの水素ガスが生産された。以上により、本酵素を用いた水素生産の有効性が証明された。(2)A.caminiと同属のAeropyrum pernixを各地の熱水環境から分離し、培養株の粗酵素液を用いてヒドロゲナーゼ活性染色法を用いて高活性株の検索を行なった。鹿児島県山川町の沿岸熱水孔から分離した多数の株の中から、A.caminiの約7倍の活性を示す高活性株を見出した。さらに本酵素遺伝子であるAPE2213、APE2216およびAPE2219の塩基配列を比較した結果、一次構造においても高活性株と低活性株に分かれた。しかしながら、本酵素遺伝子の転写量と酵素活性の間には相関性は見られなかった。従って、本酵素の発現に複雑な成熟過程が関与していると推測された。
高伝導性を示す有機金属化合物錯体の電子状態と物性

高伝導性有機金属化合物錯体の開発をめざし, Ni(dmit)_2の錯体の合成およびその電子状態と電気物性の解明を行った.HMTSFとの錯体では通常の物質のように,圧力とともに抵抗は減少するが, HMTTeFとの錯体では圧力を増すとともに抵抗が増大した.両錯体とも半導体的温度変化を示し,圧力の増加に伴い活性化エネルギーも大きくなった. Ni(dmit)_2錯体の超伝導体の転移温度の圧力依存性はほかの有機超伝導体と逆であることと,今回見いだした逆の圧力依存性との関連は興味深く,両錯体の構造と伝導度の圧力依存性の関連について検討中である.一方M(dmit)_2が電気伝導に関与する時,中心金属が伝導に寄与するか,まわりの有機部が寄与するか調べることは伝導機構を解明するために重要である.そのためab intio SCF分子軌道計算を行った.各酸化数での電荷分布から,酸化数が変化してもNi上の電荷分布は,ほとんど変化せず,酸化数が0から-2に変化しても,わずかに電荷が0.04減少するにすぎないことがわかった.この結果はこれまでの実験結果とよく対応している.電荷分布の変化は硫黄原子に大きく現れることも明らかになった. Ni(dmit)_2や類似化合物であるNi(mnt)_2では酸化数の変化に伴い大きな変化が見られる原子は硫黄である.硫黄原子は炭素原子などと異なり,浅いレベルに軌道の広がりが大きいd軌道をもつ.この軌道が電気伝導に寄与するかどうか調べることはこのような錯体における伝導機構およびカルコゲン原子を含む有機伝導体の伝導機構を解明するためにも重要である. Ni(mnt)_2錯体の硫黄原子の電子状態を内殻励起吸収スペクトルを測定し調べた.その結果Ni(mnt)_2のHOMOに硫黄原子の寄与がほとんどないことが明らかになった.したがって電気伝導にも硫黄原子のd軌道はほとんど関与しないことがわかった.高伝導性有機金属化合物錯体の開発をめざし, Ni(dmit)_2の錯体の合成およびその電子状態と電気物性の解明を行った.HMTSFとの錯体では通常の物質のように,圧力とともに抵抗は減少するが, HMTTeFとの錯体では圧力を増すとともに抵抗が増大した.両錯体とも半導体的温度変化を示し,圧力の増加に伴い活性化エネルギーも大きくなった. Ni(dmit)_2錯体の超伝導体の転移温度の圧力依存性はほかの有機超伝導体と逆であることと,今回見いだした逆の圧力依存性との関連は興味深く,両錯体の構造と伝導度の圧力依存性の関連について検討中である.一方M(dmit)_2が電気伝導に関与する時,中心金属が伝導に寄与するか,まわりの有機部が寄与するか調べることは伝導機構を解明するために重要である.そのためab intio SCF分子軌道計算を行った.各酸化数での電荷分布から,酸化数が変化してもNi上の電荷分布は,ほとんど変化せず,酸化数が0から-2に変化しても,わずかに電荷が0.04減少するにすぎないことがわかった.この結果はこれまでの実験結果とよく対応している.電荷分布の変化は硫黄原子に大きく現れることも明らかになった. Ni(dmit)_2や類似化合物であるNi(mnt)_2では酸化数の変化に伴い大きな変化が見られる原子は硫黄である.硫黄原子は炭素原子などと異なり,浅いレベルに軌道の広がりが大きいd軌道をもつ.この軌道が電気伝導に寄与するかどうか調べることはこのような錯体における伝導機構およびカルコゲン原子を含む有機伝導体の伝導機構を解明するためにも重要である. Ni(mnt)_2錯体の硫黄原子の電子状態を内殻励起吸収スペクトルを測定し調べた.その結果Ni(mnt)_2のHOMOに硫黄原子の寄与がほとんどないことが明らかになった.したがって電気伝導にも硫黄原子のd軌道はほとんど関与しないことがわかった.
ヒト甲状腺髄様がん癌抑制遺伝子としての野生型N-ras遺伝子

Rbヘテロ型欠損マウスは、甲状腺C(カルシトニン産生)細胞において、正常アレルの体性欠損により、C細胞腺腫(良性)を生じる。このマウスでN-ras遺伝子を追加欠損すると、Rb欠損C細胞腺腫が悪性転換する。RbN-ras二重ヘテロ型マウスに生じたC細胞腫では、Rbの正常アレル欠損に続いて、N-ras遺伝子座のLOHと悪性化が観察された。特定の遺伝学的背景において、N-rasが、がん抑制遺伝子様の挙動を示したということだ。本研究は、まず、N-rasの癌抑制作用の本態を明らかにすること、そして、ヒトのC細胞癌に該当する甲状腺髄様がん、とくにret癌遺伝子異常の比較的少ない散発性の症例で、N-ras遺伝子の異常を見いだすことが出来るかを検討することを主眼とした。N-ras野生型のRb欠損C細胞腺腫を詳細に解析したところ、多種のDNA損傷応答因子と、セネセンスマーカーの発現を観察した。これらはことごとく、N-rasホモ型マウスから生じた腫瘍では、発現消失していた。Rbパスウェイの異常は、ヒト発癌にほぼ必須のイベントだが、Rb遺伝子自身の突然変異は、限定された種類の癌でしか見つからない。我々の発見は、Rb遺伝子の失活が、N-ras依存的に、DNA損傷応答、セネセンスを誘導することにより、腫瘍が完に癌化することを妨げることを示唆した。また、RbN-ras両欠損細胞株と、マイクロアレイを用いた解析から、Rb欠失が、E2F依存的に、N-Rasの活性制御に直接関わる一連の遺伝子群の転写活性化を誘導することも突き止めた。これは、癌化に対抗する重要な生体防御機構のひとつと考える。一方で、ヒト癌の解析では、東京女子医大内分泌外科より、約20症例の提供を受け、免疫組織学的な解析を開始、ゲノム解析の為の予備的データを蓄積した。Rbパスウェイの異常は、ヒト発癌において頻繁に観察される。Rbヘテロ型欠損マウスは、脳下垂体中葉細胞と甲状腺C(カルシトニン産生)細胞において、正常アレルの体性欠損により、それぞれ、下垂体腺癌(悪性)、C細胞腺腫(良性)を生じる。このマウスでN-ras遺伝子を追加欠損すると、Rb欠損C細胞腺腫が悪性転換し、高率に肝転移する。我々の発見は、Rb遺伝子の失活が、N-ras依存的に、DNA損傷応答、セネセンスを誘導することにより、腫瘍が完全に癌化することを妨げることを示唆した。

一方で、ヒト癌の解析では、解析に適した品質の標本の入手が遅延し、H18年度予算繰り越しの原因となった。倫理委承認のもと、ようやく、東京女子医大内分泌外科より、約20症例の提供を受け、免疫組織学的な解析を開始、ゲノム解析の為の予備的データを蓄積した。Rbヘテロ型欠損マウスは、甲状腺C(カルシトニン産生)細胞において、正常アレルの体性欠損により、C細胞腺腫(良性)を生じる。このマウスでN-ras遺伝子を追加欠損すると、Rb欠損C細胞腺腫が悪性転換する。RbN-ras二重ヘテロ型マウスに生じたC細胞腫では、Rbの正常アレル欠損に続いて、N-ras遺伝子座のLOHと悪性化が観察された。特定の遺伝学的背景において、N-rasが、がん抑制遺伝子様の挙動を示したということだ。本研究は、まず、N-rasの癌抑制作用の本態を明らかにすること、そして、ヒトのC細胞癌に該当する甲状腺髄様がん、とくにret癌遺伝子異常の比較的少ない散発性の症例で、N-ras遺伝子の異常を見いだすことが出来るかを検討することを主眼とした。N-ras野生型のRb欠損C細胞腺腫を詳細に解析したところ、多種のDNA損傷応答因子と、セネセンスマーカーの発現を観察した。これらはことごとく、N-rasホモ型マウスから生じた腫瘍では、発現消失していた。Rbパスウェイの異常は、ヒト発癌にほぼ必須のイベントだが、Rb遺伝子自身の突然変異は、限定された種類の癌でしか見つからない。我々の発見は、Rb遺伝子の失活が、N-ras依存的に、DNA損傷応答、セネセンスを誘導することにより、腫瘍が完全に癌化することを妨げることを示唆した。また、RbN-ras両欠損細胞株と、マイクロアレイを用いた解析から、Rb欠失が、E2F依存的に、N-Rasの活性制御に直接関わる-連の遺伝子群の転写活性化を誘導することも突き止めた。これは、癌化に対抗する重要な生体防御機構のひとつと考える。一方で、ヒト癌の解析では、東京女子医大内分泌外科より、約20症例の提供を受け、免疫組織学的な解析を開始、ゲノム解析の為の予備的データを蓄積した。
脳機能・自律神経機能の測定・解析による若年者の性格安定度の定量化

本研究では、若年者における脳機能変化を定量的に捉えることで、不安定性格の形成過程(原因)および不安定性格の構成要素(症状)を抽出することを目的とした。方法として、脳波を用いた脳機能および脈波を用いた自律神経機能を測定・解析し、ストレスとトラウマ(心の傷)に関する脳機能変化の定量化を行った。その結果、ストレス時における脳機能活動は生体抵抗性と類似した傾向を示し、トラウマ保有者はトラウマを連想させる状況で脳機能が活性化することを示した。[目的」本研究では、若年者における「脳機能変化を定量的に捉えることで、不安定性格の形成過程(原因)および不安定性格の構成要素(症状)を抽出すること」を目的とする。その際、非定常解析を用いた詳細な脳機能解析を行い、微細な脳の時間的空間的変化を捉える。それにより、次の問題の解決を目指す。一つは、不安定な性格がどの時期にどのような原因で形成されたのかということであり、脳機能変化の定量化を用いて、人間関係におけるトラウマ(心の傷)を抽出することにより、定量的にヒトの不安定な性格形成の過程を調べる。もう一つは、不安定な性格とは、どの点が問題であるかということである。つまり、不安定な性格を構成する感情と意欲の種類と強さを調べる。これらの問題を客観的・定量的に明らかにすることで、精神的問題を抱える患者の治療をより効果的に行うことが可能となり、さらには、精神疾患の予防に役立つと考える。[研究実施]本研究は、若年者の不安定性格の原因とその構成要素を、脳機能(脳波、fMRI)や自律神経機能(心電図、脈波、サーモグラフィ)を測定・解析することで、定量的に調べている。平成19年度の研究実績は次の通りである。1脳機能解析手法の開発脳機能測定として、脳波を用いて、脳機能状態を時々刻々に捉え、さらに情報の部位間伝播や関連性を調べる非定常解析手法を開発した。2自律神経機能解析手法の開発自律神経機能測定として、心電図、脈波、サーモグラフィによる顔面および末梢温度変化を用いて、自律神経反応の非定常解析手法を開発した。現在、脳機能との関連性を求めるアルゴリズムを開発中である。3情動刺激タスクの作成ヒトのトラウマ、ストレス、感情、性格安定度を客観的に評価するために、視聴覚動画像を用いた情動刺激タスクを作成した。以上より次年度では、情動刺激下での脳機能、自律神経機能測定・解析を速やかに開始する事が可能である。[目的]本研究では、若年者における「脳機能変化を定量的に捉えることで、不安定性格の形成過程(原因)および不安定性格の構成要素(症状)を抽出すること」を目的とした。その際、非定常解析を用いた詳細な脳機能解析を行い、微細な脳の時間的空間的変化を捉えることにより、ストレスとトラウマ(心の傷)に関する脳機能変化の定量化を目指した。[研究実施]本研究では、若年者の不安定性格の原因とその構成要素を、脳波を用いた脳機能および脈波を用いた自律神経機能を測定・解析することで、定量的に調べた。その結果は次の通りである。1.不快情動ストレス負荷時は、ストレス群では脳波の相対パワースペクトル値が有意に経時的減少を示し、非ストレス群では有意な増加を示した。2.自律神経機能では、非ストレス群はストレス群と比較して反応性がより高く、副交感神経機能が有意に高いことが分かった。3.ストレス時における脳機能活動は生体抵抗性と類似した傾向を示すことが分かった。4.人間関係に関するトラウマ保有者は、人間関係に関する刺激により、脳波の平均パワースペクトル値が有意に高値を示した。5.兵庫県出身者(大地震経験者)の内、性格不安定群において、地震タスク刺激下では、脳波の平均パワースペクトル値が有意に高値を示した。6.トラウマ保有者は、トラウマを連想させる状況で脳機能が活性化することを示した。
マウス精母細胞におけるプロテインホスファターゼ2Cの特異的発現の意義

我々はこれまでに、PP2Cには6種類のアイソフォーム(α, β-1, β-2, β-3, β-4およびβ-5)が存在することを明らかにした。これからのうちαとβは異なった遺伝子産物であり、βの5種類のアイソフォームは単一のpre-mRNAからの選択的スプライシングの産物である。また,これまでの研究の結果,マウス精巣の第1減数分裂パキテン期の精母細胞において、PP2Cβ-3, -4および-5の発現が著しく上昇することが明らかになった。そこで、今回、精母細胞におけるPP2Cβ遺伝子の発現制御機構の解明を目的に、PP2CβゲノムDNAのクローンングと構造解析およびRT-PCRを用いた転写産物の解析を行った。その結果、翻訳開始点を含むエクソン(IV)の上流に3つのエクソン(I, II, III,)が存在し、新生児マウス精巣(精巣細胞のみを含む)ではIIVを含む転写産物のみが検出されたのに対し、成獣マウス精巣の転写産物では、II, III, IVエクソンの読みとりが行われた。さらに、Iエクソンの上流には構成的発現に関与すると考えられるプロモーター活性が検出された。以上の結果から、IIエクソンの上流に精巣特異的発現に関わるプロモーターが存在することが示唆され、現在その解析を進めている。PP2Cの6種類のアイソフォームの機能の解析を目的に、HAタッグをPP2CのN末端に付加したキメラタンパク質のCOS7細胞での発現システムを確立した。抗HA抗体による免疫染色により、発現されたPP2Cの細胞内局在を調べたところ、いずれのアイソフォームも、主に細胞核い局在することが判明した。また、6種類のアイソフォームのうちPP2Cαのみが細胞内でリン酸化され、その部位がC末端領域のセリン残基であること、および、PP2Cαのリン酸化レベルが、培養中に添加したオカダ酸によって2倍に上昇することが明らかになった。以上のことから、PP2Cαを介する新規の脱リン酸カスケードの存在が示唆された。
高率に心筋に分化する細胞株を用いた心筋細胞分化機序の解析

我々の研究の目的は、非心筋細胞から心筋細胞を分化誘導する手法の確立と、それを応用した心筋再生医療の実現である。我々は、心筋細胞分化の分子的機序の解明を果たすため、細胞増殖因子に着目し以下の研究を行った。転写因子SmadファミリーとMAPKKKであるTAK1は心筋分化にも重要な骨形成因子(BMP)のシグナル伝達因子であり、また最近ATF/CREBファミリーに属する転写因子ATF-2がSmadとTAK1の共通の核内ターゲットであることが報告された。そこで心筋分化の有用なモデルであるP19CL6細胞培養系を用いてSmad、TAK1およびATF-2による心筋細胞分化への関与を検討した。P19CL6はジメチルスルフォキシド(DMSO)の存在下で高率に心筋細胞に分化するが、BMPの阻害因子であるnogginを恒常的に過剰発現する細胞株P19CL6nogginは心筋細胞へは分化しなかった。この細胞にBMP特異的なSmadであるSmad1と共通のSmadであるSmad4の両者を同時に過剰発現させると、DMSOの存在下で拍動する心筋に分化した。一方抑制型SmadであるSmad6を恒常的に過剰発現させた細胞株を解析すると、心筋細胞へは分化せず、心筋特異的遺伝子の発現も認めれなかった。すなわち、Smad経路がBMPにより誘導される心筋細胞の分化に必須であることが示された。また転写因子ATF-2はSmadおよびTAK1と協調してβMHCのプロモーター活性を上昇させた。不活性型のATF-2の過剰発現によって心筋特異的遺伝子のプロモーター活性は抑制され、心筋特異的遺伝子の発現および心筋細胞への分化も抑制された。以上により、ATF-2がSmadおよびTAK1と協調して心筋細胞の分化に重要な役割を果たすことが示唆された。この研究によって、心筋分化におけるBMPシグナルの重要性が分子レベルで明らかとなった。そこでP19CL6細胞培養系を用いてSmad、TAK1およびATF-2が心筋細胞分化に関与しているかどうかを検討した。この細胞にBMP特異的なSmadであるSmad1と共通のSmadであるSmad4の両者をリポフェクション法を用いて同時に過剰発現させると、DMSOの存在下で抗MHC抗体を用いた免疫染色に陽性の拍動する心筋に分化した。一方BMPのシグナルを抑制すると考えられているSmad6を恒常的に過剰発現する細胞株P19CL6Smad6を単離し解析したところ、DMSO処理によっても拍動する心筋細胞へは分化せず、ノーザンブロット法などによる心筋特異的遺伝子の発現も認められなかった。これらのことから、Smad経路がBMPにより誘導される心筋細胞の分化に必須であることが新たに示された。

またP19CL6を用いたルシフェラーゼ・アッセイにより転写因子ATF-2はSmadおよびTAK1と協調してβMHCのプロモーター活性を上昇させた。逆に不活性型のATF-2の過剰発現によってβMHCを含むいくつかの心筋特異的遺伝子のプロモーター活性は抑制され、更には心筋特異的遺伝子のmRNAの発現および心筋細胞への分化も抑制された。以上により、ATF-2がSmadおよびTAK1と協調して心筋細胞の分化に重要な役割を果たすことが初めて示された。心筋細胞は増殖能、再生能を持たず、廃絶した心筋は二度と回復が望めない点が心不全の治療を困難にする原因となっている。我々の研究の目的は、非心筋細胞から心筋細胞を分化誘導し、それを不全心への移植により心機能を改善させる、すなわち、自己の細胞から心臓を再生させるという再生医療の実現である、本研究では、心筋細胞分化の分子的機序の解明、非心筋細胞から心筋細胞を分化誘導する分子生物学的手法の確立を目的とした。転写因子SmadファミリーとMAPKKKであるTAK1は心筋分化にも重要な骨形成因子(BMP)のシグナル伝達因子であり、また最近ATF/CREBファミリーに属する転写因子ATF-2がSmadとTAK1の共通の核内ターゲツトであることが報告された。そこでP19CL6細胞培養系を用いてSmad、TAK1およびATF-2による心筋細胞分化への関与を検討した。P19CL6はジメチルスルフォキシド(DMSO)の存在下で高率に心筋細胞に分化するが、BMPの阻害因子であるnogginを恒常的に過剰発現する細胞株P19CL6nogginは心筋細胞へは分化しなかった。この細胞にBMP特異的なSmadであるSmad1と共通のSmadであるsmad4の両者を同時に過剰発現させると、DMSOの存在下で拍動する心筋に分化した。一方BMPのシグナルを抑制すると考えられているSmad6を恒常的に過剰発現する細胞株P19CL6Smad6を解析すると、DMSO処理で拍動する心筋細胞へは分化せず、心筋特異的遺伝子の発現も認めれなかった。すなわち、Smad経路がBMPにより誘導される心筋細胞の分化に必須であることを示した。またP19CL6を用いた解析で、転写因子ATF-2はSmadおよびTAK1と協調してβMHCのプロモーター活性を上昇させた。不活性型のATF-2の過剰発現によって心筋特異的遺伝子のプロモーター活性は抑制され、心筋特異的遺伝子の発現および心筋細胞への分化も抑制された。以上、ATF-2がSmadおよびTAK1と協調して心筋細胞の分化に重要な役割を果たすことも証明した。我々の研究の目的は、非心筋細胞から心筋細胞を分化誘導する手法の確立と、それを応用した心筋再生医療の実現である。我々は、心筋細胞分化の分子的機序の解明を果たすため、細胞増殖因子に着目し以下の研究を行った。転写因子SmadファミリーとMAPKKKであるTAK1は心筋分化にも重要な骨形成因子(BMP)のシグナル伝達因子であり、また最近ATF/CREBファミリーに属する転写因子ATF-2がSmadとTAK1の共通の核内ターゲットであることが報告された。そこで心筋分化の有用なモデルであるP19CL6細胞培養系を用いてSmad、TAK1およびATF-2による心筋細胞分化への関与を検討した。
シアン・チオシアンの生物酸化分解に関する研究

製鉄所のコークス炉廃水などに含まれる有害・難分解性物質であるシアン・チオシアンの生物酸化分解を行なったところ、以下に示す知見を得た。1.チオシアン分解菌の馴養:コークス炉廃水の活性汚泥処理施設より種汚泥を採取し、汚泥抜き取り操作,ステップ状の滞留時間短縮操作,ステップ状の基質濃度増加操作を駆使して、チオシアン馴養を行なった。この馴養の結果、約70日で入口チオシアン濃度200ppmを95%処理可能とする分解菌を得た。また、チオシアン分解菌は壁面に付着しやすい性質を持つので、チオシアンの処理には活性汚泥法より生物膜法の方が向いていることが判明した。2.接触曝気型流動層によるチオシアン処理:接触曝気型流動層を用いてチオシアン処理を行なったところ、この装置による処理方法がチオシアン処理に向いていることが判明した。また、実験過程で、入口濃度に変動を与えると出口濃度が逆転する現象が認められた。これは、変動のショックによって、生物膜に吸着されていたチオシアンが放出されて濃度が増加したためと考えられた。この現象は、馴養時にも確認された。処理実験結果を、先に著者らが提出した生物膜法の処理特性式に適用したところ、チオシアンの処理はO次反応であることが判明し、その処理特性値Kの値は、K=7.58g/【m^2】aayと得られた。3.シアン・チオシアン複合基質の処理:シアン・チオシアンの複合基質を活性汚泥法で回分処理したところ、チオシアンの処理は初発シアン濃度にかかわらずシアン濃度が約0.2ppmに減少して初めて進行した。このことからシアン・チオシアンの処理は、(1)シアン,(2)チオシアンの順に進行することが判明した。また、シアン共存下でのチオシアン比基質除去速度を計算すると、シアン無添加の場合に比べて約1/2に低下した。これより、シアンはチオシアン処理に阻害を示すことが判明した。
エネルギー代謝を介した造血幹細胞の自己複製分裂・分化分裂のスイッチング

造血幹細胞は造血システムにおいて最も中心的な役割を果たす体性幹細胞として知られているが、その自己複製分裂の制御機構においては未だ不明な点が多い。これまでに申請者らは、分裂誘導時に上昇する造血幹細胞の細胞内Ca2+/ミトコンドリア膜電位を抑制することが、分裂後の幹細胞の運命を「分化」から「幹細胞性維持」にシフトさせることを見出している。本研究では、分裂誘導刺激時のエネルギー代謝の状態が自己複製分裂・分化分裂のスイッチと働くことを明らかにし、造血幹細胞の自己複製分裂のメカニズムに迫ることを目的とする。