hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
婦人科癌幹細胞の特性と上皮間葉転換

培養の結果から、腹膜中皮細胞はCD133発現維持に関与するとともに、CD133陽性細胞においてのみ、コロニー形成能、腹膜浸潤能を亢進し、がん幹細胞ニッチとしての機能をもつことを証明した。さらに我々はCD133陽性細胞においてCXCR4の発現が亢進していることを確認し、CXCR4中和抗体投与したところ腹膜中皮細胞によって促進した、CD133陽性細胞のコロニー形成能、腹膜浸潤能は抑制され、ヌードマウスを用いた腹膜播種モデルにおいてもCD133陽性細胞の腹膜播種を抑制した。次いで通常培養の腹膜中皮細胞とNOY1の培養液上清を添加後24時間の腹膜中皮細胞との比較を行ったところがん細胞と共培養した中皮細胞はCD133陽性細胞の維持、コロニー形成能、腹膜浸潤能ともに有意に亢進していた。遺伝子発現プロファイルの比較ではα-SMAの発現亢進を認めた。臨床検体の免疫染色の結果腹、膜播種病巣におけるα-SMAの発現の亢進を認めた。α-SMA陽性中皮細胞はCAMとしてがん幹細胞の維持に関与することが示された。また、腹膜中皮細胞にTGF-βを添加すると中皮細胞に上皮間葉転換が認められα-SMAの発現は亢進していた。以上の結果から卵巣がん細胞と腹膜中皮細胞の共培養によって上皮間葉転換は癌細胞のみならず腹膜中皮細胞にも起こり癌細胞の浸潤、転移を促進する可能性が示唆された。
イオン伝導性固体とイオン液体のハイブリッド化による新規固体電解質の創製

本年度は硫化物固体電解質の導電率向上を目的として、メカノケミカル法を用いたLi_2S-P_2S_5系ガラスとイオン液体の複合化について検討した。75Li_2S・25P_2S_5(mol%)ガラスへ様々なイオン液体を添加し、遊星型ボールミル装置を用いたミリング処理を行うことによって電解質を作製した。その結果、1-ethyl-3-methylimidazolium bis(fluorosulfonyl)amide([EMII[FSA])がガラスの導電率向上に効果のあることがわかった。75Li_2S・25P_2S_5(mol%)ガラスへ10mol%の[EMI][FSA]を添加することによって、ガラスの室温導電率が3.8×10^<-4>Scm^<-1>から7.3×10^<-4>Scm^<-1>へと増加した。さらに、あらかじめリチウム塩lithium bis(trifluoromethanesulfonyl)amide Li[TFSA]を溶解しておいた[EMI][FSA]を添加して得られた電解質は、室温で10^<-3>Scm^<-1>以上の導電率を示した。またサイクリックボルタンメトリーより、この電解質は約5Vの電位窓を有することがわかった。ラマン分光測定の結果、作製した電解質中には、出発物質である硫化物ガラスおよびイオン液体の構成イオン種(PS_4^<3->や[EMI]^+、[FSI]^-)が分解せずに存在していることがわかった。一方、[EMI]BF_4を添加して得られた電解質では、母ガラスと比較して導電率が大きく減少し、これはミリング処理によるBF_4^-の分解に起因していると考えられた。以上の結果から、導電率が高く化学的に安定なイオン液体との複合化が、硫化物ガラス電解質の導電率向上に有効であると結論づけた。本年度は、リチウムイオン伝導性酸化物ガラスとイオン液体のハイブリッド化を検討した。酸化物ガラスとしては比較的低いガラス転移温度(T_g)を有するLi_2O-B_2O_3系酸化物ガラスを用い、イオン液体としてはイオン伝導性の高い1-エチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート([EMI]BF_4)を用いた。ハイブリッド化には、ボールミル装置を用いたメカノケミカル法を用いた。67Li_2O・33B_2O_3(mol%)ガラスに10mo1%の[EMI]BF_4を添加してボールミル処理して得られた試料は室温で粉末状であった。得られた試料について熱分析を行ったところ、[EMI]BF_4の結晶化温度(T_c)と融点に対応するピークが観測されなかったため、酸化物ガラスとイオン液体が互いに相溶し、ハイブリッド化していることが示唆された。・作製した試料のT_gは特定できなかったが、T_cは酸化物ガラスに比べて30°C低下していることからT_gも相対的に低下していることが推定された。また、FT-IR測定および^11B MAS-NMR測定から、ハイブリッド試料中には[EMI]^+およびBF_4^-イオンが分解されずに存在していることを確認した。交流インピーダンス法を用いて粉末成形体の導電率を測定した。ハイブリッド試料は、イオン液体を加えていない酸化物ガラスに比べて導電率が約4桁増加し、室温において2×10^-4Scm^-1の値を示した。また、導電率の温度依存性から求めた伝導の活性化エネルギーは、イオン液体の導入によって小さくなることがわかった。よって、ガラス電解質とイオン液体をハイブリッド化することによって、高イオン伝導性固体電解質の得られることがわかった。
トリアゾールをジアゾ前駆体とした含窒素化合物の合成法の開発

まず去年に引き続き、ロジウム触媒存在下、N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランとの反応について検討を行った。N-スルホニルトリアゾールとロジウム触媒が反応し生成するα-イミノロジウムカルベン種のロジウム上の配位子がかさ高くなると、シロキシフランが接近する面の選択性が向上することが分かった。条件検討の結果、アミノ酸由来のかさ高い配位子をもつRh2[(S)-NTTL]4を触媒として用いることで選択的にα,β,γ,δ-不飽和イミンを与えることを見出した。また前年度にピリジン存在下、α,β,γ,δ-不飽和イミンを加熱攪拌すると分子内環化が進行し、ジヒドロピリジン誘導体が得られることを見出していた。加えて、条件検討の過程でRh2(esp)2を触媒として用いると、α,β,γ,δ-不飽和イミンとジヒドロピリジンの選択性は悪いながらも総収率は良好であった。これらに着目し、トリアゾールとシロキシフランの反応後、系中に直接ピリジンを加え、再加熱することでジヒドロピリジン誘導体を高収率、高選択的に得られる条件を見出した。N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランのそれぞれに様々な置換基を有する基質を用いても反応は問題なく進行することが分かった。また、得られたジヒドロピリジン誘導体はN-メチルマレイミドとのDiels-Alder反応により、イソキヌクリジン誘導体を与えることが分かった。これらの成果について、英文論文として学会誌に発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。末端アルキンとアジドから容易に調製されるトリアゾールに遷移金属触媒を作用させて得られるα-イミノメタルカルベン種を用いて、含窒素化合物の簡便かつ環境負荷の少ない合成手法の開発を目的に検討を行っている。まず当初の計画に従い、N-スルホニルトリアゾールとベンゼン環の分子内[3+2]付加環化反応を用いて、麦角アルカロイド群(リゼルグ酸)の合成中間体として用いられるUhleケトンの合成を検討した。ロジウム触媒の存在下で、4-(3-フェニル-3-((トリエチルシリル)オキシ)プロピル)-1-トシル-1,2,3-トリアゾールを、トルエン中80°Cで加熱攪拌し、ジヒドロインドール誘導体を得たのち、TBAFを用いてトリエチルシリル基を除去した。その後、二酸化マンガンで芳香化およびアルコール部位の酸化を行い、水酸化カリウムのエタノール溶液中で加熱攪拌することで目的のUhleケトンを4ステップ50%収率で得た。次に、N-スルホニルトリアゾールとアルデヒドが反応することに着目して、求核剤としてホルミル基を有するジメチルホルムアミドを用いて検討を行った。ロジウム触媒の存在下で、1-メシル-4-フェニル-1,2,3-トリアゾールとジメチルホルムアミドのクロロホルム溶液を60°Cで1時間加熱攪拌したところ、エナミノン誘導体が収率よく得られた。得られたエナミノン誘導体は複素環化合物の合成中間体として有用であり、ピリミジン、ピラゾール、イソキサゾール誘導体へと高い収率で変換することができた。まず去年に引き続き、N-スルホニルトリアゾールとチオエステルとの反応について検討をおこなった。すなわち、求核剤としてチオエステルを用いたところ、N-スルホニルトリアゾールから窒素分子の脱離を経て生成するα-イミノロジウムカルベン種の1,3-挿入が進行しβ-スルファニルエナミドが高い収率で得られた。また求核剤としてチオラクトンを用いたところ、同様にα-イミノロジウムカルベン種の1,3-挿入が進行し含硫黄中員環ラクタムが得られた。本研究成果は、ドイツ化学会誌にて報告した(Angew. Chem., Int. Ed. 2015, 54, 9967)。続いて、ロジウム触媒存在下、N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランが反応し6-イミノヘキサジエンカルボン酸シリルエステルを与えることを見出した。さらにピリジン存在下、6-イミノヘキサジエンカルボン酸シリルエステルを加熱攪拌すると分子内環化が進行し、ジヒドロピリジン誘導体がえられることを見出した。現在これらの成果について、英文論文として学会誌に投稿準備中である。また、ロジウム触媒存在下、1-トシル-1,2,3-トリアゾール-4-カルボン酸メチルのベンゼン溶液を加熱攪拌することで、系中で生成したα-イミノロジウムカルベン種と溶媒のベンゼンが[3+2]付加環化してジヒドロインドール誘導体を与えることを見出し、現在その詳細について検討している。去年に引き続き、N-スルホニルトリアゾールとチオエステルとの反応について検討をおこないβ-スルファニルエナミドが高い収率で得られる反応を確立した。また求核剤としてチオラクトンを用いて、同様にして含硫黄中員環ラクタムが得られる反応を確立した。本研究成果は、ドイツ化学会誌にて報告した。また、N-スルホニルトリアゾールとチオノエステルとの反応について検討をおこない、研究成果の一部を英文論文として報告した。

これらの成果が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。まず去年に引き続き、ロジウム触媒存在下、N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランとの反応について検討を行った。N-スルホニルトリアゾールとロジウム触媒が反応し生成するα-イミノロジウムカルベン種のロジウム上の配位子がかさ高くなると、シロキシフランが接近する面の選択性が向上することが分かった。条件検討の結果、アミノ酸由来のかさ高い配位子をもつRh2[(S)-NTTL]4を触媒として用いることで選択的にα,β,γ,δ-不飽和イミンを与えることを見出した。また前年度にピリジン存在下、α,β,γ,δ-不飽和イミンを加熱攪拌すると分子内環化が進行し、ジヒドロピリジン誘導体が得られることを見出していた。加えて、条件検討の過程でRh2(esp)2を触媒として用いると、α,β,γ,δ-不飽和イミンとジヒドロピリジンの選択性は悪いながらも総収率は良好であった。これらに着目し、トリアゾールとシロキシフランの反応後、系中に直接ピリジンを加え、再加熱することでジヒドロピリジン誘導体を高収率、高選択的に得られる条件を見出した。N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランのそれぞれに様々な置換基を有する基質を用いても反応は問題なく進行することが分かった。また、得られたジヒドロピリジン誘導体はN-メチルマレイミドとのDiels-Alder反応により、イソキヌクリジン誘導体を与えることが分かった。これらの成果について、英文論文として学会誌に発表した。当初の計画通り、N-スルホニルトリアゾールとベンゼン環の分子内[3+2]付加環化反応を用いて、麦角アルカロイド群(リゼルグ酸)の合成中間体として用いられるUhleケトンの合成を行い、研究成果の一部を、アメリカ化学会誌にて報告した。また、ロジウム触媒の存在下で、1-メシル-4-フェニル-1,2,3-トリアゾールとジメチルホルムアミドのクロロホルム溶液を60°Cで1時間加熱攪拌すると、エナミノン誘導体が収率よく得られることを見出し、研究成果の一部を、英文論文として報告した。これらの成果が得られたことから,本研究は概ね順調に進行していると言える。ロジウム触媒存在下、N-スルホニルトリアゾールと2-(トリイソプロピルシロキシ)フランが反応し6-イミノヘキサジエンカルボン酸シリルエステルを与えることを見出している。さらにピリジン存在下、6-イミノヘキサジエンカルボン酸シリルエステルを加熱攪拌すると分子内環化が進行し、ジヒドロピリジン誘導体が得られることを見出しており、現在これらの成果について、英文論文として学会誌に投稿準備中である。また、ロジウム触媒存在下、1-トシル-1,2,3-トリアゾール-4-カルボン酸メチルのベンゼン溶液を加熱攪拌することで、系中で生成したα-イミノロジウムカルベン種と溶媒のベンゼンが[3+2]付加環化してジヒドロインドール誘導体を与えることを見出し、その詳細について検討していく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
移植するだけでNASHを発症させるNKT細胞の発見、その機能解析と創薬への挑戦

NASH(非アルコール性脂肪性肝炎)は肝硬変、さらには肝がんへと移行する重篤な疾患であるが、NASH発症・進展機序の詳細は不明である。最近我々は、移植するだけで、マウスにNASHを発症させる特殊なNKT細胞集団を発見した。本研究は、1この特殊なNKT細胞の免疫学的機能解析を詳細に行い、2治癒困難なNASHに対する創薬に挑戦することである。本結果から、1NASHの初期状態は、CXCL16欠損マウスに2週間CDAA食摂食によって観察された。さらに、NKT細胞による肝単核細胞から産生されるIFN-γおよびTNF-αは、肝細胞における脂質蓄積のためのエフェクター分子であることが明らかとなった。メタボリックシンドロームの代表的な表現型である脂肪肝は、病態の悪化に伴って、肝慢性炎症疾患であるNASH(nonalcoholic steatohepatitis:非アルコール性脂肪性肝炎)に進行する。NASHは肝硬変、さらには肝がんへと移行する重篤な疾患であるが、NASH発症・進展機序の詳細は不明である。最近我々は、驚くべき事実として、尾静脈より移植投与するだけで、レシピエントのNKT細胞欠損マウスにNASHを発症させる特殊なNKT細胞集団を発見した(未発表データ)。上記の萌芽的な発見を基盤として、本申請研究は、1この特殊なNKT細胞の免疫学的機能解析を詳細に行い、さらには、2このNKT細胞機能阻害を標的として、治癒困難なNASHに対する創薬に挑戦する。【目的】CXCL16は、細胞遊走作用、接着作用、および酸化LDLのスカベンジャー受容体として、3つの機能を有するケモカインであるが、肥満などの代謝異常への関与は分かっていない。本研究では、脂肪組織の形成に対するCXCL16の関与を明らかにすることを目的とした。【方法】野生型マウス(C57BL/6)、および自然発症肥満マウス(TSOD)の脂肪組織を経日的に採取し、CXCL16の発現量の変化をreal-time PCR法にて確認した。また、同様にマウス脂肪前駆細胞株(NIH-3T3 L1)に関して、脂肪細胞への分化前後で、CXCL16の発現量を確認した。さらに、通常食下で飼育した20週齢のC57BL/6マウスまたはCXCL16欠損マウスの脂肪重量を測定し、それら組織の免疫染色を行った。【結果】C57BL/6およびTSODにおいて、CXCL16の発現量は、経日的な脂肪量の増加とともに有意に増加していた。また、NIH-3T3 L1の分化前後でも、その発現量は有意に増加していた。さらに、CXCL16欠損マウスの精巣上体脂肪組織の重量は野生型マウス(C57BL/6)の60%程度であり、脂肪細胞の小型化が確認できた。代謝学NKT細胞の免疫学的な同定およびその機能解析表面分子はFACS解析、サイトカイン産生はELISA、またNKT細胞の転写制御の観点からqPCR解析を行った。また、マクロファージ、および樹状細胞等との供培養を行い、産生されるサイトカインプロファイルより、NKT細胞の機能を解析した。平成25年度までに明らかになったNKT細胞の表面分子に対する機能阻害剤、産生されたサイトカインに対する中和抗体を用いて、NASHの治療実験を動物モデルにて遂行する。第一選択肢としては、NKT細胞のアゴニストとして初めて同定されたα-GalCerの誘導体である。これら誘導体はアンタゴニストとして機能することが報告されており、NASHの新規治療薬のシーズとなり得るかを検証する。計画は予定通り進んでいるが、物品が予定価格より安く購入できたため。平成26年度の本研究における物品費として使用予定。
排尿反射亢進に伴う膀胱知覚路ならび運動路のイオンチャンネルの可塑性の解析

(1)雌性成熟ラットを用いて、膀胱壁内に蛍光色素(ファストブルー)を注入し、膀胱を支配する後根神経筋内の一次求心性神経細胞ならびに骨盤神経節内の遠心神経細胞を逆行性軸索輸送によって標識した。そして、トリプシンを含む酵素液を用いて単一細胞に分離したのち、蛍光顕微鏡下に膀胱由来の知覚細胞ならびの自律神経細胞を特異的に識別した。(2)微小ガラス管電極を用いたホールセルパッチクランプ法によって単離細胞の電気的活動を記録し、膀胱由来の知覚神経細胞および自律神経細胞に対して、下部尿路機能の神経伝達物質として注目されている一酸化窒素(Nitric oxide,NO)を投与し、その効果を検討した。NOのドナーであるSNAPを投与すると、膀胱由来の知覚細胞のカルシウムチャネルを介する電流が抑制された(抑制率約30%)。またこのNOを介する抑制効果は、NO依存性のguanylate cyclaseの阻害薬であるODQの前投与によって阻害され、逆にcyclic-GMPの投与はNOと同様の抑制効果を示した。これらの結果は、NOがcyclic-GMPの産生を介して、膀胱知覚路に対して抑制的に作用していることを示している(これらの結果は、平成9年度の第27回米国神経科学学会において発表した)。(3)ホールセルパッチクランプ法によって膀胱由来の知覚神経細胞および自律神経細胞に対して、神経成長因子(NGF)の効果を検討した。NGFを膀胱知覚神経細胞に投与したところ、NOとは逆に、カルシウムチャネルを介する電流の可逆性の増強が見られた(増強率約30%)。また、NGFによるカルシウム電流の増強効果は、TTX非感受性ナトリウム電流を有する無髄C型知覚細胞に特異的に観察され、神経成長因子が、膀胱知覚路の興奮性の制御および排尿反射亢進の発現に関連していることが示された。(1)雌性成熟ラットを用いて、Th8-9脊髄間を切断し脊髄損傷運動を作成した。手術後3週間を経過した時点で、膀胱壁内に蛍光色素(ファストブルー)を注入し、膀胱を支配する後根神経節内の一次求心性神経細胞ならびに骨盤神経節内の遠心神経細胞を逆行性軸索輸送によって標識した。(2)雌性成熟ラットを用いて、麻酔下に尿道を露出し、不完全結紮による尿道部分狭窄を作成した。手術後4週間を経過した時点で、膀胱壁内に色素を注入し、膀胱由来の一次求心性細胞ならびに遠心性細胞を標識した。(3)脊髄損傷および尿道狭窄ラットを用いて、麻酔下にL6-S1後根神経節を切除し、酸素液を用いて単一細胞に分離したのち、短期細胞培養を行った。これらの手法により、蛍光顕微鏡下に膀胱由来の知覚細胞ならびの自律神経細胞を特異的に識別することが可能となった(文献1、2)。(4)微小ガラス管電極を用いたホールセルパッチクランプ法によって単離細胞の電気的活動を記録した。膀胱由来の知覚神経細胞および自律神経細胞において、ナトリウム電流はテトロドトキシン(TTX)感受性及び非感受性の2種類の電流に分類され、そのうちTTX非感受性電流は知覚神経の7割を占める無髄C細胞に特異的に発現していた。また、これらの細胞では、A-タイプのカリウム電流が細胞の興奮性を制御していることが明らかとなった(文献1、2)。そして、脊髄損傷動物では、細胞肥大とともに、膀胱知覚神経の電気的興奮性の増大を認め、TTX感受性のナトリウム電流の増大とA-タイプカリウム電流の減少がその原因となっており、脊髄損傷後に起こる排尿反射亢進の発生に関与していると考えられた。

また、尿道狭窄動物において、TTX感受性ナトリウム電流の増大を認め、前立腺肥大による尿道閉塞時に見られる排尿反射亢進の一因となっているとが明らかとなった(文献3-5)。(1)雌性成熟ラットを用いて、膀胱壁内に蛍光色素(ファストブルー)を注入し、膀胱を支配する後根神経節内の一次求心性神経細胞ならびに骨盤神経節内の遠心神経細胞を逆行性軸索輸送によって標識した。そして、トリプシンを含む酵素液を用いて単一細胞に分離したのち、蛍光顕微鏡下に膀胱由来の知覚細胞ならびに自律神経細胞を特異的に識別した。(2)微小ガラス管電極を用いたホールセルパッチクランプ法によって単離細胞の電気的活動を記録し、膀胱由来の知覚神経細胞および自律神経細胞に対して、下部尿路機能の神経伝達物質として注目されている一酸化窒素(Nitric oxide,NO)を投与し、その効果を検討した。NOのドナーであるSNAPを投与すると、膀胱由来の知覚細胞のカルシウムチャネルを介する電流が抑制された(抑制率約30%)。またこのNOを介する抑制効果は、NO依存性のguanylate cyclaseの阻害薬であるODQの前投与によって阻害され、逆にcyclic-GMPの投与はNOと同様の抑制効果を示した。これらの結果は、NOがcyclic-GMPの産生を介して、膀胱知覚路に対して抑制的に作用していることを示している。(これらの結果は、平成9年度の第27回米国神経科学学会において発表した)。(3)ホールセルパッチクランプ法によって膀胱由来の知覚神経細胞および自律神経細胞に対して、神経成長因子(NGF)の効果を検討した。NGFを膀胱知覚神経細胞に投与したところ、NOとは逆に、カルシウムチャネルを介する電流の可逆性の増強が見られた(増強率約30%)。また、NGFによるカルシウム電流の増強効果は、TTX非感受性ナトリウム電流を有する無髄C型知覚細胞に特異的に観察され、神経成長因子が、膀胱知覚路の興奮性の制御および排尿反射亢進の発現に関連していることが示された。
野生チンパンジーの薬的利用植物中の生理活性成分の化学的究明と生物学的意義に関する研究

タンザニア産の8種類の野生植物を抽出し、その殺塩水エビ活性、一酸化窒素産生阻害活性、抗細菌活性、抗カビ活性、ならびに植物生長と種子発芽に対する活性試験の結果に基づき、最も強い抗細菌活性を示したSanrafaelia ruffonammariの活性成分を各種クロマトグラフィーを用いて精製単離した。しかしながら単離量が微量だったため、構造決定に至らなかった。そこで再度、タンザニアより同植物の乾燥粉末を入手した。なお、新たにEctadiopsis oblongifolia (Kahembe wansya)も入手した。S.ruffonammari(1.5kg乾燥重)樹皮のメタノール抽出液より活性成分の単離を行い、5種の化合物を得た。そのうち3種の化合物の化学構造をNMRとMSスペクトルなどにより解析した結果、2つは既知の、1つは新規のstyrylpyrone類と同定した。ただし、これらは既知化合物も含め、絶対配置は決定されていない。残り2つの化合物は、構造的に互いに関連しており、メタノールやクロロフォルムなどの有機溶媒への溶解度が低かった。したがって、そのままではスペクトル測定が困難なため、アセテートなどに誘導することによって構造解析を試みている。なお、3つのstyrylpyrone類はいずれも50ppmで殺塩水エビ活性を、2つの未知化合物は0.1mgで枯草菌に対して強い抗菌活性を示した。同じ植物が異なる生理活性を示す複数の化合物群を含んでいることは、同植物が種類の異なる生物からの攻撃に対して多面的な防御機構を備えていることを示唆しており、興味深い。これらのうち、強い抗細菌活性を示したS. ruffonammariの活性成分を各種クロマトグラフィーを用いて精製単離した。現在、最も強い活性を示す物質の化学構造を各種スペクトロメトリーを用いて検討している。本植物はこれまで化学的分析に関する報告例がないので、活性成分は新規化合物の可能性が高い。
難治性神経疾患の治療に資する膜輸送・リソソーム分解調節薬物の検索と開発

本課題では、難治性神経疾患として神経変性疾患、虚血性脳疾患、気分障害を対象に、これらの共通の病態として膜輸送やタンパク質分解の異常に着目して新たな治療戦略を得ることを研究目的とした。神経変性疾患については脊髄小脳失調症14型を引き起こす変異γPKCについて検討した。変異γPKCはアミロイド線維形成を引き起こすこと、また、マクロピノサイトーシスを抑制することを明らかにした。虚血性脳疾患の治療ターゲットであるGPR3が突起先端に向けて動き、突起伸長を調節することを明らかにした。さらに、抗うつ薬のターゲットであるセロトニントランスポーターの膜輸送を調節する薬物としてシグマ1受容体リガンドを見出した。1脊髄小脳変性症14型(SCA14)の原因タンパク質である変異γPKCの凝集体形成と細胞毒性と分子シャペロンである熱ショックタンパク質HSP70との関連を解析した。神経系の培養細胞であるSH-SY5Y細胞に変異γPKCを発現させたところ、HSP70の発現は上昇し、siRNAでHSP70をノックダウンすると、変異γPKCの凝集体形成は増加し細胞毒性も上昇した。この結果からHSP70はSCA14変異γPKCの凝集体形成を抑制し、細胞毒性を阻害する役割を持つことが明らかとなり、HSP70はSCA14の治療標的であることが示唆された(BBRC 2013 440 : 25-30)2脊髄小脳変性症14型(SCA14)の原因タンパク質である変異γPKCがどのような機序で神経細胞死や樹状突起の発育不良を引き起こすか、その分子機序を解析した。細胞内のγPKCはその活性化薬であるフォルボールエステルのTPAを処置すると、一旦、細胞膜に移動した後、マクロピノサイトーシスにより核近くに凝集する。しかしながら、SCA14変異γPKCでは、TPAで処置してもそのような現象が見られないことが明らかとなった。また、変異γPKCはマクロピノサイトーシスに重要なMARCKSのリン酸化を引き起こさないことがわかり、そのことがTPAによるマクロピノサイトーシス惹起を阻害する一因になることが解った。SCA14の発症原因にマクロピノサイトーシスの制御不全の関与が示唆された。(Frontiers in Physiology (2014)5: 126.)3セロトニントランスポーター(SERT)のC末端欠損体(SERT ΔCT)は、小胞体に停留し凝集体を形成することがわかった。この凝集体は4-PBAなどのケミカルシャペロンで減少することが示されたので、SERTΔCTの凝集体形成を指標に膜輸送活性化物質を検索することが可能となった。1プロテインキナーゼCγ(PKCγ)の発現が消失しているラットやマウスでは線条体におけるドパミン遊離が減少し、パーキンソン病に類似した病態が観察されることを見出した。そこで、PKCγノックアウトマウスにおいてリン酸化が減少しているPKCの基質を網羅的に同定した。この中でβPIXをさらに詳細に検討した結果、βPIXはドパミン遊離に重要な役割をもつPKCの基質であることがわかり、その機能がPKCのリン酸化により調節されていることが明らかとなった。(J. Neuroscience. 34 (2014) 9268-9280)2脊髄小脳変性症14型(SCA14)の原因タンパク質である変異γPKCは凝集体を形成しやすく、その性質がSCA14で見られるプルキンエ細胞死に関与していると考えられる。そこで、γPKCの凝集体形成に注目した。γPKCは野生型でもSCA14の変異体でもともに細胞内で凝集体を形成し、凝集体内部にはアミロイド様の線維が観察された。また、変異γPKCは、野生型よりもアミロイド線維を形成しやすい性質を持っていた。γPKCのC1Aドメイン、キナーゼドメインの会合が凝集体形成に重要な役割をすることがわかり、変異γPKCでは、その会合が促進され、よりアミロイド線維形成が促進されることが明らかとなった。(Hum Mol Genet. 24 (2015) 525-39.)3セロトニントランスポーター(SERT)のC末端欠損体(SERT ΔCT)の取り込み活性を指標に膜輸送を活性化させる薬物としてシグマ受容体リガンドに着目した。シグマ受容体リガンドの一部、特にアゴニストのSKF10047はSERT ΔCTの取り込み活性を上昇させたが、その効果は、シグマ受容体をノックダウンさせた細胞でも観察された。このことから、これらリガンドのSERTΔCTに対する取り込み促進効果はシグマ受容体を介さず発揮していることが予想された。これら薬物の膜輸送促進効果の機序を明らかにすることで、新たなシャペロン系が見出される可能性がある。1オルファンGタンパク質共役受容体GPR3は、中枢神経に豊富に発現し、恒常的にcAMPを上昇させる機能を受容体である。これまで明らかでなかった脳における発現様式、細胞内での局在を検討したところ、GPR3は海馬CA3領域、内側手綱核、小脳顆粒細胞に強く発現しており、細胞内では、形質膜、ゴルジ体、エンドソームに局在していることが明らかになった。

また、GPR3は、小脳顆粒細胞において細胞体から突起先端に輸送され、突起先端部での細胞内cAMPを上昇させ突起伸長に寄与することも明らかとなった( PLoS One. 11 (2016) e0147466)。2ミクログリアは神経細胞傷害的にも保護的にも働くことが報告されている。Toll様受容体4をリポポリサッカライド(LPS)で刺激したところ、ほとんどの細胞が数時間以内に死滅するのに対し、3日以上長期にわたり生存する細胞集団があることを見出した。このLPS誘発性長期生存ミクログリアは、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を自己産生し、その下流でJAK/STAT系が活性化することにより長期生存することが明らかとなった。また、これらミクログリアは神経保護的に働くことを明らかとなった(Neurochem. Int. 93 (2016) 82-94)。3セロトニントランスポーター(SERT)のC末端欠損体(SERT ΔCT)の取り込み活性を指標に膜輸送を活性化させる薬物として熱ショックタンパク質(HSP)の誘導剤に注目した。その結果、HSP誘導剤ではSERT ΔCTの活性を減少させ、SERTΔCTタンパクを減少させる効果が見られた。これら薬物は、小胞体関連分解(ERAD)を促進する作用があるのかもしれない。本課題では、難治性神経疾患として神経変性疾患、虚血性脳疾患、気分障害を対象に、これらの共通の病態として膜輸送やタンパク質分解の異常に着目して新たな治療戦略を得ることを研究目的とした。神経変性疾患については脊髄小脳失調症14型を引き起こす変異γPKCについて検討した。変異γPKCはアミロイド線維形成を引き起こすこと、また、マクロピノサイトーシスを抑制することを明らかにした。虚血性脳疾患の治療ターゲットであるGPR3が突起先端に向けて動き、突起伸長を調節することを明らかにした。さらに、抗うつ薬のターゲットであるセロトニントランスポーターの膜輸送を調節する薬物としてシグマ1受容体リガンドを見出した。セロトニントランスポーター(SERT)のC末端欠損体(SERT ΔCT)を用いた新たな評価方法の開発の可能性が明らかになり、SERTを用いた検索法の開発には進展があったが、TetOnのシステムの発現効率が予想以上に悪く、従来計画した目的にたどり着いていない状況である。しかしながら、新たに各種シグマ受容体リガンドがSERTΔCTの取り込み活性を上昇させることが明らかとなった。この発見を契機に、これらの薬物の作用機序や結合タンパク質を検索することにより、新たな膜輸送を促進させるシャペロン系の解明を目指すことが可能となった。GAPDHーHTによるャペロン介在性オートファジー活性評価系では、この系は、シャペロン介在性オートファジーのみならず、ミクロオートファジー系の解析にも有用であることが明らかとなり、今後の解析に期待が持てる。27年度が最終年度であるため、記入しない。薬理学SERTΔCTの取り込み活性を上昇させる薬物の検索にさらに努める。また、現在までに明らかになったそれらの薬物の結合タンパク質を同定することにより、膜輸送を促進させる新たなシャペロン系の解明を目指す。セロトニントランスポーター(SERT)のC末端欠損体(SERT ΔCT)を用いた新たな評価方法の開発の可能性が明らかになり、SERTを持ちいた検索法の開発には進展があったが、GAPDHーHTを用いたシャペロン介在性オートファジー活性評価系の開発は、誘導発現系(具体的にはTetONシステム)の調整に手間取り、十分とは言えない状況である。
胃集検受診者群の悪性腫瘍発生リスクに関する疫学的研究

本研究は間接X線撮影法を一次スクリーニングに用いている胃集検において、受診者集団に対する低線量X線被曝が悪性腫瘍(特に白血病)の発生のリスクにいかなる関連をもつか疫学的手法をもちいて明らかにすることである。昭和63年度は、症例・対照研究の手法を用いて白血病発生リスクとしての胃集検受診を要因とする相対危険度(Relative Risk.RR)をオッズ比(Odd's Ratic)で算出した。対象とした白血病は昭和53年から60年までの8年間に宮城県内でリンパ性白血病(ICD No.204)骨髄性白血病(No.205)およびその多の白血病(No.206-208)の診断を受け、宮城県悪性新生物レジストリーに羅患症例として登録された4065歳男女である。そのうち、住民の転出転入などの人口移動が激しく逆追跡調査の困難な都市部を除き、かつ、症例にマッチさせた対照群を選ぶための資料が整った町村(38カ町村)の白血病患者79名を症例とした、本研究の最も困難な作業は、症例に対する近隣コントロールを無作為に抽出し、それをさらに羅患率の10年前にさかのぼって胃集検の受診歴を調べることである。その他白血病羅患者が、広島、長崎の原爆被曝歴があるか否かの照合作業も重要かつ作業量の膨大なものである。なお、対照は、症例に性、年齢(±5歳)および住所(同じ町村)をマッチさせた非白血病正常者で症例1に対し2倍の158例をランダムに選んだ。結果の概要は、白血病患者(男45名、女34名)79名(平均年齢53.5歳)、対照は男90名、女68名、平均年齢54.1歳であった。全白血病の受診歴のRR=1.09(n.s.)、骨髄性白血病(28名)のRR=0.88(n.s.)、診断前の5年間を潜伏気管とした場合のRRはそれぞれ1.17(n.s.)、0.77(n.s.)であった本研究は、間接X線撮影法を一次スクリーニングに用いている胃集検において、受診者集団に対する低線量X線被曝が悪性腫瘍(白血病を含む)の発生リスクにいかなる関連をもつか疫学的手法を用いて明らかにすることである。研究初年度の昭和61年度は以下のような研究実績である。1.昭和35年以来胃集検が行なわれている宮城県内のモデル地域住民(40歳以上の男女)を対象とした全員(約2万人)の基礎台帳を作製した。2.胃集検の実施機関である宮城県対がん協会がん検診センター検診記録から、昭和56年までの約20年間分の受診状況(一次検診受診の有無,精密検査受診の有無および診断名)を調査し台帳に記録した。3.上記の研究と平行して、当該モデル地域の対象住民の死亡,死因ならびに悪性腫瘍罹患状況について、宮城県新生物レジストリーの登録資料とのリンケージの他、保健婦等による家庭訪問インタビューの情報集収による調査を行なった。4.以上の記録をコンピュータに入れるためのコーディング作業と入力作業を行なった(但し、61年度においては、入力作業とデータの点検作業は未完結であり、次年度に継続して行なう予定である。)。以上述べた研究はコホート研究の手法を用いたものであるが、この手法は比較的長期の研究期間を要するため、昭和61年度では症例対照研究の手法を用いた研究も行なった。症例は、昭和53年から58年までの県内の白血病罹患者のうち60名を症例とし、性年齢住所をマッチさせた非白血病正常者を対照として、過去の胃集検受診歴を逆追跡調査し胃集検をリスク要因とした場合の白血病発生の相対危険度を算出するための集計分析を行なっている(但し、これも未完結で現在継続研究中である)。本研究は,間接X線撮影法を一次スクリーニングに用いている胃集検において,受診者集団に対する低線量X線被曝が悪性腫瘍,特に白血病の発生リスクにいかなる関連をもつか疫学的手法を用いて明らかにすることである.昭和61年度及び62年度の研究実績の概要は以下の通りである.1症例・対象研究による方法昭和53年から58年まで宮城県内でlymphatic leukenia(ICD No.204), myeloid leukemia(205),およびその他のleukemia(206-208)の診断で宮城県新生物レジストリーに登録された4065歳の白血病患者のうち集検受診歴の逆追跡可能な地域でかつ症例にマッチさせた対照群を選ぶための資料の整っている地域の白血病患者48例を症例とした.対照は,症例に性,年齢および住所をマッチさせた非白血病の者を症例1に対し2倍の96例をランダムに選んだ.検診受診歴の逆追跡から胃集検をリスク要因とした場合の白血病発生の相対危険度(Relative Risk,RR)をOdd's比で算出した.結果は,全白血病(48名)ではRR=1.0, myeloid leukemia(28名)ではRR=0.82(n.s.),また,潜伏期を仮に5年とした場合の同様の検討では,前者のRR=1.0,後者のRR=0.87(n.s.)であった.以上の成績から「胃集検は白血病発生のリスク要因になっているとはいえない」と結論づけられよう.しかし,本研究の過程で,県内では生した白血病患者の原爆被曝歴の有無の検討,急性骨髄性白血病での検討の必要性が討論されたので,上記の成績は中間的報告という型にとどめ,さらに上記問題点を解決するための各種記録との照合作業が行われている.

また,胃集検の受診回数との関連についても検討中である.2.コホート研究による方法悪性腫瘍の罹患状況と胃集検受診状況との照合作業はなお継続中である.本研究は間接X線撮影法を一次スクリーニングに用いている胃集検において、受診者集団に対する低線量X線被曝が悪性腫瘍(特に白血病)の発生のリスクにいかなる関連をもつか疫学的手法をもちいて明らかにすることである。昭和63年度は、症例・対照研究の手法を用いて白血病発生リスクとしての胃集検受診を要因とする相対危険度(Relative Risk.RR)をオッズ比(Odd's Ratic)で算出した。対象とした白血病は昭和53年から60年までの8年間に宮城県内でリンパ性白血病(ICD No.204)骨髄性白血病(No.205)およびその多の白血病(No.206-208)の診断を受け、宮城県悪性新生物レジストリーに羅患症例として登録された4065歳男女である。そのうち、住民の転出転入などの人口移動が激しく逆追跡調査の困難な都市部を除き、かつ、症例にマッチさせた対照群を選ぶための資料が整った町村(38カ町村)の白血病患者79名を症例とした、本研究の最も困難な作業は、症例に対する近隣コントロールを無作為に抽出し、それをさらに羅患率の10年前にさかのぼって胃集検の受診歴を調べることである。その他白血病羅患者が、広島、長崎の原爆被曝歴があるか否かの照合作業も重要かつ作業量の膨大なものである。なお、対照は、症例に性、年齢(±5歳)および住所(同じ町村)をマッチさせた非白血病正常者で症例1に対し2倍の158例をランダムに選んだ。結果の概要は、白血病患者(男45名、女34名)79名(平均年齢53.5歳)、対照は男90名、女68名、平均年齢54.1歳であった。全白血病の受診歴のRR=1.09(n.s.)、骨髄性白血病(28名)のRR=0.88(n.s.)、診断前の5年間を潜伏気管とした場合のRRはそれぞれ1.17(n.s.)、0.77(n.s.)であった
オーストラリアの対アジア緊密化に伴う地域変容の研究

オーストラリアにおけるアジア諸国の影響を、具体的な地域を事例として検証した。たとえば北部準州のダーウィンでは、ベトナム系住民による新たな第一次産業の動きがあり、また西オーストラリア州のパースでは、インド系の中程度技術労働者の流入が大きな影響をもたらすことが判明した。他の都市との比較調査でも、労働現場におけるアジア化の影響が明白であった。中国製工業製品の流入や、日本の資本参入といったモノとカネの動きだけではなく、ヒトの移動に伴うオーストラリアの地域変容の実態を把握することができた。1.資料収集による知見(1)4月29日、第1回研究会。ダーウィンを調査対象に設定した。研究テーマは以下のとおり。〔南出〕対アジア貿易の動向、〔森島〕現地企業の労使関係、〔山中〕アジア諸国の対豪直接投資、〔重松〕人的資源の移動と交流、〔西川〕国立公園の観光動向、〔筒井〕ベトナム人コミュニティー、〔金田〕肉牛ビジネスの展開。(2)5月25日、6月29日、7月19日、各研究会。ABS統計資料等をめぐる討議を行った。その結果、北部準州のみでは経済模規が小さく政府主導型の地域開発が中心であることが、各側面にわたって明らかになった。2.合同調査による知見(1)7月下旬8月上旬、ダーウィン合同調査。海外研究協力者である西オーストラリア大学デニス・ラムレイ氏を通じて、北部準州政府プロジェクト担当のジョン・マッキュー氏、ウォーターフロント再開発担当のブレンダン・ローソン氏等から説明を受けた。その後各テーマに関わる資料収集を行った。(2)8月31日、第5回研究会。各自の収集資料による討議を行った。その結果、アジアに対する地理的近接性が最も顕著に反映されているのは、沿岸漁業や海底ガス採掘など、むしろ海域においてであることが明らかになった。その点でも、西オーストラリア州との比較が重要であることが再確認された。3.個別調査による知見11月25日、第6回研究会。比較研究が必要な地域を討議し、2007年23月に再度のダーウィン調査、西オースートラリア州、中国などの個別調査を行った。その結果、2007年度はアジア諸国側からの移民や企業進出、投資等に関する両面的な調査の必要性が展望された。1.資料収集による知見2006年度のダーウィン調査の結果から展望して、より経済規模の大きな都市との比較研究が有意義であろうと判断した。ダーウィンの人口は12万人であり、政府による国際会議場プロジェクトをのぞけば、民間企業レベルでの動きが分かりにくいからである。そこで2007年度の合同調査地として西オーストラリア州の州都であるパースを選定した。パースは人口200万人を超えてなお成長を続けており、インド洋に面する都市として、ダーウィンとは別の側面からアジア化の影響を看取できる地域として意義が大きいと考えた。2.合同調査による知見8月57日をパースの合同調査期間とした。海外研究協力者を2006年と同様にデニス・ラムレイ氏(エディス・コーワン大学に転勤)に依頼し、同大学において州商工会議所のティム・シャナハン氏から資源開発の現況について、政府統計局のフィル・スミス氏からはアジア系移民の動向について解説を受けた。その後、同大学のイアン・アレキサンダー氏の案内により日系資本による住宅地開発の現場を見学し、聞き取り調査を行った。インド系の労働者の流入と日系企業・中国系企業の投資が目立った動きであることがわかった。3.個別調査による所見合同調査の前後に、各研究分担者がテーマに応じた個別調査を行った。また「アジア化」の発信側であるアジア諸国からオーストラリアがどのような対象として位置づけられているのかを確認するために、中国(上海)、ホンコン、シンガポールなどにおいても資料収集を行った。その結果、国際的な対オーストラリア直接投資が中国を中心に急増しており、それが各地に大きな影響を与えていることが分かった。1.補足調査による知見平成20年度は全体としての合同調査は行わず、平成18年度のダーウィン調査、および平成19年度のパース調査を補足する形で、シドニーなどの他都市との比較を個別的に行った。またオーストラリアのカウンターパートとしてのアジア諸国側の動向に関しても、中国、マレーシア、シンガポールなどについて補足調査を行った。その結果、たとえばダーウィンにおいては、平成18年当時まだ建設中であった国際会議場が完成し、いくつかのイベントが行われていたが、いま一つ、町のあるいは州の経済発展に直結するような活発さはみられなかった。むしろ国際会議場という付加価値を利用したうウオーターフロント地域の高級住宅地化、他州からの移住促進がメインのようにみえた。公共政策としては、住民レベルでの対アジア交流以前にインフラ整備が優先されることと、航空ネットワークの問題が極めて大きな影響力を持っていることが明確になった。それに対し日本との関係変化はむしろ東海岸の大都市において顕著であり、たとえばジェットスター便の就航と航路再編成に伴い、ケアンズやゴールドコースト、さらにシドニーなどをめぐるツーリズムあるいはコンテナ空輸の現況に変化が生じていることなどが判明した。

2.資料分析による知見平成18・19年度に収集したデータについては、平成20年度も追跡調査を行い、この間の変化を分析した。その結果、ダーウィンにおけるアジア系移民やパースにおけるインド人労働者の増加などは、予想していたほど顕著な動きではなく、東海岸大都市地区ほどの変移はみられなかった。つまり、オーストラリア各地における対アジア緊密化の動向は、オーストラリア側からみればアジア最前線にあたる北部・西部からの発信が大きいが、逆にアジア諸国からみれば、やはり就業機会や所得水準において東南部のスケールメリットが大きな吸引力となっており、このインとアウトのずれこそが、今回の研究で指摘できる重要な結論の一つではなかったかと考えられる。
単一ネフロン由来株化培養細胞を用いたフリーラジカル産生薬物のスクリーニング

【研究方法および結果】1、株化細胞の作成;SV40-T抗原の温度感受性(ts)変異遺伝子を受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作出した。実体顕微鏡下で各ネフロン分節を無菌的に単離し培養に付した。各ネフロン分節由来の培養細胞株が得られ、その増殖は温度感受性の増殖様式を示し、継代を重ねても上皮様の形態は保たれていた。2、株化細胞の機能解析、1)ホルモンの応答性;VasopressinによるcAMPの産生増加は、近位尿細管で反応がなく遠位および集合尿細管で産生亢進をみとめ、新鮮ネフロンの形質が保たれていた。2)近位尿細管特異酵素の発現;近位尿細管特異酵素のであるALP,γ-GTP,LAPの発現も、新鮮ネフロン同様、近位尿細管終末部(S3)細胞で高く髄質外層部集合管(OMCT)細胞では陰性であった。3、各種薬物のフリーラジカル産生、1)シスプラチン;尿細管細胞は濃度、時間依存性に障害され、OMCTに比べS3で過酸化脂質(LPO)の産生は亢進していた。この結果は、今までのin vivoの結果を補完するものであった。2)パラコート;S3に比べOMCTでLPO産生は亢進していた。その原因として、OMCTではS3に比べ内因性SOD活性が低下していることが考えられた。3)6価クロム;S3細胞浮遊液に6価クロムを添加しスピントラップ剤(DMPO)を加えESRで観察するとヒドロキシルラジカルがみられた。そしてこのラジカルのシグナル強度は、SODを前処置すると減弱し、DFOによって完全に抑制された。【考察と今後の課題】今回我々の樹立した培養細胞株は、由来部位がはっきりし、かつ新鮮ネフロンの有する機能が保たれていた。この細胞は、フリーラジカル産生や消去能を有する各種薬物のスクリーニングに有用であると思われた。
マイクロフルイディックエンジニアリングの深化と生体分子高感度定量計測への展開

本研究では、微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、以下の新規マイクロ流体デバイス要素技術を開発した。1)自由なサイズの液滴作製技術の構築,2)自由な流れのコントロール技術の構築,3)液滴のパッシブソーティング技術の構築。次に要素技術をシステム化することにより、微小発光サンプルの計測を実現した。1)液滴に生体サンプルを個別に抱合して環境微生物個々の遺伝子を解析,2)個別に抱合された細胞の成長を観察して酵素反応活性を評価。本研究の遂行により、従来定性的観察のみ可能であった光学信号が高感度な定量的計測結果を得るのに十分なレベルに増幅され、光学的定量計測が実現された。1.研一究の目的微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、on demand型の光学的補助機能を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発する。具体的にはマイクロ流体内超高感度光学観察場のon demand構築技術及びそれをサポートする周辺技術の構築、並びに超高感度光学的定量計測に適した微小サンプル前処理技術を開発する。H23年度は、研究グループが既に保有している要素技術の問題点の検討と改良を行い、本研究課題への応用を試みる事を目的とする。2.研究実績の概要1)マイクロレンズ・マイクロガラスピラー・超フラットガラス平面等の光学部品の作製とフロー制御による固定化マイクロドロップレット生成デバイスを応用してマイクロレンズを作製し、これをアレイ上に配置することにより、インラインでの集光の可能性を示した。また、XeF2を使ってエッチングしたSiを鋳型として使い、マイクロガラス流路中にたくさんのガラスレンズを簡単に作製する手法を新たに確立し、従来ではプロセスの複雑さから実用性が疑問視されていたガラスレンズアレイによる高感度センシングシステムの可能性を示した。2)微小サンプル前処理用マイクロ流体デバイスの開発マイクロドロップレット生成デバイスを応用して培地で作製したゲルドロップレットに細胞を一つずつ閉じ込め、これを所定の場所まで運び細胞培養を行うことに成功した。これにより、綱胞を傷つけることなく、外部刺激等に対するリアルタイムな観察を可能とした。また,マイクロドロップレットのアクティブおよびパッシブソーティングが可能なデバイスの作製に成功し、ドロップレットを破壊しないまま選別することに成功した。さらに、マイクロドロップレットのデジタル的な融合が自由に可能なデバイスの作製に成功し、定量的刺激と反応への道筋をつけた。1.研究の目的微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、on demand型の光学的補助機能を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発する。H25年度は、トータルシステムのプロトタイプ製作と評価、及び得られた結果の要素技術へのフィードバックを目的とする。2.研究実績の概要(1)「システム化による実際のバイオ・生体試料等への応用と要素技術へのフィードバック」(庄子・竹山・関口)三次元シースフローデバイスを応用した人工血管の作製に成功した。LCチップの構造に改良を加え、超高感度なたんぱく質の分析を可能とした。バイオサンプルを扱うに当たり、要求仕様にしたがってマイクロ流体デバイスの設計変更を行った。(2)「マイクロ流体デバイスを利用したバイオサンプルの新しい前処理法と観察法の検討」(竹山・関口・水野)GEL Micro droplet(GMD)に一つずつ細菌を入れ、培養・観察を行う技術を応用して、単一細胞の機能解析を進めた。細胞内に蛍光ナノプローブを導入して培養を行ったのち、人工的に細胞死を誘引させることで、アポトーシスのメカニズムのリアルタイムイメージングに成功した。(3)「マイクロ流体デバイスシステム化のための直接接合技術の検討」(庄子・水野)同種/異種基板材料同士の表面処理技術と直接接合技術を確立した。これを応用して流体デバイス型有機ELの作製に初めて成功した。【連携研究者】早稲田大学竹山研究室モリテツシ(細胞関連)、同ナノ理工学研究機構尹棟鉉(ドロップレット関連)、埼玉大学工学部鈴木美穂、福田武司(バイオプローブ関連)、帝京平成大学薬学部枝川義邦(薬理関連)1.研究の目的微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、on demand型の光学的補助機能を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発する。H24年度は研究グループが築き上げてきた要素技術の改良を行い、システム化への基盤を築くことを目的とする。2.研究実績の概要1)「マイクロレンズ・マイクロガラスピラー・超フラットガラス平面等の光学部品の作製とフロー制御による固定化」(庄子・水野・関口)マイクロ流体デバイスを用いたMicro Glass Lensの作製に注力した。この結果、様々なN/AをもつMicro Glass Lensの作製に成功した。2)「微小サンプル前処理用マイクロ流体デバイスの開発」(庄子・竹山・関口)マイクロ流体デバイスを用いて作製したGEL Micro droplet(GMD)に一つずつ大腸菌を入れ、培養・観察を行う技術の確立に成功した。また、パッシブソーティングを用いたドロップレットの流し分けに成功し、外力を用いない柔らかなサンプルの分別に道を開いた。更にドロップレットの自由な分割と融合を実現するデバイスの開発にも成功した。3)「材料の表面処理と直接接合に関する検討」(庄子・水野)

マイクロ流体デバイスのパッケージングへの応用のため、基板材料の表面処理技術および同種/異種基板同士の直接接合技術を確立した。研究の進捗に伴い、下記の者を連携研究者として向かい入れ、さらなる展開をはかった。【連携研究者】1、早稲田大学モリテツシ(細胞関連)、尹棟鉉(ドロップレット関連)2、埼玉大学鈴木美穂、福田武司(バイオプローブ関連)3,帝京平成大学枝川義邦(薬理関連)1.研究の目的微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、on demand型の光学的補助機能を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発する。H26年度は、試作した要素素子をアプリケーション側からの要求に応じてシステム化したプロトタイプデバイスを作製し、細胞、DNA等微小サンプルを使用した実証実験を行った。2.研究実績の概要1)ドロップレット関連技術のシステム応用(庄子・竹山・関口):マイクロ流体デバイスを用いて、ナノ粒子表面へのたんぱく質の修飾に成功した。また、サイズが異なるドロップレットをパッシブにソーティングすることにより、柔らかい物質に損傷を与えることのないソーティング技術を開発し、システム化した。2)三次元シースフロー関連技術のシステム応用(庄子・関口):前年度よりも長い人工血管の作製と培養、および内腔が実際に空いているかの確認に成功した。3)細胞の光学的手法を用いた機能解析(庄子・竹山・関口・水野):前年度に引き続き細胞やDNA等にあらかじめ光学的に観察可能なマーカーを付与してから培養等を行い、その後解析を行うことで、メタゲノムに関する新たな知見を得ることに成功した。4)各種パッケージング技術の検討(水野・関口):マイクロ流体デバイスの作製には各種材料の直接接合技術の確立が不可欠であり、本年度も引き続き接合技術の検討とパッケージングへの応用を行い、システム化に不可欠な技術を確立した。【連携研究者】早稲田大学・助教:モリテツシ、助教:細川正人(細胞・バクテリア関連アプリケーション)ナノ理工学研究機構助教:尹棟鉉(マイクロドロップレット作製デバイスの開発)、埼玉大学・助教:鈴木美穂、福田武司(バイオプローブの合成と評価)、東京大学・教授:船津高志(生体たんぱく質の解析)、早稲田大学・准教授:武田直也(細胞から組織への再構成)1.研究の目的:微小発光サンプルの光学的超高感度定量計測を可能とすべく、on demand型の光学的補助機能を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発する。H27年度は、前年度までに確立したマイクロ流体デバイスシステムを用いて、各種応用と評価を行う。2.研究実績の概要:1)ドロップレット関連技術のシステム