hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体表面と吸着分子館の相互作用「吸着振動」の直接観測

これまでに吸着振動の対カチオンとして、アルカリ金属(Li+, Na+, K+, Rb+)イオン交換型ZSM-5および分子カチオン(アンモニウムイオン、ピリジニウムイオン)をZSM-5に吸着して観測してきたが、加えてRb+およびピリジン誘導体(2,4,6-trimethylおよび3,5-dimethylピリジニウムイオン)の吸着振動を観測した。金属カチオンの場合、振動波数は311 cm-1 (Li+)から87 cm-1 (Cs+)へと順にシフトし、シフト率は金属イオンの質量とイオン半径に依存していることが明確になった。分子カチオンの場合、電荷が分子内で偏っておりイオン半径が定義できないため質量依存性について検討した。アンモニウムイオンをNH4+からND4+に代えた場合、低波数シフトは観測されたが質量差が少ないので明確ではなかった。そこで上記ピリジン誘導体を用いたが、誘導体は質量が大きいのにもかかわらず高波数シフトした。このことから、置換基の電子的効果を考慮することが示唆され、確認のためメチル基とは逆に電子吸引性の3-fluoroピリジンの吸着を試みた結果、ピリジンよりも低波数に現れた。従って、ピリジン環の電子密度が高くなると吸着が強くなることを、吸着振動の直接観測で確認した。吸着種の安定性はその吸着振動で比較することができるため、対カチオンをNa+に固定して種々のゼオライト(FAU, MOR, BEA, MFI, CHA)について吸着振動を比較した。吸着振動波数は189-138 cm-1に観測され、最安定なものと不安定なもので約50 cm-1すなわち0.6 kJ/molのエネルギー差があることがわかった。これはファンデルワールス結合に相当し、この違いがゼオライトの"confinement effect"と呼ばれる「閉じ込め空間場の効果」に対応するものと考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。専用のセルの設計・作成は、真空排気下から気相分子存在下の様々な雰囲気で、なおかつ液体窒素温度から高温領域までの温度が可変で遠赤外領域の光を分光測定することができることを条件として行った。窓板の設置条件により、これまで用いていたセルよりも小型にし、セルと窓板の設置面の温度変化を抑える工夫をした。窓板材はポリエチレンとし、真空排気に対する強度と光散乱のバランスをとって厚みを調整した。遠赤外領域の研究は、様々なゼオライトディスクを大気下で観測することで行った。ゼオライトは擬似吸着系、すなわちイオン交換体を選び、カチオンとゼオライト格子酸素との相互作用に起因する、いわゆる「カチオン振動」の観測を行い、カチオンの質量の増加に伴う吸着振動波数の変化を知見として得た。さらにカチオンの種類(Na)を絞ることで、カチオン振動のエネルギーはゼオライトのトポロジーに依存することがわかった。また、一つのゼオライト(モルデナイト)について、Naのイオン交換率を変えた際のカチオン振動の観測を行い、半定量的な取り扱いをすることができた。中赤外領域の予備実験は、様々なプローブ分子の吸着挙動について詳しく行った。具体的には、塩基性プローブであるピリジン、アセトニトリル、ピバロニトリル、コリジン、ルチジン、ヘキサメチレンイミンなどの吸着測定条件の設定を行った。ここで、CO2が酸性プローブ分子となることがわかった。CO2は通常室温以上の温度で吸着させると、表面での化学反応を伴いカーボネートを生成し、単純な分子状吸着・脱離の過程を観測できていなかった。一方で、-50 °C以下での吸着を行うと、分子携帯を保ったまま塩基性サイトに吸着し、真空排気で脱離することから測定条件を選ぶことで塩基点のプローブとして用いることがわかった。なお、CO2の分子内振動が吸着サイトの塩基性強度を反映していることも確認できている。平成28年度はまず、液体窒素温度から高温領域までの温度が可変で、真空排気下から気相分子存在下の雰囲気で、遠赤外領域の光を分光測定することができる専用のセルの設計し、作成した。特に、窓板の材料を検討した結果、ポリエチレンを採用し、真空排気に対しても機械的に安定で、光散乱を最小限に抑えることのできる条件(厚み)を決定した。この系の設置により、既存のセルを用いた中赤外領域の測定と条件を揃えることで、吸着モードの現れる遠赤外領域から擬似的に連続したスペクトルを得ることができる。上記セルを用いなくても測定することのできる系での研究を、粉体試料をディスク状に圧縮成形することで自立させ、大気下においての測定をすることで進めた。まず、ゼオライトを、最初の対象固体試料としイオン交換型(Na型)ゼオライトの「カチオン振動」と呼ばれている、カチオンとゼオライトの格子酸素との相互作用の観測を行った。この系は厳密には「吸着振動観測」とは異なるが、カチオンの種類(質量)を変えることで吸収エネルギーが変化するので、ゼオライトの格子酸素と吸着種との相互作用、すなわち、ゼオライト格子酸素の塩基性の評価についての知見を得ることができる。また、カチオンの種類をナトリウムに絞って、様々なゼオライトについて検討した結果、振動エネルギーはトポロジーによって異なることを見出した。これが格子酸素の塩基性強度の違いに起因するのか、単純に幾何構造的な因子に由来するのかは、今後検討していく。

さらに一つのゼオライトについて、イオン交換率を変えた際のカチオン振動の観測を行い、半定量的な取り扱いをすることができた。ルイス酸点への吸着プローブ分子は、ピリジンの他にもアセトニトリル、アンモニア、COなど多くの種類が知られているので、含窒素化合物からその種類を広げていくために、中赤外領域での観測を行い、測定条件の最適化を行った。最適化したIRセルおよびin-situ測定用閉鎖循環系を用いて様々な条件下での測定を行った。これまではイオン交換型ゼオライトディスクを大気下で観測し、カチオンとゼオライト格子酸素との相互作用に起因する、「カチオン振動」の観測を行ってきたが、同じ試料を加熱真空排気し、共存する吸着水を除去することで、ピークが明確に現れることがわかった。一方で、ゼオライト試料も自作し直し、良好なサンプルを準備した。ゼオライト触媒の活性点である酸性水酸基を有するプロトン体は、合成で得られるNa型をアンモニウム体にイオン交換したのちに、アンモニアを加熱による除去して得られる。今回は、金属カチオンに止まらず、アンモニウムイオン(NH4+)とゼオライト格子酸素とのカチオン振動を観測することに成功し、その振動が加熱真空排気(アンモニア脱離)に伴いプロトン型に変化する際に消失することも確認できた。さらにプロトン型ゼオライトに室温でアンモニアを徐々に吸着させることで、アンモニウムイオンのカチオン振動が吸着量に応じて復活する様子も観測した。[Na+ →NH4+ →H →NH4+](プロトン体の場合、OH間の共有結合に由来する振動が3600 cm-1付近に現れる。)吸着実験ではアンモニア以外にピリジンも取り扱った。プロトン型ゼオライトにピリジンを吸着させるとピリジニウムカチオン振動が、アンモニウムのものより低波数に観測され、振動波数が質量に依存していることを確かめた。ただし、分子全体が帯電しているアンモニウムイオンと他の有機分子とは直接比較することはできないので、現在ピリジン誘導体を用いて検討を行っている。配位結合に由来する振動も観測を試みたが、結合エネルギーが弱く、測定の限界である50 cm-1に満たないものと推定された。この点はもう少し詳細に検討する。平成29年度はすでに作成した専用のセルおよび測定系の最適化を図った。この系の設置により、これまでの大気下での測定では除去できなかった共存する吸着水の影響を除外することができた。その結果、アルカリイオン交換型ゼオライトにおいて、これまでよりはるかに明確な吸収ピークを観測することができ、ピーク波数についての議論に耐えられる結果が得られた。すなわち、アルカリイオンの質量あるいはイオン半径が増加するに従って、ピークは徐々に低波数側にシフトし、Cs体になると測定の限界である50 cm-1を超え、観測できなくなった。さらにアンモニウム型ゼオライトの吸着水を除くことで、アンモニウムカチオンの振動も明確に観測した。真空加熱排気ができるin-situ測定では、吸着ー脱離過程を直接観測することもできた。アンモニウム型ゼオライトを200 °Cまで加熱排気することでアンモニアを脱離させると、アンモニウムのカチオン振動が消滅し、ここに室温で段階的にアンモニアを吸着させることで、アンモニウムカチオン振動が次第に現れる過程を観測した。さらに重アンモニアを用いることで、この振動が低波数シフトし、同位体を用いて振動の同定も行った。
グリセルアルデヒド修飾タンパク質の構造と糖尿病・老化関連疾患発症機構の解明

N^α-acetyllysine, N^α-acetylarginine,グリセルアルデヒド(GLA)の反応系でAGE(advanced glycation end products)であるMG-H1, GLAP, argpyrimidineおよび,新規ジヒドロピリミジウム化合物の2-(4-acetylamino-4-carboxy-butylamino)-5-(5-acetylamino-5-carboxy-pentyl)-7-hydroxy-3, 4-dihydro-pyrido[3,2-d]pyrimidin-5-ium(P4)が生成した。さらに、グルコースとフルクトースの分解によってGLA、α-ジカルボニル化合物のglucosone, 3-deoxyglucosone(3-DG), 3-deoxyxylosone, tetrosone , triosone, 3-deoxytetrosone, glyoxalとmethylglyoxalが同定された。3-DGの生理作用について検討を行い、3-DGがマウスマクロファージ細胞株に対して小胞体ストレスを介したアポトーシスを誘導することを見いだし、動脈硬化症など糖尿病合併症の発症機構におけるカルボニルストレスの意義を明らかにした。GLAとクレアチンとN^α-アセチルリジンの反応溶液からもGLAP、MG-H1、Argpyrimidine、P4の類似体が生成した。一方、グリセルアルデヒドにより修飾されたタンパク質が、インターフェロンβにより誘導される感染防御遺伝子の発現を抑制することを見出した。グルコース系やグルコース・タンパク質系でグリセルアルデヒドの生成を明らかとし,グリセルアルデヒドの定量法を確立し,それぞれの系でグリセルアルデヒドの定量を行い,グルコース系で生成するグリセルアルデヒドの生成量はグルコース・タンパク質系よりも高かった。これは,グリケーションの場合は生成したグリセルアルデヒドがさらにタンパク質を修飾し,AGE(advanced glycation end products)の生成に至ると考えられた。また,グリセルアルデヒドは3-デオキシグルコソン(3-DG)やglucosone(GLUCO)からも生成した。グルコースとフルクトースの分解によって生成するα-ジカルボニル化合物の化学構造を明らかにした。GLUCO,3-DG,3-deoxyxylosone,tetrosone,triosone,3-deoxytetrosone,glyoxalとmethylglyoxalが同定された。さらに,グリセルアルデヒドが関与するグリケーションでアルグピリミジンが生成することを明らかにした。N-alpha-acetyllysine,N-alpha-actylarginine,グリセルアルデヒドの反応系でAGEであるMG-H1,GLAPとアルグピリミジンが生成したが,N-alpha-actylarginineとグリセルアルデヒドの反応系では生成しなかった。従って,アルグピリミジンの生成にはリジン残基が必須であることが明らかとなった。さらに,アミノカルボニル反応の中間体である3-デオキシグルコソン(3-DG)の生理作用について検討を行い,3-DGがマウスマクロファージ細胞株に対して小胞体ストレスを介したアポトーシスを誘導することを見いだし,動脈硬化症など糖尿病合併症の発症機構におけるカルボニルストレスの意義を明らかにした。カルボニル化合物はタンパク質と反応し、様々なグリケーション後期段階生成物(AGE)を生成する。研究代表者らはグリセルアルデヒドの関与するメイラード反応で生成するAGEとして、グリセルアルデヒド由来AGEであるGLAPと、グリセルアルデヒドおよびメチルグリオキサール由来AGEであるMG-H1とアルグピリミジンを報告した。今年度はグリセルアルデヒドの関与するグリケーションで生成する架橋性AGEの化学構造を解析した。実験方法はグリセルアルデヒドをN-アセチルアルギニン、N-アセチルリジンと生理的な条件化でインキューベートし、反応生成物を逆相系HPLCで精製し、機器分析に供した。結果として、すでに同定したMG-H1,GLAP,アルグピリミジンと未同定の生成物を単離・精製した。この未同定な化合物は蛍光を有する黄色化合物であり、FAB-MS,NMRにより2-(4-acetylamino-4-carboxy-butylamino)-5-(5-acetylamino-5-carboxy-penty1)-7-hydroxy-3,4-dihydro-pyrido[3,2-d]pyrimidin-5-iumと同定した。

本化合物はグリセルアルデヒドの関与するグリケーションで生成する新規ジヒドロピリミジウム化合物であった。この化合物は糖尿病合併症の指標に成りうると考えられる。一方、グリセルアルデヒド修飾タンパク質がウイルス感染により発現するインターフェロン誘導遺伝子を下方制御することを見出した。このようなAGEの作用は、糖尿病患者が感染症にかかりやすくなる原因の一部となっていることが考えられる。本年度は生理的条件下においてグリセルアルデヒド(GLA)とグアニジノ化合物、N^α-アセチルリジンから生成するAGEの化学構造を解析することを目的とした。さらにラット尿細管上皮株化(NRK-52E)細胞を用いてそれらのAGEの生理作用について検討した。GLAとクレアチンとN^α-アセチルリジンの反応溶液から6種の主要ピークを検出し、そのうち1種は既知のAGEであるGLAPであり、その他のピークをCP0、CP1、CP2、CP3、CP4と命名した。CP0はMG-H1、CP3はArgpyrimidine、CP4はP4の類似体であった。CP0は反応の初期に増加し生成量が最も多かった。さらに、CP0はNRK-52E細胞に対する細胞傷害性を示さなかった。従って、CP0はnon-toxic AGEであることが示唆された。グアニジノ化合物はタンパク質モデルのアルギニンより反応速度が速いため、生体内では、クレアチンを始めとした遊離のグアニジノ化合物が、タンパク質を構成するアルギニンより速く反応しイミダゾリノン化合物を生成すると推察した。一方、グリセルアルデヒドにより修飾されたタンパク質が、インターフェロンβにより誘導される感染防御遺伝子の発現を抑制することを見出した。このことから糖尿病患者の体内に生成・蓄積したAGEが、感染防御応答を抑制する作用を発揮しうることが示唆された。
ストレス蛋白質発現誘導の薬理プロテオーム機構解析

本研究において、病態負荷時に発現誘導されるストレス蛋白質システムが、新しい治療薬ターゲットになることを発見し、その分子機構を解明したので報告する。すなわち独自に見出した新しい低酸素応答遺伝子であるカルシウム結合蛋白質S100Cや新しく見出している他のストレス蛋白質発現誘導に焦点をあて、病態モデルにおける血管リモデリングの薬理プロテオーム機構を解明した。そして、独自の薬理プロテオームデータベースと薬理プロテオーム解析の統合により医薬品作用のプロテオーム機構を明らかにした。具体的には、低酸素暴露による肺高血圧症モデルにおいて、HIF-1を介したストレス蛋白質S100Cの発現誘導が肺動脈のリモデリングに対し抑制的な役割を果たしていることを発見した。さらにメタボローム解析により、タウリンの経口投与がHIF-1及びS100Cの発現抑制を介し、肺動脈の血管リモデリングを抑制、肺高血圧症治療薬としての可能性を報告した(The Pharmacogenomics J.3:183-188,2003)。また、くも膜下出血モデルにおいて、遅発性脳血管攣縮時の脳底動脈におけるストレス蛋白質HSP72の発現上昇、さらに胃潰瘍治療薬テプレノン(Geranylgeranylacetone)の経口投与が、脳底動脈におけるストレス蛋白質HSP72の発現誘導を介して、遅発性脳血管攣縮の改善を促進することを発見した(Circulation. 110:1839-1846,2004)。これらの研究成果により、血管リモデリングの新しい薬理プロテオーム機構を解明した。我々が、世界に先駆けて提唱した「病態薬理プロテオームデータベースと病態モデルにおけるストレス蛋白質誘導の薬理プロテオーム解析の統合的解明」が、本研究により達成されたので、この研究戦略は今後広範な応用が可能である。本研究の目的は、生体レベルで、特定の標的分子に作用する医薬品による治療的介入が可能なのかという本質的課題に対して答を出すことにある。薬理学は、長年にわたり医薬品の作用機構を分子レベルで解明してきたが、生体レベルでは、この本質的課題に対して答を出していない。しかしながら、ポストゲノムシークエンス時代に初めて答えが出る可能性がある。我々は医薬品の作用機構の解明をトランスクリプトーム解析により行い、病態形成時に誘導されるストレス蛋白質であるHO-1,HSP72,S100Cに医薬品ターゲットとしての治療的作用機構を見出し、病態形成時のストレス応答遺伝子クラスターに治療薬ターゲット分子が内在することを明らかにした。さらに、我々は、独自に構築した病態薬理プロテオームデータベースと薬理プロテオーム機構解析との統合的解明を試みている。低酸素曝露ストレスによる肺高血圧症ラットモデル肺のプロテオーム解析において、S100C蛋白質の発現を認め、低酸素暴露後、24時間をピークとした発現上昇が認められた。また、タウリン投与により、発現抑制が認められた。現在、S100C遺伝子のプロモーター領域における低酸素応答配列および他の転写調節エレメントを介する低酸素シグナリングのプロテオーム機構解析を進めている。さらに、くも膜下出血後の脳底動脈では、遅発性攣縮に相応してHO-1,HSP72の蛋白質発現上昇が認められ、HSP72の医薬品による誘導で脳血管攣縮が著明に改善することを見出した。これらの知見から特定のストレス蛋白質をターゲットとした医薬品による治療的介入が可能であり、今後、トランスクリプトーム解析、プロテオームデータベースと薬理プロテオーム機構解析との統合的を進めていくことで、ストレス蛋白質に作用する医薬品による治療的介入を生体レベルで包括的に解明できると考えられる。我々は、医薬品の作用機構の解明を遺伝子発現プロファイル解析により試みてきた。その結果、病態形成時に誘導されるストレス蛋白質(S100C、HSP72)に、医薬品ターゲットとしての治療的作用機構を見出した。

まず、In vivoで低酸素に暴露し、血管リモデリングが認められるラット肺を用いて行ったトランスクリプトーム解析により、低酸素刺激により発現量が変化する遺伝子クラスターを明らかにした。その中で、我々が精製し、cDNAおよび遺伝子の構造を報告してきたカルシウム結合蛋白質であるS100C及び低酸素性細胞障害に対する保護作用が報告されているタウリンが低酸素により発現レベルが上昇することを見出した。さらに、この低酸素によるS100C遺伝子発現および血管リモデリングがタウリン経口投与により抑制されることを見出した(Pharmacogenomics J. 2003 ; 3(3) : 183-8)。次に、自家血の大槽内注入によるラット脳血管攣縮モデルを用いたトランスクリプトーム解析により、脳血管攣縮の重症度や時間経過に相関して発現が誘導されるHSP72遺伝子に注目した。アンチセンスHSP72オリゴデオキシヌクレオチドにより、HSP72遺伝子発現を抑制すると、脳血管攣縮が増悪することを明らかにした。さらにgeranylgeranyacetoneによりHSP72の発現を誘導すると、クモ膜下出血後の脳血管攣縮は軽快した。そこで、脳血管攣縮におけるHSP72遺伝子発現誘導は、内因性の抗脳血管攣縮因子であり、新しい創薬ターゲット(治療遺伝子)の可能性が示唆された(Circulation 2004 in press)。本研究において、病態負荷時に発現誘導されるストレス蛋白質システムが、新しい治療薬ターゲットになることを発見し、その分子機構を解明したので報告する。すなわち独自に見出した新しい低酸素応答遺伝子であるカルシウム結合蛋白質Sl00Cや新しく見出している他のストレス蛋白質発現誘導に焦点をあて、病態モデルにおける血管リモデリングの薬理プロテオーム機構を解明した。そして、独自の薬理プロテオームデータベースと薬理プロテオーム解析の統合により医薬品作用のプロテオーム機構を明らかにした。具体的には、低酸素暴露による肺高血圧症モデルにおいて、HIF-1を介したストレス蛋白質S100Cの発現誘導が肺動脈のリモデリングに対し抑制的な役割を果たしていることを発見した。さらにメタボローム解析により、タウリンの経口投与がHIF-1及びS100Cの発現抑制を介し、肺動脈の血管リモデリングを抑制、肺高血圧症治療薬としての可能性を報告した(The Pharmacogenomics J.3:183-188,2003)。また、くも膜下出血モデルにおいて、遅発性脳血管攣縮時の脳底動脈におけるストレス蛋白質HSP72の発現上昇、さらに胃潰瘍治療薬テプレノン(Geranylgeranylacetone)の経口投与が、脳底動脈におけるストレス蛋白質HSP72の発現誘導を介して、遅発性脳血管攣縮の改善を促進することを発見した(Circulation.110:1839-1846,2004)。これらの研究成果により、血管リモデリングの新しい薬理プロテオーム機構を解明した。
雌性両全異株を用いた重イオンビーム照射による植物Y染色体の創出モデル実験

植物性染色体の出現は極めて新しい。その起源を探るため、マンテマ属を異種交配し染色体構造が複二倍体化した雌性両全異株を作出し、重イオンビームを照射することで染色体異常と雌性不稔を同時に誘起させ、非組換え領域をもった擬似的性染色体が出現するかどうかを調査することをめざしている。平成20年度は最終年度に当たるが、具体的には以下の課題を実施し当初の目的をほぼ達成した。<1>BAC-FISHとマルチカラー競合FISHで、マンテマ属の個々の染色体を識別できるようなBAC-FISHプローブが単離できた。<2>異種交配による雌性両全異株の作出に関しては、S. latifolia x S. conicaとs. latifolia x S. viscocaの有望株を選抜して核型解析をしているところである。<3>20年度から、重イオンビームに加えγ線照射による雌雄異株の突然変異体の作出が可能となっている。(1)重イオンビーム照射条件を検討し、植物の染色体に最大の影響を与える条件を決め、致死率、生存した個体の核型、PCRマーカーを用いたDNA損傷部位の解析が可能となった。(2)異種交配で作出した雌雄両全株や三性株に、重イオンビームを照射することで、変異体誘発によって雌雄異株化が促進されるかを調査した。(3)重イオンビーム照射で得られた雌雄異株の核型解析し、野生型株の核型解析結果と比較検討することで、減数分裂期に各染色体の対合の有無を減数分裂期の二価染色体を確かめた。(4)野生株と雌性両全異株へのγ線照射することで、重イオンビームよりより強いDNA損傷能を与えた場合の効果を調査した。(5)γ線照射で得られた雌雄異株突然変異体の核型解析を、誘導された雌雄異株に限らず変異を起こした雌性両全異株の減数分裂期の二価染色体の挙動に注目して、染色体異常と異型染色体の出現頻度を解析した。雌性両全異株に重イオンビームを照射することで、植物Y染色体の進化を再現できるのではないかと考えている。雌雄同株は優勢の雄性決定(M^F)と劣勢の雌性決定遺伝子(F^f)の相同染色体(M^F-F^f)からなっている。雄性決定(M^F)に劣勢の雄性不稔変異(M^s)が起こると、雄性不稔(M^s-F^f)と両性花(M^F-F^f)からなる雌性両全異株が出現する。M^Fをもつ染色体に優勢の雌性不稔遺伝子(F^S)が生じると、この染色体をもつものは雄株となる。これが三性株で一度雌株と雄株が出現すると、雌雄同株が集団から排除される。この選択圧のもとで染色体M^F-F^fが消失し、原X染色体(M^s-F^f)と原Y染色体(M^F-F^S)の組換えが抑制されXY染色体が完成する。マンテマ属を異種交配し染色体構造が複二倍体化した雌性両全異株を作出し、重イオンビームを照射することで染色体異常と雌性不稔を同時に誘起させ、非組換え領域をもった擬似的性染色体が出現するかどうかを調査する。これによってチャールズワースの模式図に代表される植物性染色体の進化モデルを実証する。重イオンビーム(重粒子線)は理研のリングサイクロトロンで発生させたものを用いた。初年度は以下の3つのテーマを中心に解析した。1.マンテマ属のBAC-FISHとマルチカラー競合FISHを用いた核型解析ゲノム解析とBAC-FISHの可能性を検討した。マンテマ属の染色体はほとんどが中部動原体で個々の染色体を識別することが難しい。BACクローンを直接プローブとして用い染色体特異的な繰り返し配列をスクリーニングして候補を得た。2.異種交配による雌性両全異株の作出S.latifolia x S.conicaの交配を試みている。S.latifoliaの核型は2n=22+XY、S.conicaは2n=22で、交雑が可能である。これらを交配して、雌雄両全異株や三性株の作出に取り掛かっている。3.重イオンビーム照射による雌雄異株の作出と性染色体重イオンビーム照射条件の検討をした。植物の染色体に最大の影響を与える照射条件を、致死率と生存した個体の核型解析から探り、いくつかの突然変異体を単離することに成功している。三性株で一度雌株と雄株が出現すると、雌雄同株が集団から排除される。この選択圧のもとで染色体M^F-F^fが消失し、原X染色体(M^S-F^f)と原Y染色体(M^F-F^S)の組換えが抑制されXY染色体が完成する。重イオンビームを照射することで染色体異常と雌性不稔を同時に誘起させ、非組換え領域をもった擬似的性染色体が出現するかどうかを調査する。

マンテマの生育期間と開花までの時間を考慮すると、研究は複数年度に渡って何回も繰り返す必要があろう。19年度は初年度の18年度に引き続き以下の研究を行った。1.マンテマ属のBAC-FISHとマルチカラー競合FISHを用いた核型解析:ゲノム解析とBAC-FISHの可能性を検討した。マンテマ属の染色体はほとんどが中部動原体で個々の染色体を識別することが難しい。BACクローンを直接プローブとして用いスクリーニングした結果、染色体特異的な繰り返し配列とSTS配列を得ることができた。2.異種交配による雌性両全異株の作出:S. latifolia x S. conicaの交配と重ビームイオン照射を試みている。S. latifoliaの核型は2n=22+XY、S. conicaは2n=22で交雑が可能で、重ビームイオン照射後、雌雄両全異株や三性株のスクリーニングに取り掛かっている。3.重イオンビーム照射による雌雄異株の作出と性染色体:重イオンビーム照射条件の検討をした。植物の染色体に最大の影響を与える照射条件を、致死率と生存した個体の核型解析から探り、いくつかの突然変異体を単離することに成功している。種子照射に加え花粉照射も行っている。植物性染色体の出現は極めて新しい。その起源を探るため、マンテマ属を異種交配し染色体構造が複二倍体化した雌性両全異株を作出し、重イオンビームを照射することで染色体異常と雌性不稔を同時に誘起させ、非組換え領域をもった擬似的性染色体が出現するかどうかを調査することをめざしている。平成20年度は最終年度に当たるが、具体的には以下の課題を実施し当初の目的をほぼ達成した。<1>BAC-FISHとマルチカラー競合FISHで、マンテマ属の個々の染色体を識別できるようなBAC-FISHプローブが単離できた。<2>異種交配による雌性両全異株の作出に関しては、S. latifolia x S. conicaとs. latifolia x S. viscocaの有望株を選抜して核型解析をしているところである。<3>20年度から、重イオンビームに加えγ線照射による雌雄異株の突然変異体の作出が可能となっている。(1)重イオンビーム照射条件を検討し、植物の染色体に最大の影響を与える条件を決め、致死率、生存した個体の核型、PCRマーカーを用いたDNA損傷部位の解析が可能となった。(2)異種交配で作出した雌雄両全株や三性株に、重イオンビームを照射することで、変異体誘発によって雌雄異株化が促進されるかを調査した。(3)重イオンビーム照射で得られた雌雄異株の核型解析し、野生型株の核型解析結果と比較検討することで、減数分裂期に各染色体の対合の有無を減数分裂期の二価染色体を確かめた。(4)野生株と雌性両全異株へのγ線照射することで、重イオンビームよりより強いDNA損傷能を与えた場合の効果を調査した。(5)γ線照射で得られた雌雄異株突然変異体の核型解析を、誘導された雌雄異株に限らず変異を起こした雌性両全異株の減数分裂期の二価染色体の挙動に注目して、染色体異常と異型染色体の出現頻度を解析した。
脳における甲状腺ホルモン作用の特殊性を規定する因子の分子生物学的解析

甲状腺ホルモンは大脳を含めた中枢神経系の発育、機能発達に不可欠であるが、その作用は他臓器に比較し、いくつかの点で特殊である。本研究では、ラットをモデルとして脳における甲状腺ホルモンによる標的遺伝子の転写段階での作用の特殊性を規定する因子の解析を行った。リンゴ酸酵素遺伝子は肝臓では甲状腺ホルモンによる誘導を受けるが、脳では発現レベルが高いにもかかわらず、甲状腺ホルモンによる調節を受けない。リンゴ酸酵素遺伝子プロモーター領域をDNAプローブとしてelectrophoretic mobility shift assay(band shift assay)を行ったところ、in vivoの甲状腺ホルモン投与により肝では特異的コンプレックスを形成する因子の出現が認められたが、脳ではこのような因子の出現は認められなかった。また、in vitroで発現させたラットα甲状腺ホルモン受容体とともにリンゴ酸酵素遺伝子プロモーター領域に存在する甲状腺ホルモン応答DNA配列をもちいてband shift assayを行ったところ、肝、脳ともに受容体・DNA結合を安定化するthyroid hormonereceptor auxiliary protein(TRAP)の活性が認められたが、それらの泳動パターンは相互に異なっており、臓器特異的TRAPの存在が強く示唆された。これらのTRAPの活性に対してはin vivoの甲状腺ホルモン投与の影響は認められなかった。以上のように甲状腺ホルモン作用の臓器特異性を規定する因子として、少なくともTRAPおよびTRAP以外の特異的転写因子の二種が存在することが明らかになった。NGFI-A遺伝子プロモーターでは脳の発育段階に特異的なTRAPの存在が示唆されており、現在、これらについてレチノイドX受容体との異同も含めて検討中である。
音楽創作による戦争協力－第二次大戦中のアメリカ作曲界を対象にして－

本研究は第二次大戦期のアメリカにおける現代音楽作曲家たちによる戦争協力の実態を明らかにすることを目的としている。初年度となる2018年度は全体の基礎をなす作業として、主として重要文献の収集と精読を行なった。以下、もっとも重要と思われる3つの文献について記す。まずはベン・アーノルド『音楽、意味、戦争』(Ben Arnold“Music,Meaning, and War: The Titles of War Compositions"InternationalReview of the Aesthetics and Sociology of Music 22/1,1991)は、戦争に関連する作品(アメリカに限らない)を対象にしながら、それぞれがどのような形で戦争と関わっているのかについて考察したものである。この文献について著者のArnold氏と電子メールでいくつかの議論を交わし、氏の過去の著作である『音楽と戦争』(Music and war,1994)を、本研究の一種のデータベースとして用いることを決定した。一方で、アイルランドにおける学会Documenting Jazzに参加し個人研究発表を行なった。この学会においては、戦争と音楽の関係性を問う発表が多く、きわめて重要な示唆を多数得ることができた。20世紀における戦争と音楽に関する研究の駄一人者Ben Arnoldと様々な意見交換ができたこと、そしてAnnegret Fauserの浩瀚な書籍を消化することにより、研究の基礎段階はほぼ終わったと考えられるため。当初の研究をこのまま推進するつもりである。2019年度はアメリカにおける資料研究および現地学者との意見交換が中心になるはずである。
ヒト21・22番染色体をモデルとする遺伝子発現制御機構の解析

本研究は、染色体の全塩基配列情報とマイクロアレイ技術を使って、染色体のマクロ構造と遺伝子発現制御の関連を解析することを目的としている。ヒト21番・22番染色体には、それぞれ225個・545個の遺伝子があると予想されているが、昨年度はそのうち計152遺伝子のマイクロアレイ化を行い解析した。今年度は、昨年分と合わせてマイクロアレイ化した計449遺伝子について解析を行った。内訳は、21番染色体が142遺伝子、22番染色体から307遺伝子であり、発現している遺伝子をほぼ網羅していると考えられる。解析に用いたサンプルは、薬剤(DNAメチル化やヒストンのアセチル化、その阻害剤など)で処理した様々な細胞のRNAである。高密度の解析を行うために公開情報の利用を検討したが、信頼度の高い解析結果は得られなかった。現在、クラスタリング解析を進めるとともに、データの信頼性を高めるための更正系を構築している。
中学生の不定愁訴発現と大気圧に対する心拍・血圧変動及び運動の関連性に関する研究

成長期における不定愁訴の発現と運動の関連性について横断的・縦断的に研究した。横断的研究の対象者は741名、縦断的研究の対象者は41名であった。以下の成果を得た。身体活動量の多い・少ないが不定愁訴発現に関連した。生活習慣が不定愁訴発現に関連した。朝食摂取が不定愁訴発現に関連した。肥満と動脈の硬さが関連した。中学生男子の身長伸び率と動脈の硬さが関連した。横断的研究と縦断的研究の評価が一致した。以下の成果を得た。成長期は、身体的な発育だけでなく精神的な発達が同時に生じる。いわゆる第二次性徴期に一致した身体発育の加速現象のみられる時期である。身体的に身長の成長と骨格の成長に遅延が生じたりする例から推測すると、身体的な発育と精神的な発達の遅延に身長と骨格の関連性が関与していると考えられる。このことがいわゆる不定愁訴の発現と関連する事例をこれまで多く観察してきた。特に、気象環境の変化のなかでも大気圧変動と血圧変動の関連性を認める知見から不定愁訴発現との時期的な共通性をこれまで探究してきた。これまでに、小学生から中学生にかけての身長の伸びと血圧の関連性を縦断的な手法で観察し続けてきた。その結果、身長の伸びる第二次性徴期に差し掛かると収縮期血圧が増加する知見を得た。同時に、運動前後の不定愁訴を確認するための問診から大気圧変動が著しい(0.6hPa/h)日の翌日には血圧の変動よりも不定愁訴の発現が多く観察された。中学生の脈波伝搬速度の横断的な観察から、男子の脈波伝搬速度は学年が進むに伴い(身長の増加)増加する傾向が有意である知見を得た。一方、中学生女子については学年が進むに伴い(身長・体重の増加)脈波伝搬速度が減少する傾向が有意である知見を得た。これらのことは、中学生男子の脈波伝搬速度変化から推測すれば第二次性徴期にある中学生男子の動脈の柔らかさが一時的に硬さを増すことを示唆する。しかしながら、この動脈の柔らかさの変化は正常範囲の変動であり、このことが直接不定愁訴出現に関与する可能性は少ないものと考えられる。ところが、大きな大気圧変動に暴露された場合、このような動脈の柔らかさの変化が収縮期血圧の一時的な増大に結びつく可能性も考えられる。一方、中学生女子については男子の脈波伝搬速度変化とはミラーイメージの動態を示すが、この背景として女性ホルモンの関連性が高いと推測できる。本邦において発育期のPWV(脈波伝播速度)と不定愁訴の関連性を課題とした論文・報告は見当たらない。発育期中学生の不定愁訴発現には、骨成長の時期と身長成長の時期(血管成長の時期)の「ずれ」が関与し、発育期の血管の弾性の低下とそれに伴う自律神経系調節の関与が気圧依存の血圧変化に影響を及ぼすとする仮説を立て、運動との関連性について研究を行うことを目的とした。発育期の中学生を対象に不定愁訴、血圧、身長、体重、脈波伝搬速度及び心臓自律神経系活動の測定を2年間継続してきた。これまでに中学生約500名における血管の硬化度(動脈スティフネス)、不定愁訴に関するアンケート調査を行い、運動の関連性について明らかにする分析を進めてきた。次の5課題の検証と相互の関連性についてまとめることを目標にして研究を継続中である。(1)身長の伸びと血管弾性変化、(2)身長の伸びと自律神経系活動、(3)血管弾性の低下と不定愁訴の発現頻度変化、(4)気圧に依存する血圧変化、(5)不定愁訴に関するアンケート調査、(6)運動習慣に関するアンケート調査対象者約500名の資料を横断的・縦断的に分析し、次のことが明らかになった。(1)二次性徴期にある男子の血圧、脈波伝播速度は、学年の進行に伴い上昇すること、(2)中学生女子の血圧、脈波伝播速度は、各学年間に差がないこと、(3)中学生男子の脈波伝播速度の増加に身長の伸び率が関与すること、(4)二次性徴期にある児童・生徒の肥満や血圧の高値が脈波伝播速度を増加させることを明らかにした。これらの分析から中学生の動脈スティフネス変化に性差が存在し、特に男子の身長の伸び率との関連が深く、成長期の生活習慣が動脈スティフネス変化に関連するものと考えられた。不定愁訴の発現と関連する生理指標と時期的な共通性をこれまで探究してきた。小学生から中学生にかけての身長・血圧・運動パフォーマンス・及び不定愁訴の関連性を縦断的な手法で調査・観察した。以下の知見を得た。

(1)中学生481名(男子290名、女子191名)の身体活動量と血圧の資料から身体活動量の多い中学生の脈波伝播速度が有意に低値を示すこと。(2)中学生481名(男子290名、女子191名)の肥満度と血圧の資料から肥満と判定された中学生の脈波伝播速度が有意に高い値を示すこと。(3)小・中学生女子(213名)の月経有群の身長・体重・体脂肪率・拡張期血圧が有意に高い値を示したこと。(4)中学生女子(1名)の日照時間と収縮期血圧の資料(5年4ヶ月間、781サンプル)から日照時間と運動時の収縮期血圧の関連性を認めたこと。(5)中学生男女(72名)の身長増加率と柔軟性に有意な相関関係を認めたこと。(6)男子中学生(40名)の握力と収縮期血圧の有意な相関関係を認めたことから、性ホルモンの分泌亢進、筋量と血液量の増加が発育期の動脈ステッフネス変化に影響すること。(7)朝食を3品以上摂取する児童(小学6年生男児58名)のシャトルランの成績が優れていること。(8)朝食を3品以上摂取する児童(小学6年生男児58名)の不定愁訴の発現が低いこと。これらの知見を3つの研究成果として、まとめた。(1)成長期の身体活動量の多少が不定愁訴発現に関連すること。(2)成長期の日照時間が不定愁訴発現に関連すること。(3)成長期の朝食摂取が不定愁訴発現に関連すること。
ヒストン・メチル化によるTCRβ遺伝子座の対立遺伝子排除の制御

リンパ球抗原受容体遺伝子は分化段階特異的にV(D)J組換えをおこすが、これはクロマチンの開閉状態により制御されている。我々は、インターロイキン7レセプターにより活性化されたStat5が、TCRγ遺伝子座に転写共役因子をリクルートし、ヒストンのアセチル化により転写とDNA組換えを誘導することを示した。最近、ヒストンH3Lys9のメチル化が種々の遺伝子座のサイレンシングを誘導することが報告されているので、TCRγ遺伝子座が閉じた状態とヒストンのメチル化との関連について解析した。BaF3/pim-1細胞ではIL-3刺激によりTCRγ遺伝子座においてヒストンのアセチル化が誘導される。この実験系を用いて、サイトカイン刺激後のTCRγ遺伝子座全域のヒストン修飾の経時的な変化を、抗アセチル化ヒストンH3Lys9抗体と抗メチル化ヒストンH3Lys9抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法にて解析した。その結果、サイトカイン非刺激の状態でJγ遺伝子やエンハンサー領域が高レベルでメチル化されていたが、刺激後数日間でそのメチル化レベルが徐々に低下し、代わりにアセチル化レベルが上昇した。この時、Jγ領域のgermline転写の誘導をノザン法で、クロマチンの開閉状態を制限酵素accessibility法にて解析すると、サイトカイン刺激後数日間をかけて転写とaccessibilityが除々に上昇した。一方、Cγ遺伝子においては、ヒストン修飾のこのような変化は見られなかった。以上の結果から、TCRγ遺伝子座におけるヒストンH3Lys9の修飾は調節領域に特異的に誘導され、クロマチンの閉じた状態とヒストンのメチル化が良く相関することが示された。
ヘルペスウイルス再活性化と特発性顔面神経麻痺発症に関する分子生物学的研究

1.交代性顔面神経麻痺症例における単純ヘルペスウイルスの検出交代性顔面神経麻痺2症例について、PCR法を用いて発症早期と治療経過中の唾液・涙液よりHSV-1の検出を試みた。2症例ともに治療経過中に唾液または涙液からHSV-1が検出されたが、発症早期にはHSV-1の再活性化は検出できなかった。麻痺発症後に麻痺に伴うストレス、ステロイドの使用等が契機となりHSV-1が再活性化したことが疑われ、麻痺発症とHSV-1再活性化の関連は明らかにできなかった。2.Bell麻痺患者におけるHSVの唾液中の排出Bell麻痺患者の唾液を採取し、再活性化したHSV-1の排出の有無を検索した。Bell麻痺患者では20例中5例(25%)の症例でHSV-1が検出された。このうち発症7病日以内に検出されたのは3例、それ以降に検出されたもの2例であった。発症5日目に検出されたが、治癒とともに検出されなくなった症例が1例みられた。発症早期にHSV-1が検出された症例では、発症との因果関係が濃厚であるが、治療経過中に検出された症例では、麻痺に伴うストレス、ステロイド剤の投与が再活性化の原因とも考えられる。今後、HSV抗体価陽性の健常人についても調べ比較する必要があると思われた。3.PCR法を用いたzoster sine herpeteの診断初診時にBell麻痺と診断された症例におけるVZV再活性化をPCR法を用いて検索することにより、zoster sine herpeteの診断を試みた。咽頭ぬぐい液からは27例中4例(15%)でVZVが検出された。末梢血は15例で調べたが、VZV DNAが検出された症例はなかった。PCR法を用いたVZV再活性化の診断は、ウイルスを直接的に検出する方法である点、血清検査より早期に診断可能である点で有用である。またzoster sine herpete症例ではウイルス血症を呈していることが少なく、末梢血よりは咽頭ぬぐい液を検査したほうが良いことが明らかとなった。
梵語仏典における仏教用語の語源解釈の研究―文法学的観点から―

研究目的「梵語仏典に現れる語源解釈の教学的意義を古典インド文法学(パーニニ文法学)の観点から解明する」にかかる平成17年度の研究実施計画に基き下記成果を得た。1一次資料(収集済)調査:称友著『倶舎論釈』に現れる語源解釈に関わる文法学的記述を特定し,アルバイトの協力も得て,テキスト形式で51ファイルのデータベースを作成した。2海外調査:3文献収集:主に欧文の学術雑誌論文を主とする資料を収集し,これに収集済みの一次・二次資料を併せ,アルバイトの協力も得て,約3300件の文献データベースを作成した。4研究発表(1)北海道印度哲学仏教学会第22回学術大会(平成17年8月26日北海道武蔵女子短期大学)において「インド文法学における行為名詞の問題」と題して研究発表を行なった。この中で,サンスクリット語の一次派生語の語義解釈に多用される"動詞語根表示"(bhava表示)にかかる最古の資料Nirukta当該部分の解釈史ならびに意味論的観点に立った分析・解釈を試みた。(刊行準備中)研究目的「梵語仏典に現れる語源解釈の教学的意義を古典インド文法学(パーニニ文法学)の観点から解明する」にかかる平成17年度の研究実施計画に基き下記成果を得た。(刊行準備中)
理系日本人学生と留学生の課題解決型・課題探求型対話における意思決定プロセスの研究

本研究は、将来、日本のものづくり産業を牽引する理系の日本人学生と非日本語母語話者である留学生とを対象に、二者間における異文化を超えた対話力育成のための基礎資料の構築を目指すものである。日本人学生および留学生からなる参加者の日本語による問題解決型・課題探求型の2タイプのディスカッションについて、結論に至るまでのプロセスや、話し合いに最も影響を与えている要因、コミュニケーション上の問題点等について分析・検討を行う。
綿毛発生における基底小体付属構造形成の分子機構の解明

線毛細胞の線毛は、細胞表面の可動性の細胞質突起で、中心子と同じ構造の基底小体から伸長する。基底小体には、basal foot、ルートレット、alar sheetという基底小体附属構造が付随している。線毛細胞の形成機構を線毛発生という。基底小体の複製に重要なFGは、ルートレットの形成にも深く関与する。中心体には、100を越える分子の存在が考えられている。ゴルジ関連たんぱく質の中心体への局在について検討したところ、Golgi 58Kが中心体、特に線毛を伸長する母中心子周囲の中心子周囲物質中に強く発現していることを見出した。この局在は、ゴルジ装置の断片化、微小管などの細胞骨格系の破壊によっても保持され、また細胞分裂時にも保たれた。Golgi 58K、すなわちformiminotransferasecyclodeaminase(FTCD)は、中間代謝産物としてグルタミン酸を産生する。線毛を伸長する中心子、基底小体は、高度にグルタミン酸修飾されている。基底小体のグルタミン酸修飾におけるグルタミン酸の供給に、FTCDによる代謝過程で生産されたグルタミン酸が使用されている可能性が高い。また中心体に局在するC-Nap1、Nek2、Ran、AKAP450などの中心体関連分子と線毛発生における基底小体の複製との関係について、細胞生物学的、免疫組織化学的に解析をした。ルートレットは、195K蛋白質、205-215K蛋白質、ルートレチンなどの分子によって構成されている。KD細胞の線毛形成におけるルートレチンの働きについて、RNAi法よるノックダウンにより解析した。ルートレチンのsiRNAの細胞内導入により、ルートレチンの発現は高率にブロックされたが、線毛形成は正常に行われた。線毛構成分子の輸送にルートレットとは別のレールが存在することが示唆された。またルートレチンsiRNAにより細胞の分裂が早期に誘導されることが示唆された。線毛は、中心子と同じ構造の基底小体から伸長し、基底小体には、ルートレット、根小足、翼状板という三つの主要な基底小体附属構造が付随している。ルートレットは195K蛋白質、205-215K蛋白質、ルートレチンなどの分子によって構成されている。ヒトとマウスのルートレチン(hsa:9696,mmu:230872)に共通抗原ペプチドRVEDLLAQSRAERDELAIKYを作成した。これをウサギに注射して、特異抗体(h-m rootletin)を作製した。線毛を伸長した基底小体や中心子におけるゴルジ関連たんばく質の局在について、Golgizone、TGN46、Golgin97、Golgi58(formiminotransferase cyclodeaminase)などに対する抗体を用いて、細胞生物学的、免疫組織化学的に検討したところ、Golgin97、Golgi58K陽性の顆粒状構造がこれらに密接して存在していることが認められた。この局在は、細胞分裂時にも保たれ、また微小管やアクチンフィラメントの阻害によっても変化は見られなかった。HSC-4細胞などの培養細胞で研究をすると、二つの中心子のうちの一方が、ゴルジ関連たんばく質と強く反応していた。線毛を伸長したKD細胞やBalb/c3T3細胞における実験から、二つの中心子のうちの、線毛を伸ばした基底小体(母中心子)の方に強く反応が見られることが証明された。Triton-

Xによる抽出標本の蛍光抗体法と免疫電顕法による実験から、膜系ではなく、基底小体(中心子)の周囲物質中に、これらのゴルジ関連たんぱく質が存在することが確認され、基底小体附属構造を含めた線毛装置の形成に、基底小体に付随するゴルジ関連たんばく質が密接に関係していることが考えられた。哺乳類の細胞には、中心子がペアで存在し、中心子周囲物質とともに、中心体を形成している。線毛は、中心子と同じ構造の基底小体から伸長し、基底小体には、basal foot、ルートレット、alar sheetという基底小体附属構造が付随している。ゴルジ関連たんぱく質の中心体への局在について細胞生物学的、免疫組織化学的に検討したところ、Golgi 58K(formiminotransferase cyclodeaminase, FTCD)が中心体、特に線毛を伸長する母中心子の中心子周囲物質中に強く発現していることを見出した。この局在は、細胞分裂時にも保たれ、またゴルジ装置の断片化、微小管などの細胞骨格系の破壊によっても保持された。線毛を伸長する中心子、基底小体の安定化には、チュブリン分子のグルタミン酸修飾が密接に関与する。線毛を伸長する基底小体のグルタミン酸修飾において、グルタミン酸の供給に、FTCDによる代謝過程で生産されたグルタミン酸が密接に関与することが示唆された。また中心体に局在するC-Nap1、Nek2、Ran、AKAP450などの中心体関連分子と基底小体の複製機構との関係について、線毛発生細胞をもちいて細胞生物学的に解析を行った。ルートレットは、横紋を持った線維状構造の束で、195K蛋白質、205-215K蛋白質、ルートレチンなどの分子によって構成されている。KD細胞の線毛形成におけるルートレチンの働きについて、RNAi法よるノックダウンにより解析した。ルートレチンのsiRNAの細胞内導入により、ルートレチンの発現は高率にブロックされたが、線毛形成は正常に行われた。線毛形成における線毛構成分子の輸送にルートレットとは別のレールが存在することが示唆された。またルートレチンsiRNAにより細胞の分裂が早期に誘導されることが示唆された。
宿主応答撹乱を誘導するヘリコバクターピロリ由来ncRNAの同定

感染時に宿主応答を撹乱させる作用を有する、未知のヘリコバクターピロリ(H.pylori)エフェクター分子の探索を実施した。その結果、DNA立体構造を加味したinsilico解析からは、エフェクターRNAとしての可能性の高いH.pyloriRNAの同定には至らなかったものの、H.pylori感染によって細胞内の存在量が増大するmicroRNAを同定した。特に増大が顕著にみられたmicroRNAは、感染宿主細胞の細胞増殖に影響を与える可能性が示唆された。H.pylori感染時に細胞内で発現量が増大するmicroRNAは、菌体からRNAが移行するのではなく、主に宿主細胞の発現変動に由来することが明らかとなった。本研究では、ヘリコバクターピロリ菌(Helicobacter pylori, H. pylori)が感染時に宿主応答を撹乱させる未知エフェクター分子を明らかにする目的で、H. pyloriがコードするnon-coding RNA (ncRNA)が、感染宿主細胞内で感染宿主応答を撹乱するncRNAとして作用する可能性を検証することを目指す。2年間の研究期間の中で、以下の解析を企図した。(A) in silico検索によるH. pylori候補RNA配列を選定する。(B)候補RNA配列の感染細胞内における宿主miRNA様作用をin vitroで検証する。(C)候補RNA配列の菌体外分泌機構を解明する。また期間的に可能であれば、(D)モデル動物感染実験を行い、in vivoでの作用を解析する。今年度は、ヒトの感染症状に類似した胃炎、胃潰瘍、胃癌を呈するスナネズミ感染株、低病原性のマウス感染株、および、高病原性マウス感染株の、計3株のゲノム解析において、サンガー法による補足データ確認を終了した。これにより、病原性の違いによるRNA配列の違いを解明することができるだけでなく、各種遺伝子改変動物が作出されているマウスでのin vivo実験への発展的展開が容易となることが期待できる。また、RNA-seq解析用サンプルの調製が難航していたが、系を確立して解析を行うことができた。候補RNA選定作業を現在遂行中である。今年度は、RNA配列解析を着手する準備段階として、ヒトの感染症状に類似した胃炎、胃潰瘍、胃癌を呈するスナネズミ感染株、低病原性のマウス感染株、および、高病原性マウス感染株の、計3株に関して、染色体およびプラスミドの配列解析を行い、全配列情報を得た。現在サンガー法による補足データ確認を行い、遺伝子領域予測およびアノテーション解析を進行している。本ゲノム解析に関しては、新学術領域研究「ゲノム支援」の支援を受けて解析を行った。また、RNA-seq解析用サンプルの調製条件検討を行い、解析用サンプル調製系の確立を行った。当初の計画では、スナネズミ感染株1株のみを配列解析に供する予定であったが、申請後に、マウスでの高病原性株を入手することができたことから、高病原性と低病原性マウス感染株を解析に加えることが可能となった。今後は以下の研究を推進する予定である。・in silico検索によるH. pylori候補RNAを選定する。・候補RNA配列の感染細胞内での宿主miRNA様活性を検証する。・候補配列の宿主細胞移行経路を解明する。次年度は、in vitroでの候補RNA配列活性解析のための各種RNA実験用試薬が必要となる予定であることから、主に当該研究用試薬の購入のために研究費を使用する予定である。