hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯髄疾患の治療を目指した神経分化誘導羊膜上歯髄由来細胞シートの作成

生物学的材料として様々な医療領域分野で注目されている羊膜を基質とした羊膜上歯髄由来細胞シートを応用し、歯髄疾患の新たな治療法の開発を目的としている。羊膜上に歯髄由来細胞を培養し、神経細胞へと分化誘導した羊膜上培養歯髄由来細胞シートを作成した。作成した培養シートを約20週齢Fischer 344ヌードラット(雄)の歯髄を露出させた臼歯へ移植した。約4週間後、顎骨ごと採取。組織学的・免疫組織学的検討を行ったところ移植した培養シートの局在を認めたが、周囲組織の形態的変化は認めなかった。羊膜は基底膜においてIV型コラーゲンおよびラミニンの発現がみられるなど、細胞の培養基質として妥当な組織であり、さらには血管成分を含まないため、移植後の免疫反応を軽減することが可能である。各種細胞の培養基底膜として適し、皮膚移植、膣形成術、腹部手術の際の癒着・瘢痕防止、皮膚熱傷後などの創部の被覆による治癒促進、さらには眼表面の再建などの手術療法に用いる報告があり、その移植材料としてだけでなく、培養基質としても高い有用性・有効性が注目されている。羊膜は、帝王切開時の胎盤より採取したもの、および再生医療支援機構・近畿羊膜バンクからの研究用羊膜の譲渡・供給を受け、研究に用いた。歯髄由来組織は智歯抜歯術の際に、無菌的に採取した。得られた歯髄由来組織を抗菌薬を添加したPBS(-)にて洗浄後、初代細胞を得るための培養を行った。34継代培養後、歯髄由来細胞として使用した。羊膜上の細胞培養系にて歯髄由来細胞を培養し、神経分化誘導培地を用いて、神経細胞へと分化誘導した羊膜上培養歯髄由来細胞シートを作成した。組織学的・免疫組織学的検討を行ったところ、神経細胞へと分化誘導した歯髄由来細胞は羊膜上にて増殖し、層状を有しており、培養細胞シートの作成が可能であった。羊膜上において歯髄由来細胞を培養し、神経分化誘導を行った結果、羊膜上にて歯髄由来細胞は増殖し、層状構造を得ている。以上より、研究はおおむね順調に進展していると判断される。歯髄由来細胞は智歯抜歯術の際に、無菌的に採取した。組織学的・免疫組織学的検討を行ったところ、神経細胞へと分化誘導した歯髄由来細胞は羊膜上にて増殖し、培養細胞シートの作成が可能であった。作成した培養シートを約20週齢Fischer 344ヌードラット(雄)へ移植した。移植方法は、実験動物の臼歯の咬合面を削合し歯髄を露出させた歯髄炎モデルへ移植した。非移植、羊膜のみ移植、羊膜上培養歯髄由来細胞シートを移植(Control群)、神経分化誘導させた羊膜上培養歯髄由来細胞シートを移植したモデル(神経分化誘導群)を作製。約4週間後、顎骨ごと移植片を採取。CT撮影。さらに粘着フィルムを用いることにより、非脱灰硬組織の凍結切片が作製可能な川本法を用いて、凍結切片を作製。HE染色、神経細胞マーカー(MAP2、β-tubulin III)や象牙芽細胞マーカー(DSPP)の局在について免疫組織学的な検討を行い評価した。Control群、神経分化誘導群において培養シートの局在を認めたが、非移植、羊膜のみ移植したモデルと比較して明らかな組織学的変化は認めなかった。作成した培養細胞シートに対して、さらなる免疫組織学的検討を加える。また、作成した培養細胞シートを実験動物へ移植を行う。移植方法は、実験動物の臼歯の咬合面を削合し歯髄露出させた歯髄炎モデルへ移植する。移植約2・4週間後、歯牙ごと移植片を採取し、組織学的、免疫組織学的検討を加える。再生医療平成28年度の実験に必要な物品を、当初予定していた金額よりも安価に入手することが可能であったため次年度使用額が生じた。
リンホカインによるキラーリンパ球の誘導機構に関する研究

1.レコンビナントインターロイキン2(rIL-2)による活性化キラー(AK)細胞の誘導:正常ヒト末梢血リンパ球(PBL)を数単位のrIL-2で培養するとIFNγが産生されると共にIL-2レセプター発現及びAK細胞が誘導される。またこの実験系にインターフェロンγ(IFNγ)を添加するとAK細胞誘導は更に増強された。癌患者(メラノーマ)PBLでもrIL-2添加により自己癌細胞に対する傷害活性を示すAK細胞が誘導された。しかし進行性癌患者PBLでは患者血清中に含まれているIL-2反応抑制物質の為に添加rIL-2の反応が阻害されてAK細胞の誘導に至らない事が示された。AK細胞の前駆細胞の同定は正常人PBLを用いて解析した結果、【T(^-_3)】【T(^-_4)】【T(^-_8)】【Leull^+】のnonT細胞でNK活性を示すlarge granular lymphocyteがIFNγの刺激でAK細胞に分化する事が示唆された。2.自己(または同系)の体細胞に対する免疫応答誘導とIL-3の役割:AK細胞とcytotoxic lymphocyte(CTL)細胞の誘導には自己の癌をT細胞が認識してIL-2とIFNγを産生する事が必要である。C3H/Heマウスの脾細胞から刺激細胞(nonT細胞)と反応細胞(T細胞)を取り出して混培養するとIa抗原に反応して【Thyl^+】【Lyt^+】のヘルパーT細胞がIL-3を産生するがIL-2とIFNγは産生しない。同系の腫瘍細胞を刺激細胞にした場合でも同じ結果であったが、rIL-2を数単位添加するとNK細胞とAK細胞が出現した。同系腫瘍(X5563,MH134,MM48,MM46)を移植した担癌マウスにrIL-2(10,000単位/日)を数日投与するとNK活性とAK活性が増強され一部のマウスでは癌移植が成立しなかった。アロリンパ球の混培養反応(MLR)はIL-2,IFNγ,IL-3等のリンホカインが産生される系であるが、このMLRにIL-3を添加するとアロキラーの誘導が増強された。またマウスIL-3の特異抗体をアロMLRに加えるとアロキラー誘導が特異的に抑制された。この事はアロキラー誘導にIL-3が関与している事を示している。
X線表面散乱法を用いた極微パターン形状の定量的評価法の開発

本年度は、サブミクロンオーダーの微細構造の作製と、その微細構造に起因した散乱の測定を行った。その結果、本研究で目的とする評価法は、実験室レベルのX線発生装置でも十分可能であり、また、ナノメートルのオーダーで評価が可能であることがわかった。微細構造は、Si(001)表面上に、ライン幅0.8μm、高さ10μm、間隔4.5μm、ライン長6.5mm、ライン数47本となるように作製した。X線回析の測定条件は、ターゲットにCu、モノクロメータにGe220チャンネルカットモノクロメータ、受光部にGe220チャンネルカットアナライザーを用いた。測定は、113、111ブラッグ反射近傍について、2θ-ωスキャン及び逆格子に沿ったhklスキャンを行った。これらの測定には、自動測定が行えるように作製したプログラムを用い、測定の効率を上げた。113反射については、低角入射、高角入射の2条件で測定を行った。その結果、113反射の高角入射条件では、ブラッグ点まわりには微細構造に起因する散乱を観測することはできなかったが、低角入射条件では、0.8μmのラインの両側壁からの散乱波の干渉縞を観測することができた。この干渉の間隔よりライン幅を、その強度分布よりラインの側壁の荒さをナノメータスケールで見積もることができる。さらに111反射については、両壁面からの散乱波の干渉縞上にラインの周期に対応した強度変調を観測することに成功した。これからラインの間隔も見積もることができる。本年度は、高安定X線発生装置と高分解能回折計の立ち上げを行った。X線発生装置は、高周波タイプの18kW発生装置であり、ターゲットにMo,Cu等を用いることにより測定に用いる波長を変えることが可能である。また、管球部はダイレクトドライブ方式を採用しており、従来のものに比べ容易にフォーカスタイプ(ライン、ポイント)を変えることができる。回折計は、モノクロメータにGeのチヤンネルカットモノクロメータを用いており、比較的高強度のままで平行性の良い入射線を得ることができる。また、ω軸、及びθ軸、最小パルスがそれぞれ0.0001度、0.0002度であり、高い結晶性を持つ半導体試料に対応したものとなっている。さらに、受光部にもアナライザー結晶を用いることにより、より高分解能な測定が可能である。また、オープンユ-レリアンクレードル型サンプルステージが採用されており、このため、In-Plane回折のジオメトリを取ることができ、また、4インチウエハまでのエリアマップをとることが可能である。これらの装置の立ち上げと共に、極微パターンからの散乱強度分布をシュミレートするプログラムを作製した。そして、異なる特徴を持った極微パターンからの散乱強度分布を比較した結果、パターンの側面や底面の平坦性、側面の傾斜角などの情報を得られることがわかった。さらに、これらの情報を定量的に解析できる可能性があることが示された。来年度は、これらを組み合わせることにより極微パターンからの散乱の測定及び解析法の確立を試みる。微細構造は、Si(001)表面上に、ライン幅0.8μm、高さ10μm、間隔4.5μm、ライン長6.5μm、ライン数47本となるように作製した。X線回折の測定条件は、ターゲットにCu、モノクロメータにGe220チャンネルカットモノクロメータ、受光部にGe220チャンネルカットアナライザーを用いた。

これらの測定には、自動測定が行えるように作製したプログラムを用い、測定の効率を上げた。113反射については、低角入射、高角入射の2条件で測定を行った。その結果、113反射の高角入射条件では、ブラッグ点まわりには微細構造に起因する散乱を観測することはできなかったが、低角入射条件では、0.8μmのラインの両側壁からの散乱波の干渉縞を観測することができた。この干渉の間隔よりライン幅を、その強度分布よりラインの側壁の荒さをナノメータスケールで見積もることができる。さらに111反射については、両壁面からの散乱波の干渉縞上にラインの周期に対応した強度変調を観測することに成功した。これからラインの間隔も見積もることができる。
口腔癌発生に関わる腫瘍免疫学的解明と早期診断法の確立

口腔扁平上皮癌の腫瘍周囲のTCR遺伝子ライブラリは原発巣とリンパ節転移巣で異なっていたことより、転移に伴う腫瘍抗原性の変化が示唆された。一方、含関連遺伝子である上皮増殖因子(EGFR)関連遺伝子の発現解析により、口腔扁平上皮癌原発組織におけるErbB1の有意な高発現を認めた。また、リンパ節転移陽性群での有意な低生存率が確認されたため、リンパ節転移陽性群で強発現を呈したErbB4は口腔癌の予後予測を直接反映する有用なバイオマーカーとなり得ることが示唆された。本研究では、口腔粘膜疾患の発癌過程における獲得免疫機構の挙動を解析することで、口腔がんの早期発見・予後予測に関する新規診断法の確立を目指す。その研究手法として、異型上皮内の腫瘍性上皮を上皮関連遺伝子発現解析から探索し、またそれに相応して発生するTリンパ球による免疫応答を網羅的T細胞受容体(TCR)解析を用いて行うことで、初期がん発生時の腫瘍抗原特異的免疫応答の有無を検索する。本研究で解明される口腔がん発症に関わるTCR遺伝子情報は、腫瘍性異型上皮に対する腫瘍抗原特異的免疫応答の見地からの口腔がん発生の早期検出を可能とし、さらに予後予測を行うという新たなテーラーメード型遺伝子診断法の礎となることが期待される。初年度は口腔前癌病変のうち癌化した数症例を抽出し、患者背景調査を行った。術前に対象患者の年齢・性別・既往歴・現病歴・現症(全身,局所)についての詳細な調査を行うと同時に患者に本研究の意義を説明し、研究に関する遺伝子発現解析ならびに早期癌の検出のための臨床情報取得についての同意を得た。同意の得られた患者から採取した検体組織の一部を用いて、解析を開始した。具体的には免疫組織学的な側面からの予備検討を開始し、口腔粘膜疾患・口腔がん生検あるいは切除時の切除材料を用いてリンパ球浸潤度やモノクローナル抗体(サイトケラチン13・17・19)を用いて腫瘍性上皮の免疫組織学的検索を行った。口腔前癌病変のうち癌化した数症例を抽出し、継時的な変化を免疫組織学的予備検討により行うことが出来た。具体的には、モノクローナル抗体(サイトケラチン13・17・19)を用いて腫瘍性上皮の免疫組織学的検索を行うことで、癌化メカニズムの一端を観察することが可能であることが判明した。本研究では,口腔粘膜疾患の発癌過程における獲得免疫機構の挙動を解析することで,口腔がんの早期発見・予後予測に関する新規診断法の確立を目指す.その研究手法として,異型上皮内の腫瘍性上皮を上皮関連遺伝子発現解析から探索し,またそれに相応して発生するTリンパ球による免疫応答を網羅的T細胞受容体(TCR)解析を用いて行うことで,初期がん発生時の腫瘍抗原特異的免疫応答の有無を検索することを研究目標としている.平成28年度は前年度から継続して口腔がんおよび口腔粘膜疾患患者の検体組織を用いて,病理・免疫組織学的解析を実施した.腫瘍性異型上皮に関する病理・免疫組織学的解析と浸潤リンパ球に対する免疫組織学的解析を行った.TCR解析については、RNA安定化試薬に保存した組織からRNAを抽出しTCRレパトア解析に用いた.具体的には,RNAからcDNAを合成した後, Adaptor付加cDNAを適当な形にし,AdaptorおよびTCR定常領域にそれぞれ相補的なオリゴDNAプライマーセットとして用いてnestedPCRを行い,全てのTCRをコードする遺伝子を同一条件下で特異的に増幅する.得られたPCR産物を全てのTCRVファミリーにそれぞれ相補的なオリゴDNAを固層化したマイクロプレートに播種してハイブリダイゼーションを行った後,酵素反応を用いて発色させ吸光度を測定する.得られた吸光度から各TCRVファミリーの相対存在率を算出(TCRレパトア解析)し,T細胞のレパトアを比較検討することでTCR遺伝子発現ライブラリの構築を図った.その結果,腫瘍浸潤リンパ球はおもにCD8陽性細胞であり,腫瘍周囲には特定のTCR遺伝子を有するT細胞が存在しており,腫瘍抗原特異的免疫応答を担当していると考えられた.今年度は,口腔がんおよび口腔粘膜疾患患者の検体組織を用いて,病理・免疫組織学的解析およびTCR解析を実施した.腫瘍性異型上皮に関する病理・免疫組織学的解析と浸潤リンパ球に対する免疫組織学的解析を行っており,腫瘍抗原特異的免疫応答が明らかとなった.口腔癌の中でも発癌・増殖に関与する上皮増殖因子受容体(Epidermal growth factor receptor: EGFR/ErbB1)は、チロシンキナーゼ型受容体のひとつであり、構造上の類似性からEGFRファミリーとよばれるErbB1(EGFR)、ErbB2、ErbB3、ErbB4の4つの受容体が存在する。EGFRは癌細胞の発生・増殖・転移にも関与するとされており、口腔癌においても同抗体薬が臨床応用されるに至り、放射線療法や他の抗癌剤との併用効果等が報告されている。しかしながら、口腔癌組織におけるEGFRファミリーの発現様式や、その臨床データとの相関性については不明な点が多い。今年度は、口腔扁平上皮癌原発組織におけるEGFRファミリーの発現量を、定量的PCR法および免疫組織化学染色を用いて正常組織における発現量と比較した。また、各種臨床データとEGFRファミリーの発現量との相関性についても検討した。本研究の結果より口腔扁平上皮癌原発組織におけるErbB1の有意な高発現を認めた。臨床データとの相関性において、リンパ節転移陽性群ではErbB4の有意な高発現を認めた。

ErbB4はEGFRファミリーとヘテロ二量体形成し癌の浸潤や増殖に関与すると報告されているが、EGFRファミリーとの共過剰発現の様式については明確にされていない。さらにリンパ節転移陽性群ではErbB2とErbB4およびErbB3とErbB4間において有意な相関を認め、免疫組織化学染色におけるEGFRファミリーの蛋白発現を確認したところ、mRNAレベルでの発現と相関する結果を得た。また、リンパ節転移陽性群での有意な低生存率が確認されたため、リンパ節転移陽性群で強発現を呈したErbB4は口腔癌の予後予測を直接反映する有用なバイオマーカーとなり得ることが示唆された。口腔扁平上皮癌の腫瘍周囲のTCR遺伝子ライブラリは原発巣とリンパ節転移巣で異なっていたことより、転移に伴う腫瘍抗原性の変化が示唆された。一方、含関連遺伝子である上皮増殖因子(EGFR)関連遺伝子の発現解析により、口腔扁平上皮癌原発組織におけるErbB1の有意な高発現を認めた。次年度では、口腔粘膜疾患・口腔がん生検あるいは切除時の切除材料を用いて浸潤リンパ球を解析を行う。研究手法としてはTCR(T cell receptor)レパトア解析を行う。前年度までに得られたデータと予後に関する臨床データと比較することで、全各個人の腫瘍性異型上皮に対する腫瘍抗原特異的免疫応答を臨床免疫学的な見地から解析し、TCR遺伝子ライブラリからの予後予測の可能性を探る。網羅的TCR解析による免疫学的解析を継続して行い,腫瘍免疫学的な見地から初期癌としての病態評価ならびに臨床免疫応答の有無について解析を行っていく.口腔がん発症に関わるTCR遺伝子情報は,腫瘍性異型上皮に対する腫瘍抗原特異的免疫応答の見地からの口腔がん発生の早期検出を可能とし,さらに予後予測を行うという新たなテーラーメード型遺伝子診断法の礎となることを目的として進めていく.口腔外科初年度では検体採取に時間を要したため、臨床情報収集が主であった。よって免疫組織化学的染色および定量PCR法による病態解析に供する消耗品が少なかったことが要因と考えられる。症例数の不足により,解析に関わる消耗品および研究試薬の使用量が想定していた量よりも少なかったため.次年度では免疫組織化学的染色および定量PCR法による病態解析に供する消耗品に使用する予定である。TCR解析用の研究試薬の購入を予定している.
環太平洋地域における第四紀後期の地震性地殼変動調査ー第二次ー

環太平洋地域における第四紀後期の地震性地殼変動を解明するために、チリ中・北部において海成段丘と活断層を、ニュ-ジ-ランド南島北東海岸で更新世および完新世の海成段丘の調査を行った。両地域に共通する調査方法は,1)空中写真判読による地形分類と精査を要する地域の選定、2)野外調査による地形調査、高度測定、段丘構成層の調査と年代測定用試料の採集、3)各種方法による年代測定、などである。細部については地域ごとに異なる調査方法をとった。以下に地域ごとに調査結果の概要を記す。段丘の形成期、変形速度については年代測定後考察の予定。ニュ-ジ-ランド調査対象地域は、北はビッグラグ-ンから南はカイコウラ半島にいたる約120kmにわたる海岸地域である。カイコウラ半島:1)本半島の更新世段丘は4段に大別され、半島の頂部(高度約100m)も海成段丘からなる。旧汀線高度の測定から、北西方への累積的傾動が推定される。2)最高位の段丘の掘削調査によって段丘構成層中から豊富な貝層が発見された。貝のアミノ酸法による年代測定を実施中で、段丘の編年が明らかになると期待される。3)完新世海成段丘は3段にわかれ、間欠的離水を示す。各段から貝化石が得られ、^<14>C年代の測定を行っている。カイコウラ半島からケ-プキャンプベル地域:1)高度約100mの段丘から貝と木(年代測定中)を含む河口性堆積物が発見され、この段丘が海進に伴って形成されたことを示す。この段丘は北方への傾動を示す。2)ロングポイント付近の更新世海成段丘は曲降的変形を示す。3)完新世海成段丘は最高20mに近く、最大7段にわかれ、地震隆起の可能性が大きい。ビッグラグ-ンおよびグラスメ-ル潮地域:これらの地域では低い沖積低地がひろがる。海成層上限は2m以下で、当地域が沈降地域であることを示す。掘削調査によって多量の貝化石を含む河口性堆積物を得た。チリトンゴイ地域とラセレナ地域:1)更新世性海成段丘の高度測定および段丘構成層からの貝化石の採集を行った。貝化石はESR法による年代測定を実施中である。2)本地域では海岸線ないしは山地の主方向と平行する南北方向の断層が多く見出された。主な断層は山地と段丘との地形境界をなす。3)そのうちのケブラダテニヤンテ断層は長さが最大で海成段丘を明瞭に変位させ、しかも累積的変位が予想される。見かけ上、左横ずれがあるが、これが真の横ずれを示すか否かについては検討の必要がある。4)タリナイ山地東方の主要断層は第三紀層を変位させているが段丘にはみるべき変形はなく、活動は古そうである。5)両断層とも露頭観察から正断層であることが確認された。メヒヨネス半島:1)本地域では海成段丘の発達が顕著で、最高750mに達する。既存の年代資料によると、隆起速度はきわめて小さいので、高位の段丘は第三紀にさかのぼる可能性がある。各段丘から貝化石を得ているのでESR法によって確実な編年ができる見とうしがある。2)ほぼ南北方向の断層によって段丘が変形している。扇状地の累積的変形も見られる。3)主要な断層が正断層であることが確認された。完新世海成段丘:全域を通して15の貝化石が完新世段丘構成層から得られた。これらの14C年代測定によって、完新世における地殼変動速度の情報が得られると期待されるが、高度からみて、隆起速度はきわめて小さく、地震隆起は考えにくい。これは、上に述べた更新世段丘や活断層の資料とあわせて、チリ-中・北部でのプレ-ト境界の性質が日本やニュ-ジ-ランドとは著しく異なることを示唆している。

各段から貝化石が得られ、^<14>C年代の測定を行っている。カイコウラ半島からケ-プキャンプベル地域:1)高度約100mの段丘から貝と木(年代測定中)を含む河口性堆積物が発見され、この段丘が海進に伴って形成されたことを示す。この段丘は北方への傾動を示す。2)ロングポイント付近の更新世海成段丘は曲降的変形を示す。3)完新世海成段丘は最高20mに近く、最大7段にわかれ、地震隆起の可能性が大きい。ビッグラグ-ンおよびグラスメ-ル潮地域:これらの地域では低い沖積低地がひろがる。海成層上限は2m以下で、当地域が沈降地域であることを示す。掘削調査によって多量の貝化石を含む河口性堆積物を得た。チリトンゴイ地域とラセレナ地域:1)更新世性海成段丘の高度測定および段丘構成層からの貝化石の採集を行った。貝化石はESR法による年代測定を実施中である。2)本地域では海岸線ないしは山地の主方向と平行する南北方向の断層が多く見出された。主な断層は山地と段丘との地形境界をなす。3)そのうちのケブラダテニヤンテ断層は長さが最大で海成段丘を明瞭に変位させ、しかも累積的変位が予想される。見かけ上、左横ずれがあるが、これが真の横ずれを示すか否かについては検討の必要がある。4)タリナイ山地東方の主要断層は第三紀層を変位させているが段丘にはみるべき変形はなく、活動は古そうである。5)両断層とも露頭観察から正断層であることが確認された。メヒヨネス半島:1)本地域では海成段丘の発達が顕著で、最高750mに達する。既存の年代資料によると、隆起速度はきわめて小さいので、高位の段丘は第三紀にさかのぼる可能性がある。各段丘から貝化石を得ているのでESR法によって確実な編年ができる見とうしがある。2)ほぼ南北方向の断層によって段丘が変形している。扇状地の累積的変形も見られる。3)主要な断層が正断層であることが確認された。完新世海成段丘:全域を通して15の貝化石が完新世段丘構成層から得られた。これらの14C年代測定によって、完新世における地殼変動速度の情報が得られると期待されるが、高度からみて、隆起速度はきわめて小さく、地震隆起は考えにくい。これは、上に述べた更新世段丘や活断層の資料とあわせて、チリ-中・北部でのプレ-ト境界の性質が日本やニュ-ジ-ランドとは著しく異なることを示唆している。
分裂組織の機能を維持するシグナル因子と細胞周期制御の解析

本研究では、分裂組織においてその維持や細胞周期制御に関わる因子の解析を行った。シロイヌナズナに7種類存在するCDKインヒビターについて、発現様式や機能欠損変異体の解析を行った結果、分裂組織における細胞周期の制御に関わる可能性のあるメンバーを同定した。また、サイトカイニンの下流で根端分裂組織における細胞分裂の制御に関わる因子が欠損した変異体の候補を単離した。1.シロヌナズナ培養細胞系を用いた幹細胞誘導化因子の探索今年度はWUSの下流で幹細胞化を促進するような生理活性物質(幹細胞化誘導因子)を含むエフェクターの調製法の検討を行った。試みの一つとして、WUSをエストロゲンの添加依存的に強制発現させるコンストラクトを作成し、シロイヌナズナ培養細胞株に導入した。また、幹細胞化誘導因子の生理活性のレポーターとして用いるpCLV3 :: GUSを導入した培養細胞系統も作成し、現在液体培養系の確立を行っている。2.サイトカイニンシグナルによる細胞分裂および分化の制御機構の解析分裂組織の維持にはサイトカイニンが重要な働きを持つことが報告されている。B型ARRであるARR1はサイトカイニンシグナルの初期応答を制御する転写活性化因子として機能する。レシーバードメインを欠くARR1(ARR1ΔDDK)にGRを付加した融合タンパク質を過剰発現させた35S :: ARRIΔDDK-GR植物体では、DEX処理により恒常的なサイトカイニン応答が引き起こされることが報告されている。この35S::ARR1ΔDDK-GR植物体では、根端における分裂領域がDEX処理依存的に縮小し、根の伸長が抑制されることを確認した。このことから、サイトカイニンによる根端の分裂領域の制御にはARR1の下流に存在する因子が関与することが示唆された。そこで、ARR1の下流で根端分裂組織の領域決定に関与する新規因子の探索を行うため、35S::ARR1ΔDDK-GR形質転換体に対して変異原処理を行い、DEX処理を行っても根の伸長抑制が起こらないサプレッサー変異体の単離を試みている。現在、M2世代の種子を回収して変異体の探索を始めたところであるが、これまでにサプレッサー変異体の候補をいくつか単離した。高等植物の分裂組織の維持を司る因子群の下流には、細胞周期因子の制御を通して幹細胞の分裂活性を厳密に調節する機構があると考えられる。本研究では、幹細胞の維持や形成を直接誘導するシグナル分子を同定し、さらにその分子を介した幹細胞の細胞分裂制御機構の解析を行うことで、分裂組織の維持機構を細胞周期制御の側面から理解することを目的としている。今年度は、1)シロヌナズナ培養細胞系を用いた幹細胞誘導化因子の探索、2)サイトカイニンシグナルによる細胞分裂および分化の制御機構の解析、3)分裂組織の維持に関わる細胞周期因子の探索を行った。1)に関しては、昨年度、WUSをエストロゲンの添加依存的に強制発現させるコンストラクトを導入したシロイヌナズナ培養細胞株を作成した。作成した培養細胞株100系統以上について、エストロゲン処理に応答したWUSの発現量の変化をRT-PCRにより調べたが、誘導的にWUSを高発現する系統を単離することはできなかった。さらにデキサメタゾン誘導系など別の誘導系ベクターを用いた強制発現も試みたが、いずれの方法においても誘導的にWUSを高発現する細胞株は得ることはできなかった。2)に関しては昨年度に引き続き、35S::ARR1ΔDDK-GR形質転換体のサプレッサー変異体の候補の探索を進めた。3)については、シロイヌナズナに7個存在するCDKインヒビターのうち、茎頂および根端の分裂組織で発現し、比較的相同性が高い因子群、KRP3,KRP4およびKRP5に注目し、それら全ての機能が欠損した三重変異体の単離を行った。現在、この三重変異体の表現型の詳細な解析を進めている。
非定常開水路流れのバースティング現象とその浮遊砂機構の解明

開水路流れに発生する組織渦やそれに伴って発生する土砂輸送現象は,洪水の増水期と減水期とでは全く異なる特性を示すことから,流れの非定常性や空間的な河床形状などの変化による乱流構造や組織渦に及ぼす影響を解明することが重要となる.さらに,等流状態の開水路乱流においては,自由水面の存在によって乱れの非等方性が誘発され,乱れ強度分布に開水路特有の変化が観察される.したがって,非定常開水路流れでは,定常時より水面変動の影響が大きくなり,このような乱流特性量の変化が観察されるものと推測される.本研究では,水流に非接触でかつ高精度なレーザー流速計(LDA)の利点を生かして,底面近傍の領域だけでなく,水面付近の水深増加領域を詳細に乱流計測し,乱流特性量の時間変化,せん断応力特性,自由水面の時間変化による影響などについて理論的・実験的考察を行った.その結果,底面近傍の内層においては平均流速分布や乱れ特性に非定常性や二次流の影響が見られず,壁面の影響の方が支配的であり,ほぼ定常等流時で観察されるものと一致した.一方,水面付近の外層,特に水深増加領域において非定常性の影響が大きく現れ,平均流速の変化,乱れ強度分布などにその傾向が観察された.さらに本研究では開水路乱流の組織構造を解明するための一つの手段として,河床波背後に発生する剥離渦および再付着点からの大規模な組織渦に着目し,河床波背後に発生する時空間的挙動の解明を目的とした.これに従い,二台のレーザー流速計を用いた同時乱流計測,さらに染料による可視化実験との組み合わせによる実験を行った.この結果として,河床波背後に発生する組織渦の時空間的挙動を条件付きサンプリング手法により捉えることが可能となり,より実現象に近い組織渦モデルの提案を行い,さらにその組織渦に伴って発生する物質輸送との関連について実験的考察を行った.開水路流れに発生する組織渦やそれに伴って発生する土砂輸送現象は,洪水の増水期と減水期とでは全く異なる特性を示すことから,流れの非定常性や空間的な河床形状などの変化による乱流構造や組織渦に及ぼす影響を解明することが重要となる.さらに,等流状態の開水路乱流においては,自由水面の存在によって乱れの非等方性が誘発され,乱れ強度分布に開水路特有の変化が観察される.したがって,非定常開水路流れでは,定常時より水面変動の影響が大きくなり,このような乱流特性量の変化が観察されるものと推測される.本研究では,水流に非接触でかつ高精度なレーザー流速計(LDA)の利点を生かして,底面近傍の領域だけでなく,水面付近の水深増加領域を詳細に乱流計測し,乱流特性量の時間変化,せん断応力特性,自由水面の時間変化による影響などについて理論的・実験的考察を行った.その結果,底面近傍の内層においては平均流速分布や乱れ特性に非定常性や二次流の影響が見られず,壁面の影響の方が支配的であり,ほぼ定常等流時で観察されるものと一致した.一方,水面付近の外層,特に水深増加領域において非定常性の影響が大きく現れ,平均流速の変化,乱れ強度分布などにその傾向が観察された.さらに本研究では開水路乱流の組織構造を解明するための一つの手段として,河床波背後に発生する剥離渦および再付着点からの大規模な組織渦に着目し,河床波背後に発生する時空間的挙動の解明を目的とした.これに従い,二台のレーザー流速計を用いた同時乱流計測,さらに染料による可視化実験との組み合わせによる実験を行った.この結果として,河床波背後に発生する組織渦の時空間的挙動を条件付きサンプリング手法により捉えることが可能となり,より実現象に近い組織渦モデルの提案を行い,さらにその組織渦に伴って発生する物質輸送との関連について実験的考察を行った.開水路流れに発生する組織渦やそれに伴って発生する土砂輸送現象は,洪水の増水期と減水期とでは全く異なる特性を示すことから,流れの非定常性や空間的な河床形状などの変化による乱流構造や組織渦に及ぼす影響を解明することが重要となる.さらに,等流状態の開水路乱流においては,自由水面の存在によって乱れの非等方性が誘発され,乱れ強度分布に開水路特有の変化が観察される.特に,Froude数が1に近い限界流状態では,水面変動などの低周波成分によって,普遍関数分布から系統的なずれを示すことが指摘されている.したがって,非定常開水路流れでは,定常時より水面変動の影響が大きくなり,このような乱流特性量の変化が観察されるものと推測される.本研究では,水流に非接触でかつ高精度なレーザー流速計(LDA)の利点を生かして,底面近傍の領域だけでなく,ベースフロー水深からピーク時まで変化する領域,すなわち水深増加領域を詳細に乱流計測し,乱流特性量の時間変化,せん断応力特性,自由水面の時間的変化による影響等について理論的・実験的考察を行った.その結果,底面近傍の内層においては平均流速分布や乱れ特性に非定常性や2次流の影響が見られず,壁面の影響の方が支配的であり,ほぼ定常等流時で観察されるものと一致した.一方,水面付近の外層,特に水深増加領域において非定常性の影響が大きく現れ,平均流速の変化,乱れ強度分布などにその傾向が観察された.

一般に,開水路流れでは,様々な組織渦が存在し,各種の物質輸送がこの組織渦によって引き起こされる.また,実河川においては,自由水面を持たない閉管路の乱流や境界層乱流とは異なった大規模な組織渦が存在する.この組織渦の代表例が,縦渦とボイルである.縦渦は,二次流を引き起こす障害物,すなわち非等方性を発生させる要因がないにもかかわらず河床から巻き上げられた浮遊物の集合によって発生し,一方,ボイルは砂漣や砂堆の背後に形成され,強いエネルギーを伴って,かつ高濃度の浮遊砂を伴って水面に向かって浮上する.したがって,洪水時に発達する砂漣などの河床形状あるいは時間的に変化する流量,いわゆる非定常性との関連を解明することが重要となる.そこで,本研究では開水路乱流の組織構造を解明するための一つの手段として,河床波背後に発生する剥離渦および再付着点からの大規模な組織渦に着目し,それらの時空間的渦挙動の解明を目的とした.これに従い,ファイバーレーザー流速計一台のみの点計測,二台のレーザー流速計を用いた同時乱流計測,さらに染料による可視化実験との組み合わせによる実験を行った.これにより得られたデータから,河床波背後に発生する組織渦の時空間的挙動を条件付きサンプリング手法により捉えることが可能となり,より実現象に近い組織渦モデルの提案を行い,さらにその組織渦に伴って発生する物質輸送との関連について実験的考察を行ったものである.
G蛋白質共役型受容体の活性調節機能を有する多環縮環型フラン環化合物の創生

当該年度は、前年度で構築された多環縮環型複素環化合物群の合成法の基本理論に基づいて、まず化合物ライブラリーの構築を行うとともに、さらに一部の反応開発を実施した。アレニルエーテルとハロゲン化ジエンとの分子内環状付加反応において、ジエン部を芳香環とした基質での反応制御機構について解析した。ジエン部のそれぞれのオレフィンをベンゼン環とした気質については、脱芳香環化エネルギーが高いため、いずれも目的とする環状付加反応が進行しなかった。これに対して、芳香化エネルギーの低いフラン環やチオフェン環を導入した気質では、目的とする環化体を得ることに成功した。これらフランおよびチオフェン誘導体では、骨格中に種々の置換基を導入した場合においても、良好に反応が進行し、目的とする環化体を与えた。これらの反応開発に基づき、さらなるライブラリーの拡張を実施した。また、化合物ライブラリー構築とともに、G蛋白質共役型受容体の評価系の構築を図った。とくにセロトニン5HT2受容体の活性化において、プレートリーダーを用いた細胞内Ca濃度の測定法を開発した。経時的解析が必要なため、現時点で、約100検体を2時間で処理できる評価系の構築に成功した。そこで本評価系を基礎として、各種5HT2受容体の変異体を調整し、その活性測定を行ったところ、これら変異受容体においても、目的の活性を測定できることを明らかとした。さらに、化合物ライブラリーを本評価系で評価したところ、新規な5HT2Cアゴニストの創生に成功した。本化合物は、従来報告の5HT2Cアゴニストと、母核の全く異なる化合物であった。最後に、本研究課題で構築された化合物ライブラリーの毒性試験もかねて細胞毒性試験を実施し、一部の化合物群において、強い抗腫瘍活性が認められた。そこで、それら化合物群の抗腫瘍活性について、構造活性相関を解明した。当該年度においては、前年度に引き続き、化合物ライブラリーの拡充を目指してさらなる反応開発を行い、より詳細な反応制御機構を解明した。分子内環状付加反応を主反応とする本研究課題においては、基質の電気的・立体的要因により反応の進行は異なる。このため、反応への基質の適合性の詳細な解析は、本研究課題遂行における鍵となる。当該年度において、反応に寄与するジエン部の電気的・立体的特徴を解明したことで、さらなる化合物ライブラリーの拡充に成功した。評価系の構築においては、通常の評価系ではhigh content screening(HCS)によるため、画像としての測定・解析が必要となるが、本評価系ではプレートリーダーを使用することで、デジタル信号の量として測定可能なため、測定・解析の時間の効率化が可能である。本評価系を用いることで、HCSによる評価と比較して、格段の数の検体の評価が可能となった。さらに本評価系を利用して、当該研究課題の根幹である、セロトニン5HT2C受容体のアゴニストの創薬に向け、そのシード化合物の創生に成功した。また構築された化合物ライブラリーにおいては、それぞれのがん細胞に対する細胞毒性試験を並行して実施することにより、毒性評価を行うとともに、抗がん剤としての可能性を評価している。これにより、新機構主要かっし物質としてアザアントラセノン類の創生に成功してきている。以上の成果をもとに、若干の遅れはあるものの、概ね順調に進行していると判断した。当該年度は、前年度までの成果をもとに、化合物ライブラリーを完成させる。また完成した化合物ライブラリーは、まずセロトニン5HT2C受容体に対するGq活性評価を行う。前年度までに、1つの化合物に対して新規5HT2Cアゴニスト活性が見いだされつつあるため、交差反応性を検討するうえで、5HT2Aおよび5HT2B受容体に対する活性化について検討する。これらの検討を踏まえ、5HT2Cアゴニストとしてのプロファイルを確立する。また、5HT2C受容体の変異受容体の作成に成功しており、本変異体を用いて、受容体との相互作用領域の解析を実施する。得られた結果は、化合物のリファインの重要なエビデンスであり、その結果を用いて分子軌道計算ソフトにより、さらなる構造のリファインメントを実施する。さらに拡充されたライブラリーからは、それらの活性評価により、化合物の活性発現要件の解明を実施する。高いダイバシーティーは持ちつつも、合成類縁体を含むため、類縁体による構造特性の解明が可能と考えられる。そこで、類縁体の活性評価を注力的に行うことで、活性発現構造の詳細についての解明を図る。当該年度は、多環縮環型複素環化合物群の合成法の構築を中心とし、さらに評価方法の確立を目指した研究を実施した。まず多環縮環型複素環化合物群の簡便合成法の開発については、アレニルエーテルとハロゲン化ジエンとの分子内環状付加反応について検討し、特にジエン部に芳香環を導入した分子について、その反応の開発を行った。多環縮環型の化合物合成において、反応に関与するジエン部に芳香環を導入することは、化合物群の合成において必要と考えられる。そこでベンゼン環、チオフェンをジエン部に導入した基質での分子内環状付加反応について検討したところ、チオフェンでは、目的とする環化反応が進行した。この反応制御機構について、ビニルチオフェンのビニル部の回転障壁について分子軌道計算を行ったところ、チオフェンの回転障壁はほとんどないことが明らかとなった。この要因として、硫黄原子のファンデルワールス半径の大きさが示唆された。

これに対して、スチレンでは、ベンゼン環の回転には大きな障壁があり、さらに環状付加反応の際、脱芳香環化が必要となるため、遷移状態エネルギーは著しく高くなり、結果、目的とする環状付加反応が進行しなくなることが明らかとなった。次に、化合物群の評価系の確立に並行して着手した。評価系としては、多検体対応型のCaシグナル評価系の構築と、細胞毒性に関する評価系の2種類に着手した。多検体対応型Caしぐなる評価系については、マイクロプレートリーダーを用いることで、その可能性が確立されつつある。細胞毒性については、目的とする化合物ライブラリーが完全には完成していないため、リピドカルバゾール誘導体およびアリールピペリジン誘導体によるライブラリーで、評価系の確立および検証を行った。本研究により、両化合物による抗腫瘍活性発現構造に関する知見を得ることに成功した。当該年度においては、ライブラリーの構築を目指して、多環縮環型複素環ライブラリーの合成法の構築を主課題として、また並行して、評価系の構築を行うものである。ライブラリー構築のための、アレニルエーテルとジエンの分子内環状付加反応については、反応基質の精査および反応制御に関する分子軌道計算の結果との相関性が明らかとなってきている。これらの結果より、本反応の反応制御法について、ほぼ解明されてきており、このことは種々の化合物を合成しライブラリーを構築する上で、重要なエビデンスとなる。一方、活性評価系については、現在進行中であるが、本研究の骨子ともいえる多検体対応型Ca評価系については、ほぼ完成しつつあることより、おおむね順調に研究が遂行されているものと判断する。また、ヒット化合物については、細胞毒性を評価することを計画しており、このため細胞毒性の評価系の確立と検証が必要となる。目的とする多環縮環型複素環ライブラリーは未だ完成していないため、確立した細胞毒性の評価系の検証を、アリールピペリジン誘導体ライブラリーで行い、その評価系の堅牢性を示すことに成功した。以上、ライブラリー構築法の確立、評価系の確立ともに、予定通り実施されており、概ね順調に進行していると判断された。当該年度は、前年度で構築された多環縮環型複素環化合物群の合成法の基本理論に基づいて、まず化合物ライブラリーの構築を行うとともに、さらに一部の反応開発を実施した。アレニルエーテルとハロゲン化ジエンとの分子内環状付加反応において、ジエン部を芳香環とした基質での反応制御機構について解析した。ジエン部のそれぞれのオレフィンをベンゼン環とした気質については、脱芳香環化エネルギーが高いため、いずれも目的とする環状付加反応が進行しなかった。これに対して、芳香化エネルギーの低いフラン環やチオフェン環を導入した気質では、目的とする環化体を得ることに成功した。これらフランおよびチオフェン誘導体では、骨格中に種々の置換基を導入した場合においても、良好に反応が進行し、目的とする環化体を与えた。これらの反応開発に基づき、さらなるライブラリーの拡張を実施した。また、化合物ライブラリー構築とともに、G蛋白質共役型受容体の評価系の構築を図った。とくにセロトニン5HT2受容体の活性化において、プレートリーダーを用いた細胞内Ca濃度の測定法を開発した。
光誘起流体効果によるバイオマテリアルの状態制御

光誘起の流体効果で生体関連物質の相転移,特異的結合,細胞の状態制御の原理を開拓し,社会で求められるバイオ分析技術に発展させることが本研究の目的である.これまでに金属ナノ粒子固定化ビーズを分散した水中にレーザー光を照射すると,開始からわずか数秒で沸騰現象が起こる条件があることを見出したが,最終年度はマイクロ流路中での圧力駆動流の下で光集積した金ナノ粒子固定化ビーズを熱源として,光誘起バブルによる微量タンパク質の迅速検査に関する新たな知見を後輩との共同研究で獲得して論文投稿を行った.また,集光したレーザー光照射による集合現象と溶液中に誘起される流れの相乗効果により,金ナノ粒子表面に修飾した一本鎖DNAと浮遊状態の一本鎖DNAの衝突確率を高めることで,DNAの二重鎖形成プロセスを加速できることを2年目に解明したが,タンパク質や異種DNAの混合条件下でもDNA二重鎖形成の光加速が可能であることも示し,遺伝子検査などへの実用展開における重要な知見も獲得した.これらの知見を活かし,DNAチップへの実装を目指した検討も行った.派生テーマに関して後輩にサンプル調製の方法を伝授し,電極間に光集積したプローブ粒子とターゲットDNAの電気検出の迅速化に関する新たな知見も獲得して特許申請にも貢献した(特願2017-095715).さらに,高温状態で疎水性を示す有機分子を表面修飾した金ナノ粒子内包デンドリマーの特性に注目し,非共鳴レーザー照射による局所加熱により癌細胞表面への集積化に成功した.集積化後に細胞の生死判定を行ったところ,非共鳴条件下であるにもかかわらず,レーザー照射点近傍の癌細胞だけを選択的に死滅できることも明らかにした.この成果は非従来的な光誘導型ドラッグ・デリバリー・システムの新原理開拓につながり,医薬学の発展に貢献し得るものである(国際特許PCT2017-20883).29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。光誘起の流体効果で生体関連物質の相転移,特異的結合,細胞の状態制御の原理を開拓し,社会で求められるバイオ分析技術に発展させることが本研究の目的である.初年度は「金属ナノ粒子固定化ビーズ(金属ナノ粒子を高密度にプラスチックビーズ表面に集積化した構造体)」が分散したサンプル液中に赤外レーザーを照射して生成される「光誘起バブル」の発生機構・安定化機構の解明に挑んだ.この光誘起バブルは光発熱効果による局所的な沸騰現象によって生じているが,実験結果からバブルのサイズはレーザー照射時間の平方根に比例することが分かり,この関係を熱力学的理論によって説明することに成功した.さらに,金属ナノ粒子固定化ビーズの個数濃度を変化させて発生させた光誘起バブルのレーザー停止後の経時変化を調べたところ,バブル表面で金属ナノ粒子固定化ビーズが密に配列することでバブルが安定化した可能性が示唆され,そのプロセスを光学顕微鏡下で可視可することにより,この系でバブルが安定化するメカニズムを解明した[2016/3応物学会で発表].また,我々はこの光発熱効果を利用した熱変性タンパク質の高感度検出を提案していたが,その課題であった定量化を克服するためにマイクロ流路を用いた実験を行った.マイクロ流路の使用は立ち上げ段階のため,初年度は流路内での光誘起バブル発生の条件探索を行った.その結果,四方を壁で囲まれた狭小空間において静止流体中,またシリンジポンプでサンプル液を流した動的流体中の両方において効率的に光誘起バブルを発生させる条件を見出した[2016/5分析化学討論会で発表予定].得られた知見を基にタンパク質検出を行ったところ,多数のバブルが発生することが分かり,これまでより一桁低い濃度で検出できる可能性も解明した.得られた原理はマルチバブルを利用した迅速かつ高感度なタンパク質センサの開発に応用できる可能性がある.「研究実績の概要」に記載したように,光誘起の流体効果に注目した新しい集積化方法である光発熱アセンブリングの原理解明に成功しており,流れの効果を巧みに利用した微小物体の状態制御の指導原理開拓を目的とした本課題を十二分に進展させたと言える.また,これらの知見を基にしたDNAハイブリダイゼーションの光加速の原理構築と遺伝子検査法への応用の検討については当初次年度以降の計画として挙げていた.しかし,光照射によってDNAのハイブリダイゼーションが加速されてマクロな集合体を形成することを発見し,ターゲットDNAの塩基配列を変化させて光照射した場合には塩基配列の違いによって異なる集合挙動と光学スペクトルの変化を示すことを明らかにした.これはミスマッチDNA検出に応用できる可能性を示唆するものであり,この成果は現在学術論文誌に投稿中である.さらには最終年度に着手する予定である細胞の光集積と機能制御に関しても,光誘起バブルによる単細胞生物の集積化に成功して細胞の光集積に関する基礎的知見を得ており,米国光学会誌に掲載された.このように順調に進展している計画の中でも一部前倒しにすることができ,目覚ましい成果も得られていることから,当初の計画以上に進展していると考えている.光誘起の流体効果で生体関連物質の相転移,特異的結合,細胞の状態制御を目指し,社会で求められるバイオ分析技術に発展させることが本研究の目的である.

2年目は,DNAハイブリダイゼーションの光加速の原理を構築することに挑戦した.集光したレーザー光照射による集合現象と溶液中に誘起される流れの相乗効果により,金ナノ粒子表面に修飾した一本鎖DNAと浮遊状態の一本鎖DNAの衝突確率を高めることで,DNAの二重鎖形成プロセス(ハイブリダイゼーション)を加速できることを解明した.試行錯誤の末,液滴の表面近傍にレーザーを集光すると効率よくプローブ粒子とターゲットDNAがハイブリダイゼーションして,100 pMという希薄な濃度の相補鎖DNAの分散液を用いた場合でも(測光領域で約5 zmol),わずか2分程度でサブミリメートル程度の大きさのネットワーク状の集合体を形成できることが分かった.一方で,同じ濃度の完全ミスマッチDNAを用いた場合には集合体は形成されず,塩基配列の違いが光照射による集合現象にも影響を及ぼすことを確認した.また,レーザースポット付近の局所的な消衰スペクトルを測定したところ,相補鎖DNAの場合のみ顕著なスペクトルのブロード化と長波長シフトが確認でき,理論的に予言されていた局在表面プラズモンの協力現象によるプラズモニック超放射の動的光制御の実験的検証にも成功した.通常fmol程度のDNAを検出するのに数時間を要するが,本研究で得られた原理を利用すれば,わずか数分で100万分の1のzmolオーダーの微量DNAの二重鎖形成からサブmmに迫るマクロな集合体を形成して検出できるため,遺伝子検査の迅速・高感度化が期待できる.将来的には,予防医療や食品の遺伝子検査の簡素化など,21世紀の人類の重要課題である食の安全・健康長寿のための革新的技術に繋がる成果である.「研究実績の概要」に記載したように,光誘起の流体効果を利用したDNAハイブリダイゼーションの光加速の原理構築に成功しており, Nature系論文誌のScientific Reportsに掲載された.この成果は流れの効果を巧みに利用した微小物体の状態制御の指導原理開拓を目的とした本課題を十分に進展させるものであると言える.さらに,臨床現場では様々な生体物質が夾雑物として含まれる可能性があるため,実際のDNA検査を想定してサンプル分散液中にタンパク質や異種DNAを含む条件下でも実験を行ったが,結果としてそのような夾雑物の存在下でもDNAのハイブリダイゼーションの光加速することに成功した.このように,光加速に基づく迅速・高感度なDNA検出技術の実用化へ向けた重要な成果も得られている.また,初年度に取り組んだ金属ナノ粒子を高密度にプラスチックビーズ表面に集積化した「金属ナノ粒子固定化ビーズ」が分散したサンプル液中に赤外レーザーを照射することによって生成される「光誘起バブル」の発生機構・安定化機構の解明に関する研究を後輩の補助の下で実施し,その成果を論文にまとめ,学術論文誌に投稿完了した.さらには最終年度に着手する予定である細胞の光集積と機能制御に関しても,光発熱集合法による金ナノ粒子内包デンドリマーの集積化に成功して医薬学分野への応用可能性が期待できる基礎的知見を得ており,国内特許出願も行った.このように計画の一部を前倒しで実施しており,上記のように目覚ましい成果も得られていることから,当初の計画以上に進展していると考えている.光誘起の流体効果で生体関連物質の相転移,特異的結合,細胞の状態制御の原理を開拓し,社会で求められるバイオ分析技術に発展させることが本研究の目的である.
天然型ラッカーゼメディエーターの検索とグリーンケミストリーへの利用

17年度は、天然型ラッカーゼメディエーター活性画分検出のための簡便なアッセイ系の確立を中心に検討した。当初は、広葉樹未晒パルプのラッカーゼーメディエーター系での漂白前後による白色度とKappa価を指標として評価したが、酸素導入や、アルカリ抽出を必要とすることから、この方法は簡便法としては不適当であると判断した。そこで、ラッカーゼーメディエーター共存下のみで分解が認められる多環式芳香族化合物であるアントラセンを用いたアッセイ系を検討した。その結果、本法は反応溶液を直接HPLC分析して分解率を算出できる簡便なアッセイ系であることが確認できた。18年度はこのアッセイ系を用いて、カワラタケ菌体の水抽出物(F)と、ラッカーゼ調製時菌体外培養液の限外ろ液(分画分子量10,000)濃縮物(B)からのメディエーターを検索した。その結果、アントラセンが、これら抽出物の添加により分解され(分解率F:10.3%,B:15.9%)、両フラクションにメディエーター存在の可能性が示唆された。また、界面活性剤Tween80の添加によりアントラセン分解がさらに促進されることを明らかにした(分解率F:67.3%,B:75.5%)。両抽出物はヘキサンおよび酢酸エチルで抽出し活性成分の分画を試みた。各フラクションのアントラセン分解率を測定した結果、ラッカーゼメディエーターであるHBTの分解率97.3%には及ばないものの、F-Hex、F-EtOAcが共に70.0%、B-EtOAcが75.6%の分解率を示した。この結果は、これらフラクション中にメディエーターが存在することを示しているが、抽出物に対する各溶媒可溶部は1%以下と極めて微量であり、これ以上分画・構造決定することが困難であった。本年度は、天然型ラッカーゼメディエーター活性画分検出のための簡便なアッセイ系の確立を中心に検討した。はじめに、最も強力な合成メディエーターである1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HBT)をポジティブコントロールとして用いて、広葉樹未晒パルプのラッカーゼ-HBT系での漂白前後による白色度とkappa価の変化を指標として評価した。その結果、この酵素系処理のみでは、白色度増加やkappa価減少が見られず、反応中に酸素を常時導入し、反応後のパルプをアルカリ抽出しなければ有意差が見られないことから、この方法は簡便なアッセイ法としては不適当であると判断した。そこで、ラッカーゼ単独では分解できず、メディエーター添加によってのみ分解が認められると報告されている多環式芳香族化合物であるアントラセンを用いたアッセイ系を検討した。その結果、ラッカーゼ-HBT系を用いると、24時間で約60%の分解が確認でき、反応溶液を直接HPLC分析して分解率を算出できる簡便なアッセイ系が確立できた。そこで、このアッセイ系を用いたカワラタケ菌体および菌体外培養液からのメディエーター検索に着手した。メディエーター候補としては、カワラタケ菌体の水または熱エタノール抽出物と、ラッカーゼ調製時菌体外培養液の限外濾過(分画分子量10,000)で生成する濾液の濃縮物を用いた。HBTの代わりに同量の候補液を加え反応させたところ、全ての候補でアントラセンの分解が認められた。特に、限外濾液に関してはHBTに匹敵する分解率を示し、このフラクションにメディエーターが含まれている可能性が強く示唆された。現在、このフラクションをさらに分画し、メディエーター化合物の単離を試みている。