hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトiPS細胞からの網膜神経節細胞の分化誘導系の確立ならびに緑内障の病態解明

またNanog陽性細胞の割合が、80%近くを占めており未分化細胞の割合が多かったので、feeder細胞の抜き方を変更した。その結果、passageを繰り返してfeederを抜いたものでは、Nanog+細胞が少なかった。2010年度に、我々は網膜ホメオボックス遺伝子であるRxのプロモーター下流にDsRedを発現するBACクローンをiPS細胞に導入し、SFEB/DLFA法を用いる事により、網膜前駆細胞と思われるRxDsRed陽性細胞をFACSにてソートする事が可能であった。その後、我々はソートした細胞が網膜前駆細胞であるかを確認するためにRxやPAX6、SOX3などのマーカーのリアルタイムPCRによる発現の確認を試みた。ところが、実験を重ねるにつれRxDsRed陽性細胞の発現が徐々に減少し、ついには蛍光顕微鏡にても確認困難になった。そこで我々はOsakadaらのSFEB/DLFA法から、DL濃度が濃く、かつ培養時間の長いHiramiらのSFEB/DL法へと変更した。しかしRxDsRed陽性細胞は検出する事が出来なかった。我々は続いてRxDsRedを遺伝子導入したmiPS細胞のtransgeneの発現が継代を重ねた結果として、弱まった可能性を考え、強く発現が見られたラインの継代数の若い細胞を用いて再度SFEB/DLFA法を行ったが、RxDsRed細胞は検出できなかった。feeder細胞が分化誘導中に残存し分化を抑制している可能性を考慮し、feederをゼラチンコートディシュに張り付けて除去する方法から、LIFの存在下で継代することにより除去する方法を行いfeeder細胞をより確実に除去したが、Nanog陽性細胞数は著明に減少したもののRxDsRed陽性細胞数は増加しなかった。我々は20ライン作ったRxDsRedを遺伝子導入したmiPS細胞の全ラインでSFEB/DLFA法ならびにSFEB/DL法を行ったところ、極めて微量な蛍光を発するRxDsRed陽性細胞を認めたが、FACSによる回収は困難であった。以上より我々は2010年度にRx-promoter下流にDsRedを発現するBACクローンを作製する事に成功し、かつ、同クローンをマウスiPS細胞に遺伝子導入する事に成功した。なおかつOsakadaらの方法を用いて網膜前駆細胞と思われる細胞を回収する事が出来たといえる。しかしその後、分化誘導効率が落ち、様々な検討を行ったが再度回収する事は困難であった。以上が研究成果である。
喉頭機能障害に対する新治療法の検討-機能的電気刺激を用いた機能回復の試み

喉頭機能障害は様々な原因で引き起こされ、特に神経障害に基づく機能低下は高齢者に多く認められる。近年、微小電気刺激により麻痺筋を収縮させる機能的電気刺激(functional electrical stimulation : FES)が失われた機能を回復させる一つの方法として注目されている。本研究では中枢、末梢神経障害を原因として引き起こされた種々の喉頭機能障害に運動補助FESを用いて機能再建することを目指し、その遂行に必要な基礎的実験成績を動物実験により収集した。まず、種々の喉頭機能を筋活動の観点から解析し、喉頭運動を制御する神経機構の特徴をまとめた。そして、人工的な喉頭運動を誘発させるために必要な適切な刺激条件を決定した。あらかじめ反回神経麻痺を引き起こしたネコを用い、麻痺側の甲状披裂筋と後輪状披裂筋に電極を刺入して微小電気刺激を加え、声門の閉鎖と開大運動を誘発した。横隔膜運動のトリガーにより声帯の開大運動は再現された。また、中脳中心灰白質に電気p刺激を加え、発声運動を誘発した際に、麻痺筋に電気刺激を加え、発声時の声門下圧の上昇と発声音の音圧が上昇し、気息性嗅声を改善させた。さらに、機能的電気刺激が反回神経切断により誘発される内喉頭筋萎縮に対して抑制効果を示すかについて組織学的手法により検討をくわえた。その結果、脱神経された内喉頭筋に機能的電気刺激を加えることで筋萎縮を抑制できることが明らかとなった。近年、微小電気刺激により麻痺筋を収縮させる機能的電気刺激(functional electrical stimulation : FES)が注目されている。本研究では中枢、末梢神経障害を原因として引き起こされた種々の喉頭機能障害を運動補助FESを用いて機能再建することを目指し、その遂行に必要な基礎的実験成績を主に動物実験により収集した。まず、種々の喉頭機能を筋活動の観点から解析し、得られた喉頭運動の筋電図的な特徴をまとめ、人工的な喉頭運動を誘発させるために必要な適切な刺激条件を決定した。声門運動の変化は硬性鏡とCCDカメラにより観察した。その結果、声帯の閉鎖開大運動の誘発には30-50Hzの微小電気刺激が適していることが明らかとなった。さらに、横隔膜の筋活動をトリガー信号として麻痺声帯に電気刺激を加え、声帯の吸気運動を誘発することができた。また、中脳中心灰白質に電気刺激を加え、発声運動を誘発した際に、麻痺筋に電気刺激を加え、発声運動を誘発した。その結果、発声時の声門下圧の上昇と発声音の音圧が上昇した。喉頭機能障害は様々な原因で引き起こされ、特に神経障害に基づく機能低下は高齢者に多い。近年、微小電気刺激によって麻痺筋を収縮させ、失われた機能を再現する機能的電気刺激(functional electrical stimulation : FES)が注目されている。平成13年度は除脳ネコを用い、内喉頭筋への微小電気刺激の最適な刺激条件を決定し、微小電気刺激を用いて吸気運動あるいは発声運動の再現を試みた。その結果、除脳ネコではこれらの運動の再現が可能であることが明らかとなった。平成14年度はこれらの喉頭運動を誘発する微小電気刺激が内喉頭筋の神経切断に伴う筋萎縮に対してどの様な影響を与えるか解析した。

電気刺激を継続的に内喉頭筋に加え反回神経麻痺側の内喉頭筋の萎縮変性を防止する作用を確認する検討では組織標本を多く用いる必要があり、形態学的研究において従来より幅広く使用されてきたラットを用いた。具体的には反回神経を切断したラットの内喉頭筋に微小電気刺激を加え続けることで、内喉頭筋の萎縮変性に対して変化が現れないか組織学的手法を用いて解析し、電気刺激が形態学的変化を誘発するか否かを解析した。そして、機能的電気刺激を加えた群では神経切断後2週間目までは非刺激群と同様に萎縮性変化が内喉頭筋に認められたが、その後刺激群では有意に切断側の筋断面積、筋繊維断面積、筋線維密度が改善し、健常側と同様の値になることが明らかとなった。
悪性黒色腫の上皮-間葉移行におけるBMPの役割と新規浸潤・転移モデルの確立

悪性黒色腫はメラニン産生能をもつメラノサイトから発生する悪性腫瘍である。皮膚や口腔粘膜上皮に発生し、早期に周囲組織に浸潤し、転移しやすく悪性度が高い。口腔粘膜に発生する悪性黒色腫は皮膚のものと比べ予後不良であるが、発症頻度が全悪性黒色腫10%前後と低いため研究があまり進んでいない。また、悪性黒色腫の進行にはBMPシグナルの関与が示唆されているが依然として不明な点が多い。前年度までに、培養細胞を用いた実験から、マウス悪性黒色腫細胞株B16をBMP2やBMP4処理すると間葉系細胞形態に変化した。また形態変化した細胞では上皮系細胞マーカーの発現が低下し、間葉系細胞マーカーの発現が上昇した。また、構成活性型ALK3受容体を恒常的に発現するB16細胞を作製した。すると、このBMPシグナルが活性化した細胞は間葉系細胞様に形態が変化し、移動能・浸潤能の亢進が認められた。これらデータに基づき、当該年度はin vivo実験を行った。8 10週齢のマウスをペントバルビタールの腹腔内投与による麻酔下でDMEMに懸濁したB16細胞(1.0 x 105/ ml)を50μl左咬筋部に接種した。細胞接種3週間後にイソフルランの過量吸入により安楽死させた後,腫瘍サイズを測定した。さらに顎骨頭蓋骨をμ-CT撮影装置で撮影し3D画像を構築した骨破壊を評価した。するとBMPシグナルが活性化したB16細胞はコントロール細胞に比べて腫瘍が増大し骨破壊が亢進する結果が得られた。以上の結果から、もし悪性黒色腫細胞特異的にBMPシグナルを抑制することができれば画期的な悪性黒色腫治療法の開発に繋がるかもしれない。当該年度にin vivoの実験を行う計画をしていたが、実際にin vivoの実験を行い結果を得られることができたため。最終年度を迎えるにあたり、現在までに得たデーターを整理し、我々の仮説を証明するのに足りないデータを集める。また、期間終了までに論文が受理されることを目指し、論文執筆を行う。マウス悪性黒色腫株B16を処理したところ、間葉系細胞用形態に変化した。さらにBMPのI型受容体の一つであるALK3の構成的活性型受容体遺伝子(Ca ALK3)を過剰発現してBMPシグナルを活性化した細胞も同様に間葉系細胞様形態に変化した。またBMPのI型受容体のキナーゼ阻害剤のLDN-193189で処理した細胞ではBMP2を添加しても細胞の形態変化を誘導しなかった。すなわち, BMPシグナルは悪性黒色腫B16細胞の形態を間葉系細胞用形態に変化させることが明らかとなった。次にBMPシグナルが誘導するB16細胞の形態変化が上皮間葉移行(EMT)かどうか検討した。BMP2処理をして形態変化したB16細胞のE-cadherin、N-cadherin、Vimentin、およびSnailのmRNAを定量した。するとBMP2により形態変化したB16細胞ではコントロール群にくらべて上皮系細胞マーカーのE-cadherinの発現レベルが低下したのに対し、間葉系細胞マーカーのN-cadherin、VimentinおよびSnailの発現が上昇した。すなわち、BMPシグナルによるB16細胞のEMTを誘導し、形態変化を引き起こすことがわかった。さらにBMP処理したB16細胞では,ゼラチンコートを破り浸潤する細胞数がコントロールに比べて増加することがわかった。がんの浸潤に関与するMMP9の発現を検討したところ, BMP処理したB16細胞ではMMP9のmRNAおよびタンパク量が増加し、さらにゼラチンザイモグラフィーアッセイからMMP9の活性も上昇していることを突き止めた。すなわち、BMPシグナルはMMP9の発現を上昇し、その結果、浸潤能が亢進すると考えられた。悪性黒色腫は、メラニン色素産生能を持つメラノサイトから発生する腫瘍で皮膚に好発し、早期にリンパ行性または血行性に転移する悪性腫瘍であり、転移には細胞のEMTによる細胞の形態変化、移動、浸潤能の亢進が知られている。当初の研究計画に従って、我々はすでにマウス悪性黒色腫細胞株B16細胞を用いた実験から、BMPシグナルが悪性黒色腫におけるEMTのインデューサーであることを突き止めた。さらに、現在動物実験の準備も順調にしている。よって、本研究の進捗状況は概ね順調であると自己評価した。

これらデータに基づき、当該年度はin vivo実験を行った。8 10週齢のマウスをペントバルビタールの腹腔内投与による麻酔下でDMEMに懸濁したB16細胞(1.0 x 105/ ml)を50μl左咬筋部に接種した。細胞接種3週間後にイソフルランの過量吸入により安楽死させた後,腫瘍サイズを測定した。さらに顎骨頭蓋骨をμ-CT撮影装置で撮影し3D画像を構築した骨破壊を評価した。するとBMPシグナルが活性化したB16細胞はコントロール細胞に比べて腫瘍が増大し骨破壊が亢進する結果が得られた。以上の結果から、もし悪性黒色腫細胞特異的にBMPシグナルを抑制することができれば画期的な悪性黒色腫治療法の開発に繋がるかもしれない。当該年度にin vivoの実験を行う計画をしていたが、実際にin vivoの実験を行い結果を得られることができたため。申請した実験計画書に従って、今後はin vivoにおける悪性黒色腫の顎骨浸潤・転移におけるBMPシグナルの役割を検討する。昨年度に樹立したBMPシグナル構成的活性型B16細胞株をマウス咬筋部に摂取し、顎骨に対する浸潤をμCT画像や組織学的、分子生物学的に解析する予定である。最終年度を迎えるにあたり、現在までに得たデーターを整理し、我々の仮説を証明するのに足りないデータを集める。また、期間終了までに論文が受理されることを目指し、論文執筆を行う。当初本年度解析予定だったものが、次年度に施行することにしたため、それにともない、かかる費用を次年度に繰り越すこととした。実験がスムーズに進んだため、試薬、器具等が節約できた。また、次年度にインパクトファクターが高いオープンアクセスジャーナルに投稿する予定であるため、その投稿料を確保することとした。
蒸気爆発における液体金属塊の分裂と飛散の数値解析法の開発

蒸気爆発の素過程として、高温の液体金属塊が分裂・飛散し、低温液との界面面積が急激に増大することによって急速な蒸気発生が生じると考えられている。研究代表者らが開発した粒子法(MPS法)は格子を全く用いない新しい数値解析法で、流体が分裂・飛散する場合にも容易に計算することができる。そこで本研究では、MPS法によって、蒸気爆発の素過程のシミュレーションを試みた。本年度は、MPS法に関して、新たに以下の計算モデルを開発した。・計算アルゴリズムの改良これまでのアルゴリズムでは2流体の密度比が10程度までが数値安定性の限界であったので、水と液体金属しか同時に扱えず、蒸気相を計算に含めることができなかった。そこで、圧力の計算を2つの部分に分け、重い流体と軽い流体に対してそれぞれ計算することで、密度比が1000以上であっても安定に計算できるようになった。これによって、蒸気相も含めて解析ができるようになった。・相変化モデルの開発水と蒸気の間の相変化を、蒸気粒子の発生・消滅で計算するモデルを開発した。粒子法では粒子数を計算中に変えることは容易であり、粒子法の1つの大きな利点である。以上の新しい計算モデルをMPS法に加え、蒸気爆発の素過程のシミュレーションを行ない、以下の知見が得られた。・水ジェットの潜り込み本年度は水、蒸気相、液体金属の2種類の流体と、水から蒸気への相変化も考慮して計算を行なったが、Kim-Corradiniモデルで想定している水ジェットが液体金属に潜り込む現象は見られなかった。・フィラメントの上昇Ciccarelli-Frostは、X線撮影により、液体金属より複数のフィラメント状の突起が生じることを報告している。そこで、2本の水ジェットが液体金属に衝突する計算を行なった。計算結果にはフィラメントが見られ、蒸気爆発の素過程としてCiccarelli-Frostモデルが支持される。
プロスタグランジン機能解析のための新規PETトレーサーの設計及び合成

アクロメリン酸は難治性の神経性疼痛の一つであるアロディニアを誘発させるが、類似の構造を持つカイニン酸が全くその作用を示さないことから、アクロメリン酸に特異的な未知の受容体が存在する可能性が示唆されている。本研究では、この新規アクロメリン酸受容体を同定・解析するための光親和性標識プローブの設計・合成を試みた。アクロメリン酸より数倍強い脱分極作用を示し、より単純な構造を持つ人工類縁体MFPAをリード化合物として、プロリン環の4位に光官能基と検出用のヨードを導入したフェニル基をエーテルの形で結合させたプローブ分子を設計した。まず、設計した分子がアクロメリン酸活性を示すか確認するため放射核非標識体の合成を検討した。骨格構築の鍵反応としては、光官能基を有するフェノール体とヒドロキシプロリン誘導体の光延カップリングを検討することにした。4-ヒドロキシ-L-プロリンを出発物質とし、7行程を経て2位にカルボキシメチル基を導入した4-ヒドロキシプロリンユニットを合成し、フェノールユニットはニトロフェノールから3段階で合成した。二つのユニットを光延反応の条件で反応させたところ、4位の立体化学が反転してフェノキシ基が導入された化合物を得ることができた。これを脱保護し、イオン交換クロマトグラフィーにて精製することで目的の化合物が得られた。合成した化合物の生物活性を評価したところ、天然のアクロメリン酸に匹敵する強いアロディニア誘発作用を示すことがわかった。この結果を承けて、光親和性標識プローブとして活用するため同分子への放射性元素導入反応を検討し、パラジウム触媒によるスズ化反応とスズ-ハロゲン交換反応によって効率的に合成する手法を確立した。今後、放射標識プローブの合成とこれを活用した光親和性標識実験を行う予定である。一方、アゴニストおよびアンタゴニスト活性を示す化合物を創製するため、種々の類縁体の合成を行った。プロスタグランジン(PG)類は、痛みの伝達や発熱などに関与している。PGE_2やPGF_<2α>はグルタミン酸およびNOを介してアロディニアを誘発するが、グルタミン酸に類似した構造を持つアクロメリン酸がPGF_<2α>のアロディニアを特異的に消失させることから、未知のアクロメリン酸受容体の存在が示唆されている。本研究ではPGF_<2α>のアロディニア消失に関わる新規アクロメリン酸受容体を同定・解析するためのプローブ分子の設計・合成を試みた。まず、アクロメリン酸による活性評価系を構築するため、市販されておらず、天然からの入手も困難であるアクロメリン酸の全合成を行った。4-ヒドロキシ-L-プロリンを出発物質とし、6行程を経て合成したビニルトリフレート体と、別途合成した置換フェニルホウ酸化合物との鈴木カップリングにより基本骨格を構築し、さらに6行程を経て目的とするアクロメリン酸を合成することに成功した。合成したアクロメリン酸はPGF_<2α>のアロディニアを消失させることを確認できた。アクロメリン酸自体は構造が複雑で分子プローブ化のための構造修飾に適さないことから、アクロメリン酸より数倍強い脱分極作用を示し、より単純な構造を持つ人工類縁体MFPAを探索プローブ創製のリード化合物として用いることにした。まずMFPAがアロディニア作用を示すか検証するため、MFPAの合成を行った。アクロメリン酸合成における中間体であるビニルトリフレート体と2-メトキシフェニルホウ酸との鈴木カップリングにより得られた化合物を水素添加し、4位での異性体を分離した後、脱保護、イオン交換クロマトによる精製で目的とするMFPAおよび4S-異性体を合成した。いずれの化合物も低濃度で強いアロディニア誘発活性を示すことがわかった。現在、いくつかのMFRへの構造修飾体を設計し、合成を検討中である。

この結果を承けて、光親和性標識プローブとして活用するため同分子への放射性元素導入反応を検討し、パラジウム触媒によるスズ化反応とスズ-ハロゲン交換反応によって効率的に合成する手法を確立した。今後、放射標識プローブの合成とこれを活用した光親和性標識実験を行う予定である。一方、アゴニストおよびアンタゴニスト活性を示す化合物を創製するため、種々の類縁体の合成を行った。
細胞内Ca^<2+>動員における免疫抑制剤結合蛋白質(FKBP)の役割の解明〜FKBPサブタイプとの相互作用によるリアノジン受容体チャネル機能の多様化〜

本研究課題は細胞内Ca^<2+>放出チャネル/リアノジン受容体(RYR)とFK506結合蛋白質(FKBP)との相互作用について解析することを目的として行った。1)心筋型RYR(RYR2)に結合している内因性FKBP(FKBP12.6)は外から加えたFKBP12.6とは交換反応を起こしたが、FKBP12とは交換反応を起こさなかった。一方骨格筋由来CRC/RYR1に結合している内因性FKBP(FKBP12)は外から加えたFKBP12及びFKBP12.6いずれとも同等の効率で交換反応を起こした。次に心筋あるいは骨格筋小胞体(SR)分画をFK506処理することにより内因性FKBPを除去したCRC/RYRの空位のFKBP総合部位に対するFKBP12あるいはFKBP12.6の直接結合能を調べたところ、CRC/RYR2に対してはFKBP12.6のみが選択的に結合を示しFKBP12は全く結合しなった。一方CRC/RYR1の空位のFKBP結合部位にはFKBP12およびFKBP12.6は同等の結合能を示した。これらの結果から心筋型CRC/RYR2のFKBP12.6に対する結合親和性はFKBP12に対する結合親和性に比べて1,000倍程度高いことが推定された。一方骨格筋型CRC/RYR1はFKBP12およびFKBP12.6に対して同等の結合親和性を持つことが明らかとなった。2)in vivoにおいてもRYR/CRCにFKBPが結合しているか否かを検討するために骨格筋組織中でのRYRとFKBP12の局在を免疫組織化学的に比較検討した。RYR,FKBPともに筋繊維の縦走方向に対して直角に一定の間隔(約2μm)で並ぶバンドとして検出された。RYRとFKBPを同一切片上で二重染色すると両者のバンドの局在は一致していた。これらの結果からRYR/CRCはin vivoにおいてもFKBPが結合した形で存在することが示された。(1)本研究における解析対象である二種類のFKBP(FKBP12及び12.6)それぞれに対する特異的な抗体を得る作業は現在進行中であるが、FKBP12と12.6を区別し得る抗体はまだ得られていない。しかし手持ちの抗体を用いてラット骨格筋のパラフィン切片に対して免疫組織化学染色法によるRYRとFKBPの二重染色を行い、この二種類のタンパク質が光顕レベルでは同じ場所に局在することを確かめ、このことを現在投稿準備中である。(2)本研究ではFKBPのCRC/RYRに対する結合、交換、解離反応を解析することを目的とするが、まずFKBP12.6とRYR2との特異的結合がいろいろな動物種において一般的な現象であるか否かを調べる目的でラット、ウサギ心筋SRのRYR2にFKBP12.6が結合しているか否かを調べた。ラット、ウサギ心筋SRのCRC/RYR2には、SR分画を調整する際の組織量に対するバッファー量に依存してチャネル1分子当たり02分子程度のFKBP12.6が結合していることが分かった。このことはFKBP12.6の濃度、あるいはCa^<2+>,Mg^<2+>各種塩濃度がFKBPのRYRからの解離に影響を及ぼす可能性を示唆するものと考えられる。

本研究課題は細胞内Ca^<2+>放出チャネル/リアノジン受容体(RYR)とFK506結合蛋白質(FKBP)との相互作用について解析することを目的として行った。1)心筋型RYR(RYR2)に結合している内因性FKBP(FKBP12.6)は外から加えたFKBP12.6とは交換反応を起こしたが、FKBP12とは交換反応を起こさなかった。一方骨格筋由来CRC/RYR1に結合している内因性FKBP(FKBP12)は外から加えたFKBP12及びFKBP12.6いずれとも同等の効率で交換反応を起こした。次に心筋あるいは骨格筋小胞体(SR)分画をFK506処理することにより内因性FKBPを除去したCRC/RYRの空位のFKBP結合部位に対するFKBP12あるいはFKBP12.6の直接結合能を調べたところ、CRC/RYR2に対してはFKBP12.6のみが選択的に結合を示しFKBP12は全く結合しなかった。一方CRC/RYR1の空位のFKBP結合部位にはFKBP12およびFKBP12.6は同等の結合能を示した。これらの結果から心筋型CRC/RYR2のFKBP12.6に対する結合親和性はFKBP12に対する結合親和性に比べて1,000倍程度高いことが推定された。一方骨格筋型CRC/RYR1はFKBP12およびFKBP12.6に対して同等の結合親和性を持つことが明らかとなった。2)in vivoにおいてもRYR/CRCにFKBPが結合しているか否かを検討するために骨格筋組織中でのRYRとFKBP12の局在を免疫組織化学的に比較検討した。RYR,FKBPともに筋繊維の縦走方向に対して直角に一定の間隔(約2μm)で並ぶバンドとして検出された。RYRとFKBPを同一切片上で二重染色すると両者のバンドの局在は一致していた。これらの結果からRYR/CRCはin vivoにおいてもFKBPが結合した形で存在することが示された。
肝癌自然発症LECラットを用いた発癌に対する酸化ストレスの影響の研究

本研究はLECラットの高い発癌率に対する酸化ストレスの関与を明らかにすると共に酸化ストレスによって生じたDNA損傷や細胞周期調節の異常遺伝子の解析を通じて肝癌発生との関連性を明らかにすることを目的として実施し、以下のような研究成果を得た。1)LECラット肝臓においては銅だけでなく、鉄も同時に蓄積され、鉄や銅は生体内で種々の酸化ストレス物質を産生すると考えられているが、肝細胞におけるDNA損傷は銅の蓄積に依存し、鉄の蓄積には関与しないことを示し、こららの金属の生体内における反応性について重要な知見を得た。2)酸化ストレスによって生じたDNAの2本鎖切断は主として非相同性末端結合(NHEJ)によって修復されるが、LECラット細胞ではこの修復に異常が存在する。LECラット細胞ではNHEJに重要な役割を果たすDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の機能に異常があることを示した。また、DNA-PKの構成成分であるKuタンパク質のDNAの切断生成後における細胞内局在を調節する機序に異常があることを示した。3)疾患モデル動物を作製するため、バッククロスを繰り返しているが、特に雌で妊性が悪く、現在5代目で当該コンジェニックの作製にはまだ時間が必要と考えられる。4)LECラット細胞はG1期だけでなく、G2/M期における細胞周期の進行調節にも異常があることを示し、DNA損傷によって引き起こされる細胞内の情報伝達系に種々の特徴的な反応を有することを示した。さらに、DNA損傷と関連しないストレスに応答する細胞内情報伝達系にも異常があることを示し、その原因遺伝子について検討中である。本研究はLECラットの高い発癌率に対する酸化ストレス関与を明らかににすると共に酸化ストレスによって生じたDNA損傷や細胞周期調節の異常遺伝子の解析を通じて肝癌発生との関連性を明らかにすることを目的として今年度は以下のような結果を得た。1) LECラット細胞における細胞周期調節遺伝子の検討:酸化ストレスとは異なった種類のDNA損傷を引き起こす短波長紫外線の照射によってLECラットの細胞に高頻度でアポトーシスが誘発され、この際対照のWKAHラット細胞で見られるp53タンパク質の増加が認められず、LECの細胞がp53に依存しない経路におけるアポトーシス誘発に高感受性であることを示した。また、DNAトポイソメラーゼ阻害剤に対するLEC細胞の高い感受性を示し、この点でもATの細胞との類似性を示した。2)肝臓における酸化ストレスとDNA損傷の解析:コメット法を用いてLECラット肝臓における個々の肝細胞のDNAの切断頻度について現在解析をしており、肝炎が発生するよりもかなり早い時期からDNA切断が起こっていることを検出し、銅濃度との関連について解析中である。3)肝癌発生に関わる疾患モデル動物の作製と当該遺伝子のマッピング:LECラットを他の系統のラットへと交配した後、バッタクロスを繰り返して現在3代目ととなっている。また、当該遺伝子のマッピングについても現在検討中である。4) DNA切断修復遺伝子などの解析:DNA損傷後の早い時期での潜在性致死損傷の回復にLECラットは異常があることを見い出し、これと関連するDNA切断の修復に重要な役割を果たしているDNA依存タンパク質キナーゼの細胞内局在に異常があるとの結果を得、現在解析を継続中である。本研究はLECラットの高い発癌率に対する酸化ストレスの関与を明らかにすると共に酸化ストレスによって生じたDNA損傷や細胞周期調節の異常遺伝子の解析を通じて肝癌発生との関連性を明らかにすることを目的として今年度は以下のような結果を得た。l)LECラット細胞における細胞周期調節遺伝子の検討:LECラット細胞を電離放射線など酸化ストレス処理した後G2/M期において細胞周期は正常細胞と比較して長期間停止して、LECラット細胞ではG1/S期だけでなくG2/M期においても細胞周期調節遣伝子に異常が存在することを示した。2)肝臓における酸化ストレスとDNA損傷の解析:コメット法を用いてLECラット肝臓における個々の肝細胞のDNAの切断頻度について解析し、週齢に依存してDNAの切断が生じていることを示した。

また、LECラット肝臓においては銅と共に鉄も週齢に依存して蓄積されるが、低銅食を与えたラットの解析からDNA切断の主たる原因は鉄ではなく、銅の蓄積であることを示した。3)肝癌発生に関わる疾患モデル動物の作製と当該遺伝子のマッピング:コンジェニック系統のラットの作製は継続中であるが、放射線高感受性の主たる原因遺伝子は第4染色体上に位置していることが示された。4)DNA切断修復遣伝子などの解析:DNA2本鎖切断の修復に重要な役割を果たしているDNA依存タンパク質キナーゼ(DNA-PK)について解析し、その阻害剤であるワートマニン処埋によって正常細胞は放射線感受性が増加するのに対し、LECラット細胞では影響を受けず、LECラットのDNA-PKにおける異常を示すと共にその細胞内局在に異常があるとの結果を得、その分子生物学的機序を現在検討中である。本研究はLECラットの高い発癌率に対する酸化ストレスの関与を明らかにすると共に酸化ストレスによって生じたDNA損傷や細胞周期調節の異常遺伝子の解析を通じて肝癌発生との関連性を明らかにすることを目的として今年度は以下のような結果を得た。1)肝臓における酸化ストレスとDNA損傷の解析:LECラット肝臓では銅と共に鉄も蓄積され、どちらの蓄積が病態の主たる原因となっているか明らかでなかったが、コメット法を用いた解析によってDNAの切断を引き起こすような酸化ストレスの原因は銅であり、鉄の蓄積は余り関与していないことを示した。2)DNA切断修復異常の解析:酸化ストレスによって生じたDNAの2本鎖切断は主として非相同性末端結合(NHEJ)によって修復されるが、LECラット細胞ではこの修復に異常が存在する。LECラット細胞ではNHEJに重要な役割を果たすDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の機能に異常があることを示した。また、DNA-PKの構成成分であるKuタンパク質は正常細胞ではDNA切断の生成後細胞質から核へ移行し、核で蓄積するが、LECラット細胞ではこの核への蓄積が起こらず、このことがLECラット細胞における修復異常の原因であることを示した。3)肝癌発生に関わる疾患モデル動物の作製:LECラットをWKAHラットと交配した後、バッククロスを繰り返しているが、特に雌で妊性が悪く、現在5代目で当該コンジェニックの作製にはまだ時間が必要と考えられる。また、当該遺伝子のマッピングについても現在検討中である。4)細胞周期調節遺伝子・の検討:LECラット細胞はS期で細胞周期の進行を停止させるヒドロキシウレアに対して高い感受性を示し、また、ヒートショック後の細胞内情報伝達系に異常があることを示し、現在その原因遺伝子について検討中である。
肺癌に対する光感受性物質(フェオフォバイドa)を用いた光線力学的治療

(目的)低エネルギーレーザー照射と腫瘍親和性光感受性物質を組み合わせた癌のphotodynamic therapy(PDT)は、1996年4月よりPhotofrinとエキシマダイレーザーの組み合わせが保険適応となったが、全身投与による副作用の日光過敏症のため長期の暗室内生活が余儀なくされ臨床応用例は増えていない。クロロフィル(葉緑素)の代謝により生じる光感受性物質Pheophorbidea(Phde a)は、静注および局注においても光照射で高い殺腫瘍効果が得られることが報告されているが、水に難溶性のため有機溶媒等にて溶解してから作用させる必要があり一般的でなかった。今回我々は、水溶性のPhde aのNa塩(Na-Phde a)を調整し、腫瘍内へ局注することを前提とした基礎的実験を施行した。(対象・方法)ヒト肺扁平上皮癌の細胞株(RERF-LC-AI)を使用してNa-Phde aを0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mlの濃度に調整し、5分、30分、1時間、2時間、4時間、6時間作用させた。作用時間終了後は直ちに細胞を洗浄し、細胞に取り込ませたPhde aをメタノールにて抽出後、分光学的に色素量を測定した。培養癌細胞内へのPhde取り込み濃度は色素量よりLambert-Beerの法則を用いて算出し細胞内濃度を求めた。さらに培養癌細胞に対しその結果を考慮した濃度および時間変数でNa-Phde aを作用させ、300Wハロゲン光を15分間照射によるPDTを施行し、殺細胞効果をMTT試験法にて3日後判定した。(結果)細胞内に取り込ませたPhde aの濃度は、その細胞内濃度曲線よりおよそ4時間で飽和状態に達し、Na-Phde aの濃度が0.04mg/ml以上ならば細胞内の飽和濃度が約1.4pg/cellと最高濃度に達した。次にNa-Phde aの濃度を0.04mg/mlとし、培養癌細胞に5分、15分、30分、1時間、4時間作用させPDTを施行したが、1時間以上作用させることでコントロールとの相対生存率は3%以下となり有意に培養癌細胞は死滅した(p<0.01)。(結語)1.Na-Phdeaは0.04mg/mlという低濃度でも4時間作用させれば細胞内最高濃度に達した。2.濃度0.04mg/mlのNa-Phde aを1時間作用させる程度で十分な殺腫瘍効果が得られた。ポルフィリンは生体機能に欠かせない化合物であるが、光増感色素とレーザーを併用した光線力学的治療では、腫瘍細胞のみを選択的に攻撃できることがわかっている。これは、本来毒物であるポルフィリン化合物が、正常細胞では直ちに排泄され、腫瘍細胞では蓄積される性質を利用したものである。その殺腫瘍効果は、レーザー光線を使用するため、細胞昇華的に作用すると思われてきたが、最近の我々の実験からは、以下のような作用機序が推測される。我々は、肺癌細胞株RFLC-A1(扁平上皮癌)を使用し、フェオフォバイトaを作用させたところ、レーザー光を作用させずとも腫瘍細胞が死滅する現象に遭遇した。当初は、フェオフォバイトaの毒性から生じたものかと思われたが、偶然近隣してあったハロゲンランプから発せられた波長と、フェオフォバイトaの吸光帯とに一致をみたためであると推察された。これにより、組織深達度にすぐれたQswitchND:YAGレーザーを使用せずとも腫瘍細胞の障害が生じたため、小林らが報告してきたように、DNA障害を介して、細胞障害が招来されるものと考える。これらは、我々の実験系がより簡素にかつ明確に行えるという福音であり、今後は目的に示したとおり細胞内至適濃度とそれに到達する至適時間を測定し、殺腫瘍効果を確認・証明していきたい。

(結果)細胞内に取り込ませたPhde aの濃度は、その細胞内濃度曲線よりおよそ4時間で飽和状態に達し、Na-Phde aの濃度が0.04mg/ml以上ならば細胞内の飽和濃度が約1.4pg/cellと最高濃度に達した。次にNa-Phde aの濃度を0.04mg/mlとし、培養癌細胞に5分、15分、30分、1時間、4時間作用させPDTを施行したが、1時間以上作用させることでコントロールとの相対生存率は3%以下となり有意に培養癌細胞は死滅した(p<0.01)。(結語)1.Na-Phdeaは0.04mg/mlという低濃度でも4時間作用させれば細胞内最高濃度に達した。2.濃度0.04mg/mlのNa-Phde aを1時間作用させる程度で十分な殺腫瘍効果が得られた。
セントロメア・クロマチンの動構造の分子基盤と意義

セントロメアは、細胞分裂において染色体動態の制御中枢を担う特殊な染色体ドメインであり、微小管と相互作用をするための動原体が形成される。われわれは先行研究で、分子イメージング法を応用して、動原体は伸張と収縮を繰り返すダイナミックな構造体であることを見出した。本研究では、この「染色体ストレッチング」と呼ぶこの現象に焦点を絞り、セントロメアの動的な構造変化の分子機構とその生物学的意義の解明を進めた。その結果、動原体のストレッチングは、動原体の構成因子CENP-Tの長大な天然変性領域の関与を明らかにすることができた。つまり、この可変ドメインが動原体の内層と外層を繋ぐスプリングとなっていることで、微小管の重合・脱重合によって、動原体が伸張・収縮をすることを突き止めた。そしてその知見をベースにして、ストレッチング運動を人為的に操作する実験系を作り出すことに成功した。本研究は重複制限ルールに沿って中途廃止となったが、ストレッチングの操作実験系を活用することで、動原体構造の変化がいかにM期チェックポイント信号を制御するのかについて鋭意解析を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。M期染色体動態の制御中枢であるセントロメアは、高度に凝縮したクロマチンと特異的に局在するタンパク質によって特殊な染色体構造を構築している。その一方で、セントロメアは、微小管との相互作用によって機械的な力を受けて、ブリージング、オシレーションといった運動をすることが知られている。さらに我々は「ストレッチング」と呼ばれる動原体の伸縮運動を見出した(Uchida et al., 2009)。こうした3つのダイナミックな運動がいかにして起こり、どのような効果をもたらしているのかはよく分かっていない。本研究の目的は、セントロメアに局在するタンパク質複合体の動態を手掛かりにして、セントロメア・クロマチンの動構造の成因を探り、その生物学的意義を明らかにすることである。平成26年度は、セントロメア構築に中心的な役割を担うAurora B複合体を蛍光標識した細胞を作成し、その局在をライブイメージング解析によって検討したところ、Aurora B局在(濃縮した点)はセントロメア内で姉妹動原体間を変動することを見出した。その変動によってAurora Bが近づいた動原体ではより強くAurora Bの基質がリン酸化され、遠のいたとこでは弱くなるといった動的特性をもつことが分かり、それに基づいて動原体のストレッチングの発生頻度が変化することが明らかとなった。予定した実験が順調に進み、実験系の確立に成功した。動原体ストレッチングの動態を人為的に抑制する実験系を作成することができたので、これを活用して動原体ストレッチングの生物学的意義の解析を進める。
難治がんの克服に向けた高感度病態診断法の開発と実用化

難治性がんの予防・早期発見・治療に適用できる新しいがん診断法の開発に向けて、多数のがん組織および血液試料を用いて、がん細胞で特異的に産生される分子の網羅的・高感度の解析と探索に取り組んだ。この中から血液診断やがん組織診断に応用可能な診断マーカー候補を同定した。得られた研究成果は各種の学会で報告し、国際学術雑誌に論文発表した。以上、本研究において、悪性度の高いがんの個別化医療の開発に向けた基盤情報を得た。我が国の癌の3分の2以上を占める難治がん(難治固形癌)の組織・血清試料と網羅的ゲノム・プロテオームおよび高感度微量分子解析技術を基盤として、先端的バイオマーカーとなりうる癌由来分子を同定・検証し、癌の発症リスクから未病状態および疾患発症・増悪を早期に感知する分子病態診断法を実用化し、その迅速な癌予防・診断・治療への展開による癌年齢層の健康寿命の延長をめざして、(1)難治固形癌の発症リスクや早期癌を検出する統合的診断系の開発、(2)難治固形癌の集学的治療適用指標となる悪性度診断系の開発、(3)難治固形癌の低侵襲迅速病態診断系の基盤確立と検証・実用化等を目的とした解析基盤の整備を行った。平成27年度は、第1段階として解析基盤(技術・試料)の確立とバイオマーカー候補分子の探索に取り組んだ。難治固形癌組織・血清の蛋白解析と微量分子の迅速多検体解析においては、各種の早期進行癌のサンプルセットを用いた血清蛋白解析と網羅的遺伝子発現解析等で独自に同定したバイオマーカー候補(組織・血清蛋白およびExosome中のDNA, mRNA等)やその関連分子経路について、組織染色、ELISA、Digital PCRおよびBioplex解析技術の確立と検証を行った。また、難治固形癌のゲノム・プロテオーム解析情報と臨床情報の拡充および発癌リスク診断モデルの検討に向けた取り組みとして、臨床試料および臨床情報の収集・充実と癌特異的バイオマーカーの解析情報の収集・整備を行った。難治固形癌組織・血清の蛋白解析と微量分子の迅速多検体解析の技術基盤の確立に取り組み、また、バイオマーカー候補分子の探索および臨床試料・情報や癌特異的バイオマーカーの解析情報の充実を図ることにより解析基盤を整備できたため。我が国の癌の3分の2以上を占める難治がん(難治固形癌)の組織・血清試料と網羅的ゲノム・プロテオームおよび高感度微量分子解析技術を基盤として、先端的バイオマーカーとなりうる癌由来分子を同定・検証し、癌の発症リスクから未病状態および疾患発症・増悪を早期に感知する分子病態診断法を実用化し、その迅速な癌予防・診断・治療への展開による癌年齢層の健康寿命の延長をめざして、(1)難治固形癌の発症リスクや早期癌を検出する統合的診断系の開発、(2)難治固形癌の集学的治療適用指標となる悪性度診断系の開発、(3)難治固形癌の低侵襲迅速病態診断系の基盤確立と検証・実用化等を目的とした解析基盤の整備と探索解析を行った。平成28年度は、前年度に引き続き、第1段階である解析基盤(技術・試料)の拡充とバイオマーカー候補分子の探索を進めた。難治固形癌組織・血清の蛋白解析と微量分子の迅速多検体解析においては、各種の早期進行癌のサンプルセットを用いたバイオマーカー候補(組織蛋白および血液中核酸等)やその関連分子経路について、組織染色、Digital PCRおよびBioplex解析等による探索を行い、併せて難治固形癌のゲノム・プロテオーム解析情報の収集・整備を行った。また、第2段階として難治固形癌の免疫組織学的バイオマーカー候補分子の同定と臨床病理学的評価を組織マイクロアレイ解析で行った。選出された血清バイオマーカー候補および網羅的発現情報解析で癌組織における高レベルの遺伝子発現が確認されたバイオマーカー候補の抗体を入手して、複数の難治固形癌患者群での発現分布(組織型、分化度、病期、予後との相関)を検討し、蛋白発現レベルが各癌種の患者の生命予後の短縮やリンパ節・遠隔転移等の臨床的な癌の悪性度に相関する組織染色バイオマーカー候補を抽出した。難治固形癌組織・血液中の微量バイオマーカー分子候補の探索に取り組み、また、難治固形癌の悪性度に相関する組織染色バイオマーカー候補を抽出したため。平成29年度は、前年度に引き続き、解析基盤(技術・試料)とバイオマーカー候補分子の拡充・整備を進めた。各種の早期進行癌のサンプルセットを用いたバイオマーカー候補(組織および血液中の蛋白・核酸等)やその関連分子経路について、組織染色、高感度分子検出技術等による難治固形癌組織・血清中の微量分子の迅速多検体解析を行い、癌悪性度診断システム及び早期血清診断システムの構築を以下の手順で行った。難治固形癌の免疫組織学的バイオ

マーカー候補分子については、多数の癌患者群での発現分布(組織型、分化度、病期、予後との相関)と臨床病理学的評価を組織マイクロアレイ解析等で行うとともに、選択された複数の組織バイオマーカー候補を組み合わせた悪性度診断システムの構築を実施した。一方、血清診断バイオマーカー候補分子については、ELISA、Digital PCR及びBioplex解析等を行い、選択された複数の血清バイオマーカー候補を組み合わせた早期血清診断システムの構築を実施した。以上、癌の迅速分子病態診断系の実用化に関わる試料収集とアッセイ系構築の基盤整備を行った。難治性がんの予防・早期発見・治療に適用できる新しいがん診断法の開発に向けて、多数のがん組織および血液試料を用いて、がん細胞で特異的に産生される分子の網羅的・高感度の解析と探索に取り組んだ。この中から血液診断やがん組織診断に応用可能な診断マーカー候補を同定した。得られた研究成果は各種の学会で報告し、国際学術雑誌に論文発表した。以上、本研究において、悪性度の高いがんの個別化医療の開発に向けた基盤情報を得た。難治固形癌組織・血清の蛋白解析と微量分子の迅速多検体解析基盤の拡充やバイオマーカー候補分子の探索および臨床試料・情報やバイオマーカー情報の充実を引き続き図るとともに、第2段階として免疫組織学的バイオマーカー候補分子の探索を行う。難治固形癌組織・血清の蛋白解析と微量バイオマーカー分子候補の探索を引き続き行うとともに、複数のバイオマーカーを用いたがんの新規診断法の構築を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学29年度が最終年度であるため、記入しない。
植物の高次生命現象における小胞輸送の機能解析

本年度は,エンドサイトーシスを担うオルガネラであるエンドソームの動態解析を中心に研究を行った.エンドソームに局在し,その融合を制御している低分子量GTPase (Ara6,Ara7)とGFPの融合タンパク質は,これまで観察が困難であったエンドソームの優れたマーカーとなり得る.我々は,それらを発現する形質転換シロイヌナズナ,及びその培養細胞を高感度高速顕微鏡観察システムを用いて可視化することにより,エンドソームが細胞内を非常に速い速度で運動していること,その運動がアクチンに依存していること,Brefeldin Aがエンドソームの凝集を引き起こすこと,オーキシンの極性輸送の阻害剤として知られるTIBAがエンドソームの運動を完全に阻害すること等を明らかにした.近年,オーキシンの排出輸送体の一つであると考えられるAtPin1タンパク質や,細胞壁を構成するペクチン,細胞膜の成分であるステロール等が,細胞内と細胞膜をリサイクリングしていることが報告されている.これらのリサイクリングはアクチンに依存していることから,植物のエンドサイトーシスがアクチンに依存しているであろうと予測されていたが,われわれの結果は,それを直接証明するものであった.さらに,これらのエンドソームマーカーを用いることにより,体軸形成に欠損を持つgnom変異体においては,エンドソームが異常に肥大していることも見いだした.今後は,現在の手法を改良することにより,エンドソームの動態のさらなる解明を目指すとともに,各種ストレス,植物ホルモン等へのエンドサイトーシスの応答を解析したい.また,エンドサイトーシスに関与する遺伝子に欠損を持つ変異体を収集,解析することにより,エンドサイトーシスが植物のいかなる現象に関与するのかも,さらに明らかにしていきたいと考えている.本年度は,エンドサイトーシスを担うオルガネラであるエンドソームの動態解析を中心に研究を行った.エンドソームに局在し,その融合を制御している低分子量GTPase (Ara6,Ara7)とGFPの融合タンパク質は,これまで観察が困難であったエンドソームの優れたマーカーとなり得る.我々は,それらを発現する形質転換シロイヌナズナ,及びその培養細胞を高感度高速顕微鏡観察システムを用いて可視化することにより,エンドソームが細胞内を非常に速い速度で運動していること,その運動がアクチンに依存していること,Brefeldin Aがエンドソームの凝集を引き起こすこと,オーキシンの極性輸送の阻害剤として知られるTIBAがエンドソームの運動を完全に阻害すること等を明らかにした.近年,オーキシンの排出輸送体の一つであると考えられるAtPin1タンパク質や,細胞壁を構成するペクチン,細胞膜の成分であるステロール等が,細胞内と細胞膜をリサイクリングしていることが報告されている.これらのリサイクリングはアクチンに依存していることから,植物のエンドサイトーシスがアクチンに依存しているであろうと予測されていたが,われわれの結果は,それを直接証明するものであった.さらに,これらのエンドソームマーカーを用いることにより,体軸形成に欠損を持つgnom変異体においては,エンドソームが異常に肥大していることも見いだした.今後は,現在の手法を改良することにより,エンドソームの動態のさらなる解明を目指すとともに,各種ストレス,植物ホルモン等へのエンドサイトーシスの応答を解析したい.また,エンドサイトーシスに関与する遺伝子に欠損を持つ変異体を収集,解析することにより,エンドサイトーシスが植物のいかなる現象に関与するのかも,さらに明らかにしていきたいと考えている.
非典型担保理論の再構成

1非典型担保全般についての資料文献の蒐集およびその整理非典型担保全般について資料文献の蒐集を行なった。これと平行して整理を行ない,その総まとめとして,甲斐道太郎編『物権法』の中の第九章「非典型担保」を分担執筆した。2譲渡担保の法的構成各非典型担保は担保としてどのような内容を有するかという観点から分析したところ、信託譲渡説に対する従来の理解が正当でないこと,所有権的構成と担保権的構成に対比する従来の学説の分類が妥当でないことなどが明らかとなった。これについては,拙稿「譲渡担保の法的構成」として『谷口知平先生追悼論文集(第3巻)』に執筆した。3非典型担保の実行権能・実行方法このテーマについては,現在「譲渡担保の実行権能・実行方法」を執筆中である。個々の担保方法の担保としての内容すなわち担保構造を明らかにし,そこから譲渡担保における実行根拠およびその実行根拠に基づく実行方法を明確にすることができると考える。4代理受領と法定相殺・相殺予約の優劣このテーマについても,非典型担保の担保構造を比較するという観点から,現在執筆中である。5集合債権の担保このテーマについては,担保構造からみるとどのような性質・効力を有するかを『注釈民法第8巻』に「集合債権」として執筆した。6非典型担保の新たなアプローチこのテーマは,方法論も含む重大な問題であり,現在研究継続中である。これまでの研究から一定の方向が見えているので,継続して研究を行ない,次年度末までに一定の成果をだしたいと考えている。
メカニカルストレス応答の破綻に着目した大動脈瘤形成メカニズムの解明

大動脈瘤は破裂時の死亡率が高いため、瘤の発生や成長を早い時期に阻止、遅延させる有効な治療法が必要となる。申請者らが独自に作製した大動脈瘤モデルマウス(SMKO)の解析を通じ、弾性線維を構成する細胞外マトリクスの異常が血管壁の弾性板の破壊と同時に平滑筋細胞のメカノセンシングの異常を誘発し、瘤形成に至ることを報告してきた。そこで本研究では、「大動脈壁のメカニカルストレス応答機構の破綻が大動脈瘤を形成する」という仮説の下、その詳細なメカニズムを解明し、新たな大動脈瘤阻害薬創出の基盤を構築することを目的とする。すなわち、1)TSP1を標的とした大動脈瘤治療に向けた治療的戦略を確立、2)Ssh1の大動脈瘤における生化学的特性と治療目的としての基盤を確立、3)大動脈壁のメカニカルストレス応答細胞の可視化と網羅的遺伝子発現解析を行う。2018年度は、血管壁のメカニカルストレス応答因子の一つとして我々が同定した、マトリセルラータンパク質トロンボスポンディン1(TSP1)の発現制御機構を詳細に検討した。ラット平滑筋細胞を用いた実験では、周期性伸展負荷やアンギオテンシンIIの添加により、TSP1の発現が顕著に抑えられること、また転写因子であるEarly growth response gene 1(Egr1)をノックダウンさせるとTSP1の上昇が抑えられることを報告した。さらに、大動脈瘤初期では、TSP1は内皮細胞と内側に近い平滑筋細胞に強く発現すること、上行大動脈と下行大動脈では発現が上行部のみに見られることなどを見出した。また、SMKOからTSP1を欠損させたマウス(DKO)では、大動脈瘤の発症が抑制されること、ヒト胸部大動脈瘤病変でも、TSP1が有意に上昇していることを見出した。メカニカルストレス応答細胞の可視化は、TACによる圧負荷下での血管壁のVenous陽性細胞ではなく、TSP1の発現を指標とした。目的1)「TSP1を標的とした大動脈瘤治療に向けた治療的戦略の確立」、に関して、SMKOマウス大動脈瘤でTSP1の発現を抑制すると、弾性線維の断裂が改善し、大動脈瘤の発症が抑止された。弾性線維ー平滑筋細胞の連結部(エラスチンエクステンション)も改善し、細胞内のメカニカルストレス応答因子の異常上昇も野生型と同じレベルまで回復した。これにより、TSP1阻害による大動脈瘤の抑制効果を詳細に記載した。また、ヒトの胸部大動脈瘤サンプルの解析を行い、TSP1が有意に病変で上昇していることも見出した。目的2)「Ssh1の大動脈瘤における生化学的特性と治療目的としての基盤の確立」では、Ssh1欠損マウスの作製に続き、SMKOとのダブルノックアウトマウスも予定通り作製した。現在までの解析では、我々の予想と異なり、Ssh1を欠損しても大動脈瘤は抑止されないことがわかった。また、Ssh1マウスはヘテロ接合体でも、野生型と比べて明らかに死亡率が高いこともわかっており、Ssh1は個体の生存に関与していることが示唆された。目的3)「大動脈壁のメカニカルストレス応答細胞の可視化と網羅的遺伝子発現解析」では、Egr1-venusトランスジェニックマウスのトランスジーンの発現がサイレンスされてしまったので、方針を変更した。メカニカルストレス応答因子であるTSP1が、生体内での圧負荷や血流の停止に反応して発現が増加することがわかった。とくに、大動脈の圧負荷では血管平滑筋細胞に、頸動脈の結紮では内皮細胞に発現の増加が観察された。平成31年度は、1)TSP1のメカニカルストレス応答経路を、分子生物学的に明らかにする。さらに、TSP1の中和抗体もしくはsiRNAを用いたマウスでの治療効果を検討する。2)SMKO;Ssh1-nullマウスの解析をすすめ、Ssh1ヘテロマウスの致死の原因を確かめる。3)大動脈瘤におけるEgr1の上流シグナルを同定し、その因子の発現を制御することで、大動脈瘤の抑止をはかる。申請者はこれまでに、独自に作製した大動脈瘤モデルマウス(SMKO)の解析により、弾性線維を構成する細胞外マトリクスの異常が血管壁の構造破壊を引き起こし、瘤形成の一因となることを明らかにしてきた。さらにこのマウスを用いた経時的プロテオミクスの解析から、瘤形成の初期段階で、血管壁のメカニカルストレス応答因子である、アンギオテンシン変換酵素(ACE)や転写因子Egr1、マトリセルラータンパク質トロンボスポンディン(TSP1)とその下流因子スリンゴショット1(Ssh1)の発現が異常に上昇することを見出した。また、ACE上昇によるアンギオテンシンシグナルを阻害すると大動脈瘤の形成が著明に抑制されることを見いだした。そこで本研究では、「大動脈壁のメカニカルストレス応答機構の破綻が大動脈瘤を形成する」という仮説の下、その詳細なメカニズムを解明することで、新たな大動脈瘤阻害薬創出の基盤を構築することを目的とする。すなわち、1)TSP1を標的とした大動脈瘤治療に向けた治療的戦略を確立、2)Ssh1の大動脈瘤における生化学的特性と治療目的としての基盤を確立、3)大動脈壁のメカニカルストレス応答細胞の可視化と網羅的遺伝子発現解析を明らかにする。