hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
耐熱性D-アミノ酸トランスアミナーゼのタンパク質工学的研究

この方法を用いて検討した結果、AspATやオルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT)がSi面上での水素転移を触媒するのに対し、DAAT,BCATは(4′-R)-[4′-^3H]PMPと反応させた場合にのみトリチウムを溶媒中へ放出し、re面上での水素転移を触媒することが明らかとなった。これはre面上での水素転移が報告された初めての例である。アミノトランスフェラーゼは一次構造から(1)AspATグループ、(2)OATグループ、(3)DAAT,BCAT、(4)セリントランスアミナーゼのグループに分類され、このうち(1),(2),(4)のグループとDAAT,BCATのグループは一次構造から別のファミリーに属すると報告された。水素転移反応の立体特異性は、この反応に関わる触媒基が補酵素のどちらの面上に位置するかによって規制されるものであり、これは酵素の立体構造、ひいては分子進化を反映する。明らかとなった水素転移反応の立体特異性は一次構造比較に基づくアミノトランスフェラーゼの分類と合致している。AspATとDATでは補酵素と触媒基の位置関係が逆転していることは、X線解析の結果確かめられた。またDATはAspATを代表とする他のアミノトランスフェラーゼとは全く異なる主鎖フォルディングを示しており、立体構造の上からも他とは異なる分子進化を遂げてきたことが明らかとなった。本研究ではまた、DAAT活性中心付近の残基の役割について、部位特異的変異法を用いて解析した。まずPLPの結合するリジン145(K145)をアルギニン、アラニン、グルタミン、アスパラギンなどに変換し、これら変異酵素の性質を検討し、K145が基質α-水素の引き抜きを触媒する触媒基である可能性を示した。またre面上でPLPに近接するロイシン201(L201)変異酵素を作成し、これらが反応中に失活していくこと、基質存在下では平衡がPMP型酵素の生成に傾くこと、失活はアミノ基供与体との半反応によって起こることなどを明らかにした。この結果、L201はPMP型酵素からPLP型酵素への転換反応に関わるものと推測された。D-アミノ酸トランスアミナーゼはD-アミノ酸のみをアミノ基供与体とし、細菌のD-アミノ酸代謝の中心に位置するピリドキサル酵素である。本研究では、ユニークな本酵素の立体構造を解明するとともに、タンパク質工学的手法により各種の変異酵素を作製してそれぞれの立体構造や機能を調べ、タンパク質の立体構造保持、活性発現に寄与しているアミノ酸残基とその役割をあきらかにし、耐熱性酵素と非耐熱性酵素、並びにそれぞれの変異酵素の構造と安定性を比較することにより、耐熱性酵素におけるタンパク質構造の安定化機構を解明し、酵素利用の新しい可能性を探索することを目的としている。既に研究を進めている中等度好熱性細菌、Bacillus sp.YM-1由来のD-アミノ酸トランスアミナーゼをPEG4000溶液からハンギングドロップ法によって結晶化した。本結晶の結晶形は単斜晶形に属し、格子定数はa=58.5A、b=76.2A、C=73.3A、β=103.9、非対称単位中に2モノマーを含んでいた。結晶の塩化エチル水銀誘導体を重原子同型置換法および異常分散法により解析し、1.94Aの分解能で精密化した。本酵素の主鎖フォールディングはアスパラギン酸トランスアミナーゼや他のピリドキサル酵素のそれとは全く異なること、および本酵素のピリドキサルリン酸を結合するLys145の側鎖がピリドキサルリン酸のC4'位に対してre面側に位置することが明らかになった。
脊髄損傷に対する治療戦略:異常知覚(中枢痛)の予防からみた検討

脊髄損傷(spinal cord injury : SCI)後に生じる異常知覚,特に中枢痛は,SCI部より吻側,尾側に生じことが知られており,いずれの疼痛も治療に抵抗性を示し,異なった機序に起因することが考えられる.このSCIより吻側(above-level)と尾側(below level)の疼痛機序をラットを用いて検討した.方法:ハロタン麻酔下にSprague-Dawleyラットの脊髄を腰部L2で半切した.SCI側の足底,および腰・臀部に機械刺激し,痛覚過敏とアロディニアの発生を観察したところ,SCI後,7日10日でほぼ最大となり,観察期間(21日),同程度の痛覚過敏とアロディニアが維持された.そこで,SCI後,10日14日のラットをハロタン麻酔下に,L2L5脊髄を露出し,動物を固定し,SCIより10mm吻側および10mm尾側にタングステン電極を刺入し,脊髄後角のwide-dynamic-range (WDR)およびhigh-threshold (HT)ニューロンの単一細胞活動を細胞外記録で導出した.自発活動,非侵害・侵害刺激に対する応答を測定後,静脈内にモルヒネを加算的に投与して,ニューロン活動に対する抑制をみた.また脊髄表面に作製したチャンバー(1000μl)内にモルヒネを加算的に投与し,同様の変化を調べた.結果:自発活動は,above-level, below-levelともにsham手術ラット(コントロール)に比べて有意に増加していたが,burstパターンを示すニューロンはabove-levelでのみ観察された.L2後根はSCI時に切除したが,足底部(皮膚節L3L5)の刺激でabove-levelニューロンも応答が見られた.above-level, below-levelのニューロンともに非侵害刺激,侵害刺激に対する応答がコントロールに比べ有意に増加していたが,その増加はbelow-levelニューロンでより有意であった.HTニューロンはSCI後も自発活動の増加を示さなかったが,侵害刺激に対する応答はabove-level, below-levelニューロンともに増加しており,above-levelニューロンでより有意に増加していた.モルヒネの全身投与は,above-levelニューロン活動を有意に抑制したが,below-levelニューロンへの影響は軽微であった.モルヒネの脊髄投与はabove-levelおよびbelow-levelともに非侵害刺激に対するWDRニューロン活動を抑制した.モルヒネ投与はHTニューロンへはほとんど影響を与えなかった.結語:以上の結果から,脊髄ニューロンはSCI後,障害より吻・尾側ともに,自発性,および刺激で惹起される反応性が増大するが,その生理学的機序やモルヒネに対する抑制度が異なることが示唆された.また皮膚節から,below-levelと考えられる部位からもSCIより上位の脊髄への投射があり,皮膚節部での同一部位でも,異なった機序に起因する疼痛が混在していることが示され,これらにより,SCI後の中枢痛の治療が画一的な戦略では成果が得にくい可能性が示された.脊髄損傷(spinal cord injury : SCI)後に生じる異常知覚,特に中枢痛は,SCI部より吻側,尾側に生じことが知られており,いずれの疼痛も治療に抵抗性を示し,異なった機序に起因することが考えられる.このSCIより吻側(above-level)と尾側(below level)の疼痛機序をラットを用いて検討した.方法:ハロタン麻酔下にSprague-Dawleyラットの脊髄を腰部L2で半切した.SCI側の足底,および腰・臀部に機械刺激し,痛覚過敏とアロディニアの発生を観察したところ,SCI後,7日10日でほぼ最大となり,観察期間(21日),同程度の痛覚過敏とアロディニアが維持された.そこで,SCI後,10日14日のラットをハロタン麻酔下に,L2L5脊髄を露出し,動物を固定し,SCIより10mm吻側および10mm尾側にタングステン電極を刺入し,脊髄後角のwide-dynamic-range (WDR)およびhigh-threshold (HT)ニューロンの単一細胞活動を細胞外記録で導出した.自発活動,非侵害・侵害刺激に対する応答を測定後,静脈内にモルヒネを加算的に投与して,ニューロン活動に対する抑制をみた.また脊髄表面に作製したチャンバー(1000μl)内にモルヒネを加算的に投与し,同様の変化を調べた.結果:自発活動は,above-level, below-levelともにsham手術ラット(コントロール)に比べて有意に増加していたが,burstパターンを示すニューロンはabove-levelでのみ観察された.L2後根はSCI時に切除したが,足底部(皮膚節L3L5)の刺激でabove-levelニューロンも応答が見られた.above-level, below-levelのニューロンともに非侵害刺激,侵害刺激に対する応答がコントロールに比べ有意に増加していたが,その増加はbelow-levelニューロンでより有意であった.HTニューロンはSCI後も自発活動の増加を示さなかったが,侵害刺激に対する応答はabove-level, below-levelニューロンともに増加しており,above-levelニューロンでより有意に増加していた.モルヒネの全身投与は,above-levelニューロン活動を有意に抑制したが,below-levelニューロンへの影響は軽微であった.モルヒネの脊髄投与はabove-levelおよびbelow-levelともに非侵害刺激に対するWDRニューロン活動を抑制した.モルヒネ投与はHTニューロンへはほとんど影響を与えなかった.

結語:以上の結果から,脊髄ニューロンはSCI後,障害より吻・尾側ともに,自発性,および刺激で惹起される反応性が増大するが,その生理学的機序やモルヒネに対する抑制度が異なることが示唆された.また皮膚節から,below-levelと考えられる部位からもSCIより上位の脊髄への投射があり,皮膚節部での同一部位でも,異なった機序に起因する疼痛が混在していることが示され,これらにより,SCI後の中枢痛の治療が画一的な戦略では成果が得にくい可能性が示された.1.脊髄半切による脊髄損傷モデルの作製(1)SDラットのT12レベルでの脊髄半切(Christiansen et al.,1996)により運動障害が出現したが,手術後1週間目までにはほぼ前値に回復した.患側下肢および大腿のvon Frey filament機械刺激に対する逃避閾値は34日目より有意に低下し,3週間は持続した.(2)健側の機械刺激に対する逃避閾値も低下傾向を示したものの,明らかな有意差はな,今後さらなる検討を要するものと思われ.2.脊髄後角ニューロンにおける電気生理学的検討(1)脊髄半切部より1椎体以内の尾側脊髄後角において,単一広域作動性(wide-dynamic-range ; WDR)ニューロンの活動を細胞外記録し,活動電位の自発発射頻度,非侵害・侵害刺激に反応する受容野(receptive field : RF)面積,RF中心に対する刺激に応答する発射頻度を測定した.脊髄損傷ラットでは自発発射頻度,受容野面積が明らかにコントロールに比べ増加していた.これらは脊髄損傷後の自発痛に対応しているものと思われた.非侵害刺激に対する発射頻度も増加をしめしたが,侵害刺激に対する反応性についてはニューロン間に差も大きく,今後さらなる検討を要する.(2)これら脊髄半切部より尾側ニューロンの興奮性増大に関与しているレセプターシステムについては脊髄への薬物還流実験により検討していく.また脊髄切除部位,切除部より上位レベルでの脊髄後角ニューロンの反応特性が今後の検討課題である.1.脊髄半切モデルにおける脊髄後角ニューロンの特性変化(1)Christensenらの方法(Pain 1996;68:97-107)を一部改変し,脊髄半切による脊髄損傷(Spinal Cord Injury:SCI)を行った.脊髄半切後,足底部,腰部における痛覚過敏を術後14日まで観察した.術後34日目より痛覚過敏が観察され,14日まで持続した.(2)損傷部より頭側(Above : A),尾側(Below : B)の脊髄後角ニューロン活動を単一細胞外記録で導出し,自発発射,非侵害・侵害性機械刺激に対する応答を記録・解析した.Aニューロンは他部位のニューロンより頭側に受容野を有したものの,足底に受容野を持つニューロンも存在した.自発発射はすべてのニューロンで増強しており,Aニューロンの一部ではburst発射を認めたが,Bニューロンでは認めなかった.
小児アレルギーマ-チの解析-乳児期のアトピー性皮膚炎と喘息を中心に-

(1)未熟児の好酸球:気管支喘息は近年炎症の観点からその病態が考察されている。ヒトの人生における最初の慢性肺疾患ともいうべき新生児気管支肺異形成における好酸球機能を検討した。その結果、好酸球は活性化された状態にあることが判明し、アレルギー疾患での好酸球の役割の解析に一助になるものと考えられた。(2)アトピー性皮膚炎(AD)患児の好中球機能:1歳以下のAD患児の末梢好中球の黄色ブドウ球菌貪食能は低く、このことがAD児の皮膚にみられる本菌の持続感染・浸潤性皮膚病変の成立に大きく関与しているものと考えられる。逆に2歳以上の乾燥性皮膚病変を持つ児では過酸化水素産生能が亢進状態にあり、好中球はプライミングされた状態にあると推定された。その後縦断的に観察したところ病状の改善とともに、低下していた貪食能および亢進していた過酸化水素産生能も正常化した。これらの所見はADの成り立ちと経過を知る上で貴重な情報を提供している。(3)超酸性水によるアトピー性皮膚炎患児のスキンケア:一方、機序解明とともに患者治療に関する臨床研究も現場では急務である。アトピー皮膚炎の病変部位からは黄色ブドウ球菌が高率に検出され、本菌が産生する毒素が病変の増悪因子と推定されている。そこで皮膚病変に超酸性水を噴霧したところ、有意な菌数減少、さらにこれに伴い臨床症状の改善と認めた。超酸性水による治療は簡便な方法として推奨できるものの一つと考える。気管支喘息患者の血漿エンドセリン-1について気管支喘息患者の血漿エンドセリン-1値と気管支の過敏性について検討した。62名の患者で発作中の血漿中エンドセリン-1値を測定し、一部の患者では肺機能との関連性を調べた(FEV_1/FVC)。さらに12名の患者でメサコリン吸入試験を施行した。その結果、発作時のエンドセリン-1値は臨床的スコアで分類した重症度とよく相関し、臨床的な分類を客観的に裏付けるものであった。またメサコリン吸入試験時のエンドセリン-1値は、気管支収縮の程度と相関した。血漿中エンドセリン-1値と肺機能との間には有意な負の相関が認められた。総合的に考察すると、血漿中エンドセリン-1は喘息発作の重症度を反映するものと考えられた。(2)肺胞マクロファージによるスーパーオキシドアニオン産生に及ぼすエンドセリン-1のプライミング効果について気管支喘息と気管支肺異形成とは、病態的にみれば肺の慢性炎症という基盤を共通項とする。炎症のメディエータであるスーパーオキシドアニオン産生に及ぼすエンドセリン-1のプライミング効果について、新生児の気管洗浄液の上清とウサギ肺胞マクロファージとを用いて検討した。この結果、気管上皮細胞/肺胞細胞で合成・分泌されるエンドセリン-1は肺胞マクロファージにプライミング効果を及ぼし、スーパーオキシドアニオンの産生を促すことがわかった。この所見は、上記(1)と照らし合わせ考察すると、喘息発作の誘導・増悪にエンドセリン-1が病態生理的に深く関与しているものと解釈できる。(1)好酸球と気管支肺異形成との関連について気管支喘息は近年、気道の炎症性疾患として位置づけられている。アレルギー疾患で主要な役割を果たす好酸球が肺疾患とどのように関わっているかを知るために、新生児期にまで遡って未熟児の末梢好酸球と気管支肺異形成との側面から検討した。対象は呼吸窮迫症候群に気管支肺異形成が続発した群と非発症群の2群で、末梢好酸球数、好酸球核数、血清好酸球カチオン蛋白、気管分泌物の好中球エラスターゼについて比較した。気管支肺異形成群では、これらの測定結果が有意に高く、肺組織では好酸球由来の主要塩基性蛋白が証明された。

この結果から、気管支肺異形成発症の未熟児では末梢好酸球が活性化された状態にあり、この程度は肺疾患の重症度と関連していると考えた。アレルギー疾患の好酸球の役割を解明する上で有力な情報を提供するものである。(2)アトピー性皮膚炎(AD)患児の好中球機能1歳以下のAD患児の末梢好中球の黄色ブドウ球貧食能は低く、このことがAD児の皮膚にみられる本菌の持続感染・浸潤性皮膚病変の成立に大きく関与しているのもと考えられる。逆に2歳以上の乾燥性皮膚病変を持つ児では過酸化水素産生能が亢進状態にあり、好中球はプライミングされた状態にあると推定された。AD児の皮膚病変の管理に超酸性水が有効な症例で好中球機能との関連性を検討中である。
染色体工学を応用した次世代型遺伝子改変マウス作製技術の開発

複数の遺伝子を導入できるMultiple Gatewayシステムを搭載した人工染色体ベクターと、効率的な子孫伝達が可能な遺伝子改変マウス作製法を併用することで、遺伝子挿入部位の位置効果による発現消失や宿主側の染色体上の遺伝子破壊をなくした上、サイズに関係なく複数の遺伝子・ゲノムを導入でき、効率的に子孫伝達するといった利点を備えたトランスクロモソミックマウスを作製することを目的に研究を進めている。本年度は、Multiple Gateway人工染色体ベクターへの効率的な遺伝子導入条件の確立と、そのベクターを用いた遺伝子導入細胞の作製について以下のように検討を行った。組換え酵素であるintegrase発現下で、外来遺伝子をMultiple Gateway人工染色体ベクター上に搭載するための至適導入条件を検討した。その結果、ほとんどの条件でintegraseによる組換え効率は、広く使用されているCre、FLPeと比較して高かったことから、integraseは遺伝子導入に適していると考えられた。また、Multiple Gateway人工染色体ベクター上にEGFP遺伝子を導入して得られたコロニーでは、均質な発現を示すコロニーが多かった。これは、Multiple Gateway人工染色体ベクター上の決まった箇所に遺伝子が導入され、挿入部位の位置効果を受けにくいためではないかと考えられる。また、Multiple Gateway人工染色体ベクターがマウスA9細胞に移入でき、A9細胞においてもintegraseが機能したことは、様々な細胞でこのsystemが使用できる可能性を示唆している。こうして定めた条件をもとに、昨年度作製したNanog RFP IRES Neo BACのMultiple Gateway人工染色体ベクター上への搭載を試みている。本年度の目的の一つであった、Multiple Gateway人工染色体ベクターへの効率的な遺伝子導入条件の確立と、そのベクターを用いた遺伝子導入細胞の特性の検証を完了し、筆頭著者として2報の論文を投稿でき、本年度の研究実施計画を概ね達成できた。本年度は、マウスES細胞の未分化状態を容易に維持できるMultiple Gateway人工染色体ベクターの構築を目指し、以下の研究を実施した。(2)Nanogゲノムを含むBACにRFP IRES NeoをBAC改変技術により導入し、未分化状態を容易に維持できるBACコンストラクトを作製した。(3)組み換え酵素であるIntegrase発現下で、外来遺伝子をMultiple Gateway人工染色体ベクター上に搭載するための至適導入条件を検討した。(4)その条件のもと、作製したNanog RFP IRES NeoBACのMultiple Gateway人工染色体ベクター上への搭載を試みている。本年度の目的であった、未分化状態を容易に維持できるコンストラクトを作製することができ、本年度の研究実施計画を概ね達成できた。次年度は、微小核細胞融合法により、構築したMultiple Gateway人工染色体ベクターをC57/B6由来のマウスES細胞に導入してクローンを取得し、薬剤選択により未分化状態を容易に維持できるかと、個体作製が可能であるかを検証する。
デジタル時代に求められる映像人類学－新たな映像民族誌の創造に向けて

本年度はインドネシア、バリ島、ギャニャール県の調査村を3度訪れ(6月、10月、12月)、フィールドワークと民族誌映像作品の撮影を行った。バリ人の社会は、宗教、芸術、慣習を規範に成立しているといわれるが、これらの要素がいかに相互に関わり合うことによりバリの社会を形成し、活性化しているのか。この問いを民族誌映像の制作を通して明らかにするのが本研究のテーマとなっている。そこで、伝統芸能の伝承者でもある調査村の長老にご協力いただき、長老の視点から、老人の生活世界を通してこれらの要素をとらえた民族誌映像作品を制作している。6月の訪問時には、調査村の村立記念に基づく宗教儀礼の調査を行った。宗教儀礼のなかで長老はバリの伝統芸能である影絵人形芝居ワヤン・クリを演じた。バリ人の社会においてワヤン・クリは娯楽であると同時に、バリ人の宗教であるバリ・ヒンドゥーと関係の深い芸術として宗教儀礼のなかで儀礼的上演が行われる。これは神に対する奉納上演であり、村のなかで最も芸術的素養と経験を持つ人物が演じるのが通例である。10月の訪問時には、長老の生活世界について日常生活に着目して撮影を行った。生活空間、時間、家族、地域社会、人付き合い、仕事、自然・動物との関わり、風景等について調査と撮影を行った。12月の訪問時には、それまでに撮影・編集した映像を調査地の人々と視聴し、その内容について話し合った。編集により正しく内容が伝わっているか、足りない映像は何か、映像から新たにどのような問題発見につながるのか等について、有意義な話し合いを持つことができた。次年度は研究成果をとりまとめ学術論文と映像作品を完成する予定である。インドネシア、バリ島、ギャニャール県の調査村を訪れ、宗教儀礼と芸術の関わりをテーマにフィールドワークを継続している。具体的には、調査村における芸術の伝承を担う長老の生活世界に着目し、日常生活、宗教儀礼、そのなかでバリ人の生き方の規範となっている宗教、芸術、慣習がいかに相互に作用し、バリ文化を形成し、活性化しているのかを考察する映像による民族誌を制作している。当初のスケジュールより多少の遅れはあるが、想定の範囲内であり、スケジュール以外の点においては順調に進んでいる。本年度はこれまでのフィールドワークで得たデータを精査して研究の成果をまとめる。学術論文と民族誌映像作品を作成する予定である。作成に際しては、その内容について調査村の調査協力者ともしっかり議論することにより、学術と研究倫理の両方の点において精度を高めていきたい。本研究の目的は、研究代表者自ら映像民族誌を創造することにより、映像民族誌の創り方、それを研究・教育に活用することができる創造的な実践モデルを構築することにある。映像民族誌の撮影は研究代表者のフィールドであるインドネシアで次年度から行う予定であり、本年度はそれに向けての予備調査、及び、関連する研究機関を訪問して基礎資料の収集を行った。次にその詳細について述べる。(1)インドネシアにおける予備調査映像民族誌の撮影地であるインドネシア、バリ島内陸部ギャニャール県の農村を訪問し、撮影対象や撮影協力体制、スケジュールについて話し合った。撮影に協力していただくことになったのは、これまで研究代表者の現地協力者として調査を支援していただいてきた村長のクトゥ・アルダナ氏とご家族、村人の方々である。(2)欧州におけるインドネシア民族資料の収集インドネシア民族資料に関して世界最大規模のコレクションを有するオランダの熱帯博物館(アムステルダム)、国立民族学博物館(ライデン)を訪問し、インドネシア文化に関する博物館展示、映像・文献資料に関して調査を行った。初年度の研究目標である(1)映像民族誌の撮影に向けてのインドネシアでの予備調査と(2)欧州の教育・研究機関におけるインドネシア民族資料の調査(資料収集と撮影)は、概ね達成することができた。予備調査で得られた成果とそこから明らかになる課題についてはより慎重に精査する必要があり、収集した民族資料に関しても読み込みにはまだ時間を要する。そのうえで、次年度も研究計画に基づいて調査を展開していくことにより、新規性と実証性を併せもつ研究を着実に実現していきたい。初年度は、欧州の大学にも訪問し、映像人類学教育について教員や学生と意見交換することも視野に入れて準備を進めていたが、双方のスケジュールが合わず、まだ実現できていない。研究期間中に実現できるように調整を進める。本年度は、インドネシア、バリ島内陸部ギャニャール県の調査村を再訪し、伝統芸能に関するフィールドワークを継続的に行った。具体的には、バリの文化を代表する芸能でありユネスコ世界無形文化遺産にも指定されている影絵人形芝居ワヤン・クリの名人、そして、バリの芸能で使用される様々な仮面を彫る職人、この二人の伝統芸能の継承者が生きる生活世界、継承する技術とその社会的文脈について文化人類学調査を進めた。そして、以上のテーマを総合的にとらえた映像民族誌の撮影に着手した。本年度の研究目標である(1)前年度の予備調査で得たデータの整理と解釈、及び(2)それにより得た知見をもとに調査地を再訪し、映像民族誌の撮影を開始する作業は、概ね達成することができた。撮影を進めるなかで新たな知見や課題を得ることも多く、その都度、撮影対象や撮影の進め方について再検討するなかで作業を進めている。そのため当初の計画よりも多少時間を要しているが、それにより研究に厚みが加わることになった。次年度も研究計画に基づいて調査を継続していくことにより、新規性と実証性を併せもつ研究を着実に実現していきたい。

本年度はインドネシア、バリ島、ギャニャール県の調査村を3度訪れ(6月、10月、12月)、フィールドワークと民族誌映像作品の撮影を行った。バリ人の社会は、宗教、芸術、慣習を規範に成立しているといわれるが、これらの要素がいかに相互に関わり合うことによりバリの社会を形成し、活性化しているのか。この問いを民族誌映像の制作を通して明らかにするのが本研究のテーマとなっている。そこで、伝統芸能の伝承者でもある調査村の長老にご協力いただき、長老の視点から、老人の生活世界を通してこれらの要素をとらえた民族誌映像作品を制作している。6月の訪問時には、調査村の村立記念に基づく宗教儀礼の調査を行った。宗教儀礼のなかで長老はバリの伝統芸能である影絵人形芝居ワヤン・クリを演じた。バリ人の社会においてワヤン・クリは娯楽であると同時に、バリ人の宗教であるバリ・ヒンドゥーと関係の深い芸術として宗教儀礼のなかで儀礼的上演が行われる。これは神に対する奉納上演であり、村のなかで最も芸術的素養と経験を持つ人物が演じるのが通例である。10月の訪問時には、長老の生活世界について日常生活に着目して撮影を行った。生活空間、時間、家族、地域社会、人付き合い、仕事、自然・動物との関わり、風景等について調査と撮影を行った。12月の訪問時には、それまでに撮影・編集した映像を調査地の人々と視聴し、その内容について話し合った。編集により正しく内容が伝わっているか、足りない映像は何か、映像から新たにどのような問題発見につながるのか等について、有意義な話し合いを持つことができた。次年度は研究成果をとりまとめ学術論文と映像作品を完成する予定である。インドネシア、バリ島、ギャニャール県の調査村を訪れ、宗教儀礼と芸術の関わりをテーマにフィールドワークを継続している。具体的には、調査村における芸術の伝承を担う長老の生活世界に着目し、日常生活、宗教儀礼、そのなかでバリ人の生き方の規範となっている宗教、芸術、慣習がいかに相互に作用し、バリ文化を形成し、活性化しているのかを考察する映像による民族誌を制作している。当初のスケジュールより多少の遅れはあるが、想定の範囲内であり、スケジュール以外の点においては順調に進んでいる。本研究の中心にあるのは、研究代表者自ら映像民族誌を製作することを通して、デジタル時代に求められる映像人類学とは何かを、製作から公開、アーカイブズをも含む技術的な問題、文化人類学の研究と教育に映像を活用する手法、映像倫理まで、多角的に考察し、その理論的基礎を実践モデルとして築くことにある。次年度から映像民族誌の製作を開始する予定である。様々なことに配慮して製作を進めると同時に、そのプロセスを記録し、着実に研究を実現していきたい。前年度も書いているように、本研究が取り組むのは、研究代表者自ら映像民族誌を製作し、製作、保存、文化人類学の研究と教育における活用、そして、映像活用の倫理的課題に至るまで、多角的に考察することにより、デジタル時代に求められる映像人類学とは何か、その理論的基礎を築くことにある。次年度もフィールドワークに基づく映像民族誌の製作を継続する。
高速一方向溶融凝固法による超高温耐熱強度材ファイバーの開発〜ミクロ構造の制御〜

本研究は、セラミック複合材料であるY_3Al_5O_<12>(YAG)/Al_2O_3(sapphire)共晶体、GdAlO_3(GAP)/sapphire共晶体の組織および構造をサブミクロンからナノスケールで制御することによって得られる耐熱強度特性に着目した材料開発研究に形状のミクロンスケール制御(ファイバー化)という概念を取り入れた研究である。特に1700°C以上の超高温大気中で安定に使用できる耐熱強化繊維を目指し、その微細構造の制御、ファイバー径の制御法の確立、高品質・安定成長条件、結晶の均質性・完全性、高温強度特性等について基礎から応用まで幅広く研究を行った。特に以下のような結果が得られた。1.微細組織の制御:共晶体を構成するYAGとsapphireまたはGAPとsapphireの微細組織を透過型電子顕微鏡の電子線回折像を利用して詳細に観察し、それら微細組織の方位関係を明らかにした。これは今後の共晶体成長メカニズム解明の鍵となるものである。2.ファイバー径の制御:ファイバー作成時にはるつぼ先端にメニスカスを保持するが、このるつぼ先端の形状とファイバーの径の間に強い相関関係が存在するのをすでに見出しており、この解析結果を応用し、150μmφまでの細径化を実現した。3.高温強度特性:引っ張り強度を室温(大気中)および1500°C(アルゴン中)において評価した結果、熱膨張率等の基礎物性値が明らかになった。引っ張り強度は、これまでに、室温(大気中)で927.3MPa、1500°C(アルゴン中)で576.5MPaという値が得られている。報告者等は1700°C以上の超高温大気中で安定に使用できる耐熱強化繊維として酸化物共晶体に注目し、YAG/sapphire共晶体GAP/sapphire共晶体を基調に、微細組織の制御、ファイバー径制御法の確率、高品質・安定成長条件、結晶の均質性・完全性、高温強度特性等に関して基礎から応用まで幅広く研究を行った。具体的には1.微細組織の制御:共晶体を構成するYAGとsapphireもしくはGAPとsapphireの微細組織を走査型電子顕微鏡の反射電子像を利用して観察し、ラメラの幅をコントロールするのに必要なパラメータを検討した結果、ラメラ幅と作成速度の逆数の1/2乗の間に比例関係が存在するのを見出した。すなわち、微細組織は作成速度により制御可能であることを見出した。2.ファイバー径の制御:ファイバー作成時には坩堝の先端にメニスカスを保持するが、こC坩堝先端の形状とファイバーの径の間に強い相関関係が存在するのを見出した。この解析結果を応用し、更なる細径化を試み成功した。3.高温強度特性:引っ張り強度を室温(空気中)および1700°C(Ar中)において評価した結果、室温(空気中)で927.3MPa、1700°C(Ar中)576.5MPaを得た。特に、1700°Cにおける引っ張り強度の値は従来のこの系の最高強度の4倍以上の強度であり、1999年3月現在において世界最高記録である。といった結果を得た。本研究は、セラミック複合材料であるY_3Al_5O_<12>(YAG)/Al_2O_3(sapphire)共晶体、GdAlO_3(GAP)/sapphire共晶体の組織および構造をサブミクロンからナノスケールで制御することによって得られる耐熱強度特性に着目した材料開発研究に形状のミクロンスケール制御(ファイバー化)という概念を取り入れた研究てある。特に1700°C以上の超高温大気中で安定に使用できる耐熱強化

繊維を目指し、その微細構造の制御、ファイバー径の制御法の確立、高品質・安定成長条件、結晶の均質性・完全性、高温強度特性等について基礎から応用まで幅広く研究を行った。特に以下のような結果が得られた。1.微細組織の制御:共晶体を構成するYAGとsapphireまたはGAPとsapphireの微細組織を透過型電子顕微鏡の電子線回折像を利用して詳細に観察し、それら微細組織の方位関係を明らかにした。これは今後の共晶体成長メカニズム解明の鍵となるものである。2.ファイバー径の制御:ファイバー作成時にはるつぼ先端にメニスカスを保持するが、このるつぼ先端の形状とファイバーの径の間に強い相関関係が存在するのをすでに見出しており、この解析結果を応用し、150μmφまでの細径化を実現した。3.高温強度特性:引っ張り強度を室温(大気中)および1500°C(アルゴン中)において評価した結果、熱膨張率等の基礎物性値が明らかになった。引っ張り強度は、これまでに、室温(大気中)で927.3MPa、1500°C(アルゴン中)で576.5MPaという値が得られている。
ニッケル含有補欠分子族F430の生合成酵素の触媒機構解明

ニッケルは、通常生物にとっては毒ですが、一部の生物は「F430」と呼ばれる補因子の形で、細胞内でのエネルギー獲得に積極的に利用しています。そこで、F430の生合成酵素に注目し、その酵素が細胞内にごく微量しか存在しないニッケルを巧みに利用する仕組みを解明するともに、細胞内でその酵素を遺伝子工学的に作り変えることで、F430をベースとした新たなニッケル化合物を産生し、その酵素触媒としての利用可能性を示します。
不完全競争下での市場開放政策の多様化と税制改革を含む公共・産業政策の理論的研究

平成30年度は研究期間の最終年度であるため、研究計画の研究テーマをを完遂すべく、研究課題「不完全競争下での四條開放政策の多様化と税制改革を含む公共・産業政策の理論的研究」の下で、研究計画に従って残されたテーマの研究を進めた。本年度では、国内の寡占企業が、海外の企業から生産に投入する中間財を輸入し、最終消費財を生産し国内市場に供給する垂直貿易モデルについて分析を行った。政府は輸入中間財に関税を課しており、また寡占企業には利潤税を課している。そして、貿易の自由化政策により、関税を引き下げた場合に、政府の税収入を引き下げることなく一定に保つ条件の下で、利潤税の引き上げを行う政策の厚生効果を理論的に分析した。この場合、中間財を供給する海外企業が、競争市場の企業である場合と、海外独占企業である場合の二つのケースを分析した。後者の中間財が海外独占企業により供給される場合は、前者のケースより分析が複雑になるが、いずれの場合にも、厚生効果は、関税引き下げ前の初期の関税水準と関税の引下げ幅の大きさに依存して、この貿易自由化と国内利潤税の改革の厚生効果が異なることが明らかとなった。そして、本研究では、上記二つのケースについて、厚生効果を決める関税の初期水準と関税の下げ幅の二つの閾値を明らかにした。また、外国企業が国内市場に参入する際の合弁企業(Joint venture)を設立する際のパートナー選択と外国企業の出資比率規制の理論的研究についても、ほぼ研究を終えることが出来た。現在、多くの国は多様な形での市場開放政策を進めている。貿易自由化に伴う市場構造の変化などが問題となり、国内税制改革も重要な課題となっており、その理論的研究は重要な政策的意義を持つ。本研究課題では、貿易自由化とリンクした国内税制改革、外国企業への政策について理論的に分析する。本年度は研究計画に従って国際寡占市場を対象として、関税の引き下げと国内販売税の改革の厚生分析を行い、以下の成果を得ることが出来た。1.では、寡占企業が国内市場で競争するモデルで、関税の引き下げと連動して販売税を変化させるときの国内厚生に与える効果を最適関税と最適販売税との関係で分析した。2.では国内企業、FDIにより国内で生産する外国企業、海外の輸出企業の3つのグループを導入し、政府が初期の関税レベルから関税をゼロにする際の販売税改革の方向と厚生の変化を分析した。平成27年度は、国際寡占市場のもとでの貿易の自由化とそれに伴う国内販売税の改革についての理論的研究において、当初の研究目的、研究計画に沿った研究結果を得ることが出来た。またそれに加えて、研究課題のひとつのてーまである、国際合弁企業(international joint venture)におけるパートナーの内生的選択行動と技術移転行動の理論的分析を行っており、おおむね良好な結論を得られ手織り、今年度中には結論をまとめられる予定である。さらに、当該国が外国の寡占企業から中間財を輸入して、最終財を生産する国際寡占市場での、最終財と中間財に対する政府の関税の自由化と消費税の改革についての分析も進めている。また、現在、国内の寡占市場で差別化された財を供給する寡占企業が、生産に必要な中間財を海外の独占企業から輸入する垂直貿易モデルで、政府が中間財に対する関税と、国内企業へ利潤税をかしている状況で、政府の関税引き下げと利潤税の引き上げによる厚生効果を、国内企業がCournot競争とBertrand競争を行う2ケースに分けて比較分析を行い、興味深い結論を得ている。また、国内の寡占市場で差別化された財を供給する寡占企業が、生産に必要な中間財[あるいは原料]を海外の独占企業から輸入する垂直貿易モデルでの、関税の引き下げによる貿易自由化とそれに伴う企業の利潤税および消費税の改革についての分析も、井口達也氏との共同研究で興味深い結論を得ており、海外のjournalに投稿する予定である。

研究課題の中の、不完全競争下での貿易の自由化と国内税制改革の理論的分析については、一定の成果を得られており、今年度は国内外のコンファレンス等で報告して、コメントをもらい、さらに質的に向上させて、海外の査読つき雑誌に投稿する計画である。また国際合弁企業の分析についても、年度内に論文を完成させて、学会あるいはコンファレンス等で報告する予定である。その後本論文も査読つき専門誌に投稿する計画である。また、政府収入がインフラストラクチュアや公共財の供給に支出される場合について、貿易の自由化および国内税制改革のあり方について分析を進めてゆく予定にしている。平成29年度は、今研究期間の最後の年になるため、これまでの研究成果を詳細に点検すると共に、申請した研究課題の計画に沿って、すべての研究課題を遂行する方針である。より具体的には, (i)Joint ventureの"Partner choice, endogenous technology transferand spillovereffects of international joint venture,"についての分析をさらに進めて、論文を完成し、国内外でのセミナー、コンファレンス等で報告し、修正の後海外の雑誌へ投稿等を行う。(ii)国際寡占市場で、最終消費財のみならず輸入中間財の貿易を含む貿易下での、関税引き下げおよび国内税改革の理論的分析をさらに進めて完成する。本論文も、現在一定の結論を得ているがさらに分析を発展させて論文にまとめて、セミナー等での報告を行い、その後投稿する計画である。これらと並行して、(iii)関税収入や消費税収入が公共財の支出に使われる場合の、貿易の自由化と国内税制改革の影響についての理論的分析をさらに進めてゆく。以上、申請研究課題の遂行するために研究を推進してゆく方針である。国際寡占市場を含む垂直貿易モデルでの、関税引き下げと国内税制度の改革の分析をさらにモデルを拡張できればと考えている。いくつかの拡張の方向を検討中である。また、これまでの研究では、政府の関税あるいは消費税収入などが消費者等に暗黙的に再分配されることを仮定していたが、政府が収入を公共財の供給に使用する場合の関税引き下げ及び国内税制改革の効果について分析を行う予定である。研究課題遂行にかかわるテーマの、ワークショップに出席するための費用に使用する予定の額であったが、開催時期が年度末であり、本務校のどうしても欠席できない会議と日程が重なり、ワークショップに出席できなかった。2017年9月に老齢の父親が逝去し、それに伴ういくつかの法事、手続き・整理及び老齢の母親の生活および身体介護のために、実家と自宅を頻繁に往復した。その為に、予定していた国内外の学会、コンファレンスなどに出席できず、予定していた助成金の執行計画を変更せざるを得なくなった。今年度予定している、国内学会、ワークショップ、国際コンファレンスの出席等で執行する予定である。翌年度に用いる予定の研究旅費に追加して、出席あるいは報告する国内外のセミナー、学会、コンファレンスの出席費用に充当する計画である。
キラルイミドを用いる高立体選択的アルドール型反応の改善・展開と応用

キラルイミドを不斉補助基として用いるジアステレオ選択的反応は、複雑な骨格を有する標的分子の不斉合成において重要な手段として国内外で活用されている。本研究では本申請者がこれまでに開発した二種類のアルドール型反応に関し、(1)ビニロガス向山アルドール反応の改善、(2)不斉3級アルコールを含む1,2-ジオールの立体選択的合成法については、基質一般性の検討、(3)これらの方法論を活用した生物活性天然物の不斉合成への応用を行った。キラルイミドを不斉補助基として用いるジアステレオ選択的反応は、操作性、反応スケールなどの観点から複雑な骨格を有する標的分子の不斉合成において重要な手段として国内外で活用されている。本研究では本申請者がこれまでに開発した二種類のアルドール型反応に関し、(1)ビニロガス向山アルドール反応については、従来とは逆の選択性を発現させるsyn-選択的反応の開発と、α,β-不飽和アルデヒドを基質としたときの反応性の改善、(2)1,2-ジオールの立体選択的合成法については、種々のアルデヒドを用い、基質一般性の検討を行うことを目的とし検討を行い、以下の成果を挙げることができた。ビニロガス向山アルドール反応を、トルエン中で水を少量加えることにより、不飽和アルデヒドでも収率よく、再現性良く行えることを見出し、フォミテリン酸Bの全合成を達成した。一方、TMC-151Cに関しては、ビニロガス向山アルドール反応により左側、右側フラグメントを立体選択的に合成した。さらに、これらを結合するにあたって、極めて稀なE-オレフィンを選択的に与える閉環メタセシスを見出すことにより、全合成を達成することができた。また、α-ハロエナールを用いると一般のアルデヒドと同様に収率よく付加体を得ることができ、さらにPdを用いる種々のカップリング反応を適用することにより、ハロゲン原子を様々な置換基に変換できることを明らかにした。一方、1,2-ジオールの立体選択的合成法の応用として、インセンソールアセテート、ナフレジン-γの合成研究を行い、このうち、ナフレジン-γの全合成を達成することができた。本研究では本申請者がこれまでに開発した二種類のアルドール型反応に関し、(1)ビニロガス向山アルドール反応については、従来とは逆の選択性を発現させるsyn-選択的反応の開発と、α,β-不飽和アルデヒドを基質としたときの反応性の改善、(2)不斉3級アルコールを含む1,2-ジオールの立体選択的合成法については基質一般性の検討、(3)これらの方法論を活用した生物活性天然物の不斉合成への応用について検討し、以下の成果を挙げることができた。ビニロガス向山アルドール反応におけるsyn-選択的方法論の開発に関しては、ルイス酸、反応剤の添加順序などを変えて検討しているが、現時点では具体的な成果は得られていない。水を少量添加することによるビニロガス向山アルドール反応の加速効果は不飽和アルデヒドにおいて常に観察されることが多くの基質での検討の結果明らかとなった。syn-選択的反応の開発に関しては最終年度の課題と考え、両方法論の改善に目処が立ったので、本年度は天然物合成への応用について主として検討を加えた。本年度は昨年度に引き続き、インセンソールアセテート、マイクサラミドA、メチノリドの合成について検討した。インセンソールアセテートに関しては、ファルネソール由来のアルデヒドとのアルドール反応により、不斉3級水酸基を含む1,2-ジオール部分の構築に成功した。マイクサラミドAに関しては、ビニロガス向山アルドール反応を活用し、またヨウ化ビニルボロナイトをC2ユニットとするワンポットStille-Suzukiカップリングにより極めて効率的、かつ保護基フリーの全合成を達成した。一方、メチノリドの合成に関しては、両方法論により不斉点の制御は既に解決しており、より効率的なアプローチについて現在検討を続けているところである。本研究では本申請者がこれまでに開発した二種類のアルドール型反応に関し、(1)ビニロガス向山アルドール反応については、β-シロキシ基を有する基質での反応性の確認、(2)不斉3級アルコールを含む1,2-ジオールの立体選択的合成法については基質一般性の検討、(3)これらの方法論を活用した生物活性天然物の不斉合成への応用について検討し、マイクサラミドA、インセンソールアセテート、メチノリドの合成において以下の成果を挙げることができた。ビニロガス向山アルドール反応において、α-シロキシ基を有する基質では生成物の立体選択性が逆転し、syn体が得られることが分かっている。そこで種々のβ-シロキシ基を有する基質を用いて、反応の検討を行った。

その結果、TBDMSO基では選択性が発現せずsyn体とanti体が同程度得られたが、TBDPSO基の場合では、従来通りの高選択性でanti体を得ることに成功した。マイクサラミドAに関しては、ビニロガス向山アルドール反応を活用し、またヨウ化ビニルボロナイトをC2ユニットとするワンポットStille-Suzukiカップリングにより極めて効率的、かつ保護基フリーの全合成を達成した。インセンソールアセテートに関しては、ファルネソール由来のアルデヒドとのアルドール反応により、不斉3級水酸基を含む1,2-ジオール部分の構築に成功した。さらにリレー閉環メタセシスにより13員環エーテル構造の構築にも成功した。一方、メチノリドの合成に関しては、両方法論によりC1-C8フラグメントおよびC9-C13フラグメントの合成に成功し、両者を結合することで全合成を達成した。syn-選択的ビニロガス向山アルドール反応の開発に関しては、未解決となっているが、両方法論を用いる生物活性天然物の全合成においては成果を挙げることができた。特に、マイクサラミドAの全合成は極めて効率的なものとなっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。生物活性天然物の全合成に関しては、インセンソールアセテート、メチノリドの全合成を平成24年度(最終年度)に達成する。syn-選択的ビニロガス向山アルドール反応に関しては、マイクロリアクターなども活用することにより解決できるものと考えている。
PCNAサイクルと連動したタンパク質分解による複製制御

CRL4-Cdt2はユビキチン化酵素で、DNA複製のライセンス化因子Cdt1の分解により再複製を抑制する。本研究では、S期が開始するとCRL4-Cdt2がCdt2のC末を介してPCNAと結合して素早い分解に関わることを示した。精製Cdt2はPCNAと直接結合した。一方、サイクリン-CDKはCdt2をリン酸化し、PCNAとの結合を抑制する結果を得た。よって、CRL4-Cdt2の活性は細胞周期の進行に応じて制御されている。また、紫外線照射後のCdt1分解には、ヌクレオチド除去修復に加えてミスマッチ修復系も関わり、損傷修復を円滑に行うために必要であると考えられる。遺伝情報を正しく受け継ぐため、染色体の複製は細胞周期に一度だけ正確に行なわれる。CRL4-Cdt2によるユビキチン化を介した分解系は、クロマチン上に装着(ロード)されたPCNAに依存して、ライセンス化因子Cdt1をはじめとする特定の因子をS期に(およびDNA損傷後においても)迅速に選別的に分解する。その機構の解明のため研究を行った。1、ヒトCdt2は酵母Cdt2に比べて300アミノ酸におよぶ長いC末領域を有す。ヒトCdt2を、酵母Cdt2に対応するN末とC末の2つに分けて解析するため細胞内で発現する安定株を得た。N末だけでは、PCNA fociへのリクルートが低下していた。一方、C末はリクルートが見られた。C末領域の末端に見いだしたPCNA結合配列(PIP-ボックスという)に変異を入れるとPCNAへのリクルートが低下したので、この配列が複製部位への集積に重要であると考えた。しかし、C末は、本体のCRL4の構成要旨DDB1との結合が無く、ユビキチン化活性を有していなかった。また、Cdt2はS期でおいて高度にリン酸化される。これは、主にC末で起こることが、バンドシフトより認められた。2、PCNAがDNA上にロードされた時のみCRL4-Cdt2が作動することを解析するため、in vitroでの解析を進めた。ssDNAにビオチン化したオリゴDNAを結合させたものを基に、DNAビーズを作成した。ニックを導入してPCNAローディング部位を作成し、精製したPCNAとRFC1-RFCを用いて、PCNAのローディング系の確立に成功した。ここに精製した基質Cdt1タンパク質を加えてプルダウン後、Cdt1が、一緒に共沈することを確かめた。PCNAが無いときは、結合は見られなかった。CRL4-Cdt2でも同様の結果が得られた。細胞増殖において、次世代の細胞へ遺伝情報を正しく継承するため、染色体の複製は細胞周期に一度だけ正確に行なわれるように制御されている。CRL4-Cdt2によるユビキチン化を介した分解系は、クロマチン上に装着(ロード)されたPCNAに依存して、複製開始に必須なライセンス化因子Cdt1をはじめとする特定の因子をS期に(およびDNA損傷後においても)迅速に選別的に分解する。その機構を分子レベルで解明するため研究を行った。1.精製タンパク質を用いたin vitroでの解析.ニックが1カ所入った環状DNAを結合したビーズに、精製したPCNAおよびローダータンパク質RFC1-RFCを用いて、このDNA上にPCNAをロードする系を確立したので、Cdt1およびCRL4-Cdt2の結合について検討した。両者ともDNAのみとも弱い結合が見られたが、PCNAがロードされていると,さらに結合量が増加した。CRL4-Cdt2は,PCNAに結合したCdt1を捉えてDNA上に結合してくると予想されたが、Cdt1なしでもPCNAに結合することが分かった。この結合には、in vivoの解析から得られていたようにCdt2のPIPーボックスが直接重要な働きをすることが分かってきた。2. Cdt2のドメイン解析_C末側の機能解析酵母Cdt2と比較するとヒトCdt2は長いC末領域を持ち、そのC末端にPIPボックス配列がある。Cdt2(PIP)変異を発現する安定発現株を作成した。CRL4-Cdt2(PIP)が核内PCNA部位へのリクルートが低下することを確かめた。さらに内在性Cdt2をノックダウンして、CRL4-Cdt2(PIP)のCdt1ポリユビキチン化活性を調べると低下しており、N末だけを持つCdt2と比較しても、かなり低下することが分かった。精製タンパク質を用いたin vitroの解析により、CRL4-Cdt2は、基質なしでもDNAにロードされたPCNAに結合するという予期していなかった結果を得た。そして、基質認識に関わると予想されるWT40リピートを含むN末だけでは、ユビキチン化能力を発揮出来ないことから、C末、特にPIPボックスのユビキチン化促進における重要性をより明確に証明できつつある。また、C末側に存在するプロテインキナーゼCDKのリン酸化配列をアラニンに変異したCdt2を作成し,安定発現株を作成したところ,S期およびM期で見られるCdt2のリン酸化がほぼ起こらなくなることを見いだしている。その他、ライブイメージングを行なうための蛍光タンパク質融合PCNAプラスミドの発現も見ており、次年度の研究を進める準備も行なっている。よって、研究は、おおむね順調ん進行していると判断される。細胞が分裂増殖するとき、次世代の細胞に遺伝情報が正しく継承されなければならない。そのため染色体の複製は細胞周期に一度だけ正確に行なわれる。

CRL4-Cdt2によるユビキチン化を介した分解系は、S期が開始するとクロマチンにロードされたPCNAに依存して、複製開始因子Cdt1を素早く分解する。また、UVなどによるDNA損傷時にも同様のシステムが機能する。これらの分子機構を明らかにするため研究を行なった。1.Cdt2のC末端にPCNA結合モチーフ(PIPボックス)が存在する。PIPボックス変異Cdt2(Cdt2-PIP)発現細胞では、内在性Cdt2をノックダウンすると、S期およびUV照射後のCdt1分解が低下することをウエスタン法および免疫染色法で確かめた。S期の分解が不十分なため、Cdt2-PIP発現細胞では、G2期細胞の増加がみられた。2.精製タンパク質を用いたin vitro系での実験を進め、PIPボックスを持たないとCdt2は、Cdt1存在下でもDNAにロードしたPCNAとの結合が低いこと、Cdt2はフリーのPCNAとの結合が弱いが、DNAにロードしたPCNAには強く結合することを見いだした。3. Cdt2のCdkリン酸化コンセンサス部位SPあるいはTPのSおよびTをアラニンAに変異させた。S期及びM期でのリン酸化がほぼ抑制され、PCNAとの結合が強くなっていることを見いだした。Cdt1のユビキチン化活性が増強すると予想された。4. UV照射後のCdt1分解にはヌクレオチド除去修復系が関わっている。新たに、ヌクレオチド除去修復系が機能しなくても、ミスマッチ修復タンパク質がUV損傷部位にリクルートされ機能することを見いだした。G1期において、UV照射によるDNA損傷応答にミスマッチ修復系も関わることを発表した。CRL4-Cdt2によるユビキチン化機能において、Cdt2のPIPボックスの重要性を、PIP変異Cdt2を発現する細胞を用いた解析および精製したタンパク質を用いたin vitro系の解析により明らかにできており、ほぼ論文投稿の準備段階に入っている。また、UV照射後のCdt1分解は損傷修復に関わっていると考えられている。Cdt1のPIPデグロンを高発現すると、DNA修復が阻害されること、そして、CRL4-Cdt2によるUV照射後の分解には、ヌクレオチド除去修復と平行してミスマッチ修復系も関わっていることを論文発表した。よって、研究は、おおむね順調に進展していると判断される。生物が生命を維持するためには、細胞が分裂して増殖する過程において、遺伝情報を正しく継承されなければならない。染色体は細胞周期に一度だけ正確に複製される。また、エピジェネティックな情報も維持されなければならない。CRL4-Cdt2によるユビキチン化を介した分解系は、S期が開始するとクロマチンにロードされたPCNAに依存して、複製開始因子Cdt1、ヒストンメチル化酵素Set8、CDKインヒビターp21などを素早く分する。また、UVなどによるDNA損傷時にも同様なシステムが機能する。このような分解の分子機構を明らかにするため研究を行なった。