hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ES細胞未分化性維持におけるポリコーム遺伝子Eedの機能解析

胚性幹細胞(ES細胞)の未分化状態は、転写因子やクロマチン修飾因子に代表される様々な分子によって制御されていることがこれまでに報告されている。ES細胞の未分化性を維持するためにはこれらの分子群が互いにクロストークを行うことによって協調的に未分化状態を制御することが必要であるが、そのようなクロストークの実態は不明のままであった。そこで今年度は、これまでに進めてきたクロマチン修飾因子であるポリコーム分子Eedに関する研究を発展させる目的で、Eedとクロストークを行っている転写因子の探索を行った。その結果、Eedが未分化維持に必須な転写因子であるSox2の発現を間接的にではあるが正に制御していることを見出した。さらに興味深いことに、Sox2もEedのプロモーター領域に直接結合してEedの発現を正に制御することも見出し、この2つの分子がES細胞において正の制御ループを形成していることを明らかにした。このことは、ES細胞が未分化/分化状態を遷移する際に観察される遺伝子発現の変化とクロマチン構造の変化の間の協調性保持にEed/Sox2制御ループが関与している可能性を示唆している。さらに、Sox2がヒストンのアセチル化を促進することによって未分化関連遺伝子の発現を正に制御するのと平行して、EedがヒストンH3のLys-27のメチル化を促進して分化関連遺伝子の発現を抑制することにより、この制御ループがヒストン修飾を介したES細胞の未分化性維持に関与していることも明らかとした。クロマチン修飾因子であるEedと転写因子Sox2の制御ループのES細胞の未分化性維持への関与ES細胞が分化する際、ダイナミックなクロマチン構造の変化に伴い遺伝子発現が劇的に変化する。未分化維持に必要である因子が知られているが、その因子とクロマチン変化との関連はあまり知られていない。今年度の研究により、未分化維持に必須である転写因子Sox2はEedのプロモーター領域に直接結合し制御し、逆にEedが間接的にSox2の発現を制御し、EedとSox2が制御ループを形成していることが明らかになった。さらにその制御ループは転写活性化に関与するヒストンアセチル化を制御し未分化関連遺伝子を正に制御し、また転写不活性化に関与するヒストンH3K27メチル化を制御して分化関連遺伝子を抑制することにより、ES細胞に未分化性維持に関与していることが明らかとなった。このEed-Sox2制御ループが、ES細胞が分化する際の遺伝子発現制御に伴うダイナミックなクロマチン構造の変化を的確に行うのに必要である可能性が示された。
言語の文脈情報処理の研究

本研究の目的は、言語の文脈情報処理に関するものであり、まず、文脈構造の分析・解析とモデル化を行い、その基盤の上に個々の文の意味構造、文章全体の意味構造・談話構造、及び文脈構造と対象世界の一般的知識との関係などを明らかにして、文脈構造とその処理法の計算機モデルを解明し、さらに、これらの基礎の上にたって、特に文脈処理が重要な位置を占める対話システムの研究を行なうものである。得られた成果は次の通りである。(1)(田窪)日本語を対象として、メンタルスペース理論の基本的な考え方をふまえて、言語場制約を複数信念スペースの立場から捉えた。(2)(坂原)発話内容がどのように最終的言語理解に転化されるかを、メンタルスペース理論の立場から考察した。(3)(山田)発話行為を状況意味論の立場から構文や認知と統合して捉え、言語と行為に関する一般理論の枠組を構成した。(4)(金水)日本語の名詞句の指示対象がどのような機構によって形成されるかを、メンタルスペース理論の立場から、明らかにした。(5)(桃内)文章生成過程における意味構造から表層表現への変換過程を文章の結束性の観点から分析的に構成した。(6)(中村、辻井)メンタルスペース理論を形式意味論の枠組により定式化し、解析的・構成論的に解明した。(7)(堂下)文脈構造と知識や推論を一体とした統合的自然言語理解システムを作成し、空間情報の理解に適用した。(8)(田村)構文・意味解析において、文の概念の解釈に独立的な根拠に基づく複数の知識を推論に利用する多重推論を提案した。(9)(中川)構文解析・意味解析・談話解析に超並列的な計算モデルであるコネクショニストモデルの適用を行なった。(10)(米澤)人と機械の自然な対話を信念・意図の相互理解として捉え、オブジェクト指向プログラミング方式で実現した。(11)(安部)文脈理解を機械部品組み立てという専門的タスクに対して具体的に適用し、その過程を計算機でシミュレートした。
細胞内in situ誘導体化による細胞内分子局在解析

細胞内に存在する様々なオルガネラ中の代謝物を正確に分析するために、オルガネラ選択的に取込まれ、オルガネラ内に存在する代謝物の誘導体化をオルガネラ内で行い、誘導体化された代謝物のみを選択的に質量分析する必要がある。ミトコンドリアは生命現象の発現や維持に重要な器官であり、糖代謝やTCAなどの重要な代謝経路が存在し、ミトコンドリアの代謝物局在を正確に分析することは細胞現象メカニズムを解明するうえで重要であることから、本研究ではミトコンドリアをターゲットオルガネラとすることとした。細胞内に存在するミトコンドリア中の代謝物を正確に分析するために、ミトコンドリア選択的に取込まれ、光を照射することによりミトコンドリア内に存在する代謝物を誘導体化することができる、ミトコンドリア局在型光アフィニティープローブを合成した。このプローブがミトコンドリアに移行することを確認するため、HepG2細胞に合成したプローブを投与し、レーザー共焦点顕微鏡により細胞観察を行った。比較のため、市販のミトコンドリア染色試薬であるMitoBright Greenと本合成プローブを同時に投与したところ、どちらの試薬を用いた場合も同一の細胞内部位が染色されたていたことから、本プローブがミトコンドリアへ局在していることが確認できた。次に本合成プローブを投与した細胞に対し光を照射して誘導体化反応を行い、得られた細胞抽出液をLC-MS/MSにより分析を行った結果、光誘導体化された代謝物と思われるピークが検出された。これらの結果より、本合成プローブがミトコンドリア選択的に局在し、ミトコンドリア中の代謝物と光反応することが確認できた。誘導体化効率の向上のためは、より詳細な反応条件などの検討が必要であるが、本方法は細胞内代謝物の局在を調べるうえで非常に有用であると考えられる。本年度の研究では、細胞内に存在するオルガネラなどの微小部位に存在する代謝物を選択的に分析するために、細胞内やオルガネラ内で代謝物を誘導体化させるための誘導体化試薬の開発と、誘導体化した代謝物の分析方法の開発を行った。細胞内のオルガネラなどの微小部位に存在する低分子代謝物を選択的に検出するために、細胞内部に導入し、目的とするオルガネラ以外での誘導体化反応の進行を防ぐため、誘導体化反応のon/offをコントロールすることができる光反応を誘導体化に用いることとした。光反応基については、UVにより反応が進行し、比較的反応収率が良いとされるジアジリンを用いることとし、アミノ酸などのモデル代謝物を用いて反応条件の検討を行った。さらに細胞内代謝物と光反応した誘導体化生成物を選択的に検出するためのLC-MS分析条件の検討を行った。また、質量分析を行う際の大きな問題としてエレクトロスプレーイオン化の際に、夾雑物質によるマトリックス効果によりサンプル間のデータのばらつきが挙げられる。このようなサンプルごとのイオン化のばらつきを一斉に補正するため、安定同位体標識化したクロレラ抽出液を内部標準物質として用い、クロレラ中の安定同位体標識化された代謝物のイオンピークを利用して検出された代謝物を一斉に補正するための方法の開発を行った。その他、代謝物やペプチドのキラル異性化体を分離・検出するための新規方法についても開発し、LC-MSによる代謝物分析の基盤技術の開発を行った。これらの質量分析による代謝物検出における基礎的研究開発に関して論文発表及び学会発表を行った。本研究課題遂行の要となる、細胞内オルガネラなどの標的微小領域に取り込まれ、その中に存在する代謝物と反応することができる、新規誘導体化プローブの開発を行った。誘導体化反応は、細胞内の不特定多数の場所で誘導体化反応を起こさずに、標的部位に到達した後にその中の代謝物とのみ反応を行うため、誘導体化反応のON、OFFをコントロールすることができる光反応を用いることとした。また、細胞内代謝物と光反応プローブが反応するための、光反応試薬の検討をおこなった。その結果、UVにより反応が進行し、比較的反応収率が良かったジアジリンを光反応基として使用することとした。さらに、モデル代謝物としてアミノ酸などを用いて、照射する光の波長や照射時間などの光反応誘導体化条件の検討を行った。さらに光反応により誘導体化した代謝物を質量分析計で検出するためのLC分離条件および質量分析計による検出条件の検討を行った。さらに質量分析計により検出された光反応誘導体化物とされるイオンについてMS/MSによるフラグメント解析を行い、代謝物の同定を行った。また、細胞内へ光反応誘導体化試薬を導入されたことを確認するために蛍光プローブにジアジリン光反応部位を有した試薬の合成を行った。これまでの研究により、実際に細胞内で誘導体化反応するためのプローブ及び反応条件などの検討が終了することができたため、本年度は当初の予定通り、実際の細胞を用いた誘導体化を行うことが可能となった。細胞内に存在する様々なオルガネラ中の代謝物を正確に分析するために、オルガネラ選択的に取込まれ、オルガネラ内に存在する代謝物の誘導体化をオルガネラ内で行い、誘導体化された代謝物のみを選択的に質量分析することができれば、代謝物の細胞内局在情報を得ることができる。前年度までの研究で、細胞内部に移行する際に目的とするオルガネラ以外での誘導体化反応の進行を防ぐため、誘導体化反応のon/offをコントロールすることができる光反応を誘導体化に用いた。

光反応基については、UVに比べて細胞への影響が低いUVAにより反応が進行し、比較的反応収率が良いとされるジアジリンを用いることとした。本年度の研究では、細胞活動の中心的な役割を担っているミトコンドリアに存在する代謝物を分析するために、ミトコンドリア選択的局在誘導体化試薬の合成及びその性能評価を行った。ミトコンドリア認識部位としてローダミンを用い、これに光反応基であるジアジリンを結合したミトコンドリア局在型光反応プローブを合成した。このプローブを培養細胞に投与し、蛍光顕微鏡で観察したところ、プローブが細胞内に移行してミトコンドリア選択的に局在していることが確認できた。また、細胞内の微量代謝物を高感度かつ高精度に質量分析するために、エレクトロスプレーイオン化の際のフラグメント化メカニズムの解明や、夾雑イオンの影響によるイオン化効率のばらつきを網羅的に補正するための方法などの質量分析基盤技術の開発を行い、学会発表および論文発表を行った。前年度に引き続き、細胞内の小器官に存在する代謝物を特異的に誘導体化することができる誘導体試薬の合成を行った。今年度はミトコンドリアに存在する代謝物を検出するために、細胞内のミトコンドリアに選択的に取り込まれ、光を照射することによりミトコンドリア内に存在する代謝物を誘導体化させる、ミトコンドリア局在型光アフィニティープローブを合成した。ミトコンドリアは生命現象の発現や維持に重要な器官であり、糖代謝やTCAなどの重要な代謝経路が存在するほか、脂質などについても他の器官と組成が異なることなども報告されている。そのため、ミトコンドリアの代謝物局在を正確に分析することは細胞現象メカニズムを解明するうえで重要であると考え、本研究のターゲットオルガネラとすることとした。合成した光アフィニティープローブと代謝物との反応については、反応溶液から原料と目的反応生成物を高効率で分けるための分離精製条件の検討に時間を要してしまい、実際の細胞代謝物との光反応について詳細な条件検討が完了していない。また、合成したプローブの投与や光照射に対する細胞への生物学的影響について確認を行う必要がある。細胞内に存在する様々なオルガネラ中の代謝物を正確に分析するために、オルガネラ選択的に取込まれ、オルガネラ内に存在する代謝物の誘導体化をオルガネラ内で行い、誘導体化された代謝物のみを選択的に質量分析する必要がある。ミトコンドリアは生命現象の発現や維持に重要な器官であり、糖代謝やTCAなどの重要な代謝経路が存在し、ミトコンドリアの代謝物局在を正確に分析することは細胞現象メカニズムを解明するうえで重要であることから、本研究ではミトコンドリアをターゲットオルガネラとすることとした。細胞内に存在するミトコンドリア中の代謝物を正確に分析するために、ミトコンドリア選択的に取込まれ、光を照射することによりミトコンドリア内に存在する代謝物を誘導体化することができる、ミトコンドリア局在型光アフィニティープローブを合成した。このプローブがミトコンドリアに移行することを確認するため、HepG2細胞に合成したプローブを投与し、レーザー共焦点顕微鏡により細胞観察を行った。比較のため、市販のミトコンドリア染色試薬であるMitoBright Greenと本合成プローブを同時に投与したところ、どちらの試薬を用いた場合も同一の細胞内部位が染色されたていたことから、本プローブがミトコンドリアへ局在していることが確認できた。
心筋小胞体Ca^<2+>放出チャネルの細胞内環境下での開口制御機構の研究

Yellow Cameleonにチトクロームオキシダーゼのミトコンドリア移行シグナルあるいはカルレティキュリンの小胞体(ER)移行シグナル及び小胞体残留シグナル(KDEL)を付加したcDNAを作製し、これらを改良型アデノウイルスベクターを用いて初代培養心筋細胞及び肝細胞に遺伝子導入し、発現させた。共焦点レーザー顕微鏡を用いてカメレオン由来の蛍光の細胞内分布を調べた。心筋細胞、肝細胞共にYC2.1-mito及びYC3.1-mitoによる蛍光の分布ははテトラメチルローダミンの分布と一致したことから、これらの蛍光プローブが確かにミトコンドリアに分布していることが判明した。YC2.1-ER及びYC3.1-ERに関しては現在その分布を詳細に検討中である。心房心室の収縮時のRYRからのCa放出の誘発へのL型T型両カルシウムチャネルの寄与をラットの単離心筋細胞で調べた。L型を抑制することなくT型を抑制する50マイクロMニッケルイオンと1マイクロMのmibefradilはカルシウムトランジェント初期相に全く影響しなかった。ニカルジピン投与によりカルシウムトランジェントはほぼ完全に消失した。マウス心室筋のα刺激によりSRからのCa放出の指標とされているポストレスト収縮が有意に抑制され、また、SRから放出されたCaをNaCa交換機構が細胞外へ汲み出す際の電流により保持されているマウス活動電位のLatePlateau相が著明に減少したことから、α刺激によりSRから放出されるCa量が減少していることが判明した。まとめ1)アデノウイルスベクターを用いて心筋細胞への遺伝子導入に成功し、タンパク性蛍光プローブYellow Cameleonをミトコンドリア特異的に発現させることに成功した。2)L型カルシウムチャネルはRYRからのCa放出を惹起する。3)T型カルシウムチャネルはRYRからのCa放出を惹起しない。RYRからのCa放出を抑制する。T管のよく発達した心室筋細胞と未発達な心房筋細胞とで正常収縮時のCa^<2+>濃度上昇のパターンを比較した。心室筋細胞を電気刺激すると約4ms後に細胞質全体でほぼ同時にCa^<2+>濃度の上昇が起こった。Ca^<2+>濃度上昇開始後約5msの間上昇の速い部分と遅い部分が見られた。Ca^<2+>濃度上昇の速い部分は細胞の長軸方向に約2μm間隔で規則的に分布しており、x-t表示すると櫛の刃状の画像が得られた。T管の位置と一致していた。一方心房筋細胞では電気刺激後510msecの時点では細胞膜から数ミクロン以内の細胞周辺部でのみCa^<2+>濃度上昇が起こり、それが数十msecかかって細胞深部に拡がるのが観察された。Ca^<2+>濃度上昇が細胞深部に伝わる速度は約100μm/secで、心房筋細胞や心室筋細胞で観察されたCa^<2+>waveの伝搬速度とほぼ同じであった。Ca^<2+>sparkやCa^<2+>waveの性質に心房心室間で違いが見られなかったことから、筋小胞体からのCa^<2+>放出の基本的性質は両部位で同じであると考えられる。T管の未発達な心房筋では細胞膜に接する周辺部の筋小胞体から最初にCa^<2+>放出が起こり、Ca^<2+>waveと同様の機構で細胞深部に伝搬していくと考えられる。タンパク性カルシウム蛍光プローブ"カメレオン"のcDNAを取得し、チトクロームオキシダーゼcDNAの部分配列をもとにミトコンドリア移行シグナルを付加することに成功した。また、カルセクエストリン由来の筋小胞体移行シグナルの付加にも取り組んでいる。カメレオンおよびミトコンドリア移行

シグナルつきカメレオンを培養心筋細胞に強制発現させる方法を検討中である。本年度はリポフェクションを中心に検討したが、発現はみられなかった。以後、トランスフェリン受容体を利用したトランスフェクション法やアデノウイルスを使った方法を検討する予定である。Yellow Cameleonにチトクロームオキシダーゼのミトコンドリア移行シグナルあるいはカルレティキュリンの小胞体(ER)移行シグナル及び小胞体残留シグナル(KDEL)を付加したcDNAを作製し、これらを水口らの開発した改良型アデノウイルスベクターシステムのシャトルベクターに挿入し、ついでウイルスゲノムベクターに挿入した(YC2.1-ER及びYC3.1-ER)。これを大腸菌で増やした後にHEK293細胞に感染させ、YC2.1-mito及びYC3.1-mitoをコードする遺伝子を持つアデノウイルス粒子を産生させた。初代培養心筋細胞及び肝細胞にこれらを感染させ、2日日から3日後に共焦点レーザー顕微鏡を用いてカメレオン由来の蛍光の細胞内分布を調べた。心筋細胞、肝細胞共にYC2.1-mito及びYC3.1-mitoによる蛍光の分布ははテトラメチルローダミンの分布と一致したことから、これらの蛍光プローブが確かにミトコンドリアに分布していることが判明した。YC2.1-ER及びYC3.1-ERに関しては現在その分布を詳細に検討中である。心房心室の収縮時のRYRからのCa放出の誘発へのL型T型両カルシウムチャネルの寄与をラットの単離心筋細胞で調べた。50マイクロMニッケルイオンと1マイクロMのmibefradilが、L型を抑制することなくT型を抑制することをvoltage clampにより確認した。心房筋と心室筋のカルシウムトランジェント初期相を画像化しつつこれらを投与したが、全く変化は見られなかった。L型カルシウムチャネルを抑制する1マイクロMニカルジピン投与によりカルシウムトランジェントはほぼ完全に消失した。マウス心室筋のα刺激によりSRからのCa放出の指標とされているポストレスト収縮が有意に抑制され、また、SRから放出されたCaをNaCa交換機構が細胞外へ汲み出す際の電流により保持されているマウス活動電位のLatePlateau相が著明に減少したことから、α刺激によりSRから放出されるCa量が減少していることが判明した。
画像の記憶容易性を操作可能にする新規パラダイムの開拓

高度な視覚機能を持ち、また視覚文化を発展させてきた人類にとって、画像情報の持つ重要性は大きい。情報の伝達や記録の媒体として人は日々膨大な量の画像情報を日常生活のあらゆる場面で利用している。画像を用いた情報伝達やコミュニケーションが効果的であるには、目にした画像が簡単に忘却されてしまうことなく記憶に強く残ることが重要である。本研究は、写真画像に対して質感やスタイルに変調を加える操作を行うことでその画像の記憶しやすさ(記憶容易性)がどう変化するかを検討した。
次世代型アクティブセンサ搭載衛星の複合解析による雲微物理特性・鉛直流研究

2021年に打ち上げ予定のEarthCARE衛星に搭載される高スペクトル分解ライダATLIDと同じ波長355nmで観測可能な多視野角多重散乱ライダと、波長532nmのスキャン型干渉計を用いた多重散乱高スペクトル分解ライダをそれぞれ完成した。多視野角多重散乱ライダ観測データ解析によって、波長355nmで衛星ライダと同等の光学的に厚い雲のライダ多重散乱信号の初の観測データ取得と、多重散乱型高スペルトル分解ライダによってライダー比の初期観測に成功した。2018年8月に打ち上げに成功した高スペクトル分解機能を持つ波長355nmのドップラーライダを搭載したADM-Aeolus衛星観測と同期したドップラーライダ、多視野角多重散乱ライダ観測をAeolus検証チームとして実施し、風速の鉛直構造や氷雲の後方散乱係数の比較検証の初期解析結果を得て、第1回Aeolous CAL/VALワークショップで発表した。衛星搭載ライダによって観測される光学的に厚い下層雲の微物理特性解析を行う目的で、Vectorized Physical Model(VPM)を開発した。N回散乱による位相行列を解析的に求めることで、初めて衛星搭載偏光ライダ特性をモンテカルロ法と比較して精度を損なわずにはるかに高速に理論計算することが可能になり、雲微物理特性の高精度解析へ道を拓いた。成果はOptics Express誌に掲載され、質的に優れた、当該分野を代表する研究としてEditor's Pickに選出された(Sato et al, 2019)。EarthCARE衛星搭載94GHzドップラー雲レーダによる降雪粒子抽出アルゴリズムの開発と検証用に、94GHz雲レーダ搭載衛星CloudSatと全球降水観測計画(GPM計画)の主衛星に搭載されている二周波降水レーダ(DPR)のDual Frequency Ratio (DFR)のデータと降雪粒子抽出解析を開始した。強い降雪領域で我々のCloudSatの解析結果とGPMの結果は良く対応していたが、NASAのCloudSat標準プロダクトでは強い降雪が抽出されていないという初期結果を得た。多視野角多重散乱偏光ライダ、多重散乱型高スペクトル分解ライダ、ドップラーライダを中心として構成される最先端衛星アクティブセンサ複合解析システムの構築を目指しているが、2021年度打ち上げ予定のEarthCARE衛星に搭載される波長355nmの高スペクトル分解ライダと同じ波長355nmの多視野角多重散乱偏光ライダとCALIPSO衛星搭載の波長532nmで初めて多重散乱型高スペクトル分解ライダの開発と観測に成功した。また、従来衛星搭載偏光ライダの多重散乱光の解析に不可欠な高速な手法が存在しなかったが、今回ベクトル型物理モデル(VPM法)の開発と検証に成功した事で、初めて実用的な衛星搭載偏光ライダの解析が可能となった。2018年8月に打ち上げられたドップラーライダを搭載したAeolus衛星と同期したドップラーライダと多視野角多重散乱偏光ライダの観測も実施する事ができ、風速の鉛直構造と、雲の後方散乱特性に関する初期同期解析結果も得る事ができた。これらの進捗状況から、概ね順調に進展していると判断した。地上型高感度型多視野角・多重散乱偏光ライダ、多重散乱型多波長高スペクトル分解ライダ、多重散乱型ドップラーライダを開発し、これら複数の測器を組み合わせた次世代型衛星アクティブセンサ複合解析システムによる雲とエアロゾルの同時観測を実施する。ベクトル型物理モデル(Physical Model)の拡張を行い、衛星搭載ライダや次世代型の観測機器で得られる信号のシミュレーションを可能にする。これらの測器の観測データ、VPM法、そして氷粒子の非球形散乱理論計算に基づく衛星搭載レーダとライダの雲の微物理特性解析アルゴリズムの検証と改良を実施する。ドップラー雲レーダとドップラーライダの同時観測を実施し、雲粒子の落下速度と鉛直流の分離や風速の鉛直シア抽出を実施する次世代型地上観測システムの観測結果と解析結果を用いて、雲-エアロゾル相互作用と雲対流機構の研究を実施する。2018年度に打ち上げに成功したAMD-Aeolus衛星搭載のドップラー高スペクトル分解ライダの解析に適用可能なアルゴリズムを開発し、次世代型観測システムとVPM法で検証と改良を実施する。ミーライダを搭載したCALIPSO衛星とADM-Aeolus衛星の雲粒子とエアロゾル粒子の全球特性の比較解析を実施する。次世代型地上測器による同時観測解析から、EarthCARE衛星搭載ドップラー雲レーダと高スペクトル分解ライダ解析用アルゴリズムの開発と検証を実施する。ドップラー雲レーダと高スペクトル分解ライダを搭載する衛星信号の地上における再現のため、地上型高感度型多視野角・多重散乱偏光ライダ、多重散乱型多波長高スペクトル分解ライダ、多重散乱型ドップラーライダの開発を実施した。衛星に搭載されたライダは、高高度からの観測となるため、地上の通常のライダと比較して多重散乱の影響が大きくなる。そのため、同じ有効半径で同じ雲水量の雲に対して、衛星ライダで観測される減衰後方散乱係数と偏光解消度は、地上ライダの場合と比較して大きくなる特徴を持つ。偏光を含むライダ光の計算には、従来モンテカルロ法を利用するしかなかったが、時間がかかりすぎ衛星解析には利用できないといった問題があった。また簡単な物理的仮定に基づく高速な計算手法も提案されていたが、偏光解消度の計算ができなかった。この問題に対して、物理モデル(Physical Model:PM)法を考案した。この手法では、n回散乱後の位相関数の解析解を利用することで散乱光の角度依存性を表現し、距離がすすむにつれて光量が減衰する量を見積もるのに、経路積分の手法を利用した。

さらにライダ光を単散乱(ss)成分、時間の遅れのない多重散乱成分(ms,on)、そして時間の遅れのある多重散乱成分(ms,off)の3つに分けそれぞれを求める事にした。モンテカルロ法を用いて検証を実施した所、、相対誤差が15%以内で解を求める事が可能であり、従来の手法と比較して、4倍の高精度を達成できた(Opt. Express)。多視野角多重散乱ライダとPM法を用いて、衛星用雲検出手法である雲マスクアルゴリズムを改良した。また高スペクトル分解ライダの観測結果と、氷粒子の理論計算結果を比較し、雲粒子タイプ識別手法を改良した(Springer Remote Sensing/Photogrammetry)。地上型高感度型多視野角・多重散乱偏光ライダ、多重散乱型多波長高スペクトル分解ライダ、多重散乱型ドップラーライダの開発を行っているが、当初計画通りの設計で順調に進んでいる。これらの機器はライダ後方散乱で衛星ライダに起きる多重散乱過程を再現するものとして設計されているが、光学的に厚い雲を大きなライダフットプリントで観測した場合の後方散乱強度の計算を高速に行うための理論の開発も順調に進み、物理モデル(Physical Model)の開発を実現することができ、Opt. express誌に公表することができた。このPM法のモンテカルロ法を用いた検証も進み、従来の手法より高精度で衛星からのライダの全信号強度を高速で計算することが可能になり、また偏光解消度についても計算可能である理論を作る事ができた。この手法は十分高速であるため、衛星解析アルゴリズムに組み込む事ができるようになった。また多視野角多重散乱ライダを用いた初期解析では、従来の雲検出手法では雲域を過小評価する問題のある事、多重散乱によって減衰が緩和される事をアルゴリズムで考慮することで、これを改善できることが判明し、高スペクトル分解ライダの信号解析と、氷粒子の非球形散乱理論を用いた計算結果を比較し、氷粒子タイプの識別結果を、改善できることも判明した。これらの衛星解析アルゴリズムの改良結果についても発表することができた。これらの進捗状況から、概ね順調に進展していると判断している。2021年に打ち上げ予定のEarthCARE衛星に搭載される高スペクトル分解ライダATLIDと同じ波長355nmで観測可能な多視野角多重散乱ライダと、波長532nmのスキャン型干渉計を用いた多重散乱高スペクトル分解ライダをそれぞれ完成した。多視野角多重散乱ライダ観測データ解析によって、波長355nmで衛星ライダと同等の光学的に厚い雲のライダ多重散乱信号の初の観測データ取得と、多重散乱型高スペルトル分解ライダによってライダー比の初期観測に成功した。
施設宿根花卉の栽培基準に関する研究

1.小鉢植え(福助作り)大菊の栽培養水分管理の改善につづいて,冬に開花させるときの花の品質改善法について調べた。9月中旬以降まで電照して開花を抑制すると管状花数が増加して品質のわるい露心花になるが,花芽形成期の短日開始10日後から10日間だけ昼の光を2030%に弱くすると管状花が増えず,完全な八重花になった。2.ミヤコワスレの早期促成栽培年内開花の早期促成栽培では苗冷蔵開始期の7月末までに大苗を作る必要があるが,冬を越したミヤコワスレは初夏まで花芽を形成して大苗にならない。3月にエセフオン散布,高温処理することにより花芽分化しなくなり,7月には大苗が得られた。3.カ-ネ-ションの長期栽培生長速度に合せた養水分管理により,通常の2倍の切花(本数、重量)を得た。植物にストレスを与えないこの方法で,3年間は高い生産性が維持できた。4.トルコギキョウの秋出し栽培67月に播種してロゼット化を防止し,1012月に良質の切花を得る方法を検討した。吸水種子を15°Cで40日間低温処理して6月中旬に播種したものは9月下旬10月に開花し,7月中旬播種で10日間だけ夜温17°Cとしたものが1012月に開花した。5.シェクコンカスミソウの冬出し栽培普通はロゼット化する秋植え栽培で,低節位摘心のものはロゼット化したが、定植後生長がおう盛になってから10節で摘心し,生育初期に深夜電照,多灌水で栽培したものはロゼット化しないで121月に開花した。1.多年切りカーネーションの栽培基準品種ノラとタンガーを用い、1年目の本年度は6月に定植して栽培した。従来の研究成果に基づき、栽植密度を48株/m^2、1株平均3本仕立ての144本/m^2とし、灌水点をpF1.52.0、施肥はOK-F1(15-8.5-17)を用いて1回にN成分で3g/m^2、年間50回に分けて与えることとした。(総施肥量150-85-170g/m^2)。まだ生育途中であるが、2月末現在でベンチ1m^2当たりの切り花本数が361本、切り花重約9kgとなっていて、わが国平均の3倍近くなっている。来年度以降は、この植物を5月末に切り戻して、最低3年間は同じ灌水と施肥管理で栽培しつづけ、生産性がどうなっていくかを調べる。2.小鉢植え大菊の栽培基準この実験は来年度実施の予定であったが、本年度予定していたミヤコワスレの良苗が得られなかったので、1年繰り上げて実施した。観賞用大菊15品種を8月1日に15cm鉢に植え、矮化剤処理によるいわゆる「福助」作りの栽培を行った。従来の研究成果に基づき、1鉢当たり1-0.5-1gのN、P、Kを吸収曲線に合わせて23回に分けて与えた。その結果、趣味栽培家の菊花展で上位入賞するものに相当する鉢花が生産できた。来年度は、冬にも良質の花を咲かせるための栽培方法を検討する。1.多年切りカ-ネ-ションの栽培基準:昭和63年6月植えの株をそのまま前年と同じ管理で栽培しつづけ、当年植えのものと生産性を比較した。

2年生株の切り戻しを当年植え株の摘心と同じ時期に行うと一番花の開花が遅れて生産性はかなり劣ったが、15日ぐらい早く切り戻すと、生産性は当年植えにわずかに劣る程度であった。2.ミヤコワスレの早期促成栽培の栽培基準:7月からの株冷蔵処理による11月開花栽培でのジベレリン散布方法を検討した。植え付け25日後に40ppm、その後10日ごとに20ppmを散布するとほとんど連続して二番花が開花したが、花の品質が劣った。散布を3回にとどめ、一番花の収穫が終ってから地上部を切り戻し、芽が成長し始めからジベレリンを散布すると、開花は遅れるが良品質の切花になった。3.小鉢植え大菊の栽培基準:大菊を9月中旬まで電照して11月下旬以降に開花させると管状花が増えて心の出た花(露心花)になり、花の品質が低下する。その防止策を検討した。電照をやめて10日後から10日間だけ昼間の光を2030%に減光すると管状花が増えず、完全な八重花になり、良品質の鉢花になった。4.シェクコンカスミソウの栽培基準:夏に挿し芽して9月以降に摘心するシェクコンカスミソウはロゼット化しやすく、晩秋冬に開花させる栽培には冷蔵した古株を使っているが、切花品質がよくない。若苗でのロゼット化防止策を検討した。挿し芽苗を植えて、10節以上で摘心して上位の側芽を生長させると9月上中旬摘心でもロゼット化しなかったが、5節で摘心して下位の芽を生長させるとロゼット化した。1.多年切りカ-ネ-ションの栽培基準:据え置き3年目までは当年植えのものとほとんど違わない生産性を示したが,4年目になるとウィルス病も発生して,生産性が著るしく低下した。日本では,据え置くとしても3年以下で改植するのがよいと思われた。2.シュクコンカスミソウの栽培基準:秋植えの場合,挿し芽苗を定植して低節位で摘心するとロゼット化してしまうが,活着して生長がおう盛になってから10節で摘心し,深夜電照のうえpF1.5で灌水して(乾かさないで)栽培すると順調に生長して121月に開花した。またシュ-ト密度を変えて栽培し,各シュ-トの太さや小花数を調べたところ、極端な低密度は別として,茎の太さと小花数との間には高い相関があり,単位面積当たりの小花数はほぼ一定となった。そこで、頂芽が花芽分化するころに頂部を摘除して上位側枝を生長させたところ,それぞれが多くの小花をつけ,1株から数本の品質の良い切花が得られた。3、トルコギキョウの栽培基準:トルコギキョウは6月以後の高温期に播種するとロゼット化して翌春まで開花しない。そこで67月に播種して秋冬に開花させる方法を検討した。吸水種子を15°Cで40日間冷蔵処理して6月中旬に播種すると,ロゼット化しないで9月下旬10月に開花した。同じく処理した種子を7月中旬に播種すると,10日間だけ夜温17°Cで発芽させたものは10月下旬12月に開花した。これらは草犬が低くて開花したが、発蕾と同時に第1,第2花蕾を摘除すると開花位置が高くなり,良品質の切花となった。4、栽培基準書の作成:従来の研究成果と本研究の結果を基にして,キク、シュクコンカスミソウ,カ-ネ-ション,トルコギキョウ,ミヤコワスレの栽培基準を作成した。
微生物によるトリチウムガスの酸化に関する研究

本研究は(1)ラットおよびヒトの腸内菌によるトリチウムガスの酸化について比較検討し、トリチウムガスの酸化能を持つ腸内菌を分離し同定することによってどのような腸内菌群がトリチウムガスの体内酸化に与かっているかを明らかにすること、(2)土壌におけるトリチウムガスの酸化の実体を把握するとともに、その土壌から空気中トリチウムガスを実際に酸化する菌を分離することを試みた。研究成果を以下に述べる。1.腸内環境が嫌気的であることから、各種の嫌気性菌選択分離・鑑別用培地を用いて、ラットおよびヒトの糞便よりトリチウムガス酸化能をもつ腸内菌を多数分離し、同定した。トリチウムガス酸化活性を持つ分離菌株の大半は腸内の最優勢菌群であるBacteroidesやPeptostreptococcusに属するものであった。またVeillonella purvulaは最も酸化活性が高い菌株であった。2.土壌によるトリチウムガスの酸化を定量的に測定する方法を確立し、山林土壌,水田土壌,畑土壌についてトリチウムガスの酸化活性とその特性を調べた。酸化活性は、土壌表層で最も強く、0°Cから75°Cまで広巾い温度範囲で検出され、土壌の水分含量で大きく変化し、土壌の乾操あるいは加湿により著しく低下した。各種滅菌処理や阻害剤添加により、トリチウムガス酸化活性の全てあるいは一部が失われた。3.各土壌よりトリチウムガス酸化能をもつ好気性細菌を分離した。分離菌株の6割がグラム陰性菌であった。これらの同定は一部についてはほぼ完了したが、さらに検討中である。
神経細胞の活動動態と細胞種とコネクトームをつなぐ技術の確立

脳の動作原理を理解するには、回路構造と機能を同一個体で包括的に明らかにすることが重要である。そこで、本研究では脳の3次元的な構造を保ったまま抗体等で染色し、さらに透明化を行ってメゾスケールのコネクトームを明らかにすることを目指した。比較的高濃度のサポニンを用いて、形態に影響を与えることなく深部まで抗体染色が可能になることを見出した。またイオヘキソールを用いて屈折率を調整し、球面収差を減らした透明化法SeeDB2を開発した。これにより、組織深部における高解像イメージングを確立した。現在、神経回路の詳細な構造を明らかにするコネクトミクスのアプローチが着目されているが、脳の動作原理を理解するには、回路構造と機能を同一個体で包括的に明らかにすることが重要である。そこで、本研究では神経細胞の機能・細胞種・回路を同一個体の脳で統合的に理解する為の方法の確立を目指した。具体的には、カルシウムイメージングなどを行った脳組織に対して、3次元的な構造を保ったまま抗体等で染色し、さらに透明化を行ってメゾスケールのコネクトームを明らかにするという流れが有望であると考えた。そこで、本研究では、新しい透明化法SeeDB2を開発し、深部の抗体染色を行いつつ、形態を最大限保持し、高解像イメージングすることを目指した。比較的高濃度のサポニンを使うことで、形態に影響を与えることなく深部(約200um)の抗体染色が可能になることを見出した。さらに熱処理を加えると1mm程度の深さまで抗体染色が可能になった。GFPの他、Gad67やPVなど、ニューロンのサブタイプ同定にも成功した。また、透明化に関しては、イオヘキソールをもちいて屈折率をグリセリンまたはオイルといったイマージョン液と一致させることにより、深部まで高解像イメージングを実現した。実際に超解像顕微鏡やAiryscanを用いて、神経細胞をシナプスレベルで3D計測することに成功した。これらの新しい方法論は神経回路の包括的計測に道を拓くと期待される。神経科学
網膜オルガノイドを用いた急性網膜壊死の発症機序解明

この研究は、急性網膜壊死(ARN)という失明率の高いウイルス感染症が、どのようにして起きるのかを明らかにし、治療成績の向上に役立てようとするものである。網膜は眼底部に位置する緻密な層構造の組織であり、これまで特にヒトの網膜を使って実験することは難しかった。しかし近年オルガノイドという擬似臓器の作成技術が進歩し、網膜オルガノイドも作成が可能となった。そこで本研究では、網膜オルガノイドに原因ウイルス(単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス)を感染させ、体内での感染経路の推定、炎症反応の全容解明、ウイルス増殖と炎症反応を抑える薬の開発を目標に、研究を行う。
ナノメータ微粒子薄膜ブリッジ接合を用いた単電子デバイスの研究

接合寸法が数nm以下の微小トンネル接合の2次元アレイからなる微粒子薄膜は、2次元伝導性を有するため、単電子トンネル効果が不鮮明となる。一方、我々は、微粒子薄膜のサイズを電荷ソリトン長よりも小さくすることで、その特性が疑ゼロ次元的になることを指摘した。また窒化ニオブ微粒子薄膜を用いたナノメータスケールの微粒子薄膜ブリッジ接合において、明確な単電子トンネル効果を観測し、電荷KT転移温度が外部電界の印加に対して敏感に変化することを見いだした。本年度では、ナノメータスケールの微粒子薄膜ブリッジ接合における電荷KT転移温度が、外部電界の印加に対して劇的に変化することを利用し、高感度電界効果デバイスの実現を目指した。その結果、以下の知見が得られた。(1)良好な微粒子構造を有する微粒子薄膜の探索とその構造の評価を行い、Pd微粒子薄膜が、微粒子粒径が小さく均一で良好な微粒子構造を持つことを明らかにした。(2)Pd微粒子薄膜を用いたブリッジ素子を作成し、低温での伝導特性を調べた。これにより、低温での電子伝導特性が、正負の電荷ソリトンの結合に起因した電荷KT効果に支配されることを見出した。また、理論から導かれる、KT転移温度と実験から得られた温度とを比較し、微粒子薄膜におけるKT転移温度が理論値よりも小さくなること、これらの転移温度の減少は、微粒子薄膜上の電荷トラップ効果に起因することを明らかにした。(3)Pd微粒子薄膜をチャネルとした電界効果素子の製作を試みたが、Pdのシリサイドの形成により、良好なゲート絶縁膜が作成できず、今後の課題となった。
ヒトiPs細胞からの軟骨細胞の分化誘導

本研究では、ヒトiPS細胞からの効率的な軟骨細胞誘導法の開発と誘導軟骨細胞の特性解析を実施した。1) iPS細胞から間葉系幹細胞(MSCs)を誘導し、段階的に軟骨細胞を誘導することで、効率的な軟骨細胞の獲得を試みた。誘導環境を低酸素状態とすることで、高率にMSC-like性質を有する細胞が得られることを見出した。2)誘導したMSCsについて発現解析を実施し、誘導MSCsが骨髄由来MSCsに類似した発現パターンを示すこと、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への誘導が可能であることを示した。また、3)未分化iPS細胞およびiPS由来軟骨細胞に機械的ストレスを加え、未分化維持分子機構に及ぼす影響を検討し、機械的ストレスの負荷は未分化性の制御に影響しうることを明らかにした。高齢社会の到来に伴い変形性関節症の有病率が増加しており、その治療は大きな社会的問題となっている。変形性関節症の治療戦略として、軟骨欠損部に対する培養自家軟骨移植が確立されたが、健常部の軟骨採取を必要とするとともに、培養軟骨細胞脱分化の問題が解決されていない。一方、近年樹立が報告されたヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、多能性を有しながら体外でほぼ無限に増殖させることが可能なため、理想的な再生医療資源として注目されている。本研究では、iPS細胞の関節軟骨損傷に対する軟骨再生材料としての有用性を検証することを目的に、1)ヒトiPS細胞から軟骨細胞を誘導する、2)誘導された軟骨細胞の特性を検討する、という2段階の実験を計画した。初年度は、我々が独自に開発したマウスiPS細胞から軟骨分化能をもつ間葉系幹細胞を誘導する方法に基づき、ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞を誘導する方法の検討を行った。しかしながら、ヒトiPS細胞をレチノイン酸(RA)添加培地で誘導しても、増殖性の間葉系幹細胞を安定的に得ることは出来なかった。近年の研究により、ヒト多能性幹細胞とマウス多能性幹細胞の発生学的な隔たりが次々と明らかになっており、本研究で見られたRAに対する反応性の違いも、両細胞の発生段階の異なりを反映している可能性が考えられた。そこで我々は分化誘導法を原理から見直し、免疫不全マウスへの未分化ヒトiPS細胞の移植により、マウス体内でiPS細胞由来間葉系幹細胞を得る方法を開発した(特許出願中)。同法で得られたヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪細胞への分化能力を有しており、CD271、CD105、PDGFRa、Vimentinなどの間葉系幹細胞マーカーを発現していた。また、分化誘導後も正常な染色体型を維持しており、極めて有用な分化誘導方法であると考えられた。再生医療は新たな治療戦略として様々な領域で注目されている.変形性関節症においては軟骨欠損部に対する培養自家軟骨移植が確立されているが、同法は健常部の軟骨採取を必要とするとともに培養軟骨細胞脱分化の問題が解決されていない。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は自己の体細胞より作製できるため再生医療の理想的な材料である。これまでにiPS細胞から効率よく軟骨細胞を誘導する方法が充分でないことから、1)ヒトiPS細胞から効率よく軟骨細胞を誘導すること, 2)誘導した軟骨細胞の特性を詳細に検討することを目的に研究を実施した。具体的な研究課題として、1:未分化多能性幹細胞から効率よく軟骨細胞を誘導する方法の開発に取り組むとともに、2:ヒトiPS細胞およびiPS細胞由来軟骨細胞について機械的ストレスに対する細胞応答を観察する、3:癌化の制御に関して、分化誘導条件とレトロウィルスベクター由来遺伝子の発現制御機構の関係を明らかにする、という3点のテーマに取り組んだ。1:について、軟骨細胞は発生学的に間葉系幹細胞(MSCs)を由来とすることから、iPS細胞から高純度に軟骨細胞を得るためその前駆細胞であるMSCsを高率に誘導する方法の確立を目指し研究を実施した。本研究計画22年度、23年度にヒトiPS細胞から間葉系幹細胞をin vitro,in vivo両方でMSCsを高率に獲得する方法を確立した。遺伝子発現パターンや分化能力において、コントロールであるヒト骨髄MSCsに類似する性質を有する細胞を誘導することが可能な系を確立しており、iPS細胞実用に向けた方法論として有益であると考えられる。軟骨細胞の最も特徴的な形質は機械的ストレスに対する細胞応答であることから、テーマ2を設定した。23年度は、まず未分化iPS細胞に機械的ストレスを加え、未分化維持分子機構にどのように影響するかを検討した。その結果、機械的ストレスによりGTPase Rhoが活性化され、Aktのリン酸化レベルの低下を介して未分化性が低下することが明らかとなった。

本研究成果により、機械的刺激により未分化細胞の混入とこれに起因する発癌を制御出来る可能性が示唆された。3:については、マウスiPS細胞で予備的検討を行い、in vitroでの分化誘導によって一部のレトロウイルスベクターが再活性化することが確認されたことから、来年度以降の重要な課題とした。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は自己の体細胞より作製できるため再生医療の理想的な材料である。これまでにiPS細胞から効率よく軟骨細胞を誘導する方法が充分でないことから、1)ヒトiPS細胞からの軟骨細胞の誘導,2)誘導軟骨細胞の特性解析を実施した。具体的な研究課題として、1:未分化多能性幹細胞から効率よく軟骨細胞を誘導する方法の開発、2:ヒトiPS細胞およびiPS細胞由来軟骨細胞について機械的ストレスに対する細胞応答の観察、3:誘導細胞における癌化の制御、という3点のテーマに取り組んだ。研究1について、iPS細胞から高純度に軟骨細胞を得るため、その前駆細胞である間葉系幹細胞(MSCs)を高率に誘導する方法を検討した。平成22年度、平成23年度にヒトiPS細胞から間葉系幹細胞をin vitro、in vivo両方でMSCsを高率に獲得する方法を確立した。次に研究2として、未分化iPS細胞に機械的ストレスを加え、未分化維持分子機構にどのように影響するかを検討した。その結果、機械的ストレスはGTPase Rhoを活性化し、Aktのリン酸化レベルの低下を介して未分化性が低下させることを明らかにした。平成24年度には誘導MSCsと正常ヒトBMMSCsについてマーカー発現等について詳細な比較を行い、iPS由来MSCsはBMMSCsに非常に類似したマーカー発現を示すことを明らかにした。また、誘導MSCsをコラーゲンスポンジ内に包埋し、軟骨分化培地内で分化させた後、周期的圧迫負荷を行った結果、未分化マーカー遺伝子の発現低下を認めた。また、研究3において、ヒトiPS細胞から誘導したMSCsでは、長期の培養で腫瘍化の原因となる細胞が出現すること、CD44/CD73/CD105をマーカーとしたセルソーティングにより、より安全性の高いMSCsを採取できることを見出した。1:において効果的な分化誘導方法が確立されたことから、来年度に速やかにストレス負荷実験を実施することが可能である。また、2:において機械的ストレスが未分化維持遺伝子の発現を低下させることが明らかになったため、分化細胞に対する適度な機械的刺激の負荷が最終産物である軟骨細胞の誘導に効果的に機能する可能性は高い。3:が本研究最大の課題であると考えられる。しかしながら、ある培養条件においてウイルスベクターのサイレンシングに関わる機構が影響を受ける事を予備的に既に確認しており、新たな探索を実施する予定はないことから予定通り研究を遂行できると考えている。尚、研究開始以降、2件の特許と2件の原著論文(修正後受理含む)を発表しており、順調な成果をあげている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究細目2:において、適切なストレス負荷条件を決定すること、細目3:において実際にウイルスベクターのサイレンシングに関わる機構をコントロールできるかどうかが最終的な課題となる。2:の課題については既にウシ軟骨組織を用いた予備実験において、負荷の上限を決定しつつある。今後はより詳細な調整を実施する。
抗リン脂質抗体症候群の新しい分子病態解明と治療への展開

抗リン脂質抗体が胎盤血栓から不育症に至る過程で、まず補体活性化が起こることについてはコンセンサスが得られているが、病態形成に関わる分子機構の全体像を把握するために、陰性荷電リン脂質に結合する血漿タンパク質の網羅的解析を行った。オクチルセファロースにカルジオリピンあるいはフォスファチジルセリンを結合させ、それに対して結合する血漿タンパク質を二次元電気泳動、ペプチドマスフィンガープリントにより同定した結果、次のような分子が得られた。factor H, FHR-1(factor H-related protein 1),IHRP(inter-alpha-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein),C4,C1q。これらのうちfactor HとFHR-1はいずれもβ2-glycoprotein I(β2GPI)と同じくSUSHIドメインを持つ分子である。factor Hは自己膜面上でC3bに結合することで補体活性化を制御すること。また、マクロファージが非炎症的にアポトーシス細胞を貪食除去するには急性相反応蛋白CRPがfactor HとC1qの存在下でアポトーシス細胞に結合していることが必要であり、さらにfactor H欠損症は腎微小血管血栓により溶血性尿毒症症候群HUSを起こすことが知られていることから、β2GPIと同様に、factor Hに対して抗リン脂質抗体が結合する病態発生機構を考えた。実際の患者においてfactor Hに対して結合性を有する抗体を有しているものがいることもわかったが、臨床症状との強い関わりを証明することはできなかった。抗リン脂質抗体が補体を活性化する系をin vitroにおいて解析するために、ウサギ赤血球の溶血を指標とする系を立ち上げた。そして、抗リン脂質抗体の抗原とされてきたβ2グリコプロテインI自体に補体活性化活性があることを見出した。一方、着床期についても研究を進めた。着床期の細胞外マトリックス(ECM)ではECMを分解する担い手とされるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のメンバーであるMMP9の活性が着床期前に上昇することを見出し、それが精漿に誘導された白血球によってもたらされることをin situ zymography、免疫組織化学、精管結紮雄マウス、精嚢切除雄マウス、RB6-8C5抗顆粒球抗体を用いた白血球減少雌マウスなどを用いて明らかにし、論文として発表した。抗リン脂質抗体が胎盤血栓から不育症に至る際にまずはじめに起こるのが補体活性化であることはほぼコンセンサスを得ている。従来、抗リン脂質抗体の抗原とされてきたβ2グリコプロテインI自体に補体活性化活性のあることを、ウサギ血球を用いた溶血実験によって見出した。次に、着床期の細胞外マトリックス(ECM)構築変化機構についてマウスを用いた研究を進めた。ECMを分解する担い手とされるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のメンバーであるMMP9の活性が着床期前に上昇することを見出し、それが精漿に誘導された白血球によってもたらされることをin situ zymographyや免疫組織化学、精管結紮雄マウス、精嚢切除雄マウス、RB6-8C5抗顆粒球抗体を用いた白血球減少雌マウスなどを用いて明らかにした。

不妊治療における精漿の意義にも繋がる研究成果である。また、マウスcytotoxic Tlymphocyte associated protein-2α: CTLA-2αは、全身の組織でmRNAの発現が観察されるが、そのタンパクは雌雄生殖器や胎盤において顕著に発現する。そこで、着床および妊娠維持に関与するタンパクとしてCTLA-2αに着目し、マウスを用いてmRNAとタンパク発現を調べたところ、mRNAは非妊娠子宮の管腔上皮、妊娠初期の子宮の子宮内膜間質細胞、妊娠中期の母体胎盤(間膜腺と脱落膜)、胎盤迷路部および胎子において広範囲に発現が観察された。しかし、タンパクは非妊娠子宮の管腔上皮、妊振初期の子宮の子宮内膜間質細胞、妊娠中期の母体胎盤のみで発現が見られた。さらに、エストロゲン、プロゲステロンそれぞれのアンタゴニストをマウスに投与した実験から、子宮におけるCTLA-2αは上皮に発現するものはエストロゲンの、内膜間質細胞に発現するものはプロゲステロンの制御を受けていることが示唆された。抗リン脂質抗体による血栓形成において、凝固活性化の前に補体活性化が起こることは、我々が当初の研究申請書に書いた仮説の通りであることが、海外の研究者によって報告され、ほぼコンセンサスを得ている。一方、特にわが国において長らく研究が集中してきた検査抗原であるβ2グリコプロテインI(β2GPI)はほとんど研究対象からはずれてしまっている。我々は以前は反対にβ2GPIからは距離を置いたアプローチをとってきたが、ウサギ血球を用いた溶血実験によってβ2GPI自体に溶血活性のあることが判明し、それはホモロガスな構造を有する補体制御分子との競合によるものと考えられた。今後、補体制御を中心にしたトランスレーショナルリサーチに向かわねばならないが、その方向性の手がかりを与える知見である。また、着床期の細胞外マトリックス(ECM)構築変化機構についてマウスを用いた研究を進めているが、MMP9の着床期前の活性上昇は、精漿に誘導された白血球によってもたらされることを免疫組織化学、精管結紮雄マウス、精嚢切除雄マウス、RB6-8C5抗顆粒球抗体を用いた白血球減少雌マウスなどを用いて明らかにした論文を発表した。さらに、脱落膜化におけるマウスcytotoxic Tlymphocyte associated protein-2α(CTLA-2α)に着目して、その発現制御を観察するうち、脱落膜化の引き金として生理活性物質は必ずしも必要が無く、物理的な刺激で十分であることを、ガラスビーズを用いた実験によって発見した。補体を中心とする解析を離れ、妊娠初期における抗リン脂質抗体の病態形成機構を探るため、トロホブラスト細胞融合過程に関する分子群の探索を次のように行った。まず、絨毛癌細胞株BeWoに対してフォルスコリンで細胞融合刺激を行った。その際、異なる蛍光タンパクを発現させた二種類の細胞間で細胞融合を誘導することで融合細胞を正確かつ容易に区別できるようにした。また、BeWo細胞と293細胞の共培養を行うことで多核体の誘導効率を上昇させた。