hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二次元図形解析法を用いた心電図“カオス"の解析

この事は迷走神経がHis束より房室結節に密に分布していることによる差であると考えられた。以上の結果より、白色ノイズを用いて記録した一見カオスと思われる不規則な心電図RR間隔にもRR間隔の二次元図形表示法をもちいて解析すると生理的意義が抽出できることがわかった。今後はこの結果を臨床例に応用してゆきたい。平成8年度には自律神経系の温存された犬交叉潅流心において房室結節の生理的機能を不規則な白色ノイズ刺激を与える事により検討し、機能的不応期が連続的先行RR間隔の変化に連動して変わる事を報告した。平成9年度は動物実験ではの房室結節の生理的機能をふまえてヒト心房細動における変行伝導と心室性期外収縮の鑑別が可能である事、また、その定量的鑑別法について検討した。対象は発性性心房細動34例、慢性心房細動62例で12例を除いて84例で弁膜症などの基礎心疾患を合併していた。発作性心房細動では洞調律と心房細動の発作中のホルター心電図を記録し、上室性期外収縮の変行伝導と同一波形は心房細動中でも変行伝導と判断した。32例においてHis束心電図を記録し、H波の有無により心室性期外収縮か変行伝導かのgolden standardとした。ホルター心電図のRR間隔時系列データのRRnをX座標、RRn+1をY座標として二次元図形表示し、心室性期外収縮と変行伝導の二次元図形パターンの違いを検討した。変行伝導は右脚もしくは左脚の機能的不応期が房室結節のそれより長い時に房室結節と右脚、左脚の機能的不応期の差により出現するので心房細動の二次元分布図の下限に一致した出現をみた。一方、心室性期外収縮は心房細動の分布とは無関係な領域に分布し、変行伝導とは異なる分布を示した。連結時間の短い心室性期外収縮は心房細動の二次元図形分布の下限からさらにX軸に近い領域に心房細動の分布と分離してみられ、明瞭に区別できた。この二次元分布図の違いはHis束心電図により心室性期外収縮か変行伝導かの確証も得る事が出来た。一見、心房細動は不規則なRR間隔であるが、二次元図形表示によりそのなかに潜む規則性を抽出できた。本法はカオスから規則性を解析するのに有用な方法である。平成9年度は動物実験での房室結節の生理的機能をふまえてヒト心房細動における変行伝導と心室期外収縮の鑑別が可能である事、また、その定量的鑑別法について検討した。平成10年度はさらに心房細動に心室期外収縮を合併した症例において心室期外収縮の詳細な検討を行った。対象は81例で弁膜症などの基礎心疾患を合併していた。ホルター心電図のRR間隔時系列データのRRnをX座標、RRn+1をY座標として二次元図形表示し、心室期外収縮と変行伝導の二次元図形パターンの違いから各々の不整脈を診断した。心室期外収縮の連結時間の違い、発生時の先行RR間隔の違い、および不整脈の悪性度や心機能などの臨床的指標との関連を検討した。心室期外収縮の連結時間は非常に連結時間の固定したものから変動するものまで混在し、連結時間の変動する症例ほど不整脈の悪性度が高く、心室頻拍などがみられた。また、心室期外収縮の発生時の先行する2つのRR間隔が最初に短く、次に長いRR間隔がくるという規則性があって心室期外収縮が出現するものと全く不規則なRR間隔の関係のものまでみられ、不規則な症例において心室頻拍などのような、より悪性の不整脈が出現していた。心機能もこのような症例において低下していた。このように本法は一見カオスと思われる心房細動のRR間隔と心室期外収縮の発生において規則性を解析するのに有用な方法であることが解った。また、心室性不整脈の発生機序を考える上でも有用な方法である。
化学吸着法を利用した基板上でのグラフェンナノリボン合成

本研究では、新規グラフェンナノリボン(GNR)合成法の確立のため、1)金基板への吸着部位を導入したGNR前駆体分子の単分子膜形成および脱水素環化反応の検討、2)バンドギャップ制御を目指した幅広のGNR合成に必要な高次アセン前駆体およびエッジ修飾GNR前駆体の合成、を行った。(1)に関しては、合成したGNR前駆体分子の単分子膜形成基板を真空条件下で加熱したところ、脱水素環化反応の進行を示唆する結果を得た。(2)に関しては、ヘプタセン・ノナセン前駆体やエッジにフッ素を導入したGNR前駆体分子の合成に成功した。さらに、エッジ修飾GNRの形成メカニズムに関する知見を得ることに成功した。本研究は、「単分子膜を形成できる化学吸着法」と「難溶な分子を可溶な前駆体分子から熱や光を用いて変換できる前駆体法」に着目し、電極上でのグラフェンナノリボン(GNR)の合成と単分子膜としての固定化を一気に行い、基板上での新規GNR合成法を確立することを目的とする。本年度は、「化学吸着法」に必要な吸着部位を検討し、吸着部位を導入した分子の合成と金基板への単分子膜としての吸着実験を行った。また、エッジ修飾GNR合成を目指し、エッジ部位に置換基としてフッ素を導入した分子の合成を行った。まず、多くの報告例があるアントラセンナノリボン合成を目指し、吸着部位を導入したモデル分子(アントラセンダイマー)の合成を行った。さらに、モデル分子中のアセン部位と吸着部位を結ぶリンカー長さが異なる分子を合成し、リンカーの長さが吸着状態に与える影響を、サイクリックボルタンメトリーを用いて評価した。その結果、単分子膜の形成は確認されたが、DFT計算より単分子膜化に適切と見積もったリンカー長さは、実際にうまく基板上に吸着できる長さよりも短い可能性が示唆された。そこで、リンカー長さを少し変更した吸着部位を導入した分子を新たに設計・合成した。基板上合成には、基板として用いる金属の触媒作用を利用した脱水素環化反応進行が鍵となるため、リンカー長さと吸着状態の関係解明は非常に有益な情報となる。また、参照化合物としてすでに環化反応を行った分子の合成も行い、環化反応前後における基礎物性の違いを明らかにした。エッジ修飾を行ったGNRは、未だ報告例がほとんどないが、その重要性から計画を前倒しして研究を行った。エッジ部位の修飾としてフッ素を導入したアセン分子の合成が完了し、特許出願(特願2015-185711)を行った。本研究達成に向けて鍵となる「単分子膜の作製」に関して、アセン骨格と吸着部位を結ぶリンカー長さに関して重要な知見を得ることができた。合成した吸着部位は、当初計画していたペンタセンオリゴマーへも適用可能であり、今後の実験を効率的に推進することができる。また、エッジ修飾GNRの基板上合成に関して、その前駆体となる分子の合成ルートを確立し、特許申請を行うことができた。グラフェンナノリボン(GNR)は、次世代のエレクトロニクスを担う材料として期待されているが、凝集性が高いため通常の手法では取り扱いが困難である。本研究では、「単分子膜を形成できる化学吸着法」と「難溶な分子を可溶な前駆体分子から熱や光を用いて変換できる前駆体法」に着目し、電極上でのGNR合成と単分子膜としての固定化を一気に行い、基板上での新規GNR合成法を確立することを目指した。最終年度である今年度は、「化学吸着法」を導入したGNRモデル分子の金基板への吸着、および、基板上での脱水素環化反応の検討を行った。リンカー長さの異なる2種類のGNRモデル分子を金基板上に吸着させ、サイクリックボルタンメトリーに吸着状態を評価した結果、金基板上に単分子膜形成をしていることが示唆された。試験的に真空中で脱水素環化反応を検討したところ、さらなる詳細な解析が必要ではあるが、脱水素環化反応の進行が示唆された。また、本年度は、より幅広のGNRやエッジ修飾GNRの合成に必要な鍵化合物の合成も行った。とくに、バンドギャップの狭い幅広のGNR合成の重要な鍵化合物であるヘプタセンやノナセンの光変換型前駆体を合成することに成功した。また、フッ素修飾GNRのモデル化合物(フッ素化ビスアンテン)を合成し、そのねじれた構造をX線構造解析によって明らかにした。このフッ素化ビスアンテンは、光に対して安定であり、トルエン・メタノール中で半導体特性を示すナノファイバーを形成することを明らかにした。また、フッ素を導入したGNR前駆体を用いて、昇華法によるGNR合成を検討した結果、フッ素が脱離することが明らかになったため、その反応メカニズムを量子化学計算を用いて解析した。新規なGNR合成法の確立として下記を推進する。

1モデル分子を利用して、基板上での縮環反応(GNR化)の検討を行う。リンカーの長さや吸着部位の種類が単分子膜形成に与える影響を評価し、吸着部位のさらなる最適化を行う。2得られる単分子膜を、走査型プローブ顕微鏡などを用いて観測するとともに、分光測定などの物性評価を行い、縮環反応進行を評価する。3上記の実験により得られた知見を、より幅広のGNR合成を目指したペンタセン前駆体や、フッ素をエッジ部位に導入した分子に適用し、基板上への単分子膜化を検討する。また、優れた溶解性を確保できる前駆体法の利点を利用し、ペンタセン前駆体のオリゴマー化を行い、単分子膜化や基板上でのGNR化の検討を行う。材料化学次年度使用額が生じた理由は、合成研究に必要な試薬や溶媒の購入に必要な経費を計上していたが、必要に応じて研究費を執行した結果、当初の予定よりも効率的に合成研究を推進できたことに伴う。平成28年度は、幅広の(バンドギャップの狭い)グラフェンナノリボンやエッジ修飾グラフェンナノリボン作製に向けた合成研究に必要な試薬や溶媒の購入を行う予定である。さらに、基板上での膜構造を走査型顕微鏡などにおいて評価するため、マイカや金基板、走査型顕微鏡測定に必要な探針の購入を行う予定である。
慢性組織障害とクロマチン構造変化を介した心不全治療戦略の開発

核内転写調節因子であるHMGB1は、様々な働きを有しているが、心不全時の胎児型遺伝子発現に与える意義に関しては明らかではなかった。マウス圧負荷心やヒト不全心サンプルでHMGB1が核内から細胞質へ局在変化をしていることを明らかにした。HMGB1を過剰発現すると、心肥大刺激時のANP, BNP発現や心筋細胞肥大が優位に抑制されていた。SiRNA-HMGB1を用いてHMGB1の発現を低下させると、心肥大刺激によるANP, BNPの発現がさらに亢進した。この一連の研究成果は、HMGB1の心筋細胞保護効果を示唆しており、心不全治療の開発への重要な基盤研究と考えられる。核内転写調節因子であるHMGB1は細胞外へ分泌され、細胞の遊走と増殖、損傷組織の修復など様々な働きを有しているが、細胞内のHMGB1が、心不全時の胎児型遺伝子発現に与える意義に関しては明らかではなかった。培養心筋細胞にHMGB1を過剰発現すると、Angiotensin II, Endothelin-1刺激時のANP, BNP発現や心筋細胞肥大が優位に抑制されていることを見出した。一方、HMGB1の局在変化の検討を行ったところ、Angiotensin II, Endothelin-1の刺激によって、核内のHMGB1がアセチル化を受け細胞質へ局在変化をしていることを見出した。核内HMGB1の意義を明らかにするために、SiRNA-HMGB1を用いてHMGB1の発現を低下させると、Angiotensin II, Endothelin-1刺激によるANP, BNPの発現がさらに亢進することから、細胞内HMGB1が心不全に関係する様々な刺激に対して、心筋細胞保護作用を有していることを見出した。動物モデルにおいても、大動脈縮窄術後に、核内HMGB1がアセチル化を受け核内から細胞質に局在変化をきたしていることを明らかにした。ヒト不全心でのHMGB1の局在を検討するために、不全心の心筋生検サンプルを用いて免疫染色を行った。心不全を呈していない心筋組織に比べて、不全心を呈した心筋組織では、HMGB1が核内から細胞質へ局在変化をしていることを明らかにした。これらの一連の研究成果は、抗心不全効果という点で、HMGB1が心筋細胞内で、重要な役割を担っていること、HMGB1の細胞内保持が心筋細胞保護効果があることを示唆しており、新しい心不全治療の開発にむけての重要な基盤研究であるといえる。ヒト心筋核内HMGB1心不全重症度との相関関係予備研究では、慢性心不全患者の血中HMGB1濃度が心不全重症度や予後と相関しなかったが、心不全を伴わない肥大型心筋症サンプルに比べ、心不全を伴う肥大型心筋症での心筋生検サンプルでは、核内のHMGB1発現が低下していた。拡張型心筋症、肥大型心筋症で入院した患者から得られた心筋生検サンプルを用いて、HE染色、Elastica-Masson染色、HMGB1抗体を用いて免疫染色を行い、心不全重症度や臨床経過を対比させたところ、ANP, BNP血中濃度とHMGB1の局在変化の比較検討を行った。心不全を伴うサンプルでは、HMGB1は核内から核外へ移行していた。ANP, BNPの上昇を伴わないサンプルでは、核内にとどまっていたことから、核外移行と胎児型遺伝子発現の相関を認めた。培養心筋細胞を用いて酸化ストレス、LPS、エンドセリン1によるHMGB1の局剤の変化を検討した。これらの刺激によりHMGB1はアセチル化修飾を受け、その結果核外へ移行することが明らかになった。さらに、酸化ストレスにより、細胞内シャンペロンであるheat shock proteinの発現が低下するが、その低下が、HMGB1の細胞内への存在下では、優位に抑制されていた。HSPによりミトコンドリア機能が改善され、Smacの発現に影響を与え、ストレス下でのアポトーシスを抑制することが知られており、核内HMGB1とheat shock protein, Smacの関連やミトコンドリア機能の変化を明らかにしていく必要がある。心筋細胞のおけるHMGB1の局在変化が、さまざまな病的刺激によって生じることをあきらかにした。さらに、臨床像と対比させその意義を明らかにした。局在変化の原因として、アセチル化によることを明らかにし、胎児型遺伝子発現調節機構を明らかにした。さらに、転写因子との結合実験の過程において、酸化ストレスとHSPとの関連に着目し、細胞内HMGB1の抗アポトーシス作用の可能性を見いだした。さらに、核内HMGB1とHSPプロモーター領域の結合部位を明らかにし、HMGB1によるHSP発現調節機構を検討する。

HMGB1によって、HSPが保たれることでミトコンドリア障害を軽減させる可能性を見出しており、HMGB1とミトコンドリア機能異常やcopy numberの変化を検討する。さらに、酸化ストレスモデルにおける、HMGB1-HSPを介した抗アポトーシス作用を明らかにするために、HMGB1-TGマウスのアポトーシス抑制機構をしていく。
偏微分方程式に対する高速な構造保存解法の構築と応用

本研究ではこれまで知られていた構造保存解法をさらに進化させ,高速かつ実用的な手法に昇華させることを目的とした.本研究を通じて,「不連続Galerkin法に基づく高速な構造保存数値解法の基礎的構築」,「力学系理論に基づく構造保存解法の安定性解析手法の開発」,「動的格子法の導入」,「混合微分を含む偏微分方程式に対する構造保存解法の提案」を行った.以上を通じて,構造保存解法はさらに一段深化した.現代科学・工学の現場では,微分方程式の数値解法は欠かせぬツールであるが,近年,方程式の数理的構造を活用することで汎用解法を遙かに超える専用解法ー通称「構造保存数値解法」を構成する試みが盛んに行われている.特に偏微分方程式に対しては,申請者自身による前研究において,有限要素法に基づく新しい構造保存数値解法の原理とそれに関連する基礎技術が得られており,これらは世界的にも有力なアプローチのひとつとみなされている.本研究はこの研究の流れをさらに加速させ,「計算コストを実用レベルまで低減すること」および「誰にでも使える手法として整備すること」により,真に実用的な「高速な構造保存数値解法」を構築しその応用を展開することを目的とする.本年度は,このゴールを目指して,「不連続Galerkin法に基づく構造保存数値解法」に関する基礎検討,および「力学系理論に基づく差分スキームの安定性解析」に関する数学的考察を行った.1つめ,不連続Galerkin法に関しては,これまで構造保存的となるスキームが構成可能であるか,(本研究者自身が本研究以前に行った基礎的検討を除いて)まったく分かっていなかった.今年度は,空間1次元の偏微分方程式に対して,既存の構造保存数値解法の枠組を不連続Galerkin法で再現可能であることを突き止め,その新原理の整備を行った.より具体的には,不連続Galerkin法を特徴付けるnumericalfluxを,構造保存的に構成可能であることを示した.2つめ,差分スキームの安定性解析に関しては,前研究により,非常に基本的な散逸系に対しては,拡大位相空間の考えを用いてLyapunov理論が使えることが示されていた.今年度は,適応刻み幅制御を行った場合のLyapunov理論を新しく構築した.現代科学・工学の現場では,微分方程式の数値解法は欠かせぬツールであるが,近年,方程式の数理的構造を活用することで汎用解法を遙かに超える専用解法---通称「構造保存数値解法」を構成する試みが盛んに行われている.特に偏微分方程式に対しては,申請者自身による前研究において,有限要素法に基づく新しい構造保存数値解法の原理とそれに関連する基礎技術が得られており,これらは世界的にも有力なアプローチのひとつとみなされている.本研究はこの研究の流れをさらに加速させ,「計算コストを実用レベルまで低減すること」および「誰にでも使える手法として整備すること」により,真に実用的な「高速な構造保存数値解法」を構築しその応用を展開することを目的とする.本年度はこのゴールを目指して,「力学系理論に基づく差分スキームに対するLyapunov理論完成」および「動的格子法導入の検討」を行った.1つめ,Lyapunov理論については,前年度基本的な構築を行った同理論を完成させた.2つめ,動的格子法導入については,計算効率を上昇させる手法のひとつである動的格子法の構造保存数値解法における実現可能性に関して検討を開始した.その結果,特殊な系に対してではあるが,自己適合動的格子法を構成できることが分かった.概要に記したように,当初の目的は順調に達成しつつある.ただし,研究の当初計画では通常の有限要素法および不連続Galerkin法の詳細な比較を行い,どちらかを最終候補として研究を進める予定であったが,近年,動的格子法が発達しつつある状況を鑑みて,そちらの検討も開始したため,上記判断は最終年度にやや先送りする形になっている.とはいえ,研究計画自体は順調に推移しており,また,上述のように新しいトレンドも取り入れて研究全体をさらに補強している状況にある.現代科学・工学の現場では,微分方程式の数値解法は欠かせぬツールであるが,近年,方程式の数理的構造を活用することで汎用解法を遙かに超える専用解法---通称「構造保存数値解法」を構成する試みが盛んに行われている.特に偏微分方程式に対しては,申請者自身による前研究において,有限要素法に基づく新しい構造保存数値解法の原理とそれに関連する基礎技術が得られており,これらは世界的にも有力なアプローチのひとつとみなされている.本研究はこの研究の流れをさらに加速させ,「計算コストを実用レベルまで低減すること」および「誰にでも使える手法として整備すること」により,真に実用的な「高速な構造保存数値解法」を構築しその応用を展開することを目的とする.本年度はこのゴールを目指し,「短波方程式に対する自己適合格子法の完成」,「混合微分を含む偏微分方程式に対する平均化差分法の提案」を行った.1つめ,短波方程式に対する自己適合格子法については,従来無限区間でのみ提案されていたホドグラフ変換に基づく自己適合格子法が周期境界条件下でも有用であることを厳密に示し,構造保存解法と組み合わせることで有意な数値解法を構成できることを示した.2つめ,混合微分を含む系への数値計算法は,近年,この種の偏微分方程式が盛んに提案されるようになり重要なトピックであるが,非標準的な,平均化と差分化を併用する離散化が有用であることを示した.本研究ではこれまで知られていた構造保存解法をさらに進化させ,高速かつ実用的な手法に昇華させることを目的とした.

本研究を通じて,「不連続Galerkin法に基づく高速な構造保存数値解法の基礎的構築」,「力学系理論に基づく構造保存解法の安定性解析手法の開発」,「動的格子法の導入」,「混合微分を含む偏微分方程式に対する構造保存解法の提案」を行った.以上を通じて,構造保存解法はさらに一段深化した.概要に記したように,本年度の主な進捗は,「不連続Galerkin法に基づく新原理の開発」および「力学系理論を用いた安定解析技法の確立」の2点である.前者においては,空間1次元の場合には,保存・散逸いずれの場合にも基本的な原理が開発できたといえる.この意味において,当初年度の目的はほぼ達している.このとき,基本的な境界条件(Dirichlet,Neumann,周期等)に対する対応もほぼできている.後者は,本来は2年次以降に予定していたものであったが,共同研究者(指導学生を含む)との作業が予想以上に速く進み,前倒しして本年度に成果として一部報告できたものである.以上より,本課題は当初の予定よりも速いペースで推移しているといえる.本年度検討を開始した動的格子法について,引き続き調査・検討を行う.その上で,判断を先送りした有限要素法・不連続Galerkin法の選択の判断を早期に行い,最終的に2次元以上の大規模系に構造保存解法を適用して,その高速性を計測する.数値解析不連続Galerkin法については,本年度の研究により新原理が整備され,数値実験等によりその実用性も確かめられた.このことにより,不連続Galerkin法に基づく構造保存解法は有望であると考えられる.次年次以降はこの流れを推し進め,空間2/3次元の場合を含めたより応用の現場に近い問題に対して,この構造保存数値解法の枠組を整備し,またHPC的な観点からその高速化を狙っていくことが目標となる.HPC技術との組み合わせはまだ未知数の部分があるが,初年度に当初計画を越える進捗があり若干余裕が生まれたため,今後は構造保存数値解法に適用可能なHPC技法の精査を始め,次年次に具体的な適用を狙っていく.力学系理論による安定性解析については,次元が高い場合の多段スキームの解析を,引き続き行っていく.ここで言う「次元」とは,空間離散化して得られる常微分方程式の次元のことであり,一般には数百を超える数であるから,可視化による力学系構造の理解が困難であり,数学における高次元力学系の理論の援用など,新しいツールを入れていく必要がある.上記2つが軌道に乗り次第,数学的保証,パッケージ整備などを進めていく.研究の進捗状況の欄で記述したように,当初の計画を変更して,最近のトレンドである動的格子法に関する調査を開始した.そのため,当初予定していた成果発表を最終年度に先送りし,より充実した成果発表とする方が適切であると判断した.当初予定では,研究を遂行するために数値計算に必要な備品等を購入する予定であったが,当該年度は数学的基礎研究が予想以上に進展したためそれに注力し,最低限行った数値計算に関しては既存設備でまかなえたため,残額が出た.ただし,残額は当初請求金額の1割程度であり,概ねに予算は適切に執行されている.上述のとおり,最終年度に,これまでの研究成果を総合して,国際会議発表,論文刊行(オープンアクセス化を含む)を積極的に行う.本研究の二年次以降においては,より大規模な数値計算を行っていく.初年次の若干の残額については,二年次における備品購入の増強に充てる予定である.
左右非対称な発現を司るnodal遺伝子の初期エンハンサーの同定

本研究ではnodalの左側での発現が最初にどのようにして誘導されてくるのかに注目し、nodal遺伝子のASEとは異なったエンハンサーに注目し、解析を進めた。まず、nodal遺伝子の新たな左側特異的なエンハンサーの同定を試みた。nodal遺伝子のゲノム領域をトランスジェニックマウスの手法を用いて解析したところ、上流約5kbに位置する約300bの領域に左側板中胚葉特異的なエンハンサー(LSE : lleft side specific enhance)を同定することに成功した。詳細な欠失解析から、LSEは3つのそれぞれ独立した領域が活性を示すのに必要であることが判明した。FoxH1結合配列を持たず、ASEとは異なり非常に複雑な制御を受けていることが予想された。LSEの役割を証明するため、LSEエンハンサー領域を除いた、欠失型ノックアウトマウスを作製することによって、機能を調べてみた。ES細胞を用いて、LSE領域を含む約500bをloxP配列で挟んだPGK-neo遺伝子と置換し、さらにCre遺伝子を発現させることによってPGK-neo遺伝子を除いた。このES細胞を胚盤胞に導入し、ノックアウトマウスを樹立した。LSEを欠損したホモマウスは生まれてきて、成長するが、正常なマウスに比べると、成長が遅い。また、生後すぐのマウスの心臓の形態を調べると、心房中隔欠損が見られるものがあり、左右軸形成に異常を来していることが予想された。しかし、他の臓器の左右非対称性は正常であり、大きな影響は見られなかった。そこで、詳細に左側側板中胚葉での遺伝子発現を調べたところ、nodalは一見正常に発現しているが、その発現時期が正常胚に比べて遅れて出てくることを観察した。マウス初期胚において左右軸形成期に左右非対称に発現する遺伝子群の転写調節機構の解析を行ってきた。leftyやnodalは、左側特異的なエンハンサー(ASE)を介して、転写因子FASTによって活性化すること、さらにこれらの転写調節機構はnodal遺伝子を中心としたauto-regulatory loopを形成しており、何らかの左側特異的なinitiationのシグナルが入ることにより発現が拡張してゆく機構であることが明らかになった。そこで本研究では、その発現誘導のシグナル自身がnodalだという仮説に基づき、nodal遺伝子の初期エンハンサーを同定し、どのような転写調整機構によって左側特異的な転写が始まるのかをしるため、解析を行ってきた。まず、nodal遺伝子の初期エンハンサーの同定を行った。ASEとは異なった、5'上流約5kbのところに左側側板中胚葉で強い活性を持つエンハンサー領域を同定した。欠失解析からその活性が380bpに存在すること、ASEの活性に重要な役割を果たしていたFAST結合配列が見られたが、この配列に変異を導入してもその活性は変化しなかったことからASEとは異質なエンハンサーであること、さらに点突然変異や様々な欠失コンストラクトの解析から複数の転写因子によって制御されていることが明らかになってきた。今後は、さらにコアとなる転写因子結合配列を同定し、転写因子の同定を行っていく予定である。また、このnodal遺伝子のエンハンサーが左右非対称な遺伝子群のトリガーであることを証明するため、このエンハンサー領域の欠失突然変異マウスの作製を行っており、現在、欠失突然変異を持ったES細胞由来のマウスを得ることが出来たところである。本研究では哺乳動物の左右非対称性決定おいて、nodalの左側での発現が最初にどのようにして誘導されてくるのかに注目し、nodal遺伝子のASEとは異なったもう一つのエンハンサーの解析を進めた。

nodal遺伝子のゲノム領域をトランスジェニックマウスの手法を用いて解析したところ、上流約5kbに位置する約300bの領域に左側板中胚葉特異的なエンハンサー(LSE : left side specific enhance)を同定することに成功した。詳細な欠失解析から、LSEは3つのそれぞれ独立した領域が活性を示すのに必要であることが判明した。FoxH1結合配列を持たず、ASEとは異なり非常に複雑な制御を受けていることが予想された。LSEの役割を証明するため、LSEエンハンサー領域を除いた、欠失型ノックアウトマウスを作製することによって、機能を調べてみた。ES細胞を用いて、LSE領域を含む約500bをloxP配列で挟んだPGK-neo遺伝子と置換し、さらにCre遺伝子を発現させることによってPGK-neo遺伝子を除いた。このES細胞を胚盤胞に導入し、ノックアウトマウスを樹立した。LSEを欠損したホモマウスは生まれてきて、成長するが、正常なマウスに比べると、成長が遅い。また、生後すぐのマウスの心臓の形態を調べると、心房中隔欠損が見られるものがあり、左右軸形成に異常を来していることが予想された。しかし、他の臓器の左右非対称性は正常であり、大きな影響は見られなかった。そこで、詳細に左側側板中胚葉での遺伝子発現を調べたところ、nodalは一見正常に発現しているが、その発現時期が正常胚に比べて遅れて出てくることを観察した。
5配位1,2-オキサシレタニドを鍵中間体とする新しい有機合成反応の開拓

交付申請書に記載の計画に従い研究を行い次の成果を得た。1.ジブロモメチル-t-ブチルジメチルシランにLDAを作用させて得られる炭素陰イオン1にベンズアルデヒドを作用させるとベンズアルデヒドが2分子とりこまれた生成物が得られることを見いだした。反応は次のように進行するものと考えられる。炭素陰イオン1がカルボニル化合物に付加しアルコキシ陰イオンを生成する。次にこのアルコキシ陰イオンにおいてシリル基が1,3転位し炭素陰イオンが再生し最後に2分子目のアルデヒドが反応するというものである。ジクロロメチル-t-ブチルジメチルシランとLDAから調製した炭素陰イオンにひとつめのアルデヒドを作用させ次にHMPAを加えケイ素の1,3転位を起こさせ最後にふたつめの求電子剤を加えれば2種の求電子剤をone-potで順次反応させることができることを見いだした。得られたジクロリドは容易に対応するメチレン体に変換できる。従ってt-ブチルジメチルシリルジクロロメチルリチウムがメチレンジアニオン等価体として利用できる。2.t-ブチルジメチルシリルジハロメチルリチウムとカルボニル化合物の付加体のアルコキシド陰イオンにおいてシリル基が1,3転位し1,1-ジハロ-2-t-ブチルジメチルシロキシアルカン2が生成する。この2をエーテル中、-78°CでLDAで処理し室温まで昇温すると(Z)-1-ハロ-2-t-ブチルジメチルシロキシ-1-アルケンが99:1以上の高立体選択性をもって生成することを見いだした。アルケン部分をもつケトンから導いたシリルエーテルに対してLDAを作用させるとカルベンが分子内アルケンによってトラップされたシクロプロパン体の生成が認められる。従ってこの転位反応はリチウムカルべノイドから直接起こるのではなく,カルベノイドからLiBrの脱離によって生成するカルベンを経由して進行するものと考えられる。
シグナル伝達分子活性化の1分子イメージングによる細胞内情報伝達機構の解明

低分子量Gタンパク質Rasの細胞膜上での運動と活性化を1分子可視化した。まず、全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きている培養細胞中に発現させたGFP-H-Ras分子を1分子可視化した。H-Ras分子は、細胞膜上でリン脂質並みに速い拡散運動をしていた。つまり、定常状態では、ほとんどのH-Rasが安定なラフトに入っているわけではないことが示された。次に、活性化したH-Ras分子を生細胞中で可視化する方法を開発した。すなわち、YFP-H-Ras発現細胞にAlexa594標識したRBD(Raf-1のRas binding domain)を顕微注入し、YFPからAlexaへの蛍光共鳴エネルギー移動を1分子観察した(1分子FRET)。幹細胞因子(SCF)刺激をすると、1分子FRETの輝点が多数観察された。しかし、この各輝点の寿命は非常に短く、0.67秒以下のものが殆どであった。FRET輝点の個数は、刺激後3-4分に顕著に増加し、生化学的解析による活性の時間変化と一致した。すなわち、通常の生化学的計測や画像解析で見られる活性曲線は、各分子のパルス状の活性化の合計を見ているものと考えられる。さらに、FRETを起こしている間、分子ペアは殆ど運動を停止していた。また、刺激後3-4分に細胞膜上に現れるGFP-Raf-1の輝点も静止していた。このような、活性化されたRas分子の一時停留は、上流や下流のシグナル分子との結合によるものではなく、また、カベオラ/ラフトにも依存しなかった。ところが、活性化Rasのスキャッフォールディングタンパク質SUR-8は、一時停留を促進した。これは、Rasが活性化されると、SUR-8などのスキャッフォールディングタンパク質の結合により、シグナル伝達のための大きな活性化Ras分子複合体が協同的に形成されること、そこで下流分子にシグナルが伝達され、その後、複合体はすぐに分解されること、Rasシグナルは、エフェクターとのランダムな衝突だけで伝わるのではないこと、を示唆している。本研究において、低分子量Gタンパク質Rasのシグナル伝達機構を明らかにするため、生細胞中でGFP-H-Ras分子を1分子可視化し、さらに、生細胞中でバルクのH-Ras分子と区別して活性化したH-Ras分子を可視化する方法を開発した。すなわち、YFP-H-Ras発現細胞にAlexa594標識したRBD(Raf-1のRas binding domain)を顕微注入し、YFPからAlexaへの1分子蛍光共鳴エネルギー移動(1分子FRET)を観察した。リガンド刺激によって、生化学的解析でRasが活性化する事が示された時間帯に、FRETシグナルが顕著に増加した。FRETの持続時間は殆どが0.67秒以下と短く、活性化がタイトに制御されている可能性を示唆した。不活性型のH-Ras分子は、細胞膜上でリン脂質並みに速い拡散運動をしているが、FRETを起こしている間は殆ど運動を停止した。Rasが活性化する時間帯のGFP-Raf-1の運動は、FRETシグナルの運動に一致した。いずれのeffectorとも結合しないRasの変異体も活性化した場合停留することから、活性化したRasの停留は、effectorとの相互作用によるものではないと考えられた。一方、上流のシグナル分子とは結合するH-Ras N17変異体は、リガンド刺激しても停留を示さなかった。また、この停留はカベオラ/ラフトに依存しなかった。これらの結果から、我々は、Rasが活性化に伴って、SUR-8などのRas scaffolding proteinに結合し、停留した場所で短時間に信号伝達をおこなってすぐに不活化される可能性を考えている。このようにして、癌遺伝子産物であるH-Rasのシグナル伝達は空間的・時間的に非常にタイトに制限され、暴走しないように、また、空間情報を維持するように厳密に制御されているものと考えられる。

このような、活性化されたRas分子の一時停留は、上流や下流のシグナル分子との結合によるものではなく、また、カベオラ/ラフトにも依存しなかった。ところが、活性化Rasのスキャッフォールディングタンパク質SUR-8は、一時停留を促進した。これは、Rasが活性化されると、SUR-8などのスキャッフォールディングタンパク質の結合により、シグナル伝達のための大きな活性化Ras分子複合体が協同的に形成されること、そこで下流分子にシグナルが伝達され、その後、複合体はすぐに分解されること、Rasシグナルは、エフェクターとのランダムな衝突だけで伝わるのではないこと、を示唆している。
ハイドライドイオン導電体の創製

本研究の目的は、数GPaの高圧下で合成される新規な水素化物においてハイドライドイオン(H^+)伝導の可能性を検討することである。今年度は、水素化物のBader解析による負イオン性の評価、核磁気共鳴による拡散現象の確認、複素インピーダンス法による電気伝導度測定を実施した。Bader解析では、常圧相であるMgH_2、高圧合成により得られる面心立方型のMg_7TiH_<16>、及び、高圧合成により得られる体心立方型のMgCuを仮想的に水素化H/M=0.5まで水素化した相を対象とした。水素の価数は常圧相のMgH_2では-0.82e、Mg_7TiH_<l6>では-0.79e、MgCuHでは-0.73eとなり、いずれも負イオン性が強いことが判明した。これら水素化物では、Mg-H間のBonding Critical Point(BCP)における電子密度のラプラシアンが正に大きいことや、さらには曲率の解析等から共有結合性よりもイオン結合性が強いことが示唆された。水素化物中でのイオン輸送を検証するためには核磁気共鳴のスピンー格子緩和を用いた。測定には、H共鳴周波数が300MHzであり、最高400°C程度まで昇温できる拡散プローブを装備したものを用いた。試料には、昨年度までに合成方法や水素量が確定されているMg-Y系水素化物を用いた。この試料では、合成時の水素供給源の有無によりMgY_2H_<7.8>とMgY_2H_6を作り分けることが可能である。いずれの試料においてもイオンの輸送を決定づけるT_1の極小が550K近傍で観測された。水素量の大小はT_1の極小が観測される温度にはほとんど影響しなかった。MgY_2H_<7.8>の電気伝導度はCO-CO_2またはAr-H_2雰囲気下で複素インピーダンス法により測定された。明瞭な円弧が確認されたが、イオン伝導性を示唆する低周波領域での立ち上がりは認められなかった。これは、主要なキャリアーが電子伝導度であり、イオン輸率が低いことに起因していると推察される。数GPaの高圧下で合成される新規な水素化物においてハイドライドイオン(H^-)伝導の可能性を検討することが本研究の目的である。今年度は以下の3項目を実施した。1.蛍石型結晶構造を有するMg-Y系水素化物の合成と物性まず、立方晶蛍石型結晶構造を有することが明らかとなっているMgY_2H_X水素化物の高圧合成条件の確立、結晶構造の精密解析、ならびに水素量の同定を実施した。目的の高圧水素化物は5GPa、800°C、2時間の合成条件により単相化された。SEM-EDXの組成分析結果と粉末X線回折データを用いたリートベルト解析によりMgとYは4aサイトを各々1/3、2/3の占有率でランダムに占めることが示唆された。水素量は溶解抽出法と熱重量分析からx=7.8であることが確認された。これらの結果よりMgY_2H_<7.8>水素化物中には水素空孔が存在することが明らかとなった。また、陽イオン-水素間の結合に関する知見を得るためにBader解析が実施された。2.ペロブスカイト型及び蛍石型結晶構造を有する新規水素化物の高圧合成イオン伝導の発現に有利であると推測されるペロブスカイト型及び蛍石型結晶構造を有する新規水素化物の探索を実施した。対象系はMg-TM-H系(TM=Zr, Nb, Mo)とした。これらの系には常圧下で合成されない新規な高圧水素化物が存在したが、それらの結晶構造は単斜晶系や六方晶系など対称性が低いものであった。3.高温高圧下におけるイオン伝導度測定技術の確立高温かつ数GPaの高圧下でのイオン伝導度の測定手法を検討した。水素化物の測定に先立ち、標準試料として単結晶8YSZを用いて25GPa、最高温度900°Cの条件下で複素インピーダンス解析を行える環境を構築した。その結果、8YSZの酸素イオン伝導に必要な活性化体積が12cm^3/molであることが明らかとなった。この手法を来年度水素化物のイオン伝導度測定に利用する。

水素化物中でのイオン輸送を検証するためには核磁気共鳴のスピンー格子緩和を用いた。測定には、H共鳴周波数が300MHzであり、最高400°C程度まで昇温できる拡散プローブを装備したものを用いた。試料には、昨年度までに合成方法や水素量が確定されているMg-Y系水素化物を用いた。この試料では、合成時の水素供給源の有無によりMgY_2H_<7.8>とMgY_2H_6を作り分けることが可能である。いずれの試料においてもイオンの輸送を決定づけるT_1の極小が550K近傍で観測された。水素量の大小はT_1の極小が観測される温度にはほとんど影響しなかった。MgY_2H_<7.8>の電気伝導度はCO-CO_2またはAr-H_2雰囲気下で複素インピーダンス法により測定された。明瞭な円弧が確認されたが、イオン伝導性を示唆する低周波領域での立ち上がりは認められなかった。これは、主要なキャリアーが電子伝導度であり、イオン輸率が低いことに起因していると推察される。
無給電判別機能と高耐衝撃性を持つ磁気反発型振動スイッチと知能化システムへの応用

無給電,判別機能、高耐衝撃性をもち、超低周波数で動作する磁気反発型の振動のリミットスイッチを開発した。異常振動を検出することができるので、防犯/災害対策/医療福祉/検査システムへの応用が期待できる。このスイッチの設計指針として、振動パラメータの導出と反発・吸着力を考慮した定量化を行った。反発しあった磁石はお互いに消磁しない限り反発しあうが、反発磁石間にある大きさの磁性体を挿入することによって、初期状態では反発しあい、設定値以上の加速度の振動を与えることで、この磁性体を媒介としてこれら反発しあった永久磁石が結合する現象を見出した。この現象を用いて、結合面に導電テープなどを貼り付けなど、振動のリミットスイッチとして応用することで、防犯/災害対策/医療福祉/検査システム、あるいは、粘性液中での吸着/反発作用の設定値の変化より粘度リミッタなどへ展開することである。すでに、永久磁石、磁性体の種類および非磁性材料との組み合わせや形状について調査した結果より、磁力や磁性体の大きさによって任意の特性に設計することができる設計の指針などを示しているが、反発磁石間の磁束を磁性体でどのように制御するかが重要となる。このことを踏まえてより詳細に、測定精度および、測定領域を調査し、そのメカニズムを解明することで物理的な限界を把握し、具体的な応用例を見出し、それぞれの応用に適したスイッチの設計と製作を行う。今年度実施した研究での成果は下記通りである。(1)バネ係数、減衰係数を導出して、スイッチの構造とそれら係数との定量的な関係を導き出した(2)ものづくり教育のための磁石教材として、公開講座や出前授業などで実施、紹介した。身の回りには、地震、風や交通による構造物のゆれ、手を振ることや居眠りで首が揺れる人間の動作などの多くの振動が存在する。これらの振動において、設定値以上の振動を加えると動作する振動のリミットスイッチである。その構造は、同極を向かい合わせた永久磁石とその間のどちらかの磁石に鋼などの磁性体を吸着させたもので構成する。このときの磁性体が反発磁石間の間隔によって磁化状態が変化するため、反発から吸着への構造変化を引き起こす現象を利用する。身の回りに存在する振動を受けて、この構造変化を引き起こし、吸着させたときに導通させることによってスイッチとなる。また、工作機械における軸ズレの微振動を検知して、無給電で光や音で知らせるシステムである。パソコンなどの識別装置や配線が不要なため携帯することが容易となり、駆動のための電池を必要としないため環境に優しい。このスイッチの設計や物理的な限界を知るためには、様々な構造においての定量的なパラメータが必要となる。そのため、振動パラメータであるバネ係数や減衰係数で表される振動方程式を用いて、周波数応答結果から振動パラメータを導出し、構造の長さについて、振動パラメータを定量化した。一方で、振動リミットスイッチでの反発磁石間の磁性体の磁化状態の観測や反発・吸着力を測定し、スイッチとして動作後に安定する構造を示してきた。導出した結合時のバネ係数や減衰係数と,反発力の最大値と吸着力との相関は調査したところ次のようになることがわかった。(1)バネ係数は,反発力の最大値が大きくなれば大きくなり,吸着力が大きくなれば小さくなる。(2)同様に、減衰係数は,反発力の最大値が大きくなれば小さくなり、吸着力が大きくなると大きくなると考えられるが、磁石と磁性体によって生じる渦電流による減衰も影響することがわかった。これらの関係を構造である磁性体の長さを用いて、数式として定量的に表すことができた.
生体分子デバイスの構築に向けた生体内電子移動に関する理論的研究

将来のデバイス化を見据えて、単分子計測の技術を駆使した分子の伝導度計測が盛んである。特に、フォトクロミック分子の伝導性は光異性化に伴って大きく変化するため、分子スイッチとしての応用が期待されている。Tamらは代表的なフォトクロミック分子であるジチエニルエテンについてその伝導度のON/OFF比をおよそ2桁程度であると報告している。一方、Roldanらはジチエニルエテンとは別のフォトクロミック分子であるジヒドロピレンについてその伝導度のON/OFF比をおよそ4桁程度であると報告している。両者とも電極と分子の接続にはピリジンをアンカーとして用いており、このON/OFF比の違いは主にπ骨格に起因するものと考えられる。そこで、我々は単純ヒュッケル法とグリーン関数法を組み合わせたアプローチによってこの系の伝導性について解析を行い、電極と分子の接点におけるフロンティア軌道の位相と振幅がジアリールエテンのスイッチ特性を支配していることを見出した。さらに、電極と分子を接続する位置(アンカーの置換位置)を変えることでON/OFF比を調整することが可能であることなども見出した。これは従来OFF状態であると考えられていた開環体がON状態として振る舞い、他方、従来ON状態であると考えられていた閉環体がOFF状態として振る舞う系の構築も可能であることを示唆しており、分子デバイスの設計の幅をさらに広げる有用な知見である。(抄録なし)πスタック系の電気伝導物性はDNAや有機伝導体などの系において幅広く調べられている。最近では単一分子レベルでのπスタック系の電気伝導度計測が可能となっている。単一分子レベルでの電気伝導物性を明らかにすることは、単一分子デバイスの実現のために非常に重要である。これまでに有機エレクトロニクスの分野において、電荷移動錯体や多環芳香族炭化水素などのπスタック系の電気伝導物性が数多く調べられている。特に、電荷移動錯体における電気伝導物性に関しては、分子性金属や有機超伝導体などの興味深い物性が報告されている。本研究では、生体内における電荷移動において重要な役割を果たしているキノン系に着目した。キンヒドロンは電子ドナーであるヒドロキノンと電子アクセプターであるベンゾキノンがπ-π相互作用によって結合した電荷移動錯体である。キンヒドロンのシクロファン型分子について、πスタック方向の電子輸送物性を非平衡Green関数法によって調べた。キンヒドロン分子のπスタック方向の伝導において整流特性が得られることが明らかとなった。整流比は0.8Vにおいて2.37であった。分子軌道に基づいた伝導性の解析を行ったところ、キンヒドロンの最低空軌道(LUMO)の電場に対する非対称的な挙動が整流作用の起源であることが明らかとなった。πスタック系の整流特性を単一分子レベルで示したのは本研究が初めてであり、今後の高機能な単一分子デバイスの設計において大変有用な知見を与える。πスタック系の電気伝導物性はDNAや有機伝導体などの系において幅広く調べられている。キンヒドロンの多層シクロファン型分子について、πスタック方向の電子輸送物性を非平衡Green関数法によって調べた。整流機構はAviramとRatnerによって提案されていた従来の分子整流素子のものとは異なり、ドナーのHOMOとアクセプターのLUMOが相互作用してできる分子全体のHOMOとLUMOの電場に対する応答によって説明できることを見出した。さらにこの機構に基づき、層数を増やしていくと整流特性が向上することを明らかとした。四層のシクロファン型キンヒドロン分子において最大整流比12.5を得ており、二層のシクロファン型キンヒドロン分子のそれに対して約5倍も整流特性が向上することを示した。

これは従来OFF状態であると考えられていた開環体がON状態として振る舞い、他方、従来ON状態であると考えられていた閉環体がOFF状態として振る舞う系の構築も可能であることを示唆しており、分子デバイスの設計の幅をさらに広げる有用な知見である。生体内での電子移動において重要な役割を果たしているキノンの伝導性について調べた。さらにそのデバイス化の可能性について有意義な提案を行った。単一分子レベルのπスタック系において整流作用が発現するということを初めて見出した。単一分子レベルのπスタック系においてπスタックを拡張することによって整流特性が向上するということを初めて見出した。今後はキノンとヒドロキノンの間のプロトン移動も考慮に入れ、更なるデバイスの高機能化について検討を行う。その際、プロトンと電子が共役したPCET(proton-coupled electron transfer)の効果が重要になってくると思われる。また、πスタック方向の伸長も行い、πスタックを介したドナーとアクセプターの相互作用についても検討を行う予定である。ヒドロキノンはラシカル阻害剤の一種である。ヒドロキノンがラジカルを補足するとセミキノンを生成する。シクロファン型キンヒドロン分子においてセミキノンが発生した場合の電子輸送物性、ラジカル輸送物性および整流特性について検討を行う予定である。さらに、ラジカルはスピンを持っているため伝導電子のスピンとも相互作用することが期待される。したがって、スピンに依存した伝導物性についても研究を行う。(抄録なし)
ステロイドコアクチベーターMTI-IIを用いた炎症制御による骨組織再生療法の開発

近年、発癌や動脈硬化症の発症に慢性炎症が関与することが注目されている。歯内治療においても慢性炎症が根尖部に持続していることが難治性の根尖性歯周炎の原因の一つと考えられる。今回、炎症の主たるシグナル伝達経路であるNF-κBシグナルを抑制するMTI-IIに着目し、骨芽細胞分化への影響について検討した。骨芽細胞様細胞にMTI-IIとTNFα、BMP4で刺激したところ、BMP4刺激によってALP活性上昇が誘導されたが、TNFαで刺激するとその活性は抑制された。しかし、MTI-IIで刺激した細胞ではその抑制が解除された。以上より、MTI-IIはBMPによる骨形成の有効な補助薬となる可能性が示唆された。根尖歯周組織に生じた骨欠損の再生を確実にするためには、感染制御と再生療法技術に加え、慢性炎症制御が重要と言える。そこで炎症の主たるシグナル伝達経路であるNF-κBシグナルを抑制するステロイド受容体コアクチベーターのMacromolecular Translocation Inhibitor II(MTI-II)に着目し、骨芽細胞様細胞における炎症応答抑制効果について検討した。今年度の研究においての研究実績としては、ヒト骨肉腫細胞MG-63にNF-κBルシフェラーゼ発現プラスミドを遺伝子導入し、MTI-IIの酸性アミノ酸領域を利用したペプチド(MTI-IIペプチド)で前処理した後、炎症性サイトカインTNFα(10 ng/ml)で刺激後にルシフェラーゼ活性を測定し、NF-κBの転写活性を分析した。MG-63細胞をTNFαで刺激すると、NF-κBの転写活性が著しく上昇した。しかし、MTI-IIによってNF-κBの転写活性の上昇が解除・抑制された。次に、MTI-IIペプチドとTNFαで刺激後、全RNAを調整し、NF-κB標的遺伝子としてMatrix metallopeptidase-2,9 (MMP-2,9)とInterleukin-6,8 (IL-6,8)のプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、発現を分析した。その結果、MTI-IIによってMMP-9やIL-6の発現が抑制されることがわかった。以上より、MTI-IIは抗炎症剤として有効であることが示唆された。重篤な根尖性歯周炎では大きな骨欠損を伴い,その再生には適切な歯内治療を行っても長期間を要することが多い.そこで骨の再生を確実にするためには,感染制御と再生療法技術に加え,慢性炎症制御が重要と言える.今回,炎症の主たるシグナル伝達経路であるNF-κBシグナルを抑制するMPAIDsを化学合成し, BMP誘導性の骨芽細胞分化に対するMPAIDsの影響について検討した.マウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞にNF-κBルシフェラーゼ発現プラスミドを遺伝子導入し, MPAIDsで前処理した後,炎症性サイトカインTNFα(10 ng/ml)で刺激後にNF-κBの転写活性を分析した.また, MPAIDsとTNFαで刺激後, NF-κB標的遺伝子としてMMP-9とIL-6,8の発現を分析した.さらに, MPAIDsとTNFα, BMP4(10 ng/ml)で刺激し,アルカリホスファターゼ(ALP)活性測定を行った.また,ウェスタンブロット法によりSmad1/5のリン酸化を分析した.その結果,細胞をTNFαで刺激すると, NF-κBの転写活性やMMP-9とIL-6,8の発現が著しく上昇したが, MPAIDsで刺激するとNF-κBの転写活性やNF-κB標的遺伝子の発現増加が解除・抑制された,さらに, BMP4刺激によって著明なALP活性上昇が誘導されたが, TNFαで刺激するとその活性は抑制された.しかし, MPAIDsで刺激した細胞ではその抑制が解除された.ただし, Smad1/5のリン酸化には変化がなかった.今回の結果より,TNFα刺激によるNF-κBシグナルを抑制することで, BMP誘導性の骨芽細胞分化を促進することから, MPAIDsがBMPによる骨形成の有効な補助薬となる可能性が示唆された.歯周組織平成25年度の計画としては、in vitro実験系において、骨芽細胞分化・炎症応答へのMTI-IIの影響を検討することを予定していた。その結果、MTI-IIによる石灰化能への影響の検討を現在行っているところではあるが、抗炎症効果の確認をすることができた。そのため、おおむね順調に進展していると考える。今後は引き続き、MTI-IIによる石灰化能への影響の検討を行う予定である。

具体的には、BMPとTNFα刺激で骨芽細胞の石灰化能と炎症応答も誘導し、MTI-II存在下・非存在下で一定時間培養後、位相差顕微鏡下で形態変化の観察を行う。また、細胞増殖能に及ぼす影響をWST-1 assayで、石灰化能へ及ぼす影響をアルカリフォスファターゼ(ALP)活性で検討する。さらに、骨芽細胞分化マーカーの発現をリアルタイムPCR法およびウエスタンブロット法で検討することを予定している。また、骨芽細胞株へのMTI-IIの影響が明らかとなった後、あるいは同時進行で、in vivo実験系において生体へのMTI-IIの影響を検討する。具体的には、ラット下顎骨第一臼歯を抜歯後、抜歯窩に(1)コラーゲンスポンジ単独、(2)MTI-II含有コラーゲンスポンジを埋入する。数週間後に埋入部位をμCTで撮影し、MTI-IIの有無による骨形成量の違いを骨形態計測により分析する。その後、下顎骨を摘出し、組織切片を作製する。組織形態や細胞の同定は、H•E染色によるスポンジ埋入部位の組織形態の観察およびTRAP染色によって行い、MTI-IIの影響を分析する予定としている。
疫学的評価方法を用いた不正咬合の人類学的特徴に関する研究

不正咬合の発現状況を疫学的評価方法を用いて調査するために、われわれはこれまでDenatal Aesthetic Index(DAI)を用いた比較研究を行ってきた。今回、インドネシア・バリ島在住の青年を対象としてこのDAIを用いた不正咬合の発現的特徴に関する疫学調査を行った。対象としてインドネシア・バリ島在住の18歳から31歳の青年の歯列模型を採取し、歯列咬合状態の明らかな173名(男85名、女88名)の歯列模型を用いて不正咬合の評価を行った。評価方法はConsらの方法に従って行い、この結果を既に報告されている日本人、台湾在住の中国人、およびConsらが報告したアメリカ人(白人)、アメリカ原住民の各集団に結果と比較し、インドネシア・バリ島青年における不正咬合の発現状況について考察した。バリ島青年におけるDAI値の平均値±標準偏差は、男性31.2±6.88、女性30.5±7.38、男女計173名では30.8±7.13であり、平均値では男女間に有意な差は認められなかった。次にすでに報告されている各集団の評価結果との比較を行った。バリ島青年と各集団のDAIの平均値をt-testを用いて比較した結果、台湾在住の中国人、アメリカ人(白人)に較べて有意(p<0.01)に審美性の劣る歯列を有しているものが多い傾向が認められた。しかし、日本人、アメリカ原住民との間には有意な差は認められなかった。DAIは一般人の歯列審美性感覚を基準とするものであり、DAI値が高いことはすなわち歯列審美性の低い歯列であるといえる。今回の結果から、バリ島青年における不正咬合の発現は、日本人やアメリカ原住民と非常に近似しており、台湾在住の中国人およびアメリカ人(白人)に較べて審美性の低い歯列を有するものが多いと考えられた。