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ランタニドナノ粒子の光特性を利用する膜タンパク質光操作分析法の創発

照射した近赤外光をアップコンバージョン粒子により青色光を放出する現象を用いて,既存の青色光照射により駆動する光制御システムを利用可能であるかどうかを確認するため,培養細胞を用いた検証実験を行った.具体的には,まずアップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基板上で光制御システムを導入した細胞を培養した.共焦点顕微鏡観察下で近赤外光レーザー(976 nm, CW)を照射し,青色光駆動光制御システムの駆動を検証した.検証した光制御システムとしては,細胞膜移行システム(iLID/Sspb, CRY2/CIBN),核内移行システム(LINuS),細胞膜移行システム(CRY2/CIBN),タンパク質クラスター化システム(CRY2olig)を使用した.その結果,アップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基盤上で培養した細胞において青色光駆動光制御システムが近赤外光レーザー照射により駆動することを確認した.さらに近赤外光ファイバーレーザーシステムを利用することで,最大約4 Wの近赤外光(976 nm)を直径約1 cmの範囲に照射するシステムを構築し,光制御システムによる細胞内シグナル制御を試行した.具体的には,当研究室で開発したAkt光活性化システム(optoAkt),および遺伝子発現制御システム(GAVPO)を用いて検証実験を行った.結果,光制御に伴うAktの活性化,および遺伝子発現を確認できた.また,アップコンバージョン粒子をマウス個体に静脈注射し,各臓器の滞留時間を肝臓スライスの組織染色および蛍光観察により検証した.その結果,肝臓においては導入から24時間後でも安定して滞留していることが確認された.申請時に予定していた(I)アップコンバージョンLNPの表面修飾と光操作ツールの開発については,概ね予定通りの成果を得ることに成功している.特に光操作タンパク質であるCRY2が,LNPの近赤外光照射により動作することが培養細胞レベルで確認することができたこと,さらに近赤外光ファイバーレーザーシステムにより光操作ツールが駆動できることが解ったことから,マウス個体内での光操作を実現するための基礎データが着実に得られたことは技術的に大きな進捗であった.また表面修飾したLNPをマウス尾静脈から導入して,安定して肝臓に滞留させる技術を確立することができた.今後は,マウス個体の外部からの赤外光照射,あるいは光ファイバー導入による赤外光照射いずれも,CRYを動作することが大きく期待できる成果である.本年度は,モデルとして肝臓に焦点をしぼり,肝臓の特異的膜リセプターを外部光により時間的・空間的に制御できることを実証する.マウスに光操作ツールを発現するレトロウィルスを導入して,肝臓に発現させる.また表面修飾をしたLNPをマウスの尾静脈から注入し,肝臓表面に浮遊させる.マウスの腹側から局所的に近赤外光を照射し,CRY2の構造変化を惹起させ,光操作ツールを細胞膜上で活性化または不活化できることを実践する.光照射から1時間後まで,経時的に肝臓のスライス切片を作成し,免疫染色ならびにWestern blotにより肝細胞内のシグナル活性を,タンパク質リン酸化などを指標として評価する.最終的には,マウス肝臓深部での近赤外光による光操作が実現可能であることを実験的に立証する.照射した近赤外光をアップコンバージョン粒子により青色光を放出する現象を用いて,既存の青色光照射により駆動する光制御システムを利用可能であるかどうかを確認するため,培養細胞を用いた検証実験を行った.具体的には,まずアップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基板上で光制御システムを導入した細胞を培養した.共焦点顕微鏡観察下で近赤外光レーザー(976 nm, CW)を照射し,青色光駆動光制御システムの駆動を検証した.検証した光制御システムとしては,細胞膜移行システム(iLID/Sspb, CRY2/CIBN),核内移行システム(LINuS),細胞膜移行システム(CRY2/CIBN),タンパク質クラスター化システム(CRY2olig)を使用した.その結果,アップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基盤上で培養した細胞において青色光駆動光制御システムが近赤外光レーザー照射により駆動することを確認した.さらに近赤外光ファイバーレーザーシステムを利用することで,最大約4 Wの近赤外光(976 nm)を直径約1 cmの範囲に照射するシステムを構築し,光制御システムによる細胞内シグナル制御を試行した.具体的には,当研究室で開発したAkt光活性化システム(optoAkt),および遺伝子発現制御システム(GAVPO)を用いて検証実験を行った.結果,光制御に伴うAktの活性化,および遺伝子発現を確認できた.また,アップコンバージョン粒子をマウス個体に静脈注射し,各臓器の滞留時間を肝臓スライスの組織染色および蛍光観察により検証した.その結果,肝臓においては導入から24時間後でも安定して滞留していることが確認された.申請時に予定していた(I)アップコンバージョンLNPの表面修飾と光操作ツールの開発については,概ね予定通りの成果を得ることに成功している.特に光操作タンパク質であるCRY2が,LNPの近赤外光照射により動作することが培養細胞レベルで確認することができたこと,さらに近赤外光ファイバーレーザーシステムにより光操作ツールが駆動できることが解ったことから,マウス個体内での光操作を実現するための基礎データが着実に得られたことは技術的に大きな進捗であった.また表面修飾したLNPをマウス尾静脈から導入して,安定して肝臓に滞留させる技術を確立することができた.

今後は,マウス個体の外部からの赤外光照射,あるいは光ファイバー導入による赤外光照射いずれも,CRYを動作することが大きく期待できる成果である.本年度は,モデルとして肝臓に焦点をしぼり,肝臓の特異的膜リセプターを外部光により時間的・空間的に制御できることを実証する.マウスに光操作ツールを発現するレトロウィルスを導入して,肝臓に発現させる.また表面修飾をしたLNPをマウスの尾静脈から注入し,肝臓表面に浮遊させる.マウスの腹側から局所的に近赤外光を照射し,CRY2の構造変化を惹起させ,光操作ツールを細胞膜上で活性化または不活化できることを実践する.光照射から1時間後まで,経時的に肝臓のスライス切片を作成し,免疫染色ならびにWestern blotにより肝細胞内のシグナル活性を,タンパク質リン酸化などを指標として評価する.最終的には,マウス肝臓深部での近赤外光による光操作が実現可能であることを実験的に立証する.培養細胞を用いたLNPの光操作実験にて,夾焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡をしようしていたが,不測の故障が生じたため,当装置の修理・調整が必要となり,評価実験の再開に時間を要した.翌年度分として請求した助成金は,培養細胞を用いた光操作実験の検証のための消耗品として使用する予定である.
浮上工具方式による超平面切削加工技術に関する研究

現在の超精密切削の基本概念は,「極めて運動精度の優れた工作機械で,極めて切れ味のよい工具を用いて,極めて被削性のよい加工物表面に工具形状を転写する」という加工機械の運動転写原理に従っている.このため加工物の弾性変形量を無視できる範囲内で,非常に精度の高い加工機械により切削が行われれば,高精度の加工面が期待できる.しかし,現状の超精密工作機械の運動精度は非常に優れているものでも10nm程度であり,またこれらの運動の駆動源は特定の周波数が卓越する振動成分を持っているため,今後これを改善していくことが困難な状態にある.そこで,本研究では「加工機械の運動誤差や振動によらず,ダイヤモンド切削により超平面を製作する基本技術を確立すること」を目的としている.こうした加工機械の運動精度によらず高精度の加工面を得る方法としては,圧力転写原理を応用した研磨加工法が存在するが,本研究では運動転写原理と圧力転写原理を混合したハイブリッドな方法による加工を試みた.すなわち,ダイヤモンド工具を取り付けたスライダを,磁気ディスクドライブ装置のように流体の動圧により加工物から微小量だけ浮上させ,スライダが加工物表面に倣いながら切削していく技術「前加工面基準の加工」を実現した.この方法は,(1)スライダ面は前加工面の粗さの基本波長の500倍程度の大きさを有しているために,そのスライダ面の平均化効果により仕上げ面粗さを向上できる,(2)加工面表面形状のうねり成分の周波数が高くなるほど,スライダの加工面に対する追従は悪くなる.この加工面に対するスライダの追従遅れを利用すれば,加工面のうねりを向上できるという二つの大きな特徴があることが明らかになった.現在の超精密切削の基本概念は,「極めて運動精度の優れた工作機械で,極めて切れ味のよい工具を用いて,極めて被削性のよい加工物表面に工具形状を転写する」という加工機械の運動転写原理に従っている.このため加工物の弾性変形量を無視できる範囲内で,非常に精度の高い加工機械により切削が行われれば,高精度の加工面が期待できる.しかし,現状の超精密工作機械の運動精度は非常に優れているものでも10nm程度であり,またこれらの運動の駆動源は特定の周波数が卓越する振動成分を持っているため,今後これを改善していくことが困難な状態にある.そこで,本研究では「加工機械の運動誤差や振動によらず,ダイヤモンド切削により超平面を製作する基本技術を確立すること」を目的としている.こうした加工機械の運動精度によらず高精度の加工面を得る方法としては,圧力転写原理を応用した研磨加工法が存在するが,本研究では運動転写原理と圧力転写原理を混合したハイブリッドな方法による加工を試みた.すなわち,ダイヤモンド工具を取り付けたスライダを,磁気ディスクドライブ装置のように流体の動圧により加工物から微小量だけ浮上させ,スライダが加工物表面に倣いながら切削していく技術「前加工面基準の加工」を実現した.この方法は,(1)スライダ面は前加工面の粗さの基本波長の500倍程度の大きさを有しているために,そのスライダ面の平均化効果により仕上げ面粗さを向上できる,(2)加工面表面形状のうねり成分の周波数が高くなるほど,スライダの加工面に対する追従は悪くなる.この加工面に対するスライダの追従遅れを利用すれば,加工面のうねりを向上できるという二つの大きな特徴があることが明らかになった.現在の超精密切削の基本概念は、「極めて運動精度の優れた工作機械で、極めて切れ味のよい工具を用いて、極めて被削性のよい加工物表面に工具形状を転写する」という加工機械の運動転写原理に従っている。しかし、現状の超精密工作機械の運動精度は非常に優れているものでも10nm程度であり、これを改善することが困難な状況にある。そこで、前加工面に倣いながら、しかも前加工面よりも優れた加工面を得るために、圧力転写方式で単刃切削の加工法を提案した。すなわち、具体的には磁気ディスクドライブ装置の浮動スライダに切れ味のよい工具(切刃)を取りつければ、スライダは前加工面に倣いながら移動し、切刃の突き出し量と浮上すきまとの差が切込み量となる。この際、浮上すきまは動圧とスライダの面積により決定されるため、加工物の回転速度やスライダの押し付け荷重を調整することにより、変化させることが可能である。この加工法の特徴は、(1)切刃先端が粗さの山と谷の中間にくるように設定することにより、スライダの面積分の平均化効果により、粗さの山部のみを削り取ることが可能で、粗さを向上することができる。(2)スライダは前加工面に倣いながら上下するが、波長の短い周波数の高いうねり成分に対しては追従しきれずに、切込み量が増加する。この現象を利用すれば、うねりの向上を図ることができる。本年度は、この加工方法の加工メカニズムの検討を行い、上記の山部のみが切削されるトランケ-ションが、12μmRmaxの粗仕上げ面のみならず50nmRmax程度の超精密仕上げ面についても生じることが確認された。さらにうねり成分についても向上する可能性があることが確められた。今後、この加工法の制御性を高めることについて検討を行うと共に加工限界について明確にする予定である。現在の超精密切削の基本概念は,「極めて運動精度の優れた工作機械で,極めて切れ味のよい工具を用いて,極めて被削性のよい加工物表面に工具形状を転写する」という加工機械の運動転写原理に従っている.

このため加工物の弾性変形量を無視できる範囲内で,非常に精度の高い加工機械により切削が行われれば,高精度の加工面が期待できる.しかし,現状の超精密工作機械の運動精度は非常に優れているものでも10nm程度であり,またこれらの運動の駆動源は特定の周波数が卓越する振動成分を持っているため,今後これを改善していくことが困難な状態にある.そこで,本研究では「加工機械の運動誤差や振動によらず,ダイヤモンド切削により超平面を製作する基本技術を確立すること」を目的としている.こうした加工機械の運動精度によらず高精度の加工面を得る方法としては,圧力転写原理を応用した研磨加工法が存在するが,本研究では運動転写原理と圧力転写原理を混合したハイブリッドな方法による加工を試みた.すなわち,ダイヤモンド工具を取り付けたスライダを,磁気ディスクドライブ装置のように流体の動圧により加工物から微小量だけ浮上させ,スライダが加工物表面に倣いながら切削していく技術「前加工面基準の加工」を実現した.この方法は,(1)スライダ面は前加工面の粗さの基本波長の500倍程度の大きさを有しているためにそのスライダ面の平均化効果により仕上げ面粗さを向上できる.(2)加工面表面形状のうねり成分の周波数が高くなるほど,スライダの加工面に対する追従は悪くなる.この加工面に対するスライダの追従遅れを利用すれば,加工面のうねりを向上できるという二つの大きな特徴があることが明らかになった.
スピン偏極ＳＴＭによる単一分子の磁気伝導特性の解明

有機分子π電子軌道と磁性金属3d電子軌道の強い結合を、走査トンネル顕微鏡(STM)およびSTM電子分光法を用いて探ってきた。3d電子状態をフェルミ準位近傍に有する基板に、π共役系有機分子を吸着すると強い電子混成による新たな結合が生じ、吸着エネルギーが熱拡散エネルギーを上回り、室温でも熱拡散しない単一有機分子および単分子膜を実現した。また、逆に、単一有機分子を下地として、これに磁性原子を吸着すると、1個の有機分子内の局所的な配位子場により、磁性原子の3d電子状態が変化できることが判明した。グラフェンナノリボンのような大きな分子の基板への吸着方法の開発とSTM電子分光計測に成功した。「スピン偏極STMによる単一分子の磁気伝導特性の解明」を目指して、自作した300Kと4Kの2台の超高真空・スピン偏極STM(走査トンネル顕微鏡)を用いて研究を進めてきている。2013年度、単一フタロシアニン(Pc)有機分子を絶縁膜、貴金属、磁性金属という異なる電極に吸着し、その電子状態を正確に測定することに成功した。これまで電極による分子の電子状態への影響は小さいと考えられてきたが、単一有機分子を介する伝導は、分子そのものよりも2つの電極/分子界面の効果がより支配的である事が分かった。さらに、この研究を進める過程で面白いことが分かってきた。単一有機分子接合による精密な電子スピン伝導測定は、これまで極低温でしか成功していなかった。温度上昇に伴い分子が拡散するためである。しかし、理論と実験による研究から、鉄(001)面を電極とすれば室温でも単一Pc分子は熱拡散しなくなることを実証した。Pc分子のLUMOが、エネルギー的に近い位置にある鉄(001)の電子状態と強く結合し、貴金属に比べ分子はFe(001)電極に強く吸着し、さらに非常に高い拡散エネルギー障壁が生じることにより室温でも熱拡散しなくなる事が明らかとなった。室温・単一有機分子磁気接合の実現への手掛かりを掴んだ。また、Pc分子はスピン偏極していない。一方、Fe(001)電子状態は少数スピンが支配的である。そのため、Fe (001)の少数スピンは分子の少数スピンと結合し新たな混成少数スピン電子状態を形成する(状態位置シフト)。一方、鉄(001)には多数スピンがほとんどないため、分子の多数スピンは影響を受けない。結果として、Fe(001)/分子界面にスピン偏極電子状態が発現することが分かった。「スピン偏極STMによる単一分子の磁気伝導特性の解明」を目指して、自作した300Kと4Kの計3台の超高真空・スピン偏極STM(走査トンネル顕微鏡)を用いて研究を進めてきている。単一フタロシアニン(Pc)有機分子を絶縁膜、貴金属、磁性金属という異なる電極に吸着し、その電子状態を正確に測定することに成功した。さらに、磁性金属のFe(001)と単一Pc分子の間の電子結合を利用することで、温度を極低温から室温へ上昇させても熱拡散しない、室温でも安定な単一分子接合を作成できることを実証した。単一分子を介する磁気伝導は、分子と磁性金属電極界面で発現するスピン偏極度ベクトルが起因である。解析を進めていく中で、この界面スピン偏極度ベクトルの定量的測定手法を求めた。その結果、磁性基板の磁区上の単一有機分子のスピン偏極度は、ひろく使用されている微分伝導dI/dVでは検出できないことが分かってきた。新たにトンネル確率関数で規格化する必要があることを見つけた。この手法を用いて初めて単一分子の定量的スピン検出が可能となる。さらに、スピン偏極度はベクトルである。x , y, z成分を測定する必要がある。試料にx,y,z方向から磁場を印加する。その際、探針のスピンは外磁場応答してほしくない。そこで外字場応答しない反強磁性探針を開発し、そのスピン偏極度を求めた。現在、超電導コイルを自作しこれを新たな交流したクライオスタットに取り付け、磁場印加実験を開始する。世界初の、単一分子スピン偏極度ベクトルの定量的3次元測定を目指す。本研究では原子分解能を有する走査トンネル顕微鏡(STM)を用いる。STMは、“観る"だけでなく探針を用いて分子を操作できる。動かしたい分子に探針を接近させ、横方向へ針を動かすと1個の分子だけを選択的に移動できる。さらに、電気伝導測定を行いながら探針を分子へ接近させ、探針先端を分子に接触させる事で単分子接合を作成し、単一分子を介する伝導が測定できる。2011年に我々はスピン偏極STMを用いて1個の有機分子を介する伝導を調べた所、単一分子を挟む2つの磁性電極の磁化の結合(平行・反平行)で分子を介する伝導を制御できることを発見した。本研究では「スピン偏極STMによる単一分子の磁気伝導特性の解明」を行ってきている。以下の3研究テーマの測定・解明を目指してきている。(1)STM原子操作による磁性原子と単一分子複合体を介する磁気伝導。(2)CO単一分子・磁性原子複合体を介する磁気伝導測定。(3)グラフェンナノリボン伝導への有機分子・磁性原子ドープ効果。(1)原子レベルで平坦な基板に吸着したπ

電子系の単一フタロシアニン分子に、同じ基板上に吸着した単一磁性原子をSTM探針で動かし任意の位置に吸着させる。原子は、分子の吸着位置により異なる配位子場分裂を生じ、異なるスピン角運動量Sおよび伝導が生じると考える。原子レベルでの分子伝導制御を行う。(2)2次元CO膜は分子グラフェンの特性を示すことが知られる。このCO分子と単一磁性原子をSTM原子操作で組み合わせることで、人工的に新たな原子複合体ができる。1個の原子・分子が与える伝導への影響を正確に測定する。(3)グラフェンナノリボンはグラフェンと類似の伝導特性を有するが、幅とキラリティを有する。これに単一分子・単一磁性原子・単一ナノ磁石を吸着することで、グラフェン伝導の新たな可能性を探る。「スピン偏極STMによる単一分子を介する磁気伝導の解明」では、上記の3つの研究テーマの実現を目指して研究を順次行ってきている。(1)2015年度までに、Cu(111)基板上にH2Pc単一分子を吸着し、同じ試料基板上にFe単一原子を吸着した。STM探針を用いて原子を分子に向けて動かした。その結果、分子の上2サイトに吸着することがわかった:分子の中心と側鎖の上。STM分光測定と第一原理計算より、吸着サイトにより異なる配位子場分裂が生じFe原子のスピン角運動量が変化することが分かった。Co原子でも同様に測定を行った。(2)CO単一分子を介する伝導は、Cu(111)基板上のCO分子を吸着しW探針を用いて[Cu/CO/W]接合を作成、約0.1Goであった。しかし、CO単一分子をW探針先端に吸着し、[Cu/CO-OC/W]接合では伝導は0.002Goまで急激に減少した。原因は、CO分子同士が接近した際、CO分子間で斥力が働きCu(111)上の分子が横方向に一原子格子分移動したためであった。さらにCu(111)上の隣り合う2つのCO分子に対して伝導測定を行うと、伝導0.001Goでふたたび横方向に動いた。この伝導測定の結果から、各接合の場合のポテンシャル曲線を作成できた。(3)A01班の田中啓文グループとの共同研究で、グラフェンナノリボンを金膜基板上に液滴し、これを我々の装置で超高真空加熱することで、清浄なグラフェンナノリボンを得た。偶然、2枚のグラフェンナノリボンが交差する位置を見つけ、ここでSTM分光測定を行った。Au膜上のGNRは通常金属的な特性を示すが、クロス部分ではギャップが開きp型半導体特性を示した。また、グラフェンナノリボン内では、電子状態を形状の変化に比べて非常に安定である事も確認した。本研究では原子分解能を有する走査トンネル顕微鏡(STM)を用いる。STMは、“観る"だけでなく探針を用いて分子を操作できる。動かしたい分子に探針を接近させ、横方向へ針を動かすと1個の分子だけを選択的に移動できる。さらに、電気伝導測定を行いながら探針を分子へ接近させ、探針先端を分子に接触させる事で単分子接合を作成し、単一分子を介する伝導が測定できる。2011年に我々はスピン偏極STMを用いて1個の有機分子を介する伝導を調べた所、単一分子を挟む2つの磁性電極の磁化の結合(平行・反平行)で分子を介する伝導を制御できることを発見した。本研究では「スピン偏極STMによる単一分子の磁気伝導特性の解明」を行ってきている。
高分子の結晶化過程・結晶形態の分子量依存性に関する研究

分子量の異なるポリエチレンを用いて、結晶化過程、結晶形態の分子量依存性を調べた。結晶化速度の分子量依存性を調べるためには、大きさが無限大とみなし得るほど大きな結晶の融点、すなわち平衡融点の分子量依存性を明らかにする必要がある。本研究では、高圧下で生成した伸びきり鎖単結晶を固相転移させたものを用い、これの融点を測ることで、平衡融点の分子量依存性を決定することが出来た。このようにして決定した平行融点の分子量依存性から、結晶化速度の過冷却度依存性を決定し、分子量によりどのように変化するかを調べた。その結果、結晶化速度が、分子量に依らず、V=Aexp(-B/Tc・△T)の温度依存性に従うことが分かった。ここで、Tcは結晶化温度、△T(≡Tm^0-Tc、Tm^0:平衡融点)は、平衡融点と結晶化温度の温度差即ち過冷却度である。平衡融点の近くでの結晶化によって得られるtypeAと呼ばれるモルホロジーを持った単結晶の生成では、最小二乗によりAとBの値を決定した結果、Bは分子量に依らず一定であるが、Aは分子量に大きく依存し、分子量の増加と共に大きく減少することが分かった。高分子の結晶成長は、結晶成長界面に吸着した高分子鎖が結晶ラメラに取り込まれることにより進行するというモデルを立て、これに基づく理論的考察より、Aは高分子鎖の重合度nに対して、A∝exp(-bn^<1/2>)の分子量依存性を持つことが予測され、実験値はこれによくあうことを示すことが出来た。
消化管筋線維芽細胞プロテアーゼ活性化受容体の炎症性刺激による発 現調節機構

消化管筋線維芽細胞の線維化過程におけるPAR(protease activated receptor)の役割は明らかとされていない。そこで,本研究では,消化管筋線維芽細胞におけるPARの役割と発現調節機構を明らかにすることを目的とした。その結果,炎症性刺激による細胞に発現するPAR絶対量の時間的変化は認められなかったが,炎症と深く関与する生理活性物質PGE2により,細胞膜から細胞質内への空間的変化が観察された。プロテアーゼ活性化受容体(PAR)は、トリプシンなどのプロテアーゼによって受容体自身が持つリガンド部位が露出し、受容体自身に結合して活性化する。一方、粘膜上皮細胞の分化増殖の足場になる消化管筋線維芽細胞の,線維化過程におけるPARの役割は明らかとされていない。そこで,本研究では,消化管筋線維芽細胞におけるPARの役割と発現調節機構を,常在型マクロファージとの相互反応という観点から明らかにすることを目的とした。1)炎症性刺激によるPAR発現の時間的変化炎症に伴い増加するprostaglandin E2の処置により,PAR2のタンパク質発現量をwestern blotting方により検討したが,PAR2発現量の変化は認められなかった。2)炎症性刺激によるPAR発現の空間的変化炎症に伴い増加するprostaglandin E2の処置により,PAR2の細胞な局在を,Flag-PAR2-HAを導入した細胞を用いて検討したところ,PGE2の刺激時間に応じて,細胞膜のPAR2発現量が減少し細胞内発現量が増加した。この結果より,PGE2によりPAR2がinternalization起こすことが示唆された。また,これはEP2またはEP4受容体の活性化を介するcAMP増加により起こることが示唆された。1)炎症性刺激によるPAR発現の時間的・空間的変化炎症に伴い増加するprostaglandinE2は細胞内cAMP濃度が増加することで,PAR2タンパク質発現量を変化させることなく,細胞膜のPAR2発現量が減少し細胞内発現量が増加した。そこで,より直接的にPAR2の空間的変化を確かめるため,Flag-PAR2を強制発現させた細胞の作成に着手し成功した。H24年度にその細胞を利用して空間的変化について更に検討する。2)消化管筋線維芽細胞の機能に関する研究消化管筋線維芽細胞に対するPAR2発現とその活性化の影響はこれまで検討されていなかった。我々は,単離初代培養筋線維芽細胞標本を用いてこの点について検討し,PAR1,2,3,4が発現していること,また,PAR2刺激によりこの遊走能が活性化されることを見出した。また,筋線維芽細胞の病態生理機能解析のために,スフィンゴシンによる遊走能変化についても検討し,スフィンゴシン受容体2を介して遊走能が抑制されていることを明らかとした。3)マクロファージのLPS受容体のトリプシンによる変化常在型マクロファージの機能に対する,PAR2活性化薬トリプシンの役割を検討した。・トリプシンはPAR2受容体を介することなく,正PS受容体活性化経路を抑制し,それはセリンープロテアーゼ機能に由来するCD14タンパク質の分解に寄ることが明らかとなった。1)不死化筋線維芽細胞株の作成消化管筋線維芽細胞を用いた研究の発展を妨げてきた主要因の一つに,株化消化管筋線維芽細胞やその特異的抗体が存在しないことが考えられる。そこで申請者は,ウィルスベクターを用いて不死化した消化管筋線維芽細胞(LmcMF)と自然発生的不死化消化管筋線維芽細胞(SmcMF)の2種類の株化細胞をマウス結腸より樹立し,単離消化管筋線維芽細胞(IMF)と細胞性状を検討した。その結果,α-SMA等のタンパク質発現,LPSに対する反応性などにおいて,3種の細胞で違いは認められず,株化細胞の性状が等しいことを明かとした。2)消化管筋線維芽細胞のPARを介する情報伝達系に関する研究IMFおよびLmcMFとSmcMFを用いて,PAR受容体サブタイプの発現を遺伝子レベルで検討した。

その結果,いずれの細胞もPAR1,2,3,4が発現していることが明かとなった。また,PAR刺激により遊走能が活性化され,その刺激はPAR1と4を介したRac系に依存しており,PAR2刺激では遊走が起こらないことを明らかとした。また,PAR1と4の活性化により,p38やERK等のMAPキナーゼ系が活性化されることも明かとした。当初の研究目的である,消化管筋線維芽細胞のプロテアーゼ活性化受容体の炎症性刺激による発現調節機構を解明することに向け研究を行った結果,プロスタグランジンE2が細胞内cAMPを増加させることで,空間的制御を受けていることを明らかとした。24年度が最終年度であるため、記入しない。筋線維芽細胞の研究をより簡便にするために,不死化細胞の樹立を行う。また,上皮細胞との相互作用についても検討し,炎症性刺激が上皮細胞に由来すること,また筋線維芽細胞からの刺激により,上皮細胞が影響を受けていることを明らかにする。
明治期におけるロシア文化の受容の歴史

前半期は以下の各地において基本的文献の収集にあたり、所期な成果を挙げることができた。1).7月21日26日.東北地方のハリストス正教会(白河,仙台,石巻,盛岡,大館)を歴訪し、各教会所蔵の古文書を閲覧し、必要な個所を筆写ないし複写し、同時に各教会所属の古くからの信徒に回観談をうかがいこれを録音した。2).8月11日16日.北海道、札幌正教会においても同様の作業を行い、あわせて北海道大学村落スラヴ研究センター、北方資料室等で蔵書、ならびに所有資料を閲覧し、必要と思われる個所の複写を行った。3)10月13日11月3日大阪ハリストス正教会}11月6日11月10日京都ハリストス正教会}1).2)で記した各地の教会での作業と同様の作業に従事した。上記作業と並行して、『正教新報』『正教時報』(いづれもハリストス正教会本会の機関誌、前者は明治期に刊行、後者は大正、昭和の刊行にかかり今日に到っている。)を主として手掛りに、教会から派遣されてロシア各地の神学大学をはじめ教会関係の諸機関に学んだ神学生たちの帰国後の足跡を調査し、日露文化交流の一端を明らかにしようとつとめた。その成果は「ニライ堂の人々」という総合タイトルのもとで『窓』誌に連載中の論文である。
クロマチン構造および転写因子による染色体複製の制御機構の研究

1.転写因子の複製制御における役割の検討(村上)真核細胞において転写因子が複製を制御する分子機構はわかっていない。そこで、複製起点が詳細にわかっている出芽酵母を用いて、クロマチン免疫沈降法を用いて解析を行った結果、転写因子が複製のイニシエーターであるORCの複製起点への安定な結合を促すこと、さらにその促進がヒストンの高アセチル化を会していることを明らかにした。さらにショウジョウバエのChorion遺伝子の複製起点でも同様の現象が起こっている可能性が示唆されつつある。我々の結果は転写因子がその複製起点結合の特異性、言い換えれば複製起点の場所を決める因子として機能している可能性を示している。2.哺乳類細胞における複製起点の同定(宮武)competitive PCR法を用いた複製起点のマッピング法を確立し、IL-3/GM-CSFを産生しないヒト細胞株ではGM-CSF遺伝子下流領域に、産生細胞では、誘導的DNaseI感受性領域近傍に複製起点が検出された。このことは、転写特異的な遺伝子活性化特にアセチル化などによるクロマチン構造変換が複製活性を規定していることを示唆する。(2)前駆T細胞からTh2細胞に分化する過程でIL4/IL13領域の染色体構造が変化しこれらのサイトカインの産生が起こるがTh1細胞ではいずれもおこらない。精度を上げたマッピングより、Th1細胞でもすでにTh2細胞で見いだしていたのと同じIL13遺伝子下流のサイトカイン発現の制御領域とIL13遺伝子の間に複製起点が存在することがわかった。ポリオーマウイルス(Py)をモデル系として転写因子Runx1による複製制御機構の解析を複製ファクトリーとの関連からおこなった。ウイルス由来のイニシエータータンパク質のT抗原、Runx1の核マトリクス上での局在を複製ファクトリーの指標としてのPCNAの局在と比較検討を行ない、以下の結果を得た。なお、1)3)の結果は免疫蛍光染色を用いている。1)T抗原はS期特にS期初期においてPCNAと同一の局在を示し、複製ファクトリーにターゲティングする活性をもつ。これはPyDNAの有無に関係がなく、T抗原そのものにそのような活性があると思われる。2)Runx1はそれ自身ではPCNAと同じ局在を示さない。3)Py複製起点とRunx1結合部位をもつDNAが存在するときにRunx1はT抗原およびPCNAは同じ局在を示す。4)クロマチン免疫沈降法を用いて、T抗原は、複製起点近傍に結合する転写因子に依存して複製起点に結合することを示す予備的結果を得た。以上の結果から、転写因子はPy複製開始において複製起点近傍に結合し、そのDNAをT抗原が存在する複製ファクトリーにリクルートすることにより、複製開始を制御すると考えている。現在、このモデルを確認するために核内でのDNAの挙動をFISH法を用いて解析するための準備をおこなっている。真核細胞において染色体複製は「複製ファクトリー」と呼ばれる、核構造上に形成される核内構造体で起こる。一方、転写因子は転写のみならず染色体複製等の染色体機能ににおいて重要な働きをしている。我々は以前、核構造に結合する転写因子Runx1がポリオーマウイルス(Py)のDNA複製を促進し、その際、核構造への結合が必要なことを示している。核構造の結合と複製ファクトリーの関係を明らかにするための、さらにChIP法や蛍光免疫染色法による解析をおこない、以下の結果を得た。1)複製のイニシエータであるT抗原が複製因子PCNAと今日局在する。これはT抗原そのものが複製ファクトリーに局在する活性を持つことを示している。2)Runx1はT抗原のPy複製起点への結合をin vivoで促進する。その際核構造結合活性を持つ複製活性化ドメイン必要である。3)Runx1はPy複製起点とRunx1結合部位をもつ複製可能なプラスミドが存在するときにのみT抗原を含む複製ファクトリーに共局在する。これらのことから、我々はRunx1がPy複製起点をT抗原を含む複製ファクトリーにリクルートしているとのモデルを提出した。転写も核内の特定の構造体で起こることを考慮すると、標的DNAを適当な核構造にリクルートするのが転写因子の染色体機能における一般的な役割の一つなのかもしれない。宮武はIL13遺伝子領域に存在が予想される複製起点の同定をcompetitive PCR法でこころみ、実際にこの領域に複製起点が存在することを示唆する結果を得た。1.転写因子の複製制御における役割の検討(村上)転写因子に依存してゲノムDNA複製をおこなうポリオーマウィルスをモデル系として、転写因子の複製開始制御における役割を検討した。核マトリクスに結合する活性をもつ転写因子RUNX1によるポリオーマウィルスの複製促進の検討を行い、「RUNX1は複製起点に結合し、核マトリクス結合能を介してT抗原の存在する複製ファクトリーに複製起点をリクルートすることにより、複製を促進する」と結論した(図)。このような「核内の機能的コンパートメントへのリクルート」という活性化の機構は、今まで提唱されてきた活性化機構とは異なる新規のメカニズムである。2.哺乳類細胞における複製起点の同定(宮武)転写活性と複製活性の相関をクロマチン構造の変化と関連づけて解析するために、転写活性化のパターンやそれに伴うクロマチン構造の変化についての情報の豊富なサイトカイン遺伝子領域に着目し、複製起点の同定を行った。2)マウスIL-4/IL-13領域:この領域の複製起点をIL-4,IL-13

遺伝子を発現していない未分化状態のマウスES細胞で探索したところ、IL-13遺伝子の下流に複製起点が検出された。IL-4,IL-13等のサイトカインを発現するTh2細胞ではES細胞で見い出された複製起点とほぼ同じ領域に複製起点が見い出されたが、発現しないTh1細胞においては、調べた15kb内には複製起点は見い出されなかった。1.転写因子の複製制御における役割の検討(村上)真核細胞において転写因子が複製を制御しうることが明らかになりつつあるが、しかし、その分子機構はわかっていない。そこで、複製起点が詳細にわかっている出芽酵母を用いて、転写因子が複製開始のどのステップを制御するかクロマチン免疫沈降法を用いて解析を行った。その結果、転写因子が複製のイニシエーターであるORCの複製起点への安定な結合を促すことが明らかとなった。高等真核細胞ではORCのDNA結合特異性が低く何が複製起点への結合の特異性を決めているか明確で無かったが、我々の結果は転写因子がその複製起点結合の特異性、言い換えれば複製起点の場所を決める因子として機能している可能性を示している。2.哺乳類細胞における複製起点の同定(宮武)competitive PCR法を用いた複製起点のマッピング法を確立した、(1)IL-3/GM-CSFを産生しないヒト細胞株ではGM-CSF遺伝子下流領域に、産生細胞では、誘導的DNaseI感受性領域近傍に複製起点が検出された。このことは、転写特異的な遺伝子活性化に伴うクロマチン構造によりその複製活性が規定されていることを示唆する。(2)前駆T細胞からTh2細胞に分化する過程でIL4/IL13領域の染色体構造が変化しこれらのサイトカインの産生が起こるがTh1細胞ではいずれもおこらない。精度を上げたマッピングより、Th1細胞でもすでにTh2細胞で見いだしていたのと同じIL13遺伝子下流のサイトカイン発現の制御領域とIL13遺伝子の間に複製起点が存在することがわかった。この領域は種を超えて保存されていて、。ヒトの白血病細胞株においてこの領域の複製タイミングがS期の非常に初期であることがみいだされた。これはヒトでもこの領域に複製起点が存在する可能性を示している。1.転写因子の複製制御における役割の検討(村上)真核細胞において転写因子が複製を制御する分子機構はわかっていない。そこで、複製起点が詳細にわかっている出芽酵母を用いて、クロマチン免疫沈降法を用いて解析を行った結果、転写因子が複製のイニシエーターであるORCの複製起点への安定な結合を促すこと、さらにその促進がヒストンの高アセチル化を会していることを明らかにした。さらにショウジョウバエのChorion遺伝子の複製起点でも同様の現象が起こっている可能性が示唆されつつある。我々の結果は転写因子がその複製起点結合の特異性、言い換えれば複製起点の場所を決める因子として機能している可能性を示している。2.哺乳類細胞における複製起点の同定(宮武)
クロストリジウム・ディフィシル感染症に対するDNAワクチンの開発と応用

Clostridium (Clostridioides)difficileは医療関連感染の原因菌であり、その症状は下痢から腸閉塞や消化管穿孔まで幅広く、死亡例の報告も稀ではない。通常、C. difficile感染症の重症例ではメトロニダゾールやバンコマイシンによる治療を行うが、治療後の再燃・再発が多いため、他の治療・予防法が必要とされている。そこで、本研究では毒素をターゲットにしたワクチンを開発することを目的とした。毒素をターゲットにしたワクチンはトキソイドが一般的であるが、毒性復帰などの副反応の問題があるため、副反応を考慮した安全性の高いワクチンとして、毒素の活性領域を除いたDNAワクチンを考えている。昨年度構築したToxin Bに対するDNAワクチンの有用性をin vitro実験系において確認できたことから、本年度はin vivo実験系での効果を調査した。本DNAワクチンで免疫したマウスの血清とToxin Bを混合し、一定時間反応させた後、マウス腹腔内に投与し、生死判定を行った。コントロールマウスの血清と混合したToxin Bを投与したマウス群では、投与後数日で全てのマウスが死亡したが、免疫マウスの血清と混合したToxin Bを投与したマウス群では、投与後一週間経っても全てのマウスが生存していた。また、Toxin BとToxin Aは一次構造の相同性が90%であることから、本DNAワクチンがToxin Aにも効果があるかを調べたところ、本DNAワクチンを免疫したマウスの血清中にToxin Aに反応する抗体が存在することがwestern blotで認められ、さらに、Toxin Aの細胞障害活性の中和能を有していることがin vitroおよびin vivo実験系で確認することができた。Clostridium difficileは医療関連感染の原因菌であり、その症状は下痢から腸閉塞や消化管穿孔まで幅広く、死亡例の報告も稀ではない。通常、Clostridium difficile感染症(CDI)重症例ではメトロニダゾールやバンコマイシンによる治療を行うが、治療後の再燃・再発が多いため、他の治療・予防法が必要とされている。本年度は、DNAワクチンの構築を試みた。C. difficileの毒素には、toxin A、toxin B、binary toxinの3種類があることから、それぞれの毒素に対するDNAワクチンが必要となるため、まず、それぞれの毒素において、毒素の活性領域を除いた遺伝子配列のどの部分をDNAワクチンとして用いるかを検討した。Toxin Aおよびtoxin Bにおいてはレセプター結合領域、binary toxinにおいてはBサブユニットを中心に領域を変えた複数のDNAワクチンを構築し、HEK293T細胞へtransfectionした後、24時間培養し、DNAワクチン由来のタンパク質が発現しているかをwestern blotにて確認した。その結果、現在のところ、DNAワクチン由来のタンパク質の発現は確認できていない。本年度はDNAワクチンの構築を行い、DNAワクチン由来のタンパク質の発現を確認するところまでを予定していたが、現在のところ、培養細胞内でのタンパク質の発現は確認できていないため、研究の進捗状況としてはやや遅れている。本年度は、C. difficileの病原因子として最も重要なToxin Bに対するDNAワクチンを構築した。Toxin Bのレセプター結合領域の遺伝子をベクターであるpVAX1に結合し、HEK293T細胞へtransfectionした後、24時間培養したところ、細胞内にDNAワクチン由来のタンパク質が発現していることを、western blotを用いて確認した。次に、2週間に1度の頻度で計3回、マウスにDNAワクチンを投与し、抗体産生の有無をELISAで調べたところ、非常に高いレベルでの抗体産生が認められた。そして、この抗体に毒素の中和活性があるかVero細胞を用いて調べたところ、本抗体は中和活性を有していた。本年度はDNAワクチンの構築、培養細胞によるDNAワクチン由来タンパク質の発現、マウスでの抗体産生、抗体の中和活性まで確認することができたため、昨年度の遅れを取り戻すことができたと考えている。これにより、来年度はDNAワクチンのin vivoでの効果を確認することができるため、研究の進捗は順調と言える。

毒素をターゲットにしたワクチンはトキソイドが一般的であるが、毒性復帰などの副反応の問題があるため、副反応を考慮した安全性の高いワクチンとして、毒素の活性領域を除いたDNAワクチンを考えている。昨年度構築したToxin Bに対するDNAワクチンの有用性をin vitro実験系において確認できたことから、本年度はin vivo実験系での効果を調査した。本DNAワクチンで免疫したマウスの血清とToxin Bを混合し、一定時間反応させた後、マウス腹腔内に投与し、生死判定を行った。コントロールマウスの血清と混合したToxin Bを投与したマウス群では、投与後数日で全てのマウスが死亡したが、免疫マウスの血清と混合したToxin Bを投与したマウス群では、投与後一週間経っても全てのマウスが生存していた。また、Toxin BとToxin Aは一次構造の相同性が90%であることから、本DNAワクチンがToxin Aにも効果があるかを調べたところ、本DNAワクチンを免疫したマウスの血清中にToxin Aに反応する抗体が存在することがwestern blotで認められ、さらに、Toxin Aの細胞障害活性の中和能を有していることがin vitroおよびin vivo実験系で確認することができた。本年度は予定していた段階まで研究を進めることができなかったため、来年度は早々に培養細胞内でタンパク質の発現が行われる配列を持つDNAワクチンを構築し、本年度の遅れを取り戻したいと考えている。本年度は、DNAワクチンに組み込む毒素遺伝子の領域を変えることにより、培養細胞内でタンパク質が発現されるDNAワクチンを構築することを目指していたが、来年度はコドンの最適化などを加え、培養細胞内でのタンパク質発現の可能性を高める予定である。本年度は予定していた段階まで研究を進めることができたため、来年度は予定通り、DNAワクチンを投与したマウスに毒素そのものを投与し、その毒性を抑えることができるか、また、菌株を投与し、実際の感染に近いモデルでDNAワクチンの効果を検証することを予定している。年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成28年度分についてはほぼ使用済みである。外注作業が遅れ、本年度内の納品が間に合わず、次年度の納品および支払いとなった案件があったため、次年度使用額が生じた。本件についてはすでに納品され、現在支払い手続き中である。(約45万円)外注品が納品された後、動物実験を行う予定であったため、本件も上記と連動して次年度使用額となった。こちらも外注品が納品されたことからすでに動物実験を開始している。(約30万円)翌年度請求分の助成金は予定通り、主に動物実験に使用する予定である。上記のとおり。
認証・暗号化・負荷分散の機能を持つ情報コンセント管理用サーバの実装と評価

本年度の研究実施計画は,前年度に試作したプロトタイプシステムをベースとして,(1)複数の認証方式を追加・選択する機能の実現,(2)通信路の暗号化を追加・選択する機能の実現,(3)サーバの負荷分散(クラスタリング)機能への暗号化機能の追加,および,(4)プロトタイプシステムの運用による評価であった.まず,(1)と(2)に対しては,サーバ側でPPPoEとPPTPのそれぞれをサポートするプロセスが1枚のネットワークカードを共有できる仕組みを実現した.これにより,利用者はどちらのプロトコルでも選択して利用できる.(2)については,PPPoEとPPTPのどちらでも,暗号化手段としてMPPEを使えるようにした.(3)の負荷分散に対しては,複数サーバで構成しているときに,サーバ・クライアント間のセッションを別のサーバに移動させることで実現した.また,MPPE機能で使われている初期ベクタなどのシステム内部情報を取り出すAPIを,サーバのカーネルモジュールに追加することにより,暗号化を負荷分散機能に組み込むことができた.さらに(4)に対しては,学生食堂にて継続的に実証実験を続けた.PPPoEとPPTPの選択,およびMPPEによる暗号化を追加できるようにしたほか,クライアント側のプロキシ設定なども自動化できるようにしたので,スループットが若干落ちてもよい場合には,Wiindows(98/Me/2000/XP)に含まれているPPTPを利用してもちうことで,PPPoE用ドライバの配布やインストールの支援といった運用上の手間の問題を軽減できた.より高い通信速度を必要とする利用者は,多少のインストールの手間はかかるものの,PPPoEを選択することがでる.また,さらにセキュリティが必要な場合には暗号化を追加できる.このように利用者のニーズに応じた運用が可能であることを実証した.本年度の研究実施計画は,前年度に試作したプロトタイプシステムをベースとして,(1)複数の認証方式を追加・選択する機能の実現,(2)通信路の暗号化を追加・選択する機能の実現,(3)サーバの負荷分散(クラスタリング)機能への暗号化機能の追加,および,(4)プロトタイプシステムの運用による評価であった.まず,(1)と(2)に対しては,サーバ側でPPPoEとPPTPのそれぞれをサポートするプロセスが1枚のネットワークカードを共有できる仕組みを実現した.これにより,利用者はどちらのプロトコルでも選択して利用できる.(2)については,PPPoEとPPTPのどちらでも,暗号化手段としてMPPEを使えるようにした.(3)の負荷分散に対しては,複数サーバで構成しているときに,サーバ・クライアント間のセッションを別のサーバに移動させることで実現した.また,MPPE機能で使われている初期ベクタなどのシステム内部情報を取り出すAPIを,サーバのカーネルモジュールに追加することにより,暗号化を負荷分散機能に組み込むことができた.さらに(4)に対しては,学生食堂にて継続的に実証実験を続けた.PPPoEとPPTPの選択,およびMPPEによる暗号化を追加できるようにしたほか,クライアント側のプロキシ設定なども自動化できるようにしたので,スループットが若干落ちてもよい場合には,Wiindows(98/Me/2000/XP)に含まれているPPTPを利用してもちうことで,PPPoE用ドライバの配布やインストールの支援といった運用上の手間の問題を軽減できた.より高い通信速度を必要とする利用者は,多少のインストールの手間はかかるものの,PPPoEを選択することがでる.また,さらにセキュリティが必要な場合には暗号化を追加できる.このように利用者のニーズに応じた運用が可能であることを実証した.本年度は、既に試作したプロトタイプシステムに、(1)認証・追跡機能の充実、(2)通信の暗号化機能の追加実装、(3)サーバの負荷分散とその評価、を行う計画であった。まず、(1)に対しては、squidを用いた透過型プロキシ機能によるウェブアクセス追跡機能とメール配送のアクセス追跡機能を追加した。さらに、利用されているMAC addressの一覧を監視し、もし不正なMAC addressを発見した場合には警報を発する機能も追加した。次に(2)に対しては、MPPE(Microsoft Point to Point Encryption)機能を追加した。この機能は一部の実装には問題があることが分かり、その組合せの調査を、実験協力者の協力の元に行った。さらに、プロトタイプシステムで利用していたPPPoE(Point-to-Point Protocol over Ethernet)だけでなく、PPTP(Point-to-Point Tunneling Protocol)を併用する仕組みを、実験協力者の協力の元に行った。最後に(3)に対しては、PPPoEプロトコルに元来含まれている、接続時の負荷分散機能をさらに充実させるため、複数サーバ間で負荷情報を交換する仕組みを実装した。本年度は、これらに加えて、対象とする認証つき情報コンセントシステム自体を可搬型のシステムにまとめ、学会など、特に一時的な使用を要求される場面での利用を考慮したシステムの設計も行い、運用実験も行った。そのようなシステムでは、(1)さまざまな場面で簡単に設定・運用が出来ること、(2)さまざまな認証方式に対応できること、(3)必要十分な性能を持った上でコンパクトであることが要求される。これらの要求は本研究での要素技術が利用できるため、本研究の応用範囲が広いことが示された。本年度の研究実施計画は,前年度に試作したプロトタイプシステムをベースとして,(1)複数の認証方式を追加・選択する機能の実現,(2)通信路の暗号化を追加・選択する機能の実現,(3)サーバの負荷分散(クラスタリング)機能への暗号化機能の追加,および,(4)プロトタイプシステムの運用による評価であった.まず,(1)と(2)に対しては,サーバ側でPPPoEとPPTPのそれぞれをサポートするプロセスが1枚のネットワークカードを共有できる仕組みを実現した.

これにより,利用者はどちらのプロトコルでも選択して利用できる.(2)については,PPPoEとPPTPのどちらでも,暗号化手段としてMPPEを使えるようにした.(3)の負荷分散に対しては,複数サーバで構成しているときに,サーバ・クライアント間のセッションを別のサーバに移動させることで実現した.また,MPPE機能で使われている初期ベクタなどのシステム内部情報を取り出すAPIを,サーバのカーネルモジュールに追加することにより,暗号化を負荷分散機能に組み込むことができた.さらに(4)に対しては,学生食堂にて継続的に実証実験を続けた.PPPoEとPPTPの選択,およびMPPEによる暗号化を追加できるようにしたほか,クライアント側のプロキシ設定なども自動化できるようにしたので,スループットが若干落ちてもよい場合には,Windows(98/Me/2000/XP)に含まれているPPTPを利用してもらうことで,PPPoE用ドライバの配布やインストールの支援といった運用上の手間の問題を軽減できた.より高い通信速度を必要とする利用者は,多少のインストールの手間はかかるものの,PPPoEを選択することができる.また,さらにセキュリティが必要な場合には暗号化を追加できる.このように利用者のニーズに応じた運用が可能であることを実証した.
カイコガ精巣内エクジステロイド合成の制御機構

精子形成と精巣でのエクジステロイドとの関係、合成に関するペプチドホルモン類の関与などについて調べ、精巣でのエクジステロイド合成制御機構を解明することを目的として研究を行った。得られた結果は以下の如くである。1.5齢0日目から羽化にいたる間でのエクジステロイドの変動について体液および精巣で調べた。体液中でのエクジステロイドは既知の報告と同様の変動が見られた。また精巣での変動はほぼ体液の変動とパラレルであったが、その含量は体液の約1/1000であった。精巣でのエクジステロイドは主に20Eであった。2.マイマイガのTestis-ecdysiotropin(TE)のカイコガ精巣に対するエクジステロイド合成刺激作用について、培養系をもちいて検討した。その結果、(1)TEはカイコガ精巣エクジステロイドの合成を活性化する(2)TEによる精巣エクジステロイドの合成刺激作用はステージスペーシフィクであった(ワンダリング期での精巣はTEによりエクジステロイド合成を2-3倍高められるが、その他の時期では効果が見られなかった。(3)TEは前胸腺に対しては活性化作用は持ってなかった。(4)TEの効果が培養液で認められるのは投与後23時間目からであった。3.既知カイコガペプチドホルモン類は培養系で、いずれも精巣エクジステロイド合成を活性化することはなかった。4.以上の結果より、精巣でのエクジステロイド合成は既知のカイコガペプチドホルモン類ではなく、新規の物質が関与している可能性が高いことが示唆された。TEがカイコガ精巣のエクジステロイド合成に関与していることから、TEに類似した新規ペプチドホルモンの検索が次年度の検討課題となった。