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戦前期南洋の地域形成と沖縄県出身移民に関する基礎的研究

研究の目的は、1.沖縄県出身者の移動現象そのものを解明すること。2.沖縄県出身移民が南洋の地域形成に、どのように関与していたのかを空間的に解明すること。3.沖縄県出身移民の生活経験を、彼ら自身あるいは現地住民の証言から記録をとること。4.内南洋と外南洋で沖縄県出身移民の形態を比較すること。以上の四点である。移動現象については、沖縄県庁所蔵の「引揚者在外事実調査票(1万3千人分の情報記載)」をデータベース化することによって、その輪郭が明らかになった。また、沖縄県出身移民など日系移民により構築されて施設が、ニューカレドニアのヌーメア等でみられるように現在の市街地でも活用されていることを確認した。第二次世界大戦は、沖縄県出身移民に多くの犠牲者を出すこととなった。内南洋では、そのほどんとが日本・沖縄へ引き揚げたが、外南洋(ニューカレドニア)では戦争勃発とともに家族が離散し、残留沖縄県系人が発生した。これらの地域と沖縄とでは、ダバオ会等の組織にみられるように沖縄と現地のつながりが現在でも維持され、ニューカレドニアでは、残留沖縄県系人の存在を契機として、沖縄に友好協会が設立された。以上の四点である。本研究の目的は,戦前期南洋に着目しながら沖縄県出身移民の実態を明らかにするところにある。4年計画の1年目である本年度は,1.南洋に関する資料収集,2.南洋帰還者のデータベース作成,3.現地調査の実施,4.南洋帰還者への聞き取り調査の準備,を行った。具体的には,米国議会図書館で南洋庁コレクションの所在を確認するとともに,米国公文書館で戦闘終結後に設置されたフィリピン・ダバオの捕虜収容所の収容者名簿を発見・複写した。また,沖縄県の海外引揚者の実態を市町村および町丁字レベルから把握することを念頭に,沖縄県庁が所蔵する約1万3千人の情報が記載された「引揚者在外事実調査票」の書き写しを行い,次年度以降のデータベース化に備えた。現地調査では旧ポナペ島と旧トラック諸島に赴き,現地住民から当時の日本人と現地住民との関係について聞き取りを行った。さらに,引揚者への聞き取り調査に利用することを念頭に,GISを用いて南洋の日本人街や農園などの景観復元を行うための基盤を整えた。具体的には,南洋群島地形図のデジタル化を行うとともに,これまでに作成された復元地図や空中写真のGIS化のために,沖縄県出身移民であった慰霊団メンバーとともにマリアナ諸島を訪問しGPSを用いて戦前期の残存建築物の位置情報を取得した。特にサイパン島では,戦前期に日本人によって建立されたとされる「八十八箇所」の石仏について,GPSを用いて位置を同定した。同様の手法をフィリピン・ダバオに応用すべく,戦前期に作成されたダバオ市街の地形図および1945年前後の市街地や農園が撮影された空中写真の所在を米国公文書館にて確認し,一部を複写することで次年度以降に備えた。なお,南洋の旧日本人街に関する研究集会を開催し,景観復元についても意見交換を行った。本研究の目的は,戦前期南洋の地域形成に着目しながら沖縄県出身移民の実態を明らかにするところにある。4年計画の2年目年である本年度は,昨年度に引き続き戦前期南洋に関する資料調査・収集,データベース化,および移民居住地域の景観復元のための資料収集を行った。具体的には,米国公文書館などにおいて外南洋(東南アジア地域)では最大の日本人居住地域であり,その半数を沖縄県出身者が占めたフィリピンのダヴァオについて,当時のマニラ麻(アバカ)栽培の実態に関する資料とともに,アメリカ軍および旧日本軍が作成した当該地域の当時の地図等を複写した。また,外交資料館では,これまでその存在が注目されてこなかったダヴァオ居住者や日本との移動について推察可能な「外国旅券下付出願ニ要スル在外公館発給各種登録証明交付人名表報告雑纂」についてデータベースを作成すべく一部を複写した。また,ニューカレドニアの首府ヌーメアでも地図・測量局や図書館で当時の様子を窺い知ることのできる地図・資料等を収集するとともに,現地においても当時の主要施設が現存するのかを確認した。

さらに,ニューカレドニアではツホのニッケル鉱山跡や鉱山集落跡地を確認するなど,次年度の本格調査に取り掛かかるための予備調査を行った。さらに,南洋移民関連資料を多数所蔵するハワイ・ハミルトン図書館にて,当該関連資料を収集するとともに,沖縄系移民個人が所蔵する録音テープや貴重書類などの資料も収集した。加えて,マーシャル群島ではマジェロおよびヤルートでは,現地住民から日本人移民についての聞き取りを行うとともに,居住地跡などについて記録した。こうした作業は,戦前期南洋の市街地等を復元し,日本人移民がどのように地域形成に関与していたのかを解明する重要な手がかりとなるものである。本研究では、内南洋と外南洋における沖縄県出身移民の形態を比較することを念頭に置きながら、(1)沖縄県出身移民の移動現象そのものを解明すること、(2)沖縄県出身移民が南洋の地域形成にどのように関与していたのかを空間的に解明すること、(3)沖縄県出身移民の生活経験を、彼ら自身あるいは現地住民の証言から記録すること、を目的とし、あわせて、収集した資料をデータベース化し、統計ソフトやGISソフトを用いて分析・考察を行うことにしている。そのために、本年度は次のことを実施した。まず、戦前期南洋でも多数の日本人が居住していたダバオ、マニラ、シンガポールについて、出身地などを含めた居住者の特性を把握するために、当該地域で発給された「外国旅券下付出願に要する在外公館発給各種証明書」の交付人名表について、その写しを外務省外交史料館から入手した。次に、沖縄県庁所蔵の「引揚者在外事実調査票(1万3千人分の情報記載)」について、昨年度に引き続いてデータベース化作業を実施した。さらに、外南洋のうち、多くの沖縄県出身移民が存在したフィリピンとニューカレドニアの現地調査を行った。まずフィリピンでは、多くの沖縄県出身移民がマニラ麻(アバカ)栽培に従事したダバオにおいて、戦前期における沖縄県出身移民の居住状況などを把握するために、沖縄ダバオ会の協力を得て現地調査を実施した。その際、事前に米国公文書館等で入手した1940年代の地形図や米軍撮影空中写真のGIS化を行い、かつての集落やアバカ耕地跡などの確認作業を帰還者の証言やGPSなどを利用して行った。また、今年度より開始したニューカレドニアの調査では石川友紀博士(琉球大学名誉教授)を研究協力者に迎え、沖縄県出身移民二世や三世や帰還者の調査を実施した。残された文書資料がきわめて少ないため、その探索も行っている。なお、本研究課題の成果の一部を取り入れた大学の講義に関する実践報告もまとめた。本研究は、内南洋と外南洋における沖縄県出身移民の形態を比較することを念頭に置きながら、(1)沖縄県出身移民の移動現象そのものを解明すること、(2)沖縄県出身移民が南洋の地域形成にどのように関与していたのかを空間的に解明すること、(3)沖縄県出身移民の生活経験を、彼ら自身あるいは現地住民の証言から記録すること、を目的とした。まず、前年度に引き続いて、沖縄県庁所蔵の「引揚者在外事実調査票(1万3千人分の情報記載)」について、データベース化作業を実施した。次に、外南洋のうち、多くの沖縄県出身移民が存在したニューカレドニアの現地調査を行い、公文書館で外国人登録簿や日本領事館の記録を収集した。また、首都ヌメアに加え、沖縄県出身移民が集住した主島グランド・テール島の東海岸の集落で、一世との記憶をもつ高齢二世に対して聞き取り調査を行った。
甲状腺C細胞の分化誘導の実態とその機序の分子レベルでの解析〜ライソソ-ムラビライザ-による誘導作用とその機序〜

C細胞機能の発現とその調節について、甲状腺組織内でのカルシトニン(CT)の定量、CTmRNAのノ-ザンブロットによる検索とCTmRNA量の定量を行った。外来性にサケのCTを投与すると、内因性CTは減少し、血中カルシウムイオンは著明に低下する。この時血中カルシウムはCT投与量(0.5IU/kgと100IU/kg)で差がなかったが、組織中CT量は50.0±15.1ng/mg、35.2±19.0ng/mgと投与量の増加に従い低下し、コントロ-ル65.2±15.8と有意差を示した。さらに一方、CTmRNAは、低濃度投与では、コントロ-ルの94%と著変がなかったのに対し、高濃度投与により50%と有意の低下を示した。すなわち、外来性CT投与によりCTの合成はmRNAレベルでの減少、新たに合成されたCT含量の減少を来した。すなわち、外来性CTにより、血中カルシウムイオン低下に差がなかったため、血中カルシウムを介さずにC細胞機能を抑制する経路が示唆された。次にC細胞増殖能に対する影響を調べるため、増殖細胞分画について検討した。C細胞増殖能は、チミジンのアナログであるブロモデオキシウリジン(Brdu)を持続投与し、CTとBrduの免疫組織化学的二重染色によりC細胞増殖分画を検討した。C細胞のS期細胞パ-セントは、Brdu投与14日で7.2%に達したが、外来性CT高濃度投与群では2.8%、低濃度投与群では4.3%と有意に低下した。すなわち、CT投与により、C細胞のカルシトニン新生が抑制されるだけでなく、C細胞の増殖期細胞数も減少していることが判った。以上より、外来性CTはC細胞機能を抑制し、その増殖とCT合成を低下させることが判った。さらに、未分化型C細胞腫瘍HMCaに対し、紫外線照射(254nm、0.530J/m^2)を行い、CT産生分泌の変化を検討した。照射1030J/m^2では、96120時間後に細胞は死滅したが、5J/m^2群では、96時間後より酵素抗体法で陰性であったCTが陽性となった。C細胞機能の発現とその調節について、甲状腺組織内でのかルシトニン(CT)の定量、CTmRNAのノ-ザンブロットによる検索とCTmRNA量の定量を行った。この時血中カルシウムはCT投与量(0.5IU/kgと100IU/kg)で差がなかったが、組織中CT量は、50.0±15.1ng/mg,35.2±19.0ng/mgとの投与量の増加に従い低下し、コントロ-ル65.2±15.8と有意差を示した。

すなわち、外来性CTにより、血中カルシウムイオン低下に差がなかったため、血中カルシウムを介さずにC細胞機能を仰制する経路が示唆された。次にC細胞増殖能に対する影響を調べるため、増殖細胞分画について検討した。C細胞増殖能は、チミジンのアナログであるブロモデオキシウリジン(Brdu)を持続投与し、CTとBrduの免疫組織化学的二重染色によりC細胞増殖分画を検討した。C細胞のS期細胞パ-セントは、Brdu投与14日で7.2%に達したが、外来性CT高濃度投与群では、2.8%、低濃度投与群では4.3%と有意に低下した。すなわち、CT投与により、C細胞のカルシトニン新生が仰制されるだけでなく、C細胞の増殖期細胞数も減少していることが判った。以上より、外来性CTはC細胞機能を仰制し、その増殖とのCT合成を低下させることが判った。C細胞機能の発現とその調節について、甲状腺組織内でのカルシトニン(CT)の定量、CTmRNAのノ-ザンブロットによる検索とCTmRNA量の定量を行った。外来性にサケのCTを投与すると、内因性CTは減少し、血中カルシウムイオンは著明に低下する。この時血中カルシウムはCT投与量(0.5IU/kgと100IU/kg)で差がなかったが、組織中CT量は50.0±15.1ng/mg,35.2±19.0ng/mgと投与量の増加に従い低下し、コントロ-ル65.2±15.8と有意差を示した。さらに一方、CTmRNAは、低濃度投与では、コントロ-ルの94%と著変がなかったのに対し、高濃度投与により50%と有意の低下を示した。すなわち、外来性CT投与によりCTの合成はmRNAレベルでの減少、新たに合成されたCT含量の減少を来した。すなわち、外来性CTにより、血中カルシウムイオン低下に差がなかったため、血中カルシウムを介さずにC細胞機能を抑制する経路が示唆された。C細胞のS期細胞パ-セントは、Brdu投与14日で7.2%に達したが、外来性CT高濃度投与群では2.8%、低濃度投与群では4.3%と有意に低下した。すなわち、CT投与により、C細胞のカルシトニン新生が抑制されるだけでなく、C細胞の増殖期細胞数も減少していることが判った。以上より、外来性CTはC細胞機能を抑制し、その増殖とCT合成を低下させることを判った。さらに、未分化型C細胞腫瘍HMCaに対し、紫外線照射(254nm,0.530J/m^2)を行い、CT産生分泌の変化を検討した。照射1030J/m^2では、96120時間後に細胞は死滅したが、5J/m^2群では、96時間後より酵素抗体法で陰性であったCTが陽性となった。
炎症性腸疾患におけるエクソソームとRNA結合蛋白の機能解析

1、腸炎モデルマウス・炎症性腸疾患(IBD)におけるエクソソーム内RNA結合蛋白とRNAの発現と作用メカニズムの解析DSS急性腸炎モデルマウスの血液からエクソソームを回収し、エクソソーム内RNA結合蛋白の発現を解析した。DSS腸炎群では、コントロール群に比較してRNA結合蛋白hnRNP D、hnRNP K、PABPの発現が高い傾向があることを確認した。次にラットDSS急性腸炎モデルマウスを作成し、急性期・回復期において経時的に血液内エクソソームを回収したのち、DSS腸炎モデルマウスにおいて変化のあったRNA結合蛋白の変化について検討を行った。急性期においてhnRNPH・hnRNP K・PABPの発現低下および、経時的な回復傾向が確認された。炎症性メディエーターや腸管炎症の程度との対比や、変化のあったRNA結合蛋白による免疫沈降後のRNAを網羅的解析することにより、標的RNAの解析を進める。また、活動期クローン病・潰瘍性大腸炎および健常者の血清より回収したエクソソーム内のRNA結合蛋白の変化を検討したところ、hnRNP Uの発現変化が認められた。多数例での解析、および標的RNAの網羅的解析を行うことで、腸炎病態に関連のあるエクソソーム内RNA結合蛋白・RNAの解析を計画している。2、炎症性腸疾患における腸管炎症・腸管外病変におけるRNA結合蛋白とmRNA・miRNAの相互作用と病態への関連クローン病活動期の患者血清を回収し、小腸・大腸上皮培養細胞、炎症細胞(単球芽培養細胞THP-1をマクロファージへ分化誘導し作成)に添加してサイトカインの変化を検討している。さらに患者血清より回収したエクソソームを添加することによるサイトカインの変化を検討し、腸管非連続性病変や腸管外病変の発生・進展におけるエクソソームの関連に関して検討していくことを予定している。研究計画に沿って研究が進捗しているが、追加解析や学会・論文報告の必要性などから研究期間の延長を行った。腸炎モデルおよび、炎症性腸疾患患者検体での解析から、血液中エクソソーム内のRNA結合蛋白の発現変化があることを同定しているものの、標的RNAの検討や腸炎病態との関連についての解析に関して、追加検討に時間を要している。また、研究成果の学会報告・論文作成も予定している。腸炎モデルマウスや炎症性腸疾患患者検体での解析から、エクソソーム内RNA結合蛋白の変化があることが明らかとなった。今後の追加解析において、標的となるRNAの同定やRNA結合蛋白-RNA相互作用やエクソソームが腸炎病態にどのような関連があるかについて明らかにしていく。1、腸炎モデルマウス・炎症性腸疾患(IBD)におけるエクソソーム内RNA結合蛋白とmessengerRNA(mRNA)・microRNA(miRNA)の発現と作用メカニズムの解析DSS急性腸炎モデルマウスを作成し、血液からエクソソームを回収し、エクソソーム内RNA結合蛋白の発現解析を解析した。次にラットDSS急性腸炎モデルマウスを作成し、急性期・回復期において経時的に血液内エクソソームを回収したのち、DSS腸炎モデルマウスにおいて変化のあったRNA結合蛋白の発現変化と腸炎の進展・回復における関連を検討中である。加えて活動期クローン病患者の血清より回収したエクソソーム内のRNA結合蛋白の変化を検討中である。炎症関連サイトカインやシグナルに関連するエクソソーム内mRNAやmiRNAの網羅的解析を行い、発現変化のあったRNA結合蛋白との結合について検討を進める予定である。マウス・ラットでの実験腸炎モデル、炎症性腸疾患患者検体でのエクソソーム内RNA結合蛋白の発現変化に相違があることからRNA結合蛋白の絞り込みと標的RNAの絞り込みにも時間を要するものと考えられる。標的RNAの検索のために網羅的解析を準備している。また、患者検体の収集を進めている1、腸炎モデルマウス・炎症性腸疾患(IBD)におけるエクソソーム内RNA結合蛋白とRNAの発現と作用メカニズムの解析DSS急性腸炎モデルマウスの血液からエクソソームを回収し、エクソソーム内RNA結合蛋白の発現を解析した。

また、活動期クローン病・潰瘍性大腸炎および健常者の血清より回収したエクソソーム内のRNA結合蛋白の変化を検討したところ、hnRNP Uの発現変化が認められた。多数例での解析、および標的RNAの網羅的解析を行うことで、腸炎病態に関連のあるエクソソーム内RNA結合蛋白・RNAの解析を計画している。2、炎症性腸疾患における腸管炎症・腸管外病変におけるRNA結合蛋白とmRNA・miRNAの相互作用と病態への関連クローン病活動期の患者血清を回収し、小腸・大腸上皮培養細胞、炎症細胞(単球芽培養細胞THP-1をマクロファージへ分化誘導し作成)に添加してサイトカインの変化を検討している。さらに患者血清より回収したエクソソームを添加することによるサイトカインの変化を検討し、腸管非連続性病変や腸管外病変の発生・進展におけるエクソソームの関連に関して検討していくことを予定している。研究計画に沿って研究が進捗しているが、追加解析や学会・論文報告の必要性などから研究期間の延長を行った。腸炎モデルおよび、炎症性腸疾患患者検体での解析から、血液中エクソソーム内のRNA結合蛋白の発現変化があることを同定しているものの、標的RNAの検討や腸炎病態との関連についての解析に関して、追加検討に時間を要している。また、研究成果の学会報告・論文作成も予定している。実験腸炎モデルと患者検体におけるエクソソーム内RNA結合蛋白の発現変化について、検討を進め、エクソソーム内RNAの網羅的解析を行い、RNA結合蛋白の結合部位の配列と比較検討することで、標的RNAの絞り込みを進める。それと同時に、患者検体の収集を進め、各種培養細胞への血清・エクソソーム添加による炎症性サイトカイン・炎症シグナルの変化の解析、RNA結合蛋白・標的RNAの変化とエクソソームの細胞内移送・標的細胞への情報伝達に関する検討を進める。RNA結合蛋白と標的RNAの相互作用の観点から、炎症性腸疾患の病勢や腸管非連続性病変と腸管外病変の発生進展におけるエクソソームの関連を明らかにするための検討を進めていく。腸炎モデルマウスや炎症性腸疾患患者検体での解析から、エクソソーム内RNA結合蛋白の変化があることが明らかとなった。今後の追加解析において、標的となるRNAの同定やRNA結合蛋白-RNA相互作用やエクソソームが腸炎病態にどのような関連があるかについて明らかにしていく。当初予定した物品を使用し、研究計画は順調に進行しているが、次年度の学会報告・論文発表のため次年度使用額を設定した。追加研究・解析のため研究機関の延長申請を行っており、次年度での追加検討や学会・論文報告を行うため。
概日時計を創る：1細胞計測と操作による細胞ネットワークの再構築

哺乳類の概日リズムの中枢である視床下部の視交叉上核は、約2万個の神経細胞とそれを取り巻くグリア細胞から構成される。視交叉上核の個々の神経細胞では、時計遺伝子の転写と翻訳産物による転写抑制のループ機構が概日リズムの分子基盤であると想定され、その詳細なメカニズムの解明が進んでいる。一方視交叉上核は組織全体としては強靭なリズムを示すが、個々の神経細胞に分離するとリズム周期は24時間からばらついて不安定となることが報告されている。この事から、神経細胞はネットワークを形成して互いに連絡することで、組織全体として安定したリズムを作り出すと想定されている。しかしながら、従来の研究手法では単一の神経細胞のみの機能を計測することは困難であり、神経細胞間の相互作用やグリア細胞との相互作用を区別して調べることは難しかった。本研究では、微細加工技術により微小区画が多数配置されたパターン基盤を作成し、新生マウスより視交叉上核を摘出してパターン基盤上に分散培養を行った。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて遺伝子コード型高感度カルシウムプローブを神経細胞特異的に発現させ、蛍光シグナルをニポウディスク式共焦点と高感度CCDカメラにより検出した。その結果、他の神経細胞やグリア細胞と一切物理的接触(シナプス結合やギャップ結合)を持たない単一の視交叉上核神経細胞において、計測を行ったほぼ全ての神経細胞で安定した概日リズムを観察した。また予想しなかったことに、グリア細胞と接触を持つ単一神経細胞においては概日リズムを示す細胞の割合が大幅に減少していた。このことは、神経細胞はグリア細胞から何らかの抑制性シグナルを受けることで概日リズムを不安定化させていることを示唆している。本研究課題では、Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)を利用した微細加工技術を用いて、ほ乳類の生物時計(概日リズム)の中枢である細胞ネットワーク作動原理を構成的に理解することを目指している。初年度は、MEMSを用いて培養細胞数を厳密に制御できるマイクロパターン基盤の作成を確立を目指し、単一細胞から少数細胞の光イメージング(時計遺伝子発現とカルシウム濃度計測)を行う実験系の確立を目指した。特にマイクロパターン基盤の作成法や、ウェルのサイズ、間隔、数を最適化し、少数の神経細胞を長期的に培養する方法を確立し、多数のウェルから同時に蛍光/発光による光計測することが可能となった。またアデノ随伴ウイルスを用いた蛍光プローブの感染発現や、時計遺伝子の発光プローブを導入することで、数日間安定的に細胞内カルシウム濃度や時計遺伝子発現の概日リズムを計測することが可能となった。次年度以降の研究を発展させる為の基盤技術となる実験系となることが期待される。初年度の目的であった「微小加工技術によるマイクロパターン基板の作製」および「マイクロプレートを用いた少数細胞培養と時計遺伝子の発現リズムの測定」の実験系をほぼ確立することができた為、概ね順調と判断した。本研究課題では、Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)を利用した微細加工技術を用いて、哺乳類の概日リズムの中枢である視交叉上核の神経細胞の数、位置、形を自在に制御して細胞ネットワークを培養基盤上で再構成することで、視交叉上核のリズム発振メカニズムを構成的に理解することを目指している。昨年度までに、培養細胞数を厳密に制御できるマイクロパターン基盤を作成する技術基盤を確立している。少数の神経細胞を基盤のウェル上に長期的に培養し、アデノ随伴ウイルスを用いて蛍光カルシウムプローブを感染発現させることで、単一細胞から少数細胞から長期間(数日間)光イメージングすることが可能とした。加えて本年度は、PC制御によるXYステージによりパターン基盤上の多数のウェルの神経細胞から一挙に光計測を行うことができるハイスルーアウトプットな実験系を確立した。透過光像および実験後の免疫染色画像により、1個から数個の神経細胞のみ存在するウェル、グリア細胞のみ存在するウェル、神経細胞とグリア細胞が共在するウェルを確認した。その結果、1個の神経細胞のみでも、ほぼ全てのウェルにおいて安定でロバストで概日カルシウムリズムを観察した。この実験結果は、従来の定説とは異なり、視交叉上核の神経細胞は1細胞のみで安定な自律振動能を有していることを示している。現在、周期、振幅などのリズム特性を詳細に解析し、細胞相互作用の効果などを解析している。一昨年までに「微小加工技術によるマイクロパターン基板の作製」および「マイクロプレートを用いた少数細胞培養と発現リズムの測定」を確立した。本年度はさらにマイクロパターン基盤の多数のウェルから一挙に光イメージング計測することを可能とし、従来の計測法と比較して飛躍的に取得できるデータ数が増加した。その結果、統計的な解析や薬理効果の検討が段違いに容易にかつ高速化した。当初の目的に加えて、ハイスルーアウトプットな計測系を確立し、データ取得のスピードアップを達成することが出来たため、概ね順調と判断した。本研究の課題では、Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)を利用した微細加工技術を駆使し、哺乳類の概日リズムの中枢である脳視床下部の視交叉上核の神経細胞を単離して長期培養を行い、神経細胞の数、位置、形を自在に制御して細胞ネットワークを基盤上で再構成することで、視交叉上核の単一神経細胞から神経ネットワークのリズム発振メカニズムを構成的に理解することを目指して研究を行ってきた。これまでに、培養する神経細胞の数を厳密に制御することができるマイクロパターン基盤を作成する技術基盤を確立した。

少数の神経細胞を基盤のウェル上に長期的に培養し、長期培養しても細胞が隣のウェルに移動したり軸索突起を伸ばすなどせず、単一神経細胞のみをウェル内に孤立させることができることを確認した。アデノ随伴ウイルスを用いて遺伝子コード型の高感度蛍光カルシウムプローブを神経細胞特異的に感染発現させ、単一の神経細胞から長期間(数日間)光イメージング計測を行い、概日カルシウムリズムを計測した。さらにPC制御とXYステージにより、パターン基盤上の多数のウェルの神経細胞から一挙に光イメージング計測を行うことができるハイスルーアウトプットな実験系を確立した。概日リズム分野で普及している発光イメージング計測と比較して、一挙に多量のデータの取得が可能となった。また透過光像および実験後の免疫染色画像により、1個から数個の神経細胞のみ存在するウェル、グリア細胞のみ存在するウェル、神経細胞とグリア細胞が共在するウェルを確認した。その結果、他の神経細胞やグリア細胞とは直接の物理的接触のない単一神経細胞のみでも安定でロバストで概日リズムが長期間継続することを見出した。この実験結果は、これまでの単一神経細胞のリズムは不安定でばらつくとする定説とは異なり、視交叉上核の神経細胞は1細胞のみでも安定な自律振動能を持つことを示している。これまでに、微小加工技術によるマイクロパターン基板の作製、および、単一神経細胞培養と概日リズム測定の研究手法を確立し、本研究課題の目的を達成した。この手法を用い、多数の単一神経細胞から一挙に光イメージング計測することを可能とし、従来の計測法と比較して飛躍的に取得できるデータ数が増加した。その結果、哺乳類の概日リズム中枢の単一神経細胞の概日リズム特性を詳細に解析することが可能となり、概日リズム発振メカニズムの本質に迫る結果を得ており、概ね順調と判断した。哺乳類の概日リズムの中枢である視床下部の視交叉上核は、約2万個の神経細胞とそれを取り巻くグリア細胞から構成される。視交叉上核の個々の神経細胞では、時計遺伝子の転写と翻訳産物による転写抑制のループ機構が概日リズムの分子基盤であると想定され、その詳細なメカニズムの解明が進んでいる。一方視交叉上核は組織全体としては強靭なリズムを示すが、個々の神経細胞に分離するとリズム周期は24時間からばらついて不安定となることが報告されている。この事から、神経細胞はネットワークを形成して互いに連絡することで、組織全体として安定したリズムを作り出すと想定されている。しかしながら、従来の研究手法では単一の神経細胞のみの機能を計測することは困難であり、神経細胞間の相互作用やグリア細胞との相互作用を区別して調べることは難しかった。本研究では、微細加工技術により微小区画が多数配置されたパターン基盤を作成し、新生マウスより視交叉上核を摘出してパターン基盤上に分散培養を行った。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて遺伝子コード型高感度カルシウムプローブを神経細胞特異的に発現させ、蛍光シグナルをニポウディスク式共焦点と高感度CCDカメラにより検出した。
対人関係の円滑化に寄与できるアパレルデザインの効果と評価者特徴指標の構築

私たちは「見た目(外見)」で人を判断することがあり、それらが対人関係に影響することもある。外見の中でも大きな面積を占める「衣服」はその役割の多くを担っている。衣服におけるデザイン要素は見る人に様々な影響を及ぼすものの、心理評価で検討されたものが多く、客観的指標を用いた検討は非常に少ない。また、円滑な人間関係を構築するためには、評価者(見る人)の評価方法(見方)の特徴も把握しておくことが有効と言える。本研究では、アパレルデザイン(形、色、素材)の効果と評価者の評価特徴を客観的評価手法により数値化・可視化し、対人関係の円滑化に寄与できる「アパレルデザインの効果と評価者特徴の指標」を構築した。本研究は、アパレルデザインの効果と評価者の評価特徴を客観的評価手法により数値化・可視化し、対人関係の円滑化に寄与できる指標の構築を目的としている。平成25年度はアパレルデザインの「形」の中から分割線(分割線なし、縦分割、横分割)7種、模様(模様なし、直線、曲線などの幾何学模様)12種類、シルエット8種類を取り上げ、それらの心理効果と評価時における視線動向を測定した。被験者(女子大学生9名)にアイマークレコーダーEMR-9(nac製)を装着し、「身長が高く見えるものを挙げてください」と説明し、分割線7種類を掲載したスライド1枚を10秒間呈示した。10秒後、身長が高く見えた試料の番号を口頭で回答させた。この方法で計16項目の質問をした。模様とシルエットについても、同様の方法で実験を行った。心理効果の解析には単純集計とクラスター分析、視線動向は専用ソフト(dStream)を用いて分析した。心理効果を測定した結果、分割線(7種)は「身長は低く太って見えるが、落ち着きや親しみ、優しさを感じるかわいらしく見せる」もの(3種)と、それとは逆の効果を有するもの(4種)に分かれた。模様(12種)では、「身長が低く、落ち着きや親しみ、優しさを感じ、かわいらしく見せて好感度が高い」もの(4種)、「身長は高くやせて見え、知的で落ち着きがあり、カッコよく見せて好感度が高い」もの(2種)、「知的さや落ち着きがなく、親しみにくく好感度が低くなる」もの(6種)の3つに分かれた。シルエット(8種)は「身長が低く太って見え、知的さや落ち着きはないが、親しみやすくて優しい、かわいらしく見せる」もの(5種)、それとは逆の効果を有するもの(3種)に分かれた。視線動向を分析した結果、分割線では線の位置と面積比、模様では模様の配置場所や形状、シルエットではウエストのくびれと重心を手掛かりに評価している様子が確認できた。そこで本研究は、アパレルデザインの効果と評価者の評価特徴を客観的評価手法により数値化・可視化し、対人関係の円滑化に寄与できる「アパレルデザインの効果と評価者特徴の指標」を構築することにし、平成26年度は「色」と「素材」が及ぼす効果について検討した。検討に当たり、アパレルデザインの「色」の中から「単色」、「配色」に着目し、それぞれの心理効果と評価時における視線動向の特徴を捉えることにした。被験者は女子大学生・大学院生の計10名であり、2014年9月に実験を行った。色が及ぼす効果については、単色試料(15種)は、知的で落ち着いて恰好よく見える「中・低明度(dk、Gyなど)グループ」、ふっくらとして親しみやすい、優しくてかわいらしく好感度の高い「高明度(p)グループ」、知的さや落ち着きは低いが恰好よく見える「高彩度(v)グループ」の3つに分かれた。配色(39種)では、知的で落ち着きがあり、恰好のよい「低明度(dk)・低彩度(p)グループ」、身長が高く恰好よく見える「高彩度(v)グループ」、ふっくらと親しみやすく、優しくてかわいらしい「高明度(p)、色相が赤(色相番号2)グループ」の3つに分かれた。心理効果測定中の視線動向を分析した結果、質問に対する回答に該当する試料において注視回数が多くなる傾向が認められた。「素材」が及ぼす効果については、生地のたわみ具合に着目して評価をしていることが明らかとなった。平成25年度、26年度は、アパレルデザインの基礎的要素である「形」と「色」が及ぼす効果を検討した。最終年度である平成27年度は、これまでの結果をふまえて「形」と「色」の組み合わせによる効果の検討と、「素材」情報を加えてそれらの効果が実際の衣服においても発揮されるかを検証した。これまでの結果をもとに、「形」はシルエット3種、分割線6種、柄1種を選出し、「色」は単色8種、配色3種を選出して組み合わせ効果を検討するための計51試料を作成した。この中から11試料を選出し、実際の衣服(生地:綿ブロード)を制作し、1/2トルソーに着装させ検証実験用呈示試料とした。被験者は女子大学生・大学院生の計6名であり、組み合わせ効果の検討実験は2015年9月に、実際の衣服を用いた効果の検証実験は2015年12月に行った。

いずれの実験においても、心理効果測定中にアイマークレコーダーを用いた視線動向の測定を行った。心理効果の解析には単純集計、主成分分析、クラスター分析を用い、視線動向の解析には専用ソフト(dStream)を用いて視線軌跡、停留時間を分析した。ディスプレイ呈示における心理効果を測定し、主成分分析を行った結果、「クール(カッコよく、やせて見え、知的で身長が高く見える)」と「ソフト(親しみがあり、落ち着いた、優しい感じ)」の2主成分が抽出された。分析時に算出された主成分得点から、高明度色(W、p18)を全身や上部(ハイウエスト、ミドルウエスト)に配した場合やシルエットが「トラペーズ」の場合に「かわいらしくてソフト」の印象を形成し、v2やv2+Bkの配色は「ハード」な印象が強く、縦ライン(縦分割)が入るとその効果は高まった。実物呈示においても同様の効果を発揮することが確認できた。視線動向を分析した結果、質問回答の該当試料において注視回数が多くなる傾向がみられた。私たちは「見た目(外見)」で人を判断することがあり、それらが対人関係に影響することもある。外見の中でも大きな面積を占める「衣服」はその役割の多くを担っている。衣服におけるデザイン要素は見る人に様々な影響を及ぼすものの、心理評価で検討されたものが多く、客観的指標を用いた検討は非常に少ない。また、円滑な人間関係を構築するためには、評価者(見る人)の評価方法(見方)の特徴も把握しておくことが有効と言える。本研究では、アパレルデザイン(形、色、素材)の効果と評価者の評価特徴を客観的評価手法により数値化・可視化し、対人関係の円滑化に寄与できる「アパレルデザインの効果と評価者特徴の指標」を構築した。平成26年度は、アパレルデザインの「色」と「素材」が及ぼす効果と評価者の評価特徴を明らかにすることを目的としている。目的を達成するために、実験データの解析作業についてはアルバイトを雇用し、研究チームを構成して作業効率を高める工夫を図った。また、昨年度に引き続き、アイマークレコーダーの取り扱いについては、開発元(株式会社ナックイメージテクノロジー)に協力を仰ぎ、実験に協力・参加いただいた。このようにして計画した実験は順調に遂行され、充分な成果を得ることができた。被服心理学、被服意匠・色彩学平成25年度、平成26年度の結果をもとに、平成27年度は「形」、「色」、「素材」を組み合わせ、具体的な服飾品に展開し、効果の異なる試料を作成して実験を実施する。引き続き、大学生を被験者として心理効果と視線動向の特徴傾向を把握することとした。平成25年度は、アパレルデザインの「形」が及ぼす効果と評価者の評価特徴を明らかにすることを目的としている。目的を達成するために、調査・実験データの入力作業や実験試料の作成等については、アルバイトを雇用し、研究チームを構成して作業効率を高める工夫をはかった。また、アイマークレコーダーの取り扱いについては、開発元(株式会社ナックイメージテクノロジー)に協力を仰ぎ、実験に協力・参加頂いた。このようにして、計画した実験は順調に遂行され、十分な成果を得ることができた。平成26年度は、旅費および人件費・謝金の一部を別経費にて支出した。これは、最終年度である平成27年度に、これまでの成果をもとに実際の服飾品を作成するため、これまで以上に人件費・謝金、および消耗品費が必要となるため、平成26年度の経費使用を控え、次年度使用分として繰り越すことにした。
遠隔看護の実践能力育成に向けた研修プログラムの開発と評価

地域包括ケアシステムの実現に向けては、新しい視点での医療や看護の提供システム構築が求められている。その中でも、離れた場所にいる対象者や継続的なケアが必要な患者に、情報通信の知識・技術を活用して実践する遠隔看護(telenursing)の必要性がより高まっている。そこで、本研究では、医療においての情報活用に求められる能力を明らかにするとともに、次世代を見据えた看護基礎教育および一般看護師が今後身につけておくべき遠隔看護の知識・技術を学修するために必要な教育・研修プログラムの開発・評価を目的として取り組んでいる。本研究では、この研究目的達成のために、最終年度までにA・Bの2段階で研究計画を立案している。初年度である平成30年度においては、研究計画Aである「遠隔看護を実践するうえで学習すべき能力と、研修プログラムに含むべき内容の検討と優先順位の選定」に取り組んだ。研修プログラムに含むべき教育項目や内容の収集を行った結果、発表された研究はまだ少なかったが、「Telehealthに関わる看護活動に必要な能力」に関する研究があった。これは、遠隔看護の実践家への調査を基にしたもので、遠隔看護の実践者に求められる能力を明らかにしていた。この研究結果は、遠隔看護実践者に将来なる可能性のある看護師の看護基礎教育、そして、生涯教育や専門教育も含めた段階的な教育デザイン構築に向けた遠隔看護に必要な能力の基準として今後活用していく。初年度の成果は、本研究の最終目的である研修プログラムの開発・評価に向けての教育項目・内容を選定するための情報基盤として、最終成果に向けた研究計画Bの「遠隔看護の実用化に向けた研修プログラムの構築と評価」に向けて研究を進めていく。初年度である平成30年度においては、研究計画の最初の段階である「遠隔看護を実践するうえで学習すべき能力と、研修プログラムに含むべき内容の検討と優先順位の選定」に取り組んだ。本研究で最終目標とする研修プログラムの開発には、その研修プログラムの構成要素や内容をまず選定する必要がある。よって、その基盤となる情報収集として、国内外における遠隔看護や教育研究の現状や動向調査を行った。その結果、発表された研究はまだ少なかったが、「Telehealthに関わる看護活動に必要な能力」を明らかにした研究があった。これは、遠隔看護の実践家への調査から遠隔看護の実践者に求められる能力を明らかにしており、遠隔看護の実践者に将来なる可能性のある看護師の看護基礎教育、そして、生涯教育や専門教育も含めた段階的な教育デザイン構築に向けた遠隔看護に必要な能力の基準として今後活用できると分析した。よって、当初の計画通り、教育項目・内容について優先順位選定のための情報収集が達成でき、来年度に向けての準備を整えることができたため、おおむね順調に進展していると評価した。今後、遠隔看護の研修プログラム構築に向けて初年度の成果を踏まえて研究を進めていく。令和元年度は、研修プログラムに含むべき教育内容の優先順位の決定と、優先する教育項目・内容の教育方法の検討を行う。その推進方策として、ICTを活用した遠隔看護を具現化する技能を習得するための学習内容の優先度の決定について、初年度に情報収集および分析した結果を活用する。さらに、収集した学習内容・項目が重複・分散等しているときは、学修すべき知識や技術に関する教育内容についての再整理やカテゴライズを行う。そのうえで、教育方法の構築にむけた教育内容の優先順位の選定・決定を行う。特に、本研究の段階的な実行プロセスである、a)遠隔看護の知識と実践技術を教育する要素や事象の抽出と選定、b)教育方法の検討と選定および教材作り、c)提案する教育方法の評価(実証実験と評価)について、次の段階を常に見据えながら実行していくことが重要である。遠隔看護の実践能力育成のための教材づくりを推進するためには、どのような遠隔看護のシステムを使って看護ケアを実践するのかの決定が要となる。適当な技術・道具が現存しない場合には、各種デバイスの組み合わせや、遠隔看護システムそのものの開発も必要になる。そして、最終的には開発した研修プログラムの評価対象者が必要になるため、その選定やリクルートも視野に入れながら研究計画を先取りしながら実行していく。教育項目・内容の優先順位決定の際には、国内外の実態や背景を検討する必要があることも示唆されたため、併せて検討していく。そのため、国内外の先駆的研究者との共同も模索しながら、研究を進める予定である。

これは、遠隔看護の実践家への調査を基にしたもので、遠隔看護の実践者に求められる能力を明らかにしていた。この研究結果は、遠隔看護実践者に将来なる可能性のある看護師の看護基礎教育、そして、生涯教育や専門教育も含めた段階的な教育デザイン構築に向けた遠隔看護に必要な能力の基準として今後活用していく。初年度の成果は、本研究の最終目的である研修プログラムの開発・評価に向けての教育項目・内容を選定するための情報基盤として、最終成果に向けた研究計画Bの「遠隔看護の実用化に向けた研修プログラムの構築と評価」に向けて研究を進めていく。初年度である平成30年度においては、研究計画の最初の段階である「遠隔看護を実践するうえで学習すべき能力と、研修プログラムに含むべき内容の検討と優先順位の選定」に取り組んだ。本研究で最終目標とする研修プログラムの開発には、その研修プログラムの構成要素や内容をまず選定する必要がある。よって、その基盤となる情報収集として、国内外における遠隔看護や教育研究の現状や動向調査を行った。その結果、発表された研究はまだ少なかったが、「Telehealthに関わる看護活動に必要な能力」を明らかにした研究があった。これは、遠隔看護の実践家への調査から遠隔看護の実践者に求められる能力を明らかにしており、遠隔看護の実践者に将来なる可能性のある看護師の看護基礎教育、そして、生涯教育や専門教育も含めた段階的な教育デザイン構築に向けた遠隔看護に必要な能力の基準として今後活用できると分析した。よって、当初の計画通り、教育項目・内容について優先順位選定のための情報収集が達成でき、来年度に向けての準備を整えることができたため、おおむね順調に進展していると評価した。今後、遠隔看護の研修プログラム構築に向けて初年度の成果を踏まえて研究を進めていく。令和元年度は、研修プログラムに含むべき教育内容の優先順位の決定と、優先する教育項目・内容の教育方法の検討を行う。その推進方策として、ICTを活用した遠隔看護を具現化する技能を習得するための学習内容の優先度の決定について、初年度に情報収集および分析した結果を活用する。さらに、収集した学習内容・項目が重複・分散等しているときは、学修すべき知識や技術に関する教育内容についての再整理やカテゴライズを行う。そのうえで、教育方法の構築にむけた教育内容の優先順位の選定・決定を行う。特に、本研究の段階的な実行プロセスである、a)遠隔看護の知識と実践技術を教育する要素や事象の抽出と選定、b)教育方法の検討と選定および教材作り、c)提案する教育方法の評価(実証実験と評価)について、次の段階を常に見据えながら実行していくことが重要である。遠隔看護の実践能力育成のための教材づくりを推進するためには、どのような遠隔看護のシステムを使って看護ケアを実践するのかの決定が要となる。適当な技術・道具が現存しない場合には、各種デバイスの組み合わせや、遠隔看護システムそのものの開発も必要になる。そして、最終的には開発した研修プログラムの評価対象者が必要になるため、その選定やリクルートも視野に入れながら研究計画を先取りしながら実行していく。
HMGB-1制御による劇症肝不全に対する新治療法の開発

大小動物の劇症肝不全モデル、さらには患者検体における血液、肝組織中のHMGB1動態を明らかにし、HMGB1を制御するべく各種のストラテジーを開発することに成功した。すなわち、HMGB1中和抗体、HMGB1抑制タンパクの肝細胞への遺伝子導入、HMGB1吸着カラムなどである。これらを、劇症肝不全モデルを使用し、有用性を検討した。HMGB1抑制産生タンパクの遺伝子導入についてはラットモデルで、HMGB1吸着カラムについてはブタモデルで、病態改善の傾向を認めた。研究成果:(1)HMGB-1の阻害タンパクであるHMGB-1 A Boxを遺伝子導入するアデノウイルスベクター(Adex-HMGB1ABox)の作製を完了した。本ウィルスの培養上清においてウエスタンブロットにより当該ウィルスがAboxを産生していることが確認された。(2)劇症肝不全ラットモデルにAdex-HMGB1ABoxを投与し、その血清パラメータおよび生存率の改善が確認された。(3)劇症肝不全ブタモデルに対して、HMGB1吸着カラムを用いて体外循環を施行し、本カラムがHMGB1を吸着することを確認した。生存率については、現在、実験動物数を増やして検討をしている段階である。考按:これまでに、本研究室では薬剤誘導性劇症肝不全ラットおよびブタモデル、また劇症肝不全ヒトにおいても血清HMGB1が上昇していることを確認してきた。本年度の研究成果により、劇症肝不全ラットモデルにおいて、ウイルスの直接投与が病態改善効果があることが確認され、今後、人工肝臓を用いた臨床応用に向けた治療法の開発へと期待がもたれる。また、大動物(ブタ)において実際に体外循環によるHMGB1吸着カラムが有効であることが確認されており、実際の臨床応用に非常に現実的な劇症肝不全の治療法としての確立が期待できる。肝移植以外に治療法がなく、極めて予後が不良である劇症肝不全に対する、新しい治療法の開発という点で、本年度の研究成果は非常に意義深いものである。i)HMGB-1動態:劇症肝不全動物モデル(ラット、ブタ)及び患者におけるHMGB-1動態を解析し、いずれのモデル・患者においても血中HMGB-1が著明に上昇し、肝組織中のHMGB-1が著明に減少することを報告した。ii)小動物モデル:HMGB-1を制御するためラットを用いて3種類のstrategyを検討中、検討予定である。(1)HMGB-1抗体。肝不全モデルに初めて使用し、劇的な病態改善効果を認めた。下記論文1や多数の学会で発表した。(2)HMGB-1阻害タンパクであるHMGB-1 A Boxの遺伝子導入。本学分子生物学教室と共同で本実験用にHMGB-1ABoxのアデノウィルスベクター(以下Adex-HMGB-1ABox)を作製し、培養肝細胞、ラット肝臓に遺伝子導入した。培養上清中におけるA boxタンパクの発現、ラット肝細胞内におけるタンパク発現を確認している。現在ラット肝不全モデルにおける病態改善効果を検討中である(3)Adex-HMGB1ABoxを培養肝細胞(ラット初代肝細胞、ブタ初代肝細胞、不死化ヒト肝細胞等)に感染させHMGB-1A Box産生性肝細胞を作製し、さらにこの肝細胞を人工肝臓に内蔵し体外循環下に治療するという手法を予定している。共同研究関係を結んでいる米国マサチューセッツ総合病院外科(Martin L Yarmush教授ら)から小動物用平板型ハイブリッド人工肝臓を供与され、A boxタンパク産生性ラット肝細胞を樹立するまでに至っている。今後体外循環実験を行う予定であるiii)大動物モデル:臨床応用を念頭に、HMGB-1特異的吸着カラムをブタ肝不全モデルで稼働させている。カラムによるHMGB-1吸着効果を明らかにしたため、現在生存率、血液データを改善させることができるか実験中である。本研究においては、まずi)大小動物の劇症肝不全モデル、さらには患者検体における血液、肝組織中のHMGB-1動態を明らかにし、次に、ii)小動物モデルにおいてHMGB-1を制御・阻害し病態改善効果を示すことで、HMGB1の病態メカニズムとの関連を明らかにする。最終的に、iii)大動物モデルにおいて体外循環実験を行い、劇症肝不全の新たな前臨床的治療法を開発する、ということを具体的な研究目的として実験を行ってきた。i)HMGB-1動態:HMGB-1動態の解析については、教室では薬剤誘導性劇症肝不全ラット、ブタモデルおよび劇症肝不全患者血清でHMGB1が上昇していることを確認してきた。HMGB1の肝組織内での動態についても免疫染色、組織内タンパク定量などによって世界で初めて詳細に解明することができた。ii)小動物モデル:HMGB-1を制御するためのstrategyは以下の3種類。(1)抗HMGB-1抗体。ラット薬剤誘導肝炎モデルにおいて抗HMGB-

1抗体により、肝酵素などさまざまなパラメーターを改善させることがわかった。(2)HMGB-1阻害タンパクであるHMGB-1 A Boxの遺伝子導入。本実験用にHMGB-1 A Boxのアデノウィルスベクター(以下Adex-HMGB-1ABox)を作製済みであった。実際にラットの肝臓に遺伝子導入することで臓器自身にタンパクを合成させることができ、肝不全ラットの生存率を改善させた。(3)Adex-HMGBlABoxを感染させたHMGB-1 A Box産生性培養肝細胞を作製し、さらにこの肝細胞を人工肝臓に内蔵し体外循環下に治療する手法を検討中である。iii)大動物モデル:臨床応用を念頭に、HMGB-1特異的吸着カラムをブタ肝不全モデルで稼働させ、各種面液データを有意に改善させ、生存率を改善させる傾向があることがわかった。
視細胞の免疫特性を指標とする細胞系統樹の試み

1.ヤツメウナギ網膜細胞に対する単クローン抗体の作製23種類の単クローン抗体が作製され、光顕の所見から、以下のような部位に陽性反応を示した。1)光受容細胞外節:長光受容細胞(LPC)外節F1,A1短光受容細胞(SPC)およびLPC外節H14)外境界膜から内境界膜:外果粒層を中心A3,H6,D12,A85)網膜全領域A12,F11,E126)脈絡膜E77)色素上皮層A1特に4)のD2抗体については、光顕・電顕免疫組織化学およびウエスタンブロットにより、ミュラー細胞内の細胞骨格糸に存在する76kDの抗原物質を認識していることが分かった。今後は、D2抗体が認識する抗原物質の解析を進めたい。2.透過電顕による免疫反応の定量法H16抗体(ヤツメウナギロドプシンを認識する抗体)の反応をSDS処理フリーズレプリカ免疫標識(SDS-FRL)法より検討したところ、円板膜のP面に多く局在する大型の粒子およびE面に散在する粒子に金コロイド粒子の付着が観察され、H16抗体には、この方法が、免疫電顕法と同様に有効であった。しかし、中間径フィラメントを認識するD2抗体では、シャドーイングにほとんどのコロイド金粒子が重なってしまった。コロイド金粒子の定量化には、詳細な反応条件の検討が必要と考えられる。1.ヤツメウナギ網膜細胞に対する単クローン抗体の作製と分析今回導入したクリーンベンチより、単クローン抗体作製時の無菌操作が従来よりスムーズに行なえるようになった。単クローン抗体は継続的に免疫組織化学によるスクリーニングが行われ、現在までに、23種類のハイブリドーマを獲得している。これらのハイブリドーマが産生する抗体は、以下のような部位に陽性反応を示した。1)光受容細胞外節:長光受容細胞(LPC)外節F1,A1短光受容細胞(SPC)およびLPC外節H1外境界膜から内境界膜:全領域神経層を中心D2,D5,G3,D1,F11外果粒層を中心A3,H6,D12,A8網膜全領域A12,F11,E12脈絡膜E7色素上皮層A1平成9年度の研究により光受容細胞外節以外にも、他の網膜構成細胞に陽性反応を示すものを多数作製することができた。2.単クローン抗体を用いた円板膜に局在する粒子の同定凍結割断法により網膜の形状をできるだけ保持した状態で、SDS処理フリーズレプリカ免疫標識(SDS-FRL)法を行い、単クローン抗体と膜内粒子との反応を観察した。ロドプシンを認識する抗体H16との反応では、P面に多く局在する大型の粒子とE面に散在する粒子に金コロイド粒子の付着が観察された。本年度は、昨年度に得られたカワヤツメ(昇川型ヤツメウナギ,Lampetra japonica)網膜細胞を抗原とした23種類の単クローン抗体のうち、免疫組織化学より外境界膜から内境界膜に特に強い陽性反応を示したD2抗体の解析を行なった。共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫組織化学より、D2抗体は、ミュラー細胞の内境界膜から外境界膜の広い範囲にある繊維成分と思われる領域に反応が観察され、その反応は、視細胞、水平細胞、アマクリン細胞および双極細胞の輪郭を顕し、支持細胞としてのミュラー細胞の網目構造が良く観察された。また、post-embedding法による免疫電顕では、光顕で観察されたように、外境界膜下の視細胞間、2次ニューロン間および足板に存在するミュラー細胞内の中間径フィラメント近傍に金粒子の沈着が観察された。一方、非還元SDS-PAGEウエスタンブロットから、D2抗体は分子量約76kDの蛋白質を認識し、抗体はこの蛋白質の高次構造部位と反応しているものと考えられた。

松果体複合体での反応は、壁をつくり、光受容細胞を取り囲む円柱状支持細胞に陽性反応が広範性に観察され、さらに脳では、第三脳室の上衣細胞および実質の神経細胞を取り囲む広い範囲に陽性反応が認められた。また、同じ円口類に属するスナヤツメ(陸封型ヤツメウナギ,L.resseneri)の網膜、松果体複合体および脳での反応性を検討したところ、カワヤツメ同様の反応が観察された。以上のことからD2抗体は、網膜ミュラー細胞を含むヤツメウナギ属の星状膠細胞骨格細糸に存在する約76kDの蛋白質を特異的に認識すると考えられた。
粒状アルミナ固体ルイス酸担持白金触媒の調製とファインケミカルズ合成

1)ルイス酸触媒による有機合成反応プロセスは副生成物の処理および装置腐食が大きな問題となっている。その代替触媒として24mmφのγ-アルミナを担体としたアルミナ固体ルイス超強酸(AmLSA)を調製し,固体ルイス酸-白金二元機能触媒を作成した。さらに,ベンゼンのアルキル化反応に対する活性・性能を検討した。白金担持は水素解離能付与が目的である。2)24mmφのγ-アルミナを用いて,高温塩素化-排気処理法,CVD法によるPtCl_2担持および水素還元法でアルミナ固体ルイス酸担持白金触媒(Pt/AmLSA)を調製した。半回分反応法で同触媒をベンゼン中に静置し,H_2共存下でベンゼンの(CH_3)_2CHClによるアルキル化反応を行った結果,前年度の粉体触媒の場合と同様の成果が得られた。3)C_3H_6とH_2の混合ガスの気泡が下部から触媒層を通過するような新規の半回分式気液固接触反応器を設計製作し,室温近傍で同アルキル化反応を行った。反応液の撹拌が容易に起り,H_2供給がなくとも反応は円滑に進行するようになった。触媒0.2g(粒子12個),Pt担持量0.5-2mg,C_6H_610ml,C_3H_610mlmin^<-1>で6時間後,C_6H_6転換率20%以上,クメン選択率80%以上が得られた。白金無担持の場合は転換率約5%であった。4)上記の結果から,実用化に一歩近付いたものと解釈できた。5)並行して,前年度に引き続き,SiO_2,TiO_2,HZSM-5の高温塩素処理法を行い,FT-IRを使用して表面の特性化を試み,架橋酸素の残留によりルイス酸表面の得られないことを明らかにし,「表面科学」誌に掲載した。