hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA結合蛋白質の機能解析のためのマイクロ秒時分割単分子計測技術の創出

本研究では、従来の装置の分解能ミリ秒以内に起こる“ホッピング"などの探索機構を検証し、DNA結合タンパク質が標的配列を認識し結合する過程を明らかにする。まず、がん抑制DNA結合タンパク質p53のマイクロ秒の分解能での計測を行い、“ホッピング"を検証した。サブミリ秒の時間分解能の単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾したp53が、DNAガーデン法によりガラス基板に固定されたDNA上を動く様子を撮影した。DNA上でのp53の時系列データには、DNAと接触した状態で移動する“スライディング"に加えて、短い距離の“ホッピング"が含まれているこが明らかとなった。従来の方法では“ホッピング"が時間平均により“スライディング"の中に埋もれ、検出することが難しいが、マイクロ秒の分解能での計測により“ホッピング"を“スライディング"から分離して検出することに成功した。次に、障害物のあるDNAにおいてp53がDNA探索時に障害物を回避する仕組みとして、あるDNAから別のDNAへ移動する“セグメント間移動"が考えられる。そこで、“セグメント間移動"を検証するため、DNAガーデン法を改良し、ガラス基板上に2本のDNAを十字に固定する方法を開発し、蛍光色素修飾p53がDNA間を移動するかを検証した。その結果、p53は、プラスの電荷をもった天然変性領域を用いて、DNA間を高速で移動することが明らかとなった。まず、マイクロ秒の分解能でのp53の計測を行い、“ホッピング"を検証した。単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾したp53が、DNAガーデン法によりガラス基板に固定されたDNA上を動く様子をサブミリ秒の時間分解能で撮影した。この測定には、昨年度開発した、サブミリ秒の時間分解能を持つ分子蛍光装置とDNA整列固定技術“DNAガーデン"を用いた。DNA上でのp53の時系列データには、DNAと接触した状態で移動する“スライディング"に加えて、短い距離の“ジャンプ"が含まれているこが明らかとなった。従来の方法では“ジャンピング"が時間平均により“スライディング"の中に埋もれ、検出することが難しいが、マイクロ秒の分解能での計測により“ジャンピング"を“スライディング"から分離して検出することに成功した。そこで、“セグメント間移動"を検証するため、DNAガーデン法を改良し、ガラス基板上に2本のDNAを十字に固定する方法を開発した。ガラス基板上に作成した十字DNAと単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾p53がDNA間を移動するかを検証した。その結果、p53はDNA間を高速で移動することが明らかとなった。他のDNA結合タンパク質のセグメント間移動の速度を比較したところ、p53は1桁以上速くDNA間を移動できることが分かった。さらに、p53変異体の計測により、p53の高速セグメント間移動はプラスの電荷をもった天然変性領域によって達成されることが明らかとなった。DNA結合タンパク質は、膨大なDNAの中から標的配列を探し出し、結合する。
水/セラミック電極の応用技術の開発

VAWP(Vertical Aqua-Wall Plasma)の電極として用いることができる下向きに放電可能な水/セラミック電極の構造を考案しVAWP放電を確認した。また、セラミックが溶融する超高温状態を簡単に得られる特徴を活かし、これをセラミック材料を含む溶接技術や、アスベスト等の難溶融有害物質の溶融無害化処理技術に応用することができることを実験により明らかにした。水/セラミック電極を、VAWP(Vertical Aqua-Wall Plasma)リアクタの放電電極としての応用の検討に入るに当たり、先ず、基本的なその放電メカニズムについての知見を蓄積すべく、放電の基礎特性である電圧電流特性に対してセラミック部材の有無が与える影響について調べた。その結果、放電によってセラミック部材が灼熱状態となることにより、セラミック部材からの輻射によって水面を介しての電気伝導が促進され、放電電圧が低下するとともに、より低電流値まで放電が維持される効果があることが分かった。また、セラミック部材が電極として機能する状態とそうでない状態とには、明確なモードの違いがあり、モード間の遷移は極めて短時間で起きることを見出した。さらに、放電の極性によって、セラミック部材の加熱のされ方は異なり、放電特性に与える影響も異なること、陰極として働く場合は、灼熱状態のセラミックの上に陰極点が形成されること、等が明らかになった。水/セラミック電極の応用技術として、難溶融物質の溶融処理技術への展開を図るべく、種々の材料について放電による溶融を試み、あらゆる高融点物質に対して、放電によるエネルギー効率の高い溶融が可能であることを確認した。また、この時、被溶融材料が水と接触している場合には、加熱溶融部分は例外無く水面から12cmの部分に形成され、放電によって絶縁材料が電極として機能して溶融に至るためには、水面からの水蒸気供給が重要な役割を果たしていることが分かった。VAWPリアクタの高圧側電極は放電領域の上側にあるため、水/セラミック電極をVAWPリアクタの高圧側電極として用いるためには、水を放電領域の上に蓄える仕組みが必要になる。これを実現するために、粒状のセラミックをバインダで結合した中にパイプ状の金属電極を仕込んだ構造の電極を試作した。パイプ状の金属電極に高圧を印加しつつ、ここから水を供給すると、粒状セラミックの粒間の間隙に水が蓄えられ、この蓄えられた水を介して表面に通電し、最も外側のセラミック粒が水/セラミック電極におけるセラミック部材の働きをして、ここにアークが終端し電極として働くことを実験により確認した。これにより、VAWPリアクタの高圧側電極として水/セラミック電極の適用の可能性を確認することができた。また、放電によりセラミック部材が溶融する超高温状態を簡単に得ることができる特長を活かし、この超高温状態のセラミックを反応場として、これによる新材料の創製を試みるべく、水/セラミック電極による放電を密閉された容器内で起こすことができる実験装置を試作し、開放雰囲気下におけるのと同様の放電ができることを確認した。今後、容器内の雰囲気ガスや、水/セラミック電極に供給する水、あるいは放電プラズマ領域に、気体・液体・固体の各種材料を混入させ、超高温状態のセラミックを介するこれらの相互の反応による新たな材料の創製を実験により試みることが可能になった。水/セラミック電極による放電において、セラミックが溶融する超高温状態を容易に得ることができる特長を活かし、これをアスベスト含有建材等の難溶融物質の溶融処理技術、および、有害・危険廃棄物の溶融無害化処理技術への応用を図るべく、種々の放電実験装置の試作を行った。1つは、アスベスト含有建材等が実際に建築物に用いられている状態を想定して、天井面や壁面に対して放電部を接近させ、天井面や壁面の表面の耐火建材を溶融するための電極構造の装置を試作した。これによる放電実験の結果、1A程度の放電電流(この場合、放電電力は数kW)の放電強度で、アスベストと同等の耐火性能を有する代替試料に対して、これを溶融して有害性の原因となっている結晶構造を完全に破壊することが可能であることを確認した。また、試料と放電電極の相対位置を順次移動させることにより、平板状の試料に対して連続的に溶融部を走査し、一定の面積にわたって溶融処理を施すことが可能であることも確認した。また、医療廃棄物等の効率的な溶融無害化処理を想定して、種々の形状・材質の被処理物を連続的に放電部に供給して順次溶融処理を行うための装置を試作して実験を行った。その結果、被処理物中への水の含浸の程度、および、被処理物の電気伝導性によって溶融の程度が大きく影響を受けることが判明し、これらによる影響を抑え、被処理物を確実に溶融するための装置構造的工夫がさらに必要であることが明らかとなった。雰囲気制御のできる容器内での放電による新材料の創製については、実際の放電実験を実施するためには、装置の改良がさらに必要であることが判明し、装置を鋭意準備中であり、H23年度末段階では、実際に原料ガス等を導入して実験するには至っていない。
東シナ海の黒潮前線渦

東シナ海の陸棚縁で年間を通じて発生している黒潮前線渦の特徴を明らかにするために、これまで5月ないし6月、4回にわたって、長崎大学の練習船「長崎丸」又は「鶴洋丸」を使って、現地海洋観測を行った。観測は陸棚縁を横切る観測船上で毎日のCTD観測、ADCP観測を1週間反復することにより、この観測断面を通過する前線渦の水温、塩分、流速、濁度、栄養塩分布の3次元構造を明らかにしようとしたものである。これまでの現地観測の結果を総合すると、黒潮前線渦の波長は約200Km、発生周期は約10日、位相速度約30cm/secで黒潮の流下方向に移動する。この前線渦は陸棚縁の陸岸側に高温、高塩の黒潮水、外洋側に低温、低塩の陸棚水を張り出すが、陸棚水の外洋側への張り出しの中央部には下層から低温、高塩分水の湧昇が見られ、この湧昇に伴って、溶存無機リン、溶存態無機窒素など栄養塩濃度の高い黒潮亜表層水が陸棚に輸送される。この前線渦は傾圧不安定により生成されるが、同じように傾圧不安定により生成される湾流前線渦は同じ波長なのに、周期は5日、位相速度は60cm/secと黒潮前線渦の2倍の速さで伝播する。この理由は湾流前線渦の生成される陸棚の水深が約50mと、黒潮前線渦の生成される陸棚の水深約100mの半分であるためである。今後、東シナ海全域の陸棚水と黒潮水の海水交換に対して黒潮前線渦の果たす役割を定量的に評価する必要がある。東シナ海の陸棚縁で年間を通じて発生している黒潮前線渦の特徴を明らかにするために、1996、1998、1999年の5月ないし6月、3回にわたって、長崎大学の練習船「長崎丸」又は「鶴洋丸」を使って、現地海洋観測を行った。3年間の現地観測の結果を総合すると、黒潮前線渦の波長は約200Km、発生周期は約10日で、前線渦は位相速度約30cm/secで黒潮の下流に運ばれていく。この前線渦は陸棚縁の岸側に高温、高塩分の黒潮水を張り出し、外用側に低温、低塩分の陸棚水を張り出すが、陸棚水の外用側への張り出しの中央部には下層からの低温、高塩分水の湧昇が見られ、この湧昇に伴って、溶存態無機窒素、溶存無機リンなど栄養塩濃度の高い黒潮亜表層水が陸棚に輸送される。この前線渦は主に、傾圧不安定により生成されると考えられるが、その発生・維持・消滅の詳細な力学、同様な」前線渦が観測されている湾流との比較、数値モデルによる黒潮前線渦の再現と機構解明、さらに東シナ海全域の陸棚水と黒潮水の海水交換に果たす黒潮前線渦の定量的な役割の評価に関しては、平成12年度に明らかにする予定である。

これまでの現地観測の結果を総合すると、黒潮前線渦の波長は約200Km、発生周期は約10日、位相速度約30cm/secで黒潮の流下方向に移動する。この前線渦は陸棚縁の陸岸側に高温、高塩の黒潮水、外洋側に低温、低塩の陸棚水を張り出すが、陸棚水の外洋側への張り出しの中央部には下層から低温、高塩分水の湧昇が見られ、この湧昇に伴って、溶存無機リン、溶存態無機窒素など栄養塩濃度の高い黒潮亜表層水が陸棚に輸送される。この前線渦は傾圧不安定により生成されるが、同じように傾圧不安定により生成される湾流前線渦は同じ波長なのに、周期は5日、位相速度は60cm/secと黒潮前線渦の2倍の速さで伝播する。この理由は湾流前線渦の生成される陸棚の水深が約50mと、黒潮前線渦の生成される陸棚の水深約100mの半分であるためである。今後、東シナ海全域の陸棚水と黒潮水の海水交換に対して黒潮前線渦の果たす役割を定量的に評価する必要がある。
ラム波の非線形挙動に着目した接着構造の高感度な健全性評価

薄肉構造を伝わる弾性ガイド波の一種であるラム波を用いた高感度な健全性評価の実現に向けて,平板の重ね接着部とラム波との相互作用について理論解析を実施した.本検討で得られた成果は以下の通りである.1.ラム波の示す非線形挙動を理解するために必要な知見を得るため,重ね接着部におけるラム波の反射・透過特性解析を行った.研究代表者らが突合せ接着および接触部に対して行った検討結果に基づき,接着界面を線形スプリング界面としてモデル化した.ハイブリッド有限要素法による数値解析の結果,低周波数域におけるラム波0次対称(S0)および反対称(A0)モードの反射・透過係数は,接着部の長さおよび接着界面剛性に依存した周波数で極値を取ることが明らかとなった.また,特定周波数のラム波A0モードを入射すると,接着界面両側での変位差が増大した.2.界面両側での変位差に関して2次の非線形性を有する非線形スプリング界面モデルを接着界面に適用し,重ね接着部におけるラム波の二次高調波発生挙動に対して数値解析を実施した.線形解析で得られた知見を基に,界面変位差が増大する周波数のラム波を入射した場合,接着部で発生する二次高調波の全エネルギー流束は増大する傾向が見られた.しかしながら,重ね接着部の端部で生じる反射・透過の影響により,二次高調波の反射・透過振幅は複雑な周波数依存性を示すことがわかった.界面変位差が増大する周波数と接着部の長さおよび接着界面剛性との関係を含め,今後さらなる検討が必要であると考えている.さらに,理論解析と並行して,超音波測定を実施するための実験系を構築した.斜角探触子を用いた予備実験を行い,透過ラム波の測定が可能であることを確認した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ロボットシステムによる半月板生体力学機能評価ー半月機能温存治療の新たな評価法ー

半月板損傷は損傷部位や形態により、その機能障害に差が生じる。膝関節への垂直荷重及び外反トルク負荷に対し、半月板中節横断裂にて、33%幅及び66%幅の横断裂では有意な変化はなかったが、100%幅の横断裂にて半月板荷重が有意に減少した。同様に、中節から後節への半月板縦断裂にて、辺縁部での損傷よりは実質部での損傷の方が高い荷重減少率であった。さらに後節に横断裂作成すると、中節に作成したものより120度屈曲位で、より関節間の接触圧が上昇した。膝関節における半月板の機能としては、荷重分散や衝撃吸収、潤滑および前方制動などが報告されており、重要な役割を担っている。ところで半月板損傷はスポーツ障害や外傷において発生することが多く、半月板の縦断裂や横断裂は比較的頻度の高い損傷である。損傷した半月板を放置すると、疼痛や水腫のみならず、変形性関節症性変化も生じるため、正確な診断および外科治療時期の判断が重要である。今年度は、外側半月の横断裂による半月板機能低下を評価した。評価方法は、生体関節力学試験用ロボットシステムを用い、ブタ膝の外側半月板中節に、33%、66%、および100%幅の断裂を順次作製し、それぞれの断裂幅時における半月板荷重を計測した。結果として、33%および66%幅の断裂では正常と比べ、大きな荷重変化は見られなかったが、100%幅断裂にて、急激な半月板荷重の減少を認めた。したがって、画像検査で診断困難な程度の小さな横断裂は、荷重変化を来さないので、臨床上大きな問題となることは少ないが、MRI画像にて診断ができる、外周縁に達するような横断裂は、半月板荷重が減少し、その減少分を関節軟骨が負担することになるので、早期の診断と治療が必要であることがわかった。本研究より、半月板機能として、内縁を走行する線維よりは外周縁付近を走行する線維の方が重要であり、この部位の損傷に対して、確実な診断と治療が施されるようになれば、膝関節機能維持が図れるものと考える。今年度は、1外側半月に100%幅の横断裂を加える際、損傷部の違いによる関節への圧負荷の変化、2内側半月の縦断裂による半月機能変化、3外側半月板横断裂に対する縫合術の影響に取組んだ。1については、100%横断裂作製部を半月板中節、中後節、後節と3群に分け、垂直荷重を負荷した際の関節に生じる圧変化を、フィルム圧センサーを用いて計測している。損傷部により影響を及ぼす膝屈曲角度が、損傷部位の違いにより異なることが判明しつつあるが、今後症例数を増やす予定である。2については、滑膜と半月の間での損傷モデルにおいては、損傷部の長さを5, 10, 15mm長と変化させて垂直荷重を半月板に負荷したところ、半月のin situ forceへの影響がないことが示された。3については、100%横断裂に対して、縫合糸1本と3本の2群を作製して半月修復を行ない、正常半月荷重の復元可否を調べたが、繰り返し負荷による縫合部の損傷や縫合糸の弛みが大きく、損傷半月よりは大きな半月荷重が生じたが、正常半月よりは小さく、また両群での差は認めなかった。以上の研究より、昨年度の半月板横断裂に対する半月機能評価に加え、横断裂の部位による影響や縫合による限界、半月辺縁部での縦断裂の影響等、さらに半月板損傷による半月機能の変化が判明しつつあると考える。これらの情報は臨床における半月治療や術後リハに非常に有用と考える。半月板損傷および縫合術による、半月荷重の変化を計測することを目的とした研究である。その中で、平成26年度は外側半月板の横断裂において、断裂幅の変化よる影響を調べた。平成27年度は横断裂の損傷部位による関節圧負荷変化の影響、縦断裂による半月機能変化、横断裂に対する縫合術の影響に取り組み、結果を出しつつある。今年度は、1外側半月に100%幅の横断裂を加える際、損傷部の違いによる関節への圧負荷の変化、2内側半月の縦断裂部位による半月機能変化、3外側半月板横断裂に対する縫合術の影響に取組んだ。1については、100%横断裂作製部を1)半月板中節、2)中後節、3)後節と3群に分け、垂直荷重を負荷した際の関節に生じる圧変化を、フィルム圧センサーを用いて計測したところ、関節間に生じる圧は、後節部損傷は中節部に比べ、深屈曲角度で有意に大きい事が示されました。

2については、1)滑膜と半月の間、2)半月板実質部で外周辺縁から1/3実質部、および3)外周辺縁から2/3実質部(内周縁から1/3実質部)に、中節から後節に及ぶ縦断裂を作成し、垂直荷重を半月板に負荷したところ、いずれの実質部損傷でも、辺縁での損傷と比べて、半月のin situ forceは減少することが示された。3については、100%横断裂に対して、縫合糸1本と3本の2群を作製して半月修復を行ない、正常半月荷重の復元可否を調べたが、繰り返し負荷による縫合部の損傷や縫合糸の弛みが大きく、損傷半月よりは大きな半月荷重が生じたが、正常半月よりは小さく、また両群での差は認めなかった。半月板損傷は損傷部位や形態により、その機能障害に差が生じる。膝関節への垂直荷重及び外反トルク負荷に対し、半月板中節横断裂にて、33%幅及び66%幅の横断裂では有意な変化はなかったが、100%幅の横断裂にて半月板荷重が有意に減少した。同様に、中節から後節への半月板縦断裂にて、辺縁部での損傷よりは実質部での損傷の方が高い荷重減少率であった。さらに後節に横断裂作成すると、中節に作成したものより120度屈曲位で、より関節間の接触圧が上昇した。半月板損傷および縫合術による、半月荷重の変化を計測することを目的とした研究である。その中で、平成26年度は外側半月板の横断裂において、断裂幅の変化よる影響を調べた。今回の結果は臨床的にも妥当性のある結果であり、本手法にて縫合術の評価や他の種類の断裂の評価が可能であることがわかり、評価方法の確立もできた。平成28年は、1100%横断裂半月損傷の部位の相違による、関節圧変化の症例数を揃えて結果を出すこと、2半月板縫合における繰り返し負荷の影響が判明したため、縫合半月に対し、繰り返し負荷を加えた際の荷重変化を、縫合糸数を変化させて評価すること、3半月板の縦断裂の部位による荷重変化の影響を調べる予定である。平行して、半月修復材料がin vivoで用いられるようになってきており、その機能評価を行なうことも目標とする。平成26年に行なった、横断裂半月損傷に対して、縫合を施す事による荷重機能の改善の評価および半月板の縦断裂による荷重変化の影響を平成27年度に調べる予定である。少額であったため、無理して使用せず、次年度に回すため学会発表の機会が今年度は少なかったため平成28年度に行なう研究の材料費に追加使用する次年度も引き続き、予定通り、研究を進行する予定である。
酸化ストレスによるオートファジー／エネルギー代謝異常の分子機構の解明

酸化ストレスは、各種代謝疾患をはじめ多彩な病態メカニズムとの関連が示唆されている。本研究では、活性酸素の消去を行うSuperoxide dismutase 1 (SOD1)と抗酸化物質アスコルビン酸合成に関与する酵素Akr1aを二重に欠損したマウスを用いて、酸化ストレスの生体影響を解析した。SOD1/Akr1a二重欠損マウスは、アスコルビン酸の投与を休止すると、週齢や性別に関わらず、約2週間以内に死亡した。アスコルビン酸投与休止により、血漿中ALT値の増加および肝細胞の腫大や軽度の炎症を認めた。SOD1は酸化ストレスの抑制に働く一方で、ビタミンCは活性酸素と反応してその無毒化を行なう。SOD1とビタミンC合成に関わるAkr1aを同時に欠損したマウス(SOD1;;Akr1a二重欠損マウス)は著しい酸化障害を示すことがわかった。一方で、ビタミンCの給与により、その致死的な表現型に改善が認められることから、生体ではビタミンCによるスーパーオキシドの抑制が重要であることが示唆されたため、分子機構について詳細な検討を進めている。本年度では、SOD1;;Akr1a二重欠損マウスをビタミンC給水下で飼育した後、ビタミンC給水を停止することによる心臓および肝臓における組織障害の程度を解析した。その結果、以下のことを明らかにできた。(1)ビタミンC給水停止2週間以内に、二重欠損マウスの生存率は顕著に低下した。(2)ビタミンC給水停止に伴い、二重欠損マウスの体重は顕著に低下した。(3)心エコー検査の結果、ビタミンC給水停止に伴う心機能の低下は認められなかった。血圧・心拍数は正常の範囲内であった。(4)ビタミンC給水停止に伴う血漿中ALT値の増加(肝障害の増悪化)が認められた。この結果は、とくに老齢マウス(約6ヶ月齢)で顕著であった。以上の結果から、ビタミンCは、SOD1;;Akr1a二重欠損マウスの生存にとって必須であり、生体内で酸化ストレスからの組織障害にビタミンCが保護的に働いていることが示唆された。本年度では、初年度の目標であったSOD1;;Akr1a二重欠損マウスのビタミンC非給水下における心臓に対する酸化障害を中心に検討した。心機能を評価した結果、SOD1;;Akr1a二重欠損マウスの死因は心臓の障害ではないことを明らかにできた。一方で、ビタミンC非給水によって肝障害が顕在化することを示せたため、マウスの表現系型の解析結果はほぼ期待通りであったSuperoxide dismutase 1 (SOD1)は酸化ストレスの抑制に働く一方で、ビタミンCは活性酸素と反応してその無毒化を行なう。本研究において、SOD1;;Akr1a二重欠損マウスをビタミンC給水下で飼育した後、ビタミンC給水を停止することによる心臓および肝臓における組織障害の程度を解析した。(1)ビタミンC給水停止2週間以内に、二重欠損マウスはすべて死亡した。マウスの週齢および性別は死亡するまでの日数に影響しなかった。初年度の結果からSOD1;;Akr1a二重欠損マウスの肝障害を明らかにできたため、今後はマウスの肝臓における酸化ストレスならびに小胞体ストレスが、ビタミンCの投与により緩和するかどうかに焦点を当て、病理組織学的解析と遺伝子発現、脂質・蛋白質の酸化状態を検討し、その分子機構を検討する予定である。同様に、活性酸素によりオートファジーの障害が起こることで小胞体ストレスや肝障害を助長することが報告されているため、SOD1;;Akr1a二重欠損マウス肝臓でのオートファジー障害の程度を評価する予定である。また、SOD 1;;Akr1a二重欠損マウスから単離した肝細胞にビタミンCを添加して培養後、ビタミンCを含まない培地に移した時に現れる細胞死への影響およびその細胞傷害の分子機構について解析を進める予定である。

これにより、in vivoとin vitroの両面からビタミンCの保護的影響の詳細な分子機構の解析や酸化修飾の標的分子の探索を行いたいと考えている。生化学・分子生物学
分子を工具とする新しいマイクロマシン接合技術の開発

複雑な形状を持つマイクロマシンを作製する場合の加工技術としては,微小な構造を持つ部品の作製だけではなく,多様な材質の部品を接合し集積化する技術が必要である。マイクロマシン接合技術の一つとして陽極接合法が知られているが,材料に制約がある,高温・高電場を必要とするなど,酵素を利用するバイオセンサーなどには不適当である。本研究は,材料の表面を化学修飾することで化学結合力を利用した材料を接合する方法論の開発を目指した。また,シリコーンゴムであるポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたマイクロチャンネル作成について検討した。<ポリイオン積層膜を利用したガラス接合>電荷の異なるポリイオン膜をガラス基板間に積層する事でガラス基板同士の室温接合を行ったところ,500V以上の高電圧を印加することで接合が観測され,その接合強度は1.36kgfcm^<-2>であることを確認した。<シランカップリング剤の重合反応を利用したマイクロチャンネルの接合>シランカップリング剤をガラス基板間に塗布することで基板接合を試みたところ,ガラス基板の透明性を保ったまま接合が可能であり,その接合強度が5.6kgfcm^<-2>であることを確認した。ガラス基板にマイクロチャンネルを加工し,重合反応を利用した接合後送液を行ったところ,溶液のリークは観測されず本手法がマイクロチャンネルの常温接合手法として有効であることを示すことが出来た。<PDMSを利用したマイクロチャンネル作成>PDMS基板表面にマイクロチャンネルを加工し,ガラス基板と張り合わせるだけでマイクロチャンネルとして利用可能であることを確認した。また,ガラス基板上に有機・無機構造物を作成し,流路内に構造物を導入した場合においても正常な送液が観測された。PDMSを利用したマイクロ酵素センサーを開発したところ,本手法は電極型酵素センサーの集積化に対して有効であることを明らかとした。そのようなマイクロマシン接合技術の一つとして陽極接合法が知られているが,これは使用する材料に制約があり,また400°C程度の高温で高電圧をかける必要があるなど,問題点が残されている。本研究は,材料の表面を化学修飾して化学結合力を利用して材料を接合する方法論の開発を目指している。本年度は,ガラス基板上にポリイオン集積化膜を形成させ,反対電荷を有する表面を静電的に接合する技術の開発を中心に研究を進めた。まず,ポリイオン高分子をガラス基板上に固定化するために,分子末端にアミノ基を有するシランカップリング処理剤を用いてガラス基板表面を化学修飾した。反応後,基板を塩酸処理し,化学修飾したシランカップリング処理剤の末端のアミノ基が正電荷を持つようにした。その表面に負電荷を有するポリイオン高分子(ポリスチレンスルホン酸ナトリウム,PSS)を積層するため,PSS水溶液にシランカップリング処理したガラス基板を浸漬し,洗浄した。さらに,反対電荷を有するポリイオン高分子(ポリエチレンイミン,PEI)水溶液にガラス基板を浸漬し,表面を正電荷にした。このようにして得られた表面がPEIで処理されたポリイオン集積化膜は,負電荷を表面に有する微粒子を効率よく捕捉することが可能であったが,PSS(負電荷)で処理された表面では捕捉することができないことが示され,化学的手法によりガラス表面の電荷を制御できることに成功した。今後,反対電荷を有するガラス基板を接合することを試み,その接合力についても定量的に評価していきたいと考えている。

複雑な形状を持つマイクロマシンを作製する場合の加工技術としては,微小な構造を持つ部品の作製だけではなく,多様な材質の部品を接合し集積化する技術が必要である。そのようなマイクロマシンの接合技術の一つとして陽極接合法が知られているが,これは使用する材料に制約があり,また400°C程度の高温で高電圧をかける必要があるため,酵素を利用するバイオセンサーなどには不適当である。本研究は,材料の表面を化学修飾して化学結合力を利用して材料を接合する方法論の開発を目指している。今年度は,昨年度確立したガラス基板表面修飾技術を用いてガラス基板同士の室温接合を行い,その接合力を引っ張り試験器を用いて測定した。また修飾したガラス表面の分光学的評価を光スペクトラムアナライザを用いて評価した。最初に,表面に負電荷を修飾したガラス基板と正電荷を修飾したガラス基板とを直接接触させることによって接合を試みたが,これでは接合力がほとんどなかった。そこで,接合面をはさんでその両側から1000VI以上の高電圧を引加したところ,接合が確認された。さまざまな条件下で試みた結果,接合には基板表面の電荷と加える電圧の両方が必要であることが明らかになった。接合力は接合直後には約100kPaであり,陽極接合に比べると弱いものの,用途によっては実用的である。また,接合力は時間経過とともに弱くなり,約1週間後にはほぼ0となった。接合力を失って剥離した基板は,同様に処理することにより再接合することが可能だったので,流路等を加工した基板を有効に再利用することができる。マイクロマシン接合技術の一つとして陽極接合法が知られているが,材料に制約がある,高温・高電場を必要とするなど,酵素を利用するバイオセンサーなどには不適当である。本研究は,材料の表面を化学修飾することで化学結合力を利用した材料を接合する方法論の開発を目指した。今年度は,シランカップリング剤の重合反応を利用したガラス接合,およびシリコーンゴムであるポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたマイクロチャンネル作成について検討した。<シランカップリング剤の重合反応を利用したマイクロチャンネルの接合>シランカップリング剤をガラス基板間に塗布することで基板接合を試みたところ,ガラス基板の透明性を保ったまま接合が可能であり,その接合強度が5.6kgf cm^<-2>であることを確認した。ガラス基板にマイクロチャンネルを加工し,重合反応を利用した接合後送液を行ったところ,溶液のリークは観測されず本手法がマイクロチャンネルの常温接合手法として有効であることを示すことが出来た。<PDMSを利用したマイクロチャンネル作成>PDMS基板表面にマイクロチャンネルを加工し,ガラス基板と張り合わせるだけでマイクロチャンネルとして利用可能であることを確認した。また,ガラス基板上に有機・無機構造物を作成し,流路内に構造物を導入した場合においても正常な送液が観測された。
進化工学・遺伝子工学を基軸としたバイオプラスチックの1ステップリサイクルシステム

現在のバイオプラスチックリサイクルシステムでは、まず、二酸化炭素を出発原料として3ステップあるいは2ステップ生産法により、バイオプラスチックが生産される。使用後のバイオプラスチックは、環境微生物の作用により二酸化炭素と水に分解され、再生可能なバイオマスに変換される。近年、バイオリサイクルに加え、ポリマーを直接の原料であるモノマーにまで分解(原料化)し、再重合するケミカルリサイクルが注目されている。特に、酵素を用いたケミカルリサイクルでは、化学法に比べ温和な条件で重合が行え、触媒由来の金属が含まれないなど環境低負荷型のリサイクルシステムであると考えられる。しかし酵素触媒法は、酵素の可逆反応性のため重合と同時に分解反応が生じることから、再生プラスチックの高分子量化が難しい点や多分散度が大きくなる欠点を有する上、リサイクルには最低2ステップ以上が必要となる。そこで本研究では、1ステップかつ再生プラスチックの高分子量化(高性能化)が期待できるバイオプラスチックリサイクルシステムの構築を目指す。平成19年度は、平成18年度に構築したPHB分解系で生じるモノマーから菌体内においてPHBを際重合するため、PHB生合成系酵素遺伝子群を導入して、分解→重合を1ステップで行える系を構築した。PHBを際重合するため、Ralstonia eutropha H16由来の合成系酵素遺伝子を有するプラスミドで宿主を形質転換し、分解酵素と合成系酵素群とを共発現できる系を構築した。組み換え大腸菌の性質を調べたところ、PHBに対する分解能を有しつつ、菌体内でPHB重合が可能であることが示唆された。代表的なバイオプラスチックであるポリヒドロキシブタン酸(PHB)を原料とした1ステップバイオリサイクルシステムを目指すためには、高選択・高効率なPHB分解系の構築が重要となる。そこで平成18年度は、まず、PHB分解酵素による高選択・高効率な分解系の構築を行った。宿主として操作性の良い大腸菌を用い、R.pickettii T1由来のPHB分解酵素遺伝子を有するプラスミドで宿主を形質転換し、分解酵素を発現できる系を構築した。組み換え大腸菌の性質を調べたところ、分解酵素を発現させた大腸菌は、PHBに対して高い特異性を有していることが示唆された。
希釈ビスマスIII-V族半金属半導体混晶GaInAsBiの創製と物性制御

本研究では、全く未開拓な混晶半導体であるビスマス系III-V族半導体GaInAsBiの製作法を確立し、その物性の解明を目的としている。分子線エピタキシー法を用いてGaInAsBiが製作可能なことを世界で初めて実証した。GaAs中のBiは偏析しやすいため、量子井戸構造の製作は不可能とされてきたが、本研究で(In)GaAsBi/GaAs量子井戸構造を実現した。InGaAsBi、GaAsBi/GaAs量子井戸構造の発光波長は温度無依存化することを明確にした。分子線エピタキシー(MBE)法を用いてInP基板上にIn_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yを成長した。350°C以下の低温で成長した場合に、Biが成長層に取り込まれた。適切なAs供給量の範囲が比較的狭く、過剰なAs供給ではBiの成長層への取り込みが抑制され、As供給量が不足すると結晶成長しなかった。得られたIn_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_y中のBi原子は格子位置に置換型で取り込まれていることをラザフォード後方散乱分光法のチャネリング測定により確認した。得られたIn_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_y成長層から、組成に応じて、1.6μmから2.1μmの波長帯でホトルミネセンスが得られた。ただし、室温でのホトルミネセンス強度は弱かった。ホトルミネセンス強度の改善を図るために、ランプアニールを行ったところ、2倍程度の強度の増大が見られたものの十分な改善がみられなかった。ホトルミネセンススペクトルは、10Kから100Kまでの温度範囲では深い準位からの発光が優勢であった。100K以上の温度ではバンド端発光と思われる発光が優勢になるものの、発光強度が低下するため、バンド端発光のピークエネルギーの温度係数を明確に求められなかった。また、成長層の光吸収スペクトルは裾準位の存在をうかがわせるブロードな吸収端を示しており、Biの取り込みによる吸収端エネルギーの温度無依存化を確認できなかった。深い準位からのホトルミネセンスが優勢であることと合わせて考えると、In_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_y成長層内に局在準位が多く存在していると考えられる。この局在準位の存在のために、吸収端の温度無依存化が発現しなかったといえる。次年度では、アニール温度の最適化やIn_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yを含む超格子を作製することで、In_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yの禁制帯幅の温度無依存化を明確にする。初年度は分子線エピタキシー法を用いてIn_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yを成長し、組成に応じてピーク波長1.6から2.1μmのホトルミネセンス(PL)が得られた。しかし、発光強度が弱く発光波長の温度係数を明確に求められなかった。本年度は、In_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yを含む多重量子井戸構造(MQW)を作製することで、In_xGa_<1-x>As_<1-y>Bi_yの発光強度の増大を図った。まず、GaAs_<1-x>Bi_x/GaAsMQWを製作した。従来、Biを含む混晶はBiの偏析が懸念され、MQWの製作は困難とされてきた。GaAs_<1-x>Bi_x/GaAs MQWの製作中に、反射高速エネルギー電子線回折強度の振動が見られ、MQWは一原子層ごとに成長できることが確認できた。(1)X線回折パターンでMQWに起因する明瞭なサテライトピークが確認できること、(2)試料の透過電子顕微鏡(TEM)像で、平坦な界面と乱れのない格子像が見られることから、Biを含有する混晶を用いてMQWが製作できることを、世界で初めて実証した。GaAs_<0.891>Bi_<0.109>/GaAs MQWからは、通信用波長帯1.3μmにおけるPL発光を室温において観測した。GaAs_<0.946>Bi_<0.054>/GaAs MQWの発光波長の温度係数は約-0.19meV/Kであり、GaAsの禁制帯幅の温度係数の約1/2に無依存化した。このMQWは、400°C程度での低温成長が必要にもかかわらず、800°Cまで熱的に安定であった。Biを含有する混晶を含むMQWは、高温でのデバイスの製作プロセスに耐えることが明らかになった。

次に、In_<1-y>Ga_yAs_<1-x>Bi_x/GaAsMQWを製作した。二次イオン質量分析とX線回折、TEM観察によりMQWが製作できていることを明確にし、ホトルミネセンス発光を得た。引き続き、製作条件の改善やアニールにより発光強度の向上を図る。
生体内動態解析を可能とする網羅的タンパク質分子標識法の開発

本研究の目的は、生体内に存在して機能するタンパク質分子を正確に検出する方法を開発し、その手法を神経系で機能する分子群に応用することである。このために、抗体に代わる低分子量のケミカルプローブとそれを認識するペプチドタグを組み合わせた系を採用する。ペプチドタグは、標的分子の機能に影響しないと予想される部位を構造生物学的知見から想定し挿入する。なお、タグの挿入は、遺伝子編集法でマウス胚に直接組み入れ、迅速に解析対象の動物を作出する技術を整備する。このために、迅速なタグノックインマウス樹立法を進めてきた。即ち、C57BL/6系統のマウスを用いて、200ベース以下の1本鎖DNAとCas9タンパク質/gRNA複合体を授精直後の胚に電気穿孔法で導入して、組換え産子を得る。受精卵の採取後に電気泳動チャンバーを利用する方法と、卵管内に存在する胚に対して卵管内に直接CRISPR複合体を注入して電気泳動的導入する方法のいずれでも、標的の分子に目的のタグ配列をノックインしたマウスを作出することができた。それぞれ長短があり、一度に多くの産子を得たいときには、大量の受精卵を処理できる泳動チャンバーを利用する方が良いが、レシピエントを準備して胚移植する手間がかかる。一方、卵管内導入法は、移植の手間は不要であるが、生まれる産子数が少なく、帝王切開による産子取得の手間がかかることが多い。多くの産子を得て、迅速な解析をする場合は前者が、ライン化して解析する場合は後者が良い。なお、NMDA型グルタミン酸受容体のサブユニット構造を電子顕微鏡で可視化するプロジェクトに関しては、九州大学の王子田教授グループが開発した金粒子ラベルしたプローブが共有結合する20アミノ酸残基からなるhD2タグをGluN1分子にノックインしたマウスを樹立し、現在オーストリアの重本教授が形態学的な解析を進めている。本研究の目的は、生体内に存在し機能するタンパク質分子を正確に検出する方法を新たに開発し、その手法を神経系で機能する分子群に応用することである。この目的のために、抗体に代わる低分子量のケミカルプローブとその認識するペプチドタグを組み合わせた系を採用する。ペプチドタグは、標的分子の機能に影響しないと予想される部位を構造生物学の知見から想定し挿入する。なお、タグの挿入は、遺伝子編集法を用いてマウス胚に直接組み入れ、迅速に解析対象の動物を作出する技術を整備する。このために、2つの方向から研究開発を進めている。1つは、迅速なタグノックインマウス樹立法の確立である。このために1本鎖DNAとCas9タンパク質/gRNA複合体を授精直後のマウス卵管内に注入して、電気泳動的に胚導入し、目的のタグ配列をノックインしたマウスを直接作出する手法の検討をおこなった。今1つは、当該タグを持つ分子の動物個体における低分子ケミカルプローブによる検出である。これらの目的のために、本研究では九州大学大学院薬学研究院成体分析化学分野王子田教授のグループが開発したケミカルプローブとその認識タグ配列を利用した。また、その作動確認はオーストリアの重本教授と共同で形態的側面から進める。卵巣内電気穿孔法によるタグ配列挿入マウスの樹立は一部成功しており、この方法の有用性が証明されたので、さらなる効率化を目指して改良をおこなっている。さらに、ケミカルプローブによる分子同定に関しては、タグ標識分子発現マウス脳を固定してオーストリアに送り、重本教授と共同で解析を進めている。NMDA型グルタミン酸受容体のサブユニット構造を電子顕微鏡で可視化するプロジェクトに関しては、九州大学大学院薬学研究院成体分析化学分野王子田教授のグループが開発した、金粒子ラベルした亜鉛錯体プローブが共有結合する20アミノ酸残基からなるhD2タグをGluN1分子にノックインしたマウスを作製した。この分子の機能に影響を与えないと思われる部位をその結晶構造から推定した。次に迅速にタグをノックインするために、挿入配列を持つ1本鎖DNAとCas9タンパク質/gRNA複合体を授精直後のマウス輸卵管に注入し、電気穿孔法で導入をおこなった。その結果、複数の産子でhD2タグがGluN1分子にノックインしていることが確認できた。現在これらの産子の子孫を採るべく繁殖を進めている。また、これとは別の種類のタグを同様な方法で挿入する試みをおこなっている。さらに、効率的にタグ挿入マウスを樹立するために、卵管電気穿孔法の諸条件の検討を進めている。また、NMDA型受容体を構成する他のサブユニットであるGluN2A及びGluN2BをGluN1とは異なったケミカルプローブで検出するためにHisタグを挿入したマウス作製の準備を進めている。タグを挿入した分子を培養細胞で発現させ、その受容体機能に影響しないことを検討している。さらに、AMPA型受容体サブユニットGluA2へのタグ挿入計画を進めている。

即ち、C57BL/6系統のマウスを用いて、200ベース以下の1本鎖DNAとCas9タンパク質/gRNA複合体を授精直後の胚に電気穿孔法で導入して、組換え産子を得る。受精卵の採取後に電気泳動チャンバーを利用する方法と、卵管内に存在する胚に対して卵管内に直接CRISPR複合体を注入して電気泳動的導入する方法のいずれでも、標的の分子に目的のタグ配列をノックインしたマウスを作出することができた。それぞれ長短があり、一度に多くの産子を得たいときには、大量の受精卵を処理できる泳動チャンバーを利用する方が良いが、レシピエントを準備して胚移植する手間がかかる。一方、卵管内導入法は、移植の手間は不要であるが、生まれる産子数が少なく、帝王切開による産子取得の手間がかかることが多い。多くの産子を得て、迅速な解析をする場合は前者が、ライン化して解析する場合は後者が良い。なお、NMDA型グルタミン酸受容体のサブユニット構造を電子顕微鏡で可視化するプロジェクトに関しては、九州大学の王子田教授グループが開発した金粒子ラベルしたプローブが共有結合する20アミノ酸残基からなるhD2タグをGluN1分子にノックインしたマウスを樹立し、現在オーストリアの重本教授が形態学的な解析を進めている。これまでに樹立した、hD2タグラベルGluN1マウスを繁殖させ、固定した脳をオーストリアの重本教授に送付して、金属粒子ラベルケミカルプローブでの同定をおこない、本方法の有用性を検証する。また、現在進めている各種タグマウスを樹立し、蛍光ラベルケミカルプローブでの検出をおこなう。さらに、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluA2にCre依存的にエクソンスワップがおこり、タグ配列が発現するマウスを樹立する。このためにflexタイプのベクターを構築し、ES細胞での組換えをおこない、キメラマウスを作製する。これらの計画を遂行することにより、本研究目的を達成できると考えている。九州大学大学院王子田教授のグループによるケミカルプローブとその認識配列の開発は、日進月歩の状況であり、より特異性高く高感度で分子同定ができる系の確立を待っていたために、挿入タグ配列が決まらずその点で遺伝子編集に係る分子生物学的な準備が遅れた。この遅れを挽回するために、卵管電気穿孔法に用いるマウスを自己繁殖せずに業者から購入してその推進を図る。
霊長類におけるマイクロサテライトの塩基配列多型解析によるヒトの進化論的研究

ヒトのマイクロサテライトのひとつであるD14S299(wg1c5)ローカスは,GGATあるいはGGAAの多型的リピート部位を有し,日本人における各アリールの塩基配列がすでに報告されている.昨年度は,類人猿3種,旧世界ザル8種,新世界ザル6種,原猿類2種の計19種の霊長類のゲノムDNAを試料として,ヒトD14S299を特異的に増幅するプライマーを用いてPCR増幅を行い,原猿類以外の試料から増幅産物を得ることができた.それら増幅産物のうち,類人猿3種(コモンチンパンジー,シロテテナガザル,アジルテナガザル),旧世界ザル7種(マントヒヒ,ミドリザル,パタスザル,ベニガオザル,カニクイザル,アカゲザル,ニホンザル)の各アリールの塩基配列を決定し,ヒトのアリールと比較した.ヒトにおいて存在する3ヶ所の多型的リピート部位は霊長類においても存在しており,チンパンジー以外の霊長類ではさらに1ヶ所のリピート部位(GGAT)がみられ,計4ヶ所のリピート部位を有していた.また,その他に種あるいは属に特異的な塩基置換,4塩基単位の挿入・欠失も観察された.その結果は,「DNA多型」にまとめられた.今年度は,さらに3種の類人猿(ピグミーチンパンジー,ゴリラ,オランウータン)についても塩基配列を決定した.ヒトに最も近縁であるといわれているコモン及びピグミーチンパンジーでは,ヒトと比較すると1塩基の変異があるのみで,この塩基置換はヒトとチンパンジーが分岐後ヒトにおいて生じたと示唆される.マイクロサテライトD14S299は,霊長類においても保存され,そのリピート構造は基本的にはほぼ同じであることが明らかとなった.現在,既存の系統樹を用いて,今回観察された科,属あるいは種に特異的な変異がどの分岐過程において生じたかを推定し,ヒトへの分子進化論的解析を試みている.ヒトのマイクロサテライトのひとつであるD14S299(wg1c5)ローカスは,GGATあるいはGGAAの多型的リピート部位を有し,日本人における各アリールの塩基配列がすでに報告されている.昨年度は,類人猿3種,旧世界ザル8種,新世界ザル6種,原猿類2種の計19種の霊長類のゲノムDNAを試料として,ヒトD14S299を特異的に増幅するプライマーを用いてPCR増幅を行い,原猿類以外の試料から増幅産物を得ることができた.それら増幅産物のうち,類人猿3種(コモンチンパンジー,シロテテナガザル,アジルテナガザル),旧世界ザル7種(マントヒヒ,ミドリザル,パタスザル,ベニガオザル,カニクイザル,アカゲザル,ニホンザル)の各アリールの塩基配列を決定し,ヒトのアリールと比較した.ヒトにおいて存在する3ヶ所の多型的リピート部位は霊長類においても存在しており,チンパンジー以外の霊長類ではさらに1ヶ所のリピート部位(GGAT)がみられ,計4ヶ所のリピート部位を有していた.また,その他に種あるいは属に特異的な塩基置換,4塩基単位の挿入・欠失も観察された.その結果は,「DNA多型」にまとめられた.今年度は,さらに3種の類人猿(ピグミーチンパンジー,ゴリラ,オランウータン)についても塩基配列を決定した.ヒトに最も近縁であるといわれているコモン及びピグミーチンパンジーでは,ヒトと比較すると1塩基の変異があるのみで,この塩基置換はヒトとチンパンジーが分岐後ヒトにおいて生じたと示唆される.マイクロサテライトD14S299は,霊長類においても保存され,そのリピート構造は基本的にはほぼ同じであることが明らかとなった.現在,既存の系統樹を用いて,今回観察された科,属あるいは種に特異的な変異がどの分岐過程において生じたかを推定し,ヒトへの分子進化論的解析を試みている.近年,法医学での個人識別や人類遺伝学などの分野において,多型性に富むマイクロサテライトが盛んに利用されているが,霊長類においても各ローカスにおいて多数のアリルが存在すると考えられる.そこで,アリル内部の塩基配列解析による霊長類におけるヒトへの進化の過程の探究を目的として,本年度は4塩基の繰り返し単位(リピート)を有するヒトのマイクロサテライトのひとつであるD14S299(wglc5)ローカスについて,各種霊長類にて検出されたアリルの塩基配列を決定し,ヒトと霊長類間での塩基配列の比較を行った.原猿類,新世界ザル,旧世界ザル,類人猿の各種霊長類のゲノムDNAを試料として,ヒトD14S299を特異的に増幅するブライマーを用いてPCR増幅を行ったところ,原猿類と新世界ザルではほとんど増幅が認められなかったが,旧世界ザ゚ル並びに類人猿では全ての試料において増幅産物が得られた.それら増幅産物の一部について,クローニング法にて各アリルを単離後,塩基配列を決定し,ヒトのアリルの塩基配列と比較した.ヒトに最も近縁であるチンパンジーでは,ヒトと比較すると1塩基の置換があるのみで,それ以外には相違はなかった.なお,この置換は他の全ての霊長類においても観察された.ヒトにおいて存在する3ケ所の多型的リピート部位は霊長類においても存在しており,チンパンジー以外の霊長類ではさらに1ケ所のリビート部位がみられ,計4ケ所あリビート部位を有していた.

また,旧世界ザルであるマカク属のニホンザルとカニクイザル間では,同じ塩基配列構造を示し,マカク属に特徴的と思われる配列も認められた.以上の結果から,D14S299のリビート構造は,霊長類においても基本的にはほぼ同じであるが,属あるいは種によって特徴的な配列を有することがわかった.本年度は,3種の類人猿(ピグミーチンパンジー,ゴリラ,オランウータン)のゲノムDNAについて,昨年度と同様にヒトのマイクロサテライトのひとつであるD14S299(wg1c5)ローカスを特異的に増幅するプライマーを用いてPCR増幅を行い,増幅産物を得た.それら増幅産物の各アリールをクローニング法にて単離後,塩基配列を決定し,既に得られているヒト及び10種の霊長類(類人猿3種及び旧世界ザル7種)のアリールの塩基配列と比較した.この3種の霊長類においても,ヒトを含む霊長類と同様に3ヶ所の多型的リピート部位が存在し,またヒト及びコモンチンパンジー以外の霊長類のように,さらに1ヶ所のリピート部位(GGAT)がみられ,計4ヶ所のリピート部位を有していた.オランウータン,テナガザルに共通な配列や,ゴリラあるいはオランウータンにおいてのみ観察される4塩基単位の挿入・欠失もみられた.また,コモンチンパンジーとピグミーチンパンジーは,リピート数以外は全く同じ塩基配列構造を示した.ヒトに最も近縁であるといわれているコモン及びピグミーチンパンジーでは,ヒトと比較するとリピート数が異なる以外には,1塩基の変異があるのみで,この塩基置換はヒトとチンパンジーが分岐後ヒトにおいて生じたと示唆される.マイクロサテライトD14S299は,ヒト以外の霊長類においても保存され,そのリピート構造は基本的にはほぼ同じであるが,科,属あるいは種に特徴的な塩基置換,挿入・欠失が存在することが明らかとなった.現在,各アリールの塩基配列の整列方法をさらに検討した後,既存の系統樹を用いて,今回観察された科,属あるいは種に特異的な変異がどの分岐過程において生じたかを推定し,ヒトへの分子進化論的解析を試みている.
悪性軟部腫瘍に対する新たな分子標的治療法の開発

明細胞肉腫の発生における、EWS/ATF1融合遺伝子の役割を解明する目的で、EWS/ATF1トランスジェニックマウスを用いた腫瘍モデルを作製した。EWS/ATF1発現マウスの全例で、全身の皮下組織に多発軟部腫瘍が発生した。その組織像は明細胞肉腫と類似した特徴を有していた。EWS/ATF1により発生する腫瘍の起源を検討したところ、神経提由来の細胞であることが明らになった。EWS/ATF1の発現誘導によって、Fosの発現量が著明に増加しており、ヒト明細胞肉腫においてもFOSの発現抑制が抗腫瘍効果を示した事実から、FOSは明細胞肉腫の分子標的治療の重要な標的候補になり得ることが示唆された。我々は特異的な染色体転座を持つ明細胞肉腫に注目し、染色体転座の結果生じる融合遺伝子EWS/ATF1(明細胞肉腫)の機能解析を行ってきた。EWS/ATF1融合蛋白は異常な転写活性をもつ転写因子として働き、細胞増殖や癌化に強く関与していることを明らかにした。さらに融合遺伝子EWS/ATF1を強制発現させることが出来るEWS/ATF1-inducibleマウスの作成に成功し、EWS/ATF1を強制発現させたマウスの全てにおいて約3カ月の短期間で軟部組織に明細胞肉腫様の肉腫が発生することを見出した。加えて、モデルマウスに発生した腫瘍、ヒト明細胞肉腫細胞株および手術切除標本において、FOS(proto-oncogene)が過剰発現していることを発見した。しかも、mRNAレベルでの発現量は正常細胞や他の肉腫の10800倍と高値であった。これらの知見をふまえ、明細胞肉腫におけるFOSの過剰発現のメカニズムの解析を行った。まず、EWS/ATF1発現誘導マウスに発生した腫瘍におけるEWS/ATF1とFosの発現量を評価し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてEWS/ATF1によるFosのプロモーター活性を評価した。さらにクロマチン免疫沈降法にてFosのプロモーター領域へのEWS/ATF1の直接的結合の有無を評価した。その結果、FOSの発現がEWS/ATF1の発現量に比例することを見出した。またFosのプロモーター解析にて,EWS/ATF1がFosプロモーター上のcAMP-resposive element (CRE)に直接結合してFosの転写を活性化していることが判明した。さらに、マウスおよびヒト明細胞肉腫の培養細胞において、RNA干渉によりFOSのノックダウンを行ったところ、細胞増殖活性、トランスフォーメーション能が低下した。次にFOSのinhibitor(T5224)をEWS/ATF1-inducibleマウスに経口投与したところ、一定の抗腫瘍効果が認められた。これまで多種類の悪性骨軟部腫瘍において染色体相互転座による融合遺伝子が発見され、その遺伝子産物である融合蛋白質が組織特異的な腫瘍の発生に関与していると考えられている。