hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質ラフトと膜貫通型キナーゼの協働によるシグナル変換機構：１分子追跡による研究

本研究の目的は、免疫シグナルに重要な役割を担う、IgE抗体の受容体であるFceRIとシグナルアダプター分子SLP-76およびLATの相互作用および活性化の機構の解明である。これまでに、マスト細胞様細胞株RBL-2H3において、抗原刺激有無に関係なくLATとSLP-76の共局在は見られなかった。つまり、従来考えられてきたSLP-76-LATの安定的複合体形成とは異なる分子挙動を示すことを明らかにしてきた。今年度は、SLP-76と相互作用することが報告されている膜結合分子(LAT1、LAT2、LAT1/2、あるいはCD6)について、CRISPR/Cas9システムを用いて内在性分子発現をなくした。これらのノックアウト(KO)細胞を用いて、SLP-76や下流エフェクター分子の動きを1分子イメジングで検討したところ、LAT1/2ダブルKO細胞では、SLP-76が巨大で安定なクラスターを形成することを見出した。さらにこのSLP-76クラスターには常に下流分子Vav1が共局在することが分かった。また、CD6の関与はこれまでT細胞でしか報告されていなかったが、CD6KO細胞ではSLP-76の膜リクルート挙動に変化はなかったが、膜へリクルートされてくるVav1の頻度と膜滞在時間が増加した。対して、LAT1あるいはLAT2単独をKOしただけでは、野生型細胞と比較して変化なかった。これらのことから、マスト細胞において、1LAT1とLAT2の機能は相補的である、2LAT1/2の他にSLP-76を強固に膜結合させる分子(X)が存在する、3LAT1/2が分子XとSLP-76の結合を阻止している可能性がある、さらに4新規FceRIシグナル伝達分子CD6がSLP-76への下流エフェクター分子リクルートに関与している、ことが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。本提案研究では、『GDNFの細胞内シグナルの時空間制御機構と、それに関わるラフト機構』について、1GPIアンカー型タンパク質である受容体GFRと膜貫通キナーゼRETの相互作用および活性化の機構の解明と、2RETとSrcの下流シグナルの時空間制御機構の解明を目的とする。初年度ではまず、刺激前におけるGFRとRETの細胞膜上での挙動を、1分子イメジングを用いて観察した。その結果、両方の分子には、1)常に動いている、2)常に止まっている、3)動いたり止まったりしている、という3種の軌跡があると考えられた。そこで、以前研究室で開発したソフトを用いて、観察された全ての分子の軌跡を「動いている」「ずっと止まっている」「一時停留」の3つに定量的に分類し、各々の合計時間を求めた。その結果、GFRとRETの両者とも、共発現させたときに常時静止している成分が増加した。しかし、その時GFRとRETはほとんど共局在しなかった。これは、両者が結合した結果、シグナル系が介在して、両者の存在様式が変わった可能性を示唆している。次に動いている分子について調べた。それらの拡散運動の速さは、共発現によって変わるのかどうか、「常に動いている」と分類された各分子1つずつについて、それらの拡散係数を求めた。GFRの拡散係数は、0.67μm^2/s、一方でRETは0.21μm^2/sであり、GFRの方がRETより約3倍速い。この結果は、GFRとRETが刺激前の状態ではほとんど結合していないことを示唆している。実際、共発現させても、両者の拡散係数に変化はみられなかった。前出の結果と合わせると、共発現はGFRとRETの両者の止まっている分子の数を増やすが、動いている分子については、拡散運動に影響を与えない、ということが考えられる。本提案研究では、『GDNFの細胞内シグナルの時空間制御機構と、それに関わるラフト機構』について、GPIアンカー型タンパク質GFRと膜貫通キナーゼRETの相互作用および活性化機構の解明を目的としていた。今年度は新たに長寿命な色素を用いて、GFRとRETの細胞膜上での挙動を1分子イメジングで観察した。その結果、常に存在すると考えられていたリガンド刺激後におけるGFRとRETの共局在は全くみられず、むしろGFRとRETの細胞膜上での挙動は全く異なることがわかった。さらに、我々の所有する高分解能高速顕微鏡のセットアップをもってしても、2分子の共局在は観察不可能なほど最速の反応であることが判明した。このことから、GFRとRETの共局在はリガンド結合後、非常に短時間で終了することが予想される。しかし、現在の実験装置ではその反応系は観察出来ない。そこで、同様な脂質ラフトとキナーゼが恊働するシグナル変換機構で、我々の実験装置で観察可能な『FceRIとシグナルアダプター分子SLP-76およびLATの相互作用と活性化機構の解明』を行う事にした。FceRIはIgE抗体の受容体であり、脂質ラフトで機能することが知られている。抗原の結合によって架橋されたFceRIはLynキナーゼによるリン酸化を経て、SLP-76やLATなどのシグナルアダプター分子を含む複合体を介して、下流へとシグナルが伝達されると言われている。しかし、1分子イメジングの結果、抗原刺激有無に関係なく、SLP-76とLATの共局在はみられなかった。つまり、従来考えられていたようなSLP-76とLATの複合体形成とは異なる分子挙動を示すことが明らかとなった。

SLP-76はLATを介して細胞膜上に存在すると言われていたが、LATノックアウト細胞を用いても、SLP-76の分子挙動に変化はみられなかった。この結果は、LATがなくともSLP-76が細胞膜に滞在できることを示唆する。今年度は長寿命蛍光タグを用いて再度GFRとRETの1分子イメジングを行った結果、リガンド刺激直後から刺激後5分以上観察しても、GFRとRETの共局在は全くみられなかった。また、その反応系が我々のもつ高分解能高速顕微鏡をもってしても、観察不可能なほどの最速なものであったため、観察する分子を変更する必要が出てきた。新たな分子の探索とそれに伴う実験材料の確保、およびそのシグナル伝達経路の勉強に少し時間を取られたので、計画より多少の遅れが出てしまった。しかしながら、今回の実験系の変更で、観察する分子は変わったものの、『脂質ラフトとキナーゼの協働によるシグナル変換機構』というテーマの本質に変わりはない。全体の区分としては(3)のやや遅れているにしたが、新たな分子(IgE-FceRI-LAT-SLP-76)の反応系を用いて1分子イメジングを行い、その分子挙動を観察した点は計画通りである。また、4月から出産・育児に伴って、現在研究を中断しているところである。本研究の目的は、免疫シグナルに重要な役割を担う、IgE抗体の受容体であるFceRIとシグナルアダプター分子SLP-76およびLATの相互作用および活性化の機構の解明である。これまでに、マスト細胞様細胞株RBL-2H3において、抗原刺激有無に関係なくLATとSLP-76の共局在は見られなかった。つまり、従来考えられてきたSLP-76-LATの安定的複合体形成とは異なる分子挙動を示すことを明らかにしてきた。今年度は、SLP-76と相互作用することが報告されている膜結合分子(LAT1、LAT2、LAT1/2、あるいはCD6)について、CRISPR/Cas9システムを用いて内在性分子発現をなくした。これらのノックアウト(KO)細胞を用いて、SLP-76や下流エフェクター分子の動きを1分子イメジングで検討したところ、LAT1/2ダブルKO細胞では、SLP-76が巨大で安定なクラスターを形成することを見出した。さらにこのSLP-76クラスターには常に下流分子Vav1が共局在することが分かった。また、CD6の関与はこれまでT細胞でしか報告されていなかったが、CD6KO細胞ではSLP-76の膜リクルート挙動に変化はなかったが、膜へリクルートされてくるVav1の頻度と膜滞在時間が増加した。対して、LAT1あるいはLAT2単独をKOしただけでは、野生型細胞と比較して変化なかった。これらのことから、マスト細胞において、1LAT1とLAT2の機能は相補的である、2LAT1/2の他にSLP-76を強固に膜結合させる分子(X)が存在する、3LAT1/2が分子XとSLP-76の結合を阻止している可能性がある、さらに4新規FceRIシグナル伝達分子CD6がSLP-76への下流エフェクター分子リクルートに関与している、ことが示唆された。これまでの研究結果から、SLP-76とLATは抗原刺激有無に関係なく、SLP-76分子クラスターとLAT分子クラスターは共局在しないことがわかった。つまり、従来考えられていたようなSLP-76とLATの複合体形成とは異なる分子挙動を示すことが明らかとなった。
ダウン症候群における免疫応答の個体差に着目した歯周病のオーダーメイド医療の可能性

Down症候群(DS)は歯周病の罹患率が高く,健常者と比較して早期に発症し進行が速く重篤であることが知られているが,DSにおける歯周疾患の発症と進行の機序は未だ不明な点が多い.これまでに我々は,炎症性サイトカイン発現誘導において中心的役割を果たす転写因子NF-κB p65サブユニットについて検討し,歯周病原菌であるP. gingivalis由来LPS刺激によって健常者由来歯肉線維芽細胞(NGF)と比較してDS由来(DGF)ではリン酸化が高くなることを明らかにしている.近年,NF-κBの活性化を抑制する分子機構について注目されている.なかでもユビキチンリガーゼE3としての機能を持つPDZ and LIM domain protein 2 (PDLIM2)は,核内に移行したNF-κBに結合してユビキチンを付加し,プロテアソームによるNF-κBの分解を誘導することで炎症反応を抑制することが報告されている.これらのことから, DSにおける重篤な歯周病の惹起と進行にPDLIM2が関与している可能性が推察される.しかしながら,これまでに歯肉線維芽細胞においてPDLIM2の存在を明らかにした報告はない.従って,ヒト歯肉線維芽細胞株(HGF-1)を用いてP. gingivalis由来LPSに対するPDLIM2の発現変動を検討することで本研究を遂行するための足がかりとした.その結果,HGF-1において恒常的にPDLIM2が発現していることが明らかとなり,LPS刺激によりPDLIM2発現およびタンパク発現は濃度依存的に有意に減少した.以上より,ヒト歯肉線維芽細胞においてもPDLIM2が炎症応答を抑制的に制御している可能性が示された.さらに興味深いことに,NGFと比べDGFではPDLIM2発現が低い傾向を示したため,DGFにおける異常な炎症応答にPDLIM2が関与する可能性が考えられた.Down症候群(DS)における歯周病の有無と免疫担当細胞の機能異常の関連性について明らかにする目的で,初年度よりフローサイトメトリー法を用いてDS患者の末梢血中における免疫担当細胞の分画解析を行う予定であったが,サンプル採取が困難であり実施できていない状況である.しかしながら,NF-κBの活性化を抑制するPDLIM2が歯肉線維芽細胞においても炎症応答を抑制的に制御している可能性を示す新たな知見が得られたことは,本研究計画を展開していくにあたり,重要な足がかりになったと考えている.本年度の研究結果より,ヒト歯肉線維芽細胞株であるHGF-1において恒常的にPDLIM2が発現していることが明らかになった.しかしながら,ヒト歯肉線維芽細胞におけるPDLIM2の詳細な働きについては未だ不明であるため,siRNAによるPDLIM2発現ノックダウンの実験条件を確立し,P. gingivalis由来LPS刺激に対するNF-κB p65の核移行についてウェスタンブロット法を用いて確認するとともに,real time PCR法による炎症性サイトカインの遺伝子発現解析を行う.また,PDLIM2ノックアウトマウスを用いて,P. gingivalis感染による歯周病モデルマウスを作製し,in vivoでの検討も予定している.さらに,NF-κBの活性化を抑制するPDLIM2の遺伝子発現が健常者由来歯肉線維芽細胞(NGF)と比較してDown症候群由来(DGF)では恒常的に低い傾向を示すことが明らかになったことから,Down症候群(DS)における重篤な歯周病の惹起と進行にPDLIM2が深く関与している可能性が高いと考えられる.臨床サンプル数を増やし,DS患者における歯周病の有無や重症度とPDLIM2の関連性について遺伝子発現解析を含めた検討を行っていく.また, PDLIM2はSTATを不活性化することにより炎症反応に対して抑制的に働くだけではなく,その後の修復期においては,TGFβ-Smadのシグナルを不活性化して,組織修復が過剰にならないように創傷治癒反応を制御しているとの報告もあることから,スクラッチアッセイを行い,DGFにおける創傷治癒に及ぼすPDLIM2の影響についても検討する.一方,課題である末梢血サンプル採取については引き続き対応策の検討を行っていく.Down症候群(DS)は歯周病の罹患率が高く,早期に発症し進行が速く重篤であることが知られているが,その機序については未だ不明な点が多い.歯周病原菌Porhyromonas gingivalis(P. g)は,線毛の遺伝子型(fimA)によってIからV型に分類されている.日本人の進行性歯周炎患者で検出されたP. gの多くがII型であり,興味深いことにDS患者でもII型P. gが高頻度で検出されるとの報告がある.これらのことから,先行研究の多くで用いられてきたI型ではなく,II型P. gがDSにおける重篤な歯周病の惹起に深く関与している可能性が推察される.従って,初年度はII型P. gに焦点を当て,DS歯肉線維芽細胞(DGF)におけるII型P. g由来LPSに対する応答性を検討した.まず,I型P. g(ATCC 33277株)およびII型P. g(TDC60株)より分離・精製したLPSをDGFと健常者歯肉線維芽細胞(NGF)に作用させ,リアルタイムPCR法で炎症の指標となるIL-6,IL-8ならびにCCL20の遺伝子発現を解析した.その結果,IL-6発現は,I型およびII型LPSによってNGFよりもDGFにおいて有意に上昇した.

NGFではII型に比べI型LPSによる発現が高かった.IL-8発現は,I型LPSによってDGFよりもNGFの方が,II型LPSによってDGFの方が有意に上昇した.NGFではI型LPSによる発現が有意に高く,DGFではII型LPSの方が有意に高かった.CCL20発現は,II型LPSによってNGFよりもDGFにおいて有意に上昇した.興味深いことに,LPS非刺激のDGFでもIL-6,IL-8ならびにCCL20遺伝子発現が有意に高く検出された.以上のことから,DSにおける重篤な歯周病の発症と病態進展には異常な遺伝的背景因子とII型P. gのLPSが深く関与している可能性が考えられた.Down症候群(DS)における歯周病の有無と免疫担当細胞の機能異常の関連性について明らかにする目的で,初年度はフローサイトメトリー法を用いてDS患者の末梢血中における免疫担当細胞の分画解析を行う予定であったが,サンプル採取が困難であり実施できていない状況である.しかしながら,DS歯肉線維芽細胞を用いた予備実験によりDSにおける重篤な歯周病の発症と病態進展に,DSの持つ異常な遺伝的背景因子とfimAII型P. gingivalisのLPSが深く関与している可能性を示す新たな知見が得られたことは,本研究計画を展開していくにあたり,重要な足がかりになったと考えている.Down症候群(DS)は歯周病の罹患率が高く,健常者と比較して早期に発症し進行が速く重篤であることが知られている.しかしながら,DSにおける歯周疾患の発症と進行の機序は未だ不明な点が多い.これまでに我々は,炎症性サイトカイン発現誘導において中心的役割を果たす転写因子NF-κB p65サブユニットについて検討し,歯周病原菌であるP. gingivalis由来LPS刺激によって健常者由来歯肉線維芽細胞(NGF)と比較してDS由来(DGF)ではリン酸化が高くなることを明らかにしている.近年,NF-κBの活性化を抑制する分子機構について注目されている.なかでもユビキチンリガーゼE3としての機能を持つPDZ and LIM domain protein 2 (PDLIM2)は,核内に移行したNF-κBに結合してユビキチンを付加し,プロテアソームによるNF-κBの分解を誘導することで炎症反応を抑制することが報告されている.これらのことから, DSにおける重篤な歯周病の惹起と進行にPDLIM2が関与している可能性が推察される.しかしながら,これまでに歯肉線維芽細胞においてPDLIM2の存在を明らかにした報告はない.従って,本年度はヒト歯肉線維芽細胞株(HGF-1)を用いてP. gingivalis由来LPSに対するPDLIM2の発現変動を検討することで本研究を遂行するための足がかりとした.その結果,HGF-1において恒常的にPDLIM2が発現していることが明らかになった.一方,LPS刺激によってIL-8遺伝子発現は有意に上昇したのに対し,PDLIM2遺伝子発現およびタンパク発現は濃度依存的に有意に減少した.また,NF-κB p65の核移行は濃度依存的にLPS刺激で誘導された.以上のことから,ヒト歯肉線維芽細胞においてもPDLIM2が炎症応答を抑制的に制御している可能性が示された.
立木用ポータブルX線検査装置の開発と材質研究およびマツ材線虫病研究への適用

超小型X線源を用いた検査装置を試作した.4樹種(スギ,ヒノキ,クロマツ,カラマツ)の室内実験により得られたCT画像から樹幹内の節の分布,心材と辺材の区分,年輪等の抽出が可能であり,小径木対象にした材質調査であれば非破壊的に適用可能であることを実証した.ただし,クロマツのCT画像からは,マツ材線虫病による症状とも関連するとされている水分通道停止領域(低含水率領域)の特定は困難であった.したがって,現段階における本装置の解像度ではマツ材線虫病に関する研究には活用できないことが分かり,装置のさらなる改善が必要である.材質研究をはじめとする野外の樹木等を対象にした様々な研究に活用できる立木用X線検査装置の開発を目標に研究を進めている.本研究では,前回採択された科学研究費補助金(基盤研究(C)一般,代表古賀信也)により実施した予備的な開発研究を展開し,プロトタイプの検査装置の製作とフィールド実証試験による評価・改良,小型軽量・出力可変型のX線源の開発,さらには材質研究とマツ材線虫病研究に適用し,新知見を得ることを目的としている.今年度前半は,プロトタイプの装置の製作にむけて,研究分担者の一人である鈴木らが開発した超小型X線源のX線特性の把握,測定項目・観察内容に適した様々な検知条件の探索,野外での使用に適したハードウェアの検討,測定項目・観察内容・CT化に適した画像処理方法の検討等を中心に進めた.これらの検討結果をもとに,今年度後半は,装置の再設計を行い,最終的にプロトタイプの検査装置を製作した.また,年間を通じて,現在使用しているX線源よりもさらに小型のX線源の開発を進めるとともに,今後のマツ材線虫病研究への適用にむけ,超小型X線源を用いたマツ材線虫罹病木の木部の予備的観察実験を行った.さらに,今後実施予定である野外における実証実験の結果の評価に備え,打撃音波速度とレジストログラフによる微小ドリルの穿孔抵抗値を用いた2つの方法による樹幹内の腐朽検査を実施し,比較検討のための基礎データを収集した.最終的には野外でのX線使用となることから装置の放射線障害防止対策について検討した.材質研究をはじめとする野外の樹木等を対象にした様々な研究に活用できる立木用X線検査装置の開発を目標に研究を進めている.本研究では,前回採択された科学研究費補助金(基盤研究(C)一般,代表古賀信也)により実施した予備的な開発研究を展開し,プロトタイプの検査装置の製作とフィールド実証試験による評価・改良,小型軽量・出力可変型のX線源の開発,さらには材質研究とマツ材線虫病研究に適用し,新知見を得ることを目的としている.今年度は以下項目について実施した.(1)前年度製作した検査装置を用い,画像再構成ソフトウェアの撮影素子位置の調整およびフィルタの調整による再構成画像の品位向上を行った.その結果,針葉樹乾燥材で鮮明な画像を取得でき年輪が確認できた.また,生材状態の木材に対する撮影条件を検討するためにアクリル製基準樹木模型(モデル)を作製し,そのモデルを用いた様々な水分条件での撮影実験を行い,装置の調整を行った.さらに,生材状態の直径約15cmのスギ・ヒノキ樹幹を対象に撮影実験を行い,CT画像を取得した.その画像で心材と辺材の区分が可能であることを確認した.さらに,取得画像と実測による心材率の比較検討を行った.(2)当初のX線源よりもさらに小型軽量のX線源の開発を行った.(3)最新の小型軽量X線源を用いマツ材線虫罹病木の木部の予備的観察実験を行った.(4)昨年度同様,野外実証試験のための基礎資料として,樹幹横断面における打撃音波速度とレジストグラフによる樹幹接線面における微小ドリルの穿孔抵抗値を用いた2つの方法による樹幹腐朽検査を実施し,比較検討のためのデータの収集・検討を行った.(5)昨年度同様,装置の放射線障害防止対策について検討するとともに,タングステンシートよりも軽量な遮蔽シートの探索,回転レールの軽量化の検討など全体的な装置の改良について検討した.材質研究をはじめとする野外の林木・樹木を対象にした様々な研究に活用できる立木用X線検査装置の開発を進めている.平成25年度に超小型X線源に対応した立木用検査装置の試作機を製作し,平成26年度にはその装置の一部改良作業を行った.本年度は以下の内容について実施した.(1)X線透過画像をより鮮明でスピーディに得られるように,立木に対する測定項目・観察内容に適した検知条件の探索を行うとともに,画像処理システム,制御システムのさらなる改良を行った.(2)野外フィールドでの使用に適した軽量かつ高出力を可能とするカーボンナノ構造体電子源を用いたX線源の開発を進めた.(3)九州大学福岡演習林および北海道演習林から得られた生材状態のスギ(1個体)・ヒノキ(1個体)・クロマツ(1個体)・カラマツ(2個体)の円板(直径15cm20cm)を対象に撮像を行った.その結果,得られたCT画像から樹幹内の節の分布,心材と辺材の区分,心材内の異常な高含水率領域,心材内の年輪を抽出でき,さらにその情報から年輪数,年輪幅および心材率等を求めることができることを確認した.ただし,クロマツ円板のCT画像からは,辺材における低含水率領域の特定は難しく,現段階での解像度ではマツ材線虫病による症状とも関連する水分通導停止領域の評価できないことが分かった.

引き続き画像の解像度・品位をあげるための改良が必要である.(4)放射線障害防止のための所定の手続き・対策等に関する情報を収集するとともに,野外適用のための諸条件の探索およびそれにもとづく装置の改良について検討した.以上の結果をとりまとめ第66回日本木材学会大会(名古屋市)で発表した.また論文投稿にむけ資料の収集をおこなった.超小型X線源を用いた検査装置を試作した.4樹種(スギ,ヒノキ,クロマツ,カラマツ)の室内実験により得られたCT画像から樹幹内の節の分布,心材と辺材の区分,年輪等の抽出が可能であり,小径木対象にした材質調査であれば非破壊的に適用可能であることを実証した.ただし,クロマツのCT画像からは,マツ材線虫病による症状とも関連するとされている水分通道停止領域(低含水率領域)の特定は困難であった.したがって,現段階における本装置の解像度ではマツ材線虫病に関する研究には活用できないことが分かり,装置のさらなる改善が必要である.超小型X線源のX線特性の把握,測定項目・観察内容に適した検知条件の探索,野外での使用に適したハードウェアの検討,測定項目・観察内容・CT化に適した画像処理方法の検討に計画よりも多くの時間を要しているため27年度が最終年度であるため、記入しない。木質科学前年度同様,測定項目・観察内容に適した検知条件の探索,測定項目・観察内容・CT化に適した画像処理方法の検討を行いながら,試作装置の評価と改良を行う.また,前年度に引き続き,野外フィールドに適した超小型・軽量X線源の開発を進めるとともに放射線障害防止対策を検討する.さらには,試作装置の材質研究およびマツ材線虫病研究への適用を試みる.得られた成果を公表する.超小型X線源のX線特性の把握,測定項目・観察内容に適した様々な検知条件の探索,野外での使用に適したハードウェアの検討,測定項目・観察内容・CT化に適した画像処理方法の検討に計画よりも多くの時間を費やすことになったため27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。前年度に引き続き,測定項目・観察内容に適した様々な検知条件の探索,測定項目・観察内容・CT化に適した画像処理方法の検討を行いながら,試作装置の評価と改良を行う.また,前年度に引き続き,野外フィールドに適した超小型X線源の開発を進めるとともに放射線障害防止対策を検討する.さらには,試作装置の材質研究およびマツ材線虫病研究への適用を試みる.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年3月中旬に九州大学においてポータブルX線CT装置の納品・検品がなされた後,実験実施場である独立行政法人産業技術総合研究所(茨城県つくば市)に搬送する予定であったが,消費税増税による影響もあり,年度内に対応可能な精密機器の搬送業者が見つからなかったため.平成26年度内に,独立行政法人産業技術総合研究所(茨城県つくば市)へのポータブルXX線CT装置の搬送費としての使用を計画している.
ドップラ光コヒーレンス断層法による脳皮質深部微小循環調節機構の解析

OCT信号に含まれる血流からのドップラ信号を微小血管のマーカーとすることによって、ラット大脳皮質深部の微小血管を可視化した。ドップラOCT法によって得られた血流の3次元空間分布は、深さ1.5mmに至る皮質の微小血管、特に穿通枝微小血管の走行を明瞭に示した。同時に計測した血流速度の拍動変化から、細動脈と細静脈を分離できた。更に、下肢電気刺激に伴い、1次体性感覚野の下肢領域における微小血管の血流速度は10%程度の増大を見せたのに対して、他領域の微小血管で変化は見られなかった。皮質の深さ方向での微小血管の構築や血流の情報は、コラム間のみならず層間の血流調節機構の新しい理解につながるだろう。脳皮質は機能的カラム・層構造のようなサブミリメータの3次元構造を有し、神経活動も空間的に局在化している。神経活動に伴う酸素需要の増大は局所血流の増大を必要とし、神経循環カップリングと呼ばれる血流調節が為されている。従って皮質内の神経組織におけるカップリングを解析するためには、脳皮質組織を深さ数mm、数μm程度の空間分解能で観察する必要がある。光干渉断層法(OCT)はこれら条件を満たしているが、反射率の違いを画像化するだけであるため、皮質深部の微小血管を構造画像から同定することは困難である。本研究では、血流によるドップラ周波数偏移を検出し微小血管のマーカーとすることにより、脳皮質深部微小血管の3次元構築及び血流速度分布の計測法を確立し、神経活動に伴う脳局所血流変化の解析に応用した。ラットを対象にしたin vivo実験によって、本手法は皮質の深さ2mm程度までの微小血管、特に穿通枝細動静脈を有効に検出できることが示された。血流速度の3次元分布は脳表軟膜細動脈から穿通枝細動脈への分岐部の構造、穿通枝血管の皮質内分布を明瞭に可視化可能にした。また、同時計測した大腿動脈圧を基準にして微小血管血流の拍動性を定量化でき、動脈、静脈の分別を可能にした。更に、下肢電気刺激をした際の皮質内微小血管血流速度を計測した結果、1次体性感覚野下肢領域を走る血管では、軟膜細動脈、穿通枝動脈、静脈のいずれも10%程度の血流速度増大を示したのに対し、他領域の微小血管ではいずれも有意な変化は見られなかった。このようにドップラOCT法は、ミクロンレベルでの3次元的な神経循環カップリングの解明、皮質の各層間への血流分配機構の解明に役立つと期待される。脳皮質は機能的カラム・層構造とよばれるサブミリメータスケールの構造を有し、神経活動も空間的に局在化している。このような脳皮質内の血流調節機構を解析するためには、脳皮質を数μm程度の空間分解能で深さ数mmまで計測する必要がある。光コヒーレンス断層法(OCT)は、観察可能深度・空間分解能の条件はこれを満たしているが、単に構造画像のみでは皮質深部の微小血管を識別することは困難である。これまでにラットを用いたin vivo実験によって、本手法が大脳皮質の深さ2mm程度までの微小血管の可視化とともに、深部微小血管の血流速度を定量的に評価出来ることを示した。更に、同時計測した大腿動脈圧を基準にして深部微小血管血流の拍動性を定量化でき、動脈、静脈の分別を可能にした。時間領域OCTを用いて皮質深部微小血管を可視化し、下肢電気刺激をした際の神経活動による血流変化を体性感覚野の広い範囲で計測しデータを収集した。周波数掃引レーザを光源に用いて新たに周波数領域OCT法を導入するとともに、ガルバノスキャナーを用いた2次元走査を行うことによって、OCT画像取得を大幅に高速化することが出来た。脳皮質は脳表と平行に機能的カラム、垂直に層構造というサブミリメータスケールの3次元構造を有するとともに、神経活動も局在化している。皮質内の神経組織におけるこのカップリング機構を解析するためには、脳皮質を深さ数mmにわたり、数um程度の空間分解能で観察する必要がある。

光干渉断層法(OCT)はこれら条件を満たすが、皮質深部の微小血管を構造画像から同定するのは困難である。本研究は、血流によるドップラ偏移を検出し微小血管のマーカーとすることにより、脳皮質深部微小血管の3次元構築及び血流速度分布の計測法を確立し、神経活動に伴う脳局所血流変化の解析への応用を目的とした。ラットを用いたin vivo実験によって、本手法が皮質の2mm程度の深さまで微小血管を可視化可能なこと、また深部微小血管の血流速度を定量的に評価出来ることを示した。また、同時計測した大腿動脈圧を基準にして深部微小血管血流の拍動性が定量化でき、動静脈の分別を可能にした。本システムを用いて、下肢電気刺激した際の脳神経活動による血流変化を体性感覚野の広い範囲で計測した結果、下肢感覚領域を走る血管では、軟膜細動脈、穿通枝動脈、静脈のいずれも10%程度の血流速度増大を示したのに対し、他領域の微小血管で有意な変化は見られなかった。更に、時間領域OCTに加え、周波数掃引光源を用いた周波数領域OCT法を導入するとともに、ガルバノスキャナーを用いた2次元走査を行うことによって、OCT画像取得を大幅に高速化することが出来た。このシステムを用いることにより、皮膚におけるOCT信号強度の深さ方向依存性と血糖値との間の相関を確かめることができた。本手法は血糖値の非侵襲的評価につながると期待される。時間領域OCTによる皮質深部微小血管の可視化、神経活動による変化を脳皮質体性感覚野の広い範囲で計測できた。更に周波数掃引光源を用いた周波数領域OCTへの発展、ガルバノメータスキャナによる高速2次元走査により、構造画像の高速度取得のためのシステム改良は達成できた。しかし、この手法によるドップラ計測法が未だ確立出来ていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。データ処理法を工夫することにより、周波数領域ドップラOCT法の確立に注力する。組織内部の微小血管の実時間in vivo計測を可能にする改良を行う。
鳥類における音声コミュニケーション：複雑な情報伝達を進化させる社会要因の解明

本研究では,鳥類を対象とし,社会要因がコミュニケーションを複雑に進化させる要因となるかどうか検証にした。シジュウカラ科鳥類(以下,カラ類)は冬季に同種・他種とともに群れ(混群)を形成する。各個体の餌台への訪問の時系列データの記録や音声の録音を通して,複雑な群れ社会を形成する種や多くの鳥類種とともに群れをつくる種ほど,個体の発する音声が複雑になることが明らかになった。また,新たな展開として,他種との社会的結束が強い種においては,他種の音声とその意味の関連学習など,高度な認知能力も確認された。これらの結果は,社会性が認知能力の進化要因になるという社会脳仮説を支持している。近年の研究で,一部の哺乳類や鳥類が,異なる鳴き声を使い分け,捕食者の種類や食物の在処など,様々な情報を他個体に伝えることが明らかになってきた。しかし,このように複雑な音声コミュニケーションが,どのような要因によって進化したのか未だに明らかでない。群れを形成し,音声によって集団行動を統制する動物においては,社会関係が複雑になればなるほど,コミュニケーションもより精巧なものへと進化すると予測される。本研究では,冬季に同種・他種とともに群れ(混群)を形成するシジュウカラ科鳥類を対象に,社会的な要因(社会的相互作用や群れの種構成)がコミュニケーションの進化圧となりうるか検証することを目的とする。本研究は,ひとつの鳥類群集を対象として,混群における社会的相互作用と音声コミュニケーションの複雑性の関係を詳細に調べる研究課題(課題1)と,複数の鳥類群集を対象とし,混群の種構成と音声の複雑さの関係を明らかにする地域間比較(課題2)の二つの課題に大別される。平成28年度は,主に長野県軽井沢町にて課題1を主に進捗させた。その結果,混群の種間の優劣関係において劣位である種は,群れの動態をリードし,状況に応じて様々な音声を使い分けることが明らかになった。一方,混群において優位な種は,劣位種に追従し,様々な状況において単純な音声を汎用する傾向がみられた。さらに,平成28年度は,北海道や隠岐島,石垣島においても野外研究を実施し,課題2も進捗させた。しかし,鳥類群集の種構成と音声の複雑さの関係を明らかにするには,より多くの調査地において野外研究を進める必要があり,これについては平成29年度に進める計画である。平成28年度は,当初の計画通り,長野県において,混群内での社会的相互作用と音声の複雑さの関係を明らかにする研究課題(課題1)を進捗させた。その結果,混群に参加する種が協同で餌の探索や捕食者の追い払いをおこなう際,種によってその役割が異なることがわかってきた。体サイズが小さく,餌場において種間での優劣関係が劣位な種(コガラ)は積極的に餌を探索し,特異な音声を発することで餌場に群れを誘引する。また,捕食者を追い払う際にももっとも激しく音声を発し,この際,複数の音声要素が組み合わさった音声を発することも明らかになった。この音声は警戒と集合という異なる意味の組み合わさった複合語であり,語順には文法規則も確認された。一方で,餌場における優位種は,劣位種に追従する傾向があり,異なる音声の使い分けや音声の組み合わせ規則は確認されなかった。また,混群はいくつかの同種群から成り立つが,同種群の群れ構成が変わりやすく,群れの離散集合が激しい種(シジュウカラ)のほうが,いつも決まった個体と群れをなす種(ヤマガラなど)よりも音声が複雑に発達している傾向がみられた。これらの結果は,社会関係の複雑さが音声コミュニケーションを複雑化させる淘汰圧となるという仮説を支持する。さらに,本年度は,北海道や隠岐島,石垣島においても野外研究を実施し,鳥類群集の種構成と音声の複雑さの関連性(課題2)についても調べた。これらの研究成果の一部はすでに論文化しており,国際誌に投稿中である。また,本年度は,関連する研究成果を国際行動生態学会,日本鳥学会,日本動物行動学会,日本生態学会において発表した。しかし,このように複雑なコミュニケーションが,どのような要因によって進化したのか未だに明らかでない。本研究では,冬季に同種・他種とともに群れ(混群)を形成するシジュウカラ科鳥類を対象に,社会的な要因(社会的相互作用や群れの種構成)がコミュニケーションを複雑化させる進化圧となりうるか明らかにすることを目的とした。本研究は,社会ネットワーク分析などを駆使して,混群における社会的相互作用と音声コミュニケーションの複雑性の関係を明らかにする研究(課題1)と,複数の鳥類群集を対象とし,混群の種構成と音声の複雑さの関係を明らかにする地域間比較(課題2)の二つの課題に大別される。最終年度である平成29年度は,主に長野県軽井沢町にて課題1について研究を進捗させた。また,6月から8月にかけてアメリカのモンタナ大学からAlexis Billings氏を招聘し(JSPSサマー・プログラムを利用),本研究課題についても推進させた。さらに,北海道や滋賀県,福岡県においても野外研究を実施し,課題2も進捗させた。研究期間全体を通して,これらの研究課題はおおむね順調に進んだと自己評価する。

また研究内容は6編の論文として発表しており,現在もなお複数の論文を執筆中である。また,研究内容は学会においても高く評価され,2018年3月に開催された日本生態学会では日本生態学会宮地賞を受賞した。本研究では,鳥類を対象とし,社会要因がコミュニケーションを複雑に進化させる要因となるかどうか検証にした。シジュウカラ科鳥類(以下,カラ類)は冬季に同種・他種とともに群れ(混群)を形成する。各個体の餌台への訪問の時系列データの記録や音声の録音を通して,複雑な群れ社会を形成する種や多くの鳥類種とともに群れをつくる種ほど,個体の発する音声が複雑になることが明らかになった。また,新たな展開として,他種との社会的結束が強い種においては,他種の音声とその意味の関連学習など,高度な認知能力も確認された。これらの結果は,社会性が認知能力の進化要因になるという社会脳仮説を支持している。鳥類の群れの種構成は地域によって大きく異なる。鳥類の音声は同種のみならず他種に対しても情報を伝えるので,混群が多くの種から構成される地域の鳥類では,種構成が単純な地域に生息する鳥類と比べて,コミュニケーションが複雑に発達している可能性がある。この課題(課題2)については,これまでに,北海道や長野県,隠岐島,石垣島において,野外録音や捕食者提示実験などを通じてデータを収集してきた。しかし,混群の種構成と音声の複雑さの関係性を明らかにするには,より多くの調査地に出向き,データを収集する必要がある。そこで,平成29年度は,より複数の調査地を設定し,野外実験をおこなうことで,鳥類の群集構造と音声構造の地域差の関係性について明らかにしたいと考えている。しかし,地理的に離れた複数の地域においてデータを収集するだけでは,音声の変化が遺伝的な変異によるものなのか,鳥類の種構成に応じた学習の結果なのか区別することは難しい。そこで,本年度は,遺伝的差異が想定できない,より小さなスケールにおいて,鳥類の種構成と音声の複雑さの関係を明らかにすることで,これらの可能性についても検証したい。具体的には,長野県の調査地において,山地から平地まで連続する調査プロットを設置し,音声の録音をおこなうことで,標高差による種構成の違いと音声コミュニケーションの関係について明らかにすることが可能である。本年度は6月から9月にかけて,アメリカのモンタナ大学からAlexis Billings氏を招聘する予定であり(JSPSサマー・プログラムを利用),夏季は同氏と共に本研究課題についても推進させる計画である。また,昨年度は主に音声の録音や解析に主眼をおいた研究をおこなってきたが,本年度は音声再生実験によって音声から情報を解読する能力を定量化し,社会性との関係も明らかにしていきたい。動物行動学平成28年度の調査において当初は課題1のみをおこなう予定であったが,学会などで各地に行く都合ができ,その際に課題2についても遂行した。このスケジュールの変更に伴い,費用の比較的多くかかる課題1の作業の一部を翌年度におこなうことになり,144,460円の次年度使用額が生じた。
主体性概念の現代的変容に関する基礎的研究-構造主義への哲学的-視角-

本研究は、次の試みを遂行することを目的としていた。すなわち、申請者が従来行ってきた、現象学を中心とした一連の研究の成果を受けながら、更に構造主義的な諸思考に視点を拡張しつつ、構造主義的な思考の立場を検討し直し、個的で行動的なモデルのもとに包括しえない主体性の姿、すなわち根源的に共存という存在形態を採り、関係の編目の一項でありながら、しかしそこにおいて異他的な効果を及ぼしゆく運動体としてこそ、従来とは異なった「創造性」や「自由」を発揮しゆく、そうした主体性のモデルを提示すること、これである。しかしながら、具体的に申請書の段階で計画していた、1)言語学的研究、2)文化人類学的研究、3)精神分析学的研究、の内、今年度は、その1)及び3)に関して、研究の端緒を切り開いたにとどまった。1)に関しては、主にソシュールの言語学の改釈的受容を、言葉を語る主体とは何かという観点からまとめ、語られるものとしての言葉を喧伝する立場(パロールの優位)と、語ることを支配する言葉の力を際だたせる立場(シニフィアンの優位)という、二つの視角の交鎖を描き出そうと試みた。3)に関しては、ラカンが提示した鏡像段階という、独自な仕方で間主体的想像界に篭絡され、一種の成熟を遂げる主体のあり方を、メルロ=ポンティ及びラカンの言説を内在的に辿ることを試みた。申請者は、以上の成果を更に展開するとともに、2)に関しても、とりわけ主体の原初的なレヴェルでの共同性の場所を看取るべく、研究の一層の展開を図りたいと考えている。
大腸癌に対するEGFR経路の抑制を基盤とした新たな分子標的放射線療法の開発

EGFRの分子標的薬であるセツキシマブと放射線療法の併用により頭頸部癌において放射線増感効果を有することが報告されている。化学放射線療法は、EGFRを発現した大腸癌に対して有効な治療法と考えられる。そこで我々は大腸がんにおいてもセツキシマブと放射線療法との併用が有効な治療法であると考えた。8種類のヒト大腸癌細胞株の放射線感受性およびセツキシマブによる放射線増感効果の有無をコロニー形成法により調べた結果、セツキシマブによる放射線増感効果を、8種類の細胞株のうち3種類の細胞株で認めた。増感効果はセツキシマブの後処理のみであった事より、セツキシマブが放射線損傷の回復を阻害している事が考えられた。大腸癌の放射線治療を行う場合において大腸自身が決定臓器となっており、IMRTなどの技術を用いても投与線量の増加が難しい。そこで薬剤を併用した放射線化学療法により放射線の効果を増強する治療法は非常に有効と考える。大腸癌の多くはEGFRを発現していることが報告されており、このEGFRをターゲットとした分子標的薬としてcetuximabなどが存在する。すでに頭頚部癌ではこのcetuximabと放射線治療を組み合わせる事で相乗効果をしめし、治療成績が向上得ることが報告されている。今回我々は大腸癌でも放射線とcetuximabを併用する事で有効な治療法になるのでは考えた。今年度は使用する各種の大腸がん細胞のEGFR発現状態をwesternblotで確認した。また各細胞の放射線感受性をコロニー形成法を用いて調べた。その結果、EGFRの発現量はSW480、LoVo、HCT116、LS174T、HT29、RKO、CoCM-1の順に高くCoCM-1はEGFRのタンパク発現が認められなかった。一方、放射線線感受性はHT29、RCM-1、LoVo、SW480、LS174T、RKO、HCT116、CoCM-1の順に抵抗性であった。以上のことから、EGFRの発現量と放射線感受性の間には直接の関連は認められなかった。kーRas、bーRaf等の遺伝子変異の状態とも照らし合わせてみたが遺伝子変異と放射線抵抗性との関連についても法則性は見られなかった。今年度は使用する細胞においてEGFRの発現量と放射線感受性には相関がないがEGFRが発現すると放射線には抵抗性になることが分かった。研究時間が当初の想定よりも確保できなかった。昨年度までに使用した8種類の大腸がん細胞株(SW480,LoVo,HCT116,LS174T,HT29,RKO,CoCM-1,RCM-1)における其々のEGFRの発現量をWesternblotで確認し、各細胞株の放射線感受性をコロニー形成法を使用して調べた。その結果、各細胞株のEGFRの発現量と放射線感受性との間に直接的な関係は見られなかった。しかし、EGFRが発現している細胞とEGFRが発現していない細胞の放射線感受性を比べると発現している細胞株群の方が放射線抵抗性になることが示唆された。昨年度までの結果を受け今年度は、抗EGFR抗体薬であるcetuximabを用いた実験を行った。初めに放射線と併用するcetuximabの濃度の決定を行った。cetuximabを放射線増感剤として使用することを考え、単独での殺細胞効果が20%以下となる濃度をアラマーブルー法を用いて8種類の大腸がん細胞株について調べた。ここで決定したcetuximabの濃度を以降の実験に使用した。次に8種類の大腸がん細胞株において放射線とcetuximabを併用した時の放射線の殺細胞効果に及ぼすcetuximabの影響をコロニー形成法を用いて調べた。放射線照射単独群、cetuximabを照射前の24時間処理し、その後放射線照射を行った群(pre)、cetuximabを放射線照射後24時間処理した群(post)での殺細胞効果をコロニー形成法で比較した。その結果、3つの細胞株(RCM-1,HCT116,HT29)においてcetuximabを放射線照射後24時間処理した場合に放射線増感効果が認められた。放射線増感効果を示した細胞株群において各細胞株の持つ遺伝子変異とcetuximabの作用機序に関係性は認められなかった。来年度は3つの細胞株が示したcetuximabによる放射線増感効果のメカニズムの探索を目指す。所属施設の異動等があり、研究時間が想定より取れなかった。我々は前年度までに使用した8種類の大腸がん細胞株のうち3種類でcetuximabが放射線感受性を示すことを見出した。そこを踏まえて最終年度は、cetuximanによる放射線増感効果のメカニズムを解明することを目的として研究を進めた。放射線増感効果を示した3種類の細胞株と放射線増感効果を示さなかった6種類の細胞株についてEGFRの発現量及びEGFRのシグナル伝達関連の遺伝子変異を比較した結果、そこには放射線感受性との相関は見出せなかった。そこで、別の観点から放射線増感効果の原因を考えた。放射線増感効果を示した細胞株において、増感効果が表れたのは、すべてpost treatであるという共通点に着目した。増感効果を示したのがpost treatのみである事より、放射線照射後のcetuximabの存在が、放射線によって作られたDNA損傷の修復を阻害している、つまり放射線障害からの回復を阻害している可能性を我々は強く疑った。そこで放射線によって生じたDNA2重鎖切断(DSB)の数の継時的変化に及ぼすcetsuximabの影響を調べた。放射線照射単独では照射直後にDSBの数が多数存在したが、その数は継時的に減少し、24時間後にはコントロールとほぼ同程度にまで減少した。

一方、cetuximabを併用するとDSB数の減少が抑制され、24時間後では、放射線照射単独と比較して約20%程度多くなっていた。よって、cetuximabがDNA2重鎖切断の修復阻害していることを示唆する結果が得られた。次にDNA2重鎖切断の修復阻害の結果、細胞の放射線障害からの回復阻害が、実際に起こっているのか調べた。細胞の放射線障害からの回復には亜致死損傷回復(SLDR)と潜在的致死損傷回復(PLDR)の2種類がある。我々は、SLDR、PLDRともにcetuximabによって阻害されることを示唆するデータを得た。EGFRの分子標的薬であるセツキシマブと放射線療法の併用により頭頸部癌において放射線増感効果を有することが報告されている。化学放射線療法は、EGFRを発現した大腸癌に対して有効な治療法と考えられる。そこで我々は大腸がんにおいてもセツキシマブと放射線療法との併用が有効な治療法であると考えた。8種類のヒト大腸癌細胞株の放射線感受性およびセツキシマブによる放射線増感効果の有無をコロニー形成法により調べた結果、セツキシマブによる放射線増感効果を、8種類の細胞株のうち3種類の細胞株で認めた。増感効果はセツキシマブの後処理のみであった事より、セツキシマブが放射線損傷の回復を阻害している事が考えられた。今年度も計画書通りに実験を進めていく。昨年度に決定した薬剤濃度を使用して放射線と組み合わせることによる効果を調べる。今後は、さらに研究時間が確保できるように努めできるだけ計画書通りに研究が遂行できるように努める。そして昨年度までに分かった放射線増感効果について、そのメカニズムの解明を進めていく。放射線生物進捗がやや遅れているので15011円の次年度使用額が生じた。今年度は予定通りに計画的に使用していく。進捗がやや遅れているために、次の実験で使用する高額試薬等の購入がなかった為に次年度使用額が生じた。次年度使用額は高額ではないので試薬等の消耗品に充当していく予定である。その他は計画書通りに使用していく。研究の遅れを取り戻し、次の実験に使用予定の高額試薬等に予算を充てる。また、所属施設の異動があったため、新規にデータ処理・記録のためのパソコン等の購入を行う。
プルー銅蛋白質の分子構造と電子移転反応に関する研究

オシダプラストシアニンの電子移動反応速度定数のpH依存性を調べた結果、高等植物とは異なり、ヒスチジン残基のプロトン化による反応性の低下は認められず、バクテリア由来のブルー銅蛋白質アズリンと同様に、酸性条件下で電子移動が速くなることが判明した。このことは、オシダのプラストシアニンでは酸性pHにおいても活性中心のH87残基はプロトン化を受けず、活性中心近傍にある解離性アミノ酸残基のプロトン化によって、静電的反発が抑制されるために電子移動が速くなったものと結論された。オシダプラストシアニンのX-線結晶構造解析により、H87はF12残基のフェニル基と面間距離約3.4Åでスタッキング相互作用によりH87-Cu結合を安定化するとともに、立体的な回転障害によりH87のプロトン化をもたらさないと結論された。亜硝酸還元を触媒する非ブルー銅サイトについての知見を得るために、還元型亜硝酸還元酵素へのCO結合について検討したところ、Alcaligenes由来の酵素は2052cm^<-1>に、Achromobacter由来の酵素は2050cm^<-1>にCO伸縮振動をそれぞれ示した。これは両者の非ブルー銅サイトは互いに類似した構造・環境を有することを示唆するものであり、このことは高いアミノ酸配列の相同性からも支持された。電子移動とカップルするプロトン移動反応の機構を調べるために亜硝酸還元酵素への電子供与体として機能するシュウドアズリンの紫外共鳴ラマンスペクトルおよび時間分解紫外共鳴ラマンスペクトルの検討を行った結果、酸性条件下において還元を受けると銅イオンに配位しているヒスチジン残基がプロトン化を受けて約150μ秒以内に銅イオンから解離することを見いだした。
新規カルシウムセンサーによる標的分子の認識機構の解明

細胞内pH環境や浸透圧の維持は細胞の正常な活動にとって非常に重要で、H^+, Na^+に関するイオン代謝を行うNa^+/H^+交換輸送体(NHE)が主にこの役割を担う。NHEは、N末端側に12回膜貫通領域からなる活性部位とC末端細胞質側に活性制御領域をもっ。高等動物のNHEはその一次構造や発現する組織の違いから、様々なアイソフォームが存在する。なかでも普遍的な発現パターンを示すNHE1は細胞内pH・Na^+濃度・細胞容積の制御を担っている特に重要なアイソフォームである。このC末端細胞質領域は多くの細胞内因子と相互作用するが、多様な因子のうち、カルシニューリンB様タンパク質CHP1は特に重要である。CHP1は形質膜に発現するすべてのNHEアイソフォームの生理的活性を発揮させるのに必須な因子で、4つのEFハンドをもつ蛋白質である。生化学的な実験からCHP1へのCa^<2+>結合がないとNHEの活性調節が部分的に阻害されることが明らかになっている。我々はCHPの標的タンパク質の一つであるDRAK2(DAPK related apoptosi sinducing kinase 2)に注目し構造科学的な研究に着手した。DRAK2に対しCHPはカルシウム非依存的に結合し、カルシウム依存的にリン酸化活性を抑制する。DRAK2のキナーゼドメインの発現系を構築し、結晶化条件を検索した。現在数種類の条件で結晶が観察されさらに条件を最適化しているところである。細胞内pH環境や浸透圧の維持は細胞の正常な活動にとって非常に重要で、H^+,Na^+に関するイオン代謝を行うNa^+/H^+交換輸送体(NHE)が主にこの役割を担う。NHEは、N末端側に12回膜貫通領域からなる活性部位とC末端細胞質側に活性制御領域をもつ。我々は、2.2Å分解能でラットCHP1の結晶構造解析に成功した。その結果、CHP1は10本のαヘリックスによって構成される蛋白質で、大まかにNローブ、Cローブの2つのドメインからなることが明らかとなった。さらにNローブ,Cローブをつなぐ長いループの存在がCHPの特徴である。それぞれのドメインは2組のEFハンドから構成されカルシウムはEF-3,EF-4に結合していることが示された。これは生化学的な実験結果とも一致する。CHP1においてEF-1,EF-2にはカルシウムは結合していないが、分子内の水素結合や疎水的な相互作用によりEFハンドを安定化している。CNBファミリーにはEFハンドの反対側に基質結合部位と考えられる疎水性ポケットが存在するがCHP1の構造ではこのポケットに10番目のヘリックスが部分的に入り込んでいた。細胞内pH環境や浸透圧の維持は細胞の正常な活動にとって非常に重要で、H^+、Na^+に関するイオン代謝を行うNa^+/H^+交換輸送体(NHE)が主にこの役割を担う。

このC末端細胞質領域は多くの細胞内因子と相互作用するが、多様な因子のうち、カルシニューリンB様タンパク質CHP1は特に重要である。CHP1は形質膜に発現するすべてのNHEアイソフォームの生理的活性を発揮させるのに必須な因子で、4つのEFハンドをもつ蛋白質である。生化学的な実験からCHP1へのCa^<2+>結合がないとNHEの活性調節が部分的に阻害されることが明らかになっている。我々はCHPの標的タンパク質の一つであるDRAK2(DAPK related apoptosis inducing kinase 2)に注目し構造科学的な研究に着手した。DRAK2に対しCHPはカルシウム非依存的に結合し、カルシウム依存的にリン酸化活性を抑制する。DRAK2のキナーゼドメインの発現系を構築し、結晶化条件を検索した。現在数種類の条件で結晶が観察されさらに条件を最適化しているところである。