hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写ダイナミクスの世代間での継承の解析

多くの生物に共通して見られる発生分化過程では、分化した細胞の増殖や分裂に伴い、母細胞で機能していた分化を担う因子の濃度が娘細胞において低下していくと考えられる。にもかかわらず、発生分化が正確に遂行されるのは、ノイズの多い生物システムの中で、母細胞から娘細胞へと転写の活性化状態などが正しく引き継がれていく何らかのメカニズムが存在するためと考えられる。そこで本研究では、細胞間での遺伝子発現が大きくばらつく変異株を解析することにより、母細胞から娘細胞へと転写の挙動が引き継がれるメカニズムについて詳細に解明することを目的とした。そこで初年度は、細胞間での遺伝子発現が大きくばらつく変異株のゲノムワイドなスクリーニングを実施した。その結果単離された株について、表現型の原因となった遺伝子の同定に成功した。そのうちの一つの変異株は、ヒストンのメチル化に関わる既知の分子と相同性の高い遺伝子であったため、ヒストン修飾と遺伝子発現のばらつきの関係性についても生化学的手法やライブセルイメージングを用いて検討した。今後ここで得られた変異株を用いて転写維持機構の理解を進めることで、細胞間での転写のばらつきを自在に操作するための基礎知見を得られると期待される。転写の細胞間でのばらつきの増加が、癌細胞の薬剤耐性獲得に関わるという報告があることから、今後期待される転写のばらつきを制御する技術は、医療面における応用へ発展する可能性がある。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
磁石回転円板型バイオリアクターに磁力で固定化した黒カビによるクエン酸の連続発酵法

クエン酸生成能力の高い黒カビAspergillus nigerを磁性粉(マグネタイト,Fe_3O_4)と三角フラスコ中で48時間、前培養して磁性粉を取り込んだ黒カビのフロックを調製した。円板(直径18cm)の約2割を浸漬した回転円板型のバイオリアクタを製作し,円板の数、培地体積などの条件を変えてクエン酸生成の最適条件を検討した。円板の素材はプラスチック磁石とした。上記の黒カビのフロックは磁力で速やかに付着し、培地と微生物の分離が容易な生物模型のバイオリアクタとすることができた。実験中、ろ過操作など行わなくても菌体と培養液はほぼ完全に分離できた。生成クエン酸や原料糖濃度の経時変化は主に高速液体クロマトグラフィで測定した。培地体積一定の条件では、円板の枚数が多い方が、クエン酸生成は速いことがわかった。培地に対する円板の比表面積と、20日間のバッチ培養後のクエン酸濃度との関係は比表面積1-5cm^<-1>の範囲でほぼ比例関係となり、最大57g/lのクエン酸濃度を得た。Fe_3O_4、Fe^<2+>、Fe^<3+>の影響を調べたところ、これらの添加濃度が高くなるにつれて、生成クエン酸濃度が高くなった。バッチ培養の最適条件では31日後に最大生成クエン酸濃度69g/lを得た。この値は既報の値と比較して良好な値と言える。さらに、本報は生成物と微生物の分離が容易で有利である。また液中での懸濁培養後、磁気分離する方法、ドラムタイプの磁石支持対に固定化する方法、連続醗酵などの実験、検討を現在行っており、本研究をさらに進める予定である。現在、上記内容で日本生物工学会において講演発表、また論文投稿することを計画中である。
代数的組合せ論の総合的研究

この科研費のひとつの目的は研究集会の講演者旅費の援助などを通じて、日本の代数的組合せ論の発展に広く寄与することであった。平成13-15年度は、第18,19,20回代数的組合せ論シンポジウム(於、千葉大、熊本九北大)、京大数理解析研における3回の研究集会「代数的組合せ論」、浜松における3回の保型形式関連分野シンポジウム(責任者:伊吹山.坂内、斎藤、宮本)、平成14年11月の山形のシンポジウム、平成15年11月の福岡における国際会議EACAC2(責任者坂内),などを支援した。日本の代数的組合せ論は順調な進展を持続している。また、成果は距離正則グラフとアソシエーションスキーム、コード、デザイン、格子、モジュラー形式など多岐にわたる。研究代表者のこの期間の成果は、(i)可換アソシエーションスキームの指標表とラマヌジャングラフ・(ii)コード・格子・モジュラー形式の間の関連性、(iii)球面上のtight4-,5-,7-デザインの研究(坂内-宗政-Venkov),(iv)グラスマン空間上のtight designs/codesの研究(Bachoc-Bannai-Coulangeon),などの研究に加えて、ユークリッド空間上のデザインについての研究に力を注いだ。坂内悦子との共同研究として、ウエイト定数のtight 4-Euclidean designsの分類、Gaussian tight 4-designsの分類、2つの同心球上のoptimal tight 4-designsの分類を行い、さちに一般の場合の分類問題に挑戦中である。なお、Oleg Musinの画期的な結果:4次元kissing numberの決定、の検証にも田上真とともに取り組み、その完成の手助けにも参加した。この科研費のひとつの目的は研究集会の講演者旅費を援助することなどを通じて、日本の代数的組合せ論の発展に広く寄与することであった。この意味で、本年度は7月の第18回代数的組合せ論シンポジウム(千葉大学)、12月の京大数理解析研における研究集会「代数的組合せ論」(責任者:宗政昭弘)、2月の保型形式関連分野シンポジウム(浜松、責任者:伊吹山、坂内、斎藤・宮本)を主に支援した。また、台湾で開催された第1回EACAC(East Asian Conference on Algebra and Combinatorics)の日本からの講演者(分担者)旅費の援助にも充てた。日本の代数的組合せ論は現在活発に研究が持続されており、アソシエーションスキーム、コード理論、デザイン理論において注目すべき研究が進展している。また、球面デザイン、スピンモデル、Terwilliger代数、モジュラー形式などとの関連性においても注目すべき研究が進展している。研究代表者の周辺での今年度の研究としては、次ぎの結果を得、論文として投稿した。GL(2n, q)/GL(n, q^2)はGelfand-pairを与えるがその置換表現の既約指標への分解を決定した(田中太初との共同研究)。実Grassmann空間上のコード、デザイン理論において、そのサイズの下限/上限を示し、そこで等号を満たすtight design/codesの概念を定義し、それらの存在問題を研究した(Bachoc, Coulangeonとの共同研究)。球面におけるtight designの存在問題t=4, 5, 7の時に未解決であったが、格子理論を応用することにより、多くの場合に非存在を示すことができ、いままでのいきづまりを打破した(B. Venkov,宗政昭弘との共同研究)。また、アソシエーションスキーム、有限幾何、上半平面の有限版、モジュラー形式の有限版などの間の関連性などの研究に進展を見た。

本年度は7月の第19回代数的組合せ論シンポジウム(熊本大学)、12月の京大数理解析研における研究集会「代数的組合せ論」(責任者:伊藤達郎)、2月の保型形式関連分野シンポジウム(浜松、責任者:伊吹山、坂内、斎藤、宮本)を主に支援した。その際に、A.Terras, C.Bachoc, P.Terwillgerなどを海外から招聘した。日本の代数的組合せ論は順調な進展を持続している。研究代表者の周辺では現在次の研究が進展中である。(1)種々の可換アソシエーションスキームの指標表の決定をめざした研究。特にある特殊な条件をもつGelfand-pairsに注目し、それを満たす多くの例の存在とその性質の意味付けについて研究した。また、可換アソシエーションスキームの指標表を用いて多くのラマヌジャングラフの例を新しく見い出した。(2)球面上のtight4-,5-,7-デザインの研究(坂内-宗政-Venkov),グラスマン空間上のtight designs/codesの研究(Bachoc-Bannai-Coulangeon)の研究に加えて、ユークリッド空間上のデザインについての研究を開始した。特に著しい結果はユークリッドtight 4-designsの分類の成功(坂内-坂内)である。これは、統計学におけるconstant weightを持つ、tightな次数2のrotatable designsの分類の成功を意味する。現在この方法を統計にあらわれる他の多くの種類のデザイン(種々のoptimal designs)のtightなものの分類に向けて努力中である。(3)ヨード、格子、モジュラー形式との関連性、有限幾何と関係したモジュラー形式の有限版、などの研究も継続している。この科研費のひとつの目的は研究集会の講演者旅費の援助などを通じて、日本の代数的組合せ論の発展に広く寄与することであった。本年度は7月の第20回代数的組合せ論シンポジウム(北海道大学、責任者吉田知行)、11月の福岡における国際会議EACAC2(責任者坂内)、2月の保型形式関連分野シンポジウム(浜松、責任者:伊吹山、坂内、斎藤、宮本)、3月の京大数理解析研における研究集会「代数的組合せ論」(責任者:平木彰)を主に支援した。その際に、B.Venkov,C.Bachocなどを海外から招聘した。
球根植物の開花に伴う水分バランス機構の解明

本研究では、エチレン非感受性の花であるグラジオラスおよびチューリップの花を用い、数種の少糖類および阻害剤のうち、トレハロースが花弁の老化抑制に最も効果的であることを明らかにした。開花直後から萎凋期までの花弁について、^1H-NMR縦緩和時間(T1)を反転回復法により求め、成分分割を行い自由水成分を求めた。また-40°Cで横緩和時間(T2)をソリッドエコー法で求め、結合水成分を求めた。さらに、TNBT法により花弁組織の代謝活性の程度を観察した。老化が進行するにつれて、含水量や自由水量の減少、膨圧の低下、結合水の減少、活性染色の低下を伴い、トレハロースはこれらの現象をすべて抑制することを明らかにした(Iwaya-Inoue et al.1999;Otsubo and Iwaya-Inoue 2000,Iwaya-Inoue and Takata 2001)。本研究では、トレハロースによる花弁の老化抑制過程を^1H-NMR観測による自由水成分および結合水成分の維持という視点からも捉えることができた。これらの結果については、園芸学会、植物学会、低温生物工学会およびトレハロースシンポジウムで発表し、植物生理学会(2001年)でも発表予定である。一方、トレハロースは細胞伸長には寄与しないこと(Ikeda et al.2000;Iwaya-Inoue and Takata 2001)や、花弁細胞内に取り込まれた糖が微量なこと(Iwaya-Inoue et al.2000)から、切り花への糖の役割として考えられてきたエネルギー源や浸透圧調節剤として働くのではなく、スクロースなどとは異った機能により組織の生理活性を維持していることが示唆された。さらに、イオン漏出の抑制、タンパク質量や組織の代謝活性の維持が認められたことから、切り花花弁におけるトレハロースによる膜系や生体高分子に対する保護機構があることが示された。本研究では、非エチレン感受性の花であるグラジオラス花穂を用い、数種の少糖類、シクロへキシミドやPMSFなどタンパク合成阻害剤を用い、花弁の老化抑制に最も効果的な処理剤を検討した.その結果、0.1Mトレハロースの投与が老化抑制に最も効果的であることを明らかにした(Iwaya-Inoue et al.1999,Otsubo and Iwaya-Inoue2000)。開花直後から萎凋期までの4つの異なるステージにおいて、花弁組織の水の動態を調べるために^1H-NMR縦緩和時間(T1)を反転回復法により求め、成分分割および連続スペクトル解析を行った。また、組織化学的観察はTNBT法により行った.老化により、花弁は含水量や自由水量の減少、活性染色の低下などを伴った.また、チューリップでも同様の結果が得られ、さらに膨圧、水ポテンシャル、浸透ポテンシャルが著しく低下することが明らかになった(井上ほか1999)。このことから、含水量は自由水量に依存し、道管から周辺の細胞への水のとりこみ阻害により膨庄が低下し、含水率の低下を引き起こしている可能性が示唆された。さらに、老化に伴い、花弁のタンパク量の減少およびイオン漏出の増大を伴うことも明らかにした(大坪と井上1999)。トレハロースはこれらの現象をすべて抑制したことから、植物組織が水ストレスを受けた際に、水分子の変わりにトレハロースの構造上の特徴から生体膜の機能を守る「水分子置換仮説」をin vivoで支持する結果を得た。これらの結果については、園芸学会、日本植物学会、低温生物工学会で8件発表した。

また、活性酸素生成が花弁の老化を促進することも知られていることから、基礎研究としてマメ科芽生え胚軸を用い、T1と活性酸素生成との関係についても検討した(Iwaya-Inoue et al.2000)。一方、葉やホウなどではトレハロースは阻害的に働く現象も認められたことから、培養細胞による水分生理学的研究を行った.ダイズ芽生え胚の培養細胞の生長においても阻害的に働き、細胞への水透過性の低下に依存することを明らかにした(Ikeda et al al.2000)本研究では、エチレン非感受性の花であるグラジオラスおよびチューリップの花を用い、数種の少糖類および阻害剤のうち、トレハロースが花弁の老化抑制に最も効果的であることを明らかにした。開花直後から萎凋期までの花弁について、^1H-NMR縦緩和時間(T1)を反転回復法により求め、成分分割を行い自由水成分を求めた。また-40°Cで横緩和時間(T2)をソリッドエコー法で求め、結合水成分を求めた。さらに、TNBT法により花弁組織の代謝活性の程度を観察した。老化が進行するにつれて、含水量や自由水量の減少、膨圧の低下、結合水の減少、活性染色の低下を伴い、トレハロースはこれらの現象をすべて抑制することを明らかにした(Iwaya-Inoue et al.1999;Otsubo and Iwaya-Inoue 2000,Iwaya-Inoue and Takata 2001)。本研究では、トレハロースによる花弁の老化抑制過程を^1H-NMR観測による自由水成分および結合水成分の維持という視点からも捉えることができた。これらの結果については、園芸学会、植物学会、低温生物工学会およびトレハロースシンポジウムで発表し、植物生理学会(2001年)でも発表予定である。一方、トレハロースは細胞伸長には寄与しないこと(Ikeda et al.2000;Iwaya-Inoue and Takata 2001)や、花弁細胞内に取り込まれた糖が微量なこと(Iwaya-Inoue et al.2000)から、切り花への糖の役割として考えられてきたエネルギー源や浸透圧調節剤として働くのではなく、スクロースなどとは異った機能により組織の生理活性を維持していることが示唆された。さらに、イオン漏出の抑制、タンパク質量や組織の代謝活性の維持が認められたことから、切り花花弁におけるトレハロースによる膜系や生体高分子に対する保護機構があることが示された。
新たなＴａｑ酵素を用いた迅速な感染症起因菌同定ＩＴシステムの臨床応用

試験した200検体中、Tm mapping法陽性かつ培養陽性が43検体(同定一致が41検体)、Tm mapping法陰性かつ培養陰性が128検体、Tm mapping法陽性かつ培養陰性が27検体、Tm mapping法陰性かつ培養陽性が2検体であった。以上の結果、実用的に運用可能と確認した。平成25年度は、全プロトコールの再評価と固定、データベース中の登録菌種を増やすこと、そして同定の正確性の評価および従来法との比較を行った。1.全プロトコールの再評価と固定:検体到着から結果報告までの全プロトコールにおいて、特にバクテリアDNAのコンタミネーションを防止する観点からプロトコールを見直した。そのため、真空採血管やDNA抽出キットについて各社製品を比較検討し、もっともコンタミネーションの少ない製品を厳選した。その結果、DNA抽出過程からdistilled waterを用いたnegative controlにて、殆ど全てのサンプルでcontamination freeを実現した。2.データベース中の登録菌種を増やす:ATCC標準菌株を約200菌種購入してそれぞれDNAを抽出し、データベースに登録した。更に臨床分離株で見出したmutant strainもデータベースに逐次登録した。その結果、mutant strainを含む約200菌種のバクテリアのデータベースが完成した。3.同定の正確性の評価および従来法との比較:本研究の感染症起炎菌迅速同定システム(Tm mapping法)について、富山大学附属病院で3か月、共同研究を行っている外病院で6か月の試験運用を行い、計200検体以上の臨床検体を検査した。その結果、Tm mapping法で陰性と判定した場合、培養法が陰性である一致率は98%、Tm mapping法で陽性と判定した場合、培養法が陽性である一致率は60%であった。また、Tm mapping法&培養法ともに陽性の場合、菌種同定の一致率は85%であった(不一致検体は、複数菌のため同定出来なかったもの)。特にTm mapping法陽性&培養法陰性の場合が多かった理由は、遺伝子検査では死菌をも検出するためと考えられる。これは遺伝子検査全体で認められる傾向であるが、今後は死菌の判定方法をより明確となるように改善する計画である。平成24年度は、システムの適用範囲の拡大(血液、羊水、脳脊髄液、眼房水)、全プロトコールの再評価(迅速性・感度・特異度)と固定、同定の正確性の評価、および従来法との比較、そして、データベース中の登録菌数を増やすことを行った。1.システムの適用範囲の拡大:感染症の患者検体を血液(敗血症)、羊水(胎児子宮内感染症)、脳脊髄液(髄膜炎)、眼房水(眼科感染症)とし、それぞれ迅速同定実施の体制を整えた。プロトコールの相違は前処理のみであるため、前処理において、最も迅速・効率的で感度の高い方法を選択した。また、検体毎(臨床科毎)の連絡シートを作成し、申し込みから結果報告までを専用FAXで迅速に送受信するようにした。2.全プロトコールの再評価と固定:検体到着から結果報告までの全てのプロトコールを迅速性・感度・特異度の観点から再評価した。そして、問題点や改善の余地があれば全て洗い出し、プロトコールの改善&再評価を繰り返し、最終的に全プロトコールを最適化して固定した。3.同定の正確性の評価、および従来法との比較:実際に患者検体を多数用い、同定結果について従来法(マイクロスキャンWalkAway: SIEMENS)の結果と共に、Sequencing結果を用いて比較検討した。その結果、本研究法による正確性の評価、および従来法との一致率は97%であった。検体は血液、羊水、脳脊髄液、眼房水で、菌陽性検体を42検体、実施した。4.データベース中の登録菌種を増やす:データベースに存在しない菌やmutant strainsが検出された場合には、得られた菌DNAよりTm値を測定し、新たにデータベースに加えてった。現在、データベース中には130菌種(+mutant strains)が登録されているが、今後、200菌種以上を目標に増やす計画である。平成26年度は、システム全体の評価、試薬のキット化、そして多施設での実施と結果のフィードバックを行った。1,システム全体の評価:本年度は先ずシステムの学内試験運用を実施し、200検体以上の実施を行い、システムの正確性、従来法(培養法)との比較、迅速性、簡便性、そして経済性を比較検討し、その優位性と安全性を全体評価した。以上は論文化を行い、現在、Scientific Reportsにてリバイス中である。2,試薬のキット化:先ずプロトコールを標準化を行い、次に安定した結果を得るために試薬のキット化を行った。特に本研究システムでは微量のバクテリアを高感度にPCR検出するため、試薬の全てにバクテリアDNAのコンタミが無いことが重要な条件となる。具体的には、独自開発したeukaryote-made Taq polymerase, Primer set, Eva green, Reagents, distilled Water, Tubes等、全てがバクテリアDNA contamination freeを保証したキットとし、三井化学株式会社と共同でキット化を行った。

3,多施設での実施と結果のフィードバック:多施設での実施において、上記のキットを用いることで試薬とプロトコールを標準化することが出来、また、webを介して起炎菌同定ソフトウェアを共用することで、施設間(and測定機器)での差が無く安定した同定結果を得ることが期待出来る。実施条件としては、Tm値解析において、サンプル間誤差の最も少ない(±0.05°C)RotorGeneQ (QIAGEN)あるいはLightCyclernano (Roche)を用いてHRM解析を行うことを必須とする。本年度は実際に長崎大学、京都府立医科大学、京都医療センター、山梨大学、そして埼玉県小児医療センターとの多施設実施を行った。そして、多施設間で行った260検体の結果を併せ、同定結果をフィードバックすることで、プロトコールの更なる最適化を行った。感染症検査方法の開発今回、先ずは目標であったデータベース登録菌種数を、ATCC標準菌株を用いて200菌種まで増やすことが出来た。次に本研究システムの評価をより詳細に行うため、大学病院および共同研究先の外病院を含め、大規模な試験運用を実施した。そして従来法である培養法との結果を比較検討した。その結果、200検体以上の臨床検体で検討を行うことが出来、本システムの有効性、およびシステムの問題点(DNA抽出工程以前のbacterial DNA contaminationなど)を浮き彫りにすることが出来た。その後、その問題点の修正を行った。それらをふまえて26年度は再度、試験運用を実施する予定である。菌陽性検体は稀であるため、検体を集積することは難しく、平成24年度の菌陽性検体は42検体であった。この改善のため、院外の病院とも共同研究を開始して、菌陽性検体を増やす予定である。データベース中の登録菌種は、臨床検体からの新規菌種の出現を待っていたため、登録菌数は増えなかった。従って、今後はACTT株を購入することで、データベース中の登録菌数を200菌を目標に増やす計画である。起炎菌同定ソフトウェアは登録菌数を増やした後の、次のステップである。そのため、平成24年度は手付かずであった。今年度は真菌の同定も含め、ソフトウェアをアップデートしていく計画である。1.ソフトウェアのインターフェイスを改善する。2.生菌・死菌を判定できるようにする。3.システム全体を再評価する。4.先進医療へ申請する。1.院外の検体も含め、菌陽性検体の解析数を増やす。2.ATCC株の購入により、データベース中の登録菌数を200菌を目標に増やす。3.ソフトウェアのインターフェイスを改善する。4.システム全体を再評価する。5.先進医療へ申請する。該当なし
学校や職場における客観的なメンタルヘルス評価法の確立

本研究では、207名の大学生を対象とした自覚症状調査、自律神経解析、睡眠覚醒リズム解析を実施し、自律神経機能評価が疲労、抑うつ、睡眠障害の指標となることを明らかにした。さらに、東日本大震災被災地域の教職員430名、開催地区の教職員304名を対象とした調査を実施し、教職員は自覚的な疲労感の増加とともに交感神経系の過緊張、日中の活動量の低下、居眠り回数の増加などがみられることを明らかにした。これらの解析結果より、自律神経系機能の変化は活動量や睡眠状態とも関連していることを確認しており、今後これらの指標を用いた疲労・抑うつ診断アルゴリズムを作成し、実用化に向けた検証を進める予定である。【目的】東日本大震災被災地域の1つである気仙沼市における学校教職員の疲労病態を調査し、疾病予防プログラムの構築に活用できる疲労の客観的な特徴を明らかにする。【対象】疲労調査を希望した気仙沼市教職員430名(男性220名、女性210名)と大阪府学校教職員304名(男性131名、女性173名)、関西在住の健常者53名(男性25名、女性28名)を対象とした。【方法】問診票を用いた自覚症状調査とともに、自律神経機能評価を実施し、気仙沼市教職員群を大阪府教職員群、健常者群と比較検討した。【結果】自覚症状調査では気仙沼市教職員群は健常者群と比較して身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労尺度のすべてが有意に上昇しており、強い心身の疲労を自覚していることが明らかになった。自律神経機能解析でも、気仙沼市教職員群は交感神経系の相対的な過緊張状態がみとめられ、震災ストレスに伴う自律神経系の異常が自覚的な心身の疲労と結びついていることが判明した。同様に、大阪府教職員群も健常者群と比較して身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労尺度のすべてが有意に上昇しており、自律神経機能解析でも大阪府教職員群は相対的な交感神経系機能亢進状態にあることが明らかになった。気仙沼市教職員群と大阪府教職員群には有意な差は認められなかった。【結論】気仙沼市教職員群では、震災ストレスが自律神経系の異常と自覚的な心身の激しい疲労の誘因となっている可能性が明らかになってきた。また、大阪府教職員群においても自律神経系の異常と自覚的な強い疲労が認められ、教職員の職場環境ストレスが同様の病態を引き起こしている可能性も判明した。現状では、両群ともにメンタルヘルス障害に陥るリスクが高いと思われ、今後、睡眠・覚醒リズム解析などの客観的な評価を行うことにより、疾病予防に向けての支援を行うことが望ましい。【目的】東日本大震災被災地域の宮城県A市における学校教職員の疲労病態を調査し、疾病予防プログラムの構築に活用できる疲労の客観的な特徴を明らかにする。【対象と方法】2013年度も疲労調査を希望したA市教職員142名を対象とし、問診票を用いて、身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労を判定、さらに客観的な疲労評価として自律神経機能評価と睡眠・覚醒リズム解析を実施した。【結果】2013年度調査結果でも、身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労のすべてが高く、自律神経機能解析でも交感神経系の相対的な過緊張状態が確認され、震災後2年が経過しても強い心身の疲労状態が続いていることが明らかになった。2013年度は、睡眠・覚醒リズムについても評価したところ、日中の活動量の低下、いねむり回数の増加が認められた。さらに、覚醒時活動量(覚醒時ZC)は、自律神経バランスを反映するlogLF/HF比と有意な負の相関がみられ、覚醒時の活動量が低下しているものは自律神経バランスは交感神経系が優位になっていることが判明した。睡眠効率の評価では、疲労に伴う睡眠の質の低下はみられなかった。【結論】2011-13年度研究により、一般労働者においては、自覚的な疲労感の増強と共に交感神経系の相対的な過緊張状態がみられることが明らかになった。さらに、疲労病態では日中の活動量の低下やいねむり回数の増加が確認され、客観的評価が可能であることも判明した。疲労回復には休養と睡眠が重要であるが、多くの職員が心身の疲労を自覚しながらも働かざるを得ない状況においては、疾病の予防に向けてどの職員を休養させる必要があるのかを客観的に判断する必要がある。このような場合、自律神経機能評価と睡眠覚醒リズム評価の活用が極めて有用な対策となることが判明した。目的と方法:客観的なメンタルヘルス評価法の確立を目的に女子大生147名を対象に、自覚症状調査と心拍変動解析による自律神経機能の解析を行った。41名はライフ顕微鏡(日立社製)を用いた睡眠・覚醒リズム解析を実施した。また、20名の労働者に対して月に月に1度、3か月(計60回)同様の調査を実施した。

さらに、宮城大学が行った東日本大震災後検診に実装者として参加し、369名の疲労客観的評価に取り組んだ。結果と考察:女子大生145名より有効データを得た。総合疲労得点、CES-D質問紙による抑うつ得点、ピッツバーグ得点(睡眠評価)はいずれも一般健常者104名と比較して有意に高値であり、この3者には正の相関がみられた。客観的な評価では、自律神経バランスLog(LF/HF)と主観的疲労度とに正の相関がみられたが、疲労、抑うつ、睡眠障害と自律神経機能活動との関連はみられなかった。41名に実施した睡眠・覚醒リズム解析では、客観的な睡眠効率や中途覚醒数と問診票による睡眠評価とには相関がみられず、自覚的睡眠評価と客観的睡眠評価とは必ずしも一致しないことが判明した。また、チャルダー質問紙疲労得点と覚醒時活動量に正の相関がみられ、学生の疲労は慢性疲労患者とは異なる病態であることが明らかになった。一方、労働者調査ではLog(LF/HF)とチャルダー疲労得点に正の相関、全周波数帯心拍変動パワー値と抑うつ得点に負の相関が認められ、自律神経活動が疲労、抑うつと関連している可能性が示唆された。東日本大震災後調査では、酸化ストレス(d-ROMs)が有意に上昇しており、酸化ストレスの増加が疲労病態と関連していることが判明した。抗酸化力(BAP)も多くの職員で上昇がみられたが、約1割では逆に顕著な低下が認められた。BAP低下は未病状態を早期に見出すサインである可能性が考えられ、疾病予防につながる知見と思われる。研究の達成度:100%(平成24年度に計画した内容はほぼすべて実施できた)気仙沼市教職員430名、大阪府学校教職員304名、健常者53名と当初予想した以上の被験者を対象に問診票を用いた自覚症状調査とともに自律神経機能評価を実施することが可能であった。その結果、気仙沼市教職員群は健常者群と比較して身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労尺度のすべてが有意に上昇しており、強い心身の疲労を自覚していることが明らかになった。自律神経機能解析でも、気仙沼市教職員群は交感神経系の相対的な過緊張状態がみとめられ、震災ストレスに伴う自律神経系の異常が自覚的な心身の疲労と結びついていることが判明した。さらに、東日本大震災地区に対するコントロールとして大阪地区の学校教職員の調査を行ったところ、東日本大震災とは無関係の大阪地区の教職員においても、身体的疲労、精神的疲労、総合的疲労尺度のすべてが有意に上昇しており、自律神経機能解析でも大阪府教職員群も相対的な交感神経系機能亢進状態にあることが明らかになった。以上の結果より、学校教職員における自覚的な強い疲労と自律神経系異常との関連が認められ、教職員の職場環境ストレスが自律神経系異常を介した体調不良と結びついている可能性が示唆された。研究の達成度:大学生を対象とした調査:100%(研究計画書内容はすべて実施)、職員調査:70%(一部は共同研究として実施)女子大生147名を対象に質問紙を用いた自覚症状調査を実施し、女子大生の多くに自覚的な疲労、抑うつ、睡眠障害がみられることを明らかにした。そこで、このような病態の女子大生における客観的な変化を明らかにするため、心拍変動解析による自律神経機能の解析、ライフ顕微鏡(日立社製)を用いて睡眠・覚醒リズム解析を実施したが、女子大生の訴える疲労、抑うつ、睡眠異常と自律神経機能活動とにはあまり関連がみられないことが判明した。
骨と歯の石灰化における基質小胞の役割

基質小胞(Matrix vesicles:MV)は軟骨や歯の初期石灰化に関与するとされる小胞様細胞小器官で、特にその小胞膜には高いAlkaline phosphatase(ALP)活性が検出される。最近ラットの肋軟骨骨端部の成長層にはALPおよびLactate dehydrogenase(LDH)の両活性を含む基質小胞が存在するのに対し、静止層にはALPを含まずLDHのみを含む基質小胞様の小胞が存在することを明らかにした。またウシ歯胚象牙前質にもMVとは密度の異なるLDHを含む基質小胞様小胞が存在することを明らかにした。今年度は次のことを明らかにした。(1)ニワトリ骨端軟骨成長層を用いコラゲナーゼ処理後、分画遠心法によりMV画分を調製し、さらにMV画分をグリセロール密度勾配遠心分画を行い、密度の大きい小胞(A)と密度の小さい小胞(B)を分離した。両小胞ともLDH、ALPを含んでいたが、その活性比(LDH/ALP)は小胞Aは0.14、小胞Bは0.016と明らかに異なっていた。両小胞は電顕的に異なっていることを明らかにした。(2)基質小胞性石灰化を行わないといわれているエナメル芽細胞層にもALPを含まずLDHのみを含む小胞があることを明らかにした。(3)これまで基質小胞に関する生化学的な研究はすべて軟骨性骨化部位に関する研究であったが、我々は膜性化骨部位であるマウスおよびウシ胎仔の頭蓋骨の基質小胞画分に基質小胞とは異なり、ALPを含まずLDHを含む基質小胞様小胞が存在することを明らかにした。このLDHは細胞の形質膜や細胞内オルガネラに由来したものではなく、また人工的な産物でなく、in vivoで形成されたものであることを明らかにした。このことにより、LDHを含む基質小胞様小胞が膜性化骨部位に普遍的に存在することが示唆された。
新しく同定された非定型心筋細胞の機能と生理的意義の検討

成体マウス心室筋細胞単離の最終段階で得られた「心筋細胞を含まない文画」を集めて培養したところ、特徴ある形態に変化するとともに自動的に拍動する細胞が出現することを見出し、atypically-shaped cardiomyocytes (ACMs)として新規に同定した。ACMsの細胞数は、新生仔期に一番多く、その後減少したが、成体になると老齢にいたるまでかずはかわらなかった。また、老齢マウスから単離したACMsでも、心筋胎児型遺伝子産物を発現していた。心筋細胞を含まない分画を致死的な低酸素状態に曝露した後に培養すると、約50%のACMsは生き延びて成長し拍動を開始した。また、正常条件の培養においてもACMsは恒常的にオートファジーが活性化していることがわかった。これらの結果から、成体マウスの心臓において、ACMsが一定数存在し、細胞の周辺環境条件によっては、大きく成長して自発的に拍動を開始する可能性があるとかんがえられた。心臓は,心筋細胞,内皮細胞,血管平滑筋細胞など種々の細胞から構成されている.近年ではcardiac progenitor cellsおよびside population cellsに分類される心筋幹細胞が組織内に存在することが明らかになり,これらの幹細胞を培養し,5'-azacytidine,oxytocin,trichostatin A等を添加することによって心筋細胞に分化させる方法が報告されている.申請者らは,マウス心臓において今まで知られていない細胞を探索するため,ランゲンドルフ灌流による成体マウス心室筋細胞単離の最終過程において,遠心によって取り除かれた上清分画(心筋細胞を含まない分画)を集めてmethylcelluloseを含む半固形状培地中で培養したところ、培養4日後の接着細胞群の中に,丸い細胞本体の端が長く伸長し枝分かれした形態に変化するとともに自動的に拍動する細胞が出現することを見出した。この細胞は独自の形態を有するが,心筋細胞に特異的なタンパク質を発現し,洞房結節細胞に類似した自発的活動電位を記録した.また,長期にわたる培養においても分裂・増殖は見られず,幹細胞マーカータンパク質の発現もみられなかった.これらのことから,マウス心室から得られた拍動するこの細胞を新しい種類の細胞「非定型心筋細胞(atypically-shapedcardiomyocytes,ACMs)」として同定した.申請者らは,マウス心臓において今までに知られていない種類の細胞の存在を探索した.ランゲンドルフ灌流による成体マウス心室筋細胞単離の最終段階で得られた「心筋細胞を含まない分画(cardiomyocyte-depleted fraction, CMDF))を集めて培養したところ,枝分かれした突起を有した形態に変化するとともに自動的に拍動する細胞が出現することを見出し,atypically-shaped cardiomyocytes (ACMs)として新規に同定した.ACMsは新生仔期から老齢にいたるまで心臓に存在し,atrial natriuretic peptide (ANP)やT型Ca2+チャネル(CaV3.2)などの心筋胎児型遺伝子産物を発現していた.CMDF細胞を致死的な低酸素状態に曝露した後に培養すると,拍動を開始したACMsの数は正常酸素条件で得られた細胞数の約50%であった.また,単離した心臓に対して虚血・再灌流をおこなった後に細胞を調整すると,拍動するACMsの細胞数は無処理の心臓から得られた細胞の約90%であった.電子顕微鏡を用いてACMsの微細構造を観察したところ,細胞内に自食胞(autophagosome)が多数存在し,細胞膜にはautophagosome内残存物の細胞外への放出に伴う乳頭状突起(papillae)が見られた.ACMsにおけるオートファジーの恒常的活性化は,自動的拍動,ANPの発現,虚血耐性とともにこの細胞の特徴の1つとして挙げられた.心臓発生において,オートファジーが活性化するのは胎生期から新生仔期のみであり,本研究結果はACMsが胎児心筋細胞に似た特徴を持つ可能性をさらに示唆すると考えられた.申請者らは,マウス心臓において今までに知られていない種類の細胞の存在を探索した.ランゲンドルフ灌流による成体マウス心室筋細胞単離の最終段階で得られた「心筋細胞を含まない分画」であるcardiac myocyte-depletedfraction (CMDF)をさらに遠心して集めた細胞を培養したところ,枝分かれした突起のある形態に変化するとともに自動的に拍動する細胞が出現することを見出し,atypically-shaped cardiomyocytes (ACMs)として新規に同定した.

ACMsの細胞数は,新生仔期に一番多く,その後減少したが,成体になると老齢にいたるまで数は変わらなかった.また,老齢マウスから単離したACMsでも,atrial natriuretic peptide (ANP)やT型Ca2+チャネル(CaV3.2)などの心筋胎児型遺伝子産物を発現していた.CMDF細胞を致死的な低酸素状態に曝露した後に培養すると,約50%のACMsは大きく成長して拍動を開始した.電子顕微鏡を用いてACMsの微細構造を観察したところ,細胞内に自食胞(autophagosome)が多数存在し,細胞膜にはautophagosome内残存物の細胞外への放出に伴う乳頭状突起(papillae)が見られた.ACMsにおけるオートファジーの恒常的活性化は,自動的拍動,ANPの発現,虚血耐性とともにこの細胞の特徴の1つとして挙げられた.心臓発生において,オートファジーが活性化するのは胎生期から新生仔期のみであり,ACMsが胎児心筋細胞に似た特徴を持つ可能性が強く示唆された.これらの結果から,成体マウスの心臓において,胎児心筋細胞の特徴と高い虚血耐性を有する細胞であるACMsが一定数存在し,細胞の周辺環境条件によっては,大きく成長して自発的に拍動を開始する可能性があると考えられた.申請者らは,成体マウス心室筋組織内に新規に発見した,非定型心筋細胞(atypically-shaped cardiomyocytes, ACMs)を安定して採取する方法を確立した.また,ACMsは機能的に心筋細胞であること,幹細胞の特徴を示していないこと,新生仔期から老齢にいたるまで心臓に存在し,atrial natriuretic peptide (ANP)やT型Ca2+チャネル(CaV3.2)などの心筋胎児型遺伝子産物を発現していることを明らかにした.さらに,ACMsは心室筋細胞よりも虚血耐性が高いことを見出した.これらのことから,ACMsが胎児期から胎児心筋細胞に似た特徴を保ったまま心臓内に存在している可能性が示唆された.24年度が最終年度であるため、記入しない。ACMsが心室筋細胞に比べて高い虚血耐性をもつ原因の1つとして,オートファジーの活性化が考えられる.ACMsのオートファジーの実態と,その活性化がACMsの機能にどのような影響を与えているかを調べることによってACMsの生理的意義を検討する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
近世後期上方読本の基礎的研究

前年度に引き続き、後期上方読本の作品につき、資料収集作業を行いつつ、研究の総括を行い、日本近世文学会秋季大会(2000.10)において口頭発表し、その内容を増補して論文化した(本報告書11参照)。そこで得られた結論は概ね下記の如くである。後期上方読本の諸作家は、後期江戸読本(山東京伝・曲亭馬琴の作)を強く意識し追随しようと試みた。そこから従来の評価では、京伝・馬琴の模倣、亜流とされてきた。しかし主要作家である栗杖亭鬼卵・好華堂野亭等の作品を調査研究した結果、大枠の方法においては江戸読本を踏襲しながら、上方独自の作風を示し得ていることが明らかになった。上記発表・論文では、鬼卵の『今昔庚申譚』、『茶店墨江草紙』等に即して、京伝・馬琴に見られた、宿業等の人力を超えたものの支配する構図を後退させ、代わって人間当然の情を辿ることで長編小説としての構成の合理性を保っていること、同作者の『絵本更科草紙』に即して、善悪対立構図に基づく勧善懲悪の貫徹が崩れていること、野亭の『部領使世継草紙』等において、既定の道徳規範から逸脱しようとも当然なる一念を貫く生き方を肯定する態度が認められることを指摘し、江戸読本と異なる上方読本の独自性について論じた。なお前年に続き、後期上方読本に属する手塚兎月の『夢裡往事』の後半を翻刻し、当作品の特色等についての論考を付した(本報告書11参照)。後期上方読本の作品について、資料収集の作業を行いつつ、主要作品に関して、下記のような問題を検討した。好華堂野亭『絵本金石譚』に関して、先行する前期読本『両剣奇遇』(伊丹椿園作)、また素材源となった盗賊日本左衛門の話などと対比しながら、この作者が独自の設定を用いることにより、善悪の描写、人物の内面の葛藤の扱いに、独自の部分を見せている点を整理した。また同作者の『大伴金道忠孝図会』に関しては、典拠である軍記『大伴真鳥実記』との対比から、構成の緊密性の追求が行われ、また読者に共鳴を起こさせるべく描写に新たな留意が施されていることを知り得た。また栗杖亭鬼卵『茶店墨江草紙』に関しては、お家騒動の枠を用いながらも、典拠の実録体小説『天下茶屋敵討真伝記』と比べて、人物が騒動の中に運命的に巻き込まれて行く、というのではなく、あくまでも個人レベルで人物を捉えようとする姿勢が見られること、また敵討が達成されるまでの苦難の部分を増幅させ、読者により大きな共鳴を与えようとしていることが知られた。同作者の『絵本更科草紙』では、予め特定の事件を提示しておき、それが時間を経て作用してくるように意識的に描いていること(構成性)、予言者的役割の者の配置、英雄であろうとも完全無欠の人間とは書かない、主家への忠義というような一種の大儀の中に人物を押し込めることなく、自発的意志や欲望などに立脚して行動するごとく描こうとする姿勢などの特質が見出された。なお、後期上方読本作品のうち、手塚兎月『夢裡往事』(島根大学附属図書館堀文庫蔵本)のうち、前半の巻二までを翻刻し、作品内容についての論の用意を開始した。
こどもの協同的な造形活動に対する混合的アプローチによる質的分析

本研究は,幼児と児童の協同的な造形活動に対して,質的分析の混合的なアプローチの方法を確立することにより,こども間の自然発生的な相互作用と,作品の制作過程との関係性を総合的に検討していく。発達的差異と文化的差異の両側面から多重的に比較することにより,協同的な造形活動におけるこどもの特徴的な行動を明確化させていく。研究結果は,学習者同士の学び合いを方向付ける基盤を検討する上での基礎的データとなり,こどもの成長・発達について理解する視座を拡充することにつながる。
欧州における税制・企業法制の調和の相互調整と日本への影響

(1)バニステンデール及びバン・フーレと共同研究「EUにおける投資環境-直接税制と会計基準を中心として-」を行った。バン・フーレは欧州委員会の財務情報会計基準課長でもあるので、国際会計基準に対する欧州基準の戦略についても貴重な見解を披露した。(2)EUにおける有害な租税競争と取り組むためのパッケージ(1997.11.5)の翻訳と分析、(3)EU委員会のDGXX1の改組とマーストリヒト条約に伴う欧州議会の権眼強化、(4)租税競争論者の主張(ブキャナン、ミルトン・フリードマン、ロバート・マンデル等)、(5)租税競争の具体例(ルクセンブルグ-源泉徴収税なし、オランダ-participation exnamination、ベルギー-コーディネーションセンター、英-キャピタル・ゲイン非課税、アイルランド-ダブリン・ドッグ、シャノン空港フリーゾーン、伊-トリエステ、オフショアセンター、ポルトガル-マディラ・フリーゾーン、スペイン-カナリア諸島特別ゾーン等)の分析、(6)EU貯蓄所得課税共存モデル導入の背景、(7)共存モデルの逐条的分析、(8)ユーロ導入と租税政策・税務、(9)レベル・プレイイング・フィールドとしてのEU法人税調和、(10)EUにおける移転価格税制の変化-基本三法から利益分割法及び定式配賦法ヘ-、(11)欧州裁判所ジリー事件判決、(12)欧州裁判所シューマッカー判決、(13)EUフロンティア・ワーカー課税問題、本研究では、この問題を取り上げ分析した。1.カトリック・ルーバン大学では,バニステンデ-ルはEU税制,特にルディング報告以後の立法化状況についてほとんど進行せず,欧州裁判所における判例法の形成に委ねているのが,実情だと強調した。会社法制を中心とするEU各国における企業法制の調整状況を把握するため,主としてティルマン教授から情報を収集した。それによると,中小企業による国境を越えた協力を目指す欧州利益共同体(EEIG)は,各国法制との調和を優先した加盟国に多くの立法上の選択権を与えた結果,各国で統一性を欠く組織形態となってしまい,必ずしも活発に利用されていない問題点が指摘され,大企業レベルの合併・企業再編を目的とする欧州株式会社法案も,現状では容易に採択される見込みはないとの予測が示された。1997年度のプロジェクトについては,日本企業の対欧投資の視点からEUにおける租税法,会社法及び労働法について,カトリック・ルーバン大学からバニステンデ-ルをはじめとする3名の教授と日本側で10月後半,11月後半又は1998年2月中旬頃にシンポジウムを行うことで,ほぼ意見の一致をみた。EU域内税法教授連合準備会がドイツ,ケルン大学税法研究所で行われるので参加しないかとバニステンデ-ル教授に誘われ,私もこの会合に出席した。ドイツの大学をはじめ域内各国の大学がこれに参加し,今後,比較税法研究を進めることになったが,同時にEU税制に関する政策提言についても重要な役割が期待される。2.ベルリンでは,レーナー教授(ベルリン自由大)と、EU税法、国際税法及び二国間条約の優先劣後の関係を抵触、競合の視点から意見交換を行った。この論点は、宮本の修士論文「トリ-ティ・ショッピングと条約便益制限条項について」で深く分析されている。3.MunchenerSteuerfachtagungでは,特に,ビルケンフェルドによる「売上税に関する欧州裁判所判例」とシュルツェ-オスターロ-による「収得税に関する欧州裁判所判例」が,詳細な体系的判例分析を行っており,我々の研究に裨益するところ大であった。4.ミュンヘン滞在中は、特にレ-ドラ-教授との意見交換が有意義であった。KLUのバニステンデ-ル教授と異なり、レ-ドラ-教授は、EU税法について、やや悲観的意見を述べ、ただし欧州裁判所におけるEU税法の形成に期待するのみである。このところドイツの税法学者は欧州税法よりも、まずドイツ国内税法に力点を置くべきであるとするナショナリスティックな傾向が認められるのが心配されると述べた点が注目される。

また、コーディネーション・センター(白)、インターナショナル・ファイナンシャル・センター(アイルランド)及びMadeira(ポルトガル)にみられる一連のEU租税政策は、いずれも長期的視点を欠いた大きな誤りであると批判された。ただし、この点についてはバニステンデ-ルはむしろ積極的見解を示し、資本輸出国対資本輸入国の間の微妙な意見の対立がみられた。フランツ・バニステンデ-ル教授(ル-ヴェン・カトリック大学)とEU委員会DG15会計基準・財務情報課長バン・フ-レ氏(ル-ヴェン・カトリック大学客員教授)がEU情報を提供した。1997年12月1日、EU加盟国大蔵大臣達は、有害な租税競争に関する今後の対策につき政治的合意に達した。欧州委員会は、コミュニケーションを1997年11月5日に公表した。それによると、(1)単一市場の歪み(その中には、有害な租税競争も含まれている)の軽減、(2)有害な租税競争による資本流出国における税収の大幅減少の防止、(3)税制を媒介する雇用促進、(4)資金移動にみられるような可動的課税ベースと比べて労働に対する租税負担が増加する傾向をリバースすること、(5)エネルギー製品課税のための枠組の再構築等が欧州レベルで取り組むべき調整行動とされた。欧州委員会は、次のパッケージを提案した。(1)事業課税の為の行動要領、(2)資本所得課税に対する歪みを除去する為の措置、(3)法人間の国際的利子・使用料の支払に対する源泉徴収税を除去する為の措置。行動要領は、事業の可動的形態に対する租税競争が経済的歪みを生じ、共同体域内の課税ベースを侵食するおそれがあるとの認識に立ち、次のことを内容とする。行動要領の対象は、域内の事業活動の場所に影響を及ぼす事業課税措置である。問題は、何が潜在的な有害課税措置に当たるかである。この点については、当該加盟国において一般に適用されるよりもはるかに低い課税(ゼロ課税を含む)を意味する。有害と判断される為には、(1)そうした租税弁益が専ら当該加盟国の非居住者に対してのみ与えられるか、(2)そうした租税便益が実質的な経済活動を伴わないで利用されるか、(3)多国籍企業群の活動に関する利益確定の基礎が国際的に承認された原則に基づき行われているか、(4)特別措置の透明性の欠如という要素が必要とされている。(1)バニステンデール及びバン・フーレと共同研究「EUにおける投資環境-直接税制と会計基準を中心として-」を行った。バン・フーレは欧州委員会の財務情報会計基準課長でもあるので、国際会計基準に対ずる欧州基準の戦略についても貴重な見解を披露した。(2)EUにおける有害な租税競争と取り組むためのパッケージ(1997.11.5)の翻訳と分析、(3)EU委員会のDGXX1の改組とマーストリヒト条約に伴う欧州議会の権限強化、(4)租税競争論者の主張(ブキャナン、ミルトン・フリードマン、ロバート・マンデル等)、
蛍光相互相関分光法による三重鎖DNA分子間相互作用の解析

本研究の目的は分子間相互作用を高感度に検出する蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy、FCCS)を用い、蛍光標識二重鎖DNA+蛍光標識オリゴDNAを対象にして、三重鎖DNA生成時の分子間相互作用の特徴を明らかにすることである。これまで我々の開発してきた蛍光相関分光法(FCS)ではその検出は分子の大きさ、分子を球としたときのその半径、そのため2重鎖+1重鎖のように分子量変化が2倍程度の時はFCSの測定パラメータである拡散時間の変化は1.2倍の相違しか検出が期待できない。そこで、発光波長の異なる2種類の蛍光分子の揺らぎの「同時性」を解析することに基づくFCCSを用いて、分子が結合して同時に動く時の、同時に揺らいでいる信号を検出し、それを解析することで三重鎖形成解析のための定量的手法を確立し、安定化機構を明らかにしようとするものである。FCCSでは2種類の蛍光色素を用いて、それぞれ別のオリゴDNA鎖に結合させて、その蛍光強度の揺らぎを測定する。これまでにRhodamine GreenとCy5の組み合わせが最適であることが分かった。また、相補的な20塩基対、相補的な40塩基対並びに、相補的でない20塩基と40塩基の組み合わせで、それぞれFCCSの測定を行った。その結果、相補的な20塩基並びに40塩基の組み合わせにおいては明確な相互相関の信号が得られ、それぞれ2重鎖の形成率が43%と50%であること、また一方、相補的でない組み合わせでは信号が得られなかった。一方、DNA結合蛋白質である、Fos、Junとその認識DNA配列の組み合わせを用いたモデル実験では、色素と蛋白もしくはDNAの組み合わせによっては凝集体ができたりして、条件によっては測定が不可能な事があることが分かった。現在これらの結果をもとに3重鎖形成の過程をFCCSを用いて測定解析を進めている。本研究の目的は分子間相互作用を高感度に検出する蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy,FCCS)を用い、蛍光標識二重鎖DNA+蛍光標識オリゴDNAを対象にして、三重鎖DNA生成時の分子間相互作用の特徴を明らかにすることである。我々の開発してきたこれまでの蛍光相関分光法(FCS)ではその検出は分子の大きさに依存していたが、FCCSでは、発光波長の異なる2種類の蛍光分子の揺らぎの「同時性」を解析することに基づく分子間の相互作用を直接検出することが可能となる。分子が結合して同時に動くことがあるなら、その揺らぎの中に同時に揺らいでいる信号が見つかるはずである。それを解析する事で分子間の相互作用を解析する方法である。この手法を利用して三重鎖形成解析のための定量的手法を確立し、三重鎖安定化機構を明らかにしようとするものである。このとき、それぞれの蛍光発光を別々の光学フィルターを経由して、明確に分離する必要がある。本年は基礎的なデータを得るために、種々の蛍光色素の組み合わせを考慮し測定をした結果、現在までにRhodamin GreenとCy5の組み合わせが最適であることが分かった。

今後、これらの結果をもとに3重鎖形成の過程をFCCSを用いて測定解析する予定である。本研究の目的は分子間相互作用を高感度に検出する蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy、FCCS)を用い、蛍光標識二重鎖DNA+蛍光標識オリゴDNAを対象にして、三重鎖DNA生成時の分子間相互作用の特徴を明らかにすることである。これまで我々の開発してきた蛍光相関分光法(FCS)ではその検出は分子の大きさ、分子を球としたときのその半径、そのため2重鎖+1重鎖のように分子量変化が2倍程度の時はFCSの測定パラメータである拡散時間の変化は1.2倍の相違しか検出が期待できない。そこで、発光波長の異なる2種類の蛍光分子の揺らぎの「同時性」を解析することに基づくFCCSを用いて、分子が結合して同時に動く時の、同時に揺らいでいる信号を検出し、それを解析することで三重鎖形成解析のための定量的手法を確立し、安定化機構を明らかにしようとするものである。FCCSでは2種類の蛍光色素を用いて、それぞれ別のオリゴDNA鎖に結合させて、その蛍光強度の揺らぎを測定する。これまでにRhodamine GreenとCy5の組み合わせが最適であることが分かった。また、相補的な20塩基対、相補的な40塩基対並びに、相補的でない20塩基と40塩基の組み合わせで、それぞれFCCSの測定を行った。その結果、相補的な20塩基並びに40塩基の組み合わせにおいては明確な相互相関の信号が得られ、それぞれ2重鎖の形成率が43%と50%であること、また一方、相補的でない組み合わせでは信号が得られなかった。一方、DNA結合蛋白質である、Fos、Junとその認識DNA配列の組み合わせを用いたモデル実験では、色素と蛋白もしくはDNAの組み合わせによっては凝集体ができたりして、条件によっては測定が不可能な事があることが分かった。現在これらの結果をもとに3重鎖形成の過程をFCCSを用いて測定解析を進めている。
矯正学的歯の移動を促進するROCK（Rhoキナーゼ）阻害剤の作用機序の解明

矯正歯科治療を短期間で効率的に進めるためには、骨吸収と骨添加を活性化し、歯槽骨の骨代謝を亢進させる治療法が考えられる。本研究では、骨吸収を担う破骨細胞と骨添加を担う骨芽細胞に促進効果を示し、矯正学的歯の移動速度を促進するROCK阻害剤の骨代謝における作用機序を細胞分子レベルで明らかにする。本研究による成果は、骨代謝促進効果をもつROCK阻害剤の臨床応用への橋渡しとなり、これによって矯正歯科治療の期間を短縮することができれば、患者の満足度が向上することが期待される。