hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨補填用リン酸カルシウム系セメントの開発に関する基礎的研究

本研究はTCA回路を構成する有機酸を用いたリシ酸カルシウム系セメントの生体反応性と臨床応用を考慮した場合の操作性の改善,X線造影性の付与ならびに液成分を高分子化することによる物性の向上を計ることを主眼として行った.生体反応性について検討を行う前に,X線造影性の付与について検討を行った.X線造影性については,α-TCP粉末と構造が類似したα-リン酸3ストロンチウム(α-TSP)を使用することにした.α-TCPとα-TSPを混合した粉末とクエン酸を用いたセメント硬化体について検討を行った.その結果,α-TSPの混合比率を増加させるとX線造影性が増加した.物性についてはα-TSPの混合比率が増加すると硬化時間は延長し,圧縮強さに関してはα-TCPとα-TSPの混合比率が9:1までは圧縮強さに有意な変化は認められなかった.従って,α-TCPとα-TSPの混合比率が9:1までは物性を変化させることなくX線造影性を付与することが可能であることが判明した.この混合粉末を用いたセメント硬化体をイヌの大腿骨の一部を切除した部分に填塞し,経時的にセメント硬化体がどのように変化していくかについては現在,観察中である.さらに,液成分の高分子化を行い,セメント硬化体の物性なちびに操作性の改善を試みた.液成分にはセメント硬化体が得られたリンゴ酸を用いた.このリンゴ酸を高分子化し,ポリリンゴ酸を合成し,セメント硬化体の物性の測定を行った.その結果,リンゴ酸を高分子化したポリリンゴ酸を用いることによりα-TCPセメントの物性は同程度もしくは低下する傾向を示し,当初,予想していた物性の向上は得られないことが判明した.しかしながら,練和感に若干の改善が認められた.従って,ポリリンゴ酸とリンゴ酸ではα-TCPとの反応機構に相違があることが推測され,さらなる検討が必要であることが示唆された.本年度は粉末としてリン酸三カルシウム(α-TCP)のみを使用することとした.本年度の実験計画のように各種カルボン酸(濃度10,20,30ならびに40wt%水溶液)と練和を行い,硬化体がセメントとしての操作性を有するか確認を行った.!練和開始後30分の時点で硬化しないもの,"練和途中に硬化するものを硬化体形成不可能あるいは操作性不良なものと分類した.この時点で硬化体を形成するα-TCPならびに練和液の組み合わせについて硬化時間,圧縮強さならびに崩壊率の測定を行った.その結果,適度の操作性を有しかつ硬化体の形成が可能であったのは30,40wt%リンゴ酸と20,30,40wt%クエン酸,40wt%オキサロ酢酸,30wt%コハク酸ならびに40wt%cis-アコニット酸を用いた場合であり,用いたカルボン酸の種類による特定の規則的な影響は確認されなかった.硬化体の硬化時間に関しては,リンゴ酸ならびにクエン酸では水溶液の濃度の増加に伴い有意に硬化時間が短くなる結果を示した.また,粉液比の増加は硬化時間を有意に短くさせた.硬化体の圧縮強さでは,練和液に30wt%コハク酸を用いた試料については蒸留水浸漬中に試料が崩壊し圧縮強さを測定することが不可能であった.30wt%リンゴ酸ならびに20,30wt%クエン酸水溶液では粉液比の違いによる有意な差は認められなかったが,40wt%リンゴ酸ならびにクエン酸水溶液を用いた場合では粉液比の増加により有意に強さを増大させた.以上のことから,従来から報告されている以外のTCA回路内の酸を使用してもリン酸カルシウムセメント硬化体が得られることが明らかになった.次に,骨補填材への応用を検討する場合に,X線造影性の付与が必要不可欠となる.α-TCP粉末にX線造影性のある同系統の粉末を添加することにより硬化時間が延長し,操作時間を確保できることが明らかになった.本研究はTCA回路を構成する有機酸を用いたリシ酸カルシウム系セメントの生体反応性と臨床応用を考慮した場合の操作性の改善,X線造影性の付与ならびに液成分を高分子化することによる物性の向上を計ることを主眼として行った.生体反応性について検討を行う前に,X線造影性の付与について検討を行った.X線造影性については,α-TCP粉末と構造が類似したα-リン酸3ストロンチウム(α-TSP)を使用することにした.α-TCPとα-TSPを混合した粉末とクエン酸を用いたセメント硬化体について検討を行った.その結果,α-TSPの混合比率を増加させるとX線造影性が増加した.物性についてはα-TSPの混合比率が増加すると硬化時間は延長し,圧縮強さに関してはα-TCPとα-TSPの混合比率が9:1までは圧縮強さに有意な変化は認められなかった.従って,α-TCPとα-TSPの混合比率が9:1までは物性を変化させることなくX線造影性を付与することが可能であることが判明した.この混合粉末を用いたセメント硬化体をイヌの大腿骨の一部を切除した部分に填塞し,経時的にセメント硬化体がどのように変化していくかについては現在,観察中である.さらに,液成分の高分子化を行い,セメント硬化体の物性なちびに操作性の改善を試みた.液成分にはセメント硬化体が得られたリンゴ酸を用いた.このリンゴ酸を高分子化し,ポリリンゴ酸を合成し,セメント硬化体の物性の測定を行った.

その結果,リンゴ酸を高分子化したポリリンゴ酸を用いることによりα-TCPセメントの物性は同程度もしくは低下する傾向を示し,当初,予想していた物性の向上は得られないことが判明した.しかしながら,練和感に若干の改善が認められた.従って,ポリリンゴ酸とリンゴ酸ではα-TCPとの反応機構に相違があることが推測され,さらなる検討が必要であることが示唆された.
中毒性表皮壊死症モデルマウスを用いた表皮ケラチノサイトのアポトーシス誘導の解明

TEN/スティーブンス・ジョンソン症候群におけるケラチノサイトのアポトーシスを起こすメカニズムを解明するため、マウスのGVHDモデルを基礎としてTEN/スティーブンス・ジョンソン症候群類似の皮膚症状の再現を試みた.しかし、残念ながら確実に再現する条件を見つけることができなかった.その原囚として、動物をモデルとする限界が考えられたが、また、疾患モデルとして薬剤との関連性が検討できないという問題点も指摘された.そこで改めて疾患モデルを作製するため、患者自身のケラチノサイトを使用して3次元培養表皮を作製し、患者リンパ球と被疑薬を反応させて「in vitroモデル」を作製する方法に変更した。現在モデルの作製中であるが、現時点では患者自身の皮膚から培養したケラチノサイトを使用して、安定して3次元培養表皮が作製可能となり、今後これを使用してモデルを作製する予定である。中毒性表皮壊死症の主な病態は表皮ケラチノサイトのアポトーシスと考えられていますが、その詳細なメカニズムがはっきりしていないためマウスの骨髄移植後のgraft-vs-host disease (GVHD)で生じる皮膚症状をモデルとして中毒性表皮壊死症のモデルマウスの作成を開始しました。まず最初にGVHDモデルの条件設定として、allo GVHDをモデルとして採用しました。具体的にはヌードマウス(H-2^d)をhostとし、C57BL/6マウス(H-2^b)の脾臓から採取した白血球を移植する方法で、recipientとしてCD4陽性Tリンパ球をMACS法にて除去してCD8陽性Tリンパ球の割合を増加させた白血球を2x10^7個尾静脈より移植を行いました。皮膚症状の発現はみられましたが、個体差が生じるため、現在移植するリンパ球の細胞数を増やしたり、移植するリンパ球全体におけるCD8陽性T細胞の割合を増加させたり(具体的には更にB細胞や樹状細胞を除去)、投与経路を変更(一部皮内投与など)するなどして、確実に皮膚症状を発症させ、かつ再現可能な条件を検討しています今後はgldマウス(FasL機能欠損)、perforinノックアウトマウスなど一般的にアポトーシスを誘導するために必要な機能の異常を有するマウスをrecipientとして使用することで、表皮ケラチノサイトのアポトーシスに関与するメカニズムを解明していく予定です。中毒性表皮壊死症の主な病態は表皮ケラチノサイトのアポトーシスと考えられていますが、そのメカニズムの解明のためマウスの骨髄移植後のgraft-vs-host disease(GVHD)で生じる皮膚症状をモデルとして昨年度に引き続き中毒性表皮壊死症のモデルマウスの作成を行いました。allo GVHDをモデルとして昨年度の方法に改良を加え、予め致死量の放射線照射を行ったヌードマウス(H-2^d)をhostとし、C57BL/6マウス(H-2^b)の脾臓から採取したCD8陽性Tリンパ球を2x10^7個尾静脈より移植を行いました。しかしながら、皮膚症状の発現に個体差が生じたり、皮膚症状の出現前にGVHDにより死亡する個体が出現するため、現在はhostからの培養ケラチノサイトを予めdonorに免疫した後、donorのリンパ球をhostに移植して、皮膚症状を確実かつ再現が可能な条件を検討しています。今後はgldマウス(FasL機能欠損)、perforinノックアウトマウスなど一般的にアポトーシスを誘導するために必要な機能の異常を有するマウスをdonorとして使用することで、表皮ケラチノサイトのアポトーシスに関与するメカニズムを解明していく予定です。中毒性表皮壊死症の主な病態は表皮ケラチノサイトのアポトーシスと考えられていますが、そのメカニズムの解明のためマウスの骨髄移植後のgraft-vs-host disease(GVHD)で生じる皮膚症状をモデルとして、昨年度に引き続き中毒性表皮壊死症(TEN)のモデルマウスの作成に取り組みました。これまでのallo GVHDをモデルでは皮膚症状の発現がまちまちで、皮膚症状の発現前に死亡してしまう個体が多かったことから、特異的にalloのケラチノサイトを認識するリンパ球を誘導する必要があると考え、hostのケラチノサイトを予めdonorに免疫した後、donorのリンパ球をhostに移植するモデルで検討を行いました。具体的には、hostの胎児からケラチノサイトを分離培養し、25x10^5のケラチノサイトをdonorの腹腔内に投与、2週間後にdonorの脾臓から採取したCD8陽性Tリンパ球を2x10^7個尾静脈に移植を行いました。しかし、皮膚症状が軽度でTEN様の症状が誘導できなかったため、その後免疫の回数を23回に増やしたり、donorのリンパ球を5x10^7に増やして検討しましたが同様の結果でした。

元々、モデルを作成後、gldマウス(FasL機能欠損)、perforinノックアウトマウスをdonorとして使い、ケラチノサイトのアポトーシスに関与する分子を解明する予定でしたが、granulysinが表皮ケラチノサイトのアポトーシスに関与しているというデータがNature medicineに報告されたことから、このマウスのGVHDモデルでは表皮ケラチノサイトのアポトーシスの解明は難しいと考え、現在実験方法を変更し、患者自身のケラチノサイトを用いて3次元培養表皮を作成し、それを患者のリンパ球および被疑薬と反応させることで、TENにおける表皮アポトーシスのモデルを作製しているところです。
新しいヒトT細胞活性化抗原の遺伝子クローニング

既に決定したH105抗原のN末端の20個のペプチド配列から、このペプチドの両端に対応するDNA配列のmixtureのプライマーを作製し、この抗原を強く発現しているHPB-ALL細胞株のcDNAを合成してRT-PCR法により60塩基を増幅した。この60塩基をTAクローニング法でTベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。cDNAライブラリーは当初、HPB-ALL細胞株のmRNAから作製を試みていたが、qualityの高いライブラリーを得ることができず、この抗原を発現しているPHA刺激Tリンパ球のlamda gt10 cDNAライブラリーをclonetech社より購入した。1次スクリーニングとして、このライブラリーのうち計80万個のクローンを大腸菌にトランスフェクションして20枚のシャーレにまき、プラークハイブリダイゼイション法によるスクリーニングを開始した。プローブとして上述の60塩基のうち特異性の高い38塩基の部分をオリゴヌクレオチドとして合成し、p32で末端ラベルして使用した。トランスフェクションしたシャーレにニトロセルロースフィルターをあてレプリカを作製し、このプローブとハイブリダイズさせ、オートラディオグラフィーを行なった。1次スクリーニングで陽性のシグナルがでたプラーク20個を回収し、再び大腸菌にトランスフェクションしてシャーレにまいて2次スクリーニングを行なった。現在、2次スクリーニングで得られた数個のポジティブクローンをプラスミドベクターにサブクローニングし、その塩基配列を解析中である。
Ｃ―マンノシル化糖修飾による新規細胞増殖制御の分子機構研究

C-マンノシル(C-Man)化TSRペプチドによるTGF-β誘導性細胞増殖に対する抑制作用の制御機構について解析を行った。C-Man化ペプチドは細胞内でHsc70やミオシン-1cと特異的に結合した。C-Man化ペプチドは、TGF-β存在下で標的分子の一つであるHsc70とSmadの結合を増強することにより、TGF-β/Smad経路の抑制を通じて細胞増殖を制御するという新たな分子機構が明らかとなった。(1)研究の目的:本研究では、我々が発見したC-Man化ペプチドによるトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)誘導性細胞増殖に対する抑制制御の知見をもとに、C-Man化ペプチドあるいはTSRドメインのTGF-βシグナルに対する新たな作用機構を明らかにすることを目的とする。(2)研究実施内容:C-Man化TSRペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trpなど)と誘導体は化学合成により調製した。C-Man化TSRペプチドやC-Man化TSRドメインが、TGF-β誘導性の細胞増殖やシグナル伝達に与える影響については、Smad経路を中心にラット線維芽細胞NRK49Fを用いて解析した。Smadの活性化状態や核移行については、イムノブロット法などの生化学的手法や、免疫蛍光染色法を用いた形態学的解析法などにより評価した。C-Man化TSRペプチド特異的に結合する分子については、合成ペプチドビオチンに結合したものをアビジンビーズで単離し、マス-フィンガープリンティング解析を行った。(3)研究結果:C-Man化TSRペプチドが、線維芽細胞株におけるTGF-β誘導性の細胞増殖を抑制することに関連して、そのシグナル伝達機構への影響について解析を行った結果、C-Man化TSRペプチドはTGF-βによるSmad2/3のリン酸化と核内移行を抑制することが明らかとなった。C-Man化TSRペプチド特異的に結合する分子を探索したところ、Hsc70, Myosisn 1cが同定、特異抗体により確認された。Hsc70はSmad2と細胞内で相互作用しており、Hsc70はTGF-βによるSmad2のリン酸化と核内移行の制御に促進的に作用することが示唆された。これらの知見は、C-Man化TSRペプチドが新規な経路を介してTGF-β誘導性細胞増殖を制御する可能性を示唆している。(1)研究の目的:本研究では、我々が発見したC-Man化ペプチドによるトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)誘導性細胞増殖に対する抑制制御の知見をもとに、C-Man化ペプチドあるいはTSRドメインのTGFーβシグナルに対する新たな作用機構と、その標的制御分子を明らかにすることを目的とする。(2)研究実施内容:C-Man化TSRペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trpなど)やその誘導体は、我々の既報に従い化学合成により調製した。また、ヒトトロンボスポンジン-1 cDNAを鋳型にMyc+His-Tag標識融合タンパク質としてTSRドメインをほ乳類細胞で発現させる遺伝子発現ベクターを設計構築した。HEK細胞に発現ベクターを導入し、分泌型タンパク質として産生させ、目的タンパク質を細胞培地からイオン交換や親和性クロマトグラフィーにより調製した。ラット線維芽細胞NRK49Fを用いて、C-Man化TSRペプチドやC-Man化TSRドメインが、TGF-β誘導性の細胞増殖やシグナル伝達に与える影響について、細胞生物学的あるいは生化学的手法や細胞の免疫蛍光染色などの手法で解析した。(3)研究結果:C-Man化TSRペプチドが、線維芽細胞株におけるTGF-β誘導性の細胞増殖を抑制し、コラーゲンIなどの標的タンパク質の産生を抑えることが明らかとなった。また、C-Man化TSRペプチドはTGF-βの細胞表面受容体に対する結合を直接的には阻害しなかった。さらに、C-Man化TSRペプチド結合分子の解析により、Myosin 1c、Hsc70などが結合分子の候補として同定された。(1)研究の目的:本研究は、C-Man化ペプチドによるトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)誘導性細胞増殖に対する抑制作用の知見をもとに、C-Man化ペプチドあるいはTSRドメインのTGF-βシグナルに対する新たな制御機構の解明を目指した。(2)研究実施内容:本年は、動物個体レベルでのC-Man化TSRペプチドによるTGF-βシグナルの抑制制御について、マウス肺線維症モデルを用いた研究を行った。C57BL/6J雄マウス(9週齢)に、0.075Uのブレオマイシンを気管内投与した。投与3日後に3群に分け、WSPWあるいはC-Man-WSPWペプチド(10 μmol/50 μL)、もしくは溶媒(0.4%ジメチルスルホキシド(DMSO)/生理食塩水50 μL)を再度気管内投与した。

その後、ブレオマイシン投与から2週間の時点でマウスを頸椎脱臼により屠殺、肺サンプルの採取を行った。得られたサンプルを用いて、TGF-βシグナルに関連する分子の発現やリン酸化レベルについて生化学的解析を行った。(3)研究結果:常法に従い、ブレオマイシンによるマウス肺線維症モデルを作製した。ペプチド投与後の肺サンプルについて、抗リン酸化Smad3、抗Snail、Collagen I、Fibronectinなどのイムノブロット解析を行ったが、C-Man-WSPWとコントロールのWSPWペプチドの間で、有意な差異は認められなかった。ただし、本実験におけるサンプル収集時点で、予想されたブレオマイシンによる肺組織の傷害が認められなかったことから、実験手技の問題が示唆された。一連の研究により、C-Man化ペプチドによるTGF-β誘導性細胞増殖に対する抑制機構を線維芽細胞のレベルで明らかにしたが、今後は動物個体レベルでのTGF-βシグナル制御について、さらに詳細な検証が必要と考えられた。生物学当初の計画に従って研究は進捗している。C-Man化TSRペプチドが新規の経路を介してTGF-β誘導性細胞増殖を抑制する分子機構の存在を発見した。C-Man化TSRペプチドは、NRK49F細胞においてTGF-βによるSmad2/3のリン酸化と核内移行を抑制することが明らかとなった。C-Man化TSRペプチド特異的に結合する分子としてHsc70, Myosisn 1cが同定された。Hsc70はSmad2と細胞内で相互作用しており、Hsc70はTGF-βによるSmad2のリン酸化と核内移行の制御に促進的に作用することが示唆された。これらの結果は、C-Man化TSRペプチドがTGF-βシグナルを抑制する新たな分子機構を示唆しており、当初目的の一部は明らかになったと考えられるが、その詳細はいまだ不明である。当初の計画に従って研究は進捗している。C-Man化TSRペプチドが新規の経路を介してTGF-β誘導性細胞増殖を制御する新たな分子機構の存在を発見した。しかし、この分子機構の詳細は不明な点が多い。そこで今後は、C-Man化されたTSRペプチドのもつTGF-βシグナル抑制制御について、C-Man化ペプチドの機能発現の構造特異性や、標的結合分子との相互作用と細胞機能における役割等についての解析を進める。C-Man化TSRペプチドが新規の経路を介してTGF-β誘導性細胞増殖を抑制する可能性が示唆された。今後は、C-Man化ペプチドの機能発現の構造特異性や、標的結合分子との相互作用と細胞機能における役割等についての解析を進める。具体的に、C-Man化TSRペプチドとSmad2/3との相互作用の異同に着目した解析を進めることで、C-Man化TSRペプチドの増殖制御の作用点にあたる分子機構を明らかにする。また現在、当初計画にあるマウス創傷治癒モデルを用いたC-Man化TSRペプチドの生理作用解析実験を準備中であり、動物個体レベルでのTGF-βシグナル制御についての解析へと展開する。C-Man化TSRペプチドが新規の経路を介してTGF-β誘導性細胞増殖を制御する可能性が示唆された。
金属および半導体ナノ粒子の外部電場による発光制御

発光特性に関して金属および半導体ナノ粒子と電場効果の間には二つの重要な問題が考えられる。一つは、金属自体を大きな電場の源と考えて、その電場が周囲の分子や物質の発光特性に影響を与えるのではというものであり、もう一つは金属や半導体ナノ粒子自身の発光特性が周囲の電場により影響を受けるのでは、というものである。前者は例えば、金属清浄表面では分子の化学吸着が容易に起こるために特異的な光化学反応を示すことや、発光の消光や発光の増強を誘導するRadiative Decay Engineeringにも関係する。私達は特に後者に着目し、金属や半導体ナノ粒子の発光特性が、外部電場によりどのように変化するかを調べた。例えば、ポリアミドアミンデンドリマー水溶液に塩化金水溶液を加え、それに水素化ホウ素ナトリウム水溶液を加えて還元することにより得られる金ナノクラスターの発光の電場効果を調べた。これらクラスターの水溶液は、一光子励起でAu_8は青、Au_<13>は緑色の強い蛍光を示し、各々の寿命は5.6ns、1.4nsであることを確かめた。Au_8クラスターをポリマー薄膜にドープし0.7MVcm^<-1>の電場を印加して電場蛍光スペクトルを得ることができた。電場蛍光スペクトルは蛍光スペクトルの零次、一次および二次微分の組み合わせで再現することができ、一次微分の寄与から、分子分極率の変化量が得られる。零次項の存在は電場により蛍光が消光することを示しており、CdSナノクラスターの場合と同様蛍光状態からの反応が電場によって加速されることを示している。これらの実験により、ナノ粒子の吸収、発光特性を外部電場を印加することにより制御できることを示した。
ヒト培養膵癌細胞におけるNecrosisとApoptosis-膵癌に対する集学的治療の改善をめざして

膵癌細胞に対する集学的治療の改善を目的として、大線量照射による膵癌細胞の細胞死を中心とし、ヒト膵癌培養細胞におけるネクローシスとアポトーシスについて検討した。実験に用いたヒト膵癌培養細胞株は、MIA Paca-2とPanc-1で、さらに当施設にて確立したヒト胆嚢癌細胞株GB-d1も合わせて使用した。trypan blueexclusion testによって染色される細胞を死細胞とし、浮遊細胞と付着細胞をそれぞれ別個に染色するとともに、coulter counterによる細胞数の計測をおこなって死細胞率を決定した。50Gyの大線量X線を照射し5日目に細胞死をみると3種の細胞とも60%以上の細胞死が観察された。照射後1μMのcycloheximideを投与した群では、3種の細胞株のすべてで有意な細胞死の抑制が観察された。パパニコロ染色ではすべての細胞株でアポトーシスの典型的な像とされる核の断片化とapoptotic bodyが観察された。照射後の細胞からDNAを抽出して電気泳動をおこなうとPanc-1およびGB-d1では、200bpごとのladder patternが観察されたが、MIA paca2ではこれがみられず、DNAは、smear状を呈した。MIA paca2にetoposide 10μMを投与してもDNAは同様にsmear状であった。MIA paca2に50Gy照射し24時間後に細胞周期をみるとG2-M期が94%となり、著明なG2-M arrestをみとめ、etoposideでも同様にG2-Mへの集積を認めた。TBHPを投与すると6時間でほぼすべての細胞がネクローシスに至り、FLowcytometryでは細胞周期の変化は観察されなかった。今回の研究により、膵癌および胆嚢癌細胞株において大線量X線照射をおこなうとアポトーシスによって細胞死がおこることが示唆され、少なくともネクローシスによる細胞死とは全く異なる細胞死であった。これらの知見は今後の膵癌における集学的治療を改善させる上で重要な基礎的情報となると思われる。我々は、膵癌に対する集学的治療の改善を目的として、ヒト膵癌培養細胞における細胞死の研究を進めている。平成6年度は、膵癌の集学的治療うち、臨床的に効果が期待されている術中開腹照射を念頭におき、培養膵癌細胞に対する大線量X線照射による細胞死を中心に検討した。本年度使用した培養株は、ヒト膵癌の3株とヒト胆嚢癌細胞株の1株である。ヒト膵癌細胞株MIA-paca2に対して50grayのX線を照射すると、およそ7日の経過である大半の細胞が死に至った。形態学的には、nuclear fragmentation(NF)が観察されたが、電気泳動による観察ではDNA ladder formation(Ladder)はみられなかった。50grayの照射15分後に蛋白合成阻害剤であるcycloheximideを投与すると細胞死が明らかに抑制された。さらに、これまでの報告から幾つかの細胞株においてapopotisisをおこすと報告されているetoposideを投与するとNFとcycloheximideによる細胞死抑制がみられたが、照射と同様にLadderは観察されなかった。一方、胆嚢癌細胞株では、50gray照射とetoposideの投与によってそれぞれNFとcycloheximideによる細胞死の抑制、Ladderが確認された。

以上のような結果から、膵癌細胞に対して大線量のX線照射とtopoisomerase II inhibitorであるetoposideを投与しておこる細胞死は、Ladderは観察されないもののapoptosisの1型であることが示唆された。しかし、この両者を単純に複合処置しただけで細胞死の加算効果は得られず、より有効な治療を行うためにはなんらかの工夫が必要であると考えられる。また、他の膵癌培養株についても検索を進めている。膵癌細胞に対する集学的治療の改善を目的として、大線量照射による膵癌細胞の細胞死を中心とし、ヒト膵癌培養細胞におけるネクローシスとアポトーシスについて検討した。実験に用いたヒト膵癌培養細胞株は、MIAPaca-2とPanc-1で、さらに当施設にて確立したヒト胆嚢癌細胞株GB-d1も合わせて使用した。trypan blueexclusion testによって染色される細胞を死細胞とし、浮遊細胞と付着細胞をそれぞれ別個に染色するとともに、coulter counterによる細胞数の計測をおこなって死細胞率を決定した。50Gyの大線量X線を照射し5日目に細胞死をみると3種の細胞とも60%異常の細胞死が観察された。照射後1μMのcycloheximideを投与した群では、3種の細胞株のすべてで有意な細胞死の抑制が観察された。パパニコロ染色ではすべての細胞株でアポトーシスの典型的な像とされる核の断片化とapoptotic bodyが観察された。照射後の細胞からDNAを抽出して電気泳動をおこなうとPanc-1およびGB-d1では、200bpごとのladder patternが観察されたが、MIApaca2ではこれがみられず、DNAは、smear状を呈した。MIApaca2にetoposide10μMを投与してもDNAは同様にsmear状であった。MIApaca2に50Gy照射し24時間後に細胞周期をみるとG2-M期が94%となり、著名なG2-M arrestをみとめ、etoposideでも同様にG2-Mへの集積を認めた。TBHPを投与すると6時間でほぼすべての細胞がネクローシスに至り、Flowcytometryでは細胞周期の変化は観察されなかった。今回の研究により、膵癌および胆嚢癌細胞株において大線量X線照射をおこなうとアポトーシスによって細胞死がおこることが示唆され、少なくともネクローシスによる細胞死とは全く異なる細胞死であった。これらの知見は今度の膵癌における集学的治療を改善させる上で重要な基礎的情報となると思われる。
カイコW染色体上の雌決定遺伝子のクローニング

本研究の目的は、カイコの性染色体上の雌決定遺伝子Femのクローニングである。これまでに本研究の代表者(阿部広明)を中心とするグループにより、W染色体上の分子マーカーであるRAPDマーカーの探索と、W染色体特異的BACライブラリーのDNA塩基配列の解析が行われてきた。その結果、Femは、あるひとつのRAPDマーカー(W-Rikishi)に極めて近い位置に局在していることが明らかとなった。W染色体部位が極端に短くなっている限性黄色繭W染色体のW部位は、必ずFemを含んでいるはずである。現在、W-Rikishiマーカーを含むBACクローンを解析し、さらにcontig作業を続けている。W染色体は、多くの転移因子が複雑に入り込んだ「入れ子構造」をしている。それとは別に、これまでに解析が困難であり、意味不明のW染色体上の塩基配列が存在したが、カイコホールゲノムショットガンのデータを使用して解析したところ、これらは新規の転移因子であることが判明した。これにより転移因子の蓄積によるW染色体構成の歴史が詳細に解明された。さらにカイコの野生種とも考えられる「クワコ」のW染色体も解析したところ、一部のレトロトランスポゾンの入れ子状態が、カイコのW染色体の入れ子状態と共通して存在していた。このことは、カイコとクワコが分化する前は、共通するW染色体を保有していたことを示唆している。またこの部分はFemに近いと考えられることから、現在、BACクローンのcontig、ならびにDNA塩基配列を利用したウォーキングなどを駆使し、Femのクローニングを試みているところである。またこの部分はFemに近いと考えられることから、現在、BACクローンのcontig、ならびにDNA塩基配列を利用したウォーキングなどを駆使し、Femをクローニングを試みているところである。
タブーサーチを内包したモンテカルロ木探索に基づく囲碁アルゴリズムの研究

コンピュータ囲碁の主流はモンテカルロ木探索である。この手法は一手の探索に約1万回のプレイアウトを実施する必要がある。プレイアウトとは現局面からランダムに石を打って終局させることである。プレイアウトの精度が上がれば、少ないプレイアウト数で正確に探索木を成長させられる。しかしこれが意外に難しい。本研究では、プレイアウトに正確性でなく、多様性を持たせて、より多くの局面を試行することを提案した。探索木が深さ方向に成長するのを抑制し、代わりに木が均一的に成長するのを促進する。これを実現するためにプレイアウトにタブーリストの導入を試みた。タブーリストとはタブーサーチで利用される短期メモリのことである。交付申請書の研究目的(概要)で1)定石・手筋を考慮したモンテカルロ木探索を提案し、2)さらに禁忌表を使ったタブーサーチを内包させることで棋力の向上を図る、と記した。これら2つの視点から研究実績の概要をまとめる。まず、研究目的の1つ目は、オープンソース・ソフトウェアであるGNU Go 3.8 (gnugo)を改良することで実現した。gnugoは9路盤までしかモンテカルロ木探索を導入できていないが、これを19路盤で動作するように改良した。定石・手筋はgnugoオリジナルから変更していないが、この部分の解析と改良はこれから行う予定である。19路盤に拡張してコミを6目半にして1,000局ほどgoguiを使って自動対戦させた。理由は不明であるが、先手の方が勝率が高く、後手が明らかに不利になることが判明した。原因はこれから究明する。次に、研究目的の2つ目であるが、これはタブーサーチで主要な役割を果たすタブーリストをモンテカルロ木のすべての葉ノードに導入することで部分的ではあるが実現した。ただ、現状ではタブーサーチの導入までには至っていない。タブーサーチの解の多様性を本囲碁の研究では候補手の多様性と捉え直している。候補手多様性の優位を検証するために詰碁で数値実験を行った。モンテカルロ木探索オリジナルとモンテカルロ木探索にタブーリストを内包させた提案法で詰碁の正答率を比較した。結果は概ね良好であった。gunugoソースにタブーリストを内包させた19路盤の提案法アルゴリズムを実装して平成26年3月に電気通信大学で開催された第7回UEC杯コンピュータ囲碁大会にカテゴリC枠で出場した。対戦成績は7戦して3勝4敗であった。モンテカルロ木探索のすべての葉ノードにプレイアウト初手から数手分のタブーリストを内包させて、候補手をタブーリストに登録する。タブー期間の間、タブーリストに存在する合法手を強制的に禁じ手とすることで候補手多様性を実現した。2つの数値実験により提案法の優位性を統計的に示した。ひとつは詰碁を対象とした実験であり、もうひとつは詰碁よりも大きい9路盤での対局である。詰碁では、黒番着手が詰碁問題の最終手順まで辿り着いた回数で正答数を評価した。この正答数をカイ二乗検定を使って統計的に提案法の優位性を示した。一方の9路盤対局では、オープンソースのGNU Go 3.8に提案法を組み込み、二項検定を使って提案法の有効性を統計的に検証した。現在、タブーリストに手ではなく、局面を登録する、局面タブーリストを使ったモンテカルロ木探索手法を検討している。基本的にモンテカルロ木探索なので、最良優先探索の挙動をとることに変わりはない。予備実験では良好な結果が得られている。平成26年度までに達成したタブーリストを内包したモンテカルロ木探索はコンピュータ囲碁における詰碁や9路盤囲碁といった比較的小さな探索空間では有効に機能した。しかし、19路盤囲碁では統計的有意差を獲得するには至らなかった。平成27年度はこの点の改良に注力した。手のタブーリストへの登録を局面の登録に改めた。登録する局面は、盤面交点への手ではなく、現局面と手の排他的論理和で構成されるゾブリストハッシュを登録するよう改めた。タプーリストに登録・更新するタイミングも、手の登録同様、逐次更新する方法と自分手番で始まるプレイアウトが負けたときのみタブーリストを一括更新する方法の2つを試みた。一括更新法のアイデアはLGRF(Last Good Reply with Forgetting)から着想した。自分手番で始まるプレイアウトが負けた場合、負けた局面をタブーリストに登録して以降のプレイアウトでその局面を禁忌する。これにより負けた局面を避けられるので、直接的ではないが以降のプレイアウトを勝ちに誘導できる。数値実験では、1)19路盤での対局、2)同一局面重複数、3)1回のプレイアウトでタブーになる平均候補手数、これらを評価し提案法は良好な結果を得た。ただ、平均思考時間だけは手をタブーリストに登録する前手法よりも劣る結果となった。ハッシュ処理の計算部分が大きく影響している、と考えられる。平成27年度は上述した局面タブーリストの提案と検証だけでなく、プレイアウト履歴を短期メモリに保存するタブーサーチ的手法も検討し、9路盤囲碁で対局実験を行った。短期メモリに保存する各プレイアウトの着手手番や攻め合いを計量化して、次の一手を導き出す手法である。予備実験では、GNU Go 3.8 MCTSと100回対戦させ、残念ながら、提案法のタブーサーチ的手法は19勝81敗と大きく負け越す結果となってしまった。

この手法は一手の探索に約1万回のプレイアウトを実施する必要がある。プレイアウトとは現局面からランダムに石を打って終局させることである。プレイアウトの精度が上がれば、少ないプレイアウト数で正確に探索木を成長させられる。しかしこれが意外に難しい。本研究では、プレイアウトに正確性でなく、多様性を持たせて、より多くの局面を試行することを提案した。探索木が深さ方向に成長するのを抑制し、代わりに木が均一的に成長するのを促進する。これを実現するためにプレイアウトにタブーリストの導入を試みた。タブーリストとはタブーサーチで利用される短期メモリのことである。タブーリストを内包したモンテカルロ木探索による詰碁と9路盤囲碁への応用までは達成できた。詰碁では評価の仕方を昨年度から改めた。昨年までは黒先白死の詰碁で黒番初手をもって正答数を評価していた。これを最終手順まで辿りついた回数で正答数を評価するよう改めた。モンテカルロ木探索が一本道の手筋を苦手としている点が克服できているかを検証するためである。また、9路盤囲碁でも昨年までは生成ノード数を上限に対局させていた。これを上限ノード数ではなく、プレイアウト数の上限で勝率を比較するように改めた。より公平に従来法と比較できるようにするためである。オープンソースへの提案法の組み込みも全面的に書き換えた。プレイアウトにタブーリストを導入することによって候補手多様性を実現でき、結果として好手を見逃がさないようにすることに成功した。数値計算による提案法の優位性検証だけでなく、タブーリスト導入に伴う解析的なオーバーヘッドの算出も仮定から見直した。昨年まではタブーリストに登録済みの手が出現した時点でプレイアウトを初手からやり直すと仮定して、無駄になる候補手数の平均を近似的に算出していた。これをその手のみ破棄すると仮定して、無駄になる平均候補手数の上界を求めるように式展開を改めた。結果は、候補手多様性確保のために1回のプレイアウト中に高々平均57手を余分に生成するだけで済むことが判明した。このように昨年度から細かい修正を多数行った結果、肝心のタブーサーチ導入への取り組みが遅れる結果となった。平成27年度卒業研究紹介では本研究課題に関連する4件の研究テーマのみを掲載している。愛知工業大学学術情報リポジトリから論文``局面タブーリストを内包したモンテカルロ木探索の19路盤囲碁への応用''のPDFファイルが取得できる。システム最適化タブーリストを内包したモンテカルロ木探索による9路盤囲碁への応用までしか完成していない。19路盤囲碁では従来法の改善に完全に失敗している。探索空間の大きさを克服できていないのが原因であると考えられる。これを打破する一つの方策が局面タブーリストを使ったモンテカルロ木探索手法である。モンテカルロ木探索なのでやはり最良優先探索の枠組みからは脱却できない。しかしまず、これを実装して数値実験で定量的に局面タブーリストの有効性を評価したい。次なるステップはやはり、タブーサーチの導入である。
ATM遺伝子とプロモーターを共有するNPAT遺伝子の転写調節及び機能の解析

第一に、ATM遺伝子及びNPAT遺伝子の転写制御のメカニズムを解析するために、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、両遺伝子の転写開始点にはさまれた領域は、どちらの遺伝子の方向に対してもプロモーター活性を持つことから双方向性を示すことと、それぞれ異なる領域が転写活性化に重要であることを明らかにした。次に、このプロモーター領域にどのような転写因子が結合しているか、ゲルシフトアッセイで解析した結果、CREに類似した配列及びE2Fに類似した配列に何らかの転写因子が結合していることから、これらの配列に変異を導入してプロモーター活性を調べたところ、これらの配列がどちらの遺伝子の転写に対しても関与しており、特にCREに類似した配列が重要であることが明らかにした。そこで、CREに類似した配列付近をプローブとしてゲルシフトアッセイを行ったところ、この配列にはCREBなどの転写因子とは異なる新規の転写因子が結合していることと、双極性の結合能を持つことが明らかにした。第二に、NPAT遺伝子産物が核タンパク質であると推定された理由は、カルボキシル末端領域に核移行シグナルと推定される、塩基性アミノ酸が4つ連続した配列が3ヶ所存在するためであるが、これらの配列の解析をGFPとの融合タンパク質を用いて行ったところ、NPAT遺伝子産物が核タンパク質であることと、核への移行には3ヶ所の4連続塩基性アミノ酸配列全てが必要であることを明らかにした。また、NPAT遺伝子産物の中間部の20アミノ酸配列についても、新規の核移行シグナルとして機能していることを明らかにした。各遺伝子の転写調節について調べるため、ATM遺伝子の5'上流2200bp及びNPAT遺伝子の5'上流2800bpをルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだプラスミドを作製し、これらを肝癌由来の細胞株HepG2や子宮頚癌由来のHeLa、繊維芽肉腫由来のHT1080、AT患者由来のAT3B2やAT1BRに導入し、ルシフェラーゼ活性を調べたところ、全ての細胞株においてプロモーターが機能することが明らかとなった。次にプロモーターを徐々に欠損させていったところ、ATM遺伝子は5'上流700bp.NPAT遺伝子は5'上流350bpの領域がもっともプロモーター活性が高いことが明らかとなった。こららの領域は両遺伝子の転写開始点にはさまれており、共通する領域である。そこで、この共通する領域の両端に2種類のルシフェラーゼ遺伝子をつないで上記の細胞株に導入したところ、両方のルシフェラーゼ活性が検出された。これらのことから、ATM.NPAT両遺伝子の共通のプロモーターが両方向性を持つことと、さまざまな細胞株での転写活性を持つことが明らかとなった。次に、共通のプロモーターにどのような転写因子が結合するかを検索したところ、既知の転写因子の結合配列と完全に一致するか、極めて類似した配列として、Splが4ケ所、CAATTboxが2ケ所、CREが1ケ所、E2Fが2ケ所推定された。これらの内、CREに類似した配列に変異を導入したところ、プロモーター活性がATM、NPATのどちらの遺伝子の方向に対しても4分の1から10分の1に低下することが明らかとなった。ゲルシフト法を用いてこの配列に結合している因子を調べたところ、CREBとは異なる因子が結合していることが明らかとなった。NPAT遺伝子産物の機能解析の1つとして、核局在シグナルの解析を行った。NPAT遺伝子とGreeen Fluorescein Protein (GFP)遺伝子のキメラ遺伝子を作製して培養細胞に導入し、その局在を調べた。まず、NPAT遺伝子産物のC末端領域には塩基性アミノ酸が4つ連続する典型的な核局在シグナルが1368KKRK1371、1397KKKK1400、1401KKKK1405の3ヶ所存在することから、NPAT遺伝子の全長(11427アミノ酸)とこれらのシグナルを除いたD1(11366アミノ酸)をGFP遺伝子につなぎ、cos7細胞に導入してGFPの局在を調べたところ、全長は核のみに局在していたがD1は核と細胞質の両方、すなわち細胞全体に局在が認められた。

次に、これらの核局在シグナルのいずれが必要であるかを調べたところ、どのシグナルが欠けても核のみへの局在が認められなくなることから、3つのシグナル全てが核局在に必要であることが明らかとなった。さらに、D1はNPATの1366アミノ酸とGFPの241アミノ酸の合計1607アミノ酸からなる巨大なタンパク質であるにも関わらず核への移行が観察されることから、拡散などの受動的な移動によるものではなく、他の核局在シグナルが存在するために核へ移行したと考えられた。そこで、D1からN末端側に欠失変異体を作製し、cos7細胞に導入してGFPの局在を調べたところ、D7(1974アミノ酸)まではD1と同様に細胞全体での局在が認められたが、D10(1923アミノ酸)よりもN末端側に欠失させた変異体では細胞質のみで局在が認められたため、NPAT遺伝子産物の924974アミノ酸の領域にも核局在シグナルが存在すると考えられた。
遺伝子発現プロファイリングを応用した膵癌に対する新規ペプチド免疫療法の開発

膵癌は予後不良な癌腫のひとつであり、新規膵癌治療を目指し膵癌の転移・浸潤に関与する遺伝子群の検索が多くなされてきた。膵癌切除例ではリンパ節転移が唯一の予後不良因子であることが報告され、膵癌リンパ節転移関連遺伝子の同定は予後予測マーカーのみならず新規膵癌治療の分子標的になり得ると考え、われわれは膵癌切除凍結サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析により膵癌リンパ節転移遺伝子を検索した。平成21年度には膵癌切除凍結サンプル30例を用い、組織を9μmに薄切した後、膵癌腫瘍部を選択的にマイクロダイセクションし、そのRNAを抽出し、網羅的遺伝子発現解析を施行した。網羅的遺伝子発現解析はAffymetrix社のGeneChip Human U133 plus 2.0 arrayを用い、マイクロアレイデータをDNA Chip softwareを用いて、Normalizationした後、リンパ節転移陽性群15例と陰性群15例で比較検討した。その結果リンパ節転移陽性群で高発現した遺伝子29個と低発現した遺伝子17個を同定した。さらに、これらの遺伝子群がタンパクレベルでもリンパ節転移に関与する遺伝子群かどうかを立証するべく、免疫染色解析を行った。その結果4遺伝子(AP2α, MUC17,LI-cadherin, XK)が、リンパ節転移陽性群と陰性群で差を認めた。本年度は、これらの4遺伝子の臨床学的意義を同定するべく、200例の膵癌サンプルで免疫染色解析を施行し、臨床病理学的因子を含めた多変量解析を行ったところ、これら4遺伝子のうちAP2α低発現とMUC17高発現の2遺伝子が、膵癌のリンパ節転移に有意に関与していることが分かった。さらに、AP2α低発現群とMUC17高発現群は、膵癌切除患者の予後不良因子であることが同定できた。次にこれらの遺伝子群の分子学的機能を解明するべく、In vitroにおける浸潤・転移機能を解析を行った。MUC17のshRNAを膵癌細胞株(PK9)にtransfectし、MUC17の発現を十分に抑制した。Invasion chamber解析では、MUC17をdownregulateした細胞ではコントロール群より優位に浸潤能が抑制でき、さらにMigration assayにおいても、コントロール群よりも優位にmigration levelの低下を認めた。このことからMUC17は膵癌において浸潤・転移に関与する遺伝子であることが分かった。今後、上記の結果とさらなるIn vitroおよびIn vivo実験を行い、MUC17タンパクからHLA-A24に結合するペプチドを同定して、ワクチン療法に向けた基礎的検討を行っていく予定である。根治切除した膵癌組織80例で、リンパ節転移陽性群を51例、陰性群を29例を対象とした。まず膵癌摘出標本の一部を凍結包埋し、その組織を9μmに薄切した。続いてヘマトキシレン染色をした後、膵癌腫瘍部を選択的にマイクロダイセクションし、膵癌細胞のみを回収した。回収した膵癌細胞から、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。そのRNAをAgilent 2100Bioanalyzer(Agilent社)にてQualityをチェックし、RNAの質の指標であるRINが5.0以上であることを確認した。続いて膵癌組織RNA 100ngを用いて、RNAマクロアレイアッセイ(Affvmetrix社)を行った。逆転写酵素とpoly-Tプライマーを用いてcDNA合成を行い、T7RNAポリメラーゼを用い、2サイクル増幅させ、in vitro transcriptionを行った後、biotinにてラベル化した。15μg分のcRNAを35200ntにたるように断片化し、GeneChip Human U133 plus 2.0 array(Affymetrix社)に注入し、17時間hybridizationを行った。Fluidics Station(Affymetrlx社)にてwash and stainを行い、Fluorometric scannerにてスキャンし、シグナル強度をGeneChip Operating Software(GCOS)で解析した。そのマイクロアレイデーターをDNA Chip softwareを用いて、Normalizationし、その絶対値をリンパ節転移陽性群と陰性群で比較解析した。その結果リンパ節転移陽性群で高発現しだ遺伝子29個と低発現した遺伝子17個を同定した。これらの遺伝子群は膵癌のリンパ節転移に強く相関する遺伝子群であり、これらの遺伝子群を立証するべく、免疫染色解析を行った。その結果4遺伝子(AP2α, MUC17, LI-cadherin, XK)が、リンパ節転移陽性群と陰性群で差を認めた。臨床病理学的因子を含めた多変量解析では、これら4遺伝子のうちAP2α低発現とMUC17高発現の2遺伝子が、膵癌のリンパ節転移に有意に関与していることが分かった。その結果を受けて、MUC17タンパクからHLA-A24に結合するペプチドを同定して、ワクチン療法に向けた基礎的検討を行った。

膵癌切除例ではリンパ節転移が唯一の予後不良因子であることが報告され、膵癌リンパ節転移関連遺伝子の同定は予後予測マーカーのみならず新規膵癌治療の分子標的になり得ると考え、われわれは膵癌切除凍結サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析により膵癌リンパ節転移遺伝子を検索した。平成21年度には膵癌切除凍結サンプル30例を用い、組織を9μmに薄切した後、膵癌腫瘍部を選択的にマイクロダイセクションし、そのRNAを抽出し、網羅的遺伝子発現解析を施行した。網羅的遺伝子発現解析はAffymetrix社のGeneChip Human U133 plus 2.0 arrayを用い、マイクロアレイデータをDNA Chip softwareを用いて、Normalizationした後、リンパ節転移陽性群15例と陰性群15例で比較検討した。その結果リンパ節転移陽性群で高発現した遺伝子29個と低発現した遺伝子17個を同定した。さらに、これらの遺伝子群がタンパクレベルでもリンパ節転移に関与する遺伝子群かどうかを立証するべく、免疫染色解析を行った。その結果4遺伝子(AP2α, MUC17,LI-cadherin, XK)が、リンパ節転移陽性群と陰性群で差を認めた。本年度は、これらの4遺伝子の臨床学的意義を同定するべく、200例の膵癌サンプルで免疫染色解析を施行し、臨床病理学的因子を含めた多変量解析を行ったところ、これら4遺伝子のうちAP2α低発現とMUC17高発現の2遺伝子が、膵癌のリンパ節転移に有意に関与していることが分かった。さらに、AP2α低発現群とMUC17高発現群は、膵癌切除患者の予後不良因子であることが同定できた。次にこれらの遺伝子群の分子学的機能を解明するべく、In vitroにおける浸潤・転移機能を解析を行った。MUC17のshRNAを膵癌細胞株(PK9)にtransfectし、MUC17の発現を十分に抑制した。Invasion chamber解析では、MUC17をdownregulateした細胞ではコントロール群より優位に浸潤能が抑制でき、さらにMigration assayにおいても、コントロール群よりも優位にmigration levelの低下を認めた。このことからMUC17は膵癌において浸潤・転移に関与する遺伝子であることが分かった。今後、上記の結果とさらなるIn vitroおよびIn vivo実験を行い、MUC17タンパクからHLA-A24に結合するペプチドを同定して、ワクチン療法に向けた基礎的検討を行っていく予定である。