hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新構造の有機リン含有機能性色素材料の創成

これらの解析を基に,イミン由来の置換基が導入されるホスフィニン3,4位に様々な置換基を導入するために段階的な縮合反応を設計し,検討を重ねた結果,イミン窒素上の置換基が異なる2つのイミンを使い分けることで,ホスフィニン骨格を形成する縮合反応において段階的に2つの置換基を導入できるようになった。これは今後の研究遂行上,極めて重要な進展である。実際にいくつかの置換基を導入したモデル化合物では,蛍光波長,発光効率が置換基により大きく変化したことから,置換基チューニングによる物性調整が可能であることが示せた。現在のところ合成反応における選択性,効率にまだ改善の余地があり,今後も検討を続ける予定である。一方,本検討と並行して,ホスフィン部分の置換様式変更に必要となる原料ホスフィン化合物の効率的合成法開発,リンイリド含有共役系の新規な変換反応開発にも取り組み,極めて効率的なホスフィン合成法と,λ5系からλ3系への変換反応も見出すことができた。平成24年度中の研究計画では,反応制御方法開発の継続と、系統的な置換誘導体の合成を行うこと、及びその物性評価と分子設計へのフィードバックを行うこととしていた。このうち誘導体合成方法については、本年度の研究実績欄にも記載したとおり,未だ改善の余地はあるものの、環上に各種置換基を導入した誘導体の合成・単離に至っており、物性評価に必要な環境は整ったといえる。さらに平成24年度中に発表することができたホスフィン合成手法を利用してホスフィン部分の置換まで行うことができている。一方で、評価した物性は期待したほどの値を示さなかったこと、及び様々な置換基効果の検証から、今後さらなる分子設計が必要であることも明らかとなっている。これらのことをあわせても、研究は当初の計画どおり順調に進展しているといえる。平成23年度中の研究計画では,主に多段階カスケード反応の制御に必要となるホスフィニン形成縮合反応の詳細な反応過程解析と,反応生成物の構造解析を行うこととなっていた。このうち反応生成物の構造解析はX線結晶構造解析も含めて成功しており,また本年度の研究実績欄にも記載したとおり,多段階反応の解析により中間体の構造を含む反応過程を明らかにし,さらに平成24年度研究計画にあげた,多段階反応の段階的制御方法についても,有望な新手法を見出すに至っている。加えてさらに次の課題であるホスフィン部分の変換についても必要な合成手法開発,変換反応開発の目処を付けている。このように,研究は当初の計画以上に順調に進展しているといえる。本年度の研究実績欄にも記載したとおり,ホスフィニン骨格を有する様々な誘導体を合成して物性評価を行ったが、現在のところ合成反応における選択性,効率、さらには合成した化合物の蛍光効率に改善の余地があり,今後は分子設計を含めて引き続き検討を続ける予定である。特に置換基効果の大きい位置における共役系の拡張を含めた置換様式の変更に取り組む予定である。また、並行してリンイリド変換反応による複素環拡張の検討も続ける予定である。本年度の研究実績欄にも記載したとおり,ホスフィニン骨格を形成する縮合反応において段階的に2つの置換基を導入できる目処はついたが,現在のところ合成反応における選択性,効率にまだ改善の余地があり,今後も検討を続ける予定である。さらに当初の研究計画通り,各種置換様式を持つ対象化合物を合成し,その構造物性相関を詳細に調査する予定である。並行して合成に必要となるホスフィン合成手法開発とリンイリド変換反応の検討も続ける予定である。
低分子量Ｇ蛋白質Ａｒｆ６／リン脂質キナーゼＰＩＰ５Ｋによる脳内βアミロイドの調節

アルツハイマー型認知症の関連物質Aβの脳からの排出には、LRP1とMegalinという膜受容体が重要な働きを担っている。両者は、脳毛細血管内皮細胞、脈絡叢上皮細胞において、脳内Aβを取り込み循環血液中に排出する。本研究において我々は、低分子量G蛋白質Arf6とリン脂質キナーゼPIP5Kが、Megalin、LRP1の細胞内ドメインに結合することを見出した。また、Arf6をノックダウンした細胞において、Megalin、LRP1が細胞内の微小構造に蓄積し、両者の発現量が顕著に増加することを明らかにした。以上より、Arf6がMegalin、LRP1のリソソームへの移行を制御していることが示唆された。平成26年度は、培養細胞を用いて、引き続きMegalin、LRP1の細胞内への取り込みと、その後の細胞内輸送におけるArf6、PIP5Kの関与について解析を行った。通常、受容体などの細胞膜タンパク質は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、初期エンドソームに取り込まれた後、リソソームへと運ばれ分解されるか、あるいは細胞膜へと再度リサイクリングされる。そこで、初めにMegalin, LRP1の取り込みへのArf6の関与を検討した。Arf6をノックダウンしたHeLa細胞において、細胞膜表面のMegalin, LRP1をビオチンにてラベルし、細胞内への取り込みを測定した。その結果、コントロールとノックダウン細胞との間で、両者の取り込みに顕著な差は認められなかった。さらに、Megalin、LRP1のリサイクリングを検討したところ、こちらもArf6ノックダウンによる影響は認められなかった。しかしながら、MegalinおよびLRP1の発現量を解析したところ、Arf6をノックダウンした細胞では、両者の発現量が著しく増加していた。このことから、Arf6はMegalin、LRP1の安定性制御に関わっている可能性が考えられた。さらに、Arf6をノックダウンした細胞において、Megalin、LRP1の細胞内での局在を解析したところ、取り込まれたMegalin、LRP1が細胞内の微小構造に蓄積しているのが観察された。このような細胞内の蓄積と発現量の増加は、Arf6の不活性型変異体の過剰発現でもみられた。以上の結果より、細胞内に取り込まれ、リソソームにおいて分解されるよう決定付けられたMegalin、LRP1が、リソソームへと輸送される過程においてArf6の活性化が必要と考えられる。本研究は、Magalin, LRP1を介したアミロイドβの排出機構へのArf6, PIP5Kの関与を検討し、そのメカニズムの解明を目的とする。平成24年度は、主に培養細胞を用いてMegalin, LRP1とArf6, PIP5Kとの結合様式の検討、および、Megalin, LRP1の細胞内への取り込みとその後の細胞内トラフィッキングにおけるArf6, PIP5Kの関与について解析を行った。Megalinの細胞内ドメインには、3つのNPXYモチーフが存在する。このモチーフには、エンドサイトーシス関連因子が結合し、細胞内への取り込みや細胞内での輸送の制御に関わることが知られている。この3つのモチーフうち、最もN末端側(細胞膜側)にArf6,PIP5Kが結合することを明らかにした。また、Arf6の不活性型変異体の過剰発現により、取り込まれたMegalinが細胞内の微小構造に蓄積することを見出した。この結果は、Arf6が、取り込まれたMegalinのリサイクリングや分解の場であるリソソームへの輸送に関わっていることを示唆している。さらに、Arf6をノックダウンすることにより、Megalinの発現量が増加することを見出した。以上の結果より、Arf6はMegalinのNPXYモチーフに結合し、細胞内におけるリソソームへの輸送に関与していることが想定される。今後は、そのメカニズムの解明とともに、アミロイドβをはじめとしたリガンドの輸送、シグナル伝達への影響を検討する予定である。当初は、培養細胞において各因子(Megalin, LRP1, Arf6, PIP5K)の結合様式の解析、Megalin, LRP1のエンドサイトーシス、トラフィッキングへのArf6, PIP5Kの関与を検討する予定であったが、巨大分子であるMegalin, LRP1の発現系、検出に手間取り、解析がやや遅れてしまう結果となった。現在は、発現系は構築でき、Arf6の関与を示唆する結果を得ることができたが、分子メカニズムの解明にまでは至っていない状況である。加えて、本年度は研究代表者が海外に長期出張していたため、トラブルへの対処が遅れてしまったのも一因と考えられる。次年度は、上記のような問題は解消できていることから、急ぎ解析を進め、予定していた研究計画を遂行していきたいと考えている。

Arf6のMegalinの細胞内輸送への関与が示唆されたことこから、Megalin、さらにはLRP1のArf6による輸送制御のメカニズムの解明を培養細胞を用いて進めていく。さらには、その際にPIP5KもArf6と共に働くのかを検討する。また、メカニズムの解明と並行して、in vitro脈絡叢モデル系を用いて、実際にArf6, PIP5Kが、Megalin, LRP1を介してアミロイドβの取り込み、輸送に関与するかを検討する。脈絡叢モデルとしては、ラット脈絡叢由来TR-CSFB細胞(東北大学大学院薬学研究科寺崎哲也教授よりご供与)を用い、脳脊髄液関門のモデルとする予定である。また、Arf6-Floxマウス、PIP5Kノックアウトマウスより細胞を単離し、Arf6,PIP5Kの関与を検討していく。さらには、遺伝子改変マウスを用いて、個体レベルにおいてArf6, PIP5Kがアミロイドβの輸送に関わるのかの検討を行っていく予定である。なお、本研究では以下の3名の大学院生を研究協力者として参画させる予定である。筑波大学大学院人間総合科学研究科博士過程1年山内庸平、修士課程1年宮地泰人筑波大学ヒューマンバイオロジー学位プログラム2年三浦悠樹本年度は、研究代表者が長期海外出張中であったため、予定していた研究の一部を遂行できず、また、学会参加も一部取りやめたため、次年度への繰り越しが生じる結果となった。繰り越した予算については、次年度以降も引き続き培養細胞を用いた解析を継続していくため、主に、細胞培養関連試薬、遺伝子工学関連試薬の購入に使用していく予定である。次年度に新たに請求する研究費については、同様に細胞の培養に掛かる費用に使用するとともに、実験動物の購入費、維持・管理費にも使用していく予定である。また、研究成果を国内外の学会にて発表予定のため、出張旅費にも使用予定である(旅費は、本年度からの繰り越し分もあてる予定)。研究を進める上で必要な機器類・設備は、所属研究室、あるいは所属機関の共通機器として揃っているため、大型機器の購入費に使用する予定はない。
統合失調症者のメタ認知機能を高めるリアリティモニタリングプログラムの開発

リアリティモニタリングは現実に知覚した体験と、内的に作り出された出来事を区別することである。これまでの研究では、統合失調症者は認知機能の低下や陽性症状のためにリアリティモニタリングにエラーがあることが明らかになった。しかし、統合失調症者へのインタビューから、過去の体験を振り返り、違和感を感じていたり、現実を見つめようしていることが明らかになった。特に陽性症状が活発であった時の自分の状態を振り返って、「思うように行動に移せない」「何をするのにも集中力がない」「リアルではない」というように【何か変な自分】を違和感としてとらえることができていた。また、以前の体験について「薬でよくなった」「精神症状は確かにあった」ととらえ【やはり私は病気だ】と語ることができ、病状が悪かった時の様子を客観的にみることができていた。このインタビューを通して、対象者が治療などにより陽性症状が改善されるにしたがい、自分の状況を洞察し、リアリティモニタリングを修正することができるようになっていることが確認された。そこで統合失調症者のリアリティモニタリングを高めるために、過去との体験の比較や目標設定などを確認することや、メタ認知機能に直接関わる自分に目を向けることが有効であると確認された。そのため「自分自身」について考えることができるようなプログラムを作成した。内容は1身体の機能、2友人関係、3感情に関すること、4病気である統合失調症、5治療、6住もうとする地域のこと、の6側面から自分に起こったことや自分が体験していることをどのようにとらえるかを考えるように構成した。また、これからの目標や過去の体験との比較ができるように介入方法を工夫した。このプログラムについて専門家、臨床看護師に確認をしたところ、概ね良いのではないかという意見をいただいた。今後、作成した援助プログラムの有用性を明らかにすることが課題である。昨年度は「過去の体験との比較」「今後の目標」「目標設定の理由」「現在の状況のとらえ方」が中心でプログラムを構成していたが、内容が少し漠然としてしまった。また対象者が病院に入院している患者のため、リクルートに時間がかかり、分析が間に合わなかった。今後は現在、過去、未来との繋がりについて確認をしていくようなプログラムに加え、具体的な内容を加えたプログラムに変更し、対象者に実施すること、またそこから有用性を明らかにしていきたいと考える。リアリティモニタリングは、知識や記憶、信念の情報源を区別することであり、統合失調症者は、リアリティモニタリングの異常が起こる。そのため断片的で、部分的な情報でも十分な証拠になり、結論が飛躍してしまうことが指摘されている(佐藤,2008)。そこで統合失調症者の病気受容のプロセスとリアリティモニタリングの実態を明らかにすることを目的に、対象者10名にインタビュー調査を行った。対象者は全員精神科病院に受診中20歳以上の統合失調症者で、病気について告知され、疾病教育を受けたことがあるものであった。研究に先立ち、筑波大学医学医療系医の倫理委員会及び対象施設の倫理審査を受審し、承認後に実施した。インタビュー中にメモをとり逐語録を作成し、内容分析を行った。対象者は9名男性、1名が女性であった。統合失調症者は、幻覚や妄想の起こりはじめは【違和感】や誰かにはめられているという【猜疑心】を抱いていた。この違和感を自分なりに解釈して、【アドバイスを受けている】と考えたり、自分は特別な存在でなければならないから【自分が注目されている】考えるようになっていた。しかし同時に【自分では止められない】と感じていた。さらに薬物療法や心理教育などを通して、過去を振り返り【理性的ではなかった】、【病気だった】、【本来の自分とは違っていた】と思うようになることが認められた。統合失調症者は、幻覚妄想状態にあるときには、リアリティモニタリングの異常があるものの、同時に『自分では止められない』という感覚があり、どこか客観的にみつめようとするメタ認知機能が働いているのではないかと考えられた。しかし、これは今回の対象者が病気を受けとめようとしているためとも考えられた。そのため、今後追究することが課題である。当初、対象者は20名と計画したが、病名を告知され疾患教育を受け、さらに研究に協力が得られた対象者は10名であった。当初の計画より人数は少なかったが、1人のインタビューは約30分1時間程度で十分な回答を得ることができ、分析も可能であった。リアリティモニタリングは、現実に知覚したり体験した出来事と、内的に作り出された出来事を区別することである。統合失調症者は幻覚などの症状により、リアリティモニタリングに障害をきたす。しかし、薬物療法や疾患教育などにより「何かが違っていた」「おかしかった」「自分が自分でなかった」と表現できるようになることがこれまでの分析で明らかになった。これは、適切な刺激と不適切な刺激の区別がつかないまま、自己生成した行為を他者に帰属し、新しく提示された証拠に対して自己の信念としていると乾(2012)が述べていることと同様であると考えられた。これらのことから統合失調症者は自己感覚が得られにくく、認知的操作に対する情報が十分に形成されていない時期には、適切な治療を受けることによって「あの刺激(幻覚や妄想)は何であったのか」と考え、自分なりに解釈するようになるのではないかと思われた。また過去の体験を振り返ることや、今自分が感じていること、それに対して思っていることなどのメタ認知を高める援助を実施することが、リアリティモニタリングの改善には有用なのではないかと考えた。

しかしながら、これまでの看護援助は、その日の身体状況や精神状態の観察が多いこと、日常生活、セルフケア能力を高める支援が中心であり、患者のメタ認知能力を意識したものではないことも明らかになった。そこで、様々な文献から日々の看護援助の中に「過去の体験との比較」や「今後の目標」「なぜその目標を設定したのか」「現在の状況をどのようにとらえているか」、さらに「目標達成のために何が必要か」などの問いかけを増やすようなプログラムの作成を試みた。今後、作成した援助プログラムの有用性を明らかにすることが課題である。対象者からのインタビュー、現在実施している看護援助の分析、文献検討を通じてメタ認知機能を高めるプログラム(試案)を作成することができた。当初、作成したプログラム(試案)を対象者に実施することも考えていたが、28年度内に実施することはできなかった。リアリティモニタリングは現実に知覚した体験と、内的に作り出された出来事を区別することである。これまでの研究では、統合失調症者は認知機能の低下や陽性症状のためにリアリティモニタリングにエラーがあることが明らかになった。しかし、統合失調症者へのインタビューから、過去の体験を振り返り、違和感を感じていたり、現実を見つめようしていることが明らかになった。特に陽性症状が活発であった時の自分の状態を振り返って、「思うように行動に移せない」「何をするのにも集中力がない」「リアルではない」というように【何か変な自分】を違和感としてとらえることができていた。また、以前の体験について「薬でよくなった」「精神症状は確かにあった」ととらえ【やはり私は病気だ】と語ることができ、病状が悪かった時の様子を客観的にみることができていた。このインタビューを通して、対象者が治療などにより陽性症状が改善されるにしたがい、自分の状況を洞察し、リアリティモニタリングを修正することができるようになっていることが確認された。そこで統合失調症者のリアリティモニタリングを高めるために、過去との体験の比較や目標設定などを確認することや、メタ認知機能に直接関わる自分に目を向けることが有効であると確認された。そのため「自分自身」について考えることができるようなプログラムを作成した。内容は1身体の機能、2友人関係、3感情に関すること、4病気である統合失調症、5治療、6住もうとする地域のこと、の6側面から自分に起こったことや自分が体験していることをどのようにとらえるかを考えるように構成した。また、これからの目標や過去の体験との比較ができるように介入方法を工夫した。このプログラムについて専門家、臨床看護師に確認をしたところ、概ね良いのではないかという意見をいただいた。昨年度は「過去の体験との比較」「今後の目標」「目標設定の理由」「現在の状況のとらえ方」が中心でプログラムを構成していたが、内容が少し漠然としてしまった。また対象者が病院に入院している患者のため、リクルートに時間がかかり、分析が間に合わなかった。
ヒストン修飾を介した造血器悪性腫瘍細胞の耐性化機構の解明と治療への応用

多発性骨髄腫など造血器悪性腫瘍の薬剤耐性獲得において、骨髄微小環境との相互作用は重要な役割を果たしている。そこで、造血器悪性腫瘍の中から多発性骨髄腫細胞を用いて、抗がん剤処理時のヒストン修飾様式の変化を骨髄ストローマ細胞との接着/非接着下間で比較した。その結果、非接着下ではアポトーシス誘導に伴うヒストンH3の複数箇所のリジン残基へのメチル化誘導が観察されたが、接着下ではアポトーシスの抑制と共にヒストンH3のK27のトリメチル化(H3K27me3)が特異的に抑制されていた。ここから、多発性骨髄腫細胞の接着耐性獲得には、H3K27me3抑制を介した機序が重要な役割を担っている可能性を明らかにした。多発性骨髄腫など骨髄増殖性の造血器悪性腫瘍では、造血幹細胞の維持される骨髄微小環境との相互作用が薬剤耐性獲得に重要な役割を果たしている。そこで、セルカルチャーインサートを用いて骨髄腫細胞株を骨髄ストローマ細胞と接着状態で共培養し、抗がん剤に対する接着耐性を再現するin vitroのシステムを構築した。そして、このシステムを用いて骨髄腫細胞の抗がん剤処理時のヒストン修飾様式の変化を接着時と非接着時で比較した。その結果、ストローマ細胞と非接着状態では抗がん剤処理によるアポトーシスの誘導に伴いヒストンH3K27のトリメチル化(H3K27me3)の誘導が観察されたが、接着状態ではアポトーシスの抑制と共にH3K27トリメチル化の抑制が観察された。なお、H3K27トリメチル化と同様転写抑制に働くH3K9、また、転写活性化に働くH3K4やH3K36のメチル化など他の多くのヒストン修飾様式には接着/非接着状態間で違いは見られなかった。一方、抗がん剤作用時に誘導されるH3K27のトリメチル化をメチル化阻害剤(DZNeP)により抑制すると細胞死の誘導は有意に抑制された。以上より、多発性骨髄腫細胞の接着耐性獲得には、H3K27のトリメチル化の抑制が重要な役割を担っている可能性が明らかになった。なお、H3K27トリメチル化を介して負に制御される遺伝子として、多発性骨髄腫細胞の生存に必須のHOXA9やIRF4がある。接着シグナルを介したEZH2不活性化によるこれら遺伝子の発現亢進が接着耐性獲得に働いている可能性が示唆される。造血器悪性腫瘍の薬剤耐性獲得において、特に骨髄内で増殖する多発性骨髄腫などの腫瘍細胞では、造血幹細胞の維持される骨髄微小環境との相互作用が重要な役割を果たしている。そこで、セルカルチャーインサートを用いて多発性骨髄腫細胞株を骨髄ストローマ細胞と接着状態で共培養し、抗がん剤に対する耐性(接着耐性)を再現するin vitroのシステムを構築した。その結果、ストローマ細胞と非接着状態では抗がん剤処理によるアポトーシスの誘導に伴いヒストンH3K27のトリメチル化(H3K27me3)の誘導が観察されたが、接着状態ではアポトーシスの抑制と共にH3K27me3の抑制が観察された。なお、H3K27me3と同様転写抑制に働くH3K9、また、転写活性化に働くH3K4やH3K36のメチル化様式には接着/非接着状態間で違いは見られなかった。一方、抗がん剤作用時に誘導されるH3K27me3をメチル化阻害剤(DZNeP)により抑制すると細胞死の誘導は有意に抑制された。以上より、多発性骨髄腫細胞の接着耐性獲得には、H3K27me3の抑制が重要な役割を担っている可能性が明らかになった。これまでの報告によると、H3K27me3を介して負に制御される遺伝子として骨髄腫細胞の生存に必須のHOXA9やIRF4が示されている。ここから、接着シグナルを介したH3K27me3抑制によるこれら遺伝子の発現亢進が接着耐性獲得に働いている可能性を明らかにした。本研究では、造血器悪性腫瘍の抗がん剤耐性の克服を目指し、腫瘍細胞が抗がん剤耐性を獲得する際のヒストン修飾を介した遺伝子発現調節機構の解明を進めた。まず、造血器悪性腫瘍細胞を抗がん剤にて処理の後、耐性化した細胞におけるヒストンコードの特徴を解析した。今回は、造血器悪性腫瘍の中でも抗がん剤耐性の克服が重要な課題であり、現在も難治性の疾患である多発性骨髄腫をモデルに用いて検討を進めた。

抗がん剤としては、多発性骨髄腫の治療に用いられるデキサメタゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシンやボルテゾミブを用いた。これらの抗がん剤を骨髄腫細胞株に作用させ、アセチル化やメチル化などの修飾を受けるヒストンH3のlysine-4(以下H3K4と略)やH3K9、H3K18、H3K27、H3K36及びH4K12のヒストン修飾様式を、それぞれの特異抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した。4種類の骨髄腫細胞株に先記した4種類の抗がん剤を作用させた結果、H3K27のメチル化の亢進が特徴的に観察された。また、H3K27のメチル化酵素であるEZH2の発現も検出された。EZH2はH3K27をメチル化して転写抑制的に働くことが報告されている。従って、EZH2が骨髄腫細胞のアポトーシス誘導に働く遺伝子の発現抑制を介して抗がん剤耐性に関与している可能性が示唆された。今後、EZH2遺伝子の過剰発現とノックダウンや、EZH2ヒストンメチル化阻害剤などを用いて抗がん剤耐性における機能解明を進める方針である。平成24年度中の目標は、耐性に鍵となるヒストンコードを明らかにすることと、その下流で発現制御を受ける遺伝子の中から耐性化の鍵分子を明らかにすることであった。耐性に鍵となるヒストンコードとしてH3K27トリメチル化を鍵分子としてHOXA9やIRF4を同定できたことから、目標は概ね達成できたと考える。平成23年度中の目標は、耐性化した造血器悪性腫瘍細胞に特徴的なヒストンコードとヒストン修飾制御因子の解明であった。ヒストンコードとしてH3K27のメチル化を、ヒストン修飾制御因子としてEZH2を同定できたことから、目標は概ね達成できたと考える。まず、H3K27トリメチル化抑制を介した接着耐性獲得機構の作業仮説を以下に示す。骨髄腫細胞はストローマ細胞との接着、特に接着耐性の鍵分子であるVLA-4からのシグナルにより、integrin-linked kinase (ILK)を始めとする種々のkinaseを活性化する。H3K27のトリメチル化酵素であるEZH2は、CDK2やAKTなどのkinaseによりリン酸化を受けると不活性化し、メチル化活性が失われる。ここから、接着を介して活性化した何らかのkinaseが、EZH2をリン酸化して不活性化させてH3K27トリメチル化を抑制している可能性が示唆される。当面は、この仮説の検証を進めるが、これらの機構が検証されれば、接着耐性抑制に有効な治療薬としてEZH2のリン酸化kinaseに対する阻害剤の有効性が示唆される。以下の計画から、有効な阻害剤をスクリーニングし、in vitro及びin vivoにおける前臨床試験により接着耐性を克服しうる新規治療法の開発を進める。・kinase阻害剤のライブラリーやkinase遺伝子のノックダウン等により、EZH2リン酸化に関与するkinase群を同定し、VLA-4からEZH2リン酸化に至るシグナル伝達経路を解明する。・Kinase阻害剤ライブラリーの中から抗腫瘍効果を示し、EZH2リン酸化と接着耐性抑制に有効な阻害剤を同定する。阻害剤の効果をin vitro及びマウスモデルを用いたin vivoで検証する。さらに従来の抗がん剤との併用効果について、isobologramやマウスモデルを用いて検証する。今後は、耐性化した細胞で発現の見られたEZH2について、遺伝子過剰発現やノックダウン、またはEZH2ヒストンメチル化阻害剤などを用いて、抗がん剤耐性におけるEZH2の機能解明を進める。まず、レンチウィルスベクターを用いてEZH2遺伝子あるいはEZH2に対するsh-RNAを骨髄腫細胞株へ導入し、過剰発現あるいはノックダウン亜株を樹立する。
微小電子源からの空間変調電子ビームを用いたテラヘルツ帯自由電子レーザの研究

・シリコン電界放出微小電子源を製作し、微小電子源からの直流状の電子ビームをアルミレプリカ回折格子上を通過させ、スミスパーセル放射光を観測した。ビーム量は200nA、加速電圧は25kVから30kV、回折格子のピッチは416nmである。観測したスミスパーセル光は、350nm付近の紫外領域で4次光、400nm付近で3次光、600nm付近で2次光、1300nm付近で1次光である。観測されたスミスパーセル光の波長は、スミスパーセル光の理論計算と良く一致した。・高周波パルス電子ビーム発生用GaAsエミッタを開発するため、ウェットエッチングを用いたGaAsエミッタ製作技術の確立を行った。GaAs表面に(NH_4)_2S_x溶液表面処理を行うことにより、表面酸化物の除去、平坦性の改善、大気中での自然酸化膜の形成を遅らせることができ、エミッションの立ち上がり電圧を低下させる等、放出電流特性の改善を行えることを確認した。・スミスパーセル放射光を高輝度化し、自由電子レーザを実現するためには、高周波パルス電子ビームを作る必要がある。高周波パルス電子ビームの発生にはパルス光により光カソードを励起するのが最も容易である。そこで、励起高周波パルス電子ビーム発生用GaAs光カソードを開発するため、GaAs表面にCsと酸素を交互に加えるYo-Yo法で負の親和力を形成する技術の確立を行った。その結果、GaAs表面を負の親和力にすることに成功し、He-Neレーザ(波長632.8nm)、強度0.1mWの励起でマイクロアンペアの放出電流(量子効率約2%)を得ることに成功した。1.シリコン電界放射微小電子源を製作し、微小電子源からの直流状の電子ビームをアルミレプリカ回折格子上を通過させ、スミスパーセル放射光を観測した。2.FTIRとボロメータを組み合わせたテラヘルツ光の分光検出システムを製作した。この分光検出システムを用い、熱電子源と回折格子を用いたテラヘルツ光の検出を試みたが、FTIR内の光軸のずれかまたはミラーによるテラヘルツ光の減衰のため、テラヘルツ光は検出できなかった。今後、検出器を変更して、テラヘルツ光の検出を試みる。3.自由電子レーザー用の変調電子ビームはp型GaAsエミッタにレーザパルスを照射することにより発生させる予定である。GaAsウエハーの裏面を50μmまで薄くエッチングし、かつGaAsウエハーの表面にエミッタを製作する技術を開発し、裏面から光照射ができる2極GaAsエミッタを製作した。このエミッタの電界電子放出を測定し、平均電界7V/μmから電界電子放射が起こることを確認した。今後、光応答特性の測定を行う。4.スミスパーセル自由電子レーザ用の真空チャンバーの設計・製作を完了した。1.高周波パルス電子ビーム発生用GaAsエミッタを開発するため、ウエットエッチングを用いたGaAsエミッタ製作技術の確立を行った。N, P-TypeのGaAs基板を用い、2極型エミッタを製作した。

(NH_4)_2S_x溶液表面処理を行うことにより、表面酸化物の除去、平坦性の改善、大気中での自然酸化膜の形成を遅らせることができ、エミッションの立ち上がり電圧を低下させる等、放射電流特性の改善を行えることを確認した。P-Typeにおいて、波長532nmのレーザを照射し、アノード電圧750Vでおよそ平均190pAの電流増加を得ることができ、光照射によるパルス電子ビームを形成できることを確認した。次に、3極型エミッタ製作プロセスの基礎を確立した。2極型を基に絶縁膜となるポリイミド、ゲート電極となるCrを形成し、エッチバック法により先端を露出し概形を製作した。また光照射部を裏面とする裏面メンブレン構造エミッタのプロセスの基礎を確立した。裏面を30μm程度の厚さにし、表面に均一なエミッタを作製した。このエミッタからアノード電圧1000Vで10μA程度のエミッション電流を得た。2.シリコン電界放射微小電子源を製作し、微小電子源からの直流状の電子ビームをアルミ製回折格子上を通過させ、スミスパーセル放射光を観測した。ビーム量は200nA、加速電圧は25kVから30kV、回折格子のピッチは416nmである。観測したスミスパーセル光は、350nm付近の紫外領域で4次光、400nm付近で3次光、600nm付近で2次光、1300nm付近で1次光である。1.シリコン電界放射微小電子源からの直流状の電子ビームをアルミ製回折格子上を通過させ,近赤外領域(波長11001500nm)でのスミスパーセル放射光を観測した。ビーム量は200nA,加速電圧は25kVから30kV,回折格子のピッチは416nmである。加速電圧を上昇するにつれ,発光波長のピークはブルーシフトした。これにより,観測した近赤外光はスミスパーセル光であることがわかった。2.集束電極一体型微小電子源微小電子源の最大の欠点は,針状の電子源から電子ビームを取り出すため,ビームが広がることである。そこで,広がりを防ぐために,リアクティブイオンエッチングとエッチバック法を用いて,集束電極の高さを電子引き出し電極の高さより低くした新構造のシリコン集束電極一体型微小電子源を製作した。この電子源では,集束動作時においても,アノードに到達する電流量をマイクロアンペア以上に保つことができることがわかった。これは,従来の集束電極一体型微小電子源の欠点である,集束動作時におけるアノードに到達する電流量の著しい減少を克服するものである。3.スミスパーセル放射光を高輝度化し,自由電子レーザを実現するためには,高周波パルス電子ビームを作る必要がある。高周波パルス電子ビームの発生にはパルス光により光カソードを励起するのが最も容易である。そこで,励起高周波パルス電子ビーム発生用GaAs光カソードを開発するため,GaAs表面にCsと酸素を交互に加えるYo-Yo法で負の親和力を形成する技術の確立を行った。その結果,GaAs表面を負の親和力にすることに成功し,He-Neレーザ(波長632.8nm),強度0.1mWの励起でマイクロアンペアの放出電流(量子効率約2%)を得ることに成功した。
細胞外pHの酸性化がLPA受容体を介した関節リウマチ病態形成を促進するしくみ

滑膜細胞が異常に増殖・肥厚した関節リウマチ(RA)関節内では、関節滑液のpHが低下することが知られている。本研究では、炎症によって生じる局所的な細胞外微小環境の変化に着目し、細胞外pHの酸性化が誘発する炎症応答を調べた。その結果、細胞外環境の酸性化は、RA滑膜細胞(RASC)に発現するプロトン感知性受容体OGR1を介してCOX-2やADAMTS-4の発現を誘発すること、この応答はLPA存在下で相乗的に増大することを見出した。関節滑液のアシドーシスは、炎症性メディエーターによる炎症応答を増幅し、RAの病態形成において重要な役割を果たしている可能性を示した。関節リウマチ(RA)の関節腔内では、滑膜細胞が著しく増殖してパンヌスを形成する。このような激しい炎症が生じているRA関節腔内では、関節滑液のpHが酸性に傾いていることも知られており、関節内の局所的酸性化がRA病態の増悪に寄与している可能性が考えられる。本研究では、炎症によって生じる局所的なアシドーシスがプロトン感知性受容体を介して滑膜細胞に炎症応答を誘発するしくみを解析し、RAの病態形成に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。平成27年度では、滑膜細胞におけるプロトン感知性受容体の発現と機能、細胞外pHの酸性化が誘発する細胞内シグナリングのしくみについて検討し、以下の事実を見出した。1RA滑膜細胞(RASC)、正常ヒト関節滑膜細胞や正常ヒト線維芽細胞には、プロトンを感知する受容体のうちOGR1が主に発現していた。特に、患者関節内で炎症性の刺激を受けていたRASCではOGR1が高発現しており、その発現量は非炎症性の正常細胞の約10倍であった。2RASCを酸性条件下で培養するとpHの低下に伴いCOX-2の発現量とPGE2生成量が増大した。しかし、正常細胞をpH6.2の酸性環境下で培養してもCOX-2の発現量は変化しなかった。3細胞外pHの低下は、RASCのp38 MAPKのリン酸化反応を強く亢進した。さらに、p38 MAPK阻害剤は、細胞外pHの酸性化により誘発されるCOX-2の発現を強く抑制した。4酸性環境下で誘発されるp38MAPKのリン酸化反応、COX-2の発現及びPGE2生成の亢進は、OGR1のノックダウン、あるいはGq阻害剤によって強く抑制された。以上の結果より、細胞外pHが低下すると、Gqが共役するOGR1を介してp38 MAPKが活性化され、COX-2の発現が誘発されると考えられる。平成27年度では、1RA滑膜細胞(RASC)には正常ヒト関節滑膜細胞に比べ、プロトン感知性受容体であるOGR1が高発現していること、2RASCの細胞外環境が酸性化すると、OGR1→Gq→p38MAPKの系を介して、COX-2のmRNAおよびタンパク質発現量が増大すると共にPGE2生成反応が亢進することを明らかにした。このCOX-2発現に至るシグナリング経路の解析によって、関節滑液のアシドーシスがRAの病態形成において重要な役割を果たしていることを示唆する結果が得られた。このように、培養細胞を用いたin vitroでの研究計画は概ね順調に進展している。一方、RAモデルマウスを用いたMRIによるRA関節炎の可視化を目的としたin vivoでの研究計画に関しては、まだ関節炎診断法の確立に至っていない。RA関節内では、滑膜細胞が異常に増殖・肥厚して関節軟骨や骨組織を侵食すると共に、炎症性刺激を受けた滑膜細胞や軟骨細胞が産生する種々の因子によって関節の軟骨および骨破壊が生じる。平成28年度では、細胞外pHの酸性化がECM分解酵素の発現誘導に及ぼす影響を検討し、以下の事実を見出した。1RA滑膜細胞のみならず、変形性膝関節症(OA)由来の滑膜細胞においてもOGR1が高発現しており、この細胞を酸性条件下で培養すると、RA滑膜細胞と同様にCOX-2 mRNAの発現誘導を強く亢進した。2RA滑膜細胞およびOA滑膜細胞を酸性環境下で培養しても、ECM分解で最も中心的な役割を果たしているMMP-3 mRNAの発現誘導は認められなかった。一方、興味深いことにアグリカンを分解して軟骨組織の破壊に寄与することが知られているADAMTS4 mRNAの発現量は、RA滑膜細胞で著しく増大したが、OA滑膜細胞では発現量に変化は認められなかった。3RA滑膜細胞を酸性条件下で培養するとpHの低下に伴い細胞内のADAMTS4 mRNAおよびタンパク質発現量と細胞外に分泌されるADAMTS4量が増大するが、このADAMTS4発現の亢進は、OGR1のノックダウン、あるいはGq阻害剤によって強く抑制されると共にP38MAPK阻害剤およびNFκB阻害剤によって部分的に阻害された。以上の結果より、細胞外pHが低下すると、Gqが共役するOGR1を介してp38 MAPKあるいはNFκBが活性化され、ADAMTS4の発現が誘発されると考えられる。平成28年度では、1RA滑膜細胞だけでなくOA滑膜細胞にもプロトン感知性受容体であるOGR1が高発現していること、2細胞外環境の酸性化によるADAMTS4発現誘導はRA

滑膜細胞にのみ認められること、3RA滑膜細胞の細胞外環境が酸性化すると、OGR1→Gq→p38MAPKあるいはNFκBの系を介して、ADAMTS4のmRNAおよびタンパク質発現量が増大することを明らかにした。RA滑膜細胞の細胞外環境が酸性化することによって軟骨のアグリカンを分解する酵素であるADAMTS4の発現量が増大するという知見は、関節滑液のアシドーシスがRAの病態形成、特に関節軟骨の破壊において重要な役割を果たしていることを示唆している。このように、培養細胞を用いたin vitroでの研究計画は概ね順調に進展している。一方、RAモデルマウスを用いたMRIによるRA関節炎の可視化を目的としたin vivoでの研究計画に関しては、まだ関節炎診断法の確立に至っていない。関節リウマチ(RA)関節内では、顕著な血管新生や血管透過性の亢進が認められる。RA関節炎の誘発には、炎症細胞が産生するサイトカインの他に、血管から滲出した血漿成分などの種々の因子も関与している。我々は関節滑液中に存在するリゾホスファチジン酸(LPA)がGタンパク質共役型受容体のLPA1を介してCOX-2の発現を一過性に増大させること、炎症性サイトカインのIL-1が誘発するCOX-2の誘導を相乗的に増大させることを明らかにしている。平成29年度では、LPAやIL-1が誘発する炎症応答に細胞外pHの酸性化が及ぼす影響を検討し、以下の事実を見出した。1酸性環境下、Gqが共役したプロトン感知性のOGR1を介して誘導されるCOX-2やADAMTS4の発現量は、LPAが共存すると相乗的に増大した。2生理的条件下において、LPAはGiあるいはG12/13が共役するLPA1を介してCOX-2やADAMTS4の発現を誘導するが、酸性環境下においてLPAは、GiあるいはG12/13が共役するLPA2を介してp38MAPKを活性化し、持続的にCOX-2の発現を誘導した。ADAMTS4発現の増大は、LPA2に共役したGiあるいはG12/13を介して活性化したp38MAPK、NFkBが関与していた。3酸性環境下でRA滑膜細胞を24時間培養すると、LPA2 mRNA量が増加したが、LPA1 mRNA量に変化は認められなかった。4軟骨細胞に発現するOGR1mRNA量は、RA滑膜細胞の発現量に比べ1/10程度と非常に低いが、IL-1共存下で培養すると発現量が約3倍に増加した。滑膜細胞が異常に増殖・肥厚した関節リウマチ(RA)関節内では、関節滑液のpHが低下することが知られている。本研究では、炎症によって生じる局所的な細胞外微小環境の変化に着目し、細胞外pHの酸性化が誘発する炎症応答を調べた。その結果、細胞外環境の酸性化は、RA滑膜細胞(RASC)に発現するプロトン感知性受容体OGR1を介してCOX-2やADAMTS-4の発現を誘発すること、この応答はLPA存在下で相乗的に増大することを見出した。関節滑液のアシドーシスは、炎症性メディエーターによる炎症応答を増幅し、RAの病態形成において重要な役割を果たしている可能性を示した。平成27年度では、細胞外微小環境の変化がRAの病態形成に及ぼす影響を解析する過程で、RASCは細胞外pHが低下するとRASCではOGR1を介して炎症応答が誘発されることを明らかにした。平成28年度は、関節破壊に重要な役割を担う細胞外マトリックス(ECM)分解酵素に対する細胞外pHの低下の影響を解析する。
異所性酵素によるDNAメチル化とモノアミン神経障害

本研究の目的は,異所性に核内で発現するカテコールアミン代謝酵素がDNAメチル化をもたらすこと,および,そのDNAメチル化が緩徐な神経細胞死に係わることを明らかにすることである。そのため,(1)カテコールアミン代謝酵素であるCOMTおよびPNMTが核内に過剰に存在した場合,どのようなメチル化が誘導されるか,(2)核内におけるカテコールアミン代謝酵素の過剰発現が,ストレス下で生じる細胞障害にどの様な変化を生じさせるのか,を明らかにするべく種々の検討を行った。なお,DNAメチル化の解析には,カテコールアミン神経細胞の表現型を備えるSK-N-AS細胞を用いた。SK-N-AS細胞において,血清除去によるストレス下ではPNMTの発現が上昇するとともに核内への移行が生じた。しかし,総量としてのDNAメチル化には変化が認められなかったことから,今後はさらに,メチル化のパターンに変化が現れる可能性を含めた検討の必要性が示唆された。また,核内へCOMT/PNMTを過剰に存在する状態を作り出すため,核移行シグナルを付加したCOMT/PNMT cDNAを発現ベクターに組み込み,培養細胞に導入する発現系を作製した。さらに,本研究で用いる培養細胞におけるCOMT/PNMTの発現を抗COMT抗体および抗PNMT抗体を用いて免疫染色法にて検討した結果,SK-N-AS細胞,グリア由来細胞株であるGI-1およびU251には,COMT/PNMT両酵素の核内発現は認められなかった。一方,GI-1において細胞質でのPNMTの強い発現が認められたことより,COMT/PNMT cDNA強制発現系細胞としては神経細胞モデルとしてSK-N-AS細胞,グリア細胞モデルとしてU251が適切であることが明らかとなった。遺伝子発現のエピジェネティックな調節機構であるDNAメチル化の異常は,細胞生存にとって重要な影響をもたらす。ドパミン神経の選択的変成脱落を特徴とするパーキンソン病(PD)においてその発症に遺伝的因子の関与は知られているが,エピジェネティックな機構の関与については明らかでない。本研究の目的は,異所性に核に発現するカテコールアミン代謝酵素がDNAメチル化をもたらすこと,それが緩徐な細胞死に係わることを明らかにすることである。このためカテコールアミン代謝酵素であるCOMT/PNMTの核内発現とそれがもたらす過剰あるいは異常なDNAメチル化の状態を明らかにすべく,カテコールアミン神経細胞の表現型を備えるSK-N-AS細胞を用いて解析を行った。血清除去によるストレス下でPNMTの発現が上昇し,それに伴い核内への移行が生じた。この時,総量としてのDNAメチル化には変化が認められなかった。メチル化のパターンに変化が現れているか否かを今後解析する予定である。また,核移行シグナルを付加したCOMT, PNMT cDNAを発現ベクターに組み込み,SK-N-AS細胞に導入する系を現在作成中であり,これを用いることでより詳細なDNAメチル化の動態を解析する予定である。研究は当初の計画に沿って進行しており,不測の事態は特に生じていない。メチル化のパターンを解析し,血清除去により生じるメチル化遺伝子の同定を行う。核移行シグナルを付加したCOMT, PNMT cDNAを用い,SK-N-AS細胞でより詳細なDNAメチル化の動態を解析する。繰り越した費用は発現用コンストラクトの作成に要するもので,H23年度末から次H24年度にかけ使用するので,次年度の研究計画に大きな変化はなく,次年度研究経費は当初の計画通りに執行する予定である。
機能的過負荷に伴う筋肥大、筋線維組成の変化に及ぼす局所的因子の影響

本研究は機能的過負荷による筋肥大、筋線維組成の変化に対するカルシウム-カルシニューリン系の影響を調べるため,協働筋切除による機能的過負荷に対するカルシニューリン阻害剤であるサイクロスポリンA投与の影響について観察した。被験動物として10週齢のWistar系雄性ラット(170240g)を用い,協働筋切除による機能的過負荷を施したグループ、協働筋切除の偽手術を施したグループ、サイクロスポリンAを投与し、協働筋切除による機能的過負荷を施したグループ、サイクロスポリンAを投与し、協働筋切除の偽手術を施したグループの4つのグループを作成し実験を行った。機能的過負荷は足底筋の協働筋である腓腹筋とヒラメ筋を遠位1/2切除することによって足底筋に対し過負荷を施した。サイクロスポリンAの投与は一日一回腹腔内注射することにより行い(25mg/kg/day),対照群に対してはサイクロスポリンAの溶剤のみ投与した。2週間の機能的過負荷によって足底筋のtype IIb線維の筋線維横断面積の変化は認められなかったものの,筋重量、およびtype I,IIa線維の筋線維横断面積の有意な増加が観察された。サイクロスポリンAを投与したラットは2週間の機能的過負荷によって足底筋の筋重量,およびtype I,IIa,IIb線維の筋線維横断面積の有意な増加が観察された。体重あたりの筋重量の変化はサイクロスポリンAを投与した足底筋により大きな肥大率が観察された。筋線維組成を決定するミオシン重鎖アイソフォームは,サイクロスポリンAの投与によってその組成に変化は認められず,機能的過負荷に対してもサイクロスポリンAの投与の有無に関わらずtype IIaの割合の増加とtype IIbの割合の低下が観察された。これらの結果は、機能的過負荷による筋肥大,筋線維組成の変化はカルシニューリンと無関係な系で行われていることを示唆する。本研究は機能的過負荷による筋肥大、筋線維組成の変化に対する局所的な因子の関与を明らかにするために、局所的に発現する成長因子であるIGF-Iの影響を中心にして観察した。被験動物として10週齢のWistar系雄性ラット(190220g)を用い、正常な下垂体のグループと下垂体摘出グループを作成した。両グループとも一方の脚に対し足底筋の協働筋である腓腹筋とヒラメ筋を遠位1/2切除することによって足底筋に対し過負荷をかけた。また反対脚に対しては偽手術のみを施した。さらにトレッドミルによる運動を協働筋切除5日後より、3日に2日の割合で負荷した。2週間後、足底筋を摘出し、遠位1/3部位、および近位1/3部位について筋線維タイプの分類、IGF-I mRNAおよびGH receptor mRNAの測定を行った。正常な下垂体のグループ、下垂体摘出グループともに2週間の機能的過負荷によって足底筋の筋重量は有意に増加した。部位別の変化をみると、機能的過負荷によって足底筋の遠位1/3部位では、いずれの筋線維タイプにおいても横断面積の有意な増加が観察されたが、近位1/3部位ではtypeI、IIA、およびIIC線維の筋線維横断面積の有意な増加が観察されたものの、正常な下垂体のグループ、下垂体摘出グループともにtypeIIB線維の横断面積は有意な変化が観察されなかった。機能的過負荷によってGH receptor mRNAは、正常な下垂体グループ、下垂体摘出グループともにその発現量が遠位部、近位部ともに低下する傾向にあった。IGF-I mRNAの発現量は機能的過負荷3日後に正常な下垂体グループ、下垂体摘出グループともに増加し、肥大効果の大きい遠位部で発現量が大きくなる傾向にあった。これらの結果は、機能的過負荷による筋肥大が成長ホルモンとは無関係に筋において発現される局所的なIGF-Iが関与することを示唆する。

筋線維組成を決定するミオシン重鎖アイソフォームは,サイクロスポリンAの投与によってその組成に変化は認められず,機能的過負荷に対してもサイクロスポリンAの投与の有無に関わらずtype IIaの割合の増加とtype IIbの割合の低下が観察された。これらの結果は、機能的過負荷による筋肥大,筋線維組成の変化はカルシニューリンと無関係な系で行われていることを示唆する。
乳がんの質的診断、治療効果判定を支援する高精度触診ロボットシステムの開発

近年,世界的な社会問題となっている乳がんにおいて,良性腫瘍であるか悪性腫瘍であるかを判別する腫瘍の質的診断や,腫瘍領域を根治できたかどうか判断する治療効果判定を対象とした低侵襲かつ高精度な乳がん診断支援技術が求められている.本研究では,非線形弾性パラメータ分布を推定する触診ロボットシステムの開発を行う.ロボットの初期接触条件を事前に計画して,収集されたデータから非線形弾性パラメータを最適化するオフライン推定手法を構築した.本研究では,低侵襲性かつ高精確性な乳腺腫瘍の質的診断および治療効果判定を支援するために,臓器変形シミュレータを用いて高精度に生体組織の非線形弾性パラメータ分布を推定する触診ロボットの開発に取り組んでいる.平成25年度は,以下の研究課題に取り組んだ.(1)触診ロボット動作軌道の逐次計画に用いる乳房変形応答データベース構築:腫瘍と周辺組織について高精度な非線形弾性パラメータ推定を実現するために,ある時点で推定されたパラメータ分布から関心領域に関してさらに詳細なパラメータ分布を推定できる可能性が最も高いロボットの動作軌道が最適な動作軌道であるとして,パラメータ分布が更新されると共にロボットの動作軌道を逐次計画する手法を提案する.提案手法の実現のために,本年度は,乳房を摘まむように圧縮する2本のロボットマニピュレータの先端部大きさ・接触位置を変化させた際の乳房組織の変形状態を,臓器変形シミュレータを用いて解析し,乳房変形応答データベースを構築した.次に,構築した乳房変形応答データベースから,関心領域の非線形弾性パラメータの差異が明確になる変形応答を得ることができる先端部大きさ・接触位置の特徴を解析した.その結果,関心領域を変形させやすい条件として,次の2条件が得られた.(a)先端部大きさは関心領域の1.5倍以上であること.(b)マニピュレータの初期接触位置から関心領域中心位置までの距離が2本のマニピュレータで等しくなるような接触位置とすること.(2)触診ロボットの開発:申請者がこれまでに取り組んできた穿刺支援ロボットで得てきた小型ロボット設計のノウハウを生かし,臨床応用可能な触診ロボットの要素設計を行った.本研究では,低侵襲かつ高精確な腫瘍の質的診断および治療効果判定を支援することを目指し,触診のように体表から生体組織の非線形弾性パラメータ分布を推定する触診ロボットの開発を目的とする.前年度は、触診ロボット動作軌道の逐次計画に用いる乳房変形応答データベースを作成し、関心領域を変形させやすいロボット先端の大きさ・位置条件を導出した。また、検証実験に用いるための触診ロボットの要素設計をおこなった。これらの結果を受けて、本年度は、以下の研究課題に取り組んだ.(1)非線形弾性パラメータ分布の実時間最適化手法の構築:非線形弾性パラメータ分布推定において,実時間性と推定精度はトレードオフの関係にある.そこで,腫瘍とその周辺組織についてのみ高精度な推定を行い,関心領域外については臓器変形シミュレーションのメッシュを粗くすることや,非線形弾性パラメータに初期値入力の段階で制約を付けて同定するパラメータ数を減らすことなど,計算処理時間を削減する方策を検討した.また,準ニュートン法やPSOなどの最適化手法を比較して,推定精度の高さを比較検討した.(2)触診ロボットの開発:臨床試験で使用可能なロボットとするための要求仕様の検討,および,詳細設計に着手した.また,臨床試験において,提案手法により推定した非線形弾性パラメータが妥当であるかを検証するために,摘出組織の非線形弾性パラメータの測定が必要となるため,摘出臓器を対象とした小型材料試験機の設計にも着手した.(3)臨床試験の準備:九大関連病院施設にて,実際の乳がん患者における臨床試験を実施するために,施設の下見や試験方法の打合せを行い,倫理申請書の作成に着手した.本研究では,低侵襲かつ高精確な腫瘍の質的診断および治療効果判定を支援することを目指し,触診のように体表から生体組織の非線形弾性パラメータ分布を推定する触診ロボットの開発を目的とする.前年度までに、臓器内部の腫瘍箇所を想定した関心領域を変形させやすいロボット先端の大きさ・位置条件を導出した。また、非線形弾性パラメータ分布を推定するための最適化手法について比較検討を行った.非線形弾性パラメータ分布推定に向けた最適化手法を検討した結果,許容される制御サンプリング周期内にパラメータ最適化を組み込むには計算コストが膨大であること,および,変形が小さい間には非線形弾性パラメータに対する変形応答の感度は微小であるため非線形弾性パラメータの推定が困難であることが示された.したがって,本年度は,非線形弾性パラメータ最適化とロボット軌道の逐次計画を組み合わせたオンライン推定手法ではなく,ロボット軌道を事前計画して,収集されたデータから非線形弾性パラメータを最適化するオフライン推定手法を検討することとした.具体的には,事前に用意したデータベースより非線形弾性パラメータ分布を仮定し,仮定した値に対して非線形弾性パラメータ分布を推定できる可能性が高いロボット軌道を計画し,計画軌道に基づき収集された触診データから実際の非線形弾性パラメータ分布をオフラインで推定するという手法である.また,提案手法の妥当性をin vitro実験にて検証するために,摘出臓器を対象とした圧迫試験機を開発した.