hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高活性金属エノラートによる炭素ーヘテロ元素結合のSN2求核置換反応の開発

高活性マグネシウムエナミドを用いて,溶媒,温度,濃度などの条件を検討した結果,2級のフッ化アルキル及び2級のアルキルトシラートに対するSN2反応が効率的に進行することが明らかとなった.エナミドの窒素上置換基としてはN,N-ジメチルアミノエチル基が最も良い収率を与えた.また,E2脱離を経て得られるオレフィンはアルキルトシラートを用いた場合ほとんど得られなかった.これは,糖由来のアルキルトシラート誘導体を用いる上で重要な知見である.これら実験化学的検討と平衡してDFT計算による反応機構解析を行った.準備段階としてマグネシウムエナミドのSN2反応に先駆けて見出した,インジウムエノラートのアルキンに対する付加反応の解析を行ったところ,インジウムとアルキンのπ錯体の形成に引き続く,8中心の協奏的な炭素-炭素結合生成が,本反応の反応径路として妥当であることが明らかとなった.マグネシウムエナミドとアルキルトシラートの反応に置いてもトシル基がマグネシウムに対し配位することで錯化し,そこから分子内で反応が進行していることが示唆されるが,SN2機構及びマグネシウムエナミド単量体を想定すると遷移状態に大きなひずみがかかることが明らかとなったため,マグネシウムエナミド2量体を計算のモデルとした今後の検討が必要である.高活性マグネシウムエナミドを用いて,溶媒,温度,濃度などの条件を検討した結果,2級のフッ化アルキル及び2級のアルキルトシラートに対するSN2反応が効率的に進行することが明らかとなった.エナミドの窒素上置換基としてはN,N-ジメチルアミノエチル基が最も良い収率を与えた.また,E2脱離を経て得られるオレフィンはアルキルトシラートを用いた場合ほとんど得られなかった.これは,糖由来のアルキルトシラート誘導体を用いる上で重要な知見である.これら実験化学的検討と平衡してDFT計算による反応機構解析を行った.準備段階としてマグネシウムエナミドのSN2反応に先駆けて見出した,インジウムエノラートのアルキンに対する付加反応の解析を行ったところ,インジウムとアルキンのπ錯体の形成に引き続く,8中心の協奏的な炭素-炭素結合生成が,本反応の反応径路として妥当であることが明らかとなった.マグネシウムエナミドとアルキルトシラートの反応に置いてもトシル基がマグネシウムに対し配位することで錯化し,そこから分子内で反応が進行していることが示唆されるが,SN2機構及びマグネシウムエナミド単量体を想定すると遷移状態に大きなひずみがかかることが明らかとなったため,マグネシウムエナミド2量体を計算のモデルとした今後の検討が必要である.
高次脳機能障害者の社会参加を促進する教育用VTRの作成とその効果

2017年度は高次脳機能障がい者とその家族が障害を認識することにかかわる経験を明らかにするために高次脳機能障害協議会(TKK)の協力を得てアンケート調査を行い,2018年度はその結果について2回の国際学会発表と1編の原著論文,支援者対象の後援会を2回,高次脳機能障がい者および家族対象の後援会2回において発表し,意見交換を行った.国際学会発表の1編はWDRC2018(World Disability Rehabilitation Conference)にて高次脳機能障がい者の障害の自覚にかかわる体験と必要とする支援について,もう1編はIBIA2019(International Brain Injury Association)にて高次脳機能障がい者とその家族の障害の自覚にかかわる体験と必要とする支援について発表をした。また東京都区西北部の板橋区、練馬区、豊島区の各区において講演依頼などを通じて研究成果を発表する機会を得ることができた。原著論文(査読あり)は男性脳卒中者の復職プロセスを明らかにしたものであった.最終年度の高次脳機能障がい者の障害の理解を促進する教育用VTR作成のため制作会社を選定し,現在シナリオとなる原稿を作成中である.国際学会の発表では,外傷性脳損傷のリハビリテーションの分野で世界的に実績が認められている米国クレイグ病院の脳損傷チームのディレクターであるアラン・ウェイントロー博士と情報交換を行い,日本での脳損傷の急性期から就労までの意識障害・認知障害の段階的リハビリテーションについての動画の解説本の出版について協議し,出版社に企画を提出した.現在書籍の政策についての回答を待っている.また,高次脳機能障がい者の地域支援に造詣の深い慈恵医科大学第三病院リハビリテーション科渡邉修博士と研究協力について情報交換をすることができた.2018年度の成果発表として2編の国際学会発表と1編の原著論文、支援者対象の後援会2回、高次脳機能障がい者および家族対象の後援会2回の準備に時間がかかったためである。また、都内西北部における研究代表者の高次脳機能障がい者の障害者自立支援にかかわる業務の多忙さも加わっていた。しかし,同時に高次脳機能障害者および家族との意見交換および動画への出演依頼をすることができた。2019年度内には効果判定を含め研究を終了できる予定である。2019年度は最終年度となる.高次脳機能障害者の障害の理解を促進する教育用VTRを完成する.15分程度のVTRを作成する.その際,シナリオへの転換,映像企画,撮影,ナレーションおよび編集を映像制作会社に依頼する.シナリオ作成は共同研究者および目白大学リハビリテーション学研究科院生,筆者がかかわる板橋区の高次脳機能障がい当事者と家族会の意見により校正する.出演は高次脳機能障がい当事者と家族に依頼する予定であるが,現在のところおおむねの同意が得られている.作成された動画を研究協力の得られた急性期病院,回復期病院,高次脳機能障がい者施設(地域活動支援センター、自立訓練など)で高次脳機能障がい者およびその家族に視聴してもらい,障害の理解についての効果を聞き取りアンケートにより測定する.本研究は平成29年度から平成31年度の3年間に,高次脳機能障がい者のすみやかな就労や社会参加を目指すために,障害に対する自覚の経験と理解のプロセスを取り入れた高次脳機能障害の教育用VTRを作成し,障がい当事者および家族の障害の理解、医療福祉連携の促進に対するその効果を検討することを目的としている.平成29年度は本研究の1年目であったため,主にデータ収集のプロセスを行い,前年度までの科研費基盤(C)研究の成果を中心に、論文1件,学会発表1件,海外学会発表2件を行った.また「高次脳機能障がい者の社会参加を促進するために」と題する国内講演4件(高次脳機能障がい者家族会の招待講演2件,地方公共団体の依頼による講演1件,埼玉県作業療法士学会の講演1件)を行った.それを通じて当事者・家族の意見を聞き,また国内外の専門家と本研究に関する情報交換を行った.本研究の進捗を利用した研究業績は,高次脳機能障がいの理解を促すVTRのコンテンツを作成するためにアンケート調査の実施および当事者家族の語りを収集したが,1年目であったため論文発表および学会発表はできていない。アンケートの結果及び当事者・家族の語りから,高次脳機能障がい者が公的支援の対象となって6年がたつが,いまだにモデル的な地域以外の医療福祉連携は乏しく,特に回復期リハビリテーション分野の高次脳機能障がいの地域支援に関する理解が低く,職業リハビリテーションや復職のサービスに円滑につながっていない実態が明らかになった.本研究の目的は高次脳機能障がい者の障害の自覚を促進する教育用VTRを作成し,その効果を検討することである.まず初年度となる平成29年は、高次脳機能障がい者の障害の自覚と社会参加を促進する教育用VTRを作成するための情報を収集することを目的に,高次脳機能障がい者とその主介護者へのアンケート調査を実施した.そして協力の得られた家族会の集会に参加し,当事者及び家族の障害を負ってから現在までの実体験の語りを収集した。アンケート調査は選択式および自由記述式の両方を採用し,高次脳機能障がい者の障害の自覚の経験,社会参加に至るプロセス、困ったことや手掛かりとなったことなどを調査した。対象者は特定非営利活動法人東京高次脳機能障害協議会(TKK)の協力を得て、高次脳機能障がい者および家族に調査を依頼した。

都内9か所の高次脳機能障がい者家族会の協力を得られ、会員(障がい当事者および家族)にアンケートを配布、当事者約90名、家族約80名の回答を得た。現在、残ったもう1か所の高次脳機能障がい者家族会との調査依頼が進行している.そして収集したアンケートデータの集計を行っている。また当事者及び家族の実体験の語りは9名のデータを収集した。その中の対象者から,本研究の目的であるVTRへの出演の内諾も得られている。2017年度は高次脳機能障がい者とその家族が障害を認識することにかかわる経験を明らかにするために高次脳機能障害協議会(TKK)の協力を得てアンケート調査を行い,2018年度はその結果について2回の国際学会発表と1編の原著論文,支援者対象の後援会を2回,高次脳機能障がい者および家族対象の後援会2回において発表し,意見交換を行った.国際学会発表の1編はWDRC2018(World Disability Rehabilitation Conference)にて高次脳機能障がい者の障害の自覚にかかわる体験と必要とする支援について,もう1編はIBIA2019(International Brain Injury Association)にて高次脳機能障がい者とその家族の障害の自覚にかかわる体験と必要とする支援について発表をした。また東京都区西北部の板橋区、練馬区、豊島区の各区において講演依頼などを通じて研究成果を発表する機会を得ることができた。原著論文(査読あり)は男性脳卒中者の復職プロセスを明らかにしたものであった.最終年度の高次脳機能障がい者の障害の理解を促進する教育用VTR作成のため制作会社を選定し,現在シナリオとなる原稿を作成中である.国際学会の発表では,外傷性脳損傷のリハビリテーションの分野で世界的に実績が認められている米国クレイグ病院の脳損傷チームのディレクターであるアラン・ウェイントロー博士と情報交換を行い,日本での脳損傷の急性期から就労までの意識障害・認知障害の段階的リハビリテーションについての動画の解説本の出版について協議し,出版社に企画を提出した.現在書籍の政策についての回答を待っている.また,高次脳機能障がい者の地域支援に造詣の深い慈恵医科大学第三病院リハビリテーション科渡邉修博士と研究協力について情報交換をすることができた.2018年度の成果発表として2編の国際学会発表と1編の原著論文、支援者対象の後援会2回、高次脳機能障がい者および家族対象の後援会2回の準備に時間がかかったためである。また、都内西北部における研究代表者の高次脳機能障がい者の障害者自立支援にかかわる業務の多忙さも加わっていた。しかし,同時に高次脳機能障害者および家族との意見交換および動画への出演依頼をすることができた。2019年度内には効果判定を含め研究を終了できる予定である。アンケート調査結果、障がい当事者と家族の口頭データの分析を行う。国内外の学会で発表し、医療福祉連携を促進するためのVTRのコンテンツを作成する。またVTR作成の準備として出演者の選定、シナリオ原案の作成、映像制作および撮影者の選定を行う。VTRが完成した後、効果測定のためのVTR視聴を板橋区、練馬区の急性期・回復期病院および高次脳機能障がい者支援施設に依頼し、高次脳機能障がい者とその家族,支援者の高次脳機能障がいとその社会参加への理解に関する視聴前後の比較を行う。
転写制御ネットワークから見る原口形成と原腸胚オーガナイザーの進化のメカニズム

脊椎動物の胚発生の初期で、基本的なボディプランを定めるのが原腸胚オーガナイザーである。この重要な組織において中心的役割を担う転写因子の役割と、進化的な成り立ちを調べることを目的とし、ツメガエルの原腸胚を用いた免疫沈降-シーケンス(ChIP-seq)解析を行った。その結果、転写因子のOtx2、Lim1/Lhx1、Gsc、Siaは、特定の配列をもつ遺伝子制御領域のDNA上で組み合わさって、数多くの遺伝子を正または負に制御することが示唆された。また脊椎動物の祖先型であるナメクジウオの遺伝子制御領域との比較より、制御領域の機能的進化による脊椎動物の頭部形成の進化の一端が示唆された。脊椎動物初期発生の原口と原腸胚オーガナイザーは基本的ボディプラン形成において重要な役割を担う。この発生様式の進化過程を明らかにするため、本研究では原口とオーガナイザーに発現する転写因子に注目し、染色体免疫沈降シーケンス(ChIP-Seq)法を用いて、二胚葉動物イソギンチャク(Nematostella:Nv)や脊椎動物ネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis:Xt)で転写制御ネットワークの大規模比較解析を行う。本年度は以下の点について計画し遂行した。2)Xt胚を用いたChIP-seq解析:抗Xt_Lhx1/Lim1、Xt_Otx2抗体とXt原腸胚を用いてChIP-seqを行った。得られたタグをXtゲノム配列上にマップし、特異的な結合を示す多数のピークを得た。結合領域がエンハンサーかサイレンサーかを識別するため、coactivatorのp300とcorepressorのTLE/Grouchoの抗体で同様にChIP-seqを行った。3)ChIP-Seqの結果の査定:Lhx1/Lim1とOtx2ついて精査したところ、両者は多くの箇所でピークが重なり、かつp300やTLEのピークとも重なった。さらに進化的に保存された配列とも重なることから、これらの領域はシス制御モジュールを形成すると考えられる。4)標的遺伝子のシス制御モジュール解析:同定されたシス制御モジュールは、近傍遺伝子の発現パターンやLhx1/Lim1とOtx2の機能阻害胚における発現解析から、エンハンサーかサイレンサーとして機能することが予想された。そこでX.laevis胚を用いたレポーターアッセイを行ったところ、予想通りの結果が得られた。特にOtx2との関連でみると、Otx2は転写の活性化と抑制の両方に関わること、それにより個々の遺伝子はOtx2という位置情報を基に発現のオンとオフを決めていることが示唆された。これは注目すべき結果である。脊椎動物胚における原口と原腸胚オーガナイザーは基本的ボディプラン形成に重要である。この発生様式の進化過程を明らかにするため、本研究では原口とオーガナイザーに発現する転写因子に注目し、染色体免疫沈降シーケンス(ChIP-Seq)法を用いて、脊椎動物ネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis:Xt)のおける転写制御機構の大規模解析を行い、さらに同様な解析を二胚葉動物イソギンチャク(Nematostella:Nv)や他の生物で行い、比較解析する。昨年度に引き続き本年度は以下の点を明らかにした。1)抗体の準備:Nv_Lhx1の特異抗体を精製し、Nv_Lhx1を発現させたアフリカツメガエル(X.laevis:X1)胚を用いたウエスタンブロットにより特異性を確認した。市販の抗FoxA2抗体、抗Bra抗体を購入し検討したところ、抗FoxA2抗体がXlに利用可能であることを確認した。3)オーガナイザー領域を含む内胚葉と中胚葉に発現するVegTとMix1のChIP-seq解析を行った。いずれも多くのCRMでOtx2やLim1と共局在が認められ、4者の機能的関連性が支持された。それに加えて、VegTは内胚葉系列の組織や器官に後期発生過程で発現する遺伝子周辺のCRMにも結合しており、ヒストン修飾との関連性から、「発生準備エンハンサー」が示唆され、Gene Ontology(GO)解析の結果からも支持された。以上より、転写制御機構の大規模解析により、Xt原腸胚におけるCRMを特徴づける多くのデータが得られ、次年度の解析に活かすことが可能となった。本年度は転写因子SiaのChIP-seq解析を行った。Siaは頭部オーガナイザーの形成に関わり、単独でXenopus胚に完全二次軸を形成させる活性をもつ。抗Sia抗体は本研究室で作成したもの(Sudou et al., 2012, Development 139:1651)を用いた。データ解析は、X. tropicalisゲノム配列version 7.1と、ピーク検出法としてMACS (Model-based Analysis of ChIP-Seq)を用いた。

これまでChIP-seq解析を行ってきた転写因子Lim1、Otx2、Gsc、Mix1、VegT、およびヒストン修飾H3K4me1、H3K27acは、tropicalisゲノム配列version 4.1と、ピークの検出法として菅野研で作成したプログラムを用いていたので、これらについても全てデータ解析をやり直した。全てのChIP-seqピークデータを用いて相互の共局在を検討した結果、SiaはTLE, Mix1, p300, Otx2と共局在するシス制御モジュール(CRM)が最も多かった。そこでこれら5つのピークが重なった領域をtype A CRMとして、その特徴を解析した。その結果、type A CRMsは、以前同定した83個の頭部オーガナイザー遺伝子の近傍に複数存在し、その存在比率は他の遺伝子に比べて有意に高かった。そこで任意に選んだ18個のtype A CRMsをクローニングしてレポーター解析を行ったところ、これらはSiaに反応してレポーター遺伝子を活性化し、かつトランスジェニック胚では頭部オーガナイザー領域での発現をもたらした。従ってtype A CRMsをもつ頭部オーガナイザー遺伝子はSiaの標的遺伝子であることが強く示唆された。ネッタイツメガエルを用いて、オーガナイザー関連転写因子のChIP-seq解析から、オーガナイザー遺伝子の転写制御の実体が明確に示された点は計画以上に進展したと言えるが、原口に発現する転写因子の解析が、良い抗体が得られず進展せず、またイソギンチャクを用いたChIP-seq解析が準備段階でとどまっている点で、課題を残しているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。H12年度は最終年度であり、転写因子SiaとFoxA2のChIP-seq解析のデータを得ることで、オーガナイザーに発現する転写因子の大規模解析のデータが出揃う。これらの転写因子の組合せとヒストン修飾、ならびにレポーター解析によるCRM活性(正と負、および発生準備エンハンサー)との関連性からCRMをグループ化し、各グループごとに「denovoモチーフ検索」を行うことでCRMの特徴付けを行う。これにより組織分化が開始する原腸胚期でのCRMの使い分けの分子メカニズムを明らかにする。これに加え神経胚でのChIP-seq解析を行うことで、原腸胚から神経胚におけるCRMの切り替えのメカニズムを明らかにする。以上の結果をイソギンチャクと比較するため、抗Nv Lim1を用いてNematostella胚での初めてChIP-seq解析を行う。以上の結果を論文で発表する。
「カクテル型」コンセプトによる「猛禽類対応型」新世代殺鼠剤の開発

野生齧歯類は35種以上の人獣共通感染症を媒介する。また、野生ラットは繁殖力の強さから離島へ生息域を広げ外来動物として生態系を攪乱している。齧歯類の駆除方策として、殺鼠剤ワルファリンなど抗凝血系化学物質が比較的安全性が高いため広く利用された。一方、度重なる使用により抵抗性を持つ個体群が世界各地に出現している。その対策に欧米では致死性の高い第二世代抗凝血系殺鼠剤が用いられている。しかしながら、これらは毒性が強く駆除対象外生物の二次被害が絶えない。一方、選択性の高い新規殺鼠剤の開発は、感受性種差に関する毒性学的知見も服なく、困難である。当該研究は、in silicoシミュレーションによるサンプル入手が困難な抵抗性ラット・鳥類種における殺鼠剤感受性評価法の確立を目的とする。今年度は、ビタミンKエポキシド還元酵素(VKOR)やシトクロムP450(CYPs)について研究を進めた。殺鼠剤の標的生物であるラットにおける抵抗性メカニズムについて、分析を行った。電子伝達系に関して抵抗性個体ではこの機構が明らかに高活性であることを明らかにし、これが抵抗性獲得の一因であることが予測された。この研究を進める際に、ビタミンKエポキシド還元酵素活性の新たな分析方法も構築して実験を進めた。殺鼠剤を投与し、血中濃度や血液凝固時間を測定したところ、対象動物であるラットなど齧歯類に比して、比較的感受性が低いことが分かった。上記の試験系により同定した抵抗性獲得因子をターゲットとする新規殺鼠剤を作成することを目的として、シトクロムP450阻害剤と殺鼠剤との併用によるin vivo試験を実施した。海産物から得られた天然素材を用いた試験では想定した効果は得られなかったが、CYPの典型的な阻害剤を併用投与したラットでは血中の殺鼠剤濃度が上昇し、一定の効果が出ることがわかった。シトクロムP450やビタミンK還元酵素に関しては、順調に実験が進み、新規の抵抗性獲得のメカニズムまで提唱することができた。また、学会発表や論文発表も順調に行っており、論文発表ではいくつか受賞もするなど成果が認められていることから表記の区分とした。研究課題について、当初想定していなかった問題点はなく、順調に研究を進めている。今後も計画通りに研究を実施する。特に、in vitroだけではなく、個体を用いたin vivo試験も実施することで、実際のフィールドに即した研究成果を得られるように実験を進めていく。
植物ウイルスの細胞間移行に関する分子生物学的研究

トマトモザイクウイルス温度感受性変異体Ls1の解析トマトモザイクウイルス(ToMV)は、宿主植物の細胞間を移行し感染域を拡げるために、約30kDaの移行タンパク(MP)をゲノムにコードする。ToMVのLs1株は、MPにアミノ酸置換を持ち、非許容温度(32°C)において細胞間移行ができなくなる温度感受性変異体である。温度シフトにより移行能欠損を誘導できるため、Ls1株はウイルスの細胞間移行の研究において重要なコントロールとして現在も利用されているが、なぜ温度感受性になるのかは現在も明らかになっていない。タバコ培養細胞BY2プロトプラストを用い、ウイルス感染後のMPの蓄積量を調べたところ、許容温度の26°Cでは野生型とLs1のMPの蓄積量に大きな差は見られなかったが、非許容温度においてLs1感染細胞では野生型ToMV感染細胞よりもMPの蓄積が少ないことが分かった。また、シクロヘキシミドの添加により、タンパク合成を停止した後のMPの残存量を調べると、26°CにおいてもLs1のMPの残存は野生型に比べて少ないことが分かった。32°Cではその差はさらに顕著になった。この結果から、Ls1株の細胞間移行の温度感受性はMPの安定性の低下に起因する事が考えられた。また、Ls1のMPを過剰発現するような実験系においては、32°CでもToMVの細胞間移行が観察された。このことから、MPとしての機能自体は32°Cにおいても損なわれていないと考えられた。以上の結果から、Ls1株ではMPの安定性が低下しており、高温条件下ではウイルスの移行に必要なだけのMPが蓄積しないため、温度感受性の表現型を示すことが示唆された。ククモウイルス、ブロモウイルスの移行機能における外被タンパク要求性Cucumber mosaic virus(CMV)の移行タンパク(3aタンパク)と外被タンパク(CP)の両者を発現させることにより、Tomato mosaic virus(ToMV)およびPotato virus X(PVX)両者の移行能欠損を相補できること、およびCMV 3aのC末端を欠失させたタンパクはCP非存在下でToMVの移行能欠損を相補できることは前年に報告した。ククモウイルスと近縁のブロモウイルスの移行機能について同様の解析をしたところ、Brome mosaic virus(BMV)および同属のCowpea chlorotic mottle virus(CCMV)の3aタンパクはCP非存在下でToMVの移行能欠損を相補したが、PVXの移行能欠損は相補しなかった。ところがこれらの3aタンパクをそれぞれのCP(BMV CP、CCMV CP)と共に発現させるとPVXの細胞間移行を相補した。CMVおよびBMVの細胞間移行には3aタンパクとCPの両者が必要であるが、CCMVはCPを必要としないことが報告されている。これらの事実と上記の結果を合わせると、ククモウイルス、ブロモウイルスの移行機能におけるCPの要求性は、3aタンパクの変異あるいは運搬されるゲノムRNAの種類に応じて変化するといえる。このことからククモウイルス、ブロモウイルスはCP依存的、非依存的な2種類の移行機能を持つことが示唆された。以上の結果は現在Virology誌に投稿中である。PVX移行タンパク間相互作用PVXは4種類の移行タンパクを持つ。そのうちの2つのタンパクp12およびp8の間には機能上の相互作用が存在することを前年報告した。本年度は酵母を利用した実験系を構築し、これらのタンパク間に分子間相互作用があるかどうかを現在解析中である。
昆虫寄生性線虫による生物的防除手法の開発

本研究の当初の目的は、線虫によって農薬では防除困難な植物体や土中に隠棲する害虫を駆除し、あわせて農薬公害を軽減することにあった。確かに施用量を多くすれば100%近い効果は得られるが、多くの場合これは実際的でないように思われる。線虫の単独施用では充分に防除効果を挙げるのは困難であるが、農薬と適宜組合せることによって、極めて良好な効果をあげることができた。即ち農薬も線虫も単独施用では効果のない低濃度でも、混合施用により相乗効果が得られた。混合施用は減農薬となるばかりでなく、害虫に農薬抵抗性を生じさせない手段にもなった。また燻蒸処理土壌への施用は侵入害虫を効果的に迎撃するばかりでなく、有害線虫の急速な回復を抑制し、総合防除への展開を期待させた。以下に3年間の進歩を列挙する。(1)コガネムシ幼虫に対し従来の輸入線虫より遥かに殺虫力の強い線虫が本邦で発見された。(2)マツノマダラカミキリ,ゴマダラカミキリ,キボシカミキリなどの難防除害虫には圃場施用で80%以上の駆除効果を得た。(3)麩、米糠油かすなど植物質培地では生産は劣るが、昆虫寄生の芽胞細菌との混合培養も可能で相乗効果が期待される。(4)ミノガ,シイタケバエ,アメリカシロヒトリ,ハマキガ,ハスモンヨトウ,芝草害虫等の防除に好成績が得られた。(5)コナガ,アオムシ,カブラヤガには農薬混合施用で抜群の防除効果があった。(6)混合施用は単に線虫が低濃度の農薬で刺激され、活発に活動するだけのようである。(7)乾燥下生存は線虫の体内にトレハロースが高まる。糖・脂肪酸エステルは有力な乾燥保護剤であるとともに、線虫の殺虫効果を高めた。(8)線虫と共生細菌には昆虫の液性成分の防御機構を破壊するものがある。昆虫の免疫システムを崩壊させるものであれば、興味ある展開が(昆虫生理学的にも、殺虫剤の開発にも)期待される。(9)線虫の大量施用で土壌節足動物相は一時的に動揺するが、持続しない。1.静岡県で発見されたコガネムシ幼虫寄生のSteinernematidae科線虫(新種?)は、現在アメリカ、オーストラリアから輸入している数種類の線虫よりも遥かに殺虫力があり、線虫による生物的防除はわが国において、新しい展開が期待される(林業試験場)。2.次の害虫には、有望な防除手段になることが判明した。ギボシカミキリ(日化)、マツノマダラカミキリ(林試)、ゴマダラカミキリ(果樹試)、コナガ、アワヨトウ、ハスモンヨトウ、カブラヤガ(九州農試)、三重大、野菜試、佐賀大)、アメリカシロヒトリ(SDSバイテク)、芝草りん翅目害虫(静岡大)、コガネムシ(林試、王子製紙)、ミノガ(福岡林試)、ニクバエ、キンバエ(予衛研)。

一方、実験的には殺虫性を示しても実用性は認められないものは、イネミズゾウムシ(北陸農試、三重大)、ウンカ、アブラムシ。3.コガネムシ幼虫に対するバーク堆肥混入施用は、Steinernema feltiaeよりも、S.glaseriでより高い防除効果が得られた(王子製紙)。4.線虫の地上部施用には乾燥防護剤として卵白アルブミン(塩野義)、パラフィンと脂肪酸混液が有効である(佐賀大)。5.施用線虫の土壌中生存は、土性による差が大きく、一般に粘土質(植土)土壌は砂質土壌よりも線虫の生存率を高める(佐賀大)。6.nictating(立上る)行動は線虫の分散行動の1つであって、宿主侵入への前駆行動として必ずしも必要ではないが、nictatingを起す個体は宿主への侵入率も高い。この行動は土壌水分30%で最も起りやすい(佐賀大)。7.線虫の感染に抵抗性を示す昆虫(例.カブラヤガ)は、線虫に対する誘引性が低いばかりでなく、血液中のポリフエノールオキシダーゼ活性が通常においてもきわめて高い。抵抗性昆虫も農薬との線虫混合施用で相乗的殺虫効果が得られ総合防除の可能性もある。最終年度として(1)線虫による防除容易な害虫への確実な施用法の確立。(2)困難な害虫には防除の可能性が期待できるものできないものの区別。(3)農薬混合施用法の推進。(4)総合防除法の可能性の追求。(5)保護剤の開発。(6)本邦産昆虫寄生線虫の生理的特性。(7)線虫の感染動態、昆虫の防御機構の解明。(8)共生細菌の病原性の維持、線虫培養法の改良等に重点を置いた。当研究班が対象とした害虫類は殆んどが線虫によって防除・駆除可能であるが、イネミズゾウムシとウンカ、オンシツコナジラミ等には防除の可能性はない。実験室内では殺虫性がみられても、実際の野外では困難なものは、畜舍発生害虫,イエバエ,コガネムシ幼虫(殺虫性の高い線虫が静岡県で発見された)、アザミウマ等である。しかしこれらも今後の研究で防除の可能性は残されている。合成農薬との混合施用は顕著な殺虫効果となった。この手法は今後更に発展するであろう。そのメリットは(1)低濃度の農薬との連用で害虫に薬剤低抗性を生じさせない。(2)接触型線虫防除剤との混用では土壌害虫と植物寄生線虫の同時防除が可能。(3)燻蒸剤処理土壌への施用は侵入害虫に対する効果的迎撃ばかりでなく、有害植物線虫の急速な回復を抑制する。(4)以上を総括して減農薬を指向することができる。保護剤の開発として脂肪酸パラフィン混合と脂肪酸蔗糖エステルが乾燥保護剤として効果があった。乾燥下での生存には前者が良かったが、後者は殺菌作用もあり、共生細菌と他細菌との競合を減少させるためか、殺虫効果は前者よりも高かった。線虫は乾燥下に徐々に曝されるとトレハロースが体内に高まり、乾燥耐性に寄与していると考えられる。トレハロースと脂肪酸のエステル化合物ができれば乾燥保護剤として有望であろう。線虫には昆虫体の免疫システムを崩壊させるものがあり、昆虫生理学的にも興味深い。国内産線虫はコガネムシ幼虫の防除に使える
熱処理によるInN系半導体の高品質化に関する研究

昨年度は液相エピタキシャル装置を熱処理実験装置として転用し、熱処理実験を行ったが、この装置ではInNの熱処理を行う比較的低い温度領域での温度の制御性および精度が乏しく、詳しい実験検討ができないことが分かった。そこで本年度は、別途予算で購入した応答性・均熱性に優れたランプアニール装置を用いて実験を行った。昨年度に引き続き、試料作製のためのRF窒素プラズマ支援分子線エピタキシー装置の不良状態が続いたため、研究計画を遂行するための試料提供を充分に受けることができなかったが、以下のような成果を得た。真空中で熱処理を行うと、C面In極性InN膜の場合、450°Cで既に表面形態に明瞭な変化が現れ、550°Cではほとんど跡形もなく膜が分解してしまうのに対し、C面N極性InNの場合、500°Cでようやく表面形態に若干の変化が現れ、550°Cでも表面に少しInドロップレットが形成される程度で膜厚もほとんど変化がみなれなかった。ただし、600°Cでは膜がほとんど分解されてなくなってしまった。これらの結果は、N極性InNがIn極性InNよりも熱的に安定であることを示しており、N極性InNの方が成長温度を高くできるという報告と矛盾がない。A面無極性InN膜についても同様に、真空中で600°Cまでの温度範囲で熱処理を行ったが、膜が分解する様子はみられず、膜厚にも特に変化はみられなかった。これは、A面無極性InNの熱的安定性がC面有極性InNよりもかなり高いことを示している。無極性面を有する結晶膜は、膜に垂直な方向に分極電場が存在しないため、発光デバイスに応用された場合、発光効率を飛躍的に上げることができると期待されている。本研究により、A面無極性InNを用いれば、発光効率が高いだけではなく耐熱性にも非常に優れた赤外発光デバイスが実現する可能性があるという、InNのデバイス応用上非常に重要な知見が得られた。本年度は、まず、InN系半導体(InN、In_xGa_<1-x>N、In_xAl_<1-x>N)薄膜の熱処理実験装置として使用する液相エピタキシャル成長(LPE)装置のコントローラユニットのオーバーホールを行い、熱処理実験を行うための環境を整えた。ところが、試料を作製するためのRF窒素プラズマ支援分子線エピタキシー(RF-MBE)装置が例年になく頻繁に故障し、この1年間で10回ほどメンテナンスを行ったため、予定していた研究計画を遂行するための試料の提供を充分に受けることができなかった。このような状況の中、限られた個数の試料を用い、InNに関して、まず以下のような重要な知見を得た。1.大気圧窒素雰囲気中にて熱処理を行うと、もともとの試料の表面に凹凸が場合は、In極性およびN極性のInNともに熱処理後に表面平坦性が向上する。2.InNは、窒素大気圧下においては真空中の場合に比較して熱的安定性が増し、両極性の試料とも、RF-MBE法によるInNの成長温度(In極性:約450°C、N極性:約530°C)よりも少なくとも100150°C高い温度まで試料表面に顕著な劣化がみられない。以上の結果は、今後より詳細な熱処理実験を行う上で、試料を破壊しない熱処理温度の上限に関して重要な情報となるものである。今後は、両極性のIn_xGa_<1-x>N、In_xAl_<1-x>Nに関しても熱的安定性を詳細に検討するとともに、これらInN系薄膜の高品質化(結晶性の改善、残留キャリアの低減)を行うとともに、これらInN系薄膜の積層構造のヘテロ界面の熱的安定性を検討し、InN系デバイス開発に応用していく予定である。

無極性面を有する結晶膜は、膜に垂直な方向に分極電場が存在しないため、発光デバイスに応用された場合、発光効率を飛躍的に上げることができると期待されている。本研究により、A面無極性InNを用いれば、発光効率が高いだけではなく耐熱性にも非常に優れた赤外発光デバイスが実現する可能性があるという、InNのデバイス応用上非常に重要な知見が得られた。
EGFR肺がんにおける免疫チェックポイント阻害薬治療バイオマーカーの確立

免疫チェックポイント阻害薬治療中のEGFR陽性肺癌がん患者の血漿から、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害するアデノシンの産生に関与するCD73の発現が関わるサイトカインの動態を明らかにすることでEGFR陽性肺がんにおける免疫応答機構を解明し、EGFR陽性肺がんに対する免疫チェックポイント阻害薬の適正使用につながるバイオマーカーの確立と、更なる治療戦略を構築することを目的とする。
ナノ弾性の顕在化による超高面密度ZnO自立ナノロッド配列の圧電電荷出力の向上

膨大な量の小型センサをあらゆるものに導入し情報を収集・活用する高度センサ化社会においては、そのセンサ用電源として安価で生体・自然環境に無害な永続的に給電可能な小型自立電源が求められる。その動作原理として圧電変換による機械的振動エネルギー回収技術が注目されている。そこで安価で生体・自然環境に無害な圧電材料およびその作製手法として、圧電性半導体ZnOの単結晶自立ナノロッド配列構造、および前駆体水溶液中でのZnO化学合成を原理とする溶液成長法に注目した。本研究では、バルク単結晶よりも弾性限界歪が2桁高い単結晶自立ナノロッドの「ナノ弾性」を利用し、ZnO単結晶自立ナノロッドの微細化・高密度化により配列構造の同じ膜厚のZnO薄膜を超える圧電電荷出力を実現することを目標とし、昨年度は下地オーミック電極Au上のZnO単結晶自立ナノロッド配列のヘテロエピタキシャル成長技術、および、前駆体溶液への添加剤導入によるZnO単結晶自立ナノロッドのアスペクト比制御技術を開発した。平成30年度は、高面密度の自立ナノロッド配列に適切な粘性を有する有機フォトレジスト膜を塗布することで、これを埋め込む技術を開発した。この自立ナノロッド配列埋め込み構造は、圧電デバイス応用の観点から、1上部電極が形成可能になる、2ロッド軸直交方向の剪断応力に対して耐久性が上がり応力集中によるナノロッド根本での構造破壊を防げる、という利点がある。また、本埋め込み技術はZnO単結晶自立ナノロッド配列構造に限らず、他材料、多孔質材料なども埋め込み可能で汎用性があり、応用展開が期待できる。平成30年度は、年度初めに大阪大学から東北大学への異動があったため、まず成長系・測定環境の再立ち上げを行った。また、ZnOナノロッド配列構造の圧電デバイス作製のため、有機膜埋め込み技術を開発した。具体的には以下の項目に取り組んだ。(1)有機膜埋め込み技術を軸長・直径・間隔の異なる様々な自立ナノワイヤ配列に適用した結果、軸長10um、間隔100nmの高アスペクト比のナノ空隙を有する自立ナノワイヤ配列を埋め込み可能なことを示した。今後、間隔100nm以下のナノ空隙が埋め込み可能か否かも検証する。(2)有機膜埋め込み後の機械研磨により、自立ナノロッド配列埋め込み構造の表面を平滑化可能なことを示した。これより埋め込まれたナノロッドと上部電極材料との電気的接触が可能となるため、重要な結果である。(3)ZnO自立ナノロッドだけでなく、Si自立ナノワイヤ配列に適用した結果、埋め込み可能であった。よって、本埋め込み技術は他材料の空隙構造も埋め込み可能で汎用性があることを示した。ZnO自立ナノロッド配列のほか、他材料、多孔質材料などにも応用展開が期待できる。平成31年度は、以下の手順で研究遂行する。1単一ZnO自立ナノロッドの物性評価と圧電応答力顕微鏡PFMを用いた圧電応答検出。2成長条件制御によるZnO単結晶自立ナノロッド配列の高面密度化・長軸化と、単一ZnO自立ナノロッドの圧電応答の改善。3有機膜埋め込み技術を用いたZnO単結晶自立ナノロッド配列圧電デバイスの作製と圧電応答評価。本研究では、バルク単結晶よりも弾性限界歪が2桁高い自立ナノロッドの「ナノ弾性」を利用し、ZnO単結晶自立ナノロッドの微細化・高密度化により配列構造の同じ膜厚のZnO薄膜を超える圧電電荷出力を実現することを目標とした。平成29年度は、Si(111)基板上にAuを真空蒸着した場合、(111)配向が優勢になること、またAu薄膜/Si(111)基板を用いてZnO溶液成長を行うと、ZnO(0001)配向単結晶自立ナノロッドがAu(111)面上にヘテロエピタキシャル成長すること、を見出した。このZnO(0001)ナノロッド/Au(111)構造は、Au薄膜がZnOのヘテロエピタキシャル成長の下地層としての役割だけでなく、圧電デバイスにおける下部電極の役割も果たすこと、ZnO/Au界面が一般にオーミック接触であることから、圧電変換による環境発電デバイスの実現に有用な技術といえる。また、前駆体溶液に添加剤を導入して溶液成長を行うことで、ZnO単結晶自立ナノロッド配列のアスペクト比を低減し、薄膜化することに成功した。この溶液成長ZnO(0001)薄膜は、先のZnO単結晶自立ナノロッド配列の比較参照試料として用いることができる。平成29年度は以下の項目に取り組んだ。1ZnO単結晶自立ナノロッドのAu薄膜/Si基板へのヘテロエピタキシャル成長Si(111)基板上に真空蒸着によりAu薄膜を作製した。XRD評価から、Au薄膜は(111)配向が優先であることを確認した。その後、Au薄膜/Si基板を前駆体溶液中に導入・加熱して溶液成長を行った。

Au薄膜上にそのままZnO溶液成長を行った場合、Au(111)面上に(0001)配向したZnO単結晶自立ナノロッド配列(直径1um,長さ10 um,面密度106 cm-2)がヘテロエピタキシャル成長することを確認した。今後、ナノロッド配列の高面密度化が課題である。高面密度化の方策として、電子線描画を用いた選択成長の適用や前駆体溶液条件の再検討を考えている。2参照用ZnO薄膜のAu薄膜/Si基板へのヘテロエピタキシャル成長続いて、同じAu薄膜上に参照用ZnO薄膜の溶液成長を試みた。通常の成長条件では自立ナノロッドが形成するため、添加剤を導入して、ZnO単結晶自立ナノロッドの垂直方向の頂面成長を抑制を試みた。結果、ナノロッドのアスペクト比が10から10-2へと低減した。これより自立ナノロッド配列を薄膜化するに成功した。今後、溶液成長条件を検討することで、厚膜化を目指す。膨大な量の小型センサをあらゆるものに導入し情報を収集・活用する高度センサ化社会においては、そのセンサ用電源として安価で生体・自然環境に無害な永続的に給電可能な小型自立電源が求められる。その動作原理として圧電変換による機械的振動エネルギー回収技術が注目されている。そこで安価で生体・自然環境に無害な圧電材料およびその作製手法として、圧電性半導体ZnOの単結晶自立ナノロッド配列構造、および前駆体水溶液中でのZnO化学合成を原理とする溶液成長法に注目した。本研究では、バルク単結晶よりも弾性限界歪が2桁高い単結晶自立ナノロッドの「ナノ弾性」を利用し、ZnO単結晶自立ナノロッドの微細化・高密度化により配列構造の同じ膜厚のZnO薄膜を超える圧電電荷出力を実現することを目標とし、昨年度は下地オーミック電極Au上のZnO単結晶自立ナノロッド配列のヘテロエピタキシャル成長技術、および、前駆体溶液への添加剤導入によるZnO単結晶自立ナノロッドのアスペクト比制御技術を開発した。平成30年度は、高面密度の自立ナノロッド配列に適切な粘性を有する有機フォトレジスト膜を塗布することで、これを埋め込む技術を開発した。この自立ナノロッド配列埋め込み構造は、圧電デバイス応用の観点から、1上部電極が形成可能になる、2ロッド軸直交方向の剪断応力に対して耐久性が上がり応力集中によるナノロッド根本での構造破壊を防げる、という利点がある。また、本埋め込み技術はZnO単結晶自立ナノロッド配列構造に限らず、他材料、多孔質材料なども埋め込み可能で汎用性があり、応用展開が期待できる。平成30年度は、年度初めに大阪大学から東北大学への異動があったため、まず成長系・測定環境の再立ち上げを行った。また、ZnOナノロッド配列構造の圧電デバイス作製のため、有機膜埋め込み技術を開発した。具体的には以下の項目に取り組んだ。(1)有機膜埋め込み技術を軸長・直径・間隔の異なる様々な自立ナノワイヤ配列に適用した結果、軸長10um、間隔100nmの高アスペクト比のナノ空隙を有する自立ナノワイヤ配列を埋め込み可能なことを示した。今後、間隔100nm以下のナノ空隙が埋め込み可能か否かも検証する。(2)有機膜埋め込み後の機械研磨により、自立ナノロッド配列埋め込み構造の表面を平滑化可能なことを示した。これより埋め込まれたナノロッドと上部電極材料との電気的接触が可能となるため、重要な結果である。(3)ZnO自立ナノロッドだけでなく、Si自立ナノワイヤ配列に適用した結果、埋め込み可能であった。
造血幹細胞の支持細胞「ニッチ細胞」としての骨芽細胞の機能解析

本研究では、成体骨髄の骨芽細胞ニッチに存在する、静止期造血幹細胞(c-Kit+Sca-1+Lin-Tie2+のside-population細胞)に特異的に発現しているN-cadherinに注目し、造血幹細胞の制御における役割を検討した。まず、マウスの成熟過程におけるN-cadherinの発現を造血幹細胞と骨芽細胞で検討したところ、静止期造血幹細胞の増加する6週齢以降にN-cadherinの発現が造血幹細胞と骨芽細胞の双方で上昇することを見出した。この結果から造血幹細胞-ニッチの相互作用がN-cadherinによって形成されることを示すものと考えられた。また、N-cadherinを介した幹細胞とニッチの接着は幹細胞のコロニー形成能の維持、細胞分裂速度の低下に働くことがわかった。さらに、N-cadherinの骨髄再構築能における機能を検討するため、野生型N-cadherin (WT-N-cadherin)、優性阻害型N-cadherin (DN- N-cadherin)を造血幹細胞に導入し移植実験を行った。その結果、DN- N-cadherinを発現する造血幹細胞は骨髄再構築が著しく抑制された。また、WT-N-cadherinを強発現する造血幹細胞はSP分画に濃縮されることがわかった。これはN-cadherinにより造血幹細胞がニッチと強固に接着し、細胞周期の静止が誘導されたものと考えられた。以上の結果から、N-cadherinが造血幹細胞とニッチとの接着に働きHSC-骨芽細胞の接着を促進することで造血幹細胞をニッチに留め、さらに細胞分裂の抑制/細胞周期の静止に働き、未分化性を維持することが示唆された。一方、抗がん剤による骨髄抑制を誘導すると、造血幹細胞内の活性酸素が上昇し、N-cadherinが切断されることがわかり、幹細胞のニッチからの離脱に際し、活性酸素による幹細胞とニッチの接着の阻害が関連することがわかった。本研究では,造血幹細胞(HSC)の支持細胞である骨芽細胞とHSCの相互作用を明らかにし,ニッチにおいて骨芽細胞が造血幹細胞の未分化性維持機構をどのようにして制御しているのか、その解明を試みた。我々はTie2受容体陽性の造血幹細胞が細胞周期の静止した幹細胞で、骨髄内では骨梁表面で骨芽細胞と接着して存在していることを明らかにしており、このことからTie2とそのリガンドであるアンジオポエチン-1(Ang-1)のシグナルが成体骨髄においてニッチ-幹細胞の関係を成立させるために必要とされることが示唆された。そこで、骨髄におけるAng-1の局在及びAng-1産生細胞の同定を試みたところ、Ang-1は主に骨芽細胞から産生されることが分かった。またTie2/Ang-1のシグナルは,in vitroでは幹細胞の骨芽細胞および細胞外マトリックスへの接着を誘導し,さらにin vivoにおいては,HCSの細胞周期の静止ならびに骨髄再構築能の維持に働くことが明らかになった。一方,HSCと骨芽細胞の細胞接着にかかわる分子の候補としてカドヘリンに注目し、両者に共通するカドヘリンの発現を検討した。その結果,N-カドヘリンがHSCと骨芽細胞の両方で発現しており,さらに,SP-HSCsにおけるN-カドヘリンの発現がAng-1により増加することも確認された。ソコデHSCとストローマ細胞ニN-カドヘリンを強制発現させ共培養をおこなったところ、LTC-ICの維持、細胞分裂・増殖の抑制がみられた。このことから、HSCと骨芽細胞がN-カドヘリンを介して接着し、細胞周期を静止させていることが示唆された。以上の結果から,HSCsは骨芽細胞からのTie2/Ang-1等の刺激により骨芽細胞との細胞接着を亢進させ,細胞周期を静止させることで,幹細胞の未分化性の維持していることが明らかになった。

以上の結果から、N-cadherinが造血幹細胞とニッチとの接着に働きHSC-骨芽細胞の接着を促進することで造血幹細胞をニッチに留め、さらに細胞分裂の抑制/細胞周期の静止に働き、未分化性を維持することが示唆された。一方、抗がん剤による骨髄抑制を誘導すると、造血幹細胞内の活性酸素が上昇し、N-cadherinが切断されることがわかり、幹細胞のニッチからの離脱に際し、活性酸素による幹細胞とニッチの接着の阻害が関連することがわかった。
一次シリア基底部における選択的拡散障壁・分子フィルター機構の解明

本研究では、「一次シリアの細胞膜を、細胞体の細胞膜から隔てている境界構造の実体と、その構造が拡散障壁として、しかも、特定の分子の選択的な出入りを決めるフィルターとしてはたらくことにより、一次シリア全体の極性を維持し、その機能を制御する機構」の解明を目指した。本年度は、以下の研究進捗があった。1.細胞膜分子の拡散抑制機構として、「膜骨格フェンス効果」を与えると考えられる、transition fiberを形成するODF2と、移行帯に局在するMKS1およびCEP290、「アンカード膜タンパク質ピケット効果」を与えると考えられる、移行帯のciliary necklaceに相当するTMEM17に、超解像観察用の蛍光タンパク質を付加した。ヒトRPE-1細胞に発現させたところ、ベーサル面に形成された一次シリアの基底部に局在することが全反射蛍光顕微鏡観察で確認できた。2.上記の拡散障壁候補分子の超解像観察と同時に1分子観察をおこなうための、一次シリアに局在する膜貫通型タンパク質のプローブとして、Smoothened、Sstr3、Htr6、PDGFRαのACP (細胞外で蛍光色素を共有結合で標識できるタグ分子)融合体を作製した。また、コントロールのプローブ分子として、不飽和リン脂質蛍光アナログのSeTau647-DOPEを合成した。3.前年度に開発した装置で、拡散障壁の超解像観察と、上記の1分子観察プローブの同時観察をおこなったが、一次シリア基底部は顕微鏡のz軸(上下)方向に傾いた構造を取ることが多いので、現在の装置で可能なxy軸(水平)方向に投影した観察をするだけでは、不十分であることが分かった。今後、3次元の位置決めに対応できるように装置を改造し、一次シリア基底部の構造(細胞膜の配向)を3次元的に把握しながら、分子選択性を決める機構を調べたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、「一次シリア基底部の細胞膜にある選択的拡散障壁・分子フィルター機構」、すなわち、「一次シリアの細胞膜を、細胞体の細胞膜から隔てている境界構造の実体と、その構造が拡散障壁として、しかも、特定の分子の選択的な出入りを決めるフィルターとしてはたらくことにより、一次シリア全体の極性を維持し、その機能を制御する機構」の解明を目指している。1.ヒト網膜色素上皮由来のhTert-RPE-1細胞で、無血清培地での48時間培養、細胞密度約50%の条件では、細胞の上側と下側(カバーグラスに面した側)に形成される一次シリアの割合はほぼ同じで、構造全体の長さもほとんど変わらなかった。共焦点顕微鏡観察で、カバーグラスから一次シリアの基底部と先端部までの距離を定量したところ、基底部の32%、先端部の80%が300 nm以下の距離に存在することから、一次シリアへの分子の出入りは、全反射蛍光顕微鏡で観察可能であることが分かった。2.拡散障壁の候補と考えられる分子(5種)について、免疫蛍光染色をおこなったところ、細胞の下側に形成された一次シリアの基底部でも、上側の一次シリアと同様な局在を示すことが分かった。3.細胞の下側に形成された一次シリアを、全反射蛍光顕微鏡で可視化(マーカーはSmoothened-EGFP)し、不飽和リン脂質(DOPE)、スフィンゴ糖脂質(GM3)の蛍光アナログ1分子の2色同時観察をおこなったところ、一次シリア基底部には、1分子の脂質分子でも通り抜けられない拡散障壁が存在することが示唆された。4.拡散障壁マーカー分子の生細胞超解像観察と、一次シリアに局在する、あるいは、一次シリアから排除される細胞膜分子の1分子観察(時間分解能0.1ミリ秒ー数秒)を同時におこなうことができる顕微鏡システムを構築した。

今後、3次元の位置決めに対応できるように装置を改造し、一次シリア基底部の構造(細胞膜の配向)を3次元的に把握しながら、分子選択性を決める機構を調べたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞膜と一次シリアの間に形成されるサブミクロンサイズの仕切りは、従来の顕微鏡法では回折限界(250 nm)のためその微細構造が観察できない。また、典型的な細胞膜分子の拡散を考えると、数10ー数100ミリ秒で移動できるサイズであるため、その拡散障壁としての機構、さらに、選択的な分子フィルターとしての機構を解明するためには、サブミリ秒時間分解能での1分子イメジングが必須となる。そこで、1年目は、空間分解能20 nmの生細胞超解像(PALM)観察と、時間分解能0.1ミリ秒、位置決め精度20 nmの高速1蛍光分子観察を組み合わせた顕微鏡システムを構築し、ほぼ装置は完成した。また、一次シリアを形成させた細胞試料の調製・観察条件と、拡散障壁マーカー分子の選定を進め、本研究の作業仮説「一次シリア基底部の細胞膜にある選択的拡散障壁・分子フィルター機構」を次年度以降、本格的に検証するための準備が整った。次年度は、1年目に開発した装置を用いて、以下の研究をおこなう。1.一次シリア基底部における選択的拡散障壁・分子フィルター機構の解明細胞膜と一次シリアを構造的に隔てている、細胞膜分子の拡散抑制機構を、「膜骨格フェンス効果」、「アンカード膜タンパク質ピケット効果」、「脂質ドメイン効果」の代表的な3つの仮説に分類し、それぞれの効果を与える分子群の生細胞超解像観察をおこなう。各拡散抑制機構の分子選択性を調べるためには、まず、脂質分子のコントロールとして蛍光リン脂質アナログ、膜貫通型受容体のコントロールとしてトランスフェリン受容体、その後、一次シリアに局在する分子(Smoothened、PDGF受容体など)、一次シリアから排除される分子(GPIアンカー型タンパク質など)の高速1蛍光分子観察(0.1ミリ秒ービデオレート)を、超解像観察と同時におこない、それぞれの拡散障壁でどのように振る舞うか(排除/通過/トラップ)を明らかにする。2.能動的一次シリア極性形成機構の解明一次シリア基底部の拡散障壁が、特定の分子に対してはアフィニティが高く、これらの分子のみを特異的にトラップし、その後、微小管結合モータータンパク質依存的な極性輸送をおこなうことによって、一次シリアへの選択的な出入りを決めるフィルターとしてはたらいている可能性を調べる。低サンプリングレート(ビデオレートー数秒)の1蛍光分子追跡により、拡散障壁でのトラップから、キネシンファミリー依存的な一次シリア先端(+端)方向への極性輸送が開始する過程を追跡する。また、ダイニンファミリー依存的な根元方向(ー端)への極性輸送の後、拡散障壁を通過して一次シリア外に出て行く過程が存在するかどうかを調べる。