hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中脳黒質網様部アストロサイトに発現するD1ドーパミン受容体の生理的意義

ドーパミンは報酬、運動、学習などに重要な伝達物質である。運動制御に重要な大脳基底核の出力部を担う中脳黒質網様部アストロサイトにD1ドーパミン受容体が発現していることを見出し、その生理学的な意義を電気生理学的アプローチとD1ドーパミン受容体を黒質網様部アストロサイト特異的に欠損した動物個体を用いた行動解析により解明を試みた。動物個体作製に際してトラブルがあり行動解析に至らなかった。また電気生理学的アプローチにおいても核心をつく結果を出すに至っていない。本研究のきっかけとなった事象については最終年度に論文として発表した。本研究は、黒質網様部アストロサイトに発現するD1ドーパミン受容体(D1R)の生理学的意義を、脳スライスを用いた電気生理実験およびコンディショナルノックアウトマウスを作成することによって検討しようという研究である。H26年度に予定していた脳スライスを用いた電気生理では、ドーパミンを検出するために用いるカーボンナノチューブを使用した微小ドーパミン電極を安定して作成することができておらず、現在までのところ、視床下核からの電気刺激を効率よく行えているか確認を取れていない。黒質網様部でのドーパミンの放出が本研究の核心となるため、この段階をクリアせず、研究を進めることはできないと考えている。一方、新型の脳スライスのリカバー装置・脳スライス電気生理記録チェンバーについては設計図が年度末に近いところでの完成となったため、装置の作製から納入までが遅れている。いずれも近日中に納入となる。また以下2点の不測の事態により、D1ドーパミン受容体のコンディショナルノックアウトマウスの作成が遅れている。(1)所属機関付属動物実験施設が取り壊し、もしくは段階的増改築を行うという話があり、認可された場合はH27年度から工事が開始する旨、通達があったため、予定していた凍結精子の購入のタイミングが取れなかった。(2)購入した凍結精子の移送中に液体窒素がタンクより漏出し、サンプルが室温に晒されてしまい人工授精に使用できなくなった。この点に関しては、人工授精を行っていただくことになっている委託業者と協議中である。しかしながら、D1受容体の発現解析の対照として行った実験では、予想し得なかった結果を得ることができている。現在までのところ、諸般の理由により、ポジティブな結果を得られていない。申請時に記載した基礎研究の論文執筆に関しても、疑義が生じており、確認のための追加実験など併せて行っている。脳スライス実験のドーパミン検出は、当初予定していた方法を変更し、別法にて、視床下核からの電気刺激を効率よく行えているか検討している。黒質網様部でのドーパミン放出が本研究の革新となるため、注意深く検討する必要がある。この方法の調整および結果の検討に至るまで、1からの再スタートになっている。前年度に生じた想定外の凍結精子融解に関する事案については、業者と協議した結果、精子の再度購入した時の輸送費用は返金するとの回答を得た。しかし先立って、研究費ではなく私費から支払う必要があった為、実施することができずに日にちが経過した。しばらくして本研究の根幹部分に疑義が生じた為、遺伝子改変動物を用いた実験に優先して、申請時に提示したデータに関する確認実験(電子顕微鏡レベルでのドーパミン受容体の発現解析)を行う必要が出てきた。この確認を行わないと動物を作成しても意味がないと分かり、現在、詳細な確認実験を遂行中である。ドーパミンの検出方法を変更する為に注文した装置の納入が部品入手困難などの理由から遅れ、年度末になり、ようやく納入された。また実験装置の移設や新規購入装置の納入が遅れたことなどにより、想定外の遅延が生じている。現在、この研究課題の基礎となっている研究の論文を執筆している。執筆中の論文では、黒質網様部アストロサイトに発現するD1受容体の生理的機能には踏み込んでおらず、本研究課題で生理学的意義の検討を行っている。D1受容体の対照として行った発現解析からD2受容体に関して重要な知見が得られている。また黒質網様部GABAニューロンに分子Xの発現を指標にすると2割程度でサブポピュレーションが存在すると示唆される結果が得られている。GABAニューロンに関しては、本研究課題で自発発火頻度を指標にして研究を進めることになっているが、サブポピュレーションの存在に関しては、今後、解析過程で考慮する必要が出てくる。D1受容体コンディショナルノックアウトマウスに関しては、上記2点の通り、不測の事態により、個体作製に至っていない。凍結精子購入費および凍結精子輸送費に関して資金面に関する協議も行っており、早急に個体作製を進めていく必要がある。

以上のような状況から金銭的な面において、遺伝子改変動物作製の実施を断念している。また基礎データの見直しを兼ねて、確認実験を早急に行っている。また脳スライス実験では、カーボンナノチューブを使用したドーパミン電極によるドーパミン放出の検出が困難となり、現在、ケミカルクランプによる検出方法に切り替えて、実験を行っている。神経科学新型の脳スライスのリカバー装置・脳スライス電気生理記録チェンバーについては、近日中に納入されることになっているため、新型チェンバーに変更し、電気生理実験および薬理実験を行う。カーボンナノチューブを使用した微小ドーパミン電極に関しては、カーボン電極によるアンペロメトリーに変更することを視野に入れており、カーボン電極を使用している研究者の方に実験手法を教授していただく予定である。黒質網様部でのドーパミン放出過程が重要であると上記したが、研究の進捗を考慮すると、二次的に、ドーパミンニューロンの自発発火抑制を指標に、視床下核の刺激強度を決める必要があると考えられる。コンディショナルノックアウトマウスの凍結精子に関しては、委託業者とトラブルに関して、二度と起こらないようにするための対策をどのように行うべきなのか連絡を取りつつ、人工授精を開始して、固体作製を行ってもらう。また付属動物実験施設に関しては、動物実験施設のワーキンググループに参加することで、実験が滞らないように(数年間動物が使用できなくならないように)要望を積極的に出している。さらに現在の実験動物施設では、アデノ随伴ウイルスを使用できる部屋が限られており、他の研究者との兼ね合いで使用できない可能性もあるが、たとえ研究期間が終了しても、どうにか動物実験が続けられるようにアプローチしていく。特注製品につき、複数の業者と設計の段階からやりとりを行っていた為、価格面での折り合いなどで、発注が遅れてしまい、納入が次年度となったため。新設計の脳スライス回復チャンバーと記録チャンバーにつき、作製がやや年度末にかかり、納品が遅れているため(10万円x2台相当)。新設計チャンバーの納品が遅れている理由は、年度末の繁忙期にかかったためと考えられる。また、不測の事態による凍結精子の室温融解に伴い、マウス個体作成にかかる経費執行がストップしているため(27万円相当)。発注済みの為、納入待ちであり、今年度使用することを計画している。チャンバー製作費執行については4月中を目処にしている。またマウス個体作成に関しては、再度凍結精子を入手し、早急に個体作成を実施する。本件に関して、現在、委託業者と協議中であり、会社としてどのような対策を取ることが出来るのかなどを含めて連絡を取り合っている。
一絨毛膜性双胎における胎児環境動態の解明と胎盤胎児血管微細構造に関する研究

本年度は前年度の超音波血流計測の結果より、一絨毛膜性双胎(MD Twin)の管理方針を作成し,external checkともいえる前方視的な検討を行った。また、前年度に引き続きMD Twinにおける胎盤内の血管構築についても検討を行った。超音波血流計測に関しては今年度から検査者を複数とし、computerによるdatabase管理を導入した。昨年の結果から両児の下大動脈血流速度の差が30cm/sec以上となることを集中管理の基準とし、その他の超音波検査項目は参考項目として管理を行った。この管理方針に基づき本年度は双胎間輸血症候群(TTTS)4症例を含む13症例のMD Twinの管理を行った。この内1児は子宮内胎児死亡を起こしたが、これはその予測が可能であったにも関わらず、児の未熟性から妊娠継続し、子宮内胎児死亡に至った症例である。それ以外の症例は重症例を含め適切な時期に、分娩とすることができたが、新生児早期に脳室周囲白室軟化症を認めた症例が1例存在した。以上より、この管理方針は子宮内胎児死亡を防ぐ点で有効であると思われたが、TTTSにおける中枢神経病変の胎内発症の予防には、さらなるParameterの検討が必要であることが推測された。胎盤の血管構築の検討では4例のTTTSを含む9胎盤で検討を行った。TTTSでは、その発生に胎盤内での両児間の血管吻合が関与しているとされながら、ほぼ全てのMD Twinに血管吻合が観察されている。そこで我々は両児の臍帯動静脈よりラテックス注入を行い、両児の占拠している絨毛量と血管吻合の関係に着目し検討を行った。その結果、TTTSでは胎盤内に占める両児間の絨毛量に極端な違いがあることが判明し、この絨毛量の違いのある症例に何らかのtriggerが加わることがTTTSの原因ではないかと考えられた。なお今回の検討では胎盤深部での血管吻合が認められた症例は存在しなかった。本年度は一絨毛膜性双胎において超音波断層装置を用いて心拍出量、前負荷状態、臍帯循環に着目し、35例の一絨毛膜性双胎の症例を前方視的に検討を行った(双胎間輸血症候群10例、正常25例)。また、これらの症例に対し、臍帯動静脈カニュレーションによる標本固定を行い、胎盤より双胎間輸血症候群における両児の胎盤構築の比較検討を行った。超音波による検索では、胎児心拍出量と相関するとされている下行大動脈最高血流速度において双胎間輸血症候群では両児間で差が生じ、その差が週数毎に大きくなることが明らかとなった。この差は正常例と比較して明らかに大きく、統計学的検討においても有意差を認めた(双胎間輸血症候群62.1cm/sec.、正常18.1cm/sec.;p<0.001)。また、胎盤の検索では臍帯の付着部異常が多く認められた。しかし、臍帯の付着部異常は双胎間輸血症候群が発生しなかった症例においても多く観察され、双胎間輸血症候群の発生とは因果関係が少ないことが明らかとなった。そこで、双胎間輸血症候群例2例を含む5例において臍帯動静脈カニュレーション挿入による固定後のラテックス注入による検索を行った。その結果、双胎間輸血症候群の症例の出生体重が小さかった児の方では、臍帯の卵膜もしくは辺縁付着があるだけでなく、その児の占拠する胎盤葉の数が少ないことが明らかとなった。これらの結果より、双胎間輸血症候群はその着床もしくは胎盤の発達段階における胎盤葉の発育の差にその発生原因があることが推測され、それらの予知には超音波パルスドプラ法による胎児下行大動脈最高血流速度の測定が一絨毛膜性双胎の管理の指標として重要であることが明らかとなった。

そこで我々は両児の臍帯動静脈よりラテックス注入を行い、両児の占拠している絨毛量と血管吻合の関係に着目し検討を行った。その結果、TTTSでは胎盤内に占める両児間の絨毛量に極端な違いがあることが判明し、この絨毛量の違いのある症例に何らかのtriggerが加わることがTTTSの原因ではないかと考えられた。なお今回の検討では胎盤深部での血管吻合が認められた症例は存在しなかった。
二酸化炭素ガスを用いるアミノ酸の化学合成

二酸化炭素は石油資源に代わる魅力的な炭素資源であるが、非常に安定な化合物であるために、その有機合成への利用は限られている。特に二酸化炭素ガスを用いた効率的なC-C結合形成反応の開発は非常に重要な研究課題である。このような背景のもと、我々は二酸化炭素をカルボン酸ユニットとするイミンからのアミノ酸合成に初めて成功した。二酸化炭素は、地球上に豊富に存在し、しかも毒性が低く安価な炭素資源であるため、その効率的な利用法の開発が積極的に試みられている。今回我々は、対応するアルデヒドより調製が容易で、かつ安定なN-Boc-α-アミドスルホンを基質とする二酸化炭素ガスとCsFを用いたα-アミノ酸のワンポット合成に成功した。本ワンポット反応は、1)CsFがN-Boc-α-アミドスルホンに作用し、系中でN-Boc-イミンが生成し、2)TMSSnBu_3とCsFから発生したトリブチルスズアニオンが、そのイミンに付加することでN-Boc-α-アミドスズを与え、3)CsFがさらにスズを活性化し生じたカルバニオン様の活性種が二酸化炭素に付加することで進行していると考えられる。副生成物としてN-Boc-α-アミドスズからの脱スズ化により生成したプロトン化体が若干ながら観測されているものの、芳香環に様々な置換基を導入したアリールグリシン誘導体、およびチオフェンやフランのようなヘテロ原子を含有したアミノ酸を、最高88%で合成することに成功した。本反応はイミンの形成、イミンへのスズアニオンの付加、二酸化炭素への付加の3工程がひとつのフラスコで順次進行しており、また、CsFがそれぞれの工程で異なる作用をしていることから(塩基、ケイ素の活性化、スズの活性化)反応機構的にも大変興味深い。現在光学活性なアミノ酸の合成に向けて精力的に研究を行っている。二酸化炭素ガスは、ゆくゆくは枯渇する石油資源に代わる魅力的な炭素資源であるが、非常に安定な化合物であり有機合成への利用は限られていた。しかし最近になって、触媒的な二酸化炭素ガスの活性化、続く有機化合物への固定化反応が次々と報告され注目を集めている。そのような背景のもと、我々のグループも精力的に二酸化炭素の効率的な利用法の研究を行っており、すでにアミノスズからのフッ化セシウムを用いた二酸化炭素ガスによるカルボキシル化の開発に成功している。23年度はそのカルボキシル化の反応機構に関する知見を得るべく研究を開始した。まず、出発物質となるアミノスズの効率的な合成法の開発を行い、さまざまな置換様式のアミノスズの合成に成功した。合成したアミノスズを用いて置換基効果やNMR実験を行うことで、アミノスズの窒素原子の保護基がBoc基の場合はカルバニオン経由で、一方スルホニル基の場合は高配位スタネートを経由してカルボキシル化が進行していることを明らかにした。また光学活性なN-Boc-アミドスズを用いた場合には対応するアミノ酸がラセミ体で得られるのに対し、N-スルホニル-アミドスズを用いた場合には100°Cという高温条件においても不斉転写を伴いカルボキシル化が進行することがわかった。また、アミノスズに代えて毒性の少ないアミノケイ素を用いても不斉転写を伴い、カルボキシル化が進行することを合わせて見い出している。通常イミンから光学活性なアミノ酸を合成する場合、不斉Strecker反応に続くシアノ基の加水分解が一般的な手法であるが、本発見はN-スルホニルイミンにケイ素アニオンをエナンチオ選択的に付加されることができれば、二酸化炭素ガス雰囲気下イミンから一挙に光学活性なアミノ酸が得られる可能性を秘めており、大変重要な発見である。
活動を通して体験する科学学習の効果について-活字・映像による学習との比較-

本研究は、近年各地に設立されている体験型科学センターを利用し、体験による学習、映像で学ぶ学習、活字で学ぶ学習では、学習がどのように違ってくるかを検討した。平成9年度では、約200人の大学生に体験型科学センターを訪問して記入してもらった自由記述のアンケートをベースに質問紙を作成した。質問紙は、上記の3つの違いを反映できると予測できる5段階評定の12項目とした。平成10年度は、この質問紙を用いて、大学生に科学センターで、体験型学習3課題、映像型3課題に取り組んでもらい、アンケートに答えてもらった。活字群は、科学センターの機材の解説を活字と挿し絵で解説した文章を提示し、それを読んで同じ質問に答えてもらった。各項目ごとに、体験型、視聴覚型、活字型を比較する分散分析を行った。その結果、視聴覚型の学習は、活字による学習と比較すると「どうしてだろうなどど考えた」「なるほどと納得した」「自分はよく学んだと思う」「すごいと思った」「驚いた」という項目が有意に高かった。また、活字型の学習と体験型の学習の比較では、上記の視聴覚型で高かった項目にと加えて「楽しかった」「進んで取り組む気が起きた」「どんな結果がでるかわくわくした「もっと深く調べたくなった」という項目が有意に高かった。つまり、体験型の学習では、視聴覚型の学習効果に加えて、楽しいと思う気持ち、わくわくする気持ち、進んでやりたくなる気持ち、もっと調べたくなる気持ちなど、学習に前向きに取り組む気持ちを起こさせることが伺えた。逆に言えば、活字型、映像型の学習では、学習に前向きに取り組む「気持ち」が生じにくいことを意味している。本研究から、体験型学習を組む際には、学習に前向きに取り組む気持ちを生じさせる教育効果をねらったらよいことが示された。机の上で学ぶ活字、映像による学習と体験による学習がどのように異なるかを検討するため、実験、質問紙の変数を見つけることを本年度の目標とした。そこで50人の披験者に、体験型科学センターである「倉敷科学センター」を訪問してもらい、活字で学ぶ知識と体験型学習の違いをレポート形式でまとめてもらった結果を整理した。活字で学ぶ知識と体験型の知識の主な違いは、次のようなものである。つまり、体験的な学習は、「楽しい」ということが大きく違う。また、他者の視点で見せられている映像や、他者の視点で描かれている説明文とは異なり、自分の視点で、自分のレベルでものが見られるところが違う。加えて、直接対象に働きかけることで「なぜだろう?」という疑問がわき起こったり、「故障したら修理がたいへんだ」「昔の人はたいへんだったんだ」など、他者を思いやる気持ちが生じるが、これらは活字や映像では生じにくいものである。さらに、体験には失敗はつきもので、失敗したときには「どういてだろう」と考える。活字、映像による情報提供には失敗がないので、この種の反省は生まれないといえる。加えて、活字による学習では、満足する経験は少ないが、体験による学習では、その過程において、たとえ結果は満足できなくても、大きな満足感を得ることができる。このように、体験による学習では、学習への満足感、好奇心、内発的動機付けが喚起されやすいと予測できる。来年度は実験で、さらに検討する予定である。
肥満細胞の増殖と亜群間における形質転換に及ぼすIL3,IL4の作用に関する研究

肥満細胞は存在部位により組織肥満細胞(CTMC)、粘膜肥満細胞(MMC)に大別されるが、両者は細胞の大きさ、染色性、プロテオグリカンの種類、増殖因子依存性など種々の点で異なっている。MMCはin vivoではT細胞依存性に、in vitroではILー3依存性に増殖することが知られているが、CTMCの増殖については充分解明されていない。われわれは最近、マウス腹腔細胞より分離した成熟CTMCがその性質を有したままメチルセルロース中で増殖することを見い出した(Nature1986)。本研究において、われわれはCTMCはILー3のみの存在下ではクローナルな増殖は起こらないが、ILー3とILー4の両者の存在下で増殖することを明らかにした。さらにILー4に代わる物質としてprotein kinase C(PKC)のactivatorである12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)の作用について検討した。ILー3、TPAいずれも単独ではCTMCからのコロニー形成は誘導されなかったが、両者の存在下において多数のコロニーが形成された。PKCを活性化する作用のある他の3種類のフォルボール誘導体にはTPA同様ILー3存在下でCTMCからコロニー形成を誘導したがPKCの活性化作用を有しないフォルボール誘導体にはコロニー形成を誘導する作用は全くみられなかった。CTMCの持続的な増殖のためにはILー3とILー4あるいはTPAが培養液中に常に存在することが必要であった。このことはTPAがCTMCの増殖の点においてILー4に代わるシグナルになりうることを示すとともにPKCの活性化がCTMCの増殖の上から重要な意味を持つものと考えられる。ILー3とILー4あるいはTPAで形成される肥満細胞コロニーを個々にとり出し、形態学的に検索すると、成熟肥満細胞からアルシャングルー(+)、サフラニユ陰性(-)、ベルベリン染色陰性のMMCに近い細胞に転換する可能性が明らかとなった。肥満細胞は存在部位により組織肥満細胞(CTMC),粘膜肥満細胞(MMC)に大別されるが,両者は細胞の大きさ,プロテオグリカンの種類,ヒスタミン含量など種々の点で異なっている.マウス骨髄,脾細胞をIL3存在下で培養するとIL3の濃度依存性に肥満細胞コロニーが形成され,これは肥満細胞前駆細胞CFU-Mastに由来することが明らかとなった.さらに,処理脾細胞より存在下で形成される芽球コロニーよりマイクロマニプレーターを用いた単細胞培養すると,肥満細胞コロニー,肥満細胞を含む混合コロニーが形成され,これらコロニーに含まれる肥満細胞はいずれもMMCの性質を有していた.即ち,造血幹細胞からIL3により誘導される肥満細胞はMMCの性質を有すると考えられる.一方,マウス腹腔肥満細胞よりCTMCコロニーの形成はIL3のみでは起こらずIL3とIL4の両者が必要であることが判明した. IL3は25UのIL4存在下で濃度依存性にCTMCコロニーを増加させ, IL4もIL350存在下で濃度依存性にCTMCコロニーを増加させた.CTMCコロニーは取り出し, 2分し,構成細胞の染色性および種々の条件下への植元換元実験を行うと,コロニー構成細胞の一部にMMCの性質を有する細胞が出現し,植元換元を重ねる毎にIL4非依存性のクローンが出現した. IL3, IL4両者に依存性のある細胞株IC2を用いてIL4のシグナル伝達機構について検討中であるが, IL4は細胞内Ca^<2+>濃度やプロテインキナーゼCの活性化に関与していないようである.

一方,プロテインキナーゼCの直接的な活性化物質であるTPAがCTMCの増殖に対しIL4と全く同じ作用を持つことが明らかとなり, IL4とTPAの両者のCTMCにおけるシグナル伝達機構の詳細について検討中である.組織肥満細胞(CTMC)はIL-3のみの存在下では増殖できないがIL-3とIL-4の両者の存在下で持続的に増殖することが明らかとなっている。本研究ではCTMCの増殖に対するIL-4の作用が他の物質によって代用できないか否か検討することにより、CTMCの増殖機構を明らかにすることを目的とした。IL-4に変わる物質としてプロティニキナーゼC(PKC)を活性化(初期におけるPKCの膜分画への移動およびひき続くPKCのdown-regulation)することが解っているフォルボールエステル(TPA)について検討した。IL-3、FPAいずれも単独ではCIMCの増殖を誘導しなかったが、両者の存在下で多数のコロニーが形成された。IL-3とTPAの相乗作用は無血清培養法、CTCの単細胞培養法によっても確認された。PKCを活性化する作用のある他の3種類のフォルボール誘導体には同様の作用が認められたが、PKCを活性化する作用のない3種類のフォルボール誘導体はIL-3存在下においてもコロニーを誘導する作用は全く認められなかった。CTMCの持続的な増殖のためには、IL-3とTPAの両者が常に培養液中に存在する必要があった。IL-3+IL4で形成されるコロニーとIL-3+TPAで形成されるコロニーを比較すると後者の方が分裂速度が早く、大きなコロニーになる傾向があり、コロニーを構成する肥満細胞が小さい傾向がみられた。以上より、IL-3共存下でCTMCの増殖を誘導する物質としてIL-4以外にTPAの存在が明らかになった。TPAはPKCを活性化することにより作用していると考えられるが、IL-4にはPKCを活性化する作用はないことから、今後、両者のシグナル伝達機構を検討することによりCTMCの増殖機構が明らかとなることが期待される。
服薬アドヒアランスの維持を目的とした病院・保険薬局薬剤師の連携プログラムの開発

○研究目的:病院-薬局薬剤師の真の連携を実現するために、病院薬剤師による入院患者の服薬アドヒアランス評価および患者指導データを薬局薬剤師と共有し、患者の外来診療での服薬アドヒアランス総合評価を各種病態・検査値の変化と共に経時的に観察する。さらに、如何なる患者の特性が服薬アドヒアランスの維持に影響を与えるかを薬局薬剤師からの情報をもとに明らかにする。○研究方法:対象は岡山大学病院循環器内科病棟に入院歴のある冠動脈疾患、心不全の慢性疾患患者とし、以下の調査を行った。1,入院患者のこれまでの服薬(服薬アドヒアランスを含む)に関する自己評価、2,病院薬剤師による服薬評価、3,薬局薬剤師による服薬評価、4,外来での病識・薬識の経時的変化調査、である。薬剤師は、患者の入院・外来通院中における病識・薬識・内服コンプライアンスを各5段階で評価を行った。また薬局薬剤師は、処方薬の残数チェックにより、服薬アドヒアランスの厳守度を経時的に評価した。また、心血管リスク因子として脂質検査値(LDL、HDL、TG)、血糖検査値(HbA1C(NSGP)、IRI)や腎機能検査値(Cr、UA、K)を経時的に調査した。さらに、患者の疾病再発率と患者の特性との相関を検討した。○研究成果:計10例の患者情報を収集・解析した。病院および薬局薬剤師間で病識・薬識・内服コンプライアンス評価が一致する場合がほとんどであったが、一部、評価が異なる場合もみられた。アドヒアランスに問題のある患者が抽出され、より効果的な指導や処方提案につなげていくことが可能であることが明らかとなった。また病院との患者情報共有により、適切に患者服薬指導を実施することができたと薬局薬剤師からの高い評価を受けた。今後、研究を継続し、外来患者の薬物治療管理・検査値変化・予後改善について調査を重ねていく。
結晶性ホストへの戦略的機能統合による革新的触媒システムの構築

近年、化石燃料の枯渇や地球温暖化といった環境問題により、持続可能なエネルギー変換システムの構築が求められており、二酸化炭素(CO2)の還元触媒の開発が重要な研究課題となっている。そのため、CO2の還元触媒として様々な触媒が研究されているが、その中の一つに金属ポルフィリン錯体が挙げられる。ポルフィリン錯体はmeso位に様々な置換基を導入することができ、触媒能を向上させることが可能である。そこで、本研究では、金属ポルフィリン錯体の置換基に分子間相互作用を示すピレンを導入することで、CO2還元反応に有利な空間を有するフレームワーク触媒を自己集積化により構築することを志向した。このような考えに基づき、ピレン置換基を有するポルフィリン(H-BPPy)を設計した。そして、このポルフィリンを用いて金属ポルフィリン錯体(M-BPPy)を合成し、CO2還元反応の触媒活性について評価することを研究の目的とした。本年度の研究においては、鉄ポルフィリン錯体(Fe-BPPy)の合成・構造決定・触媒機能評価を実施した。Fe-BPPyの単結晶X線構造解析では、ピレン置換基のCH-π相互作用によりフレームワークが構築されていることが確認された。よってFe-BPPyは、CO2の凝集に適した疎水場と、CO2の活性化に適した近接した活性中心を有するフレームワーク構造を自己集積化により構築できることが示唆された。そこで、Fe-BPPyの結晶を担持したカーボンクロスを作用電極とし、CO2を飽和させたNaHCO3水溶液中で定電位電解を行った。その結果、還元反応が進行し、COとHCOOHの生成が確認された。また得られた触媒能をピレン置換基を持たない錯体(Fe-TPP)と比較したところFe-BPPyのCOの生成におけるファラデー効率はFeTPPと比較して大きくなることが明らかになった。本研究では、相補的相互作用サイトを有するポルフィリン分子を用いた結晶性ホストの創出ならびに結晶性ホストの疎水的空間を利用した物質変換反応系の構築を目指し、研究を行っている。本年度の研究においては、鉄ポルフィリン錯体にピレン置換基を導入することで、フレームワーク構造が構築可能であること、また得られたフレームワークを用いた場合、フレームワーク構造を持たない錯体と比較して触媒能が向上することが確認された。したがって、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。今後の研究においては、ピレニル置換基以外の置換基を導入したポルフィリン錯体を新たに合成し、異なる反応場を有するフレームワーク構造の構築を行う。得られたフレームワークについて反応場の構造・物性・触媒能を詳細に調査し、反応場が触媒能に与える影響について系統的な評価を行いたいと考えている。導入する置換基の一例としては、まず相補的相互作用を示すことが期待できるアレーンーパーフルオロアレーン型サイトの利用を考えている。また水素結合型相互作用サイト・D-A型相互作用サイト等の比較的強い分子間相互作用を示すサイトの導入についても検討する予定である。いずれの場合においても、金属ポルフィリン錯体の基礎物性を均一溶液中で評価した後、フレームワーク状態での物性評価を行い、両者を比較することで反応場導入の影響を明らかにする予定である。現在我々人類が直面するエネルギー・環境問題を解決に導くために、太陽光や風力等の再生可能エネルギーを有効活用する技術の開発への要請が高まっている。とりわけ、天然の光合成反応を模倣し、太陽光エネルギーを化学エネルギー(水素・メタノール・アンモニア等)へと変換可能な人工光合成技術は大きな注目を集め、精力的に研究が行われている。しかしながら、天然の光合成システムに匹敵する効率を有した光-化学エネルギー変換触媒システムの構築は未達成である。このような研究背景を踏まえ本研究では、高効率な光-化学エネルギー変換システムの構築を志向した新規触媒材料の開発に取り組む。より具体的には、活性中心に対し、光-化学エネルギー変換に不可欠な1光捕集サイト、2電子移動サイト、3基質認識サイトを規則的に配置した「反応場」を合理的に構築する手法を確立し、種々の光ー化学エネルギー変換反応の高効率化を可能にする触媒プラットフォームの創製へと繋げる。平成29年度の研究においては、自己集積化を利用することでフレームワークの構築が可能な置換基を有する金属ポルフィリン錯体を合成し、置換基の導入がその電気化学的特性ならびにCO2還元能へ与える影響を調査した。ピレン置換基を有するフリーベースポルフィリンは、鈴木-宮浦カップリングおよびピロールとの縮合反応により2段階で合成した。また、フリーベース体に金属挿入反応を行うことで金属ポルフィリン錯体を得た。得られた金属ポルフィリン錯体を室オウンで自己集合させたところ、、9.03Å×8.64Åの空孔を有するフレームワークを形成することがわかった。空孔は疎水性で、そのサイズがCO2の分子サイズよりも充分に大きいことが明らかとなった。また、触媒活性サイト間も近接した構造をとっており、基質の認識サイトとして機能することが期待される。平成29年度の研究においては、化学エネルギー産出反応の代表的な例である二酸化炭素還元反応の触媒として機能することが知られる金属ポルフィリン錯体に対し、相補的π-π相互作用サイトを導入することで、“π集積型活性化結晶性ホスト(π-Electronic Activated Crystalline Host, PEACH)"が構築できることを明らかとした。更に得られた結晶性ホストは基質であるCO2の濃縮に適した疎水性空間ならびに近接した活性サイトを有していることも判明した。これらの知見は、本研究で目的とする光ー

化学エネルギー変換反応の高効率化を可能にする触媒プラットフォームの創製の根幹を成す非常に意義深いものである。従って研究はおおむね順調に進展していると判断した。近年、化石燃料の枯渇や地球温暖化といった環境問題により、持続可能なエネルギー変換システムの構築が求められており、二酸化炭素(CO2)の還元触媒の開発が重要な研究課題となっている。そのため、CO2の還元触媒として様々な触媒が研究されているが、その中の一つに金属ポルフィリン錯体が挙げられる。ポルフィリン錯体はmeso位に様々な置換基を導入することができ、触媒能を向上させることが可能である。そこで、本研究では、金属ポルフィリン錯体の置換基に分子間相互作用を示すピレンを導入することで、CO2還元反応に有利な空間を有するフレームワーク触媒を自己集積化により構築することを志向した。このような考えに基づき、ピレン置換基を有するポルフィリン(H-BPPy)を設計した。そして、このポルフィリンを用いて金属ポルフィリン錯体(M-BPPy)を合成し、CO2還元反応の触媒活性について評価することを研究の目的とした。本年度の研究においては、鉄ポルフィリン錯体(Fe-BPPy)の合成・構造決定・触媒機能評価を実施した。Fe-BPPyの単結晶X線構造解析では、ピレン置換基のCH-π相互作用によりフレームワークが構築されていることが確認された。よってFe-BPPyは、CO2の凝集に適した疎水場と、CO2の活性化に適した近接した活性中心を有するフレームワーク構造を自己集積化により構築できることが示唆された。そこで、Fe-BPPyの結晶を担持したカーボンクロスを作用電極とし、CO2を飽和させたNaHCO3水溶液中で定電位電解を行った。その結果、還元反応が進行し、COとHCOOHの生成が確認された。また得られた触媒能をピレン置換基を持たない錯体(Fe-TPP)と比較したところFe-BPPyのCOの生成におけるファラデー効率はFeTPPと比較して大きくなることが明らかになった。本研究では、相補的相互作用サイトを有するポルフィリン分子を用いた結晶性ホストの創出ならびに結晶性ホストの疎水的空間を利用した物質変換反応系の構築を目指し、研究を行っている。本年度の研究においては、鉄ポルフィリン錯体にピレン置換基を導入することで、フレームワーク構造が構築可能であること、また得られたフレームワークを用いた場合、フレームワーク構造を持たない錯体と比較して触媒能が向上することが確認された。したがって、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。平成29年度までに得られた成果を礎に、今後は中心に導入する金属イオン(Mn+)を適宜変更することで、反応活性中心(M = Mn(酸素発生反応)、M = Fe (CO2還元反応)等)または光捕集サイト(M = Zn, Pt等)として機能する新たな結晶性材料の開発に取り組む。また、相補的π-π相互作用サイトとして、更に強固な骨格を構築可能なアレーンーパーフルオロアレーン(Ar-ArF)相互作用型サイトの導入についても検討を行う。
線虫C.elegansの行動の中心的制御遺伝子の探索

線虫C.elegansを材料として、変異体の分離と解析により行動の中心的制御を行う遺伝子を探索する目的で、以下の研究を行った。(i)レリーサーとなる感覚刺激がなくても行動プログラムを発現する変異体の探索法:野生型は、餌の存在下でのみ摂食行動や脱糞行動を行う。餌の非存在下で蛍光ラテックスビーズの腸内への取込みや腸からの排出を測定するアッセイ法を開発した。これにより、餌による摂食行動や脱糞行動の制御に関する変異体を分離できるようになった。(ii)餌の効果が見られない変異体の解析:ブタノンへの走化性行動は行うが餌とブタノンの対提示による学習行動が異常なo1rn-1(ut305)変異体を解析した。細胞特異的プロモーターによるo1rn-1野生型cDNAの強制発現では、ブタノンを受容するAWC感覚神経を含む少数の神経細胞で発現させた場合のみ、表現型が野生型を示した。AWC感覚神経細胞は左右一対の片方でのみstr-2遺伝子を発現することが知られているが、o1rn-1(ut305)変異体ではどちらのAWCもstr-2遺伝子を発現せず、この異常が学習異常の原因らしいことを見つけた。(iii)忌避刺激が行動に与える効果:揮発性の忌避物質や高浸透圧などの忌避刺激を長時間与えた時に、それぞれの忌避行動がどのように変わるかを網羅的に調べ、これらの効果が異常な変異体を同定する基盤を確立した。(iv)感覚統合を調節するHEN-1蛋白質の信号を伝える遺伝子群:HEN-1の受容体の候補であるチロシンキナーゼ型受容体の遺伝子scd-2について、プロモーターを挿げ替えた実験により、神経での発現が野生型表現型に十分なこと、発生の過程でなく完成した神経系で機能することを明らかにした。これらの研究は発展する可能性があるので、新たな研究費により継続させたい。
神経細胞移動の分子機構の解明とてんかんモデルマウスの開発

神経細胞移動は、中枢神経系の形成における重要な発生過程であり、これがうまくいかないと、てんかんや精神遅滞の原因となりうる。我々は、ある自閉症関連遺伝子がアクチン細胞骨格系を制御し、神経細胞移動及び神経突起伸長に関与していることを見いだした。そのノックアウトマウスでは、認知機能障害や不安様行動の低減が認められた。さらに、脳スライスに対する各種キナーゼ阻害剤のスクリーニングから、神経細胞移動に関与する可能性のあるリン酸化酵素を多数同定した。またFocal Cortical Dysplasia様構造を持つマウスを作り出したが、てんかん発作を観察するには至らなかった。(1)平成25年度には、引き続き自閉症関連分子であるAuts2 (Autism Susceptibility Candidate 2)が神経細胞移動に関与していることについての研究を継続している。Auts2はヒト遺伝学から自閉症およびてんかんに関連があることは示唆されていたが、その分子・生理機能については全くわかっていなかった。ただ、神経細胞の核で働くと信じられていただけである。私は、この遺伝子産物AUTS2がRac1およびCd42を介して細胞骨格系を制御するということ、そして神経突起伸長や神経細胞移動に関わるということを明らかにすることができた。また、このノックウアウトマウス個体において、自閉症様行動や精神発達遅滞様行動を示すことも観察されたため、このマウスをAuts2の異常によって引き起こされる精神疾患の動物モデルとして使えるということが明らかになった。(2)前年度から引き続きRac1およびCdk5のドミナントネガティブ体発現ベクターを胎仔脳の様々な特定の領域に導入しその領域での神経細胞移動を阻害したマウス個体をこれまでに多数作製したが、マウス個体ではてんかん様発作を見ることができなかった。しかし一般的に、マウスは抗てんかん性がラットよりも強いことが知られているため、次にラット個体を用いて同様な実験を行っているところである。(1)平成24年度には、新たに自閉症関連分子であるAuts2 (Autism Susceptibility Candidate 2)が神経細胞移動に関与していることを明らかにした。免疫染色により、神経細胞内においては、核にも存在するが、主として神経突起や成長円錐などに強く局在し、アクチン線維と共局在することがわかった。培養細胞系においてAuts2を強制発現させると、Rac1が活性化され、Cdc42が不活性化されることがわかった。また、プロテオミクス解析や生化学実験から、Auts2が二種類のRac活性化因子(RacGEF)と結合することによって、Rac1を活性化させていることが示唆された。また、子宮内エレクトロポレーション法によってノックダウンベクターを発生途上の大脳皮質に導入すると、細胞分化に影響することなく、神経細胞移動が顕著に阻害された。ノックアウトマウスを作製したところ、やはりこの神経細胞移動の異常は再現された。以上から、Auts2は大脳皮質の錐体神経細胞においてRac1を活性化、Cdc42を不活性化し、アクチン細胞骨格系を制御することによって、神経細胞移動に関与することが明らかになった。(2)Rac1およびCdk5のドミナントネガティブ体発現ベクターを胎仔脳の様々な特定の領域に導入しその領域での神経細胞移動を阻害したマウス個体をこれまでに多数作製した。今後数ヶ月から1年以上に渡って、これらのマウスおけるてんかん様症状について詳細に調べて行く。これまでに神経細胞移動に関わる分子経路としては、STEF/Tiam1/P-Rex1-Rac1-JNK-MAP1B-微小管経路、Cdk5-p27-RhoA-cofilin-アクチン経路、N-Cadherinの細胞内小胞輸送経路、などについて明らかにしてきた。本研究では、さらにAUTS2という新たな分子が神経細胞移動に関与するということを明らかにできた。それだけでなく、この分子の異常は、ヒトにおいて自閉症やてんかんを引き起こすことが知られている。そのため、単に神経細胞移動の分子機構の一端を明らかにしただけでなく、その異常によっていかにしてヒトのてんかんや自閉症が引き起こされるのか、について、その病理を知るための第一歩となりうる。そういう意味においても意義深い。神経細胞移動の分子機構に関わる分子について網羅的に調べる予定であったが、AUTS2の機能を明らかにしてんかんとの関連を解析する仕事が大きく展開しそうなので、重点をこの分子の解析にやや置いて行こうと考えている。そのために、多分子のスクリーニングは控えめにして、その代わりAUTS2のコンディショナルノックアウトマウスの作製や、さらにてんかんや自閉症関連行動を観察する行動解析、およびin vitroにおけるAUTS2の解析などに力点を置いて解析する。一部の遺伝子改変マウスの完成が遅れた結果、平成24年度の動物飼育費用への支出が大幅に減少したため、次年度に繰り越した。その分、平成25年度の動物飼育費用がかなり増えることになると思われる。

また、平成24年度に予定していた海外出張に行かなかったので、旅費を平成25年度に繰り越した。平成25年度に成果の発表として海外出張に行く予定である。その他、そのマウスの解析のための、抗体、DNA関連試薬、などのために次年度の支出が見込まれる。
コンピュ-タ利用教育における教授・学習過程の分析とその応用

本研究は、コンピュ-タ-利用教育(CAI)における教授・学習の過程を学習者の生理心理的な側面を中心に分析するとともに、学習者の生理量に関する情報フィ-ドバックのCAIへの応用可能性について検討したものである。一般の、CAIの利点として、個々の学習者の学習状況に応じて適切な教材等を用いた指導ができるという点があげられる。しかし、現在のCAIにおける指導プログラムの多くは、学習者の学習成績に重点をおいた評価を行い、予め与えられた手順に従って指導していく方式を採用している。このため、学習者の学習意欲や学習態度のような人間的な側面が十分にはとり入れられておらず、予期したほどの成果があがっていない。本研究の目的は、(1)CAIにおける教授・学習の過程を脳波・皮膚電位等の生理的な指標を用いて分析し、学習者の集中度や覚醒レベルの変化を明らかにするとともに、(2)その情報を実時間的にフィ-ドバックした場合の、CAIに与える効果の基礎的な検討を行うことにある。まず、CAIを模したコンピュ-タ画面を介して知的作業を行わせた場合の、作業者のパ-フォ-マンスを生理量(脳波。皮膚電位、心拍数)との関連を実験によって求めた。その結果、作業者の集中度や覚醒レベルを反映する生理量として皮膚電位が最もすぐれていることが判明した。そこで、皮膚電位を手がかりとして作業者の覚醒レベルの評価を行い、その情報を作業者にフィ-ドバックすることによって、覚醒レベルをある範囲内に保つことを試みた。その結果、作業のパ-フォ-マンスを維持する上で適切な覚醒レベルの範囲が存在するこ、また、フィ-ドバックを行うに際しては、慣れの問題を考慮に入れる必要のあることなどが見出された。以上から、このような生理量情報のフィ-ドバックを含むCAIの可能性と有用性が示された。
スクールカウンセラーによる多層的アセスメントを用いた適応促進支援方法

本研究は,小学生から高校生を対象に多層的アセスメント(質問紙法・投影法等)を横断的・縦断的研究の見地から実施し,不適応から適応に至るまでのプロセスを解明し,スクールカウンセラーによる有効な心理査定実施法について検討することを目的とした。この目的にそって今年度は以下を実施した。1)質問紙法研究:小学生版の学校不適応感尺度とSCへの関心尺度を作成し,関連について検討した結果,学校不適応感が高いほど,SCへの関心が高いことが明らかになった。また横断的調査(548名)と縦断的調査(313名)を用いて学年差について検討を行った結果,SCへの関心と不適応要因(友人関係問題)及び不適応徴候(情緒面)が小学5年生から6年生間で有意に低下していた。これらの結果は,心理臨床学研究に掲載された。次に,学校不適応を抑制する要因としてロールフルネス(役割満足感:Kato & Suzuki,2018)に着目し,小学生版ロールフルネス尺度を作成し,学年差について検討するとともに,学校不適応感とロールフルネスとの関連についても検討を行い,学会にて発表を行った。高校生においても,3年間の縦断的調査より,学校不適応感とロールフルネスとの関連について検討を行い,学会にて発表を行った。また,学校不適応を抑制する保護要因について文献研究を行い,論文化した。2)投影法研究:小学生におけるSCに対するイメージについてSCTを用いて尋ね,その記述内容について,SCへの関心尺度と学校不適応感尺度との関連について検討を行い,学会にて発表を行った。3)心理査定実施法研究:実施頻度,調査内容の差異が児童・生徒のメンタルヘルスにどのような影響を与えるかについて現在,調査を行っているところである。平成30年度では、小学生と高校生の学校不適応を抑制する要因として,ロールフルネスに着目し,調査を行った結果,ロールフルネスが不適応徴候に至る過程に影響を与えていることが明らかになった。また,小学生のロールフルネスに関して,学年差についても検討し,社会的ロールフルネスは,3,6年生の得点が,4,5年生の得点に比べて有意に高かった。内的ロールフルネスは,3年生の得点が4,5年生に比べて有意に高い等,学年差がみられた。学校適応に関するSCT調査を実施し,SCのイメージに関して記述した内容と学校不適応感及びSCへの関連尺度との関連についても検討を行った。その結果,学校不適応感が高くSCへの関心が高い生徒は,SCに対してポジティブな記述がなされていることを明らかにできた。国内外の学校不適応を抑制する保護要因について文献研究を行い,当該領域の課題点について明らかにした。なお,具体的な今年度の研究全体についての成果としては、関連論文2編、学会発表5編について学術的発信を行うことができた。平成31(令和1)年度では,ロールフルネスがSCへの関心に与える影響過程について検証を行う。また,ロールフルネス以外の学校不適応感を抑制する要因(レジリエンス等)についても,学校不適応感との影響関係について検証を行う。同時に,これらの学校不適応を抑制する要因の学年差についても検討を行う予定である。SCT研究では,先生に関する記述内容と学校不適応感及びSCへの関心との関連について検討を行う。心理査定実施法研究では,SCがフィードバックする際にどのような形式の質問調査がより有効であったかについて検討を行う予定である。

内的ロールフルネスは,3年生の得点が4,5年生に比べて有意に高い等,学年差がみられた。学校適応に関するSCT調査を実施し,SCのイメージに関して記述した内容と学校不適応感及びSCへの関連尺度との関連についても検討を行った。その結果,学校不適応感が高くSCへの関心が高い生徒は,SCに対してポジティブな記述がなされていることを明らかにできた。国内外の学校不適応を抑制する保護要因について文献研究を行い,当該領域の課題点について明らかにした。なお,具体的な今年度の研究全体についての成果としては、関連論文2編、学会発表5編について学術的発信を行うことができた。平成31(令和1)年度では,ロールフルネスがSCへの関心に与える影響過程について検証を行う。また,ロールフルネス以外の学校不適応感を抑制する要因(レジリエンス等)についても,学校不適応感との影響関係について検証を行う。同時に,これらの学校不適応を抑制する要因の学年差についても検討を行う予定である。SCT研究では,先生に関する記述内容と学校不適応感及びSCへの関心との関連について検討を行う。心理査定実施法研究では,SCがフィードバックする際にどのような形式の質問調査がより有効であったかについて検討を行う予定である。協力者にデータ入力等をお願いする予定であったが、今年度使用したデータに関しては,スキャネット用紙等を用いて効率化を図り、謝金が発生しなかったため、次年度未使用額が生じた。ただ,本年度扱いきれなかったデータ(自由記述内容等)も多くあり,次年度にそれらのデータ入力等を協力者にお願いするために謝金が必要である。また,国際学会にて発表する予定をしていたが,都合がつかず参加できなかったため,差額金が生じた。次年度において,今回発表できなかった研究について,発表予定であるため,経費が必要となる。
関節リウマチにおける破軟骨細胞の解析

破骨細胞に形態が似て軟骨組織の近傍にあるため破軟骨細胞と呼ばれている細胞の関節リウマチ(rheumatoid arthritis; RA)における役割を解明することを目的とした。患者組織を用いた研究の結果から破軟骨細胞は軟骨組織を分解する酵素を産生すること、培養細胞を用いた研究の結果から特定のサイトカインの存在下で破軟骨細胞に分化する細胞があらわれることが明らかになり、RAでは破軟骨細胞が軟骨の破壊に働き関節破壊に関与することが示唆された。軟骨や骨組織の破壊により不可逆的な機能障害を生じる関節リウマチにおいて、軟骨の破壊には軟骨細胞や線維芽細胞様滑膜細胞が、骨の破壊には破骨細胞が主に関わると考えられているが不明な点も多い。破骨細胞と同様の多核巨細胞の形態を示し軟骨周囲に存在する破軟骨細胞は、その存在する位置から軟骨の分解に関わると考えられているが、その特性は明らかではない。本研究では関節リウマチ病変部の多核巨細胞の特徴について免疫染色等で解析するとともに、細胞株を用いて病変部で認められるような性質をもつ多核巨細胞への分化条件を検討した。マウス単球細胞株であるRAW264.7を破骨細胞に分化させる際に様々なサイトカインを添加して培養した結果、TNF-α添加によりADAMTS-4のmRNAの発現が亢進することやTGF-β添加によりADAMTS-5のmRNAの発現が顕著に亢進することがreal-time PCRにより明らかになった。また、これらの条件でもTRAPの発現量はコントロールに比べ減少せず、TNF-α添加ではTRAPの発現量は増加していた。これらのことから、関節リウマチにおいて、通常の破骨細胞とは異なり軟骨を分解する性質を持つ破軟骨細胞への分化が誘導されること、この細胞が軟骨の分解と骨吸収に働き関節破壊に関与することが示唆された。関節リウマチでは、軟骨や骨組織の破壊により不可逆的な機能障害を生じる。軟骨の破壊には分解酵素を産生することで線維芽細胞様滑膜細胞や軟骨細胞が関与し、骨の破壊には破骨細胞が関与すると考えられている。しかし、不明な点もある。破骨細胞と同様の多核巨細胞の形態を示し、軟骨周囲に存在することから破軟骨細胞と呼ばれる細胞は、その存在する場所から軟骨の分解に関わると考えられているが、その特性は明らかではない。本研究では、関節リウマチ病変部の多核巨細胞の特徴について免疫染色等で解析するとともに、培養細胞を用いて病変部で認められる細胞と同様の性質をもつ多核巨細胞への分化条件を検討した。免疫染色の結果、病変部の破軟骨細胞において、軟骨の細胞外基質を構成するプロテオグリカンであるアグリカンを分解する酵素ADAMTS-4およびADAMTS-5の発現が認められた。また、これらの細胞は破骨細胞のマーカーであるTRAPが陽性だった。マウス単球細胞株であるRAW264.7に様々なサイトカインを添加した状態で破骨細胞への分化誘導を行ったところ、TGF-βによりADAMTS-5 mRNAの発現が顕著に亢進することがRT-PCRおよびreal-time PCRにより明らかになった。破骨細胞への分化後にTGF-βで刺激した場合には発現量の増加はわずかであり、未分化のRAW264.7をTGF-βで刺激した場合には発現変化は認められなかった。ヒト末梢血単核球を用いて破骨細胞分化誘導時にサイトカインを添加した実験では、RT-PCRの結果、RAW264.7ほど顕著ではなかったもののTGF-β添加でのみADAMTS-5のバンドが検出できた。これらのことから、関節リウマチにおいて軟骨を分解する性質をもつ特殊な多核巨細胞である破軟骨細胞への分化がおこること、この細胞は軟骨の分解と骨吸収に働き関節破壊に関与することが示唆された。分子生物学関節リウマチ病変部の免疫染色とTRAP染色の実験を行った。当初の実施計画を変更し、ヒトの細胞培養実験前に、破骨細胞研究に用いられることの多いマウス細胞株RAW264.7を用いて、ADAMTSS-4, -5の発現に影響するサイトカインの検討を行った。RAW264.7分化におけるmRNAの発現の変化を解析できたため、蛋白質の発現量の変化の解析を行う。ヒトの細胞培養実験を行い、RAW264.7を用いて行った実験と同様の発現の変化が認められるかを明らかにする。細胞培養用の試薬の一部の購入が次年度になったため。学会出張の際に科研費を使用しなかったため。RAW264.7およびヒト細胞培養を行い、分化誘導するためのサイトカインや培地の購入にあてる。また、mRNAおよび蛋白質の発現量の変化を調べるため、real-time PCR用の酵素やプローブおよびウエスタンブロット用の抗体やメンブレンの購入に使用する。
血小板の接着反応における複合糖質の関与

マウス大腸癌由来の株細胞(colon26)を脾臓に注入して惹起した肝腫瘍を癌転移のモデル系として組織化学的検討を行うと、癌細胞はしばしば血小板の凝集を伴って肝内血管壁に接着し、またECAレクチン(Erythrina crystagalli agglutinin)に強く染色される傾向を示した。colon26細胞の可溶化膜画分より、ECA-Sephar ose結合成分として分子量130kDa糖蛋白を主成分とする複数の糖蛋白質が回収された。このECA陽性糖蛋白質を添加すると、癌細胞と血小板との接着性は有意に抑制された.特に130kDa糖蛋白質の糖鎖は、tunicamycin前処理により消失することから、N-グリコシド型糖鎖であり、かつα2-6シアル酸や、フコース残基を有していることが明らかとなった.癌細胞表面にあるECA陽性糖鎖の性状と、血小板との相互作用について更に検討するために、単層培養したcolon26細胞に、各種複合糖質存在下でPRP(多血小板血漿)を添加し、血小板の接着を計測した.対照としてPPP(貧血小板血漿)を添加した。ECA結合糖の主成分とされるラクトサミン糖鎖に、各種のシアル酸やフコースを付加した合成糖鎖を添加して、血小板と癌細胞との接着性を検討すると、フコシルラクトサミン型の糖鎖や分岐型ラクトサミン糖鎖が、血小板と癌細胞との接着を強く阻害することが示された。これらの所見より、ECA陽性のシアリルフコシルラクトサミンを含んだN-グリコシド型糖鎖が、血小板を介した細胞間相互作用に関与していることが考えられる。N末アミノ酸配列の解析結果から、130kDa糖蛋白質はα_5インテグリンと類似しており、抗α_5インテグリン抗体を添加すると、癌細胞と血小板との接着性が有意に阻害されることも明らかとなった。インテグリンファミリーによる接着反応と糖鎖の関連性についても注目に値する。マウス大腸癌由来の株細胞(colon26)を脾臓に注入して惹起した肝腫瘍を癌転移のモデル系として組織化学的検討を行うと、ガン細胞はしばしば血小板の凝集を伴って肝内血管壁に接着し、またECAレクチン(Erythrina crystagalli agglutinin)に強く染色される傾向を示した。ECA陽性糖蛋白質は、分子量130kDa糖蛋白を主成分とする複数の糖蛋白質であり、この成分を添加すると、癌細胞と血小板との接着性は有意に抑制された。そこで癌細胞表面にあるECA陽性糖鎖の性状と、血小板との相互作用について更に検討するために、単層培養したcolon26細胞に、各種複合糖質存在下でPRP(多血小板血漿)を添加し、血小板の接着を計測した。130kDa糖蛋白質の糖鎖は、tunicamycin前処理により消失することから、N-グリコシド型糖鎖であり、かつα2-6シアル酸や、フコース残基を有していることが明らかとなっている。