hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代高精度ミラー製作のための法線ベクトル追跡型高速ナノ精度形状測定法の開発

第三世代放射光施設やX線自由電子レーザー、極紫外光リソグラフィー、多くのデジタル映像機器からは、多種多様の形状を持つ高精度ミラー・レンズが要請されている。本研究の目的は、平面から平均曲率半径10mm以下の自由曲面の形状を、測定精度1nm PV以上、スロープエラー0.1μrad以下、測定時間5min/sample以下で測定できる法線ベクトル追跡型高速ナノ形状測定法を開発することである。提案した形状計測法の原理は、レーザーの直進性を活用し、光源から出射されたレーザービームがミラーに反射されて、光源の位置にある検出器の中心に戻るように2軸2組のゴニオメータを制御して、ミラーの任意測定点(座標)の法線ベクトルを測定することから形状を求める。法線ベクトルの測定から形状を求めるため、従来の干渉法と異なり基準面を必要とせず、原理的に測定形状に制限がなく、自由曲面の絶対形状測定が可能になる。高速ナノ形状測定装置の精度を支配するロータリーエンコーダを国家標準器により絶対校正した結果、不確かさは±0.12μradであり、さらにオンマシン校正でも不確かさに変化が無かった。また、波動光学シミュレーションによって検出器上でレーザー光強度がガウス分布になる光学配置を設計し、平均曲率半径10mmから平面までの形状測定を可能にする光学ヘッドを製作した。そして、校正したロータリーエンコーダと光学ヘッドを搭載した高速ナノ形状測定装置を完成した。本装置によって、R=100,400mm,1000mm凹球面ミラーとR=47mm基準球、平面ミラー、非球面ミラーの形状を測定した。非球面ミラーの形状測定において、再現性は0.37 nm(標準偏差)、1.60 nm PV(偏差値相当)を最終的に達成した。位相シフトフィゾー干渉計による形状測定と比較すると、それぞれの系統誤差範囲内である±5nm PV以下で一致した。極紫外光(波長13.5nm)を用いたリソグラフィー、多くのデジタル映像機器からは、多様な形状を持つ高精度ミラー・レンズが要請されている。提案した形状計測法は、レーザーの直進性を活用し、光源から出射されたレーザービームがミラーに反射されて、光源の位置にある検出器の中心に戻るように2軸2組のゴニオメータを制御して、ミラーの任意測定点(座標)の法線ベクトルを測定することから形状を求める。そのため、従来の干渉法と異なり基準面を必要としない。高速ナノ形状測定装置の精度を支配するロータリーエンコーダを国家標準器によって絶対校正した結果、各ロータリーエンコーダは、装置取付け時の偏心や負荷の影響を考慮しても校正の確からしさは±0.12μradである。また、波動光学シミュレーションによって検出器上でレーザー光強度がガウス分布になる光学配置を設計し、平均曲率半径10mmから平面までの形状測定を可能にする光学ヘッドを新たに製作した。そして、校正したロータリーエンコーダと新しい光学ヘッドを搭載した高速ナノ形状測定装置を完成した。そして、本装置によって、R=400mm, 1000mm凹球面ミラーとR=46.8mm基準球、平面ミラーの形状を測定した。
昆虫培養細胞クローニング法の開発

昆虫培養細胞のクローニングは限られた細胞系でしか成功していなかったので,より汎用性のある方法の開発を目的とした。1.単細胞分離法:単細胞を分離するためには,単細胞増殖用培地に〓〓した希釈細胞浮遊液から,倒立顕微鏡下で無菌的に先端を直径20μmになるように引き伸したガラスキャピラリーで吸引する方法が有効でまた効率も良く,十分実用的であった。2.単細胞増殖用容器:分離した単細胞に培養細胞が分泌する増殖促進物質を供給しながら培養するために,メンブランフィルターで作った円筒をシャーレに接着した容器を作った。円筒内に分離した単細胞を入れ,周辺で親細胞通常培養を行い,ある程度の増殖が得られた。3.単細胞増殖用ゲル化培地:精製寒天の1種であるSea Plagaeアザロース0.2%を含む培地での細胞生存率,コロニー形成率,細胞分裂率が良いことが判明したが,クローン分離には至らなかった。4.単細胞増殖用馴化培地:クローニングする細胞系で7-10日間培養した培地上清と富栄養価培地MGM-450の等量混合培地で単細胞を増殖させることができた。しかし馴化培地を使ってもクワゴマダラヒトリ細胞のクローニングは成功しなかった。5.クローンの特性:得られたクローンの特性を調べたところ、分離後比較的早期に形態,大きさなどが不均一になり,染色体数も大きな変異巾を示した。これらの変異は親細胞集団で見られるものと同様であった。また増殖性も親細胞集団と差がなかった。6.クローンのウイルス感受性:アワヨトウ由来細胞系のクローンのキアシドクガ核多角体病ウイルス感受性を調べたところ,親細胞より多角体形成率の高いクローンがいくつか見られた。7.クローンの保存:10%グリセリン添加で凍結保存可能であった。本年度は主として単細胞クローンの分離法を検討した。ミクロマニプレーターによる分離は時間がか丶り、効率が悪かった。希釈細胞浮遊液分注法は簡単であるが、細胞1個だけを含だウエルを検出するのに時間がか丶り、また細胞が1個だけ分離されたことを確認することが困難であった。いろいろな方法をテストした結果、先端を20μm位に引き伸したパスツールピペットにゴム管を接続し、フリーハンドで操作して、十分希釈した細胞浮遊液から顕微鏡下で細胞1個を吸り上げて、マイクロテストプレートに移す方法が良いことが分った。この方法により、なれれば1時間に60個位の単細胞を拾うことができた。次に上の方法で、ヨトウガ血球由来、脂肪体由来、およびアゲハチョウ卵巣由来細胞のクローニングを試みた。クローニング培地にはそれぞれの細胞がプラトーレベルに達するまで培養したMM培地を馴化培地とし、これと10%FBS含有MGM-450培地とを等量混合したものを用いた。クローニング成功率は細胞系により非常に異った。ヨトウガ血球細胞系、脂肪体細胞系、アゲハチョウ卵巣細胞系で、1回以上分裂した細胞はそれぞれ86.7%、73.3%、3.3%で、クローン分離可能なまでに増殖した細胞は23.3%、3.3%、0%であった。クローン分離用容器として、メンブランフィルターで円筒を作り、それをシャーレに固定してその中で分離した細胞を培養し、円筒の外側で同種細胞の集団培養を行う方法を検討したが、メンブランフィルターの透過性に問題があり、目下材料を検討している。

半固型培地によるクローニング法も検討し、そのための培地凝固剤として寒天由来製品各種をテストしたが、いずれも細胞に毒性を示した。クローンが分離された時にその性質を評価するために、数種培養細胞系について、ウィルス感受性を調べた。昨年度確立した単細胞分離法を用い,昨年度に引き続き馴化培地によるクローニングの条件の検討とクローニング効率の改善を行った。まず,比較的密度依存増殖性の弱いヨトウガ幼虫血球由来NIAS-MaBr-93を用い,培地の馴化条件を検討した。その結果,細胞が飽和密度に達する時期,すなわちMM培地を用いた場合25°C培養で7-10日目に培地を回収するのが良いことが分かった。MaBr-93細胞による馴化培地とMGM-450培地の等量混合培地でMaBr-93細胞がクローニングできるので,この培地が他の細胞系のクローニングにも有効であるかどうかを検したところ,効果はなく,それぞれの細胞独自の馴化培地が有効であることが分った。このことから馴化培地には細胞種特異性があるように思われたが,逆に,アゲハチョウ蛹卵巣由来細胞系,ヨトウガ幼虫脂肪体由来細胞系,ニクバエ胚子由来細胞系による馴化培地はMaBr-93細胞のクローニングに有効であり,特にヨトウガ脂肪体由来細胞による馴化培地は,分離した単細胞の増殖支持効果が高かった。上の方法で樹立したMaBr-93細胞のクローンについて,その特性を調べた。分離した単細胞に由来するクローンは,分裂をくり返す過程で比較的早期に不均一な細胞集団となることが明らかになった。樹立された連続継代性クローンも形態,大きさは不斉一であり染色体数分布も大体親集団と同じかむしろ広範囲に分散していた。増殖性はいずれも親集団と大差なかった。一方、ハスモンヨトウ近似種Spodoptera frugiperda細胞系を限界希釈法によりクローニングして,得られたクローンのキアシドクガ核多角体病ウイルス感受性を検討した。その結果,親細胞系より多角体形成率が高いクローンが数株得られた。
海底における高忠実度・高ダイナミックレンジ地震観測手法の開発研究

海底に設置を行える自己記録式の強震計の開発を実施した。開発した強震計は内蔵したコンパクトフラッシュメモリーにデータを100Hz1kHzで最大4チャンネル分記録し、リチウム電池駆動により長期間の連続観測が行える。強震計センサーは最大計測加速度が2gであり、センサーを交換することにより最大100gまで計測できる仕様のものを開発した。強震計の設置状態を把握することを目的に強震計には傾斜計も搭載した。強震計の海底への設置法は、強震動時に海底の動きを忠実に描くため重要な検討項目である。そこで、強震計を海底に埋設した金属管に取り付けることにより、海底と地震計との良好な結合をはかる手法の開発を行った。そこで、強震計は、金属管に収納できるサイズとなるよう開発設計を実施した。強震計の開発とあわせ海底への金属管の埋設法を検討し、ピストンコアラーを応用した装置により金属管を海底に埋設する手法を開発した0埋設手法の有効性を確かめるため、相模湾への埋設試験をJAMSTEC研究船「かいよう」にて平成17年12月および「なつしま」にて平成18年12月に実施した。開発した強震計の動作試験は陸上および三陸沖の海底で平成18年7月、相模湾で平成18年12月、伊豆小笠原沖にて平成19年2月にそれぞれ数日3ヶ月程度の期間実施しいずれも良好な記録が得られることを確認した。開発研究の初年度として、今年度は海底強震計に使用する加速度計およびデータロガー周辺の整備、加速度計とデータロガーのインターフェースの確認を実施した。加速度センサーは、陸上の強震観測網に広く用いられているキネメトリクス社Episensorと同等のもので海底への槍を用いた埋設設置に適した直径の小さな筒型タイプを採用することとし、その調達を実施した。次に海底での記録のため小型の耐圧容器に収納が行える大きさで、かつ低消費電力であり自動記録が行えるデータロガーを市販のCPUボードとAD変換器を組み合わせることで製作した。今回製作した、データロガーに調達した加速度計を接続、他種の地震計(広帯域地震計、短周期地震計)とともに陸上に設置して試験観測を実施し、加速度計のノイズおよび試験中に発生した試験場所周辺で発生した地震の記録を得た。記録の解析を行うことにより、加速度計の動作に問題がないこと、微小地震から大きな地震まで高忠実度な観測が行えることを確かめるとともに、データロガーのインターフェースが正しく行えていることを確認した。また、来年度の海底での試験観測に先立って、試験観測の適地の検討を実施した。来年度に利用できる船舶およびその行動海域と時期、海域での地震活動状況の検討を行い、来年度の試験観測を相模湾で行うことが適当であるとの結論を得た。以上の研究結果により来年度には、海底での試験観測に向けての開発が行える目処が立ったと考えられる。
分化型甲状腺癌に伴う結合組織成分の形態学的分析と腫瘍特性との相関性の評価

甲状腺の瀘胞癌・瀘胞腺腫と乳頭癌を研究対象に設定し,それらに伴う『被膜あるいは被膜様基質を形成する結合組織成分』に着目して多角度から定量的ならびに定質的に検索をすすめた。この結果から,腫瘍に隨伴するこれらの結合組織成分には,腫瘍組織型および進行度に相応し,形態学的には微細な腫瘍上皮成分の浸潤・増殖様式をも反映する系統的な所見の差が存在することを明らかにした。まず、『被膜』の共通構造所見を明らかにすることにより,被膜成立の概説が形態学的に始めて裏付けられ,いわゆる腫瘍基質や間質と異なる組成・構築が明らかにされた。一方,コラ-ゲン型分類により,腫瘍の浸潤特性に比例して,増量するタイプIとIIIの存在が一部で明らかになり,とくに定型的な被膜を有する瀘胞性腫瘍のなかでは,これらの増量していく所見から,いわゆるadenomaーcarcinoma sequenceを帰結出来た。加えて,従来着目度の低いこれら非上皮成分からの鑑別診断,とくに瀘胞性腫瘍における難解な良悪性の区別,瀘胞亜型乳頭癌の瀘胞癌からの区別,に有用な所見が明らかにされ,微細な浸潤特性を表現する被膜の数量値的デ-タ,わずかな脈管浸潤に伴うコラ-ゲン型分類による反応分布所見などと合わせ,従来よりも感度の高い形態学診断基準が形づくられたものと考える。本研究の主眼とする臨床病理形態診断におけるこれらの崩芽的知見の確立とともに,実践面においては,研究の過程で開発した“切り出し法"の有効性と応用性も確認でき,附隨的な研究としての筋線維芽細胞および腺様嚢胞癌にみられた新たな知見も有益なものと考えられる。以上の結果は,考察とともに,国内の諸学会において発表し,欧文誌にその詳細を発表した(別紙参照)。その他,ペ-ジェット病・子宮腺筋腫・神経線維腫・副腎癌等についても応用研究として誌上発表した。上記課題の研究対象として,甲状腺手術検体から〓胞腺腫・〓胞癌・乳頭癌の計72例と対照の非腫瘍性病変26例を収集し,各例の結合組織性被膜と間質を中心に約2600枚の検体を作成,HE,vanGieson弾性線維,Alcian青等の染色および各種の抗collagen抗体免疫組織化学染色を行い,これらの染色性の比較所見と量形態測定値を求めdatabaseとした。その分析から,当初の研究命題別に,1)乳頭癌と〓胞性腫瘍には,結合組織成分の構築と形状の差のみならず,組成collagenに顕著な差(I・III型の広汎な非特異的分布vs・IV型の層状分布)が認められ,両腫瘍特性との相関性(第80回日本病理学会総会で発表)とともに〓胞亜型乳頭癌の乳頭癌としての概念確立所見のひとつ(第24回甲状腺外科検討会発表予定)などを評価した。2)〓胞性腫瘍のなかでは,〓胞腺腫と進行〓胞癌のcollagen profilesと被包型あるいは微小浸潤〓胞癌のprofileに質的(IV型の有無とI・III型の分布)および量的(被膜厚とIV型の多寡)な差が認められ,修飾を加えた〓胞性腫瘍のadenomacarcinoma sequence考察に役立つ所見と考えられた(病理関係雑誌に発表予定)。

しかし,3)乳頭癌と非腫瘍性病変の共通所見は非特異的因子にとどまり,これらをもって,末梢肺癌に提唱されている“癈痕癌"の概念を,乳頭癌に敷衍することの困難さを認めた。もっとも非特異的ではあるが,経時的な生体反応を反映する所見として,上記2)の考察に帰趨できる部分は少なくないと考えられる。加えて,4)IV型collagenの対照検体の腺様襄胞癌に特徴的な所見が確認出来,付隨研究成果としてその細胞診断学への応用および腫瘍の本質的構築分析に役立つ方法論をまとめた(第33回日本臨床細胞学会発表)。以上,腫瘍隨伴結合組織に形状構造上の差以上の腫瘍特異的な,診断学に応用可能な所見がいくつか認められ,崩芽的研究課題として,今後の客観的な組織形態学的分析・考察の礎となるdataが蓄積された。今年区は,平成2年度およびそれ以前からのデ-タを基に,(1)統計学的数値デ-タ処理,理論的デ-タ分析,(2)電顕検査による微細構造からの免疫染色反応デ-タの補完,(3)新たに抗エラスチン抗体を用いた検査所見の補完・追試などを行った。これらの結果に,考察を加え,以下の2点に論旨を焦り,研究業績として報告・発表した(裏面参照)。ひとつは,従来から議論の多い瀘胞腺腫と早期瀘腫癌の鑑別に,腫瘍の浸潤特性は結合組織にみられる定量的所見から,(1)被膜の厚さを数値化し,浸潤特性との関連性を明らかにし,(2)被膜の結合組織成分の実質成分との相対部分の所見のとり方を実践面から理論づけ,(3)研究の過程で開発した“切り出し法"および多切切片の重要性・有効性を強調した。ここでは,被膜の増殖が腫瘍成育に対するhostの反応という従来の仮説を数値的に裏づけ,浸潤特性の表現因子のひとつとして位置づけた。次の質的・組成別分析の礎となる研究成果も得られている。もうひとつは,主にコラ-ゲン型分類により,いわゆる問質と被膜の差を明らかにし,弾性結合組織および基底膜様物質の分布を含め,瀘胞性腫瘍に特微的な被膜の存在を証明し,その成立機序も理論的に形づくった。コラ-ゲン・タイプIVとIおよびIIIが,この理論展開に有意な分布を示した点を基に,瀘胞性腫瘍と乳頭癌の本質的な結合組織成分の差を明確にし,診断学的に問題の少なくない瀘胞亜型乳頭癌をこの結合組織成分から位置づけた。さらに,瀘胞性腫瘍に伴う“被膜"部分の組成差と浸潤特性の関連性を捉え,前述の量的な差を質的に補完する結果を導くことが出来た。なお,附髄的に,同様の検索から,特殊癌の腺様嚢胞癌と筋線維芽細胞から成る反応性偽腫瘍の病態を明らかにし,附加研究業績とし報告した(裏面参照)。
哺乳動物における中枢神経伝達路の再生に関する研究

従来哺乳動物の中枢神経伝導路は、再生しない、若しくは極めて部分的な再生しか起こらないとされてきた。しかし、京都大学川口らによるネコ小脳遠心投射に関する先駆的研究(J Comp Neurol245:258-273,1986)により、限定を受けない完全再生が可能であることが明かとなった。私たちは、哺乳動物の中枢神経伝導路は、どんな経路であれ、潜在的には極めて大きな再生能を有しているとの観点から、ラット(845日齢)の錐体路の切断実験を行った。錐体路の標識にはWGA-HRPを用い、大脳皮質のトレーサー注入部位から脳幹、脊髄においては仙髄の下端まで錐体路の全走行にわたって観察した。その結果、部分的な再生も含めると、42匹全てのラットにおいて、何らかの再生が観察された。42匹のうち30匹においては、切断部にグリア癜痕若しくは嚢胞が形成され、再生線維が延髄切断部を僅かに越える、あるいは異所性の走行をきたすといった限定的な再生を示した。一方、42匹のうち12匹においては、グリア癜痕あるいは嚢胞いづれも形成されず、ほぼコントロールに匹敵する、完全再生が観察された。すなわち、再生線維は延髄錐体部を通過し、錐体交叉を形成したのち、後索を下降し、後角に終末を形成しつつ、仙髄にまで達した。本課題科学研究費の支援を受け、以上の成果をNeurosci Lett247:151-154,1998に発表した。哺乳動物の中枢神経伝導路は再生しないとされるが、条件さえよければ著名な再生を示す。当研究室では、予備実験でラットの錐体路が再生し得ることを観察しており、本研究で、再生に適切な条件の解明を試みた。835日齢のWistar系ラット45匹を用いた。ネンブタール麻酔下(40mg/kg,i.p.)に、腹側から頭蓋底骨を削除し、延髄を露出した。手術用顕微鏡下に錐体路を確認し、脳底動脈を正中の目印として、直視下に、片側を切断した。術後4日9ヶ月の後、WGA-HRPを用いた錐体路の順行性標識を行い、再生の有無を観察した。また腰髄レベルでの再生線維の占める面積を画像解析装置を用いて計測し、再生の程度を定量化し、regeneration index(RI)とした。また切断部局所の状態を、Neutral Red染色及び、Holzer染色で観察した。45例中、8例で著明な再生が認められ、2例は貧弱な再生であった。また術後早期観察された2例では,再生の途中経過が観察された。残り33例では、局所にglial scarが形成され再生は失敗に終わっていた。再生の起こった最高齢は29日齢であった。著明再生例では、controlと同じく再生繊維は切断部局所を通過し、錐体交叉を形成した後、後索を下降し仙髄に達した。RIはいずれも90%以上を示した。Neutral Red染色体及び、Holzer染色では、glial scarを認めなかった。以上より、従来の報告より、かなり進んだ日齢でもラット錐体路の自然再生が起こることが判明した。また、再生を規定する因子は、日齢よりもglial scarの形成の有無によるところが大きい。このことは、臨床治療として神経修復を考える場合、glial scarの形成抑制が重要であることを意味する。新生ラットでは脊髄髄節を摘出しても、胎仔脊髄の相同部位を移植することにより、下肢の運動機能が回復する(Kawaguchi et al,Nature367:1994)。しかし、この方法を、脊損治療を想定し成ラットにそのまま応用することは困難である。一旦成熟した中枢神経はOligodendrocyte,CNSmyelinの存在により再生しないものとされている。本年度我々は、限定されてはいるが適切な条件下で、成ラットの損傷錐体路が再生することを見出した。Wistar系ラット(4752日齢)の錐体路を、parapharyngeal routeにより延髄の高位で、顕微鏡下に片側切断した。引き続き切断部に15日齢の胎仔脳組織片を移植した。組織片は、cephalic及びpontine flexureを指標として橋・延髄を摘出し、さらにその腹側1/2を切り出し、損傷部に対する相同部位としたものである。移植後32日21ヶ月後、切断側の感覚運動野にWGA-HRPを注入し、錐体路の順行性標識を行い、再生線維の切断部での状態、走行経路、終止を観察した。9例中5例(56%)で切断部を乗り越える線維が観察された。良好再生例では再生線維は切断部において若干の配列の乱れを生じるものの、延髄切断部を通過し、錐体交叉を形成したのち、後索を下降し、仙髄にまで達した。つまり正常の経路を辿り、正常部位に終末を形成した。このことは同種胎仔の相同部位脳組織の移植により、損傷錐体路の再生が誘導されることを示し、臨床においては、中枢神経伝導路の再建による脳機能の修復という治療概念の理論的根拠となるものである。

しかし、京都大学川口らによるネコ小脳遠心投射に関する先駆的研究(J Comp Neurol245:258-273,1986)により、限定を受けない完全再生が可能であることが明かとなった。私たちは、哺乳動物の中枢神経伝導路は、どんな経路であれ、潜在的には極めて大きな再生能を有しているとの観点から、ラット(845日齢)の錐体路の切断実験を行った。錐体路の標識にはWGA-HRPを用い、大脳皮質のトレーサー注入部位から脳幹、脊髄においては仙髄の下端まで錐体路の全走行にわたって観察した。その結果、部分的な再生も含めると、42匹全てのラットにおいて、何らかの再生が観察された。42匹のうち30匹においては、切断部にグリア癜痕若しくは嚢胞が形成され、再生線維が延髄切断部を僅かに越える、あるいは異所性の走行をきたすといった限定的な再生を示した。一方、42匹のうち12匹においては、グリア癜痕あるいは嚢胞いづれも形成されず、ほぼコントロールに匹敵する、完全再生が観察された。すなわち、再生線維は延髄錐体部を通過し、錐体交叉を形成したのち、後索を下降し、後角に終末を形成しつつ、仙髄にまで達した。本課題科学研究費の支援を受け、以上の成果をNeurosci Lett247:151-154,1998に発表した。
去勢抵抗性前立腺癌におけるFGFR2IIIbを用いた新規治療戦略の開発

前立腺癌細胞株の薬物療法感受性と遺伝子発現プロファイルの違いの関連について解析、FGF-FGFRファミリーおよびその関連分子群を中心に、注目した分子群について臨床検体での解析を進めた。FGF19は、非癌症例、HSPC症例に比較してCRPC症例において有意に高値であり、病勢進行と血清濃度との関連は腎細胞癌および尿路上皮癌症例に比較して著明にみられた。また、薬物療法への奏効とFGF19濃度の低下との間に関連が示唆された。PRL1は根治的前立腺全摘除術組織標本での解析において再発症例での高発現を認め、また、CRPCや高悪性度症例での高発現を認めた。1CAST libraryを比較し、膜蛋白であるProtein Tyrosine Phosphatase of Regenerating Liver 1 (PRL1)に注目し、根治的前立腺全摘除術組織標本および前立腺癌細胞株を用いて解析を行った。組織標本においてPRL1は小胞体に局在し、正常前立腺組織と比較して前立腺癌組織で高発現しており、特に去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)や高悪性度症例で高発現していた。またPRL1の発現した前立腺癌は有意に予後不良であった。前立腺癌細胞株においてPRL1は前立腺癌の増殖と遊走、浸潤に関与していた。2Fibroblast Growth Factor(FGF)-FGF receptor (FGFR)ファミリーについて前立腺癌組織における発現解析を進めた。これらのうち、内分泌性FGFサブファミリーであるFGF19に注目し、根治的前立腺全摘除術組織標本および患者血清を用いて解析を行った。組織標本におけるFGF19陽性群は陰性群に比較してPSA再発率が有意に高く、多変量解析でFGF19陽性はPSA再発の独立した予測因子であった。患者血清において血中FGF19濃度は高悪性度症例で有意に高値であった。3去勢抵抗性前立腺癌となった段階での前立腺組織(針生検)および血清の保存を継続的に行っている。2FGF-FGFRファミリーのうち内分泌性FGFサブファミリーであるFGF19、FGF21、FGF23について、去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)症例における血清濃度を測定、非癌症例、ホルモン感受性前立腺癌(HSPC)や腎細胞癌、尿路上皮癌症例における血清濃度と比較した。4引き続きCRPCとなった段階での前立腺組織(針生検)および血清の保存を継続的に行っている。内分泌性FGFサブファミリーを中心に有意なデータが得られている。4本研究において、それぞれの癌種における臨床病理学的因子および血液生化学所見とFGFファミリー血清濃度の関連についても解析し、その過程で新たに得られた臨床病理学的背景と予後との関連について論文発表した。CRPCの薬剤耐性にかかわる分子機構におけるFGFーFGFRとその関連分子群について研究し、いくつかの候補分子をピックアップすることができた。今後は臨床検体におけるにおけるそれらの発現解析と臨床経過およびの関連、さらに前立腺癌細胞株への導入もしくはノックダウンによる機能解析を進めていきたい内分泌性FGFサブファミリーを中心に有意なデータが得られているので、臨床検体におけるにおけるそれらの発現解析と臨床経過およびの関連、さらに前立腺癌細胞株への導入もしくはノックダウンによる機能解析を進めていく予定である。前立腺癌
理科教育における臨床的研究と理科教師教育への適用

授業研究は、授業における構成要素である教師、子ども、教材の動的関係を時間経過に伴って追求する必要がある。教員の資質能力として、授業を分析研究する能力の育成を図ることも重要である。過去2カ年は、小、中学校の協力校でいくつかの理科授業を収録しながら、評価分析する視点を再度検討した。その方法として小倉(2003)の方法を中心に研究を深めた。その分析視点は、大まかには4視点であり、(1)教育する事柄の工夫(学習課題、教育内容の扱い、学習方法の工夫、前時間との関連性)、(2)教育技術(授業形態、教材・教具、学習状況評価)、(3)学習活動の活性化(学習支援、子どもの主体性・意欲の喚起、学習時間)、(4)学習環境(信頼関係、学級づくり、環境整備)である。この方法の利点は、教師自身がどのように創意工夫したかを第三者が客観的に判断する視点を与えることになり、評価者がどのように判断する傾向があるかも明らかにすることにもなる。2007度は、これまでと同様に小、中学校の協力校でいくつかの理科授業の収録を進めた。これまでの授業記録の収集から、2台のビデオカメラにより理科授業を的確に記録する方法について確立できた。また、教員養成学生が、上記の授業分析の視点((1)から(4))から授業を観察評価することができるかを明らかにしてきた。具体的には、学生に中学校理科授業ビデオを視聴しながら、教師のどのような行動が優れているか、あるいは問題があるかを逐次評価する能力を調査した。調査対象として教育実習経験がある群(教員養成課程3年=合計5週間の実習後)と無い群(環境教育課程2年)の各30名程度とした。その結果、(1)教育実習を経験した学生は、上記の視点(1)から(3)の観点から評価し、優れている面と問題がある点の両面を指摘することができた。(2)一方、教育実習の経験が無い学生は、おもに、教材・教具などについての観点((2)の一部)を評価し、評価観点の広がりは少ないことが明らかになった。さらに、(3)理科教育法の講義に「優れた理科授業とは」を解説した後では、両群とも、観点の大幅な拡大が見られ、理科授業の見方が多様になったことが分かった。(1)授業研究を行う際には、第一の視点として、授業の計画としての学習指導案のあり方から検討を始め、授業の実際の中で学習指導案は具体的にどのようなかたちで展開されていくかが重要である。第二の視点では、教師の持つ授業スキル(技術)が重要である。授業における教師の指導スキルは、発問、助言、板書、机間指導、ノート指導、評価などである。指導技術の他に理科の場合、観察実験の準備、観察実験の指導助言(安全指導などを含む)、観察実験のデータ処理、考察などの指導が重要になる。理科授業をより具体的に分析するためには上記の2視点をふまえ、目標-計画-実施(授業)-評価を一連の活動として検討を重ねるべきである。

(2)今年度の研究調査は、愛知県岡崎市立小学校3校、中学校3校の理科授業を対象に、(1)学習指導案の目標・計画の検討、(2)授業の記録、(3)授業後の研究協議を通した授業研究を展開した。(1)の検討では同市の理科指導員を交えた事前検討会を通して、教材の最適化、展開の検討などを進め、学習指導案の改善を目指した。(2)では(1)で検討した学習指導案に基づいて担任教師が授業を実施した。授業過程は、教師の指導活動、児童生徒の学習活動、特定グループの学習活動について3台のビデオカメラで録画した。なお、教師の活動にはワイヤレスマイクにより教師の発話記録を、児童生徒用はズームマイクを使用し発話記録を録音した。(3)は授業を担当した教師、同校の理科教師または同じ学年の教師、岡崎市理科指導員、研究代表者(吉田)が約1時間の研究協議を行い、授業者の反省点、授業展開の自己評価、指導員および研究代表者からの指導助言を行った。(3)上記の学習指導案、ビデオ記録およびプロトコール化、研究協議の記録は編集し、データベース化を図っている。(4)教師教育への適用の試みとして、上記の授業について理科専攻の大学院生、学生(4年次生、3年次生)を対象に、授業ビデオとプロトコール(発話)から理科授業の逐次評価、総括評価を行った。今後、理科教員からの逐次評価、総括評価も進める予定である。授業研究は、授業における構成要素である教師、子ども、教材の動的関係を時間経過に伴って追求する必要がある。昨年度の研究は、おもにどのように授業を記録するかを中心に展開してきた。特に、2台のビデオカメラを使用し、一方は教師の行動を、他方は児童生徒の全体活動や班・個別別活動をポイントを決めた収録する方法について実証的に研究した。今年度は、(1)小中学校の協力校でいくつかの理科授業を収録しながら評価分析する視点を再度検討し、小倉(2003)の方法を中心に行うことを検討した。その分析視点は、大まかには4視点であり、(1)教育する事柄の工夫(学習課題、教育内容の扱い、学習方法の工夫、前時間との関連性)、(2)教育技術(授業形態、教材・教具、学習状況評価)、(3)学習活動の活性化(学習支援、子どもの主体性・意欲の喚起、学習時間)、(4)学習環境(信頼関係、学級づくり、環境整備)である。この方法の利点は、教師自身がどのように創意工夫したかを第三者が客観的に判断する視点を与えることになり、評価者がどのように判断する傾向があるかも明らかにすることにもなる。さらに、(2)教員養成学生がどのような視点から授業を観察評価することができるかを明らかにしている。学生に授業ビデオの視聴から、教師のどのような行動に目を向けて評価できるかを調査した。その結果、教育実習を経験する以前の学生は、上記の視点(2)の教材・教具に観点が集中しているのに対して、教育実習を経験した学生は授業技術や学習環境などの他の観点からの評価に広がり、教育実習以前ではネガティブな評価が多かったが、実習後はポジティブな評価も増加する傾向が見られた。また、専攻する研究分野によっても差異が見られることが明らかになった。今後は、留学生の視点や海外の理科授業も調査対象にする。教員の資質能力として、授業を分析研究する能力の育成を図ることも重要である。昨年度は、小、中学校の協力校でいくつかの理科授業を収録しながら、評価分析する視点を再度検討した。その方法として小倉(2003)の方法を中心に研究を深めた。
理工系大学生の適職発見のためのガイダンス機能を備えたWebシステムの有効性の検討

本研究の目的は、理工系の大学生の職業選択を支援するために、先行研究(JSPS科研費JP 26350333)において開発した「適職発見のためのWebシステム」に新たにガイダンス機能を追加し、学生が自発的に効率よく最適な職業を選択できることを検証する。そのために、次の2つの課題に取り組む。(1)既に開発したWebシステムを支援に用いて、学生が独力で職業選択を行う上で、どのようなガイダンス機能が必要か、及びユーザインタフェースなどの操作性も含めた要件定義を明らかにする。(2)上記ガイダンス機能を実装した新Webシステムが、キャリアカウンセラーを代替し、就職支援を効率的に最適化できるようにする。
哺乳類精子の真空乾燥及び室温保存法の開発：究極の長期室温保存法を目指して

マウス精子を室温保存できれば、凍結保存に比べ、保存スペースが少なくて済み、液体窒素を補充する必要もなく、輸送も容易である。本研究では、マウス精子の室温保存技術を確立するために、トレハロース及び緑茶ポリフェノールを含む保存液を用いて真空乾燥させたマウス精子を室温保存し、復水後の受精率及び発生率を確認した。また、一部の保存精子ついて、1年以上の室温保存を行い、産仔の作出も試みた。その結果、トレハロースの室温保存における有効性が明らかになった。また、1年以上(446日)長期室温保存した精子を用いて顕微授精を行い、得られた受精卵の卵管移植により、正常な産仔の作出に成功した。マウス精子を室温保存できれば、凍結保存に比べ、保存スペースが少なくて済み、液体窒素を補充する必要もない。また、停電時も保存可能であり、輸送も容易である。本研究では、マウス精子の最適な室温保存法を開発するために、トレハロース(Tr)、緑茶由来ポリフェノール(エピカテキン:EC)及びアスコルビン酸(Asc)を含むTris-EGTA緩衝液(TE)を保存液として種々の条件下でマウス精子の室温保存を行った。まず、1.5mlマイクロチューブ内及びスライドグラス上にて真空乾燥させた後、真空のデシケーター内にて1週間室温保存した。また、一部のマイクロチューブは、1年以上室温保存した。保存後、復水した精子は、顕微授精(ICSI)にて未受精卵に顕微注入された後、受精能及び胚盤胞までの発生能を確認した。また、1年以上室温保存した精子について、ICSI後に得られた受精卵を卵管移植し、産仔の作出を試みた。マイクロチューブで保存した場合の胚盤胞への発生率は、1M Tr+100μM EC+Asc/TE, 1M Tr/TE, 100μM EC+Asc/TE及びTEで各々30%, 34%, 15%及び10%であった。また、スライドグラス上で保存した場合では、各々26%, 21%, 0.5%及び0%であった。これらの結果より、Trの室温保存における有効性が示された。なお、ICSI後の受精率及び2-細胞期への発生率は、各保存液及び保存容器による差は認められなかったことから、精子頭部に存在する卵子活性化因子は、各保存液での乾燥・保存でも変性することなく、精子頭部に存在することが示唆された。一方、1M Tr+EC+Asc/TE液にてマイクロチューブ内で長期室温保存(446日)した精子で、ICSI後、移植したところ正常な産仔が得られた。このことから、Trを含む保存液での長期室温保存の可能性が初めて示された。室温保存したマウス精子は、凍結保存及び凍結乾燥に比べ、液体窒素や低温下で保存する必要がなく、輸送する際も特別な保存容器や温度調節も不要であり、容易に輸送が可能である。我々は、以前より、マウス真空乾燥精子の室温保存法の開発を行ってきた。そこで、本研究では、近交系マウスのC57BL/6J、BALB/c、C3H/HeNおよびDBA/2Nマウス精子をトレハロース(Tr.)、緑茶ポリフェノール(epicatechin:EC)およびアスコルビン酸(Asc.)を含むTris-EGTA液に懸濁させ、真空乾燥した後、室温保存し、系統間における復水後の受精能および発生能を確認した。C57BL/6J、BALB/c、C3H/HeNおよびDBA/2Nマウスの精巣上体尾部より採取した精子を、α-hemolysin処理した後、保存液(1.0M-Tr /Tris-EGTA-100μM EC+100μM Asc.)に懸濁し、50μlずつ2-Dチューブに移した。これらの2-Dチューブをデシケーター内に移し、一晩、室温下にて真空乾燥を行った後、7日間常圧下にて室温保存した。保存後、精子を復水させ、BDF1雌マウスより採取した未受精卵を用いてICSIを行い、受精率および胚盤胞への発生率を確認した。7日間室温保存したC57BL/6J、BALB/c、C3H/HeNおよびDBA/2Nのマウス精子の受精率は、各々95.8%、100%、91.7%および90.0%であった。また、2-細胞期胚への発生率は、各々95.7%、96.9%、100%および94.4%であり、受精能および2-細胞期胚への発生率では、系統間に有意な差は認められなかった。一方、胚盤胞への発生率は、各々13.0%、59.4%、50%および5.6%であり、BALB/cおよびC3H/HeNマウスの室温保存精子の胚盤胞への発生率は比較的良好であったが、C57BL/6JおよびDBA/2Nマウス精子では低値を示し、系統差が認められた。

その結果、トレハロースの室温保存における有効性が明らかになった。また、1年以上(446日)長期室温保存した精子を用いて顕微授精を行い、得られた受精卵の卵管移植により、正常な産仔の作出に成功した。室温保存したマウス精子は、凍結保存及び凍結乾燥に比べ、液体窒素や低温下で保存する必要がなく、輸送する際も特別な保存容器や温度調節も不要であり、容易に輸送が可能である。そこで、我々は、新規なマウス精子の室温保存法を開発するため、トレハロース(Tr.)、緑茶由来ポリフェノール(エピカテキン:EC)及びアスコルビン酸(Asc.)を含む保存液でマウス精子を乾燥させた後、1週間室温保存した精子の受精能及び胚盤胞への発生能を確認した。また、室温保存精子の形態的な正常性を確認するために、電子顕微鏡を用いた超微形態学的解析、免疫形態学的解析及び精子クロマチンの構造解析を行った。Tris-EGTAを基本液として、Tr.,EC及びAsc.を種々の濃度で含む4種類の保存液で精子を乾燥・保存した後、これらの保存精子を用いて顕微授精し、受精能を確認したところ、4種類の保存液間では差は認められなかったが、胚盤胞への発生能は、1.0M Tr.,100microM EC及びAsc.を含む保存液で最も良好であった。室温保存した精子の超微形態学的及び免疫形態学的解析では、4種類の保存液の間での微細構造に差は認められず、いずれも精子頭部細胞膜が欠損していることがわかった。一方、精子クロマチンの構造解析(SCSA)では、いずれも精子クロマチンのダメージは少なかった。更に、Tr.+EC+Asc./Tris-EGTAを含む保存液で乾燥後、半年間室温保存した精子を顕微授精し、得られた受精卵を移植したところ、正常な産仔が得られた。これらのことから、精子は、乾燥、室温保存あるいは復水の過程で、精子頭部の細胞膜は破壊されるが、精子クロマチン構造は正常に保持されており、受精能及び発生能も有していることが明らかになった。また、半年間の室温保存でも精子は、受精後、正常な産仔に発生し得ることが初めて示された。今までの研究において、マウス真空乾燥精子の室温保存における、トレハロース(Tr.)、ポリフェノール(epicatechin: EC)およびアスコルビン酸(Asc.)の有効性を明らかにすると共に、これらを含む保存液にて、約1.5年室温保存した精子から、産仔を得ることに成功した。しかし、未だ産仔への発生能が低いことから、保存液、乾燥・保存法の検討が必要である。そこで、本研究では、Methyl-beta-cyclodextrin(MBCD)を用いて、コレステロールを除去した精子を真空乾燥・室温保存し、復水後の受精能および発生能を確認した。精巣上体尾部精子を、0mM, 0.75mM, 7.5mMおよび75mM MBCDで前処理後、1M Trを含むTris-EGTA-100μM EC + 100μMAsc.保存液に各々懸濁し、マイクロチューブに移した後、デシケーター内で、一晩、室温下にて真空乾燥を行い、常圧下にて7日30日間室温保存した。保存後、精子を復水させ、ICSIにより受精能および胚盤胞への発生能を確認した。0mM, 0.75mM, 7.5mMおよび75mM MBCDで前処理後、7日間室温保存した精子の受精率は、各々95.7%, 91.7%, 87.2%および86.0%であり、有意な差は認められなかった。また、胚盤胞への発生率は、各々17.8%、29.5%, 0%および5.4%であった。一方、30日間室温保存した精子の受精率は、各々97.1%, 95.7%, 90.9%および86.1%であり、有意な差は認められなかったが、胚盤胞への発生は0mM (14.7%)および0.75mM (27.3%)のみ認められた。
運動感覚の知覚に関わる神経回路網の解明と知覚強度を示す生理学的評価指標の検討

近年,運動感覚の知覚を治療アプローチとして応用し,ギプス固定による運動機能の低下予防や疼痛抑制に効果があることを示した報告が散見される。これらの運動感覚の知覚に関する研究では,運動を知覚しないような感覚入力をコントロールとして用い,感覚入力自体ではなく,感覚入力によって運動を知覚させることの必要性が論じられている。運動感覚の知覚という心理状況は,被験者の主観を基に評価されることが多く,知覚の誘導を客観的かつ簡便に判断する指標はない。この点において当該研究は,臨床応用を見据え,運動感覚の知覚を簡便に評価するための生理学的指標を確立するというところに意義があった。平成30年度は,昨年度に作成した運動知覚中のAntagonist vibratory responseをオンラインで解析するプログラムを改良し,頭皮上脳波をオンラインで解析するプログラムを試作した。運動感覚の知覚を誘導する感覚入力には視覚入力を用いた。オフライン解析では,運動感覚を知覚している最中には感覚運動皮質より後方から記録したα周波数帯域の脳波に事象関連脱同期が生じることが明らかとなっている(柴田ら,バイオメカニズム,2018)。当該年度は,α周波数帯域の他にβ周波数帯域を解析対象に追加し,運動感覚の知覚が誘導されているかを示すバイオマーカーを検証した。その結果,運動前野と頭頂葉のα周波数帯域における事象関連脱同期を組み合わせることで,運動感覚の知覚が誘導されていることを判別できる可能性が示唆された(投稿中)。平成30年度は,運動知覚が誘起する際に生じるAntagonist vibratory responseをオンラインにて解析するプログラムを改良し,頭皮上脳波を解析するプログラムを試作した。このプログラムを用い,運動知覚を誘導する感覚入力を視覚入力に変更した検証を追加しており,当初予定していた経頭蓋磁気刺激を用いた検証が実施できていないため,区分(4)とした。平成31年度は,平成30年度迄に実施予定であった経頭蓋磁気刺激を用いたAntagonist vibratory response中の一次運動野興奮性の検証および脳磁図の測定を行う。実験デザインに変更はなく,プログラムも作成済みであるため,技術的には問題ないものと考える。近年,この運動感覚の知覚を治療アプローチとして応用し,ギプス固定による運動機能の低下予防や疼痛抑制に効果があることを示した報告が散見される。そこで当該研究では,臨床応用を見据え,運動感覚の知覚を簡便に評価するための生理学的指標を確立するというところに意義があった。平成29年度は,筋腱に対して経皮的に振動刺激を行い,実際には関節運動が生じないにも関わらず,刺激された筋が伸張する方向への運動を錯覚させるという手法を用いて,運動知覚中のAntagonist vibratory responseを測定した。その結果,筋からの感覚入力状況は同じであっても関わらず,運動知覚が生じている状況では知覚した運動の主動作筋の筋活動量が増大することが明らかとなった。このことから,運動知覚が生じているかを客観的かつ生理学的に示す指標の一つとして,筋活動量を用いることができる可能性が示された(Shibata E, Exp Brain Res, 2017)。また,この筋活動と同期した一次運動野の興奮性を検証するため,筋活動をオンラインで解析するプログラムを作成した。平成29年度は,拮抗関係にある筋群からの感覚入力によって運動知覚が誘起する際に生じるAntagonist vibratory response (AVR)を検証した。さらにAVRをオンラインにて解析するプログラムを作成した。しかし,当初はこのプログラムと経頭蓋磁気刺激を用いて,AVRと同期した一次運動野の興奮性を明らかにするところまでを予定していたため,区分(3)とした。

このプログラムを用い,運動知覚を誘導する感覚入力を視覚入力に変更した検証を追加しており,当初予定していた経頭蓋磁気刺激を用いた検証が実施できていないため,区分(4)とした。平成29年度に実施予定であった経頭蓋磁気刺激を用いたAVR中の一次運動野興奮性の検証を行う。実験デザインに変更はなく,プログラムも作成済みであるため,技術的には問題ないものと考える。また平成30年度の実験デザインを踏襲し,AVR中に脳磁図を測定を行う。こちらも,実験デザインに変更はなく,技術的にも問題はないと考える。平成31年度は,平成30年度迄に実施予定であった経頭蓋磁気刺激を用いたAntagonist vibratory response中の一次運動野興奮性の検証および脳磁図の測定を行う。平成29年度に購入を予定していた振動刺激装置の選定に時間を要し,購入を次年度に繰り越したため次年度使用額が生じた。そのため,平成30年度に振動刺激装置の購入で使用する予定である。検証項目の追加に伴い,平成30年度に購入を繰り越していた振動刺激装置を用いた実験を一時中断した。そのため,振動刺激およびAD変換ボード購入予定分が未使用となっている。どちらの機器も平成31年度に購入予定である。
メタボリックシンドロームにおけるリゾホスファチジン酸受容体LPA4の機能解析

リゾホスファチジン酸(以下LPA)は特異的なGタンパク質共役型受容体を介して様々な生理機能を発揮する生理活性脂質である。当研究室において、新規のLPA受容体、LPA4が同定されたが、その機能についてはほとんどわかっていない。本研究では、LPA4欠損マウスを用い、LPA4が肥満に伴うインスリン抵抗性の惹起や脂肪肝の進行に関わることを明らかにした。本研究は、多彩な生理機能を発揮する脂質メディエーターであるリゾホスファチジン酸(LPA)に対する受容体であるLPA4を研究ターゲットとし、本分子がメタボリックシンドロームの進行において果たす役割について明らかにすることを目的とする。平成22年度は、肥満モデルでLPA4欠損マウスにおいて認められたインスリン抵抗性の改善について、そのメカニズムについて生体・臓器レベルで解析することを研究計画とした。まず、野生型マウスとLPA4欠損マウスに高脂肪食を摂食させ、血清中のグルコース、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸の濃度を比較したところ、欠損マウスにおいて、空腹時血糖値が有意に低いがトリアシルグリセロールや遊離脂肪酸には有意な差は認められなかった。また、各種アディポカインの血中濃度をElisaで検討した結果、インスリン感受性ホルモンであるアディポネクチンが欠損マウスにおいて高値であった。組織の解析においては、欠損マウスにおいては肥満とともに進行する脂肪肝の程度が著しく弱いことも明らかとなった。LPA4の高発現が認められた脂肪組織においては、その重量は両者に違いはなかったが、脂肪細胞個々の大きさが欠損マウスでは小さく、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化が亢進している可能性が示唆された。さらに、定量PCRで脂肪組織における各種遺伝子発現を検討した結果、慢性炎症に関わる遺伝子(TNFaやMCP-1など)が欠損マウスで有意に低いことがわかり、インスリン抵抗性の基盤となることが知られている慢性炎症が欠損マウスで軽減していることが示唆された。平成22年度に行った、肥満モデルにおいてLPA4欠損マウスで認められるインスリン抵抗性改善の個体レベルでのメカニズム解明に引き続き、平成23年度は、その基盤となる細胞レベルでの分子メカニズムを解析することを研究計画とした。まず、野生型マウスとLPA4欠損マウス由来の胎児線維芽細胞(MEF)を調整し、脂肪細胞分化誘導処理を行った際の分化の程度について、脂肪細胞特異的マーカー遺伝子の発現により検討した。結果、LPA4欠損マウス由来のMEFは野生型マウス由来のMEFと比して、高い脂肪細胞分化能を示すことが明らかとなった。また、LPA4の下流で活性化されると考えられる因子であるROCKの阻害剤を用いた実験により、上記の差はROCK活性の程度によりもたらされている可能性が示された。LPA4選択的アゴニストを用いたレポータージーンアッセイにより、LPA4が転写因子であるSRFをROCK依存的に活性化することも明らかとなり、SRFがROCKの下流で脂肪細胞分化を抑制している可能性が考えられた。近年マウス前駆脂肪細胞が同定されたため、この初代培養細胞を調整して実験を行ったところ、上記の実験結果と一致する結果が得られた。従って、脂肪前駆細胞においてLPA4-ROCK経路が脂肪細胞分化を抑制することが、肥満モデルにおいて生ずるインスリン抵抗性の基盤の1つとなっている可能性が示唆された。
特異な塩基対形成能を持つヌクレオシドの研究

変異原性塩基アナログ、N^4-アミノシトシンがどのようにグアニンともアデニンとも塩基対を形成できるか知るために、その二本鎖形成能について検討した。まず、シトシンをただ一つ含む9-mer,5'-TAGGCGGTA-3'を亜硫酸-ヒドラジン混液で処理し、シトシンが特異的に反応してアミノシトシン(C^<am>)に喬化したオリゴヌクレオチド5'-TAGGC^<am>GGTA-3'に変換し、HPLCで精製した。その一部をとり、N^4-アミノシトシンに特異的な誘導体化後、酵素消化して調べたところ、A:T:G:アミノシトシンが2:2:4:1と予想どうりの結果となった。従って、この条件で5'-TAGGC^<am>GGTA-3'が合成できているることがわかった。この9-merと相補的でC^<am>の相手にGあるいはAが位置する2種のオリゴヌクレオチド5'-TACCGCCTA-3'および5'-TACCACCTA-3'を合成し、それぞれをアニールして2種のduplexを得た。これらC^<am>をふくむduplexと対応する通常塩基のみを含むduplexの熱融解の実験から、塩基対の安定性はC-G>C^<am>-A>C-Aと推定され、アミノdCTPの取り込みの実験と良く一致した。また、異常塩基を含むオリゴヌクレオチドを直接、酵母に作用してクロモソームDNA中に異常塩基を導入することを試みた。まず、変異原性ヌクレオシドアナログ、6-ヒドロキシルアミノプリンをクロモソームDNA中に導入し、生じた変異を分析した。その結果6-ヒドロキシルアミノプリンは主にアデニンとして振る舞うが、グアニンとしても振る舞って、ATからCGへの変異を引き起こすことが示された。この方法を利用してその他の修飾塩基の塩基対形成能についても現在解析を進めている、変異原性塩基アナログ、N^4-アミノシトシンがどのようにグアニンともアデニンとも塩基対を形成できるか知るために、その二本鎖形成能について検討した。この方法を利用してその他の修飾塩基の塩基対形成能についても現在解析を進めている、