hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モデル植物ミヤコグサにおける生殖様式の進化生物学的研究

地域により野生集団の生殖様式の異なる原因についてポリネーションバイオロジーの観点で調査を行う予定であったがまだ準備段階にとどまっている。一方、国内野生集団の遺伝解析が進み、おもに日本の南部では遺伝的に2型に別れることが明らかになってきた。これは非常にクリアーでいい結果と考えている。2012年1月からの花期に予定していた調査が遅れ、2012年4月以降にずれ込んだが、4月以降に各地で調査を行う予定である。主に南西諸島で,島ごとに遺伝的に分化している状況をポリネーターとのの関連を含め明らかにしたい。南西諸島以南、台湾、アジア地域の調査を行いたい。2012年春の花期(地域により1月8月頃)については1月から予定していた調査が2012年4月以降にずれ込んだため速やかに調査および解析を実施する。調査地域は沖縄本島および南西諸島、対馬、隠岐など大陸からのミヤコグサの伝搬・分布拡大において重要と考えられる地域と、国内全域をカバーするための北日本各地である。調査では集団の遺伝解析のためのサンプリングと、ポリネーターの調査を行う。地域集団の生殖様式の違いと遺伝的な違いに相関があるのか解析を進めたい。年度末に試薬購入の予定が後ろにずれ繰り越し分が生じた。すでに実験を進めているので、今後、滞り無く予定の試薬を購入し、解析を進める。次年度研究費は調査旅費、遺伝解析の試薬費などの物品費、研究補助者の謝金として使用したい。ミヤコグサの花期(地域により1月8月ぐらいまで)は、各地で野生集団の調査、サンプリングを行う。2012年1月から予定していた調査が遅れたため、そのための旅費、解析のための試薬・物品費の執行を速やかに行う。得られたサンプルについてフローサイトメトリーを用いた倍数性解析、マイクロサテライトマーカーを用いた集団の遺伝的解析を行い、ミヤコグサ野生集団の国内の遺伝的分布、生殖様式の地域的な分布を明らかにする。生殖様式、遺伝的に異なる集団からいくつかの個体を選定し、比較のためのセイヨウミヤコグサも含め自家不和合性に関わる遺伝子を単離し、配列と機能について比較検討する。研究費は国内調査旅費、試薬費、研究補助のための人件費として使用したい。
植物共生C1微生物を用いた革新的な青果物の鮮度保持技術の開発

本研究では、ホウレンソウの保蔵時における微生物相の推移を観察した。3日目(20°C)では、Erwinia属細菌が大部分を占めたが、7日目(20°C)にはPseudomonas属細菌が優勢属に変化していた。またメチロトローフ細菌(C1細菌)に焦点を絞り、菌相推移を解析したところ、主要種はメチロバクテリウム属細菌であり、それらは3つのグループに分けられた。ホウレンソウの保蔵中、3グループのメチロバクテリウム属細菌は支配的に生育し、これら3グループ間で支配的な種が変遷したことから、ポストハーベスト青果物でもメチロバクテリウム属細菌は菌相の変化を伴って、何らかの影響を青果物に与えていることが示された。本年度は、市販のホウレンソウを青果物のモデル材料として選抜し、ホウレンソウの保存状態(20°C)における葉上の微生物相の推移を観察した。特に、一般生菌数のみならず、これまで青果物の菌相変化について報告事例のないメタノールを唯一の炭素源として生育できるメチロトローフ細菌に焦点を絞り、ホウレンソウの葉上でのその菌相推移について詳細に解析をおこなった。その結果、ホウレンソウ葉上のメチロトローフ細菌数は、一般細菌数と同様、保蔵時間に比例して増加することをはじめて示すことができた。また、その主要種の同定を16S rRNA配列などを指標におこなったところ、ホウレンソウ葉上の主要なメチロトローフ細菌は、メチロバクテリウム属細菌であり、それらも大きく3グループ(M. mesophilicumグループ、M. fujisawaenseグループ、M. extorquensグループ)に分けられることが明らかになった。ホウレンソウの保蔵中、これら3グループのメチロバクテリウム属細菌は支配的に生育し、これら3グループのメチロバクテリウム属細菌の間で支配的な種が変遷した。メチロバクテリウム属細菌は生育過程中の作物の成長に大きな影響を及ぼすことがすでに報告されているが、これら結果は、ポストハーベストの青果物においても、メチロバクテリウム属細菌は菌相の変化を伴って、何らかの影響を青果物に与えている可能性を示すことができた。基本計画では、初年度はホウレンソウ葉上の生菌数の推移とメチロバクテリウム属細菌の種の特異性の解明が主たる計画であり、本年度、はメチロバクテリウム属細菌の種の変遷までを示すことができ、おおむね順調に研究を進めることができた。ただ、保蔵環境中におけるホウレンソウ葉上の主要メチロバクテリウム属細菌の種の変遷が起こるものと想定をしていたが、その種の劇的な変遷が観察されず、その存在を完全に証明するにはいたらなかった。来年度以降、一般細菌も含めたホウレンソウ葉上の微生物相の変遷を異なる方法にて示す必要があるものと考えているものの、本年度に関しては当初の目標を達成することはできたものと考えている。昨年度、市販のホウレン草のメチロバクテリウム属細菌群の菌叢解析により主要な3種のメチロバクテリウム属細菌を同定した。本年度は、これらメチロバクテリウム属細菌および菌株の培養液を青果物に直接塗布することによるホウレン草の鮮度保持効果について観察した。その結果、予想に反し、メチロバクテリウム属細菌またはその培養液を塗布したホウレン草の方が、鮮度低下が先行して進むことが明らかになった。このことは、メチロバクテリウム属細菌が青果物葉上でPQQおよび植物ホルモン様物質を生産し、その能力を発揮することでポストハーベストの青果物自身の代謝を亢進し、ホウレン草の鮮度低下を促進している可能性が示唆された。つまり、本研究の初期に想定していたメチロバクテリウム属細菌およびPQQによる鮮度保持に関して逆効果を持つ可能性を示している。また、メチロバクテリウム属細菌では、Caと希土類元素がメタノール代謝の初段階酵素MDHの鍵因子として、その代謝の切り替えを行っていることが知られている。今回の主要ターゲットであるPQQもまたMDHの補因子であることから、メチロバクテリウム属細菌におけるCaおよび複数の希土類元素によるPQQ生産性の違いについて観察した。その結果、Caでは顕著なPQQ生産が観察されたが、希土類元素ではPQQの生産性が低下した。このことは、青果物のCaを制限した方がPQQの鮮度低下を押さえることができる可能性を示している。初期の本研究の設定通り、研究計画は進んでいるものの、メチロバクテリウム属細菌およびその培養上清の青果物に対する機能が予想に反し、鮮度低下に寄与する可能性を示すデータを得た。これにより、本データの裏付けと鮮度保持技術の開発に向けた方向性を修正に時間を要しているため、若干の遅れが出ている。来年度は、これまでのデータを踏まえ、メチロバクテリウム属細菌およびPQQの鮮度保持への関与を明らかにし、それらを排除する技術の開発が鮮度保持に対してどのように働くか、これまでの計画に加えて同時並行で進めていく。本年度は、市販のホウレンソウを青果物のモデル材料として選抜し、ホウレンソウの流通状態を想定した状態(20°C)における葉上の微生物相の推移をメタゲノム解析にて観察した。その結果、20°C保存3日目には、Erwinia属細菌が大部分を占め、サンプルによっては50%を超えるものもあった。その主要な種はE. mallotivoraであり、全体の3割程度を占めた。

続いてPseudomonas属細菌、Sphingobacterium属細菌、Stenotrophomonas属細菌が主要な構成細菌叢であった。一方、20°C保存7日目には、Pseudomonas属細菌が優勢属になっており、サンプルによってはPseudomonas moraviensisが半数を占めるまでに菌叢が変化していた。このように市販のホウレン草の葉上の細菌群は保蔵環境下で劇的に変化していた。また、昨年までの研究によりメチロバクテリウム属細菌群に関しても保蔵環境下でその菌叢が変化し、最終的に大きく3グループ(M. mesophilicumグループ、M. fujisawaenseグループ、M. extorquensグループ)が支配的になることを明らかとしている。今回の研究では、ホウレン草葉上の細菌群の菌叢変化とメチロバクテリウム族細菌群の菌叢変化、さらには主題であるホウレン草の鮮度保持との関連性を詳細に証明することはできなかったが、メチロバクテリウム属細菌が生育過程中の作物の成長に大きな影響を及ぼすことがすでに報告されていることから、青果物のポストハーべスト技術開発においても、メチロバクテリウム属細菌の制御が鍵である可能性を示すことができた。本研究では、ホウレンソウの保蔵時における微生物相の推移を観察した。3日目(20°C)では、Erwinia属細菌が大部分を占めたが、7日目(20°C)にはPseudomonas属細菌が優勢属に変化していた。またメチロトローフ細菌(C1細菌)に焦点を絞り、菌相推移を解析したところ、主要種はメチロバクテリウム属細菌であり、それらは3つのグループに分けられた。ホウレンソウの保蔵中、3グループのメチロバクテリウム属細菌は支配的に生育し、これら3グループ間で支配的な種が変遷したことから、ポストハーベスト青果物でもメチロバクテリウム属細菌は菌相の変化を伴って、何らかの影響を青果物に与えていることが示された。保蔵状態におけるホウレンソウ葉上の主要メチロバクテリウム属細菌の劇的な種の変遷が変遷を観察することができなかったため、来年度以降、あたらな手法のもと、ホウレンソウ葉上の主要メチロバクテリウム属細菌の劇種の変遷を観察する必要が生じた。そこで、次年度は本来の計画通り、青果物保存におけるメチロバクテリウム属細菌の影響を示すのと同時に、一般細菌も含めたホウレンソウ葉上の微生物相の変遷を16S rRNAをもとにした網羅的な方法にて新たに示すことにする。1. C1微生物およびPQQによる青果物の鮮度保持に対する評価:青果物上のC1微生物のポピュレーションを調整(増加および減少させる)による青果物の鮮度への影響を観察する。具体的には、青果物上に様々な生菌数のC1微生物を散布(または抗生物質にて減少させる)し、共生細菌数と青果物鮮度パラメーターとの関係性を評価する。2. C1微生物のマイクロフローラへの影響:C1微生物の植物共生は、その他の微生物の生息を制限または活性化することが考えられ、これにより腐敗菌等の生菌数を低く押さえる(もしくは増大)ことができるものと考えられる。そこで、青果物上に様々な生菌数のC1微生物を散布し、収穫後青果物上のマイクロフローラの変化を追跡する。これにより、PQQの生産能のみならず、C1微生物による青果物上のマイクロフローラの制御の可能性を示していく。青果物上のマイクロフローラは一般生菌数および次世代シーケンサーによる網羅的解析にて評価し、同定することでC1微生物によるマイクロフローラの制御について評価していく。
極東域における爆弾低気圧と中緯度海洋の相互作用に関する研究

前年度までの研究において、黒潮/黒潮続流域における温帯低気圧の急発達において後屈前線付近の潜熱加熱と寒冷コンベヤベルト(cold conveyor belt: CCB)との正のフィードバック過程(CCBー潜熱加熱フィードバックプロセス)が重要な働きをすることを明らかにした。これまでの研究では、黒潮/黒潮続流域からの水蒸気供給の効果に注目し、上記のフィードバックプロセスを構築したが、暖流域からは顕熱供給も生じる。今年度は、領域雲解像モデルによる数値実験を利用し、CCBー潜熱加熱フィードバックプロセスにおける顕熱供給の働きについて調査した。主に2013年1月に黒潮/黒潮続流域で発達した低気圧に注目し、コントロール実験と暖流域から顕熱フラックス、潜熱フラックス、顕熱・潜熱フラックスを除く感度実験を実施した。実験間の比較から、黒潮/黒潮続流域周辺の顕熱供給が低気圧中心気圧の低下、CCBの発達、後屈前線付近の潜熱加熱の増加へ関与することが明らかとなった。数値実験から得られた結果は、顕熱供給には、CCBに沿った大気境界層内の対流不安定な状態の形成へ寄与し、後屈前線付近の上昇流とこれに伴う潜熱加熱を促進する可能性があることを示した。加えて、顕熱加熱に伴う気温上昇にはCCB周辺の地表付近の飽和水蒸気混合比および水蒸気混合比を増大させる働きもあることが感度実験によって検証された。この水蒸気量の増加は、後屈前線付近における水蒸気収束の強化に貢献し、最終的に潜熱加熱の増加を導くと考えられる。上記の2つの暖流域からの顕熱供給の効果を考慮することによって、顕熱供給の役割を追加したCCBー潜熱加熱フィードバックプロセスを構築した。さらに、2013年1月事例以外の暖流域で発達した低気圧に関する数値実験も実施し、これらの追加実験から得られた結果も2013年1月事例の結果と整合的であることを確認した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は高解像度大気海洋結合モデル:CReSS-NHOESを用いて急発達する温帯低気圧(爆弾低気圧)の再現実験を行い、爆弾低気圧と中緯度海洋との相互作用について調査した。またこの解析を実施する過程で、従来の研究では理解が限られていた黒潮/黒潮続流域から蒸発する水蒸気が低気圧の発達へ与える影響に関するプロセスについても明らかになってきた。再現実験に用いた事例は2013年1月中旬に発生した南岸低気圧である。爆弾低気圧が海洋へ与える影響として低気圧中心近傍において海洋の表層から中層にかけて湧昇が誘起される様子が見られた。これは、低気圧の力学的強制に対して海洋が応答した結果であると考えられる。しかしながら、冬季は海洋混合層が深いために湧昇に対応して海面付近の水温の顕著な低下は現れなかった。本低気圧では海面水温の顕著な変動は現れなかったが、低気圧発達中に低気圧北象限で黒潮/黒潮続流域から多量の水蒸気蒸発が生じるという特徴的な現象が見られた。水蒸気の潜熱解放は低気圧の発達を促進するので、この暖流から蒸発した水蒸気が低気圧発達へどのような影響を及ぼしているのか、調査した。まず、低気圧北象限に位置する寒冷コンベアベルト(CCB)と呼ばれる乾燥した強い東風のベルトが暖かい暖流上に重なることで、暖流域からの水蒸気蒸発が促進されていことが明らかになった。さらに、暖流から蒸発した水蒸気はCCBによって低気圧中心近傍へ輸送され、収束・上昇し、潜熱解放をする様子が確認された。この潜熱解放は低気圧の発達を促進し、それに伴いCCBも強化されることが考えられる。これらの結果は、中緯度暖流域上においてCCBを介して低気圧発達を促進するフィードバックプロセスが生じていることを示唆する。これらの一連の研究成果は、7つの国内学会、2つの国際学会で発表を行い、現在、学術論文誌に投稿中である。急速に発達する温帯低気圧(爆弾低気圧)は日本の気象災害の発生と関連しているため,その発達プロセスを適切に理解することは重要である.前年度の本研究の成果によって,黒潮・黒潮続流(暖流)域からの水蒸気供給と低気圧発達を繋ぐフィードバックプロセスの存在が示唆された.今年度はまず,暖流域からの水蒸気供給を除く数値実験を利用してこのプロセスの検証を行った.雲解像モデルCReSSを用いて,暖流域からの水蒸気を除く実験と除かない実験を行い,二つの実験結果を比較した.暖流からの水蒸気供給を除いた実験では,除かなった実験よりも,後屈前線付近の潜熱加熱の生成および低気圧発達が抑制され,寒冷コンベヤベルトが顕著に弱化した.これらの結果は,これまでの研究で指摘してきたフィードバックプロセスが低気圧発達に対して有効に働いていることを支持する結果である.これまでの研究成果を発展させて,西部黒潮-親潮混合水域の海面水温変動が爆弾低気圧へ与える影響に関する調査を行った.CReSSを用いて西部黒潮-親潮混合水域の海面水温を改変した複数の感度実験を実施することで,当該海域の海面水温偏差に対して低気圧がどのような応答をするのかについて調べた.この調査の結果から,西部黒潮-親潮混合水域の海面水温は当該海域を通過する低気圧の中心近傍の東西非対称構造や低気圧に伴う対流圏下層の強風分布に影響を及ぼすことが明らかとなった.また,日本海に焦点を当てて,爆弾低気圧と関連する大気海洋相互作用について調査した.

寒候期の日本海の海面水温の日々の変動について解析を行うと,12日の比較的短い期間で急激に海面水温が低下するイベントが発生していることがわかった.再解析データなどでこのイベント前後の大気循環場について調べたところ,爆弾低気圧を含む温帯低気圧が日本海を通過する際に,この海面水温低下が生じていることが示された.本研究の一連の低気圧の再現実験およびデータ解析によって,暖流域からの水蒸気供給と爆弾低気圧の発達を繋げる詳細なプロセスが明らかとなった.また,この結果を基に暖流域における温帯低気圧の急発達に関する正のフィードバックプロセスを構築し,数値実験を利用してその効果を検証した.このフィードバックプロセスの発見は低気圧発達過程の理解を推し進める成果である.さらにこの成果を発展させることで,中緯度海洋(西部黒潮-親潮混合水域)の海面水温変動が個々の低気圧の構造や強風分布へ及ぼす影響についても明らかになってきた.本研究課題以前では得られていなかった新たな知見が着実に得られており,この成果の一部はすでに国際学術誌に掲載されている.このようなことから全体的に順調に研究が進展している.前年度までの研究において、黒潮/黒潮続流域における温帯低気圧の急発達において後屈前線付近の潜熱加熱と寒冷コンベヤベルト(cold conveyor belt: CCB)との正のフィードバック過程(CCBー潜熱加熱フィードバックプロセス)が重要な働きをすることを明らかにした。これまでの研究では、黒潮/黒潮続流域からの水蒸気供給の効果に注目し、上記のフィードバックプロセスを構築したが、暖流域からは顕熱供給も生じる。今年度は、領域雲解像モデルによる数値実験を利用し、CCBー潜熱加熱フィードバックプロセスにおける顕熱供給の働きについて調査した。主に2013年1月に黒潮/黒潮続流域で発達した低気圧に注目し、コントロール実験と暖流域から顕熱フラックス、潜熱フラックス、顕熱・潜熱フラックスを除く感度実験を実施した。実験間の比較から、黒潮/黒潮続流域周辺の顕熱供給が低気圧中心気圧の低下、CCBの発達、後屈前線付近の潜熱加熱の増加へ関与することが明らかとなった。数値実験から得られた結果は、顕熱供給には、CCBに沿った大気境界層内の対流不安定な状態の形成へ寄与し、後屈前線付近の上昇流とこれに伴う潜熱加熱を促進する可能性があることを示した。加えて、顕熱加熱に伴う気温上昇にはCCB周辺の地表付近の飽和水蒸気混合比および水蒸気混合比を増大させる働きもあることが感度実験によって検証された。この水蒸気量の増加は、後屈前線付近における水蒸気収束の強化に貢献し、最終的に潜熱加熱の増加を導くと考えられる。上記の2つの暖流域からの顕熱供給の効果を考慮することによって、顕熱供給の役割を追加したCCBー潜熱加熱フィードバックプロセスを構築した。さらに、2013年1月事例以外の暖流域で発達した低気圧に関する数値実験も実施し、これらの追加実験から得られた結果も2013年1月事例の結果と整合的であることを確認した。高解像度大気海洋結合モデル:CReSS-NHOESによる爆弾低気圧の再現実験によって、本研究が明らかにしようとしている課題の一つである、爆弾低気圧が海洋へ与える影響について明らかになってきた。しかしながら、この影響によって生じる海面水温低下は明瞭でないため、この効果が大気へ与える影響も不明瞭である。
サイクロデキストリン包接オクタコサノールの栄養学的意義

平成10年度は、サイクロデキストリン(CD)で抱接したオクタコサノール(OCT)の機能発現について、流速を調整できる水流プールでの自発的水泳能を測定することにより、運動機能に及ぼす影響を評価した。その結果、CD抱接OCTの運動機能増強作用が認められ、水溶性OCTは体内へ良く吸収された後、運動機能増強作用の発現に関与していることが示唆された。平成11年度は前年度の結果をふまえ、(1)老齢・若齢マウスへのCD抱接OCTの運動能への影響、(2)CD抱接OCT投与量の違いによる運動能への影響、(3)剤形の異なるOCTの運動能への影響とその効果消失、について検討した。その結果、(1)加齢により運動能への影響が異なること、(2)作用の強さがOCTの投与量により異なること、(3)乳化型OCTを経口投与した場合にも運動能増強作用が認められること、を明らかにした。OCTのカテコールアミン分泌に及ぼす影響を明らかにするために、運動機能増強作用が認められたddY系雄マウスの血液、副腎等のアドレナリン、ノルアドレナリン量をHPLC-電気検出器で測定中である。これらの結果を総合することで、OCTの吸収量と機能の発現との関係を明らかにでき、その作用機作の解明へとつなげることができる。オクタコサノール(OCT)は、米、小麦胚芽、砂糖キビ等から抽出される炭素鎖28の天然アルコールである。研究代表者並びに研究分担者等は、最近、サイクロデキストリン(CD)で包接したOCTの合成に初めて成功し、この物質が消化管からの吸収性に優れていること、中でも、褐色脂肪組織、脳への集積が高いことを動物実験により明らかにした(微量栄養素研究14、149、1997)。そこで、体内に吸収されたOCTは、(1)副腎からのアドレナリンの分泌を惹起し、一連のカテコールアミン分泌を亢進する。(2)中枢神経系ではカテコールアミン作動性神経系を通じ作用が発現する。という作業仮説をもとに、OCTの栄養学的意義を解明しようとするものである。本年は、まず、機能発現について、流速を調製できる水流プールでの自発的水泳能を測定することにより、運動機能に及ぼす影響を評価した。実験には、ddY系雄性マウス(3237g、7週齢)を供し、京大松元式運動測定水槽を用いて遊泳実験(水温30°C、流速30cm/秒)を行った。あらかじめ、遊泳能力に差のないマウスを選抜し、CD包接OCTの投与群と、コントロールとして生理食塩水投与群の2群(各群9匹)をもうけた。連続して3週間経口投与(17.4μgOCT/0.2ml/匹/日)を行い、各週毎に遊泳時間を測定した。投与1週間目では、2群の間に遊泳時間の差は認められなかった。2週間目以降から、CD包接OCT投与群がコントロール群に比較して遊泳時間が有意に長いことが示された。しかし、投与中止1週間目には2群間の差は無く、再投与を行うと2週間目にはCD包接OCTの効果が認められた。以上の結果から、CD包接OCTの運動機能増強作用が認められ水溶性OCTは体内へ良く吸収された後、運動機能増強作用の発現に関与していることが示唆された。。CD包接OCTの使用により、OCTの吸収量と機能の発現との関係を明らかにできること、血中動態等に相関したより詳細な結果を得ることができる。さらにはその作用機作の解明へとつなげることができ、新しい機能性の発見が予測される。平成10年度は、サイクロデキストロン(CD)で包接したオクタコサノール(OCT)の機能発現について、流速を調整できる水流プールでの自発的水泳能を測定することにより、運動機能に及ぼす影響を評価した。その結果、CD包接OCTの運動機能増強作用が認められ、水溶性OCTは体内へ良く吸収された後、運動機能増強殖作用の発現に関与していることが示唆された。

本年度は、昨年度の結果をふまえて、(1)老齢・若齢マウスへのCD包接OCTの運動能への影響、(2)CD包接OCT投与量の違いによる運動能への影響、(3)剤形の異なるOCTの運動能への影響とその効果消失、について検討した。その結果、(1)加齢により運動能への影響が異なること、(2)作用の強さがOCTの投与量により異なること、(3)乳化型OCTを経口投与した場合にも運動能増強作用が認められること、を明らかにした。OCTのカテコ-ルアミン分泌に及ぼす影響を明らかにするために、運動機能増強作用が認められたddY系雄マウスの血液、副腎等のアドレナリン、ノルアドレナリン量をHPLC-電気検出器で測定中である。これらの結果を総合することで、OCTの吸収量と機能の発現との関係を明らかにでき、その作用機作の解明へとつなげることができる。
アクノロジン生産完全再構成系による単機能反復型生合成反応の網羅的分子機構解明

本研究は、多様な生理活性物質の生産者として放線菌に注目し、代表的ポリケタイド二次代謝産物アクノロジン(ACT)を取り上げ、その生合成に必要な20段階の酵素反応を試験管内で完全再構成することを基盤とする。諸反応中には、単機能型縮合酵素による反復的炭素鎖構築反応、酵素反応中間体の支持タンパク質からの遊離機構および基本骨格修飾反応における酵素基質認識、単機能型酵素による多段階反応の制等が含まれる。本研究では、ACT生合成再構成系を材料として、酵素学的解析、各種機器分析を用いた酵素反応の精密解析、タンパクモデリング法を含む情報科学的解析を駆使した上記問題の網羅的解明を目的とする。本年度の研究計画として、ACT基本骨格形成反応(反復的炭素鎖構築反応)の再構成系の構築を設定し、以下の成果を得た。ACTの基本骨格形成に必須のタンパク群、すなわちActtI-ORF1(ケト縮合酵素α)、ActII-ORF2(ケト縮合酵素β)、ActI-ORF3(アシルキャリアタンパク)、ActIII(ケト還元酵素)、sfp(フォスホパンテニルトランスフェラーゼ)、fabD(アシルトランスフェラーゼ)の発現を放線菌および大腸菌の宿主を用いて実施し、組換精製タンパクとして調製した。これらのタンパクを用い、マロニルCoAを基質としたin Vitroでの生合成反応の再構築を試みたところ、7段階のケト縮合反応を経て生成するオクタケタイド鎖の閉環生成物であるSEK4/SEK4bとともにオクタケタイド鎖の炭素9位還元後の閉鎖生成物であるmutactinの生成がHPLCおよびLC/MSで確認された。この結果は、ACT生合成に関わる炭素骨格形成反応に関わる単機能縮合酵素による反復的炭素鎖構築反応を再現したものであり、本年度の研究計画の一部を達成することができた。ACTの基本骨格形成に必須のタンパク群、すなわちActtI-ORF1(ケト縮合酵素α)、ActII-ORF2(ケト縮合酵素β)、ActI-ORF3(アシルキャリアタンパク)、ActIII(ケト還元酵素)、sfp (フォスホパンテテイニルトランスフェラーゼ)、fabD(アシルトランスフェラーゼ)の発現を放線菌および大腸菌の宿主を用いて実施し、組換精製タンパクとして調製した。これらのタンパクを用い、マロニルCoAを基質としたin vitroでの生合成反応の再構築を試みたところ、7段階のケト縮合反応を経て生成するオクタケタイド鎖の閉環生成物であるSEK4/SEK4bとともにオクタケタイド鎖の炭素9位還元後の閉環生成物であるmutactinの生成がHPLCおよびLC/MSで確認された。

対象タンパクの発現条件の最適化に改善点が必要だが概ね目的を達成できた。対象タンパクの発現系最適化のため、発現宿主の培養条件の継続的なモニタリングを行い、効率的な条件決定を行う。たんぱく発現宿主の培養条件の継続モニタリングにODモニター付バイオシェーカーの導入を検討したい。
C型肝炎ウイルス感染におけるミトコンドリア機能異常の機序の解明

C型肝炎ウイルス(HCV)コア蛋白が直接ミトコンドリア蛋白量に変化を与えていることを肝臓内ミトコンドリア蛋白定量を行うことにより明らかにした。これらの蛋白は新しいC型肝炎治療のターゲットとなるばかりでなく、発癌抑制の新しいターゲットとなる可能性がある。HCV感染症は慢性肝炎、肝硬変を引き起こし、高率に肝細胞痕を合併することが知られている。また慢性C型肝炎患者においては肝病変だけでなく、insulin抵抗性、脂質代謝異常も認められることを我々は報告し他研究者からも確認されている。HCV core蛋白質が脂肪酸代謝や酸化ストレス誘導に関わるミトコンドリアの機能に影響を与えていることが考えられる。今回、HCVコア遺伝子トランスジェニックマウス、core蛋白質発現培養細胞において、ミトコンドリア、特に電子伝達系に関わる蛋白に着目し、機能異常とその機序を解明する。2研究の進捗状況3ケ月齢♂HCVcore遺伝子発現マウスおよび3ケ月齢♂コントロールマウスに対し窒素含有畳およびカロリーを同一としたコントロール餌およびBCAA添加餌を投与し血糖,インスリン測定,臓、筋肉における脂質、糖質代謝およびエネルギー代謝関連遺伝子群発現変化の検討をおこなった。BCAA食によって有意に肝臓の脂肪化抑制とともに血糖の有意な低下およびインスリン抵抗性改善を確認した。また遺伝子発現(mRNA,蛋白)変化の検討において肝臓,筋肉,脂肪組織において解糖系ミトコンドリアTCA、回路電子伝達系における酵素発現をmRNAレベルで検討し、HCVcor蛋白により発現低下、分枝鎖アミノ酸により改善する蛋白を複数同定した。BCAAはC型肝炎における肝臓の脂肪化を軽減し、insulin抵抗性の進行を抑制した。3現在までの達成度(2)おおむね順調に進展している。上記のようにHCV core蛋白による肝臓脂質代謝変化を改善するBCAAの検討によりHCVによる遺伝子発現変化の検討手段が拡大された。4今後の研究推進方策HCVcore蛋白による解糖系およびミトコンドリアTCA回路電子伝達系の遺伝子、蛋白発現変化および酵素活性変化を網羅的に検討していく。我々が作成したHCVコア遺伝子トランスジェニックマウスは肝臓脂肪化、肝細胞癌(Moriya et al.Nat Med 1998)、インスリン抵抗性(Gastroenterology 2004)脂質代謝異常(Moriya et al.Biophys Biochem Res Commun 2001)肝臓内酸化ストレス増加(Moriya et al.Cancer Ees 2001)が認められ臨床像に極めて近い。またこれらの病態がミトコンドリア機能異常に起因することを現在まで示してきや。今回コア蛋白によるミトコンドリア機能異常の同定と分子レベルの機序の検討をミトコンドリアプロテオーム解析を用いてを行った。培養細胞、レプリコン系、トランスジェニックマウスにおいてコア蛋白存在下でミトコンドリアに局在するprohibitinの著名な発現亢進を認めた。Prohibitinはミトコンドリア電子伝達系cytochrome coxidase(COX)subunitと結合、発現亢進により電子伝達系IV機能低下を示した(Hepatology. 2009)。またミトコンドリア保護機能を有するTacrolimusをトランスジェニックマウスマウス系に投与しコア蛋白による脂肪肝、インスリン抵抗性の軽減を認めた。コア蛋白発現培養細胞系の検討からコア蛋白によるTNFα亢進をTacrolimusが軽減し、ひいては脂質代謝の改善、酸化ストレスの減少をもたらすという新しい治験と、新しい治療法の可能性を示した(Moriya et al.Am J Pathol 2009)。HCVコア遺伝子トランスジェニックマウスは肝臓脂肪化、肝細胞癌(Moriya et al.Nat Med 1998)、インスリン抵抗性(Gastroenterology 2004)脂質代謝異常(Moriya et al.Biophys Biochem Res Commun 2001)肝臓内酸化ストレス増加(Moriya et al.Cancer Res 2001)が認められ臨床像に極めて近い。またこれらの病態がミトコンドリア機能異常に起因することを現在まで示してきた。コア蛋白によるミトコンドリア機能異常の同定と分子レベルの機序の検討をミトコンドリアプロテオーム解析を用いてを行った。コア蛋白存在下でミトコンドリアに局在するprohibitinの発現変化を認めた。Prohibitinはミトコンドリア電子伝達系cytochrome coxidase (COX) subunitと結合、発現亢進により電子伝達系IV機能低下を示した(Hepatology.2009)。またミトコンドリア保護機能を有するTacrolimusをトランスジェニックマウスマウス系に投与しコア蛋白による脂肪肝、インスリン抵抗性の軽減を認めたコア蛋白によるTNFα亢進をTacrolimusが軽減し、脂質代謝の改善、酸化ストレスの減少をもたらすという新しい治療法の可能性を示した(Moriya et al.Am J Pathol 2009)。FDL-LC-MS/MS)proteomics analysis by fluorogenic derivatization-liquid chromatography-tandem mass spectrometryをおこない肝臓ミトコンドリア文画おいての有意な蛋白量変化を認める蛋白質を複数認めた。このうち一つはsteroid hormoneに関する酵素でありHCV肝臓発癌への性差関与、HCVによる電子伝達系障害によるミトコンドリア内NADH/NAD比の代償が関与している可能性が示唆された(submit)。
エピジェネティック制御機構を利用した進行性／加齢性難聴治療法の検討

代表者は、進行性/加齢性難聴動物モデルDBA/2Jマウスに対するエピジェネティック調節剤の投与により、聴力低下が有意に抑制されることを見出した。遺伝子発現網羅解析を実施し、定量的RTPCR法および免疫組織化学的検証により、蝸牛組織における亜鉛トランスポーターをコードするZip4(Slc39a4)遺伝子発現量の上昇と難聴進行抑制との関連が示された。Zip4発現上昇作用をもつ緑茶カテキン成分EGCG投与によっても聴力低下は有意に抑制された。以上、聴覚がエピジェネティクス制御により調節されること、および蝸牛細胞内での亜鉛取り込み能が聴覚機能維持に関与することが示唆された。申請者はこれまで、「加齢性難聴にエピジェネティック制御不全が関連する」という独自の仮説に基づき、進行性/加齢性難聴動物モデルDBA/2Jマウスに対するエピジェネティック調節剤投与により、聴力低下の有意な抑制に成功してきた。本研究は同動物モデルを用い、遺伝子発現網羅解析と統計学的遺伝子ネットワークパスウェイ解析およびエピジェネティック制御機構解析を組み合わせて、薬理作用の分子機序を解析し、より効果的な進行性/加齢性難聴の予防・治療剤を提案し、その効果を検討することを目的とする。平成25年度は、前年度の薬剤投与・非投与動物群間の蝸牛で網羅的遺伝子発現解析を行い抽出された複数の候補について、定量的PCR法および免疫組織化学的検証による候補の絞り込みを進めた。また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の投与により、ヒストンアセチル化が蝸牛組織内で上昇していることを免疫組織化学的手法で確認し、薬剤投与が実際に蝸牛内細胞に到達し、直接効果を及ぼしていることを明らかにした。細胞培養実験、また難聴発症前の蝸牛における遺伝子発現量との比較検討も加え、最終的に、エピジェネティクス調節薬剤投与により有意に蝸牛内で発現量が上昇する遺伝子候補のうち、分子標的となりうる候補を1つに絞りこんだ。本遺伝子産物はイオントランスポーターをコードしており、蝸牛細胞の機能の維持に関与していることが予測された。平成24年度は、薬剤投与・非投与動物群間の蝸牛において、難聴進行にエピジェネティック制御調節により発現量が変化する遺伝子群・分子経路の同定をめざした。4週齢、12週齢(聴力低下前後)、および薬剤投与により聴力低下を抑制した動物、各群5頭計15頭の片側蝸牛より全RNAを抽出し、マイクロアレイ法を用い、網羅的遺伝子発現解析を行なった。3群を比較し、群間で統計的有意差がある、聴力低下に関連する候補遺伝子群を検出し、また候補分子経路の同定を試みた。さらに複数の候補遺伝子について、定量的PCR法および免疫組織化学的検証を行った。薬剤投与群蝸牛においては、内耳形態形成遺伝子、熱ショック応答遺伝子群などの発現がコントロール群に比較し有意に上昇しており、一方、特定の神経伝達関連因子の発現が低下していた。エピジェネティック調節剤は複数の遺伝子ネットワークパスウェイ制御を介して、蝸牛細胞機能の低下を防止している可能性が見出された。研究代表者はこれまで、「加齢性難聴にエピジェネティック制御不全が関連する」という独自の仮説に基づき、進行性/加齢性難聴動物モデルDBA/2Jマウスに対するエピジェネティック調節剤投与により、聴力低下の有意な抑制に成功してきた。本研究は同動物モデルを用い、遺伝子発現網羅解析と統計学的遺伝子ネットワークパスウェイ解析を用いて薬理作用の分子機序を解析し、より効果的な進行性/加齢性難聴の予防・治療剤を提案し、その効果を検討することを目的とした。平成24,25年度は薬剤投与・非投与動物群間の蝸牛で網羅的遺伝子発現解析を行い、抽出された複数の候補について、定量的PCR法および免疫組織化学的検証による候補の絞り込みを進めた。また、候補遺伝子産物シグナルが蝸牛組織内で上昇していることを免疫組織化学的手法で確認し、また、ヒストン脱アセチル化酵素Hdacの内耳組織における発現も確認し、投与薬剤が実際に蝸牛内細胞に到達し、直接効果を及ぼしていることを明らかにした。平成26年度はエピジェネティクス調節薬剤投与により有意に蝸牛内で発現量が上昇する分子標的候補Zip4 (Slc39a4)を同定した。

本遺伝子産物は亜鉛トランスポーターをコードしており、内耳組織における発現上昇により細胞への亜鉛イオン取り込みを促進し、細胞機能の維持に関与していると考えられた。Zip4発現上昇作用をもつ緑茶カテキンの主成分エピガロカテキンガレート(EGCG)の投与により、DBA/2Jマウスの聴力低下が有意に抑制され、このときZip4の内耳組織における発現は上昇した。本研究はエピジェネティック調節剤が難聴進行を有意に抑制できること、その主要な分子機構がaip4の内耳組織における発現上昇であること、EGCGの投与によりZip4上昇と難聴進行抑制できることを示した。耳科学分子生物学当初の計画通り、本年度で遺伝子発現の網羅的解析より、薬剤投与の影響で発現上昇もしくは抑制される遺伝子候補を同定、検証を行い、分子メカニズムの一端を解明しつつある。エピジェネティクス調節機構は、多様な酵素やマイクロRNAが関与する複雑な遺伝子転写調節機構であり、難聴進行抑制のための分子標的を設定することに困難が予想された。しかし本年度の研究により、エピジェネティクス調節機構により調節され、難聴進行抑制薬剤の開発のための分子標的となりうる候補遺伝子を、少なくとも一種類同定することに成功した。当初の計画通り、本年度で遺伝子発現の網羅的解析より、薬剤投与の影響で発現上昇もしくは抑制される遺伝子候補を同定、検証を行い、分子メカニズムの一端を解明しつつある。平成26年度は、進行性/加齢性難聴モデルマウスを用い、昨年度までに同定した候補遺伝子を分子標的として、これを上昇させる薬剤のマウス個体への投与により、聴力の低下抑制が可能かどうかを聴性脳幹反応(ABR)法により検討する。この時、標的遺伝子発現量の変化を、分子生物学的および免疫組織学的手法により解析し、従来のエピジェネティクス調節剤投与の結果と比較する。平成25年度は、細胞系および蝸牛細胞初代培養系を用い、薬剤投与により発現量変化を及ぼした遺伝子のエピゲノムレベルにおける分子機序(ヒストン修飾レベル変化、DNAメチル化レベル)を、DNAを用いたメチル化DNA特異的PCR、クロマチン免疫沈降-PCR法によって検証計測し検討する。さらに細胞系実験において、各種薬剤投与による、細胞生存率に対する影響を濃度・経時的に計測し、細胞機能・生存を有効に維持すると考えられる薬剤の最適な組み合わせおよび濃度を予測する。検討する薬剤には、研究者がこれまでに見出してきたエピジェネティック制御剤だけでなく、今回見出した候補遺伝子機能を標的とする薬剤も検討対象に含める。平成25年度は、細胞・組織培養実験系の条件検討に多大な時間を費やし、実験動物購入費および関係する試薬・消耗品購入費が当初の予定より大幅に減少したことが、次年度繰越額が生じたことの一番の原因である。また実験の遅れから国内外の学会参加・発表予定が各1回中止となり、旅費の出費額が減少し、さらに論文投稿・出版費も計上しなかった。平成26度は動物実験に重点的に研究費を配分し、難聴進行の抑制実験の成否にかかわらず本研究結果をまとめ、国際誌への投稿をおこなう。また、国内外の学会での発表を予定している。論文の投稿・出版費、学会参加費、旅費にも本研究費を用いる。次年度(平成25年度)は細胞培養関連の物品費、TUNEL法によるアポトーシス陽性細胞数の計測など組織化学的検討用の物品費について、重点的に研究費を使用する。
花粉母細胞の減数分裂時に見られる特異な細胞質分裂のライブイメージング

タペート細胞は葯壁の最内層を構成し、発達中の花粉が必要とするさまざまな物質を供給する哺育細胞である。この細胞の特徴は核を2個ずつ持つことである。我々はシロイヌナズナを用いたライブイメージングに取り組み、この二核化は葯内のタペート細胞で同調的に進行することを明らかにした。このとき前期前微小管束や隔膜形成体が正常に形成されておらず、これが有糸分裂は進行するのに細胞質分裂が起こらない原因であると推定した。一方、葯の発達後期では、タペート細胞はその崩壊に先立ってプロトプラスト化し、葯室内に潜り込むことがわかった。全ての花粉に均一にポレンコートを形成するのに寄与していると推定される。葯を構成する細胞のうち、花粉母細胞とタペート細胞は同一の起源を持つが、前者が減数分裂で花粉を生じるのに対し、後者は花粉に対する哺育細胞としての働きを持つ。タペート細胞自身はもちろん減数分裂をしないのだが、花粉母細胞の減数分裂に先行して二核化するという興味深い挙動を示す。本研究ではこの二種類の細胞について、それぞれ減数分裂と二核化の過程についてライブセルイメージングを試みた。まずタペート細胞に関して、チューブリンにGFP、ヒストンにRFPを連結して有糸分裂の様子を観察した結果、分裂後期までは通常の体細胞分裂と同様に進行するものの、終期に形成されるフラグモプラストが遠心的な発達をしないまま消滅することが明らかとなった。従ってタペート細胞の二核化は、通常の体細胞分裂が細胞質分裂直前で停止することによって起こると考えられた。また、G2期に形成され、将来の分裂面を決める前期前微小管束がタペート細胞では観察されず、未発達のフラグモプラストとの関連が示唆された。次に花粉母細胞の減数分裂過程のライブイメージングを試みたが、花粉母細胞で蛍光タンパク質を強く発現させるプロモーターがないため、タペート細胞のような明瞭な画像を得るには至っていない。そこで、花粉母細胞で発現する遺伝子のカタログ化を進め、プロモーターの選抜を試みた。また、葯から減数分裂が進行している花粉母細胞を取り出し、まず抗体および各種蛍光色素を用いる方法で減数分裂過程の可視化を試みた。タペート細胞自身はもちろん減数分裂をしないのだが、細胞分裂に関しては通常の細胞とは異なった挙動を見せる。すなわち、タペート細胞は花粉母細胞の減数分裂に先行して二核化することが知られている。しかし、そのしくみや意義はよくわかっていない。そこで、本研究では、減数分裂前後のタペート細胞で働くプロモーターと蛍光マーカータンパク質を用いて、シロイヌナズナにおける二核化過程のライブセルイメージングを試みた。チューブリンにGFP、ヒストンにRFPを連結して有糸分裂の様子を観察した結果、分裂後期までは通常の体細胞分裂と同様に進行するものの、終期に形成されるフラグモプラストが遠心的な発達をしないまま消滅することが明らかとなった。一部のタペート細胞では、二核化した核はそれで分裂を停止せず、核相の増加が起きることが報告されている。この核相の増加はエンドリデュプリケーションではなくエンドマイトーシスによるものであることが確認できた。つまり、タペート細胞の核は細胞質分裂を伴わない有糸分裂を最大2回行うことが明らかになった。葯を構成する細胞のうち花粉母細胞とタペート細胞は同一の起源を持つが、前者が減数分裂で花粉を生じるのに対し、後者は花粉に対する哺育細胞としての役割を持つ。本年度はこのタペート細胞の二核化について解析を進めた。シロイヌナズナの葯を培地とともにプレパラートに封入し、二光子励起顕微鏡を用いて、前年度よりもさらに高分解能のタイムラプス画像を取得した。蛍光標識ヒストンで核や染色体を可視化した植物を作出して観察した結果、二核化は減数分裂の直前に隣接するタペート細胞間で同調的に起こることがわかった。

このことより有糸分裂を制御する何らかのシグナルが原形質連絡を通って移動している可能性が示唆された。続いて、核と微小管を異なる蛍光タンパク質で可視化して核分裂の過程を観察すると、一般の細胞では有糸分裂の前に形成され、細胞板の形成位置を規定する前期前微小管束がタペート細胞の核分裂の前には現れず、隔膜形成体も一時的に形成されるものの不完全なまま消失してしまう様子が観察された。細胞板は全く形成されなかった。一部のタペート細胞では、二核化の後にさらに染色体数の倍加が起きていた。細胞周期を負に制御する因子をタペート細胞で発現させると二核化が抑制され、このとき花粉の形成に異常が生じることが確認された。このことから、正常な花粉の発達にはタペート細胞の二核化が必要であることが明らかになった。植物分子遺伝学タペート細胞の二核化のライブイメージングには成功し、染色体や微小管の挙動について詳細な観察結果が得られた。花粉母細胞のライブイメージングについてはまだ方法の改良を続けており、いくつか試してみたいアイディアがある。顕微鏡下で有糸分裂を阻害しないように葯を培養しタイムラプス観察を行うというシステムが完成しただけでも1年目の成果としては大きな成果である。さらにタペート細胞の二核化の詳細な観察ができたことから、当初計画以上に進展していると言ってよい。タペート細胞の結果については論文として発表するためのとりまとめを行う。花粉母細胞のライブイメージングを進める。二年目に実施を予定していたタペート細胞のイメージングを今年度先行して実施したので、次年度はもともと一年目に予定していた花粉母細胞のイメージングを重点的に進める。今年度後半に雇用予定であった研究支援者が雇用を辞退したため再度人選を行う必要があり、雇用開始が遅れた。また、研究を進める上で当初使用を予定していたシロイヌナズナよりも解析に適した材料が見つかり、それを用いることにしたが、一部の実験で条件検討をやり直す必要が生じたため研究計画に遅れが生じた。研究支援者の人件費と、条件検討をやり直したために遅れた実験を遂行するための消耗品として経費を使用する。これによって行う研究は当初の目的に沿ったものである。顕微鏡下で葯を有糸分裂可能な状態に長時間保持してライブイメージングを行うには培養条件を細かく検討する必要があると考え、そのための人工気象器の購入や、培養試薬、資材の購入を予定していた。この条件検討が予想外に早く終了したためこれらの物品を購入する必要がなくなり、余剰の資金が生じた。この資金は次年度の研究を効率的に進めるための人件費や消耗品費、および研究成果の積極的な公表のための研究成果発表旅費として活用する予定である。
血管平滑筋の分化制御と血管機能異常における意義

現在、血圧調節に関わる蛋白の遺伝子が次々と同定されているが、本態性高血圧の原因として重要な遺伝子は未だに不明である。Na^+/H^+逆輸送系は、本態性高血圧の患者で機能亢進が認められ、高血圧の遺伝素因としての可能性が注目されている。我々は、Na^+/H^+逆輸送担体を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し、Na^+/H^+逆輸送担体の機能亢進が血圧調節に及ぼす影響を検討した。まずウサギ胎児大動脈のcDNAlibraryよりNa^+/H^+逆輸送担体の全長cDNAを単離し、これをヒトペプチド鎖伸展因子elongationfactor laのプロモーターの下流に連結して導入遺伝子(EFNaH)を構築した。次に、常法に従い、マウス(B6C3F1)受精卵の雄性前核にEFNaHをマイクロインジェクションした後、あらかじめ偽妊娠を誘発しておいた雌マウス(ICR)の卵管に移植し、仔を得た。仔マウスの尾を切断してDNAを抽出し、Southern blottingでスクリーニングしたところ、235匹の仔マウスのウチ28匹に遺伝子が導入されていることが判明した。これら28系統のトランスジェニックマウスのうち現在まで16系統で導入遺伝子の発現を検討しているが、そのうち3系統ではRNAレベルでの過剰発現が確認されている。そのうちの1系統を用いた検討では、導入遺伝子は特に、脳、肺、精巣などでの発現が強く、通常の10-20倍程度の過剰発現を認めている。本トランスジェニックマウスの血圧の動態については予備的検討を始めた段階であるが、1%NaClを投与して3週後の時点で、ヘテロマウスでは対照群に比べ約20mmHgの血圧上昇が認められている。
生物時計によるmIPSCの時刻依存性制御の検討

視交差上核ニューロンにおけるmIPSCの時刻依存性の検討は、視交差上核スライス回旋培養標本のニューロンにパッチクランプ法を適用することに行った。mIPSCに時刻依存性が存在するとは、結論できない結果となった。同一ニューロンにおいてmIPSCの24時間以上の測定が、侵襲的なパッチクランプ法の技術限界で不可能であるため、複数のニューロンを標本としたことが、主因であると思われる。このため、mIPSCの時刻依存性が、ニューロン同士の電気的性質のばらつきや同一スライスのニューロン間の時刻位相のばらつきの中に包含された可能性がある。この仮説の検証には、同一スライス上のニューロンのシナプス現象を非侵襲的に長時間に渡って測定する技術の開発を要すると思われる。視交差上核ニューロンの電気的性質を性格付けしていく過程で、研究に別方向への発展がみられた。視交差上核スライス培養法本においてもニューロン間に存在するギャップ結合が保存されていることを明らかになった。すなわち、パッチ電極にギャップ結合を通過可能である蛍光色素を加え、視交差上核スライス回旋培養標本の神経細胞に対してホールセルパッチクランプ法を施行したところ、隣接する細胞に色素が拡散していることを蛍光顕微鏡下に確認している。さらに色素が拡散した細胞にパッチクランプ法を施行すると、興奮性膜を有するニューロンであることが明らかになった。従来は、ギャップ結合が存在する二つのニューロンにダブルホールセルパッチクランプ法を適用することが極めて困難であったが、スライスが単層化する回旋培養標本とダブルホールセルパッチクランプ法の組み合わせによって、ギャップ結合の電気的及び化学的細胞間情報伝達の性格を明らかにしうることが可能になった。この研究の進展によって、ギャップ結合を介するニューロン間伝達機構の役割・性格を解明しうると思われる。視交差上核領域に豊富に存在するGABA作動性後シナプス電流に対して、その性質(振幅・頻度)を修飾する制御因子の検索を行った。これらのうち、特に、ニコチン性アセチルコリン受容体のGABA作動性後シナプス電流に対する効果を、パッチクランプ法を用いて検討した。その成果の一部を、第28回北米神経科学学会(セッション:327.4)にて発表したので、その内容を以下に報告する。視交差上核は、哺乳動物のサーカディアンリズムの形成に必要不可欠な役割を果たしていると同時にアセチルコリン作動性の神経入力を受けている。この研究では、視交差上核におけるGABA伝達に対するアセチルコリン作動性入力の役割について検討した。ホールセルパッチクランプ法を適用し保持電位-60mVで、自発性後シナプス電流が観測された。あるニューロンにおける後シナプス電流は、平均頻度が1.38Hzで平均振幅が25pAであり、反転電位は約0mVであり、塩素イオンの平衡電位に一致した。さらにこの後シナプス電流は、ビククリン(10μM)により可逆性に抑制されることから、GABA電流であることが示された。ニコチン(100μM)存在下で後シナプス電流の平均頻度は、384%(5.3Hz)増強されたが、平均振幅には影響がなかった。ニコチンは、微小性後シナプス電流についても同様に作用した。これらのことから、視交差上核培養脳切片においては、ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化により活動電位非依存性に前シナプスからのGABA放出が増強されることが示された。
卵巣癌におけるBH3模倣薬による細胞死誘導をもとにした新規治療法の開発

卵巣癌は抗癌剤耐性を獲得し再発を繰り返す難治性の悪性腫瘍であり新規治療ターゲットの解明が求められている。我々は、卵巣癌を含む婦人科悪性腫瘍においてアポトーシスと関連するBcl-2 familyを標的として、卵巣がん及び子宮体癌の細胞株を用いてBH3模倣薬ABT737及びABT199の抗腫瘍効果を証明した。続いて、卵巣明細胞癌では、アポトーシスに関わる分子であるMDM2の高発現、TP53の低変異率、PI3K/mTOR経路の高頻度活性化などから、新規MDM2阻害剤DS-3032bとEverolimusの併用も新規治療の選択肢となり得ると考えた。卵巣明細胞腺癌株および淡明細胞型腎細胞癌株に対するMDM2阻害剤(DS-3032b)、mTOR阻害剤(Everolimus)の細胞増殖抑制効果をMTT assayおよびFlow cytometryを用いて解析し、Western blottingによりタンパク発現の変化を確認した。また、ヌードマウス皮下移植モデルを作成し、薬剤経口投与(DS-3032b 50 mg/kg/day, Everolimus 5mg/kg/day)による抗腫瘍効果の検討を行った。EverolimusはTP53非依存的に静細胞性の細胞増殖抑制効果を認めたが、DS-3032bは野生型TP53細胞株においてのみ濃度依存性に細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導効果を認めた。Wetern blotingでは、DS-3032bによるアポトーシス関連蛋白の誘導、EverolimusによるmTOR下流蛋白の抑制を確認した。DS-3032bとEvelolimus併用によりヌードマウス皮下移植モデルでは、単剤と比較して有意な細胞増殖抑制効果の増強を認めた。以上の結果より、DS-3032bが野生型TP53卵巣および腎明細胞腺癌における新規分子標的治療薬となり得る可能性が示唆された。卵巣癌は抗癌剤耐性を獲得し再発を繰り返す難治性の悪性腫瘍であり、殺細胞効果を高める新規治療ターゲットの解明が求められている。また、子宮体癌は再発時の抗癌剤の選択肢が限られており、新規の治療戦略が求められている。我々は、卵巣癌や子宮体癌といった婦人科悪性腫瘍においてアポトーシスに関連するBcl-2 familyを標的としてアポトーシスを効率的に誘導する新規治療法を確立することを目的として研究を開始した。はじめに、子宮体癌細胞株6株と卵巣癌細胞株11株(明細胞癌6株、粘液性癌5株)を用い、BH3模倣薬(Bcl-2 familyを標的とした治療薬)であるABT737及びABT199を添加し、細胞増殖抑制効果について検討した。Cell proliferation assayを行い、子宮体癌細胞株では、ABT737、ABT199共に50μMの添加でコントロールと比較して7割以上細胞増殖を抑制した。卵巣癌細胞株では、10μMで7割以上の細胞増殖抑制を示した。卵巣癌細胞株2種類を用いて、ABT737を添加した際の細胞周期に与える影響を検討した。ABT737は濃度依存的にsub-G1期細胞の割合を減少させ、アポトーシスを誘導する可能性が示唆された。続いて、細胞株を用いてBH3模倣薬と他の薬剤を併用することでこのアポトーシスをより効率的に誘導できるかについて検討するため、抗癌剤としてパクリタキセル、分子標的薬としてPI3K/mTOR同時阻害薬を候補とし、ABT737との併用が細胞増殖抑制に与える影響を検討した。パクリタキセルとの併用では、併用による相乗効果は認められなかったが、PI3K/mTOR同時阻害剤であるDS7423との併用では、相乗効果が示された。細胞株維持においてトラブルが発生したため。また薬剤添加濃度の調整のための予備実験に時間を要したため。以上の結果より、DS-3032bが野生型TP53卵巣および腎明細胞