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春先の大雨時における積雪内部での降雨融雪浸透水の挙動

降雨と融雪が重なって生じる河川洪水の発生メカニズムを解明するため、北海道母子里で行われた積雪上への模擬降雨散水実験の結果を、雪氷防災研究センターで開発された積雪水分移動モデルによって再現できるかどうかを検討した。その結果、積雪底面流出の出現に最も効くと考えていた層境界の粒径コントラストは、層境界で浸透水の滞留を引き起こすという面では重要であるが、底面流出の出現やその流出率は、層境界を通過した後の水みちの発達の仕方に強く依存することが分かった。水みちが鉛直下向きに発達すると顕著な底面流出が出現し、水みちが側面方向に傾くと底面流出が出現しないことが明らかになった。1)北海道母子里で融雪期に行った7回の模擬降雨散水実験では、積雪底面流出が顕著に現れる場合とそうでない場合とが観測された。そこで、流出が顕著であった実験(積雪深116cm、総雨量120mm)について、積雪底面流出水の水素同位体比(δD)とNaイオン濃度の時間変化を解析し、降水の積雪内での浸透過程を考察した。δDは流出量の時間変化ともよく対応し、流出過程は新しい水と古い水との単純な2成分混合で考えられる。一方Naは、濃い水を薄い積雪層に散布したにもかかわらず、積雪底面からはさらに濃い水が流出した。液相と固相とを区別し、雪粒間での再凍結や水みち形成などを考慮する必要があることが分かった。2)防災科学技術研究所によって開発された積雪水分移動モデルを用いて、上位/下位層境界の位置、密度、粒径、初期体積含水率、それらのばらつき度合い、傾斜角、などの積雪条件を設定し、雪面からの水供給量を入力条件、積雪底面流出量を検証データとして模擬降雨散水実験結果の再現計算を行った。特に粒径については、野外での大まかな測定結果の傾向は取り入れつつも、チューニング・パラメーターとして大小の調整を行い、底面流出量の実測値で内挿検定した。これによって大粒ザラメ層の存在とそれを挟む上下層との粒径コントラストが底面流出の出現する・しないに効くという仮説が概ね支持できる結果が得られた。3)野外において積雪内部での水挙動がどのようになるかを見極める方法を確立させるために、粒径コントラストなどの支配因子を野外で簡便に測定し数値で表す技法を検討した。長岡市の雪氷防災研究センターにおいて当所が開発した複合センサー付き積雪検層ゾンデのデモや、国際雪科学ワークショップでAvaTech社のスノーゾンデSP1の有効性を吟味した。次年度以降はこれらの導入を試みる。北海道母子里で融雪期に行った7回の模擬降雨散水実験の結果を多次元水分移動モデルで再現できるかどうかを検討した。今回の計算には実際の層構造、密度、粒径、含水率を与えて2次元で行い、底面流出量の再現性の指標として流出率に着目した。流出率を計算するために、積雪中の左右の境界条件は自由に流出する条件とし、水みちが左右両端から逃げる場合には底面流出に現れなくなり流出率は1以下になる。また、水みちを再現するために積雪層内に乱数配列を与えるため、計算の際にはこの乱数配列によって異なる水の浸透パターンとなり、それによって流出率も異なる。その影響も考慮するため、5種類の乱数パターンを作成してそれぞれのケースについて、流出率の平均や取りうる値の幅を計算した。その結果、流出率がよく再現できたケースと、再現できなかったケースが現れた。特に、積雪層内部で大きい粒径コントラストがあると、層境界で水がとまり、そこから横方向に水が逃げるため流出率が極端に小さくなることがわかった。このように、散水実験結果をモデルで再現検討することにより、積雪底面流出の出現に最も効くと考えていた積雪層境界の粒径コントラストは、層境界で浸透水の滞留を引き起こすという面では重要であるが、積雪底面流出の出現やその流出率は、層境界を通過した後の水みちの発達の仕方に強く依存することが明らかになった。さらに、これまで野外で観測された降雨融雪に伴う積雪底面流出の現れ方は、減衰型よりはむしろ圧力伝播型に近くなる。この特徴を水分移動モデルで説明可能かどうかを試行計算した。その結果、層構造や水みち発生条件が整えば圧力伝播型に近い流出が起きることが示唆された。1)野外観測体制の整備と機器設置:母子里の融雪観測室前の露場において20112013年に引き続き、2016年4月にも降雨量を4通りに時間変化させた場合の散水実験を計画している。本年はそのために必要な散水実験用施設を製作した。また、熱収支解析に用いる各種放射量、気温湿度、風向風速、積雪深、降水量などの観測機器の整備と更新を行うと共に、観測データをWebを介して札幌に送信するシステムを開発した。さらに、現有の3.6m×3.6m大型積雪ライシメーターを用いて積雪底面流出量を連続測定も継続中である。2)模擬降雨散水実験結果のモデルへの入力条件の整理:母子里で実施された7回の模擬降雨散水実験について、上位/下位層境界の位置、密度、粒径、初期体積含水率、それらのばらつき度合い、傾斜角などの積雪条件、水供給量、底面流出量などの入出力データをモデルへ組み込んだ。3)国内の水関係学会での公表得られた成果の一部を国内の水関係学会で発表するとともに、隔年で開催される国際雪科学ワークショップでの発表準備を行った。

降雨と融雪が重なって生じる河川洪水の発生メカニズムを解明するため、北海道母子里において積雪上に100mm以上の大雨が降った時を想定した模擬降雨散水実験を行った結果、積雪底面流出が顕著に現れる場合とほとんど現れない場合とが観測された。その流出状況は散水量や積雪深とは関係がなく、その時の積雪層構造に応じて鉛直浸透が顕著な場合と水平流動が顕著な場合のどちらもが起こり得ることが分かった。こうした違いには層境界での粒径コントラストが効くと考えられる。そこで本研究では、層境界での粒径コントラストが水挙動の支配因子となるという仮説のもとに、模擬降雨散水実験の結果を雪氷防災研究センターで開発された積雪水分移動モデルによって再現できるかどうかを検討した。その結果、積雪底面流出の出現に最も効くと考えていた層境界の粒径コントラストは、層境界で浸透水の滞留を引き起こすという面では重要であるが、積雪底面流出の出現やその流出率は、層境界を通過した後の水みちの発達の仕方に強く依存することが分かった。水みちは多量の浸透水を輸送するため、水みちが鉛直下向きに発達すると顕著な積雪底面流出が出現し、水みちが側面方向に傾くと底面流出が出現しないことが明らかになった。さらに、これまで野外で観測された降雨融雪に伴う積雪底面流出のハイドログラフは、減衰型よりはむしろ圧力伝播型に近くなる。この特徴を積雪水分移動モデルで説明可能かどうかを試行計算し、層構造や水みち発生条件が整えば圧力伝播型に近い流出が起きることが示唆された。以上のように、積雪水分移動モデルによって多様な積雪内浸透の説明が可能になったが、この結果を災害発生予測モデルに組み込むためには、積雪内部条件と鉛直方向の水みち発達の因果関係解明が今後必要である。成果の一部は国内外の水関連学会で発表したほか、現在投稿中の和・英論文が1篇ずつある。降雨と融雪が重なって生じる河川洪水の発生メカニズムを解明するため、北海道母子里で行われた積雪上への模擬降雨散水実験の結果を、雪氷防災研究センターで開発された積雪水分移動モデルによって再現できるかどうかを検討した。その結果、積雪底面流出の出現に最も効くと考えていた層境界の粒径コントラストは、層境界で浸透水の滞留を引き起こすという面では重要であるが、底面流出の出現やその流出率は、層境界を通過した後の水みちの発達の仕方に強く依存することが分かった。水みちが鉛直下向きに発達すると顕著な底面流出が出現し、水みちが側面方向に傾くと底面流出が出現しないことが明らかになった。1)野外観測体制の整備と機器設置:春先の大雨時における降雨融雪浸透水の積雪内部での挙動を調べるための観測体制を整備した。現有の気象測器に加え放射収支計を更新設置し、十分な信頼性で降雨量と融雪量の連続測定が行えるようになった。同時に、現有の3.6m×3.6m大型積雪ライシメーターを用いて積雪底面流出量を連続測定も継続中である。2)模擬降雨散水実験結果のモデルへの入力条件の整理:母子里で実施された7回の模擬降雨散水実験について、上位/下位層境界の位置、密度、粒径、初期体積含水率、それらのばらつき度合い、傾斜角などの積雪条件、水供給量、底面流出量などの入出力データをモデルへ組み込んだ。3)積雪水分移動モデルによる再現計算と支配因子の抽出:積雪水分移動モデルを用いて模擬降雨散水実験結果の再現計算を行い、大粒ザラメ層の存在とそれを挟む上下層との粒径コントラストが底面流出の出現する・しないに効くという結果が得られた。4)国内の水関係学会での公表:得られた成果の一部を国内の水関係学会や国際雪科学ワークショップで発表した。
光機能性分子と人工二分子膜フィルムを用いた生体内電子移動反応系の構築

昨年度までの研究で電極修飾用の膜にポリイオンコンプレックス型の人工二分子膜脂質を用いる事で、アゾベンゼン誘導体を修飾膜中に安定に固定化した混合二分子膜修飾電極を作製することが可能であることを明らかにした。本年度は昨年度の研究により得られた電極作製手法を用いて修飾した電極を用い、電極表面に紫外光を照射し、紫外光照射前後でのサイクリックボルタンメトリー(CV)法による測定を行い、アゾベンゼン分子の電気化学応答と光異性化挙動の関係について検討を行った。修飾電極表面に紫外光を照射する前のCV測定では固定化されたアゾベンゼン誘導体に由来する一対の酸化還元応答が観測された。修飾電極表面に紫外光を所定時間照射した後に同様の測定を行うと、二対の酸化還元応答が観測され修飾電極の電気化学応答に光依存性がみられた。光照射前後での電気化学応答について詳細な検討を行った。光照射後に観測される二対の応答のうち一対の応答は光照射前の測定でも観測されていることがわかった。光照射後に新たに観測される応答に注目して検討を行った。その結果、新しい応答は明らかな光依存性(紫外光照射後にのみ発現する)を持つこと、および一対の酸化還元応答であることがわかった。光照射前にはフィルム中に固定化されたアゾベンゼン誘導体のtrans体に由来する応答が、光照射後にはフィルム中でtrans体からcis体へと異性化したアゾベンゼン誘導体のcis体の電気化学応答が新たに発現され、trans体、cis体に由来する二対の電気化学応答が観測されることが明らかとなった。以上のように本研究は、作成した修飾電極が電気化学的に応答しない状態(光照射前)をOFF、応答する状態(光照射後)をONとして考えると、作成した混合二分子膜修飾電極が、光により電流を制御可能な光機能性材料として有用であることを明らかにした。さらに本研究ではフィルム形成分子に生体膜類似の人工二分子膜脂質を用いているという特徴があり、構築した修飾電極系を用いる事で光応答能を有する生体内電子移動反応モデルへの応用と発展が期待できる。本年度は光異性化する分子を人工二分子膜脂質中に固定化したフィルムで修飾した電極系の構築を目的として研究を行った。実験には市販で比較的容易に入手可能なアゾベンゼン骨格を有する分子を主に用いて、電極上への人工二分子膜脂質との混合フィルムでの固定化を行った。電極上への混合フィルムの固定化は当初予測したよりも非常に困難であり、フィルムの経時変化による溶液中への溶解、電極上からの剥離の問題が明らかとなった。フィルムの溶解に関してはポリイオンコンプレックス型の人工二分子膜を用いることでかなり改善することが可能となった。電極上からのフィルムの剥離に関しては、当初使用していた金電極では改善することができなかったが、電極表面の疎水性が高いカーボン電極を用いることでこちらの問題も解決することができた。引き続き、修飾電極のデバイス化のために、構築した電極系でのアゾベンゼン分子の電子移動反応と光異性化挙動の関係についてサイクリックボルタンメトリー(CV)法を用いて検討を行った。アゾベンゼン骨格に対して置換基を持たない分子をフィルム中に固定化した電極を用いた場合、電極の電気化学応答は得られなかったが、4,4'の位置に長鎖を有する誘導体を固定化した電極では電気化学活性が発現し分子の構造依存性が見られた。以上より、混合フィルム中での電気化学活性の発現のためにはアゾベンゼン骨格が長鎖アルキル基を有している必要があることが明らかとなった。さらにアゾベンゼン分子の光異性化による電極応答のスイッチングを期待したが、作製した電極系では明確な照射光依存性は観測されずフィルム中のアゾベンゼン分子は常に電気化学活性を示した。この結果は二分子膜フィルムが有機溶媒中と同じような反応場を提供するマトリックスとして作用している事を示唆しており、非常に興味深い知見である。さらに今後の詳細な実験で明らかにしたい。来年度はフィルム中の分子の異性化や電気化学反応に与える二分子膜脂質の影響についてさらに詳細な知見を得、さらに生体内電子移動反応や植物の光合成に関するモデル反応場としての応用の可能性を探る事を計画している。

光照射前にはフィルム中に固定化されたアゾベンゼン誘導体のtrans体に由来する応答が、光照射後にはフィルム中でtrans体からcis体へと異性化したアゾベンゼン誘導体のcis体の電気化学応答が新たに発現され、trans体、cis体に由来する二対の電気化学応答が観測されることが明らかとなった。以上のように本研究は、作成した修飾電極が電気化学的に応答しない状態(光照射前)をOFF、応答する状態(光照射後)をONとして考えると、作成した混合二分子膜修飾電極が、光により電流を制御可能な光機能性材料として有用であることを明らかにした。さらに本研究ではフィルム形成分子に生体膜類似の人工二分子膜脂質を用いているという特徴があり、構築した修飾電極系を用いる事で光応答能を有する生体内電子移動反応モデルへの応用と発展が期待できる。
メタボリックシンドロームに対する分子標的療法の開発

褐色脂肪細胞は、げっ歯類等では脂肪酸を酸化分解したエネルギーを熱として散逸する細胞として知られるが、ヒトでは機能性で培養可能な褐色脂肪細胞がほとんどavailableでなかったため、未解明の点が多い。我々は、ヒトおよびマウスの褐色脂肪細胞を誘導する新しい技術を開発した。そこで本研究では、我々の技術で樹立した褐色脂肪細胞の遺伝子発現パターン、エピジェネティックマーク、代謝制御能とその制御、誘導の分子機構等の解析を行った。本研究の結果、メタボリック症候群等に対する新しい分子標的治療とそのための標的分子の探索につながる数々の知見が得られた。褐色脂肪細胞は、肥満やII型糖尿病の制御に重要な意義を持つが、その研究は従来、マウスやラットを対象として発展してきた。ヒトの褐色脂肪細胞は、入手が困難であり、そのプロフィールには不明な部分が多かった。我々は最近、ヒトiPS細胞から褐色脂肪細胞を誘導する技術を開発したので、正常人や患者より褐色脂肪細胞を大量に調整する事が可能となった。本プロジェクトではこの技術を基盤として、in silico分子進化法とスーパーコンピューターを用いた論理的創薬システムの技術を融合させることにより、ヒト褐色脂肪細胞の分化誘導あるいは増殖させるための分子標的薬剤の開発を目指す。本研究の成果は、内臓型肥満症やII型糖尿病に対する全く新しい分子標的治療の創出に繋がる可能性がある。ゲノムに外来遺伝子のインテグレーションの無いヒト褐色脂肪細胞を、ヒトiPS細胞から誘導する系を、EBVエピゾーマル・ベクターを用いて立ち上げる。さらにその系を用いて、候補分子として、褐色脂肪細胞の誘導にポジティブに働いていると考えられる転写因子(BMP7、C/EBPβ、PGC-1α、PPARγ)や、ネガティブに働いていると考えられる転写因子(MyoD、Myo5、MEF2、MRF4)を制御し、もっとも効率の良い分化誘導パターンを見出す。それらの研究データをもとに、連携研究者の田村裕(千葉大学)が独自に開発した「論理的創薬システム」を用いて、上記の候補分子を制御して褐色脂肪細胞の分化を誘導できるペプチドの配列の決定する。in silicoで算出した配列のペプチドを合成し、in vitro、in vivoの両面で褐色脂肪細胞の分化誘導効率と増殖について検討を行う。褐色脂肪細胞は、主としてミトコンドリア内膜に局在するUCP1たんぱくの機能により、脂肪酸を酸化分解したエネルギーを熱として放散する細胞であり、肥満やII型糖尿病の病態にも重要な意義を有することが、げっ歯類等でよく知られている。ヒトにおいても、肥満者やII型糖尿病患者では褐色脂肪組織の機能が低いことから、褐色脂肪細胞を誘導しあるいは活性化することができれば、これら疾患の治療に繋がる可能性が期待できる。しかしながら、ヒトの褐色脂肪細胞は、機能性で培養可能なものが事実上availableでなかったため、このような研究はほとんど進んでいない。我々は最近、ヒトの褐色脂肪細胞を誘導する新しい技術を開発した。そこで本研究では、この技術に種々の創薬システムを応用することで、ヒト褐色脂肪細胞を誘導、増殖あるいは活性化させるための新規分子標的薬剤の開発を目指した。その結果、ヒト褐色脂肪細胞の誘導に寄与する可能性のある小分子化合物の候補を見出した。この候補化合物をリード化合物として合成展開し、あるいはこれらの化合物をミミックするペプチドを構築することにより、さらに優れた褐色脂肪細胞の分化誘導系を構築できる可能性がある。また、これらの化合物やペプチドの標的分子を探索することで、褐色脂肪細胞の誘導のメカニズム解明につながるであろう。本研究の成果は、未解明な点が多いヒト褐色脂肪細胞の分化機構、生理機能、病態における役割等の解明や制御技術の確立等に極めて有用であるのみならず、メタボリック症候群やII型糖尿病に対する新しい分子標的治療の創生に結びつくものと期待できる。

さらにその系を用いて、候補分子として、褐色脂肪細胞の誘導にポジティブに働いていると考えられる転写因子(BMP7、C/EBPβ、PGC-1α、PPARγ)や、ネガティブに働いていると考えられる転写因子(MyoD、Myo5、MEF2、MRF4)を制御し、もっとも効率の良い分化誘導パターンを見出す。それらの研究データをもとに、連携研究者の田村裕(千葉大学)が独自に開発した「論理的創薬システム」を用いて、上記の候補分子を制御して褐色脂肪細胞の分化を誘導できるペプチドの配列の決定する。in silicoで算出した配列のペプチドを合成し、in vitro、in vivoの両面で褐色脂肪細胞の分化誘導効率と増殖について検討を行う。iPS細胞から褐色脂肪細胞の誘導のみならず、繊維芽細胞からiPSを経ずに、褐色脂肪細胞を誘導することに成功している。さらに、ウイルスベクターを用いないで、EBVプラスミドベクターを用いて、高効率に褐色脂肪細胞を繊維芽細胞から直接にコンヴァートすることにも成功している。さらに、遺伝子導入なしでペプチドや小分子ライブラリーをでiPS細胞や繊維芽細胞から褐色脂肪細胞誘導するためのスクリーニング系の構築も、ほぼ完成しており、実際に研究計画より、はるかに先に進んでいる。研究のスタート時点での褐色脂肪分化誘導効率と比較して飛躍的に向上できる導入遺伝子の組み合わせにを既に見出している(20%→80%)。また誘導に必要な時間の短縮できるようになっている(40日→12日)。またゲノムに対するインテグレーションの無い褐色脂肪細胞も得られつつある。1千葉大学より、in silico分子進化法とスーパーコンピューターを用いた論理的創薬システムで算出され合成されたペプチド群の供与を受ける。ヒトiPS細胞から分化させた褐色脂肪細胞に添加し培養する。添加後の細胞の、UCP-1をはじめとする遺伝子の発現を検証する。またマイクロアレイを用いて広範囲に遺伝子の変化を検討する。2繊維芽細胞から褐色脂肪細胞へのダイレクトリプログラミングの系に対してのペプチド群の影響を検討する。ゲノム・インテグレーション。フリーの分化誘導系が確率されてきたので、次年度はいよいよ分子進化法により得られたペプチドのスクリーニングを行っていく予定である。設備備品なし消耗品本研究では、細胞培養、遺伝子導入、分子生物学的解析、生化学的解析、細胞生物学的解析、DNAマイクロアレイ解析、プロテオミクス解析等を行い、H26には実験動物を用いた解析も行うので、以下の消耗品は必要なものである。試薬類(酵素、試薬、カラム、リコンビナント因子、マイクロアレイ関連試薬、質量分析関連試薬)核酸類(プライマー、TaqManプローブ)抗体等(イメージングサイトメトリー解析用蛍光抗体、Westernブロッティング用抗体)培地,血清類(細胞培養用培地および血清、各種添加試薬)プラスチック製品(培養容器、保存用器、遠心チューブ)実験動物(C57BL/6マウス、Balb/cマウス、NOGマウス)旅費研究成果の発表のために必要な、国内外の学会出張の旅費(国内旅費1回40千円×2回(H25、26)次年度は、ペプチドの合成と、リアルタイムPCR関連に重点的に研究費を使用していく予定である。
コレラ毒素によるGsのADP-リボシル化を制御する低分子量GTP結合蛋白質ARF及びARI

コレラ毒素が標的細胞内に侵入して3量体GTP結合蛋白質のひとつであるGsのαサブユニットをADP-リボシル化する際に、低分子量GTP結合蛋白質のひとつであるADP-ribosylation factor(ARF)がコレラ毒素のADP-リボシル化活性を亢進させることを発見し、そのメカニズムを明らかにしてきた。これは細胞内での3量体GTP結合蛋白質と低分子量GTP結合蛋白質との相互関係を明らかにした最初の例である。さらに、ARFと分子量的によく似ているが、コレラ毒素のADP-リボシル化活性を阻害する蛋白質を発見し、その精製に成功した。ADP-ribosylation inhibitor(ARI)と名づけられたこの蛋白質は、NADase活性をもっておらず、しかも、コレラ毒素やGSに対するprotease活性を有しておらず、コレラ毒素のAサブユニットに直接結合してそのADP-リボシル化活性を阻害していることが明らかになった。そこで、ARFとARIに着目してコレラ毒素によって惹起される情報伝達のネットワークをより詳細に解析できるようになった。特に今年度は、特殊な環境下での種々の細胞に対するコレラ毒素の興味深い作用をいくつか明らかにすることが出来た。例えば、コレラ毒素が副腎皮質ミトコンドリアでのCa^<2+>の透過性とpregnenolone産生を亢進させること、あるいは、長期飲酒ラットの肝臓では、コレラ毒素がGsαをコントロールに比較して圧倒的に強くADP-リボシル化することなどである。これらの現象を初めとして、いくつかの実例ではコレラ毒素のみに注目した解析では説明できないことが多く、未知の領域として残されていた分野である。しかし、ARFとARI、あるいは他のいくつかの似たような因子が、これらの現象において重要な役割を演じている可能性を示唆する成績も得られて来ており、コレラ毒素を用いた情報伝達のネットワークを新たな視点から具体的に解析できるようになった。
異質倍数体植物の環境適応性に関わるゲノム機能の解明

代表者のこれまでの研究で、温帯産草本のミナトカモジグサ属植物の異質倍数体種Brachypodium hybridumとその一方の祖先二倍体種は栄養成長期間の高温ストレスに対して耐性をもち、他方の祖先二倍体種は耐性をもたないことが分かっている。これら三種の高温ストレス耐性を事例として、異質倍数体植物の環境ストレス応答を調査し、B. hybridumにおける高温ストレス耐性獲得の要因となる遺伝子や小RNA分子を同定することを目的に、時系列トランスクリプトーム解析を進めた。三種を通常環境と高温環境で育成し、葉のサンプリングを3日おきに5時点分行った。サンプリングした葉のRNA-seq解析を行い、得られたシーケンスデータをミナトカモジグサの参照ゲノム配列にマッピングし、遺伝子発現データを得た。また、これまでに三種を高温環境下で登熟期まで育てたところ、異質倍数体種であるB. hybridumのみが通常環境下で育てた植物と同程度の数の種子を形成することを観察していた。そこで、生殖成長期間における高温ストレス耐性の再調査を行い、B. hybridumのみが高温環境下でも種子を残すという現象の再現性を確認した。この形質は農業的にも有用な形質であり、その背景にある雑種強勢のメカニズムを理解するため、出穂の直前及び直後の葉に関しても上記の時系列サンプルとともにRNA-seq解析を行った。さらに、モデル植物のミナトカモジグサ属植物の知見や解析技術をもとに、異質倍数体の作物の研究に発展するため、パンコムギにおける共発現ネットワーク解析を行った。公共利用可能なRNA-seqデータを集め、重み付き遺伝子共発現ネットワーク解析によりパンコムギの同祖遺伝子を22個の共発現モジュールに分け、同祖遺伝子間で異なる共発現モジュールに属する遺伝子を網羅的に同定した。RNA-seq解析によって得られたシーケンスデータにいくつかクオリティの悪いデータがあり、それらのやり直しを検討している。しかし、当初の研究計画に加え、異質倍数体植物の高温ストレス応答の理解を出穂期まで展開したことで、異質倍数種であるB. hybridumが高温環境下においても通常環境下で育った植物と同程度の数の種子を形成するという有用形質を発見した。さらに、その背景にある転写制御を解明するために、出穂の直前及び直後の葉のトランスクリプトーム解析を進めることができた。また、異質倍数体植物のゲノム・トランスクリプトームデータの解析手法を、異質倍数体の作物であるパンコムギのトランスクリプトームデータに適用し、同祖遺伝子の発現パターンの多様性を網羅的に明らかにすることができた。異質倍数体植物の環境ストレス応答には、同祖遺伝子毎の多様な転写制御が示唆されているものの、転写制御に関わる小RNA分子等との関連について詳細な理解がなされていない。本研究では異質倍数体植物の環境ストレス応答の理解を、タンパク質をコードする遺伝子とともに、ncRNAやsORF遺伝子といった小RNA分子にも拡張する。これまでに、異質倍数体種B. hybridumとその祖先二倍体種(B. distachyon及びB. stacei)を、通常環境と高温環境で育成し、葉のサンプリングを行った。また、サンプリングした葉から抽出したTotal RNAを用いてmRNA用のシーケンスライブラリを作製し、高速シーケンサーを用いてRNA-seq解析を行い、遺伝子発現データを得た。今後は、small RNA-seq用のシーケンスライブラリを作製し、small RNAのシーケンスを行う。シーケンスデータがそろい次第、各サンプルの小RNA分子の発現量を求める。利用可能な変数セット(RNA分子の発現量と外環境)から種間、祖先ゲノム間、環境ストレス耐性の有無等を分類できる少数の有効な変数セットを得るために、教師なしの機械学習を用いたデータ構造の分類と変数選択を行う。選択されたRNA分子のセットとB. hybridumの環境適応性の因果関係を、深層学習を用いたニューラルネットワークによりモデリングする。選択された重要なRNA分子の発現量と外環境を説明変数に、高温ストレス耐性の指標となる遺伝子群の発現を目的変数にする。具体的には、高温耐性獲得への関与が知られているHSFやHSP等の発現パターンを指標として高温ストレス耐性が発動する時点とその要因となるRNA分子を明らかにする。

さらに、モデル植物のミナトカモジグサ属植物の知見や解析技術をもとに、異質倍数体の作物の研究に発展するため、パンコムギにおける共発現ネットワーク解析を行った。公共利用可能なRNA-seqデータを集め、重み付き遺伝子共発現ネットワーク解析によりパンコムギの同祖遺伝子を22個の共発現モジュールに分け、同祖遺伝子間で異なる共発現モジュールに属する遺伝子を網羅的に同定した。RNA-seq解析によって得られたシーケンスデータにいくつかクオリティの悪いデータがあり、それらのやり直しを検討している。しかし、当初の研究計画に加え、異質倍数体植物の高温ストレス応答の理解を出穂期まで展開したことで、異質倍数種であるB. hybridumが高温環境下においても通常環境下で育った植物と同程度の数の種子を形成するという有用形質を発見した。さらに、その背景にある転写制御を解明するために、出穂の直前及び直後の葉のトランスクリプトーム解析を進めることができた。また、異質倍数体植物のゲノム・トランスクリプトームデータの解析手法を、異質倍数体の作物であるパンコムギのトランスクリプトームデータに適用し、同祖遺伝子の発現パターンの多様性を網羅的に明らかにすることができた。異質倍数体植物の環境ストレス応答には、同祖遺伝子毎の多様な転写制御が示唆されているものの、転写制御に関わる小RNA分子等との関連について詳細な理解がなされていない。本研究では異質倍数体植物の環境ストレス応答の理解を、タンパク質をコードする遺伝子とともに、ncRNAやsORF遺伝子といった小RNA分子にも拡張する。これまでに、異質倍数体種B. hybridumとその祖先二倍体種(B. distachyon及びB. stacei)を、通常環境と高温環境で育成し、葉のサンプリングを行った。また、サンプリングした葉から抽出したTotal RNAを用いてmRNA用のシーケンスライブラリを作製し、高速シーケンサーを用いてRNA-seq解析を行い、遺伝子発現データを得た。今後は、small RNA-seq用のシーケンスライブラリを作製し、small RNAのシーケンスを行う。シーケンスデータがそろい次第、各サンプルの小RNA分子の発現量を求める。利用可能な変数セット(RNA分子の発現量と外環境)から種間、祖先ゲノム間、環境ストレス耐性の有無等を分類できる少数の有効な変数セットを得るために、教師なしの機械学習を用いたデータ構造の分類と変数選択を行う。選択されたRNA分子のセットとB. hybridumの環境適応性の因果関係を、深層学習を用いたニューラルネットワークによりモデリングする。選択された重要なRNA分子の発現量と外環境を説明変数に、高温ストレス耐性の指標となる遺伝子群の発現を目的変数にする。具体的には、高温耐性獲得への関与が知られているHSFやHSP等の発現パターンを指標として高温ストレス耐性が発動する時点とその要因となるRNA分子を明らかにする。
最終工程に高特異性セラチア56Kプロテア-ゼを用いる生理活性ポリペプチド合成

平成1年度、セラチアプロテア-ゼを用いるモデルペプチド合成において、Arg-Leu結合の生成収率は高いが、Arg-Gly結合生成収率は低いこと等から、SPが配列特異的にペプチド結合生成を触媒することを発見した。平成2年度は、本プロテア-ゼを長鎖ポリペプチド合成に応用するための基礎実験として、高選択性のArg-Leuおよび低選択性のArg-Gly両結合を含むモデルペプチドBz-Gly-Arg-Gly-Phe-Arg-Leu-NH_2のArg-Leu結合生成触媒による合成を試みた。結果、目的のペプチドを得ることはできなかったことより、如何に高特異的なプロテア-ゼを触媒として使用しても、加水分解反応を抑えることは不可能であるとの結論に達した。ペプチド性ホルモン製造のためには、量的合成に応用可能な高効率合成法の確立が必要である。そこで、ペプチド結合生成の好触媒であるトリプシンを用い、低含水量においてもプロテア-ゼを失活させず高収率にペプチドを生成可能な優れた溶媒系の検索を行なった。その結果、4%H_2O/ヘキサフルオロイソプロピルアルコ-ル/ジメチルホルムアミド(1:1)混合溶媒中において、83%の収率でArg含有テトラペプチドを得た。次に、オキシム樹脂を用いた高収率保護ペプチドフラグメント合成と最終工程に本混合溶媒中でのトリプシン縮合法を組み合わせた方法をヒト成長ホルモン放出因子の活性フラグメント(hGRF(1-29)-NH_2)の合成に応用した。トリプシン触媒により90%の収率で保護hGRF(1-29)-NH_2を合成可能であった。脱保護の後、高純度のhGRE(1-29)-NH_2を得た。SPによる高効率合成は困難であったが、優れた溶媒系およびトリプシンによる高効率合成法の確立を行なうことができた。最終工程にセラチアプロテア-ゼ(SP)を触媒として用い、高効率に生理活性ポリペプチドの合成を行うための基礎研究として、平成元年度に以下の研究を行い成果を得た。1.モデルペプチドの合成:プロテア-ゼ触媒によるペプチド合成のモデル系として、酸成分、Abz-Gly-Phe-Arg-OH(Abz:アミノベンゾイル)とアミン成分、Leu-Nba(Nba:ニトロベンジルアミン)、Ala-NbaあるいはGly-Nbaとの縮合反応を、SP触媒により行った。SPはArg-Leu結合を速やかに高収率縮合するが(収率50%、2hr)、Arg-AlaやArg-Gly結合を収率よく縮合しなかった(収率20%)。この結果は、SPの加水分解系での高基質特異性がペプチド合成系においても保存されていることの発見である。同じArg特異的プロテア-ゼであるトリプシンでは、この様な高い特異性は見出されなかった。またSPはアミン成分Leu-Ala-Nbaとの縮合反応も高収率で触媒することにより、本プロテア-ゼがより長鎖の生理活性ポリペプチドの合成に適用可能であることが示された。反応最適条件は、溶媒50%DNF、pH7.0である。2.アフィニティカラムの作成:プメテア-ゼの大量精製技術として、プロテア-ゼの拮抗阻害剤をゲル担体に固定化したアフィニティカラムを作成したルプロテア-ゼとの解離定数が10μM程度の阻害剤が最適であることを見出した。3.ヒト成長ホルモン放出因子のフラグメント合成:上記成果を踏まえ、高価値医薬品としての可能性の高いヒト成長ホルモン放出因子の活性フラグメントの高純度、高効率合成をプロテア-ゼ触媒により行う。合成原料である保護

ペプチドセグメントを三原およびKaiserの方法により高収率合成することができた。平成2年度においては、最終工程のプロテア-ゼ触媒により、上記生理活性ポリペプチドの合成を行う計画である。平成1年度、セラチアプロテア-ゼ(SP)を用いるモデルペプチド合成において、SPが高特異的にArgーLueペプチド結合の生成を触媒することを発見した。平成2年度は、本プロテア-ゼを長鎖ポリペプチド合成に応用するための基礎実験として、高選択性のArgーLeuおよび低選択性のArgーGly両結合を含むモデルペプチドBzーGlyーArgーGlyーPheーArgーLeuーNH_2のArgーLeu結合生成触媒による合成を試みた。その結果、SPはArgーLeu結合の生成を触媒するが、ArgーGly結合もすばやく加水分解し、目的のペプチドを得ることはできなかった。したがって、如何に高特異的なプロテア-ゼを触媒として使用しても、加水分解反応を抑えることは不可能であるとの結論に達した。ペプチド性ホルモン製造のためには、量的合成に応用可能な高効率合成法の確立が必要である。そこで、ペプチド結合生成の好触媒であるトリプシンを用い、低含水量においてもプロテア-ゼを失活させず高収率にペプチドを生成可能な優れた溶媒系の検索を行なった。結果、4%H_2O/へキサフルオロイソプロピルアルコ-ル/ジメチルホルムアミド(1:1)混合溶媒中において、83%の収率でArg含有テトラペプチドを得た。次に、オキシム樹脂を用いた高収率保護ペプチドフラグメント合成と最終工程に本混合溶媒中でのトリプシン縮合法を組み合わせた方法をヒト成長ホルモン放出因子の活性フラグメント(hGRF(1ー29)ーNH_2)の合成に応用した。トリプシン触媒により90%の収率で保護hGRF(1ー29)ーNH_2を合成可能であった。脱保護の後、高純度のhGRF(1ー29)ーNH_2を得た。SPによる高効率合成は困難であったが、優れた溶媒系およびトリプシンによる高効率合成法の確立を行なうことができた。
関節疾患に対するFrzb遺伝子導入による再生医療の開発

本研究の目的は、Wntの可溶型受容体の一つであるFrzb遺伝子の関節疾患に対する治療効果および同遺伝子に関連した分化・アポトーシスのメカニズムを解明することである。まず、OAにおける軟骨細胞のアポトーシスのメカニズムを明らかにするため、その病態で重要な役割を担うことが知られているheat shock protein70(HSP70)に注目し実験を行った。HSP70遺伝子を軟骨細胞にアデノウイルスを用いて遺伝子導入し、過剰に発現させることでNOおよびstaurosporineで誘導される軟骨細胞のアポトーシスをほぼ完全に抑制できることを明らかにした。また、ウェスタンブロッティングを用いた実験から軟骨細胞のアポトーシス機構の一部が明らかになった。次に、Frzb遺伝子の過剰発現がRA滑膜細胞およびOA軟骨下骨骨芽細胞に及ぼす影響を評価し、治療効果の可能性について検討した。Frzb遺伝子をそれぞれの細胞にリポフェクション法を用いて遺伝子導入し、過剰に発現させた後に炎症性サイトカイン(IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α)の発現の変化をRT-PCR法を用いて検討した。RA滑膜細胞において認める炎症性サイトカインの発現は、Frzb遺伝子の過剰発現によって変化を認めなかった。OA骨芽細胞においては、内在性のFrzb遺伝子の発現を認め、Frzb遺伝子の過剰発現によって炎症性サイトカインの発現は低下を認めた。このことからOA病態における軟骨下骨・関節軟骨での異常分化メカニズムが存在する可能性およびFrzbのOA治療効果の可能性が明らかになった。今後、軟骨細胞アポトーシスの観点からHSP70とFrzbの関係について実験を進め、家兎OAモデルを用いてin vivoでのFrzのOA治療効果を検討していく予定である。)本研究の目的は、Wntの可溶型受容体の一つであるFrzb遺伝子の関節疾患に対する治療効果および同遺伝子に関連した分化・アポトーシスのメカニズムを解明することである。)変形性関節症に対する保存的治療としてヒアルロン酸やステロイドの関節内投与,温熱療法、筋力増強訓練,体重減少指導などのリハビリテーションが行われているが,治療が長期にわたる上に症状の進行を十分に抑制するには至っていない.軟骨破壊に関わっているアポトーシスを抑制するために有効な蛋白やサイトカイインを利用して遺伝子治療も試みられてきたが,その有効性は未だ確立されていない.最近になりこれまで明らかでなかった軟骨の分化システムが解明されてきた.そして,軟骨細胞の分化の決定は先天的に決定されたものではなく,関節形成部位における特有の場のシグナルにより調節されていること,軟骨細胞の分化はその過程で関節軟骨を構成する永久軟骨細胞と肥大化して軟骨基質の石灰化を誘導する成長軟骨細胞への方向付けがなされていることがわかってきている.今回われわれは軟骨関節形成に深く関わっているwntの可溶型受容体の一つであり,軟骨細胞の内軟骨骨化を抑制する働きがあるFrzbに注目した.本研究の目的は,変形性関節症における軟骨細胞の異常分化のメカニズムを解明し、関節軟骨変性疾患に対する効果的な治療法を開発することである.閉鎖腔である関節内にマーカー遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを直接投与した.その際、滑膜細胞には高率に遺伝子導入が可能であったが,軟骨細胞に対しては低い効率しか得られなかった.非ウイルス性遺伝子導入法として,各種のcationic polymerと導入するプラスミドとしてEBVプラスミドベクターを組み合わせて培養軟骨細胞に対して遺伝子導入効率を検討した.従来の非ウイルス性導入法と比較して非常に高率な遺伝子発現と,長期にわたる発現維持が可能であった.現在,変形性関節症や関節炎モデル動物の関節に対し,Frzb遺伝子を導入を行い変性抑制効果を検討している.本研究の目的は、Wntの可溶型受容体の一つであるFrzb遺伝子の関節疾患に対する治療効果および同遺伝子に関連した分化・アポトーシスのメカニズムを解明することである。

まず、OAにおける軟骨細胞のアポトーシスのメカニズムを明らかにするため、その病態で重要な役割を担うことが知られているheat shock protein 70 (HSP70)に注目し実験を行った。HSP70遺伝子を軟骨細胞にアデノウイルスを用いて遺伝子導入し、過剰に発現させることでNOおよびstaurosporineで誘導される軟骨細胞のアポトーシスをほぼ完全に制御できることを明らかにした。また、ウェスタンプロッティングを用いた実験から軟骨細胞のアポトーシス機構の一部が明らかになった。次に、Frzb遺伝子の過剰発現がRA滑膜細胞およびOA軟骨下骨骨芽細胞に及ぼす影響を評価し、治療効果の可能性について検討した。Frzb遺伝子をそれぞれの細胞にリポフェクション法を用いて遺伝子導入し、過剰に発現させた後に炎症性サイトカイン(IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α)の発現の変化をRT-PCR法を用いて検討した。RA滑膜細胞において認める炎症性サイトカインの発現は、Frzb遺伝子の過剰発現によって変化を認めなかった。OA骨芽細胞において、内在性のFrzb遺伝子の発現を認め、Frzb遺伝子の過剰発現によって炎症性サイトカインの発現は低下を認めた。このことからOA病態における軟骨下骨・関節軟骨での異常分化メカニズムが存在する可能性およびFrzbのOA治療効果の可能性が明らかになった。
フレーバー対称性に基づく素粒子の標準理論の拡張

フレーバー対称性と超対称性を導入することによって、素粒子の標準理論を拡張し、その現象論的帰結と実験的検証可能性を調査した。クォークの質量と混合行列が更に精密に測定されれば、フレーバー対称性は検証可能であることを明らかにした。また、フレーバー対称性のために暗黒物質の質量と中性子の電気双極子モーメントが、B中間子のCPの破れの大きさと密接に関連していることを見いだし、LHCbでBs中間子のCPの破れが高精度で測定されれば、フレーバー対称性は検証可能であることを示した。これらの結果を様々な国際会議で発表し、総合報告を行なった。1.非可換対称群に基づくフレーバー対称性を持つ模型は、二つ以上(多くの場合三つ以上)のHiggs粒子の存在を予言している。このため中性のHiggs粒子で、摂動論最低次ですでにFCNC反応(粒子の電荷は変えないが、フレーバーの種類を変える反応)を起こすものが存在する。更に、小林・益川理論が予言するCPの破れ以外のCPの破れも可能になる。このような、FCNC反応やCPの破れは、原理的には様々な実験で観測可能できる。今年度は、有限群Q6に基づくフレーバー対称性を持つ超対称模型の枠組みで、BO中間子混合におけるCPの破れを計算した。超対称を破る項のCPの破れに対する量子補正が大きくなることを見いだした。このCPの破れは、TEVATRONで示唆されている大きさであり、LHCで検証可能であることが判明した。2.超対称を破る項から寄与するCPの破れを抑える一つの方法は、CPを自発的に破ることである。今年度は、有限群Q6に基づくフレーバー対称性を持つ超対称模型の枠組みでヒッグスセクタを拡張すると、CPとフレーバー対称性を自発的に破ることができることを見いだした。さらに、この模型では、二つの異なった真空が存在することも分かり、各々について現象論的帰結を調べた。素粒子標準理論の持つ最大の問題の一つは、物質粒子のフレーバーの構造を決めている湯川相互作用を決定する原理が欠けていることである。更に、この理論は、場の理論としてtrivialな理論であるという理論的欠陥がある。当研究目的の要旨は、この二つの問題の一つ目は底エネルギーフレーバー対称性を導入することで、二つ目は超対称性を導入することによって、標準理論を拡張し、拡張した理論の現象論的帰結とその実験的検証可能性を調査することである。今年度は、有限群Q6に基づくフレーバー対称性を導入した超対称モデルにおいて、フレーバー対称性とCPの対称性が自発的に破に破る可能性を探り、その場合のFCNC反応やCPの破れを定量的に評価することを行なった。暗黒物質の質量と中性子の電気双極子モーメントが、B中間子によるCPの破れの大きさと密接に関連していることを見いだし、LHCbで検証可能であることを示した。また、暗黒物質とフレーバー対称性に関する研究においては、輻射補正によってニュートリノ質量を生成する超対称模型の枠組みで、最小標準超対称模型では現実的な暗黒物質が存在できるパラメータ領域は非常に狭いにもかかわらず、この模型ではその領域が大幅に広がるということを見いだした。低エネルギーフレーバー対称性のある超対称模型の検証可能性について総合報告を行なった(Fortsch.Phys.)。特に、フレーバー対称性を課すと複数のヒッグス場の導入が必須となり、電荷は変わらないがフレーバーが変わる素粒子の反応(FCNC反応)の大きさが実験の制限を越えてしまう問題が生ずる。この問題を緩和するために、フレーバー対称性はどのような役割を果たしているかに焦点を当てて報告をまとめた。さらに、フレーバー対称性のために複数の暗黒物質が存在する系についての研究を新たに展開した(PRD,JHEP)。特に、論文(JHEP)では、標準模型のエネルギースケールをカイラル対称性の動力学的破れを使って説明する模型を構築し、動力学的破れのために存在する(疑)南部ーゴールドストーン粒子が現実的な暗黒物質の候補になりうるかを調べた。この論文は、今後の研究の方向を決めるうえで、重要な位置をしめることになると考える。当研究目的の要旨の一つは、底エネルギーフレーバー対称性が物質粒子のフレーバーの構造を決めていると仮定し、標準理論を拡張し、現象論的帰結とその実験的検証可能性を調査することである。さらに、低エネルギーフレーバー対称性がフレーバーの構造を決めている原理であるとすれば、それによってニュートリノ質量・混合と暗黒物質の性質を結びつけることができる。1.暗黒物質とフレーバー対称性に関する研究離散対称性を導入することによって摂動最低次でニュートリノ質量を禁止し、量子補正で生成する輻射シーソー模型についての研究を行なった。この離散対称性は同時に暗黒物質の安定性を保証するもので、それによってニュートリノ質量・混合と暗黒物質には密接な繋がりが生じる。さらに、対称性を拡張すると、複数種類の暗黒物質が存在できる。

そのような具体的は模型を考察した結果、模型の許されるパラメータ領域が大幅に変更する可能性があることがわかった(論文2)。また、ヒッッグスが二つのガンマに崩壊する崩壊幅とこの模型の暗黒物質が二つのガンマに対消滅する反応を計算した。前者はLHCで観測されている標準模型からの極わずかなズレを説明でき、さらに、後者についてはFermi LATで観測された可能性がある暗黒物質の対消滅を説明できる可能性があることを示した。2.フレーバー対称性とCPの対称性の自発的破れについての研究ヒッグス二重項が複数存在すると、一般には標準模型にないFCNC反応が可能になり、実験的に強い制限が与えられる。フレーバー対称性とCPの対称は、超対称性をsoftに破る項が引き起こす過大なFCNC反応やCPの破れも抑制する。このようなフレーバー対称性の機構についてまとめ、総合報告を行なった。標準理論側のhidden sectorにおけるカイラル対称性の自発的に破れによって生成されたエネルギースケールをスカラー場によって標準理論側に伝達させ、標準理論のスケールの起源をdynamicalに理解する模型を考察した。この模型では、非可換フレーバー対称性が南部-Goldstoneボゾンの安定性を保証し暗黒物質の候補であり、特にその現象論的帰結(直接・間接観測による検出可能性)を調べた。特に、hidden sectorのフェルミオンが電荷を持つように模型を拡張し、Fermi LatやHESS等の宇宙観測実験からの制限が満たされているパラメータ領域があることを確かめた。hidden sectorのフェルミオンが電荷を持つと、hidden sectorはもはやdarkではなく、"明るく"なり、将来の加速器実験で検証できることを指摘した。離散対称性を導入することによって摂動最低次でニュートリノ質量を禁止し、量子補正で生成する輻射シーソー模型についての研究を続けた。この離散フレーバー対称性は同時に暗黒物質の安定性を保証するもので、対称性を拡張すと、複数種類の暗黒物質が存在できる。今回考察した模型にはZ2 x Z2フレーバー対称性があり、3種類の暗黒物質が対消滅し単色エネギーのニュートリノを生成する。太陽に捉えられた暗黒物質の対消滅によって生成されるニュートリノフラックスを計算し、南極でニュートリノの観測を行なっているIceCubeにおいての検出可能性を議論した。26年度が最終年度であるため、記入しない。素粒子論26年度が最終年度であるため、記入しない。23年度は、1.「フレーバー対称性とCPの対称性の自発的破れについての研究」と2.「暗黒物質とフレーバー対称性に関する研究」について実施計画をたてたが、研究実績の概要にも記述したように、おおむね計画通りの研究が進展しているため。これまでの研究によって、将来クォークの質量と小林・益川クォーク混合行列が格子QCDやSuperKEKB等で更に精密に測定されれば、低エネルギーフレーバー対称性は検証可能であることを明らかにした。
さんご礁における魚類の毒化調査と毒の性状解明

南方のさんご礁の発達した海域では、本来は無毒な食用魚種が毒化し、しばしば食中毒の原因となり、食品衛生上の重大な問題となっている。毒化した個体と無毒な個体の識別が困難な為、毒化の可能性のある多数の魚種が食用を禁止され、沿岸資源の有効利用の上でも大きな障害となっている。このような現象は原因毒や中毒症状によって3種に大別できる。第一はシガテラと呼ばれる中毒で、死亡率は低いが発生率は最も高く、発生海域も広い。年間の患者発生数は2万人にも達すると推定されていて、その解決は最も重要視されている。第二はクルペオトキシズムと呼ばれる中毒で、死亡率は高いが発生件数は少ない。第三はパリトキシン中毒でやはり高死亡率ながら発生件数は少ない。本研究はシガテラにおける、魚類の毒化機構の解明、毒の化学構造の解明に最も重点を置き、併せて、他の魚類中毒についての情報収集をも試みた。その成果は以下のように要約される。毒の起源の確定シガテラにおいては、魚の毒性の個体変化や地域変化が著しいことから食物連鎖による毒の移行と蓄積が推定されており、毒の第一次生産者の確認が問題となっていた。我々は昭和53年から54年に行った前回の海外学術調査において、海藻付着性の渦鞭毛藻Gambierdiscus toxicusを発見して2成分の毒を検出し、その性状がシガテラ魚に見いだされる水溶性の毒マイトトキシンと脂溶性の毒シガトキシンに類似していることから、毒の起源であろうと推定した。その後、本鞭毛藻を培養してマイトトキシンの生産は確認したが、シガトキシンの生産の確認は成功しなかった。そこで、今回の調査ではタヒチの研究者との協力で、天然に生育するG.toxicusを大量に採集・抽出し、GTー4Bと仮称する成分740ugを単離して構造解析を行い、後述するシガトキシンと基本骨格が完全に一致することを証明した。このことによって、シガテラにおける毒の起源が海藻付着性の渦鞭毛藻G.toxicusであり、その毒が藻食魚を介して多くの肉食魚に移行することが初めて確証された。毒の化学構造シガテラの中毒症状発現に最も重要な役割りを果たすシガトキシンの化学構造は、多くの研究者の努力にも拘らず決定されずにいた。その理由は有毒個体の入手の困難さ、精製の複雑さ、複雑な毒の構造にあった。今回の調査では、タヒチ島周辺のみならず、ツアモツ諸島、マルケサス諸島の広範な海域から毒性の最も強いドクウツボ840尾(約4トン)を集め、その内臓125kgを抽出原料とした。精製法にも改良を加え、純品シガトキシン350ugを得ることが出来た。試料が極めて微量な為、スペクトル分析法を主体に構造解析を進め、下図に示すようにエ-テル環13個が梯子状に連結したポリエ-テル構造を初めて明らかにした。前述したように、毒化原因生物のG.toxicusから得たGTー4Bとは基本骨格が同一であり、分子両端の酸化の状態のみが異なる。このような複雑な構造を1mg以下の試料で構造決定できたことは画期的といえる。毒の微量検出法の検討中毒発生防止には有毒個体の識別法が必要であるが、現行の動物実験法は操作が複雑で長時間を要し、精度も低く実用的でない。そこで簡便な毒の検知法の開発が望まれている。本研究でシガトキシン分子末端に1級水酸基の存在が判明したので、蛍光化試薬1ーアンスリルジアゾメタンと反応させ、高速液体クロマトグラフィ-で検出する方法を考案した。また、1級水酸基のコハク酸へミエステルを蛋白に結合させた抗原を用いて抗体を得、酵素免疫法を開発出来る可能性を指摘した。G.toxicus調査タヒチ島、ツアモツ諸島、マルケサス諸島で調査を実施し、毒化海域での分布を確認した。採集した渦鞭毛藻は現在培養中であり、栄養生理及び毒生産性の試験に供する予定である。魚類毒化に関するその他の情報モンガラカワハギ類によるパリトキシン中毒が希に発生するが、入手した試料の毒性は低かった。クルペオトキシズムの発生は確認されなかった。

毒の起源の確定シガテラにおいては、魚の毒性の個体変化や地域変化が著しいことから食物連鎖による毒の移行と蓄積が推定されており、毒の第一次生産者の確認が問題となっていた。我々は昭和53年から54年に行った前回の海外学術調査において、海藻付着性の渦鞭毛藻Gambierdiscus toxicusを発見して2成分の毒を検出し、その性状がシガテラ魚に見いだされる水溶性の毒マイトトキシンと脂溶性の毒シガトキシンに類似していることから、毒の起源であろうと推定した。その後、本鞭毛藻を培養してマイトトキシンの生産は確認したが、シガトキシンの生産の確認は成功しなかった。そこで、今回の調査ではタヒチの研究者との協力で、天然に生育するG.toxicusを大量に採集・抽出し、GTー4Bと仮称する成分740ugを単離して構造解析を行い、後述するシガトキシンと基本骨格が完全に一致することを証明した。このことによって、シガテラにおける毒の起源が海藻付着性の渦鞭毛藻G.toxicusであり、その毒が藻食魚を介して多くの肉食魚に移行することが初めて確証された。毒の化学構造シガテラの中毒症状発現に最も重要な役割りを果たすシガトキシンの化学構造は、多くの研究者の努力にも拘らず決定されずにいた。その理由は有毒個体の入手の困難さ、精製の複雑さ、複雑な毒の構造にあった。今回の調査では、タヒチ島周辺のみならず、ツアモツ諸島、マルケサス諸島の広範な海域から毒性の最も強いドクウツボ840尾(約4トン)を集め、その内臓125kgを抽出原料とした。精製法にも改良を加え、純品シガトキシン350ugを得ることが出来た。試料が極めて微量な為、スペクトル分析法を主体に構造解析を進め、下図に示すようにエ-テル環13個が梯子状に連結したポリエ-テル構造を初めて明らかにした。前述したように、毒化原因生物のG.toxicusから得たGTー4Bとは基本骨格が同一であり、分子両端の酸化の状態のみが異なる。このような複雑な構造を1mg以下の試料で構造決定できたことは画期的といえる。毒の微量検出法の検討中毒発生防止には有毒個体の識別法が必要であるが、現行の動物実験法は操作が複雑で長時間を要し、精度も低く実用的でない。そこで簡便な毒の検知法の開発が望まれている。本研究でシガトキシン分子末端に1級水酸基の存在が判明したので、蛍光化試薬1ーアンスリルジアゾメタンと反応させ、高速液体クロマトグラフィ-で検出する方法を考案した。また、1級水酸基のコハク酸へミエステルを蛋白に結合させた抗原を用いて抗体を得、酵素免疫法を開発出来る可能性を指摘した。G.toxicus調査タヒチ島、ツアモツ諸島、マルケサス諸島で調査を実施し、毒化海域での分布を確認した。採集した渦鞭毛藻は現在培養中であり、栄養生理及び毒生産性の試験に供する予定である。魚類毒化に関するその他の情報モンガラカワハギ類によるパリトキシン中毒が希に発生するが、入手した試料の毒性は低かった。クルペオトキシズムの発生は確認されなかった。