hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋外洋浮遊生物群集の食物網の機能解析

構成生物種のごく一部である優占種に着目した従来の生態系の理解は、正しさが疑問である。したがって、全構成生物種を対象とした生態系の理解を行って、これまで得られた知見の検証が必要である。そこで、本研究では比較的小さな空間規模で均一性が成り立ち、生物種と生物量並びに食物連鎖関係が把握しやすい水界生態系に着目して、外洋の熱帯・亜熱帯・亜寒帯の外洋浮遊生態系を対象として研究を行った。それぞれの生態系内のプランクトン生物を可能な限り完全に採取・同定し、種ごとの生物量と種間の「食う-食われる関係」を把握して、食物網に整理した。その際に、真光層中心の表層生物群集から、真光層以深の従属栄養過程中心の、中・深層も含めて、海洋全体の把握を目指した。熱帯・亜熱帯・亜寒帯の外洋表層浮遊生態系で得られた種と各種の生物量の情報をもとに、食性の違いで一次生産者、溶存有機物利用生物、懸濁粒子利用生物の機能群に分け、さらに「小が大に食べられる」という食物連鎖の基本原理を利用して、全生物種を大きさ別にコンパートメントに分けた。それぞれの機能群でコンパートメント化した各生物種を食物連鎖系でつなぐ新しい方法で食物網を推定した。実測データに基づいた全生物種を含んだ食物網の推定は始めてである。種、大きさ、生物量の3つの因子が作用して生物群集の機能が特徴的に決定している様子が明らかになり、従来型の優占生物種に着目した解析では評価されない非優占生物種が関与した重要現象の存在が複数示された。海洋の中・深層の浮遊生物群集は、生産者を欠く従属栄養過程中心の生態系であるが、これについては種ごとの生物量の整理までで、食物網解析は今後に残された。赤道海域(東経175°)の熱帯外洋浮遊生物群集を対象とし、水深200mまでの水柱内の全プランクトン生物を種・属もしくはバクテリアなどのグループレベルで同定し、それぞれの生物量を把握した。データは当該研究者が関与して19911995年(この内1994年は5月、その他は9月の同時期)に実施された「海洋中の炭素循環メカニズムの調査研究」で得られた単年度のデータを整理し、未計測のものは保存試料を用いて同定して計数した。ついで、得られた生物種・属もしくはグループを栄養と補食の特徴から10機能群に分け、さらに各機能群構成生物を大きさ別にコンパートメントに分けた。機能群とコンパートメントをベースにして食物連鎖関係に基づいて食物網図に整理した。その際に、必要な捕食・被食関係は実際の観察結果と既存の文献資料から得、それ以外はサイズ依存則で推定した。バクテリア、植物プランクトン、原生動物、後生動物の成長速度は既存の関係式で求めた。その結果、同一機能群の生物でも、大きさによって食物網内での貢献が顕著に異なっていることが明らかになった。例えば、植物プランクトンの場合、圧倒的に生物量の多いピコ植物プランクトンの生産物は高次栄養段階の生物に達するまでに多くの栄養段階を経由するが、ミクロ植物プランクトンでは経由する栄養段階数が少なくなるために少ない生物量でも高次栄養段階の生物を支える割合が格段に大きいことが明らかになった。同様のことは各栄養段階でも認められた。得られた結果は現在論文として纏めている。

表層200mまでの赤道域外洋表層プランクトン群集を対象として、分類群を元にした機能群と、各機能群の構成生物種を大きさ別のコンパートメントに分け、コンパートメントを用いて食物網を表し、生物群集構造を検討する新しいアプローチを工夫した。さらに、捕食活動の際の餌の大きさ依存性に着目して、食物網の物質・エネルギーの流れを推定し、生物群集の機能を解析した。こうした新しい解析方法で明らかになったことは、生物群集の機能維持では、従来から考えられていた一次生産者の生物量に応じた重要性ではなく、生物量の多寡にかかわらずそれぞれの生物グループが生物群集の維持で決定的な役割を果たしている可能性である。それは、一次生産者であるプランクトン藻類の大きさが3桁にわたる多様性をもつことと、捕食者のサイズ依存捕食の相乗効果の結果である。本研究で開発した新しい生物群集の構造と機能の解析法を用いて、前記の赤道群集と同一時期に太平洋旋回亜熱帯海域で取得された19911995年の5ヶ年のデータを用いて、同様の解析を行った。西部北太平洋の熱帯・亜熱帯・亜寒帯3代表海域の外洋浮遊生物群集を対象に、食物網を把握し、その機能を解析した。研究では、全構成生物を種もしくはグループで把握し、さらにそれぞれを分類群と栄養摂取の特徴で機能群に分け、機能群内を生物の大きさの違いでコンパートメント区分した。次いで、得られた構成生物群を、コンパートメントを基礎にした食物網で整理し、食物連鎖モデルを用いて機能を調べた。これにより優占種に着目した従来の概念的な食物網の整理しかなかった外洋浮遊生物群集を、より具体的でかつ深く理解することに成功した。平成16年度は、亜熱帯外洋浮遊生物群集の食物網の解析研究を継続して進め、同時に、亜寒帯外洋生物群集の解析作業に着手した。実際の作業では、当該研究者が関与してこれまでに行った「海洋中の炭素循環メカニズム調査研究」で得られた5年間のデータを用い、未計測のものは保存試料を同定し計測・計数した。食物網の整理に必要な捕食・被食関係は、実際の観察結果と既存の文献から得、それ以外はサイズ依存則を用いた。成長速度は、バクテリア、植物プランクトン、原生動物、後生動物に分け、既存の関係式で推定した。植物プランクトンを出発点として、食物網内でのエネルギーと物質の流れを食物連鎖モデルによって定量把握し、各栄養段階間の生態効率で検証した。対象とするそれぞれの生物種・属もしくはグループの貢献度は、最上位の栄養段階の生物群の成長速度の支援度によって判定した。
てんかん焦点病理診断の科学的根拠に関する探索研究

本研究では、難治性てんかんを引き起こす大脳皮質にどのような病変があるのかを探索した。てんかん外科治療で切除された器質的病変に加えて、その周囲において一見正常な皮質にも、アストロサイトに鉄顆粒が取り込まれる病理変化、グリア型グルタミン酸トランスポータの表出異常を認めた。これらはアストロサイト機能異常によるてんかん原性獲得のメカニズムが存在していることを示しており、治療法開発に繋がる知見を得ることができた。てんかんを惹起する様々な要因を多岐に渡る神経系抗体および特殊染色によって病理組織学的に探索している。今年度はパイロット検索を行なっている過程で脳組織における鉄の暴露、およびそれによるアストロサイトの形態異常に遭遇し、主に頭部外傷後てんかんの脳外科焦点切除検体を用い検討した。このような焦点部は受傷後しばらく時間が経過してからてんかん原性を獲得するわけであるので、発症までの期間中に神経可塑性の異常が惹起されていると考える。頭部外傷後の海馬において鉄イオン陽性の微細顆粒の沈着、およびアストロサイト細胞体内への蓄積が認められ、加えて歯状回顆粒細胞の乖離現象(dispersion)を伴う定型的な海馬硬化を生じていた。陳旧性脳挫傷の周辺でも同様の鉄沈着に加えて、アストロサイトの特殊な形態異常であるfoamy spheroidbodyが多数形成されており、グリア型興奮性アミノ酸トランスポーターの表出異常が確認された。これらの外傷後てんかん原性領域においては、アストロサイトの鉄過剰蓄積が生じていることが明らかとなり、また、それによるアストロサイト機能異常が本来の役割(アミノ酸トランスポーターを介するエネルギーリサイクル)が破綻し、神経細胞の過剰興奮が引き起こされていることが示唆された。今年度の探索研究により、鉄過剰暴露によるアストロサイトの機能異常が背景にあると想定されている疾患群(ニューロフェリチノパチー、無セルロプラスミン血症による脳障害など)に、鉄起因性てんかんが新たに追加されるべきであることを明らかにした上で重要な成果であると思われる。焦点切除部に様々な程度の鉄沈着を認めることがある。これらの所見がどのようなメカニズムによって発症および難治化に関連しているか否かを検証するため、鉄沈着様式と神経可塑性異常について免疫組織学的に検討した。検体はいずれも焦点切除した大脳皮質で、外傷後遺症5例、海綿状血管腫7例、表層性ジデローシス3例、原因不明の皮質内鉄沈着2例。ベルリン青染色の他、GFAP、EAAT2、AQP4、synaptophysin、neurofilament、MAP-2、CRMP-2、Arcadlin、Arc、Rheb、GLUT3、に対する抗体を用いた免疫染色を施し定性的に評価した。病変は境界が不明瞭な連続性を持った2つのタイプに分けられた;塊状のヘモジデリン沈着、グリオーシス、アストロサイトの異常構造物foamy spheroidbodyが多数出現する領域(reactive zone)、および微細な鉄陽性顆粒がニューロピルに散在あるいはアストロサイトに取り込まれている領域(minimal zone)。Reactive zoneではアストロサイトのGFAP表出増加・EAAT2表出低下、神経細胞の細胞骨格・シナプス蛋白の表出低下がみられ、一方、minimal zoneでは微細な鉄顆粒を含むアストロサイトにおいて、GFAP表出は変化なくEAAT2表出低下・AQP4表出増強、血管壁Glut3表出低下を認めた。一部の検体でArcadlin、Arcの神経細胞内表出の増加を認めた。両zoneともに共通するEAAT2表出低下はアストロサイトのグルタミン酸リサイクルの不全による神経細胞の機能異常の存在がてんかん原性に関与していると推測された。Minmal zoneでのAQP4とGLUT3の表出パタンは血液脳関門の破綻の存在を示唆しているが、てんかんとの関連は不明であった。また、てんかん原性脳形成異常の代表である限局性皮質異形成の国際的な診断基準を国際抗てんかん連盟のNeuropathology Task Forceの一環として提唱し共同発表した。その基準作りのための免疫染色を施し、科学的根拠の検証を遂行した。
頭頸部癌の発癌・転移に対する分子生物学的研究と免疫遺伝子治療への応用

1)頭頸部癌におけるβカテニン過剰蓄積の原因を探るため,ダイレクトシークエンス法により,APCとβカテニンの遺伝子変異を検討し,APCについて15例中1例にAPCのアミノ酸の異常を伴う遺伝子変異が見られた.一方,βカテニンについては,頭頸部癌31例を対象としたが,遺伝子変異は認められなかった.頭頸部癌においては,βカテニンの過剰蓄積の機序としてAPC及びβカテニン遺伝子変異の関与の頻度は低いと推測された.2)血管新生抑制因子による腫瘍増殖抑制の検討VEGF, bFGFなどの血管新生増殖因子によって誘導される血管新生を血管新生因子非特異的に阻害するとされるFumagilin誘導体であるTNP-470によるVEGF産生腫瘍の増殖に対する影響を検討した.VEGF産生腫瘍OKK-LN/pCIneo-VEGFをヌードマウスに移植する際に同時にTNP-470を投与した.投与群(n=5)は非投与群(n=5)にして35日後,42日後で腫痕体積は約1/3となり有意な抑制が認められた.また,ヌードマウスの生存日数もTNP-470投与群で有意な延長が認められた.3)Survivinを用いた腫瘍特異的免疫療法の可能性の検討IAPファミリー分子、survivinがCTLの標的となりうるか評価するため、survivinのアミノ酸1次構造より、日本人に一番多いHLAアリルであるHLA-A24の結合モチーフを検索し、T細胞のエピトープの候補となる3種類のペプチドを合成した。これらのHLA-A24結合能力を調べ、さらにペプチドをパルスした樹状細胞を用いて、HLA-A24拘束性にペプチドを認識するCTLを癌患者末梢血より誘導した。このCTLはHLA-A24陽性survivin陽性の悪性腫瘍細胞株を障害することが可能であった。このことは,多くの悪性腫瘍で発現を認めるsurvivinがHLA-A24陽性の癌患者に対する腫瘍特異的免疫療法の標的分子となり得ることが示された。本研究の目的ぱ、頭頚部扁平上皮癌について、癌抑制遺伝子APC(adenomatous polyposis coli)、細胞接着因子であるカドヘリン及びその裏打ち蛋白であるβカテニンの異常が腫瘍の発生、進行、転移にどのように関与しているか検討するとともに、血管新生因子と癌の浸潤・転移との関連を探ることである。すなわち、APC、βカテニン蛋白の発現の有無や発現様式を検討し、臨床的な予後、再発、臨床病期などとの関連を研究する。本年の研究では、26例の頭頸部扁平上皮癌の治療前の腫瘍組織から手術、生検で採取した標本を用い、凍結組織、またはホルマリン固定組織で切片を作成する。抗βカテニン抗体(mouse IgG/Transduction Laboratories社)を用い、avidin-biotin complex(ABC)法によりAPC、βカテニン蛋白の発現の有無、発現様式を観察した。陽性コントロールとしては血管上皮を用い、陰性コントロールとしては、反応系から一次抗体を除いた免疫組織像を使用した。結果1.βカテニン染色像による分類パターンにより次の2つの型に分類された。すなわち、membranous pattern(膜陽性型):細胞膜のみに弱い染色性が認められるが、核や細胞質は染色されない2.βカテニンの染色パターンと臨床像との関連26例の頭頚部癌患者において、6例が集積型を示し、残りの20例は膜様性型を示した。

βカテニンの染色性と予後との関連を検索すると、集積型では5年生存率は0%であったが、膜様性型は50%であり、後者の方が予後良好であった。1)頭頸部癌におけるβカテニン過剰蓄積の原因を探るため,ダイレクトシークエンス法により,APCとβカテニンの遣伝子変異を検討し,APCについて15例中1例にAPCのアミノ酸の異常を伴う遣伝子変異が見られた.一方,βカテニンについては,頭頸部癌31例を対象としたが,遺伝子変異は認められなかった.頭頸部癌においては,βカテニンの過剰蓄積の機序としてAPC及びβカテニン遺伝子変異の関与の頻度は低いと推測された.2)血管新生抑制因子による腫瘍増殖抑制の検討VEGF, bFGFなどの血管新生増殖因子によって誘導される血管新生を血管新生因子非特異的に阻害するとされるFumagilin誘導体であるTNP-470によるVEGF産生腫瘍の増殖に対する影響を検討した.VEGF産生腫瘍OKK-LN/pCIneo-VEGFをヌードマウスに移植する際に同時にTNP-470を投与した.投与群(n=5)は非投与群(n=5)に比較して35日後,42日後で腫瘍体積は約1/3となり有意な抑制が認められた.また,ヌードマウスの生存日数もTNP-470投与群で有意な延長が認められた.3)Survivinを用いた腫瘍特異的兔疫療法の可能性の検討IAPファミリー分子、survivinがCTLの標的となりうるか評価するため、survivinのアミノ酸1次構造より、日本人に一番多いHLAアリルであるHLA-A24の結合モチーフを検索し、T細胞のエピトープの候補となる3種類のペプチドを合成した。これらのHLA-A24結合能力を調べ、さらにペプチドをパルスした樹状細胞を用いて、HLA-A24拘束性にペプチドを認識するCTLを癌患者末梢血より誘導した。このCTLIはHLA-A24陽性survivin陽性の悪性腫瘍細胞株を障害することが可能であった。このことは,多くの悪性腫瘍で発現を認めるsurvivinがHLA-A24陽性の癌患者に対する腫瘍特異的免疫療法の標的分子となり得ることが示された。
過渡回折格子法を用いた分子配向液晶系でのダイナミックスの解明

過渡回折格子法は分子運動を解明するための非常に有力な検出法である。しかしこの手法を応用した従来の液晶系での研究には、理論的に説明できない、いくつかの疑問点が有ることがわかった。こうした点に関して研究を重ねた結果、液晶系で過渡回折格子信号の現れる過程に、これまで見落とされていた機構が存在することが明らかとなった。すなわち光励起された分子とされていない分子の光学的性質の差によって過渡回折格子信号が現れているのではなく、ディレクターという液晶特有の光学的性質の空間的変調によって信号が現れていることが結論された。この解釈に基づき、信号の時間変化を解析した結果、液晶特有の分子運動の温度依存性が明らかとなった。また液晶分子と界面との相互作用の問題は、多くの分野から注目されている大切な問題であるが、従来の手法ではミクロなダイナミックスの観点からのアプローチは不可能であった。この問題に対して、界面付近の分子だけを選択的に検出する過渡回折格子法を応用し、初めてこうした問題に対してのデータを与えた。その結果、膜界面での分子運動は相互作用によって押さえられるであろうという直感的予想に反して、相互作用によって分子運動が促進されるという奇妙な事実を見出した。現在、この結果を理論的に解釈できてはいないが、もしこの事実が普遍的ならば多くの分野に影響を与える重要な意味を含んでいるものと思われる。
キャリアドープされたノーダルリング半金属におけるトポロジカル超伝導の発現

波数空間において円環状に繋がったディラック点:ノーダルリングをもつ物質系においてトポロジカル超伝導の発見を目指す。最近、ノーダルリング半金属候補物質CaAgX (X = P,As)の理論研究により、キャリアドープしたノーダルリング半金属に現れる超伝導がゼロでないトポロジカル不変量をもつトポロジカル超伝導であること、表面に二次元カイラルp波超伝導が現れることが指摘された。本課題では、化学置換により系統的にキャリア数を制御したCaAgX単結晶・ノーダルリング半金属を実現する新物質の合成と、0.1 Kに至る低温物性測定により、キャリアドープしたノーダルリング半金属における超伝導転移を発見する。
Dual energy imagingにおける線質改善と画質向上への基礎的研究

本年度はDual energy CTの2つのX線エネルギーの分離のため、高管電圧側のX線管に付加する金属フィルタの材質、厚さをフィルタ透過後のX線スペクトル解析により決定した。フィルタを付加後の2つのX線エネルギーにおける物質のCT値の変化を測定し、最適な処理パラメータの検討も行った。診断用の画象として2つのエネルギーの画像の割合を変えて合成し作成する仮想の120kV画像について最適な合成割合について検討し、被ばく線量の低減を目指すことも踏まえ実験を行った。EMF123型に付属のレスポンス補正ソフトウェアは2010年7月に開発された最新の解析ソフトウェアで3keVから200kevまでのX線エネルギーをモンテカルロ計算によりシミュレーションし、ストリッピング法を用いて補正可能であった。直接X線の他、カーボン散乱体で90度方向へ散乱したX線を測定したデータより、クライン-仁科の計算式を用いて入射光子のスペクトルへ逆変換することができるため、直接線測定の困難なCTにおいても、X線スペクトルの解析が可能となった。また、従来の検出器と比較して、検出効率が向上したことにより、低エネルギー成分の数え落としが無くなったため、X線光子スペクトルデータより、照射線量(C/kg)、空気カーマ(Gy)、1cm線量当量(Sv)の70μm線量当量(Sv)の各線量スペクトルを精度良く求めることができ、このスペクトルアナライザを用いることにより付加フィルタ透過後のX線スペクトルと、その被ばく線量を同時に評価した。アルミニウムや銅などの軟X線除去用のフィルタと、高原子番号のk吸収端フィルタを単独または組み合わせて用いることにより、X線管の出力可能な範囲内で最も効率良くエネルギー分離が実現できる条件の検討、決定も行った。なお現在結果を分析中であり発表、論文にはまだ至っていない。
植物の遺伝子発現機序を利用した培養細胞による物質生産系の構築

遺伝子組換え技術を用い植物細胞培養による物質生産を効率よく行わせる、新しい系の開発を目指し、本研究では宿主細胞として選んだタバコ培養細胞、Nicotiana tabacum BY2の増殖速度に関わる細胞周期制御遺伝子の解析と、外来遺伝子を高発現させるプロモーターおよび発現を誘導・抑制できるシスエレメントの検索を行った。1)培養温度による遺伝子発現のON-OFF抑制が可能で、かつ高発現プロモーターの候補として、シロイヌナズナ、Arabidopsis thaliana、熱のショックタンパク質遺伝子、HSP18.2の熱ショックプロモーターを選んだ。熱ショックエレメントを含む約700bp断片をβ-グルクロニダーゼ(GUS)構造遺伝子に連結し、タバコ培養細胞の染色体に組み込んだ。タバコ細胞の生育温度は25-28°Cが最適であるが、GUS活性は極めて低く、期待どうり35-37°Cで高い活性を示した。培養温度を25°Cから37°CにシフトするとGUSのmRNAは15分後に検出され、2時間で最大値に達し、4時間後にはほぼ消失した。一方、酵素活性は4時間まで急速に上昇し、24時間までほぼ一定であった。37°Cでの酵素活性は25°Cでの値の約3000倍と極めて高い熱ショック誘導が確認された。2)西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ遺伝子、prxC2、のプロモーターはタバコ細胞で高い転写活性を有すること、およびそのプロモーター上流、-289bpに傷害による発現誘導に関するCACGTCをコアとするシス配列の存在が明らかにした。このシス配列を破壊したプロモーターでは、タバコ細胞でのGUS活性が明らかに低下した。培養細胞での遺伝子の高発現にはこのシス配列が有効であると考えられる。3)真核生物の細胞周期の進行を制御しているプロテインキナーゼの活性を調節するサイクリンのcDNAをタバコ茎頂から3種類単離した。タバコ細胞の同調培養において、各遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで解析した結果、いずれもG2からM期に発現するG2サイクリンであった。3種のサイクリン遺伝子のアンチセンスRNAをプローブにタバコ茎頂、根端部についてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、予想通り増殖が盛んな組織において転写物が検出された。タバコ培養細胞への遺伝子導入による物質生産系作成のための有用発現素子の解析をまず行った。1)植物遺伝子の高発現プロモーターの解析:西洋ワサビのペルオキシダーゼ遺伝子prxC2,アラビドプシスのペルオキシダーゼ遺伝子PrxEaキュウリのアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子aso1はいずれもGUS′融合遺伝子のタバコプロトプラストでの一過性発現解析によりCaMV35Sプロモーターの約10倍の転写活性を示した。欠失上流断片の解析からPrxC2は-1023bpと-457bpの2か所に存在するヒト遺伝子のエンハンサーのコア配列が高発現に寄与していることが強く示唆された。aso1遺伝子では-736bpと-494bpの間にエンハンサー様配列が存在することが示唆されたが、既知のものと一致する配列は見出されなかった。prxEaは欠失に伴い順次プロモーター活性は低下し、数種の配列の複合により強い転写活性を示すと思われた。prxC2プロモーターはトランスジェニックタバコにおいても同じ傾向が示された。2)prxC2の傷害およびABA誘導のシス領域:西洋ワサビのPrxC2遺伝子は傷害により転写レベルで発現が誘導された。上流断片とGUS融合遺伝子をもつタバコ形質転換体においては、傷害によりGUSが誘導発現した。次いで5'上流断片の欠失、ゲルシフトアッセイ、DNase1フットプリンティング解析を行った結果、傷害誘導のシス配列は-288bpに存在するCACGTGであると結論された。これを含むものでは傷害以外にもアブシジン酸によってもGUSが誘導された。また西洋ワサビにおいてもprxC2転写物がABAで誘導された。しかし、発現応答は傷害では2時間で十分であったが、ABAでは少くとも1日を要した。

2)西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ遺伝子、prxC2、のプロモーターはタバコ細胞で高い転写活性を有すること、およびそのプロモーター上流、-289bpに傷害による発現誘導に関するCACGTCをコアとするシス配列の存在が明らかにした。このシス配列を破壊したプロモーターでは、タバコ細胞でのGUS活性が明らかに低下した。培養細胞での遺伝子の高発現にはこのシス配列が有効であると考えられる。3)真核生物の細胞周期の進行を制御しているプロテインキナーゼの活性を調節するサイクリンのcDNAをタバコ茎頂から3種類単離した。タバコ細胞の同調培養において、各遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで解析した結果、いずれもG2からM期に発現するG2サイクリンであった。3種のサイクリン遺伝子のアンチセンスRNAをプローブにタバコ茎頂、根端部についてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、予想通り増殖が盛んな組織において転写物が検出された。植物培養細胞の中でも極めて増殖の速いタバコ細胞、Nicotiana tabacum BY2、を遺伝子組換え技術により有用物質を生産させる系の開発を目指し、まず有用な制御遺伝子の獲得と利用を試みた。成果を要約すると、1.西洋ワサビのペルオキシダーゼ遺伝子、prxC2上流の傷害誘導シス配列とトランス因子の同定上記遺伝子は傷害により発現が転写レベルで誘導されるが、上流の欠失断片とGUS構造遺伝子との融合遺伝子のトランスジェニックタバコでの解析、ゲルシフトアッセイ、フットプリンティングにより、傷害誘導にかかわるシス配列は翻訳開始点の289bp上流のCACGTG配列であった。またこれに結合するトランス因子のcDNAをサウスウエスタン法により単離した。培養細胞はすでに障害を受けた状態にあると考えられる。GUSをレポーターとするタバコプロトプラストでの一過性発現を調べた結果、本来のシス配列の有無でGUS活性には30倍の差があり、このシスエレメントは培養細胞での遺伝子高発現に有用であることが示唆された。2.アラビドプシスの熱ショックエレメントの機能GUS遺伝子をアラビドプシスの熱ショックタンパク質遺伝子、HSP18.2上流のプロモーターに連結し、タバコ培養細胞に導入し、安定な形質転換細胞を得た。この細胞は37°Cで培養すると28°Cに比べ約1000倍のGUS活性を示した。対照のCaMV35Sプロモーターの支配下ではGUS活性は25-37°Cの範囲でほぼ一定であった。この熱ショックエレメントは培養温度による遺伝子発現の制御に利用可能である。遺伝子組換え技術を用い植物細胞培養による物質生産を効率よく行わせる、新しい系の開発を目指し、本年度は宿主細胞として選んだタバコ培養細胞、Nicotiana tabacum BY2の増殖速度に関わる細胞周期制御遺伝子、サイクリンの解析と、外来遺伝子を高発現させるプロモーターおよび発現を誘導・制御できるシスエレメントの検索を行った。1)培養温度による遺伝子発現のON-OFF制御が可能で、かつ高発現プロモーターの候補として、シロイヌナズナ、Arabidopsis thaliana、の熱ショックタンパク質遺伝子、HSP18.2の熱ショックプロモーターを選んだ。熱ショックエレメントを含む約700bp断片をβ-グルクロニダーゼ(GUS)構造遺伝子に連結し、タバコ培養細胞の染色体に組み込んだ。
細菌内毒素の機能性部位・リピドAをリ-ド化合物とする新規医薬品の開発研究

内毒素の本体として多彩な生物活性を示すリピドAは、構造上D-グルコサミン-beta(1→6)-ジサッカライドの1,4′位にリン酸が結合したものである。我々は既にリピドA構成最少単位糖であるD-グルコサミン-4-リン酸誘導体を基本骨格とする各種誘導体を合成し、その生物活性を報告してきた。最近、リピドAの部分構造に類似したリポアミノ酸が、マクロファージ活性化作用等を示すことが報告された。そこで整理活性物質であるリピドA誘導体の合成研究の一環として、今回我々は、本助成金を得てリピドAの還元糖部分をD-グルコサミンと構造等価と考えられるL-セリン誘導体で置換し、リピドAのジサッカライド骨格を模擬したD-グルコサミン-4-リン酸誘導体(la-c)の合成に成功し、その生物活性について興味ある知見を得ることが出来た。すなわち、糖脂質部分のD-グルコサミン塩酸塩から5ステップで得られるジオール体を出発物質としてジベンジル化、脱アリル化そしてブロム化した後、coupling反応でbeta-グリコシド体を得た。さらに脱保護し、最終物である二種類の化合物(la,b)を合成した。次にD-グルコサミン-4-リン酸を含むリピドA誘導体(lc)の合成は、ジオール体から選択的なBOM化、リン酸化、1位の脱保護さらにブロム化を行った。先と同様にcoupling反応を行い、脱保護しさらに脂肪酸を導入して目的物であるlcの合成に成功した。次に得られたリピドA誘導体(la-c)について、マイトゲン活性および致死毒性の測定を行った。その結果laおよびlcともに母核のD-グルコサミン-4-リン酸と比較してその活性の増強は認められず、リン酸基を含むlcは低濃度で多少毒性を有することが分かった。しかし興味あることにlbは基本骨格と比較して2倍近くのマイドゲン活性の増強が認められた。
コムギにおける登熟期の早枯れ障害における植物体内窒素の役割

本研究では、コムギの登熟期の早枯れは、穂形成期以降に激増する窒素シンク容量に対して根からの窒素供給速度が追い付かないため、タンパク質や酵素などの貯蔵窒素化合物の分解が早くに促進されるため起こるという作業仮説を検証する。検証試験では、先行試験によって特定した2つの早枯れ発症圃場(枯れ熟れ様登熟不良、湿害)を対象として、早枯れする個体と早枯れしない個体の間で、窒素吸収量や体内の窒素化合物含有率の変化を比較する。また、耐性に明確な品種間差がある枯れ熟れ様登熟不良については、上記の生理分析を行うとともに、量的遺伝子座位(QTL)を特定し、耐性品種の育成・選抜過程で分子マーカーが利用できるようにする。
依存行動に対する非難の差し控えを可能にする思考枠組みの構築

平成30年度では、前年度に引き続き、非難の哲学・倫理学および依存症関連の資料を収集し、文献調査を行うとともに、以下の課題について研究発表および論文の公刊を予定していた。その課題とは、第一に非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理すること、第二に非難の本性の諸理論に対応した依存者の責任能力を同定すること、第三に依存者への非難を差し控える条件を同定することである。第一の課題については、「関係に基づく非難ースキャンロンの非難の関係性理論の検討」(『倫理学年報』第68集)および「アンジェラ・スミスの非難の抗議説について」(『哲学・人間学論叢』第10号)においてその成果を発表した。また、第二、第三の課題については、東京大学のPhilosophy of Psychiatry and Psychology研究会および立命館大学先端総合学術研究科生命倫理研究会から講演を依頼され、研究成果のアウトリーチを行った。これらの論文、講演において明らかにしたのは、依存症者への非難においては、非難する者と依存症者との関係が重要になるという点である。われわれは人々と多様な関係を築いているが、その関係においてわれわれは関係する人との間に特定の期待と意図とを相互に持ち合っている。そして非難とはこの相互的な期待が外れたことに対する反応である。依存症者に対する非難において問題なのは、依存症者が依存症のために自身がコントロールできる事柄が限定されているにもかかわらず、依存症者への期待が変化していないという点である。本研究では、このずれこそが依存症者に対する非難の失敗の原因だということを示した。依存症者と適切な関係を保つには適切な行為者性の理解が必要であり、依存症者にどのような行為者像を期待するかが重要になる。本年度の研究の意義は、この洞察により依存症者に対する非難の指針を部分的に提供した点にある。本年度では非難の哲学・倫理学に関する論文を2本発表し、その中で、非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理すること、非難の本性の諸理論に対応した依存者の責任能力を同定することという二つの課題を達成することができた。また、アルコール・薬物依存関連学会学術総会に参加したり、精神科医が参加する東京大学Philosophy of Psychiatry and Psychology研究会において講演を行うことで、精神科医との交流を広げるとともに、自身の依存症理解を深めることができた。本研究の目的のひとつとして、精神科医の臨床に対して哲学・倫理学の側から依存症者の責任についての理解を提供することがあげられるが、今年度の研究成果の公表は着実にその目標に近づいていることを示している。ただ、非難の本性に関する研究が進展する中で、その問題領域の広大さがしだいに明らかになってきた。そのため、予定していた国際学会での発表をとりやめ、非難の哲学・倫理学の問題圏を正確に把握することを目的として、「非難の哲学・倫理学研究会」を立ち上げ、第1回研究会を開催した。国際学会での研究発表をとりやめたものの、本年度の研究は申請時に計画していた課題を十分に達成しており、研究は順調に進展していると言える。本研究では、「治療関係者に有用な、依存者の行為者性理解のための思考枠組みを提案する」という目標を達成するため、以下の4つの課題を設定した。1.非難の哲学・倫理学をめぐる議論の現状を把握し、非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理すること、2.非難の本性の諸理論に対応した依存者の責任能力を同定すること、3.依存者への非難を差し控える条件を同定すること、4.道徳的非難可能性の背後にある価値観としての人間像を明らかにすること。これらのうち、13についてはこの2年間の研究によって達成できたため、来年度の研究においては4を完遂した後に、最終的な目標である思考枠組みを完成させ、それを依存症関連学会で公表することが目指される。以上は当初見込まれていた計画通りである。本研究は、依存症患者による依存行動について道徳的な責任がいつどのようにして問えるかを評価するための思考枠組みを構築することを目的としている。とはいえ、「道徳的責任」という概念の曖昧さと多義性のために、特定行動への責任の有無を判定するためには個人の直観に頼らざるを得ないというのが従来の責任論の大きな問題点であった。そこで本研究では、伝統的に道徳的責任の一部とされてきた「道徳的非難」および「非難可能性」に焦点をあて、また近年の「非難」に関する論争の高まりを背景に、依存症患者の責任を依存行動に対する非難という観点から分析することにした。このような目的のもと、本年度は次年度以降の分析の基盤をつくるべく、「非難をめぐる議論の現状について非難の本性に関わる諸理論と非難の帰属条件を整理する」という課題を設定し、近年出版されている非難の哲学・倫理学の文献サーベイに取り組んだ。これを通じて、非難の哲学・倫理学をめぐる議論の現状を把握し、非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理することが研究初年度の計画として目指された。研究の具体的実績としては、まず非難の哲学・倫理学の分野で論争の中心人物の一人である、T・M・スキャンロンの理論を批判的に検討し、その結果を「道徳的非難は可能かースキャンロンの非難の関係性理論の観点から」と題して、日本倫理学会第68回大会にて発表した。また、現在注目されている主要理論を調査し、その特徴を比較したサーベイ論文「非難の本質は何かー

BLAME: Its Nature and Normsサーベイ論文(2)」が『哲学・人間学論叢』第9号に掲載された。また、自身の責任論および非難の理論の基礎となっているジョン・ロックの責任論について、これまでの研究を整理し、著書『ジョン・ロックの道徳哲学』として発表した。計画時に予定していた論文調査は順調に進んでいる。またその成果を学会発表および論文として投稿している。平成30年度では、前年度に引き続き、非難の哲学・倫理学および依存症関連の資料を収集し、文献調査を行うとともに、以下の課題について研究発表および論文の公刊を予定していた。その課題とは、第一に非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理すること、第二に非難の本性の諸理論に対応した依存者の責任能力を同定すること、第三に依存者への非難を差し控える条件を同定することである。第一の課題については、「関係に基づく非難ースキャンロンの非難の関係性理論の検討」(『倫理学年報』第68集)および「アンジェラ・スミスの非難の抗議説について」(『哲学・人間学論叢』第10号)においてその成果を発表した。また、第二、第三の課題については、東京大学のPhilosophy of Psychiatry and Psychology研究会および立命館大学先端総合学術研究科生命倫理研究会から講演を依頼され、研究成果のアウトリーチを行った。これらの論文、講演において明らかにしたのは、依存症者への非難においては、非難する者と依存症者との関係が重要になるという点である。われわれは人々と多様な関係を築いているが、その関係においてわれわれは関係する人との間に特定の期待と意図とを相互に持ち合っている。そして非難とはこの相互的な期待が外れたことに対する反応である。依存症者に対する非難において問題なのは、依存症者が依存症のために自身がコントロールできる事柄が限定されているにもかかわらず、依存症者への期待が変化していないという点である。本研究では、このずれこそが依存症者に対する非難の失敗の原因だということを示した。依存症者と適切な関係を保つには適切な行為者性の理解が必要であり、依存症者にどのような行為者像を期待するかが重要になる。本年度の研究の意義は、この洞察により依存症者に対する非難の指針を部分的に提供した点にある。本年度では非難の哲学・倫理学に関する論文を2本発表し、その中で、非難の本性と帰属条件に関わる諸理論を整理すること、非難の本性の諸理論に対応した依存者の責任能力を同定することという二つの課題を達成することができた。また、アルコール・薬物依存関連学会学術総会に参加したり、精神科医が参加する東京大学Philosophy of Psychiatry and Psychology研究会において講演を行うことで、精神科医との交流を広げるとともに、自身の依存症理解を深めることができた。本研究の目的のひとつとして、精神科医の臨床に対して哲学・倫理学の側から依存症者の責任についての理解を提供することがあげられるが、今年度の研究成果の公表は着実にその目標に近づいていることを示している。ただ、非難の本性に関する研究が進展する中で、その問題領域の広大さがしだいに明らかになってきた。
重力対抗体制から見た植物個体のコスト類型化

生活型の異なる多様な植物の個体呼吸もほぼ「混合ベキ関数」(個体重量と個体呼吸の関係は両対数軸上で上に凸の関係)の分布内にあった。重要な結果は、裸子-被子樹木で個体呼吸の明確な差は無かった点にある。これは、一群落内で個体呼吸の個体間変異や可塑性が大きく、これらが多数集合して、裸子-被子樹木の違いがなくなり個体呼吸がロバストになったと考えた。これは、実生巨木の個体呼吸を見た場合に、裸子-被子などの系統に関係なく、植物個体呼吸は物理化学要因により主に制御を受けている可能性がある。植物個体呼吸は生命維持や成長の「コスト」であり、生命科学の重要課題である。本研究は、重力対抗体制の異なる「ツル」「タケ」「草本」「樹木」等の個体呼吸を実生大型植物で連続的に実測する。これらは重力対抗体制が異なり、ひいては同化/非同化器官の割合も異なる。個体呼吸の実測で重力対抗特性が植物コストを制御する重要要因であることを示す。重力対抗体制で異なる個体呼吸の制御要因を解明して、包括的な陸上植物全体の機能類型化を植物個体で行うことで新学説を提案し、従来に無い陸上生態系の炭素収支研究の基本概念を構築するのが目的である。22年度はツル植物、タケ、小型植物(草本、コケ)を材料にした新たな植物個体呼吸測定方法の開発・検討を行った。ツル植物は樹木貼り付いたり、もたれ掛かったり、巻き付いたりするなど多様な形態をもっている。また、通水組織の直径が大きく、通水速度も速い、こうしたツル植物の内、フジ、ツタウルシ、アケビ、ツルアジサイなどを材料とした。これら材料を素早く切断して採取するが、測定に際しては小雨か曇りの日を選択した。また、切断後、直ちに水を掛け日陰においた、さらに材料の上から濡れた黒い布をかぶせて遮光して材料から水分が蒸発散しないようにした。その結果、切断の前後で個体呼吸速度に差は見られなかった。同様に、ササやタケ類4種についても検討した結果、材料からの蒸発散を十分に防ぎ短期間の冷暗所保存であれば、個体呼吸速度は切断の前後で変化は無かった。測定の結果、ツル植物は樹木に比べて非同化部分の割合が少なく、個体呼吸速度と重量の関係は両対数軸上で自立型の樹木と明らかに異なり、直線式で表現され、その傾きは樹木より高かった。同様に、ササ・タケ類も樹木の個体呼吸スケーリングとは明確に異なる高い傾きを示した。これらは重力に対抗する体制の違いを繁栄していると考えられた。以上本年度は、ほぼ想定した結果を得られた。近年、「重力の生物影響」が注目されている。最近、植物に重力感知細胞が発見されたが、重力と代謝の研究は無い。本研究は、重力対抗体制の異なるツル、タケ、草本、樹木(マングローブを含む)等の個体呼吸を実生大型植物で連続的に実測する。これらは重力対抗体制が異なる。重力対抗体制で異なる個体呼吸の制御要因を解明して、陸上植物全体の機能類型化を植物個体で行うことが目的である。本課題では、実生から大木までの多様な樹木とともに、タケ、ヤシ、木生シダ、つる植物、着生植物等の多様な形態の植物個体全体を測定して比較した。その結果、それぞれの植物の形態に応じて個体重量と個体呼吸の関係は規定された。草本やつる植物では個体重量と呼吸の関係は直線性が高く重量比例に近かった。しかし、タケのようにやや大きくなるイネ科植物では1よりもやや0.9の傾きであった。また、ヤシ(ビンロウ)では傾きはほぼ0.75(3/4)であった。同じ個体重量間で個体呼吸を比較した場合、幅は10倍20倍程度であり、両対数軸上で陸上植物界全体を見た場合にはMori etal(2010)が示した測定点の範囲にほぼすべてが収まった。ただく樹木の様に内部に呼吸活性の低い部分がないタケでは個体呼吸の値は樹木に比べて高い傾向があった。また、樹木ついては裸子植物と被子植物などの比較でも大きな差が見らえなかった。以上より、植物個体呼吸は一定の範囲に収まりつつも、各形態で傾き(Scaling Exponent)は10.75の範囲で変化していた。
凸代数幾何と最適化理論

平成29年度に引き続き,Nondegenerateな半正定値計画問題,行列補完問題におけるグラフのChordalityについての研究,特異な半正定値計画問題の摂動理論の研究,特異な半正定値計画問題の最適性条件から得られる代数多様体の研究を行った.特異な半正定値計画の研究では,これまでの研究で未解決だった問題を反例を見つけることで否定的に解決した.この反例を追加し修正した論文を現在投稿中である.この反例は従来の予想に反する非常に特殊な性質を持っており,半正定値計画問題の幾何学を発展させる可能性を秘めている.この反例に対して射影幾何的な考察をし,半正定値計画問題の最適解の構造の解析を続けている.また,二次錐計画問題に対して代数次数を求める研究を開始し継続中である.本課題では,実代数幾何,計算代数,凸解析などの手法を用いて最適化理論を研究する.本年度は5年計画の初年度にあたり,まずニュートン図形を用いた最適性条件とべき級数環上の二次加群の所属問題に関する研究を進めた.多項式の最小値を求める際,停留点においてヘッセ行列が退化している場合は,ヘッセ行列の正値性を調べることで最適性を判定することができない.しかし,ニュートン図形とその辺に付随する多項式を調べることで,局所最適性を判定することができる.これらの条件を用いて,与えられた非負多項式がべき級数の二乗和で書けるための十分条件を与えた.この結果は、それ自体大変興味深いものであるのと同時に,多項式最適化問題の半正定値緩和法の収束性と深い関係を持つ.結果は国際会議と論文にて発表した.また,Real Idealと多項式最適化問題の半正定値緩和法に対する有限収束性問題に関する研究を進めた.研究代表者は共同研究により,Real Idealと多項式最適化問題から生成される半正定値計画問題の双対性との関係を明らかにしている.この研究結果を進め,多項式最適化問題が有限個の半正定値計画問題で近似できるための条件をReal Idealを用いて与えた.結果は論文にて発表した.概ね初年度の計画通りに成果を出すことができた.ただし,得られた結果については当初の予想よりも多くの条件が必要となってしまったものがあり,これらの結果をより精緻化することが課題として残された.平成28年度はドイツのコンスタンツ大学に滞在し研究を行った。コンスタンツ大学は実代数幾何とその最適化理論への応用研究のドイツにおける研究拠点である。コンスタンツ大学では定期的に開かれるセミナーと研究集会などを通じて、ドイツにおける研究グループと交流し、最新の話題について情報交換を行った。半正定値計画問題は、多項式最適化問題や組合せ最適化問題の近似解法などで用いられる重要な問題であり、近年では代数幾何の応用研究対象として注目されている。本研究では、特異な半正定値計画問題の摂動解析を行った。特異な半正定値計画問題は、行列補完問題などで頻繁に現れる問題であるが、摂動に対して最適値が不連続に変化する。そのため、内点法を用いても解くことが難しい問題であり、その構造の理論的な解明が必要であると考える。摂動解析の研究はほとんどの場合、正則な問題に対して行われており特異な問題に対しての研究は少ない。本研究では、与えられた特異な半正定計画問題の最適値の連続変化が、問題に現れるどの行列のどの成分の摂動で起こるのかを判定する方法を発見した。さらにその判定法を応用し、制御問題より得られる特異な半正定値計画問題の構造を解析した。結果を論文"Perturbation Analysis of Singular Semidefinite Program and Its Application toa Control Problem"にまとめarXivで公開し(arXiv:1607.05568)、現在投稿中である。この研究は九州大学の脇隼人准教授との共同研究である。今までほとんど行われていなかった特異な半正定値計画問題の摂動解析を行い、安定な摂動方向に対する行列を用いた具体的な判定法を発見したことは、最適化理論の研究において意義深いと考える。また、代数幾何と関係の深い多項式最適化問題、行列補完問題においても簡単に特異な半正定問題を作ることができることから、本結果を代数幾何の文脈で捉え直し、研究を発展させることができると期待される。スペクトル多面体とは,半正定値行列錐と線形部分空間との共通部分で表される集合である.スペクトル多面体は半正定値計画問題の実行可能領域や相関行列の集合など様々な場面で現れる複雑な集合であるが,一方で多面体のような性質も持つ非常に興味深い数学的対象である.前年度の研究では,半正定値計画問題の摂動解析を通じて,「特異な」スペクトル多面体について調べた.本研究では,その知見を応用し,「特異でない」スペクトル多面体を発見することを目標とした.凸多面体においては「非常に良い振る舞いをする凸多面体」がいくつか知られており,それらの概念に対応するものをスペクトル多面体に対して発見することを目指す.そのためにまず,半正定値計画問題において既知の概念であるNondegeneteなスペクトル多面体について調べた.特殊な例について,横断性定理を代数的に解釈することにより,Degenerateなスペクトル多面体の決定方程式をSparse Resultantを使って求めた.しかしその手法の一般化は難しいということが分かった.

また,Nondegenerateなスペクトル多面体は,行列補完問題を考える時,Chordalグラフと関係が深いことが知られている.行列補完問題は近年凸代数幾何的な手法でも盛んに研究されており,その関係性を代数幾何的に見直すことが,Nondegenerateなスペクトル多面体の理解には必要だと予想している.平成29年度に引き続き,Nondegenerateな半正定値計画問題,行列補完問題におけるグラフのChordalityについての研究,特異な半正定値計画問題の摂動理論の研究,特異な半正定値計画問題の最適性条件から得られる代数多様体の研究を行った.特異な半正定値計画の研究では,これまでの研究で未解決だった問題を反例を見つけることで否定的に解決した.この反例を追加し修正した論文を現在投稿中である.この反例は従来の予想に反する非常に特殊な性質を持っており,半正定値計画問題の幾何学を発展させる可能性を秘めている.この反例に対して射影幾何的な考察をし,半正定値計画問題の最適解の構造の解析を続けている.また,二次錐計画問題に対して代数次数を求める研究を開始し継続中である.28年度は一年間ドイツのコンスタンツ大学に滞在する.受け入れ教員のMarkus Schweighofer、研究グループのその他の教員、ポスドクなどと活発に議論し,研究を深める.平成29年度は特異な半正定計画問題の摂動解析を、代数幾何の文脈で捉え直すことで発展させる。その際、多面体論、マトロイド理論などの離散数学の概念が関係していると予想されるので、離散数学の研究者と情報交換や共同研究を積極的に行う。行列補完問題は,近年凸代数幾何的な手法でも盛んに研究されており,それらの手法も取り入れながら,「非常に良い振る舞いをするスペクトル多面体」とChordalグラフの関係について代数幾何的な研究を進める.研究成果の一部を,数理系専攻で学ぶ修士課程の学生が理解できるように講義ノートとしてまとめ,九州大学にて集中講義を行った.当初予定していた22nd International Symposium on Mathematical Programmingへの参加を取りやめにしたために余剰が生じた.ドイツにおける研究環境の整備に必要な金額が、予定していた額を大幅に下回った。平成29年度は計画通り予算を使用したが,平成28年度の余剰金がまだ残っているため.28年度はドイツのコンスタンツ大学に参加する.予算は,ヨーロッパで開催される研究集会等に参加するための旅費および研究環境の整備に用いる.カナダで開催されるSIAM Conference on Optimizationとアメリカで開催されるSIAM Conference on Applied Algebraic Geometryへ参加するために使用する。
栄養貯蔵器官特異的遺伝子のプロモーターに結合するホメオドメイン型タンパク質の解析

本研究は熱帯産マメ科植物シカクマメの種子と塊根に特異的に蓄積するKunitz型キモトリプシンインヒビター(WCI)の発現制御機構を解明することにより、栄養貯蔵器官において発現する遺伝子の調節機構を分子レベルで理解することを目的とした。WCI遺伝子の器官特異的な発現の転写レベルにおける制御には、WCI遺伝子プロモーター上のA-T塩基対に富む領域と種子特異的な遺伝子に共通して存在するRY配列(5'-CATGCAT-3')が必要であることが明らかになっている。このA-T塩基対に富む領域に結合するホメオドメインタンパク質(WBHD1)をクローニングした。本研究ではシカクマメ種子を用いた一過的発現系により、このWBHD1タンパク質がWCI遺伝子の転写制御因子であるか否かを検証することを第一の目的とした。現在までにWBHD1の翻訳開始コドンと終始コドンをカバーするcDNA領域をCaMV35Sプロモーターの下流に、WBHD1 cDNAの下流にはノパリン合成酵素のタ-ミネーターを融合させたエフェクタープラスミドおよびWCI遺伝子プロモーターをレポーター遺伝子の上流につないだレポータープラスミドの構築を完成させた。今後、これらプラスミドをシカクマメ種子にパーテイクルガンを用いて導入し、WBHD1の転写制御因子としての機能を検証していく。次に、WBHD1を過剰発現させたトランスジェニック植物を作出し、その植物体を解析することにより、WBHD1の生体内における機能を検証することを第二の目的とした。現在までにタバコおよびアラビドプシスにおける形質転換用バイナリーベクターのT-DNA領域内に、上記と同様の構造をもつプラスミドの構築が完了した。現在形質転換植物体の作出が進行中である。
染色体逆位特異的EVI1発現機構を用いた白血病幹細胞の同定と新規治療標的の探索

染色体3q21と3q26との間の転座または逆位は、EVI1遺伝子の高発現を誘導することによって、予後不良の白血病を引き起こす。本研究では、3番染色体逆位を再現するモデルマウス(3q21q26マウス)を用いて白血病幹細胞を同定することを目的とした。白血病を発症した3q21q26マウスの骨髄では、B細胞マーカーであるB220陽性細胞と骨髄球マーカーであるGr1陽性細胞が増加していた。このうちB220陽性かつ前駆細胞マーカーc-Kit陽性細胞は、コロニー形成能を有し、ヌードマウスにおいて白血病を再現した。このことから、B220陽性c-Kit陽性画分に白血病幹細胞が含まれることが示された。3q21と3q26との間の染色体転座や逆位は、予後不良の急性骨髄性白血病を惹起する。この白血病では、3q26側に存在するEVI1遺伝子が異常に発現することが白血病発症の原因となるが、その詳細なメカニズムに関しては不明な点が多い。私たちはこの白血病発症機構を解明するために、大腸菌人工染色体(BAC)クローンを用いて、ヒトの3q21と3q26との間の逆位を再現したトランスジーンをもつマウス(3q21q26マウス)を樹立した。3q21q26マウスでは、造血幹・前駆細胞特異的にヒトEVI1遺伝子が高発現しており、このマウスは24週齢以降に実際に白血病を発症した。3q21q26マウスの白血病細胞を解析したところ、B細胞マーカーであるB220または骨髄球マーカーであるGr1が陽性となるB220+/Gr1-細胞、B220+/Gr1+細胞、B220-/Gr1+細胞の3種類の白血病細胞が混在する混合型白血病であることがわかった。これらの3分画において、未分化細胞のマーカーであるc-Kitの発現を解析したところ、B220+/Gr1-分画が最も多くc-Kit陽性細胞を含んでおり、B220+/Gr1-/c-Kit+分画は、高いコロニー形成能を有していた。さらに、この細胞分画から骨髄球系細胞(B220-/Gr1+細胞)への分化が認められた。また、B220+/Gr1-/c-Kit+分画の細胞では、EVI1遺伝子の高発現も認められた。以上の結果から、白血病細胞分画のうち、B220+/Gr1-/c-Kit+分画が最も未熟な細胞を含んでおり、この細胞から白血病細胞が発生しているものと理解される。さらに、このB220+/Gr1-/c-Kit+分画から白血病幹細胞を同定するために、逆位アリルの制御下にtdTomato蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを樹立した。現在、このマウスのtdTomato発現プロファイルを解析中である。3番染色体長腕21領域(3q21)と同じく3番染色体長腕26領域(2q26)との転座および逆位は、3q21に存在するGATA2遺伝子エンハンサーが、3q26領域に存在するEVI1遺伝子の高発現を誘導することによって、予後不良の急性骨髄性白血病を誘導する。以前に、私たちは3q21と3q26との逆位アリルを約200 kbにわたって再現する大腸菌人工染色体(BAC)トランスジェニックマウス(3q21q26マウス)を樹立した。このマウスは24週令以降に白血病を発症し、ヒト白血病のモデルとなっている。本研究では、このモデルを用いて、3番染色体転座または逆位を伴う白血病における白血病幹細胞を同定することを目的とした。27年度は、この転座アリルによって制御されるEVI1遺伝子の発現を可視化するために、転座アリルの制御下にtdTomato蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを樹立し、その解析を行った。このマウスにおいてtdTomato蛍光の発現プロファイルを解析したところ、tdTomato蛍光は、造血幹細胞および前駆細胞を含むLin-/Sca1+/c-Kit+(LSK)細胞において最も強く観察され、分化マーカーを発現する細胞では減少する傾向があった。一方で、B細胞の分化マーカーであるB220陽性細胞では、tdTomato蛍光が維持されていた。26年度までの白血病を発症した3q21q26マウスを用いた解析からも、B220陽性細胞に白血病幹細胞が含まれることが示唆されており、今回の解析と一致していた。これらの結果から、B220陽性細胞では、転座アリルによってEVI1遺伝子の発現が高く維持されており、これらの細胞が白血病発症の母体となっていることが示唆された。