hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
妊娠中毒症発症に関するCa代謝の意義

また、ラット胸部大動脈のリング標本をマグヌス法実験装置に装着し、先に採血した血漿を栄養液の代わりとして用い、同一血管に対しそれぞれの対象者の血漿を反応させ、ノルアドレナリンにより血管収縮の反応性の違いを比較検討した。基礎実験段階の成績では、腎・脳組織に比べ赤血球膜標本のNa-KATPase活性はかなり低い。活性を上げるための方法をいくつか試みているが、ヨウ化ナトリウム処理を加える方法が有効であると判明した。そこで本法を用い、正常妊婦、妊娠中毒症患者、本態性高血圧合併妊婦を対象に目下検討中である。Ca摂取量の少ない国では,多い国に比べて高血圧症の発症頻度は少ないという報告がある。妊娠中毒症(以下中毒症)においても,Ca摂取が中毒症の発症予防の上から着目されてきている。この観点から今年度は沖縄県の食生活におけるCa摂取量の現況を調査し、一方妊婦の中毒症発症のハイリスク要因として遺伝的高血圧素質者(高血圧家系)、既往中毒症妊婦、本態性高血圧や慢性腎炎の合併患者を取り上げ、これらの妊婦にCa剤(200400mg、1.3mEq2.6mEq)を投与し、中毒症の発生率を対照群と比較した。さらに中毒症の高血圧発症の機序をCa代謝の面から動物実験によって解明しようと試みた。成績:1.沖縄県における食生活はCaを含む食品、とくに牛乳および乳製品、卵類は本土の摂取量とほぼ同程度に普及しており、海草類はより多く取り入れられている傾向がある、全体的には他県と比べて碍にCa摂取量が少ない傾向はみられなかった。2.ハイリスク要因のある妊婦に妊娠初期(妊娠16週)からCa剤を投与した群(12例)では同じハイリスク要因の無投与妊婦16例にし、中毒症の発症率はそれぞれ16.7%、33.3%であり、Ca剤投与が中毒症発症予防の有力手段と考えられた。3.血管平滑筋細胞膜のNa,K-ATPaseを抑制する内因性ウアバイン様物質が血液中に存在し、その増加によりCa^<++>濃度が上昇して、血管収縮性が増し血圧上昇を惹起するという仮説に基き、ラット胸部大動脈、イヌの腸間膜動脈の摘出標本を用いて、ウアバインのノルエピネフリン(NE)による血管収縮への影響、K^+濃度によるNa,K-ATPaseの抑制作用を検討すると、高濃度によるウアバイン存在下ではNEによる血管収縮は有意に増加し、K^+freeの状態に近づけるとウアバイン非存在下でも有意な血管収縮の増強が認められることから、高濃度ウアバイン存在下や細胞外液K^+濃度を低下させことによりNa,K-ATPaseを抑制することは血管収縮性をもたらすと考えられた。
半導体超微粒子の電子構造と表面電子移動のダイナミクス

半導体超微粒子の示す電気・磁気・光学・化学的諸性質はバルク結晶のそれとは大きく異なることが考えられる。本研究では、半導体超微粒子の合成を行なうと共に、パルスレーザーにより励起した超微粒子からの発光の減衰時間分解スペクトルから励起状態の電子構造、表面吸着分子との間におこる電子移動の動的過程を明らかにすることをめざした。その結果以下のような研究成果を得ることが出来た。1)Cds、ZnSのような【II】-【VI】族の半導体超微粒子(粒径:100【A!°】)を多孔質ガラスに担持する方法を開発した。この方法は、溶液中に懸濁した半導体コロイドと違い、凝集、沈殿の恐れはなく、熱処理が可能となった。また、極低温でのルミネッセンスや光吸収の実験、ガス分子の吸着実験が容易にできるようになった。2)これらの超微粒子を用い、吸収・発光スペクトルを測定した。発光スペクトルはバルク結晶とかなりちがうことがわかった。たとえばCdSの場合バルク結晶で強くみられるグリーン・エミッションは、微粒子では非常に弱くしかも低温にしてもシャープにならない。寿命も短い。一方、長波長にみられるレッド・エミッションは微粒子では強い。3)これらの微粒子の表面に種々の分子を吸着させると、発光が著しく消光される。とくに電子受容性分子によって消光されることがわかった。しかも発光寿命は変わらず、初期強度が変化する。この消光は光触媒効果と関連すると共に、半導体の伝導電子と吸着分子のあいだの電子移動に起因することを示唆し、発光の動的特性を説明するモデルを提唱した。また、これらの発光の温度変化を低温まで詳細に測定することにより、負の活性化エネルギーをもつ電子移動過程の存在の可能性など、電子移動にたいする新しい知見を得ることが出来た。寿命も短い。
ＪＡの戦略的営業に関する研究－青果物を対象としたモデル化－

本研究の目的は、JAによる青果物の戦略的営業活動モデルを明らかにすることである。青果物の営業活動では、ターゲット顧客、産地内の資源の量・質を見極め、直接販売の構築を行うことが重要となる。また、顧客への営業では、「店頭へのプッシュ営業」のみならず、「店外でのプル営業」と連動することで、その効果が期待される。一方、先進的な県域組織では、その営業活動の優位性が確認されることから、両者の連携、棲み分けに注意が必要となる。なお、本研究で得られた成果は、フードシステムのバリュー、サプライ双方のチェーンを融合化するものである。そしてそのための重要な役割を「営業活動」が担っていることを実証的に示した。JAにおける青果物の営業について,今年度は主として単協と県域組織(全農県本部・経済連)における営業活動の相違点(特徴)について明らかにした。具体的には,茨城県,徳島県,宮崎県などでのヒアリング調査を行い,県域組織における以下のような具体的な特徴を抽出した。1.JA以外の法人や顧客との関係性構築において,商品ラインアップの広さやロットの大きさ,さらには周年商品供給など,県域組織の優位性がみられること。2.商品加工(パッケージング等の流通加工)や物流体制を整備するための投資を行い,「拡張商品」を営業品目とすること。3.技術指導体制については,単協との協力体制,県域TACの活用などにより,その機能強化を図りつつあること。なお,これらの営業戦略は,フードシステムにおけるバリュー及びサプライチェーン双方の融合化を図る試みとして,農業サイド主導によるチェーン構築として評価した。これら成果として得られた点については,すでに学会報告や雑誌論文などで公表を行った。また,本年度は小売店,外食店における仕入れ担当者(バイヤー)を対象とした営業評価に関するアンケート調査を一部で実施した。次年度,同アンケート調査のさらなるサンプル数を確保し,最終的な分析を行い,学会報告などでの公表を予定している。本年度の成果は以下の通り。1、単位JAの営業活動のモデルについて、これまでの都市近郊、伝統的産地を対象としたものに加え、遠隔地の新興産地の分析を行った。また、2、全国の単位JAを対象としたアンケート調査を実施し、営業活動の現状と課題について定量的に把握した。3、県域JAの分析では、店頭プッシュと店頭プルの連動した営業活動についてのケース分析を行い、その両者の連動が有効であること明らかにした。なお、外食店では、近年、バイヤー機能が変化していることをケース分析により明らかにした。研究全体を通じて得られた成果は次の通り。1、青果物の営業対象である小売店、外食店のバイヤーは、JAの営業担当者に単なる窓口としての業務だけではなく、技術、生産者指導を繋ぐ力量、組織体制のあり方を重視している。また、JAによる様々な提案活動とそのための力量を求めている。2、単位JAの営業活動の現状と課題と定量的に明らかにするとともに、先進的なJAにおける立地及びその規模などからそのモデル化を図った。具体的には、「顧客適応」の高低と「産地内生産組織・体制の再編可能性」の高低、から類型的なモデルを提案した。3、それに加えて県域JAにおける営業活動では、JA以外の法人や顧客との関係性構築において、商品ラインナップの広さやロット、さらには周年供給などの面から、県域の優位性がみられる。また、商品加工(パッケージング等の流通加工)や物流体制を整備するための投資を行い、「拡張商品」を営業品目とする。そして、技術指導体制でも、単位JAとの協力体制を構築することで、その機能強化を図っている。以上、本課題で得られた成果は、JAの営業活動の新たな方向性を示すとともに、フードシステムのバリュー、サプライチェーン双方の融合化を農業サイド主導で図るものであり、そのための重要な役割を営業活動が担っていることを示唆するものである。JAにおける青果物の営業実態について、単協、県域組織(全農県本部・経済連)に分けてそれぞれ先進的な取り組みを行っている事例についてヒアリング調査を行い、単協を中心として、以下の点を明らかにした。具体的には、1、JA全体としての経営戦略、販売事業戦略に基づき営業活動が展開されている。2、青果物における営業は、「生産財営業」に近い特性をもつ。3、顧客企業との長期的、継続的な取引関係の維持に配慮した行動をとる。4、営業と営農指導における有機的な連携が組織的に行われる。これらについては、学会報告と論文などによりすでに公表を行った。その一方で、単協と県域組織における営業活動の相違点(特徴)としては以下のことが明らかとなった。具体的には、JA以外の法人や顧客との関係構築について、県域組織においてその優位性がみられること。

しかし、県域組織においては、技術指導や産地(県内)における物流体制構築の面で、新たな体制構築なり取り組みが必要となることである。これらについては、次年度に補足調査を実施し、学会などでの成果公表を予定している。一方、小売店、外食店における青果物仕入れについては、スーパー、外食店における仕入れ担当者(バイヤー)を対象としたヒアリング調査を実施した。その結果、1、バイヤーはJAの営業担当者に対し、単なる営業窓口としての業務だけではなく、技術、生産者指導を繋ぐ力量、組織体制の在り方を重視していること、2、営業担当者に対して様々な提案力量を求めていること、などが知見として得られた。これらの結果を踏まえて、次年度の定量調査(アンケート調査)設計のための準備作業を行った。最終目的に向けて,有益な知見を得られためである。具体的な理由は以下の通りである。1.初年度の単協を中心とした分析に加え,昨年度は県域組織を中心とした分析を行い,その特徴や相違点を抽出することができた。これらは,JAにおける営業戦略のモデル化に際して,フードシステムにおけるバリュー及びサプライチェーン双方の融合化を図る試みとして位置付けられる。2.小売業,外食店におけるバイヤー担当者を対象としたアンケート調査についても順調に進み,来年度はさらなるサンプル数を確保する状況になっていること。3.全国のJAを対象としたアンケート調査についてはプレ調査を行い,アンケート内容の改善・ブラッシュアップを行い,次年度の実施に備えることができた。最終目的であるJAの営業モデル構築についての有益な知見が得られたためである。本年度は2つのパートに分かれ研究を実施したが、JAサイドについては予定を上回る成果と進捗状況で研究が進んでいる。一方、取引先サイドについては、本年度はヒアリング調査を中心としたが、研究業績でも述べたように定性情報ながらも重要な知見を得ることができた。これにより、次年度の予定であるJAを対象としたアンケート調査のフレーム、仮説を構築することができた。次年度(最終年度)は以下について研究を進める。1.本年度につづき,小売店,外食店のバイヤーを対象とした定量調査を継続実施し,分析を行う。2.本年度のプレ調査でアンケート内容の改善・ブラッシュアップを行ったものを中心に,全国のJA(単協と県域組織)を対象としたアンケート調査を実施し,分析を行う。3.本研究課題の最終的な目標である,JAにおける営業モデルについてのとりまとめを行う。当初計画・予定通り、次年度は以下の2点について研究を進める。1、本年度のJAヒアリングの結果と補足的なヒアリング調査の結果を踏まえ、全国のJA(単協と県域組織)を対象としたアンケート調査を実施し、その結果についての定量的な分析を行う。2、小売店、外食店における仕入れ担当者(バイヤー)を対象としたアンケート調査を実施し、バイヤーサイドからのJA営業についての評価に関する定量分析を行う。次年度の主な研究費の使用計画としては以下の通りである。1.JAを対象としたアンケート調査に際して経費(郵送費,印刷費,等)を予定している。
生物学的由来によるセルロース分子の多様性の解明とそれに基づく高度利用法の開発

当研究の目的は、生物学的由来の異なるセルロースの分子特性を明らかにし、それらを高度に利用する方法を開発することにある。まずセルロースのマーセル化による分子特性の変化について、レオロジー測定および光散乱を用いて研究した。その結果マーセル化により溶媒への溶解性が低下すること、それに関連して、溶液中のマーセル化セルロース分子は一部凝集状態で存在することが明らかにされた。またバクテリアセルロースの液晶から、従来のレーヨンと同等かそれ以上の強度を持つ繊維が紡糸できることも判明した。またセルロースの溶解性は、セルロースのエチレンジアミンへの浸漬処理と凍結乾燥の組合せにより著しく促進されることも判明した。これらの結果は、セルロースの高度利用に際して必須の、セルロースの溶解に関する有用な手段となり得る。さらにセルロースの燃料電池用膜としての利用に関する基礎的研究も行い、有用な結果を得ている。特にバクテリアセルロース膜は、耐酸化性試験として用いられるフェントン試験によって、重量減少率は20%程度と低い。これはナフィオン膜の重量減少率10%程度に匹敵する。また植物由来のセルロースや再生セルロース膜の重量減少率がほぼ100%であることと比較して、バクテリアセルロース膜の耐酸化性が強く、燃料電池膜として優れていることを示唆する。さらにバクテリアセルロース膜内での水素触媒としてのパラジウム微細粒子の析出にも成功している。また、セルロース溶液から水蒸気添加あるいはイオン交換樹脂の添加による、透明な光学的異方性ゲルおよび透明異方性フィルムの作成にも成功している。以上のように、当研究は生物学的由来の異なるセルロースの分子特性に関する基礎的研究から始め、各種セルロースの分子特性に適合した高度利用への道を模索する段階に入りつつあり、今後のさらなる発展が期待される。セルロースは地球上で最も大量に生産されるバイオマスの一つであり、将来セルロースを高度に利用するためには、その分子特性の解明が不可欠である。地球上でセルロースは植物界、モネラ界(酢酸菌)、動物界(ホヤ類)で生産されている。従来これらのセルロースはそれぞれの由来の違いにもかかわらず、分子特性・分子構造はすべて同じであるというのが常識であった。しかし当研究によって、我々はこれら由来の異なるセルロースを、溶媒系LiCl/DMAc及びLicl/DMIに溶解させることによって、それらの分子特性に明白な違いのあることを見出した。セルロースは一般にかなり溶解性の低い高分子である。特にホヤ由来のセルロース(ツニシン)は高分子量であることも原因して溶解しにくい。当研究では、レオロジー特性、小角X線散乱、光散乱およびラマン分光測定等を用いて、セルロースの溶解機構について、およびその促進法について詳細に研究し、多くの成果を得た。また、酢酸菌由来のバクテリアセルロースの液晶性及びツニシンの高分子量性に起因する、その溶液の高い曳糸性を利用することによって、高強度の新規セルロース繊維を創製する可能性が示された。得られた成果は次のようにまとめられる。1)バクテリアセルロース溶液から液晶紡糸することによって、従来のセルロース繊維(レーヨン)と同等かそれを超える強度の繊維が得られることが判明した。2)セルロースの溶解促進効果には、アミン処理が効果的であり、これによってセルロースのミクロフィブリル構造にナノメートルオーダーの構造変化が生じ、溶解性が著しく向上することが示唆された。3)バクテリアセルロースは、他のセルロース材料と比べて、対酸化性が大きく、またそれ自身でも還元能を有し、パラジウム等の金属イオンを還元する。これによって、燃料電池等の電解質膜として有用であることが判明し、将来のエネルギー変換膜としての高度利用の方向性が示唆された。当研究では、セルロースの分子特性に関する情報を得るとともに、高度利用の基礎情報を得るために、セルロースのマーセル化による分子特性の変化について、レオロジー測定および光散乱を用いて研究した。

その結果マーセル化により上記溶媒への溶解性が低下すること、それに関連して、溶液中のマーセル化セルロース分子は一部凝集状態で存在することが明らかにされた。またバクテリアセルロースの液晶から、従来のレーヨンと同等かそれ以上の強度を持つ繊維が紡糸できることも判明した。またセルロースの溶解性は、セルロースのエチレンジアミンへの浸漬処理と凍結乾燥の組合せにより著しく促進されることも判明した。これらの結果は、セルロースの高度利用に際して必須の、セルロースの溶解に関する有用な手段となり得る。さらにセルロースの燃料電池用膜としての利用に関する基礎的研究も行い、有用な結果を得ている。特にバクテリアセルロース膜は、耐酸化性試験として用いられるフェントン試験によって、重量減少率は20%程度と低い。これはナフィオン膜の重量減少率10%程度に匹敵する。また植物由来のセルロースや再生セルロース膜の重量減少率がほぼ100%であることと比較して、バクテリアセルロース膜の耐酸化性が強く、燃料電池膜として優れていることを示唆する。さらにバクテリアセルロース膜内でのゾルーゲル法による、水素触媒としてのパラジウム微細粒子の析出にも成功している。また、セルロース溶液から水蒸気添加あるいはイオン交換樹脂の添加による、透明な光学的異方性ゲルおよび透明異方性フィルムの作成にも成功している。以上のように、当研究は生物学的由来の異なるセルロースの分子特性に関する基礎的研究から始め、各種セルロースの分子特性に適合した高度利用への道を模索する段階に入りつつあり、今後のさらなる発展が期待される。
分子進化学から探る酸性リン蛋白質による生体内石灰化機構の解明

酸性リン蛋白質であるdentinmatrix protein 1(DMP1)の分子進化学的研究から、カゼインキナーゼ(CK)によりリン酸化されることがDMP1機能に重要であることが推測される。すなわち、CKによりリン酸化されたDMP1はマイナス荷電体となり、Ca^<2+>結合能を介して骨の石灰化に関与すると考えられる。本研究では、骨組織や骨芽細胞培養系においてDMP1のSerがリン酸化していること、さらに骨芽細胞由来のCKがDMP1のリン酸化に関与することが示唆された。次に、骨芽細胞培養系にCK阻害剤を添加してリン酸化を阻害すると石灰化が抑制された。従って、骨組織でDMP1はCKによりリン酸化されてマイナス荷電体となり、Ca^<2+>結合能を有して骨の石灰化促進に関与すると考えられた。骨の非コラーゲン性酸性リン蛋白質であるdentinmatrix protein 1 (DMPI)は、生体内で強力なマイナス荷電体となり、強いCa^<2+>結合能を介して骨の石灰化に関与すると考えられているが、その石灰化機構の詳細は明らかではない。我々は、「機能にとって重要な分子の性質や部位は長い進化過程において変化しない」という分子の進化学的性質から、DMP1分子の機能に重要と考えられるアミノ酸配列の特徴を見出した。その1つは、カゼインキナーゼ(CK)によるリン酸化配列であり、CKによるリン酸化はDMP1分子の機能に重要であると考える。本研究では、骨組織に特異的なCKアイソフォームを同定するため、マウス骨組織からレーザーマイクロダイセクション法により骨膜と骨を選択的に採取して、RNA抽出後、cDNAを作製した。CKのアイソフォームを幅広く検討するため、degenerateプライマーを用いてCKのアイソフォームを検討したところ、CK2の発現率が高いと考えられる結果を得た。また、骨芽細胞株でCK1およびCK2発現をリアルタイムPCRにて検討したところ、分化過程の石灰化時期に一致して、CK1とCK2の両者の発現が上昇することが分かった。骨基質蛋白質であるdentinmatrix protein 1 (DMP1)は、生体内でマイナス荷電体となり、強いCa2結合能を介して骨の石灰化に関与すると考えられているが、その石灰化機構の詳細は明らかではない。我々は、分子進化学的検討から、DMP1分子の機能に重要と考えられるアミノ酸配列の特徴を見出した。昨年度の研究では、骨組織に特異的なCKアイソフォームとして、CK2の発現が高いことが分かり、骨芽細胞株(MC3T3-E1)培養において、石灰化時期にCK1とCK2の両者の発現が上昇することが分かった。本年度は、マウスとヒトのCK2をレンチウイルスを用いてMC3T3-E1に過剰発現するための2種類のベクターを作製して検討を行ったが、両者とも293細胞ではCK2は発現するが、MC3T3-E1ではCK2の過剰発現はみられなかった。さらに、CK2過剰発現マウスを作製するため、哺乳類ベクターにマウスCK2を挿入した。また、石灰化部位のCK2分布やリン酸化部位を同定するため、様々な処理を行った組織切片にて、何種類かの両抗体を用いて免疫染色を検討して、CK2分布やリン酸化部位の同定を行った。骨基質蛋白質の酸性リン蛋白質であるdentinmatrix protein 1(DMP1)は、生体内でマイナス荷電体となり、強いCa^<2+>結合能を介して骨の石灰化に関与すると考えられているが、その石灰化機構の詳細は明らかではない。その1つは、カゼインキナーゼ(CK)によるリン酸化配列であり、CKによるリン酸化はDMP1分子の機能に重要であると考えられる。本年度は、セリンのリン酸化(P-Ser)を特異的に認識する良い抗体を購入できたため、骨組織を用いて、DMP1とP-Serの分布を共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、生体内ではDMP1中のSerがリン酸化していることを証明した。次に、培養骨芽細胞の石灰化過程において、同様の手法で、培養骨芽細胞が分泌したDMP1中のSerがリン酸化状態にあることを証明した。

また、骨芽細胞におけるCK2過剰発現実験による石灰化促進効果を検討しようとしたがうまく行かず、その代わりに、骨芽細胞の石灰化培養実験にCKII活性阻害剤を添加して、リン酸化阻害を行い、石灰化に及ぼす影響を検討した。アリザリン染色による検討の結果、CKII活性の阻害により石灰化が抑制されることから、生体内でCKIIによりリン酸化されてマイナス荷電したDMP1は石灰化を促進させると推測された。
公衆衛生プログラムとしての乳幼児に対する肺炎球菌ワクチン接種の臨床経学

本研究では、我が国が出生コホートを対象とした7価肺炎球菌ワクチンの定期接種の導入した場合、その公衆衛生プログラムの費用対効果を検討した。その結果、定期予防接種の実施による延命効果が示唆されたが、支払者の立場(接種費用および肺炎球菌関連疾患の医療費のみを考慮)からの分析結果では、1QALY(質を調整した生存年)獲得あたりの費用は約700万円であった。この値は、WHOが推奨しているcost-effectiveの基準(国民1人あたりのGDPの3倍以下)を下回ったものの、「極めて費用対効果に優れる」とは言い難かった。研究成果は学術誌Vaccineに既に掲載された。2009年10月、乳幼児にも使用できる7価肺炎球菌ワクチン(PCV-7)がわが国で承認された。接種費用はこれまでのワクチンに比べ高額であるため、承認前から公的予防接種プログラムの実施が期待されている。現在、世界で30以上の国が小児の定期予防接種にPCV-7を組み込んでいる。しかし、定期接種の導入の経済的効率性に関する研究結果に多様性がみられ、cost-savingから1QALY(質を調整した生存年、Quality-Adjusted Life Year)獲得あたり100,000ユーロと報告されている。本研究は我が国における公費助成PCV-7予防接種プログラムの効率性を評価し、政策決定者の意思決定に有用な情報を提供することを目的とした。初年度(2010年度)の研究内容としては、費用効果分析を行うための数理モデルの構築とそれを行うための文献レビューを行った。その手順として、先ずは国内外の乳幼児に対するPCV-7の予防接種プログラムの経済評価に関する文献についてレビューし、費用効果分析を行うためのデーター覧を作成した。その後は、関連省庁のデータベース、医中誌およびPubMedを用いて、(1)わが国における乳幼児に対する接種政策または接種費用の負担制度、(2)自己負担と接種率の関連、(3)小児肺炎球菌関連疾患(髄膜炎・菌血症・中耳炎)の疫学に関する文献、(4)ワクチン血清型による髄膜炎・菌血症・中耳炎が各疾患に占める割合に関する文献、をレビューした。レビューの成果として、岩田ら(2008)、神谷ら(2008)と山中ら(2008)が報告した肺炎球菌性諸疾病の罹患率および予後に各種費用データ(直接医療費)を用いて、初歩の余命延長マルコフ・モデルと経済モデルを作成した。作成したモデルは現在、感染症の専門家の意見を求めているところである。年度内に経済評価の要であるモデルが構築作成できたことによって、来年度以降の研究が予定通りに運ばれる可能性が示されたと考える。二年目(2011年度)の研究内容としては、(1)前年度に構築した余命延長マルコフ・モデルと経済モデルを実際に走らせ、デバッグを行った、(2)デバッグしたモデルでベース・ケース分析を行った、(3)モデルの不確実性を検討するため各変数に対する一元感度分析を行った。(4)ベース・ケースと一元感度分析の結果に関して感染症の専門家の意見を求めた。(5)分析結果を更に整理し、論文を纏めるに際して必要な図表の作成を行った。(6)医中誌およびPubMedを用いてモデルに必要となるデータ、例えば、(1)わが国における乳幼児に対する接種政策または接種費用の負担制度、(2)自己負担と接種率の関連、(3)小児肺炎球菌関連疾患(髄膜炎・菌血症・中耳炎)の疫学に関する文献、(4)ワクチン血清型による髄膜炎・菌血症・中耳炎が各疾患に占める割合に関する新たな文献の検索を行った。年度内に費用効果分析の結果が得られたことによって、来年度以降の研究が予定通りに運ばれる可能性が示されたと考える。

現在、世界で30以上の国が小児の定期予防接種にPCV-7を組み込んでいる。しかし、定期接種の導入の経済的効率性に関する研究結果に多様性がみられ、cost-savingから1QALY(質を調整した生存年、Quality-Adjusted Life Year)獲得あたり100,000ユーロと報告されている。本研究は我が国における公費助成PCV-7予防接種プログラムの効率性を評価し、政策決定者の意思決定に有用な情報を提供することを目的とした。一年目(2010年度)は、医中誌およびPubMedを用いてモデルに必要となるデータに関連する文献の検索を行った。二年目は、構築した余命延長マルコフ・モデルと経済モデルを実際に走らせベース・ケース分析と不確実性を検討するため各変数に対する一元感度分析を行い、図表の作成を行った。乳幼児に対する肺炎球菌ワクチンの臨床経済学の評価の結果は以下の通りである。(1)支払者の立場(すなわち、接種または肺炎球菌関連疾患罹患時の受診、のためのcare-giverの生産性損失を考慮しない場合)から分析を行った結果、乳幼児に対するPCV-7の定期予防接種は1QALY(質を調整した生存年)獲得あたりが約7,441,000円であった。(2)社会全体の立場から分析を行った結果(すなわち、生産性損失を含む場合)、1QALY獲得あたりが5,489,000円9,065,000円であった。三年目は、分析結果を報告書にまとめたほか、欧文学術誌にも投稿した。交付申請書に記載した研究目的である「乳幼児の肺炎球菌ワクチン接種の定期化をめぐる議論に寄与させる」は遂行できたと思われる。モデルに必要なパラメータは一応確保または推計でき、当該モデルにそれらを投入し、一定の費用対効果分析はできた。これまでも類似の研究を実施してきたので、今後必要とされる各ステップにかかる時間は把握でき、概ね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究のパラメーターの多くは、2次資料からの引用、または2次資料の組み合わせにより推計した値であるため、今後これらのデータの精度をより高めることが必要である。さらに各パラメーターの不確実性(Uncertainty)について、より質の高い感度分析(Sensitivity analyses)を行い、その後は論文としてまとめ投稿する予定である。
新規H^+チャンネル欠損マウスの作製とその呼吸・循環調節の解析及び欠損修復の試み

1.新規H^+チャンネルの機能と欠損マウスの作製[1]ASPTは751のアミノ酸で構成されており12回膜貫通型の構造を示す。[3]生体内で脳にのみ発現を示し、細胞外環境の酸性化に伴いVMSにおける発現が高まる。[4]マウスES細胞からゲノムDNAを抽出しEMBL vectorを用いてGenomic libraryを作製後、Libraryのスクリーニングを行い複数の陽性クローンを分離した。[5]ASPC遺伝子の構造を決定し、Exon 13を欠損させるためのTargeting Vectorを構築した。[6]ASPTtargeting VectorをES細胞にElectroporationにより導入しG418にてHomologous recombinationをおこしたESクローンを選択した。2.中枢性化学受容機構に関与する遺伝子の検索[1]PLP/DM20-M6b遺伝子ファミリーに属する新規遺伝子をクローニングしRhombex-29と命名した。これはで脳特異的に発現し4回の細胞膜貫通領域を持っている事が明らかになった(研究発表1)。[2]核内転写因子であるMafGのラットのHomologueをクローニングした(研究発表2)。[3]新規遺伝子であるRhombex-40をクローニング・命名した。これは脳特異的な発現を示し、1回の細胞膜貫通領域を持っている事が明らかになった(研究発表3)。[4]MafGの新規splice variantをクローニングしMafG-2と命名した。これはMafGに27アミノ酸が挿入されており、核内に局在することがGreen Fluorescent Proteinを用いた実験で明らかになった(研究発表4)。CO_2やH^+の変化に応じて呼吸反射を起こす部位は中枢性化学感受領域に局在している.そこで中枢性化学受容体の検索には、異なる組織や条件下の細胞で発現している差異を見つけだすDifferential Display法(DD法)を用いた.VMS細胞と他の神経領域(Frontal Cortex)から抽出したPoly(A)tailを持つmRNAを試料として、216種類のプライマーの組み合わせによるPCRを行った。その結果、中枢性化学受容体の候補として複数の新規遺伝子の構造決定を行った.Phombex-40は脳特異的に発現する新規遺伝子で、1回の細胞膜貫通領域を持っている事が明らかになった。マウス遺伝子LibraryからASCP遺伝子を含む断片をクローニングしTargeting vectorを構築した。また、VMS細胞と他の神経領域(Frontal Cortex)から抽出したPoly(A)tailを持つmRNAを試料として、216種類のプライマーの組み合わせによるDifferential Displayを行った。その結果、中枢性化学受容体の候補としてさらに複数の新規遺伝子の構造決定を行った.1.核内転写因子であるMafGはCO_2やH^+の変化に応じて呼吸反射を起こす部位である中枢性化学感受領域に顕著に発現が高いことを見いだした。さらにこの遺伝子は高炭酸ガス刺激によって有意に発現が高まる(研究発表1)。2.新規遺伝子であるRhombex-40をクローニング・命名した。これは脳特異的に発現する新規遺伝子で、1回の細胞膜貫通領域を持っている事が明らかになった(研究発表2)。3.Rhombex-29をクローニング・命名した。これはPLP/DM20-M6b遺伝子ファミリーに属する新規遺伝子で脳特異的に発現し、4回の細胞膜貫通領域を持っている事が明らかになった(研究発表3)。1.ASPCの構造と機能の解明(1)ASPTは751のアミノ酸で構成されており12回膜貫通型の構造を示す。(3)生体内で脳にのみ特異的な発現を示す。(4)細胞外環境の酸性化に伴い本遺伝子のVMSにおける発現が有意に高まる。2.ASPCノックアウトマウスの作製(1)ASPC遺伝子の構造は全長は約40kbで9つのExonで構成されていた。

(2)ASPT遺伝子のExon13を欠損させるためのTargeting Vectorを構築した。(3)ASPTtargeting VectorをES細胞にElectroporationにより導入しG418にてHomologous recombinationをおこしたESクローンを選択した。3.転写因子MafGの新規splicing variantであるMafG-2の同定(研究発表1)(2)この遺伝子産物はMafGより27アミノ酸が挿入されている。(3)Trasfectionの実験により核内に移行することが確認された。(4)細胞外環境の酸性化に伴い本遺伝子の延髄における発現が有意に高まる。
光誘起希土類新触媒系の開発

本研究では、われわれが最近開発したサマリウム-光還元系、およびサマリウム複合還元系を利用することにより、ケイ素-塩素結合の高効率還元法を開発し、分子量分布が狭く高純度なポリシランの高効率合成法の確立を目指した。研究成果は以下のように要約できる。(1)ヨウ化サマリウム単独系や金属サマリウム単独系では還元が全く進行しないのに対して、両試薬の複合系では還元が生起し、対応するジシランが得られた。さらにこの反応系に金属マグネシウムを添加することにより、収率が向上した。(2)次にこの手法を同族のゲルミルクロリド、スズクロリドの還元に応用したところ、金属マグネシウム共存下ヨウ化サマリウムの触媒反応として効率良く進行することが明らかとなった。(3)モノクロロシランの高効率還元法をジクロロシランの還元に応用し、ポリシランの合成を行った。基質としてジクロロフェニルメチルシランを用い、照射する光の種類、試薬と基質のモル比、反応条件等を詳細に検討し、ポリシランの分子量分布との相関を詳しく調べた。得られたポリシランの紫外-可視スペクトルを測定し、ケイ素-ケイ素単結合に基づく極大吸収のシフト値を検討した。以上の結果から、SmI_2-Sm-Mg還元系により合成されたポリシランは均質な分子量分布を有し、かつケイ素-ケイ素単結合に基づく極大吸収が長波長シフトしていることから純度が高いことが明らかとなった。従来法によりポリシランを合成する際には、反応系に混入した酸素や水によりSi-O-Si結合が生成し、低品質のポリシランが生成する。これに対して、本サマリウム還元系では、反応系に混入した酸素や水は速やかにサマリウム還元種が優先して反応するため、ケイ素-酸素単結合の生成は完全に抑制され、良質なポリシランの合成が可能となった。
移植腎慢性拒絶反応の病態解明と新たな診断基準の確立

移植腎生検症例を収集し、臨床データの整理・分類および解析を行った。次に、全症例の移植腎生検標本を検鏡し、Banff分類に基づいて慢性拒絶の有無を組織診断した。次に、本研究の目的である新たな診断基準の作成を試みた。研究代表者は、移植腎の傍尿細管毛細血管(peritubular capillary,PTC)基底膜の肥厚に着目しており、その程度や分布を定量的に評価する方法の確立を試みた。最初に、0-3の4段階評価にてPTC基底膜肥厚を評価したところ、3,4の高スコアはBanff分類の慢性拒絶とよく相関することが明らかになった。しかし、複数の腎病理医に今回使用した症例を個別に評価してもらったところ、4段階評価は観察者間の乖離が大きく、再現性に問題があることが判明した。そこで、評価方法0-2の3段階評価に簡略化し、再度有用性、再現性について検討した。3段階評価法では、4段階評価で0,1だったものを0にまとめ、2を1、3を2とした。3段階評価法では、スコア2が慢性拒絶とよく相関する結果が得られた。スコア0,1では多少観察者間の乖離が生じるものの、スコア2は観察者間でほぼ完壁な一致が得られた。以上より、PTC基底膜肥厚は慢性拒絶と高い相関があること、基底膜肥厚は簡明な3段階評価法で鑑別することが可能であることが証明された。研究代表者は、移植腎の傍尿細管毛細血管(peritubular capillary, PTC)基底膜の肥厚に着目しており、その程度や分布を定量的に評価する方法の確立を試みた。そこで、評価方法を0-2の3段階評価に簡略化し、再度有用性、再現性について検討した。スコア0,1では多少観察者間の乖離が生じるものの、スコア2は観察者間でほぼ完璧な一致が得られた。
がん原物質によるDNA損傷、修復と誘発変異特異性のシャトルベクターによる解析

本年度各班員の研究成果の大要を次項に記す。(i)シャトルベクターによるTrpーP2誘発突然変異の詳細な解析から、TrpーP2の変異一がん原性はDNAのグアニン附加体(C8GーTrpーP2)の生成による変異生成が主要であること、その誘発機構としてSlippage misalignmentモデルを提示した(加藤、木村)。この仮説を更に検証するため、AAFおよびOHーTrpーP2誘発変異の解析を行った。(ii)真核細胞でのこれら新しい知見を、データーの蓄積の多い大腸菌で比較するためIQおよびTrpーP2の変異スペクトルの解析を進めている(大西、尾川)。(iii)突然変異誘発とはDNA修復欠損の関係を調べるため、XP、AT細胞株にシャトルベクターを導入した系を樹立した。それを用いて、発がん物質により誘発された突然変異の解析を進めている。(古山)。(iv)シャトルベクター系では、cDNA遺伝子を用しているがゲノム遺伝子での研究も重要である。遺伝子増巾法(PCR法)の応用によってゲノム遺伝子の解析も可能となってきた。ヒトのゲノムHPRT遺伝子の突然変異をPCR法で解析する方法をほぼ確立した(加藤,松永)。立花らによって、これまでにサザンブロット法で解析されたヒト、リンパ芽球のHPRT変異細胞のゲノムHPRT遺伝子をPCR法で詳細に解析する実験がスタートした(巽)。(v)マウス培養細胞の修復欠損株を用いて、IQによる突然変異誘発頻度を調べたが、これまで高い感受性を示す修復欠損株は見つかっていない(佐藤)。(古山)。
有機分子触媒による不斉4級、4置換炭素構築を鍵とする天然物の不斉全合成と反応開発

キラルなスピ口環含有化合物は天然物、医薬品に数多く存在し、中にはハリコンドリンBのような強力な抗腫療活性を有し、医薬品のシードとなるような化合物が存在する。そのため、多くの研究者によって、キラルなアセタール型スピロ環、ヘテロ環含有スピロ環、スピロエーテル環あるいは4級炭素含有スピロ環の構築法の開発が盛んに研究されてきた。しかしながら、これまで多くの方法論が開発されているにもかかわらず、基質に多くの制限が存在したり、エナンチオ選択性が中程度にとどまってしまうなどの問題点が存在しており、効率的で高いエナンチオ選択性を発現する触媒及び反応の開発はいまだ求められている。特に4級炭素を含有するスピロ環の構築法はヘテロ原子を有するスピロ環構築と比較し、4級炭素を作る原子の活性化自体が関難なことから難易度が高く、不斉反応への展開も方法論が制限される。近年、この課題に取り組むべく、多くの研究者が競って研究を行っているものの4級炭素あるいは4置換炭素を有するスピロ環を高エナンチオ選択的に構築する方法は、特定の触媒あるいは反応性の高い基質で検討が行われることが多く、いまだ発展途上である。当研究室では、有機分子触媒を用いる分子内Friedel-Crafts型1.4付加反応とオキシマイケル付加によって不斉4級炭素あるいは不斉4置換炭素の構築に成功した。さらにその方法論を利用し(-)-misramineと(-)-(R)-cordiachromeneの二つの天然物の全合成を達成した。キラルなスピロ環含有化合物は天然物、医薬品に数多く存在し、中には医薬品のシードとなるような化合物が存在する。そのため、多くの研究者によって、キラルなアセタール型スピロ環、ヘテロ環含有スピロ環、スピロエーテル環あるいは4級炭素含有スピロ環の構築法の開発が盛んに研究されている。しかしながら、これまで多くの方法論が開発されているにもかかわらず、4級炭素を含有するスピロ環の構築法はヘテロ原子を有するスピロ環構築と比較し、4級炭素を作る原子の活性化自体が困難なことから難易度が高く、不斉反応への展開も方法論が制限される。申請者はこれらの課題を解決すべく有機分子触媒を用いる高エナンチオ選択的な不斉4級および4置換炭素含有スピロ環構築法を見出した。今回、開発した有機触媒反応による3環性のキラルなスピロ環化合物の合成法を鍵反応として天然物あるいは強力な生物活性を有する化合物への合成に適応を行った。具体的には有機触媒を用いる不斉4級炭素含有スピロ環構築法を鍵とするプロアポルフィンアルカロイドmisramineのラセミ全合成を達成した。また、不斉4置換炭素含有スピロ環構築法を鍵とするクロマンあるいはクロマノン化合物の不斉全合成を検討し、(-)-(R)-コルジアクロメンの触媒的不斉全合成を達成出来た。特にプロアポルフィリンアルカロイド類はその興味深い生物活性、および特徴的な構造を有しているにも関わらず、光学活性体での合成の報告例は極めて少ないため、エナンチオマー間における生物活性評価や、構造活性相関研究およびケミカルバイオロジー研究へ展開する予定である。申請者は有機分子触媒を用いる高エナンチオ選択的な不斉4級および4置換炭素含有スピロ環構築法を見出し、それらを鍵反応として天然物あるいは強力な生物活性を有する化合物への合成に適応を行った。具体的には有機触媒を用いる不斉4級炭素含有スピロ環構築法を鍵とする、特異な構造をもつプロアポルフィンアルカロイドmisramineの全合成および、不斉4置換炭素含有スピロ環構築法を鍵とするクロマンあるいはクロマノン化合物の不斉全合成を検討した。その結果、全炭素不斉4級炭素構築を鍵とするmisramineのラセミ体での全合成に成功した。また、キラルな不斉4置換炭素含有スピロ環構築法を鍵とする(-)-(R)-コルジアクロメンの触媒的不斉全合成を達成することが出来た。その結果,昨年度プロアポルフィンアルカロイドmisramineのラセミ全合成を達成した。本年度は我々の開発した有機分子触媒によるエナンチオ選択的なスピロ環化反応を用いることによってmisramineの初の不斉全合成を達成した。また、(-)-(R)

-コルジアクロメンの触媒的不斉全合成のルート改善にも取り組んだ。申請者は有機分子触媒を用いる高エナンチオ選択的な不斉4級および4置換炭素含有スピロ環構築法を見出し、それらを鍵反応として天然物あるいは強力な生物活性を有する化合物への合成に適応を行った。具体的には有機触媒を用いる不斉4級炭素含有スピロ環構築法を鍵とする、特異な構造をもつプロアポルフィンアルカロイドmisramineの全合成および、不斉4置換炭素含有スピロ環構築法を鍵とするクロマンあるいはクロマノン化合物の不斉全合成を検討した。その結果、全炭素不斉4級炭素構築を鍵とするmisramineの初の不斉全合成に成功した。また、キラルな不斉4置換炭素含有スピロ環構築法を鍵とする(-)-(R)-コルジアクロメンの触媒的不斉全合成のルート改善を達成した。キラルなスピ口環含有化合物は天然物、医薬品に数多く存在し、中にはハリコンドリンBのような強力な抗腫療活性を有し、医薬品のシードとなるような化合物が存在する。そのため、多くの研究者によって、キラルなアセタール型スピロ環、ヘテロ環含有スピロ環、スピロエーテル環あるいは4級炭素含有スピロ環の構築法の開発が盛んに研究されてきた。しかしながら、これまで多くの方法論が開発されているにもかかわらず、基質に多くの制限が存在したり、エナンチオ選択性が中程度にとどまってしまうなどの問題点が存在しており、効率的で高いエナンチオ選択性を発現する触媒及び反応の開発はいまだ求められている。特に4級炭素を含有するスピロ環の構築法はヘテロ原子を有するスピロ環構築と比較し、4級炭素を作る原子の活性化自体が関難なことから難易度が高く、不斉反応への展開も方法論が制限される。近年、この課題に取り組むべく、多くの研究者が競って研究を行っているものの4級炭素あるいは4置換炭素を有するスピロ環を高エナンチオ選択的に構築する方法は、特定の触媒あるいは反応性の高い基質で検討が行われることが多く、いまだ発展途上である。当研究室では、有機分子触媒を用いる分子内Friedel-Crafts型1.4付加反応とオキシマイケル付加によって不斉4級炭素あるいは不斉4置換炭素の構築に成功した。さらにその方法論を利用し(-)-misramineと(-)-(R)-cordiachromeneの二つの天然物の全合成を達成した。次年度は合成計画に従い、misramineを当研究室で開発した不斉第4級炭素構築反応を用いることで不斉全合成へ展開する。これらはシンコナアルカロイド誘導体アミンを用いることで両エナンチオマーを作り分けることが可能であると考えている。また、misramineを合成した過程において出来る中間体より派生可能で、より複雑天然物であるプロポルフィリン-トリプタミンダイマー化合物の全合成を目指す。また、全炭素不斉四級炭素を触媒的に構築する新規方法論の開発にも着手する。次年度は合成計画に従い、misramineを合成した過程において出来る中間体より派生可能で、より複雑な天然物であるプロアポルフィリン-トリプタミンダイマー化合物の全合成を目指す。またmisramineを誘導化することで類似天然物であるmisrametineに変換可能であるため、それら化合物の合成も目指す。さらに、全炭素不斉四級炭素を触媒的に構築する新規方法論の開発にも着手する。
末梢性T細胞リンパ腫のゲノム異常解析と遺伝子発現解析による疾患単位の解明

末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)の中で、明確な疾患名に診断できない症例は末梢性T細胞リンパ腫・分類不能型(PTCL-U)として扱われる。PTCL-Uは未知の疾患が混在していると考えられるが、明確な報告はなかった。本研究ではPTCL-U51症例にアレイCGH法によるゲノム異常解析を行い、ゲノム異常様式・予後・病理像すべてに相関する二つの疾患群に分類できることをはじめて明らかにした。また二つのうち片方の疾患群は、別のPTCLである成人T細胞性白血病リンパ腫・リンパ腫型とよく似た均質な一群であることも明らかにした。末梢性T細胞リンパ腫は明確な疾患単位に分類し得ない症例は末梢性T細胞リンパ腫、分類不能型(PTCL-U)として扱われており,実際は複数の疾患が含まれていると考えられる。PTCL-Uは末梢性T細胞リンパ腫全体の半数近くを占めており,その再分類は重要なテーマである。これまで様々にその分類が検討されてきたが,いまだ明確な疾患グループを特徴付ける報告はない。またPTCL-Uに特徴的なゲノム異常も明らかにされていない。そこで本研究においてPTCL-Uのゲノム異常をアレイCGH法を用いて解析し,病理組織診断,臨床病態と相関させ,予後の異なるサブグループが抽出できるかを検討した。すでに施行済みであった20症例に加えて,本研究において新たに31例の末梢性T細胞リンパ腫、分類不能型(PTCL-U)症例に対してアレイCGHを行った。全51症例を解析した結果,ゲノム異常を見出せた症例26例と見出せなかった25症例に大きく分類できることを明らかにした。この二群において予後を比較するとゲノム異常を有する症例は有しない症例に比較して優位に予後不良であることが判明した。また,病理形態学的検討ではゲノム異常を有する症例は核異型を伴い,核の大きさは大小様々な所見を呈する症例が多いことも明らかにすることができた。一方,ゲノム異常を見出せなかった症例では,類上皮細胞浸潤や,好塩基球、形質細胞浸潤,血管細胞の増生などの腫瘍以外の細胞が増えていることも明らかにすることができた。PTCL-Uがゲノム異常のみならず,予後、病理像にも相関する二つのサブグループに分類できることをはじめて明らかにできた本研究結果は末梢性T細胞リンパ腫研究において非常に重要な知見である。末梢性T細胞リンパ腫の中で、明確な疾患単位に分類し得ない症例は末梢性T細胞リンパ腫・分類不能型(PTCL-U)として扱われており、実際は複数の疾患が含まれていると考えられる。PTCL-Uは末梢性T細胞リンパ腫全体の半数近くを占めており、その再分類は重要なテーマである。これまで様々にその分類が検討されてきたが、いまだ明確な疾患グループを特徴付ける報告はない。昨年度の本研究ではアレイCGH法を用いてPTCL-U51症例のゲノム異常を解析した。その結果、ゲノム異常様式のみならず、予後・病理像にも相関する二つのサブグループに分類できることをはじめて明らかにした。本年度はさらに発展させ、本研究で新しく見出したPTCL-Uサブグループと、他の末梢性T細胞リンパ腫病型の比較を行った。その結果、PTCL-Uの二つのサブグループの片方は、成人T細胞性白血病リンパ腫(ATLL)のリンパ腫型に非常によく似た病理像を呈することを見出した。このPTCL-UサブグループとATLLリンパ腫型はそのゲノム異常様式も非常によく似ており、PTCL-Uサブグループの高頻度ゲノム異常領域の約半分は、ATLLリンパ腫型でも同じく高頻度にゲノム異常が見られる領域であることを明らかにした。両群の予後曲線はほぼ重なっており、予後も非常に似ていることも明らかにした。これらの事実はこのPTCL-UサブグループがATLLリンパ腫型と似た臨床・分子病態をもち、且つ、比較的均質な症例で構成されていることを意味している。本年度の研究結果は末梢性T細胞リンパ腫研究において非常に重要な知見であり、論文報告した(Clinical Cancer Research 2009;15:30-38)。
細胞治療薬としての間葉系幹細胞の特性解析指標の探索とバリデーション

本研究では虚血条件下におけるヒト間葉系幹細胞(hMSC)のサイトカイン分泌プロファイリングおよび複数ロットのサイトカイン分泌能の差を検討し、虚血後のサイトカイン分泌能予測因子を明らかにした。虚血後におけるhMSCでは、血管内皮細胞成長因子(VEGF)の遺伝子発現に有意な上昇が見られた。虚血前の遺伝子発現量と虚血後のVEGF応答性から、17種類の遺伝子が見出された。このうちVSR6およびVSR7の2遺伝子は、RNAiによる阻害後に虚血後のVEGF分泌量および分泌変化率が双方とも抑制されることが明らかになり、これらの遺伝子は、hMSCの虚血組織保護効果予測因子として有用であることが示唆された。1.血管新生予測遺伝子候補のバリデーションとその生理的役割の検討本研究により、ヒト骨髄間葉系幹細胞(hBMSC)は虚血培養条件下で、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の遺伝子発現量およびタンパク質分泌量を増加させ、また、VEGFはhBMSCの心筋保護作用の主要な役割を担っていることを明らかにした。さらに、血管新生予測遺伝子候補の探索研究によりVEGF secretion-related candidate (VSR) 7を見出した。VSR7は、VEGF以外の低酸素誘導因子(HIF-1α)感受性遺伝子であるSERPINEおよびPDGFβに対しても、虚血応答性の相関がみられた。異なったロットにおける血管新生関連生理活性物質産生能との相関性を評価し、血管新生予測因子としての有用性を検討すると同時に、血管新生予測因子候補の発現をRNAiによりノックダウンし、血管新生関連生理活性物質産生への影響を評価し、両者の因果関係および血管新生作用における生理的役割を明らかにした。臨床で細胞治療を行なう際には拒絶反応を起こす可能性があり、投与した細胞が生着して機能するには免疫系に対する挙動について調べておくことが重要である。本研究では、ヒト間葉系幹細胞において、免疫抑制効果を簡便に評価することができる実験系を構築することを目的とし、本年度は、混合リンパ球反応にヒト間葉系幹細胞を添加して、その免疫抑制効果を評価する方法を確立することを試み、同時に、ヒト間葉系幹細胞の異なったロットについての検討を行なった。ヒト末梢血リンパ球濃度は1.0×105cells/wellよりも5.0×104cells/wellの方が混合リンパ球反応のコントラストがはっきりしていること、また、用いる細胞数も少なく済むことから5.0×104cells/wellの方がアッセイ系として優れていると考えられた。混合リンパ球反応の方法は、Two Way法よりもOne Way法の方が混合リンパ球反応のコントラストがはっきりしているので、アッセイ系として優れていた。今回の研究では、異なったロットのヒト間葉系幹細胞を用いて免疫抑制効果について調べたが、顕著な免疫抑制効果は観察されなかった。このことは、ヒト間葉系幹細胞は拒絶反応等に対しては、特に影響を与えないことを示唆していると考えられる。しかし、One Way法混合リンパ球反応では自己反応性が見られることがあり、ヒト間葉系幹細胞が有する細胞増殖作用と免疫抑制作用が相殺されて、見かけ上影響を与えていない可能性もあり、この点に関して今後詳細に検討する。また、他の免疫抑制剤を用いた場合の免疫抑制効果について検討することや他のロットのヒト間葉系幹細胞に関しても検討していきたいと考えている。平成23年度の研究計画に従って実施し、「間葉系幹細胞の心筋分化における血管新生関連マーカー探索」について下記の研究成果を得た。1.細胞培養条件:互いに異なるドナー由来のヒト間葉系幹細胞(hMSC)6ロット、継代数9のhMSCを虚血条件下(インキュベーター:N2:O2:CO2=94.0%:1.0%:5.0%,グルコースなし)で培養し、培養条件に関する検討を行なった。2.遺伝子発現量の変化に関する検討:定量性RT-PCRにより、数種の血管新生関連遺伝子の発現量を測定し、虚血条件における発現量の変化を検討した。すなわち、培養24hr後に回収した細胞からRNAを抽出し、ABI-PRISM7000(Applied Biosystems)を用いて、Ct(閾値サイクル)を算出し、発現量を比較した。3.血管新生関連生理活性物質分泌の変化に関する検討:定量性RT-PCRの結果、虚血により有意な発現の変化が認められた血管新生関連遺伝子について、その産物(血管新生関連生理活性物質)の細胞上清中の濃度をELISAにより測定し、虚血条件においての変化に関する検討を行なった。4.間葉系幹細胞の免疫制御作用(immunomodulatory effects)の検討:5-bromodeoxyuridine(BrdU)法によるリンパ球混合培養試験(mixed lymphocyte reaction: MLR)により、間葉系幹細胞のimmunomodulatory effectを検討するための条件検討等の予備的研究を行なった。血管新生予測遺伝子候補遺伝子候補