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造血幹細胞ならびに造血因子に関する臨床的研究

造血幹細胞と造血因子に関するin vitro及びin vitroの研究は臨床の場における血液疾患の病態の解析や診断、治療の面でその有用性が広く認められる様になっている。本研究は全国13施設の血液学の研究者が共同して研究を行い成果をあげることを目的として計画されたものである。各種のコロニー刺激因子(CSF)の中でG-CSFに関しては多くの研究成果が報告された。G-CSFの遺伝子を線維芽細胞に組み込ませ、G-CSFを産生する様になった細胞をマウスに移植すると顆粒球数が増加することが示され、G-CSFによる遺伝子治療の可能性が示唆された。同じくG-CSFに関する臨床的研究として、G-CSFが著効を示した慢性好中球減少症に関する報告や、骨髄異形成症候群の症例にG-CSFを投与した際の血液所見並びに染色体の変化に関する報告がなされた。GM-CSFに関してはその受容体の解析やその作用機構の中で単球-マクロファージの役割についての研究が行なわれた。また、G-CSFやGM-CSFのヒト白血病細胞に対する増殖促進効果が明らかとなった。エリスロポエチンは慢性腎不全に合併する腎性貧血の症例に有効で、さらに再生不良性貧血や骨髄異形成症候群などの難治性貧血にも有効であることが明らかとなった。一方、造血幹細胞と造血因子の関連についてはこれまで研究が比較的困難であった巨核球やBリンパ球の分化の研究が進められた。さらに、インターロイキンやヒスタミン、プロスタグランジン、コラゲナーゼインヒビターなどの血球分化における役割が報告された。また、マクロファージの分化に伴うTNF受容体の発現やエリスロポエチンの作用の分子機構に関する報告がなされた。各班員が従来行ってきた造血幹細胞および各種の造血因子に関する研究を更に発展させ、共同してその成果を臨床的な診断および治療の面に積局的に応用することを目的として以下の研究を行った。1.再生不良性貧血,赤芽球癆,発作性夜間血色素尿症における造血幹細胞および造血微小環境の変動の病態生理学的意義を明らかにする目的で、invitroのコロニー形成能と治療に対する反応性について検索し、必ずしも治療に対する反応を予知することはできないが、症例によっては病状の推移とコロニー形成能が平行することを見出した。2.造血因子については、エリスロポエチンの第一相試験を健常人を対象として行い、遺伝子工学によって作成したヒト型エリスロポエチンの安全性を確認した。また、エリスロポエチンの腎性貧血に対する初期第二相試験を開始した。3.G-CSFの実験小動物に対する顆粒球産生促進効果をin vivoで確認した。造血幹細胞および各種の造血因子に関する研究を発展させ,共同してその成果を臨床的な診断および治療の面に応用することを目的として以下の研究を行った.1.エリスロポエチンの腎性貧血に対する第II相試験を推進し,明らかな貧血改善効果を確認した.2.顆粒球コロニー刺激因子(GーCSF)の顆粒球産生促進効果をマウスを用いる動物実験において確認し,正常人を対象とする第I相試験を完了させた.3.造血幹細胞からのリンパ球分化は,ILー3存在下に支持された造血幹細胞が,マクロファージとILー2の存在下に大顆粒リンパ球に分化することを見出した.4.インターフェロンγと活性型ビタミンD_3が,骨髄異形成症候群の芽球を単球系に分化させる可能性があることを見出した.5.エレー3が巨核球コロニー刺激因子として作用し,エリスロポエチンにはILー3存在下で巨核球系前駆細胞の増殖を刺激する作用を持つことが示された.6.再生不良性貧血患者由来HTLVーI感染細胞株による巨核

芽球白血病細胞株増殖因子の産生が示された.造血幹細胞と造血因子に関する研究を推進し、共同してその成果を臨床診断や治療法の確立に応用することを目的として以下の共同研究を行なった。1.エリスロポエチンが再生不良性貧血や骨髄異形成症候群などの難治性貧血に有効であることが示された。2.顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)が慢性好中球減少症や骨髄異形成症候群、再生不良貧血などに有効で、顆粒球数の増加が見られた。骨髄異形成症候群については特に詳細な検討が行なわれ、G-CSFを投与した際の血液所見並びに染色体の変化について報告された。3.G-CSF遺伝子を線維芽細胞に組み込ませ、その細胞をマウスに移植すると顆粒球数が増加することが明らかとなり、G-CSFによる遺伝子治療の可能性が示された。4.GM-CSFの受容体の性質が調べられ、各種白血病細胞、特に急性非リンパ性白血病におけるGM^CSFの作用機構について検討がなされた。5.白血病に対するG-CSFの作用が詳細に検討され、ことに難治性再発性の急性非リンパ性白血病病例にG-CSFを化学療法剤と同時に投与すると有効であることが示され、白血病に対する新しい治療法の可能性が示唆された。
超音波フェーズトアレイ法を応用した接着欠陥検出

超音波を利用した画像処理は,非破壊検査法として多くの分野で使用され,診断や研究にも用いられている。本研究の目的は,超音波の性質を応用して象牙質とレジン充填物における欠陥を検出することである。そこで,接着界面付近に欠陥を付与あるいは付与することなく接着操作を行い,レジンペーストを填塞した後,超音波フェーズトアレイ法を用いて象牙質とレジン充填物間のイメージ画像を作成し評価した。その結果,非破壊検査である超音波フェーズトアレイ法による接着欠陥の検出は可能であることが示唆された。接着界面付近に生じた欠陥は,術後疼痛あるいはレジン修復歯の長期的な予後に影響を及ぼすものと考えられている。しかし,この欠陥を正確に検出する方法は無く,何らかの臨床的不快症状からその存在を予測しているのが現状である。そこで申請者は,超音波測定装置のうちフェーズトアレイ法に着目し,これを歯質との接合界面における非破壊的な欠陥評価法として,口腔内で応用するための基礎的事項について検討した。まず,接着界面付近の欠陥の検出に関しては,その界面付近の象牙質,ボンディング材ならびにレジンの弾性率が音響特性に影響を与えることに着目した。そのため,この音響特性を利用して超音波フェーズトアレイ法によって得られる画像処理技術からその検出を行うこととした。すなわち,ウシ下顎前歯唇側面に内径4mm,深さ2.5mmの規格窩洞を形成した。次いで,窩洞内面に歯面処理を行い,レジンペーストを填塞,光照射を行った。その際,接着界面付近に意図的に直径0.2mの欠陥を付与し,この試片に対してフェーズトアレイ探傷器(Omniscan^<MX>, RDTech)および探触子として周波数17MHzのプローブを用いてASスキャンモードによってイメージ画像を製作した。その結果,接着欠陥を有する試片では界面付近に約直径02mm程度の赤色の不感体の存在を示すイメージ画像が得られた。このことは,接着システムにおいて音響インピーダンスの異なる物質が介在すると視覚的に色調の異なるイメージ像が得られるものの,連続性が保たれている際には,不感体は認められないことから,接着欠陥を示すものと考えられた。従って,本法による接着欠陥のイメージ画像化は有効であることが示唆された。接着界面付近の欠陥に関しては,界面付近の象牙質,ボンディング材ならびにレジンの機械的特性の一つである弾性率が音響特性に影響を与えるとされている。そこで申請者は,超音波測定装置のうちフェーズトアレイ法に着目し,接合界面における音響特性の違いをフェーズトアレイ法の画像処理技術から解析し,その検出を行う。このことによって接着界面付近に生じた欠陥を非破壊的に評価し,口腔内で応用するための基礎的事項について検討することを目的とした。1年目に得られた結果から,接着欠陥を有する試片では界面付近に約直径0.2mm程度の赤色の不感体の存在を示すイメージ画像が得られた。このことは,接着システムにおいて音響インピーダンスの異なる物質が介在すると視覚的に色調の異なるイメージ像が得られるものの,連続性が保たれている際には,不感体は認められなかった。このことから,音響特性を利用した超音波フェーズトアレイ法によるイメージ画像は,接着欠陥の検出に有用であることが判明した。そこで,本年度は接着欠陥の検出およびその寸法を測定し接着欠陥検出の基礎的資料の収集を行った。すなわち,接着界面付近に糸状フロロカーボンを設置し意図的に接着欠陥を製作し,超音波フェーズトアレイ法を用いて接着欠陥のイメージ画像を作成し,接着欠陥の大きさを測定した。その結果,イメージ画像から得られた接着欠陥の計測値は,実際の糸状フロロカーボンの実測値と統計学的に有意差は認められなかった。このことから,接着欠陥の検出に際して,超音波フェーズトアレイ法の応用は臨床的に可能であることが示唆された。
ヒト口腔扁平上皮癌細胞を標的としたオートファジー誘導療法の開発に関する基礎研究

ビタミンK_2、イミダゾール誘導体のヒト口腔扁平上皮癌細胞に対する腫瘍選択性は低く、ベンズアルデヒド、テトライソキノリン類、新規環状α、β不飽和ケトン類は高い腫瘍選択性を示した。これらの化合物はミトコンドリアの傷害を伴うオートファジーを誘導したが、オートファジー阻害剤は、細胞死をほとんど阻害しなかった。細胞傷害活性と脂溶性、あるいは、表面積、体積、幅などの分子サイズを表す記述子との間には高い相関が得られた。我々は、多くの環状α、β-不飽和ケトン類は、アポトーシスを誘導しないことを報告してきた。ビタミンK_2誘導体は、ナフトキノン骨格の2位の炭素に種々の大きさのイソプレニル基が、3位の炭素にメチル基が結合したものである。今回、様々なサイズのイソプレニル単位(n=1-14)が結合したビタミンK_2誘導体のヒト口腔扁平上皮癌細胞(HSC-2、HSC-3、HSC-4)、ヒト肝癌細胞(HepG2)、ヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60)、およびヒト正常口腔細胞(歯肉線維芽細胞、歯髄細胞、歯根膜線維芽細胞)に対する細胞傷害活性、および誘導される細胞死のタイプを検討した。14種類のビタミンK_2誘導体の中では、n=2のMK-2、n=3のMK-3が最大の細胞傷害活性を示した。n≧4では、CONFLEX/PM3で求めた最安定化構造が折れ曲がるため(Ishihara and Sakagami,Anticancer Res 47:4039-4064、2007)、細胞傷害活性が著しく低下した。側鎖部分のプレニルアルコールにおいては、n=4のgeranylgeraniol(GGO)が最大の細胞傷害活性を示した。腫瘍選択係数は、MK-2、GGOいずれも2.0程度であった。GGOはHL-60細胞にアポトーシスを誘導したが、環状α、β-不飽和ケトン構造を有するMK-2は、ほとんど誘導しなかった。オートファジーマーカーである酸性オルガネラの形成も誘導されなかったので、オートファジーの誘導の可能性も低かった(Sakagami et al.,Anticancer Res 28:151-158、2008)。MK-2で誘導される細胞死のタイプは現在までのところ未定であり、更なる検討が必要である。38種類のtetrahydroisoquinoline誘導体の細胞傷害活性、腫瘍選択性、誘導される細胞死を、ヒト口腔扁平上皮癌細胞を用いて検討した。3,4-Dimethoxybenzoyl基の様なかさ高い置換基をを有する6,7-dimethoxy-3,4-dihydroisoquinolin-2 (1H)-yl)(3,4-dimethoxyphenyl)methanone (TQ9)が最大の腫瘍選択性を示した(腫瘍選択係数12.5)。TQ9は、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60には、ヌクレオソーム単位のDNAの断片化とカスパーゼ-3の活性化を誘導したが、ヒト口腔扁平上皮癌細胞(HSC-2, HSC-4)には、DNAの断片化やカスパーゼ-3の活性化を誘導せず、酸性オルガネラの形成を促進したことから、オートファジーが誘導された可能性が示唆された。半経験的分子軌道法を適用して、細胞傷害活性と分子量、あるいはCONFLEX/PM5法で計算された16種類の化学的記述子との相関を求めた。同様に、表面積、体積は、4-trifluoromethylimidazoleおよびdihydroimidazole誘導体の細胞傷害活性を予測するのに有用であることが判明した。タンニン関連化合物をヒト血清アルブミンとインキュベーションすることにより、斎場正常細胞に対する細胞傷害活性が低下することが判明した。
病理学の強化と病的材料の有効利用のための共同研究

今回の総合(B)班は、「病理学の強化と病的材料の有効利用についての共同研究」をテ-マとし、病理解剖や生検業務の圧迫のために現代化の進んでいない病理学に分子科学を導入することなどで病理学を強化活性化することを目的とした。さらに、その1つの方向として、病理学分野に無尽蔵に集まる病理材料の遺伝子研究への活用を共同の目的とした。現在、病理材料での遺伝子研究には、(1)病理標本内での蛋白質などをモノクロ-ン抗体で証明する、(2)mRNAを解析して遺伝子発現を組織の中で研究する、(3)DNA、RNA、蛋白質を新鮮標本から抽出して解析するなどの方法があった。これに対して最近では、(4)固定した病理標本の中から遺伝子DNAを抽出し、さらに、PCR等の方法で数万倍に増幅して遺伝子解析に使用する方法が確立されたこのことにより、新鮮な病理組織のみならず、長期保存された病理標本を遺伝子研究に使用することが可能になった。さらに、(5)固定標本から蛋白質を抽出してモノクロ-ン抗体を作成することにも成功した。このように病理標本の活用には多くの新しい可能性が開け、種々の角度からの基礎的研究が必要になっている。本研究班の目的は、これらの目的で平成3年度申請の重点領域研究申請の準備の協議をもつことであった。この線にそって、平成元年12月15日に東京都市センタ-における班会議(出席者、班員15名)で重点領域研究の申請に向けて研究課題名、研究代表者、研究分担社、研究組織、感じ、総括班組織、予算申請学などについて協議した。そして、申請研究課題については、「病理材料の活用」と「遺伝子研究」を軸にすること、代表者にはこれまでの経緯から、杉山が組織を構成することになった。そして、「病理材料を用いる遺伝子研究ー基礎と応用」の申請を提出した。
古墳出現前後における土器の比較検討を通じた日本と朝鮮半島の相互交流

本年度は2回(計10日)の韓国での資料調査と、8回(計16日)の国内資料調査を行った。韓国での資料調査では日本に搬入例の多い全羅道に重点を置いた。この結果、甑や鍋などでも全羅道と慶尚道の違いを把握することができ、今後日本の出土例にも適用できる見通しができた。また、京畿道の遺跡で出土している楽浪系土器についても実見する機会を得た。ロクロを用いている点は楽浪土城のものと共通するが、格子タタキが採用されているなど、異なる点も多い。今後、日本で出土している楽浪系土器についても楽浪郡以外の土器か否かは注意しなければならない。国内調査では壱岐・福岡市・香川県・愛媛県・島根県・神戸市の資料を調査した。特に、これまでも注意していた模倣・折衷土器の情報収集に力を入れ、在来土器に朝鮮半島的要素である格子タタキや耳が加わった土器などを重点的に調査した。その結果、島根県出雲市の中野清水遺跡で全羅・忠清道タイプの両耳付短頸壺を模倣した土器が明らかになり、この種の壺の模倣・折衷例が北部九州に限らないことが明らかになった。なお、日本出土の両耳付短頸壺については6世紀までのものも含めて朝鮮半島からの搬入例や日本での模倣・折衷例について集成し、検討を加えた。さらに、国内での資料調査や報告書による情報収集によって、古墳出現前後の朝鮮半島系土器についてのデータベースを作成した。この作業を通じて、全体的には全羅・忠清道系の土器が多いものの、対馬・壱岐には慶尚道の土器も比較的多いことがはっきりした。また、全羅・忠清道系の土器は日本で楽浪土器が減少し始める古墳時代初頭以降に増加することも明らかになった。今後これらのデータについて研究発表を通じて公表し、学界に寄与したいと考える。なお、本課題研究の成果の一部は、大阪府立弥生文化博物館の平成16年秋季特別展『大和王権と渡来人三・四世紀の倭人社会』に展示協力することによって、還元することができた。本年度は6回(計19日間)の国内資料調査と2回(計13日間)の韓国での資料調査を行うとともに、韓国の三韓三国時代の遺跡のカード化を進めた。資料調査で重点を置いたのは、日本国内で出土した古墳出現前後の朝鮮半島系土器についての検討で、次の2点の新たな知見を得ることができた。まず1点目は、日本出土の朝鮮半島系土器は全羅道や忠清道など朝鮮半島南西部に系譜が求められるものが多く、日本から距離的に近い慶尚道(朝鮮半島南東部)のものが少ないことが明らかになった。古墳時代中期においても日本と朝鮮半島との交流には、半島南西部の影響が色濃く見えるため、古墳出現前後に半島南西部の土器が多いということはその先駆けと言えるであろう。2点目は、朝鮮半島の土器の特徴の一部を取り入れた日本在来の土器について検討を加え、その中で格子タタキが施された日本在来の器形をもつ土器について興味深い傾向を把握できたことである。このような土器は、西は壱岐島から東は金沢市までの8遺跡11点が出土しており、広く浅く分布していたことが分かる。特徴的なのは、通常タタキメを残さないような器種でも、格子タタキが施されたものはタタキメを消さずに残しているものが多いということであった。例えば、布留式甕や北部九州在来の壺は通常ハケメ調整でタタキメを残さないが、格子タタキが施されているものは胴部全面に残っていた。タタキメを残すのはある意味朝鮮半島の特徴であり、単にタタキ板を平行タタキのものから格子タタキに置き換えたというだけではなく、製作工程も朝鮮半島のものを採用している可能性がある。以上の新たな知見については、来年度(平成15年度)に韓国で資料調査を重点的に行い、当地の土器を日本出土のものと比較しながら検討することによって、さらに深めていきたいと考えている。本年度は7回(計15日間)の国内資料調査と2回(計14日)の韓国での資料調査を行った。もっとも力をいれたのは折衷土器の研究である。特に古墳出現前後には格子タタキが施された在来土器が西は壱岐島から東は金沢までの各地で発見されており、その数は13遺跡に及ぶ。昨年度の概要で指摘したように、布留甕など通常タタキメを残さない器種にも格子タタキメが残されており、単に平行タタキが置き換わっただけではないと思われる。また、口縁端部や突帯の上面に格子タタキを施す例も存在するが、北部九州で平行タタキを用いて同様の調整を行っている例がわずかながらあることから、その関連性を検討する必要がある。一方、慶尚南道南部の折衷土器、特に布留甕の器形を採用した格子タタキの土器について重点的に調査を行った。朝鮮半島では酸化焔焼成の土器で格子タタキや縄蓆文タタキを施した土器には、ハケ調整が施されることがほとんどない。しかし、朝鮮半島の布留甕の器形を採用した土器には一部でハケ調整が見られた。また、釜山市の東莱莱洞遺跡では慶尚南道在来の長胴甕あるにもかかわらず、格子タタキの後、ハケが施されている土器が存在することが明らかになった。両地域の土器に見られる交流は一方向でなく、相互交流的であるのがわかる。

以上のような研究内容の一部は『第15回東アジア古代史・考古学研究会』(於東京)にて発表した。また、今年度では対馬でも資料調査を実施した。昨年度の研究成果において、日本列島で出土する朝鮮半島系土器は、全羅道や忠清道といった朝鮮半島南西部に系譜が求められるものが多いことが明らかになったが、対馬では距離的に近い慶尚南道の土器が多いことを確認することができた。ただ、楽浪土器が極めて多く、朝鮮半島南西部の土器も存在するのは、対馬を経由して朝鮮半島の文物が北部九州などに渡来したことを示しているのであろう。本年度は2回(計10日)の韓国での資料調査と、8回(計16日)の国内資料調査を行った。韓国での資料調査では日本に搬入例の多い全羅道に重点を置いた。この結果、甑や鍋などでも全羅道と慶尚道の違いを把握することができ、今後日本の出土例にも適用できる見通しができた。また、京畿道の遺跡で出土している楽浪系土器についても実見する機会を得た。ロクロを用いている点は楽浪土城のものと共通するが、格子タタキが採用されているなど、異なる点も多い。今後、日本で出土している楽浪系土器についても楽浪郡以外の土器か否かは注意しなければならない。国内調査では壱岐・福岡市・香川県・愛媛県・島根県・神戸市の資料を調査した。特に、これまでも注意していた模倣・折衷土器の情報収集に力を入れ、在来土器に朝鮮半島的要素である格子タタキや耳が加わった土器などを重点的に調査した。その結果、島根県出雲市の中野清水遺跡で全羅・忠清道タイプの両耳付短頸壺を模倣した土器が明らかになり、この種の壺の模倣・折衷例が北部九州に限らないことが明らかになった。なお、日本出土の両耳付短頸壺については6世紀までのものも含めて朝鮮半島からの搬入例や日本での模倣・折衷例について集成し、検討を加えた。さらに、国内での資料調査や報告書による情報収集によって、古墳出現前後の朝鮮半島系土器についてのデータベースを作成した。この作業を通じて、全体的には全羅・忠清道系の土器が多いものの、対馬・壱岐には慶尚道の土器も比較的多いことがはっきりした。また、全羅・忠清道系の土器は日本で楽浪土器が減少し始める古墳時代初頭以降に増加することも明らかになった。今後これらのデータについて研究発表を通じて公表し、学界に寄与したいと考える。なお、本課題研究の成果の一部は、大阪府立弥生文化博物館の平成16年秋季特別展『大和王権と渡来人三・四世紀の倭人社会』に展示協力することによって、還元することができた。
米国から日本への原子力技術導入に関する歴史研究

本年度は,昨年度に引き続き,冷戦期の1950-60年代において,日本の科学研究及び科学者について米国政府がどのように評価していたのかを解明するために,米国国立公文書館の所蔵する文書史料の調査を行ってきた.特に,米軍諸機関が行っていた学術的な基礎研究の振興活動について,その目的と実態を明らかにすることに取り組んできた.その結果,米軍は当時のソ連の技術力に対抗するために科学研究全体の振興が必須だとみなし,米国だけでなく日本を含む同盟国全体の科学研究の水準を向上させることを目指していたことと,その一環として,日本の大学など研究機関にする研究資金の提供が行われていたことついて,その実態の一部を明らかにすることができた.これらの成果の一部を,2018年5月27日に東京理科大学で開催された日本科学史学会年会等で発表した.本研究は,日本への原子力技術導入の歴史について,冷戦期における日米間の外交関係の歴史の中に位置づけることを主要な目的とするものである.しかし本研究を進める中で,原子力技術の導入の背景には,科学研究活動全体の振興そのものを目的とする米国の外交政策があったことが明らかになってきた.1961年に設立された日米科学協力委員会は,そのような目的を持った政策の一部であった.また,1960年代末に「米軍資金問題」として日本で大きな社会問題となった,米軍諸機関が実施していた日本の大学などに対する研究資金の支援活動についても,米国の冷戦政策の一環であったことを明らかにすることができた.そして,そのような米国の目的にとって課題だったのが,日本国内で活発に行われていた米国に批判的な科学者運動対策であったことも合わせて明らかにすることができた.以上のように,本研究は,米国から日本への原子力技術の導入の背景にあった,科学に関する米国の外交政策についてその一部を明らかすることができた.本年度は,日本学術会議の所蔵する史料の調査を行った.同時に,特に重要な科学者について公刊された資料を中心に分析を行ってきた.日本学術会議は,1949年に設立されて以来,様々な声名・提言を行ってきたが,特に原子力の利用については,1954年4月に出された原子力の利用を平和利用に限り自主・民主・公開の原則を要求する声名に示されるように,原子力の平和利用を強く求めてきた.原子力の安全性についても強い問題意識を持ってきており,日本に最初に導入された商業用原子炉であるコールダーホール型と呼ばれた黒鉛減速・ガス冷却型の原子炉についても,その安全性について調査と提言をってきた.本研究では,コールダーホール型原子炉に関する公開の議論の文書史料を収集し,その分析をおこなってきた.また,本研究では,1960年代半ばにおいてなされた,アメリカの原子力潜水艦の日本への寄港をめぐる議論(原潜寄港問題)についても調査してきた.原潜寄港問題では日本学術会議を含め,多くの科学者たちが論争に加わった.本研究では,原潜寄港問題に関する文書史料を収集し,その分析を行ってきた.これらの研究の成果については,2014年9月に東京工業大学で開催された西脇安展において,会場の展示物や配布用のパンフレットなどで,その一部を発表した.放射線生物学者である西脇安は,1954年3月のアメリカの水爆実験による被害について,いち早く世界に伝えたことで1955年に発表された核兵器の廃絶を求めるラッセル・アインシュタイン宣言の端緒となった科学者であるが,コールダーホール型原子炉の導入と原潜寄港問題の双方においても積極的に発言してきた.西脇安とコールダーホール型原子炉や原潜寄港問題について,本研究の一部を発表することができた.本年度は,昨年度に引き続き,米国から日本への原子力技術導入と,当時の科学者たちが行った社会的運動との関わりを中心に,文献や各種史資料の調査を行ってきた.本年度では,1960年代半ばにおいてなされた,アメリカの原子力潜水艦の日本への寄港をめぐる議論(原潜寄港問題)を中心に調査を行った.原子力潜水艦の日本への寄港は,都市部へ原子炉を設置することと同じであるとして,日本学術会議を含め多くの科学者たちがその安全性について問題を提起し,多くの国民・市民を巻き込んだ大きな社会問題となった.本年度の前半では,日本に存在する原潜寄港問題に関する文書史料を収集し,日本の科学者たちの発言や行動を中心にその分析を行ってきた.その研究成果を,2015年5月31日に大阪市立大学で開催された日本科学史学会年会で発表した.また,この科学史学会年会では,2014年9月に東京工業大学で開催された「西脇安展」のために準備した研究成果の一部が発表された.2015年7月21日に,東工大で開催された科学史技術史の研究者で運営される研究会である「火曜日ゼミ」で,その研究成果を発表し,研究者たちから今後の研究課題や研究の展望について多くの助言を受けた.本年度の後半では,原潜寄港問題や,日本への原子力技術の導入について,アメリカ側がどのように見ていたのかを調べることを目標とし,そのための文献資料の調査と,米国メリーランド州の国立公文書館の所蔵する文書史料の調査を行った.

本研究は公文書資料の調査を行うためまとまった時間を必要とするが,大学教員(非常勤)としての教育業務に時間がとられるため,研究に十分な時間を割くことができなかった.本年度は,昨年度に引き続き,米国から日本への原子力技術導入と,当時の科学者たちが行った政治的・社会的運動との関わりを中心に,文献や各種史資料の調査を行ってきた.本年度の本研究は,1950年代から1960年代を中心に日本の科学者たちが展開した様々な政治的・社会的活動について,米国政府がどのように理解していたのかを調査してきた.その結果,当時から噂されていた,一部の日本人科学者と米政府関係者との非公式な接触について,そのことを示す証拠文書をいくつか発見することができた.具体的には,米原子力潜水艦が日本に寄港する問題において,原潜の原子炉の安全性をめぐる議論の中で,その安全性を主張していた日本人科学者の一人が,米大使館の科学者と接触して情報をやりとりしているという噂が当時からあったが,その正式な記録の一部を発見することができた.その他にも,米国政府が当時の日本人科学者たちの政治的・社会的活動について,きわめて注意深く対応していたことを示す文書もいくつか発見することができた.具体的には,米国政府機関からの科学の共同研究や研究資金援助の目的の中に,米国の外交政策に批判的だった科学者たちを敵視し,彼らの活動を「穏健化」させることがあったことを示唆する文書である.これらのことは,今まで一部の噂にすぎなかったことが米国の対日外交政策の一端であったことを,公文書史料によって裏付けられたこととなり,実証的歴史研究の一つの成果といえる.これらの調査成果の一部を,2016年5月29日に東京の工学院大学で開催された日本科学史学会で発表し,幾人かの研究者たちから助言をいただくことができた.本研究は,米公文書館での調査を行うことが中心的な研究活動であり,まとまった長期の調査時間を必要とする.普段,非常勤講師で生計をたてており,まとまった休みのとれる春と夏しか調査活動に時間を取ることができないため,研究に十分な時間をとることができないことが,遅れの大きな原因である.とはいえ,本年度は夏と春の2回,渡米して調査を行うことができた.調査では,調査すべき文書群が広範囲に渡って分散されて保存されていることがわかり,想像していたよりも時間がかかったことも遅れの理由である.また,本研究は日本と米国の外交関係に関わるため,調査目的が異なる他の研究者と調査したい文書群(箱の中に複数のフォルダに分かれて文書が保存されており,調査目的のフォルダを調査するためには箱全体を注文する)が重なることが多く,限られた調査期間を効率的に使用することが十分にできなかったことも,遅れの理由の一つである.本年度は,昨年度に引き続き,1950-60年代の科学者たちについて米国政府がどのように理解していたのかを解明するために,主として米国国立公文書館の所蔵する文書史料の調査を行ってきた.これまでに,科学研究活動全体が米外交政策の重要な手段の一つとしての役割を果たしていたことを,かなり具体的に明かにすることができた.昨年度までに原子力技術の日本への導入に関する米外交政策を中心に調査を進めてきたが,米の外交政策は科学全体に及んでおり,原子力技術の日本への導入はその一部にすぎず,科学に関する米外交政策全体の中で,原子力技術がどのような位置づけられていたのかを明らかにする必要があることが明らかになってきた.第二次世界大戦の終結から1950年までに,米国務省は外交政策における科学の重要性を自覚するようになり,科学に関する外交政策を体系的にまとめた報告書を作成し,その報告書の勧告に従って,国務長官の下に科学局を新設し,主要国に科学者を科学アタッシェとして派遣するようになった.日本への原子力技術の導入はこの枠組みの中で行われたものであった.
個体の大きさに関与するGタンパク共役型受容体のリガンド探索とその作用

Gタンパク共役型受容体Rigp2-/-マウスは統計的に体が小さいことが判明した。ヘテロマウスの掛け合わせから生まれてくるRigp2-/-マウスの数はRigp2+/-や+/+マウスよりも少ないため、胎児期においても生存に不利な何らかの欠陥があることがわかった。また、このタンパク質の一つのアスパラギン残基のみがN型糖鎖で修飾されることがわかった。当初の目標であるリガンドの同定には至らなかった。今年度はオーファン受容体Rigp2およびRigp3について以下のような研究を行った。(1)CHO-K1細胞を用いたリガンドのスクリーニング。Rigp2およびRigp3を永久発現するcHO-K1細胞を用いて、まず様々な糖やアミノ酸による細胞内cAMPの増加を調べたところ、全くcAMPの増加はみられなかった。続いて、細胞内カルシウムの増加をカルシウムイメージングによって調べたが、同様に全く増加は見られなかった。さらに、ウシ血清が細胞内カルシウムの増加を促進するかどうかを調べたが、バックグラウンドの蛍光が強く正しく解析ができなかった。今後、解析法の改良が必要だと思われる。(2)Rigp2/3のノックアウトマウス。2系統のマウスについてC57BL/6にバッククロスを十分に行い、ホモ接合体を得た。Rigp2については、バッククロスを行う前にはホモ接合体が野生型に比べてかなり小さかったが、バッククロス後は差があまり顕著ではなくなってきた。このことについてはノックアウトマウスの供与先と綿密に連絡を取り合って真相を究明していきたい。Rigp2のヘテロ接合体どうしを掛け合わせると、明らかにRigp2-/-の子供の数がメンデルの法則から予測される野生型やヘテロ接合体の子供の数よりも少なかった。このことは、Rigp2が生存に何らかの影響を与えていることを示唆する。Rigp3についてはメンデルの法則に従って子孫が得られた。このマウスについて血中インスリンの濃度を測定したところ、野生型よりも有意に低かった。Rigp3は膵臓に多く発現しているため、インスリン分泌に何らかの役割をしているのかもしれない。Gタンパク質共役型受容体Rigp(仮名)はリガンドが知られていないオーファン受容体の一つである。Rigpを欠損したショウジョウバエは体が一回り小さく、糖尿病様の病体を示すという予備的な結果が得られている。マウスでははRigp1Rigp4の4つからなるファミリーを形成しており、そのうちRigpと最も相同性のあるものがRigp2である。平林らは既にRigp2とRigp3の欠損マウスの構築に成功しており、Rigp2-/-マウスは野生型よりも統計的に有意に個体が小さいことが判明した。本研究ではRigpのリガンドの同定とRigp欠損マウスの解析を2つの大きな目的として研究を行った。1) Rigpリガンドの探索ここ2年間リガンド探索に取り組んできたが、発見には至らなかった。動物細胞を用いたレポーターアッセイでは感度はいいが、非特異的なシグナルをとらえてしまうことがあるのが原因の一つかもしれない。また、リガンドのソースを生体内からの調製物であるのも発見を難しくしている可能性もある。2) Rigp遺伝子ヘテロ接合体マウスのバッククロス及びホモ接合体の予備的解析理化学研究所脳科学研究センター平林義雄博士より平成19年度に2系統(Rigp2,3)のヘテロ接合体を受理し、バッククロスも完了し、ノックアウトマウスが得られるようになった。統計的解析によりRigp2ノックアウトマウスは有意に体重が軽いことがわかった。1) Rigpリガンドの探索リガンド探索は困難を極めた。いくかのアミノ酸が候補に上がったが、詳細に調べてみるとリガンド活性はなかった。これは、カルシウムイメージングによるアッセイ系が安定せず、かなり熟練を要することも一つのファクターであると思われる。2) Rigp遺伝子ヘテロ接合体マウスのバッククロス及びホモ接合体32Rigp2ノックアウトマウスは有意に体重が軽いことがわかった。このことから、野生型マウスとRigp2ノックアウトマウスにおいて、何らかの遺伝子の発現が変化しているのでは無いかと考え、DNAマイクロアレイによる解析を試みることにした。しかし、バッククロスが進んだヘテロ接合体ではノックアウトマウスがほとんど生まれず、RNAを調製するに至らなかった。逆に考えると、この遺伝子はマウスの発生段階において重要な働きをしているため、メンデルの法則に従わない可能性が示唆される。今後、研究を続けるとすれば、マウスの発生のどの段階に必要であるかを調べる必要があると考えられる。
有機界面の構造と電子構造:理想界面と実デバイスを貫く新しい学理の実験的探求

近年、新しい光-電子デバイスとして注目されている諸種の有機半導体デバイスの基礎研究を行った。特に、有機デバイスに内在し、デバイスの性能を決定する上で重要な役割を果すと考えられている有機界面の理解は、当該分野において重要な課題である。そこで、本研究では、有機界面の構造と電子構造を、総合的、かつ精緻に解明した。有機デバイスに内在する諸種の有機界面の構造と電子構造を、さまざまな表面科学的手法を駆使する事により、総合的、かつ精緻に解明する。単結晶表面上に吸着した高配向有機薄膜のような良く規定された「理想界面」から、実デバイスに即した様々な有機界面までを取り扱い、基礎から応用まで一貫した有機界面の理解を目指す。具体的には、以下の5つの主題について取り組む。(1)高秩序試料を用いた界面電子構造の精密解明:角度分解光電子分光(ARUPS)と有機試料用逆光電子分光(IPES)を併せ、高配向有機薄膜などの高秩序試料を有機デバイスに内在する有機/電極界面のモデル系として捉え、その占有、非占有電子構造の精密解明を行う。(2)実デバイス関連界面に対する気体効果の検証:界面電子構造などの基礎研究による成果を実デバイス特性の理解に活かすため、デバイスの駆動環境における気体が有機界面の構造や電子構造へどのように影響するかを解明する。(3)ドーピングや界面修飾による界面の構造・電子構造制御:有機半導体薄膜に対する優れたドーパントや界面修飾分子を探索・開発し、電気特性の測定と併せて優れた界面制御法の創成を目指す。(4)新しい界面への展開:これまで研究分野の主流であった有機/金属界面、有機/有機界面に加え、本研究では有機/無機物質界面や、重要性に比して研究が十分でない導電性高分子界面を研究する。これらは学術的に興味深く、新しい界面制御の方法や機能の創成につながると期待される。(5)有機界面に適した新手法の開発と新情報:任意雰囲気中で測定可能である光電子収量法(PYS)、非占有電子構造の情報が直接得られるIPESなどの新手法を積極的に活用して界面に関する新たな情報を得る。一方で、手法自体のさらなる高度化も目指す。また、顕微的手法も用い、有機膜の成長モードのその場観察、蒸着膜での電子構造の場所による不均一性などの情報を得る。1.高秩序試料を用いた界面電子構造の精密解明:p型有機半導体ペンタセンの超薄膜をCu(110)基板上に作製し、その特異な界面電子構造の詳細を明らかにした。また、n型材料フッ素化フタロシアニンの超薄膜を無機半導体GeS単結晶表面に作製し、界面電子構造の詳細を明らかにした。これらの成果は、有機分子と金属表面電子との相互作用の詳細に迫るものであり、有機デバイスの重要課題である有機薄膜/電極界面での電子準位接続に関する重要な知見を与える。2.実デバイス関連界面の解明と制御:より実デバイスに密着した有機/金属電極界面のモデル系として、有機/金属多結晶基板界面での電子構造、電子準位接続を解明した。具体的には、(1)有機電界発光素子の正孔注入層として知られる銅フタロシアニン薄膜や、n型材料ペリレンテトラカルボン酸無水物(PTCDA)と各種金属基板の間の電荷注入障壁を系統的に調べ、金属の仕事関数と障壁の関連性を解明した。(2)有機太陽電池で高い素子性能を与えるフラーレン誘導体PCBMの電子構造を始めて解明し、有機太陽電池で陰極材料として使用されるAg電極との界面の電子構造を明らかにした。これらの成果は、実デバイスの動作原理の理解に直接的な情報を与える。3.有機/無機半導体界面への展開:諸種の不飽和分子の水素終端シリコン表面への反応を検討し、次年度に予定している軟X線吸収や紫外光電子分光による評価の準備を行った。4.有機界面に適した新手法の開発と新情報:有機物の非占有電子構造を直接調べられる逆光電子分光装置を開発し、これまで有機物の測定で問題だった電子線照射損傷を劇的に低減できる装置の製作に成功した。また、大気から超高真空に至る様々な雰囲気下で、有機薄膜のイオンエネルギー等の電子構造を観測可能な光電子収量分光装置を開発し、チタニルフタロシアニン薄膜への各種気体の効果を詳細に調べた。1.有機デバイスにおける有機/金属電極界面のモデル系として、代表的な有機電界発光素子材料として知られる銅フタロシアニン(CuPc)薄膜、ペリレンテトラカルボン酸無水物(PTCDA)と各種金属基板との間に形成される電荷注入障壁を系統的に調べ、金属の仕事関数と電荷注入障壁の関連性を解明した。(E.Kawabe et al., Org. Electron., 9(5), 783(2008))また、有機太陽電池材料として知られているPCBMと、その薄膜の電子構造を初めて解明した。また、有機太陽電池の陰極材料として使用されているAg電極とPCBM薄膜の界面電子構造を調べ、AgとPCBM分子との相互作用によって、特異な界面準位が形成される事を解明した。

(Appl. Phys. Lett., 94 043309(2009)(Virtual Journal of Nanoscale Science&Technologyに選出・転載))これらの成果は、デバイスの動作原理の理解に知見を与えるものであると同時に、構造有機の見地からの新規電子機能性有機物質設計にとっても重要な知見となる。2.有機試料用逆光電子分光装置の開発を行った。これを用い、代表的な電子輸送性材料や電子受容性分子の研究を行い、分子構造と電子親和力の関係等を議論する事ができた。(K.Kanai etal.,Appl. Phys. A95(1)309(2009),他)平成20年6月に関(前研究代表者)の死去、平成21年2月に研究代表者の異動があったが、研究代表者と分担者が研究実施体制の再編などに関して十分な議論、意見交換を行い、当初の計画を問題なく遂行する事が出来ている。(1)有機試料用逆光電子分光(lPES)の高性能化と、積極的な活用:これまで、有機試料用IPESの検出器の高効率化、高分解能化、劇的な試料電流の低減などを実現し、多くの有機試料のIPES測定が可能になっている。本年度は、この利点を活かしてIPESによる研究成果を含む原著論文を6報発表した。一例として、これまで試料損傷が問題とされてきた導電性高分子、Poly (3-hexylthiophene)(P3HT)薄膜やフルオレン誘導体薄膜のlPES測定に成功し、占有-非占有電子構造の直接観測を行った[K. Kanai etal, Phys. Chem. Chem. Phys., 12, 273-282, (2009)]。この成果は、本研究で開発したlPES装置によって、導電性高分子においても、信頼性の高い非占有状態の電子構造の直接観測が可能となった事を示すものである。(2)新しい界面への展開:太陽電池の機能発現にとって重要な有機/有機界面の電子構造はほとんど調べられていなかった。そこで、本年度は、有機太陽電池の典型的な材料であるC_<60>またはC_<60>誘導体であるPCBMと銅フタロシアニンの有機層間の界面を紫外光電子分光(UPS)とlPES、およびXPSを用いて詳細に調べた。その結果、有機/有機界面においては、これまでに考えられてきたような、無機半導体のpn接合とは全く異なる電子構造が実現している事が分かった[K. Akaike, K. Kanai, et al., Advanced Functional Materials, 20, 1-7, (2010)]。この結果は、多くの研究者の先入観に反するものであり、関連分野に対するインパクトはきわめて大きい。特に、これまでに直接調べられていなかった有機/有機界面の電子準位接合を明らかにした事は、今後の有機太陽電池の高効率化や機能の最適化のための基本となると考えられる。この研究成果は独Wiley社Materials Viewに選出され、編集者の解説記事とともに紹介された。また、2010年2月期の"Most accessedarticle"となっている。その他に、本年度は、新たな試みとして、非線形振動分光(SFG)を用いて、有機太陽電池に内在するP3HTとPCBMの「埋もれた界面」の構造と電子構造を調べる事に成功した。
磁気浮上を利用した反磁性磁化率の精密測定

反磁性物質に働く磁気力と重力が釣り合った磁気浮上状態を利用し,反磁性磁化率の微小な温度変化の測定に成功した.ベンゾフェノンやパラフィンなどの有機物質を試料とした測定を行い,固体から溶融状態までの磁化率の温度変化を非接触で連続的に測定できることを示した.この技術は磁気浮上を利用した無容器での材料作製にとって非常に有用であると考えられる.反磁性物質に働く磁気力と重力が釣り合った磁気浮上状態を利用し,反磁性磁化率の微小な温度変化の測定に成功した.ベンゾフェノンやパラフィンなどの有機物質を試料とした測定を行い,固体から溶融状態までの磁化率の温度変化を非接触で連続的に測定できることを示した.この技術は磁気浮上を利用した無容器での材料作製にとって非常に有用であると考えられる.反磁性物質の磁化率測定を磁気浮上を利用することによって精密に測定することを試みた.本年度においては,磁化率の温度変化と試料空間の雰囲気の影響についての知見を得ることができた.試料として有機結晶ベンゾフェノン(融点約48°C)の単結晶を用い,恒温槽を用いることで試料の温度を2045°Cの範囲で変化させ実験を行った.試料の磁化率は,浮上に要した中心磁場から試料位置での(磁場×磁場勾配)を磁場分布計算から求めることによって見積もった.雰囲気の影響を見極める実験として,試料周囲の雰囲気を大気と窒素の2つの場合において測定したところ,大気中においては常磁性気体である酸素の影響が顕著であり,定量的な値だけでなく,定性的な振る舞いさえも酸素の磁化率の温度変化に影響されることが分かった,特に,試料の磁化率の温度変化が酸素の磁化率の温度変化よりも小さい領域では,観測される見かけ上の磁化率が酸素の磁化率の温度変化に埋もれてしまうことが分かった.一方,窒素雰囲気の場合では,窒素の磁化率の温度変化を考慮した場合の解析と真空を仮定して求めた値において0.01%程度の違いしかないことが分かった.大気中で磁気浮上を行う場合の浮上磁場に与える酸素の影響はこれまでに指摘されていたが,酸素の有無による影響をその温度変化を含めて明確に観察したのは初めてである.ベンゾフェノンの磁化率の温度変化においては,融点である48°Cよりもかなり低い40°C程度から磁化率が急激に変化し始めることが観察された.これは結晶内での分子振動がこの近傍の温度から激しくなり始めているためと推察された.また,温度変化に伴う磁化率の変化量として,最小で0.02%程度の微小な変化を本測定法により観測できることが分かった.主にパラフィンを試料として,磁気浮上を利用した反磁性磁化率の温度変化の測定を行った.試料としたパラフィンは融点48-50°Cと56-58°Cの2種類を用いた.その結果,どちらの試料も融点の20°C程度下から磁化率が僅かに増加し,融点直下から減少するという定性的には同様な挙動を示すのが観測された.パラフィンを構成する直鎖型飽和炭化水素(n-alkane)は融点近傍の固相で多段の固相-固相相転移を起こし,その転移温度は炭素数に依存することが知られている.そのため,磁化率の温度変化で見られた融点直下での挙動は固相-固相相転移に伴う磁場配向が起こっているとも考えられ,その因果関係に興味を持たれることとなった.そこで,これを明らかにするために,単分散のn-alkaneであるn-tricosane(炭素数23,融点47°C)とn-docosane(同22, 46°C)を試料として同様の測定を行った.その結果,単分散試料の場合はどちらも,パラフィンで見られた磁化率の増加は見られず,室温から融点までほとんど変化しないことが分かった.このことからパラフィンでの磁化率の増加は,固相-固相相転移による影響よりも,融点の低いn-alkaneが溶融し始めたところで融点の高いn-alkaneのドメインが磁場により配向した可能性が高いことがわかった.また,上記一連の測定を通して,固体から溶融状態,さらに再凝固する過程の磁化率変化を連続的に非接触で測定することに成功した.さらに,測定試料の大きさを2×2×2mm^3に揃えることにより,それ以前には12%程度あった測定間の絶対値のバラつきを0.4%程度に収めることができた.このことは,小さい試料ほど正確に測定できるという磁気浮上を利用した磁化率測定法の特徴を示していると言える.
胚性癌腫細胞の分化誘導におけるFGFとFGFレセプター亜種の発現と機能の解析

神経細胞の分化誘導過程における線維芽細胞増殖因子(FGF)とFGFレセプター(FGFR)亜種の果たす役割について明らかにするため、これらの遺伝子発現および蛋白質の発現について解析した。多分化能を持つ胚性癌細胞Embryonal carcinoma(EC)P19細胞の細胞塊を形成し、レチノイン酸RAで処理し、神経系細胞に分化を誘導した。FGFは9種の異なる遺伝子に由来するFGFファミリーメンバーが、FGFRについては4種のFGFRファミリーメンバーが見いだされている。未分化P19細胞および分化を誘導したP19細胞からRNAを抽出し、RT-PCRによってこれらの遺伝子発現を解析した。未分化P19細胞ではFGF4、FGF5、FGF6、FGF8およびFGFR1、FGFR2、FGFR3の遺伝子が発現していた。10^<-6>MのRAで神経細胞への分化を誘導すると、FGF2、6、9の発現が上昇し、FGF4は分化誘導開始時に一過性に上昇しその後は減少した。FGF5、8の発現は減少した。神経細胞の分化誘導におけるFGF2とFGF9の発現上昇は二相性であり、細胞塊形成時すなわち神経細胞への分化方向が決定する時期と、形態的に分化した神経細胞やグリア細胞が発現する時期に見られた。FGF6は細胞塊形成時ではなく、組織培養皿において発現が上昇した。FGFRについては、FGFR1の遺伝子は常に発現しており、FGFR2とFGFR3の発現が神経細胞への分化誘導過程で上昇した。FGFR4は細胞塊形成時に一過性の発現が認められたが、その発現は非常に弱かった。神経細胞への分化誘導過程で発現するマウスFGF9のcDNAをクローニングし塩基配列を決定し、日本DNAデータバンクDDBJに登録した(D38258)。次に蛍光抗体法を用いて、FGF9の蛋白質の発現を解析した。FGF9に対する抗体で神経細胞が強く染色されたが、次第にグリア細胞も染色された。本研究より、FGF9は分化方向決定時の神経幹細胞と分化した神経細胞やグリア細胞に作用しそれらの機能の維持に関与している可能性が示唆された。多分化能を持つ胚性がん腫細胞Embryonal carcinoma(EC)P19細胞の細胞塊を形成し、レチノイン酸RAで処理することにより神経細胞への分化を誘導することが出来る。神経細胞の分化誘導過程におけるFGFとFGFレセプター亜種の果たす役割について明らかにするため、これらの遺伝子の発現についてRT-PCR法を用いて解析した。FGF(Fibroblast Growth Factor)は広範な標的細胞の増殖または分化を促進する多様な生理作用を持つタンパク性の因子であり、哺乳動物においては現在までに9種のFGFファミリーのメンバーが知られている。FGFのレセプターについては、4種の異なる遺伝子にコードされているFGFR-1,FGFR-2,FGFR-3,FGFR-4が見出されている。未分化P19細胞ではFGF4、5、6、8およびFGFR1、2、3の遺伝子が発現していた。10^<-6>MのRAで神経細胞への分化を誘導すると、FGF2、6、9の発現が上昇し、FGF4、5、8の発現は減少した。しかし、RAを添加しない場合でもFGF4の発現は低下した。神経細胞誘導におけるFGF2とFGF9発現の上昇は二相性であり、細胞塊形成時すなわち分化方向決定時と組織培養皿において分化した神経細胞とグリア細胞が発現する時に見られた。またFGF6は細胞塊形成時には発現は上昇せず、組織培養皿において発現が上昇した。FGF2、9は分化方向決定時と分化した神経細胞やグリア細胞の機能維持に関与していることが示唆された。レセプターについては、FGFR1の発現はほとんど一定していたが、FGFR2とFGFR3の発現が神経細胞への分化誘導過程で上昇した。FGFR4は一過性で細胞塊形成時に発現が認められたが、その発現は非常に弱かった。本研究では、マウスP19細胞にFGF9が発現していることを初めて明らかにし、そのcDNAをクローニングして延期配列を決定し、日本DNAデータバンクDDBJに登録した(D38258)。ラットFGF9の塩基配列とは98.2%、ヒトFGF9とは92.4%のホモロジーがあり、アミノ酸配列はラットと100%、ヒトとアミノ酸1個(N末端から9番目のアスパラギン→セリン)だけ異なっていた。この配列の保存性の高さは、FGF9の機能が非常に重要であることを示唆している。10^<-6>

MのRAで神経細胞への分化を誘導すると、FGF2、6、9の発現が上昇し、FGF4は分化誘導開始時に一過性に上昇しその後は減少した。FGF5、8の発現は減少した。神経細胞の分化誘導におけるFGF2とFGF9の発現上昇は二相性であり、細胞塊形成時すなわち神経細胞への分化方向が決定する時期と、形態的に分化した神経細胞やグリア細胞が発現する時期に見られた。FGF6は細胞塊形成時ではなく、組織培養皿において発現が上昇した。FGFRについては、FGFR1の遺伝子は常に発現しており、FGFR2とFGFR3の発現が神経細胞への分化誘導過程で上昇した。FGFR4は細胞塊形成時に一過性の発現が認められたが、その発現は非常に弱かった。神経細胞への分化誘導過程で発現するマウスFGF9のcDNAをクローニングし塩基配列を決定し、日本DNAデータバンクDDBJに登録した(D38258)。次に蛍光抗体法を用いて、FGF9の蛋白質の発現を解析した。FGF9に対する抗体で神経細胞が強く染色されたが、次第にグリア細胞も染色された。本研究より、FGF9は分化方向決定時の神経幹細胞と分化した神経細胞やグリア細胞に作用しそれらの機能の維持に関与している可能性が示唆された。多分化能を持つマウス胚性癌腫細胞EC P19細胞は、レチノイン酸濃度に応じて神経系の細胞や筋肉系の細胞に分化誘導される。平成6年年度の研究により、P19細胞のレチノイン酸(10^<-6>M)による神経細胞の分化誘導過程において、FGF9の遺伝子発現が誘導されることを明らかにした。そこで、P19細胞のレチノイン酸による神経細胞の分化誘導過程において、FGF9の発現をタンパク質レベルで確認し、FGF9がニューロン及びグリア細胞の機能にどのような影響を及ぼしているのかを明らかにすることを平成7年度の研究目標とした。最初に、神経細胞とアストログリアの細胞マーカーであるニューロフィラメント160、GFAP、そしてFGF9の発現を、P19細胞の神経系細胞への分化誘導過程において経時的に蛍光抗体法及びウェスタンブロット分析を用いて検出した。その結果、それら3種類のタンパク質が未分化細胞では発現しておらず、分化誘導した細胞においてのみ発現していることが明らかになった。次に、神経細胞及びアストログリアのうち、どちらの細胞がFGF9を分泌しているのかを調べるために、ニューロフィラメント160及びGFAPをFGF9と共に二重染色した。その結果、FGF9の抗体により神経細胞及びアストログリア共に染色された。同様にして、FGFのレセプターであるFGFR1、FGFR2、FGFR3の発現を蛍光抗体法によって検出した。その結果、特にFGFR2の発現は興味深いものであり、FGF9と全く同様な発現分布を示していた。このことは、FGF9がFGFR2に結合することによってシグナルを伝達し、神経細胞の成長及び維持に働いている可能性を示唆する。今後、ニューロフィラメント160とFGFR2、またFGFR2とFGF9を二重染色することによって神経細胞にFGFR2が存在し、さらにFGFR2がFGF9に親和性のあるレセプターであることが確認できれば、この研究結果を裏付けることが出来るであろう。