hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水素終端シリコン表面における低温ヘテロエピキタシ-

我々は、既に平成6年度より実施した同科学研究費補助金基盤研究(A)(2)で、水素で終端されたシリコン表面上では金属薄膜のエピタキシ-が大きく影響され、しかもこれは可逆的に金属薄膜中に水素を吸着した場合も同様な現象を示すことを、AgやAu等の金属薄膜について報告してきたが、本年度は最終年度として、この現象が下地シリコン基板に与える影響について、In薄膜を用いて、総括的に調べた。In薄膜は作成時の基板温度と被覆原子数によって各種の異なった構造をとり、その際下地シリコンとの界面において再構成するシリコン原子の数が0ML,1ML,2MLと段階的に異なるので、水素終端効果を調べるのに適している。結果は以下の通りとなった。(1)In薄膜は水素終端シリコン表面において、直接シリコン表面上に成長させた場合と異なったクラスター構造をとり、このことは直接シリコン表面上にIn薄膜を成長させ、後で水素吸着させた場合と同様な結果となり、水素がヘテロエピタキシ-を制御していることがわかった。(2)In薄膜形成の際、In薄膜の構造によってシリコン界面で再構成するシリコン原子の数が異なる現象を利用して、水素によるクラスター促進によって生じる露出したシリコン表面の構造を調べ、それぞれの特徴を明らかにした。これは、他の金属薄膜のエピタキシ-制御についても成立し、水素の働きを解明する鍵となるものである。以上のような結果から、本年度の研究計画を完全に達成したと考える。
金属間化合物中の水素同位体拡散

1.金属間化合物Ti_3Al中の水素、重水素の拡散係数を初めて測定した。交付金により購入した分子ポンプと高純度Ti_3Al試料を用いて、超高真空条件下でガス吸収法により水素、重水素の拡散係数を正確に測定できた。比較のために測定したチタン中での水素、重水素拡散に比べ、Ti_3Al中では活性化エネルギーが大きく、拡散係数も小さくなることがわかった。2.水素と重水素の拡散係数を比較することによりTi_3Al中での水素の拡散機構を明らかにした。(1)チタン中での水素、重水素拡散の活性化エネルギーがチタン中におけるよりも大きいことから、チタン中のアルミニウム原子が水素原子の拡散経路を塞いでいることがわかった。これはTi_3Alが金属間化合物でアルミニウム原子が規則的に配列していることとアルミニウム中への水素の溶解熱がチタン中へのそれとは異符号であることから生ずるTi_3Alに特有の拡散機構であることがわかった。(2)水素と重水素の拡散係数の違いから、Ti_3Al中では水素原子は金属のフォノン(格子振動)に助けられて拡散していくことがわかった。これが本研究の中心的成果である。チタンでは水素と重水素の拡散係数の比は古典的に水素と重水素の質量の比の平方根になったが、Ti_3Alではその値が1に近くなり水素と重水素の質量の違いの影響が小さかったことから導かれた結果である。
「カンボジア暫定統治機構」の事例を中心とする国連平和維持活動の多角的研究

最終年の今年度は、これまでの資料調査と研究をふまえて、各自それぞれ以下のような研究成果を発表した。加藤は、これまでの資料調査に基づいて「地域民族紛争と国連平和維持活動-カンボジア問題を中心に」(『静岡精華短期大学紀要第3号)を研究論文として発表した。小田部も同様に、これまでの資料調査から「『カンボジア・タイムズ』に見る自衛隊撤収後のカンボジア」(『静岡精華短期大学紀要第3号)を研究論文として発表した。渡部は、国連・PKOの資料分析から単著『国際機構の機能と組織-新しい世界秩序を構築するために』(国際書院)を出版、また「『国際社会の民主化』に関する一考察」(『静岡精華短期大学紀要第3号)を研究論文として発表した。以上により、本研究は一定の成果を達成した。今年は研究に関係する資料の検索・収集・調査を中心とした。加藤(代表者)は、PKOに関する総合的な資料調査と分析を行い、民族紛争に対応するPKOの動きなどを単行本にまとめた。小田部は、主にアジア諸国・カンボジア関係の資料収集と分析・整理を渡部は国連・PKO関係の資料を分析し、一部を研究論文として発表した。19GA01:渡部,茂巳最終年の今年度は、これまでの資料調査と研究をふまえて、各自それぞれ以下のような研究成果を発表した。
阪神大震災におけるマンション復興コンフリクトとコミュニケーション様態の関係

本研究では、1995年1月17日の阪神大震災で特に大きな被害を受けた分譲マンションの復興過程について、その全体像を明らかにした。具体的には、「建替」が復興の選択肢として浮上するほどの被害を受けた分譲マンション23棟について、その復興過程において中心的な役割を果たした人物への面接調査と、関連の文献資料に基づいて、(1)被災当初から復興に至るまでの過程を「初動フェーズ」「決定フェーズ」「事業化フェーズ」にわけてモデル化し、(2)復興形態(建替か補修か)、復興の成否、復興に要する時間を規定・左右するコンフリクトを剔出し、(3)それらのコンフリクトの帰趨によって、復興過程の類型化を行った。(2)については、1)初動フェーズにおける復興方針策定、2)既存不適格への対応、3)資金計画、4)必要多数獲得工作、5)建替計画頓挫後の復興方針策定、6)事業フェーズにおける資金調達、が復興過程の岐路となっていたことが明らかになった。(3)については、1)補修一枚岩(復興方針を左右するコンフリクトなく補修に決定)、2)初動紛争後補修(初動フェーズにおいてコンフリクト1)2)が存在、結果的には補修)、3)移行型補修(当初の建替計画が頓挫、コンフリクト5)の結果、補修方針に移行)、4)建替一枚岩(区分所有法に基づきほぼ一枚岩で建替に決定)、5)紛争後建替(コンフリクト4)5)を経て結果的には建替)、6)解体後建替(建替計画策定前に解体、建替)の6パターンが見いだされた。今後、復興過程をゲーム理論に基づいて定式化するとともに、大被害を受けた分譲マンション約300棟のすべてを対象にした実態調査を実施し、阪神大震災における大被害分譲マンションの復興過程の全貌を明らかにする予定である。
肥満者に対する適正な経皮的ドラッグデリバリー方法の確立

本研究の目的は、肥満者の皮膚生検組織を用いて、経皮的ドラッグデリバリーに関わる表皮バリア機能および皮膚内の薬物代謝酵素の発現動態を明らかにすることである。これにより、肥満度の上昇が経皮的ドラッグデリバリーの変化に与える影響を明らかとし、肥満者の皮膚特性を考慮した新しい経皮吸収方法の確立を目指す。平成30年度は、形成外科手術時に採取した対象者の皮膚組織からディスパーゼを用いて表皮を分離し、1表皮バリア機能に関わる因子(表皮セラミド、フィラグリン)、2臨床で頻用されているフェンタニルパッチの薬物代謝酵素であるCYP3A4発現量の解析を実施した。解析時には対象者を肥満群(BMI25以上)、非肥満群(BMI25未満)に分類し比較を実施するとともに、BMIの増加と各因子の相関解析を実施した。表皮内のセラミドの定量には液体クロマトグラフィー(逆相カラムを用いたグランジュエント分析)、フィラグリンは免疫組織染色法を用いて評価した。薬物代謝酵素CYP3A4はリアルタイムRT-PCR法を用いたmRNA量およびウエスタンブロット法を用いタンパク量を定量した。その結果、CYP3A4発現量は肥満群および非肥満群の2群間の解析において有意な差は認められなったが、BMIの上昇に伴いmRNAおよびタンパク質レベルで上昇する可能性が示唆され、肥満度の上昇が経皮的ドラッグデリバリーに影響を及ぼす可能性が示唆された。本研究の目的は、肥満が薬剤経皮吸収に与える影響を明らかとし、肥満者を対象とした適正な経皮的ドラッグデリバリー方法の確立を目指すことである。平成28年度は、ヒトの表皮組織を用いて、肥満度の上昇に伴う薬物代謝酵素の発現量の変化を検討した。乳癌術後乳房再建術を受ける20-64歳の患者を対象とし、BMI25以上の肥満者とBMI25未満の非肥満者の2群に分類した。皮膚の薬物代謝に影響する因子を持つ者(65歳以上の高齢者、糖尿病、慢性炎症性皮膚疾患、過去2年以内に化学療法・放射線療法を実施した者)は除外した。乳房再建時に残余皮膚として回収される皮膚組織を用いて、経皮吸収に関与する代謝酵素であるCYP3A4等に着目し、条件検討および解析を進めている。現在、肥満者約15名、非肥満者70名の対象から基礎情報および皮膚サンプルを得た。皮膚組織は免疫染色用とmRNA発現用の2つにわけ、mRNA解析用のサンプルは、皮膚組織をディスパーゼ処理し、表皮のみを分離した。免疫染色用のサンプルは凍結切片を作成した。現在、全対象者の凍結切片作成およびmRNA抽出が終了している。今後は、薬物代謝酵素に加えて皮膚バリア機能に関わる因子も含め、関連要因の免疫組織染色による皮膚内のタンパク質発現およびリアルタイムPCR法により、mRNA発現量を解析する予定である。ヒトの皮膚組織からディスパーゼを用いて表皮のみを分離し、mRNA抽出を試みており、その条件検討、および免疫染色を行う上での条件検討に時間を要しているため。平成29年度は、対象者の皮膚組織から表皮を分離し、肥満度の症状に伴う皮膚内薬物代謝酵素の発現動態を検討した。特に、経皮吸収剤として臨床で頻用されているフェンタニルパッチの代謝酵素であるCYP3A4に着目し、皮膚内の発現動態をmRNA量およびタンパク質発現量で評価した。乳房再建術を受ける成人女性を対象とし、腹直筋皮弁法により生じた残余皮膚組織を解析した。対象者は非肥満群(BMI<25)16名、肥満群(BMI≦25)16名であり、平均年齢は非肥満群で49.6(5.3)歳、肥満群で50.5(4.7)歳であり、両群に有意な差は認められなかった。平均BMIは非肥満群21.5、肥満群27.2であり、有意な差が認められた(p<0.001)。リアルタイムPCR法を用いてCYP3A4の表皮内発現量を検討した結果、肥満群では非肥満群と比較してCYP3A4mRNA発現量の有意な低下が認められた(p=0.002)。また、CYP3A4mRNA発現量とBMIの間には、中程度の負の相関関係が認められた(Person's r=-0.405、p=0.023)。タンパク質発現量は蛍光免疫組織染色を実施した。その結果、CYP3A4は表皮に特異的に発現し、肥満群は非肥満群と比較して表皮におけるCYP3A4シグナルの低下が認められた。この結果から、肥満者の皮膚において、CYP3A4によって代謝されるフェンタニル貼付剤などの薬物は、表皮における吸収過程において代謝が変動することが予測され、血中への移行に影響することが推察される。この後は、CYP3A4の発現を制御するさらに上流の因子にも着目し、引き続き解析を実施する予定である。本研究は形成外科手術を受ける患者を対象としており、当初の想定よりも肥満に該当する患者が少なく、予定サンプル数の確保に時間を要した。

これにより、肥満度の上昇が経皮的ドラッグデリバリーの変化に与える影響を明らかとし、肥満者の皮膚特性を考慮した新しい経皮吸収方法の確立を目指す。平成30年度は、形成外科手術時に採取した対象者の皮膚組織からディスパーゼを用いて表皮を分離し、1表皮バリア機能に関わる因子(表皮セラミド、フィラグリン)、2臨床で頻用されているフェンタニルパッチの薬物代謝酵素であるCYP3A4発現量の解析を実施した。解析時には対象者を肥満群(BMI25以上)、非肥満群(BMI25未満)に分類し比較を実施するとともに、BMIの増加と各因子の相関解析を実施した。表皮内のセラミドの定量には液体クロマトグラフィー(逆相カラムを用いたグランジュエント分析)、フィラグリンは免疫組織染色法を用いて評価した。薬物代謝酵素CYP3A4はリアルタイムRT-PCR法を用いたmRNA量およびウエスタンブロット法を用いタンパク量を定量した。その結果、CYP3A4発現量は肥満群および非肥満群の2群間の解析において有意な差は認められなったが、BMIの上昇に伴いmRNAおよびタンパク質レベルで上昇する可能性が示唆され、肥満度の上昇が経皮的ドラッグデリバリーに影響を及ぼす可能性が示唆された。上記条件検討を進めながら、薬物代謝酵素に加えて皮膚の薬物代謝に関与する皮膚バリア機能に関わる因子の測定も進めていく。非肥満、肥満の2群ではなく、BMIの連続値としての評価も含め、解析を実施していく。平成28年度は、皮膚の経皮吸収に関わる薬物代謝酵素の発現の評価において、当初予定していたin vitroの評価が、当初計画よりも条件検討等の理由により計画進行がやや遅れたため。本研究は形成外科手術を受ける患者を対象としており、当初の想定よりも肥満に該当する患者が少なく、予定サンプル数の確保に時間を要し、当初の予定よりも遅れているため。平成30年度はBMIを連続値で評価するなど解析方法を工夫しサンプル数を確保した上で計画を遂行する予定である。平成29年度は、引き続き経皮吸収に関わる代謝酵素およびバリア機能の構成因子のタンパク質発現およびmRNA発現量の解析を行うための各種物品費および学会発表費として使用する。
エバネッセント波の干渉を用いたレーザー計測によるコロイド固液界面挙動の解明

本研究ではコロイド粒子の流動と伝熱特性の関連に注目した。不溶性粒子が分散したナノ流体や相変化エマルションはコロイドであり、高い流動性を有することで熱輸送媒体として期待される。利用においては固液境界での伝熱を伴うため、伝熱特性の解明と向上には境界近傍での粒子の電気運動学的挙動の把握が重要と考えた。固体壁近傍での流動挙動の補足には粒径程度の高空間分解能が要求され、本研究では固液境界の全反射で発生させたエバネッセント(EW)光の干渉を利用し、粒子による散乱光を基にレーザードップラー原理で流動速度を求める手法を採用した。EW光は流体側への浸透距離が数百nm程度と短く、境界面垂直方向に回折限界を超える高空間分解能を実現できる。また、他の手法と違い、計測体積が常に壁面に固定されるので境界面に対する位置の不確かさに影響を受けない。さらに、粒径の小さなレイリー散乱域では散乱強度が粒径の6乗に比例して著しく減衰するのに対し、本手法では光電子増倍管など高感度検出器を利用でき、画像計測で観測不能な粒径での計測が期待される。本研究は2年計画で進め、計測手法を確立し、その応用を推進した。1年目に計測システムを設計・構築し、性能を評価した。自作プローブを用いた実験で原理の成立を確認し、速度計測の不確かさを評価した。さらにコロイド試験部に直流電場を印加し、電気泳動・浸透による粒子流動速度への影響を調べた。2年目には粒径と粒子濃度、印加電場強度による流速への影響を調べた。電場強度に比例した流速が計測され、理論に一致する結果が得られたことからコロイド流動計測の妥当性が確認された。また、粒径が小さい場合に単一の周波数ピークが得られにくく、ブラウン運動の影響が相対的に強まったことが示唆された。さらに温度勾配による熱泳動とブラウン運動の温度依存を調べるため、温度境界条件を確立したうえで計測可能な試験部を製作した。本研究では、熱輸送媒体としてのコロイドの流動挙動と伝熱特性の関連に注目する。液体にナノサイズ金属粒子を添加したナノ流体では、粒子濃度から予測されるよりも高い熱伝導率が報告され、より高効率な熱輸送を実現する作動流体として期待される.また,溶媒にマイクロ・ナノサイズ相変化物質を分散させた相変化エマルションは体積あたりの熱容量に優れ,潜熱蓄熱輸送媒体として有望である.こうしたコロイドは流動性を持つことで熱輸送媒体としての利用が期待され、固液境界での伝熱を伴う。そのため,伝熱特性の解明と向上には境界近傍における粒子挙動の把握が重要である。固体壁近傍での流動挙動を捉えるには粒径程度の高空間分解能が要求される。本研究では固液境界の全反射で発生させたエバネッセント(EW)波を干渉させ、コロイド粒子による散乱光を利用してレーザードップラー原理に基づき流動速度を計測する.EW波は流体側への浸透距離が極めて短く,境界面垂直方向に回折限界を超える高空間分解能を実現できる.また,マイクロ粒子画像流速計や速度プロファイルセンサーと異なり,計測体積が常に壁面に固定され、境界面に対する位置の不確かさが生じることなく計測できる.さらに,粒径が波長よりも小さくレイリー散乱が支配的な熱輸送コロイドでは散乱光強度が粒径の6乗に比例して著しく減衰するのに対し、本計測では光電子増倍管など高感度光検出器を利用でき、画像計測では観測不能な微粒子の挙動を捕捉できると考えられる。本研究は研究期間を2年間で計画し、1年目に計測システムを設計・構築し計測可能な粒子サイズを把握し、2年目に試験セルの温度境界条件を確立し、定常伝熱下で熱輸送コロイドに電場を印加し流動させた状態で本格的に計測する。固液界面の伝熱で電場を印加した際に電気泳動と電気浸透によるコロイド粒子の電気運動学的挙動を調べ,熱輸送コロイドの伝熱特性への影響を調べる.1年目は研究計画どおり、計測システムの確立を目指した.計測システムは全反射によるエバネエッセント派の干渉により、ガラスと試験コロイドの接する固液境界から約300 nm以内の領域のコロイド粒子の流動速度を計測すべく構築した。計測信号のSN比の向上のため、可干渉性の高い狭線幅のレーザーを光源として導入した。また、研究対象のコロイドは粒径が小さくレイリー散乱が支配的となることを考慮し、検出器を光電子増倍管に換装した。これらの結果、信号のSN比に大幅な改善は見られなかったが、以前の検出器では観測不能であった微弱な散乱光を観測でき、粒径のより小さなコロイド粒子の計測が実現可能な見込みとなった。次に、計測原理の検証と計測性能の評価を実施した。検証実験では、半球レンズとロッドレンズを組み合わせた自作プローブの先端にコロイド粒子を模擬したアルミナ粒子を付着させ、ガラス表面に形成された計測体積を一定速度で走査した。その際に粒子による散乱光のドップラー周波数を計測するとともに、走査速度をレーザー変位計で計測した。その結果、ドップラー周波数と走査速度は比例関係にあり、比例定数が干渉縞間隔の設計値と不確かさの範囲内で一致したことから、計測原理が設計どおり成立することが実証された。さらに,溶液中のコロイド粒子の流動速度計測を試みた.試験セルにアルミナ水溶液を充填し,直流電場を印加して粒子を泳動させ、ガラス壁面から約300 nm以内の領域の粒子流動速度を計測した。

その結果、印加電場強度に対し概ね比例した流動速度が得られ、これは過去の研究での理論計算から予想される挙動と整合した。また、他の研究で報告された水溶液中のアルミナ粒子とガラス壁面のゼータ電位から固液境界での粒子流動速度を計算した。実験で得られた流動速度はその予測範囲に納まり、本計測システムでコロイド粒子の流動速度の計測が可能なことが確認された.本研究ではコロイド粒子の流動と伝熱特性の関連に注目した。不溶性粒子が分散したナノ流体や相変化エマルションはコロイドであり、高い流動性を有することで熱輸送媒体として期待される。利用においては固液境界での伝熱を伴うため、伝熱特性の解明と向上には境界近傍での粒子の電気運動学的挙動の把握が重要と考えた。固体壁近傍での流動挙動の補足には粒径程度の高空間分解能が要求され、本研究では固液境界の全反射で発生させたエバネッセント(EW)光の干渉を利用し、粒子による散乱光を基にレーザードップラー原理で流動速度を求める手法を採用した。EW光は流体側への浸透距離が数百nm程度と短く、境界面垂直方向に回折限界を超える高空間分解能を実現できる。また、他の手法と違い、計測体積が常に壁面に固定されるので境界面に対する位置の不確かさに影響を受けない。さらに、粒径の小さなレイリー散乱域では散乱強度が粒径の6乗に比例して著しく減衰するのに対し、本手法では光電子増倍管など高感度検出器を利用でき、画像計測で観測不能な粒径での計測が期待される。本研究は2年計画で進め、計測手法を確立し、その応用を推進した。1年目に計測システムを設計・構築し、性能を評価した。自作プローブを用いた実験で原理の成立を確認し、速度計測の不確かさを評価した。さらにコロイド試験部に直流電場を印加し、電気泳動・浸透による粒子流動速度への影響を調べた。2年目には粒径と粒子濃度、印加電場強度による流速への影響を調べた。電場強度に比例した流速が計測され、理論に一致する結果が得られたことからコロイド流動計測の妥当性が確認された。また、粒径が小さい場合に単一の周波数ピークが得られにくく、ブラウン運動の影響が相対的に強まったことが示唆された。さらに温度勾配による熱泳動とブラウン運動の温度依存を調べるため、温度境界条件を確立したうえで計測可能な試験部を製作した。1年目の研究では計測システムを確立し、計測原理と性能を検証し、コロイド粒子の流動速度を計測した。しかし、研究を通じて課題も見つかった。まず、可干渉性に優れた光源を導入したが、信号のSN比の向上は僅かに留まった。この問題は根本的原因が把握できておらず、今後も検討を続ける。また、計測中に予期せぬノイズによる周波数ピークが計測周波数帯域に出現する問題に悩まされた。判明した原因の中には光源の冷却ファンによる機械的振動によるものがあり、本研究のようにサブミクロン・スケールの実験ともなると振動対策の必要性も明らかとなった。さらに、ノイズの原因を調べるうちに、粒子による散乱光に加え固液境界での散乱光も同時に観測され、その周波数が本来のドップラー周波数によるピークとともに出現することが確認された。これは事前に予見できなかった問題で、今後の研究を進めるうえで解決を要する。マイクロ粒子画像流速計測と異なり、本研究では蛍光粒子を使わずコロイド粒子そのものをトレーサー粒子として計測に用いる。
マングローブ植物耐塩性機構の解析とマングローブ林維持・回復に関する基礎研究

1.Burguiera sexangulaの展開直後の葉を用いてRNAの抽出とcDNAライブラリーの作製を試みた。また、RNA抽出実験と独立に、塩耐性に関与するイオン輸送分子として、細胞膜のH^+ポンプに注目した。すでに知られているH^+ポンプ遺伝子構造から、保存性の高い配列(ATP結合部位とリン酸化部位)を選び出し、プライマーの設計を行った。結果:設計したプライマーを用いて、イネおよびエンドウのcDNAからH^+ポンプ遺伝子を見いだすことに成功した。一方、実験材料であるマングローブ植物では、実験上の困難が多く、各種の方法で、マングローブ新葉組織からの全RNA抽出に挑戦しているが、有為な結果を得られていない。2.Burguiera sexangula、Burguiera gymnorrhiza,Rhizophora apiculataそれぞれの葉組織及び胎生種子を滅菌した後、小片に切り分けて培養した。培地としてムラシゲ・スク-グ培地及びアミノ酸培地を用いた。植物ホルモンとして、2,4-Dと4PUを用いた。結果:主に葉組織を用い、かなり強い滅菌法を用いたが、培養開始後約23週間で、生き残った葉切片の切り口からカルス様の細胞塊の出現が見いだされた。また、繁殖子切片からも同様のカルス様細胞塊が成長を始めた。培養条件の検討から、アミノ酸培地が優れていること、ホルモン濃度としては約2μM程度が良いこと、さらに培養温度として30°Cの場合にカルス様細胞塊の形成が25°Cより早いことが明らかになった。3.細胞膜でのイオン輸送活性を電気生理学的に測定するための前段階として、葉組織からの単一細胞の酵素的単離を試みた。
内在性レクチンの存在様式と意義

内在性レクチンのうち、とりわけガレクチンを中心に組織細胞化学的に検討した。ガレクチンはガラクトースに特異的な動物レクチンであり、細胞膜は細胞間基質にあって糖の関与する様々な接着反応や各種の情報伝達に関与するとされる。16-kDaガレクチンは、線虫の消化管の開口部、後頭部上皮と微繊毛の細胞膜、および消化管上皮細胞膜などに見出された。一方、32-kDaかレクチンは、これらの部位に加えてクチクラ層直下の皮下細胞膜状にも観察された。カレクチンはニワトリ肺では皮膚の細胞膜やデスモゾーム領域にも見出されており、さらに発生過程に応じて、肝、筋、腸などの各臓器に発現することを確認した。一方、ヒト腎では、ガレクチン-1とガレクチン-3とは、その局在性が異なっていた。即ち、ガレクチン-1は主に糸球体及び尿細管間質に存在し、一方、ガレクチンー3は主に遠位尿細管と集合管に局在することが確認された。また、ガレクチンの局在は同じ種類の細胞においても発現している場合と、そうでない場合があり、cell cycleによっても発現が変化すると推測された。内在性レクチンの組織細胞化学的検討に関連して、外来性レクチンの広範囲にわたる適用、糖鎖や糖転移酵素の性状や分布・局在の検索、並びに画像処理に努めた。1)線虫(C.elegans)におけるガレクチンの局在の検討:ガレクチンはガラクトースに特異的な動物レクチンであり、細胞膜や細胞間基質にあって糖の関与する様々な接着反応や各種の情報伝達に関与するとされる。近年、高等動物のみならず線虫や海綿などを下等動物に見出され、糖鎖特にガラクトースを介した細胞間相互作用が、動物界に普遍的に存在して重要な役割を果していると推定されている。とりわけ、線虫(Caenorhabditis elegans)は、わずか千個程度の細胞からなる下等動物であり、生活環が短く、ゲノム解析もかなり進んでおり、実験モデルとして極めて優れた特性を有している。今回、C.elegansに存在する主要ガレクチン(32-kおよび16-kDa)に対する特異抗体を用い、これらの局在を光顕・電顕的に検討し、発生過程に伴う変化を比較した。様々な発生ステージの線虫(C.elegans)を4%ホルムアルデヒドまたは0.2%グルタルアルデヒド+4%ホルムアルデヒドで前固定(4°C,1h)したのち、一部はクリオスタット切片(厚さ5-10オm)を作製、抗ガレクチン抗体の局在を、Cy3標識二次抗体を用いて共焦点レーザ顕微鏡により観察した。また一部はLR-Whiteに包埋し、超簿切片を作製、抗ガレクチン抗体の分布をコロイド金標識二次抗体により検出し、透過電顕下で観察した。16-kDaガレクチンは、線虫の消化管の開口部、咽頭部上皮と微絨毛の細胞膜、および消化管上皮細胞膜などに見出された。一方32-kDaガレクチンは、これらの部位に加えてクチクラ層直下の皮下細胞膜上にも観察された。ガレクチンはニワトリ胚では皮膚の細胞膜やデスモゾーム領域にも見出されており、さらに発生過程に応じて、肝、筋、腸などの各臓器に発現することが知られている。線虫では発生過程を通じて、腸管や表皮に幅広く分布し。形態形成過程のみならず、採餌や消化活動に積極的に関与し、また外部環境との境界面におけるバリアーとして機能していることが想像される。1)線虫(C.elegans)におけるガレクチンの局在:ガレクチンはガラクトースに特異的な動物レクチンであり、細胞膜や細胞間基質にあって糖の関与する様々な接着反応や各種の情報伝達に関与するとされる。

昨年度に引続き、線虫C.elegansに存在する主要ガレクチン(32-kおよび16-kDa)に対する特異抗体を用い、これらの局在を光顕・電顕的に検討し、発生過程に伴う変化を比較し、目下論文の形で公刊準備中である。3)ラット膵臓におけるO-GlcNAc並びにO-GlcNAc転移酵素の局在糖蛋白質の糖鎖には、アスパラギン型糖鎖とムチン型糖鎖がよく知られている。それらに加えて、細胞質および核内の種々の蛋白質を構成するセリン或いはスレオニン残基に、N-アセニルグルコサミン(GlcNAc)が1つだけO-グリコシド結合したO-GlcNAcの存在が、近年明らかとなった。このようなO-グリコシド結合型N-アセチルグルコサミン(0-GlcNAc)の機能は、セリンやスレオニンのリン酸化の調節や、細胞内シグナル伝達或いは核内での転写の制御への関与などが示唆されている。またO-GlcNAcは、従来より知られている糖鎖合成過程とは全く異なる経路で合成される。最近、このO-GlcNAc転移酵素の遺伝子がラット、ヒト、線虫などでクローニングされたが、その局在については不明である。今回、ラット膵臓におけるO-GlcNAc並びにO-GlcNAc転移酵素の局在を検討した。光顕的に観察すると、O-GlcNAc転移酵素は外分泌部では腺房細胞に、またランゲルハンス島ではA細胞と膵ポリペプチド(PP)細胞に強く発現していることが認められた。さらに、電顕観察より、O-GlcNAc転移酵素は主に細胞の核のユークロマチンに存在し、また腺房細胞の酵素原顆粒の周囲、並びにA細胞のα顆粒の周囲の細胞質に存在することが明らかになった。このようなO-GlcNAc転移酵素の局在は、O-GlcNAcの場合とほぼ一致していた。(本研究は米国ジョン・ホプキンス大学医学部G.W.Hart博士らとの共同研究の一端である。)3)かねてより準備を進めていた総説“Endogenous Animal Lectins"が、Progress in Histochemistry and Cytochemistry誌に掲載、公刊された(業績欄参照)。これは、内在性動物レクチンに関する最近の知見を一括してまとめた内容である。ガレクチン-1とガレクチン-3とは、その局在性が異なっていた。即ち,ガレクチン-1は主に糸球体および尿細管間質に存在し、一方、ガレクチン-3は主に遠位尿細管と集合管に局在することが確認された。また、ガレクチンの局在は、同じ種類の細胞においても発現している場合と、そうでない場合があり、cell cycleによっても発現が変化すると推測された。
脊髄後角細胞におけるGABAA受容体介在性Tonic電流と神経因性疼痛メカニズム

ddyマウスの坐骨神経にPEチューブを装着し、一側神経を圧迫し後肢の慢性疼痛モデルを作成した。Hargreave testで、カフ装着前の潜時が健肢で6.7±0.3秒、患肢で6.7±0.4秒と差がないのに対し、カフ装着3日目より患肢では4.9±0.3秒と有意に短くなり、熱刺激に対する疼痛閾値の低下が認められた。閾値の低下は術後15日目頃より回復傾向が認められた。また、Von Frey testで機械刺激に対し、カフ装着前では健肢9.4±0.6、患肢で8.3±0.4と有意差がないのに対し、カフ装着後3日目では患肢で2.4±0.2と有意に閾値の低下が認められた。閾値の低下は、熱刺激とは異なり、術後15日以降も持続した。また、熱刺激、機械刺激ともに、坐骨神経の露出だけを行ったSham手術群と比較しても有意な閾値の低下が認められた。次に、RT-PCR法により、マウスの脊髄におけるGABA_A受容体サブユニットのmRNAの発現量の変化を検討した。Tonic電流に関与するサブユニットの候補として、δ-、α5、α4、α6の発現量を検討した結果、δ-サブユニットが疼痛モデルマウスの脊髄で減少していることが明らかになった。現在、ホールセルパッチクランプ法により、脊髄後角膠様質細胞におけるtonic電流の検討を行っているが、モデルマウスではtonic電流を有する細胞の数が減少している傾向にある。これらの結果から、GABA_A受容体介在性tonic電流の減少が、坐骨神経カフモデルのマウスの疼痛行動を引き起こしていると考えられる。本研究は、GABA_A受容体介在性tonic電流の生理的意義の解明だけではなく、減少したGABA_A受容体を増加させる遺伝子治療や薬剤の開発により難治性疼痛の治療の開発にも役立つと考えられる。
X線撮像分光観測で解明する銀河系中心部の3次元構造

本研究の目的は銀河系中心領域の3次元構造をあきらかにすることである。すざくによるX線観測は、天体からのX線放射と、それが受ける星間吸収を分離することで、天体種と奥行き位置を同時に決定する。したがって本年度もすざくを用いて銀河系中心方向のX線探査をおこなった。その結果、銀河系中心方向の2天体、電波天体Tornadoと超新星残骸W28に関して、起源を明らかにし、奥行き一を決定することに成功した。Tornadoは渦巻き状の奇妙な電波構造をもつ。すざくはその両端に1対のプラズマ球を発見した。このプラズマ対は、温度などが互いにほぼ同じであり、星間吸収量から決めた距離も約3万6先光年と同等であることから、同一起源をもつ双子のプラズマである。さらに電波構造Tornadoとも同程度の距離であった。そこで野辺山45m望遠鏡でCO分子輝線観測をおこなったところ、双子プラズマのそれぞれに衝撃波励起されたCO分子雲が付随していることを発見した。これらから、電波放射をになう双極アウトフローが分子雲と衝突することで双子のプラズマをつくったと結論した。アウトフローの起源は、過去活動的であったブラックホール連星系からのジェットか、高速回転する大質量星の超新星爆発であろう。申請者らはこの成果を記者発表し、新聞各紙にて報道された。W28は標準進化モデルが予想しない複合形態型の空間構造をもつ奇妙な超新星残骸である。過去の観測では、このタイプとしては異常に高温な2千万度という温度をもつとされてきた。しかし申請者らはすざくの観測を用いたより正確なバックグラウンド評価により、このような高温成分がないことを初めて示した。さらに強い再結合連続線をともなう再結合優勢プラズマであることが明らかにし、その温度は5百万度程度と、複合形態型としてむしろ典型的であることを発見した。再結合優勢プラズマは通常の超新星残骸の熱的進化がつくる電離優勢プラズマの逆であり、その起源が明らかではない。そこで電離状態の元素依存性と、熱的構造の空間分布を詳細解析した。その結果、ネオン、マグネシウムおよび鉄が低い電離度であるのに対しシリコンと硫黄では高い電離度が観測された。また電離度とプラズマの温度がともに中心部で高く周辺部で低いことを示した。この結果は、大質量星がみずからの恒星風で作った高密度領域で爆発したというシナリオで説明できることを示した。銀河系中心部の3次元構造解明の足がかりとして、硫黄の高階電離輝線と、中性鉄輝線による輝線マッピングを行い新天体の探査を行った。これらは超新星残骸の約1000万Kの高温プラズマ、および外部からの電子やX線で照らされた約10Kの巨大分子雲という、銀河系中心領域に特徴的な2大天体種をそれぞれよくトレースする。すざく衛星の優れた分光性能とバックグラウンド環境により、本年度観測した2領域から新構造を発見するとともに、奥行き方向の位置を決定した。Arches星団は銀河系中心巨大ブラックホールから30pcの近距離に位置し、かつ太陽付近の30万倍もの高密度を誇る特異な星団である。この星団の極近傍1pcを取り巻く巨大分子雲が中性鉄輝線で輝いていることが知られているが、その起源は謎であった。私はすざく衛星による高統計データから中性鉄輝線マップを作成し、これまで知られていたより遥かに広い約10pcの領域からも中性鉄輝線放射を発見した。この広域分子雲と星団極近傍の分子雲が電波分子輝線において同じ速度帯にあり、両者のX線スペクトルが酷似していることから、これらが同じ距離すなわち銀河系中心近傍にあると結論した。Tornadoはhead-tail状の非熱的電波天体で、銀河系中心の約2度西に位置する。電波の放射スペクトルや偏光の検出などは超新星残骸起源を示唆するが、形状の特異性のため高速移動するパルサー星雲説、歳差運動するX線連星からのジェット説なども提唱されてきた。すざく衛星で検出された硫黄輝線の分布は東西にのびる電波放射の両端に位置していた。このような双極的な形態は、これまでのhead-tail型の描像を打ち破る画期的結果である。さらにX線放射の熱的起源を確定したことで、パルサー風星雲説を明確に棄却した。特殊な環境での超新星爆発あるいは過去に活動的だったX線連星からのジェットが濃い分子雲などに衝突し熱化したと考えられる。熱的X線が受けた星間吸収量を精度よく決定し、これよりTornadoの距離が銀河系内しかし銀河系中心の向こう側であると結論した。この他、次期X線衛星Astro-H搭載X線CCDへの中性子バックグラウンドの実験的研究も行った。これを可能にするのはすざく搭載X線CCD検出器XISの優れた分光性能である。X線CCDは軌道上で宇宙線粒子による損傷を受け、電荷転送効率が時間とともに劣化する。これは分高性能の劣化に直結するため、電荷転送効率を精確に較正することが必須となる。XISの較正手法はすでに確立されていたが、近年(2009年後期)のデータを正しく補正できないことを見いだした。ゲイン・分解能の較正精度の低下は、本研究の目的にとって致命的である。

そこで、5年以上におよぶすざくXISのデータを系統的に解析し直し、これまで見過ごされてきた新たな電荷転送効率の特性を2点見いだした。これを較正に取り込むことで、すざく打ち上げ前に予定されていた較正目標を再び達成することに成功した。その結果、銀河系中心方向に近い超新星残骸W28のX線スペクトルから強い再結合連続線を発見し、この残骸が再結合優勢状態にあることを明らかにした。再結合優勢プラズマは標準的な超新星残骸の進化では実現しないものであり、銀河系中心領域に特有の高密度環境がその形成に関わっている可能性があることを指摘した。すざく以降の銀河系中心研究に向けて、次期X線衛星ASTRO-H搭載X線CCD検出器SXIの開発も継続している。SXIの特長はこれまでより3倍厚い空乏(有感)領域であり、これにより10keV付近の硬X線の感度が向上する。しかしながら、同時にこれまで問題とならなかった軌道上中性子によるバックグラウンドの増加も懸念される。申請者らはその定量評価を、Cf-252による中性子照射試験により行った。さらに、X線検出のために用いられるイベント形状判定法を応用して、X線CCDにおいて中性子とγ線イベントを判別可能であることを示した。本研究の目的は銀河系中心領域の3次元構造をあきらかにすることである。すざくによるX線観測は、天体からのX線放射と、それが受ける星間吸収を分離することで、天体種と奥行き位置を同時に決定する。したがって本年度もすざくを用いて銀河系中心方向のX線探査をおこなった。その結果、銀河系中心方向の2天体、電波天体Tornadoと超新星残骸W28に関して、起源を明らかにし、奥行き一を決定することに成功した。Tornadoは渦巻き状の奇妙な電波構造をもつ。すざくはその両端に1対のプラズマ球を発見した。このプラズマ対は、温度などが互いにほぼ同じであり、星間吸収量から決めた距離も約3万6先光年と同等であることから、同一起源をもつ双子のプラズマである。さらに電波構造Tornadoとも同程度の距離であった。そこで野辺山45m望遠鏡でCO分子輝線観測をおこなったところ、双子プラズマのそれぞれに衝撃波励起されたCO分子雲が付随していることを発見した。これらから、電波放射をになう双極アウトフローが分子雲と衝突することで双子のプラズマをつくったと結論した。アウトフローの起源は、過去活動的であったブラックホール連星系からのジェットか、高速回転する大質量星の超新星爆発であろう。申請者らはこの成果を記者発表し、新聞各紙にて報道された。W28は標準進化モデルが予想しない複合形態型の空間構造をもつ奇妙な超新星残骸である。過去の観測では、このタイプとしては異常に高温な2千万度という温度をもつとされてきた。しかし申請者らはすざくの観測を用いたより正確なバックグラウンド評価により、このような高温成分がないことを初めて示した。さらに強い再結合連続線をともなう再結合優勢プラズマであることが明らかにし、その温度は5百万度程度と、複合形態型としてむしろ典型的であることを発見した。再結合優勢プラズマは通常の超新星残骸の熱的進化がつくる電離優勢プラズマの逆であり、その起源が明らかではない。そこで電離状態の元素依存性と、熱的構造の空間分布を詳細解析した。
原子炉環境におけるクラッドの生成と変換および溶解の基礎過程に関する研究

実験と調査により、次のような研究成果を得た。1.模擬クラッドの生成とキャラクタリゼーション:5種類の異なる方法によって組成の異なるマグネタイトを調製するとともに、水溶液中での150300°CにおけるNi(OH)_2とCo(OH)_2に対する各種の鉄の酸化物および水酸化物の反応性を調べた。gamma-FeOOHのNi(OH)_2とCo(OH)_2に対する反応性は極めて高く、150250°CにおいていずれもNiFe_2O_4およびCoFe_2O_4を生成した。alpha-FeOOHとalpha-Fe_2O_3のNi(OH)_2に対する反応性は低かったが、微粒子状のalpha-FeOOHとalpha-Fe_2O_3はNi(OH)_2と反応することを見出した。Fe_3O_4はNi(OH)_2およびCo(OH)_2と反応しなかった。2.マグネタイトの溶解反応機構:マグネタイトの溶解速度に対する溶解速度に対する溶液条件(pH、ヒドラジン濃度、EDTA濃度、温度)の影響を調べ、反応機構を推定した。ヒドラジンを含まない場合には、pH510においてはマグネタイトの溶解は放物線則に従った。pH4では溶解反応は2段階に進行し、第1段階は放物線則、第2段階は時間指数2の速度則に従った。ヒドラジンを含む場合も反応は2段階に進行し、その濃度が0.0010.003moldm^<-3>では第1段階は放物線則、第2段階は直線則となり、0.0050.010mol dm^<-3>では第1段階は直線則、第2段階は時間指数2の速度則に従った。3.化学除染データベースの構築:水冷却型原子炉の冷却回路の化学除染に関連してクラッドの生成、転換、溶解、除染に関わるデータベースの構築を試みた。また、クラッド生成に関連する各種の鉄酸化物等の生成と転換過程およびスピネル化合物の生成について検索してみた結果を示した。また、クラッドに関わるデータの調査例として、クラッド挙動のモデリング、クラッドの放射化および冷却回路の除染につき検索した。クラッドの生成と変換に関しては、ニッケルフェライトとコバルトフェライトの生成に対する鉄の酸化物および水酸化物の種類による影響を明らかにした。まず、α-FeOOH、微粒子状のα-FeOOH、γ-FeOOH、Fe_3O_4、α-Fe_2O_3、微粒子状のα-Fe_2O_3およびγ-Fe_2O_3を調製し、これらの酸化物とあらかじめ調製しておいたNi(OH)_2あるいはCo(OH)_2をFe:NiあるいはFe:Coの比が2:1になるように計算し、テフロン製沈澱管に入れ再蒸留水を加えてよく撹拌した。その後オ-トクレ-ブにセットし、精製N_2による溶存酵素の除去後、蓋をして、150-300°Cにおいて24h加熱した。生成物をX線回折、Xスバウア分光分析等により調べ、次のような結果を得た。クラッドの溶解に関しては、Fe_3O_4の溶解について予備的結果を得た。溶解を記述する速度式は溶解剤の種類、濃度、温度、溶解率などの条件によって変化することを見出した。また、クラッドの生成と変換および溶解に関するデ-タベ-スの整備はほぼ完了した。

模擬クラッド物質の合成については,Ni(OH)_2あるいはCo(OH)_2に対するFe_3O_4,αーFeOOH、微粒子状αーFeOOH,γーFeOOHなどの反応性を調べた。X線回折では、マグネタイトとニッケルフェライトおよびコバルトフェライトの区別が不可能であることが判明したので、メスバウアスペクトルの磁気分裂の相違によって両者の区別を試みた。Fe_3O_4、αーFeOOH、γーFeOOHとNi(OH)_2から150300°Cの範囲で水熱合成した結果は次の通りである。Fe_3O_4+Ni(OH)_2では250300°CでもNiFe_2O_4は生成せず、αーFeOOH+Ni(OH)_2では275°CにおいてNiFe_2O_4が生成したが、250°Cでは生成しなかった。また、微粒子状αーFeOOH+Ni(OH)_2またはγーFeOOH+Ni(OH)_2からは150250°CでNiFe_2O_4が生成した。αーFeOOH,γーFeOOH,Fe_3O_4とCo(OH)_2からのコバルトフェライトの合成実験の結果は次の通りである。αーFeOOH+Co(OH)_2からは150と180°CではCoFe_2O_4は生成しなかったが、200°Cでは生成した。γーFeOOH+Co(OH)_2からは150250°Cのいずれの温度においてもCoFe_2O_4が生成した。Fe_3O_4+Co(OH)_2では250300°CでもCoFe_2O_4は生成しなかった。マグネタイトの溶解については,溶解速度におよぼすpH、ヒドラジン濃度、EDTA濃度および温度の影響を調べ,マグネタイトの溶解反応機構を明らかにした。マグネタイトの溶解は2段階に進行し、また、その速度は条件によって大幅に異なり、典型的な放物線則あるいは直線則に乗るものから、混合型およびそれらのいずれによっても整理できないものも認められた。クラッドの生成と変換および溶解に関するデ-タベ-スの整備もすゝめている。あと少しで完了の見通しである。
Bcngham型変分不等式に対するある種の境界値問題

ニュートン的ないしは非ニュートン的粘性流体について、その解の存在、一意性、時間的減衰、微分可能性、Blocking upの現象などはかなり解明されて来ていたが、しかしながらこれらはすべて壁面に流体が粘着していることを仮定している.ところが非ニュートン的な高分子溶液は壁面の近くで純媒質のごくうすい層が出来て、その高分子溶液が滑る現象が古くから観測されている.特にチューブの中の定常的な層流についてはいろいろがデーターも集めた.それを基にして本研究ではまずこの場合について数理的解析を行った.その際、壁面でのshare Stressのみが滑りに関係していると仮定した.この考えに基づいて境界条件を設定することが出来た.このようにして解くべき方程式を変分不等式の形にして立てる.次にこの不等式を近似して、偏微分方程式に対するNeumann問題とし、その解u_Σを求める。壁面でのshare stressをかりにgとし、それに対応する解をu_Σ,gを求める.その一意性,正則性などをしらべる,gに対してu_Σ,gを対応させる写像Tが定まる.Schananの不動点定理を用いてTの不動点g_Σを求める.そして最後にΣ→0として求めるべき解uをうる.こうして求めた解の正則性もしらべたが、通常の楕円型方程式におけるような十分な正則性は得られなかった.その原因は、このようなBingham流においては核といわれる部分が在存するからである.実際,その核のでき具合についても23の結果をうることが出来た.ニュートン的ないしは非ニュートン的粘性流体について、その解の存在、一意性、時間的減衰、微分可能性、Blocking upの現象などはかなり解明されて来ていたが、しかしながらこれらはすべて壁面に流体が粘着していることを仮定している.ところが非ニュートン的な高分子溶液は壁面の近くで純媒質のごくうすい層が出来て、その高分子溶液が滑る現象が古くから観測されている.特にチューブの中の定常的な層流についてはいろいろがデーターも集めた.それを基にして本研究ではまずこの場合について数理的解析を行った.その際、壁面でのshare Stressのみが滑りに関係していると仮定した.この考えに基づいて境界条件を設定することが出来た.このようにして解くべき方程式を変分不等式の形にして立てる.次にこの不等式を近似して、偏微分方程式に対するNeumann問題とし、その解u_Σを求める。壁面でのshare stressをかりにgとし、それに対応する解をu_Σ,gを求める.その一意性,正則性などをしらべる,gに対してu_Σ,gを対応させる写像Tが定まる.Schananの不動点定理を用いてTの不動点g_Σを求める.そして最後にΣ→0として求めるべき解uをうる.こうして求めた解の正則性もしらべたが、通常の楕円型方程式におけるような十分な正則性は得られなかった.その原因は、このようなBingham流においては核といわれる部分が在存するからである.実際,その核のでき具合についても23の結果をうることが出来た.
Infra-slow oscillation の脳機能における役割の解明

脳波に含まれる0.1Hz以下の非常に遅い律動成分としてinfra-slow oscillationが知られている。しかしその発生メカニズムや生物学的意義については分かっていない。本研究ではトランスジェニック動物作成といった分子生物学的手法によってinfra-slow oscillationのリズムを外部操作できるモデル生物を作り出し、このリズムは生物にとってどのような役割があるのかを電気生理学的手法を用いて明らかにする。
リフレクティブ構成モデルの研究

米澤グループでは、多数の並列オブジェクトとよばれる自立した実行主体(ソフトウェアモジュール)で構成されるシステムに関するレフレクションについて研究し、並列オブジェクトそれぞれあるいその一部が,自己やその外部環境に関するの[表現]を内蔵して、これを操作することにより柔軟性の高い進化が可能になるシステムの構築をめざした。その結果、そのようなシステムを記述するための2つのプログラム言語RbClとABCL/R2を設計・実装した。佐々グループでは、属性文法に基づくリフレクティブ構成モデルの研究の一環としてインクリメンタル属性評価法について研究した.まず、その基礎となるインクリメンタルLR構文解析法について研究し、属性評価の部分をつけ加え,プロトタイプを作成した.このインクリメンタルな属性評価器は,ソースプログラムを外界,属性付解析木をシステムと考えると,リフレクティブな計算モデルの実現になっている.大内グループでは、リフレクティブな関数型言語の形式的仕様を,項書き換えシステムとして実行可能なように代数的に記述する方法を確立しその結果,インプリメンテーションに先立って,項書き換えにより直接実行でき、かつ一階等式論理に基づいているので機械的な推論にがある程度可能になった。また実際にBrownというリフレクティブ言語の代数的仕様を作成し,それをCLOS(Common Lisp Object System)で実装した。中島グループでは、リフレクションのマルチメディアUIMSへの応用について研究した。マルチメディアUIMSでは、今までのUIMSとは違い動画、音声などの動的なデータを扱う必要がある。さらに、マルチメディアのデータ一般を統一的に扱うためには、動画、音声などの基本的なデータを組み合わせたデータを考える必要がありこのような複合データは、再生順序などの制御の概念を含んおり、この複合データをリフレクションの概念を使って系統的に管理することに成功した。
植物の鉄結合性ユビキチンリガーゼによる鉄栄養制御

(1)鉄との結合状態がHRZのタンパク質分解と細胞内局在に与える影響の解析:OsHRZ1、OsHRZ2の全長または部分配列とGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換イネの作製と解析を続行した。鉄・亜鉛が主に結合するN末端側領域を導入すると、根でタンパク質の発現が検出された。GFP蛍光のパターンとタンパク質の蓄積量から、HRZのN末端側領域には、鉄栄養条件に応答して自身のタンパク質の安定性と局在を変化させる領域があることが示唆された。(2) HRZが鉄硫黄クラスターと結合して機能を変化させるかどうかの検証:2種類の鉄硫黄クラスター合成・輸送に関わると期待される遺伝子の発現量を変化させた形質転換イネを作製した。これらのイネは鉄欠乏耐性が変化したことから、当該遺伝子が鉄ホメオスタシスに関与することが明らかになった。(3) HRZによるユビキチン化標的タンパク質の同定と解析:前年度に見いだした標的候補遺伝子の発現量を変化させた形質転換イネを作製した。これらのうち3種類は鉄欠乏耐性が変化したことから、鉄ホメオスタシスに関与することが明らかになった。また、大腸菌でリコンビナントタンパク質を作製し、in vitroユビキチン化アッセイおよび根細胞抽出液によるin vitro分解アッセイを行ったところ、3種類がHRZのユビキチン化、分解の標的タンパク質である可能性が示された。以上のことから、HRZは鉄ホメオスタシスに関与するタンパク質をユビキチン化、分解することにより機能する可能性が考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。(1)鉄との結合状態がHRZのタンパク質分解と細胞内局在に与える影響の解析:ドメインに変異または欠失を導入したHRZとGFPとの融合遺伝子を発現する形質転換イネを数種類作製した。これらのイネを鉄十分条件および鉄欠乏条件で水耕栽培し、共焦点レーザー顕微鏡でGFPを検鏡した。完全長のHRZを導入したイネでは、HRZ-GFP融合タンパク質の発現はほとんど観察されなかったが、Zn finger、RING finger、Rubredoxin-type foldを含むC末端側のドメインを欠失したHRZを導入したイネでは明確な発現が観察された。鉄栄養条件により発現量と細胞内局在が変化する傾向がみられた。(2) HRZが鉄硫黄クラスターと結合して機能を変化させるかどうかの検証:2種類の鉄硫黄クラスター合成・輸送に関わると期待されるタンパク質がHRZと相互作用することを酵母two-hybrid法とpull-down法により明らかにした。このタンパク質の発現量を変化させた形質転換イネの作製に着手した。(3) HRZによるユビキチン化標的タンパク質の同定と解析:酵母two-hybrid法とプロテオーム比較解析により、HRZのユビキチン化基質タンパク質の候補を見いだした。これらの候補タンパク質のうち、鉄栄養制御に関わる可能性の高いものについて、当該タンパク質の発現量が変化していると期待されるトランスポゾンおよびT-DNA挿入変異体イネを取得し、次世代の種子を採取した。また、特に有望な候補タンパク質については発現量を変化させる形質転換イネの作製に着手した。HRZが鉄欠乏応答性遺伝子の発現だけでなく、ジャスモン酸経路に関わる遺伝子の発現も制御することを発見した。さらに、鉄欠乏のごく初期にジャスモン酸シグナリングが活性化することを見いだした(Kobayashi et al. 2016Plant Mol. Biol. in press)。(1)鉄との結合状態がHRZのタンパク質分解と細胞内局在に与える影響の解析:ドメインに変異または欠失を導入したHRZとGFPとの融合遺伝子を導入したイネの多くは形質転換効率が低く、解析に必要な系統数を確保するのに苦労している。また、鉄栄養条件により発現量と細胞内局在が変化する傾向について、個体差・系統間差が存在するため、統一的な見解を得るまでに至っていない。(2)HRZが鉄硫黄クラスターと結合して機能を変化させるかどうかの検証:おおむね順調に進展しているが、人手の制約により鉄硫黄クラスターの生化学的調査については後回しになっており、有効な実験系の構築に至っていない。(3)HRZによるユビキチン化標的タンパク質の同定と解析:ほぼ予定通り進行している。鉄欠乏応答とジャスモン酸シグナリングの関連に関する論文を出版することができた(Kobayashi et al. 2016Plant Mol. Biol. in press)。

(3) HRZによるユビキチン化標的タンパク質の同定と解析:前年度に見いだした標的候補遺伝子の発現量を変化させた形質転換イネを作製した。これらのうち3種類は鉄欠乏耐性が変化したことから、鉄ホメオスタシスに関与することが明らかになった。また、大腸菌でリコンビナントタンパク質を作製し、in vitroユビキチン化アッセイおよび根細胞抽出液によるin vitro分解アッセイを行ったところ、3種類がHRZのユビキチン化、分解の標的タンパク質である可能性が示された。以上のことから、HRZは鉄ホメオスタシスに関与するタンパク質をユビキチン化、分解することにより機能する可能性が考えられた。(1)鉄との結合状態がHRZのタンパク質分解と細胞内局在に与える影響の解析:ドメインに変異または欠失を導入したHRZとGFPとの融合遺伝子を導入したイネの作製を継続し、多くの系統を解析に供することにより上述の問題点の解決を試みる。また、酵母を用いた実験系およびin vitro実験系の構築を試みる。(2)HRZが鉄硫黄クラスターと結合して機能を変化させるかどうかの検証:作製中の形質転換イネの種子が取得でき次第、次世代を鉄十分条件および鉄欠乏条件で水耕栽培し、導入遺伝子の発現量、鉄欠乏応答およびHRZのタンパク質発現量を調査する。有望な結果が得られた場合、鉄硫黄クラスターの生化学的調査について実験系の構築に着手する。(3)HRZによるユビキチン化標的タンパク質の同定と解析:入手した変異体および作製中の形質転換イネについて、次世代を鉄十分条件および鉄欠乏条件で水耕栽培し、導入遺伝子の発現量、鉄欠乏応答およびHRZのタンパク質発現量を調査する。また、in vitro系によるユビキチン化反応の検証を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。