hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
咳嗽能力判定システムの開発

咳嗽時の胸腔内圧の変化,肺・胸郭のコンプライアンスを測定し,標準的な咳嗽モデルを作成することで,呼吸筋力,肺活量という臨床上測定可能なパラメータから容易に咳嗽時の流量波形をシミュレーションすることが可能となった.妥当性の検討では,7割は良好なシミュレーションが得られたが,約3割は低い値を示した.実測値が低かった対象者は全て咳嗽時の呼気量が肺活量の半分以下であったことから,咳嗽のスキルが低いことが原因と考えられた.これらに関していくつかの関連学会で発表し,座長推薦を受けた.現在投稿に向けて論文執筆中である.本研究は,声帯部分の抵抗を電気回路の可変抵抗で表したオリジナルの咳嗽モデルで流量波形をシミュレーションするものである.今年度は,健常若年男性に食道バルーンを用いて,咳嗽時の胸腔内圧の変化を測定し,シミュレーションに利用した.これによって,シミュレーションの精度が飛躍的に向上した.但し,まだ被験者が少ないため,今後被験者を増やして行き,標準的な咳嗽時の胸腔内圧の変化を作成し,それを元に標準的な咳嗽時の流量波形を作成していく予定である.また,現在の標準モデルを他の被験者に利用して,シミュレーションしたところ,約70%は良いシミュレーションが得られたが,30%は実際の波形の方が低い傾向を示した.原因は,咳嗽時の呼気量が肺活量の30%程度と非常に低かったことと考えられた.これは,シミュレーションの精度の問題と言うよりは,咳嗽のスキルの問題と考えられ,トレーニングや指導をすることで,咳嗽力を高くすることが可能と考えられた.ある意味,シミュレーションが有効であることを示していると考えた.今年度は,日本理学療法士学会,日本呼吸ケアリハビリテーション学会の各学術大会で演題を発表した.既に平成27年度の日本呼吸器学会では発表済みであり,日本理学療法士学会,日本呼吸ケアリハビリテーション学会には演題を登録した.また,27年度は欧州呼吸器学会にも演題を登録しており,発表予定である.平成27年度の予定としては,標準モデルを完成させるために健常者のデータ収集に努める予定.十分なデータが得られば,健常高齢者,呼吸器疾患患者の測定も行い,その精度や咳嗽力低下の原因判定について検討したいと考えている.本研究は,声帯部分の抵抗を電気回路の可変抵抗で表したオリジナルの咳嗽モデルで,流量波形をシミュレーションするものである.今年度は食道バルーンを用いて胸腔内圧を測定し,シミュレーションに利用しており,精度の高いシミュレーションモデルが完成しつつある.但し,まだデータは十分でないため,来年度も継続して測定する必要がある.また,今年度は消化器外科,呼吸器外科,食道癌手術前後の咳嗽時の流量波形の測定を始めている.術後の咳嗽力低下は,創部痛,肺活量低下,呼気筋力低下だけでなく,声帯機能の低下の影響が大きいことを発見し,理学療法士学会や呼吸ケア・リハビリテーション学会,欧州呼吸器学会で報告した.食道癌では声帯麻痺が起こりやすく,特に声帯機能の影響を受けやすいと思われる.これに関しては来年度報告予定である.平成28年度の予定としては,健常者のデータを測定し,標準モデルを完成させる.術後患者のデータを整理し,術後の咳嗽力低下の原因をシミュレーションモデルから明らかにしていく.また,健常高齢者,他の呼吸器疾患患者についても測定し,咳嗽力低下の原因について検討したいと考えている平成27年度は,食道バルーンを用いて胸腔内圧を測定し,標準的なモデルを完成させる事であった.しかし,食道バルーンが侵襲的なものであることから対象者が集まりにくく,また測定手技も難しいため,完成には至らなかった.但し,スキルの高い研究室の仲間に測定の協力依頼をしており,来年度には十分達成できると考えている.一方,有疾患患者に関して消化器外科,呼吸器外科,食道癌手術における周術期の咳嗽については既に測定を始めており,この点については進んでいる状況である.本研究は,声帯部分の抵抗を電気回路の可変抵抗で表したオリジナルの咳嗽モデルで,流量波形をシミュレーションするものである.今年度は食道バルーンを用いて胸腔内圧を測定し,シミュレーションに取り入れ,精度の高いシミュレーションモデルがほぼ完成した.現在データをまとめて関連学会へ発表の準備をしている.また,今年度は簡易型の機器を用いて消化器外科,呼吸器外科,食道癌手術前後の咳嗽時の流量波形の測定をしている.術後の咳嗽力低下は,創部痛,肺活量低下,呼気筋力低下だけでなく,声帯機能の低下の影響が大きいことを発見した.食道癌では声帯麻痺が起こりやすいとされているが,我々のデータでも声帯機能の影響を受けやすい傾向を認めた.これら研究成果についても現在関連雑誌への投稿を進めている.本研究の結果,咳嗽時の流量波形のシミュレーションが可能となり,咳嗽力低下の要因が推定できる事が示唆された.しかし現状では精密機器での結果であり,臨床適応可能な簡易型の機器では,まだその精度は不十分である.上記で述べた臨床データも多くの機器を用いての結果であり,咳嗽時の流量波形の解析までは進んでいない.本研究の最終目標は,咳嗽波形のみで咳嗽力低下の要因を判定する事であるため,与えられた研究期間では最終目標に達することが出来なかった.

今後は簡易型のスパイロメーターを用いて,現行の機器と同等の評価が可能か明らかにしていく必要がある.そして簡易型の機器での測定精度を高め,シミュレーション波形との相違点から,周術期患者の咳嗽能力低下のトレンドだけでなく,その要因についても明らかにしていきたい.咳嗽時の胸腔内圧の変化,肺・胸郭のコンプライアンスを測定し,標準的な咳嗽モデルを作成することで,呼吸筋力,肺活量という臨床上測定可能なパラメータから容易に咳嗽時の流量波形をシミュレーションすることが可能となった.妥当性の検討では,7割は良好なシミュレーションが得られたが,約3割は低い値を示した.実測値が低かった対象者は全て咳嗽時の呼気量が肺活量の半分以下であったことから,咳嗽のスキルが低いことが原因と考えられた.これらに関していくつかの関連学会で発表し,座長推薦を受けた.現在投稿に向けて論文執筆中である.平成26年度は咳嗽時の胸腔内圧を測定し,標準的な咳嗽モデルを作成することであった.しかし,研究者本人の体調不良(頚椎症)のため,十分に実験を行うことが出来なかった.現在は回復しているため,今後実験を進めることは十分に可能と考える.一方,まだ不十分ではあるものの,現時点での標準モデルを用いて,他の健常者の咳嗽時流量波形をシミュレーションを実施したところ,比較的良好な結果が得られ,良い感触は得ている.平成27年度は,食道バルーンを用いて胸腔内圧を測定し,標準的な咳嗽モデルを完成させる事であったが,上記のごとく十分にはデータが集まらなかった.既に研究室内で協力依頼をしており,来年度には完成可能と思う.一方,呼吸器外科などの有疾患患者については,既に測定を開始しており,今後もデータ収集を継続する予定である.高齢者については,地域の健康増進教室の日程に合わせて測定する予定である.既に関係者には内諾済みである.呼吸理学療法平成26年度は咳嗽時の胸腔内圧を測定し,標準的な咳嗽モデルを作成することであったが,上記のごとく研究者の体表不良のため十分に進まなかった.今年度は,昨年度の続きを実施していく予定である.既に,研究室仲間に被験者および研究協力の承諾は得ているので,順調に進むと考えている.健常高齢者については,地域の健康増進に関わっている研究者の協力を得られることが決まっており,標準モデルが出来た段階で,健常高齢者の測定も可能になると考えている.平成27年度は,上記のごとく食道バルーンの測定が進まなかったため,謝金や消耗品が少なかった.また周術期の測定については,謝金が発生しなかったことも1要因である.平成26年度は,研究者の体調不良のため十分に測定が出来ず,謝金や消耗品が発生しなかった.平成28年度は被験者を増加させるため,その分を謝金と消耗品に当てる.現在,研究の一部をまとめ投稿の準備をしている.その掲載料や各種学会での発表にも利用する予定である.平成27年度は,研究の遅れを取り戻すために測定を増加させ,10人分の謝金に充てる予定である.
合成ハイドロキシアバタイト熱分解産物の骨セメントとしての応用

合成ハイドロキシアパタイト(HAp)の熱分解産物を水と混和すると泥状となった後硬化し再び純粋なHAPを生ずる。これをアパタイトセメントと呼んでいるが、この新しい自己硬化型材料の骨親和性、力学的強度、生体内毒性試験、および閉経後モデル動物生体内における組織親和性について調査検討した。(1)家兎大腿骨内に注入し経時的にX線像、非脱灰組織標本像により親和性を評価した。注入後2、4、9週ではアパタイトセメントは一塊となっており、X線回折でHApであることを確認した。2週で既に周囲に新生骨の形成が起こっており、骨とHApの界面をSEM像で観察すると介在物は存在しなかった。この傾向は観察期間中見られ、良好な骨親和性が認められた。(2)次に同様にして大腿骨内にアパタイトセメントを注入し3日、1、4、8、週後の力学的強度を測定した。大腿骨を円柱状に採型し圧縮強度、押し出し強度を測定した。圧縮強度は4週後で50MPa以上とPMMAセメントの約70%を示し、押し出し強度はPMMAセメントを凌いでおり、力学特性の面でも実用性が証明された。(3)臨床応用に係わる生体内安全性の検討を行った。急性毒性試験として、アパタイトセメント抽出液をラット静脈内に注射し状態を観察した。亜急性毒性試験としてラット皮下、腹腔内、筋肉内埋入後、1、2、4週で屠殺し全身状態、血液生化学所見、埋入部位組織像を評価した。慢性毒性試験として、家兎大腿骨内に注入し26週、52週で屠殺し短期試験と同様の検討を行った。いずれの毒性試験でも毒性の所見はみられなかった。(4)骨粗鬆症モデルラット大腿骨内注入実験では、新生骨形成が対照群では4週から見れていたのに対して、8週後からと遅かったが、経時的に新生骨面積は漸増し、良好な骨伝導能を有していた。以上よりアパタイトセメントは有望な自己硬化型材料であり将来の臨床応用に期待ができると考察された。1,ハイドロキシアパタイト熱分解産物を家兎大腿骨骨随内に注入した組織反応ハイドロキシアパタイト熱分解産物すなわちα型リン酸三カルシウムとリン酸四カルシウムの粉末体10gに1.7%リン酸ナトリウムと1.7%クエン酸ナトリウムを含有する水を3.5ml添加,泥状とし,NSWラビット(体重26202860g)28羽の大腿骨骨随内に注入した。埋入後2,4,9週で屠殺,軟X線撮影後,非脱灰標本を作成した。X線像では2,4,9週のいずれの時期でも全例本材料は一塊となっており,本材料周囲に骨透明像は見られなかった。屠殺時,肉眼所見でも本材料は骨随内で骨随内で硬化しており,組織像ではすでに2週で一部本材料周囲に新生骨が新生骨が接していた。4週以降では本材料表面でほぼ全周性に新生骨が接していた。X線回折では摘出したセメントはすべてハイドロキシアパタイトであった。SEM像でも骨との境界面に軟部組織の介在は認められなかった。また,エネルギ-分散型X線分光分折法(EDXA)スペクトルでは皮質骨とセメントとのカルシウム,リンの比は同じであった。

以上の結果より本材料は家兎骨随内においても硬化し,100%純粋なハイドロキシアパタイトとなり,極めて良好な骨親和性を有することが判明した。2.ハイドロキシアパタイト熱分解産物のマウス腹腔内大量投与ウイスタ-系白色ラット雄8週齢18匹の腹腔内,皮下にハイドロキシアパタイト熱分解産物の硬化体0.3gを投与した。投与後7,14,28日(各群3匹)では死亡したラットはいなかった。局所の炎症反応もみられず,血液生化学検査でも異常はみられなかった。今年度は,合成ハイドロキシアパタイト熱分解産物の骨セメントとしての応用,可能性を探るために,骨髄内および軟部組織内における力学的強度,毒性実験(投与量と各臓器におよぼす影響)について実験を施行した。1,力学的強度について日本白色家兎60羽の大腿骨をリ-ミングの後,アパタイトセメントおよび対照としてPMMAセメントを注入し,術後3日,1週,4週,8週,12週で各6羽ずつ屠殺し。大腿骨を摘出し内部の硬化物を3mmφX3mmの円柱状に採型し力学試験機(島津オ-トグラフAG500A)にてクロスヘッド速度1mm/minで荷重を加えて圧縮強度および押し出し強度を測定した。また周囲の骨との反応を観察した。アパタイトセメントの圧縮強度は術後4週で平均50MPa以上に達し以後維持された。これはPMMAセメントの約6070%の強度だった。また,押し出し強度は経過中,PMMAセメントに比べて有意に大きかった。さらにアパタイトセメントの周囲には炎症反応の所見なく,新生骨が形成され,アパタイトセメントとその新生骨は介在組織なしに,直接,接していた。したがってアパタイトセメントは組織学的に生体親和性を有するだけでなく,力学特性の面からも自己硬化型生体材料(いわゆる骨セメント)として十分に有用であると考察された。2,毒性試験について生後6週齢のラット30匹の皮下組織内にアパタイトセメント0.3gをエ-テル麻酔下に注入した。注入前・注入後1週,2週,4週で血液・生化学検査を施行し,短期の毒性及び軟部組織との反応を検討した。注入後は白血球の軽度増加および軽度の炎症反応を認めたものの,組織学的に明らかな炎症所見はなかった。また,屠殺後,主要臓器に関しては,炎症所見および異常所見は認めなかった。今後は,アパタイトセメントを長期に注入したあとの長期毒性・耐久性についてさらなる検討が必要と思われた。今年度は,合成ハイドロキシアパタイト熱分解産物(アパタイトセメント)の骨セメントとしての応用,可能性を探るために,前年度に引き続き,長期毒性実験を行い,また,閉経後骨粗鬆症モデルとして卵巣摘出後の動物骨髄内における組織反応について実験を施行した。1,毒性試験について体重2-2.5kg日本白色種家兎18羽を,高容量(3g)埋入群,低容量(1g)埋入群,手術のみ群の3群に分け,大腿骨骨髄内にアパタイトセメントを埋入,埋入後26週,52週で血液・生化学検査を施行し,慢性の毒性及び主要臓器,埋入周囲組織との反応を検討した。埋入後,白血球の軽度増加および軽度の炎症反応を認めたものの,組織学的に明らかな炎症所見はなかった。また,屠殺後,主要臓器に関しては,炎症所見および異常所見は認めず,アパタイトセメントを比較的長期に埋入した後の毒性も,前年度に報告した埋入後短期の毒性と同様,低いと考察された。2,卵巣摘出後の動物骨髄内における組織反応8週齢ウィスター系雌ラット36匹中,24匹に両側卵巣摘出術を施行し,閉経後骨粗鬆症モデルを作成,9ヵ月後に右大腿骨内にアパタイトセメントを埋入した。対照には残り12匹を使い,同様にアパタイトセメントを埋入した。術後
近代ドイツにおける文学とメディアの関連性-J.W.ゲーテを中心に-

まずはじめに、印刷技術の発展と識字運動の浸透によって書物という媒体が普及し、読者という大衆が成立した近代ドイツの社会的背景を明らかにした。次に、こうしたメディア変革に伴うコミュニケーションの変容、すなわち、口承から書承、音読から黙読へ向かう伝達の問題性を、『若きウェルテルの悩み』や『親和力』をはじめとするゲーテの文学作品において分析した。この成果は、平成13年6月に催された日本ゲーテ協会のシンポジウムにおいて口頭発表された後、論文「音読から黙読へ-ゲーテ時代における書籍メディアと読書行為-」として学会誌『ドイツ文学』107号に掲載された。本研究ではさらに、こうした書籍メディアの発展を、その渦中を生きたゲーテ自身との関連において分析した。つまり、自伝『詩と真実』を主要テクストにして、(1)初期のゲーテがフランクフルトとライプツィヒという書籍文化の中心都市に生活していた点、(2)彼が、当時ドイツ語圏で蔓延していた盗版に悩まされていたこと、また、そのため彼が、まだ確立していなかった「著作権」という作者のステータスをめぐって、出版社やドイツ連邦と度重なる交渉を強いられたこと、(3)最後に、彼が書籍メディアを通じて作家的成功を収めたにもかかわらず、読者という大衆に疎外感を味わっていたこと、特に、彼が晩年において、書承のあり方を否定して口承に固執する姿勢を見せたことを論究した。この論文「ゲーテを取り巻く印刷・出版文化とその展開--『詩と真実』の視点から-」は、平成14年10月発刊予定の『ゲーテ年鑑』44号に掲載される予定である。(1)ゲーテ時代における書籍メディアをめぐる諸状況、つまり印刷技術や識字教育の実態、さらに著作権が確立して文学作品が商品として市場に流通する経緯を、メディア技術史、社会文化史視点から調査した。その結果、特に十八世紀後半のドイツ語圏においては、書物の出版件数が飛躍的に増加し、口承文化から印刷・出版文化への過渡期にあたることが確認された。ただし、職業としての作家の地位に関しては、著作権や印税等の経済的条件が依然として劣悪であり、その確立は出版先進国であるイギリスに大きく遅れをとっている事実が判明した。(2)上記の分析によって得られた結果を、ゲーテ自身の文学作品を通じて検証する作業を行った。そのために、ドイツ古典出版社の最新版ゲーテ全集、およびメディア関係のゲーテ研究書を購入した。この研究は継続中であるが、現段階においては、口承から書承という先のメディアの変遷がゲーテ文学の中では「音読から黙読へ」というコミュニケーションの変化となって現れ出ている点1)と、彼が劣悪な文筆業の地位を憂慮してその向上を訴え続け、ドイツ語圏で初めて著作権を獲得した点2)が確認された。(3)現在、メディア分析をゲーテ文学研究に援用する本研究のモデルとして、小説『親和力』に関するデータベースを作成している。今のところ、この小説においては、口承-書承-映像というゲーテ時代のメディアの変遷が、かなり色濃く反映されていることが検証されている。将来的には、この結果をゲーテ文学一般に敷衍することになる。なお、(1)(2)の研究成果は、一本の論文にまとめて学会誌に投稿した。(現在掲載審議中)まずはじめに、印刷技術の発展と識字運動の浸透によって書物という媒体が普及し、読者という大衆が成立した近代ドイツの社会的背景を明らかにした。
GDP結合型G蛋白質と受容体とのイニシャルコンタクトのメカニズム

受容体によるG蛋白質の活性化においては、まず活性化するG蛋白質サブタイプの選別が行われ、その後に効率のよい活性化が行われると考えられる。脊椎動物のロドプシンはGtを含むGiグループのG蛋白質を高効率に活性化するが、その活性化にはG蛋白質αサブユニットC末端領域が関わることが知られている。そこで本研究では、ロドプシンとG蛋白質とのイニシャルコンタクトに対する、G蛋白質αサブユニットC末端領域の関わりを解析した。これまでに、ヌクレオチド非結合型G蛋白質が結合するロドプシン中間体(MetaII)に先んじて、GDP結合型G蛋白質が結合するMetaIb中間体を見いだしている。前年度にGiαサブユニットC末端11アミノ酸配列をGq、Gs、Goの配列に置換した変異体でロドプシン中間体との相互作用の解析を行った。本年度は、さらにG蛋白質の選択的結合に関わる領域を絞るために、C末端5アミノ酸配列を置換した変異体で解析を行った。その結果、GiグループのGoの配列に置換すると中間体との相互作用が見られたが、GqやGsの配列に置換すると中間体との相互作用は見られなかった。また、G蛋白質αサブユニットC末端領域でよく保存されている2カ所のロイシン残基がMetaIb中間体との結合に果たす役割を検討するため、これらの残基に変異を施したGi変異体を作製し、ロドプシンとの相互作用を測定した。その結果、どちらかのロイシン残基を置換するだけで、MetalIだけでなくMetaIbとの相互作用も大きく減少することを見いだした。これらの結果は、G蛋白質αサブユニットC末端5アミノ酸の配列や、2つのロイシン残基が関わるこの領域の構造形成が、受容体とG蛋白質とのイニシャルコンタクトの段階で深く関わることを示している。研究計画書に記載の実験計画に従い、以下の研究を行った。我々は、ロドプシンを実験材料とすると、Gタンパク質の活性化機構を時間分解能の高い分光学的手法を用いて観測できることに着目して研究し、従来ロドプシンのGタンパク質活性化中間体と考えられてきたメタII中間体の前に新たにGタンパク質と相互作用する中間体(メタIb)を発見した。この状態はGタンパク質とのイニシャルコンタクト(状態I)の状態であると考えられる。そこで、この状態でGタンパク質サブタイプの選別が行われているかを検討するために、C末端アミノ酸が各種のGタンパク質サブタイプの配列になったGi-α-サブユニットの変異体を発現させ、ウシ網膜から調製したロドプシンを含む膜試料と混合し、これらのGタンパク質存在下でのメタIbおよびメタIIの挙動変化を測定した。その結果、GiグループであるGoのC末端アミノ酸配列をもつGタンパク質はメタIbと相互作用し、そのアフィニティーの強さはGt(Gi)のC末端アミノ酸配列をもつGタンパク質に比べて約1/2であった。また、このGタンパク質はメタIIとも相互作用し、そのアフィニティーの強さはメタIbの場合と同様約1/2であった。一方、GqおよびGsタイプのC末端アミノ酸配列をもつGタンパク質とは、両中間体ともに相互作用しないという結果が得られた。以上のことから、メタIbですでにGタンパク質サブタイプの選別が行われていることが明らかになった。なお、培養細胞系で発現させたロドプシンおよび細胞外第3ループをGo共役型ロドプシンの細胞質に置換したロドプシン変異体については、かなりの試料を要する分光学的な実験をするためには発現系の効率的な整備が必要であることがわかった。
骨軟部腫瘍の地域差と家族内発生に関する病理疫学的並びに分子疫学的研究

沖縄、九州及び東京の3地区の骨軟部腫瘍の頻度を比較した。沖縄(琉球大)での頻度は、最近19年間に骨悪性腫瘍については、骨肉腫30/66(45%)、軟骨肉腫14/66(21%)、Ewing肉腫13/66(29%)、悪性リンパ腫3/66(5%)、骨髄腫3/66(5%)、MFH3/66(5%)、軟部悪性腫瘍については、脂肪肉腫14/55(26%)、滑膜肉腫9/55(16%)、MFH6/55(11%)、悪性リンパ腫6/55(11%)、平滑筋肉腫3/55(6%)、骨良性腫瘍については、骨嚢腫52/239(22%)、外骨腫42/239(17.5%)、線維性異形成40/239(17%)、非骨化性線維腫24/239(10%)、骨巨細胞腫19/239(8%)、内軟骨腫16/239(7%)、良性軟部腫瘍については、血管腫33/125(26%)、脂肪腫29/125(23%)、神経鞘腫16/125(13%)、腱鞘巨細胞腫12/125(10%)、弾性線維腫11/125(9%)という結果を得た。九州地区(産業医大)の19851994年の10年間の検索では、Ewing肉腫6/70(9%)、滑膜肉腫5/277(2%)、骨嚢腫46/486(9%)、腱鞘巨細胞腫74/4,884(2%)、弾性線維腫(0%)であった。東京地区の19851994年の10年間の検索で、東大例では、Ewing肉腫6/85(7%)、滑膜肉腫11/142(8%)、骨嚢腫13/155(8%)、腱鞘巨細胞腫25/1,059(2%)、弾性線維腫3/1,059(0.3%)であった。以上の結果より、骨悪性腫瘍では、沖縄には九州及び東京に比してEwing肉腫が多く、軟部悪性腫瘍では滑膜肉腫の多いこと、骨良性腫瘍では骨嚢腫が沖縄に多く、軟部良性腫瘍では、弾性線維腫と腱鞘巨細胞腫が沖縄に多いことが明らかになった。沖縄に多い弾性線維腫については、町並らは岩政より送られた検体の培養に成功し、3例中1例に染色体異常を認めた。その他、班員が各自骨軟部腫瘍についての研究発表を別紙の通り行った。
「史料」としての教育関係映画フィルムの整理、分析及び利用に関する基礎的研究

本研究は、教育関係映画フィルム史料を文書史料と並ぶ教育研究上の基本素材として活用するための調査分析及び利用方法の開発を目的として前年度(昭和62年度)がら着手した課題を堀り下げ、その成果をふまえ、次年度以降に予定している隣接領域の関係者を交えた総合的研究へと発展させるための準備的性格をもつものとして企画、実施された。本研究においては、関係映画フィルムの所在を確認し、その視聴を経て、主要な作品については忠実度の高い複製品を得て、内容の精査分析を行うことに調査研究の重点を置いた関係上、所要経費のほとんどが調査旅費及び著作権使用料を含めた複製品(フィルム、ビデオテープ)の購入経費で占められている。前年度(150万円)及び本年度(230万円)の研究費により、全国に散在する関係フィルム史料をほぼ把握することができ、最も重要度の高い作品群については、それらの複製品を研究素材として確保することができた。ことに、文書にくらべ格段に整備が立ち遅れている教育・文化・記録映画フィルムの所在状況を、内容の視聴をふまえてまとめ得たことは、特筆に価する成果であり、単に文化財としての当該フィルムの保存上の意義に止らず、今後の当該フィルムに関する研究分析の進歩上、不可欠の基礎資料となろう。上記の成果をふまえて、当該研究の一層の深化と発展を期するためには人間形成論、コミュニケーション論、映像分析論、視覚行動論、映画文化論など、諸般の専門家を加えた共同研究体制を組み、関連諸課題に対処する必要がある。この観点から、次年度以降3年計画で、全国の関係者を網羅した総合研究への展開を計画している。
実空間手法を用いた強磁場ナノ領域電子相の解明

強磁場下において実空間上の局所的な物性を研究する手段として、走査トンネル顕微鏡(STM)、磁気光学イメージング、走査ホール素子顕微鏡、スピン偏極イメージングの手法を開発した。特に、初めてハイブリッドマグネットを使った27テスラの磁場中でSTM観察に成功した。また、超低ドリフトSTMの開発に成功した。これらのテクニックを利用して、新奇強相関物質や2次元電子系のナノ-マイクロ領域における電子・磁気的状態の研究をおこなった。(1)強磁場中における強相関電子系物質のナノ電子状態を明らかにするために、30T級ハイブリッドマグネット中で使用可能な小型の走査トンネル顕微鏡(STM)ヘッドの試作を行った.また、RHK社のSTMコントローラ(設備備品,SPM1000)を導入し、自作のSTMヘッドの動作テストとハイブリッドマグネット環境での測定システムの作製を行った.(2)数テスラ程度の磁場における層状ルテニウム酸化物の磁気抵抗異常の原因を探るため、超伝導磁石中での磁気光学観察を予定しているが、現有のシステムでは光学像の焦点が観察を行う低温において鏡筒の熱収縮により室温と比べ大幅に変化する。本年度は、この収縮を補正する為の機構を大型ヘリコイドを用いて作製した。(3)超高真空、0.4Kから20Kまでの温度、最大11Tまでの磁場中で、原子レベルで同一視野の原子分解能STSが可能なSTMを開発した。このSTMを用いて高温超伝導体(Ca, Na)_2CuO_2Cl_2の低エネルギー電子状態マッピングを行い、超伝導に起因すると思われるギャップ構造とその磁場依存性の観測に成功した。(4)低温強磁場での量子ホール状態にある2次元電子系の電位分布を計測するシステムを構築し、電流分布のイメージングを行った。ZnSe/BeTeタイプII量子構造での発光の詳細を微細開口マスクを併用した空間分解測定から調べ、光励起で生成されたキャリアが面内方向にマクロな距離伝播することを明らかにした。(5)第II種超伝導体の混合状態の電子論を発展させた.特に、磁場中の熱力学量の測定からいかに超伝導体のノードの様子等のギャップ構造を知ることができるかを理論的に検討した.その結果、低温の磁場中比熱の精密測定からギャップ異方性の度合いを定量的に見積もることができることを明らかにした.(1)強磁場中における強相関電子系物質のナノ電子状態を明らかにするために,小型の走査トンネル顕微鏡(STM)を作製した。30Tハイブリッドマグネット,18T冷凍機冷却マグネット環境下で特性評価を行ない、環境ノイズがSTMの原子分解能に与える影響を明らかにし、対策を進めた。(2)STM/STSによって高温超伝導体(Ca,Na)_2CuO_2Cl_2の低エネルギー電子状態マッピングを行い、d波超伝導に特有な準粒子'干渉効果を発見し、転移温度にフェルミアークの実効的長さが関連していることを明らかにした。更に、準粒子干渉効果の磁場依存性の測定に成功し、散乱前後に準粒子が感じる秩序パラメータの符号によって磁場効果が大きく異なることを発見した。また,酸化物高温超伝導体YBa_2Cu_3O_yのSTM測定を7Tまでの磁場中で行い,CuO_2面の電子状態が磁場によって変調されることを観測した. (3)Sr_4Ru_3O_<10>における遍歴メタ磁性転移に伴う抵抗の異常の原因を明らかにするため、H//cにおける磁気光学観察を行った結果、磁化の温度依存性に対応するほぼ均一な強磁性状態を確認した。一方、H//abにおける磁化-磁場曲線の角度依存性を詳細に測定し、メタ磁性転移磁場が面内磁場一定から大きく逸脱することを明らかにした。(4)GaAs結晶のポッケルス効果を用いた低温・強磁場中の2次元電子系における電位分布のイメージング装置を構築し、量子ホール効果における電流分布および量子ホールブレークダウン現象について調べた。(5)実験グループとの連携の下に、高温超伝導体を念頭におき,渦のSTM実験の基礎理論を展開した.特に高磁場STMで観測可能な常磁性効果の効いた特異な渦の電子構造を研究した.更に高磁場領域で期待されるFulde-Ferrell-Larkin-Ovchinnikov状態の微視的理論を発展させた.(1)小型、高剛性、低ノイズのSTM装置を作製し、世界で始めて18T-無冷媒超伝導マグネット中でHOPGの原子像観察に成功した。この技術を30Tハイブリッドマグネット中で実現するためのシステムを構築した。(2)フーリエ変換分光イメージングSTMによって、高温超伝導体(Ca,Na)_2CuO_2Cl_2における準粒子干渉パターンの磁場依存性を調べd波超伝導状態固有のコヒーレンス効果を観測した。高温超伝導の対形成機構に関する情報が得るために、同様の測定を非超伝導領域まで拡張することによって、高温強磁場領域への測定の拡張を行った。

(3)Sr_4Ru_3O_<10>における遍歴メタ磁性転移(H//ab)に伴う抵抗の不連続な変化の起因を探るため局所磁場分布を測定した。その結果、メタ磁性磁揚以上で磁場分布が大幅に均一化することを明らかにしそのメカニズムを議論した。(4)ポッケルス効果を用いたGaAs2次元電子系の低温・強磁場中の電位分布と量子ホール電流密度のイメージング装置を構築し量子ホールブレークダウンの機構について調べた。また、量子ホール状態にある2次元電子のスピン分極を超高感度なKerr回転計測を用いて調べ、スピン緩和のダイナミクスやスピン偏極度の占有数依存性についての知見を得るとともに、電子スピンイメージング装置を構築した。(5)国内外の実験グループとの緊密な連携の下に磁場下の超伝導体の基礎研究を遂行した.渦糸からなる混合状態に対するパウリ常磁性効果を微視的理論に基づいて計算した.その結果いくつかの熱力学量に特徴的な現象が生じることを見出した.TmNi2B2Cの小角中性子回折実験,CeCoIn5,CeRu2の低温比熱実験や磁化測定でそれらを実証した.・強相関電子系物質の強磁場中におけるナノ電子状態を解明するために、以下の走査トンネル顕微鏡(STM/STS)の開発とそれに基づく電子状態の観察を行った。(1)強磁場中において安定度の高いSTMを開発し、冷凍機冷却マグネットを用いて18Tまで原子分解能を持つSTM測定を行った。(2) 30Tハイブリッドマグネットを用いたSTM測定を実現するために小型STMの設計を行った。(3)高温超伝導体の磁束近傍で観測されるチェッカーボード状の電子超構造の起源を調べるため、Bi_2Sr_2CaCu_2O_yに対して強磁場中STM/STSを行った結果、磁束チェッカーボードの変調周期はフェルミ波数によって決まること、磁束の中心で鋭い局所状態密度のピークがフェルミエネルギー近傍に存在することを明らかにした。・セルフフラックス法による良質なBa_<1-x>Co_xFe_2As_2単結晶の作製に成功し、磁気光学イメージングを用いて結晶全体にわたる臨界状態を確認した。またSTM/STSによるトンネル分光測定を行った。・磁場の印加角を変数とした電子比熱の振動パターンから超伝導体の対関数の対称性決定のための理論を構築した。また、高磁場でのパウリ常磁性効果を取り入れた定量的理論を構築し、CeCoIn_5等で検証した。・光ファイバーとホモダイン検波を活用した高感度な光磁気カー効果による量子ホール2次元電子系の電子スピン分極のイメージングシステムを開発した。量子ホール系のスピン分極度の計測から量子ホール状態での電流分布や電流経路におけるスピン分極度、揺らぎの実空間分布について計測可能性を実証した。強磁場走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて以下の成果を得た。(1)30Tハイブリッドマグネット中で実験が可能な強磁場STM測定システムを開発した。(2)27Tまでの磁場中において、グラファイトの1原子層ステップの観測に成功した。(3)銅酸化物超伝導体(Pb,Bi)_2Sr_2CuO_yのトンネル分光を行い、磁場中における電子秩序状態を見出した。(4)トポロジカル絶縁体Bi_2Se_3表面のヘリカルDirac電子の性質を調べた。
がん細胞表面糖鎖をレクチン融合薬で標的する革新的がん治療開発

本課題は膵癌を始めとする難治癌に対して、癌細胞の最外層を覆う糖鎖層(glycocalyx)をレクチン(糖鎖結合蛋白)で標的するという、全く新しい概念に基づく新規がん治療法の具現化を目指している。既に、膵癌マウスモデルで多くの基礎的な知見を得ているが、本件研究ではi)抗原ー抗体に比べて結合力が劣ると言われる糖鎖ーレクチン結合を使った本戦略が、in vitroで1000倍以上も強力な抗腫瘍効果を上げたメカニズム解明を目指す。また、ii)狭義のレクチンは猛毒(リシン)と同様に赤血球凝集活性を持つものが多いが、rBC2レクチンを使ったLDCでは赤血球凝集が起こらないメカニズムは何か?そして、iii)がん以外の組織、細胞表面糖鎖にレクチンが非特異的に結合する可能性や、それによってもたらされる不都合な副次反応はないのか?を検証する。H30年度は、主に、iii)の課題について、LDCでの毒性をラットで検証した。(1) LDCによる雌ラットを用いた単回静脈内投与(30分インフュージョン)毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)。(2)LDCによる雌ラットを用いた単回腹腔内投与毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)(3)LDCによる複数回静脈内投与。150, 200, 250 &μg/kg(30minかけてinfusion投与)を週2回×3週間(計6回)投与。その結果、ラットでは濃度依存性はなく散発的に死亡動物がでる事、また、複数回投与の後半で蓄積毒性により死亡がでる事はなく、死亡動物は初回投与時に亡くなっている事が示された。今後、動物種を替えての検証、障害臓器の組織解析などを行っていく。H30年度は、主に、iii)の課題(がん以外の組織、細胞表面糖鎖にレクチンが非特異的に結合する可能性や、それによってもたらされる不都合な副次反応はないのか?)についてラットで検証した。i)LDCによる雌ラットを用いた単回静脈内投与(30分インフュージョン)毒性試験(投与量250、300、350、400及び500μg/kg)。各群5匹=計25匹のうち、3匹が死亡(300及び400 μg/kg投与群で各1, 2匹)し、LDC投与による急性毒性が示唆された。一方で、350及び500 μg/kg投与群では計10匹中1匹も死亡例がみられず。ii)LDCによる雌ラットを用いた単回腹腔内投与毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)。各群5匹=計25匹のうち、1匹が死亡(400 μg/kg投与群の1匹)。一方で、500μg/kg投与群を含めた残り24匹は血液データの異常も示さず生存。iii)LDCによる複数回静脈内投与。150, 200, 250μg/kg(30minかけてinfusion投与)を週2回×3週間(計6回)投与。各群5匹=計15匹のうち、1匹が死亡(200μg/kg投与群の1匹)。この1匹も初回投与後に死亡しており、250 μg/kg×6回=合計1500 μg投与群の5匹は血液データの異常も示さず生存。iv)LDCによる複数回腹腔内投与。200, 250, 300 μg/kgを週2回×3週間(計6回)投与。各群5匹=計15匹のうち、250 μg/kg投与群の2匹が死亡。【1.膵癌3Dオルガノイドにおけるレクチン融合薬(LDC)の抗腫瘍効果】I:ヒト膵癌3Dオルガノイドバンクの構築ー本年度、来年度は、膵癌3DオルガノイドにおけるLDCの抗腫瘍効果を解析し、臨床応用へ向けたPOC(proof of concept)の確立を目指す。我々は、既に膵癌3Dオルガノイド培養に着手している。2019-4/9現在、7例の患者から5例のオルガノイドを樹立した。しかし、培養確立まで50日と時間がかかること、また、増殖速度が既報に比べて遅い、などの問題があり、3Dオルガノイド培養の安定した手技の確立を目指す。20ー30症例のオルガノイドバンクを確立する。II:ヒト膵癌3DオルガノイドにおけるLDCの薬剤感受性試験ーフコシル化糖鎖(H-type 1/3/4)が高発現している膵癌細胞株におけるIC50は1.04 pg/ml=19.5 fmol/Lと極めて低かったが、低発現株では23.01711.2 ng/Lと高く、LDCの効果は期待できない。

実際の臨床膵癌患者においてLDCがどれだけ効果があるのか、確立した20ー30症例のオルガノイドバンクでのMTT assayを行い、臨床膵癌における最小有効濃度を決定する。III:(安全性-a) rBC2レクチン染色による正常組織、複数の癌種への反応性評価ーrBC2レクチン染色による正常組織、複数の癌種への反応性評価ー血管内にLDCを投与した際、非腫瘍組織への集積(N=noise)は不都合な副次反応の原因となる。rBC2レクチンが反応するH type 3糖鎖が発現する臓器をマウス及びヒト組織で検討し、治療対象となる癌種の絞込、副作用がでる可能性を検証する。マウス、ラット、サルなどの動物種を替えて、臓器集積性を解析する。本課題は膵癌を始めとする難治癌に対して、癌細胞の最外層を覆う糖鎖層(glycocalyx)をレクチン(糖鎖結合蛋白)で標的するという、全く新しい概念に基づく新規がん治療法の具現化を目指している。既に、膵癌マウスモデルで多くの基礎的な知見を得ているが、本件研究ではi)抗原ー抗体に比べて結合力が劣ると言われる糖鎖ーレクチン結合を使った本戦略が、in vitroで1000倍以上も強力な抗腫瘍効果を上げたメカニズム解明を目指す。また、ii)狭義のレクチンは猛毒(リシン)と同様に赤血球凝集活性を持つものが多いが、rBC2レクチンを使ったLDCでは赤血球凝集が起こらないメカニズムは何か?そして、iii)がん以外の組織、細胞表面糖鎖にレクチンが非特異的に結合する可能性や、それによってもたらされる不都合な副次反応はないのか?を検証する。H30年度は、主に、iii)の課題について、LDCでの毒性をラットで検証した。(1) LDCによる雌ラットを用いた単回静脈内投与(30分インフュージョン)毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)。(2)LDCによる雌ラットを用いた単回腹腔内投与毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)(3)LDCによる複数回静脈内投与。150, 200, 250 &μg/kg(30minかけてinfusion投与)を週2回×3週間(計6回)投与。その結果、ラットでは濃度依存性はなく散発的に死亡動物がでる事、また、複数回投与の後半で蓄積毒性により死亡がでる事はなく、死亡動物は初回投与時に亡くなっている事が示された。今後、動物種を替えての検証、障害臓器の組織解析などを行っていく。H30年度は、主に、iii)の課題(がん以外の組織、細胞表面糖鎖にレクチンが非特異的に結合する可能性や、それによってもたらされる不都合な副次反応はないのか?)についてラットで検証した。i)LDCによる雌ラットを用いた単回静脈内投与(30分インフュージョン)毒性試験(投与量250、300、350、400及び500μg/kg)。各群5匹=計25匹のうち、3匹が死亡(300及び400 μg/kg投与群で各1, 2匹)し、LDC投与による急性毒性が示唆された。一方で、350及び500 μg/kg投与群では計10匹中1匹も死亡例がみられず。ii)LDCによる雌ラットを用いた単回腹腔内投与毒性試験(投与量250、300、350、400及び500 μg/kg)。各群5匹=計25匹のうち、1匹が死亡(400 μg/kg投与群の1匹)。一方で、500μg/kg投与群を含めた残り24匹は血液データの異常も示さず生存。iii)LDCによる複数回静脈内投与。150, 200, 250μg/kg(30minかけてinfusion投与)を週2回×3週間(計6回)投与。各群5匹=計15匹のうち、1匹が死亡(200μg/kg投与群の1匹)。この1匹も初回投与後に死亡しており、250 μg/kg×6回=合計1500 μg投与群の5匹は血液データの異常も示さず生存。iv)LDCによる複数回腹腔内投与。200, 250, 300 μg/kgを週2回×3週間(計6回)投与。
大気圧プラズマと高周波誘導加熱を利用したチタン合金の超短時間窒化プロセスの開発

チタン合金の耐摩耗性を改善する手法としては,窒化が最も一般的であるが,長時間要することや加熱により素材の強度が低下することなどが問題視されている.本申請では,数分オーダーの超短時間処理により,チタンの耐摩耗性を改善する手法の構築にチャレンジした.その結果,高周波誘導により基材を加熱した状態で窒素ガスをブローすることにより,わずか3分の処理で,数時間のガス窒化より深い効果層を得ることに成功した航空宇宙分野や医療分野をはじめとして多くの産業分野で幅広く実用化されているチタン合金の最大の弱点は,耐摩耗性に劣るという点がある.これを完全するために,硬質薄膜の被覆や窒化処理等の表面処理が施されるが,炉内での加熱を伴うため,素材の結晶粒が粗大化し,その結果として母材強度の低下を招くという難点がある.とくに疲労強度を対象とした場合には,大幅な低下を招くため,実用的観点から問題視されている.当該申請は,この点に着目し,チタン合金の性能を改善させることを目的として実施しているものである.具体的には,現在は長時間を要する窒化処理を,高周波誘導加熱の効果とプラズマの効果を利用して,窒素ガスブローするのみで超短時間(具体的には数分オーダー)で表面を窒化する新しい処理プロセスの構築を目指している.初年度は,提案するガスブローIH窒化に関する基本的な知見を得ることを目的として実施した.その結果,高周波誘導により900°Cに加熱したチタンに180秒間窒素ガスをブローすることで,通常のガス窒化(850°C,5時間の処理)と同等の窒素化合物層と窒素拡散層が形成されることを明らかにしている.詳細は後述するが,窒化のメカニズムについても詳細な検討を行い,今後の研究のための基礎的な知見を多く得ることができたい.その成果は1件の雑誌論文(原著,査読付き)および5件の学会発表として公開されている.なお,当該年度は,別途研究室内で構築した微粒子ピーニングが可能となるシステムを利用した実験を行ってきたが,プラズマの照射を併用するためにシステムの構築に向けての基本設計も実施した.チタン系材料に対して窒化処理を施した場合,被処理材の疲労特性が低下することが従来までに広く報告されており,ガスブローIH窒化処理材でも同様の報告がなされている.その要因の1つとして,高温,特に高い温度で窒化処理を施すことによる相変態や結晶粒粗大化が挙げられる.これは,窒化処理の温度を低温化することにより抑制されると考えられる.従来,ガスブローIH窒化処理において,噴射するガスの流量を増加させることにより窒化が促進することが報告されている.それより,被処理材表面に窒素ガスを積極的に噴射することで,窒化がより促進される可能性が考えられる.そこで平成28年度はまず,ガス流速を変化させて処理を行い,形成される窒化層の特性に及ぼすガス流速の影響を検討した.さらに,ガス流速を上昇させることによる処理温度の低温化の可能性について検討を加えた.その結果,ガスブローIH窒化処理において,ガス流速を上昇させることにより,被処理材の窒化が促進することが明らかとなった.これは,ガス流速を上昇させることにより,IHの出力が増加し,それにより窒素原子の拡散が促進したことに起因するものと考えられる.また,ガス流速を上昇させることにより,低温(700°C)で処理した場合でも,高温(900°C)で処理した場合と同程度に被処理面を高硬さ化できる.これにより,Ti-6Al-4V合金の耐摩耗性を向上させつつ,疲労特性低下を招く針状アルファ相の形成および結晶粒粗大化を抑制できることが明らかとなった.疲労特性に関しても検討を行っており,低温化することで,これまでは処理により疲労強度が低下したが,ほとんど変化がないことがわかってきた.この点に関しては次年度以降も継続的に検討をする予定である.チタン合金の唯一の欠点である,耐摩耗性の向上を目指した検討はこれまで多く行われている.しかし,いずれも数時間から10時間単位の処理時間を要することが問題視されている.本申請は,それと同等の表面を数分単位の処理により創り出そうとするものである.その結果明らかになった事柄を以下にまとめる.(1)短時間で処理するプロセスとして『ガスブローIH窒化』を提案し,それに対する基礎的な知見を得た.具体的には,高周波誘導により900°Cに加熱したチタンに180秒間窒素ガスをブローすることで,通常のガス窒化(850°C,5時間の処理)と同等の窒素化合物層と窒素拡散層が形成されることを明らかにした.(2)ガスブローIH窒化処理において,ガス流速を上昇させることにより,被処理材の窒化が促進することを明らかにした.これは,ガス流速を上昇させることにより,IHの出力が増加し,それにより窒素原子の拡散が促進したことに起因するものである.また,ガス流速を上昇させることにより,低温(700°C)で処理した場合でも,高温(900°C)で処理した場合と同程度に被処理面を高硬さ化できる.このことあh,Ti-6Al-4V合金の耐摩耗性を向上させつつ,疲労特性低下を招く針状アルファ相の形成および結晶粒粗大化を抑制できる可能性を示唆している.(3)小型の4点曲げ疲労試験用治具を用いて疲労試験を実施し,被処理材の疲労強度特性を調べた.その結果,高温で処理した試験片の場合には,その疲労特性は未処理材と比較して低下するが,低温(700°C)で処理した試験片の場合にはその低下は抑制されることがあきらかとなった.

この原因は,低温化により素材の組織変化が抑制できたことに起因することを明確にした.以上の成果は,本研究で提案した『ガスブローIH窒化』が,チタンの新たな表面処理として実用化される可能性を示唆するものである.チタン合金の耐摩耗性を改善する手法としては,窒化が最も一般的であるが,長時間要することや加熱により素材の強度が低下することなどが問題視されている.本申請では,数分オーダーの超短時間処理により,チタンの耐摩耗性を改善する手法の構築にチャレンジした.その結果,高周波誘導により基材を加熱した状態で窒素ガスをブローすることにより,わずか3分の処理で,数時間のガス窒化より深い効果層を得ることに成功した疲労特性を向上させるためには,処理の低温化が最重要課題である.次年度は,基材と窒素との反応性を高めることを目的として,処理時に窒素プラズマを照射できるようなシステムを構築する.具体的には,ガスブローIH窒化の専用処理システムを構築し,種々の検討を実施する予定である.当初の申請書には,これまでの処理システムを改良することを計画していたが,ここでは新しいシステムを構築することを計画している.これにより処理の低温化が実現されたじてんで下記の検討を行う予定である.まずXRDによる分析を行い,表面に窒素化合物が形成されているか否かを調べる.これより,窒化ができたか否かをしることができる.また,試験片断面上において,EDXによる元素分析を行い,窒素の拡散状態を調べる.さらに,断面上でSEMおよび光学顕微鏡による観察を行い,組織の粗大化の有無を確認する.必要に応じて結晶粒径の定量化を行う.また,疲労特性には素材の硬さも大きな影響を及ぼす.そのような観点から,断面上において,深さ方向のビッカース硬さ分布の測定も行う.つぎに,疲労特性の評価を実施する.具体的には,小型の4点曲げ疲労試験用治具を用いて疲労試験を実施し,S-N曲線を得ることにより疲労強度特性を調べる.なお,この治具を用いることにより,長さ18mm,幅3mm,厚さ1mmの寸法の小型試験片の疲労試験が可能となる.次に疲労破壊メカニズムの解明に取り組む.表面改質材の場合には,試験片内部から疲労破壊が発生する場合がある.ここでは,破面観察を実施し,疲労破壊起点を明確にする.また,別途,引張圧縮負荷のもとでの疲労試験も実施し,疲労き裂の発生と進展の挙動を詳細に調べる.これらの成果を総括して,申請タイトルにも書かれている,大気圧プラズマアシストIH窒化プロセスの研究に関する今後の課題をまとめる.材料工学
膜タンパク質小胞体回避モチーフ作用因子の機能解明への挑戦

真核細胞でタンパク質が適切な細胞内オルガネラに配分される機構は、生命活動維持のために必須事項である。大半の膜タンパク質は、合成の初期段階で、膜貫通部の疎水性アミノ酸が連続した配列の情報に従って小胞体膜に移行し、ポリペプチド鎖の伸長に伴って膜内に組み込まれる。一方、ペルオキシソームの一群の膜タンパク質は、このような小胞体への標的化を免れて、その分子の合成が完了してからペルオキシソーム膜に配分される。本研究では、70kDaペルオキシソーム膜タンパク質(PMP70)N末端に存在する小胞体標的化を抑圧する作用(ETS作用)を持つモチーフと化学架橋する因子を精製し、候補タンパク質を同定した。質量分析で同定された候補因子を大腸菌にて発現し、組み換え体を使ってETS-配列への結合を確認し、N-末端ミリスチル化酵素(Nmt1)であることを明らかにした。Nmtにはアイソフォーム1,2が存在することが知られているが、ノックダウンによって両者ともにETS作用が低下することを確認した。さらにノックダウン抵抗性のcDNAを作成し、レスキュー実験によって、Nmt1、Nmt2いずれもETS作用を示すことが確認された。また、HeLa細胞ではNmt1が圧倒的に多く、Nmt2はほとんど発現していないことがわかった。Nmt1の立体構造情報をもとに、ミリスチルCoA結合部位、基質ペプチド鎖結合部位、転移反応触媒残基などの特定のアミノ酸残基に変異を導入し、それらによるETS作用のレスキューを解析し、ペプチド結合部位の変位によってETS作用が低下することを明らかにした。以上、ETSモチーフの発見から、結合因子の同定、機能確認まで達成でき、本萌芽的研究で目的とした事項は達せられたと考えている。分泌タンパク質や、多くの膜タンパク質は、その合成の初期段階で、疎水性アミノ酸が連続した配列の情報に従って小胞体膜に移行し、合成と同時に膜を通過したり、膜内に組み込まれたりする。一方、ペルオキシソームの膜タンパク質は、このような小胞体への標的化を免れて、その分子の合成が完了してからペルオキシソーム膜に配分される。我々は、70kDaペルオキシソーム膜タンパク質(PMP70)N末端に、小胞体標的化を抑圧する作用(ETS作用)を持つモチーフがあることを発見した。そのモチーフは、網状赤血球溶血液のタンパク質合成系とイヌ膵臓の粗面小胞体を組み合わせた無細胞系では、ETS作用を発揮することが確認されたが、ヒト培養細胞から取得された、精製因子を使った無細胞タンパク質合成系ではETS作用は認められなかった。その他のことから、このモチーフのETS作用にはそれに作用する因子が作用しており、精製因子によるタンパク質合成系にはその因子が含まれないと結論された。化学架橋反応を指標にして、各種分画手法を駆使して、結合因子の精製と候補の同定に成功した。候補因子を大腸菌にて発現し、組み換え体を使って、ETS-配列への結合を確認した。候補Aでは、点変異(S5A)で結合が大きく低下するなどの、配列特異性も確認された。その候補Aについて、細胞内での作用を確認するために、ノックダウン実験を計画し、複数種のsiRNAを入手し予備実験を行った。また、因子Aと類似性を示す因子A2を含めて、特異的抗体を入手し、HeLa細胞内にA, A2ともに検出可能な量存在することを確認した。今後、siRNAによる発現抑制を特異抗体を使って確認し、ETS作用の変動を解析する予定である。PMP70のN-末端にETS作用のあるモチーフを発見したのみならず、それに作用する因子を同定し、精製した組み換え型がモチーフに結合性を有することを確認できたことは特筆に値する。ETS作用に必要な配列の解析は常法通りのDNA操作と細胞生物学の実験手法でなしうるが、それに結合する因子の同定には、その結合活性の定量的アッセイ系の設定、生化学的な分画の実行など、きわめて困難な作業が必要であるからである。一方、同定後、その因子のノックダウン手法による機能解析に移ったが、その過程で、特異抗体の入手に手間どった。いくつかの市販抗体を試みたが、期待通りの検出ができなかった。最終的に、A因子、A2因子の特異抗体を得ることができたが、機能解析は翌年度に持ち越すこととなった。総合して、(2)おおむね順調に進展していると、判断した。大半の膜タンパク質は、合成の初期段階で、膜貫通部の疎水性アミノ酸が連続した配列の情報に従って小胞体膜に移行し、膜内に組み込まれる。本研究では、70kDaペルオキシソーム膜タンパク質(PMP70)N末端に存在する小胞体標的化を抑圧する作用(ETS作用)を持つモチーフと化学架橋する因子を精製し、候補の同定に成功した。質量分析で同定された候補因子を大腸菌にて発現し、組み換え体を使って、ETS-配列への結合を確認し、候補Aではモチーフの点変異(S5A)に対しては結合が大きく低下するなどの、配列特異性が確認された。候補Aにはアイソフォーム1,2が存在していた。