hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転移RNAを確認する新しい自己抗体の臨床的・病因的意義に関する研究

【目的】膠原病患者血清におけるtRNAを認識する抗体(抗tRNA抗体)をスクリーニングし,さらに大腸菌tRNAおよびそのミュータントを用いて,かかる抗tRNA抗体を認識するtRNAの構造およびエピトープの解析を行い,その臨床的病因的意義および産生機序の追求を目的とした.【方法】1)^<32>P-標識HeLa細胞抽出物,および脱蛋白RNAを抗原とする免疫沈降法(Lerner-Steitz法)により膠原病患者血清をスクリーニングし,tRNA自身と反応する抗tRNA抗体を検出した.2)クローニングされた大腸菌tRNAおよび,そのミュータントを抗原に用いた免疫沈降法により抗tRNA抗体が認識するtRNAの特異構造を検討した.3)抗tRNA抗体の自己免疫疾患における出現頻度,およびその臨床的意義を検討した.【結果】1)膠原病患者1460例の血清をスクリーニングし,tRNAを沈降する血清49例を見いだした.このうち脱蛋白HeLa-tRNAを沈降する抗tRNA抗体陽性4例を検出した.2)これら4例の血清は大腸菌tRNAとも反応した.大腸菌のミュータントを用いたエピトープの解析により,抗tRNA抗体は全tRNAに共通し,DループとTψCループが結合して形成される立体構造(L字構造)を認識することが明らかになった.3)抗tRNA抗体は肺線維症を持つシェ-グレン症候群1例,SLE3例に検出された.【考察】抗tRNA抗体はいままでに報告のない新しい自己抗体である.抗tRNA抗体はヒトおよび大腸菌由来のあらゆるtRNAを確認し,種の進化を通じて保存されている特定の構造を認識すると考えられた.この事実は細菌感染が自己抗体産生ならびに自己免疫疾患発症に関わるという可能性を示唆する.今後かかる抗tRNA抗体の反応様式をさらに詳細に検討することが,自己抗体産生機序および膠原病の原因解明に役立つと考えられる.【目的】膠原病患者血清におけるtRNAを認識する抗体(抗tRNA抗体)をスクリーニングし,さらに大腸菌tRNAおよびそのミュータントを用いて,かかる抗tRNA抗体を認識するtRNAの構造およびエピトープの解析を行い,その臨床的病因的意義および産生機序の追求を目的とした.【方法】1)^<32>P-標識HeLa細胞抽出物,および脱蛋白RNAを抗原とする免疫沈降法(Lerner-Steitz法)により膠原病患者血清をスクリーニングし,tRNA自身と反応する抗tRNA抗体を検出した.2)クローニングされた大腸菌tRNAおよび,そのミュータントを抗原に用いた免疫沈降法により抗tRNA抗体が認識するtRNAの特異構造を検討した.3)抗tRNA抗体の自己免疫疾患における出現頻度,およびその臨床的意義を検討した.【結果】1)膠原病患者1460例の血清をスクリーニングし,tRNAを沈降する血清49例を見いだした.このうち脱蛋白HeLa-tRNAを沈降する抗tRNA抗体陽性4例を検出した.2)これら4例の血清は大腸菌tRNAとも反応した.大腸菌のミュータントを用いたエピトープの解析により,抗tRNA抗体は全tRNAに共通し,DループとTψCループが結合して形成される立体構造(L字構造)を認識することが明らかになった.3)抗tRNA抗体は肺線維症を持つシェ-グレン症候群1例,SLE3例に検出された.【考察】抗tRNA抗体はいままでに報告のない新しい自己抗体である.抗tRNA抗体はヒトおよび大腸菌由来のあらゆるtRNAを確認し,種の進化を通じて保存されている特定の構造を認識すると考えられた.この事実は細菌感染が自己抗体産生ならびに自己免疫疾患発症に関わるという可能性を示唆する.今後かかる抗tRNA抗体の反応様式をさらに詳細に検討することが,自己抗体産生機序および膠原病の原因解明に役立つと考えられる.
細胞周期・細胞接着因子を指標とする口腔癌悪性度評価法の開発

口腔扁平上皮癌について臨床検体および培養細胞株を対象に検討し,以下の知見を得た。p53蛋白発現の予後因子としての検討では、口腔癌(OSCC)症例140症例のp53蛋白発現について陽性症例を辺縁型と散在型、その混合型に分類し検討した。その結果、p53蛋白発現の有無のみでは、臨床病理学的所見および5年累積生存率との相関は認められなかった。しかし、p53の蛋白発現様式は腫瘍細胞の分化度、局所リンパ節転移、5年累積生存率と有意に相関を示し、辺縁型p53陽性症例の予後は良好であったのに対し、散在型p53陽性症例の予後は不良であった。次にOSCC 70症例のp53遺伝子異常についての検討では,34%に遺伝子異常が認められた。さらに、p53遺伝子異常と蛋白発現との関連では辺縁型(14.3%)、混合型(50.0%)、散在型(57.1%)に遺伝子異常を認め、この検討においても辺縁型p53陽性症例の予後は良好であったのに対し、散在型p53陽性症例の予後は有意に不良であった。従って、p53遺伝子異常は口腔癌悪性度と相関する可能性が示唆された。以上より、口腔癌患者におけるp53蛋白発現様式、遺伝子異常は腫瘍の悪性度、さらには臨床像を把握する上で重要であり、OSCCの予後因子として意義あるものと考えた。次にOSCCにおけるRAS関連遺伝子のジェネティックおよびエピジェネティックな異常の解析としてRASシグナル経路における遺伝子の異常メチル化を解析し、OSCCにおける同経路の異當との関連を検討した。OSCC細胞株17株におけるRASSFfamily遺伝子の異常メチル化は、RASSF1(41.2%)、RASSF2(70.6%)、RASSF5(23.5%)とRASSF2に高頻度に認めた。また、RASSF2の発現が消失している細胞株にRASSF2遺伝子を導入すると、コロニー形成の抑制を認めた。一方、OSCC臨床例の46症例では、RASSF1(13.0%)、RASSF2(26.1%)、RASSF5(10.9%)に異常メチル化を認め、H-RASの変異は1症例に認めた。以上の結果から、OSCCにおいてRASシグナル経路の異常はこれまで考えられていたよりも高頻度に認められ、RASシグナル経路の異常が治療の分子標的となる可能性が示唆された。p53蛋白発現の予後因子としての検討では、p53蛋白陽性症例を辺縁型と散在型、その混合型に分類し、検討した結果、p53蛋白発現の有無のみでは、臨床病理学的所見および5年累積生存率との相関は認められなかった。

以上より、口腔癌患者におけるp53蛋白発現様式は腫瘍の悪性度、さらには臨床像を把握する上で重要であり、口腔癌の予後因子として意義あるものと考えた。次に口腔扁平上皮癌におけるRAS関連遺伝子のジェネティックおよびエピジェネティックな異常の解析としてRASシグナル経路における遺伝子の異常メチル化を解析し、OSCCにおいて同経路の異常がいかに関わっているか検討した。OSCC細胞株17株におけるRASSFfamily遺伝子の異常メチル化は、RASSF1(7/17:41.2%)、RASSF2(12/17:70.6%)、RASSF5(4/17:23、5%)とRASSF2に高頻度に認めた。また、RASSF2の発現が消失している細胞株にRASSF2遺伝子を導入すると、コロニー形成の抑制を認めた。一方、OSCC臨床例の46症例では、RASSF1(6/46:13.0%)、RASSF2(12/46:26.1%)、RASSF5(5/46:10.9%)に異常メチル化を認め、H-RASの変異は1症例に認めた。以上の結果から、OSCCにおいてRASシグナル経路の異常はこれまで考えられていたよりも高頻度に認められ、RASシグナル経路の異常が治療の分子標的となる可能性が示唆された。また、P16遺伝子のメチル化は口腔癌細胞15株のうち5株(33.3%)、一方臨床検体では24/96(25%)に認められた。またp16のメチル化はT分類と相関し、腫瘍径の増大が腫瘍細胞のHeterogeneityを引き起こす可能性が示唆された。口腔癌における形態学的悪性度の獲得と共に接着因子(β-カテニン)は、発現の消失を示した。さらにこの発現の消失に遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化が関与しているかを現在検索している。口腔扁平上皮癌について臨床検体および培養細胞株を対象に検討し,以下の知見を得た。p53蛋白発現の予後因子としての検討では、口腔癌(OSCC)症例140症例のp53蛋白発現について陽性症例を辺縁型と散在型、その混合型に分類し検討した。その結果、p53蛋白発現の有無のみでは、臨床病理学的所見および5年累積生存率との相関は認められなかった。しかし、p53の蛋白発現様式は腫瘍細胞の分化度、局所リンパ節転移、5年累積生存率と有意に相関を示し、辺縁型p53陽性症例の予後は良好であったのに対し、散在型p53陽性症例の予後は不良であった。次にOSCC 70症例のp53遺伝子異常についての検討では,34%に遺伝子異常が認められた。さらに、p53遺伝子異常と蛋白発現との関連では辺縁型(14.3%)、混合型(50.0%)、散在型(57.1%)に遺伝子異常を認め、この検討においても辺縁型p53陽性症例の予後は良好であったのに対し、散在型p53陽性症例の予後は有意に不良であった。従って、p53遺伝子異常は口腔癌悪性度と相関する可能性が示唆された。以上より、口腔癌患者におけるp53蛋白発現様式、遺伝子異常は腫瘍の悪性度、さらには臨床像を把握する上で重要であり、OSCCの予後因子として意義あるものと考えた。次にOSCCにおけるRAS関連遺伝子のジェネティックおよびエピジェネティックな異常の解析としてRASシグナル経路における遺伝子の異常メチル化を解析し、OSCCにおける同経路の異常との関連を検討した。OSCC細胞株17株におけるRASSFfamily遺伝子の異常メチル化は、RASSF1 (41.2%)、RASSF2 (70.6%)、RASSF5 (23.5%)とRASSF2に高頻度に認めた。また、RASSF2の発現が消失している細胞株にRASSF
通電加熱法による金属間化合物の熱物性値測定

1.研究成果金属間化合物(TiAl,NiAl)の化学量論的組成域においてAl含有率の変化による熱物性値(熱拡散率、熱浸透率)の値の変化を常温から900Kの温度域で測定し、実用化において必要となる熱物性情報を明らかにした。特に、NiAlはコーティング材として有望であるばかりでなく、最近実用化に向けて脚光を浴びている傾斜機能材料(厚さ方向にセラミックスから金属へなめらかに変化させたもの)に匹敵する新素材として、Ni母材から表面に向けてAlの含有率を変化させ、表面層ではAl-rich層の金属間化合物を形成させた材料が考えられる。本研究において開発した熱浸透率の測定法により、そのような新素材の開発上重要な資料が提供可能となった。研究内容(1)熱物性測定装置の制御部のコンピュータを更新し高速処理可能かつオンライン計測システムを構築した。(2)リモートコントロール可能な電離真空計を設置することによって、測定雰囲気の正確な把握が可能となった。(3)熱浸透率の測定原理を開発し本装置による正確な測定が可能となった。(4)NiAlの試料を作成し、その熱浸透率が大きな温度依存性を有することを明らかにした。
オピオイドレセプターの多様な細胞内情報伝達系に関する研究

オピオイドレセプターの多様な細胞内情報伝達機構について,アフリカツメガエル卵母細胞翻訳系を用いて調べた。ラット脳poly(A)^+RNAを注入した卵母細胞において,μ,δ,κの各オピオイドレセプターサブタイプに特異的なアゴニストは,いずれも細胞内Ca^<2+>振動の活性化に基づくCl^-電流応答を惹起した。分子クローニングされたラットκレセプターのみを発現させた場合もCキナーゼ阻害薬であるstaurosporineを添加した培地で一晩処置することにより,同様なCl^-電流応答が見出され,百日咳毒素(PTX)感受性GTP結合タンパク質(G蛋白)がその応答に介在していることが明らかになった。次に,κレセプターと細胞内cAMP系および電位依存性Ca^<2+>チャネルとの共役について,それぞれ嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御タンパク質(CFTR)およびQ型Ca^<2+>チャネルとの同時発現を試みた。κアゴニストはCFTR応答を増強,すなわち細胞内cAMP量を増大させ,またCa^<2+>チャネル応答を抑制した。これらの細胞応答にはいずれもPTX感受性G蛋白が介在していた。以上の結果によって,オピオイドレセプターを卵母細胞に発現させた場合,レセプター分子はPI代謝の活性化によるCa^<2+>動員,細胞内cAMP産生の相乗的亢進,電位依存性Ca^<2+>チャネルの抑制という独立した3経路の情報伝達系と共役しうることが示された。また,これらの細胞応答にはいずれもPTX感受性G蛋白(Gi/Go)が介在していることが明らかになった。
遺伝子診療における心理臨床的援助に関する研究

本研究では、医師による遺伝カウンセリングに心理カウンセラーが同席し、その後に個別心理面接を行って、クライエントの不安や危険を早期に汲み上げて対応するという実践的意義をもつ体制を作り上げつつ、研究を推進してきた。本研究の目的は、この実践を基盤として、(1)発症前遺伝子検査がもたらす心理的影響を慎重に把握するための心理検査バッテリーを検討すること、(2)遺伝子診療・遺伝子検査における心理面接の機能を明確にし、遺伝カウンセリング体制構築に寄与すること、の2点であった。(1)については、心理検査バッテリーとして、質問紙,(POMS)・バウムテスト・遺伝SCTを組み合わせることにし、遺伝SCTを本研究グループで独自に作成した。施行法については、心理面接を行う者が心理検査も担当するという方法で、医師による数回にわたる遺伝カウンセリングに組み込んで実施した。すなわち、心理検査を行うに際しても、心理面接関係を基盤として慎重に行うと同時に、遺伝子検査結果が出た後にもクライエントを守る体制作りをしておく機能を果たすことが目指された。その結果、POMSはクライエントの意識的な自己把握、バウムテストは無意識的な側面、遺伝SCTはその狭間にある心理的対人的な多様な側面をクライエントとともに確認するための有効な役割を果たすことが示された。また、(2)については、遺伝医学という先端医療の知識の説明を正確に行う立場の専門家と、クライエントの心の次元からの言葉をじっくり聴くという心理臨床の専門家による役割分担によって、医療者からクライエントに遺伝情報を提供するだけではなく、その情報をクライエントがどのように受け.取ったかについての心の次元の吟味がなされ、クライエントが主体的に遺伝情報を用いる可能性が高くなることが示された。我々は京大医学部附属病院遺伝子診療部において、医師による遺伝カウンセリングの中に心理面接を導入する体制を作り、遺伝子診断や遺伝情報の開示における心理臨床学的援助の実践を行い、その在り方を研究してきた。次のことが明らかにされてきている。(1)心理面接においては医師の遺伝カウンセリングとは質の異なる内容が語られる。医師に対するクライエントの相談内容は医学知識に限局されやすいが、心理面接では、遺伝の問題にさらされている不安や葛藤、さまざまな相対立する思いが語られる。この過程を経ることによって、病気の遺伝子をもつ子の出産や遺伝病の受容についての主体的な判断がなされていった。(2)遺伝医学においては、遺伝病の発症に関する確率が重視されている。それに対して、本研究から明らかになってきたことは、人間の決断には確率を越えた主体的な心の次元が大きく関与していることを示唆するものである。(3)したがって、出生前診断や発症前診断に関する遺伝子検査の実施においても、受検そのものについて主体的に判断するための早い時期からの心理面接が重要になる。遺伝子診療部での心理臨床実践を行ってきたが、発症前遺伝子検査についても心理検査と心理面接を実施、これらの実施と米国の体制を比較検討し、以下の点を明らかにした。(1)発症前遺伝子検査の希望者に心理検査を実施することは、クライエントの心的安定度を把握し得るのみならず、遺伝子検査受検と類似の体験を生じさせ、そこに喚起されたクライエントの感情を心理面接で取り扱うことが可能になるとの新たな知見を得た。尚、心理検査としては、我々が今回作成した遺伝SCT・バウムテスト・質問紙を用いたが、結果判明後の援助のためには、遺伝SCTとバウムテストの有効性が示唆された。(2)上の知見も含め、心理臨床の観点から遺伝カウンセリングの構成要素を促えると、(1)クライエントの来談動機、(2)臨床遺伝専門医から提供される遺伝医学の最新の正確な情報、(3)クライエントによる判断、の3要素が抽出された。(1)は主に遺伝医学的相談として表現されるが、根底には自己の生の基盤・自己同一性・子孫への継承・死・運命等人間の根源的主題があるのであって、無意識的なものも含んだ来談動機についての見立てが必須となる。

(2)においては、クライエントの心の状態に対する十分な配慮をもって提供されることが必要である。(3)では、遺伝医学の知識を正確に受け取り、知識の次元を超えて主体的な判断に至る心の次元が重要になる。したがって、遺伝医学の専門家と心理臨床の専門家が協働し、3要素が一体となった体制を作っていくことによって、クライエントの「主体的な判断」が生まれるための援助が可能になる。(3)以上の知見と昨年から行ってきた米国(メリーランド大学やサウスカロライナ大学)の遺伝カウンセリング体制を比較検討、本研究の意義を示し、ヒトゲノム解析が完了した時代に、人間は遺伝病をどのように受け取るか、本研究から示唆を明らかにした。本研究では、医師による遺伝カウンセリングに心理カウンセラーが同席し、その後に個別心理面接を行って、クライエントの不安や危険を早期に汲み上げて対応するという実践的意義をもつ体制を作り上げつつ、研究を推進してきた。本研究の目的は、この実践を基盤として、(1)発症前遺伝子検査がもたらす心理的影響を慎重に把握するための心理検査バッテリーを検討すること、(2)遺伝子診療・遺伝子検査における心理面接の機能を明確にし、遺伝カウンセリング体制構築に寄与すること、の2点であった。(1)については、心理検査バッテリーとして、質問紙(POMS)・バウムテスト・遺伝SCTを組み合わせることにし、遺伝SCTを本研究グループで独自に作成した。施行法については、心理面接を行う者が心理検査も担当するという方法で、医師による数回にわたる遺伝カウンセリングに組み込んで実施した。すなわち、心理検査を行うに際しても、心理面接関係を基盤として慎重に行うと同時に、遺伝子検査結果が出た後にもクライエントを守る体制作りをしておく機能を果たすことが目指された。その結果、POMSはクライエントの意識的な自己把握、バウムテストは無意識的な側面、遺伝SCTはその狭間にある心理的対人的な多様な側面をクライエントとともに確認するための有効な役割を果たすことが示された。また、(2)については、遺伝医学という先端医療の知識の説明を正確に行う立場の専門家と、クライエントの心の次元からの言葉をじっくり聴くという心理臨床の専門家による役割分担によって、医療者からクライエントに遺伝情報を提供するだけではなく、その情報をクライエントがどのように受け取ったかについての心の次元の吟味がなされ、クライエントが主体的に遺伝情報を用いる可能性が高くなることが示された。
複核金属錯体を用いる水の光酸化触媒の開発

自然界で行なわれている光合成では太陽エネルギーは主として水の酸化に使用される。この水の酸化により得られたエネルギーをそのまま利用すれば地球温暖化を引き起こす二酸化炭素の放出を避けることができる。しかし、水を電子源とする適当な触媒が未だ見出されていない。従って、21世紀に地球環境およびエネルギー問題の危機の根本的解決をはかるためには、水の効率的な酸化触媒を開発することが鍵となる。本研究は、複核金属錯体を用いて水の効率的な酸化触媒を開発することを目的とした。そこで、触媒にマンガンポルフィリン、酸化剤に一電子酸化剤であるルテニウム(III)トリスビピリジン錯体(Ru(bpy)_3^<3+>)を用いて電子移動反応により活性種である高原子価マンガン-オキソポルフィリン錯体を生成させ、P450モデルとなる種々のオレフィンおよびアルカンの酸素化に成功した。その際、水が酸素源になることを見いだした。また、種々のポルフィリンを触媒として用い、その触媒活性の比較を行った。さらに高効率な反応系を構築するために、マンガンポルフィリンデンドリマーを合成しマンガンポルフィリンの複核集積化を行った。その結果、マンガンポルフィリンモノマーより高い触媒活性を示した。一方、マンガンポルフィリン錯体をゼオライトに担持すると、錯体同志が近接した位置に固定され、一電子酸化剤よる水の4電子酸化による酸素発生の触媒として機能することも見出した。21世紀に地球環境およびエネルギー問題の危機の根本的解決を図るためには、水の効率的な酸化触媒を開発することが鍵となる。そこで本研究では、水の4電子酸化を達成するために高原子価二核鉄およびマンガンの基礎ポルフィリンカチオンラジカルを触媒活性中心とし、その生成に必要となる4つのルテニウム錯体を連結した複核金属錯体を用いて、水の触媒的光酸化を達成することを目的としている。高原子価鉄およびマンガンオキソポルフィリンはP450酵素反応にみられるように、生体内において基質酸化反応における酸化活性種として重要な役割を果たしている。これまでその生成は過酸化物などの強力な活性酸素種との反応によって行われてきたため電子移動特性について不明な点が多く残されていた。そこで今年度は金属ポルフィリンを電子移動酸化し、生成する不安定過渡種の同定を各種分光学的手法により行うことにより電子移動過程に関する系統的な検討を行った。また高原子価金属ポルフィリンが水を電子供給源とした反応の有効な触媒となることも見いだした。(TMP)Mn^<III>(OH)(TMP=5,10,15,20-テトラキスメシチルポルフィリン)を電子移動酸化として高原子価Mn(IV)とし、水の酸化触媒作用について検討した。MeCn/H_2O(5:1 v/v)の混合溶媒中、水酸化テトラメチルアンモニウム(Me_4NOH)存在かにおいて(TMP)Mn^<III>(OH)をルテニウムトリス(2,2'-ビピリジン)(III)錯体[Ru(bpy)_3]^<3+>により酸化し[(TMP)Mn^<IV>(=O)]^<・+>を生成させたところ同時に酸素の発生が観測され、酸素の発生量は添加した酸化剤の1/4当量となった。また、このとき[Ru(bpy)_3]^<3+>の濃度の増加速度は[(TMP)Mn^<IV>(=O)]^<・+>濃度に対して二次の依存性を示して増大したので[(TMP)Mn^<IV>(=O)]^<・+>のオキソ基のカップリングにより酸素が発生すると考えられる。従って、[(TMP)Mn^<IV>(=O)]^<・+>は水を四電子酸化し酸素を発生させる触媒として有効に機能することがわかった。

この水の酸化により得られたエネルギーをそのまま利用すれば地球温暖化を引き起こす二酸化炭素の放出を避けることができる。しかし、水を電子源とする適当な触媒が未だ見出されていない。従って、21世紀に地球環境およびエネルギー問題の危機の根本的解決をはかるためには、水の効率的な酸化触媒を開発することが鍵となる。本研究は、複核金属錯体を用いて水の効率的な酸化触媒を開発することを目的とした。水の酸素への酸化には4電子酸化することが必要であるので、少なくとも4つの金属錯体を活性中心に配置する必要がある。また、水を酸化して酸素にするためにはO-O結合ができる水の配位環境が必要となる。二核鉄あるいはマンガンポルフィリン錯体を合成し、それがRu(bpy)_3^<3+>(bpy=2,2'-ビピリジン)による水の酸化触媒として機能するかどうか検討し、ポルフィリン環の連結については各種連結基を用いて、最大の触媒活性を有するものを探索した。外側の軸配位子には立体障害を有する塩基を用いて、内部にのみ水酸基が配位するように工夫した。設計・合成した二核金属ポルフィリン錯体の電気化学特性を明らかにした。一方、マンガンポルフィリン錯体をゼオライトに担持すると、錯体同志が近接した位置に固定され、一電子酸化剤よる水の4電子酸化による酸素発生の触媒として機能することも見出した。自然界で行なわれている光合成では太陽エネルギーは主として水の酸化に使用される。そこで、触媒にマンガンポルフィリン、酸化剤に一電子酸化剤であるルテニウム(III)トリスビピリジン錯体(Ru(bpy)_3^<3+>)を用いて電子移動反応により活性種である高原子価マンガン-オキソポルフィリン錯体を生成させ、P450モデルとなる種々のオレフィンおよびアルカンの酸素化に成功した。その際、水が酸素源になることを見いだした。また、種々のポルフィリンを触媒として用い、その触媒活性の比較を行った。さらに高効率な反応系を構築するために、マンガンポルフィリンデンドリマーを合成しマンガンポルフィリンの複核集積化を行った。その結果、マンガンポルフィリンモノマーより高い触媒活性を示した。
神経細胞特異的ポリオウイルス感染機構と病原性

ラット中枢神経系からの運動神経細胞の初代培養系を確立し、これを使用して、昨年度作製に成功した蛍光標識ポリオウイルス(PV)の軸索内での動きをリアルタイムで観察した。すなわち、培養運動神経細胞にGFPを付加したPV受容体(PVR) cDNAをトランスフェクションし、そこに蛍光標識PVを感染させた。PVRとPVを同時に持つ小胞体を観察したところ、軸索内を逆行性に移動することを確認できた。現在、神経細胞体のどの部位で複製を開始するかを検討中である。蛍光標識PVが、PVRを持たないマウス血管内皮細胞MBEC4に小胞体として取り込まれることを明らかにし、PVが血液脳関門を越えるメカニズムを解析する基盤が確立した。これまでの研究から、神経細胞はPVの一回の感染・複製に対しては抵抗性を示し、細胞変性を示さないが、複数回の感染を受けると細胞変性を起こすことが示唆されていた。しかし、一般的には同一の細胞に同系統のウイルスの重感染は起こらない(ウイルス干渉現象)ことが知られている。そこで、神経細胞のウイルス干渉現象を解析したところ、HeLa細胞に比べ、2回目の感染によって起こるウイルス特異的蛋白合成量がかなり高いことが明らかとなり、我々の考えに矛盾しないことが示された。この実験系は、ウイルス干渉現象のメカニズムを解析するための実験系として期待される。mRNAの5'末端と3'末端の相互作用により、翻訳活性が上昇することが知られている。PVのIRES (internal ribosome entry site)とPV特異的2Aプロテアーゼを利用した実験系により、このリボソームリサイクリングには、Cap構造、eIF4E、eIF4G、PABP、およびポリAは関与していないことを示す結果を得た。ヒトとサルのみに感染するポリオウイルスの強毒マホニー株は、ゲノムRNAの塩基番号928がAからGに変化(カプシド蛋白質VP4のアミノ酸番号62がIleからMetへ変化)すると、マウス脊髄の神経細胞表面分子をレセプターとして認識し、マウス脊髄に適応した変異株となることを既に報告した(Jia et al.,1999)。この変異株から復帰変異株を得、そのゲノムを解析した。その結果、サプレッサー変異株は、VP1のアミノ酸番号107がValからLeu,VP2のアミノ酸番号33がValからIle、またはVP3のアミノ酸番号231がIleからThrへと変化した変異株であった。これらのアミノ酸残基は、ウイルス粒子立体構造上では表面近くであったり、内部に位置していたり、VP4の変異点近くであったりと様々な位置に存在していた。これらのサプレッサー変異により、本来のポリオウイルスレセプター(PVR)のみを認識するようになることから、PVRの認識に働くキャニオンの構造は、60コピーずつの4種類のカプシド蛋白質全体により形成されるウイルス粒子構造に影響を受けていることが示された。PVRとして働く分子は2種類(PVRαとPVRδ)知られている。これら分子の極性細胞における局在性を検討したところ、異なる局在性を示した。ポリオウイルスのエンドサイトーシスにはPVRδがより強く関与していることを示唆した。神経細胞SK-N-SHを使用し、ポリオウイルスによる神経病原性を解析した。他の培養細胞(HeLa細胞など)とは異なり、SK-N-SH細胞のポリオウイルスによる細胞変性効果は、2回目の感染後に現われることが明らかとなった。ヒトのポリオウイルス受容体(hPVR)として機能する分子として2つのisoform(hPVRαとhPVRδ)が存在している。hPVRαとhPVRδは、スプライシングの違いによって生じ、前者の方が大量に産生されるメジャーなhPVRである。両分子とも細胞外領域および膜貫通領域のアミノ酸配列は同一であるが、細胞質領域内に一部異なるアミノ酸配列が存在している。このアミノ酸配列の違いに着目したところ、hPVRαのみに上皮細胞特異的なクラスリンアダプター複合体AP-1Bのサブユニットμ(μ1Bと呼ぶ)と結合し、basolateral側へsortingされるためのシグナル(チロシンを含むモチーフ)が存在することを見出した。そこで、極性細胞を使用したhPVRαとhPVRδの局在性を観察し、予想が正しいことを証明した。PV感染の最初の標的細胞が消化管の粘膜上皮細胞であるならば、管腔側からのPV感染には、マイナーなhPVRであるhPVRδが主に関与していることを示唆している。ポリオウイルスは、細胞質で複製するRNAウイルスであり、核の機能の関与は、あるとしても少ないと考えられてきた。しかしながら、本研究において、通常核に局在している分子の多くが、ポリオウイルス感染により細胞質へ分布を変えることが明らかになった。一方、ポリオウイルスによる細胞変性効果に中心的役割を果たすと考えられていた2Aプロテアーゼを発現させたところ、その局在は核であることが明らかとなった。このことは、2Aプロテア-ゼこそ、核・細胞質間の物質移行に影響を与える分子であることを示唆している。HAタグ付きの2Aプロテアーゼをコードするポリオウイルスを作製し、HeLa細胞およびSK-N-SH神経細胞で発現させ、感染細胞内で2Aプロテアーゼが確かに核へ移行することを明らかにした。ポリオウイルスによる細胞変性効果を分子レベルで明らかにする基盤が確立したと考えている。イメージング技術により、神経筋接合部に存在するポリオウイルス(PV)がブンガロトキシンと共局在することを見出した。さらに電顕により、シナプスのPVが小胞に包まれて存在することを示した。

軸索輸送に関しては、PC12細胞の軸索内において、ヒトポリオウイルス受容体(hPVR)とPVを持つエンドソームは逆行性に輸送されるが、hPVRの細胞質領域に存在するTCTEL1(細胞質ダイニン軽鎖1)認識モチーフに変異を導入した変異hPVRを使用すると逆行性輸送が観察されなくなった。すなわち、hPVRの細胞質領域とTCTEL1の効率良い相互作用がPVの逆行性軸索輸送に必要であることを示した。PV感染細胞内では、キャップ構造依存性の翻訳開始が阻害されている(shut off現象)。このshut off現象は、PVの2Aプロテアーゼによる翻訳開始因子eIF4Gの切断によると信じられてきた。このメカニズムに加え、2Aプロテアーゼによる新たなキャップ構造依存的翻訳開始の阻害メカニズムを明らかにした。すなわち、2AプロテアーゼがeIF4Eに結合するとeIF4Eのキャップ結合能が失われることを見出した。PV感染細胞のプロテオミクスによる解析を行い、少くとも14箇のスポットの量が経時的に増加することを見出した。これらの中には複数の熱ショック蛋白質の他、RNA結合蛋白質hnRNP Kなどが存在していた。これまで知られていないhnRNPKも含まれている。ポリオウイルス(PV)の感染力を失うことなく、PV粒子を蛍光標識することに成功した。このように1粒子イメージングの基盤を築くことが出来た。PV感染に応答し、神経細胞が産生するPV IRESの阻害物質の活性をin vitro蛋白合成系で検出することに成功した。また阻害物質の産生を促すPV遺伝子産物は2Aプロテアーゼであることを証明した。ヒトPV受容体(PVR)を持つトランスジェニック(Tg)マウスは、経口感染が成立しない。そこでインターフェロン受容体KOマウスと交配させたところ、経口感染が成立するマウスの作出に成功した。各種の欠陥干渉(DI)粒子を作製し、神経細胞およびHeLa細胞に対する細胞毒性を検討した。その結果、神経細胞への細胞毒性は観察されず、1度のPV感染では細胞変性効果(CPE)発現には到らないという我々の考えを支援する結果となった。なお、HeLa細胞はDI粒子感染によりCPEを起こす。この研究過程で、2Aプロテアーゼコーディング領域を欠損させてもRNA複製は起こることを見出した。2AプロテアーゼはCPE発現の中心的役割を担っていると考えられているので、この2Aプロテアーゼ欠損PVをHeLa細胞に感染させたところCPEはほとんど観察されなかった。以上の結果は、PVを基礎とした安全な発現ベクターの開発につながる可能性を強く示唆している。PV IRESの活性は、3'非翻訳領域により制御されていることが知られている。このことを示す実験系を世界で初めて確立することに成功した。さらに、ヒトPVRのヒト分子としての機能を解析し、そのリガンドの刺激により、細胞の接着性が阻害されること、また細胞の移動性が促進されることを見出した。2種類のヒトPVR(PVRαとPVRδ)のうちPVRαのみにこの活性があり、PVRαのみに存在するITIM
ゲルマン語強変化動詞並びに関連する品詞の形態組織発達に関わる歴史・比較言語学研究

動詞体系などの形態体系は、「体系」を成しているがゆえに、体系的にアプローチせねば、説得力ある新たな説明は生まれない。と同時に、それは「語等置の方法」を緻密にかつ正確に用いた重厚な経験的基盤がなければ、説得力を欠くものになる。緻密で正確な語等置の手段を用いて、それぞれのゲルマン語動詞が他方言のどの動詞(のどの活用形)と等置されるべきか、それを厳密に洗い出すことから本研究は出発する。個別のゲルマン語動詞のより妥当な歴史的由来を究明することを研究の第1の目的とする。そしてその積み重ねに則り、ゲルマン語動詞体系生成過程の新たな解明に貢献することを、第2の目的としたい。
実験計画の統一解析理論とその応用の研究

何らかの“数理的よさ"の基準に基づくデザインの分類とモデル設定の統一的な取り扱い方は未だ完成されていなく、各論が発散し、実務家・研究者の間に混乱もある。今回の目的を2年前に設定した時、その方面に特に造詣が深い研究者と共同研究することが、計画の早期完全遂行を可能ならしめると考え、共同研究者として我々と同じ統計観に立ち更に同じ問題意識をもち数多くの研究結果を発表し世界的にも認められているサリンスキー、メイザ両氏が最適であると判断し、今年度の国際共同研究を計画した。この認識は正しかった。実際、この分野で現在精力的に研究している者のグループなので実り多き成果を得た。たとえば(1)無作為化原理を用いてのモデル設定の統一的な扱い方の提示(2)(1)に基づいて、ブロックサイズ一定の計画の統計的妥当性の根拠の導出(3)(1)に基づいて、ブロックサイズが一定でない計画への無作為化原理の導入と統計的意味づけの確立(4)(1),(2),(3)をふまえ、計画の効率のクラスの決定を行った後、その個数を用いてのブロック計画の体系的分類についての結果(5)スプリット-ブロック計画の最適性と構成法の導出が挙げられる。本計画は2年間で集中的に課題解決を目指した。現在でも各自の分担課題を研究すると共に、電子メール、Fax等を用いながら随時連絡を取り合い、データ解析用のモデル設定のために導入した無作為化原理に基づいて、ブロック計画に関する2つの大きな研究方法を統一的に扱える理論の構築を目指した体系的な研究を行っている。現在まで多くの資料を集め、アイディアの交換も行っている。最近、研究成果を論文や著書にする作業を続けている。これらは今年度景山がポーランドを訪問し、ポズナニにあるサリンスキー、メイザ両氏を中心とした実験計画法研究者グループの中で、直接的に不断の討論を行い、またメイザ氏が日本を訪問し討論をしたことで、本研究目標、研究方法の妥当性を含め実り多き成果を導いたものである。また今後の研究方針の決定の議論をポーランドの多くの研究者の組織的協力の下で行えることは特に重要であるとの見解も得た。メイザ氏来日中に景山、藤越、正法地、〓田、神保を加えて統計科学の枠組みの中で得られた成果の発展性を議論し、更に研究を遂行している。

たとえば(1)無作為化原理を用いてのモデル設定の統一的な扱い方の提示(2)(1)に基づいて、ブロックサイズ一定の計画の統計的妥当性の根拠の導出(3)(1)に基づいて、ブロックサイズが一定でない計画への無作為化原理の導入と統計的意味づけの確立(4)(1),(2),(3)をふまえ、計画の効率のクラスの決定を行った後、その個数を用いてのブロック計画の体系的分類についての結果が挙げられる。本計画は2年間で集中的に課題解決を目指した。現在でも各自の分担課題を研究すると共に、電子メール、Fax等を用いながら随時連絡を取り合い、データ解析用のモデル設定のために導入した無作為化原理に基づいて、ブロック計画に関する2つの大きな研究方法を統一的に扱える理論の構築を目指した体系的な研究を行っている。現在まで多くの資料を集め、アイディアの交換も行っている。最近、研究成果を論文や著書にする作業を続けている。これらは今年度景山がポーランドを訪問し、ポズナニにあるサリンスキー、メイザ両氏を中心とした実験計画法研究者グループの中で、直接的に不断の討論を行い、またメイザ氏が日本を訪問し討論をしたことで、本研究目標、研究方法の妥当性を含め実り多き成果を導いたものである。また今度の研究方針の決定の議論をポーランドの多くの研究者の組織的協力の下で行えることは特に重要であるとの見解も得た。メイザ氏来日中に景山、藤越、正法地、〓田、神保を加えて統計科学の枠組みの中で得られた成果の発展性を議論し、更に研究を遂行している。
次世代シーケンシングによる網羅的解析でヒノキ発根性関連遺伝子に迫る

ヒノキは一般的に発根性が低いため挿し木が難しい針葉樹と認識されているが、この課題では発根性に優れた挿し木品種であるナンゴウヒに着目し、一般的なヒノキと比べてどのような遺伝子に発現の違いがみられるかを調査し、発根性関連の候補遺伝子の検出を試みた。RNAシーケンスの結果、148,163の挿し木発根性に関連すると考えられる発現遺伝子群を収集することができた。シロイヌナズナの発根性関連候補遺伝子との配列類似性を調べたところ、90遺伝子がヒノキの配列との類似性を示した。ナンゴウヒと普通ヒノキの間では1,312の遺伝子で発現量に違いがあり、その多くがストレス応答やシグナル伝達に関係する遺伝子であった。平成25年4月26日および4月30日に、挿し木発根性に優れたヒノキであるナンゴウヒ(系統名:ナンゴウヒ14型)および、挿し木では発根しにくいとされているヒノキ精英樹(大井6号)の挿し木を行った。各系統30本の挿し木を行い、10日毎に3ヶ月間発根調査をした。最終的な発根有無の評価は6ヶ月後にあたる10月下旬に行った。その結果、ナンゴウヒでは挿し木後1ヶ月には発根開始が確認され、3ヶ月後には85%にあたる25本で発根が見られた。一方、大井6号は調査期間を通じて発根がみられず、3ヶ月後ではほとんどの挿し穂の切り口がカルス化していた。6ヶ月後の最終判断時には、1個体で発根が見られた以外は、全てカルスを形成していた。以上から、ナンゴウヒ14型の発根性の良さと発根までの期間が確認できた。続いてナンゴウヒ、および大井6号からのRNA抽出を行った。挿し木当日およびその後10日毎に50日後までの合計6回、採取した本葉を-80°Cで凍結保存した後に抽出に用いた。凍結保存期間は短いサンプルで3週間、長いサンプルで2ヶ月だった。その結果、いずれの本葉からも十分な量のRNAを抽出することは出来なかった。一方、本葉を採取後速やかにRNA抽出を行った場合には、500mgの本葉から約1.52μgのRNAが抽出できた。このことから、ヒノキのRNA抽出には凍結サンプルは適さず、採取後速やかに抽出を行う必要があることが明らかになった。抽出後のRNAについては、濃度を調整し、次世代シーケンサーを用いたRNAシーケンスを行うために、バイオアナライザーで濃度測定をし、-80°Cで保存した。ヒノキは難挿し木発根性の針葉樹と認識されているが、中でも発根性に優れた挿し木品種であるナンゴウヒに着目し、普通ヒノキ(この場合,精英樹大井6号)との発現遺伝子の比較から、発根性関連の候補遺伝子を明らかにすることを試みた。発根ステージが異なる3種類の挿し穂(ナンゴウヒN14型(0日)、ナンゴウヒN14型(一ヶ月経過、根を含む)、大井6号(一ヶ月経過、カルスを含む))を用い、挿し穂全体をすり潰し、RNAを抽出した。Illumina社のHiSeq2000で配列データ(各サンプルあたり4Gb、総計12.5Gb)の発現遺伝子データを収集した。その結果、148,163本のコンティグ配列(平均長は700bp)を得ることができた。シロイヌナズナのタンパク質配列とのBLASTXによる相同性探索(では、50,002本(33.7 %)のコンティグ配列にシロイヌナズナの配列と類似した配列が見つかった。さらにシロイヌナズナで側根と不定根の発生に関係のある139個の候補遺伝子に着目したところ、90個の遺伝子が993個のヒノキのコンティグ配列との配列類似性を示した。また、挿し木後一ヶ月経過したナンゴウヒN14型と大井6号のサンプル間で発現量に違いのある遺伝子の探索を行った。その結果、1,312個の遺伝子の発現に違いがあると考えられた。発現量に違いがあった配列は、ストレスへの応答やシグナル伝達に関係する遺伝子であることが多かった。挿し木直後と一ヶ月経過時のナンゴウヒの発現遺伝子の種類と発現量の違い、挿し木1ヶ月経過時のナンゴウヒと普通ヒノキにおける発現遺伝子の種類と発現量の違いを検出し、ヒノキの挿し木発根性に関連すると思われる発現遺伝子群を収集した。これらの遺伝子に対して塩基配列を明らかにし、DNAマーカーを開発するためのプライマーのデザインを行った。このことにより、針葉樹種の系統進化学的研究、造林、育種などで利用できる道筋を作ることができた。

森林遺伝育種学研究目的に対して、進行はやや遅れている。平成25年度中に次世代シーケンサーによるRNAシーケンスを行うところまでを予定していたが、RNA抽出までしか完了できなかったためである。理由としては、これまでスギ等で行っていたRNA抽出方法と同様では、ヒノキ本葉からは十分量のRNAが抽出できず、手法の再検討を行う必要があったためである。目標達成の進度は遅れているが、十分量のRNAの確保は出来たため、今後、速やかに次世代シーケンサーによるRNAシーケンスを始めることで、進度の回復は可能である。また、実験補助を雇用することで、課題遂行の迅速化をはかる。よって、研究計画に変更はなく、平成26年度の課題の推進はできるものと考えている。次世代シーケンサーによるシーケンスのためのRNAの準備に遅延が生じたため、次年度に実行することとした。そのため、当年度に使用する予定だったシークエンス関連試薬などの一部の購入が行われず、次年度使用額が生じた。次年度使用分と翌年度分として請求した助成金を合わせ、約150万円の助成を予定している。翌年度に移行した次世代シーケンサーによるRNAシーケンスには、およそ100万円の経費(試薬、消耗品代など)を見込んでいる。その他、課題推進を加速する手段として実験補助員を採用した際の謝金等に約40万円、旅費などに10万円程度を見込んでおり、助成金額内で課題を執行することができると判断した。
非侵襲的ヒト眼循環測定装置を用いた眼循環障害の病態生理の検討

動物実験家兎のInternal Ophthalmic Artery (I0A)の血流を超音波カラードプラ(CDI)で測定した。実験1:血流測定の再現性は我々が開発した測定装置を用いることで約7%と良好であった。実験2:血管抵抗指数(RI)における血圧(BP)の影響を検討した。RIはBPと明らかに逆相関した。実験3:フェニレフリン点眼による10AのRIへの影響を検討した。血圧・眼圧の変動はなく、IOAの血管抵抗指数(RI)は上昇した。実験4:カルナクリン1 IU/kg静注によるRIへの影響を検討した。RIと血圧の間には明らかな相関はなかった。次にカニクイザルの網膜動脈(RA)の血流測定をレーザードプラ装置(LDV)で行った。実験1:RAにおけるBPの影響を検討した。RIはBPおよび血管抵抗値(R)と明らかに逆相関した。実験2:RAにおけるエンドセリン(ET-1)局所注射の影響について検討した。BPの明らかな変化はなかったが、血流量の減少傾向を認めた。ヒト実験実験1:正常有志者のCRAの血流測定をCDIでRAの測定をLDVで行った。RIとRの相関について検討した。RIはRと明らかに逆相関することが認められた。実験2:高血圧家族歴の有るまたは無い正常若年有志者と高血圧患者を対象にCRAの血流測定をCDIで行い、さらにRAの血管径測定を血管解析機で行った。高血圧家族歴のある正常若年有志者はBPと拡張期の血流速度が明らかに上昇していた。高血圧患者に対し降圧剤(アムロジピン5mg)を内服した後のCRAに対する効果を検討した。BPは低下、RA血管径は拡大、血流は低下し、RIは上昇した。今回の研究結果は生体においてRIとRは一致しないこと、血圧と眼循環の関連を調べるためには、網膜血管のコンプライアンスと脈波速度が重要であることを示している。家兎を用いた実験NZ rabbitのIeternal Ophthalmic Artry(IOA)の血流は超音波カラードプラ(CDI)を用いて測定した。麻酔は、カルバミン酸エチル(ウレタン1g/kg)を用い、眼灌流圧の変化(眼圧と血圧の変化)を常に圧センサーで監視しながら血流測定を行った。開発したプローブ固定装置を用いた本実験の測定値の再現性は約7%と良好であった。フェニレフリン点眼による家兎の眼循環への影響では血圧・眼圧の変動のない状態で、IOAの血管抵抗指数(RI)はフェニレフリン点眼により上昇した。眼灌流圧の変化による家兎の眼循環への影響は、灌流ボトルの高さを変化させて眼圧を変動させながら眼循環の変化を観察した。眼灌流圧の低下と共に血流は減少したが、RIは変化に乏しかった。カルナクリン1IU/kg静注による眼循環への影響では、血圧下降作用と、血管拡張作用が相まって、RIの変化の方向性ははっきりと捉えられることができなかった。血圧の変化による眼循環への影響では、RIは血圧と逆相関していることが分かった。ヒトを対象とした実験高血圧患者のRIが投薬前後でどのように変化するか検討するため、内科受診され降圧治療が必要となった患者に対し、同意を得た上で、降圧剤(ノルバスク5mg)内服前・後(平均観察期間5ケ月)に血圧、眼圧、CDIを用いた血流測定、また、眼底写真より網膜動脈・静脈径測定を行った。血圧は下がり網膜血管は拡張していたが、血流速度は低下しRIは上昇していた。

CDI以外の血流測定機器であるレーザードプラー法(LDV)を用いて得られる血管抵抗値(以下R)とCDIのRIの相関を検討するために、健常若年ボランティアに対し、血圧、眼圧、CDIおよびLDV測定を行い、相関を調べた。ヒトにおいてRIとRはほとんど相関しないことが分かった。動物を用いた実験:家兎のInternal Ophthalmic Artery(IOA)の血流を眼圧と血圧の変化を圧センサーで監視しながら超音波カラードプラ(CDI)を用いて測定を行った。血流測定の再現性は我々が開発した測定装置を用いることで約7%と良好であった。実験1:フェニレフリン点眼によるIOAの血管抵抗指数(RI)への影響を検討した。血圧・眼圧の変動は認められなかったが、IOAの血管抵抗指数(RI)は上昇した。実験2:眼灌流圧の変化によるRI(IOA)への影響を検討した。血流は眼潅流圧の変化に相関して変動したが、RIに明らかな変動は認められなかった。実験3:カルナクリン1IU/kg静注によるRI(IOA)への影響を検討した。RIと血圧の間には明らかな逆相関の関係があることがわかった。次にカニクイザルの網膜中心動脈(CRA)と血流測定をCDIで、網膜動脈(RA)の測定をレーザードプラ装置(LDV)で行った。エンドセリン(ET-1)を局所注射した後のCRAとRAへの影響について検討した。RIとRAの血管抵抗値(R)の間には逆相関の関係があることがわかった。ヒトを対象とした測定:高血圧患者のCRAの血流測定をCDIで行い、また、RAの血管径測定を血管解析機で行った。実験1:降圧剤(アムロジピン5mg)を内服した後のCRA(RI)とRA(R)に対する影響を検討した。治療の後、血流は低下しRIは上昇したが、血圧は低下しRAの血管径は拡大した。実験2:正常有志者の血流測定をCRAはCDIで、RAはLDNを用いて行った。RIとRの相間について検討した。RIとRの間には逆相関の関係があることが分かった。今回の研究で動物およびヒトにおいてRIとRは逆相関することが明らかになり、Rによって眼循環障害の病態生理を解明することができた。
ナノ領域イメージングを用いた血管内皮細胞の焦点接着斑の力学応答ダイナミクス

本研究では,力学刺激を受けた細胞が形態変化を起こす過程を明らかにするため,焦点接着斑会合タンパク質FAKの一部であるFAT domainと焦点接着斑に連結しているアクチンフィラメントに注目し,力学刺激時の両者の動きを観察,解析しその役割を明らかにすることが目的である.特に,本研究で導入する新しいテクニックは,流れ刺激を負荷しながらFAT domainおよびアクチンフィラメントの動的挙動を直接観察する方法や表面形状を工夫した伸展膜を用いた伸展刺激負荷方法を開発することにある.まず, RFP-FAT domainおよびGFP-アクチンのベクターを用いて流れ刺激に対する細胞の形態変化を経時的に観察する実験系を確立した.ウシ大動脈由来内皮細胞を用いて実験を行った結果, FAT domainの消失,出現と密接に関連しながらアクチンフィラメントは再配列する様子が観察された.次に,微細加工を用いてマイクロピラーを有するPDMS膜を作製し,焦点接着斑の間のみに局所的に伸展刺激を負荷する方法を開発した.本法により,内皮細胞はマイクロピラー上面の周辺部に焦点接着斑を形成し,伸展方向に対して直交する方向にアクチンフィラメントの太い束であるストレスファイバを発達させることが明らかとなった.さらに,細胞内の力学情報伝達を考える上で重要なストレスファイバの力学特性を計測するためにマイクロ引張試験装置を開発した.内皮細胞から化学的処理により単離したストレスファイバに対して初めて引張試験を行い荷重-変位関係を得た.ストレスファイバの荷重-変位関係は非線形であり大きな伸展性を有することが明らかとなった.本研究により,細胞の力学応答機構における焦点接着斑と細胞骨格の果たす役割について重要な知見を得ることができた.本研究では,力学刺激を受けた細胞が形態変化を起こす過程を明らかにするため,焦点接着斑会合タンパク質FAKの一部であるFAT domainと焦点接着斑に連結しているアクチンフィラメントに注目し,力学刺激時の両者の動きを観察,解析しその役割を明らかにすることが目的である.特に,本研究で導入する新しいテクニックは,流れ刺激を負荷しながらFAT domainおよびアクチンフィラメントの動的挙動を直接観察する方法や表面形状を工夫した伸展膜を用いた伸展刺激負荷方法を開発することにある.まず, RFP-FAT domainおよびGFP-アクチンのベクターを用いて流れ刺激に対する細胞の形態変化を経時的に観察する実験系を確立した.ウシ大動脈由来内皮細胞を用いて実験を行った結果, FAT domainの消失,出現と密接に関連しながらアクチンフィラメントは再配列する様子が観察された.次に,微細加工を用いてマイクロピラーを有するPDMS膜を作製し,焦点接着斑の間のみに局所的に伸展刺激を負荷する方法を開発した.本法により,内皮細胞はマイクロピラー上面の周辺部に焦点接着斑を形成し,伸展方向に対して直交する方向にアクチンフィラメントの太い束であるストレスファイバを発達させることが明らかとなった.さらに,細胞内の力学情報伝達を考える上で重要なストレスファイバの力学特性を計測するためにマイクロ引張試験装置を開発した.内皮細胞から化学的処理により単離したストレスファイバに対して初めて引張試験を行い荷重-変位関係を得た.ストレスファイバの荷重-変位関係は非線形であり大きな伸展性を有することが明らかとなった.本研究により,細胞の力学応答機構における焦点接着斑と細胞骨格の果たす役割について重要な知見を得ることができた.力学的刺激を受けた血管内皮細胞の形態変化の過程を明らかにするため,細胞骨格の1つであるアクチンフィラメントおよび焦点接着班の働きに着目して実験・解析を行った1.シリコーン膜上への近接場光の形成システムの開発倒立型光学顕微鏡に落射レーザ光照射システムを取り付け,特殊な対物レンズを用いてシリコーン膜上約100nmの領域に近接場光の存在を確認することができた。しかしながら,細胞底面における接着班の観察においては,厚さ約70μmのシリコーン膜を通しての観察のため明瞭性の点でさらに工夫が必要である。2.力学的刺激負荷による細胞骨格および焦点接着班の応答解析ウシ大動脈由来内皮細胞をシリコーン膜上に播種し,GFP-アクチン,RFP-FATのベクターを細胞内に導入して引張負荷実験を行った。ひずみ10%,1Hzでシリコーン膜を繰り返し伸張したところ,細胞自体は膜の伸びと直交する方向に配向し,アクチンフィラメント,FATも同様の配向を示した。これにより,シリコーン膜上で細胞の動的挙動を直接観察することが可能であることが示された。また,シリコーン膜上に不均一なひずみ場を形成したところ,同一細胞内でもひずみの大きい箇所でアクチンフィラメントの発達がみられ,かつ核の位置が低ひずみ側に偏っていることが観察された。培養内皮細胞に流れによるせん断応力を負荷して,アクチンフィラメントが再配列し,同時に焦点接着班の配置も変化する現象を詳細に観察した。焦点接着班のスライド運動,伸張,出現・消失も明瞭に観察された。これらの結果から,流れの負荷に対して内皮細胞は,(1)デンスペリフェラルバンドの移動あるいは消失,(2)焦点接着班の移動,出現・消失,(3)葉状仮足の形成,(4)焦点接着班の回転と細胞の伸張,(5)ストレスファイバの形成,の過程を経て形態変化を起こしていることが推察された。