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中国農村の土地財産権と末端行政に関する学際的研究

本共同研究では、法学・政治学・農業経済学の諸領域において、農村の土地財産を巡る諸関係に関する制度・理論・実態の基本問題の発見と整理、およびいくつかの具体的問題の解明を進めた。法学領域では、重要な立法(農村土地請負法、農業法および物権法等)が相継ぎ、テーマに関する法整備が進んだことから、立法面・法制面での動きをフォローしながら法理論的問題の発見と整理、考察をおこなった。政治学領域では、基層といわれる「郷鎮-村」レベルの権力関係とそれを支えている構造をできるだけ詳細に明らかにするという課題を設定し、北京市に対象を絞って制度および実態の解明をおこなった。農業経済学領域では、農民の家族経営と農地の請負経営権の分配に関する研究を進めた。そこでの主題は、市場経済化を目指す中国において、農地(または耕地)という農業の生産要素が、他の生産要素(資本)あるいは他の土地(都市の工商業用地や住宅地)と同じように市場で取引される財となりえるのか、ということであった。以上のとおり各領域で本共同研究は進められたが、その結果、農村土地財産権に関する契約と権利構成の基本的内容、末端行政組織の形成プロセス、権利分配に関する集団の意思決定、に関する問題を明らかにすることができた。また、制度・理論・実態の諸層で矛盾が生じ、不安定な状況が生まれ、解決すべき問題が山積していることを確認することができた。その上で、市場経済への移行ないしは市民社会の形成を進めている中国について法学・政治学・経済学の共同研究を進めるにあたっては、「団体と団体構成員」または「集団と個人・家族」という分析概念を用いるのが有効であり、これらの概念で中国農村の土地財産を巡る諸関係を分析していくことが今後の課題である、という結論が導き出された。本年度は、法学、政治学、経済学の立場から共同研究者各自が問題の所在を確認して中国農村地域の土地財産楮および末端行政に関わる実態的・理論的基本問題を整理し、どのようなアプローチが効果的であるかを検討することに費やされた。文献資料調査(過去の実態調査資料を含む。)によって進められた研究の中間報告は、共同研究会で、(1)菅沼圭輔「農村の農地請負経営権保有行動に関する一考察請負経営権譲渡リスクに関する意思決定論的アプロチ」平成13年7月24日、(2)國谷知史「婚姻法改正をめぐる諸問題」平成13年10月16日、(3)真水康樹「基層・地方における各種選挙の可能性と限界に関する-考察-村長選挙の郷鎮・村ネットワークヘの影響を中心に-」平成14年1月29日、と題して発表された。菅沼は、農村土地請負経営権の「調整」の継続を望む農民の請負経営権保有行動を意思決定論の分析方法を適用して分析し、請負経営擢の流動化を図るには、社会保障制度や「社会化服務体系」の整備などが必要であることを明らかにしようとしている。國谷は、平成13年4月28日の婚姻法改正で離婚夫婦の土地請負経営権をそれぞれ保護する内容(第39条2項)が追加されたことから、婚姻法改,正を農村土地財産権の視点から検討し、家族単位ではなく、個人の権利として土地請負経営権を捉える立法が進んでいることを明らかにし、法制度全般の整備方向を確認しようとしている。真水は、村民委員会主任・委員選挙プロセスの分析を通して村民委員会と党または政府の関係および関係(党による領導-従属関係)の変化の可能性を明らかにしようとしている。各自、その後も中間報告の方向で研究を進めたが、真水は、2月中旬に北京大学へ行き、このような研究対象・方法等について中国の専門家に対する面接聴き取り調査をおこなった。

本年度は、前年度の文献資料調査に基づく基本的な問題整理を踏まえ、実態的・理論的な問題点の分析に取り組む一方、法及び経済の両分野における問題状況及び実態の聞き取り調査を実施した。調査は國谷知史と菅沼圭輔によって平成14年8月に行われた。國谷は、北京大学で北京大学法学院の銭明星教授(民法)・潘剣鋒教授(民事訴訟法)と面接し、農村土地請負経営権の設定及び紛争処理並びに農村土地請負法制定にあたっての問題点について聞き取りを行った。菅沼は、陝西省延安市において請負経営権の分配制度と退耕環林政策の実施に伴う集団の意思決定の特徴について実態調査を行った。実地及び文献調査によって進められた研究の中間報告は、共同研究会で、(1)國谷知史「農村土地請負契約について」平成14年10月1日、(2)真水康樹「『街居制』の問題点と『社区』建設」平成14年12月3日と題して発表された外、(3)菅沼圭輔「耕地利用権分配に関する集団の意思決定一請負期間延長と退耕環林政策の実施状況の分析」と題する討論用研究ノートとして提出された。國谷は、昨年度の婚姻法改正に続き平成14年8月に農村土地請負法が制定されたことで、個人の権利として土地請負経営権を捉える立法が進んでおり、中国法学界でも理論的検討がなされていることを主に契約法の側面から明らかにした。真水は、北京市に対象を絞り、特に農村部における郷鎮人民代表選挙について「北京市郷・民族郷・鎮人民代表大会組織条例」の1996年改正を検討した上で、それと結びつけて2002年選挙の実態を分析した。菅沼は、請負経営権の分配について集団と個人の意思決定の関係や山地を含めた集団所有地全体の利用権分配における「平等原理」の現れ方について文献及び延安市での調査結果から分析し、個人レベルでは耕地の「調整」停止に対する否定的見解が多く存在する等、集団と個人の意思決定にずれがあることを明らかにした。本年度は、これまで2年間の研究成果を踏まえ、農村土地財産権設定契約と権利構成の基本的内容、末端行政組織の形成プロセス、権利分配に関する集団の意思決定、を軸に研究の統合をおこなった。法学領域では、國谷が、関連の法整備が進んだことから、立法面・法制面での動きをフォローしながら理論的問題の発見と整理、考察をおこなった。政治学領域では、真水が、まず、基層といわれる「郷鎮-村」レヴェルの権力関係とそれを支えている構造を明らかにすること、次に、基層の権力関係を、それが一部をなす中国の広義の中央-地方関係全体のなかに位置づける枠組みを考えること、という2つの課題を設定し、北京市に対象を絞って制度および実態の解明をおこなった。農業経済学領域では、菅沼が、農民の家族経営と農地の請負経営権の分配に関し、市場経済化を目指す中国において、農地(または耕地)という農業の生産要素が、他の生産要素(資本)あるいは他の土地(都市の工商業用地や住宅地)と同じように市場で取引される財となりえるのか、その可能性はどのように実現されるのかを主題として研究を進めた。また、資料収集と整理の面では、岡が、村民委員会および土地請負制に関する法令資料の目録を作成した。本研究によって、中国農村社会に対する政策・立法とその実現過程を法学的・政治学的・経済学的視点から観察したとき、制度・理論・実態の諸層で不安定な状況が生まれ、解決すべき問題が山積していることを確認することができた。
ひずみ場制御による鉄鋼材料のせん断型変態組織の微細化法確立

本研究では、せん断型変態特有の大きな変態ひずみを利用して,別方位結晶の核生成を促進することでせん断型変態組織を微細化する新たな手法を確立する.変態ひずみがマルテンサイト組織に及ぼす影響を明確にするため,本年度は,以下の点に取り組んだ.昨年度,薄膜試料を用いて変態ひずみの影響を明確にすることは困難であることが明らかになったため,当初予定していた様々なバルク組成を有する試料を用いた実験を拡張し,Fe-Mn-C合金を中心として,γ粒径,炭素濃度およびMn濃度を変えた試料におけるラスマルテンサイトのブロックサイズ,パケットサイズを系統的に調査する.具体的には,Fe-(0,2,4)Mn-(0.2,0.4)C合金を850°Cから1200°Cの種々の温度でγ化した後に焼入れ,様々なγ粒径の試料におけるマルテンサイト試料を作製する.この試料をEBSD測定して,ラスマルテンサイトのブロックおよびパケットサイズを測定し,ラスマルテンサイト組織形成に及ぼす母相粒径,炭素濃度およびMn濃度依存性を調査した。その結果,ブロック厚さは旧γ粒径には依存せず一定であること、CおよびMn添加に伴い減少することが確認された。また、ブロック長さについては旧γ粒径の微細化およびC添加に伴い減少し、Mn添加はほとんど影響しないことが確認された。ブロック組織の形成に密接に関係するバリアント組織について見ると、CおよびMn添加によりバリアント隣接傾向が変化していたことから、バリアントの生成機構を決定する因子である変態駆動力や母相強度がブロック厚さに影響していることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。せん断型変態特有の大きな変態ひずみを利用して,別方位結晶の核生成を促進することで,せん断型変態組織を微細化する新たな手法を確立するため,本年度は,旧オーステナイト粒径を約200umに揃え0.05%から0.75%まで炭素量を変えたFe-2Mn-C合金を種々の温度でベイナイト変態および焼入れによりマルテンサイト変態させた.その結果,マルテンサイト組織のブロックは炭素濃度が高くなるほど単調に微細化することが明らかとなった.また,高炭素ほどKC条件に有利なバリアント対が多く生成していた.一方,ベイナイト組織では,変態温度が低下するほどブロック組織は微細化するが,炭素濃度依存性は変態温度によって傾向が異なり,500°C変態材では高炭素ほどやや微細化するのに対して,450°C,400°C変態材では,高炭素になるほど粗大化する傾向が見られた.このようなブロックサイズの炭素濃度と変態温度依存性は,変態温度での母相強度と変態駆動力で整理することができることを示した.また、変態ひずみの定量評価については,収束電子線ビーム(FIB)で周期的なパターンを書き込んだ基準板を作成して,画像相関法によるひずみ測定の可否について検討を行った.その結果,SEM内で一定角度差をつけて撮影した写真を三次元画像相関ソフトで解析することで,精度は悪いながらも光学顕微鏡観察よりもより高倍での三次元ひずみ分布測定ができることを示した.測定精度については,角度差をより大きくし,FIB加工によるパターンの鮮明度を上げることで,改善できるものと考えている.当初の予定通り、Fe-Mn-C合金についてのデータベースが完成し,変態ひずみ測定について実験条件をほぼ絞り込むことができているため,順調に進展していると考えている.本年は、以下の二点に取り組んだ。(1)マルテンサイトのバリアント選択機構の解明本年は、Fe-C, Fe-NiおよびFe-C-Ni合金における種々のマルテンサイト組織におけるバリアント構造を調査した。各試料をオーステナイト化のち焼き入れてマルテンサイトを得た。また、Ms点が室温以下の試料についてはサブゼロ処理によりマルテンサイトを得た。得られたマルテンサイト組織について、バリアントの隣接傾向を調査した。その結果、ラスマルテンサイトでは、最密面平行関係を共有するバリアントが隣接しやすくその中でも方位差の小さなバリアントもしくは双晶関係にあるバリアントが隣接しやすいことが明らかとなった。一方、レンズマルテンサイト、バタフライマルテンサイトでは、晶癖面が平行に近い特定バリアントが隣接しやすいことが明らかとなった。自己緩和機構ではこれらの優先隣接バリアントは説明がつかない。一方、バリアント界面でのひずみの連続性に注目するKinematic compatibilityを解析すると、いずれの優先隣接バリアントもK-C条件に有利なことから、バリアント境界でのひずみの連続性がバリアント構造発達に大きく影響しているものと考えられる。(2)薄膜試料でのマルテンサイト薄膜試料のマルテンサイト変態では周囲の拘束が少なくなるため、マルテンサイト変態に及ぼす試料厚さの影響を調査することで、ひずみの影響を明確にできるものと考えられる。そこで、種々の厚さを有するFe-32Ni合金を冷却してマルテンサイト変態させ、その組織を調査した。電気抵抗およびDSC測定によりMs点を調査したが、予想に反し、試料厚さが薄くなるほどMs点は低下する結果となった。また、マルテンサイト組織は30um-1mmの試料厚さではほとんど変わらない結果となったため、この調査を打ち切ることにした。当初、薄膜試料でのマルテンサイト変態を調査することで、変態ひずみの影響を明確にできると考えていたが、薄膜化することで表面状態や表面方位の影響が大きくなり、Ms点やマルテンサイト組織は試料厚さの影響以外の因子に影響されることが明らかとなり、方針を変更したため。

本研究では、せん断型変態特有の大きな変態ひずみを利用して,別方位結晶の核生成を促進することでせん断型変態組織を微細化する新たな手法を確立する.変態ひずみがマルテンサイト組織に及ぼす影響を明確にするため,本年度は,以下の点に取り組んだ.昨年度,薄膜試料を用いて変態ひずみの影響を明確にすることは困難であることが明らかになったため,当初予定していた様々なバルク組成を有する試料を用いた実験を拡張し,Fe-Mn-C合金を中心として,γ粒径,炭素濃度およびMn濃度を変えた試料におけるラスマルテンサイトのブロックサイズ,パケットサイズを系統的に調査する.具体的には,Fe-(0,2,4)Mn-(0.2,0.4)C合金を850°Cから1200°Cの種々の温度でγ化した後に焼入れ,様々なγ粒径の試料におけるマルテンサイト試料を作製する.この試料をEBSD測定して,ラスマルテンサイトのブロックおよびパケットサイズを測定し,ラスマルテンサイト組織形成に及ぼす母相粒径,炭素濃度およびMn濃度依存性を調査した。その結果,ブロック厚さは旧γ粒径には依存せず一定であること、CおよびMn添加に伴い減少することが確認された。また、ブロック長さについては旧γ粒径の微細化およびC添加に伴い減少し、Mn添加はほとんど影響しないことが確認された。ブロック組織の形成に密接に関係するバリアント組織について見ると、CおよびMn添加によりバリアント隣接傾向が変化していたことから、バリアントの生成機構を決定する因子である変態駆動力や母相強度がブロック厚さに影響していることが示唆された。H29年度は,本年度の結果を受けて,Fe-Ni基合金において生成するレンズおよびラスマルテンサイトについて画像相関法を用いて変態ひずみを定量測定する.さらに,薄膜試料をマルテンサイト変態させることで,変態ひずみがマルテンサイト変態に及ぼす影響について解明する.薄膜試料を用いて変態ひずみの影響を明確にすることは、困難であることが明らかになったため,当初予定していた様々なバルク組成を有する試料を用いた実験を拡張し,Fe-Mn-C合金を中心として,γ粒径,炭素濃度およびMn濃度を変えた試料におけるラスマルテンサイトのブロックサイズ,パケットサイズを系統的に調査することに加え,部分焼入れ材を用いて母相粒界でのマルテンサイトの核生成およびマルテンサイト/母相界面における自己緩和による核生成を調査して,変態ひずみがラスマルテンサイト組織サイズに及ぼす影響を明確にする.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
エアロジェル中の超流動ヘリウム3の理論的研究

本研究課題では、エアロジェルという多孔質媒質中の超流動ヘリウム3の相図と可能な対状態を調べることにより、スピン三重項対状態による軌道、スピン自由度がからむ多成分秩序パラメタを持つ超流動への乱れ(不純物)の効果という、超伝導体では実現できない新奇な量子凝縮相が期待される状況下にある系を理解することを目的とした。この研究プロジェクトの準備段階の調査は平成16,17年に済ませており、当初は乱れにより軌道自由度の長距離秩序を失った可能な超流動相という側面からのA-like相(高圧超流動相)の研究を行ったが、その後エアロジェルを一方向に圧縮あるいは伸張した形でヘリウム3に異方性を与えることにより、バルクの超流動状態としては実現し得ないポーラー対状態が超流動転移線近くの新たな相として実現しうることを提唱した。その結果国内外の実験グループではエアロジェルの加工に基づいた研究が行われ、新奇な相の探求が試みられている。しかし、通常等方的と考えられているエアロジェル中でも、エアロジェルによる準粒子散乱効果が元来異方的であると考えると、A-like相に関する相図の特徴を理解できると期待されるようになり、これに関係して強結合効果というA-like相を微視的に安定化する準粒子間の強相関効果を詳しく調べた。本研究課題に基づいた研究の多くがこの強結合効果の調査に費やされた。海外の他のグループによる過去の調査に依れば、強結合効果はエアロジェルの不純物散乱効果により強まるという結果が示唆されており、これではエアロジェル中でA-like相が極めて狭い温度域に限られて存在するという事実が説明できなかった。今回、我々は強結合効果への不純物効果を詳しく調べ、過去の研究で見落とされていた項が不純物依存性の傾向を逆転させることを突き止め、前述の異方性の効果と絡めて計算された相図が実験で見出された相図と類似していることを示した。平成18年度の本研究課題では、エアロジェル中の液体ヘリウム3の超流動転移温度直下に現れる等スピン超流動対状態A-like相の正体を理論的に明確にすることを目的とした研究を行った。1)A-like相で観測されるNMRシグナルの特徴がバルク液体のA相における特徴と顕著に違うことや、2)AB転移線の圧力依存性がバルク液体と逆の傾向を示すこと、などから、A-like相の対状態が従来のAnderson-Brinkman-Morel(ABM)状態ではないという提案があり、この問題を理解することが現在超流動ヘリウム3ではホットな題材である。上記のA-like相がABM状態でないという示唆は熱力学量の考察と調査から出てくる結論とは正反対であるため、理論的解明が必要であった。今回、上記の1)に関してはA-like相がABM状態であった場合、Leggett方程式においてクーパー対の軌道角運動量方向について乱れに関し平均をとることにより、ABM状態であってもNMR実験は理解できることを示した。また、2)の現象は、微視的にABM状態の安定性の原因となる(粒子相関による)強結合効果がエアロジェルがもたらす乱れの効果により著しく弱まることを意味しているため、今回強結合効果への乱れの効果を体系的に調べた。その結果、従来の理論では無視されていたバーテックス補正項が強結合効果の減退の要因であることを突き止め、実験事実との矛盾は解消されたと言える結果を得た。特に、エアロジェルによる準粒子散乱にわずかな異方性を考慮すれば、この強結合効果の減退に基づいたモデルで2)の特徴は十分理解できることがわかった。これにより、A-like相をABM対状態とする解釈に問題が無いことが立証されたと考えている。

今回、我々は強結合効果への不純物効果を詳しく調べ、過去の研究で見落とされていた項が不純物依存性の傾向を逆転させることを突き止め、前述の異方性の効果と絡めて計算された相図が実験で見出された相図と類似していることを示した。
胎生環境と中枢神経機能

胎盤は母体側では代謝系を妊娠特有の状態に保ち胎仔への栄養の供給を行ない、母体とは遺伝子の異なる胎仔を免疫的に拒絶しないよう調節し、さらに内分泌学的に帰納するなど多くの機能を果たし、胎仔の発育と生存に必須の役割を果たしている。胎盤の主な機能は胎盤性ラクトジェン(PL)を介して行なわれている。下垂体ホルモンであるプロラクチンの分泌は妊娠期にPL分泌が開始すると停止すること、PLと類似した構造を持つプロラクチンを投与すると母性行動が誘起されることが知られている。これらは胎盤はPL分泌を介して母親の中枢神経系に影響を与えていることを意味している。本研究では神経細胞分化前の神経前駆細胞を含んだ胎仔の脳でPL受容体mRNAを発現していることを発見した。また、この時期に妊娠中期特異的に発現しているPL、PL-Imを発見しそのcDNAクローニングと組み替えタンパク質の生産に成功した。これらの研究の課程で、胎仔脳特異的分子を認識する単クローン抗体の作成に成功した。また、ステロイド代謝酵素20a-ハイドロキソステロイドデヒドロゲナーゼが胎盤で発現し胎仔の発育環境を調節していることが明らかになった。生・胎仔の発育は妊娠のステージの進行に伴い、適切な胎生環境のもとで胎仔の遺伝子プログラムに従い不可逆的に進行する。神経系の発達も例外ではなく、多くの神経機能獲得が胎生環境により影響を受ける。胎盤は母体の持つ生理活性物質のほとんど全てを作り出す能力があり、胎盤由来の糖タンパク、胎盤性ラクトゲンは母親の中枢神経機能に作用し妊娠から哺乳期に至るまで、行動、代謝に重大な影響を与えている。これらの物質は臍帯動脈中や羊水中にも存在し、未発達の消化管や皮膚を通して胎仔内に取り込まれることが明らかになっている。したがって後に述べるように、胎生期を通して、羊水中や臍帯血中の成分が胎仔の神経系の発達に関与していることは容易に推測できる。本研究計画では、羊水、臍帯血、胎仔血中、胎盤培養上清の解析と向神経因子(神経細胞の機能獲得やシナプス形成に与える因子)の探索、胎生期液性環境と胎児の神経発達、胎生環境の成熟後の神経活動(特に視床下部機能:内分泌機能、自律機能、本能行動)におよぼす影響、について研究を行った。まず、妊娠各期の胎仔の液性環境と胎盤生成物質について二次元電気泳動により妊娠中期動物で羊水中に胎盤性ラクトジェン様の物質が存在すること、胎仔の神経系にラクトジェン受容体が発現していることを発見した。同時記はグリア細胞の分化前であるため極めて興味深い。現在mRNAを発現している細胞の同定を行っている。神経細胞初代培養系によるインビトロで神経細胞の明暗リズムを解析する系を確立した。さらに、ラットでインビボ、インビトロにおける神経単一ニューロン活動の記録にも成功した。さらに、本技術をシバヤギに応用し、神経活動と自由行動下でのテレメトリー解析による自律機能(呼吸、血圧、体温、脈拍)および行動との関連を観察した。胚発生・胎仔の発育は妊娠のステージの進行に伴い、適切な胎生環境のもとで胎仔の遺伝子プログラムに従い不可逆的に進行する。胎盤は母体の持つ生理活性物質のほとんど全てを作り出す能力があり、母親の行動、代謝に重大な影響を与えている。これらの物質は胎仔内にも取り込まれることが明らかになっており、胎仔の神経系の発達に関与していることが容易に推測できる。本研究計画では、羊水、臍帯血、胎仔血中、胎盤培養上清の解析と向神経因子(神経細胞の機能獲得やシナプス形成に与える因子)の探索、胎生期液性環境と胎仔の神経発達、胎生環境の成熟後の神経活動(特に視床下部機能:内分泌機能、自律機能、本能行動)に及ぼす影響について研究を行った。妊娠ラット血清中より精製したPL-αの分子性状を解析することで妊娠中期特異的な新規PLであることを明らかにした。また、妊娠中期特異的な新たなPL分子、PL-Imのクローニングに成功し、バキュロウイルス-昆虫細胞発現系による大量生産システムを確立した。

ラット脳シナプトゾームに対する単クローン抗体の作成し、神経細胞培養系におけるシナプス形成の評価系によりスクリーニングを開始した。胎仔脳のPLの特異受容体には妊娠の推移によって発現が量的に変化することを遺伝子レベルで明らかにした。胎盤で分泌されるPLその他の細胞成長因子、神経成長因子の胎仔脳の分化・発達に対する影響を調べるための評価系として、神経細胞培養系におけるシナプス形成の評価法や生体外全胚培養系を開発した。微小透析法による脳内神経伝達物質の測定系を確立し、また、インビトロで視床下部スライス脳脊髄液のアミノ酸組成と同一の成分を有する培養液を用いることでより生理的に近い状態での解析を可能とした。胚発生・胎仔の発育は妊娠のステージの進行に伴い、適切な胎生環境のもとで胎仔の遺伝子プログラムに従い不可逆的に進行する。神経系の発達も例外ではなく、多くの神経機能獲得が胎生環境により影響を受ける。胎盤は母体の持つ生理活性物質のほとんど全てを作り出す能力があり、母親の行動、代謝に重大な影響を与えている。これらの物質は胎仔内にも取り込まれることが明らかになっており、胎仔の神経系の発達に関与していることが容易に推測できる。本研究計画では、羊水、臍帯血、胎仔血中、胎盤培養上清の解析と向神経因子(神経細胞の機能獲得やシナプス形成に与える因子)の探索、胎生期液性環境と胎仔の神経発達について研究を行った。本年度は妊娠中期特異的分子、胎盤性ラクトジェン(PL-Im)のバキュロウイルス-昆虫細胞発現系による大量生産システムを確立した。また、羊水中には母体血清中と異なった分子量の大きなPL用分子が存在することが明らかになった。申請者らは先に神経分化前の胎仔脳においてPL受容体のmRNAが発現していること、日令によりその発現量が大きく変化することを明らかにしているが、羊水中の大分子PLとの関連は今後の研究として興味深い。脳各分画に対する単クローン抗体を作成し、胎仔期特異分子P70とP90分子を発見した。これらは神経前駆細胞が神経細胞とグリア細胞に分化する前の段階で特異的に胎仔脳で発現している。そこで神経前駆細胞の培養系を確立しin vitroでのこれら分子の発現調節と機能についての研究を開始した。本培養系は条件により神経細胞あるいはグリア細胞に分化し、様々な評価系に利用できる。羊水や遺伝子組換えPL-Imの添加時における神経分化の研究を行なっている。
症例に応じた分子標的治療を目指した急性白血病幹細胞の定量と特性の検査法の開発

白血病細胞の培養系で、種々の幹細胞制御シグナルをリガンドで活性化、もしくは阻害薬やsiRNAで抑制して、増殖や蛋白活性化を解析し、各シグナルの役割を調べた。Hedgehog活性化は短期増殖に影響を与えないが、コロニー形成能を有する細胞の自己複製を促進した。BMP活性化は、一部の細胞の短期増殖を促進したが、コロニー形成能を抑制した。阻害薬やsiRNAによるNotch、Hedgehog、Wnt、mTOR、HIFシグナルの抑制は細胞増殖を抑制した。これらのシグナル間には相互に関連があることが分かった。フローサイトメトリーによるNotchの発現解析では幹細胞の定量はできなかった。急性白血病を治癒させるには、白血病細胞の単なる増殖抑制でなく、白血病幹細胞を根絶する治療戦略が必要である。そのためには、白血病幹細胞の自己複製の機序や特性を理解し、幹細胞を定量的に評価する必要がある。平成24年度はBMP4、mTOR、Notchの白血病幹細胞に対する役割について知見を得て論文発表を行った。BMP4蛋白刺激によるBMPシグナル活性化は、細胞の短期増殖は促進するが、白血病細胞株のコロニー形成能を抑制することが多く、幹細胞レベルには抑制的に作用することを見い出した(論文1)。mTORシグナル阻害剤を白血病細胞の培養系に添加すると、白血病細胞のアポトーシス誘導を介した増殖抑制をきたすが、一部の細胞ではNotchシグナルを活性化することを見い出した(論文2)。Notch蛋白は幹細胞マーカーの一つであるが、白血病細胞におけるNotch蛋白の発現をフローサイトメトリー法で定量的に測定する検査法を確立し、白血病の病型によって、その発現パターンに違いがあることを見出した(論文3)。このほか、骨髄増殖性腫瘍で見られるJAK2遺伝子変異を従来のシークエンス法ではなく、PCRを用いてより簡便に検出できる種々の検査法を開発し、その検出感度などを比較検討した(論文4)。また、白血病細胞の増殖におけるEph/EphrinシグナルやHIFシグナルの役割や、慢性骨髄性白血病の遺伝子検査において、検査間での検出感度の差異に関して得た知見を学会で報告した。急性白血病を治癒させるには、白血病細胞の単なる増殖抑制だけでなく、白血病幹細胞を根絶する必要がある。そのためには白血病幹細胞の特性を理解し、それに関わる分子を標的とする治療戦略が必要である。平成25年度はHIFとNotchを中心に研究を行い、以下のような成果を得た。白血病幹細胞は骨髄の低酸素環境下に存在する。われわれは白血病細胞が通常酸素下でもHIF(低酸素誘導因子)を発現することを見出した。そこでHIFの機能を阻害する化合物であるエキノマイシンの白血病細胞に対する作用を調べた。エキノマイシンの投与は、細胞増殖を抑制しアポトーシスを誘導すること、さらには、Notchシグナルをも抑制することを見出した(論文1)。以前にNotch阻害薬は白血病細胞の増殖を抑制することを報告したが、その作用の特異性を確認するため、NOTCH遺伝子のsiRNAによるNOTCHのノックダウンの効果を調べた。NOTCHのノックダウンはNotch阻害薬と同様の抑制効果を示した。このノックダウンに伴い、mTORシグナルも抑制されることを見出した(論文2)。また、白血病細胞を低酸素下で培養すると、NotchシグナルやNFκBシグナルを抑制することを見出して米国血液学会で報告した(学会発表1)。これまでの3年間の研究で、白血病幹細胞にNotch, Wnt, Hedgehog, mTOR, BMP4, HIFなどの分子が関与していることを見出した。これらの作用はWST-1法、コロニーアッセイ、定量RT-PCR、イムノブロットなどの検査法で明らかにでき、これらの分子に対する阻害薬が治療に応用しうる可能性を示した。これらの成果を7編の英文原著論文で報告した。急性骨髄性白血病を治癒させるには単なる増殖抑制だけでなく、白血病幹細胞を根絶する治療戦略が必要である。われわれは患者由来の白血病細胞の解析に先立ち、白血病細胞株を用いて、Hedgehogシグナルの白血病幹細胞に対する作用について検討した。Sonic hedgehog蛋白刺激によるHedgehogシグナル活性化は、短期的増殖能には有意な影響は与えないが、コロニー形成能を有する細胞の自己複製を促進することを報告した(論文1)。このほか、BMP4蛋白刺激によるBMPシグナル活性化の、白血病細胞の増殖に対する効果も検討し、BMP4刺激はコロニー形成能を抑制することを発表した(学会発表1)。これまでに我々は、Notchシグナル阻害薬が白血病細胞の増殖抑制をもたらすことを報告したが、その効果は充分なものではなかった。そこで、Notchシグナル阻害薬とHedgehog阻害薬であるシクロパミンとを合わせて白血病細胞培養系に添加して効果を調べた。

両者の添加は増殖抑制効果を相加的に増強すること、シクロパミン添加はHedgehogシグナルの阻害だけでなく、Notchシグナル活性化をも抑制することを明らかにした(論文2)。このほか、患者の白血病細胞を用いて、幹細胞の指標の候補であるNotch関連蛋白の発現をフローサイトメトリーで解析し、白血病の病型によりその発現パターンが異なることを報告した(学会発表2)。幹細胞を制御する種々の分子やシグナルと白血病幹細胞との関連について知見が得られてきており、また、白血病幹細胞の定量解析に関する検査法の一部も確立でき、研究は順調に進行している。幹細胞を制御するシグナルと白血病幹細胞との関連について、および、幹細胞を定量解析する検査法についての研究が順調に進行している。当初作成した研究計画と24年度までの成果をふまえて、種々のシグナルの白血病幹細胞に対する作用が、細胞株だけではなく患者由来の細胞でも認められるか否かを検討する。また、シグナル阻害薬の作用の特異性を明らかにするため、シグナル構成分子に対するsiRNAによる発現抑制でも同様の作用が得られるか否かを明らかにする。さらには、得られた知見を統合して、各症例での白血病幹細胞の特性を把握するにはどういった検査が重要であるかを検討し、その特性に対する分子標的治療薬の感受性検査法を確立する。当初の研究計画と23年度の成果をふまえて、細胞株だけでなく患者細胞でも同様の現象が認められるか否かを検討する。また、これらの作用が起こる機序をcDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析する。細胞培養に必要な培地などの消耗品、シグナル活性化や抑制に関する試薬やsiRNA、その分子生物学的解析のためのPCRプライマー、イムノブロット用の抗体などを購入し、研究成果を発表する論文の別刷代にも充てる。細胞を培養するのに必要な試薬や、その分子生物学的解析のためのPCRプライマー、既製のマイクロアレイ、イムノブロット用の抗体などを購入する。
非線形共鳴相互作用が支配する漸近的力学系と流体方程式

回転球面上の2次元Navier-Stokes方程式の解が,回転角速度の増大とともに,非線形項を非線形共鳴相互作用のみに限定した流体方程式(極限方程式)の解に近づくことを示した。これは,共鳴相互作用項以外の非線形相互作用は,回転角速度の増大とともに激しく振動して打ち消し合いが生じるためである。帯状流に対応するモードはこの共鳴相互作用を通じて,他のモードのエネルギー輸送に直接の寄与は行わないが,他のモードの位相変化には寄与する。数値シミュレーション結果は,この位相変化の効果は全系のエネルギー輸送を考える際に無視できない効果を及ぼすことを示している。空間的波動を伴う非線形系では,しばしば波動の非線形共鳴相互作用が非線形解の空間パターンを決定する上で重要な役割を担っている.特に非線形共鳴相互作用による時間発展は,波動の振動数が大きい極限において,非線形系の漸近挙動を記述すると期待される.本研究の目的は,線形波動解をもつ流体方程式を対象として,共鳴相互作用が卓越する状況を記述する漸近的力学系を支配する方程式を数学的に導き,さらに,得られた方程式の解の性質を,理論的および数値的に調べ,非線形共鳴相互作用系の性質とその役割を明らかにすることである.本年度は計画初年度として,回転球面上の2次元Navier-Stokes (NS)方程式の解について高速回転の極限を研究した.これまでに2次元ベータ面CHM方程式の高速回転の極限方程式を得ている.この解析ではベータ面上ではフーリエモードの共鳴相互作用が簡明な形になることの利点が大きいが,回転球面上では球面調和関数の非線形相互作用となるため共鳴条件自体が複雑なものとなる.現在,この共鳴条件のもとでの共鳴相互作用方程式と2次元NS方程式の関係(解の収束性)の解析を継続して行っている.またこの共鳴相互作用方程式の数値解析も実行中である.これまでに,共鳴相互作用を行うモード(球面調和関数)のクラスターへの分解を行って,それぞれのクラスター内のダイナミクスを数値的に調べている.数値結果は2次元NS方程式におけるエネルギー逆カスケードは,クラスター内のダイナミクスによるものではなくクラスター同士の相互作用によるところが大きいことを示唆する結果を得ている.計画二年度は上記の解析とともに,この数値計算を組織的に行って,共鳴相互作用方程式の性質の解明を目指す予定である.本研究計画では線形波動を含む流体方程式において線形波動の非線形共鳴相互作用のみから成る漸近方程式とその解の性質を明らかにすることである.本年度は,流体方程式(CHM方程式)について高速回転極限を考え,その解が漸近方程式の解にどのように収束するかを検討し,同時に,漸近方程式において線形モードが非線形共鳴相互作用によってクラスター分解されることに注目して,それぞれのクラスター内部におけるダイナミクスとクラスター同士の相互作用によるダイナミクスを数値的に調べた.その結果,2次元Navier-Stokes方程式におけるエネルギー逆カスケードには,クラスター内部のダイナミクスではなく,クラスター同士の相互作用の効果が大きいことを示唆する結果を得た.この結果は回転球面二次元流における共鳴相互作用と非共鳴相互作用それぞれの役割の解明につながるものとして興味深く,次年度の研究に繋がるものである.空間的波動を伴う非線形系では,波動の振動数が大きい極限において共鳴相互作用が漸近挙動を記述すると期待される.本研究では,このような漸近的力学系を支配する方程式を数学的に導き,さらに,得られた方程式の解の性質を,理論的および数値的に調べる.本年度は計画初年度に続いて回転球面上の2次元Navier-Stokes (NS)方程式の解について高速回転極限を調べた.これまでに2次元ベータ面CHM方程式の解の高速回転極限を記述する方程式を得ていたが,本年度は回転球面上での2次元Navier-Stokes方程式において,共鳴条件のもとでの共鳴相互作用方程式と2次元NS方程式の関係(解の収束性)の解析を行い,収束すべき方程式と高速回転極限における収束性について証明の概要を得,現在,この内容の確認作業を行っている.また前年度に引き続き,共鳴相互作用を行うモード(球面調和関数)のクラスターへの分解を行って,それぞれのクラスター内のダイナミクスを数値的に調べている.数値結果は各々のクラスターのカオス的な挙動を示しており,時間発展の総体によって東西ジェット流形成を説明することは困難である.流れ場の方程式の解は,回転角速度が増加するときに,有限時間内で極限方程式の解への収束を示し,その時間範囲内での共鳴相互作用の重要性を示している.しかしさらに後の時間においては,共鳴相互作用以外の相互作用の効果が重要となるため,東西ジェット流形成にはこれらの相互作用が重要となると考えられる.これらの結果は高速回転流体系では,初期の共鳴相互作用が重要な初期の時間領域と,後期の共鳴相互作用以外の効果が重要となる時間領域の二つの時間領域の存在が示唆される.回転球面上の2次元Navier-Stokes方程式について,高速回転極限における共鳴相互作用クラスター分解を実行し,各々のクラスターのダイナミクスを数値的に調べている.これまでの数値結果から,これらのクラスターは,総体として東西ジェット流形成のような全体としての顕著な流れパターン形成を導かずカオス的な振る舞いに留まると考えられる.これは時間発展には,初期の共鳴相互作用優位の時間領域と,後期の共鳴相互作用以外の相互作用が重要となる時間領域の二つがあることを示唆していており,最終年度においてさらに両者の時間領域の特性を明らかにすることを目指す.またこの極限における極限方程式の導出の概要を得てその確認作業を行っており,概ね研究は順調に進展している.

線形化した系が波動解をもつ非線形系では,高振動数の極限において共鳴相互作用が他の相互作用よりも大きな効果を持つため、系は漸近的に共鳴相互作用のみに支配すると期待される.本研究の目的はこのような漸近的力学系を支配する方程式を導き,さらに,得られた方程式の解の性質を調べてもとの非線形系の振舞と比較・検討することである.本年度は計画3年度であり、回転球面上の2次元Navier-Stokes (NS)方程式の解について高速回転極限を記述する方程式として、共鳴相互作用方程式の導出を基礎づける作業を行い、この方程式の高速回転極限における記述有効性を調べた.前年度の研究から,共鳴相互作用を行うモード(球面調和関数)のクラスターへの分解によって得られる個々のクラスター内のダイナミクスが、長時間後の東西ジェット流形成を説明しないことが分かり、極限方程式の有効な時間区間とその後の区間において、系の振舞が大きく異なることが示唆されている.そこでβ面の系に対し、波数空間において、初期のエネルギー分布から共鳴相互作用によってエネルギー輸送が可能な範囲を求め、後の時刻のエネルギースペクトルとの比較を行ったところ、これらの特徴に比較的良い一致が見られることを見出した.この結果は、極限方程式の有効な時間区間の後においても、共鳴相互作用の痕跡が残り続けることを示している.この結果は,数学的な収束性が保証される時間範囲を越えても,物理的な流れの特徴は極限方程式の解の特徴を残すことを示唆している..回転球面上の2次元Navier-Stokes方程式の解が,回転角速度の増大とともに,非線形項を非線形共鳴相互作用のみに限定した流体方程式(極限方程式)の解に近づくことを示した。これは,共鳴相互作用項以外の非線形相互作用は,回転角速度の増大とともに激しく振動して打ち消し合いが生じるためである。帯状流に対応するモードはこの共鳴相互作用を通じて,他のモードのエネルギー輸送に直接の寄与は行わないが,他のモードの位相変化には寄与する。数値シミュレーション結果は,この位相変化の効果は全系のエネルギー輸送を考える際に無視できない効果を及ぼすことを示している。計画初年度の研究から,漸近方程式における共鳴相互作用クラスター分解において,クラスター内部のダイナミクスとクラスター相互のダイナミクスの役割についての示唆が得られた.計画二年目以降は,この役割分担について研究を進めていく.各クラスター内部のダイナミクスのみからなる系が,全体として回転球面上の二次元流のどのような側面に対応するのかを明らかにすることが目的である.また同時にこの計算は,弱い非共鳴相互作用が系全体の振る舞いに果たす役割を明らかにすることにもつながるため,数値計算上の困難はあるものの,できるだけ大きな波数まで考慮したクラスターダイナミクスの数値計算を実行する予定である.
法科学及び臨床化学に役立てる乱用薬物の迅速分析法の開発

乱用薬物分析における、測定方法と生体試料からの前処理方法に関して斬新な手法の構築を試みた。MDMAなどの脱法ドラッグ、ベンゾジアゼピン系薬物やリタリン、覚せい剤のメタンフェタミンなどを測定対象薬物とし、精密質量の測定が可能なLC/TOF-MSを駆使して、迅速にこれらの乱用薬物を同定できる方法を検討した。また、生体試料中から測定対象物質を効率よく抽出、濃縮および精製するための新規前処理法として固相分散抽出法を開発し、その操作を簡便化するために、遠心ろ過フィルターを発明(実用新案取得)した。近年、いわゆる脱法ドラッグといわれる薬物の乱用が大きな社会問題となっている。これらの脱法ドラッグの中には、規制薬物の分子構造の一部を組み替えただけの類似薬物(デザイナードラッグ)もあることから、次々と合成される薬物とその乱用実態を把握し、新たな薬物指定に向けた作業に取りかかると共に、健康被害者の治療も行わなければならない。そのためには、該当する薬物の化合物を同定できる信頼性の高い分析法が要求されている。しかし、該当する薬物を測定するためには標準品が必須であるが、多くの乱用薬物の場合、標準品を入手することは極めて困難である。そこで、標準品なしでも乱用薬物の測定を可能にする信頼性の高い分析方法を確立することにより、薬物乱用の実態調査や中毒患者の治療に資することができると推察された。本研究では、デザイナードラッグが出現しやすい薬物として、フェネチルアミン骨格を有するMDMA、BDB、Methylone、MMDA-2の4種、およびピペラジン骨格を持つTFMPP、2MPP、4MPP、2CPP、4CPP、3、4-DMPP、2M-3MPPの7種、計11種類の薬物を測定対象として、精密質量の測定が可能な液体クロマトグラフィー/飛行時間型質量分析法(LC/TOF-MS)を駆使して、標準品なしでも迅速にこれらの乱用薬物を同定できる方法を検討した。その結果、今回測定した11種の薬物すべてについて、LC/TOF-MSにより良好な相互分離が得られ、濃度範囲2-50ppbにおいて相関係数0.999以上の良好な直線性が得られた。また、各薬物の精密質量測定において、標準品および尿中の薬物を測定する際の精密質量誤差は、5ppm以内であったことから、これら薬物の定性が可能であると示唆された。これらの結果から、本法は法科学分野において要求される薬物の検出・同定に応用することが可能であると考えられた。これらの脱法ドラッグの中には、規制薬物の分子構造の一部を組み替えただけの類似薬物(デザイナードラッグ)もあることから、次々と合成される薬物とその乱用実態を把握し、新たな薬物指定に向けた作業に取りかかるためには、該当する薬物の化合物を同定できる信頼性の高い分析法が要求されている。前年度までの研究において、デザイナードラッグが出現しやすい薬物として、フェネチルアミン骨格を有するMDMAなど4種およびピペラジン骨格を持つTFMPPなど7種、計11種類の薬物を測定対象として、精密質量の測定が可能な液体クロマトグラフィー/飛行時間型質量分析法(LC/TOF-MS)を駆使して、標準品なしでも迅速にこれらの乱用薬物を同定できる方法を構築した。本年度の研究では、フェネチルアミン系のエフェドリンと類似の化合物で、心筋梗塞等の健康被害の発生などが問題となっている、Citrusaurantium由来のアルカロイド(シネフリン)やプリンアルカロイド(カフェイン、テオブロミン、テオフィリン)のLC/TOF-MSによる同時分析法について検討し、市販に流通している製品中の分析を行い、その品質評価を行った。これらの結果から、本法は法科学分野において要求される薬物の検出・同定に応用することが可能であると共に、健康食品等に使われている場合には食品の安全性を確保する上で有用であり、健康被害の防止に寄与するものと期待される。薬物の乱用は社会的に大きな問題となっており、乱用によって中毒症状を呈した患者が救急搬送されるケースがある。そのため、救急医療や法科学分野において、中毒や乱用の原因物質の同定・定量を行うために迅速かつ信頼性の高い分析法の確立が求められている。生体試料分析において、試料中から微量の測定対象物質を効率よく抽出、濃縮および精製するための前処理は極めて重要である。しかし、従来汎用されている固相抽出(SPE)法は通液速度の変動が回収率を低下させることや、開放系での処理のため感染性試料の実験者への曝露が危惧されるといった様々な問題点がある。本年度の研究では、向精神薬のベンゾジアゼピン系薬物やリタリン、覚せい剤のメタンフェタミンなどを測定対象薬物とし、新規前処理法として迅速かつ簡便な前処理が可能な固相分散抽出(SPDE)法を開発した。

その際、SPDE法の操作簡便化を目的に、遠心ろ過フィルターを発明(実用新案取得)し、実験に用いた。SPDE法では微粒子である固相を液体試料中に分散させることで、固相と液相間の分配平衡が瞬時に到達し、迅速な抽出・クリーンアップが可能となり、SPE法の約半分の時間で前処理が可能となった。また、開発した遠心ろ過フィルターの使用により、より閉鎖系での処理が可能となり、SPE法における実験者への曝露は低減された。これらの結果から、生体試料分析の多検体処理に際して、本研究で開発したSPDE法は従来のSPE法に比べて迅速な前処理が期待され、迅速な対応が求められる救急医療や処理検体数の多い法科学分野での有用性が示唆された。
ショウジョウバエ求愛歌生成を制御する神経回路の同定とその動的特性の生理学的解析

ショウジョウバエの体細胞の性分化はfruitless (fru)とdoublesex (dsx)と呼ばれる二つの性決定因子により制御されている。近年の研究により求愛行動の実現には性決定因子であるこれらの遺伝子を発現する神経回路が重要である事が分かってきた。雄が雌に対して示す求愛では、羽展開・振動による求愛歌生成が最も特徴的な行動要素である。本研究ではfru/dsx発現ニューロンの活動の人為的操作技術とモザイク法を組み合わせることにより、特徴的な音響パターンをもつ求愛歌がどのニューロンによって生み出されているのかを明らかとした。1:強制活性化法を用いた求愛歌生成に関わる神経細胞群の同定(A)昨年度までにdsx発現ニューロン全体に温度感受性チャンネルdTrpA1を発現し高温条件下で強制活性化することによってpulse songとsine songから構成される正常な音響パターンを持つ求愛歌が生成されることを明らかとした。本年度はMARCM法を用いてごく少数のdsx発現ニューロンにdTrpA1を発現し強制活性化する機能的モザイク解析を行った。その結果、脳内のpC1, pC2l、胸腹部神経節内のTN1, prAと名付けられたニューロン群をそれぞれ強制活性化することにより、羽振動による音響生成がなされることが明らかとなった。興味深いことに、上記ニューロン群を強制活性化した際に生成される音響パターンはそれぞれのニューロン群で異なっていた。例えばpC1ニューロン群はpulse songを主に生成するのに対して、TN1は連続したsine songのみを生成した。これらのdsx発現ニューロン群が協調して働くことにより正常な求愛歌が生成されると示唆される。(B)求愛歌生成に関係するニューロンを探索する中で、あるfru発現ニューロン群を強制活性化すると求愛歌とは異なる音響パターンを生み出すことを見出した。この誘発される音響は攻撃行動時に発せられる音に類似していた。さらにこのニューロン群の強制活性化は求愛行動を強く抑制することも明らかとなった。これらのニューロンが求愛行動と攻撃行動を切り替えるスイッチとして機能していることが示唆された。2:単離脳標本を用いた求愛歌生成神経回路の生理学的解析昨年度開始したパッチクランプ法を用いたニューロンからの電気生理学的応答記録システムの構築を続け、中枢ニューロンからの電気生理学的応答記録に備えて、極めて微小な胚筋肉からのパッチクランプ記録を可能とした。1:強制活性化法を用いた求愛歌生成に関わる神経細胞群の同定(A)ショウジョウバエの体細胞性決定因子fruitless(fru)とdoublesex(dsx)を発現する神経回路に注目して実験を行った。温度感受性チャンネルdTrpA1をfruもしくはdsx発現ニューロンに異所発現し、高温条件下でこれらのニューロン群を強制活性化することによって、pulseとsineから構成される正常な音響パターンを持つ求愛歌が生成されることが明らかとなった。さらに少数のニューロンのみを操作する機能的モザイク解析により、異なるニューロン群の強制活性化は求愛歌の異なる音響要素を生成することを見出した。(B)胸部分節化に関わるteashirt(tsh)遺伝子を利用して、脳もしくは胸部神経節のみのfru/dsx発現神経細胞をdTrpA1により強制活性化する実験を行った。脳のfru/dsx発現細胞を強制活性化したところ、片翅展開が観察されpulse songが誘導できることが明らかとなった。またこの条件では明確なsine songは生成されなかった。一方で、胸部のfru発現ニューロンのみの強制活性化で生成される音響パターンは求愛歌とは全く異なり、翅展開についても両翅展開となることが明らかとなった。以上の結果より、pulseとsineから構成される片翅展開に伴う正常な求愛歌生成は、胸部の運動パターン生成回路の強制活性化のみで生成できるのではなく、脳に由来するコマンド信号との相互作用により生み出されている可能性が示唆された。2:単離脳標本を用いた求愛歌生成神経回路の生理学的解析ニューロンの強制活性化とCa2+イメージングを組み合わせた記録システムの構築および予備実験を行った。また、H25年度以降に計画していたパッチクランプ法を用いたニューロンからの電気生理学的応答記録システムの構築を始めた。1:強制活性化法を用いた求愛歌生成に関わる神経細胞群の同定昨年度までに温度感受性陽イオンチャンネルdTrpA1を少数のニューロンに異所発現し強制活性化する機能的モザイク解析を行い、脳内のpC1, pC2l、胸腹部神経節内のTN1, prAと名付けられたdsx発現ニューロン群が求愛歌生成に関わる事を明らかとしてきた。今年度はpC2lの機能についてさらに解析を行った。通常の求愛歌生成時には片翅のみが使用される。しかしながら胸部神経節内に存在する求愛歌制御用ニューロンの強制活性化では、多くの場合両翅が展開される。このことは脳からの下行性シグナルが片翅展開の実現に重要である事を示唆している。興味深いことにpC

2lの強制活性化では求愛歌生成時に細胞体とは反対側の羽が優先的に使用されることが分かった。一方、pC1の強制活性化ではこのような羽使用の偏りは観察されない。このことはpC2lが通常の求愛行動での片翅展開の制御に寄与する事を示唆している。羽展開の側方性には脳内の側抑制的な神経回路が機能している可能性がある。さらにGABA合成酵素であるGad1のノックダウン実験を通して、片翅展開にはGABA作動性fru発現ニューロンの一つであるmALが関与している可能性も明らかとなった。2:単離脳標本を用いた求愛歌生成神経回路の生理学的解析パッチクランプ法を用いた電気生理学的応答記録システムの構築を続け、昨年から開始した胚筋肉の電気生理学的解析を行った。その結果、Ca2+チャンネルDmca1Dが胚筋肉の活動電位発生に中心的である事を明らかとした。現在その結果を投稿中である。さらに脳内fru/dsx発現ニューロンに対してパッチクランプ法を適用し、一部ニューロンからの電気生理学的応答の記録に成功した。神経行動学機能的モザイク法を用いる事によって求愛歌生成に関わる4種ののdsx発現ニューロンを同定することができた。さらにこれらのニューロン群の強制活性化に伴う音響パターン生成はそれぞれのニューロン群で異なっていることも明らかとした。これらは計画に沿ったもので順調に成果をあげている。さらに強制活性化実験では、求愛行動と攻撃行動を切り替えている可能性のあるニューロン群を発見した。これらは求愛歌生成のさらに上位のシステム同定の可能性を示唆し、当初の計画以上の成果であったと考えている。一方、単離脳標本を用いた生理学的解析については、昨年度より始めたパッチクランプ法を用いた記録システムの構築を続け、中枢ニューロンからの記録の前段階として胚の筋肉からの電気生理学的応答記録を可能とした。ショウジョウバエの神経筋接合部の解析は主に3齢幼虫を用いた実験が行われているが、胚の筋肉は極めて小さいため研究自体も多くない。これを実現したことは中枢ニューロンからの応答記録にむけて大きな進展であったと考えている。1:強制活性化を用いた求愛歌生成に関わるニューロン群の同定に関しては、複数のfruもしくはdsx発現ニューロンを同定するとともに、正常な求愛歌の生成に脳と胸部神経節のニューロン群の相互作用が必要である可能性が示唆できた。計画をやや上回る成果が得られている。2:単離脳標本を用いた求愛歌生成神経回路の生理学的解析については、温度感受性チャンネルを用いてニューロンの強制活性化を試みたが、温度変化による脳標本の移動が大きくCa2+イメージングの際に障害をもたらすことが判明した。より強固な脳固定法の開発が必要であることが判明した。また、fru/dsx発現神経回路全体のイメージングと同時に少数のニューロンのみにdTrpA1を発現させる事を目的として、hs-Flpを用いたモザイク個体作成を行った。