hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ユーラシア東部草原地帯における騎馬遊牧社会形成過程の総合的研究

2013・2015年にモンゴルにおいて調査したボル・オボ遺跡、ヒャル・ヒャラーチ遺跡の英文発掘報告書を2017年7月に刊行した。そして、本報告書を国内や海外においても発送し、特にモンゴル国内の研究者に配布した。2017年8月にかけて、宮本・田尻・松本や九州大学院生とモンゴル考古学研究所研究員やモンゴル国立大学学生の参加のもと、モンゴル国バヤン・ホンゴール県エメルト・トルゴイ遺跡を発掘調査した。撥形墓1基、円形墓1基、方形墓1基、板石墓1基を発掘調査した。この墓地は2015年度調査したヒャル・ヒャラーチ遺跡と墓地構造を同じくしており、モンゴル西部の青銅器時代墓葬を考える上で貴重な資料を追加することができた。また、撥形墓の18号墓からは、発掘調査で初めて三翼鏃を発見し、実年代を決定できる可能性が開けた。さらに発掘調査後、モンゴル考古学研究所で整理作業を行った。この整理作業には岡崎も参加し、出土古人骨の整理調査とともに、比較人骨資料の計測や筋発達度付着部発達速度分析を行った。また、米元はモンゴル出土古人骨のストロンチウム安定同位体比分析を行った。さらに東京大学総合研究博物館米田研究室で、エメルト・トルゴイ遺跡で出土した古人骨の年代測定を行った。2017年2月には、本基盤研究の本年度の研究成果を持ち寄り、研究会を開いて研究成果の確認を行った。さらに、2017年3月11日には東京大学で開催された第19回北アジア調査研究報告会に参加し、エメルト・トルゴイ遺跡の発掘調査の成果を報告した。エメルト・トルゴイ遺跡で4種類の異なった墓葬を発掘調査することができ、さらにそのすべての墓葬から人骨試料を採集できたため、年代決定が可能である。これにより、調査の目的であるモンゴル東部における青銅器時代墓葬の変遷の仮説を検証できるであろう。その仮説については、『史淵』第155輯で発表した。また、ボル・オボ遺跡やヒャル・ヒャラーチ遺跡の英文発掘報告書を作成し、国際発信をおこなうことができた。さらに英文での調査成果の論文を準備中である。9月には約1週間、モンゴル北西部のザフハン県とアルハンガイ県を中心にモンゴル青銅器時代の墓地遺跡の踏査を行った。モンゴル歴史・考古学研究所研究員の案内で、踏査には分担研究者の田尻義了と九州大学大学院生福永将大が参加した。調査中にはドローンによる空中撮影や3D撮影なども行った。これにより、モンゴル西北部における青銅器時代墓葬の変遷に関する有効な資料を入手した。エメルト・トルゴイ遺跡の英文発掘報告書の執筆・編集などを進め、年度末までに報告書の出版を行った。これは、本科研費の第2・3年度の発掘調査を含んだ発掘報告書である。また、これまで10年間進めてきたモンゴル高原での発掘成果によって、モンゴル青銅器時代墓制を復元することができている。その内容を英文でまとめ、報告書に掲載することにより、国際発信するものとなっている。12月にはモンゴルの研究者を招聘し、国際研究集会を開催し、これまで4年間の研究成果を総括した。発表者と発表内容は以下の通りである。宮本一夫「モンゴル国ヒャル・ヒャラーチ遺跡、エメルト・トルゴイ遺跡の調査からみたモンゴル青銅器時代墓制」、田尻義了「モンゴル国における遺跡の3D化およびドローンの有効性について」、松本圭太(九州大学人文科学研究院)
無力精子症様を示す遺伝子改変マウスの機能解析

本研究は生殖不全機構を解明するために、精細胞に特異的に発現する極めて特徴的なDNA結合タンパク質Protaminel(Prm1)に着目した。ヒトではPrmの発現低下が不妊に関係しているという知見が報告されており、ES細胞を用いた遺伝子相同組換え技術によりPrm1遺伝子を破壊し疾患モデル動物を用いて解析をおこなった。その結果、Prm1 KOマウスの♂は、染色体の一方を破壊したヘテロの状態で不妊であり、その主因はミトコンドリアの膜電位低下と鞭毛微小管構造の欠陥による精子運動能の喪失による事を明らかにした。FACS解析からPrm1 KOマウスの精子ではProtamineの量に反比例するとされるChromomycinA3のDNA結合量の増加が認められ、さらにウェスタンの結果からPrm1のみならずPrm2の発現量をも低下している事が明らかになった。精子形成過程後期では蓄積されたmRNAからの翻訳レベルで発現調節がされることが特徴的とされているが、電子顕微鏡の結果からもPrm1 KOマウスでは精子核におけるクロマチン凝縮が充分にされていない事が明からになっている。これらの事からPrm1の発現低下はクロマチン構造を変化させ、Prm2の発現低下や本来抑制されるべき遺伝子が転写されるなどして結果的に運動能の喪失に至る可能性が予想される。本研究によりPrm1の発現低下は生殖不全を来すことが明らかとなり、またクロマチンの凝縮が精子の機能上重要であることが示唆された。本研究は生殖不全機構を解明するために、精細胞に特異的に発現する極めて特徴的なDNA結合タンパク質Protamine1(Prm1)に着目し、ES細胞を用いた遺伝子相同組換え技術により破壊したPrm1遺伝子欠損マウスを用いておこなった。Prm1 KOマウスの♂は、染色体の一方を破壊したヘテロの状態で不妊であった。ヒトではPrmの発現低下が不妊に関係しているという知見が報告されており、これらのことからその発現量を維持するためにPrm1遺伝子は両染色体に必要であると推測された。不妊の主因は精子運動能の喪失であり、それらがミトコンドリアの膜電位低下と鞭毛微小管構造の欠陥による事を我々はこれまでに明らかにした。この事からヘテロ変異♂マウスの精子はそのほとんどが死んでいると考えられた。しかし細胞膜の変化をSYBRとPIの2重染色で行ったが、wildマウスとの差は見受けられなかった。これは先の運動能の消失とは相反する結果である。さらにかねてから推測されていたとおり、Prm1の発現量の低下は精子核におけるDNA凝縮が充分にされていないことが明らかになった。これらのことからPrm1 KOマウスはヒトの不妊疾患の解析モデルになりうると思われる。またPrm1 KOマウスでは、Prm1だけでなく協調して働くとされるPrm2の発現にも異常を来していた。精子形成過程後期では蓄積されたmRNAからの翻訳レベルで発現調節がされることが特徴的とされており、さらなる解析が必要である。
照明空間の印象に照射位置と色温度が与える影響の多面的測定方法の検討

本研究は人の概日リズムを考慮し,生活リズムが異なると照明空間とその行為に対する印象に与える影響も異なるのか,評価語を使用した主観評価と,唾液アミラーゼ濃度,注視点計測を使用した客観評価から多面的に評価を取得して検討を行い,空間での行為に対する照明のふさわしさと文脈依存性の相互関係を明らかにすることを目的とした.実験に際して,被験者の生活リズムをアンケートから把握することで,異なる生活リズムを持った被験群を設定した.また人の概日リズムの指標を体温とし,体温は起床時数時間前に最低となり夕方に最高となる概日リズムがあると言われていることから,全被験者に対して同日朝10時と夕方18時に計測を行うことで,概日リズムを考慮した印象評価結果を取得した.評価対象は,色温度2種類と照射位置2種類を組み合わせた照明条件を演出できる照明装置を制作し,不快感を与えない空間を設定した.多面的評価については,実験開始前に被験者の唾液アミラーゼ濃度を計測し,空間観察開始から注視点計測を行った上で,空間での行為に対して照明がふさわしいか,形容詞に対する5段階評価をアンケートから取得した.また実験後に再度唾液アミラーゼ濃度を計測した.この結果から,空間に対する主観評価については朝と夜で印象が変化し,その内容は色温度と照射位置の組み合わせによって異なることがわかった.また人の生活リズムが異なれば色温度に対する印象が異なった傾向を示すこともわかった.さらに評価中の視線においては,色温度の種類によって顕著な違いは確認できなかったが,照明空間を評価する際には空間内に置かれたモノのエッジからなる陰影と光が特に当たっている面が多く注視される傾向があったことから,照射位置を変えることで異なった表情を見せる陰影は,照明空間の印象に対して影響を与えることが示唆された.本研究は,人の概日リズムを考慮し,生活リズムが異なると照明空間とその行為に対する印象へ与える影響も異なるのか,評価語を使用した主観評価と,唾液アミラーゼ濃度,注視点,瞳孔径計測を使用した客観評価から多面的に評価を取得して検討を行い,空間での行為に対する照明のふさわしさと文脈依存制の相互関係を明らかにすることから,照明デザインに対する多面的な印象評価方法の検討を行うことを目的としている.平成28年度は,照明空間の使用用途に応じて人がふさわしいと感じるイメージの有無と共通性の調査を行うことを計画していた.これは,住宅や商空間またはオフィスのように,空間で行われる行為の対象は多く考えられるため,人が照明により共通なふさわしさのイメージを持つ対象を選択する必要があるためである.またふさわしさの評価に影響をあたえる文脈も,空間内で自分が生活をしているところから想起するのか,取り扱う商品のイメージから想起するのか,一緒にすごしている人のイメージから想起するのかと異なることが考えられる.本実験を行うにあたり,まずは電球色の空間と昼光色の空間から感じる印象について評価をもとめた結果,電球色の空間へ人の持つイメージは共通性が見られ,特に住宅の居間を連想する可能性が考えられた.昼光色の空間に関しては人によって感じる印象にばらつきがある可能性が見えた.この結果より本年度の実験において対象とする空間の使用用途を選定している.平成28年度の実験目的は,照明空間の使用用途に応じて人がふさわしいと感じるイメージの有無と共通性の調査を行うことを計画していた.平成29年度の実験に繋げる詳細な実験計画選定に至るまでの調査が完了しなかったためやや遅れてはいるが,すでに調査が完了する目処が立っているため,平成29年度の実験計画において支障がでるものではないと考える.本研究は,人の生活リズムが異なると照明空間とその行為に対する印象は異なるのか,評価語を使用した主観評価と,唾液アミラーゼ濃度,注視点,瞳孔径計測を使用した客観評価から多面的に評価を取得して検討を行い,空間での行為に対する照明のふさわしさと文脈依存の相互関係を明らかにすることから,照明デザインに対する多面的な印象評価方法の検討を行うことを目的としている.平成28年度は照明空間の使用用途に応じて人がふさわしいと感じるイメージの有無と共通性の調査を行なった.これは住宅や商空間またはオフィスのように空間で行われる行為の対象は多く考えられるため,人が照明により共通なふさわしさのイメージを持つ対象を選択する必要があるためである.またふさわしさの評価に影響をあたえる文脈も,空間内で自分が生活をしているところから想起するのか,取り扱う商品のイメージから想起するのか,一緒にすごしている人のイメージから想起するのかと異なることが考えられる.本実験を行うにあたり,電球色の空間と昼光色の空間から感じる印象について評価をもとめた結果,電球色の空間へ人の持つイメージは共通性が見られ,特に住宅の居間を連想する可能性が考えられた.昼光色の空間に関しては人によって感じる印象にばらつきがある可能性があった.この結果より平成29年度は空間の使用用途を選定し,照明空間に対する印象評価を多面的に測定できるような実験計画と予備実験を行なった.特に注視点と瞳孔径計測において有効なデータを取得できるような環境を当初計画と変更し整えた.平成29年度に予定していた実験では瞳孔径・注視点を計測する予定であった,しかし当初使用を予定していた装置よりも,本実験において有効なデータの取得が期待できる装置が発売されたため,研究計画の見直しをした.

そのため全体の計画に遅れが生じている.本研究は人の概日リズムを考慮し,生活リズムが異なると照明空間とその行為に対する印象に与える影響も異なるのか,評価語を使用した主観評価と,唾液アミラーゼ濃度,注視点計測を使用した客観評価から多面的に評価を取得して検討を行い,空間での行為に対する照明のふさわしさと文脈依存性の相互関係を明らかにすることを目的とした.実験に際して,被験者の生活リズムをアンケートから把握することで,異なる生活リズムを持った被験群を設定した.また人の概日リズムの指標を体温とし,体温は起床時数時間前に最低となり夕方に最高となる概日リズムがあると言われていることから,全被験者に対して同日朝10時と夕方18時に計測を行うことで,概日リズムを考慮した印象評価結果を取得した.評価対象は,色温度2種類と照射位置2種類を組み合わせた照明条件を演出できる照明装置を制作し,不快感を与えない空間を設定した.多面的評価については,実験開始前に被験者の唾液アミラーゼ濃度を計測し,空間観察開始から注視点計測を行った上で,空間での行為に対して照明がふさわしいか,形容詞に対する5段階評価をアンケートから取得した.また実験後に再度唾液アミラーゼ濃度を計測した.この結果から,空間に対する主観評価については朝と夜で印象が変化し,その内容は色温度と照射位置の組み合わせによって異なることがわかった.また人の生活リズムが異なれば色温度に対する印象が異なった傾向を示すこともわかった.さらに評価中の視線においては,色温度の種類によって顕著な違いは確認できなかったが,照明空間を評価する際には空間内に置かれたモノのエッジからなる陰影と光が特に当たっている面が多く注視される傾向があったことから,照射位置を変えることで異なった表情を見せる陰影は,照明空間の印象に対して影響を与えることが示唆された.今後は昨年度の成果をふまえて平成29年度の実験計画を進める.照明空間で行われる行為に対してふさわしいと感じる印象が,生活リズムや計測時間が変われば異なるのか,アンケート評価と視線計測,アミラーゼ濃度から検討する予定である.評価対象は模型上で照明空間を作成することを考えているが,視線計測に適した条件と実験期間における空間構築に費やす時間や労力,再現性を考え,より適した提示方法を検討している.照明空間で行われる行為に対してふさわしいと感じる印象が,生活リズムや計測時間が変わると異なるのか,アンケート評価と瞳孔径・注視点,アミラーゼ濃度から検討する予定である.平成29年度に行なった予備実験の結果をふまえた上で,適切な環境を構築し,実験を進める.平成28年度に作成予定であった実験環境について新たに内容を見直し,平成29年度に作成することになったため,その必要経費が次年度繰越となった.(理由)平成29年度に行う予定であった実験について,計画の見直しがあったため,実験環境必要経費が次年度繰越となった.(使用計画)見直しとなった計画に基づいて,実験環境を整えるため使用する計画である.平成28年度に使用予定であった実験環境を作成する額を平成29年度に使用し,実験環境を構築する.
第4世代移動通信に向けた超高効率パケット無線アクセス技術の研究

本課題では,ピークデータレート1Gbpsを実現する第4世代移動通信方式に位置づけられるInternational Mobile Telecommunications(IMT)-Advancedに向けた高効率無線パケットアクセス技術を提案し,効果を計算機シミュレーションで明らかにした.具体的には,100MHz程度の送信帯域幅を有するLayered OFDMの無線インタフェース,高効率マルチアクセス,無線リソース割り当て制御,制御情報の高効率多重法,高精度チャネル推定,高次マルチアンテナ技術などを提案し,効果を計算機シミュレーションあるいは実験評価により明らかにした.本課題では,ピークデータレート1Gbpsを実現する第4世代移動通信方式に位置づけられるInternational Mobile Telecommunications(IMT)-Advancedに向けた高効率無線パケットアクセス技術を提案し,効果を計算機シミュレーションで明らかにした.具体的には,100MHz程度の送信帯域幅を有するLayered OFDMの無線インタフェース,高効率マルチアクセス,無線リソース割り当て制御,制御情報の高効率多重法,高精度チャネル推定,高次マルチアンテナ技術などを提案し,効果を計算機シミュレーションあるいは実験評価により明らかにした.(1)適応無線アクセス技術:マルチキャリア/シングルキャリアのハイブリッドを用いる適応無線アクセスにおいて,H19年度は,最適な無線リソース割り当てを中心に検討を行った。・直交周波数分割多重(OFDM)アクセスにおいて周波数スケジューリングを行った場合,ハイブリッド再送制御を用いたときに,リソースブロック(RB)共通変調方式制御が,RB独立変調方式制御よりも適することを示した。・狭帯域サブキャリアを有するOFDMにおいて,通信開始時の移動局端末の基準発振器が数ppmの誤差を有する場合の,同期チャネルを用いる周波数ドリフト補正の効果を実験的に明らかにした。・上りリンクを対象としたシングルキャリア周波数分割多重アクセス(FDMA)において,セル内のFractional送信電力制御(TPC)に加えて,セル間のTPCを併用した揚合の最適なTPC法を明らかにした。(2)MIMO多重の高効率伝送:H19年度は最尤判定のための予備検討を行った。・OFDMを用いるプリコーディングを用いるMIMO多重伝送におけるプリコーディングベクトル選択,および信号分離に与えるチャネル推定誤差の影響を明らかにした。・OFDMにおける開ループ型送信ダイバーシチの効果および最適な送信ダイバーシチ法を屋外実験により明らかにした。(3)マルチホップ(リレー)技術:・無線メッシュネットワーク中継ノードのアンテナ指向性制御による同期運用法の,エスパアンテナを想定した制御法とマルチホップ環境下でのスループット評価を行った。・マルチホップ経路の安定化と経路構築率向上を目的とした経路制御法および中継ノード配置法を提案し,移動アドホックネットワーク(MANET)環境での適応性を確認した。・低伝送遅延と低コスト化を実現する電力増幅転送型リレー伝送における,周波数利用効率の劣化の低減法を考案し,カバレッジの増大効果を検証した。(1)適応無線アクセス技術:・直交周波数分割多重(OFDM)アクセスにおいてパケットアクセス技術に必要な制御情報(リソースブロック割り当て,変調方式,再送制御関連情報など)の周波数ダイバーシチ効果の観点から,高効率な多重法を明らかにした.・上りリンクシングルキャリア(SC)-FDMAアクセスにおける制御情報の高効率多重を目的として,最尤判定を用いたときの巡回シフトを用いる直交CDMA多重のブロック拡散多重に対する優位性を示した.(2)MIMO多重の高効率伝送:・OFDMを用いるプリコーディングを用いる2および4アンテナのMIMO多重伝送における,ストリーム数(ランク),変調方式,コードブックサイズをパラメータにしたときの,プリコーディングベクトル選択,および平均2乗誤差最小(MMSE: Minimum Mean Square Error)信号分離法に与えるチャネル推定誤差の影響を明らかにした.・最尤判定信号分離を用いるOFDM-MIMO多重において送信ストリーム数分の受信SNR (Signal-to-Noise power Ratio)に応じた変調方式・チャネル符号化率のテーブルを用いる適応変調・チャネル符号化制御法を提案し,従来法に対するスループットの改善効果を示した.・DFT-Spread OFDMに基づくシングルキャリアMIMO多重において,周波数領域受信信号の準最尤検出法を提案し,従来のMMSE受信に比較してパケット誤り率の改善効果が得られることを示した.(3)マルチホップ(リレー)技術:・無線メッシュネットワークの面的な拡大に備えて、標準化既定のシグナリングと連携して周辺セルへの干渉を考慮した迂回拡大型輻輳制御法および,システム容量増大を目指した移動端末位置管理法の基本的な制御アルゴリズムを提案し、各々の性能評価を進めた。・移動アドホックネットワーク(MANET)の適用領域拡大を目指して、片方向リンクを許容する経路構築法の効率化を図ると共に、車々間通信や無線センサーネットワークへの適応性を確認した.(1)適応無線アクセス技術:・直交周波数分割多重(OFDM)アクセスにおいて参照信号を用いた同期検波復調を行ったときの,パケットアクセス技術に必要な制御情報(リソースブロック割り当て,変調方式,再送制御関連情報など)の周波数ダイバーシチ効果の観点から最適な多重パラメータを明らかにした.・上りリンクシングルキャリア(SC)-FDMAアクセスにおける周波数ホッピングを用いる制御情報の高効率多重を目的として,符号化語の最尤判定を用いたときのホッピング信号の最適合成法を明らかにし,巡回シフトおよびブロック拡散を用いる直交CDMA多重のブロック誤り率特性を明らかにした.・4G移動通信方式の無線インタフェースの候補であるLTE (Long-Term Evolution)-Advancedにおいて,下り/上りリンクにおける基地局間協調送信(受信)を行ったときのセル端ユーザスループットの改善効果を明らかにした.

(2)MIMO多重の高効率伝送:・DFT-Spread OFDMに基づくシングルキャリアMIMO多重において,提案した周波数領域受信信号の準最尤検出法が,最適な拡散率を選択することによりOFDM MIMO多重伝送に比較してパケット誤り率を低減できることを示した.(3)マルチホップ(リレー)技術:・無線メッシュネットワークの面的な拡大を実現するアクセスノードからゲートウェーへの経路を対象とした迂回経路構築アルゴリズムの評価を行った.また,DHT(ハッシュ)アルゴリズムを適用した大規模網の端末位置分散管理法を提案し,シミュレーションにより優位性を確認した.・車々間通信へのモバイルアドホックネットワーク(MANET)の適用の検討,ZigBeeネットワークと無線メッシュネットワークを組み合わせた広域センシング情報流通網のアーキテクチャの提案を行った.
新規ミトコンドリアタンパク質AMFのエネルギー代謝調節に関する機能解析

心臓はポンプ機能を維持するため他臓器に比して激しくATPを消費するが、虚血におけるミトコンドリアATP産生を制御するメカニズムは明らかでない。本研究では、低酸素誘導遺伝子AMFがどのようにミトコンドリアATP産生制御に関わっているかについて検討した。(1) AMFの相互作用因子としてFoF1-ATP合成酵素を同定した。(2) ATP感受性FRETプローブを培養心筋細胞およびゼブラフィッシュ心臓に応用し、AMFの発現増強が虚血時のミトコンドリアATP産生低下を減弱させることが明らかとなった。これらの結果から、AMFはFoF1-ATP合成酵素を介して虚血心に対して保護的に働くことが示唆される。心臓は常に自律拍動をするために莫大なエネルギーを消費している。心筋が虚血状態になると、エネルギーの供給と需要のバランスが崩れ心不全に陥る。しかし虚血時におけるエネルギーすなわちATPの供給制御メカニズムについては未だ解明されていない。本研究では虚血におけるATP産生制御機構を解明するために、エネルギー飢餓により発現誘導される新規遺伝子AMFと相互作用する因子の同定・機能解析を行い、虚血において心筋細胞のATP産生とエネルギー代謝にAMFがどのように関わっているかを明らかにする。平成25年度では、心筋細胞を材料として独自のタンパク質精製方法を用いて、ミトコンドリアタンパク質AMFと相互作用する因子の探索・同定を試みた。その結果、新たにAMFと相互作用する因子としてFoF1-ATP合成酵素複合体を同定した。生化学的解析からFoF1-ATP合成酵素との相互作用を確認し、さらに精製したFoF1-ATP合成酵素を用いてAMFと直接相互作用することを明らかにした。我々が新たに確立した細胞内ATP濃度測定法を用いた実験ではAMFのノックダウンされた心筋細胞でミトコンドリア内のATP濃度が低下していることを見出した。またAMFノックダウン心筋細胞においてATP合成の低下に起因する酸素消費量の低下もみとめられた。さらにAMFを強制発現した心筋細胞では低酸素条件下でのATP濃度の低下が軽減されることを明らかにした。これらの結果からミトコンドリアタンパク質AMFはエネルギー飢餓状態において発現誘導されミトコンドリアでのATP合成を司るFoF1-ATP合成酵素と相互作用することにより、ATP合成を促進することが示唆される。以上の成果をProc.Natl.Acad.Sci.USA誌に発表した。本研究では虚血におけるATP産生制御機構の解明を目的として新規ミトコンドリアタンパク質AMFと相互作用する因子の同定・機能解析を行う。平成25年度ではAMFと相互作用する因子としてFoF1-ATP合成酵素複合体を同定し、AMFがこの複合体との相互作用を介して虚血におけるミトコンドリアATP濃度の維持に寄与していることを培養心筋細胞にて明らかにした。平成26年度では、これらの成果をもとにゼブラフィッシュを用いた機能解析を中心に行った。当研究室で確立されたゼブラフィッシュ心臓でのリアルタイムATP濃度測定系を用いて、虚血におけるミトコンドリアATP濃度の変化にAMFがどのように影響を及ぼすかについて検討した。ゼブラフィッシュAMF遺伝子を受精卵にインジェクションし、3日後の胚の心臓のATPを顕微鏡下で観察・測定した。AMF遺伝子を発現している心筋細胞群では、発現していない細胞群に比して虚血でのATP濃度の低下が軽減していることが明らかとなった。この結果からAMFはin vitroおよびin vivoにおいて虚血でのミトコンドリアATP産生の維持に寄与していることが示唆された。これらの成果を第18回日本心不全学会学術集会にて発表した。さらに、イヌの虚血再灌流モデルを作成し、再灌流後の心臓を領域ごとにサンプリングして遺伝子発現解析を行ったところ、虚血領域でのAMFの発現上昇を認めた。ゼブラフィッシュに加えてイヌにおいてもAMFがエネルギー飢餓に応答することが示唆され、AMFがエネルギー代謝調節分子としての役割をもつことが示された。以上の成果について現在論文作成中である。循環器内科学交付申請書に記載した平成25年度の研究実施計画の2項目、I) AMFの相互作用因子の同定・生化学的解析およびII) AMFの心筋細胞におけるATP濃度およびエネルギー代謝への影響の検討についてほぼ予定通り実験を進め、成果を発表することができた。平成26年度では、平成25年度の成果をもとに研究材料を培養細胞からゼブラフィッシュに移し、当研究室で確立された心臓でのATP濃度測定系を用いてAMF遺伝子導入またはアンチセンスモルフォリノ導入個体での心臓のATP濃度変化についての検討を行う。

その後研究実施計画に基づくイヌの虚血再灌流モデル、ヒトのミトコンドリア病患者サンプルを用いた検討を行う予定である。計画が予想以上にすすみ、生体におけるAMFの作用を解析すべくゼブラフィッシュの特殊なラインを作成し解析することを年度末に計画していたが、ラインの作成が予想より時間がかかり、余剰金が発生した。AMFの解析に使用する特殊プローブを導入したゼブラフィッシュを作成し、AMFの生理機能解析を上記方策通り進める。
利害調整問題としてみた公共事業用地取得制度の改善方策

本研究は社会資本整備をめぐる用地取得の困難性に着目し、以下のことを行った。1)事例分析に基づく利害対立状況の整理、2)現行の利害調整システムの問題点の抽出、3)社会における利害調整手段を踏まえた改善方策の検討。まず、利害対立要因には事業の目的、その実現手段、計画策定手段、事業による利益、の4要因があることを示した。ここで前3要因に関する利害対立は計画策定段階での争点であり、その段階での利害の不調整が事業による利益をめぐる利害対立を拡大させ、逆に事業による利益をめぐる利害対立が目的や手段、手続をめぐる利害対立を引き起こすという循環構造が存在していること、またこの利害対立状況は、いわゆる「囚人のジレンマ」と呼ばれる構造であり、この構造が用地干渉を通じてゆがめられ、解消を困難にしていること、を明らかにしている。次に現行の用地取得関連法制度の整理を通じて、我が国の社会資本整備における計画策定段階には利害対立構造を明らかにした上で妥協を図るという手続きが不十分であり、事業者が先手として行動するために、地権者の選択肢が制限されていること、地権者の交渉に応じるインセンティブが不十分であることなどを示している。「囚人のジレンマ」の解消方策は、経済学、社会学、心理学等で広く研究されてきているが、ここではそれらの成果を整理し、まず利害対立主体が互いにその構造を理解することが前提であり、その次に清算の手段として、利得構造の変更もしくは第3者への委託が求められることを示している。最後に、関係権利者が利害対立状況の理解をした上で計画決定を行うこと、また補償制度の見直し、弁護士など専門家の活用が用地取得の円滑化に寄与することを示すとともに今後の課題を明らかにしている。
うっ血性心不全に対するエンドセリン作用阻害の臨床効果に関する研究

Sunu Budhi Raharjo博士は、日本学術振興会・外国人特別研究員に採用されて以来、心不全に対する新たな治療戦略としてのエンドセリン作用拮抗を検討する研究に従事してきた。その概要・状況と成果について下記にまとめる。1.心不全に対するエンドセリン変換酵素阻害薬の効果に関する検討心不全に対する新たな治療標的として、エンドセリン変換酵素阻害薬を心不全モデルに用い、その有効性について評価した。心不全モデルとして、ダール食塩感受性ラットを用い、高血圧に伴う心肥大から心不全への移行に伴う、心機能、各種神経体液性因子、病理学的な検討を行った。その結果、エンドセリン変換酵素阻害薬が高血圧に伴う心不全の予防に効果があることが示され、新たな治療薬として、臨床応用が期待できることが明らかとなった。この知見に関しては、論文を国際一流誌であるHypertension誌に投稿し、査読後追加実験を行った上で、再投稿中である。2.エンドセリン変換酵素遺伝子欠損マウスにおける循環動態に関する検討エンドセリン変換酵素の生体内機能を遺伝学的に解明する目的で、エンドセリン変換酵素遺伝子欠損マウスの血行動態について検討した。ヘテロ接合体マウスでは、野生型と比較して血圧・脈拍などに有意な差は認められないものの、重要な循環調節因子であるレニン・アンジオテンシン系がヘテロ接合体マウスにおいて、非常に亢進していることが明らかとなった。これは、エンドセリン系を標的とした薬物治療を行う際には、同時にレニン・アンジオテンシン系を十分に抑制すべきであるという臨床的に重要な示唆に富む知見であり、現在論文作成中である。
深海性フジツボにおける矮雄の適応的意義

深海性フジツボ類において,矮雄の適応的意義について調べた。まず,ミョウガガイにおいて遺伝マーカーを開発して矮雄の繁殖成功度を測定したところ,小さな個体ほど高い繁殖成功を収めていたことが判明した。同種の雌や雌雄同体の生活史についても,飼育実験や現場での測定により,一定の情報が得られた。さらに,数理モデルや現時点までの文献レビューと理論的統合をおこない,低密度下で矮雄が進化したことを明らかにした。本研究の目的は,矮雄をもつミョウガガイ類を対象に,矮雄の適応的意義を解明することである。このために,平成22年度は,ミョウガガイにおいて,1)矮雄間の授精をめぐる精子競争の実態を解明し,2)矮雄と雌の成長といった基本的な生活史パラメータを比較した。1.矮雄間の精子競争の実態解明:申請者らが開発したマイクロサテライトマーカー4つを用いて,各胚がどの雄に授精されたかを決めた。また,同じ標本において,雌の体サイズ(頭状部長)や矮雄の定着位置(もっとも産卵口に近く授精に有利であると考えられる雌の開口部下端からの距離),および矮雄の体サイズ(厚さ0.1mmの血球計算盤で押しつぶして面積を測定)を記録した。それらのデータから,個々の矮雄の授精成功を調べ,その体サイズや着生位置との関係などを解析した。その結果,矮雄の着生位置は,授精成功に関係していないことが明らかになった。一方,体サイズの小さな矮雄ほど,授精成功度が高いという結果が得られた。これは,1)小さな矮雄が授精において有利である,または2)多くの卵を授精した矮雄が精子を使ったために縮んだ,という2つの可能性を示唆する。以下の結果をみると,後者の可能性のほうがよりあり得そうだと考えられた。2.矮雄と雌の生活史パラメータ:2010年5月に潜水艇で採集したミョウガガイ雌4個体を15°C,1気圧に保った100リットルの水槽で11ヶ月飼育した。うち3個体の雌が11ヶ月生存したものの,成長は確認されなかった。今回の飼育条件が成長に不適であった可能性は否定できないが,雌の成長率の低さが示唆された。一方,別の水槽において,飼育下で定期的に一定数の雌を固定し,雌上の雄の体サイズの変化を調べた。その結果,飼育期間が長くなるにつれ,雄の体サイズが減少する傾向がみられた。このために,平成23年度は,ミョウガガイにおいて雌の成長を調査し,ヨーロッパミョウガガイの矮雄と矮雄同体間で,変態後の初期発生について比較研究をおこなった。1.ミョウガガイにおける矮雄と雌の成長:2011年4月に,鹿児島県野間岬沖でミョウガガイ24個体を採集し,カルセイン等で生体染色し,ステンレススチールに結束バンドやボンドで付けて,現地に沈めた。2012年3月に現地に無人潜水艇を沈め,観察・回収したところ,1個体(雌)のみ再回収された。この個体は,頭状部長で2011年の57,65mmから1.2mmの成長が見られた。この遅い成長は,ミョウガガイの雌が非常に長生きするという推定を支持する証拠である。今後,殻の切片を作成し,カルセイン等の染色部位からの成長を正確に決定し,成長線が年輪に相当するのか調べる。また,定着基盤(カキ殻)に頭状部長4.49mmの小個体が定着した。これは今後室内(約12度)の水槽で飼育して,成長を追跡する。2.ヨーロッパミョウガガイの矮雄と雌雄同体の比較:幼生の定着実験をおこなったところ,ヒドロ虫に定着した個体はすべて雌雄同体となり,雌雄同体のreceptacle上に定着した個体はすべて矮雄になった。雌雄同体になった個体と,矮雄になった個体の比は1:1と有意に異ならなかった。矮雄はreceptacle上に密集して定着し,精子間競争がおこる状況であることが確認された。一方,雄の繁殖成功を調べるためのマイクロサテライトマーカーについては,ミョウガガイで開発されたマーカーがヨーロッパミョウガガイで使用できるか検討したが,現在のところ成功していない。このために,平成24年度は,ミョウガガイ類を含むフジツボ類の性表現の多様性,連続性,可塑性について理論的・実証的研究を進め,当該分野の現時点での研究の到達点と今後の課題についてとりまとめた。1.ミョウガガイ類を含むフジツボ類の性表現および矮雄の進化についての理論的研究をおこなった。

まず,従来別分野であった性配分理論と生活史戦略理論とを結びつけて,性表現の多様性を説明する新たなモデルを作成した(文献4)。次に,従来の性表現理論とは異なり,性表現が環境で決まる場合の新たな理論を構築した(文献6)。2.フジツボ類ソリエラエボシならびにヒメエボシにおいて,自然状態で他個体上に着生する個体の出現率や性表現,および実験処理による性表現の可塑性について研究をおこなった。ソリエラエボシでは他個体上に着生する個体は自然状態では存在しないにも関わらず,実験的に他個体上に着生させた個体は対照個体に比べて雄機能を増強し,矮雄的になった(文献8)。ヒメエボシでは他個体上に着生する個体が見られるが,実験的に他個体上に着生させても雄機能は増強されなかった(Yamaguchi et al. submitted)。3.これらの結果,および現時点で知られているフジツボ類の性表現に関する理論的・実証的研究をまとめたレビューをおこなった。その結果,フジツボ類の性表現や矮雄の出現は繁殖集団の大きさと深く関係していること,性表現は従来考えられていたよりはるかに連続的かつ可塑的であること,フジツボ類はこのような進化の研究に適していること,などが明らかになった(文献8)。4.その他,フジツボ類の生態や矮雄を持つ動物の発生,性表現の可塑性に関する研究をおこなった(文献1-3,5,7)。ミョウガガイの矮雄の繁殖成功の評価については,目的をほぼ達成した。成長等のパラメーターについても,ほぼ順調に進んでいる。論文等の成果も期待以上に出ている。しかし,ヨーロッパミョウガガイで使用できるマーカーの開発がうまく行っておらず,雄の繁殖成功の評価が進んでいない。24年度が最終年度であるため、記入しない。成果については順次論文発表をおこなう。ヨーロッパミョウガガイのマーカー開発については,引き続き進めるが,次世代シーケンサーの活用も視野に入れる。
遷移金属-カルコゲン結合の特性を活用した新触媒反応開発

イソニトリルの硫黄-パラジウム間への挿入を素反応に含む新触媒反応を開発しその反応機構を詳細に検討した。(A)触媒反応:芳香族ジスルフィドと芳香族イソニトリルとの反応をパラジウム触媒存在下反応させると両者の付加体が得られた。イソニトリルに対し、2当量以上のイソニトリルを用いて反応させると、1:2-付加体が高収率で生成した。一方、単離した1:n-付加体を反応基質として用いると、さらにイソニトリルを取り込んだ生成物が得られることが分かった。最高9分子のイソニトリルが取り込まれた付加体を単離するができた。この触媒反応には、パラジウムと同族の白金錯体は全く触媒活性を示さなかった。(B)反応機構:反応機構に関して検討した結果、ゼロ価パラジウムへのジスルフィドの酸化的付加、イソニトリルの配位を経て触媒反応の活性種が生成することが分かった。中間体の錯体は単離して同定した。1:1-付加生成物とゼロ価パラジウムとの反応によっても同じ活性種に変換されることから、パラジウム-硫黄間へのイソニトリルの挿入および1:1-付加体の還元的脱離はいずれも平衡であり、前者の平衡は脱挿入の方に大きく片寄っていることが判明した。1:n-付加体の還元的脱離により生成するゼロ価のパラジウムがジスルフィドの酸化的付加を受けることにより1回のサイクルが完結する。一方、白金錯体を用いた量的反応を検討したところ、パラジウム触媒の活性種の場合と全く同じ型の錯体が生成するもののイソニトリルの白金-硫黄結合間への挿入が脱挿入の方向への付可逆過程であり、このことが白金錯体が触媒活性を示さない原因であることが明らかとなった。
酢酸菌の制限酵素, 新しい酵素の開発とその分類学的側面

酢酸菌は組換えDNAの研究に有用な6塩基のパリンドロームを認識切断する多数の制限酵素を産生する.Acetobacter pasteurianus IFO13753の産生するII型制限酵素ApalIを本菌の無細胞抽出液よりストレプトマイシン処理,硫安分画,ヘパリンーセファロースCL-6BおよびDEAE-セフアロースCL-6Bの各クロマトグラフィーおよびMonoQHR5/5を用いる高速液体クロマトグラフィーで,ポリアクリルアミド電気泳動的に単一にまで精製した.精製酵素は入力NAを4か所で切断し, 24時間の酵素反応でも,その切断パターンに変化は見られなかった.本酵素反応の至適条件は, 45°C, PH8.0, 7mMMgC1_2, 20mMNaClであった.しかし, NaClは0mMでも本酵素反応は充分に進行した.本酵素の分子量はゲル濾過的に26,000,等電点はアンホライン等電点電気泳動で4・8,クロマトフォーカシングで4.7であった.本酵素の5分間のプレインキュベーションによる温度安定性では45°Cまで極めて安定であった.本酵素のPH安定性は5.08.0の間にあった.本酵素はλ, Ad2, SV40, M13mp18RF, YbdintgX174RF, pBR322の各DNAを,それぞれ, 4, >6, 0, 1, 1, 3か所で切断した. YbdintgX-174RFDNAを本酵素で切断1, 5′末端を^<32>Pでラベルした後, Maxam-Gil-bert法で末端付近の塩基配列を決定した.その結果,本酵素はDNAの塩基配列, 5′-GTGCAC-3′を特異的に認識し,そのGとTの間で切断する全く新しいII型制限酵素であることが解った.本研究は他に, Acetobacter pasteurianus IFO13752のApa ORI, Gluconobacter cerinus IFO3260のGce inI, Gluconobacter cerinusIFO3285のGceGLIの各II型制限酵素を電気泳動的に単一にまで精製し,それらのDNA上における認識塩基配列およびその切断部位を決定した.酢酸菌は組換えDNAの研究に有用な6塩基のパリンドロームを認識切断する多数の制限酵素を産生する.Acetobacter pasteurianus IFO13753の産生するII型制限酵素ApalIを本菌の無細胞抽出液よりストレプトマイシン処理,硫安分画,ヘパリンーセファロースCL-6BおよびDEAE-セフアロースCL-6Bの各クロマトグラフィーおよびMonoQHR5/5を用いる高速液体クロマトグラフィーで,ポリアクリルアミド電気泳動的に単一にまで精製した.精製酵素は入力NAを4か所で切断し, 24時間の酵素反応でも,その切断パターンに変化は見られなかった.本酵素反応の至適条件は, 45°C, PH8.0, 7mMMgC1_2, 20mMNaClであった.しかし, NaClは0mMでも本酵素反応は充分に進行した.本酵素の分子量はゲル濾過的に26,000,等電点はアンホライン等電点電気泳動で4・8,クロマトフォーカシングで4.7であった.本酵素の5分間のプレインキュベーションによる温度安定性では45°Cまで極めて安定であった.本酵素のPH安定性は5.08.0の間にあった.本酵素はλ, Ad2, SV40, M13mp18RF, YbdintgX174RF, pBR322の各DNAを,それぞれ, 4, >6, 0, 1, 1, 3か所で切断した. YbdintgX-174RFDNAを本酵素で切断1, 5′末端を^<32>Pでラベルした後, Maxam-Gil-bert法で末端付近の塩基配列を決定した.その結果,本酵素はDNAの塩基配列, 5′-GTGCAC-3′を特異的に認識し,そのGとTの間で切断する全く新しいII型制限酵素であることが解った.本研究は他に, Acetobacter pasteurianus IFO13752のApa ORI, Gluconobacter cerinus IFO3260のGce inI, Gluconobacter cerinusIFO3285のGceGLIの各II型制限酵素を電気泳動的に単一にまで精製し,それらのDNA上における認識塩基配列およびその切断部位を決定した.
コレステロール生合成後段階の阻害剤探索法の開発とその応用

哺乳類のコレステロール生合成後段階酵素に対する阻害剤探索法を開発するに当たり、先ずスクアレン・エポキシダーゼ(SE)を標的酵素に検討した。一次スクリーニング法確立の戦略として、酵母にクローニングした哺乳類SEのcDNAを発現ベクターと共に導入し、酵母と哺乳類のSE両方を発現させ、酵母のSE活性のみを酵母SEに特異的な阻害剤テルビナフィンで阻止し、哺乳類SEを利用した生育条件下でカビや放線菌の分泌物及び菌体成分の中に、哺乳類SEに対する阻害剤の候補が存在するかどうかを生育阻害を指標に検討した。また、酵母のSE欠損株を作成し哺乳類SEのcDNAを発現ベクターと共に導入して生育させた酵母の生育阻害を指標にスクリーニングする方法も合わせ検討した。導入する哺乳類のSEとしてネズミ、マウス、ヒトのcDNAをクローニングし、酵母のトランスフォーマント作成にはネズミ由来のSEを用いた。酵母のSE欠損株の作成にはまだ成功しておらず、暫定的にトランスフォーマント酵母の生育条件の最適化を計る予備実験を行ない、SE阻害アッセイ系の構築としての培養、判定条件を設定した。既知の抗真菌活性物質39薬剤をアッセイに供した結果、15薬剤については10,01μg/mlで生育抑制を示したが、組換体のみに特異的に生育抑制を示すサンプルはなかった。一方、ポジティブコントロールであるNB-598はホストに比べ100倍強い生育抑制を示した。現在まで570サンプルの菌体成分についてのアッセイを終了したが、少なくとも5%以上の生育抑制を示したサンプルは18サンプルあり、組換体のみに特異的に生育抑制を示すサンプルは9サンプル存在したが、何れも生育抑制活性は弱く、これらについては広い濃度を採り、阻害活性を検討中である。ラットスクアレンエポキシダーゼcDNAをもつ酵母組み換え体をタ-ビナフィン存在下において酵母SEを抑制し、様々な物質による生育抑制を調べることによるラットSEの阻害剤スクリーニング法の開発を行った。まず条件検討を行いスクリーニング条件を次のように設定した。初発の菌濃度は1×10^8cells/mlとし、96ウエルプレートを用い、1ウエル当たり180μ1とし、インキュベーション時間は24時間とする。また溶媒(エタノール、DMSO)の最終濃度は0.1%、タ-ビナフィン濃度は最終濃度0.1μg/ml、サンプル濃度は100、10、及び0.1g/mlの3濃度とする。この条件下で、既知の抗真菌活性物質39薬剤のアッセイを行った。その結果15物質については10.01μg/mlで生育抑制を示したが、組み換え体のみに特異的に生育抑制を示すサンプルはなかった。一方ポジティブコントロールであるNB598は、特異的に組み換え体に対して、ホストに比べて100倍強い生育抑制を示した、このことは今回の方法及び条件がSE阻害剤のスクリーニング法として十分に機能していることを示している。そこで実際に種々の物質に対してスクリーニングを開始した。現在570サンプルについてアッセイを終了している。これまでの結果では少なくとも5%以上の生育抑制を示したサンプルは18サンプルであった。組み換え体のみに特異的に生育抑制を示すサンプルは9サンプルであったが、いずれも生育抑制活性は弱かった。これらについては濃度を広く取り検討をする予定である。今後はより多くのサンプルのスクリーニングを行い、またバイオセンサーを用いたより簡便で感度の高い酵素活性測定法の開発を行う予定である。ラットスクアレン・エポキシダーゼ(RSE)cDNAを持つ酵母組み換え体(Transformant-RSE)を作成し、これを用いて酵母のSEを特異的に阻害するterbinafine存在下で様々な菌体成分による生育抑制を調べることによりRSE阻害剤をスクリーニングする方法を開発した。

既知の抗菌剤、NB598での予備実験により確立した設定条件が、SE阻害剤一次スクリーニング法として十分機能していることを確認したので、この方法を用いて804種のサンプルを一次スクリーニングした。その結果、(1)transformantsの生長が20%以上生育抑制され且つhost cellより15%以上生育抑制されているものが47例、(2)上記の性質の他にhostの生育が80%を越えるものが25例検出された。現在これらの候補の中から更にRSEの阻害剤同定を計画中である。ラットRSEのcDNAをプローブとして用いてマウス、ヒトのcDNAクローニングを完成させた。アミノ酸レベルにおけるホモロジーはラットに対しマウスは93%、ヒトでは81%であった。現在ヒトのSEcDNAを酵母に組み込んだtransformantを作成中で、これを使用してヒトのSEに特異的な阻害剤を一次スクリーニングする計画である。基質結合部位はベンゾフェノンを用いたphotoaffinity法とMALDI-MSによるペプチド検索から3種の哺乳類並びに酵母のSEで共通に保存されているRHPLTGGGMTV近傍が有力と推定された。本酵素の遺伝子発現はHela cellを用いた実験からウエスタン、ノーザンブロット共にリポ蛋白欠乏血清培地で増加し、転写レベルでSE発現が調節されていることを明らかにした。ラットスクアレン・エポキシダーゼ(SE)発現系を分裂酵母に組み込んだトランスフォーマントを用いる阻害剤一次スクリーニングの培養条件とその生育阻害の判定法がほぼ確立したので、ヒト酵素に対するトランスフォーマントを作成する目的で、ヒトのスクアレン・エポキシダーゼ、ラノステロール合成酵素のcDNA、ゲノムDNAのクローニングについて検討した。ラットのSEcDNAをプローブにヒトのcDNAを単離しその塩基配列を決定した。更に、ヒトのSEcDNAをプローブにヒトの遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。200万クローンのスクリーンから15個のクローンを得、イントロンの長さ及びイントロン-エクソン結合部位を決定した。ヒト遺伝子の全長は17kbで11個のエクソンを含んでいた。10個のイントロンは87から3.2kbの範囲にあった。エクソンI、IIにはそれぞれ推定膜ドメイン及びFAD結合モチーフを持ち全ての遺伝子で共通なウンデカペプチドはエクソンVIIIに存在した。ヒトのラノステロール合成酵素のcDNAを単離し目下ゲノムDNAをクローニング中であるが未だ完全構造解析までに至っていない。分裂酵母で酵素欠損株を得ることが難しいので、Saccharomyces cerevisiaeへの組換体に代えるための予備実験を進めたが、殆どがテルビナフィン耐性で目下のところ実用化のメドは立っていない。また分裂酵母を用いたヒトSEの組換体作成の試みも今のところ成功していない。阻害剤の一次スクリーニングを進めた結果、候補となる菌体成分を数個見出したが、その検体の酵素阻害特異性、培養液、酵母の不ケン化物解析結果からは確認されるまでに至っていない。
マウス精子形成において半数体精子細胞特異的に発現する新規遺伝子の機能の解明

TISP40遺伝子の精細胞内での存在について明らかにするTISP40遺伝子の発現様式を確認するため、マウスの種々の組織のRNAをメンブレンにブロットしたもの、またマウスが生まれてから成熟した精子を形成するまで(35日齢)を2-5,8,17,23,29,35の6つに分けてそれぞ.れ精巣からRNAを採取し、メンブレンにブロットしたものとを用いてNorthern解析を行ったところ、精巣組織のみにまた23日齢以降に発現が認められた。さらにTISP40 mRNAが強く発現しているgerm cellsのdevelopmental stageを決定するために、TISP40 cDNAから生成したアンチセンスおよびセンスcRNAプローブと成体マウスの精巣を用いてin situ hybridizationを行ったところ、Stage VVIIIにおいて発現が認められた。この結果はNorthern解析の結果と同調していた。TISP40蛋白をGST融合タンパク質として大腸菌を用いて大量発現させ、GST-TISP40融合蛋白として精製した後、ラビットに免疫しポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体の品質確認した後、抗体を用いて免疫染色を行ったところ、精巣内でのTISP40蛋白の発現はstep1416において認められた。このことはmRNAと蛋白の発現「転写と翻訳」におよそ1週間のタイムラグがあることを示した。また細胞内局在については精子の核部にあることを明らかにした。TISP40遺伝子が転写制御因子として機能しているか明らかにするSAAB法を用いてTISP40蛋白に結合するDNA配列を決定し、その配列を用いてGel shift assayを行う。さらにTISP40遺伝子のノックアウトマウスを作製することで、その機能の詳細について明らかにすることを目指している。TISP40近傍のgenomeは採得した。そして得られたgenome上でTISP40遺伝子をdisruptし、ノックアウトマウス作製のためのコンストラクトを作成中である。マウスES細胞中にてgenome上でうまくTISP40遺伝子がdisruptされていることをPCRで確認した後、当微生物病研究所・遺伝子組み換え研究分野と共同研究としてノックアウトマウス作製を目指す。ノックアウトマウスができ次第、解析に入りたい。うまく表現形が出ると仮定する場合、その点についてさらに詳しい解析に入る。表現形が出なかった場合には、ノックアウトマウスより採取した精巣のRNAを用いて、現在まで申請者らが得たTISP遺伝子80種類についてNorthern解析を行い、それら遺伝子がTISP40遺伝子の上流あるいは下流にあるかを明らかにすることで、TISP40遺伝子の機能について検索する。そこでTISP40遺伝子の機能を解明するために、まずTISP40遺伝子の発現様式をノーザン解析により確認した。その結果マウスの種々の組織中精巣のみでかつgerm cellに特異的に、またマウスが生まれてから23日齢以降の時期に発現が認められた。さらに精巣切片を用いてin situ hybridizationを行い、TISP40mRNAが強く発現しているgerm cellsのdevelopmental stageを決定した。その結果、ノーザン解析の結果と同調してround sprematidの時期に発現が強く認められることを見いだした。次にTISP40蛋白のペプチド抗体を作成し、その抗体を用いてTISP40蛋白の発現様式を明らかにした。TISP40蛋白は精巣でのみ、また面白いことにTISP40遺伝子の転写パターンとは異なり、蛋白翻訳は約1週間遅く約28日齢(elongated spermatid)の時期以降に発現することがウェスタン解析により認められた。さらに精巣切片を用いて免疫染色を行い精細胞内での局在について明らかにした。その結果、ウェスタン解析に同調してelongated spermatidからspermが染色された。さらにspermについて免疫染色を行ったところ、sperm頭部が染色された。このことからこの蛋白は、精子形成そのものよりも精子と卵子の結合やその後の卵成熟に関わる可能性が示唆された。そこで現在受精卵についても免疫染色を行なっている。やはりTISP40遺伝子のノックアウトマウスを作製によりその機能の詳細について明らかにしたい。TISP40近傍のgenomeをマウスBACゲノムライブラリーを用いて採得した。現在得られたgenome上でTISP40遺伝子をdisruptし、ノックアウトマウス作製のためのコンストラクトを作成中である。

また細胞内局在については精子の核部にあることを明らかにした。TISP40遺伝子が転写制御因子として機能しているか明らかにするSAAB法を用いてTISP40蛋白に結合するDNA配列を決定し、その配列を用いてGel shift assayを行う。さらにTISP40遺伝子のノックアウトマウスを作製することで、その機能の詳細について明らかにすることを目指している。TISP40近傍のgenomeは採得した。そして得られたgenome上でTISP40遺伝子をdisruptし、ノックアウトマウス作製のためのコンストラクトを作成中である。マウスES細胞中にてgenome上でうまくTISP40遺伝子がdisruptされていることをPCRで確認した後、当微生物病研究所・遺伝子組み換え研究分野と共同研究としてノックアウトマウス作製を目指す。TISP40遺伝子が他のTISP遺伝子とどのように関わるかを明らかにするノックアウトマウスができ次第、解析に入りたい。うまく表現形が出ると仮定する場合、その点についてさらに詳しい解析に入る。表現形が出なかった場合には、ノックアウトマウスより採取した精巣のRNAを用いて、現在まで申請者らが得たTISP遺伝子80種類についてNorthern解析を行い、それら遺伝子がTISP40遺伝子の上流あるいは下流にあるかを明らかにすることで、TISP40遺伝子の機能について検索する。