hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルファルファにおけるアルミニウム耐性カルスの選抜と再生植物の作出

アルファルファは酸性土壌における耐性がきわめて弱いことが栽培上の最大の課題である。酸性土壌における生育障害の主要因は、土壌中の可溶可された過剰なアルミニウムイオンによる根部の生育阻害である。そこで本研究では、アルミニウムストレス条件下でアルファルファの細胞を選抜し、耐性細胞から再分化個体を得ることを目的に実験を行った。まず、成植物体におけるアルミニウム耐性の品種間差を確認するために、耐性品種L2915と非耐性品種キタワカバをアルミニウム濃度を調製した水耕法によって生育させ、生存率を調査した。その結果、耐性品種はアルミニウム100μMでも生存率は低下しなかったが、非耐性品種は50μMの低濃度で50%の生存率しか示さなかった。このことより、市販品種のアルミニウム耐性は極めて低いことが再確認された。酸性土壌が多い我が国においてアルファルファの定着を計るためには、アルミニウム耐性の改良が必須である。つぎに、細胞選抜におけるアルミニウム濃度を決定するために、アルミニウム非耐性品種キタワカバおよび耐性品種L2915のカルスをアルミニウム濃度が0-600μMのSH改変培地で培養して増殖率を比較した。その結果、培養4週間の高濃度区で耐性と非耐性の品種間で細胞の増殖率に明かな差が認められた。この結果を基にアルミニウムの選抜濃度を600μMに設定し、非耐性品種のカルスの突然変異誘発剤を処理して変異を拡大し、その材料から耐性細胞を選抜した。これまで4週間毎に継代培養を行い、ほぼ安定した細胞系を得た。現在これらの細胞系を再分化培地で培養中である。
ポリアミンレギュロンによる細胞増殖と生存率の調節

1.大腸菌においてポリアミンにより合成促進を受ける蛋白質として、オリゴペプチド輸送に関わるオリゴペプチド結合蛋白質、アデニル酸シクラーゼに次いで、RNAポリメラーゼσ^<38>因子を見出した。σ^<38>因子のポリアミンによる合成促進は、N末端から33番目の終止コドンUAGのread through促進によるものであった。このポリアミンによる促進は、UAG依存のsuppressor Gln-tRNA^<Gln>のリボソームへの結合がポリアミンにより促進を受けるためであった。2.大腸菌では終結因子RF1のmRNAの26番目に終止コドンが存在し、+1 frameshiftによりRF2が合成される。このRF2合成に対するポリアミンの効果を検討したところ、ポリアミンは+1 frameshiftを促進しないことが明らかとなった。一方、マウスのアンチザイムmRNAの+1 frameshiftに対するポリアミンの効果を大腸菌で検討したところ、ポリアミンは真核細胞の場合と異なり強く+1 frameshiftを阻害することが明らかとなった。3.大腸菌でポリアミンにより翻訳レベルで合成促進を受ける蛋白質をポリアミンモジュロンと命名し、ポリアミンモジュロンの更なる同定とポリアミンモジュロンにより発現調節を受ける遺伝子の同定を試みた。ポリアミンモジュロンとして新たにFecI (σ^<18>)とDNA結合蛋白質Craを同定した。また、ポリアミンにより転写促進を受ける遺伝子として2742種のmRNAのうち309種を同定した。
分子プレカーサー法を利用した新規3次元スキャホールドの再生医療への応用

本研究では,新規な3次元スキャホールドであるチタンファイバーメッシュ(Tiメッシュ)に分子プレカーサー法を用いて炭酸含有アパタイト(CA)薄膜コーティングを施し,動物埋入実験によってその骨適合性について検討した.分子プレカーサー溶液はEDTA-Ca錯体のアルコール溶液とメタリン酸ジブチルアンモニウム塩をCa/P=1.67の割合で調整して作製した.Tiメッシュを分子プレカーサー溶液に20分間浸漬し,その後,60°Cで20分間,600°Cで2時間加熱処理を行なった(3回繰り返し).電子プローブマイクロアナリシス(EPMA)測定の結果,Tiメッシュ内部までCA薄膜が形成されていた.薄膜形成法と知られているPVD法ではTiメッシュの様な複雑な構造体の内部にまでCA薄膜を形成することは不可能であり,分子プレカーサー法の有効性を明確にすることができた.擬似体液に浸漬したところ,CAコーティングを施したチタンファイバーメッシュ上にはその内部にまで,アパタイト結晶が析出した.さらに,CA薄膜形成を施したチTiメッシュの骨適合性について調べた.動物埋入実験は日本大学松戸歯学部動物実験倫理委員会の指針に従って行った(承認番号05-0016).ウサギの大腿骨関節内側穎部の海綿骨部にCA薄膜コーティングしたTiメッシュを埋入した.その結果,埋入12週間後でCAコーティングTiメッシュの内部にまで骨が良好に侵入して形成されている様子が観察された.一方,無処理Tiメッシュでは,ほとんど骨は形勢なれていなかった.以上,分子プレカーサー法を用いてCAコーティングを施したチタンファイバーメッシュは良好な骨適合性を示すことが判明した.CAコーティングチタンファイバーメッシュは再生医療のための3次元スキャホールドとして有望であることが示唆された.本研究では,新規な3次元スキャホールドであるチタンファイバーメッシュ(Tiメッシュ)に分子プレカーサー法を用いて炭酸含有アパタイト(CA)薄膜コーティングを施し,動物埋入実験によってその骨適合性について検討した.分子プレカーサー溶液はEDTA-Ca錯体のアルコール溶液とメタリン酸ジブチルアンモニウム塩をCa/P=1.67の割合で調整して作製した.Tiメッシュを分子プレカーサー溶液に20分間浸漬し,その後,60°Cで20分間,600°Cで2時間加熱処理を行なった(3回繰り返し).電子プローブマイクロアナリシス(EPMA)測定の結果,Tiメッシュ内部までCA薄膜が形成されていた.薄膜形成法と知られているPVD法ではTiメッシュの様な複雑な構造体の内部にまでCA薄膜を形成することは不可能であり,分子プレカーサー法の有効性を明確にすることができた.擬似体液に浸漬したところ,CAコーティングを施したチタンファイバーメッシュ上にはその内部にまで,アパタイト結晶が析出した.さらに,CA薄膜形成を施したチTiメッシュの骨適合性について調べた.動物埋入実験は日本大学松戸歯学部動物実験倫理委員会の指針に従って行った(承認番号05-0016).ウサギの大腿骨関節内側穎部の海綿骨部にCA薄膜コーティングしたTiメッシュを埋入した.その結果,埋入12週間後でCAコーティングTiメッシュの内部にまで骨が良好に侵入して形成されている様子が観察された.一方,無処理Tiメッシュでは,ほとんど骨は形勢なれていなかった.以上,分子プレカーサー法を用いてCAコーティングを施したチタンファイバーメッシュは良好な骨適合性を示すことが判明した.CAコーティングチタンファイバーメッシュは再生医療のための3次元スキャホールドとして有望であることが示唆された.本研究では,3次元スキャホールドとしてチタンファイバーメッシュに着目した.まず,分子プレカーサー法を用いてチタンファイバーメッシュへの炭酸含有アパタイト薄膜コーティングについて検討した.分子プレカーサー溶液はEDTA-Ca錯体のアルコール溶液とメタリン酸ジブチルアンモニウム塩をCa/P=1.67の割合で調整して作製した.EDTA-Ca錯体は通常アルコールに溶解しないのであるが,ジブチルアミンを加えることによってアルコール可溶性となり,製膜性も向上する.チタンファイバーメッシュは気効率82%,直径15mm,厚さ3.0mmのディスク状の物を用いた.チタンファイバーメッシュを分子プレカーサー溶液に5分間浸漬し,その後,60°Cで20分間,600°Cで2時間加熱処理を行なった.チタンファイバーメッシュ内部での炭酸含有アパタイト薄膜の形成状態の確認をX線光電子分光(XPS)法にて確認した.その結果,1回処理ではチタンファイーバーメッシュの表面にはCa原子,P原子の存在が確認され,炭酸含有アパタイト薄膜が形成されていたが,ファイバーメッシュ内部ではCa原子,P原子の存在はほとんど確認されず,薄膜の形成は不十分であった.これは,プレカーサー溶液のファイバーメッシュ内部への浸透が不十分であったためと思われる.そこで,溶液の浸透性を高めるために,溶液浸漬と加熱処理を3回繰り返す3回処理を行なった.その結果,チタンファイバーメッシュ内部までCa原子,P原子の存在が確認され,効率よく炭酸含有アパタイト薄膜が形成されたことが判明した.以上,分子プレカーサー法を用いて,3次元スキャホールドとして有望なチタンファイバーメッシュの内部にまで炭酸含有アパタイト薄膜コーティングを施すことができた.本研究では,新規な3次元スキャホールドであるチタンファイバーメッシュに分子プレカーサー法を用いて炭酸含有アパタイト(CA)薄膜コーティングを施し,動物埋入実験によってその骨適合性について検討した.分子プレカーサー溶液はEDTA-Ca錯体のアルコール溶液とメタリン酸

ジブチルアンモニウム塩をCa/P=1.67の割合で調整して作製した.本プレカーサー溶液はアルコール溶液であり,複雑な形状をしたチタンファイバーメッシュの内部にまでCA薄膜がコーティングできることを前年度の研究で見出している.チタンファイバーメッシュとしては,気効率85%,直径2.8mm,長さ6.0mmの円柱状の物を用いた.超音波処理を施しながら,チタンファイバーメッシュを分子プレカーサー溶液に20分間浸漬し,その後,60°Cで20分間,600°Cで2時間加熱処理を行なった.この操作を3回繰り返してCA薄膜コーティング処理を行なった.動物埋入実験は松戸歯学部動物実験倫理委員会の指針に従って行った(承認番号05-0016).ウサギ(日本白色種,3ヶ月齢)の大腿骨関節内側顆部の海綿骨部にCA薄膜コーティングしたチタンファイバーメッシュを埋入した.対照としてCAコーティング処理を施していないチタンファイバーメッシュを埋入した.その結果,埋入12週間後で,病理組織学的に検索するとCAコーティングチタンファイバーメッシュの内部にまで骨が侵入して形成されている様子が観察された,一方,無処理チタンファイバーメッシュでは,ファイバーメッシュ内部にはほとんど骨は形勢なれていなかった.以上の結果から,分子プレカーサー法を用いてCAコーティングを施したチタンファイバーメッシュは良好な骨適合性を示すことが判明した.CAコーティングチタンファイバーメッシュは再生医療のための3次元スキャホールドとして有望であることが示唆された.
小型汎用パルス強磁場を用いた先端測定による強磁場物性開拓

本研究計画では、非常に高い磁場領域で実現する新奇物性を先端的な精密測定を用いて観測し、その起源を解明していく。一般的な超伝導磁石を用いた強磁場発生法では、15テスラ程度の磁場が限界であるが、瞬間的に強磁場を発生させるパルス磁場技術ではこれをはるかに超える30テスラ超級の磁場を発生させることができる。しかし、数十ミリ秒のあいだに数十テスラの磁場変動が起こるため、パルス磁場下での精密測定は困難であった。そこで、最新の磁場制御技術により数ミリ秒の間磁場の時間変動が全く無くなる準定常磁場を利用することで、複数の精密測定を実現し、これらを多角的に用いた研究により強磁場物性を開拓する。
慢性脳虚血ラットの記憶障害に関与する内因性物質の分子生物学的研究

両側総頸動脈永久結紮(2VO)ラットでは、記憶学習障害が徐々に進行し、結紮後24ヵ月目に顕著になることを報告してきた。そこで学習障害発症前の脳慢性虚血初期の段階での生理的変化を明らかにし、それを制御することによる痴呆の治療薬・予防薬の開発をめざした研究をこの「萌芽的研究」によって行なった。昨年度は2VO処置後17日間の脳組織変化を時間を追って検討し、白質の粗鬆化、海馬神経細胞の萎縮、樹状突起の消失とアストロサイトの発現等を報告した。本年度、これらの機序をさらに分子的に明らかにするために、2VO4日後の脳中で発現量の変化する遺伝子のクローニングをDifferential Display法により行なった。その結果11個のmRNA発現量の増大する因子を単離し、その全ての配列を決定した。得られた11種の因子のsense鎖を決定した後、定量的PCR法によりその発現量変化を、2VO処置群と対照群との間で詳細に検討した。発現量増大の程度が最も大きかったvof-21(単離配列は415塩基)について、その全長のクローニングを行なう目的で、5'-race,3'-race法を行なった。その結果、3'側ではこれ以上の配列は得られなかったが、5'側の266塩基の新たな配列が明らかとなった。明らかにした計681塩基は新規の配列であったが、種々の検討から、vof-21は5'側にさらに配列を有するものと考えられた。また、通常内部標準として用いられるGAPDHの発現量も2VO処置4日後に増大している事が認められたため、本研究では内部標準はβ-actinを用いた。現在、vof-21の全長についてさらに検討を加え、発現量の時間的変化や、発現部位についての詳細な知見を得ることにより、この因子の機能の解明を行なっている。また、咋年報告した、THAやGST-21のvof-21発現への影響について解明するとともに、その他の10個の因子についての検討も行なう予定である。学習障害モデル動物として確立しつつある両側総頚動脈永久結紮(2VO)ラットの結紮にともなって脳内で生ずる分子的変化を検討した。2VO処置1-3日後で白質の粗髭化および海馬での神経細胞の萎縮がみられた。また、繰条体では2VO処置7日目に脳梗塞巣が確認された。免疫学的検討により、皮質および海馬での組織的変化には樹状突起の消失が伴っていること、2VO処置3-7日後の組織障害部位には反応性アストロサイトが発現しており、30日では大脳皮質・海馬においてその顕著な増加がみられることが明らかとなった。アルツハイマー病における記憶・学習障害の治療薬として処方されているコリンエステラーゼ阻害薬THA(9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine)の投与により、2VOラットの学習行動障害に改善作用がみられた。THAは術後1ヵ月以上経過したラットにおいても学習障害改善作用が認められたが、薬剤投与を中止すると学習障害が再発した。また、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストであるGTS-21(3-(2,4-dimethoxybenzyylidene)-anabaseine dihydrochloride)は、2VO処置前から投与すると、学習障害および脳組織障害に対し保護効果がみられた。明らかな学習障害を生ずる術後4カ月のラット脳よりDifferential Display法によって、発現量が増減する因子を数種単離し、その配列を決定した。得られた因子のうち、2VOにより発現量の増大するvof-16(仮称、遺伝子バンク登録No.AB006881)は、PCR法に基づく定量から、海馬、大脳皮質に多く発現していることが認められた。海馬におけるvof-16発現量は結紮によって24倍程度増大すること、ならびにその発現量の増大と学習障害の程度に相関性があるかもしれない点が、定量的PCR法により示唆された。明らかにした計681塩基は新規の配列であったが、種々の検討から、vof

-21は5'側にさらに配列を有するものと考えられた。また、通常内部標準として用いられるGAPDHの発現量も2VO処置4日後に増大している事が認められたため、本研究では内部標準はβ-actinを用いた。現在、vof-21の全長についてさらに検討を加え、発現量の時間的変化や、発現部位についての詳細な知見を得ることにより、この因子の機能の解明を行なっている。また、咋年報告した、THAやGST-21のvof-21発現への影響について解明するとともに、その他の10個の因子についての検討も行なう予定である。
視床下部毛細血管ダイナミクスの新規制御因子探索と作用メカニズム解明の試み

視床下部毛細血管とグリアネットワークは、ホルモンや血中栄養素の変化に呼応して、ダイナミックに変化する。この変化は、食欲調節や全身の代謝ネットワークと密接に関連していることから、その分子メカニズムの解明は重要な課題である。本年度は、細胞内外の脂質微小環境の変化により、視床下部毛細血管およびグリアネットワークが、いかなる変化を示すかについて、検証を加えた。その結果、マウス高脂肪食投与により、視床下部の毛細血管網が、拡大することが分かった。さらに、この変化に呼応して、視床下部ニューロンのレプチン応答性が低下することが明らかになった。現在、毛細血管ネットワークを制御する因子の同定を、血清成分分析や視床下部の質量分析等から解析を進めている。加えて、細胞内の脂肪酸代謝と密接に関連するミトコンドリア機能が視床下部で変化すると、視床下部ホルモンの分泌能の変化に伴って、下垂体の性ホルモン分泌に影響が及ぶことが明らかになりつつある。現在、ミトコンドリア機能に異常をきたす遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析を進めているが、視床下部ニューロンの数や視床下部ホルモンの中でも性腺刺激ホルモン放出ホルモンの産生および分泌に変化があることが示されている。下垂体毛細血管ネットワークが、マウス高脂肪食投与により、ダイナミックに変化することが確認できた。このモデルを使用することで、形態学的・分子生物学的な解析を進める目途が立った。動物モデルのみならず、視床下部のグリア細胞と内皮細胞の培養細胞レベルで、両細胞間のネットワークを制御する新規分子同定につなげていく。具体的には、前述の通り、高脂肪食投与マウスの血清や視床下部のパンチアウトサンプル、さらには、分離培養細胞レベルでの遺伝子発現アレイや質量分析による解析が中心となる。ある程度の候補分子が絞られた時点で、平行して培養血管内皮細胞への投与実験なども行う予定である。消耗品費が予定より少なかっため、翌年度分の消耗品費として使用する予定である。
新規培養系を用いた藻類バイオ燃料生産の高率化に関する遺伝子工学的研究

本研究の目的は、微細藻類による低コストの脂質大量生産法を実験室レベルで確立して、藻類バイオマス燃料の普及・発展に寄与することである。そのために、以下の二つのアプローチにより研究を進めている。(1)先行研究で開発した単細胞紅藻C. merolae (シゾン)の新規培養法である高効率燃料生産条件を用いて、ゲノム情報を基盤にした解析により、細胞増殖を維持したまま高率に脂質を生産するメカニズムの解明を目指すとともに脂質高生産株の育種を行う。(2)新規の脂質高生産藻類を単離し、脂質を高生産する培養条件を決定する。(1)シゾンを用いた、細胞増殖を阻害しない脂質蓄積条件下における網羅的な遺伝子発現解析から、脂質生産、油滴形成、脂質蓄積に関わると考えられる遺伝子を9遺伝子選抜した。特に重要と考えられた4遺伝子について脂質の高生産性との関連を調べる為に、変異体を作製した。これまでに当該鍵遺伝子の高発現形質転換体が獲得され、現在その表現型について解析を行っている。また、遺伝子機能の解析のためのノックアウト相同組み換え体を併せて現在作製している。(2)低コストの大量培養系を実現するためには、開放系培養が望まれるが、閉鎖系培養よりも他種生物の混入と増殖の可能性が大きくなる。培養系のpHを強酸性或いは、強塩基性にすることで他生物の混入を抑制できる。本年度は、平成29年度に高pHの温泉より単離された、分裂細胞の多い時期でも脂質を蓄積する脂質高生産藻類について、系統解析およびガスクロマトグラフ質量分析による脂肪酸解析をおこなった。新規脂質高生産藻類は、緑藻クロロコッカムに属し、主に9種類の脂肪酸を含む脂質を生産していた。得られた脂肪酸のうち、特に含有量の大きい脂肪酸は、他の脂質生産藻類と同様にオクタデセン酸であった。(1)昨年度やや遅れているとしたシゾンの変異体作製と解析は、技術的問題などが解消され、作製と解析をおこなえるようになった。(2)新規単離藻類は、順調に解析が進み、現在、より生産性をあげるための条件検討をおこなっている。よって進行状況をおおむね順調に進展しているとした。(1)今後は得られた脂質生産の鍵遺伝子の高発現体、ノックアウト相同組み換え体について、増殖性、脂質生産性などを検討し、細胞が増殖しながら脂質を生産するメカニズムの解明を目指す。作製した変異株の脂質生産性が強化されていた場合は、高脂質生産株として有用かどうかの評価をおこない、高脂質生産系の確立をめざす。(2)高脂質高生産が認められた新規単離藻類については、寒天培養は一般的な藻類と同等の増殖速度だが、液体培養法での増殖が遅いことが分かっている。今後は、条件検討をおこない、より高増殖、高脂質生産を示す液体培養条件を決定する。1先行研究で開発した単細胞紅藻Cyanidioscyzonmerolae(シゾン)の新規培養法である高効率燃料生産条件を用いて、ゲノム情報を基盤にした解析により、細胞増殖を維持したまま高率に脂質を生産するメカニズムの解明を目指すとともに脂質高生産株の育種を行う。2新規の脂質高生産藻類を単離し、脂質を高生産する培養条件を決定する。平成29年度は、1シゾンを用いた、細胞増殖を阻害しない脂質蓄積条件下における網羅的な遺伝子発現解析から、脂質生産、油滴形成、脂質蓄積に関わると考えられる遺伝子を9遺伝子選抜し、特に重要と考えられた4遺伝子について変異体の作成を開始した。現在、大量発現株の作製を行っている。2低コストの大量培養系を実現するためには、開放系培養が望まれるが、閉鎖系培養よりも他種生物の混入と増殖の可能性が大きくなる。本年度は、開放系培養を実現可能な極限環境(低pH、高pH、高温、高塩濃度など)から採取した微細藻類を単離し、脂質生産性を検討した。その結果、高pHの温泉より、脂質高生産藻類を単離した。一般的に藻類は、増殖中は脂質をほとんど蓄積せず、ストレス条件下で脂質を蓄積するが、本藻類は分裂細胞の多い時期でも脂質を蓄積した。さらに、長期的に培養した定常期では、分裂細胞は見られず、各細胞の葉緑体量が減少し、大量の脂質を蓄積していた。本藻類の至適生育pHを検討したところ、生息地よりも中性よりのpH7-8であった。新規単離藻類は、pH9、22°Cで増殖するため、大量培養の際、低コストで培養可能であるため、藻類バイオマス燃料生産種として極めて有望と考えられる。新規高効率燃料生産条件下における網羅的な遺伝子発現解析から、細胞増殖を阻害せずに脂質を大量に蓄積するのに寄与すると考えられる9遺伝子を選抜し、そのうち4遺伝子の変異体作成を着手した。しかし、シゾンを用いた当該遺伝子の大量発現株などの変異体の作製が、技術的問題等の理由で遅れている。本年度は変異体作成を行う人員を増加し、進めている。一方、次年度予定だった新規単離藻類の解析は、単離した藻類が予想したよりも多量に脂質を生産する株であったため、当初の予定よりも進んでいる。よって進行状況をやや遅れているとした。

本研究の目的は、微細藻類による低コストの脂質大量生産法を実験室レベルで確立して、藻類バイオマス燃料の普及・発展に寄与することである。そのために、以下の二つのアプローチにより研究を進めている。(1)先行研究で開発した単細胞紅藻C. merolae (シゾン)の新規培養法である高効率燃料生産条件を用いて、ゲノム情報を基盤にした解析により、細胞増殖を維持したまま高率に脂質を生産するメカニズムの解明を目指すとともに脂質高生産株の育種を行う。(2)新規の脂質高生産藻類を単離し、脂質を高生産する培養条件を決定する。(1)シゾンを用いた、細胞増殖を阻害しない脂質蓄積条件下における網羅的な遺伝子発現解析から、脂質生産、油滴形成、脂質蓄積に関わると考えられる遺伝子を9遺伝子選抜した。特に重要と考えられた4遺伝子について脂質の高生産性との関連を調べる為に、変異体を作製した。これまでに当該鍵遺伝子の高発現形質転換体が獲得され、現在その表現型について解析を行っている。また、遺伝子機能の解析のためのノックアウト相同組み換え体を併せて現在作製している。(2)低コストの大量培養系を実現するためには、開放系培養が望まれるが、閉鎖系培養よりも他種生物の混入と増殖の可能性が大きくなる。培養系のpHを強酸性或いは、強塩基性にすることで他生物の混入を抑制できる。本年度は、平成29年度に高pHの温泉より単離された、分裂細胞の多い時期でも脂質を蓄積する脂質高生産藻類について、系統解析およびガスクロマトグラフ質量分析による脂肪酸解析をおこなった。新規脂質高生産藻類は、緑藻クロロコッカムに属し、主に9種類の脂肪酸を含む脂質を生産していた。得られた脂肪酸のうち、特に含有量の大きい脂肪酸は、他の脂質生産藻類と同様にオクタデセン酸であった。(1)昨年度やや遅れているとしたシゾンの変異体作製と解析は、技術的問題などが解消され、作製と解析をおこなえるようになった。(2)新規単離藻類は、順調に解析が進み、現在、より生産性をあげるための条件検討をおこなっている。よって進行状況をおおむね順調に進展しているとした。今後は、シゾンの変異体を作製し、その解析により、細胞が増殖しながら脂質を生産するメカニズムの解明を目指す。作製した変異株の脂質生産性が強化されていた場合は、脂質生産株として有用かどうかの評価を行う。新規単離藻類については、pH以外の至適生育条件、至適脂質生産条件の検討を行う。また、新規単離藻類の生産する脂質の同定等を行う。(1)今後は得られた脂質生産の鍵遺伝子の高発現体、ノックアウト相同組み換え体について、増殖性、脂質生産性などを検討し、細胞が増殖しながら脂質を生産するメカニズムの解明を目指す。作製した変異株の脂質生産性が強化されていた場合は、高脂質生産株として有用かどうかの評価をおこない、高脂質生産系の確立をめざす。(2)高脂質高生産が認められた新規単離藻類については、寒天培養は一般的な藻類と同等の増殖速度だが、液体培養法での増殖が遅いことが分かっている。今後は、条件検討をおこない、より高増殖、高脂質生産を示す液体培養条件を決定する。納品が間に合わなかった試薬があったため、再度発注し、購入する。山口大学大学研究推進機構の協力を得ることができ、脂肪酸解析に必要な費用が少なくてすんだため。次年度物品費として使用予定。この研究課題の基盤となっている新規脂質生産法の特許が登録された。
含水珪酸塩溶融体の高温高圧下におけるその場観察:マントルの融解過程における水の役割の解明

高温度高圧力条件での含水マグマの化学構造を知ることは地球惑星の物質進化における最も基本的な問題である。地球内部でマグマが発生する場合、多かれ少なかれマグマ中にはH2Oが含まれる。H2Oはソリダス温度を低下させるだけではなく、シリケイトを多く溶かし込む。最近、アルバイトメルトなどのシリケイトメルトとH2Oの混和現象が報告されている。このような混和現象が地球内部でも起こっているとすると、ソリダス温度の定義を変更する必要が生じる。すなわち、H2O中に急激にシリケイト成分が溶け込む温度が重要になってくるだろう。私達はマグマ中の水の存在形態の圧力変化を知るために、外熱式ダイアモンドアンビルセルを利用して含水マグマを作成し、顕微赤外・顕微ラマン分光法を用いたスペクトル解析を行っている。その過程で、天然の安山岩とH2Oとの間での完全混和現象を発見した。バセット型外熱式ダイアモンドアンビルセルは、ダイアモンド全体を加熱するため、結果として試料全体を均一に加熱することができる。1050度Cよりも低温では容易に実験を行うことが可能である。ガスケットには高温で変形の少ないと考えられるレニウムを使用している。顕微赤外分光は日本分光のMICRO20とFTIR610を用いて行っている。20mmのWDを持つ標準のカセグレン鏡(16倍、NA0.5)以外に、新たに25mmのWDを持つカセグレン鏡(10倍、NA0.45)を作成した。富士火山の1707年の噴出物であるカルクアルカリ岩質安山岩に2wt.%の水を加えたガラスをピストンシリンダーで作成した。このガラス片を水とともにDACに封入し加熱した。約1GPa、950度Cで、ほぼ完全な一相の流体がえられ、圧力の低下に伴って全体がパール状に「もやもや」し二相に分離した。臨界現象は圧力増加とともに低温度で起こると考えられる。つまり、1GPa(およそ30km)よりも深く950度Cよりも高温度のところでは、H2Oを含んだ安山岩質メルトとシリケイトを溶かし込んだH2Oフルイドの区別はなくなる。また、1000°C,1GPaにおいて安山岩質マグマの近赤外スペクトルの採集に成功した。(1)外熱式ダイアモンドアンビル装置のセットアップダイアモンドアンビルの試料温度を制御する装置を直流電源安定化装置と温度計を用いて自作した。3種類の標準物質の融点の観察を行うことによって温度較正を行った。現在、1000°Cまで安定に加熱できる。また、ダイアモンドアンビルの試料圧力の測定方法を次のように行った。厚さ125ミクロンのレニウム箔ガスケット中に水と気泡を封入し、温度を上昇させる。そして、これらの均質化温度を測定し系としての密度を求める。均質化温度以上での圧力は水の状態方程式で求める。この方法で1万気圧までの圧力を発生させた。この手法で2.5万気圧の圧力を発生させることが可能である。(2)エンスタタイト-

水系の高温高圧状態でのその場観察マントルの主要構成鉱物の一つであるエンスタタイト(化学式MgSiO3)組成の無水ガラスをダイアモンドアンビルに水とともに封入し1000°C、1万気圧までの温度圧力範囲において、光学顕微鏡を用いてその場観察した。その結果、無水エンスタタイトガラスには微小な結晶が数多く晶出し、ガラス転移温度までアルファス状態を維持できないことがわかった。現在、ピストンシリンダー型高圧発生装置を用いてよりガラス転移温度が低い含水ガラスを作成している。(3)フーリエ変換型顕微近赤外分光光度計のセットアップフーリエ変換型顕微近赤外分光光度計を購入・設置した。現在、OHおよびH2Oの吸収スペクトルの測定および全含水量の決定のため標準物質を用いて検量線を作成している。1外熱式ダイアモンドアンビルセルの高温度高圧力条件での安定性を向上させるために、レニウム製のガスケットの穴開け方法を次に述べるように改良した。昨年度までは、穴の開けてあるレニウムガスケットを購入し試料室として使用していたが、実験中に試料室の変形が起こるため、ダイアモンドのアンビルでレニウム箔を圧し、その中央に放電加工機を用いて穴を開け試料室として用いた。この結果、高温条件でも試料室の変形が少なくなり、実験を容易に行うことが可能となった。また、断熱材のセラミクスをジルコニア製とし、強度が強くなった。2フーリエ変換型顕微赤外分光器のカセグレン鏡の焦点距離を25mmから30mmに拡大し、ダイアモンドアンビルセルでの実験を可能にした。これと、上の1の改良により研究の主目的に向けてやっと本実験を行う準備が整った。3エンスタタイト、ディオプサイド、高マグネシウム安山岩のガラスを用いて過冷却状態のメルトを得ようとしたが、300-600°Cで結晶成長が起こってしまい失敗した。成果を容易に出すためには、結晶成長が起こらず過冷却メルトが得られる系、具体的には重合度の高いアルバイトやデイサイト、流紋岩マグマなどの系で実験を行うことが容易に考えられる。しかし、それらの系では既にドイツの複数の研究グループが実験を報告しているので、新しい結果を出すことは困難かもしれない。適切な実験の系を模索する作業が続けられる。高温度高圧力条件での含水マグマの化学構造を知ることは地球惑星の物質進化における最も基本的な問題である。地球内部でマグマが発生する場合、多かれ少なかれマグマ中にはH2Oが含まれる。H2Oはソリダス温度を低下させるだけではなく、シリケイトを多く溶かし込む。最近、アルバイトメルトなどのシリケイトメルトとH2Oの混和現象が報告されている。このような混和現象が地球内部でも起こっているとすると、ソリダス温度の定義を変更する必要が生じる。すなわち、H2O中に急激にシリケイト成分が溶け込む温度が重要になってくるだろう。私達はマグマ中の水の存在形態の圧力変化を知るために、外熱式ダイアモンドアンビルセルを利用して含水マグマを作成し、顕微赤外・顕微ラマン分光法を用いたスペクトル解析を行っている。その過程で、天然の安山岩とH2Oとの間での完全混和現象を発見した。バセット型外熱式ダイアモンドアンビルセルは、ダイアモンド全体を加熱するため、結果として試料全体を均一に加熱することができる。1050度Cよりも低温では容易に実験を行うことが可能である。ガスケットには高温で変形の少ないと考えられるレニウムを使用している。
開放型共振器を用いた氷結晶のマイクロ波・ミリ波誘電特性の研究

本研究を実施した目的は、従来から測定の空白域となっている氷のマイクロ波・ミリ波誘電特性を、高精度測定の可能な手法である開放型共振器法を用いて測定し、新たに明らかにすることにあった。設計した開放型共振器は、26.5GHz40GHz(Kaバンド)で使用可能なものであり、この周波数帯の誘電特性を調査した。氷結晶の誘電特性としては、純粋単結晶の複素誘電率テンソル(結晶軸方位依存性)、0°C-60°Cの範囲の温度依存性をまず調査した。これを基礎データとし、さらに多結晶氷や粉体氷の誘電特性を調べ、単結晶の場合と比較した。これにより、天然の雪や氷の内部で起こると考えられている電波散乱の効果を実験的に検知することができた。この成果の初期結果は速報として論文公表された。当研究において、高精度測定のためのポイントは測定治具である開放型共振器の製作と調整にあり、年度の前半はこの製作と、最大限の性能を引き出すための調整作業にあてた。測定に必要なシステムのうち、共振器は別途の予算で準備できたため、科学研究費補助金は、測定サンプルと測定系そのものの電気特性を実測できるようにする目的で、エレクトロメータの調達にあてた。その他の測定系は申請者の従来の研究により確立しているものを使用した。氷のマイクロ波・ミリ波誘電特性は、近年実用上の重要性が上がっているにもかかわらず未知であるため、これを調査にすることは、結晶格子の振動に起因した氷の高周波電気物性がわかるばかりでなく、地球雪氷圏、さらには氷惑星電波探査の鍵になる物性が明らかにする点で意義が大きい。したがって、今回明らかになった30GHz付近の周波数帯の結果をふまえて、将来は依然未知のまま残っているより高周波(100GHz付近)の研究が重要であると考える。
Ca^<++>流入とカテコラミン分泌の急速脱感作の分子機構のリアルタイム同時測定による研究

各種刺激による神経伝達物質などの遊離には脱感作が起こることが知られているが、その機構には不明な点が多く、脱感作の機構を明らかにすることは刺激-分泌関連、特にその調節機構の解明に重要なことと考えられている。本研究では、培養牛副腎髄質クロマフィン細胞を用い灌流系においてCA分泌の測定と同時に細胞内遊離カルシウム濃度変化を経時的に測定する新しい方法を用い、脱感作の分子機構を明らかにすることを目的としている。(1)実験方法の確立:牛副腎髄質クロマフィン細胞は単離して、differential platingによる精製の後、minimum essential mediumに10%牛胎仔血清を補った培養液にMEM non-essential amino acids(x100)をlml/100ml加えた培養液中で、マイクロビ-ズと混合し、5-7日目に実験に用いた。この方法により細胞の剥離が最小限に抑えられた。さらに、試作品であるが、分解洗浄可能でデッドスペ-スが約70μlのセルが完成した。(2)本灌流系での各種刺激薬物の効果:培養牛副腎髄質クロマフィン細胞において、高カリウムまたニコチンのパルス刺激により340nm励起の蛍光強度の上昇と380nm励起の蛍光強度の減少、又その比の上昇が見られ、その反応に伴い急速なカテコラミン分泌が認められた。パルス刺激の場合には両刺激ともに細胞内遊離カルシウム濃度とカテコラミン分泌の増減はパラレルであった。一方、持続刺激の場合、ニコチンが灌流液中に存在するにもかかわらず、細胞内遊離カルシウム濃度とカテコラミン分泌の上昇は急速な脱感作(t1/2=60sec)を受けることが明らかになった。また、興味あることに高カリウム刺激の場合細胞内遊離カルシウム濃度は高いレベルを維持するが、カテコラミン分泌には急速な脱感作が生じた。この結果はニコチン刺激と高カリウム刺激とでは脱感作現象が異なること、さらに高カリウム刺激の場合、細胞内遊離カルシウム濃度上昇以後の過程がカテコラミン分泌の脱感作に関与していることが示唆された。
加湿水を必要としない膜式加湿器の開発と臨床応用

従来用いられてきたbubbling humidifierは加湿用の水を用いるため院内感染の原因になるとされてきた.我々は加湿水の不要な膜式加湿器を開発した.原理は室内気の水蒸気を利用する,全く新しい装置である.実験用の試作器を作成し,実験を行った.承諾の得られた慢性呼吸器疾患の患者10例に使用し,本器に酸素を通過加湿することによる影響を調べるため,加湿酸素流を吸入中に(1)動脈血ガス分析を行った.(2)直接加湿酸素流の酸素濃度を酸素濃度計で測定した.In vitroの実験として,乾燥酸素を加湿用の水を潜らせる従来用いられてきたbubbling humidifierと膜式加湿器により加温された酸素の相対湿度を比較した.また,膜式加湿器が細菌の混入を防げるか否かを調べた.膜式加湿器を使用することで,患者のPaO_2への影響は認めなかった.100%濃度の酸素を加湿した場合の酸素濃度を各々直接,酸素濃度計で測定した結果,97.8±1.2%と97.6±1.1%で有意差を認めなかった.膜式加湿器により,乾燥した酸素(相対湿度:7.1±1.1%)を相対湿度:82.2±10.7%まで加湿できた.一方,従来の加湿器では相対湿度:89.9±2.6%まで加湿できた.膜式加湿器は十分な相対湿度を乾燥酸素に与えることができた.3×10^8のPseudomonas aeruginosaで,膜式加湿器の膜外を10日間汚染したが,膜内を通過させた酸素流に対して細菌の混入を防ぐことができた.本器は在宅酸素療法の吸着型酸素濃縮器に組み込むこともできる.患者にとって従来のbubbling humidifierに比べて煩雑な加湿水の交換の手間を省き,さらに細菌感染の機会を減らせる可能性がある.実用化も可能と考えられた.従来用いられてきたbubbling humidifierは加湿用の水を用いるため院内感染の原因になるとされてきた.我々は加湿水の不要な膜式加湿器を開発した.原理は室内気の水蒸気を利用する,全く新しい装置である.実験用の試作器を作成し,実験を行った.承諾の得られた慢性呼吸器疾患の患者10例に使用し,本器に酸素を通過加湿することによる影響を調べるため,加湿酸素流を吸入中に(1)動脈血ガス分析を行った.(2)直接加湿酸素流の酸素濃度を酸素濃度計で測定した.In vitroの実験として,乾燥酸素を加湿用の水を潜らせる従来用いられてきたbubbling humidifierと膜式加湿器により加温された酸素の相対湿度を比較した.また,膜式加湿器が細菌の混入を防げるか否かを調べた.膜式加湿器を使用することで,患者のPaO_2への影響は認めなかった.100%濃度の酸素を加湿した場合の酸素濃度を各々直接,酸素濃度計で測定した結果,97.8±1.2%と97.6±1.1%で有意差を認めなかった.膜式加湿器により,乾燥した酸素(相対湿度:7.1±1.1%)を相対湿度:82.2±10.7%まで加湿できた.一方,従来の加湿器では相対湿度:89.9±2.6%まで加湿できた.膜式加湿器は十分な相対湿度を乾燥酸素に与えることができた.3×10^8のPseudomonas aeruginosaで,膜式加湿器の膜外を10日間汚染したが,膜内を通過させた酸素流に対して細菌の混入を防ぐことができた.本器は在宅酸素療法の吸着型酸素濃縮器に組み込むこともできる.患者にとって従来のbubbling humidifierに比べて煩雑な加湿水の交換の手間を省き,さらに細菌感染の機会を減らせる可能性がある.実用化も可能と考えられた.従来用いられてきたbubbling humidifierは加湿用の水を用いるため院内感染の原因になるとされてきた.我々は加湿水の不要な膜式加湿器を開発した.原理は室内気の水蒸気を利用する,全く新しい装置である.実験用の試作器を作成し,実験を行った.承諾の得られた慢性呼吸器疾患の患者10例に使用し,本器に酸素を通過加湿する事による影響を調べるため,動脈血ガス分析を行った.また直接酸素流の酸素濃度を測定した.In vitroの実験として乾燥酸素を加湿用の水を潜らせる,従来用いられてきたbubbling humidifierと膜式加湿器により加湿された酸素の相対湿度を比較した.また,膜式加湿器が細菌の混入を防げるか否かを調べた.膜式加湿器を使用することで,PaO_2への影響は認めなかった.100%濃度の酸素を加湿した場合の酸素濃度を各々直接,酸素濃度計で測定した結果,97.8±1.2%と97.6±1.1%で有意差を認めなかった.膜式加湿器により,乾燥した酸素(相対湿度:7.1±1.1%)を相対湿度:82.2±10.7%まで加湿できた.

一方,従来の加湿器では相対湿度:89.9±2.6%まで加湿できた.膜式加湿器は十分な相対湿度を乾燥酸素に与えることができた.3×10^8のPseudomonas aeruginosaで,膜式加湿器の膜外を10日間汚染したが,膜内を通過させた酸素流に対して細菌の混入を防ぐことができた.本器は在宅酸素療法の吸着型酸素濃縮器に組み込むこともできる.患者にとって従来のbubbling humidifierに比べて煩雑な加湿水の交換の手間を省き,さらに細菌感染の機会を減らせる可能性がある.今後は実用化に向けてコスト面と詳細な検討をする予定である.従来用いられてきたbubbling humidifierは加湿用の水を用いるため院内感染の原因になるとされてきた。我々は加湿水の不要な膜式加湿器を開発した。原理は室内気の水蒸気を利用する、全く新しい装置である。実験用の試作器を作成し、実験を行った。承諾の得られた慢性呼吸器疾患の患者10例に使用し、本器に酸素を通過加湿することによる影響を調べるため、加湿酸素流を吸入中に(1)動脈血ガス分析を行った。(2)直接加湿酸素流の酸素濃度を酸素濃度計で測定した。In vitoroの実験として、乾燥酸素を加湿用の水を潜らせる従来用いられてきたbubbling humidifierと膜式加湿器により加湿された酸素の相対湿度を比較した。また、膜式加湿器が細菌の混入を防げるが否かを調べた。膜式加湿器を使用することで、患者のPaO2への影響は認めなかった。100%濃度の酸素を加湿した場合の酸素濃度を各々直接、酸素濃度計で測定した結果、97.8±1.2%と97.6±1.1%で有意差を認めなかった。膜式加湿器により、乾燥した酸素(相対湿度:7.1±1.1%)を相対湿度:82.2±10.7%まで加湿できた。一方、従来の加湿器では相対湿度:89.9±2.6%まで加湿できた。膜式加湿器は十分な相対湿度を乾燥酸素に与えることができた。3×10^8のPseudomonas aeruginosaで、膜式加湿器の膜外を10日間汚染したが、膜内を通過させた酸素流に対して細菌の混入を防ぐことができた。本器は在宅酸素療法の吸着型酸素濃縮器に組み込むこともできる。患者にとって従来のbubbling humidifierに比べて煩雑な加湿水の交換の手間を省き、さらに細菌感染の機会を減らせる可能性がある。実用化も可能と考えられた。
タンザニアにおける大型食肉目の行動・生態学的研究

平成28年度は、タンザニア・マハレ山塊国立公園において5月28日7月13日および2月9日3月30日の期間ヒョウの生態に関する調査をおこなった。前期におこなった赤外線センサーカメラを用いた調査では、調査地に1頭のみ生息していたオスが撮影されなかった。また、後期の調査でも撮影されなかった。老齢個体であると思われるため、若い個体になわばりを奪われたか、死亡した可能性がある。また、28年度の調査では、乾季および雨季におけるヒョウの食性傾向を調査することを目的とした。さらに、タンザニア国内で野生動物のサンプル輸出に関する制度が改変され、糞サンプルの輸出が難しくなったため、現地にて分析を行うことを目的とした。現地滞在中は調査域内をくまなく歩き回り、可能な限りヒョウの糞を採集した。収集した糞は、その残渣物を肉眼や実体顕微鏡を用いて精査し、骨、角、爪などの内容物から被食者の同定を行った。糞内部に含まれる毛も食性をする上では重要な情報となるが、毛を同定するためにはリファレンスが必要となる。しかし、野生下でリファレンスとなる毛を見つけるのは困難であったため、日本国内で、現地に生息する動物のはく製を探し、毛を少しずつ採取させていただいてきた。しかし、キイロヒヒの毛だけは状態のよいものを採取するのが困難であった。今回の調査では、キイロヒヒを追跡し、観察する時間を設けることでリファレンスにできる毛を採取することができた。そのため、今後は、生物顕微鏡を用いて毛小皮紋理や毛の断面の形態を1本ずつ確認することで、より精度の高い同定を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。2014年度の調査では、共同研究者と協力し、赤外線センサーカメラをより広域、長期的に設置することで、調査地に生息するヒョウの頭数や行動範囲に関する知見を得ることを第一の目的とした。タンザニア・マハレ山塊国立公園のチンパンジーMグループの遊動域のうち16km2内において、1km2ごとにもっともヒョウの利用頻度が高いと思われる場所1ヶ所を抽出し、32台のカメラを2台1組として設置した。カメラはすべて、動物が通過すると連続して3枚の写真が撮影されるよう設定されている。ヒョウは、両体側面の模様から個体識別が可能であるとされている(Henschel and Ray, 2003)ことから、2台のカメラの間を通過した際に撮影された個体の両体側面の模様から、個体識別をおこなった。結果、オス1頭、メス5頭、メスとともに歩く子1頭の計7頭が識別された。また、2014年度の調査では、雨季におけるヒョウの食性を調査することを第二の目的とした。現地滞在中、調査域内をくまなく歩き回り、可能な限りヒョウの糞を採集した。不在中も研究協力者らに収集してもらったため、7月8日から2月14日の間で合計81個の糞を収集することができた。7月に見つけた新しい糞については半年以上放置し、糞の崩壊の速度と程度を記録した。植生によって糞の発見効率が異なると考えられたため、10分ごとに地面を撮影することで糞の発見効率をはかる手がかりとした。27年度はおもにカメラトラップによるマハレ山塊国立公園に生息する動物の生息場所、活動時間帯の推定と、糞分析によるヒョウの食性の解析をおこなった。ヒョウの個体識別は前年度に完了していたため、今年度はより広域の、多数地点にカメラを設置した。結果、前年度以降、ヒョウの移出や、新たなヒョウの移入はなかったことが確認された。母子を除くメス2個体が、同じカメラで1分以内に撮影された事例が複数あり、いずれも妊娠中とみられるメスとともに撮影されていた。メスはこどもを産む前後に他のメスと接触することがあるという報告がある(Bailey, 1994)ため、マハレでも同様に出産が近づくにともないほかのメスと行動することが増えた可能性が示唆された。また、収集した糞のDNA分析及び糞に含まれている毛から、獲物の種同定を試みた。今までの調査で収集した糞88サンプルについて、糞に含まれる獲物のDNAを抽出し、被食者の種を特定するべく、予備実験をおこなった。毛小皮紋理(キューティクル)の形態は消化によって破壊されず(Quadros and Monteiro-Felo., 2000)、さらに多数の糞から毛は採取できるため、糞の残渣物から食べられている動物種を識別するうえで毛は有力な資料となる。毛の種同定は、毛の形態を記載したリファレンスと見比べておこなわれるが、マハレ山塊国立公園に生息する霊長類の毛については、形態に関する記録が一切なかった。そこで、日本モンキーセンターとの共同研究としてマハレに生息する霊長類と同種または近縁種の剥製から毛を採取し、光学顕微鏡を用いて毛を観察し、リファレンスの作成をおこなった。今後、このリファレンスを用いて糞に含まれる毛の分析をおこなう予定である。27年度は、タンザニアでのフィールド調査をおこなったほか、これまでに収集してきたヒョウの糞

サンプルから獲物となっている種のDNAを識別するための次世代シークエンサー解析、糞から回収された動物の毛の同定に必要な毛小皮紋理の形態のリファレンス作成、赤外線センサーカメラで撮影されたヒョウの個体識別などの分析をおこなった。前年度、雨季に糞を収集したが、十分な数の糞を得られなかった。そのため今年度も雨季に渡航して糞の収集に努め、結果として十分な数の糞を集めることができた。糞に含まれる獲物のDNA解析はヒョウではまだ報告がなく、予備実験をおこなったが、信頼にたる結果は得られなかった。実験系を見直す必要がある。糞に含まれている毛の種同定をおこなうため、前年度は走査型電子顕微鏡を使っていた。走査型電子顕微鏡では毛小皮紋理の詳細な観察が可能である一方、観察に時間がかかった。そこで、今年度は光学顕微鏡での観察を試みた。まず、毛の太さを計測した。次に、スンプ法にて毛小皮紋理の模様を写し取り、透過型顕微鏡で観察した。また、カミソリで切断し、毛髄の発達の度合いを観察した。結果、これらの指標を組み合わせることで毛の種同定が可能であると考えられた。現在、この指標を用いて糞の中に含まれる毛の種同定を試みているところである。また、研究に加え、野生動物に関する一般書や小冊子の分担執筆をおこない、国内外のシンポジウムや研究会などでも積極的に成果発表をおこなった。さらに、海外の研究者とも相談しながら計画を進めている。以上のことから、進行状況はおおむね順調であると言える。平成28年度は、タンザニア・マハレ山塊国立公園において5月28日7月13日および2月9日3月30日の期間ヒョウの生態に関する調査をおこなった。前期におこなった赤外線センサーカメラを用いた調査では、調査地に1頭のみ生息していたオスが撮影されなかった。また、後期の調査でも撮影されなかった。老齢個体であると思われるため、若い個体になわばりを奪われたか、死亡した可能性がある。また、28年度の調査では、乾季および雨季におけるヒョウの食性傾向を調査することを目的とした。さらに、タンザニア国内で野生動物のサンプル輸出に関する制度が改変され、糞サンプルの輸出が難しくなったため、現地にて分析を行うことを目的とした。現地滞在中は調査域内をくまなく歩き回り、可能な限りヒョウの糞を採集した。収集した糞は、その残渣物を肉眼や実体顕微鏡を用いて精査し、骨、角、爪などの内容物から被食者の同定を行った。糞内部に含まれる毛も食性をする上では重要な情報となるが、毛を同定するためにはリファレンスが必要となる。しかし、野生下でリファレンスとなる毛を見つけるのは困難であったため、日本国内で、現地に生息する動物のはく製を探し、毛を少しずつ採取させていただいてきた。しかし、キイロヒヒの毛だけは状態のよいものを採取するのが困難であった。今回の調査では、キイロヒヒを追跡し、観察する時間を設けることでリファレンスにできる毛を採取することができた。そのため、今後は、生物顕微鏡を用いて毛小皮紋理や毛の断面の形態を1本ずつ確認することで、より精度の高い同定を行う。当初の計画通り、マハレ山塊国立公園にて雨季におけるヒョウの糞サンプルの採集をおこなうことができた。タンザニアでは、11月に乾季から雨季に移行し、5月に雨季から乾季に移行する。2014年度、雨季におこなった調査は12月から2月の2ヶ月間と短期間であったこと、雨季は乾季に比べ降雨量が増すために糞の崩壊速度が増し、発見効率が下がることから、今回の調査の中でも雨季に見つかった糞は38個と乾季に比べ少なかった。
粘膜型ワクチン開発の為のIgAreceptorの基礎的検討

本研究では、分泌型IgAの粘膜面への分泌に重要なレセプター(SC)の局所における分布と、その、遺伝子の発現をmRNA transcriptレベルで検討をおこなった。さらにIgA欠損をしめす免疫不全マウスを用いて、イデオタイプIgAを静脈より投与して、胆汁への分泌型IgAの移行を検討し、免疫不全患者の治療モデルの基礎的検討を行い、以下の結果をえた。1)マウスに於けるSCの分布は、唾液腺、胃腺、腸管、気管支腺、肝臓、腎、子宮腺などの上皮細胞に分布し、分泌型IgAの産生にレセプターとして働くことがしめされた。IgA欠損をする免疫不全マウスにおいても、SCは同様な分布を示し、このレセプターの発現は、局所のIgA産生とは異なった発現調節を受けていることを明らかにした。2)レセプターの発現レベルを、RT-PCRおよびIn situ hybridization法で検討した結果、唾液腺、肝臓および腸管で発現が強く、他の部では両臓器以下であった。このことはマウスにおいてこれらの臓器が、分泌型IgAによる免疫防御の重要な臓器あることを明らかにした。3)唾液、胆汁、腸管液中には、IgA欠損をする免疫不全マウスにおいてもfree SC(IgAと結合していない)が持続的に分泌されていることを明らかにし、唾液中に最も多いことを見いだした。3)免疫不全マウスに、イデオタイプIgAを投与し胆汁への分泌を検討した結果、投与したのち短時間で分泌され、粘膜感染防御のモデルとして有効であることを明らかにした。現在、このマウスを用いて、感染実験およびサイトカインによる分泌型IgAの産生調節を検討している。