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磁気力顕微鏡の高分解能化および磁性材料磁化状態とナノ構造解析に関する研究

探針と高磁気異方性材料のL11-CoPtのハイブリッド膜被覆探針構造により、分解能(811 nm)と反転磁界(0.41.5 kOe)が制御可能であり、膜比選択により高反転磁界(>1 kOe)と高分解能(<10 nm)特性を合わせ持つ探針実現性を示した。(b)磁性探針の磁性材料は酸化し易く、またSiなどに比べ軟質であるため、耐食性と耐摩耗性が劣る。これらの問題に対処するため、硬質の極薄保護膜形成技術を検討した。厚さ2 nmの保護膜(C, Si-N, Si-C)を磁性探針表面に被覆することにより、未被覆探針に比べて耐食性が少なくとも5倍、耐摩耗性が3倍向上することが分かった。高分解能で高反転磁界特性を持つ実用性に優れた磁性探針作製の基本技術を確立した。平成25年度27年度の研究により、先端曲率3 nmのSi探針にFe被覆した探針で高分解能特性(<7 nm)を、200 nmのL11-CoPt磁性膜被覆した探針で高反転磁界特性(6 kOe)を、Fe/L11-CoPtハイブリッド被覆膜探針で高分解能(<10 nm)と高反転磁界特性(>1 kOe)が両立できることを示した。極薄の硬質保護膜被覆により耐食性と耐摩耗性を3倍以上改善可能で、磁性探針実用性を大幅に向上できることを明らかにした。本研究では、(a)磁気力顕微鏡探針の分解能を向上する技術(分解能6 nm)、(b)反転磁界特性を増大できる探針構造技術を開発し、これらの技術を組み合わせることにより、(c)高分解能(<10 nm)と高反転磁界特性(>1 kOe)を両立させた磁性探針の実現が可能であることを示した。さらに極薄保護膜被覆により(d)耐食性(>5倍)と耐摩耗性(>3倍)を改良した実用性に優れた磁性探針を実現した。本研究により、nmレベルで超高密度磁気記録媒体などの構造と磁化状態の相関解析が可能となった。今後、磁性材料改良指針を明確化するため有効活用が期待される。過去2年間の研究を通して、磁気力顕微鏡用の磁性探針を材料(10種類以上)、製膜条件(製膜法、温度、膜厚、下地材料)、および耐食性を系統的に研究し、高分解能、高反転磁界特性を持つ磁性探針作製の条件が明らかになってきた。効率の良い研究推進ができた背景には、本研究着手以前から培ってきた基礎技術(分解能や反転磁界決定法、分解能判定標準試料技術、探針形態観察技術など)がある。先端曲率半径が揃った非磁性探針をメーカから系統的に導入できたことによる効果も大きい。本研究で達成している高分解能と高反転磁界特性の両立(7.5 nm, 2 kOe)は世界トップであると思われる。関連学会でも研究成果は高く評価されている。研究進捗は順調であり、平成27年度に予定していた課題(耐食性などの検討)に先行着手できた。工学被覆磁性膜のハイブリッド化(高い飽和磁束密度を持つ磁性材料と高い磁気異方性を持つ材料の組み合わせ)や下地材料の検討を進め、高分解能と高反転磁界特性を併せ持った磁性探針の可能性をさらに検討する。磁性材料と形成条件の詳細検討により、5 nmレベルの高分解能特性を持つ磁性探針の開発を目指す。併せて、磁性探針の実用条件(耐食性や耐摩耗性の付与)を検討する。この研究で開発した磁性探針を磁気記録媒体や永久磁石材料の磁区構造観察に適用し、その有効性を検証する。研究開始から既に10種類以上の被覆磁性材料について、被覆条件(膜形成法、膜厚、形成基板温度、被覆下地材料など)を系統的に検討した。これにより高分解能、高感度、高反転磁界特性を実現するための磁性探針基本構造を明らかにすることが可能となり、既に研究最終目標に近い6 nm程度の分解能を実現しつつある。高分解能特性を持つCoあるいはCoFe合金被覆の磁性探針の反転磁界強度は0.5 kOe程度であるが、磁性多層膜もしくは比較的低温(300°C)で形成可能なL11-CoPt合金被覆の磁性探針で1.5 kOe以上を実現できる見通しを得つつある。
超対称性暗黒物質の質量の上限についての研究

超対称性模型は非常に有力な新物理の候補であるが、どのエネルギースケールに超対称性が存在するかは不明である。このスケールを推定するのに暗黒物質の存在が有用であると考えられる。暗黒物質の質量には現在観測されている存在量と無矛盾であるためには上限がある。本研究ではその暗黒物質質量の上限を明らかにし、超対称性スケールの上限を求める。
相分離構造表面における抗血栓性機序の解明

本研究は親水性ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)と疎水性ポリスチレン(PSt)のセグメントが交互に規則的に並ぶラメラ状の相分離構造を有するPHEMA-PSt-PHEMA ABA型ブロック共重合体(HSB)表面の抗血栓性機序の解明、とりわけ血小板内への刺激伝達抑制機序の解明を目的にした。材料表面に最初に粘着するサイトであり、膜糖蛋白質(GPs)を主成分とする血小板膜グリコカリックス(GC)の微細構造及び膜貫通性GPsから膜骨格(MS)を解離した血小板及びMS非解離血小板の粘着挙動の違いについて、主に、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて解析した。対照群として、PSt及びPHEMA-PStランダム共重合体(HSR)表面を用いた。血小板GCの染色にはルテニウムレッドを用いた。血小板MSの解離にはジプカイン塩酸塩を用いた。材料表面と血小板との相互作用は種々の流速を設定してマイクロスフィア・カラム法を用いて行った。1)血小板GCについて:HSB表面に対する血小板はGCを足場にした狭小の空間を保持して粘着しており、その細胞膜全体のGCの微細構造は正常血小板のそれと同様に良好に保持されていた。一方、PSt、HSR表面に対する血小板は強固な粘着を示すように血小板GCの狭小の空間は観察されなかった。そして、その粘着血小板の外表面のGCはところどころ欠損して観察された。2)MS非解離血小板を用いた場合:PSt及びHSR表面に粘着した血小板は活性化を受けており、貯蔵顆粒(SG)が放出された伸展形を呈していた。一方、HSB表面に粘着した血小板は著しく活性化が抑制されており、SGが豊富に保持された球状形を呈していた。このHSB表面での1μm^2当たりSG数は正常血小板のそれとの間に有意差はなかった。3)MS解離血小板を用いた場合:PSt、HSR及びHSB表面に粘着した血小板はいずれの場合も球状形であり、SGは豊富に保持されていた。これらの材料表面での1μm^2当たりSG数は正常血小板のそれとの間に有意差はなかった。以上のことより、流速の違いを問わず、HSBの相分離構造表面は血小板膜の安定性に寄与し、血小板GCからMSへの刺激伝達を阻止することにより血小板の超微形態変化を抑制することが示唆された。「目的」本研究は親水性ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)と疎水性ポリスチレン(PSt)のセグメントが交互に規則的に並ぶラメラ状の相分離構造を有するPHEMA-PSt-PHEMA ABA型ブロック共重合体(HSB)表面の抗血栓性機序の解明、とりわけ血小板内への刺激伝達抑制機序の解明を目的にした。

今年度はHSB表面に接触及び粘着した血小板の膜糖蛋白質(GPs)を主成分とし、異物認識の重要なサイトである膜グリコカリックス(GC)の微細構造の保存性を透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて解析した。「方法」保護基を用いたアニオンリビング重合法により合成し、ラメラ幅160Åの相分離構造を有するHSB[平均分子量(Mn)は10600であり、このうちPHEMAのMnは5100、PStのMnは5500]を調製した。疎水性の均一表面を有するPSt及びPHEMA-PStランダム共重合体(PHEMA/PSt=1/1)(HSR)を対照群として用いた。これらのポリ-マ-ビーズ(φ150μm)を最密充填した塩化ビニル製のカラム(長さ:10cm、内径:3mm)に血小板浮遊液をマイクロスフィア・カラム法を用いて3種類の流速((1)0.05ml/min×30min、(2)0.1ml/min×15min、(3)0.5ml/min×3min)で室温にて流した。そして、これらの材料表面に接触及び室温にて3時間静置粘着した血小板の膜GCをルテニウムレッドにて染色した後その微細構造の保存性をTEMにて解析した。「結果・考察」PSt及びHSR表面の場合とは事なり、いずれの流速においてもHSB表面に接触及び粘着した血小板の膜GCの微細構造は正常血小板の膜GCと同様に良好に保持されていた。特に興味深いことは、HSB表面に粘着した血小板は膜GC長さ分の狭小の空間を保持しそれを足場にしたsoft landingの粘着挙動をとっていたことである。これらのことから、HSB表面は流速の違いを問わず、血小板の膜GCの微細構造を良好に保持することが明らかになった。このことに加えてHSB表面に接触及び粘着した血小板の貯蔵顆粒数は正常血小板のそれと比較して有意差がないことから、HSB表面は血小板の膜流動性に影響をあたえないで血小板の活性化を抑制することが示唆された。来年度はHSB表面の血小板膜骨格(膜貫通性のCPsと細胞骨格とを結び付けており、外部刺激を細胞内へ伝達する重要な役割を担っている)との関わり合いについて研究を行う。「目的」本研究は親水性ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)と疎水性ポリスチレン(PSt)のセグメントが交互に規則的に並ぶラメラ状の相分離構造を有するPHEMA-PSt-PHEMA ABA型ブロック共重合体(HSB)表面の抗血栓性機序の解明、とりわけ血小板内への刺激伝達抑制機序の解明を目的にした。今年度はHSB表面に対する膜貫通性糖蛋白質から膜骨格(MS)を解離した血小板及びMS非解離血小板の粘着挙動の違いについて、電子顕微鏡学的手法を用いて解析した。「方法」保護基を用いたアニオンビング重合法により合成し、ラメラ幅160Åの相分離構造を有するHSB[平均分子量(Mn)は10600であり、このうちPHEMAのMnは5100、PStのMnは5500]を調製した。血小板MS解離にはジブカイン塩酸塩(最終濃度:0.5mM)を用いた。ポリマービーズ(φ150μm)を最密充填した塩化ビニル製のカラム(長さ:10cm、内径:3mm)にMS解離及びMS非解離血小板浮遊液をマイクロスフィア・カラム法を用いて2種類の流速((1)0.1ml/min×15min、(2)0.5ml/min×3min)で室温にて流した。そして、これらの材料表面に室温にて3時間静置粘着した血小板の超微形態変化を走査型電子顕微鏡(SEM)及び透過型電子顕微鏡(TEM)にて解析した。さらに、粘着血小板のTEM像を画像解析装置(Luzex 3U)を用いて定量的に評価した。「結果・考察」
GSK3βを分子標的とする神経膠芽腫治療の基礎基盤の確立

膠芽腫は最も予後の悪い疾患の一つであり、様々な治療を行っても未だに予後不良な腫瘍である。我々はこれまでにglycogen synthase kinase 3β(GSK3β)がグリオーマの悪性基質促進因子であること、GKS3βを抑制することで腫瘍細胞の増殖・浸潤が抑制されることを報告した。また、この知見を元にGSK3β阻害作用を有する既存の4種薬剤を用いた第1/II相臨床試験を行い、その有効性と安全性を確認したが、これらの成果を2017年に論文報告し(Furuta, et al.Oncotarget.2017 4;8(14))、脳腫瘍関連の全国学会でも報告した。さらなる膠芽腫の治療成績向上のため、新規薬剤の登場が必須であるも今だ有効な薬剤がないのが現状である。薬剤開発には様々なプロセスと多大な資金を必要とするため、既存する市販薬剤を適応外の疾患に応用するdrug repositioningが注目されている。我々が行った臨床試験は、GSK3β阻害作用を有する既存薬剤を膠芽腫治療に応用したdrug repositioningの1つであり、基礎研究から得られた知見を直接的に実臨床に反映させ、有効性ならびに安全性を証明したことが特筆すべき点である。実臨床での導入をさらに進めるためには、4種の薬剤では患者への負担も大きく、眠気などの副作用もあり、2剤に減らすため最も有効な薬剤の組み合わせを探っているところである。それによってさらに臨床への応用が容易になり、膠芽腫治療成績の向上に寄与できると考える。実臨床が多忙なため、まとまった時間が確保するのが難しいが、その中でもうまく計画を立て実行する必要がある。また、この知見を元にGSK3β阻害作用を有する既存の4種薬剤を用いた第1/II相臨床試験を行い、その有効性と安全性を確認したが、これらの成果を2017年に論文報告(Furuta, et al.Oncotarget. 2017 4;8(14))している。この結果は脳腫瘍関連の全国学会でも報告を行っている。膠芽腫の治療成績向上のため、新規薬剤の登場が待たれるところであるが、薬剤開発には様々なプロセスと多大な資金を必要とするため、既存する市販薬剤を適応外の疾患に応用するdrug repositioningが注目されている。我々が行った臨床試験は、GSK3β阻害作用を有する既存薬剤を膠芽腫治療に応用したdrug repositioningの1つであり、基礎研究から得られた知見を直接的に実臨床に反映させることが可能であった。また、その有効性・安全性を証明、さらには論文として世界に発信することができた。今後は、実臨床での導入をさらに進めるため、最も有効な薬剤の組み合わせを探り、それによって併用薬剤数を減らし、より患者への負担を軽くすることを目指している。臨床に費やす時間が長くなるため、研究の時間を確保することが難しい。その中で空き時間を見つけて行っているのが現状である。これまでの研究では、既存薬剤を4剤併用した治療であるが、今後の実臨床への応用を推進するに当たり、副作用を可能な限り抑える必要がある。4剤の中で、比較的副作用が少なく、基礎実験で増殖・浸潤抑制効果が強い2剤の組み合わせ、in vivo, in vitroで腫瘍抑制効果を検討する。これまでは既存薬剤4剤を併用した治療であったが、一定の結果が出たため、今後はその中の2剤に絞った組み合わせの検証を引き続き行っていく方針である。予想よりもわずかに物品費が少なくなったため。
原料リサイクルCVD法による太陽電池用結晶シリコン薄膜の低コスト合成

大規模太陽光発電はクリーンエネルギーシステム構築に不可欠である。バルクシリコン型は、資源量・安定性・安全性・発電効率等に優れ、現状8-9割を占める。しかしシリコン供給が半導体産業に依存し、生産量拡大の限界が指摘されている。本研究では、シリコン基板の大規模・低コスト製造法を研究した。現状、シリコン基板はインゴットのスライスで作られ、基板厚さ換算500μm程度のシリコンを消費している。厚さ10μm程度の薄膜に置きかえれば、大規模化・低コスト化が同時に果たせる。そこで、単結晶シリコン基板を鋳型とし、犠牲層を介して発電層シリコンをヘテロエピタキシャル成長、犠牲層を溶解し、単結晶シリコン薄膜を得、基板を繰り返し利用するエピタキシャルリフトオフ(ELO)法を研究した。この際、発電層シリコンのエピタキシャル成長が重要となる。化学蒸着(CVD)法が一般に用いられるが、原料のクロロシランの利用率が低い。クロロシランは金属級シリコンと塩化水素の反応で合成する為、そこにCVD出口ガスをリサイクルすることで、金属級シリコンが入り単結晶シリコン薄膜が出る、無駄のないプロセスができる。現行のクロロシラン製造プロセスの調査に加え、クロロシラン生成とCVDの反応速度過程の実験的検討も行い、リサイクルプロセスの妥当性を検証した。しかし、塩素を用いることによる不純物の混入や、シリコンエピタキシャル成長中の犠牲層の構造劣化の問題が判明した。一方で、一般には低温で低速にエピタキシーさせる物理蒸着(PVD)法が本プロセスに有効なことが示唆された。急速蒸着(RVD)法のコンセプトの下、基板温度800-1000°Cにて10μm/minのエピタキシャル成長を確認した。ELO法と、RVD法を組み合わせ、小面積ながら厚さ5-10μmの単結晶シリコン薄膜のリフトオフに成功、これはシリコン問題の解決に繋がる重要な成果である。平成15年度は、クロロシラン生成反応を実験的に検討し、また現行の高純度シリコン生成プロセスであるSiemens法のプロセス情報収集と解析を行った。クロロシラン生成実験では、流動層反応器にシリコン粒子と流動化媒体のシリカ粒子を充填し、350°C450°C,0.9atmで110vol%の水素希釈塩化水素ガスを流通・反応させ、ガスクロマトグラフィーで出口ガス組成を分析し、光学顕微鏡・走査型電子顕微鏡・窒素吸着型非表面積測定装置で反応後のシリコン粒子を分析した。主生成物は99vol%以上トリクロロシランで、四塩化珪素は1vol%以下であった。塩化水素流通開始直後は反応速度が小さく、時間とともに速度が増大し、極大値を示した後、再び減少に転じ、反応が終了するという変化を示した。これは、シリコン粒子表面の自然酸化膜が反応を阻害している為で、シリコンのクロロシラン化反応が進行するとともに酸化膜が剥れ、反応活性が向上するために起きると分かった。この過程をモデル化し、反応速度の経時変化を再現に成功し、モデル化に使用可能なクロロシラン生成速度を導出した。平成16年度は、プロセス全体の再設計と、それにより新たに生じた研究開発課題である急速蒸着法によるシリコンのエピタキシャル成長を検討した。本研究では、ポーラスシリコン法やエピタキシャルリフトオフ法への適用を想定し、太陽電池発電層用の単結晶シリコンのエピタキシャル成長を低コストで実現することを目指している。単結晶シリコン膜の厚さは10μm以上であり、高速製膜が必須である。

そこで、1μm/min程度の高速製膜が可能なクロロシラン原料によるCVDを製膜手法とし、その際のクロロシラン原料をリサイクルすることで、低コスト化を目指してきた。平衡論・速度論的検討により、主反応を中心とした設計の目処は立った。しかし、塩素系ガスによる装置壁の腐食と不純物混入が大きな問題であった。一方で、シリコンの物理蒸着は、従来、電子デバイス分野でのエピタキシーの低温化の手法として用いられてきた。しかしながら、融点1410°Cでの融液成長では、シリコンは10mm/min以上とCVDの1万倍の速度でエピタキシャル成長する。すなわち、基板温度を高温に持っていけば、高速でエピタキシャル成長させられる可能性が高い。発電層の10μm程度への薄膜化により、半導体産業からの超高純度シリコンの供給量が十分に見合い、かつ、装置腐食・不純物混入のない、簡易なプロセスの構築が可能になる。1000°Cまでの基板加熱が可能な真空蒸着装置を作製し、実験的検討を行った。現段階までに、基板温度800-1000°Cで、10μm/minとCVDよりも大きい製膜速度での、シリコンの良質なエピタキシャル成長を確認した。本研究では、太陽電池用の単結晶シリコン薄膜の低コスト合成法の確立を目指している。当初は、単結晶シリコン基板を「コピー」する方法である、レイヤートランスファープロセスで鍵となるシリコンのエピタキシャル成長を、リサイクルCVD法で行うことを想定してきた。しかし、CVD法では成膜速度に限界があること、また装置腐食や不純物混入の問題対策が困難であることが分かってきた。一方で、単結晶シリコン薄膜合成では、高純度シリコン原料自体のコストは問題にならない。そこで、シリコンを高温で物理蒸着することで高速なエピタキシャル成長を行う、急速蒸着(RVD)法を提案、昨年度までに高速なエピタキシーの実証を行った。本年度は、RVD装置の改良から着手した。シリコンの物理蒸着は半導体分野で盛んだが、低温・低速が研究の流れであり、RVD法で目標とする基板温度1200-1400°Cでの物理蒸着装置は存在しない。昨年度の実証実験は800-1000°Cであり、本年度は1200°C以上の基板温度に対応するよう装置改良を行った。時間が掛かってしまったものの、改良を終え、RVD実験を進めている。一方、エピタキシャル成長したシリコン薄膜は、単結晶シリコン基板との間に挟む「犠牲層」を選択エッチングすることで分離する計画である。高濃度ドープシリコンは、HF/HNO_3/CH_3COOH混合溶液で選択エッチング出来る為、この方法でのリフトオフを進めてきた。しかし、反応時間が長くなると、エッチング選択比が低下してしまう問題が発生、ポーラスシリコン分野の知見も援用し、改良を進めている。今後の研究で、単結晶シリコン薄膜の低コスト合成法を確立したい。
下水汚泥の嫌気性消化過程への脱窒機能の導入

下水汚泥、厨芥、畜糞尿等の嫌気性消化については広く研究されてきているが、この嫌気性消化槽に硝酸塩が混入した場合の研究は少なく、嫌気性消化槽に硝酸塩あるいは亜硝酸塩が混入した場合には一般に脱窒反応ではなくアンモニア生成反応が主要な経路になると考えられている。嫌気性消化の副生成物である脱離液にはアンモニア態窒素が含まれており新しい排水基準を満たすためにはこの処理を含めた新たな汚泥処理システムの構築が必要である。本研究は、高速汚泥処理法として実用化され始めている二相嫌気性消化法の全く新しい利用法である酸生成相およびメタン生成相に対して、嫌気性消化脱離液を硝化して返送する場合を想定し、硝酸塩含有廃水を流入させ各相で脱窒反応を主要な硝酸還元経路とすることについて検討した。酢酸を有機炭素源とした場合,酢酸からメタンへの転換率はCOD/Nの低下に伴って低下したが,硝酸性窒素から窒素への転換率はCOD/N15で最大となり,COD/Nを最適値より増大あるいは低下させると脱窒率は減少した。グルコースを有機炭素源とした場合,硝酸性窒素及び亜硝酸性窒素を添加した系の脱窒率は,それぞれCOD/N15及びCOD/N6で最大となり,どちらの場合も酢酸と硝酸性窒素を用いた場合と同様にCOD/Nを最適値より増大あるいは低下させると脱窒率は減少した。C/Nの低下に伴って脱窒反応に利用されるCODの比率が高くなり、それに伴ってメタン生成に利用される比率が低下した。また、脱窒反応及びメタン生成反応に利用されたCODの総量もC/Nの低下に伴って減少した。これらのことから、硝酸性窒素がメタン生成槽に流入することで、メタン生成細菌と脱窒細菌の間での基質を巡る競争関係及び硝酸性窒素による阻害作用の2種類の負の影響がメタン生成反応に対して生じていたと考えられた。下水汚泥、厨芥、畜糞尿等の嫌気性消化については広く研究されているが、この嫌気性消化槽に硝酸塩が混入した場合の研究は少なく、嫌気性消化槽に硝酸塩あるいは亜硝酸塩が混入した場合には一般に脱窒反応ではなくアンモニア生成反応が主要な経路になると考えられてい。この傾向は、COD/Nの大きい場合には特に顕著であるため単相式嫌気性消化槽ではメタン生成反応と脱窒反応を同時に行わせることは不可能であると考えられてきた。嫌気性消化の副生成物である脱離液にはアンモニア態窒素が含まれており新しい排水基準を満たすためにはこの処理を含めた新たな汚泥処理システムの構築が必要であるが、下水汚泥の嫌気性消化脱離液は活性汚泥槽へ戻されている。下水汚泥の集約処理システムが進むと活性汚泥槽への脱離液の輸送が困難なケースも出てくると考えられる。本研究はこのような現状を解決するため、高速汚泥処理法として実用化され始めている二相嫌気性消化法の全く新しい利用法である酸生成相およびメタン生成相に対して、嫌気性消化脱離液を硝化して返送する場合を想定し、硝酸塩含有廃水を流入させ各相で脱窒反応を主要な硝酸還元経路とすることについて検討した。これらのことから、硝酸性窒素がメタン生成槽に流人することで、メタン生成細菌と脱窒細菌の間での基質を巡る競争関係及び硝酸性窒素による阻害作用の2種類の負の影響がメタン生成反応に対して生じていたと考えられた。

これらのことから、硝酸性窒素がメタン生成槽に流入することで、メタン生成細菌と脱窒細菌の間での基質を巡る競争関係及び硝酸性窒素による阻害作用の2種類の負の影響がメタン生成反応に対して生じていたと考えられた。
下垂体前葉の発生・分化の過程で分泌顆粒の多様性はどのように確立されるか

下垂体前葉では少なくとも5種類の内分泌細胞が区別され、それぞれ微細構造および構成成分に関して特徴のある分泌顆粒を有する。本研究課題では、まずラット下垂体前葉の発生分化過程におけるグラニン蛋白群の発現パターンおよび細胞内局在の変化を解析し、平成14年度には、下垂体前葉のプロラクチン産生細胞(PRL細胞)と甲状腺刺激ホルモン産生細胞(TSH細胞)におけるグラニン蛋白群の発現パターンから、この2種類の細胞系列の確立に寄与しているPit-1などの転写調節因子が、グラニン蛋白群の発現調節を介して分泌顆粒の特徴の確立に関与している可能性を報告した(研究発表欄の雑誌論文(2)に発表。また、この研究過程で得られた関連する知見を論文(1)(3)(4)に発表)。さらに,平成15年度からは、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞の生後発達過程の解析を始め、生後3週までにいったん雌雄ともに同細胞内に出現したクロモグラニンAを含む大型分泌顆粒が、雌では性成熟が完了する生後6週までの間に消失することを発見した。この所見は,同細胞の微細構造が、加齢に伴う性ステロイドホルモン環境の雌雄差の確立過程に強く影響されることを示唆している。そこで,平成16年度には,この生後発達過程のさまざまな時点で下垂体組織からmRNAを抽出してDNAマイクロアレイを解析を行い,その結果得られた雌雄のラット下垂体における遺伝子発現の経時的変化と上述した微細構造上の変化との関連性を比較・検討した。現在この関連性を検証する追加実験を行っており,この両者の間の因果関係を明らかにできたところで論文としてまとめ発表する予定である。下垂体前葉は胎生期に順次分化を遂げた結果生じる多様な内分泌細胞の集合体であり、成体では少なくとも5種類の内分泌細胞が区別され、それぞれ微細構造および構成成分に関して特徴のある分泌顆粒を有する。本研究課題では、ラット下垂体前葉の発生分化過程におけるグラニン蛋白群の発現パターンおよび細胞内局在の変化を免疫組織化学法で検討するとともに、これらの多様性がどのような遺伝子制御のメカニズムによって確立されるのかを解析している。平成14年度には、まず代表的なグラニン蛋白の下垂体前葉内での正確な分布を免疫組織化学法を用いて解析し、下垂体の細胞分化系列とグラニン蛋白の発現パターンの間に何らかの関係性がないかどうか検討した。その結果、下垂体前葉の内分泌細胞のうち、プロラクチン産生細胞(PRL細胞)と甲状腺刺激ホルモン産生細胞(TSH細胞)におけるグラニン蛋白群の発現パターンが非常に似ていることを見い出し、この2種類の細胞系列の確立に寄与しているPit-1などの転写調節因子が、グラニン蛋白群の発現調節を介して分泌顆粒の特徴の確立に関与している可能性を明らかにした(研究発表欄の雑誌論文(2)に発表)。この成果を踏まえて、来年度以降は、出生から性成熟が完了する生後6週までの標本の解析を行い、生後発達のどの時点で分泌顆粒の微細構造やグラニン蛋白群の発現パターンが成体と同じになるかを明らかにする予定である。さらに、このような記述的な研究と並行して、グラニン蛋白群の発現調節と分泌顆粒の微細構造上の多様性確立過程の間の関連性についても、順次、下垂体特異的な転写調節因子の発現実験などを通して、明らかにしてしていきたい。

本研究課題では、ラット下垂体前葉の発生分化過程におけるグラニン蛋白群の発現パターンおよび細胞内局在の変化を解析しており、平成14年度には、下垂体前葉のプロラクチン産生細胞(PRL細胞)と甲状腺刺激ホルモン産生細胞(TSH細胞)におけるグラニン蛋白群の発現パターンから、この2種類の細胞系列の確立に寄与しているPit-1などの転写調節因子が、グラニン蛋白群の発現調節を介して分泌顆粒の特徴の確立に関与している可能性を明らかにした(研究発表欄の雑誌論文(2)に発表。また、この研究過程で得られた関連する知見を論文(1)(3)(4)に発表)。平成15年度には、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞の生後発達の過程を解析し、出生から性成熟が完了する生後6週までの間に分泌顆粒の微細構造やグラニン蛋白群の発現パターンの雌雄差が確立される過程を明らかにした(現在、投稿準備中)。さらに、このような形態学的な解析に加えて、この生後発達過程のさまざまな時点で下垂体組織を採取してmRNAを抽出し、微細構造上の変化と呼応する遺伝子発現の変化があるかどうか、DNAマイクロアレイを用いて現在解析中である。下垂体前葉では少なくとも5種類の内分泌細胞が区別され、それぞれ微細構造および構成成分に関して特徴のある分泌顆粒を有する。本研究課題では、まずラット下垂体前葉の発生分化過程におけるグラニン蛋白群の発現パターンおよび細胞内局在の変化を解析し、平成14年度には、下垂体前葉のプロラクチン産生細胞(PRL細胞)と甲状腺刺激ホルモン産生細胞(TSH細胞)におけるグラニン蛋白群の発現パターンから、この2種類の細胞系列の確立に寄与しているPit-1などの転写調節因子が、グラニン蛋白群の発現調節を介して分泌顆粒の特徴の確立に関与している可能性を報告した(研究発表欄の雑誌論文(2)に発表。さらに,平成15年度からは、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞の生後発達過程の解析を始め、生後3週までにいったん雌雄ともに同細胞内に出現したクロモグラニンAを含む大型分泌顆粒が、雌では性成熟が完了する生後6週までの間に消失することを発見した。この所見は,同細胞の微細構造が、加齢に伴う性ステロイドホルモン環境の雌雄差の確立過程に強く影響されることを示唆している。そこで,平成16年度には,この生後発達過程のさまざまな時点で下垂体組織からmRNAを抽出してDNAマイクロアレイを解析を行い,その結果得られた雌雄のラット下垂体における遺伝子発現の経時的変化と上述した微細構造上の変化との関連性を比較・検討した。現在この関連性を検証する追加実験を行っており,この両者の間の因果関係を明らかにできたところで論文としてまとめ発表する予定である。
計画への顧客ニーズの反映を目指した顧客間交渉による日程計画立案手法に関する研究

高い生産効率と多様な顧客ニーズへの対応の両立を目指すマスカスタマイゼーション実現の鍵は顧客を生産に巻き込むことであるとされている.本研究では,これまで単なる製品の購入者と捉えられていた顧客を「生産に関わる計画の立案者」とし生産に巻き込むことを目指す.企業が自身の基準で日程計画(生産スケジュール)を立案するのではなく,顧客同士が交渉を行うことで日程計画を立案する手法を提案し,それを用いたシリアスゲームを開発する.開発したゲームを人間がプレイした時のプレイログを分析し,計画立案時の顧客の行動が他者及び最終的に立案される計画に与える影響を明らかにすることで顧客を生産に巻き込むことの有効性を検討する.高い生産効率と多様な顧客ニーズへの対応の両立を目指すマスカスタマイゼーション実現の鍵は顧客を生産に巻き込むことであるとされている.本研究では,これまで単なる製品の購入者と捉えられていた顧客を「生産に関わる計画の立案者」とし生産に巻き込むことを目指す.企業が自身の基準で日程計画(生産スケジュール)を立案するのではなく,顧客同士が交渉を行うことで日程計画を立案する手法を提案し,それを用いたシリアスゲームを開発する.開発したゲームを人間がプレイした時のプレイログを分析し,計画立案時の顧客の行動が他者及び最終的に立案される計画に与える影響を明らかにすることで顧客を生産に巻き込むことの有効性を検討する.
尿細管細胞傷害におけるカスパーゼの機能解析と障害抑制の可能性

[目的]薬剤性の腎障害をはじめ、腎尿細管細胞の細胞障害が認められるケースは非常に多岐に認められる。今回尿細管細胞の細胞障害様式の検討、及び細胞障害抑制の可能性について検討を行った。[方法]腎尿細管細胞由来の細胞株であるMDCK細胞を利用し、細胞毒性の報告されている薬剤、およびATP枯渇等の細胞障害の報告がある細胞ストレスを加えた。細胞死実行に関与しているカスパーゼファミリーと呼ばれるプロテアーゼファミリーの発現、活性化を検討した。次に、カスパーゼ活性化を抑制、促進することが報告されているBcl-2ファミリー遺伝子群に関して、その発現、細胞内分布等を検討した。また、尿細管細胞には種々のイオンチャネルやトランスポーターが存在しているが、それらのブロッカーやオープナーの一部は細胞死抑制作用が認められる。それらの薬剤の尿細管細胞障害抑制における作用様式について検討を加えた。[結果]PKC阻害剤であるスタウロスポリンを用いた尿細管細胞障害の系を中心に検討したところ、一部のカスパーゼファミリーが活性化していることを認めた。Bcl-2ファミリーのうち、Mcl-1という蛋白の発現量が減少していることを確認した。クロライドチャネルのブロッカーはスタウロスポリンによる細胞障害を抑制したが、その際減少していたMcl-1の発現量は回復し、カスパーゼの活性化も抑制されることが確認できた。Pl3-KやMEKKなどのキナーゼカスケードが細胞死の実行を調節することがしられているが、クロライドチャネルブロッカーによるこれらの細胞障害抑制効果は、Pl3Kの抑制により減弱することが認められた。申請者は尿細管細胞死におけるカスパーゼの役割及びその抑制の可能性について研究している.尿細管細胞死の刺激としてcAMPの枯渇及び薬剤性障害としてシクロスポリンAを用いている.これらの刺激により尿細管細胞(ヒト近位尿細管細胞及びMDCK細胞)において細胞死の亢進及びカスパーゼ活性の上昇を認めた.これらはカスパーゼ阻害剤にて抑制されることは認めたが,臨床応用は難しいと考え,デキサメサゾン及びHGFを用いてさらに検討した.これらの前処置後cAMP枯渇やシクロスポリンA投与を行うと,細胞死は抑制されカスパーゼ活性の上昇も抑えられることを認めた.現在この働きの詳細を調べる目的で,カスパーゼの活性化を制御していると考えられているbcl-2ファミリーの発現を蛋白質レベルで確認し,またミトコンドリアの障害の指標と考えられているcytochrom cの放出について検討している.またすでに障害を受けた尿細管細胞について,細胞死抑制剤を投与してもおこってしまった障害は抑制できないことより,新しい尿細管細胞を移植することを考え,尿細管細胞の分化,誘導の可能性について検討している.現在骨髄間葉系幹細胞を用い,既知の成長因子や分化誘導因子として知られているactivinAなどを利用して検討している.dexameth asone,activinA,bFGF,TGFの投与により細胞形態変化を認めたが,細胞分化マーカーの検討より,尿細管細胞ではなく神経系の細胞である可能性が高いと現在考えている.今後異なる誘導法を用いて尿細管細胞が分化誘導できないかの検討を更にすすめていく予定である.[目的]薬剤性の腎障害をはじめ、腎尿細管細胞の細胞障害が認められるケースは非常に多岐に認められる。
義歯の二酸化チタンコーティングの口腔内での防汚効果と床用レジン物性への影響の評価

デンチャープラークは、義歯性口内炎や誤嚥性肺炎の一因となる。高齢者や要介護者では、十分な義歯清掃が困難であり、多量のデンチャープラークの付着が認められることが多い。そこで簡便に清掃可能な義歯を開発するために、義歯床表面への二酸化チタンコーティングの応用を試みている。これまでの基礎的研究により、食塊や微生物の付着を減ずることができる可能性と組織為害性がないことを示した。しかし、口腔内における効果の検討は未だなされていない。そこで、床用レジンに対する二酸化チタンコーティングの微生物およびデンチャープラークの付着抑制効果を口腔内にて評価する目的で本研究を行った。被験者は、健常有歯顎者10名(平均年齢27±2歳)とし、デンチャープラーク、微生物数、ガムの付着の三項目について評価を行った。床用アクリルレジンに対するスプレー法による二酸化チタンコーティングは、口腔内においてデンチャープラーク、微生物およびチューイングガムに対する付着抑制効果を発揮することが示された。二酸化チタンコーティングを行うと床用レジン表面のぬれ性が向上し、また、S. sanguinisの付着が抑制されることが報告されている。今回の結果は、デンチャープラークの形成における初期付着菌の床用レジン表面への付着が抑制され、その後の他の微生物付着を抑制し、床用レジンに付着する総微生物数が減少したためと考えられる。以上の結果より、床用アクリルレジンに対するスプレー法による二酸化チタンコーティングは、口腔内においてデンチャープラーク、微生物およびチューイングガムに対する付着抑制効果を発揮することが示された。一般的に床用レジンは熱や乾燥により寸法変化を起こすとされているが、二酸化チタンコーティングを行う上で施される加温処理による義歯床用レジンへの影響は検討がなされていない。そこで我々は今回、二酸化チタンコーティングを行う上で施される加温処理による義歯床用レジンの寸法変化を検討することを目的として、研究を行うこととした。石膏製無歯顎模型[G2-402](NISSIN)上に床用レジンの義歯床用レジン(アクロンNo.3、GC)を用いて、厚さ約1.5mmの基礎床形態の実験床を計6個製作した。模型後縁より約1cmトリマーで削り、左右床辺縁部、左右歯槽頂部、口蓋正中部の5ヶ所に印をつけた。製作した実験床を模型に戻し、実体顕微鏡を用いて5ヶ所の模型と実験床間の距離(浮き上がり量)を測定した(処理前)。その後実験床にプライマー2秒間吹き付け後、70°Cにて10分乾燥、二酸化チタンコート材2秒間吹き付け後、70°Cにて10分乾燥という処理を施した後、実験床を模型に戻し、5ヶ所の浮き上がり量を測定した(処理直後)。その後、蒸留水に浸漬保管し、保管後14日後の時点で各群の5ヶ所の浮き上がり量を測定した(水浸漬14日後)。結果、処理前と処理直後の比較では口蓋中央部の浮き上がり量に有意差を認めたが、処理前と水浸漬14日後の口蓋中央部の浮き上がり量には有意差を認めなかった。したがって、乾燥工程により一時的な変形が見られるものの、その後の吸水により変形が緩和されることが示唆された。追加での採択であったため、内定時期が通常より半年以上遅かった。そのため、研究調書に記載の計画より遅れているが、来年度末までには計画通りに進捗できるものと思われる。高齢者や有病者では、義歯清掃を行っていても十分ではないことが多い。義歯清掃が簡便にかつ効果的に行えることは、単に口腔内の衛生状態を良好に保つだけではなく、誤嚥性肺炎など全身疾患を予防することに直結する。我々が開発・研究を行っている義歯に対する二酸化チタンコーティングは、義歯の清掃を容易にし、細菌付着の抑制、着色の防止などの効果がin vitroで確認されている。そこで、ヒト口腔内での有用性を確認し、また、コーティング処理が義歯の変形や物性変化を引き起こさないことを確認することで本法の実用化につなげることを目的に、本研究課題を計画した。2種類の実験床を用いて検討を行った。実験床の一部に二酸化チタンコーティングを施し、コーティングの有無により各評価項目についての比較・検討を行った。頬側床による検討では、上顎にスプリントを製作し、その左右側小臼歯部および大臼歯部頬側に計4枚の床用アクリルレジンプレートを固定した。この4枚のプレートのうち、ランダムの2枚に対しコーティングを行った。口蓋床による検討では、上顎口蓋床を床用アクリルレジンで製作した。粘膜側および研磨面側をそれぞれ前後・左右の計4分割した。そのうち、ランダムに2部位を選択し、マスキングを行った後にコーティング処理を行った。実験床表面をプラーク検知薬にて染め出し、染色面積を算出した。Kadoら(2005)の方法に準じて実施した。実験床表面をスワブし、総嫌気性菌数・カンジダ菌数の計測を行った。使用開始前と使用後の表面粗さの計測を行った。評価期間は4週間とし、1週間ごとに評価を行った。ディスクについて、評価後にSEM観察を行った。おおむね研究計通りに進捗している。

高齢者や要介護者では、十分な義歯清掃が困難であり、多量のデンチャープラークの付着が認められることが多い。そこで汚れを簡便に洗い流すことができる義歯を開発するために、義歯床表面への二酸化チタンコーティングの応用を試みている。これまでの基礎的研究により、食塊や微生物の付着を減ずることができる可能性と組織為害性がないことを示した。しかし、口腔内における効果の検討は未だなされていない。そこで、床用レジンに対する二酸化チタンコーティングの微生物およびデンチャープラークの付着抑制効果を口腔内にて評価を行った。被験者は、健常有歯顎者10名(平均年齢27±2歳)とした。各試験には床用レジン片を用い、二酸化チタンコーティングの有無で2群(TiO2-coated群、uncoated群)に分けて行った。デンチャープラーク染色試験では、レジン片を被験者の口腔内に3日間留置後、歯垢染色液にて染色し、染色率を算出した。微生物数測定試験では、レジン片を被験者の上顎頬側および口蓋部に3日間および7日間留置した。留置後、レジン表面に付着した総微生物数を計測した。粘着物付着性の主観的評価では、口蓋床を装着した被験者にガムをチューイングさせ、その際の付着感をVisual analog scale(VAS)法で評価した。客観的評価には、チューイングガム付着性試験を行った。レジン片間にガムを介在させ圧縮後に牽引力し、その際の最大牽引力を計測した。染色率、総微生物数およびVAS値については、Wilcoxonの符号付き順位和検定を行った。ガム付着力はStudentのt検定を行った。床用アクリルレジンに対するスプレー法による二酸化チタンコーティングは、口腔内においてデンチャープラーク、微生物およびチューイングガムに対する付着抑制効果を発揮することが示された。研究の進捗は概ね計画通りである。デンチャープラークは、義歯性口内炎や誤嚥性肺炎の一因となる。そこで簡便に清掃可能な義歯を開発するために、義歯床表面への二酸化チタンコーティングの応用を試みている。そこで、床用レジンに対する二酸化チタンコーティングの微生物およびデンチャープラークの付着抑制効果を口腔内にて評価する目的で本研究を行った。被験者は、健常有歯顎者10名(平均年齢27±2歳)とし、デンチャープラーク、微生物数、ガムの付着の三項目について評価を行った。二酸化チタンコーティングを行うと床用レジン表面のぬれ性が向上し、また、S. sanguinisの付着が抑制されることが報告されている。今回の結果は、デンチャープラークの形成における初期付着菌の床用レジン表面への付着が抑制され、その後の他の微生物付着を抑制し、床用レジンに付着する総微生物数が減少したためと考えられる。以上の結果より、床用アクリルレジンに対するスプレー法による二酸化チタンコーティングは、口腔内においてデンチャープラーク、微生物およびチューイングガムに対する付着抑制効果を発揮することが示された。
植物細胞の分裂を制御するMyb転写因子

シロイヌナズナの3R-Myb遺伝子は、A-type(MYB3R1とMYB3R4)、B-type(MYB3R2)、およびC-type(MYB3R3とMYB3R5)に構造上分類される。本年度はC-type 3R-Mybの機能解析を中心に行った。C-type 3R-Mybの破壊株では一群のG2/M期遺伝子が野生型よりも強く発現することから、転写抑制因子である可能性が示された。C-type 3R-Myb遺伝子の破壊株に見られるG2/M期遺伝子のmRNAレベルの上昇は、発生初期の若い葉よりも、発生の進んだ葉において顕著にみられること、またA-type 3R-MybとC-type 3R-Mybを同時に破壊してもA-type 3R-Myb単独の破壊株に見られるサイトキネシスの異常が抑圧されないことから、C-type 3R-Mybは増殖中の細胞では転写抑制因子としての働きをもたず、その主要な働きは増殖を停止した(あるいは停止しつつある)組織におけるG2/M期遺伝子の転写抑制であると考えられた。さらにC-type 3R-Myb破壊株において見られるG2/M期遺伝子の発現の上昇は、A-type 3R-Mybを同時に破壊することにより強調された。一方、標的遺伝子の一つであるKNOLLEのプロモーター中に存在するMSAエレメントに変異を導入すると、根端などの増殖の盛んな組織ではGUSレポーターの発現が減少するが、逆に発生の進んだ葉などでは顕著にGUSの発現を上昇させた。これらの結果から、A-type 3R-Mybは増殖の盛んな組織ではG2/M期遺伝子の転写活性化因子として働くが、逆に発生の進んだ組織ではC-type 3R-Mybと共同して転写抑制因子として働くのではないかと考えられた。今後この仮説をGtype 3R-Mybの破壊株に見られる表現型と標的遺伝子の発現との関連から検証したいと考えている。植物はMyb転写因子をコードする大きな遺伝子ファミリーを持っているが、そのうちMybドメインが3つの繰り返し配列から構成されるMyb(3R-Myb)が小さなサブファミリーを形成しており、それらが細胞周期のG2/M期特異的な転写制御に関わっていることを明らかにしてきた。シロイヌナズナの3R-Mybは構造的、機能的に3種類、すなわち転写活性化因子であるA-type、抑制因子であるB-type、機能未知のC-typeに区別することができる。本研究ではこれらのMybの遺伝子破壊株を用いた機能解析を行った。1.シロイヌナズナには3R-Mybコードする遺伝子が5つ存在しており(MYB3R1MYB3R5)、そのうちA-type 3R-Mybが二個存在している(MYB3R1とMYB3R4)。昨年度までの研究から、この二つの遺伝子の二重変異体は、核分裂、細胞質分裂、分裂面決定の機構に欠損を持つことを明らかにした。今年度は、この二重変異体が示すサイトキネシスの異常がA-type 3R-Mybの標的遺伝子であるKNOLLE遺伝子の発現の低下が原因であることを遺伝学的解析から突き止めた。2.A-typeに加え、B-typeやC-typeの3R-Myb遺伝子の破壊株も作成し、転写産物レベルを網羅的に解析した。その結果、A-type 3R-Mybの変異体ではKNOLLEを含む一群のG2/M期遺伝子の発現低下が見られ、逆にC-type 3R-Mybを欠くと別の一群のG2/M期遺伝子が野生型よりも強く発現することが明らかになった。つまりシロイヌナズナのC-type 3R-Mybは転写抑制因子である可能性が示された。次年度はC-type 3R-Mybの破壊株の解析を中心に行う予定である。

これらの結果から、A-type 3R-Mybは増殖の盛んな組織ではG2/M期遺伝子の転写活性化因子として働くが、逆に発生の進んだ組織ではC-type 3R-Mybと共同して転写抑制因子として働くのではないかと考えられた。今後この仮説をGtype 3R-Mybの破壊株に見られる表現型と標的遺伝子の発現との関連から検証したいと考えている。
時間分解赤外分光法で捉えるバクテリオロドプシン内部の水分子の動態

蛋白質の内部結合水の中には単に空間を充填するだけでなく、機能に重要な役割を演ずる水分子の存在が考えられている。我々は、光駆動プロトンポンプ蛋白質であるバクテリオロドプシンに対する精緻な低温赤外分光により、内部結合水の重要なはたらきを明らかにしてきた。本研究では、我々が低温で捉えた実験結果が、蛋白質が実際に機能する室温でも同様に起こるのかどうかを確かめるため、時間分解赤外分光を用いた解析により明らかにすることを目指している。水分子の振動バンドを室温で捉えることはきわめてチャレンジングな実験テーマであるが、ステップスキャン法を用いた時間分解赤外分光計測を最適化することによって、水分子の信号の実時間計測に挑んでいる。初年度において水分子を捉えるための測定系を最適化することを計画していたが、幸い予想以上の進展があり、Biochemistry誌に論文発表することができた。この実験結果によれば、マイクロ秒の領域で過渡的な温度上昇による見かけのスペクトル変化を正確に補正した結果、興味深いことに、L中間体の水は室温と低温で大きく異なっていた一方、M中間体の水は室温と低温でほぼ同じ水素結合構造をしていることがわかった。平成21年度はこの計測をさらに発展させ、過去、最高精度の計測を行った結果、M1,M2という2つのM中間体の構造は、プロトン放出基である水クラスター以外には構造変化は起こらないことを見出した。時間分解赤外分光法以外の計測の結果も含め、11編の原著論文を世に出すことができた。また、8件の招待講演を含む43件の学会発表を行った。2年のうちの初年度となる本年度は、水分子を捉えるための測定系を最適化することを計画していたが、幸い予想以上の進展があり、Biochemistry誌に論文発表することができた。この実験結果によれば、マイクロ秒の領域で過渡的な温度上昇による見かけのスペクトル変化が起こるのでL中間体における水分子の解析においては、これを正確に補正することが重要であることがわかった。実際に、米国のMaedaらによる同様の報告では温度上昇の補正をしておらず、時間分解法で水を捉えることの難しさを物語っている。温度上昇成分を補正した結果、興味深いことに、L中間体の水は室温と低温で大きく異なっていた一方、M中間体の水は室温と低温でほぼ同じ水素結合構造をしていることがわかった。時間分解法の重要性を示す結果と言うことができる。時間分解赤外分光法以外の計測の結果も含め、2008年には14編の原著論文を世に出すことができた。また、平成20年度には13件の招待講演を含む51件の学会発表を行った。
プラズマ照射による中枢神経組織・細胞制御と機能再生

プラズマは光・電子・イオン・ラジカルの集団で、生体分子や組織と相互作用することが知られ、近年、癌治療や止血等に応用されようとしている。しかしながら、中枢神経組織へのプラズマの作用については報告が少なく、その応用の可能性は未知数である。本研究ではラットの中枢神経組織を対象に大気圧プラズマを照射し、神経伝達や組織の可塑性・再生機能へ及ぼす効果を検討した。特に、大脳新皮質へ大気圧プラズマを直接照射して、その後の組織学的な変化を観察した結果、照射3日から7日後にかけて、大脳皮質の照射部位近傍において、グリア前駆細胞マーカーを発現する細胞やミクログリアマーカーを発現する細胞などの複数の細胞種が層状に配列する特徴的な組織構築が形成され、組織の再生を誘導する再生面を形成することを発見した。また、照射後3日をピークに未分化細胞マーカーを発現する細胞も多数出現し、活発に増殖していることも見出した。そこで、こうした大脳皮質組織を採取し、培養試験系にてスフェア形成実験を実施し、多分化能を有する幹細胞が誘導されているかを検討した。その結果、プラズマ照射組織からは大型のスフェアが多数形成され、分化誘導するとニューロン・オリゴデンドロサイト・アストロサイトなどの中枢神経細胞が得られることもわかった。大気圧プラズマ照射技術は、今後、中枢神経組織をはじめ、生体のさまざまな組織の再生医療に応用展開できる可能性が見出された。28年度が最終年度であるため、記入しない。われわれは、成熟したラットを対象に、麻酔下に頭頂部頭蓋骨の一部をくも膜を残して除去し、大脳新皮質へ大気圧プラズマ(ヘリウムガス使用)を直接照射して、その後の時間経過に伴う組織構造や出現細胞の変化を追跡した。その結果、プラズマ照射後に大脳皮質内で、前駆細胞マーカー(NG2)陽性のグリア細胞・ミクログリア(Iba-1陽性)・アストロサイト(GFAP陽性)で構築される特徴的な多層構造が形成されることを見出した。また、Ki-67の発現を指標に細胞の増殖活性を観察したところ、プラズマ照射領域において多数の増殖細胞が出現することもわかった。こうした増殖細胞の多くは前駆細胞マーカーであるNG2を発現していたが、グリア前駆細胞のような突起は乏しかった。そこで、こうした多層構造の形成と増殖細胞の出現を基準に、プラズマの照射条件の最適化をおこない、増殖活性の高い細胞を多量に取得する条件を確立した。現在、こうした増殖細胞の由来や性質を調べるとともに、今後、プラズマの再生医療へ向けた実用化を睨みながら、プラズマ照射によって誘導・出現した様々な細胞の分化誘導実験等を実施する予定である。当初の予定に沿って研究を進められており、プラズマの照射条件の最適化も実施した。研究に必要な機材も既に調っており、照射条件の最適化によって再現性のよい実験系も確立でき、研究は順調に進んでいる。今後、大気圧プラズマの中枢神経組織の再生医療への実用化を目指すため、プラズマ照射によって誘導される様々な細胞の詳細なキャラクターを解明し、さらに分化誘導実験等を実施する。また、病態モデルにおけるプラズマ照射の効果を確認する。