hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規株式公開企業のイノベーション活動に関する実証分析：上場基準の緩和に着目して

本研究の目的は,2000年前後に行われた新規株式公開(IPO: initial public offerings)市場に対する一連の上場基準緩和が,IPO企業のイノベーション活動に与える影響を明らかにすることである。新規株式公開をすることにより、企業の構造が大きく変化することが知られているものの、その具体的影響については分かっていない。本年度は中小企業の個票データの分析に多くの時間を費やした。データの特性を明確化したところ、いくつかの特徴が確認された。特許などのイノベーション指標には多くの欠損値が含まれる、また0値の企業が多い。それらを考慮するため、推定に用いるサンプルを複数の方法でサブサンプルに分ける、マッチングを行ったうえでの差の差の検定など、複数の分析を行った。さらにイノベーション指標は企業ごとの差が確認されたことに加えて、産業ごとのばらつきが確認された。結果としてはおおむね、上場基準緩和がイノベーション活動に負の影響を与える、あるいは無関係との結果が出た。結果はイノベーションの変数によってばらつきが存在する。ただし少なくとも上場基準緩和が正の影響を与えたとの結果は得られなかった。これらの結果をもとに現在ディスカッションペーパーの作成を行っている。またこれらの内容については国内大学でのセミナーで報告を、また国際学会への投稿を行う。また今後は、IPO企業の産業や地域との関係も追加検証することにより、今回の分析結果が企業固有の要因なのか、それ以外の要因によるものなのかを明確化する。中小企業の個票データを用いたイノベーションとIPO規制に関する一連の分析が終了したことから、当初予定通りに進展していると判断できる。本年度中に国際学会での報告およびジャーナルへの投稿を行う。その過程で、研究協力者からの助言を適宜いただくことにより、質の高いジャーナルに採択されることを目指す。それに鑑み、本年度は、特許データの整備を進めた。データの取得は終わったものの、研究費が申請額から大幅に減額されたため、その後の整備作業に遅れがある。別途財務データを取得を行った。また学術研究者に対して、研究概要の進行方向についてコメントを頂いた。特にイノベーションの指標としてもちいる特許情報については多様なデータプロバイダから様々な形式のデータが提供されているため、選定作業を行うにあたって、経営学や産業組織論などで特許情報を用いたことがある先生方からアドバイスをいただいた。現在、はテキスト形式でデータを取得したものの、企業コードに一貫性が無いなどの問題があるため、それに対して手入力で修正を加えているところである。証券会社関係者やアナリストなどの実務家の方々と意見交換をおこなった。具体的に述べると、大手証券会社で、以前に引き受け担当を行っていた専門家、また独立系のアナリストの方に、今年度中、数回にわたってヒアリングを行った。それらの結果から、分析の方向性、とくに拡張可能性について探ることができた。研究費が当初予定より大幅に減額されたため、予定していたデータセットの購入ができなくなった。そのため、手入力など代替手段に依存せざるを得ず、結果として時間がかかることになった。本年度は特許データの整備を概ね終了させた。さらに財務データについて翌年度にかけてデータプロバイダーと契約を締結し、整備を進めている。来年度から本格的にデータ分析を開始することが可能となる。さらにイノベーションについては経営学や応用ミクロ経済学として多くの研究が行われているため、本年度は関連論文の読み込みやセミナーでの報告機会をいただくことで、知見を深めることが可能となった。別途、中小企業の個票データにアクセスをすることができた。このデータには企業の研究開発に関する指標が多数含まれている。データ利用の承認に時間を要した。さらにデータ形式が特殊であった、具体的には中身がテキストデータであり、年度ごとに別フォーマットのファイルとして提供されていた、データハンドリングに時間を要したものの、接続作業を進めることができた。これにより、来年度以降のデータ分析を行うことが可能となった。ただし特許関連情報については多くの企業が欠損値であることから、それらに関する処理をどの様に対処するかを今後考慮する必要がある。データ処理については、上場企業についてはデータの取得目処がつき、さらに未公開企業の財務データにもアクセスできた。

それらを考慮するため、推定に用いるサンプルを複数の方法でサブサンプルに分ける、マッチングを行ったうえでの差の差の検定など、複数の分析を行った。さらにイノベーション指標は企業ごとの差が確認されたことに加えて、産業ごとのばらつきが確認された。結果としてはおおむね、上場基準緩和がイノベーション活動に負の影響を与える、あるいは無関係との結果が出た。結果はイノベーションの変数によってばらつきが存在する。ただし少なくとも上場基準緩和が正の影響を与えたとの結果は得られなかった。これらの結果をもとに現在ディスカッションペーパーの作成を行っている。またこれらの内容については国内大学でのセミナーで報告を、また国際学会への投稿を行う。また今後は、IPO企業の産業や地域との関係も追加検証することにより、今回の分析結果が企業固有の要因なのか、それ以外の要因によるものなのかを明確化する。中小企業の個票データを用いたイノベーションとIPO規制に関する一連の分析が終了したことから、当初予定通りに進展していると判断できる。前年度に引き続き、データセットの構築を行う。データセットの接続が概ね完成したため、次年度以降はIPOの制度変化とイノベーションの程度に関するデータ分析を行う。本年度中に国際学会での報告およびジャーナルへの投稿を行う。その過程で、研究協力者からの助言を適宜いただくことにより、質の高いジャーナルに採択されることを目指す。
高等植物の根機能に関する遺伝子発現機構の解明と遺伝子工学的改良

1.根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明:イネにおける根の形態および胚発生突然変異体など、根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明に不可欠な突然変異体を多数得ることに成功した。土と根を分離する技術の改善、画像解析による微細根の測定法を開発するとともに、根の分布が幼植物の根の伸長角度により評価し得ることを明らかにした。イネの根の伸長方向は重力屈性と酸素屈性との感受性のバランスによって決まることを明らかにした。一部の短根突然変異および胚発生突然変異が1遺伝子劣性突然変異によるものであることを明らかにし、それらの染色体上の位置を同定した。オオムギカルスにおける根の再分化能には第2および第3染色体上の遺伝子が関与している可能性の強いことを示した。根長が顕著に短い突然変異体の短根性は細胞の短小化によらず、細胞分裂能の低下に起因する細胞数の減少によること、また根の生長阻害はパーオキシダーゼ活性と関連することを認めた。2.養分吸収と代謝:水稲の多くの畑作物のP吸収量は根の量と相関を示すこと、また根重当りのP吸収活性は土壌のP可吸度と根の養分吸収の生理的特性によって決定されることを明らかにした。養分吸収と代謝に関する研究に不可欠な硝酸吸収欠失突然変異体、硝酸還元酵素欠失突然変異体の作出に成功した。ホウレンソウの硝酸還元酵素ゲノムを含むDNA断片をクローニングベクターに組込み、組換え体約50万のDNAライブラリーを構築した。3.ストレス耐性:イネの深播耐性は生態型によって顕著に異なること、またオオムギの耐湿性は根の機能と強く関連することを明らかにした。イネの障害型耐冷性と根の低温処理耐性間に何らかの関係があること、またイネの耐塩性は根の細胞間隙を経由して地上部に運ばれる塩の吸収速度の低下によるものであることを明らかにした。1.根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明:イネを中心に根の形態・生理および分化能に関する多数の突然変異体の獲得に成巧した。イネの根の形態異常突然変異は根の表皮細胞系および内部組織の突然変異と強く関連していることが判明した。オオムギ種子根由来のカルスにおける根の再分化率はカルスサイズと関係があり,再分化能を持たない小さな分裂中心では第5染色体が消失しやすいことが明らかになった。コムギにおける根の屈地性の評価法を開発するとともに,我が国コムギ品種間にみられる屈地性の地理的変異が在来品種から地方番号系統に至る段階で生じたことを明らかにした。イネの1生態型Buluが持つ根の屈地性は重力屈性によらず化学屈性によるものであることが示唆された。2.養分吸収と代謝:イネ硝酸還元酵素欠失突然変異体M819の硝酸還元酵素の欠失は1遺伝子劣性突然変異によるものであることが判明した。培地のK濃度を減らした場合,NaおよびMgの分配・吸収過程は作物によってかなり異なることが判明した。イネの塩素酸高感受性突然変異は硝酸吸収キャリアの変異ではなく,吸収を制御する機能あるいは吸収のエネルギ-に関わる変異によると考えられた。ホウレンソウの硝酸還元酵素cDNAを単離しその一次構造の一部を明らかにした。イネの1大粒突然変異遺伝子は根の活性の低下作用と登熟速度および枯上り速度の増大作用を持つと考えられた。3.ストレス耐性:オオムギの耐湿性および耐旱性は根圏の形態と関係のあることが示唆された。

イネの耐冷性は根の量と無関係であることが明らかになった。耐塩性の機構を解明する第一段階としてNaの根から地上部への輸送経路について解析したところ,イネでは地上部Naの約30%が細胞間隙を通って輸送されることが判明した。1.根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明:イネにおける短根、細根など根の形態に関する突然変異体、およびシュートは分化するが幼根が分化しない胚発生突然異体など、根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明に不可欠の突然変異体を多数作出することに成功した。土と根を分離する技術の改善、画像解析による微細根の測定法の導入により、従来困難であった作物とくに水稲における根の長さの正確な測定法を開発した。コムギの根の屈地性を支配する遺伝子型が地域によって異なること、およびイネの根の長伸方向は重力屈性と酸素屈性との感受性のバランスによって決ることを明らかにした。RFLPマーカーとチメル化感受性の異なる2組の制限酵素を用いて、オオムギの根と芽の再分化能の差を調べ、再分化能が第2染色体のチル化と直接には関係のないことを明らかにした。根長が顕著に短い突然変異体の短根性は細胞の短小化によらず、細胞分裂能の低下に起因する細胞数の減少によることを明らかにした。2.養分吸収と代謝:項目1で開発し得た根長の正確な測定法を用いて、水稲の養分吸収量が主に根長に制御されていることを明らかにした。養分吸収と代謝に関する研究に不可欠な硝酸吸収欠失突然変異体、硝酸環元酵素欠失突然変異体の作出に成功した。ホウレンソウの硝酸環元酵素(NR)cDNAの構造解析から、高等植物のNRがサブユニット内に3つのドメインをもつと推定した。3.ストレス耐性:イネの深播耐性は生態型によって顕著に異なること、またオオムギの深播耐性は品種によって明らかに異なることを明らかにした。イネの障害型耐冷性と根の低温処理耐性間に何らかの関係があることを示した。イネの塩害感受性品種のNacl(100mM)の吸収速度は耐塩性品種の2倍であることを認め、耐塩性は根の細胞間隙を経由して地上部に運ばれる塩の吸収速度の低下と関連していることを明らかにした。1.根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明:イネにおける根の形態および胚発生突然変異体など、根形質の評価基準の確立と遺伝子発現機構の解明に不可欠な突然変異体を多数作出することに成功した。コムギにおける種子根と生育後期の根の分布が密接な関係にあることを認め、根の分布は幼植物の根の伸長角度により評価し得ることを明らかにした。一部の短根突然変異および胚発生突然変異が1遺伝子劣性突然変異によることを明らかにし、それら遺伝子の染色体上の位置を同定した。また、イネの冠根の伸長方向が遺伝的に支配されていることを明らかにした。オオムギカルスにおける根の再分化能には第2および第7染色体上の遺伝子が関与している可能性の強いことを認めた。根長が顕著に短い突然変異体の短根性は細胞の短小化、または細胞分裂能の低下に起因する細胞数の減少によることを明らかにした。根の生長阻害はパーオキシダーゼ活性の高揚と関連することを認めた。2.養分吸収と代謝:多くの畑作物のP吸収量は根量と相関を示すこと、また根重当りのP吸収活性は土壌のP可給度と根の養分吸収の生理的特性によって決定されることを明らかにした。硝酸吸収能の低いイネの3突然変異体はいずれもアニオン/カチオン共輸送に関わる可能性が大きいことを示した。ホウレンソウの硝酸還元酵素(NR)
淡水魚の体積管理による精密養殖が肉質に及ぼす影響

遊泳中の魚を水(海水)から取り出すことなく水中で魚体積を測定できる装置を開発することで,魚養殖における精密な飼養管理と成長管理システムの実現を目指す.本研究では,すでに開発に成功している測定装置のスケールアップと実際の飼養現場への導入試験を行い,当該システムの実用性評価を行うことを最終目標としている.遊泳中の魚を水(海水)から取り出すことなく水中で魚体積を測定できる装置を開発することで,魚養殖における精密な飼養管理と成長管理システムの実現を目指す.本研究では,すでに開発に成功している測定装置のスケールアップと実際の飼養現場への導入試験を行い,当該システムの実用性評価を行うことを最終目標としている.
バキュロウイルス遺伝子導入系の魚類生殖生理研究における利用技術開発

1、濾胞刺激ホルモン(FSH)強制発現ベクターの作製と培養細胞におけるFSH産生分泌の確認およびウナギFSH発現バキュロウイルスの作製:CMVプロモーターを持つ、ウナギFSH pFastBac-FSH強制発現ベクターは、HEK293T細胞に導入したものの培養液に分泌ウナギFSHは検出されなかったため、昨年度、AGプロモーターを持つpCAGGSベクターに、ウナギFSHβとαサブユニットをリンカー配列で連結したcDNAを挿入したコンストラクトを作製した。それをHEK293Free細胞に導入したところ、培養液に多量のウナギFSHが検出された。pCAGGSベクターのAGプロモーターとウナギFSHの組合せで産生された組換えFSHは分泌されることが確認されたことから、AGプロモーターからウナギFSHの配列全体をpFastBacのCMVプロモーター配列と入れ替えたコンストラクトを作製し(AG-FSH-pFastBac)、HEK293T細胞に導入したところ、ウエスタンブロット解析で培養液へのウナギFSHの分泌が確認された。このAG-FSH-pFastBacをバクミド(バキュロウイルスゲノム)を持つ大腸菌DH10Bacに形質転換し、その中からAG-FSHが組み込まれたバクミドを作製することに成功した。2、GFP発現バキュロウイルスの作製:昨年度GFP配列が組み込まれたpFastBac-GFPを大腸菌DH10Bacに形質転換し、GFPが組み込まれたバクミドを得た。GFP-バクミドを精製し、ヨトウガ由来のSf9細胞に導入し、GFP強制発現バキュロウイルスを作製した。pFastBacにウナギFSH配列を組込み培養細胞に導入しても、細胞中にはウナギFSHの産生が認められたものの、培養液には分泌されないという問題の克服に時間がかかった。試行錯誤に時間がかかったが、pFastBacに含まれるCMVプロモターをpCAGGSベクターから切り出したAGプロモーターに交換し、その下流にウナギFSHを組み込むことで組換えウナギFSHが培養液に分泌されるコンストラクトを作製することに成功した。pFastBacの改造は容易ではなく、トライアンドエラーを繰り返し、コンストラクト完成までに1年を要した。コンストラクト作製に想定以上に時間がかかってしまったことが研究計画が遅れている一番大きな理由である。このため、研究期間を1年延長し、次年度にAG-FSHを含むバキュロウイルスを作製し、それを介してウナギEK1細胞へのAG-FSHの導入を行う予定である。1、分泌性FSH発現バキュロウイスルの作製:AG-ウナギFSH-バクミドは作製した。来年度はAG-FSH-バクミドをSf-9細胞に導入し、ウナギFSH-バキュロウイルスを作製する。FSH-バキュロウイルスをトランスポゾン-バキュロウイルスと供にEK1細胞に感染させ、34世代細胞を植え継ぎ、培養液にバキュロウイルスが存在しないことを確認するとともに、大量分泌性ウナギFSH産生EK1細胞を作製する。2、FSH産生EK1細胞をウナギ腹腔内に移植する。FSHの産生は移植後ウナギの血液をサンプルとしたイムノブロット法で検証する。FSHの産生が確認されれば、産生が継続する期間を定期的な血液採取によって検討する。FSH産生が低下すればさらにFSH産生EK1細胞を移植する。移植1ケ月後にサンプリングし、性成熟が誘導されたか否かを組織学的に解析する。2、GFP強制発現バキュロウイルスを利用して、ティラピア培養精巣への導入、ティラピア受精卵へインフェクションを試行する。精巣培養では薄切した精巣を器官培養した場合にどの程度内部までGFPの導入が可能かを検討する。受精卵への遺伝子導入の検討では、まず、受精卵の卵膜除去条件を検討し、卵膜除去が可能になればバキュロウイルスをインフェクションし、胚へのGFP導入が可能かどうかを検証する。胚への導入が成功すれば、現行法の受精卵への顕微注射をバキュロウイルス経由に技術転換することを検討する。1、濾胞刺激ホルモン(FSH)強制発現ベクターの作製:バキュミドへの外来遺伝子転送用pFastBac-FSH強制発現ベクターを作製した。pFastBacに終止コドンを除いたウナギFSHβサブユニット、15残基のリンカーおよび終止コドンを含めたウナギFSHαサブユニットを連結したcDNAを挿入したベクターを構築した。2、FSH強制発現ベクターによる培養細胞におけるFSH産生分泌の確認:ウナギ腎臓由来EK1細胞へのトランスフェクションでは、pFastBac-GFP強制発現ベクターを用いた4種類のトランスフェクション試薬を試した結果、FreestyleMaxのみである程度の導入が見られた。これを利用してリンカーを含むpFastBac-FSHベクターをHEK293T細胞、EK1細胞にトランスフェクションした。培養後、細胞抽出タンパク、培養液をサンプルに抗ウナギFSHβ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った結果、いずれの細胞でも、細胞抽出タンパクからは明瞭な陽性バンドが検出されたものの、培養液からは検出されなかった。3、ベクターの再設計:リンカーが立体構造に影響することで正常にFSHが分泌されない可能性を考え、ウナギFSHβおよびαサブユニット、それぞれ個別に発現するベクターを設計した。終止コドンを含んだβサブユニットと終止コドンを含めたαサブユニットの間にIRES配列を組み込んだcDNAを挿入したpFastBacベクターを構築した。

4、KE1細胞の生体移植の検討:GFP強制発現pFastBacベクターをトランスフェクションしたEK1細胞をウナギ腹腔内に移植した後、1週間後に開腹したがGFPの蛍光は確認されなかった。1、当初、ウナギFSH強制発現ベクターを構築し、EK1細胞でのFSHの分泌を確認した後、バキュロウイルスの作製を行う予定であった。しかし、細胞内でのFSH産生は確認されたものの、培養液への分泌が確認できなかった。リンカーを介した複合タンパクを設計したため、立体構造の違いにより分泌されない可能性を考慮して、それぞれのサブユニットを個別に転写するように設計したベクターを新たに構築した。今後、このベクターをトランスフェクションした細胞においてFSHの分泌を確認していくが、もし、分泌されないようならプロモーターの変更など、新たに設計したベクターを構築する予定である。予定よりも分泌性FSHを強制発現させるベクターの構築に時間がかかっている。2、GFP発現EK1細胞をウナギ腹腔に移植したが、1週間後にGFP発現細胞の残存が確認できなかった。10万程度の細胞を移植したが、移植細胞を100万程度に増やして移植後の残存率を検定する。予想よりも細胞残存率が低いのか、または、一過性発現のためGFP発現が検出限界以下に低下していた可能性も考えられ、当初の予定通りには進行していない。1、濾胞刺激ホルモン(FSH)強制発現ベクターの作製と培養細胞におけるFSH産生分泌の確認:昨年度検討したウナギFSH pFastBac-FSH強制発現ベクターは、ヒト胎児腎細胞由来HEK293T細胞に導入したものの培養液に分泌ウナギFSHは検出されなかった。そこで、高密度培養が可能な浮遊細胞系HEK293Free細胞にベクターを導入したが、やはり培養液にはFSHは分泌されなかった。いずれも、細胞抽出サンプルでは多量のウナギFSHが産生されていることは確認されたため、分泌に問題があると考えられた。そこで、過去にティラピア組換えFSH作製の際に使用したpCAGGSベクターに、ウナギFSHβとαサブユニットをリンカー配列で連結したcDNAを挿入し、それをHEK293Free細胞に導入したところ、培養液に多量のウナギFSHが検出された。pCAGGSベクターのAGプロモーターとウナギFSHの組合せで産生された組換えFSHは分泌されると考えられたことから、AGプロモーターからウナギFSHの配列全体をpFastBacのCMVプロモーター配列と入れ替えることで、分泌性ウナギFSH産生バキュロウイルスが作製できると予想された。2、分泌性ウナギFSH産生バキュロウイルス作製に手間取っているため、GFP発現バキュロウイルスの作製を進めた。GFP配列が組み込まれたpFastBac-GFPを大腸菌DH10Bacに化学的にトランスフォーメーションしたがGFPが組み込まれたバクミドは得られなかった。試行錯誤を繰り返した後、エレクトロポレーション用に新たにDH10Bacを調整し、電気的にトランスフォーメーションを行ったところ、GFPが組み込まれたバクミドをようやく得ることができた。1、昨年度、pFastBacそのものにウナギFSHを挿入した強制発現ベクターを構築したものの、ベクターを導入した細胞培養液にFSHは分泌されなかった。
新奇Ｇサイクルの起動制御と新たな存在様式・作動原理の統合的解析

G蛋白質は、GDP/GTP結合型のコンホメーション転換(Gサイクル)により、細胞の様々なシグナル伝達系で分子スイッチとしての役割を果たしている。本基盤研究(S)では、これまでに解析の進んだ刺激依存活性化型とは異なる、特異な生化学的特性や構造を有する新奇のG蛋白質群を対象に、それらの存在様式・作動原理を細胞レベルから個体レベルに至るまで広範な階層で解析した。これらの新奇G蛋白質群のGサイクルは、リソソームの形成・成熟やエンドサイトーシス・エキソサイトーシスといった細胞内小胞輸送経路で機能していることを新たに見出し,G蛋白質が果たす生理的役割の拡大に貢献した。本基盤研究(S)の初年度においては、既知タイプとは異なるG蛋白質群、すなわち、1)従来の刺激依存性GDP-GTP交換によるコンホメーション転換型とは異なるGTP結合待機型G蛋白質(申請者らが先に同定したArfファミリーに属するArl8、RasファミリーのDi-Rasなど)、2)低分子量Gドメインに加えて別の機能領域も有するユニークな構造のマルチ・ドメイン型G蛋白質(ArfファミリーのArl13b、二量体型Ragなど)について生化学、分子生物学、細胞生物学的な検討を加え、以下の知見を得た。1.線虫Arl8欠失変異体を用いた解析から、Arl8欠失変異体ではアポトーシス細胞のファゴサイトーシスによる分解除去に遅延が生じることを見いだし、Arl8が、後期エンドソームに加えてファゴソームとリソソームの融合に必須の役割を果たすことを明らかにした。2.Di-Rasの生化学的性状を解析する目的で、成体ラット脳からDi-Ras2の部分精製を行い、Di-Ras2がsmgGDSとヘテロ二量体を形成して、細胞質画分にも存在することを明らかにした。また、精製リコンビナントタンパク質を用いた解析から、Di-Ras2のグアニンヌクレオチドに対する結合親和性がsmgGDSとの相互作用により低下することを明らかにし、smgGDSがDi-Ras2の活性制御に関与する可能性を見いだした。3.線虫Di-Ras欠損変異体の解析から、神経筋接合部において、Di-Rasが神経細胞からのアセチルコリン放出に促進的に機能することを見いだした。4.N末端側のArfドメインに加えて、Coiled-coil及びPro-rich配列を有するユニークなG蛋白質Arl13bは、繊毛に限局して繊毛内物質輸送系に介在するが、Arl13の繊毛局在性が、ゴルジ体でのN末端側パルミトイル化修飾とC末端側に存在するRVEP配列の両者に依存することを見いだした。本研究では、これまでに解析の進んだ既知タイプとは異なるG蛋白質、すなわち、GTP結合待機型G蛋白質(RasファミリーのDi-RAS、ArfファミリーのARL8など)とユニークな構造のマルチ・ドメイン型G蛋白質(ヘテロ二量体G蛋白質のRAGなど)を対象に、新奇Gサイクルの時空的起動制御と新たな存在様式・作動原理の解明に向けて、精製蛋白質標品を用いた生化学的解析、遺伝子導入やノックダウンによる細胞レベルでの分子生物学・細胞生物学的解析、さらにモデル生物の遺伝子破壊による個体レベルでの分子遺伝学的解析から統合的に研究を進め、以下の知見を得た。1.リソソームと後期エンドソーム、ファゴソームとの融合過程に介在するARL8の機能を解明するために、ARL8と相互作用する因子群を探索し、HOPS複合体の構成因子であるVPS41を同定した。さらに、線虫VPS41/VPS39の欠失変異体では、arl-8変異体と同様に、アポトーシス細胞を含むファゴソームが多数蓄積した。したがって、ARL8とHOPS複合体が協調的にリソソームとファゴソームや後期エンドソームの融合を制御すると考えられた。2.線虫のRagをコードするraga-1及びragc-1両遺伝子の欠失変異体を用いた解析から、Ragは食餌中の必須アミノ酸に応答した神経前駆細胞の活性化に介在することを見出した。同様の表現型を示す線虫変異体をスクリーニングした結果、哺乳動物のマイクロRNA miR-92オルソログであるmiR-235が、神経前駆細胞の活性化を負に制御することを見出した。さらに、miR-235の発現は飢餓時に亢進し、摂食によりインスリン経路依存的に抑制されることを解明した。3.cTAGE5/TANGO1複合体は、VII型コラーゲンを小胞体から分泌経路へと送り込む積み荷受容体として機能することを先に同定したが、この複合体がArfファミリーG蛋白質Sar1の活性化因子Sec12と相互作用し、VII型コラーゲンの分泌に関与することを見出した。本研究では、これまでに解析の進んだ既知タイプとは異なるGTP結合待機型とユニークな構造のマルチ・ドメイン型を対象に、新奇Gサイクルの時空的起動制御と新たな存在様式・作動原理の解明に向けて、精製蛋白質標品を用いた生化学的解析、細胞レベルでの分子生物学・細胞生物学的解析、さらにモデル生物の遺伝子破壊による表現型解析などから統合的に研究を進めて以下の知見を得た。1.リソソームと後期エンドソーム、ファゴソームとの融合過程に介在するARL8の機能解明に向けて、相互作用する因子群を探索し、ARL8のGTPアーゼ活性を促進するGAPの存在を組織抽出液中に同定した。ARL8a、ARL8bのノックアウトマウスを作出し、ARL8bノックアウト

マウスの樹状細胞において、Toll様受容体刺激を介した炎症性サイトカイン・I型インターフェロンの産生が顕著に減弱すること、また、ARL8bノックアウトマウスの胚発生期において、脳の形態形成が異常となることを認めた。2.線虫の神経前駆細胞は、大腸菌を与えると活性化して分裂や分化が進むが、大腸菌の代わりにアミノ酸と脂肪酸合成を促進するエタノールを同時に与えると、神経前駆細胞が静止期から離脱して活性化すること、また、エタノール存在下で、アミノ酸を与える代わりに、ヒトのRagA/Bオルソログである線虫RAGA-1の恒常活性化体を神経前駆細胞に隣接する表皮で過剰発現すると、mTORC1活性依存的に神経前駆細胞を活性化できることを見出した。VII型コラーゲンを小胞体から分泌経路へと送り込む積み荷受容体として機能するcTAGE5/TANGO1複合体を先に同定したが、この複合体がcTAGE5を介してArfファミリーG蛋白質Sar1のGEFであるSec12と結合し、ER exit siteへのSec12、Sar1の効果的な局在化に寄与することを見出した。本研究では、これまでに解析の進んだG蛋白質とは異なり、細胞質でsmgGDSとの複合体として存在するRasファミリーのDi-RAS、細胞内膜系で機能するArfファミリーのARL8とSAR1、さらにヘテロ二量体G蛋白質のRAGを対象として、G蛋白質の新しい存在様式とユニークなGサイクルの作動・制御機構の分子基盤を解明する。精製蛋白質を用いた生化学的解析から、遺伝子導入やノックダウンによる細胞レベルでの分子生物学・細胞生物学的解析、さらにモデル生物(線虫、マウス)の遺伝子破壊による個体レベルの解析まで、諸種の階層で統合的に研究を進めて以下の知見を得た。1.Arl8bノックアウトマウスは、初期胚発生期において、胎仔体長の縮小や卵黄嚢内胚葉細胞内のLAMP1陽性小胞が異常蓄積する表現型を認めた。これらの原因として、母胎由来の蛋白質が内胚葉細胞内リソソームで分解されずに、胎仔側への栄養供給が低下する可能性が示された。さらにArl8b欠損では、脳の発生が遅延し、これは背側正中線の異常に由来することが見出された。2.線虫変異体を用いた解析から、リソソームに局在するG蛋白質raga-1とragc-1がアミノ酸に応答した生殖幹細胞や神経芽細胞の静止期からの活性化に介在することが示された。また、各種変異体やRNAiを用いた遺伝学的相互作用の解析により、Ragはインスリン経路やAMPKの下流で機能し、その一方でmTORC1の上流で機能することが示唆された。さらに酵母2ハイブリッド法を用いて、線虫Rag/Ragulatorの相互作用因子群の探索に着手し、いくつかの候補因子を単離した。3.VII型コラーゲンを小胞体から分泌経路へと送り込む積み荷受容体として、SAR1-GEFのSec12とTANGO1-L/cTAGE5からなる約1 MDa複合体に加えて、Sec12とTANGO1-S/cTAGE5からなる約750 KDa複合体を見出し、それらが独立して機能する可能性を見出した。研究実績の概要に示したように、本研究で解析対象としたG蛋白質群において、それらの活性調節因子群と新しい機能をいくつか見出せたことは大きな進展である。共同研究から、Di-RASと複合体を形成するsmgGDS単体でのX線結晶構造が決定され、複合体構造での解析も進めば、存在様式とヌクレオチド結合特性がユニークなDi-RASのGサイクル制御に関わる分子基盤の解明に繋がる。
PCR法を用いたDNA塩基配列比較によるキンウワバ類の類猿関係解析法の開発

遺伝子本体であるDNAのうち、ある特定の遺伝子をコードしている部分をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅させ、この部位の塩基配列を読みとり種間での比較からキンウワバの類猿関係を明らかにすることを目的とした。まず研究上の基礎的な条件設定を決定することとし、成虫の脚1本を用いてProteinase KによりDNAの抽出を行った。抽出したDNAに遺伝子をコードしている部分のプライマーを反応させて増幅を行うこととなるが、当初予定したDNAのデータベースを利用する方法は利用するのにあたり設備等が必要であったため、研究討議なども参考にしてこれまでに公表されている論文から増幅させる部位を決定した。その結果ミトコンドリアDNA上にコードされている遺伝子の方が、DNAの抽出条件にあまり左右されず安定して遺伝し部位の増幅が行えるようであったため、チトクロームオキシダーゼII(COII)を選定し、蛾で報告されているこの遺伝子の両端部分のプライマーを合成し、増幅を試みた。その結果、一般に行われているPCRの温度および試薬条件でCOIIと思われる断片長(約600塩基対)の増幅がアガロース電気泳動により確認されたが、安定して増幅されなかったため反応時の試薬などの条件の検討を行った。これによりほぼ安定した増幅が行えるようになったが、使用したプライマーに非特異的な部位の増幅に由来する断片が現れ、この存在により塩基配列の比較を行うことはできなかった。今後は目的とするCOII-DNA断片のみを増幅させる条件と検討と、増幅後速やかに塩基配列を行うことができる質の良い断片を得る条件の検討を行う予定である。
低圧運転・共存物質存在下でのナノ濾過膜の分離特性・物質移動機構の解明

本研究は、特に低圧運転領域でのナノ濾過膜の共存物質存在下での分離特性、物質移動機構を解明することを目的としている。本年度は、玉川浄水場に設置したパイロットプラント実験を行い、河川水のナノろ過処理における非解離物質・解離物質共存系における分離特性を詳細に調べた。塩高阻止率のNF膜を用いることにより、トリハロメタン前駆物質やその他の溶存有機物質の高い除去率と、溶存イオンの高い阻止率を半年以上の長期間連続運転において維持された。膜分離機構としては、サイズ排除効果、荷電効果、親和性を導入することにより説明可能であることが示された。また、修正Extended-Nernst Plank Equation式への正電荷膜への適用について検討した結果、各種溶存イオンに対して概ね良好な予測結果を与えることが検証された。ただし、硫酸イオンに付いては、理論値と実験値の乖離が認められ、混合イオンにおける理論式の更なる改良が必要で、今後の検討課題である。また、ヒ素除去への低圧ナノ濾過の適用として、手押しポンプ及び自転車を利用した人力ナノ濾過装置を組み立て、実際にバングラデッシュ・ダッカ近郊の農村地域において、テスト運転を行った。3気圧程度の圧力でも、実際の地下水に対してろ週の透水性能の点では十分実用性があることが証明できた。ただし、高濃度のヒ素汚染地区においては、3価のヒ素化合物の存在割合が高く、その場合、3価のヒ素の除去性能は落ちるため、水質的には直接ろ過ではなく、何らかの簡易な酸化のための前処理が必要であることが示された。この点は、既に本研究の成果として物質移動機構の詳細が解明されており、対処法が明らかになっている。逆浸透膜・ナノろ過膜の分離機構の解明のために、本年度は、共存イオン存在系、非解離有機物質系に分けて実験を行った。イオン系での実験では、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、硫酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオンなどが任意の比で混在した系での阻止率のフラックス依存性を調べた。解析には、Donann平衡およびExtended Nernst Plank式を用いた。これまでの化学工学的な取り扱いでは、塩化物イオン・硝酸イオンで代表される1価のアニオンの阻止率の差が説明できないことを示し、膜との親和性を表すパラメーターを導入した。また、その際の膜の有効荷電密度、細孔径などを求めることにより、モデルの意味を考察した。非解離系(有機性溶質)の実験では、糖類、芳香族、可塑剤(環境ホルモンとして疑われるものを含む)などの阻止率がどのような因子で決定されるのかを調べた。初期吸着の影響はオクタノール/水分配係数から予測可能であること、芳香族は、同じ程度の分子量を持つ糖類よりも膜を通過しやすいことなどがわかった。分子力場計算で分子幅を計算して結果を整理したが、やはり芳香族は同じ程度の分子量の糖類よりも膜を通過しやすいことが明らかになった。これらの結果から、膜の分離機構には、膜と溶質との相互作用を何らかの形で考慮するべきであることが明らかとなった。逆浸透膜・ナノろ過膜の分離機構の解明のために、本年度は、特にヒ酸、亜ヒ酸、カコジル酸のヒ素化合物の阻止特性を調べるとともに、玉川浄水場に仮設のナノろパイロットプラントを用いて、各種イオンの各種膜による阻止特性を調べた。ヒ素化合物の阻止特性の実験では、ヒ素の形態別分析手法をIC/ICP/MS法により確立し、実試料への適用可能性を調べた。その結果、ヒ酸、亜ヒ酸、カコジル酸の分離定量に成功し、本方法をナノろ過膜の評価に適用した。ヒ酸、亜ヒ酸については、イオンで存在するpH範囲で阻止率が高くなること、カコジル酸については、すべてのpH範囲で阻止率が高いことがわかった。

これらの現象を塩化物イオン、硫酸イオンなど他の共存イオンの挙動とともに説明するために、ドナン平衡を加味したネルンストプランク式をイオンの数だけ連立させた式に各種平衡条件を組み入れたモデルを作成した。また、膜と溶質との親和性、および分子サイズによる立体障害因子をモデルに組み込んだ。その結果、膜の種類によって、適切に親和性を加味すれば、モデルによって挙動が説明されることが明らかになった。また、廃棄物処分場浸出水に各種ヒ素を添加した場合、地下水にヒ素を添加した場合、など溶液環境を変化させた実験も行い、モデルを検証に成功した。一方、玉川浄水場に仮設のナノろ過パイロットプラントを用いた研究では、実際の河川水を精密ろ過によって前処理した原水を用いて、ナノろ過膜を2か月間の連続運転によって評価した。種々の脱塩率の膜を用い、また、正荷電の膜、負荷電の膜の両方を用いて実験を行った。また、得られた阻止率データーに対して前述のモデル(ただし、ヒ素化合物の場合と異なり各種の平衡は考慮不要である)を適用し解析した。塩化物イオンと硝酸イオンの阻止率の差が正荷電の膜では見られないことから親和性のファクターの考え方についてさらに考察をした。本研究は、特に低圧運転領域でのナノ濾過漠の共存物質存在下での分離特性、物質移動機構を解明することを目的としている。本年度は、玉川浄水場に設置したパイロット・プラント実験を行い、河川水のナノろ過処理における非解離物質・解離物質共存系における分離特性を詳細に調べた。塩高阻止率のNF膜を用いることにより、トリハロメタン前駆物質やその他の溶存有機物質の高い除去率と、溶存イオンの高い阻止率を半年以上の長期間連続運転において維持された。膜分離機構としては、サイズ排除効果、荷電効果、親和性を導入することにより説明可能であることが示された。また、修正Extended-Nernst Plank Equation式への正電荷膜への通用について検討した結果、各種溶存イオンに対して概ね良好な予測結果を与えることが検証された。ただし、硫酸イオンに付いては、理論値と実験値の乖離が認められ、混合イオンにおける理論式の更なる改良が必要で、今後の検討課題である。また、ヒ素除去への低圧ナノ濾過の適用として、手押しポンプ及び自転車を利用した人力ナノ濾過装置を組み立て、実際にバングラデッシュ・ダッカ近郊の農村地域において、テスト運転を行った。3気圧程度の圧力でも、実際の地下水に対してろ過の透水性能の点では十分実用性があることが証明できた。ただし、高濃度のヒ素汚染地区においては、3価のヒ素化合物の存在割合が高く、その場合、3価のヒ素の除去性能は落ちるため、水質的には直接ろ過ではなく、何らかの簡易な酸化のための前処理が必要であることが示された。この点は、既に本研究の成果として物質移動機構の詳細が解明されており、対処法が明らかになっている。
酸性土壌適応植物の栄養生理特性の解析

酸性土壌適応植物の栄養特性について明らかにするために、葉のそれぞれの要素含有率について、北大植物園と酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌に生育する植物を綱・亜綱間で比較した。多量要素では、N、P、K含有率は土壌間差が小さく、Ca含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で低く、Mg含有率は北大植物園に比べて酸性土壌で低く、蛇紋岩土壌で高い傾向にあった。微量要素では、Fc含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で低く、Mn含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で高い傾向にあった。Al含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で一定の傾向を示さず、酸性土壌で可溶性のAlが多く、塩基性の土壌で可溶性のAlが少ないが、このような土壌の性質は葉のAl含有率に直接反映していなかった。以上のように、土壌養分よりは植物の特性に基づいて集積する要素(N、P、K、Al)や土壌養分を強く反映する要素(Ca、Mg、Fc、Mn)が認められた。タイ半島部に酸性硫酸塩土壌、泥炭土壌、砂質ポドゾル性土、および塩類土壌が広く分布している。Melastoma malabathricumとMelaleuca cajuputiは低pH土壌(酸性硫酸塩および泥炭)に生育する優勢種である。M.malabathricumは多量のアルミニウム(Al)を葉、特に若い生長過程にある葉に集積することからAl集積植物と分類した。一方、M.cajuputiは地上部にAlを集積しないことからAl排除植物と分類した。両種とも低pH土壌によく適応した植物だが、Alに対しては異なる戦略をとっている。これらも植物を水耕栽培したところ、Al添加により生育はむしろ良くなり、特にリンの吸収が改善された。酸性土壌適応植物の栄養特性について明らかにするために、北海道大学植物園(沖積土)、酸性硫酸塩および火山性酸性土壌(酸性土壌)、蛇紋岩土壌(超塩基性土壌)に生育する166種以上の草本と木本植物の葉を採取し各種養分の分析を行ない、比較検討した。北大植物園(沖積土)に生育する木本植物では、葉のN、P、Ca、Mg含有率は進化とともに高まるが、K含有率はほとんど変化せず、草木植物では、進化との関連性は認められなかった。しかしながら、P、K含有率はN含有率と関係が深く、特にP含有率は進化に伴い相対的関係が変化した。葉のそれぞれの要素含有率について、北大植物園と酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌に生育する植物を綱・亜綱間で比較した。微量要素では、Fe含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で低く、Mn含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で高い傾向にあった。以上のように、土壌養分よりは植物の特性に基づいて集積する要素(N、P、K、Al)や土壌養分を強く反映する要素(Ca、Mg、Fe、Mn)が認められた。

酸性土壌適応植物の栄養特性について明らかにするために、葉のそれぞれの要素含有率について、北大植物園と酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌に生育する植物を綱・亜綱間で比較した。多量要素では、N、P、K含有率は土壌間差が小さく、Ca含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で低く、Mg含有率は北大植物園に比べて酸性土壌で低く、蛇紋岩土壌で高い傾向にあった。微量要素では、Fe含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で低く、Mn含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で高い傾向にあった。Al含有率は北大植物園に比べて酸性土壌もしくは蛇紋岩土壌で一定の傾向を示さず、酸性土壌で可溶性のAlが多く、塩基性の土壌で可溶性のAlが少ないが、このような土壌の性質は葉のAl含有率に直接反映していなかった。以上のように、土壌養分よりは植物の特性に基づいて集積する要素(N、P、K、Al)や土壌養分を強く反映する要素(Ca、Mg、Fe、Mu)が認められた。タイ半島部に酸性硫酸塩土壌、泥炭土壌、砂質ポドゾル性土、および塩類土壌が広く分布している。Melastoma malabathricumとMelaleuca cajuputiは低pH土壌(酸性硫酸塩および泥炭)に生育する優勢種である。M. malabathricumは多量のアルミニウム(Al)を葉、特に若い生長過程にある葉に集積することからAl集積植物と分類した。一方、M. cajuputiは地上部にAlを集積しないことからAl排除植物と分類した。両種とも低pH土壌によく適応した植物だが、Alに対しては異なる戦略をとっている。これらも植物を水耕栽培したところ、Al添加により生育はむしろ良くなり、特にリンの吸収が改善された。
抗原提示細胞による食品アレルゲン蛋白質の提示機構の解明とアレルギー抑制法の開発

マウスを用いて,食品抗原タンパク質の提示機構を解析した.B10.Aマウスを鶏卵白リゾチームで免疫した場合,87-96特異的T細胞の応答は誘起されないが,ペプチド85-96で免疫すると誘起され,T細胞抗原決定基87-96/Ekはクリプティック(潜在的)であった.またC3H/Heマウスに牛乳αs1-カゼインで経口寛容を誘導した場合,ドミナント(優勢)な抗原決定基に特異的なT細胞には寛容が誘導されるにもかかわらず,クリプティックまたはサブドミナント(劣勢)な抗原決定基に特異的なT細胞には寛容が誘導されないことが判明した.87-96/Ekに対する応答を詳細に調べた結果,1)抗原提示細胞(APC)によって提示する抗原決定基は異なること,2)in vivoにおいて87-96/Ekに応答するT細胞が活性化されない理由は,マウス体内でT細胞を初期に活性化するAPCは,in vitroの実験で観察された応答に関与するAPCとは異なり,87-96/Ekを提示できないためであることが示唆された.また,インターフェロンγは,抗原決定基の提示されやすさに影響を与え,その影響は抗原決定基ごとに,またAPCごとに異なっていた.以上のことより,抗原提示細胞によって特定の抗原決定基の提示されやすさは異なり,さらに炎症で分泌されるサイトカインも提示されやすさに影響を与えることが判明した.したがって,自己免疫疾患や食品アレルギーにつながる過剰な免疫応答には,何らかの要因によって抗原決定基の提示のされやすさが変化し,寛容になっていないT細胞の過剰な応答を誘導することが原因であるというモデルを立てることができた.このことは,アレルギー抑制法を開発するうえでも有用である.マウスを用いて,食品抗原タンパク質の提示機構を解析した.B10.Aマウスを鶏卵白リゾチームで免疫した場合,87-96特異的T細胞の応答は誘起されないが,ペプチド85-96で免疫すると誘起され,T細胞抗原決定基87-96/Ekはクリプティック(潜在的)であった.またC3H/Heマウスに牛乳αs1-カゼインで経口寛容を誘導した場合,ドミナント(優勢)な抗原決定基に特異的なT細胞には寛容が誘導されるにもかかわらず,クリプティックまたはサブドミナント(劣勢)な抗原決定基に特異的なT細胞には寛容が誘導されないことが判明した.87-96/Ekに対する応答を詳細に調べた結果,1)抗原提示細胞(APC)によって提示する抗原決定基は異なること,2)in vivoにおいて87-96/Ekに応答するT細胞が活性化されない理由は,マウス体内でT細胞を初期に活性化するAPCは,in vitroの実験で観察された応答に関与するAPCとは異なり,87-96/Ekを提示できないためであることが示唆された.また,インターフェロンγは,抗原決定基の提示されやすさに影響を与え,その影響は抗原決定基ごとに,またAPCごとに異なっていた.以上のことより,抗原提示細胞によって特定の抗原決定基の提示されやすさは異なり,さらに炎症で分泌されるサイトカインも提示されやすさに影響を与えることが判明した.したがって,自己免疫疾患や食品アレルギーにつながる過剰な免疫応答には,何らかの要因によって抗原決定基の提示のされやすさが変化し,寛容になっていないT細胞の過剰な応答を誘導することが原因であるというモデルを立てることができた.このことは,アレルギー抑制法を開発するうえでも有用である.抗原提示細胞においてタンパク質抗原がクラスII分子によって提示される場合、通常、抗原はプロセシングを受けてから提示される。本研究では、T細胞抗原決定基のペプチド領域のプロテオリシスの受けやすさを調べた。ペプチドとして、鶏卵白リゾチーム由来の4661残基と8596残基に相当するペプチド(p46-61とp85-96)を、また酵素としては、抗原のプロセシングへの関与も推定されているカテプシンを用意した。その結果、カテプシンBはp46-61の57-58と59-60の間の2箇所を切断することが判明した。p46-61はH-2^aまたはH-2^Kのマウスにおいてdominantな抗原決定基52-61/A^Kを含むことが知られている。カテプシンBが切断できた部位はT細胞抗原決定基として重要な部位であるので、この領域はプロテアーゼによって切断されるより早くI-A^K分子に結合し、プロテオリシスを受けないと考えられる。一方、p85-96はcrypticな抗原決定基87-96/E^Kを含み、これはリゾチーム分子からは提示されない。p85-96は、カテプシンBとDのどちらによっても切断されなかった。この部分はMHC分子に結合するより前にプロテオリシスを受けることが予想されるが、それに関与する酵素はカテプシン以外であり、以前からの知見と合わせて塩基性カルボキシペプチターゼの関与があると推定した。以上のことをさらに確かめるために、各種プロテイナーゼ遺伝子のアンチセンスDNAを合成した。また、抗原提示細胞によって実際に提示されているペプチドを同定する実験を開始した。抗原ペプチドとMHC(主要組織適合遺伝子複合体)クラスII分子との結合性を解析する系を開発した.クラスII分子として,C57BL/6(B6)

マウスの脾臓からA^b分子を精製した.ペプチドとして,ウシβ-ラクトグロブリンの119-133残基を合成した.このペプチドは,すでにB6マウスにおいて優勢なT細胞抗原決定基を含むことが示されている.このペプチドをビオチン化し,試料ペプチドによる標識ペプチドのA^b分子への結合の阻害を酵素標識免疫測定法で測定した.その結果,この方法によって感度よく結合能を測定できることが判明した.そこでさらにアナログペプチドを用意して,アレルゲンのアグレトープを解析する予定である。またマウスを用いて,抗原提示機構を解析した.B10.A(H-2^a)マウスを鶏卵白リゾチーム(HEL)で免疫した場合87-96特異的T細胞の応答は誘起されないが,ペプチド(p)85-96で免疫すると誘起され,T細胞抗原決定基87-96/E^kはクリプティック(潜在的)であった.ところがin vitroにおいてp85-96特異的T細胞はp85-96に応答するのみならず,HELにも応答した,HELからの87-96の提示されやすさは抗原提示細胞の種類によって異なっていた.したがって,体内でT細胞を初期に活性化する抗原提示細胞は87-96を提示できないことが示唆されたクリプティックな抗原決定基の提示は抗原提示細胞の種類によって異なっていた.これは,自己免疫応答や食品アレルギーの原因を解明する上で重要である.マウスを用いて,食品抗原タンパク質の提示機構を解析した.B10.A(H-2^a)マウスを鶏卵白リゾチーム(HEL)で免疫した場合,87-96特異的T細胞の応答は誘起されないが,ペプチド(p)85-96で免疫すると誘起され,T細胞抗原決定基87-96/E^kはクリプティック(潜在的)であった.この潜在的な抗原決定基に対する応答の解析は,自己免疫疾患の原因を調べるうえで重要であることが知られており,また食品アレルギーの原因究明の上でも重要であると予想できる.そこでこの抗原決定基の抗原提示について,より詳細に解析した.in vitroにおいては,p85-96特異的T細胞はp85-96に応答するのみならず,HELにも応答した.HELを異なる抗原提示細胞(APC)に与えた場合,マクロファージは87-96/E^kを比較的提示しやすいのに対し,B細胞は87-96/E^kを提示しにくく優勢な抗原決定基(46-61/A^kや20-35/A^kなど)を提示しやすいことが判明した.したがって,1)APCによって提示する抗原決定基は異なること,2)in vivoにおいて87-96/E^kに応答するT細胞が活性化されない理由は,マウス体内でT細胞を初期に活性化するAPCは,in vitroの実験で観察された応答に関与するAPCとは異なり,87-96/E^kを提示できないためであることが示唆された.また,インターフェロンγは,B細胞によるHELからの87-96/E^kの抗原提示を増強し,マクロファージによる提示には影響しなかった.しかしこの影響の与え方は,抗原決定基によって異なっていた.したがって,炎症反応などで分泌されるサイトカインは,抗原決定基の提示されやすさに影響を与え,その影響は抗原決定基ごとに,またAPCごとに異なっていた.抗原決定基の提示のされやすさは免疫寛容に深く関係するので,以上のことは,自己免疫応答や食品アレルギーの原因を解明する上で重要である.