hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リアノジン受容体の構造と生理機能

興奮性細胞での脱分極の電気シグナルからCa2+シグナルへの変換反応では、表層膜上の電位依存性Ca2+チャネルと細胞内ストア膜上の放出Ca2+チャネル(リアノジン受容体)の機能共役による活性化が普遍的に観察され、両分子の機能的共役が極めて重要である。研究代表者のグループでは興奮性細胞の細胞内Ca2+ストアの構造と機能に関する研究を手掛けており、リアノジン受容体とジャンクトフィリン(細胞表層膜とCa2+ストアの近接構造を形成するタンパク質)の分子生物学的な実験を遂行している。本研究では興奮性細胞の細胞内ストアの構造とCa2+放出機構の制御を包括的に理解するために、(i)リアノジン受容体のチャネル活性の生理的機能、(ii)ジャンクトフィリンの生理機能、(iii)ストア膜の構成タンパク質の新規同定とその機能、に着目した研究を遂行した。主要な成果としては、リアノジン受容体の中枢系での記憶学習への寄与、ジャンクトフィリンの中枢系での運動協調性への寄与を明らかにするとともに、ミツグミン53と命名した新規タンパク質の同定したことが特記される。計画調書に記述した実験計画に従い、平成13年度は以下の研究を遂行した。我々の以前の実験で、3型リアノジン受容体欠損マウスは数種の記憶学習テストで能力の低下が観察されている。中枢系の機能レベルにおけるその機構を解析するため、海馬領域の長期増強(LTP)に着目して解析を行った。変異マウスではAMPA型グルタミン酸受容体の活性の低下に起因するLTPの減弱が明らかになり、個体レベルでの記憶学習の能力低下の原因となるものと推定された。一方、3型リアノジン受容体は骨格筋にも低レベル発現している。蛍光Ca2_+測定実験にて、新生児の骨格筋細胞では3型リアノジン受容体は生理的Ca2_+シグナル増幅機構に寄与することも明らかにした。2.1型ジャンクトフィリンの機能解析(Mol. Cell 154,1059,2001)リアノジン受容体の生理的活性には、ジャンクトフィリンによる結合膜構造が必須であると考えられる。骨格筋に発現する1型ジャンクトフィリンの欠損マウスは授乳が出来ずに、生後すぐに死亡する。これは結合膜構造である三つ組の形成阻害、それに伴うリアノジン受容体の活性不良に起因することが示された。神経・筋組織を構成する興奮性細胞においては,神経伝達物質の放出や筋収縮などの生理的反応に先立ち,脱分極による電気的入力が細胞内Ca2+濃度上昇の科学的情報へ変換される。このシグナル変換は細胞表層膜の電位依存性Ca2+チャネルや細胞内Ca2+ストアのCa2+放出チャネルであるリアノジン受容体が主要な役割を担う。細胞内Ca2+ストア膜の機能分子については,生理的状況下での解析が困難で,それらの機能や疾患との関連については不明な点が多い。本研究においては,リアノジン受容体の構造と機能,リアノジン受容体の生理機能の発揮のために必須な膜構築について解析を計画した。興奮性細胞での脱分極の電気シグナルからCa2+シグナルへの変換反応では,表層膜上の電位依存症Ca2+チャネルと細胞内ストア膜の放出上Ca2+チャネル(リアノジン受容体)の機能共役による活性化が普遍的に観察され,両分子の機能的共役が極めて重要である。研究代表者のグループでは興奮性細胞の細胞内Ca2+ストアの構造と機能に関する研究を手掛けており,リアノジン受容体とジャンクトフィリン(細胞内表層膜とCa2+ストアの近接構造を形成するタンパク質)の分子生物学的な実験を遂行している。本研究では,興奮性細胞の細胞内ストアの構造とCa2+放出機構の制御を包括的に理解するために,1.リアノジン受容体のチャネル活性の生理的機能2.ジャンクトフィリンの生理機能3.ストア膜の構成タンパク質の新規同定とその機能に着目した研究を遂行した。主要な成果としては,リアノジン受容体の中枢系での記憶学習への寄与,ジャンクトフィリン中枢系での記憶学習への寄与,ジャンクトフィリンの中枢系での運動協調性への寄与を明らかにするとともに,ミツグミン53と命名した新規タンパク質の同定したことが特記される。
極微細径工具による切削特性解明および超音波振動切削システムの開発

金型加工,自動車部品加工,あるいは携帯情報機器の部品加工に対して,極微細径工具による切削特性の向上が要求されている.それに対して,本研究では,極微細径工具による切削特性の解明と,切削能力を向上させるための研究を行った.その結果,極微細径工具による切削特性解明に関する研究では,直径30μmおよび10μmといった工具に対して,工作機械主軸の動バランスと切削特性との関係を明らかにした.それにより,極微細径工具により切削特性を向上させるための方策を明らかにすることができた.金型加工,自動車部品加工,あるいは携帯情報機器の部品加工に対して,極微細径工具による切削特性の向上が要求されている.それに対して,本研究では,極微細径工具による切削特性の解明と,切削能力を向上させるための研究を行った.その結果,極微細径工具による切削特性解明に関する研究では,直径30μmおよび10μmといった工具に対して,工作機械主軸の動バランスと切削特性との関係を明らかにした.それにより,極微細径工具により切削特性を向上させるための方策を明らかにすることができた.極微細切削加工に対する要求が高いのに対し,現状では,切削の状況そのものが十分に解明されておらず,加工現場では,加工精度不良や工具折損などの問題がある.本研究では,極微細径(直径30μm以下とする)の回転切削工具としてのエンドミルによる(1)微細切削挙動の解明,および(2)効果的な切削法の提案に関する研究を実施する.当研究年度における成果概要を以下に述べる.上記研究テーマ(1)では,工作機械の主軸の動的アンバランスと極微細径工具の歩行現象との関係について実験により調査した.工具として直径30μmの超硬スクエアエンドミルを準備し,実験装置には,超精密非球面加工機を用いて,精密チャックによりアンバランスを調整した.その結果,主軸アンバランスと切削溝の幅の寸法精度,ばりの大きさ,および工具の歩行挙動との関係を捉えることができた.すなわち,極微細径工具における工具挙動の一端を明らかにすることができた.研究テーマ(2)では,超音波振動を利用する対策法を検討した.はじめに極微細径エンドミルに超音波振動を効果的に作用させることができる実験装置の開発を行った.その結果,極微細径工具を高精度に保持でき,主軸アンバランスを微小とし,かつ工具に周波数41kHzの超音波振動を与えることが可能で,40,000min^<-1>で高速回転することが可能な工作機械の主軸を開発することができた.切削実験では,金型焼入鋼に対する溝切削実験を実施した.その結果,超音波振動切削により工具の折損が防止できることなどの効果を明らかにすることができた.以上の研究成果により,極微細径回転工具の切削挙動の一端を明らかにし,工具折損を防止するための実用的な手法を提案することができた.当年度の研究目的を達成し,極微細径エンドミルを工業的に利用するための一助とすることができた.極微細切削加工に対する要求が高いのに対し,現状では,切削の状況そのものが十分に解明されておらず,加工現場では,加工精度不良や工具折損などの問題がある.本研究では,極微細径(直径30μm以下とする)の回転切削工具としてのエンドミルによる(1)微細切削挙動の解明,および(2)効果的な切削法の提案に関する研究を実施する.当研究年度における成果の概要を以下に述べる.上記研究テーマ(1)では,単粒を用いた微細切削加工において,ガラスを切削した場合の切削挙動を調査した.特に,超音波振動を用いた場合の切削挙動の変化に注力して実験により調査した.工具として,粒径50100μm程度のダイヤモンド砥粒電着砥石を準備し,実験装置には,リニアモータ型精密ステージを用いて,各種の加工条件にて単粒引っかき実験を行った.その結果,超音波振動が無い場合のガラスの切削機構,および超音波振動がある場合のそれに関して,切削機構の変化や超音波振動による効果を捉えることができた.すなわち,極微細径工具における切削挙動の一端を明らかにすることができた.研究テーマ(2)では,超音波振動を回転切削工具に利用する方法を検討した.はじめに微細径ダイヤモンド砥粒電着砥石に超音波振動を効果的に作用させることができる実験装置の開発を行った.その結果,極微細径工具を高精度に保持でき,主軸アンバランスを微小とし,かつ工具に周波数41kHzの超音波振動を与えることが可能で,40,000min-1で高速回転することが可能な工作機械の主軸を開発し,それをさらに高性能かつ高寿命の主軸とすることができた.切削実験では,セラミックスや超硬合金に対する形状切削実験を実施した.その結果,超音波振動切削により工具の折損が防止できることなどの効果を明らかにすることができた.直径数mm以下の微小径ダイヤモンドエンドミルを用い,焼入鋼に対する溝加工実験を行い,主軸動バランスおよび工具回転数と切削された溝の性状との関係を調査し,切削挙動に関して解析した.

これによって,ダイヤモンドボールまたはスクエアエンドミルにおける切削挙動を明らかにした.実験は,超精密加工機を用い,直径数mmのダイヤモンドスクエアまたはボールエンドミルを試作した.工作物には,組織が均質で高硬度な焼入鋼および窒化処理鋼を使用した.主軸回転数は40,000min-1の範囲で変化させた.なお,工具の振れ回りは5μm以内とした.切削された溝形状,切削表面の変化に関して観察した結果,良好な切削特性が得られる切削条件を見出すことができた.極小径細長工具による良好な切削を可能とする超音波スピンドル装置の開発に関するテーマでは,直径数mmのアスペクト比が5以上の研削砥石などの工具による良好な切削を可能とするために,超音波振動を発生させることができるスピンドル装置による切削機構を明らかにした.まず,単粒モデルによる超音波振動研削機構の解明を行った.すなわち,振動素子をビルトインした超音波振動スピンドルによる単粒の引掻き試験を実施し,振動条件と切削特性との関係を明らかにした.次に,高速超音波スピンドルによる加工実験を行った.すなわち,前記要素を具備する高速超音波スピンドルを製作し,総合性能を評価した.具体的には,超硬合金,焼入鋼,あるいはセラミックスやガラスなどの高硬度および脆性材料を微小切削し,その切削特性を明らかにした.すなわち,切削された溝形状などの変化を観察し,超音波振動の効果および試作スピンドルによる加工結果を評価し,その有効性を明らかにした.前記の研究成果は,精密工学会およびプラスチック成形加工学会といった関連学会へ口頭発表あるいは論文投稿により行った.極微細径回転工具の振れまわり挙動に関する研究の進捗は,初年度23年度を見込んでいたが,初年度においてその成果をほぼ達成した,そのため,23年度では,単粒での微小切削挙動を調べるといった,より発展した研究を実施することができ,達成目標の内容を充実させることができた.超音波主軸開発も,23年度において目標をほぼ達成することができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。極微細径切削工具に関して,超硬合金,cBNとステップアップしてきたが,最終年度では究極の工具であるダイヤモンド工具に挑戦する.ダイヤモンド工具への展開は,本研究の次のステップにもつながる究極目標であり,これまでの成果を踏まえて,最終年度にそれに挑戦する.これまでの知見を踏まえた微細径ダイヤモンド工具を製作し,それにより高硬度材料を切削し,本研究成果を総合的にまとめる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
高度好熱菌MutM蛋白質を用いた活性酸素障害DNA塩基除去修復機構の解析

酸素呼吸の代謝の過程で生じる酸素ラジカル種はDNAに様々な傷害をひきおこし、細胞死や癌化の原因となる。特に8-オキソグアニン(GO)は、シトシンともアデニンとも塩基対を形成し、突然変異を引き起こす。MutM蛋白質はGOによる変異を防ぐ修復酵素として、傷害GO : C塩基対からGO塩基を除去し、生じた脱塩基部位の3'側と5'側を両方切断する塩基除去修復酵素である。我々は既に、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のMutM蛋白質の1.9Å分解能でのX線結晶構造解析を行い。MutM分子の2つのドメイン間に分子表面静電ポテンシャルは正である大きな溝があり、触媒反応に重要なN末端のプロリン残基が溝の底に位置しやホモログ間で保存されたアミノ酸残基はこのプロリンの周りに集中していた。また、DNA結合が示唆されていたZINCフィンガーモチーフの他に、多くの塩基除去修復酵素にみられるヘリックス・ヘアピン・ヘリックスモチーフと類似のヘリックス2ターンヘリックスもDNA結合の溝に位置していた。MutMと傷害DNAの相互作用を予測するために、複合体モデルを作成し分子動力学計算を行った。この結果、得られたモデルから、MutMの溝にある保存された残基がDNAの傷害塩基対を被うように作用し、触媒反応に重要な働きをすることが予想された。特に2つのDNA結合モチーフは、他の塩基除去修復酵素と同様の機能を果たしていると考えられた。反応機構についてはDNA鎖の3'側と5'側を両方切る活性に対応する2つの触媒基Glu2,Glu5のうちGlu5をAlaに置換したE5Aの活性は、野生型タンパク質とほとんど同じであった。それに対し、Glu2をAlaに置換したE2Aでは、グリコシラーゼ活性が大きく低下していたが、結合過程やAPリアーゼ活性は、野生型とほとんど同じであることが示された。また、傷害塩基対に直接作用することが予想されたArg99をAlaに置換した変異型酵素R99Aについては、DNA結合能が野生型よりも大きく低下していることが示された。酸素呼吸の代謝の過程で生じる酸素ラジカル種はDNAに様々な傷害をおこし、細胞死や癌化の原因となる。特にグアニンの酸化によって生じる8-オキソグアニン(GO)は量的にも多く、シトシンともアデニンとも塩基対を形成できるので突然変異を誘発する。MutMはGO : C塩基対からGOを直接取り除く塩基除去修復酵素であり、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のMutMのX線結晶構造解析を行い、1.9Å分解能での3次元構造決定を行った。MutM分子は2つのドメインからなり、ドメイン間には2重鎖DNAが入ることのでき、分子表面静電ポテンシャルは正である大きな溝があった。MutMの触媒反応に重要なN末端のプロリン残基はこの溝の底に位置していた。MutMホモログ間で保存されたアミノ酸残基はこのプロリンの周りに集中していた。また、MutMは、既にDNA結合が示唆されていたZincフィンガーモチーフの他に、多くの塩基除去修復酵素にみられるヘリックス・ヘアピン・ヘリックス(HhH)モチーフと類似の構造モチーフを持ち、これらもDNA結合の溝に位置していた。得られたモデルから、MutMの溝にある保存された残基がDNAの傷害塩基対を被うように作用し、触媒反応に重要な働きをすることが予想された。MutMは他の塩基除去修復酵素と異なり、傷害塩基を除去するだけでなく、DNA鎖の3'側と5'側を両方切る活性があるが、それぞれに対応する2つの触媒基の存在が推定された。3'側のみを切断する他の酵素には触媒基が1つしかなく、MutMにおいて2つの触媒基が関与する反応機構が支持された。現在、構造とモデルを基に触媒反応、気質認識に重要と思われる部位特異的変異体を作成し、その活性を調べている。

この結果、得られたモデルから、MutMの溝にある保存された残基がDNAの傷害塩基対を被うように作用し、触媒反応に重要な働きをすることが予想された。特に2つのDNA結合モチーフは、他の塩基除去修復酵素と同様の機能を果たしていると考えられた。反応機構についてはDNA鎖の3'側と5'側を両方切る活性に対応する2つの触媒基Glu2,Glu5のうちGlu5をAlaに置換したE5Aの活性は、野生型タンパク質とほとんど同じであった。それに対し、Glu2をAlaに置換したE2Aでは、グリコシラーゼ活性が大きく低下していたが、結合過程やAPリアーゼ活性は、野生型とほとんど同じであることが示された。また、傷害塩基対に直接作用することが予想されたArg99をAlaに置換した変異型酵素R99Aについては、DNA結合能が野生型よりも大きく低下していることが示された。
国際社会において、戦略的行動を抑止する意志決定手続きについて

国際社会の意志決定手続きは、選択肢に関する各国の選好や態度を表明させ、それらを集約するもの、と一般的にはとらえることができる。本研究は、以下のようなケースで、次のことを行っている。すなわちi)戦略的行動を抑止すると同時に他の望ましい条件を満たす決定手続きを探す、または考察する。ii)得られた決定手続き、またはそれを含むあるクラス手続きしか、望ましい諸条件を満たせないことを、数理的に証明する。
微小変化型ネフローゼ症候群における糸球体基底膜透過性亢進因子の解析

1974年Shalhaubが「微小変化型ネフローゼ症候群はリンパ球の異常により惹起される」とする仮説を発表して以来多くの免疫学的異常が報告されてきたが未だ病因の解明には至っていない。微小変化型ネフローゼ症候群の病因を解明するために、私どもは過去数年にわたり免疫学的、病理学的研究を行い、微小変化型ネフローゼ症候群患児の糸球体基底膜は陰性荷電が滅少していることを明かにした。微小変化型ネフローゼ症候群患児の血清、リンパ球培養上清をラットの腎動脈に注入したところ、糸球体基底膜の陰性荷電は減少、尿中アルブミン排泄の増加を認め、微小変化型ネフローゼ症候群ではリンパ球によって産生される因子が糸球体基底膜陰性荷電の減少を起こし、高度蛋白尿を引き起こすと考えられた。最近共同研究者のConnollyによってヒトリンパ腫細胞株の培養上清から血管透過性亢進因子が分離精製され、微小変化型ネフローゼ症候群患者の血中、尿中に血管透過性亢進因子が検出された。血管透過性亢進因子をラットの腎動脈に注入すると、尿中アルブミン排泄は増加した。血管透過性亢進因子産生細胞を明らかにする目的で血管透過性亢進因子mRNA発現を検討したところ、末梢血単核球、糸球体メサンギウム細胞に血管透過性亢進因子mRNAの発現を認めた。さらにメサンギウム細胞を抗血管透過性亢進因子抗体で染色したところ、メサンギウム細胞内に血管透過性亢進因子の発現を認めた。微小変化型ネフローゼ症候群では血管透過性も亢進しており、かつ血管透過性亢進因子は電気的に陽性荷電を有する。以上の所見から、微小変化型ネフローゼ症候群では、単核球、糸球体メサンギウム細胞が血管透過性亢進因子を産生し、糸球体基底膜陰性荷電の減少、透過性の亢進を起こし、ネフローゼ症候群を惹起すると考えられる。微小変化型ネフロ-ゼ症候群(MCNS)では、従来より多くの免疫学的異常の存在が指摘されている。1974年Shalhoubは、微小変化型ネフロ-ゼ症候群は細胞性免疫機構の異常でリンパ球のあるクロ-ンが増殖し、産生されたリンフォカインが糸球体基底膜の透過性を亢進させ、蛋白尿が出現するという仮設を提唱した。その後、微小変化型ネフロ-ゼ症候群のリンパ球機能異常を指摘する多くの報告があるが、微小変化型ネフロ-ゼ症候群の発症機序はいまだ不明である。微小変化型ネフロ-ゼ症候群におけるリンパ球機能異常とネフロ-ゼ症候群発症との関係を明らかにすることは重要な課題である。今回私共は、微小変化型ネフロ-ゼ症候群患児の末梢血単核球培養上清をラット腎動脈に注入し、ラット尿中アルブミン排泄量と糸球体基底膜の陰性荷電を測定することにより、微小変化型ネフロ-ゼ症候群の発症機序について検討した。微小変化型ネフロ-ゼ症候群患児の末梢血単核球培養上清をラット腎動脈に注入すると、注入後6時間のラット尿中アルブミン排泄量は注入前値に比し有意に増加し、ラット糸球体基底膜の陰性荷電は有意に減少した。一方、健常小児の末梢血単核球培養上清をラット腎動脈に注入しても、ラット尿中アルブミン排泄量は増加せず、ラット糸球体基底膜陰性荷電の減少も見られなかった。

以上の結果から、微小変化型ネフロ-ゼ症候群では、末梢血単核球によって産生される因子(糸球体基底膜透過性亢進因子)が糸球体基底膜陰性荷伝の減少を起こし、糸球体の蛋白透過性を亢進させると考えられる。現在この因子を解析中である。1974年shalhaubが「微小変化型ネフロ-ゼ症候群はリンバ球の異常により惹起される」とする仮説を発表して以来多くの免疫学的異常が報告されてきたが未だ病因の解明には至っていない。微小変化型ネフロ-ゼ症候群の病因を解明するために、私どもは過去数年にわたり免疫学的、病理学的研究を行い、微小変化型ネフロ-ゼ症候群患児の糸球体基底膜は陰性荷電が減少していることを明かにした。そこで微小変化型ネフロ-ゼ症候群患児の血清とリンパ球の糸球体基底膜陰性荷電への影響を調べるために、患児の血清、リンパ球培養上清をラットの腎動脈に注入したところ、糸球体基底膜の陰性荷電は減少、尿中アルブミン排泄の増加を認めた。健常児の血清、リンパ球培養上清を注入しても尿中アルブミン排泄、糸球体基底膜陰性荷電の変化は認めず、微小変化型ネフロ-ゼ症候群ではリンパ球によって産生される因子が糸球体基底膜陰性荷電の減少を起こし、高度蛋白尿を引き起こすと考えられる。最近共同研究者のConnollyによってヒトリンパ腫細胞株の培養上清から血管透過性亢進因子が分離精製された。ELISAによる血管透過性亢進因子の測定で、微小変化型ネフロ-ゼ症候群患児の血中、尿中に血管透過性亢進因子が検出された。一方健常児の血中、尿中には血管透過性亢進因子は検出されなかった。さらに血管透過性亢進因子をラットの腎動脈に注入すると、尿中アルブミン排泄は増加した。微小変化型ネフロ-ゼ症候群では血管透過性も亢進しており、かつ血管透過性亢進因子は電気的に陽性荷電を有することから、血管透過性亢進因子が糸球体基底膜陰性荷電の減少を起こし、高度蛋白尿を引き起こし、ネフロ-ゼ症候群を惹起すると考えられる。正常な糸球体基底膜は陰性荷電を有し、同じく陰性荷電を有するアルブミン等に対して、電気的障壁となり、アルブミン等の蛋白は糸球体基底膜を透過しないことが明らかにされている。微小変化型ネフローゼ症侯群では糸球体基底膜の陰性荷電が減少しており、この結果高度の蛋白尿が出現し、ネフローゼ症侯群が惹起されると考えられる。平成3年、私共は共同研究者のConnollyによってヒトリンパ腫細胞株の培養上清から分離精製された血管透過性亢進因子をラットの腎動脈に注入すると、尿中アルブミン排泄は増加することを明らかにした。微小変化型ネフローゼ症侯群では血管透過性も亢進しており、かつ血管透過性亢進因子は電気的に陽性荷電を有することから、この血管透過性亢進因子が糸球体基底膜陰性荷電の減少を起こし、高度蛋白尿を引き起こす可能性が考えられる。そこで平成4年度は血管透過性亢進因子産生細胞を明らかにする目的で血管透過性亢進因子mRNAは発現を検討したところ、末梢血単核球、糸球体、糸球体メサンギウム細胞に血管透過性亢進因子mRNAの発現を認めた。さらに培養メサンギウム細胞を抗血管透過性亢進因子抗体で染色したところ、メサンギウム細胞内に血管透過性亢進因子の発現を認めた。以上の所見から、微小変化型ネフローゼ症侯群では、単核球、糸球体メサンギウム細胞が血管透過性亢進因子を産生し、その結果糸球体基底膜の透過性は亢進し、ネフローゼ症侯群が惹起される可能性が示唆された。
クリプトクロム／ＤＮＡ光回復酵素ファミリーの光反応機構の解明

DNA光回復酵素の反応機構解明のために以下の研究を行った。1(6-4)光回復酵素の光活性化反応の詳細について分光法による解析を行った。2CPD光回復酵素の機能発現に伴う構造変化をFTIR分光法により計測し、(6-4)光回復酵素のシグナルと比較した。その結果、以下の結果を得た。1277 Kで「酸化型ー中性セミキノン型ー還元型」の一連の反応に伴う構造変化の検出に成功した。また、200 Kで光照射することにより、アニオンラジカル型の蓄積を確認することが出来た。2CPD光回復酵素がCPD結合の際にαヘリックスが構造変化を起こすこが、この構造変化の様式が(6-4)光回復酵素逆向きであることがわかった。本研究では、進化的に近縁であるが異なる機能をもつクリプトクロム(CRY)/DNA光回復酵素(PHR)ファミリーを対象として、DNA修復活性の発現に必要な要素を明らかにし、反応機構を解明することを目的とする。PHRには、シクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)を修復するCPD-PHRと(6-4)光産物を修復する(6-4)PHRが存在する。平成25年度は、CRY-DASHと名付けられたCRYを鋳型として、二本鎖DNAの損傷を修復するDNA光回復酵素への機能転換を試みた。シアノバクテリア由来のCRY-DASHは生体内の機能は不明であるが、試験管内において一本鎖DNAの損傷(ssCPD)を修復することが報告されている。一方、二本鎖DNA中のCPD(dsCPD)には結合しない。そこで、dsCPDを結合させることができればdsCPDを修復する酵素(すなわちCPD-PHR)に変換できるのではないかと考えた。CPD-PHRのアミノ酸配列、結晶構造を参考にしてdsCPDの結合に重要だと思われるトリプトファンとメチオニン残基をCRY-DASHに導入した。これまで当研究室ではフーリエ変換赤外(FTIR)分光法によるCPD修復を計測する手法を確立していたので、FTIR測定を行ったところ、トリプトファン残基を導入した変異体がdsCPDを修復できることがわかった。この変異CRY-DASHをDNA修復能を欠失した大腸菌に導入してCPD修復能を調べたところ、大腸菌内でCPDを修復する結果は得られなかった。これは、変異CRY-DASHのdsCPDに対する親和性が低いせいであると推察された。FTIR測定では高濃度のタンパク質と基質の条件で行っていることから、両者の親和性が低くても変異CRY-DASHがdsCPDを結合して修復したのに対し、大腸菌内ではCRY-DASHとdsCDPが結合するには十分な濃度ではなかったせいで効果が現れなかったと考えられた。本研究では、進化的に近縁であるが機能の全く異なるクリプトクロム/DNA光回復酵素ファミリーを対象として、DNA修復活性の発現に必要な要素を明らかにし、反応機構を解明することを目的とする。DNA光回復酵素(PHR)には、シクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)を修復するCPD-PHRと(6-4)光産物を修復する(6-4)PHRが存在する。それぞれの光活性化過程と修復過程を赤外分光法で捉え両者を比較した。1PHRが活性型になるためには、FADが二電子還元を受けた完全還元型になる必要がある。活性化過程の詳細な解析を行うため、アフリカツメガエル(6-4)PHRを用いて、一電子ずつ還元される反応条件を検討した。試料を200 Kにセットして光を照射したところアニオンラジカル型の生成を確認し、この温度では電子移動反応のみが起こりプロトン移動反応は起きていないことがわかった。この条件でFTIR測定を行い、それぞれの酸化還元状態に特異的に現れるFTIRバンドを確認した。また、タンパク質二次構造を反映するamide-I領域のシグナルから、FAD・-ではβシートの構造変化が、FADH・ではαヘリックスの構造変化が起こることがわかった。2CPD-PHRを対象に、そのDNA修復過程と基質特異性の解明を目指して、FTIR分光法による解析を試みた。大腸菌由来のCPD光回復酵素を大腸菌の大量発現系を用いて調製しFADH・からFADH-への反応のFTIR測定を行った。また、化学合成されたCPDを含むDNA基質を結合させ光反応とDNAの修復の反応のFTIR測定を行った。

基質DNAの結合に伴う構造変化の観測を行ったところ、CPD-PHRがCPDを結合する際にαヘリックスの構造変化が確認できたが、この構造変化の様式が(6-4)PHRが(6-4)光産物を結合する際に起こす構造変化と逆向きであることがわかった。平成24年度はCPD-PHRと(6-4)PHRを対象として、両者の光活性化過程と損傷DNA修復のFTIRスペクトルデータを得ることができた。これらのデータは、今後の安定同位体標識試料やアミノ酸変異体を用いたシグナルの帰属に向けての基礎となるものであり、光回復酵素の反応機構解明に向けて重要な情報を与えるものである。平成25年度はクリプトクロムから光回復酵素への機能転換を目指す。シアノバクテリア由来のクリプトクロム-DASHは、in vivoではDNA修復には関与していない(Hitomi et al., 2000)が、in vitroで一本鎖DNAを修復する活性を持つことが報告された(Selby et al., 2006)。但し、in vitroでは二本鎖DNAの修復は観測されなかった。本研究では、大腸菌などのCPD光回復酵素のアミノ酸配列(図4)を参考に、二本鎖DNAの損傷を結合に重要と考えられるアミノ酸をクリプトクロム-DASHに導入し、CPD光回復酵素への転換を行う。そして作製した変異体ついて各種分光法を適用することでその反応機構を明らかにする。研究費の用途は試薬、実験器具等の消耗品及び旅費である。特に、サーマルサイクラーを利用した変異体作製のための耐熱性DNAポリメラーゼ、大腸菌用培地の購入に充てる。また、学会へ参加し研究成果を発表するのに必要な旅費を計上した。
トウガラシにおけるジェミニウイルス耐病性機構の解明および品種改良への応用

ジェミニウイルスはタバココナジラミ媒介性のDNAウイルスであり,熱帯から温帯までの広範囲で園芸生産における脅威となっている.なかでも香辛料や野菜として世界的に需要の大きいトウガラシ属においては,生産現場で強く求められているジェミニウイルス耐病性品種が未だ報告されていない.本研究では,複数のジェミニウイルス耐病性トウガラシ系統を分子生物学的手法で解析し,交雑後代を用いたマッピングにより耐病性遺伝子の単離を試みる.本研究の成果が新たなジェミニウイルス耐病性品種の開発につながれば,トウガラシ生産における莫大な経済的損失が軽減できると期待される.ジェミニウイルスはタバココナジラミ媒介性のDNAウイルスであり,熱帯から温帯までの広範囲で園芸生産における脅威となっている.なかでも香辛料や野菜として世界的に需要の大きいトウガラシ属においては,生産現場で強く求められているジェミニウイルス耐病性品種が未だ報告されていない.本研究では,複数のジェミニウイルス耐病性トウガラシ系統を分子生物学的手法で解析し,交雑後代を用いたマッピングにより耐病性遺伝子の単離を試みる.本研究の成果が新たなジェミニウイルス耐病性品種の開発につながれば,トウガラシ生産における莫大な経済的損失が軽減できると期待される.
脊髄損傷に対するP2X受容体の神経保護作用の検討

ラット脊髄横断スライス標本にホールセル・パッチクランプ法を適用し、脊髄運動ニューロンにおけるプリン受容体の役割を検討した。代謝安定型のATP受容体作動薬であるATPβS(100μM)を灌流投与すると、約半数の脊髄運動ニューロンにおいて内向き電流が発生すると共に、グルタミン酸を介する興奮性シナプス後電流の発生頻度ならびに振幅は著明に増加した。また、P2X受容体作動薬であるα, β-methylene ATP (100μM)は興奮性シナプス後電流の発生頻度ならびに振幅を著明に増加した。以上の結果から、脊髄運動ニューロンのシナプス前にはα, β-methylene ATP感受性のP2X受容体などプリン受容体が発現しており、その活性化によってグルタミン酸の遊離が増強する。さらに、シナプス後細胞にも2-methylthio ADP感受性のP2Y受容体などプリン受容体が発現しており、その活性化によって直接的に脊髄運動ニューロンを脱分極することが明らかとなったラット脊髄横断スライス標本にホールセル・パッチクランプ法を適用し、脊髄運動ニューロンにおけるプリン受容体の役割を検討した。さらに、シナプス後細胞にも2-methylthio ADP感受性のP2Y受容体などプリン受容体が発現しており、その活性化によって直接的に脊髄運動ニューロンを脱分極することが明らかとなった脊髄損傷による麻痺の主原因は直接外力による脊髄神経細胞の損傷であるが、遅発性に麻痺は急激に拡大する。直接外力による不可逆的な脊髄神経細胞損傷は治療困難であるが、急性期における遅発性脊髄障害への対策は非常に重要であり、長らく副腎皮質ステロイドホルモンの大量療法が施行されてきた。しかしながら、副腎皮質ステロイドホルモン大量療法の有効性は乏しいだけでなく副作用も多く、新しい作用機序を有する治療薬の登場が待ち望まれている。近年、脊髄損傷の急性期治療としてP2X_7受容体阻害薬が有効であると報告されて、脊髄損傷におけるATP受容体の関与が指摘された。しかしながら、脊髄前角細胞におけるATP受容体の機能的役割はほとんど知られていない。今回、ラット脊髄横断スライス標本にホールセルパッチクランプ法を適用し、脊髄前角細胞におけるATP受容体の役割を検討した。電位固定法を用いて保持膜電位を-70mVに固定して、代謝安定型のATP受容体広作動域作動薬であるATPγSを灌流投与すると、約40%の脊髄前角細胞において内向き電流が観察され。また、ATPγSによって内向き電流が観察される細胞にP2X受容体作動薬であるα、β-methylene ATPならびにBzATPを灌流投与したが内向き電流は観察されなかった。同様に、P2Y受容体作動薬であるUTPならびにUDPの灌流投与により内向き電流は観察されなかったが、2-methylthio ADPを灌流投与するとATPγSと同様に内向き電流が観察された。さらに、ATPγS灌流投与によって生じた内向き電流は、P2Y_1受容体拮抗薬であるMRS2179の存在下において完全に阻害された。以上の結果から、約半数の脊髄前角のシナプス後細胞においてP2Y_1受容体が発現しており、細胞外ATPによって脊髄前角細胞はP2Y_1受容体を介して脱分極することが明らかとなった。電位固定法を用いて膜電位を-70mVに保持して、代謝安定型のATP受容体作動薬であるATPγS(100μM)を灌流投与すると、約半数の脊髄運動ニューロンにおいて内向き電流が発生すると共に、グルタミン酸を介する興奮性シナプス後電流の発生頻度ならびに振幅は著明に増加した。ATPγS(100μM)によって内向き電流が観察される細胞に、P2Y受容体作動薬である2-methylthio ADP (100μM)を灌流投与すると、内向き電流が観察されたが、興奮性シナプス後電流の発生頻度ならびに振幅に変化はみられなかった。また、ATPγS灌流投与によって生じた内向き電流は、記録電極内にGDPβS(2mM)を加えることによって有意に抑制された。一方、P2X受容体作動薬であるα,β-methylene ATP (100μM)ならびにBzATP (100μM)は保持膜電流に全く影響を与えなかったが、α,β-methylene ATP (100μM)は興奮性シナプス後電流の発生頻度ならびに振幅を著明に増加した。以上の結果から、脊髄運動ニューロンのシナプス前にはα,β-methylene ATP感受性のP2X受容体などプリン受容体が発現しており、その活性化によってグルタミン酸の遊離が増強する。さらに、シナプス後細胞にも2-methylthio ADP感受性のP2Y受容体などプリン受容体が発現しており、その活性化によって直接的に脊髄運動ニューロンを脱分極することが明らかとなった。脊髄損傷の急性期における脊髄運動ニューロンの遅発性神経
北インド中近世城郭史研究

本年度は諸般の事情によりラージャスターン調査がかなわず、代わりにラージャスターンの城砦の比較対象として、日本の古代山城(鬼ノ城、大野城)および戦国・近世期の城郭都市(備中松山城、伊予松山城)を調査した。その比較調査の結果、以下のような新たな知見を得た。日本の古代山城は基本的に13世紀以前のラージャスターンの大規模山上城砦と、規模としても構造としても非常に似通った城砦である。ただしラージャスターンの大規模山上城砦が王都として政治都市の機能を完備する都市城砦であるのに対して、大野城など日本の古代山城はそうした性格ではなく、倉庫・防衛機能が目立った城砦である。また、日本の山城は谷を囲う構造であり、城砦内が凸型ないし平坦なラージャスターンの山上城砦とは子細に見れば構造的にも異なっている。他方、備中松山城や伊予松山城のように濠と土塁で山麓政庁と城下町を囲い、山頂に小規模城砦を配置する戦国末期・江戸初期の城郭タイプはラージャスターンでも見られ、しかも興味深いことにほぼ同時期である1617世紀に作られている。その典型はアーンベールやブーンディーであるが、それら以外にも山麓の政庁・宮殿と城下町を囲う城郭都市はこの時代のラージャスターンでは極めて一般的である。古代山城と同様、この時代においても見られるラージャスターンとの構造的類似性は、今年度の調査による重要な発見であると思われる。こうした類似性にもかかわらず、日本では古代山城と中近世の城郭との間には技術的にも文化的にも明らかに断絶があるとされる一方、ラージャスターンでは日本のように古代の山城が放棄されることはなく、大規模山上城砦と近世城郭との間の連続性が際立っているという両地域の相違点もまた、今回の調査の重要な知見である。本年度は、以下の通り、主に北東ラージャスターンを中心に、城砦データを収集・整理し、あわせて実地調査を行った。・8ー18世紀建造と考えられる北東ラージャスターンの城砦・城郭都市を、歴史研究文献および考古学調査報告書などから探り出し、インターネットの衛星画像情報からその立地(標高および比高)・規模・城壁配置を確認し、新たに20件ほどデータベースに加えた。・3月に北東ラージャスターンを訪れ、新たに加えられたデータの城砦を中心に、城門・城壁構造、濠の配置、宮殿・寺院・水源の配置、市街区の位置と城壁の有無などを調査した。その結果、16-17世紀に山麓部に形成された城郭都市は、これまで調査してきたBundi, Amber, Bhangarなどとよく似ており、山上に詰めの城砦、山腹ないし山麓に堅固な宮殿、山麓から平地部に城壁で囲まれた市街区という構成をとることがわかってきた。これは城砦・都市構造を論ずる古典文献には出てこない構成で、新しい都市パターンとして注目すべき点である。・7月に東京外大で「パンチャクラとマハージャナー中世初期ラージャスターン・グジャラートの都市行政と集会組織」を報告し、刻文史料から12ー13世紀の王朝の地方支配と都市自治組織との関係を明らかにした。都市自治組織と城砦との関係については未解明だが、城郭都市が一般化する以前の都市のあり方として、今後考察していく足がかりになるものである。・一般向けのものではあるが、「ラージャスターンの城砦・城郭都市ー中世から続くインドの町」を書いた。当初3月に予定していたラージャスターン南部の城砦調査がインド側の事情で平成28年度に延期されたため、本年度は主に城砦データの収集・整理と都市に関する論文作成に重点を置いて研究を進めた。刻文史料にはときどきdurga, gadha, kottaといった城砦を示すタームが現れる。これらのタームを刻文史料から探ることで、いつ、どの都市に城砦が存在したか、またその都市の周辺地形から平地城砦か山上城砦かなど城砦タイプまで判明することがある。昨年度以来の推進方策として掲げていたように、本年度からこれらのタームを網羅的にピックアップして整理する作業を開始した。現在もこの作業は継続中であるが、現段階では当初期待していた城砦の創建年代については、なお多くの城砦に関して確定できていない。ただし興味深い事実として、12世紀の刻文史料には記されながらも現存しない城砦が存在すること(例えばNadolのdurga)、それが平地部の城砦であるらしいことなどが判明してきた。報告者は13世紀以前の城砦の特徴を大規模山上城砦と規定してきたが、このようなすでに消え去った平地城砦の存在をも考慮しなければならないことが、今後の大きな課題となった。また、論文「パンチャクラとマハージャナー中世初期ラージャスターン・グジャラートの都市行政と集会組織」を作成し、城郭都市が一般化する以前である12・13世紀の共同体的な都市社会の在り方と王朝支配との関係を論じた。当初予定していたラージャスターン南部の城砦調査が次年度に延期されたことが大きな理由である。また城砦や都市城壁の建造年代の確定のため刻文史料の整理を行っているが、想定していたよりも年代確定が難しい。今後の史料収集に期待する。本年度は以下の通り2回の実地調査を行った。とくに城砦の構造と立地状況、市街区を囲む残存城壁の構造・特質など、衛星画像や既存の報告書では確認できない諸点を中心に調査を進めた。

・9月に行ったラージャスターン南部各地の城砦(Acalgarh, Candravati, Sirohi, Jalor, Siwanaなど)の調査では、とくにアーブー・パラマーラ朝の王都Candravatiとアーブー山の山上城砦Acalgarhの、互いに20kmも離れた二つの城郭が密接に関係していることが判明した(後者はいくつもの小さな郭から構成されており、平地王都の詰めの城として機能していたと考えられる)。今後、この城砦間の関係を刻文史料などに依拠してさらに詰めるとともに、他の城砦・城郭都市についても王朝統治や軍事・外交政策と関わらせて城砦間関係を考察する必要がある。・3月に行ったラージャスターン北東部各地の城砦(Nimrana, Alwar, Dausa, Kishangarhなど)の調査でも城砦構造に関していくつもの新たな知見を得た。とくに11世紀以降の創建と考えられているAlwar城は一見、大規模山上城砦であるが、一山の上部を囲う一般的形態の山上城砦ではなく、U字形の山の谷部分を取り囲むように城壁をめぐらしており、主要な施設も谷底ではなく城壁に近いところに位置している。大規模山上城砦としては極めて特異であり、その位置づけは今後の研究の進展に期するところである。今回の実地調査では多くの新知見を得て成功と言いうる。データベースへの新データの追加は少なかったが、旧データの更新が非常に多かったので、概ね順調と言いうる。ただし、城砦や都市城壁の建造年代については、現段階でもなおはっきりしない城砦が多く、また改築も頻繁に行われてきたことを考慮に入れると、年代確定をめぐる問題は今後の最重要課題である。本年度はラージャスターン東部の城砦を中心に実地調査を行った。その結果は以下の通りである。Timangarh(11世紀末創建)、Khandar(12世紀末創建)、Mandrayal(創建時不明)の三城砦はいずれも大規模山上城砦のカテゴリに属する山城であり、うち前二者はJalor、Ranthambhor、Cittorgarhなどと同様、典型的な中世初期の城砦形態である。これらのうち創建時不明(おそらく14世紀以降)のMandrayalの城砦構造は通常の大規模山上城砦とはかなり異なっており、城砦内部の最上部(中心部)に小さな、しかし堅固な城砦をさらに設置している。この城砦の年代確定、およびこうしたタイプの山上城砦の位置づけは今後の課題である。平地城郭都市のKarauli(14世紀半ば創建)は、城郭都市の東寄りに宮殿城砦が建設されており、14世紀建造の最奥部から15世紀・17世紀と増築が繰り返されていった様子が、建物自体および壁画から確認できる。また、町を取り囲む城壁および6つの城門もひとつひとつ確認し撮影した。城門・城壁はその後も修復を繰り返したと見られるが、崩れた一部の城壁の内部状態や城壁下部の古い基礎の様子から、その概ね円形の城郭の形態と城門の位置は17世紀創建時の状態を残していると考えられる。なお、1月に京都大学で「関係性の中の国家:インド中世の非領域的国家システム」と題する報告において、817世紀のラージャスターンの国家システムの変遷を領域国家の形成過程として説明する試みを行ったが、それは本研究の城砦構造の変遷と深く関わるものである。今回の実地調査でも、これまでほとんど調査されていない城砦について多くの新知見を得ることができ、概ね成功であったと言いうる。問題はそれぞれの城砦の創建および改築の年代であり、これについては現在もなお不明な点を多く残している。
琉球列島における酸性雨起源物質の由来に関する研究

沖縄島における浮遊粉塵量は冬から晩春にかけて増加し、夏期には減少する傾向にある。その量的変化は033.34ug/m^3で平均値が4.2ug/m^3であった。また、その量は風向、雨量、中国大陸での乾燥気候の変動などに影響されて変化している。大気粉塵中のCl/Na比は一般に海水値より小さく、粉塵輸送の過程で塩素が塩酸のような揮発性ミストになって減少し、いわゆる「塩素損失」として沖縄島に到達しているものと考えられる。Be-7と大気圧との間には高い相関性があり、その量は高気圧優勢地点で高く、低気圧部では、一般に低い。しかし、その変化の態様は時間的に少々の遅れが観察され、Be-7の最高値が高気圧の移動の後方にそって変化していることがわかった。硫酸イオンは海洋性起源と工業産業排出を中心とする非海洋性起源とからなっている。沖縄島では海塩の影響を受けて、平均で5.4ug/m^3を示し、札幌(2.7ug/m^3)などより高く約2倍の濃度を示している。また、[nss SO4]/[NO3]比は沖縄島で4.5であるのに対し、ロシヤ(Vladisostok)で1.7、札幌で1.59であり、沖縄島で大陸起源の硫酸ミストの影響がより高いことがわかる。これらのことは、将来大陸起源の酸性物質による酸性雨の影響を受けるとすれば琉球列島がより早く、また、強い影響を受けることを示唆している。沖縄島に到達する黄砂は一般にSO4、Cl、NO3、ZnおよびCuにとぼしいことがわかった。また、1992年4月における黄砂の沖縄島通過量は大気厚が1Kmとし、幅2Km、風速が29Km/hrとすれば8時間で約145トンに達することがわかった。
らせんキラリティをもつ遷移金属多核錯体の合成とその不斉反応への応用

申請者は本(萌芽的)研究において、ピリジン誘導体である光学活性な架橋配位子を用い、らせんキラリティをもつ金属錯体の合成とその不斉反応への応用について調査している。この種の光学活性配位子を用いて銀(I)錯体を合成すると無限らせん鎖構造をもつポリカチオン性錯体が、また配位子のラセミ混合物を用いると全く構造の異なる二核錯体が得られることを既に明らかにした。本年度は、ポリカチオン性無限らせん鎖の構造に対する陰イオンの影響を調べるためAgPF_6を用いて合成を行った。結晶構造解析によりらせん鎖中の銀イオンと陰イオン間に相互作用がなく、また無限鎖のらせん半径が大きくなることが明らかとなった。このことから、らせん鎖構造をもつ錯体の合成において、対イオンの選択が重要であることを実証した。また、ヘリカルキラリティをもつ多核錯体の均一系触媒としての可能性を探るため、この多核錯体の溶存構造を分光学的手法を用いて調べた。溶液中1:1の錯形成は認められたが、ラセミ混合配位子を用いた場合との差異はなく、結晶解析において見いだされた無限らせん鎖構造は保たれていないと推定された。また、銀-配位子間の解離-再結合が非常に早く起こっていることも実証された。このことから、不斉反応に応用するためには、置換不活性な金属イオンを用いることが必要不可欠であると結論できた。金属イオンに銅(I)を、また架橋配位子にビピリジン誘導体を用いて合成を試みたが、いずれも構造解析に適した結晶を得ることができなかった。現在、八面体型六配位構造をもち置換不活性である金属イオン(コバルト、ロジウム、レニウムなど)を用いた錯体の合成を試みている。また、この配位子の架橋配位であるジオキソレイン間の構造が、ヘリケイト合成に立体的に不利であると推定されたため、新たな架橋配位子の合成も行っている。
β2レセプター遺伝子導入による心不全の遺伝子治療

Transgenic miceを使って示されたβ2-adrenergic receptor遺伝子を導入した心機能改善の研究を、HVJ-Liposome法を用いて開始した。まず、1)HVJ-Liposome法により導入したβ2-adrenergic receptor遺伝子が正常ラット心臓で有効に発現可能かを検討した。心臓に効率良く遺伝子導入可能なベクターはadenovirusとHVJのみだが、HVJは価値ある特徴を有し応用が期待されている。β2-adrenergic receptor cDNAはDukeのLefkowitz教授らにより供給うけ、Chikin βactin promoter.CMV enhancerをもつ発現vectiorに組み換え、実験に用いている。Ex vivoでは摘出したドナー心臓に心筋保護液を注入後、HVJ-Liosome vectorにて置き換え、冷却心筋保護液中に15分間留置し、再び心筋保護液にてフラッシュし、レシピエントに同種異家移植、3日後の移植心臓を摘出し、Langendolf法による心筋潅流下に各種薬物に対する収縮反応等を検討している。In vivoでは、バルーンカテにて上行大動脈を一時遮断しながら、HVJ-Liposome vectorを冠状動脈に投与した。心機能の検討はex vivoと同様、摘出後に検討する方法と、麻酔下に超音波で測定する方法を併用している。β2-adrenergic receptorの発現は、C末端に対する抗体を用いた免疫組織化学染色で蛋白発現を検討すると同時に、導入遺伝子をプローブとしてNorthern Blotting,in situ hybrydiztionで検討中だがin vivoは予想以上に難航し現在満足な発現レベルに達していない。次に、2)トランスジェニックマウスで示した心機能の改善を成熟後の心筋への一過性の遺伝子導入法でも同様に得られるか現在検討中であるが、うまく進み出した時点でIsoproterenol刺激時のaortic mean pressure.heartrate,LV dp/dt max,摘出心におけるisometric tension等の測定を行う予定である。さらに3)HVJ-Liposome法の利点を生かした反射投与を試み、遺伝子発現と、結果としての心機能改善が長期間に渡って維持出来るかを将来検討予定である。たとえ一過性でも遺伝子導入により心機能の改善の可能性が示されれば難治性心不全の治療に道を開くと思われる。
手術用ロボットに代わる小児内視鏡手術用細径多自由度持針器の開発

先端に屈曲と回転の自由度を有する内視鏡手術用の細径持針器を東京大学大学院工学系研究科と共同開発し,既存の持針器と比較した以下の有用性評価を行った.ドライボックス内の水平面上で持針器挿入方向と垂直方向に運針した場合には,既存持針器の方が短時間で運針が可能であったが,水平方向の運針では開発した持針器の方が短時間で行える傾向を示した.また,垂直平面上に対して多方向の運針を行った場合,新型持針器を用いた方が針の湾曲に沿った理想的な軌道で,かつ,縫合対象にかかる力を少なく愛護的に運針することができていた.ウサギの生体内でも問題なく使用することが可能であった.先端に屈曲と回転の自由度を有する内視鏡手術用の細径持針器を東京大学大学院工学系研究科と共同開発し,既存の持針器と比較した以下の有用性評価を行った.ドライボックス内の水平面上で持針器挿入方向と垂直方向に運針した場合には,既存持針器の方が短時間で運針が可能であったが,水平方向の運針では開発した持針器の方が短時間で行える傾向を示した.また,垂直平面上に対して多方向の運針を行った場合,新型持針器を用いた方が針の湾曲に沿った理想的な軌道で,かつ,縫合対象にかかる力を少なく愛護的に運針することができていた.ウサギの生体内でも問題なく使用することが可能であった.腹腔鏡手術では,鉗子の自由度が少なく多方向の運針が困難である.また,小児には腹腔内容積が小さいという制約もある.本研究の目的は,小スペース内での多方向運針が要求される高難易度の新生児腹腔鏡手術を容易化する持針器を開発することである.東京大学大学院工学系研究科光石・杉田研究室と共同開発した新型持針器は,先端部に屈曲1自由度と屈曲部よりも先の長軸周り回転1自由度,把持の1自由度の計3自由度を持ち,鉗子径が3.5mmかつ屈曲部よりも先の長さが15mmとなっている.また操作部は,作成したいくつものプロトタイプを用いてシミュレーター上で医師に縫合動作を行ってもらい,直感的に使える操作部を選定した.平成24年度は,ドライボックス内に設置した水平面と垂直平面において多方向の運針タスクを医師に課し,既存持針器と比較した有用性評価を行った.水平面実験においては,刺入・刺出の正確性および運針時間に関して両持針器間で有意差は認められなかったが,既存持針器の縦方向運針では,臨床で行うと臓器損傷につながると思われる種々の操作が認められ,縦方向運針に関する新型持針器の有用性が示された.垂直平面実験においては,運針の刺入・刺出の正確性に有意差を認めなかった.運針の深さは全体的に既存持針器の方が深く,運針対象を押し込みながら運針している可能性が考えられた.運針軌道の傾きを比較したところ,左右方向運針において,新型持針器の方が運針面に対してより垂直に運針していた.つまり,新型持針器の方が理想的な運針軌道に近いと考えられた.運針対象を牽引する方向にかかる力を計測したところ,左右方向運針において新型持針器のほうが有意に小さい値であった.よって,新型持針器のほうが組織を損傷する可能性が低いと考えられた.本研究の目的は,高難易度の新生児腹腔鏡手術を容易にする持針器の開発である.これまでに,胆道閉鎖症に対する腹腔鏡下肝門部空腸吻合術を模した垂直平面上において,開発した多自由度持針器を用いることにより,多方向の運針を正確に行う事ができることを確認してきた.平成25年度は以下の実験を行った.1.肝表面における運針精度比較ウサギの腹腔内で、多自由度持針器および従来持針器を用いて肝表面に対する多方向運針を行い、運針精度を比較した。肝表面にリングを置き、外縁から中央の穴を目標に運針を行い、穴から針を刺出できたら運針成功とした。上下左右それぞれの方向に運針し、成功率、持針に要する時間、刺入から刺出までの時間を比較した。運針成功率は、多自由度持針器が既存持針器よりも有意に高かった。持針動作の所要時間は有意差を認めなかったが、運針動作の所要時間は多自由度持針器が既存持針器より有意に多くかかった。2.多自由度持針器を用いた生体内での腹腔鏡下肝門部空腸吻合術胆道閉鎖症に対する腹腔鏡下肝門部空腸吻合術を想定し、ウサギの肝下面と空腸を吻合する手技を腹腔鏡下に多自由度持針器を用いて行った。ウサギの生体内でも問題なく多自由度持針器を使用することができた.また,操作に習熟することで、早く確実に吻合できることを確認した。3.持針器の動作解析による問題点抽出多自由度持針器の問題点を抽出する目的で、多自由度持針器の習熟度、内視鏡手術経験の異なる被験者に、位置センサー等を取り付けた多自由度持針器を用いて運針操作を行わせ、多自由度持針器の動作を解析した。

多自由度持針器を用いて正確な運針を行うためには、持針器そのものの捻り動作を極力抑え、先端の屈曲自由度や回転自由度を適切に使用する事が必要で、内視鏡手術経験以上に、多自由度持針器そのものの操作方法に習熟している必要があることが明らかとなった。平成24年度は,新型持針器を用いてドライボックス内で,1.水平面における横方向運針と縦方向運針,2.垂直平面における多方向運針を行い,従来型持針器と比較した有用性評価を計画した.前述の如く,実験は予定通り遂行された.25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,新型持針器をin vivo実験で使用して有用性を評価するとともに,滅菌・洗浄性も評価した上で改良を加え,臨床応用を目指していく.25年度が最終年度であるため、記入しない。