hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
親水－疎水二重被覆空間で規制された銅ハロゲン化物クラスター錯体の光電子機能化

銅アセチリドを利用し、電極からの信号による反応選択性の開発に成功した。触媒が形成する化学結合の選択性は、触媒自身の化学構造を調節することで得られるのが通常の考え方である。本研究では銅触媒の酸化還元活性と分子骨格を伸長するカップリング反応に着目し、この選択性が分子→分子ではなく、電位の設定値→分子構造の選択性にダイレクトに変換できるスキームを開発した。炭素電極上の固定エチニル基に対し、正側の電位設定値Aと負側の電位設定値Bを印加すると、各電位印加下のみで別の基質とのカップリング反応が進行する、オルソゴナル反応性を見出した。本年度は目的とするための長鎖アルキル基を導入したトリフェニルホスフィン誘導体配位子の合成およびクラスターの調製、それらの発光特性に関するデータを得た。長鎖アルキル基を持たないキュバン型クラスター錯体は結晶層では強い黄緑色発光を示すが、加圧による結晶相の破壊するとその発光波長が長波長に移動し、セルロース担体に展開すると展開溶媒の種類によってもとの結晶相の発光をしめすか、あるいは全く発光を示さない。一方、今回新たに合成した長鎖アルキル型配位子を用いてヨウ化銅(I)と反応させると、錯形成に伴って黄色発光を示す液体が得られ、クラスター構造を液化することができたと考えられる。この液体クラスターは、非アルキル性の錯体とは異なり、無極性溶媒にも可溶であるが、少量の溶媒添加によってすぐに発光は消失する。また、これらの溶媒を用いてセルロース上に液化クラスター錯体を展開したところ、担体上に一様に分散して、溶媒の種類に関わらず同じ発光を示した。本年度は銅を架橋してクラスターを構成する要素に、有機物であるアセチリドがあることに着目し、電極応答による新たな反応選択性の開発に成功した。銅を触媒とする結合形成には、外部電子移動を必要とする酸化カップリングと電子移動を必要としないカップリングがある。またこれら両方の反応に共通する基質としてエチニル基が挙げられる。ここでエチニル基から分子骨格を伸長するときに、触媒種の銅に対する外部電子移動の有無によって、結合相手の化合物を切り替えることができる。1)酸素と窒素雰囲気の切り替えによるワンポット条件での結合形成切り替え2)炭素電極固定化したエチニル基への二種類の触媒活性化が、設定電位値に対して相補的に起こることを実証した。従来化学結合の選択性は、触媒種の分子構造が生成物の分子構造に構造的、あるいは電子的に反映されることで行われてきた。本研究ではこの選択性が分子→分子ではなく、電位の設定値→分子構造の選択性というリンクでできることを提唱している。すなわち、多種類の原料化合物を含む溶液から、電位設定によってある化学種を選んで特定の場所に固定することが可能になる。現時点でそれが実現可能であるという知見はほぼ揃えており、現在その最終段階として、すべての基質を含む溶液から電位設定条件で目的の化学種を選択的に電極に固定する実験を進めており、反応速度の調整などの検討によって良好なデータ得て発表することで、大きな反響が期待できる。本成果と合わせ、当初の目的であった銅クラスター作成は、触媒種が電極に固定され、かつ活性点が出やすいという利点がある。銅電極の酸化電解による直接的な銅アセチリドクラスターの生成により、電極固定化触媒の形成を試みた。銅電極表面に生成する銅アセチリドの形成には2段階の過程があり、初期段階においては溶液合成で生成するアセチリドポリマーと異なる構造形成を行うデータが得られた。銅-ハロゲン化物クラスター錯体は発光特性や、クラスター構造内部の電子の非局在性に由来する従来にない光物性を示すことが期待できる。一方で、銅-ハロゲン、銅-配位子間の結合が弱いためにクラスター構造は容易に再構成し、個々の分子ユニットとして用いることは困難であり、また電子移動に対して化学的に安定でないという欠点がある。本課題では銅ハロゲンキュバン型クラスターを周縁の配位子で構造的に内包し、光電子機能を引き出すことを目的とした。まず、中心のCuX4L4キュバン型骨格を安定化させるためには、4つの配位子L同士が3回対称性を持ち他の配位子と相互作用することが有効と考えた。そこでリン配位子PR3のR部分の芳香環を拡張し、互いにπスタックさせることで全ての面を等価に被覆し、内部のクラスターに合致した密な空間を構成することを試みた。R=PhおよびR=1-naphthylの配位子を用いて同様の調製法で得られたサンプルの電気化学測定を行うと、R=Phでは酸化波がブロードになり、また比率の異なる多重波が観測された。一方芳香環を拡張したR=Naphでは、明確に分離した2つの酸化波が観測された。

芳香環同士の相互作用によって内部の銅を含むユニットをサポートすることで、電子移動に対する大きな構造変換の抑制と、金属核同士の電荷反発が大きくなっていることが推測できる。また、同濃度の溶液試料を比較すると、R=Phでは発光が見られないが、R=1-naphthylでは黄色発光を示す。これは1-Naph基自体の蛍光よりも長波長にあるため、CuXクラスター骨格からの発光と考えられる。1-Naphにおける特異的な発光は、溶液中に存在するクラスター骨格への構造的な影響の他に、UV吸収を持つNaph基のアンテナ効果の寄与が考えられる。新規に合成した液体相のクラスター錯体は、流動体で膜状に塗布、担持してもその発光特性があまり変わらないという点で、当初の目的に沿った、孤立化させたクラスター錯体を発光させるという点では進捗している。しかし、発光性に関する定量評価(発光波長および強度)や、発光以外の電子移動特性などの評価がまだ途中段階である。また、クラスターを液体化することによって正確なクラスター構造の同定が困難になっており、これについては関連化合物との比較などをあわせてデータを積み重ねる必要がある。被覆基として3回対称の伸張した芳香環が有効であり、クラスターの電子移動特性を調節できる手掛かりを得ているが、一方でこの芳香環は、クラスターユニット同士でも相互作用できるため、現在得られている分子構造はきわめて溶解性が悪い。したがって同定や測定の条件検討が極めて限られている。従って、研究計画の次の段階である、現在の配位子のさらに外側に外部環境との相互作用を決める置換基を入れることで、逆に芳香族による被覆の効果の基礎的な知見が得られると考えている。まず今までに得られている発光性について、様々な基板や相において定量評価できるようにする。それを踏まえて、現在得ているクラスター錯体はそれ自身が液体相ではあるが、少量の有機溶媒を添加すると発光は消失する。アルキル部分と相互作用する溶媒や基板上の分子構造とそのアルキル部分との親和性が発光性の鍵であると考えられるので、混合する溶媒/基板表面の性質、あるいはアルキル鎖の自己集合性を用いた水・有機溶媒での界面構造形成の条件下において、主に発光性を手がかりとして各クラスター錯体の構造の柔軟性について調べる。より強固な内部クラスター構造を持つ条件下において、電子移動に対する構造安定性を調べ、光電子移動特性への応用を試みる。配位子の内部の骨格は3回対称で、配位子間の相互作用を持つものが有効と考えられる。現在サンプルの可溶化が最優先課題であるので、PNaph3をベースに合成的に修飾した新規配位子を合成する。また、この基本骨格の酸化還元特性から、酸化電位が比較的低く、準可逆でというデータが得られているため、酸化体の単離を試みる。単離および構造同定によって1電子酸化体においてクラスター骨格が保持されているか、また、多中心の金属間で、酸化に際して電荷の非局在化の判定ができる。π-スタックによるクラスター錯体の調製方法についても検討の余地があると考えている。配位子の骨格を伸張することは、配位子間の近接による相互作用を増大させるが同時に立体反発も増大させる。従って、空間に適合する被覆骨格を最適化する必要がある。ここで銅-配位子結合は溶液内で比較的容易に交換するため、2種の配位子を競合する条件とすると、異種の配位子の組み合わせで最安定な構造に収束することが期待できる。
酸素八面体金属酸化物モレキュラーシーブの創成と新触媒機能

酸素四面体構造が縮合した金属酸化物は多様な結晶性多孔材料群を造る。本研究はこれらと異なり酸素八面体構造を基本にした新しいミクロ細孔物質群を生み出すことを目的とする。また、その物質化学と特徴を活かした触媒反応を展開した。結晶性のミクロ細孔構造を有する新規なMo-V-O酸化物の合成にユニット法により成功したことを受け、5族(V,Nb,Ta)、6族(Mo,W)の元素との組み合わせへと発展させた。部分結晶性ではあるがミクロ細孔性を有するMo-V-O酸化物類縁物質の合成に成功した。これらは固体酸触媒として優れた性能を有し、また水が存在する系で有効であった。W-Ta-Oは光触媒機能を示した。Mo-V-O酸化物のミクロ細孔特性を詳細に検討し、このものは還元を受けると金属酸素結合が伸張し、ミクロ細孔径が減少することを見出した。ミクロ細孔径は物質の酸化・還元状態で制御でき、触媒反応する小アルカン分子のサイズに適合したときに初めて高い触媒活性が発現する効果が示唆された。4族から8族の金属酸化物、複合酸化物について、ユニット合成法により酸素八面体構造モレキュラーシーブを合成し、広範に新規物質事例を示すとともに、その細孔内への小分子の吸着と活性化の化学、またその特徴を活かした触媒反応を展開することを目的に研究を遂行した。1.基礎構築研究として物質合成研究を重点的に遂行したことにより、新しい酸素八面体構造モレキュラーシーブ物質の合成に成功した。ニオブ、タングステン、バナジウムなどのV族VI族を中心とした元素の酸化物、複合酸化物で酸素八面体構造モレキュラーシーブの合成を、研究室で開発した水熱合成法で展開し、全く新しい多孔性物質を見出すに至った。特にニオブの酸化物材料では表面積は予想を超えた高い物質となり、研究当初に想定していたものより細孔構造が異なるものと予想され、現在、より結晶性の高い材料へと合成を進め、また様々な角度から構造解析を進めている。2.酸化・還元性能を有するモリブデンとバナジウムで酸素八面体複合金属酸化物モレキュラーシーブを合成した場合の細孔サイズの構成元素の酸化状態による変化現象を基礎解明した。通常のシリカ系のゼオライトと異なり、この酸化物はMoを主構成元素としているため、価数の変化が容易に起こる。このことを反映して、小分子の吸着が試料を酸化雰囲気で処理した時にのみ観測され、一方低原子価状態にした場合にはまったく観測されない現象が生じた。水素還元処理に伴う触媒の還元度を求め、その値に対する各種吸着物の吸着量変化を調べたところ、明らかに触媒還元の進行に伴って、吸着量が減少することが分かった。基礎的定量データを下に、水素還元により、水素原子が酸素7員環の外周囲にある酸素原子上に存在し、これが細孔径変化をもたらしたと推定した。細孔内格子中に水素原子が存在することで、吸着物性が変化すると言う、初めての事実を明確にしたもので、酸化物-水素の従来知られているブロンズ構造体と多孔体の化学の融合が期待される。本年度はユニット合成に関する根幹となる論文を発表し、触媒分野における5族、6族を主構成元素とする酸化物触媒の新しい合成方法論を提示した。この考えに基づき、前駆体水溶液のpHを変化させることで斜方晶系と三方晶系のMoV複合金属酸化物触媒の結晶つくりわけ制御が可能であり、また使用するMo原料試薬のNH_4/Mo比を減少させると三方晶の生成pH範囲が広がることを見出した。水熱合成溶液中のモリブデン-酸素の5角形ユニットを有するMo_<72>V_<30>組成のポリオキソモリブデート濃度のpHとNH_4/Mo比依存性を調査し、三方晶の生成には低pHで5角形ユニットが安定に存在することが必須であることを明確にした。また、結晶成長に対する水熱合成温度の影響も検討し、高結晶性斜方晶Mo_3VO_x酸化物の合成に成功した。また,ユニット合成をMoやV以外の5族、6族を主構成元素とする複合酸化物の合成に展開し、類似構造体がMo-Nb-O,W-Nb-O,W-Ta-O,Nb-O,Nb-V-Oでも生成することを見出した。

特に、Mo-Nb-Oは、棒状粒子が乱雑に積み重なる形でワームホール型のメソ孔性物質を構成し、Nb比の上昇に伴い棒状粒子が発達することによって粒子間の間隙が大きくなり、孔径が大きくなることを見出した。同様のことはNb-Oにおいても起こり、極めて単純なNb_2O_5触媒でありながら、極めて効率よく芳香族のベンジルアルコールによるアルキル化に活性を示し、アルキル化物を得ることができた。通常酸化ニオブは酸触媒として知られ、この反応にも活性を示すが、本研究で合成した触媒活性に及ぶものではなく、ミクロ細孔構造形成の重要さが触媒反応においても明確となった。4族から6族の金属酸化物、複合酸化物について、ユニット合成法により酸素八面体構造モレキュラーシーブを合成し、広範に新規物質事例を示すとともに、その細孔内への小分子の吸着と活性化の化学、またその特徴を活かした触媒反応を展開することを目的に研究を遂行した。1.ユニット合成による4族、5族、6族を構成元素とする酸素八面体構造モレキュラーシーブ様複合酸化物の合成展開と触媒作用検討基材となる6族元素をタングステンに固定し、4族、5族としてジルコニア、タンタル、ニオブ、バナジウム、タングステンをそれぞれ組み合わせ、すなわちW-Zr-O, W-Ta-O, W-Nb-O, W-V-Oの合成を進めた。いずれの場合にもアンモニウムイオンを固体中に含み、特徴ある棒状結晶を生成した。固体内アンモニウムイオンを加熱により取り除くと、ミクロ細孔が形成された。このようにして合成した複合酸化物は同元素からなる従来の酸化物に比べ格段に酸触媒活性があることを見出した。また、W-Ta-Oは光触媒活性があることも見出した。現在、より結晶性の高い材料へと合成を進め、また様々な角度から構造解析を進めている。2.還元によるMo-V-O複合酸化物のミクロ細孔サイズ制御とアルカン酸化活性の関係この酸化物はMoを主構成元素としているため、価数の変化が容易に起こる。触媒を還元すると小分子の吸着量が減少することが分かり、還元によってミクロ細孔サイズが制御できることが分かった。一方、酸化触媒活性は還元により向上し、更なる還元で触媒は不活性化した。これらのことから、アルカン分子のサイズがミクロ細孔サイズと適合するときに最も活性が高くなる細孔による分子強調効果が初めて観測された。この効果によりメタンの酸化も進行することが分かった。
モデル動物を用いたHTLV-I関連疾患発症機構の解析に関する研究

ATLのほか脊髄症(HAM/TSP)や関節症などのHTLV-I関連疾患発症機構解明を目指し、我々が樹立したHTLV-I感染及び遺伝子導入ラットモデルを用いて、以下の研究成果を得た。1.脊髄症発症HTLV-I感染WKAHラット(HAMラット):HAMラット脊髄の経時的な形態や遺伝子発現の変化および分離グリア細胞を用いた検討を行った。HTLV-Iは全身への感染とともに脊髄のマクロファージ/ミクログリアに感染し、ウイルスの増殖とTax蛋白をコードするpX遺伝子の発現増強が起こる。Taxの発現は感染マクロファージ/ミクログリア系細胞にTNF-α産生を誘導し、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2の発現抑制を伴ったオリゴデンドロサイトにアポトーシスを起こし、髄鞘の破壊を招く。その後スカベンジャーとして活性化マクロファージ/ミクログリアが浸潤、増殖しさらに髄鞘の破壊を進行し、脊髄症の発症に至る。一方、その修復機転として局所のアストログリアが増殖する。以上が本モデルにおける脊髄症の発症機構として考えられた。2.種々の膠原病発症LTR-env-pX遺伝子導入ラット(env-pXラット):env-pXラットのリンパ球の特徴の解析および骨髄、脾細胞、胸腺の移植実験を行った。本ラットでは末梢リンパ球の免疫学的高反応性の獲得や免疫制御細胞の機能異常が確認された。移植実験では以下の3通りの疾患発症機構が存在した。血管炎は胸腺での、皮膚炎は末梢リンパ球での、関節炎などは標的組織ほかでの導入遺伝子が疾患発症を誘導していた。一方、2系統のenv-pXラットの内、1系統に局所でpXとTNF-αの高発現を伴うHANラット様の脳脊髄症を発症した。3.胸腺腫発生lck-pX遺伝子導入ラット(lck-pXラット):lck-pXラットの導入遺伝子の発現と胸腺腫発生の関係、腫瘍細胞の由来について検討した。胸腺腫の発生には導入遺伝子の発現量が重要であった。腫瘍は胸腺髄質上皮細胞から発生し、その前駆細胞は骨髄の浮遊系単核細胞であることを証明した。HTLV-Iは成人T細胞白血病(ATL)のほか、多岐に亘る自己免疫類似疾患を含む炎症性疾患の原因ウイルスとして注目されている。一方、感染者全員がこれらの疾患を発症するわけでない。我々はこれらの関連疾患発症機構解明を目指し、以下のモデルを作製し解析を行っている。今年度は以下の点を明らかにした。1. HAM/TSPモデルHTLV-I感染ラット脊髄ではオリゴデンドロサイトのアポトーシスの出現時期に一致してプロウイルスDNA量の増加、pXの高発現やTNF-α発現、bcl-2の一過性発現抑制を認めた。しかし、非発症系感染ラットには見られず、HAM発症系感染ラットに特徴的であった。in situ PCRによるウイルス感染細胞の同定では少なくともマクロファージ/ミクログリア系への感染が証明されるとともに、分離したオリゴデンドロサイトにも感染細胞の存在が示唆された。分離オリゴデンドロサイトの細胞死はTNF-α添加のみならず系統差やHTLV-I感染の有無に強い影響を受けた。2.膠原病発症env-pXトランスジェニックラット関節炎局所浸潤

T細胞には個体間で共通クローンの増殖やTCR VβCDR3領域に共通のアミノ酸モチーフは認めなかった。本ラットにII型コラーゲンを接種すると正常ラットとは異なり、高率に関節炎を発症した。3.上皮系胸腺腫発生lck-pXトランスジェニックラットでは、胸腺腫発生以前に分離した胸腺上皮/間質細胞で強い導入pX遺伝子の発現を確認した。本ラットの骨髄細胞を致死量の放射線照射した正常ラットに移入しても高率に胸腺腫を発生した。したがって、本ラットの胸腺腫は骨髄細胞由来の細胞と考えられた。HTLV-I関連疾患の発症機序解明に向けて、我々が独自で開発した脊髄症発症HTLV-I感染WKAHラット(HAMラット)、自己免疫疾患発症env-Px遺伝子導入ラット(env-pXラット)、胸腺腫発生lck-pX遺伝子導入ラット(lck-pXラット)で発症機構の解明を行い、以下の点を明らかにした。1.HAMラットでは脊髄局所でのTax蛋白の発現を証明した。一方、分離した脊髄細胞ではミクログリアにPx mRNAの高発現を確認した。また、このミクログリアでのTNF-α産生を確認した。HAM発症系および非発症系HTLV-I感染ラット脊髄からオリゴデンドロサイトを分離培養し、発症系感染ラットに特徴的なbcl-2の強い発現抑制があるとともに、非発症系や正常発症系ラットに比べアポトーシスを起こしやすいことを証明した。2.Env-pXラットでは正常ラット脾細胞の投与により、このラットに発症するほとんどの疾患およびII型コラーゲンで本ラットに誘導した関節炎の発症が抑制された。本ラットの脾臓では免疫制御機能を有するCD4CD25陽性細胞が脾臓の成熟過程で正常ラットと異なる動態を示しており、本ラットにおける免疫学的高反応性や疾患発症には導入遺伝子による免疫制御細胞への影響が深く関わっていると考えられた。3.lck-pXラットでは、胸腺腫細胞でTax蛋白の発現を確認するとともに、この胸腺腫細胞の培養株の樹立を行った。また、lck-pXラット骨髄細胞を致死量の放射線照射正常同系ラットに移入してもpX遺伝子、pXmRNAやTax蛋白の発現を見る胸腺腫を誘導でき、胸腺腫の由来として骨髄中に含まれる細胞が胸腺内に入り、Tax蛋白の発現を伴って上皮性胸腺腫を発生すると考えられた。1.脊髄症発症HTLV-I感染WKAHラット(HAMラット)モデル本モデルではHTLV-I感染後約3ヶ月で脊髄にプロウイルスの存在が確認でき、WKAH系の脊髄に限って7ヶ月でプロウイルスがミクログリア系細胞で増殖、pXの発現増強しTNF-αの産生を誘導、オリゴデンドロサイトでのアポトーシス抑制因子bcl-2の発現抑制とアポトーシスによるオリゴデンドロサイトの細胞死を招いていることを明らかにした。1)自己免疫疾患発症env-pX遺伝子導入ラット:胸腺移植と骨髄移植の組み合わせにより、血管炎の発症には、env-pX遺伝子を発現する胸腺におけるリンパ球の分化異常が主要な病因となっていることを明らかにした。また、本ラットで免疫制御CD4CD25陽性T細胞の機能が十分に働いていない可能性を示した。一方、2系統樹立した本遺伝子導入ラットのうち1系統で、継代を重ねることによりその一部にHAMラット類似の病態の発症を確認した。2)胸腺腫発生1ck-pX
金属界面における水素の濃度ゆらぎと動的挙動

金属-水素系は水素エネルギー関連材料から関心が持たれている。金属界面は,水素の出入口であり,同時に反応の場である。我々は,安定な白金を試料とし,白金-水素系界面の水素の状態を独自の電気化学的手法等により調べ,水素の化学ポテンシャルや水素の拡散・脱離過程等の熱力学的諸量や各種反応過程を解析した。さらに,白金界面における水素の同位体効果を調べ,白金界面におる水素の状態を明らかにした。以下に得られた具体的な知見を示す。1.Pt-水素系電池の起電力(EMF)の「ゆらぎ」とその温度依存性を測定した。結果をパワースペクトル法,相関関数法及び確率密度関数法により解析を行った。その結果,以下の知見を得た。(1)ゆらぎは系に固有のものである。(2)ゆらぎは金属界面における水素濃度のゆらぎに起因する。(3)パワースペクトル法および相関関数法の解析からこのゆらぎはマルコフ過程に分類される。(4)確率密度関数法の解析から,水素の吸着エネルギーを評価した。2.この電池をショートした時の電流特性や短路回路を外した後のEMFの回復過程等の面方位依存性と温度依存性を調べ,水素の吸着・脱離等の過程の表面構造依存性の知見を得た。特に,Pt (110)-H系の温度依存性を調べたところ,転移的な振舞いが観測され,その結果を表面再構成で議論した。また,測定の再現性を図るため酵素/水素交互吸着法(仮称)を提案した。3.白金-水素系界面における水素の同位体効果を分離係数Sの測定により調べた。質量分析計により, S値として5.0を得た。また,Sの温度依存性から界面反応の活性化エネルギーを得た。結果をBockris等の理論に従い評価し,白金-水素系の界面反応はslow recombination機構によること等を論じた。また,EMF法からは過電圧以下での情報が得られることを示唆した。尚,結果(1)は投稿準備中,(2)は投稿中,(3)は掲載済である。本研究では,水素|H^+|金属で構成される電池の起電力(EMF)のゆらぎの詳細を調べ,EMFの発生機構および金属界面における水素の動的挙動を明らかにすることを目的とし,平成7年度実施計画に基づき,特に,白金-水素系電池に関して調べた。1.Pt-水素系電池の起電力(EMF)の「ゆらぎ」に関して,(1)EMFの時間推移依存性(ゆらぎ),(2)EMFのゆらぎの温度依存性,等の観点から測定し,測定結果をパワースペクトル法,相関関数法及び確率密度関数法により解析を行った。2.解析の結果,次の知見が得られた。(4)確率密度関数法は積分法の一種であり,ゆらぎの系統的な解析に適している。この解析法から,平均値<EMF>は試料に固有(金属界面の状態に強く依存)な情報を与える。標準偏差<EMF^2>^<1/2>の温度依存性を,金属界面における水素の吸着状態により議論した。

3.この電池をショートした直後の電流の変化や短絡回路を外した後のEMFの回復過程の測定を行い,その温度依存性を調べ,金属界面での水素の吸着・脱離等の過程に関する知見を得た。本測定法は既に発表している。尚、結果の一部は平成7年10月開催の日本物理学会において発表した。前年度において,白金-水素系で構成される電池の起電力(EMF)のゆらぎを調べ,その発生機構を白金界面における水素濃度のゆらぎに基づき論じた。また,白金界面における水素・重水素の同位体効果を調べた。本年度は,独自の電気化学的方法を改良し,金属-水素系電池の電流特性や短絡回路を除いた後の起電力の回復過程から,金属界面における水素の動的状態を明らかにすることを目的とし,以下の知見が得られた。1.白金-水素系電池をショートした時の電流特性や短絡回路を外した後のEMFの回復過程等の面方位依存性と温度依存性を調べ,白金界面での水素の吸着過程や吸着点の表面構造依存性の知見を得た。特に,Pt(110)-H系の温度依存性を調べたところ,転移的な振舞いが観測され、その結果を表面再構成で議論した。また,測定の再現性を図るため酸素/水素交互吸着法(仮称)を提案した。2.次に物質依存性であるが,これまでに,周期律表におけるVIB-VIIB族を境としてその前後で電流特性に本質的な差異が認められていた。とりわけ,Moでは異常に大きい電流特性を認めており,本研究では,Mo単結晶-水素系に関しての詳細を調べた。その結果,起電力や電流特性やそれらの温度依存性に関して大まかにMo(111)-H系とMo(110)及び(100)-H系に分類できた。また,それらの温度依存性から,Mo(111)-H系では転移的な振舞いが観測された。3.Pt単結晶-水素系と比較した場合,Pt-H系の場合にはPt(110)-H系とPt(111)及びPt(100)に分類でき,また前者の場合には転移的な振舞いが観測されている。これらの結果を表面構造(Mo;bcc/Pt;fcc)と表面再構成で議論した。また,Mo-H系とPt-H系の吸着エネルギーの違いに関しても調べた。尚,結果の一部は投稿中である。また,結果を日本物理学会で発表及び発表を予定している。
高血圧性動脈硬化進展の分子機構-細胞肥大における転写因子の役割-

1.培養血管平滑筋細胞の肥大における転写因子の関与(1)angiotensin II(AII)により肥大させたSprague-Dawleyラットの培養血管平滑筋細胞(VSMC)に、cationic liposemeを用いて転写因子Sp1と、STAT1、STAT2の認識配列であるISRE、GAS、SIEに対応したDNA decoyの細胞内導入を行い、対照としては、random DNA decoyを用いた。(2)Spl、ISRE配列、ISE配列またはGAS配列をもつ0.2μM濃度のDNA decoyの導入により、A II刺激後の培養VSMCにおける3H-leucineの取り込みはそれぞれ減少し(69%,58%,66%,41%)、これらの減少はdecoyの濃度に依存的であった。同時に、PDGFのA鎖のmRNA量および3H-thymidineの取り込みも減少したが,random配列のDNA decoyの導入では以上の変化は認めなかった。VSMCの肥大にSTAT系転写因子の関与が示唆された。2.高血圧自然発症ラットの高血圧性動脈硬化病変における、STAT1、STAT2の関与(1)15週齢の高血圧自然発症ラット(SHR)の胸部大動脈中膜において、ISRE、GAS、SIEを含む2本鎖DNAをプローブとして、各転写因子量を測定した。(2)GASならびにSIE配列結合性の転写因子は約20%の増加を認め、PDGFのA鎖の遺伝子発現量は約30%増加し、これらの増加はA II受容体拮抗薬により抑制された。STAT系転写因子は高血圧性動脈病変に関与する可能性が示唆された。3.SHRの大腿動脈へのDNA decoyの細胞内導入による高血圧性動脈硬化病変の変化(1)SHRの大腿動脈にISRE配列、SIE配列またはGAS配列をもつDNA decoyを導入した結果、血圧の変化は伴わずにhypertrophy indexはそれぞれ減少した(85%,88%,81%)。(2)組織学的な検討では各DNA decoyの投与により、動脈中膜の断面積の減少(10%)を認めた。Random配列のDNA decoyの導入では以上の変化は認めなかった。高血圧性動脈壁肥大の進展にはA IIを介したJak/STAT系の関与が示唆された。1)培養血管平滑筋細胞の肥大における転写因子の関与c)肥大に対する影響を検討したところ、^3H-thymidineのuptakeは、約80%に減少し、^3H-leucineのuptakeも約85%に減少し、VSMCの肥大にSTAT系転写因子の関与が示唆される。2)高血圧自然発症ラットの高血圧性動脈硬化病変における、STAT1、STAT2の関与a) 15週齢の高血圧自然発症ラット(SHR)の胸部大動脈中膜を分離し、既報の方法によりヒストンを除去した細胞抽出液を準備した。d)体重に対する胸部大動脈の重量の比を計算して肥大計数とし、約20%の増加を認めた。GASならびにSIE配列結合性の転写因子は約20%の増加を認め、PDGFのA鎖の遺伝子発現量は約30%増加した。STAT系転写因子は高血圧性動脈病変に関与する可能性が示唆される。1.培養血管平滑筋細胞の肥大における転写因子の関与

(1)angiotensin II (AII)により肥大させたSprague-Dawleyラットの培養血管平滑筋細胞(VSMC)に、cationic liposemeを用いて転写因子Sp1と、STATI、STAT2の認識配列であるISRE、GAS、SIEの対応したDNA decoyの細胞内導入を行い、対照としては、random DNA decoyを用いた。(2)Sp1、ISRE配列、ISE配列またはGAS配列を持つ0.2μM濃度のDNA decoyの導入により、AII刺激後の培養VSMCにおける3H-leucineの取り込みはそれぞれ減少し(69%,58%,66%,41%)、これらの減少はdecoyの濃度に依存的であった。同時に、PDGFのA鎖のmRNA量および3H-thymidineの取り込みも減少したが、random配列のDNA decoyの導入では以上の変化は認めなかった。VSMCの肥大にSTAT系転写因子の関与が示唆された。2.高血圧自然発症ラットの高血圧性動脈硬化病変における、STAT1,STAT2の関与(1)15週齢の高血圧自然発症ラット(SHR)の胸部大動脈中膜において、ISRE、GAS、SIEを含む2本鎖DNAをプローブとして、各転写因子量を測定した。(2)GASならびにSIE配列結合性の転写因子は約20%の増加を認め、PDGFのA鎖の遺伝子発現量は約30%増加し、これらの増加はAII受容体拮抗薬により抑制された。STAT系転写因子は高血圧性動脈病変に関与する可能性が示唆された。3.SHRの大腿動脈へのDNA decoyの細胞内導入による高血圧性動脈硬化病変の変化(1)SHRの大腿動脈にISRE配列、SIE配列またはGAS配列をもつDNA decoyを導入した結果、血圧の変化は伴わずにhypertrophy indexはそれぞれ減少した(85%,88%,81%)。(2)組織学的な検討では各DNA decoyの投与により、動脈中膜の断面積の減少(10%)を認めた。Random配列のDNA decoyの導入では以上の変化は認めなかった。高血圧性動脈壁肥大の進展にはAIIを介したJak/STAT系の関与が示唆された。
タンパク質飢餓への適応と生存維持における肝臓セリン合成を介した臓器相関の分子機構

本研究は,全身レベルでのタンパク質栄養の不足・飢餓に適応して生存を維持する応答機構における肝臓でのde novoセリン合成の必須性を,セリン合成酵素Phgdhの肝臓特異的なKOマウスを用いることで解明を目指した。de novoセリン合成系を担うリン酸化経路を構成する酵素Phgdh, Psat1およびPsphの発現は,摂取するタンパク質の栄養状態に敏感に応答し,タンパク質飢餓の際には高レベルに誘導されることが知られている。この応答がタンパク質飢餓への適応と生存維持に果たす役割を,特に肝臓でのアミノ酸代謝恒常性と遺伝子発現応答,さらに腸管との臓器間機能連関を基軸に解析を行った。本研究課題は,タンパク質栄養飢餓に適応し生存を維持する応答機構における肝臓セリン合成の必須性を,肝臓と腸管の機能連関を基軸に分子レベルで解明する事を目的としている。代表者は,肝実質細胞でセリン合成能を喪失した肝臓特異的系Phgdh KO(LKO)マウスを作製しており,それらに無タンパク質食を摂取させることで現れる表現型から肝臓と腸管間の機能連関の解明を目指している。平成26年度は,LKOマウス表現型について以下の予想外の結果を得た。LKOマウスは肝実質細胞にCreタンパク質を発現させるアルブミン遺伝子プロモーターをTGマウスより導入することで作製した。まず肝臓ではPhgdh遺伝子の不活性化をゲノムでのnullアリルの存在によって確認した。また,Phgdh mRNAをQRT-PCR法により定量することで,同腹正常個体の40%レベルに低下していることを確認した。これはPhgdhが肝臓非実質細胞に発現している可能性を示す。しかしながら,通常の給餌条件でLKO肝臓のアミノ酸分析を行うと遊離セリン含量は正常対照とほぼ同レベルであり,量的低下を検出できなかった。また血清遊離アミノ酸濃度を測定すると,セリンは正常対照と同レベルであるが,グリシンが40%程度にまで低下しており,一方でグルタミン酸が増加していた。このプロファイルより,LKOが肝臓以外の末梢臓器でグリシンからの変換系によりセリンを代償的に合成し,肝臓に供給している可能性が推定された。そのためLKO主要末梢臓器の遊離アミノ酸分析を行い,腎臓と筋肉において正常対象よりセリン含量が増加しており,肝臓への供給源となっていることが明らかとなった。また,LKOマウスに無タンパク質を短期間給餌(48時間)するとPhgdh mRNAは増加するが,外見上下痢等の腸管機能異常所見は生じず,より長い期間の給餌が必要であることが明らかとなった。代表者は,肝実質細胞でセリン合成能を喪失した肝臓特異的系Phgdh KO(LKO)マウスを作製しており,タンパク質栄養低下により現れる表現型から肝臓と腸管間の機能連関の解明を目指している。平成27年度は,前年度明らかとなった通常給餌条件下の同マウス肝臓でセリン濃度が維持されていることを前提に,無タンパク質食摂取および一般表現型について解析を行った。開始に先立ち,代表者所属機関に本課題に関連する動物実験として無タンパク質食摂取実験計画を申請した際,開始時体重から20%の減少が生じた段階を人道的エンドポイントと設定して実験中止することが承認条件とされた。申請時の予備検討では無タンパク質食給餌2週目以降から死亡する個体が出現し,3週間後に腸管機能異常を伴って生存率が劇的に低下した。そこで無タンパク質給餌下でLKOマウス体重測定と生存率を経時的に検討したところ,給餌後2週間で既に体重が20%近く低下しており,生存率や腸管機能に顕著な変化が現れる前に実験を中止しなくてはならないことが判明した。給餌後2週間経過した状態では,野生型マウス肝臓ではPhgdhが顕著に誘導されるが,LKO肝臓では全く誘導が起こらず,肝臓セリン合成能は大きく低下していることが示された。しかし今回設定された人道的エンドポイントにより,当初意図していた無タンパク質摂食による肝臓と腸管間の機能連関について申請時プロトコールにより解析を行うことが困難となった。そこで通常給餌条件下での表現型につても解析を行ったところ,LKOマウス肝臓においてインスリンシグナル経路の減弱が認められ,Phgdh不活性化がインスリン抵抗性を惹起している可能性が強く示唆された。LKOマウス肝臓でのセリン含量が,当初の予想と異なりほぼ正常対照と同レベルに維持されていることが平成26年度の解析から明らかとなった。それは腎臓と筋肉による合成・供給により代償されていることに起因すると考えられた。その結果を踏まえ,予備的結果として得ていた無タンパク質食の長期給餌(3週間)による生存率低下と腸管機能低下の再現性確認を行ったが,給餌開始後約2週間で所属機関動物実験委員会により設定された人道的エンドポイント(体重20%減で実験中止)に抵触してしまった。そのため,生存率及び腸管機能の低下を観察出来る前に実験を停止せざるを得なかった。無タンパク質食給餌2週間後の実験停止の段階では,野生型肝臓でのPhgdh発現は顕著に誘導されていたが,LKOではそれが認められなかった。また,いずれの遺伝子型においても小腸幹細胞マーカーであるLgr5のmRNA発現量に有意な違いは認められなかった。

一方で小腸でのPhgdh発現について組織化学的発現解析を行い,腸陰窩の極少数の細胞に抗体陽性シグナルを検出したことから,小腸でのセリン合成能は低いと推定した。無タンパク質食摂取実験については予備的結果を得たものの,申請時に予定していた3週間継続する給餌実験の実施が不可能となったため,改変給餌プロトコールを策定中であり,平成28年度に実施の予定である。昨年度に動物実験委員会によって設定された人道的エンドポイント(体重20%減で実験中止)に従い、無タンパク質食摂取による肝臓特異的Phgdh KO(LKO)マウス肝臓と小腸の変化について、小腸幹細胞マーカー遺伝子発現および遊離アミノ酸組成に着目して解析を行った。体重が20%減少に達するまでの期間はLKOおよび対照群(Floxed、野生型)とも約14日間であった。その段階での体重は各遺伝子型とも無タンパク質食摂取は正常食(カゼイン20%)摂取に比べて経時的に有意に減少したが、各遺伝子型群間に有意差は認められなかった。摂食量も同傾向であり、全遺伝子型で無タンパク質食摂取により有意に低下していた。肝臓の形態にも影響は認められなかった。この条件で小腸幹細胞マーカーとして昨年度行ったLgr5に加えOlfm4とPhlda1の発現について検討したが、いずれも摂餌条件による発現変化は認められなかった。両組織におけるセリンを中心とした遊離アミノ酸分析から、野生型およびFloxed肝臓においては、無タンパク質摂取は正常食に比べて有意なセリン増加を確認した。LKO肝臓では無タンパク質食摂取でセリンは変化していなかったが、グリシンは無タンパク質食によりほぼ半減していた。小腸では、肝臓同様にセリンについて摂餌条件による有意な変化は認められず、グリシンは、Floxed群のみ無タンパク質食摂取による有意な量的減少を見いだした。小腸Phgdh mRNAレベルも各遺伝子型で摂餌条件による有意な違いは認められなかった。以上の結果を総合すると、肝臓実質細胞でPhgdhを欠損すると、タンパク質制限条件下でグリシンからSHMT1/2によるセリン合成を増やしてそのレベルを維持していると推定された。その際に小腸のセリンは維持され、予想とは異なり小腸幹細胞の増殖や分化に与える影響は少ないものと判断された。本研究は,全身レベルでのタンパク質栄養の不足・飢餓に適応して生存を維持する応答機構における肝臓でのde novoセリン合成の必須性を,セリン合成酵素Phgdhの肝臓特異的なKOマウスを用いることで解明を目指した。de novoセリン合成系を担うリン酸化経路を構成する酵素Phgdh, Psat1およびPsphの発現は,摂取するタンパク質の栄養状態に敏感に応答し,タンパク質飢餓の際には高レベルに誘導されることが知られている。この応答がタンパク質飢餓への適応と生存維持に果たす役割を,特に肝臓でのアミノ酸代謝恒常性と遺伝子発現応答,さらに腸管との臓器間機能連関を基軸に解析を行った。平成26年度にLKOマウス肝臓でのセリン含量が,当初の予想と異なりほぼ正常対照と同レベルに維持されていることが明らかとなった。この現象は今後の研究と得られた結果の解釈に大きく影響するため,その分子的背景の解明に大部分の時間を費やすこととなった。結果的には,上記の腎臓と筋肉における代償的合成・供給の可能性を見いだした。
既設構造物背後における円柱の空力振動の発生機構解明と風力発電可能性に関する研究

複数物体の背後において、上流側物体のウェイクに位置する円形断面の構造物や部材に生じる振動現象(ウェイクエクサイテーション)を対象として、円柱の表面粗度がウェイクエクサイテーションの応答特性に及ぼす影響の把握と流れの可視化によるその振動発生メカニズムの解明、建物屋上部における自然風作用下の円柱に生じるウェイクエクサイテーションの発電可能性を調査検討した。複数物体の背後において,上流側物体のウェイクに位置する円形断面の構造物や部材に生じる振動現象は,斜張橋の並列ケーブルのウェイクギャロッピングや送電線におけるウェイクインデュースドフラッター等がよく知られている.そして,これらの現象は,上流側物体の後流と下流側物体の相互干渉作用による自励振動である.本年度においては,その振動発生のメカニズム並びに振動応答特性に及ぼすレイノルズ数や固有振動数の影響等について検討し,得られた成果を以下に示す.・下流側円柱の応答特性は,円柱の固有振動数fと円柱の直径Dで風速Uを無次元化した換算風速U/fDによって説明することができず,レイノルズ数UD/vに依存していることが再確認された.・上流側円柱からの剥離せん断層の影響を調査するため円柱表面に粗度を付与した場合には,気流直交方向とともに気流方向にも応答振幅が増大することもあることが明らかとなった.・ヘリカルワイヤーを30度の傾きで3本設置した場合には,ヘリカルワイヤーの直径が円柱の4%程度以上になると円柱の直径と同程度の大振幅のウェイクギャロッビングの応答が発生しなくなり,円柱の半径と同程度の応答は安定して発生することが確認された.・2段階の応答振幅は,上流側円柱背後の風速分布計測から,上流側円柱のカルマン渦のほぼ中心(円柱の半径と同程度の小振幅応答)と上流側円柱の剥離境界層(円柱の直径と同程度の大振幅応答)に密接に関連していることが明らかとなった.複数物体の背後において,上流側物体のウェイクに位置する円形断面の構造物や部材に生じる振動現象は,斜張橋の並列ケーブルのウェイクギャロッピングや送電線におけるウェイクインデュースドフラッター等がよく知られている.そして,これらの現象は,上流側物体の後流と下流側物体の相互干渉作用による自励振動である.本年度は,その振動発生のメカニズム並びに振動応答特性に及ぼす表面粗度の影響等について検討し,得られた成果を以下に示す.・円柱の表面に設置した粗度を定量的に評価するために、平板上に粗度を敷き詰めて、その表面粗度上に発達する境界層特性から、粗度長を求めた.・円柱表面に粗度を付与した場合には,後流側円柱に生じるウェイクギャロッピングの振動が低風速で生じるとともに応答振幅が増大することもあるが,逆に、高風速においては、大振幅の応答が発現せず、応答振幅が円柱の半径と同程度に留まることも明らかとなった.・ヘリカルワイヤーの傾きを大きくすると気流の2次元性が低下し、20度以上の傾斜を与えると不安定振動が抑制されることが確認できた.・本研究で対象としている2円柱間の中心間隔が直径の3倍で比較的質量や減衰が小さい場合には,2段階の応答振幅(小振幅は半径程度であり,大振幅は直径と同程度から1.5倍程度まで風速の増加とともに増大する)が,発生ずることが昨年度の研究から明らかとなっている.これは,円柱周りの流れの可視化実験から,小振幅の振動現象は上流側円柱背後に形成される止水領域に後流側円柱が位置し,振動時に上流側円柱の剥離流が下流側円柱の上流側剥離流の発生している側面と逆方向の側面に流れ込む従来から指摘されている流れのスイッチング現象に起因していることが確認できた.一方,大振幅現象は上流側円柱背後にカルマン渦が生じており,平均的な上流側円柱の剥離境界層に応答振幅が密接に関連していることが明らかとなった.複数物体の背後において,上流側物体のウェイクに位置する円形断面の構造物や部材に生じる振動現象は,斜張橋の並列ケーブルのウェイクギャロッピングや送電線におけるウェイクインデュースドフラッター等がよく知られている.そして,これらの現象は,上流側物体の後流と下流側物体の相互干渉作用による自励振動である.本年度は,その振動発生のメカニズム並びに風力発電装置としての可能性等について検討し,得られた成果を以下に示す.・本研究で対象としている比較的質量や減衰が小さい2本の円柱状物体の中心間隔が直径の3倍に配置された場合には,2段階の応答振幅(小振幅は半径程度であり,大振幅は直径と同程度から1.5倍程度まで風速の増加とともに増大する)が,発生することが本研究によって明らかとなっている.さらに,円柱表面に粗度を付与した場合には,大振幅の応答が低風速で生じることも明らかとなった。この低風速における大振幅応答のウェイクギャロッピングも表面粗度を付与していない円柱の高風速におけるウェイクギャロッピングの振動と同様なメカニズムで発生していることが流れの可視化から明らかとなった。

・5階建て建物の屋上のパラペットや手摺の背後に上下振動が可能なように支持された1本の円柱の自然風中におけるウェイクギャロッピングの応答特性について設置位置等を変化させて調査を行ったが、観測期間中においては、明確なウェイクギャロッピングの発生について確認できなかった。本年度における研究実施項目として,構造物背後に設置された円柱に生じる空力振動特性を各種風洞実験によって調査・検討し,さらには,この空力不安定振動現象の風力発電への適用性についても検討するとともに実構造物を利用した風力発電のための風況調査を挙げており,おおむね計画通りに実験・観測等を順調に進展することができているため.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22年度,本年度と予定された計画に沿っておおむね順調に研究が遂行されており,平成24年度においては,後流側円柱に生じるウェイクギャロッピング振動発生のメカニズムをより明らかにするとともに自然風の作用下において構造物背後に設置した円柱に生じるウェイクギャロッピングを利用した風力発電の可能性を検証する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
歯の形態の個体レベルでの解析による先史・原史時代日本列島住民の地域性と系譜

大陸より渡来したと考えられている北部九州および山口地方の弥生人の骨格形態が、土着の縄文人と大きく異なることは周知のとおりでる。本研究では、まず第一に、歯の形態から渡来系弥生人が縄文人とどの程度まで判別可能なのかを分析した。その結果、縄文人と渡来系弥生人は最大90%以上の正答率で判別することが可能であった。次にこの結果を応用し、日本列島から発見されている他の弥生人骨について、土着の縄文人と渡来人のどちらの特徴が強いかの判別を試みたところ、広島県帝釈名越の1例は渡来系、愛媛県の釈迦面山の1例は土着系、奈良県の唐古・鍵遺跡の2例は渡来系、長野県の伊勢宮遺跡の7例中6例が渡来系、篠ノ井遺跡の3例がすべて土着系、群馬県の岩津保遺跡の2例のうち1例は土着系、他の1例は中間型、神奈川県の毘沙門洞穴の3例のうち2例は渡来系、1例が土着系、千葉県房総半島の佐野洞穴と安房神社の5例すべては土着的要素が強いと判定された。以上の結果から、少なくとも東海地方および関東西部の太平洋岸地域,あるいは長野県にいたる中部地域にも渡来人の遺伝的影響が相当な程度まで及んでいたことが示唆された。一方、渡来系弥生人の起源については、同じく歯の形態の比較から、中国江南地域の前漢時代の人々に強い類似がみられ、この地域が弥生人の原郷の有力候補地であることが示唆された。縄文人の歯の分析からは、後期旧石器時代の東南アジアに起源が求められる結果となった。
受精と妊娠の蛍光生体イメージング

わが国における少子化問題は存在感が大きくなる一方であり、世界的にも、先進国の間で不妊と認定されるカップルの比率は6組に1組まで増加するなど、受精と不妊に関する研究は要求度が増す一方である。一方、ここまで哺乳類の受精に関する研究は“いかにして受精卵(胚)を得るか"などの試験管内で再現できる課題に偏ってきた面がある。実際には、哺乳類の受精や着床は母体内で起こるが、その点において我々が持っている知見はあまりに狭く、また、試験管内での受精卵の挙動は必ずしも体内とは一致しないことが知られ始めている。そのため母体高齢化などの問題と関連しながら、母体内で起こっていることの知見が急速に求められている。本研究では、遺伝子組み換え技術とライブイメージング技術を駆使することで、これまで見るのが不可能とされてきた母体内での受精・着床・妊娠の様子を、蛍光in vivoライブイメージング技術を駆使することで明らかにするのが目的である。計画全体としては、1)受精のin vivoライブイメージングと2)着床・妊娠のin vivoイメージングとに大別して進めてきた。このうち、1)では、蛍光プローブの開発とともに、特に精子が雌性生殖器内を上ってから卵が発生を開始するまでの主な5つのイベントを可視化することが目的である。また、2)では、妊娠マウス中の胎盤を非侵襲的に経時観察する手法について検討していく。ここまでに、1)の中の卵Ca2+振動と多精子受精拒否の成立について、前年度に得られた結果を発展させる様々な発見につながり、卵が不必要な精子にさらされるリスクを回避するメカニズムについて、新たな蛍光プローブを用いて定量的に解析することに成功し、新たなメカニズムを明らかにすることができた(論文投稿中)。また、2)については、多角的に進行してきたMRI(核磁気共鳴画像法)での解析が一定の成果を上げている。26年度が最終年度であるため、記入しない。哺乳類の受精や着床は母体内で起こる。そのため、今でもそこで起こっていることは断片的にしか知られておらず、ここまでの研究は“いかにして受精卵(胚)を得るか"などの試験管内で再現できる課題に偏ってきた。しかし、現在、先進諸国を中心に母体高齢化などの問題と相まって母体内で起こっていることの知見が急速に求められている。本研究では、遺伝子組み換え技術とライブイメージング技術を駆使して、これまで見るのが不可能とされてきた母体内での受精と着床・妊娠の様子について蛍光in vivoライブイメージングを用いて明らかにすることを目的にしている。本研究では、計画全体を(1)受精のin vivoライブイメージングと(2)着床・妊娠のin vivoライブイメージングとに大別している。このうち、(1)では、蛍光プローブを開発して特に精子の遡上・卵と精子の融合・卵Ca2+振動・多精子受精拒否の成立・卵割開始の5つのイベントを可視化することを目的としている。また、(2)では、レンチウィルスを用いた胎盤特異的な遺伝子導入法などを用いて、妊娠マウス中の胎盤を非侵襲的に経時観察する手法について検討していく。この中で、本年度は特に(1)の中の卵Ca2+振動と多精子受精拒否の成立について、蛍光プローブの開発と定量的解析の手法に大きな進展があった。また、そのほかの項目についても順調に進行している。ここで得られた結果は、生殖医療への応用のみならず、生物学の発展と応用について重要な知見になることは間違いない。

本研究における主な実験項目は、(1)受精のin vivoライブイメージングと(2)着床・妊娠のin vivoライブイメージングとに大別できる。そのうち、(1)の中では、不妊の要因として予想される、精子の遡上・卵と精子の融合・卵Ca2+振動(卵の活性化、細胞周期の再開)・多精子受精拒否の成立・卵割開始という5つのイベントに特に注目し、これらを可視化すること、そしてできる限りその結果について定量的に解析を行うことを目的としている。また、(2)では、レンチウィルスを用いた胎盤特異的な遺伝子導入法などを用いて、妊娠マウス中の胎盤を非侵襲的に経時観察する手法について検討していく。この中で、本年度は特に(1)の中の卵Ca2+振動について、卵へのRNA注入(マイクロインジェクション)法による、非常に侵襲性の低い可視化法を検討し、この結果、卵Ca2+振動に対する受精顆粒の放出などについて、定量的な解析を行うことに成功し、胚の質や多精子受精拒否の成立について新たな事実を明らかにすることができた。また、受精顆粒についてはさらに、主要な構成蛋白質と蛍光蛋白質との融合蛋白質の遺伝子を成熟前の卵子にマイクロインジェクションすることで顆粒形成メカニズムの可視化にも成功している。そのほか、従来のES細胞を用いた遺伝子ノックアウト法に加えて、新たに申請者らが開発したCRISPR/Cas9プラスミドDNAインジェクション法による遺伝子改変動物作製法(Mashiko et al., Sci. Rep. 2013、およびMashiko et al., Dev. Growth. Differ. 2014)を用いることで、迅速に遺伝子欠損個体および点変異導入体を作製することに成功したため、これを用いて特に初期化における精子側・卵側の重要因子について、それぞれ複数の遺伝子の欠損個体/点変異個体の作製に成功した。26年度以降は、これまでに得られた知見について積極的に論文として発表していくとともに、作出した遺伝子変異個体に対してこれまでに確立した観察法を適用することで、重要と目される因子、またはその変異箇所が、受精や卵の活性化にどのような働きを持っているのかを明らかにしていく。また、in vivoイメージングの実現のために、これまで用いてきた蛍光プローブの遺伝子を卵または精子中で特異的に発現する遺伝子組換え個体を作出し、ここまでに得られた知見(培養環境中)と生体内での反応の差を見出すことを目的に、具体的には卵Ca2+振動プローブであるCa2+結合蛍光蛋白質の遺伝子を卵特異的発現ベクターに導入して、受精時のCa2+振動を卵管外から観察するなどを目指していく。そのほか、(1)で掲げた諸現象について、25年度に複数の可視化に成功しているため、これらイベント間の連携について各イベントのプローブを組み合わせ、多次元ライブイメージングの手法を行うことで、継時的な変化を観察する。(2)で挙げた研究についても、遺伝子改変技術をより活用し、特に胎盤関連の因子をターゲットに、浸潤不全や胎児の扶育につながる因子を破壊するなど、イメージングの材料をより積極的に開発していく。