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宿主防御機構としての粘膜免疫系の老化にともなう変動

歯周疾患をはじめとする口腔感染症において粘膜免疫系は重要な宿主防御機構として働くことが予想されるが,老化にともなう変動については依然不明な点が数多く残されている.そこで,老化促進マウス(SAMマウス)系あるいは老化マウスを用いて検討し,以下の成績を得た.1.老化徴候を示すSAM-PマウスB細胞のマイトジェン活性は対照のSAM-RマウスB細胞比較して有意に低かった.2.PgLPS刺激後の多クローン性B細胞活性化反応も,マイトジェン活性同様,SAM-PマウスB細胞でその反応性が有意に低下していた.しかし,多クローン性B細胞活性化反応の低下が現れる月齢は,マイトジェン活性の低下発現の月齢とが若干異なっていた.3.コレラトキシンをアジュバントにした口腔免疫系(粘膜免疫系)の成績からは,老化マウスの実効組織(消化管粘膜固有層およびパイエル板)で,全身免疫系(脾臓)と同様に,老化にともなう反応性の低下が観察された.4.しかし,12ヶ月齢,24ヶ月齢の老化マウスでの反応性の比較検討から,粘膜免疫系での老化にともなう反応性の低下は,全身免疫系とくらべて,比較的早期に認められる可能性が示唆された.5.老化マウスのT細胞について検討した結果,細胞レベルでの反応性(マイトジェン活性)の低下は認められなかったが,T細胞ポピュレーションの変動,特に胸腺外分化T細胞率の上昇が観察された.以上の成績より,宿主防御機構としての免疫系では,老化にともないB細胞では個々の細胞レベルでの反応性の低下,T細胞では細胞ポピュレーションの変動が惹起されていることが明らかとなった.これら免疫担当細胞の老化にともなう細胞レベルでの変動および細胞のポピュレーションの変動が結果として,粘膜免疫系の実効組織での老化にともなう反応性の低下につながっていることが強く示唆された.歯周疾患をはじめとする口腔感染症において粘膜免疫系は重要な宿主防御機構として働くことが予想されるが,老化にともなう変動については依然不明な点が数多く残されている.そこで,老化促進マウス(SAMマウス)系あるいは老化マウスを用いて検討し,以下の成績を得た.1.老化徴候を示すSAM-PマウスB細胞のマイトジェン活性は対照のSAM-RマウスB細胞比較して有意に低かった.2.PgLPS刺激後の多クローン性B細胞活性化反応も,マイトジェン活性同様,SAM-PマウスB細胞でその反応性が有意に低下していた.しかし,多クローン性B細胞活性化反応の低下が現れる月齢は,マイトジェン活性の低下発現の月齢とが若干異なっていた.3.コレラトキシンをアジュバントにした口腔免疫系(粘膜免疫系)の成績からは,老化マウスの実効組織(消化管粘膜固有層およびパイエル板)で,全身免疫系(脾臓)と同様に,老化にともなう反応性の低下が観察された.4.しかし,12ヶ月齢,24ヶ月齢の老化マウスでの反応性の比較検討から,粘膜免疫系での老化にともなう反応性の低下は,全身免疫系とくらべて,比較的早期に認められる可能性が示唆された.5.老化マウスのT細胞について検討した結果,細胞レベルでの反応性(マイトジェン活性)の低下は認められなかったが,T細胞ポピュレーションの変動,特に胸腺外分化T細胞率の上昇が観察された.以上の成績より,宿主防御機構としての免疫系では,老化にともないB細胞では個々の細胞レベルでの反応性の低下,T細胞では細胞ポピュレーションの変動が惹起されていることが明らかとなった.これら免疫担当細胞の老化にともなう細胞レベルでの変動および細胞のポピュレーションの変動が結果として,粘膜免疫系の実効組織での老化にともなう反応性の低下につながっていることが強く示唆された.歯周疾患をはじめとする口腔感染症において粘膜免疫系は重要な宿主防御機構として働くことが予想されるが,老化にともなう変動については依然不明な点が数多く残されている.そこで本研究では,粘膜免疫系で中心的役割を果たすB細胞を対象に,成人性歯周炎の原因菌であるProphyromonas gingivalisのLPS(Pg-LPS)に対する機能的受容体およぴ反応性の老化にともなう変動について検討する.本年度は,まず老化(SAM)マウスの脾臓B細胞を用いて,Pg-LPSによるマイトジェン活性および多クローン性B細胞活性化反応について検討した.その結果,老化徴候を示すSAM-PマウスB細胞および対照のSAM-RマウスB細胞とも,培養2日目にマイトジェン活性の反応性のピークが認められた.しかし,SAM-PマウスB細胞の反応性はSAM-RマウスB細胞と比較して有意に低いことが明らかとなった.一方,Pg-LPS刺激後の抗ヒツジ赤血球抗体産生細胞数から測定した多クローン性B細胞活性化反応も,マイトジェン活性同様,SAM-PマウスB細胞でその反応性が有意に低下していた.しかし,SAM-Pマウスでマイトジェン活性の低下が現れる月齢と多クローン性B細胞活性化反応の低下が現れる月齢が若干異なることが認められた.

そこで次年度には,これらの成績をもとに,研究実施計画通り,B細胞上のPg-LPSに対する機能的受容体であるCD14およびToll-like receptorsの発現状況についてmRNAレベルでの解析を行い,B細胞の細胞レベルでの老化にともなう変化について明らかにするとともに,機能面での特異性との関連性についても検討を加える予定である.歯周疾患をはじめとする口腔感染症において粘膜免疫系は重要な宿主防御機構として働くことが予想されるが,老化にともなう変動については依然不明な点が数多く残されている.そこで本年度は,老化促進マウス(SAMマウス)系あるいは老化マウスを用いて粘膜免疫系の組織レベル・細胞レベルでの老化について,全身免疫系と比較検討し以下の成績を得た.1.アジュバントとしてコレラトキシン(CT)を添加したOVA抗原を用いた口腔免疫系(粘膜免疫系)の成績からは,老化マウスの実効組織(消化管粘膜固有層およびパイエル板)では,全身免疫系(脾臓)と同様に,老化にともなう反応性の低下が観察された.2.SAMマウスの免疫担当細胞を用いた検討から,粘膜免疫系の老化にともなう反応性の変動は,B細胞では個々の細胞レベルでの反応性の低下によること,T細胞では細胞ポピュレーションの変動によることが示唆された.すなわち,老化マウスでは,サイトカイン産生能の低下といった細胞レベルでの反応性の変動とともに,胸腺外分化T細胞率が上昇しており,結果として,粘膜免疫系の実効組織での老化にともなう反応性の低下が誘導されることが強く示唆された.3.また,12ヶ月齢および24ヶ月齢の老化マウスを用いた検討から,粘膜免疫系での老化にともなう反応性の変動は,全身免疫系とくらべて,比較的早期に認められる可能性が示された.以上の成績より,宿主防御機構としての粘膜免疫系の老化にともなう反応性の変動は,全身免疫系と比較して早期に発現すること,その変動は免疫担当細胞の老化にともなう細胞レベルでの変動および細胞のポピュレーションの変動によることが示唆された.
インゲンマメにおける緑色光の小葉運動と葉枕活動電位に及ぼす影響に関する研究

インゲンマメの小葉運動における緑色光の効果を明らかにするため、赤色光(Red;>600nm),緑色光(Green;>500nm,<600nm)、青色光(Blue;<500nm)、および白色光(White)からこれらを除去した光(-Red,-Green,-Blue)をバンドパスフィルターを用いて照射した。30分の照射処理による小葉の上下傾斜角の変化(傾斜反応)と葉枕の上部と下部の表面電位を測定し、その効果を検討した。RedとBlueによる傾斜反応は極めて小さかったが、GreenではWhiteに続く大きな反応が認められた。しかし-GreenはGreenとほぼ同様の効果を示した。また-Blueの傾斜反応はWhiteと同程度となり、-Redは著しく小さかった。-Greenおよび-Blueには赤色光成分が含まれており、-Redではこれが欠如していた。このことはGreenのほかRedもまた他の光成分の存在により小葉の傾斜反応に関与することを示唆している。Greenおよび-Greenの電位変動は共に、RedおよびBlueと比べると極めてWhiteに類似した。そのパターンは照射開始直後から35分後までマイナス方向に変化し、その後葉枕の下部ではプラス方向に変化したが上部ではほぼそのままの電位を維持する電位分極が認められた。このような分極は、赤色成分の欠如した-Blueにおいても見られ、特に下部の変動が大きかった。-Blueは著しく大きな小葉の傾斜変化を示したので、葉枕下部の電位変動は特に小葉の傾斜反応と密接に関係することが推察された。以上の傾斜反応と葉枕表面の電位変動の結果は、小葉運動における2つの作用スペクトルの存在を示唆した。即ち、単独で効果のある緑色光成分(500600nm)と他の成分の存在により効果を示す赤色光成分(>600nm)である。インゲンマメ品種、姫手亡を1/10,000aポットに育成し、開花期にその第4葉の頂小葉を用いて実験を行った。暗黒下で、スポット照明装置(オリンパス/LGW)により白色光(500W/m^2)およびこれにバンドパス・フィルタ(日本真空工学/DF)を通した赤色光(620nm以上、240W/m^2)、緑色光(520570nm、108W/m^2)および青色光(500nm以下、33W/m^2)を葉枕の上部に30分間照射した。これらの処理にはそれぞれ4または5個体を用いた。光照射直前から終了までの小葉の上下傾斜角(垂直方向の角度)を10分間隔で測定し、また葉枕の上部と下部の電位を6秒毎に同時に測定した。電位の測定は、前置増幅器の付いた注射筒にガラス電極を取り付けた自作のプローブを用いた。2つのガラス電極の先端を葉枕の上部と下部に各々確実に接触させ、またもう1つの電極を主茎基部に接触させて基準電極とし、これらをペンレコーダおよびデータロガーと接続して記録した。30分間の照射による小葉の上下傾斜角は、白色光による変化が最も大きく、緑色光がこれに近似した。しかし、赤色光と青色光では極めて小さな変化であった。緑色光照射による葉枕の電位は変動幅が小さかったものの、白色光の変動パターンに類似した。赤色光の場合は、葉枕の両部位ともに照射直後からプラス方向に変化し、その変動は小さかった。青色光の照射では、赤色光とは逆にマイナス方向に大きく変動し、白色光による葉枕上部の変動とほぼ一致した。以上の異なる波長光の照射による傾斜反応と葉枕の電位変動から、緑色光が小葉運動に大きく関与することが明らかになった。

本研究は、インゲンマメの小葉運動において、その機動器官である葉枕の形態的、生理的変化のメカニズムの基礎的知見を得ることが目的である。赤色光(RL,>610nm)、緑色光(GL,505575nm)および青色光(BL,<495nm)の照射による前年度の結果は、小葉の傾斜反応および葉枕表面の活動電位において、GLが白色光(WL)に最も類似する効果を示した。この結果を確認するため、本実験ではWL(520W・m^<-2>)から上記の単色光をそれぞれ除去したフィルター[シアン(rR,<590nm)、マゼンタ(rG,<495nm&>605nm)、イエロ-(rB,>520nm)]を用いて照射処理を行い、それぞれによる小葉の傾斜反応および葉枕表面の活動電位を比較、検討した。上下傾斜角の変化による小葉の傾斜反応において、緑色光を除去した「rG」の反応が青色光を除去した「rB」より小さかった。このことは前年度の実験結果と同様に、緑色光の効果が青色光よりも大きいことを示した。また赤色光を除去した「rR」の照射効果が赤色光照射と同様に小さかった。自作のガラス電極およびアンプにより導出された葉枕下部表面の活動電位は、「WL」では照射開始から約2分間、マイナス方向に4060mV変化し、その後急激にプラス方向におよそ80100mV程変化した。「rG」においても同様の変動が見られたが、これは「GL」の効果と類似するものであった。一方「rB」では照射開始から約2分間の変動は見られず、大きくプラス方向へ変化した。以上の結果から、葉枕の活動電位は傾斜反応、即ち葉枕の形態的変化と直接的に関係するものではなく、内部の複雑な反応を表わすものであることが推察された。
フランス語圏におけるケベック文学の受容とフランコフォン・アイデンティティ

ケベックでは1930年代から新たな社会におけるアイデンティティの模索が始まっていた。「心理小説」は自己実現しきれない内的葛藤を描きだした。ただし、受容という観点から見れば、そうした作品は一部の知識人にしか読まれなかった。1960年代「静かな革命」期にケベック文学はフランスでも受容が進んでいく。そうした現象はケベック人に誇りを与え、ナショナル・アイデンティティを高揚させた。言語面でも、「訛ったフランス語」として蔑まれていたケベック方言が、自分達の言葉として、肯定的な役割が見出されていく。フランス本国の言葉が唯一正統であり、その他を変種とするのではなく、様々なフランス語の存在を認めようとする意識は、「クレオール文学」においても見られる。しかし、70年代に入るとすぐに、様々な出自の人々が集まるケベックでは、「国民文学的」枠組みがあてはまらないことが露呈してくる。『フォルクス・ワーゲン・ブルース』(1984)は転換期の象徴的な作品であろう。「国民意職」が均一な共感を必要とするのに対して、現代ケベックの作家たちの多くは、言語や地域をアイデンティティの拠り所にするのではなく、多様性の中で漂うことをむしろ運命として引き受け、歓迎し始めているように思える。1980年代から頻繁に用いられるようになった「フランコフォン」という表現も、「純粋性」よりも「混血性」、「単一性」よりも「多様性」を含意しているのではなかろうか。本年度は、小畑がフランス・ベルギーに、寺家村がカナダに赴き、現地の研究者と交流、また、資料を収集、帰国後は収集資料の整理と分析を行った。その中で特にケベック以外でも出版され、読まれた小説の受容に注目し、考察を加えてみたい。例えばイヴ・テリオーの『アガグック』は、一九五八年にフランスとカナダで同時に刊行されている。『三十アルパン』など若干の例外はあるが、フランス人のケベックに対する関心は低く、フランスで出版されるケベックの小説は当時珍しかった。この小説もケベックの小説というよりも、当時エスキモーと呼ばれていたイヌイットの物語として読まれたようである。しかし、この小説は、青年アガグックの成長を語り、二十世紀前半のイヌイットの生態を活写すると同時に、伝統と近代化の対立というケベック社会自体の問題がそこに織り込まれているようである。それは閉鎖性から開放へと向かう当時のフランス系カナダ人の意識の反映でもあろう。彼らは広い世界の中での存在として自分たちを考え始めたのである。また、『やぁ、ガラルノー』(一九六七年)は、当初パリのEditions de Seuilから刊行され、主人公フランソワの手記を通して『アガグック』が孕んでいたフランス系カナダ人の意識の変容をはっきりとフランス人読者に示した。こうした小説はフランコフォン意識の形成に繋がっていくと考えられる。カナダ・ケベック州の「仏系カナダ文学」が「ケベック文学」として語られるようになるのは1960年代のことである。それまで、仏系カナダ人は、フランスの伝統とカトリック教会の説く精神的崇高さを拠り所としていた。「静かな革命」と呼ばれる60年代に彼らは「フランス」から自立したアイデンティティを確立し、自らを「ケベック人」と称するようになった。70年代に入るとフランス本国でも「ケベック文学」は認知されるようになり、新たなフランコフォン意識の形成に大きな影響を持つようになる。かつてのネグリチュードもフランス本国を中心とした「フランス語圏」意識に対する意義申し立てであったが、それは植民地主義VS反植民地主義という対立を軸にしたものであった。それに対して、「ケベック文学」の受容は、グローバリズムに対するローカリズムとして捉えられるようである。それはまたエーメ・セゼールらのネグリチュードから、マリーズ・コンデやラファエル・コンフィアンらの「クレオール文学」への変容と呼応してもいるようである。言語面でも、「訛ったフランス語」として蔑まれ、「ジューアル」と呼ばれていたケベック方言が、60年代には自分達の言葉として、肯定的な役割を見出されていく。小説においても、ジャック・ルノーらはジューアルを積極的に使用するようになった。

フランス本国の言葉が唯一正統であり、その他を変種とするのではなく、様々なフランス語の存在を認めようとする意識は、これまた、「クレオール文学」においても見られる現象であろう。
国民医療費・世代間格差・医療貯蓄勘定に関する研究

本研究の目的は、公的医療制度のもたらす世代間格差と、それの改善が見込める公的医療改革がもたらす個々人の医療費支出超過の確率の上昇について定量的に分析を行うことである。本研究では、実際のデータに基づき、医療費の遷移確率から個々人の医療支出超過の確率を推計する。それらの推計をもとに、世代間格差の改善と個々人の医療支出超過の確率について政策的な含意について検討する。
電力負荷平準化を目的とした帯水層蓄熱システムの開発

本研究では、蓄熱媒体として、粘土層などの難透水層と施工上必要な止水壁とに囲まれた建物直下の地下帯水層に着目し、地中蓄熱の有効性を検討した。地盤中への投入熱量、回収熱量は、土壌の性質と同時に、蓄熱槽の形状、止水壁の特性、給水・揚水井戸の位置・口径など蓄熱槽に関するパラメータや、水頭勾配、蓄熱・汲み上げ期間などの運転制御に関する種々のパラメータにより大きく左右される。また、最終的な蓄熱効率は、蓄熱量・回収水温などの利用二次側からの要求を考慮して評価されなければならない。以上の観点より、本研究においては、以下の事柄を明らかにした。(1)相似則に基づき地盤模型を用いた蓄熱実験を行い、水頭勾配と流速・揚水量との関係、地盤内温度・含水率分布と蓄熱量、土壌物性値と流速、井戸配置の影響などを明らかにした。また、熱水分同時移動解析の結果と照合し、解析法の妥当性を確認し、実用に供しえることを確認した。(2)不飽和領域を含む土壌の温度場・水分場の測定を行うとともに、移動境界値問題として定式化された不飽和水分流解析モデルにより水分流の非定常性の再現を試み、実験との良好な一致を得た。(3)実大建物・地盤における測定により蓄熱効率を調べ、蓄熱性状、非一様な土壌層の影響を検討し、短期間における蓄熱においては、やはり初期温度の影響の大きいことを確認した。(4)二次側の運転を考慮した最適蓄熱制御方式を、遺伝的アルゴリズムを利用して明らかにした。(5)実物大の建物とその下部地盤を利用した蓄熱実験の計画立案と予備測定を行い、実地盤における蓄熱実験の問題点の洗い出しを行った。実用化に向けての方策を提案した。本研究は、蓄熱方式の中で地盤蓄熱方式、蓄熱媒体としては、粘土層などの難透水層と施工上必要な止水壁とに囲まれた建物直下の地下帯水層に着目し、地中蓄熱の有効性を検討する。このシステムは、年間負荷に占める冷房負荷の割合が大きい建物への適用を前提に、夏季の冷水取り出しを目的としている。二次側を含めたトータルな評価を、空調運転を考慮したシミュレーション等で評価する必要がある。以上の観点より、本年度は、(1)地盤中での熱水分移動解析により、蓄熱・回収熱量に及ぼす種々のパラメータの影響を把握した。(2)土壌の水分伝導率を推定した。(3)相似則に基づく蓄熱過程の実験を行い、種々のパラメータが蓄・回収熱量に及ぼす影響を明らかにした。(4)実大建物・地盤における測定により蓄熱効率を調べ、蓄熱性状、非一様な土壌層の影響を検討した。(5)二次側の運転を考慮した最適蓄熱制御方式について検討した。本研究では、蓄熱媒体として、粘土層などの難透水層と施工上必要な止水壁とに囲まれた建物直下の地下帯水層に着目し、地中蓄熱の有効性を検討している。

地盤中への投入熱量、回収熱量は、土壌の性質と同時に、蓄熱槽の形状、止水壁の特性、給水・揚水井戸の位置・口径など蓄熱槽に関するパラメータや、水頭勾配、蓄熱・汲み上げ期間などの連転制御に関する種々のパラメータにより大きく左右される。また、最終的な蓄熱効率は、蓄熱量・回収水温などの利用二次側からの要求を考慮して評価されなければならない。以上の観点より、本年度は昨年度に引き続き以下の事柄について検討した。(1)相似則に基づき地盤模型を用いた蓄熱実験を行い、水頭勾配と流速・揚水量との関係、地盤内温度・含水率分布と蓄熱量、土壌物性値と流速、井戸配置の影響などを明らかにした。また、熱水分同時移動解析の結果と照合し、解析法の妥当性を確認した。(2)不飽和領域を含む土壌の温度場、水分場の測定を行うとともに、不飽和水分流の解析により水分流の非定常性の再現を試みた。(3)実大建物・地盤における測定により蓄熱効率を調べ、蓄熱性状、非一様な土壌層の影響を検討した。(4)実物大の建物とその下部地盤を利用した蓄熱実験の計画立案と予備測定を行い、実地盤における蓄熱実験の問題点の洗い出しを行った。(5)二次側の運転を考慮した最適蓄熱制御方式について検討した。
神経幹細胞の分化調節機構の解明:脳神経回路の再生・修復を誘導するバイオ技術の開発

成体の脳内においても神経幹細胞が存在し、この細胞から新しくニューロンが生み出されていることが見出されている。この現象を利用すれば、疾患などにより傷ついた脳の神経回路を、生体に備わった自然治癒力を賦活するで、再生させることが出来るはずである。本研究では、成体脳内に存在している神経幹細胞にスポットを当て、この細胞からニューロンへの分化機構について研究を行った。1)「成体霊長類の大脳新皮質においては、ニューロン新生が起こっている。」という、グールド博士らの1999年の研究結果(Science誌に掲載)について、追試験をおこなったが、大脳新皮質部位でのニューロン新生の証拠は、一切得ることが出来なかった。しかしながら、大脳新皮質の実質内において、非常に盛んに分裂を繰り返す細胞集団が存在することを確認し、報告した(Journal of Neuroscience,23:937-942(2003))。2)これまでに、成体でのニューロン新生が立証されている海馬歯状回をモデル系に選定し、当部位でのニューロン新生の仕組みについて解析を行った。本研究において、海馬歯状回部位で神経幹細胞のマーカーであるネスチンを発現する細胞は2種類に分類され、グリア細胞としての性質を有する初期前駆細胞からニューロンとしての性質を持つ後期前駆細胞へ分化した後、新生ニューロンが生み出されていることを発見した(Journal of Neuroscience,23:9357-9366(2003))。3)大脳新皮質に存在する分裂中の細胞については、マウスを用いて解析を進め、この細胞がネスチンを発現する細胞であることを突き止めた。成熟した中枢神経系は、多数のニューロンおよびグリア細胞によって構成されているが、これらの細胞の大半が脳発生期に神経幹細胞から分化することによって生じたものである。従来、神経幹細胞の分化に関する研究は、in vitroの培養実験を用いた分化誘導因子の探求によって広く行われて来た。この方法により、グリア細胞への分化に関与する多くの液性因子が同定され、神経幹細胞からアストロサイトやオリゴデンドロサイトといったグリア細胞への詳細な分化機構が解明されている。しかしながら、ニューロンへの分化に関しては、決定的な因子の発見には至らず、現在も神経幹細胞からニューロンへの分化機構の解明が、神経科学分野における最も中心的かつ重要な課題となっている。ニューロンは、神経幹細胞の自己複製が停止した後、分裂周期から神経幹細胞が離脱することによって分化誘導されることが明らかとなっている。このことから、本研究では、神経幹細胞の増殖とニューロンへの分化の間には極めて密接な関係があると考えた。すなわち、神経幹細胞に対する増殖シグナルが喪失した場合に、神経幹細胞はニューロンへと分化するのではないかと考えた。本研究では、中枢神経幹細胞に特異的に発現する中間径フィラメントであるnestinのプロモーター下にGFPを組み込んだpNestin-GFPトランスジェニックマウスを用いることで、直接的に胎児脳より神経幹細胞を調製することが可能となった。そこで、神経幹細胞の膜表面に存在する細胞接着因子についての解析を行った。フローサイトメトリーにより、定量的な発現解析を行った結果、神経幹細胞においては、インテグリン分子群の中でもα_5β_1が非常に強く発現しており、この分子のはたらきにより細胞の増殖性が維持されていることが示唆された。さらに、ニューロンへの分化に伴って、その発現が低下し、細胞周期からの逸脱が誘導されるとともに、ニューロン様の形態へと細胞が変化することが観察された。
マウス嗅結節の入出力経路から探る適応的な嗅覚行動誘起の神経メカニズム

匂いの感覚は動物に多様な生理・心理作用をもたらす。たとえば餌を関連づいた匂いに対しては誘引行動を獲得する。一方で同じ匂いでも、危険な目にあったときに嗅ぐと、警戒行動を獲得する。申請者はこれまでに、餌と関連付いた匂いへの誘引行動では嗅結節の前内側ドメインが、危険と関連付いた匂いへの警戒行動では嗅結節の外側ドメインが活性化されることを見いだした。なぜ過去の経験によって嗅結節の応答ドメインが変わるのか、また両ドメインからはどのような経路で誘引もしくは警戒行動へと至るのだろうか。嗅結節投射ニューロンにはドーパミン受容体D1とD2を発現するサブタイプが存在し、それぞれ行動の促進と抑制に関わると予想している。本研究では神経解剖学的手法でマウス嗅結節の入力・出力経路をドメイン特異的かつ神経細胞種特異的に同定することを目標とした。入力経路の解析では、蛍光色素付コレラ毒素Bサブユニットと改変型狂犬病ウイルスの注入実験を行った。改変型狂犬病ウイルスの注入実験では、D1-CreマウスならびにD2-Creマウスを用いることで、神経細胞種特異的な嗅結節への入力経路の標識が可能になった。出力経路の解析では、Cre依存的にチャネルロドプシンを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた。前内側ドメインにおいてD1発現神経細胞とD2発現神経細胞を区別してそれぞれ光遺伝学によって操作し、嗅結節の神経操作がマウスの行動に与える影響を評価した。動物は餌を食べたときに嗅いだ匂いに対して誘引行動を獲得する。同じ匂いでも、危険な目にあったときに嗅ぐと、警戒行動を獲得する。本研究では神経解剖学的手法でマウス嗅結節の入力・出力経路をドメイン特異的かつ神経細胞種特異的に同定する。過去の餌や危険の経験が嗅結節の特定のドメインに集約され、そこから誘引行動や警戒行動が誘起される神経経路を明らかにする。入力経路の解析には、蛍光色素付コレラ毒素Bサブユニットと改変型狂犬病ウイルスの注入実験を行う。改変型狂犬病ウイルスの注入実験では、D1-CreマウスならびにD2-Creマウスを用いることで、神経細胞種特異的な嗅結節への入力経路の標識が可能になる。出力経路の解析には、シンドビスウイルス注入実験を行う。これにより、前内側ドメインまたは外側ドメインの神経細胞をごく少数個だけ蛍光タンパク質標識し、免疫染色によりその細胞種を同定する。蛍光タンパク質で標識された軸索の投射から、嗅結節からの出力経路を評価する。蛍光色素付コレラ毒素Bサブユニットの注入実験により、嗅結節の前内側ドメインと外側ドメインではそれぞれ異なる領域から入力を受ける可能性が示唆された。改変型狂犬病ウイルスの注入実験では、逆行性に標識される神経細胞は見られたものの標識効率が低かった。ウイルスの力価が低いと考えられるため、ウイルスの調製方法を改善する。シンドビスウイルスを用いた出力経路の解析実験では、嗅結節の神経細胞を蛍光タンパク質で標識することができた。平成28年度の後半では、D1発現ニューロンとD2発現ニューロンを同一個体内で異なる蛍光タンパク質で標識するために、AAV-EF1a-DO-tdTomato-DIO-EGFPを導入した。今後はこのウイルスとD1-CreマウスならびにD2-Creマウスを用いて神経細胞種特異的な出力経路解析を行う。出力経路の解析には、Cre依存的に蛍光タンパク質を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いる。これにより、前内側ドメインまたは外側ドメインの神経細胞を神経細胞種特異的に蛍光タンパク質標識できる。

蛍光タンパク質で標識された軸索の投射から、嗅結節からの出力経路を評価する。蛍光色素付コレラ毒素Bサブユニットの注入実験により、嗅結節の前内側ドメインと外側ドメインではそれぞれ異なる領域から入力を受ける可能性が示唆された。改変型狂犬病ウイルスの注入実験では、標識効率の改善が必要であった。当該年度ではウイルスを自作するのではなく、開発元のSalk Instituteから導入したところ、標識効率が改善された。嗅結節の神経路標識を進めるなかで、嗅結節の近傍に新しい脳領野を見出した。新しい脳領野は嗅結節と同様に嗅球からの軸索投射を受ける嗅皮質に属しており、前嗅核後腹側部と嗅結節の間に位置していた。この新規嗅皮質領域を腹嗅核(ventral olfactory nucleus)と名付け、腹嗅核を構成する神経細胞種と軸索投射を調べている。匂いの感覚は動物に多様な生理・心理作用をもたらす。たとえば餌を関連づいた匂いに対しては誘引行動を獲得する。一方で同じ匂いでも、危険な目にあったときに嗅ぐと、警戒行動を獲得する。申請者はこれまでに、餌と関連付いた匂いへの誘引行動では嗅結節の前内側ドメインが、危険と関連付いた匂いへの警戒行動では嗅結節の外側ドメインが活性化されることを見いだした。なぜ過去の経験によって嗅結節の応答ドメインが変わるのか、また両ドメインからはどのような経路で誘引もしくは警戒行動へと至るのだろうか。嗅結節投射ニューロンにはドーパミン受容体D1とD2を発現するサブタイプが存在し、それぞれ行動の促進と抑制に関わると予想している。本研究では神経解剖学的手法でマウス嗅結節の入力・出力経路をドメイン特異的かつ神経細胞種特異的に同定することを目標とした。入力経路の解析では、蛍光色素付コレラ毒素Bサブユニットと改変型狂犬病ウイルスの注入実験を行った。改変型狂犬病ウイルスの注入実験では、D1-CreマウスならびにD2-Creマウスを用いることで、神経細胞種特異的な嗅結節への入力経路の標識が可能になった。出力経路の解析では、Cre依存的にチャネルロドプシンを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた。前内側ドメインにおいてD1発現神経細胞とD2発現神経細胞を区別してそれぞれ光遺伝学によって操作し、嗅結節の神経操作がマウスの行動に与える影響を評価した。新規嗅皮質領域(腹嗅核)の解析も並行して進める。予定よりも安価な実験機材を導入できたため。(理由)予定よりも人件費および実験機器、試薬の購入が安価であったため。(使用計画)実験機器、試薬の購入にあてる。実験機材・試薬・実験動物の購入にあてる。
HITECマウスを用いたプラズマのゲノム影響評価

プラズマ照射は、がん細胞のアポトーシス誘導や皮膚損傷の治癒に有為な効果を示す。また、細胞膜に作用して細胞へのDNA等の物質の取り込みを促進する。これらの効果を生み出す「プラズマと生体組織の反応」の分子メカニズムには不明な点が多い。プラズマ照射の遺伝毒性に関する安全性評価の研究基盤を提供することを目的として、平成28年度は、マウス個体およびヒト細胞を用いて下記の2つの実験系でプラズマ照射によるDNA損傷や突然変異の解析を行った。(1)マウス皮膚組織に対するプラズマ照射の影響プラズマ照射は、遺伝子DNAを酸化して突然変異を誘発する酸素ラジカルや窒素ラジカルを発生させる。皮膚に対するプラズマ照射の影響を検討するために、空気プラズマ照射装置を用いて脱毛したマウス皮膚に8分間照射して、1時間後に安楽死させたのち解剖して皮膚組織の標本を作製し、HE染色および抗リン酸化H2AX抗体免疫染色を行った。照射中心部位では表皮細胞の核は非照射と比較してHEでは非常に弱く染色された。また、抗リン酸化H2AX抗体では全く染色されず、ネクローシスの可能性が考えられた。照射周辺部では非照射と比較して抗リン酸化H2AX抗体で非常に強く染色され、多くのDNA損傷が誘導されることが解った。プラズマ照射されたマウスの皮膚では顕著な突然変異頻度の上昇は認められなかったが、実際にヒトに照射する場合には、DNA損傷の誘発を防ぐ照射法の確立が必要と考えられる。(2)ヒト細胞を用いたプラズマの影響細胞へのDNA導入に有効なプラズマ源をHeLa細胞に照射して、HPRT遺伝子座を指標とした突然変異解析を行った。DNA導入が認められる10秒照射群では突然変異の上昇は認められなかったが、30秒照射群では、510倍の突然変異頻度の上昇が認められた。実用化には、突然変異が誘導されないプロトコールの作成が必要であると考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。プラズマ照射は、がん細胞のアポトーシス誘導や皮膚損傷の治癒・再生に極めて有為な効果を示す。がん細胞における細胞死誘導の際には、プラズマにより生じるラジカルが酸化DNA損傷を誘導することが示されているが、これらの効果を生み出す「プラズマと生体組織の反応」の分子メカニズムには不明な点が多い。本研究では、個体で生じる突然変異を効率良く検出できるHITECマウスを用いてプラズマ照射が引き起すDNA損傷と突然変異の解析を進め、治療に使用されている抗がん剤や放射線の効果と比較することにより、プラズマ照射の遺伝毒性に関する安全性評価のための研究基盤を提供することを目的とする。平成27年度はHITECマウス個体を用いて下記の2つの実験系でプラズマ照射による細胞死や突然変異解析を行った。(1)マウス皮膚組織に対するプラズマ照射の影響プラズマ照射は、皮膚疾患や傷病組織の治癒や再生に極めて有為な効果を示す一方で、遺伝子DNAを酸化して突然変異を誘発する酸素ラジカルや窒素ラジカルを発生させる。トーチ型空気プラズマ照射装置を用いて脱毛したマウス皮膚に8分間照射して、24時間後に安楽死させたのち解剖して皮膚組織の標本を作製し、HE染色および抗リン酸化H2AX抗体および抗ssDNA抗体を用いた免疫染色を行った。照射された部位では表皮細胞の核がHEおよび抗リン酸化H2AX抗体、抗ssDNA抗体で全く染色されず、細胞形態を保ったまま重度のDNA損傷が生じている可能性が考えられた。(2)マウス脾臓細胞を用いた正常細胞に対するプラズマの影響生体内の正常細胞に対するプラズマ照射の生物影響を検証するために、増殖停止状態のマウス脾臓細胞にプラズマを照射したのち増殖刺激を行い、突然変異解析を行った結果、1および2分間照射された細胞の突然変異頻度が未照射と比較するとそれぞれ5.7倍、6.5倍上昇していた。本年度はHITECマウス個体を用いて下記の2つの実験系でプラズマ照射によるDNA損傷、細胞死や突然変異解析を行った。(1)マウス皮膚組織に対するプラズマ照射の影響トーチ型空気プラズマ照射装置を用いて脱毛したマウス皮膚に8分間照射して、24時間後に安楽死させたのち解剖して皮膚組織の標本を作製し、HE染色を行って組織の観察を行ったところ、炎症や顕著な病変は観察されなかったが、照射部の表皮細胞では核の染色が全く見られないという奇妙な結果が得られている。抗リン酸化H2AX抗体および抗ssDNA抗体を用いた免疫染色を行った結果、照射された部位では表皮細胞の核が抗リン酸化H2AX抗体や抗ssDNA抗体で全く染色されない。抗リン酸化H2AX抗体による免疫染色では非照射部位は軽度の染色が認められ、境界領域では強度の染色が認められた。これらの観察から細胞形態を保ったまま重度のDNA損傷が生じている可能性が考えられた。予備的な突然変異解析では、照射された皮膚における突然変異頻度の顕著な上昇は観察されていない。(2)マウス脾臓細胞を用いた正常細胞に対するプラズマの影響生体内の正常細胞に対するプラズマ照射の生物影響を検証するために、増殖停止状態のマウス脾臓細胞にトーチ型空気プラズマ照射装置を用いてプラズマを照射したのち増殖刺激を行い、突然変異解析を行った結果、1および2分間照射された細胞の突然変異頻度が未照射と比較するとそれぞれ5.7倍、6.5倍上昇していた。これらのことから、プラズマの医療応用は潜在的な遺伝毒性に留意して進める必要があることが明らかになった。

プラズマ照射は、がん細胞のアポトーシス誘導や皮膚損傷の治癒に有為な効果を示す。また、細胞膜に作用して細胞へのDNA等の物質の取り込みを促進する。これらの効果を生み出す「プラズマと生体組織の反応」の分子メカニズムには不明な点が多い。プラズマ照射の遺伝毒性に関する安全性評価の研究基盤を提供することを目的として、平成28年度は、マウス個体およびヒト細胞を用いて下記の2つの実験系でプラズマ照射によるDNA損傷や突然変異の解析を行った。(1)マウス皮膚組織に対するプラズマ照射の影響プラズマ照射は、遺伝子DNAを酸化して突然変異を誘発する酸素ラジカルや窒素ラジカルを発生させる。皮膚に対するプラズマ照射の影響を検討するために、空気プラズマ照射装置を用いて脱毛したマウス皮膚に8分間照射して、1時間後に安楽死させたのち解剖して皮膚組織の標本を作製し、HE染色および抗リン酸化H2AX抗体免疫染色を行った。照射中心部位では表皮細胞の核は非照射と比較してHEでは非常に弱く染色された。また、抗リン酸化H2AX抗体では全く染色されず、ネクローシスの可能性が考えられた。照射周辺部では非照射と比較して抗リン酸化H2AX抗体で非常に強く染色され、多くのDNA損傷が誘導されることが解った。プラズマ照射されたマウスの皮膚では顕著な突然変異頻度の上昇は認められなかったが、実際にヒトに照射する場合には、DNA損傷の誘発を防ぐ照射法の確立が必要と考えられる。(2)ヒト細胞を用いたプラズマの影響細胞へのDNA導入に有効なプラズマ源をHeLa細胞に照射して、HPRT遺伝子座を指標とした突然変異解析を行った。DNA導入が認められる10秒照射群では突然変異の上昇は認められなかったが、30秒照射群では、510倍の突然変異頻度の上昇が認められた。実用化には、突然変異が誘導されないプロトコールの作成が必要であると考えられた。(1)マウス皮膚組織に対するプラズマ影響実際に使用されているプラズマでマウス皮膚を処理し、皮膚の病理解析や抗リン酸化H2AX抗体や抗8-oxoG抗体を用いた免疫染色を行い、細胞死やDNA損傷を検討する。また、プラズマ処理したHITECマウス皮膚からDNAを抽出して突然変異解析を行う。(2)マウス脾臓細胞を用いた正常細胞に対するプラズマ照射の生物影響DNA損傷による細胞死誘発能および突然変異誘導能を抗がん剤投与やX線照射とプラズマ処理との間で比較検討するために、がん細胞(HeLe細胞)を用いて、同程度の細胞死を誘発する用量を決定した後、DNA損傷、細胞死および突然変異を解析する。がん細胞とは異なり、生体内の正常細胞は増殖を停止した状態で存在し、必要に応じて発動される増殖刺激を受けて数回分裂する。マウスから取り出した脾臓細胞はそのままでは培地中で培養しても増殖を停止したままである。培地にFCSと増殖刺激剤ConAとPLSを添加することで容易に増殖停止状態から増殖状態へ移行させることが可能である。生体内の正常細胞に対するプラズマの生物影響を検証するために、HeLe細胞を用いて決定した用量のプラズズマで増殖停止状態の脾臓細胞を処理し、細胞死と突然変異の解析を行ない、プラズズマ処理の突然変異誘導能を検討する。
ヒストンＨ３リジン７９（Ｈ３Ｋ７９）メチル化特異的ＦＲＥＴプローブの開発

ヒストンH3のリジン79 (H3K79)のメチル化は、遺伝子の転写の活性化に資すること、心・血管系の発生、ES細胞の分化に必須であることが知られている。しかし生細胞内でH3K79メチル化を検出する技術は確立されていない。本研究において当初は、既知のメチル化結合タンパク質とH3K79メチル化との結合の可視化を試みたが、有意な結果が得られなかった。そこで改めてH3K79メチル化に結合するタンパク質を探索し、いくつかの候補を同定した。これによりメチル化の可視化が可能になるだけでなく、H3K79メチル化結合因子の性質の解明を通してH3K79メチル化の生理的意義が明らかになることが予想される。53BP1を用いてK79メチル化プローブを作製したがK79メチル化を反映しておらず他のK79メチル化結合タンパク質を用いてプローブを作製することを目指した。現在のところ53BP1の他にK79メチル化結合タンパク質は報告されていないため新たに同定することを試みている。ビオチン化K79メチル化ペプチドを用いたプルダウン実験を行い、検出されたバンドをマススペクトロメトリーで同定した。その後同定遺伝子をクリーニングし293T細胞の過剰発現系を用いてK79メチル化との結合を調べたが検出されなかった。真のK79メチル化結合タンパク質が同定されなかった原因として、(i)ビオチン結合タンパク質が優先的に同定された、(ii) K79メチル化との結合にはヌクレオソーム等の立体構造が必要でありペプチドの状態では結合しないことが挙げられる。そこで293T細胞においてFlagタグ融合ヒストンH3安定発現株を作製し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、H3結合タンパク質を同定する。その中でDot1Lの過剰発現の有無によってバンドの量が増減するものを選択することによってK79meメチル化特異的に結合するタンパク質を同定する。またK79メチル化が高いレベルで見られるH3.3バリアントを用いることで結合量が増えると予想される。本報告書を作製時点において、H3安定発現細胞株を作製したところであり今後、K79メチル化結合タンパク質を同定していく予定である。また同定した後には申請書にあるとおりK79メチル化プローブの作製とスクリーニングを行う。研究計画書通り、H3K79のメチル化を検出するプローブを作製し蛍光顕微鏡によりFRET効率を測定した。Dot1Lの過剰発現の有無によりFRET効率が変化したプローブが1種類認められたので、さらに詳細に確認するためフローサイトメーターを用いてFRET効率の変化を計測したがDot1Lの有無によって有意な差は認められなかった。今回のH3K79のメチル化を検出するFRETプローブは53BP1のH3K79メチル化認識(と考えられている)部位を用いたが、53BP1とH3K79メチル化との結合については否定的な論文も出ており、今回の結果から考えても本FRETプローブのアクセプターとしては適切ではないらしい。しかしながら他にH3K79メチル化を認識するタンパク質はいまだに見つかっていない。そこで我々はK79を含むヒストンペプチドでかつK79にメチル化が入っているものと入っていないものを用意して293Tから調整した核画分中にこれらのペプチドと結合するタンパク質の同定を試みている。銀染色の結果からはメチル化されたペプチドのみで見られるバンドも見つかっており現在、質量分析器による同定を試行中である。これらの実験から新たなH3K79メチル化結合タンパク質が見つけられれば、FRETプローブ作製にとって有用なだけではなくH3K79メチル化の生理的意義の解明にとっても重要な発見となることを期待している。最終年度は、ヒストンH3のリジン79 (H3K79)のメチル化に特異的に結合するタンパク質の同定とその確認を行った。研究期間を通しては、H3K79メチル化を生細胞内で可視化することを目的としてFRET (Forester/Fluorescence resonance energy transfer)現象を利用したプローブ作製を行った。エピジェネティクスは、遺伝子配列に依存しない遺伝子発現調節機構であり、基本的な細胞の生命活動を始め、発生、癌化などにも重要である。中でもヒストンのメチル化はよく知られたエピジェネティック修飾であり、細胞の多様かつ複雑な遺伝子発現調節に必須である。ヒストンメチル化の一つであるH3K79のメチル化は、ヒストンメチル化酵素Dot1Lによって特異的に触媒されることや、転写の活性化と相関すること、心・血管系の発生、ES細胞の分化、血赤芽球系の分化に必須であることが知られている。しかしながら個々の細胞について生細胞内でH3K79メチル化修飾を検出する技術は確立されていない。

本研究において当初は、53BP1タンパク質とH3K79メチル化との結合をFRET現象を利用して可視化を試みたが、有意な結果が得られなかった。そこで改めてH3K79メチル化に結合するタンパク質を探索したところ、いくつかの候補を同定できた。現在、それらのタンパク質が真にH3K79メチル化の結合因子であるか、H3K79メチル化と結合することによってどのような機能を発揮しているのかを明らかにしようとしている。結合因子の同定によってFRETプローブの作製が可能になるだけでなく、H3K79メチル化との結合を介した制御機構を明らかにすることによって、H3K79メチル化の生理的意義の解明につながることが予想される。エピジェネティクス成果報告書に記載した通り当初予定していた53BP1を用いたプローブがK79メチル化を反映しておらず他にK79メチル化結合タンパク質が同定されていないことから、一から結合タンパク質の同定を行っている。このことが予定を遅らせている原因である。ビオチン化K79メチル化ペプチドを用いた系では新規の結合タンパク質が同定されなかったので現在はH3安定発現株を作製しているところである。この系を用いて結合タンパク質が同定されれば、K79メチル化プローブの開発に有用なだけではなくK79メチル化の昨日を解析する上で重要なエビデンスとなる。研究の進捗が計画よりやや遅れている最大の理由は、期待したFRETプローブがDot1L依存的に働かなかったことである。そのため現在あたらしいアクセプター候補を同定しているところである。研究実績に記載した通り、銀染色レベルではあるがいくつの候補が見つかってきているので、今後はタンパク質の同定と新しいプローブの作製を急ぎたい。293T細胞においてFlagタグ融合ヒストンH3安定発現株を作製し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、H3結合タンパク質を同定する。その中でDot1Lの過剰発現の有無によってバンドの量が増減するものを選択することによってK79meメチル化特異的に結合するタンパク質を同定する。またK79メチル化が高いレベルで見られるH3.3バリアントを用いることで結合量が増えると予想される。本報告書を作製時点において、H3安定発現細胞株を作製したところであり今後、K79メチル化結合タンパク質を同定していく予定である。また同定した後には申請書にあるとおりK79メチル化プローブの作製とスクリーニングを行う。平成24年度は予想していたFRETプローブが完成せず、次におこなう予定であったiPS細胞作製やその他の実験系に必要な予算を消化できなかった。あたらしいFRETプローブの作製が現在進行中であり、これが完成すれば上記の実験系に必要な物品及び試薬類に繰越した予算を使用する予定である。研究実績及び現在までの達成度の項目に記載した通り、計画は予定より遅延している。本研究課題において特に予算を必要とするのは、(i)骨髄細胞の初代培養、(ii) iPS細胞を用いた実験、(iii)マウスの管理、維持またはトランスジェニックマウスの作出である。また現在までのところ培養細胞を用いた新規K79メチル化結合タンパク質の同定には当初予定した予算額を必要としていない。
日清戦争以降における東アジアの冊封体制の崩壊と朝鮮の近代化

朝鮮半島に立国した国家は、3C以来、自国の安全保障のために中国大陸の国家と宗属関係を結んでその冊封体制下に入り、この体制に最適合することが行なわれてきた。しかし、19世紀後半に入って東アジアも近代化の波に呑まれ、一国レベルと国際関係のそれぞれの近代化に迫られた。このとき、冊封体制の枠外にいた日本が欧米に開国した後、いち早く国内の体制変換(明治維新)を終え国民国家を形成するとともに、東アジアの国際関係の旧体制てある冊封体制を解体して新たな条約体制を創出しようとした。朝鮮は1860年代からウェスタン・インパクトに見舞われたが、国内の鎖国攘夷派が強くて開国政策に転換できなかったが、宗主国の清の国際戦略によって鎖国攘夷派を排除して開国政策が進められ、かえって清への隷属性が強まった。日清戦争によって清が敗北した結果、朝鮮は清から独立したが、この独立は、単に政治的な独立だけではなく、文化的な独立をも意味した。政治的独立としては、元号の使用(1896)、国号を大韓帝国、君主の称号を皇帝に改称(1897)、大韓国国制の制定(1899)なとがあり、文化的独立としては科挙の廃止(1894)、ハングルを公用文に使用(1895)などが挙げられる。宗主国の清に最適合した属国から独立した国家になるために、国民の形成が必要とされ、そのためには国民文化の形成が求められ、文化的独立の意味は日本の近代化にはない大きな特徴であった。本年度は、本研究の課題と関連する論文・書籍・史料を収集し、分類・整理することに重点を置いた。具体的には、册封体制・日清戦争・大韓帝国・甲午改革に関する史料、近代日朝関係外交史料などをマイクロ・フィルム、コピー、書籍などの形で収集した。本年度は、昨年に引き続いて本研究の課題と関連する論文・書籍・資料の収集・整理を行う一方で、これまで収集した論文・書籍・資料を読み分析した。本研究の課題の要点はa)「日清戦争以後における東アジアの册封体制の崩壊」とb)「朝鮮の近代化」の2点にある。a)「日清戦争以後における東アジアの册封体制の崩壊」については、日清戦争(1894-95年)と清からの朝鮮の独立(1894年独立宣言、1895年に下関条約で国際的に独立承認)を、旧来の東アジアの册封体制の解体と近代国際法(万国公法)の受容と適用という視点から検討した。b)「朝鮮の近代化」についてはどのようにして朝鮮の国民国家建設が模索されて行ったかという視点から検討した。このほか、本年度も、国内はもとより韓国のソウル大学や国史編纂委員会にも出向き、関係者から本研究の課題について貴重なレクチャーを受けた。本研究の目的は、清の属国の朝鮮が日清戦争によって清から独立し、清と対等な国際関係を樹立する前後の過程の課題を明らかにすることにあった。1880年代になって、清は属国の朝鮮を維持するために朝鮮に欧米へ開国させた(いわゆる「両截体制」の成立)。清のこの対朝鮮政策を理論的に推進したのは清の黄遵憲の『朝鮮策略』(1880)であり、この政策を批判したのはアメリカ人のO.N.Denny、CHINA AND KOREA(Shanghai,1888)であった。朝鮮が清の属国になったのは17世紀の武力侵攻によってであったが、O.N.Dennyにはこれについて観点が欠けていたため、O.N.Dennyの主張では朝鮮は清から独立は実現できず、日清戦争によって独立し、清との間で欧米と同様の韓清通商条約(1896)を締結するにいたった。

本研究は『朝鮮策略』(1880)、CHINA AND KOREA(1888)、日清戦争(1894ー95)、韓清通商条約(1896)を初めて総合的にかつ同一視野の中でとらえた。
アミロイド線維の動的秩序形成過程の全貌の理論的解明

アミロイド線維は間違って折りたたんだタンパク質の線維状凝集体である。アミロイド線維は40種類以上の病気の原因と考えられている。例えばアルツハイマー病はアミロイドβ(Aβ)ペプチドが凝集してできたアミロイド線維が原因ではないかと言われている。我々はこれまでAβペプチドの分子動力学シミュレーションを行ってきた。親水性/疎水性界面ではアミロイド線維が凝集しやすいということが報告されている。そこで今年度はAβペプチドの一部分であるAβ(16-22)を親水性/疎水性界面を含む系に100本入れ凝集させる分子動力学シミュレーションを行った。162500個の水分子と100本のAβ(16-22)を含み、親水性/疎水性界面を持つ系を用意した。タンパク質の力場にはAMBER parm14SBを、水にはTIP3Pを用いた。静電相互作用の計算はパーティクルメッシュエワルド法で行った。時間ステップ幅はタンパク質については0.5 fsに、水分子については4 fsに設定した。水分子は剛体として扱い、温度は能勢・フーバー熱浴を使って制御した。シミュレーションの結果、時間が経つにつれバルクの水中から界面にAβ(16-22)ペプチドが移動し、界面でのAβ(16-22)ペプチド濃度が上昇した。さらに界面上でも濃度の高い領域と薄い領域ができ、高濃度領域で界面に沿って反平行分子間βシート構造を持つ凝集体が生成された。また、水中でも反平行分子間βシート構造が生成された。これらのオリゴマーの分布を計算すると単量体四量体は界面で多く存在しているのに対し、五量体七量体は界面からやや水中よりで多く存在していることが分かった。この現象はアミロイド線維の形成初期過程において親水性/疎水性界面からオリゴマーが芽のように伸びてくる現象を表している。この発見は親水性/疎水性界面からアミロイド線維がどのように形成されるかを理解する上で役に立つものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。アミロイド線維はタンパク質が間違って折りたたみ、凝集することによってできた不溶性の線維である。アミロイド線維は40種類以上の病気の原因となっている。例えば、アルツハイマー病はアミロイドβ(Aβ)ペプチドが凝集してできたアミロイド線維が原因ではないかと言われている。アミロイド線維の伸長は末端にAβ1分子が順次結合してβシート構造に変化することで起きるため、末端構造を明らかにすることはアミロイド線維形成を理解する上で重要である。しかし、アミロイド線維の末端領域は12分子しかないため、実験では観察困難である。そこで分子動力学シミュレーションによりアミロイド線維末端の構造を調べた。20本のAβペプチドからなるアミロイド線維、57876個の水分子、20個のナトリウムイオンをシミュレーションボックスに用意した。タンパク質の力場にはAMBER parm99SBを、水にはTIP3Pを用いた。水分子は剛体として扱い、温度は能勢・フーバー熱浴、圧力はアンダーセンの方法を使って制御した。9つの異なる初期条件から200nsのシミュレーションを行った。プログラムは代表者が独自に開発してきたGEMB(Generalized-Ensemble Molecular Biophysics)プログラムを用いた。その結果、一方の端では2本のβシートが離れているのに対し、もう一方では閉じたままになっていることを実験に先駆けて発見した。またその現象は2枚のβシートβ1とβ2の水素結合の強さの違いとAβアミロイド線維の形状に起因していることも解明した。この発見はアミロイド線維の伸長機構を理解するのに役立つと考えられる。今年度はアミロイド線維の両末端の構造がことなることを実験に先駆けてシミュレーションで発見した。これはアミロイド形成の本質に迫る発見であるので、おおむね順調に進展していると言える。

また、水中でも反平行分子間βシート構造が生成された。これらのオリゴマーの分布を計算すると単量体四量体は界面で多く存在しているのに対し、五量体七量体は界面からやや水中よりで多く存在していることが分かった。この現象はアミロイド線維の形成初期過程において親水性/疎水性界面からオリゴマーが芽のように伸びてくる現象を表している。この発見は親水性/疎水性界面からアミロイド線維がどのように形成されるかを理解する上で役に立つものである。現在、100本のモノマー状態のペプチドから核生成過程、伸長過程を経てアミロイド線維が形成された平衡状態に至る動的秩序形成過程の全貌を解明する全原子分子動力学シミュレーションを行っている。今後その解析を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。