hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
伝統木造構法の知識表現における部品加工に関する研究

研究計画で挙げた5つのテーマのうち、主に2つのテーマについて取り組んだ。以下に、それぞれの取り組みについて詳説する。1)ワークの位置取得に関する実験本研究では、コンピュータビジョンを応用しワークの配置を取得する方法をとり、特殊な機材が不要であり、2台のカメラのみで計測可能なステレオ写真測量を用いてワークの計測の実験を行なった。ワーク(木材)を作業台上に固定し、これをステレオ写真測量と計測ツールを取り付けたロボットを用いてワークを計測し、両者の計測から得られる座標点を比較した。結果としては、ロボットで計測した値と比較して、ワークの稜線の長さは概ね良好な値を得ることができたが、方向によって座標値の誤差が大きくなる傾向が見られた。現状の精度でも、出来上がりの形状にワークの表面が残らないような加工に対しては、余裕をもたせる条件の下ではあるが、適用可能であると考える。2)部品加工システムの構築昨年度までに取り組んだ、加工知識のモデル化、制御情報導出に関する考察、加工ツールの実装から、ロボットによる部品加工において必要となる要素や技術を整理した。設計から部品加工までの流れの概要を図2に示す。部品加工システムを構築するにあたり、シミュレーション時の動作確認の直感性の向上や、コマンダによる加工時の作業者への指示出力など、これまでに開発した個々のソフトウェアを改良しながら、各ソフトウェア間での連携について考察し、部品加工システムとして実装した。ここでは、特定のCADやCAMに従属しない、できるだけ汎用性の高いシステムを構築する方針をとった。独自に開発したCAMでは、汎用ファイルフォーマット(STL)を入力とし、また、シミュレータやコマンダへの入力は、ポストプロセスの簡易な定義で既存のCAMからの入力を受けられるようデータフォーマットを考察した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、部品形状に立脚した大工職人による部品加工についてのモデル化と、これらからロボットの制御情報を導出する手法について考察し、3次元形状に基づいたロボット制御情報の生成について重点的に取り組んだ。加工知識として形状に対する工具(加工ツール)の選択とその動作の2つを扱い、これらのモデル化を試みた。加工ツールの選択では、手仕事を手掛かりに加工によって切削される形状を類型化し、形状それぞれと開発した4種類の加工ツールとの対応をとることで選択を行なう手法を提案した。工具の動作は加工対象物の3次元モデルに含まれる面や辺といった幾何情報から計算することができ、類型化した形状それぞれに対して各加工ツールの動きを整理し、アルゴリズムとしてプログラム言語での記述を試みた。ロボットの制御情報の導出に関して考察及び整理し、部品加工システムの基盤となる部分について開発を行なった。主な開発項目はCAM、ロボット動作シミュレータ、ロボットコマンダである。CAMはCADで設計した部品の3次元モデルを入力とし、前述の加工知識のモデル化をもとに、ツールパス生成の仕組みを実装した。事故や作業の手戻りを防ぐことを目的に、動作の事前確認のためのロボット動作シミュレータを開発し、安全に加工が行えるよう配慮した。ロボットに制御情報を与える方法には、汎用コンピュータからロボットシステムへ制御情報を送信する仕組みを用い、運転の安定化を試みた。また、加工ツールに関してはモータの出力向上や形状を変更し、加工ツールの改良を行なった。開発した部品加工システムと加工ツールの検証を目的に、伝統木造構法による五重塔の屋根隅部を対象に制作試験を行なった。ありのままの部品形状を加工できることを確認し、また、シミュレーションによる加工の事前確認が効果的であることといった結果が得られた。ロボットを用いた部品加工システムについて、その基盤となる部分を実装し、伝統木造構法による五重塔の部品加工を通して、この構法による部品を、ロボットによってありのままの形状で加工できることを確認し、設定したいくつかの計画を達成することができたため、おおむね順調であると判断した。今後は、ワークの固定方法及び位置取得について取り組むことを考えている。

特に、カメラ等を用いたロボットビジョンによるワークの位置検出について重点的に取り組み、ワークの位置や形状といった現実の情報をコンピュータで把握する方法について検討し、精度や加工に掛かるコストといった面からロボットによる部品加工システムの在り方について考察したいと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
膵島移植における肝臓内免疫感作の解明と制御法の開発

近年の膵島移植成績向上に伴い、欧米では腎不全発症前の1型糖尿病患者に対して膵臓単独移植よりも優先される機会が多くなっているが、良好な治療成績を得るために複数回の膵島移植が必要となる。本邦において膵島移植が普及するには移植効率の向上が必須であり、初回膵島移植後の肝臓内免疫細胞活性化メカニズムと免疫感作に伴う再移植後の膵島傷害メカニズムを解明し、肝臓内免疫細胞活性を制御する治療戦略の確立を目的とした。マウス経門脈的膵島移植モデルを用いて膵島移植後に肝臓内NK細胞の膵島に対する細胞傷害活性が増強し、細胞傷害分子TRAILを介して膵島グラフトが廃絶されることを報告し、移植後急性期の膵島傷害に関わるIBMIR環境下で活性化することで移植膵島生着が妨げられ、活性化が持続するために再移植時の膵島傷害の要因となり得ることが解明できた。次に、肝臓内免疫応答活性を制御するための手段として、PGE2やTGF-βなどの生理活性物質による細胞傷害活性抑制効果を有する間葉系幹細胞(MSCs)を炎症性サイトカインで活性化させた後に、膵島移植と同時移植することで、PGE2の産生能が増強し、細胞傷害活性が強くメモリー機能を有する肝臓内NK細胞の活性化を制御することを証明した。更に、活性化MSCsの同時投与が膵島移植成績の著明な改善効果に寄与することを証明し、PGE2産生能のない活性化MSCsの同時投与では、膵島移植成績の改善効果が認められないことも証明した。以上から、十分量の膵島と複数回の移植でのみ治療効果が認められていた膵島移植が、活性化MSCsを同時投与することで、少量でも効果が期待できる可能性があることを証明でき、結果を論文報告した。平成28年度に計画していた研究課題は、「膵島移植における肝臓内NK細胞活性化とメモリー機能獲得メカニズムの証明」と「肝臓内NK細胞活性抑制に寄与する作用メカニズムの証明」であった。膵島移植後に肝臓内NK細胞の膵島に対する細胞傷害活性が増強するメカニズムとして、移植後急性期の膵島傷害に関わるIBMIRとの関連について検討を行った。IBMIRに関わる主要サイトカイン存在下に肝臓内NK細胞をin vitroで培養すると同時に、膵島移植後急性期の肝臓内NK細胞活性についてin vivoで検討を行ったところ、肝臓内NK細胞活性化メカニズムにTNFαを主体とするIBMIR環境が関与していることが確認できた。次に、肝臓内在住NK細胞がIBMIR環境下で活性化することで膵島グラフト生着が妨げられ、活性化が持続するために再移植時の膵島傷害の要因となり得ることが示唆され、膵島移植後の肝臓内在住NK細胞のメモリー機構の獲得メカニズムを解明することで移植効率向上に貢献できると考え、膵島移植後35日までの肝臓内在住NK細胞のphenotype変化を検証したところ、肝臓内NK細胞数の更なる増加、肝臓内NK細胞の活性化増強が確認できた。順調に研究は進み、29年度に行う予定の膵島移植後の血糖改善効果にMSCsが寄与する可能性についても順調に成果が得られると考えている。平成29年度に計画していた研究課題は、「膵島移植が間葉系幹細胞の免疫抑制機能に与える影響の証明」であった。膵島移植後に肝臓内NK細胞の膵島に対する細胞傷害活性が増強するメカニズムに、移植後急性期の膵島傷害に関わるIBMIRとの関連が関与しており、TNFαを主体とする炎症性サイトカインの存在が関与していることを確認してきた。次に、膵島移植後に生じる肝臓内免疫応答活性を制御するための手段として、間葉系幹細胞(MSCs)に着目した。MSCsは、細胞傷害活性抑制効果を有することから、肝臓内NK細胞の活性を抑制できる可能性があると考え、in vivoにおける膵島移植実験を行った。抑制効果について肝臓内NK細胞の活性化マーカーを評価したところ、MSCsを同時投与することで、肝臓内NK細胞のCD69、TRAIL表出抑制効果が確認できた。しかしながら、膵島グラフトの生着率改善効果は不十分であった。次に、あらかじめ炎症性サイトカインで活性化させたMSCsを用いて、同様の膵島移植実験を継続したところ、有意差をもって膵島グラフトの生着率改善効果が誘導できることが確認できた。現在、このメカニズムにMSCsが産生する生理活性物質であるPGE2(prostaglandin E2)の関与についてノックアウトモデルを用いて検討中である。順調に研究は進み、30年度に行う予定の膵島移植後の血糖改善効果にMSCsが産生する液性因子が関与するメカニズム解明についても順調に成果が得られると考えている。マウス経門脈的膵島移植モデルを用いて膵島移植後に肝臓内NK細胞の膵島に対する細胞傷害活性が増強し、細胞傷害分子TRAILを介して膵島グラフトが廃絶されることを報告し、移植後急性期の膵島傷害に関わるIBMIR環境下で活性化することで移植

膵島生着が妨げられ、活性化が持続するために再移植時の膵島傷害の要因となり得ることが解明できた。次に、肝臓内免疫応答活性を制御するための手段として、PGE2やTGF-βなどの生理活性物質による細胞傷害活性抑制効果を有する間葉系幹細胞(MSCs)を炎症性サイトカインで活性化させた後に、膵島移植と同時移植することで、PGE2の産生能が増強し、細胞傷害活性が強くメモリー機能を有する肝臓内NK細胞の活性化を制御することを証明した。更に、活性化MSCsの同時投与が膵島移植成績の著明な改善効果に寄与することを証明し、PGE2産生能のない活性化MSCsの同時投与では、膵島移植成績の改善効果が認められないことも証明した。以上から、十分量の膵島と複数回の移植でのみ治療効果が認められていた膵島移植が、活性化MSCsを同時投与することで、少量でも効果が期待できる可能性があることを証明でき、結果を論文報告した。適宜、研究結果を慎重に判断し、方向性の確認を行っていく予定である。研究内容についての論文投稿も計画している。当初の計画よりも、研究が進んだため、追加で購入する試薬が必要になったため
がん治療薬を指向した新規カチオン性金属錯体の設計・合成と標的分子の同定

カチオン性ペプチドを有する両親媒性Ir錯体の細胞死誘導メカニズムの解明を目指したこれまでの研究を継続し、本研究では、Ir錯体が細胞表面で作用する標的分子の同定を行った。具体的には、光反応性基であるジアジリンを導入したカチオン性Ir錯体を設計・合成し、Jurkat細胞に作用させた後にフォトアフィニティーラベリングを行った。プロテオーム解析の結果、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンがカチオン性Ir錯体の標的タンパク質の一つであることが示唆された。実際に、カチオン性Ir錯体は、カルシウム-カルモジュリンと安定な複合体を形成できることが発光滴定実験により明らかになった。我々は最近、カチオン性ペプチドを有するイリジウム(Ir)錯体が、ヒト白血病T細胞株であるJurkat細胞表面に結合することで細胞死を誘導することを見出した(Bioconjugate Chemistry, 26, 857-879 (2015))。本研究では、光反応性基としてジアジリンを導入したカチオン性両親媒性Ir錯体を設計・合成し、Ir錯体が結合するがん細胞表面のターゲット分子の同定に取り組んだ。本年度は、まず、光反応性基であるトリフルオロメチルフェニルジアジリンをKKKGG (K:リシン、G:グリシン)ペプチドのN末端側に導入したIr錯体(生理条件下での総電荷: +9)を設計・合成し、フォトアフィニティーラベリングを行った。Ir錯体は緑色に発光するため、ラベル化後電気泳動を行えば、ゲル上でIr錯体が結合したタンパク質のバンドを発光検出できると期待した。まず、Jurkat細胞に対して4°C下でIr錯体を添加し光照射を行った後、細胞を溶解し膜成分と細胞質成分に分画した。得られたサンプルの電気泳動(SDS-PAGE)を行った結果、膜成分の分画において、比較的低分子量(15-20 kDa)の領域で緑色に発光するバンドが観察できた。そのバンドに関して、プロテオーム解析を行った結果、カルシウム結合性タンパク質であるカルモジュリンがターゲット分子の一つであることが示唆された。さらに、カチオン性Ir錯体が、カルモジュリンと錯体形成することを滴定実験およびフォトアフィニティーラベリングにより確認した。本年度の目標であったジアジリンを導入したカチオン性Ir錯体の合成とフォトアフィニティーラベリングを達成できた。さらに、Ir錯体のターゲット分子の一つとしてカルモジュリンを同定することができた。我々はこれまでに、配位子の5'位にカチオン性ペプチドとしてKKGG(K:リシン、G:グリシン)テトラペプチド導入した両親媒性トリスシクロメタレート型イリジウム(Ir)錯体が、ヒト白血病T細胞株であるJurkat細胞の細胞膜に作用することで細胞死を誘導することを見出した(Bioconjugate Chemistry, 26, 857-879 (2015))。本研究では、光反応性基であるジアジリンを導入したカチオン性両親媒性Ir錯体を設計・合成し、Ir錯体が結合するがん細胞表面のターゲット分子の同定に取り組んだ。昨年度は、フォトアフィニティーラベリングおよびプロテオーム解析を行った結果、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンが、Ir錯体の標的分子の一つであることが示唆された。今年度は、カチオン性ペプチドの導入位置と細胞死誘導活性の関係性を評価するため、配位子の4'位にKKGGテトラペプチドを導入したIr錯体を設計・合成し、Jurkat細胞に対する細胞死誘導活性を評価した。その結果、5'位よりも4'位にぺプチドを導入したIr錯体の方が優れた細胞死誘導活性を示すことが分かった。また、4'位にペプチドを導入したIr錯体に対して光反応性基であるジアジリンを導入し、フォトアフィニティーラベリングを行ったところ、5'位に導入した場合と同様にカルモジュリンが標的分子の一つであることが示唆された。さらに、Ir錯体によって誘導される細胞死誘導過程において、Ir錯体の細胞膜近傍からミトコンドリアへの移行が示唆された。今後、これらの知見をもとにさらなる検討を進めることで、カチオン性両親媒性Ir錯体の細胞死誘導メカニズムの核心に迫りたい。Ir-(カルシウム・カルモジュリン)複合体の結晶化を行うことにより、結合部位などの錯体形成に対する知見を得るとともにIr錯体の構造最適化を検討したい。さらに、Ir-(カルシウム・カルモジュリン)複合体形成と細胞死誘導シグナル活性化メカニズムとの関連性について明らかにしていく予定である。生物有機化学、錯体化学研究室にストックされている試薬、ガラス器具や機器を活用することで、当初予定していた試薬や消耗品の購入が抑えられたため。本年度は、生化学実験に必要な試薬や消耗品の購入に使用する。また、論文投稿や学会発表にも使用する。
森林環境における超音波成分の疲労回復効果に関する研究

本研究は,森林環境に含まれる超音波成分の聴取の疲労回復効果につついて検討した.調査1(n=20)では,安静時聴取中の脳波のパワースペクトルを分析した.可聴閾音聴取に比べ,超音波聴取時は前頭-中心領域のβ帯域パワーが有意に高かった.調査2(n=28)では,精神的作業(視覚探索課題)後の安静状態で音聴取を行い,唾液を採取した.分泌型免疫グロブリンA(s-IgA)の濃度は,超音波音聴取時でわずかに上昇した.以上の結果は,超音波音の聴取による疲労回復効果は小さいが,前頭-中心領域の脳活動を増加させる可能性を示唆している.本研究は,森林環境に含まれる超音波成分の聴取の疲労回復効果につついて検討した.調査1(n=20)では,安静時聴取中の脳波のパワースペクトルを分析した.可聴閾音聴取に比べ,超音波聴取時は前頭-中心領域のβ帯域パワーが有意に高かった.調査2(n=28)では,精神的作業(視覚探索課題)後の安静状態で音聴取を行い,唾液を採取した.分泌型免疫グロブリンA(s-IgA)の濃度は,超音波音聴取時でわずかに上昇した.以上の結果は,超音波音の聴取による疲労回復効果は小さいが,前頭-中心領域の脳活動を増加させる可能性を示唆している.目的森林環境にて採取した4つの音響素材(緩流、急流、人工池、小雨)を用いて,出力サンプリング周波数44.1kHzの可聴閾条件と192kHzの超音波条件を設定した.これらの音響素材聴取時におけるα波誘導効果の比較を行った.方法聴覚機能および精神障害のない健常成人20名(男:女=9:11,年齢21.3±3.1歳)を被験者とした.音刺激はコンピュータによって再生され,オーディオアンプを介し,スピーカー(S-A77TB;パイオニア製)から出力された。この時、最大音圧を調査地と同じ音圧レベル(6070dB)になるよう調整した.実験は条件毎に安静時(5分),音聴取(8分),事後測定(4分)から構成された.脳波は,生体信号収録装置によって8部位(F7,F8,C3,C4,P3,P4,T5,T6)から導出され,デジタル記録(500Hz)された.そしてFFTにより0.19550Hzまでのパワースペクトルが求められた。さらに条件別にα1(810Hz)、α2(1013Hz)、β(1330Hz)の帯域毎にパワー値を算出した。結果と考察安静時から聴取時のパワー値の変化量を求めた.その結果,超音波条件において前頭,中心-頭頂領域(F7,F8,C3,C4)のβ波帯域において,パワー値の増加が認められた.またα2波帯域においては僅かに増大した。しかしα1については顕著な差が認められなかった.これらの結果は,超音波成分暴露によるスペクトル密度の増加は,α波帯域に限定されず,10Hz以上の周波数帯に影響する可能性を示唆している.目的森林環境にて採取した4つの音響素材(緩流、急流、人工池、小雨)を用いて,出力サンプリング周波数44.1kHzの可聴閾条件と192kHzの超音波条件を設定し,これらの音響素材聴取時の自発脳波の分析,および分泌型免疫グロブリンA(s-IgA)の変化を分析した.方法聴覚機能および精神障害のない健常成人20名(男:女=9:11,年齢21.3±3.1歳)を被験者とした.音刺激はコンピュータによって再生され,オーディオアンプを介し,スピーカー(S-A77TB;パイオニア製)から出力された。結果と考察安静時から聴取時のパワー値の変化量を求めた.その結果,超音波条件において前頭,中心-頭頂領域(F7,F8,C3,C4)のβ波帯域において,パワー値の増加が認められた.またα2波帯城においては僅かに増大した,しかしα1については顕著な差が認められなかった.これらの結果は,超音波成分暴露によるスペクトル密度の増加は,10Hz以上の周波数帯に影響する可能性を示唆していた.
東アフリカにおける水溶性有機エアロゾルの分子組成と安定炭素同位体比

本研究では、アフリカで頻繁に起こっている森林火災、農業廃棄物の燃焼、また、日常生活(料理など)で使用されるバイオ燃料の燃焼の大気エアロゾルへの影響を評価するために、セルロースの燃焼により生成する脱水糖の一種であるレボグルコサンの測定を行った。'アフリカの東部に位置するタンザニアにおいて採取した大気エアロゾル試料を、有機溶媒で抽出した後、BSTFA試薬で水酸基を誘導体化し、GC/MSで糖類を測定した。その結果、試料中にバイオマス燃焼のトレーサーであるレボグルコサンを検出し、その濃度を決定することに成功した。また、エアロゾル試料を水抽出後、イオンクロマトグラフィーで分析し、カリウムを含み無機イオンを測定した。K+は、植物中に多く含まれ燃焼によって大気中に放出され、大気エアロゾル粒子に取り込まれる。本研究で、レボグルコサンはより微細なエアロゾル画分(PM2.5)に濃集していること、その濃度は、雨期に低い値(38-307ng m-3,平均146ng m-3)を、乾期に高い値(138-408 ngm-3,平均252ng m-3)を示すことが明らかとなった。また、レボグルコサンの濃度は、バイオマス燃焼の無機トレーサーであるK+と強い正の相関を示した。本研究の結果、タンザニアでは、バイオマス燃焼やバイオ燃料の燃焼が大気質を大きく変えていることが明らかとなった。また、雨期には降水による除去の結果、エアロゾル濃度は低くなることがわかった。更に、レボグルコサン濃度は、エアロゾル中の水溶性有機炭素(WSOC)濃度と良い相関を示し、バイオマス燃焼が雲凝結核として作用するWSOCの重要なソースであることを示唆した。また、同位体比質量分析計を用いて、エアロゾル中の炭素・窒素の安定同位体比を測定し、エアロゾルの起源を議論した。更に、低分子ジカルボン酸の組成を解析し、シュウ酸が最も濃度の高い成分であることを明らかにした。シュウ酸などジカルボン酸の安定炭素同位体比をGC/IRMSを用いて個別に測定し、大気中での光化学的酸化プロセススを議論した。2年間の滞在予定が、1年と1ヶ月となったが、短い期間中にも多くの仕事をこなした。また、4つの論文を執筆し、そのうち2つが国際誌に掲載された。現在投稿中の論文を改訂し、国際誌の受理される様にメールでの改訂作業を行っている。Mkoma氏は、現在タンザニアにてエアロゾル試料のサンプリングを新たに行っている。これらの試料について、今後、共同研究として推進することを計画している。本研究では、東アフリカの有機エアロゾルの分子レベル解析を実施すること、および、そのための研究者を育成することを目的としている。本年度は、アフリカで頻繁に起こっている森林火災、また、日常生活(料理など)で使用されるバイオ燃料の燃焼の大気エアロゾルへの影響を評価するために、セルロースの燃焼により生成する脱水糖の一種であるレボグルコサンの測定を行った。アフリカの東部に位置するタンザニアにおいて採取した大気エアロゾル試料を、有機溶媒で抽出した後、BSTFA試薬で水酸基を誘導体化し、GC/MSで糖類を測定した。また、エアロゾル試料を水抽出後、イオンクロマトグラフィーで分析し、カリウムを含み無機イオン脅測定した。K^+は、植物中に多く含まれ燃焼によって大気中に放出され、大気エアロゾル粒子に取り込まれる。本研究で、レボグルコサンはより微細なエアロゾル画分(PM2.5)に濃集していること、その濃度は、雨期に低い値(38-307ngm^<-3>,平均146ngm^<-3>)を、乾期に高い値(138-408ngm^<-3>,平均252ngm^<-3>)を示した。

本研究で、レボグルコサンはより微細なエアロゾル画分(PM2.5)に濃集していること、その濃度は、雨期に低い値(38-307ng m-3,平均146ng m-3)を、乾期に高い値(138-408 ngm-3,平均252ng m-3)を示すことが明らかとなった。また、レボグルコサンの濃度は、バイオマス燃焼の無機トレーサーであるK+と強い正の相関を示した。本研究の結果、タンザニアでは、バイオマス燃焼やバイオ燃料の燃焼が大気質を大きく変えていることが明らかとなった。また、雨期には降水による除去の結果、エアロゾル濃度は低くなることがわかった。更に、レボグルコサン濃度は、エアロゾル中の水溶性有機炭素(WSOC)濃度と良い相関を示し、バイオマス燃焼が雲凝結核として作用するWSOCの重要なソースであることを示唆した。また、同位体比質量分析計を用いて、エアロゾル中の炭素・窒素の安定同位体比を測定し、エアロゾルの起源を議論した。更に、低分子ジカルボン酸の組成を解析し、シュウ酸が最も濃度の高い成分であることを明らかにした。シュウ酸などジカルボン酸の安定炭素同位体比をGC/IRMSを用いて個別に測定し、大気中での光化学的酸化プロセススを議論した。1年目に既に論文投稿(J.Geophys.Res,)するまでに研究が進んだ。現在、低分子ジカルボン酸などを測定する準備を行っており、研究は順調に進んでいる。2年間の滞在予定が、1年と1ヶ月となったが、短い期間中にも多くの仕事をこなした。また、4つの論文を執筆し、そのうち2つが国際誌に掲載された。低分子ジカルボン酸などの測定にも続き、アフリカにおける有機エアロゾルの組成を特徴付ける。また、シュウ酸などの安定炭素同位体比の測定より、大気中での光化学反応過程の研究を行う。現在投稿中の論文を改訂し、国際誌の受理される様にメールでの改訂作業を行っている。Mkoma氏は、現在タンザニアにてエアロゾル試料のサンプリングを新たに行っている。これらの試料について、今後、共同研究として推進することを計画している。
生体レベルにおけるカスパーゼ生理機能とその制御メカニズムの遺伝学的解析

カスパーゼは細胞死のメディエーターとして機能するシステインプロテアーゼであり、線虫からほ乳類まで保存されている。しかしながらその後の研究から、カスパーゼは細胞死実行のみならず、細胞分化、増殖、移動および炎症性サイトカインの放出といったさまざまな生理現象にも関与していることが明らかとなってきた。我々はこれまでに、細胞死以外の細胞機能に関与するカスパーゼ活性調節因子をスクリーニングにより同定した。この解析の中で我々は、FRET型のカスパーゼ活性インディケーター(SCAT)を用いて、個体レベル・単一細胞レベルでの段階的カスパーゼ活性を検出する方法を確立した。以降、生体レベルにおけるカスパーゼの生理機能を、このSCATを用いて解析している。今年度の本研究において特に注目したカスパーゼの生理機能は、周辺細胞に対する代償性増殖因子の放出である。死ぬ細胞が組織の中で自分の消失した間隙を埋めるように周りの細胞に対して増殖因子を分泌すると考えられ、「代償性増殖」として位置づけられている。この代償性増殖を誘導する細胞死シグナルの一つとしてショウジョウバエcaspase-9が、当研究室を含めた研究グループから報告された。代償性増殖因子は死ぬ細胞から放出されるため、死ぬ細胞が死なずに停滞する、または除去されない場合には、周りの細胞に過剰な増殖がみられるため、がん化のリスクを上昇させてしまうであろう。平成19年度に行った研究において、我々はショウジョウバエcaspase-9の活性を検出するSCATプローブを作製し、代償性増殖を誘導した組織において、caspase-9の強い活性上昇を検出した(未発表)。また、caspase-9による代償性増殖過剰モデルを用いて、RNAiクリーニング行い、過剰増殖を抑制する系統を複数得た。候補タンパク質がcaspase-9によって切断されることを、培養細胞を用いた実験により確認し、基質としてin vivoでどのような生理機能を発揮するか、さらなる解析が必要である。
黄色植物の鞭毛に局在する未知蛍光物質の同定

黄色植物の一系統群である褐藻カヤモノリScytoshiphonlomentariaの遊走細胞を材料として、(1)鞭毛の大量分画法の開発と(2)走行性反応の光受容体の候補である鞭毛局在の未知の緑色蛍光物質の分析を行った。室蘭と相生で採集でした藻体を成熟誘導(暗黒下で数日間半乾燥状態におく)後に光照射下で冷海水に浸し遊走細胞を放出させた。細胞を1Mソルビトールを含む緩衝液に懸濁し,バイアルミキサーで鞭毛を細胞から脱離させ,遠心分画で鞭毛を分画した。遊走細胞の鞭毛部位の顕微鏡下でのUV励起蛍光スペクトルと鞭毛分画の蛍光スペクトルは,500nm付近に蛍光極大を示した。この結果は、ユーグレナ植物ミドリムシEuglena gracilis鞭毛基部の蛍光極大波長(530nm)とは異なり、褐藻の光受容色素としてミドリムシの光受容色素(FAD)とは異なるフラビン化合物が機能していることが示された。現在、色素分子の化学構造をNMRとMSで解析するため、試料の大量調整を進めている。次に、鞭毛粗分画の構成タンパク質をSDS電気泳動で分離し、チューブリン以外のタンパク質主要バンド7本についてアミノ酸配列の解析を行った。高分子量(110kDと85kD)の2本については約20アミノ酸の配列が明らかになり、鞭毛を構成する新規タンパク質であった。現在、抗体を用いた遊走細胞局在性の解析と遺伝子のクローニングを進めている。褐藻の光受容体タンパク質の候補となる50Kda以下のタンパク質バンドはN末端がブロックされており、現在までのところ未同定のままである。しかし、ミドリムシの緑色蛍光タンパク質と相同性のあるタンパク質は検出されず、黄色植物では新規のタンパク質が走光性光受容体として機能する可能性が非常に高い。今後,緑色蛍光タンパク質の精製度を上げながら、鞭毛局在の未知蛍光物質の構成成分(タンパク質と色素分子)の同定を進める。
強弾性結晶の特異な自己微粉化現象の解明と巨大内部応力誘起材料への展開

強弾性結晶RE2(MoO4)3(RE:希土類)がRE2O3-MoO3-B2O3系ガラスから結晶化する際に、結晶自らが微粉化する自己微粉化現象の解明を加熱ステージ付きの偏光顕微鏡観察により行った。粒径が約40ミクロン以上の球状結晶でクラックが中心部分から周囲に放射状に発生し、結晶は自発的に破壊する。自己微粉化現象は希土類酸化物の種類に強く依存する。結晶の密度が、母体ガラスの密度よりも小さいために、結晶には大きな体積膨張が誘起され、内部応力の蓄積の結果、クラックが生成したというモデルを提案した。ガラス粉末の焼結により、RE2(MoO4)3結晶から成る緻密なバルク状の結晶化ガラスの作製に成功した。強弾性結晶beta'-RE2(MoO4)3 (RE:希土類)がガラス(RE2O3-MoO3-B2O3系ガラス)から結晶化する際に、自ら微粉化する現象(自己微粉化現象)について加熱ステージ付きの偏光顕微鏡観察により以下に示す研究成果が得られた。1)自己微粉化現象は希土類酸化物の種類に強く依存する。特に、Gd2O3, Dy2O3では顕著に自己微粉化が起こるが、Sm2O3ではその程度は非常に小さい。検討されたB2O3量(15, 20, 25 mol%)の範囲では、いずれも自己微粉化が起こる。結晶粒子径が40ミクロン以上になると、結晶の中心からクラックが放射線状に形成される。そのクラックは結晶の粒径の増大と共に成長し、最終的に三角錐状の形をした微粒子に分解する。2)自己微粉化現象は、550-600oCの熱処理温度域で起こり、この温度は、強弾性と常弾性の転移温度(100oC前後)よりはるかに高いため、強弾性による結晶内部の自発ひずみには直接関係づけられない。通常、ほとんどの場合において、ガラスとガラスから生成する結晶相の密度は、結晶相の方が大きい。しかしながら、本研究の場合では、ガラスの密度が、beta'-RE2(MoO4)3結晶よりも大きいという極めて特異なガラス系であることが明らかになった。このため、結晶化領域、すなわち結晶には大きな体積膨張が誘起され、その結果としてクラックが生成したものと結論づけた。3)微粉化した個々の粒子において、屈折率の周期的な変化が観測され、レーザーパターニングでの結晶成長と同様に、RE2(MoO4)3結晶内のMoO4構造単位はらせん状に回転しながら結晶成長するというモデルを提案した。強弾性結晶RE2(MoO4)3 (RE:希土類)がガラス(RE2O3-MoO3-B2O3系ガラス)から結晶化する際に、自ら微粉化する現象について加熱ステージ付きの偏光顕微鏡観察によりその機構を明らかにした。1) 21.25Gd2O3-63.75MoO3-15B2O3組成のガラスを加熱ステージで熱処理し、生成した粒径約40ミクロンの結晶の光学顕微鏡観察を行った結果、クラックが存在し、結晶の中心部分から周囲に放射状に伸びていることを見出した。異なる粒径に対する観察の結果、粒径が約50ミクロン以上の結晶でクラックが発生し、結晶は自発的に破壊することを明らかにした。2)自己微粉化現象は、強弾性と常弾性の転移温度(100oC前後)よりはるかに高い温度で起こるため、破壊の原因、すなわち、結晶内部に巨大な応力が発生する原因をGd2O3-MoO3-B2O3系ガラスとRE2(MoO4)3結晶の密度に注目した。通常のガラスの結晶化においては、自由体積の多いガラスの方が生成する結晶よりも密度は小さい。しかしながら、Gd2O3-MoO3-B2O3系では、ガラスの密度が、RE2(MoO4)3結晶よりも大きいという極めて特異なガラス系であることが明らかになった。3)巨大内部応力誘起材料への展開のためには、どうしてもバルク状の試料が必要である。ガラス粉末をボールミリング法で調整し、一軸加圧成形手法により、RE2(MoO4)3結晶から成る緻密なバルク状の結晶化ガラスの作製に成功した。4)微粉化した個々の粒子において、屈折率の周期的な変化が観測され、レーザーパターニングでの結晶成長と同様に、RE2(MoO4)3結晶内のMoO4構造単位はらせん状に回転しながら結晶成長するというモデルを提案した。

材料工学RE2O3-MoO3-B2O3系ガラスから強弾性結晶beta'-RE2(MoO4)3が生成する過程で生じる結晶自らの破壊は、我々が発見した現象であり、極めて特異である。この現象の詳細を明らかにし、さらにこの現象を利用して新たな材料(巨大内部応力誘起材料)に繋げることが本研究の目的である。本研究において、現象の詳細を調べ、自己微粉化現象の機構を提案することができた。提案した自己微粉化機構の概念を展開(ガラス組成と結晶相の設計)することによって、新規な巨大内部応力誘起材料の開発に繋がると確信する。1.結晶内部および結晶とガラス界面に誘起される応力の大きさを複屈折イメージング装置を用いて定量的に評価する。特に、微粉化前の段階、微粉化直前の段階、微粉化直後の段階について応力の大きさと分布がどうのように変化していくかを明らかにする。2.強弾性結晶beta'-Sm2(MoO4)3が生成する場合は、顕著な自己微粉化現象が起きないことに着目する。この場合でも、結晶の密度は母体ガラスの密度と比べて小さいことには変わりはないことから、内部応力を結晶内部に効率的に閉じ込める可能性があることを示している。Sm2O3-MoO3-B2O3系ガラスの結晶化による応力の大きさ、分布状態を明らかにする。また、ガラス形成成分B2O3の量をかなり含むガラスでも自己微粉化現象を詳細に検討する。これらの研究により、本研究で提案しているアイデアの実証を行う。平成25年度において、強弾性結晶内部に誘起され、自己微粉化に至らしめる巨大な応力測定と集束イオンビーム(FIB)加工による透過電子顕微鏡(TEM)観察を計画していたが、使用装置の不具合等で実験が進まなかった。特に、FIB加工とTEM観察には、かなりの費用が必要であり、結果として未使用額が生じた。なお、研究自体は、加熱ステージ付きの偏光顕微鏡観察により、自己微粉化機構を提案することができ、多くの研究成果を得ることができた。平成26年度において、強弾性結晶内部に誘起され、自己微粉化に至らしめる巨大な応力について、特に、複屈折イメージング装置によるマクロスケールでの定量的評価とFIB加工とTEM観察による原子レベルでの評価を、平成25年度の未使用額と平成26年度の交付額を使用して実施する。具体的には、観察用試料作製のための物品、実験補助謝金、研究成果発表旅費に使用する。
非線形分散型方程式における定在波の安定性解析

今年度の主な研究成果の一つは,赤堀公史氏(愛媛大)と名和範人氏(大阪大)との共同研究の下で行った,非線形シュレディンガー方程式の解の挙動に関するものである.具体的には,ある変分値を用いて特徴付けられる互いに素な集合を2つ導入し,その一つ集合の元を初期値とした解は散乱し,もう一方の集合の元を初期値とした解は有限又は無限時間で爆発することを示した.そして,その系として,基底状態の不安定性を示すことを出来た.非線形項が単純冪の場合は,既にAkahori-Nawa (preprint)において,類似のことが証明されたが,今回はより一般の非線形項を取り扱うことに成功した.もう一つ研究成果は.Fouad Hadj Selem氏(Reims Univ.)とJun-Cheng Wei氏(Chinese Univ.of Hong Kong)との共同で行った,調和ポテンシャルを伴うソボレフ超臨界の非線形項を持つ楕円型方程式の正値解が存在に関するものである.ソボレフ劣臨界のときは,正値解が一意であり,分岐のダイアグラムの形状もHirose-Ohta(2002, 2007)により,よく知られている.しかし,数値計算によると,ソボレ超臨界のときは,分岐のダイアグラムは劇的に変化することが示唆されている.具体的には,正値解の一意性が成立せず,多数存在することが予想されている.この研究では,この現象に対して,厳密な証明を与えることが目標である.そのため,まず大域的な正値解の分岐が存在することを証明した.次に,正値解の多重性を示すためには,得られた分岐解のMorse indexを計算することが重要である.これを計算するのに,分岐解の極限が,原点で特異性を持つ解であることを示し,その特異解のMorse indexを計算することが出来た.それにより,冪乗型非線形項の指数がある範囲の場合には,分岐のパラメータが大きくなると,分岐解のMorse indexは無限大になることが分かった.これらの成果をまとめて,いくつかの研究集会などで講演し,今後の課題を述べた.福泉麗佳氏(東北大情報)との共同研究の下,有界領域上におけるべき型非線形項を持つシュレディンガー方程式(以後,(NLS)と略す)の定在波解の安定性について研究した.定在波解とは,時間に関して位相の周期的変動しか依存しない(NLS)の特別な形をした解である.そして,定在波解が安定であるとは,定在波解に摂動を加えて時間発展させても,定在波解に近い状態にあり続けることであり,そうでないときは不安定であるという.これまでは,空間領域が全空間の場合にはよく研究されており,空間次元をN,べき型非線形項の指数をpとすると,基底状態から作られる定在波解は,pが1+4/Nより小さいときには安定であり,pが1+4/Nより大きいときには不安定であることがよく知られている.このように1+4/Nを臨界値として,安定・不安定が変化し,ちょうど臨界値のときには不安定となる.しかし,空間領域が球の場合には,これと異なる現象が起こることが数値計算の結果により示唆されている.その数値計算とはFibich-Merle(2001)によるもので,彼らはpが臨界値のときである1+4/Nのときは,全空間と異なり,安定となることを予想した.この現象について厳密な証明を与えようと試み,一般次元については,以下の結果を得ることが出来た.(i)p=1+4/Nとする.このとき,振動数が十分大きい,または,-λ_{1}に十分近ければ,基底状態から作られる定在波解は安定となる.ここで,λ_{1}は球上のラプラシアンの第1固有値である.このように一般次元では,振動数に技術的な条件を課さなければならないが,空間1次元に限れば,この条件を取り除くことが出来る.つまり,次を示すことが出来た.(ii)N=1,p=5とする.このとき,基底状態が存在する全ての振動数に対して,それから作られる定在波解は安定となる.今年度の主な研究成果の一つは,赤堀公史氏(愛媛大)と名和範人氏(大阪大)との共同研究の下で行った,非線形シュレディンガー方程式の解の挙動に関するものである.具体的には,ある変分値を用いて特徴付けられる互いに素な集合を2つ導入し,その一つ集合の元を初期値とした解は散乱し,もう一方の集合の元を初期値とした解は有限又は無限時間で爆発することを示した.そして,その系として,基底状態の不安定性を示すことを出来た.非線形項が単純冪の場合は,既にAkahori-Nawa (preprint)において,類似のことが証明されたが,今回はより一般の非線形項を取り扱うことに成功した.もう一つ研究成果は.Fouad Hadj Selem氏(Reims Univ.)とJun-Cheng Wei氏(Chinese Univ.of Hong Kong)との共同で行った,調和ポテンシャルを伴うソボレフ超臨界の非線形項を持つ楕円型方程式の正値解が存在に関するものである.ソボレフ劣臨界のときは,正値解が一意であり,分岐のダイアグラムの形状もHirose-Ohta(2002, 2007)により,よく知られている.

しかし,数値計算によると,ソボレ超臨界のときは,分岐のダイアグラムは劇的に変化することが示唆されている.具体的には,正値解の一意性が成立せず,多数存在することが予想されている.この研究では,この現象に対して,厳密な証明を与えることが目標である.そのため,まず大域的な正値解の分岐が存在することを証明した.次に,正値解の多重性を示すためには,得られた分岐解のMorse indexを計算することが重要である.これを計算するのに,分岐解の極限が,原点で特異性を持つ解であることを示し,その特異解のMorse indexを計算することが出来た.それにより,冪乗型非線形項の指数がある範囲の場合には,分岐のパラメータが大きくなると,分岐解のMorse indexは無限大になることが分かった.これらの成果をまとめて,いくつかの研究集会などで講演し,今後の課題を述べた.
体外受精における卵子凍結保存の研究

昨年度に我が国初の凍結受精卵による妊娠・出産を報告して以来、研究の主眼を受精卵の簡易凍結法と卵子の凍結保存に移行した。その結果、以下の知見を得た。プログラムフリ-ザ-を使用した従来からの凍結保存法と比較して、断熱剤で保護された小型容器中の雰囲気で自然に冷却する簡易凍結法は1回当たりの液体窒素消費量が約15分の1であり、また凍結用ストロ-を水平にした状態で植氷操作を行うため細胞に対する温度ストレスをより小さくできることが判明した。さらにプログラムフリ-ザ-では植氷操作後の温度平衡を必要としたが、簡易凍結法では平衡時間を廃しても融解後の蘇生率は統計学的に有意の差を認めなかった。したがって、凍結保存には簡易凍結法でも充分に満足のいく成果が得られることが分かった。卵子の凍結保存では、卵丘細胞を除去せずに凍結保存したほうが融解後の生存率が高いことがわかり、卵丘細胞と卵子との間の内分泌学的相互作用が融解後の生存を決定する重要な要素であることが推測された。次に、凍結保護剤に関して検討を加かた結果、ジメチルスルフォキシドよりもプロパンジオ-ルのほうが良好な成績を示し、後者の持つ膜透過性の高さが反映された。また、これら細胞膜透過性凍結保護物質だけでなく、細胞外浸透圧亢進作用を有する蔗糖を添加すると、初期胚の場合と同様に融解後の蘇生率が先らに向上し、凍結過程における細胞内自由水の脱水が重要な要素であることが示唆された。さらに融解直後のマウス胚の電子顕微鏡写真より、ミトコンドリア等の細胞内小器官の超微形態が変形していることが判明し、微小な低温障害が発生していること可能性が明らかになった。凍結前の卵子の成熟度も融解後の生存性と密接に関係し、ヒト臨床応用にあたっては更なる凍結法の改良と綿密な成熟判定が不可欠であることが明らかになった。本年度は、ヒト未受精卵の凍結保存の基礎研究として、受精卵を用いた凍結及び解凍の諸条件の検討を行った。対象は、実験動物としてICR系マウスを、また臨床研究では倫理的規定に基づく所定の手続を踏まえたヒト受精卵を使用した。第1段階では、マウスでは8細胞期胚及び4細胞期胚を用い、ジメチルスルフォキシドを凍結保護剤とする凍結プログラムを開発した。凍結保護剤の添加方法、添加の時間間隔、室温下の平衡時間、植氷操作の諸条件、植氷後の平衡時間、及び急速凍結の開始温度について、約100種類の条件を検討し、至適条件の設定に成功した。即ち、ジメチルスルフォキシドは、3段階に分けて順次高濃度の溶液を作製し、最終濃度1.5モルとすること。各段階の所要は、5分間隔が最適であり、それ以上の時間では成績が低下すること。最終濃度に達した後の平衡時間は10分が望ましいこと。植氷は手動でも自動でも受精卵に与える物理的衝撃には差が無く、植氷後の平衡時間は30分とすること。その後の緩慢凍結は氷点下40度迄で十分であり、以後は急速凍結でも良好な成績をあげられること、等が判明した。第2段階では、決定された至適凍結プログラムに従い、凍結胚の解凍方法に関して諸条件の検討を行った。

即ち、細胞外凍結保護物質として近年注目されている蔗糖を中心に、添加の有無による成績の変化、至適濃度の設定、更に解凍操作中の温度環境が胚に及ぼす影響を検討したところ、蔗糖を0.1モルないし0.5モル添加して室温で解凍操作を行う場合に最も胚の蘇生率と発生率が高いことが判明した。第3段階では、以上の知見を基に体外受精におけるヒト受精卵を対象として凍結保存と解凍を行った。その結果、平成元年2月にわが国初の凍結受精卵による妊娠に成功した。詳細に関しては次年度の報告に記載する予定である。来年度は、コンピュータによる画像解析を加え、安全性を検討する予定である。本年度の研究は、ヒトを対象とした臨床応用の段階に入った。すなわち、体外受精プログラムにおいて得られた余剰胚を、患者およびその家族の同意のもとに、日本産婦人科学会の倫理規約に準拠して凍結保存し、融解後の生存性と妊娠率を検討した。その結果、以下のことが明らかになった。(1)凍結方法は、氷点下7°Cにて手動植氷、以後毎分0.33°Cで氷点下40°Cまで緩徐に冷却し、以後は液体窒素の温度まで急速に冷却する「急速冷却法」が、良好な成績を納めた。(2)凍結方法は、液体窒素より容器を取り出し、室温に1分間暴露、続いて20°Cの水槽中で1分間加温する方法が適していること。(3)凍結保護剤として、1.5Mジメチルスルフォキシド(DMSO)と0.1Mショ糖を凍結操作の段階から添加し、融解過程においても使用すると、胚の保護効果が非常に高いこと。(4)凍結の時点で8細胞期胚以降にまで発生が進行していた群は、それ以前の段階にあった胚よりも生存性が有意に高いこと。(5)排卵誘発剤による卵巣の過剰刺激を行わない月経周期にのみ、着床が成立した。これらの新知見を基礎として、1989年12月25日に凍結保存胚による日本初の出産に成功した。この症例は2個の凍結保存胚を子宮内移植した結果成立した妊娠によるものであり、全妊娠経過中特記すべき異常を認めず、奇形等の障害もなく、出生後も正常に発育している。以上の研究業績は、裏面の学術雑誌に掲載されているほか、第7回日本受精着床学会で発表、また、同学会誌に英文で掲載予定である。来年度は、本研究の最終段階としてヒト未受精卵を対象とした研究を計画している。また、コンピュ-タ画像解析システムも実用化に成功したので、それを用いた非侵襲的な卵細胞の生存性判定技術により、安全性の高い凍結保存・融解法の確立する予定である。昨年度に我が国初の凍結受精卵による妊娠・出産を報告して以来、研究の主眼を受精卵の簡易凍結法と卵子の凍結保存に移行した。その結果、以下の知見を得た。プログラムフリ-ザ-を使用した従来からの凍結保存法と比較して、断熱剤で保護された小型容器中の雰囲気で自然に冷却する簡易凍結法は1回当たりの液体窒素消費量が約15分の1であり、また凍結用ストロ-を水平にした状態で植氷操作を行うため細胞に対する温度ストレスをより小さくできることが判明した。さらにプログラムフリ-ザ-では植氷操作後の温度平衡を必要としたが、簡易凍結法では平衡時間を廃しても融解後の蘇生率は統計学的に有意の差を認めなかった。したがって、凍結保存には簡易凍結法でも充分に満足のいく成果が得られることが分かった。卵子の凍結保存では、卵丘細胞を除去せずに凍結保存したほうが融解後の生存率が高いことがわかり、卵丘細胞と卵子との間の内分泌学的相互作用が融解後の生存を決定する重要な要素であることが推測された。次に、凍結保護剤に関して検討を加えた結果、ジメチルスルフォキシドよりもプロパンジオ-ルのほうが良好な成績を示し、後者の持つ膜透過性の高さが反映された。また、これら細胞膜透過性凍結保護物質だけでなく、細胞外浸透圧亢進作用を有する蔗糖を添加すると、初期胚の場合と同様に融解後の蘇生率がさらに向上し、凍結過程における細胞内自由水の脱水が重要な要素であることが示唆された。
GTP結合蛋白質を介する細胞増殖情報伝達系の機能制御ーチロシンリン酸化反応の関与

1.細胞増殖シグナル伝達反応系において、百日咳毒素(PT)感受性GTP結合タンパク質(G_<PT>)の機能はCキナ-ゼ(PKC)活性化に連動していることを明らかにした。2.その増殖シグナル伝達におけるG_<PT>/PKCの関与によりペプチド増殖因子は3種類に分類されることを明らかにした。即ち、(a)そのシグナルをすべてG_<PT>/PKCの機能に依存して伝達するもの(スロンビン、ボンベシン、ブラジキニンなど)、(b)半分程度G_<PT>/PKCを含む経路によって伝達するもの(EGF、PDGFなど)、(c)G_<PT>/PKCの機能にほとんど依存せずにそのシグナルを伝達するもの(FGFなど)。3.その受容体がチロシンキナ-ゼ活性を持つEGF、PDGFだけでなく、リン酸化チロシン特異的フォスファタ-ゼの阻害剤であるバナジン酸ナトリウムの細胞増殖作用もG_<PT>/PKCの機能にある程度依存することにより、蛋白質チロシンリン酸化の促進とPKC活性化反応の間に何らかの相関(Cross Talk)がある可能性が示唆された。特にこれらの因子の増殖作用がG_<PT>の機能阻害によってもPKC downregulationの場合と同様無処理細胞に比べて半分程度に抑制されたことにより、上記2反応の間の接点が各増殖因子のシグナル伝達反応においてG_<PT>よりも上流にある可能性が示唆された。4.上記2つの反応の間のoss Talkの実体、即ちPKC活性化に関与する何らかの蛋白質がチロシンリン酸化によって機能制御されている可能性については、まずヒト血小板から精製したPLCーγとA431細胞から部分精製したEGF受容体チロシンキナ-ゼを利用して試験管内でPLCーγのチロシン残基をリン酸化したが、PLCーγ活性はチロシンリン酸の促進によってほとんど変動しなかった。PI3キナ-ゼ、G蛋白質活性化因子などのチロシンリン酸化による機能の変動については現在検討中である。百日咳毒素(PT)処理でPT感受性G蛋白質の機能を特異的に阻害し、あるいはTPA長時間処理でCキナ-ゼをdown regulationさせたマウス、ヒト繊維芽細胞において,各ペプチド増殖因子の細胞増殖作用が無処理細胞の場合と比べてどのように影響されるかを検討した。その結果、(1)PT感受性G蛋白質、Cキナ-ゼは増殖シグナル伝達反応において同一系路上に位置し、連動してその機能を発現している、(2)そのシグナル伝達におけるPT感受性G蛋白質、Cキナ-ゼの関与により3つのグル-プ,(a)その増殖シグナルをすべてPT感受性G蛋白質,Cキナ-ゼを含む経路によって伝達するもの(スロンビン、ボンベシン、ブラジキニンなど)、(b)半分程度PT感受性G蛋白質およびCキナ-ゼの機能に依存してその増殖シグナルを伝達するもの(EGF,PDGF,バナジン酸ナトリウムなど)、(c)PT感受性G蛋白質、Cキナ-ゼの機能にあまり依存せず、それらとはほとんど無関係にその増殖シグナルを伝達するもの(FGFなど)、に分類することができることなどを明らかにした。EGFやPDGFだけでなくリン酸化チロシンホスファタ-ゼの阻害剤であるバナジン酸ナトリウムの細胞増殖作用も部分的にではあるがCキナ-ゼの機能に依存することより、蛋白質チロシンリン酸化の促進とCキナ-ゼ活性化反応の間になんらかの「Cross Talk」があることが示唆された。特にこれら因子の増殖作用がPT感受性G蛋白質の機能阻害でもCキナ-ゼdown

regulationと同様に抑制されたことは、上記2つの反応の間の接点がそれらのシグナル伝達反応においてG蛋白質よりも上流にある可能性を示唆する。現在この点については特にp21^<ras>ーGTPア-ゼ活性化蛋白質を中心として検討中である。細胞増殖促進の情報伝達系は(I)受容体の持つチロシンキナ-ゼ活性を介するもの、(II)受容体がGTP結合蛋白質(G蛋白質)と共役して促進されるホスホリパ-ゼC(PLC)活性を介するもの(これはCキナ-ゼ活性化に連動する)、の2種類に大別され、PDGF、EGFなどは(I)の系でその情報を伝達すると考えられている。一方、我々は昨年度までの解析よりPDGF、EGFなどが上記(II)の系をもその作用発現に動員していることを明らかにしたが、これはチロシンリン酸化の促進とG蛋白質⇒PLC⇒Cキナ-ゼの活性化という上記2つの反応系の間に何らかの相関(Cross Talk)がある可能性を示唆する。そこで本年度はPLC活性化反応に関与するいずれかの蛋白質(PI3キナ-ゼ、G蛋白質、G蛋白質活性化因子、あるいはPLCそれ自身など)が受容体チロシンキナ-ゼによるリン酸化によってその活性を制御されている可能性について検討した。まず増殖刺激した細胞中のチロシンリン酸化蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロット法によって解析した。各増殖因子によってチロシンリン酸化が促進される蛋白質はそれぞれに特徴的であり、EGF、PDGF刺激で共通にチロシンリン酸化の促進が認められる蛋白質は見当らなかった。EGF、PDGFはいずれもG蛋白質、Cキナ-ゼなどの機能に部分的にではあるが依存してその情報を伝達することは先に述べたが、この結果は上記2つの情報伝達反応系の間のCross Talkのメカニズムが増殖因子によって異なっている可能性を示唆した。次に、血小板から精製したPLCーγとA431細胞から部分精製したEGF受容体チロシンキナ-ゼを利用して試験管内でPLCーγのチロシン残基をリン酸化した。PLCーγ活性はチロシンリン酸化の促進によってほとんど変動せず、上記2つのシグナル伝達系の間のCross talkの実体をPLCのリン酸化によって説明することはできなかった。PI3キナ-ゼ、G蛋白質活性化因子などのチロシンリン酸化による機能の変動については現在検討中である。