hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強い重力場における物理素過程とその観測的検証に関する研究

活動銀河核やX線連星のX線スペクトルとその時間変動を理論的に説明するために、ブラックホール降着流のモデルとして、光学的に厚い標準降着円盤とそれを取り巻く光学的に薄く高温のコロナからなる系を考え、その中でのコンプトン散乱を考慮に入れた光子の伝播を、3次元モンテカルロシミュレーションで追うことによって、モデルから予測されるX線スペクトルを求めた。特にコロナのモデルとしてはKato, et. al.(2003)において行われた、ブラックホール降着流の3次元磁気流体シミュレーションの結果を用いた。その結果、スペクトルの幕など広帯域で見たときのスペクトルの形状が活動銀河核のそれとよく一致することを確かめた。また、コロナ流の変動に伴うX線の時間変動についても調べた。この研究は円盤コロナ系からの放射の特徴を、磁気流体シミュレーションを用いて計算した世界で最初の例である。現在、同様の計算によってX線連星の最新の観測結果を説明する計画も進行中である。一方、ガンマ線バーストの中心エンジンとしての大質量降着円盤についての研究も進展した。まず大質量降着流からのニュートリノスペクトルを、希薄な円盤コロナ中での輻射過程を考慮して計算しなおし、その結果からガンマ線バーストを起こすのに使える解放エネルギーが従来のモデルよりも1.5倍程度増大することを示した。現在は大質量降着円盤中の磁気流体不安定性の分析から、後期質量降着の様子について示唆を行い、ガンマ線バーストの残光の光度曲線の特徴を説明する理論モデルを構築する試みを進めている。1.活動銀河核やX線連星のX線スペクトル中には、しばしば幅の拡がった蛍光鉄輝線が見られる。この鉄輝線は、ブラックホール降着円盤を何らかのX線源が照射することによって生成され、相対論的効果によってそのプロファイルが変形したと考えられているが、過去の研究ではX線源のモデルについては単純化されたものしか考えられることはなかった。我々はX線源として磁気リコネクションによって加熱された円盤コロナを考え、それに基づいて円盤上の鉄輝線強度分布を求め、遠方の観測者から輝線プロファイルがどのように見えるかを、相対論的効果をフルに取り入れて計算した。得られたプロファイルは過去の観測結果と極めてよく一致した。これはX線照射の物理モデルを取り入れて円盤からの反射スペクトルを計算した世界で初めての例である。2.ガンマ線バーストの中心エンジンのモデルとしては、星程度のブラックホールに毎秒太陽質量程度のガスが落ち込む降着円盤といったものが有力視されている。このような円盤は非常に高密度かつ高温となるため、光子による冷却はほとんど効かず、代わりに移流やニュートリノ放射による冷却が卓越すると考えられる。我々はそのような円盤の構造を、ニュートリノ放射、電子・核子の縮退、原子核の解離、レプトン数保存といった物理をできるだけ詳細に取り入れて解きなおした。特に原子核の解離が起こる半径において円盤の不安定性を誘起するような物理量の急激な変化があるかどうかを調べたが、現在のところはそのような兆候は見出せていない。これについては今後も引き続き解析を進める予定である。ガンマ線バーストの中心エンジンのモデルとしては、星程度のブラックホールに毎秒太陽質量程度のガスが落ち込む降着円盤といったものが有力視されている。特に原子核の解離が起こる半径、ニュートリノ冷却が効きはじめる半径、ニュートリノに対して厚くなる半径において円盤の安定性を調べ、このような円盤においては熱的な不安定性もsecularな不安定性も存在しないことを確かめた(Kawanaka and Mineshige 2007)。また、このような大質量円盤における磁気流体不安定性の成長についても考察を行い、円盤内縁付近で不安定性が成長しにくく、したがって角運動量輸送が効率よく行われなくなる可能性を指摘した。これにより、円盤内縁部に外側から落ちてきたガスが集積し、やがて自己重力不安定となると一気に中心ブラックホールに向かってガスが落ち込み、再び外側からガスが集積し、という間欠的な質量降着が起こることが期待され、これがガンマ線バーストの即時放射の激しい光度変化に対応しているという仮説を提唱した(Masada et al. 2007)。

まず大質量降着流からのニュートリノスペクトルを、希薄な円盤コロナ中での輻射過程を考慮して計算しなおし、その結果からガンマ線バーストを起こすのに使える解放エネルギーが従来のモデルよりも1.5倍程度増大することを示した。現在は大質量降着円盤中の磁気流体不安定性の分析から、後期質量降着の様子について示唆を行い、ガンマ線バーストの残光の光度曲線の特徴を説明する理論モデルを構築する試みを進めている。
脳血管内皮細胞・神経膠細胞cocultureによる脳血液関門実験系の構築と応用

脳血液関門に関して脳毛細血管内皮細胞を用いて次の研究を行った。(1)in vitro脳血液関門実験系を用いた研究ラット脳微小血管内皮細胞をAudusの方法に準じて分離培養し、mesh上に単層培養して電気抵抗と14C-sucrose透過性を指標として脳血管透過性を測定するin vitro BBBの実験系を確立した。Leukotriene C4(LTC4)の脳血管に対する作用にenzymatic barrierがあるという仮説を同実験家系を用いて検証して、gamma-GTPを欠如するin vitro BBB実験系においてもLTC4による透過性亢進を認めないことから、gamma-GTPがenzymatic barrierとして働くという仮説を棄却した。脳腫瘍治療における高浸透圧溶液による可逆性脳血液関門開放の機序を明らかにするために、培養ラット脳毛細血管内皮細胞を用いたBBB実験系とin situ brain perfusion法によるin vivo実験系によってBBBの可逆的開放の時間的経過を明らかにした。次に、共焦点レーザー顕微鏡を用いて高浸透圧溶液作用後の細胞内Caイオンの変化を観察し、作用後の急速な細胞内Caイオンの増加と経時的な細胞内から細胞外へのCaイオンのくみ出しを確認した。この時間的経過はin vitro,in vivoのBBB実験系における経過と一致していたことから、細胞内Caイオンの変化が可逆性BBB開放の機序に関与していると結論した。(2)低散素条件下における脳微小血管内皮細胞の障害機序と保護の検討虚血性脳障害における脳血管内皮細胞の関与をフリーラジカルの産生とそれによる細胞障害の見地から研究すするために培養ヒト脳微小血管内皮細胞を用いたin vitro実験系を確立した。それによって、低酸素後の再酸素化による内皮細胞細胞障害が内皮細胞自身が産生するフリーラヂカルによるものであることを明らかにした。次に、NOが低酸素条件下で増加することを明らかにした後、それがフリーラヂカルの産生を介して細胞障害性に働くかいなかの基礎実験を行った。(3)脳毛細血管内皮細胞に対するANP,BNP,CNPの作用の検討脳血液関門に関して脳毛細血管内皮細胞を用いて次の研究を行った。(3)脳毛細血管内皮細胞に対するANP,BNP,CNPの作用の検討(1)ラット脳毛細血管内皮細胞の培養系を確立し、第八因子が組織化学的に一様に存在し、PGI2などの内皮細胞特有の生理活性物質の存在も確認した。secondary cultureを用いて細胞間反応研究用チャンバーの多孔性膜(collagen処理)に一様な内皮細胞層を形成することに成功した。この膜はsucroseに対して不完全な透過性を示すことを確認した。(2)共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて、脳血管内細胞の細胞内Caのin vitro,real timeの観察を可能とした。共焦点レーザー顕微鏡の載物台上に温度、酸素濃度,PHを一定に保つ還流装置を作製し、無酸素実験、各種生理学的実験を可能とした。高浸透圧刺激により細胞内Ca濃度の変化が観察され、高浸透圧による可逆性のBBB openingに細胞内Caが関与している可能性が明らかにされた。コラーゲン膜(Cellugen)を用いたin vitro BBB実験が完成し、14C-Sucrose、Ethylenglycole、Leucineを用いて確認した。leulotrien C4,serotonine等のchemical mediatorによるBBB透過性の変化も確認した。以上の結果は、1993年度国際脳浮腫シンポジウムにおける、パネルディスカッションに採択され、monographとして発行される。

(3)神経膠細胞とのcocultureに関しては、いくつかの困難な課題を残している。C6グリオーマとのcocultureを試みると共に、新生ラット脳を用いて星状神経膠細胞の分離・培養に着手した。これによって、より生理的なcoculture条件が得られる。以上、生理的条件下における実験系が確立し平成5年度以降に病態研究への道が開かれた。病的状態における脳微小血管内皮細胞の変化を検討した。無酸素負荷に対する脳微小血管内皮細胞の反応、特に糖輸送キャリアーの変化を明かにした。次に、Leukotrien C4の脳微小血管内皮細胞に対する影響とgamma-GTPの関係を明らかにして、脳神経外科学会内で論議されていたgamma-GTPがLTC4に対するenzymatic carrierとして働いているのではないかという仮説を棄却し、議論に終止符を打った。この結果は“International Symposium on Brain Edema"に報告した。研究を進めるにしたがい、脳微小血管内皮細胞自体の病的状態における様々な問題、例えば糖やアミノ酸輸送キャリアーの変化などの問題に手をつけざるを得ず、結局脳微小血管内皮細胞と星状神経膠細胞のcocultureへと進むことは1年延ばして平成5年度後半からとした。現時点で、脳微小血管内皮細胞の生理的な実験と、いくつかの病的条件かでの実験を終了し、星状神経膠細胞とのcocultureにすでに着手した。平成6年度は、in vitroの脳血液関門実験系を確立する。同時に、星状神経膠細胞を障害した場合に生じる脳血液関門の異常を生理学的・生化学的に検出するシステムを確立する。これによって、脳のvolume regulationの主役である2つの細胞系の相互関係を明らかにし、病態理解と治療に結び付ける。平成6年度は脳毛細血管内皮細胞に関する3つのテーマについて研究を行った。脳腫瘍治療における高浸透圧溶液による可逆性脳血液関門開放の機序を明らかにするために、培養ラット脳毛細血管内皮細胞を用いたBBB実験系とin situ brain perfusion法によるin vivo実験系によってBBBの可逆的開放の時間的経過を明らかにした。次に、共焦点レーザー顕微鏡を用いて高浸透圧溶液作用後の細胞内Caイオンの変化を観察し、作用後の急速な細胞内Caイオンの増加と経時的な細胞内から細胞外へのCaイオンのくみ出しを確認した。この時間的経過は、invitro,invivoのBBB実験系における経過と一致していたことから、細胞内Caイオンの変化が可逆性BBB開放の機序に関与していると結論した。(2)低酸素条件下における脳微小血管内皮細胞の障害機序と保護の検討虚血性脳障害における脳血管内皮細胞の関与をフリーラジカルの産生とそれによる細胞障害の見地から研究すするために培養ヒト脳微小血管内皮細胞を用いたin vivo実験系を確率した。
極小主義プログラムの新たな展開を踏まえた論理形式表示の研究

本研究は、極小主義プログラムの新たな展開を踏まえて、概念・意図システムへの入力としての論理形式表示のあるべき形式と解釈を明らかにすることを目的とする。具体的には、1適切な解釈に対応するラベル付けの解明、2付加構造の解釈の解明、3遂行節の詳細な構造の解明により、新たな論理形式表示の理論を提示することを目的とする。1のラベル付けに関しては、極小主義プログラムにおけるラベル付けアルゴリズムを提唱したChomsky(2013)、およびChomsky(2015)を基盤として、日本語の格助詞に関わるラベル付けを提案し、その帰結を考察したSaito(2016)、凍結効果をラベル付けによって説明する分析を提案したBoskovic(2019)、ラベル付けに関わる最新の論文集であるBauke and Blumel (eds.)(2017)等を批判的に検討した。2の付加構造の問題に関しては、等位構造制約と付加詞条件を考察したBoskovic(2018)、付加詞の外置現象の生成過程について基底生成と移動による分析を比較考察したReeve and Hicks(2017)等を検討した。3の遂行節については、修辞疑問文の疑問文としての統語的・意味的特性を考察したCaponigro and Sprouse(2007)、極小主義プログラムにおける連鎖の概念を考察したMartin and Uriagereka(2014)“Chains in Minimalism,"等を検討した。このような研究の成果として、金子(2019)「時の付加詞節における時制の調和現象と極小主義プログラムについて」として発表した。これに加えて、文献および研究情報の収集を行った。本研究は全体として4年間にわたる研究であり、初年度を基盤的研究年度、2年目を拡充的研究年度、3年目を展開的研究年度、最終の4年目を総括的研究年度と位置づけて行う。今年度は初年度の基盤的研究年度であり、3つの具体的目標である、1適切な解釈に対応するラベル付けの解明、2付加構造の解釈の解明、3遂行節の詳細な構造の解明についての基盤的研究を行った。その成果は論文として、金子(2019)「時の付加詞節における時制の調和現象と極小主義プログラムについて」を発表した。同論文では、Geis(1970)Adverbial Subordinate Clausesにおいて時制の調和現象と名付けられた、英語の時の付加詞節の時制と主節の時制との間に見られる制約(cf. John left before Bill left vs. *John left before Bill leaves)を考察し、この現象の実証的記述を精緻化するとともに、極小主義プログラムの最新の展開に対する理論的帰結を考察した。その結果、時制の調和現象を適切に捉えるためには、時制の統語的同一性に基づいて述べることはできず、意味解釈プロセスとしての時制解釈によってもたらされる時制構造に言及する必要があることを論じた。その帰結として、インターフェースへの転送後も統語対象はそのまま残り、統語構造全体を領域にしてフェーズを越えた意味解釈操作の適用を可能にするChomsky, Gallego, and Otto(2017)の提案が支持されることを論じた。この結果は、極小主義プログラムの最新の展開を踏まえた、論理形式理論を構築する上で、重要な基盤となる成果である。今年度は遂行節関係の文献が少なく、その方面の研究が手薄であったので、次年度以降、強化していきたい。以上より、今年度の研究進捗状況は概ね順調に進展していると判断される。上述のように、本研究は全体として4年間にわたる研究である。今年度は初年度の基盤的研究年度であり、3つの具体的目標である、1適切な解釈に対応するラベル付けの解明、2付加構造の解釈の解明、3遂行節の詳細な構造の解明についての基盤的研究を行い、その成果を金子(2019)として発表した。今年度は、初年度に行った基盤的研究に基づき、拡充的研究を行う。具体的には、前述の金子(2019)に加えて、金子(2018)等の成果を組み込んで発展させ、音声部門インターフェースへの転送に関わる外在化(externalization)に関わる研究等も勘案しながら、論理形式に関わる研究の進展につなげて行く方針である。この成果は、2019年度日本英語学会におけるシンポジウムにおいて発表する予定である。また、上述の3つの具体的視点については、1についてはラベル付けに関わる上記研究論文集Bauke and Blumel (eds.)(2017)所収論文を引き続き検討するとともに、上記Saito(2016)を進展させたOku(2018)等を検討する。2については、極小主義プログラムにおける付加操作を理論的に考察しているJakielaszek(2017)等を考察する。3については、英語の助動詞システムの統語的階層性を意味的概念にもとづいて導き出す試みであるRamchand(2018)等を検討していく。以上に加えて、引き続き、文献および研究情報の収集、並びに多研究者との交流をすすめる。以上のような計画で研究を拡充し、次年度以降の研究の展開につなげていく方針である。

1のラベル付けに関しては、極小主義プログラムにおけるラベル付けアルゴリズムを提唱したChomsky(2013)、およびChomsky(2015)を基盤として、日本語の格助詞に関わるラベル付けを提案し、その帰結を考察したSaito(2016)、凍結効果をラベル付けによって説明する分析を提案したBoskovic(2019)、ラベル付けに関わる最新の論文集であるBauke and Blumel (eds.)(2017)等を批判的に検討した。2の付加構造の問題に関しては、等位構造制約と付加詞条件を考察したBoskovic(2018)、付加詞の外置現象の生成過程について基底生成と移動による分析を比較考察したReeve and Hicks(2017)等を検討した。3の遂行節については、修辞疑問文の疑問文としての統語的・意味的特性を考察したCaponigro and Sprouse(2007)、極小主義プログラムにおける連鎖の概念を考察したMartin and Uriagereka(2014)“Chains in Minimalism,"等を検討した。このような研究の成果として、金子(2019)「時の付加詞節における時制の調和現象と極小主義プログラムについて」として発表した。これに加えて、文献および研究情報の収集を行った。本研究は全体として4年間にわたる研究であり、初年度を基盤的研究年度、2年目を拡充的研究年度、3年目を展開的研究年度、最終の4年目を総括的研究年度と位置づけて行う。今年度は初年度の基盤的研究年度であり、3つの具体的目標である、1適切な解釈に対応するラベル付けの解明、2付加構造の解釈の解明、3遂行節の詳細な構造の解明についての基盤的研究を行った。その成果は論文として、金子(2019)「時の付加詞節における時制の調和現象と極小主義プログラムについて」を発表した。同論文では、Geis(1970)Adverbial Subordinate Clausesにおいて時制の調和現象と名付けられた、英語の時の付加詞節の時制と主節の時制との間に見られる制約(cf. John left before Bill left vs. *John left before Bill leaves)を考察し、この現象の実証的記述を精緻化するとともに、極小主義プログラムの最新の展開に対する理論的帰結を考察した。その結果、時制の調和現象を適切に捉えるためには、時制の統語的同一性に基づいて述べることはできず、意味解釈プロセスとしての時制解釈によってもたらされる時制構造に言及する必要があることを論じた。その帰結として、インターフェースへの転送後も統語対象はそのまま残り、統語構造全体を領域にしてフェーズを越えた意味解釈操作の適用を可能にするChomsky, Gallego, and Otto(2017)の提案が支持されることを論じた。この結果は、極小主義プログラムの最新の展開を踏まえた、論理形式理論を構築する上で、重要な基盤となる成果である。今年度は遂行節関係の文献が少なく、その方面の研究が手薄であったので、次年度以降、強化していきたい。以上より、今年度の研究進捗状況は概ね順調に進展していると判断される。上述のように、本研究は全体として4年間にわたる研究である。
血管形成における新規ＡＬＫ１シグナル下流因子の分子生物学・生化学的解析

血管は、個体発生初期の脈管形成とそれにつづく血管新生により構築され、その過程で内皮細胞は中心的な役割を担う。内皮細胞のBMP9・ALK1シグナル伝達系は血管新生の初期過程に必須である。しかし、BMP9・ALK1シグナルがどのようにして血管形成に関わるのか、下流制御因子などシグナル経路の分子機構は不明のままである。申請者らは、BMP9・ALK1シグナルにより発現制御を受ける下流因子を探索し、候補遺伝子としてSGK1を見いだした。そこで、血管新生期の内皮細胞におけるSGK1下流のリン酸化標的の同定を試みた。まず、恒常的活性化型SGK1を強制発現させた培養内皮細胞から、アフィニティ精製によりリン酸化タンパク質を分取し、対照細胞から得たそれとリン酸化タンパク質プロファイルの比較を行った。現在も解析中であり、実験系の確立ののちに遺伝子改変マウス胎仔をサンプルとする計画である。これらの知見は、ALK1シグナルの分子機構の理解につながり、ALK1欠損で起こる遺伝性血管疾患のオスラー病などの難病のみならず、血管新生制御を介した疾病治療の足がかりにもなる可能性がある。リン酸化タンパク質の純度と分取量の少なさから十分なシグナルが再現性良く得られない。効率を上げるための工夫を行っているところである。SGK1のリン酸化標的タンパク質の同定をモデル細胞系で確立し、遺伝子改変マウス胎仔を用いた胎生期におけるSGK1標的の同定を行う予定である。血管は、発生初期の脈管形成とそれにつづく血管新生により血管網が構築され、その課程における内皮細胞の役割は必須である。内皮細胞のBMP9・ALK1シグナル伝達系は、血管新生の初期過程に必須である。詳細な解析の結果、SGK1はBMP9・ALK1シグナルにより制御される転写因子Smad1/5/8の直接の下流標的因子であることが明らかとなった。難病に指定される遺伝性血管疾患のオスラー病では、ALK1遺伝子に変異が見られる。従って、血管新生に必須なALK1シグナルの分子機構を理解することは、この難病のみならず血管新生制御を介した疾病治療にもつながり重要であると考えられる。ほぼ計画通りに進捗している。これまでほぼ計画通りに進捗しているので計画通りに研究を進める。今後、BMP9・ALK1・SGK1シグナルの更に下流のSGK1によるリン酸化基質の同定に向けて、網羅的解析を含む生化学的な解析を中心に進める予定である。網羅的な解析で候補遺伝子を絞れない場合は、既知の基質の胎生期血管新生における内皮細胞での発現、役割を検討する。本助成金は主に試薬などの消耗品を購入しているが本年度は予想よりも消費が少なく終わったが、その分はそのまま翌年度に消費予定である。実験補助者の人件費に充当する必要が生じたため、物品費への支出を抑えた結果である。次年度はさらに、成果発表に使用する予定である。
側頭葉てんかんの外科手術例とモデル動物を用いた記憶固定化障害の病態解明と治療開発

近年、側頭葉てんかん(TLE)患者において、一旦覚えた物事を週・月の単位で病的に早く忘却する現象であるacclerated long-term forgetting (ALF)が生活の質を低下させる一因になっていることが認知されるようになった。ALFは記憶の固定化障害と考えられているが、てんかん性放電、海馬神経細胞脱落、抗てんかん薬など様々な要因が関与している可能性があり、その病態は明らかになっていない。本研究では、多数例のてんかん患者を集積し、ALFと関連する要因を解明することを目的の一つにしている。初年度は、先行研究を参考にして、ALFを定量的に評価する試験を独自に開発し、健常者群に対して検証を行った。今年度は、この試験を多数例のてんかん患者と健常コントロールに対して施行し、併せて、高解像度MRI、睡眠時脳波などのデータも収集した。TLE患者群をALF試験の結果をもとにdata drivenにクラスタリングすると、健常コントロールと同程度の成績を示す群、短期記憶は正常だがALFを呈する群、短期記憶も障害されている群の3群に分類された。今後は、記憶障害を認めない群とALFを呈する群に差を認める因子、ALFの程度と相関する因子を解析していく予定である。また、集積した患者群の中で外科手術を行った群において、海馬病理所見との関連も検証する予定である。臨床試験の患者登録が順調に進行しており、解析を開始している。TLE群の中で、記憶障害を認めない群とALFを呈する群に差を認める因子、ALFの程度と相関する因子を解析していく予定である。側頭葉てんかん患者における忘却の促進(accelerated long-term forgetting; ALF)を検出するための神経心理課題がないため、先行研究をもとに新たに作成した。言語性記憶に関しては、物語を記憶し、キーワードを再生する課題とした。空間的記憶に関しては、事前に車載カメラで走行中の町並みを撮影しておき、その映像を記憶させ、道順およびランドマークを再生する課題とした。10分後、1時間後、1週間後に再生し、1週間後の忘却度合いをALFの指標とすることにした。複数の物語、映像を準備し、健常人を対象に検証し、課題間の難易度を統制した。また、頭部MRIで海馬の微細構造を同定するための撮像方法、解析手法を検討し、撮像プロトコールを作成した。解析方法の選定にあたっては、側頭葉てんかん患者の病理所見とMRI画像で計測される容積の対応関係を指標とした。以上の準備を踏まえて、てんかん患者を対象とした臨床研究の登録を開始し、実施している。てんかん患者を対象とした臨床研究が計画通りに進行している。当初予定していたモデル動物研究も実施していく。てんかん患者を対象とした研究の登録・実施が完了していないため、次年度に継続して行う。計上していた旅費に余剰が生じたため次年度使用額が生じた。次年度は成果発表が増えるため、そこで償却する予定である。
慢性筋痛を有する顎関節症患者における睡眠障害と概日リズム変化の解析

本研究の目的は睡眠・覚醒状態および日中の身体活動状態が咀嚼筋の慢性痛に及ぼす影響を明らかにすることである.分析には混合効果モデルを用いた.前日の熟睡度は顎の痛みに有意に影響していた.前日の身体活動量も顎の痛みに有意に影響していた.前日の顎の痛みは翌日の顎の痛みに有意に影響していた.すなわち,前日の熟睡度が低いと,あるいは前日の身体活動量が少ないと,あるいは前日の顎の痛みが強いと顎の痛みが強くなることが示された.以上のように睡眠および身体活動量は咀嚼筋の慢性痛の程度に密接に関係しており,個体差治療を進める上で睡眠状態および身体活動状態を評価することの有用性が示された.治療に反応しにくい慢性筋痛を有する顎関節症患者においては,疼痛の中枢性過敏化が生じ,慢性疼痛疾患においても疑われている睡眠障害や概日リズムの障害が伴っていることが考えられる.このことは,睡眠時ブラキシズムとともに,慢性筋痛患者の疼痛強度の増大や変動に影響を及ぼしていると思われるが,これまでに詳細な検討は行われていない.そこで,慢性筋痛を有する顎関節症患者を対象とし,自宅という日常の環境下で10日間にわたり,睡眠時咀嚼筋筋活動,睡眠状態,および概日リズムを記録し,これらがストレスやライフスタイル等も含めたさまざまな要因とともに慢性筋痛における疼痛強度の変動や増大にどのように影響を及ぼすのかを共分散構造解析手法により明らかにすることを目的とした.平成25年度には,記録,分析システムの構築を行い,被験者8名を対象として,睡眠,概日リズム,および日中の活動量の測定にはアクチグラフ(Ambulatory Monitoring, Inc.米国)による記録を行った.本装置は腕時計型で,非利腕に装着し,測定は入浴時を除いて,昼夜を通して14日間行った.睡眠状態の評価項目は,全睡眠時間(Sleep Minutes),睡眠効率(Sleep Efficiency),入眠潜時(Sleep Latency),5分以上の覚醒エピソードの合計(Long Wake Episode)とした.覚醒時運動量の評価項目は,身体活動数の中央値(Median Activity Score)とした.以上の解析には専用ソフトウェア(AW2)を用いた.得られたパラメーターを時系列で比較したところ,日中の活動量など,顎や身体の他部位の主観的な痛みの変動に対する関連が疑われる項目が見いだされた.治療に反応しにくい慢性筋痛を有する顎関節症患者においては,疼痛の中枢性過敏化が生じ,慢性疼痛疾患においても疑われている睡眠障害や概日リズムの障害が伴っていることが考えられる.このことは,睡眠時ブラキシズムとともに,慢性筋痛患者の疼痛強度の増大や変動に影響を及ぼしていると思われるが,これまでに詳細な検討は行われていない.そこで,慢性筋痛を有する顎関節症患者を対象とし,自宅という日常の環境下で14日間にわたり,睡眠時咀嚼筋筋活動,睡眠状態,および概日リズムを記録し,これらがストレスやライフスタイル等も含めたさまざまな要因とともに慢性筋痛における疼痛強度の変動や増大にどのように影響を及ぼすのかを共分散構造解析手法により明らかにすることを目的とした.平成26年度には,構築された記録,分析システムを用い,16名の被験者を対象として以下の計測を行った.総睡眠時間および身体活動数の測定にはアクチグラフを用いた.装置は被験者の非利腕に装着させ,14日間の昼夜連続測定を行った.被験者には測定期間中の毎日,質問票への記入を行わせた.患者の主観的な疼痛強度の記録にはVisual Analogue Scale(以下VAS)を用い,顎の痛みは起床後から3時間ごとに記録させた.前夜の熟睡度は,起床時にVASを用いて記録させた.睡眠・覚醒状態,身体活動状態および前日の顎の痛みが顎の痛みに及ぼす影響についての分析には混合効果モデルを使用した.前日の身体活動量が多いと顎の痛みが小さくなること,前日の熟睡度が高いと顎の痛みが小さくなること,前日の顎の痛みが強いと当日の顎の痛みも強くなることが示された.以上の結果より,睡眠不良および身体活動低下は顎の慢性痛のリスク因子である可能性が示された.引き続きデータの収集に努め,睡眠および身体活動量が顎の慢性痛に及ぼす影響を明らかする予定である.慢性痛は治療に反応しにくく,Yunusにより提唱された中枢性過敏を原因として発症すると推測される疾患群(中枢性過敏症候群,central sensitization syndrome)の疾患概念に包含されると考えられる.従来,痛みが睡眠の質を低下させると考えられてきたが,現在では睡眠障害が疼痛閾値を低下させ,疼痛の慢性化や重篤化を招くという仮説も支持されている.そこで本研究は,日常生活における睡眠状態および身体活動状態が,顎の痛みに及ぼす影響について明らかにすることを目的とした.被験者として,2013年10月から2014年11月の間に研究の概要を説明し,文書による同意が得られた女性16名を選択した.16名中1名がアクチグラフの装着を続けることに困難を訴えて脱落したため,最終的な被験者数は15名となった(平均年齢38.86歳±10.10歳).15名のうち8名は顎に3か月以上継続する慢性痛を有しており,残りの7名は顎に慢性痛を認めなかった.

顎に慢性痛を有する被験者のうち8名全員が顎関節症と診断された.顎の痛みのない被験者に関しては,訴えがまったくないこと,側頭筋および咬筋の触診を行い,筋の疼痛がまったくないことを確認した.解析の結果,前日の身体活動量が多いと顎の痛みが小さくなること,前日の熟睡度が高いと顎の痛みが小さくなること,前日の顎の痛みが強いと当日の顎の痛みも強くなることが示された.以上の結果より,睡眠不良および身体活動低下は顎の慢性痛のリスク因子である可能性が示された.これらのことから,睡眠および身体活動量が顎の慢性痛に及ぼす影響が明らかとなり,個体差治療を進める上で,患者の睡眠状態および身体活動状態を把握し,個体ごとの睡眠状態および身体活動状態を是正していくことの臨床的な有用性が示された.本研究の目的は睡眠・覚醒状態および日中の身体活動状態が咀嚼筋の慢性痛に及ぼす影響を明らかにすることである.分析には混合効果モデルを用いた.前日の熟睡度は顎の痛みに有意に影響していた.前日の身体活動量も顎の痛みに有意に影響していた.前日の顎の痛みは翌日の顎の痛みに有意に影響していた.すなわち,前日の熟睡度が低いと,あるいは前日の身体活動量が少ないと,あるいは前日の顎の痛みが強いと顎の痛みが強くなることが示された.以上のように睡眠および身体活動量は咀嚼筋の慢性痛の程度に密接に関係しており,個体差治療を進める上で睡眠状態および身体活動状態を評価することの有用性が示された.現時点において,統計解析が可能な被験者数が確保でき,平成27年度にも引き続き協力が得られる被験者を確保できる見込みであるため.27年度が最終年度であるため、記入しない。顎口腔機能学平成27年度には,引き続き被験者からのデータ収集作業を進め,統計解析をさらに進め,学会発表および論文投稿を行う予定である.現時点において,予定していた被験者を対象としたデータ収集はほぼ予定通り進んでおり,平成26年度にも引き続き協力が得られる被験者を確保しているため.27年度が最終年度であるため、記入しない。データ収集準備作業のため,謝金支払を伴わない被験者(研究代表者や研究協力者)を用いたことにより,平成25年度に次年度使用額が生じたこと,および,協力が得られた患者数が予定より少なかったため,おもに謝金として計上した金額に差額が生じた.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度には,引き続き被験者からのデータ収集作業を進め,同時に統計解析を進め,学会発表を行うことを予定している。平成27年度には,謝金支払が伴う被験者からのデータ記録の増加が見込まれるため,平成27年度に予定通り使用いたします.27年度が最終年度であるため、記入しない。記録・解析システムの構築を,謝金支払いを伴わない被験者(研究代表者や研究協力者)を対象として進めたため.平成25年度後半より,謝金支払いが伴う被験者からのデータ記録を開始したため,平成26年度以降に予定通り使用いたします.
人工的血液脳関門の構築とその応用

一般に脳では血液脳関門(blood-brain barrier : BBB)により血管内物質の侵入が防御されている。BBBは、脳血管内皮細胞、血管傍細胞およびグリア細胞足突起から構成されている。我々は、培養系で人工的BBBを再構築することに成功している。ラット脳血管内皮細胞が大量のアドレノメデユリンを産生・分泌していることに注目して、BBBにおけるアドレノメデユリンの役割について検討した。その結果、以下の点を明らかにした。(1)酸化ストレス、低酸素によりBBBは傷害を受けることはよく知られている。人工的BBBを用いて、過酸化水素刺激による人工的BBBの傷害度(指標としてBBB内外の電気抵抗およびアポトーシスを調べた)に対するアドレノメデユリンの作用を調べた。その結果、アドレノメデユリンの培養液中への投与により過酸化水素刺激による人工的BBBの傷害度が有意に抑制された。この効果は、細胞内ミトコンドリアの機能保護に依存することも明らかにした。(2)BBBを強固にするというアドレノメデユリンの脳血管内皮細胞への保護作用は、細胞内F-アクチンの細胞内分布を変化させることによる可能性を見出した。(3)ラット脳脊髄液を採取して、脳脊髄液中のアドレノメデユリンを測定した。2%高張食塩水をラットに飲水負荷すると5日目および7日目の脳脊髄液中のアドレノメデユリン濃度はコントロールと比較して有意に増加した。この時、血液中のアドレノメデユリン濃度は有意に変化しなかった。培養系での人工的BBBおよびin vivoの実験により脳内アドレノメデユリンがBBBに対し保護作用を持つこと、さらに脳内でのアドレノメデユリン産生は末梢と異なる機序で制御されていることを明らかにした。一般に脳では血液脳関門(blood-brain barrier : BBB)と呼ばれる細胞構築により血管内物質の侵入が防がれている。BBBは、血管内皮細胞、血管傍細胞およびグリア細胞足突起から構成されている。生体においてBBBの生理機能について研究することは困難であり、限界がある。そこで、培養系で人工的BBBを再構築することにより、BBBを介した血管系から中枢神経系への情報伝達様式を解明することを目標とした。初年度である本年度は、ラット脳から血管内皮細胞を分離後に培養することが安定して行えるようになった。本手法によるラット脳血管からの培養細胞の95%以上が血管内皮細胞であることを抗von Willebrand因子抗体を用いた免疫書式染色法により確認した。これらの細胞はGFAP免疫陰性(アストロサイトで陽性)、α-smooth muscle actin免疫陰性(pericyteで陽性)であることも確認した。この培養血管内皮細胞を用いて以下の点を明らかにした。(1)細菌の菌体毒素であるリポポリサッカライドを培養液中に投与すると濃度依存性に誘導型NO合成酵素であるiNOS mRNAが培養血管内皮細胞で著明に発現することをRT-PCR法により明らかにした。(2)血管内比が産生する強力な抹消血管拡張性ペプチドであるアドレノメデュリンの産生・分泌が培養したラット脳血管由来の血管内皮細胞で抹消血管内皮に比較して有意に増加していることを明らかにした。(3)培養液に投与したアドレノメデュリンは濃度依存的に血管内皮細胞間のタイトジャンクションをより堅固にすることを明らかにした。(4)(3)のアドレノメデュリンの作用はタイトジャンクションを形成する分子を増加させることではないことを明らかにした。現在、ラット胎児脳の大脳皮質ニューロンを培養することにも成功している。培養系での人工的BBBの再構築とニューロンの共培養により、BBBを介した血管系から中枢神経系への情報伝達様式を今後さらに検討していく予定である。

培養系での人工的BBBおよびin vivoの実験により脳内アドレノメデユリンがBBBに対し保護作用を持つこと、さらに脳内でのアドレノメデユリン産生は末梢と異なる機序で制御されていることを明らかにした。
新奇レクチン機能の分子機構解析と魚類抗病性への展開

本研究では,我われが魚類において発見した新奇レクチンファミリー(RBL)の生理機能を解析し,抗病性への展開を図った。まずモデル動物ゼブラフィッシュにおいて複数のRBLの存在を確認し,構成分子(サブユニット)の多様性を明らかにした。これらレクチンの微生物に対する凝集活性,生体内分布と発生・分化・成長に伴う動態を明らかにした。また,ゼブラフィッシュ胚膜における輸送経路の解析,それを利用した抗病性に関わる抗酸化ストレスの測定法を設定した。さらに胚発生毎の酸化ストレス応答,ペプチドとオリゴ糖鎖,ポリアミンおよびその前駆体の抗酸化ストレス作用を明らかにした。ゼブラフィッシュ未受精卵からラムノースに結合特異性をもつ複数のレクチン(RBL)を単離し,生化学的性状を調べた。ゼブラフィッシュに植物性レクチンを添加した餌料を投与後,腸管輸送機能の変化を輸送経路既知の蛍光マーカーを使って解析した。培養細胞単層膜を腸管モデルとして用い,シロサケ卵由来RBL投与による経上皮電気抵抗値と蛍光マーカーの透過性変化から,RBLがタイトジャンクション(TJ)を開放することを明らかにした。またTJ構成タンパク質に対する抗体を用いた蛍光免疫染色によりレクチンによるタンパク質発現に影響がないことを明らかにした。これらの結果により,RBLが細胞表面の特異糖鎖に結合し,細胞内のカルシウムイオン濃度を増加させ,細胞骨格アクチンの脱重合を引き起こすことでTJを可逆的に開放する分子機構を明らかになった。ゼブラフィッシュ成体へのレクチン投与が成体に及ぼす影響を正確に評価するために,個体毎の新規の摂餌量測定法を開発し,摂餌誘因物質の活性評価に応用してその実用性を確認した。レクチン処理による腸管上皮のタンパク質発現パターンをプロテオーム解析した。抗酸化剤・免疫賦活剤としてアスタキサンチンとβ-グルカンをそれぞれ加え,ゼブラフィッシュにおける抗酸化剤と免疫賦活剤の生体内の評価を行った。また併せて,ゼブラフィッシュ胚膜における蛍光マーカーの透過輸送を蛍光HPLCで調べ,複数の輸送系の存在を明らかにした。今後,これらの輸送系に対するレクチンの影響を詳細に検討する計画である。モデル動物であるゼブラフィッシュを用い,生体内でのHis含有ペプチドの抗酸化作用機構を調べ,また,生成する活性酸素種が異なる酸化ストレス発生剤を用いてゼブラフィッシュ胚を処理し,胚の発生段階毎の酸化ストレス応答の変化を調べた。受精後9時間(9 hpf)の胚において,酸化ストレス発生剤(AAPH)による酸化ストレス応答が最も大きかった。また,カルシウムイオン量も,酸化ストレス発生剤による活性酸素種(ROS)量の増加と共に増加したが,7 hpf以降では,ROS生成に伴うカルシウムイオン量の増加はみられなかった。グルタチオンとカルノシンは共に,1 mMでは酸化ストレス発生剤によるROSの消去活性は小さく,5 mM以上においてROS消去活性を示した。一方,カルシウムイオン量はペプチドが1 mMでも減少した。このことは,カルシウムイオン流入がペプチドの添加により起きることを示している。抗酸化ペプチドの抗酸化活性やレクチンの腸管輸送・吸収機構に対する影響を生体毎に評価するために,ゼブラフィッシュ個体毎の摂餌量の測定法を確立した。その方法を摂餌誘引物質の評価に応用し,小型魚類個体毎の摂餌量の測定が可能であることを示した。また,哺乳動物の腸管モデルにおいて輸送経路が知られている蛍光マーカーを用いて,ゼブラフィッシュ胚膜には複数の選択的透過輸送経路が存在していることを示した。さらに,ゼブラフィッシュ未受精卵に含まれるラムノース結合特異性レクチン(RBL)のサブユニット構造を解析するとともに,RBLサブユニットに対する特異抗体を作成し,それらの抗体を使って組織免疫染色を行い,様々な成長段階におけるゼブラフィッシュにおけるRRLの体内分布を明らかにした。その結果から,RRLは受精直後の形態形成が不完全な期間に病原菌などに対する生体防御機能に働くと結論した。ゼブラフィッシュの胚を必要量,安定的に確保できるようになり,抗酸化ストレスや胚膜の輸送透過の実験を計画通りに進めることができている。また,ゼブラフィッシュ未受精卵から調製用電気泳動装置で単離したレクチン・サブユニットに対する特異抗体の作成に成功し,組織免疫染色を行うことができた。魚類において発見した新奇レクチンファミリー(RBL)の生理機能を解析し、抗病性への展開を図ることを目的とした。まず、モデル動物ゼブラフィッシュにおいてもRBLの存在を確認し、RBLの生化学的性状を明らかにした。その結果、ゼブラフィッシュRBLの分子種多様性、及びこれらは7種のサブユニットから形成されていることが分かった。さらに、ラムノースカラムに対してRBLよりも強い結合活性をもつレクチンを新たに検出し、異なるファミリーであることを示した。これらのレクチンには微生物に対する凝集活性がみられた。免疫学的手法によって解析したRBLの生体内分布と発生に伴う動態から、成魚において、RBLは、雄魚にも存在し、卵巣だけでなくエラ・肝臓にも存在することを明らかにした。一方、RBLは受精後912時間をピークに減少し、RBLが魚類の発生初期に重要な役割を担っていることを示した。これらの結果から、ゼブラフィッシュの未受精卵に存在するマルチプルレクチンは、複数のファミリーに属し、生体防御だけでなく発生分化において機能性を有していると考察した。

受精卵からの胚発生に対する内因性・外因性レクチンの作用を調べるとともに、作用様式の異なる複数の酸化ストレス試薬で処理後、活性酸素種(ROS)量とカルシウムイオン量を同時に測定したところ、胚の発生段階により酸化ストレス応答には差異がみられ、抗酸化ペプチドで処理することにより、酸化ストレスによるROSとカルシウムイオンの増加量が濃度依存的に減少した。一方、ポリアミン類とその前駆体は、アミノ基数に拘わらず、いずれの酸化ストレス試薬に対しても抗酸化活性を示した。しかし、カルシウムイオン量には変化はみられなかった。酸化ストレス試薬処理とUV照射によりゼブラフィッシュ胚の生存率は、発生段階の違いやエネルギー量、酸化ストレス試薬の種類によって変動した。本研究では,我われが魚類において発見した新奇レクチンファミリー(RBL)の生理機能を解析し,抗病性への展開を図った。まずモデル動物ゼブラフィッシュにおいて複数のRBLの存在を確認し,構成分子(サブユニット)の多様性を明らかにした。これらレクチンの微生物に対する凝集活性,生体内分布と発生・分化・成長に伴う動態を明らかにした。また,ゼブラフィッシュ胚膜における輸送経路の解析,それを利用した抗病性に関わる抗酸化ストレスの測定法を設定した。さらに胚発生毎の酸化ストレス応答,ペプチドとオリゴ糖鎖,ポリアミンおよびその前駆体の抗酸化ストレス作用を明らかにした。Caco-2細胞単層膜における輸送機構に対するレクチンの作用とその分子機構を明らかにすることができた。この研究成果は論文にまとめ,現在,投稿中である。また,ゼブラフィッシュに投与して,その抗酸化活性を確認したヒスチジン含有ペプチド,およびその関連ペプチドライブラリーの構造活性相関を詳細に検討した結果をまとめた論文を投稿した。これらの成果を基に,レクチンの新規機能性の解析をさらに進める見通しを得た。従前の計画にそって研究を進める予定であるが,ゼブラフィッシュ胚を使用したペプチドとオリゴ糖の抗酸化ストレス活性と免疫賦活活性を,蛍光・化学発光同時測定装置でさらに調べ,抗病性の検討を行う方針であり,測定結果については連携研究者と討議しながら考察する。また,ゼブラフィッシュ未受精卵には新奇レクチンが複数存在することが明らかになったので,すべてのレクチンを単離して,それらの生化学的性状と生物機能の解析を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。農学水圏応用科学水圏生命科学ゼブラフィッシュ卵に含まれるマルチプルレクチンを分取型ゲル電気泳動によって調製できたので,これらのラムノース特異的レクチンに対する特異抗体を作成し,局在と発現調節の解析するとともに,レクチンを胚にマイクロインジェクションすることによってレクチンの生体機能性を明らかにする計画である。その他の研究については,当初の計画に沿って進める予定である。
発癌・進展に関わる背景肝ゲノム要因の探索とiPS細胞を用いた肝発癌機構の統合解析

申請者らはウイルス排除後にも依然発癌リスクが存在することを明らかとしてきた(Hepatology 2010, 2013)。今回、半導体シークエンサーを用いて肝細胞癌関連遺伝子プロファイルを網羅的に解析し、HCV排除(SVR)の有無および核酸アナログ(NUCs)によるHBV複製制御の有無、およびHBV排除後における発癌要因の差異について検討した。対象は肝切除をした197例。HCV陽性肝癌はTP53変異は少ないが(P= 0.002)、TERT promoter変異が多く(P=0.003)、AXIN1やRB1などWNT signaling pathwayの遺伝子変異やARID1A、ARID2などのクロマチン修飾に関わる遺伝子変異を認めたがSVRの有無による遺伝子変異の頻度の差は認めなかった。HBV持続感染肝癌はTP53変異が比較的高頻度で、HBV integrationは93%で検出されヒト側遺伝子ではTERT、MLL4、MYO7Aが多かった。NUCs内服の有無でTERT領域も含めHBV integrationの頻度に差はなかったがTERT promoter変異はNUCs内服群で内服していない群と比較して低下しており、HBV DNA検出感度未満の症例で有意に少なかった(0% versus 40%, p=0.02)。一方NBNC肝癌はTERT promoter 64.6%, CTNNB1 33.3%, TP53 41.0%で、そのうちHBV既往感染例の遺伝子変異はTERT promoter71.4%、CTNNB138.0%、TP53 71.4%であった。HBV integrationは12%で検出され、HCV抗体陰性、若年発症、正常肝からの発癌という特徴を有していた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者らはウイルス排除後にも依然発癌リスクが存在し(Hepatology 2010, 2013)、発癌ゲノム変異は病因により異なり予後と関連することを明らかとした(J Gastroenterol 2015)。本研究では、発癌初期及び進展を規定する遺伝要因、およびウイルス排除後あるいは増殖制御下における発癌に関与する遺伝要因を解明することを目的としている。本年度は、特に多段階肝発癌における経時的ゲノム異常を明らかとするために、背景肝、異型結節、高・中・低分化肝細胞癌に至る各分化段階の手術標本および同一結節内に異なる分化度の腫瘍組織を内包する結節内結節のFFPE組織標本本を対象として、LCMを用いて、分化度の異なる各段階の腫瘍結節を正確にサンプリングし、ゲノムDNAを抽出後次世代シークエンサーを用いてゲノム解析を行った。FFPEサンプルから抽出したDNAの断片化は著しくPCRベースの解析が困難であったため、制限酵素を利用したHaloPlexを用いて解析した。腫瘍部と非腫瘍部のペアでデータが得られている検体について腫瘍部にのみ変異を認めるものをその検体の腫瘍部の変異として扱った。その結果、コントロールを含む7検体が解析対象となり、6検体14癌関連遺伝子29か所に変異を認めた。LGDNで6遺伝子(NOTCH1, TP53, STK11, KMT2C, RET, CCNE1)、早期肝癌では11遺伝子(NOTCH1, TP53, KMT2C, PIK3CA, SMO, FGFR3, TSC1, ARID2, AXIN1, TSC2, KEAP1 )に変異が検出された。LGDN,早期肝癌で検出された癌関連遺伝子中にはTP53, ARID1, AXIN1, PIK3CA, KEAP1等が含まれおり、多段階発癌の初期段階でも肝細胞癌のドライバー遺伝子変異が存在する可能性が示された。FFPE検体における解析では、DNAの断片化が当初の予測以上に著しいことが判明し、PCRベースの解析が困難であったため、様々な条件検討を行った結果、制限酵素を利用したHaloPlexを用いて解析し、漸く一部のFFPE検体で解析可能となった。本年度は、半導体シークエンサーを用いて肝細胞癌関連遺伝子プロファイルを網羅的に解析し、HCV排除(SVR)の有無および核酸アナログ(NUCs)によるHBV複製制御の有無による発癌要因の差異について検討した。対象は肝切除をした142例。癌部と背景肝において癌関連54遺伝子2910箇所のhotspotに対してdeep sequenceを施行し、TERT promoter領域のhotspotについてはdirect sequenceとdeep sequenceを行った。また、HBs抗原陽性例においてはHBV integrationをIllumina Miseqを用いて網羅的に解析した。C型肝癌ではTERT promoter変異84%, CTNNB1変異61%, TP53変異28%とTP53変異は少ないが(p = 0.002)、TERT promoter変異が多く(p = 0.003)、SVRの有無による遺伝子変異の頻度に差は認めなかった。B型肝癌ではTP53変異67.9%, TERT promoter変異30%, CTNNB1変異11%で遺伝子変異を認め、HBV integrationを93%に検出しヒト側ではTERT、MLL4、MYO7Aが多かった。

NUCs内服の有無でHBV integrationの頻度に差はなかったがTERT promoter変異はNUCs内服群で内服していない群と比較して低下しており、HBV DNA検出感度未満の症例で有意に少なかった(p = 0.02)。これらの解析結果から、C型肝炎ではウイルス排除の有無で遺伝子変異による発癌機序の違いは明らかではなかったが、B型肝炎ではHBV複製制御の有無で異なることが示唆された。本年度は、HCV排除の有無および核酸アナログ薬によるHBV複製制御の有無による癌遺伝子プロファイルの差異に関して、高頻度に変異がみられる遺伝子について検討することができた。しかし、変異が低頻度の遺伝子の解析や結果の検証のためには更なる症例の集積と解析が必要である。申請者らはウイルス排除後にも依然発癌リスクが存在することを明らかとしてきた(Hepatology 2010, 2013)。今回、半導体シークエンサーを用いて肝細胞癌関連遺伝子プロファイルを網羅的に解析し、HCV排除(SVR)の有無および核酸アナログ(NUCs)によるHBV複製制御の有無、およびHBV排除後における発癌要因の差異について検討した。対象は肝切除をした197例。HCV陽性肝癌はTP53変異は少ないが(P= 0.002)、TERT promoter変異が多く(P=0.003)、AXIN1やRB1などWNT signaling pathwayの遺伝子変異やARID1A、ARID2などのクロマチン修飾に関わる遺伝子変異を認めたがSVRの有無による遺伝子変異の頻度の差は認めなかった。HBV持続感染肝癌はTP53変異が比較的高頻度で、HBV integrationは93%で検出されヒト側遺伝子ではTERT、MLL4、MYO7Aが多かった。NUCs内服の有無でTERT領域も含めHBV integrationの頻度に差はなかったがTERT promoter変異はNUCs内服群で内服していない群と比較して低下しており、HBV DNA検出感度未満の症例で有意に少なかった(0% versus 40%, p=0.02)。一方NBNC肝癌はTERT promoter 64.6%, CTNNB1 33.3%, TP53 41.0%で、そのうちHBV既往感染例の遺伝子変異はTERT promoter71.4%、CTNNB138.0%、TP53 71.4%であった。HBV integrationは12%で検出され、HCV抗体陰性、若年発症、正常肝からの発癌という特徴を有していた。多段階肝発癌におけるゲノム異常のさらなる基盤情報を得るために、比較的新しいFFPE検体での解析と、現在行っている前向きでの検体収集を進め、ゲノム解析を進展させる。また、条件によってはFFPE検体においては、DNAよりむしろRNAの方が良好に抽出可能との報告があるため、本研究においても試みる。また、HCV排除後の発癌に関与する遺伝要因を解明するためにHCV排除後に発癌した症例についてゲノム解析を行い、HCV持続感染状態での発癌例と比較解析する。さらに、HBV起因性肝癌におけるHBVゲノムと宿主ゲノムの相互作用と発癌機構を解明するために、HBV持続感染とHBV装飾制御下、およびHBV既往感染からの発癌例を対象として、HBV-宿主遺伝子の関連を解析する。本研究ではこれらを統合的に推進することで肝発癌機構の全容解明に関わる知的・技術的基盤を確立を目指す。