hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光異性化骨格を持つ分子を利用した単一分子の力学的な化学識別とマニピュレーション

本研究の目的は、針状分子1個を非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)の`探針'として用いることで高い空間分解能をもち、且つ化学種識別が可能な探針を開発し、相互作用力顕微鏡を実現することである。実効的な探針曲率半径を小さくすることで、長距離力の寄与を減らして化学的相互作用(短距離力)を顕在化し、また`探針'先端の官能基をデザインすることで相互作用の大きい特定の化学種を画像化できる。本研究では光異性化骨格を持つ分子を用いて、外部からの光照射により`構造観察用探針'と`化学相互作用検知用探針'を可逆的に切り替えて同一箇所を観察することを可能とし化学識別を行う。合成したアゾベンゼン骨格を有する三脚型探針分子を金基板上に吸着させてNC-AFM観察を行い、UV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じた光異性化に伴い約1nmの高さ変化が可逆的に起こることを実証した。また、この分子を金コートしたカンチレバー探針先端に吸着させて、同様に光照射に応じた探針先端分子の可逆的形状変化を実証し、本分子が光という外部刺激に対して応答する分子探針としての基本的性質を満たすことが分かった。さらに、カルボン酸を先端官能基としてもつ三脚型分子を新たに合成し、trans型の時にカルボン酸が表面化学種と水素結合を形成することを利用した高い空間分解能をもつ化学種識別の可能性を検証した。TiO_2(110)表面にまばらに分布する表面水酸基に対して適用した結果、カルボン酸官能基で観察したときに、0.65nm周期の酸素の1次元原子列が観察できるとともに、表面水酸基の位置でより大きな引力が働くことが分かり、これが水素結合形成によると結論した。以上の結果により、局所的な水素結合形成により表面化学種の高分解能観察が可能であることを示すことができた。非接触原子間力顕微鏡(Noncontact AFM ; NC-AFM)は、STMに迫る高い空間分解能を持ちながら試料の導電性を必要としない新しい表面原子・分子観察手法として発展している。NC-AFMは探針-試料間に働く微弱な引力的相互作用をカンチレバーの共振周波数の変化として検知し、画像化する。長距離力の寄与を減らして原子・分子分解能の画像化に寄与する化学的相互作用(短距離力)を顕在化できれば、化学的相互作用を積極的に利用した高分解能化学種識別が可能となる。本研究の目的は、針状分子を`探針'として用いることで高い空間分解能をもち、且つ化学種識別が可能な探針を開発し、相互作用力顕微鏡を実現することである。カンチレバー先端に固定した分子を`探針'として用いて高い空間分解能を達成するため、アダマンタン骨格を中心として自由度の小さい針状分子鎖を足と`探針'に持つ三脚型で、かつ`探針'分子鎖の途中に外部からの光照射に応じて構造異性化を起こすアゾベンゼン骨格を導入した分子を設計し、合成、NMR, Mass等でキャラクタリゼーションを行った。また、ジクロロメタン溶液中の合成分子の紫外・可視吸収スペクトルが、UV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じて可逆的に変化することを確認した。合成した分子が探針に吸着した状態で光異性化を起こすのか、また高分解能探針と成りうるのかを確認するため、合成分子のTIF溶液中にAu基板を浸漬し、分子を分散した状態でAu-S結合により吸着させ、NC-AFMで評価を行った。

その結果、分子が室温においても十分強く基板に吸着していること、期待されるようにUV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じた光異性化に伴い約1nmの高さ変化が可逆的に起こることが実証できた。また、`探針'分子により、観察に用いているNC-AFM探針先端の形状を反映した像が観察された。本研究の目的は、針状分子1個を非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)の`探針'として用いることで高い空間分解能をもち、且つ化学種識別が可能な探針を開発し、相互作用力顕微鏡を実現することである。実効的な探針曲率半径を小さくすることで、長距離力の寄与を減らして化学的相互作用(短距離力)を顕在化し、また`探針'先端の官能基をデザインすることで相互作用の大きい特定の化学種を画像化できる。本研究では光異性化骨格を持つ分子を用いて、外部からの光照射により`構造観察用探針'と`化学相互作用検知用探針'を可逆的に切り替えて同一箇所を観察可能とすることで、高い確度で化学識別能を実証する。昨年度までに、アダマンタン骨格を中心として自由度の小さい針状分子鎖を足と`探針'に持つ三脚型で、かつ`探針'分子鎖の途中に外部からの光照射に応じて構造異性化を起こすアゾベンゼン骨格を導入した分子を設計・合成し、合成した分子を金基板上に吸着させてNC-AFM観察を行い、UV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じた光異性化に伴い約1nmの高さ変化が可逆的に起こることを実証した。今年度はさらに、その光異性化挙動の詳細を検討するとともに、その分子を金コートしたカンチレバー探針先端に吸着させて、光異性化挙動を調べた。金基板上に吸着させた場合と同様に、UV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じた探針先端分子の可逆的形状変化を実証し、本分子が光という外部刺激に対して応答する分子探針としての基本的性質を満たすことが分かった。これらの成果は2報の論文として発表し、その論文が他の専門雑誌でも紹介されるなど注目を集めた。本研究では光異性化骨格を持つ分子を用いて、外部からの光照射により'構造観察用探針'と'化学相互作用検知用探針'を可逆的に切り替えて同一箇所を観察可能とすることで、高い確度で化学識別能を実証する。昨年度までに、合成した三脚型探針分子を金コートしたカンチレバー探針先端に吸着させて、UV光(360nm)-可視光(450nm)の照射に応じた探針先端分子の可逆的形状変化を実証し、本分子が光という外部刺激に対して応答する分子探針としての基本的性質を満たすことが分かった。今年度は、カルボン酸を先端官能基としてもつ三脚型分子を新たに合成し、trans型の時にカルボン酸が表面化学種と水素結合を形成することを利用した高い空間分解能をもつ化学種識別の可能性を検証した。TiO_2(110)表面にまばらに分布する表面水酸基に対して適用した結果、カルボン酸官能基で観察したときに、0.65nm周期の酸素の1次元原子列が観察できるとともに、表面水酸基の位置でより大きな引力が働くことが分かり、これが水素結合形成によると結論した。
ミトコンドリアを標的とする多重型・多機能性エンベロープ型ナノ構造体の開発

研究目的本申請研究では、疾患細胞ミトコンドリア(Mt)を標的とした新規送達システムの開発を目的とする。研究戦略は、細胞膜とMt膜を突破するために、エンベロープを多重構造にする(多重型・多機能性ナノ構造体:多重型MEND)。外膜には癌細胞の標的に用いられるトランスフェリン、内膜にはMt移行性ペプチド(MTS)を付加し、ナノ粒子のまま癌細胞のMt内へ送達するシステムを開発する。細胞膜、ミトコンドリア膜は膜融合を介して突破する。現在までに、MTS修飾MENDの構築とその評価を行ったので、ここで報告する。(1)MTS修飾MENDの構築1)MTS脂質誘導体の合成を行い、質量分析により目的産物が得られた事を確認した。2)MTS修飾MENDの構築:MENDにMTS脂質誘導体を導入した構造体の調製に成功した。(2)ミトコンドリア移行能評価蛍光標識を施したMENDをHeLa細胞ホモジネート溶液に加え、Mtと結合したMENDの蛍光強度を求めた。R8(今まで用いていたMt結合素子)を修飾したMENDを用いた場合には、10%程度の移行が確認された。一方、MTSを修飾した場合には、移行率が劇的に上昇し、従来のキャリアよりも5倍以上の移行量が確認された。(3)MTS修飾MENDの細胞内動態観察本実験では、GFPを封入した各種MENDを細胞に添加し、その細胞内動態を共焦点レーザースキャン顕微鏡によって観察した。R8(細胞導入素子)-LPを用いた場合、内封物質GFP単独のドットが多く観察された。MTS-MENDを用いた場合には、キャリアの細胞導入量が極めて低くGFPはほとんど観察されなかった。一方、R8&MTS-MENDを用いた場合、GFPの多くがMtで観察された。以上の結果より、R8とMTSの両修飾が、細胞内Mtへの選択的送達を可能とする事を明らかとした。
タイ国北部に多発する女性肺癌の宿主要因と環境要因の研究

タイ国北部チェンマイ州の肺癌罹患率は男女とも高く、特に女性肺癌の増加は著しい。われわれは、チェンマイ大学医学部と共同で、女性肺癌多発の原因を究明し、その成果をもとに予防方策を見出すことを目的として、疫学・栄養学・病理学・分子生物学・生化学等の多様な角度から研究を行ってきた。平成7・8年度は、女性肺癌の高率(サラピー地区)および低率(チョントン地区)地域において、5074才の一般女性住民を対象に、(1)生活習慣調査、(2)末梢血サンプルの血清学的検討および尿中変異原物質の抽出、(3)食餌サンプルの分析、(4)居住家屋内の浮遊細菌、喀痰中の細菌分析等の調査を実施した。その結果、女性の喫煙率はサラピー地区28.1%、チョントン地区61.0%と両地区とも非常に高いが、喫煙者の割合はむしろ低率地区で高かった。これは、喫煙だけでは肺癌多発の原因を説明できず、何らかの促進因子が存在することを示唆している。チョントン地区に比べ、サラピー地区では果物・緑黄色野菜の摂取が少ないほか、良性肺疾患の既往者の割合が3倍以上高いこと(49.3%)が見出された。さらに、サラピー地区で肺疾患の既往を持つ喫煙者は、イムノグロブリンEが1000U/ml以上と異常高値を示し、肺組織が喫煙以外の環境物質に暴露されていることが示唆された。浮遊細菌の分析では両地区とも多様な菌相が見られたが、特にサラピー地区の菌量は多く、Mカニス菌が特徴的に見出された。今後、平成9年に収集した良性肺疾患患者の血清についてもサイトカインなどの測定を行うとともに、動物実験により培養した浮遊細菌の発がんプロモーター活性を検討する予定である。さらに、同時に進めている患者対照研究、病理学的検討、分子生物学的検討の結果とあわせて、タイ国北部の女性肺癌多発の原因を究明したい。本研究班では、多発する肺癌の原因を、疫学・病理学・分子生物学・栄養学・生化学の様々な角度から究明するため、以下の三つのアプローチに基づいて研究を進めている。第一のアプローチは、チェンマイ大学医学部病院における手術および生検材料を用いた病理学的検討と肺組織から抽出したDNAによる分子生物学的検討である。肺癌組織型判定の基準の合意、DNA抽出のプロトコールなどの準備は終了し、現在病理およびDNA検体を蓄積している。二番目のアプローチは、チェンマイ大学病院における患者対照研究である。生活習慣・生活環境に関する質問票の作成、面接担当者の訓練を終了し、平成7年11月から面接調査を開始した。三番目のアプローチは女性肺癌の高率および低率地域における女性一般地域住民の調査である。この調査は患者対照研究では導入できない生体マーカー、居住環境の直接調査、食餌の分析を目的としたものである。調査内容は、(1)患者対照研究の質問票による面接調査、(2)末梢血の血清学的検討・DNA抽出、(3)尿中の変異原物質の抽出、(4)食餌サンプルの収集と分析、(5)居住家屋内の浮遊細菌の解析、(6)喀痰中の細菌の解析、である。平成7年度は女性肺癌が最も高率なサラピー地区で、女性一般住民57名を調査した。血清成分の定量分析は完了し、現在面接調査データとの関連と検討している。その結果に基づき収集した食餌サンプルの分析を行う予定である。尿中の変異原物質の抽出は終了し、平成8年度のサンプルと併せて変異原性試験を行う。

(5)と(6)は肺癌高率地域で良性の肺疾患がきわめて多いことから、肺癌発症との関連を検討するために実施したもので、現在菌の同定と定量を進めている。平成7年度に、三つのアプローチをすべて順調に開始することができた。今後、各種サンプルの分析を進める一方、病理・DNA検体、患者対照調査データの蓄積を行う。本研究班では、多発する肺癌の原因を、疫学、病理学、分子生物学、栄養学、生化学の様々な角度から究明するため、以下の三つのアプローチに基づいて研究を進めている。第一のアプローチは、チェンマイ大学医学部病院における手術及び生検材料を用いた病理学的検討と肺組織から抽出したDNAによる分子生物学的検討である。本年度は、病理学的検討のため2回の派遣を行い、タイ北部肺癌の特徴の把握に努めている。また、平成8年11月までに男女計31検体のDNAを抽出し、現在継続中である。二番目のアプローチは、チェンマイ大学病院における患者対照研究である。平成8年11月までに、肺癌患者50名(男31、女19)および対照患者33名(男9、女24)の生活習慣・生活環境に関する調査を行った。面接体制も確立し、今後さらに調査が進むものと考えられる。三番目のアプローチは女性肺癌の高率及び低率地域における女性一般住民調査の調査である。この調査は患者対照研究では導入できない生体マーカー、居住環境の直接調査、食餌の分析を目的としたものである。調査内容は、(1)患者対照研究の質問票による面接調査、(2)末梢血の血清学的検討、(3)尿中変異原物質の抽出、(4)食餌サンプルの収集と分析、(5)居住家屋内の浮遊細菌の解析、(6)喀痰中の細菌の解析、である。女性肺癌が最も高率なサラピー地区(年齢訂正罹患率:35)での平成7年度の調査(調査対象57名)に引き続き、平成8年度は、前年度と同じ調査時期を選んで、サラピー地区と気候風土・人口規模が類似し、かつ女性肺癌が低率なチョントン地区(年齢訂正罹患率:8)の女性住民59名について、同じ調査を行った。採取した各種サンプルは、現在解析中あるいはサラピー地区のサンプルと合わせての解析を準備中である。予備的解析の結果によると、肺癌の高率なサラピー地区は低率なチョントン地区と比べ、血清中の過酸化脂質のレベルが高く、アルブミンやビタミンB_2が低い、また大気中の浮遊細菌・菌類の種類・量ともに多く、肺の良性疾患の既往を持つ者が多い、喫煙歴のある者の割合はむしろサラピー地区の方が低い、という特徴が見いだされた。タイ国北部チェンマイ州の肺癌罹患率は男女とも高く、特に女性肺癌の増加は著しい。われわれは、チェンマイ大学医学部と共同で、女性肺癌多発の原因を究明し、その成果をもとに予防方策を見出すことを目的として、疫学・栄養学・病理学・分子生物学・生化学等の多様な角度から研究を行ってきた。平成7・8年度は、女性肺癌の高率(サラピー地区)および低率(チョントン地区)地域において、5074才の一般女性住民を対象に、(1)生活習慣調査、(2)末梢血サンプルの血清学的検討および尿中変異原物質の抽出、(3)食餌サンプルの分析、(4)居住家屋内の浮遊細菌、喀痰中の細菌の分析等の調査を実施した。その結果、女性の喫煙率はサラピー地区28.1%、チョントン地区61.0%と両地区とも非常に高いが、喫煙者の割合はむしろ低率地区で高かった。これは、喫煙だけでは肺癌多発の原因を説明できず、何らかの促進因子が存在することを示唆している。チョントン地区に比べ、サラピー地区では果物・緑黄色野菜の摂取が少ないほか、良性肺疾患の既往者の割合が3倍以上高いこと(49.3%)が見出された。
歯科医学教材作成のための汎用3次元CGモデルライブラリの構築とその有用性の検討

3次元コンピュータグラフィックス(以下、3D-CG)を応用した教材を作成するために適した汎用3D-CGモデルが供給されれば、誰でも比較的容易に3D-CG教材を作成することが可能となる。3D-CG教材をできるかぎり容易に作成できる環境を作るための汎用3D-CGモデルライブラリを構築するため、平成17年度は、歯、顎骨、軟組織、主な神経組織の3D-CGモデルを基にした(1)齲蝕のひろがりを示す3D-CG教材、および、(2)歯周疾患の進行を形態を示す3D-CG教材を実際に試作し、汎用3D-CGモデルが持つべき所要性質について検討したところ、立体的な位置関係をわかりやすく表示するためには、半透明の3D-CGモデルを利用するだけでは不十分であり、さらなる工夫が必要であることが示された。平成18年度は、さらに第3学年保存修復学模型実習において、試作教材を活用しながら、3D-CG教材の改良を行った。その結果、わかりやすい3D-CG教材を作製するためには、3D-CGモデルだけを利用するのではなく、2次元的な断面図の表示を併用する必要があることが示唆された。3D-CGモデルの断面図を表示するためには、3D-CGモデルから自動的に生成する方法と、別に作製した断面図を貼り付ける方法が考えられるが、より汎用的な3D-CG教材を作成するためには、前者が望ましいと考えられる。以上の用件を満たすソフトウェアとしてAcrobatを活用した汎用3D-CGモデルライブラリを試作した。Acrobat3Dは、当講座で従来から活用してきたShockwave3D技術を踏襲しており、断面図を自動的に生成する機能を有しながら、広く普及しているAdobe Readerを用いて3D-CGの表示が可能である。3D-CG教材をできるかぎり容易に作成できる環境を作るための汎用3D-CGモデルライブラリを構築し、その有効性を検討するために、平成17年度は実際に3D-CG教材を試作、評価しながら、汎用3D-CGモデルが持つべき所要性質について検討した。まず、3D-CG専用コンピュータ(ワークステーション)は高価であるため、今回の研究に必要な機能だけを、高性能なPCに追加した機械を採用した。3D-CGモデルは、従来から作成してきた歯と歯列の3D-CGモデルの形態を修正し、別にスキャンしたデータと統合して歯と顎骨のモデルを作成後、さらに主な神経、上皮組織の3D-CGモデルを作成した。これらの3D-CGモデルを用いて、(1)齲蝕→歯髄炎→根尖性歯周炎と続く齲蝕継発疾患と、関連する神経の走行を示す3D-CG教材、および、(2)窩洞の形態を示す3D-CG教材を試作した。歯の内部における病変の進行、神経の走行については、半透明な3D-CGモデルを用いたが、立体的な位置関係をわかりやすく表示するためには、さらなる工夫が必要であることが示された。また、窩洞の形態を示す3D-CGは、第3学年保存修復学模型実習において、教員が窩洞の形態を具体的に示すための補助ツールとして有効に活用することができたが、CAI (Computer Aided Instruction)の本来の姿である自習用教材としての効果は限定的であった。3D-CG教材が有効な分野、3D-CGを用いることで教材作成が効率的になる分野を模索する必要性が示された。

3D-CG教材をできるかぎり容易に作成できる環境を作るための汎用3D-CGモデルライブラリを構築するため、平成17年度は、歯、顎骨、軟組織、主な神経組織の3D-CGモデルを基にした(1)齲蝕→歯髄炎→根尖性歯周炎と続く齲蝕継発疾患と関連する神経の走行を示す3D-CG教材、および、(2)窩洞の形態を示す3D-CG教材を実際に試作し、汎用3D-CGモデルが持つべき所要性質について検討したところ、立体的な位置関係をわかりやすく表示するためには、半透明の3D-CGモデルを利用するだけでは不十分であり、さらなる工夫が必要であることが示された。平成18年度は、さらに第3学年保存修復学模型実習において、試作教材を活用しながら、3D-CG教材の改良を行った。その結果、わかりやすい3D-CG教材を作製するためには、3D-CGモデルだけを利用するのではなく、2次元的な断面図の表示を併用する必要があることが示唆された。3D-CGモデルの断面図を表示するためには、3D-CGモデルから自動的に生成する方法と、別に作製した断画図を貼り付ける方法が考えられるが、より汎用的な3D-CG教材を作成するためには、前者が望ましいと考えられる。0.以上の用件を満たすソフトウェアとしてAcrobatを活用した汎用3D-CGモデルライブラリを試作した。Acrobat3Dは、当講座で従来から活用してきたShockwave3D技術を踏襲しており、断面図を自動的に生成する機能を有しながら、広く普及しているAdobe Readerを用いて3D-CGの表示が可能である。
高校生の英語語彙学習方略に関する縦断的研究

本研究では、高校生英語学習者の語彙サイズを算出し、語彙学習方略の使用実態を明らかにすることを試みた。以下の4点を研究目的とした。1.語彙サイズテスト(1, 000語4, 000語レベル)を実施し、学習者の平均語彙サイズを明らかにする。2.語彙学習方略質問紙を実施し、学習者が使用する方略の変化を追跡して調査する。3.高校3年間にわたり学習者を指導し、縦断的な研究を行うことで、指導の成果と課題を確認する。4.コミュニケーション能力に焦点を置く学習指導要領の基礎研究とし、指導のための知見を得る。研究方法としては、学習者に上記テストと質問紙をそれぞれ1回ずつ3年間にわたって実施し、実施ごとに全て回収することで調査結果に影響が出ないように配慮した。データは統計的分析を用い、分散分析と多重比較を行った。研究の結果より、学習者の使用する方略には偏りが見られ、一定の熟達度まで到達して使用や選択に幅や深みが出てくることが明らかとなった。方略の偏り関しては、教師やネイティブ・スピーカーを活用した社会的方略は、学年の進行とともに使われなくなったこと、また、他人と協調して単語学習を進める方略の使用率も低いまま推移したことが挙げられた。一方で、方略の幅や深みに関しては、方略使用は学年が進行するにつれて認知処理の浅いものから深いものへと多様化することが示された。特にイメージ化やキーワード法を含む精緻化方略は、高校3年間をかけて有意な使用率の上昇が見られた。さらに、語彙を計画的に学習したり、定期的に復習したりするメタ認知方略に関しても、3年次に差異が現れるという結果が得られた。このことから、英語教師が意識的に学習者に対して精緻化方略やメタ認知方略に関わる指導を早い段階から行っていくことが語彙力向上に有効であることが示唆された。今後の課題として、方略指導を実際に行い、その意義について検証していく必要があると考えられる。
遺伝子工学を用いたhCG及びLHホルモンの生理活性部位の同定

ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を含め4種類の糖蛋白ホルモン,黄体刺激ホルモン(LH),卵胞刺激ホルモン(FSH),甲状腺刺激ホルモン(TSH)はいずれもα,β鎖のサブユニットよりなり,α鎖はすべてに共通で同一遺伝子からコ-ドされ,各々の生理活性はβ鎖に由来している。β鎖はアミノ酸配列,及び遺伝子レベルにおけるDNA塩基配列において高い相同性を示し,特にN末端より約30アミノ酸の部位にはCAGY領域と呼ばれるCysーAlaーGlyーTyrの4アミノ酸配列の完全な保存が認められ,これらのホルモンにとって重要な構成部位であることが予測される。我々はすでに遺伝子工学の手法を用いて,CAGY領域に点突然変化を起こしたhCGβ鎖をsiteーdirected mutagenesisの手法を用いて作成し,4種のアミノ酸の中でM1(Ala→Ser),M2(Gly→Arg),M3(Gly→Asp)と変異させることに成功した。作成した3種の変異hCGβcDNAと無変異のネイティブなhCGβcDNA,α鎖のcDNAに対応するmRNAをin vitro transcriptionによって合成,精製した。これらのα,β鎖のmRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に微量注入してin vitroで蛋白を合成した。その結果,M1変異から合成された変異蛋白の免疫応状性はRIAシステム測定上,正常β鎖と同程度であったのに対して,M2,M3変異のmRNAの注入では無変異蛋白に比して約10%にまで低下することをみいだした。これはCAGY領域のグリシンの変異がα鎖,β鎖の会合に重要な部位であることを示している(J.Mol.Endocrinol.1990,5,pp97)。我々はさらにCAGY領域の重要性を検討するため,これらの糖蛋白ホルモンの立体構造を解析して,これらそれぞれのβ鎖のCAGY領域と会合するα鎖のアミノ酸配列に注目した。立体構造上,その候補領域として^<28>Cysー^<29>Metー^<30>Glyー^<31>Cysー^<32>Cysー^<33>Pheー^<34>Serー^<35>Arg ー^<36>Alaー^<37>Tyrを設定した。本年度の点突然変異作成には,それぞれ点突然変異塩基を含む3'と5'合成ヌクレオチドプライマ-を作成し,polymerase chain rection(PCR)法により無変異cDNAを鋳型にして変異cDNA断片を増幅,合成した。合成された変異cDNA断片は両端を制限酵素で切断して粘着末端とし,無変異cDNA断片の相補的な部分と置換することで,発現可能な変異cDNAとした。これによって^<28>Cys→Tyr, ^<29>Met→Arg, ^<30>Gly→Arg, ^<30>Gly→Ala, ^<30>Gly→Asp, ^<37>Tyr→Aspの6種類のα鎖の変異cDNAを作成することに成功した。これらのcDNAをin vitro transcripton法でmRNAを合成,精製して現在アフリカツメガエルの卵母細胞にwild typeのhCGβ鎖のmRNAとともに微量注入し,分泌されたhCGの生化学的性質を解析中である。

本年度の点突然変異作成には,それぞれ点突然変異塩基を含む3'と5'合成ヌクレオチドプライマ-を作成し,polymerase chain rection(PCR)法により無変異cDNAを鋳型にして変異cDNA断片を増幅,合成した。合成された変異cDNA断片は両端を制限酵素で切断して粘着末端とし,無変異cDNA断片の相補的な部分と置換することで,発現可能な変異cDNAとした。これによって^<28>Cys→Tyr, ^<29>Met→Arg, ^<30>Gly→Arg, ^<30>Gly→Ala, ^<30>Gly→Asp, ^<37>Tyr→Aspの6種類のα鎖の変異cDNAを作成することに成功した。これらのcDNAをin vitro transcripton法でmRNAを合成,精製して現在アフリカツメガエルの卵母細胞にwild typeのhCGβ鎖のmRNAとともに微量注入し,分泌されたhCGの生化学的性質を解析中である。ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を含め4種類の糖蛋白ホルモン,黄体刺激ホルモン(LH),卵胞刺激ホルモン(FSH),甲状腺刺激ホルモン(TSH)はいずれもαβ鎖のサブユニットよりなり,α鎖はすべてに共通で同一遺伝子からコ-ドされ,各々の生理活性はβ鎖に由来している。β鎖はアミノ酸配列,及び遺伝子レベルにおけるDNA塩基配列において高い相同性を示し,特にN末端より約30アミノ酸の部位にはCAGY領域と呼ばれるCysーAlaーGlyーTyrの4アミノ酸配列の完全な保存が認められ,これらのホルモンにとって重要な構成部位であることが予測される。我々はすでに遺伝子工学の手法を用いて,CAGY領域に点突然変異を起こしたhCGβ鎖をsiteーdirected mutagenesisの手法を用いて作成し,4種のアミノ酸の中でM1(Ala→Ser),M2(Gly→Arg),M3(Gly→Asp)と変異させることに成功した。作成した3種の変異hCGβcDNAと無変異のネイティブなhCGβcDNA,α鎖のcDNAに対応するmRNAをin vitro transcriptionによって合成,精製した。これらのα,βの鎖のmRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に微量注入してin vitroで蛋白を合成した。その結果,M1変異から合成された変異蛋白の免疫応答性はRIAシステム測定上,正常β鎖と同程度であったのに対して,M2,M3変異のmRNAの注入では無変異蛋白に比して約10%にまで低下することをみいだした。これはCAGY領域のグリシンの変異がα鎖,β鎖の会合に重要な部位であることを示している(J.Mol.Endocrinol.1990,5,pp97)。
単一国家の政府体系再編と住民意識-フランスにおける「州意識」の現状と課題-

本年度も、本研究課題に関わる文献資料(主として仏文)の収集に努めると共に、9月下旬にフランス・ボルドー市およびレンヌ市を訪問し、現地調査及び研究打ち合わせを行い、それを受けて二つの議会議員へのアンケート調査を実施し、日仏両国の広域行政についての比較検討を行う論文を執筆した。(1)まず、アキテーヌ州庁及び州議会を訪問し州の行政施策関連の資料を収集するとともに、この際に得られた知見も参考にして、ボルドー政治大学地方政治研究センターの教育スタッフである、Vincent Hoffmann-Maritinot,及びJacques Palardの各氏と協議を行った。(2)次いで、ブルターニュ州の州都、レンヌ市を訪問し、州庁及び州議会において関連資料の収集を行った。この二つの州を選定した理由は、自治体としての州を構成する県の存立の態様(歴史、社会経済的状況及び行政区域の設定)、及び1960年代以降の地域主義運動のエネルギーの対照性にある。聴き取り及び文献調査によって、両州議員の意識の違いが明らかになった。(3)この違いを実証的に確認するため、上記(1)の協議を経て作成し、帰国後再調整した両州議会議員への質問票を、ボルドー政治大学のVincent Hoffmann-Maritinotの手をかりて、両州議会議長宛に送付した。現在、その質問票へ回答の送付を待機している段階である。(4)研究成果の一つは、現在日本で進行中の「道州制」論議と、フランスの「レジオナリスム」の歴史・現状を比較検討した論文である。この研究の意味は、しばしば先行事例として取りあげられるフランスのレジオナリスムと日本の道州制が、制度の組み方、国の出先機関との関係、制度改革を支える国民的運動、国際環境等において、少なからぬ相違があることを明らかにしたことにある。本年度は、本研究課題に関わる文献資料(主として仏文)の収集に努めると共に、9月下旬にフランス・ボルドー市において現地調査及び研究打ち合わせを行った。(1)まず、二人のアキテーヌ州議会議員、Pierre Hurmic氏およびAnnie Garrissou氏にたいして聴き取り調査を行った。次いで、アキテーヌ州庁及び州議会を訪問し州の行政施策関連の資料を収集するとともに、この際に得られた知見も参考にして、ボルドー政治大学地方政治研究センターの教育スタッフである、Vincent Hoffmann-Maritinot, Claude Sorbets及びJacques Palard各氏と協議の上、議員に対する質問票の検討・調整を行った。(2)また、町長職も兼務するAumie Garrissou議員の招きにより、1日を費やしてボルドー市郊外に立地するFargues-Saint-Hilaire町役場及びこの町を中核とする「コミューン共同体」事務所を訪問し、聞き取り調査を行った。「コミューン共同体」は、日本における市町村合併の機能的代替物であり、現在フランス全土で急速に普及している。18年度では、フランスの地方制度において州の存在が次第に重みを増す一方、「コミューン共同体」による下からの圧迫もあって、県が事務事業の徳面でそのアイデンティティを脅かされている状況を確認することができた。(3)更に、3月には名古屋大学政治学研究会において、ケルト文化の専門家でもある中木康夫名誉教授を囲んで、ブルターニュ地方の歴史、地域意識、地域主義運動についての講演をうけ、討議を行った。19年度には、ボルドー政治大学の協力を得て、上記の質問票をアキテーヌおよびブルターニュ両州の議員に送付し、そのデータを元にボルドー市及びレンヌ市を訪れ、データの精査のための聞き取り調査を行う予定である。
感染記憶：ゲノムに刻まれたウイルス抵抗性の解明

生物には、感染したウイルスの遺伝情報をゲノムに記憶し進化に利用する仕組みがあることが示唆されている。本研究は、哺乳動物ゲノムで発見された内在性ボルナウイルス様配列(EBLs)の機能、特に感染防御に関する働きを明らかにすることを目的に遂行された。本研究により、ヒト由来EBLsの発現と遺伝子発現調節機能が明らかになるとともに、マウスならびにジュウサンセンジリスにおけるEBLsがそれぞれpiRNAとタンパク質を発現して、ボルナウイルスの感染防御に働く可能性を示した。さらに、Eptesicus属コウモリに内在化したEBLsが機能性のRNA依存性RNAポリメラーゼ酵素をコードする可能性も明らかにした。ヒトをはじめとする多くの哺乳動物のゲノムに見つかった内在性ボルナウイルス配列(EBLN)は、現存するボルナウイルスの遺伝子配列との相同性がきわめて高い。面白いことに、ボルナウイルスによる疾患を自然発症する動物は、ゲノムにEBLNを持たない種であり、EBLNを持つ動物ではボルナウイルスに対して抵抗性を示すことが確認されている。本研究は、内在性ボルナウイルス配列(EBLN)の感染防御への多様な関与を解析し、私たちが生まれながらにして持つウイルス抵抗性の謎を明らかにすることを目的としている。本年度は、ジュウサンセンジリスのゲノムに存在するEBLN(itEBLN)に着目し解析を行った。itEBLNは、外来性ボルナウイルスのN遺伝子とアミノ酸レベルで77%の相同性を有しており、またmRNAとしての発現が予測されてた。itEBLNのタンパク質としての機能を予測するため、組換えitEBLNを作成し、ボルナ病ウイルス(BDV)感染に対する効果を検討した。その結果、一過性に発現させた組換えitEBLNは、BDV持続感染細胞の核内に形成されるウイルス複製点に局在し、ウイルスmRNAならびにゲノムRNAレベルを有意に減少させることが明らかになった。そこで次に、組換えitEBLNを恒常的に発現するヒト由来細胞株を作成し、BDV感染実験を行なったところ、itEBLN恒常的発現細胞ではBDVの感染が顕著に阻害されることが示された。さらに、itEBLNとBDVの複製複合体であるRNPが結合していること、itEBLNの発現によりBDVポリメラーゼの転写活性が有意に低下することが明らかになった。今回の研究により、itEBLNはタンパク質としてBDVの複製を顕著に抑制することが示された。詳細な機序については不明ですが、itEBLNはBDV-Nタンパク質のドミナント・ネガティブ阻害体として機能すると考えられた。本年度は、齧歯類ならびにヒトゲノムのEBL局座から、ボルナウイルスmRNAのアンチセンスとして働く小分子RNA (piRNA)が発現していることを明らかにした。piRNAを発現するEBLはすべてゲノム中のpiRNA発現領域に組み込まれており、このEBLの進化には自然選択圧がかかっていることを示した。これは、EBLをpiRNA発現領域の組み込んだ個体が選択的に進化したことを示唆しており、EBLが遺伝免疫として機能している証拠と考えられた(RNA 2015)。また、ヒトゲノム内のEBLについて発現解析を行い、EBLの転写が内在性レトロウイルスとは異なるエピジェネティック制御を受けていること明らかにするとともに、EBL RNAが宿主遺伝子の発現を負に制御することを証明した。これらの発見より、生物は、進化の過程で感染したRNAウイルスを自らのゲノムに取り込み(内在化し)記憶することで、ウイルス抵抗性や新規の遺伝子として利用してきたとする「感染記憶」仮説を提唱した。計画していた哺乳動物由来のEBLNの機能解析は順調に進展している。特に、上述したようなマウス由来のEBLNやヒト由来のEBLNに由来するpiRNAやヒトEBLNの発現機構に関する論文をすでの発表している。これらの進捗状況からも当初の計画以上であると言える。本年度はコウモリゲノムに内在化しているボルナウイルス由来のRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)遺伝子の解析を行った。Eptesicus Endogenous Bornavirus-like L 1(eEBLL-1)と名づけられた内在性遺伝子は、ボルナウイルスのL遺伝子とほぼ同じ長さの、5000塩基以上からなる巨大なオープンリーディングフレーム(ORF)を持っていた。進化学的解析により、eEBLL-1は1180万年以上前にEptesicus属コウモリのゲノムに内在化し、現代に至るまで巨大なORFを維持してきたことが明らかとなった。また、進化の過程においてeEBLL-1に自然選択が作用していることがわかり、機能的なタンパク質をコードしていることが示唆された。eEBLL-1のアミノ酸配列を解析すると、RdRp活性に必須の配列がすべて存在することがわかった。さらに、Eptesicus属コウモリの体内でeEBLL-1がmRNAとして転写されていることを実験的に証明した。これらのことから、eEBLL-1はEptesicus属コウモリにおいて機能的タンパク質をコードすることが強く示唆され、RdRpとして働く可能性が考えらた。哺乳動物はRdRpを持ってない。

一方、植物等のゲノムはRdRpをコードしており、抗ウイルス機構や遺伝子発現調節機構において重要な役割を担っていることが報告されている。本研究は、哺乳動物がウイルスからRdRpを獲得したことを示唆する世界で初めての研究であり、哺乳動物とウイルスの共進化の解明する新たな手がかりになると期待された。生物には、感染したウイルスの遺伝情報をゲノムに記憶し進化に利用する仕組みがあることが示唆されている。本研究は、哺乳動物ゲノムで発見された内在性ボルナウイルス様配列(EBLs)の機能、特に感染防御に関する働きを明らかにすることを目的に遂行された。本研究により、ヒト由来EBLsの発現と遺伝子発現調節機能が明らかになるとともに、マウスならびにジュウサンセンジリスにおけるEBLsがそれぞれpiRNAとタンパク質を発現して、ボルナウイルスの感染防御に働く可能性を示した。さらに、Eptesicus属コウモリに内在化したEBLsが機能性のRNA依存性RNAポリメラーゼ酵素をコードする可能性も明らかにした。昨年度に計画していた哺乳動物由来のEBLNの機能解析は順調に進展している。特に、上述したようにジュウサンセンジリスのゲノム由来のEBLNの機能解析は、予想以上の進展を見せ、論文投稿ならびにパブリッシュまで行なった。この点において予想以上の進展と言える。その他、マウス由来のEBLNやヒト由来のEBLNの解析も既に論文投稿まで終了している。これらの進捗状況からも当初の計画以上であると言える。今年度は、昨年度までに解析が終了していないコウモリに内在化しているボルナウイルス由来RNAポリメラーゼ(EBLL)とヌクレオタンパク質(EBLN)の解析を中心に行う。EBLLはきわめて長いオープンリーディングフレームを保持しており、RNAポリメラーゼの基本構造も維持していることから、宿主内での機能が示唆されているものであり、その発現解析を行う。またコウモリEBLNは多くのコウモリに内在化しているが、その発現と機能にに関してはまだなにも明らかになっていない。そこで本年度は、コウモリ由来EBLLとEBLNに焦点を絞り解析を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス学今後は、他の哺乳動物由来EBLNの機能解析を精力的に進める予定である。具体的にはコウモリに内在内しているボルナウイルス由来RNAポリメラーゼ(EBLL)やゾウに内在化しているEBLNである。EBLLはきわめて長いオープンリーディングフレームを保持しており、RNAポリメラーゼの基本構造も維持していることから、宿主内での機能が示唆されている。一方、ゾウ由来EBLNはこれまでに発見されたEBLNの中で最も古くに宿主に入り込んだものと考えられている。それにもかかわらず、オープンリーディングフレームの保持や細胞内での発現が確認されているものである。本年度は、EBLLとゾウEBLNに焦点を絞り解析を行う。
触覚入力に誘発される不随意頭部回旋の機序解明と運動性疾患への適用

本研究はハンガーを頭部にかぶると不随意に頭部が回旋する現象であるハンガー反射の生起条件を明らかにし,得られた知見に基づいた装具の小型軽量化を実現することを目的とした.生起条件の解明については,皮膚刺激への注意が必要であるかどうかを観察するため睡眠時および振動提示時の観察を行った結果,ハンガー反射には少なくとも覚醒している必要があることが明らかとなった.装具の小型化については空気圧アクチュエータを用いて広い面積への触覚提示を可能とし,腰部のハンガー反射を用いることで歩行の制御を行った.本装置によりユーザの歩行を精細に制御できること,およびその誘導量は教示内容に強く依存することが明らかとなった.本年度はハンガー反射の脳内プロセスに関する仮説を検証した.第一の仮説(A)はハンガーによる頭部皮膚圧迫を意識下で外力と解釈し,その外力を緩和する方向に逃避する運動を生成するというものであった.第二の仮説(B)は,皮膚刺激に対する無意識下の反応として反射運動が生じ,その運動を意識下で観察することで外力を認識するというものであった.第三の仮説(C)は,皮膚刺激が無意識下で擬似力覚として生起され,その擬似力覚に従う運動生成までが無意識下に行われた後,認識された外力及び運動を統合して外力に寄って運動が生じたと解釈されるというものであった.これらの仮説を検証するために,ハンガー反射に意識を向けていない状況を作るために歩行に関するハンガー反射を利用した実験を行った.装具は頭部以外に腰部,脚部にも取り付け,各部位においてハンガー反射を生じることを確認した後,閉眼状態で自然に歩かせた時に歩行軌跡にどのような影響が生じるかを検証した.その結果,特に腰部に装着した際に歩行軌跡が大きく影響を受けること,またその影響は,ハンガー反射によって曲げられた上半身の方向と一致することが確認された.この結果から仮説(A)に関してはほぼ棄却されたと考えられる.次に,(B)と(C)の切り分けのために,ハンガー反射を生じている状態で別の手段で振動提示を行った.その結果振動提示によって主観的なハンガー反射の強度が強まること,またハンガー反射で力を感じるユーザのすべてが必ずしも運動を生じないことが明らかとなり,これは我々の先行研究と一致した.以上の結果により,おそらくハンガー反射の機序は仮説(C)であると結論づけた.当初計画では本年度はハンガー反射の機序の解明を目標に,例えば睡眠時のハンガー反射を調べることを計画していた.しかし実際の実験セットアップが困難であったため,歩行中のハンガー反射実験等によって代替した.結果として当初計画は概ね遂行されたと考えている.本年度はハンガー反射の実応用に関する研究を行った.従来知られていたハンガー反射は頭部の回旋を伴うものであったが,我々はハンガー反射が腰部,足首部,手首部など身体の広範囲で発生する一般的な現象であることを発見していた.まず行動誘導の第一の応用先として,歩行に対してハンガー反射がどのように影響をおよぼすのか,昨年度に引き続いて詳細に調べた.この結果,腰のハンガー反射の「ツボ」に該当する部位(これは皮膚変形を大きく発生させる部位である)を圧迫することによって大きく歩行を誘導できることを確認した.さらにこれを動的に制御するために空気圧バルーンを用いた制御装置を開発した.この結果,ユーザの歩行を精細に制御できることが判明した.これをバーチャルリアリティ環境下でもちいる予備的な検討の結果,ユーザは左右に回旋する方向に誘導されている事自体には気づくものの,強制的な感覚を与えることなく歩行を制御することが可能であることが判明した.また手首部に対するハンガー反射についても応用展開を行った.手首の皮膚を牽引するウエアラブルな装置を開発し,回旋力を制御できること,また同装置が振動を含めた広範な触覚を提示できることをあわせて検証した.当初計画では本年度はハンガー反射装置の小型軽量化を行い,今後の応用に備えることとなっていた.空気圧で駆動されるバルーンによってこの目的は達成された.結果として当初計画は遂行されたと考えている.本年度は昨年度に引き続きハンガー反射の実応用に関する研究を行うと共に,ハンガー反射の機序に関する原理的考察を行った.まずハンガー反射による歩行誘導に関して,昨年度までに作成した空気圧バルーンを用いた制御装置の評価実験を実施し,明瞭な歩行誘導が可能であること,およびその誘導量は教示内容に強く依存することを示した.ハンガー反射の機序に関しては,意識状態がハンガー反射の生起に関連するかを調査した.その結果,睡眠時にはハンガー反射の生起が抑えられることが明らかとなった.このことは,ハンガー反射が一度力覚を意識下で知覚したうえで運動が生起しているという可能性を示唆する結果であると言える.またハンガー反射を生起しやすい皮膚変形の物理量を明らかにするために,人の頭部と同じ形状の弾性体を用いた触覚センサを作成した.これをもちいてハンガー反射の主観量と皮膚変形の物理量との関係を観察した.本研究はハンガーを頭部にかぶると不随意に頭部が回旋する現象であるハンガー反射の生起条件を明らかにし,得られた知見に基づいた装具の小型軽量化を実現することを目的とした.生起条件の解明については,皮膚刺激への注意が必要であるかどうかを観察するため睡眠時および振動提示時の観察を行った結果,ハンガー反射には少なくとも覚醒している必要があることが明らかとなった.

装具の小型化については空気圧アクチュエータを用いて広い面積への触覚提示を可能とし,腰部のハンガー反射を用いることで歩行の制御を行った.本装置によりユーザの歩行を精細に制御できること,およびその誘導量は教示内容に強く依存することが明らかとなった.前年度の仮説検証に基づき,ハンガー反射を生じる装具の小型軽量化を行う.ハンガー反射が擬似力覚によって生じている現象であるならば,外力と誤認しうる皮膚変形を効率的に生じさせれば良い.現段階で申請者は皮膚にせん断変形(横ずれ)を生じさせる専用の装置によって従来よりも効率的な運動生成を行えることを確認しているが,これをさらに日用品として使用可能な装具とするための小型軽量化を行う.また今回の歩行実験に関する成果は実応用事例としても興味深いものであり,本年度では引き続き,応用の方面での研究を行う予定である.当初予定では,最終年度は運動障害への適用を含めた応用事例を開拓し,今後の定常的な研究につなげるという方針であった.ハンガー反射の腰への適用に関しては現在までにすでに,ハンガー反射デバイスをバーチャルリアリティ環境における歩行制御に用いるという,応用の端緒は掴んでおり,今後GPS等と連動したナビゲーション等応用展開を行う.また手首に対するハンガー反射に関しても医療応用を中心とした検討を行う予定である.バーチャルリアリティ
ガングリオシドーシスの中枢神経系における炎症のメカニズムの解明

ライソゾーム病の一つであるサンドホフ病(SD)は、β-ヘキソサミニダーゼの異常により、その基質である糖脂質が蓄積する難病である。我々はアポトーシスを引き起こした神経細胞からGM2、GA2が遊離し、アストロサイトを活性化することで炎症反応が引き起こされる予想した。SDマウスより調製した神経細胞にアポトーシスを誘導すると、GM2,GA2が培養液中に遊離することが確認された。一方、遊離したGM2,GA2は、TLR2およびTLR4を介して、炎症性分子を産生することが明らかとなった。これらのことから、代謝されないGM2,GA2がアストロサイトを活性化し、炎症反応を引き起こすことが示唆された。ライソゾーム病の一つであるガングリオシドーシスは、中枢神経系に先天的に代謝できないGM2ガングリオシド(GM2)、アシアロGM2ガングリオシド(GA2)が分解されずにリソソーム内に蓄積し、炎症反応等の種々の障害が引き起こされ病態が進行すると考えられてきた。一方近年の研究で、この病態の進行は中枢神経系へのガングリオシドの蓄積以外の要因により炎症反応等が引き起こされる事が示唆されている。我々はサンドホフ病マウスを用い、中枢神経系に進入した自己抗体や細胞外に放出された代謝できないガングリオシドが炎症反応を引き起こしていると推測し、これらを中心にガングリオシドーシスの炎症反応発症メカニズムの解明を試みた。これまでに病態の発症が認められる14週齢SDマウスの中枢神経系に活性化マイクログリアの増殖を確認し、ケモカインMIP-1α、CXCL-13,サイトカインTNF-α、IL-1β、TNFスーパーファミリーの一つBAFF等が高発現しているのを見出した。我々は代謝されないGM2, GA2のいずれかがマイクログリアを刺激し、ケモカイン、サイトカインの発現を促していると推測し、これらの発現メカニズムを解明するため、SDマウスのマイクログリアを脳から分離し、in vitroの系においてGM2, GA2それぞれのガングリオシドを用い刺激実験を行った。その結果、GA2ではケモカイン、サイトカインの顕著な発現は確認されなかったが、GM2では、Toll様受容体4(TLR4)を介して刺激され、ケモカインMIP-1α、CXCL-13,サイトカインTNF-α、IL-1βが産生されることを確認した。これらのことから、SDマウスにおける炎症反応は、自己抗体による抗原抗体反応の他に代謝されないガングリオシドがTLR4を介して直接マイクログリアを刺激し、炎症反応を引き起こしている可能性があることを見出した。ライソゾーム病の一つであるガングリオシドーシスは,中枢神経系に先天的に代謝できないGM2ガングリオシド(GM2),アシアロGM2ガングリオシド(GA2)が分解されずにリソソーム内に蓄積し,炎症反応等の種々の障害が引き起こされ,病態が進行すると考えられてきた.一方,近年の研究で,この病態の進行は中枢神経系へのガングリオシドの蓄積以外の要因により,炎症反応等が引き起こされることが示唆されている.我々は,サンドホフ病マウスを用い,中枢神経系に進入した自己抗体,及び細胞外に放出された代謝できないガングリオシドが炎症反応を引き起こしていると推測し,これらを中心に,ガングリオシドーシスの炎症反応発症メカニズムの解明を試みた.これまでに,病態の発症が認められる14週齢SDマウスの中枢神経系において,活性化マイクログリアの増殖を確認し,ケモカインMIP-1α,CXCL-13,サイトカインTNF-α,IL-1β,TNFスーパーファミリーの一つBAFF等が高発現しているのを見出した.更に,これら炎症関連因子の誘導要因として,代謝されない細胞外に遊離したガングリオシドGM2,GA2が,直接TLR-4を介してマイクログリア等を刺激し,MIP-1α,CXCL-13,TNF-α,IL-1βを産生することを見出したが,BAFFの産生は認められなかった.BAFFの異常発現はSLE等の自己免疫疾患で確認されており,主にB細胞の異常活性化や自己抗体の産生を介した自己免疫疾患で確認されている.そこで自己抗体の産生の低減を狙って作製したB細胞遊走性ケモカインCXCL-13遺伝子を欠損させたSDマウスでの14週齢でのBAFFの発現量を確認した結果,同週例のSDマウスより低減していることが確認された.これらのことから,SDマウスの炎症発症機序は,遊離したガングリオシドが直接マイクログリアを刺激し,炎症性サイトカインの発現を促すと同時に,CXCL-13やBAFFの異常発現により自己抗体産生B細胞の誘導,活性化が促されて病態の進行に関与している事が示唆される.ライソゾーム病の一つであるサンドホフ病(SD)は、β-ヘキソサミニダーゼの異常により、その基質である糖脂質が蓄積する難病である。

ライソゾーム病のひとつであるガングリオシドーシスは、中枢神経系に先天的に代謝できないガングリオシドが蓄積することにより、種々の障害が引き起こされ、病態が進行すると考えられてきた。一方、近年の研究で、この病態の進行は中枢神経系へのガングリオシドの蓄積以外の要因により、炎症反応等が引き起こされることが示唆されている。我々は、サンドホフ病(SD)モデルマウスを用い、中枢神経系に進入した自己抗体、及び細胞外に放出された代謝できないガングリオシドが炎症反応を引き起こしていると推測し、これらを中心に、ガングリオシドーシスの炎症反応発症メカニズムの解明を試みた。SDマウスの中枢神経系では、病態の進行と共に炎症性サイトカインTNF-αの発現が確認され、且つ関節炎リウマチなどの自己免疫疾患において病変部分で発現が確認されているB細胞遊走性ケモカインCXCL-13、B細胞の分化やIg抗体の産生に関与しているTNFスーパーファミリーの一つBAFF(B cell activating factor)の発現を確認した。一方、自己抗体の産生が低減し、病態進行が緩和することが確認されているFcrγ遺伝子欠損SDマウスでは、中枢神経でのTNF-α, CXCL-13発現量がSDマウスの約半分程度まで低減し、SDマウスの中枢神経系で見られる神経細胞の脱落、変性も改善していることを確認した。SDマウスでは、中枢神経系での炎症反応を低減させることにより病態の進行が緩和することが確認されており、これらの知見がSDにおいて抗炎症剤を用いた新たな治療法の開発に繋がる可能性のある大変意義のある結果と考えられる。次年度は更にSDマウスの炎症起因因子を網羅的に解析し、炎症反応発症メカニズムを解明する。平成24年度はSDマウスから分離したマイクログリアを蓄積するGM2, GA2それぞれで刺激し、GM2がTLR4を介した経路でマイクログリアを活性化し、MIP-1α、CXCL-13, TNF-α、IL-1β等の産生を促すことを確認した。しかしながら予定していたGM2、GA2のいずれかにSDの中枢神経系でその発現が認められたTNFスーパーファミリーの一つBAFFの発現誘導性があるかの確認は出来なかった。平成23年度は、SDマウス、Fcrγ欠損SDマウスを用いて、TNF-α, CXCL-13、BAFF発現量の経時的解析、組織学的解析等を行った。しかし一方、震災の影響の影響で十分な量のモデルマウスの準備が出来ず、in vitroの系での炎症メカニズムの詳細な解析を行うことが出来なかった。<今後の研究の推進方法>今年度は計画書通りFcrγ欠損SDマウスとSDマウスを比較することにより、自己抗体が中枢神経系におけるTNF-αの発現に関与していることが確認できた。更に炎症反応を誘発する因子としてSDマウスの中枢神経系でBAFFの発現が認められた。しかし、本年度は震災の影響でFcrγ欠損SDマウスの繁殖が遅延し、in vitroの系での炎症メカニズムの詳細な解析を行うことが出来なかった。そのため、平成24年度は、BAFFの発現誘導に関与しているケモカインCXCL-13を欠損したSDマウスを用いin vivoの系での解析を追加し、且つ、他グループの発表する研究成果を柔軟に取り入れ、SDの炎症メカニズムの解明を行う。平成25年度以降は、平成24年度に行うことの出来なかった下記の研究を行い自己抗体産生機序と病態への影響の解明を進める。