hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子コミュニケーションにおける対人調整:言語・非言語情報の透明性錯覚への影響

このほか,謝罪の伝達に関しても,送り手の過剰評価が生ずるかどうかを実験的に検討した.研究分担者佐々木は,透明性錯覚に介在する感情的要因の検討のために,葛藤における感情反応を実験的に検討した.具体的には,実験によって,運転者同士が宥和的に行動する方法を考察した.路上の状況設定をデジタルカメラで撮影された写真で呈示され,運転者として予想される感情を自己評定した.相手の運転者が好意的行動を行った方が敵意的行動を行った場合よりも,ポジティブな感情を想起していた。また,これには,葛藤状況の種類も影響していた.研究分担者多門は,話しことばにおける定型表現の扱いに焦点を当てた.定型表現は電子コミュニケーションにおいても重要な役割を果たすし,また,送り手の使用意図と受け手の解釈との食い違い,さらには送り手の透明性錯覚を生ずる可能性を孕むものである,また,多門は新しい比喩の作成動機についても検討した.新しい比喩も電子的コミュニケーション状況での伝達の齟齬の一因となりうるものである,これら定型表現や比喩に関して,主として用例の分析によって問題の解明を試みた.
男性不妊の新マウスモデルを用いての、不妊症の免疫調節療法の開発

我々は同系精巣細胞(TC)の2、3回の皮下注射のみで、アジュバントその他の免疫増強操作なしに、マウスに実験的自己免疫性精巣炎(EAO)をきわめて高率に発症させることをみいだした。この実験系を免疫制御の検定系に用いて、男性不妊症の免疫調節療法の開発に努力してきたが、本年度に得られた成果は、次のごとくである。1.上記の新しいEAOモデルをその前臨床期(preclinical phase)において抑制する能力をもつT細胞株の樹立に成功した。正常C3H/He系雄マウス(生後8週齢)に1x10^8個の同系TCを2週間隔で10回皮下注射を反復し、最終感作より7日後に摘出した脾より得たリンパ球をマウス可溶性精巣抗原(mTA,300μg/ml)とシクロスポリン(250ng/ml)の存在下で7日間培養し、その後rILー2で維持するstarve phaseと30Gy照射同系脾細胞とmTA(100μg/ml)と共に培養する'feed'phaseとの交互反復によりmTA特異的細胞株を選択した。樹立された細胞株(CTs)の表面形質はThy1.2^+,CD4^+,CD8^ー,CD3^+,slg^ーであり、in vitroリンパ球増殖性応答ではmTA刺激に対し有意の反応性を示した。本株化細胞の養子移入の実験では、EAOのinductive phaseまたはclinical phaseに移入しても発症抑制効果はみられなかったが、preclinical phaseに移入した場合には完全に病気の発症を抑制することができた。また、この細胞株の抑制効果は'feed'phaseにある株にのみ認められた事実から、抑制効果の発現には特異抗原刺激による細胞活性化が必須であることが明らかとなった(Proc.5th Ann.Meeting Jap.Soc.Basic Reprod.Immunol.1991)。現在、千葉大学医学部附属高次機能制御研究センタ-免疫機能分野・谷口克教授との共同研究の下に、本CTs細胞のT細胞レセプタ-に関する分子生物学的研究が進行中である。2.昨年度の研究で新しいEAOモデルをその誘導期において阻止する能力のあるCD8^+サプレッサ-T細胞を誘導できる実験系を確立したが、現在、この系で働く抑制性T細胞因子産生性サプレッサ-細胞の株化に、引続き努力中である。
仔ラットの母親への愛着行動を制御する脳部位の同定：神経活動変化の検出による解析

仔ラットの冠状断面の部分の切断実験を行い、仔ラットの各愛着行動(吸乳、母親への接触の維持、輸送反応やそれに付随する生理的反応)への影響を調べた。前年度に行った冠状断面での除脳実験で、愛着行動に多くの影響がみられた間脳前縁近傍面において、外側部のみ、内側部のみ、背側部のみ等の部分切断実験を行った。内側部を両側切断した場合、仔ラットは自力で母親に接触し吸乳できたが、外側部を両側切断した場合には、母親への接触維持の成績は低下し全ての仔で吸乳ができなかった。また、脳表面から脳の約半分の深さまで背側部を両側切断した場合仔ラットは吸乳できたが、さらに深部まで切断すると約半数の仔は吸乳ができなかった。これらの結果から、母への接触や吸乳には前脳底部外側の腹側部寄りの領域が関与していることが示唆された。また、母への接触維持と吸乳への影響は必ずしも一致しないことから、異なる脳部位によって制御されていると考えられた。脳の背側部を切断した場合、輸送反応の不動時間は対照群と同程度であったが、さらに深部まで切断すると不動時間が減少した。また内側部の切断では不動時間は変わらなかったが、外側部の切断では不動時間が減少傾向にあった。これらの結果から、前脳底部外側の腹側部寄りの領域が関与していることが示唆された。このように、前脳底部の特定の領域、あるいはこの領域の通過線維が、吸乳、接触、輸送反応といった仔ラットの愛着行動制御に関与していることを明らかにした。親子関係は哺乳類の最も基本的な社会単位であり、親子関係を通じた生後早期の社会性学習は将来の複雑な社会行動の基礎となる点でも特に重要である。親子関係は親の養育と子の親に対する愛着の相互依存的な関係からなるが、愛着行動の脳内機構には未知の点が多い。愛着行動の際には親からの特有の感覚入力を受けて啼泣減少、痛覚閾値上昇、副交感神経活性化による心拍数低下などの鎮静化反応が起こると想定されるが、愛着行動を包括的に制御する中枢脳部位は明らかにされていない。本研究では、生後離乳期までの仔ラットを用い、仔ラットの代表的な愛着行動である吸乳、母親への接触、輸送反応に着目し、子の親に対する愛着行動の生理的反応とその制御脳部位を明らかにすることを目的とする。今年度は、仔ラットにおいて、吸乳、母親への接触行動、輸送反応の3種の愛着行動を計測する方法を確立した。母親への接触時、輸送反応時には、先行研究での報告と同様に、鎮静化、啼泣減少、心拍数低下が確認できた。仔ラットの愛着行動・反応の発達変化を調べ、これらの3つの指標を検出しやすい生後12-13日齢で実験を行うことにした。この日齢の仔ラットを用い、脳を冠状断面に切断する除脳実験を行った。除脳処置の翌日に母親への接触行動、輸送反応をテストしたところ、切断部位によっては母親への愛着行動に異常が確認できた。現在はこれらのデータから愛着行動制御に関わる脳領域を絞り込んでいる段階である。仔ラットにおいて、吸乳、母への接触行動、輸送反応の愛着行動を確認した。麻酔した母親を横に寝かせ、近くに仔を置くと、仔ラット自ら母親に接触し、啼泣減少、鎮静化、吸乳行動が確認できた。また、輸送反応については実験者が指で仔ラットの背中をつまみ上げることにより、先行研究と同様に、鎮静化、啼泣減少、交感神経活性化による心拍数低下が確認できた。これらの行動・反応について発達変化を調べ、母親に対する接触行動における鎮静化、吸乳行動、輸送反応での鎮静化、啼泣減少、心拍数低下が全て観察できる生後12-13日齢の動物を対象に今後実験を行うこととした。当初の計画では、愛着行動を制御する脳部位を神経活動マーカーであるFosの発現を脳全体で網羅的に調べることを計画していたが、探索対象範囲が広すぎることや、脳全体の活動レベルが変化してしまうこと等から、愛着行動によりFosの発現が異なる領域をうまく検出できなかった。そのため、脳を冠状断面に切断する除脳を行い、その後の愛着行動を調べることで、愛着行動を制御する脳領域を絞りこむよう計画を変更した。上記で決定した日齢の仔ラットを用いて脳を冠状断面に切断する除脳を行い、翌日に母への接触行動、輸送反応を計測した。除脳した仔ラットは自力では母から吸乳することができなくなったが、実験者がミルクを経口投与することで生き続けることができた。脳切断部位によっては母への接触行動や輸送反応時の鎮静化、心拍数低下に異常が確認できた。現在、これらのデータから愛着行動制御に関わる脳領域を絞り込んでいる。昨年度、当初の予定から除脳による脳領域絞り込みへと計画を変更した後、今年度は冠状断全面の脳切断、部分面での切断の実験を行い、仔ラットの各愛着行動(吸乳、母親への接触行動、輸送反応やそれに付随する生理的反応)への影響を調べた。正常な仔ラットでは、自力で母親の腹部に辿り着き、乳首を探し咥えて吸乳する、母親へ接触する際には腹部を好んで接触し維持する、また、輸送反応時には鎮静化とそれに付随して心拍数低下が生じることが明らかになっている。

脳をいくつかの前後軸位置において冠状断面で切断する実験を行ったところ、前脳前縁部で切断しても仔ラットの吸乳行動は阻害されたため、仔ラットの吸乳行動には嗅球が関与していることが明らかとなった。前脳前縁部での切断の場合、母親への接触様式や輸送反応時の鎮静化、心拍数低下には大きな影響は見られなかった。間脳前縁近傍で切断した場合には、吸乳行動の異常に加え、母親への接触様式や輸送反応の鎮静化、心拍数低下に影響が確認された。これらの実験より、脳切断面の前後軸位置により各愛着行動への影響の現れ方が異なったため、愛着行動は複数の脳領域によって制御されていることが示唆された。愛着行動を制御する脳領域をさらに絞り込むため、多くの愛着行動に影響が見られた間脳前縁近傍において、外側部のみ、内側部のみ、背側部のみ等の部分切断実験を行った。その結果、前脳底部の特定の領域、あるいはこの領域の通過線維が、仔ラットの愛着行動制御に関与していることが示唆された。除脳実験の進行により愛着行動制御に関与する脳領域が絞り込まれ、近傍の脳神経核について検討できる段階に近づいたため。仔ラットの冠状断面の部分の切断実験を行い、仔ラットの各愛着行動(吸乳、母親への接触の維持、輸送反応やそれに付随する生理的反応)への影響を調べた。前年度に行った冠状断面での除脳実験で、愛着行動に多くの影響がみられた間脳前縁近傍面において、外側部のみ、内側部のみ、背側部のみ等の部分切断実験を行った。内側部を両側切断した場合、仔ラットは自力で母親に接触し吸乳できたが、外側部を両側切断した場合には、母親への接触維持の成績は低下し全ての仔で吸乳ができなかった。また、脳表面から脳の約半分の深さまで背側部を両側切断した場合仔ラットは吸乳できたが、さらに深部まで切断すると約半数の仔は吸乳ができなかった。これらの結果から、母への接触や吸乳には前脳底部外側の腹側部寄りの領域が関与していることが示唆された。また、母への接触維持と吸乳への影響は必ずしも一致しないことから、異なる脳部位によって制御されていると考えられた。脳の背側部を切断した場合、輸送反応の不動時間は対照群と同程度であったが、さらに深部まで切断すると不動時間が減少した。また内側部の切断では不動時間は変わらなかったが、外側部の切断では不動時間が減少傾向にあった。これらの結果から、前脳底部外側の腹側部寄りの領域が関与していることが示唆された。このように、前脳底部の特定の領域、あるいはこの領域の通過線維が、吸乳、接触、輸送反応といった仔ラットの愛着行動制御に関与していることを明らかにした。現在行っている除脳実験による愛着行動制御の脳領域絞りこみを進める。除脳実験によって愛着行動制御に関連すると推測される脳領域を数区画に分け、脳部位損傷実験を行う。徐々に損傷部位を狭め、愛着行動に影響が見られる脳部位をリストアップする。リストアップされた脳部位において神経活動記録実験を行い、愛着行動に伴って神経活動が変化する神経核を見つけ出し、愛着行動を制御する脳部位を明らかにする。現在行っている部分除脳実験による愛着行動制御の脳領域絞りこみから、さらに詳細に脳領域を推定するため、局所脳機能阻害実験を行い、愛着行動に影響が見られる脳部位をリストアップする。リストアップされた脳部位において神経活動記録を行い、愛着行動に伴って神経活動が変化する神経核を見つけ出すことで、愛着行動を制御する脳部位を明らかにする。当初の予定から計画を変更し、組織染色試薬に必要な薬品額が少なくなったため。昨年度の計画変更に伴い、脳神経核識別のための試薬購入が少なかったため、次年度使用額が生じた。次年度は脳神経核識別を多く行う予定であり、それらの試薬購入代として利用する予定である。
神経型Caチャネルを標的とした鎮痛薬の開発

電位依存性Caチャネルの新しい鎮痛薬標的分子としての可能性を調べるために、種々の疼痛に対する電位依存性Caチャネル遮断薬の効果を検討した。圧刺激、熱刺激および化学物質によって誘発された疼痛に対する各種Caチャネル遮断薬(脊髄内投与)の効果を行動薬理学的手法により評価した。その結果、これらの疼痛に対してN型およびP/Q型Caチャネル遮断薬は有意な鎮痛作用を持つことがわかった。しかし、bradykininとATP誘発疼痛では関与するCaチャネルが異なり、疼痛刺激に対応して、異なる性質の神経が疼痛の伝達に関与することが示唆された。また、モルヒネの鎮痛効果が閾値以下の用量のCaチャネル遮断薬で増強された。STZやvincristineを投与すると圧刺激に対する閾値低下(知覚過敏)が見られたが、熱刺激に対する閾値低下は見られなかった。この閾値低下に対してモルヒネは効果がなかったが、P/Q型Caチャネル遮断薬とN型遮断薬は、それぞれの薬物による閾値低下を回復させた。一方、L型Caチャネル遮断薬は効果が小さく、脊髄後角部における疼痛伝達に対する関与が他の2種のCaチャネルに比べて弱いことが示された。以上の結果から、疼痛伝達において刺激特異的な電位依存性Caチャネルを介する経路が脊髄後角部に存在し、(1)モルヒネによる疼痛制御機構と独立して疼痛制御を行っており、両機構の抑制は鎮痛効果を相乗的に増加させること、(2)モルヒネでは閾値低下を改善できない知覚過敏に対してもある種のCaチャネル遮断薬は有効であることがわかった。今研究の結果は神経型電位依存性Caチャネルが知覚過敏などの神経因性痛覚に対する治療薬の効果的な標的分子となる可能性を示している。BradykininとATPを手掌部投与により発生する疼痛に対する各種Caチャネル遮断薬の効果を検討し、神経に存在する電位依存性Caチャネルの鎮痛薬の作用点としての役割を検討した。各種Caチャネル遮断薬および受容体遮断薬は脊髄内に注射投与した。Bradykininによって誘発された疼痛反応は濃度依存的にNK1受容体遮断薬(L-703,606)によって抑制されたが、NMDA受容体遮断薬(D-AP6)は効果がなかった。一方、ATPによって誘発された疼痛反応はNMDA受容体遮断薬によって抑制されたが、NK1受容体遮断薬は効果がなかった。以上の結果から、bradykininはNK1受容体を介して、ATPはNMDA受容体を介して疼痛を引き起こすことがわかった。次に、2種の疼痛反応に対する各種電位依存性Caチャネル遮断薬の効果を検討したところ、Bradykininによって誘発された疼痛反応はω-conotoxin GVIAおよびcalciseptineによって有意に減弱したが、ω-agatoxin IVAは効果がなかった。一方、ATPによって誘発された疼痛反応はω-conotoxin GVIAおよびω-agatoxin IVAによって有意に減弱したが、calciseptineは効果がなかった。NK1受容体作用薬であるsubstance P(SP)およびNMDA受容体作用物質であるNMDAを脊髄内に注射投与することによっても疼痛反応が誘発された。SPによる疼痛反応はcalciseptineで減弱したが、ω-conotoxin GVIAは無効であった。また、NMDAによる疼痛反応はω-conotoxin GVIAおよびω-agatoxin IVA両者とも無効であった。以上の結果から、神経系に存在する電位依存性Caチャネルは疼痛信号の伝達に重要な役割を担っているが、疼痛の種類によって関与するCaチャネルが異なることが明らかとなり、鎮痛薬の作用点としてこれらCaチャネルを考えた場合、N型Caチャネルがより普遍的な可能性を持っていると考えられた。

昨年は発痛物質であるBradykininとATP投与により発生する疼痛に対する各種Caチャネル遮断薬の効果を検討し、神経に存在する電位依存性Caチャネルの鎮痛薬の作用点としての役割を検討した。その結果、Bradykininによる疼痛にはN型・L型Caチャネルが関与し、ATPによる疼痛はN型・P/Q型Caチャネルが関与することを見出した。これらのことから、鎮痛薬の作用点としてこれらCaチャネルを考えた場合、N型Caチャネルがより普遍的な可能性を持っていると考えられた。この考えの妥当性を検討するため、今年度は知覚過敏など異常感覚におけるCaチャネルの役割を検討した。材料として、ストレプトゾトシン注射による糖尿病ラットを作成し、糖尿病で起こる知覚過敏に対する効果を検討した。その結果、糖尿病性ラットで起こる知覚過敏は機械的刺激に対して認められたが、熱刺激に対しては知覚過敏が認められなかった。この機械的刺激に対する知覚過敏はP/Q型チャネル遮断薬で特異的に抑制されたが、N型およびL型チャネル遮断薬では効果が認められなかった。また、糖尿病ラットで見られた知覚過敏に対して代表的な鎮痛薬であるモルヒネでは特異的な抑制は認められなかった。特異的抗体を用いた組織免疫染色では糖尿病ラットで特異的にP/Q型Caチャネルが発現していることがわかった。以上の結果から、糖尿病ラットの知覚過敏は痛覚伝達神経でのP/Q型Caチャネルの発現亢進による神経伝達の亢進が原因であろうと考えられ、Caチャネルサブタイプの発現変化と痛覚異常の質的変化に関連があると想像される。種々の発痛物質による末梢性疼痛は脊髄後角部のシナプス部で電位依存性Caチャネル依存性の伝達が行われ、関与する電位依存性Caチャネルが刺激によって異なるという発痛物質特異的な伝達を行うことを見いだした。同様な結果は、知覚過敏症においても認められ、STZ誘発糖尿病性知覚過敏においてはP/Q型チャネル遮断薬で特異的に抑制されたが、N型およびL型チャネル遮断薬では効果が認められなかった。そこで、知覚過敏誘発物質としてvincristineを用いて同様な実験を行い、以下の結果を得た。STZ誘発知覚過敏と同様、vincristine誘発知覚過敏も圧刺激による疼痛感受性を亢進したが、熱刺激に対する疼痛感受性には影響しなかった。しかし、STZ誘発知覚過敏と異なり、vincristine誘発知覚過敏ではN型Caチャネルが関与し、P/Q型およびL型チャネルの関与は認められなかった。一方、モルヒネはこうした知覚過敏に対して特異的な鎮痛増強作用は起こらなかった。STZおよびvincristine誘発知覚過敏は圧刺激による疼痛に対して認められ、熱刺激に対する疼痛では起こらないことから、薬物誘発性知覚過敏は二次的に特定の電位依存性Caチャネルを介した特定の神経経路の感受性亢進によるものと推測できる。また、本研究により、それ自身では鎮痛効果が認められない低用量の神経型Caチャネル遮断薬でもモルヒネの鎮痛効果を増強することがわかった。以上の結果から、疼痛伝達において刺激特異的な電位依存性Ca
宿主細胞内におけるレジオネラの多彩な生存戦略の解明

本申請研究では、1:LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明、2:LCVの小胞体への輸送機構の解明、3:レジオネラの小胞体定着機構の解明の3点のテーマを柱としている。そこで、当該年度の研究実施計画をテーマごとに以下に記載する。1:LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明当該年度の解析により、Rab5のユビキチン化を惹起するレジオネラエフェクターを含む遺伝子群であるisland7の中から、データベース解析によりE3ユビキチンライゲース様のレジオネラエフェクターを見いだした。そして、その中の一つのエフェクターを発現させるとRab5のユビキチン化が促進されること、当該エフェクターの遺伝子破壊によりレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化が抑制されることを見いだした。2:LCVの小胞体への輸送機構の解明これまでの解析により、Rab33BをLCVへと供給するレジオネラエフェクターがisland7に含まれている可能性を見出していた。そこで、当該年度はisland7にコードされる全てのレジオネラエフェクターをクローニングし、各々のエフェクターとRab33Bとの結合及び局在を解析した。その結果、2つのレジオネラエフェクターがRab33Bと特異的に結合すること、Rab33Bの局在を自身が局在する領域へと変化させることを見いだした。3:レジオネラの小胞体定着機構の解明当該年度の解析により、滑面小胞体と粗面小胞体を循環する宿主タンパク質であるBap31がLCVへと供給されること、またBap31を発現抑制すると小胞体に到達したLCVが粗面小胞体へと以降することができず、滑面小胞体に留まったままであることを見いだした。更に、粗面小胞体にスペースを作り出す因子のclimp-63を発現抑制するとレジオネラ増殖が有意に抑制されることも見いだした。本申請研究は、申請時に計画したプラン通り順調に進展していると考えている。理由は以下に記載する。本申請研究は3本の柱(1:LCVのリソソーム輸送回避機構の解明、2:LCVの小胞体への輸送機構の解明、3:レジオネラの小胞体定着機構の解明)を軸として行ってきた。まず、研究計画1と2に関しては、各々の機構を制御するレジオネラエフェエクターの候補分子が同定できたことは、極めて重要な進展であったと考えている。レジオネラエフェクターを同定できたことから、レジオネラが当該ツールを用いて「どのように」機能の制御を行っているのかの詳細を明らかにできることが期待される。また、研究計画3に関しては、小胞体に到達したレジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する際に利用する宿主因子が同定できたことが大きな進展だと考えている。当該因子が同定できたことにより、次は本因子を制御するレジオネラエフェクターを同定することに重点を置くことができ、本因子を制御するレジオネラエフェクターが明らかとなれば、レジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する分子機構の全容解明が期待される。本申請研究の今後の推進方策をテーマ毎に以下に記載する。1:LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明では、当該エフェクターの遺伝子欠損株を作製し、本遺伝子の欠損ががレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化に与える影響やレジオネラの増殖に及ぼす影響を解析する。また、当該遺伝子のE3ライゲース活性に重要なアミノ酸残基の同定を目指す。これらの解析により、レジオネラによるリソソームへの輸送回避機構の詳細が明らかになることが期待される。2:LCVの小胞体への輸送機構の解明では、当該レジオネラエフェクターの遺伝子破壊株(single及びdouble)を作製し、本株を含むLCVへのRab33bの供給やERへの到達状況を解析する。また、これらのレジオネラエフェクターのRab33bに対する活性も調べる。これらの解析により、リモデリングを完了したLCVが小胞体へと移行する分子基盤の詳細が明らかになることが期待される。3:レジオネラの小胞体定着機構の解明では、Bap31の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索及びclimp-63の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索を引き続き行う。本解析により、小胞体に到達したレジオネラが、どのように滑面小胞体から粗面小胞体へと以降し、粗面小胞体で増殖する分子基盤が明らかになることが期待される。

そして、その中の一つのエフェクターを発現させるとRab5のユビキチン化が促進されること、当該エフェクターの遺伝子破壊によりレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化が抑制されることを見いだした。2:LCVの小胞体への輸送機構の解明これまでの解析により、Rab33BをLCVへと供給するレジオネラエフェクターがisland7に含まれている可能性を見出していた。そこで、当該年度はisland7にコードされる全てのレジオネラエフェクターをクローニングし、各々のエフェクターとRab33Bとの結合及び局在を解析した。その結果、2つのレジオネラエフェクターがRab33Bと特異的に結合すること、Rab33Bの局在を自身が局在する領域へと変化させることを見いだした。3:レジオネラの小胞体定着機構の解明当該年度の解析により、滑面小胞体と粗面小胞体を循環する宿主タンパク質であるBap31がLCVへと供給されること、またBap31を発現抑制すると小胞体に到達したLCVが粗面小胞体へと以降することができず、滑面小胞体に留まったままであることを見いだした。更に、粗面小胞体にスペースを作り出す因子のclimp-63を発現抑制するとレジオネラ増殖が有意に抑制されることも見いだした。本申請研究は、申請時に計画したプラン通り順調に進展していると考えている。理由は以下に記載する。本申請研究は3本の柱(1:LCVのリソソーム輸送回避機構の解明、2:LCVの小胞体への輸送機構の解明、3:レジオネラの小胞体定着機構の解明)を軸として行ってきた。まず、研究計画1と2に関しては、各々の機構を制御するレジオネラエフェエクターの候補分子が同定できたことは、極めて重要な進展であったと考えている。レジオネラエフェクターを同定できたことから、レジオネラが当該ツールを用いて「どのように」機能の制御を行っているのかの詳細を明らかにできることが期待される。また、研究計画3に関しては、小胞体に到達したレジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する際に利用する宿主因子が同定できたことが大きな進展だと考えている。当該因子が同定できたことにより、次は本因子を制御するレジオネラエフェクターを同定することに重点を置くことができ、本因子を制御するレジオネラエフェクターが明らかとなれば、レジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する分子機構の全容解明が期待される。本申請研究の今後の推進方策をテーマ毎に以下に記載する。1:LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明では、当該エフェクターの遺伝子欠損株を作製し、本遺伝子の欠損ががレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化に与える影響やレジオネラの増殖に及ぼす影響を解析する。また、当該遺伝子のE3ライゲース活性に重要なアミノ酸残基の同定を目指す。これらの解析により、レジオネラによるリソソームへの輸送回避機構の詳細が明らかになることが期待される。2:LCVの小胞体への輸送機構の解明では、当該レジオネラエフェクターの遺伝子破壊株(single及びdouble)を作製し、本株を含むLCVへのRab33bの供給やERへの到達状況を解析する。また、これらのレジオネラエフェクターのRab33bに対する活性も調べる。これらの解析により、リモデリングを完了したLCVが小胞体へと移行する分子基盤の詳細が明らかになることが期待される。3:レジオネラの小胞体定着機構の解明では、Bap31の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索及びclimp-63の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索を引き続き行う。本解析により、小胞体に到達したレジオネラが、どのように滑面小胞体から粗面小胞体へと以降し、粗面小胞体で増殖する分子基盤が明らかになることが期待される。
摘出心房展開標本を用いた異常自動能にともなう 不整脈発現機構の光イメージング解析

ラット摘出心房標本において、不整脈(頻拍様興奮tachycardia-like excitation)を電気刺激により誘発し、その際の興奮波伝播の時間的・空間的パターンを膜電位の光学的イメージング法により解析した。その結果、興奮波の伝播パターンには誘発のイベントごとに大きな違いが見られ、これらは誘発時の生理学的条件の微小な揺らぎによるものと考えられた。このことから、ここで見られた不整脈は時空カオスとしての特徴を持っていることが明らかとなった。本年度は、摘出心房標本におけるブレビスタチン誘発性不整脈(撃発活動および異所性自動能)の発現時における膜電位感受性色素を用いた光学的マッピングのデータの蓄積をおこなった。その結果、ブレビスタチン誘発性撃発活動においては、電気刺激により誘発された最初の活動電位に続いて発現する第二の活動電位の発生源およびその伝播範囲が撃発活動のイベントによって異なっていることが明らかにされた。さらにその伝播の空間的パターンにおいても、時に変則的な変化がみられることが明らかとなった。また、異所性自動能についても、その発現のイベントによって異所性ペースメーカーの位置が異なる例がみられた。さらに、撃発活動と異所性自動能の混合パターンもみられることを明らかにした。これらの実験結果で見られるイベント間の発現パターンの変化に注目し、その視点からのデータの解析を開始した。一方、カルシウムイオンイメージングを用いた実験では、心房摘出標本に対してカルシウムイオンイメージングをおこなうための光センサーとして新型CCDカメラを導入し、その性能を検討した。また、従来から問題になっていた光学系では、従来の正立型大型顕微鏡に代えて、実体顕微鏡を改造した光学系を設計する方向へ方針転換し、測定システムの基本的設計のを完成させた。さらにあわせて、もうひとつの重要な条件であるカルシウムイオンプローブを標本に取り込ませる至適条件の探索をすすめ、プローブとしてカルシウムグリーンが適していることを明らかにした。本年度もひきつづき、摘出心房標本で誘発された不整脈発現時の興奮波伝播パターンの膜電位感受性色素を用いた光学的マッピングのデータの蓄積をおこなった。その結果、ブレビスタチン誘発性撃発活動においては、電気刺激により誘発された最初の活動電位に続いて発現する第二の活動電位の発生源およびその伝播範囲が撃発活動のイベントによってひとつひとつ異なっていることが時間的・空間的マッピングにより明らかにされた。これらの実験結果で見られるイベント間の発現パターンの違いに注目し、ここで見られる現象がカオス的ではないかという視点からのデータの解析を開始した。さらに、ブレビスタチン投与の他にも同様なイベント間の発現パターンの違いを示す不整脈発現の条件を探索すると共に、これまでに蓄積されていた実験性不整脈のデータについてもイベントごとの発現パターンの変化に注目し、見直しを行った。また、従来から問題になっていた光学系では、従来の正立型大型顕微鏡に代えて、実体顕微鏡を改造した光学系を設計する方向へ方針転換し、測定システムの基本的設計を完成させた。さらにあわせて、もうひとつの重要な条件であるカルシウムイオンプローブを標本に取り込ませる至適条件の探索をすすめ、プローブとしてカルシウムグリーンをもちいて予備的実験を開始した。その結果、tetanus刺激により誘発される頻拍性不整脈(tachycardia-like excitation)において、刺激の過程および刺激終了後の12秒間の時期に興奮伝播の不規則なblock(blocked area)や異所性自動能のfocusが出現する複雑な(“chaotic"な)興奮伝播パターンが現れ、その後準安定的な興奮のcircus movementあるいは異所性ペースメーカーが発現するパターンに移行することが明らかにされた。さらにこの過程における興奮伝播パターンは不整脈のイベントによってひとつひとつ異なっていることが時間的・空間的マッピングにより明らかとなった。これらの実験結果で見られるイベント間の発現パターンの違い(event-to-event variations)に注目し、ここで見られる現象がカオス的ではないかという視点からのデータの解析を開始した。その結果、ここで見られるvariationsは不整脈発現時における生理学的初期条件のわずかな違いによって引き起こされるものであることが示唆された。この「複雑系」としての特徴はここで見られる不整脈が「機能的自己組織化」的現象であるという考えを強く支持するものである。これらの事から、この不整脈が“physiology-specific attractor"と呼ぶべきものであることが明らかになった。ブレビスタチン誘発性不整脈の発現パターンの解析はきわめて順調に進行し、その時間的・空間的パターンのイベントごとの発現変化が明らかにされ、研究当初には計画されなかったそのevent-to-event variationのカオス的特性についての解析という新たな研究上の展開が得られた。

カルシウムイメージングについては、まだ予備的実験の段階である。これはおもに従来の光学系においては十分な励起光強度を得ることが出来ないことに起因していた。これについては、光学系の見直しにより良好な蛍光シグナルが得られるという技術的見通しが立ったため、来年度には改善されることが期待されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ブレビスタチン誘発性不整脈の不整脈発現パターンの解析はすでにかなりの量のデータを蓄積することが出来た。今後はこの不整脈の発現の時間的・空間的パターンの解析を進め、そのカオス性についてもデータの解析をさらに進める。これは本研究の大きな目標である興奮波のカオス的伝播がその基礎にあると言われてきた心房細動のモデル化に重要な意義がある。さらに、われわれのこれまでの実験のデータから、このようなカオス的興奮現象の背景には、細胞内カルシウムイオンのダイナミックスの不安定性が示唆されているので、カルシウムイメージングのこの実験系への適用のためのハード面およびソフト面の両面での実験技術の確立を目指す。
ポンプレス人工胎盤システムの開発: 人工羊水に対する濾過殺菌法の検討

現行の新生児医療は出生直後から人工呼吸管理を開始して,早産児に胎児循環から成人循環への適応を強制している.そのため,妊娠24週未満で生まれた成育限界児は左心不全や動脈管開存に陥りやすく,しばしば脳出血,脳白質損傷,壊死性腸炎を併発する.そこで我々は,ヒト胎盤循環を模したポンプレス人工胎盤システムを,ヒツジ胎仔を用いた動物実験で開発した.このシステムを臨床応用すれば,現行の保育器で育てる新生児医療を人工子宮で育てる新生児医療へと転換させ,成育限界児の後遺症なき生存を可能にするかもしれない.その一方で,感染抵抗力が弱い成育限界期のヒツジ胎仔は人工羊水内で増殖した微生物による菌血症や敗血症に陥りやすいことが指摘された.そこで本研究期間には,微生物の増殖による感染症を予防するために人工羊水の浄化システムを確立する.具体的には,(1)羊水量を減少させ,(2)物理的濾過フィルターを強化し,(2)最も効率のよい濾過流量に設定すれば,成育限界期のヒツジ胎仔であっても,人工羊水内での微生物の増殖や感染症を予防できることを証明する.平成29年度は人工胎盤システムによる養育において,人工羊水量を減らし(羊水量10L),0.2マイクロメートルの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を併用した羊水循環浄化装置を使用したが,羊水培養からはグラム陰性桿菌が検出され,敗血症を克服できなかった.平成30年度には比較的成熟した妊娠135-138日のヒツジ胎仔を用いた.6時間毎に人工羊水の入れ替えを行い,羊水感染症を防ぐことが可能かを検証した.人工羊水中で9日間の養育が可能であった3例において検討を行った.216時間における羊水培養では,2例でEnterococcus faeciumを,1例でCandida albicansを同定した.しかし羊水培養で同定された菌による敗血症の発症はなかった.人工羊水量を減らし(羊水量10L),0.2マイクロメートルの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を併用した羊水循環浄化装置では,羊水培養からはグラム陰性桿菌が検出され,敗血症を克服できていない.そのため平成30年度には人工羊水の6時間毎の入れ替えを行った.羊水中にグラム陰性桿菌や真菌は検出されたが,それによる敗血症は防ぐことができた.当初予想されていたよりも人工羊水内での微生物の増殖を抑えることに難渋している.平成31年度には人工羊水の入れ替えや"かけ流し"による安全性の検証が必要と考えられる.また閉鎖式人工子宮バッグの導入も検討課題である.早産児を後遺症なく生存させることは周産期新生児医療の喫緊の課題である.現行の新生児医療は出生直後から人工呼吸管理を開始して,早産児に胎児循環から成人循環への適応を強制している.そこで我々は,ヒト胎盤循環を模したポンプレス人工胎盤システムを,ヒツジ胎仔を用いた動物実験で開発した.このシステムの導入により,現行の保育器で育てる新生児医療を人工子宮で育てる新生児医療へと転換させ,成育限界児の後遺症なき生存を可能にするかもしれない.その一方で,感染抵抗力が弱い成育限界期のヒツジ胎仔は人工羊水内で増殖した微生物による菌血症や敗血症に陥りやすいことが指摘された.そこで本研究期間には,微生物の増殖による感染症を予防するために人工羊水の浄化システムを確立する.具体的には,1.羊水量を減少させ,2.物理的濾過フィルターを強化し,3.最も効率のよい濾過流量に設定すれば,成育限界期のヒツジ胎仔であっても,人工羊水内での微生物の増殖や感染症を予防できることを証明する.平成29年度には妊娠88-103日(満期147日)のヒツジ胎仔に人工胎盤システムを装着し,5日間養育する実験を8回予定した.しかし1例は受胎が得られず,1例は臍帯脱出による子宮内胎仔死亡のため,6回の実験(妊娠日齢91.8 ±5.5日,平均±SD)を実施した.この6回の実験は,開放型人工子宮バッグ(羊水量10L)に0.2μmの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を装着した羊水循環浄化装置を併用した.手技的な問題により2例は早期に十分な胎盤血流を確保できずに死亡した.データを収集できた4例において,人工胎盤装着後24時間における羊水培養検査を実施したところ,全例でP. aeruginosaとEnterococcus faecalisが検出された.またその後に敗血症性ショックにより2例が死亡した.平成29年度は人工胎盤システムによる養育において,人工羊水量を減らし(羊水量10L),0.2μmの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を併用した羊水循環浄化装置を使用したが,羊水培養からはグラム陰性桿菌が検出され,敗血症を克服できていない.現行の新生児医療は出生直後から人工呼吸管理を開始して,早産児に胎児循環から成人循環への適応を強制している.そのため,妊娠24週未満で生まれた成育限界児は左心不全や動脈管開存に陥りやすく,しばしば脳出血,脳白質損傷,壊死性腸炎を併発する.そこで我々は,ヒト胎盤循環を模したポンプレス人工胎盤システムを,ヒツジ胎仔を用いた動物実験で開発した.

このシステムを臨床応用すれば,現行の保育器で育てる新生児医療を人工子宮で育てる新生児医療へと転換させ,成育限界児の後遺症なき生存を可能にするかもしれない.その一方で,感染抵抗力が弱い成育限界期のヒツジ胎仔は人工羊水内で増殖した微生物による菌血症や敗血症に陥りやすいことが指摘された.そこで本研究期間には,微生物の増殖による感染症を予防するために人工羊水の浄化システムを確立する.具体的には,(1)羊水量を減少させ,(2)物理的濾過フィルターを強化し,(2)最も効率のよい濾過流量に設定すれば,成育限界期のヒツジ胎仔であっても,人工羊水内での微生物の増殖や感染症を予防できることを証明する.平成29年度は人工胎盤システムによる養育において,人工羊水量を減らし(羊水量10L),0.2マイクロメートルの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を併用した羊水循環浄化装置を使用したが,羊水培養からはグラム陰性桿菌が検出され,敗血症を克服できなかった.平成30年度には比較的成熟した妊娠135-138日のヒツジ胎仔を用いた.6時間毎に人工羊水の入れ替えを行い,羊水感染症を防ぐことが可能かを検証した.人工羊水中で9日間の養育が可能であった3例において検討を行った.216時間における羊水培養では,2例でEnterococcus faeciumを,1例でCandida albicansを同定した.しかし羊水培養で同定された菌による敗血症の発症はなかった.人工羊水量を減らし(羊水量10L),0.2マイクロメートルの細菌濾過フィルターと紫外線照射装置を併用した羊水循環浄化装置では,羊水培養からはグラム陰性桿菌が検出され,敗血症を克服できていない.そのため平成30年度には人工羊水の6時間毎の入れ替えを行った.羊水中にグラム陰性桿菌や真菌は検出されたが,それによる敗血症は防ぐことができた.当初予想されていたよりも人工羊水内での微生物の増殖を抑えることに難渋している.平成29年度に導入した羊水持続循環装置によっても,人工羊水の汚染を防ぐことは不可能であった.そのため平成30年度には人工羊水の入れ替えや"かけ流し"による安全性の検証が必要と考えられる.また閉鎖式人工子宮バッグの導入も検討課題となった.平成31年度には人工羊水の入れ替えや"かけ流し"による安全性の検証が必要と考えられる.また閉鎖式人工子宮バッグの導入も検討課題である.次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である.平成30年度請求額と合わせ平成30年度の研究遂行に使用する予定である.次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である.平成31年度請求額と合わせ平成31年度の研究遂行に使用する予定である.
2D-DIGEシステムを用いた新規乳癌関連遺伝子の同定と機能解析

乳癌抑制遺伝子産物であるBRCA1を蛋白質レベルで制御する因子の解析は乳癌抑制のメカニズムを知る上できわめて重要である。以下、当初の目的とその結果を述べる。目的:(1)BRCA1によってユビキチン化される基質およびBRCA1を制御する上流の因子のスクリーニング。(2)HERC2によるBRCA1制御機構の解析。(3)HERC2トランスジェニック(TG)マウスの表現型の解析。結果:(1)内因性のBRCA1複合体を大量に免疫沈降することを目的とし、抗BRCA1ウサギ抗体を作成した。しかし、スクリーニングによる新たな因子の同定には至らなかった。(2)抗HERC2抗体による免疫沈降とウェスタンブロットによって内因性のHERC2はBRCA1と結合した。HERC2全長をクローニングし、フラグメント解析した結果、C末端の3559-4834アミノ酸(HERC2-CT)がBRCA1に結合した。一方、BRCA1のフラグメント解析をした結果、HERC2はBRCA1の分解を誘導するdegronと呼ばれるドメインの一部65-167に結合することが判明した。HERC2とBRCA1の結合は細胞周期依存的で、S期にBRCA1の発現が低下している時にHERC2が結合した。また、HERC2の2292-2923は核内に局在し、それ以外のフラグメントは細胞質に局在すること、内因性のHERC2は主に細胞質に局在するが、Crm1阻害剤であるレプトマイシンBによって核内に移動することから、細胞質、核内を移動するシャトルタンパク質であることがわかった。以上よりHERC2はS期にBRCA1を細胞質に移送して分解するユビキチンリガーゼである可能性が示唆された。(3)MMTV誘導化にHERC2 C末端を発現するTGマウス、13クローンを得て、このうち乳腺でのmRNA発現をするものを選抜し、観察したが、有意な表現型を示すマウスは得られなかった。(1)DNA傷害によってユビキチン化されるBRCA1の基質のスクリーニング(2)DNA傷害およびM-G1移行期にBRCA1が分解する際にBRCA1と結合する蛋白質のスクリーニングBRCA1を免疫沈降し、LC-MS/MS質量分析計を用いて結合蛋白質および基質を同定する際にこれまでのトランスフェクションを用いた系ではアーチファクトが生じる可能性があることから、内因性のBRCA1複合体を大量に免疫沈降することを目的とし、有用な既知のエピトープに対するウサギ血清を作成した。全長14506bpの巨大なHERC2のcDNAを、7つのFragmentに分けてクローニングし、それぞれ段階的に融合させ、N末端とC末端の2つのFragmentまで作成した。Fragmentを用いた結合部位のマッピングの結果、HERC2はC末端のみでBRCA1と結合すること、中央部分のみが核内に移行すること、さらにこの部分がp53に結合するという結果を得た。(4)HERC2トランスジェニック(TG)マウスMMTV誘導化にHERC2C末端を発現するTGマウス、13クローンを得て、このうち乳腺でのmRNA発現をするものを選抜し、観察したが、現在のところ乳癌発症例はない。

遺伝子発現プロフィールから生まれた新しい乳癌のサブタイプで予後の悪いbasal-like乳癌がBRCA1の機能異常に起因することがわかり、BRCA1をタンパク質レベルで制御するメカニズムは乳癌の臨床上きわめて重要となっている。平成19年度はこのメカニズムを知る上で重要な因子を同定し、機能解析を行うことを目的とした。しかし、平成18年度に作成したBRCA1抗体がうまく機能せず、新たな因子の同定には至らなかった。そこで本研究ではHERC2の機能を中心に解析し、以下の知見を得た。抗HERC2抗体による免疫沈降とウェスタンブロットによって内因性のHERC2はBRCA1と結合することが確認された。Double-thymidine blockにて細胞周期を同調させたHeLa細胞を用いた実験にてHERC2とBRCA1の結合は細胞周期依存的で、S-G2期にBRCA1の発現が低下している時にHERC2が結合した。HERC2全長をクローニングし、フラグメント解析した結果、C末端の3559-4834アミノ酸(HERC2-CT)がBRCA1に結合した。一方、BRCA1のフラグメント解析をした結果、HERC2はBRCA1の分解を誘導するdegronと呼ばれるドメインの一部65-167に結合することが判明した。また、HERC2の2292-2923は核内に局在し、それ以外のフラグメントは細胞質に局在すること、内因性のHERC2は主に細胞質に局在するが、Crm1阻害剤であるレプトマイシンBによって核内に移動することから、細胞質、核内を移動するシャトルタンパク質であることがわかった。以上よりHERC2はBRCA1を細胞質に移送して分解するユビキチンリガーゼである可能性が示唆された。
米国におけるNBPTSの展開と効果-教育修士プログラムと教員の役割変容に着目して

NBPTSの創設以来、各大学が、NBPTSのスタンダードやNBC取得に向けたサポートを意識したプログラムを開発してきた。また、近年は、NBC取得教員を対象に、評価者養成プログラムを積極的に開発・実施している。大学が新たに開発した授業の多くは、NBPTSの資格証明プロセスで用いられるポートフォリオを通じた授業分析や評価方法に関わるものである。学区のリーダーとして活躍するNBC取得教員は、本研究では、多くの場合、大学のプログラム修了者であったことが明らかになった。平成21年度は、まず、1987年に設立されたNBPTSの展開過程を時系列的に整理することから着手した。この段階では、文献調査を基本とし、NBPTSが認定した教員数(NBC教員数)の変化・認定領域の変化・州別のNBC教員分布数の変化等の状況について明らかにした。次に、NBPTSが州や学区の政策に与えてきた影響に関して、文献を基に追究した。現在、多くの州や学区がNBPTSから認定を受けてNBC教員になることを推奨する政策を実施してきており、さらに、NBPTSの基準を意識した教員評価制度を導入してきている。この過程では、州や学区による各政策の特徴と導入経緯等について明らかにし、その上で、主として、バージニア州内の学区を具体的に事例として取り上げて分析を進めた。また9月には、州や学区の現職教育と、大学における教員養成・現職教育に対してNBPTSが具体的に与えている影響を調べるために、現地調査を行った。今年度の調査対象は、主としてバージニア州およびワシントンD.C.地区とした.この過程で行った調査内容には、(1)NBPTSの関係者へのインタビュー、(2)NBC教員候補生用のワークセッションへの参加、(3)NBC教員候補生へのインタビュー、(4)学区関係者および大学関係者へのインタビュー、以上が含まれる。平成22年度は、NBPTSが大学における教育プログラムと学区における現職教育プログラムに与えた影響に関して、まず、文献を基に研究をすすめ、その上で、2月下旬から3月中旬にかけて現地での実地調査を行った。調査は、ワシントン州シアトル市近郊の学区とワシントン大学を中心に行った。ワシントン大学およびシアトル市近郊の各学区は、NBPTSが認定する優秀教員(NBC教員)を養成・輩出するプログラムをそれぞれ開発して実施に移している。ある意味両者は競合関係にあるとも捉えられ、また同時に切磋琢磨し合う関係にある。従って、第一に、NBCの認定証取得に向けた各プログラムが大学や学区においていかに生み出されてきたのかを明らかにするとともに、第二に、大学と学区それぞれのプログラムを比較検討し、大学プログラムの特性と学区プログラムの特性を明らかにした。また第三に、それぞれのプログラムの効果を検証する作業を進めてきた。効果検証に関しては、現地の大学で出された博士論文等も参照し、それらの知見や方法を踏まえて、新たなインタビューガイドの作成なども進めている段階にある。日本においても、近年は、大学と教育委員会の関係は、競合関係であるとともに、連携しあい、互いに磨き合う関係に捉えなおされつつある。米国での実態と研究成果を踏まえ、日本独自の教師教育のあり方に対を追究したい。今年度は、上記の現状を踏まえて、ワシントン州のワシントン大学と近隣学区における、NBC取得に向けたサポートプログラムと、評価者としてのNBCTsの訓練プログラムの現状と課題を明らかにすることを目的に研究を進めた。また、大学によるプログラムと学区が主導するプログラムの比較を試みた。その結果、まず、学区プログラムでリーダーシップを発揮している学区関係者およびNBCTsの多くが、大学プログラム修了者ということが明らかになった。また、評価者としてのNBCTs訓練プログラムにおいても、大学のプログラムが学区プログラムを主導している実態が明らかになった。これらから、大学における新しい修士プログラムが、学区や学校における教員研修プログラムを変容させ、主導してきたことが看取できた。しかし一方で、大学プログラムは学区プログラムに比べてコスト高という課題が存在する。また、学区の人事システムにおいて、NBCTsをいかに配置し活用するかに関しても、課題が残っている。「優秀な教員を最も必要な学区・学校に配置させる」という現オバマ政権の改革指針とあわせて、今後の動向をさらに追究していきたい。
圧力駆動型蒸留システムの装置化と安定運転技術の開発

圧力駆動型蒸留装置は従来の蒸留装置に比べて少ないエネルギーで操作できることが理論的に示されている。本研究では、この理論検討の結果に基づき、実際に装置を構築して、圧力駆動型蒸留装置の消費エネルギーの測定を進めている。本研究で製作した装置は大学の実験室で使用することを前提にした設計となっており、熱源として電気エネルギーを使用する。実際に実験で消費される電気エネルギーは、分離のために使われるエネルギーと放熱によって失われるエネルギーの和に等しい。研究対象とする装置は分離のための消費エネルギーが小さい装置であり、その消費エネルギーを評価するためには、放熱のエネルギーをできるだけ小さく抑える必要がある。そこで、装置構成の変更や断熱対策を施すことによる放熱量の変化を検証することとした。本装置は、蒸留装置本体のほか、装置のジャケットに流通させる温水を保持するための恒温槽、各種ポンプ類、それに制御部から構成されている。放熱が大きい箇所としては、恒温槽の水面、チューブそれにジャケット表面が考えられる。周囲との接触面積を低減させるように装置構成を工夫したり、断熱材を巻くなどの処置を行った。その上で、例として水-エタノール2成分系を取り上げて測定実験を行ったところ、分離のためのエネルギーの測定に成功し、本実験条件では0.02kWであることが示された。フィード流量などの条件が消費エネルギーに与える影響なども明らかとなった。本研究では、多段圧力駆動型蒸留システムが十分な分離性能および優れた省エネルギー性を有することを実験によって示すことを目的としている。まず、蒸気輸送をスムーズに行うことができ、安定した運転が可能となるように配慮しながら、装置設計を行った。その結果、研究室で以前に開発していた装置に比べて、内容積が大きくかつ蒸気輸送路もより太い配管を使用することとなった。この結果に基づき、1段の分離を担う装置を試作してその分離性能を評価した。分離対象として、水-メタノール混合物を取り上げた。装置の温度は80°Cの温水を装置のジャケットに循環させて制御した。フィードは恒温槽で予熱した後に装置に供給するように実験装置を構築した。実験当初は蒸気の抜出し操作によって、装置内部の圧力が大きく変動する現象が見られたが、蒸気抜出しの制御法を改良したところ、圧力変動を抑制することができた。原料溶液の供給量を580mL/minまで大きく変化させて実験を行ったが、流量によらず気相、液相ともにほぼ平衡組成となっていることが確認された。1段の分離を担う装置をさらに2個追加で製作し、3段の圧力駆動型蒸留システムを構築した。このシステムを使用して多段分離実験を行ったところ、3段の全てにおいて気相、液相ともにほぼ気液平衡に達していた。以上から、3段の蒸留装置としても十分な分離性能を示すことが分かった。現在は液の抜出しがソレノイドバルブを使ったオンオフ制御であるため、状態が変動しやすいなどの問題が存在しているが、これらを改良すればさらに多様な運転状態の実現が可能になると言える。当初の計画通り、平成29年度には1段の分離を担う装置を開発することに成功している。また、多段蒸留装置の開発も計画通り進行している。多段圧力駆動型蒸留装置の開発を進めて、より高度な分離が可能であることを実証することを目指す。またエネルギー消費量を正確に測定するため、装置からの熱ロスの抑制にも取組む。装置の試作を予想よりも安価に行うことができた。また、学会発表を行ったが、その学会では別の研究プロジェクトの発表も行ったので、旅費・参加費はその研究予算から支出した。以上のような事情から次年度使用額が発生することとなった。
植物細胞におけるリン酸輸送機構とリン酸ホメオスタシスの解析

各種無機イオンは、植物体内で極めて多様な役割を果たしているが、その機能を維持するために、体内濃度が巌密に維持されていると予想されている。我々は、無機リン酸イオンに注目し、大麦を用いて、リン酸の組織・細胞内分布、原形質膜・液胞膜のリン酸輸送能を測定してきた。大麦葉肉細胞では、細胞内に蓄積しているリン酸の大半は液胞内に存在し、細胞質中のリン酸濃度は、液胞のリン酸量を変動させることで一定に調節されていた。また、それぞれの膜輸送能がリン酸の細胞内状態に応じて変動することを見いだし、この輸送能の変化が細胞質濃度調節機構の主要因として働いているものと予想してきた。さらに、in vivo環境を明らかにする目的で、葉アポプラストのリン酸濃度を測定したところ、細胞外のリン酸濃度も一定に維持されていることを見いだした。こうして植物体においては細胞外アポプラスト、細胞質、液胞の三つのコンパートメントが、それぞれをしきる細胞膜、液胞膜の輸送活性の調節を通じて相互に関わりあっているものと考えられる様になってきた。本年度はこれまでの研究結果を基礎に、各コンパートメントのリン酸濃度が、成長に応じてどの様に変動しているかを詳細に検討し、植物体全体のリン酸ホメオスタシスにおいて、液胞が最も重要な役割を果たしていることを実証することができた。また、各コンパートメントのタンパク質組成を検討することでリン酸代謝と関連して変動するタンパク質分子の同定を行なった。現在アポプラストにおいて、リン酸栄養条件に応じて顕著に変動するタンパン質を複数個確認することができ、その同定を進めている。また、大麦葉組織から、cDNAライブラリーを作製することにも成功した。リン酸栄養条件に応じて変動するタンパク質分子の遺伝子同定を進めることで、大麦葉肉細胞のリン酸イオン濃度認識機構を分子レベルで明らかにする実験系の開発が可能になりつつある。