hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい整流回路方式を用いた低電圧スイッチング電源の高周波・小形化に関する研究

提案した新しい整流回路はスイッチ、コンデンサ、ダイオードで構成されており、前期スイッチを整流電流の極性に同期してスイッチングし、前記コンデンサとスイッチング電源のトランスの漏れインダクタンスによる共振現象を利用して整流を行い、スイッチング時間を短縮するものである。本研究では整流回路の基本特性の解析を行った。整流回路内部のコンデンサ容量、トランスの漏れインダクタンス、整流回路内のスイッチQ1、Q2の駆動タイミングをパラメータとして変化させた場合の、これらのパラメータと整流電流のスイッチング時間との関係を調べた。その結果、次のようなことが明らかになった。1.整流電流のスイッチング時間は共振整流器の順電流(スイッチング電源の負荷電流と同じ)によって変化し、順電流の増加と共に整流電流のスイッチング時間も長くなる。2.スイッチング電源の負荷電圧と整流電流のスイッチング時間とはあまり相関がなく、負荷電圧が5V以下では従来のダイオード1個を用いた整流と比較してスイッチング時間が短縮できる。3.整流回路内部のコンデンサには整流電流の転流終了後にピーク電圧が発生し、共振整流器の順電流とスイッチング電源の負荷電圧の増加と共にこのピーク電圧も増加する。4.コンデンサの容量とトランスの漏れインダクタンスの減少と共にスイッチング時間は減少するが、コンデンサピーク電圧は増加する。5.整流回路内のスイッチQ1、Q2のタイミングを変えることにより、磁気増幅器のようにスイッチング電源の負荷電圧の調整が可能となる。6.共振整流器内部のダイオードのスイッチング特性が理想的な場合には、スイッチング周波数は1MHz以上に上げられる。
酸素発生型光合成生物での鉄硫黄クラスター生合成と光化学系複合体構築に関する研究

われわれは、これまでの研究により、らん藻および植物葉緑体に存在するCnfU蛋白質が2Fe-2S型の鉄硫黄クラスターを保持し、そのクラスターを基質蛋白質であるアポ型のferredoxin分子へとin vitroにおいて効率よく転移することができる、すなわち鉄硫黄クラスター生合成過程において、Scaffold protein(足場蛋白質)として中心的な役割を果たすことを示してきた。さらに、われわれが既に実験に着手しているIscA蛋白質も、やはりScaffold proteinのひとつと考えられており鉄硫黄クラスターを一過的にアセンブリーすることができることが分かっている。本研究では、これらの蛋白質の生化学的・物理化学的特性や作用機構、立体構造の解明を目指すと同時に、らん藻や植物葉緑体の光化学系複合体の構築において鉄・硫黄クラスター生合成系がいかに関与しているのか、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。常温性らん藻SynechocystisPCC6803のゲノム情報に加えて、好熱性らん藻のゲノム配列も明らかになっている。また、植物においてもシロイヌナズナの全ゲノム情報が明らかになっている。これらの情報をもとに、酸素発生型光合成を営む細胞中での鉄硫黄クラスター生合成のキーとなるScaffold蛋白質の大量発現系を構築、構造解析に適した発現および精製条件の検討を進め、以下の成果を得た。(1)らん藻CnfUおよびIscAに関しては、その立体構造の解明がScaffold proteinとしての反応メカニズムに直接的に結びつくと考え、好熱性らん藻由来の蛋白質の発現系を構築し、精製をおこなった。精製IscA蛋白質は足場上に[2Fe-2S]型クラスターを比較的安定に保持していた。そこでこの標品を結晶化し、2.6Å分解能での結晶構造を決定することに成功した。(2)また、葉緑体に存在するCnfUに関しては、その葉緑体内での存在様式に加えて、この蛋白質を欠損するシロイヌナズナ変異体が著しい生育阻害を示し、実際にその葉緑体中で光合成電子伝達に必須なフェレドキシン([2Fe-2S]クラスターを持つ)および光化学系I([4Fe-4S]クラスターを持つ)の生合成に欠陥があることを示した。また、そのリコンビナント蛋白質を用いて、[2Fe-2S]クラスターをホモダイマー間に結合し、クラスター転移能を有する事を示した。加えて結晶化をおこない、アポ型の1.6Åの分解能の結晶構造、および配位した鉄硫黄クラスターの構造情報を得ることに成功した。生物界に広く分布する鉄硫黄蛋白質はポリペプチド鎖に無機の鉄と硫黄が特徴的な配位構造-鉄横クラスターと呼ばれる-を形成して組み込まれている蛋白質の総称で、細胞内で様々な代謝活動に関与している。その代表的な役割としては、呼吸鎖や光化学系の電子伝達鎖における電子伝達のキーコンポーネントとしてのものである。

また鉄硫黄蛋白質は電子伝達だけでなく、さまざまな酵素反応に直接関与したり、あるいは、細胞内の酸化還元状態をモニターする遺伝子発現の制御因子としても働く場合もある。われわれはこれまでに、らん藻および植物葉緑体に存在するNifU蛋白質が2Fe-2S型の鉄硫黄クラスターを保持し、そのクラスターを基質蛋白質であるアポ型のferredoxin分子へとin vitroにおいて効率よく転移することができる、すなわち鉄硫黄クラスター生合成過程において、Scaffold protein(足場蛋白質)として中心的な役割を果たすことを示してきた。さらに、われわれが既に実験に着手しているIscA蛋白質も、やはりScaffold proteinのひとつと考えられており鉄硫黄クラスターを一過的にアセンブリーすることができることが分かっている。本研究では、これらの蛋白質の生化学的・物理化学的特性や作用機構、立体構造の解明を目指すと同時に、らん藻や植物葉緑体の光化学系複合体の構築において鉄-硫黄クラスター生合成系がいかに関与しているのか、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。本年度これまでの研究から、らん藻IscA蛋白質、および植物葉緑体局在型のCnfU蛋白質について、結晶の作製に成功し、X線結晶構造解析により立体構造のモデルを組み立てることができた。今後さらに、立体構造情報に基づいた構造機能連関の解析を進めて行く予定である。われわれはシアノバクテリア由来のCnfUおよび2種のIscA蛋白質に関して、大腸菌における大量発現系から得られた、これらの精製蛋白質および、鉄-硫黄クラスターを受け取る側のアポ型の基質蛋白質を用いたin vitroにおける鉄-硫黄クラスター転移・再構成実験系を用いて、クラスター形成反応素過程の詳細な解析を進めた。特に、反応活性中心と思われるシスティンや保存性の高いアミノ酸残基に部位特異的変異を導入し、中間クラスター形成に影響を与えるもの、クラスターの保持に影響を与えるもの、クラスターの転移に影響を与えるもの、蛋白質相互作用に影響を与えるもの、等について詳細な解析を進めた。さらに、われわれは、らん藻のCnffU,IscAに相当するホモログ蛋白質が植物葉緑体に局在していることを明らかにした。また、単離葉緑体ストロマ画分にアポ型基質蛋白質に鉄-硫黄クラスターを挿入しホロ型鉄-硫黄蛋白質を形成させるような活性が存在することを証明しているが、この鉄-硫黄クラスター挿入活性が、葉緑体に存在するCnfU,IscA蛋白質のホモログとどう関連しているのかを明らかにする第一段階として、これらの蛋白質をコードする遺伝子について、シロイヌナズナのノックアウト植物体ラインの確立に成功した。特に葉緑体CnfUホモログのノックアウト植物では著しい矮小化が起こること、pale-greenの形質を示し、光化学系の構築にデフェクトが生じていることがわかっている。そこで、これらのデフェクトが、CnfUの機能のどのような働きと直接結びついているのか明らかにするために、変異体から調製した葉緑体を生化学的に詳細に解析した。一方、葉緑体IscA蛋白質のホモログのノックアウトでは、顕著な形質が現れないことが分かった。しかし、先のCnfUホモログのノックアウト株で、IscA蛋白質の存在量に著しい減少が観察され、IscAの機能維持にもCnfUが必要であることが示唆された。
卵巣明細胞癌に対するNEFHを標的とした新規治療法の開発

上皮性卵巣癌におけるNEFH遺伝子の変異やNEFH/Akt/B-catenin経路関連蛋白発現を検索しこれらの変化を組織型別に検討するとともに、NEFHのバイオマーカーとしての可能性を模索する。NEFHの明細胞癌細胞における細胞増殖に与える影響を検討するとともに、抗がん剤感受性の変化を検索する。また、明細胞癌に対するNEFH導入による治療や、抗がん剤との併用療法の可能性を検討する。さらに、NEFH導入による抗がん剤耐性克服機序を解明し、新規治療法の開発を目指す。
機能記述を導入した設計過程の論理的モデルに関する研究

本研究では設計における機能を挙動と状態によって定義し、設計過程におけるこの機能の変化を記述することで設計過程を記述する方法を提案するとともに、プロトコル解析によってその記述法の妥当性を検討した。まず機能を記述する枠組みとしてはFBSモデルを用いる。このモデルにおいては、まずある視点を設定することにより、ものの状態を記述する。この状態の時間的変化の特徴的な部分を抽出したものを挙動として記述する。さらにこの挙動を有用性という観点からとらえ直したものが機能である。状態と挙動はある視点を定めると決定可能という意味で客観的である反面視点依存であるが、機能は有用性と問題が関わるため主観的な要因を含むが視点は依存しない。また、機能自体は機能本体と機能修飾子などからなる。機能は設計過程において、状態、挙動と連動して順次詳細化される。その方法は以下の4つがある。「機能分解」では機能そのものが別の細かい機能の組合せで置き換えられる。「条件機能の同定」では挙動レベルのシミュレーションを行なうことで、必須の挙動を発見して、その挙動に対応する機能を加える。「補強機能の同定」では状態や挙動で表現された設計対象を機能のレベルで評価することで、機能的な加不足を発見して、それを補う機能を追加する。「機能修飾子の分解」では、機能修飾子を分解して、機能分解された機能に配分する。次にこのモデルを設計を模擬的に行なった設計過程に適用した。設計題材は自転車の荷台の設計で、3人の技術者が約2時間かけておこなったものをプロトコル解析をした。結果として42個の機能モデル、73個のFBSモデルを得ることができた。
植物における翻訳アレストにより誘導されるmRNA 分解機構

植物では、mRNA上でリボソームが停滞した場合にmRNA品質管理機構によるmRNA分解が誘導されるかどうかは不明であった。本研究では、上流ORFにコードされるペプチドによってリボソームの停滞が引き起こされると考えられる3つの遺伝子を用いて解析を行い、3つのうち2つのuORFでペプチド配列依存的な翻訳抑制と共役してnonsense-mediated mRNA decay NMDによるmRNA分解が起こることを示した。以前の解析により、シロイヌナズナのポリアミン生合成鍵酵素であるS-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素をコードするSAMDC1遺伝子において、ポリアミンに応答してuORFの終止コドンでリボソームが停滞し、それと共役してmRNA分解が促進されることを見出した。今年度は、この翻訳アレストと共役したmRNA分解機構を明らかにするために、Nonsense-mediated mRNA decay(NMD)経路が関与する可能性を検討した。その結果、シロイヌナズナのNMD因子の欠損変異株では、野生型株でみられたようなポリアミンに応答したSAMDC1 mRNA分解の強い促進は観察されなかった。このことから、SAMDC1遺伝子のuORFの翻訳終結段階において翻訳アレストが起きた場合に、NMD経路によるmRNA分解が促進されることが示唆された。次に、翻訳伸長段階における翻訳アレストとmRNA分解の共役について解析する目的で、uORFによる翻訳抑制を受ける遺伝子の中から、uORFにコードされるペプチドによって翻訳伸長アレストが起こる遺伝子を探索した。シロイヌナズナの培養細胞から調整したプロトプラストを用いた一過的発現解析の結果、NAC082遺伝子のuORFをレポーター遺伝子のORFと融合した場合に、翻訳伸長アレストが起こることが示唆された。今後、この系を用いて、翻訳伸長アレストとmRNA分解の共役について解析する予定である。植物において翻訳アレストとmRNA分解の共役の普遍的性について検討する目的で、新生ペプチドによって翻訳アレストが引き起こされる可能性が考えられるuORFの系を用いて解析を行った。前年度に新たに同定したペプチド配列依存的に翻訳抑制を起こす2つのuORFについて、試験管内翻訳系において翻訳アレストが起こるかの検討を行ったが、通常の翻訳条件では翻訳アレストは観察されなかった。細胞内に存在する何らかの代謝産物が翻訳アレストを誘導するために必要である可能性も考えられるため、今後、どのような条件で翻訳抑制が誘導されるかについての詳細な検討を行う。また、それらのuORFにおいて翻訳抑制と共役したmRNA分解の促進が見られるかを検討するために、各遺伝子の翻訳抑制に必要な野生型配列と翻訳抑制が起こらない変異型配列をそれぞれ導入した形質転換植物を作出した。次年度に、これらの植物を用いて、このuORFによる翻訳抑制と共役してmRNA分解が誘導されるかを検討する予定である。今年度に新たに同定したペプチド配列依存的に翻訳抑制を起こすuORFの中に、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド処理によってmRNA蓄積量が増加するものを見いだした。このuORFでは、翻訳と共役してmRNA分解が起こる可能性が考えられる。このuORFについて、アミノ酸置換解析を行うことによって、uORFにコードされるペプチド中の翻訳抑制に重要な領域を同定した。植物における翻訳アレストとmRNA分解の共役の普遍的性について検討する目的で、新生ペプチドによって翻訳アレストが引き起こされる可能性が考えられるuORFの系を用いて解析を行った。そのために、これまでにペプチド配列依存的に遺伝子発現抑制を起こすことを見いだした2つのuORFについて、野生型uORF配列と機能欠損変異型uORF配列の下流にそれぞれレポーター遺伝子をつなぎ、それらを導入した形質転換シロイヌナズナを作出した。これらの植物を用いてレポーター遺伝子のmRNA量とレポーター活性を解析した結果から、いずれのuORFも通常条件で栽培した植物体内においてペプチド配列依存的に翻訳抑制を引き起こすことが示唆された。これまでの解析により、シロイヌナズナのSAMDCl遺伝子において、uORFペプチドによる翻訳抑制と共役してNonsense-mediated mRNA decay(NMD)経路によるmRNA分解が誘導されることを見出した。そこで、上述の2つのuORFについても、uORFペプチドによる翻訳抑制と共役してNMD経路によるmRNA分解が誘導されるか否かを検討するために、各uORFをつないだレポーター遺伝子をNMD因子の欠損変異株に導入した。その結果、2つのuORFのうちの1つでは、uORFペプチド配列依存的なレポーター遺伝子の発現抑制が、NMD因子の欠損変異によって緩和された。この結果から、uORFの種類によって、uORFペプチド配列依存的な翻訳抑制と共役してNMD経路によるmRNA分解が誘導される場合とされない場合があることが示唆された。
炎症性サイトカインが骨治癒に与える影響

実験用マウスの大腿骨を人為的に骨折させた.0,1,2,7日のマウス骨折大腿骨を取り出し骨髄細胞を採取した.骨髄細胞よりRNAを抽出し遺伝子発現を確認した.骨折早期ではTNFα,IL-6,IL-1βといった炎症性サイトカインの発現がみられた.中でもIL-6の発現が最も強いことが確認できた.また,中期に移行すると炎症性サイトカインによって誘導される破骨細胞誘導因子の一つである,RANKLや骨形成マーカーであるALP,osterixの発現も確認することができた.今後は炎症性サイトカインの発現の増強,減弱を起こし,骨治癒に最も影響する因子を同定し骨治癒と炎症性サイトカインのメカニズムの解明を試みる.従来,炎症性サイトカインの存在下では,破骨細胞の分化・機能亢進が起こり,骨再生は抑制され,骨吸収が促進されるという考えが主流であった.しかし最近では炎症性サイトカインの存在下では骨再生が促進されるといった報告も見受けられている.そこでわれわれは,従来の炎症と骨再生の矛盾点に着目した.つまり,創傷治癒早期では,骨芽細胞分化を促進し,後期慢性期では破骨細胞の分化・機能促進を促す,もしくはその逆の現象を起こすような,炎症性サイトカインの作用が変化する時期があると想定した.まずはじめにc57BL/6の8週齢マウスに対し,人為的に大腿骨の骨折を起こし,炎症性サイトカイン,各種骨形成,骨吸収マーカーの経時的変化をPCR法にて確認した(術後17日目).すると主要な炎症性サイトカインTNFα,IL-6,IL-1βのうち,術後1日目にIL-1が最も発現が強まった.また2日目以降は3種とも発現は経時的に減少し,1日目が炎症のピークであることを確認した.次に破骨細胞分化マーカーであるRANKLの発現を確認した.術後7日目より発現が確認できた.骨形成マーカーであるALP,Osterixは術後1日目より経時的に発現が増加していき7日目にピークをむかえた.上記の結果を踏まえ,マーカーの発現ピークが術後7日目以後にある可能性があること,最も発現の強かったIL-6を調節することで各種マーカーの発現がどのように変化するかを今後の課題としたい.実験用マウスの大腿骨を人為的に骨折させた.0,1,2,7日のマウス骨折大腿骨を取り出し骨髄細胞を採取した.骨髄細胞よりRNAを抽出し遺伝子発現を確認した.骨折早期ではTNFα,IL-6,IL-1βといった炎症性サイトカインの発現がみられた.中でもIL-6の発現が最も強いことが確認できた.また,中期に移行すると炎症性サイトカインによって誘導される破骨細胞誘導因子の一つである,RANKLや骨形成マーカーであるALP,osterixの発現も確認することができた.今後は炎症性サイトカインの発現の増強,減弱を起こし,骨治癒に最も影響する因子を同定し骨治癒と炎症性サイトカインのメカニズムの解明を試みる.研究目的:創傷の治癒過程において,炎症反応が生じることは周知である.臨床においては,術後の過剰な炎症反応が様々な有害事象を起こすが,過剰な抑制は創傷治癒を遅延をさせることが知られている.近年,骨のリモデリングと炎症との関わりがOsteoimmunologyとして注目されている.IL-1,IL-6,TNFα,PGE2などの炎症性メディエーターは,骨再生と骨吸収の両面に関与しているといわれているが,その詳細は不明である.本研究は,骨の治癒過程における炎症性サイトカインの役割を明らかにし,骨再生に臨床応用することを目的とする.研究実施計画(概要):実験用マウスに人為的に骨折を起こし,骨折部位の仮骨および隣接組織より組織採取を行う.試料は骨折時期よりタイムコースを取り各治癒過程におけるものとする.各試料の炎症性サイトカインと骨分化マーカーのタンパク・遺伝子レベルの発現を検討する.骨治癒過程における形態的・免疫組織学的検討を併せて行い,炎症性サイトカインの骨吸収および再生への移行時期を同定する.その後再度マウス人為的骨折を起こし,適切な時期に抗炎症剤の投与や特異的阻害剤を使用し,骨治癒への影響をタンパク・遺伝子レベル・放射線学的・形態学的・免疫組織学的に多方面より検討し,より低侵襲,低コストかつ確実性のある骨再生治療への応用を目指す.研究の成果:今年度は予備実験として,実験用マウスに人為的骨折を起こし,試料採取手技の確立とPCR用のプライマーを作製した.当初の予定より遅れが生じたが,実験手技は安定し,使用予定プライマーにも反応することを確認できた.今後は骨折時期をずらし,各時期における各種マーカーの発現や組織学的変化を確認する予定である.当初はウエスタンブロット法にて蛋白発現を確認していく予定であったが,当研究室の器具の故障により予定をPCR法に変更した.そのためPCR用の機材やプライマーの作製を行うこととなり計画が遅れた.またマウスの骨折手技,試料採取の安定に計画以上の時間を要したことが主な理由である.今後はmRNAの発現を中心に各種マーカーの発現を確認していく予定である.

現在はQ-PCR法を中心に検討しているが,mRNA発現の強弱の評価が難しい.そのためRT-PCR法の導入を考慮している.RT-PCR法を導入することでより実験結果の客観的な評価と時間短縮が見込まれるため,研究の推進に寄与すると思われる.また可能であれば蛋白発現も併せて確認をしていく予定である.結果が安定しないようであれば目的分子の見直しや,その数の変更を考慮していくことも視野に入れている.主に実験機材や試薬,動物などの購入と研究補助員の採用に研究費を使用する予定である.具体的にはRT-PCR法導入のため,新たな試薬の購入.またウエスタンブロット法導入のため,各種抗体の購入.また研究推進のための研究補助員の雇用を検討している.
高純度間葉系幹細胞由来ミトコンドリアの移入によるミトコンドリア病の治療開発

ミトコンドリア病は、核DNA上の遺伝子変異あるいはミトコンドリアDNAの異常により、エネルギー産生だけでなく活性酸素の発生、アポトーシス、カルシウムイオンの貯蔵、感染の防御などのさまざまなミトコンドリア機能が障害されることで発症する。臨床症状は非常に多岐にわたり、頭痛や糖尿病、難聴などの単一の臓器症状から、脳卒中様症状、心筋症、腎不全などの多臓器の症状を合併するものまである。治療に関して、有効な治療法が確立しておらず、重症例は致死的な経過をとる。間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell, MSC)は、骨髄や脂肪、臍帯などに存在する細胞で、骨・軟骨・脂肪の再生だけでなく、抗炎症作用および組織修復作用を有している。MSCは通常の培養方法で増殖しやすいこと、また、多くの機能を有していることから、MSCを用いた臨床応用が数多くの疾患を対象に進んでおり、造血幹細胞移植後の治療抵抗性GVHDに対する治療薬は保険収載されている。その効果は疾患によって様々であるが、安全性は担保されている。MSCが脳梗塞や急性肺疾患などの障害された部位に遊走して、局所の炎症を抑えるだけでなくMSC内のミトコンドリアが障害された細胞に移入して細胞機能を回復させることが報告されている。その機序として、MSCがミトコンドリアを含む細胞外小胞を分泌して、障害された細胞がその小胞を取り込むこと、MSCがnanotubeを障害された細胞に伸ばし、その中を通ってミトコンドリアが移動することが考えられている。その結果、エネルギー産生能の回復だけでなく、アポトーシスの低下、活性酸素の減少などの多くのミトコンドリア機能が改善することが明らかとなっている。したがって、「ミトコンドリア機能全体を回復する治療開発」という命題を、MSCからのミトコンドリア移入は有効かつ安全な治療法となりうるかを検討する。ミトコンドリアをラベルした高純度間葉系幹細胞をミトコンドリア病患者由来細胞と共培養して、ミトコンドリアが移入することを証明できた。次に、正常なミトコンドリアが移入したミトコンドリア病患者由来細胞の機能が改善することを明らかにするために、機能解析を行なった。生存率、アポトーシスに、活性酸素、β酸化能、ATP産生能、呼吸鎖機能、ミトコンドリア膜電位を見るために、それぞれの実験系を確立することができた。さらに、ミトコンドリア病患者由来iPS細胞から神経や心筋に分化させることに成功して、高純度間葉系幹細胞由来のミトコンドリアの移入を確認した。1.高純度ミトコンドリア病の細胞の機能解析を行う。2.ミトコンドリアが移入する機序として、細胞間接着、微小管、細胞外小胞が考えられる。細胞間接着の必要性を明らかにするためにトランスウェルアッセイ(ボイデンチャンバー)を行う。微小管の形成は免疫蛍光染色(チュブリンなど)で評価し、Mito-redラベルしたミトコンドリアが微小管内を移動することを証明する。また、微小管形成を阻害する薬剤(コルヒチンなど)を用いて微小管がミトコンドリアの移入に必要かを明らかにする。細胞外小胞に関して、高純度間葉系幹細胞が通過しないが細胞外小胞は通過するボイデンチャンバーを用いてミトコンドリアが移入することを証明する。また、CD38shRNAなどを用いて細胞外小胞の分泌を阻害させることによって、細胞外小胞がミトコンドリアの移入に重要な役割を果たしているかを明らかにする。

次に、正常なミトコンドリアが移入したミトコンドリア病患者由来細胞の機能が改善することを明らかにするために、機能解析を行なった。生存率、アポトーシスに、活性酸素、β酸化能、ATP産生能、呼吸鎖機能、ミトコンドリア膜電位を見るために、それぞれの実験系を確立することができた。さらに、ミトコンドリア病患者由来iPS細胞から神経や心筋に分化させることに成功して、高純度間葉系幹細胞由来のミトコンドリアの移入を確認した。1.高純度ミトコンドリア病の細胞の機能解析を行う。2.ミトコンドリアが移入する機序として、細胞間接着、微小管、細胞外小胞が考えられる。細胞間接着の必要性を明らかにするためにトランスウェルアッセイ(ボイデンチャンバー)を行う。微小管の形成は免疫蛍光染色(チュブリンなど)で評価し、Mito-redラベルしたミトコンドリアが微小管内を移動することを証明する。また、微小管形成を阻害する薬剤(コルヒチンなど)を用いて微小管がミトコンドリアの移入に必要かを明らかにする。細胞外小胞に関して、高純度間葉系幹細胞が通過しないが細胞外小胞は通過するボイデンチャンバーを用いてミトコンドリアが移入することを証明する。また、CD38shRNAなどを用いて細胞外小胞の分泌を阻害させることによって、細胞外小胞がミトコンドリアの移入に重要な役割を果たしているかを明らかにする。1.予定した消耗品の費用負担が少なくて済んだこと2.実験補助を行う人件費がかからなかったこと
作物におけるストレス回避の遺伝学

イネ・オオムギ・牧草などの作物を用い、細胞・個体・集団のレベルで各種の環境ストレスに対する耐性獲得の方策に関する基礎的研究を行うことをめざした。1.Aグループ:ストレス耐性の遺伝変異とその機構土壌環境のストレスに対する反応として根の行動の遺伝的変異や遺伝子支配が研究され、また耐旱性と特定遺伝子との関係も指摘された。低温ストレスに対しては、イネを用いて抵抗性遺伝子の解析が進み、抵抗性の生理的機構も研究された。オオムギの赤かび病抵抗性についてはその量的遺伝がとり上げられた。環境汚染によるストレスとしては、鉱山近くの重金属汚染土が植生に及ぼす影響および大気汚染物質に対するイネ感受性の品種間差が明らかになった。細胞選技によって耐塩性個体が効率的に得られることもわかった。また細胞選技によって得られた薬剤耐性個体の交雑実験を通してその耐性の特異的な遺伝行動が見出された。2.Bグループ:作物の多様性によるストレス回避草地における多様性が半野性的植物集団にとって重要な適応的な特性であること、イネで見出された集団内遺伝変異も変動環境に対する緩衝作用としての意義があることなどが示唆された。イネとイモチ病菌の集団生物学的研究により、両者の"共進化"的関係が指摘された。3.団体レベルでの耐性をとり上げたAグループと集団レベルでの耐性をとりあげたBグループの立場を総合するためには、耐性個体の適応度(農業的特性)についてさらに解析する必要があると思われる。1.ストレス耐性の遺伝的・生理的基礎(1)遺伝的変異の探索--多数品種の調査から、オオムギの発芽前浸水耐性品種(武田)、イネの【SO_2】耐性系統(佐藤・藤沼)、根の発育に関する突然変異(蓬原)などが見出だされた。(2)遺伝子分析--遺伝実験の結果、イネの耐冷性(前川)とオオムギの高温感受性には主仂遺伝子が見出され、イネの耐旱性(平岡)では複数の因子が関与していることが示唆された。(3)生理的機作--イネ耐冷生の変異が花粉の発育生理によって説明された(佐竹)。またイネの芒の生理的役割がストレス耐性の観点から検討された(高橋)。(4)培養細胞系--カルスを用いて遺伝変異の誘発・耐塩性細胞の選抜・植物体復元が試みられ(大野)、また薬剤耐性因子が見出されている(菊池)。2.集団の遺伝的多様性とストレス耐性(1)牧草の集団内変異(島本)および混播による種多様性(福岡)が各種の環境下でどんな役割を果すかを検討した。(2)在来イネ品種の集団内変異を水陸稲との関係で調査した(森島)。(3)イネいもち病原菌の病原性遺伝子の消長に関するシミュレーション、および病原性遺伝子の安定化選択の存在を各県のデータから解析した(清沢)。3.各分担者の研究はほぼ計画通りに進んでいるが、細胞・個体・集団レベルの研究が有機的に結びつけられるような討論を工夫する必要がある。2グループのそれぞれにおいて得られた主な結果は次の通りである.1.ストレス耐性の遺伝変異とその機構(1)イネの障害型冷害耐性は穂ばらみ期の時期別に異なる要因が介在しているらしいこと,またSilewah由来の耐冷性遺伝子の行動が明らかになった.(2)オオムギにおける耐塩性の品種間変異を調査し,極強品種を検索した.(3)イネにおけるSO_2感受性の遺伝子のトリソミックス分析を進めると共に,受精卵処理による突然変異体からSO_2感受性個体を選抜した.(4)イネの登熟に低温ストレスが与える影響を調べ,生理機能の適応を考察した.(5)イネで見出された5ーメチルトリプトファン抵抗性系統における特異な抵抗性の遺伝行動を培洋系を用いて解析した.

(6)陸稲に多い無毛性遺伝子(gl)が畑地適応性に関係しているかどうかを,同貭遺伝子系統を用いて調査したが,否定的な結果が得られた.2.多様性によるストレス回避(2)チモシーにおいて種子の大きさが幼植物定着に関与するが,そのパタンは品種によって異なった.(3)雲南の山地稲の集団内変異を調査したところ,水田よりも畑地で多称性がよく保存されていることがわかった.前年度同様、2班に分れ、A班はストレス耐性の変異調査とメカニズム解析を、B班は生体遺伝学的立場からストレス回避の基礎的研究を行った。最終年度であるので、各自実験を続行すると共に統計的解析や総合的とりまとめを行った。A班では土壌環境のストレスを対象として根の行動の遺伝学的研究に進展があり、また乾燥(土壌の)抵抗性と特定の主働遺伝子との関係が示唆された。低温ストレスに対しては、低温耐性のイネ品種の遺伝子解析が進み、また品種比較試験や形質相関の研究からイネ耐冷性の強弱に関わると思われる4つの発育段階が指摘された。環境汚染物質としては大気中のNOxがとりあげられ品種間にみられる感受性の変異が明らかなった。生物的環境ストレスとしてはオオムギの赤かび病がとり上げられ、その抵抗性の遺伝解析が行われて量的遺伝子支配が明らかになった。培養細胞系を用いた研究では、耐塩性などを含む変異の誘発が効果的に行われ、また細胞レベルで選抜された薬剤耐性突然変異の個体レベルにおける遺伝実験が進み、その耐性が特異的な遺伝行動をすることが確められた。B班では、牧草を用いた研究が2つ行われ、草種の混合による多様性や種子の大小による変異性が草地の適応性にいかに貢献するかが示唆された。またイネでも在来品種には多量の遺伝変異が含まれており、それが環境ストレスに対して緩衝作用をもたらしていることが推論された。イモチ病菌のレースの変動と栽培されるイネ品種の動向との関係が統計的に解析され、ある種の安定化選択が働いていることが示された。
キャビティ内のマイクロ波加熱における加熱特性の高効率化と温度均一化手法の開発

本研究では,キャビティ内のTEモードおよびハイブリッドモードのマイクロ波による物体加熱の高効率化および最適化手法の開発を目的として,(1)キャビティ内における電磁場解析と熱解析を組み合わせた数値シミュレーション法を開発した.(2)加熱物体内における電磁波干渉および反射波制御による加熱特性の高効率化法を明らかにした.(3)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化法を明らかにした.(4)誘電特性が急激に変化する乾燥過程の最適化手法を明らかにした.本研究では,多重反射を含むキャビティ内のマイクロ波加熱に対し,(A)加熱物体内における電磁波干渉および反射波抑制による加熱特性の高効率化,(B)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化,(C)誘電特性が急激に変化する相変化過程の最適化,を研究対象として,(1)被加熱物体内における電磁波干渉の制御,(2)被加熱物体の表面および内部構造による反射波の制御,(3)高加熱物体の熱拡散を利用した熱的制御,に基づくマイクロ波加熱の高効率化および被加熱試料の温度均一化の最適化手法を提案することを目的としている.平成25年度は,研究項目(B)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化を理論的に検討した.具体的には,加熱物体内の温度均一化に対して,(1)位相制御用補助物体および反射板の設置による電磁波モードおよび電磁場干渉を制御する手法,(2)加熱補助物体から加熱物体への熱伝導効果を利用した熱的制御法を検討した.以下に検討事項を示す.1.位相制御補助物体および反射板を設置した場合の電磁波モードの変化や電磁波干渉状態を,誘電物性,補助物体の厚さおよび設置位置と関連づけて検討し,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に明らかにした.また,電磁波の干渉制御による温度均一化手法を検討した.2.加熱補助として高加熱物体を付加した場合のマイクロ波加熱における熱伝導の効果を,補助物体の厚さおよび設置位置と関連づけて検討し,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に明らかにした.また,加熱補助物体からの熱拡散を利用した温度均一化の手法を検討した.3.透過波と反射波の制御に加えて熱伝導効果を複合的に捉え,最大加熱量および温度均一化に対する補助物体の誘電物性,厚さおよび設置位置の影響を三次元TEモードのもとで理論的に検討した.本研究では,キャビティ内のTEモードおよびハイブリッドモードのマイクロ波による物体加熱の高効率化および最適化手法の開発を目的として,(1)キャビティ内における電磁場解析と熱解析を組み合わせた数値シミュレーション法を開発した.(2)加熱物体内における電磁波干渉および反射波制御による加熱特性の高効率化法を明らかにした.(3)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化法を明らかにした.(4)誘電特性が急激に変化する乾燥過程の最適化手法を明らかにした.本研究では,多重反射を含むキャビティ内のマイクロ波加熱に対し,(A)加熱物体内における電磁波干渉および反射波抑制による加熱特性の高効率化,(B)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化,(C)誘電特性が急激に変化する相変化過程の最適化,を研究対象として,(1)被加熱物体内における電磁波干渉の制御,(2)被加熱物体の表面および内部構造による反射波の制御,(3)高加熱物体の熱拡散を利用した熱的制御,に基づくマイクロ波加熱の高効率化および被加熱試料の温度均一化の最適化手法を提案することを目的とする.平成24年度は研究項目(A)加熱物体内における電磁波干渉および反射波抑制による加熱特性の高効率化を理論的に検討した.具体的には,反射波の抑制に対して有効な表面および内部構造を解明するため,(1)被加熱物体の前面および内部に反射波制御用補助物体を設置し,物体表面における反射波の位相を制御する方法,(2)反射波制御用補助物体による反射波の抑制法を検討した.以下に検討事項を示す.1.キャビティ内のマイクロ波加熱に対する三次元電磁場と熱の複合解析の取り扱いを確立するとともに,物体の誘電物性および設置位置とモード変化を解析的に明らかにした.2.物体前面および内部に補助物体を設置して透過波の位相を制御した場合の透過波と反射波の干渉実験を行い,共振現象に及ぼす誘電物性および補助物体の影響を示すとともに,物体内の温度分布をマイクロ波出力と関連づけて実験的に明らかにした.3.補助物体を設置して透過波の位相を制御した場合の透過波と反射波の干渉状態,および,キャビティ内のマイクロ波加熱に及ぼす誘電物性,補助物体の厚さおよび設置位置と関連づけて解析的に明らかにし,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に明らかにした.本研究では,多重反射を含むキャビティ内のマイクロ波加熱に対し,(A)加熱物体内における電磁波干渉および反射波抑制による加熱特性の高効率化,(B)電磁波干渉制御および熱拡散効果を利用した熱的制御による加熱物体の温度均一化,(C)誘電特性が急激に変化する相変化過程の最適化,を研究対象として,(1)被加熱物体内における電磁波干渉の制御,(2)被加熱物体の表面および内部構造による反射波の制御,(3)高加熱物体の熱拡散を利用した熱的制御,に基づくマイクロ波加熱の高効率化および被加熱試料の温度均一化の最適化手法を提案することを目的としている.

平成26年度は,反射波制御用補助物体の表面形状変化による反射波の抑制法の検討に加えて,研究項目(C)誘電特性が急激に変化する相変化過程の最適化を検討した.具体的には,マイクロ波による木材の乾燥過程を対象に,マイクロ波加熱の有する内部加熱および選択的加熱の特性を利用して,誘電物性が急激に変化する場合の加熱特性の最適化を検討し,以下の成果を得た.1.補助物体を設置して透過波の位相を制御した場合の透過波と反射波の干渉状態,および,キャビティ内のマイクロ波加熱に及ぼす表面形状の影響を,誘電物性,補助物体の厚さ,設置位置および表面構造パラメーターと関連づけて解析的に明らかにし,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に明らかにした.2.外部流を含む粒子層内の非等温気・液二相流れと電磁場・熱解析を組み合わせた乾燥モデルを提案し,マイクロ波加熱の特長である選択的加熱と内部加熱の効果により,乾燥域の温度上昇を抑えた乾燥過程を明らかにするとともに,乾燥の進行にともなう層内の水分分布の変化により誘電特性が急激に変化するため,マイクロ波の透過波と反射波の干渉状態が複雑に局所的に変化し,乾燥速度および物体内の温度分布が周期性を有することを明らかにした.熱工学現在までの研究計画の達成度はやや遅れぎみである.研究計画で予定していた「反射波制御用補助物体の表面形状変化による反射波の抑制法」の検討について,平成25年度までに研究成果を得ることができなかった.これは表面構造の効果を検討する上で必要となる誘電物性や表面形状などのパラメーターが多く,すべての効果を検討するには至らなかった.現在,表面構造を用いた反射波抑制法について研究を成し遂げるべく,キャビティ内のマイクロ波加熱に及ぼす表面形状の影響を,誘電物性,補助物体の厚さ,設置位置および表面構造パラメーターと関連づけて解析的・実験的に明らかにするとともに,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に検討している.平成24年度の研究は概ね順調に進展している.しかし,研究計画で予定していた「反射波制御用補助物体の表面形状変化による反射波の抑制法」の検討については,年度内に研究成果を得ることができなかった.これは表面構造の効果を検討する上で必要となる誘電物性や表面形状などのパラメーターが多く,すべての効果を検討するには至らなかった.現在,表面構造を用いた反射波抑制法について研究を成し遂げるべく,キャビティ内のマイクロ波加熱に及ぼす表面形状の影響を,誘電物性,補助物体の厚さ,設置位置および表面構造パラメーターと関連づけて解析的・実験的に明らかにするとともに,同一強度のマイクロ波に対する最大加熱量を理論的に検討している.平成26年度は,反射波制御用補助物体の表面形状変化による反射波の抑制法の検討に加えて,研究項目(C)誘電特性が急激に変化する相変化過程の最適化を検討する.具体的には,マイクロ波による木材の乾燥過程や冷凍食品の融解過程を対象に,マイクロ波加熱の有する内部加熱および選択的加熱の特性を利用して,誘電物性が急激に変化する場合の加熱特性の最適化を検討する。以下に検討事項を示す.(C-
心筋の虚血耐性獲得の機序に関する研究

単離心室筋細胞による虚血再灌流障害のモデルを作成した。すなわち、気密性の高い容器で、無グルコースTyrode液を窒素ガスでbubblingし、無酸素溶液を調整し、倒立型顕微鏡のステージ上のチャンバー内に心筋細胞を入れ、表面灌流を行い、その表面に窒素ガスを通気することにより、大気からの酸素の逆拡散を防止した。こうして、無酸素溶液により無酸素灌流を15分間行ったのち、大気と平衡させたグルコースを含んだTyrode液を40分間灌流し、再酸素化した。ミトコンドリアのK_<ATP> channel openerとして、30μmM diazoxideを無酸素とする5分前から無酸素終了時まで灌流した。Rod cellを生存細胞の判定基準として、実験毎に無酸素灌流を開始する前の生存細胞数を100%とすると、実験終了時の再酸素化40分では、対照群22.0±13.3%、diazoxide(D)群59.3±10.6%(n=6,8 ; p<0.05)とD群で有意に生存率が高かった。BCECFにより測定した細胞内pHは、虚血前後とも2群間に有意差はなかった。観察対象とした初期rod cell、対照群84 cells、D群123 cellsについて、再酸素化40分のときの形態は、対照群では、round cell 62.3%、rigor contracture 10.7%D群では、round cell 20.3%、rigor contracture19.5%と対照群では死細胞は、多くがround cellであるのに対し、D群では、rigor contractureの比率が高かった。、ミトコンドリアのK_<ATP> cannel openerは、ラットの単離心筋細胞の無酸素・再酸素化障害を抑制したが、これは、Ca overloadを抑制し、round cellになりにくくする可能性が考えられた。虚血・再潅流時にin vivoで生じている変化をラットの単離心筋細胞レベルでsimulateする方法について検討した。ミトコンドリアのoxidative phosphorylationのuncouplerであるcarbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone(CCCP)を潅流液中に加えて、潅流したころ、一過性の細胞内pH(BCECFで測定)の上昇ののち徐々に低下し、正常Tyrode液に戻すことによりさらに細胞内acidosisが観察された。35分の潅流でほぼ全細胞がround cellとなった。通常の器具では、窒素ガスで置換するだけでは、潅流液の酸素分圧を十分に低下させることができなかったため、脱酸素剤であるsodium hydrosulfite(SH)を溶液に添加したところ、潅流液のPO_2は0mmHgとなった。この溶液で潅流したところ、細胞内pHは一過性に上昇したのち、徐々に低下し、再酸素化によりさらにacidosisとなったのち、はぼ元のレベルにまで戻った。SHで脱酸素化した溶液を大気中に2、3時間放置することにより、再酸素化した溶液(PO2 198mmHg)で潅流し細胞内pHを観察したが、有意な変化は見られず、SHそのものは細胞内pHに影響しないことが示された。また、Na,Ca交換機構の機能を虚血・再酸素化の間に検討できるよう、whole cell clamp法により、細胞内Ca低下時に内向き電流として記録する実験系を確立した。来年度は、SHを含んだ溶液で潅流し、preconditioningのmediatorと考えられるadenosine、phorbolester、cromakalimなどで前処置をした群と無処置の群に分けて細胞内pH、Na,Ca、Na,Ca交換機構の機能の経過を比較したい。

1214週齢の雄性Sprague-Dawleyラットの左室からcollagenase処理により、心筋細胞を単離した。倒立型顕微鏡のステージ上に設置したチャンバー内に細胞を入れ、大気と平衡させたHEPES bufferで表面灌流を行った。無酸素とするためには、密閉度の高い容器を用い、窒素ガスでbubblingした無グルコースHEPES bufferを大気との接触を避けるため、ステンレス管を用いて灌流し、チャンバーの表面にも窒素ガスを通気し、ガス交換を生じないようにした。無酸素灌流を15分間行ったのち、40分間再酸素化した。この間、細胞の形態観察とBCECFによる細胞内pHの測定を30秒毎に行った。ミトコンドリアのK_<ATP> channel openerとして、30μM diazoxideを無酸素とする5分前から無酸素終了時まで灌流した。Rod cellを生存細胞の判定基準とすると、細胞の生存率は、無酸素15分後では、diazoxide群74.4±11.4、対照群43.6±18.4%とdiazoxide群で高い傾向にあった。再酸素化40分後では、それぞれ59.3±10.6、22.0±13.4%と有意にdiazoxide群で生存率が高かった(p<0.05)。細胞内pHは、無酸素15分後では、6.77±0.04、6.76±0.02と2群間に有意差はなかった。ミトコンドリアのK_<ATP> channel openerは、無酸素中の細胞内pHには有意な変化を与えなかったが、単離心筋細胞の無酸素、再酸素化障害を抑制した。
γ/δ型T細胞による抗腫瘍防御機構の解析と治療への応用

熱ショック蛋白質(HSP)は細菌から高等生物までその構造の相同性が高く、自己反応性T細胞の中にはしばしば細菌由来のHSPと交差反応するものがあることが知られている。私どもはマイコバクテリア由来の65kdHSP反応性γ/δT細胞ならびα/βT細胞がマウスのリステリア感染症の初期防御および多臓器特異的自己免疫病の誘導に重要な役割を担っていることを見いだした。今回、さらに65kdHSP特異的T細胞のMethA腫瘍に対する免疫応答誘導における役割を検討した。BALB/c由来の65kdHSP特異的T細胞株をMethAとともに皮下に移植したところ、移植後7日目の局所リンパ節にMethA特異的CD8^+キラ-T細胞が検出され、MethAは14日目までに拒絶された。65kdHSP特異的T細胞株はCD4^+CD8^ーでa/b型T細胞レセプタ-を有しており、Hー2dクラス2分子に拘束された65kdHSP反応性を示し、ILー2、γIFNを産生した。実際、MethA担癌マウスの初期に65kdHSP反応性T細胞(g/d型およびα/β型)T細胞が検出されており、これら65kdHSP特異的T細胞が抗腫瘍防御機構として働いている可能性が考えられている。MethAに対する抗腫瘍防御機構はCD4^+CD8^ーヘルパ-T細胞とCD4^ーCD8^+キラ-T細胞による腫瘍免疫によっておもに担われていると考えられている。しかし、腫瘍特異的抗原の抗原性が弱いためにまたCD4^+CD8^ーT細胞がサプレ-サ-細胞として働くために、効果的にCD8^+キラ-T細胞が働き得ないとされる。本研究により、腫瘍特異抗原ではなく、HSPといった広く分布する抗原に反応するT細胞が腫瘍特異的キラ-T細胞を誘導するヘルパ-T細胞として働き得ることが示唆された。
分岐型ヘリックスペプチドから構成される分子集合体の形状制御とナノキャリアへの応用

申請者は分子集合体の構成要素としてα-ヘリックスを有する両親媒性ペプチドを用いることで、モルフォロジーの精密制御や生体材料としての応用を目指した研究を行っている。以下に2つのテーマの研究概要について述べる。1つ目のテーマは、相分離した分子集合体の一部をpH変化によって選択的に破壊することである。左巻きのヘリックスとpH応答部を有する右巻きのヘリックスとのステレオコンプレックス形成を利用することで、相分離膜を有する丸底フラスコ型の分子集合体の調製に成功した。また、相分離を利用することで、pH応答性分子を丸底フラスコ型のネックまたは丸底の部分に選択的に集め、形態を部分的に破壊することに成功した。2つ目のテーマは、膜の裏と表が非対称なベシクルを調製し、癌組織のイメージング用ナノキャリアとして応用することである。ヘリックスの特徴であるダイポール相互作用とステレオコンプレックス形成に加えて、親水鎖の本数に差を付けることによって、立体障害の大きな右巻きヘリックスが外側に配向した非対称ベシクルを調製することに成功した。また、機能性分子を修飾したヘリックスは、その螺旋方向に応じてベシクルの内側または外側に選択的に配向できることが示唆された。さらにイメージング実験を行うための近赤外蛍光分子(ICG)を導入したベシクルを担癌マウスに投与したところ、ICGが内側に配向したベシクルは癌組織への集積量が多くなり、抗体の産生量が少なくなることを明らかにした。これは、ICGが修飾されたヘリックスが内側に配向するとき、ベシクル表面の親水鎖密度が高くなり、免疫系から逃れやすくなったためと考えられる。このように本成果は、ヘリックスの特徴を活用することで、分子集合体の形態を精密かつ高次元に制御することに成功し、さらに新規の生体材料としての応用に繋げた重要な研究であり学術的に意義深いと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。
アジアにおける社会包摂型アーツマネジメントモデル形成と応用

本研究は、アジアに赴いて社会包摂型のアーツマネジメントの実態を調査するとともに、毎年3つの国際会議をタイ、インドネシア、そして両国以外のアジア諸国(開催国は毎年変わる)において開催し、研究者・実務家の情報交換ならびにネットワークを形成する。調査する国はインドネシア、マレーシア、タイ、ベトナムの予定である。成果としてアジア型アーツマネジメントのツールキット(英文)と論文集(英文)を準備し、科研終了翌年度に出版する予定である。
モンキーを用いた新しい骨髄移植方法の開発

マウス,ラットを用いて、骨髄内(Intra-bone marrow : IBM)に骨髄細胞を移植(IBM-BMT)すると、従来の方法(静脈内[IV]に骨髄細胞を移植するIV-BMTや門脈[PV]内に骨髄細胞を移植するPV-BMT)よりも、放射線量を減量しても生着率が高く、造血の回復も速やかであることを発見した(Blood 97:3292-3299,2001)。それ故、ヒトへの応用を視野に入れて、モンキーの実験を開始し、次のような結果が得られた。ii)灌流法に用いる骨髄採取セットを考案中で、骨片が骨髄内に混入せず、しかも摩擦熱の少ない電動式の骨髄採取セットを開発中である(特許申請中)。iii)"Conditioning"としては、マウスの実験でDonor lymphocyte infusion(DLI)を用いれば、放射線量を減量しても生着不全が起らないことを見出した。モンキーを用いて次のような新しい骨髄移植(BMT)の方法を開発した。この方法は腸骨よりAspirationによって骨髄細胞(BMCs)を採取する従来の方法に比較して末梢血の混入が少ないため(T細胞は5%以下)、T細胞を除去しなくてもGVH反応が起らない(Stem Cells 18:453-456,2000)。
イヌがん幹細胞の分離法と遺伝子解析に基づいた治療法の開発

イヌがん幹細胞を標的とした治療法の開発のためにヒトがん幹細マーカーのイヌオルソログに対するモノクローナル抗体(mAb)の作製を行った。大腸菌で発現系させたCD133あるいはCD29抗原に対するmAbが得られた。ウェスタンブロットでは全ての抗イヌCD133mAbはイヌの骨髄膜画分中のCD133タンパクおよびHEK293細胞で発現させたCD133タンパクを検出しなかった。一方、抗イヌCD29抗体は、免疫組織化学染色でイヌ胎児の椎体軟骨および血管の間葉系細胞に陽性を示した。今後、実際のイヌCD133を認識する抗イヌCD133mAbの作製と抗イヌCD29mAbの有用性の検討を予定している。本研究は、犬の悪性腫瘍に対するがん幹細胞をターゲットとした新たな治療法開発を目的とする。犬がん幹細胞の分取・培養、遺伝子解析に基づき、がん幹細胞特異的に発現が見られる分子に対する分子インプリントポリマーを作製し、がん幹細胞を特異的に攻撃する治療薬を作製する予定である。犬がん幹細胞の分取には、ヒトがん幹細胞で発現が報告されているCD133オルソログに対するモノクローナル抗体を用いたソーティングが不可欠であると考える。これまでいくつかの犬悪性腫瘍組織でCD133の発現を確認後、このタンパクを大腸菌発現系を利用して抗原とし、それに対するモノクローナル抗体を作成してきた。前年度作成したHisTag-CD133融合タンパクに対するモノクローナル抗体は発現タンパクを認識するも、犬骨髄細胞の膜画分中のネイティブなタンパクを全く認識できなかった。これは、HisTagを用いた大腸菌発現系がCD133のコンフォーメーションを変化させたためネイティブなタンパクを認識出来なくさせている可能性が考えられたため大腸菌発現系を変更した。当該年度はCD133-GST融合タンパクを発現・精製しこれに対するモノクローナル抗体を作成した。作成されたモノクローナル抗体全ては、発現タンパクは認識出来たが犬骨髄細胞のネイティブなタンパクは認識不可能であった。これらの結果は、発現に用いられた領域はネイティブなタンパクを認識しにくい領域であった可能性がある。現在これまでとは別領域のタンパクを発現・精製し、モノクローナル抗体を作成中である。加えて、CD133以外のがん幹細胞マーカー候補分子に対するモノクローナル抗体も予定している。悪性腫瘍性疾患は、抗がん剤や放射線に対する抵抗性のため未だ根本的治癒に至っていない。本研究はイヌの悪性腫瘍に対するがん幹細胞をターゲットとした新たな治療法開発を目的とする。犬がん幹細胞の分取・培養、遺伝子発現解析に基づき、がん幹細胞特異的に発現が見られる分子に対する分子インプリントポリマーを作製し、がん幹細胞を特異的に攻撃する治療薬を作製する予定である。犬がん幹細胞の分取には、ヒトがん幹細胞で発現が報告されているCD133オルソログに対するモノクローナル抗体を用いたソーティングが不可欠であると考えた。これまで、a)イヌの数種の悪性腫瘍組織においてCD133mRNAの発現が観察された。このことはイヌの悪性腫瘍においてもがん幹細胞が存在する可能性を示すものである。b)イヌCD133の細胞表面が予想される領域数カ所に対して大腸菌発現タンパクを作製した。これらに対する抗イヌCD133モノクローナル抗体を作製したが、大腸菌発現タンパクを認識するも、イヌ骨髄膜画分中のCD133タンパクを認識しなかった。骨髄膜画分中での発現量が少ない可能性を考慮し、哺乳類細胞HEK293でイヌCD133-HA融合タンパクを強制発現させ、このタンパクを認識するかを検討した。しかし、得られたモノクローナル抗体はこの発現タンパクを認識しなかった。糖鎖付加による抗原認識の阻害が予想されたため、現在哺乳類細胞発現系を用いたイヌCD133タンパクの発現・精製を行っている。c)一方CD133以外のがん幹細胞マーカー候補分子CD29にも着目し、同様にイヌ抗CD29モノクローナル抗体を作製した。この抗体は免疫組織化学にて間葉系幹細胞を認識することが判明した。今後、この抗体が細胞分離用抗体として利用可能か否か検討を予定している。近年、人医において`がん幹細胞'の存在が示唆され始めた。この細胞は、ヒトの悪性腫瘍における抗がん剤や放射線に対する抵抗性克服の鍵となる細胞と考えられている。一方、イヌの悪性腫瘍におけるがん幹細胞の存在に関して、分離・同定・培養法が確立していないことから、イヌの悪性腫瘍においてがん幹細胞が存在するのか?