hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ｍｉｔｏｔｉｃ　ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅの新規マーカー：リン酸化ｃａｓｐａｓｅ－９

リン酸化caspase 9がmitotic catastropheのマーカーであることを証明することは困難であった。そこで、胃癌および大腸癌を用いて、アポトーシス阻害活性をもつサバイビンと、サバイビン活性を抑制するSmac/DIABLOの発現を免疫組織化学的に解析した。その結果、胃癌と大腸癌ではサバイビンによる細胞死抵抗性のメカニズムに違いがあり、大腸癌は胃癌と比較するとサバイビンだけではなくSmac/DIABLOも高発現しており、大腸癌においてSmac/DIABLOは、サバイビンの抗アポトーシス作用を抑制するために発現増加されている可能性が示唆された。本研究の目的は、リン酸化caspase-9の免疫組織化学染色が優れたmitotic catastropheの証明法であることを実証することである。平成23年度は、proximity ligation assay(PLA法)によるcyclin B1・cdc2複合体の検出を、蛍光色素標識法および酵素標識法の2種の検出法を用いて試みたが結果は不安定であった。そこで、平成24年度は、(1)パラフィン切片におけるPLA法の至適条件の検討、(2)同種動物から作製された抗体を含む3種の1次抗体を用いた蛍光多重染色の検討、(3)G2/M期に発現するタンパク質であるsurvivinの胃癌・大腸癌における癌細胞内局在に関する検討、を行った。結果は以下の通りであった。(1) PLA法を用いて、2種のタンパク質複合体の検出および1種のタンパク質発現の検出を行った。反応温度・時間、洗浄方法等の条件を変化させ検討したが、陽性シグナルの増強・安定化には至らなかった。(2)加熱処理後の蛍光が比較的保存されると言われている蛍光色素(FITC、Cy3、Cy5)を用いて、種々の1次抗体の組合せにおける蛍光3重染色の至適条件を検討中である。(3)胃癌72例および大腸癌78例を対象としてsurvivin免疫染色を行ったところ、陽性症例の割合は、胃癌(核;49%、細胞質;35%)、大腸癌(核;72%、細胞質;56%)であり、胃癌では核と細胞質での発現に相関が見られたが、大腸癌では相関は見られなかった。以上から、胃癌と大腸癌では、survivinによる細胞死抵抗性のメカニズムに違いがある可能性が示唆された(第102回日本病理学会総会で発表予定)。そこで、平成24年度は、G2/M期に発現するタンパク質でありapoptosis阻害活性をもつsurvivinの発現を、大腸癌および胃癌を用いて調べ、両腫瘍の細胞死経路の相違を解明した。さらに、平成25年度は、survivin活性を抑制するSmac/DIABLOの発現を明らかにし、survivinとの関連を免疫組織化学的に解析した。その結果、(2)大腸癌は胃癌と比較すると、survivinだけではなくSmac/DIABLOも高発現しており、大腸癌におけるSmac/DIABLOの発現は、リン酸化caspase 9がmitotic catastropheのマーカーであることを証明することは困難であった。平成23年度は、リン酸化caspase-9(p-cas-9)抗体の特異性の確認、proximity ligation assay(PLA法)によるcyclin B1・cdc2複合体の検出を目的とした。PLA法は、抗原タンパクと1次抗体との反応・proximity ligation assay・シグナルの検出、の各ステップから構成される。そこで、PLA法実施に先行しcyclin B1・cdc2ニ重免疫染色の至適条件を設定した。結果を以下に要約する。1、p-cas-9抗体の特異性;アルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化処理によりp-cas-9抗体の特異性の確認を行なった。Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(400 U/ml)を37°Cで2時間反応させることによりp-cas-9は陰性化した。さらに、2種の抗原ペプチドを用いて吸収試験を行なったが、吸収は見られなかった。2、cyclin B1・cdc2ニ重染色;抗CyclinB1およびcdc2抗体を用いた単染色の至適染色条件を設定した。両染色とも陽性部位は核と細胞質に局在し、特にcyclin B1は核周囲の細胞質、cdc2は細胞質および核に多数の陽性像を示した。以上を考慮し、酵素抗体法では第1染色(cyclin B1-PermaBlue発色)・第2染色(cdc2-DAB発色)により良好な染色結果を得た。蛍光染色では、cyclin B1-Cy3・cdc2-FITC・核-DAPIにより良好な染色結果を得た。1次抗体は、2種の抗体の混合液を使用したが、この時の各抗体の最終希釈濃度は、単染色と同一であった。3、PLA法によるcyclin B1・cdc2複合体の検出;蛍光色素標識法(Red)と酵素標識法(NovaRED)の2種の検出法を用いて染色した所、結果は不安定で染色条件を検討中である。リン酸化caspase-9免疫染色が優れたmitotic

catastrophe証明法であることを実証するために、proximity ligation assay法によりcyclin B1・cdc2複合体の検出を試みたが、陽性シグナルは弱く、種々の条件を設定し検討を重ねたが、安定した結果は得られなかった。そこで、同種の動物より作製した抗体を含む3種の1次抗体を用いた蛍光多重染色の至適染色条件を検討している。それと同時に、G2/M期に発現するタンパク質であるsurvivinの、胃癌・大腸癌における癌細胞内局在に関して検討を行っている。p-cas-9抗体の特異性の確認のため、pro-cas-9(全長型)抗体陽性像との局在比較を行う。PLA法が最終的に不安定な場合は、蛍光多重染色により、cyclin B1、cdc2、およびp-cas-9の局在を証明する。また、p-cas-9の特異性が否定された場合は、本抗体の認識部位を解析し、交差反応物質の特定を試みる。免疫組織化学染色(蛍光抗体法、酵素抗体法)に必要な試薬および消耗品の購入を行う。また、成果報告(学会発表、論文投稿)のための経費にあてる。proximity ligation assay法、蛍光抗体法、酵素抗体法に必要な試薬、消耗品の購入を行う。また、成果報告(学会発表、論文投稿)のための経費に充てる。
アルカリ金属アジ化物を用いた多成分系金属窒化物の合成と結晶化学

本研究では、アジ化ナトリウムを窒素源に、また、フラックスとしてナトリウム金属融液を用いて多成分系窒化物の合成を試みた。ニオブなどの金属シートでチューブ内を覆ったステンレス・スチール製チューブ内に原料の金属元素とアジ化ナトリウムおよび金属ナトリウムを封入し、このチューブをアルゴンガス雰囲気中摂氏750度で加熱した。加熱後、チューブ内のナトリウムフラックスを液体アンモニアを用いて取り除いた。このために必要な器具(H型セル)を作製した。この方法で、大きさ1mm以下の黄色で透明な薄板状の窒化ストロンチウムガリウムの単結晶が合成された。単結晶X線構造解析の結果、化合物が斜方晶系(格子定数:a=5.9579(12),b=10.285(2),c=9,557(2)Å)で空間群がPnnaであることを明らかになった。窒化ストロンチウムガリウムの結晶構造は、窒化ストロンチウムアルミニウムと同型構造である。各々のガリウム原子は窒素原子により四面体西配位されており、四面体の2つの稜が共有されることにより一次元鎖が形成されている。ストロンチウム原子は窒素原子に六配位されている。ナトリウムフラックスを用いた多成分系窒化物の合成では、ストロンチウムよりもバリウムを含む系で、結晶が得られやすい傾向がみられた。また、希土類元素が入った系では、希土類元素の窒化物が単独で生成し、多成分系の窒化物を形成しにくいことが明らかになった。典型元素のAlやGaを組み合わせた系での実験においても、2元系窒化物が主生成相となる場合が多かった。この原因として、融液内の組成の均一性や元素による窒化反応の起こり安さや、各2元系窒化物の生成速度の影響などが考えられた。出発物質にはBaやSrなどのアルカリ土類金属とZn金属,フラックスのNa金属および窒素源のNaN_3を用いた。これらの原料をArガス雰囲気のグローブボックス中で秤量し、Arガス雰囲気のアーク炉内でNbチューブ中に封入した。電気炉を用いて出発物質を750°Cで1h加熱後、6.4°C/hの速度で徐冷した。冷却後、Nbチューブ内のNaフラックスを液体アンモニアを用いて取り除いた。得られた単結晶についてエネルギー分散型X線(EDX)分析で金属元素成分を分析した。単結晶は空気中で不安定なため、ガラスキャピラリー内にArガスとともに単結晶を封入してX線回折を行った。プリセッションカメラで空間群を調べるとともに4軸型自動回折計を用いてX線回折強度の測定を行った。アルカリ土類金属のうち、750°Cからの徐冷によってZnを含む3成分系の窒化物が得られたのはBaとSrだけで、CaやMgではその生成は認められなかった。Sr_2ZnN_2単結晶の大きさは、0.1mm以下であったのに対し、Ba_2ZnN_2では1-2mm程度であった。Baの場合500°Cからの徐冷によっても大きさ0.5mm程度の単結晶が得られた。単結晶X線構造解析の結果、いずれの窒化物とも、正方晶系、空間群:I4/mmm、Z=2の同型構造を有し、Sr_2ZnN_2ではa=3.8568(2)、C=12.935(1)Å、Ba_2ZnN_2ではa=4.152(1)、c=13.055(3)Å、であることがわかった。

これらの結晶構造は、K_2HgO_2型構造で、[N=Zn=N]^<4->のイオン基を含んでいる。窒素原子はBaまたはSrとZnがつくる六配位八面体内に位置することが判明した。アルカリ金属アジ化物を用いた本研究で、新規多成分系窒化物Sr_2ZnN_2とBa_2ZnN_2の単結晶が750°C条件で合成することができたので、今後は多成分系の元素の組み合わせを拡張して研究を進める。金属ナトリウム融液をフラックスに用いることにより、アルカリ土類金属を含む新しい3元系窒化物の単結晶を作製し、それらの結晶構造を明らかにした。出発物質にはアルカリ土類金属、希土類金属、典型金属元素、フラックスのナトリウム金属および窒素源のアジ化ナトリウムを用いた。これらの原料をアルゴンガス雰囲気のグローブボックス中で秤量し、ステンレススチール製チューブ内に封入した。出発原料とステンレススチールとの反応が見られた場合には、タングステンやモリブデン、ニオブなどの金属シートでチューブ内を覆い反応容器とした。チューブをアルゴンガス雰囲気中摂氏700800度で加熱した。加熱後、チューブ内のナトリウムフラックスを液体アンモニアを用いて取り除いた。単結晶は空気中で不安定なため、ガラスキャピラリー内にアルゴンガスとともに単結晶を封入し、X線回折強度の測定を行った。ストロンチウム-ガリウム-窒素系の合成では、大きさ1mm以下の黄色で透明な板状結晶が得られた。X線回折データの解析した結果、この結晶が斜方晶系(格子定数はa=5.9579(12)、b=10.2851(2)、c=9.5567(2)Å)で空間群がPnnaであることを明らかになった。窒化ストロンチウムガリウムの結晶構造は、窒化ストロンチウムアルミニウムと同型構造で、解析の結果得られた格子定数はa=5.9579(12)、b=10.2851(2)、c=9.5567(2)Åである。各々のGa原子はN原子により四面体四配位されており、四面体の2つの稜が共有されることにより一次元鎖が形成されている。ストロンチウム原子は窒素原子に六配位されている。
in silico創薬スクリーニングのためのドッキング評価関数の開発

本研究では、in silicoスクリーニングの精度向上のため、ドッキング評価関数の開発を行った。開発されたドッキング評価関数は従来の2倍の正答率が得られた。新薬を開発するに当たって、疾病に関連する標的タンパク質に対して新薬候補となる低分子化合物との結合親和性をコンピュータシミュレーションによって結合予測・選別を行うことは、これからの時代の新薬開発に掛かる時間を短縮するのみではなく、オーダーメード医療と呼ばれる個人個人のDNA型に合わせて副作用の少なく、高機能な薬を開発するために重要である。本研究ではコンピュータシミュレーションによる低分子化合物と標的タンパク質の複合体予測から、薬となりうる結合親和力の高い低分子化合物をスクリーニングすることを支援するため、高精度なドッキング評価関数の開発に取り組んでいる。この研究の初年度として、平成19年度は、評価関数開発で基データとなる約10000の低分子化合物と約400の標的タンパク質を使用した複合体予測計算とそのデータのデータベース化を行った。19年度は主にデータ収集を目的としているため、論文等での成果は出ていないが、目的のデータ収集自体は低分子化合物の初期コンフォメーションが予想外に複合体予測結果に影響を与えることが分かり、複合体予測計算の再計算が必要になったなど、時間はかかってしまったが、データ収集は無事に完了させることができた。その一部データを簡易解析したところ、ドッキング評価関数の性能を少なくとも1.5倍に向上させられるこどが分かった。次年度は得られたデー夕に基づき、ドッキング評価関数の開発を行う。新薬を開発するに当たって、疾病に関連する標的タンパク質に対して新薬候補となる低分子化合物との結合親和性をコンピューターシミュレーションによって結合予測・選別を行うことは、これからの時代の新薬開発に掛かる時間を短縮するのみではなく、オーダーメード医療と呼ばれる個人個人のDNA型に合わせて副作用の少ない高機能な薬を開発するために重要である。本研究ではコンピューターシミュレーションによる低分子化合物と標的タンパク質の複合体予測から、薬となりうる結合親和力の高い低分子化合物をスクリーニングすることを支援するため、高精度なドッキング評価関数の開発を行った。開発には、約10000の低分子化合物と約400の標的タンパク質を総当りで使用した大規模な複合体予測計算結果を利用し、そのデータを基に評価関数の最適なパラメータを決定した。また、アミノアシル合成酵素等の活性試験を行い、シミュレーションに依らない実測値を得ることにより、開発する評価関数の精度確認・精度向上に利用できるようにした。パラメータを最適化し開発した評価関数は、従来のドッキング評価関数と比べ1.5倍以上の正答率で、正解となる低分子化合物を見つけ出すことができることがわかった。また、最適化を行った複数の評価関数を組み合わせることによって、従来の約2倍の正答率で創薬スクリーニングの精度を向上させることができた。本研究の主要部分での成果発表については、現在準備中である。
遺伝子改変動物の造血幹細胞動態制御を指標としたサイトカイン系薬剤評価モデルの開発

本研究は大別して、(1)導入遺伝子ベクターの構築と「ト」マウスの作製、(2)「ト」マウスの遺伝子挿入確認と発現解析、(3)「ト」マウスを用いたサイトカインに対する反応性の解析、等から構成されており、以下に実績の概略を示す。1.導入遺伝子ベクターの構築と「ト」マウスの作製:(平林・横田・井上)IL-3受容体各サブユニット遺伝子の「ト」マウス作製のための導入遺伝子ベクターの構築およびその「ト」マウスの作製は、既に一通りの系統樹立を終了しているので、一部の同一遺伝子による「ト」マウス系統の不足しているものについて複数系統の樹立観察を目的として、熊本大学鈴木操、山村研一博士の協力の元、追加作製を行った。2.「ト」マウスの遺伝子挿入確認と発現解析:(平林・梅村・横田・井上)導入遺伝子の確認は主に、すでに条件設定のなされているPCR法にて行い、導入遺伝子の発現の解析の為、RT-PCR法や遺伝子産物特異抗体(京大・米原教授より恵与)を用いたFlow cyotmetric assayにて確認を行った。3.「ト」マウスを用いた当該サイトカインに対する反応性の解析:(平林・高木・梅村・井上)当研究課題では表題にも示したとおり、IL-3受容体のサブユニット毎の遺伝子過剰発現「ト」マウスでの個体レベルでの受容体分子の再構成を促し、幹細胞制御のモデルを構築しようとするものである。このため具体的には、1)IL-3受容体のα鎖と同β_<IL3>鎖の機能の異同につき、新しく樹立した「ト」マウスを含めた培養性幹細胞レベルでの解析を行い、新たな知見を得つつある。2)IL-3受容体の共役β鎖(βc)「ト」マウスを用いた、α鎖「ト」マウスとの相互関係の解析を行い、このものがβ_<IL3>鎖と異なった反応性を持つことが明らかとなり、すでに樹立されている幾つかの別系統での検証を行うべく準備を進めているところであるが、移動に伴う生産計画の遅れから解析には至らなかった。尚、備品には遺伝子導入装置の付属機器を用意し、追加「ト」マウス作成、遺伝子構築その他に有効に活用した。
物体軸の捉えと操作への身体化認知の関わりと発達障害特性：不器用さへの支援に向けて

前年度の研究成果として,現在2本の論文を執筆・改稿中である。今年度実施を予定していた身体化認知と発達障害特性との関連について,ASD当事者を中心にこれまで行ってきた1心的回転における身体への類推,2感覚の過敏性と認知的柔軟性,に関わる実験を始動できた。貴重なデータを取得することができたほか,当事者の方の聞き取りから今後の展開へ参考になるご意見を多数いただくことができた。児童から成人までを対象のために分析までには人数の追加が必要であり,引き続きデータ取得していく予定である。新たな実験手法での検討と環境設計をさらに進めることができた。脳波計測(事象関連電位)については,特徴類似性に基づく群化過程を事象関連電位と行動反応データをもとに解析を行い学会発表を行うことができた。短期間,理化学研究所・北城研究室へ研修に行くことで,解析から解釈まで多くの助言をいただくことができた。視線計測については,コントロール群とASD群の幼児を対象に,実験を行うことができ,来年度の学会発表や論文化について準備中である。さらに,発達障害特性との関連を検討するために昨年度から整えていたASD当事者の協力者プールについても,実際に運用できるまでになった。協力者プールが完成したことで,当事者への研究リクルートが円滑にできるようになったほか,より直接的に当事者からの意見をうかがえる体制ができるようになった。さらに研究を発展させていくうえでも意味のある成果といえる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度予定していた,心的回転における身体への類推に関する2つの行動実験を終え,新たな研究手法の習得や研究環境の整備を行うことができた。(1)色の効果の検討: 2つの図形が同じであるかどうか判断する心的回転課題において,図形を身体へ類推すると成績が向上するが,特に女性で効果が大きいことを明らかにした(蒔苗・河西,2017)。しかし,これは用いられていたピンク色の刺激が女性特有にはたらいた可能性があったため,ピンク色と青色の刺激で同様の課題を実施した。結果,ピンク色と青色ともに身体への類推は有効だったが,その効果は男女ともにピンク色で大きかった。身体状態として生物学的に妥当な色かどうかが身体への類推に関わる知見を得た。(2)児童を対象とした検討:小学1-3年生を対象に,簡易に実施できる筆記式の心的回転課題を作成して行った。その結果,どの学年においても身体に類推可能な図形で不可能な場合よりも正答が増加したことから.児童においても身体への類推が空間認知操作に有効に働くことの証拠を得た。・実験に関わるスキルや環境について:脳波計測(事象関連電位)や眼球運動測定を用いた実験パラダイムの作成や実施方法を学び,実際に実験を実施しデータを取得するまでの一連の過程を習得した。現在は取得したデータに基づいた分析方法を学習中である。また,発達障害特性との関連を検討するために,主にASD当事者における協力者プールを作成し,当事者研究の環境を整えることができた。徐々に登録者も増えて実施への状況が整いつつある。また発達過程を分析するために,小学生対象に心理学実験を実施できるフィールドも開拓できた。本年度に予定していた行動実験の実施と分析を終えることができた。加えて,新たな実験手法の習得や研究環境の整備ができた。次年度の研究課題も一部実施済みであり,おおむね順調に進展しているといえる。本年度得られた知見について論文化が思うように進んでいないため,次年度最初に2本の論文投稿を済ませる。次年度の課題については,一部データを取得済みであり,かつ臨床研究の実施体制を整えることができているため,論文投稿後すみやかに始動させる。
生化学的見地からみた細胞膜電位記録の簡便化及び二次元可視化の開発

神経科学研究は、単一シナプス解明の段階を経て、今や多ニューロン間ネットワークの相互機能を解析する時代を迎えている。神経興奮が脳機能の源である以上、生化学者といえども脳研究を行う上で、電気現象を的確にとらえることが不可欠であるが、これまでの電気生理学は、急速に多分野に浸透していった遺伝子工学に比べ、明らかに特殊な領域であった。本研究は、生化学的見地から、定型的電気生理学を用いることなく、生体(細胞)電気信号を検知する非接触型電位計測プローブ(リモートセンサープローブ)を開発するとともに、電位感受性色素やイメージングシステムを組み合わせて、脳スライスの記録をし、従来の電気生理学的解析結果との比較対照を行うことにより、新しいニューロンの機能解析系を構築することを目的とする。電気生理学的解析及び電位依存性色素の利用のためのシステムを構築するとともに、マウス海馬CA1,CA3におけるLTP記録を行い、その薬理学的調節機構を明らかにした。一方、多電極記録法を用いた細胞外記録を行うために、マルチチャンネル細胞外記録システムによる海馬におけるLTP記録に成功した。本研究に用いるシステムは機械(ロボット)化が可能であり、単に基礎医学にとどまらず、化合物の網羅的スクリーニング等、創薬、産業化にも貢献すると期待される。また、電位感受性色素を用いたシステムでは、単に細胞レベルの測定に留まらず、進歩したイメージングシステムを組み合わせることにより、例えば、脳内ニューロンの興奮の二次元的可視化が可能になり、多ニューロン間の相互作用の解析を行うことができると推察される。本年度は、電気生理学的解析及び電位依存性色素の利用のためのシステムを構築するとともに、マウス海馬CA1,CA3におけるLTP記録を行い、その薬理学的調節機構を明らかにした。

一方、多電極記録法を用いた細胞外記録を行うために、マルチチャンネル細胞外記録システムによる海馬におけるLTP記録に成功した。本研究に用いるシステムは機械(ロボット)化が可能であり、単に基礎医学にとどまらず、化合物の網羅的スクリーニング等、創薬、産業化にも貢献すると期待される。また、電位感受性色素を用いたシステムでは、単に細胞レベルの測定に留まらず、進歩したイメージングシステムを組み合わせることにより、例えば、脳内ニューロンの興奮の二次元的可視化が可能になり、多ニューロン間の相互作用の解析を行うことができると推察される。
ゲル微粒子の超高密充填によるソフトマテリアルの高強度化・高速応答化

マクロゲルにゲル微粒子を高充填させることによって,ゲルの力学的強靭化および刺激応答特性の創出をねらっている。このようなマクロゲルは,ゲル微粒子が高充填された分散液に反応性モノマーと架橋剤を溶解させ,重合反応を行うことにより得ることを想定している。本年度は,ゲル化前のゲル微粒子が高充填された分散液のレオロジー特性について詳細な解析を行うとともに,前述のスキームによるゲルの作製を試みた。架橋密度や粒径の異なるゲル微粒子を合成した。総ゲル微粒子の体積分率(みかけを一定に保ったまま,架橋密度や粒径が異なるゲル微粒子の二成分系の混合分散液のレオロジー的性質を調べた。粒径が同程度で硬軟だけが異なる混合系の場合,分散液の平衡弾性率の対数が組成に比例するという単純則が成立することがわかった。一方,硬軟と粒径のいずれも大きく異なる場合,硬軟にかかわらず,弾性率が小粒子の重量分率にほとんど依存しない領域が高重量分率領域に広域に現れた。これは数分率で圧倒的に大きい小粒子は連続相を形成しやすく,そのような小粒子の連続相が混合物の弾性率を支配すると考えられる。これらの高充填ゲル微粒子懸濁液に対して上述の方法でマクロゲルの作製を試みた。微粒子の充填率の増加に伴ってマクロゲルの弾性率が増加することは確認できた。しかし,微粒子の存在によってマクロゲル作製時の架橋反応度が低下しており,厳密な相対評価が難しいことがわかった。他の架橋反応を検討することにより,真の意味でゲル微粒子の充填効果を議論できるモデル系を構築することを次年度の目標とする。ゲル化前の分散液の弾性的性質については精査が完了した。分散液からのマクロゲルの作製は成功したが,現状では架橋反応が微粒子の存在をうけやすいという問題があり,異なる架橋反応の検討が必要である。マクロゲルの架橋反応として現状の熱ラジカル反応ではなく,光開始剤を利用した光架橋反応を検討する。分散液中の混合物に光開始剤を加え,透明ガラスセル中の溶液に光照射し,ゲルを作製する。微粒子の存在が架橋反応を阻害していないかどうか,マクロゲルの弾性率の微粒子充填率に対する依存性を検討して確認する。意図する反応系が得られれば,そのマクロゲルを利用し,大変形挙動および温度応答性の微粒子充填率依存性を検討する。マクロゲルの作製条件がなかなか確定できなかったため,マクロゲル作製用のゲル微粒子を当初の予定ほどは合成せずに今年度は終了してしまった。このため,ゲル微粒子合成用の原料の購入費の分で,当該助成金が生じた。来年度はマクロゲルの作製条件は確定するため,翌年度分として請求する助成金とあわせて,当該助成金を用いて,様々なゲル微粒子を合成するための原料購入費に充当するつもりである。
K理論からのアプローチによる安定ホモトピー論の研究

研究代表者は、K理論の局所化同値によるCW複体の分類を行なうための前段階として、それと比べて幾分粗い分類を与えることを目的に1990年に疑似KOホモロジー同値という概念を導入した。それ以来、「擬似KOホモロジー同値」と「K-局所化」の二つの研究対象を中心にして一貫した研究を押し進めて既に幾つかの満足すべきを得ており、平成12年度から平成14年度においても次の様な新たな研究成果を得ることが出来た。第1の研究対象は、KU群が自由アーベル群と1個か2個の2捩じれ巡回群の直和であるような、KU群が簡単な形をしたCW複体(又はCWスペクトラム)を疑似KOホモロジー同値型によって分類することである。平成12年度として、1次元KU群が0であるという制限を加えること無しにKU群が2つの2捩じれ巡回群の直和であるCW複体に対して、疑似KOホモロジー同値型による分類を行なった。1次元KU群が0であるという制限を外す場合には、疑似KOホモロジー同値型による分類を試みる際にある種の障害が生じて一般には解決を困難にする。そこで、今回は少細胞CW複体を構成してその幾何構造を利用する従来の手法を捨てて、バウシュフィールドの圏を利用した代数的な手法を採用することにより障害を克服することができて、その結果分類に成功した。第2の研究対象は、疑似KOホモロジー同値型によって既に分類されているCW複体(又はCWスペクトラム)をK-局所化同値型によって分類することである。K-局所化同値型の決定のためには、KO群へのアダムス作用素の振る舞いを調べる必要があるが、これはかなり複雑であり決して易しくはない。平成13年度-平成14年度として、KU群が階数2の自由アーベル群である場合と、階数1の自由アーベル群と1つの2捩じれ巡回群である場合のそれぞれにおいて、それらCW複体(又はCWスペクトラム)をK-局所化同値型によって分類することに成功した。これら2つの場合は疑以KOホモロジー同値型が既に決定されているので、少細泡CW複体を幾つか構成してそれらの幾何構造を利用するという従来の手法により深い考察加えた結果、疑似KOホモロジー同値型より精密にしたK-局所化同値型の決定を成し遂げた。代数的位相幾何学においては、CW複体や多様体を安定ホモトピー同値によって分類することが最も重要な問題の一つとして挙げられるが、そのためにはまずK理論による局所化同値によって分類を試みることが極めて有効である。研究代表者は、CW複体の実K群を単にアーベル群の圏内で計算するのではなく幾何学的な構造を含めて計算するために、疑似KOホモロジー同値という概念を1990年に導入した。それ以来、CW複体や多様体をまず最初に疑似KOホモロジー同値で粗く分類し、しかる後にK理論の局所化同値でより細密に分類するという手法を構築して現在まで一貫した研究を進めてきた。研究代表者は既に位相幾何学上重要な幾つかの多様体(又はCW複体)対してそれらのKU群に作用する共役作用素の振る舞いを考察して、疑似KOホモロジー同値型を決定している。

更に、KU群が自由群であるとか自由群と一つの2捩れ巡回群の直和であるなど、KU群が比較的簡単な形をしているCW複体(又はCWスペクトラム)を疑似KOホモロジー同値型によって分類することを既に成し遂げている。この研究を継続発展させた結果、KU群が二つの2捩れ巡回群の直和であるCW複体(又はCWスペクトラム)を疑似KOホモロジー同値型によって分類することに成功したことが平成12年度の新しい研究成果である。KU群が二つの2捩れ巡回群の直和であって1次元KU群が0であるという制限を加えた場合は既に1996年に研究代表者が開発した従来の手法によって中井洋史君(大阪市大)との共同研究で分類を成し遂げている。しかし、0次元および1次元KU群が2捩れ巡回群である場合は分類を試みる際にある種の障害が生じるので、それを克服するためにBousfield(1990)によって導入されたCRT圏を利用する。そのため、従来の方法がCW複体の細胞構造を用い幾何学的であったのに比べると、新しい方法は長完全列を用いてKO群を計算するので極めて代数的である。Hopkins(アメリカ)が可逆である局所化CWスペクトラムからなるピカード群の概念を導入した後、Hovey-Sadofskiは1999年にBP理論から派生するE(n)理論に対するピカード群Pic(E(n))はE(n)ホモロジー群が余加群として階数1であるCWスペクトラム全体からなることを示した。特に、n=1の場合はE(1)理論は複素K理論に他ならず、ピカード群Pic(E(1))の構造は容易に決定される。実際、K理論に対するピカード群Pic(K)の構造はKUホモロジー群が階数1の自由群であるCWスペクトラム全体をK理論による局所化同値型によって分類したものとして与えられる。そこで、研究代表者はピカード群からは一歩離れて、KUホモロジー群が階数2の自由群であるCWスペクトラム全体をK理論による局所化同値型によって分類することを平成13年度の研究課題にした。研究代表者は、CW複体の実K群を単にアーベル群の圏内で計算するのではなく幾何学的な構造を含めて計算するために、疑似KOホモロジー同値という概念を1990年に導入した。それ以来、CW複体や多様体をまず最初に疑似KOホモロジー同値で粗く分類し、しかる後にアダムス作用素の振る舞いを考察してK理論の局所化同値でより細密に分類するという手法を構築して現在まで一貫した研究を進めてきた。既に、研究代表者は、KUホモロジー群に作用する共役作用素の振る舞いを考察することにより、KUホモロジー群が自由群であるとか、自由群と一つの2捩れ巡回群の直和であるとか、二つの2捩れ巡回群の直和であるなどKUホモロジー群が比較的簡単な形をしているCW複体(又はCWスペクトラム)に対して、それらを疑似KOホモロジー同値型によって分類することを成し遂げている。この研究成果を発展させて、KUホモロジー群が階数2であるCW複体(又はCWスペクトラム)に限定して、それらのKOホモロジー群に作用するアダムス作用素の振る舞いを考察して、K理論による局所化同値型による分類を成し遂げることに成功したのが、平成13年度の新しい研究成果である。Hopkins(アメリカ)が可逆である局所化CWスペクトラムからなるピカール群の概念を導入した後、Hovey-Sadofskiは1999年にBP理論から派生するE(n)理論に対するピカール群Pic(E(n))はE(n)ホモロジー群が余加群として階数1であるCWスペクトラム全体からなることを示した。特に、n=1の場合のE(1)理論は複素K理論に他ならず、ピカール群Pic(E(1))の構造は容易に決定される。
ヤヌス環を持つロタキサンの創製：新しいスイッチング形式の開発と多段階スイッチング

前年度に引き続き、新しいスイッチ形式を持つ分子の基質となるロタキサン合成を検討し、合成を達成したロタキサンを用いて、刺激に対するスイッチングを実施した。ロタキサン合成の鍵となる環部の合成は、まず、第3級テトラアミド環を基軸に、軸認識部となるアミド間のスペーサーが異なる複数のアミド環について、4種を新たに合成した。これらに対し、軸となるモノアンモニウムイオン、ビスアンモニウムイオン、グアニジニウムイオン、ジアミド、アミノ酸誘導体等を用い、[2]ロタキサン合成を検討した。その結果、1種の環がモノアンモニウムイオンと、また特定のビスアンモニウムイオンとそれぞれ擬ロタキサン形成することを見出した。得られた擬ロタキサンの末端封鎖にオキシムエーテル形成反応を活用することで、新規ロタキサン2種の合成に成功した。一方、他のアミド環に関しては、フェーストゥーフェース錯体形成が優先された。スペーサーが長いアミド環を用い、[3]擬ロタキサン形成を検討したものの、現在までそれらの確認は出来ていない。合成した[2]ロタキサンを用いて、塩基と酸に対するスイッチングを行った。モノアンモニウムイオンロタキサンに塩基を加えたところ、アンモニウムの脱プロトン化に伴い環部のアミドの固定化が解消され、アミド部の回転が確認できた。さらに酸を加えたところ、アミンのプロトン化が進行し、元の状態のロタキサンへ戻ることが確認でき、その可逆的なスイッチングを達成した。ビスアンモニウムイオンロタキサンに関しては、加える塩基の当量に応じ、段階的に脱プロトン化が進行し、それらに伴うアミド部の回転制御にも成功した。一方、酸を加えた場合には、酸の強さと当量に応じ段階的にプロトン化することを見出した。第一の目的である「水素結合ドナーとアクセプターの両方の性質を有し,それらの性質変換が可能な環(ヤヌス環)を持つロタキサンを合成」について検討した。計画に沿って、まずヤヌス環にはオリゴエチレングルコールと2個のアミドを持つ環部を複数用い、それらを用いたロタキサン合成を検討した。それぞれの環部とアンモニウムイオンを含む軸部からその合成を行い、一部の環でロタキサンの単離に成功した。しかしながら、鍵となるアミドのコンフォメーションが外部刺激により応答することなく固定されており、目的の環部の回転を伴う性質変換について現在まで確認されていない。そこで、次に計画していた、4個のアミドを持つ環状化合物を環部とするロタキサン合成を実施し、収率は高くないものの、ロタキサン合成を達成した。本ロタキサンの構造について核磁気共鳴による解析を行い、非極性溶媒において全てのアミドのカルボニル基が環内部方向に向いたコンフォメーションであることが確認した。予想通りアミドとアンモニウムイオン間の水素結合によってコンフォメーションの固定化が実現した。一方、種々の溶媒を用い同様の実験を実施したところ、極性溶媒に於いて、異なるコンフォメーションを有するロタキサンの存在が示唆された。本コンフォメーション変換は、一部のアミドではあるものの軸・環間の水素結合が溶媒によって切断されたことに由来するものと予想される。これらの事実は、溶媒と言う化学的な外部の環境(刺激)に対する分子の応答であり、本研究の第一の目標である「新しい形式のスイッチング」に相当する現象である。また液性変化に対するスイッチングについても検討したところ、何らかの変化と変化の可逆性は見出されたものの、どのような状態変化に起因しているかは未だに解析できていない。申請段階で計画した2種類(サイクリックジアミド、並びにサイクリックテトラアミド)のヤヌス環について、その合成を完了した。それぞれの環とアンモニウムイオンを有する軸状化合物とのロタキサン合成(ジアミドロタキサン、並びにテトラアミドロタキサン)についても計画通りに実施し、それらの単離についても成功している。これらのことより、計画したロタキサンの合成について、全て行っていることになる。続いて目的とする刺激応答に対する新しい様式のスイッチングについての検討であるが、まずジアミドロタキサンを用いて検討したが、目的とする応答は観測できなかった。一方、テトラアミドロタキサンでは、当初、アミドは第1級アミンからなるアミドを用いた場合に於いてのみ新しい様式のスイッチングが観測できるものと予想したが、予期に反し第1級アミンからなるアミドを持つロタキサンであっても期待したスイッチ様式が観測できることが見出され、予想以上の結果が観測された。本年度は、液性等の刺激に対する多段階応答も計画していたが、上述したコンフォメーション変化によるスイッチングの解析に時間を費やしたため、多段階応答については現在まで顕著な結果は得られていない。以上より、最大の目的である「新しい様式のスイッチング」について、予期しなかった化合物で達成することができたことがプラス要因であり、また「多段階応答」では結果が得られていないことがマイナス要因であり、これらを総合し概ね順調に進行していると判断した。前年度に引き続き、新しいスイッチ形式を持つ分子の基質となるロタキサン合成を検討した。検討内容は、(1)第1級アミンからなるアミド(NHアミド)を2個、環に持つロタキサンの合成、(2) 4個のNHアミドを環に持つロタキサンの合成、(3) 4個のアミドを環に持つ[3]ロタキサンの合成、(4)テトラアミド環からなる[2]ロタキサンの軸部の変更、(5)テトラアミド環のアミド部間のスペーサー変更とその効率合成、(6)ウレアを導入したロタキサン合成、それぞれについてである。

(1)については、2種の新しいロタキサン合成は出来たものの、合成収率も低く、また刺激応答も観測できなかった。(2)については、合成の前駆体となる環分子の溶解性に難があり、ロタキサン合成検討も行えなかった。(3)では、過剰の軸部を存在させた条件で反応を行ったものの、目的の[3]ロタキサンの存在は確認できなかった。(4)では、軸部にジアンモニウム塩を用いたところ、高い比率で擬ロタキサン形成が認められ、その合成も達成した。(5)については、まず、効率合成法を検討したところ、スペーサー部位の導入順序と方法を変更することで短いルートでの合成法を見出したところである。またこの際、異なるスペーサーを有するテトラアミド環の合成も行っている。(6)は、シャトリングと環反転を組み合わせたスイッチングを期待した検討であるが、現在までウレア部を持つロタキサン合成は確認されていない。一方、新規に合成したロタキサンのスイッチングについても実施した。(4)で得られたロタキサンの溶媒に対するコンフォメーション変化(スイッチング)を検討したが、その応答は確認できなかった。しかしながら、モノアンモニウム塩からなるロタキサンでは溶媒に対するスイッチングが一部観測できたことから、テトラアミドとアンモニウムからなるロタキサンの新しい特性を見出した。プラス要因は次の通りである。テトラアミドとアンモニウムからなるロタキサンの合成については、軸部にジアンモニウム塩を用いることで、従来法に比較し高い収率で目的とするロタキサン合成を達成し、また多段階を有していた環部の合成が、比較的容易にできる合成ルートを見出した。これらの結果より、今後、類縁のロタキサン合成が容易に行える手筈が整った。また、軸部をジアンモニウムイオンとしたことで、ジアンモニウムの脱プロトン化が段階的に進行することが可能となり、予定した研究以上の多段階応答が期待できること、またモノアンモニウムイオンを持つ軸との相違も観測でき、新たな知見が見出された。一方マイナス要因は以下の通りである。刺激に対する新しい様式のスイッチング(環部のコンフォメーション変化)が認められたものの、応答比率が予想より悪いのが現状である。また、今年度予定していた[3]ロタキサン、並びにウレアを有するロタキサンの合成を集中して行ったものの、予定していたこれらの合成は未だ達成していない。そのため、環部のコンフォメーション変化とシャトリングを組み合わせたスイッチングを検討できなかった。以上より、第一の目的で「新しい様式のスイッチング」見出し、その類縁体合成法を確立し、足場を固めることはできた。しかしながら、論文などに投稿できる完全なデータが、今年度蓄積されなかったことより、総合的に「やや遅れている」と判断した。前年度に引き続き、新しいスイッチ形式を持つ分子の基質となるロタキサン合成を検討し、合成を達成したロタキサンを用いて、刺激に対するスイッチングを実施した。ロタキサン合成の鍵となる環部の合成は、まず、第3級テトラアミド環を基軸に、軸認識部となるアミド間のスペーサーが異なる複数のアミド環について、4種を新たに合成した。
好塩基球受容体遺伝子変換体とシグナル伝達

平成8年度のアレルギー担当細胞である好塩基球細胞の高親和性IgE受容体遺伝子変換体の確立ならびに変換体を用いる情報伝達に関する研究から、下記の知見が得られた。(1)イムノグロブリンE(IgE)受容体の動態の解析:平成7年度に確立したラットIgE受容体のβ,γ鎖のITAM(Immuno-receptor tyrosine activation motif)を含む細胞内領域を欠失した遺伝子を導入したマウスマスト(P815)細胞を用いて、IgE受容体の架橋形成後のクラスター形成を、長波長蛍光色素であるシアン系蛍光色素(CY5.13)を結合したIgE抗体を用いて観察した。その結果、β,γ鎖のITAM領域の欠失により、受容体の架橋形成からエンドサイトーシスに至る過程が抑制されることが判明した。このことからβ,γ鎖のITAM領域の欠失が、受容体の動きも抑制することが判明した。(2)初期シグナルの解析:無欠のIgE受容体を導入した肥満細胞では、抗原刺激に伴いカルシウムシグナルを伝達し、IgE受容体、Syk(72k)kinase,Lyn(56k)kinase,42k蛋白質のチロシンリン酸化反応の上昇が観察されたが、IgE受容体β,γ鎖の細胞内(ITAM)領域を改変した遺伝子を導入した細胞では、抗原刺激に伴うこれらの反応が抑制された。チロシン脱リン酸化酵素阻害剤である過酸化バナジウム酸による刺激においてもβ,γ鎖のITAM領域の欠失により、カルシウムシグナルの抑制が観察された。(3)脱顆粒過程の解析:上記変換体を用いた脱顆粒反応について顆粒膜抗原(CD63)の細胞膜上への表現を指標に単一細胞レベルでの解析を行ったところ、β,γ鎖の細胞内領域の欠失により、CD63抗原の細胞膜上への表現が低減化する、すなわち、脱顆粒反応も抑制されているという結果が得られた。これらのことより、IgE受容体のβ,γ鎖の細胞内領域のリン酸化反応が、カルシウムシグナルの応答及びIgE受容体のエンドサイトーシスに重要な役割を持っていることが示された。平成7年度のアレルギー担当細胞である好塩基球細胞の高親和性IgE受容体遺伝子変換体の確立ならびに変換体を用いる情報伝達に関する研究から、下記の知見が得られた。(1)イムノグロブリンE(IgE)受容体の遺伝子変換体の作製:蛋白質チロシンリン酸化反応の基質になるラットIgE受容体遺伝子のβ,γ鎖のITAM (Immuno-receptor tyrosine activation motif)を含む細胞内領域をコードする部位の改変を行った。次いで、IgE受容体を持たないマウスマスト(P815)細胞への上記受容体遺伝子の導入を行い、無欠失のIgE受容体α,β,γ鎖を導入したもの(WT),α,β,γ鎖のうちβ鎖のみまたはγ鎖のみのC末側の細胞内領域を欠失したもの(βcdまたはγcd)を導入した安定なIgE受容体発現細胞の選択に成功した。(2)初期シグナルの解析:

WTでは,抗原刺激に伴うIgE受容体の会合、カルシウム応答、蛋白質チロシンリン酸化反応が観察されたが、IgE受容体の細胞内領域を改変した遺伝子を導入した細胞では、抗原刺激に伴う情報伝達の初期シグナルの中で、IgE受容体の会合、受容体(β、γ鎖)及び受容体結合蛋白質(72K,42K蛋白質)のチロシンのリン酸化反応、及び細胞内カルシウム濃度上昇が抑制され、IgE受容体のβ,γ鎖の細胞内領域が受容体を介する情報伝達に大きく関与することが判明した。阻害の程度としては、β鎖の細胞内欠失では、初期シグナルは完全に阻害され、γ鎖の細胞内欠失では、初期シグナルの抑制は部分的であった。一方、小胞体Ca^<2+>-ATPase阻害剤DTBHQのカルシウム応答には、受容体の改変は無影響であった。(3)脱顆粒過程の解析:上記変換体を用いた脱顆粒反応について顆粒膜抗原(CD63)の細胞膜上への表現を指標に単一細胞レベルでの解析を行ったところ、β,γ鎖の細胞内領域の欠失により、CD63抗原の細胞膜上への表現が低減化する、すなわち、脱顆粒反応も抑制されているという結果が得られた。また、CD63抗原膜上への表現に、細胞骨格系蛋白質の関与する可能性を示唆するデータも得られた。平成8年度のアレルギー担当細胞である好塩基球細胞の高親和性IgE受容体遺伝子変換体の確立ならびに変換体を用いる情報伝達に関する研究から、下記の知見が得られた。(1)イムノグロブリンE(IgE)受容体の動態の解析:平成7年度に確立したラットIgE受容体のβ,γ鎖のITAM(Immuno-receptor tyrosine activation motif)を含む細胞内領域を欠失した遺伝子を導入したマウスマスト(P815)細胞を用いて、IgE受容体の架橋形成後のクラスター形成を、長波長蛍光色素であるシアン系蛍光色素(CY5.13)を結合したIgE抗体を用いて観察した。その結果、β,γ鎖のITAM領域の欠失により、受容体の架橋形成からエンドサイトーシスに至る過程が抑制されることが判明した。このことからβ,γ鎖のITAM領域の欠失が、受容体の動きも抑制することが判明した。(2)初期シグナルの解析:無欠のIgE受容体を導入した肥満細胞では、抗原刺激に伴いカルシウムシグナルを伝達し、IgE受容体、Syk(72k)kinase,Lyn(56k)kinase,42k蛋白質のチロシンリン酸化反応の上昇が観察されたが、IgE受容体β,γ鎖の細胞内(ITAM)領域を改変した遺伝子を導入した細胞では、抗原刺激に伴うこれらの反応が抑制された。チロシン脱リン酸化酵素阻害剤である過酸化バナジウム酸による刺激においてもβ,γ鎖のITAM領域の欠失により、カルシウムシグナルの抑制が観察された。これらのことより、IgE受容体のβ,γ鎖の細胞内領域のリン酸化反応が、カルシウムシグナルの応答及びIgE受容体のエンドサイトーシスに重要な役割を持っていることが示された。
関節リウマチにおけるスフィンゴシンキナーゼ1の働き

昨年度に引き続き,関節炎におけるスフィンゴシンキナーゼ1(Sphk1)の働きを検討するため,C57BL/6及び129/svの背景を持つSphk1KOマウス(JBiolChem.2003;279:52487)に対しDBA/1Jマウスを6世代backcrossし,F6世代のSphk1+/-の雄及び雌を交配し生まれた野生型(WT)及びKOマウス及びその子孫を実験に用いた。昨年度はコラーゲン関節炎モデルを用い,関節炎の発生頻度や時期,関節炎スコアを検討したがSphk1WTマウス及びKOマウスにおいて差異を認めなかった。また組織学的な検討でも明らかな差異を認めなかった。本年度は上記WT(n=7)及びKO(n=8)マウスを用いモノクローナル抗体カクテル(Chondrex)を用いた関節炎モデルを作成した。モノクローナル抗体カクテルを第1日,LPSを第4日に接種することで関節炎を誘導し,第15日まで観察,関節炎の程度を検討後屠殺した。屠殺後,関節炎組織をホルマリン固定しH&E染色で組織の状態を評価比較した。関節炎の程度は関節スコアで重症度を評価したがSphk1WTマウス及びKOマウスにおいて差異を認めずともに激しい関節炎を発症した。また関節炎の発症時期においてもともに第6日より発症し第13日にはピークとなり,発症頻度も全例に発症し差異を認めなかった。また組織学的な検討でもSphk1WTマウス及びKOマウスにおいて何れもパンヌスの形成と軟骨の破壊を認め激しい滑膜炎の所見を呈した。Sphk1WTマウス及びKOマウスにおいて関節炎の発症の程度,時期,頻度いずれにおいても差異を認めないという結果は,S1Pの炎症への関与という観点から見るとSphk1KOマウスにおけるSphk2による代償機転の関与を示唆すると考えられたが,この点については今後の検討が必要である。関節炎におけるスフィンゴシンキナーゼ1(Sphk1)の働きを検討するため、Sphk1ノックアウト(KO)マウスを用いコラーゲン関節炎モデルを作成した。C57BL/6及び129/svの背景を持つSphklKOマウス(J Biol Chem.2003;279:52487)に対しコラーゲン関節炎モデルに適したDBA/1Jマウスを6世代backcrossし、F6世代のSphk1+/-の雄及び雌を交配し生まれた野生型(WT)及びKOマウス及びその子孫を実験に用いた。ウシII型コラーゲンを第1日、完全型アジュバントを第1日及び第21日に接種することで関節炎を誘導し、第60日まで観察、関節炎の程度を検討後屠殺した。屠殺後、関節炎組織をホルマリン固定しH&E染色で組織の状態を評価比較した。関節炎の発生頻度や時期、また関節スコアで評価した重症度はSphk1 WTマウス及びKOマウスにおいて差異を認めずともに激しい関節炎を発症した。また60日後の組織学的な検討ではともにパンヌスの形成と軟骨の破壊を認め慢性の滑膜炎の所見を呈した。また組織レベルでのスフィンゴシン1リン酸(SIP)のレベルをHPLC法を用い前足の組織で測定したところ、免疫をする前とコラーゲン関節炎を誘導した後のSlPレベルはそれぞれ免疫前ではSphkl WTマウスで3.9±0.5、KOマウスで5.5±0.4また誘導後ではWTで4.9±0.7、KOで5.2±1.3pmol/mg proteinと変化を認めなかった。これらの結果はSphk2による代償機転の関与を示唆すると考えた。関節炎の急性期における検討として現在モノクローナル抗体カクテルを用いた関節炎モデルを用い、関節炎の程度や組織学的検討を行っている。

Sphk1WTマウス及びKOマウスにおいて関節炎の発症の程度,時期,頻度いずれにおいても差異を認めないという結果は,S1Pの炎症への関与という観点から見るとSphk1KOマウスにおけるSphk2による代償機転の関与を示唆すると考えられたが,この点については今後の検討が必要である。
分子モーターの動作機構のマルチスケールな解析 : 全原子・粗視化シミュレーション

分子モーターの階層的なダイナミクスを全原子・粗視化シミュレーションを駆使して解析して、その動作機構を明らかにするという研究目的の中で、最終年度である本年度は、アクトミオシンの弱結合状態の粗視化シミュレーションのまとめと強結合状態の全原子シミュレーション、F_1-ATPaseの回転メカニズムに関する全原子シミュレーションを行った。まず、アクトミオシンに関しては、デバイ-ヒュッケル型静電相互作用を用いた粗視化モデルで、弱結合状態のシミュレーションを行って、解離定数の塩濃度/温度依存性や弱結合状態の複合体構造を調べた結果を論文にまとめて投稿した。また、強結合状態に関しては、アクチン3量体+ミオシンの系で、溶媒を陰に考慮したモデルで全原子シミュレーションを引き続き行った。次に、F_1-ATPaseに関しては、ATP加水分解後のリン酸解離と共役した回転子γサブユニットの40度回転のステップに注目をして、γサブユニットの回転が引き起こすαβサブユニットの構造変化と、リン酸解離の回転角依存性のメカニズムを全原子シミュレーションにより解析した。具体的には、γサブユニットに拘束をかけて回転させてやり、各回転角度で緩和シミュレーションを行って、γサブユニットの回転が引き起こすαβサブユニットの構造変化を観察した。その結果、αβ界面の構造変化を見いだした。また、リン酸解離の回転角依存性を定量的に調べるため、熱力学積分法を用いた結合自由エネルギー計算を行った。この研究は、アメリカ国立衛生研究所のHummer博士のもとに約10ヶ月間研究留学して、ディスカッションを重ねた結果、可能になった。分子モーターの階層的なダイナミクスを全原子・粗視化シミュレーションを駆使して解析するという研究目的の中で、本年度は粗視化シミュレーションに重点をおいて研究を行った。まず、現実的な蛋白質間粗視化力場の開発を行った。これは、静電相互作用と疎水性相互作用からなるアミノ酸配列依存の普遍的なものである。疎水性相互作用に関しては、コンタクトエネルギーを用いた二体力相互作用と各残基の埋もれ度を計算する多体相互作用の2種類の相互作用を試した。また、蛋白質間結合の過程で柔らかなループの動きが重要になることがあるので、ループの部分の分子内相互作用を全原子シミュレーションの結果を再現するように決めた。以上のモデルをアクチンモノマー19個からなるアクチン繊維とミオシンIIの系に適用をした。まず、静電相互作用のポテンシャルエネルギー地形を調べると、先行研究[Takano, Terada and Sasai(in press)]に見られるようなポテンシャルの坂を確認し、実際5,10nmの一方向性のステップを観察することができた。次に、疎水性相互作用のエネルギー地形を、上述の2種類の相互作用を個別に用いて比較した。その結果、二体相互作用の場合のエネルギー地形は非現実的なほどでこぼこしてしまうのに対して、多体相互作用だと比較的なだらかで現実的なエネルギー地形が得られることが分かった。さらに、従来言われてきたアクトミオシン複合体構造とは違う場所の疎水性相互作用エネルギーが安定になることを発見し、現在も解析中である。また、より信頼性の高い粗視化モデル構築のために、解離定数など実験値を再現するようにパラメータ決めを現在行っているところである。分子モーターの階層的なダイナミクスを全原子・粗視化シミュレーションを駆使して解析して、その動作機構を明らかにするという研究目的の中で、本年度は主にアクトミオシンの弱結合/強結合状態をそれぞれ粗視化/全原子シミュレーションで解析した。まず、弱結合状態の粗視化シミュレーションについては、分子間相互作用としてデバイ-ヒュッケル型静電相互作用を用いたモデルで、タンパク濃度を調節するため複数の大きさの球に閉じ込めて長時間分子動力学シミュレーションを行うことで、解離定数を計算した。その解離定数の塩濃度/温度依存性を実験と比較したところ、定性的には良い一致が見られた。特に、温度が上がるにつれて結合標準自由エネルギーが下がるという現象に関して、従来は、疎水性相互作用等のエントロピー駆動によるものという解釈がなされてきたが、水の誘電率の温度依存性とタンパク濃度の標準状態の取り方を考慮すると、今回用いた静電相互作用モデルで実験結果が説明できることを示した。この結果は、今までエントロピー駆動型結合とされてきた他の系に関しても静電相互作用の寄与を示唆するもので、タンパク質間結合の本質の解明に貢献しうるものであると考える。次に、強結合状態に関しては、アクチン3量体+ミオシンの全1905残基という大きな系で、溶媒を陰に考慮したモデルで全原子シミュレーションを行っている。その結果、ミオシンのクレフトの開閉と結合エネルギーとの間に相関が見られ、結合親和性の調節機構の一端を解明しつつある。また、F_1-ATPaseの階層的なダイナミクスを網羅的なX線構造の比較から解析した結果をまとめて、論文として発表した。