hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外光計測法による脳酸素状態モニタリング

今回の結果上り、脳血流の完全停止時には、SjvO2やS-100b蛋白が脳障害あるいは脳酸素化状態の変化を反映しない可能性が示唆された。一方、cyt.ox.では血流が完全に停止した状態でも脳内酸素化状態をリアルタイムに検出できることが判明した。<今後の展開>次年度は、このモデルを用いて急速復温や空気塞栓による脳障害発生がcyt.ox.のパターンから評価できるのかを検討すると同時に、cyt.ox.の還元パターンを指標にcyt.ox.の還元状態を正常化するような脳管理を行った場合、脳予後が変化するのかを検討したい。体外循環中に発生する脳障害の早期検出および病態把握対する近赤外光計測法(NIRS)によるチトクロームオキシダーゼ(cyt. ox.)測定の有効性を評価する目的で、イヌに低体温下完全循環停止(脳血流停止)モデルを作成し、cyt. ox.の酸化還元状態と、各種パラメータおよび術後脳障害の程度を比較検討した<方法>イヌに対外循環を導入し体温を低下させ(25°Cと15°C)完全循環停止を60分間行った後復温し、対外循環を離脱するNIRS測定プローブは頭蓋骨に固定し、超音波血流計は頸動脈に装着.内頸静脈酸素飽和度(SjvO2)を連続的にモニタし、同時に脳細胞由来のS-100b蛋白の血中濃度を経時的に測定した.さらに近年NIRS装置(NIR300)で測定したcyt. ox.の変化がヘモグロビンのartifactであると報告された(Pediatr Res 49:770. 2001)ため、NIRO300と我々の4波長解析装置でcyt. ox.測定の信頼性に関して比較検討した<結果および考察>SjvO2は低体温に伴い上昇したが、完全循環停止時はあまり変化せず、対外循環再開により大きく低下したS-100b蛋白は完全循環停止時には緩除に還元された今回の結果より、脳血流の完全停止時にはSjvO2やS-100b蛋白が脳障害あるいは脳酸素化状態の変化を反映しない可能性が示唆されたが、cyt. ox.は血流が完全に停止した状態でも脳内酸素化状態をリアルタイムに検出出来ることが判明した一方、cyt. ox.の測定信頼に関しての実験では、対外循環下に純窒素で5分間の低酸素状態を作成するとcyt. ox.NIRO300ではほとんど変化せず、4波長解析では大きく還元が見られたシアン投与後に血液を希釈してNIRO300ではヘモグロビンの変化に伴いcyt. ox.は大きく還元されたが、4波長解析ではほとんど変化しなかった以上の結果より、我々の4波長解析はNIRO300とは異なり、cyt. ox.の酸化還元状態を正確に反映している可能性が示唆された
転写因子の機能解析から探るアスペルギルス属カビのアミラーゼ生産制御機構の多様性

C2H2型転写因子FlbCは、glaBのみならず固体培養で発現が大幅に上昇するプロテアーゼ遺伝子pepA、nptA、nptBや酸性カルボキシペプチダーゼocpA、cpIの発現にも関与していることを明らかにした。glaBはプレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件により誘導されることが知られているが、flbCの発現に関わらずglaBは両条件が揃わないと発現量が上昇しなかった。麹菌のMAPK遺伝子5種類それぞれの破壊株を用いて、メンブレンを敷いたプレート培養上でGlaBの生産を調べた結果、50 mMのCaCl2を含む最小培地においてGlaBは野生株では生産されず、ΔhogAとΔmpkC株において生産が認められた。同様の条件でmpkCとflbCの二重破壊株ではGlaBの生産が大幅に減少した。このことから、MpkCがFlbCを負に制御することによりglaBの発現を制御していることが示唆された。黒麹菌においてamyR、creAを欠失させた株をデンプンプレート培地で生育させたところ、ΔamyR株において著しい生育の悪化が見られたものの、野生株と同等のハローが見られたことから、ΔamyR株においてもアミラーゼが生産されていることが示唆された。小麦ふすまを基質とした固体培養ではΔamyR株は著しい活性の低下は見られなかった。ΔamyR株の酵素液を低pH処理すると酵素活性がほぼ見られなくなった。ΔamyR株においてamyAの発現は野生株とほとんど大差なかった一方でasaAの発現は見られなくなった。ΔcreA株では野生株と比較しamyAの発現は同程度であったのに対しasaAの発現は上昇する結果となった。以上の結果より、asaAは黄麹菌と同様の制御機構で制御されているのに対し、amyAはAmyRとは異なる転写因子によって制御されていることが示唆された。FlbCが制御する有用分泌酵素遺伝子として、glaB以外にも固体培養で発現が大幅に上昇する酸性・中性プロテアーゼ遺伝子や酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子の発現に関与していることを明らかにすることができた。また、プレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件が揃わないと発現量が上昇しないことも明らかとなった。さらに、麹菌の5種類のMAPキナーゼのうちMpkCがFlbCを負に制御することによりglaBの発現を制御していることを示唆する結果が得られたことは成果として評価できると考えている。一方、黒麹菌におけるamyRおよびcreA破壊株を用いた研究から、黒麹菌の生産する耐酸性α-アミラーゼ遺伝子はAmyRとCreAの制御を受けるものの、非耐酸性α-アミラーゼ遺伝子はそれらの制御下になく、AmyRとは異なる未知の転写因子によって制御されていることが示唆される結果が得られたことも評価できると考える。1)AmyR活性化基質のイソマルトースの細胞内輸送に関わるイソマルトーストランスポーターとイソマルトースのセンシングに関わるイソマルトースセンサーをゲノム情報と変異株スクリーニングから特定し、遺伝子破壊やアミノ酸置換変異などによりその機能を明らかにする。2)細胞内および細胞外α-グルコシダーゼのイソマルトース変換に及ぼす寄与について解析することにより、AmyR活性化への関与を明らかにする。3)転写因子FlbCが結合するシスエレメントをゲルシフトアッセイとChIP解析などにより同定するとともに、AmyRとの相互作用を調べることで協調的な発現制御機構を明らかにする。4)黒麹菌においてAmyRとFlbCの遺伝子破壊株を用いて、アミラーゼ生産への影響を解析するとともに、AmyRの活性化とFlbCの機能を調べることにより、麹菌とA. nidulansのアミラーゼ生産制御機構との相違の有無を明らかにする。麹菌のMALクラスター内に存在するmalTにコードされている細胞内α-グルコシダーゼのタグ化タンパク質を精製し、マルトースを基質にして反応産物を調べたところ、グルコース以外にもイソマルトースやパノースを生成することが明らかとなり、MalTが糖転移活性を示すことが示された。また、転写因子MalRに存在する2種類の推定核移行シグナル(NLS)のそれぞれに変異導入したGFP融合体を作製し細胞内局在を調べた結果、NLS1に変異導入したMalRとNLS2に変異導入したMalRでは比較的強い蛍光が核に認められるものの菌糸全体にも蛍光が観察された。一方、NLS1とNLS2の両方に変異導入したMalRでは核内に蛍光は観察されなかったことから、NLS1およびNLS2の両配列に変異導入することでMalRの核局在能が失われることが明らかになった。麹菌flbC破壊株では酸性プロテアーゼの活性が著しく低下し、固体培養特異的な発現を示す酸性プロテアーゼPepAと中性プロテアーゼNptBの遺伝子発現はほとんど認められなかった。一方、アルカリプロテアーゼAlpA遺伝子はflbC破壊株で僅かに発現が上昇しており、興味深いことに、野生株ではほとんど発現が認められなかった中性プロテアーゼNptA遺伝子がflbC破壊株で発現が顕著に上昇していた。中性プロテアーゼでは主要な2つの遺伝子がFlbCによって逆の発現制御を受けており、これがflbC破壊株で中性プロテアーゼ活性に大きな影響が現れない理由であると考えられた。液体培養で構成的にflbCを発現させると、glaB及びpepAの発現が認められるようになり、グルコアミラーゼ活性も上昇することが示された。

glaBのプロモーター領域を用いたFlbCのゲルシフト解析により、当初予想していたGCボックスとは別の配列に結合する可能性が示唆された。黒麹菌のアミラーゼ生産制御ならびに固体培養特異的な遺伝子発現制御の解析を目的として、amyR、flbC、creAのそれぞれのオーソログ破壊株を作製した。麹菌でHis-tag付加したMalTを精製して、イソマルトースへの糖転移活性を明らかにした。また、MalRの核移行シグナルを明らかにした。FlbC破壊株と相補株の解析から、FlbCがglaBだけでなく酸性プロテアーゼ遺伝子pepAと中性プロテアーゼ遺伝子nptBの固体培養における発現を正に制御していること、逆にもう一方の中性プロテアーゼ遺伝子nptAの発現を抑制しているという興味深い結果を得ることができた。また、ゲルシフト解析により、当初予想したGCリッチ配列とは異なる配列に結合する可能性があることを認めた。さらに、黒麹菌のamyR, flbC, creA破壊株を得ることができており、次年度の解析実験のための基盤が確立できた。一方、イソマルトーストランスポーターとレセプター候補については、ゲノム情報から可能性のある遺伝子の抽出だけにとどまった。以上のように、一部は未達の課題はあるものの、研究はおおむね順調に進んでいると判断する。C2H2型転写因子FlbCは、glaBのみならず固体培養で発現が大幅に上昇するプロテアーゼ遺伝子pepA、nptA、nptBや酸性カルボキシペプチダーゼocpA、cpIの発現にも関与していることを明らかにした。glaBはプレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件により誘導されることが知られているが、flbCの発現に関わらずglaBは両条件が揃わないと発現量が上昇しなかった。麹菌のMAPK遺伝子5種類それぞれの破壊株を用いて、メンブレンを敷いたプレート培養上でGlaBの生産を調べた結果、50 mMのCaCl2を含む最小培地においてGlaBは野生株では生産されず、ΔhogAとΔmpkC株において生産が認められた。同様の条件でmpkCとflbCの二重破壊株ではGlaBの生産が大幅に減少した。このことから、MpkCがFlbCを負に制御することによりglaBの発現を制御していることが示唆された。黒麹菌においてamyR、creAを欠失させた株をデンプンプレート培地で生育させたところ、ΔamyR株において著しい生育の悪化が見られたものの、野生株と同等のハローが見られたことから、ΔamyR株においてもアミラーゼが生産されていることが示唆された。小麦ふすまを基質とした固体培養ではΔamyR株は著しい活性の低下は見られなかった。ΔamyR株の酵素液を低pH処理すると酵素活性がほぼ見られなくなった。ΔamyR株においてamyAの発現は野生株とほとんど大差なかった一方でasaAの発現は見られなくなった。ΔcreA株では野生株と比較しamyAの発現は同程度であったのに対しasaAの発現は上昇する結果となった。以上の結果より、asaAは黄麹菌と同様の制御機構で制御されているのに対し、amyAはAmyRとは異なる転写因子によって制御されていることが示唆された。FlbCが制御する有用
爆発的水底噴火モデルの構築

島根半島の中新世水冷火山弾について気孔数密度分布と孔隙率を調べ、それらがストロンボリ式噴火と同様の過程で生産されたことを明らかにした。次に、島根半島の中新世浅海底火砕丘の噴出物が火道充てん堆積物よりもかなり細粒で、火砕粒子が放出されてから定置するまでの間にさらに粉砕される可能性を指摘した。また、奥尻島勝澗山火山において、外来水に触れた高温の珪長質メルト/ガラスが水冷と水和によって破断するとともに、水が爆発的に体積膨して繰り返し発生した火砕サージの事例を見出した。これらの事例研究は、爆発的水底噴火では火道内での過程に加えて噴煙やメルトに取り込まれた外来水の果たす役割が重要であることを示す。水深2001500mの海底に噴出したとされている松江市諸喰付近の前期中新世安山岩は、水に急冷されて生じた細かな収縮割れ目が発達する水冷火山弾とその砕片からなる水中降下堆積物と噴火に直接由来する水底密度流堆積物などからなり、法田から馬上り鼻まで東西2.5km南北0.8kmの範囲に分布する。馬上り鼻東方では同質の水冷自破砕溶岩・枕状溶岩がこれに重なる。火砕岩と直下の黒色泥岩との間には上方に朝顔状に開いた火砕岩と同質の安山岩が貫入している。これは火砕岩と同源で、そこから派生した岩脈は火砕岩に貫入してペペライトを形成している。火山弾は水冷された徴候が顕著で有り、段階的に熱消磁したところ、590620 °Cで磁化強度が初生磁化の5%に減少したことから、これより高温で水中に放出されたことが示された。この熱残留磁化は偏角141.4°、伏角-58.8°付近に集中しており、着底直前から直後にかけて磁化し、そのまま定置したことがうかがえる。火山弾の気孔を対象とした直径と累積数密度との関係、直径に対する数密度の比と直径との関係は、気泡の核形成と成長、合体が連続的に進行したことを示す。しかし、火道を上昇中にこれらが起こったとしても、数密度(100700/mm^3)、孔隙率(1528%)とも爆発的噴火を起こすには気泡の数も体積も小さすぎることもわかった。このことは、噴火に直接関係した気泡はマグマ溜まり上部に濃集して合体し成長して、マグマとともに浮力を得て火道を上昇し、水中で爆発したことを示唆する。その結果生じた降下堆積物がその後の噴火で崩壊し、密度流が発生すれば火山弾とそれらの砕片からなる密度流堆積物がもたらされる。火山礫・粗粒火山灰粒子主体の多重層は、気泡が少ないにも関わらず破断が進行していることから、火道に流入した水とマグマとの爆発的反応(マグマ水蒸気噴火)で生じたと考えられる。島根半島佐波湾から外海へと続く海食崖には中期中新世に半深海から浅海へと成長した海底複合火山の断面が露出する。その最下部は湾奥の両岸に露出する安山岩枕状溶岩で、湾の東岸ではこれに水冷スパター、玄武岩質安山岩の破片からなる水底噴火起源タービダイト、水深100m以浅に生息する生物の遺骸や生痕をまれに含む火山源再堆積物が順に重なる。西岸には直径450mの複合火道があって火道周辺の溶岩火砕岩に類似した岩石の破片がこれを埋めている。火道内にあって壁に直に接しているのは強溶結した安山岩スパターで、その内側には、細粒物に乏しい玄武岩質安山岩角礫岩、同質のアグルチネートとこれに漸移するコーンシートがあり、さらに内側に再び玄武岩質安山岩角礫岩が現れる。東岸の水冷スパターは火道を埋積する強溶結スパターと同質で、強溶結スパターのブロックを取り込んでおり、ストロンボリ式噴火に似たマグマ爆発で水中に放出されて火口周辺に堆積したものと解される。また、火道中の玄武岩質安山岩角礫岩は対応する溶岩が外部にはないので、水冷破砕またはマグマ水蒸気爆発で生じた角礫が火道内にとどまったものと考えられる。水冷スパター直上のタービダイトには斜交層理や火炎構造、ブロック・サグなどがあって、これが直近の火道方向から流れてきたことを示唆する。これを構成する岩片は、火道内のアグルチネートやコーンシートと同質で様々な程度に発泡しているが、細粒で平滑な破断面で囲まれているものが多い。これは、ハワイ式もしくは強いストロンボリ式噴火に似たマグマ爆発で火山ガスと共に噴煙柱をなして放出された後、噴煙柱に取り込んだ水によるマグマ片の水冷破砕と,加熱された水が水蒸気に変わる急激な体積膨張によるマグマ片のジェット粉砕の結果と考えられる。研究対象とした火山岩が予想よりも広い範囲に分布していて噴出中心の複雑な構造構造を復元するのに手間取り、噴出物が変質しているために組織の解析にも時間がかかっている。本研究では爆発的水底噴火モデルの構築に向けて各年度に1つずつ代表的事例をとりあげて、噴出物から読み取れる噴火プロセスを検討した。

初年度は、島根半島諸喰の、水深200m以深で放出された水冷火山弾とその破片をとりあげ、気孔数密度分布と孔隙率、産状などから、それらが陸上のストロンボリ式噴火と同様の噴火プロセスで生産された可能性が高いことを示した。次年度は島根半島佐波湾で見つかった海底複合火砕丘の断面をとりあげ、そこに凍結されている気泡の成長・合体に伴う噴火プロセスを記述するとともに、水中に放出された火砕粒子が火道内で形成された火砕粒子よりも細かく粉砕されていることを見出した。これは、噴煙が水中に放出され密度流となって流下する過程で水を取り込み、それが急激に体積膨張して粉砕を促進したことを示唆する。最終年度は、奥尻島勝澗山火山から繰り返し噴出した火砕サージ堆積物を調べた。この火砕サージは破断面に囲まれた流紋岩パーライト片からなるが、個々の破片内部に生じた真珠岩様割れ目を粒子表面の破断面が切っている。また、火砕粒子に含まれる構造水のD/H比は外来水とメルト/ガラス中のOHとの間で水素同位体交換が高温で起こったことを示唆する。真珠岩様割れ目は、高温のメルトが水に接して水冷破砕し、水和するにつれてガラス転移温度(400500°C)付近まで冷えて膨張、破断して生じる。地下の閉じた系でこれが起こると、外来水が加熱されて生じた水蒸気が割れ目内にとどまって内圧を高め、マグマ上昇に伴う圧力変化や振動が引き金となって爆発に至る可能性が高い。このようなメルト/ガラスと外来水との爆発的反応は後続のメルト/ガラスが次々と外来水と接触すれば繰り返し起こりえる。本研究でとりあげた爆発的水底噴火の3つの事例は、火道内でのプロセスに加えて、噴煙及び溶岩内部に取り込まれた外来水の果たす役割が重要であることを示す。島根半島の中新世水冷火山弾について気孔数密度分布と孔隙率を調べ、それらがストロンボリ式噴火と同様の過程で生産されたことを明らかにした。次に、島根半島の中新世浅海底火砕丘の噴出物が火道充てん堆積物よりもかなり細粒で、火砕粒子が放出されてから定置するまでの間にさらに粉砕される可能性を指摘した。また、奥尻島勝澗山火山において、外来水に触れた高温の珪長質メルト/ガラスが水冷と水和によって破断するとともに、水が爆発的に体積膨して繰り返し発生した火砕サージの事例を見出した。これらの事例研究は、爆発的水底噴火では火道内での過程に加えて噴煙やメルトに取り込まれた外来水の果たす役割が重要であることを示す。研究対象とした火砕岩の分布が予想よりも広い範囲に分布していて、船でないとアクセスできない露頭があることもわかった。このため、火砕岩がなす火山の形態の把握と追加試料の採取に手間取り、データ処理が遅れているところがある。複雑な火道の構造はほぼ見えてきたので、これから雪解けを待って次の対象に取り掛かるまでの間に、できるだけ数多くの噴出物の岩石組織を解析する予定でいる。火山地質学研究2年度目の調査研究対象が地理的に近く、また、研究手法も共通していることから、これと併せて遅れている作業を補う予定である。
現代社会日本における「教育・子育て」の社会哲学的布置

本研究は、現代日本社会における「教育・子育て」のありようを主として法哲学的・社会哲学的な分析枠組みを用いて探究することを目的とした。広く、教育および子育てに含まれる哲学的問題は、子ども観をどのように見るのかという問題とそこからどのような処遇が望まれるのかという問題となる。その際にどのような道具立てが有効かを検討した。特に、「子どもの権利」という観念を研究の中心に据え、そこでの法哲学的含意(権利語法の意義と課題等)を種々の角度から検討した。本研究は、現代日本社会における「教育・子育て」のありようを主として法哲学的・社会哲学的な分析枠組みを用いて探究することを目的とする。基本的に文献資料を用いた研究を想定しているが、副次的に学校や児童福祉施設、フリースクールなどの諸機関(に属する人物)に聞き取り・調査などを行う予定である。初年度である平成21年度は、本研究における柱的な論点・問題枠組みの各論点に結節するような意図を持って、文献資料を収集し、そこでの個別論点を整理することを基本的作業とした。具体的には、1.「国家-親-子ども」の三者の立場を代表する議論の検討に資する資料・文献の収集、2.公教育の中立性に関する文献・資料の収集、3.拙著『関係的権利論』出版時期以降の子どもの権利に関する文献の収集、4.子ども論の類型化に役立つような議論を探索し、関連する文献の収集である。以上の資料収集・論点整理に加えて、初年度は次年度の「頭出し」として、平成21年9月に札幌で開催された「『地方自治と子ども施策』全国自治体シンポジウム2009in札幌」に参加した。そこでは子どもの権利条例などについて各自治体から報告がなされた。これらの情報収集が本研究のひとつの重要な検討課題につながるものであった。刊行は平成22年度になるが、法律文化社において平成22年秋に出版予定の『講座人権論の再定位』所収予定の「子どもの権利を問うこと」という論文を執筆した(平成22年3月末に出版社に提出)。本研究の第二年度である平成22年度では、初年度の資料収集・論点整理を踏まえて本格的な論点の検討に入った。「誰の子ども?」という検討すべき論点に関しては、初年度に概括的に整理検討された「国家-親-子ども」三者それぞれの立場の対立点のみならず、三者の内的連関性や複合性なども視野に入れた検討を行った。また引き続き、「子どもの権利論」に関しては、本研究の問題枠組みに資する子どもの権利論をフォローした。特に、拙著「関係的権利論」出版時期以降の子どもの権利に関する文献の収集・論点整理を行った。特に平成22年度に力を入れたものとして、「子ども論(と法哲学・社会哲学)」の整理という研究課題が挙げられる。子ども論(childhood)という論点が哲学、文化人類学、社会学、歴史学、心理学、法学、政治学等々においてどのように取り扱われているかについて、文献研究を中心に整理した。これらの論点整理が本研究の最終年度である平成23年度に生かされる。刊行は平成23年度になるが、上記研究の成果として立教法学81号において「子どもの権利論における人間学的基礎-子ども論・子ども学から」という論文を執筆した(脱稿平成23年1月)。最終年度では、本研究の全体的なまとめおよび、得られた成果の積極的な発信を執筆(論文)作成という形で行うことができた。具体的には、大江洋「子どもの権利論における人間学的考察一子ども論・子ども学から一」(立教法学2011年83号)であった。同論文においては、子どもの権利論にとっての一定の子ども論・子ども学の必要性を説き起こし、本質主義批判の視点から構造的な子ども論がいかにして成立しうるのかという論点を一定提示できたと思われる。まず、前年度(平成22年度)に執筆された論文である「子どもの権利を問うこと」(愛敬浩二編『講座人権論の再定位2巻人権の主体』2010年法律文化社所収)で残された課題を詳細に再検討した。その検討過程の中で明らかになったものとは、いわゆる「子ども論・子ども学(Childhood Studies)」の考察の必要性であった。本研究課題であるA:「国家一親一子ども」という登場する主体間の関係、B:「中立性」「平等性」「権利」という鍵となる理念間の関係、さらには、C:理論と実践、基礎と応用という考察次元問の関係の複雑さに注視しつつ、その絡み合いを丁寧に考察していく予定であった。

その中でも、Aの基礎理論たる「子ども論」について一定程度検討を進めたことは課題を残しつつも、一定の研究成果であったと言えるだろう。また、本研究の成果は、SC研究会一「構造改革型」統治システムの学際的研究で平成23年12月25日に行われた研究会(上智大学四谷キャンパス)において「『子どもの権利』をめぐる関係性のありよう」として発表された。
固体高分子形燃料電池用インテリジェントパワーコンバータの開発

固体高分子形燃料電池(PEMFC)に電気二重層キャパシタ(EDLC)を組み合わせることにより,PEMFCの長寿命化と高い応答性が実現されるが,これらの負荷配分が課題となる。すなわちPEMFCの顕著な劣化を引き起こす負荷変動を抑えつつ,EDLCのSoC(State of Charge)を定格の範囲内に収める必要がある。本研究ではこのようなエネルギーマネジメントを実現可能なパワーコンバータを開発するために,まず数値モデルを用いてPEMFCの負荷変動条件と劣化速度の関係を推定し,これらよりPEMFCが劣化しやすい負荷変動を避けつつ,EDLCのSoCを定格内に収めるような制御手法を検討した。本研究の目的は固体高分子形燃料電池(PEMFC)用の劣化低減と診断を行うためのパワーコンバータの開発である。これまで我々は,PEMFCに電気二重層キャパシタ(EDLC)を組み合わせることで,PEMFCの長寿命化を実現し,またPEMFCの電気化学診断を可能にしている。本研究ではこれを更に発展させ次の目的を達成することである。(a)PEMFCを劣化する負荷変動を明確にし,より適切なパワーマネジメントを実現する。(b)PEMFCの診断情報から補機を制御し出力・安定性を向上させる。平成25年度は,まず(a)に関して前段階としてPEMFCの劣化速度を推定するためのシミュレーションの開発を進めた。PEMFCの触媒層と電解質膜の一次元シミュレーションを構築し,負荷変動時の電位分布の過渡的な変化を計算することに成功した。これまでの数値シミュレーションではPEMFCが劣化しはじめる電位が実験とシミュレーションで異なっていたが,電解質膜内のイオン移動の遅れを考慮することにより,これらが一致させることができた。この成果により,PEMFCの負荷変動と劣化の関係をより正確に推定することができる。また,PEMFCとEDLCのパワーマネジメントについてはEDLCの電圧値に長時間周期のLPFを適用した値をベースにPEMFCの電圧目標値を決定することでPEMFCの劣化が顕著な周波数の負荷変動を避けられることを明らかにした。さらに,(b)に関しては我々が過去に開発したパワーコンバータによるPEMFCの交流インピーダンス診断技術の精度向上を検討した。回路定数や制御プログラム,PEMFCへ印加する交流信号の最適化などにより,より正確な測定と測定する周波数帯の拡大を実現した。平成26年度は平成25年度で開発した数値シミュレーションをベースに白金表面積低下が顕著に起こる負荷変動の周波数を正確に再現することを検討した。白金を触媒としたPEMFCは負荷変動が起こると,白金溶解やオストワルド成長による白金粒子の表面積が小さくなり出力が低下することが知られている。しかしながら実験ベースでは一部の周波数帯でのみ負荷変動の周波数と白金表面積低下が明らかになっていなかった。開発した固体高分子形燃料電池(PEMFC)と電気二重層コンデンサ(EDLC)のハイブリッド電源においては,これらの情報は制御器を設計する上で非常に重要である。これまでの数値シミュレーションでは特に高周波域での白金表面積低下については再現できていなかった。本研究ではこれを白金イオンの拡散速度による影響と考えモデルの変更を行った。具体的にはDarlingらの白金の直径を2値化し簡略化したモデル(2005)を元に,白金近傍とバルク間の白金イオンの濃度差による拡散を導入した。その結果,スイッチングによるリプルが関係する100kHz程度から,負荷変動が関連する0.01Hz程度の周波数全域において白金表面積低下量が報告されている実験結果と定性的に一致した。すなわち0.11Hzの周波数において白金表面積の低下が顕著に起こることが示される。本成果はPEMFCとEDLCのハイブリッド電源においてPEMFCの劣化を低減するためのエネルギーマネジメントに有効に利用できる。エネルギー工学パワーコンバータによるPEMFCの診断の精度向上に計画よりも時間がかかってしまったため,補機類の制御は完了していない。その他については計画通り進行している。平成26年度は開発したPEMFCの劣化を推定するシミュレーションにより,PEMFCが顕著に劣化する条件(例えば運転電圧や変動幅や周波数)を明らかにし,PEMFCの劣化を最小限にするための制御手法を確立する。制御については,まずは数値シミュレーションにて検討し,必要なEDLCの容量等についての見積等を行う。次に,平成25年度に未完了であった補機類の制御についても実現する。具体的にはPEM水分量をパワーコンバータから得られた交流インピーダンス特性から推定し,これらを空気供給系と温度調節器へフィードバックする。改良したパワーコンバータの試作が予定より順調に進み,購入する消耗品が最小限で済んだことと,一部未完了の課題があったためその分の費用に余剰が生じたことから,未使用額が生じた。

PEMFCの劣化を最小限にするためのパワーコンバータの制御手法を確立することと,補機類の制御を実現するために,実機検討を行うための電子部品類,PEMFCの動作に必要な消耗品,制御用のPCなどの購入をする。
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ヒルギ科構成属、およびその近縁群と考えられているAnisophyllea科、フトモモ科、ホルトノキ科構成属のDNAを抽出し、葉緑体DNA上のrbcL遺伝子の塩基配列約1300bpを解析した。材料に用いたのはヒルギ科構成属の9属(Rhizophora,Bruguiera,Kandelia,Ceriops,Carallia,Gynotroches,Pellacalyx,Crossostylis,Cassipourea)、Anisophylleaceaeから2属(AnisophylleaとCombretocarpus)、フトモモ科から2属(SyzygiumとEugenia)、ホルトキノ科から1属(Elaeocarpus)である。解析した結果をもとに最節約法、近隣結合法で系統樹を作製した。その結果、次の事項が明らかになった:1.ヒルギ科は単系統群である。2.Anisophyllea科はフトモモ科よりもヒルギ科から離れており、広義のヒルギ科(Anisophylleaceaeもヒルギ科に含める見解)は支持されない。3.マングローブ生の4属(Rhizophora,Bruguiera,Kandelia and Ceriops)は単系統群である。4.tribe Gynotrocheae(Gynotroches,Pellacalyx,Carallia,Crossostylis)は側系統群になり支持されない5.tribe GynotrocheaeとRhizophoreaeの構成属(Rhizophora,Bruguiera,Kandelia,Ceriops)は単系統である。系統樹への形質再配置から市議の事項が考察された:1.ヒルギ科植物のマングローブへの進出は1回だけ起こったことで、この際に種子の胎生発芽と耐塩性の特徴を獲得した。2.stiltタイプの気根の獲得は内陸生の段階で獲得したもので、マングローブ生への移行に伴う獲得形質ではない。3.雄蘂の多数化と雌蘂の多心皮化は複数の分類群で平行して起こっている。4.ヒルギ科全体としては子房上位→子房半下位→子房下位の進化が起こっている。但し、GynotrochesとRhizophoraで平行して逆方向への変化が起こっている。ヒルギ科としての共有派生形質は子房壁の樹脂含有細胞層と托葉内部の粘液腺(colletor)が該当する。しかし、これを言い切るためには、本研究の対象以外の分類群の系統上の位置が確固たるものになることが必要である。
大気吸込式レーザー推進機の吸気バルブシステムの開発

大気吸い込み式レーザー推進器における一連のエンジンサイクルの中で、吸気不足による推進効率の低下は、推進器打ち上げにおける主要な問題の一つである。この推進器におけるエンジンサイクル改善を目的とし、ガソリンエンジンなどで利用されているリードバルブをレーザー推進器用に開発することを本研究では行ってきた。本年度は、レーザー推進器におけるリードバルブ開発の第一段階として、推進器内部での圧力変化や衝撃波の伝播を調べるために、可視化実験及び圧力測定を行った。可視化実験においてはレーザープラズマ及び衝撃波を100万分の1秒単位で計測し、その伝播特性を詳細に記録することに成功した。この結果から、投入エネルギーと最適な推進器の形状が判明し、推力効率の高い推進器を設計する指針を得た。一方で可視化実験と同程度の計測精度を持つピエゾ素子型圧力測定器を利用し、推進器内部の圧力測定に成功した。その結果、推進器内部での推力に寄与しない負圧部分の時間が判明し、リードバルブの作動周波数を特定することが可能となった。大気吸い込み式レーザー推進器における推力低下の改善においては、過去にリードバルブを利用した施策は過去に例がなく、また設計指針やその改善について研究がなされず本研究はその点において重要な成果を挙げた。またこれらの結果は、レーザー推進器だけでなく、高周波マイクロ波を利用した推進器など様々な先進的な大気吸い込み式推進器に利用することが可能な研究成果である。(抄録なし)大気吸い込み式レーザー推進器における一連のエンジンサイクルの中で、吸気不足による推進効率の低下は、推進器打ち上げにおける主要な問題の一つである。(抄録なし)
サプリメント療法が機械研磨インプラント体の骨結合促進に与える影響

インプラント体の表面形状はオッセオインテグレーションの短期獲得の観点から滑面な機械研磨から粗面なエッチングブラスト処理等に進化してきた。しかしながら粗面な表面処理はオッセオインテグレーションを短期間で獲得することが可能であるが、細菌の付着がしやすいという傾向を持っている。細菌が付着しにくい表面処理として滑面な機械研磨がある。しかしながら粗面な表面形状と比較してオッセオインテグレーションの獲得までに長期間を必要としている。従って、局所的アプローチに頼らない方法でオッセオインテグレーションを促進させる事が必要と考える。申請者は全身的アプローチとしてサプリメント(Synthetic Bone Mineral:SBM)療法に着目し、ブラスト処理をしたインプラント体を埋入したラットにSBMを経口摂取させた研究を行ってきた。この研究結果を踏まえ申請者はSBMの経口摂取が機械研磨の表面処理をしたインプラント体のオッセオインテグレーション獲得に寄与できるか検討を行った。実験動物は6週齢のWister系雌性ラットを、7週齢時に実験群(SBM群)および標準食群(Control群)に無作為に割り付けた。9週齢時にインプラント埋入手術を行い、埋入2週および4週後に取り出した。BMD、引き抜き強度、骨代謝マーカーおよび蛍光染色画像を群間で比較した。結果は埋入2週および4週後のBMD、引き抜き強度および骨代謝マーカーの発現量は、SBM群はControl群と比較していずれも有意に高い値を示し、蛍光染色画像ではSBM群はControl群と比較して強い蛍光を示した。以上の結果よりSBMはインプラント体周囲の骨形成を促進させる事が示された。これにより機械研磨の表面性状を有するインプラント体のオッセオインテグレーション獲得の一助となることが示唆された。そのため粗面な表面形状はインプラント周囲炎の危険因子の一つと考えられている。特にインプラント体埋入者が高齢化し様々な理由で自ら十分な口腔内清掃を行うことが不可能になった場合、インプラント周囲炎が顕在化する可能性が高いことからインプラント周囲炎に対する対策は必須である。しかしながら粗面な表面形状と比較してオッセオインテグレーションの獲得まで長期間必要とされる。つまり、インプラント周囲炎の予防とオッセオインテグレーションの獲得効率は相反するものとなり、表面形状の観点からのアプローチでは限界がある。従って、局所的アプローチである表面処理に頼らない方法でオッセオインテグレーションを促進させる事が必要と考える。これまでに申請者は全身的アプローチとしてサプリメント療法に着目し,SBM経口摂取がオッセオインテグレーションの短期獲得に寄与することを明らかにした。評価項目の中でも特記すべき結果はインプラント体の安定性に深く関わる引き抜き強度がサプリメント療法により大きく改善されたことである。今回の研究ではSBMを経口摂取させることでインプラント周囲炎に罹患しにくい滑面な機械研磨の表面処理をしたインプラント体を埋入したラットのオッセオインテグレーション獲得に寄与できるか検討を行い、さらにブラスト処理したインプラント体を埋入したラットのオッセオインテグレーションの獲得期間と比較検討を行う。平成29年度は動物実験を行った。実験動物は7週齢雌性Wister系骨粗鬆症モデルラットを使用した。実験動物の群分けは普通食を与え光機能化をしないNN群、普通食を与え光機能化をしたNV群、SBM配合食を与え光機能化をしないSN群およびSBM配合食を与え光機能化をしたSV群に分類した。実験の結果はBMDおよびBMD color imagingからSV群は他の群と比較してインプラント体周囲に有意に高いBMDを示した.この結果はSV群は他の群よりインプラント体を支える骨が多く存在することを示し.そのため引き抜き試験においてもSV群は高い値を示したと考えられる.埋入2週間後の引き抜き試験においてNV群はSN群と比較して有意に高い値を示した.この結果は光機能化によりインプラント体表面の濡れ性が向上し骨芽細胞を誘導したためだと考えられる.組織学的観察においても光機能化をしたNV群およびSV群では光機能化をしていないNN群およびSN群と比べ埋入2週間後でインプラント体周囲に骨が形成されたことを示している.埋入4週間後の引き抜き試験においてNV群とSN群は有意な差を示さなかった.この結果はSBMの効果が埋入4週間後で光機能化に追いついてきたことを示している.以上から光機能化による局所的アプローチは初期の骨形成を促進させ,全身的アプローチであるSBMは後期の骨形成を促進させることで相乗効果を得ることがわかった。

申請者は全身的アプローチとしてサプリメント(Synthetic Bone Mineral:SBM)療法に着目し、ブラスト処理をしたインプラント体を埋入したラットにSBMを経口摂取させた研究を行ってきた。この研究結果を踏まえ申請者はSBMの経口摂取が機械研磨の表面処理をしたインプラント体のオッセオインテグレーション獲得に寄与できるか検討を行った。実験動物は6週齢のWister系雌性ラットを、7週齢時に実験群(SBM群)および標準食群(Control群)に無作為に割り付けた。9週齢時にインプラント埋入手術を行い、埋入2週および4週後に取り出した。BMD、引き抜き強度、骨代謝マーカーおよび蛍光染色画像を群間で比較した。結果は埋入2週および4週後のBMD、引き抜き強度および骨代謝マーカーの発現量は、SBM群はControl群と比較していずれも有意に高い値を示し、蛍光染色画像ではSBM群はControl群と比較して強い蛍光を示した。以上の結果よりSBMはインプラント体周囲の骨形成を促進させる事が示された。これにより機械研磨の表面性状を有するインプラント体のオッセオインテグレーション獲得の一助となることが示唆された。平成29年度の研究結果からは光機能化による局所的アプローチは初期の骨形成を促進させ,全身的アプローチであるSBMは後期の骨形成を促進させることで相乗効果を得ることができることがわかった。平成30年度は骨代謝マーカーを用いることで各群における骨代謝の違いについて検討を行うことでさらに詳細な検討を行っていく予定である。さらに研究成果を報告するために学会発表および論文投稿の準備を進めていく予定である。平成29年度は動物実験を行い、予定していた実験は行うことができ一定の結果を得ることが出来た。しかし予定していた組織切片作製の委託には至らなかったため次年度の計画として繰り越した。
CD4陽性ヘルパーT細胞への細胞傷害活性付与による抗腫瘍効果の検討

本研究では,腫瘍抗原特異的なCD4+T細胞株に細胞傷害活性を付与した後,体内に戻して腫瘍を攻撃させるという新規遺伝子細胞療法の確立を最終目的とし,解析を行った。その結果,2つのT-boxファミリー転写因子, EomesとT-betについて,その遺伝子の単独導入によりCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)と同様の細胞傷害活性が付与されることが示された。またマイクロアレイ解析により,多数のCTL特異的遺伝子の発現が誘導されることも示唆された。現在,臨床応用に向けた解析用にEomes-Tgマウスを作成している。本研究は,細胞傷害活性を持たないCD4陽性T細胞に遺伝子導入により細胞傷害活性を付与する方法を開発し,クラスIIMHC結合性の腫瘍抗原ペプチドをターゲットとした新たな細胞療法の確立することを最終目的としている。今年度までに行った研究により以下のことが明らかとなった。1).CD8陽性細胞傷害性T細胞やNK細胞の細胞傷害機能を制御すると考えられているT-boxファミリーの転写因子Eomesoderminの遺伝子を,細胞傷害活性を持たないマウスヘルパーT細胞ハイブリドーマに導入することにより,FasL-Fas経路を介した細胞傷害活性を誘導することができた。PerforinやGranzymeBの発現は見られなかったが,細胞傷害性細胞に特有のケモカインやプロテアーゼなどいくつかの遺伝子の発現がEomes導入により誘導されることがマイクロアレイ解析により明らかになった。2).Eomesoderminを正常な(腫瘍化していない)マウスTh2細胞株に導入したところ,この場合はPerforinの発現誘導も見られ,FasL非依存性の細胞傷害活性が観察された。Perforin経路を特異的に阻害するConcanamycin Aを用いて細胞傷害経路の検討を行ったところ,Eomes導入株による細胞傷害はFasLも関与していることが明らかとなった。以上の結果より,クラスII MHCに提示された腫瘍抗原ペプチド特異的なCD4陽性ヘルパーT細胞に対して,Eomesodermin遺伝子を単独導入することによってCD8陽性細胞型の細胞傷害性細胞に変化させられることが示唆された。また,Eomesoderminの機能に関して,この転写因子がPerforinやGranzymeBの遺伝子発現だけでなく,FasL-Fas経路の活性化にも関与していることも示唆された。本研究の最終目的は,腫瘍抗原が主にクラスII MHCに提示されるような腫瘍に対する新たな治療法の確立,すなわち,その腫瘍抗原に特異的なCD4^+T細胞株を株化し,遺伝子導入により細胞傷害活性を付与して生体に戻し腫瘍を攻撃させるという,遺伝子細胞療法を検討,確立することである。前年度,細胞傷害活性を持たないマウスTh2細胞に対して,CD8^+キラーT細胞におけるマスター制御分子と考えられているT-boxファミリー転写因子Eomesodermin(Eomes)を導入したところ,CD8^+キラーT細胞で見られる2つの細胞傷害経路(perforin/granzyme経路とFasL-Fas経路)両方が活性化され細胞傷害活性が付与されるという結果を得た。これを踏まえて本年度には研究計画調書に記述した通り以下の事を行い,本研究計画を進展,展開させた。1.Eomesによる細胞傷害経路活性化の機序について解析するために,細胞傷害活性を持たないTh2細胞に,遺伝子導入によりperforin/granzymeを高発現させたところ,その細胞傷害活性はEomes導入株に比べて有意に低く,Eomesはこれらの分子の誘導のみならず,これらの分子が機能するための環境整備等も行っていることが示唆された。2.ヘルパーT細胞をキラーにするための導入遺伝子について複数の候補を確立すべく,CD8^+キラーT細胞中で細胞傷害活性発現に重要だと考えられているもう1つの転写因子T-betについても同様な検討を行ったところ,Eomesと同等の活性が見られ,細胞に導入する候補遺伝子として用いられることが示唆された。3.動物モデルとしては,アロ抗原をモデル抗原として用いる予定であるが,宿主マウスに生着させるために必要と考えられるFas欠損株を得ることができた。CD8^+キラーT細胞の関与をなくすために現在までにb2ミクログロブリン欠損マウスを10回BALB/cマウスに戻し交配し,BALB/cマウス由来のBリンパ腫A20.2J細胞やそれにアロ抗原(I-A^k)遺伝子を導入した細胞が生着するマウスの系の確立を目指している。本研究の最終目的は,クラスII MHCに提示される腫瘍抗原をターゲットとした新たな抗腫瘍療法の確立,すなわち,腫瘍抗原特異的なCD4+ T細胞を株化し,遺伝子導入により細胞傷害活性を付与して生体に戻し腫瘍を攻撃させるという,遺伝子細胞療法を検討,確立することである。

前年度までに,細胞傷害活性のないマウスTh2細胞において,2つのT-boxファミリー転写因子,Eomesodermin(Eomes)とT-betの強制発現の効果を検討したところ,いずれの遺伝子を単独導入した場合でもCD8+ CTLで見られる2つの細胞傷害経路(perforin/granzyme経路とFasL-Fas経路)両方が活性化され細胞傷害活性が付与されるという結果等を得た。これらの結果を踏まえて本年度は研究計画調書に記述した通り以下のことを遂行し,本研究計画を進展させた。1.ヘルパーT細胞においての重要機能分子であるCD154の発現上昇について, Eomes/T-bet遺伝子導入Th2細胞株で検討したところ,いずれの遺伝子の導入株の場合でもCD154の発現上昇が抑制されることが判明し,これらの分子はCD8陽性細胞中で細胞傷害機能の付与だけでなくヘルパー機能の抑制も行っていることが示唆された。2. Eomes遺伝子導入による遺伝子発現の変化についての知見を得るためにマイクロアレイ解析を行ったところ,GzmKやNkg7,CD160,Slamf7など主にCD8+ CTLやNK細胞で発現している遺伝子の誘導がEomes導入株で観察され,Eomesはこれらの分子についても転写誘導,促進を行っている可能性が示唆された。3. Eomes遺伝子導入細胞を生体に戻す際の副作用について解析するためにEomes-Tgマウスの作成を行った。現在まで2つのラインが得られており,導入遺伝子の発現について解析しているところである。Eomesoderminにより活性化される細胞傷害経路については,Fas欠損の1prマウスの細胞やperforin経路特異的阻害剤Concanamycin Aなどを用いることにより計画通り明確に示すことが出来た。またEomesoderminがperforinやgranzymeの誘導以外に重要な機能を持つことや,万一Eomesの使用に問題(重大な副作用等)が生じた際のバックアップ遺伝子としてT-betも使用可能であることも示され,計画が順調に遂行できたと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は動物モデル系の確立,副作用等の検討を行う予定である。モデルマウスについてはアロ抗原の使用が困難な場合に備え,バックアップとして(卵白アルブミンなどの)可溶性抗原を用いる系の確立も目指している。副作用の検討としてはEomes導入による遺伝子発現パターンを解析し,本治療法の副作用に対する予防,対処の基礎とする。また将来的にはT細胞特異的に発現させたTgマウスを作製し,CD4陽性T細胞にEomesを強制発現させた場合の,個体の免疫応答に対する影響を詳細に解析する。
片頭痛のトリガーの実態調査と解明

片頭痛は若年者に好発する慢性頭痛疾患であり、有病率(約10%)、生活支障度ともに高い。片頭痛患者の一部ではストレス、生活習慣、天候の変化など何らかの頭痛発作の誘発因子を有している。本研究では片頭痛の誘発因子の実態について調査を行い、科学的な検討を試みる。最終的には片頭痛患者のQOL向上を目指す。
血球の増殖・分化制御におけるケイシンキナーゼIδおよびεの機能解明

ケイシンキナーゼ(CKI)は、多くの細胞に発現するセリン・スレオニンキナーゼで、種を超えて保存されている。なかでもCKIδ・εは酵母で発見されたDNA複製・修復に関与するHRR25と高い相同性を持ち、空胞輸送、日内リズムや癌遺伝子Wntの信号伝達にも重要な役割を果たしている。私達は、ヒト血球におけるCKIδ・εmRNA発現を解析したところ、成熟顆粒球では末梢血単球や骨髄細胞に比し明らかな発現低下が認められ、分化に伴う発現制御の存在が示唆された。ヒト前骨髄性白血病細胞を顆粒球系に分化誘導するとCKIεmRNAの著減が見られるが、単球系への分化誘導では変化しない。マウス造血細胞32D細胞は、G-CSFやGM-CSF刺激により、CKIεmRNA発現に明らかな変化は認めなかったが、分化とともにCKIε蛋白が減少し、顆粒球分化に伴うCKIεの発現制御の存在が確認された。CKIε蛋白発現制御の機能的意義を解明するためヒトCD34^+細胞cDNAライブラリーから単離した野生型およびキナーゼ活性を消失させた変異型CKIεcDNAを、レトロウイルスベクターを用い造血細胞へ導入し、サイトカインによる分化誘導能を検討した。CKIεの過剰発現によりG-CSFおよびGM-CSF刺激による顆粒球分化が抑制された。キナーゼ活性を消失させたCKIε(dominant negative型)の導入により、サイトカイン刺激による分化の促進が逆に認められた。以上より、造血細胞においては、G-CSF・GM-CSFの刺激によりCKIεは発現調節され、その蛋白発現量の変化が直接顆粒球分化の制御に大きく関わっていると考えられた。CKIεが血球の増殖・分化異常を病態とする白血病やMDSの発症に関与しているかどうか興味のある課題である。
筋ジストロフィー原因遺伝子産物LARGEによる糖鎖の伸長機構の解明

先天性筋ジストロフィーの原因遺伝子産物の1つであるLARGEは2つの糖転移ドメインを有し、キシロースとグルクロン酸のリピート配列を形成する酵素である。本研究では、こうした2つの糖転移ドメインを有する糖転移酵素を対象にして、酵素がいかにして効率よく、一連の糖鎖伸長反応を行っているかという動的な作動メカニズムの解明を目指した。その結果、2つの糖転移ドメインを有する酵素は、各ドメインの配向を柔軟に変化させることにより、ドメイン間で基質糖鎖を受け渡し、糖鎖のリピート構造の伸長を効率的に行っていることを明らかにした。本研究は、2つの糖転移ドメインを有する糖転移酵素LARGEの糖鎖伸長機構の解明を目指すものである。LARGEの構造解析を行うため、本年度はLARGEの大量発現系の構築を試みた。カイコを利用した大量発現系の場合、大部分のタンパク質が不溶性分画に発現してしまい、構造解析に十分量のタンパク質を得ることができなかった。しかしながら、哺乳細胞を用いた浮遊培養や高密度培養を試みた結果、細胞1L培養あたり5mgタンパク質を精製することに成功した。さらには、LARGRのアクセプター基質を調製するために、4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside対して、酵素反応を行い、重合度の異なる糖鎖(3糖、4糖)を調製することにも成功した。以上のように、リコンビナントタンパク質と基質の安定的な調製法を確立したことで、次年度以降に、LARGEの基質認識を対象とした構造解析を行うための基盤を整えることができた。本研究を通じて、予定どおりLARGEの大量発現系の構築成功し、重合度の異なる基質を調製することに成功した。以上、総合的に判断して概ね順調に研究は進展している。非変性質量分析(nMS)、X線小角散乱(SAXS)、高速原子間力顕微鏡(AFM)を行うためのモデル系として、本年度はLARGEと同じドメイン構成を有する大腸菌由来のバイファンクショナルな糖転移酵素K4CPを用いた実験条件の検討に主に注力した。K4CPのSAXSの散乱プロファイルから本タンパク質の慣性半径は37オングストロームと見積もられた。すでに報告されている結晶構造から予想される散乱プロファイルと比較したところ、K4CPの溶液構造は単量体よりも2量体モデルとよく一致した。一方でnMSでは、K4CPは大部分が単量体に由来するイオンピークを与えたものの、2量体由来のピークも一部観測された。これらのことから、K4CPは溶液中では2量体を形成しており、その分子間の相互作用が弱いためnMSの条件では、2量体が解離した単量体に由来するシグナルが優先的に検出されたものと考えられる。また、高速AFMによってK4CPに由来する2輝点が近接している像が観測され、2つの輝点が揺動している様子を観察することに成功した。さらに、基質を加えることで、時間の経過とともに合成された糖鎖と考えれる構造体が伸延する様子が確認され、K4CPによる糖鎖合成の過程を捉えることができた。K4CPの2量体の結晶構造では、K4CPのグルクロン酸転移ドメインとNアセチルがラクトサミン転移ドメイン間は分子内、分子間のいずれにおいてもおよそ50オングストローム離れているが、水溶液中ではK4CPは2量体を形成するサブユニットの配向を柔軟に変化させることにより、2種類の触媒ドメインを空間的に接近させ、糖鎖のリピート構造の伸長を効率的に行っている可能性が考えられる。様々な物理化学的計測を行うことで、LARGEと同等のドメイン構成を有する糖転移酵素であるK4CPのキャラクタライズを行うとともに糖鎖伸長過程を捉えることができた。これにより、LARGEの構造解析を行う基盤が整った。本研究は、2つの糖転移ドメインを有する糖転移酵素(LARGEおよびK4CP)の糖鎖伸長機構の解明を目指すものである。昨年度までに、超分子質量分析(nMS)およびX線小角散乱(SAXS)を利用した解析により、K4CPは溶液中では2量体を形成していることが予想された。本年度は、K4CPの会合状態の濃度依存性を超遠心分析を利用して調べたところ、nMSやSAXSの測定濃度領域である0.2mg/mL以上の濃度では2量体として存在しているが、0.05mg/mLの領域では単量体として存在していた。単量体として存在していた濃度は、高速AFMによってK4CPに由来する2輝点が近接している像が観測された濃度であり、1つの輝点が1つのドメインであることが明らかになった。このような濃度依存的な2量体形成の傾向は筋ジストロフィーの原因遺伝子産物であるLARGEにも認められ、高速AFMによる観測においても、2つの輝点が揺動している様子を捉えることができた。さらに基質を加えることで、時間の経過とともに糖鎖が伸延する様子が確認され、LARGEによる糖鎖合成の過程を捉えることができた。以上より、2つの糖転移ドメインを有する糖転移酵素は、各ドメインの配向を柔軟に変化させることにより、ドメイン間で基質糖鎖を受け渡し、糖鎖のリピート構造の伸長を効率的に行っているものと考えられる。

本研究では、こうした2つの糖転移ドメインを有する糖転移酵素を対象にして、酵素がいかにして効率よく、一連の糖鎖伸長反応を行っているかという動的な作動メカニズムの解明を目指した。その結果、2つの糖転移ドメインを有する酵素は、各ドメインの配向を柔軟に変化させることにより、ドメイン間で基質糖鎖を受け渡し、糖鎖のリピート構造の伸長を効率的に行っていることを明らかにした。大量調製に成功したリコンビナントLARGEを利用して、非変性質量分析、X結晶構造解析、溶液散乱などの物理化学的手法を行うことで、LARGEによる糖鎖の伸長機構の構造基盤を明らかにすることを目指す。また原子間力顕微鏡を利用して、糖鎖の伸長過程をライブイメージで捉えることも試みる。そのためのモデル系として、LARGEと同じドメイン構成を有する大腸菌由来のバイファンクショナルな糖転移酵素K4CPを用いた条件検討も合わせて行う予定である。モデル系として利用しているバイファンクショナルな糖転移酵素K4CPに関しては、高速AFMと一分子蛍光共鳴エネルギー移動の同時計測を行うことで、糖鎖合成と分解過程における酵素のダイナミクスを一分子レベルで解析することを試みる。一方で、K4CPの研究を通じて得られた基盤技術の蓄積を利用して、LARGEによる糖鎖の伸長機構の構造基盤を明らかにすることを目指す。糖鎖生化学年度末に実験遂行のために必要な試薬があったため、次年度に使用額が生じた。3月に予定していた研究打合せを次年度に変更したため、若干の残額が出た。次年度使用額としての11,703円は年度末の試薬代として使用した。残金は物品費に組み入れて研究を進める。