hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
卓球において打球の時空間特徴が得点に与える影響の定量化

最終年度に実施した内容はボールトラッキングの自動化、映像収集、およびボールの時空間特徴と得点との関係性の解明であった。ボールトラッキングの自動化は初年度から取り組んでいたが、検出率、誤検出率の性能が想定より低く、手動で修正する時間が多くなる問題が未解決であった。2018年度は機械学習を応用することで検出率、誤検出率の性能が改善されるとともに、検出にかかる時間も大幅に短くすることができた[1]。また、映像収集については2017年度と同様に全日本卓球選手権大会において実施した。ボールの時空間特徴と得点の関係性については、2017年度に撮影した映像を対象に実施した。学会または論文への発表は達成できなかったが、2019年度内に発表できる見通しである。研究期間全体を通して達成された主要な成果は、ボールトラッキングの自動化、試合映像収集、そして打球の時空間特徴と得点の関係性を明らかにしたことである。前述したように、ボールトラッキングについては機械学習を応用することにより十分な性能を達成した。この成果により、打球の時空間特徴について2019年度以降も継続的に調査することが容易になった。第2の課題は試合映像を収集することであった。これは2017年度と2018年度に全日本卓球選手権大会での撮影を実施したことで、概ね達成できた。第3の課題であるボールの並進運動と得点の関係性については発表が遅れているものの成果は出ている。2019年度内に、これまで未解明であった卓球におけるボールの時空間特徴と得点の関係性についての知見を提供し、本研究の目標を達成する。これまでに動画像からボールの移動軌跡を自動的且つ高精度に復元する技術の開発を進めてきており、本研究の目的は、この技術を応用し、卓球における得点打の時空間的な特徴を定量的に解明することである。今年度の目標はボールの移動軌跡、打球時刻、選手の位置を計測するソフトウェアを開発することであった。アルゴリズム検証時に作成したプロトタイプをベースとし、使いやすいプログラムの作成を目指した。開発の進捗状況は当初の想定より遅れているが(1)カメラ内部パラメータの計算、(2)ボール検出、(3)ボールを用いたカメラ外部パラメータおよびカメラ間の時刻ずれの推定、が完成している。加えて(4)ボールの移動軌跡復元、(5)移動軌跡に基づく打球時刻および落球時刻の検出、(6)選手位置の計測支援、も実装する予定であったが、完了することはできなかった。既に完成しているプロトタイプからの移植に想定以上の時間がかかっていることが最も大きい理由である。プロトタイプは2視点撮影を前提としたものであり、多視点撮影に対応できるようアルゴリズムを変更する箇所があるが、非常に複雑な書き換えが必要であるため不具合が起こらないよう慎重に作業を進めている。また、プロトタイプはCUIベースであるが、本プログラムは一般の大学生をユーザとして想定しているためGUIが必須である。そのための技術調査や新たなプログラミングライブラリの習得に想定以上の時間を要している点も理由の1つである。今年度はボールの移動軌跡を計測するソフトウェア開発が完了した。当初はラリーの開始から終了までの全期間を完全に自動化できるプログラムの開発を目指していたが、選手とボールが重なる期間、コート上の白線とボールが重なる期間などはどうしてもボールの検出および追跡が不安定になった。本研究の目的は得点打の時空間的な特徴の解明であり、ボール検出の技術的な問題の解決ではない。そのためボール検出の完全自動化は諦め、ボール検出が不安定になる期間においてはボール位置を手動で計測する半自動のボール追跡プログラムを開発し、確実にボールの位置を記録できるようにした。本プログラムはGUIでの操作が可能であり、ボール検出やボール位置の記録だけではなく、ボール位置の編集も簡易に実施できるようにした。これは、ボール位置の計測作業を複数の作業者で分担できるようにするためである。競技会会場でカメラ3台を用いた映像撮影を実施し、国内トップレベルの男女選手が行う計18試合を収録した。通常、3次元計測を目的とした競技会会場における多視点撮影は難しいが、本研究では複数台のカメラを同期させず、さらにプレー領域におけるコントロールポイントの配置を省略できる計測アルゴリズムを採用するため、比較的で簡易に実施できた。昨年度から開発が遅れていたプログラム開発が完了し、当初の目標としていた試合中のボールの時空間特徴を明らかにする研究が進んでいる。今年度中に本研究で目標としている研究結果が出せる見込みであるため、進捗状況を「(2)おおむね順調進展している」と評価する。

研究期間全体を通して達成された主要な成果は、ボールトラッキングの自動化、試合映像収集、そして打球の時空間特徴と得点の関係性を明らかにしたことである。前述したように、ボールトラッキングについては機械学習を応用することにより十分な性能を達成した。この成果により、打球の時空間特徴について2019年度以降も継続的に調査することが容易になった。第2の課題は試合映像を収集することであった。これは2017年度と2018年度に全日本卓球選手権大会での撮影を実施したことで、概ね達成できた。第3の課題であるボールの並進運動と得点の関係性については発表が遅れているものの成果は出ている。2019年度内に、これまで未解明であった卓球におけるボールの時空間特徴と得点の関係性についての知見を提供し、本研究の目標を達成する。一般大学生を対象とした映像収集や分析は縮小し、その時間をプログラム開発に充てることで、来年度の前期には残された課題について解決する。並行して研究資料の収集に取り組み、プログラム完成後すぐに時空間特徴の分析を開始する。(1)昨年度に撮影した試合映像の解析を進めること、(2)さらに1大会で映像撮影を実施すること、(3)研究成果を発表すること、の3点が本研究の今後の課題となる。当初の計画では安価な撮影機器を購入する計画であったが、より高性能な機器のレンタルに変更したため、その差額分が未使用額となった。
抗アレルギー薬とドパミン関連薬物の相互作用に関する基礎的研究

抗アレルギー薬とドパミン関連薬物との相互作用を考える基礎的検討として各種抗アレルギー薬のドパミン取り込みに対する効果を検討した。in vitroにおける検討では、ラット線条体シナプトゾーム画分を[^3H]ドパミン10^<-8>Mと37°Cで5分間インキュベートし全取り込みを求め、インキュベーションを氷中で行い非特異的取り込みを求め、この分を差し引くことにより特異的ドパミン取り込みを求めた。各種抗アレルギー薬のIC_<50>は、テルフェナジン3x10^<-7>M、オキサトミド8x10^<-7>M、アゼラスチン4x10^<-6>M、ケトチフェン、トラニラスト、ペミロラスト10^<-5>M以上であった。また、抗ヒスタミン薬のクロルフェニラミンもオキサトミドと同定度のドパミン取り込み阻害作用を示した。in vivoにおける検討では、α-メチルチロシン投与後のマウス脳内ドパミンの減少から代謝回転を測定することによりドパミン取り込み阻害作用を推定した。その結果、アゼラスチンは著明な抑制作用を示したが、テルフェナジン、オキサトミドは明らかな抑制作用を示さなかった。以上の結果より、テルフェナジンは強いドパミン取り込み阻害作用を有するが通常は脳に移行しないために脳内ドパミン代謝には影響しないこと、オキサトミドも強いドパミン取り込み阻害作用を示すがおそらくそれ自身のドパミン受容体拮抗作用により作用が減弱されること、アゼラスチンも強いドパミン取り込み阻害作用を示すことが示唆され、ドパミン関連薬物との相互作用に注意が必要であることが結論された。今後、これらの作用を行動薬理学的にも明かにするために、レボドパによるマウスの運動興奮に対する抗ヒスタミン薬の作用を検討した結果、ドパミン取り込み阻害作用を有する抗ヒスタミン薬は強くその運動興奮を増強することが明かとなった。
ストレス環境における口腔機能変化の生理学的解析

慢性的なストレス環境下にある人では、無意識下の噛みしめや歯軋りなどの咀嚼筋活動が生じることは経験的に知られている。また、この現象の背後には、視床下部や大脳辺縁系など高次脳の興奮による交感神経系の関与が考えられるが、そのメカニズムはほとんど明らかにされていない。本研究は、動物を用いて様々なストレスや末梢交感神経系の興奮が咀嚼筋活動に及ぼす影響を神経生理学的方法を用いて解析することを目的とした。実験にはラットを用い、慢性実験と急性実験を行った。慢性実験では(1)ラットを4度の冷水中に入れる、(2)チューブの中に入れて拘束する、(3)無理な姿勢(立位)をとらせる、(4)不安薬(FG7142)をラットにあたえる等の操作を行った。しかしいずれの場合でも咀嚼筋に著しい活動が生じなかった。また、麻酔を施したラットの顎関節腔口にマスタードオイルを注射して痛みを与えたが、一過性の閉口筋活動を除いては咀嚼筋に著しい活動が生じなかった。すなわち、不安や痛みのようなタイプのストレスは、長期間におよぶ閉口筋活動を生じさせないと言える。今後は、どのようなタイプの慢性的ストレスが有効であるかを調べる必要がある。一方、麻酔にしたラットの頚部交感神経を刺激して閉口筋の活動を調べると、開口によって反射性に誘発された閉口筋活動(下顎張反射)は抑制された。この結果は予想に反するものであると言える。さらに、この抑制は閉口筋中の血流減少のためではなく、筋紡錘の活動が抑制されるために生じることが明らかとなった。また、交感神経の効果は中枢性に生じたものではなく、動脈に沿って閉口筋に入った末梢神経の活動によることが明らかにされた。なお、この研究はJ.Physiol.に掲載された。慢性的なストレス環境下では交感神経活動の高まることが知られている。この神経活動亢進が無意識下の噛いしばりや歯ぎしりなどによって咀嚼筋や顎関節の痛みを生じる原因になっているのではないかと考えられるので、平成5年度では先ず頸部交感神経を電気刺激した場合の咀嚼筋活動および咀嚼筋血流への影響をラットを用いて分析した。その結果、以下の結果が得られつつある。1.麻酔ラットの頸部交感神経に反復電気刺激(8V、1ms、10Hz)を与えると瞳孔が散大し、下顎張反射により生じた側頭筋、咬筋の筋活動が刺激開始後2秒以内に抑制された。この筋活動の抑制は交感神経の刺激側と同側にのみ認められた。なお、刺激終了後は逆に筋活動の一過性増大が生じた。一方、開口筋である顎二腹筋の自発性筋活動は交感神経刺激によってはほとんど影響を受けなかった。2.交感神経の切断末梢端より記録した筋感覚神経活動に対して、交感神経の電気刺激は抑制のみを生じさせた。この筋感覚神経の活動は1mm以下の僅かな開口(閉口筋の伸張)で生じ、咬筋の一過性収縮時には活動を停止したので筋紡錘の求心性神経であると考えられた。3.頸部交感神経を5秒間反復電気刺激すると咬筋のみならず、顎二腹筋の血流も減少することがレーザードプラー法を用いた記録で明らかとなった。

なお、この刺激を短時間内に反復すると血流は減少したままであった。これらの実験結果から、頸部交感神経の興奮は咀嚼筋活動を亢進せず、むしろ抑制する作用が主体であることが明らかとなった。そこで今後は交感神経薬を全身性に投与することにより、咀嚼筋活動がどのような影響を受けるかを明らかにする計画である。慢性的なストレス環境下にある人では、無意識下の噛みしめや歯軋りなどの咀嚼筋活動が生じることは経験的に知られている。また、この現象の背後には、視床下部や大脳辺縁系など高次能の興奮による交感神経系の関与が考えられるが、そのメカニズムはほとんど明らかにされていない。本研究は、動物を用いて様々なストレスや抹消交感神経系の興奮が咀嚼筋活動に及ぼす影響を神経生理学方法を用いて解析することを目的とした。実験にはラットを用い、慢性実験と急性実験を行った。慢性実験では(1)ラットを4度の冷水中に入れる、(2)チューブの中に入れて拘束する、(3)無理な姿勢(立位)をとらせる、(4)不安薬(FG7142)をラットにあたえる等の操作を行った。しかし、いずれの場合でも咀嚼筋に著しい活動が生じなかった。また、麻酔を施したラットの顎関節腔内にマスタードオイルを注射して痛みを与えたが、一過性の閉口筋活動を除いては咀嚼筋に著しい活動が生じなかった。すなわち、不安や痛みのようなタイプのストレスは、長期間におよび閉口筋活動を生じさせないと言える。今後は、どのようなタイプの慢性的ストレスが有効であるかを調べる必要がある。一方、麻酔したラットの頚部交感神経を刺激して閉口筋の活動を調べると、開口によって反射性に誘発された閉口筋活動(下顎張反射)は抑制された。この結果は予想に反するものであると言える。さらに、この抑制は閉口筋中の血流減少のためではなく、筋紡錘の活動が抑制されるために生じることが明らかとなった。また、交感神経の降下は中枢性に生じたものではなく、動脈に沿って閉口筋に入った末梢神経の活動によることが明らかにされた。なお、この研究はJ.Physiol.に掲載された。
能動的音楽鑑賞支援のための楽曲推薦技術に基づくソーシャルネットワーク構築

本研究の目的は、ユーザに対して高精度かつ優れたレスポンスで楽曲の推薦が可能な推薦技術、およびユーザがシステムとのインタラクションを通して能動的に推薦結果をコントロール可能にするための技術の開発である。まず、(1)音楽音響信号の音楽内容を自動認識し、推薦の手がかりにするための研究を行った。その結果、音楽音響信号中に含まれる多重音の基本周波数を高精度に推定する手法を開発するだけでなく、推薦アルゴリズム自体の高精度化も達成することができた。さらに、(2)ユーザが重視する音楽内容へ重み付けができるようにしたり、同じ好みを持つユーザを発見できるようにしたりするなどソーシャルネットワークとしての機能を実現するための研究を行った。具体的には、推薦システムをWEBアプリとして実装することで、インタフェースの初期的な検証を行うことができた。今後、ソーシャルネットワーク機能の強化とWEBシステムを実運用していくことが課題である。平成20年度にはまず、ハイブリッド型音楽推薦システムをRuby on Railsを用いてWEBアプリケーションとして実装した。このことは、実際に推薦精度とレスポンスが良い推薦が可能であるかを調査する上で重要である。従来の協調フィルタリング手法と内容に基づく推薦手法も併せて利用可能なように実装を行い、推薦結果を比較できるようにした。インタフェース・インタラクション関連の学会WISS2008にて無線LAN経由で各自のPCからシステムに接続できるようにしてデモ発表を行った。多くの来場者に体験してもらった結果、従来の推薦システムより好ましい結果が得られると好評を得た。今後、推薦結果を能動的に自分好みなものに変えていけるように確率モデルを改良していく下地ができた。一方、推薦アルゴリズムそのものに関しても、ユーザの好みに合う推薦を行うための有用な音楽特徴量の検討、モデルの妥当性についての検証などを行った。その結果、従来のように楽曲全体から抽出する特徴量だけでは、推薦精度の点でも、ユーザが能動的に推薦結果をコントロールできるようにする目的においても、不十分なことが明らかとなった。特に、主にポピュラー音楽を扱う上では歌唱特徴量が重要であることが分かったので、これを取り入れることでさらに柔軟かつ高精度な推薦が可能であると期待できる。複数の特徴量を統合する方式は引き続きの検討課題とする。平成21年度には、ハイブリッド型音楽推薦システムの拡張および高精度化のための技術開発を行った。従来、音楽推薦のための確率モデルは、楽曲インデクスなどの離散的な特徴量を直接扱うことができるが、音響的特徴量などの連続値を扱うためにはVQなどであらかじめ離散化しておく必要があった。しかし、音楽の様々な特徴量は多次元実数ベクトルで表現できることから、自然な方式とは言えなかった。この問題の解決を図るため、確率モデルにおける音楽特徴量の出力分布を離散分布ではなく混合ガウス分布とすることで確率モデルを再定式化し、学習アルゴリズムを導出した。さらに、大規模データを扱う場合に過学習によって推薦精度が低下する問題に対処するため、ユーザやアイテムのクラスタリングやガウス分布のパラメータタイングなどのスムージングを行う手法を考案した。実験の結果、音楽の連続特徴量を適切に扱うことができ、高精度な推薦ができることが確認できた。これらの研究成果は、音楽情報処理分野のトップ国際会議であるISMIR2009にて登壇発表を行った(投稿212件中38件)。現状では、平成20年度に開発した音楽推薦インタフェースと合わせて、ユーザ間のインタラクションを促進する音楽推薦システムの下地ができた。今後は、確率モデルの複雑さを自動で推定するようにする改良や、より実際的なWEBインタフェースへの実装に取り組むことが重要である。
ゲノム薬理学を活用する遺伝子の機能および薬物反応性の個人差の解析

β遮断薬には日本人に特徴的な変異が存在するCYP2D6の代謝を受けるものが多い。さらにβアドレナリン受容体には循環器系と関係のある機能の変化を伴う遺伝子多型がβ1,β2の型に存在する。そこで大阪府病院協会の協力によりCYP2D6による代謝が関与しているβ遮断薬が投与されている高血圧症の患者を対象として薬物反応性の個人差を調査することとした。このためβ1,β2受容体の遺伝子多型の判定法を確立し、これと同時に日本人に多いCYP2D6^*10AとCの酵母による発現系を確立し、これを用いてCYP2D6の基質となるβ遮断薬に対しての代謝活性を測定することとした。糖尿病患者についてβ受容体遺伝子多型を判定した。β1受容体のArg389Glyでは141名の検討ではワイルド群82名(59.9%)、ヘテロ群53名(36%)、ホモ変異群6名(4.1%)であった。β2受容体については174名の検討でArg16Glyではワイルド群49名(28.2%)、ヘテロ群89名(51.1%)、ホモ変異群36名(20.7%)であり、Gln27Gluにつてはワイルド群146名(83.9%)、ヘテロ群28名(16.1%)、ホモ変異群名(0%)であった。遺伝子型と臨床検査上の関連はArg16Glyでは女性においてBMIが変異を持つ群(25.17±3.7)のほうが有意に持たない群(22.17±3.9)より大きく、Gln27Gluではへテロ群(230.7±278.7mg/dl)がワイルド群(141.5±86.9mg/dl)に対して有意に中性脂肪が高値であった。発現系による検討ではCYP2D6の基質となりβ遮断薬であるBufuralolと抗うつ薬であるVenlafaxineを用いて代謝活性を測定した。Vmax/KmはCYP2D6^*1>CYP2D6^*10A>CYP2D6^*10Cであった。さらに^*10酵素の活性の低下は酵素の不安定性ならびに低発現であることも明らかとなった。今後β遮断薬の投与されている患者を対象として検討をおこなう。
血液脳関門通過性オキシム類による有機リン中毒の解毒に関する研究

地下鉄サリン事件にて,救命時解毒剤2-PAMが投与されたにも関わらず亡くなられた被害者の解剖では,末梢AChE活性は回復したが脳内AChE活性は回復しなかった.これは2-PAMのBBB通過能が乏しいたためと考えられ,よりBBB通過能の高い解毒剤の開発を検討した.脂溶性オキシム4-PAOが十分なラットBBB通過能とAChE回復能を示すことがわかり,ラットを用いたin vivo解毒実験を行った.脳内AChE活性を12.5%まで阻害したラットに4-PAOを継続静注したところ,脳内AChE活性が定量的に回復,8mg/kg投与時で79.3%まで回復し,4-PAOが新たな解毒剤となり得る可能性が示された.ヒト有機リン中毒において、中枢神経のダメージを回復させ得る血液脳関門(BBB)通過性オキシムの開発の最初の段階として、初年度は、アセチルコリン(AChE)回復能とBBB通過能の両方が期待される、以下の4-置換長鎖脂溶性オキシム類を新規合成した(研究代表者)。1.4-PAD(側鎖炭素数10)、2.4-PAL(側鎖炭素数12)、3.4-PATd(側鎖炭素数14)、4.4-PAHd(側鎖炭素数16)。前記14のうち、解毒剤としての投与に必要な水溶性を確認したところ、1は水溶性を示したが、2以降は水溶性が減少し、4は水溶性を失った。またBBB通過活性の測定に必要な透析膜通過実験を行ったところ、1は透析膜通過能を示したが、2以降は透析膜通過能が減少し、3以降は透析膜通過能を失った。以上から、1.4-PAD(側鎖炭素数10)及び2.4-PAL(側鎖炭素数12)の2つが解毒剤となり得ると考えられたため、この2化合物を用いてラットを用いたBBB通過能試験を行った(研究代表者、連携研究者)。ラット脳線条体にマイクロ透析プローブを固定し、各オキシム類を致死量の1/10投与し、細胞外液及び血液を経時的に採取し、オキシム類の細胞外液中濃度と血中濃度を比較、BBB通過能を算出した。その結果、1.4-PAD(側鎖炭素数10)が十分なBBB通過能を示した。2もBBB通過能を示したが、僅かであった。以上から、今回新規に合成したオキシム類中、4-PAD(側鎖炭素数10)がBBB通過性有機リン中毒解毒剤として最も有望と考えられた。今後は、新規合成オキシム類のAChE回復能を測定し、さらに有機リン中毒状態にしたラットへのオキシム類静注による解毒実験を行う。ヒト有機リン剤中毒において、中枢神経のダメージを回復し得る血液脳関門(BBB)通過性オキシムの候補として、ここまで新規オキシム類4種、4-PAO(側鎖炭素数8)、4-PAD(側鎖炭素数10)、4-PAL(側鎖炭素数12)、4-PAT(側鎖炭素数14)を合成したが、これらについて、今後の活用に必要な1毒性データ、2BBB通過能の数値化、3有機リン剤により阻害されたアセチルコリンエステラーゼ(AChE)回復活性について検討した。1毒性データについては、側鎖炭素数8が最も低毒性(ラット経口半致死量8.9mg/kg)であり、以下炭素数10及び12は毒性が増加した(4.3及び4.0mg/kg)。炭素数14で再度毒性が減少(9.5mg/kg)したが、これは水溶性を失い薬毒物活性を失ったためと考えられた。2BBB通過能の数値化については、対数線形回帰分析によりラットBBB通過能を数値化したところ、側鎖炭素数の延長に伴い、炭素数8で通過率30%、10で9.4%と算出された。炭素数12ではほぼ0%で、炭素数14は水溶性を失い測定不能であった。3AChE回復活性については、2-PAMに対する相対活性として、炭素数8→10の延長により46→59%の増強が見られたが、炭素数12以上では水溶性低下により測定不能であった。以上から、BBB通過性オキシムとしては、毒性、BBB通過能は水溶性と、AChE回復活性は疎水性との間に相関が見られ、そのバランスが重要であることがわかり、最もバランスの取れた4-PAO(炭素数8、最も低毒性で最もBBB通過能が高く、AChE回復活性が2番目に高い)が最も有望であることが確認された。予定している動物実験(ラット脳内アセチルコリンエステラーゼ(AChE)活性回復実験)に先立ち,ラット脳及びラット全血中のAChE活性測定法の検討を行った.ラット脳からのAChE抽出については,従来のブレード型ホモジナイズとビーズを用いた室温/凍結粉砕を比較した結果,室温粉砕法が最良であった.超音波処理を併用することでさらにAChE抽出効率は向上した.全血については,生理食塩水リン酸緩衝液で希釈するのみで測定可能であった.全血のAChE活性測定については,血漿由来酵素の妨害を避けるため,従来は血漿を洗い流して血球のみを取り出す煩雑な作業が必要であったが,AChEに特異的に反応する新規試薬MATP+を用いることで,全血を直接測定可能となった.また成果が学術論文1報に掲載された.

本研究は平成26年度までは予定通り進捗し,平成27年度に動物実験を行い終了予定であったが,平成26年度末に動物実験担当者が他部署と兼務となり以降動物実験を行えなくなったため遅れが発生した.そのため平成28年度までの期間延長をお願いすることとなり,承認された.平成27年度は,動物実験に必要な各種分析・測定法の開発を行った.これまで我々が開発した血液脳関門(BBB)通過性オキシム4-PAOの持続静注により,サリン中毒ラット脳内の阻害されたアセチルコリンエステラーゼ(AChE)を直接回復できるかどうか検討した.サリン阻害ラットは,これまで我々が開発した安定で安全なサリン類似体INMPを0.15mg/kg単回静注することにより調製した.サリン阻害ラットの脳内AChE阻害率の平均値は,コントロールラット(100%)に対し87.5%±2.3%(n=5)であった.このサリン阻害ラットに,4-PAOを2mg/kg/hの速度で0(ネガティヴコントロール),1,3,8mg/kg持続静注投与した.また同時にアトロピン0.4mg/kgを20分かけて持続静注した.INMP投与から4時間20分後に,ラット脳内AChE活性を測定した.活性測定は,AChEに特異的な試薬であるMATP+を用いて行った.その結果,ラット脳内AChE活性は,4-PAOの1mg/kg投与群では12.5%から+8.8%±5.1%(3.8%15.3%,n=5,P<0.01),3mg/kg投与群では+21.4%±6.6%(15.6%31.2%),8mg/kg投与群では+12.5%から66.8%±12.3%(56.3%81.2%,n=5)の回復が見られ,4-PAOの投与量に応じた定量的な回復が見られた.最終的に8mg/kg投与群では脳内活性が79.3%(68.9%93.8%)に達した.4-PAOの0mg/kg投与群は,INMP投与から4時間20分後でも痙攣及び起立不能の症状が持続したが,1,3,8mg/kg投与群ではこれらの症状は消失し,特に8mg/kg投与群では歩行する等ほぼINMP投与前の状態に回復した.BBB通過性オキシムの持続静注による,サリン阻害ラット脳内AChE活性の定量的な回復は,これが初めての報告となる.地下鉄サリン事件にて,救命時解毒剤2-PAMが投与されたにも関わらず亡くなられた被害者の解剖では,末梢AChE活性は回復したが脳内AChE活性は回復しなかった.これは2-PAMのBBB通過能が乏しいたためと考えられ,よりBBB通過能の高い解毒剤の開発を検討した.脂溶性オキシム4-PAOが十分なラットBBB通過能とAChE回復能を示すことがわかり,ラットを用いたin vivo解毒実験を行った.脳内AChE活性を12.5%まで阻害したラットに4-PAOを継続静注したところ,脳内AChE活性が定量的に回復,8mg/kg投与時で79.3%まで回復し,4-PAOが新たな解毒剤となり得る可能性が示された.当初の計画通り、初年度と2年目で、新規BBB通過性オキシム類4種を合成し、これらについてそれぞれBBB通過能、AChE回復活性及び毒性を明らかにし、各化合物の構造活性相関を明らかにするとともに、最も有望なオキシム1種を選定することができた。平成27年度までの研究により,有機リン剤により阻害されたAChEを回復可能で,血液脳関門を通過し,水溶性で点滴剤として使用可能で,かつ毒性の低い新規解毒剤4-PAOを見出した.平成28年度中に,本解毒剤4-PAOを用い,実際に有機リンにより阻害された脳内AChEの活性を回復可能か動物実験で確認する.すなわち,ラットにサリン類似化合物INMPを投与し,有機リン中毒状態に陥らせた後に4-PAOを投与し,血中及び脳内AChEがいずれも回復するかどうかを測定する.毒性学3年目は、ここまで合成した新規BBB通過性オキシム類の中で最も有望な4-PAO(側鎖炭素数8)について解毒作用を検証する。
原発性肺高血圧症の発症機序の解明と新規治療法の開発

原発性肺高血圧症は肺動脈の肥厚から肺動脈圧上昇、右心肥大、心不全へと進行する難治性疾患である。活性酸素種の産生酵素であるNADPHoxidaseの触媒サブユニットNox1の遺伝子欠損マウ(Nox1-/Y)において右心室および肺動脈が肥厚していることを見出した。Nox1-/Y由来の肺動脈平滑筋細ではアポトーシスの抑制が認められ、これは電位依存性カリウムチャネルの一つであるKv1.5蛋白の発現低下に伴う細胞内カリウム濃度の上昇に起因することが明らかとなった。肺高血圧症の発症機序は不明であるため根治的な療法は未だ確立されていない。申請者は活性酸素種(ROS)の産生酵素として近年注目されているNADPHoxidaseの触媒サブユニットNOX1の遺伝子欠損マウス(NOX1-KO)の右心室が著明に拡張していることを見出した。心カテーテルを用い右心室の機能について検討したところ9週齢以降のNOX1-KOにおいて異常が認められ、また肺動脈肥厚も同様に9週齢以降において認められた。肺高血圧症の病態に関与するエンドセリンおよびその受容体の発現、一酸化窒素合成酵素の発現と活性、Bone morphogenic protein(BMP)とBMP受容体、hypoxia-inducible factors(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)の発現はNOX-KOと野生型マウスに差違は認められなかった。また肺高血圧症の増悪に関与すると報告のあるNADPHoxidaseの他の触媒サブユニット(ホモログ)の発現に変化は認められなかった。肺動脈平滑筋の細胞ターンオーバーの異常が肺高血圧症の発症に関与することが知られている。細胞ターンオーバーの異常を検討するためマウス肺動脈平滑筋細胞の初代培養系を確立した。NOX1由来ROSの肺高血圧症の発症および進展への関与を明確にするため、NOX1を高発現するNOX1-TGとNOX1-KOを交配し繁殖維持した。免疫染色により肺組織でのNOX1の局在を明らかにするため抗NOX1ポリクローナル抗体の作製に着手した。数匹のウサギにNOX1合成ペプチドを抗原免疫し、血清の抗体価を測定し抗体をスクリーニングしている。肺高血圧症の発症に肺動脈平滑筋細(PASMC)のターンオーバー異常が関与することが知られている。21年度の検討によりNOX1-KO由来PASMCの培養細胞では細胞増殖能およびアポトーシスに野生型マウス由来PASMCと差違が認められた。肺高血圧症患者のPASMCでは電位依存性カリウムチャネルの一つであるKv1.5の発現低下が、細胞のアポトーシスの抑制を誘導することが知られている。NOX1-KO由来PASMCにおいてKv1.5の発現が低下とともに細胞内のカリウム濃度の上昇していることを見出した。また電位依存性カリウムチャネルの阻害薬はPASMC細胞内のカリウム濃度の上昇とともにアポトーシスを抑制した。NOX1を高発現するトランスジェニックマウス(NOX1-TG)とNOX1-KOを交配し、外因的にNOX1を導入したところ、NOX1-KOの右心室肥大および肺動脈の肥厚は抑制された。以上からNOX1の活性の低下はKv1.5の発現低下を介した細胞内カリウム濃度の上昇を引き起こし、その結果アポトーシスの抑制により肺動脈を肥厚させると考えられる。NOX1-KO由来PASMCの培養細胞では野生型マウス由来PASMC比較してアポトーシス細胞数の減少が認められた。

肺高血圧症患者のPASMCでは電位依存性カリウムチャネルの一つであるKv1.5の発現低下が、細胞のアポトーシスの抑制を誘導することが知られている。NOX1-KO由来PASMCにおいてKv1.5蛋白発現が低下することを見出した。しかしNOX1-KOでのKv1.5蛋白質の発現低下にはmRNAの変化を伴わず、プロテアソーム阻害薬を用いた検討でもNOX1の蛋白質分解系の関与は認められなかった。22年度はROSによる発現調節が報告されているmicroRNAによるKv1.5蛋白質翻訳調節の可能性について検討した。DNAアレイを用いた網羅的解析により、4候補遺伝子が抽出された。しかしながらリアルタイムPCR法で確認したところ有意な発現変化を認めなかった。NOX1を介するKv1.5の発現調節機構は未だ明らかでは無いが、本研究にてNOX1の肺高血圧症の発症における役割を明らかにすることで未だ有効な根治的療法が確立されていない本疾患の新しい治療法の開発につながると考えている。
日本とドイツにおける解雇制限規定と雇用政策法の相互関係に関する比較研究

第一に、ドイツ・ボーフム大でのヒアリングや資料収集を通じて、解雇制限法と雇用政策法の相互関係に関する調査を行った。とくに、最終年度である今年度は、ハルツ改革と解雇制限法の関係に加え、2004年の解雇制限法の規制緩和がドイツでどのように評価されているかを総合的に検討した。その結果、解雇制限法の規制緩和が即時的に雇用政策的効果を持つものではないが、特定の労働者層(例えば、女性あるいは高年齢者)の雇用状況に影響を持ちうることを明らかにした。第二に、ドイツにおける議論動向と比較して、解雇の金銭解決制度をめぐって日本でどのような議論が展開されてきたのかを考察した。ドイツの金銭解決制度がドイツの学説内でどのように評価されているかを改めて検討したうえで、日本の議論状況と比較検討を行ったのである。結論的には日本においては、ドイツと異なり、解雇の理由に分類して(例えば、事業閉鎖の場合あるいは非解雇者選定に問題がある場合など)金銭解決制度を論じる見解は存在しないが、解雇事由との関係で金銭的解決制度を検討する余地があることを明らかにした。とくに、事業閉鎖型の解雇事案においては、金銭的な解決制度が有効に機能する余地があり、この点に関わる判例と学説を再検討した。第一に、日本とドイツに存する文献等を通じて、2003年から2004年にかけて行われたドイツ解雇制限法の改正状況(1条aの導入)と、「ハルツ(Hartz)」法など新しく導入された雇用政策法の検討を行った。その結果、当事者の合意に基づく金銭賠償解決システムという、雇用政策と密接な関連性を有した制度を導入することが解雇制限法改正(2004年施行)の大きな柱となったことを明らかにできたが、この制度の利用については労働契約当事者に主導権があるため、法政策的な効果が減殺されるとの危惧が指摘されている点を知り、この点を法的に詳細に分析した。この制度がどのように利用され、法的にどのような論点が生じているかをドイツで改めて調査することが次年度以降の課題として残った。第二に、ドイツにおける解雇法と雇用政策法の相互関係を分析するための比較モデルを得るためにも、日本の解雇法や雇用政策法の相互関係がどのようになっているかをまとめることが必要となり、この点について論文を執筆・公表した。この論文は、ドイツでの実態調査に生かすためにも、日本語だけでなく、ドイツ語でも作成し、ドイツの研究者と意見交換できるようにした。第一に、ドイツへの訪問や国際会議などへの参加を通じて、解雇制限法と雇用政策法の相互関係に関する調査、資料収集を行った。とくに、2004年1月1日から施行されたドイツ解雇制限法の改正法は、雇用政策を意識して制定されたものであるため、この制定過程とその後の議論状況を丹念に調べた。その結果、解雇制限法の規制緩和が即時的に雇用政策的効果を持つものではないが金銭解決制度の導入や解雇制限の適用範囲などに関して、雇用政策を意識して解雇規制が変容しつつあることを明らかにできた。第二に、第一の点とも関わり、解雇の金銭解決制度が、どのような意義や問題点を有するかを調査、研究し、ドイツの金銭解決制度の現状について、ドイツの学説の中でどのような議論がなされ、どのような立法提案がなされてきたかを明らかにし、その問題点を分析した。具体的には、解雇の理由に分類して(例えば、経営上の理由あるいは非解雇者選定に問題がある場合に限って)金銭解決を提案する意見があり、金銭解決制度を導入する場合でも、解雇事由との関係を調べる必要があることを明らかにした。
ゲノム変異を指標とした生物学的被ばく線量推定法の開発

一細胞からゲノムDNAの基配配列を決定することで放射線被ばく影響の定量的測定法の開発を目指した。少量のDNAを鋳型としたDNA増幅はdUTPを含んだdNTP mixを使用してphi29 DNA polymeraseによって全ゲノム増幅を行った。種々の酵素によって断片化し,5'末端および3'末端は,引き続く酵素反応で5'-リン酸/3'-水酸基を付与した形で二本鎖DNAとすることが出来た。DNA断片は,そのまま次世代シーケンサーの塩基配列決定用のライブラリーに調整できた。しかし,残念ながら一細胞へ定量的に放射線照射して,ゲノム変異数と定量的な放射線照射の影響を測定するまでには至らなかった。目的は,生物学的被ばく線量測定法の開発(development of biological dosimetry method)である。放射線被ばく影響の定量的測定法としてゲノム変異を指標とする方法開発の基礎研究を行うことである。放射線被ばく量ぼ生物学的線量測定法は未だに感度の高い測定法はなく,末梢血の染色体検査による転座等の染色体異常数のカウントに頼っているのが現状である。本研究では,ゲノム変化を指標として,低線量の被ばく時でも被ばく後に被ばく線量の推定が出来ないかと考え,生物学的被ばく線量測定法の開発の基礎研究を目的とする。本年度は,少量のゲノムDNAから次世代シーケンサーに供するDNA断片ライブラリーの作成を行った。phi29 DNA polymerase,あるいはdUTPが混合されたdNTPを使ってDNA増幅が可能なphi29 DNA polymerase以外のDNA polymerase探しを行った。また,Uracil DNA Glycosilase等の酵素を組み合わせてのdUTP取り込み部位の二本鎖切断のプロトコールを作成した。また,dUTP取り込み部位の二本鎖切断からシーケンスのためのDNAライブラリー作成プロトコール作成まで終了した。来年度には,一細胞相当のDNAからライブラリー作成を行い,次世代シーケンサーを用いて放射線によって惹起されるDNA変異率の測定を行う。生物学的線量測定法は,染色体異常が出現頻度に頼るのが現状であり,高線量の被ばく時にしか利用できない。未だに感度の高い測定法はないので,本研究を提案した。一細胞からゲノムDNAの基配配列を決定することが基本であるから,まずは少量のDNAからシーケンサーで解析可能なライブラリーの調製法を改良した。少量のDNAを鋳型としたDNA増幅にはdUTPを含んだdNTP mixを使用してphi29 DNA polymeraseによって全ゲノム増幅を行った。またライブラリー作製時のプロトコール作成のための酵素処理については,適切な酵素選定のために通常の耐熱性ポリメラーゼ(dUTPを含んでいても増幅可能なポリメラーゼ)を用いた。uracil DNA glycosylaseと他の種々の酵素によって断片化し,5'末端および3'末端は,引き続く酵素反応で5'-リン酸/3'-水酸基を付与した形で二本鎖DNAとすることが出来た。それら二本鎖DNAは,そのまま次世代シーケンサーの塩基配列決定用のライブラリーに調整できた。しかし,残念ながら一細胞へ定量的に放射線照射して,その細胞毎にDNA変異数を測定して,ゲノム変異数と定量的な放射線照射の影響を測定するまでには至らなかった。人類遺伝学本年度は,DNA変異率測定のためのDNAライブラリー作成手順の適正化をはかった。一細胞から開始したDNAライブラリー作成までは至っていないが,プロトコール自体はおおむね完了した。順調に進んでおり,平成26年度には一細胞からのDNAライブラリー作成と放射線障害によるDNA損傷率の測定まで進む基礎データをそろえることが出来た。平成26年度には,細胞への放射線照射->細胞単離-> DNAライブラリー作成と進めて,放射線照射によるDNA変異率の測定を目指す。初年度は,一細胞からのDNAライブラリー作成に向けたプロトコール整備に時間をかけた。従って,費用のかかる次世代型シーケンサーのシーケンス作業は,後回しになり差額が生じた。初年度に手順は,全て作成したので,平成26年度に次世代シーケンサーによる塩基配列決定に使用する。
外来遺伝子の安定発現を可能にするニワトリ遺伝子組み換え技術の開発

ニワトリは重要な産業動物であり、遺伝子改変技術が求められている。例えば卵管細胞にバイオ医薬品を安定発現するニワトリは、有用物質を白身に大量に含む卵を産むと考えられる。本研究で外来遺伝子を安定的かつ大量に生産するニワトリを作製するための幾つかの手法開発を試みた。ニワトリ始原生殖細胞を用いてマウス人工染色体を導入し、生殖巣キメラニワトリを樹立した。また、トランスポゾン系を用いて始原生殖細胞に外来遺伝子を導入し、これを用いて組換えニワトリを樹立した。さらに、ゲノム編集によりノックインやノックアウトニワトリを作製した。これら技術は有用な遺伝子改変ニワトリ作製に大きく貢献すると考えられる。ニワトリ遺伝子組換えは発生生物学をはじめとする基礎生物学から有用蛋白質の大量生産などの産業応用まで幅広い需要がある。ニワトリ遺伝子組換え技術は黎明期で、特に外来遺伝子の安定発現に課題がある。哺乳動物では同じ問題が人工染色体の使用により解決可能であり、本研究では人工染色体技術のニワトリへの適用を目指した。雄ホワイトレグホン3日胚の血液より樹立された始原生殖細胞株を用いて、微小核融合法によるマウス人工染色体の安定導入を試みた。始原生殖細胞への微小核導入は前例が無いため、初めに導入法の検討を行った。A9細胞よりマウス人工染色体を含む微小核を抽出し、始原生殖細胞へ融合する方法としてポリエチレングリコールを用いた従来法に加え、センダイウイルスエンベローブを用いた方法を検討した。いずれの方法でもマウス人工染色体を安定的に保持する始原生殖細胞株が樹立可能であったが、センダイウイルスエンベローブを用いた融合法の方が従来法に比べて効率が10倍程度高く、5x10の5乗から1x10の6乗細胞に1クローンの導入を認めた。人工染色体を導入した始原生殖細胞株は親株と同様の形態を保持し、BRL(buffalo rat liver)フィーダー細胞の存在下で安定的に増殖した。また、始原生殖細胞マーカーであるCVH (chicken vasa homolog)も親株と同程度発現することを免疫蛍光染色により確認した。今後、人工染色体のニワトリ始原生殖細胞から個体への適用技術を開発することにより、宿主染色体の影響を受けない遺伝子発現技術が得られると考えられる。体内受精し卵発生するという独特の発生形態に起因し、ニワトリをはじめとする鳥類の遺伝子操作は他の生物種に比べて大きく遅れている。一方でニワトリの遺伝子改変技術が今後発展することにより、バイオ医薬品等の高品位蛋白質を鶏卵内に安価に大量生産することが可能になると期待されている。本研究で申請者らは外来遺伝子産物を安定的にニワトリに発現させる技術開発を行っている。昨年度微小核融合法により樹立した人工染色体を導入したニワトリ始原生殖細胞を用いて、本年度はこれを移植したキメラニワトリの樹立と解析を行った。ニワトリ初期胚(2.5日胚)血液中に約2000個の人工染色体導入始原生殖細胞を移植し、18-20日胚の生殖巣を解析した。移植細胞の生殖巣寄与率は5-20%以下と低いものの精細管内に定着し、生殖細胞分化が期待された。一方、人工染色体を導入した生殖巣キメラニワトリを樹立し、後代検定を行ったが現在までのところ組み換え後代は得られていない。また、外来遺伝子安定発現の別の試みとして、従来行われていないニワトリ染色体の複数箇所に外来遺伝子を導入する技術の開発を行った。トランスポゾンシステムを用いて外来遺伝子複数コピーを始原生殖細胞へ導入した。この細胞を上述と同様にニワトリ初期胚に移植し、生殖巣キメラニワトリを樹立後、後代検定を行った。103羽の後代のうち移植細胞由来後代が32羽、うち外来遺伝子を有する組換え後代が21羽得られた。組換え後代の有する外来遺伝子コピー数を複数羽の個体において検定したところ1-8コピーの外来遺伝子が染色体上の複数部位に存在することが明らかとなった。本技術を活用することにより、組換えニワトリにおける外来遺伝子の安定発現技術に繋がると大いに期待される。ニワトリの遺伝子を組換えることで、鶏卵中に有用組換え蛋白質を生産する技術に期待が寄せられている。本研究ではニワトリで外来遺伝子を安定的に発現する技術の開発に取り組んだ。人工染色体を用いた試みは生殖巣キメラニワトリを得る事ができたが、後代に組換え体を取ることが出来なかった。一方、トランスポゾンシステムを用いることで複数コピーの外来遺伝子(蛍光遺伝子)をニワトリ染色体上の様々な場所に挿入することが出来た。本年度はまず、ニワトリが安定的な遺伝子発現を行うかを解析した。トランスジェニックニワトリ(G1)の後代(G2)を得てその胚を解析した結果、強い蛍光を認めることが出来たため、経世代的な安定発現を達成できた。また、新たな取り組みとして染色体上の特定位置に外来遺伝子の挿入が可能か否かを検討した。鶏卵への発現を想定し、卵白蛋白質の遺伝子座に対してゲノム編集が可能かを検討することとした。オボアルブミンならびにオボムコイド遺伝子座を標的としたCRISPR/Cas9法の適用を試み、ニワトリ始原生殖細胞を用いて9割程度の非常に高い効率で遺伝子変異を誘導することに成功した。

また、オボムコイドに関しては変異導入した細胞を元に変異ニワトリ個体の樹立を試み、ノックアウト個体の作製を達成した。さらに、外来遺伝子の安定発現を目指したオボアルブミン遺伝子座への外来遺伝子ノックインを始原生殖細胞を用いて達成し、現在ノックイン後代を得ている。ニワトリは重要な産業動物であり、遺伝子改変技術が求められている。例えば卵管細胞にバイオ医薬品を安定発現するニワトリは、有用物質を白身に大量に含む卵を産むと考えられる。本研究で外来遺伝子を安定的かつ大量に生産するニワトリを作製するための幾つかの手法開発を試みた。ニワトリ始原生殖細胞を用いてマウス人工染色体を導入し、生殖巣キメラニワトリを樹立した。また、トランスポゾン系を用いて始原生殖細胞に外来遺伝子を導入し、これを用いて組換えニワトリを樹立した。さらに、ゲノム編集によりノックインやノックアウトニワトリを作製した。これら技術は有用な遺伝子改変ニワトリ作製に大きく貢献すると考えられる。人工染色体導入キメラニワトリの作出を達成するとともに、外来遺伝子の安定発現に繋がる複数コピーの遺伝子導入ニワトリ後代の樹立に成功したため。分子生物学人工染色体導入キメラニワトリのキメラ率向上や後代取得を目指すとともに、複数コピーの外来遺伝子導入を達成した組換えニワトリが今後安定発現を持続するか、またその後代における発現動態はどうか等の解析を行う。当初計画した人工染色体のニワトリ始原生殖細胞への安定導入技術を開発し、人工染色体を保持した細胞株を樹立、解析することができたため。樹立した細胞株をニワトリ初期胚に移植し、始原生殖細胞としての特性解析を行うとともに、生殖巣キメラニワトリを樹立し、将来の人工染色体を有する組換えニワトリ作成技術開発を目指す。
ヒドロキシチロソール生産を指向した微生物の探索、機能解析とバイオプロセス開発

本研究では、オリーブ由来の有用生理活性物質であるヒドロキシチロソールを、2-フェニルエタノールから合成可能な微生物を探索し、取得した微生物をヒドロキシチロソール生産に応用することを目的としている。一昨年度および昨年度の研究を通して、当該活性を示す微生物を発見し、さらに培養条件等を検討してチロソールおよびヒドロキシチロソールを効率的に合成可能な手法を確立している。本年度は、取得した微生物の水酸化機能を分子レベルで明らかにするために、2-フェニルエタノール水酸化酵素の精製を試みた。トルエンを炭素源として培養した当該微生物の菌体をリン酸カリウム緩衝液50 mM (pH 7.0)に懸濁後、超音波破砕および遠心分離により得られた上清を回収し、カラムクロマトグラフィーにより2-フェニルエタノール水酸化酵素の精製を試みた。DEAETOYOPEARL 650SおよびHiprep Butyl Fast Flow 16/10を用いることで2-フェニルエタノール水酸化酵素に対する候補タンパク質を部分精製できた。これにより、目的酵素が約50 kDaのタンパク質と約25 kDaのタンパク質から構成されている可能性が示唆された。カラム精製後の候補タンパク質のN末端アミノ酸配列解析を行なったところ、15アミノ酸残基の配列を決定できた。このアミノ酸配列をクエリーとしてBLAST検索を行なったところ、相同性が高いタンパク質として非ヘム鉄ジオキシゲナーゼのβサブユニットが挙げられたため、目的酵素は非ヘム鉄ジオキシゲナーゼである可能性が示された。今後は、得られたアミノ酸配列をもとに、当該酵素をコードする遺伝子のクローニングを行なう予定である。本研究では、オリーブ由来の有用生理活性物質であるヒドロキシチロソールを、2-フェニルエタノールから合成可能な微生物の取得、および取得した微生物のヒドロキシチロソール生産への応用を目的としている。昨年度(平成28年度)の研究では、tert-ブチルベンゼンを分解可能な微生物は、ベンゼン環のパラ位に対する水酸化活性を示すことを予想し、tert-ブチルベンゼン分解菌を探索した。その結果、Cupriavidus属のtert-ブチルベンゼン分解菌を取得し、本菌株は2-フェニルエタノールからp-チロソールを経由してヒドロキシチロソールを合成可能なことを明らかにしている。平成29年度は、本菌株のヒドロキシチロソール生産への応用を試みた。まず、本菌株の2-フェニルエタノール変換活性を効率的に誘導可能な炭素源について検討した。本菌株は、リンゴ酸、クエン酸、フェノール、トルエンを炭素源とした場合に液体培地で増殖した。そこで、これらの炭素源で増殖した菌体を回収して、2-フェニルエタノール変換活性を評価した。その結果、フェノールおよびトルエンを炭素源として増殖した菌体において、2-フェニルエタノール変換活性が誘導されていた。つぎに、変換活性が最も強く誘導されたトルエンを炭素源として、培養時間と誘導される変換活性の相関について調べた。その結果、21時間培養後に回収した菌体が最も高い2-フェニルエタノール変換活性を示した。以上より、トルエンを炭素源として21時間培養することで、本菌株の2-フェニルエタノール変換活性が効率的に誘導されることが明らかとなった。平成29年度は、「取得した微生物のヒドロキシチロソール生産への応用」と、「2-フェニルエタノール水酸化機能の酵素・遺伝子レベルでの解析」の実施を計画していた。前者については、取得した微生物が2-フェニルエタノールをヒドロキシチロソールに効率的に変換可能な培養条件を見いだすことができた。後者の「2-フェニルエタノール水酸化機能の酵素・遺伝子レベルでの解析」については、現在実施中であり、2-フェニルエタノール変換活性が誘導された菌体を二次元電気泳動に供したところ、変換活性が誘導された菌体において強く発現しているタンパク質のスポットをいくつか見いだせており、2-フェニルエタノール変換酵素・遺伝子の同定に向けて予備的な実験データを取得できている。

平成30年度は、「取得した微生物のヒドロキシチロソール生産への応用」と、「2-フェニルエタノール水酸化機能の酵素・遺伝子レベルでの解析」の実施を計画している。前者については、培養条件に加えて反応条件(至適温度・pH・基質濃度、各種添加物の影響等)を検討し、ヒドロキシチロソールの効率的生産を図る。後者については、2-フェニルエタノール変換活性が誘導されているときに強く発現するタンパク質を二次元電気泳動で詳細に解析する。さらに、そのタンパク質の中から2-フェニルエタノール変換酵素を同定してアミノ酸配列情報を取得する。最終的には、アミノ酸配列情報をもとに当該酵素をコードしている遺伝子の同定、および異種発現を試みる。(理由)次年度使用額は比較的小額(2364円)であり、端数として生じた。(使用計画)次年度使用額は比較的小額(2364円)であり、消耗品費として使用することを計画している。
加速度を利用し軟骨細胞と骨髄幹細胞を用いた培養軟骨・骨複合体の開発

前年の結果より加速度刺激が培養軟骨細胞を活性化させることが示唆されたが、同じ振動の一種である超音波にも同様の効果があるかを検証した。3次元培養軟骨細胞にヒアルロン酸と超音波刺激(1.5MHz、30mW/cm^2)を与え、培養液中のコンドロイチン4、6硫酸異性体量を定量した。その結果、超音波刺激の有無をU+,-、ヒアルロン酸の有無をHA+,-として表示する。(U-,HA-)群と(U+,HA+)群のコンドロイチン4硫酸異性体量はそれぞれ培養後7日で27.8と32.5μg/ml、14日では64.9と90.2μg/mlであり有意に(U+,HA+)群が高かった(<0.01)。また、コンドロイチン6硫酸異性体量も同様で、それぞれ培養後7日で30.5と42.7μg/ml、14日では86.2と123.2μg/mlであり有意に(U+,HA+)群が高かった(p<0.01)。また(U+,HA-)群と(U-,HA+)群とには有意差はなかった。すなわちヒアルロン酸と超音波刺激が培養軟骨細胞を活性化させることが示唆された。ブタの脛骨骨髄より骨髄細胞を採取し、3日間15%FBSを含むDMEM培地にて培養し、その後底面に接着した細胞を単離し、2週間かけてDexamethasone、β-Glycerophosphate、L-ascorbic acid phosphateを含む培養液にて培養し骨芽細胞への分化を行った。この骨芽細胞浮遊液を1.0×10^6cellsづつ円盤状ハイドロキシアパタイトブロック内にろ過させることでブロック内に細胞を停留させ、24 well plateの底に置き1×10^<-4>Gの加速度を与えた条件下で2週間培養した。4週間経過した時点で、ブタ足関節より採取した軟骨より軟骨細胞を単離し、コラーゲンゲル内に包埋、2.0×10^6cellsづつ前述した骨芽細胞培養アパタイトブロック表面に撒き、さらに2週間、1×10^<-4>Gの加速度下に培養を継続した。結果は、アパタイトブロック内にて骨芽細胞はある程度とどまってはいたが、骨器質を形成まではいたらなかった。しかし、表面の軟骨層は層状に形成し、一部アパタイトブロックの孔内にも浸潤し、軟骨層がアパタイト層と比較的強固に固着し、いわゆるアパタイト・軟骨複合体を形成した。コラーゲンスポンジを担体とする3次元ブタ軟骨細胞培養を行い、それに対するメカニカルストレスの影響についての研究を行ってきた。その結果、ヒアルロン酸とある種の振動を同時に加えて培養すると培養軟骨細胞が活性化されることを発見した。ここでは、振動とヒアルロン酸が培養軟骨に及ぼす影響について述べる。【方法】ブタ足関節より採取した軟骨を酵素処理にて単離し、コラーゲンゲルに懸濁し、コラーゲンゲルスポンジ上で培養した。初期細胞は、2×10^6個/mlとし、振動(V+)と非振動(V-)、さらに培養液中にヒアルロン酸添加(HA+)と無添加(HA-)の組み合わせの4群に分けた。培養後7,14日の培養液中のコンドロイチン硫酸異性体量(C6S、C4S)を定量し、組織学的観察を行った。免疫組織学的にはMAPK、FAK、beta catenin、beta-1 integrin alpha-1 integrinおよびphalloidinの抗体染色を行い、integrinを介した細胞内シグナル伝達系を観察した。さらに、電子顕微鏡像による観察も行った。【結果】培養後7,14日のC6Sの平均は(HA+、V+)、(HA+、V-)、(HA-、V+)、(HA+、V-)群それぞれ21.3と35.5pg/ml、18.1と33.8pg/ml、15.4と33.2pg/ml、12.4と26.2pg/mlであり(p<0.05)、C4Sはそれぞれ15.8と31.2、μg/ml、13.2と29.4μg/ml、11.4と28.4μg/ml、9.7と22.4μg/mlでいずれも(HA+、V+)群が高値を示した(p<0.01)。工学顕微鏡像では、培養2週後でスポンジ上に軟骨様細胞の多層構造を得た。免疫組織学所見では、MAPK、FAK、beta catenin、beta-1 integrin alpha-1 integrinおよびphalloidin等のタンパクは、(HA+、V+)群で顕著に発現していた。電子顕微鏡像では(HA+、V+)の細胞膜に多数の細長い突起の形成を観察した。また、細胞外に細胞器質様物質の旺盛な生成を推測させる所見が得られた。【結語】振動刺激とヒアルロン酸は有意に培養軟骨細胞の器質合成を促進した。