hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
製品の長期使用を目的とした射出成型技術の確立

本研究は,様々な材料から成るフィラーを混練したプラスチックを射出成形機によって作製するための基礎的な技術を確立するとともに,フィラーを混練したサンプルが使用に伴ってどのように変化するかを明らかにすることを目的とした.具体的には,母材であるポリプロピレンに複数種類の金属粉やセラミックス粉,和紙繊維を混練した後,手動式射出成形機によって,卵型形状のサンプルを作製した.これによりアバガ紙を混練したもの以外は比較的容易に成形ができることが判明した.また被験者実験によって成形直後のサンプルと振とう機により研磨した後のサンプルを比較することによって,フィラーと質感変化の関係を明らかにした.本研究課題では,成形時に製品表面に異素材を混入させることによって,高い質感を実現することを試みている。そして,使用に伴って質感が向上するようなフィラーを選択することを目的とする。本年度は,3種類の方法によってサンプルを作製し,質感向上と経年変化に適したフィラーの選択を試みた。今年度の予算で手動式の射出成形機を購入することから,まずは成形機を用いずに成形可能な圧縮成型と紫外線硬化型樹脂を用いた成形を行った。圧縮成形は熱風乾燥器を用い,ポリプロピレンとポリエチレン,ポリカーボネートの3種類の樹脂中にフィラーを挿入した円盤状サンプルを作製した。フィラーには金属やガラス,プラスチックの3種類を用いた。金属フィラーは,粉状のものだけでなく,メッシュ状,釘状,環状形状計4種類とした。そして,十分大きな金属製有形フィラーは表面を硫化処理したものとメッキ処理したものを用いた。またガラスはビーズ状,プラスチックは箔状のものである。これらを熱風乾燥器で融解するまで加熱し,試験片を作製した。一方紫外線硬化樹脂を用いたサンプル作製においては,異なる種類のフィラー混入した凸上の円盤状サンプルを複数作成した。ついで,これらのサンプルの印象を明らかにするために,被験者を用いた印象評価実験を実施した。得られた感想を,可視化する目的で,テキスト分析を行い,サンプルの印象評価におけるフィラーの特徴を把握した。最後に,手動式の射出成形機を用いてサンプル作製を行った。使用した樹脂は,ポリエチレンとポリプロピレン,ポリカーボネートの3種類である。試行錯誤を経て,これら3種類の樹脂を用いて卵型形状のサンプルを作製する各種パラメータの値は把握することができた。手動射出成形機の納品が3月上旬となったため,手動式の射出成形機によるサンプル作製は遅れ気味となっている。今年度は,ポリプロピレンと各種フィラーを混練したものを手動射出成形機によって卵型形状のサンプルを成形することを試みた.特に成形時の「成形容易性」と「サンプル表面の質感」に焦点を当てて検討を行った.その結果,ポリプロピレンとフィラーの配合割合を変化させたところ,金属粉やセラミックス粉,珪藻土をフィラーとした場合は,それほど明確に確認できなかった成形時の粘度上昇が,和紙をフィラーとした場合には極めて顕著に現れた.特に,和紙繊維をフィラーとした場合には,重量比で母材であるポリプロピレンと同等以上の場合は,成形に大きな荷重が必要となることが確認できた.また粉体をフィラーとした場合は均一に分散する傾向にある一方,和紙繊維をフィラーとした場合では,複数の箇所で和紙繊維の割合が大きくなり,フィラーが均一に分散しないことが確認できた.混練後のプラスチックでは和紙繊維が均一に分散されていることから,成形時に何らかの理由で繊維が集中したものと考えられる.これによりサンプルの表面に和紙繊維が不均一に分散するサンプルが得られることとなり,予想外に有機的な外観となった.加えて,触れたときの表面の質感も部分的に異なり,母材であるポリプロピレンとは大きく質感が異なるものとなった.さらに成形したサンプルを,ブラスト装置により研磨することによって,従来のプラスチックとは大きく表面の質感が異なるものが得られた.以上のように,手動射出成形機によるサンプル作製のノウハウとフィラーの特性を把握しつつある段階にある.またフィラーの種類によって外観や触知覚が大きく異なるサンプルが得られることが確認できたことから,今後はフィラーによる質感変化を定量的に把握する予定である.昨年度末に納品された手動射出成形機を用いて,ポリプロピレンと様々なフィラーを混練し,サンプルを作製した.昨年度までの遅れを取り戻している.最終年度である本年度は,前年度までに作製したサンプルを対象に,被験者を用いた質感評価実験を行い,その印象を明らかにすることを試みた.作製したサンプルは,ポリプロピレンと金属粉,和紙繊維,無機材料を異なる割合で混練したものとフィラーを混練していないサンプルを加えた計34サンプルである.評価対象サンプルは,これらにサンプル表面をサンドブラスト装置により研削した34サンプルものを加えた計68サンプルである.被験者は男女で計20名とした.被験者は提示されたサンプルに触れずに観察し,その印象を7段階SD評価尺度によって評価した.得られた結果を因子分析法によって集約したところ,これらのサンプルの印象は3つの因子に集約できた.これによりフィラーを混練していないサンプルと比較して,フィラーを混練したサンプルの多くは新品感が減少し,古さや複雑さの印象が増加することが判明した.また表面研削による印象変化の程度はフィラーによって大きく異なり,和紙繊維や珪藻土をフィラーとしたものは印象変化が大きいことが確認できた.

さらに使用に伴うサンプル表面の摩耗が,質感の印象変化にどのような影響を与える可能性があるのかを明らかにする目的で,卓上振とう機と研磨紙や研磨剤,オレイン酸,市販植物油からなる皮脂模擬液を用いて,サンプルの表面処理を行った.そしてこれら表面処理後のサンプルを対象として,再度質感評価実験を実施し,その結果を前述の因子分析のデータに加えて分析した.これによりアバカ紙繊維や化粧泥粉をフィラーとしたサンプルでは,より新しい印象へと変化することが判明した.一方,金属粉をフィラーとしたサンプルでは,新品感や硬さ,重さの印象が増加することが示唆された.以上の結果から,様々なプラスチックにフィラーを混練したサンプルを作製することで,使用に伴う質感変化に必要なフィラーの特性を明らかにすることができた.本研究は,様々な材料から成るフィラーを混練したプラスチックを射出成形機によって作製するための基礎的な技術を確立するとともに,フィラーを混練したサンプルが使用に伴ってどのように変化するかを明らかにすることを目的とした.具体的には,母材であるポリプロピレンに複数種類の金属粉やセラミックス粉,和紙繊維を混練した後,手動式射出成形機によって,卵型形状のサンプルを作製した.これによりアバガ紙を混練したもの以外は比較的容易に成形ができることが判明した.また被験者実験によって成形直後のサンプルと振とう機により研磨した後のサンプルを比較することによって,フィラーと質感変化の関係を明らかにした.フィラー材質と質感の掲示変化の関係を把握することと,フィラーを入れた際の手動式射出成形機のパラメータ設定を把握することが必要である。またフィラーを混入した樹脂の物理的・力学的な特性を把握するための試験片を作成する。最優先課題とするのは,まず第一に様々なフィラーを混入して作製したサンプルが従来のプラスチックと質感がどのように異なっているかを定量的に把握することである.具体的には,プラスチックとは異なる金属やセラミックス,天然繊維をフィラーとしたものが,どのような質感と捉えられるのかを明らかにすることを試みる.被験者実験では,被験者にサンプルの状態がわからないように視覚情報を遮断した上程で提示し,触知覚のみによってサンプルの評価を行ってもらう.この際に重要と考えられるのは被験者の発話である.得られた発話データは,テキストマイニング手法を用いることによって,可視化することを試みる.ついで,質感の差を量として表すための評価実験を実施する.ここでは触知覚のみの場合と,触知覚だけでなく視覚情報を与えた場合についても検討する.以上の検討によって,プラスチックの触感覚をフィラーによってどの程度変化させることができるかが明確になるものと考える.続いて使用に伴う経時変化を明らかにする目的で,作製したサンプルを被験者に一定期間使用してもらい,その使用前後の印象評価を実施する.これにより,使用によって好ましい方向へ変化するものとそうでないもの,そして変化しないものに大別することができる.そして,ここまでに得られた知見を活かして,樹脂と単独のフィラーだけでなく,樹脂と複数のフィラーを含むプラスチックを用いて射出成形を行い,それらの評価実験を実施する.そしてフィラーを組み合わせることによって,より高い質感を有するようなものを提案していく.
英国モダニズム文学における<情動>と「公共性」の変容

本研究は、<情動>についての近年の批評的関心の台頭を踏まえて理論的枠組みを構築しつつ、英国モダニズム文学が同時代の「公共性」の変容過程に積極的に参入するさまを検証した。<情動>を個別作品の内面性や自律性を掘り崩す要素と見なすことで、シンクレア、ワイルド、ウルフなど、さまざまな作家の作品が同時代社会に批評的に介入し、それらが共同体の再編に向けたユートピア的衝動に駆動されているさまを浮き彫りにした。本年度は3年に渡る研究計画の初年度にあたるため、基礎的・理論的研究の充実を図るとともに、抽象的になりがちな<情動>理論を具体的に考察するためは欠かせない歴史的・社会的条件との関係について理解を深めた。本研究の主な焦点は20世紀前半のモダニズムにあるが、その現代への継承という観点から、まず南アフリカ出身のポストコロニアル作家J.M. Coetzee(モダニズムに深い影響を受けている)の小説『恥辱』について論文を執筆し、7月に出版した。この研究の結果、一方では具体的な歴史・社会的問題に発しつつも、同時に困難な共同性の可能性をかいま見させる「恥辱」という情動の特殊な性格について理解を深めることができた。夏にはVirginia Woolfの情動表現と、第一次大戦前後の前衛芸術運動について論文を執筆し、10月に出版した。この論文は、Woolfのモダニズムと、イタリア未来派の前衛芸術とのあいだの、従来顧みられてこなかった関係を当時の「公共性」の変容という見地から探求したものである。この研究で私は、従来は反感情的なものとして理解されてきた「没個性(impersonality)」の美学を、モダニズムの情動への関心という観点から捉えなおす可能性を示唆した。また、情動を理解するためには、身体性の問題、さらにその特殊近代的支配形態である「生政治(biopolitics)」との関係性を探求する必要があり、このような理論的観点の検証のために、2009年11月には日本英文学会関東支部にて、他の研究者2名とシンポジウム「バイオポリティカル・モダニズム-ジェンダー、人種、アメリカ」を行った。このシンポジウムにおける口頭発表で私はWyndham Lewisにおける人種観と、彼の諷刺小説における特殊な情動表現との関連性を探求した。この問題設定は非常に大きな歴史的射程を持つものであり、今後さらに研究を深める必要がある。本年度は3年に渡る研究計画の2年目にあたり、基礎的・理論的研究の充実を踏まえて、本研究の主な焦点である20世紀前半のモダニズムの関連作家における情動・感情の主題について考察を深めた。その結果は、出版物1つ、口頭発表3つ(うち国際学会1回)の成果にまとめた。まず「気持ち/感情」と題した短い論文では、近年の情動論的展開の概略をまとめ、そのめざすところが、レイモンド・ウィリアムズのいう「感情の構造」、すなわち私的でも公的でもある新たな情動の領域の探求にあることを示唆した。6月にはそのウィリアムズも重視したモダニズム作家D・H・ロレンスについて口頭発表し、ロレンスの詩学における情動の「没個性的」側面に着目した。また、12月には20世紀前半のモダニズム作家の先駆けでもあるオスカー・ワイルドの批評について口頭発表を行い、ワイルドの特殊な情動観が当時の社会への批評であると同時に、ユートピア的衝動の発露ともなっていることを確認した。また、同じ12月にスコットランドのグラスゴーで行われたモダニズムに関する3日間にわたる国際学会では、このような「公的」でもあり、「没個性的」でもある情動の具体的発露の手段としての前衛芸術的マニフェスト形式、ならびにモダニスト的実験の関わりを考察して報告し、専門家との意見交換を行った。これらの研究は、複数の作家・芸術家間の相互作用を重視する本研究課題のアプローチに完全にかなったものであり、口頭発表については次年度以降、活字化を検討したい。本年度は3年にわたる研究計画の最終年度にあたり、1年目と2年目におこなった情動理論にまつわる基礎研究をベースに、イギリスにおける「モダニズム」の歴史的展開を踏まえて、具体的な作家・作品分析を仕上げることを目的に研究をおこなった。そのうえで特に注目したのが、しばしば「19世紀的リアリズム」によって特徴づけられるヴィクトリア朝の文学と、20世紀初頭における盛期モダニズムの台頭との境界線上に位置する、19世紀末に活躍した作家たちであり、この研究では特にその作家たちを「初期モダニズム」ないし「発生期のモダニズム」と位置づけた。まず、Tsuda Reviewに掲載した論文では、19世紀末に作家としてのキャリアを開始したMay Sinclairの作品を、自然主義作家George Gissingの作品と比較した。Gissingに見られる公衆に対する世紀末的不信とは対照的に、Sinclairの小説は文学・文化と社会との互恵的な関係性を想像しており、特にその想像がT.H.Green的British Idealismの思想に影響を受け、「名誉/恥辱」という感情の語彙に依存している点を指摘した。

だがこのような感情の語彙の有効性はSinclair自身が後の作品で疑問に付すものでもあり、その点にSinclairのモダニズムへの移行が観察できると結論した。次に、『オスカー・ワイルド研究』に掲載した論文では、Oscar Wildeの作品における「批評/批判」というテーマの変遷をたどりつつ、そのなかにいっぽうでは盛期モダニズム的な大衆文化蔑視、他方では、自己変容的な情動をともなう「ユートピア的衝動」の実演が見てとれることを指摘した。後者の点は特に、Wildeの社会主義論と獄中書簡をつなぐ線に見いだすことができる。イギリスの盛期モダニスト、例えばWyndham LewisやT.S.EliotはしばしばWildeに対する両面価値的な態度を示しているが、Wildeの批評の再読と同時にこれらのモダニストのWilde観を具体的に再検討することにより、この論文では、初期モダニズムの角度からの盛期モダニズムの見直しの方向性を示した。
膜電位の高精細in vivoマッピングに向けた基盤技術開発

神経細胞は互いに複雑な回路を構成し、情報の保持や処理等を行い、動物の知的で多様な行動の基礎となっている。そこで行われる、高度に並列化され、分散的な処理様式の解明は、現代科学の究極の対象の一つであろう。その挑戦において、細胞膜電位の信頼性の高い時空間測定法を確立することは避けて通る事の出来ない技術的課題であると考えられている。我々は、ホヤゲノムから新しく発見された電位センサーをもつ酵素蛋白質であるVSP(voltage sensitive phosphatase)、及び独自にクローニングした新規蛍光蟹白質を巧みに組み合わせ、従来にない優れた性能を持つFRET(蛍光エネルギー移動)型の膜電位プローブを開発し、哺乳類神経細胞において単一発火のイメージングなどに成功してきた。動作している、in vivoの神経回路を計測対象とするために、さらなるレポーター分子の改良に取り組んでいる。高強度キセノン光源と独自に開発した画像処理ソフトを用いて、蛍光蛋白質のphostabilityを試験管内分子進化により向上させるための効率的なアッセイ系を構築した。この系を用い、従来に比べて明るく、photostabilityの高い単量体蛍光蛋白質を開発した。膜電位計測におけるSNRの向上に繋がる。光計測と電気生理学を駆使し、電位センサードメインの動作原理の解明にも取り組んだ。得られた知見をレポーター分子の設計に活かし、性能を向上させることができた。今後、in vivo神経回路に適用し、その特性を評価したい。そこで行われる高度に並列化され、分散的な処理様式の解明は、現代科学の究極の対象の一つである。この点において、細胞膜電位の信頼性の高い時空間測定法を確立することは、現在の神経生理学の重要な課題となっている。申請者らは、ホヤゲノムから新しく発見された電位センサーをもつ酵素蛋白質であるVSP(voltage sensitive phosphatase)、及び独自にクローニングした新規蛍光蛋白質を巧みに組み合わせ、従来にない優れた性能を持つFRET(蛍光エネルギー移動)型の膜電位プローブを開発し、哺乳類神経細胞において単一発火のイメージングなどに成功してきた。In vivoでの計測には、プローブのさらなるチューニングや、計測ノウハウの蓄積が必須である。膜電位プローブを心筋特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、心臓における膜電位ダイナミクスを無拘束下でin vivo計測を行うことに成功した。この手法を用い、過去に抗ヒスタミン剤として医薬品市場で実際に使われ、その後、心毒性の可能性により市場撤退した化合物(アステミゾール)の、ゼブラフィッシュ心臓の興奮伝導における効果について解析した。さらに、生理学的なレンジの膜電位には応答しない変異体を開発し、それを発現するトランスジェニックラインも作製した。これにより、モーションアーティファクト等のノイズ成分を見積もることが可能となった。このような計測法は、化合物や遺伝子発現による心臓電気特性への摂動を大規にアッセイするための基盤技術となりうる。また、それと平行して、光安定性や、キネティクスに優れたバリアントの開発を続けている。
ｃｌａｓｓ　Ａ　ＧＰＣＲｓの構造解析

本年度は、脂質受容性GPCRのX線結晶構造解析と、あるclass A GPCRとG蛋白質との複合体のクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を試みた。脂質受容性GPCRに関しては、すでにホモロジーモデルを用いた設計とスクリーニングによって、4つの耐熱化変異を同定していた。耐熱化変異体の脂質中間層を用いた結晶化に成功した。結晶が小さかったものの、微小結晶データをマージすることによって低分解能ながらも6Å分解能のまとまったデータを得ることに成功した。分子置換法によって位相決定を行い、結晶化パッキングを議論できるレベルでの構造決定に成功した。構造から、結晶化パッキングを構成している疎水性相互作用をより強める変異体を設計し、発現精製することができた。あるclass AGPCRについては、ヒト由来のものについては安定性や発現量が悪かったため、他の生物種のホモログスクリーニングを行った。その結果、ある生物種由来のホモログが作動薬存在下で安定に発現精製できることが分かった。この精製受容体と刺激性G蛋白質複合体を混合してゲルろ過クロマトグラフィーを行ったところ、安定に複合体を形成できることを確認した。複合体溶液を約7 mg/mlになるまで濃縮してグリッド上で凍結した。このグリッドを東京大学のクライオ電子顕微鏡TALOSによって観察し、粒子の画像を得て統合すること分解能4.8オングストロームの構造決定に成功した。複合体中のヘリックスの電子密度が明瞭に観察された。脂質受容性GPCRについては、安定化変異を用いることで結晶化に成功し、低分解能ながら分子置換による位相決定に成功している、当初の計画以上に進展しているといえる。class A GPCRについては、ホモログスクリーニングの結果安定に精製できるホモログの同定に成功し、Gsタンパク質との複合体の調整に成功した。そして、クライオ電子顕微鏡TALOSを用いて分解能4.8オングストロームでの構造決定にもすでに成功している。こちらも、当初の計画以上に進展しているといえる。今後は、まず脂質受容性GPCRについては、結晶を大きくすることで分解能の向上を狙う。具体的には、LCPハンギングドロップ法などを用いて結晶を大きくして、より結晶へのダメージが少ない方法で結晶を回収し、SPring-8 BL32XUにて高分解能のX線回折データを収集する。また、低分解能データから示唆された、さらに結晶化パッキングを安定化させる変異体を作製し、精製と結晶化を試みる。class A GPCR-Gタンパク質との複合体については、約7 mg/mlの濃度の精製試料をグリッド上に添加し、複合体溶液を加えてろ紙で吸って凍らせる。このグリッドを東京大学Titan kriosで3000枚程度の画像を撮影し、約100万粒子のデータを集めてMotionCor2やRelion 3.0を用いて処理する。分解能3.0オングストロームで構造決定することを目標とし、小分子作動薬の結合様式を解明することを目指す。エンドセリン受容体とは、ペプチドホルモンであるエンドセリン-1によって活性化されるGタンパク質共役受容体であり、血圧などの体内の恒常性を担う様々なシグナル伝達に関与している。エンドセリンシグナルの異常な上昇は高血圧やがんにつながるため、エンドセリン受容体アンタゴニストはこうした疾患に対する治療薬として研究されている。実際に、アンタゴニストであるボセンタンが肺動脈性高血圧の治療薬として使われている。本年度は、ヒト由来エンドセリン受容体B型(ETBR)とアンタゴニストであるボセンタン、K-8794との複合体のX線結晶構造解析に成功し、その成果を論文発表した。ボセンタンは、その活性に重要なスルホンミド基が受容体のアルギニン残基、リシン残基とイオン性相互作用を形成していた。ボセンタン結合型構造はリガンド非結合状態の不活性型の受容体構造と酷似しており、ボセンタンは受容体の不活性型構造を安定化することでアンタゴニストとして働くことを明らかにした。これにより、ボセンタンの結合様式やどのようにして受容体を不活性化しているのか、その構造基盤が明らかになった。こうした成果は、構造情報を元したアンタゴニストの理論的な開発に役立つものである。さらに、ETBRと4つの異なるアゴニスト・アンタゴニスとの共結晶化に成功し、その構造解析に成功した。これらの成果をまとめて、現在論文投稿を準備している。更に、他のいくつかのGPCRの発現・精製に成功し、結晶を得ることに成功している。ボセンタンおよびその誘導体K-8794との複合体構造の成果は高く評価され、Nature structual and molecular biology誌に掲載された。また、ETBRの他のリガンドとの複合体についても構造解析に成功し、それらを2つの論文としてまとめる予定である。また、新規GPCRについて結晶化に成功し、その構造解析の達成まであと一歩のところまで来ている。

構造から、結晶化パッキングを構成している疎水性相互作用をより強める変異体を設計し、発現精製することができた。あるclass AGPCRについては、ヒト由来のものについては安定性や発現量が悪かったため、他の生物種のホモログスクリーニングを行った。その結果、ある生物種由来のホモログが作動薬存在下で安定に発現精製できることが分かった。この精製受容体と刺激性G蛋白質複合体を混合してゲルろ過クロマトグラフィーを行ったところ、安定に複合体を形成できることを確認した。複合体溶液を約7 mg/mlになるまで濃縮してグリッド上で凍結した。このグリッドを東京大学のクライオ電子顕微鏡TALOSによって観察し、粒子の画像を得て統合すること分解能4.8オングストロームの構造決定に成功した。複合体中のヘリックスの電子密度が明瞭に観察された。脂質受容性GPCRについては、安定化変異を用いることで結晶化に成功し、低分解能ながら分子置換による位相決定に成功している、当初の計画以上に進展しているといえる。class A GPCRについては、ホモログスクリーニングの結果安定に精製できるホモログの同定に成功し、Gsタンパク質との複合体の調整に成功した。そして、クライオ電子顕微鏡TALOSを用いて分解能4.8オングストロームでの構造決定にもすでに成功している。こちらも、当初の計画以上に進展しているといえる。結晶が得られているGPCRに関しては、今後X線結晶構造解析に向けて結晶化条件の最適化を行い、構造決定を目指す。また、今後はサブタイプ選択性の詳細な理解のためにヒト由来エンドセリン受容体A型の発現・精製系を構築し、エンドセリンやA型選択的な阻害剤との複合体の構造解析を目指す。今後は、まず脂質受容性GPCRについては、結晶を大きくすることで分解能の向上を狙う。具体的には、LCPハンギングドロップ法などを用いて結晶を大きくして、より結晶へのダメージが少ない方法で結晶を回収し、SPring-8 BL32XUにて高分解能のX線回折データを収集する。また、低分解能データから示唆された、さらに結晶化パッキングを安定化させる変異体を作製し、精製と結晶化を試みる。class A GPCR-Gタンパク質との複合体については、約7 mg/mlの濃度の精製試料をグリッド上に添加し、複合体溶液を加えてろ紙で吸って凍らせる。このグリッドを東京大学Titan kriosで3000枚程度の画像を撮影し、約100万粒子のデータを集めてMotionCor2やRelion 3.0を用いて処理する。分解能3.0オングストロームで構造決定することを目標とし、小分子作動薬の結合様式を解明することを目指す。
セピアプテリンの脳内モノアミンレベル上昇効果の作用機序の解明

脳内のセロトニン(5HT)生合成は,律速酵素トリプトファン水酸化酵素の補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)量により調節される。ドーパミン(DA)も同様である。BH4の前駆体であるセピアプテリン(SP)をマウスに末梢投与したところ,脳内BH4,5HT,DAとその代謝産物は経時的かつ容量依存的に増加した。5HT合成能を持つ培養細胞にSPを与えると,5HT合成が促進されたが,同等の効果をBH4で再現するにはSPの数十倍の濃度が必要であった。また血液脳関門モデルにおいて,SPは実用的な透過を示した。これは,投与されたSPのすべてが末梢でBH4に転換せず,一部がSPのまま脳内に到達したことを示した。うつは脳内セロトニン(5HT)量の低下により引き起こされる脳神経系の失調であり,処方される抗うつ薬の70%が程度が5HT再取り込み阻害作用を持つSSRIである。しかし,その遅効性,副作用,低い寛解率が問題となっており,これらは,5HTの再利用を長期間抑制することによる,脳内5HT量の枯渇の結果と考えられる。5HT生合成を律速する補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)の前駆体セピアプテリン(SP)は効率よく脳内BH4レベルを上昇させることから,SPの末梢投与における5HT生合成に与える影響について,主にin vivoにおいて検証することを目的としてる。平成28年度では,SPの薬理作用をSP末梢投与後の脳内SP,BH4,5HTとその代謝産物,およびDAとその代謝産物を経時的に定量することで生化学的に解析を行った。その結果,(1)SP投与後,脳内BH4レベルは急激に上昇した後,速やかに減少したが,5HTとDAおよびこれらの代謝産物は経時的に増加した。また,このBH4,5HT,DAおよび代謝産物の増加はSP投与量に依存した。これは,SPが脳神経細胞内のBH4レベルを上昇させ,5HT,DA生合成を促進させた事を強く示唆した。この5HTレベルの上昇が5HT生合成活性の促進によることを検討するために,(2)脳内5HT生合成活性を,律速酵素トリプトファン水酸化酵素(TPH)の活性によって測定したが,SP投与が5HT合成の基質,トリプトファン(Trp)レベルを変動させるため,5HT合成活性を定量的に測定することができなかった。Trp代謝の95%以上がキヌレニン経路に導入されるため,血中および脳内Trpの変動はキヌレニン経路代謝産物レベルの変動を伴う。Trp代謝産物であるキノリン酸とキヌレニン酸は強い中枢効果を示すことが知られている。SP投与による脳内Trpレベル変動はSP投与による治療を考える上で非常に有用である。研究計画では,平成28年度中にSP投与後の脳内5HT合成活性を測定することで,SPが脳内5HT神経細胞内においてBH4濃度を上昇させ,その結果5HT合成活性を促進させることを解析する予定であった。しかし,5HT合成の基質トリプトファンの脳内レベルがSP投与により変動したため,5HT合成活性の促進が基質量の増加によるものか,補酵素量の増加によるものかを区別しなければならなかった。脳内Trpが増加しないSP投与量,アッセイの時間等を検討したことにより,当初の計画より遅れが生じた。様々な条件を検討したが,SP投与後で脳内Trpが変動しない条件を決定することは困難であり,SP投与後の5HT合成活性の変化がTrpとBH4のどちらによるものかを区別することはできなかった。現在はDA合成活性に着目し,モノアミン生合成活性の促進が補酵素BH4レベルの増加によることを確かめる予定である。5HT生合成を律速する補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)のサルベージ経路前駆体であるセピアプテリン(SP)は効率よく脳内BH4レベルを上昇させ,脳内5HT生合成を促進すると考えられる。本研究では,SPの末梢投与が5HT,およびドーパミン(DA)生合成に与える影響とその作用機序についてin vivo,およびin vitroにおいて検証した。本研究により(1)マウスへのSPの末梢投与は,脳内BH4レベルの上昇と5HT,DAおよびこれらの代謝産物の経時的な増加を引き起こすこと,(2)芳香族アミノ酸脱炭酸酵素阻害剤を用いた脳内DA合成活性において,大脳皮質のDOPA/DAがSP投与により約10%程度上昇することを明らかにした。さらに(3)血液脳関門のin vitro再構成系モデル(BBBキット)におけるSPの血液脳関門透過性は,脳内5HT補充に用いられる5HT前駆体(5-HTP)と同程度であることが示された。また,(4)モノアミン産生細胞(PC12)を用いたSP輸送体の絞込では,SPの輸送特性は核酸輸送体(ENT)と類似することが明らかとなった。これらの結果は,末梢投与したSPが血液脳関門を透過し,神経細胞内にENTによって取り込まれ,サルベージ経路によってBH4に変換,蓄積することでモノアミン生合成を促進することを強く示唆した。

今後は,SPをより効率よく脳へ輸送するドラッグデリバリーシステムの改善が必要と考えられる。脳内のセロトニン(5HT)生合成は,律速酵素トリプトファン水酸化酵素の補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)量により調節される。ドーパミン(DA)も同様である。BH4の前駆体であるセピアプテリン(SP)をマウスに末梢投与したところ,脳内BH4,5HT,DAとその代謝産物は経時的かつ容量依存的に増加した。5HT合成能を持つ培養細胞にSPを与えると,5HT合成が促進されたが,同等の効果をBH4で再現するにはSPの数十倍の濃度が必要であった。また血液脳関門モデルにおいて,SPは実用的な透過を示した。これは,投与されたSPのすべてが末梢でBH4に転換せず,一部がSPのまま脳内に到達したことを示した。前年度に引き続き,SP投与後のモノアミンレベルの上昇が補酵素BH4の補充によって引き起こされるモノアミン生合成活性の促進であることを確かめるために,DA合成活性に着目しこれを検討する。DA生合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)はTPH同様にBH4を補酵素とし,脳内BH4レベルはTHに対して飽和していないことが知られている。そこで,SP投与後の脳内BH4蓄積とTH活性の対応関係を解析する。さらに,SPの末梢投与による脳内BH4レベルの増加が,神経細胞内における平衡型核酸輸送体(ENT)によるSP取込みとBH4への変換,蓄積によることを,5HT神経細胞,DA神経細胞におけるENT発現を抗ENT抗体と抗TPHと抗THとの二重染色によって確認する。薬理学脳内5HT合成活性測定に関する検討とその分析に時間を要したために,DA合成活性の測定が遅れており,HPLC/電気化学検出器の使用が当初の計画よりも少なかった。このため,HPLC/電気化学検出器に関する維持費等が使用予定額よりも少なくなったと考えられる。また,実験動物を用いた合成活性の測定に関する研究が計画よりも遅れているため,マウスの購入量,および投与するSPなどの試薬の購入量が少なかったと考えられる。脳内BH4濃度の上昇と脳内DA合成活性の対応関係の解析を行った後,神経細胞内におけるSP取込みへの核酸輸送体(ENT)の関与を免疫組織化学的・生化学的に解析するために,(1)SPの血液脳関門透過性を血液脳関門のin vitro再構成系モデルBBBキットを用いて検討する。(2)神経細胞がSP輸送能を持つENTを発現することを免疫組織化学的に解析するする。(3)神経細胞のSP取込みがENTによることを生化学的に検証するする。これらを行うために,BBBキットの購入,免疫染色に必要な抗体の購入,マウスに投与する試薬(SP,BH4,阻害剤(NSD-1015,NBMPR))の購入,実験動物の購入,および生化学的な分析には,HPLC/蛍光検出器とHPLC/電気化学検出器の運転と維持に関わる費用が必要となる。また,研究成果の発表のため,学会への参加費,論文発表のための英文校閲料が必要である。
造血細胞のチロシンキナーゼを介する情報伝達機構

我々は、造血因子依存性ヒト白血病細胞株(UT-7等)を用いて、顆粒球前駆細胞に作用する顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)や赤芽球前駆細胞に作用するエリスロポエチン(EPO)のシグナル伝達の研究を続けてきた。本年度の成果は以下の通りである。(1)Grb2/Ash共沈蛋白質pp94の解析-GM-CSF、IL-3、EPO依存性のヒト白血病細胞株UT-7をGM-CSF、IL-3、EPOで刺激すると、Grb2/Ashと複数のチロシンリン酸化蛋白質が共沈する。これらの共沈蛋白質のうち最も強くリン酸化される94kDのチロシンリン酸化蛋白質(pp94)の性状解析を進めた。pp94のチロシンリン酸化は造血細胞の造血因子と関係し、また、GST融合蛋白質を用いたin vitroの沈降実験から、pp94はGrb2/AshのSH2と結合することがわかった。(2)Vavの役割-造血細胞において実際にRasを活性化するguanine nucleotide exchange factor(GEF)として、我々はプロトオンコジーンであるVavに注目した。Vavは、最近になって、Rasを活性化するGEFであると報告された。UT-7からVavを免疫沈降してチロシンリン酸化レベルを調べると、VavはGM-CSF、IL-3、EPOの刺激でチロシンリン酸化される。さらに、GST融合蛋白質を用いたin vitroの沈降実験から、UT-7においてVavがGrb-2/AshのSH3と結合することを明らかにした。造血細胞におけるRasの活性化経路の一つとして、チロシンキナーゼ→Grb2/Ash→Vav→Rasの可能性があり興味深い。
レーザプロセスによるNi基単結晶超合金膜のその場創成

Ni基単結晶合金は航空機エンジンのタービンブレードなど高温・高圧の過酷な環境で使用される部品の材料として利用されている.このような部品は極めて高価であるため,使用時に表面に欠陥が生じた場合でも,それを補修して再利用することがメンテナンスコストを削減する上で重要である.しかしながら,同材料における補修溶接時に,一部が多結晶化するため特性が著しく劣化することが問題となっており,補修技術の確立が急務となっている.そこで,本研究では単結晶状態を維持し得る補修プロセスの開発を目的として,半導体レーザを用いた肉盛補修技術の適用性について検討した.まず,単結晶化を達成し得る条件を明らかにするため,逆に溶融部内が多結晶化する条件,すなわち同部内におけるストレイクリスタルの成長条件について,逆問題熱伝導解析,デンドライトの成長方向に関する理論およびデンドライト先端の組成的過冷理論を用いて解析した.その結果,デンドライト先端での組成的過冷幅が大きい場合にストレイクリスタルが成長し易くなり,多結晶化することが判明した.さらに,レーザ照射時の出力や処理速度等の条件には適正範囲が存在することが明らかとなった.次に,前述のストレイクリスタルの成長に関する理論解析を,表面を肉盛補修する技術,すなわちレーザによる結晶制御クラッディング技術の確立に向けての研究に応用・発展させることを試みた.肉盛材をワイヤーの形でレーザ照射領域に挿入・供給して肉盛補修を実施した結果,比較的低いレーザ出力・ワイヤー供給量の条件において表面のごく一部を除く肉盛部の大部分が一方向デンドライト組織で構成され,わずかに異方向デンドライトが形成されるものの単結晶化が実現されることが明らかとなった.Ni基単結晶合金は航空機エンジンのタービンブレードなど高温・高圧の過酷な環境で使用される部品の材料として利用されている.このような部品は極めて高価であるため,使用時に表面に欠陥が生じた場合でも,それを補修して再利用することがメンテナンスコストを削減する上で重要である.しかしながら,同材料における補修溶接時に,一部が多結晶化するため特性が著しく劣化することが問題となっており,補修技術の確立が急務となっている.そこで,本研究では単結晶状態を維持し得る補修プロセスの開発を目的として,半導体レーザを用いた肉盛補修技術の適用性について検討した.まず,単結晶化を達成し得る条件を明らかにするため,逆に溶融部内が多結晶化する条件,すなわち同部内におけるストレイクリスタルの成長条件について,逆問題熱伝導解析,デンドライトの成長方向に関する理論およびデンドライト先端の組成的過冷理論を用いて解析した.その結果,デンドライト先端での組成的過冷幅が大きい場合にストレイクリスタルが成長し易くなり,多結晶化することが判明した.さらに,レーザ照射時の出力や処理速度等の条件には適正範囲が存在することが明らかとなった.次に,前述のストレイクリスタルの成長に関する理論解析を,表面を肉盛補修する技術,すなわちレーザによる結晶制御クラッディング技術の確立に向けての研究に応用・発展させることを試みた.肉盛材をワイヤーの形でレーザ照射領域に挿入・供給して肉盛補修を実施した結果,比較的低いレーザ出力・ワイヤー供給量の条件において表面のごく一部を除く肉盛部の大部分が一方向デンドライト組織で構成され,わずかに異方向デンドライトが形成されるものの単結晶化が実現されることが明らかとなった.本研究では,半導体レーザによる結晶制御クラッディング技術の確立を目的として,溶融部内の凝固形態,優先凝固成長方向および単結晶条件に関する理論的検討を行った.また,Ni基単結晶超合金に対して表面溶融を施し,溶融池内の組織観察をすることにより単結晶化状況を調査し,解析の有効性について検証した.さらに,肉盛部の結晶制御および単結晶化可能領域の拡大について検討を加えた、熱伝導解析とデンドライト成長方向に関する理論解析から,溶融池内は平滑界面,セルおよびコラムナーデンドライトで構成され,大部分はコラムナーデンドライトで構成されると予測した.また,溶融池内の優先凝固成長結晶の遷移を計算した結果から,溶融池内中央部の大部分は[100]デンドライト,端部は[010]デンドライト,底部は[001]デンドライトによって構成されることを予測した.さらに,単結晶化条件について溶融池内部を温度勾配(G)/凝固速度(V)によって整理した結果より,溶融池内部の中央付近で最も多結晶化しやすいと予測した.これらの予測結果は実験結果と良好な対応関係が認められた.半導体レーザおよびTIGアークによって表面溶融を行った溶融池内は単結晶化が達成されている領域,溶融池内で異方向に成長するデンドライトが観察されるものの単結晶化が達成されている領域,ストレイ結晶が発生し多結晶化している領域の3つに分けることができ,入熱量の増加とともにストレイ結晶が発生しやすいことがわかった.また,この表面溶融の結果を踏まえ,レーザおよびアーク条件を制御することによりシングルパス肉盛部内も単結晶化できることがわかった.さらに,肉盛部の単結晶化可能領域を拡大するためには,マルチパスマルチレイヤー肉盛により単結晶化領域を拡大すること,および表面再溶融により最終層表面の多結晶化部を単結晶化することが有効な手法であると確認できた.Ni基単結晶合金は航空機エンジンのタービンブレードなど高温・高圧の過酷な環境で使用される部品の材料として利用されている.

このような部品は極めて高価であるため,使用時に表面に欠陥が生じた場合でも,それを補修して再利用することがメンテナンスコストを削減する上で重要である.しかしながら,同材料における補修溶接時に,一部が多結晶化するため特性が著しく劣化することが問題となっており,補修技術の確立が急務となっている.そこで,本研究では単結晶状態を維持し得る補修プロセスの開発を目的として,半導体レーザを用いた肉盛補修技術の適用性について検討した.まず,単結晶化を達成し得る条件を明らかにするため,逆に溶融部内が多結晶化する条件,すなわち同部内におけるストレイクリスタルの成長条件について,逆問題熱伝導解析,デンドライトの成長方向に関する理論およびデンドライト先端の組成的過冷理論を用いて解析した.その結果,デンドライト先端での組成的過冷幅が大きい場合にストレイクリスタルが成長し易くなり,多結晶化することが判明した.さらに,レーザ照射時の出力や処理速度等の条件には適正範囲が存在することが明らかとなった.次に,前述のストレイクリスタルの成長に関する理論解析を,表面を肉盛補修する技術,すなわちレーザによる結晶制御クラッディング技術の確立に向けての研究に応用・発展させることを試みた.肉盛材をワイヤーの形でレーザ照射領域に挿入・供給して肉盛補修を実施した結果,比較的低いレーザ出力・ワイヤー供給量の条件において表面のごく一部を除く肉盛部の大部分が一方向デンドライト組織で構成され,わずかに異方向デンドライトが形成されるものの単結晶化が実現されることが明らかとなった.
タンパク質の機能構造研究のための無細胞合成系

大腸菌抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系に関して,これまでの研究成果により,合成量は,生細胞を用いた発現系に匹敵するレベルにまで達している.さらに,無細胞系では,PCR増幅したDNA断片を,そのままタンパク質合成の鋳型として利用できるため,目的DNA断片の発現ベクターヘのクローニングという,従来必要であった煩雑な操作を経ることなく,コードされたタンパク質を調製することが可能である.そこで本年は,無細胞タンパク質合成系を核として,多数のDNAにコードされたタンパク質を,同時並行的に迅速に発現調製する,high throughputタンパク質発現系を確立することを目指した.系の流れとしては,各々のcDNA断片に固有のプライマーセットを用いた1段階目のPCR反応と,発現調節配列(プロモーター,ターミネーター,SD配列など)やTag配列(His-tagやGST-tagなど)を持つ共通プライマーセットによる2段階目のPCR反応を,引き続きおこない,発現用の鋳型DNA断片を作成する.次に,この鋳型を用いた無細胞タンパク質合成により,DNA断片にコードされたタンパク質を発現して解析する.すべての反応は,96穴マイクロプレート上で行い,多数試料の同時処理を可能とする.実際に,無作為に選んだマウスのcDNA 87クローンを,His-tag fusionの形で発現した結果,0.1mg/ml以上の比較的高い合成量が,24クローンについて得られ,また,クローン中で最も大きな分子量214kDaのタンパク質の合成も確認できた.さらに,目的cDNAクローンのPCR増幅から開姶して,発現量や可溶性の解析結果を得るまでに必要な時間は約12時間と,極めて短時間であった.この結果から,多数のタンパク質を,同時並行的に,迅速に発現調製する系を確立できたと考えられる.本年度は,まず,生細胞を用いた発現系では調製が困難なタンパク質(発現しない,ないしは,発現しても封入体を作ってしまう)を中心として,10種類程度のタンパク質の無細胞系での発現を試みた.対象となったタンパク質は,タンパク質分解酵素,核酸分解酵素,RNAポリメラーゼ等,多岐にわたるが,多くの場合において,可溶性なタンパク質を得ることができた.その際,結合する相手タンパク質が同定されている場合には,相手タンパク質存在下でタンパク質合成をおこなうことが極めて有効であった.また,すでに我々は,無細胞系を用いてタンパク質中の一残基だけを安定同位体標識する手法を確立しているが,今年度は,この手法を拡張し,タンパク質中の一残基だけに重原子置換アミノ酸を導入する手法を開発した.従来の,soakingによる重原子同型置換法では,重原子の配位特異性が低いため,数種類の異なる重原子置換体を作成して,反射データの位相決定をおこなうことが普通であった.これと比べて,新しい手法により調製されたタンパク質の結晶においては,高い同型性が保たれ,重原子の配位特異性が極めて高いことから,1種類の重原子置換体を作成すれば十分であり,しかも,反射データの位相決定も劇的に容易になるため,X線結晶解析法によるタンパク質の構造決定のための試料調製法として,有望なな手法であると期待される.さらに,重金属を使用しないことから,環境に優しいという利点もある.実際には,Rasタンパク質の32位にヨウ化フエニルアラニンを高い効率で導入することに成功し,現在,反射データ測定のために結晶の作成をおこなっている.大腸菌抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系に関して,これまでの研究成果により,合成量は,生細胞を用いた発現系に匹敵するレベルにまで達している.さらに,無細胞系では,PCR増幅したDNA断片を,そのままタンパク質合成の鋳型として利用できるため,目的DNA断片の発現ベクターヘのクローニングという,従来必要であった煩雑な操作を経ることなく,コードされたタンパク質を調製することが可能である.そこで本年は,無細胞タンパク質合成系を核として,多数のDNAにコードされたタンパク質を,同時並行的に迅速に発現調製する,high throughputタンパク質発現系を確立することを目指した.系の流れとしては,各々のcDNA断片に固有のプライマーセットを用いた1段階目のPCR反応と,発現調節配列(プロモーター,ターミネーター,SD配列など)やTag配列(His-tagやGST-tagなど)を持つ共通プライマーセットによる2段階目のPCR反応を,引き続きおこない,発現用の鋳型DNA断片を作成する.次に,この鋳型を用いた無細胞タンパク質合成により,DNA断片にコードされたタンパク質を発現して解析する.すべての反応は,96穴マイクロプレート上で行い,多数試料の同時処理を可能とする.実際に,無作為に選んだマウスのcDNA 87クローンを,His-tag fusionの形で発現した結果,0.1mg/ml以上の比較的高い合成量が,24クローンについて得られ,また,クローン中で最も大きな分子量214kDaのタンパク質の合成も確認できた.さらに,目的cDNAクローンのPCR増幅から開姶して,発現量や可溶性の解析結果を得るまでに必要な時間は約12時間と,極めて短時間であった.この結果から,多数のタンパク質を,同時並行的に,迅速に発現調製する系を確立できたと考えられる.
奈良時代年中行事の基礎的研究

上記研究課題に関する今年度の研究成果は、以下の通りである。1.わが国の年中行事が朝儀として明瞭になって来るのは、平安時代の弘仁期前後からで、それ以前の奈良時代の実態は余り明らかではない。そこで(イ)国史の記事の性格の検討、(ロ)国史以外の年中行事資料を当時の文献文書、金石木簡資料等を総合的に調査した結果、(1)国史の記載以外にも、奈良時代に多くの年中行事が実際に行われたことが確認ないし推定できること、(2)続日本紀は、基本的に年中恒例の行事を載録しない方針であり、これは中国の史書の中に既に認められること、(3)しかしその行事が通常とは異なる月日・場所・儀式内容であったり、特に外国使臣の出席があった場合や福祉行政的施策を伴ったものであった場合には、国史の記事として書き留められたこと、などが明らかになった。従って国史の記事のみで奈良時代の朝儀の実態を推測することは、かえって当時の常態を見失う恐れがあり、沈黙の史料に慎重な配慮を要することが指摘されるであろう。2.奈良時代の主要な年中行事である雑令にみえる正月一日以下の七節日の成立とその背景を考察した結果、少なくとも次の点を明らかにした。(1)日唐間の節日には相違があり、その相違は両国の風俗習慣に由来するもので、大陸の節日観を移入するに当り、わが国の自主的判断が働いていたと推定されること(2)七月七日の節日は、星に対する信仰がないわが国においては、容易に受容されず、その成立は最も遅かったのではないかと推測される。3.年中行事ではないが、年中の祭祀を含め大嘗祭と天皇の即位儀礼・祭祀について考察し口頭研究発表(神道史学会)した。今後、2の節日の研究と3の祭祀儀礼をさらに推進する必要を痛感している。
光起電力前駆体としての希土類錯体の応用

本研究は、光起電力材料の前駆体として希土類イオンを位置付け、その特徴的な光活性を生かして太陽電池母材に有効に太陽光エネルギーを移動させ、高効率の太陽電池を開発する事を目的としている。具体的には、太陽電池の表面に蒸着されている無反射膜に、希土類イオンをドープする事によってこの目的を達成できる。この実験では、太陽電池の無反射膜材料の屈折率に近いCaF_2にEu(4f^7)をドープした単結晶を用いた。使用した太陽電池の効率を1として、Euの種々の仕込み濃度を持った単結晶に対する効率の上昇の相対比を、太陽電池受光面での照度を変えて調べたところ、ほぼ全ての結晶で効率の向上が認められ、基本的に希土類Euを使うアイデアは有望であることが明らかとなった。そして効率の上昇のためにはEu濃度に最適値があり、それはモル濃度で0.05mol%であることが実験的に求められた。この濃度で最大の変換効率の相対比は、照度1万ルックスで1.5に達し、通常のアモルファス太陽電池の変換効率を10%とするとEuの効果によって5%もの効率の上昇を見込めることになる。得られた実験データは、絶縁体結晶にドープした希土類イオンが太陽エネルギーの高エネルギー側成分を、低エネルギー側成分へと十分に変換を可能とさせるものであり、太陽電池の変換効率を上昇させることを示した。しかし実用的には、絶縁体結晶部分を電池の無反射膜にそのまま適応できるような方向に持っていくことが必要である。そこで太陽電池の無反射膜のダミ-として、純粋なCaF_2の薄い単結晶に最大加速エネルギー200keVのイオンインプランテーション装置を用いて、Euメタルを蒸発させて加速注入し、光吸収を測定してそのド-ズを確かめたが、アニール後Euの光吸収は消え、Euは脱離したものと思われた。更に注入後に表面が薄く着色し、透明度の低下を伴うことが判明し、アニールには、上記の目的と同時に着色をも取り除く条件が要求されねばならず今後の課題となった。
ステロイド筋症に対する新たな予防・治療戦略の確立

積極的な身体運動は、ステロイド療法の副作用の一つである骨格筋機能低下の治療や進行予防に有効であるが、臨床で遭遇する患者の中には、原疾患そのものの特異的な病態や合併症などによって運動制限を有する者も多く存在するため、その代償となる治療法の早期開発が求められている。これまでに我々は、熱刺激に対する筋細胞応答に着目し、筋細胞への加温が、ステロイド投与に伴うタンパク質の合成抑制・分解亢進に関わる細胞内シグナル伝達分子の活性化と筋萎縮を抑制することを明らかにしてきた。そこで、本研究課題では、熱という物理的刺激とアミノ酸栄養に対する筋細胞応答に着目し、温熱刺激またはホエイプロテイン投与がステロイドによる代謝異常とそれに伴う筋萎縮の進行過程に及ぼす影響とその作用機序の解明を行い、臨床応用に向けた科学的根拠を集積するとともに、温熱刺激とホエイプロテイン投与を組み合わせた治療介入が、タンパク質の合成能・分解能と代謝異常を相加的に改善することで、より効果的かつ効率的に筋萎縮の進行を抑制するのではないかといった仮説を検証することが目的である。温熱刺激の効果を検証した実験では、ステロイド投与により萎縮が誘導される筋管細胞に温熱刺激を加えると、その萎縮進行が抑制されるとともに、タンパク質分解に関わる情報伝達経路の活性化が抑制されるだけでなく、タンパク質合成に関わる情報伝達経路の不活性化も抑制されることを明らかにした。アミノ酸栄養の効果を検証した実験では、筋管細胞にホエイプロテインを投与すると、タンパク質合成に関わる情報伝達経路が活性化され、タンパク質分解に関わる情報伝達経路は不活性化されるとともに、筋肥大が引き起こされることを確認した。本研究は、温熱刺激またはアミノ酸栄養がステロイド筋症の進行過程に及ぼす影響とその作用機序を解明するとともに、骨格筋加温とホエイプロテイン投与を組み合わせた新しい治療介入が、ステロイドにより引き起こされる代謝異常とそれに伴う筋萎縮の進行過程に及ぼす影響を検討する。さらに、その作用機序を解明することで、筋機能低下に対する治療や予防を目的とした効果的で効率的な治療法の開発に向けた基礎的資料を提供する。2018年度においては、まず、培養骨格筋細胞(C2C12筋管細胞)を用いて、温熱刺激によりステロイド投与に伴う筋管細胞の萎縮進行が抑制されるとともに、温熱刺激が萎縮進行抑制をもたらす作用機序のひとつとして、温熱刺激がステロイド投与によって生じるタンパク質合成に関わる情報伝達経路の不活性化とタンパク質分解に関わる情報伝達経路の活性化の両方を抑制することが関与している可能性を示した。また、ホエイプロテインの投与によりタンパク質合成に関わる情報伝達経路の活性化およびタンパク質分解に関わる情報伝達経路の不活性化と肥大を生じることを示した。以上の検証は、培養細胞実験に基づくものであるが、これらの研究成果はステロイド投与に伴う骨格筋の機能低下に対する治療や予防を目的とした新たな治療戦略の開発につながる基礎的資料を提供することができるものと確信している。2018年度に行った培養骨格筋細胞(C2C12筋管細胞)を用いた実験では、温熱刺激によるステロイド投与に伴う筋萎縮抑制効果およびそれらの作用機序やホエイプロテイン投与による筋肥大効果について検討した。今後は、これらの結果を基に、培養細胞を用いて追加実験を行い、温熱刺激とアミノ酸栄養がステロイド投与に伴う筋萎縮を抑制する詳細な作用機序を検討するとともに、温熱刺激とアミノ酸栄養を併用した治療介入が、タンパク質の合成能・分解能と代謝異常を相加的に改善できるかどうかを、組織病理学的、生化学的、分子生物学的指標を用いて検討していく予定である。また、培養細胞実験で得られた結果を基礎資料として、ステロイド筋症モデル動物を対象に用いて、温熱刺激、アミノ酸栄養、またはそれらの併用による治療介入を行い、ステロイド投与に伴う筋萎縮ならびに代謝異常の進行過程にどのように影響するのか、その効果検証を進めていく予定である。