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血管内皮細胞における機械刺激受容の分子構築とその活性化による一次応答の解明

血管内皮細胞は機械的な刺激を感知してその生理機能を果たしている。本研究は、内皮細胞が機械刺激を感知する分子機構を明らかにすることを目的とし、ヒト謄帯静脈内皮細胞及びウシ大動脈内皮細胞を用いて以下の結果を得た。低浸透圧刺激を加えると、刺激後数分以内に小分子G蛋白RhoAの活性化とそれに続くFAKとパキシリンのチロシンリン酸化を認めた。これらの活性化によってATPの放出とそれに続くCa^<2+>濃度変化、さらにそれと並行してアクチン線維の一過性重合を認めた。内皮細胞の機械刺激に対するこれらの即時一次反応は、細胞を抗インテグリンα5β1抗体で処理した場合と、ヘパラン硫酸プロテオグリカンをヘパリナーゼIIIで分解した場合に全て消失した。一方、剪断力刺激の感知に関わるという報告があるPECEM-1のMrna発現をsiRNAで抑制したが、この場合は低浸透圧刺激によるアクチン重合は抑制されなかった。また、TGFβ1で処理して形態が変化した内皮でも機械刺激による反応が消失したことから、細胞形態そのものが機械刺激受容メカニズムの一部である可能性が示唆された。さらに、環境変化による機械刺激としての重力負荷を内皮細胞に加えたところ、低浸透圧刺激と全く同一のメカニズムによる即時反応が得られた。従って、本研究の成果より、血管内皮細胞の機械刺激感知機構は単一ではなく、今回のインテグリンα5β1とヘパラン硫酸プロテオグリカンをセンサー分子とした構築と、従来報告のPECAM-1等を含む分子構築の少なくとも二種類存在することが明らかとなり、特に前者は重力や浸透圧等のより恒常的な機械刺激の変化に対応する機構である可能性が示唆された。血管内皮細胞機能の持つ病態生理的意義から考えると、これら複数の分子構築が関わることは、今後機械刺激感知機構を治療標的として捉える上で有用な特徴であると考えられた。血管内皮細胞は機械的な刺激を感知してその生理機能を果たしていることがよく知られている。ところが、従来報告されている多くの反応は、数時間以上の機械刺激に対する遺伝子発現や細胞形態変化などを対象としており、その多くは侵害刺激としての機械刺激への非特異的反応であることが明らかになってきた。本研究は、血管内皮細胞に機械刺激を与えたときの数分以内の反応を一次反応とし、これを指標に内皮細胞がどのような分子機構で機械刺激を感知しているのかを明らかにすることを目的としている。本年度は以下の結果を得た。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に低浸透圧刺激を与えるとFAKのチロシンリン酸化が生じ、これは刺激後2分以内に発現し、5分で最大反応となった。また、同じ時間経過で一過性のチロシンリン酸化を生じた。このチロシンリン酸化とアクチンの一過性重合は抗インテグリンα5β1抗体で処理することによって消失した。ところが、検討したその他の抗インテグリン抗体(抗α2、α6、αv、β4抗体)では影響を受けなかった。従って、機械刺激感知機構にインテグリンα5β1が関与していることが明らかになった。さらに、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)のヘパラン硫酸側鎖をヘパリナーゼIIIによって分解したBAECで同様の検討を行ったところ、低浸透圧刺激によって抗インテグリンα5β1抗体処理の場合と同様に低浸透圧刺激によるアクチンの重合とFAKリン酸化の両方が抑制された。従って、本年度の結果より、少なくともインテグリンα5p1とHSPGが血管内皮細胞の機械刺激感知機構に関与することが明らかとなった。

血管内皮細胞は機械的な刺激を感知してその生理機能を果たしている。本研究は、内皮細胞が機械刺激を感知する分子機構を明らかにすることを目的とした。本年度は以下の結果を得た。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)をヘパリナーゼIIIで分解し、低浸透圧刺激を与えた。共焦点レーザー顕微鏡で測定した細胞の膨化縮小能にはヘパリナーゼ処理後にも変化がなかったが、機械刺激に対するFAKリン酸化等の全ての即時反応が消失した。また、TGFβ_1で処理して形態が変化したBAECでも機械刺激による反応が見られなかったことから、細胞形態そのものが機械刺激受容メカニズムの一部である可能性が示唆された。さらに、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用い、剪断力刺激の感知に関わるという報告があるPECEM-1のmRNA発現をsiRNAで抑制し、低浸透圧刺激を与えた。ヘパリナーゼ処理や前年度の抗インテグリン抗体処理の場合とは異なり、PECAM-1の発現を抑制しても低浸透圧刺激に対するアクチン重合は抑制されず、HUVECにおける低浸透圧の感知にPECAM-1は関与していないと考えられた。以上の結果より、インテグリンα5β1とHSPGが血管内皮細胞の低浸透圧刺激感知機構に関与し、これは過去に報告されたPECAM-1を中心とした剪断力感知機構とは異なるものであることが明らかとなった。即ち、血管内皮細胞の自律的機能調節に重要な機械刺激感知機構の分子構築は単一ではないことが本研究により明らかになった。一方で、血管内皮細胞機能の持つ病態生理的意義から考えると、これら複数の分子構築が関わることは、今後治療標的として機械刺激感知機構を捉える上で有用な特徴であると考えられた。
高度な複素環設計能を有する多官能三員環化合物の開発

複素環化合物より高度な機能や新機能の開拓のために、複素環の多官能化や新規骨格合成のための新試薬や新合成法の開発が多方面から切望されている。このような観点から、本研究では大きな環歪みを有する三員環が直結した多官能ヘテロクムレンを開発し、環開裂をキーとする新しいタイプの複素環設計試薬として有用性の確立を試み、以下のような成果を得た。1.ジハロおよびモノハロシクロプロピル基を有する新規なイソシアナートの合成法を確立した。また、ジハロシクロプロパンカルボニルイソチオシアナート、オキシラニルイソシアナートなどの反応性官能基を有する三員環化合物の合成法も明らかにした。2.ハロシクロプロピル基を有するヘテロクムレン類のアミン類との付加反応や、ニトロンとのシクロ付加による複素環合成を検討し、これらの新規多官能ヘテロクムレンの反応特性を解明した。3.ハロシクロプロパン誘導体の環開裂を活用する複素環設計ルートを開拓した。例えばジブロモシクロプロピル尿素誘導体のメトキシド処理により、プロパン環の開裂をともなってイミダゾリノン環が生成することを見出した。セミカルバジド誘導体からはブロモビニル基を有するトリアゾリジノン環が合成できた。反応を詳細に検討し、反応経路についても明らかにした。4.ジブロモおよびモノブロモシクロプロピル尿素誘導体を塩基処理することによりプロパン環が容易に開裂し、複素環設計試薬として有用なアザジエン誘導体が合成できることを明らかにした。アザジエンのシクロ付加による複素環形成についてもその可能性を確認した。以上のように、多官能シクロプロパンは環開裂により、C3ユニット導入をともなう複素環設計試薬として有用である。複素環化合物のより高度な機能を開拓するために,複素環の多官能化や新規骨格合成のための斬新な試薬や合成ルートの開発が要望されている.このような観点から,本研究では大きな環歪みを有する三員環が直結した多官能ヘテロクムレンを開発し,環開裂をキーとする新しいタイプの複素環設計試薬としての有用性の確立を試み,以下のような成果と得た.1.ジハロシクロプロピル基を有するヘテロクムレンの合成法を確立した.不飽和カルボン酸エステルを相開移動反応を利用してジハロシクロプロパン誘導体とし,次いで酸クロリド,アシルアジドヘと誘導し,アシルアジドの熱分解により新規なジハロシクロプロピルイソシアナート類を合成した.また酸クロリドとロダン鉛との反応によりジハロシクロプロパンカルボニルイソチオシアナートを合成するルートも明らかにした.2.ジハロシクロプロピル基をもつフテロクムレン類とアミン,ヒドラジンとの付加反応やニトロンなどとのシクロ付加による複素環成形反応を検討し,これらの新規は多官能ヘテロクムレンの反応特性を解明した.3.このようにして得たジハロシクロプロパン誘導体を活用する複素環設計ルートを検討した.例えばジブロモシクロプロピルイソシアナートのアニリン付加体をナトリウムメトキシドで処理することにより,プロパン環の開裂を伴ってイミダゾリノン環が生成することを見出した.他方,ヒドラジン誘導体からはブロモビニル基を有するトリアゾリジノン環が得られ,ジハロシクロプロパン誘導体の複素環設計への応用の基礎を確立した.4.オキシラン環を有するイソシアナートの合成についても検討し,その合成法を見出した.今後複素環合成への応用を展開する予定である.複素環化合物のより高度な機能や新機能を開拓するために、複素環の多官能化や新規骨格合成のための新試薬や新合成法の開発が多方面から要望されている。

このような観点から、本研究では三員環化合物がもつ大きな環歪みに着目し、環開裂をキーとする新しいタイプの複素環設計試薬を開発することを目的とした。本年度は前年度の成果をもとに、多官能化シクロプロパンの環開裂について検討し、C_3ユニット導入を伴う複素環合成への応用の可能性を明らかにした。1.ジハロシクロプロパン誘導体をトリアルキルホスファイトートリエチルアミン系で還元することにより、既存の方法よりはるかに簡便にモノハロ誘導体が合成できることを明らかにした。2.ジブロモシクロプロパンカルボン酸エステル類を酸あるいはアルカリ加水分解条件下で処理することにより、β-ブロモブテノリドが合成できることを見出した。生理活性物質と密接に関連するブテノリドの合成法として利用できる可能性が大きい。3.ジブロモシクロプロビル尿素誘導体をナトリウムメトキシドで処理することによりプロパン環が開裂し、生成物の再閉環によりイミダゾリノン環が得られた。この反応を詳細に検討し、多段階の経路を明らかにするとともに、これらをワンポットで行うことが可能であり、条件の改善により収率を飛躍的に向上させることに成功した。4.上記の尿素誘導体を塩基処理すると容易に環開裂が進行し、複素環合成試薬として非常に有用なアザジエン誘導体が生成することを見出した。本法は新しいアザジエン発生法として有用であり、系内に適当な試薬を共存させると、シクロ付加によって複素環形成が可能であることも明らかにした。
「満洲国」中国人作家の日本における文学経験――女性作家・梅娘を中心に

本研究では、満洲国の女性作家・梅娘の日本における文学経験に着目し、彼女が日本滞在期にモダン文化と総動員体制が並存する文化的環境に置かれるなか、多数の日本文学に触れ、日本社会で形成されていた近代女性像に共感していたことを明らかにした。そして梅娘が日本の帝国主義と近代性に向き合うなかで、中国知識人としてのアイデンティティを強めていく過程を解明した。これにより中国文学における日中交流史を補完するとともに、それまで一面的な理解に偏ってきた被占領国作家の占領国体験について、豊富な読書経験、女性観の形成、近代体験と民族主義の相克、それによる民族アイデンティティの強化といった多様な要素を見出した。本研究は、従来注目されてこなかった「満洲国」の中国人作家の日本における文学経験についてとりあげることにより、被占領国作家の占領国体験の意義を検討し、ポストコロニアルの視点から満洲国文学を捉えなおすことを目的としている。具体的には満洲国を代表する女性作家・梅娘の日本経験がその文学にどのように影響を与えたのかについて焦点をあてている。当該年度は、梅娘の日本における主な文学活動の場とされる新聞『大同報』の文藝欄の基礎調査を行った。『大同報』のマイクロフィルム(北京:全国図書館文献縮微中心、1987)を購入し、梅娘が同紙で活動していた時期(1936-1941)の文藝欄を閲覧し、その性質や満洲国文壇における位置について分析した。とくに文藝欄で頻繁に組まれていた文学特集について考察を行った。それとともに梅娘の掲載作品を収集し、その作品を整理した。以上の調査により、『大同報』文藝欄は満洲国文壇において重要な作品発表の場であり、梅娘はその中心的な存在として活躍していたことが明らかになった。そして従来の梅娘の作品目録には掲載されていなかった多数の創作作品を収集することができ、また初出が不明であった梅娘の単行本『第二代』収録作品の大半が『大同報』に掲載されていたことが判明した。さらに『大同報』文藝欄における梅娘の文学活動をたどることによって、それまで曖昧であった彼女の日本滞在時期を確定することができた。以上の基礎調査の成果をもとに、梅娘作品の読解・分析に着手しており、今後これを論文化する予定である。当該年度の成果発表としては、本研究課題の背景となる、梅娘が日本滞在時期に結成していた読書会について論文を発表したほか、満洲国の中国人知識人の日本観に関する研究発表をおこなっている。本研究は、従来注目されてこなかった「満洲国」の中国人作家の日本における文学経験を取り上げることにより、被占領国作家の占領国体験の意義を検討し、ポストコロニアルの視点から満洲国文学をとらえなおすことを目的としている。具体的には満洲国を代表する女性作家・梅娘の日本経験がその文学にどのような影響を与えたのかについて焦点を当てる。前年度に行った『大同報』の文藝欄の基礎調査により、梅娘が文学活動の初期から日本滞在期にかけて『大同報』文藝欄で多数の創作作品を発表していたことを明らかになったが、当該年度はまずこれをもとに論文化する作業をおこなった。論文では『大同報』における梅娘の文学活動を整理することにより、これまで曖昧な点のあった梅娘の日本滞在の時期を明確なものにした。さらに梅娘が日本滞在時に日本を舞台とした小説「女難」を『大同報』に掲載していたことに着目し、その分析を通じて、梅娘が日本のモダニズム世界の中に潜む闇ー女性の困難、そして植民者のエゴイズムを二重に抉り出していたことを指摘した。このほか、留日後の北京での梅娘の文学活動についての研究を進め、雑誌『中国文学』や『婦女雑誌』における日本文学の翻訳や日本を背景にした小説「小婦人」の読解・分析を行った。これにより梅娘の日本経験や日本認識をより明確な形で捉えることが可能になった。当該年度の成果発表としては、梅娘の『大同報』文藝欄における文学活動と「女難」に関する論文「梅娘の日本滞在期と『大同報』文藝欄ー小説「女難」と梅娘の描く日本」(『中国21』43号)と、本研究課題の背景となる満洲国の中国知識人の日本認識に関する論文「満洲国留学生の日本見学旅行記ー在日留学生のみた「帝国日本」」(『漂泊の叙事』勉誠出版)を発表している。また当初の計画にはなかったものの、本研究課題の背景ともなる、満洲国の中国知識人の日本認識に関する論文を発表した。ただし当該年度において予定していた、梅娘の長女である柳青女史に対するインタビューが実施できなかった。これは北京在住であった柳青女史がアメリカに移住したため、旅費の捻出が難しくなったためである。また中国国家図書館(北京)と国立国会図書館(東京)での調査を予定していたが、これについても校務の関係から長期間の出張ができなかったため実施できなかった。具体的には満洲国を代表する女性作家・梅娘の日本経験がその文学にどのような影響を与えたのかについて焦点を当てている。前年度に梅娘の日本経験や日本を背景にした小説の検討を始めていたが、当該年度はさらに梅娘の文学活動全体における位置づけを踏まえたうえで、これらに対する分析を深めた。

そしてその成果を学会で発表し、論文化する作業をおこなった。これにより、梅娘の日本文学の翻訳を通じて、彼女がその日本滞在期にモダニズムと総動員体制が併存する文化的・政治的な洪水の中に身を置いていたことを明らかにした。そしてその作品には、日本の植民地支配に対する抵抗意識だけでなく、それと複雑に絡み合った形で、近代的なモダン文化への憧憬、それによって生まれるジレンマや葛藤、卑屈な心情もまた描き出されていたことを指摘した。これはそれまでの梅娘研究では着目されることのなかった一面である。それとともに梅娘文学の日本滞在期から帰国後の北京での活動に至るまでの成熟を読み解いた。またこの研究の過程で、梅娘が日本の戦争下における女性の動員や銃後の女性像に対して強い関心を抱いており、それがその文学活動にも反映されていることを発見した。このほか、より客観的な考察を導き出すために、梅娘と同時代に日本に留学した田琳という満洲国の女性作家の日本経験や日本題材小説との比較を行い、その特殊性について検討した。当該年度の成果発表としては、梅娘の日本での文学経験や日本題材の小説についての研究発表を行い(2件)、また梅娘の日本における文学経験に関連する論文を中国語に翻訳し、中国大陸で出版された論文集で発表している(1件)。当該年度は、予定していた梅娘の日本における文学経験と日本を背景にした作品について、梅娘の文学活動全体における位置づけを踏またうえで読解・分析を深めた。そしてこの成果を学会で発表し、論文の形にまとめた(論文については平成29年度に掲載予定)。さらにより客観的な考察を行うために、他の満洲国作家の日本経験や日本題材小説との比較についても分析を進め、梅娘の特殊性について検討している。また当該年度には梅娘の日本経験と童話作品との関わりについて分析を行う予定であったが、研究の過程で当該研究課題における重要性が低いことに気づいた。そのため、より重要性が高いと思われる、日本の戦争期における女性の動員や銃後の女性像に対する梅娘の認識についての検討に切り替え、調査や分析を進めている。これらにより本研究課題の研究の目的であった梅娘の日本での文学経験やそれが構築した日本イメージ、国家を超えたジェンダー的視点の形成が明らかになりつつあるといえる。今年度は、前年度に引き続き梅娘の日本経験や日本題材小説の考察について検討を深め、梅娘が日本滞在中に日本の近代性に強い関心を抱き、日本の帝国主義と近代性に向き合うなかで中国知識人としての自覚を強めていく過程を明らかにした。また、梅娘の日本における近代女性像の受容について着目し、とくに梅娘の石川達三や細川武子の作品の翻訳、日本女性に関する論説を取り上げ分析を行った。これにより、梅娘は日本滞在中、日本女性との交流を通じて、良妻賢母思想に基づいた日本の主婦像に深く共感し、帰国後は中国女性に向けて日本女性をモデルにした近代主婦像を紹介したことを明らかにした。従来、梅娘が日中戦争中に日本女性を称賛する文章を発表したことに対し民族主義の観点から批判がなされていたが、その背景には国家や民族主義を越えた立場から、同じ男性中心社会で生きる女性への共感があったことを指摘した。そのほか、梅娘と同時期に日本に滞在した満洲国の女性作家である田琳の日本経験や日本題材小説との比較を行った。
ポドフィロトキシン骨格原子置換体の設計・合成・抗がん活性

ポドフィロトキシン系抗癌剤エトポシド2__ーはその糖部分の変換誘導体による活性強度増強、毒性の軽減が検討されている。本研究ではこうした手法に加えて、ポドフィロトキシン1__ー自体の骨格の注目し、新規含窒素骨格3__ーを設計し、その合成法の開発及び生物活性を検討した。3__ーは短工程、高収率、高立体選択的に合成できた。すなわち、d1ーあるいは光学活性なアミノ酸を還元、環化、ベンジル位の酸化、次いでトリメトキシベンツアルデヒドと縮合するとトランス体4__ーが得られた。シスートランス異性化及びベンジル位置換反応を経由して4__ーから3__ーおよびその誘導体の合成は容易であった。3__ーは期待通りin vivoさらにはin vitroで強い制癌活性を発現することが判明した。また、天然ポドフィロトキシン1__ーと同じ絶対配置を有する3__ーにより強い活性が認められた。これらの結果は含窒素骨格3__ーが新たなリ-ド化合物として多大な可能性を有していることを示すものである。
原発性免疫不全症における復帰変異による体細胞モザイクの意義と分子生物学的基盤

原発性免疫不全症において復帰変異による体細胞モザイクの報告が増えている。復帰変異により機能回復した細胞が増殖優位性を示す場合、一部の症例で臨床症状の改善が認められる。本研究では復帰変異のためOmenn症候群様の症状を呈したX連鎖重症複合免疫不全症症例を見出し、復帰変異の機序や病態修飾因子としての重要性を明らかにした。本現象の解析は、病因蛋白の生体内での役割を理解する上でも有用であり、今後のさらなる進展が期待される。重症複合免疫不全症の中で最も頻度の高いX連鎖重症複合免疫不全症は,サイトカインレセプターであるγc鎖の異常に起因し,T細胞とNK細胞の発生が障害されることが特徴である.我々は今年度の研究において,世界で2番目の報告例となるreversion(遺伝子変異の復帰)を有したX連鎖重症複合免疫不全症乳児例を見出し報告した(Wada T et al. Blood 2008.).患児はIL2RG遺伝子に変異IVS1+5G>Aを有し,スプライス異常により大部分のmRNAは早期翻訳停止となっていたが,一部に正常mRNAも作られており,γc鎖発現の低下した異常なT細胞とNK細胞が認められた.この異常T細胞の存在を背景に,患児では皮膚浸潤CD8^+T細胞にreversionが起こり,Omenn症候群様症状を呈していた.Revertantでは元の変異IVS1+5G>Aにより生じるcrypticなスプライス部位の近傍に第二変異IVS1+29G>Aが出現したために,正常なスプライシングが回復していた.本例の特徴として,復帰変異を有するT細胞が末梢血中では検出されず,皮膚にのみ認められたことがあげられる.おそらく感染や自己抗原などの局所の要因によりrevertantクローンが増殖したためと考えられた.このようにreversionによる体細胞モザイクは,原発性免疫不全症患者の臨床症状に複雑な変化をもたらし得ることが示された。一方、in vitroの実験として計画しているWiskott-Aldrich症候群(WAS)をモデルとしたreversionの誘導実験に関しては、WAS蛋白と薬剤耐性遺伝子であるNeoRの融合遺伝子を発現するベクターを構築中である。融合遺伝子はクローニングが終了し、発現ベクターに組み込む段階にあり、今後の進展が期待される。本年度は、遺伝子変異のreversion(復帰変異)を認めたX連鎖重症複合免疫不全症患児から樹立したT細胞株を用いた実験を行った。X連鎖重症複合免疫不全症では通常T細胞が欠損するため、これまでT細胞株を樹立することは不可能と考えられていた。しかし患児では、特異なスプライス変異によりγc鎖発現の低下した異常自己T細胞が出現していたため、ヘルペスウイルスサイミリを用いたT細胞株の作製に成功した。限界希釈法によるクローニングを行い、もとの変異を有したγc鎖発現の低下したT細胞株と復帰変異を有するγc鎖発現の回復したT細胞株を得ることができた。フローサイトメトリーによりそれぞれのT細胞株の表面抗原発現を解析したところ、いずれもCD8陽性のT細胞で活性化抗原等には差は認められなかった。現在、復帰変異の生体内での役割が明らかにするため、同細胞株を用いてIL-2やIL-4などサイトカイン刺激に対するJak3やSTAT5のリン酸化の違いをウエスタンブロットやフローサイトメトリー法により検討している。またもとの変異を有したT細胞株を種々の条件で培養しているが、現在のところ復帰変異の出現は認めていない。さらに本年度は、患児の弟が出生し、臍帯血を解析する機会を得た。次子では同じγc鎖の遺伝子変異を有しているにもかかわらず、異常自己T細胞や復帰変異を有したT細胞の出現は認めなかった。復帰変異の出現を考える上で貴重な症例と考えられた。X連鎖重症複合免疫不全症(X-SCID)は、インターロイキン-2/-4/-7/-9/-15/-21の受容体として共用されるγc鎖の異常に起因する。T細胞とNK細胞の発生が障害されるため、末梢血に両細胞を欠くのが特徴である。以前、我々が報告した復帰変異(reversion)を有する非典型的X-SCID乳児例(Blood 2008)では、γc鎖遺伝子のスプライス異常のため一部正常mRNAが作られ、γc鎖発現の低下した異常な自己T細胞とNK細胞が認められた。これら異常細胞の存在を背景に、患児では皮膚浸潤T細胞に復帰変異が生じ体細胞モザイクとなっていた。今回、我々は、NK細胞を有する別の非典型的X-SCID症例を解析する機会を得た。キメラ解析により母親由来の細胞の混入は否定され、患児のNK細胞は自己由来と考えられた。顆粒球由来DNAを用いた解析では、exon5の先頭に1塩基欠損を認め、フレームシフトによる早期翻訳停止が予想された。そこでNK細胞を磁気ビーズにより分離し解析したが、同変異のみ認められ復帰変異は検出されなかった。

mRNAを用いた解析より、患児にみられた1塩基欠損は単純なフレームシフトではなくスプライス異常を惹起し、余分な33塩基対を含む異常mRNAが作られることが判明した。原発性免疫不全症の患児が非典型的症状を示した場合、必ずしも復帰変異がみられるわけではないが、その頻度は予想以上に高いことが知られており、常にその存在に注意する必要があると考えられた。
歩行時の動的バランスの定量評価に関する研究

本研究では、加速度センサと角速度センサを用いた動作測定装置を開発するとともに、臨床において実用的で定量的な動的バランスの評価方法を提案することを目的とした。本年度は、リハビリテーションや転倒教室など臨床の場で、歩行を中心とした移動動作の評価に用いられるTimed up & goテスト(以下、TUGテスト)を工学的に解析・評価し、動的バランスの定量化が可能なパラメータに関して検討した。動的バランスの定量化方法を検討するために、試作した動作測定装置を用いて歩行が自立レベルである片麻痺患者10名(以下、歩行自立群)、監視レベルである片麻痺患者10名(以下、歩行監視群)を対象にTUGテストを測定した。その結果、動的なバランス能力が低い歩行監視群は、歩行自立群に比べてTUGテストの遂行時間が有意に長くなり(P<0.05)、その原因は座位からの立ち上がりや着座動作よりも歩行の遂行時間が影響していることが明らかになった。そこで、歩行時の腰背部の動揺に着目し、歩行監視群と歩行自立群の腰背部に生じる加速度を比較したところ、歩行監視群は左右方向と上下方向において有意に小さいRMS値を示した(P<0.01)。さらに、1周期ごとに算出したRMS値をみると歩行監視群は歩行自立郡に比べて値のばらつきが大きくなる傾向がみられた。また、角速度センサの出力から体幹の回転角度幅を算出したところ、歩行監視群ではロール角度幅の再現性が有意に低下した(P<0.05)。以上の結果から、歩行監視群では動的なバランス能力の低下にともないゆっくりとした動作で安全性を確保していること、歩行の再現性が乏しいことが確認された。加速度センサと角速度センサを用いた動作測定装置は動的なバランスを評価する上で有用な情報を提供し、特に体幹の加速度RMS値や回転角度幅が動的バランスを定量化するパラメータになりうると示唆された。高齢者の転倒を予防するためには、動的なバランスなどの身体機能の低下を評価し、転倒を予防するためのリハビリテーションを充実させることが重要である。その評価やリハビリテーションの効率化には、主観の介入しない工学的な評価手法を導入することも必要不可欠であると考える。そこで、臨床応用を考慮し、被検者が携帯可能かつ動作の妨げにならない小型・軽量な動作測定装置の試作を試みた。試作した装置は、加速度センサと角速度センサを組み合わせたものであり、加速度センサ出力の低周波成分(重力加速度)と角速度センサの情報を元に姿勢角を算出した。本装置により算出される姿勢角の精度を検証するために、関節角度計の一方を台座に固定し、もう一方に試作した装置を取り付け、Timed Up & Go testを模擬した角度変化を手動にて行い、角度変化の比較を行った。また、健常者(男性31歳)の立ち上がり動作と歩行距離を1mに設定したTimed Up & Go testを対象に、3次元動作分析装置により算出される角度との比較を行った。関節角度計との比較実験において、姿勢角の算出にこれまで用いられてきた加速度センサ出力の低周波成分のみでは、今回模擬したような複雑な角度変化を正確に算出できないのに対し、両センサを用いて算出した角度変化は関節角度計で測定したものと極めてよく一致した。また、その誤差は関節角度計の可動域に対してほぼ一定に分布し、誤差はおよそ1゚以内であった。また、3次元動作分析装置との比較では、近似な角度変化が得られるものの算出値に差がみられた。3次元動作分析装置が空間座標系で角度を算出するのに対し、姿勢角度測定装置は運動座標系で角度を推定する。今回の測定では、座標軸を完全に一致させることができなかったため、算出した角度に差がみられたと考えられた。本研究では加速度センサと角速度センサを用いた動作測定装置を開発するとともに、臨床において実用的で定量的な動的バランスの評価方法を提案することを目的とする。本年度は、リハビリテーションにおいて用いられるTimed Up and Go Test(TUGテスト)に着目し、その定量的な評価を試みた。TUGテストは、座位から立ち上がり、歩行、歩行しながらの方向転換、着座までの一連の基本動作能力を評価する簡便な手法として知られている。しかしながら、その評価は全遂行時間から転倒のリスクを推定にとどまり、動作フェーズごとに評価基準は設けられておらず質的な評価は療法士の経験と主観に頼る部分が多い。本研究では、まず、加速度センサと角速度センサを被験者の腰背部と大腿部に装着し、TUGテストの動作フェーズを特定する手法を提案した。さらに、療法士の観察による各動作フェーズの特定情報とセンサから得られた情報が一致するかについて検討した。健常若年者を対象としたTUGテストの測定で、立ち上がり時の上体の前傾、歩行開始時の下肢の前方への振り出し、方向転換時のヨー角方向への大きな角速度、着座終了後が角速度センサの出力に明確に確認された。この結果を用いて動作フェーズの特定方法を提案し、高齢片麻痺患者のTUGテストへの適用したところ、健常若年者に比べて各動作にともなうセンサ出力が小さくなるものの同様な傾向が示された。また、本手法で推定した各動作時間と療法士の主観によるものの間には高い相関が示された。以上の結果から、角速度センサの出力からTUGテストにおける動作フェーズの特定に対する有用性が示唆された。これにより、これまでの加速度センサを用いた動作解析に関する研究で得られた知見を有効に利用でき、今後の一連の動作の定量的な評価への応用が期待される。

本研究では、加速度センサと角速度センサを用いた動作測定装置を開発するとともに、臨床において実用的で定量的な動的バランスの評価方法を提案することを目的とした。本年度は、リハビリテーションや転倒教室など臨床の場で、歩行を中心とした移動動作の評価に用いられるTimed up & goテスト(以下、TUGテスト)を工学的に解析・評価し、動的バランスの定量化が可能なパラメータに関して検討した。動的バランスの定量化方法を検討するために、試作した動作測定装置を用いて歩行が自立レベルである片麻痺患者10名(以下、歩行自立群)、監視レベルである片麻痺患者10名(以下、歩行監視群)を対象にTUGテストを測定した。その結果、動的なバランス能力が低い歩行監視群は、歩行自立群に比べてTUGテストの遂行時間が有意に長くなり(P<0.05)、その原因は座位からの立ち上がりや着座動作よりも歩行の遂行時間が影響していることが明らかになった。そこで、歩行時の腰背部の動揺に着目し、歩行監視群と歩行自立群の腰背部に生じる加速度を比較したところ、歩行監視群は左右方向と上下方向において有意に小さいRMS値を示した(P<0.01)。さらに、1周期ごとに算出したRMS値をみると歩行監視群は歩行自立郡に比べて値のばらつきが大きくなる傾向がみられた。また、角速度センサの出力から体幹の回転角度幅を算出したところ、歩行監視群ではロール角度幅の再現性が有意に低下した(P<0.05)。以上の結果から、歩行監視群では動的なバランス能力の低下にともないゆっくりとした動作で安全性を確保していること、歩行の再現性が乏しいことが確認された。加速度センサと角速度センサを用いた動作測定装置は動的なバランスを評価する上で有用な情報を提供し、特に体幹の加速度RMS値や回転角度幅が動的バランスを定量化するパラメータになりうると示唆された。
森林流域における溶存物質の降雨流出特性の解析と数理モデル化に関する研究

森林流域における水質浄化機能の定量評価する手段として,流域内における物質循環機構を的確に表現できる数理モデルの開発を行った。本モデルでは流域内で溶存物質は雨水の流動にともなって移動するとの仮定に立っている。そこで、徳島県白川谷森林試験流域での雨量・流量・水質データを基にして、溶存物質の流動特性と渓流水質形成機構を把握するために、研究代表者らのグループが開発した森林水循環モデルによって流出成分の分離を行い、渓流物質濃度変化との関係について検討を行った。その結果、溶存物質を渓流へ運搬する流出成分は時間とともに変化することが示された。特に硝酸イオンのように濃度の鉛直分布が明瞭に現れる物質において顕著であった。このことは、雨水の浸透にともなう溶存物質の降下とそれの搬送に当たる流出成分の同定を的確に行う必要性を示唆している。以上の結果を踏まえ,森林流域における溶存物質の流動機構を表現するために、先述の森林水循環モデルを基礎として流域を直列に連結した2つのタンクで表現する物質流出モデルを構築した。一般に、溶存物質は単に雨水とともに移動するのみならず、植生による吸収や微生物による分解などの作用を受けるとされている。しかしながら、本モデルにおいては、モデルの基本構造の確立を主眼におくことにし、対象物質としては塩素イオンおよび硫酸イオンを選定して、雨水流動にともなう溶存物質の移流過程に加えて可動水と土壌組織に吸着された不動水に含有される物質間での交換過程(吸脱着過程)を考慮の対象とした。本モデルを徳島県白川谷森林試験流域での観測データに適用し、塩素イオンならびに硫酸イオンの渓流水濃度の再現を試みた。その結果、いずれの溶存物質についても本モデルによって渓流濃度を良好に再現できた。
ポートフォリオを用いた「チーム医療に必要なコンピテンシー」の評価方法の開発

平成30年度は、1ポートフォリオ評価のためのルーブリック評価表、1プロダクト評価のためのチェック表の作成を行った。作成した評価表、チェック表に基づき、平成30年度に実施された「臨床シナリオ学部連携PBLチュートリアル」、「病棟実習シミュレーション学部連携PBLチュートリアル」においてファシリテータからの評価を得た。評価結果は、ただいま分析中である。また昨年度、チーム医療学修カリキュラムの最終段階に位置する「学部連携病棟実習」を終えた学生が修得した能力を明らかにし、その内容を踏まえ、平成30年度は「学部連携病棟実習」で身につけた能力を測定するための自己評価シートならびにファシリテータ評価表を作成した。本来の予定であれば、平成30年度に実施された「学部連携病棟実習」において評価を得る予定であった。しかしながら平成30年度は、医学部のカリキュラム改変に伴い、医・歯・薬学部において「学部連携病棟実習」の実施学年が5年次から6年次に変更されために、例年通りの「学部連携病棟実習」が実施できなかった。薬学部・保健医療学部連携による「学部連携病棟実習」の形をとらざるを得ない状況となったために、平成30年度に作成した自己評価シートならびにファシリテータ評価表を「学部連携病棟実習」で用いることを見送ることとなった。平成30年度は、上記の状況にて収集した結果を分析し、学会等で広く結果を公開するまでに至らなかった。平成27年度は、昭和大学における多職種連携教育カリキュラムの最終段階にある学部連携病棟実習を終えた学生が修得した能力を浮き彫りにし、多職種連携教育に求められるコンピテンシーを明らかにするために、電子ポートフォリオシステムに蓄積されているポートフォリオの質的検討を行った。結果、<専門職連携のための価値観/倫理>では、患者の尊厳を尊重した関わりができる、患者の問題を常に多職種連携実践の中心に置く、様々な視点から多職種で患者の全体像を把握する、患者の問題点の優先順位を多職種連携により決定する、他職種の独自の文化、価値観、役割/責任を尊重する、多職種連携実践の必要性を認識し述べられる、<チームワーク>では、様々な場面において多職種がどの様に協働すれば多職種連携実践がうまくいくか説明する、多職種の誰でもが状況に応じてリーダーシップがとれる、困難な状況、職種間での衝突の際には合意を形成しうまく対処する、多職種連携実践に寄与したり支え合ったりして協働関係を築く、<専門職連携に必要なコミュニケーション>では、メンバーそれぞれが収集した情報を全員で共有する、専門職の視点から自分の意見を積極的に発言する、他のメンバーの意見に積極的に耳を傾ける、<専門職の役割/責任>では、多職種連携における自己の役割/責任を見いだし自分がどう貢献できるか説明する、分からないことは調べ自己の専門分野の視点で学問的裏づけを持って他のメンバーに伝える、などが明かとなった。研究計画に沿って、概ね実施できている。平成28年度は、昭和大学における多職種連携教育の最終段階にある学部連携病棟実習を終えた学生が修得した能力をポートフォリオの質的検討により明らかにし、日本医学教育学会等で発表した。また、本研究により得られた結果(学部連携病棟実習を終えた学生の修得した能力)が、昭和大学における多職種連携教育のコンピテンシーとして妥当かどうかを検討するために、全てのポートフォリオから本研究の分析対象を除き、そこから無作為に抽出した複数グループのポートフォリオの評価を、「学部連携病棟実習を終えた学生が修得した能力」を用いて行なった。ポートフォリオの評価をするためのパラメータを決定する。・「多職種連携教育において学生が修得すべき能力」の評価ツールの作成まで進展した。平成29年度は、昭和大学における多職種連携教育の最終段階にある学部連携病棟実習を終えた学生が修得した能力をポートフォリオの質的検討により明らかにし、「医学教育」に論文投稿した。また、過去に行った研究結果(昭和大学における多職種連携教育の第1段階、第2段階のそれぞれを終えた学生のポートフォリオを質的に検討した)を踏まえ、段階的にどのような能力を積み上げ、最終段階に至ったのかを明らかにするための具体的な検討を行った。段階的に積みあげられることを目指した昭和大学における多職種連携教育において、それぞれの段階の修得すべき能力を明らかにする、までは進展した。しかし、ポートフォリオの評価ツールとして作成、活用するには至っていない。

平成30年度は、上記の状況にて収集した結果を分析し、学会等で広く結果を公開するまでに至らなかった。今後は、抽出された「チーム医療に必要なコンピテンシー」の評価方法の検討を行う。平成27年度の分析結果をもとに、ポートフォリオを評価するためのパラメータを決定。平成28年度のチーム医療学習カリキュラムにおいて運用予定。評価方法の妥当性の検討も多角的な視点から行っていく。平成29年度は、昨年購入した分析ソフトを用いて量的な検討を行い、妥当性の検討を行う。本年度は、これまでの研究結果を踏まえ、ポートフォリオの評価ツールを作成、活用し、その妥当性を検討する。平成27年度は、ポートフォリオの質的検討を行った。学術研究助成基金助成金に採択される以前から質的検討に取り組んでおり、大分進展していたため、当初購入予定であった物品を購入せずに、また人件費をかけることなく実施できた。当初、人件費、謝金の予算として計画していたが、PCを2台購入し、作業を量的な検討と質的な検討の2手に分担したことで使用するに至らなかった。(理由)当初、人件費、謝金を計上していたが、昨年度PCを2台購入し、作業を2手に分担したことで使用せずに済んだ。また、昨年度、分析ソフトを追加で購入する計画を立てていたが、購入するに至らなかった。(計画)平成30年度は、詳細な量的検討を行うために、分析ソフトの追加購入を行う。平成28年度以降は、量的な検討を行う。よって平成27年に購入予定であった物品等を購入し、研究に活用していく。本年度は、さらに詳細な量的な検討を行うために、分析ソフトの追加購入を行う。
古生物デジタル標本の登録・保管・再利用システムの構築

近年、博物館標本・資料の三次元デジタル化が進み、古生物学においても、化石標本の表面形状や内部の断層撮影など、様々な方法で形態のデジタルデータが取得されるようになった。本研究の目的は、このような「デジタル標本」を登録・保管するとともに、それらを再利用できる研究基盤システムを構築することである。特に、「デジタル標本」について、博物館でキュレーティングされた「標本」のように、登録・保管・再利用の手順をきちんと確立しようとするものである。平成30年度は、研究分担者の伊庭が進める研磨断層撮影法(Grinding Tomography:実物標本試料を研磨しながら連続的に断層画像を撮影する方法)によって生成された連続画像セットである「デジタル標本」をケーススタディとして、デジタル標本を登録・保管・再利用するためのシステムの構築を進めた。特に、オリジナルデータの取得から長期保存に至るまでの一連の体制の確立を目指して研究を行った。すなわち、1非圧縮画像データの取得、2それらのソーティング、3研究室での一次保存、4長期保存施設へのデータ移送、5長期データ保管、6データの再利用・公開等、これら一連の手続き・方法の確立やインフラの構築を進めた。また、これらのシステムはウェブベースで構築する計画であるが、本年度はクラウドをプラットフォームとした様々なアプリケーションやサービスをテスト的に利用するなど、それらの将来的な利用可能性について試行する調査や研究を行った。その上で、これらを一部利用する形での本研究専用ウェブサイトの構築を行ってきた(未公開)。1)連続画像をセットとした「デジタル標本」については、おおむね登録・保管・再利用の一連の体制を確立することができた。これは、今後、CT画像データについても応用ができるなど、汎用性が高い体制を作ることができた。2)また、本年度はクラウドの様々なアプリケーションやサービスをテスト利用することができ、将来的な利用可能性について、おおむね目途をつけることができた。1)これまで試行的に構築してきた「デジタル標本」の登録・保管・再利用するためのウェブサイトについて、本年度中に公開可能にし、できるだけ公開しながらシステムのブラッシュアップを進めていく計画である。2)これまでは研磨断層撮影法によって生成された画像データセットのみを扱っていたが、今後は、標本試料の形態デジタルデータについて、CT画像やレーザスキャナ等、異なるファイル形式で取得されたデータについても収集・保管する計画である。3)その上で、これらのデータ内容に関する情報を入力・登録するデータベース(メタデータベース)の構築を進め、異なるデータ取得形式のものでも試料内容による一括検索ができるようにしていく計画である。本研究計画では、化石・古生物試料のCT画像やレーザスキャナ等によるデジタルデータについて、本研究グループだけでなく、他の研究者・研究機関において生成されたデジタルデータを収集する計画である。そのために、直接当該機関に出向いて依頼や研究打ち合わせをするが、平成30年度はその日程調整ができなかったため、次年度に繰り越した。繰り越した助成金は翌年度分と合わせ、おもに出張旅費として使用する計画である。
遷移金属表面での水素の量子的振る舞いに関する研究

Hは、最も軽い元素であり、その運動は、時として古典力学より量子力学で記述される方が適切なことがある。表面に吸着したH原子も例外ではなく、Hは各サイト間をトンネル拡散することができる。熱拡散の活性化エネルギーは振動エネルギーと同程度であるため、振動励起状態にあるHは、量子力学的に非局在化しており、振動準位が有限の幅をもったバンド構造を形成することが理論的に予測されている。ちょうど、ブロッホ状態にある電子と同じことが、表面のHにも言えるわけである。Ni(111)表面におけるHでは、バンド幅は基底状態で数meV、励起状態では数十meVと見積もられている。本研究では、高分解能電子エネルギー損失分光装置を整備して、Pd(110)、Ni(111)、Rh(111)表面におけるH原子の量子的非局在化の研究を行った。Pd(110)の振動スペクトルには、表面被覆率θ依存性が観測され、量子的非局在化モデルを仮定した理論計算との比較から、水素は、この表面では量子的非局在化を示すことがわかった。Ni(111)表面では、(2×2)-2H構造に対して、17、90、96、135meVにピークが観測された。90、96meVはそれぞれ、hcpサイト、fccサイトに吸着したHの非対称伸縮振動である。本研究で初めて、2種類の吸着サイトの分離に成功した。17meVのピークは、基板のフォノンである。θ0.2でもこのピークは観測されることから、(2×2)-2H構造は島状成長することがわかる。低被覆率では、島状成長した(2×2)-2H構造と格子ガスの2相分離状態にある。θ<0.1では、90と96meVのピークの他に、60-70meVから110meVまで拡がっていると思われるブロードなピークが観測された。このブロードなピークは格子ガス相に対応しており、Hの励起状態が量子的非局在化を起こしていることと関係していると考えている。Rh(111)についても、同様の実験を行った。量子的非局在化を示す実験的証拠は得られなかったが、分解能が7-8meVと悪いためであるとも考えられる。水素原子のドブロイ波長は他の原子に比べ長く、水素の振る舞いには著しい量子効果が期待される。2次元周期ポテンシャルにおける水素原子の運動(振動)を考えてみる。水素原子が各吸着サイト間をトンネルするため、表面平行方向の振動準位がバンド構造を形成すると予想される。ちょうど周期ポテンシャル内におかれた電子がバンド構造を形成するのと同様である。基底状態のバンド幅は非常に狭いと考えられるが、遷移金属表面での水素原子の熱拡散の活性化障壁が0.20.3eVで振動エネルギー(0.1eV)と同程度のため、振動励起状態のバンド幅は比較的広いと考えられる。Ni表面でのバンド幅は面方位にもよるが、数数10meVであると理論的に予測されている。基底状態の水素原子は一つのサイトに局在しているが励起状態の水素は表面全体に非局在化していることになる。

水素の振動スペクトルには、エネルギー幅を持った励起状態を反映して、線幅の広がりなどの特徴が見られるものと予想される。非局在状態から局在状態への遷移は、水素原子間の相互作用が本質的である。今年度は、水素の作る超構造を調べ原子間の相互作用を明らかにすることを目的に、コンピューター制御による、CCDカメラを用いた低速電子回析像の取り込みシステムを立ち上げた。操作性の良いユーザーインターフェースを作った。また、電子エネルギー損失分光の高強度/高分解能化を目的に分光器本体の改良を行った。従来用いていた127度型電子分光器を140度型に変更した。強度の若干の増加が確認されたが、予想していたほどの増加は現在のところ得られていない。Rh(111)表面上での水素の研究と平行して装置の条件整備を進めている。表面に吸着したH原子は、各サイト間をトンネル拡散することができる。トンネル拡散の確率が大きいとHは量子的に非局在化し、振動準位が有限の幅をもったバンド構造を形成することが理論的に予測されている。Ni(111)表面におけるHでは、バンド幅は基底状態で数meV、励起状態では数十meVと見積もられている。本研究では、CCDカメラを用いた低速電子回折パターン取り込みシステムを改良整備し、IV曲線の測定を行った。また、高分解能電子エネルギー損失分光装置を整備して、Ni(111)表面におけるH原子の量子的非局在化の研究を行った。用いた分光器のエネルギー分解能は、1-2meVと世界最高水準である。Hの表面被覆率θの関数として、H原子の振動スペクトルを測定したところ、θ=0.5で、17、90、96、135meVに損失ピークが観測された。このθでは、Hは(2×2)-2H構造という超構造を作る。このとき、H原子は、hcpサイト、fccサイトの2種類のサイトに吸着している。90、96meVはそれぞれ、hcpサイト、fccサイトに吸着したHの非対称伸縮振動である。本研究で初めて、2種類の吸着サイトの分離に成功した。17meVのピークは、基板のフォノンである。θ0.2でもこのピークは観測されることから、(2×2)-2H構蓬は島状成長することがわかる。低被覆率では、島状成長した(2×2)-2日構造と格子ガスの2相分離状態にある。θ<0.1では、90と96meVのピークの他に、60-70meVから110meVまで拡がっていると思われるブロードなピークが観測された。このブロードなピークは格子ガス相に対応しており、Hの励起状態が量子的非局在化を起こしていることと関係していると考えている。
TOFーSIMS(飛行時間型質量分析)顕微鏡を用いた角質バリア機能可視化法の開発

アトピー性皮膚炎の要因として角質バリア障害が注目されている。だが、角質のバリア障害を観察評価する手段は限られており、角層内の物質分布を観察する方法も同じく限られている。本研究では、TOF-SIMS(飛行時間型二次イオン質量分析)顕微鏡を用い、角質内の物質分布の新しい可視化方法、角質バリア機能の新しい可視化方法を開発した。その結果、角質層が3つの異なる性質を持った層に分けられることを発見した。フィラグリンKOマウスでは、角質最内層のバリア機能が障害されていた。TOF-SIMSにより観察するのに適した皮膚サンプルの作成方法化、観察手法の最適化を行った。マウス尻尾皮膚をTOF-SIMSを用いて観察し、角質と生細胞層を分けて観察できるようになった。角層はセラミドの分解産物を多く含み、Naに富む領域として同定できた。また、フィラグリンの分解産物であるアルギニンの角層内分布を可視化することに成功した。興味深いことに、アルギニンは角質の中層に集積しており、角質層は、K-high, Arginine-lowな上層、K-low, Arginine-highな中層、K-low, Arginine-lowな下層、の3つの層に分けられることが明らかとなった。上層を水で洗うと、上層に含まれるNa, Kは洗い流された。また六価クロムは上層には容易に浸透するが、中層には浸透しなかった。以上より、角質上層はさまざまな低分子が容易に出入りするスポンジのような構造を取っていることが示唆された。また角質中層はバリアとして機能していた。次に三価クロムの浸透性を評価したところ、三価クロムは角質中層に浸透してアルギニンを洗い流したが、角質下層には浸透しなかった。以上より、角質の中層と下層はそれぞれ異なる物理的性質を持ったバリアとして働いていることが明らかとなった。質量分析顕微鏡を用いることで、これまで知りえなかった角質層の三層構造を明らかにした。本研究では、TOF-SIMS(飛行時間型二次イオン質量分析)顕微鏡を用い、角質内の物質分布の新しい可視化方法、角質バリア機能の新しい可視化方法を開発している。今年度はまず、TOF-SIMSにより観察するのに適した皮膚サンプルの作成方法の最適化、観察手法の最適化を行った。マウス尻尾を粉末ドライアイス中で急速凍結してサンプルを作成し、クライオスタットにて凍結切片を作成。サンプルを融解させることなく直接フリーズドライすることで、融解によるサンプルダメージを防止した。フリーズドライした凍結切片は、走査型電子顕微鏡観察用の導電テープを予め-25°Cに冷却しておいたものでピックアップした。以上により、可溶性分子の拡散による非特異的シグナルの増加を防いだサンプル作成が初めて可能となった。導電テープ上のサンプルをTOF-SIMSにて観察した後、同じサンプルを蛍光染色して蛍光顕微鏡にて観察・撮影し、TOF-SIMS解析により得られた画像データと蛍光顕微鏡観察した画像をスーパーインポーズすることにより、マウス尻尾中の構造とTOF-SIMSの観察結果を対応させることに成功した。マウス尻尾全体をTOF-SIMSを用いて観察したところ、細胞豊富な領域である筋肉が高K低Na領域として観察されるのに対し、間質豊富な領域である結合組織は低K高Na領域として観察された。次に、精製したセラミド6をTOF-SIMSにて解析し、セラミド6のマススペクトルデータを得た上で、セラミド6に特徴的なピークをマウス尻尾断面上で画像化したところ、同ピークは角質領域から特異的に観察され、TOF-SIMSによる角質セラミドの検出に成功したと考えられた。質量分析顕微鏡の強みは、プローブを用いる必要がないため、物質そのものの分布を直接観察できることと、一度の観察で様々な物質を同時に解析できることである。MALDIを用いたものは質量分解能には優れるが、解像度が50100μmと粗いのに対し、TOF-SIMS(飛行時間型二次イオン質量分析)は質量分解能には劣るが、1μm以下の解像度を誇る。本研究では、(1) TOF-SIMSを用いた皮膚切片の観察方法を開発し、(2)アミノ酸の角質内分布の可視化、(3)金属イオン(Ni, Crなど)の角層への浸透の可視化、(4)バリア障害時の角層の構造変化、金属イオン浸透度変化の解析、(5)保湿薬によるバリア障害修復の評価、を目的としている。

今年度は目標通りに、TOF-SIMSを用いた皮膚切片の観察方法を確立することに成功した。また、角質セラミドを特異的に角質から検出することにも成功しており、概ね順調に研究は進展している。また、次年度で解析するための角質バリア障害マウスについても、フィラグリン欠損マウス、flaky tailマウス、クローディン1欠損マウスが準備されている。角質層への物質浸透を画像化するために、まずプローブの選定を行う。プローブに用いる物質は、TOF-SIMSにより高感度に検出可能であり、かつ皮膚に元々存在する量がTOF-SIMSによる検出感度以下である必要がある。元来、TOF-SIMSは金属イオンの検出感度に優れることから、様々な金属イオン、中でもクロムやニッケルといったヒトにおけるアレルギーに関係する金属イオンをプローブとして用いることを検討する。さらに、それらの金属イオンの角質への浸透を画像化する。次にフィラグリン欠失マウス皮膚の解析を行う。フィラグリンは角層内で分解されてアミノ酸にまで至ると考えられている。すなわち、フィラグリン欠失マウスでは、角質内アミノ酸の供給源であるフィラグリン蛋白が消失しているため、角質アミノ酸量が減少していることが予想される。また、フィラグリンの分解過程には様々な酵素が関与していることが判明している。しかしフィラグリン分解の調節機構は全く不明である。何重にも積み重なっている角質層のどこで分解されているのか、角質層全体にフィラグリンの分解産物は均等に分布しているのか、それとも偏った分布を示すのか、言い換えれば、角質層は均一なバリア構造物なのか、それとも何層かの特徴を持った層からなる構造物なのか?角質内のアミノ酸分布の可視化を通じて、これらの疑問に答える。さらに、フィラグリン欠失マウス皮膚において金属イオンの浸透実験を行い、フィラグリンの欠失および角質アミノ酸量の減少により、正常皮膚と比べて角質バリア機能がどう変化しているのかを明らかにする。さらに、保湿剤の塗布によりフィラグリン欠失マウスにおける皮膚バリア障害の治療を試み、金属イオンの角質層への過剰な浸透を防御できるのかを観察する。TOF-SIMS装置は販売価格1億円を超える高価な設備であり、当研究室単独で購入できるものではない。また、TOF-SIMSによる測定は熟練を要するため、専任のオペレータが必要である。そこで、本研究課題では、TOF-SIMSの開発・販売をおこなっているアルバック・ファイ株式会社の協力を得て、サンプルを当科にて作成し、測定はアルバック・ファイにて行うこととした。測定の条件設定のために頻繁にアルバック・ファイを訪れる必要があり、そのための交通費を計上していたが、Skype会議などの活用により直接の訪問を減らすことができ、経費を抑えることができた。また、予備実験を効率よく進めることができたため、消耗品などの使用にかかる経費も節約することができた。