hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胆道癌にて高頻度に同定されたGCF2遺伝子変異がもたらす転移形成メカニズムの解明

遺伝子解析として1癌細胞株を用いた解析,2凍結標本を用いた解析の準備として対象疾患の絞り込みや,プライマー等の準備などが済んでおり概ね順調に進捗しているものと考えられる.胆管癌細胞株を用いた機能解析については,最終的には変異部位が胆管癌に及ぼす機能を評価することを目標に据えているが,これまで胆管癌においてGCF2の発現が及ぼす影響について検証されていないこともあり,まずはその機能解析が必要と判断した.このため細胞株を用いて,これまで当科で行ってきたsiRNAを用いた検証を行うことで,GCF2が胆管癌でも移動能や浸潤能,さらにはEMTなどのメカニズム関与するかについて検証を行うべく,現在機能解析を行っている.こちらも現段階での進捗状況としてはおおむね順調に進行しているものと判断する.本研究は3年での研究を予定している.次年度は,臨床検体を用いた解析を行う前に,変異部位についてのあたりをつけるために,胆管癌における各種細胞株を用いた遺伝子変異解析を行うことを予定している.またこれに並行して細胞株を用いた機能解析を進める予定である.機能解析としては,我々は特に消化器癌においてはGCF2がEMTに何らかの影響を及ぼしていると考えており移動・浸潤能について評価を行うとともに,抗癌剤の感受性といった機能についても評価していきたいと考える.またそのメカニズムを説明するうえで,発現量のよる評価を行うとともに,変異部位を同定しその部分での細胞内でのinteractionを評価することで,どのシグナルに影響を及ぼしているのかを検証していきたいと考えるが,これは3年目になるものと予想している.次世代シーケンサーでの遺伝子解析に若干の遅れが出ており、次年度への繰り越しが発生した。次年度請求分とあわせて使用予定である。
非ＤＮＡに対する放射線損傷に伴う生物影響の検討

リボ核酸の一種であるアデノシン三リン酸(ATP)は、生体エネルギー供与物質として様々な生化学反応へエネルギーを供与している。また同時に、遺伝情報の仲介物質であるメッセンジャーRNAを合成するための基質として、さらには細胞間情報伝達物質としても働く。本研究では、γ線やX線などの電離放射線により、ATPに生じた放射線障害が、ATPのもつ生物学的作用にどのようにかかわっているかに注目して、その生物学的効果への寄与を解析することを試みた。本年度はまず、軟X線を照射したときに起こるATPの分子変化を、軟X線吸収スペクトルの変化から予測した。それによると、ATP薄膜に軟X線を照射すると、ATP分子中の糖部位のC-O結合切断が効率よく起ることが明らかになった。さらに、ATP溶液に対してγ線照射を段階的に行い、液体クロマトグラフ質量分析装置(LC/MS)を用いた測定を行った。検出器としてすべての核酸分子を直接酸化検出することが可能なナノカーボン電極を配置した。γ線の照射量に応じた変化としては、リン酸基の加水分解によるATP量の減少が見られた。また、質量分析結果から、リン酸基の加水分解以外の分子変化を示唆する結果を得た。電気化学分析では、リン酸基の加水分解に伴うATP量の減少が見られたことに加え、5Gyのγ線を照射したATP試料のみ、未知ピークが観察され、質量分析と同様の分子変化が確認された。電気化学的反応によって検出された観点から、アデニン環構造の破壊が起きている可能性は低く、不飽和二重結合への水酸基の付加反応や、アミノ基の酸化反応が進行していることが推察された。上記の分析に加えて、ATPの生化学的な活性を評価するために、ATP溶液を様々な強度のγ線照射あるいはX線照射した後、ルシフェラーゼによるATP加水分解活性ならびに試験管内転写系を用いたRNA合成の基質としての活性の2点を調べた。その結果、放射線照射依存的なATP加水分解活性の低下が認められた。一方、RNA合成基質としての活性に明瞭な活性低下は認められなかった。これらの生化学実験の結果は、放射線照射によるATPの化学的変化がATPの生化学的活性の低下を導くことを示唆する。さらに、ATP受容体活性化能についてERK1/2活性化を指標に検討したところ、Tris溶解ATPの30Gy照射によりATP受容体活性化能が低下していることが明らかとなった。また5Gy照射では若干の増強効果が認められ、γ線照射によってATPの構造が変化している可能性が示唆された。本研究では、非DNA性の核酸生体分子であるRNA分子が、放射線によって損傷した場合の生体影響を多角的に解析し、どのような生物学的効果を示すかをin vitroおよびin vivo実験で検証することが目的である。リボ核酸の一種であるアデノシン三リン酸(ATP)は、生体エネルギー供与物質として多様な生化学反応へエネルギーを供与している。さらに、遺伝情報の仲介物質であるメッセンジャーRNAを合成するための基質でもあるため、遺伝子情報の正確な発現にも重要な働きをしている。そのため、ATPの塩基部位に生じる僅かな分子変異が、このRNA合成にも深く関わり、突然変異や発がんの原因となる可能性がある。そこで、本課題では、DNA以外の分子が損傷を受けた場合に引き起こす生物効果を指標としてATPの生化学機能を網羅的に解析する。放射線照射によるATP分子の変化に伴った分子変異の分析や生物学的効果の分析を行うためには、未照射試料において分子の分解を抑えることが必要である。さらに、放射線によって生じた分子分解は全体の数%程度以下であることが予想されるため、極微量の分子変化を定量する必要がある。そのために、平成24年度はATP溶液について、放射線を照射しない状態で安定な試料条件を検討した。その結果、溶液状態においてリン酸基の脱離が起こらないTrisバッファーの濃度やATPの濃度の最適化を行うことができた。ATP分子の分解については、質量分析、軟X線吸収スペクトルおよび電気化学分析により行い、生物学的効果については、ATPのルシフェラーゼ活性、および細間情報伝達能力を定量することのできる、P2Y受容体活性により分析を行った。上記の最適条件を用いて、γ線照射あるいは軟X線照射による細胞間情報伝達およびATP分子変異の解析を行い、放射線照射による分子変化の同定や生物学的効果の解析を行った。平成24年度は計画時に予定していた放射光を用いた実験及び照射試料の質量分析や電気化学分析による分子構造変異の同定実験について概ね順調に遂行することができた。また、生物学的効果を検証する実験においても実験条件の最適化を行うことができ、試験的な結果について、論文発表や学会発表などを行うことができた。平成24年度の研究について、計画に基づいて概ね順調に研究が進んでおり、今後の研究は研究計画に従って、放射光実験、および照射試料の分析実験による評価、そして、照射試料の生物学的評価を行い論文や学会などに発表する予定である。平成24年度の研究は主に試験的な実験を行った。その結果に基づいて次年度以降は、より定量的な実験データの分析を行う。

最終年度はその定量的な評価をまとめ、論文や学会等での発表を行う。また、研究代表者及び分担者らにおいて議論を重ね、次年度には、最新の実験技術を駆使することにより、試料溶液に対する放射光照射および照射中の電気化学分析を行うことを検討している。そのため、当初予定していた分析装置の高度化を一部中止して、新たな装置の開発に向けるため、一部の助成金を繰り越して次年度に執行する。
沖積平野の形成発達過程を制御する海水準変動以外の要因の抽出とその定量化

日本の海岸平野の沖積層は,これまで海水準変動によって形成されたものとして考えられてきた.しかし,沖積層の形成は,構造運動や火山活動による土砂供給などを受けていることが予測される.本研究の結果,特に高田平野では,沖積層において4回の火山性の大規模土砂供給イベントが認定できた.これらの土砂イベントは,平野の埋積を大きく進捗させ,堆積環境の変遷を日本の海岸平野の沖積層は,これまで海水準変動によって形成されたものとして考えられてきた.しかし,沖積層の形成は,構造運動や火山活動による土砂供給などを受けていることが予測される.本研究の結果,特に高田平野では,沖積層において4回の火山性の大規模土砂供給イベントが認定できた.これらの土砂イベントは,平野の埋積を大きく進捗させ,堆積環境の変遷を日本各地の海岸平野を構成する沖積層は,これまで海水準変動の影響を強く受けて形成されたものとして,層序や堆積相・堆積システムなどの検討が進められてきた.しかし,日本のような変動帯に発達する沖積層は,構造運動(活構造によるイベント性沈降運動)や火山活動に起因した過剰な土砂供給の影響など海水準変動変動以外の要因の影響を受けていることが予測される.本研究は,新潟地域の沖積層の検討成果を活かして,構造運動や土砂供給システムの背景が異なる新潟地域の柏崎・上越(高田)地域の沖積層を対象とし,沖積層の形成に対する海水準変動以外の要因の抽出とこれを要因とした時間空間的な埋積量変化を定量的に明らかにすることを目的とした.平成21年度は,柏崎・上越(高田)地域の沖積層に対して予察的な検討のため,オールコアボーリングを実施して,平野沖積層の基本層序,堆積環境の変遷,地質年代の推定等を行い,平野沖積層の発達過程を明らかにした.また,この中で,上越地域では,15,000年前以降の沖積層の形成において,4回の火山性の大規模土砂供給イベントが検出でき,それぞれ妙高火山の山体崩壊による岩屑なだれ堆積物や火砕流の2次堆積物であることが明らかとなった.これらの土砂イベントは,平野の埋積を大きく進捗させ,堆積環境の変遷をもたらしていることから,上越地域はグローバルな海水準変動のなかで,火山起源の土砂供給が平野形成の規制要因であることが明らかとなった.日本各地の海岸平野を構成する沖積層は,これまで海水準変動の影響を強く受けて形成されたものとして,層序や堆積相・堆積システムなどの検討が進められてきた.しかし,日本のような変動帯に発達する沖積層は,構造運動(活構造によるイベント性沈降運動)や火山活動に起因した過剰な土砂供給の影響など海水準変動変動以外の要因の影響を受けていることが予測される.本研究は,新潟地域の沖積層の検討成果を活かして,構造運動や土砂供給システムの背景が異なる新潟地域の柏崎・上越(高田)地域の沖積層を対象とし,沖積層の形成に対する海水準変動以外の要因の抽出とこれを要因とした時間空間的な埋積量変化を定量的に明らかにすることを目的とした.平成22年度は,上越(高田)地域の沖積層に対しての検討を深めるため,オールコアボーリングを実施して,平野の海岸部の沖積層の基本層序,堆積環境の変遷,地質年代の推定等を行い,平成21年度の成果と合わせて平野全体の沖積層の発達過程をより詳細に明らかにした.具体的には,15,000年前以降の沖積層の形成において,4回の火山性の大規模土砂供給イベントの内陸部から海岸部までの対比ができ,これらの土砂イベントは,平野の埋積を大きく進捗させ,堆積環境の変遷をもたらしていることが明らかとなった.上越地域はグローバルな海水準変動のなかで,火山起源の土砂供給が平野形成の規制要因であることが明らかとなった.日本各地の海岸平野を構成する沖積層は,これまで海水準変動の影響を強く受けて形成されたものとして,層序や堆積相・堆積システムなどの検討が進められてきた.しかし,日本のような変動帯に発達する沖積層は,構造運動(活構造によるイベント性沈降運動)や火山活動に起因した過剰な土砂供給の影響など海水準変動変動以外の要因の影響を受けていることが予測される.本研究は,新潟地域の沖積層の検討成果を活かして,構造運動や土砂供給システムの背景が異なる新潟地域の柏崎・上越(高田)地域の沖積層を対象とし,沖積層の形成に対する海水準変動以外の要因の抽出とこれを要因とした時間空間的な埋積量変化を定量的に明らかにすることを目的とした.平成23年度は,柏崎地域と上越(高田)地域の沖積層において実施したオールコアボーリング試料や既存コア試料を用いて,平野の沖積層の基本層序,堆積環境の変遷の理解をより深めるため,全有機炭素量と全イオウ量の分析を行い,これまでの成果と合わせて平野全体の沖積層の発達過程をより詳細に明らかにした.具体的には,柏崎平野では,海進に伴い形成された浅い内湾域での海進速度の変化に対応した堆積環境の変遷(還元的な環境への変化)と海岸部での構造運動による沈降・圧密作用の量的変化を解明できた.上越(高田)地域では,15,000年前以降の沖積層の形成において,4回の火山性の大規模土砂供給イベントの内陸部から海岸部までの対比ができ,これらの土砂イベントは,平野の埋積を大きく進捗させ,堆積環境の変遷をもたらしていることが明らかとなった.また,これらの土砂イベントに対応した海水の影響変化の具体的な様相が明らかとなった.上越地域はグローバルな海水準変動を受けながらも,構造運動ではなく火山起源の土砂供給が平野形成の規制要因であることが明らかとなった.
象牙細管経由の新しいdrug delivery systemに関する基礎的研究

象牙細管内容液には歯髄内圧に由来した外向きの流れが存在し,この流れが象牙質表面の細菌や刺激物質の侵入を防御するばかりでなく,象牙質に作用された薬剤の歯髄側への侵入も抑制している.そこで,本研究では歯髄方向への静水圧とイオン導入が露出象牙質に加えた薬物の象牙細管を経由した歯髄への送達にどれほど貢献できるかを解明した.1)健全犬歯をもつ17匹の成ネコで,象牙質先端を露出させ,酸エッチングした.歯髄側に向かう圧力を,歯牙チャンバーを介して象牙質に加えた.歯頚部と歯頂部に電極を装着し,機能的単一歯髄神経線維を分離した.チャンバー内には50%リドカインを容れ,20分間0-10.0kPaの圧を加えた.2)0.70mm厚さの象牙質ディスクを48本のヒト新鮮抜去大臼歯から得,スプリットチャンバー装置に装着した.エナメル側チャンバーにはメトロニダゾール,サリチル酸ナトリウム,ナプロキセンナトリウム溶液を容れた(0.05モル/リットル,pH7.4).0.05mAで10分間イオン導入した後に,象牙質ディスクを通過した各サンプルを分光光度計で計測した.その結果,1)歯冠電極への陰極通電に対する全ての順行性神経応答は,どの圧力(0-10.0kPa)でもリドカイン作用後にブロックされた.逆行性複合活動電位の振幅は,加えた圧力が大きくなるほど有意に減少した.2)イオン導入は全ての薬剤の拡散をコントロールと比較して促進した.この促進は,健全象牙質とう蝕下の象牙質の両方で観られた.歯髄方向への静圧力増加とイオン導入は,薬物の象牙細管を経由した歯髄内送達を促進した.今後,(1)象牙質窩洞形成を対象とした,切削時の疼痛に対する注射針を用いない無痛局所麻酔への発展や(2)可逆・不可逆の境界領域の歯髄を対象として,抗炎症約薬を歯髄に送達することで,歯髄保存(救済)の可能性を拡大するという今後の発展への可能性を秘めている.象牙質には,外向象牙細菅内容液の流れがあるので,象牙質表面に貼付した薬剤は歯髄に到達することを抑制される.加圧やイオン導入は外向きの流れに抗して薬剤を送達することを促進するかもしれない.イオン導入法が抗炎症薬や抗生物質を歯髄に送達するのを助ける可能性を検索する目的で研究は行われた.情報を提示された患者から得た歯より髄角直上の象牙質ディスク(0. 7mmの厚み)を採取し,表面を酸エッチングした.0. 05Mのmetronidazole, sodium salicylate, naproxensodiumをスブリットチェンバーの一方に入れ,他方には生理食塩水を入れた.Hydraulic conductanceを計算し,基準値とした.イオン導入(0. 05mAの定電流)の有無でサンプルを採取した後,spectophotometerで濃度を計測した.表面性状は走査式電子顕微鏡を用いて観察した.その結果,う蝕象牙質直下の浸透性は健全象牙質に比較してhydraulic conductanceが有意に小さかった.電子顕微鏡像では健全歯では象牙細菅は空いたままだったが,う蝕下の象牙質では結晶で詰まっていたり,象牙質で修復されたりしていた.こうした形態学的観察結果からの予想とは異なり,陰通電のイオン導入を行うことで健全・う蝕象牙質とも薬剤透過性は増加した.これらのことから,イオン導入法は3種の薬剤の拡散を増強することが判明した.象牙細管内容液には歯髄内圧に由来した外向きの流れが存在し,この流れが象牙質表面の細菌や刺激物質の侵入を防御するばかりでなく,象牙質に作用された薬剤の歯髄側への侵入も抑制している.そこで,本研究では歯髄方向への静水圧とイオン導入が露出象牙質に加えた薬物の象牙細管を経由した歯髄への送達にどれほど貢献できるかを解明した.1)健全犬歯をもつ17匹の成ネコで,象牙質先端を露出させ,酸エッチングした.歯髄側に向かう圧力を,歯牙チャンバーを介して象牙質に加えた.歯頚部と歯頂部に電極を装着し,機能的単一歯髄神経線維を分離した.チャンバー内には50%リドカインを容れ,20分間0-10.0kPaの圧を加えた.2)0.70mm厚さの象牙質ディスクを48本のヒト新鮮抜去大臼歯から得,スプリットチャンバー装置に装着した.エナメル側チャンバーにはメトロニダゾール,サリチル酸ナトリウム,ナプロキセンナトリウム溶液を容れた(0.05モル/リットル,pH7.4).0.05mAで10分間イオン導入した後に,象牙質ディスクを通過した各サンプルを分光光度計で計測した.その結果,1)歯冠電極への陰極通電に対する全ての順行性神経応答は,どの圧力(0-10.0kPa)でもリドカイン作用後にブロックされた.逆行性複合活動電位の振幅は,加えた圧力が大きくなるほど有意に減少した.2)イオン導入は全ての薬剤の拡散をコントロールと比較して促進した.

この促進は,健全象牙質とう蝕下の象牙質の両方で観られた.歯髄方向への静圧力増加とイオン導入は,薬物の象牙細管を経由した歯髄内送達を促進した.今後,(1)象牙質窩洞形成を対象とした,切削時の疼痛に対する注射針を用いない無痛局所麻酔への発展や(2)可逆・不可逆の境界領域の歯髄を対象として,抗炎症約薬を歯髄に送達することで,歯髄保存(救済)の可能性を拡大するという今後の発展への可能性を秘めている.
エンドミルによるサファイアの微細切削技術の開発

特殊,極限環境下で使用されるサファイアデバイスの製造技術として,微細切削技術を開発した.六方晶のサファイアの平削りとエンドミル切削では,結晶面および結晶軸に対する切削方向によって切削特性が異なる.また,エンドミル切削では脆性損傷とともに仕上げ面に対する切りくずの溶着が問題であり,これらを考慮した切削条件を選定しなければならない.分割切込みによって,溶着に起因する仕上げ面粗さの劣化を抑えることが可能である.特殊,極限環境下で使用されるサファイアデバイスの製造技術として,微細切削技術を開発した.六方晶のサファイアの平削りとエンドミル切削では,結晶面および結晶軸に対する切削方向によって切削特性が異なる.また,エンドミル切削では脆性損傷とともに仕上げ面に対する切りくずの溶着が問題であり,これらを考慮した切削条件を選定しなければならない.分割切込みによって,溶着に起因する仕上げ面粗さの劣化を抑えることが可能である.サファイアはAl_2O_3を主成分とする六方晶であり,a,c,m,rの結晶面に対して,機械的特性や化学的特性が異なる.今年度は,r面に対する機械的特性と切削特性を調べた.まず,変位制御式の押込み試験機を製作し,ダイヤモンド圧子による押込みによって,サファイア平板の各結晶面におけるき裂発生時の応力を測定した.製作した試験は,荷重の安定性を考慮して微動ステージによって試験片にダイヤモンド圧子を押込むものであり,荷重はテーブル側に装着した圧電型動力計によって測定する.一方,き裂の発生はAEセンサによって検出する.また,比較のためにクラウンガラス,パイレックス,石英ガラスの特性も測定した.押込み試験の結果,サファイアのき裂発生時の応力は,比較したガラスのものに対して極めて高いことを明らかにした.次に,切れ刃先端部のノーズ半径が0.6mmの単結晶ダイヤモンドの工具で平削り切削試験を実施した.この試験では,試験片を35゚程度傾けて切込みを連続的に変化させ,切削過程が延性モードから脆性モード遷移する臨界切込みと,切削力の変化を測定した.なお,表面の脆性損傷状態の観察と切込みの測定は,レーザ顕微鏡を使用した.また,r面は切削する方向によって異方性があるため,a軸方向を基準に45度ずつ切削方向を回転させた.切削方向によって切削力特性が大きくことなり,切削力に対する異方性を確認した.次に,a軸に沿って切削すると3μmの切込みでも脆性損傷のない良好な加工面を得られるが,a軸と直交する方向では,切込み1μm以下でも脆性損傷が生じ,脆性損傷が発生する限界切込みにも異方性があることを確認した.サファイアはAl_2O_3を主成分とする六方晶であり,a, c, m, rの結晶面に対して,機械的特性や化学的特性が異なる.今年度は,m面における平削りとエンドミル切削の特性を調べ,良好な仕上げ面を得るための切削条件を検討した.まず,切れ刃先端部のノーズ半径が0.6mmの単結晶ダイヤモンド工具による平削り切削様式において,C軸方向に対する切削方向が切削特性に及ぼす影響を調べた.切削試験では,被削材を35°程度傾け連続的に切削厚さを変化させ,切削厚さに対する仕上げ面の変化を観察した.また,切削力を測定し切込みに対する切削力の変化を調べた.その結果,切削力のAC成分の変動に基づいて,延性モードから脆性モードから遷移する状態を判定できることがわかった.また,脆性損傷が発生する限界切込みには異方性があり,C軸に対して垂直方向に切削する場合が最も大きく安定した仕上げ面が得られやすいことがわかった.次に,直径0.4mmのcBNボールエンドミルによる切削について,C軸方向に対する工具の送り方向,回転数,送り速度が仕上げ面に及ぼす影響を調べた.C軸に対して垂直方向にエンドミルを送り,回転数20000rpmで切削すると良好な仕上げ面が得られる.また,送り速度は小さいほど仕上げ面が良好であることが明らかとなった.エンドミル切削では,脆性損傷とともに切りくずの再溶着が問題となった.再溶着は切削温度に起因するため,溝加工作業を粗工程と仕上げ工程に分割し,仕上げ工程では微小切込みにより温度上昇の抑制を図った.その結果,材料の溶着が抑制され,仕上げ面が改善された.サファイアのボールエンドミル切削では,工具を送り方向に傾斜させる.まず,この工具姿勢が工具摩耗と仕上げ面粗さに対して以下の効果があることをシミュレーションに基づいて議論した.(1)実切削時間が短くなるため,切削温度が下がり,工具摩耗が抑制される.(2)切削点が高くなり回転半径が大きくなるため,切削速度は上がり,その変動範囲が少なくなる.そのため,一様で良好な仕上げ面が得られる.(3)脆性材料では,切れ刃稜線の粗さが仕上げ面に転写される.工具傾斜により,その影響を抑えられる.次に,脆性損傷や溶着のない仕上げ面を得るための切削条件と作業工程を検討し,以下の結論を得た.(1)結晶面によって仕上げ面あらさが異なり,a,c,r面ではr面の切削において,最も良好な仕上げ面が得られる.(2)m面に対するエンドミル切削では,スピンドル回転数5000rpmと20000rpmの場合に最も良好な仕上げ面となった.

なお,この影響は,スピンドルや工具の動的振れにも依存する.また,送り速度の影響では,送り速度が小さいほど良好な仕上げ面となる.さらに,いずれのスピンドル回転数と送り速度でも,工具をc軸方向に対して直角方向に送ると良好な仕上げ面が得られる.(3)サファイアのエンドミル切削では,脆性損傷とともに溶着を抑制する必要がある.材料の溶着を抑制するためには,できるだけ低い切削温度で加工することが望ましい.これを踏まえ,工程分割によって軸方向切込みを数回に分けることで,溶着に起因する仕上げ面粗さの劣化を抑えることが可能である.(4)エンドミルによる溝加工では,切れ刃が材料から抜ける縁部の近傍で脆性損傷が生じやすい.これを抑制するために,あらかじめ切れ刃の出口部に微小切込みで溝を加工し,その後に所定の深さで溝加をする.
工業的利用を見据えた触媒的光延反応の開発研究

本年度は、触媒的光延反応に関する研究の中から前年度に新たに利用価値を見出した光延触媒の再酸化容易な光延試薬としての性質について明らかにした。前年度に最適化検討で見出した光延試薬2-(3,4-ジクロロフェニル)アゾカルボキシレートを用いて、一般的な光延試薬であるジエチルアゾジカルボキシラート(DEAD)を用いた場合の基質適用範囲に含まれる基質を用いて検討を行ったところ、ほぼ全ての基質に対して有効に機能することが示された。生成物の立体選択性の問題が生じる基質や求核剤の酸性度が問題となる基質に対しても、試薬の芳香環上の官能基を適切に選択することで適用範囲が広がることを明らかにした。また、前年度にone-potでの再酸化によって反応に用いた光延試薬および目的物を容易に回収する手法を報告しているが、今年度は酸化に弱い基質4種類に対しても本手法が有効に機能することを示した。開発した光延触媒を工業的スケールで利用するために最も重要な安全性に関する知見を得るために、触媒の酸化体であるアゾ化合物の安定性に関して前年度に引き続きさらなる評価検討を行った。具体的には、密封セル示差走査熱量計(SG-DSC)を用いて耐圧容器中での熱分解の挙動を観察することによって、汎用される光延試薬と比べて熱分解温度が上昇していることを示した。本研究課題で扱う触媒的光延反応は酸化剤側であるアゾ化合物のみを触媒化した反応であるが、この知見を基に他のグループが発表したアゾ化合物と還元剤のホスフィン化合物が共に触媒化された両触媒型光延反応が、光延反応機構で進行しない異なる反応系であることを示し、真の両触媒型光延反応を開発するために今後解決しなければならない課題を明らかにした。得られた研究成果の一部は日本化学会第97春季大会等にて学会発表を行い、その詳細をまとめたものは海外学術誌に掲載された。28年度が最終年度であるため、記入しない。触媒的光延反応の機構解析を行い、得られた知見を基に条件最適化を行った。エチル2-フェニルアゾカルボキシラートとホスフィンとのベタイン形成反応を観察したところ、本ベタイン形成は平衡関係にあることがわかった。さらに置換基効果の検討を行ったところ、電子求引基を有する場合に、平衡がベタイン側へ片寄ることが判明した。次にエチル2-フェニルヒドラジンカルボキシラートを基質とした鉄触媒と酸素による酸化反応を追跡したところ、反応速度は0次に従うことが明らかとなった。さらに、置換基が反応速度に与える影響を調べたところ、いずれの置換基を有する場合も無置換体と比べ反応が加速されることが判明し、ラジカル中間体の関与が示唆された。ここまでの検討から光延触媒には、ベタインの形成では電子求引基が必要である一方で、酸化段階においてはラジカル種を安定化する官能基があればよいことがわかった。この事実はエチル2-(3,4-ジクロロフェニル)ヒドラジンカルボキシラートが最適触媒である理由をよく説明する。一方で、これらの結果に基づけば、比較的強い電子求引基を有する触媒が効果的だと考えられる。そこで、1級アルコールとフタルイミドを基質として光延触媒の検討を行ったところ、4位にシアノ基を持つ触媒を用いた場合に、より高い収率で生成物が得られた。しかし、生成物の立体選択性が問題となる2級アルコールとカルボン酸に代えて検討を行ったところ、立体選択性の低下が確認された。これらの事実は、適切な光延触媒を選択することで幅広い基質に対応できる可能性を示している。ここまでの知見を基に、反応条件の最適化と基質一般性の検討を行ったところ、二つの触媒を併用することで最終的に触媒量10 mol%、室温条件において17種類の基質に対応する目的物を良好な収率で得ることができた。また一部の基質においては両触媒量を3 mol%に抑えることに成功した。触媒的光延反応に関して1光延触媒の還元過程に関する速度論解析2基質適用範囲の評価3NMR (核磁気共鳴法)を用いた反応中間体の構造解析4光延触媒の安定性評価を行い、さらに5光延触媒の酸化体の当量光延反応への適用検討を行った。1では前年度に報告したアゾ化合物とホスフィンとの付加過程を評価するために、ホスフィンおよび水を過剰量用いる反応系を設定し、その反応速度定数を求めた。得られた反応速度定数をハメット則に適用したところ、正の相関を示す直線が得られた。このことから、アゾ化合物とホスフィンの付加反応の速度は電子求引性の置換基によって大きく促進されていることが明らかとなった。2では前年度に見出した最適条件を用いて、基質適用範囲の検討を行った。その結果、酸化に弱いとされるチオフェン化合物等を含む32種類の基質に対して触媒的光延反応が機能することが明らかになった。3ではNMR観察によるアゾ化合物とホスフィンの付加過程の反応中間体に関する詳細な構造解析を行った。その結果、本付加過程においてはカルボイミダート構造を有するベタイン中間体が形成されることが示された。4では光延触媒の安定性評価を行ったところ、熱重量示差熱分析および示差走査熱量測定の結果から、一般的な光延試薬に見られるような発熱的な分解は起きないことが明らかとなった。

5では光延触媒の酸化体の当量光延試薬としての利用検討を行った。光延試薬の最適化の結果、エチル2-(3,4-ジクロロフェニル)アゾカルボキシラートが最も良い反応性を示した。さらに、酸素酸化によるヒドラジン化合物の再利用についての検討を行ったところ、反応終了後に反応系内にフタロシアニン鉄を加えることで同一容器内でのアゾ体への再酸化および試薬の回収が可能であることが確認された。本研究の目的は、申請者が以前に開発した触媒的光延反応の改良を行い、既存の光延反応の完全な代替法にするとともに、その適用範囲を工業的スケールにまで拡大することである。申請者は前年度までの目標として、鉄触媒と光延触媒の二触媒系もしくはハイブリッド化による単一触媒系を問わず、触媒的光延反応を実験室レベルにおける光延反応の完全な代替法となるまで高めることを挙げていた。光延反応の完全な代替法となるためには1反応性2安全性3再利用性の全ての面において既存の光延反応と同等もしくは上回る必要があるが、触媒的光延反応を開発した時点で3の再利用性の面で優位性を持つものの、1の反応性には改善の余地があり2の安全性については評価されていなかった。申請者は、前々年度における反応条件の最適化、および前年度までの反応機構解析に基づいた新規光延触媒の発見により1の反応性の面で二触媒系の触媒的光延反応が既存の光延反応と同等の性能を持つことを示した。また、前年度に熱重量示差熱分析などを用いて熱安定性の評価を行ったところ高い熱安定性を持つことが示されたことから、2の安全性の面においても既存の光延試薬と比較して優位性を持つことが明らかとなった。さらに、ここまでの実験は全てミリグラムスケールで検討を行っていたが、グラムスケールでの検討を行った場合にも同様の収率で目的物を得られることを確認した。これらのことから触媒的光延反応は実験室レベルにおける光延反応の代替法として利用できる段階に達したと判断できる。また、3の再利用性を応用することで、光延触媒の酸化体であるアゾ化合物を当量試薬として用いた際にその廃棄物として生じるヒドラジン化合物を鉄と酸素によって容易にアゾ化合物として変換および回収できることを明らかにした。以上のことから、実験室レベルでは冒頭の目的をほとんど達成できたといえる。本年度は、触媒的光延反応に関する研究の中から前年度に新たに利用価値を見出した光延触媒の再酸化容易な光延試薬としての性質について明らかにした。前年度に最適化検討で見出した光延試薬2-(3,4-ジクロロフェニル)アゾカルボキシレートを用いて、一般的な光延試薬であるジエチルアゾジカルボキシラート(DEAD)を用いた場合の基質適用範囲に含まれる基質を用いて検討を行ったところ、ほぼ全ての基質に対して有効に機能することが示された。生成物の立体選択性の問題が生じる基質や求核剤の酸性度が問題となる基質に対しても、試薬の芳香環上の官能基を適切に選択することで適用範囲が広がることを明らかにした。また、前年度にone-potでの再酸化によって反応に用いた光延試薬および目的物を容易に回収する手法を報告しているが、今年度は酸化に弱い基質4種類に対しても本手法が有効に機能することを示した。開発した光延触媒を工業的スケールで利用するために最も重要な安全性に関する知見を得るために、触媒の酸化体であるアゾ化合物の安定性に関して前年度に引き続きさらなる評価検討を行った。
膜電位操作回路による生体骨構築のための基盤研究－光照射による骨リモデリング制御－

超高齢化社会を迎えて、骨粗鬆症を代表とする骨疾患は増え続けている。この治療・改善には、骨リモデリング機構を明らかにするとともに、そのコントロールが必要である。光活性化型分子を用いて、骨芽細胞・破骨細胞に膜電位操作回路を導入することに成功した。本研究では、創出した膜電位操作回路導入骨芽細胞・破骨細胞を用いて、骨リモデリング制御により、生体内において骨構築をおこなうことを目的とした。本年度では、マウス生体内において、膜電位操作を介した骨リモデリング制御を通して骨構築をおこなうことを目的とした。確立した膜電位操作回路を用いて、生体内骨構築を試みた。頭頂骨由来の骨芽細胞に膜電位操作回路を導入して、マトリゲルとともにマウス頭頂骨欠損部に埋め込んだところ、細胞群の欠損部位における定着が確認された。透明プラスチックを通して光照射による膜電位操作をおこなうと、8週間後に骨欠損部の骨量回復が対照群に比べて顕著に認められた。この結果から、本研究で開発した膜電位操作回路の生体内における適用性が確認された。また、膜電位操作による細胞機能コントロールについても検討をすすめた。分子の細胞内輸送に焦点をあてて検討をおこなったところ、骨芽細胞において、破骨細胞形成因子の一つであるRANKLの細胞内輸送と膜電位変動の関係が明らかとなった。その細胞内輸送には、多様なイオンチャネルが関与しており、特に電位依存性のカルシウムチャネルの役割を確認した。これらの結果から、非興奮性細胞における膜電位変動の重要性が明らかとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。超高齢化社会を迎えて、骨粗鬆症を代表とする骨疾患は1000万人を超えると推定される。光活性化型イオンチャネル・ポンプを用いて、骨芽細胞・破骨細胞に膜電位操作回路を導入することに成功した。本研究では、創出した膜電位操作回路導入骨芽細胞・破骨細胞を用いて、骨リモデリング制御により、生体内で任意の部位・時期で骨構築をおこなうことを目的とする。本年度では、生体内での骨関連細胞機能のコントロールによる骨リモデリング制御を通して骨構築をおこなうことを目的とした。具体的には、レンチウィルスによる遺伝子導入を用いて、マウス生体内で膜電位操作回路を組み込んで、骨構築を試みる。マウス由来の骨髄細胞をIn vitroで培養して、骨芽細胞・破骨細胞を分化・誘導する。それらに、レンチウィルスにより膜電位操作回路を組み入れてから、標的部位に細胞移植をした後、局所的な光刺激により膜電位操作をおこなう。A:頭頂骨部に焦点をあてて、頭頂骨を切り取った部分に、マトリゲルとともに膜電位操作回路を組み入れた細胞を埋め込み、定着させることに成功した。細胞定着の試行錯誤のため、予想以上に時間がかかったが、現在、この細胞を埋め込んだマウスにたいして、光照射をおこない、骨量のコントロールをおこなうことを試みている。B:膜電位操作回路の発展のため、膜電位感受性分子の破骨細胞の機能的スクリーニングをおこない、その結果、ライソソームにある膜電位感受性イオンチャネルのカルシウム透過性チャネルTPC2を同定した。破骨細胞の分化過程において、細胞内カルシウム濃度の変動が深くかかわっているが、TPC2はこの細胞内カルシウム変動を制御しており、破骨細胞分化をコントロールしていることを報告した(発表論文2)。また、力学的負荷・膜電位変動時における骨芽細胞の細胞内カルシウム変動にイオンチャネルTRPV4の関与を見出した(発表論文1)。現在、これら分子を膜電位操作・細胞内カルシウム変動に生かすために、細胞における発現調整をおこなっている。C:非興奮性細胞における膜電位の役割を検討するため、軟骨細胞株に膜電位操作回路を組み入れて、検討をすすめている。予備実験の結果、過分極により軟骨細胞分化が促進して、脱分極により分化抑制が生じることを確認した。A:

In vivoにおいては、頭頂骨に細胞を埋め込んだマウスに対しての光照射を続けて、骨構築の程度を観察していく。B:膜電位操作回路に関しては、報告した分子を使用して、膜電位操作・細胞内カルシウム変動に生かすために、細胞における発現調整をおこなう。C:他の非興奮性細胞については、予備実験結果をもとに、膜電位の役割をスクリーニングしていく。25年度が最終年度であるため、記入しない。
超短パルスレーザー/多光子イオン化法による多塩素化ダイオキシンの高感度分析

本研究では、フェムト秒レーザーを光源として用いる多光子イオン化質量分析法により、多塩素化ダイオキシン類のイオン化・検出を実現することを目的としている。平成17年度は、本研究の主要な研究課題である多塩素化ダイオキシン類の検出について、マイルストーンとなる以下に示す実験結果を得た。1.ダイオキシン類の高感度化を目的として、飛行時間型質量分析装置の分解能の改善を試みた。レーザーエネルギー等の最適化を行った結果、分子量112のピークにおいて分解能1500を達成し、平成16年度と比較して約3倍向上した。2.フェムト秒レーザー及びナノ秒レーザーを用いて、1塩素化から5塩素化までのジベンゾフランのマスクロマトグラムの測定を行った。その結果、ナノ秒レーザーでイオン化した場合と比較して、フェムト秒レーザーを用いた場合、多塩素化ジベンゾフランの感度が1桁程度向上し、フェムト秒レーザーの有用性が確認された。3.多光子イオン化質量分析法を用いたダイオキシン類の測定において、1塩素化から5塩素化までのジベンゾフラン類の質量スペクトル中のフラグメントパターンに、各同族体共通の特徴があることが確認された。4.紫外フェムト秒レーザーを用いて5塩素化ジベンゾフラン異性体の混合物のマスクロマトグラムを測定し、そのピークの強度比を測定した。また、感度の向上を目的として装置の最適化を行い、最終的に平成16年度と比較して、検出限界が2桁以上向上した。平成16年度は、本研究の主要な研究課題である紫外フェムト秒レーザーの発生、及びダイオキシン類のイオン化において、マイルストーンとなる以下に示す実験結果を得た。1.ダイオキシン類のイオン化光源として用いる紫外フェムト秒レーザーを発生させる為の装置の改良を行った。この結果、波長:260nm、エネルギー:40μJ、パルス幅:150fsの紫外短パルスレーザーの発生に成功した。2.パルスパルブを用いずにキャピラリーを用いて試料を直接導入するため、ノズル部の改造を行った。これにより、繰返し周波数1kHzの高繰返し紫外レーザーをイオン化光源とするダイオキシン類の質量スペクトルの測定が可能となった。また、従来のノズル・駆動装置、及びそれらとレーザーのタイミングの調整が不要となり、測定時間の短縮が達成された。3.紫外フェムト秒レーザーを用いて、ダイオキシン類の前駆体であるクロロベンゼンとテトラクロロベンゼン、及び2-モノクロロジベンゾフランの質量スペクトルの測定を行った。また、レーザーのパルス幅によるイオン化効率の比較検討を行う為、ナノ秒レーザー及びピコ秒レーザーを用いて多塩素化ダイオキシン類の質量スペクトルの測定を行った。その結果、レーザーのパルス幅が短くなるにつれて、多塩素化ダイオキシン類の感度が向上することが実証され、フェムト秒レーザーの有効性が確認された。
抗ヒスタミン薬治療抵抗性慢性蕁麻疹におけるIL-1βを起点とする炎症病態の解明

本研究はNLRP3疾患関連変異体を導入した肥満細胞を移入した家族性寒冷蕁麻疹モデルマウスで確認される好中球性炎症の惹起と血管透過性亢進の機構を明らかにするとともに、同様の知見が抗ヒスタミン薬治療抵抗性の慢性蕁麻疹患者において確認されるかを検証することを目的とした。ヒトの自己炎症性疾患患者で認められるNLRP3疾患関連変異体と同一の部位に遺伝子変異を導入したマウスNLRP3変異体を発現する肥満細胞をIL-17欠損マウスへ移入した際には,好中球遊走や血管透過性が確認されないことから,この反応にはIL-17が関与すると示唆された。しかし,NLRP3疾患関連変異体の発現に伴い細胞死が誘導されるため,細胞は徐々にIL-1βの産生能を失い,実験の再現性が乏しかった。この問題を克服するため,テトラサイクリン添加によりNLRP3遺伝子の発現が誘導される細胞を樹立し検討を行ったが,好中球遊走や血管透過性を引き起こしているものが,IL-1βに依存するのか,細胞死によるものであるのかを評価する必要があると感じた。これに対しては,前駆体IL-1βを恒常発現する細胞を更に樹立し,NLRP3疾患関連変異体の遺伝子誘導に伴い,IL-1βの活性化を認める細胞と細胞死のみを認める細胞とに分けて,検証を継続する予定である。一方,皮膚生検組織を用いて,前駆体および活性型IL-1βに対する抗体を用いて免疫染色を行い,真皮の肥満細胞とともに真皮毛細血管周囲にIL-1βが染色されることを確認した。これらが好中球遊走を伴った疾患特異的な現象であるのかを,現在さらに解析中である。本研究では,NLRP3疾患関連変異体を導入した肥満細胞株MC/9細胞をマウス腹腔への細胞移入することで誘導される好中球性炎症の惹起と血管透過性亢進の機構を明らかにすることで,NLRP3の恒常的な活性化によって誘発される家族性寒冷蕁麻疹の皮疹の発症機序解明を目的とする。疾患変異体を導入したMC/9細胞をIL-17欠損マウスの腹腔へと移入した際は,好中球遊走が誘導されず,血管透過性も確認されないことから,この反応にはIL-17が関与することが示唆された。ただし,その機序を詳細に検討する際に,NLRP3疾患関連変異体が細胞死を誘導するためか,遺伝子を安定発現する細胞は徐々にIL-1βの自発的産生能を失い,実験の再現性が乏しかった。この問題を克服するため,テトラサイクリン誘導プロモーターによって疾患関連NLRP3を発現する細胞を樹立した。このプラスミドでは,ドキソサイクリンの添加により疾患関連NLRP3が誘導され,NF-κBの自発的活性化やIL-1βの産生など,疾患関連変異体のもつ遺伝子機能として予測される経路が働くことを確認した。来年度は,このプラスミドを安定発現する細胞を用いて,更なる検討を行う予定である。
単一アト秒パルスの高出力化によるアト秒電子ダイナミクス計測の確立

物質中の電子の動きを捉えることができるアト秒パルスレーザーは、物理学や化学のみならず生物・医科学等の分野においても必須のツールである。本研究では、我々がこれまで開発してきた2波長励起による高強度の単一アト秒パルスの発生法をさらに高度化し、その波長域をサブkeV領域にまで拡張するとともに、リング型共振器を用いた新しい超高繰り返しアト秒パルス光源を開発し、アト秒科学の先端を切り開くことを目的としている。平成30年度は、3波長励起レーザーシステムからの3波長合成パルスをArガスセルに集光し、単一アト秒パルスの発生を示す連続スペクトルの発生を確認した。この時の波長800nmの基本波、1350nmのシグナル波および1900nmのアイドラー波の[エネルギーおよびパルス幅]、それぞれ[20 mJ, 30 fs]、[4.3 mJ, 44 fs]および[1.6 mJ, 88fs]であった。この3波長合成パルスを相互作用長80 mmで圧力3 torrの高調波セルに強度1x1014 W/cm2で集光した。発生した高調波スペクトルは収差補正型凹面回折格子とMCP/CCDで構成される軟X線分光器に導かれた。観測されたスペクトルは、50eVから70eVにおいてスムーズな連続構造を有しており、この結果からパルス幅約140 as,ピークパワー1.7GWの単一アト秒パルスが発生していることがわかった。また、計算によりアイドラー波を基本波としてもちいることにより、水の窓領域で約50asの単一アト秒パルスが発生できることが明らかになった。一方、リング型共振器を用いた新しい超高繰り返しアト秒パルス光源を開発においては、効率の向上および安定性の改善を目的として、969nmLDを用いたゼロフォノン励起実験を行い、励起光として従来に比べて非常に短い270fsが得られ、より高い共振器内パワーでの安定動作を達成した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は、我々の考案した赤外パルスを用いた2波長励起法による高強度単一アト秒パルスの短波長化ならびに短パルス化を行い、本手法のスケーリング則が正しく機能すること実証した。具体的には、これまでの励起エネルギーを約2倍に高出力化しメインパルスとアシストパルスで各々約20mJと4mJに増強するとともに、高次高調波発生の媒質をXeからArに変えて、発生した高次高調波スペクトルを観測した。その結果、中心波長が約41 nm (30 eV)から26 nm (48 eV)にシフトするとともに、約3550 eVにおいて単一アト秒パルスの発生を裏付ける連続光スペクトルが得られた。スペクトル幅ならびに検出系の感度から見積もれたパルス幅および出力エネルギーは、ぞれぞれ300 asと0.5 μJである。また、Neを媒質とした場合は、中心波長11 nmにおいて200 asに相当する連続スペクトルが観測された。これら結果から、我々の開発して赤外2波長励起方式においては、当初予想したような波長およびエネルギーのスケーリング則が成り立つことが明らかになった。一方、MHz級高繰り返しアト秒パルス光源の研究においては、励起光の短パルス化の可能性を調べるため、これまでのYb:YAG結晶に変えてより広い利得帯域を有するYb:Lu2O3セラミックの試験を行った。その結果、78 MHzの繰り返しでパルス幅135 fsの安定なモード同期動作を達成した。このときの出力は1.8 Wで効率21%であった。今後、より均質で大口径のYb:Lu2O3セラミックが作成されることを期待したい。平成27年度は、我々の考案した赤外パルスを用いた2波長励起法による高強度単一アト秒パルスの高度化を目的として、高エネルギーフェムト秒励起レーザーの搬送波包絡線位相(Carrier-Envelop-Phase: CEP)の安定化の原理実証を行った。チャープパルス増幅増幅法(CPA)により構成された超短パルスレーザーシステムにおいては、パルス内におけるCEPの安定化を行うためには、発振器で発生する高速のCEP揺らぎと増幅器で発生する比較的遅いCEP揺らぎの両方を制御する必要がある。発振器のCEP安定化は、既に技術的に確立されており市販の装置でも高度な制御が可能となっているが、増幅器内における振動等に起因する遅いCEP揺らぎの制御には、フィードバック周波数の関係から高繰り返し(数100Hz)のレーザーシステムを構成する必要がある。その為、シングルショットから10Hz程度の低繰り返しの高強度超短パルスレーザーシステムでは、これまで増幅器内で発生するCEP揺らぎを安定化することは困難であった。これに対して、今回、我々は低繰り返し増幅器を通過した増幅/非増幅パルスで構成されるハイブリッドパルス列から光学チョッパーを用いてレファレンスとなる非増幅パルスのみを抽出することで、必要なフィードバック周波数を確保することによりCEPを安定化する手法を開発した。一方、リング型共振器を用いた新しい超高繰り返しアト秒パルス光源を開発においては、昨年度のYb:Lu2O3につづいてYb:CALGO結晶を作成し、その光学特性を評価した。その結果、吸収帯は十分に広く、励起半導体レーザーの多少の波長シフトにも対応できる。しかし、吸収には偏光依存性があるため、高出力化においては、半導体レーザーの偏光制御が問題となる可能性があることが明らかになった。

当初の計画どおり、単一アト秒パルスの高出力化および安定において非常重要な技術である高強度フェムト秒レーザーのCEP安定化技術を開発し、その安定化に成功した。MHz級高繰り返しアト秒パルス光源の研究においては、Yb:Lu2O3につづいてYb:CALGO結晶を作成し、その光学特性を評価した。また、新たにThinDiskの貼り付け装置を構築し、ThniDiskモジュールを作成評価する体制を整えた。平成28年度は、同時に複数の電子が励起状態にある多電子励起状態の観測をターゲットとしてHe原子の2電子励起状態のアト秒計測のためのシミュレーションモデルを開発した。このモデルでは、2電子の偏角運動や回転運動を観測する手法として、励起状態からのXUV光を用いことを新たに提案している。シミュレーションの結果では、パルス幅600fs、光子エネルギー約30eVのXUV光を10^15W/cm^2の強度でHe原子に集光し2電子励起した後、それと同じXUV光のプローブパルスの遅延時間を変えながら波長40.8eVのXUV光の変化を観測することにより、目標とする2電子の相関運動がサブフェムト秒の精度で得られることが明らかになった。さらに、この実験を実現するためには、新たなXUV多層膜鏡の開発も必要でるため、NTT AT社と協同でその開発を行った。シミュレーションコードでの計算をもとにAl/Zr多層膜鏡を作成し、その入射角を変化させて反射率を測定した結果、ほぼ当初の仕様を満たす結果が得られた。一方、リング型共振器を用いた新しい超高繰り返しアト秒パルス光源を開発においては、共振器内に高次高調波発生のための集光光学系と希ガスジェットならびに高調波取り出しのための石英基板を設置し、Arガスを用いて21次までの高調波の発生を確認した。この結果は、レーザー共振器内高次高調波発生としては、世界初の成果である。また、平行してゼロフォノン励起のための969nm半導体レーザーの開発に着手し、その波長の温度依存性等でデータを得た。当初の計画どおり、単一アト秒パルスの高出力化および安定においては2波長および3波長励起レーザーシステムの開発が順調に進み利用実験に使える見通しとなったので、ターゲットとなるHe原子の2電子励起状態のシミュレーションモデルを開発し、観測に必要なアト秒パルスの指標が得られた。MHz級高繰り返しアト秒パルス光源の研究においては、当初の計画どおりArガスを媒質として高次高調波の発生を観測した。これは、レーザー共振器内での高次高調波発生の世界初の成功である。平成29年度は、3波長システムを構築し,これを希ガスセルに集光し、連続スペクトルの発生を確認した。基本となる高エネルギーチタンサファイアレーザーのCEPの安定化については、CEPの揺らぎを850mradから650mradに改善することに成功した。また、長時間の安定性も大きく向上した。開発した高エネルギー3波長レーザーシステムは、パルス幅25fsで100mJクラスエネルギーを有するチタンサファイアレーザーとその一部を励起光とするOPAから生成されたシグナル光1350nmとアドラー光1900nmで構成される。3つパルスのタイミングジッターは、アト秒の時間精度を有するBOC法を用いて制御した。
チトクロムP450のN末付近プロリンリッチモチーフの構造安定性及び活性への影響

【研究目的】本研究では、チトクロムP450(CYP)2D6の変異遺伝子のひとつであるCYP2D6*10(34番目のプロリンがセリンに置換)によりコードされる酵素は活性の低下と共に野生型に比べ熱に対する安定性が低下すること、34番目以降の十数アミノ酸は、ヒトCYP(CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等)において、プロリンの多い高度に保存されたドメイン(プロリンリッチモチーフ、PRM)を形成していることから、N末付近のPRMは、ヒトCYPの正常な機能発現に重要であり、ここに変異が入ることで分子全体の安定性、膜への配向性あるいは発現量が変化する可能性を想定し、ヒトCYPの活性、熱安定性及び発現量に対するPRMの影響を明らかにすることを目的として検討を行った。【研究方法】市販のヒト肝mRNAを基に、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5のcDNAをクローニングし、それぞれのPRM中のプロリンをアラニンに変異させた変異型cDNAを構築した。構築した野生型および変異型CYP遺伝子をP450還元酵素と直列に連結して酵母発現用ベクターにサブクローニングし、酵母菌に感染させた。感染させた酵母菌よりミクロソームを調製し、標準化合物を用いて活性の検討を行った。【研究結果】遺伝子導入方法・導入試薬等の条件検討を行ったが、現時点ではCYP mRNAの発現は認められず、本研究の目的を達成するに十分な酵素活性を有するミクロソームを得るに至っていない。ウエスタンブロット等を利用したタンパク質レベルでの発現確認は実施していないが、CYPが発現していない可能性が高く、さらに実験条件を最適化することが必要と考えられた。今後、最適実験条件を決定し、CYPの熱安定性の検討を推進していく予定である。