hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオターゲティング素子合成に適した活性制御型ホスホリパーゼDの創製

昨年の研究報告により、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン酸(D)から構成されるその保存領域はHKDモチーフ(HxKxxxD)と呼ばれ、PLD酵素活性には必須であることが明らかとなっている。またそれぞれのHKDモチーフの下流にはグリシン・グリシン(GG)モチーフとグリシン・セリン(GS)モチーフが存在することも明らかとなっている。本年度はHKDモチーフとGG-GSモチーフに関して部位特異的アミノ酸置換を行い、触媒機能変換に関して解析を行う。最後にタンパク質立体構造予測ソフトを用い、野生型PLD酵素と変異導入PLD酵素の立体構造変化について予測を行い、触媒作用の変化と立体構造変化の相関関係について解析および考察を行う。点変異導入による部位特異的アミノ酸導入の影響の解析から、触媒活性においてHKDモチーフ内のヒスチジン、リジン、アスパラギン酸残基は必須であることが明らかとなった。また、GG-GSモチーフに変異を導入したところ、いくつかの変異体に関してリン酸基転移反応活性が野生型と比較して10倍以上に向上した。これらの変異体については今後立体構造を実際に結晶解析を行って検討しなければならないが、現段階ではGG-GSモチーフに変異を導入することで何らかの触媒作用変化がおきたものと考えられる。さらに、486番目のチロシンに変異を導入したところ、HKDモチーフ同様活性が1/3以下に減少したことから、このチロシン残基もリン酸基転移反応活性に重要な影響を及ぼしているということがあきらかになった。また触媒活性が向上したGG-GSモチーフ変異体について、タンパク質立体構造予測ソフトを使用して立体構造を解析したところ、GG-GSモチーフに変異を導入することによりある特定の構造変化を示す1つのループ構造が確認された。このことから変異導入によるループ構造の変化が、触媒活性に影響を及ぼしているものだと考えられる。本申請研究において、現在までに行ってきた放線菌由来フォスホリパーゼD(PLD)酵素の特性について下記に示すことが新たに明らかとなった。(1)酵素内に2カ所存在するHKDモチーフに存在する各ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸をアラニンに変換した各変異体は活性を示すことはなく、それぞれのアミノ酸残基が触媒活性を示す上で非常に重要である。(2)両HKDモチーフの7,8アミノ酸下流に存在するGGモチーフ、GSモチーフはともに何らかの作用によりPLD酵素と基質であるリン脂質間での触媒機能向上に関与している。特に前半HKDモチーフ下流に存在するGGモチーフにセリン残基を導入することにより、飛躍的な活性上昇を観測することが出来た。これは(1)で述べたHKDもチーフ以外の部分も触媒作用に寄与している事を示唆しており、PLD酵素の分子解析を行う上で非常に重要な発見である。(3)(1)(2)にて使用した各種変異体の基質に対する反応特性を解析したところ、野生型PLDでは反応が見られなかった基質に対しても反応を行う変異体が明らかにされ、両HKDモチーフとその下流GG、GSモチーフは触媒機構への寄与と基質認識の二つの作用に関与していることが明らかとなった。1年度に明らかとなった以上の事項について、2年度目は詳細な解析を行い、工業的に有用なPLD酵素の創製と新規リン脂質合成を目指し、研究を進行させる予定である。
ハイブリッド型繊維補強によるポーラスコンクリートの耐久性の改善

本研究では,ポーラスコンクリートに対して,ビニロン短繊維及び微細繊維による複合補強並びに,セメント混和用ポリマーの混入による結合材の改質というハイブリッド型の補強・改質手段を適用することによって,ポーラスコンクリートの耐久性の改善におけるハイブリッド型繊維補強の有用性を明らかにした。又,セメントコンクリート系材料の耐久性は力学的性質と相関があることが知られていることから,ポーラスコンクリート性能設計を可能にするため,その静弾性係数と圧縮強度の関係を明らかにし,複合則を適用した静弾性係数推定式を提案している。本研究では,ハイブリッド型繊維補強によるポーラスコンクリートの耐久性改善を目的に,1粗骨材間を架橋する一定長さの短繊維を用いたポーラスコンクリート組織の補強(単独補強),2単独補強1と微細繊維を用いた結合材補強の併用(ハイブリッド型補強I),3ハイブリッド型補強Iと構成材料間の付着特性改善のためのポリマー混入の併用(ハイブリッド型補強II)を適用した供試体を作製し,それらの耐久性試験を実施している。3年の研究期間の初年度である平成25年度は,次に示す促進耐久性試験及び屋外暴露試験を予定していた。(1)単独補強の供試体についての乾湿繰返し及び凍結融解試験(促進耐久性試験)(2)単独補強,ハイブリッド型補強I及びIIの供試体についての屋外暴露試験(1)については,予定した単独補強に加えて,ハイブリッド型補強Iの供試体についての凍結融解試験も実施した。凍結融解試験においては,所定のサイクルにおける相対動弾性係数及び質量減少率を測定し,相対動弾性係数が60%を下回った時点で曲げ試験を行い,ハイブリッド型繊維補強の優位性を把握するに至った。なお,乾湿繰返し試験についても同様の測定を行っているが,相対動弾性係数が60%を下回る劣化が認められていないため,試験を継続している。(2)については,作製した供試体を北海道泊村及び東京都三宅島に搬送した後,屋外暴露試験場に赴き,試験環境を整え,暴露試験を開始している。なお,計画段階で予定していた沖縄県辺野喜での温冷繰返しを対象とした屋外暴露試験については,(1)の結果を踏まえて暴露環境を精査し,3年の研究期間では耐久性を評価するほどの劣化が生じにくいと判断し,供試体の設置を断念した。又,屋外暴露約半年経過後に三宅島の試験場に赴き,供試体及び試験環境の状況から,問題なく試験が継続されていることを確認している。3年の研究期間の2年目である平成26年度は,次に示す促進耐久性試験及び屋外暴露試験を予定していた。(1)ハイブリッド型補強Iの供試体についての乾湿繰返し及び凍結融解試験(促進耐久性試験)(2)単独補強,ハイブリッド型補強I及びIIの供試体についての屋外暴露試験(1)については,予定したハイブリッド型補強Iの供試体の凍結融解試験は前年に終了したため,予定を繰上げハイブリッド型補強IIの供試体について実施した。なお,乾湿繰返し試験については,前年から継続して凍結融解試験同様の測定を行っているが,相対動弾性係数が60%を下回る劣化が認められていないため,試験を継続している。(2)については,屋外暴露開始1年経過した北海道泊村及び東京都三宅島において供試体の相対動弾性係数及び質量減少率を測定した後,供試体の一部を大学に送付し,曲げ試験を行った結果,いずれの調合においても現状では明らかな劣化が認められないことが確認された。研究期間3箇年の最終年度である平成27年度は,次に示す促進耐久性試験及び屋外暴露試験を予定していた。(1)ハイブリッド型補強IIの供試体についての乾湿繰返し及び凍結融解試験(促進耐久性試験)(2)単独補強,ハイブリッド型補強I及びIIの供試体についての屋外暴露試験(1)で予定した凍結融解試験は前年度に実施しており,耐凍結融解性に対するハイブリッド型補強IIの優位性を明らかにしている。乾湿繰返し試験については,相対動弾性係数が60%以下又は130サイクルになった時点において,供試体の曲げ試験を行ったものの,曲げ性状に及ぼすハイブリッド型繊維補強の影響を明らかにするには至らなかった。しかし,凍結融解のような過酷な環境下での耐久性改善にはハイブリッド型補強IIが優位である。(2)については,研究初年度に供試体を作製し,北海道泊村及び東京都三宅島での屋外暴露2年を経過した時点で実施した相対動弾性係数及び質量減少率の測定結果から,現状では明らかな劣化が認められなかった。

そこで,当初予定した曲げ試験等は今後実施することとし,屋外暴露試験を継続することにした。なお,3年間の研究で得られた知見を精査した結果,ポーラスコンクリートの圧縮強度,静弾性係数及び動弾性係数の関係を明らかにするとともに,複合則を適用したポーラスコンクリートの静弾性係数推定法を提案するに至った。本研究では,ポーラスコンクリートに対して,ビニロン短繊維及び微細繊維による複合補強並びに,セメント混和用ポリマーの混入による結合材の改質というハイブリッド型の補強・改質手段を適用することによって,ポーラスコンクリートの耐久性の改善におけるハイブリッド型繊維補強の有用性を明らかにした。又,セメントコンクリート系材料の耐久性は力学的性質と相関があることが知られていることから,ポーラスコンクリート性能設計を可能にするため,その静弾性係数と圧縮強度の関係を明らかにし,複合則を適用した静弾性係数推定式を提案している。平成26年度における研究については,研究実績の概要に示した(1)及び(2)のいずれの項目についても,おおむね計画通りに研究が進行している。その結果,研究初年度の成果を取りまとめ,審査論文1編及び口頭発表2編の研究業績を得ており,順調に研究が進展していることを裏付けている。建築材料学今後も引き続き,基本的には申請書の計画通りに,各年度に予定している促進耐久性試験及び屋外暴露試験を行っていく予定である。しかし,乾湿繰返し試験については,単独補強の供試体において,耐久性を評価できるほどの劣化の進行が認められないため,計画期間を延長して試験を継続する。そのため,ハイブリッド型補強IIの供試体については,乾湿繰返し試験を計画通りに実施しないこととする。平成25年度における研究については,研究実績の概要に示した(1)及び(2)のいずれの項目についても,おおむね計画通りに研究が進行している。平成26年度は計画段階で予定していた沖縄県辺野喜での屋外暴露試験の実施を断念したこと及び第77回日本建築学会東北支部研究報告会の会場が所属機関(日本大学工学部)であったことから出張旅費が計上されなかったため残高が生じた。今後も引き続き,基本的には申請書の計画通りに,各年度に予定している促進耐久性試験及び屋外暴露試験を行っていく予定である。そのため,ハイブリッド型補強I及びハイブリッド型補強IIの供試体の乾湿繰返し試験を計画通りに実施するか否かについては,単独補強の結果を踏まえた上で検討することとする。又,研究実績の概要に示したように,計画段階で予定していた沖縄県辺野喜での温冷繰返しを対象とした屋外暴露試験については実施しない。平成26年度に生じた若干の残高と合わせて執行する平成27年度の経費は,平成27年度の研究の実験的研究に要する使用材料費及び実験用消耗品,屋外暴露に要する出張旅費などが主たる計上となる予定である。
動脈粥状硬化の成因と酸化変性低密度リポ蛋白による酸性リパ-ゼの抑制

血中過酸化脂質の増加はLDL酸化変性を惹起し、細胞内に取り込まれてcholesterol estrase(血液由来ChEを分解するlysosomal酸性ChEaseや細胞内因性ChEを分解するmicrosomal中性ChEase)活性へ抑制的に作用し、macrophage泡沫化や動脈壁細胞内ChE蓄積につながり、粥状動脈硬化成因の一つとなる可能性を動物実験と細胞培養実験により検討した。I.動物実験:ラット各群10匹の4群(1)Linoleate hydroperoxide(LHPO)投与(2)LHPO+vit.E投与(3)リノ-ル酸(LA)投与(4)普通食のみについて8週間飼育した。血中や肝のTBA値はLHPO投与群で有意に最も高く、又血中過酸化物に曝されている単核球と胸腹部大動脈の酸性・中性両ChEase活性低下が見られた。特に大動脈では中性ChEase活性低下が顕著(普通食群活性の13%)であった。LHPO投与群のLDLは共役ジエン含量及びTBA値が普通食群の約6倍高値で、電気陰性度の増加と立体構造の変化を伴う酸化変性LDLの生成を示し、これはin vitroで普通食群の大動脈,単核球,肝の酸性・中性ChEase活性へ抑制作用を示した。vit.E投与群は過酸化脂質のこれら諸作用に対して保護効果を示した。II.細胞培養実験:タバコ煙抽出物で調製した酸化変性LDL(CSーLDL),高脂血症IIb型血清と正常血清から分離したHCーLDLやNーLDLの電気陰性度の強度がCSーLDL,HCーLDLの順に強い事を確認後、^<125>Iで標識し、正常ヒト単核球の培養培地へ添加すると、結合量と取り込み量はNーLDLが最も低く、HCーLDL,CSーLDLの順で増加したが、分解量はその逆の順序であり、酸化変性LDL中のラジカルによるApo蛋白分解酵素活性阻害がみられた。又、酸性・中性両ChEase活性も添加量100μg/mlでは50μg/mlでの各々の最大活性の約1/2へ低下し阻害作用が見られた。本研究の結果から、単核球や大動脈のChEaseに対する血中過酸化変性LDLを介した阻害作用は、動脈壁macrophage泡沫化を促進し、粥状動脈硬化成立因子の一つになる事が示唆された。動物飼育実験:Wistar系♂ラット各群10匹の4群(1)普通食のみ(2)LA投与(3)LHPO投与(4)LHPO+vit.E投与について、成熟令(6週令)の4週間飼育と若令(4週令)の8週間飼育を行った。群間で成長曲線の体重変化を最小限に抑えた状態での過酸化脂質による影響を検討する計画をしたので、LHPOやLAは体重の1/1000を、又vit.Eは2mg/dayを胃チュ-ブで投与した。飼育期間中の平均投与量は、約100144POV/1匹/dayであった。

II検体測定血中や肝のTBA値は成熟令4週飼育と若令8週飼育でLHPO投与群で有意に最も高く、又血中過酸化物にさらされている単核球と胸腹部大動脈の細胞内cholesterol esterase(lysosomal酸性ChEase,microsomal中性ChEase)の活性低下が見られた。特に大動脈では細胞内因性ChE分解酵素である中性ChEase活性低下が顕著(普通食群活性の13%)であった。LHPO投与群のLDLは共役ジエン含量及びTBA値が普通食群の約6倍高値を示しアガロ-ス膜電気泳動で電気陰性度が増加した典型的な酸化変性LDLの移動度を示した。そしてこれはin vitroで普通食群の大動脈、単核球、肝の中性・酸性ChEase活性を低下させる効果を示した。vit.E同時投与群は過酸化脂質の諸作用に対して保護効果を示した。粥状動脈硬化病巣部位にみられるChEを大量に含んだ泡沫細胞の起源は、単球由来のマクロファ-ジや平滑筋細胞とも云われている。本研究の結果から、単核球や大動脈のChEaseに対する血中過酸化変性LDLを介した阻害作用は、動脈壁のマクロファ-ジ泡沫化を促進する要因の一つになる事を示唆した。第2年度は,in vitro酸化変性LDLや高脂血症者から分離したLDLを^<125>I標識して,マクロファ-ジへ分化する単球を含む単核球によるLDLの取り込み量と細胞内ChEase活性抑制効果との関係を明かにするために培養実験を行った。1.当初in vitro酸化変性LDLは酸化リノ-ル酸により調製する予定であったが,血中に過酸化物を増加させる環境要因として最も可能性が高い喫煙と関連づけるため,Yokode&Kita(1988年)らの方法に従いタバコ煙抽出物で調製した酸化変性LDL(CSーLDL)を用いた。又,高脂血症IIb型血清と正常血清から分離したHCーLDLやNーLDLについて,電気泳動により電気陰性度の強度がCSーLDL,HCーLDLの順に強い事を確認後、MacFareneの方法により^<125>Iで標識した。2.正常ヒト単核球を分離し,3日間リポ蛋白欠血清を含む培地で培養後,(1)培養時間経過時の変化をみると,LDLの細胞への取り込み量は経時増加し,6hではHCーLDLやCSーLDLはNーLDLのそれぞれ1.5倍と6倍高く,両ChEase活性も経時上昇したが,CSーLDLでは24h以降で活性低下へと転じた。又,両酵素活性の強度はNーLDL添加時が最も高く,HCーLDL,CSーLDLの順に活性低下がみられた。(2)培養時間4hに於ける各^<125>IーLDL添加による変化をみると,LDLの細胞への結合量,取り込み量,分解量は添加量に応じて上昇し,結合量と取り込み量はNーLDLが最も低く,HCーLDL,CSーLDLの順で増加したが,分解量はその逆の順序であり,酸化変性LDL中のラジカルによるApo蛋白分解酵素に対する活性阻害がみられた。又,酸性・中性ShEase活性も添加量100μg/mlでは50μg/mlでのそれぞれの最大活性の約1/2へ低し,蛋白分解酵素と同じくChE分解酵素へも阻害作用がみられた。以上の事から,第1年度で報告したように酸化油投与ラット血中でみられた酸化変性LDLの生成とそれによる単核球や大動脈のChE分解酵素活性低下と動脈壁のChE増加蓄積との関係は,細胞培養実験でも裏付られた。
セパラーゼの自己切断による染色体分離の一斉性制御

細胞がゲノムを安定に維持するには、分裂期において姉妹染色分体間の対合を切断し、染色体分離を引き起こすプロテアーゼ、セパラーゼの適切な活性制御が重要である。申請者はほ乳類のセパラーゼが分裂期の異なる時期に様式の異なる複数の自己切断を行うことを見出しており、本研究は、こうしたそれぞれの自己切断の性質や制御の解析を行うことで、その生理学的な意義を解明し、分裂期におけるセパラーゼの急激な活性化機構について明らかにすることを目的としていた。これまでに、BAC mutagenesisの系を用いて、マウスのセパラーゼを変異させ、特定の自己切断が起きないように細工した変異セパラーゼを作製し、これをヒト子宮がん由来のHeLa細胞に導入して、変異セパラーゼの安定発現細胞株を取得した。さらに、なるべく生理的な条件下でのこれらの特定の自己切断が起きない変異タンパク質の機能を調べるため、作製したマウス由来の変異セパラーゼ安定発現株において、内在性の野生型ヒトセパラーゼのみをRNAiによって除去することにより、外来性の変異セパラーゼと内在性の野生型セパラーゼを完全に置き換えることができる系も確立した。また、これらの細胞と系を用いて、特定の自己切断が起きない条件下での細胞や染色体の挙動を調べ、それによって、それぞれの自己切断が持つ性質や制御についての解析を行い、いくつか興味深い知見を得ることもできた。しかしながら本年度は、現職場である沖縄科学技術大学院大学との契約切れのため、これ以上の解析の続行が困難となり、本研究をここで廃止することとなった。このため本年度はこれまでに得られたデータの整理に終始し、新たな解析を行うことはできなかった。これまでの本研究で得られた結果は姉妹染色体分離機構の理解を大きく助けるものと考えており、いずれ機会があれば、さらなる解析を加えたうえで発表できればと思っている。申請者はほ乳類のセパラーゼが分裂期の異なる時期に様式の異なる複数の自己切断を行うことを既に見出している。本研究は、こうしたそれぞれの自己切断の性質や制御の解析を行い、その生理学的な意義を解明することによって、分裂期におけるセパラーゼの急激な活性化機構について明らかにすることを目的としている。このため、まず、BAC mutagenesisの系を用いて、マウスのセパラーゼを変異させ、特定の自己切断が起きないように細工した変異セパラーゼを作製し、これをヒト子宮がん由来のHeLa細胞に導入して、変異セパラーゼの安定発現細胞株を取得した。次に、なるべく生理的な条件下でのこれらの特定の自己切断が起きない変異タンパク質の機能を調べるために、こうして作製したマウス由来の変異セパラーゼ安定発現株において、内在性の野生型ヒトセパラーゼのみをRNAiによって除去することにより、外来性の変異セパラーゼと内在性の野生型セパラーゼを完全に置き換えることができる系を確立した。現在、これらの細胞と系を用いて、特定の自己切断が起きない条件下での細胞や染色体の挙動を調べることで、それぞれの自己切断が持つ性質や制御についての解析を進めている。また、分裂酵母を用いたセパラーゼの解析も行ったところ、特定の変異株中で、タンパク質の切断に由来すると疑われる短いセパラーゼ産物が生じることを見いだした。現在、これがセパラーゼの自己切断と関連したものであるのか解析を進めている。昨年度までに、BAC mutagenesisの系を用いて、マウスのセパラーゼを変異させ、特定の自己切断が起きないように細工した変異セパラーゼを作製し、これをヒト子宮がん由来のHeLa細胞に導入して、変異セパラーゼの安定発現細胞株を取得している。また既に、なるべく生理的な条件下でのこれらの特定の自己切断が起きない変異タンパク質の機能を調べるため、作製したマウス由来の変異セパラーゼ安定発現株において、内在性の野生型ヒトセパラーゼのみをRNAiによって除去することにより、外来性の変異セパラーゼと内在性の野生型セパラーゼを完全に置き換えることができる系も確立していた。昨年度は、これらの細胞と系を用いて、特定の自己切断が起きない条件下での細胞や染色体の挙動を調べ、それによって、それぞれの自己切断が持つ性質や制御についての解析を行った。いくつか興味深い知見を得ており、現在、さらなる解析を進めている。また、分裂酵母において昨年度見いだして解析を進めていた短いセパラーゼ産物については、結局、切断によるものではないことが判明したが、その一方で、分裂酵母セパラーゼの必要性が栄養条件で異なることが明らかとなり、現在外部の栄養条件の変化に対する応答について解析を進めている。

申請者はほ乳類のセパラーゼが分裂期の異なる時期に様式の異なる複数の自己切断を行うことを見出しており、本研究は、こうしたそれぞれの自己切断の性質や制御の解析を行うことで、その生理学的な意義を解明し、分裂期におけるセパラーゼの急激な活性化機構について明らかにすることを目的としていた。これまでに、BAC mutagenesisの系を用いて、マウスのセパラーゼを変異させ、特定の自己切断が起きないように細工した変異セパラーゼを作製し、これをヒト子宮がん由来のHeLa細胞に導入して、変異セパラーゼの安定発現細胞株を取得した。さらに、なるべく生理的な条件下でのこれらの特定の自己切断が起きない変異タンパク質の機能を調べるため、作製したマウス由来の変異セパラーゼ安定発現株において、内在性の野生型ヒトセパラーゼのみをRNAiによって除去することにより、外来性の変異セパラーゼと内在性の野生型セパラーゼを完全に置き換えることができる系も確立した。また、これらの細胞と系を用いて、特定の自己切断が起きない条件下での細胞や染色体の挙動を調べ、それによって、それぞれの自己切断が持つ性質や制御についての解析を行い、いくつか興味深い知見を得ることもできた。しかしながら本年度は、現職場である沖縄科学技術大学院大学との契約切れのため、これ以上の解析の続行が困難となり、本研究をここで廃止することとなった。このため本年度はこれまでに得られたデータの整理に終始し、新たな解析を行うことはできなかった。これまでの本研究で得られた結果は姉妹染色体分離機構の理解を大きく助けるものと考えており、いずれ機会があれば、さらなる解析を加えたうえで発表できればと思っている。25年度は研究施設を移動したこともあり、余計な調整に時間を取られ、思っていたほどには解析を進められなかった。しかしながら、本研究の進行に必要な変異株や実験系の確立は既に終わっていたため、昨年度は順調に解析を進めることができ、十分に遅れを取り戻せたのではないかと考えている。昨年度に引き続き、特定の自己切断が起きない条件下での細胞や染色体の挙動を、生化学的手法や細胞生物学的手法を用いて調べることで、それぞれの自己切断が持つ性質や制御、および生理学的な意義についての解析を進める。また、同時に、セパラーゼの自己切断並びに活性制御に影響を与える因子・シグナルの同定も引き続き試みる。さらに、試験管内でのセパラーゼ活性をモニターする系を構築してセパラーゼ活性化機構を試験管内に再構築することを目指したい。また、平行して分裂酵母を用いた解析も行い、セパラーゼ機能・制御の種間を超えた普遍性についても検討を行う。さらに、最終的にこれらの得られた結果と考察について、論文等の形でまとめたい。しかしながら、本研究の進行に必要な変異株や実験系の確立は既に終わっているため、遅れはそれほど大きくはなく、今後の研究によって十分に取り戻せるものであると考えている。26年度は、昨年度までの遅れを取り戻して、ほぼ予定通りに研究を進めることができたが、その一方で、研究成果の発表等に当てる十分な時間的余裕を取ることができなかった。このため、研究成果の発表等で使う予定であった旅費・その他の費用を使用しなかった。
血栓形成における12-リポキシゲナーゼの局在・活性制御メカニズムの解明

血小板におけるアゴニスト受容体からのシグナルはGα13を介して低分子量GTPase RhoAを活性化する。その結果血小板の形態変化、濃染顆粒内容物の分泌をおこす。我々はアフィニティクロマトグラフィーにより活性化RhoAがフォルミンDaam1を介して12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)に結合することを見いだした。12-LOXは主に血小板に発現し、アラキドン酸からの12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸(12-HETE)等の脂質メディエーター合成を介して血小板凝集を惹起する。本研究では活性化RhoA-Daam1が、12-LOXの細胞膜への局在を誘導し活性を制御することを証明する。
樹木に胴・枝枯病害をおこすBotryosphaeria属ホロモルフの分子系統解析

樹木の胴・枝枯性病害である針葉樹暗色枝枯病、ポプラ類ギグナルディア胴枯病,ハンノキ類ギグナルディア胴枯病,クルミ褐色枝枯病,カエデ類粗皮病、カラマツ先枯病の所属の再検討を行なった。遺伝子系統解析および形態観察の結果、全ての分離菌株および標本から、Botryosphaeria属菌に所属することがわかった。しかし、針葉樹暗色枝枯病、ハンノキ類ギグナルディア胴枯病,クルミ褐色枝枯病,カエデ類粗皮病は遺伝子系統解析と形態観察の結果が異なった。樹木に胴・枝枯性病害をおこす病原菌のうちGuignardia属菌ではなくBotryosphaeria属菌ではないかといわれている病害である日本産カラマツ先枯病菌の所属の再検討を行った。森林総合研究所に保存されている1949年1988年の分離菌および、著者が2008年に分離した菌株から菌叢の比較と遺伝子系統解析を行なった結果、菌叢は白色灰色で気中菌糸を形成し、裏面は褐色黒色を呈するなどBotryosphaeria属菌の不完全時代の特徴を示した。またその色と気中菌糸の特徴でグループ分けができたものの、カラマツ先枯病菌として一様の特徴を持っているとはいい難い結果であった。遺伝子系統解析を行なった結果、属間の同定を試みた28SrDNA領域では、本研究で供試した菌株は全てBotryosphaeria属菌のクレードに含まれた。また、ITS1-5.8S-ITS2領域を用いて検討した病原菌の種も、すべて同一のクレードに含まれるという結果が得られた。このことから、属レベルの同定は菌叢判断でも充分に対応できるが、Botryosphaeria属菌の種の検討は、菌叢判断では困難なため、ITSI-5.8S-ITS2領域を用いて遺伝子系統解析を行なうことが有効であると考えられた。また今回、相同性検索をおこなったDDBJのデータベースには、B.laricinaの28S領域における塩基配列の情報が登録されていなかったため、本研究に供試した菌株とB.laricinaとの相同性を検討することができなかった。B.laricinaは、現在、日本と中国からのみ報告がなされており、世界的に他の種に比べて少ない種である。系統樹において同一のクレードに混在していたB.australisおよびB.luteaとB.laricinaの関係を述べた例は無く、今後,これらの遺伝子データのさらなる構築が望まれる。樹木に胴・枝枯性病害をおこす病原菌のうちGuignardia属菌ではなくBotryosphaeria属菌ではないかといわれている病害である針葉樹暗色枝枯病の所属の再検討を行った。遺伝子系統解析を行なった結果、本実験に供試した17菌株は,高いブートストラップ値に指示されBotryosphaeria属菌のクレードに含まれた。また,種レベルでは5菌株がB.ribis,7菌株がB.parva,5菌株がB.dothideaに分かれ,それぞれ高い相同性を示した。また形態観察では、子嚢殻は全8標本中,6標本から観察され,病斑部に形成された子座が樹皮下に埋没し,成熟すると孔口をもつ子嚢室が観察された。子嚢は無色,幅広い棍棒状,頂端は肥厚し,8個の子嚢胞子を不整2列に含んでいた。子嚢胞子は無色,単胞,紡錘形から広楕円形で,大きさは21.1×7.8μm(平均)であった。分生子殻は3標本および2菌株から観察され,黒色,亜球形で頂部に孔口を有していた。また,分生子は無色,単胞,長楕円から紡錘形,基部が裁断状で,大きさは20.4×5.9μm(平均)であった。これらの結果から,B.parvaとB.dothideaは,不完全時代の分生子の形態が異なるため,顕微鏡下で容易に識別できる。しかし,B.ribisは形態的にB.parvaとB.dothideaに類似しているため同定が困難であり,遺伝子系統解析が有効な手法となる。樹木に胴・枝枯性病害をおこす病原菌のうちGuignardia属菌ではなくBotryosphaeria属菌ではないかといわれている病害,すなわちポプラ類ギグナルディア胴枯病,ハンノキ類ギグナルディア胴枯病,クルミ褐色枝枯病,カエデ類粗皮病である広葉樹胴・枝枯病の所属の再検討を行った。遺伝子系統解析の結果,ポプラ類ギグナルディア胴枯病,ハンノキ類ギグナルディア胴枯病,クルミ褐色枝枯病,カエデ類粗皮病に供試した全ての菌株は,Guignardia属菌ではなくBotryosphaeria属菌と同じクレードに含まれ,B.dothidea(= F.aesculi)と同定された。

さらに形態観察の結果,ポプラ類ギグナルディア胴枯病は,子嚢胞子および分生子の計測値からB.dothidea(= F.aesculi)と同定した。しかし,他の3病害は子嚢胞子および分生子の計測値が数種の領域に入り,特定できなかった。以上の結果より,広葉樹4種の胴・枝枯病菌の完全時代は,Guignardia属菌ではなくBotryosphaeria属菌の特徴を示した。また不完全時代はFusicoccum属菌の特徴を示した。しかし,種の同定では,ポプラ類ギグナルディア胴枯病菌以外は,子嚢胞子および分生子の計測値が特定の種に合わず,さらに検討が必要である。
QTL解析で同定した候補領域のファインマッピングおよび候補遺伝子の機能解析

我国の2,000万人以上の糖尿病患者や予備群の診断と治療のために、糖尿病の疾患関連遺伝子の同定が急がれる。我々は、摂食抑制ホルモン受容体の変異体(ab)の導入により、強制的に過食し重度の2型糖尿病(T2D)を来す系統と、遺伝的背景が異なる2系統の糖尿病非発症マウスとの交配系によって得られるF2マウス集団を用いる独自のQTL解析法を確立した。これらのF2集団を対象とした継続的なQTL研究において、T2Dや肥満に関連する形質(体重、内臓脂肪重量、血糖値など)に影響を及ぼす新規T2D疾患関連候補座位を複数見出した。また、高エネルギー摂取により病態形成に強く影響する座を特定し、各QTLの作用をコンジェニックマウスを用いて生体レベルで評価した結果、体重、内臓脂肪重量に強い作用を認める2領域(4,5番染色体)を特定した。複数ラインの"サブコンジェニックマウスを用いたファインマッピング"により、5番染色体の候補領域を5Mbに限局、領域内に存在する57候補遺伝子を特定し、病態の原因を明らかにする研究を継続中である。我々が、独自に見出した「高脂肪食負荷で、体重、肥満重量などの糖尿病の病態に寄与すると考えられる2つの候補領域の内の1座位(領域名:A領域)に対し、コンジェニックマウスを作製し、以下の2種類の群a群)db/db産仔群およびb群)野生型産仔群について、ファインマッピングを平行して実施し、さらに、各群のサブコンジェニックマウス系統(7-16種)を用いた解析で、候補領域の絞り込みを検討した。本年度の研究期間で以下の知見を得た。1)原因遺伝子の候補領域を1-2Mb程度迄限定する目的で、サブコンジェニックマウス系統によるマッピングを2回以上実施した。b群)では、高カロリー餌負荷時の体重増加に影響を与える候補領域として、約8Mbの領域を特定した。一方、a群)では、合計3回のマッピングを実施したが、A領域の表現型(体重、脂肪重量、血糖値)が安定せず、マッピング結果に再現性が認められなかったことから、a群)における原因遺伝子同定の探索を中止した。2)b群)の野生型産仔によるマッピングにおいて、体重を指標に7種のサブコンジェニックマウス系統を用いたマッピングを3回以上実施した結果、高脂肪食負荷で、体重、肥満に作用する約3Mbの領域を特定することができた。3)上記の約3Mbの領域には、56遺伝子がコードされており、その内、C57BL6とDBA2マウス系統間で多型を有する遺伝子を調査した結果、多型によってミスセンス変異を生じる6遺伝子、ナンセンス変異を生じる1遺伝子、スプライス部位に多型を有する1遺伝子、UTRに多型を有する11遺伝子、およびイントロンに多型を有する23遺伝子が明らかとなった。現在、高脂肪食負荷によるA領域の野生型産仔によるマッピングを継続中である。申請者らは、2型糖尿病モデルマウス(dbマウス)と糖尿病非発症マウスとの交配系を用いて、糖尿病の病態に関わる体重、内蔵脂肪重量等の量的形質(Quantitative Trait:QT)を修飾する座位解析(QTL)を実施してきた。本年度の研究期間内に以下の知見を得た。1)我々が独自に見出した体重、内臓脂肪重量などの病態に寄与すると考えられる候補領域(B)の表現型効果は、体重(8週齢)で30%、腸間膜脂肪重量で40%増加しており、これらの形質を指標とすることで原因遺伝子のマッピングが可能である事が示された。さらに、5種類のサブコンジェニックマウスを用いて体重、内臓脂肪重量を指標にファインマッピングを行った結果、約8Mbの領域に絞られたが、この内、3Mb内にはほとんど遺伝子が存在しないため、約5Mbに絞られた。この領域内には57遺伝子がコードされ、これらの内で、ミスセンス変異を生じる9遺伝子を中心に、mRNA発現レベルをコンジェニックマウス/対照マウスで比較し、双方間に明らかな発現量の差を認める遺伝子の解析を、各種臓器(10種)を用いて継続して解析中である。2)4番染色体の候補領域(A)の表現型効果は、肥満するdb/dbマウスでは証明されたが、その他の肥満モデルでは明白ではない。

そこで、dbが野生型のマウスを用いて、高脂肪食負荷により肥満を誘導させたモデルでA領域の表現型効果を検討した。その結果、コンジェニックマウスで、体重、内臓脂肪重量、肝重量が対照群より有意に増加し、野生型での原因遺伝子の解析が可能である事が示された。しかし、その後の解析で、本領域内に存在するdbマウスの毛色を決めるmisty遺伝子が体重に影響を及ぼしている可能性が示唆された。そこで、7種のサブコンジェニックマウスで、D4Mit174とLepr遺伝子間(20.5M)で組換えを生じたマウス(72匹.黒毛)、組換えを生じていないマウス(24匹,黒毛又は灰色毛)を対象に、misty遺伝子の本体を同定する解析を試みた。20.5M内でC57BL6とDBA2系統間で多型を示す60SNPsのgenotypingを行った結果、D4Mit255とLepr遺伝子間の2.5Mに絞ることができた。現在、引き続きpositive controlでB6/B6型、negative contrでD2/D2型、さらに、組換えマウスでB6/B6型のgenotypeを示すSNP(すなわち、misty遺伝子の本体)を抽出中である。
プラスチック光ファイバ増幅器を用いた生体組織の性状診断と治療効果

本年度も,当研究グループより提案されたポリマー光ファイバ増幅器の基礎動作特性の評価と,その応用に関して有機的に研究を展開した.POFAから発生する高出力な増幅された自然放出光(Amplified Spontaneous Emission:ASE)の基礎特性を評価した.このシステムは励起光源のみで実現可能であり,簡易型の可視光源となる可能性を有している.Rhodamine 6GやRhodamine Bをドープ色素として使用し,最大キロワットクラスのピーク出力を得ることに成功した.このときの最小出力スペクトル幅は12nmであった.また,出力特性の励起波長依存性を検討した結果,色素分子の吸収断面積が最大である波長で励起することで,エネルギー変換効率が40%近い高効率動作を実現した.当研究グループでは,このファイバ型可視光源の応用として癌の光線力学的診断(PDD)や光線力学的診断(PDT)用の光源を提案している.本年度は,活性酸素を媒介とするPDTのミクロレベルでの機構の解明を行った.具体的には,(1)光感受性物質Zn Coproporphyrin IIIを用いたヒト肺小細胞癌MS-1細胞に対する殺細胞効果,および(2)ラット腸間膜微小循環系の血流遮断(Vascular Shut Down:VSD)効果を評価した.PDTの基礎的なメカニズムが、活性酸素産出による直接的な癌細胞破壊と,血流遮断効果による癌細胞への栄養分の遮断による間接的な癌細胞破壊に大別することができ,各効果を効果的に組み合わせることにより,治療効果の増加が期待できることを実験的に示した.本年度も,当研究グループより提案されたポリマー光ファイバ増幅器の基礎動作特性の評価と,その応用に関して有機的に研究を展開した.POFAから発生する高出力な増幅された自然放出光(Amplified Spontaneous Emission:ASE)の基礎特性を評価した.このシステムは励起光源のみで実現可能であり,簡易型の可視光源となる可能性を有している.Rhodamine 6GやRhodamine Bをドープ色素として使用し,最大キロワットクラスのピーク出力を得ることに成功した.このときの最小出力スペクトル幅は12nmであった.また,出力特性の励起波長依存性を検討した結果,色素分子の吸収断面積が最大である波長で励起することで,エネルギー変換効率が40%近い高効率動作を実現した.当研究グループでは,このファイバ型可視光源の応用として癌の光線力学的診断(PDD)や光線力学的診断(PDT)用の光源を提案している.本年度は,活性酸素を媒介とするPDTのミクロレベルでの機構の解明を行った.具体的には,(1)光感受性物質Zn Coproporphyrin IIIを用いたヒト肺小細胞癌MS-1細胞に対する殺細胞効果,および(2)ラット腸間膜微小循環系の血流遮断(Vascular Shut Down:VSD)効果を評価した.PDTの基礎的なメカニズムが、活性酸素産出による直接的な癌細胞破壊と,血流遮断効果による癌細胞への栄養分の遮断による間接的な癌細胞破壊に大別することができ,各効果を効果的に組み合わせることにより,治療効果の増加が期待できることを実験的に示した.本研究課題は,癌の光線力学的診断(Photodynamic diagnosis: PDD)や光線力学的治療(Photodynamic therapy: PDT)用光源としてパルス動作プラスチック光ファイバ増幅器(Plastic Optical Fiber Amplifier: POFA)を提案し,癌組織の性状診断および治療効果を検討することを目標としている.平成7年度はその第一ステップとしてPOFAの動作特性を評価するとともにPOFA出力光とPDD,PDT用光感受性物質との光化学相互作用を検討・評価した.POFAドープ用色素として特に高性能(吸収断面積や誘導出面積断導が大きい)な色素であるRhodamine 6G (R6G)を使用した.このR6G-POFAの動作波長域は,励起光源としてNd:YAGレーザの第二高調波光を使用した場合,波長500nm後半代に位置している.液体色素レーザから得られる微弱な信号光を増幅するアンプ型POFA及び,励起光のみを入射した際に得られる増幅された自然放出光(Amplified Spontaneous Emission: ASE)型POFA(光学系が非常に簡単になる)の動作特性を評価した結果,共にキロワット級(コア径:500μm)の出力を得ることに成功した.この値は,既存のPDT用レーザと同一オーダーの出力であった.このR6G-POFAの出力波長帯に吸収を有する亜鉛系ポルフィリン化合物の中からZinc (II) 5,0,15,20-Tetraphenyl Porphyrin (ZTP)を用いて,POFA出力光励起による光感受性物質の光化学特性を評価した.POFA出力光をZTPへ照射し,波長600nm代に光感受性物質から発生した蛍光を観測した.実際のPDD,PDTでは癌組織の新陳代謝の速度差,すなわち光感受性物質の組織選択性により診断や治療を行う.癌組織選択性を有した光感受性物質の探索を行うことにより,POFAを用いた癌の診断が可能であることを明らかにした.また,一般にPDTは光感受性物質を光励起した時の分子内のエネルギー遷移による活性酵素発生により治療を行うものである.POFA出力光をZTPへ照射した際,活性酸素が産出されることをルミノール反応を用いて検出し,PDT-POFAの可能性を示した.本年度も,当研究グループより提案されたポリマー光ファイバ増幅器の基礎動作特性の評価と,その応用に関して有機的に研究を展開した.

POFAから発生する高出力な増幅された自然放出光(Amplified Spontaneous Emission : ASE)の基礎特性を評価した.このシステムは励起光源のみで実現可能であり,簡易型の可視光源となる可能性を有している.Rhodamine 6GやRhodamine Bをドープ色素として使用し,最大キロワットクラスのピーク出力を得ることに成功した.このときの最小出力スペクトル幅は12nmであった.また,出力特性の励起波長依存性を検討した結果,色素分子の吸収断面積が最大である波長で励起することで,エネルギー変換効率が40%近い高効率動作を実現した.当研究グループでは,このファイバ型可視光源の応用として癌の光線力学的診断(PDD)や光線力学的診断(PDT)用の光源を提案している.本年度は,活性酸素を媒介とするPDTのミクロレベルでの機構の解明を行った.具体的には,(1)光感受性物質Zn Coproporphyrin IIIを用いたヒト肺小細胞癌MS-1細胞に対する殺細胞効果,および(2)ラット腸間膜微小循環系の血流遮断(Vascular Shut Down : VSD)効果を評価した.PDTの基礎的なメカニズムが,活性酸素産出による直接的な癌細胞破壊と,血流遮断効果による癌細胞への栄養分の遮断による間接的な癌細胞破壊に大別することができ,各効果を効果的に組み合わせることにより,治療効果の増加が期待できることを実験的に示した.
ヨーロッパ統合の歴史と経済理論(1955年-1965年)-フランスを中心に

本研究では、1950年代から1960年代にかけて、ヨーロッパ石炭鉄鋼共同体やヨーロッパ経済共同体などが結成されたが、そこでは、加盟諸国の経済政策が優先され、ヨーロッパ統合の経済理論の基盤にあった自由競争市場の確立は、徹底できなかったことを解明した。平成18年度においては、ヨーロッパ統合について、1950年代におけるヨーロッパ石炭鉄鋼共同体の石炭・鉄鋼共同市場の実態とヨーロッパ統合を推し進めた経済理論との関連を、理論面を中心に分析した。ヨーロッパ統合を推進した経済理論には、アンドレ・マルシャル(Andre Marchal)らが主張した、市場の枠組みなど参加諸国の法制度や政策を調整して統合を進めようとする議論と、フリードリッヒ・ハイエク(Friedrich A. von Hayek)やジャック・リュエフ(Jacques Rueff)などの市場原理を重視した新自由主義経済学者の議論とが存在した。最初のマルシャルらの議論は、ヨーロッパを統合するためには加盟諸国の経済制度や経済政策を調整することが必要であり、それを実行するために各国政府から独立した超国家的な国際機関設立の必要性を説いていた。これに対して、新自由主義経済学者は、ヨーロッパ・レヴェルでの自由競争市場の確立を優先し、各国政府にしても国際機関にしても、市場への政策的介入を最小限に抑えることを主張していた。1952年に実際設立されたヨーロッパ石炭鉄鋼共同体は、制度的にはマルシャルらが主張する構造を備えていた。だが、1950年代から60年代かけての石炭・鉄鋼共同市場の実態は、加盟国政府個別の政策や、従来から存在した各国業界団体のカルテル組織によって、石炭や鉄鋼の取引が管理されていた。したがって、実態としてはどちらの統合論にも合致しない形で、現実の市場統合は進行していたのである。これらの成果の一部は、平成18年12月に刊行された『新自由主義と戦後資本主義-欧米における歴史的経験』(共著)において発表している。平成19年度は、前年度に行ったヨーロッパ統合に関する経済理論の整理を受けて、ヨーロッパ統合の実態に関する実証分析を実施した。それによって、1955年から1960年代までの共同体の鉄鋼共同市場における鋼材取引の実態と戦後復興・発展との関係を、フランス鉄鋼業を中心に解明した。この時期のクランスにおいては、政府主導による経済の近代化・発展をめざす第2次と第3次の「近代化設備計画」が実施されており、鉄鋼業を含む経済全体が設備投資と生産拡大をめざしていた。ただしそこでは、政府・財務省によって物価上昇が厳格に抑制され、インフレ対策が採られていた。その影響を受けて、多くの国内製造業に鋼材を供給する鉄鋼業も、価格を容易に引き上げることはできなかった。しかし制度的には、鉄鋼業はヨーロッパ石炭鉄鋼共同体が管轄する鉄鋼共同市場に帰属しており、フランス政府の政策権限が及ぶ範囲外にあった。したがって、本来は自由競争下にあり、需給バランスによって価格が決定されるべき鋼材が、事実上フランス政府の管理下にあるという矛盾が生じていた。その結果、戦後成長期の物価上昇局面にもかかわらず、鋼材価格は相対的に低く抑えられ、フランス鉄鋼業界は十分な収益を得られず、設備投資資金の調達に苦しんでいた。この資金難が近代化設備計画にも悪影響を及ぼし、鉄鋼業の生産力拡大を遅らせていたのである。すなわち、実質的には同国政府の経済政策によってコントロールされていたフランス鉄鋼業は、鉄鋼価格上昇が政策的に抑制されたために、共同市場においては西ドイツやベルギーの鉄鋼業に対して不利な競争を強いられることとなった。平成20年度は、前年度に行ったヨーロッパ統合の実態に関する実証分析を継続して実施した。それによって、1950年代後半から1960年代前半までの共同体の鉄鋼共同市場における鉄鋼取引の実態と戦後復興・発展との関係を、フランス鉄鋼業を中心に解明した。戦後のフランスにおいては、政府・計画庁が中心となり、経済の近代化・発展をめざす「近代化設備計画」が実施され、鉄鋼業を含む経済全体の設備投資と生産拡大をめざしていた。多くの国内産業に鉄鋼製品を供給する鉄鋼業も、その影響を受けて価格を容易に引き上げることはできなかった。その結果、戦後成長期の物価上昇局面にもかかわらず、鉄鋼価格は相対的に低く抑えられ、フランス鉄鋼業界は十分な収益を得られず、設備投資資金の調達に苦しんでいた。上記の成果を雑誌論文「第2次近代化設備計画の進行と鉄鋼不足問題の再燃」として発表した。なお、これらを含む成果を『ヨーロッパ統合とフランス鉄鋼業』として日本経済評論社から刊行する作業を進めている。
免疫グロブリン産生不全症のB細胞異常に関する免疫生化学的・遺伝子学的研究

免疫グロブリン産生不全症のB細胞異常を、1.免疫グロブリン産生機能分析,2.膜および膜レセプターの異常につき糖タンパク糖鎖構造の分析,3.各クラス免疫グロブリンの産生と発現を遺伝子レベルで分析するという3つの点から検討し、その異常の本態と異質性を明らかにする一連の研究によって下記のような成果が得られた。2.T・B細胞(株)および患者由来B細胞(株)の膜のアスパラギン結合型糖タンパク糖鎖構造の分析。B細胞(株)では分化が進むと、2本鎖構造ではbisectのGlcNAcを有する構造が出現し、3本鎖構造ではGlcNAcとManの結合において2.4結合が多くみられ、4本鎖構造は減少した。T細胞(株)ではbisectの構造は認められなかった。現在までに検索し得た患者B細胞(株)では正常人との間に質的な差は認められなかった。このbisectの構造がB細胞としての機能発現に関与していることが示唆された。3.遺伝子レベルでの解析。正常人とcommon variableimmunodeficiency患者のB細胞(株)を用いて、mRNAからのタンパク合成を行わせ、免疫グロブリン合成をみた。その結果、患者においてもIgMの合合成が確認され、それ以降での障害が示唆された。更に他の患者についてもmRNAレベルでの検討を続けており、また免疫グロブリン遺伝子(DNA)レベルでの検索も進めている。以上の如く、3つの観点から検討した結果、B細胞異常の本態と異質性が明らかにされ、更に検討を進めている。
新規転写因子GAF1によるジベレリン信号伝達機構の解析

ジベレリンは、植物の生長を制御する植物ホルモンとして知られている。GA信号伝達において、DELLAタンパク質は、抑制因子として働き、GA依存的に分解されることが報告されている。レセプターの発見により分解までの制御機構が明らかになったが、DELLAタンパク質の機能は、不明であった。本研究では、DELLAタンパク質と相互作用する因子GAF1を単離し、酵母、植物細胞を用いた実験系を確立しGAF1-DELLA複合体によるGA信号伝達の一つの作用機構モデルを提唱した。ジベレリン(GA)は、種子発芽、伸長成長、開花時期を制御するホルモンとして知られている。GA信号伝達経路は、植物特有のGRASfamilyタンパク質が抑制因子として機能しておりGAの添加にともない、速やかに分解され下流の信号が伝達される。近年、GAの受容からDELLAタンパク質の分解までの詳細が明らかになりつつあるが、その下流の制御因子は明らかとなっていない。シロイヌナズナのDELLAタンパク質RGA/GAIとの相互作用因子GAF1を単離し、機能解析を行っている。GAF1は、RGA/GAIばかりでなく,転写抑制因子と考えられるWD repeat protein (WDR)とも相互作用することを見出した。本研究では、GAF1及びその相互作用因子の解析を通じて、GA信号伝達機構を明らかにする。本年度は、以下のことを明らかにした。1.GAF1過剰発現体は、開花時期の促進、胚軸の伸長、葉の展開の表現型を示した。またGA合成阻害剤存在下でも、開花時期の遅延を回復した。2.GAF1における、GAIとの相互作用に必要な領域を同定した。この領域を欠失したGAIと相互作用しない変異体タンパク質mtGAF1(ΔGAIbd)、を作製した。3.GAF1は、ほとんど転写活性化能を示さない転写因子あるが、GAIをともに発現させると、強い転写活性化能を有し、対照的にWDRは転写抑制因子として機能することが明らかになった。また、ゲルシフト解析により、GAF1は、GAIとは対照的にDNA配列特異的な結合能を有することが明らかとなった。4.GAF1の標的遺伝子を探索するため、花成制御遺伝子および、ジベレリン応答遺伝子に焦点をあて、GAF1過剰発現体において発現量が変化している遺伝子をマイクロアレイにより解析した。GAレセプターの発見により、GA投与からDELLAタンパク質の分解までの詳細が明らとなったが、その下流の制御因子は明らかとなっていない。独自に開発したTupl-twobhybrid法により単離したDELLAタンパク質と相互作用する転写因子GAF1の機能解析を行っている。GAF1は、シロイヌナズナのDELLAタンパク質RGA/GAIばかりでなく、転写抑制因子と考えられるWD repeat protein (WDR)とも相互作用することを見出した。GAF1過剰発現体は、開花時期の促進、胚軸の伸長、葉の展開の表現型を示した。またGA合成阻害剤存在下でも、開花時期の遅延を回復した本年度は、植物細胞を用いたトランジェントの実験系を確立し、植物細胞内におけるGAF1及び相互作用因子による、転写制御機構の解析を行った。その結果、GAF1は、単独では、弱い転写活性化因子として機能するがGAIをともに発現させると、強い転写活性化能を有し、対照的にWDRは転写抑制因子として機能することが明らかになった。また、BiFC解析より、GAF1とGAIタンパク質は、核内で相互作用することを明らかにした。さらに、この相互作用は、ジベレリンの投与によるGAIタンパク質の分解に伴い消失することが明らかとなった。これらの結果から、GA信号伝達におけるDELLAタンパク質下流の制御機構として、GAは、DELLAタンパク質の分解を促進し、GAF1相互作用因子を変化させることによりGAF1複合体の転写活性化能を調節し、GAF1標的遺伝子の遺伝子発現を制御しうることが明らかとなった。