hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スピン偏極水素原子ビームによる表面磁気秩序の解明

水素原子ビームの速度を測定するためのレーザーや光学系を準備したが,水素原子ビームの強度が低く,測定までには至らなかった.石英管の形状や冷却法が変わったため,マイクロ波の放電により石英管が高温となり,再結合率が上がったのが原因だと考えられる.一方で水素分子ビームに関しては散乱強度の角度分布を測定できる装置を作成し,単結晶の二酸化チタン表面において水素分子の散乱角度分布を測定できることを確認した.研究期間全体としては水素分子ビームの高強度化,磁石やQMSの位置制御機構の作成,多光子共鳴イオン化法による水素分子ビームの速度測定,水素ビームの散乱角度分解測定などを行った.しかし水素原子ビームの高強度化がうまくいかず,目的としていたAg(111)上の物理吸着酸素分子層の表面磁気秩序の解明までには至らなかった.個々の部分については本研究によりほぼ完成したので今後水素原子ビームの高強度化ができれば本来の目的を達成できると考える.本研究ではスピン偏極水素原子ビームを利用してAg(111)上の物理吸着酸素分子層の表面磁気秩序を明らかにすることを目的とした.水素分子ビームの高強度化,磁石や質量分析器の位置制御機構の作成,多光子共鳴イオン化法による水素分子ビームの速度測定,水素分子ビームの散乱角度分解測定などを行った.水素原子ビームの強度が低く,目的としていた表面磁気秩序の解明までには至らなかったが,個々の部分については本研究により完成したので今後水素原子ビームの高強度化ができれば上記の目的を達成できると考える.レーザーによる水素分子ビームの速度測定を行う実験を行ったため当初の計画とは遅れている.早急に水素原子ビームの速度を測定・SG磁石によるスピン偏極率の測定を行い,当初の予定に間に合わせたい.表面界面物性レーザーにより水素原子ビームの速度を測定し,その速度をもとに六極磁石とSG磁石の最適な位置を計算し,SG磁石を設置してスピン偏極率の測定を行う.また六極磁石の直後にスピン偏極していないビーム成分を除去するビームストッパーを置き,スピン偏極率とビーム強度の変化を測定する.計算結果との比較をしながら,ビームの最適化を行う.ビームの収束位置に準備したAg(111)表面上の物理吸着酸素分子層にスピン偏極水素原子ビームを照射し,散乱後のスピン偏極率の変化を測定する.表面の磁場が均一な場合ではスピン反転は起こらず,不均一な磁場があればスピン反転が起こると考えられる.酸素分子のスピンの向きは吸着量が低い場合は表面垂直で,吸着量が高い場合は表面平行になることが予測されており,水素原子の表面に対するスピンの向きによりスピン偏極率の変化に違いがあると考えられるので,試料まわりに外部磁場を印加することにより水素原子のスピンの向きを制御し,その違いを調べる.また基板温度や吸着量により酸素分子の吸着構造が変わるので,それらを変化させた測定も行う.水素原子ビームの強度が低く散乱後のスピン偏極率の測定が困難な場合は,表面における水素分子生成率をQMSによって測定することによりスピン反転時間を求めることも試みる.スキマーの導入により真空部品の再設計が必要となりやや当初の計画とは遅れている.早急に再設計を行い,当初の予定に間に合わせたい.当初予定していた真空部品の発注が間に合わなかったため.SG磁石を設置してスピン偏極率の測定を行う.超高真空槽内にAg(111)試料を準備し,その表面に物理吸着した酸素分子層で散乱した水素原子のスピン偏極率変化の測定を行う.また六極磁石の直後にスピン偏極していないビーム成分を除去するビームストッパーを置き,スピン偏極率とビーム強度の変化を測定する.計算結果との比較をしながら,ビームの最適化を行う.ビームの収束位置に準備したAg(111)表面上の物理吸着酸素分子層にスピン偏極水素原子ビームを照射し,散乱後のスピン偏極率の変化を測定する.表面の磁場が均一な場合ではスピン反転は起こらず,不均一な磁場があればスピン反転が起こると考えられる.
非天然アミノ酸導入蛋白質を用いた蛋白質のミトコンドリア移行の分子機構の解析

ミトコンドリアタンパク質の多くは,サイトゾルで前駆体として合成された後,ミトコンドリア外膜と内膜の膜透過装置の働きで,外膜と内膜を通過して,ミトコンドリア内部に移行する。本研究では,部位特異的に光架橋性の非天然アミノ酸(ベンゾイルフェニルアラニン誘導体)を導入した前駆体を用いて,膜透過装置との相互作用の解析を行い,タンパク質のミトコンドリア膜透過の仕組みを明らかにすることをめざした。サプレッサーtRNA法を用いて,プレ配列を持つ前駆体のプレ配列中の様々な部位に,光反応性の非天然アミノ酸残基を部位特異的に導入したミトコンドリアタンパク質前駆体を系統的に調製した。この前駆体と膜電位を消失させたミトコンドリアをin vitroでインキュベートすることによりミトコンドリア外膜透過反応中間体を生成し,光照射によって架橋反応を行った。架橋産物について,架橋の相手を既知の膜透過装置構成タンパク質に対する抗体による免疫沈降実験により,同定した。以上の解析の結果,プレ配列の外膜透過は,これまで考えられていたような成熟体部分のunfoldingとは共役する必要がないことが明らかになった。続いて,消失させた膜電位を復活させることにより,外膜膜透過反応中間体の内膜通過を促し(チェイスし),これまで論争が続いていたTom22の膜間部ドメインの役割について検討した。その結果,Tom22の膜間部ドメインは,外膜膜透過装置から内膜膜透過装置への前駆体の引き渡しの効率を高めていることが明らかになった。これらの結果は,アミノ酸残基レベルの空間分解能を有する部位特異的光架橋反応を行うことによって初めて解明することができたものである。さらに同様の手法をキャリアタンパク質のミトコンドリア内膜への移行,タンパク質の葉緑体包膜透過の実験系にも適用した。ミトコンドリアタンパク質の多くは,サイトゾルで合成された後,ミトコンドリア外膜と内膜の膜透過装置の働きで,外膜と内膜を通過して,ミトコンドリア内部に移行する。本研究では,非天然アミノ酸を導入した前駆体蛋白質を用いて,タンパク質複合体であるこれらの膜透過装置と前駆体の相互作用の解析を行い,タンパク質のミトコンドリア膜透過の仕組みを明らかにすることを目的としている。ミトコンドリアタンパク質前駆体のプレ配列中の様々な部位に,無細胞タンパク質合成系を用いて,光反応性の非天然アミノ酸残基を部位特異的に導入した。この前駆体と膜電位を消失させたミトコンドリアをin vitroでインキュベートすることによりミトコンドリア膜透過反応中間体を生成し,光照射によって架橋反応を行った。これまでは,外膜膜透過装置にはプレ配列結合部位がサイトゾル側(シス部位)と膜間部(トランス部位)の2ヶ所にあり,シス部位からトランス部位へとプレ配列が移動することにより,前駆体の外膜通過が駆動されるものと考えられいた。しかし今回の架橋実験より,プレ配列と外膜の膜透過装置構成タンパク質との相互作用は,シス部位結合の条件下でもトランス部位結合の条件下でも,ほとんど変化しないことがわかった。しかし,トランス部位結合の条件下では,プレ配列よりも下流の成熟体部分が膜透過装置と相互作用しているらしいことが分かった。以上の結果は,前駆体の外膜通過の駆動力はプレ配列がシス部位からトランス部位へと移行することによって引き起こされているのではないことを示しており,今後新しい分子機構を考える必要があることを示すものである。

本研究では,部位特異的に光架橋性の非天然アミノ酸(ペンゾイルフェニルアラニン誘導体)を導入した前駆体を用いて,膜透過装置との相互作用の解析を行い,タンパク質のミトコンドリア膜透過の仕組みを明らかにすることをめざした。サプレッサーtRNA法を用いて,プレ配列中の様々な部位に,光反応性の非天然アミノ酸残基を部位特異的に導入したミトコンドリアタンパク質前駆体を系統的に調製した。この前駆体と膜電位を消失させたミトコンドリアをinvitroでインキュベートすることによりミトコンドリア外膜透過反応中間体を生成し,光照射によって架橋反応を行った。架橋産物について,架橋の相手を既知の膜透過装置構成タンパク質に対する抗体による免疫沈降実験により,同定した。以上の解析の結果,プレ配列の外膜透過は,これまで考えられていたような成熟体部分のunfoldingとは共役する必要がないことが明らかになった。続いて,消失させた膜電位を復活させることにより,外膜膜透過反応中間体の内膜通過を促し(チェイスし),これまで論争が続いていたTom22の膜間部ドメインの役割について検討した。その結果,Tom22の膜間部ドメインは,外膜膜透過装置から内膜膜透過装置への前駆体の引き渡しの効率を高めていることが明らかになった。これらの結果は,アミノ酸残基レベルの空間分解能を有する部位特異的光架橋反応を行うことによって初めて解明することができたものである。
湖における底泥の物質特性と栄養塩の溶出速度に関する研究

湖における富栄養化現象が問題になって以来、多くの湖で流入栄養塩の削減、底泥の浚渫などが検討され実行に移されている。しかしながら、流入栄養塩に関しては、ある程度の精度で評価が可能となっているが、底泥からの栄養塩の溶出に関しては、実地観測の困難さから実験的に検討がなされているのが現状で、しかも水深の比較的浅い湖では底泥の物質特性が場所的に大きく変化しており、底泥からの溶出量を精度良く評価できていない。そこで本研究では、底泥からの栄養塩溶出量を評価するために、鳥取市西部に位置する湖山池(湖面積6.9km^2)を対象として、底泥の物質特性、間隙水の栄養塩濃度の分布特性を検討するとともに、現地試験および室内実験によって栄養塩の溶出速度を測定した。得られた主要な結果を示すと以下の通りである。1)夏期および冬期に間隙水中の栄養塩濃度を測定した結果、まず、無機窒素に関しては、夏期はNH_4-Nが主成分で、比較的高濃度がであるが、冬期では全体的に濃度が低く、NO_3-Nが主成分である。無機リンに関しては、夏期に濃度が高くなる傾向にあるが場所的変化が著しいが、流入河川の河口部に高濃度の場所が存在することが観測された。2)栄養塩溶出の現地試験の結果、無機リンの場合、嫌気状態で非常に大きな溶出が観測された。この値は溶出速度に関して好気状態の100倍程度であり、嫌気状態の発生がリン溶出量に大きな影響を及ぼすことがわかった。3)栄養塩の溶出量に関しては、無機窒素に関してはある程度推定が可能であることがわかったが、無機リンに関しては嫌気状態の把握が問題であり今後の課題として残った。
くも膜下出血後の交通性水頭症における髄液内TGF-B1の意義

われわれはクモ膜下出血時に髄液中に放出される血小板由来のTGF-b1の生理的役割を調べるためにTransforminggrowthfactor beta1(TGF-b1)をC57BL6マウスのクモ膜下腔内に注入した。マウスの脳室系はTGF-b1注入後3週以内に拡大しはじめ、マウスの体重は注入後6週で増加しなくなった。組織学的検討では著しい脳室拡大にもかかわらず各脳室出口に解剖学的な閉塞は認めなかった。電子顕微鏡による観察では、脳室上衣のcilliaの減少が見られhuman recombinant TGF-b1でマウスに交通性水頭症が誘導できることが照明された。より人のくも膜下出血に類似した環境でのTGF-b1の役割を調べるために、同種マウスの血清と血漿をマウスのクモ膜下腔内に注入したところ、血清のみで交通性水頭症が誘導され、これは人型抗TGF-b1抗体にてブロックすることができた。さらにTGF-b1がクモ膜下出血後に発生する交通性水頭症の発生に関与しているか否かを臨床的に調べるために24例のクモ膜下出血患者の髄液中TGF-b1濃度をELISA法にて經時的に測定した。またWestern blot法にて髄液中の活性型TGF-b1の有無を測定した。その結果、交通性水頭症と診断され脳室腹腔短絡術(VP shunt)が行われた11例のTGF-b1濃度の第12-14病日の平均値は1.11±0.09ng/mlで、同時期のVP shuntを行わなかった13例の平均値の0.56±0.22ng/mlに較べ有意に高かった。(p<0.01)またWestern blot解析を行った症例では髄液中に25kdのTGF-b1を確認した。以上よりクモ膜下出血後の髄液中のTGF-b1がクモ膜下出血後の交通性水頭症の発生に重要な役割をはたしていることが示唆された。Transforminggrowthfactor beta1(TGF-b1)はmultifunctional polypeptideの一つで、さまざまな細胞の増殖・分化を調節するとともに細胞外matrix proteinの産生を調整している。われわれはクモ膜下出血時に髄液中に放出される血小板由来のTGF-b1の生理的役割を調べるためにhuman recombinant(hr)TGF-b1を生後10日のC57BL6マウスのクモ膜下腔内に注入してみた。その結果、マウスの脳室系はTGF-b1注入後3週以内に拡大しはじめ、マウスの体重は注入後6週で増加しなくなった。電子顕微鏡による観察では、脳室上衣のcilliaの減少が見られた。これらの結果よりhr TGF-b1でマウスに交通性水頭症が誘導できることが証明された。

その結果、交通性水頭症と診断され脳室腹腔短絡術(VP shunt)が行われた11例のTGF-b1濃度の第12-14病日の平均値は1.11±0.09ng/mlで、同時期のVP shuntを行わなかった13例の平均値の0.56±0.22ng/mlに較べ有意に高かった。(p<0.01)またWestern blot解析を行った症例では髄液中に25kdのTGF-b1を確認した。以上よりクモ膜下出血後の髄液中のTGF-b1がクモ膜下出血後の交通性水頭症の発生に重要な役割をはたしていることが示唆された。研究の背景くも膜下出血はしばしば交通性水頭症を誘発する。わたしたちはヒト型recombinant(hr)TGF-β1をマウスの髄腔内に注入することによって、交通性水等症が誘導できることを発見した。研究目的今年度はhrTGF-β1のかわりに、くも膜下出血により近い形でTGF-β1を含んでいる同種マウスの血清を髄腔内注射することによって、交通性水頭症が誘導できるか否かについて検討した。方法マウスの血清と血漿および濃度を変えたhrTGF-β1を生後10日目のC57BL/6マウスの頭部に注射し、脳室と脳の各横径を1,3,6,12週で測定した。マウスの血清と血漿中のTGF-β1の分子量はwestern blot法にて測定した。誘導した水頭症の髄液の交通性は色素の注入にて確認した。結果水頭症を引き起こす最低限のhrTGF-β1量は一匹あたり0.6ngだった。血漿では水頭症は誘導されなかったのに対して、同容量の血清では水頭症を誘導することができた。血清やhrTGF-β1で誘導された水頭症では脳表に注入した色素が側脳室内に逆流することが確認された。血清注入による交通性水等症の形成はヒト型抗TGF-β1抗体の髄腔内注入によって阻止することができた。western blot法ではマウスの血清中に25kdの活性型TGF-β1を確認したが、血漿中には認めなかった。結論この研究によって、くも膜下出血後の髄液中に存在する活性型TGF-β1がくも膜下出血後の交通性水頭症の発生に寄与している可能性が示唆された。
隕石中に見られる中空状炭素質ナノ粒子の生成過程:電子顕微鏡による模擬実験

初期生命の材料供給者である可能性が論じられている中空状炭素質ナノ粒子は、46億年前の分子雲から太陽系形成初期に亘る低温環境で紫外線照射によって形成したと考えられている。この説に対し、我々はさらに昔の晩期型巨星の周囲での形成の可能性を示唆する結果を、多環芳香族炭化水素(PAH)のプラズマ改変実験で得ている。そこで、中空状炭素質ナノ粒子の生成過程つながっていく、宇宙における炭化水素分子の進化過程の一経路を提案することを目的に本研究を行った。まず分子の生成過程を考えた。宇宙に普遍的に存在し、環境を反映して構造変化するため、天体の物理的・化学的情報を得られるPAH分子は、晩期型巨星の質量放出中で生成し、集まってクラスターを形成すると考えられている。ほとんどの分子生成には、ダストと呼ばれるナノ粒子が下地として必須であるが、逆にその高い触媒作用による分解過程も無視できず、相互作用の定量的な研究が必要である。そこでまずPAHと同様に晩期星周囲に多量に存在し、且つダストの主な材料であるFeやMg、SiがPAH分子に与える触媒効果について実験を行った。実験ではヘリウムガス中で、PAH蒸気をFeやMg、Si蒸気、又はナノ粒子と反応させた。Feの存在がない場合には100nm程度のPAHナノ粒子が生成したが、Feが存在する場合には、表面がグラファイト層で覆われたFeナノ粒子が生成した。これはFeが持つ触媒作用によってPAHが分解された結果であると考えられる。また、PAH種によってこの表面のグラファイトの層数が異なることも明らかとなり、触媒効果の定量化が行える見込みとなった。
細胞骨格系アクチンの重合位置と脱重合機構

豚脳から精製したβ/γーアクチン単量体をAcceptorタンパク質とし、ボツリナムC_2毒素によりmono ADP-riboseを結合させると、修飾前にはMg^<++>添加で重合したアクチンが重合しなくなることを、アクチン重合に伴う粘度の上昇が起こらないことで確認した。このmono ADP-ribosyl化アクチンをタンパク分解酵素で切断し、ADP-riboseを結合したペプチドを高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーで精製し、得られたADP-ribose結合ペプチドのアミノ酸分析の結果、アクチンのアミノ基末端から18番目のリジン残基に結合していることが判明した。この結果は、Aktorieらがアクチン安定化因子であるCa^<++>をキレートしたアクチンをAcceptorとした結果と異なっていた。この差異はCa^<++>を除いたアクチンは、その立体構造が変化し、既にアクチン重合能を失ない、mono ADP-ribose結合位置が変化して起こったと考えている。生体内でのアクチンのmonoADP-ribosyl化機構を検索する為に、ラット脳を材料に非筋細胞アクチン単量体をAceeptorとするmono ADP-ribosyltransteraseを精製した結果、Lysophosphatidylcholineで活性上昇と、逆に阻害される分子量の異なるisozymeを見出すことが出来た。生体内の本酵素は、他臓器にも分布していたが、特に脳内での活性は約10倍以上強く、β/γーアクチンを強くmono ADP-ribosyl化する酵素は、GTP結合Goタンパクをもmono ADP-ribosyl化した。さらに、非筋細胞アクチンの50%が重合しないで存在することが知られているので、高速液体クロマトグラフィーで、非筋細胞内に存在すると考えられるmonoADP-ribosyl化アクチンを分離定量を試みた結果、豚脳内の非筋細胞(神経細胞)では、重合に寄与しなかったアクチン単量体のうち40%程がmono ADP-ribosyl化されていることが判った。
倒伏抵抗性極強の水稲品種開発のための極強稈性の生理機構の解明

食用、飼料、バイオ燃料用の水稲品種の開発では、バイオマス生産量の増加と倒伏抵抗性の改良が主要な育種目標となる。リーフスターは太稈で断面係数が大きく、強稈質で曲げ応力が大きいため、稈基部の挫折強度が大きい特性をもつ。本研究では、リーフスターとその両親である中国117号とコシヒカリを用いて、強稈性の原因となる形質を解析した。その結果、リーフスターは稈基部節間のセルロース、ヘミセルロース密度が稈質が弱く曲げ応力が小さい中国117号より大きいこと、コシヒカリに由来する稈の皮層繊維組織が厚い特性と皮層繊維細胞の2次壁肥厚がよい特性をもつことを明らかにした。高収量、高バイオマス水稲品種の開発においては、地上部全体を支える倒伏抵抗性の向上が不可欠である。それには太稈性と強稈質がもたらす強稈性の改良が重要な研究課題となるが、一般に稈を太くすると稈質がもろくなる関係があり、そのことが強稈性の改良を困難にしてきた。本研究では、強稈質に関わる曲げ応力に相違のある品種・系統、太稈で曲げ応力に相違がある極強稈性をもつ品種および準同質遺伝子系統を用いて、強稈性を高める強稈質に関わる皮層繊維組織の構造的特性、セルロース、ヘミセルロース、リグニンなど細胞壁構成成分に関わる性質を比較検討した。平成25年度は、これまで育成した太稈性で曲げ応力が大きく強稈質の水稲品種リーフスター、稈は細いが曲げ応力の大きいコシヒカリ、太稈性であるが曲げ応力が小さいリーフスターの親の中国117号、タカナリを比較し、稈の構造的性質、皮層繊維組織の発達程度、細胞壁構成成分の密度、強度に関わる質的な性質を比較した。その結果、リーフスターはタカナリや親の中国117号と比べて、稈の太さには相違がないが、皮層繊維組織が厚く発達し、皮層繊維細胞の細胞壁の2次成長がよく、細胞壁が厚く肥厚する性質をもつことがわかった。一方、曲げ応力の小さいタカナリや中国117号では、皮層繊維組織の2次壁の肥厚が悪く、中が空洞化する細胞が多くみられ、稈の脆さの原因となっていることがわかった。また、セルロース、ヘミセルロース密度が著しく高く、皮層繊維組織のほか、柔組織細胞の細胞壁にも多く集積することが明らかになった。そのためには、太稈性と強稈質がもたらす強稈性の改良が重要な研究課題になるが、一般に稈を太くすると稈質がもろくなる関係があり、そのことが強稈性の改良を困難としてきた。そこで本研究では、強稈性のその生理機構を解明することを目的に、強稈質に関わる性質に相違のある品種、系統、極強稈品種より作出した太稈性および強稈質の組換え固定系統を用いて、強稈質に関わるヤング率、皮層繊維組織の厚さ、皮層繊維細胞数、細胞壁を構成するセルロース、ヘミセルロース含有率および密度について解析を行った。その結果、リーフスターはタカナリや親の中国117号と比べてヤング率が高く、皮層繊維組織が厚く発達し、皮層繊維細胞の細胞壁の2次成長がよく、細胞壁が厚く肥厚する性質をもつことがわかった。一方、ヤング率の小さいタカナリや中国117号では、皮層繊維組織の2次壁の肥厚が悪く、中が空洞化する細胞が多くみられ、稈の脆さの原因となっていることがわかった。また、リーフスターはセルロース、ヘミセルロース密度が著しく高く、皮層繊維組織のほか、柔組織細胞の細胞壁にも多く集積することが明らかになった。リーフスターのヘミセルロース含有率および密度を高める対立遺伝子は第5染色体にあり、コシヒカリの遺伝背景にリーフスターの第5染色体全域の断片をもつ組換え固定系統は、リーフスターと同様にヘミセルロース含有率、および密度が高い性質をもつことから、リーフスターのもつ太稈遺伝子と強稈質遺伝子をコシヒカリに集積することにより、強稈性の改良が可能となることがわかった。作物学当初の予定通り、極強稈品種の強稈質に関わる皮層繊維組織、細胞壁成分の特性が明らかになったため。

H25年度の研究成果をもとにして、平成26年度は、稈の太さは同じで曲げ応力が異なり稈質が異なる中国117号、タカナリの準同質遺伝子系統を用いて、強稈性を高める生理的要因を解析し、太稈でかつ強稈質となる生理機構を解明する。強稈形質の測定試料数が当初予定よりもやや少なく済み、それに伴う試薬等の物品費が少なくなったため。次年度は強稈形質の測定試料数がやや多くなるため、使用する試薬等の物品費として使用する計画である。
網膜疾患における血管新生抑制性ペプチドＶＥＧＦ１６５ｂの病態解析と治療法の開発

カニクイザルの硝子体内にペガプタニブを投与した後に眼内VEGFは増加したが、アイソフォームによる差異は認めなかった。培養細胞を用いた実験ではペガプタニブによりVEGFが増加し、特にVEGF165bの増加が多くみられた。カニクイザルにおけるラニビズマブおよびアフリベルセプトの硝子体内投与時の半減期は両薬剤間に差は無く、どちらの薬剤も無硝子体眼では有硝子体眼よりも半減期が短かった。カニクイザルにおいても加齢黄斑変性症例においてもアフリベルセプトの方がラニビズマブよりも有硝子体眼でも無硝子体眼でもVEGFを長い期間抑制した。アフリベルセプトは血中VEGFを抑制したが、ラニビズマブは影響しなかった。加齢黄斑変性の治療薬として認可されているVEGF165の阻害剤であるペガプタニブの硝子体内投与後に眼内VEGFがパラドキシカルに増加することを報告し、その機序を解明するためにアイフォームの変化を検討することを目的に研究を始めた。1年目の結果として、カニクイザルの硝子体内にペガプタニブ(0.3 mg/90 μl)を注射し、経時的に前房水を採取し、VEGFアイフォームの濃度をELISAを用いて測定し、ペガプタニブの投与後に眼内VEGF総量は増加するがアイソフォームによる差異は認めなかったことを報告した。2年目の研究として、培養細胞を用いて抗VEGF薬投与後のVEGFアイソフォームの変化を検討した。網膜色素上皮由来の細胞であるARPE65細胞を培養し、種々の濃度のペガプタニブを添加し、培養後のVEGFアイソフォームの産生量をWestern blottingで測定した。主たるアイソフォームであるVEGF165の産生量はペガプタニブ添加で濃度によってもほとんど変化がみられなかった。血管新生抑制性のアイソフォームであるVEGF165bの産生量はコントロールであるペガプタニブ無添加群と比較し、ペガプタニブ1.6 μg/mlでは変化が認められなかったが、4.0μg/ml添加群ではVEGF産生量は約2倍となり、その後添加するペガプタニブ濃度が160μg/mlまで高くなるにつれてVEGF産生量は徐々に減少していった。臨床ならびにカニクイザルの実験においてペガプタニブ投与後にVEGFが増加していたのは、低濃度のペガプタニブ投与時のVEGF165bアイソフォームの増加による可能性があると考えられた。血管内皮増殖因子(VEGF)にはVEGF165, VEGF121などのいくつかのアイソフォームが認められているが、これらはいずれも血管新生を促進する。近年、末端の配列の異なるアイソフォームが発見されVEGFxxxbをよばれ、これらは新生血管を抑制する作用がある。われわれは以前に加齢黄斑変性の治療薬として認可されているVEGF165の阻害剤であるペガプタニブの硝子体内投与後に眼内VEGFがパラドキシカルに増加することを報告した。今回の研究では硝子体内に投与されたペガプタニブが眼内VEGFに与える影響の経時的な変化を検討するとともに、ペガプタニブ投与後の総VEGF増加の主たる原因となっているアイソフォームを同定することを目的とした。臨床症例での検討は困難であるのでカニクイザルを用いて実験を行った。カニクイザルの硝子体内にペガプタニブ(0.3 mg/90 μl)を注射し、投与直前、投与1,3,7、日および2,3,4,5,6,7,8週に前房水を採取し、VEGF全アイフォーム, VEGF165b, VEGF121の濃度をELISAを用いて測定した。ペガプタニブの投与前には前房水中の総VEGF濃度は80.5 ±15.8 pg/mlであり、投与翌日には急激に増加し155.9 ±76.7 pg/mlとなり、2週後に最高値205.0 ±70.7 pg/mlとなった。VEGF165bの濃度も同様の変化を示し、ペガプタニブ投与前には28.7 ±20.4 pg/mlであり、2週後に最高値60.5 ±46.7 pg/mlに達し、その後減少した。VGEF121は投与前、投与後の全期間を通じて検出できなかった。ペガプタニブ投与後の眼内VEGF増加にはアイソフォームによる差異は認めなかった。3年目はカニクイザルに臨床で用いられている抗VEGF薬であるranibizumabおよびafliberceptを有水晶体眼および無硝子体眼の硝子体内投与し前房水中のVEGFの動態を検討した。

Ranibizumab(0.5 mg/50 μl)あるいはaflibercept (2mg/50 μl)をカニクイザルの硝子体内に注射した。注射眼および僚眼の前房水を注射直前、注射翌日、3日後、1週後から8週後は毎週採取し、ー80°Cで保存し、ELISAでVEGF濃度を測定した。ranibizumabの前房水中の半減期は有硝子体眼では2.3日、無硝子体眼では1.4日であった。ranibizumab投与により有硝子体眼では3週間、無硝子体眼では1週間、VEGFは測定感度以下となった。afliberceptの前房水中の半減期は有硝子体眼では2.2日、無硝子体眼では1.5日であった。aflibercept投与により有硝子体眼では6週間、無硝子体眼では4週間、VEGFは測定感度以下となった。ranibizumab硝子体注射後では僚眼の前房水VEGF濃度に変化はなかったが、aflibercept硝子体注射後には3日間、僚眼の前房水VEGF濃度が低下した。Ranibizumabとafliberceptの硝子体注射後の半減期に差は無かった。どちらの薬剤も無硝子体眼では有硝子体眼よりも半減期が短かった。afliberceptの方がranibizumabよりも有硝子体眼でも無硝子体眼でもVEGFを長く抑制した。Ranibizumabでは僚眼のVEGF濃度に影響を与えないが、afliberceptは短期間ではあるが僚眼のVEGF濃度を低下させた。眼科カニクイザルを用いてVEGF165阻害薬であるペガプタニブ硝子体内投与後に種々のアイソフォーム増加がみられたことに加えて、ARPE65細胞を用いた培養実験において、ペガプタニブ投与時のVEGF各アイソフォームの産生量を測定し、VEGF165の産生量はペガプタニブの濃度により変化がなかったが、血管新生抑制性のアイソフォームであるVEGF165bの産生は低い濃度のペガプタニブでは増加し、高い濃度になると減少しコントロール群の値に近づくことが示された。カニクイザルを用いて、正常眼における各種VEGFアイソフォームの濃度をELISAを用いて測定することができた。さらに当初の予定では平成25年に行う予定であったペガプタニブ投与後のVEGFアイソフォームの変化についても予備実験としてデータが得られた。平成25年度では概ね目標を計画通りに達成できたが、VEGF阻害薬にはVEGF165のみを特異的に阻害するペガプタニブ以外にラニビズマブとアフリベルセプトの2種の薬剤が加齢黄斑変性などに使用することが承認されている。ラニビズマブやアフリベルセプトでもペガプタニブで得られた結果と同様の結果が得られるかどうかを培養実験系を用いて検討するとともに、カニクイザルを用いた動物実験においても合わせて検討する。ARPE65細胞を培養しコンフルエントになった時点で、種々の濃度のラニビズマブあるいはアフリベルセプトを添加し、VEGF165、VEGF165bの産生量をwestern blottingで定量する。カニクイザルの動物実験においては、臨床で用いられる濃度のラニビズマブあるいはアフリベルセプトを硝子体投与し、その後経時的に前房水を採取し、VEGF165およびVEGF165bの濃度をELISAを用いて測定する。さらに、臨床においては、抗VEGF薬の効果持続期間が必ずしも明らかにはなっていない。加齢黄斑変性と網膜中心静脈閉塞症では眼内のVEGF濃度が上昇しているが、増加の程度が大きく異なり、網膜中心静脈閉塞症では著しい増加がみられている。硝子体内に投与された抗VEGF薬の効果持続期間が疾患により異なる可能性がある。
先天性アミノ酸尿症の原因としてのヒト塩基性アミノ酸トランスポーターの同定

Ecotropicマウス白血病ウイルスレセプター(ERR)としてクローニングされたタンパク質分子は、細胞内外のアルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸の輸送を司るトランスポーターとしても機能する。今回は、まず私達がクローニングしたERRのヒトホモローグ(H13,アミノ酸配列の相同性は87.6%)が、マウス白血病ウイルスのレセプターとしては機能しないことを利用し、ヒトとマウスのキメラ分子、さらにSite-Directed Mutagenesisの手法を用いMutantを作製し、ウイルスレセプターとしての機能及びトランスポーター活性を調べた。その結果、ERR分子中の235番目のTyr残基がウイルス感染に重要なアミノ酸残基であり、またこれらのMutantationはトランスポーター活性にはほとんど影響を与えないことが明らかになった。次に、抗H13モノクローナル抗体を作るため、上述の領域を含む第3番目の細胞外領域とGlutathione S-TransferaseとのFusion Proteinを作製し、アルメニアハムスターに免疫し、その脾臓をAg8.653細胞と細胞融合させ、現在スクリーニング中である。抗体が得られれば、腎臓等の臓器における免疫組織学的検討を行う予定である。一方、二塩基性アミノ酸尿症患者からBiopsyにより採取し樹立した細胞株を東邦大学大森病院より頂き、DNA及びRNAを調製し、現在、Southern及びNorthern Blotを行っている。今後、この細胞のRNAよりこの患者のトランスポーターcDNAをRT-CRによりクローニングし、そのトランスポーター活性を測定する予定である。
「長い十八世紀」における女性作家の相互依存性と公共圏の問題に関する総合的研究

本研究は、十七世紀後半から十八世紀にかけて、イングランドにおける女性作家の誕生、女性作家間の相互依存性という問題を、この時期に形成されつつあった公共圏という観点から考察することを目的とした。まず、Aphra Behnに端を発する、演劇というメディアにおける職業的女性作家の誕生の社会文化的側面を検討し、さらにBehnを意識した第二世代の女性作家たちの影響関係、協力関係、敵対関係の意義や戦略の分析を行った。また、当時の人気定期刊行物などの一次資料も調査することによって、「長い十八世紀」における女性作家形成の経緯、受容の問題、また、それらに対する男性作家や(女性)読者の反応などを検証した。ジェンダー論の視点から公共圏を再考した結果、Behnの一族とでも言うべき女性作家の系譜の存在と、その形成に携わっていた女性作家のネットワークの存在が確認された。だが、この系譜が女性作家たち自身により構築、利用されていた一方で、そこから外れる、作家たちの異端性こそが、次の世代へとつながる女性作家の可能性を広げつつ、より大きな系譜を形成していくことになる。この時期、劇作家として登場した女性たちは、出版文化の隆盛に伴い、哲学的思想や政治的主張を活字化し、より広範に流通させる、作家として確立されていった。以上のような研究を通じて、作家としての個々の戦略と、演劇や小説といったジャンルの隆盛との関係性を考えることで、公共圏において相互に依存(対立)する女性作家のネットワークの存在が、「長い十八世紀」の中で重要な意味を持つことが明らかになった。本年度は、十七世紀後半から十八世紀における女性作家形成の問題を、公共圏という場において考察するために、出版関係のマーケットに存在/機能する女性の位置づけ/役割に焦点を当てて、当時、急成長しつつあった出版文化をジェンダーの観点から考察した。そこで、従来、十八世紀以降に登場したとされる公共圏の形成過程を、1662年に発足する王立協会、および協会による当時の知の構築/流通状況と絡めて、再検討した。具体的には1.職業的女性作家誕生の場を最初に提供した演劇というジャンルに関して、上演や出版に関する一次資料から、当メディアにおける女性作家誕生の意義に対して考察を行った。特に、Aphra Behnという作家の女性というジェンダーが、どのように作品の上演/出版形態に機能していたのか更に検証を行い、王政復古期から十七世紀末にかけての男性作家/女性作家との関係性について考察し、Behnを軸とする知的ネットワークを総合的に捉えることを試みた。2.十七・十八世紀女性作家関連/出版関係の一次資料を、米スタンフォード大学グリーン・ライブラリー等で、マイクロフィルム等から収集を行い、文学作品との関連性をたどりやすい形に分類・整理を進めた。3.Athenian Mercuryといった十七世紀末の人気雑誌を手がかりに、公共圏の問題をジェンダーの視点から分析し、同時に、王立協会による出版戦略と、このような雑誌の出版戦略とを比較することで、出版文化の成長過程と知の形成/流通過程との関係を考察した。本年度は、十七世紀から十八世紀にかけて、(形成されつつある)公共圏における女性作家形成の問題を考察するために、Aphra Behnを主軸とする、女性の知的ネットワークを総合的に捉えることを試みた。すなわち、Behnに続く第二世代の女性作家たちのテクストを扱うことで、これらの作家による一枚岩的な「女性作家」という概念を形成するのではなく、女性作家間の対立/協力/影響関係といった異種混交的な力関係、あるいは女性作家たちを取り巻く同時代の男性作家との関係性に焦点を当てることで、職業作家という概念/地位が、どのように当時のジェンダー意識と絡みつつ発展していったのかを検討した。具体的には1.当時の女性の知的ネットワークを再構築するために、Delarivier Manleyを初めとする十七世紀末に劇作家として登場し、十八世紀に作家として活躍する女性たちの、Aphra Behnに対する意識、同時代の女性作家(また同様に、同時代の男性作家)に対する意識を演劇/散文から、あるいは、当時の政治文化的状況、出版メディア等の商業的事情を一次資料から掘り起こすことを行った。

2.王立協会の設立といった当時の「知」の形成に関わる問題や、出版文化史等に関する十七・十八世紀の一次資料を、東北大学や英Library of Royal Societyで収集を行い、文学作品との関連性をたどりやすい形に分類・整理を進めた。3.十七世紀末の人気雑誌や芝居に描かれる、女性の「書く/読む」という行為に関する問題(意識)を、ジェンダーの視点から分析することで女性作家/読者という社会現象を考察した。研究最終年度にあたる本年度は、これまでの研究成果を踏まえた上で、「長い十八世紀」における女性作家たちの知的ネットワークをめぐる様々な政治的、経済的状況、および女性のジェンダー等が次第に問題化していく(「観客」・「読者」を含む)公共圏という場を考察し、新たな文化研究の展開を試みた。そこで、当時の女性作家の受容の問題や、それに対する男性作家/(女性)読者の反応などを扱い、ジェンダー論の視点から、「公共圏」を再考すると同時に、「小説」の誕生といったジャンル論の再解釈を行い、女性作家研究と男性作家研究の相互依存性(の可能性)に対して検証を行った。具体的には、これまで分析基盤とした主要な理論1)ジェンダー研究、2)フェミニズム研究〔女性作家同士の異同および男性作家との関係〕、3)上演・出版研究、4)公共圏の成立に関する研究〔公共圏の成立を十八世紀以前に辿る〕を、女性作家形成の問題と関連づけた形で整理し、同様に、Aphra Behnの知的ネットワークを、男性作家/劇場関係者およびアマチュアの女性作家(詩人)等との関係から、またBehnを意識した第二世代の女性作家たちへの影響関係から、明らかにした。以上に加えて、5)観客・読者研究による理論的位置づけを行うことで、新たな女性作家研究の系譜を構築することを試みた。しかしながら、女性作家の系譜やネットワークについては、確かに存在し、作家たち自身により利用されていた一方で、そこから外れる、言うなれば、それぞれの女性作家たちの異端性こそが、また更なる女性作家の支流へと広がりながら、大きな系譜を形成していく過程が窺えた。劇作家として登場した女性たちは、出版文化の隆盛に伴い、哲学的思想や政治的主張を活字化してより広範に流通させる、作家として確立されていったことが明らかとなった。
高効率・低コストアモルファスSi11多結晶Siタンデム型太陽電池の最適化研究

低コスト・高効率太陽電池実用化には低温製作プロセスが重要な基本技術であり、その実現に向けて薄膜ポリシリコンの開発研究が精力的に進められようとしている。。本研究はプラズマCVD法によるμc-SiC/ploy-Siヘテロ接合構造は単純でしかも低温製作という特徴から、将来の薄膜ポリシリコン太陽電池の製造の基盤技術として期待されている。a-Si/poly-Siタンデム型太陽電池の下部セルはμc-SiC/poly-Siヘテロ接合から構成され、現在までにAM1照射光で17.2%の効率が得られている^<1)>。しかし、出力特性からみると、まだまだ改善される余地が十分に残されている。こう言ったセルにおいては各構成層を個別に最適化した場合でも、その性能は各界面特性により大きく左右されている。特に曲線因子への影響は顕著である。我々は従来の構造において裏面にハイドープnμc-Siを挿入することによりすべての出力パラメータ、特にFFが大きく改善されることを明らかにし、これはBSF効果に基づく裏面再結合速度の減少によるものと推論した。本年度は、まず光学的な理論設計からはじめ、これを実際に検証するとともに、各セル構成膜の物性値と厚さの最適値を決定した。理論計算と対応する実験結果は一致することを確認し、各構成層の最適範囲を決定した。また、裏面にn μc-Si薄膜を挿入することにより、大きく出力特性が改善されることをすでに報告しているが、今回、その効果の一つは裏面再結合速度の低減によるものであることを確認した。裏面に高導電性を有する微結晶シリコンを挿入することによる性能向上が再結合速度の減少によるものであることが判明、裏面再結合速度はほぼ1桁に渡って減少し、約80cm/S程度であることが分かった。。
ミクロ結晶構造と架橋点濃度の制御による傾斜機能ポリウレタンの合成と特性

傾斜機能高分子材料の合成は、高分子材料中への反応性低分子の拡散制御による方法や高分子鎖の相溶性・混和性の差を用いる方法等により進められている。我々は、典型的な液状ゴムであるポリウレタンの分子設計の容易さを用いて、分子鎖の化学構造・合成条件と高次構造・諸物性との関係を調べてきたが、そのなかで硬化温度により生成する球晶の形状、数、ガラス転移温度等が異なることを見いだした。この結果に基づき金型に温度勾配をつけて硬化させる成形温度勾配法で、球晶サイズと高次構造が傾斜したポリウレタンが合成できるとの考えに至った。本研究では球晶サイズと高次構造を傾斜させることにより弾性率等の物性が傾斜したポリウレタンの合成と物性評価を第1の、また傾斜構造の制御のための基礎的知見を得るために偏光顕微鏡を用いたその場観察による球晶成長挙動の硬化温度依存性を明らかにすることを第2の目的とした。ポリマーグリコールに平均分子量2000のポリ(オキシテトラメチレン)グリコール(PTMG)、ポリ(エチレンアジペ-ト)グリコール(PEA)、ポリ(カプロラクトン)グリコール(PCL)を、ジイソシアナ-トに4,4 ́-ジフェニルメタンジイソシアナ-ト(MDI)を、鎖延長剤(硬化剤)に1,4-ブタンジオール(BD)とトリメチロールプロパン(TMP)の混合物(重量比75/25)を用いた。温度勾配を有する金型を使用する新規なPUE成形プロセスを開発してPUEの傾斜化を試みた結果、高温成形面側から低温成形面側へ球晶の大きさと数が連続的に変化したミクロ相分離構造を取る傾斜機能PUEを得ることができた。いずれのPUEともマイクロ硬度は低温成形面側から高温成形面側へと連続的に変化した。今後、、製品の要求性能、機能に合わせて温度勾配条件を制御することにより、種々の用途に応用可能な傾斜PUEの獲得が期待できる。
ビタミンD誘導体の評価系の構築

大腸菌あるいは酵母内で発現させたヒト由来酵素を用いて、現在、治療薬として使用されているビタミンD誘導体および今後、骨粗鬆症や癌の治療薬として開発が期待されるビタミンD誘導体の代謝を調べ、ヒト体内における代謝を予測した。また、25位水酸化酵素CYP2R1、1α位水酸化酵素CYP27B1、24位水酸化酵素CYP24A1の構造と機能の関係を明らかにした。以下に主な内容を記す。(1)現在、副甲状腺機能亢進症の治療薬として活性型ビタミンD_3ヘキサフルオロ体はCYP24A1により23位が水酸化されたあと、UDP-グルクロン酸転移酵素UGT1A3によりグルクロンサン抱合を受けることがわかった。(2)現在、骨粗鬆症の治療薬として開発中のED-71(中外製薬)の立体異性体であるO2C3の代謝を調べた。その結果、O2C3は1α,25(OH)_2D_3に比べ、CYP24A1による代謝を受けにくいことがわかった。O2C3のビタミンDレセプターに対する結合能はED-71の30倍であることから、O2C3あるいはC3O1はED-71よりも優れた治療薬になる可能性が示唆された。(3)くる病との関連が報告されたヒトCYP2R1を酵母内で発現させ、その酵素学的性質を調べたところ、高い25位水酸化活性が見ら、CYP2R1の生理的重要性が明確になった。(4)種々のビタミンD誘導体、すなわちA環ジアステレオマー、2位メチル化体、ヘキサフルオロ体、20-epi体、2α-(3-ヒドロキシプロポキシ)体、19-ノルビタミンD誘導体の代謝を比較したところ、各種誘導体においてCYP24A1による代謝におけるk_<cat>/K_mと血中カルシウム濃度上昇作用の間に明らかな相関が見られた。(5)コンピューターモデリングおよび部位特異的変異導入によりマウスCYP27B1のSer408が基質結合に、Arg458がアドレノドキシンとの相互作用に重要な役割を果たしていること明らかにした。また、CYP24A1の反応性における種差を決定しているアミノ酸残基がN末端から416番目および500番目のアミノ酸残基であることを明らかにした。大腸菌あるいは酵母内で発現させたヒト由来酵素を用いて、現在、治療薬として使用されているビタミンD誘導体および今後、治療薬として開発が期待されるビタミンD誘導体の代謝を調べ、ヒト体内における代謝を予測した。また、ヒト由来CYP2R1の性質を調べ、本酵素ビタミンD25位水酸化酵素として生理的に重要であること明らかにした。(1)現在、副甲状腺機能亢進症の治療薬として活性型ビタミンD_3ヘキサフルオロ体の代謝を調べたところCYP24A1により23位が水酸化されたあと、UDP-グルクロンサン転移酵素によりグルクロンサン抱合を受けることがわかった。また、多くのUGT分子種のうちUGT1A3が特異的に反応を行うことを明らかにした。

(2)現在、骨粗霧症の治療薬として開発中のED-71(中外製薬)の立体異性体であるO2C3および修飾基に水酸基のないC3O1の、CYP27A1、CYP27B1およびCYP24A1による代謝を調べた。その結果、C3O1はCYP27A1によりO2C3に変換されること、C3O1およびO2C3はCYP24A1により代謝を受けるが1α,25(OH)_2D_3に比べるとはるかに代謝されにくいことがわかった。O2C3のビタミンDレセプターに対する結合能はED-71の30倍であることから、O2C3あるいはC3O1はED-71よりも優れた治療薬になる可能性が示唆された。(3)くる病との関連が報告されたヒトCYP2R1を酵母内で発現させ、その酵素学的性質を調べ、ミトコンドリア型ビタミンD_3 25位水酸化酵素であるCYP27A1と比較した。その結果、ビタミンD_3 25位水酸化活性におけるK_<cat>/K_m値はCYP2R1の方がはるかに高く、また、ビタミンD_2に対してはCYP27A1が24位を水酸化するのに対し、CYP2R1は25位を水酸化することがわかり、CYP2R1の重要性が明確になった。大腸菌あるいは酵母内で発現させたヒト由来酵素を用いて、現在、治療薬として使用されているビタミンD誘導体および今後、骨粗鬆症や癌の治療薬として開発が期待されるビタミンD誘導体の代謝を調べ、ヒト体内における代謝を予測した。また、1α位水酸化酵素CYP27B1変異体を作成し、その性質を調べることにより、本酵素の構造と機能の関係を明らかにした。以下に主な内容を記す。(1)種々のビタミンD誘導体、すなわちA環ジアステレオマー、2位メチル化体、ヘキサフルオロ体、20-epi体、2α-(3-ヒドロキシプロポキシ)体の代謝を比較したところ、CYP24A1による代謝様式ならびに代謝速度は誘導体の構造により大きく異なりヒトとラットでは代謝様式に違いがあることがわかった。また、各種誘導体においてCYP24A1による代謝におけるk_<cal>/K_mと血中カルシウム濃度上昇作用の間に明らかな相関が見られた。(2)19-ノルビタミンD誘導体は前立腺癌等の治療薬として期待されている。シトクロムP450による25(OH)-19-ノルビタミンD_3および1α,25(OH)_2-19-ノルビタミンD_3の代謝解析を行い、体内での代謝予測を試みた。CYP27B1の25(OH)_2-19-ノルビタミンD_3に対する1α位水酸化活性は,25(OH)ビタミンD_3に対する活性に比べはるかに低く、他に二つの代謝物が検出された。また、1α,25(OH)_2-19-ノルビタミンD_3を基質としてヒトおよびラットCYP24A1による代謝を比較したところ、1α,25(OH)_2ビタミンD_3の場合と同様に、ヒトCYP24A1においてC-23代謝経路とC-24代謝経路の両者がみられ、C-23代謝経路の割合は1α,25(OH)_2ビタミンD3よりも高かったが、ラットCYP24A1においてはほとんどC-24代謝経路のみであった(3)GroEL/ESとの共発現系を用いることにより、マウスCYP27B1およびその変異体の大腸菌内大量発現に成功した。さらに、コンピューターモデリングにより構築したCYP27B1の立体構造からSer408が基質結合に、Arg458がアドレノドキシンとの相互作用に重要な役割を果たしていることを予測した。部位特異的変異導入により、それぞれ複数の変異体を作成し機能を解析したところ、予測が正しいことがわかった.
膿皮症におけるブドウ球菌の上皮内侵入機構の解明および新規予防・治療戦略への展開

本研究ではマウスに黄色ブドウ球菌を塗布して膿痂疹モデルマウスを作成し、同マウスにおける黄色ブドウ球菌の経皮侵入機構について解析した。膿痂疹モデルマウスでは、まず好中球が表皮に侵入して角化細胞間を離開させ、その後に黄色ブドウ球菌の表皮内侵入が認められることを示した。一方で膿痂疹の病原因子である表皮剥脱毒素は、菌が表皮内侵入した後に角化細胞間をより開大させる役割を有することを示した。さらに本研究では、イヌ再発性膿皮症の症例における皮膚の脂質構成の変化について解析を行い、症例犬では健常犬よりも角層セラミド量が減少していることを示し、角層バリア機構の破綻が同症の病態に関与する可能性に初めて言及した。本年度は次世代シーケンサーを用いて、Staphylococcus schleiferiの新規表皮剥脱毒素をコードする遺伝子領域の部分塩基配列解析を行ったと共に、菌の培養上清から毒素活性を持つ蛋白のフラクションをカラムクロマトグラフィーにより精製して部分アミノ酸配列解析を行った。その結果、他のブドウ球菌属の表皮剥脱毒素遺伝子の上流配列と極めて相同性の高い塩基配列が、S. schleiferiのゲノム上にも存在することを確認した。一方で部分アミノ酸配列解析の結果ではS. haemolyticusが保有するendopeptidase Clp ATP-binding subunit Cに相同性の高い配列が同定された。今後は同株のゲノム全塩基配列解析により、新規表皮剥脱毒素遺伝子ならびに他の病原遺伝子の検索を試みる予定である。また本年度は、Staphylococcus pseudintermediusをBalb/cマウスおよびHR-1ヌードマウスの皮膚に塗布して、イヌ表在性膿皮症の病理組織学的変化を再現した膿皮症モデル皮膚を作成することにした。マウスの皮膚に有機溶媒を塗布して角層間脂質を除去し、乾燥後に同部位に濃縮したブドウ球菌液を塗布したところ、角層下におけるブドウ球菌の増殖ならびに好中球の浸潤が認められた。一方で有機溶媒を塗布していない皮膚では、上述の組織学的変化は認められなかった。今後はこの膿皮症モデル皮膚を用いて、ブドウ球菌の角層通過に関与する菌側の病原因子および宿主側の皮膚バリア機能障害の分子メカニズムについて、解析を進める予定である。本年度は次世代シーケンサーを用いて、Staphylococcus schleiferiの全塩基配列解析を実施し、新規剥脱毒素遺伝子の検索を試みた。菌の培養上清がイヌデスモグレイン1を消化することを確認した菌株を用いて解析を行ったものの、表皮剥脱毒素と相同性の高い遺伝子を同株のゲノム中に検出することはできなかった。また本年度は、テープストリップを行い角層の大部分を除去したBalb/Cマウスに、表皮剥脱毒素ETBを産生する黄色ブドウ球菌を塗布することで、塗布後6時間後に膿痂疹と同様の病理組織像を再現することに成功した。この病変部における菌の表皮内侵入と好中球浸潤との関連について、病理組織学的解析および二重免疫蛍光染色を用いた経時的解析を実施した。その結果、菌液の塗布後2時間より好中球が表皮内へと浸潤したのに対し、黄色ブドウ球菌は塗布後6時間まで表皮内へと侵入出来なかったことを証明した。さらに菌の表皮内侵入における好中球の関与について解析を行うため、Balb/Cマウスにシクロフォスファミドを腹腔内投与して無顆粒球症を誘導し、皮膚に菌液を塗布した後の病理組織学的変化を解析してシクロフォスファミド非投与マウスにおける所見と比較した。その結果、シクロフォスファミド投与マウスでは、非投与マウスと異なり菌液の塗布後6時間においても黄色ブドウ球菌による表皮内侵入が認められなかったことを証明した。以上の結果から、表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌は、単独で表皮内へと侵入するのではなく、好中球浸潤により形成された表皮内裂隙を通じて表皮内へと侵入し、膿痂疹の表現型を形成することを証明することができた。またブドウ球菌は角層を通過して角化細胞へと到達することで、表在性膿皮症の表現型を誘導しうることが示唆された。本年度は該当研究で作成した表在性膿皮症マウスモデルを用い、表皮剥脱毒素の病的役割について解明を試みた。表皮剥脱毒素ETB遺伝子を保有する黄色ブドウ球菌株、ならびに同毒素遺伝子を保有していない菌株をそれぞれBalb/Cマウスの耳介に貼付し、貼付部位における角化細胞間の裂隙の面積を病理組織学的に解析した。その結果ETB遺伝子保有株では、毒素遺伝子非保有株と比較して細胞間裂隙の大きさが優位に小さいことが証明された。このことから同毒素は、表皮内へと侵入した後に細胞間裂隙を開大させ、好中球による菌の貪食から菌株自体を守っている可能性が示唆された。また表皮剥脱毒素がコルネオデスモソームを離開させることにより、菌の角層通過を補助するかを解析するため、Balb/Cマウスまたは角層間脂質の欠損がみられるHos:HR-ADマウスにETBを貼付し、角層においてデスモグレイン1が消化されるかを検討した。しかしながらETBは水溶性であるため、角層間脂質に阻まれて角層深部へと侵入出来ず、結果としてデスモグレイン1の消化は確認できなかった。