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藻食性魚類腸管内微生物の有効活用を目指した海洋生物資源利用に関する基礎的研究

一般的に藻食性魚類と記載されている魚種を網羅的に調べ,そのほとんどが雑食性魚で,藻食性に特化した魚類は非常に少数であると考えられた.雑食性魚類の特徴である無胃魚および長い腸は必須の構造であるが,胃腺を認めない胃様の腸膨大部がほとんどの海水魚種に存在していた.この膨大部の働きとして魚体の浸透圧調整機構に関与(海水飲)していると推察された.ゲノムインフォマティクス解析によって,腸管内微生物の遺伝子配列を解読.その系統的多様性と機能遺伝子の同定を行った.イソギンポ科の藻食性魚類であるヨダレカケ,藻食性+雑食性魚のホシギンポ,雑食性で藻食性でないヘビギンポ科のヘビギンポの腸内容物からDNAを抽出,16S rDNA V4-V5領域を増幅して次世代シーケンス(Illumina Miseq)により網羅的に配列を大量決定し,3種の腸内微生物叢を比較した.ホシギンポは,複数の微生物叢,ヘビギンポは単一の微生物叢であった.一方,藻食性魚類のヨダレカケは,多数の微生物叢を構成しており,Proteobacteria門,Spirochaetes門,Bacteroidetes門,Deferribacteres門,Verrucomicrobia門が見出され,特徴的な菌種ではTenericutes門等,反芻胃や無酸素の深海中などから発見される系統を認めた.これらの結果より,雑食性魚と藻食性魚の腸内微生物叢は明らかに異なっていた.計画書記載の平成30年・令和元年度の目的は,藻食性魚類の網羅的探索および消化管の特性を前年度に引き続き行うとともに,培養および消化管内容物の精査が行えなかった魚種の検討を行う.最終的な目標であるアガロース,フコイダン,アルギン酸等,多糖類の分解速度の高い微生物探索のために,ヨダレカケやホシギンポを飼育し,フコイダンを高率に有するモズクを直接食させることで,腸内微生物の中からモズクを分解する微生物を効率的に抽出する予定であるが,おおよそ計画通りに進行している.現行でのメタゲノミクスの限界.ゲノムインフォマティクス解析による腸管内微生物の遺伝子配列を網羅的に解読し,系統的多様性と機能遺伝子の同定を行うと共に,次世代シーケンスを使った新たなメタゲノミクス研究手法の開発が必要であると考えている.社会貢献としては,総説1,国際シンポ1,国内学会発表2,現在論文執筆を行っている.藻食性魚類の解剖・組織学的な考察を行い,消化器系臓器の特性を国際雑誌・総説等に公表するとともに,フコイダンに特化したゲノムインフォマティクス解析・培養を行う予定である.ゲノムインフォマティクス解析は,得られた遺伝子配列から既知のアガロース,フコイダン,アルギン酸分解細菌の16S rDNA配列と比較し系統解析を行うことで,腸内の藻類分解性微生物相を明らかにする方向である.現在,腸内細菌の培養と並行し,第3世代シーケンサーによるバクテリアゲノムのシーケンスの準備を進めており,ゲノム配列から遺伝子コード領域推定に利用する.また,培養を経ずにメタゲノムから直接PCRで海藻分解酵素の存在を確認する系を模索しており,データベース上の既知の海藻分解酵素の配列と合わせて分子系統解析(最尤法・Bayes法)を行い,多糖分解活性をもつ海藻分解酵素を同定・アノテーションする予定である.培養実験では,モズク食腸内には,アガロース,フコイダン,アルギン酸などの海藻多糖類を分解する微生物の存在を期待しており,今後は,単離した微生物の生理学的試験(生育温度,糖資化性,酸素要求度,薬剤耐性など)および分解酵素の性質の検討,酵素遺伝子の単離,大腸菌内での酵素発現,酵素の生産あるいは改変へと研究を進める方向である.社会貢献としては,国際および国内学会において成果を発表,国際誌への投稿を予定している.またこの研究手法を広く公開する手段として,セミナーやマスコミ等への方向性を検討している.一般的に藻食性魚類と記載されている魚種を解剖学的に観察,組織学標本を作製して網羅的に検討,腸内微生物を共生させる海藻・珪藻食性魚類の消化器官の特徴を明らかにした.藻食性魚類は,雑食性の魚種のなかでも藻類食に特化した特異なタイプと考えられ(秋吉英雄,消化器官「魚類学の百科辞典」第3章p136-139,丸善出版,2018),実際には海藻・珪藻に食性が限定されている魚種は非常に少ない結果を得た.腸管内微生物叢のDNA解析および培養に適した魚種として,今回スズキ目イソギンポ科のヨダレカケ(南西諸島)カエルウオ,ヘビギンポ(山陰海域)の3種を候補魚種として供した.研究分担者の吉田は,この3種の腸内細菌叢のアンプリコン解析を行った.今回は既知のプロトコルに基づき,腸内容物のDNAから16SrRNAのV3-4領域を増幅して網羅的配列解読を行い,各サンプルから95000120000本の配列データを得た.解析モジュールQIIME2を用いて予備的解析を行い,1048本の代表的な細菌の配列と各サンプルにおける頻度を得ることができた.研究分担者の川向は,3種の中でも藻食性魚類ヨダレカケに注目し,腸内微生物を単離,その菌種の同定を試みた.

腸内容液を直接LB培地で培養して8株(LB1-LB8)を単離,Zobell培地で培養して9株(ZO1-ZO9)を得た.それぞれの株の16SrDNA領域を増幅し,DNA配列を決定した.その結果,LB1, LB2, LB4, LB6株はVibrio属の細菌に属すると推定され,LB3はShewanella属,LB8はPsudomonas属の細菌であると推定された.LB3は赤色調のコロニーを形成,LB8は黄緑色のコロニーを形成することから,それぞれShewanella属とPsudomonas属の特徴を示した.計画書記載の初年度目的は,藻食性魚類の網羅的探索および候補魚種を選定,腸内容物からDNA抽出後16SrDNA領域をターゲットとした次世代シーケンサーによる系統解析と組み合わせ,腸管内の微生物を網羅的に解析する.また,腸内微生物を培養し有用な海藻・珪藻分解微生物の単離を試み,菌種の同定および有用微生物の候補菌種の選定を連続的に行うことであるが,おおよそ計画通りに進行している.藻食性魚類の腸内微生物叢の探索種にギンポ科3種を選定した.ヨダレカケは食性が藻類に限定,他の2種は雑食性であることから,腸内容物からのDNA解析では,ヨダレカケで得られた結果に較べ,イソギンポおよびカエルウオの菌種は少なかった.また,培養に関して,カエルウオは採集時期が限られていることから今回は行うことが出来なかった.従って,更なる候補魚種の選定とカエルウオの腸内容物の培養を試みる必要があると考える.今回の研究手法の特徴として,ヨダレカケ腸内容物から直接的に菌種を単離して得られた株の16SrDNA領域を増幅してDNA配列を決定して菌種の同定を行う手法と,ヨダレカケ他2種の腸内微生物集団サンプルについては,16SrRNA領域を増幅したPCR産物からライブラリーを調製後,アンプリコンシーケンスを行い,16SrRNAデータベースに対して検索および系統解析を行う方法により,サンプル中に含まれる多様な細菌の特定や存在量,培養が困難であった細菌などのゲノム情報を得る手法の2方法を平行して行い比較したことである.本研究課題の目的である「腸内微生物叢から有用な海藻・珪藻分解微生物の探索手法の確立」であると考える.社会貢献としては,研究初年度であることで,図書1であるが,2018年度は国際シンポにエントリーおよび国内学会において発表予定,現在論文執筆を行っている.一般的に藻食性魚類と記載されている魚種を網羅的に調べ,そのほとんどが雑食性魚で,藻食性に特化した魚類は非常に少数であると考えられた.雑食性魚類の特徴である無胃魚および長い腸は必須の構造であるが,胃腺を認めない胃様の腸膨大部がほとんどの海水魚種に存在していた.この膨大部の働きとして魚体の浸透圧調整機構に関与(海水飲)していると推察された.ゲノムインフォマティクス解析によって,腸管内微生物の遺伝子配列を解読.その系統的多様性と機能遺伝子の同定を行った.イソギンポ科の藻食性魚類であるヨダレカケ,藻食性+雑食性魚のホシギンポ,雑食性で藻食性でないヘビギンポ科のヘビギンポの腸内容物からDNAを抽出,16S rDNA V4-V5領域を増幅して次世代シーケンス(Illumina Miseq)により網羅的に配列を大量決定し,3種の腸内微生物叢を比較した.ホシギンポは,複数の微生物叢,ヘビギンポは単一の微生物叢であった.一方,藻食性魚類のヨダレカケは,多数の微生物叢を構成しており,Proteobacteria門,Spirochaetes門,Bacteroidetes門,Deferribacteres門,Verrucomicrobia門が見出され,特徴的な菌種ではTenericutes門等,反芻胃や無酸素の深海中などから発見される系統を認めた.これらの結果より,雑食性魚と藻食性魚の腸内微生物叢は明らかに異なっていた.
水溶液からの合金電析における異常性出現の機構

水溶液からの合金電析において、単一金属の分析挙動から予測できない特異な電析挙動を示す異常型合金電析の機構について、異常性を示す合金系の成分金属の一方が鉄族金属であることから、この鉄族金属の有する固有の性質に基づいて説明を試みた。その結果、単独では電析しないMo、Wなどが鉄族金属と共析する誘導型に関し、次の様な機構を提案した。すなわち、誘導型共析の先行反応として浴中のモリブデン酸イオンの陰極表面への吸着が起こる。この結果、鉄族金属のイオン状態での属性である大きな析出過電圧が減少し、鉄族金属はより容易に電析できる状態になる。一方、モリブデン酸イオンは電気化学的に還元され4価の低級水和酸化物が中間生成物として陰極上に生成する。この4価Mo低級酸化物は、もうひとつの鉄族金属特有の性質である不対電子を利用して金属として電析した状態で原子状水素を吸着し、この原子状水素がMoを金属状態まで還元し、その結果Moー鉄族金属合金が生成することになる。一方、より卑な金属が貴な金属に比べ優先析出する変則型共析においては、貴な金属である鉄族金属は限られた放電サイトをさらに封鎖され、より析出過電圧が増加したことにより生じたものと考えることができる。すなわち、正常型共析においては、合金電析は放電可能な元素の貴度に従って、まず水素、鉄族金属さらにZnの順で優先析出するが、水素発生速度がある値を越えると陰極ー溶液界面のpHがZn酸化物生成pHまで上昇し、陰極表面にZn水酸化物が吸着する。このZn水酸化物はもともと異種金属の存在により影響を受け易い鉄族金属の放電を抑制し大きく分極する。一方、Znは水和イオンよりむしろ水酸化物からの放電が容易であり、見かけ上鉄族金属とZnの貴度の逆転が起こり、変則型共析となるものである。昭和62年度研究実施計画にしたがって,合金電析の際の各成分金属の部分分極曲線をそれぞれの単独析出の際の部分分極曲線と比較した.その結果,変則型共析であるZnー鉄族金属系においては,Znの部分分極曲線には鉄族金属の共析により大きな変化は認められなかったものの,鉄族金属の析出電位はZnイオンの存在によりZnの析出新位付近まで分極した.このとき得られる合金は浴組成に比較してZnを極めて多く含有しており,したがってZnの共析による鉄族金属の析出が大きく抑制されたことが変則型共析と引き起こしていることがわかった.さらに,誘導型合金電着(Moー鉄族金属系,Reー鉄族金属系)においては,同時放電により単独では析出しがたいMo,Re析出の部分分極曲線だけではなく鉄族金属のそれも大きく復極する現象が認められた.しかしながら,Mo,Reが最も効率良く電析できる合金の組成は各合金系で極めて限られており,これ以上MoあるいはReを多く含有するように電解条件を変更するとこれらの酸化物の混在が認められた.以上述べた合金電着においては,その共析機構に中間生成物としてZn水酸化物(変則型共析)あるいはMo,Reの酸化物(誘導型共折)が密接に関与していることが考えられる.そこで,次に示差熱天秤とX線回折を併用して,これら酸化物の構造を決定した.

その結果,変則型共析におけるZn水酸化物はその生成量が微量なためかその存在を確認することはできなかったが,Mo一鉄族金属系においては一部6価を含んだ4価Moの無定形の含水酸化物であり,これは昇温によるMoO_2,Na_2Mo_3O_<6.5>およびNa_2MoO_4へ結晶化すると考えられた.一方,Reー鉄族金属系において得られるRe酸化物は析出したままの状態ではやはり無定形であり,これを昇温により結晶化させた結果,比較的貴な電位で得られる酸化物は4価と6価Reの混在したものであったが,電位が卑になるにつれRe_2に近づいた.前年度の研究結果から、異常性を示す合金系においては、鉄族金属ーMo誘導型析の場合Mo低級酸化物、Znー鉄族金属変則型共析においてはZnの水酸化物が中間生成物として合金電析反応に関与していると考えられた。そこで、本年度においては、X線光電子分光法によりこれら中間生成物の検出を試みた。その結果、誘導型共析においては、鉄族金属析出の消極現象が観察される電解条件においては鉄族金属、Moのいずれも金属状態で存在するが、鉄族金属の分極現象が認められるようになると電着物中のMoの4価の酸化物が観察された。一方、Znー鉄族金属変則型共析においては2価Znのピークは認められるが、このピークが合金の電解途中で中間生成物として生成したものが、あるいは電解終了後空気中の酸素により酸化されたZnによるものか判断できなかった。さらに次に、電解中のその場測定であるカレント・インターラプタ法を用いてこれら中間生成物により陰極上に生成すると考えられる皮膜による抵抗過電圧の測定の試みた。その結果、誘導型共析においてはMoを含有しない鉄族金属単独電解に比べて高い抵抗過電圧が観察された。一方変則型共析においては抵抗過電圧の増加は小さく、Zn水酸化物生成によるものがどうか確認できなかった。そこで、Znー鉄族金属合金電解浴において、電解中の水素発生によるpHの上昇に伴う陰極近傍のpHの変化を各金属の水酸化物生成pHの関係を調べた。これより、浴中で最も水酸化物を生成しやすい金属はZnであり、陰極近傍のpHも浴本体のそれからZn水酸化物生成pHまで上昇し、Zn水酸化物生成のpH援衝作用によりZn水酸化物生成pH付近で停滞していることがわかった。以上の結果から、誘導型共析においては4価Moの低級酸化物が、変則型共析においてはZnの水酸化物が中間的に生成し、さらに鉄族金属の化学的特性を反映して還元が進むものと考えられた。
高操作性を有し、超高度抗血栓性ポリマーによる冠状動脈用合成人工血管の開発

小口径人工血管は、内径4mm以下での臨床成績は極めて不良であり、その開発が重要かつ緊急な課題であり努力が重ねられている。抗血栓材料2-hydroxyethyl methacrylate-styrene blockcopolymer(以下HEMA-stと略す。)は、その親水疎水型のミクロ相分離構造により極めて優れた抗血栓性を示すことが明らかにされている。しかしスチレン素材のため弾性に乏しく人工血管の縫合性、操作性に劣り、実際の臨床使用を考える上ではその操作性の向上が不可欠である。今回弾性性を改善した抗血栓材料2-hydroxyethyl methacrylate-octylstyrene block copolymer(以下HEMA-octと略す。)をコーティングした小口径人工血管を開発作成し、その吻合操作性と抗血栓性をHEMA-stと比較検討した。人工血管の構造は、3層構造で外層は内径2または3mmのダクロン人工血管で、その内腔面をポリウレタンで裏打ちし、さらにその表面をHEMA-octでコーティングしたものである。HEMA-stに比しHEMA-octは、格段に縫合性が向上し、また通常の手術手技においてもコーティング層のひび割れ等の損傷もほとんどなく操作性は非常に良好であった。冠動脈バイパス実験では、3頭中2頭の開存が得られた。閉塞例では中枢側の吻合部血栓形成が閉塞原因である。血栓形成の初期発生部は吻合により内膜損傷をきたした生体側内膜面であり、吻合操作に起因するところが大きい。しかしHEMA-octは、ex vivoの検討では、HEMA-stとほぼ同等の抗血栓性を有しており、吻合部の損傷の改善などにより長期的な開存が得られると考えられ,冠動脈代用血管としての実用化が期待される。今後人工血管吻合部における細胞浸潤の程度、細胞浸潤の種類などを検討することにより抗血栓材料を用いた小口径人工血管においての吻合部血栓の問題解決の糸口が見つかるのではないかと期待される。雑種成犬の両側頚動脈へHEMA-stとHEMA-octの両人工血管(人工血管長5cm)及び自家静脈を左右に移植した。結果は、HEMA-stでは7日目で8本中7本、28日目で2本中1本の開存が得られた。HEMA-octでは、7日目で5本中4本の開存が得られた。自家静脈では、7日目で6本中6本、28日目で6本中6本の開存が得られた。吻合の容易さ、操作性はともに良好であったが、よりHEMA-octが良好であった。人工血管吻合後超音波flow patternの観察においては、両人工血管とも対象の自家静脈とほぼ同等の流量、およびパターンであった。摘出人工血管表面の走査型電子顕微鏡(SEM)による観察では、両人工血管ともに血小板の付着はほとんど見られず、フィブリンネットは全く見られなかった。また表面には内皮細胞は全く存在せず、従来の偽内膜形成型の人工血管とは異なりこの材料自身が抗血栓性を発現し、血小板粘着を抑制していると考えられた。HEMA-st、HEMA-octともに良好な抗血栓性を示した。今後冠動脈代用血管としての適合性につきさらに長期の検討を行う予定である。抗血栓材料2-hydroxyethyl methacrylate-styrene blockcopolymer

(以下HEMA-stと略す。)は、その親水疎水型のミクロ相分離構造により極めて優れた抗血栓性を示すことが明らかにされているが、弾性に乏しく人工血管の縫合性に劣り、また内面コーティングされたHEMA-stの損傷などにより長期の開存がえられず、広く実用されるに至っていない。今回弾性性を改善した抗血栓材料2-hydroxyethyl methacrylate-octylstyrene block copolymer(以下HEMA-octと略す。)を開発し、それをコーティングした小口径人工血管を作成した。その吻合操作性と抗血栓性を検討し、冠動脈代用血管としての適合性を評価した。≪冠動脈バイパス実験≫結果1. 8-28日の観察期間で3頭の内、2頭で開存が得られた。移植後平均流量は3-100ml/minであった。また血管の縫合性は格段に向上しており縫合操作は容易であった。結果2.光顕像では、一部中枢側及び末梢側吻合部の動脈内幕に一部内幕損傷が有り同部より血栓が形成されていた。結果3:操作電顕像中枢側吻合部では大腿動脈内膜の一部より血栓形成を認める。人工血管中央部では、僅かに球状の血小板の付着を認めるのみで、優れた抗血栓性を保っていた。またコーティング層に、ひび割れなどの剥離像は認めない。【結論】HEMA-stに比しHEMA-octは、格段に縫合性が向上し、非常に良好であった。冠動脈バイパス実験では、3頭中2頭の開存が得られた。HEMA-octは、ex vivoの検討では、HEMA-stとほぼ同等の抗血栓性を有しており、長期的な開存が得られると考えられ、操作性の格段の向上により冠動脈代用血管としての実用化が期待される。
患者が自身の細胞とマトリックスを用いて体内で作成する自家移植用心臓代用弁の開発

自家結合組織のみからなる心臓代用弁を患者体内で形成する技術を開発した。シリコンやポリウレタンからなる鋳型を家兎の皮下に4週間留置すると鋳型に沿った組織形成が行われた。鋳型を取り除くことにより心臓弁形状の組織体が得られ、フローサーキットで良好な開閉動作が確認され、またその経時的流量カーブはウサギ大動脈弁に酷似していた。最新型は短期のパイロットスターディーとして、肺動脈弁位への移植に成功し、移植後の弁機能も良好であった。不足しているホモグラフト代用弁に取って代わる可能性のある生体弁として期待される。人工物を体内に埋入した際に、生体防衛機構の働きによって周囲に繊維芽細胞とそれが産出するコラーケン線維によって構成されるカプセル状組織体を心臓代用弁に応用するための基礎的技術開発を行った。A.基材・形状設計による組織形成促進への試み鋳型基材の材質の違いが与える組織形成への影響を調べた。表面の分子レベルでの加工修飾については既に大きな成果を得ているが、今回は更に応用を進めマクロ形状設計や血管新生誘導因子の導入により組織化を促進できるかを検証した。組織形成の遅い大動物移植実験を目標に更に推進していく予定である。B.拍動型循環回路を用いたin vitroにおけるBiovalveの機能評価作成中のBiovalveはφ5mmの小口径である。初期動物実験をウサギに設定しているためこの大きさで作成しているが、これまでこのような小口径バルブの機能評価を行うための拍動流回路は開発されていなかったため現在開発中であり、1回拍出量2mL、拍動数240回/分を実現するために最適化を行い調整中である。またフローサーキット内ではバイオバルブの形態変化を経時的に流量波形とシンクロして高速度ビデオカメラを用いて撮影することにより評価することが可能となった。まずウサギ大動脈弁との機能比較を定量的に行ったが、我々のバイオバルブの機能は遜色ない物であった。今後は長時間の耐久試験を行う予定である。C.形状設計による機能改善現在のConduitモデルをさらに進めて人工物で支持しているConduit部分をも自家組織のみで形成する技術開発に着手した。大動脈基部全体としての大動脈弁大動脈の機能を理想的に追い込める事が出来る可能性が出てきた。さらには流体力学的に有利なバルサルバ洞形状をも再現することを最終目標として考えている。人工物を体内に埋入した際に、生体防衛機構の働きによって周囲に繊維芽細胞とそれが産出するコラーゲン線維によって構成されるカプセル状組織体を心臓代用弁に応用するための基礎的技術開発を行った。A.新たな鋳型を設計することにより、弁機能を改良したバルブ作成を行った。小動物では良好なバルブが形成できたが組織形成の遅い大動物移植実験を目標に更に推進中である。B.拍動型循環回路を用いたin vitroにおけるBiovalveの機能評価これまで評価してきたBiovalveはφ5mmの小口径であったが、大動物への移植実験を目差して、径10mm15mm程度のバルブ形成を試み、機能評価を開始した。D.流体力学的に有利なバルサルバ洞形状再現についても着手した。大動物への心臓弁位への移植実験を最終目標として体外での機能評価実験を行っている。人工物を体内に埋入した際に、生体防衛機構の働きによって周囲に繊維芽細胞とそれが産出するコラーゲン線維によって構成されるカプセル状組織体を心臓代用弁に応用するための基礎的技術開発を行ない、人工心肺下に肺動脈弁位への同種移植実験を開始した。A. Conduit部分をも自家組織のみで形成するし、かつバルサルバ洞形態を再現する技術開発を行い、様々な鋳型を作成した。B.鋳型のプロトタイプが完成したので、皮下組織に植え込み、組織形成性を評価した。C.大動物への心臓弁位への移植実験を最終目標として体外での機能評価実験を行ないつつ、改良を進めている。D.人工心肺下の心臓弁移植モデルをビーグル犬を用いて構築した。E.まず、同種移植に着手した。同種より作成したバイオバルブを肺動脈弁位に移植した。術後、移植後急性期に心エコーでバイオバルブが良好に機能していることを確認した。F.今後更に長期の移植を進めて組織形成過程を評価。最終的な目標の自家移植に挑む予定である。
ハロゲン結合供与体ーチオウレア共触媒系による新奇グリコシル化反応の開発と応用

昨年度、私は新規酸触媒を用いた新規グリコシル化反応の開発に取り組んだ。その内容としてはまず、グリカールに対してアミド基を直接作用させることで、直接的にアミドの2ーデオキシグリコシル体を得ることであった。アミド基は元来グリコシル化に対して反応性が乏しいことが報告されており、その理由は求核性の低さが主にあげられていた。しかしながら今回私は検討の結果アミドが酸触媒を阻害する作用を持つことが、一般的に酸触媒を用いるグリコシル化反応を適応する際に困難となる主要因であることを突き止めこれを解決するため研究に取り組んだ。アミドによる酸触媒の阻害を溶媒和のようなとらえ方をすれば、溶媒和を受けにくい酸触媒の開発がこの研究にはと必要とされるであろうと考え、塩を酸触媒として用いることを考えた。検討の結果、私が新規に開発したハロゲン化イミダゾリウム塩がこの反応に最適であることを見出した。ハロゲンとそのイミダゾール骨格が非常に重要であることがコントロール実験からも示唆された。結果として、これまでに報告例がまったくなかった反応の開発に成功し重要な基質となるアスパラギンやジペプチド、トリペプチドを直接的にグリカールに求核不可させることに成功した。反応機構解析としてH-DOSY測定を行い、最適触媒がほかの酸触媒と比べてアミドと相互作用しにくいことが分かった。このことはこれまでまったく注目されてこなかったことであり酸性度よりも基質との相互作用の弱さがより重要になる可能性、場合があることを示している。グリカールへのアミド基の直接的求核付加反応はこれまでにまったく報告されていなかったため、ちがったアプローチで取り組む必要性があった。これは非常に難易度が高く、収率を上げるのに非常に多くの時間と実験を要した。しかしながら、発想を転換し、冷静に状況を分析し、戦略を練ることで実験をたくさんするだけでは気づけないことに気付けたように思う。実際、予想外な結果ではあったが、予想外の結果に出会えたこと自体が幸運であるし考察の大事さというものを改めて感じたように思う。この研究はペプチドを目的の基質として設定していたので、最適条件がこれらの基質にもスムーズに適応できたこと幸運というほかない。さらに、ペプチドは単純なアミド基と比べても溶媒和の能力が高くこのコンセプトがより必要とされるのではないかと考えているし、それがこの研究の価値をより一層大きなものにしているとも感じられる。考えるだけではたどり着けないのもそのとおりであって、実験の数というのもまた重要な要因である。うまくいかない時期でもじっと実験を続けられたことがこの結果につながったように思う。今後の研究方針としては、引き続き基質適応範囲の拡大に取り組みたいと考えている。アミドのグリコシル化体は天然にも非常によく見られる構造で、タンパク質がグリコシル化されている場合はアスパラギン残基で行われている場合が多い。そのためこの反応は重要性が高いと考えているのだが、グリコシル化されたアスパラギンは実際、2ーアセチルアミノ基を持つグルコサミンによってグリコシル化されている。このためグルコサミンを用いたアミドの直接的グリコシル化反応の開発は非常に重要度が高いが同時に難易度も相当に高い。その理由としては上に書いた溶媒和効果が非常に大きくなることも考えられるが、アミンの保護基の選択が難しい。アセチル基は隣接基関与の後、安定した5員環を形成して反応が終わる。そのためにほかの保護基を検討する必要がある。しかしこの場合にも問題はあり、C1-C2間でオレフィンを形成してしまうこと反応が終了することがわかっている。これを抑える方法を見つけなければ打つ手がなくなってしまうほど難しいがその重要性の分、非常にやりがいのある研究テーマだと考えている。

しかしながら、発想を転換し、冷静に状況を分析し、戦略を練ることで実験をたくさんするだけでは気づけないことに気付けたように思う。実際、予想外な結果ではあったが、予想外の結果に出会えたこと自体が幸運であるし考察の大事さというものを改めて感じたように思う。この研究はペプチドを目的の基質として設定していたので、最適条件がこれらの基質にもスムーズに適応できたこと幸運というほかない。さらに、ペプチドは単純なアミド基と比べても溶媒和の能力が高くこのコンセプトがより必要とされるのではないかと考えているし、それがこの研究の価値をより一層大きなものにしているとも感じられる。考えるだけではたどり着けないのもそのとおりであって、実験の数というのもまた重要な要因である。うまくいかない時期でもじっと実験を続けられたことがこの結果につながったように思う。今後の研究方針としては、引き続き基質適応範囲の拡大に取り組みたいと考えている。アミドのグリコシル化体は天然にも非常によく見られる構造で、タンパク質がグリコシル化されている場合はアスパラギン残基で行われている場合が多い。そのためこの反応は重要性が高いと考えているのだが、グリコシル化されたアスパラギンは実際、2ーアセチルアミノ基を持つグルコサミンによってグリコシル化されている。このためグルコサミンを用いたアミドの直接的グリコシル化反応の開発は非常に重要度が高いが同時に難易度も相当に高い。その理由としては上に書いた溶媒和効果が非常に大きくなることも考えられるが、アミンの保護基の選択が難しい。アセチル基は隣接基関与の後、安定した5員環を形成して反応が終わる。そのためにほかの保護基を検討する必要がある。しかしこの場合にも問題はあり、C1-C2間でオレフィンを形成してしまうこと反応が終了することがわかっている。これを抑える方法を見つけなければ打つ手がなくなってしまうほど難しいがその重要性の分、非常にやりがいのある研究テーマだと考えている。
機械材料における各種細線の超微小硬さ実験による弾性率測定

研究目的薄膜材料や微細部品の材料特性評価方法の一つとして、押込み荷重をμNオーダーにて制御が可能となり、この時の圧子の試料への進入深さをnmの分解能で測定するナノインデンテーション法が用いられるようになった。ここでは、その方法を用い炭素繊維材料を含む細線などへ適用し、超微小押込み硬さ実験を行い、弾性率(ヤング率)のデータ測定を行なう。機械材料における超微小硬さ実験を実施することにより、最近注目を受けている炭素繊維線の弾性率をも定量的に明らかにすることを目的とした。研究方法ナノインデンテーション試験法は、圧子を試料表面に対し垂直に侵入させた際の押込み荷重および押込み変位を逐一測定し、その時に得られる荷重と変位の関係(P-h曲線)から硬さを算出する手法を利用し、押込み過程の情報も得られるため、硬さのみでなく弾性率も算出することとした。サンプルの固定、下地の影響排除、周りからの物理的振動の排除などに注意して、試験治具および試料台上の試験片が垂直軸に負荷がかかるよう固定することで改善し実験を実施して、併せて圧根の画像がどのようになっているかを確かめつつ観察した。試験モードは、主に使用される負荷-除荷試験で実施した。研究成果本実験において測定可能な材料特性は、マルテンス硬さ、押込み硬さ、押し込みクリープなどであった。鉄系材料にて基準値が算出することを確かめ、その後、主だった実験成果のうち荷重約1mN負荷にて実施した炭素繊維線の複合弾性率は、試験片20本平均にて52GPaであった。試験片は、炭素繊維線および樹脂を含むカーボンロッド丸棒を使用したため若干低めではあるが、オフセットの取り方により、P-h曲線概念図の最初の形態が違う場合が生じるため初期調整を考慮することが必要である。
2相界面を利用するメゾスコピック分子会合体の構造制御と光機能

固液2相界面、特にマイカ/水溶液界面に於けるシアニン色素pseudoisocyanine(PIC)の自己組織化J会合体形成過程とそのモルフォロジーに注目して研究を行った。マイカ/水溶液界面では、J会合体は高さが数ナノメートルで、広さがサブマイクロメートルに及ぶメゾスコピックサイズの超分子的ドメイン構造を形成することを世界に先駆けて明らかにした。更に分光測定により、ドメインを形成するメゾスコピック単一J会合体はコヒーレントな会合体の集合構造であるという事が分かった。J会合体は高発光性である点に着目し、そのモルフォロジーコントロールとその光機能性との相関を微視的に高感度に観測するために、落射蛍光顕微鏡を導入し、高感度CCDカメラを通してJ会合体をin situに観測・分光測定するシステムを構築した。このシステムを用いた観察により、鮮明に固/液界面に形成するJ会合体の超分子的メゾスコピックドメイン構造を捉えることができる様になった。これらの知見に基づき、PICとその構造類似分子との2種類の色素混合系を用いて、分子間及び各分子と固相表面との相互作用をコントロールし、その構造・形態や光機能性の変化を調べた。その結果、バルク分光特性としては2つの色素の電子状態が均一化した混合型J会合体の形成が確認されたが、メゾスコピック領域に於けるモルフォロジー特性は不均一である事が初めて明らかとなった。更に、2種類の色素の組成比を変化させると、混合型J会合体は次第に離散的に分布するようになるが、分子の界面吸着密度には変化力海かった。これは、混合型J会合体力堺面領域で形成する際に、マイクローメゾスコピックな相分離が生じていることを証明するものである。この様に、分子の界をコントロールする事により、様々な光機能やモルフォロジーの制御が期待できるため、界面を利用した新たな物質機能性の発現を目指す界面科学の発展にとって意義ある結果を得ることができた。固/液などの2相界面領域はバルクとは異なった特異的な反応場を提供する事が期待されるため、その界面を利用して新たな物質機能性の発現を目指しその機構を解明することは界面科学の発展にとって極めて重要である。これまで、固/液2相界面が関与した分子会合体(J会合体)の自己組織化過程とそのモルフォロジーに注目し、固相表面に存在するアニオンサイトとカチオン性分子との静電相互作用及び分子どうしの双極子相互作用により、固/液界面に形成するシアニン分子J会合体は高さが数ナノメートルで、広さがサブマイクロメートルに及ぶメゾスコピックサイズの超分子的ドメイン構造を形成する事を明らかにした。更に、分光測定を通した光機能性の評価により、ドメインを形成するメゾスコピック単一J会合体はコヒーレントな会合体の集合構造であるという事を明らかにした。更に、J会合体は高収量の発光性を示す点に注目し、積極的な界面制御によるメゾスコピックJ会合体のモルフォロジー変化と光機能を高感度に観測するために落射蛍光顕微鏡を導入し、高感度のCCDカメラを通してそのモルフォロジーや分光特性を観測・記録するシステムを構築した。このシステムを用いた観察により、マイカ/水溶液界面に形成するJ会合体の超分子メゾスコピックドメイン構造を鮮明に捉えることができ、更に偏光励起による蛍光画像観察から、単一の会合体ドメイン内では分子は一方向に配列していることが新たに明らかとなった。引き続きこれらの知見に基づき、2種類のシアニン分子を導入して分子間、及び各分子と固相表面との相互作用をコントロールして界面に形成するメゾスコピック分子会合体のモルフォロジーと光機能の制御を検討している。

その結果、超分子構造を形成しているドメインサイズに明らかな変化が見ちれ、従って、そのモルフォロジーの制御が可能であることを示唆する結果が得られた。前年度、メゾスコピックJ会合体を高感度に観測し、合わせて微小領域の光機能を選択的に測定できる顕微蛍光観察・分光測定システムを構築したが、今年度は、このシステムや原子間力顕微鏡などを駆使して様々なメゾスコピック超分子会合系の観察を行った。これまでは主に、固/液界面、特に構造が規制されたマイカ/水溶液界面に於ける1種類の色素のメゾスコピックJ会合体の形成過程を調べてきたが、これらの知見を元に、構造が類似する2種類のシアニン色素を導入して分子間あるいは分子と界面との相互作用をコントロールし、その構造・形態や光機能性がどの様に変化するかを詳細に調べた。その結果、バルク分光特性としては2つの色素の電子状態が均一化した混合型J会合体の形成が確認されたが、モルフォロジー特性は均一ではない事が初めて明らかとなった。偏光励起顕微蛍光観察によると、混合型J会合体は、1種の色素系の時と比較して一層大きなマイクロメートル領域のドメイン構造を形成すると共に、そのドメイン内の分子配向はほぼ一方向に揃っていた。更に、2種類の色素の組成比を変化させると、混合型J会合体は次第に離散的に分布するようになるが、分子の界面吸着密度には変化がない事が分かった。これは、混合型J会合体が界面領域で形成する際に、マイクロ-メゾスコピックな相分離が生じていることを証明するものである。メゾスコピックな相分離過程は、単一の混合型J会合体のレーザー励起顕微分光測定によっても明らかとなった。この相分離過程は、2つの極小を持つ混合自由エネルギーモデルによって解析可能であること、また、核生成・成長メカニズムで説明できることが示された。この様に、分子の界面吸着特性をコントロールする事により、様々な光機能やモルフォロジーの制御が期待できるため、界面を利用した新たな物質機能性の発現を目指す界面科学の発展にとって意義ある結果を得ることができた。
癌転移に関する基礎的研究

本研究の目的は癌細胞の転移能を規定している細胞と宿主との相互作用のうち,主として癌細胞側の諸要因を解析することにより,転移の予防,治療法向上のために役立つ基礎的資料を提供することにある.本年度得られた成果は以下の如くに要約される.(1)クローン化した細胞接着分子カドヘリンのcDNAをカドヘリン活性のないL細胞に導入したところ,カドヘリンの発現がみられ,かつ,細胞間接着性が上昇した.更にマウス卵巣腫瘍の高転移株では低転移株に比べてカドヘリン発現量が低下していることがわかった.また低転移株ではその発現が均一であるのに比べて高転移株では不定で,この形質と転移能との関連性が示唆された.(2)肺転移能がやや上昇したMCマウス肉腫細胞に種々の癌遺伝子(Hーras,Kーras,myc,Nーrasの一部)を導入しても転移能の増強効果は認められなかった.Nーrasの部分導入により得られた複数のクローンを移植したマウスでは継代三代目で既に単一クローン化していること,また移植初代でも同一個体の異なる転移巣は同一クローンから形成されること,異なる個体では転移形成クローンも異なることが明らかになった.(3)高転移癌が示す血小板凝集促進活性はトリプシン感受性膜蛋白の血小板への直接作用によることを明らかにした.この膜蛋白に対する単クローン抗体による解析から,認識する抗原は分子量44kDaの膜蛋白であり,これが血小板凝集活性の本体であると考えられた.(4)MethA肉腫由来の高及び低転移クローンの増殖因子に対する反応制を比較すると, EGF,PDGFにより共に増殖促進, TGFーβにより抑制されるが,三者共存下では高転移クローンによる強い増殖促進がみられた.(5)腫瘍特異的マクロファージの腫瘍特異的活性化はIFNーγによるプライミングの次いデLPSによるトリガリングが必要であることを明らかにした.活性化マクロファージの腫瘍破壊機構には活性酸素, TNFあるいはIL+1等は直接的には関与しないことが証明された.本研究の目的は癌細胞の転移能を規定している細胞と宿主との相互作用のうち,主として癌細胞側の諸要因を解析することにより,転移の予防,治療法向上のために役立つ基礎的資料を提供することにある.本年度得られた成果は以下の如くに要約される.(1)クローン化した細胞接着分子カドヘリンのcDNAをカドヘリン活性のないL細胞に導入したところ,カドヘリンの発現がみられ,かつ,細胞間接着性が上昇した.更にマウス卵巣腫瘍の高転移株では低転移株に比べてカドヘリン発現量が低下していることがわかった.また低転移株ではその発現が均一であるのに比べて高転移株では不定で,この形質と転移能との関連性が示唆された.(2)肺転移能がやや上昇したMCマウス肉腫細胞に種々の癌遺伝子(Hーras,Kーras,myc,Nーrasの一部)を導入しても転移能の増強効果は認められなかった.Nーrasの部分導入により得られた複数のクローンを移植したマウスでは継代三代目で既に単一クローン化していること,また移植初代でも同一個体の異なる転移巣は同一クローンから形成されること,異なる個体では転移形成クローンも異なることが明らかになった.(3)高転移癌が示す血小板凝集促進活性はトリプシン感受性膜蛋白の血小板への直接作用によることを明らかにした.この膜蛋白に対する単クローン抗体による解析から,認識する抗原は分子量44kDaの膜蛋白であり,これが血小板凝集活性の本体であると考えられた.(4)MethA肉腫由来の高及び低転移クローンの増殖因子に対する反応制を比較すると, EGF,PDGFにより共に増殖促進, TGFーβにより抑制されるが,三者共存下では高転移クローンによる強い増殖促進がみられた.(5)腫瘍特異的マクロファージの腫瘍特異的活性化はIFNーγによるプライミングの次いデLPSによるトリガリングが必要であることを明らかにした.活性化マクロファージの腫瘍破壊機構には活性酸素, TNFあるいはIL+1等は直接的には関与しないことが証明された.
１９F-NMR法と常磁性効果を用いた細胞内環境下のタンパク質の基質認識機構の解明

本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。本研究の平成30年度の成果は以下の通りである。本研究計画で解析するタンパク質のうち、多数の基質を選択的に認識する酸化ストレス応答タンパク質Keap1について、基質である転写因子Nrf2の相互作用をNMRで高次構造レベルで詳細な解析を行うとともに、別のタンパク質との相互作用に伴う構造変化についても詳細な解析を実施した。さらに別の種類の基質である各種低分子(親電子性物質)とKeap1の相互作用について、特にシステイン残基への結合に伴うKeap1やNrf2の構造変化や、Nrf2とKeap1の相互作用に親電子性物質が与える影響をNMRを用いて高次構造レベルで解析を実施した。一方、ドメイン間の構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により解析するために、3つのドメインから構成されるアミノ酸代謝酵素phenylalanine hydroxylase (PAH)や、異なるドメイン構成を持つ別の代謝酵素ASPGについても大量発現・精製を行い解析を進めている。今後は遠距離の情報が得られる常磁性効果を利用してドメイン間の距離情報を得る方法を上記3種類の解析対象に適応し、ドメイン間の構造変化を解析するとともに、細胞内における構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により詳細に解析する。平成30年度には、本研究計画で解析する各タンパク質のNMR測定を実施し、Keap1-Nrf2経路では実際に基質認識に伴う高次構造変化について詳細な解析を実施した。また19F標識を含む各種安定同位体標識の条件を検討し、本研究の目標であるin vivo環境下での動的構造変化の解析への応用を進めている。細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構の解明に向けて、平成30年度に基質認識に伴う高次構造変化等の解析を実施した各タンパク質について、各種19F標識技術や19F-NMR計測技術を中心に適宜最新の計測技術を組み合わせることで細胞内での解析を進める。特に基質結合に伴い大規模な構造変化が起こることが想定されているKeap1-Nrf2複合体を引き続き重点的に解析するとともに、新たに常磁性効果を用いた遠位距離情報の解析を組み合わせることで、ドメイン間の構造変化を詳細に解析する。さらに細胞内において同様にNMR解析を進めin vivo環境下での動的構造変化の解明をめざす。本研究の平成29年度の成果は以下の通りである。本研究計画で解析するタンパク質について19F標識を行うためにそれぞれ大量発現系の構築と発現の最適化を行うとともに、各タンパク質についてNMRを用いた基質認識機構の解析を開始した。まず既に発現系が確立しているVRK1に関してはトリフルオロメチオニン標識体の解析を進めた。一方多数の基質を選択的に認識する酸化ストレス応答タンパク質Keap1については標識方法の最適化を進めるとともに、2量体で働くKeap1と基質である転写因子Nrf2の相互作用をNMRで高次構造レベルで解析する系を確立した。現在もう一方の基質である各種低分子(親電子性物質)とKeap1の相互作用について、特にシステイン残基への結合に伴うKeap1の構造変化が、Nrf2との相互作用に与える影響をNMRを用いて高次構造レベルで解析中である。またドメイン間の構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により解析する系を構築するため新たに3つのドメインから構成されるアミノ酸代謝酵素phenylalanine hydroxylase (PAH)の大量発現系を確立し、標識条件の検討を行った。また比較対照として異なるドメイン構成を持つ別の代謝酵素ASPGの大量発現系も同様に構築を行い安定同位体標識を進めている。今後はこれらのタンパク質を細胞に導入し、細胞内における構造変化を高次構造レベルで解析するための基盤を確立する。平成29年度には、本研究計画で解析する各タンパク質の発現系の構築に成功し、19F標識を含む各種安定同位体標識の条件を検討した。また基質認識に伴う高次構造変化を詳細に解析する系の開発を進め、本研究の目標であるin vivo環境下での動的構造変化を解明するための基盤を確立した。

本研究計画で解析するタンパク質のうち、多数の基質を選択的に認識する酸化ストレス応答タンパク質Keap1について、基質である転写因子Nrf2の相互作用をNMRで高次構造レベルで詳細な解析を行うとともに、別のタンパク質との相互作用に伴う構造変化についても詳細な解析を実施した。さらに別の種類の基質である各種低分子(親電子性物質)とKeap1の相互作用について、特にシステイン残基への結合に伴うKeap1やNrf2の構造変化や、Nrf2とKeap1の相互作用に親電子性物質が与える影響をNMRを用いて高次構造レベルで解析を実施した。一方、ドメイン間の構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により解析するために、3つのドメインから構成されるアミノ酸代謝酵素phenylalanine hydroxylase (PAH)や、異なるドメイン構成を持つ別の代謝酵素ASPGについても大量発現・精製を行い解析を進めている。今後は遠距離の情報が得られる常磁性効果を利用してドメイン間の距離情報を得る方法を上記3種類の解析対象に適応し、ドメイン間の構造変化を解析するとともに、細胞内における構造変化を19F-NMR法と常磁性効果により詳細に解析する。本研究では、申請者がこれまで開発してきた各種19F標識技術、In-Cell NMR法、および常磁性効果による構造解析法を組み合わせて、細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構を解析し、本来タンパク質が機能しているin vivo環境下での動的構造変化を解明することを目的とする。平成30年度には、本研究計画で解析する各タンパク質のNMR測定を実施し、Keap1-Nrf2経路では実際に基質認識に伴う高次構造変化について詳細な解析を実施した。また19F標識を含む各種安定同位体標識の条件を検討し、本研究の目標であるin vivo環境下での動的構造変化の解析への応用を進めている。細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構の解明に向けて、平成29年度に発現系を構築した各タンパク質について、基質認識に伴うタンパク質の高次構造変化を各種19F標識技術や19F-NMR計測技術を中心に適宜最新の計測技術を組み合わせて解析を進める。平成30年度は特に常磁性効果を用いた遠位距離情報の解析を重点的に実施し、ドメイン間の構造変化を重点的に解析する。特に基質結合に伴い大規模な構造変化が起こることが想定されているKeap1やPAHを重点的に解析し、19F-NMRと常磁性効果の組み合わせによる解析技術の確立を目指すとともに、細胞内で同様に解析を進めin vivo環境下での動的構造変化の解明をめざす。細胞内におけるタンパク質の様々な分子認識機構の解明に向けて、平成30年度に基質認識に伴う高次構造変化等の解析を実施した各タンパク質について、各種19F標識技術や19F-NMR計測技術を中心に適宜最新の計測技術を組み合わせることで細胞内での解析を進める。特に基質結合に伴い大規模な構造変化が起こることが想定されているKeap1-Nrf2複合体を引き続き重点的に解析するとともに、新たに常磁性効果を用いた遠位距離情報の解析を組み合わせることで、ドメイン間の構造変化を詳細に解析する。
網羅的タンパク結合スクリーニングを駆使したステロイド性骨壊死予防法の開発

難病である特発性大腿骨頭壊死症の病態を明らかにすることを目的に、ステロイド受容体であるグルココルチコイド受容体(GR)の作用メカニズムを明らかにするため、愛媛大学独自技術である無細胞合成タンパク質による網羅的スクリーニング方法(2万種タンパク質)を用いて、GRと結合するタンパク質の同定を試みた。その結果、300を超えるタンパク質との結合が認められ、GRとの結合が既報であるタンパク質以外にも、転写因子やオートファジー関連タンパク質が含まれていた。このことから、ステロイド誘発性大腿骨頭壊死症の病態には、グルココルチコイドによるタンパク質分解のnon-genomic actionの関与が推察された。無細胞合成タンパク質による網羅的スクリーニング:当研究センターにて独自に開発されたコムギ胚を用いた無細胞タンパク質合成技術(Takai et al. Nature Protocol 2010)を応用して合成されたおよそ2万個のタンパク質とグルココルチコイド受容体(GR)とのタンパクータンパク結合スクリーニングを行った。具体的には、当研究センター保有の遺伝子ライブラリーを用いて、無細胞タンパク合成(ビオチン標識)を網羅的に行う。合成されたタンパク質の機能評価を、GR自身がホモダイマーを形成する事からGR自身をポジティブコントロールとして利用する。FLAG-TagをN末端に付加したGRを同様の技術で合成し、タンパク同士の結合により発光するアルファスクリーンシステムとマイクロプレートリーダーを用いて、網羅的なタンパク結合スクリーニングを行った。その結果、300を越える蛋白質との明らかな結合シグナルを認めた。これらの蛋白質には、GRとの結合が既報である蛋白質とともに、1)これまでには報告の無い転写因子群、2)これまでに報告の無い蛋白質分解系蛋白質が含まれていた。この結果から、グルココルチコイドによる新たな細胞内機能や細胞種特異的機能の解析が期待できる。本研究計画で最も遂行困難が予測されたスクリーニングが順調に進展した。昨年度実施した無細胞合成タンパク質による網羅的スクリーニング:当研究センターにて独自に開発されたコムギ胚を用いた無細胞タンパク質合成技術(Takai et al. Nature Protocol 2010)を応用して合成されたおよそ2万個のタンパク質とグルココルチコイド受容体(GR)とのタンパクータンパク結合スクリーニングの結果から、これまでに報告されていないオートファジーに関連した分子との結合が、もっと強いシグナルを認めた。当該分子との直接結合も確認できたことから、グルココルチコイドによるタンパク質分解のnon-genomic actionの一部が存在することが推察された。また、ステロイド誘発性大腿骨壊死マウスモデルを確立し、長期のグルココルチコイド経口投与により、大腿骨遠位骨幹端における骨細胞壊死が有意に増加することを確認することができた。また、本実験は臨床的に注目されているビタミンEを、欠乏させた餌を用いていることから、抗酸化作用とのオートファジーの関連を推察する結果となった。Big Dataを用いた細胞種特異性解析:本研究の目的は、第一に下記の如く、細胞種特異的なGR結合タンパク質の同定により、副作用を惹起する転写共役因子(副作用因子)を見出す事である。特発性大腿骨頭壊死症においてステロイドの主作用を担う細胞(T細胞)と副作用を担うと考えられる細胞(肝細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞)における発現の程度を、下記に示す複数のデータベースに登録されているから可能な限りのTranscriptome Big Dataを収集し、バイオインフォマティクスを用いて解析し、どのタンパク質がどの細胞種において特異的に発現しているかを統合的に解析する。解析には、Broad Instituteから無償提供されている解析ソフトであるGSEA(Gene Set Enrichment Analysis)を用いる。上記にて十分な分類が出来ない場合には、MeVなどの他の解析ソフトを用いる。整形外科学