hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管誘導法による垂直方向への骨再生の効果

本研究では,骨再生が困難な垂直方向への骨再生を効果的に行うために重要な血管新生を誘導・制御することを着目し,以下の検討を行った。まず,FGF-2をラット内側性骨欠損に作用し,新生血管を誘導しマイクロCTで観察した。その結果,FGF-2は早期に血管新生を促進させ骨再生を誘導した。つぎに,ラットGBAモデルを用いて垂直方向の骨再生時の血管新生を観察したところ,血管新生は,脳動脈から分岐し骨髄穿通部に達し,そこから骨外向に分布領域が拡大していった。さらに,PDGFの垂直方向の骨再生について検討したところ,PDGFはラットに対する垂直方向の骨再生に効果的であることが示された。本研究は骨再生のメカニズムを解明するために重要であると考えられている血管新生の誘導および制御に焦点を解析するために,内側性および垂直性骨欠損モデルを用いて,骨再生および血管新生の動態をマイクロCTおよび組織学的に観察した。内側性骨欠損モデルに対する結果をH22-24年度科研費において報告した。今回はそれらの実験モデルを使用し,血管誘導作用があるb-FGFについて検討した。マイクロCT観察の結果,FGF-2は非臨界骨欠損において,早期に新生血管および骨再生を促進させることが示された。臨界骨欠損では,早期に血管新生の促進が認められたが骨再生は増加する傾向にあった。よって,FGF-2の局所投与はラット頭頂骨骨欠損において毛細血管の形成を促進し,骨芽細胞および破骨細胞を刺激することで骨再生を促進させる可能性が示唆された。さらに,現在,垂直性骨欠損モデルを用いて,垂直方向への骨増生に対する血管新生について骨髄穿通の形態を変えた,2群について解析した。その結果,血管新生は両群とも経時的に骨外側方向に新生血管および骨様組織の増加を認めた。術後2週で7M群より1S群において血管新生様組織の形成が多く認められた。また,両群の新生血管様組織の高さは術後4週ではプラスチックキャップの約1/3までであった。術後4週での新生血管様組織の体積は両群ともに有意差は認められなかった。骨髄穿通孔をより大きくすることによって,穿通孔からより多くの未分化間葉系細胞や成長因子などがプラスチックキャップ内に流入し、早期により多くの新生血管様組織が形成されたと考えられた。また,この結果の一部は,H25歯科保存学会において発表した。本研究の目的は骨再生が困難と考えられている,垂直方向への骨再生を効果的に行うために,そのしくみを解明し,さらに,細胞や超音波刺激などを用いてその効果的な再生法を検討することである。これまで,ラットの頭頂骨に円柱形のプラスチックキャップを設置した垂直性骨欠損モデルを用いてマイクロCTおよび組織学的観察によって,垂直方向への骨再生時に起こる血管新生の動態を解明することを試みてきた。ここでは,はじめに血管新生を誘導させるために最も重要と考えられる自己幹細胞を誘導するために,以前,われわれの研究グループで用いた骨髄穿通孔の形態および大きさを変化(大きな孔を1つ形成する1S群,7つの小さな孔を形成する7M群)させることによって,2週後と4週後の血管新生の動態をマイクロCTおよび組織学的に観察した。さらに,詳細に血管新生の動態を肉眼的に観察するために,全組織標本による観察も遂行中である。これまで得られた結果から,血管新生は骨髄穿通部から起こり,垂直方向に広がっていく様相が観察された。とくに,1S群の方が7M群より血管新生は早期(2週)に起こることがわかった。さらに,マイクロCTにより新生血管量を定量したところ,1S群の方が7M群よりも血管新生量も大きくなることがわかった。しかし,4週目になると両群の新生血管量に有意差が認められなくなった。これらの結果は,組織学的観察によっても確認した。しかし,再生骨の石灰化が進行するとマイクロCTによる新生血管の観察は再生骨との区別が難しく,困難であることがわかった。本研究の目的は骨再生が困難と考えられている垂直方向への骨再生を効果的に行うために,その仕組みを解明することである。そこで,垂直方向の骨再生の仕組みを解明するために,研究者のグループでこれまで用いてきたラットGBAモデルにおける骨髄穿通孔の形態および大きさを変化させ,自己骨髄細胞の実験母地への流入を変化させ,その際の新生血管の動態を血管を造影法により実験動物用マイクロCTを用いて観察した。造影マイクロCTによって観察された血管は,両群ともに脳動脈から分岐し,骨髄穿通部に達し,骨外側方向に分布領域が拡大していた。また1S群は7M群と比較してプラスチックキャップ内で血管がより広範囲に分布していた。術後14日の両群で穿通部から増生した血管を含んだ結合組織が観察されたが,増生骨はほとんど認められなかった。術後28日になると両群ともに増生骨が認められたが,1S群の方が7M群に比較して骨増生が顕著であった。一方,マイクロCTで定量したキャップ内の血管占有率は術後14日において1S群で7M群と比較して有意に増加した。しかし,術後28日では有意差が認められなかった。組織標本による評価では,増生骨面積割合は術後28日において1S群で有意に増加した。一方,結合組織中の血管断面出現数は術後14日で1S群で有意に増加していたが,術後28日では有意差は認められなかった。

ラットGBAモデルにおける両群の骨外側方向の骨増生時の血管新生は,脳動脈から分岐し骨髄穿通部に達し,そこから骨外側方向に分布領域が拡大していた。骨髄穿通率が同じ場合、1S群は7M群に比較して術後14日で血管新生量が有意に増加し,術後28日で増生骨量が有意に増加した。本研究では,骨再生が困難な垂直方向への骨再生を効果的に行うために重要な血管新生を誘導・制御することを着目し,以下の検討を行った。まず,FGF-2をラット内側性骨欠損に作用し,新生血管を誘導しマイクロCTで観察した。その結果,FGF-2は早期に血管新生を促進させ骨再生を誘導した。つぎに,ラットGBAモデルを用いて垂直方向の骨再生時の血管新生を観察したところ,血管新生は,脳動脈から分岐し骨髄穿通部に達し,そこから骨外向に分布領域が拡大していった。さらに,PDGFの垂直方向の骨再生について検討したところ,PDGFはラットに対する垂直方向の骨再生に効果的であることが示された。ラット垂直性骨欠損モデルを用いてマイクロCTによる微細な新生血管の観察が当初の予想したものよりも困難であったため実験の進行がやや遅れていた。これに対しては,造影剤の注入速度や注入方法を変えることによって対処した。それらの工夫によって現在は垂直性骨欠損に対するマイクロCTによる新生血管の観察が可能となりデータを採取している。さらに,血管にプラスチック樹脂を注入する全組織標本の作製を行い,新生血管の観察の精度をさらに向上させている。再生治療ラット垂直性骨欠損モデルの血管新生の動態を解明するために,マイクロCTによる新生血管の観察を行ったきたが計画当初予測したものより手技が困難であったため,骨再生時に生じる新生血管にはかなり微細なものが発現するために,その観察に限界がみられた。そこで,プラスチック樹脂を注入した全組織標本による新生血管の観察標本の作製に着手している。さらに,当初の実験計画に従い,血管誘導因子や細胞などを加えることによって,新生血管の誘導をさらに促進刺させることによって血管誘導によって垂直方向への骨再生の調整法を検討していく予定である。内側性および垂直性骨欠損モデルにおける血管新生の動態観察をマイクロCTを用いた画像によって観察した。その結果,成長因子であるFGF-2の局所投与は内側性骨欠損において毛細血管の形成を促進した。また,垂直性骨欠損モデルにおいては骨髄穿通孔をより大きくすることによって、早期により多くの新生血管様組織が形成されることが観察された。しかし,新生されてくる血管が予測していたものよりも微細であり,マイクロCTの検出限界を超えていることから,毛細血管網の観察のためにさらなる工夫が必要であると考えている。このため,前年度の使用する予定であった経費に残金が生じた。現在,マイクロCTを用いて,さらに微細な毛細血管網を観察するために画像解析ソフトの改変を進めている。また,微細な新生血管網を観察するための樹脂系造影剤を用いた新しいモデルの作製も進めている。それらのモデル確立後,当初の計画に従い各種増殖因子および間葉系幹細胞などを添加し,血管の新生および骨再生を促進させることによって,組織学的および遺伝学的な解析を進めていく予定である。
環境動態標識としての鉛同位体比の高感度・迅速測定法の開発

多岐にわたる発生源をもつ環境鉛の動態が注目されているが、鉛の動態解析において鉛同位体組成が有用な標識となっている。そこで本研究では正確で迅速な鉛同位体比測定法として、環境試料を固体状態のままで同位体比測定を行うために、SIMS及びLA/ICP-MSによる鉛同位体比測定法の開発を目的とした。当該期間では主に大気粉塵中の直接鉛同位体比測定法の開発を検討した。まずペレット状試料の測定について検討した。環境標準試料であるNIST1648都市浮遊粉塵あるいはNIESNo.2地底質、No.8自動車排出粒子などは粉末状なので加圧成形してペレット試料を調製した。またSIMS及びLA/ICP-MS測定により鉛同位体比を求める場合、測定値の規格化が必要である。規格化にはNIST981Leadより調製した硫化鉛(STD硫化鉛)を用いた。ペレット状の環境標準試料について、SIMS及びLA/ICP-MSにより鉛同位体比測定を行ったところ、精度の高い測定が可能であり既知の値ともよく一致した。大気粉塵をエアサンプラーで採集すると大気粉塵はフィルター上に吸着するのでフィルター状のままでの測定について検討した。規格用標準物質も実試料の形状と類似していることが望ましいので、NIST981より調製した硝酸鉛をしみ込ませたフィルターと硫化鉛を付着させたフィルターの2種類の標準物質を作成した。一方、NIST1648都市浮遊粉塵をフィルターに付着させモデル試料とした。2種類の標準物質を用いてそれぞれ鉛同位体比測定を行ったところ、精度の高い測定が可能であり既知の値ともよく一致した。本法による標準物質の調製及び測定が妥当であることが分かったので、実際にサンプリングした試料について鉛同位体比を求めたところ、バラツキが大きかったが、フィルター状のままでの鉛同位体比測定の可能性を見出せた。環境中での鉛の動態解析を解析するため、同位体組成を標識とした動態解析が行われているが、前処理を省略することでより簡便な測定が可能となる。そこで二次イオン質量分析(SIMS)さらにレザーアブレーションICP-MS(LA/ICP-MS)による環境固体試料中の鉛同位体比の直接分析法を開発するために、今年度は測定条件の検討を主に行った。環境試料では、鉛含有量や共存元素、試料採集に長期間必要など種々の問題があるが、主にこれらの問題点を解決するための検討を行った。1.現在継続中のSIMSによる測定については、絶縁物試料のため、電荷蓄積を防止するためにグラファイト添加法を採用してきたが、濃度の低い試料中の同位体比をより正確に測定するためにエレクトロンスプレー法について再度検討を行った。鉛が偏在した測定点においてはかなり精度よく測定が可能であったが定常的な測定を行うために、試料の調製法など一層の検討を必要とする。2.LA/ICP-MSについては、まず硫化鉛をグラファイトと混合した試料で測定条件の最適化をはかった。引き続き環境試料の測定について検討した。環境試料の測定においては、(1)鉛濃度が小さいこと(2)種々の共存元素が存在することなどが問題となる。そこでレーザー照射位置を変化させアブレート量を増加させた。しかし、鉛濃度が小さくなるにつれ、LA/ICP-MSで測定した鉛同位体比が大きくなる傾向を示したが、濃度との相関が見られた。また、共存元素について、大気中に存在する主要な元素について測定したところ、影響は見られなかった。

そこで、環境試料中の鉛濃度を求めることにより、測定値を補正することが可能ではないかとの方向を見出した。今後、環境試料中の鉛濃度を直接定量する方法を検討した後、試料中の鉛濃度による同位体比の補正法を決定し実試料に応用していく予定である。二次イオン質量分析(SIMS)さらにレザーアブレーションICP-MS(LA/ICP-MS)による環境固体試料中の鉛同位体比の直接分析法について、今年度は主にLA/ICP-MSによる低濃度試料の測定法について、数種の環境標準試料を用いて検討を行った。LA/ICP-MSについては、昨年度に測定条件の検討を行い硫化鉛としての鉛同位体比測定について精度のよい測定法を確立した。しかし、環境試料中の鉛濃度は0.01%程度とかなり低いため、鉛濃度0.001%までの試料について引き続き測定法の検討を行った。まずNIST981標準試料を硫化鉛へと変換し、グラファイトで種々の鉛濃度に調製したものを用い測定を行ったところ、鉛濃度0.001%でも相対標準偏差0.5%以下と高い精度が得られた。また鉛濃度と同位体比については相関関係を示唆する結果が得られていたが、さらに詳細に濃度との関係を検討した結果、2%程度までは濃度に関係なくほぼ一定の同位体比が得られることが分かった。測定の際には標準試料による測定値の規格化を行っているが、通常の環境試料の測定の場合は、一定の濃度で調製した標準試料を用いても濃度による補正の必要がないことがわかった。また環境試料の測定においては、種々の共存元素が存在することが問題となるが、主なマトリックスであるケイ素、鉄、アルミニウムなどについて共存の影響を検討した結果、これらの元素が共存しても鉛同位体比に影響がないことがわかった。そこで、NIST SRM1648都市大気粉塵、NIES No.2池底質、No.8自動車排出粒子、また方鉛鉱などを用い測定を行ったところ、それぞれ既に報告されている値と良好な一致を示した。本方法により環境試料中の鉛同位体比を直接測定する可能性を得られた。大気粉塵中の鉛の起源解析を行うには、一般にエアサンプラーで粉塵を捕集する。そこで捕集したフィルターのままでの測定について、主にLA/ICP-MS法について検討した。まず測定値規格化のための標準試料を調製した。標準試料は実試料と同じ状態であることが望ましいが、標準試料をエアサンプラーで吸引してフィルター状に吸着させることは困難である。そこでフィルターに硝酸鉛溶液を滴下したものと硫化鉛粉末を付着させたものを調製した。まずNIST981標準試料を硝酸に溶解した後適宜希釈し、約10μlを約1cm角のガラス繊維ろ紙に滴下乾燥させた。一方、この硝酸鉛溶液より硫化鉛を調製し、硫化鉛約0.5mgほどをクロロホルムに懸濁させフィルターに滴下乾燥した。両者について5回繰り返し測定を行った結果、RSDが^<206>Pb/^<207>Pbについて溶液を滴下しものが0.80%、硫化鉛粉末を付着させたものが0.40%、また^<208>Pb/^<206>Pbについてはそれぞれ1.21%、0.61%となった。そこで、この2種類のフィルターを標準試料として鉛同位体比が既知であるNIST1648都市浮遊粉塵を試料として測定を行った。
戦後改革期におけるわが国金融政策・為替政策の研究

戦後改革期すなわち1945年から1952年の期間におけるわが国金融政策為替政策の展開について歴史的・実証的に解明すること、が本研究の目的である。本年度は、当初の研究計画にもとづいて、GHQ/SCAP PAPERSのうちESS関係の資料の蒐集を行い、そのデータベース化に着手した。作業は、ESS資料の該当部分をまずリストアップし、次いで当該資料のうち、Contents Listのあるものをさらに抽出、さらに、そのContents自体をデータベース化するという手順で行った。しかし、当該資料のうち、Contents Listのあるものが多数にのぼりしかも、一件毎のContents自体が膨大なものであったため、データベース化の作業は、現時点では残念ながら完了するには至っていない。資料リストそのものは、現在国会図書館でデータベース化の作業が進行中であるので、将来的には、国会図書館のData Listと、Contents Listを統合したデータベース化が可能なように作業を進めていく予定である。また、当初の計画し、予定した日本側の資料蒐集に関しては、大蔵省、日本銀行両者について一定の資料蒐集を完了させた。
蛋白性蛍光センサープローブによるショウジョウバエ脳の情報処理経路の研究

本研究はGreen Fluorescent Protein(GFP)を用いてカルシウムイオンを持つプローブを開発し、ショウジョウバエの脳に発現させて臭覚系および味覚系の神経回路の同定とその情報処理の過程を明らかにすることを目標とする。GFPにカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼのM13配列をfusionさせることによりカルシウムイオンに対する蛋白性蛍光プローブの作成を行った。このプローブは1波長励起(489nm)1波長測光(509nm)のプローブであり、その蛍光変化量が最大で4.5と大きいため、この遺伝子を筋肉細胞に発現させたとき顕微鏡を通して肉眼的にもその蛍光の変化を観察できるほどであった。このプローブに関して特許を申請した。G-CaMPには温度感受性があるため、培養細胞に発現させ37度で培養したとき蛍光団を形成できないという問題があった。この点を改良するために蛋白質のfoldingを安定化することが知られている点突然変異をG-CaMPに導入して新たにG-CaMP1.6を作成した。G-CaMP1.6は残念ながら37度では蛍光団を形成できなかったが、28度で蛍光団を形成しモル吸光係数、量子収率ともにG-CaMPより大きな値を示した。その結果G-CaMP1.6はG-CaMPに比較して約40倍明るいことが明らかとなった。またG-CaMP1.6は蛍光団を形成する速さが速く、その時定数は約22分で、G-CaMPの時定数に比べて約3倍速くなっていた。G-CaMP1.6のKdは146nM,Hill係数は3.8,最大蛍光変化量は4.9であった。現在G-CaMPおよびG-CaMP1.6をショウジョウバエ等の動物に発現させin vivoでの測定を行いつつある。(1)今年度の計画本研究は蛋白性蛍光センサープローブを開発し、ショウジョウバエの脳に発現させて嗅覚系および味覚系の神経回路の同定とその情報処理の過程を明らかにすることを目的とする。今年度の計画では蛍光センサープローブ(カルシウムプローブ)の開発とショウジョウバエへのプローブの導入を行った。(2)今年度の成果我々はGreen Fluorescent Protein(GFP)を用いて蛍光カルシウムセンサー蛋白質(G-CaMP)を作成した。G-CaMPはGFPとカルモジュリン、myosin light chain kinaseのM13断片からなっている。G-CaMPのカルシウムに対する感受性は高くKdは235nMであった。また蛍光の最大変化量Fmax/Fminは約4.5であった。G-CaMPの励起蛍光特性はGFPと非常によく似ているので従来の蛍光顕微鏡やアルゴンレーザーを用いたレーザー顕微鏡でも観察することが可能である。G-CaMPをHEK293細胞および培養骨格筋細胞に発現させて、ATPやカルバコール、脱分極等の刺激を与えてカルシウムの変化を観察したところ、サブマイクロモルオーダーのカルシウム濃度の変化を測定することができた。また培養したマウス骨格筋細胞にG-CaMPを発現させたところ電気刺激による細胞内カルシウムの上昇を顕微鏡を通して肉眼でも観察することができた。GFPを用いた蛍光センサーの開発に関して特許を申請した。G-CaMPはcofactorを必要とせず、適当はプロモーターを選択することにより細胞特異的な発現が可能で、現在ショウジョウバエにG-CaMPを発現させるべくトランスジェニックを作成中である。
培養幼植物体の形状情報の画像計測および生育状態の同定と将来予測に関する研究

(1)主に幼植物体葉群を対象とした傾斜角の3次元分布の画像計測手法の開発研究開始時点において、本計測手法を実現するプログラムは、計測対象の汎用化が考慮されていなかった。このため、本プログラムの計測対象はトマト苗など比較的大型の作物に限定されていた。さらに、実行途中において不統一なフォーマットによる中間データを取り扱わなければならないなど、プログラム間の連携の非効率さのため、本計測手法の利用に際して特別の知識が必要となるなど、手法の実用化さらには将来の自動化を妨げる状況があった。そこで本研究では、個別に散在するプログラム群を単機能のモジュールとして整理しつつ、それぞれを全面的に記述し直した。計測の手順に従って順次処理される中間データを、不可視なデータストリームとして各プログラム間で受け渡されるようにした。さらに、対象作物を限定するパラメータを抽出し別途指定可能としたため、本計測手法は、当初の目的である幼植物体葉群への適用はもちろんのこと、プログラム使用者が任意にパラメータを指定することで様々なスケール・葉形状の作物への適用が可能となった。(2)主に幼植物体葉群を対象とした色情報の2次元分光分析に関する研究幼苗期の葉群の色情報を効率よく計測し、生育に関する情報をリアルタイムで得るために、2次元走査型分光分析計の開発を行った。具体的には、市販の白黒CCDカメラを受光素子、プリズムを分光器として用いた。本器の対物レンズは、広角レンズから超望遠レンズまで交換可能なため、計測対象物は幼苗期などミクロなスケールに限定されず、圃場レベルの群落などへの適用も可能である。本器は対象物を概ね400nm1000nmの範囲で分光可能であり、適当な微動雲台に載せて1次元走査を行うことで対象物の2次元分光分析結果を容易に得ることが可能である。また、将来、微動雲台を自動操作可能とすることで、遠隔計測も可能となる。平成8年度は幼植物体の形状情報を対象とした画像計測手法の開発を行うための各種実験装置の製作を中心に活動した。以下に概要を示す。(1)画像撮影装置の製作培養瓶を回転台に乗せ、回転させると同時にカメラで定角度ごとに撮影するターンテーブル撮影装置を作成した。この装置により、カメラの幼植物体に対する仰角を数段階に変更することにより、幼植物体を水平及び垂直方向の様々な角度から撮影した画像群が得られる。カメラには高感度型の冷却CCDビデオカメラを採用し、その制御のために、小型のノート型パソコンを手当した。また、今回の対物レンズに取り付ける光学プリズムを手当し、カメラで葉面の分光反射特性を同時に記録できるように配慮した。撮影の際の、光源としては、通常の一般散乱光型ストロボ装置に加え、任意の幅のスリット光を照射可能なスリット光源装置を製作し、様々な撮影条件を設定できるように配慮した。(2)葉傾斜角の2・3次元分布の高速演算用コンピュータの設置と演算アルゴリズムの最適化本手法の基本的計算処理の概略は以下のようである。すなわち、まず初めに、撮影された各画像を小区画に分割し、各区画の2次元パワースペクトル分布を計算する。ここでの各小区画のパワースペクトル分布から得られるくさび状特徴量は、そこに含まれる物体像の傾き、すなわちこの場合は葉傾斜角を反映する。さらに、得られた葉傾斜角の2次元分布を代表的画像再構成法である逆投影法で、3次元に再構成することで葉傾斜角の3次元分布が得られる。

以上の一連の計算処理は、高速フーリエ変換を含む複雑かつ高度な演算が中心であり、さらには対象とする画像データ量が膨大となるため、一回の処理だけでも膨大な処理時間が必要となる。このため、研究の効率性および手法の実用性をそれぞれ確保するためには、極めて高速なコンピュータの使用などの計算処理の高速化が肝要となる。そこで今回は、演算アルゴリズムの高速化への配慮などの最適化作業に加え、最新のRISC(Power PC 604e 200MHz)型CPUを内蔵した高速パーソナルコンピュータを手当し、この問題の効果的解決を図った。平成9年度は、前年度に製作した幼植物体の形状情報を対象とした画像計測のための各種実験装置の改良、および計測プログラムの開発・修正を中心に活動した。以下に概要を示す。(1)画像撮影装置の改良培養瓶を回転台に乗せ、回転させると同時にカメラで定角度ごとに撮影するターンテーブル撮影装置を作成した。本装置は、対象物のカメラに対する撮影角度を数段階に変更することが可能であるため、対象物を水平及び垂直方向の様々な角度から撮影した画像群が得られる。採用したカメラは、本来は微小光度の天体を撮影するための高感度冷却CCDカメラであり、その分光感度は1000nm付近の近赤外域まで延びている。そのため、対物レンズに取り付けた光学プリズムにより、葉面の分光反射特性を可視光域(主に葉群の形状記録に使用)から近赤外域(主に体内生理を反映する情報として使用)まで記録することが可能な設計とした。本年度は、主に撮影装置の防震処理など、計測精度の安定化のための細かな改良を行った。(2)葉傾斜角の2・3次元分布の高速演算アルゴリズムの最適化本アルゴリズムでは、撮影した各画像を小区画に分割し、各区画のパワースペクトル分布から得られるくさび状特徴量から、最終的に葉傾斜角の3次元分布を得る。以上の一連の計算処理は、高速フーリエ変換を含む複雑かつ高度な演算が中心であるため、膨大な処理時間が必要となるのみならず、従来は様々なプログラムを手作業で組み合わせて作業する必要があり極めて非効率的であった。このため、研究の効率性および手法の実用性をそれぞれ確保するためには、計算処理の高速化のみならず、分散するプログラムを自動化可能な程度に統一化し、作業の効率化を図る必要が生じる。そこで今年度は、演算アルゴリズムの高速化などの最適化作業に加え、各プログラムに散在するパラメータを統一し、分散するプログラムを可能な限り結合、さらには一部処理のバッチ化などの方策をとることによって、この問題の効果的解決を図った。
ドライアイ疾患における性差の分子メカニズム

女性に高頻度で発症するシェーグレン症候群の疾患メカニズムの解明および新規治療法の確立を目指し、性ホルモンと分泌機能障害の分子メカニズムを明確にする事を目的としている。初年度はmAchRのサブタイプ(M1-M5)の違いと涙液分泌機能の変化を解析し、涙液分泌にはM1およびM3が重要であることを明らかにした。最終年度では性ホルモンが涙液分泌におよぼす影響を解析し、涙液分泌の変化が去勢処置により変動し、性ホルモンの可能性が示唆された。最近、細胞内情報伝達物質であるイノシトール3リン酸受容体欠損マウス(IP_3R欠損マウス)が、シェーグレン症候群の病態と酷似する症状を呈することを我々は次々と明らかにしてきた。その中でムスカリン性アセチルコリン受容体(mAchR)欠損マウスが唾液および涙液分泌に異常をきたすこともわかってきた。さらに、シェーグレン症候群の患者血清中にmAchRに対する自己抗体が高頻度で認められることも報告されている。これらの結果は、mAchRとシェーグレン症候群の間に何らかの密接な関係があることを示唆していると考えられ、mAchR欠損マウスの分泌機能障害を詳細に解析することがシェーグレン症候群の発症機構解明に繋がる可能性があると我々は考えている。初年度はmAchRのサブタイプ(M1-M5)の違いと分泌障害を明らかにする為、各サブタイプの欠損マウスの涙液分泌異常を解析した。その結果、ドライアイ様所見である涙液分泌障害はM1とM3が主であることを明らかにした。さらに一部のmAchR欠損マウスではヒトと同様に雌のみで分泌機能障害が認められ、性ホルモンの影響を示唆する結果を得た。以上の結果からシェーグレン症候群によって引き起こされるドライアイの涙液分泌異常解明を行なう上でmAchR欠損マウスはそのモデルマウスとなる可能性が非常に高い。最近、細胞内情報伝達物質であるイノシトール3リン酸受容体欠損マウス(IP^3R欠損マウス)が、シェーグレン症候群の病態と酷似する症状を呈することを我々は次々と明らかにしてきた。初年度はmAchRのサブタイプ(M1-M5)の違いと分泌障害を解析し、涙液分泌にはM1およびM3が重要であることを明らかにし、その遺伝子欠損マウスはドライアイ様涙液分泌障害をきたす事を明らかにした。そこで最終年度では性ホルモンが涙液分泌におよぼす影響を明らかにする事を目的に解析を実施した。マウスの去勢処置による涙液機能の変化を明らかにするために雄マウスの精巣または雌マウスの卵巣を外科的に除去し、性ホルモンの影響を減らしたマウスの涙液量を測定した。その結果、涙液分泌の性差が去勢処置によりなくなり、性ホルモンの可能性が示唆された。
ガレクチン9を介した肥満細胞、好酸球の生体防御における新規機能の解析

組織肥満細胞には明らかなガレクチン9発現が見られる。そのため肥満細胞は重要なガレクチン9産生・遊離細胞の一つと考えられるが、その産生・遊離機構については未だ不明な点が多く残されている。我々は予備的な研究でガレクチン9投与はマウスやモルモットにおけるアレルギー反応を抑制することを明らかにした。また我々はガレクチン9が活性化Th1細胞のアポトーシスを誘導するが、resting T細胞に対しては誘導しないことも明らかにしている。このガレクチンによるアレルギー反応の抑制機構は活性化T細胞に対するアポトーシスによるか、ガレクチン9による肥満細胞の活性化に対する抑制によるかの二つがあげられる。しかしながら、ガレクチン9処置によりPCA反応が抑制された事から後者の可能性が強く示唆された。その抑制機構を明らかにするために、ラット肥満細胞株を予めガレクチン9で処理し、つづいて抗DNPIgE抗体で処理した後、抗原でチャレンジすると通常は惹起される当該ガレクチン9処置細胞株からヒスタミン等の遊離は見られなかった。さらに抗DNPIgE抗体で処理した後にガレクチン9で細胞を処理してその後抗原刺激しても遊離は見られなかった。これらのことからガレクチン9は肥満細胞に対する脱感作能を有し、その活性を利用してアレルギー疾患に対するガレクチン9による脱感作療法が可能であると予想され、これまでに多くの研究者が目的とした肥満細胞の脱感作がこれによって明らかになると思われる。現在正常の肥満細胞等を用いて同様の活性を確認中である。抗原刺激T細胞が産生・遊離する好酸球特異的な遊走因子としてガレクチン9を同定し、その機能として好酸球遊走活性のほかに、活性化ヘルパーT細胞や腫瘍細胞にアポトーシス様の細胞死を誘導することを明らかにした。今回、萌芽研究として組織肥満細胞や組織に浸潤した好酸球に発現が見られることから、ガレクチン9が炎症局所においてユニークな好酸球活性化因子としての機能以外にガレクチン9を介して組織肥満細胞や好酸球の全く新しい生物作用、すなわちT細胞機能調節細胞としての機能を追求することから、萌芽研究で申請した。好酸球や組織肥満細胞をヒトから効率良くとることがきわめて困難であるため、局所において上記の細胞と同様にガレクチン9を発現しているマクロファージに対するガレクチン9の機能を検討することとした。血液単球をガレクチン9で刺激すると弱いながらもcostimulatory moleculesの発現を増強した。そこでLPSで単球を刺激しimmature樹状細胞(DC)に分化させた後にガレクチン9で刺激するとcostimulatory molecules発現増強とIL-12産生を誘導し、抗原刺激T細胞の増殖とともにIFNγ,IL-2,TNFα等のTh1サイトカイン産生を増強した。このDCに対する成熟誘導効果はラクトースで抑制されず、またβガラクトシド結合性を有さないミュータントガレクチン9でも効果が見られたことから、ガレクチン9はレクチンとしての機能の他にDC上のタンパク質と結合して生物作用を示すことが示唆された。また、ガレクチン9はMAP kinase p38やERK1/2のリン酸化を誘導すること、MAP kinase p38の特異的インヒビターでこの効果は抑制されるが、ERK1/2やPDI3 kinaseの特異的インヒビターでは抑制されなかった。これらのことから自然免疫機構のみならず、DC成熟を誘導しTh1免疫反応を誘導することにより獲得免疫にも重要な作用を示す物質であることが明らかにされた(J.Immunol.印刷中)。今回の研究では直接的には肥満細胞や好酸球の炎症や生体防御反応における重要性は明らかに出来なかったが、炎症早期に肥満細胞からのガレクチン9の産生/遊離が見られるという予備的な実験結果からそれらの細胞から遊離されたガレクチン9がその後の免疫反応をDCをとおして調節することが考えられる。
三次元ナノ周期構造液晶を用いたソフトフォトニック結晶の構築と機能応用

本研究では、ナノ周期螺旋構造を形成するカイラル液晶をもとにした三次元ナノ周期構造の実現しソフトフォトニック結晶の構築の可能性を探索することを目的とし、次の成果を得た。(1)欠陥部位に螺旋周期構造を導入することにより、極めて高いQ値を持つ新たな欠陥モードが発現することを、理論的に明らかにすると同時に、コレステリック液晶を欠陥とすることにより実験的に検証し、レーザー発振閾値の低減を確認した。(2)欠陥層に強誘電性液晶を用いることでも、顕著なレーザー発振閾値の低減が観測されることを明らかにした。(3)自己組織的に一次元ナノ螺旋周期構造を形成するコレステリック液晶の二次元、三次元化を実現するために、光重合性の感応基を分子内に有するコレステリック液晶を用いて、共焦点顕微鏡による直接描画法を採用して、三次元構造を作製した。特に、十分な空間分解能を得るために、波長800nmのチタンサファイア・フェムト秒レーザーを光源として、二光子重合過程を利用して構造描画を行った。その結果、光重合で固定化した螺旋周期構造内に、液晶螺旋周期構造を欠陥として有する複合構造が実現でき、透過スペクトルに欠陥モードが確認できた。また、温度変化により欠陥構造内の液晶螺旋構造の周期を変化させることにより、欠陥モードの波長を制御することに成功した。さらに、フォトクロミック色素を添加したコレステリック液晶を欠陥層に導入することにより、欠陥モードの位置を光照射により制御した。(4)コレステリック液晶レーザーの励起波長をフォトニックバンドギャップの高エネルギー端に合わせることにより、発振閾値の低下を観測し、励起光の閉じ込め効果をはじめて確認した。(1)自己組織的に一次元ナノ螺旋周期構造を形成するコレステリック液晶の二次元、三次元化を実現するために、光重合性の感応基を分子内に有するコレステリック液晶を用いて、共焦点顕微鏡による直接描画報を採用して、三次元構造を作製した。さらに、温度変化により欠陥構造内の液晶螺旋構造の周期を変化させることにより、欠陥モードの波長を制御することに成功した。(2)光重合性コレステリック液晶を、直接描画法およびフォロマスク法のよりパターン化し、一次元螺旋周期構造を有するロッド構造を作製した。この構造内では、螺旋周期構造による光の閉じ込めと同時に、ロッド円周におけるウィスパリング・ギャリー(WG)モードによるレーザー発振が観測された。さらに、螺旋周期構造の周期を制御することにより、螺旋周期構造に基づくバンド端モードとWGモードとの間のカップリングを確認した。(3)多光束光干渉による光重合を利用した二次元周期構造を作製し、螺旋周期構造の三次元化の検討を行った。

(3)自己組織的に一次元ナノ螺旋周期構造を形成するコレステリック液晶の二次元、三次元化を実現するために、光重合性の感応基を分子内に有するコレステリック液晶を用いて、共焦点顕微鏡による直接描画法を採用して、三次元構造を作製した。特に、十分な空間分解能を得るために、波長800nmのチタンサファイア・フェムト秒レーザーを光源として、二光子重合過程を利用して構造描画を行った。その結果、光重合で固定化した螺旋周期構造内に、液晶螺旋周期構造を欠陥として有する複合構造が実現でき、透過スペクトルに欠陥モードが確認できた。また、温度変化により欠陥構造内の液晶螺旋構造の周期を変化させることにより、欠陥モードの波長を制御することに成功した。さらに、フォトクロミック色素を添加したコレステリック液晶を欠陥層に導入することにより、欠陥モードの位置を光照射により制御した。(4)コレステリック液晶レーザーの励起波長をフォトニックバンドギャップの高エネルギー端に合わせることにより、発振閾値の低下を観測し、励起光の閉じ込め効果をはじめて確認した。
蛋白質中の硫酸化チロシン残基の蛋白質-蛋白質相互作用における役割

蛋白質の翻訳後修飾のうち、リン酸化や糖鎖の付加についてはその生体内においての重要性が広く認められ、多くの研究者がその研究に従事し実験手法も豊富に開発されている。一方、蛋白質のチロシン-O-硫酸化は古くから知られた翻訳後修飾でありながら、その生理的意義はもちろん、どのくらいの種類の蛋白質に含まれているのかすらほとんどわかっていない。本研究はチロシン-O-硫酸化の生理的意義、特にその細胞外マトリックスの蛋白質の相互作用における意義を解明することを目的としておこなった。まず硫酸化チロシンに対する抗体を用いた簡便なチロシン-O-硫酸化の検出法の開発を目指したが、研究種々の抗原や免疫法を試みてみたが実用に耐えうる抗体を得ることはできなかった。そこで硫酸化チロシンを含むことが知られているV型コラーゲンに着目し、これと結合する蛋白質について解析することを先に試みた。血小板に大量に含まれるトロンボスポンジン(TSP)がV型コラーゲンに結合する際の機能ドメインを決定した結果、分子量19-kDaのフラグメントにV型コラーゲンへの結合のみならず、硫酸化多糖であるヘパリンヘの結合能もあることがわかった。そしてTSPとこの19-kDaのフラグメントが硫酸化チロシンにも結合することをアルブミンに結合させた硫酸化チロシンを用いて明らかにした。この発見は硫酸化チロシンを認識する細胞外マトリックスのメカニズムが存在することを示唆しており、さらに硫酸化チロシン認識部位を短いアミノ酸配列に狭めることができれば、上記の抗体の代わりに硫酸化チロシン検出に役立てることもできるのではないかと考える。
内生成長モデルによる租税の経済効果の分析

平成14年度は,Howitt(1999)のモデルを用いて,各種の税が長期的な経済成長率に与える効果を,比較静学および数値分析の手法により分析した。同モデルは,財のバライエティ増加と各産業における生産性の上昇が,内生成長をもたらすというものである。まず,比較静学分析の結果,労働所得税は,長期的な経済成長率に影響を与えないが,資本所得税およびR&Dに対する補助金は,影響を与えるということが明らかにされた。しかし,数値分析の結果,資本所得税およびR&Dに対する補助金も,かなり大幅な変更を行わなければ,経済成長率に影響を与えることができないことが明らかにされた。平成15年度は,各種の税が経済成長率に与える効果を,移行過程も含めて分析したHowitt(1999)のモデルは,モデルの動学特性が不明瞭であるため,移行過程を分析することが困難である。そこで,Romer(1990)のモデルを用いて先の課題を検討することにした。Romer(1990)のモデルは,財のバライエティ増加が内生成長をもたらすというものである。同モデルの動学特性はArnold, L.G.(2000)によって分析されている。分析の結果,各種の税,補助金は,成長率の移行過程に対しては,無視できない効果を持つことが明らかにされた。参考文献本年度(平成14年度)は,まず,文献サーベイを行うことにより採用するモデルを検討した。R&Dが経済成長をもたらすとする従来の内生成長モデルは,スケール効果(人口が増加すると経済成長率が上昇する)を持つものであった。しかし,スケール効果の存在は,実証分析では否定されており,同効果を持たないモデル(non-scale model)の考案が待たれていた。この点に答えたのが,Howitt(1999)のモデルである。そこで同モデルを用いて,各種の税が長期的な経済成長率に与える効果を比較静学の手法により分析した。その結果,労働所得税は,長期的な経済成長率に影響を与えないが,資本所得税は影響を与えるということが明らかにされた。Howitt(1999)のモデルは,従来の問題点を克服しているものの,モデルの動学特性が不明瞭であるため,移行過程を分析することが困難である。その点,Howitt(1999)と同様non-scale modelであるEicher and Turnovsky(2001)のモデルは,動学特性が明らかにされており,移行過程の分析に適している。来年度(平成15年度)は,Eicher and Turnovsky(2001)のモデルを用いて,各種の税が経済成長率に与える効果を,移行過程も含めて分析する予定である。参考文献平成14年度は,Howitt(1999)のモデルを用いて,各種の税が長期的な経済成長率に与える効果を,比較静学および数値分析の手法により分析した。参考文献
振盪振動刺激による骨密度上昇と筋量増加による骨折予防効果

ヒトは静止して長時間立っていると無意識に体重を左右、前後に移動し疲労回避を行っている。それは軽度な運動を全身に及ぼしていると言える。水平に揺れる板の上で直立姿勢を保つことは、静止時以上に全身への適度な運動を促がす。その振盪刺激を骨密度が低下していくモデルマウスへ行った結果、大腿骨において部位差はあるが、低下していく骨強度を維持することが可能であるという結果が得られた。高齢者に限らず振盪刺激による全身運動が、若年者の骨折予防および健康増進の新規物理療法として予防医学に貢献できると予測する。日常、私たちが生活する中で、横揺れや振動に対して身体は無意識もしくは意識的に転倒しないように姿勢を保持している。地震体験をするような装置の小型版である振盪台の上で、転倒しないように両足をしっかり踏ん張ることが、大腿骨をはじめとした下肢骨の骨密度を上昇させると考えられる。振動刺激のような原理を用いた物理療法は、その条件設定により従来の運動療法より、十分な骨密度上昇の効果が期待できる。これは骨折予防といった予防医学と位置づけ、その効果について研究を行った。本年度(平成20年3月31日)の研究実施計画により、骨密度低下モデルマウスを用いて以下の動物実験を行った。振盪刺激群には1日1回、30分間、自作の振盪装置(TAITEK NR3)によって150min-1の強度で刺激を与え、それを10週令から17週令までの8週間継続し行った。解析方法は1.X線撮影、2.組織解析、3.骨密度測定、4.骨強度試験、5.3点曲げ試験を行った。結果、X線画像解析では、+群(振盪刺激群)において骨端に近い骨幹部において緻密骨の増強傾向が得られた。骨密度解析の結果は骨端部において、海綿骨と皮質骨ともに+群において-群(非振盪刺激群)、及びCont.群(野生型群)よりも低下傾向を示した。骨幹部では骨端部とは逆に+群が-群及びCont.群と比較して骨密度が増加傾向にあった。組織解析から骨幹部の皮質骨の厚さと骨端部の骨梁の幅を計測した。骨端部の骨梁の幅は、+群が-群及びCont.群と比較して薄い傾向を示した。骨幹部の皮質骨の厚さでは+群が最も厚く、次いでCont.群が厚く、一群が最も薄い結果となった。3点曲げ試験では破断エネルギーは、+群が最も大きく、次いで一群が大きく、Cont.群が最も小さかった。破断偏位も同様な結果だった。最大荷重は、一群が最も大きく次いでCont.群が大きくなり、+群が最も小さかった。骨増強の部位差や骨格筋量の増大を考慮し、来年度以降に研究を継続していきたいと考えている。カルセイン投与により骨の組織標本を作製し、組織解析、骨中無機質成分(Ca、P含量)の測定、および骨形態計測を行い比較検討した。骨組織の標本を作製し骨芽細胞特異的染色であるALP酵素染色において骨端線付近に染色線が観察されたが、3群間で明瞭な相違は得られなかった。また、骨幹部においては染色性が見られなかった。骨中無機質成分(Ca、P含量)の測定の結果は、3群間でCa、Pともに有意な差は得られなかったが、刺激を行なった群に増加傾向があった。骨形態計測では、骨構造解析において、+/+群では単位骨量、骨梁幅、骨梁数が増加傾向を示した。また、骨梁間隙は減少傾向を示した。反対に-/+群では単位骨量、骨梁幅、骨梁数は減少傾向を示し、骨梁間隙は増加傾向を示した。骨吸収においては、+/+群の吸収面、破骨細胞数は3群のうち最小値を示し、-/+群は最大値を示した。骨形成において、類骨面と類骨量で+/+群は、-/+群と比べほぼ同値を示し、Cont.群に比べ増加傾向を示した。骨は生体において常にリモデリングが行われている。骨の形成と吸収のバランスが骨吸収側に傾いた状態が長期にわたる事で骨量が減少し、骨粗鬆症に至る。今回の実験の結果、振盪刺激により+/+群は、-/+群に比べ骨単位量、骨梁幅、骨梁数は高値であり、骨梁の増加が確認された。ALP酵素染色や骨形成を表す類骨面・類骨量の結果では3群に差異はなかった。これらより+/+群は振盪刺激によって、骨形成が促進したというよりも、骨吸収が減少したと考えられる。よって振盪刺激は、骨密度低下の抑制が可能になるのではないかと考えられる。

本年度は骨密度という点に着目して実験を行ったが、振盪刺激には、骨格筋の増強、平衡感覚の向上、運動負荷による脂肪代謝促進などの効果も期待できる。来年度はこれらの結果を踏まえ人への応用が可能かどうかも含め研究を遂行していきたいと考えている。実験は、ICRマウスを使用し、卵巣摘出した群と野生型の2群に分類し、それぞれの群に対して、刺激を行った群と行わない、計4群に区分した(卵摘/刺激:+/+,+/-,-/+,-/-)。水平板回転装置による刺激を10週間継続した後に各筋を採取し、タンパク質発現解析と組織学的解析による筋線維の短径と線維数の計測を行なった。筋線維の形態計測解析から刺激群に筋肥大が確認された。しかし、筋線維数の変化には明らかな違いは認められなかった。筋肥大を促進するタンパク質であるGDF-8と発生・分化に関与するMyf-5,Myf-6のタンパク質は、刺激によりその発現が増加傾向を示した。また、インナーマッスルの代表的な筋である腸腰筋においてもその刺激による筋肥大が確認できた。これは、腰椎の骨密度を維持し圧迫骨折を予防できる運動になる可能性も示唆された。大腿および下腿の筋群は水平板回転装置による刺激運動により肥大し、下腿の筋群はその安定強化に役立つと考えられる。水平板回転装置による刺激が下半身、特に大腿部の骨補強に関わる筋群に効果的な物理療法になり得るのではないかと思われた。また、卵巣摘出をして刺激をする群としない群を比較すると、血中のコレステロール、中性脂肪においてはその有意な差は認められなかったが、刺激を行わない群の内臓脂肪は顕著に観察された。これは、この刺激が適度な運動となりメタボリックシンドロームの温床ともなる内臓脂肪の蓄積を回避できたことを示す。振盪刺激が骨強度維持、筋肥大、脂肪燃焼とマウスを用いた実験において有意義な結果が得られた。今後は脳の神経細胞に与えるストレスや活性化の効果を検証し、人への応用を視野にいれ研究を遂行していく予定である。
人工赤血球が持つ肺虚血再還流障害抑制効果の臨床応用を目指した、臓器保護の研究

人工赤血球が小粒子径で高い酸素運搬能力があることに注目した。肺移植で重篤な合併症である移植肺の虚血還流肺障害を防止・抑制するか、A.ラット肺虚血再還流モデル、B.ラット肺移植モデルで検証し、臓器保護効果を明らかにすることで臨床応用へと繋げることを目的とした。C.酸素運搬能によってラット摘出肺を常温で48時間維持可能か、長期的な臓器保護効果を検証した。研究の過程でD.肺の酸素化能を測定できる試験薬としての能力に着眼し、再生肺モデルで再生肺の酸素化能力を測定可能かを検討した。A.グラフトの病理学的・機能的検討において、虚血再還流障害の程度にHbV投与による差は認められなかった。A-1. HbVとEpTU液を1:11:9で混和した保存液中に肺を12時間4°Cで保存したが組織障害抑制効果は認められず。現在の保存液では冷保存状態12時間程度ではARBCの効果を必要とする程組織障害が抑制されている事を示唆した。還流のない人工赤血球内の酸素は消費され臓器保存に影響を与えていなかった。B.上記の結果肺移植モデルについては作成せず。C.配合還流液による肺保護の有用性の証明を組織学的検討で行い、アポトーシス関連遺伝子のreal-time PCR法を行いアポトーシスが抑制されることを証明した。この結果は人工赤血球を用いた新還流システムが肺保護に繋がる第一歩と考えた。一方48時間還流で人工赤血球は組織内に入り肺水腫となった。還流液浸透圧調整の必要性が示唆されたが、人工赤血球のサイズ問題からAir-bloodバリアーを通過して肺胞内に漏出してしまうとも推察された。人工赤血球は現時点では肺の特性に合わず肺組織への長期使用には不向きであることが示唆された。D.人工赤血球は人工肺で還流可能である。ラット摘出肺、再生肺ともに換気で人工赤血球溶液は酸素化され肺拡散能をex vivoで検査するモデルとなりうる。今回我々は、通常廃棄される有効期限の過ぎた献血より作成される人工赤血球(ヘモグロビン小胞体)が、小粒子径でありながら高い酸素運搬能力があることに注目した。人工赤血球を肺移植の分野に応用すれば、移植肺の虚血再還流障害を予防し肺移植の成績が向上できる可能性が高い。さらに良好な機能を有したまま、長時間の臓器保存が可能となれば、ゆくゆくは心臓死ドナーへの応用も期待できる。虚血時間を考慮すると臓器搬送に地理的に不利とされる地方の病院でも安全な肺移植が施行できる可能性がある。そのために我々は人工赤血球(ヘモグロビン小胞体;HbV)を臨床肺移植において臓器保護に応用するためにバイオリアクターを用いたex vivo lung perfusionsystemで基礎研究を行った。具体的には摘出したラット生体肺に培養液のみを灌流する群(Control群)と人工赤血球と培養液を1:9で配合した液を灌流する群(HbV群)に分けて、ex vivo lung perfusionsystemを用いて48時間灌流した。人工赤血球を配合した灌流液の方が肺保護に有用であることを証明するために、HE染色およびTUNEL染色による病理組織学的所見から比較検討を行い、その後アポトーシス関連遺伝子のreal-time PCR法を行い、Hb群でアポトーシスが抑制されることを証明した。この結果は人工赤血球を用いた新しい灌流システムが肺移植においてドナー肺保護につながる可能性の第一歩と考える。最初にex vivo lung perfusionsystemの最適な灌流条件を検討した。具体的には灌流圧の測定、灌流液のpH調整、FBS混和による膠質浸透圧の調整、培養液と人工赤血球の配合比率等である。次に培養液のみを灌流する群(Control群)、人工赤血球と培養液を1:9で配合した液を灌流する群(Hb群)に分けて、摘出したラット生体肺をバイオリアクターを用いたex vivo lung perfusionsystemで48時間灌流した。病理組織学的検討を行い、HE染色では両群に明らかな差は認めなかった。TUNEL染色ではControl群よりもHbVのほうがアポトーシスを抑制できることがわかった。灌流後のラット肺組織からRNA抽出してcDNA合成し、real-time PCR法を用いてアポトーシス関連遺伝子発現(AIF, Bax)の解析を行った(n=3)。AIFではControl群のほうがHbV群よりもRNA発現が多い傾向にあった。BaxではRNA発現に両群で差は認めなかった。低酸素刺激によって発現が誘導される膜貫通型タンパクであるCarbonic Anhydrase IX(CA9)を用いてWestern blot法や免疫染色で両群を比較した。Western blotでは肺組織でのCA9の発現自体が少ないのかControl群、HbV群ともに目的としたバンドが検出できなかった。一方でCA9の免疫染色では、人工赤血球群で人工赤血球そのものに強い発現が認められた。

虚血時間を考慮すると臓器搬送に地理的に不利とされる地方の病院でも安全な肺移植が施行できる可能性がある。現在動物実験において人工赤血球の有用性が報告され始めた。中でもラットの下肢切断モデルにおいて、臓器保存液に人工赤血球を添加し6時間再灌流し再接着したところ、下肢の酸素化や機能の復元を認めたことが報告された(Araki et al. Transplantation 2015)。これは人工赤血球の粒径が小さいため微小循環改善効果を有し、組織の酸素化に有効であった可能性が示唆された。この結果より、我々は、これまでに試みられてきた肺虚血再灌流障害治療の中で、この人工赤血球が新しい治療に成り得るのではないかと注目した。ラット摘出肺で人工赤血球(ARBC)と臓器保存液(EpTU液)との最適混和量の検討。ARBCとEpTU液を1:11:9で混和した保存液中に肺を12時間4°Cで保存したが組織検索では組織障害抑制効果は認められず。現在の保存液では冷保存状態12時間程度ではARBCの効果を必要とする程組織障害が抑制されている事を示唆した。灌流ないARBC内の酸素は消費され臓器保存に影響を与えていなかった。実験2:ARBCによる長期的な臓器保護効果を検証するためにバイオリアクターを用いたex vivolung perfusionsystemでARBCを灌流させる基礎研究を行った。摘出ラット肺に培養液のみ灌流群(Control群)とARBCと培養液を1:9で配合した液を灌流する群(HbV群)に分け、ex vivo lung perfusionsystemを用いて48時間灌流した。ARBCを配合灌流液が肺保護に有用であることを証明するために、HE染色,TUNEL染色による組織所見から検討を行い、アポトーシス関連遺伝子のreal-time PCR法を行い、Hb群でアポトーシスが抑制されることを証明した。この結果はARBCを用いた新灌流システムが肺移植で肺保護に繋がる第一歩と考える。しかし、48時間の灌流でARBCは組織内に入り肺水腫の状態になった。改善策は、灌流液の浸透圧を調整が必要で今後ARBCの品質向上も必要であろうと考えられた。現時点のARBCは組織への長期使用には不向きである。実験3:ARBCにより摘出肺のガス交換能を測定できるかを検討。摘出肺を空気or100%酸素で換気させながら、ARBC/PBS溶液を肺動脈より灌流させ、肺静脈からARBC/PBS溶液を採取し血液ガスを測定した。換気によりARBCは酸素化され肺拡散能をex vivoで検査するモデルとなりうる事が分かった。人工赤血球が小粒子径で高い酸素運搬能力があることに注目した。肺移植で重篤な合併症である移植肺の虚血還流肺障害を防止・抑制するか、A.ラット肺虚血再還流モデル、B.ラット肺移植モデルで検証し、臓器保護効果を明らかにすることで臨床応用へと繋げることを目的とした。C.酸素運搬能によってラット摘出肺を常温で48時間維持可能か、長期的な臓器保護効果を検証した。研究の過程でD.肺の酸素化能を測定できる試験薬としての能力に着眼し、再生肺モデルで再生肺の酸素化能力を測定可能かを検討した。