hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クラスII遺伝子導入トランスジェニックマウスの免疫学的解析

1.Eαd遺伝子導入トランスジェニックマウスの系統化。昨年度に引き続き、B6Eαdマウスの継代、維持を行なった。Eαd遺伝子の発現を蛍光抗体法およびT細胞クロ-ンを用いた機能的解析法により調べたところ、安定して子孫に伝達されていることが確認された。2.Ed遺伝子の他のハプロタイプのマウスへの導入。様々なH-2ハプロタイプのマウスとB6Eαdマウスを交配させて作ったF1マウスのEαd遺伝子の発現を同様の方法により調べたが、いずれのマウスにおいてもその発現が確認された。3.B6Eαdマウスに発現される新たなクラスII特異性の解析。アロ抗原反応性T細胞クロ-ンおよび抗原特異T細胞クロ-ンを作製し、B6Eαdおよ(BALB/c×B6Eαd)F1マウスのクラスII特異性を機能的に解析すると、これらのトランスジェニックマウスに特異的に発現しているクラスII分子の存在が示された。モノクロ-ナル抗体を用いた阻止実験ならびに色々なマウスを用いた実験からそれがアイソタイプ混合AβEα分子であることが確認された。また、このアイソタイプ混合クラスII分子に反応する特異抗体を作製した。これを用いた実験から、正常マウスの卑細胞をIL-4で刺激するとアイソタイプ混合クラスII分子の発現が誘導されることが明らかにされた。4.Aβd遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを山村研一(熊本大学)から入手し、継代、維持している。導入Aβd遺伝子の伝達ならびに発現は安定していることが確かめられている。B6EαdマウスとのF1を作り、Aβd遺伝子の発現を調べると、AβdAαb以外にAβdEαdアイソタイプ混合クラスII分子の発現も認められた。現在この分子の機能的解析を行なっている。
組織親和性人工材料による代用気管の研究

1イヌ・ブタ・ウサギ・ウシの気管を用いて生体気管物性を測定した。2上記で得られた、生体気管物性に類似したスパイラル入りシリコンチュ-ブ式人工式管を作成し、イヌの頚部式管で置換実験を行ったが、縫合部離解と肉芽形成が全例に起き、ノンポ-ラスチュ-ブ方式は代用管に適さないことが判明した。3メッシュ式人工気管の材質の検討として、コラ-ゲン処理プラスチック材料をラットに埋植して発癌率を見た。コラ-ゲン処理により発癌率が低下し、組織親和性が向上することが判明した。4コラ-ゲン処理ポリプロピレンメッシュにてイヌ気管の窓状置換を行ったところ、置換部全体が正常気管上皮で覆われた。5コラ-ゲン処理ポリプロピレンメッシュを管状にし、テフロンヤ-ンを支持輸として織り込んだ人工気管でイヌ気管の管状置換を行った。内腔は上皮で覆われたが、材料の変形や刺激による肉芽形成が認められ、支持輪の改良の必要性が認められた。6コラ-ゲンポリプロピレメッシュにポリプロピレンヤ-ンを熱蒸着により接着した人工気管を作成して、イヌ式管で管状置換を行ったところ、肉芽形成や狭窄も全くなく内腔も完全に上皮で覆われ、臨床に使用し得る代用気管が得られた。7生体内吸収性メッシュであるポリ乳酸メッシュと自己骨膜を用いて家兎の気管で置換実験を行ったところ、骨膜被覆部に軟骨組織の再生が認められ、吸収性材料による代用気管が生み出し得る可能性が示唆された。1.イヌ・ブタ・ウサギ・ウシの気管を用いて生体気管物性を測定した。2.上記で得られた生体気管物性に類似したスパイラル入りシリコンチュ-ブ方式の人工気管を作製し、両端にはコラ-ゲングラフト化ポリプロピレンメッシュによる縫合輪をつけ、イヌの頸部気管で置換実験を行ったが、縫合部の離解や肉芽増生が高率に発生し、良好な結果は得られなかった。これにより、シリコンのようなノン・ポ-ラスな材料は代用気管には適さないことが推察された。3.メッシュ型人工気管の材質の検討として、コラ-ゲングラフトしたポリプロピレンメッシュにてイヌ頸部気管の窓状置換を行ったところ、比較的早期に良好な組織治癒が得られ、置換部全体の内腔が完全に正常気管上皮で覆われるという知見を得た。4.上記のメッシュを円筒状とし、テフロンの支持リングを縫い込んだ人工気管を作製し、イヌ頸部気管で管状置換を行ったところ、人工気管には周囲組織が侵入し、吻合部は生体気管と完全に一体化した。ただし材料の変形などによる内腔の狭窄傾向が認められ、ステントの入れ方を含め、改良の余地があると思われる。5.吸収性材料による人工気管として、ポリグリコ-ル酸メッシュとポリ乳酸メッシュにコラ-ゲンをグラフトさせた材料で、イヌ気管の窓状置換を行ったところ、早期に良好な組織治癒と内腔の気管上皮の再生をみた。6.上記複合化吸収性メッシュと自己骨膜を用いて家兎の頸部気管で置換実験を行ったところ、骨膜被覆部位に軟骨組織の再生を認め吸収性人工気管の支持体と成りうる可能性が示唆された。1スパイラル入りシリコンチュ-ブ方式の人工気管を作成し、イヌの頚部気管で置換実験を行ったが、縫合部の離解や肉芽形成が全例に発生し、ノンポ-ラスチュ-ブ式の人工気管は代用気管に適さないことが判明した。2メッシュ式人工気管の材質の検討として、コラ-ゲン処理プラスチック材料をラットに埋植して発癌率を見たところ、コラ-ゲン処理により発癌率が低下し、組織親和性が向上することが判明した。3コラ-ゲン処理

ポリプロピレンメッシュにてイヌ気管の窓状置換を行ったところ、置換部全体の内腔が完全に正常気管上皮で覆われるという知見を得た。4コラ-ゲン処理ポリプロピレンメッシュを管状とし、テフロンヤ-ンを支持輪として縫い込んだ人工気管でイヌ気管の管状置換をを行ったところ、内腔は上皮で覆われたが材料の変形や、刺激による肉芽形成が認められた。支持輪の改良の必要性が認められた。5コラ-ゲンポリプロピレンメッシュにポリプロピレンヤ-ンを熱蒸着により接着した人工気管を作成してイヌ気管で管状置換を行ったところ、肉芽形成や狭窄も全くなく内腔も完全に上皮で覆われ、臨床に使用し得る代用気管が得られた。6生体内吸収性メッシュであるポリ乳酸メッシュと自己骨膜を用いて家兎の気管で置換実験を行ったところ、骨膜被覆部位に軟骨組織の再生が認められ、吸収性材料による代用気管が生み出し得る可能性が示唆された。
高温・高減衰能材料用SiC系複合材料の創製の研究

本研究ではPIP法やCVI法を用いて複合材料を作製し、材料の密度変化による弾性率と内部摩擦の特性・高温までの温度依存性・強度特性について調べ、高減衰能材料としての適用について検討することを目的とした。また、高温特性を改善するため、材料表面に露出しているC原子をSi気相反応でSiCに改質も行った。強化繊維はニカロン長繊維(SiC:直径14mm)を用い、500本の繊維束で8枚朱子織したシートを3枚重ねにし、PIP法のマトリックス溶液はフェノール樹脂溶液にSiC粉末(SiCpow)とC粉末を添加させ、その混合重量比を3種類変化させて1mm厚さのSiC/SiCpowC複合材料を作製した。さらに、密度向上のためフェノール樹脂含浸を繰り返し、最高密度2.0g/cm^3を得ることができた。CVI法では最高密度2.5g/cm^3まで得ることができた。弾性率は密度の増加とともに上昇する傾向を示すが、PIP法では最大で47GPa、CVI法では150GPaを得た。一方、内部摩擦は密度の増加とともに減少する傾向を示した。これは、材料中の内部欠陥が減少することによってエネルギー伝達が向上し、振動が起こりやすくなったためと考えられ、制振抑制には寄与しなかった。しかし、CVI法によって1150°Cで作製した材料では900°C付近に内部摩擦のピークを検出することができ、900°C以上の高温における高減衰能材料の指針を得ることができた。この時の曲げ強度は450MPaの高強度が得られた。PIP法で作製した材料の表面層にはCが露出しているため、耐酸化性への改質が求められている。このため、Siの気相反応によってCをSiCに改質した。その結果、SiC層の厚さは0.5μmまで改質し、曲げ強度も10%向上させることができた。本研究ではポリマー溶液含浸熱分解法(PIP法)を用い、SiC長繊維をSiC微粒子とC微粒子の混合物からなるマトリックスで複合材料を作製し、材料の密度変化による弾性率と内部摩擦の特性・高温までの温度依存性・強度特性について調べ、高減衰能材料としての適用について検討ることを目的とした。強化繊維はニカロン長繊維(SiC:直径14μm)を用い、500本の繊維束で8枚朱子織したシートを3枚重ねにし、マトリックス溶液はフェノール樹脂溶液にSiC粉末(SiCpow)とC粉末を添加させ、その混合重量比を3種類変化させて1mm厚さのSiC/SiC_<pow>C複合材料を作製した。この時の繊維含有率は約40%である。また、密度向上のためのフェノール樹脂含浸を9回まで繰り返した。フェノール樹脂を炭化すると体積が約50%減少し、マトリックス中に気孔やマイクロクラックが多数存在するが、これらの欠陥にフェノール含浸を施した結果、9回含浸で全ての材料がほぼ飽和状態に達し、最高密度2.0g/cm^3を得ることができた。弾性率は密度の増加とともに上昇する傾向を示し、最大で47GPaを得た。一方、内部摩擦は密度の増加とともに減少する傾向を示し、欠陥の減少によって振動減衰が抑制されたためと考えられる。また、9回含浸で最大応力値283MPaを得た。弾性率と内部摩擦の温度依存性ではSiCpowを多く含んでいる方が弾性率は高く、内部摩擦は800K付近から上昇をはじめた。これは粒界あるいは界面の滑りによって発生する内部摩擦の変化であることが推察される。

この他、化学気相反応法(CVI法)あるいはゾルゲル法を用いてホットプレスで作製したSiC/SiC複合材料と比較検討した結果、今回作製した試料が高温で最も高減衰能を示す材料であることが明瞭に得られた。更なる工夫によって弾性率および内部摩擦を向上させることが可能と考えられる。本研究では、これまで未開拓であった高温における高減衰能複合材料(SiC繊維系複合材料)を創製することであり、そのためには高温度域までの内部摩擦測定・弾性率測定の確立を目指すと共に、得られた特性の挙動と微細組織との関連を明らかにし、高減衰能を考慮した材料の指針を得ることである。本研究における、SiC系複合材料の作製はホットプレス法(HP)、化学気相含浸法(CVI)、ポリマー溶液含浸熱分解法(PIP)等の手法を用いてきた。しかし、構造が複雑な複合材料において高減衰能を得ることはなかなか困難であり、また高減衰能は一般的に弾性率や強度特性と相反する挙動を示している。CVI法で作製した材料が高強度を有していることから、材料作製条件の再検討を行うことで、高温での安定した高減衰能と高強度を共存した材料の創製が実現可能となってきた。CVI法による一般的な材料作製は9501000°Cの範囲で行っているが、1050°Cまで上昇させて作製(1050材)した場合には、975°Cで作製した材料(975材)よりも弾性率が約30%上昇した。また、内部摩擦はRT1100°Cまでの温度領域で975材では検出できなかったピークが870°C付近に検出され、このピーク後に再び内部摩擦は上昇傾向を示した。1450°Cで熱処理を行った材料の組織と内部摩擦とを検討した結果、SiCの結晶化の進行が認められた。1050材°Cの場合には結晶化温度よりも低温であるが、CVI過程でマトリックスが緻密に結晶化して形成されていることを示唆し、結晶化に伴う高減衰能が発現した結果と考えられる。また、曲げ強度は534MPaの高強度を維持することも可能であることが分かった。また、PIP法を用いた場合には材料表面にC原子が露出するため、Si拡散によるSiC層表面改質についても指針を得ることができた。
「ITPaseによるATPプールの品質維持機構」に普遍性はあるか

ATPはさまざまな酵素反応のエネルギー源として必要なだけでなく, RNAをはじめとする生体分子の構成成分として,またタンパク質のコファクターとしても働く,生物にとって最も重要な分子のひとつである。ATPはアミノ基を有しており,脱アミノ化を受けるとITPになる。ITPの構造はATPと非常に似ているため, ATPが作用する場所でATPと拮抗して競争阻害的に働く可能性がある。またITPを構成する塩基であるヒポキサンチンはアデニンと異なりシトシンと対合できるため,転写の際にITPがRNAに取込まれると,誤った翻訳をまねき,異常蛋白質が生じる原因となる。ITPaseは,ITPをIMPとピロリン酸に分解する活性をもつヌクレオチド分解酵素である。我々はこのITPaseが,細胞内でATPから生じるITPを分解除去し, ATP poolの品質を維持する働きを担っているのではないかと考え,これを確かめる目的でITPaseをコードするItpa遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作製した。このITPase欠損マウスは心臓のサルコメアに構造異常があり生後2週で死亡する。このことからマウスではITPase欠損により,ITPが蓄積し,ATPと競合して生体に悪影響を及ぼしている,という仮説を立てた。平成20年度はITPase欠損マウス系統から樹立した,Itpa(+/+),(+/-),(-/-)の3種類のItpa遺伝子型をもつ細胞株を解析,Itpa(-/-)細胞が染色体異常を示すことを示した。またヒトとマウスの遺伝子欠損体の表現型の違いを説明することができる第2のITPase活性を持つ酵素と遺伝子を同定した。マウスとヒトの両方の種において,ITPase活性は生物にとって重要な役割りを担っている可能性が高いことを示すことができた。ATPは生物にとって最も重要な分子のひとつである。さまざまな酵素反応のエネルギー源として必要なだけでなく、RNAをはじめとする生体分子の構成成分(材料)として、またタンパク質のコファクターとしても働いている。ATPはアミノ基を有しており、脱アミノ化を受けるとITPになる。この脱アミノ化反応は中性pH、37°Cでも進行し、亜硝酸塩存在下でさらに促進される。ITPの構造はATPと非常に似ているため、ATPが作用する場所でATPと拮抗して競争阻害的に働く可能性がある。またITPを構成する塩基であるヒポキサンチンはアデニンと異なりシトシンと対合できるため、転写の際にITPが基質としてRNAに取込まれると、誤った翻訳をまねき、異常蛋白質が生じる原因となる。このようにATPの脱アミノ化は細胞にとって好ましくない化学反応のひとつである。ITPaseは、ITPをIMPとピロリン酸に分解する活性をもつヌクレオチド分解酵素である。我々はこのITPaseが、細胞内でATPから生じるITPを分解除去し、ATP poolの品質を維持する働きを担っているのではないかと考え、これを確かめる目的でITPaseをコードするltpa遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作製した。このことからマウスではITPase欠損により、ITPが蓄積し、ATPと競合して生体に悪影響を及ぼしている、という仮説を立てた。本研究ではこの仮説を証明するとともに大腸菌でも同様の現象が観察されるかどうかを検証することを目的とする。平成19年度はITPase欠損マウスから細胞を樹立、薬剤処理に寄って細胞内にITPが蓄積する条件の検討を行い、+/+、+/-、-/-の3種類のItpa遺伝子型をもつ細胞株をそれぞれ3系統樹立した。
マラリア原虫の侵入時における赤血球側でのPKAリン酸化イベントの全容解明

仮説「PKAリン酸化による宿主赤血球側のPf受容体蛋白質の、膜骨格からの解離はマラリア原虫の赤血球侵入の必要条件となる」について検証し、膜骨格蛋白質デマチンの、未同定の結合相手(マラリア原虫の受容体の可能性がある)はPKAリン酸化により膜骨格から解離すること、一方、Pf受容体であることが知られているグリコフォリンA、グリコフォリンCはPKAリン酸化による膜骨格からの解離が起らないこと、を明らかにした。また、アンタゴニストを用いた解析ならびにRNAseq解析から、Gsを介したPKAシグナリングに加えてGqを介する経路もマラリア原虫による赤血球侵入に関与している可能性が示された。本研究の目的である、仮説「PKAリン酸化によるマラリア原虫受容体のアンカーからの離脱は、原虫の赤血球侵入の必要条件となる」の実証のために、最も主要なPKAの基質であるアンカー蛋白質デマチンが結合する、マラリア原虫の受容体候補分子(X)の同定(平成26年度計画2))に重点をおき検討を行った。赤血球から調製した反転膜小胞(デマチン、およびXの細胞内領域を外側に露出している膜小胞)を用いた解析では、PKAリン酸化の結果デマチンが反転膜小胞から解離したことから、デマチンとXとの結合はPKAリン酸化により弱まることが示された。この結果を踏まえ、次に非イオン性界面活性剤を用いて脂質二重層を可溶化して調製した赤血球膜骨格(膜骨格に、デマチンを介してXが結合していると想定される)を用い、PKAリン酸化によって膜骨格から解離してくる膜貫通タンパク質(主にXを含むと予想される)を回収し、その同定を試みた。その過程で、Xを効率よく検出・同定するためには、膜貫通タンパク質をビオチン標識する必要があること、アミノ基に加え糖鎖など複数の官能基を標的としたビオチン標識法を組合せる必要があること、が判明し(11.現在までの達成度で後述)、現在その条件検討を行っている。平成26年度計画3)については、グリコフォリンAは膜骨格に結合した分画が検出されず、したがってPKAリン酸化による膜骨格からの解離も起こらないこと、さらにグリコフォリンCは膜骨格に結合しているものの、PKAリン酸化による解離は認められなかったことを明らかにした。したがって、計画していたPKAリン酸化による膜貫通タンパク質の拡散速度の検討対象からは除外することとした。本研究の仮説「PKAリン酸化によるマラリア原虫受容体のアンカーからの解離が、マラリア原虫の赤血球侵入の必要条件となる」の実証のために、赤血球膜骨格蛋白質であり赤血球におけるPKAの最も主要な標的であるデマチンの結合相手(マラリア原虫の受容体候補分子)の同定を引き続き行っている。【現在までの進捗状況】の記述の通り、本年度は充分に研究を実施する期間が確保できなかったため、昨年度の研究実績として報告した内容の再現性を確認するにとどまっている(申請段階でマラリア受容体候補分子として挙げていたグリコフォリンA、グリコフォリンCは、PKAリン酸化によって解離しないことを確認した)。最終年度にあたる平成28度中の研究を効率よく行う方策として、リン酸化イベントをより顕著に検出・解析できると期待される網状赤血球を用いた検討を同時並行して行う計画である(「今後の研究の推進方策等」参照)。大学内規定の変更により、平成27年4月からヒト赤血球の研究使用は、基礎研究であっても臨床研究と同等の倫理審査が必要となった。基礎研究と臨床研究とではその性質に相当の乖離があり、またヒト試料を用いる基礎研究の倫理申請の、学内における最初のケースであったこと等から、承認にいたるまでに数ヶ月を費やした。その間、本研究課題の遂行に必須であるヒト赤血球を入手することができず、進捗に大きく遅れが出る結果となった。申請時の仮説に基づき、マラリア原虫の赤血球侵入に際して起る、細胞外ATPによるP2Y(11)受容体を介した宿主赤血球側で起る情報伝達経路の解析を重点的に実施してきたが、広スペクトルのプリンヌクレオチド受容体アンタゴニストに比較して、P2Y(11)受容体に特異的なアンタゴニストによる侵入阻害効果が限定的であったことから、赤血球に発現するプリンヌクレオチド受容体の発現状況について検討を行った。臍帯血ならびに末梢血から調製したCD34陽性細胞をin vitroで分化誘導・培養し、各種分化マーカーにより分画した各分化段階の赤芽球系前駆細胞(前赤芽球、塩基性赤芽球、多染性赤芽球、ならびに正染性赤芽球)におけるRNAseq解析の結果、これまで同定していたP2Y(11)受容体に加え、P2X(1)、P2X(4)、P2X(7)、ならびにP2Y(1)受容体も赤芽球系前駆細胞での発現が認められることが明らかとなった。そのうちP2Y(11)とP2Y(1)は分化段階が進むにつれて発現量が増加してくることが明らかとなり、これら2つが成熟赤血球における主要なプリンヌクレオチド受容体であると考えられた。

Gsの活性化を介してPKAリン酸化カスケードを活性化するP2Y(11)とは異なり、P2Y(1)はGqの活性化を介してCa(2+)流入とホスホリパーゼCの活性化を誘導することが知られており、これまで想定していたのとは異なる情報伝達経路の存在、あるいはGs経路とGq経路のクロストークがマラリア原虫の赤血球侵入に関与している可能性についても検討していく必要があることが示唆された。仮説「PKAリン酸化による宿主赤血球側のPf受容体蛋白質の、膜骨格からの解離はマラリア原虫の赤血球侵入の必要条件となる」について検証し、膜骨格蛋白質デマチンの、未同定の結合相手(マラリア原虫の受容体の可能性がある)はPKAリン酸化により膜骨格から解離すること、一方、Pf受容体であることが知られているグリコフォリンA、グリコフォリンCはPKAリン酸化による膜骨格からの解離が起らないこと、を明らかにした。また、アンタゴニストを用いた解析ならびにRNAseq解析から、Gsを介したPKAシグナリングに加えてGqを介する経路もマラリア原虫による赤血球侵入に関与している可能性が示された。PKAリン酸化によって膜骨格から解離する膜貫通タンパク質(主にXを含むと予想される)を回収し、質量分析によりその同定を試みたが、使用したPKA(ウシPKA触媒サブユニット、Sigma社)に大量に含まれる夾雑タンパク質が、解離した膜貫通タンパク質の単離・同定を困難にすることが分かった。解決策として、膜貫通タンパク質をあらかじめsulfo-NHS-ビオチンで標識し、リン酸化によって解離したタンパク質のうち膜貫通タンパク質のみをストレプトアビジンカラムで分離回収する方法に切り替えたが、さらにアミノ基を標的としたNHS-ビオチンでは赤血球膜貫通タンパク質の標識効率が極めて低く、アミノ基以外の官能基(糖鎖等)を標的としたビオチン標識法を組合せる必要があることが分かった。この問題の解決に時間を割かれたため、研究の進行はやや遅れた結果となっている。PKAリン酸化による膜貫通蛋白質(マラリア原虫の受容体)の側方拡散の増大効果に関して、これまで通り成熟赤血球について解析を進めると同時に、PKAリン酸化がより活発に起こることが分かっている網状赤血球(未熟な赤血球)を用いて同様の検討を行う。リン酸化による影響がより増幅されて検出できることが期待され、成熟赤血球での解析の対象とすべき膜貫通蛋白質をより効率よく、かつ幅広く網羅することができると予想される。生化学上記11.で述べた通りの方策で遅れを取り戻しつつ、研究計画調書に記載の計画に従いデマチン-X間結合に対するPKAリン酸化の影響に重点を当てて研究を進める。申請当初に計画していた4.1R-グリコフォリンCならびにアデューシン-バンド3/グリコフォリンA間結合を対象とした解析は、上記9.研究実績の概要で述べた理由で今後の検討から除外する予定である。残金が小さすぎて必要な物品の購入に充てることができなかったため。概ね計画通りに使用したものの、平成26年度使用額がやや不足したため。平成28年度使用額と合算して、物品費として使用する。平成27年度使用額と合算し、物品費として使用。
極微細スピントロニクスデバイスにおける微細構造表面の磁気特性評価とその制御

極微細スピントロニクスデバイスでは、微細構造表面の寄与が大きくなるため、その表面磁気特性がデバイス特性を左右する。したがってその表面磁気特性を評価し制御することが、極微細スピントロニクスデバイスの高性能化にとって重要となる。本研究では、微細構造表面における磁気特性が実デバイスのデバイス特性や磁化反転機構にどのように影響するかを理解し、これらの知見をもとに極微細スピントロニクスデバイスの高性能化を実現するための微細化技術の設計指針を明らかにする。
ヒト・メチレン葉酸還元酵素のリン酸化に関与する因子の検索

平成18年度科学研究費補助金交付期間中、ヒト・メチレン葉酸還元酵素(MTHFR)のリン酸化に関与する酵素を検索する端緒として、以下のような知見を得たので報告する。リン酸化はkinaseによって行われるので、本研究では、MTHFRとkinaseのタンパク質・タンパク質相互作用が鍵である。しかし、このような相互作用における分子間の結合は一過的であり、何らかの工夫が必要になる。そこで、MTHFRに化学修飾を施し、目的タンパク質と安定な結合を形成させることでこの問題を解決しようと試みた。はじめに精製MTHFR(全長、78kDa)に化学修飾を試みたが、修飾される部位の特定が困難であり、本研究には特異的にkinaseと相互作用するMTHFR中のアミノ酸配列の特定が必要であると考えた。このような場合、リン酸化部位(すなわち基質となる部位)が候補となる。しかし、MTHFRをリン酸化には、リン酸化部位から約300アミノ酸離れたリンカーの認識が重要であることを明らかにした。具体的には、Pro343-Pro355のアミノ酸配列が必須である。この部分を持つMTHFRは部分的(約50%)に修飾され、酵素活性を検出することができる。この部分以外にMTHFRのリン酸化に関与するアミノ酸配列はリンカー中に観察されなかった。このPro343-Pro355は、プロリン残基の他に疎水性アミノ酸と塩基性アミノ酸に富む領域である。そこで部位特異的変異体を作成しリン酸化状態を観察したが、リン酸化に関与するアミノ酸残基の特定には至らなかった。次に、Pro343-Pro355を含むリンカー中アミノ酸配列を参考にし、ペプチドを合成した。この合成ペプチドを化学修飾し、ラベルトランスファー法をもちいて相互作用するタンパク質の検索を行った。その結果、昆虫細胞粗抽出液中にいくつかの特異的なシグナルを検出した。現在、このタンパク質の同定を行っている。
流体シアストレスに対する植物培養細胞の動的応答の解明

本研究は,攪拌ストレスに対する植物細胞の代謝応答機構を解明することを目的とした。これまでの検討により,細胞破壊が生じる以前に膜透過選択性,呼吸活性,ATP含有量が,攪拌速度の増加に伴い低下すること,攪拌ストレスにより細胞内カルシウムイオン濃度が増加することを確認した。本年度は,ベニバナ細胞を用いてNAD(P)H,アクチン繊維量,活性酸素生成量の攪拌ストレスによる変化の測定およびカルシウム阻害剤の効果の検討を行った。攪拌槽培養は,6枚翼ディスクタービン型攪拌翼,邪魔板(3枚,幅8mm)付き攪拌槽(培養液量550mL)を用いて,攪拌速度500rpmの条件で行った。対照培養としてフラスコ振とう培養を行った。NAD(P)Hは自蛍光測定,アクチン繊維量は特異吸着を行う蛍光色素NBD-ファラシジンの吸着量測定,活性酸素量はNBT還元活性測定により評価を行った。その結果,NAD(P)H,アクチン繊維量,活性酸素生成量のいずれも攪拌ストレスにより低下を示した。また細胞膜に存在する膜電位依存性カルシウムチャンネルの阻害剤であるベラパミルを添加した場合,攪拌ストレスによる細胞内カルシウム濃度の増加が抑制されるとともに,NAD(P)H,アクチン繊維量,活性酸素生成量および膜の透過選択性の低下も抑制された。活性酸素生成量については、アジ化ナトリウムの添加によっても低下が抑制されたため,アジ化ナトリウムにより活性が阻害される活性酸素消去系であるカタラーゼの寄与が推察された。以上の結果より,攪拌ストレスに対する代謝応答として,NAD(P)H消費反応,カタラーゼ活性化,アクチンの重合阻害が,細胞外から電位依存性チャンネルを通じて動員されるカルシウムイオンの媒介により生じていることが推察された。
糖鎖の特異的な分子間相互作用と細胞のガン転移機構の分子論的解明

多生体反応の多くは,細胞膜表面などの界面での反応が重要な役割を果たしている。このような生体反応を理解するためには細胞表面・界面における分子(水、タンパク質、脂質など)の構造あるいは動的挙動を反応が進行しているその場(水溶液中)で、かつ高い空間・時間分解能で明らかにすることが重要となる。例えば、現代の外科的手術の際に必須である麻酔(全身麻酔)の作用は、吸入した麻酔薬が細胞膜に溶解することによる細胞膜の膨張、細胞膜の流動性の変化、細胞膜上で麻酔薬周囲に氷状水が形成されることに由来すると、あるいは麻酔薬が膜蛋白質の受容体やイオンチャネルに働くと言った様々な仮説がこれまでに提唱されてきたが、依然として麻酔作用のメカニズムは解明されていないのが現状である。本研究では生体内の過程を分子レベルで高い空間分解能を付与した界面顕微分光法を新たに構築し、生体界面(細胞膜、脂質二分子膜)構造・反応、および機能発現に重要な役割を果たしていると言われている界面水の構造、ダイナミクスの追跡を行う。このような生体界面の構造・ダイナミクスを分子レベルで明らかにしていくことで、生命現象の解明に寄与することを目指す。本年度は1年間、文部科学省へ出向を命じられたため、研究活動をほとんど行うことが出来なかった。昨年度までは、当研究室で既に構築・稼働済みの和周波発生分光システムと、既存の倒立顕微鏡を組み合わせることで、新規顕微SFG分光システムの構築を行っていたが、空間分解能の最適化が出来ていない状況であった。残りの研究期間を考え、空間分解能は期待できないが、FTIRを用いた表面増強赤外分光法による追跡へ変更し、スペクトルの変化から界面構造および糖鎖-タンパク間相互作用を明らかにしていくことを目指すことにする。残りの研究期間を考え、計測を和周波発生分光法から表面増強赤外分光法へシフトさせる。表面増強赤外分光法が行える系の最適化と並行して、サンプルの作成にも着手する。糖鎖の表面密度や、長さなどをパラメータとし、糖鎖とタンパクとの間に働く相互作用(水素結合、親水・疏水性相互作用など)の変化を追跡していく予定である。生体反応の多くは,細胞膜表面などの界面での反応が重要な役割を果たしている。例えば、細胞表面に存在する糖鎖は、細胞間や細胞外基質との相互作用や細胞外との情報交換に深く関わっていることが近年明らかになってきている。この糖鎖は、細胞の接着や分化、ガン細胞の転移、感染症の感染など、細胞表層の糖鎖とタンパクとの結合が関係していると言われている。したがって、細胞の表面構造を調べ、糖鎖-タンパク間相互作用を調べることは、生命現象を理解する上で重要な課題である。本研究では、表面・界面の分子構造に関する情報を取り出すことが可能な、非線形分光法(和周波発生(SFG)分光法)を用い、実細胞表面の糖鎖とタンパクとの間の特異的な分子間相互作用、および糖鎖-タンパク間相互作用におよぼす細胞表面の水の役割を調べ、依然として不明な点が多く残されている細胞表面の糖鎖の特異的認識能を分子レベルで明かにしようとするものである。本年度は、当研究室で既に構築・稼働済みの和周波発生分光システムと、既存の倒立顕微鏡を組み合わせることで、新規顕微SFG分光システムの構築を行ったが、空間分解能の最適化がまだ出来ていないが、今後スペクトルの変化から界面構造および糖鎖-タンパク間相互作用を明らかにしていく目途がついた。計測システムの最適化と並行して、サンプルの作成にも着手する。

糖鎖の表面密度や、長さなどをパラメータとし、糖鎖とタンパクとの間に働く相互作用(水素結合、親水・疏水性相互作用など)の変化を追跡していく予定である。残りの研究期間を考え、計測を和周波発生分光法から表面増強赤外分光法へシフトさせる。表面増強赤外分光法が行える系の最適化と並行して、サンプルの作成にも着手する。顕微SFG分光システムの構築で、空間分解能の最適化に予定より時間がかかっている。今後は、さらなる最適化を進める上で次年度に予算を回すことにした。文部科学省への出向を命じられたため、研究活動が行えず研究費の使用ができなかった。残りの研究機関で計画どおり研究が遂行できるように研究費の執行を行う。
血清脂質と前立腺癌:レムナントリポプロテインの役割とエンドカンの意義

レムナントリポプロテインは前立腺癌細胞の増殖に関与していることを見出したが,特にアンドロゲン非依存性株であるPC3細胞での効果が著明であった。本年度は,このメカニズムとして受容体の研究をまず行った。レムナントリポプロテインの受容体はLDL受容体,VLDL受容体,ROX1が報告されている。mRNAレベルではLDL受容体,VLDL受容体の発現を確認したが,蛋白レベルではLDL受容体のみが発現していた。LDL受容体は,レムナントリポプロテインの存在下では,PC3細胞ではdown regulationがなく,LNCAP細胞ではdown regulationを認めた。さらにsterol-responsiveelement binding protein 2(SREBP2)はPC3細胞においてdownregulationの機構が欠如していた。この結果,レムナントリポプロテインの細胞増殖には,LDL受容体および。SREBP2の発現調節機構が関与していることが判明した。ヌードマウス皮下移植モデルにおけるPC3細胞のvivoでの検討を行った。高脂肪食を与えることによって,腫瘍細胞の増殖は亢進していた。この傾向は,スタチンの投与によって抑制傾向にあり,vivoにおいても脂質の関与があることが示された。前立腺癌のリスクファクターに脂質の関与が以前から指摘されてきたが、基礎的な研究はほとんどなされていなかった。脂質が血液中でリポプロテインとして挙動するために、再現しにくいという特徴があると考えられる。我々は脂質をリポプロテインとして分離する手技によりこの中でレムナントリポプロテインに着目し、前立腺癌細胞における効果を検討した。前立腺癌細胞で特にPC-3(アンドロゲン非依存性)株に対して、濃度依存性に細胞増殖を促進した。この細胞増殖の背景には、EGFRを介さない、MAPK系の高進を伴っている。さらに、PK-CおよびGPCR-AKTの系にも関連していることが判明した。また、レムナントリポプロテインはLDLに比べて有意に上記の増殖活性を高めることを見出し、脂質による細胞増殖高進は単に、エネルギーの補充による効果ではないことも示した。レムナントリポプロテインの受容体にも着目し、VLDL受容体およびLDL受容体のmRNAおよび蛋白発現を検討し、レムナントリポプロテインは主にLDL受容体が関係していることを見出した。siRNA法によりLDL受容体の発現を抑制すると上記の増殖効果は有意に抑制され、このリポプロテインの増殖への関与をさらに示す結果となった。レムナントリポプロテインの添加により、PC-3細胞におけるLDL受容体はdown-regulationを受けなかったが、LNCap細胞では発現が抑制されており、正常細胞における反応性を保っていた。以上より、前立腺癌のアンドロゲン依存性の喪失と脂質に対する反応性の欠如は相関を認めた。
運動によるモノカルボン酸輸送担体発現機序における AMP キナーゼ活性効果の検証

本研究の目的は運動由来のAMPキナーゼ(AMPK)泯性化が運動の骨格筋MCT発現調節を媒介する重要なシグナル伝達分子であるという仮説を検証することであった。すべての実験は雄性SDラットを対象にして行った。その結果、高強度と低強度の両水?運動によりAMPKは運動筋で泯性化され、MCT1とMCT4の両mRNA量は一?的に増加した。しかし、タンパク質量の発現効果は運動強度で異なった。1回の高強度運動により、MCT4タンパク質量が増加したのに対して、低強度運動ではMCT1タンパク質量が急性に増加した。運動効果の分子機序を検証するためにAMPKを泯性化させる5-aminoimidazole-4-carboxmideribonucleoside(AICAR)とカフェインを用いてMCT発現に対するAMPK泯性化効果をinvitroで検証した。滑車上筋に対する0.5mMAICAR及び1mMカフェイン刺激はMCT1とMCT4のmRNA発現量を増加させたが、タンパク質量は変化しなかった。カフェインによるAMPKリン酸化がダントロレンによって抑制されると、MCT1とMCT4のmRNA発現量の増加も抑制された。運動由来の骨格筋AMPK泯性化はMCT1とMCT4のmRNA量を増加させる有力なシグナル因子の1つになることが明らかとなったが、タンパク質量の発現効果には関与しない可能性が示唆された。モノカルボン酸輸送担体(MCT)は乳酸の放出と酸化を中心とする乳酸代謝活性化に重要な役割を担っている。乳酸は、MCT4によって速筋線維から放出され、MCT1によって心筋や遅筋線維で取り込まれて酸化されるのが主たる代謝である。これまでにMCTの発現は加齢や持久的トレーニングによって高められることや乳酸閾値レベルを遥かに超える高強度運動トレーニングによってMCTの発現が増加されることが明らかにされている。しかしながら、運動によるMCT発現増加の分子機序は明らかにされていない。骨格筋のAMPキナーゼ(AMPK)活性化は糖代謝に関わる有力な分子である。乳酸はグリコーゲンを中心とする糖からの基質であるため、運動による糖代謝活性効果と類似した分子機序でMCTの発現を高めると考えた。本年度の目的はトレッドミル運動負荷装置を用いて、単発の高強度短時間運動モデルの構築を試みた。実験は、正常雄性SDラットを用いて、トレッドミルの速度を一定の50m/minに設定して、20秒間の走行運動と40秒間の休息を25セット行った。構築したプロトコールにおいて、グリコーゲンとAMPKのリン酸化を検討した結果、ヒラメ筋(61%)、足底筋(80%)、腓腹筋(red 82%, white 73%)のグリコーゲンの有意な減少が認められ、AMPKのリン酸化もすべての筋群において有意に上昇したことを明らかにした。今後は、構築した単発の高強度短時間トレッドミル運動モデルを用いたMCTの発現効果だけでなく、乳酸閾値未満での低強度長時間運動におけるMCT発現効果に着目して、MCT発現効果に対するAMPキナーゼの活性化効果を検証していく。本研究では異なる運動強度の一過性運動によるMCT1とMCT4発現効果を検証した。また、本実験では、MCT1とMCT4のシャペロン分子として機能するCD147タンパクの効果についても検証した。実験は雄性SDラットを用いて、安静群、高強度・短時間運動群、低強度・長時間運動群に分類して行った。高強度・短時間運動群は、ラットに体重18%の重さの錘を付け、20秒間の水泳運動後、20秒間の休憩を挟むインターバル水泳運動を15セット負荷した。乳旨酸性閾値未満の低強度・長時間運動群は無負荷で3時間の水泳運動を45分の休息を挟んで2セット行わせた。

両運動終了直後から24時間後まで経時的に滑車上筋と上腕三頭筋を摘出し、MCT1とMCT4のmRNA量とタンパク質量を分析した後に安静群と比較した。また、一過性運動によるMCT発現効果に対するリン酸化酵素を検証するため、有力視されるAMPキ-ナーゼ(AMPK)、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMKII)、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(p38MAPK)のリン酸化量を測定した。高強度と低強度での両一過性運動により上昇したリン酸化酵素はAMPKのみだった。また、高強度と低強度の両運動によりMCT1とMCT4 mRNA量も増加したが、タンパク質量の増加は異なった。MCT4タンパク質量は、高強度・短時間により増加したが、CD147タンパク質量は増加しなかった。対照的に、MCT1とCD147タンパク質量は、低強度・長時間運動直後に急性に増加し、運動終了1824時間後まで持続した。本実験の結果から、一過性運動による骨格筋のMCT1とMCT4 mRNA量の増加は運動筋のAMPK活性化効果を介して惹起するが、タンパク質量増加には関与しない可能性が示唆された。本研究では骨格筋におけるモノカルボン酸トランスポーター(MCT)の発現は、AMPK活性化効果を介して増加するという仮説を検証するため、AMPK活性化剤となる5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR)とカフェインを用いてMCT1とMCT4 mRNAとタンパク質量に対する効果を検証した。雄性SDラット(100g)から滑車上筋を単離し、AICAR (0.5mM)及びカフェイン(1mM)含有の酸素化された培養液で長時間インキュベーションを行った。また、カルシウム阻害剤のダントロレンの作用を調べるため、培養液にカフェインとダントロレンを添加してインキュベーションも行った。MCT1とMCT4のmRNAとタンパク質量を解析した後、コントロール筋と比較した。その結果、AICARとカフェインはAMPKのリン酸化を増加させた。ダントロレンは、カフェインによるAMPKリン酸化を抑制した。AICARとカフェインはコントロール筋に対してMCT1とMCT4 mRNAを有意に増加させたが、タンパク質量には影響しなかった。カフェインによるmRNAの増加はダントロレンによって抑制された。本研究の結果から骨格筋のAMPK活性化は運動由来のMCT1とMCT4 mRNAを増加させる因子の1つであることが明らかとなった。研究室スタッフが少なく、分析するサンプル数が多いことから、測定と分析に時間がかかっているため計画していた単離筋を用いたin vitro実験が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。一過性運動による骨格筋のモノカルボン酸輸送担体発現増加におけるAMPキナーゼ活性化を検証していくため、AMPキナーゼ活性化剤やAMPキナーゼリン酸化を抑制する薬剤などを用いて単離筋レベルで研究を進めていく。
超好熱菌の新規色素依存性デヒドロゲナーゼの探索と機能性電極素子への利用

色素依存性デヒドロゲナーゼ(dye-DH)は、バイオセンサーの素子としての利用が期待できる。しかし常温菌由来の酵素は総じて不安定であり、応用開発は遅れている。一方、超好熱菌には安定性の高いdye-DHが存在する。本研究では、超好熱菌のゲノム情報に基づきdye-DHの探索を行った。その結果、新規D-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、3タイプのD-乳酸デヒドロゲナーゼ、L-プロリンデヒドロゲナーゼ(LPDH)を見出し、これらの酵素化学的性質を明らかにした。さらに、LPDHについては結晶構造解析に成功した。また、数種の酵素を用いて電極に固定化し、センサー素子としての有用性を確認した。(1)Dye-DHホモログの検索を行った結果、好熱菌Rhodothermus marinasゲノムより色素依存性D-アミノ酸脱水素酵素(DADH)を見出した。本酵素を大腸菌で生産させ、性質を解析したところ、D-フェニルアラニンを最も良好な基質とするDADHであることが明らかとなった。既知のDADHは、D-アラニンまたはD-プロリンを最も良好な基質とするため、本酵素は新規DADHであることが判明した。(2)新規L-プロリンデヒドロゲナーゼ(LPDH)の構造解析に成功した。本酵素の基質結合部位にはL-プロリンが結合していた。またC-末端アミノ酸のLeuは、基質結合ポケットを溶媒から完全に遮断していた。L-プロリンは、その基質結合ポケットに強固にトラップされていた。C-末端Leuの役割を検証するため、その欠損ミュータントの構造解析を行った。ミュータントの活性中心にはL-プロリンは認められなかった。また、基質結合ポケットは溶媒に対して解放されていた。すなわち本酵素では、L-プロリンの活性中心への保持にC-末端のLeuが重要な役割を担っているという新たな知見を得た(Sakuraba, H., et al. (2012). J. Biol. Chem. 287, 20070-20080.)。(3)構造解析に成功したマルチ銅オキシダーゼ(McoP)をカーボン電極表面に滴下し、McoPを物理吸着させた電極を作成した。この電極を用いて、酸素飽和下で酸素の還元波の検出に成功した。また、McoPとpolyethyleneimineと交互に積層した電極を作成したところ、作成7日間で約70%の電流密度を維持することができた。このことから、McoPは電極に固定化しても高い安定性を維持できる、バイオ電池のカソード用素子として有用性の高い酵素であることが判明した(2013年3月:農芸化学会大会発表)。色素依存性デヒドロゲナーゼ(Dye-DH)は、バイオセンサーやバイオ電池素子としての利用が期待できる。しかし常温生物由来の酵素は総じて不安定であり、応用開発は遅れている。一方、90°C以上の高温環境に生息する超好熱菌には、安定性の高いDye-DHが存在しており、応用面で優れた潜在性を持つことが判明している。本研究では、超好熱菌のゲノム情報から存在が推定された各種Dye-DHについて機能・構造解析を行い、電極素子としての有用性を検討し、主に以下の成果を得た。(1)D-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ【最終年度実施】、3種のD-乳酸デヒドロゲナーゼ(DLDH)、L-プロリンデヒドロゲナーゼ(LPDH)を見出し、酵素化学的性質を詳細に調べ、酵素間で比較検討した。(2)ホモダイマー型LPDHの結晶構造解析に成功した。L-プロリンの活性中心への保持にC-末端のLeuが重要な役割を担っているという新たな知見を得た。本成果は、国際的に著名な生化学雑誌であるJ. Biol. Chem.に掲載された。DLDHについては、結晶作成に成功し、X線解析用の初期データを得た。これまで本酵素の構造解析例は大腸菌由来の酵素しか無く、超好熱菌由来酵素の特徴解明が期待できる【最終年度実施】。(3)マルチ銅オキシダーゼ(McoP)を物理吸着させた電極を作成した。バイオ電池のカソード用素子として有用性の高い酵素であることが判明した。(4)色素依存性アルドースデヒドロゲナーゼの固定化電極作成に成功した。カーボンナノファイバー、ベンゾキノンおよび本酵素をアガロースゲルと混合し、90°Cの高温条件下でカーボンペースト電極にスピンコーティングした。電極はグルコースに対して30日以上安定したレスポンスを示し、センサーとしての有用性が確認できた。超好熱菌酵素の耐熱性を利用した固定化法として注目されている【最終年度実施】。(1)超好熱菌の新規Dye-DHホモログ

遺伝子のクローニング、発現系の構築および産物の機能解析超好熱菌のゲノム情報に基づき、FAD結合モチーフを持つ色素依存性デヒドロゲナーゼホモログの検索を行った結果、31種類のFAD依存性デヒドロゲナーゼの存在が推定できている。このうち12種類の遺伝子の発現系を構築し、大腸菌で生産させたところAeropyrum pernix由来の酵素の一つが、可溶性各分に回収された。各種糖類、有機酸、アミノ酸、アルコールなどを基質として本酵素の活性スクリーニングを進めている。本酵素は機能が特定されておらず、その機能解明は大きな意義を持つ。(2)新規Dye-DHのX線結晶構造解析新規D-乳酸デヒドロゲナーゼ(DLDH)および新規ホモダイマー型L-プロリンデヒドロゲナーゼ(LPDH)を既に見出している。このうち、LPDHについては、Se誘導体の結晶を得た。PFビームラインを利用して1.92Åの分解能のデータを収集し、MAD法により位相決定に成功した。現在、構造の精密化を進めている。これはホモダイマー型LPDHとしては初めての構造解析例となる。また、DLDHについては、空間群P21の結晶作成に成功した。これまで本酵素の構造解析例は大腸菌由来の酵素しか無く、超好熱菌由来の酵素の特徴の解明が期待できる。さらに、すでに結晶化に成功していたマルチ銅オキシダーゼ(バイオ電池の酸素還元カソード(正極)として利用できる)については、Se誘導体の結晶を作成し、PFビームラインを利用して2.0Åの分解能のデータを収集、MAD法により位相決定に成功した。構造の詳細な解析を行い、本酵素の高い熱安定性に寄与する構造上の特徴を明らかにした。本酵素も超好熱菌由来の酵素としては初めての構造解析例となった。活性中心の構造情報に基づき、有用な基質に対する活性評価を検討している。平成24年度の研究として(1)好熱菌の新規Dye-DHホモログ遺伝子のクローニング、発現系の構築および産物の機能解析、(2)新規Dye-DHのX線結晶構造解析、(3)酵素固定化電極の作成の3つを計画した。(1)については、D-フェニルアラニンを最も良好な基質とする新規色素依存性D-アミノ酸脱水素酵素の取得に成功した。興味深いことに、ゲノム上で本酵素遺伝子は、今までに報告されているD-アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むオペロン構造とは大きく異なる新規クラスターを形成しており、未知のD-アミノ酸代謝経路の存在が示唆される。現在、本酵素の機能解析を進めている。新規Dye-DHを取得できたことから、おおむね順調に進展していると言える。(2)については新規ホモダイマー型LPDHおよびそのミュータントの構造解析に成功した。C-末端Leu欠損ミュータントの構造を解くことにより、本酵素に特徴的な基質認識メカニズムを明らかにできた。これらの成果は国際的に評価の高いJ. Biol. Chem.誌に掲載された。本研究については当初の計画以上に進展しているといえる。(3)については、昨年度構造解析に成功したMcoPの固定化電極を作成し、電極応答を確認した。電極に固定化しても高い安定性を維持することが明らかとなり、バイオ電池の酸素還元カソードとして有用であることが判明した。本研究も順調に進展しているといえる。
奄美群島の小中学校校庭に生育する野生植物の自然教育的効果の解明と教材化

校庭に生育する植物は、児童・生徒にとって最も身近な植物であり、環境教育においてとても重要な要素である。本研究では、奄美群島における環境教育を効果的に進めるための教材として校庭の植物に着目し,教材として活用するための基礎資料として、校庭に生育する全ての維管束植物のリストと簡単な写真図鑑を作成した。奄美大島(8校),加計呂麻島(3校),喜界島(3校),徳之島(8校),沖永良部島(7校),与論島(3校)において校庭の植物相調査を行った.その結果,合計で887種の維管束植物が確認された。そのうち、在来種は386種、帰化種(外来種)は140種、栽培種は291種(栽培かつ帰化種1種含む)、同定不能種は70種であった。本研究では、奄美大島と徳之島では春季と夏季の2シーズン,それ以外の島は春季調査のみ調査を行った。全ての学校において春季と夏季2シーズンの調査を行うことができなかったため単純な比較ができないが、春季と夏季合わせた奄美大島と徳之島の学校ではおよそ200種、それ以外の島の学校のように春季調査のみの調査だと100から150種が確認できることが明らかになった。また、本調査では校庭に生育する絶滅危惧種も確認された。例えば、マツバラン(準危惧)、オオタニワタリ(危惧II)、オキナワチドリ(危惧II)、フウラン(危惧II)、ヒメイヨカズラ(危惧IB)、ハマクワガタ(危惧II)、イヌノフグリ(危惧II)などである(いずれも環境省の指定)。このように、奄美の学校の校庭は少なくとも100種以上の植物がみられる場所であり、時には希少植物が生育していることもあることから,これらの植物を題材とした授業や観察会を試行的に行った。以上の成果から,奄美群島の自然や植物の多様性に関する学習をより効果的に行い、児童の身の回りの生物への興味をおこし、自然を愛し親しむ心の育成につなげる活動へと発展させたい。本研究では,亜熱帯島嶼地域における「身近な自然の観察」に注目する。世界遺産候補地である奄美群島を対象とし、その小中学校校庭に自生する植物の種組成と種多様性を明らかにし、環境教育的効果を検討することを目的とする。27年度は奄美大島と薩摩半島鹿児島市内で調査を行った。まず,校庭の植物相を把握するために学校の敷地内で植物相調査を行い、園芸植物を含む全ての維管束植物のリストを作成した。奄美大島と加計呂麻島において2015年8月と9月に11の小中学校において植物相調査を行ったところ、合計で約500種の維管束植物が確認された。各校における総出現種数の平均は約140種で、そのうち自生は平均約76種、植栽は平均約67種であった。自生のアキノノゲシ、オオバコ、オニタビラコといった畑地や路傍雑草類や、植栽のソテツ、ガジュマル、ブッソウゲなどは11の学校のほとんどで生育が確認された。一方、アダン、アカテツといった海岸林構成種が見られる学校や、希少種のマツバランが生育している学校、アマミヒイラギモチなど奄美の固有種を植栽している学校など、各校の特異性もみられた。同様の調査を,薩摩半島に位置する鹿児島市の3つの小学校で行ったところ,合計で319種の植物がみられた.これらの植物のうち197種が在来、38種が帰化、74種が栽培、10種が不明であった。また,シダ植物は12科22種、裸子植物は7科10種、単子葉類は14科56種、合弁花類は17科74種、離弁花類は53科154種、不明が3種であった。さらに,校庭に成立する植物群落の種組成と構造を解明することを目的として植物社会学的植生調査による群落区分を行うとともに,教科書に記載されている植物の把握,GISによる学校周辺の植生構造の分析を進めた。当初の計画で予定したとおり,27年度は奄美では主に奄美大島、鹿児島本土では薩摩半島地域において重点的に調査を行った.当初計画で設定した3つの調査項目の進捗状況は以下の通りである.1)小中学校校庭の植物相の解明に関する調査については,当初計画の通り,奄美大島,薩摩半島の学校において調査を行った.対象校で確認された全ての植物のリストを作成し,生態的特性をまとめた.校庭を構成する植物群落の解明を目的とした植物社会学的植生調査については,対象校を絞って詳細な調査を実施した.2)生活型による出現種の類型化については,計画の通り生活型類型の判定に用いる標本の作製、関連する文献の収集ともに順調に行うことができた。立地環境との関係性の解析については,現地での環境調査は時間的制約が大きく実施することができなかったが,学校周辺環境の評価を行うために,GISによる学校と地形・植生との関係の分析を進めている.3)校庭の植物の自然教育的有効性の検討については,当初計画にあったアンケート調査は行えなかったが,校庭調査を行った学校の教員に対して,聞き取り調査を行った.また,1校において校庭の植物を活用した授業を計画している.本研究では、亜熱帯島嶼地域における「身近な自然の観察」に注目している。世界遺産候補地である奄美群島を対象都市、その小中学校校庭に自生する植物の種組成と種多様性を明らかにし、環境教育的効果を検討することを目的とする。