hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん細胞結合ペプチド高効率探索を実現する操作システムの開発

(1)がん細胞に特異的に結合するペプチドなどの分子を探索するためのマイクロ流路デバイスの完成非特異的結合分子を除去する機能を実装した分子探索マイクロ流路デバイスを作製した.標的細胞培養チャンバの上流に複数の非標的細胞チャンバを直列させることで,非標的細胞に非特異的に結合する分子を除去したうえで標的細胞特異的結合分子を探索することができる.チャンバへの細胞導入時には細胞均一分散構造を設けることで細胞を均一に分散させた状態で培養し,細胞の有効面積を向上させることができた.また,デバイス内にマイクロバルブを組み込むことで,探索ステップに合わせて流路を切り替えることができた.蛍光標識抗体を利用して非特異的結合分子除去機能を確認した.(2)特異的結合分子のがん細胞への結合の効率化細胞培養チャンバの天井高さを変化させるデバイスを製作し,分子と細胞との距離を小さくすることにより,結合分子の回収率を上昇させることを試みた.また,それを蛍光標識抗体を用いた実験により確認した.(3)より高さの高い流路を閉鎖することができるバルブの開発これまで開発したバルブで閉鎖可能な最大流路高さは100 μmであった.これは,浮遊状態の標的細胞が通過するには十分であるが,細胞培養のためにはチャンバの高さは200 μm以上必要である.よって,チャンバと流路の高さが異なり,接続部位において段差が生じ,細胞やサンプルが滞留する問題があった.そこで,液流路断面を工夫したバルブを製作し,チャンバと段差なしに接続できる高さ350 μmの流路を閉鎖可能なバルブの開発に成功した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1)マイクロ流路内におけるペプチドの細胞への結合の効率化マイクロ流路内におけるペプチドの細胞への結合の効率化に取り組んだ.マイクロ流路内において,ペプチドと細胞の結合効率を上げるためには,細胞とペプチドの距離を近づける必要がある.しかし,安定した細胞培養のためには流路高さを高く設定する必要がある.細胞の安定した培養が可能な流路高さと,細胞とペプチドの結合効率向上を両立する方法として,細胞培養チャンバの流路高さを切り替える方法を提案した.ペプチドと細胞の結合効率を確認するため,ペプチドの回収実験を行った.流路高さ切り替え可能なデバイスにおけるペプチドの回収率は,従来のデバイスと比較して約10倍となった.また,ペプチド探索で重要となる特異的結合ペプチドと非特異結合ぺプチドの比率も,流路高さ切り替え可能なデバイスのほうが高くなった.これにより,流路高さを切り替えることがペプチドと細胞の結合効率を上げるために効果的であることが確認できた.(2)抗体修飾磁気ビーズを用いた結合力の弱いペプチドの除去抗体修飾磁気ビーズを用いた,結合力の弱いペプチドの洗浄に取り組んだ.まず,磁気ビーズの導入量の検討を主に行った.細胞培養時にできる細胞培養面の凹凸について,その深さや広さを調査し,それに適応するビーズのサイズを検討した.細胞表面の凹凸は数十マイクロメートルのオーダーであったため,直径10 μm以下のビーズが適していることが分かった.抗体修飾磁気ビーズの作成については,生命系の研究者と共に検討中である.マイクロ流路内におけるペプチドの細胞への結合の効率化については,想定していたよりも容易に実現することができた.一方,抗体修飾磁気ビーズを用いた結合力の弱いペプチドの除去や,ペプチドを用いたスクリーニング実験等の生物を用いた実験については,本研究室は機械系の研究室であり,特別研究も機械系の出身であるためノウハウが少なく,実験が困難であった.そのため,生命系共同研究者への相談や,講習の受講により実験の成功率向上に取り組む.(1)がん細胞に特異的に結合するペプチドなどの分子を探索するためのマイクロ流路デバイスの完成非特異的結合分子を除去する機能を実装した分子探索マイクロ流路デバイスを作製した.標的細胞培養チャンバの上流に複数の非標的細胞チャンバを直列させることで,非標的細胞に非特異的に結合する分子を除去したうえで標的細胞特異的結合分子を探索することができる.チャンバへの細胞導入時には細胞均一分散構造を設けることで細胞を均一に分散させた状態で培養し,細胞の有効面積を向上させることができた.また,デバイス内にマイクロバルブを組み込むことで,探索ステップに合わせて流路を切り替えることができた.蛍光標識抗体を利用して非特異的結合分子除去機能を確認した.(2)特異的結合分子のがん細胞への結合の効率化細胞培養チャンバの天井高さを変化させるデバイスを製作し,分子と細胞との距離を小さくすることにより,結合分子の回収率を上昇させることを試みた.また,それを蛍光標識抗体を用いた実験により確認した.(3)より高さの高い流路を閉鎖することができるバルブの開発これまで開発したバルブで閉鎖可能な最大流路高さは100 μmであった.これは,浮遊状態の標的細胞が通過するには十分であるが,細胞培養のためにはチャンバの高さは200 μm以上必要である.よって,チャンバと流路の高さが異なり,接続部位において段差が生じ,細胞やサンプルが滞留する問題があった.そこで,液流路断面を工夫したバルブを製作し,チャンバと段差なしに接続できる高さ350 μmの流路を閉鎖可能なバルブの開発に成功した.

前年に引き続き,抗体修飾磁気ビーズを用いた,結合力の弱いペプチドの洗浄に取り組む.前年に行った,細胞培養時にできる細胞培養面の凹凸の調査を元に,使用するビーズのサイズおよび量を決定する.その後,抗体修飾磁気ビーズを用いて,細胞の凹凸部に沈んで洗浄が困難となったファージの回収が可能であるかを確認する.さらに,一定速度で磁気ビーズを駆動するため,シミュレーションにより磁界の分布を検討した上で,電磁石と顕微鏡画像によるセンシングを用いて磁気ビーズの速度制御を行う.さらに,がん細胞スフェロイドを対象とした探索の高効率化に取り組む.がん細胞スフェロイドを対象とした探索の高効率化には,スラグ流を使用することが効果的であることが分かっているが,探索に必要なステップを実現するためには,直径数百マイクロメートルのスフェロイドが通過可能なサイズの流路の開閉を切り替えることができるバルブが必要となる.そこで,本年度は高さの高い流路であっても閉じることができるバルブの開発を行う.また,開発したバルブをデバイスに組み込み,ペプチド探索の原理検証を行う.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
大規模災害時の健康支援に対する自治体保健部門の受援体制モデルの構築

・本研究は、大規模災害時の被災自治体において健康支援を司る自治体保健部門と被災地外の支援した自治体保健部門の職員を対象に、その支援受入れを困難とする要因を明らかにし、効果的な受援体制を構築し、その効果を検証することを目的としている。・2018年度は、先行研究から支援を受ける側の問題となる要因の抽出及び調査項目の検討を行うことを計画していた。要因の抽出の方法は、1)国内外の文献システムによる検索、各自治体のホームページから資料の収集を行う。2)入手した文献から、被災した自治体の支援を受けるにあたっての課題を抽出する。3)抽出した内容をもとに、その要因を明らかにしたうえで、調査項目を抽出し検討する。4)被災自治体の支援を受けるにあたって、その自治体の被災状況及び住民の価値観等により異なると考えられるため、その自治体の特徴について概観することであった。・文献検索は国内文献を対象とし、医学中央雑誌WEB版とCiNiiのデータベースを用いて検索を行った。期間は2009年から2018年までの文献を対象とし、キーワードは「災害」「受援」と、自治体の受援の課題について検討するため「自治体」も加えた。分析は、大規模災害時の被災自治体において健康支援を司る保健部門の受援の課題および受援を円滑にするための対策の書かれた部分を、文脈単位で抽出し、コード化し、類似したコードをサブカテゴリー化、さらにカテゴリー化した。・キーワードによる検索結果から抽出した文献は15件であり、さらに研究目的、研究対象、研究結果から本研究の目的に関連する入手可能な9件を対象文献とした。・大規模災害時の被災自治体が支援を受ける際の課題として<受援計画の未整備><地域防災計画の不統一>が挙げられた。また受援対策として<受援計画の整備><災害時の公衆衛生活動の準備><災害時の適切な初動対応>等が必要であると明らかになった。・文献数が当初考えていたものよりも少なかったため、文献から抽出した内容をもとに、支援を受ける際の課題や要因を明らかにすることが難しく、調査項目を抽出・検討するまでに至らなかった。・被災自治体が支援を受け入れる場合、被災状況及びその地域住民の価値観や文化的な影響も無視できず、その自治体の特徴を概観する必要があると考えていた。しかし、文献検討が遅れてしまい、自治体の情報収集ができず、各自治体の特徴を整理し概観するに至らなかった。・次年度は、受援側である自治体保健部門職員が、支援側である自治体保健部門職員の支援の受入れが困難となった要因を聞き取り調査により明確化する計画である。・自治体への聞き取り調査は2019年9月以降に実施する計画であるため、早急に文献検索を再度行い先行研究からの要因分析を行う。その際、キーワードは「災害」「受援」で検索し精査していく。また、対象自治体の特徴を明らかにするため、予定している自治体について情報収集を行う。・聞き取り調査にあたっては、倫理審査委員会に申請し承認を得る必要があり、その準備を行い、承認が得られしだい調査を実施する。・2018年度の成果については、2019年度日本災害看護学会第21回学術集会で発表予定である。学会に参加し、本テーマに関する意見をいただき、また、情報収集を行うなど今後の研究に反映させていきたいと考えている。

・文献数が当初考えていたものよりも少なかったため、文献から抽出した内容をもとに、支援を受ける際の課題や要因を明らかにすることが難しく、調査項目を抽出・検討するまでに至らなかった。・被災自治体が支援を受け入れる場合、被災状況及びその地域住民の価値観や文化的な影響も無視できず、その自治体の特徴を概観する必要があると考えていた。しかし、文献検討が遅れてしまい、自治体の情報収集ができず、各自治体の特徴を整理し概観するに至らなかった。・次年度は、受援側である自治体保健部門職員が、支援側である自治体保健部門職員の支援の受入れが困難となった要因を聞き取り調査により明確化する計画である。・自治体への聞き取り調査は2019年9月以降に実施する計画であるため、早急に文献検索を再度行い先行研究からの要因分析を行う。その際、キーワードは「災害」「受援」で検索し精査していく。また、対象自治体の特徴を明らかにするため、予定している自治体について情報収集を行う。・聞き取り調査にあたっては、倫理審査委員会に申請し承認を得る必要があり、その準備を行い、承認が得られしだい調査を実施する。・2018年度の成果については、2019年度日本災害看護学会第21回学術集会で発表予定である。学会に参加し、本テーマに関する意見をいただき、また、情報収集を行うなど今後の研究に反映させていきたいと考えている。・文献検索に時間が必要であったため、文献から抽出した要因をもとに調査項目を出したうえで、専門家から調査項目について知識の提供を受ける予定でいたが、そこまでに至らなかった。また、被災自治体に出向き情報収集することができなかったため、当初計画していた旅費、謝金の支出金額が少ない状況にある。・ネットワークから独立した環境で使用するノートパソコンを購入する予定でいたが、その環境を必要とする状況になかったため購入を見合わせることになり、物品費の支出が少なかった。・次年度は被災自治体からの情報収集、研究成果発表のための旅費が必要である。調査票に関する専門家の助言のための謝金、データ入力のためのノートパソコンを購入するための物品費の支出を予定している。
生物時計とＡ－ｔｏ－Ｉエディティングの新しい連関とリズミックな転写後制御の重要性

哺乳類の概日時計においては、転写因子であるCLOCKとBMAL1がDNA上の時計シスエレメントE-boxに約一日周期で結合と解離を繰り返し、多様な遺伝子の転写リズムを誘起する。当研究室においては、CLOCKが結合するDNA領域を網羅的に同定し、さらにトランスクリプトーム解析が行われた。この先行研究のデータを基に本研究では、概日制御を受ける新規遺伝子群を同定し、概日時計に関与する新規の分子機構の解明を目的とした。昨年度までに申請者は、A-to-I RNAエディティング酵素をコードするAdar2のイントロン領域にCLOCKがリズミックに結合していること、並びにAdar2のmRNA量及びエディティング活性がマウス肝臓において概日変動することを見出している。本年度はまず、概日時計がエディティング活性を制御するという仮説を検証するため以下の実験を行った。CLOCKがリズミックに結合しているAdar2のイントロン領域をクローニングし、Luciferase発現vectorに組み込んだ。このレポーターを用いた転写解析により、Adar2の転写がCLOCK-BMAL1により制御されていることが示された。さらに、Adar2の発現リズムが消失しているBmal1ノックアウトマウス、及びAdar2ノックアウトマウスにおいて、転写産物中のエディティング効率リズムを測定した。その結果、野生型マウスにおいて見られたエディティング効率の概日リズムは、これらのノックアウトマウスにおいて消失していることを見出した。一方、Adar2が概日時計の発振系そのものにフィードバックしている可能性について検証するため、Adar2ノックァウトマウスの輪回し行動リズム解析を行った。その結果、Adar2ノックアウトマウスの行動リズムは、コントロールマウスと比較して有意に短周期であることが判明した。これらの実験結果から、概日時計とA-to-I RNAエディティングという二つの分子機構における双方向の連関が初めて明らかになった。(抄録なし)哺乳類の概日時計においては、転写因子であるCLOCKとBMAL1がDNA上の時計シスエレメントE-boxに約一日周期で結合と解離を繰り返し、多様な遺伝子の転写リズムを誘起する。本年度はまず、転写因子であるKLFファミリー群のmRNA量がマウス肝臓において日周変動していることをqRT-PCRにより確認した。そこで、これら遺伝子群の近傍に存在するE-box周辺配列をluciferase発現vectorに組み込んだ。これらのレポーターを用いてluciferase assayを行い、KLF遺伝子群がCLOCK-BMALlによる発現制御を受けることを示した。また申請者は、A-to-I RNAエディティング酵素をコードするAdar2のイントロン領域にCLOCKがリズミックに結合していることを見出した。さらに、Adar2 mRNA量がマウス肝臓において日周変動していることも確認できたので、Adar2のリズミックな発現がCLOCK-BMAL1により制御されているか否かを検証した。具体的には、時計遺伝子群の発現リズムが失われているBMAL1ノックアウトマウスの肝臓において、Adar2のmRNA発現リズムが消失していることを示した。さらに、エディティング制御を受ける遺伝子群の転写産物において、エディティング効率が概日変動していることを示した。これらの結果により、概日時計による新規の出力機構の一端を明らかにした。交付申請書に記載したとおり、概日制御を受ける新規の遺伝子群としてKLFファミリーを同定した。また、BMAL1ノックアウトマウスにおいてAdar2の発現リズムが消失していることを示した。また、既知エディティング部位におけるエディティング効率が日周変動していることを明らかにした。

ADAR2がリズミックに発現することにより、エディティング活性が概日変動しているのか確認するために、ADAR2のノックアウトマウスを購入する。そのマウス肝臓の転写産物中におけるエディティング活性が概日変動しているか否かを検証する。また、ADAR2が概日時計の発振機構そのものを制御している可能性について調べるために、ADAR2ノックアウトマウスを用いて、輪回し行動リズム解析などの表現型解析を行う。(抄録なし)
18世紀女性論の基礎研究

17世紀末から18世紀にかけて、新しい市民社会の成立期に、イギリスではジャーナリズムが世論の形成に大きな役割を果たすようになった。この時期に、特に女性読者に対して、読書の必要や生活の中でのモラルを説いて、女性の知的・道徳的向上と社会の改良を目指した新聞『スペクテーター』がある。今回、この『スペクテーター』を中心として、その前身の『タトラ-』および同時期のフランスの雑誌『メルキュール・ギャラン』の女性論を取り上げ、比較研究した。この時期は、英文学史上では、散文、特に小説という形式が発達する重要な時期であるが、小説の読者であり支援者でもあった女性達に注目する研究はこれまでになかったものである。女性論の中でも、女性と読書、および会話についてのテーマを中心に調べたが、『タトラ-』に取り上げられた当時の女性教育改革論者、メアリ-・アステルについても調査を始めることができた。メアリ-・アステルは、女性のための大学教育をすでに十八世紀初期に構想していた人物で、ロックやフェヌロンなどの女性教育論と比較しながら彼女の女性教育のプランの独自性を研究することが課題の一つとなろう。また、今後、18世紀半ばの新聞『フィーメール・スペクテーター』などにも対象を広げ、女性の本質論、社会的役割、家庭における位置、女性教育、子育て、女性の生活など、さまざまな分野にわたる女性論を収集し、その分類整理を行うことによって、将来の史的・文学的研究の基礎を作りたいと考えている。
マイクロバブル・ボディーフィード型新規濾過システムにおけるケーク剥離特性の評価

「マイクロバブル(MB)ボディーフィード型ケーク濾過法」におけるケーク剥離特性を調査した。考案した解析手法を用いてカオリン懸濁液の上向流濾過における剥離量を算出し,MBを混合するとケーク剥離量が大きくなること,その効果は懸濁液濃度が高いほど顕著となることを明らかにした。また,下向流濾過における濾過ケークを定速度で逆洗し,ケーク強度がMBのボディーフィードにより低下することを明らかにした。本研究では,「マイクロバブル・ボディーフィード型ケーク濾過法」におけるケーク構造と剥離特性に与えるマイクロバブル(MB)の影響を調査する。平成25年度は気泡せん断型マイクロバブル発生機によりMB含有水を調製し,MB含有水を混合した固液混合物の沈降特性,凝集特性を調査した。カオリン(体積基準メジアン径5.2μm)懸濁液にMB含有水を添加し,懸濁粒子の凝集挙動・沈降挙動を調査した。希薄な懸濁液(粒子濃度0.05wt%)にMB含有水を添加した系では,無添加の系に比べ1μm付近の粒子が減少し4μm以上の粒子が増加していた。粒子濃度0.5,1,2wt%の懸濁液で光学密度の経時変化を調査した。粒子濃度0.5,1wt%の懸濁液の系では,MB水添加の有無による懸濁液の清澄速度に差異は見られなかったが,2wt%ではMB水を添加した系の方がより速く清澄化した。粒子濃度310wt%に調製した懸濁液において界面沈降挙動を調査した。MB水を添加した系では添加しない系に比べ,界面沈降速度が増加した。この濃度領域ではカオリンは自然凝集体を形成する。沈降法から求めた凝集体径は,MB水を混合しない系において86.9μmであった。一方,MB水を添加した系では,15%ほど凝集体径が大きくなった。懸濁系の動電学的特性を調査するため,回転カラム法により沈降電位の測定系を構築した。沈降電位から求めたカオリン凝集粒子のζ電位には,MB水混合の有無による有意差はみられなかった。本研究では,「マイクロバブル・ボディーフィード型ケーク濾過法」におけるケークの剥離性に与えるマイクロバブル(MB)の影響を調査した。MB含有水は気泡せん断型マイクロバブル発生機により調製した。まず,MB含有水をカオリン(体積基準メジアン径5.2μm)懸濁液に添加し,懸濁粒子の凝集挙動・沈降挙動を調査した。1希薄な懸濁液(粒子濃度0.05wt%)にMB含有水を添加した系では,無添加の系に比べ1μm付近の粒子が減少し4μm以上の粒子が増加していた。2粒子濃度0.5,1,2wt%の懸濁液で光学密度の経時変化を調査した。粒子濃度0.5,1wt%の懸濁液の系では,MB含有水添加の有無による懸濁液の清澄速度に差異は見られなかったが,2wt%ではMB含有水を添加した系の方がより速く清澄化した。3粒子濃度310wt%に調製した懸濁液において界面沈降挙動を調査した。MB含有水を添加した系では添加しない系に比べ,界面沈降速度が増加した。次いで,MB含有水添加と未添加のカオリン懸濁液を用い,水平濾材に対し濾液の流れ方向が重力と反対方向である上向流濾過と,濾液の流れ方向が重力方向である下向流濾過を定圧条件で行った。これらの結果から,「濾過速度の逆数」と「粒子沈降の影響を考慮した積算濾液量」の関係を求め,上向流濾過におけるケーク剥離量の経時変化を算出する手法を考案した。この手法を用いて,MB含有水を混合したカオリン懸濁液の上向流濾過における剥離量を算出した結果,MB含有水未混合のカオリン懸濁液の上向流濾過に比べ,剥離量が大きくなること,また,その差異は懸濁液濃度が高いほど顕著となることを明らかにした。工学本年度の目標であるマイクロバブルの混合の有無による懸濁粒子の凝集状態の違いをとらえることができた。順調に成果が得られているので,当初の計画に従って研究を進める。現有の実験試料・研究機材・器具を有効活用したため,次年度使用額が生じた。当初の計画に加え,ケークの剥離挙動を広範に調査するための器具の試作,実験器具の購入に使用する。
ニンジン不定胚形成過程における細胞の機能分化

植物の初期発生は母体の子房内で行われるため、その過程を生化学的手法で解析することは困難である。しかし、ニンジンでは外部環境の制御により効率よく不定胚を誘導できることから、細胞あるいは分子レベルから発生過程を解析する材料としてしばしば用いられてきた。本研究では、胚分化能をもった細胞と分化能を失った細胞について、主として核蛋白分子種の差異という観点からその特性を明らかにした。同時に、発育初期の胚を構成している細胞の機能的分化を調べることを目的として、胚の各組織に由来する細胞の分画を試みた。ニンジンの培養細胞は、無菌発芽させた芽生えの胚軸から2,4-Dを含む培地を用いて誘導し、液体培地中で維持した。ニンジンの培養細胞は継代回数が少ない場合、いずれも高い胚分化能を示したが、長期間の継代により、胚分化能の低下、あるいは消失という現象が認められた。このように継代培養の期間を調節することで得られた胚分化能の異なる細胞株について、希硫酸可溶性の核蛋白分子種を電気泳動法により検討した。電気泳動は一次元目をAUTとし、二次元目をSDS-PAGEで展開した。その結果、いずれの培養細胞から得せれた蛋白もヒストンの明確なスポットが認められ、酷似したパタ-ンを示したが、高い胚分化能をもつ細胞と、分化能を失った細胞では、SDSの系で分子量20-50kdに検出されるいくつかの蛋白について量的に顕著な差が認められた。これらの蛋白は希硫酸可溶性のものの中では量的にも多いことからヒストンH1である可能性が高いが、典型的なH1の挙動とは徴妙に違うことから、分類上の問題も含めて、より詳細な検討が必要とされる。一方、胚を構成している細胞の分画化については、プロトプラストとした上で、Percollを主成分とする密度勾配遠心法により分離する方法が有効であるという結果が得られた。
ウシ乳腺上皮細胞の脂肪酸刺激によるTAG蓄積機構に関与する新規遺伝子の探索

最終年度では、前年度までの結果をまとめて、投稿論文を国際誌に公表を試みた。ヒト乳がん細胞株MCF-7を用いて短鎖脂肪酸受容体GPR41及び43が乳腺上皮細胞に存在し、機能していることを初めて証明しただけでなく、その細胞内情報伝達がストレス応答性のMAPKであるp38を特異的にリン酸化するという新たな知見を得ることができた。さらにその下流因子であるHSP27のリン酸化も起こることも確認した。これらの現象がGPR43を介して起こるということをsiRNAによって証明できた。これらの成果をCellular Signalling誌で公表することができた。また、ウシのオーソログであるbGPR41及び43もウシ乳腺上皮細胞株(bMEC)及び泌乳期乳腺組織で確認でき、bMECでも上述の現象と類似の結果を得ることができた。MCF-7との違いは、bMECではbGPR41の発現が高く、おそらくGPR41を介して細胞内情報伝達を行っていると推測される。この成果は、現在、国際誌に投稿中である。また、bMEC及び乳腺組織において長鎖脂肪酸受容体GPR40オーソログであるbGPR40が存在し、不飽和脂肪酸であるオレイン酸やリノール酸によって強くシグナルを活性化されることが明らかにでき、また、細胞内情報伝達が細胞増殖を促進するERK1/2と細胞生存を促すAkt経路を活性化することを証明できた。加えて、オレイン酸及びリノール酸によって細胞増殖効果が確認できた。加えて、無血清培養条件においても細胞増殖を促した。bMEC及び乳腺組織においてVisfatin/PBEFが存在し、ウシ乳汁中に分泌されていることが初めて証明された。この成果はFEBS lettersに公表することができた。その他のスクリーニング因子の結果も投稿準備中であり、今後、公表する予定である。本研究ではウシ乳腺上皮細胞株を用いて脂肪酸刺激による細胞内TAG蓄積時のRNAを採取しDifferential Display Methodを用い刺激時に顕著な発現差が見られる遺伝子を網羅的にスクリーニングし、未知遺伝子であれば、その生理機能を解明する。また既知遺伝子でも通常の切り口では予想できない遺伝子が発現変化する可能性があることから、既知遺伝子の別の生理機能を明らかにすることができる有益な研究である。ウシ乳腺上皮細胞株への短鎖及び長鎖脂肪酸刺激を行い、RNAを抽出しDD-RT-PCRを行ったところ、数多くのクローンを得ることができた。その内発現差が顕著だった遺伝子の中から、現在、培養細胞を用いて、11の遺伝子について解析を行っているところで、うち3つの遺伝子について論文を作製し、その成果について国際誌に投稿している。また、長鎖及び短鎖脂肪酸で発現が顕著にダウンレギュレーションする遺伝子として、スクリーニングしたクローンがウシの脂肪酸受容体と思われる4つの遺伝子群であった。これは、乳腺上皮細胞に脂肪酸受容体群が発現していて、乳腺組織において、なんらかの生理作用を担っていることを示す非常に興味深い結果である。今後、詳細な生理的意義を解明していく。現在、RACE法による完全長cDNAを取得し、真核生物細胞株に遺伝子導入を試みており、細胞内のシグナリングなどの機能相補を進めているところである。その後、抗体を作製し蛋白質レベルで検討する。さらにウシの各泌乳ステージにおける組織片及び切片を用いて個体レベルでも検討する予定である。その内発現差が顕著だった遺伝子の中から、現在、培養細胞を用いて、11の遺伝子について解析を行っているところで、うち3つの遺伝子について論文を作成し、その成果について国際誌に投稿している。長鎖及び短鎖脂肪酸受容体について、培養細胞を用いた実験により、細胞内シグナルにおいて新たな知見が得られた。この脂肪酸受容体のうち短鎖脂肪酸受容体に関して、培養細胞だけではなく泌乳期乳腺組織での発現を確認しており、論文を現在国際誌に投稿している。今後、固体レベルで詳細な生理的意義を解明していく。現在、ウシの23組織のcDNAをサンプル調整が終わったところで、各遺伝子のディストリビューションを確認するところである。

これらの成果をCellular Signalling誌で公表することができた。また、ウシのオーソログであるbGPR41及び43もウシ乳腺上皮細胞株(bMEC)及び泌乳期乳腺組織で確認でき、bMECでも上述の現象と類似の結果を得ることができた。MCF-7との違いは、bMECではbGPR41の発現が高く、おそらくGPR41を介して細胞内情報伝達を行っていると推測される。この成果は、現在、国際誌に投稿中である。また、bMEC及び乳腺組織において長鎖脂肪酸受容体GPR40オーソログであるbGPR40が存在し、不飽和脂肪酸であるオレイン酸やリノール酸によって強くシグナルを活性化されることが明らかにでき、また、細胞内情報伝達が細胞増殖を促進するERK1/2と細胞生存を促すAkt経路を活性化することを証明できた。加えて、オレイン酸及びリノール酸によって細胞増殖効果が確認できた。加えて、無血清培養条件においても細胞増殖を促した。bMEC及び乳腺組織においてVisfatin/PBEFが存在し、ウシ乳汁中に分泌されていることが初めて証明された。この成果はFEBS lettersに公表することができた。その他のスクリーニング因子の結果も投稿準備中であり、今後、公表する予定である。
身体的姿勢によって変容する視空間の特性：斟酌理論に照らして

本研究の目的は,触覚を含む自己受容覚の変化によって奥行き知覚が影響されるようすを両眼網膜像差,きめの勾配,陰影の手がかりごとに記述することであった.3実験の結果,1)両眼網膜像差は姿勢の効果(上方視,前方視,下方視)の効果がまったく認められなかった.2)きめの勾配については,姿勢の効果は認められなかったが,床パターンは天井パターンに比べて,前額平行面に近づいて見えた.3)陰影には姿勢の効果が認められた.陰影刺激を上方視で観察したときは,他の条件(前方視,下方視)と比べて,凸に見える頻度が高まる傾向があった.この実験では,奥行きの手がかりと自己受容覚の関係を明らかにした。検討する手がかりとして,両眼網膜像差,きめの勾配,陰影を用いた。距離の手がかりには,刺激図形の正立・逆転にほとんど関係なくはたらく両眼網膜像差と,刺激図形の正立・逆転に依存して奥行きの関係が変わる陰影や奥行き反転図形と,その中間に位置するきめの勾配とがあるが,自己受容覚の変化は,どの種類の奥行きの手がかりに影響するのかを明らかにした。実験では被験者にヘッド・マウンティッド・ディスプレイHMDを装着させることによって,身体が屈曲しても目に与えられる網膜像を一定にした。1両眼網膜像差を網膜に与える実験では,像差が7段階にわたって変化するステレオグラムを作成し,それをHMDの中に提示して,観察者には,正立した条件,天井を見上げた条件,足元を見おろした条件のもとでステレオグラムを融合させ,そのときに知覚された奥行きを判断させた。2きめの勾配を用いる実験では,きめの勾配が強く作用している10図形を選抜し,観察者には,上で述べた同じ3姿勢条件のもとで,各図形の正立画と倒立画を継時観察させて,奥行き量の判断を求めた。3陰影を用いる実験では,刺激図形を180°回転させると奥行きの関係が逆転するような10図形(クレータの写真など)を単眼提示した。観察者には,上で述べた同じ姿勢条件のもとで各図形を観察し,その見え姿の報告を求めた。1)昨年に行った実験から,陰影のある図形は,頭部の方向が奥行きの知覚に影響することがわかったので,今年度は,この現象の発現条件を確定するために,頭部を正立させたとき,天井の方向を見たとき,足元の方を見たときのそれぞれにおいて,陰影図形を与た.用いた図形は「球」「蛤」「鶴」であり,各図形には陰影が施されていた.各図形を0度から180度までの7段階に回転して,HMD(Head Mounted Display)の中に提示した.22人の観察者は,各頭部位置において,この21図形の奥行き感(突き出した図形か,窪んだ図形か)の判断を行った.図形と方向の各組み合わせはランダムに5回提示された.実験の結果,頭の方向の効果は,「蛤」図形を頭を上に向けて観察したときに「突き出して」見える傾向が得られたが,「球」と「鶴」図形では,そのような頭の方向の有意な効果は得られず,3つの頭の方向の間には有意な差が認められなかった.このことは,特定の図形にのみ頭の方向の効果が現れたことを意味する.2)昨年に行った実験から,円あるいは方形からなるきめの勾配のある図形は,頭部の方向によって,その奥行きの知覚が変わることはなかったが,図形自体の方向によって奥行きの知覚に大きな影響が得られた.すなわちきめの勾配によってつくられた面が床パターンとして見えたときは,天井パターンや側壁パターンとして見えたときに比べて,奥行き感がいちじるしく縮んだのである.このことを今年度はさらに追及するために,運動視差を用いてきめの勾配をつくり,昨年と同様の実験を行った.その結果,きめの勾配を持つパタンが床として見えたときには,奥行きが縮まり,これは昨年に行った静止パターンと同じ結果を示したといえる.本研究の目的は,触覚を含む自己受容覚の変化によって奥行き知覚が影響されるようすを両眼網膜像差,きめの勾配,陰影の手がかりごとに記述することであった.3実験の結果,1)両眼網膜像差は姿勢の効果(上方視,前方視,下方視)の効果がまったく認められなかった.2)きめの勾配については,姿勢の効果は認められなかったが,床パターンは天井パターンに比べて,前額平行面に近づいて見えた.3)陰影には姿勢の効果が認められた.陰影刺激を上方視で観察したときは,他の条件(前方視,下方視)と比べて,凸に見える頻度が高まる傾向があった.平成23年度に行った実験では,個別の手がかりの奥行きと自己受容覚の関係を明した.検討する手がかりとして,両眼網膜像差,きめの勾配,陰影を用いた.距離の手がかりには,刺激図形の正立・逆転にほとんど関係なくはたらく両眼網膜像差と,刺激図形の正立・逆転に依存して奥行きの関係が変わる陰影や奥行き反転図形と,その中間に位置するきめの勾配とがあるが,自己受容覚の変化は,どの種類の奥行きの手がかりに影響するのかを明らかにした.実験では被験者にヘッド・マウンティッド・ディスプレイHMDを装着させることによって,身体が屈曲しても目に与えられる網膜像を一定にした.

(1)両眼網膜像差を網膜に与える実験では,像差が9段階にわたって変化するステレオグラムを作成し,それをHMDの中に提示して,観察者には,正立したままで,あるいは股のぞきをしたままで,ステレオグラムを融合させ,そのときに知覚された奥行きを推定させた.(2)きめの勾配を用いた実験では,きめの勾配が強く作用している図形を選抜し,観察者には,上で述べた同じ2姿勢条件のもとで,各図形の正立画と倒立画を継時観察させて,奥行きがはっきり知覚される図形の選択判断を求めた.また,線遠近画の傾きをさまざまに傾けて,各姿勢のもとでその見かけの傾きを判断させた,(3)陰影を用いる実験では,刺激図形を180度回転させると奥行きの関係が逆転する図形(クレータの写真,シュレダーの寒暖図形など)を単眼提示した.観察者には,上で述べた同じ2姿勢条件のもとで各図形を観察し,その見え姿を報告するように求めた.現在,得られたデータの整理を行っている.頭の位置の変化にともなう自己受容覚の変動が,どのように奥行きの視知覚に影響するのかを明らかにした。とくに,個別の手がかりの奥行きと自己受容覚の関係を明らかにした.検討する手がかりとして両眼網膜像差,運動視差,きめの勾配,陰影を用いた.実験では被験者にヘッド・マウンティッド・ディスプレイHMDを装着させることによって目に与えられる網膜像を一定にし,頭を上方,前方,下方に傾けて画像を観察した.1両眼網膜像差の実験では,像差が9段階にわたって変化するステレオグラムを作成し,それをHMDの中に提示して,観察者は,上述した位置に頭を定めステレオグラムを融合させ,そのときに知覚された奥行きを巻尺の大きさで再生した.2運動視差の実験では,画面上部から下部にかけてドットの移動速度が線形的に高速になる7勾配刺激を提示し,観察者はそれを上述した頭の位置で観察し,その傾きを視覚勾配尺度を用いて判断した.3きめの勾配の実験では,きめの勾配が強く作用している7図形を選抜し,観察者には,上で述べた同じ3姿勢のもとで,各図形の正立画と倒立画を観察させて,傾きを視覚勾配尺度を用いて判断した.4陰影の実験では,刺激図形を180度回転させると奥行きの関係が逆転するような5図形(菓子型の写真など)を準備し,観察者は,並置された正立図形と180度回転図形を単眼観察した.観察者は,上で述べた3姿勢のをとり,凸として現れた刺激を選択した.研究の結果,両眼網膜像差と運動視差は,頭の位置の影響を受けず奥行きをつくりだした.きめの勾配は,刺激図形の正立・逆転に依存して奥行きの関係が変わったが,頭の位置の影響は受けなかった.陰影図形は,刺激図形の正立・逆転に依存して奥行きが変化したが,頭の位置によっても奥行きが変化した.陰影図形は,頭を上を向けて観察したときに凸として現れやすかった.心理学とくに困難なく,研究計画が実施できたから。得られた結果も。じゅうぶんに解釈できるようなものであった。本申請課題は,身体(とくに頭)の方向と奥行き(あるいは面の傾斜)知覚の関係を明らかにすることを目的としている.すでに過年度までに,さまざまな種類の距離の手がかり(両眼像差,運動視差,線遠近,反転図形)を含む図形を,頭部をさまざまに傾斜させて観察させたところ,陰影のある図形が,もっとも頭部の方向の影響を受けることが判明し,きめの勾配を含む図形は,頭部の方向の影響を受けないが,図形自体の方向の影響を受けることが明らかとなった.これら一連の実験によって,上述のごとく,頭部の方向によって影響される距離の手がかりが特定されたと考えられるからである.平成23年度に行う予定の実験と平成24年度に行う実験の実施順序を逆にして,実施しやすいものから手を付けたために,研究が予想以上に進展した.本年度は,当初の実験計画に従って,頭の方向判断と視覚線分の方向判断の測定を行う。
Drop-seqによる不均一性を伴う患者由来大腸癌組織微小環境の単一細胞解析

大腸癌には腫瘍微小環境中内にheterogeneityといわれる高度な不均一性をもっており、その不均一性は、癌細胞だけでなく微小環境を形成する免疫細胞などの間質細胞にも観察される。本研究は大腸癌の治療抵抗性を腫瘍微小環境の不均一性という側面から検討する研究である。本研究により大腸癌治療抵抗性に関わる重要な細胞集団やそれに関わる癌微小環境中の間質細胞集団やその特性が同定され、新規治療法の開発につながれば、従来の癌治療の飛躍的な進歩をもたらす。そのインパクトは大きく、学術的にも広範な波及効果が期待される。また将来の大腸癌患者の予後改善という社会的要請に応じ、革新的な貢献をもたらすことが期待される。
遺伝子ノックアウト→レスキューの戦略によるミオシン軽鎖キナーゼの生理機能の解析

平滑筋の収縮がCa^<2+>より制御されていることに関しては、現在、まず異論はないと考えられている。この制御に関しては、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によるミオシン軽鎖のリン酸化を介しているとのリン酸化説が主流的である。しかし最近の先端技術のとり入れにより生理・薬理学的知識は増大し、この明快なミオシン連関制御のみでは説明できなくなって来た。私どもは、後者が次のようにアクチンに連関した強力な制御作用のあることを明らかにした。i)アクチンと結合して、アクトミオシン系に抑制作用をかけること。ii)この作用はCa^<2+>存在下のカルモジュリンで解除されること。しかし、実際にどの様に平滑筋細胞内(in vitro)で機能しているか不明の点が多い。本研究では、i)MLCKのcDNAを利用して大腸菌内でアクチン結合部位を合成させ機能部位を決定することであるが、pET発現ベクター系を用い種々の長さのMLCKを得て、N末端の41残基に機能部位の局在することをつきとめた。次に、ii)平滑筋細胞でMLCKのアンチセンスcDNAを利用してMLCKをノックアウトすることであるが、レトロウイスルpCXLp-プラスミドを平滑筋株SM-3にトランスフェクトさせ、stable transformantを得た。この細胞ではMLCKの発現レベルが下っていた。現在、この細胞の機能を検討中である。この制御に関しては、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によるミオシン軽鎖のリン酸化を介しているとの考えが主流的である。しかし、近年の細胞内Ca^<2+>濃度測定やスキンド標本の作成などの技術革新によりこの明快なミオシン連関制御のみでは説明できない生理・薬理学的観察が積み重ねられて来た。ここでは注目したのはMLCKで、MLCKにはキナーゼ能と共にアクチン結合能が知られているからである。私どもは、後者がアクチンに連関した以下のような制御作用のあることを明らかにした。しかし、実際にどのように平滑筋細胞内(in vivo)で機能しているか不明の点が多い。i)アクチンと結合して、アクトミオシン相互作用を抑制することii)この作用はCa^<2+>の存在下で解除されることiii)アクチンとの結合部位はhigh-affinityとlow-affinityに分離できること本研究は「遺伝子・ノックアウト→レスキュー」の分子生物学上の戦略にのっとり、この問題に一石を投じるべく計画されたもので、i)MLCKの遺伝子を欠く平滑筋細胞をつくり、収縮の変化をみる。ii)細胞膜破壊標本にして、精製MLCK、さらにはMLCKのアクチン結合ドメインを与え収縮の回復をチェックするものである。本年度は、用いる平滑筋株SM-3の培養と、用いるベクター:CXL・レトロウイルスの感染性のチェックを行い、本研究の技術的基礎を得た。しかし最近の先端技術のとれ入れにより生理・薬理学的知識は増大し、この明快なミオシン連関制御のみでは説明できなくなって来た。本研究では、i)

MLCKのcDNAを利用して大腸菌内でアクチン結合部位を合成させ機能部位を決定することであるが、pET発現ベクター系を用い種々の長さのMLCKを得て、N末端の41残基に機能部位の局在することをつきとめた。次に、ii)平滑筋細胞でMLCKのアンチセンスcDNAを利用してMLCKをノックアウトすることであるが、レトロウイスルpCXLp-プラスミドを平滑筋株SM-3にトランスフェクトさせ、stable transformantを得た。この細胞ではMLCKの発現レベルが下っていた。現在、この細胞の機能を検討中である。
緑膿菌５型分泌装置由来の新規な分泌蛋白質の細胞接着性と感染防御抗原性の解析

日和見病原体である緑膿菌は、易感染性宿主に対して難治性を呈する様々な感染症を惹起し、近年では多剤耐性緑膿菌による院内感染が問題である。緑膿菌は、様々な細胞付随形ならびに分泌形の病原性因子を産生する。なかでも5型分泌蛋白質が緑膿菌の病原性に関与するのかは十分に解明されていない。そこで、本研究では、緑膿菌5型分泌蛋白質の一種であるEprSが、病原性因子として機能するのかについて解析を行った。その結果、EprSは、塩基性アミノ酸残基のC末端側を切断する基質特異性を示すセリンプロテアーゼであり、プロテアーゼ活性化受容体を介して炎症応答を誘導することが示唆された。緑膿菌感染症対策の一つとしてワクチンの開発は重要であるが、今日までに開発された緑膿菌ワクチンは、その効果と副作用について種々の問題を抱えており、新規なワクチンの開発が望まれている。そこで、本研究では緑膿菌の5型分泌装置によって分泌される蛋白質が、緑膿菌感染予防ワクチンの抗原として有用なのかを解明することを目的としている。平成25年度は、緑膿菌5型分泌蛋白質の一種であるPA3535 (EprS)について次の成果を得た。(1)アラビノース誘導型発現ベクターを用いて大腸菌における緑膿菌EprSの分泌発現系を構築した。本発現系におけるEprSの発現は、期待通りに菌体外で認められた。菌体外へ分泌された組換え体EprS (rEprS)は、陰イオン交換、ニッケルキレートカラムを用いて高純度に精製された。(2)EprSのアミノ酸配列から推測されたエピトープペプチドをウサギに免疫し、得られた抗血清をペプチド固定化カラムにてアフィニティ精製することで、EprSへの特異性が高い抗EprSポリクローナル抗体を得た。(3)rEprSは、塩基性アミノ酸残基のC末端側を切断する基質特異性のセリンプロテアーゼであった。(4)機能的なprotease-activated receptors (PARs)を発現しないアフリカミドリザル腎臓繊維芽様細胞株COS-7に、ヒトPAR-1, -2, -4をトランスフェクションすると、rEprS刺激によるNF-kappaBの活性化が認められた。(5)rEprSは、PARsを活性化することが知られているトロンビンやトリプシンと同様の形式で、ヒトPAR-1, -2, -4の細胞外領域を切断する酵素活性を示すことが確認された。(6)rEprSはヒト細気管支上皮細胞株EBC-1においてPAR-2を介してIL-8産生を誘導した。しかし、プロテアーゼ活性を持たない変異体ではIL-8産生の誘導は認められなかった。そこで、本研究では緑膿菌の5型分泌蛋白質であるPA4625が、緑膿菌感染予防ワクチンの抗原として有用なのかを解明することを目的としている。平成24年度は、次の成果を得た。(1)大腸菌における組換え体PA4625蛋白質の分泌発現系の構築とその精製:アラビノース誘導型発現ベクターを用いて大腸菌における緑膿菌PA4625蛋白質の分泌発現系を構築した。本発現系におけるPA4625蛋白質の発現は、期待に反して主に菌体内で認められた。菌体外へ分泌された組換え体PA4625蛋白質が微量であったことから、目的蛋白質の精製は効率的ではなかった。(2)ウサギ抗PA4625ポリクローナル抗体の作製:緑膿菌PA4625蛋白質のアミノ酸配列から推測されたエピトープペプチドをウサギに免疫した。得られた抗血清をペプチド固定化カラムにてアフィニティ精製することで、PA4625蛋白質への特異性が高い抗PA4625ポリクローナル抗体が得られた。(3)緑膿菌PA4625遺伝子破壊株の構築:緑膿菌PAO1株のPA4625遺伝子をpYK1-T遺伝子破壊ベクターを用いて破壊した。PA4625遺伝子の破壊をPCR法により確認した。また、GFPあるいはルシフェラーゼ標識緑膿菌PA4625遺伝子破壊株を構築するために、この株へGFPあるいはルシフェラーゼ遺伝子を導入した。これらの遺伝子の導入をPCR法により確認し、蛍光顕微鏡とルミノメーターを用いて機能的なGFPとルシフェラーゼの発現を確認できた。

緑膿菌感染症対策の一つとしてワクチンの開発は重要であるが、今日までに開発された緑膿菌ワクチンは、その効果と副作用について種々の問題を抱えており、新規なワクチンの開発が望まれている。そこで、本研究では緑膿菌の5型分泌装置によって分泌される蛋白質が、緑膿菌感染予防ワクチンの抗原として有用なのかを解明することを目的としている。この目的達成の前提として、緑膿菌5型分泌蛋白質の一種であるPA3535(EprS)が、病原性因子として機能するのかについて解析を行ってきた。これまでに、EprSが、塩基性アミノ酸残基のC末端側を切断する基質特異性を示すセリンプロテアーゼであることを明らかにした。また、EprSは、プロテアーゼ活性化受容体を介して炎症応答を誘導することから、EprSが緑膿菌の病原性因子として機能する可能性が考えられた。そこで、平成26年度の研究では、病原性因子としてのEprSの役割を明らかにするために、緑膿菌野生型株とそのeprS遺伝子破壊株における各種の表現型を比較し、次の成果を得た。(1)唯一の窒素及び炭素源としてウシ血清アルブミンを含む最少培地における緑膿菌eprS破壊株の増殖率は、野生型株よりも低下した。(2)緑膿菌eprS破壊株では、野生型株と比較して運動性の低下、エラスターゼ及びラムノリピッド産生の低下が認められた。(3)リアルタイムPCR解析によって、緑膿菌eprS破壊株では、エラスターゼなど各種プロテアーゼの遺伝子の発現低下が認められた。このように、EprSは、緑膿菌の様々な表現型に多面的な効果を発揮すると考えられた。細菌学平成25年度の研究計画では、組換え体PA4625蛋白質の機能解析を行う予定であったが、効率的に大量の組換え体PA4625蛋白質を得ることが困難であったことから、研究計画の遅延が予想された。そこで、本研究課題の研究計画調書に研究計画を進展させるための代替案として記載していたPA3535について機能解析を行った。その結果、得られた成果を学術論文と学術集会で発表することができた。PA3535は、PA4625と同じく緑膿菌5型分泌蛋白質の一種であることから、PA3535に関する研究成果は、PA4625の機能解析に活用できると考えられる。従って、本研究はおおむね順調に進展していると考える。効率的に大量の組換え体PA4625蛋白質を精製できなかった点を除いては、平成24年度の研究計画を当初の予定通りに遂行し、上記の項目の成果を得ることができた。目的蛋白質の精製は効率的ではないが、効率を改善するための方策はいくつか存在し、今後の研究計画を大幅に変更するまでに至ってはいない。平成25年度の研究計画がおおむね順調に進展していることから、平成26年度の研究は当初の計画通りに推進する。一方で、平成25年度は、組換え体PA4625蛋白質を実験に必要な十分量を得ることが困難であったことから、組換え体PA4625蛋白質の発現系の検討を引き続いて行う必要がある。そこで、平成26年度は当初から予定していた研究項目に加えて、組換え体PA4625蛋白質の精製効率を改善するために、発現させた異種蛋白質を分泌する能力が大腸菌よりも高い緑膿菌を用いた発現系を検討し、更なる研究の推進を図る。平成24年度の研究計画がおおむね順調に進展していることから、平成25年度の研究は当初の計画通りに推進する。一方で、平成24年度は緑膿菌PA4625
部位特異性突然変異法によるトランスアミナ-ゼ活性域の研究

立体構造についての情報が得られる大腸菌アスパラギン酸トランスアミナ-ゼに系統的なsiteーdirected mutagenesisを行った。変異酵素の大腸菌内大量生産系を確立し、精製変異酵素を用いて酵素化学的性質の変化を解析した。変異の対象は、大腸菌から高等動物の酵素にいたるまで共通に保存され、補酵素ピリドキサル燐酸(PLP)や基質である酸性アミノ酸と相互作用している残基を選び、それらの役割を調べた。基質アミノ酸のαーHの引き抜きという段階が律速段階である。それを行う残基の第一候補と考えられていたLys258の変異酵素をつくり反応動力学や吸収スペクトルの解析を行ってそれを証明した。Asp222変異体の解析からは222位に負電荷が必要なこと、Tyr225変異体の解析からは、225位とPLPの3′ー0^ーの間の水素結合が必要で、この2つの残基が協同で働くことにより、PLPが基質のαーCの周辺から電子を引っ張り、αーHを解離しやすくすることによって触媒効率を上げていることを知った。基質ジカルボン酸の認識にあずかっているArg292や386はLysでは代用されないこと、292位を中性アミノ酸に置換するとジカルボン酸は結合しなくなり、中性アミノ酸に対する反応性が増大することがわかり、基質認識過程での292位の重要性が浮かび上がった。従来より反応過程に必須の働きをすると考えられてきたTrp140は、触媒反応そのものには必須ではなく、ジカルボン酸の認識に働いていること、Tyr70が炭素数4つのAspの認識には関係しないが、炭素数5つのGluの認識に関わっていることを明らかにした。このような解析を通じて、本酵素の示す基質特異性や効率的な触媒反応を与えている分子設計を垣間見ることができた。X線結晶解析デ-タにもとづいて、site-direeted mutagenesisの手段によって大腸菌アスパラギン酸トランスアミナ-ゼの部異特異的変異体を多種作成した。基質であるジカルボン酸を認識しているArg292、Arg386、触媒反応に直接係っていると考えられるTyr70、Tyr225、Lys258、Asp222、His148などを対象とした。基質のαーカルボキシル基、側鎖のカルボキシル基は各々Arg386とArg292に結合していることが結晶解析で分っている。これらのArgをLysに置換した酵素では、いずれの場合も活性は大きく低下し、基質の認識は単なる電荷の問題ではなく、より厳密な相互作用、例えば二本の水素結合による遷移状態の安定化が必要であることが明らかとなった。Arg292をLeu、Valに置換した場合、芳香族アミノ酸への特異性が増大し、特にVal置換体ではその影響が著しいことが分った。目下、全アミノ酸への置換体を作り、基質特異性変換への詳細を解析中である。Lys258をAlaやMetで置換すると、反応はある段階次降進行しなくなることが分り、反応過程の中で、Lys258が基質アミノ酸のαープロトンを引抜く触媒基であるという仮説を証明し得た。〔Asp222→Ala,Asn,Glu〕変異体を用いた実験からは、222位に負電荷が必要なこと、〔Tyr225→Phe〕変異体で活性が無くなることから、225位はチロシンでなければならないことが示された。補酵素を中心に行われるプロトンの移動をこれらの残基が助けることによって触媒効率を高めている状況を、結晶解析の結果と併せ考えつつ、理論的に説明することができるにいたった。