hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メラノサイトの運動能を制御する遺伝子のカタログ化

悪性黒色腫(メラノーマ)は神経堤細胞に起源をもつ色素細胞(メラノサイト)から発生し、、所属リンパ節のみならず肺や皮膚に遠隔転移をきたす最も予後の悪い悪性腫瘍である。平成13年度においては、運動能と浸潤能がすでに評価された7種類のメラノーマ細胞株(低運動性:3種類、高運動性:4種類)、及び正常皮膚メラノサイトを用い、Affymetrix社製GeneChip^<TM>によって約6800個の遺伝子について各々の遺伝子発現の差異を解析し、細胞の運動性に共通した遺伝子発現のパターンの解析を行った。Silicon Genetics社、GeneSpring^<TM>を使用し、階層分析を行った結果、遺伝子発現のパターンからメラノーマ細胞株を低運動性と高運動性に分類することができた。また、細胞外マトリックスに対する接着分子・糖蛋白質、あるいは蛋白分解酵素の活性化にかかわる遣伝子にも共通した発現パターン結果が得られた。特に浸潤性の高い細胞では細胞周期関連タンパク質の発現とよく相関することが判明し、従来まで個別に捉えられてきた細胞増殖機構と細胞運動能について改めて検討すべき課題であろう。一方で、免疫担当細胞に発現するCCR7、CCR10、CXCR4などのケモカイン受容体が通常発現していないメラノーマ細胞に見られたことは、メラノーマ細胞が固有の臓器親和性をもって転移する機構が、免疫担当細胞が個々の臓器に親和性をもって遊走する機構と共通することを示唆している。
高コリンエステラーゼ(ChE)血症におけるC5アノーマリーバンドの成因について

昨年度までのコリンエステラーゼ(ChE)遺伝子〔CHE1〕の検索により、これまで遺伝子変異と考えられてきたC5アノーマリーバンドを伴うChE高活性を呈するC5(+)高ChE血症がChE蛋白に関'与する遺伝子の変異によるものではないと推察された。本年度は免疫混合法にてChE酵素蛋白とその他の生体内物質との関連について検討を加えた。対象として血清蛋白成分であるIgG, IgA, IgMおよびアルブミンの各抗体を患者と反応させた後、遠心分離し上清血清のChE活性を測定した。その結果、いずれの抗体を反応させた血清においてもChE活性値に変化は認められず、ポジティブコントロールとして用いた抗ChE抗体を反応させた血清においてのみChE活性が消失した。またこれらの上清血清を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて電気泳動を実施し、C5バンドの消失の有無を確認したところ、抗ChE抗体を反応させた血清のみが全バンドの消失を認め、それ以外の抗体を反応させたものについては泳動像に変化は認められなかった。これらの結果よりChE活性の異常高値を伴うC5バンドの成因はグロブリンやアルブミンなどの血清蛋白がChE蛋白に結合することによるものではないと推察された。また、ELISA法にて抗ChE抗体を用いChE蛋白量をコントロールと比較して求めた。その結果、C5(-)高ChE血症はコントロールと比べ、単位蛋白当たりの比活性が同程度であるのに対し、C5(+)高ChE血症は1.31.5倍増加していた。つまりC5(+)高ChE血症ではChE酵素自体の活性増強が伴っている可能性が示唆された。このことより、高ChE血症はC5(+)とC5(-)でChE高活性のメカニズムが異なっていることが判明し、C5バンドの成因とChE高活性の関係についてさらに検討を加えていく必要があると考える。当院外来患者よりネフローゼ症候群、甲状腺機能亢進症、脂肪肝、糖尿病等の血清コリンエステラーゼ(ChE)[当院基準値:32006800 IU/L]高値を呈する基礎疾患を有さない患者を対象とした。これらの症例についてポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)法にてC5のアノーマリーバンドの有無を確認し、C5バンドを有する高ChE血症(C5+)を3例,C5バンドを有さない高ChE血症(C5-)を1例見出した。これらの症例では構造遺伝子(Exon2Exon4)領域に於いて共通の変異を見出すことはなかった。さらに調節遺伝子を含むExon1の領域について、新たにプライマーを設計し、ダイレクトシークエンスを実施した。その結果、Exon1に於いても各症例に共通の変異を認めることはなかった。これまでの結果より、我々は従来、遺伝子変異とされていた原因不明の高ChE血症はChE蛋白に関与する遺伝子の変異を伴わないものと考えている。これはMasson Pら(FEBS 262:115-118,1990)が考察しているC5変異が遺伝子によるものではないとの報告と矛盾しない。次年度はこれらの症例についてChE酵素蛋白とその他の生体内物質との関連についての検討を実施する予定である。
製墨技術の変遷に関する研究

本研究では、走査型電子顕微鏡を用いて、墨書土器および硯に付着した墨の煤粒子を観察する。その大きさや形状から、製墨方法や墨品質の差異を明らかにし、各遺跡における墨使用の実態を明らかにすることを目的とする。1日本における墨および製墨技術の変遷2墨からみた地域特性3東アジアにおける墨および製墨技術の伝播以上の3つのテーマを主軸にし、日本各地および韓国、中国へ対象地域を広げ体系的な研究をおこなう。多様な地域や時代の試料を観察することにより、製墨技術研究の基礎となるデータを蓄積し、そのデータから墨の利用や製墨技術の変化をとらえることができる。
メカニカルアロイングによるリチウム侵入型金属間化合物とその電池充放電特性

本研究では、Mgと4族元素であるSiあるいはGeを用いたリチウム貯蔵性金属間化合物Mg_2SiおよびMg_2Snを合成し、それらの性質を調べ、リチウム(イオン)二次電池の負極材料としての可能性を検討した。X線回折より、MgとSiを出発原料として行ったメカニカルアロイング(MA)では、90時間で単一相のMg_2Siが合成されることがわかった。一方MgとGeの場合は、20時間程度のMA処理により比較的結晶性の良いMg_2Geが単一相で得られることがわかった。上述の2種類の試料について、電池充放電サイクル数増加にともなう放電容量の変化を調べた。充・放電試験に用いた試験電極は、MA処理試料粉末、導電材、結着材を混練した後、Cuメッシュ1cm^2上に塗布したものである。混合比率は重量比で、MA処理粉末:導電材:結着材=75:20:5とした。電解液は1MLiCIO_4/PCで、評価セルには対極と参照極をリチウム板とする3極式セルを用いた。Mg_2Siは初期放電容量(1サイクル目)は最も大きいものの、充・放電サイクルに伴い著しい容量の低下が認められた。Mg_2Geについては、異なったMA処理時間で合成された試料の電池充放電特性を調査した。MA処理時間が25,40,80,100時間と長くなるにつれ第1サイクル目の充放電容量が減少することから、MA処理時間の増加にともなう結晶化度の変化が電池容量に大きく影響することがわかった。MA処理40時間の試料に着目すると、MA処理25時間のものと比較してサイクル初期の容量は小さいものの、容量の減少が抑制されており、4サイクル目で逆転することが認められた。したがって、適度なMA処理は電池充放電サイクル寿命の延長に寄与することが見出された。
「高強度ＤＮゲルの多機能化に向けた表面選択的ミネラリゼーション

ダブルネットワーク(DN)ゲル最表面への機能性セラミクス(マグネタイト)析出条件の検討及びその過程で発見した「マグネタイトの官能基選択的析出による高分子網目の可視化」について研究を行った。ハイドロゲル最表面へのマグネタイト析出条件の検討については、種々の濃度の塩化鉄IIIと塩化鉄IIの混合液及び水酸化ナトリウム溶液に、マグネタイトの析出を促進するスルホン酸基を持ったモノマーを構成材料に含むDNゲルを交互に浸漬し、ゲル最表面に析出したマグネタイトの結晶サイズ及び析出量を評価した。またその際、種々の官能基を持つDNゲルを基質に用いることで、官能基がマグネタイト析出に与える効果を明らかにした。上記のマグネタイト析出条件の検討の中で、特定の条件下においてマグネタイトの局在が特定の場所に偏る現象が観察された。また得られた画像を過去の文献と照らし合わせたところ、析出したマグネタイトの局在は中性子散乱によって求められたゲルの構造と同じである事が確認された。このことから、マグネタイト析出によってゲルの局在を可視化することが可能であることが示唆された。これまでゲルの構造に関する研究には光散乱法や中性子散乱法などの散乱法が用いられてきた。しかしながら、これらの構造を実空間で観察することは、ゲルを構成するポリマー鎖のサイズおよび電子密度が小さいために今まで達成されておらず、本手法によって可視化に成功すればハイドロゲルの構造をナノスケールで直接観察できるようになり、ハイドロゲルのメカニズムの理解がより一層進むと期待される。また、DNゲルへの骨伝導性セラミクスであるハイドロキシアパタイト複合化の研究についても行った。上記の研究成果について4件の国際学会、2件の国内学会にて発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。
エピトープ特異性抗ヒトCYP3A抗体の作製とヒトにおける分子多型の解析

CYP3A4およびCYP3A5を特異的に識別する抗オリゴペプチド抗体を作製するために、それぞれのアミノ酸配列から特異的配列のペプチドを合成した。BSAに上記のペプチドを結合させ抗原とし常法に従い兎に免疫し、抗体を作製した。一方すでに単離しているCYP3A4およびCYP3A5cDNAをCOS-1細胞にトランスフェクションし、CYP3A4およびCYP3A5を発現したCOS-1細胞を作製し、ミクロゾームを調整した。これらのミクロゾームにCYP3A4およびCYP3A5が発現していることを抗CYP3A2抗体により確認した。これらのミクロゾームを用い、作製した抗ペプチド抗体の特異性等について検討したところ、抗CYP3Aペプチド抗体についてはCYP3A4特異的に反応し、CYP3A5とは反応しないことが示された。一方、抗CYP3A5ペプチド抗体については、特異性は認められなかった。次に抗CYP3A4ペプチド抗体がミクロゾーム中のCYP3A4の活性を阻害することができるかどうか、テストステロン6β-水酸化活性を測定することにより検討したが、活性阻害は認められなかった。抗CYP3A4ペプチド抗体はCYP3A4にのみ特異的に反応することより、ヒト肝におけるCYP3A4の含量を測定したところ有意な個体差が認められ、CYP3A4のタンパクレベルでの多型の存在が示唆された。現在異なる部位のペプチドを合成し、活性を阻害することができる特異抗体の作製を試みている。
線形計画問題の大域的構造に基づくピボットアルゴリズムの開発

線形計画問題(LP)の解法の1つに,1947年にDantzigにより提案された単体法を始祖とするピボットアルゴリズムがある。ピボットアルゴリズムとは,制約条件で記述された多面体の頂点を,目的関数値を改善する方向にたどり最適解を見つける手法である。多項式時間を達成するピボットアルゴリズムの存在の解明はLPにおける重要な未解決問題として知られる。本研究では,従来のピボットアルゴリズムの多くがLPに内在する多面体構造という大域的性質を考慮していないことに着目し,この未解決問題に挑む。多項式時間を達成するピボットアルゴリズムの存在の解明はLPにおける重要な未解決問題である。ピボットアルゴリズムは,制約条件が記述する多面体の頂点に最適解が現れるという性質に基づき,目的関数値を改善する方向に多面体の頂点をたどって最適解を見つける手法である。従来のピボットアルゴリズムでは,次に進む頂点の選択の際に使用する情報は元の頂点に隣接する局所構造のみで,LPに内在する多面体構造という大域的構造を考慮していなかった。制約条件が記述する多面体上にピボットアルゴリズムの振る舞いを記述した有向グラフを「LPグラフ」という。本研究では,LPの大域的構造としてのLPグラフの重要性に着目し,この大域的構造に基づく多項式時間ピボットアルゴリズムの構築を目指す。今年度は,マトロイド理論を用いてLPグラフの列挙法を構築することを目指した。LPグラフの列挙は,特定の構造を持つ有向マトロイド(OM)の列挙法構築と類似した構造を持つOM集合の実現可能性の判定法構築の2つに分けられる。OMは一般的に数が多く直接の列挙が難しいことから,OM集合をまとめて記述するマトロイドを通じたOM集合の列挙を目指し,マトロイドとOMの間をつなぐ向き付け可能性について研究を進めた。マトロイドにはOMを構成できない向き付け不可能なマトロイドが存在する。ランクを3に限定しても7以上の任意の要素数で向きづけ不可能なマトロイドが存在することを示した。線形計画問題(LP)の解法の1つに,1947年にDantzigにより提案された単体法を始めとするピボットアルゴリズムがある。従来のピボットアルゴリズムでは,次に進む頂点の選択の際に使用する情報は元の頂点に隣接する局所構造のみで,LPに内在する多面体構造という大域的構造を興梠してはいなかった。本研究では,LPの大域的構造としてのLPグラフの重要性に着目し,この大域的構造に基づく多項式時間ピボットアルゴリズムの構築を目指している。今年度も昨年度に引き続き,マトロイド理論を用いてLPグラフの列挙法を構築することを目指て,マトロイドの表現可能性(実現可能性)を調査した。昨年度はランク3を限定しても7以上の任意の要素数で向き付け可能なマトロイドの禁止マイナーの存在を示したが,今年度は向きづけ可能マトロイドと行列表現可能なマトロイドの和集合と積集合という異なる対象に焦点をあてたが,昨年度同様にランク3に限定しても禁止マイナーが無限個存在することを示した。更に,体の拡大による表現可能性の変化にも言及した。そして,特定の体上で表現可能なマトロイドにの列挙法の考案を目指して研究を開始した。LPグラフの列挙は,特定の構造を持つ有向マトロイド(OM)の列挙法構築と類似した構造を持つOM集合の実現可能性判定法小袿の2つに分けられる。OM集合の数は多いため,本研究ではOMをまとめて記述するマトロイドを通じてOM集合を列挙することを目指している。そこで,今年度も昨年度に続き,LPグラフに直接つながるマトロイドの表現可能性について,数々の視点から研究を進めた。マトロイドの表現可能性の研究では世界で一定の評価を受けており,来年度に招待講演を2件依頼されている。更に,特定の体上で表現可能なマトロイドにの列挙法の考案を目指して研究を開始した。LPグラフの列挙には至っていないが,LPグラフ列挙にあたり,OMをまとめて記述するマトロイドの性質を探求することは必要不可欠であることから,おおむね順調に進行しているといえる。線形計画問題(LP)の解法の1つに,1947年にDantzigにより提案された単体法をはじめとするピボットアルゴリズムがある。多項式時間を達成するピボットアルゴリズムの存在の解明はLPにおける重要な未解決問題がある。ピボットアルゴリズムは,制約条件が記述する多面体の頂点に最適解が現れるという性質に基づき,目的関数値を改善する方向に多面体の頂点をたどってさて機会を見つける手法である。従来のピボットアルゴリズムでは,次に進む頂点の選択の際に使用する情報は元の頂点に隣接する局所構造のみで,LPに内在する多面体構造という大域的構造を考慮してはいなかった。

本研究では,LPの大域的構造としてのLPグラフの重要性に着目し,この大域的構造に基づく多項式時間ピボットアルゴリズムの構築を目指している。今年度も昨年度に引き続き,マトロイド理論に基づいてLPグラフの列挙を行うことを目指して,以下2点の研究を行った。まず,マトロイドの実現可能性のうち,LPグラフ構築に繋がる特定の体上での実現可能性について研究を行った。次に,LPグラフの土台となる多面体の性質を探求することを目指して幾何の研究を行い,幾何の古典的な問題であるOpaque problemについて研究を行った。マトロイドの実現可能性の研究については世界で一定の評価を受けており,今年度は2件(共同研究)の招待講演を行った。Opaque problemとは,多角形領域に光線が差し込んだときにその光線を遮る最小の距離の壁を配置する問題である。この壁の距離に下界値を初めて更新した。線形計画問題(LP)の解法に,1947年にDantzigにより提案された単体法を始祖とする一連のピボットアルゴリズムがある。線形計画問題の別の解法として1984年に提案された内点法は多項式時間性が保証されている一方で,多項式時間を達成するピボットアルゴリズムは見つかっておらず,その存在解明はLPにおける重要な未解決問題である。制約条件が記述する多面体上にピボットアルゴリズムの振る舞いを記述した有向グラフをLPグラフという。本研究では,LPグラフに内在する多面体構造という大域的構造に着目し,この大域的構造に基づく多項式時間ピボットアルゴリズムの構築を目指して,4年間にわたり研究を続けてきた。多項式時間を達成するピボットアルゴリズムの開発という最大の目標は達成できなかったものの,最終年度である今年度は,これまでの3年間取り組んできたマトロイド理論を用いたLPグラフの列挙について部分的に解決するに至った。研究代表者は多面体の離散構造の1つである有向マトロイドについて広く研究してきた。この有向マトロイドにおいて幾何的に実現可能なものがLPグラフに対応するが,実現可能性判定が難しく,任意の多面体における列挙は達成できていなかった。そこで,多面体に0,1のみから構成されている点配置という制限を与え,対応する行列を高速に列挙する方法を提案した。本列挙はこれまで実施された列挙サイズを大きく上回るものである。本結果を元にして,LPグラフの特徴付けを目指し,多項式時間ピボットアルゴリズムの達成を目指したい。線形計画問題(LP)の解法の1つに,1947年にDantzigにより提案された単体法を始祖とするピボットアルゴリズムがある。ピボットアルゴリズムとは,制約条件で記述された多面体の頂点を,目的関数値を改善する方向にたどり最適解を見つける手法である。
肺移植ドナーの無気肺に対する新たな肺保護的保存摘出法および機能評価法の開発

前年度、研究Aとして体重30kg程度のブタ(ランドレース種)を用い全身麻酔下に右側臥位で左側方開胸し左主気管支を剥離露出、タニケットを用いて遮断、さらに左胸腔を150mLの生理食塩水で満たし左肺完全無気肺を24時間介入として与える無気肺モデルを作成した。本年度は研究Aで確立した無気肺モデルを使用し、循環停止先行法で摘出した左肺グラフトおよび再拡張処置先行法(従来法)で摘出した左肺グラフトで肺移植を実施する実験を遂行した。併せて無気肺の侵襲を加えず同様の左片肺移植を行うコントロール群を設定し、それぞれ肺移植後の移植肺機能の推移を評価した。実験手技の安定をえたのちにデータの採取を行い、年度末までに各群n=3のデータの収集を終えた。結果としては、コントロール群、循環停止先行群(実験群)、再拡張処置先行群(従来群)の順に動脈血酸素分圧の推移が良好であることが確認された。以上の結果より研究計画時に推測した通り循環停止後の肺拡張処置が移植肺にとって保護的操作となる可能性が確認された。論文作成に必要なデータ採取が順調に進んでいる。研究開始時の推測を裏付ける傾向のデータが採取されている。コントロール群、循環停止先行群(実験群)、再拡張処置先行群(従来群)の各群について論文作成性に耐える統計処理可能な数まで実施し、学会報告、論文作成を行う。無気肺を有するドナー肺に対する新しい肺保護的保存法の開発を目的とした本研究において、本年度は、新規保存法を検証するために用いる無気肺動物実験モデルの作成を行った。20-30kgのブタに全身麻酔を施したのち、左開胸し、生理食塩水を注入することで左肺を受動性無気肺に至らしめるモデルを考案した。さらに再換気後の肺障害(肺水腫)が生じる至適な侵襲負荷時間を検討するために、この状態で6時間、12時間、24時間、36時間おいた無気肺モデル群をそれぞれ作成して、設定した無気肺侵襲後に再度開胸し、無気肺解除後の肺の状態を確認した。ガス交換能、肉眼的所見、乾湿重量比、組織学的所見についてデータを採取して検討した。その結果、6時間、12時間無気肺群では無気肺にともなう障害が軽度であり、また36時間では、無気肺解除が不能な程度に肺の障害が著しく、その後に予定している移植実験による評価に耐えられない所見であった。以上より24時間無気肺曝露が、最もその後の保存、移植後評価を行う上で必要十分な侵襲であることが判明した。当初、無気肺ドナーブタの作成&#12316;肺移植まで1例につき一日中で終了する実験内容を想定していたが、以上の結果より1例につき2日間にわたる実験内容とする変更をおこなうこととした。次年度は上記の無気肺モデルを用いて大動脈クロスクランプ後(心停止後)肺のrecruitementと摘出が無気肺を呈したドナー肺に対する保護的効果があるかを検証する実験を継続して行う予定である。当初計画していたとおり、初年度で研究A(無気肺モデルの作成)を実施し、完了している。次年度では、作成したブタ無気肺モデルを利用し、肺移植実験を行う。無気肺ドナーブタより従来法で摘出し保存した後に移植を行う群と、新規法(大動脈遮断先行法)で摘出し保存した後に移植を行う群について、移植肺の機能の評価を行い、新規法の移植肺に対する保護的効果についてデータを収集する。以上の内容は当初計画していた内容に概ねそうものである。今年度の実験は予備実験であり、他実験目的で購入したブタを使用し、既存の研究室にある在庫薬等を使用して研究モデル作成を行った。次年度からは当初予定していた本実験を開始予定であり、移植手術の技術的学習に必要な実験動物や試薬を含めて物品の購入が必要となる予定である。

各実験群の肺移植実施数を次年度でさらに追加で行う必要であり、その実験動物ならびに必要物品購入費用、本年度実施したものも含めた移植実験中にサンプリングした血液、組織の免疫組織化学解析に必要な試薬の購入費用など、本年度では使用しなかった経費ついて最終年度で使用する必要がある。
実験モデルにおけるてんかん性反応の経時的なイメージング

本研究では、マウス及びラットの海馬を標的とし、電気刺激や薬物注入によって誘発されるてんかん様発作波の伝播経路を明らかにすることを目的に、脳血流イメージングを行った。その結果、海馬でのてんかん様発作波が帯状回を経由し、皮質運動野に到達することが示唆された。また、てんかん性の反応が、これまで確認されていた様な脳波変化だけでなく、血流量の変化としても、両側的に生じることが確認され、てんかん病の進展・伝播に起因する神経代謝が神経活動に付随して起きる事が示唆された。本研究では、マウス及びラットの海馬を標的とし、電気刺激や薬物注入によって誘発されるてんかん様発作波の伝搬経路を明らかにすることを目的に、脳血流イメージングを行った。海馬において誘発されたてんかん様発作波が、どのような経路を経て大脳皮質に到達するかの解明を、海馬における電場電位記録と大脳皮質における脳血流画像の取得によって試みた。実験には28匹のC57blマウスと11匹のSDラットを用いた。ウレタン、キシラジンで麻酔後、脳定位固定装置に頭部を固定し、画像撮影のため頭部を広く露出させ、電気刺激用及び薬物注入用の同心円電極は脳図譜に基づいて角度をもたせて海馬CA1野へ刺入した。ラットにおいては、頭蓋骨をドリルで削り、脳画像を取得可能な状態にした。マウスにおいては、電気刺激による後発射の発現が確認された。そのときの脳血流画像では、刺激より1秒遅れて皮質血流量が増加し、それは刺激後10秒ほど持続した。しかしながら、電気刺激を20分毎に繰り返したが、てんかん状態の増強を示す後発射持続時間の延長や進展などは観測されず、てんかん状態の進展に伴う皮質血流量変化をとらえることはできなかった。カイニン酸注入モデルでは注入直後から全身けいれんが起き、注入直後に皮質血流量が10%以上減少した。4-APにより発作を誘発したモデルでは、注入直後より注入部位から血流量の変化が空間的に皮質の注入側に進展した。それに対して、中心線付近の太い血管が目立つ部位を中心に血流量の減少が確認された。ラットにおいては、電気刺激による後発射の発現及び後発射持続時間の延長が確認できた。また、刺激側及び刺激の対側の皮質における血流量の増加が確認できた。以上の結果より、てんかん性の反応が、これまで確認されていた様な脳波変化だけでなく、血流量の変化としても、両側的に生じることが示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。
無鉛圧電セラミックスを用いたスマートアクチュエーターとその応用

圧電アクチュエータは,小型,高出力,高精度,高応答性を有するため,自動車,家電製品,マイクロ・ナノデバイス等の様々な部品へ応用されている.しかしながら,既存の圧電アクチュエータでは,小型,低コスト,かつ変位と力を両立したアクチュエータは実現困難であった.我々は,2枚のバイモルフ型圧電素子を両端支持で組み合わせ,それらを積層することにより,これらの要件を満たす新たな積層圧電アクチュエータを開発し,TAMPA(Tailor-made Multilayer Piezoelectric Actuator)と名付けた.本年度は,前年度に引き続きTAMPAの改良を行い,特に,現在問題となっている圧電セラミックス(PZT)中の鉛による環境問題に取り組むため,無鉛圧電セラミックスを用いたTAMPAの無鉛化アクチュエータを作製し,動作・特性と解析を実験的に確認した.さらに,作製したTAMPAをマイクロデバイスへ応用を試みた.本年度の成果として,下記の通り,積層圧電アクチュエータのデバイス応用および積層圧電アクチュエータの無鉛化としてまとめる.・積層圧電アクチュエータのデバイス応用本アクチュエータは,小型,低コスト,かつ変位と力を両立したアクチュエータであるので,マイクロバルブやマイクロステージ等の様々なデバイスへ応用可能である.今年度は,マイクロバルブへの応用を行い,マイクロチャネル内のマイクロ二層流の混合用デバイスとして応用を試みた結果,マイクロ二層流の混合及びマイクロチャネル内の濃度勾配の生成に成功した.・積層圧電アクチュエータの無鉛化圧電セラミックス(PZT)中の鉛が環境問題となっているので,無鉛圧電セラミックスの調査を行った.実際に,無鉛圧電セラミックス((K,Na)(Nb,Ta)O_3)を用いてアクチュエータを作製し,特性評価・解析を行った.(776字)我々は変位と力を両立したテーラーメード型積層圧電アクチュエータを提案した.既存の圧電アクチュエータでは,小型,低コスト,かつ変位と力を両立したアクチュエータは実現困難である.そこで我々は,2枚のバイモルフ型圧電素子を両端支持で組み合わせ,それを積層することにより,これらの問題を解決した.また,本積層圧電アクチュエータは,全体のサイズが同じでもバイモルフ型圧電素子のサイズを調節することにより,変位と力の割合を広範囲に変更可能なテーラーメードアクチュエータである.今年度は,まず,バイモルフ型圧電素子を解析し,固定条件に対する変位と力の関係を導出した.その解析結果は,バイモルフ型圧電素子の固定条件を片持ちはりから両端支持へ変更すると,変位は0.25倍になるが力は4倍になる,すなわち,バイモルフ型圧電素子を用いて力を得るためには,両端支持の方が有効であることを示した.次に,本積層圧電アクチュエータの変位と力の関係を理論的に導出した.その解析結果より,本積層圧電アクチュエータは約10×10×10mmのサイズで数100μmの変位や数Nの力を発生できることがわかった.次に,プロトタイプを製作し,その性能を評価した.その評価結果は解析結果と良く一致しており,解析結果の有効性が確認された.今後は,圧電セラミックス(PZT)中の鉛が環境問題となっているので,無鉛圧電セラミックスを用いて本積層圧電アクチュエータを無鉛で製作する.また,本積層圧電アクチュエータの実用化へ向けて,導電性テープの開発や生産性の向上を行うとともに,本積層圧電アクチュエータをマイクロバルブやマイクロステージ等のデバイスへ応用する予定である.圧電アクチュエータは,小型,高出力,高精度,高応答性を有するため,自動車,家電製品,マイクロ・ナノデバイス等の様々な部品へ応用されている.しかしながら,既存の圧電アクチュエータでは,小型,低コスト,かつ変位と力を両立したアクチュエータは実現困難であった.我々は,2枚のバイモルフ型圧電素子を両端支持で組み合わせ,それらを積層することにより,これらの要件を満たす新たな積層圧電アクチュエータを開発し,TAMPA(Tailor-made Multilayer Piezoelectric Actuator)と名付けた.本年度は,前年度に引き続きTAMPAの改良を行い,特に,現在問題となっている圧電セラミックス(PZT)中の鉛による環境問題に取り組むため,無鉛圧電セラミックスを用いたTAMPAの無鉛化アクチュエータを作製し,動作・特性と解析を実験的に確認した.さらに,作製したTAMPAをマイクロデバイスへ応用を試みた.本年度の成果として,下記の通り,積層圧電アクチュエータのデバイス応用および積層圧電アクチュエータの無鉛化としてまとめる.・積層圧電アクチュエータのデバイス応用本アクチュエータは,小型,低コスト,かつ変位と力を両立したアクチュエータであるので,マイクロバルブやマイクロステージ等の様々なデバイスへ応用可能である.今年度は,マイクロバルブへの応用を行い,マイクロチャネル内のマイクロ二層流の混合用デバイスとして応用を試みた結果,マイクロ二層流の混合及びマイクロチャネル内の濃度勾配の生成に成功した.・積層圧電アクチュエータの無鉛化圧電セラミックス(PZT)中の鉛が環境問題となっているので,無鉛圧電セラミックスの調査を行った.実際に,無鉛圧電セラミックス((K,Na)(Nb,Ta)O_3)を用いてアクチュエータを作製し,特性評価・解析を行った.(776字)
IL-33受容体陽性細胞がアトピー性疾患に与える影響の研究

IL-33はTh2サイトカイン産生を促す炎症性サイトカインである。研究代表者らのグループは表皮でIL-33を過剰に産生する遺伝子改変マウス(IL-33Tg)を樹立した。このマウスはアトピー性皮膚炎(AD)の症状を再現する新規ADの病態モデルであり、ILC2細胞が活性化する。喘息においてはILC2の活性化には好塩基球が産生するIL-4が必須であること(Motomura Y, Immunity. 40(5):758-71, 2014)が報告されている。一方、ADなどの皮膚炎の発症における好塩基球の関与は不明であり、皮膚炎におけるILC2の活性化に好塩基球が産生するIL-4が必要かどうかは分かっていなかった。従来HE染色で組織学的に好塩基球を判別するのは困難であったが、近年フローサイトメトリー技術にブレイクスルーがあり、ケラチノサイトなどの自家蛍光が分離可能となったため、末梢血中だけでなく皮膚炎内部の好塩基球をフローサイトメトリーで容易に判別できるようになった。そこで、新規AD病態モデルであるIL-33Tgマウスの皮膚炎局所において、フローサイトメーターを用いて、IL-4を産生する好塩基球(CD45+ DX5+ FceR1+ c-kit-)が増加していることを見いだした。さらに、好塩基球の特異的マーカーであるmmcp8が皮膚で上昇していることも判明した。IL-33TgマウスをRag2KOマウスと交配することでTh2細胞を消去してもなお、これらの皮膚への好塩基球の浸潤は変化が無かった。つまり、T細胞に頼らずとも、IL-33の過剰発現によって皮膚への好塩基球の浸潤が発症することが明らかになった。これらの研究成果は、The Journal of Investigative Dermatologyに受理され(2019/4/18付)、現在印刷中である。従来、HE染色で組織学的に好塩基球を判別するのは困難であったが、近年、フローサイトメトリー技術にブレイクスルーがあり、ケラチノサイトなどの自家蛍光が分離可能となったため、末梢血中だけでなく皮膚炎内部の好塩基球をフローサイトメトリーで容易に判別できるようになった。プレリミナリーな実験はできたものの、2017年秋で兵庫医科大学の動物実験施設が新築移転のために、いったん閉鎖となり、実験が中断したため、動物実験の進捗がやや遅くなってしまった。以前の計画ではほぼ問題なく実験続行でき、新しい施設にシームレスに移行できるはずであったが、動物実験施設と兵庫医大本体をつなぐ水道管の接続などの工事の問題が発生し、予定よりも早く動物を撤収することへと予定が変更になり、また飼育数も少なく制限することになったため、実験に遅れが生じた。さらに、兵庫医科大学における動物実験計画書を新しい施設に向けてすべて書き直すなど、新しい作業が発生したため。

そこで、新規AD病態モデルであるIL-33Tgマウスの皮膚炎局所において、フローサイトメーターを用いて、IL-4を産生する好塩基球(CD45+ DX5+ FceR1+ c-kit-)が増加していることを見いだした。さらに、好塩基球の特異的マーカーであるmmcp8が皮膚で上昇していることも判明した。IL-33TgマウスをRag2KOマウスと交配することでTh2細胞を消去してもなお、これらの皮膚への好塩基球の浸潤は変化が無かった。つまり、T細胞に頼らずとも、IL-33の過剰発現によって皮膚への好塩基球の浸潤が発症することが明らかになった。これらの研究成果は、The Journal of Investigative Dermatologyに受理され(2019/4/18付)、現在印刷中である。動物実験施設は、2018年4月に「病態モデル研究センター」へと全面的に新築移転した。新しい病態モデル研究センターは、弱酸性水の自動散布、HEPAフィルターの完備、ダストフリーの床敷きの採用、飼養エリアと実験エリアの分別など、最先端の設備とSPF環境を備えており、免疫不全マウスなどであっても安全に飼育でき、かつ飼育者(ヒト)にも優しいという、世界的にも最先端の環境を備えた施設である。したがって、今後は順調に動物実験が進捗していく予定である。実際に、実験予定のマウスは、いったん凍結受精卵などからクリーンアップしなおして、速やかに病態モデル研究センターに既に搬入ずみであり、既に動物実験施設の使用を再開し、動物実験も間もなく開始できる予定である。本研究の今後の推進方策として、実験動物の管理が最重要である。動物実験施設の閉鎖に伴いIL-33TgマウスとRag2KOマウスとの交配をやり直すことになるため、ケージ数が必要になるにも係わらず新しい病態モデル研究センターでは旧動物実験施設よりも割り当てケージ数が減少するとの通達があったため、旧動物実験施設と同等のケージ数確保ができるかどうかが、研究計画の遂行する上で重要な解決すべき課題となっている。
2光子励起ケイジドグルタミン酸を用いた樹状突起スパイン機能の研究

2光子ケイジドグルタミン酸を用いて、大脳海馬錐体細胞樹状突起スパインの機能検索を進めた。昨年度までの研究で、シナプス伝達に重要なAMPA受容体はスパイン頭部形態によって決まり、頭部の大きいスパインほど発現が多いことがわかっていた。本年度は、可塑性誘発にもっとも重要なNMDA受容体の機能的分布を調べた結果、AMPA受容体の場合とは大幅に異なり、スパインの頭部形態にほとんど依存しないことが明らかとなった。従って、AMPA受容体の発現が弱く、NMDA受容体の発現の強い細いスパインは可塑性の好発部位と考えられた。そこで、デュアルスキャン2光子励起顕微鏡を構築して、2光子励起によるグルタミン酸の局所的反復投与と、2光子励起観察によるスパインの形態可塑性の誘発を調べた。この結果、無Mg溶液中で1Hzの反復刺激を1分間行うと、ほとんどのスパインで数分でピークに達し、10分程度で減衰する、やや隣のスパインまで広がるスパインの膨張がおきることがわかった。この反応は、NMDARの阻害剤APVやアクチンの重合阻害剤LatrunculinAで完全に阻害された。およそ半分のシナプスでは、これに引き続いて、長期間に渉る、スパイン頭部の形態増加が観察された。この増大は反復刺激したスパインに特異的であった。この様に、スパインの形態可塑性がシナプス後部樹状突起へのグルタミン酸投与で誘発されること、そして、それがスパイン特異的に起きることが明らかとなった。
複数モダリティからの自己運動知覚と行動利用

本研究の目的は,視覚,聴覚,および体性感覚を物理刺激として,これらの各モダリティおよびクロス・モダリティ提示刺激からの自己運動知覚がどのように生じるかを検討することである。本年度は,聴覚情報と視覚情報のクロスモーダル提示が視覚機能・行動制御に与える影響を調べ,その相互作用のメカニズムを解明することを目的とした。今年度は,昨年度明らかにした曖昧視覚運動の聴覚捕捉による重心動揺に加えて,ともに曖昧ではない視覚運動と聴覚運動を同時提示し,その一致・不一致性の効果,および情報信頼性の効果を調べた。実験の結果,視覚運動と聴覚運動の運動方向が一致しているときのみ重心動揺の増加が見られた。聴覚運動が静止しているとき,存在しないとき,そして視覚運動とは逆方向に運動しているときは,どの条件でも差がなかった。もしも,視覚情報と聴覚情報が単純な線形加算により統合されているなら,逆方向の場合には,音静止条件や音なし条件と比較して,重心動揺は抑制されなければならない。つまり,非線形な統合が行われていることが示唆された。また,視覚運動刺激の生存時間を操作することで,その信頼性を定量的に操作したところ,信頼性が適度に低い場合に,視覚と聴覚の同時提示による重心動揺の増強が顕著に見られた。これらの結果から,視覚情報と聴覚情報からの自己運動情報処理においては,2段階のプロセスがあることが推察された。最初のプロセスは,視覚と聴覚の一致性・同期性のチェック処理であり,ここで一致していると判断された場合のみ,次の統合プロセスに進むが,一致していないと判断された場合には,聴覚情報は自己運動情報とは関係ないものとして,対象運動として処理されることになる。統合プロセスでは,視覚情報と聴覚情報は,それぞれの信頼性の高さに応じた重み付け加算が行われていると推察される。本年度は,(1)自己運動に起因するオプティカルフローと対象運動によるフローを重畳提示し,さまざまな視覚機能,さらに行動制御への影響を調べ,(2)聴覚情報と視覚情報のクロスモーダル提示が視覚機能・行動制御に与える影響を調べた。(1)では,広視野ディスプレイにランダムドットによる放射運動と平行運動を重畳提示し,受動的な重心動揺測定,および簡易型ドライビングシミュレーターを用いた能動的進行方向操作の実験を行った。(2)では,位相反転する正弦波状グレーティング(運動方向が曖昧)を提示し,音圧変化による移動音源を同時提示することによる視覚情報の聴覚捕捉,およびそれらによる重心動揺を測定した。実験の結果,(1)放射運動と平行運動の重畳刺激という同じオプティカルフローを用いているにも関わらず,受動的重心動揺の結果は,瞬間的進行方向判断および能動的進行方向操作とは異なる結果となった。重心動揺,つまり、視覚性姿勢制御を担う処理は,複数のオプティカルフローを並列的かつ自動的に処理し,生体にとって情報量の多い方をより効率的に利用するのに対し,進行方向の知覚と操作は,運動情報を統合的に処理し,意識に上った知覚現象・表象に基づいて行われると考えられる。また,(2)からは,聴覚情報によっても重心動揺が生じ,さらに視覚情報が聴覚捕捉されることによって重心動揺が増強した。つまり,視覚性姿勢制御には,複数モダリティの情報が利用されている可能性が示された。
大脳皮質回路形成過程のGABAA受容体・C1-輸送体・タウリンの機能協関

1. Cl^-トランスポーターknock-downによる細胞移動の[Cl^-]_i依存性の検討[熊田、福田]:NKCC1 mRNAの転写を干渉するshRNAをコードするコンストラクトのプラスミドを調整し、計画1.で用いたHcRedプラスミドと同時に電気穿孔法で胎仔脳室帯の新生神経細胞に導入した。2種類のプラスミドは90%以上の高率で同一の細胞に導入されるので、HcRedを発現レた細胞にはSiRNAも導入されていることになる。こうしてNKCC1遺伝子の転写をsiRNAでknock-downして、Cl^-濃度を調節したホールセルパッチクランプで[Cl^-]_iを測定したところ平均値は過分極側にシフトした。しかし、目下のところradial移動の顕著な異常はでていないので、HcRedのみの場合の移動との比較の必要性が示唆された。NKCC1mRNAの減少を確認するためreal-time PCR法を行った。2.排出型Cl^-輸送体KCC2の機能発現抑制因子の検討[福田・古川]:KCC2にはいくつかのリン酸化部位が知られており、リン酸化あるいは脱リン酸化によってCl^-排出能が抑制されている可能性を検討するため、リン酸化阻害剤(スタウロスポリン)および脱リン酸化阻害剤(5酸化バナジウム酸)をスライスに投与して[Cl^-]_i変化を測定した。しかし、ラット胎生18日の移動細胞ではいずれにおいても変化を認めなかった。ところが、生後1週前後のKCC2が機能し始める時期で同様の実験を行うとKCC2過剰発現細胞において[Cl^-]_iが有意に減少し、広範性リン酸化阻害剤で[Cl^-]_iが低下した。すなわち、生後1週ではリン酸化によるKCC2機能抑制がおこるが、細胞移動期の胎生18日ではこのプロセスが起こらないことが示唆された。GAD67-GFP knock-inマウスホモ接合体を用いて胎生14日にインビボ電気穿孔法で胎仔の脳室帯の新生神経細胞特異的にHcRed遺伝子を導入し、PLGA(poly DL lactide-co-glycolide)microsphereに吸着させて徐放性処理したGABA_A受容体阻害剤を脳室内に導入し持続的に作用させた。3日後に脳スライスを作製し、radial移動中の皮質板細胞(HcRed蛍光)の移動状態を解析したところ、細胞外GABA濃度が野生型の10%しかないにもかかわらず、対照群では移動は全く正常であった。ところが、GABA_A受容体の持続ブロック群では皮質板に分布するradial移動細胞の割合が有意に増加し、移動速度の増加が示唆された。このことからGABA以外の内在性GABA_A受容体アゴニストの存在が示唆された。2.胎仔脳内タウリン合成阻害による細胞移動障害の解析[福田・岡部・Luhmann]:タウリンが内因性GABA_A受容体アゴニストであることを証明するため、12時間毎に3日間連続でD-システインスルフィン酸(15mmol/kg)を母体腹腔内に投与してタウリンの合成を阻害したところ、HPLC法で測定した細胞外タウリン濃度は約50%減少していた。3日後のradial移動はタウリン減少群において皮質板に分布する移動細胞の割合が有意に増加していた。このことから、発達期大脳皮質において、細胞外に存在するGABAと母体由来のタウリンはGABA_A受容体に作用し、協調的に脳室下帯から皮質板への放射方向の細胞移動を抑制していると考えられた。事実、タウリンの分布も特徴的で、辺縁帯と脳室下帯にきわめて高濃度に存在していた。このことは母体由来タウリンが皮質層構造形成に重要な部位に取り込まれ、細胞移動を調節して正常な皮質層構造の形成に関わることを示唆している。

すなわち、生後1週ではリン酸化によるKCC2機能抑制がおこるが、細胞移動期の胎生18日ではこのプロセスが起こらないことが示唆された。
遺伝子工学の微細操作法を利用した着床前受精卵の遺伝子診断および胚移植に関する研究

本研究では、着床前期の受精卵の単一遺伝子異常による遺伝疾患および染色体異常による奇形を検討した。2細胞期から8細胞期(桑実胚)の細胞を取りだし、細胞遺伝学的調査、蛍光染色による卵染色体の観察(FISH法)、遺伝子構造の観察(PCR法:single cell PCR,multiplex PCR)などによる着床前の遺伝子診断を行った。また、受精後、48時間72時間に卵管を貫流し、受精卵細胞を採取した。その後、modified Krebs-Ringers Bicarbonate(m-KRB)培養液に集め、90分間培養した後、顕微鏡上で卵細胞検査操作を行った。また、発情期にある雌マウスの卵管を貫流し、卵細胞を採取した。その後、以上と同じ方法で、卵を集めた。そして、雄マウスから採取した精子で人工受精を行った。その後、受精18日後に解剖し、受精率を確認した。その結果25%の確立で受精が成立した。また、採取した受精卵細胞の単一受精卵細胞のDNA量は、非常に微量のため、PCRは困難である。従って、Primer extension preamplification(PEP)を通じて全ての遺伝子を一次増幅した後、SSCP(Single stranded conformational polymorphism)およびDGGE(Denaturing gredient gel electrophoresis)を通じて遺伝疾患を検定した。しかし、突然変異がある場合は、dideoxytermiantion方法を利用したcyclic sequencing方法で突然変異が起こった部位の塩基配列を確認した。FISH法による受精卵細胞の検査は、人工受精卵を約4872時間培養し、48細胞の卵細胞の内、二個の卵細胞を取りだし、RNaseの処理後、脱水し、常温で乾燥させた。体外受精された人工受精卵を約23日培養し、48細胞における卵細胞から単一細胞を取りだし、PCRおよびSSCPを正確に行った。そして、stock SolutionでHybridization Bufferを作る。その後、蛍光染色過程に従って染色を行った。また、MItotic Index,Pyknosis,Micronucliなどを観察した。2細胞期から8細胞期(桑実胚)迄の間は、一個一個の細胞が全ての胚体となる可能性をもつため、これらの時期の4細胞期から8細胞期迄の受精卵一つを取りだし、細胞遺伝学的調査、蛍光染色による卵染色体の観察(FISH法)、遺伝子構造の観察(PCR法:・single cell PCR・multiplex PCR)などによる着床前の遺伝子診断を行った。本研究では、遺伝子診断および染色体異常の受精卵細胞実験に良く使用するICRマウスを用いて実験を行った。68週令のICRマウスを購入し、1週間予備飼育を行った後、実験に用いた。受精後、48時間72時間に卵管を貫流し、受精卵細胞を採取した。人工受精後、58時間培養した後、顕微鏡上で卵細胞検査操作を行った。本研究では、卵細胞分離法を以下の3つの方法を確立させた。(2)Displacement方法:partial zonadissectionを鋭いdissection pipetteで透明帯を切り、microbiopsy pipetteを90°角度で入れ、培養液を少しずつ注入して卵細胞を切り口から押し流されるようにした。(3)Squeezing method:受精卵を固定して透明帯の一部をacid tyrodes solutionの方法あるいは機械的に切開し、blunt pipetteを用いて一個の細胞のみを出した。本研究の目的の一つである人工授精の方法をより精度よく行うことである。従って、これらの方法により、卵細胞分離を行った後、どの方法が卵細胞に影響を与えず、生存へと導くことが可能かを検討した。分離後の受精卵細胞群と無処置(コントロール)受精卵細胞群との生存率の比較実験を行った結果、人工授精を行った群において48hpcでは、6個、72hpcでは、32個、96hpcでは、108個までに細胞分裂が認められた。今後、更に着床前の受精卵をFISHあるいはPCRなどを用いてPoint Mutationのような遺伝子異常の検討を行う予定である。

また、採取した受精卵細胞の単一受精卵細胞のDNA量は、非常に微量のため、PCRは困難である。従って、Primer extension preamplification(PEP)を通じて全ての遺伝子を一次増幅した後、SSCP(Single stranded conformational polymorphism)およびDGGE(Denaturing gredient gel electrophoresis)を通じて遺伝疾患を検定した。しかし、突然変異がある場合は、dideoxytermiantion方法を利用したcyclic sequencing方法で突然変異が起こった部位の塩基配列を確認した。FISH法による受精卵細胞の検査は、人工受精卵を約4872時間培養し、48細胞の卵細胞の内、二個の卵細胞を取りだし、RNaseの処理後、脱水し、常温で乾燥させた。体外受精された人工受精卵を約23日培養し、48細胞における卵細胞から単一細胞を取りだし、PCRおよびSSCPを正確に行った。そして、stock SolutionでHybridization Bufferを作る。その後、蛍光染色過程に従って染色を行った。また、MItotic Index,Pyknosis,Micronucliなどを観察した。
間葉系幹細胞による大動脈瘤治療の臨床応用を目指した研究

大動脈瘤は、大動脈の中膜に存在する組織強度を担う「細胞外マトリックス(ECM)」の合成・分解バランスの喪失により、特に血管壁強度を担うエラスチンが構造破壊され、強度を失った大動脈が瘤状に拡張する。大動脈瘤の標準的な治療は人工血管置換術で、破裂の予防効果は絶大だが、一方で手術侵襲が非常に大きい。瘤径拡大を認める超高齢患者症例に対して、あるいは手術自体が危険なShaggy Aorta症例に対して、新な低侵襲な大動脈瘤治療法の開発が求められる。動脈硬化を基盤とした慢性炎症を呈する大動脈瘤に対し、我々は「間葉系幹細胞(MSC)」が有する抗炎症作用・免疫抑制作用を利用した大動脈瘤治療法の研究・開発を行ってきた。これまでの研究で、apolipoprotein E遺伝子欠損マウスにAngiotensin-IIを持続注射した大動脈瘤モデルマウスに骨髄由来間葉系幹細胞を静脈投与することによる、一過性の瘤径縮小効果を示してきた。発症機序が異なる大動脈瘤モデルでも同様な治療効果が得られるか検討を進めたが、すでに同様の論文報告で効果が示されたことを受け、本研究では、昨年度に引き続き、MSCによる治癒メカニズムの解明を行うこととした。投与したMSCが大動脈瘤病変部位にほとんど集積していないのにもかかわらず治療効果が得られた理由の一つとして、エクソソームによるものである可能性が示唆された。エクソソーム内にはmicroRNAやproteinなど様々な因子が包括されている。そこで、エクソソーム内含まれるmicroRNAを網羅的に解析したところ、537種類のmiRNAを同定した。その中から、大動脈瘤を抑制すると報告されている因子13種類を見出した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。【背景・目的】大動脈瘤の標準的治療法である人工血管置換術は、瘤破裂予防効果は絶大だが侵襲が大きいため、新たな低侵襲治療法の開発が望まれる。これまでに大動脈瘤に対する間葉系幹細胞療法の有効性を報告してきた。本研究では治療に最適な条件検討や分子メカニズムの解明、前臨床試験を行い、臨床応用を目指す。平成26年度では、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)による大動脈瘤治療効果の分子メカニズムについて検討した。【結果】横隔膜下に大動脈瘤形成が認められ、瘤径は生食群に比べBM-MSC群で有意に縮小した。同部位における瘤発生率は、生食群に比べてBM-MSC群は有意に低下した。JNK、Smad2、ERKは両群間に差がなかったが、NF-κB, STAT1が有意に活性低下し、Aktが有意に活性上昇した。また、NF-κBとAktは瘤径との間に相関関係がみられた。このことから、BM-MSCによる大動脈瘤治療における分子メカニズムには、NF-κB, STAT1, Aktシグナル伝達機構の関与が示唆された。【今後の予定】現在の瘤径評価方法は、屠殺後のendpointのみの評価となっており大動脈瘤の縮小効果の証明が十分でないと考える。従って、一個体の連続した瘤径の変化を細胞投与前後で追跡することで、細胞投与による大動脈瘤縮小効果を確認する。また、先行研究で細胞療法の持続は2週間であったことから、投与細胞数や投与回数の最適化を図る。大動脈瘤の原因は、動脈硬化などに起因した血管壁の慢性炎症であることが分かっており、マクロファージなど炎症性細胞が壁内へ浸潤し、炎症生サイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-2,9などを産生し、細胞外マトリックス(ECM)、特にエラスチンの分解や、さらなる炎症性細胞の遊走・浸潤を促す。これまでに抗炎症作用、免疫抑制能をもつ間葉系幹細胞(MSC)の静脈内投与により、炎症抑制やECM合成分解バランスの改善により、一過性の大動脈瘤縮小効果が得られたことを報告してきた。しかし、同一個体による継時的な評価ができていなかったため、超音波装置を用いて同一個体を継時的に大動脈瘤径を計測した。その結果、これまで得られた結果と同様に、骨髄由来MSCの投与2週後、4週後において瘤径の縮小が観察された。今後はサンプル数を増やして検討を進める。また、アポリポプロテインE遺伝子欠損マウスにアンジオテンシンII持続注入による大動脈瘤モデルマウスとは発症機序が異なる別の大動脈瘤モデルマウスにおいても同様に治療効果が得られるかを確認するため、エラスターゼによる大動脈瘤モデル作成を試みた。しかしクランプした腹部大動脈内に灌流させたエラスターゼ溶液の分枝への漏出により死亡例が重なったため、塩化カルシウムによる大動脈瘤モデルに変更した。塩化カルシウム溶液を腹部大動脈周囲に塗布してから6週間後に大動脈瘤の形成が認められ、塩化カルシウムによる大動脈瘤モデル作成に成功した。超音波装置による大動脈瘤径の継時的な計測および塩化カルシウムによる大動脈瘤モデルの作成に着手しており、概ね順調に進展していると考える。

瘤径拡大を認める超高齢患者症例に対して、あるいは手術自体が危険なShaggy Aorta症例に対して、新な低侵襲な大動脈瘤治療法の開発が求められる。動脈硬化を基盤とした慢性炎症を呈する大動脈瘤に対し、我々は「間葉系幹細胞(MSC)」が有する抗炎症作用・免疫抑制作用を利用した大動脈瘤治療法の研究・開発を行ってきた。これまでの研究で、apolipoprotein E遺伝子欠損マウスにAngiotensin-IIを持続注射した大動脈瘤モデルマウスに骨髄由来間葉系幹細胞を静脈投与することによる、一過性の瘤径縮小効果を示してきた。昨年度に引き続き、サンプル数を増やして超音波装置を用いて同一個体の継時的な瘤径測定を行ってきたところ、投与2週後では縮小したが4週後では徐々に拡大が進行し、8週後では生食群と同程度の瘤経となったことから、同一個体でも一過性の瘤径が縮小していたことが明らかとなった。MSCによる治癒メカニズムの解明として、MSCが産生する因子;エクソソームに着目した。MSC由来エクソソーム静脈内投与においても1週間後で瘤経縮小効果がみられた。投与したMSCが大動脈瘤病変部位にほとんど集積していないのにもかかわらず治療効果が得られた理由の一つとして、エクソソームによるものである可能性が示唆された。本年度の検討課題である発症機序が異なる塩化カルシウムによる大動脈瘤モデルでは、モデル作成には成功したが、外膜剥離の手術手技が難しく大動脈経拡大を伴わない例も多く、安定したモデル作りに時間を要した。また、投与細胞数や投与回数の検討には従来のapolipoprotein E遺伝子欠損マウスを用いるが、繁殖数に対して本実験に必要な供給数に満たなかったため、予期せず遂行困難となった。したがって、やや遅れていると判断した。大動脈瘤は、大動脈の中膜に存在する組織強度を担う「細胞外マトリックス(ECM)」の合成・分解バランスの喪失により、特に血管壁強度を担うエラスチンが構造破壊され、強度を失った大動脈が瘤状に拡張する。大動脈瘤の標準的な治療は人工血管置換術で、破裂の予防効果は絶大だが、一方で手術侵襲が非常に大きい。発症機序が異なる大動脈瘤モデルでも同様な治療効果が得られるか検討を進めたが、すでに同様の論文報告で効果が示されたことを受け、本研究では、昨年度に引き続き、MSCによる治癒メカニズムの解明を行うこととした。エクソソーム内にはmicroRNAやproteinなど様々な因子が包括されている。そこで、エクソソーム内含まれるmicroRNAを網羅的に解析したところ、537種類のmiRNAを同定した。