hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顎関節内障におけるテネイシンＣの働き

顎関節内障で生じる顎関節の線維性癒着にテネイシンC (TNC)がどのように関与しているかを、野生型(WT)マウスとTNCノックアウト(TNCKO)マウスに過開口運動を加え、顎関節線維性癒着モデルを作製し、細胞接着に関係するフィブロネクチン(FN)の発現と筋線維芽細胞の存在を示すα-smooth muscle actin(α-SMA)の発現を調べることによって検討した。その結果、TNCKOマウスではWTより関節円板の線維性癒着が遅れ、FNとα-SMAのタンパクの発現は、TNCKOマウスではWTより少なかった。ゆえにTNCは顎関節の線維性癒着の促進において重要な役割を果たしている事が示唆された。重度の顎関節内障では、関節窩と顎関節円板の間に線維性癒着が生じる。この線維性癒着にテネイシンC(TNC)が関与しているかをフィブロネクチンと筋線維芽細胞に着目して検討している。過開口後7日目に野生型(WT)マウスにおいて関節円板の線維性癒着を認めたが、テネイシンCノックアウト(TNCKO)マウスでは関節円板の線維性癒着は認めなかった。さらに過開口後20日目では、TNCKOマウスにおいても線維性癒着を認めたが、WTマウスよりも癒着の範囲は狭かった。タンパクの発現については、TNCKOマウスにおいてフィブロネクチンと筋線維芽細胞の存在を示すα-SMAの発現量がWTに比べて少なかった。TNCは糖タンパク分子の構造を持つ細胞外マトリックスで、TNCは形態形成、創傷治癒などの組織再構築過程において重要な役割を果たす細胞外マトリックスと考えられている。TNCKOマウスでは線維性癒着の時期がWTマウスよりも遅れる傾向があったことから、TNCは顎関節組織の線維化に関係する因子であると考えられた。また、創傷治癒に関係するFフィブロネクチンの発現はTNCKOマウスにおいて少なかった。筋線維芽細胞は線維化の原因となるコラーゲンを産生しているが、TNCKOマウスにおいて筋線維芽細胞の発現はWTマウスと比べて少なかった。以上のことから、TNCは筋線維芽細胞の発現をコントロールし線維性癒着に関係する因子であることが示唆された。重症の顎関節症で生じる、顎関節の線維性癒着にテネイシンCがどのように関与しているかを、マウス顎関節を用いて検討した。野生型(WT)マウスに過開口運動を加え、顎関節線維性癒着モデルを作製し、過開口運動後のWTマウスとテネイシンCノックアウト(TNCKO)マウスの顎関節癒着範囲をHE標本にて比較した。さらに、線維化に関係するテネイシンCと細胞接着に関係するフィブロネクチンの発現を免疫組織化学染色とマウス関節円板のウエスタンブロッティングにて検討した。過開口運動後7日目にWTマウスにおいて関節円板の線維性癒着を認めたが、TNCKOマウスでは、癒着の開始時期が少し遅れ、過開口運動後12日目に線維性癒着を認めた。その後、WTマウスでは癒着部位の拡大が認められたが、TNCKOマウスでは癒着部位はWTマウスに比べ拡大は認められなかった。免疫組織化学染色では、過開口運動により、関節円板、関節窩においてテネイシンCの発現が強くなった。フィブロネクチンは、TNCKOマウス、WTマウス両方の顎関節において発現が認められ、TNCKOマウスではWTマウスよりフィブロネクチンの発現量は少なかった。テネイシンCは、形態形成、発癌や創傷治癒などの組織再構築過程において重要な役割を果たす細胞外マトリックスと考えられている。過開口運動によりTNCKOマウスでは顎関節の線維性癒着の拡大を認めなかったことから、テネイシンCの欠質が原因と考えられた。過開口運動というメカニカルストレスによりテネイシンCは、関節円板、関節窩において発現した。しかし、関節円板の線維性癒着部位にはテネイシンCは発現しなかった。また、TNCKOマウスではフィブロネクチンの発現量は少なかった。以上のことから、テネイシンCは、フィブロネクチンの発現をコントロールし顎関節の線維性癒着に関係していることが示唆された。重症の顎関節内障で生じる顎関節の線維性癒着にテネイシンC (TNC)がどのように関与しているかを、マウス顎関節を用いて検討してきた。野生型(WT)マウスとTNCノックアウト(TNCKO)マウスに過開口運動を加え、顎関節線維性癒着モデルを作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色標本にて過開口運動後の顎関節内の癒着について検討するとともに、TNCと細胞接着に関係するフィブロネクチン(FN)の発現を免疫組織化学染色とマウス関節円板のウエスタンブロッティング(WB)にて検討した。

HE標本において、過開口運動後7日目にWTマウスにおいて関節円板の線維性癒着を認めたが、TNCKOマウスでは、癒着の開始時期が少し遅れ、過開口運動後12日目に線維性癒着を認めた。WTマウスにおいて過開口運動により、関節円板、関節窩でTNCの発現が強くなった。FNは、TNCKOマウス、WTマウス両方の顎関節において発現が認められ、TNCKOマウスではWTマウスよりFNの発現量は少なかった。2014年度は、マウス顎関節線維性癒着へのTNCの関与を、筋線維芽細胞に着目し検討した。WTマウスとTNCKOマウスに過開口運動を行い、マウス顎関節組織において、筋線維芽細胞の存在を示すα-smooth muscle actin(α-SMA)の発現を、免疫組織化学染色とWBを用いて検討した。結果は、免疫組織化学染色とWBのどちらにおいても、TNCKOマウスではα-SMAのタンパク発現量がWTマウスに比べて少なかった。筋線維芽細胞は線維化の原因となるコラーゲンを産生している。そのためTNCKOマウスでは筋線維芽細胞の発現が抑制されることが考えられ、また、FNの発現もTNCKOで発現が少なくなっていたことから、過開口運動後のTNCKOマウスではWTマウスに比較し、顎関節の線維性癒着が遅れることが示唆された。つまり、TNCは顎関節の線維性癒着の促進において重要な役割を果たしていることが示唆された。口腔外科学TNCKOマウスがWTよりも繊維化が遅れている原因を検索しているが、筋線維芽細胞の発現に差が出ていることが、免疫組織化学染色とウエスタンブロチィングで確認できている。また、これらの研究成果は論文にまとめ、European Journal of Histochemistryに投稿中である。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。マウス顎関節炎モデルの作製はほぼ終了している。マウス顎関節炎モデルの免疫組織化学染色による検討は、フィブロネクチンにおいては、検討されているものの、他の因子にてはまだなされていない。予定していた下顎頭軟骨の厚みの変化については検討しているものの、WTとTNCKOとの差はみいだせていない。しかし、フィブロネクチンの発現については、ウェスタンブロットまで検討されており、WTとTNCKOとの差はみいだせている。これらの理由からおおむね研究は順調に進展していると判断した。顎関節への繊維化にはさまざまな因子が関係していると考えられるが、テネイシンCノックアウトマウスと野生型マウスにおいて違いのある因子を検索していく予定である。1マウス顎関節炎モデルの標本において免疫組織化学染色を続行:WTマウスとTNCKOマウスの滑膜においてTNF-α、IL-6、およびIL-8の発現に差があるかどうかを免疫組織化学染色にて検索し、TNCが滑膜炎を増強する因子かどうかを検討する。WTマウスとTNCKOマウスの関節円板、下顎頭軟骨において免疫組織化学染色にてMMPの発現について比較検討し、TNCが関節円板と下顎頭軟骨の退行性変化に関与する因子かどうかを検討する。関節円板癒着の時期においては、免疫組織化学染色にてTGF-βとα-smooth muscle actinの発現を検索する。
ワールブルグ効果解消による癌治療開発へ-がん組織バンクを活用して

腫瘍細胞における糖代謝異常と密接に関連する、解糖系酵素ピルビン酸キナーゼM(PKM)に関する解析を行った。臨床検体の解析から、非常に多くのがん種・症例で、PKMアイソフォームの発現が、スプライシング制御の異常によって、PKM1からPKM2へと変換していることが明らかになった。また、蛍光によって、PKMのスプライシングパターンを、生細胞観察可能なレポーター遺伝子を開発した。培養細胞を用いた実験により、このレポーター遺伝子が、概ね正しく機能することを確認した。がん細胞に特徴的な代謝スタイル(嫌気的解糖系の構成的異常亢進:ワールブルグ効果)と密接に関連する「解糖系酵素遺伝子のスプライシング異常」の臨床的意義や分子機構解明について、(1)臨床サンプルを用いた解析、および(2)独自の機能的スクリーニング系開発、という2つのアプローチによって、取り組んだ。本年度の成果としては;(1)当該研究施設がん組織バンク所収検体を対象に、ピルビン酸キナーゼM(PKM)遺伝子のスプライシング解析を行うとともに、その結果と各種臨床情報との照合・比較・相関解析を進めた。その結果、いくつかのがん種において、スプライシング異常への関与が疑われる、スプライシング制御因子の、がんにおける発現上昇を見出した。(2)スプライシング異常に関わる遺伝子・因子の探索や、異常是正効果をもつ低分子化合物スクリーニングへの応用を目的として、PKMのスプライシング変換を、蛍光によって、生細胞可視化できるレポーター遺伝子を作製した。そして、このレポーターコンストラクトを組み込んだBACコンストラクトを作製した。このBACコンストラクトを用い、可視化レポーター遺伝子を染色体に安定的に組み込んだ細胞株(PKM-fp細胞)を樹立した。前述「1」にて発現上昇がみられたスプライシング因子のノックダウン実験等を行うなどして、上記レポーター遺伝子の動作確認等を行い、概ね良好な結果を得た。次いで、標準化合物ライブラリーの供与を受け、スクリーニング系の試験的運用を開始した。腫瘍細胞特有の糖代謝スタイル(ワールブルグ効果)と密接に関連する「解糖系酵素遺伝子のスプライシング異常」の臨床的意義解明に取り組んだ。当該研究施設がん組織バンク所収検体を対象に、ピルビン酸キナーゼM(PKM)遺伝子のスプライシング解析を行うとともに、その結果と各種臨床情報との照合・比較・相関解析を進めた。さらに、スプライシング異常が惹起される分子メカニズムについても検討を行った。これまでの解析により、以下の点が明らかになった:(1)非小細胞肺がんにおいて、TNM因子との相関はみとめられないが、stage 1a期の検体ではスプライシング異常の程度が比較的低いこと、(2)非小細胞肺がんにおいて、腫瘍径が比較的小さな症例においては、スプライシング異常の程度とFDG-PETシグナル(SUVmax値を使用)との間に相関がみとめられること、(3)小細胞肺がん、および頭頸部がんの多くの症例では、スプライシング異常はみとめられないものの、PKMの発現異常が起きていること、(4)乳がんにおいて、スプライシング異常とVEGF(血管新生に関与する増殖因子)発現との間に強い相関があること。Her2異常との相関はみとめられないこと、(5)乳がんのPKMスプライシング異常が、いくつかの抑制性スプライシング制御因子の発現異常と強く相関すること、(6)それらスプライシング因子の発現を抑制することで、PKMスプライシング異常を、部分的にながら、是正することができること。東日本大震災ににより、解析途上、または前処理を既に施してあったサンプルが多く失われ、保存組織から再度調製する必要等が生じたため、計画全体に遅れをきたした。バンク検体の収集と解析を継続的に行うことは当初の予定通りである。震災に伴って失ったサンプルに関しては、ほぼリカバリーを終えており、引き続きバンクの拡充とデータの蓄積、および解析症例のフォローアップを進める。当初、H23年度内を予定していたDNAマイクロアレイ解析(比較的高額を要する)等を、今後行う。実施状況報告書(様式F-6-1)における"次年度使用額"の大半は、前上述のマイクロアレイ解析に使用する予定である。
比較ゲノム的アプローチによる配偶子認識因子の探索

被子植物に見られる重複受精のしくみは複雑であるが,元は基部陸上植物の生殖機構に近いものから進化したと考えられる。従って,陸上植物に共通する配偶子認識・融合のしくみを理解するために,基部陸上植物ゼニゴケは有用なモデルとなりうると考えた。精子が卵に到達・融合するには,精子細胞膜に存在する膜タンパク質が重要である。そこで,ゼニゴケ精子特異的に発現する膜タンパク質遺伝子を探索するため,まず次世代シーケンサを用いて約60万リードの雄器床由来ESTを取得した。これまでに得た葉状体や受精前後の雌器床などに由来する約250万リードのESTとの比較および整列化により,雄器床由来ESTのみに存在する4,099配列を得た。これらのうち,37配列は他生物種の膜タンパク質と相同性を示し,かつ推定膜貫通ドメインを有していた。これらのうち,少なくとも10配列は実際に雄器床特異的に発現していることをRT-PCRにより確認した。米国Joint Genome Instituteとのゲノムプロジェクトで予備的なゲノム情報が利用可能となり,推定膜貫通ドメインをもつ他の配列についても同様に解析している。さらに,ゼニゴケ精子が卵そのものではなく,造卵器基部に強く誘引されることを見いだし,精子誘引実験系として利用できるようになった。また,Kイオンに対する走化性をもつという古い報告があったが,その再現性も確認した。最近可能となったゼニゴケ遺伝子破壊系と併せて,精子膜タンパク質遺伝子の機能解析を行っている。本研究では、雌雄異株植物であるゼニゴケを用いて、(1)精子および卵特異的に発現する膜タンパク質の候補遺伝子の探索、(2)他生物種でも保存されている遺伝子の絞り込み、(3)形質転換系を用いた候補タンパク質の細胞内局在の評価、を実施する。本年度は、ゼニゴケ精子に由来するESTの作成を試みた。ゼニゴケ精子を採取し、異なる方法でRNAの抽出を行ったが、いずれの方法でも他の組織由来のRNAに比べて分解が進んでいた。そこで、様々な生育段階にある造精器を含む雄生殖器よりRNAを抽出し、次世代シーケンサによる塩基配列解析を実施した。約50万リードが得られ、その平均長は約390bpであった。これまでの研究で獲得していた完全長cDNAライブラリ由来の配列と比較したところ、5'末端領域への到達度はやや低かった。しかし、M666C5.1といった雄生殖器特異的に発現しているY染色体遺伝子の転写産物が含まれており、本研究の目的には十分であると判断した。また、シロイヌナズナなどで受精に重要な役割を果たすことが示されているGCS1遺伝子のホモログも見いだされ、MpGCS1と名付けた。全長は明らかになっていないが、MpGCS1はY染色体のContig-Aの末端領域に位置していた。予定では卵あるいは造卵器のESTも作成することになっていたが、研究代表者の異動に伴う移転作業により材料の確保が遅れたため、試料調製およびデータ取得は次年度になる。
ものづくりを通した小学生児童の科学技術離れ・理科離れ対策教育プログラムの導出

本研究は、将来の日本における科学技術の担い手としての小学生児童を対象として、「ものづくり」を通じて「科学技術」「理科」への覚醒を図るとともに、その基礎的知識を涵養するための教育プログラムならびに教材を導出することを目的としたものである。平成17年度にあっては、千葉大学工学部において実践してきたいくつかの「ものづくり」教育の内容に基づき、教育プログラム・教材を試作し、千葉市ならびにその近郊に在住する小中学生を対象としてそれらを試用した。平成18年度にあっては、各ワークショップにおける参与観察、ならびに、ワークショップ終了後に実施したアンケート調査、小中学校において教育に携わっている教諭らへの聞き取り調査に基づき、前年度に用いた試作プログラムの問題点などを抽出したうえで改善を行った。最終的に、「ものづくり」を通じて「科学技術」「理科」への覚醒を図るとともに、その基礎的知識を涵養するための教育プログラムならびに教材の作成を行った。最終的なプログラムの課題は「風・なぜ空を飛べるのか?飛行体の仕組み」「土・なぜ藁は強いのか?植物の構造学」「光・なぜものは光るのか?光と影の科学」の3つとし、各課題2日、総計6日のワークショップに必要な教材を作成した。教材の主な特徴は、次のようである。(1)「講義」「実験」「制作(ものづくり)」のいずれにおいても、受講者が主体的に参加できるよう留意した。(2)とくに「教材」においては、受講生らの興味を惹くよう、現象を段階的にアニメーションで説明する動画を作成した。(3)「講義」には、必ず「実験」「制作(ものづくり)」を付随させ、科学現象・法則を自らの体験を通して学ぶことができるよう設定した。(4)「制作(ものづくり)」では、小学生児童のみならず、親子で協力しながら取り組むよう留意した。本研究は、将来の日本における科学技術の担い手としての小学生児童を対象として、「ものづくり」を通じた「科学技術」「理科」への覚醒を図るとともに、その基礎的知識を涵養するための教育プログラムならびに教材を導出することを目的としたものである。平成17年度にあっては、千葉大学工学部においてこれまで試行してきたいくつかの「ものづくり」教育の内容に基づき、教育プログラム・教材を試作し、千葉市ならびにその近郊に在住する小中学生を対象として、それらを試用した。プログラムの課題は「風・なぜ空を飛べるのか?飛行体の仕組み」「土・なぜ藁は強いのか?植物の構造学」「光・なぜものは光るのか?光と影の科学」の3つとし、各課題2日、総計6日のワークショップを実施した。いずれの課題においても、小中学生の児童・生徒が、「ものづくり」体験を通して、自ら手を動かし能動的に思考しながら「科学」への関心を高めるとともに、その基礎を学ぶことができるようプログラムを設定した。また、各ワークショップでは、「制作(ものづくり)」のみならず、科学的な知見に基づいた「講義」ならびに「実験」を行った。「講義」「実験」「制作(ものづくり)」のいずれにおいても、受講する小中学生の児童・生徒らが、可能な限り、積極的に参加できるよう留意するとともに、「教材」には可能な限り視覚的資料を取り入れた。各ワークショップでは、参与観察を行うとともに、終了後には、アンケート調査を実施した。その結果、以下が判明している。(1)児童・生徒らは「ものづくり」そのものに高い関心を寄せている。(2)児童・生徒らは、ワークショップへの参加を通じて、「ものづくり」の背景に「科学」があることを体得した。(3)「ものづくり」を通じて、「科学」への関心を高めた児童・生徒は、「実験」「制作」のみならず「講義」への関心が高くみられた。
新しく確立したヒトキマーゼ測定法の臨床応用:急性冠動脈症候群と危険因子の分析

特異性の高いキマーゼ阻害薬を使用して、ヒトキマーゼ依存性アンジオテンシンII(AII)産生能の測定法を確立した。この方法を用いて、人の末梢血単核球分画検体を分析し、急性冠動脈症候群症例では入院後1日目にピークを示し、その後漸減することを見出した。そのピーク値は心筋梗塞重症度と正相関していた。そして、慢性期の冠動脈危険因子との関連では、単核球中キマーゼ活性は、男性で女性より有意に増加しており、その他の病態では、白血球数・CRP増加、HOMA指数・CKD病態などと正相関することを見出した。すなわち、生活習慣病の病態で軽微な炎症病態・耐糖能異常・CKD等で、循環単核球中のキマーゼ活性が増加することを明らかにした。琉球大学との共同研究では、脂肪酸の靜注で循環単核球中のAngII産生能が増加し、その際の内皮機能障害と関連していた。香川大学との共同研究では偏腎尿管クリップで腎盂内圧を増加させると腎臓間質部分でのキマーゼ活性が増加し、組織Ang IIレベルの増加に寄与していた。このように、循環単核球中キマーゼ活性は急性期及び慢性期病態で増加し、組織AngIIレベルを増加させてその後の臓器機能障害に関与することが明らかになった。本研究の目的はI)新たに確立した循環血単核球中のキマーゼを含むAng II産生系の特異的測定を福岡大学筑紫病院来院および入院の患者で行うこと。II)急性期および慢性期心血管疾患の経時的分析を施行し、病態変化や治療経過に沿った循環血単核球中Ang II産生酵素活性の変化を分析しすること。III)臨床データとの関連性を明らかにし、どのような病態で単核球中Ang II産生酵素が活性化されているかを同定し、今後開発予定のキマーゼ阻害薬の対象疾患や現在使用されている薬物療法(とくにレニン・アンジオテンシン系阻害薬)の使用時期・使用用量などの適切性などを検討することにあった。平成21年度には、急性冠動脈症候群(ACS)に焦点を当てて分析し、福岡大学筑紫病院へ救急搬送されたACS患者からデータ収集し、ACS急性期(I-3日目)に単核球中Ang II産生酵素活性特にキマーゼ活性が有意に増加し、梗塞範囲の重症度(CK値)と正相関して増加することを明らかにし、学会報告した(Okamura et al.2009)。一方、慢性期病態(生活習慣病やCKD)のうち高血圧・インスリン抵抗性・慢性腎障害・軽度CRP増加・高尿酸血症患者などでは、単核球中Ang II産生酵素活性が増加することを単相関分析で見出した。重回帰分析の結果では、男性・慢性炎症病態(WBC増加・CRP増加)・慢性腎障害などが循環単核球中キマーゼ活性に独立して関連する因子であることが明らかになり、学会報告した(Okamura et al.2008a,b,2009)。このように研究計画に沿ったデータは得られているので今後これらのデータを論文化する予定である。本研究の目的はI)新たに確立した循環血単核球中のキマーゼを含むアンジオテンシンII(A II)産生酵素活性測定を外来および入院患者で行うこと。II)急性期および慢性期心血管疾患で上記測定結果を経時的に分析し、病態変化や治療経過に伴う循環血単核球中A II産生酵素活性変化を分析すること。III)臨床データとの関連性を明らかにし、どのような病態で単核球中A II産生酵素が活性化されているかを同定し、現在使用されている循環器領域の薬物療法(特にレニン・アンジオテンシン系阻害薬)の使用時期・使用用量などの適切性などを検討することである。平成22年度には、急性冠動脈症候群(ACS)に焦点を当てて分析し、福岡大学筑紫病院へ救急搬送されたACS患者からデータ収集し、ACS急性期(I-3日目)に単核球中A II産生酵素活性特にキマーゼ活性が有意に増加し、梗塞範囲の重症度(CK値)と正相関して増加することを明らかにした。

また、心房細動患者の心エコーにて測定された左心房径も単核球中A II産生酵素活性と正相関することを見出し学会報告した(Okamura et al.2009, 2010)。一方、慢性期病態(生活習慣病やCKD)のうち高血圧・インスリン抵抗性・慢性腎障害・軽度CRP増加・高尿酸血症患者などでは、単核球中A II産生酵素活性が増加することを単相関分析で見出した。重回帰分析の結果では、男性・慢性炎症病態(WBC増加・CRP増加)・慢性腎障害などが循環単核球中キマーゼ活性に独立して関連する因子であることも明らかになり、学会報告した(Okamura et al.2008, 2009, 2010)。研究計画に沿ったデータは得られているので今年度中に論文化する予定である。本研究の目的はI)新たに確立した循環血単核球中のキマーゼを含むアンジオテンシンII(A II)産生酵素活性測定を外来および入院患者で行うこと。II)急性期および慢性期心血管疾患で上記測定結果を経時的に分析し、病態変化や治療経過に伴う循環血単核球中A II産生酵素活性変化を分析すること。皿)臨床データとの関連性を明らかにし、どのような病態で単核球中AH産生酵素が活性化されているかを同定し、現在使用されている循環器領域の薬物療法(特にレニン・アンジオテンシン系阻害薬)の使用時期・使用用量などの適切性などを検討することである。まず、急性冠動脈症候群(ACS)に焦点を当てて分析し、福岡大学筑紫病院へ救急搬送されたACS患者からデータ収集し、ACS急性期(1-3日目)に単核球中A II産生酵素活性特にキマーゼ活性が有意に増加し、梗塞範囲の重症度(CK値)と正相関して増加することを明らかにした。また、心房細動患者の心エコーにて測定された左心房径も単核球中A II産生酵素活性と正相関することを見出し学会報告した(Okamura et al.2009,2010)。重回帰分析の結果では、男性・慢性炎症病態(WBC増加・CRP増加)・慢性腎障害などが循環単核球中キマーゼ活性に独立して関連する因子であることも明らかになり、学会報告した(Okamura et al. 2008,2009,2010)。研究計画に沿ったデータは得られている。これらの成果について論文投稿中である。
フェリチンを用いた新規「蛋白質ケージ構造解析法」の技術基盤の確立

本研究では、高い熱安定性・pH安定性を有する蛋白質ケージ(Scaffold)のもつ直径約8nmの内部空洞に標的蛋白質を閉じ込め、粒子画像抽出が容易なScaffoldごとクライオ電顕単粒子解析法によって立体構造を決定すること、そのために必要な技術基盤を構築することを目的としている。現在までに、モデル分子を用いて発現ベクターの構築から、精製、電顕観察、画像解析までを何度も繰り返し、高分解能構造を得るために必要な技術基盤を1つ1つ精査・開発を行っている状態である。蛋白質発現に関しては、Scaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量をそれぞれのベクターのコピー数をコントロールすることで、適切なScaffold-標的蛋白質複合体を発現させることに成功した。蛋白質精製に関しては、精製タグを付加することで、Scaffold-標的蛋白質複合体のみを単離することを試みた。当初は6 x his-tagを用いて精製を行い吸着・溶出条件等を検討したがScaffoldとScaffold-標的蛋白質複合体を完全に分離することができなかった。構造解析に関しては、Scaffold混在下でのScaffold-標的蛋白質複合体のクライオ電顕画像取得、構造解析を試みた。すでに、Scaffold単体の画像取得についてはその濃度、凍結条件等が確立できていたので、その条件にて行った。その結果、Scaffoldの構造は比較的高分解能で決定できるが、標的蛋白質の構造は低分解能の構造しかられていない。今後は精製タグ、標的蛋白質固定化、Scaffoldの対称を崩す方法等を検討し高分解能での構造解析を実現したい。モデル標的蛋白質としてGFPを用いて、発現系の構築・精製条件検討を行った。その結果、2.タグを付加することで、Scaffold-GFP複合体のみを単離することを試みた。当初は6 x his-tagを用いたが、Scaffold本体がNi-NTAに対して吸着が認められ吸着・溶出条件等を検討したがScaffoldとScaffold-GFP複合体を完全に分離することができなかった。現在、蛋白質タグを含めて検討を行っている。3.Scaffold混在下でのScaffold-GFP複合体のクライオ電顕画像取得、構造解析を試みた。その結果、Scaffoldの構造は比較的高分解能で決定できるが、GFPの構造は低分解能の構造しか得られなかった。これは、GFPがScaffoldに対して、複数の向きで配置していることに加え、Scaffoldの高い対称性に引きずられて、画像解析過程でGFPの向きをうまく合わせられないことに起因すると考えられる。1.精製過程で、ScaffoldとScaffold-GFP複合体を完全に分離することができなかったため、現在蛋白質タグを含めて精製タグの検討を行っている。2.GFPがScaffoldに対して、複数の向きで配置している問題に関してはGFPの相対配向を固定するために剛直なリンカーをGFPとScaffoldとの間に導入しGFPの固定化を進めている。また、GFPが導入されたScaffoldのみに目印となる分子を付加することで、Scaffoldの対称性を崩すことを検討している。3.現在まで、電顕画像取得と画像解析・構造解析を研究協力者に依頼していたが、構造解析ワークステーションを購入し、画像解析・構造解析も研究代表者が行うことで分子デザインから構造解析のサイクルを早く回す予定である。

現在、蛋白質タグを含めて検討を行っている。3.Scaffold混在下でのScaffold-GFP複合体のクライオ電顕画像取得、構造解析を試みた。すでに、Scaffold単体の画像取得についてはその濃度、凍結条件等が確立できていたので、その条件にて行った。その結果、Scaffoldの構造は比較的高分解能で決定できるが、GFPの構造は低分解能の構造しか得られなかった。これは、GFPがScaffoldに対して、複数の向きで配置していることに加え、Scaffoldの高い対称性に引きずられて、画像解析過程でGFPの向きをうまく合わせられないことに起因すると考えられる。1.精製過程で、ScaffoldとScaffold-GFP複合体を完全に分離することができなかったため、現在蛋白質タグを含めて精製タグの検討を行っている。2.GFPがScaffoldに対して、複数の向きで配置している問題に関してはGFPの相対配向を固定するために剛直なリンカーをGFPとScaffoldとの間に導入しGFPの固定化を進めている。また、GFPが導入されたScaffoldのみに目印となる分子を付加することで、Scaffoldの対称性を崩すことを検討している。3.現在まで、電顕画像取得と画像解析・構造解析を研究協力者に依頼していたが、構造解析ワークステーションを購入し、画像解析・構造解析も研究代表者が行うことで分子デザインから構造解析のサイクルを早く回す予定である。電顕画像取得と画像解析・構造解析を研究協力者に依頼していたが、分子デザインから構造解析のサイクルを早く回すため構造解析ワークステーションを購入し、画像解析・構造解析も研究代表者が行う。そのため、構造解析ワークステーションを購入に必要な経費を翌年度分より請求した。本年度に購入・交換予定であったクロマト装置のUVランプユニットは今のところ正常に動いているため、また翌年度に購入予定の消耗品であるゲル濾過カラムは本年度の利用が少なかったため翌年度も使用可能と考えられ、その分を次年度使用額に充当する。
植物の有性生殖における雌雄ゲノム相互作用の全ゲノム関連解析

有性生殖では、異なる雌雄ゲノム間の相互作用を介して交配相手が選抜され、生まれてくる多様なゲノム組み合わせを持つ子孫が再度自然選択により選抜される。この雌雄ゲノム間の相互作用を介した受精前後の選抜は、種の存続を支える基盤となっているが、系の複雑さゆえに相関遺伝子の実体解明は遅れている。本研究ではこの雌雄ゲノム間相互作用の解析に、シロイヌナズナの野生系統を用いた全ゲノム関連解析が有効であることを示した。有性生殖では、異なる雌雄ゲノム間の相互作用を介して交配相手が選抜され、生まれてくる多様なゲノムの組み合わせを持つ子孫が再度自然選択により選抜される。この雌雄ゲノム間相互作用を介した受精前後の選抜は、種の存続を支える基盤となっているが、系の複雑さゆえに相関遺伝子の実体解明は遅れている。本研究はシロイヌナズナの野生系統を用いた全ゲノム関連解析を、この異種ゲノム間相互作用研究に適用する試みである。本年度は主に以下の2点について解析を進めた。1.種間不和合性シロイヌナズナを異種アブラナ科植物と交配すると、様々な段階で不和合性反応が起きることが確認された。例えばシロイヌナズナの花粉を近縁種のナズナと交配させると花粉の吸水、柱頭への侵入といった比較的早期の段階で花粉の伸長が阻害され、雌雄ゲノム間の何らかの不適合が予測される。この時、シロイヌナズナの野生株を多数交配させるとその阻害部位や程度は野生株毎に異なることを見出した。この多様性を利用して今後全ゲノム関連解析を適用し、関与する遺伝子座の抽出を試みる計画である。2.ゲノムインプリント遺伝子群シロイヌナズナの胚乳発達は、父母由来のインプリント遺伝子間の相互作用により系統毎にバランス良く調節されていることが示唆されている。実際シロイヌナズナの異なる野生系統間で相互に交配させると胚乳の発達が促進あるいは抑制される例が複数観察された。しかし、一方で胚乳の発達は同系統内の交配でも鞘毎、個体毎にかなり変動することも確認できた。今後こうした環境的・生理要因の影響を避け、遺伝的要因を選択的に抽出する系を確立した後に、胚乳発達に影響を与えている遺伝子座の抽出を試みる計画である。有性生殖では、雌雄の異なるゲノム間の相互作用を介して適切な交配相手が選抜され、受精により多様なゲノム組み合わせを持つ子孫が作られた後、再度自然選抜が行われる。この受精前後の雌雄ゲノム間の相互作用は、種が生存に必要とする多様かつ有益なゲノム情報を保持するための基盤となっているが、系の複雑さゆえに相関遺伝子の実体解明は遅れている。本研究はシロイヌナズナの野生系統を用いた全ゲノム関連解析(GWAS)を、この異種ゲノム間相互作用研究に適用する試みである。具体的には、本来自殖性の本植物を相互交配させて異種ゲノム相互作用状態を作製し、以下の3つの複雑系において機能する相関遺伝子群の実体をGWASにより同定することを目的とした。1)種間不和合性:昨年度は、ルベラナズナCapsella rubellaの雌ずいに対し、シロイヌナズナArabidopsis thalianaの野生種の花粉を受粉させ、種間不和合性の度合いを指標にGWASにより種の障壁となっている遺伝子座の特定を行った。本年度は、特に種間不和合性の度合いが異なるシロイヌナズナの2系統のF2世代を用いて障壁となる遺伝子座の特定を進めた。2)ゲノムインプリンティング:Col系統の雌ずいに、各種野生種の花粉を受粉させ、得られる種子のサイズを指標にGWASにより胚乳の発達に影響を与える父系インプリント遺伝子の探索を行ったが、種子サイズが植物体の大きさや、さや当りの種子数により大きく変動することが判明したたため計測系の改良を行った。3)雑種強勢:Col系統と各種野生系統とのF1雑種種子を寒天培地上に播種し、4,5日後の芽生えのサイズを指標にGWASにより芽生えの生長に影響を与える遺伝子座の特定を進めた。1)種間障壁と3)雑種強勢を対象とした解析により、複数の相関遺伝子座が抽出されてきており、GWASの有効性が示されてきている。また、2)インプリント遺伝子を対象とした解析では、種子サイズに影響を与える植物体の大きさや鞘あたりの種子数の問題を解決する手法を確立することができた。当初の計画に従っておおむね順調に研究は進展している。有性生殖過程における雌雄の異種ゲノム間相互作用として知られる以下3つの事象を解析対象として取り上げ、シロイヌナズナの野生系統におけるゲノムの多様性を利用した全ゲノム関連解析(GWAS)により相互作用遺伝子群の探索を実施した。1)種間不和合性(primary incompatibility)に関わる遺伝子群:ルベラナズナCapsella rubellaの雌ずいに対し、シロイヌナズナArabidopsis thalianaの野生種を受粉させた際の種間不和合性の度合いを指標としたGWASにより種間障壁遺伝子座の一つを特定した。さらに、種間不和合性の度合いが大きく異なるシロイヌナズナの2系統のF2世代を用いて障壁遺伝子候補を絞り込むことに成功した。2)胚乳発達制御に関わるゲノムインプリント遺伝子群(genomic imprinting genes):植物体の大きさや、さや当りの種子数により種子サイズが大きく変動してしまうことが判明したため、種子サイズ計測法の改良を行った。試験区と標識した対象区の花粉を混合して同時に受粉することにより遺伝的要因以外の影響を排除しうる計測系を確立することができた。

さらに本法に基づきGWAS解析を行い、有意に相関する遺伝子座を特定した。3)雑種強勢(heterosis)に関わる遺伝子群:Col系統と各種野生系統とのF1雑種種子を寒天培地上に播種し、5日後の芽生えサイズを指標にGWASを実施し、有意に相関する一つの遺伝子座を特定することに成功した。有性生殖では、異なる雌雄ゲノム間の相互作用を介して交配相手が選抜され、生まれてくる多様なゲノム組み合わせを持つ子孫が再度自然選択により選抜される。この雌雄ゲノム間の相互作用を介した受精前後の選抜は、種の存続を支える基盤となっているが、系の複雑さゆえに相関遺伝子の実体解明は遅れている。本研究ではこの雌雄ゲノム間相互作用の解析に、シロイヌナズナの野生系統を用いた全ゲノム関連解析が有効であることを示した。有性生殖前後における異種ゲノム間相互作用の実態を全ゲノム関連解析を介して抽出する初の試みである。ゲノム間相互作用に起因する表現型の差異を、環境要因や人為的要因を出来るだけ避けて抽出することができるかどうかが本研究の成否を決すると予測される。実際、1番目の課題である種間不和合性に関与する遺伝子座の抽出に関しては、特定の系統の組み合わせ間で比較的再現性の良い結果が得られてきており、予備的な全ゲノム関連解析でも複数の遺伝子座の関与が有意に示唆されてきている。2番目の胚乳発達に影響を及ぼすゲノムインプリント遺伝子座の抽出においても、遺伝的要因の抽出に支障を来す要因の実体がみえてきており、実験手法のさらなる改善により全ゲノム関連解析が可能となる見込みである。2)種子サイズに影響を与える父性インプリント遺伝子の同定にむけて、改良した種子サイズ計測法により求めたデータをもとにGWASを行い、インプリント遺伝子座の特定を行う。特定された遺伝子座の原因遺伝子候補については、今後、分子生物学的手法により関与を検証していく計画である。細胞間情報学1.種間不和合性に関わる雌雄遺伝子群交配するシロイヌナズナ野生系統の数を増やして全ゲノム関連解析に供し、種間不和合性に関わる遺伝子座候補を抽出する。有意とされた遺伝子座については、SNPsと表現型の関連性、野生株の地理的分布、発現データなどを参考に相関遺伝子候補の絞り込みを行う。また、表現型の大きく異なる2系統間のF2後代を用いた連鎖解析や相補試験等により相関遺伝子座の特定を目指す。2.胚乳発達に関わる父母ゲノムインプリント遺伝子群シロイヌナズナ野生系統の遺伝的要因を反映した胚乳発達の度合いを計測する系を確立し、全ゲノム関連解析に供する。抽出された遺伝子座については1と同様な手法により相関遺伝子座の特定を目指す。3.他の生理現象に関わる相関遺伝子群の抽出上記以外の雌雄ゲノム間相互作用に起因すると推定される事象に着目し、全ゲノム関連解析を適用できるかどうか検討する。系の変更により、2)の父性インプリント遺伝子の同定に向けたGWASを遅らせる必要がでてきたため。シロイヌナズナ野生株を多数栽培・交配させ、複数の複雑系に関するデータを取得する計画であったが、環境要因および人為的要因によるデータの振れが予想以上に大きく、遺伝的要因を選択的に抽出する系の確立に時間がかかったため、大量のシロイヌナズナ野生株の栽培と遺伝子解析にかかる経費は平成27年度に集中して使用することにした。
ディスクブレーキの面外鳴きと面内鳴きの簡易な解析モデルおよび鳴き試験機と抑制法

ディスクブレーキの面内鳴きの発生メカニズムを解明し,面外鳴きと面内鳴きの両方を理論的に抑制する方法を提案する.まず,面外鳴きと面内鳴きの発生に必要な要素のみで構成した鳴き試験機を作成し,鳴きの発生条件を明確にする.次に,低自由度の解析モデルを用いて,面内鳴きが発生するメカニズムを解明する.従来では,面外と面内の独立した座標で考えられていた鳴き振動を,斜め方向の1自由度という本質で捉え直すことで,面内鳴き現象を簡単に説明できる.さらに,鳴き発生メカニズムに基づいた鳴き対策を鳴き試験機に施し,効率的かつ確実に鳴きを抑制できることを示す.ディスクブレーキの面内鳴きの発生メカニズムを解明し,面外鳴きと面内鳴きの両方を理論的に抑制する方法を提案する.まず,面外鳴きと面内鳴きの発生に必要な要素のみで構成した鳴き試験機を作成し,鳴きの発生条件を明確にする.次に,低自由度の解析モデルを用いて,面内鳴きが発生するメカニズムを解明する.従来では,面外と面内の独立した座標で考えられていた鳴き振動を,斜め方向の1自由度という本質で捉え直すことで,面内鳴き現象を簡単に説明できる.さらに,鳴き発生メカニズムに基づいた鳴き対策を鳴き試験機に施し,効率的かつ確実に鳴きを抑制できることを示す.
ペクチンの集積現象を利用したイチゴの花芽分化簡易診断法の確立

これまでの実験から,イチゴクラウン組織から抽出したペクチンでは,マウスによるペクチン抗体の作成は可能だが,抗原抗体反応の感度が悪く,花芽分化の診断技術への応用は難しいことが明らかになった.そこで,花芽分化に伴いクラウン内に蓄積されるペクチンを,直接確認することによって花芽分化の診断が可能かどうかについて検討した.実験は品種間差を確認するため,「とよのか」,「愛ベリー」,「麗紅」および「盛岡16号」を供試した.各品種の花芽分化段階を顕微鏡下で観察したあと,クラウンを500mgに調整してFAA固定液に浸漬した.クラウンを入れた固定液の変化を固定後2日目に肉眼で観察したあと,固定後14日目にFAA液を遠心分離し,得られた沈澱物を減圧乾燥して乾物重を秤量した.その結果,いずれの品種とも花芽分化段階の分化期(Differentiated)から雌ずい形成初期(Early stage of pistil differentiation)に至るまで,クラウン内にかなり多量のペクチンが集積し,固定液中に沈殿するゲル状のペクチンも肉眼でもはっきりと確認できた.花芽分化診断のためには出来るだけ分化初期に判定する必要があるが,いずれの品種においても分化期でのペクチンの集積量は5mg/500mg程度で,FAA10mlに対してクラウン500mgを3個体分浸漬すれば,2日後にはゲル状沈澱物をはっきりと確認できる.本研究において,抗原抗体反応による花芽分化診断技術を確立することは出来なかったが,花芽分化に伴うクラウン内のペクチンの集積をFAA固定液で確認することによって,花芽分化の開始を推察できる.これまでの実験から,イチゴクラウン組織から抽出したペクチンでは,マウスによるペクチン抗体の作成は可能だが,抗原抗体反応の感度が悪く,花芽分化の診断技術への応用は難しいことが明らかになった.そこで,花芽分化に伴いクラウン内に蓄積されるペクチンを,直接確認することによって花芽分化の診断が可能かどうかについて検討した.実験は品種間差を確認するため,「とよのか」,「愛ベリー」,「麗紅」および「盛岡16号」を供試した.各品種の花芽分化段階を顕微鏡下で観察したあと,クラウンを500mgに調整してFAA固定液に浸漬した.クラウンを入れた固定液の変化を固定後2日目に肉眼で観察したあと,固定後14日目にFAA液を遠心分離し,得られた沈澱物を減圧乾燥して乾物重を秤量した.その結果,いずれの品種とも花芽分化段階の分化期(Differentiated)から雌ずい形成初期(Early stage of pistil differentiation)に至るまで,クラウン内にかなり多量のペクチンが集積し,固定液中に沈殿するゲル状のペクチンも肉眼でもはっきりと確認できた.花芽分化診断のためには出来るだけ分化初期に判定する必要があるが,いずれの品種においても分化期でのペクチンの集積量は5mg/500mg程度で,FAA10mlに対してクラウン500mgを3個体分浸漬すれば,2日後にはゲル状沈澱物をはっきりと確認できる.本研究において,抗原抗体反応による花芽分化診断技術を確立することは出来なかったが,花芽分化に伴うクラウン内のペクチンの集積をFAA固定液で確認することによって,花芽分化の開始を推察できる.イチゴ品種`宝交早生'のクラウン組織からペクチン質多糖類の抽出と精製を行った。花芽分化期のクラウンをFAAに7日間浸漬して滲出した沈澱物を回収した。この沈澱物をEDTA及びペクチナーゼ処理し、さらにフェノールによるタンパク質等の夾雑物除去を行い、最終的に、クラウンの生体重1gから10mgのペクチン質多糖類を抽出した。さらに抽出物はエーテル処理後セルロースチューブで透析して高純度のペクチン質多糖類を得た。つぎに、SDS-PAGE電気泳動法により得られたペクチン質多糖類の定性分析を行った。その結果、クラウン内に蓄積するペクチン質多糖類の分子量は70,000以上であるか、もしくは、ウロン酸残基のエステル価が非常に高いものと推察された。しかし、カルバゾール硫酸法とHPLCによるウロン酸の定量はできなかった。すなわち、カルバゾール硫酸法においては呈色反応を示さず、精製されたペクチン質多糖類のウロン酸残基の量が非常に少ないものと思われた。一方、HPLCではカラム・キャリアーの組み合わせをさまざまに換えて試みたが、結局ピークを検出することができなかった。カラム・キャリアーの選択を誤ったものと考えられる。本年度の実験から、高純度の非常に分子量の高いペクチン質多糖類が精製された。70,000以上の分子量を持つ抽出物は抗体作成に十分な大きさと判断され、抗体を作成した。抽出精製したペクチン質多糖類を水溶液として、これにアジュヴァントコンプリートを加えて乳化し、マウス1匹当たり0.2mlずつ腹腔内に接種した。3月下旬に採血し、抗原を作成する予定である。イチゴ「宝交早生」のクラウン組織から抽出したペクチンを、エーテル処理後セルロースチューブで透析して高純度化した。得られたペクチンにメチル化BSAおよびOVAと結合させて抗原とした。BSAあるいはOVAと結合させた抗原および無結合の高純度ペクチンをマウスの腹腔内に接種した。接種は初回後

1および2週間の合計3回、それぞれマウス1匹あたり0.2mlとした。MoAbs(抗体)は脾臓細胞と骨髄細胞を融合したハイブリドーマから作成した。ドットプロットテストにおいて、メチル化BSAペクチンで免疫化した血清において1/40希釈で弱く反応した。しかし、1/320および1/640では反応が見られなかった。また、OVAおよび無結合ペクチンでは抗原抗体反応が全く認められなかった。融合によりペクチン抗体を分泌した8つのハイブリドーマが得られた。すなわち、2つはlgG1タイプに属するものであり、残りの6つはlgMタイプであった。この3タイプを滴定したが、lgG1は1/4希釈でもっとも強く反応したが、1/128希釈までペクチンを認識した。一方、2つのlgMは弱い反応しか示さなかった。以上の実験から抗原抗体反応は認められたが、目的とする花芽分化診断法への応用には不十分な反応であったため、Ca^<2+>濃度を一定にしてNa^+濃度を変化させた条件で反応させた。その結果、lgG1では1/100と1/200の間、lgMでは1/200と1/700の間でペクチンを認識した。このことから、Na^+の存在がCa架橋による分子間結合を阻害し、その結果ペクチンが単離し、抗体に認識されなかったと考えられた。これまでの実験から,イチゴクラウン組織から抽出したペクチンでは,マウスによるペクチン抗体の作成は可能だが,抗原抗体反応の感度が悪く,花芽分化の診断技術への応用は難しいことが明らかになった.そこで,花芽分化に伴いクラウン内に蓄積されるペクチンを,直接確認することによって花芽分化の診断が可能かどうかについて検討した.実験は品種間差を確認するため,「とよのか」,「愛ベリー」,「麗紅」および「盛岡16号」を供試した.各品種の花芽分化段階を顕微鏡下で観察したあと,クラウンを500mgに調整してFAA固定液に浸漬した.クラウンを入れた固定液の変化を固定後2日目に肉眼で観察したあと,固定後14日目にFAA液を遠心分離し,得られた沈澱物を減圧乾燥して乾物重を秤量した.その結果,いずれの品種とも花芽分化段階の分化期(Differentiated)から雌ずい形成初期(Early stage of pistil differentiation)に至るまで,クラウン内にかなり多量のペクチンが集積し,固定液中に沈殿するゲル状のペクチンも肉眼でもはっきりと確認できた.花芽分化診断のためには出来るだけ分化初期に判定する必要があるが,いずれの品種においても分化期でのペクチンの集積量は5mg/500mg程度で,FAA10mlに対してクラウン500mgを3個体分浸漬すれば,2日後にはゲル状沈澱物をはっきりと確認できる.本研究において,抗原抗体反応による花芽分化診断技術を確立することは出来なかったが,花芽分化に伴うクラウン内のペクチンの集積をFAA固定液で確認することによって,花芽分化の開始を推察できる.
肝細胞内微量Ｂ型肝炎ウイルスの病的意義に関する研究

肝細胞内に感染する微量HBVの病態を明らかにするため前向き研究(観察期間中央値24ヶ月(2-61ヶ月)を実施した。その結果HBs抗原陰性例からのHBV再活性化は関節リウマチRA例3/88 (3%)、悪性リンパ腫ML例3/30 (10%)、造血幹細胞移植HSCT例5/19 (26%)であった。再活性化までの期間はHSCT 3例とRA 1例では1年以上、それ以外では1年以内であった。増殖したHBVにはHBs抗原に高率に変異を認めた。モニタリング例では、HBs抗原の有無に関わらずHBV DNAが定量された時点で核酸アナログを投与し、重篤な肝障害を阻止できた。肝細胞内の微量HBVが再活性化する病態は、種々の疾患と治療内容に応じた安全でかつ効率的なモニタリング法の確立が必要と考えられる。そこで平成24年度は前向きに登録・観察している症例についてHBV再活性化の頻度・HBV関連マーカーの推移を解析した。【対象と方法】モニタリング中の203例(HBs抗原陽性37例、HBs抗原陰性・HBc抗体陽性あるいはHBs抗体陽性166例)である。対象疾患は関節リウマチ(RA)98例、悪性リンパ腫(ML)30例、造血幹細胞移植(HSCT)20例、腎移植12例、膠原病疾患17例、リツキシマブ以外の化学療法26例である。【結果】観察期間中央値22ヶ月(2-61ヶ月)においてHBs抗原陰性例からのHBV再活性化はRA症例2/85 (2%)、ML症例3/26 (12%)、HSCT症例4/19 (21%)であった。再活性化例の登録時HBs抗体価は陰性2例、50未満6例、100以上1例であり、再活性化時には1例を除きHBs抗体は陰性であった。再活性化までの期間はHSCT実施2例にて1年以上、他の治療例では1年未満であった。再活性化例を除く118例におけるHBV血清マーカーの推移は、HBs抗体陰転化は3例(ML, RA,尋常性天疱瘡)、この3例を含めてHBc抗体陰転化は8例(RA4, HSCT1)であった。いずれの症例も輸血等による抗体輸注ではなかった。モニタリング例では、HBs抗原の有無に関わらずHBV DNAが定量された時点でエンテカビルを投与し、重篤な肝障害は阻止できた。【結語】HBs抗原陰性RA、ML症例にて1年未満に再活性化が発生した。一方、HSCT例では移植後1年半以降にもHBV再活性化が発生した。再活性化していない症例にても登録時のHBs抗体やHBc抗体の陰転化を認めた。本研究では、肝細胞内の微量HBVが再活性化する病態を明らかにするため種々の疾患と治療内容に応じた安全でかつ効率的なモニタリング法の提示と積極的な介入方法を探索した。2008年から前向きに登録・観察した症例の内、平成25年度は血液悪性疾患に関するHBV再活性化の特徴を解析し、最終年度として全ての登録例の集計結果を報告する。【対象と方法】モニタリング中の229例(HBs抗原陽性50例、HBs抗原陰性・HBc抗体陽性あるいはHBs抗体陽性179例)である。対象疾患は関節リウマチ(RA)103例、悪性リンパ腫(ML)34例、造血幹細胞移植(HSCT)23例、腎移植12例、膠原病関連疾患22例、リツキシマブ以外の化学療法35例である。【結果】観察期間中央値24ヶ月(2-61ヶ月)においてHBs抗原陰性例からのHBV再活性化はRA症例3/88 (3%)、ML症例3/30 (10%)、HSCT症例5/19 (26%)であった。再活性化例の登録時HBs抗体価は陰性2例、50未満8例、100以上1例であり、再活性化時には1例を除きHBs抗体は陰性であった。再活性化までの期間はHSCT 3例とRA 1例において1年以上、残る7例では1年以内であった。血液疾患にて再活性化したHBV遺伝子を解析した結果HBs抗原決定基に高率に変異を検出した。【結語】HBs抗原陰性ML症例にて1年未満に再活性化が発生した。一方、HSCT例やRAでは治療実施後1年半以降にもHBV再活性化が発生した。再活性化の病態に関して宿主の免疫応答(HBs抗体)とともに変異HBVの存在が関与している可能性が示唆された。

モニタリング例では、HBs抗原の有無に関わらずHBV DNAが定量された時点で核酸アナログを投与し、重篤な肝障害を阻止できた。B型肝炎ウイルス(HBV)感染既往例における肝炎発症の頻度と対応策を明らかにするため、大阪市立大学医学部附属病院にて前向き調査に登録されている症例を再評価した。対象はHBs抗原陰性かつHBc抗体陽性の109例である。疾患の内訳は関節リウマチ65例、悪性リンパ腫17例、造血幹細胞移植を含む移植例13例、悪性腫瘍への化学療法6例、膠原病8例である。モニタリング中にHBV DNAが検出された症例をHBV再増殖と判定し、核酸アナログによる治療介入を実施するプロトコールである。現時点にて関節リウマチにて1例(2%)、悪性リンパ腫(リツキシマブ併用化学療法)にて3例(18%)、造血幹細胞移植例にて2例(25%)のHBV再増殖を観察した。再増殖例に治療介入したが、3例(各疾患にて1例づつ)にトランスアミナーザの上昇を認めた。しかし重篤な肝炎に発展した症例はなかった。再増殖したHBVの塩基配列を解析した結果、全例がHBV-genotype Cであり治療介入時のHBV DNA量は3.1-4.7 Log/mlまで増加していた。トランスアミナーザ上昇3例中pre-core/core-promoterに変異があった症例は2例であり、肝炎を発症しなかった症例では同部位の変異は1例のみ認めた。治療介入時にHBs抗体が陽性であった2例ではHBs抗原決定基である'a' determinantにアミノ酸置換を有する変異を認めた。以上より今年度は、各種疾患とその治療法によるHBV感染既往例におけるHBV再増殖の頻度を明らかにした。またHBV再増殖時の肝炎病態にHBV遺伝子変異が寄与する可能性を報告した。該当症例の登録および解析は2012年3月末にて203例となり、順調に進んでいる。肝炎ウイルス診療に不慣れな他領域の臨床医にも情報を発信し、HBV再活性化のガイドラインを普及できたものと考える。一方、HBV再活性化のメカニズムに関する研究には遅れが生じている。該当症例の登録および解析は順調に進んでいる。本研究の準備期間に登録した症例を解析し、微量なHBV病因について論文報告と学会発表を行い、肝疾患領域のみならず他領域の臨床医にも注目された。2011年3月末にて170例の登録例に至り、病院内での協力体制も確立できたものと考えている。一方、肝組織を用いた解析については臨床サンプルの収集が進まないため研究が停滞している。HBV再活性化のメカニズムを解明するための研究を計画している。ひとつは、再活性化したB型肝炎ウイルスの全塩基配列を決定し、共通する塩基の特徴を明らかにする。もうひとつは、HBV再活性化した症例の臨床を背景を解析する。特に遺伝的背景についてHLA遺伝子多型を決定し、HBV再活性化の起こらなかった症例との比較検討を行う予定である。さらに末梢血液中のマイクロRNAの発現パターンを解析し、HBV再活性化の新たなバイオマーカーの探索を行う計画である。今年度は、ウイルス側の病因を主として解析したが、次年度は患者側の病因について遺伝子多型との関係を解析する計画である。HBVに関する既報を参考として幾つかの遺伝子多型を解析の準備を進めている。一方、初年度において肝組織の収集は進まず、研究の方向転換を視野に考えている。初年度の成果について国内外の学会発表と論文作成を予定している。(金沢での第48回肝臓学会では、ワークショップの演題として採用されている。)再活性化したB型肝炎ウイルスの遺伝子解析と対象例のHLA遺伝子多型の解析に60万円マイクロRNAの解析に40万円国内出張費(学会等)に20万円論文作成に15万円を予定している。遺伝子多型解析のための費用を主に使用計画をたてている。