hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植食性昆虫の寄主転換とそれに伴う種分化の進化遺伝学的研究

幼虫の寄主利用能力を担っているゲノム領域を特定するため,2009年度に作製した戻し交雑(backcross)雑種を用いAFLPを遺伝マーカーとして連鎖解析とQTL解析を試みた.鱗翅目昆虫ではメスで減数分裂時に組み換えが生じないことを利用し,まずF1メスとネジキレースのかけ合わせにより作製したbackcross雑種を用いて各マーカーを連鎖群に振り分けた.その後,F1をオス親にしたbackcross雑種を用いてマーカー間の連鎖距離を算出した.一連の連鎖解析の結果,クルミホソガの染色体数(n=31)に等しい連鎖群を特定できた.各AFLPマーカーへの表現型の回帰により,1本の連鎖群のみが幼虫の寄主利用能力を司っていることが示された.そこでこの連鎖群を集中的に解析するために,合計128通りのAFLPプライマーコンビネーションを検討し,目的遺伝子の近傍(16cM以内)に位置するAFLPマーカーを16個同定した.その結果,幼虫の寄主利用能力に関わる遺伝子は,1.0cMの地図距離内に位置し,ゲノムサイズの推定と組み換え率の均一性を仮定すると,物理距離にして170kbp弱の領域に存在していることが示唆された.モデル生物であるキイロショウジョウバエの近縁種を除くと,野生の植食性昆虫において,寄主植物への適応に関わる遺伝領域を数百kbp以下にまで絞り込んだ研究例は代表者の知る限り他には無く,今後の寄主適応遺伝子の同定に向けて非常に大きな成果が得られた.雌の産卵選好性と幼虫の寄主利用能力を担っている遺伝子座を特定するため,クルミレースとネジキレースの交雑を行い,AFLPを遺伝子マーカーとして両形質のQTL解析を試みた.QTL解析では,片方のレースに特有で,かつホモ接合であるマーカー遺伝子座が多いほど解析の精度が増す.しかし野外から採集してきた個体では,上記の条件をみたすホモ接合遺伝子座が少なく,十分な解析ができないことが判明した.そこで,ネジキレースに関しては集団サイズが極めて小さい個体群を見つけ出すことで,ホモ接合を多数持つ個体を交雑に用いる道が開けた.クルミレースに関しては,近親交雑をさせて上述の条件に見合う個体を得る手法を確立した.産卵選好性は親個体をジェノタイピングに使えるが,寄主利用能力に関しては幼虫を使わざるを得ない.そして,幼虫が餌植物を食べられない遺伝子型の場合,卵から孵化した直後に死亡するため,ジェノタイピングは体長0.3mm程の1齢幼虫を用いて行うことになる.このため,小さな1齢幼虫から解析に耐えうるだけのゲノムDNAが得られるよう抽出法の改良を行った.さらに,微量のDNA抽出物からでも,成虫個体を用いた場合と同程度のAFLPバンドパターンの再現性(95%以上)が得られるよう,制限酵素処理やライゲーション,PCRのプロトコルを改良した.集団遺伝学的な解析に関しては,まずサンプリングを重点的に行い,両ホストレースが同所的に生息する地点として岡山県新見市から各ホストレースを採集した.さらに,ネジキレースが単独で生息する地点として京都市と愛知県岡崎市,鹿児島県霧島市でも採集を行った.予備的な結果では,同所的に生息する両ホストレース間ではネジキレースからクルミレースへの遺伝子流入が示唆された.幼虫の寄主利用能力を担っているゲノム領域を特定するため,クルミレースとネジキレースの交雑を行い,AFLPを遺伝マーカーとして両形質のQTL解析を試みた.QTL解析では,片方のレースに特有で,かつホモ接合である遺伝子座が多いほど解析の精度が増す.このため,山形産のクルミレースに岡崎産のネジキレースを掛け合わせてF1雑種を作成し,その雑種を霧島産のネジキレースと交配させることでbackcross世代を得た.鱗翅目昆虫の雌は,減数分裂分裂時に組み換えが起こらないため,backcross作成時のF1雑種に雌個体を用いることで,マーカー連鎖群の推定が容易となる.一方,F1雑種に雄を用いることで,マーカー間の組み換え率から遺伝距離の推定が可能となる.このため,backcross作成にあたり,F1雑種を雌親にした場合と雄親にした場合の両方の交雑を行い,それぞれ6家系分と9家系分のbackcrossを作成した.これらのうち,最も個体数が多く得られた家系(それぞれ98個体と87個体)を解析に用いた.AFLPマーカーには32通りのプライマーコンビネーションを用い,その結果,連鎖解析に使用可能なマーカーが134個得られた.現在はこれらの結果を用いて連鎖地図を作成中である.幼虫の寄主利用能力を担っているゲノム領域を特定するため,2009年度に作製した戻し交雑(backcross)雑種を用いAFLPを遺伝マーカーとして連鎖解析とQTL解析を試みた.鱗翅目昆虫ではメスで減数分裂時に組み換えが生じないことを利用し,まずF1メスとネジキレースのかけ合わせにより作製したbackcross雑種を用いて各マーカーを連鎖群に振り分けた.その後,F1をオス親にしたbackcross雑種を用いてマーカー間の連鎖距離を算出した.一連の連鎖解析の結果,クルミホソガの染色体数(n=31)に等しい連鎖群を特定できた.各AFLPマーカーへの表現型の回帰により,1本の連鎖群のみが幼虫の寄主利用能力を司っていることが示された.そこでこの連鎖群を集中的に解析するために,合計128通りのAFLPプライマーコンビネーションを検討し,目的遺伝子の近傍(16cM以内)に位置するAFLPマーカーを16個同定した.

その結果,幼虫の寄主利用能力に関わる遺伝子は,1.0cMの地図距離内に位置し,ゲノムサイズの推定と組み換え率の均一性を仮定すると,物理距離にして170kbp弱の領域に存在していることが示唆された.モデル生物であるキイロショウジョウバエの近縁種を除くと,野生の植食性昆虫において,寄主植物への適応に関わる遺伝領域を数百kbp以下にまで絞り込んだ研究例は代表者の知る限り他には無く,今後の寄主適応遺伝子の同定に向けて非常に大きな成果が得られた.
歯科診療時におけるストレスの評価法-唾液中のホルモン変動-

研究代表者は、これまでに、北海道大学歯学部附属病院小児歯科を受診した小児患者(協力児)より歯科診療中の唾液を採取し、唾液中のノルアドレナリン濃度が診療前期で上昇し、この物質の変動を測定することが、小児の歯科診療時に負荷されるストレスを客観的に評価するための有効な方法であることを示してきた(Mitome M.eta1.:Salivarycatecholamineassayforassessinganxietyinpediatricdentalpatients.Pediatr.Dent.21(3)255-259,1997)。すなわち唾液の採取はきわめて容易であり、採取すること自体で負荷されるストレスを最小限にすることができる点で利点があると思われる。今回は非協力児で拘束下で歯科診療したときにかかるストレスの程度を評価するために、最初に動物モデルを用いた研究を行った。すなわちラットを30分間、ベルトで拘束し、血中のカテコールアミン、コルチコステロン変動をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイを用いて測定した。さらにストレスの上位中枢といわれる視床下部室傍核における神経伝達物質(カテコールアミン、NitricOxide)をinvivomicrodialysis法を用いて経時的に測定した。NitricOxideはグリース法を用いて、その代謝産物を測定した。この結果、血中力テコルーラミン、コルチコステロンともにストレス負荷直後から大きく上昇を示し、この結果は室傍核の神経伝達物質の変動に対応していた。増加の割合は中枢で前値の約2倍から5倍であり、末梢ではさらに大きく、拘束ストレスは上記の反応系の中でも最大に変化するもののうちのひとつであることが推察された。これらの結果が唾液中の物質変動と相関するか、現在動物実験および非協力児の拘束治療下での唾液中のカテコールアミンおよびコルチゾール測定することにより検討中である。小児歯科診療において、唾液中のカテコールアミンの測定法の確立は、患児に負荷されたストレスの程度を無侵襲的に評価する方法として、意義があるように思われる.本研究の目的は、歯科治療中の小児患者から経時的に唾液を採取し、その中のカテコールアミンを測定する方法を確立し、患児に負荷されるストレスを客観的に評価し、臨床的な有用性を調べることにある.<実験1>本学附属病院を受診した健常小児8人(3才から7才)について、歯科治療中時の唾液中のカテコールアミンの変化を調べた。すなわち、待合い室、歯科治療台にあがった直後、局所麻酔時、歯質切削時、充填時、終了後の唾液を採取し唾液中のカテコールアミンの変動を調べた。浸麻には3%シタネストーオクタプレシンを使用した.<実験2>レストレーナーの使用が歯科治療に及ぼす影響を調べるため、治療に非協力なためにレストレーナーを使用した小児4人(4才から5才)について唾液中のカテコールアミンを測定した。実験1より、唾液中のノルアドレナリンは、待合い室時にくらべて、歯科治療台に横になったとき、および局所麻酔時に有意な上昇を示し、その後下降した。唾液中のノルアドレナリンの変動は、従来、歯科治療中の心拍変化などにより報告されてきた変動のピークと一致した。このことから唾液中のノルアドレナリン測定は患児に負荷されるストレスを客観的に評価する方法として有用であることが明らかになった。実験2では実験1よりも唾液中のノルアドレナリンの分泌が多い傾向にあったが、有意差はみられなかった。実験2に関しては、号泣中の小児から唾液を採取することは難しく、また、例数が少ないことから、引き続き研究が必要であるように思われた。これらの主な結果はSalivary catecholamine assay forassesing anxiety in pediatric dental patients.としてThe Journal of Clinical Pediatric Dentistry 21,255-259、1997.で発表した。
汎用的な認知症バイオマーカーを探索するマルチソース解析

本研究では、世界中の認知症患者の膨大な遺伝子発現解析結果とネットワーク解析結果(マルチソース)を統合解析し、汎用的な認知症バイオマーカーとなるRNAを探索し、認知症の早期発見に貢献する。今年度は、まず、遺伝子発現解析結果の統合解析のための統計理論の開発を行った(論文投稿準備中のため詳細は割愛する)。現在、アルツハイマー病を対象として、血中RNA発現解析結果(先行研究の結果)をまとめている途中で、データがまとまり次第、開発した理論を適用して、発現解析結果の統合解析を行う予定である。また、血中RNAネットワーク解析を行っている途中である。遺伝子発現解析結果の統合解析理論の開発が当初の計画よりも順調に進んだ。血中RNA発現解析結果のまとめと統合解析、血中RNAネットワーク解析は次年度以降の課題とする。まず、次年度に、アルツハイマー病患者の血中RNA発現解析結果のまとめと統合解析を優先的に実施する。血中RNAネットワーク解析も行う。その後、本研究課題の残りの計画、つまり、脳内RNA発現解析結果の統合解析、脳内RNAのネットワーク解析とその統合解析、血中RNAネットワークの統合解析を検討する。今年度は理論の開発を中心に行ったため、年度後半から雇用予定であった解析補助員の人件費が不要であった。また同じ理由から学会参加・発表のための旅費も当初の1/3程度で済んだ。次年度使用額は人件費を中心に使用する予定である。
水分状態と食品物性に関する物理化学的解析

食品中の水分状態の溶液論的方法に基づく物理化学的解析とその食品物性との関係の解明を目標とし、以下に示す成果を得ることができた。1.低分子電解質、低分子非電解質、糖類、高分子などを溶質とする二成分系水溶液について、水分活性、水の活動度係数の系統的測定を行い、水の活動度係数の溶質濃度依存性が次式により良好に記述されることがわかった。2.従来から報告されている水溶液構造パラメーターとして溶質モル比容、混合エントロピー、エカトリアル-OH数、粘度のB係数、動的水和数等の式(1)のパラメーターαとは、低分子電解質、非電解質、糖類水溶液のいずれにおいても良好な相関を示し、パラメーターαの溶液構造指標としての意義が確立した。3.ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど高分子溶液においては、パラメーターαは固有粘度と相関を示し、このことは溶液構造と食品力学物性との関わりにおいて重要な意味を有する。4.同一種類の高分子溶液においてはパラメーターαは分子量の二乗に依存する傾向を示した。5.塩類水溶液においてはパラメーターαで記述されるマクロな水溶液構造とプロトンNMRによるスピン-格子緩和時間により測定されるミクロな水溶液構造の間には良好な相関関係が見られた。水の活動度係数の溶質濃度依存性から求めたパラメーターαは溶液論的パラメーターであり、高濃度領域においても意味を有し、極限希薄状態のみでしか意味を有しない従来の溶液構造パラメーターとは大きく異なっており、さらに水分活性の推定にも利用することができるという実用的意味を有している。また、このパラメーターαによって記述されるマクロな水溶液構造とNMRレベルでの水溶液構造とが一致することは極めて興味深く、食品物性研究のうえでも重要な意義を有すると思われる。
小・中学校理科(生物領域)の目標と道徳教育との関連を明確に意識した指導法の研究

○研究目的小・中学校の理科(生物領域)の学習の前後で、生命尊重および自然環境の保全や畏敬の念などに関連した道徳の学習を行い、『生命』に関してのより深い見方や考え方を身に付けさせる。○研究方法(A)理科後道徳の学級には、「道徳の学習を終えて、理科の学習が役立ったか」、(B)道徳後理科の学級には、「理科の学習を終えて、道徳の学習は役立ったか」、また、共通に「学習を通じて『生命』についてどのようなことを感じたか」についてアンケートを行い、効果を分析した。○研究成果感じた『生命』について、(1)感謝(おかげ・支える)、(2)懺悔(食べられる・かわいそう)、(3)心配(こわい・悲しい)、(4)畏敬(生命力・頑張っている)、(5)驚き(びっくり・不思議だ)、(6)生命尊重(命は大切・かけがえのない)、(7)生命の共通性(動物と同じ・人間と同じ)、(8)行動(生物と関わりたい・エコをしよう)、(9)その他(実際に見たい・理科に活かす)などの観点の記述から分析した。小学校3年生(理科:植物を育てよう・チョウを育てよう、道徳:「お母さんなかないで」)の実践では、(A)では「心配」と「驚き」、(B)では「畏敬」と「生命の共通性」に、また、5年生(理科:生命の誕生、道徳:「命のアサガオ」)では、(A)では「懺悔」、(B)では「驚き」に、それぞれ優位が見られた(一方の学級よりも記述の割合が高かった)。この他の小・中学校の実践でも、理科及び道徳の学習内容によって『生命』の観点が変化してくること、「生命尊重」の記述は、(A)・(B)ともほぼ同じで高い割合での記述であること、『生命』に関する理科の学習を行っている時期に関連する道徳の内容を学習させることについては、6割以上が「効果があった」と記述していることなどが分かった。そして、個々の感じた『生命』の観点を交流させることによって、お互いの人間性について相互理解していくことができた。
人工亜鉛フィンガーを用いたゲノムレベルでの時計遺伝子プロモーター解析

体内時計は細胞内での時計遺伝子群の発現リズムにより維持されていることが近年明らかにされたが、詳細な調節機構については未だ不明な点が多い。本研究は体内時計の分子機構を転写レベルで詳細に解明するために新規時計遺伝子プロモーター解析法を構築することを目的としている。今年度は、DNA結合ドメインである亜鉛フィンガーモチーフを連結し時計遺伝子のプロモーター配列を標的とする亜鉛フィンガー型人工転写因子を創製し、時計遺伝子発現リズムへの影響について調べてきた。これまでに標的配列への高い選択性を確認している亜鉛フィンガー型人工転写因子を年次計画に基づいて、細胞内で発現させ、時計遺伝子発現リズムへの影響を観察した。その結果、人工転写因子がリズムの誘導を引き起こすことが分かった。さらにこの人工転写因子にスイッチ系を導入し、時計遺伝子への作用するタイミングを制御することで、時刻依存的にリズム位相を操作することに成功した。これらの結果は時計遺伝子プロモーター配列を標的とする亜鉛フィンガー型人工転写因子が体内時計の転写伊ネットワークに作用可能であることを示唆するものであり、世界で初めて人工分子による時計遺伝子選択的なリズム制御を行うことができたと考えられる。本研究はゲノムレベルでの新規時計遺伝子プロモーター解析手法の構築や生体リズム治療など、今後の体内時計研究における強力な分子ツールとしての亜鉛フィンガーの可能性に対する重要な知見を提供するものである。今年度は、DNA結合ドメインである亜鉛フィンガーモチーフを連結し長鎖DNA配列を標的とする人工亜鉛フィンガータンパク質を創製し、配列選択的な結合性を調べてきた。その結果、標的配列を特異的に認識できることを見出している。そこで、人工亜鉛フィンガータンパク質を骨格とした人工転写因子を分子ツールとして用いた新規解析方法を構築に取り組んだ。その足がかりとして現在、亜鉛フィンガー型人工転写因子を時計遺伝子プロモーターに作用させたときの時計遺伝子発現リズムへの影響ついて検討を行っている。また、人工亜鉛フィンガータンパク質の創製への新しい知見として、フィンガーの組合せが連結体全体の性質に影響を及ぼすことをBiochemical Biophysical Research Communication誌に報告した。構成するフィンガー数を変化させ、標的配列への結合親和性、転写活性化能を調べた。その結果、フィンガーの連結によって必ずしも正の協同効果が得られるとは限らないことを見出した。続いて、年次計画に基づいて人工亜鉛フィンガータンパク質をNIH3T3細胞で発現させ、クロマチン免疫沈降法を行った。その結果、ゲノム上の標的配列に対しても非常に高い選択性を持って結合していることが明らかとなった。今後、転写調節配列と発現リズム調節の直接的な関係性をより詳細に調べるために内在性の転写因子との競合実験を行う予定である。
オイルゲル化剤による有機溶媒のゲル化のダイナミクスとリサイクル

H14年度ではアミノ酸誘導体系オイルゲル化剤(試料コード:P-1)のゲル化機構を小角中性子散乱(SANS)および動的光散乱(DLS)により研究した。H15年度では、対象とするゲル化剤の種類を広げ、ゲル化剤の化学構造とゲルの構造およびゲル化機構の研究を行った。試料コードはNo.1からNo.3で、それらの化学構造はP-1に比べて構造が簡単であり、官能基とゲル化能の関係の解明研究に有効と考えられる。ゲル化後、20°Cで測定した各ゲル化剤のSANS強度曲線I(q)を得た。溶媒はいずれも重水素化トルエンである。また、試料濃度は最小ゲル化濃度であり、No.1からNo.3の順で3g/L(No.1)、12g/L(No.2),30g/L(No.3)、25g/L(P-1)であった。どのゲル化剤も溶媒であるトルエンに比べてI(q)は強く、またq依存性を持つことから、ゲル中で特徴的な構造が形成されていることがわかる。SANS測定の結果、比較的単純な構造のNo.1は棒状の会合体を形成していると推論した。一方、対称性の高い構造をもつNo.2は0.08Å^<-1>付近に散乱極大をもつことから、ラメラ的な結晶構造をもつと推測される。No.3は非常に構造対称性が低いため、かさ高い凝集構造を形成し、P-1と同じくフラクタル的な構造体が形成されていると推論できる。動的光散乱においても、試料間に違いがみられ、No.1はハイドロゲル的な柔らかい網目からなること、それ以外は、剛直な針状物の集合体を示唆する結果を得た。これらの成果は既に1報が論文掲載が決まり、さらに数報の論文としてとりまとめを行っている。ゼラチンや寒天などは水をゲル化できる物質として知られているが、油や有機溶媒をゲル化できる物質の報告は多くない。自然環境に悪影響を与える家庭内廃油・流出原油・工業廃液などは回収・処理が困難なものであるが、油や有機溶媒が主成分であるこれらの廃液をゲル化させることができれば、扱いがたやすくなりリサイクルの可能性もでてくる。分子設計のコンセプトとして、いくつかの条件が重要であることは分かってきたが、未だゲルのミクロ構造やゲル化のメカニズムに関しては明らかでないことも多い。本研究では、アミノ酸誘導体型オイルゲル化剤について、そのジメチルスルホキシド(DMSO)溶液のゲル化過程を、主に散乱法を用いてミクロ構造やダイナミクスについて調べることで、ゲル化のメカニズムを明らかにするとともに、オイルゲル化剤としてより適した構造を提案していくことを目的として研究を行った。その結果、(1)濃度によらないミクロ構造が形成され、高濃度ほど密に詰まった、自己相似的なクラスター構造を形成していることがわかった。また(2)動的光散乱法によって、ミクロクラスター形成から系全体のゲル化に至る過程に相当すると思われる挙動が観測された。これらより、空間的に不均一なクラスター形成過程が存在すると結論した。
含流アミノ酸を中心とする食質による動脈硬化性疾患の予防(SHRSPを用いて)

我々は,食質,特に含硫アミノ酸を中心とする食質による動脈硬化性疾患の予防を志向して,高血圧を自然発症し高脂血症を誘導しやすい脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHRSP)をモデル動物として,食質と脂質代謝の研究を進めている.そして昨年度は,タウリンが高脂血症におけるコレステロール代謝改善作用を有し,その作用機序としてリポ・アポ蛋白の動態から,肝臓におけるVLDL(β-VLDLやLDLの合成・分泌抑制ならびに肝コレステロールの胆汁酸への異化促進が示唆されることを報告した.今年度は,昨年度に引き続き含硫アミノ酸としてタウリンのprecursorの1つであり,高血圧の予防にも有効視されているL-メチオニン(L-Met)の効果を検討した. L-Metは,タウリンと効果を比較しやすくするため,飲水中に加え飲水とともに投与することとした.この際L-Met特有の臭気があるが,飼料ならびに飲水摂取量は,実験群と対照群の間に差異はみられなかった.またL-Metの過剰投与は成長阻害をおこすことが知られているため,慎重に0.3%と0.6%の2種の濃度を採用した.その結果,予想に反して0.3そして0.6%L-Metともにむしろ高脂血症を増悪する結果を示した.これはHDL分画はほとんど変動していなく, β-リポ蛋白分画の上昇促進によるものであった.なお0.3, 0.6%L-Metともにほぼ同等の作用を示し,成長障害はみられなかった.この予想に反した増悪効果の原因として,杉山らの報告を考慮すると,過剰のL-Metが代謝される際のメチル基転移のAcceptorのDepletionが主原因ではないかと考え,メチル基のAcceptorとして,グリシン(Gly)を同時に添加することを試みた.すなわち高脂血症を誘導した際に0.3%L-Met+2.0%Glyを併用投与しその効果を検討した.すると,タウリンの場合と異なり, β-リポ蛋白の上昇にはほとんど効果を示さないが, HDL分画の回復を中心とする興味ある効果(有効性)があることが判明した.我々は、食質による動脈硬化性疾患の予防を志向して、脂質代謝の研究を進めている。本年度は、高脂肪・高コレステロール食(HFC食)を負荷し、反応性高脂血症を誘導した脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHRSP)を用い、そのリポおよびアポ蛋白の動態を改善する方向に導くことを目的とし、食質として生体内含硫アミノ酸の一種であるタウリン(Tau)を選び、Tauの脂質代謝改善作用を検討した。Tauは飲水とともに与えることとし、3%Tau含有水道水を飼料(HFC食)とともに6週間自由摂取させた。対照として、SHRSPが由来したKyo:Wistarラット(WKY)を用い、同様な負荷実験を行った。血清よりの各リポ蛋白分画の分離は、段階的密度勾配超遠心法により行った。血清ならびに各リポ蛋白分画のコレステロール(CH)は、市販のKit(酵素法)にて、アポ蛋白類は、免疫電気泳動法にて定量した。HFC食投与により血清総CHは急上昇するが、Tau併用投与によりその上昇が顕著に抑制された。特にSHRSPの場合、血清apoA-Iの上昇とapoE減少を伴った総CHの劇的な減少が観察された(148±11vs197±6in WKY,81±4vs208±21in SHRSP:mg/dl)。SHRSPの場合、これは超低比重リポ蛋白(VLDL)、中間比重リポ蛋白(IDL)そして低比重リポ蛋白(LDL)分画におけるapoB上昇抑制を伴ったCH含量の低下に基づいていた。更に、高比重リポ蛋白(HDL)分画は、apoA-I減少抑制により若干の回復はみられるが、apoEは大きく減少したままであった。WKYの場合も各リポ蛋白分画は、SHRSPと類似した変動を示したが、VLDL,IDL,LDL分画における改善の程度はむしろ低かった。しかし、HDL分画はapoE含量の減少抑制がみられ、HDLの回復の度合が大きくみられた。以上のことから、Tauは、SHRSPの場合のようなβ-リポ蛋白増加に起因する高脂血症により有効と考えられ、その作用機序としては、肝臓におけるβ-リポ蛋白合成分泌抑制が示唆されるが、更に詳細な検討が必要と考える。我々は,食質,特に含硫アミノ酸を中心とする食質による動脈硬化性疾患の予防を志向して,高血圧を自然発症し高脂血症を誘導しやすい脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHRSP)をモデル動物として,食質と脂質代謝の研究を進めている.そして昨年度は,タウリンが高脂血症におけるコレステロール代謝改善作用を有し,その作用機序としてリポ・アポ蛋白の動態から,肝臓におけるVLDL(β-VLDLやLDLの合成・分泌抑制ならびに肝コレステロールの胆汁酸への異化促進が示唆されることを報告した.今年度は,昨年度に引き続き含硫アミノ酸としてタウリンのprecursorの1つであり,高血圧の予防にも有効視されているL-メチオニン(L-Met)の効果を検討した. L-Metは,タウリンと効果を比較しやすくするため,飲水中に加え飲水とともに投与することとした.この際L-Met特有の臭気があるが,飼料ならびに飲水摂取量は,実験群と対照群の間に差異はみられなかった.またL-Metの過剰投与は成長阻害をおこすことが知られているため,慎重に0.3%と0.6%の2種の濃度を採用した.

その結果,予想に反して0.3そして0.6%L-Metともにむしろ高脂血症を増悪する結果を示した.これはHDL分画はほとんど変動していなく, β-リポ蛋白分画の上昇促進によるものであった.なお0.3, 0.6%L-Metともにほぼ同等の作用を示し,成長障害はみられなかった.この予想に反した増悪効果の原因として,杉山らの報告を考慮すると,過剰のL-Metが代謝される際のメチル基転移のAcceptorのDepletionが主原因ではないかと考え,メチル基のAcceptorとして,グリシン(Gly)を同時に添加することを試みた.すなわち高脂血症を誘導した際に0.3%L-Met+2.0%Glyを併用投与しその効果を検討した.すると,タウリンの場合と異なり, β-リポ蛋白の上昇にはほとんど効果を示さないが, HDL分画の回復を中心とする興味ある効果(有効性)があることが判明した.
離島における上水道・下水道・廃棄物処理の統合管理に関する研究

遠隔離島である小笠原諸島を対象として,上水道,下水道,廃棄物処理の事業全体の把握を行い,それぞれの問題点を抽出し,これら3つの事業を統合管理することによって環境への負荷が削減可能かについて検討評価した.3事業それぞれの問題点を改善するため,離島でも適用可能な改善策を精査検討し,物質循環・水循環の観点から, 3事業がそれぞれの問題点を相互に補完しあう統合管理案を構築した.この統合管理案を,小笠原諸島の将来予測値に基づいて, CO2排出量,排出熱量等の環境への影響を評価算定した結果,提示した統合管理案は3事業から排出される環境負荷を削減することが出来ることを定量的に示した.遠隔離島である小笠原諸島を対象として,上水道,下水道,廃棄物処理の事業全体の把握を行い,それぞれの問題点を抽出し,これら3つの事業を統合管理することによって環境への負荷が削減可能かについて検討評価した.3事業それぞれの問題点を改善するため,離島でも適用可能な改善策を精査検討し,物質循環・水循環の観点から, 3事業がそれぞれの問題点を相互に補完しあう統合管理案を構築した.この統合管理案を,小笠原諸島の将来予測値に基づいて, CO2排出量,排出熱量等の環境への影響を評価算定した結果,提示した統合管理案は3事業から排出される環境負荷を削減することが出来ることを定量的に示した.研究の初年として、上水道から排出される廃棄物に着目し、一般廃棄物との一体処理化の検討を行った。浄水処理により発生する浄水発生土は、大部分が産業廃棄物として埋め立て処分される。しかし、最終処分場の残存埋立て可能容量の減少にともない、減容化、有効利用が種々検討されている。しかし、離島では浄水発生土を有効利用は難しい。減容化についても島単独での実施は設備などの点からも困難である。本研究で対象としている東京都小笠原村父島扇浦浄水場では、現在は浄水発生土の一部を下水管渠に投入し、下水処理の改善に利用している他は産業廃棄物処分場に埋立て処分している。この産業廃棄物処分場は、20年以上使用されており、残存埋立て可能容量は少なくなっている。しかし、東京都は小笠原諸島を、世界遺産登録の対象とするために環境を整えていることもあり、新たな処分場の設定は困難である。現在の産業廃棄物処分場をこのまま持続させるには浄水発生土をはじめとする産業廃棄物の減容化が必要である。新たな設備投資を必要としない減容化策として、清掃工場で、ゴミと一緒に焼却処理を行うことも可能である。扇浦浄水場では粉末活性炭を使用しているため、焼却による減容効果は大きい。そこで、浄水発生土量の将来値予測を行うとともに、清掃工場での焼却処理の可能性の検討を行った。その結果、離島である東京都小笠原村父島での浄水発生土量を推定するモデル式を作成し、シナリオにより2020年の浄水発生土量の予測を行い、2005年度と比較し30250%程度増加するという予測値を得た。また、この発生量予測値をもとに、清掃工場での浄水発生土焼却処分の可能性を検討し、焼却により埋立て容量を10m^3程度減容化可能であることを示した。平成18年度は、上水道からの排出物である浄水発生土の将来予測及び有効利用を研究した結果、最終廃棄物の減量が重要な課題となった。そこで、本年度においては、上水道から排出される廃棄物の減量に着目し、貯水水質を改善することで薬剤・活性炭使用量の減少を目的として、最終排出物の減量をはかった。本年度対象とした小笠原母島では、生態系に配慮した水生植物による水質浄化を試み、水生植物を食用植物である空芯菜としたことで、採取した植物が廃棄物として処分される量の減量を実現した。しかし、貯水水質の改善は明確ではなく、薬剤・活性炭使用量の減少は確認できなかったが、将来予測シミュレーションにより栽培面積の拡張と長期的に持続した植物栽培を行うことで水質改善が可能であることを示した。また、今回の研究では、採取した植物の食用に利用可能な割合が低く、廃棄量を減らすためには、今後、植物栽培方法を再検討する必要があること、さらに、栽培面積拡大による収穫量の増加にともなう植物の利用先の確保が必要なこともあきらかにし、今後の検討課題を示した。また、離島の上水道・下水道・廃棄物処理の事業者から、事業管理運営についてヒアリング調査を行い、離島における上水道・下水道・廃棄物処理の問題点の抽出を行った。さらに、上水道・下水道・廃棄物処理の事業を島内で実施している島嶼を選択し、基礎データの収集を行い、今後の研究に使用できるデータベースの作成をおこなった。平成18、19年度は、離島における上水道・下水道・廃棄物処理の維持管理について、多方面からアプローチを行い、統合管理に向けた基礎的な研究、情報の収集に努めてきた。最終年度である平成20年度は、平成18、19年度で得られた成果を基に、上水道・下水道・廃棄物処理の統合管理について、総括的な研究を進め、考察を行った。研究対象を小笠原諸島父島及び母島とし、上水道・下水道・廃棄物処理の問題点の抽出整理を行った。また、平成18年度に行った浄水発生土の清掃工場での一括焼却処理の検討に加え、下水脱水汚泥についても清掃工場での一括焼去拠理の検討を行い、それぞれの最終廃棄物の個別処理と統合処理について比較検討し、埋立量の算定を行うとともに、環境への負荷の面から評価を行った。

さらに、上水道、下水道、廃棄物処理それぞれの抽出された問題点に対する改善策に加え、過去に研究を行った上水道と下水道の連携させた上水発生土による下水汚泥及び下水処理水質改善、下水道と廃棄物処理を連携させたディスポーザーによる厨芥処理、今回検討を行った最終廃棄物の統合処理等を採用した統合管理案を作成し、小笠原村の将来予測に基づいた水需要量、廃棄物量の将来推定値を用いて、作成した統合管理案の評価を行った。その結果、統合管理案を採用することにより、CO_2排出量、排出熱量、埋立量といった環境への負荷が低減化されることを数値で示し、定量的に統合管理案の有用性を示した。
ダイヤモンド型酸化ほう素の高圧合成と機械的性質の評価

一端を封接した白金カプセル内ジルコニアあるいはジルコニウムを反応防止融離層として上下にダイヤモンド型BPと三酸化クロム,または過塩素酸カリウム粉末を配置したサンドイッチ構成に一端封接白金筒をかぶせた密封系セルを黒鉛ヒーター内に入れ,これを塩化ナトリウム圧力媒体で構成される高圧セル内に挿入し,ベルト型高圧装置を用いて, 6GPa, 1200°Cで20時間高圧酸化反応を行い,ダイヤモンド型酸化ほう素を合成した.結晶は約100μmの大きさでダイヤモンド構造特有の6-8面体あるいは4面体の形態であった.電子線回析とX線回析の結果,空間群P_3で三方晶系に属し,格子定数はa=0.2879nm, Cを0.7052nmで密度は2.48g/cm^3であり,単位格子に含まれる数はZ=2であるダイヤモンド型構造であることが判明した.立法晶構造から三方晶構造に歪む原因は,ダイヤモンド構造の6員環をほう素と酸素原子が統計的に分布するためと考えられる.構成元素の平均原子間距離は0.1763nmで,出発原料BPのB-P結合間距離である0.197nmより短く,強い共有結合性物質であると思われる.得られたダイヤモンド型酸化ほう素をアルミナ乳鉢で粉砕して粉末試料とし,白金カプセルに封入して, 6GPa, 1000°Cで10時間焼結反応を行ない,相対密度92%の焼結体を作成した.焼結体の破団面の走査型電子顕微鏡観察の結果,数10μmの粒子径より構成される微細構造を持つ焼結体で,ビッカス硬度は約4000kg/mm^2と立方晶窒化ほう素焼結体とほぼ同程度の硬度を示し,空気中は1200°Cまで酸化反応をしない結果から考えて,ダイヤモンド型酸化ほう素は超硬材料として優れた性質を有するものと考えられた.高圧酸化トポタクチック反応を利用して大型単結晶育成を試みたが,粒径100μm程度までの成長しか達成できなかった.ダイヤモンド型酸化ほう素単結晶育成に関しては,今後の研究課題であり,理論密度焼結体作成条件の検討も必要である.一端を封接した白金カプセル内ジルコニアあるいはジルコニウムを反応防止融離層として上下にダイヤモンド型BPと三酸化クロム,または過塩素酸カリウム粉末を配置したサンドイッチ構成に一端封接白金筒をかぶせた密封系セルを黒鉛ヒーター内に入れ,これを塩化ナトリウム圧力媒体で構成される高圧セル内に挿入し,ベルト型高圧装置を用いて, 6GPa, 1200°Cで20時間高圧酸化反応を行い,ダイヤモンド型酸化ほう素を合成した.結晶は約100μmの大きさでダイヤモンド構造特有の6-8面体あるいは4面体の形態であった.電子線回析とX線回析の結果,空間群P_3で三方晶系に属し,格子定数はa=0.2879nm, Cを0.7052nmで密度は2.48g/cm^3であり,単位格子に含まれる数はZ=2であるダイヤモンド型構造であることが判明した.立法晶構造から三方晶構造に歪む原因は,ダイヤモンド構造の6員環をほう素と酸素原子が統計的に分布するためと考えられる.構成元素の平均原子間距離は0.1763nmで,出発原料BPのB-P結合間距離である0.197nmより短く,強い共有結合性物質であると思われる.得られたダイヤモンド型酸化ほう素をアルミナ乳鉢で粉砕して粉末試料とし,白金カプセルに封入して, 6GPa, 1000°Cで10時間焼結反応を行ない,相対密度92%の焼結体を作成した.焼結体の破団面の走査型電子顕微鏡観察の結果,数10μmの粒子径より構成される微細構造を持つ焼結体で,ビッカス硬度は約4000kg/mm^2と立方晶窒化ほう素焼結体とほぼ同程度の硬度を示し,空気中は1200°Cまで酸化反応をしない結果から考えて,ダイヤモンド型酸化ほう素は超硬材料として優れた性質を有するものと考えられた.高圧酸化トポタクチック反応を利用して大型単結晶育成を試みたが,粒径100μm程度までの成長しか達成できなかった.ダイヤモンド型酸化ほう素単結晶育成に関しては,今後の研究課題であり,理論密度焼結体作成条件の検討も必要である.ダイヤモンド型の結晶構造を有する酸化ほう素を高圧合成する際に、その出発原料であるBPについて、XRD,SEM,蛍光X線分析,湿式化学分析を用いて性状を調べた。XRDの回折線の広がりから一次粒子径を求めると、約2425nmとなった。また、不純物として23wt%のZnを含むことがわかった。常圧下では加熱により徐々に空気酸化され、600°C付近からBP【O_4】の生成することがTG-DTAによって確認された。高圧条件下において三酸化クロムの熱分解で発生する酸素を利用するとリン化ほう素が酸化ほう素になるが、高圧反応セルの構成や、単一相となる最適温度一圧力条件について検討した。その結果、3.55.5GPa,10001200°Cの条件下で白金製のカプセル内で酸素を封じると八面体もしくは四面体の形状を有する黒褐色の酸化ほう素が生成した。この試料体についての粉末X線回析図形をRietvelt法で解析した結果、格子定数がa=0.2879nm,c=0.7052

nm,三方晶系,P3に属するダイヤモンド類似の構造であることが明らかになった。また、密度は2.48g/【cm^3】でZは2と求まった。焼結体を得るために、得られた粉末を金型形成した後、6GPa,1000°Cで処理した。その結果、相対密度が7692%の焼結体を得ることができた。この焼結体の硬度は、33.540.5GPaであると評価できた。よりち密な焼結体を得るために、焼結助剤としてのNiの可能性を検討した。その結果、900°CではBPとの反応から【Ni_3】PやBP【O_4】が生成した。従って、Niは焼結助剤としては、好適でないと考えられる。焼結体の機械的特性,電気的特性などを評価するためには、適当な焼結助剤の開発が必要となることがわかった。
前頭連合野の行動学習におけるGABA抑制の役割の研究

GO/NO-GO課題及び遅延反応課題での前頭諸領域(前頭連合野、運動連合野、補足運動野、運動野)のニューロン活動に対するGABAのアゴニストとアンタゴニストの作用をニューロン・レベルで明らかにするのが目的であった。GO/NO-GO課題を遂行中のサルの運動連合野ニューロン(GO反応及びNO-GO反応を行うときに働くニューロンのみに限った52ケ)にGABA_Aアンタゴニスト(ビククリン)とGABA_Bアゴニスト(バクロフェン)を電気泳動的に与えた。運野連合野ニューロンはすべて、ビククリンで興奮反応を起こしたが、バクロフェンは75%のニューロンで興奮反応を、25%のニューロンで抑制を起こした。またバクロフェンの抑制反応は、バクロフェンの量を増やすと、量に応じて、効果が強くなった(量依存性効果)。GO反応(キーから手を離す反応)を行うときのニューロンの変化が、ビククリンで興奮、バクロフェンで抑制であるが、NO-GO反応(キーに手を保持し続ける)やGO反応の光信号に応じるニューロン(視覚刺激に応じるニューロン)では、ビククリン、ファクロフェンともに抑制された。GABA_B抑制の視覚性運動遂行に対する役割としては、運動を急速に行えるように働く一過性のニューロン活動の変化を鋭くし、相互性運動を持続させるニューロン活動を持続させる効果があると考えられる。またバクロフェンの興奮効果は、シナプス前性で、また抑制効果はシナプス後性の効果と考えられる。遅延反応を遂行中のムシモル、ビククリン、バクロフェンとファクロフェンの効果については今年度後半にサルを実験殺し、薬物注入場所の同定がほぼ終了したので、論文として発表できる段階に来た。来年度中に2-3編の論文発表(インパクトファクター3以上のもの)を行う。大人アカゲザル(2頭)に遅延反応(視覚到達課題)を教え、46野と6野にGABA_AとGABA_B阻害剤を微量局所注入したところ、6野ではビククリンとファクロフェンで、反応時間の延長と正答率の低下があった。46野では、ビククリンで正答率の低下がみられた。子供アカゲザル(3頭)では、6野でも46野でも同様の注入で、正答率の低下がみられた。大人と子供とでファクロフェンの効果が異なるため、この事を確かめなければならず、眼位測定下での訓練、学習過程でのニュ-ロン活動の変化を調べる所まで研究は進まなかった。コザルの遅延反応の学習過程でのビククリンとファクロフェンの効果は、大人に必要な量の半分程度であった。但し、訓練の開始直後(生後4カ月)では正答率が50ー60%で、保続エラ-が多いが、局所注入で成績の低下は、はっきりとはみられなかった。この事は、生後4カ月で学習成績の悪い時には、GABA抑制が十分働いていないためと考えられた。遅延反応へ移行する前に、スクリ-ンのない遅延反応(サルの眼前にアクリル板をおき、報酬のリンゴ片を不透明なビンのフタ2つの内のどちらかの下に隠す。サルは板に遮られて報酬に手を出せず見ている;かくしリンゴテスト)を行わせると13カ月で遅延3秒の学習が成立した。その経過で使用する手と反対側のフタへの正答が減少した。つまり、サルは手と同側に間違って手を出す様になったのである。この事はフタを透明にしてもみられるので、出生直後のサルは、手と同側に到達運動を行う性向のある事が解る。また、この課題の成績は遅延反応の成績と平行して良くなり、どちらもGABA阻害剤の46野局所注入の効果がみられるので、この課題と遅延反応は同じ脳内メカニズムで実現されている事が解った。

購入したオシロスコ-プは行動観察に用いた。GO/NO-GO課題及び遅延反応課題での前頭葉諸領域のニューロン活動に対するGABAのアゴニストとアンタゴニストの作用をニューロン・レベルで調べる予備段階としての研究で、単純運動反応遂行中の6野及び4野の運動関連ニューロンに対するGABA、ムシモル、ビククリンの作用が明らかとなり、発表された。遅延反応での研究は、ニューロン活動での解析に至らず、行動実験の解析に留まっている。遅延反応遂行中のサルの46野、8野と6野にムシモル、ビククリン、ファクロフェンを微量注入すると、成積の一次低下がおこり、同時に保続傾向の増大がみられた。この効果は、使用中の同側の脳でも対側の脳でも見られた。使用する手を同側の視野に出す傾向が大となる。対側の4野の手の領域に、ムシモル、ビククリン、ファクロフェンを注入すると、遅延反応を構成する接近運動の運動時間の延長がみられ、抑制ニューロンの活動のインバランスによるものと考えられる。なお、反応時間の延長はおこらなかった。同様の効果は、薬物を溶かすのに用いているリンゲル液の注入でも、弱いが見られるが、薬を含む効果の方が有意に大きかった。対側の4野の手の領域に、上記薬物を注入する際デジタル電気刺激装置で330H_3、0.1mS、500μA以下、11パルスを、運動野同定のために与えた。遅延反応の学習中(特定の遅延時間で成積が5065%の時)に、ビククリンを46野に注入しても成積の著明な低下はおこらなかったので、GABAAによる抑制ニューロンは課題遂行ヘの積極的関与はないと思われた。GO/NO-GO課題及び遅延反応課題での前頭諸領域(前頭連合野、運動連合野、補足運動野、運動野)のニューロン活動に対するGABAのアゴニストとアンタゴニストの作用をニューロン・レベルで明らかにするのが目的であった。GO/NO-GO課題を遂行中のサルの運動連合野ニューロン(GO反応及びNO-GO反応を行うときに働くニューロンのみに限った52ヶ)にGABA_Aアンタゴニスト(ビククリン)とGABA_Bアゴニスト(バクロフェン)を電気泳動的に与えた。運動連合野ニューロンはすべて、ビククリンで興奮反応を起こしたが、バクロフェンは75%のニューロンで興奮反応を、25%のニューロンで抑制を起こした。またバクロフェンの抑制反応は、バクロフェンの量を増やすと、量に応じて、効果が強くなった(量依存性効果)。GO反応(キーから手を離す反応)を行うときのニューロンの変化が、ビククリンで興奮、バクロフェンで抑制であるが、NO-GO反応(キーに手を保持し続ける)やGO反応の光信号に応じるニューロン(視覚刺激に応じるニューロン)では、ビククリン、ファクロフェンともに抑制された。GABA_B抑制の視覚性運動遂行に対する役割としては、運動を急速に行えるように働く一過性のニューロン活動の変化を鋭くし、相互性運動を持続させるニューロン活動を持続させる効果があると考えられる。またバクロフェンの興奮効果は、シナプス前性で、また抑制効果はシナプス後性の効果と考えられる。遅延反応を遂行中のムシモル、ビククリン、バクロフェンとファクロフェンの効果については今年度後半にサルを実験殺し、薬物注入場所の同定がほぼ終了したので、論文として発表できる段階に来た。来年度中に2-3編の論文発表(インパクトファクター3以上のもの)を行う。
無負荷・非接触による骨組織の力学定数の成分選択的その場測定

骨コラーゲン(Col)の弾性率を、X線回折法によって決定した。これは、Colの回折X線強度の温度変化から、骨のCol分子の弾性率を無負荷・非接触で測定する方法である。通常、骨中Colの回折線はミネラルの回折線の中に埋もれてしまうため、ミネラル分率を半減した骨試料について測定を行った。この試料でもCol弾性率は腱Colの数倍となり、天然骨中のCol弾性率は、腱Colよりも極めて大きいことが強く示唆された。ウシ大腿骨骨幹部から緻密骨を切り出し(1)完全脱灰骨と(2)部分脱灰骨を用意した。0.5M EDTAを用い、反応時間と骨試料のミネラル分率の検量線を作成した。これに従い、ミネラル体積分率0.25の試料を作成した。X線回折には、北海道大学大学院先端生命科学研究院設置の生体分子用X線回折装置(R-Axis7)および、北海道大学大学院先端生命科学研究院設置の水平ゴニオX線回折装置(Rad 2R)を用いた。前者では、回折の2次元パターン撮影、後者では、2θ-1次元スキャンを行った。温度因子測定のため、液体窒素を用いて、室温から-30°Cまで、コラーゲンのd周期(0.29nm,ヘリックス軸に沿ったアミノ酸1残基あたりの並進距離に対応する)の回折強度の温度変化を調べた。温度因子から求めた弾性率は、完全脱灰骨(骨コラーゲン)で1.58GPa、ミネラル体積分率0.25の試料で7.08GPaだった。n=5に対してStudent t-検定を行い、p<0.05でこの差が有意であることが認められた。これは、骨内でコラーゲンの見かけの弾性率が、ミネラルの近傍で大きくなっているという従来の予想を実験的に裏付けた、世界で始めての結果である。種々のミネラル分率でこの測定を行い、ミネラル分率に対する骨コラーゲンの見かけの弾性率の依存の様子がわかれば、充填粒子によるマトリックス強化機構に関する理解が深まり、人工骨開発のために材料に求められる構造・機能を明らかにすることが可能である。当該課題と関連するテーマが2010年度、Spring-8の実験課題として採択されたので、本年度のX線実験の一部はSpring-8の放射光を利用して行った。(課題番号2010A1395実験責任者古澤和也)。(1)骨および骨コラーゲンの温度因子の測定と力学定数の算出および比較昨年度、2種類のミネラル分率の骨試料について行った、骨コラーゲン・マトリックスのd周期の温度因子測定を、種々のミネラル分率の骨試料を作成して行った。Spring-8ではSAXSとWAXD同時測定が可能な光学系を用いた(BL-40-B2)。この光学系には温度制御装置が搭載されており、測定試料は5mm角・厚さ0.5mm程度にする必要があった。種々のミネラル分率を持つ試料を用意したが、このサイズの試料では分率の空間揺らぎが大きく、完全脱灰か殆ど脱灰されていていない状態の試料と同様の測定となってしまった。実験室でのX線回折実験では、この点を注意し試料のサイズを大きくして測定を行った。ミネラル分率とともにコラーゲンの弾性率が変化している傾向は観察できたが、系統性等の詳細については現在解析中である。(2)骨破壊領域での残留応力開放と骨コラーゲン・マトリックス強化機構のbreak downこの測定では、骨試料全体の形状を保持した状態でX線回折実験を行う必要がある。実験系としては、牛大腿骨の骨幹部を輪切りにしたままの試料と、輪の一部を切り離した試料を用いた。X線を照射する予定の表面のみを部分脱灰し測定した。顕著な差は今のところ見られていない。現在詳細な実験および解析を行っている。本研究で最も難しいと予想された点は、骨のX線回折パターンから骨コラーゲン(BCol)の回折シグナルを抽出することである。これは、ヒドロキシアパタイト(HAp)がCa2+やPO43を含むことから、これらの原子散乱因子がコラーゲン・タンパク質のそれを大きく上回るためである。原理的には可能でも、実際的にはこの分離は不可能に近いと言わざるを得ない。我々は、先ず、骨ミネラルを減らして、HApとBColのピークが共存する2・プロファイルを得ることを目標とした。HAp分率を0.15程度にするとこれが実現できることが分かった。しかしながらBColの0.286nm子午線反射はHApの一群の反射(211,112,300)の大きなピークの裾で観測され、温度因子の影響を受けるのが、BCol反射だけであるとしても未だ分離の精度に問題がある。

我々は、HAp分率を0.15付近で、HAp分率の骨試料のHAp(002)反射と上の一群の反射の強度の相関を取り、前者の強度をO外挿したときの後者の強度をBColの反射としてその温度因子を決定した。これから、HAp存在下(HAp分率0.15)のBColの弾性率が、腱や靭帯といった軟組織中のコラーゲンよりも有意に大きくなっていることを初めて示した。これから、通常の骨の中では、HAp近傍のBColはより大きな見かけの弾性率を示すことが推測できる。これらはミネラルによるコラーゲンの強化を直接的に示した、世界で初めての結果である。
X染色体不活性化における機能的RNAと de novoメチル化酵素の相互作用

(1)テトラサイクリンによるDnmt3a, Dnmt3bの発現誘導系をde novoメチル化酵素欠損ES細胞へ導入することはできた.しかし,これらの酵素の発現を誘導しても,Xistプロモーターにおけるメチル化の回復は認められなかった.また,分化誘導後Xistを異所的に発現している状況でDnmt3a, Dnmt3bを誘導しても,X染色体不活性化よると思われる細胞死は引き起こされなかった.したがって,Dnmt3a, Dnmt3bはXistの発現制御のみならず,X染色体全域に結合した後のプロセスにも必要であるという当初の仮説は適切ではなかったと思われる.むしろ,X染色体不活性化が細胞分化と密接に関わっていることを考えると,de novoメチル化酵素欠損ES細胞では,異所的なXistの発現は不活性化を誘導するのに重要な分化段階を経過してから起こったため,染色体の不活性化には至らなかったのではないかと考えている.(2)Dnmt3a/Dnmt3b二重欠損マウス胚におけるX染色体不活性化を解析した.雌の正常マウス胚では二者択一的にメチル化されているXistプロモーター領域が,Dnmt3a/Dnmt3b二重欠損マウス胚では極端に低メチル化状態になっているにもかかわらず,大多数の細胞においてXistのディファレンシャルな発現は影響を受けていなかった.また,不活性化も細胞分化にともない正常に進行すると思われた.これらは,Dnmt3aおよびDnmt3bがX染色体不活性化の開始と不活性状態の染色体全体への伝播に必須ではないことを示している.また,不活性化の開始にはXistのmonoallelicな発現亢進が重要であるが,今回の解析からDnmt3a/Dnmt3bによるXistプロモーターの二者択一的なde novoメチル化がそれを担う最初のイベントではないことも強く示唆された.(1)テトラサイクリンによるDnmt3a, Dnmt3bの発現誘導系をde novoメチル化酵素欠損ES細胞へ導入することはできた.しかし,これらの酵素の発現を誘導しても,Xistプロモーターにおけるメチル化の回復は認められなかった.また,分化誘導後Xistを異所的に発現している状況でDnmt3a, Dnmt3bを誘導しても,X染色体不活性化よると思われる細胞死は引き起こされなかった.したがって,Dnmt3a, Dnmt3bはXistの発現制御のみならず,X染色体全域に結合した後のプロセスにも必要であるという当初の仮説は適切ではなかったと思われる.むしろ,X染色体不活性化が細胞分化と密接に関わっていることを考えると,de novoメチル化酵素欠損ES細胞では,異所的なXistの発現は不活性化を誘導するのに重要な分化段階を経過してから起こったため,染色体の不活性化には至らなかったのではないかと考えている.(2)Dnmt3a/Dnmt3b二重欠損マウス胚におけるX染色体不活性化を解析した.雌の正常マウス胚では二者択一的にメチル化されているXistプロモーター領域が,Dnmt3a/Dnmt3b二重欠損マウス胚では極端に低メチル化状態になっているにもかかわらず,大多数の細胞においてXistのディファレンシャルな発現は影響を受けていなかった.また,不活性化も細胞分化にともない正常に進行すると思われた.これらは,Dnmt3aおよびDnmt3bがX染色体不活性化の開始と不活性状態の染色体全体への伝播に必須ではないことを示している.また,不活性化の開始にはXistのmonoallelicな発現亢進が重要であるが,今回の解析からDnmt3a/Dnmt3bによるXistプロモーターの二者択一的なde novoメチル化がそれを担う最初のイベントではないことも強く示唆された.