hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病原菌のバイオフィルム特異的発現遺伝子の網羅的解析

歯周病の主原因細菌の1つであるPorphyromonas gingivallisのバイオフィルム形成菌と浮遊菌の遺伝子発現をDNAアレイにて網羅的に解析した。バイオフィルム形成菌において遺伝子発現が増加したものは、物質の取り込みと排出に関与するもの、エネルギー代謝に関与するもの、環境変化に関与するもの等であった。減少したものはストレスに対応するもの、酸化ストレス下で転写に関与するもの、脱リン酸酵素等であった。これらのことより、P.gingivalisはバイオフィルム形成菌と浮遊菌において遺伝子発現の相違があることが明らかになり、バイオフィルム形成に関与する遺伝子が示唆された。P.gingivalisは歯肉溝バイオフィルム形成菌の一員として生存する。バイオフィルム形成菌は抗菌薬や生体防御機構に抵抗し、歯周病の治療の大きな障害となっている。バイオフィルム形成菌の抗菌薬等に対する抵抗性は物理的要因に加え、バイオフィルム形成菌の浮遊菌とは異なる遺伝子発現が関与している可能性が考えられたことよりP.gingivalisの浮遊菌とバイオフィルム形成菌の遺伝子発現の差異を検討した。ヘミン、メナジオン、イーストエキストラクト添加Triptic soy brothにてP.gingivalisを96 well plateで2日間嫌気培養し、各wellの上清菌を浮遊菌、プレートに結合した菌をバイフィルム形成菌とした。両菌より総RNAを抽出し、cDNAを作製後、P.gingivalis W83株のゲノム解析データーを元に作製されたアレイ(GeneFrontier社)にてDNAアレイ解析を行った。1,909遺伝子をターゲットとして浮遊菌とバイオフィルム形成菌のDNAアレイ解析を行ったところ、74遺伝子において2倍以上の発現の差異がみられた。バイオフィルム形成菌で遺伝子発現が増加したものはABC transporter,efflux transporter MFP component RDNfamily,thioredoxin family,Tet R,luxP,sensor histidine kinase等の32遺伝子、減少したものはheat shock protein90,oxyR,outer membrane efflux protein,AcrB/AcrD/AcrFfamily protein等の42遺伝子であった。細胞壁における物質の取り込みや排出に関与する物質や薬剤排出に関与する物質の遺伝子の増減がみられたことより、これらが間接的または直接的にバイオフィルム形成性や薬剤感受性に関与している可能性が示唆された。成熟バイオフィルムは抗菌薬や生体防御機構に抵抗する重要な成分である。P.gingivalisのバイオフィルム形成菌は浮遊菌に比較し遺伝子発現に相違がみられたが、抗菌薬耐性機構等に関与する遺伝子等については、明確にできていない。バイオフィルムが成熟することは物理的に抗菌薬の浸透の阻害や抗体や食細胞の作用に対する阻害に関与する大きな要因と考えられる。Pseudomonoasaeruginosaのバイオフィルムの成熟にはlasI遺伝子から発現されるAI-1が必要とされている。P.gingivalisの類似の作用をもつAI-2を産生する。P.gingivalisのAI-2産生に関与するluxS変異株と親株の96well plateへのバイオフィルム形成性を検討したところ、親株に比較し、luxS変異株の方がバイオフィルム形成量が多く、バイオフィルム形成率も高いことが観察された。このことはP.aeruninosa等で報告されていることとは逆の現象であった。P.gingivalisの親株とluxS変異株における菌体のタンパク質発現の2次元電気泳動による比較において親株ではアルギニン特異的システインプロテアーゼ(Rgp)がluxS変異株より多く産生されており、luxS変異株ではNAD-specific glutamate dehydrogenaseが多く産生される違いが観察された。これらのことより、P.gingivalisではAI-2は単独でのバイオフィルム形成の成熟に働くのではなく、バイオフィルム形成菌の結合を弱め、一部の菌を遊離させ、他の菌との共凝集を促進するように働く可能性が示唆された。また、両菌株間で相違がみられたこれらの成分は直接的または間接的にバイオフィルムの成熟や遊離に関与している可能性が示唆された。P. gingivalis ATCC 33277luxS変異株は親株よりバイオフィルム形成が多いことが観察されたことより,AI-2がP. gingivalisのバイオフィルムの遊離を促進する可能性が示唆された。そこで、AI-2をP. gingivalisのluxS変異株に加え、バイオフィルム形成の変化を検討した。luxS遺伝子をpGEX 6P-3に組み込みE..coli DH5a or株にtransformationしたE..coli DH5 a/PGEXpg-luxS株にてAI-2を産生させた。P.gingivalisのluxS変異株にE..coli DH5 α株とE..coli DH5 α/p GEXpg-luxS株の培養上清を加え培養じたが、バイオフィルム形成性に違いがみられなかった。

これはLuxSがAI-2の前駆物質の生成のみならず、RNA、DNA、多くのタンパク質等に対するメチル基供与に関与するhomocysteineの生成(activated methyl cycle)にも関与することより、luxS変異によりactivated methyl cycleが変化し、その結果多くの物質に変化が生じた可能性が示唆された。その結果バイオフィルム形成や遊離に影響することが推察された。先行バイオフィルムとしてS.gordoniiのバイオフィルムを形成させ、そこにP.gingivalis菌液を添加し培養するとS.gordoniiのバイオフィルムの遊離が観察された。このことはP.gingivalisは単独での遊離も想定されるが、他の菌に結合後、その菌と共に遊離する可能性が示唆された。P.gingivalisのS.gordoniiの遊離に関与する因子を検討したところ、菌体外に産生されるRgpとKgpである可能性がrgpA、rgpB、kgpの変異株と、RgpとKgpの阻害剤であるKYT-1とKYT-36による実験より示唆された。以上のことより、luxSが関与しだ系において、AI-2以外の物質が単独でのP.gingivalisのバイオフィルムからの菌の遊離に関与し、また、P.gingivalisが産生するRgpやKgpはP.gingialisとS.gordnoniiの複合体の遊離に関与する可能性が示唆された。
STAT3によるオーガナイザーの細胞運動制御機構の解明

1)STAT3による細胞自立的運動制御を担う標的遺伝子の同定:STAT3による細胞自立的運動制御を担う標的遺伝子LIV1を同定し、さらにLIV1が上皮-間葉転換(EMT)制御因子であることを明らかとした(Nature,2004)。またZnトランスポーターLIV1がEMTのマスターレギュレーターであるZnフィンガー転写因子Snailの細胞内局在とその活性を制御することも明らかとした。これはZnトランスポーターによるZn要求性因子の活性調節を解明した最初の報告であり、Znを細胞内セカンドメッセンジャーとする新たな細胞内情報伝達系の存在を示唆するものである。2)STAT3による細胞非自律的運動制御機構の解明:STAT3シグナルが細胞非自律的にWnt/PCP経路を活性化し、平面内細胞極性を制御していることを明らかとした(JCB,2004)。Wnt/PCP経路のリガンドがSTAT3シグナルの下流に存在することが強く示唆された。3)gp130/JAKs経路によるSTAT3シグナルおよびGABsシグナルを介したEMTの統括的制御機構:gp130/JAKs/GABsシグナルがSTAT3シグナルとは異なるメカニズムでEMTを制御すること、すなわちgp130/JAKs経路によるEMTの統括的制御機構の全貌を明らかとした。4)STAT3の活性を調節する結合因子の同定:STAT3の活性を調節する結合因子を同定し、STAT3の核移行の分子機構を明らかとした。1)STAT3による細胞自立的運動制御を担う標的遺伝子の同定STAT3ノックダウン胚と正常胚を用いてサブトラクション法により、STAT3による細胞自律的運動制御を担う標的遺伝子を同定し、その細胞運動制御機構を明らかとした(論文投稿中)。この遺伝子は癌の浸潤との関連が示唆されていた機能未知の蛋白をコードしており、ゼブラフィッシュ原腸陥入のみならず、癌浸潤、創傷治癒にも適応可能な分子メカニズムであるか検討中である。また本遺伝子産物によるシグナル伝達の詳細を解析中である。2)STAT3シグナルによるWnt/PCP経路活性化メカニズムの解明我々はSTAT3による細胞非自律的運動制御機構が、Wnt/PCP経路を介した平面内細胞極性の制御によることを、FRET法を用いたRho活性化の時空間的解析から明らかとした(論文投稿中)。さらに現在Wnt/PCP経路のリガンド同定のために、STAT3の標的遺伝子をスクリーニング中である。3)gp130/JAKs経路によるSTAT3シグナルおよびGABsシグナルを介した細胞運動の統括的制御機構我々はこれまでに、gp130,Jak1,Jak2によりSTAT3が活性化されその標的遺伝子により細胞運動が制御されていることを明らかとしているが、これと同時にgp130/JAKs経路により活性化されるGABs/MAPKの標的遺伝子がSnailであり、その活性はSTAT3標的遺伝子により制御されていることを明らかとしている(論文投稿準備中)。また、GABs/MAPKシグナルの下流にはRhoを介した細胞骨格制御シグナルも存在する予備的結果を得ており、FRETを用いて現在解析中である。
全層角膜移植後の早期抗原認識反応におけるケモカイン、ケモカインレセプターの役割

我々は、合目的に細胞の移動を決定するケモカインおよびそのレセプタ-に着目し、マウス角膜移植モデルおよびランゲルハンス細胞遊走モデルを用いて検討した。結杲として、マウス角膜移植モデルにおいて、RANTES, MIP1α,MIP1β,MCP1などのケモカインmRNAおよびCCR1,CCR2,CCR5などのケモカインレセプタ-mRNA群が、角膜移植後旱期すなわち抗原認識、提示段階で発現していること、さらに同ケモカイン、レセプター群が拒絶反応発生時にも大量に発現していることが示された。またノックアウトマウスを用いた検討から、これらのケモカインレセプターのうち、CCR1が拒絶反応の成立に機能的に関与していることが明らかとなった。また抗原提示細胞として角膜輪部を中心に存在するランゲルハンス細胞の細胞移動にもRANTES, MIP1α,MIP1βとそのレセプターのCCR5が重要な役割を果たしていることをノックアウトマウスを用いた検討から明らかにした。過去に我々の行ってきた細胞接着因子に関する検討からも角膜移植の拒絶反応の成立には、抗原提示、認識段階の重要性が明らかとなっている。これらのことから抗原認識と提示および拒絶の発生に伴う細胞の移動にケモカインとそのレセプター群が重要な役割を果たしているものと考えられる。一方、同時にこれらの抗原認識と提示における頸部リンパ節の役割にも注目し研究をすすめてきた。その結杲、頸部リンパ節は、角膜移植の抗原提示、認識、増殖に不可欠であり、予めマウスの頸部リンパ節を除去しておくとで、角膜移植後の拒絶反応が完全に抑制されることを報告した。現在リンパ節や角膜とケモカインの関係について検討中である。コーテリーにより角膜中心に遊走するクラス2陽性細胞の樹枝状形態より、ランゲルハンス細胞の同定を蛍光顕微鏡観察により行ったところ、コーテリー施行施行群で、術後6日目に有意に多いクラス2陽性細胞の樹枝状細胞を同定した。そこで正常群、コーテリー施行後3日群、6日群の角膜を採取し、Ribonuclease Protection Assay(RPA)法よって、ケモカイン、ケモカインレセプターのmRNAの発現を検討した。結果として、RANTES,MIP1a,b,MIP2,MCP1,IP10などのケモカイン、CCR1,CCR2,CCR5の各ケモカインレセプターのmRNAの発現量が増加していた。そこでケモカインレセプターとそのリガンドの関係より、CCR1、CCR5に着目し、これらのノックアウトマウスを用いてランゲルハンス細胞遊走の解析を行った。結果として、CCR5KOマウスではコントロールマウスに比較して、ランゲルハンス細胞の遊走は有意に少なかったが、CCR1KOはコントロールマウスに比べて遊走は減少していなかった。また、抗CCR5抗体を用いて、樹枝状細胞を同定したところ、CCR5陽性の樹枝状細胞は、正常角膜では発現していなかった。しかし、コーテリーにより角膜周辺部には発現が認められたが、角膜中心部には認められなかった。以上より、角膜のランゲルハンス細胞遊走には、RANTES,MIP1a,bをリガンドとして持つCCR5が関与し、角膜中心部で発現が認められなかったことより遊走のイニシエーション因子としての役割を果たしている可能性が示唆された。今後はさらに、ランゲルハンス細胞の遊走に対する関与の明らかにされているTNFaやIL-1aなどのproinflammatoryサイトカインとケモカインの関係を明らかにし、ランゲルハンス細胞の遊走を分子レベルで検討していく予定である。我々は、合目的に細胞の移動を決定するケモカインおよびそのレセプターに着目し、マウス角膜移植モデルおよびランゲルハンス細胞遊走モデルを用いて検討した。

結果として、マウス角膜移植モデルにおいて、RANTES, MIP1α, MIP1β, MCP1などのケモカインmRNAおよびCCR1, CCR2, CCR5などのケモカインレセプターmRNA群が、角膜移植後早期すなわち抗原認識、提示段階で発現していること、さらに同ケモカイン、レセプター群が拒絶反応発生時にも大量に発現していることが示された。またノックアウトマウスを用いた検討から、これらのケモカインレセプターのうち、CCR1が拒絶反応の成立に機能的に関与していることが明らかとなった。また抗原提示細胞として角膜輪部を中心に存在するランゲルハンス細胞の細胞移動にもRANTES, MIP1α, MIP1βとそのレセプターのCCR5が重要な役割を果たしていることをノックアウトマウスを用いた検討から明らかにした。過去に我々の行ってきた細胞接着因子に関する検討からも角膜移植の拒絶反応の成立には、抗原提示、認識段階の重要性が明らかとなっている。これらのことから抗原認識と提示および拒絶の発生に伴う細胞の移動にケモカインとそのレセプター群が重要な役割を果たしているものと考えられる。一方、同時にこれらの抗原認識と提示における頸部リンパ節の役割にも注目し研究をすすめてきた。その結果、頸部リンパ節は、角膜移植の抗原提示、認識、増殖に不可欠であり、予めマウスの頸部リンパ節を除去しておくとで、角膜移植後の拒絶反応が完全に抑制されることを報告した。現在リンパ節や角膜とケモカインの関係について検討中である。
アトピーマウスにおけるCD8^+T細胞のTh2分化抑制機序とその治療戦略への応用

1)Id2^<-/->マウスでは脾臓中のCD8^+T細胞数が減少しており、IFNγ産生能も低下していた。Id2^<-/->マウス由来の脾臓細胞を採取し、CD4及びCD8陽性細胞数をFACS染色により解析した。その結果、正常コントロールマウスではCD4 35-50%、CD8 11-15%に対し、Id2^<-/->マウスではCD4 50-60%、CD8 1.5-4%とCD8陽性細胞数が著明に減少していた。さらに、脾臓細胞をConAで刺激後のサイトカイン産生を細胞内サイトカインFACS染色でみたところ、Id2^<-/->マウス由来CD8^+IFNγ産生細胞が正常コントロールのおよそ5分の1に減少していた。2)Id2^<-/->脾細胞にId2^<+/+>由来のCD8陽性細胞を補うことにより、Id2^<-/->由来CD4^+T細胞のTh1への分化が回復した。CD8陽性細胞がCD4陽性細胞のTh1/Th2分化に影響しているか否か検討するため、正常コントロールマウス由来のCD8陽性細胞をMACSにて分離し、Id2^<-/->マウス由来脾臓細胞に加えて抗CD3抗体とともに一定期間培養した後で細胞内サイトカイン染色によりTh1/Th2分化を検討したところ、CD8陽性細胞を補うことにより明らかにId2^<-/->マウス由来CD4陽性細胞のTh1分化が回復した。Id2^<-/->マウス由来CD8陽性細胞を加えた検討ではTh1分化への回復の程度は弱かった。3)NK細胞はId2^<-/->由来CD4^+T細胞のTh1/Th2分化に影響を与えなかった。2)と同様の検討をCD8陽性細胞のかわりに正常コントロールマウス脾臓からMACSにて精製したNK細胞で行なったがId2^<-/->マウス由来CD4陽性細胞のTh1/Th2分化には影響を与えなかった。以上より、CD8^+T細胞の減少及び機能異常がId2^<-/->マウスにおけるTh2偏移の原因の一つである可能性が示唆された。
プロトン化を鍵とするエノラート化学の新展開

aza-Morita-Baylis-Hillman反応は、第三級アミンやホスフィンといったルイス塩基存在下、α,β-不飽和カルボニル化合物がカルボニルα位でイミンと炭素炭素結合を形成し、対応するアリルアミンを与える有用な炭素骨格構築反応である。しかしながら、さらにオレフィンが共役したα,β,γ,δ-不飽和カルボニル化合物を出発物として用いたaza-Morita-Baylis-Hillman反応はこれまでに開発されていなかった。本法で得られる生成物は三つの親電子部位に加え、求核部位である保護アミノ基を有する多官能基性化合物であり、天然物や生理活性物質の合成におけるビルディングブロックとしての活用が期待され、その開発の意義は大きい。本反応では、反応部位がα位とγ位の二つがあるため、その反応性制御を分子内に酸性プロトンを有する有機触媒を設計・合成し用いることで達成する計画であった。すなわち、水酸基の位置をスクリーニングすることで、α付加体、γ付加体のつくりわけが可能と考えていた。3-vinylcyclopent-2-en-1-oneと様々な置換基を有する芳香族イミンを用いて検討を行ったところ、触媒としてDABCOを用いた場合にはα付加体が完全な位置選択性で、DMAPを用いた場合には87-96%の位置選択性でγ付加体が得られることが分かった。本知見は、aza-Morita-Baylis-Hillman反応において初めて位置選択性を制御できたことに加え、用いる求核触媒の変更という簡便な手法で位置選択性の発現に成功した点で意義が大きい。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
初期胚特異的ヒストンH1によるDNA複製速度の調節

多くの動物において初期胚特異的なヒストンH1のサブタイプが存在するが、その生理的意義は不明である。本研究では、初期胚においてはS期が著しく短いことに着目し、アフリカツメガエル卵の遠心抽出細胞質による無細胞系を用いてH1サブタイプが異なるときのDNA複製速度を定量的に解析した。その結果、以下の点が明らかになった。(1)成熟卵から調製した卵抽出液に界面活性剤処理した精子を加えてインキュベートし、核の形成およびDNA複製を誘起する系を確立した。この系におけるDNA複製量を、ラベルしたdATPの取り組み量によって定量化した。種々の精子濃度、インキュベーション時間における複製量を定量的に解析した結果、1x10^7精子/ml以下、14時間後においては、DNA複製量は精子濃度およびインキュベーション時間に比例して増加した。そこで、1x10^6精子/ml、23時間におけるdATPの取り込み量によりDNA複製速度を定量化した。(2)ツメガエル赤血球核から2Mの塩で抽出したクロマチン蛋白質にたいし、MonoSを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行ったところ、体細胞に一般的なH1サブタイプであるH1A/Bと赤血球特異的なサブタイプであるH5が分離された。また、卵抽出液で形成された核から、同様に、初期胚特異的なサブタイプであるH1Xが精製された。(3)卵抽出液にはH1サブタイプはH1Xしか含まれていない。そこで、抗H1X抗体を用いて卵抽出液からH1Xを除去し、これに上記の各H1サブタイプを加え、各々におけるDNA複製速度を調べた。その結果、H1X除去抽出液および、これにH1XまたはH1A/Bを加えた抽出液では、対照の卵抽出液と同程度の複製がみられたが、H1X除去後にH5を加えたものでは、著しい複製速度の減少がみられた。以上の結果から、ヒストンH1は核のDNA複製において必須の役割を果たしているわけではないが、複製速度の制御に対し、調節的に関与している可能性が示唆された。
オーガナイザー活性のあるホメオボックス遺伝子の細胞分化における役割

マウスgoosecoid染色体遺伝子はカリフォルニア大学のMartin Blum,Eddy M.De Robertis両博士から供与を受けた。この遺伝子はまだcDNAが単離されておらず、またその発現にも成功していない。このゲノム遺伝子の発現を困難にしているのは開始コドン上流域であると考え、295塩基対の上流域のうち250塩基対を削除した。削除した部分にはTATAboxがあり極めてGC塩基対が多い。マウスgoosecoid染色体遺伝子の上流域のTATAboxを含む部分を削除し、約50塩基対の上流域を含む約2100塩基対のゲノム遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクターのラウスサルコーマウイルスプロモーター下流に挿入し哺乳細胞での発現を試みている。このベクターでは蛋白質はヒスチジンが6個N端に結合して発現されるのでニッケルカラムを用いて精製できる。この遺伝子をCOS細胞へ燐酸カルシウム法により移入し、現在、ハイグロマイシン耐性株を選択した所である。また、TATAboxを含む上流域を削除したマウスgoosecoid染色体遺伝子をネオマイシン(G418)耐性遺伝子を持つベクターのサイトメガロウイルスプロモーター下流に挿入し、赤芽球系細胞にエレクトロポーレーション法により移入してネオマイシン耐性株を選択した。この細胞株はアクチビンへの反応性が低下していた。この原因としては、赤血球分化に必要な転写調節因子を抑えたり、あるいは細胞周期を加速する役割を果たしていることが考えられる。例えば、レチノブラストーマ蛋白質が赤血球分化に必要な転写調節因子と結合するのを妨げたり、増殖に必要な燐酸化型レチノブラストーマ蛋白質を相対的に増加させている事などが考えられる。
赤痢アメーバにおけるシステイン生合成の生理機能の解明および創薬

赤痢アメーバの含硫アミノ酸代謝は哺乳動物宿主のそれと大きく異なり、嫌気的環境での寄生に大きく寄与している。特に硫黄同化的システイン生合成経路は哺乳動物で完全に欠損しているために、創薬の観点からも極めて重要な経路である。本研究では赤痢アメーバに存在するシステイン生合成経路の最終酵素システイン合成酵素の分子生物学的、酵素学的な性状を明らかにすることを目的とした研究を行った。赤痢アメーバのゲノムデータベース上に赤痢アメーバのシステイン合成酵素遺伝子は3種類存在した。これらはCS1,CS2,CS3と名付けた。CS1とCS2はほぼ同一であり、CS3はCS1,CS2と83%同一であった。いずれの組換え酵素も2量体として存在した。0-アセチルセリンや硫化水素に体するKmやkcatなどのカイネティックパラメーターは似通っていた。いずれの酵素も細胞質に存在した。更にインビボでの機能を調べる為に、システイン合成酵素欠損大腸菌株でのCS1,CS3の発現を行ったところ、いずれの遺伝子でも欠損株のシステイン要求性が相補された。以上のことよりCS1-3のインビボでの機能が証明された。
アドレノメデュリン及びPAMPの発現,分泌調節とシグナル伝達機序の解明

本研究では、アドレノメデュリン(AM)の遺伝子発現および分泌調節とシグナル伝達機序の解析を行い以下のような成果を得た。心不全時に血漿AM濃度は増加するが、その由来については不明であった。心不全時の血漿中AMの産生臓器について、ラット心不全モデルを作成して検討した。その結果、心不全群では心筋重量,LVEDPの増加と共に血漿AM濃度も増加すること、組織AM濃度は、腎臓,副腎では変化しないが心臓,肺では増加し、AMmRNA発現の亢進も見られた。これらのことより、心不全時のAMの由来として心臓,肺での産生の亢進が示唆された。AM遺伝子の5'プロモーター領域をヒト大動脈由来の培養血管内皮細胞(HAEC)に導入し、ルシフェラーゼ活性を指標に発現活性を検討した。プロモーター領域の-85-93baseに存在するNF-IL6及び-33-68baseのAP-2のコンセンサス配列や-21-26baseのTATAboxの欠落により発現活性が低下することから、これらのシス・エレメントがAM遺伝子発現の制御に関与することが示唆された。AMの血管作用における内皮由来一酸化窒素(NO)とcGMPの関与の程度を知るために、cGMP特異的phosphodiesterase(PDE)阻害薬であるE-4021がAMの血管拡張に及ぼす効果を、ラット単離潅流腎と宗部大動脈ring標本で検討した。その結果、cGMP特異的PDE阻害薬であるE-4021がAMによる血管拡張を増強したことより、AMの血管作用の一部はNO-cGMP系に依存していることが示された。PPAMP-20(PAMP[1-20])は、AM前駆体から産生される降圧活性ペプチドである。PAMP-20のC末端部認識するRIA法を開発し、これを用いてブタ副腎髄質より、PAMPのC末端側12残基のPAMP-12をPAMP免疫活性の主要分子として単離,同定した。PAMP-12はPAMP-20と同様に降圧活性を有することから、PAMP-20の生理的役割の一部を担うものと考えられる。AM前駆体mRNAは副腎以外にも肺,心臓,腎臓など多くの組織でかなりの量発現していること、またAMは血中を循環してホルモンとして循環調節に関与することをこれまでに明らかにしている。さらに、血管組織や培養血管内皮細胞(EC),血管平滑筋細胞(VSMC)での多量の遺伝子発現及びAMの産生が見出され、その産生は種々の循環調節因子やリポポリサッカライド(LPS),IL-1,TNFなどのエンドトキシンショック誘動因子により著しく亢進することから、AMは局所因子としても循環調節に関与する可能性を示した。本年度は、AM遺伝子発現及び分泌調節機序解明の一環として、ヒト敗血症性ショック及び出血性ショック患者の血中AM濃度の検討を行った。その結果、敗血症性ショック患者では検討した全ての患者で血中AM濃度は著しく上昇し、正常者の100倍に達する例も認められた。また、血中AM濃度と抹消血管抵抗との間に負の相関性が認められ、AMがエンドトキシンショックなどの低血圧症時に降圧性物質として機能している可能性が示唆された。

さらに、出血性ショック患者においても、正常値の約4倍程度のAM濃度の上昇が見られ、出血性ショック時の血行動態への関与が考えられる。一方、AMmRNAは心臓でも高濃度存在することから、ラット培養心筋細胞を用いて、AM遺伝子発現調節の検討を行った。その結果、心筋細胞自体が血管平滑筋細胞に匹敵する高濃度のAMmRNA及びペプチドを産生していることが明らかになり、また、TNFやIL-1などのサイトカインによりAM遺伝子発現の顕著な亢進が見られた。現在AM遺伝子の5'プロモーター領域の詳細な解析を行っており、それによりこれらの因子の関与する発現機序が明らかになるものと思われる。本年度は、アドレノメデュリン(AM)の遺伝子発現および分泌機序解明の一環として、大型実験動物としてのイヌAMについて、その前駆体cDNAクローニングと敗血症ショックにおけるAM遺伝子発現について検討した。イヌAM前駆体は188個のアミノ酸で構成されており、イヌAMはヒトAMとの間に2個のアミノ酸置換が認められたが高い相同性を示し、PAMPも18位のアミノ酸が置換しているほかはヒトPAMPと同配列であった。PAMPは、ヒト、ブタ、ラットにおいてC-末端側の12残基は同一配列であり、この12残基のPAMP-12(PAMP[12-20])は、内在性に存在し活性も有することが最近明らかにしている。イヌにおいてのみ18位にアミノ酸置換が見られることは、PAMPの構造・活性を考える上で興味深い。正常イヌにおけるAMの遺伝子は、血管系では大動脈や大静脈で高く、肺動静脈や肝静脈、門脈、冠動脈などでも比較的強い発現が認められた。脳神経系では全体に発現量が低いが、大脳、視床、橋、延髄、脊髄などで比較的強かった。消化管では、上部消化管(食道、胃)および下部消化管(結腸、直腸)に強く発現していた。充実性臓器では、腎臓、副腎が同程度に強く、肝臓、脾臓、ではやや弱い発現量を示した。敗血症モデルでは、血管では動静脈を問わず増加し、消化管(十二指腸、空腸、回腸)では著明な増加が認められた。実質臓器では、平均して約1.5倍の増加を認め、脳内では視床下部、脊髄で増加が見られた。敗血症性ショックモデルにおける全身の主要な血管での発現増加は、敗血症に伴う低血圧の原因の一端をAMが担う可能性を示唆する。さらに、種々の臓器でAM遺伝子の発現に変化が認められ、またその広範な発現部位を考えると、ショックにおけるAMの作用も多岐にわたることが予想される。
エコーロケーションに基づいた運動物体の形状知覚の研究

ワンショットエコーから移動物体の形状を推定するには、ドップラーシフトの影響を除去して「反射強度分布」と位置情報である「外耳伝達関数」の両方を抽出する必要がある。特にコウモリのエコーロケーションの場合、昆虫等の餌を捕獲するためにエコーから物体形状の特徴を抽出する必要がある。このような対象物体の場合、頭部や羽などの複数の反射点の集合として物体の形状を表すことができ、この反射点の奥行きと反射率の関係を「反射強度分布」と呼ぶ。コウモリも昆虫も飛行しているため、これらの間の相対速度に依存したドップラーシフトの影響をうけている。したがって、エコーからドップラーシフトに依存しない「反射強度分布」の情報を抽出する必要がある。線形周期変調音(LPM)の瞬時周波数の時間変化はドップラーシフト量に依存しないので、移動物体の奥行推定に有用であることがわかっている。しかしながら、LPM音を用いて正確に反射強度分布を推定する計算手法は提案されていなかった。そこで、ガウス分布の振幅特性をもち、LPM音の変調に合わせた位相特性をもつチャープレット・フィルターを提案し、この提案フィルタを用いてエコーを時間周波数解析した。解析された振幅スペクトルの時間変化から最初の物体の奥行を推定し、干渉パターンの時間変化から物体間の奥行き差を順次推定していくことで、複数物体の奥行と反射率の両方、つまり、反射強度分布を推定する手法を提案した。実際に奥行が近接し、異なる反射率をもつ反射強度分布にたいしても正確に推定することができることを確かめた。ワンショットエコーから物体の形状を推定するには、「反射強度分布」と位置情報である「外耳伝達関数」の両方を抽出する必要がある。コウモリの外耳伝達関数にはスペクトル・ノッチが存在し、このノッチ周波数が音の入射方向に依存して変化していることがわかっている。このような外耳伝達関数を用いた工学的システムを構築するには、位置情報を抽出可能な模擬外耳が必要不可欠となる。しかしながら、これまでに位置推定に適当な模擬外耳の形状は明らかになっていなかった。そこで、ホーンを斜めに切った模擬外耳の伝達関数を測定解析し、ホーンの中心角、切り角、ホーン長を変えて伝達関数の入射方向依存の変化を明らかにした。位置定位に適当な外耳の条件として、伝達関数にスペクトル・ノッチが存在し、このノッチ周波数が入射方向依存に大きく変化し、広い入射範囲でノッチが存在するものとした。これらの条件を用いて、位置推定に適当な模擬外耳の形状は、中心角が25度、切り角が45度、ホーン長が7ミリメートルから10ミリメートルと決定できた。実際にこの模擬外耳を用いて、広帯域FM音を用いて、エコーを測定した。2つの受信点で得られたエコーの遅延時間から奥行きを、エコーのスペクトルのノッチ周波数から物体の方向を求めた。奥行きは10ミリメートル以内、水平・垂直方向とも1度以内の精度で推定できることを確かめた。この模擬外耳を用いて、動いている物体からのエコーを測定できるシステムを製作した。送受波システムは1つの超音波用スピーカと2つの超音波用マイクから構成され、模擬外耳はマイクの先端部に装着した。
エンドセリンの細胞内動態に関する免疫組織化学

血管内皮細胞は血液と組織との間に介在し、血行動態や血管生理に関与する種々の生理活性物質を産生・放出する多機能細胞である。我々の過去の研究において血管内皮細胞の封入体であるワイベル・パラ-デ小体(WP)がvWfのみでなく、ヒスタミン貯蔵の場であることを解明したが、それに加えてWPが内皮細胞で産生された、あるいは血行中から内皮細胞に取り込まれた種々の血管作動性物質の貯蔵の場であることを想定してきた。本研究計画の実施にあたり、我々の免疫電顕で明らかにしたWPがエンドセリン-1(ET-1)の貯蔵部位であるという事実に基づき、以下の研究を展開した。1.ET-1とその前駆体であるbigET-1のWPにおける局在において、ET-1はその中央部に集積するのに対し、bigET-1はWPの限界膜上(WPはゴルジ装置由来であるのでゴルジ膜)や周辺部に優勢である。従来からbigET-1の変換酵素は内皮細胞膜に局在すると考えられていたが、今回の免疫電顕所見は変換酵素がWP限界膜にも存在し、WPがbigET-1からET-1へのプロセッシングの場の一つであることを証明した。目下二重標識免疫電顕で一層詳細に検索中である。2.ラット脳硬膜静脈洞の静脈血還流におけるET-1の果たす役割については、内皮細胞の粗面小胞体で産生されたET-1はやはりWP小体に貯蔵される。横静脈洞は内皮下層に数層の平滑筋細胞を有するが、その形質膜上や小窩にもET-1の局在が認められる。このことは内皮細胞から傍分泌されたET-1が平滑筋細胞の受容体を介して能動的血管収縮を誘発し、脳静脈血の内頸静脈への還流の円滑化に関与していることを示唆している。3.WPがヒスタミンやET-1以外の血管作動性物質貯蔵に関与するか否かについてはラット頸動脈小体動脈、ならびにそれから分枝する細動脈が含有するWPがET-1に加え、CGRPを貯蔵することが今回の研究で明らかとなった。同器官のその大きさに比べて膨大な血流量が流入する頸動脈小体において、WP貯蔵のCGRPの血行動態における機能的意義は今後とも注目していくべきである。血管作動物質であるエンドセリンの内皮細胞における産生・放出機序の免疫細胞化学的解析を展開するに当って本年度は研究計画に沿って以下の研究を遂行した。1)各種哺乳類(ヒト、ラット、ブタ、カイウサギなど)の脳硬膜静脈洞についてエンドセリン並びにプロエンドセリンの光顕・電顕免疫細胞化学の結果、ラット横静脈洞内皮細胞の粗面小胞体・ゴルジ系に上記2種のペプチドの特異的免疫反応を認めた。このことは内皮細胞がプロエンドセリンの産生と修飾を行い、静脈血還流における血行動態に関与していることを示している。目下、免疫電顕でその産生・修飾・貯蔵並びに放出に関する詳細を観察中である。我々のデータではヒト臍静脈でWeibel-Palade bodies(以下、WP)がエンドセリンの貯蔵、さらにその限界膜がプロエンドセリンの修飾の場であることを示しているが、この件については以下の述べるごとく比較解剖学的検索を遂行している。

2)プロエンドセリンの血管内皮における修飾の場は目下意見の一致をみていない。我々はエンドセリンのC末端に特異的なモノクロナール抗体とプロエンドセリンのポリクロナール抗体とを用いた二重標識免疫電顕を続行中である。上記したごとく、ヒト臍帯臍静脈ではプロエンドセリンの修飾の場は内皮細胞のWPの限界膜並びに管腔側細胞膜であるという所見を得ているが、来年度に向けてより詳細な検索を続行中である。平成6年度研究計画は1.脳硬膜静脈洞血行動態におけるエンドセリン-1(以下ET-1)の役割に関する免疫電顕、2.bigET-1への変換に関する免疫電顕、3)ワイベル・パラ-デ(以下WP)小体内のET-1以外の血管作動性物質貯蔵であった。1.ラット横静脈洞をPLP液で6時間固定後、アルコール脱水、エポン包埋した。超薄切片の免疫染色にはマウス抗ET-1,モノクローナル抗体を用いた免疫金法を施行した。ET-1免疫陽性金粒子は内皮細胞の粗面小胞体(以下rER)やWP小体上に局在し、rERで産生されたET-1がゴルジ装置で修飾され、WP小体に貯蔵されることを示した。また、内皮細胞膜や飲小胞内に免疫陽性金粒子が局在しており、内皮細胞が血中ET-1の取り込みにも関与していることを示唆した。さらに、横静脈洞は内皮下層に若干層の平滑筋細胞を有し、その能動的収縮による血流調節が考えられるが、その形質膜上や小窩にも免疫陽性金粒子が局在しており、同形質膜にET-1受容体が存在し、内皮細胞からのET-1の傍分泌によって平滑筋細胞の収縮が誘発され、横静脈洞の能動的血流調節が営まれていることが想定された。なお、本研究詳細については本年度の日本電顕学会で発表する予定であり、Immunoelectron microscopy on the localization of endothelin-1 in the rat transverse sinus of the dura materをAnat.Rec.(1995)に投稿中である。2.bigET-1からET-1への変換酵素による修飾の場をそれぞれのモノクローナル抗体を用いて免疫電顕で検索した。両者ともrER、ゴルジ装置に局在するが、WP小体への局在がbigET-1がその限界膜上、および周辺部に集中するのに対して、ET-1はWP小体中心部の局在性が優勢であった。このことはゴルジ装置からの濃縮胞内に放出されたbigET-1の一部がWP小体の限界膜に局在する変換酵素でET-1に修飾されることを示唆するが、目下二重標識免疫電顕で検索中である。3.WP小体がヒスタミン貯蔵部位であることから、我々はET-1以外の種々の血管作動性ペプチドの貯蔵の場でもあることを想定してきたが、その一つとしてWP小体がCGRPの貯蔵の場であることがラット頸動脈小体動脈で明らかとなった。とくに細動脈のWP小体はET-1とともにCGRPを含有することが今回の免疫電顕で明らかとなった。発達した微小血管床を有する頸動脈小体の局所血流調節に血管収縮性と拡張性のこれら2種のペプチドが関与することが証明された。
高齢者の補綴治療に対する臨床判断基準作成のためのデータベース構築

超高齢化社会を迎えつつある現在,歯列の欠損から失われた機能や審美性を回復し,快適な口腔環境を維持することはQOLの向上を図るために意義深い。しかし,高齢者の補綴治療の処置方針については,明確に確立されていないのが現状である。そこで,臨床判断学とよばれる「何らかの不確実な状態で,合理的または体系的に最善の医療行為を選択する」分析手法を高齢者の補綴治療に適用することを考えた。本研究では以下の4段階の手順に絞り,現在の高齢者に対する補綴治療の成績を統合,整理し,臨床判断基準作成のデータベース構築を目指した。(1)判断すべき問題の定義:高齢者を通院可能な患者と寝たきりの在宅あるいは入院患者に分けた。(2)判断樹の設定:欠損補綴を行うか否か,可徹性か固定性か,可徹性であれば,維持装置の種類を設定した。(3)結果の想定および(4)確率の推定:過去の文献から治療成績(5年後の予後)を統合整理した。通院可能な高齢者においては,3239%に補綴処置がなされていないこと,多数歯欠損で少数歯が孤立している場合は粘膜負担の義歯が予後成績がよいことが明らかとなった。寝たきり老人では,残存歯の3040%が要抜去歯であり,欠損補綴にはオーバーデンチャーによる対応が行われ,その3年後の予後は週1回のProfessional toothcleaningと義歯の洗浄により維持されていた。以上の分析過程から,過去の文献によるコ-ホ-ト研究のみでは,症例数と条件のコントロールに制約があるため結果および確率の推定をするには不十分であった。今後,補綴処置の効果とリスクを定量化し,判断基準を明確にしていくためには,臨床的な疫学調査およびアセスメントの必要性が示唆された。
植物チロシンキナーゼを標的とするゲニステインのアレロパシー効果の分子機序の解明

我々は、これまでに、ダイズなどのマメ科植物が生産する二次代謝産物イソフラボン・ゲニステイン(GNS)によって活性が著しく阻害される植物特異的なチロシンリン酸化プロテインキナーゼ・TAGKを見出している。さらに、植物ホルモン・ジベレリンの受容体GID1が新規因子GARUによってユビキチン化依存的に分解誘導されること、一方でTAGK2がその分解誘導を抑制することによって、GAシグナルの恒常性が制御されていることを明らかにした。この結果は、マメ科植物ダイズが生産するGNSが他植物種のTAGK2を標的とするGAシグナル抑制因子として機能している可能性を示唆するものである。そこで、その仮説を検証するめに、まず、我々はモデル植物シロイヌナズナにおけるGNS依存的な生育抑制および発芽抑制が、TAGK2およびGARU遺伝子機能と関係しているのかを調査した。その結果、野生型の発芽および根伸長は低濃度のGNSによって優位に抑制されたが、一方で、TAGK2高発現体およびgaru遺伝子欠損体においてはGNSによる抑制効果がほとんど認められなかった。さらに、ダイズ種子または実生から分泌される画分を野生型シロイヌナズナ種子に投与すると、GNS生産能の高いダイズ品種由来の画分において極めて強い発芽抑制作用が認められたが、garu遺伝子欠損体は耐性を示した。さらに、ダイズ由来画分処理は、GNS処理と同様に種子内GID1タンパク質のプロテアソーム系による分解を誘導することが明らかになった。これらの結果から、ダイズ由来のGNSによる生育・発芽抑制効果はTAKG2およびGARU機能依存的であり、GAシグナルを抑制する機能性分子として働いている可能性が強く示唆された。当初予定した実験計画を順当に進めているが、ダイズ栽培の経験がなかったためにサンプル調整に時間がかかった。そのため、当初計画していた環境ストレスなどと併用したGNS効果をあまり検討できていないが、一時データは得ることができた。現在は、農業研究センターなどから栽培技術ノウハウを聞いており、栽培の問題は解決している。本年度は、研究スピードが速まることが期待できる。本年度は、前年度計画していた環境ストレス下におけるGNSによる生育・発芽抑制効果を検討していく。前年度の予備的な結果から、すでに、実験条件などは決定しているので早急に遂行できる。また、ダイズ由来分泌物と環境ストレスとの併用実験も計画している。さらに、アサガオGARU遺伝子については人工遺伝子合成を行なっており、in vitro系による遺伝子機能解析、細胞実験による機能解析の準備は整っている。
植物の栄養飢餓とオートファジー

本研究では真核生物に普遍的に備わる細胞自己分解システム「オートファジー」が、植物の栄養飢餓応答に果たす役割についてモデル植物であるシロイヌナズナを中心材料に分子レベルで明らかにすることを目的とした。本年度は特に以下の2項目について成果が得られた。1)光合成制限環境下におけるエネルギー供給源としてのRCB/オートファジーの役割葉や個体レベルでの栄養条件を様々な外的、内的条件で変化させ、それらが小胞RCB(Rubisco-containing body)の形成に及ぼす影響について調べた。その結果、RCBの形成は葉の炭水化物含量と特に密接に結びついていることが示された。そこで、炭素制限環境におけるRCB/オートファジーの役割について解析するため、オートファジーとスターチ代謝関連遺伝子の二重変異体の解析を進めた。スターチレス/オートファジー二重変異体では、短日条件において顕著な生育遅延が起き、生殖成長に至る前にほとんどの葉が枯死するというシビアな表現型が見られた。二重変異体では分岐鎖アミノ酸や芳香族アミノ酸含量が低下しており、これらアミノ酸の分解代謝に関わるIVDHやETF/ETFQO複合体のETFQOの遺伝子発現はスターチレス変異体や二重変異体で顕著に上昇していた。以上のことから、オートファジーが、炭素制限時にこれらアミノ酸分解代謝へのアミノ酸供給系として機能していることが示唆された。(Izumi et al., 2013, Plant Physiol.として発表)。2)葉の老化時のRubisco分解におけるRCB経路の貢献度の評価24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。1)葉の炭水化物量がRCB形成に及ぼす影響の解析葉における炭水化物量を様々な外的、内的条件で変化させ、それらが小胞RCB(Rubisco-containing body)の形成に及ぼす影響について調べた。外的条件としては糖や無機栄養の添加、また日周期や暗期延長実験を行った。内的条件としてはデンプン代謝関連遺伝子の変異体やRBCSの欠損変異体を単離し、RCB形成の影響について調べた。その結果、オートファジーによるRCBを介した葉緑体タンパク質の分解程度が葉の炭水化物含量と密接に結びついていることが明らかにされた。2)葉の老化時のRubisco分解におけるRCB経路の貢献度の評価RBCSと蛍光タンパク質(sGFP,mRFP)の融合タンパク質を発現する形質転換体を用いてRCB経路を定量評価することを試みた。RBCS-GFP(-RFP)は内在RBCS,RBCLと会合しRubisco-GFP(-RFP)を形成した。これらを発現する葉を個別に暗処理し老化誘導すると、蛍光の液胞内への移行が観察された。この際、液胞内ではRubisco-GFP(-RFP)がプロセシングを受けfree-GFP(RFP)を生じることが分かった。このfree-GFP(RFP)はNative-PAGEやSDS-PAGEにより分離・定量が可能であり、これによりRCB経路の定量評価ができることが分かった。葉の炭水化物量がRCB形成に及ぼす影響の解析については論文として2報発表できた。葉の老化時のRubisco分解におけるRCB経路の貢献度の評価についても論文として現在投稿中であり、本課題の目的を達成できる成果がおおむね得られているものと考えている。論文発表に至っていない項目、RCB形成に関わる新規遺伝子座の特定やRCB/オートファジーの植物種間差、についても、解析自体は着実に進んでおり、今後も当初計画通りに進めていきたいと考えている。
細胞死誘導分子TRAILの生体防御機構における機能解析

前年度までに我々は、Fasリガンド(FasL)やTNF-related-apoptosis-inducing ligand(TRAIL)といったアポトーシス誘導分子の機能および発現について、主にin vitro実験系により解析したが、その過程で、FasLやTRAIL分子以外のアポトーシス誘導分子が免疫システムにおいて重要である可能性が得られていた。本研究において、我々は、新規TNFファミリー分子であるTWEAKの発現と免疫系における機能について解析を行った。TWEAKはIFN-γで発現誘導されること、および、IFN-γ活性化単球の標的細胞傷害機構にはTRAILやTNF-αに加え、TWEAKを介した経路も存在することを示した。FasLは、AIDSや肝炎等の疾患の素因となりうることが報告されているが、臨床応用を目的として、昨年度までに樹立したヒトFasLに対する中和抗体(NOK2,マウスIgG2a/κ)のヒト型化を行うと同時に、FasLとそのレセプターであるFasとの分子レベルでの結合様式の詳細についてモレキュラーモデルを用いて解明した。さらに、FasL活性維持に重要なアミノ酸残基の位置を同定し、NOK1^-3、リコンビナントNOK203の立体エピトープ解析およびFasL活性維持に重要なFasLアミノ酸残残基の比較から、これらがある程度の類似性を示すことが明らかとした。これらの、知見は、アポトーシスを抑制する低分子化合物の開発につながることが期待される。前年度までに我々は、Fasリガンド(FasL)やTRAILといったアポトーシス誘導分子の機能および発現について、主として、in vitro実験系にて解析を行ってきた。その過程で、FasLやTRAIL分子以外のアポトーシス誘導分子が免疫システムにおいて重要である可能性が得られていた。今年度、我々は、新規TNFファミリー分子であるTWEAKの発現と免疫系における機能について解析を行った。TWEAKは、これまでに、ある種の腫瘍細胞株に細胞死を誘導すること、TWEAKのmRNAレベルでの発現は多臓器にわたって認められるが、タンパクレベルでの機能的な発現については明らかになっていないことが知られているが新たに樹立した抗ヒトTWEAKモノクローナル抗体(CARL-1)を用いて、ヒト末梢血T、B、NK細胞および単球上のTWEAKの発現を解析した結果、未刺激時には、いずれの細胞上にもTWEAKの発現は認められないが、IFN-γ存在下で、12hr培養することにより単球上にTWEAKが発現することが判明した。IFN-γ活性化単球はHSC3およびKATO IIIといった標的細胞を効率良く殺傷することが^<51>Cr release assayにより認められたが、この時、TWEAKおよびTRAILに高感受性を示すHSC3に対する細胞傷害活性はCARL-1および抗TRAILモノクローナル抗体(RIK-2)により完全に阻害された。一方TRAILおよびTNF-αに高感受性を示すKATO IIIに対する細胞傷害活性はRIK-2および抗TNF-αモノクローナル抗体により完全に阻害された。以上の結果により、TWEAKはIFN-γで発現誘導されること、および、IFN-γ活性化単球の標的細胞傷害機構にTRAILやTNF-αに加え、TWEAKを介した経路も存在することが示唆された。前年度までに我々は、Fasリガンド(FasL)やTRAILといったアポトーシス誘導分子の機能および発現について、主にin vitro実験系により解析したが、CD4陽性T細胞がHIV感染に伴い、FasLやTRAILに対して高感受性を示すようになることを報告し、アポトーシス誘導分子に対する中和抗体を投与することによりAIDS発症時のリンパ球減少を抑制できる可能性を示唆した。本研究において、我々は、臨床応用を目的として、昨年度までに樹立したヒトFasLに対する中和抗体(NOK2,マウスIgG2a/κ)のヒト型化を行うと同時に、FasLとそのレセプターであるFasとの分子レベルでの結合様式の詳細についてモレキュラーモデルを用いて解明した。

また、FasLの変異体を用いた解析により、FasL活性維持に重要なアミノ酸残基の位置を同定し、NOK1^-3、リコンビナントNOK203の立体エピトープ解析およびFasL活性維持に重要なFasLアミノ酸残基の比較から、これらがある程度の類似性を示すことが明らかとした。例えば、G199AおよびQ220A置換は、すべてのモノクローナル抗体との反応性およびFasL cytotoxicityの低下につながる。一方、K210のような他の幾つかの残基は、FasL cytotoxicityの保持に必要であったが、NOK1^-3エピトープ形成には必須ではなかった。これらの結果は、NOK1^-3、RNOK203は、二ケ所のFasL/Fas結合部位を直接的または間接的に阻害することにより、効率よくFasL活性を阻害することを示唆する。
「占領空間」の移動を問う――<フィリピン・ウチナーンチュ>の事例

本研究は、米軍駐留という「占領空間」とのかかわりで、沖縄-フィリピン間移動を「フィリピン・ウチナーンチュ」に注目しながら解明することにある。さらに、本研究は沖縄-フィリピン間の人の移動を探求することを通じて、現代の移動・移民研究(国際社会学)に貢献するものである。本研究の対象は、フィリピン人と結婚した沖縄人女性帰還者(一世と呼ぶ)と彼女らの子(二世と呼ぶ)である。2013年度には、2012年度の課題に基づき、新たな観点から本研究課題について分析を行った。「占領の空間」における移動・移民を、ライフ・コース・マイグレーションの観点から取り上げ、本研究にあらたな位相を加えることができた。具体的には、沖縄人女性の帰還者に関するライフ・コースと彼女らの移動との関係性を考察するため、現地で補充調査・参与観察等を行った。インタビューに基づいたデータ、集めた文献などに基づいて、彼女らの個々の人生における移動を社会、政治・経済、文化的構造との関連で分析することができた。この結果、沖縄戦、占領期、結婚と出産、フィリピンへの移動、沖縄への帰還、そして晩年と死、それぞれの出来事はどのようにこれらの女性の移動に影響を与えるのかを明らかにできたと考える。ライフ・コースにおいて、これらの女性の移動と「故郷」に関する意識は、言うまでもなく、自分の人生(ライフ)の出来事によって形成され、また再形成される。その一方で、晩年と死に関する決断には家族(特に彼女らの子供たち)の影響を受け、この段階では家族の役割は重要である。また、帰還者として、この一世たちは、自らの居場所を作り、沖縄(あるいは地元)への再統合を挑戦していた。ライフ・コースの観点から考察すると、彼女らの戦争と占領期の経験・移動・帰還などは、このような「居場所を作る」という行為として理解することができる。(抄録なし)本研究は、米軍駐留という「占領空間」とのかかわりで、沖縄-フィリピン間移動を「フィリピン・ウチナーンチュ」に注目しながら解明することにある。本研究の目的を達成するために、2011年12月19日-2012年1月1日の沖縄での予備調査を行い、またフィリピンでも1月23日-3月17日にフィールド・ワークを行った。主な考察点は以下である。1.フィリピン・ウチナーンチュはフィリピンと沖縄に居住し、本研究では、「帰還者」と「非帰還者」に彼ら/彼女らを区分する。彼ら/彼女ら(帰還者と非帰還者)の移動のプロセスと経験を探究し、自分の移動と故郷が、どのように語られているのかを調査した。それに関連し、2.「故郷の作り方(Home-making)」について調査し、「帰還」という概念、また移動のプロセスとして、理論的な分析を試みた。そして、3.これまでに収集したデータを使用し、「占領空間」という復帰後に継続している米軍のプレゼンスを理解しながら、現在沖縄-フィリピン間の移動の関係を考察した。具体的には、以下のように実施した。2011年12月に沖縄で調査を行い、那覇における小禄カトリック教会において参与観察を行った。小禄教会では、フィリピン・ウチナーンチュ一世と二世が多く集まっている。そこでは、クリスマスパーティーとお正月のお祝いにも参加し、一世と二世と交流した。そして、12月20日に琉球大学の国際沖縄研究所で研究報告を行った。また、1月-3月には、フィリピンで調査を行い、沖縄・フィリピン県人会を訪問し、他の日系人会にも訪問して、様々な情報と資料を収集した。また、最も多い日系人に住んでいるダバオ市に行って、フィールド・ワークを行った。マニラ以外の所(ラグナ州、ヴァレンズエラ市)でもインタビューを行った。研究成果を2月22日-23日にクアラ・ルンプールで開催されたJapan Studies Association of ASEANの学会で報告した。本研究の対象は、フィリピン人と結婚した沖縄女性帰還者(一世と呼ぶ)と彼女らの子(二世と呼ぶ)である。本研究の目的を達成するために、2012年度は、9月12日から12月11日にかけて、沖縄での調査・参与観察等を行い、また2013年3月13日から27日にかけて、フォロー・アップ調査を行った。上記の3ヶ月のフィールド・ワークの間にも、研究成果を学会などで報告した。主な成果・議論は以下である。1.沖縄に居住するフィリピン・ウチナーンチュ二世は、「日本人」として生きているが、「ハーフ」という名づけを使用し、その名づけがエンパワーメントとして機能していることが観察された。それに関連し、これらの二世は米軍基地で働いているため、その経験が文化資本となり、沖縄での生活に強く影響している。そして、二世にとって子育ては、二世・三世のアイデンティティ形成との影響だけではなく、フィリピン・沖縄間移動の特定の構造的要因との関係を明らかにする必要があることを確認した。