hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二重鎖DNAの認識配列の拡張を指向したユニーク型PIポリアミドの開発

PIポリアミドの配列拡張のため、βアラニンのクロス配置により、GGGG及びCCCCを含まない全てのDNA配列を標的とすることに成功した。さらに12塩基認識の長鎖PIポリアミドの合成のため、} IMPBレジンを用いた2・3ユニットの固相合成によりPIポリアミドブロックの合成及びそれらを組み合わせた12塩基認識のPIポリアミドの合成に成功した。さらにPIポリアミドの水溶性を克服するために、通常のヘアピン型PIポリアミドより少量で二本鎖DNAと強く結合する環状PIポリアミドの新規固相合成法を確立した。PIポリアミドは抗生物質デスタマイシンモチーフのDNA副溝へ配列特異的にDNAに結合する人工分子である。このPIポリアミドはTGF-β1やLOX-1、MMP-9といった遺伝子の発現制御に成功している。このPIポリアミドは配列選択性を持つアンチジーンドラッグとして様々な特徴を持つが、配列認識数の制限、認識配列そのものの制限、そして長鎖PIポリアミドの合成の困難さといった問題がある。そこで本申請ではこれまでの合成法を改良し、長鎖ポリアミドの合成法の開発、さらに配列選択性を高める為の設計法を確立することを目的とし、研究に取り掛かった。その結果、GCリッチな遺伝子配列を持つABCA1(塩基配列5'-AGGCCGGCGGGC)を標的とするユニーク型PIポリアミドABCA1-12(DpβPyImImImβImImβPyImImγPyPyImImβPyImβPyPyImAc)を固相合成法によって合成することに成功した。さらにこのABCA1-12のDNAに対する結合をBiacoreアッセイにより測定したところ、3.0×10^<-7>という良好な結合定数を得た。次にABCA1-12の合成効率を高めるためにPEG-HMPB-レジンを用いてPIポリアミドのブロックユニットの合成を行った。その結果、90%以上の高収率で各種PIポリアミドのブロックユニットを得ることに成功した。さらにこれらのブロックユニットを用いてABCA1-12を合成したところ、40%の収率で合成することに成功した。通常の固相合成法では収率11%であったため、ブロックユニットによる長鎖PIポリアミドの合成効率の大幅な向上に成功した。23年度ではこのABCA1の細胞実験や動物実験によりその薬効を検討する。Pyrrole-Imidazole(PI)ポリアミドは,天然に存在する抗生物質ディスタマイシンをモチーフとしたN-methyl-pyrrole(Py)及びN-methyl-Imidazole(Im)から構成されるDNAの副溝に結合する小分子であり,PyとIm及びβ-alanine linker(β)、γ-aminobutyric acid turn(γ)の組み合わせによりDNAの塩基配列を認識し,標的遺伝子の発現を抑制することが知られており、抗腫瘍活性や神経芽腫,腎障害,肥厚性療痕や網膜疾患などに対する治療薬としての研究開発が行われている。このように疾患治療薬として将来有望なPIポリアミドであるが、現在の課題として配列認識数の制限、認識配列そのものの制限、そして長鎖PIポリアミドの合成の困難さといった問題がある。そこで本申請ではこれまでの合成法を改良し、長鎖ポリアミドの合成法の開発、さらに配列選択性を高める為の設計法を確立することを目的とし、本研究に取り掛かっている。これまでの研究から12塩基認識のPIポリアミドABCA1-12をポリアミドブロックにより高収率な合成に成功し、BiacoreアッセイによりDNAとの高い親和力が得られることを確認した。そこで本年度ではこのABCA1-12の遺伝子発現抑制能を検討するため、HeLa細胞及びT24細胞にABCA1-12投与しリアルタイムPCRによりABCA1の発現をmRNAレベルで測定したところ、10μMの濃度において抑制効果が確認された。そこでマウスに対し同濃度のABCA1-12を尾静脈から投与したところ、投与直後にマウスがショック死を起こしてしまった。解剖の結果、ABCA1-12がマウスの血管内で析出し血栓を引き起こしていることが明らかとなった。これはABCA1-12が水溶性の低いImを多量に含んでいるためであった。そこでこの問題を克服するためにより低濃度でDNAに結合する環状PIポリアミド及びカチオン性アミノ酸のリシンテールの付加によるPIポリアミドの水溶性の向上を行なっている。
平面内細胞極性を調節する7回膜貫通型レセプターFlamingoの研究

平面内細胞極性(planar cell polarity,PCP)とは、上皮細胞において、頂部一基部に直交する平面上に発達する極性を指す。平面内極性の典型例として、脊椎動物内耳細胞の有毛細胞が作る不動毛(stereocilia)の配向パターンや、ショウジョウバエの翅表皮細胞の遠近軸に従った翅毛(wing hair)の形成が挙げられる。具体的には、翅の表皮細胞は必ず遠位端(翅の先端に近い側)においてアクチンを重合させて翅毛を形成し、翅毛は翅の先端に向かって伸びる。WntファミリーのレセプターFrizzled(Fz)と細胞質因子Dishevelled(Dsh)は、PCPシグナル経路の上流に位置することが知られていた。我々はすでに、カドヘリンスーパーファミリーに属する7回膜貫通型レセプターFlamingo(Fmi)が、PCPの形成に必要であることを発見していた。興味深いことに、Fmiはwing hair形成に先行して、一過的に細胞の遠近軸方向の境界(PD境界)に偏って存在する。先に紹介したFzやDshの機能が失われると、FmiはPD境界へ偏ることなく細胞境界全域に均一に分布するようになる。そこで、Fmiの分布を偏らせる分子機構をより詳細に解析するために、内在のDshの分布を抗体染色によって調べた。その結果、Dshも細胞境界においてFmiと共局在し、細胞のPD境界に偏って存在することが明らかになった。さらに、両者の非対称な分布は相互依存的であること、いずれもFzの制御下にあることがわかった。また、DshのPD境界への分布とDshの高リン酸化型と考えられるバンドの出現には相関関係があった。以上の結果から、未知のPCPリガンドを受け取った細胞の、PD境界でのみDshとFmiのコンプレックスが安定化され、その結果、細胞の遠位端でアクチン骨格の再編成が引き起こされwing hairが形成されるらしい。多くの器官形成において、上皮細胞は頂部-基部軸に沿った極性を発達させるだけでなく、その軸とは直交する上皮平面内の第二の軸(planar axis)に沿った「平面内細胞極性(planar polarity)」を獲得する。平面内極性の典型例として、脊椎動物内耳の有毛細胞が作る繊毛の配向パターンや、昆虫の翅表皮細胞の遠近軸に従った翅毛形成が挙げられる。頂部-基部極性に比べ、平面内極性の分子機構に関する研究は大きく立ち遅れている。平面内極性の乱れたショウジョウバエの突然変異体が分離され、複数の原因遺伝子がクローニングされているが、それらの遺伝子産物が働く細胞内コンパートメントに関する情報はほとんどない。この点において、われわれの7回膜貫通型カドヘリンFlamingo(Fmi)の研究が、ブレークスルーを生みだした。興味深いことに、Fmiは翅毛形成に先行して、表皮細胞の遠近両側の細胞境界に濃縮する。しかもFmiのこのような偏った細胞内分布が、正常な細胞極性化に必要であることを示した。平面内細胞極性(planar cell polarity,PCP)とは、上皮細胞において、頂部-基部に直交する平面上に発達する極性を指す。

WntファミリーのレセプターFrizzled(Fz)と細胞質因子Dishevelled(Dsh)は、PCPシグナル経路の上流に位置することが知られていた。我々はすでに、カドヘリンスーパーファミリーに属する7回膜貫通型レセプターFlamingo(Fmi)が、PCPの形成に必要であることを発見していた。興味深いことに、Fmiはwing hair形成に先行して、一過的に細胞の遠近軸方向の境界(PD境界)に偏って存在する。先に紹介したFzやDshの機能が失われると、FmiはPD境界へ偏ることなく細胞境界全域に均一に分布するようになる。そこで、Fmiの分布を偏らせる分子機構をより詳細に解析するために、内在のDshの分布を抗体染色によって調べた。その結果、Dshも細胞境界においてFmiと共局在し、細胞のPD境界に偏って存在することが明らかになった。さらに、両者の非対称な分布は相互依存的であること、いずれもFzの制御下にあることがわかった。また、DshのPD境界への分布とDshの高リン酸化型と考えられるバンドの出現には相関関係があった。以上の結果から、未知のPCPリガンドを受け取った細胞の、PD境界でのみDshとFmiのコンプレックスが安定化され、その結果、細胞の遠位端でアクチン骨格の再編成が引き起こされwing hairが形成されるらしい。
線条体コリン作動性介在ニューロン及び投射ニューロンに対するドーパミンの作用

本年度の研究の目的は、(1)ラット線条体スライス実験によりコリン作動性ニューロンに対するドーパミンの作用を調べる、(2)直接路、間接路の中型有棘細胞をそれぞれ同定し、ドーパミンに対する作用を調べ、両者に生理学的性質に差があるかについて調べることであった。このうち実現できたのは(1)のみである。従来、ドーパミンとアセチルコリンはパーキンソン病患者などの臨床的な観察から拮抗関係にあることが想定されていたが、ここ数年のmicrodialysisを用いた詳細な研究の結果、ドーパミンは逆にアセチルコリンの放出を増すらしいことが次第に明らかになってきた。その機序のひとつとしてコリン作動性ニューロンのもつD5受容体を直接介する機序が考えられる。本研究において、ラット線条体スライス標本を用いた生理学的実験により、事実ドーパミンはコリン作動性ニューロンの殆ど全てを興奮させること、その機序はドーパミンが直接D5受容体を活性化し、アデニレートサイクレース系を活性化することにより、Kコンダクタンスの抑制と非特異的陽イオンコンダクタンスの開口を引き起こすこと、これによりコリン作動性ニューロンの脱分極を引き起こすことが明かとなった。D5受容体の活性化はコリン作動性ニューロンにおいて見られる興奮性後シナプス電位のうち、NMDA成分を増強することが知られており、またコリン作動性ニューロンの浅い静止膜電位は1、2個の興奮性後シナプス電位で十分発火の閾値に達することが知られていることから、ドーパミンによるD5受容体の活性化による膜の脱分極は結果的に皮質や視床からの入力による発火の閾値を押し下げることになり、microdialysisで観察されたアセチルコリン放出の促進をひき起こす結果となるものと考えられる。
沖縄諸島における熱帯植物を利用した持続的農業生産の確立

2009年度の研究目的、成果及び意義について具体的に示す。琉球大学においては過去20年間、熱帯植物中のアレロパシー物質の研究がおこなわれてきており、特にギンネム中のミモシンやゲットウ中のカワインなどが同定され、各種合成出発物質や化粧品の原材料などとして商品実用化が図られてきた。Khanh博士は既にいくつかのアレロパシー活性の高い熱帯植物を韓国の博士課程在学中に選抜していたので、これらの成分を核磁気共鳴法やマススペクトル解析により構造式を決定し、化学構造と活性の相関を調査することにした。ベトナム出身であるKhanh博士は熱帯植物中の生理活性物質と、特にイネの雑草防除に興味を持っており、群落を形成する植物はアレロパシー物質を含み他の雑草を制御できる可能性があることからイネの雑草防除に関する研究を行ってきた。現在までに数百の植物の中から、最も強い除草活性および抗菌活性をもつ種類をいくつか選択した。また、イネそのものに含まれる植物生長抑制物質を単離、同定し、抗菌活性を示すことも明らかにした。沖縄にも多くの群落を形成する植物や海外からの侵入植物が繁殖している。これらの植物中の生理活性物質を同定し、持続可能な農業生産を目的とする雑草、病害虫防除システムの構築を試みた。世界中の温暖な地域にはタチアワユキセンダングサが生育しているが非常に厄介な雑草である。国際誌のAllelopathy Journalにこの雑草の有用性に関する論文を掲載させた。また、Journal of Plant Interactionにイヌビエに関する論文を投稿した。イヌビエは世界で最も有害な雑草の一つであり、多くの作物に多大な被害をもたらす。イヌビエで茂った水田土壌からの水抽出物は、農作物や水田雑草の生長に対して植物毒性を示した。農作物のうち、イネの生長に対する植物毒性は最も高い抑制力を示すことを明らかにした。分取用カラムを使用し、イネビエが生育する土壌中に存在する植物毒性と潜在的に関係ありそうな18種類の化合物を同定した。この結果はWeed Biology and Managementに投稿され、2010年度の日本雑草学会において最高論文賞が授与された。Journal of Agricultural and Food Chemistryには雑草のチガヤとサツマイモの関係を論じた論文が掲載されている。沖縄は我が国唯一の亜熱帯地域に属し、東南アジアと環境が同じであることから、今後は日本の優れた農業生産システムの技術移転を検討し、Khanh博士がベトナムでの農業生産物の拡大に貢献することが期待される。20年度に行った実験は(1)ヒエの土壌中に含有されるアレロケミカルの同定、作物及び雑草に及ぼす影響を検討し、(2)ベトナム産イネがヒエの生長を抑制する品種間の差異、及び(3)沖縄に広く繁殖しているキク科一種であるWedelia trilobataの除草活性、抗酸化活性、及び成分の同定を行った。ヒエが生育した水田土壌中の抽出物からterpenes,cinnamic acid,ferulic acid,long chainfatty acid等の18化合物が同定され、イネ及び他の水田雑草に強い抑制を示した。ヒエが強いアレロパシー能を示し、イネと他の水田雑草の生長に対して競合していることが認められた。次にベトナム産のイネ73品種を選択し、室内実験、温室内実験及び畑実験において、ヒエの生長に及ぼす影響を検討した。イネの抑制力はハイブリド>地元イネ>伝統モチコメ>伝統陸稲モチコメ>地元陸稲の順であった。W.trilobataの場合は0.5-0.16mg/ml濃度で検定した植物の生長を著しく抑え、W.trilobata土壌中の抽出液が大根の生長を70-90%抑制した。また、葉の抗酸化活性は茎及び根茎より最も強かった。ガスクロマトグラフィ-MSを用いて、多くのフェノール酸、coumarin,及びlong chain fatty acid及びそれらの類似化合物が同定された。

イヌビエは世界で最も有害な雑草の一つであり、多くの作物に多大な被害をもたらす。イヌビエで茂った水田土壌からの水抽出物は、農作物や水田雑草の生長に対して植物毒性を示した。農作物のうち、イネの生長に対する植物毒性は最も高い抑制力を示すことを明らかにした。分取用カラムを使用し、イネビエが生育する土壌中に存在する植物毒性と潜在的に関係ありそうな18種類の化合物を同定した。この結果はWeed Biology and Managementに投稿され、2010年度の日本雑草学会において最高論文賞が授与された。Journal of Agricultural and Food Chemistryには雑草のチガヤとサツマイモの関係を論じた論文が掲載されている。沖縄は我が国唯一の亜熱帯地域に属し、東南アジアと環境が同じであることから、今後は日本の優れた農業生産システムの技術移転を検討し、Khanh博士がベトナムでの農業生産物の拡大に貢献することが期待される。
腫瘍循環に関するProstaglandin F2αの基礎的・臨床的研究

プロスタグランジン(PG)【F_2】αの選択的腫瘍血流減少反応を、ラット肝癌を用いて実験的に確認し、この機構の解明を試みた。ラットは、日本ラット社ウィスター、週令28週を25匹用いた。この中の12匹はコントロールとして、また13匹は発癌剤として【3! ́】-Me-DABを14週投与し、肝癌を作成し使用した。組織血流の測定は、電解式水素クリアランス法を用いた。薬剤は、左頚動脈からカテーテルを腹腔動脈に挿入して投与した。麻酔はウレタンを使用、呼吸は人工呼吸器にて管理した。正常肝組織の血流は、コントロール値103.1±32.9ml/min/100gであり、【PGF_2】の1μg/kg/minの投与にて96.1±32.1となり、両者間に統計学的に有意差を認めなかった。一方、肝癌組織の血流は、コントロール値が45.5±34.7,【PGF_2】α持続動注で22.0±15.0となり、腫瘍血流は有意に減少した。また、肝癌ラットにおける癌部と非癌部との比較においても同様の結果がえられた。次に、この【PGF_2】αの腫瘍血流減少反応とc-AMPとの関連をしらべた。肝癌組織血流のコントロール値が20.5±4.1,c-AMP2mg/kg/mlで持続動注すると19.8±3.8と変化がない。さらに、【PGF_2】αを投与すると19.1±3.8であった。c-AMPが【PGF_2】αの選択的腫瘍血流減少反応を阻止していることが明らかにされた。以上の結果より、【PGF_2】αの腫瘍血流減少反応は、細胞レベル、つまり腫瘍細胞と血管内皮細胞間におけるc-AMP,Cdイオンなどセカンドメッセンジャーを介した相互作用によって惹起されると推定された。これは、腫瘍血管が正常血管のもつ自動調節能を欠くために起こるのか、或いは腫瘍血管が自動調節機構をもつために起こるのかは、今回の実験では明らかにされなかったが、今後検討する必要がある。
天然物の生合成機構とその応用に関する研究

本研究は,さまざまな生物が作る多彩な天然有機化合物の代謝や生合成の機構を広い立場から追求し,生体が営むみごとな合成反応のしくみを解明するとともに,さらにその成果を踏まえた応用的展開をはかることを目指して行われた.そのために,有機化学と生物化学ならびにその境界領域にあって天然物化学の新展開に意欲的な研究者が協力して,以下の成果をあげた.1.イソプレノイドの代謝と生合成機構(1)ジャガイモのファイアレキシンであるリシチンの生合成経路を明らかにし,かつ,その生成を誘導する内因性因子が過酸化水素であることを見いだした.(2)長鎖プレニルトランスフェラーゼによる反応の絶対立体化学を決定するとともに,この酵素の機能発現に必須の因子を明らかにした.(3)プレニルトランスフェラーゼの基質特異性を調べ,不斉合成に応用できる酵素反応を見いだした.(4)細菌からはじめてスクワレン合成酵素を分離した.また,スクワレン生合成の動的中間体の存在を示す新酵素反応生成物を見いだした. (5)カイコ蛹卵巣からエクダイステロイド代謝物として,リン酸エステル誘導体を見いだした.2.海洋生物の代謝物の研究(1)海藻から生合成的に興味深い一連のプレニルフェノール類を分離した.(2)パリトキシンの生合成研究に必須な藻の単離と培養を行った. (3)ウミホタルからルシフェリン由来の色素とルシフェラーゼの複合体を分離した.3.生合成型有機反応とその応用(1)補酵素モデルを用いる高選択的還元反応を見いだした.(2)カイニン酸の生合型合成を行った.(3)ベイユノールの合成を行った.(4)酵母による還元でキラルシントンを合成した.その他,担子菌やスナネズミの代謝物についても構造決定を行った.また,生合成研究に有用な有機合成化学反応が開発された.本研究は,さまざまな生物が作る多彩な天然有機化合物の代謝や生合成の機構を広い立場から追求し,生体が営むみごとな合成反応のしくみを解明するとともに,さらにその成果を踏まえた応用的展開をはかることを目指して行われた.そのために,有機化学と生物化学ならびにその境界領域にあって天然物化学の新展開に意欲的な研究者が協力して,以下の成果をあげた.1.イソプレノイドの代謝と生合成機構(1)ジャガイモのファイアレキシンであるリシチンの生合成経路を明らかにし,かつ,その生成を誘導する内因性因子が過酸化水素であることを見いだした.(2)長鎖プレニルトランスフェラーゼによる反応の絶対立体化学を決定するとともに,この酵素の機能発現に必須の因子を明らかにした.(3)プレニルトランスフェラーゼの基質特異性を調べ,不斉合成に応用できる酵素反応を見いだした.(4)細菌からはじめてスクワレン合成酵素を分離した.また,スクワレン生合成の動的中間体の存在を示す新酵素反応生成物を見いだした. (5)カイコ蛹卵巣からエクダイステロイド代謝物として,リン酸エステル誘導体を見いだした.2.海洋生物の代謝物の研究(1)海藻から生合成的に興味深い一連のプレニルフェノール類を分離した.(2)パリトキシンの生合成研究に必須な藻の単離と培養を行った. (3)ウミホタルからルシフェリン由来の色素とルシフェラーゼの複合体を分離した.3.生合成型有機反応とその応用(1)補酵素モデルを用いる高選択的還元反応を見いだした.(2)カイニン酸の生合型合成を行った.(3)ベイユノールの合成を行った.(4)酵母による還元でキラルシントンを合成した.その他,担子菌やスナネズミの代謝物についても構造決定を行った.また,生合成研究に有用な有機合成化学反応が開発された.1.酵母を用いる還元反応で有用なキラルシントンであるペンタン-1,3,5-トリオール誘導体を合成した。2.ファルネシルニリン酸合成酵素による人工基質の異常反応を見いだした。3.プレニルトランスフェラーゼ反応の立体過程を解析するための新手法を編みだし、細菌や高等植物由来の酵素に適用した。その結果、3つの異なる酵素につき反応の全立体化学が明らかになった。4.ヘキサプレニル二リン酸合成酵素の反応に必須なタンパク因子の性質を明らかにし、鎖延長酵素反応機構の理解を深めた。5.褐藻から【C_(19)】のジテルペンの単離、構造決定を行ない、この物質が生合成的にゲルマクラン骨格に由来することを示した。6.生合成研究のために必要となるパリトキシンの【^(13)C】-NMRスペクトルの解析を行った。7.発光魚の一種、P.natatusに【^(14)C】-ルシフェリンを投与し、それが発光器に取りこまれることを確認した。8.生合成的還元反応のモデルとして、NADまたはNADH関連化合物による新反応を見いだした。9.非対称セコオノセラン型トリテルペンの生合成型合成の研究のため、ファルネソール誘導体のドリマン型二環性骨格への閉環を検討した結果、水銀(【II】)トリフラートのジメチルアニリン錯体による反応で好結果を得た。また海綿の生理活性ジテルペンの合成研究を前進させた。10.黄色細菌、Flavobacterium菌からデヒドロスクワレン合成酵素をスクワレン合成酵素とは別の画分として分離することに初めて成功した。これはイソプレノイド生合成の基本にかかわる重要な知見である。

11.2-位を立体特異的に重水素で標識したイソペンテニル二リン酸の化学的および酵素的合成法を開発し、生合成機構研究に貢献した。12.芳香族カロチノイドを生産するカイメン中よりβ環の生合成的芳香環化に関連する代謝物を単離した。13.スナネズミのハーダー腺から得られる2,3-アルカンジオールの絶対構造を決定した。
心臓骨格筋形成術において広背筋の被覆法の相違が心機能に与える影響に関する検討

実験は広背筋の被覆法の相違によるCardiomyoplasty法の心補助効果の相違についてでありGroupを3つに分けて行なうこととした。プロトコールはGroup1は右側広背筋のみとし、Group2は左側広背筋のみ、Group3は両側広背筋とした。各グループの対象数は7匹とした。本年度中に行ない得たのはGroup3の4頭とGroup2の2頭であった。Group3では雑種成犬4頭を用いて全身麻酔下に急性実験として行なった。両側広背筋を神経血管茎を残して剥離し胸背神経が広背筋に入る場所の近くに双極の神経電極を挿入し第二肋骨を部分切除して胸腔内に挿入した。両側の広背筋を左側が下になるように心臓に被覆し心臓同期型骨格筋刺激装置(Telectronics社製Myostim)を用いて心臓に対して1:2となるように33Hzで刺激した。このうち1頭の左側広背筋が神経の損傷により収縮しなかったため除外したため3頭のデータであるが、刺激装置駆動時と非駆動時を比較すると心拍出量は16%増加、左室圧は18%の増加、肺動脈圧は64%の増加を示した。また、Group2ではGroup3と同様のプロトコールで心拍出量は6%、左室圧は3%、肺動脈圧は11%の増加であった。ここまでのデータでは対象数が少ないため統計処理ができないものの両側広背筋を用いたほうが心補助能がはるかに高い傾向を示している。今後数を増やしさらにGroup1を行い比較する予定である。
初期ソコト・カリフ国における知と暴力：ジハードと奴隷制を支える思想の研究

本研究では、19世紀初頭にジハードによって成立したソコト・カリフ国において、イスラーム知識人のウスマーン・ブン・フーディーを頂点とした支配層が、同国の成立につながった自らのジハードと、同国の政治・経済・社会を支えた奴隷制という2つの「暴力」を正当化するため、どのような先達の見解に依拠し、またそうした見解に基づき如何なる論理を構築したのかを明らかにする。これを通じ、西アフリカから西アジアへと広がるムスリムの歴史的な知の連関網の一部を解明すると同時に、そうした連関網を通じて受容された知が、イスラーム法を統治の軸としたソコト・カリフ国の「暴力」の理論化と合法化に如何に結びついていたのかを明らかにする本研究では、19世紀初頭にジハードによって成立したソコト・カリフ国において、イスラーム知識人のウスマーン・ブン・フーディーを頂点とした支配層が、同国の成立につながった自らのジハードと、同国の政治・経済・社会を支えた奴隷制という2つの「暴力」を正当化するため、どのような先達の見解に依拠し、またそうした見解に基づき如何なる論理を構築したのかを明らかにする。これを通じ、西アフリカから西アジアへと広がるムスリムの歴史的な知の連関網の一部を解明すると同時に、そうした連関網を通じて受容された知が、イスラーム法を統治の軸としたソコト・カリフ国の「暴力」の理論化と合法化に如何に結びついていたのかを明らかにする
熱電変換型水素濃淡電池用電極触媒の乾式拡散法による調製

負電極触媒上で2-プロパノール脱水素、正極触媒上でアセトン水素化を進行させ、高分子電解質膜の両側に生じさせた水素濃度差から電力を得る熱電変換システムは、沸騰加熱下高いスピルオーバー能を示す炭素担持脱水素触媒がその開発の鍵を握っている。トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム錯体を高表面積活性炭から窒素流通下170°C1h磁気撹拌して得た拡散法調製金属パラジウムは、径のよく揃ったナノサイズ粒子が炭素顆粒上に一様に分散していて、2-プロパノール脱水素活性も水素スピルオーバー能も優れたものであったが、触媒金属種はパラジウム単独ではなくそれにルテニウムを複合させると脱水素活性もスピルオーバー能もさらに向上することを見出したので、乾式拡散法による金属パラジウム微粒子へのルテニウムの複合化について詳しく検討した。あらかじめ炭素顆粒上に一様に分散させたナノサイズパラジウム粒子を水素雰囲気下、トリルテニウムドデカカルボニル錯体とともに加熱撹拌し、配位子脱離を伴う分解と面心立方品パラジウムへのルテニウムの固溶合金化させると、2-プロパノール脱水素活性ならびに水素スピルオーバー能の顕著な向上が認められた。分子性金属錯体の乾式拡散法による複合化調製処理はこれ迄いくつかのバイメタリック触媒に対して試みられ、粒子レベルでの成分組成を制御することに成功してきたが、Pt-Ru系も新たに一例として加えることができた。2-プロパノール/アセトン系ばかりでなく水素/アセトン系についても燃料電池としての機能特性が電子総合技術研究所エネルギー部で解析され、それぞれ電流-電圧曲線が求められている。活性化分極が小さい利点と開路起電力のなお小さい欠点が確認されたところである。負電極触媒上で2-プロパノール脱水素、正電極触媒上でアセトン水素化を進行させ、高分子電解質膜の両側に生じさせた水素濃度差から電力を得る熱変換システムは、沸騰加熱下高いスピンドルオーバー能を示す炭素担持脱水素触媒がその開発の鍵を握っている.既往の含浸法により塩化パラジウム水溶液から調製した高表面積活性炭素担持の金属パラジウム触媒(5wt%)に比較し、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム錯体と担体炭素を170°C、窒素流通下1時間撹拌し、配位子脱離・原子団凝集させて得た乾式拡散法調製金属パラジウムは、径のよく揃ったナノ粒子が担体上に一様に分散していて、2-プロパノール脱水素活性も水素スピルオーバー能も優れていることがわかった。しかも金属パラジウム粒子とドデカカルボニルトリルテニウム錯体を乾式拡散処理すると、脱水素活性とスピルオーバー能がさらに向上し、電極触媒としての適格性が高いと結論された。最適複合比・処理条件を検討している.太陽熱、地熱、工場廃熱のような低品位熱で2-プロパノール液相脱水素反応を進行させると、生成するアセトンと水素は電極触媒上で高分子電解質膜を透過するプロトンおよび外部回路を通る電子の介在で燃料電池を構成するため、熱エネルギーを電気エネルギーに変換する新規の熱電変換システムが構築されることになる。2-プロパノール脱水素反応と水素/アセトン燃料電池を併発させる熱再生型燃料電池に加えて、直接炭素担体上へプロトンと電子を供給する水素スピルオーバー型金属触媒に2-プロパノールとアセトンが正負電極にそれぞれ液相供給され、前者の脱水素活性と水素スピルオーバー能で決まる水素濃度は触媒特性によって決まる速度論支配であって1気圧水素相当の濃度を凌駕する可能性があるうえ、水素化・脱水素反応の転化率が大きければそれだけ蒸留分離の熱負担を小さく抑えることができる。

アセトン水素化反応のギブスエネルギー変化をできる限り大きく設定するには、高い水素濃度(熱力学的活動度)を炭素担体上に実現しうる、優れた触媒を開発する必要があり、その目的に最もよく適合する触媒調製法がパイメタリック・ナノサイズ粒子を炭素担体上に一様に、粒径と組成を揃えて用意する乾式拡散法であることが本研究により明らかになったと言える。電気化学的測定は電子総合研究所エネルギー部で行われているが、電極触媒の開発がシステムの鍵を握っている。2-プロパノールからの水素スピルオーバーをいかに速やかに、水素ガス発生なしに進行させるかの課題にはなお検討の余地が残されているけれども、炭酸ガスを出さない燃料電池の構築は21世紀エネルギー問題にとって欠くことのできない技術的課題である。
マウスP19細胞およびES細胞を用いた心筋細胞分化の分子的機序の解析

研究者は、心筋再生治療の実現に貢献しうる当研究課題を推進するため、マウスP19細胞株を用いた以下の研究を行った。ホメオボックス遺伝子Csx/Nkx2-5は様々な心筋遺伝子の発現を制御し、心臓の発生に重要な転写因子である。ヒトにおいてCSX/NKX2-5の遺伝子変異が様々な先天性心疾患の原因となることが報告されたが、研究者は代表的なCSX/NKX2-5変異体が心筋細胞分化にどのような影響を及ぼすかを、心筋分化のモデル細胞であるP19CL6細胞を用いて検討した。野生型のCSX/NKX2-5を恒常的に過剰発現するP19CL6細胞株を単離し、ジメチルスルフォキシド(DMSO)処理によって分化誘導したところ、元来のP19CL6細胞よりも高率に心筋細胞に分化した。一方、変異体を過剰発現させたP19CL6細胞株では、心筋細胞への分化能が抑制され、心筋遺伝子であるMEF2CおよびMLC2vのmRNAの発現やANPプロモータの活性化は減弱した。一方、分化誘導したP19CL6細胞株に対して24時間の過酸化水素処理か2週間培養液を交換しないという処置によって細胞外からのストレスを付与したところ、変異体発現株では多くの細胞が死に至ったが、野生型発現株のみは大部分が生存した。またラット胎仔心筋細胞において、CSX/NKX2-5変異体を過剰発現させると大部分の細胞にアポトーシスが観察されたが、野生型を過剰発現する細胞では10%程度の細胞でしかアポトーシスが認められなかった。これらの結果から、CSX/NKX2-5変異体が実際の心筋細胞分化に抑制的に働くこと、また細胞死がCSX/NKX2-5変異体によって引き起こされる心発生異常のメカニズムに関与することが示唆された。以上の研究によって、Csx/Nkx2-5が心筋発生過程において心筋特異的遺伝子の発現調節だけでなく、ストレスからの細胞保護の役割も担うことが初めて示唆された。この研究成果は、Biochem Biophys Res Commun誌に発表された。
風水害で被災する樹木の流体力評価に関する研究

風水害で被災する樹木の抗力評価と倒壊や破断の機構について実験と現地調査から検討した。室内実験からは低風速時に葉の抗力分担は60%で程度であるが、強風時には枝と葉を加えた樹冠部の抗力が90%程度を分担することになり、倒壊や破断にいたる抗力には樹冠の抗力評価が重要であることを示した。強風で被災した河道内樹木の調査から倒壊は樹齢20年程度のものが多く、破断は樹齢に関係なく発生したことを示した。樹木の引き倒し試験を行い、倒壊モーメントを求め,樹齢と樹形構造の関係を示した。さらに,曲げ試験を実施して生木の曲げ耐力を調べ、モデル解析から倒壊と破断にいたる限界領域を示しその機構を明らかにした。近年,強風の発生や想定外の集中豪雨の発生がみられ,今後一層の樹木や森林,果樹等の被災増加が予想される。しかし,複雑な樹形構造を有する樹木の抗力評価は遅れており,倒伏時の樹木に作用する流体力の評価や対策は経験的な予測の域にある。本研究は強風下の樹木の倒壊や森林の被災及び洪水時に水没し倒伏や破断に至る樹木の抗力特性に関し,流体力を評価する現地実験と実験研究を行う。平成20年2月強風によって河道内樹林約800本が倒伏や破断の被害を受けた阿武隈川左支川,荒川における被災現地調査と倒伏や破断に至る機構解明のための樹木引き倒し現場試験を国土交通省と協力して実施した。被災樹木の65%は倒伏,35%が幹途中からの破断であった。通常,松は根の耐力が強く倒伏しないが,現地は砂防区間に近く,砂礫層上の樹林のために倒伏した松の根は直径30cm程度の礫を多く抱いており,直根のない状態であった。また,樹齢は70年から80年にピークを有し,樹高20m以上で,林冠から約6m程度高く,樹冠が風応力を直接受けた。引き倒し実験から倒伏モーメントは約120kNmと推定され,胸高直径における抗力は5kNと推定された。破断した松の降伏力を算定するために引き倒したものの木材曲げ試験を実施した。破断モーメントは直径14cm程度で26kNm,直径24cmでは130kNと幅広い値が得られ,太いものでは倒伏に比べて僅かに大きな値であった。破断は林冠内の幅広い樹木に生じており,根の耐力の高いものが破断したことを示した。本研究により,風応力による本樹林帯の被災時の流体力算定が可能になった。強風や想定外の暴風雨により被災する樹木や森林,果樹等の被害は増加傾向にある。しかし,複雑な樹形構造を有する樹木の抗力評価は遅れており,倒伏時の樹木に作用する流体力の評価と対策は経験的な予測の域にある。本研究は強風下の樹木の倒壊や破断や洪水時に水没し倒伏に至る樹木の抗力特性に関し,流体力を評価する現地実験と室内実験において研究を行った。(I)樹木抗力の評価法に関する実験的検討(長林,(研究協力)防衛大学林建二郎)樹木の抗力は樹幹と枝部,葉部で発生する抗力を合成したものである。ここでは一次枝を有する単一樹木の抗力評価に関する実験的検討を実施した。大型可変傾斜水路に分岐角度35°の一枝を有するY字型樹木模型を鉛直軸周りに30°刻みに回転させたときの透過率と抗力との関係を力計による抗力測定と透過率の相違による後流渦との関係を検討した。本研究の主要設備の小型CCD搭載のカメラモジュールXC-555と高速ビデオカメラによる高速度画像入力システムによる表面流況のPIV解析を行う。解析ソフトウエアは現有設備のPIV「Flow-vec32」(ライブラリ社)を用いて解析を行った。一次枝の向きが流向と同じ0°と180°では,単一円柱と同じ抗力係数であったが,回転角30°,180°は最小,90°では最大の抗力係数であり,抗力は後流渦の発達に依存することを見出した。(II)実樹木の抗力評価への応用(長林・(研究協力)国土交通省阿賀川河川事務所長)樹木の倒伏抗力を調べるための,20年度の阿武隈川に引き続いて,樹木引倒し試験を阿賀川において実施した。荒川では松とアカシア,ミズナラの樹種であったが,阿賀川は柳の高木とアカシアであり,高水敷近傍に育成した樹木であり荒川に比較して高い倒伏モーメントを示した。

近年、台風の来襲や想定外の集中豪雨による樹木や果樹、森林等の被災が多く報告される。しかし、複雑な樹形構造を有する樹木の流体力の評価や対策については経験的な予測の域にとどまっており、高レイノルズ数下における樹木の葉や幹等の各部の抗力と繁茂状態に応じた抗力を系統的に評価する手法は得られていない。本研究は風水害下の樹木の倒伏や破断に至る機構と抗力評価に関して、現地実験と模型実験を連携研究者の林とともに以下のように検討した。(I)樹木抗力の総合評価法に関する実験的検討(長林・林)(1)風応力下における単独樹木の抗力評価(林)単一樹木に作用する流速透過率を考慮に入れた樹木の抗力評価法の検討を進めた。業績:林建二郎(4人中1番目)「開水路中に水没設置された立方体および桟粗度の流体力」水工学論文集、第55巻、pp.S1141-S1146、2011.2.(2)樹冠の形状が抗力に及ぼす効果の検討(長林)広葉樹と針葉樹の代表樹種に対する空気流と水流ついての樹木抗力に関する実験的検討から種々の樹種に対応する樹木抗力の総合評価法について検討を実施した。(II)実樹木の抗力評価への応用(長林)樹木引倒し試験は20年度の阿武隈川における検討に引き続き、平成21年度は阿賀川においても実施した。引き倒し樹木の降伏力について室内実験を行い、これまでの風洞実験の成果をもとに、強風下で被災した樹木の倒伏と破断の条件を示した。さらに、現地データーを取りまとめ、育成環境と樹種の相違による倒伏力の算定及び破断に関する機構を検討した。業績:長林久夫(2人中2人目)「強風によって被災した樹木群の倒壊破断機構に関する検討」水工学論文集、第54巻、pp.1231-1236、2010.2.
脳梗塞後の血管透過性亢進における線溶系の機能の解明

本研究では脳梗塞誘導に誘導されるプラスミン(Pli)活性の役割をマウス脳定量傷害モデル及び脳由来培養血管内皮細胞系を用い検討した。脳梗塞に伴う血管透過性亢進領域サイズの経時的な縮小がPli遺伝子欠損により有意に減少、および傷害誘導4日目の血管透過性亢進部位でのPli活性の血管に沿った血管基底部側での分布を認め、Pli活性が血管基底部のリモデリングに寄与する可能性を示唆した。培養血管内皮細胞では、虚血を模した低酸素・低グルコース処理(6時間)によって血液脳関門の構成因子の発現量は減少するもののPliの添加影響しないことを明らかにし、Pliは血液脳関門の破たんには寄与しないことを明らかにした。脳梗塞後4日目の血管透過性領域において、プラスミン活性化に伴い組織修復に寄与するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)が寄与する可能性を検討した。その結果、野生型マウスでは、血管透過性亢進領域とさらにその外縁部領域でMMP活性の上昇を認めた。一方、線溶因子であるプラスミノゲンの遺伝子欠損マウスでは、血管透過性領域でのMMP活性の上昇が認められなかったものの、外縁部領域での活性は認められた。この結果より、血管透過性亢進に関連してMMP活性の上昇が誘導されること、さらにその上昇は透過性亢進領域ではプラスミンによる活性が起こるものの、その外縁部ではプラスミン非依存的なMMP活性亢進が誘導されることが明らかとなった。血管透過性亢進に伴うプラスミン活性化のメカニズム解明する目的で、プラスミノゲンアクチベーターであるtPA及びuPAの寄与を検討した。その結果、脳梗塞後4日目の傷害周囲の血管透過性亢進領域でのプラスミンの亢進はtPA遺伝子欠損マウスでも認められた。一方、uPA遺伝子欠損マウスでは活性の減弱が認められた。この結果より、血管透過性亢進に伴うプラスミン活性化はuPAにより誘導されることが示唆された。マウス脳由来血管内皮細胞株のbEnd.3の単層培養系における2槽培養系細胞膜抵抗による血管透過性の評価条件を検討した。培養開始時の播種細胞数、培養期間、および培養皿のコラーゲンコートの影響を検討した。その結果、1.0x10の6乗/wellで10日以上培養した場合、高い抵抗値が得られることを明らかにした。また、コラーゲンコートは抵抗値の上昇を誘導した。これらの結果より、実験条件を決定した。また、マウス脳由来の血管内皮細胞の初代培養の確立を試みた。現在、細胞を得る個体の週齢、細胞処理の条件、培養皿のコーティングの条件を検討し、約90%の純度の細胞の培養条件を確立した。免疫組織化学による血管透過性に関与する因子(occludin, claudin-5, alpha2beta1-integrin、VE-Cadherin)の発現の評価については、プラスミン活性化のメカニズムの検討を先行させたため、遅れている。特に、occludinについては免疫染色の条件の検討中である。脳梗塞に伴う血管透過性亢進領域の大きさを、脳定量障害モデルを用いてプラスミノゲン(Plg)遺伝子欠損(KO)マウスと対照WTマウスに誘導した脳梗塞において比較を行った。その結果、PlgKOマウスと対照野生型(WT)マウスとも1日目から4日目にかけて血管透過性亢進領域の縮小を認めた。また1日目では両マウスの血管透過性亢進領域の大きさに有意な差を認めなかったものの、4日目ではWTマウスに比べてKOマウスで血管透過性亢進領域が有意に大きいことを明らかにした。これらの結果より、プラスミノゲンが血管透過性亢進の回復に寄与する可能性が示唆された。一方、組織レベルのプラスミン活性の分布を詳細に検討した結果、血管透過性が亢進しているものの神経細胞が生存している領域において血管様のプラスミン活性の分布が認められたのに加えて、血管透過性が亢進している領域の周囲部において、血管透過性が亢進していないもののプラスミン活性が認められる血管用構造が確認できた。これらの結果も、血管透過性の回復後もしばらくはプラスミン活性が残存する可能性を示唆する。マウス脳由来血管内皮細胞株であるbEnd.3を用いた実験においては、血液脳関門の構成因子であるVE-CadherinおよびClaudin-5のタンパク量およびmRNA量が虚血を模した低酸素・低グルコース処理(6時間)によって減少すること、およびプラスミンの添加により変化しないことを明らかにした。これらの結果より、血管内皮細胞同士の接着に寄与するこれらのタンパク質は虚血の影響で減少するもののプラスミンの分解は受けないことを確認した。これまでの検討から、プラスミン活性が血管透過性の修復の前後に発現すること、およびその欠損で修復が遅延することが明らかとなり、プラスミンが脳梗塞に伴う血管透過性亢進の修復に寄与することが明らかとなった。また、プラスミンの活性化にはウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターが寄与することが明らかになるとともに、プラスミンの下流でマトリックスメタロプロテイナーゼが寄与する可能性が示唆された。これらの結果より、本研究の検討課題である、プラスミン活性の寄与の理由の解明、およびプラスミンの作用メカニズムの解明が順調に推移していると考える。

また、培養血管内皮細胞におけるプラスミンの基質の検討においては、VE-CadherinおよびClaudin-5の分解が起こらないことを明らかにし、プラスミンが血液脳関門の構成因子であるこれらのタンパク質の分解には寄与しないことを示した。これらの結果も、プラスミンが血液脳関門の破壊ではなく、その後の修復に寄与する可能性を示唆している。線溶因子のプラスミン(Pli)は細胞外プロテアーゼであり、同じく線溶因子のuPAあるいはtPAによりプラスミノゲン(Plg)より活性化され組織リモデリングに寄与する。我々は、脳梗塞誘導後4日目に傷害周囲部の血管透過性亢進領域でPliの活性が誘導されることを認め、その役割を脳定量傷害モデル及び脳由来培養血管内皮細胞系を用いた研究により検討した。脳梗塞に伴う血管透過性亢進領域の大きさをPlg遺伝子欠損(KO)マウスと対照野生型マウス(WT)で比較した結果、PlgKOマウス、PlgWTマウスとも傷害後1日から4日にかけて縮小を認めたものの、縮小の割合はKOマウスの方が有意に少ないことを認めた。また組織学的評価より、傷害誘導後4日目の血管透過性亢進部位においてPli活性が血管に沿って血管基底部側に分布することを認め、Pli活性が血管基底部のリモデリングに寄与する可能性を示唆した。さらに、このPli活性がtPAKOマウスでは正常に認められたもののuPAKOマウスでは消失したことから、PliはuPAに活性されることも明らかにした。さらにPliの下流で組織リモデリングに寄与するMMPの活性化はPlgKOマウスとPlgWTマウスで差がなかったことから、傷害4日後のPli活性はMMPを介さず機能していることを明らかにした。マウス脳由来血管内皮細胞であるbEnd.3を用いた検討において、血液脳関門の構成因子でVE-CadherinおよびClaudin-5のタンパク質量及びmRNA量が虚血を模した低酸素・低グルコース処理(6時間)によって減少するもののPliの添加によっては変化しないことを明らかにし、血液脳関門の破たんにはPliは寄与しないことを明らかにした。本研究では脳梗塞誘導に誘導されるプラスミン(Pli)活性の役割をマウス脳定量傷害モデル及び脳由来培養血管内皮細胞系を用い検討した。脳梗塞に伴う血管透過性亢進領域サイズの経時的な縮小がPli遺伝子欠損により有意に減少、および傷害誘導4日目の血管透過性亢進部位でのPli活性の血管に沿った血管基底部側での分布を認め、Pli活性が血管基底部のリモデリングに寄与する可能性を示唆した。培養血管内皮細胞では、虚血を模した低酸素・低グルコース処理(6時間)によって血液脳関門の構成因子の発現量は減少するもののPliの添加影響しないことを明らかにし、Pliは血液脳関門の破たんには寄与しないことを明らかにした。27年度の検討より、MMP活性にプラスミン依存性と非依存のメカニズムが存在することが示唆された。この結果は、血管透過性亢進領域で複数のMMPが関与する可能性を強く示唆している。このため、血管透過性亢進領域で発現するMMPの分子種とその分布をそれぞれqPCR法と免疫組織化学法により検討する実験を追加する。脳梗塞後の血管透過性亢進とその修復に関わる因子の発現プロファイルの検討を行う。傷害1,4,7日後の脳梗塞領域でのoccludin, claudin-5, alpha2beta1-integrin、VE-Cadherinの発現をqPCRにより検討する。さらに、その分布を免疫組織化学法により検討する。
脳小血管病におけるアクチン代謝異常のメカニズム解明と新規治療法の開発に向けた挑戦

CADASILは、血管壁細胞の変性などの血管病変と大脳白質障害を特徴とする遺伝性脳小血管病である。原因遺伝子が壁細胞特異的な細胞膜受容体NOTCH3に特定されて以来、多くの研究がなされてきたが、血管の形態・機能異常に至るメカニズムは依然として明らかになっていない。本研究では、我々はCADASIL患者の皮膚生検サンプルからiPS細胞を作成し、壁細胞に分化させて、その細胞機能を健常人iPS細胞由来の壁細胞と比較した。その結果、細胞の遊走・接着能に異常がみられることがわかり、病態メカニズムにアクチン代謝が関わっている可能性が示唆された。脳小血管病の特徴的病理所見として血管平滑筋細胞の変性・消失と血管反応性異常が挙げられ、血管平滑筋細胞の機能異常が病態機序に密接に関係していると考えられる。血管平滑筋細胞は非筋細胞に近い性質を有しており、フィラメント状のF-アクチンが大部分を占める心筋や骨格筋に比べ、アクチンの単量体であるG-アクチンが比較的多く存在している。血管平滑筋細胞では、血圧上昇に伴いG-アクチンが重合してF-アクチンが形成され、収縮能が増強される。本申請課題では、Notch3変異によるCADASILの病態機序として、1Notch3変異により下流のRasファミリーG蛋白質のRhoAシグナルに異常が起こり、2RhoAで制御されるアクチン代謝が障害されることで3平滑筋細胞の変性(細胞死)と血管反応性の障害に至り、4脳血流の低下および血管周囲排出経路による老廃物やNotch3細胞外ドメイン凝集物の排出の障害を経て5白質障害が起こるという仮説を立て、Notch3変異とアクチン代謝の関係の解明とアクチンをターゲットとした治療法の探索を行うことを目的とした。変異Notch3トランスジェニックマウスの大動脈、髄膜血管、腎血管などの血管でもF/Gアクチン比を測定した。すると、大動脈よりも細動脈などの小血管で野生型と変異型に有意差がみられることがわかった。これは、CADASILが脳小血管病であることと整合性があり、マウス大動脈由来平滑筋初代培養を使った実験では病態の変化を検出しにくい可能性がでてきた。そこで、マウスの脳から血管平滑筋初代培養細胞(CVSMC)を採取し、この細胞でNotch3変異がアクチン代謝におよぼす影響を調べた。同時に、CADASIL iPS細胞由来壁細胞でも再現性を評価した。結果は、予想通りNotch3変異を持つ壁細胞では細胞内actin代謝に異常が見られることがわかった。脳小血管病の特徴的病理所見の一つとして、血管平滑筋の変性・消失と血管の収縮拡張機能異常が挙げられる。血管平滑筋細胞の機能異常が、このような表現型を示す脳小血管病の病態メカニズムに密接に関係していると考えられる。血管平滑筋細胞は、単量体であるGーアクチンと、それが重合したフィラメント状のFーアクチンが、血圧変化に応じて重合または脱重合することで収縮能を変化させ、血流の調節を行っている。本申請課題では、NOTCH3変異による遺伝性脳小血管CADASILの病態メカニズムとして、NOTCH3シグナルの下流に位置するRhoAシグナルに異常が起こり、アクチン代謝が阻害されることで血管反応性の異常に至り、脳低灌流および白質障害が引き起こされるという仮説を検証した。CADASIL患者の繊維芽細胞から樹立したiPS細胞を、血管壁細胞に分化誘導してその機能と形態を正常型と比較したところ、アクチン代謝の異常と、それに伴い遊走・接着能に異常が見られることがわかった。また、NOTCH3トランスジェニックマウスの血管壁細胞のマイクロアレイ解析でも、アクチン代謝関係の遺伝子で顕著な差が見られた。これらの結果を基に、詳細なメカニズムの解明に取り組む予定である。平成26年度に予定していたアクチン代謝の評価を、マウス組織、マウス脳血管由来平滑筋初代培養およびiPS細胞由来壁細胞で行い予想通りの結果を得ることができた。細胞生物学平成26年度の結果を基に、アクチン代謝異常のメカニズムの解明および、治療薬候補の選定を行う。まず、アクチン代謝に関係していると報告されているRhoAシグナル経路の活性を正常型および変異型Notch3をもつマウス脳血管平滑筋細胞およびiPS細胞由来壁細胞で評価する。さらに、アクチン重合阻害剤であるLatrunculinやCytochalasin D、選択的ROCK (Rho- associated coiled-coil forming kinase)阻害薬の塩酸ファスジルなどにより、アクチン代謝異常およびその他の機能不全が改善されるかを検討する。評価項目:1F-/G-アクチン比とアクチンフィラメント立体構造2圧または伸展誘導性のアクチン再編成効率3血管病理(血管平滑筋変性、凝集物GOMの沈着、血管壁肥厚)の発症遅延・予防(in vivo)

4白質障害の有無(in vivo)平成26年度にDNA microarrayによる遺伝子発現解析を行う予定だったが、一度に委託する最低数の8サンプルのうち4サンプルしか得られていなかったため。平成27年度にサンプルが集まり次第、遺伝子発現解析を外部委託して行う。