hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連続フレーム映像の3次元画像化の研究

臨場感のある映像表現として両眼視差を用いた両眼視ステレオ表示法がある。この原理にもとずく表示装置の開発が活発に行われているが、それに供給するソフトウェアは3次元用に新たに作成する必要があった。両眼視差を用いる立体表示では、シーンの完全な3次元構造を正確に再構築する必要はなく、僅かに異なる視点から撮影された画像を作成すれば良いので、3次元構造認識と比べて処理が簡略化できる。本研究では通常のカメラを用いて撮影された連続映像フレームの情報から視差情報を推定する方法の開発を目的としている。本研究では、二つの異なるアプローチを用いて連続フレーム映像から3次元映像の合成を試みた。一つは、連続フレームを用いてオプチカルフローを求め、それから奥行きを推定して視差画像を合成する方法である。オプチカルフローは画像の時系列から特徴点のスクリーン上での移動量を推定する計算処理である。静止している物体空間をカメラが並行移動して撮影したとき、オプチカルフローの大きさは視点からの距離に反比例することになり、それによって画素に対して奥行きを付加することが可能となることを示し、実験システムを作製して明らかにした。もう一つは視点移動によって撮影された連続フレーム映像から、撮像空間のテクスチャ付ボリュームモデルを合成し、3次元モデルとするものである。この方法は単に3次元ディスプレイのための奥行き感付加ではなく、完全な3次元モデルを構築するための方法としても使えるものである。この方法では対象となる撮像空間は静止していることが条件になるが、手持ち撮影の映像から3次元モデルを復元する方法として有効であることを示すことができた。平成7年度の研究実績は(1)VTR映像の連続収集システムの構築,(2)連続映像から3次元モデルを再構築する基本方式の実装の2点に要約される.(1)に関してはワークステーションと追記型光ディスク装置を結合して毎秒30フレームの時間分解能でビデオ映像を収録できるシステムを開発し,以降の実験用データベースを構築することができた.(2)に関しては基本アルゴリズムとして(a)3次元ボリュームデータ形式で3次元構造を再構築する方式(佐藤,山本;“複数撮影画像からの3次元モデルの再構成とテクスチャマッピング技法",情報処理学会第51回全国大会)と(b)オプチカルフローを用いて層構造を認識し2.5次元的に立体構造を再構築する方式(浜田,山本;“連続ビデオ画像からの2.5次元的再構成",電子情報通信学会1996年総合大会)を提案し実装してそれらの特性を調べた.(a)の方式は3次元ボリューム空間で3次元モデルを再現するため,巨大な記憶空間と計算量を必要とするが,完全な3次元形状モデルを再構築できる利点がある.(b)の方式は2次元空間の処理であり,計算量も記憶容量も少ない反面,画像を奥行きの異なる数枚のプレーンとして3次元化するものであり,応用は立体視などに限定される事がわかった.臨場感のある映像表現として両眼視差を用いた両眼視ステレオ表示法がある。

静止している物体空間をカメラが並行移動して撮影したとき、オプチカルフローの大きさは視点からの距離に反比例することになり、それによって画素に対して奥行きを付加することが可能となることを示し、実験システムを作製してから明らかにした。もう一つは視点移動によって撮影された連続フレーム映像から、撮像空間のテクスチャ付ボリュームモデルを合成し、3次元モデルとするものである。この方法は単に3次元ディスプレイのための奥行き感付加ではなく、完全な3次元モデルを構築するための方法としても使えるものである。この方法では対象となる撮像空間は静止していることが条件になるが、手持ち撮影の映像から3次元モデルを復元する方法として有効であることを示すことができた。
神経回路における細胞種特異的な細胞内シグナル解析

ドーパミンはドーパミンD1受容体、三量体Gタンパク質Gαsを介してアデニル酸シクラーゼ、cAMP、PKA経路を活性化する。一方、ドーパミンD2受容体、三量体Gタンパク質Gαiを介してアデニル酸シクラーゼ、cAMP、PKA経路を不活性化する。平成27年度から平成28年度は脳側坐核におけるD1受容体発現中型有棘神経細胞(D1R-MSN)について細胞種特異的な細胞内シグナル解析を行い、快情動に伴いドーパミンが分泌された際、PKAが低分子量Gタンパク質Rap1の活性化因子GEFであるRasGRP2をリン酸化し活性化することで、Rap1、MAPKシグナルが活性化し、神経細胞の興奮性を促進することを見出し、これらの知見について論文報告(Nagai, Kuroda et al. Neuron, 2016)を行った。平成29年度から平成30年度は、PKAが低分子量Gタンパク質Rap1の不活性化因子GAPであるRap1GAPをリン酸化し不活性化することでRap1が活性化することに着目し、D2受容体発現中型有棘神経細胞(D2R-MSN)について、細胞種特異的にmVenus蛍光蛋白質を発現するDrd2-mVenus Tgマウスを用い、D2R-MSN細胞種特異的な細胞内シグナル解析を行った。D2R-MSNにおいては、アデノシンがアデノシンA2A受容体、Gasを介してアデニル酸シクラーゼを活性化し、ドーパミンがD2受容体、Gaiを介してアデニル酸シクラーゼを抑制している。D2受容体はドーパミンによって常時活性化されており、ドーパミンの分泌が低下し抑制が解除されることでD2R-MSNにおけるPKA、Rap1、MAPKシグナルが活性化することを見出した。これらの知見について論文報告(Zhang, Kuroda et al. Neurochem Int., 2019)を行った。MAPKK, PKA, Rap1, RhoAの野生型、恒常活性型、優性阻害型を細胞特異的に発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)を作製し精製した。ドーパミンD1受容体発現細胞特異的にCreを発現するDrd1a-Cre Tgマウス、ドーパミンD2受容体発現細胞特異的にCreを発現するDrd2-Cre Tgマウス、ドーパミン神経細胞特異的にCreを発現するTh-Cre Tgマウスを入手し繁殖した。ドーパミンD1受容体発現細胞特異的プロモータであるSubstance Pプロモータ、ドーパミンD2受容体発現細胞特異的プロモータであるEnkephalinプロモータ、投射型神経細胞特異的プロモータであるCaMK IIプロモータを組み込んだAAVを作製し精製した。上記を用いて、共同研究者の永井らとともにドーパミンの細胞内シグナル伝達経路を解明する研究を行った。ドーパミンD1受容体は三量体Gタンパク質Gαsを介してアデニル酸シクラーゼ、cAMP、PKA経路を活性化する。PKAがRap1の活性化因子(GEF)であるRasGRP2をリン酸化し活性化することでPKAの下流でRap1が活性化することを見出した。Rap1はB-Rafを介してMAPKK、MAPKを活性化することが知られている。PKA、Rap1、MAPKKの恒常活性型をD1陽性細胞特異的に発現させたところ、コカインによる条件付け場所指向性(CPP)試験が促進することが、逆にこれらを抑制したところ、CPPが抑制されることを見出した。また同じマウスの電気生理学的解析を行いPKA、Rap1、MAPKシグナルが神経細胞の興奮性を促進することを見出した。これらの知見について論文報告(Nagai et al. Neuron, 2016)した。入手や作製したツールを用いて神経回路における細胞種特異的な細胞内シグナル解析を行った結果、ドーパミンD1受容体発現細胞におけるドーパミンの細胞内シグナル伝達経路を解明し論文として報告することが出来た。当初は3年間で解析を行い報告する予定であったが、1年目のうちに報告まで到達することが出来た。平成27年に作製したRhoAの野生型や恒常活性型、RhoAを不活性化するp190RhoGAPを細胞特異的に発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)をドーパミンD1受容体発現細胞に発現させ、神経細胞の形態解析、コカインによる条件付け場所指向性試験(CPP)試験を行ったところ、形態が大きく変化し、CPP試験においても変化が認められた。RhoAはアクチン細胞骨格を制御することで細胞の形態を変化させる。そのため、CPPおける変化が、RhoAによる直接的な作用か、細胞形態変化を介した二次的な作用であるかを確認するためには、RhoAの活性をより素早く制御する必要が出てきた。そこで標的タンパク質を時期・部位特異的に発現させるpAAV-TetOne-Flexシステムを開発した。pAAV-TetOne-FlexシステムにRhoAを不活性化するC3トキシンを組み込んだAAV-TetOne-Flex-C3を作製した。C3トキシンを神経細胞に長期間発現させると細胞がアポトーシスを起こすことを、共同研究を行っている小林らと報告した。D1受容体発現細胞にC3トキシンを一時的に発現させ、CPP試験を行ったところ、大きな変化が認められた。また、RhoAはRho-kinase (ROCK1/2)の活性を制御していることが知られている。Rock1のコンディショナルノックアウトマウスを入手し、Rock2のコンディショナルノックアウトマウスの作製を開始した。

ドーパミンD2受容体発現細胞特異的にCreを発現するDrd2-Cre Tgマウスを平成27年に入手したが、このマウスは線条体側坐核以外にもCreを発現させる細胞が存在する。線条体・側坐核のドーパミンD2受容体発現細胞特異的にCreを発現するAdora2a-Cre Tgマウスを新たに入手し繁殖した。平成27年に研究が計画以上に進展したため、平成28年度は新たに標的タンパク質を時期・部位特異的に発現させるpAAV-TetOne-Flexシステムの開発に取り組むことが出来た。pAAV-TetOne-Flexシステムの開発は順調に進んでおり、さらなる成果が期待できる。ドーパミンはドーパミンD1受容体、三量体Gタンパク質Gαsを介してアデニル酸シクラーゼ、cAMP、PKA経路を活性化する。一方、ドーパミンD2受容体、三量体Gタンパク質Gαiを介してアデニル酸シクラーゼ、cAMP、PKA経路を不活性化する。平成27年度から平成28年度には脳側坐核におけるドーパミンD1受容体発現中型有棘神経細胞(D1R-MSN)について細胞種特異的な細胞内シグナル解析を行い、快情動に伴いドーパミンが分泌された際、PKA、Rap1、MAPKシグナルが神経細胞の興奮性を促進することを見出し、これらの知見について論文報告(Nagai et al. Neuron, 2016)を行っている。平成29年度は、ドーパミンD2受容体発現中型有棘神経細胞(D2R-MSN)について、細胞種特異的にmVenus蛍光蛋白質を発現するDrd2-mVenus Tgマウスを用い、D2R-MSN細胞種特異的な細胞内シグナル解析を完了した。D2R-MSNにおいてアデノシンがアデニル酸シクラーゼを活性化し、ドーパミンがアデニル酸シクラーゼを抑制しており、ドーパミンの分泌が低下し抑制が解除されることでD2R-MSNにおけるPKA、Rap1、MAPKシグナルが活性化することを見出し、現在論文投稿中である。RhoAはRhoキナーゼ(Rock1, Rock2)を介しアクチン細胞骨格を制御することで細胞の形態を変化させる。平成28年度に入手したRock1およびRock2のコンディショナルノックアウトマウスについて繁殖・交配を行い、Rock1, Rock2のダブルコンディショナルノックアウトマウスを作製し解析を開始した。Rhoキナーゼダブルコンディショナルノックアウトマウスを作製しており、神経細胞の細胞種特異的な形態制御に関する解析を行っている。
肝幹細胞における自己複製制御遺伝子群の探索と肝発癌への寄与の検討

本研究では、幹細胞の自己複製制御と深い関係にあると考えられる肝発癌過程の分子機構の解明を目的とし、肝幹細胞の自己複製に必須であるポリコーム群タンパク質Ring1Bの下流制御遺伝子群の同定を試みた。Ring1B欠損マウスを用いた遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降解析より、Ring1B下流標的としてCdkn2aを含む複数の遺伝子群を抽出した。肝幹細胞の増殖・分化においてCdkn2aの機能を検討したが、Ring1Bによる肝幹細胞の増殖・分化においては、Cdkn2a以外の分子が重要な役割を持つものと考えられた。本研究では、幹細胞形質の再獲得と深い関係にあると考えられる肝発癌過程の分子機構の解明を目的とし、我々の先行研究で肝幹細胞の自己複製に必須であることが明らかとなったポリコーム群タンパク質Bmi1/Ring1Bの下流制御遺伝子群の同定を試みた。はじめに、肝幹/前駆細胞においてRing1Bにより発現抑制を受けている遺伝子群を特定するため、Ring1Bコンディショナルノックアウトマウスを用い、肝幹/前駆細胞が高頻度に存在している肝臓器官形成初期(胎生10.5日目)からRing1Bの欠損を誘導し、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を行った。その結果、Ring1B欠損時に2倍以上の発現増加を示す遺伝子群を抽出した。さらに、ChIP解析を行い、抽出された遺伝子のうち、プロモーター領域でRing1Bが集積している遺伝子を絞り込んだ。抽出された340個の遺伝子の中には、Cdkn2aを含む複数の細胞増殖制御遺伝子が含まれていた。Cdkn2aが肝幹/前駆細胞においてRing1Bの下流遺伝子として機能するか否かを検討するため、Ring1BとCdkn2aの二重欠損マウスを作製し、肝臓器官形成に及ぼす影響を検討したが、二重欠損マウスにおける肝臓器官形成のレスキューは限定的であることが明らかとなった。従来、組織幹細胞の増殖制御に関わるポリコーム群タンパク質の主な下流標的は、Cdkn2aとされていたが、本研究より、肝幹/前駆細胞においてはCdkn2a以外の分子が重要な役割を持つものと考えられた。今後、Cdkn2a以外のRing1B下流標的分子を特定することにより、ポリコーム群タンパク質を介した肝発癌過程の全貌解明が期待される。本年度は、PcGタンパク質の中でも特に重要な機能を有するとされるRing1Bに着目し、肝幹細胞における下流制御遺伝子群の同定および機能解析を実施した。(1)肝幹細胞におけるポリコーム群タンパク質標的遺伝子を同定するため、PcGの構成因子の一つであるRing1Bの下流遺伝子の抽出を試みた。Ring1Bの欠損を誘導した胎生13.5日目のマウス肝臓、およびRing1B欠損を誘導していない胎生13.5日目のマウス肝臓よりCD45- Ter119-細胞を分離し、マイクロアレイ解析を実施した。Ring1B欠損時に脱抑制を受ける遺伝子として、約900遺伝子が抽出された。抽出された遺伝子を対象としたChIP解析を行い、プロモーター領域でRing1Bが集積している340遺伝子を同定した。抽出された遺伝子の中には、サイクリン依存性キナーゼインヒビターCdkn2aなど、細胞増殖制御遺伝子が含まれていた。(2)肝幹細胞の増殖・分化過程に関与するRing1B下流遺伝子を抽出するため、Ring1B欠損時に生じる肝幹/前駆細胞のクローン性コロニー形成阻害をキャンセル可能な遺伝子の検討を行った。しかしながら、Ring1BとCdkn2aの二重欠損を誘導した肝幹/前駆細胞では、Ring1B単独欠損群と比較して、レスキューの程度は低いことが明らかとなった。本年度の研究でPcG複合体の中心的な機能を担うと考えられるRing1Bの下流候補遺伝子の抽出を行い、下流候補となる340遺伝子を抽出した。また、肝幹細胞の増殖・分化プロセスにおいて、Riong1Bと下流候補遺伝子であるCdkn2aとの機能的関係の検討を行った。概ね予定通りに研究を進めることが出来た。本年度の研究で、肝幹細胞におけるRing1B下流候補遺伝子群を抽出し、下流候補遺伝子の一つであるCdkn2aについてRing1Bとの機能的関係性を検討したところ、Ring1Bを介した肝幹/前駆細胞の増殖プロセスではCdkn2a以外の分子の関与が考えられた。そこで、次年度において、Cdkn2a以外のRing1B下流候補遺伝子群を対象として、更なる機能解析を進める。肝幹細胞の分離・特性解析をすすめるため、フローサイトメトリー関連試薬や培養関連試薬の購入を予定している。また、分離した肝幹細胞の増殖・分化プロセスにおいてRing1B下流遺伝子の機能を明らかにするため、ウイルスベクターの構築に関連した試薬購入等を予定している。Ring1B下流遺伝子の発現制御時に生じる肝幹/前駆細胞の表現型を明らかにするため、遺伝子発現解析関連試薬類の購入を予定している。
拡散的に結合した非線形振動子の振動停止現象の解析と制御

遅延拡散結合された自励発振器の振動停止現象(delayed induced amplitude death)の検討を行い,停止現象が生じない十分条件を導出した.この条件は,発振器の平衡点でのヤコビ行列が,奇数個の正の実固有値(離散力学系の場合:1を超える奇数個の実固有値)を有するというものである,本研究では,任意の個数の発振器をリング状に結合した場合でも,この十分条件が有効であることを解析的に示した.この条件は,発振器の個数,結合強度,遅延時間,結合変数に依存していない.したがって,各発振器がこの十分条件を満足していれば,いかなる発振器の個数,結合強度,遅延時間,結合変数であっても,停止現象は発生しない.本研究では,十分条件を満足していない各発振器にフィードバック制御を施すことで,各発振器が十分条件を満足する方法を提案した.このフィードバック制御は簡単な手順で設計でき,複雑な計算を要しない.これら解析的な結果はすべて数値実験で検証し,その有効性を確認している.これらの研究成果をまとめ,国際ジャーナルに投稿し,現在査読中である.また,振動停止現象の過渡現象を調べるため,リング状に結合したカオス制御システムに生じる過渡的な振る舞いを調べた,過渡現象を3つのクラスに分け,超過渡現象が生じないクラスI,IIを実現する結合強度の条件を導出した.この成果は,国際会議(NOLTA'06)で口頭発表している.自動車のワイパーのびびり振動、メトロノームの時の刻み、旋盤におけるバイト・材料間の振動、心臓のペースメーカ細胞など、非線形システムの自励振動は我々の身の回りのいたるところに存在する。複数の非線形システムを結合したシステムに生じる複雑な現象の解析は、極めて重要な基盤研究の1つである。これらの振動子が拡散的に結合された場合、結合信号に遅延時間やダイナミクスが混入すると、それらの振動が停止してしまうかもしれない。最近、2個の2次元自励振動子を遅延素子で結合すると、両振動子の振動が停止する現象(Time Delay Induced Amplitude Death)が発見され、注目を集めている。研究代表者は、平成15,16年度若手(B)により、上記の振動停止現象が発生しない十分条件(奇数条件)の導出ならびに結合にダイナミクスが含まれても同様の現象が生じることを理論的に示している。この停止現象は、振動子の挙動を利用する立場から見ると、好ましいものではない。本研究では、この先行研究で得られた結果(奇数条件)に基づき、振動停止現象を回避する方法について考察した。その結果、離散時間振動子に対する制御器の構成ならびに設計手順を提案した。結合に遅延が含まれる場合、安定性解析は困難になるが、システム制御理論における遅延時間系の安定論に関する知見を活かし、制御器の系統的な設計を提案することができた。これらの理論的な成果を、コンピュータシミュレーションによる数値実験で検証し、有用であることを実証した。これら一連の研究成果を、国際会議(NOLTA'06)で発表した。遅延拡散結合された自励発振器の振動停止現象(delayed induced amplitude death)の検討を行い,停止現象が生じない十分条件を導出した.この条件は,発振器の平衡点でのヤコビ行列が,奇数個の正の実固有値(離散力学系の場合:1を超える奇数個の実固有値)を有するというものである,本研究では,任意の個数の発振器をリング状に結合した場合でも,この十分条件が有効であることを解析的に示した.この条件は,発振器の個数,結合強度,遅延時間,結合変数に依存していない.したがって,各発振器がこの十分条件を満足していれば,いかなる発振器の個数,結合強度,遅延時間,結合変数であっても,停止現象は発生しない.本研究では,十分条件を満足していない各発振器にフィードバック制御を施すことで,各発振器が十分条件を満足する方法を提案した.このフィードバック制御は簡単な手順で設計でき,複雑な計算を要しない.これら解析的な結果はすべて数値実験で検証し,その有効性を確認している.これらの研究成果をまとめ,国際ジャーナルに投稿し,現在査読中である.また,振動停止現象の過渡現象を調べるため,リング状に結合したカオス制御システムに生じる過渡的な振る舞いを調べた,過渡現象を3つのクラスに分け,超過渡現象が生じないクラスI,IIを実現する結合強度の条件を導出した.この成果は,国際会議(NOLTA'06)で口頭発表している.
神経変性疾患への適用を目指した神経新生を促進する低分子化合物の開発

本研究では神経新生を促進する低分子化合物をセルベース・スクリーニングにより同定し、その化合物の薬効を神経新生が低下しているダウン症モデルマウスを用いて検討した。同定した化合物は有意に神経幹細胞の増殖を促進し、脳発達期に神経幹細胞の増殖を是正することにより、大脳皮質形成および空間学習などの認知機能の改善を確認した。ダウン症候群などの神経発達障害やパーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患等は神経新生の低下や脳における特定の神経細胞群が徐々に死ぬことで、運動・知覚などの脳の高次機能に異常をきたす。本研究ではこれらの疾患群への適用をめざし、神経新生を促進する低分子化合物の探索を実施した。具体的にはマウス神経新生領域より単離した初代神経幹細胞を用いてオリジナルライブラリの中から神経幹細胞の増殖を促進する低分子化合物を探索した。評価はBrdUの取り込みを指標に用い、ハイコンテント画像解析システムによりスクリーニングを実施した。その結果複数の候補化合物の取得に成功した。取得した化合物の標的同定のため300キナーゼに対するパネルアッセイを実施した結果、候補となる標的の同定に成功した。さらにIC50を検討したところ、取得化合物群は標的に対してnMオーダーでの標的能を有していることを確認した。また候補化合物がATP競合的に作用することを確認した。並行して取得した候補化合物の薬理作用を検討するため、化合物の齧歯類における体内動態を検討した。その結果経口投与により脳組織にまで移行する有望な化合物の取得に成功した。この体内動態のよい取得化合物の薬理作用を疾患モデルにおいて検討した結果、ダウン症モデルマウスへの化合物投与により、低下している神経新生が候補化合物により相補されることを確認した。以上のことから有望な候補化合物の取得に成功した。H28年度には神経新生を促進する化合物の取得とその薬効確認をめざしていたが、複数の候補化合物の取得に成功した。疾患モデルとして神経新生が低下しているダウン症モデルマウスを選択し、候補化合物の薬理作用を検討した結果、有望な化合物の取得に成功した。本申請研究では、神経変性疾患への適用を目指した神経新生を促す新規化合物の開発を目的とする。パーキンソン病やアルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性軸索硬化症(ALS)などの疾患は、脳あるいは脊髄における特定の神経細胞群が徐々に死ぬことで、運動・知覚などの脳の高次機能に異常をきたす。このような神経変性疾患に対し、特定の低分子化合物により脳・脊髄内に存在する神経幹細胞の増殖を促して新しく神経細胞を産生し(以下、これを神経新生と称する)、新生した神経細胞に失われた脳の高次機能を代替させることができれば、新たな治療法へと繋がると期待される。本研究ではこれらの疾患群への適用をめざし、神経新生を促進する低分子化合物の探索を実施し、前年度までに血液脳関門を通過する体内動態のよい有望な候補化合物を取得した。当該年度には、化合物の作用機序解析を行った。具体的には、前年度に同定した標的キナーゼが細胞周期分子サイクリンD1をリン酸化することによりその分解を促進していることから、取得化合物が標的キナーゼの活性を抑制することにより、負の増殖制御を相補していることを確認した。さらに候補化合物が胎盤を通過することを確認し、ダウン症モデルマウスにおける薬効確認を実施した。神経新生が低下しているダウン症モデルマウス仔を妊娠している母マウスへ候補化合物を投与することにより、低下した認知・学習機能が改善されることを見出し、ダウン症の出生前治療の可能性を提示した。前年度までに取得した候補化合物の体内動態の検討、疾患モデルにおける薬効確認を行った。その結果、候補化合物は血液脳関門・胎盤を通過し、良好な体内動態を示すこと、疾患モデルにおける認知学習行動を改善することを見出した。このように取得化合物の疾患モデルにおける薬効評価に加え、その作用機序(MoA)を同定し、研究成果発表を行った。今後は取得化合物の効果的な適用探索のため、疾患モデルの探索、構築を行う。神経新生が低下しているダウン症モデルに加え、パーキンソン病などの神経脱落疾患などへの適用を模索する。有望な候補化合物が取得できたため、適用疾患を探索するため次年度にモデル系構築を実施するため(理由)有望な候補化合物が取得できたため、適用疾患を探索するため次年度にモデル系構築を実施するため(使用計画)疾患モデル系構築のための物品費,情報収集疾患モデル系構築のための物品費
ホウ素中性子補捉療法のヒト口腔扁平上皮癌への応用に関する研究

本研究では、当科で樹立している高悪性のヒト口腔扁平上皮癌株FI及びその担癌ヌードマウス実験モデルを用い、以下の研究成果を得た。(1)BSHまたはBPAを用いたBNCTは、in vitroでFI細胞に対し共に強い殺細胞効果を示した。特にBPAの効果はBSHの約1020倍だった。in vivoにおいて(2)BPA250mg/kg投与2時間後に、腫瘍内^<10>B濃度:16.0PPm、腫瘍組織と正常組織の濃度(T/N)比:4.2と共に最大値(ピーク)となった。一方BSH75mg/kg投与ではそれぞれ3-6ppm、T/N比:0.9-1.2で経時的に明らかなピークは認めなかった。(3)腫瘍中で最大濃度となる2時間後の各臓器濃度は、BPAでは、腫瘍(3.0)>舌(1.9)>顎下腺(1.6)>肺(1.5)>肝臓(1.4)の順に高かった(c.f.BSH:舌(2.3)>肺(1.7)>腫瘍(1.5)>顎骨(1.3)>顎下腺(1.3)>リンパ節(0.75))。(1)-(3)より、BNCTを口腔癌に適応する上では、腫瘍組織と周囲組織(舌、顎下腺、顎骨)中のT/N比の大きいBPAの方が有利と思われた。上記データを基に担癌ヌードマウスに対するBNCTによる治療実験を実施すると、BPA250mg/kg投与2時間後、70分照射群(平均中性子フルエンス:75xE12n/cm2)で、完全治癒が達成できた。しかし、他の条件下やBSH-BNCT群では完全治癒しなかった。γ線10-20Gy照射群では殆ど腫瘍の増殖抑制効果は見られなかった。(4)BPA-BNCT群ではまた、FI担癌マウスに見られるcachexiaやLeukocytosisなどの腫瘍随伴症候群の症状を改善した。即ちBPA25mg/kgまたはBSH0.75mg/kgの少量投与-照射群では、一旦縮小した腫瘍が再増殖する為、非処置群と各群の腫瘍体積に差がないにもかかわらず、マウスの体重減少及び白血球増多症(腫瘍単位体積当りの血中白血球数)は、BPA-BNCT群で改善した。(5)頭頸部進展例モデルの頬部担癌ヌードマウス実験においても、BSH-BNCT群は、非処置群と有意差がなかったが、BPA-BNCT群は腫瘍体積で約3週間、生存期間で約7週間延長できた。また、副作用としては、口内炎は特に明らかでなかったが、長期生存したマウスでは、治療後6ヵ月頃より、白内障が認められた。以上の結果より、頭頸部癌においてもBNCTは有効であることが示唆された。

また、副作用としては、口内炎は特に明らかでなかったが、長期生存したマウスでは、治療後6ヵ月頃より、白内障が認められた。以上の結果より、頭頸部癌においてもBNCTは有効であることが示唆された。【目的】ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、^<10>Bを腫瘍細胞に選択的に集積させ、熱中性子照射で、選択的な腫瘍破壊を起こす腫瘍選択的な治療法で、現在は脳腫瘍及び悪性黒色腫のみに行われている。そのため口腔癌への適応拡大を目指し、ヒト口腔扁平上皮癌に対するBNCTの有効性を検討した。【方法】(I)ヒト口腔扁平上皮癌FI細胞を2種類のBoron化合物、^<10>B-enriched Borocaptate(BSH)または^<10>B-enriched boronophenylalanin(BPA)で、2時間処理後に中性子線を15分間照射し、生残細胞の増殖能をコロニーアッセイ法で評価した。(II)担癌ヌードマウスにBSHまたほBPAを投与し、血中、腫瘍組織及び各臓器中のBSHまたはBPAの濃度を、即発γ線ホウ素濃度測定装置を用いて経時的に測定した。(III)担癌ヌードマウスにBSHまたはBPAを投与し、熱中性子を様々な条件で照射し、腫瘍の大きさを経時的に測定し比較した。【結果】(I)BSHまたはBPAを用いたBNCTは、in vitroでFI細胞に対し共に強い殺細胞効果を示した。特にBPAの効果はBSHの約1020倍だった。(II)in vivoでは腫瘍内の^<10>B濃度と腫瘍組織と正常組織の濃度比(T/N ratio)は、BPA250mg/kg投与2時間後に最大値各々16.0ppm、4.2倍となった。一方BSH75mg/kg投与時は共に3-6ppmでピークは認めなかった。腫瘍中で最大濃度となる2時間後の各臓器濃度は、BPAでは、腫瘍(3.0)>舌(1.9)>顎下腺(1.6)>肺(1.5)>肝臓(1.4)の順、BSHでは、舌(2.3)>肺(1.7)>腫瘍(1.5)>顎骨(1.3)>顎下腺(1.3)>リンパ節(0.75)の順に高濃度に取り込まれた。すなわち、BNCTを口腔癌に適応する上では、腫瘍組織と周囲組織(舌、顎下腺、顎骨)との^<10>B化合物のT/N ratioの大きいBPAの方が有利と思われた。(III)担癌ヌードマウスに対するBNCTの治療実験では、BPA250mg/kg投与2時間後、70分照射群で、完全治癒が達成できた。しかし、他の条件下やBSH投与群では完全治癒は見られなかった。一方、γ線10-20Gy照射群では殆ど腫瘍の増殖抑制効果は見られなかった。【総括】BNCTは、治療スケジュールを適正化することでヒト口腔扁平上皮癌に対しても完全治癒効果を発揮することが明らかになった。本年度は、当科で樹立している高悪性のヒト口腔扁平上皮癌株FIを用い、以下の項目について検討した。(1)in vitroにおいて、中性子線照射、ガンマ線照射、BNCTの生物学的効果を評価するためにコロニー形成法にて細胞生存曲線を求め、この曲線をもとにD_<10>、D_0を算出し、FI細胞における中性子の生物学的効果比(relative biological effectiveness : RBE)、およびBNCTの生物学的効果比(compound biological effectiveness : CBE)を算出した。(2)in vivoでは、下肢移植FI担癌ヌードマウスのに、通常投量より少ないBPA25mg/kgまたはBSHO.75mg/kgをip投与し、1時間、2時間、3時間後に中性子を照射し、腫瘍体積の変化、体重変化、白血球数の変化を経時的に観察し、本腫瘍に特徴的な腫瘍随伴症候群(cachexia, Leukocytosis)への影響を調べた。
圧負荷心筋の代償性肥大の破綻を引き起こすエピジェネティックな遺伝子発現調節の解明

圧負荷心筋において代償性心筋肥大から代償システム破たんにより拡張型心不全に至るメカニズムは未だ不明な点が多い。我々はマウス大動脈結さつ心筋圧負荷モデルにおいて心筋細胞が炎症を惹起しない低濃度のIL-産生を誘導しさらにそのIL-がIGF-1産生誘導を介して心筋細胞の恒常性の維持に関わり代償性心筋肥大を維持する機序を報告した(Honsho et al., Circ Res 2009 in press)。圧負荷心筋での代償性システム破たんによる拡張性心不全への移行において、遺伝子DNAやヒストンのメチル化やアセチル化などのエピジェネティックな修飾による心筋保護因子の遺伝子発現の変化が関わる事を証明し、又メチル化・アセチル化修飾の抑制により拡張型心不全への移行を防止する新たな治療法の開発を試みた。結果心不全の代償期から非代償期への移行に伴い、IGF-1遺伝子プロモーターのメチル化の進行が見られた。IL-1β/ICF-1遺伝子プロモーターの高メチル化を是正するため、DNAメチル転移酵素阻害薬(,5-azacytidine (azacitidine)や、5-aza-2'-deoxycytidine (decitabine)など)をマウスに投与したところ、IGF-1発現レベルが上昇し、心エコーにおける心機能・心拡大評価、組織学的検討による心筋肥大・心筋線維化の評価で拡張型心不全への移行が抑制されることを確認しえた。またIL-1β/IGF-1の発現が回復した。さらに、同遺伝子プロモーターのメチル化の軽減が見出された圧負荷心筋において代償性心筋肥大から代償システム破たんにより拡張型心不全に至るメカニズムは未だ不明な点が多い。さらに、同遺伝子プロモーターのメチル化の軽減が見出された今回申請の研究で、圧負荷心筋での代償性システム破たんによる拡張性心不全への移行において、遺伝子DNAやヒストンのメチル化やアセチル化などのエピジェネティックな修飾による心筋保護因子の遺伝子発現の変化が関わる事を証明し、又メチル化・アセチル化修飾の抑制により拡張型心不全への移行を防止する新たな治療法の開発を試みた。本年度は今回申請の研究で、圧負荷心筋での代償性システム破たんによる拡張性心不全への移行において、遺伝子DNAやヒストンのメチル化やアセチル化などのエピジェネティックな修飾による心筋保護因子の遺伝子発現の変化が関わる事を証明し、又メチル化・アセチル化修飾の抑制により拡張型心不全への移行を防止する新たな治療法の開発を試みた。本年度は、1.IL-1β/IGF-1遺伝子プロモーターの高メチル化を是正するため、DNAメチル転移酵素阻害薬(,5-azacytidine(azacitidine)や、5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)など)をマウスに投与したところ、心エコーにおける心機能・心拡大評価、組織学的検討による心筋肥大・心筋線維化の評価で拡張型心不全への移行が抑制されることを確認しえた。さらに、COBRA法によるIL-1β/IGF-1遺伝子プロモーターのメチル化の解析により、同遺伝子プロモーターのメチル化の軽減が見出された。II.培養心筋細胞にたいする細胞伸展刺激装置を用いた脈動的な進展刺激を与えた結果、IL-1β/IGF-1遺伝子の発現が伸展刺激開始後12時間でピークとなり、48時間でその発現は低下した。また、IL-1β/IGF-1遺伝子プロモーター領域のメチル化レベルが低下し、Dnmt1,3a,3b,BMD14,MeCP2などのメチル化関連遺伝子の発現上昇が見られた。III.圧負荷心筋において代償性心筋肥大期から拡張型心不全に移行する時に、IL-1/IGF-1以外にも向炎症性サイトカイン・細胞増殖因子・細胞増殖・細胞死に関わる遺伝子群のプロモーター領域のメチル化が顕著に変動することをDNAメチル化アレイ(MIAMI法)を用いて同定した。
戦時・占領期における繊維産業の講造と展開

二年間の綿糸紡績、綿織物、合成繊維、精練・染色、繊維機械などの各産業の実態ならびに聴取調査を通じて、試論的に小括すれば、1)われわれの研究対象の時期についていえば、戦前・戦時期以降、国民経済の基軸ないしは占領期における戦後日本経済再建の中心であった繊維産業の構成の内部で、天然繊維と合成繊維との交替が開始されていた点にまづ留意すべきであろう。2)鉄鋼業ないしは先端技術産業を基軸とする戦後日本資本主義下の繊維産業もまた当然に戦前とは異なる特質をもたざるをえない。それは「新合繊」とよばれる特殊な商品に、端的に具現化されていよう。「特殊な」という意味は、現時点では、それはポリエステル系繊維であり、かつ一過性をもつ商品であるからである。3)しかも、「新合繊」の紡糸工程から、精練・染色工程、あるいは織布工程に至るまで、まつり紡織機といった繊維機械自体も含め、先端技術に依存・制約されている。4)繊維産業の構成内部で、現在では決定的に合繊部門が優位にたつが、それは後発国の激しい追上げで斜陽化することはないのか、まさに来世紀にむけての究明が今後の課題ともなろう。一年間、四回の実態調査を通じて収集された諸資料の検討や研究組織内での討論・意見交換によって以下の点につき要約を試みたい。1)戦時戦後(特に占領期をも通じ)の繊維産業の再建過程の中で、巨大紡=東洋紡と「新々紡」=都築紡との再建・展開の対比を通じて、新しい生産力基盤をいかにして造出するか、特にME化の問題が構造改善事業とも絡み合いながら極めて至要な位置にある事が痛感された。2)この点は、村田・津田駒両繊維機械メ-カ-の実況・動態にも具現されているように電子制御が基本問題となっているのであって、この点は対欧米のみならず、対アジアについても重要な課題たり続けるだろう。3)これをうけ、かつ規制された形で、福井輸出織物地帯や「西陣(室町)」の配下にる丹後機業および桐生機業でも大きな変容を余儀なくされており、むしろ「総合商社」の下請・系列化の中での存続という緊要な事態にも通じている。「革新紡」に表現される原料糸生産の動向・展開との関連こそが至要命題たらざるをえないのである。4)かかる点はまだ、旧久留米機業の変型たる「ハン天」生産の場合も全く同様であって、電子制御化の進展の中で逆に「過剰生産」に当面せざるをえない現状もまた無視できない。以上の試論的要約に大過なしとすれば、今後の課題は如上の論点の深化ないしは、論証の追加が次年度以降での中心となろう。1)綿糸紡績業については、a)新々紡の系譜をひく都築紡績出雲工場の実態をみ、タオル用原糸たる太糸生産につき、有望な生産計画をもっていたのに対し、b)巨大紡を代表する東洋紡忠岡工場の実態は、和歌山ニット工業を背景としつつも、高級糸=コーマー糸でありながら厳しい実況にあり、近時の待機(あるいは工場閉鎖)の事実に注目したい。2)福井・小松に代表される北陸産地は、「新合繊」に極めて強い自信をもっており、合繊9社の雄、東レ三島工場の態様も安定的といえよう。留意すべき点は、1)現在の日本の高度なハイテク技術に支えられており、2)しかも合繊9社の自律的ともいうべき出荷調整によって、巧みに合繊糸の生産過剰=値崩れを未然に防ぎえており、Asia Niesからの追い上げをも防ぎえている現実である。3)問題の「合繊糸」の製造工程は、二百度を超す、しかも密閉された建屋の中で高湿の下という労働条件であり、ハイテク化に加え、合理的な生産方法が維持されていることが、東レ三島工場の調査から理解することが可能となった。
痛覚受容機構における体性神経と内臓神経の比較検討

体性神経と内臓神経の比較するため胃に分布する神経と脊髄硬膜に分布する神経の脊髄神経成分と交感または副交感神経成分を解析した。1.胃に分布する迷走神経節由来の感覚神経と脊髄後根神経節由来の感覚神経を、神経標識物質WGA-HRPまたはDilを注入し比較検討した。胃幽門部WGA-HRP注入により走神経下神経節、T8-12の脊髄神経節が標識された。標識細胞は下神経節に比べ脊髄神経節が大きかった。順行性標識では迷走神経、脊髄神経のいずれの神経終末も胃壁全層に分布していた。迷走神経は幽門線の基部に多く分布していたが、脊髄神経は粘膜固有層を貫いて表面にまで達していた。2.感覚伝達機構を知るために、胃に刺激を加え、延髄孤束核、脊髄でのFos蛋白の発現を調べた。胃の内腔に酢酸、ホルマリン等を投与したとき脊髄にはFos蛋白は発現しなかったが延髄には多くのfos蛋白が出た。腹腔内に酢酸を投与する延髄と脊髄後角にFos蛋白が発現した。またストレス潰瘍作製後、胃の内腔にホルマリンを投与すると、脊髄にFos蛋白が発現した。このことから後根神経節由来の感覚神経は、延髄とは異なり、胃内腔からの刺激に応じないが、ストレスや胃粘膜病変で応じてくる、いわゆるsilent fiberであることがわかった。3.体性器官である脊髄硬膜での求心性神経を調べた。下部髄硬膜(L5、6)では神経線維の分布は硬膜の神経根領域から直接はいる終末と硬膜を縦走する線維の二種類から成っている。この縦走する線維は腰椎で顕著であり、この線維は上部腰椎交感神経(L2-3)切除により消失した。この神経が上部腰椎に起始し、交感神経幹を経由し下部腰椎硬膜に分布していることを示している。一方頚髄硬膜では根領域からの神経分布が中心で、交感神経経由で頚椎硬膜に入る線維は少ない。これは頚髄硬膜の感覚入力が主に脊髄神経節経由していると考えられる。以上から痛覚入力には単に脊髄神経節へ入る感覚入力様式(体性神経性)と、迷走神経、交感神経(内臓神経性)を経由する感覚入力が存在している。またこの二つは痛覚入力に対し相互に大きな影響を与え、部位と器官によっても大きく異なっていることが明らかになった。痛覚の交感、副交感神経との関係は今後に残された課題である。近年、最早期遺伝子であるc-fosが侵害刺激及び非侵害刺激によって脳内に発現することが報告され、c-fosによって誘導されるfos蛋白の発現は、外部刺激によって賦活されたニューロンのマーカーとして用いられるようになった。

我々は内臓の侵害受容に関わっていると考えられているニューロンの性質を調べるため、胃にさまざまな刺激を加え、侵害受容ニューロンの投射領域と考えられている第9胸髄内でのc-fosの発現を調べた。胃の内腔に生食、エタノール、酢酸(0.1%,1%,10%)、グルコース(50%)、フォルマリン(10%)を投与したときには、第9胸髄にはほとんどfos蛋白は発現しなかった。しかし腹腔内に9%酢酸を投与すると、第9胸髄後角にfos蛋白が発現した。次に第9胸髄でのfos蛋白の発現に関与していると思われるニューロンの性質を調べるため、カプサイシンを投与したラットの胃の内腔にエタノールを投与すると、第9胸髄にもfos蛋白が発現した。カプサイシンは、ペプタイドを枯渇させることにより比較的選択的にc-fiberに障害を与え、侵害受容を抑制すると考えられている。また、急性胃粘膜病変が、胃の内腔からの侵害刺激に対しどの様な影響を与えるか調べるため、ラットに水浸拘束ストレスを与え、胃潰瘍を作製したうえで、胃の内腔にホルマリンを投与すると第9胸髄に、fos蛋白が発現した。以上の結果から、胃の内腔に分布する求心性神経は、通常内腔からの刺激には応じないが、ストレスや、胃粘膜病変があると内腔からの刺激に応じてくることがわかった。また、カプサイシン投与によっても内腔からの刺激に応じてくることがわかった。今後はストレスや、カプサイシン投与が体性求心性神経の侵害受容ニューロンの機能及び形態にどの様な修飾を与えるか調べる予定である。体性神経と内蔵神経を比較するために胃に分布する神経と脊髄硬膜に分布する神経のを解析した。胃に分布する迷走神経節由来の感覚神経と脊髄後根神経節由来の感覚神経を、神経標識物質Dilを注入し比較検討した。いずれの神経も神経終末が胃壁全層に分布していたが、各層内では若干その形態が異なっていた。内蔵痛の伝達機構を調べるために、胃に刺激を加え、延髄孤束核、脊髄でのfos蛋白の発現を調べた。胃の内腔に酢酸、ホルマリン等を投与したとき脊髄にはfos蛋白は発現しなかったが延髄には多くのfos蛋白が出た。腹腔内に酢酸を投与する延髄と脊髄後角にfos蛋白が発現した。またストレス潰瘍作製後、胃の内腔にホルマリンを投与すると、fos蛋白が発現した。このことから後根神経絵節由来の感覚神経は、延髄とは異なり、通常内腔からの刺激に応じないが、ストレスや胃粘膜病変があると応じてくることがわかった。これはfosを発現する胃に分布する求心性感覚線維はいわゆるsilent fiberとして機能しているものと考えられる。体性器官である脊髄硬膜での求心性神経をCGRPペプチド染色で調べた。下部腰髄硬膜(L5、6)では神経線維の分布は一部硬膜の神経根領域から直接はいる神経終末と硬膜の正中部を縦走する線維の二種類の神経が確認できた。特にこの正中部を縦走する線維は腰椎で顕著であり、この線維は上部腰椎交感神経切除(L2-3)で消失した。これはこの神経が上部腰椎に起始し、交感神経幹をけいゆし下部腰椎硬膜に分布していることを示している。一方頸髄硬膜では腰髄硬膜に比べ、根領域からの神経分布が中心で交感神経経由の縦走する線維は少ない、これは頸髄硬膜が分節性体性神経のより主に感覚入力を行っていると考えられる。現在までの知見から痛覚入力は単に分節性神経を経由するのみならず、部位と器官により大きく異なっていることがわかった。
ウンカ類の寄主選択機構に関与する植物成分の研究

一般に食植性昆虫は特定の植物群のみを選択的に寄主としており、この選択には植物に含まれる化学因子が重要な役割を果たしている。極めて近い種間においても寄主選択の幅が異なり、この昆虫類の寄主選択の化学的基盤を相互的に解析することは、昆虫類の農業害虫化への過程を追跡、あるいは害虫防除への新しい槻念の導入や新規素材を開発する上で重要と考えられる。そのモデルとして、日本のみならず、アジア各地において稲作に多大な被害を与える3種ウンカ(トビイロ、セジロ、ヒメトビ)の寄主選択機構の生物的、化学的解析を試みた。昨年度の研究(奨励A萌芽的研究)により、上記の3種ウンカが当該するイネ科栽培ビエを寄主植物とし得ない要因が、いずれも複数の化合物が合わさることにより活性を発現する"複合系"の摂食阻害物質によることを明かにしており、本年度の研究でさらに、シコクビエに含まれるトビイロウンカの摂食阻害活性が、新規化合物2種を含む9種のシコクビエに特異的な酸性化合物群により制御されていることを明かとし、その構造をもすべて明かとした。現在さらに他の栽培ビエに含まれる摂食阻害物質の単離に着手している。
硫酸酸性電解液中の酸化物被覆アノードの改質に関する基礎的研究

鉛-銀系合金アノードの特性に及ぼすタリウム合金化の効果を調べた。鉛-銀-タリウム3元系合金を硫酸溶液中で電流密度50mA/【cm^2】、温度40°Cで定電流アノード分極し、電位の時間変化、48時間分極後の電位の測定、アノード酸化物層表面のX線回折およびSEMによる形状観察を行った。また、タリウムの合金化による電解実操業でのアノード特性への影響を推定するために長時間分極時のスライム生成量の追跡を行った。試料の銀含有量は0,0.2,0.4,0.7wt%の4水準とし、タリウム含有量は1.3wt%までとして急冷および徐冷凝固によって組織の異なる試料を調製した。アノード電位に及ぼすタリウムの合金化の影響は小さく、急冷、徐冷凝固いずれの試料でも、Ag含有量0.2%ではTl0.30.6%でやや電位の低下がおこるが高い銀含有量の合金ではTlの合金化によって電位が高くなり、0.5%以上のTl含有量でほぼ一定の値に留まるという傾向がみられた。X線回折の結果から、Tlを合金化した試料では、β-Pb【O_2】がアノード皮膜の主要酸化物となるAg含有量がPb-Ag2成分系合金に比較して低くなり銀の効果が顕在化されることが示された。Pb-Tl-Ag3元系合金アノードでは低い銀含有量からアノード酸化物層が緻密な構造をとりはじめ、Tlの合金化による影響が明らかにみられた。これらはAgが共存してはじめておこる現象であり、Tlのみの鉛への添加ではみられなかった。Tlの合金化が最も顕著に影響を及ぼすのは長時間電解におけるスライム生成量に対してである。Pb-Ag2元系合金に比較してPb-Ag-Tl3元系合金ではアノード表面から剥離するアノード生成量が著しく抑制され、アノード表面へのPb【O_2】固着量が大きくなる。
新規ラットモデルを用いた糖尿病遺伝素因と病態発症・進展機構の解明

糖尿病の克服は重要な課題であるが、これまでの研究にもかかわらず個々人が保有する遺伝素因ならびに病態発症・進展機構については不明な点が多い。糖尿病などの多因子疾患の遺伝素因や病態発症・進展機構の解明には動物モデルを用いた解析が有力な手段となる。本研究は、研究代表者らが新規に確立した肥満・糖尿病モデルZuckerfatty diabetes mellitus(ZFDM)ラットを対象として、交配実験、SNPタイピングおよびエクソーム解析による疾患候補遺伝子の同定を行うとともに、病態発症の鍵となる膵島に着目してmRNAシーケンス解析とメタボローム解析による代謝障害の経時的変化の解明ならびにプロテオーム解析による異常修飾タンパク質の同定を行うことにより遺伝素因と病態発症・進展機構を明らかにすることを目的とする。平成30年度は以下の研究を行った。1) ZFDMラットとZFラットの交配実験:肥満・糖尿病モデルZFDM系統のオスfa/fa個体と肥満モデルZF系統のメスfa/+個体を交配してF1仔を作出し、次いでF1のオスfa/fa個体とF1のメスfa/+個体の交配によりF2仔を作出した。F2仔のうちオスfa/fa個体について60週齢まで体重と血糖値の測定および糖負荷試験により糖尿病関連の表現型データを取得中である。2)膵島のmRNAシーケンス解析とメタボローム解析による代謝障害の経時的変化の解明:随時血糖値が正常な8週齢および随時血糖値の上昇とともに耐糖能異常が顕在化する12週齢のZFDMラットおよび対照のZFラットから膵島を単離し、次世代シーケンサーを用いたmRNAシーケンス解析により遺伝子発現プロファイルを獲得した。主成分分析、判別分析、パスウェイ解析等により病態発症・進展に関与する候補遺伝子を特定中である。ほぼ計画通りに進行しているため。1)糖尿病遺伝素因の解明:既に作出したF2仔のうちオスfa/fa個体について60週齢まで体重と血糖値の測定および糖負荷試験により糖尿病関連の表現型データを取得する。F2仔の脾臓から抽出したゲノムDNAを用いてSNPタイピングにより全ゲノムに散在する3万個のSNPについての遺伝子型を取得し、上記で取得した表現型データとともにカイ自乗検定や量的形質遺伝子座(QTL)解析により糖尿病発症に関与するゲノム領域および疾患候補遺伝子を同定する。さらに、ZFDMラットとZFラットのエクソーム解析により疾患候補遺伝子におけるZFDMラットに特有の変異を同定する。2)膵島代謝障害の経時的変化の解明:すでに獲得した8週齢と12週齢のZFDMラットおよび対照のZFラットから単離した膵島の遺伝子発現プロファイルの解析から病態発症・進展に関与する候補遺伝子を抽出する。また、上記と同時期の膵島を用いたメタボローム解析により代謝プロファイルの経時的変化を明らかにするとともに病態発症・進展に関与する代謝物・代謝経路を特定する。さらに、上記候補遺伝子や代謝物・代謝経路について、膵β細胞株を用いてsiRNAによるノックダウン、CRISPR/Cas9システムによるノックアウト、活性化剤・阻害剤などによりインスリン分泌や細胞増殖・維持における機能的役割を検討する。3)膵島プロテオーム解析による異常修飾タンパク質の同定:ZFDMラットと対照のZFラットから単離した膵島を用いて、抗O-GlcNAc抗体を用いた免疫沈降によりO-GlcNAc修飾タンパク質を抽出し、質量分析計を用いたプロテオーム解析によりタンパク質を同定する。両系統間でO-GlcNAc修飾の相違が認められたタンパク質について、上記2)と同様に膵β細胞における機能的役割を検討する。

F2仔の脾臓から抽出したゲノムDNAを用いてSNPタイピングにより全ゲノムに散在する3万個のSNPについての遺伝子型を取得し、上記で取得した表現型データとともにカイ自乗検定や量的形質遺伝子座(QTL)解析により糖尿病発症に関与するゲノム領域および疾患候補遺伝子を同定する。さらに、ZFDMラットとZFラットのエクソーム解析により疾患候補遺伝子におけるZFDMラットに特有の変異を同定する。2)膵島代謝障害の経時的変化の解明:すでに獲得した8週齢と12週齢のZFDMラットおよび対照のZFラットから単離した膵島の遺伝子発現プロファイルの解析から病態発症・進展に関与する候補遺伝子を抽出する。また、上記と同時期の膵島を用いたメタボローム解析により代謝プロファイルの経時的変化を明らかにするとともに病態発症・進展に関与する代謝物・代謝経路を特定する。さらに、上記候補遺伝子や代謝物・代謝経路について、膵β細胞株を用いてsiRNAによるノックダウン、CRISPR/Cas9システムによるノックアウト、活性化剤・阻害剤などによりインスリン分泌や細胞増殖・維持における機能的役割を検討する。3)膵島プロテオーム解析による異常修飾タンパク質の同定:ZFDMラットと対照のZFラットから単離した膵島を用いて、抗O-GlcNAc抗体を用いた免疫沈降によりO-GlcNAc修飾タンパク質を抽出し、質量分析計を用いたプロテオーム解析によりタンパク質を同定する。両系統間でO-GlcNAc修飾の相違が認められたタンパク質について、上記2)と同様に膵β細胞における機能的役割を検討する。