hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「回復」と「抵抗」のポリティクス‐人工妊娠中絶「当事者」の語りから

・当該年度における研究においては、胎児の人間化の程度とありようを、出産を予定する妊娠の語りと比較し、中絶においてより強固な胎児の人間化がおきていることを明らかにした。日本における人工妊娠中絶の語りにおいて、女性に「決定」と「責任」の主体であることを求めるのは、人間化した胎児の概念である。「赤ちゃん」として表象される胎児に対し、自責と後悔、母性愛を中絶経験者が表明することは、出産の医療化の中で、世界的に胎児の人間化が進行していることと、日本における母性愛規範の強さから自明視されてきた。しかし、妊娠継続者との比較でみた時に、中絶において胎児を人間化して語ることは、中絶した女性が自身への批判を回避し、中絶後の生を肯定するエージェンシーの発露として見ることができる。しかし、同時に母性愛規範を前提にした語りによる自己肯定には一定の限界があり、罪責感と表裏一体のものであることが判明した。・こうした事情が日本の、母性愛を重視する文化的背景を反映していることを明らかにするため、同じ東アジアの儒教文化圏である中国における中絶について考察した本についての書評の中で、日本との比較をおこなった。一般的に、キリスト教圏との胎児への感覚の違いは指摘されていても、東アジアのなかでの比較先行研究は多くない。これにより、夫との関係や、事後の不妊への不安が強く表明される中国での中絶の語りと比べ、胎児への愛情や罪責感に焦点が当たる日本での語りの特徴が明らかになった。・今後の研究のデータとなる、人工妊娠中絶者、妊娠継続予定者、流産経験者へのインタビューをおこなった。同データについては、一部を論文中に使用し、残りは2011年度の使用を予定して、インタビュイーとの間でデータ使用についての調整をおこなっている。本年度は中絶体験において語られる責任の概念に注目して研究を行った。中絶に関する自己決定については、哲学的な議論、また中絶カウンセリングやケアの議論の中でもその重要性が語られてきた、しかし、中絶体験の語りや、カウンセリング、ケアに関する言説の中では、決定と同時に、その決定主体である女性が責任をとることが重要だと語られる。医療現場において、医療者がクライアントに決定をゆだね、自己責任を求めようとする傾向があることはすでに指摘されているが、中絶体験をした女性たちは、何故他に選択肢がなかった中絶の決定において、その責任を自らひきうけようとすそのか。責任のひきうけが、より中絶に関する自責の念を強め、中絶体験をトラウマ的なものにしていることを鑑みれば、これは検討に値する。以上の観点から、研究の理論的な背景として、U・ベックらの提唱するリスクの個人化論に注目し、文献レビューを行った。リスクの個人化論のなかで指摘されているのは、危険がリスクに変換されることで、社会的弱者に選択が押し付けられるということ、また、選択は個人の責任であるとされるために、他者や社会構造への帰責が難しくなるという個人化による統制である。中絶における女性の責任引き受けは、まさにこの事例にあてはまる。今後は、データの中から、選択-責任引き受けの論理にはまらないイレギュラーな事例を検討し、個人化の陥穽からの抜け道を探ることとする。また、そのための参考となりえるあらたな社会構造へのクレイム申し立て主体である当事者概念について、前年に引き続きまとめを行った。
早産児臨床的核黄疸において遺伝素因は危険因子となるか？

森之宮病院で収集した核黄疸症例20例と、コントロール症例76例の比較試験について、オプトアウト期間が終了したため、統計解析を行った。その結果、UGT1A1*6のアレル頻度について両群に有意な差を認めた。本研究の結果よりUGT1A1*6が、早産児における慢性ビリルビン脳症の危険因子であることが強く示唆された。本成果について、現在論文を投稿中である。2018年5月、カナダトロントにおいて開催されたPediatric Academic Society meeting 2018において、本研究のケース群のデータについて発表を行った。2019年4月、米国ボルチモアで開催されるPediatric Academic Society meetingでシンポジストとして招待されており、コントロール症例との比較データを含めた成果を発表する予定である。また、早産児の黄疸管理上、本遺伝子多型が重要であることを広く周知するため、現在AMED研究班が作成中の慢性ビリルビン脳症の予防、治療ガイドラインに、本研究の成果を収載する予定である。ビリルビンUDPーグルクロン酸転移酵素:UGT1A1遺伝子の変異による母乳性黄疸、新生児高ビリルビン血症、遺伝性非抱合型高ビリルビン血症の研究は、日本が世界に先駆けて解明し、中でも私たちのグループが牽引してきた。我々は母乳性黄疸の発症原因、診断を臨床的側面からと分子生化学的側面から解析し、さらに我々しかもたないモデルマウスを用い網羅的に疾患の病態、分子遺伝学的背景、分子生化学特性、診断方法および診断基準を明らかにできる。このような包括的な研究を行っているグループは国内外を含めても他にはない。今回の研究を開始した背景として、申請者らはUGT1A1の遺伝子多型と、新生児黄疸との関係について長年研究してきた結果、この多型が正期産児における新生児黄疸や母乳性黄疸の危険因子であることを明らかにしている(Maruo Y, Yanagi T,et al. J Pediatr. 2014)。現時点で20例の検体を収集し、現在解析を続行中である。本研究の基礎データとして、早産児における遷延性黄疸についてケースコントロール研究を行い、その成果を論文として発表した。(J Pediatr. 2017Nov;190:159-162.e1.)核黄疸症例についてサンプル収集を終了し、すべての遺伝子解析を終了した。サンプルの80%がUGT1A1*6のアレルを持ち、同アレルの遺伝子頻度は一般日本人の約3倍、という結果であった。UGT1A1*6が臨床的核黄疸の危険因子であることを強く示唆する結果である。神戸大学小児科で行った別研究での、コントロールデータと本研究のデータを合わせて統計解析を行うため、倫理委員会申請の上、現在オプトアウト期間を設定している。オプトアウト期間が終了した時点で統計解析を行い論文投稿する予定である。核黄疸症症例については、遺伝子解析を終了し、統計解析を待つ段階である。引き続き検体を収集し、遺伝子解析を進める予定である。検体収集と解析が予定ほどは進まなかったため。遺伝子解析に必要な物品が、予定より少なくですんだため。次年度に遺伝子解析を進めていく。
NMRスペクトルによる蛋白質の溶液内高次構造決定のための新しいストラテジー

昨年度終了した関連試験研究(60880022:"安定同位体ラベルアミノ酸の多量調製法の確立と応用技法の開発")が順調に達成された結果、ラベルアミノ酸類が潤沢に利用できたことが、本研究における新しい安定同位体利用NMR技術の開発の効率的進行を可能とした。蛋白質の溶液内高次構造のプローブとして着目した主鎖カルボニル炭素^<13>CーNMRシグナルは予想どおり多彩な有用性を持つことが明らかとなった。帰属の確定したカルボニル炭素を起点とする主鎖および側鎖シグナルの帰属手法についても検討し良い見通しが得られた。^<13>C、^<15>Nーシフト相関2次元NMR(HSBC)や或いは〔1,2ー^<13>C_2〕アミノ酸を利用するαー炭素シグナルの帰属手法などは今後の蛋白製NMR研究にとって必須の技術となる。これらの手法により新たに帰属の確定したシグナルをもとに、さらに高磁場NMR(600MHz級)装置上で^1Hー検出実験や安定同位体利用3次元NMRを利用すれ先、より高感度で位置特異的構造情報が得られる。これらの応用手法の開発こそ我々の方法論の発展として、今後特に推進すべき重要課題である。このように我々の研究は尨大なデータと新手法を産み出すとともに、今後の蛋白質NMRにおける研究方向を明確に示すことができた点にも大きな価値がある。本年3月に大磯において開催した国際研究集会("安定同位体利用NMR技術による生体物質の活静発現機構の解明")においても、多くの安定通位体利用NMR技術を用いた先端的研究が報告されたが、それらの幾つかは明らかにこのような路線を意識している。蛋白質構造化学の基盤としての本研究の意義を正当に評価し、その遂行に御助力頂いた審査員及び文部省担当官各位に敬意を持って感謝する。今後のNMRによる高分子量蛋白質の構造化学的研究においては、装置の超高磁場化などが必須の条件となるので、一層の御援助を期待したい。本研究の最終目標は、蛋白質の立体構造を直接に反映する主鎖ポリペプチドのカルボニル炭素【^(13)C】-NMRシグナルを用いて、溶液内高次構造(およびその動的変化)を研究・評価する新しい手法の確立にある。そこで本年度においては、我々が独自に開発した種々の安定同位体ラベル-NMR研究手法を駆使し、SSIのカルボニル炭素領域に生じる128本のシグナルを各アミノ酸残基別に分類し、かつ可及的多数のシグナルを一次構造上の特定部位に帰属することを重点的な目標として努力した。その結果、SSIサブユニットを構成する113残基の内アスパラギン酸(6)・アスパラギン(3)の計9残基の主鎖カルボニル炭素を除き、119本のシグナルをアミノ酸残基の種類別に分類することに成功した。さらに、それらの内かなりの部分の一義的帰属も行った。この結果、SSIは最も多くの帰属の確定したNMRシグナルを持つ高分子量蛋白質となった。このように、主鎖全域に渡る帰属の確定したNMRシグナルを利用して、従来は予想も出来なかった蛋白質の高次構造の微細な動的変化を、極めて詳細に知ることが可能となった。例えば、【^(71)Cys】-【Cys^(101)】のジスルフィド結合を還元切断することにより誘起される構造変化はサブユニットの約半分に相当するC-末端側のポリペプチド鎖に局限されること、【^(18)Lys】-【^(76)Asp】間の静電相互作用の果たすSSIの立体構造形成・維持に果たす重要な役割、また【^(106)His】の僅かな構造変化がSSIの特定部位におおきな影響を与えることなどが明らかとなった。これらは何れも従来のNMR研究手法では得難いものであるばかりではなく、蛋白質構造化学上極めて重要な知見でもある。次年度においては、より多くの残基のカルボニル炭素【^(13)C】-NMRシグナルの一義的帰属、およびカルボニル炭素の【^(13)C】-NMRの帰属の側鎖原子団への拡張を通じてこれらの諸点をより明確にしてゆきたい。本課題研究の初年度に購入したNMRスペクトロメーターは十二分にその偉力を発揮し、かって得られたことのない程の精確な立体構造情報を巨大蛋白質にもたらす新しいストララジーが徐々に具体化しつつある。このストララジーの中粒をなす、主鉛カルボニル炭末の【^(13)C】-NMRシグナルの個別的規則と一義的帰属は過去一ケ年間に急速に進展した。この大発展は関連した課題で同時進行しつつある試験研究、特定研究にささえられるところが多い。特に我々がDEALS法と名づけた蛋白質の動的ゆうぎ構造とアミド交換速度との関連を明らかにする研究方法は極めて重大な発見であり、その一部を既にBiochenistry誌上で明らかにし、またドイツ(86年9月)における生体系磁気共鳴の国際会議における招待講演、本会一月の京都における日米セミナーでの招待講演で詳述した。本法の詳細については、未だ多くの研究の余地があり、特にアミド交換速度の各部位の相関性(correlated exchange)について初めて明解な結論が得られるものと大いに期待している。

また、均一に【^(15)N】化したアミノ酸培地を利用して、各部位のペプチド結合のJCN(スピン結合定数)を精確に測定する方法を本年度において確立したので、JCNと二次講造との関連についても明解な結論が得られることと思われる。安定同位体ラベル法による蛋白質NMRの研究は我々の予想どおりに極めて重要な方法論となってきた.SSIの主鎖力ルボニル炭素の^<13>CーNMRシグナルの観測・帰属はほぼ完了に近づきつつありアスパラギン・アスパラギン酸残基について現在重点的に進めている.蓄積したカルボニル炭素シグナルの化学シフトやスピン結合定数(Jcn)と二次構造との関連についてもかなりの相関関係があきらかとなってきた.また, DEALS法と名付けた定常状態におけるアミド水素の交換速度の決定法を補完する,同位体シフトを利用する非定常状態におけるアミド水素の交換速度の決定法を新たに開発した.この手法によれば交換速度がDEALS法で一律に"遅い"と判断されるアミド水素のなかにもおおきな交換速度の差が存在していることが明らかとなる.SSIのサブユニット会含面を形成するβーシートの中でも極めて異なった速度でアミド水素の交換がおこっていることなど,蛋白質構造化学的に重要な結論を得ることができた.また,帰属の確定したカルボニル炭素シグナルのシフト変化をめやすとしてSSIの立体構造変化の誘起される部位を明らかにする手法の有効性が確かめられた.例えば, SSI内部に埋めこまれたMETー103のスルフォキシド化が立体選択的に起こり,かつSSI分子の広範な部分に構造変化が起こることがわかった.同様な実験はSSIとサブチリシンとの複合体形成に伴う構造変化の及ぶ範囲を調べるうえで有効な手法となった.このように,手鎖カルボニル炭素のNMRシグナルを利用する蛋白質の構造研究手法は予期以上の有効性を発揮している.さらに,カルボニル炭素シグナルの帰属を出発点として隣接する^<15>N,^<13>Cなどのシグナルを帰属する手法の開発も順調に進み,ウィスコンシン大学のマークレイ教授のグループとの共同で新しい二次元NMR法による情報抽出手法の開発にも成功した.昨年度終了した関連試験研究(60880022:"安定同位体ラベルアミノ酸の多量調製法の確立と応用技法の開発")が順調に達成された結果、ラベルアミノ酸類が潤沢に利用できたことが、本研究における新しい安定同位体利用NMR技術の開発の効率的進行を可能とした。蛋白質の溶液内高次構造のプローブとして着目した主鎖カルボニル炭素^<13>CーNMRシグナルは予想どおり多彩な有用性を持つことが明らかとなった。帰属の確定したカルボニル炭素を起点とする主鎖および側鎖シグナルの帰属手法についても検討し良い見通しが得られた。^<13>C、^<15>Nーシフト相関2次元NMR(HSBC)や或いは〔1,2ー^<13>C_2〕アミノ酸を利用するαー炭素シグナルの帰属手法などは今後の蛋白製NMR研究にとって必須の技術となる。これらの手法により新たに帰属の確定したシグナルをもとに、さらに高磁場NMR(600MHz級)装置上で^1Hー検出実験や安定同位体利用3次元NMRを利用すれ先、より高感度で位置特異的構造情報が得られる。これらの応用手法の開発こそ我々の方法論の発展として、今後特に推進すべき重要課題である。このように我々の研究は尨大なデータと新手法を産み出すとともに、今後の蛋白質NMRにおける研究方向を明確に示すことができた点にも大きな価値がある。
群上の算術関数を用いた群の構造の研究

群の構造を算術関数、即ち群G係数の単項式を用いて調べる上での基本理論の整備を行った。前年度から引き続いての結果であるが次に挙げる結果が得られた。(I)一般素数グラフの補グラフの連結性と群の構造の関係、特に可解グラフを用いて、どの様な2元が非可解部分群を生成するかを判定できること(II)Mを群G上の単項式全体としたとき、Mは群構造を持ち、Mの正規部分群N,Lの可換化とNL及びNとLの可換化が互いに密接に関係していることを移送写像を用いて記述できること(III)Mの群論的性質PについてのP-部分群全体のなす束が一般burnside環を用いるとその構造(特にG-加群構造について)等が明確に記述出来ることなどである。これらについての論文は現在準備中であり、近日中に学術誌に投稿発表する予定である。またこれらの結果により、群の単純性、正規部分群の分布等の群の性質を解析するための群上の算術関数論の基本理論の整備がほぼ完了したものと思われる。これらに関して次のような興味ある予想を立てることもできた:「可解グラフで連結してない任意の素数p,qについてp-要素xとq-要素yについてxとXのyによる共役、又はyとyのxによる共役でされる部分群の少なくとも一方は非可解である。」である。これは、「任意の2元で生成される部分群が可解であるならばもとの群は可解である」という定理をより強力にしたもので、群の単純性を判断する上で大変有用なものであり、今後の研究の重要な課題の一つである。今回の研究機関において得られた結果は次の通りである。1.素数グラフの一般化を行い、連結性、完全性等の基本性質を明らかにした。2.一般化された素数グラフを伝統的な群論の問題に応用し、その有用性、重要性を明らかにした。(これについての論文は投稿中ある。)3.一般化された素数グラフで、群の表現、特に(群の表現のみならず位相幾何で論じられている)Burnside ringと呼ばれる環の構造が記述できることを見いだした。より具体的にいうとBurnside ringの部分環やイデアルのうち性質のよいものは一般化された素数グラフに対応していることを明らかにした。(これについては現在論文を作成中である。)以上の様な結果は,群の上の関数論が表現論、構造論と密接に関係するので、群の関数論を進めていくうえで基本的な結果である。今年度は、以上のように本研究を遂行するための土台部分の研究が特に進んだ。もちろん研究課題である群の上の関数論において、その構造論の研究を進めたが、群論においての興味ある応用等を見いだせなく、論文の形態にはまとめていない。来年度は今年度の結果を基に、関数論による群構造の研究をおこない、群論への応用を考えたい。」である。
副甲状腺ホルモンとβカテニンの相互作用による骨形成調節機構の解明

19年度は、副甲状腺ホルモン(PTH)受容体C未側細胞内ドメインに結合する蛋白質としてβカテニンを同定し、細胞内にて結合していることも確認し、その結合部位も同定することが出来たことから、その結合によりPTHシグナルが影響を受けるかを、βカテニンの強制発現系およびSiRNAによる発現抑制を行い検討した。マウス腎臓由来293細胞に恒常活性型βカテニンを過剰発見すると、PTH刺激補の細胞内cAMP活性は抑制された。逆にsiRNA導入によりβカテニンを発現抑制すると、刺激後のcAMP活性は促進され、さらに細胞内Ca^<2+>濃度が著明に上昇した。また、βカテニンとPTH受容体C末端との結合にはE-カドヘリンが必要なことが明らかとなった。カドヘリンをSiRNAによる発現抑制すると、同様にPTHのシグナルはcAMP活性が優位に上昇し、Ca^<2+>の蓄積は見られかった。骨芽細胞にてPTH刺激後βカテニンを抑制させると骨芽細胞の分化マーカーであるオステオカルシンの発現が上昇し、骨芽細胞分化が亢進していることが明らかになった。E-カドヘリンを抑制しても同様な傾向が認められ、βカテニンとE-カドヘリンがPTH受容体にC末端に結合することが示され、その結果によりPTHのシグナルがcAMPを抑制するよう調節され、βカテニンの結合が外れることでPTHのcAMPへのシグナルが亢進し、骨芽細胞分化がより亢進することが明らかとなった。PTH受容体に結合する分子として、骨芽細胞分化に影響を及ぼす分子はこれまで同定されてなく、骨芽細胞において、βカテニンが有力なPTHシグナルの調節因子であることが明らかとなった。19年度は、主に酵母ツーハイブリッドシステムを用いて副甲状腺ホルモン(PTH)受容体C末側細胞内ドメインに結合する蛋白質を網羅的に探索し。すると新たな結合蛋白としてβカテニンを同定することが出来た。マウス腎臓由来293細胞にGFP標識したPTH受容体を強制発現させると、PTH受容体と内在性βカテニンが細胞内での共局在し(蛍光顕微鏡)かつ直接結合することを確認した(免疫沈降およびWestern blotにて)。この結合はPTH刺激により低下することも確認された。さらにPTH受容体の変異体導入との結合を検討すると、C末側582-585の4アミノ酸がβカテニンの結合に必須であることが明らかとなった。また、足場蛋白であるAxinおよびAPCもβカテニンと複合体を形成してPTH受容体の同部位に結合することが確認された。続いて、293細胞に恒常活性型βカテニンを過剰発現すると、PTH刺激後の細胞内cAMP活性は抑制された。逆にsiRNA導入によりβカテニンを発現抑制すると、刺激後のcAMP活性は促進され、細胞内Ca^<2+>濃度が上昇した。以上より、PTH受容体にC末端にβカテニンが結合することが示され、その結合によりPTHのシグナルが調節されていることが示唆された。
膜タンパク質の構造形成・機能発現における脂質・タンパク質相互作用の役割

膜タンパク質の機能場である生体膜の総合的な理解を目指し、バクテリオロドプシンを合成脂質膜へ再構成した試料を用いて、脂質膜の構造・物性がバクテリオロドプシンの構造形成・機能発現に及ぼす影響を、分光学的な方法を中心に用いて調べた。その結果、脂質膜の相挙動がタンパク質のいくつかの階層構造に大きく影響を与えること、機能発現上きわめて重要な中間体に大きく影響を及ぼすこと等を明らかにした。安定な可溶化が実現可能であることを以前の研究で明らかにした穏和な非イオン性界面活性剤TritonX-100を用いた、合成脂質膜リポソームへのバクテリオロドプシン(bR)再構成法を、いくつかの脂質組成からなる脂質膜リポソームを対象に検討した。その結果、界面活性剤の除去にバイオビーズを用いることにより、迅速なbR再構成が可能であることがわかった。本研究課題における研究項目の1つである、脂質組成の違いがbRの機能中問体の寿命におよぼす影響を調べるため、当初予定していた赤外領域の時間分解測定システムに加えて、新規導入した分光器と既存設備のレーザー等からなる可視領域のマイクロ秒過渡吸収測定システムを新たに構築した。この測定システムを用いて、dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC)からなる脂質膜リポソームに再構成したbRの機能中間体の寿命を、5°Cから35°Cの温度領域で調べたところ、天然紫膜に比べて、20°C以下のゲル相ではいくつかの中間体、特にM以降の中間体において減衰が遅くなることがわかった。一方25°C以上の液晶相では、天然紫膜に類似したタイムスケールの光サイクルを示した。また、異なる寿命を持つ2つの分子種が続いて生じるM中間体においては、より遅い分子種の吸収極大波長が、天然紫膜に比べて10nm以上の大きなブルーシフトを示し、発色団レチナールとアポタンパク質の相互作用が弱くなっていることが示唆された。液晶相にあるDMPCリポソーム中では、bR分子間の相互作用が弱くなり、分子集合状態が顕著に変化することが知られており、上記の実験結果は、膜タンパク質の分子集合状態が機能発現メカニズムに大きな影響を与えることを示していると考えられる。昨年度新たに構築した可視領域のマイクロ秒過渡吸収測定システムを用いて、いくつかの組成の異なる脂質膜に再構成したバクテリオロドプシン(bR)の機能中間体の寿命を主として調べた。昨年度の予備実験から興味深い結果が示されていたdimyristoylphosphatidylcholine (DMPC)からなる脂質膜リポソーム再構成試料に関して、詳細な実験を行ったところ、脂質二重膜のゲル-液晶転移に伴うM2中間体の著しい短波長シフトを観測した。M2中間体はプロトンポンプにおけるプロトンの放出と取り込みのスイッチングに関わる重要な中間体であり、ゲル-液晶転移によりbR分子からなる二次元結晶が融解することから、脂質膜の相挙動が膜タンパク質の集合状態、さらにプロトンポンプ機能の発現に大きく影響を与えることが明らかになった。また、M2中間体の著しい短波長シフトはレチナールポケット近傍の大きな環境変化を示しており、さらに高温で観測される光退色現象との関連性が示唆される。炭化水素鎖の長さの異なる脂質を用いた実験をさらに行い、光退色現象の観点からも詳細な解析を現在進めている。さらに、短鎖リン脂質と長鎖リン脂質からなる混合脂質膜に再構成したバクテリオロドプシンについて、分光学的な方法を中心に検討を行った。その結果、円二色性スペクトルから、タンパク質の集合状態が単一の長鎖リン脂質再構成系とは異なることを示す実験結果が得られた。機能中間体の挙動については通常の再構成試料との間に顕著な違いが見られなかった。さらに詳細な実験を進め、総合的な考察を現在進めている。
ヴィクトリア時代イギリスにおける「人種」と階級問題の連関について

ヴィクトリア時代イギリスの階級に関する社会思想を、帝国主義的人種観との連関に的を絞って論じ、既存の社会思想史研究に新たな局面をもたらすことがこの研究の主旨である。1年目の平成16年度の目標は、翌年に行うイギリスでのフィールドワークのための理論的枠組みを構築することであった。研究は以下の手順で遂行された。1.19世紀イギリス思想の流れを理解するために、ロマン主義、リベラリズム、進化論、科学実証主義などについて多くの二次文献を読んだ。2.何人かの特定の思想家に焦点を絞り、歴史的背景を踏まえながら彼らの思想を分析した。(取り上げた思想家は以下の通り:Henry Mayhewの貧困層研究、Herbert SpencerとCharles Darwinの進化論、Benjamin KyddとWalter Bagehotの社会帝国主義、Francis GaltonとKarl Pearsonの優生学思想)3.自身が博士研究で積み上げた人種と階級の連関に関する歴史研究の成果を本研究に関連付ける作業を行った。特に、Ann McClintock、Gertrude Himmelfarb、Arm Stoler、Bernard Semmelらによって展開されている、人種と階級の連関に関する議論を再検討した。
有害重金属による環境汚染を特異的に検出するための新規生物工学技術の研究

本研究では、特定の重金属化合物によってのみ選択的に遺伝子が誘導発現されるシステムなどの遺伝子発現制御システムを応用した分子生物学的に重金属化合物を検出するバイオセンサー技術を開発することを目的として、生物有害性を示す重金属化合物を特異的かつ定量的に検出しかつ従来の測定技術に比較してより高感度なバイオセンサーシステムの開発を行った。本研究によって得られた主要な成果は下記の2点にまとめることができる。(1)生物に摂取されて細胞に対して生理的に有害な作用を及ぼす重金属化合物のみを特異的にかつ化合物種ごとに選択的に検出するための微生物由来の発光遺伝子(lux)をレポーターとして用いたバイオセンサーシステムを開発した。特に、芳香族系有機水銀とアルキル水銀系とをある程度識別して検出できる有機水銀バイオセンサーを開発した。(2)これまで測定不可能であった水銀汚染の濃度範囲における重金属の環境リスクを定量するためのバイオセンサーディバイスの高感度化に関する研究を行ない、従来の原子吸光法に比較して約百倍もの高い感度を持つpMレベル水銀バイオセンサーを開発した。上記の新規なバイオセンサーディバイスを組み込んだバイオモニタリングシステムの基本形式を提案することができた。本研究では、生物有害重金属化合物の選択的高感度検出方法を確立することを目指して、特定の重金属化合物によってのみ選択的に遺伝子が誘導発現されるシステムなどの遺伝子発現制御システムを適用した重金属化合物検出法の開発を行った。特に、生物有害性を示す重金属化合物を特異的かつ定量的に検出する高感度バイオセンサーシステムを開発することを課題として研究を行った。研究計画の初年度である本年度においては、上記の研究課題に対して以下のような研究成果を得ることができた。・既存の重金属検出方法の特性評価と必要改善課題の抽出を行う。有害重金属である水銀等による環境リスクを検出し定量するための有害無機物質の既存定量分析方法の実用成績をデータベースとして整理した。・上記の結果抽出できた重金属の新規検出・定量に関する開発課題に基づいて、安定な状態で存在する比較的無害な水銀化合物は検出せずに、生物に摂取されて細胞に対して生理的に有害な作用を及ぼす水銀化合物のみを特異的にかつ化合物種ごとに選択的に検出するための微生物細胞を用いたバイオセンサーシステムの基本形式を開発した。・今後の研究課題について検討し、これまでのバイオセンサーシステムでは測定不可能であった低濃度範囲における重金属の環境リスクを定量するためのバイオセンサーシステムの高感度化のための必要遺伝子群をクローニングし準備した。本研究では、生物にとって有害な環境汚染重金属を検出するために必要とされる重金属バイオセンサー技術の開発を行なっている。本年度の研究においては、安定な状態で存在する比較的無害な重金属化合物は検出せずに、生物に摂取されて細胞に対して生理的に有害な作用を及ぼす重金属化合物のみを選択的・特異的に検出するための微生物細胞を用いたバイオセンサーシステムの開発に成功した。また、環境リスクを引き起こすことが知られている重金属化合物であっても、これまでは測定不可能であった低い濃度範囲における環境リスクを定量するための高感度バイオセンサーシステムを開発する研究にも着手した。具体的には、以下のようなシステムを開発した。・重金属耐性オペロンの発現調節システムを活用しレポーター遺伝子の発現と同調させることによる細菌細胞の分子生物学的応答等を応用して、新規なバイオセンサーシステムを組み込んだ重金属化合物のバイオモニタリングシステムの基本形式を開発することができた。・新規環境リスク検出・定量方法として、遺伝子発現応答を応用した有害重金属化合物の種類ごとに選択的に定量できるバイオルミネッセンスセンサーシステムを開発した。この研究では、細菌が持っている重金属応答遺伝子発現調節システムと生物発光遺伝子の融合オペロンシステムを構築して、微生物細胞レベルで生物摂取可能な重金属化合物種ごとの特異的・選択的に定量可能なバイオセンサーデバイスを遺伝子工学的に開発した。・上記のバイオルミネッセンスセンサーシステムをさらに発展させて、バイオセンサーシステムを極低濃度の有害重金属化合物の定量に用いるための超高感度化バイオセンサーの基本デバイスを作製できた。本年度の研究では、特定の重金属化合物によってのみ選択的に遺伝子が誘導発現されるシステムなどの遺伝子発現制御システムを応用した分子生物学的に重金属化合物を検出するバイオセンサー技術を開発することを目的として、生物有害性を示す重金属化合物を特異的かつ定量的に検出しかつ従来の測定技術に比較してより高感度なバイオセンサーシステムの開発を行った。

本年度の研究によって得られた成果は下記の4点にまとめることができる。(1)生物に摂取されて細胞に対して生理的に有害な作用を及ぼす重金属化合物のみを特異的にかつ化合物種ごとに選択的に検出するための微生物由来の発光遺伝子(lux)をレポーターとして用いたバイオセンサーシステムを開発した。特に、芳香族系有機水銀とアルキル水銀系とをある程度識別して検出できる有機水銀バイオセンサーを開発した。(2)これまで測定不可能であった水銀汚染の濃度範囲における重金属の環境リスクを定量するためのバイオセンサーディバイスの高感度化に関する研究を行ない、従来の原子吸光法に比較して約百倍もの高い感度を持つpMレベル水銀バイオセンサーを開発した。(3)前述のレポーターをlux遺伝子から、オワンクラゲ由来のgfp遺伝子(Green Fluorenscent Proteinをコードする)に置換した系を構築し、汚染現場に適用可能な水銀バイオセンサーを開発した。この方法は、gfp遺伝子産物であるGreen Fluorescent Proteinは自然光のもとでも緑の蛍光を発するので肉眼的検出が可能であり、その検出には特別な機器を必要とせずかつ排水基準より低い数十nMレベルの水銀濃度を検出できることが明らかになった。(4)上に示した新規なバイオセンサーディバイスを組み込んだバイオモニタリングシステムの基本形式を提案することができた。
ミトコンドリア品質管理における融合・分裂の役割の再検討

哺乳動物細胞の中で、ミトコンドリアは主要な細胞エネルギー生産の場として必須の機能を持っている。一方、ミトコンドリアの機能不全により様々な病態が引き起こされることから、その正常機能を維持することは生体にとって重要な意義を持つ。細胞内ではミトコンドリアは細長いネットワーク構造を形形成している。ミトコンドリアは動的にその形態を変化させており、ミトコンドリアの融合と分裂によるダイナミクスはミトコンドリア品質管理に重要であると考えられている。しかし、その制御の分子機構及び意義はまだ十分には理解されていない。そこで本研究では、ミトコンドリアダイナミクスの意義の再検討を行い、ミトコンドリア品質管理の基本原理を理解することを目指して研究を進めた。これまでにミトコンドリアが失活すると内膜融合因子OPA1が分解され融合活性を失うことを見い出している。この反応は、障害を受けたミトコンドリアが細胞内の連携から排除され、その後の分解等を介した品質管理に繋がる応答だと考えられている。しかし、この細胞内ミトコンドリアネットワークからの障害ミトコンドリア成分の選別機構は未だ不明な点が多く残されている。そこで我々はOPA1のミトコンドリア品質管理への関与の詳細解析を進めている。内膜融合因子OPA1が失活したミトコンドリアは、正常なミトコンドリアと融合可能であること、即ちOPA1の抑制だけでは障害ミトコンドリアの選別・排除には不十分であることが明らかになった。この制御機構をさらに詳細に調べるため、膜結合型OPA1を大量発現・精製する実験系を構築した。この発現系を用いることで、OPA1の機能、特にGTP加水分解に依存した膜融合反応の分子詳細を解析可能となるため、現在さらなる詳細解析を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。ミトコンドリアは融合と分裂を介した動的な動きの中でその機能が維持されていると考えられている。この動きはミトコンドリアの品質を管理し正常に機能させるために重要だと考えられているが、その制御の分子機構及び意義はまだ十分には理解されていない。そこで本研究では、ミトコンドリアダイナミクスの意義の再検討を行い、ミトコンドリア品質管理の基本原理を理解することを目指して研究を進めている。ミトコンドリア融合・分裂因子の機能抑制した細胞・マウス組織を解析することで、そのミトコンドリア及び細胞機能における意義の解析を進めた。培養細胞では分裂抑制によりmtDNAの配置不全が見られ、それにより細胞死の制御に大きな変動がみられることが分かった。さらに、心筋においてミトコンドリア分裂を抑制すると、呼吸不全となり心機能不全となることが分かった。この場合もmtDNAの局在変化が見られ、さらにmtDNAの配置と呼吸活性が関連していることも明らかになった。これらの結果から、mtDNAの動的な変化がミトコンドリアの機能発現に重要な機能を持つことが明らかになった。現在、これらの表現型とミトコンドリア品質管理の関連の詳細解析を進めている。また卵子においてもミトコンドリアの分裂が必須の機能を持つことを見出している。卵子老化時にはミトコンドリア分裂活性が減弱し、その結果卵子の受精能が低下することが明らかになった。これらのさらなる詳細解析を進めることで、オートファジーにより分解される前にミトコンドリアがどのように変化し品質管理されているかについて解析を進めている。これまでに、ミトコンドリアが失活すると内膜融合因子OPA1が分解され融合活性を失うことを見い出している。OPA1のミトコンドリア品質管理への関与を詳細に調べたところ、内膜融合因子OPA1を持たないミトコンドリアは、正常なミトコンドリアと融合可能であること、即ちOPA1の抑制だけでは障害ミトコンドリアの選別・排除には不十分であることが明らかになった。一方、Drp1の生体内での意義についても理解を進めた。今回、マウス心筋のミトコンドリア分裂を抑制すると呼吸不全により新生児期致死となることがわかった。新生児期に心筋は大きく成長するが、この時期にミトコンドリア分裂が促進しミトコンドリアDNAが適切に配置されることで、心筋全体へ呼吸鎖が適正に配分されることがわかった。このように、ミトコンドリア分裂はマイトファジー制御以外にも組織形成に重要な機能を持つことがわかった。そこで現在、組織内でのミトコンドリア品質管理の詳細解析を進めている。

これまでにミトコンドリアが失活すると内膜融合因子OPA1が分解され融合活性を失うことを見い出している。この反応は、障害を受けたミトコンドリアが細胞内の連携から排除され、その後の分解等を介した品質管理に繋がる応答だと考えられている。しかし、この細胞内ミトコンドリアネットワークからの障害ミトコンドリア成分の選別機構は未だ不明な点が多く残されている。そこで我々はOPA1のミトコンドリア品質管理への関与の詳細解析を進めている。内膜融合因子OPA1が失活したミトコンドリアは、正常なミトコンドリアと融合可能であること、即ちOPA1の抑制だけでは障害ミトコンドリアの選別・排除には不十分であることが明らかになった。この制御機構をさらに詳細に調べるため、膜結合型OPA1を大量発現・精製する実験系を構築した。この発現系を用いることで、OPA1の機能、特にGTP加水分解に依存した膜融合反応の分子詳細を解析可能となるため、現在さらなる詳細解析を進めている。Drp1の生体内での意義についても解析を進める。ミトコンドリア分裂はマイトファジーに先立っておこると考えられているが個体内での詳細な理解は不十分である。ミトコンドリア分裂のマイトファジーにおける意義を培養細胞及びマウスを用いて詳細を解析することで、ミトコンドリア品質管理の制御の分子理解を進める。さらにミトコンドリアダイナミクスの意義を詳細理解するため、ミトコンドリア病モデルマウス及びその培養細胞を用いた解析を進めており、ミトコンドリアがオートファジーにより分解される前にどのように品質管理されているか、解析を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。
インターネットにおける人格的利益の侵害に対する差止請求権の基礎的研究

研究年度の第1年目に当たる2018年度においては,まず,本研究課題に関連する日本,ドイツおよびヨーロッパの文献資料(判例・学術論文)の収集とその整理とに力を注いだ。とりわけ,ドイツでは,近時,本研究課題にとって重要な法律(Telemediengesetz)の改正が相次いで行われ,さらにこれらに関する重要な判例・裁判例が次々と現れた。また,それらの動きに刺激をされて学術論文も続々と公表されるなど,今まで以上に活発な議論が交わされている。そのような最新の議論状況をできる限り早く,かつ正確に把握することに努めた。次に,主として,インターネット上で人格的利益が違法に侵害される事案の特徴を明らかにし,これに対するあるべき対応策を追及するための比較対象として,インターネット上における違法な著作権侵害に関する事案を取り上げることとし,後者に関する従来のドイツおよび日本における判例・学説による議論の整理を開始した。さらに,本研究課題の一部を成す民法上の差止請求権の一般法理に関する考察については,差止請求権の一種である物権的請求権に関して,1つの物権の侵害に複数の主体(侵害者)が関与している場合における各侵害者に対する物権的請求権の発生要件・効果の具体的内容,そして個々の物権的請求権の相互関係のありようを解明することができた(その成果は,拙稿「物権的請求権」松岡久和編『新注釈民法(4)物権総論』〔有斐閣,2019年公刊予定〕として公表される)。その結果,このような物権的請求権に関する一般法理を足がかりとしつつ,複数の侵害主体によってインターネット上で私人の人格的利益が違法に侵害される場合における差止請求権の発生要件や効果などについて体系的な分析を進めることが可能となった。第1に,本研究課題にとっては,インターネット上における違法な法益侵害に関して,インターネット・サービスプロバイダーの妨害除去義務を原則として否定することとしたドイツのTelemediengesetz 8条1項2文の意義について検討することが重要であるところ,2018年度は,まさしくこの点に関する最新の重要判例と学説とをそれぞれ集中的に分析した。その結果,現時点におけるドイツの議論状況について正確な理解を得ることができた。第2に,2018年度における研究活動のさらなる成果として,前述のとおり,差止請求権の一種である物権的請求権に関して,1つの物権の侵害に複数の主体(侵害者)が関与している場合における各侵害者に対する物権的請求権の発生要件・効果の具体的内容,そして個々の物権的請求権の相互関係のありようについて自らの見解を固めることができた。これは,2019年度以降において行われるべき,インターネット上にて複数の主体の関与の下に私人の人格的利益が違法に侵害される場合における差止請求権の発生要件や効果,各請求権の相互関係などに関する理論的分析に際して,その基盤となるものである。第3に,インターネット上における違法な人格的利益の侵害との比較対象として検討されるべき,インターネット上における違法な著作権侵害に関しても,すでにドイツ・ヨーロッパおよび日本におけるそれぞれの判例・学説の分析に着手し,かつそれらを順調に前に進めている。研究年度の第2年目に当たる2019年度においては,第1に,これまでに積み上げてきた研究成果の正確性・充実度を検証するために,本研究課題に関するドイツ人研究者との意見交換に力を入れる。具体的には,2019年9月にドイツに渡航し,彼の地の複数の研究者と直接に面会して,第1年目の研究成果を提示した上で,それに対する意見を求めるとともに,日本で研究活動を進めている過程で生じた疑問についても質問し,その解消に努める。さらに,現段階における暫定的な私見の当否についても率直な批判を受けて,そのさらなる発展を期する予定である(時間が許すならば,今年度は,2020年2月あるいは3月にも短期間,ヨーロッパの研究機関を訪れ,同じような意見交換を実施したい)。第2に,引き続き,本研究課題に関連する日本,ドイツ,ヨーロッパの文献資料(判例・学術論文)の収集と整理・解析に精力的に取り組む。近年,ドイツにおいては,2016年,2017年と立て続けに行われたTelemediengesetzの改正を踏まえて,ドイツ連邦通常裁判所や下級審裁判所の判例・裁判例や学術論文が陸続と現われている状況にある。この動向が今年度も続くであろうことは疑いを入れない。さらに,ヨーロッパ議会・ヨーロッパ司法裁判所による法形成からも目を離すことができない。第3に,インターネット上における個人情報の削除に関するいわゆる「忘れられる権利」をめぐるドイツ・ヨーロッパおよび日本における議論についても分析を開始する。第4に,インターネット上での違法な著作権侵害に関する我が国の従来の議論の把握と分析とに,2018年度以上の時間と労力とを傾注する。

次に,主として,インターネット上で人格的利益が違法に侵害される事案の特徴を明らかにし,これに対するあるべき対応策を追及するための比較対象として,インターネット上における違法な著作権侵害に関する事案を取り上げることとし,後者に関する従来のドイツおよび日本における判例・学説による議論の整理を開始した。さらに,本研究課題の一部を成す民法上の差止請求権の一般法理に関する考察については,差止請求権の一種である物権的請求権に関して,1つの物権の侵害に複数の主体(侵害者)が関与している場合における各侵害者に対する物権的請求権の発生要件・効果の具体的内容,そして個々の物権的請求権の相互関係のありようを解明することができた(その成果は,拙稿「物権的請求権」松岡久和編『新注釈民法(4)物権総論』〔有斐閣,2019年公刊予定〕として公表される)。その結果,このような物権的請求権に関する一般法理を足がかりとしつつ,複数の侵害主体によってインターネット上で私人の人格的利益が違法に侵害される場合における差止請求権の発生要件や効果などについて体系的な分析を進めることが可能となった。第1に,本研究課題にとっては,インターネット上における違法な法益侵害に関して,インターネット・サービスプロバイダーの妨害除去義務を原則として否定することとしたドイツのTelemediengesetz 8条1項2文の意義について検討することが重要であるところ,2018年度は,まさしくこの点に関する最新の重要判例と学説とをそれぞれ集中的に分析した。その結果,現時点におけるドイツの議論状況について正確な理解を得ることができた。第2に,2018年度における研究活動のさらなる成果として,前述のとおり,差止請求権の一種である物権的請求権に関して,1つの物権の侵害に複数の主体(侵害者)が関与している場合における各侵害者に対する物権的請求権の発生要件・効果の具体的内容,そして個々の物権的請求権の相互関係のありようについて自らの見解を固めることができた。これは,2019年度以降において行われるべき,インターネット上にて複数の主体の関与の下に私人の人格的利益が違法に侵害される場合における差止請求権の発生要件や効果,各請求権の相互関係などに関する理論的分析に際して,その基盤となるものである。第3に,インターネット上における違法な人格的利益の侵害との比較対象として検討されるべき,インターネット上における違法な著作権侵害に関しても,すでにドイツ・ヨーロッパおよび日本におけるそれぞれの判例・学説の分析に着手し,かつそれらを順調に前に進めている。研究年度の第2年目に当たる2019年度においては,第1に,これまでに積み上げてきた研究成果の正確性・充実度を検証するために,本研究課題に関するドイツ人研究者との意見交換に力を入れる。具体的には,2019年9月にドイツに渡航し,彼の地の複数の研究者と直接に面会して,第1年目の研究成果を提示した上で,それに対する意見を求めるとともに,日本で研究活動を進めている過程で生じた疑問についても質問し,その解消に努める。さらに,現段階における暫定的な私見の当否についても率直な批判を受けて,そのさらなる発展を期する予定である(時間が許すならば,今年度は,2020年2月あるいは3月にも短期間,ヨーロッパの研究機関を訪れ,同じような意見交換を実施したい)。第2に,引き続き,本研究課題に関連する日本,ドイツ,ヨーロッパの文献資料(判例・学術論文)の収集と整理・解析に精力的に取り組む。
対称軸近傍における衝撃波干渉の実験的、数値解析的研究

1948年にクーラン・フリードリクスにより、軸対称衝撃波の軸上での反射形態として理論的には非正常反射(Mach反射)のみが可能であるとの結論が導き出されている。衝撃波の平板上での斜め反射に関しては正常および非正常反射が可能であり、このクーラン等の結論は多くの研究者の興味をひいた。その後多くの実験的研究がなされ、小さな入射角の軸対称流れについて、対称軸付近で一見正常反射と見られるような画像が数多く記録された。この理論との不一致については、これらの実験結果ではマッハディスクが小さすぎて観測されなかっただけであろうといわれているが、このことについての結論はまだでていない。さらに1992年、ソコロフによって対称軸では常に非正常反射となることについて、空気力学的メカニズムが理論的に示された。それによれば対称軸に近づくにつれ、衝撃は徐々にその強さを増し、その結果対称軸付近では常に入射角が遷移角を上回る様になるというのである。しかしながら彼の説明にしても説得力のある実験あるいは数値解析による証明はなされていない。過去10年ほどの間、衝撃波の対称軸での非定常反射について、非常に湾曲したマッハディスクとその背後にトロイダル渦を含むような複雑な流れ場が現れることが、多くの数値計算によって示されるようになった。今回、本課題提案者らは非構造格子上での自動格子細分化法を用いた衝撃波捕獲数値計算コードを開発して、実験では実現する事の難しい非常に高い空間解像度での数値模擬を行い、軸上での衝撃波の反射がMach反射になる事を初めて示すことができた。軸対称衝撃波の軸上での反射形態として理論的には非正常反射(Mach反射)のみが可能であるとの結論が導き出されている。一方、衝撃波の平板上での斜め反射では正常および非正常反射が可能であることから、軸対称流れにおける衝撃波の軸付近での振る舞いについては様々な議論がなされている。本研究では提案期限内にこれらの事柄を系統的に研究解明する事が主たる目的である。平成13年度の研究計画では、実験的研究においては縦型衝撃波管による軸対称衝撃波の反射実験、また数値解析的研究においてはCFDコードの並列化、最適化と数値模擬が計画されているが、これらの計画項目はほぼ達成された。東北大学流体科学研究所の衝撃波研究センターにおいて軸対象衝撃波同士が干渉する様子を再現するため縦型衝撃波管を設計、開発し、設置、調整を行った。この衝撃波管は実験毎の再現性を良くするために、ピストンを利用した無隔膜衝撃波管とすることで、再現性のみ成らず実験サイクルの改善も計られている。軸対称な衝撃波の反射形態を可視化するために観測部は非球面レンズを持ちレーザーホログラフィー干渉計法による密度測定が可能である。数値計算については、2次元圧縮性軸対称流れを数値模擬するための計算コードの開発を終え、東北大学流体科学研究所の計算機システムのための最適化もほぼ終了したし計算コードは、三角形および四角形要素による非構造格子を用いており、更に空間解像度をあげるための自動格子細分化機能をもち、実距離においても数ミクロン程度の空間解像度での計算を可能としている。これら、実験および数値解析に関するこれまでの成果は複数の論文に発表した。また、現在これまでの成果を総合的に考察しながら来年度研究計画の調整を行っている。

この理論との不一致については、これらの実験結果ではマッハディスクが小さすぎて観測されなかっただけであろうといわれているが、このことについての結論はまだでていない。さらに1992年、ソコロフによって対称軸では常に非正常反射となることについて、空気力学的メカニズムが理論的に示された。それによれば対称軸に近づくにつれ、衝撃は徐々にその強さを増し、その結果対称軸付近では常に入射角が遷移角を上回る様になるというのである。しかしながら彼の説明にしても説得力のある実験あるいは数値解析による証明はなされていない。過去10年ほどの間、衝撃波の対称軸での非定常反射について、非常に湾曲したマッハディスクとその背後にトロイダル渦を含むような複雑な流れ場が現れることが、多くの数値計算によって示されるようになった。今回、本課題提案者らは非構造格子上での自動格子細分化法を用いた衝撃波捕獲数値計算コードを開発して、実験では実現する事の難しい非常に高い空間解像度での数値模擬を行い、軸上での衝撃波の反射がMach反射になる事を初めて示すことができた。
複数時間ウィンドウでの哺乳類脳操作を実現する薬剤誘導性人工遺伝子スイッチ開発

申請者は哺乳類以外の生物種(細菌、酵母、植物、昆虫、両生類)の遺伝子発現系を基に、複数の薬剤誘導性遺伝子発現スイッチを作製し、哺乳類脳において特定の機能に関連する神経細胞集団を時間軸に沿って遺伝学的に切り分ける技術開発を行っている。平成29年度にはアメリカのマサチューセッツ工科大学Ian Wickersham研究室で、設計した遺伝子スイッチを用いた標識法の検討実験を行った。「複数時間ウィンドウ」の実現には誘導は一過性でありながら、その長期間細胞内に残る標識が必要とされる。申請者はその標識の候補として、近年複数の種類が報告されているセリンインテグラーゼ(Yang, et al, Nat Methods, 2014)という遺伝子組み換え酵素を選択した。Streptomyces scabiei 87.22由来のInt2、Geobacillus sp Y412MC61由来のInt7、Staphylococcus lugdunensis N920143由来のInt12を選抜し哺乳培養細胞で実験を行った。大腸菌における文献の結果と異なりInt2はHEK293細胞において認識配列であるattB2/attP2の組み換えを起こさなかった。一方でInt7は認識配列であるattB7/attP7のみを、Int12はattB12/attP12のみを組み換え蛍光タンパクを発現させた。以上からInt7とInt12のペアは哺乳培養細胞で機能することが証明され、異なるスイッチの下流で発現させる酵素として適当と考えられた。またこれまでにGeobacillus sp Y412MC61由来のInt7、Staphylococcus lugdunensis N920143由来のInt12といったセリンインテグラーゼを哺乳細胞で使用した例は報告されておらず、これが初めての哺乳細胞における成功例であると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究は、広範な生物種由来の機能性分子から、血液脳関門というバリヤー機能を持つ哺乳類脳で動作する薬剤誘導性の新規人工遺伝子スイッチを作製し、複数の異なる神経細胞集団を別々に操作することを目的としている。平成28年度においては、様々な遺伝子スイッチの設計、各種誘導剤の血液脳関門透過性をin vitroで予測、哺乳細胞を用いた遺伝子スイッチの性能評価、ラット脳において化合物の経口摂取により遺伝子発現がONになるかどうかの最初の検証実験、まで進めた。結果として培養細胞による血液脳関門透過性試験では5種類の化合物が選抜され、最初の検証実験を行った遺伝子スイッチ1種類は経口摂取によって脳内で蛍光タンパク質を強力に誘導することが示された。経口摂取によって脳内でこれほど強力に遺伝子発現を誘導できる遺伝子スイッチは、これまでTet systemを除けば例が無い。またこの化合物も、経口摂取によって血液脳関門を通過するといった特性はこれまで知られておらず、選抜までの戦略が非常にうまく機能したといえる。この化合物とスイッチの間に1対1の関係が厳密に成り立つ事は実験的に確かめられており、神経科学だけでなく動物を使ったすべての実験においてTet systemと同時に使用することが可能である。これまでの遺伝学的ツールの多くは、単細胞を用いて開発する研究者と動物実験で使う研究者が異なり、両者がツールに求める特性が異なるために、非常に多くのツールが細胞レベルの実験では使えるが、動物実験では使えないという乖離を引き起こしてきた。今回の実験結果は、動物実験で使うことを開発の初期段階から想定して適切な戦略を立てれば、動物実験で使える十分高性能なツールを開発できること示している。薬剤誘導性人工遺伝子スイッチを哺乳類中枢神経系で動作させる為には、化合物(誘導剤)が血液脳関門を十分量通過しなくてはならない。申請者はヒトP-糖タンパク質を発現させたイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来MDR1-MDCK細胞を用いた血液脳関門透過性試験を用いて、10種類の化合物をこの実験系でテストし、ドキシサイクリンと同等かそれ以上の透過性を示す候補を絞り込んだ。次に絞り込まれた誘導剤に対応する人工遺伝子スイッチを実際に作成してヒト胎児由来腎臓上皮細胞HEK293T細胞へと導入し、培地中の誘導剤の有無によって誘導されてくるルシフェラーゼの測定を行った。血液脳関門透過性試験で好成績であった人工遺伝子スイッチをアッセイした結果、対応した誘導剤に対して100倍以上の高い遺伝子発現量をもつ5種類のスイッチを選抜した。最後にルシフェラーゼアッセイで選抜された5種類の人工遺伝子スイッチのうち1種類についてin vivoにおける検討を行った。赤色蛍光タンパク質(mCherry)を誘導剤によって発現するように組み換えたレンチウイルスベクターを作製しラット海馬に注入、誘導剤投与の有無で2群に分けて飼育した。ゲル化温度が低く作製時に熱による誘導剤分解の危険性が低いコラーゲンに、カルピスと練乳を混ぜてゼリーにしたものを1か月間、レンチウイルスを注入済みのラットに与えた。そして1か月後に誘導剤を投与した群と非投与群の両方を還流し、蛍光タンパク質の発現を観察したところ誘導剤を投与した群においてのみ顕著に赤色蛍光タンパク質(mCherry)の発現が見られた。これにより、まず新規人工遺伝子スイッチが神経細胞で機能すること、そして次に誘導剤が経口摂取の後、血液脳関門を通って神経細胞に到達することの両方が初めて示すことが出来た。