hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザー照射歯質被着体に対応した新規機能性モノマーの合成と接着システムの開発

緒言:う蝕治療時の窩洞形成に使用されているEr:YAGレーザーは、エアータービンやマイクロモーターのように騒音、振動による不快感がなく、また、無麻酔での治療が可能であることから注目されている。しかし、私達はEr:YAGレーザーを照射した歯質被着体とした場合、現行の歯質接着システムにおいてその性能が十分に発現しないことと、その原因の一つがレーザー照射歯質の脆弱化によることを解明した。そこで、Er:YAGレーザー照射後の歯質構造ならびに被着体としての性質を明らかにするとともに、本被着体に対応した新しい接着システム開発の重要性と臨床的意義から本研究に着手した。材料および方法:1)レーザー照射歯質被着体は、Er:YAGレーザー(Erwin、Morita Co.)をエナメル質には127mJ,10pps×2秒,象牙質には69mJ,10pps×2秒の条件下で照射して作製した。2)接着システムのプライマーは、トリアジン系、アミノ酸系およびエポキシ系メタクリレート/HEMA,アルコールから調整した。3)接着強さの測定は、上述の被着体に各種プライマー、リン酸エステル系ボンデング材を作用させた後、コンポジットレジン(Clearfil APX、Kurary Co.)を充填し、37°C水中浸漬24時間後の値を求めた。結果および考察:Er:YAGレーザー照射歯質被着面に対するエポキシ系プライマーシステムの接着強さは、エナメル質に対して18.6MPa(コントロール:メガボンド/Kurary Co.;12MPa)、象牙質に17.2MPa(コントロール:9MPa)の値を表示した。この結果について本報告者らは、レーザー照射歯質被着体に発生したマイクロクラック間の空隙に存在している酸素の影響と考察している。すなわち、コントロールに用いている現在の歯科用接着材はラジカル重合型であって酸素が介在すると重合反応が著しく低下する。これに対して今回用いた開環重合型レジンは、反応中での酸素の影響を受けにくいことからの現象と考えている。しかし、Er:YAGレーザーを照射した歯質被着体とした場合、現行の歯質接着システムにおいてその性能が十分に発現しないこと、さらにはその原因の一つにレーザー照射歯質の脆弱化が報告(本研究分担者、峯篤史ら)されている。そこで、Er:YAGレーザー照射後のエナメル質および象牙質の構造ならびに被着体としての性質を明らかにするとともに、本被着体に対応した新しい接着システムの開発を目的とした。材料および方法:1)レーザー照射歯質表面の構造解析は、Er:YAGレーザー(アーウィン、モリタ社)をエナメル質には127mJ,10pps×2秒,象牙質には69mJ,10pps×2秒の条件下で照射し、それぞれの試料についてSEM(走査型電子顕微鏡)およびXPS(X線光電子装置)分析した。2)レーザー照射歯質被着面に対する開環重合型接着材の接着強さの測定は、1)と同条件でレーザー照射したエナメル質および象牙質にエポキシ系接着材にて歯科用コンポジットレジン重合体を接着させ、37°C水中浸漬24時間後の引張り接着強さをオートグラフにて測定した。

結果および考察:SEMおよびXPS解析の結果、レーザー照射歯質は最表面から約400μmの深さまで蒸散し、さらにこれ以上の深さの箇所に微少クラックが発生していた。また、XPSのデータから歯質表層のカルシウムとリンの比が異なっていることが判明した。一方、上述したようにレーザーによって歯質被着面にクラックが発生し、この空隙の酸素がラジカル重合型の接着材の硬化に影響をおよぼすのではないかとの推論のもとに試みた開環重合型の接着材は、ラジカル重合型に比べて有意に接着強さが向上した。緒言:う蝕治療時の窩洞形成に使用されているEr : YAGレーザーは、エアータービンやマイクロモーターのように騒音、振動による不快感がなく、また、無麻酔での治療が可能であることから注目されている。しかし、Er : YAGレーザーを照射した歯質被着体とした場合、現行の歯質接着システムにおいてその性能が十分に発現しないこと、さらにはその原因の一つにレーザー照射歯質の脆弱化を報告(Mine, A.,Suzuki, K.,et al.Dental Materials J.25,214-218,2006)した。そこで、Er : YAGレーザー照射後のエナメル質および象牙質の構造ならびに被着体としての性質を明らかにするとともに、本被着体に対応した新しい接着システムの開発を目的とした。材料および方法:1)レーザー照射歯質被着体は、Er : YAGレーザー(アーウィン、モリタ社)をエナメル質には127mJ,10pps×2秒,象牙質には69mJ,10pps×2秒の条件下で照射して作製した。2)レーザー照射歯質被着面に対する開環重合型接着材の接着強さの測定は、1)の被着面にエポキシ系接着材を作用させた後に歯科用コンポジットレジン重合体(クリアフィルAPX,クラレ社)を接着させ、37°C水中浸漬24時間後の引張り接着強さをオートグラフにて測定した。結果および考察:Er : YAGレーザー照射歯質被着面に対するレジンの接着強さは、エナメル質に対して16MPa(コントロール:歯科用接着システル/メガボンド;12MPa),象牙質に14MPa(コントロール:メガボンド;9MPa)の値を示した。この結果について本報告者らは、レーザー照射歯質被着体に発生したマイクロクラック問の空隙に存在している酸素の影響と考察している。すなわち、コントロールに用いている現在の歯科用接着材はラジカル重合型であって酸素が介在すると重合反応が著しく低下する。これに対して今回用いた開環重合型レジンは、反応中での酸素の影響を受けにくいことからの現象と考えている。緒言:う蝕治療時の窩洞形成に使用されているEr:YAGレーザーは、エアータービンやマイクロモーターのように騒音、振動による不快感がなく、また、無麻酔での治療が可能であることから注目されている。しかし、私達はEr:YAGレーザーを照射した歯質被着体とした場合、現行の歯質接着システムにおいてその性能が十分に発現しないことと、その原因の一つがレーザー照射歯質の脆弱化によることを解明した。そこで、Er:YAGレーザー照射後の歯質被着体にエポキシメタクリレート系プライマーを用いて、その接着強さの増大を計った。材料および方法:1)レーザー照射歯質被着体は、Er:YAGレーザー(アーウィン、モリタ社)をエナメル質には127mJ,10pps×2秒,象牙質には69mJ,10pps×2秒の条件下で照射して作製した。
歴史としての戦後民主主義と「行動する知識人」――鶴見俊輔・日高六郎を対象に

2018年度はおもに日高六郎の思想に関する研究を進展させた。その成果の一部は、論文「日高六郎研究序説ー「社会心理学」に根ざす戦後啓蒙の思想ー」(『社会科学』第48巻第4号、2019年2月)としてまとめ、公表した。その要旨は以下のとおりである。戦後史・戦後思想史研究において頻繁に引用されながら、固有の知識人としては従来ほとんど論じられてこなかった日高六郎の学問・思想・行動を明らかにする必要がある。日高はマルクス主義の有効性を認めつつ、マルクス主義者の党派性と下部構造決定論の発想を一貫して批判した。日高が追求したのは異質なものの衝突による思想創造であり、サークル運動がパーソナル・コミュニケーションの場を創出することによって、日本の社会意識を変革する基盤となることに期待をかけた。フランクフルト学派やアメリカ社会心理学の発想と方法が日高の戦後啓蒙を支えたが、同時に、心理学の学知が規律権力となることの危険を1950年代から指摘していた。また日高の社会心理学のパースペクティブに根ざした学校教育へのコミットは、彼の思想の核に関わる重要性を帯びていた。歴史性を重視し、社会構造のなかの人間を思想史的にまなざす日高の主体観は、自立した強い主体を希求した戦後思想のなかにあって、独自の位置を占めている。本論文執筆後は、日高が展開した「社会心理学」の内容をさらに具体的に追及するとともに、戦後日本における「社会心理学」の展開と変容について知見を深めた。日高六郎に関する論文をまとめ、そのなかで今後の研究の道筋と論点を示すことができた。どのような視点と切り口で論じていくかが研究遂行上根本的な重要性をもつが、それを大まかにではあるが提示できたことは大きな意義をもつことであった。一方で、そこで提示した論点に沿って具体的な実証研究を進めていくことが今後最大の課題である。2018年度に公表した論文のなかで示した論点と切り口に沿って、具体的な実証研究を進めていくことが今後の主たる課題である。そのひとつは、日高が展開した「社会心理学」の内容を明らかにすることである。方法としては、1950-60年代に日高が執筆あるいは編著者を担当した論文や叢書・講座本の類を網羅的に読み込み、日高が当時の日本社会をどのように捉えどう変革しようとしていたのかを、彼の「学問」に内在しながら明らかにしていく。もうひとつは、日高の学校教育へのコミットについて明らかにすることである。日高が執筆したテクストはおおむね検討したが、それが戦後の学校教育をめぐる知識人の取り組みや言説のなかにどう位置づくのか、さらにそれが東アジア冷戦構造のなかでどのような役割を果たしたかを検討することが必要である。それらを論じる史料や先行研究を読み解いていく。

日高が執筆したテクストはおおむね検討したが、それが戦後の学校教育をめぐる知識人の取り組みや言説のなかにどう位置づくのか、さらにそれが東アジア冷戦構造のなかでどのような役割を果たしたかを検討することが必要である。それらを論じる史料や先行研究を読み解いていく。
炎症惹起因子を中心とした妊娠高血圧症候群の病態解明

妊娠中の母児に致命的な影響を与える妊娠高血圧症候群の発症について、関与する因子であるDanger signalの存在を生体由来の細胞で明らかにした他、胎盤局所での遺伝子衝突の証明からもそれら因子が発現される可能性を明らかにした。妊娠高血圧症候群を発症した妊婦で上昇するDanger signalの代表的な一つであるHMGB-1(絨毛細胞の表面にも存在し、妊娠中の炎症のトリガーとなることが分かっている)とその受容体RAGEについて、脂肪細胞表面のRAGEを分子生物学的手法を用いてノックダウンし、ここにHMGB-1を添加する方法で下流の炎症シグナルが抑制されることを確認した。またケモカイン(細胞内の炎症シグナルを実際の動脈硬化などの病態に直結させる因子)がHMGB-1RAGEの経路の下流にあることを確認し、脂肪細胞に与えられた妊娠高血圧症候群妊婦の全身性血清由来ストレスが、その後の疾患病態の形成に深く関わることを示唆した。さらに妊娠高血圧症候群由来の胎盤における免疫組織染色を行い、疾患の発症に関わる母体由来・胎児側遺伝子のコンフリクトを予見することで、その下流にある炎症惹起因子の誘導に至る可能性を強く示した。母体・胎児の生命の危機や生涯への影響に直結する妊娠高血圧症候群について、近年、生体内での炎症が疾患の本態に大きく関わっていることが分かってきた。我々は絨毛細胞や脂肪組織を用いた新たな実験系を確立し、検討を進めている。まず、これまでに確立していた絨毛細胞を用いた実験系において低酸素環境が絨毛浸潤に与える影響を明らかにした他(Tsunemi T, Naruse K, et al. The 1st joint meeting of ISFP/PA workshopにて発表)、脂肪組織を直接培養する検討方法を用いて、サイトカイン(アディポサイトカイン)・プロテアーゼ・関連因子が変動し、生体内の炎症病態が妊娠高血圧症候群に関与していることを明らかにしている(Nagayasu M, Naruse K, et al. ISSHP Sao Paulo 2016にて発表)。またこれらの変化が脂質代謝マーカーとして正常妊婦でも重要であるとの新たな知見も得て、妊娠中の代謝に関しての発表も行っている(佐道俊幸,成瀬勝彦ら.第40回日本産科婦人科栄養・代謝研究会シンポジウムにて発表)。また、胎盤由来の遺伝子解析によって、炎症性因子Danger signalを惹起する母性・父性遺伝子のバランスが妊娠高血圧症候群で変動していることを解明しつつある(常見泰平,重光愛子ら.第37回日本妊娠高血圧学会学術集会ワークショップにて発表)。これはインターネット上のデータベースを用いたものと、自らの検体から得られたデータの双方を用いてより精度の高い検討となっている。絨毛細胞の浸潤に関連した研究は順調に進行している。また、脂肪組織の直接培養系についても研究進展の目処が立っており、今後十分なデータが得られるものと思われる。一方、細胞外マトリックスと血管内皮細胞株を用いた研究については、十分な確立ができておらず今後多少の時間を要する。その代替的な方法として遺伝子解析の手法を用い、十分な進展が見られ、進捗の遅れを補っている。妊娠中の母児に致命的な影響を与える妊娠高血圧症候群の発症について、関与する因子であるDanger signalの存在を生体由来の細胞で明らかにしつつある。妊娠高血圧症候群を発症した妊婦でDanger signalの血中濃度が上昇していることはこれまで我々の検討でも明らかになっていたが、そのターゲットとなる細胞や組織については証明されていなかった。本研究では多くの生活習慣病で問題視されている脂肪細胞・組織に着目し検討を行い、Danger signalの代表的な一つであるHMGB-1(絨毛細胞の表面にも存在し、妊娠中の炎症のトリガーとなることが分かっている)が受容体RAGEを通じて病態を形成する可能性を考え、脂肪細胞表面のRAGEを分子生物学的手法を用いてノックダウンし、ここにHMGB-1を添加する方法で下流の炎症シグナルが抑制されることを確認した。加えてケモカイン(細胞内の炎症シグナルを実際の動脈硬化などの病態に直結させる因子)がHMGB-1RAGEの経路の下流にあることを確認した。このことは、脂肪細胞に与えられた妊娠高血圧症候群妊婦の全身性血清由来ストレスが、その後の疾患病態の形成に深く関わって入ることを強く示唆するものである。正常および妊娠高血圧症候群妊婦患者の血清については、研究機関の医の倫理委員会の承認を得て、総合周産期センター病院としての高度な機能と症例数を背景に集積が進んでおり、重症例・合併症例含めた多くの症例を検討できる状況になっている。また、妊娠高血圧症候群のトリガーたる絨毛細胞を得るための帝王切開時・人工妊娠中絶時の胎盤についても、研究に足る数の組織を得て研究を進めている。絨毛細胞の表面マーカーについては研究当初の予測より他の研究者の研究が進んだため、本研究で新たな知見を得るのではなく、これらの成果を利用した(ただしそれらの一部は当研究チームの過去の成果を元にしている)。一方、そのマーカーが実際に影響を与える対象としての脂肪細胞・組織の研究については期待以上の成果を得た。これらの培養系が安定して実験できるようになったため、Danger signal(DAMPs)の添加実験のみならず、そのノックダウン実験にまで展開し、疾患への影響をより高いレベルのエビデンスで明らかにすることができた。またサイトカイン・ケモカイン・プロテアーゼの解析も順調に進んでおり、血清・胎盤組織におけるDAMPsその他の炎症シグナル因子の検討が行われており、若干の変更はあったが、これまで順調に研究が進行していると考えている。後方視的にストック検体からこれらのシグナルを再発見するプロセスも進められている。

ただし、臨床的検討としての、妊婦での初期からの疾患予測可能性と介入試験についてはまだ開始されていない。実際の患者ベネフィットにつなげるために、そのプロセスが必要であることが、チーム内でも課題として共有されている。妊娠中の母児に致命的な影響を与える妊娠高血圧症候群の発症について、関与する因子であるDanger signalの存在を生体由来の細胞で明らかにした他、胎盤局所での遺伝子衝突の証明からもそれら因子が発現される可能性を明らかにした。妊娠高血圧症候群を発症した妊婦で上昇するDanger signalの代表的な一つであるHMGB-1(絨毛細胞の表面にも存在し、妊娠中の炎症のトリガーとなることが分かっている)とその受容体RAGEについて、脂肪細胞表面のRAGEを分子生物学的手法を用いてノックダウンし、ここにHMGB-1を添加する方法で下流の炎症シグナルが抑制されることを確認した。またケモカイン(細胞内の炎症シグナルを実際の動脈硬化などの病態に直結させる因子)がHMGB-1RAGEの経路の下流にあることを確認し、脂肪細胞に与えられた妊娠高血圧症候群妊婦の全身性血清由来ストレスが、その後の疾患病態の形成に深く関わることを示唆した。さらに妊娠高血圧症候群由来の胎盤における免疫組織染色を行い、疾患の発症に関わる母体由来・胎児側遺伝子のコンフリクトを予見することで、その下流にある炎症惹起因子の誘導に至る可能性を強く示した。脂肪組織の直接培養系について検討を進め、より精細なデータを得る。また、遺伝子解析の手法を推し進め、より多くの検体を用いてサイトカイン・プロテアーゼ産生に関与する遺伝子不均衡の解明をさらに進める。これまでの研究を臨床的に展開していくことを第一に考えている。現時点では実際にこれらの惹起された炎症状態を治療できる薬物はなく、発症してしまった妊娠高血圧症候群を治療する方法には乏しい。本研究から見出される炎症カスケードを抑制できる薬剤が安全に用いられるのであれば、研究を大きく進めることができる。一方、妊娠初期の超音波および胎盤由来マーカーで絞りこんだ妊娠高血圧腎症妊婦に対し、初期から低用量アスピリンを内服させることで発症率を劇的に低下させているとの報告(Rolnik DL, et al. N Engl J Med. 2017)があり、今後の初期からの疾患予知マネジメントは大きく変わっていくものと考えられている。研究責任者らはアジア人において同様の成果が得られるのかどうかを確認する多施設共同研究(日本妊娠高血圧学会主催)にも参加しており、ここで得られた知見が我が国の新たなスタンダードとなる可能性が高いといえる。今後の推進方策として、まずは上記の妊娠初期超音波・マーカー検査をシステム化しルーチンとして行っていくことが期待される。このことは本研究に大きくかかわる胎盤形成不全を妊娠の早い段階で把握できることにつながり、後期で脂肪細胞に悪影響を与える可能性のある胎盤を絞りこむことで、本研究を臨床的に推進することができるであろう。
ＡＭＰキナーゼが消化管粘膜において細胞増殖および極性形成に果たす役割

レプチンシグナル分子であるAMPKは、生体エネルギー代謝に必須な因子のみならず、細胞増殖にも調節作用を及ぼす。しかしながら、消化管におけるAMPKの生理的役割、病態における役割は全く解明されていない。本研究で、食餌性肥満モデルマウスにおいて、萎縮性胃炎の病態形成過程とAMPKリン酸化の関係が示された。組織構造の崩壊とエネルギー代謝変動は腫瘍化した細胞の特徴であることから、AMPKの細胞癌化への影響は大いに考えられる。本年度は、レプチンシグナルの過剰産生による胃癌発症モデルマウスについてOncogeneに発表した。そしてさらに食餌性肥満モデルを用い、消化管特に胃における粘膜恒常性機構を調べている。高脂肪食摂食マウスでは、ヒト萎縮性胃炎に類似の病態が示されるが、レプチンシグナル欠損であるob/obマウスおよびdb/dbマウスでは、顕著な肥満を示すものの、高脂肪食による胃粘膜過形成および萎縮性は野生型のように顕著ではない。従って、高脂肪食による胃粘膜病態形成および増悪化にはレプチンシグナルが重要であることが示唆される。また、高脂肪食摂食後、炎症など胃病理像の変化がまだほとんど見られない段階において、腸上皮化生のマーカーであるcdx2などの遺伝子発現が亢進され、それらの変動とレプチン産生の増加が並行して見られるた。これらの結果は、肥満が消化器癌発症の危険因子であることが最近報告されているが、そのメカニズムの1つとしてレプチンシグナルの重要性を示しうるものであると考えられる。組織過形成や萎縮性など、形態変化には細胞極性のダイナミックな変動が原因の1つである。レプチンシグナルの中でAMPKは、細胞増殖、極性の変化に影響を及ぼす分子として報告されている。高脂肪食のよる胃粘膜の病態形成にAMPKの活性化を中心としたレプチンシグナルの変動を現在各種遺伝子改変マウスを用い解析を行っている最中である。消化管は食物の消化・吸収に係わるだけでなく、個体全体のエネルギー代謝の調節に重要な組織である。AMPKは生体エネルギー代謝に必須な因子のみならず、細胞増殖にも調節作用を及ぼす。そこで本研究では肥満における胃粘膜での細胞増殖・細胞極性にレプチン並びにそのシグナル分子であるAMPKがどのように寄与するのか、その過程でサイトカインや免疫担当細胞がどのように働くのかを明らかにする目的で、高脂肪食を摂食させ高レプチン血症亢進状態にあるマウスを用い、胃粘膜における細胞増殖・細胞極性・構造維持に必要な細胞内シグナルの解析を行った。食餌性肥満モデルマウスにおいて、萎縮性胃炎の発症を見出した。AMPKのリン酸化が病態形成初期で一過性に上昇後、病態の進行に伴い減少した。さらに胃粘膜おけるAMPKの機能をさらに解析するためT3b-CA-AMPKα1 Tgマウスを作製しライン化を行った。しかし、Tgマウスの産仔数が極端に少ないことから、再度作製を試みている最中である。肥満における胃粘膜での細胞増殖・細胞極性にレプチン並びにそのシグナル分子であるAMPKがどのように寄与するのか、その過程でサイトカインや免疫担当細胞がどのように働くのかを明らかにする目的で、高脂肪食を摂食させ高レプチン血症亢進状態にあるマウスを用い、胃粘膜における細胞増殖・細胞極性・構造維持に必要な細胞内シグナルを解析を行った。平成23年度は高脂肪食摂取による胃粘膜の形態変化をin vivoで詳細に調べた。C57BL/6マウスに60%高脂肪食を自由摂取させた結果、摂食後3週間目から胃粘膜上皮の過形成が認められた。それと同時に細胞増殖マーカーであるKi67陽性細胞の増加、E-cadherinなどのjunction分子の発現低下、レプチン、OBRbおよびSTAT3のリン酸化の亢進が認められた。AMPKのリン酸化シグナルは摂食後8週以降に安定して検出された。摂食3週以降に炎症性浸潤細胞が胃粘膜に多く検出され、それに伴い炎症性サイトカインの産生も増加した。また、Ob/obマウスとdb/dbマウスは普通食においても胃上皮過形成を示したが、高脂肪食摂取において普通食摂取群と病理像の有意な変化はなかった。高脂肪食摂食後3週間目の腸上皮細胞で分化マーカーのmRNAレベルが上昇し、腸型の粘液も多く産生することから、高脂肪食による胃上皮細胞が腸型に変化していることが強く示唆された。これらの結果は、最近、肥満に陥ると動脈硬化や糖尿病だけでなく胃癌の危険性も高まることが報告されているが、そのメカニズム解明に踏み込むものと考えられる。さらに胃粘膜おけるAMPKの機能をさらに解析するため受精卵前核へのマイクロインジェクションと偽妊娠

マウスへの移植を終了し、現在T3b-CA-AMPKα1 Tgライン化の作製の最中である。AMPKTgマウスは作製したが、まだライン化には至っていない。その理由として、目的とするTgマウスがなかなか出産しないことが理由である。平成23年度は交付申請書の「研究目的」に記載した内容について、組織学的、生化学的および免疫学的解析をほぼすべて行った。さらにT3b-CA-AMPKα1 Tgライン化の作製も進んでいる。レプチンシグナルの亢進が、消化管の中でも特に胃に顕著に影響することを見出した。今後は、消化管におけるレプチンシグナルの重要性を示すとともに、肥満で増加する食道癌や大腸癌などすでに多く報告されている消化器癌にもレプチンシグナルが深く関与するかどうか、それぞれの消化管組織の特異性にレプチンがどのような制御機構を示すのか明らかにしていきたい。レプチンシグナルの亢進により胃上皮過形成が起こるが、ob/obマウス、db/dbマウスでは普通食でも胃上皮過形成が認められたことから、消化管特異的ObR欠損(T3b-ObR cKO)マウスを作製する必要が生じた。ObR loxPマウスをジャクソンラボラトリーより購入する計画をたてた。しかしこのstrainは胚凍結から個体化しなければならずそのための時間を要し、24年度に研究費を持ち越すことになった。消化管におけるAMPKの細胞形態および機能に及ぼす影響について、AMPKTgマウスのライン化を進め、消化管の炎症や腫瘍など病態形成への関与についてさらに解析を進める。T3b-ObR cKOマウスの作製によりob/obマウス、db/dbマウスと比較し消化管特異的なレプチンシグナルの応答がより詳細に調べることができる。またレプチンシグナルが遮断されることによりAMPKの活性化、細胞極性および消化管機能にどのような影響がでるのか、さらにT3b-AMPK Tgマウスと比較することで消化管レプチンシグナルにおいてどの段階でAMPK活性が重要であるか調べていく予定である。
ホームレスの健康を促進する看護支援のあり方

炊き出しの場所で,ホームレスの人々が主体的に自身の健康に取り組んでいけることを目指した健康支援活動を実施した。自己の健康を知る機会のなかった人々が,それを知ることを通して,健康に対する意識の変化や健康行動を獲得していくことにつながった。また、活動を積み重ねることで「互いに思いやる身近な存在としての関係」が構築された。この関係性は,支援活動の成果であるが、その一方で支援関係の基盤でもあった。中核都市A市で毎週行われている炊き出しの場所で,健康支援活動を実施した(月2回,計15回)。机と椅子を設置し,血圧計、血圧手帳・ボールペン、体温計、爪きり、綿棒・耳かき、体重計、体脂肪率計を準備し、自由に使用できるようにした。また炊き出しに集まる人々に,活動の紹介を掲載したビラを毎回配布、数回に1度はマイクで情報提供した。その際、血圧への関心は高いと考え、特に血圧測定についてアピールした。毎回1530人程度(多くは男性,時おり女性もいた)の人々が,それぞれの関心にそって自由に測定などしていた。特に継続的に血圧測定をする方が多く,回を重ねるごとに徐々に顔みしりになり,前回の測定結果を思い出しながら健康の状態を一緒に確認することが増えた。希望した人に対しては測定値を書き込んだ血圧手帳を渡していたが,少数の人が手帳を持参し,毎回測定値の変化に目を向けていた。また,血圧測定などを通して自己の健康について話されることもあり,健康だけでなく生活や生き方,将来のことについても一緒に考えることもあった。身近に自己の健康状態を知る機会があることは,自分自身の健康に関心を持っていない人にとっては関心をもつ機会となり,関心を持っている人にとっては,自己の健康状態を知り健康行動を振り返る機会になった。また定期的で継続的な活動を通して,徐々にホームレスの人々と研究者との関係性が構築でき,健康や生活上のことについて語り合える関係性に発展した。さらに回を重ねるごとに当事者同士が測定をすすめあうことが増え,友人やそこで出会った人々と測定値について語り合う場面も増えていった。この関係性の中で,ホームレスの人々同士が互いの健康に関心をもちあい,それぞれが自分自身の健康について語り合うことを通して、相乗的に健康への関心を高める結果につながったと考えられる。I健康支援活動中核都市A市で毎週行われている炊き出しの場所で,月2回,健康支援活動を以下の方法で実施した。1)活動の周知:活動の紹介を掲載したビラを毎回配布した。2)物理的環境:自動血圧計,血圧手帳,体重計などを準備し,誰でも自由に使用できるようにした。血圧の正常値を示したボードを自動血圧計付近に設置し,それぞれが測定値を確認できるようにした。3)知識や技術の提供:a.毎回配布するビラに,健康に関する情報や対処方法を掲載した。身近にあるもの(塩など)を活用した健康づくりの知識や方法についても掲載した。b.健康づくりのきっかけになるよう塩・マスク(「炊き出し利用者の健康への関心とニーズ調査」結果に基づくもの)を希望者に配布した。c.測定に来る各個人に対して,測定値をもとに現在の体調について確認し,改善方法を一緒に考えた。d.個々のニーズに合わせてその都度相談に応じたり,健康に関する情報を提供した。4)希望を引き出す関わり:日常の会話や健康に関する話題の中から,生活の中で困っていることなどを引き出せるような声かけをした。どうしたいか本人の希望を尊重しながら,その可能性を一緒に検討した。定期的で継続的な活動によって,血圧や体重など自分の健康状態を知る機会となっただけでなく,当事者同士が互いの健康について語り合うことを通して,相乗的に健康を高めあえる結果につながった。また,日頃感じている症状など,心配なことや困っていることについて表現できる場になり,研究者が相談者としての役割を持てる結果につながったといえる。II炊き出し利用者の健康への関心とニーズ調査(研究協力者40名)健康状態が悪い人は26名であった。多くの人がその人なりの健康行動をしているが(34名),自己の健康行動をしている人は4名であった。健康状態と健康行動について具体的な方法を提供していく必要があることが示唆された。1.健康支援活動を継続して実施:中核都市Y市で毎週行われている炊き出しの場所で,月2回,健康コーナーとして,野宿生活者自身が自由に血圧測定器や体重計,体脂肪率計などを使用できるような空間を提供した。さらに昨年度,本研究で調査した当事者の健康行動やニーズの内容を踏まえ,病気の予防や健康づくりの方法などを情報提供したり,その人自身が実際に行える方法を,その人の生活習慣や価値観に沿いながら,一緒に考えたりした。その結果,体脂肪率などその場の測定値をもとに自分自身の生活を具体的に振り返る例があった。また,研究者と関係を積み重ねる中で「受診をしよう」という気持ちに至るなど,健康行動に変化を起こすきっかけとなった例もあった。

さらに,活動の中で提供していた「塩」や「血圧手帳」がきっかけとなり,含嗽や血圧測定が習慣化される例もあった。定期的で継続的な関わりが,野宿生活者の健康への意識を高め,健康行動の変化を起こすきっかけになるばかりでなく,その人なりの健康行動の獲得につながった。2.健康支援活動の評価アンケートの実施:実際に健康支援活動を利用したことあり,研究協力を得られた人に対し,(1)健康状態(2)利用状況(3)健康に対する意識や行動の変化(4)活動に対する要望について,アンケート調査を行った。自身の健康行動に変化があったと答えた人は23名(有効回答31名),なかったと答えた人は5名であった。変化があった内容は「体調に気を使うようになった」「うがいの習慣がついた」「体調が悪いことを相談するといろいろ教えてもらえ,病院にかかりやすくなった(症状を言いやすい)」などであった。また「話を聴いてくれたことで,元気になる。明日につながる」という声もあった。このことから,研究者の行った支援活動は,健康行動の変化だけではなく,その人の生きる力を支えることにもつながったと言える。
ハムスターに特異的なシトクロームP450分子種の誘導機構の解析

芳香族多環炭化水素化合物の3-メチルコランスレン(3-MC)によるハムスター肝におけるシトクロームP4502A8(CYP2A8)分子種の転写調節機構を解明することを目的として研究を行った結果、次に示す様な結果を得た。1. P450の誘導能を有する培養細胞系は限られており、特にCYP2A8を誘導する培養細胞系はこれまでに報告されていない、そこで、まず初めにハムスター初代培養肝細胞を用いて、種々の培養条件を検討した結果、無血清培養条件下で3-MCによるCYP2A8誘導能を有する培養細胞系を確立することができた。2. CYP2A8のゲノムDNA上の転写開始点を決定した。さらに、ゲノムDNAのクローニングを行い、転写開始点より約1000bpまでの上流域のゲノムDNAの構造解析を行った。その結果、従来から3-MCによって誘導されることが知られているCYP1A1の転写調節領域と相同性を示す領域(Dioxin response element)は存在しないことがわかった。このことは、CYP1A1とCYP2A8の転写調節機構が明らかに異なっていることを示していた。3.転写調節領域の特定のためのレポータープラスミドを初代培養ハムスター肝細胞に導入する条件を、ルシフェラーゼ発現ベクターを用いて種々検討した。その結果、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、リポフェクション法等に比べてエレクトロポレーション法が効率よくベクターを細胞に導入できることがわかった。
TFGの膵臓・肝臓・脂肪組織における糖・脂質代謝調節機序の解明

Trk-fused gene (TFG)のインスリン分泌における役割を明らかにするため、膵β細胞特異的TFG KOマウス(βTFG KO)を作製し、その表現型解析を行った。βTFG KOはインスリン分泌能が低下し、糖負荷試験にて顕著な血糖上昇を呈した。インスリン免疫染色にてβ細胞量の低下を認め、単離膵島にてグルコース刺激によるインスリン分泌の低下を認めることから、膵β細胞量・機能双方の障害が示唆された。電子顕微鏡観察やマイクロアレイによる遺伝子解析等の結果、インスリン結晶径の低下、軽度の小胞体ストレス、Nrf2下流遺伝子群の発現低下がその機序として示唆された。Trk-fused gene (TFG)は小胞体からGolgi体へのCOPII小胞輸送に重要な役割を担う蛋白であり、その遺伝子異常がいくつかの神経変性疾患の原因となることが最近報告されてきている。我々はPTEN結合蛋白の網羅的解析にてTFGを同定し、さらに肥満モデルマウスの代謝標的臓器にてその発現量が変化していたことから、TFGの糖・脂質代謝における役割の解明に着手することにした。当該年度は主に膵β細胞特異的TFG KOマウス(以下βTFGKOマウス)の表現型解析を行った。βTFGKOマウスは普通食負荷条件下にて糖負荷後の顕著な血糖上昇を認めた。インスリン感受性には明らかな差を認めず、インスリン分泌の低下によるものと推察された。インスリン免疫染色にてβ細胞量の低下を認める他、単離膵島にてグルコースやSU薬刺激によるインスリン分泌(細胞内インスリン含量にて補正)の有意な低下を認めることから、β細胞量・機能双方の障害が原因として示唆された。また脂肪細胞におけるTFGの役割について培養細胞(3T3-L1細胞)を用いた検討を行ったところ、siRNAによるTFG knockdownにより脂質合成関連遺伝子の発現低下とともに脂肪細胞分化の抑制が認められた。現在、脂肪細胞特異的TFG KOマウスを作製中であり、作製が完了次第、高脂肪食負荷による脂肪重量増加、肥満形成への影響を検討したいと考えている。膵β細胞特異的KOマウスの表現型については解析が順調に進んでおり、現在は詳細な分子機序の解明を目指しているところである。脂肪細胞特異的KOマウスについても作製は概ね終了し、十分な個体数が確保でき次第、実験が開始できる状況となっている。Trk-fused gene (TFG)は小胞体からGolgi体へのCOPII小胞輸送に重要な役割を担う蛋白であり、その遺伝子異常がいくつかの神経変性疾患の原因遺伝子となることが近年報告されている。そのうちの1つ近位筋優位遺伝性運動感覚ニューロパチー(HMSN-P)では糖尿病・脂質異常症の合併率が高いことが知られているが、TFGの代謝制御における役割についての報告は未だなされていない。我々の研究室ではPTEN結合蛋白の網羅的解析にてTFGを同定し、肥満・糖尿病モデルマウスの代謝標的臓器にてその発現量が変化していたことから、TFGの代謝制御における役割に着目し、臓器特異的TFG KOマウスを作製した。まず、膵β細胞特異的TFG KOマウス(βTFGKO)の表現型解析を行った。βTFGKOは糖負荷試験にて顕著な血糖上昇を呈し、β細胞量の低下と単離膵島におけるグルコース応答性インスリン分泌の低下が認められ、TFGが膵β細胞量・機能双方の維持に重要であることが示唆された。βTFGKOでは高脂肪高スクロース食負荷による代償性膵島肥大の障害も認めた。電子顕微鏡観察にてインスリン顆粒の結晶径の低下が認められたほか、拡張した小胞体が散見され、軽度の小胞体ストレスの関与も示唆された。またマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析ではNrf2下流遺伝子発現低下の関与が示唆された。脂肪細胞については当初aP2-Creマウスとの交配を行ったが出生後早期に多くが致死であったため、Adipoq-ERT2Creマウスとの交配によりTamoxifen誘導性脂肪細胞特異的TFG KOマウスを作製し、現在表現型解析が進行中である。膵β細胞におけるTFGの役割については、β細胞量・機能それぞれの障害を来す詳細な分子機序につき解明を行っていく。β細胞量に関しては高脂肪高スクロース食負荷による代償性膵島肥大への影響についても現在検討を開始しているところである。脂肪細胞におけるTFGの役割については、脂肪細胞特異的KOマウスを用いて、高脂肪食負荷時の体重および脂肪重量の増加や、脂肪組織の慢性炎症への影響について、検討を行っていきたいと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。糖尿病・代謝28年度が最終年度であるため、記入しない。
眼内潅流法と組織培養法による房水流出率の研究

組織培養や眼内潅流の実験によって眼圧調整機構を調べ、房水流出率を賦活することによって、眼圧を下降させる方法を研究した。1そのために実験動物(ウシ)で房水流出抵抗を下げる薬物の投与がin vivoでも可能か検討した。摘出ウシ眼で、epinephrineやisoproterenolは房水流出率を上昇させなかった。しかしphosphodiesterase抑制剤は流出率を上げたので、今後検討したい。2NaFは8ー10mMで、55.2I80%の房水流出率低下を示した。これは低温で生じず、体温に近づくにつれ効果が認められた。KCNや2,4,Dinitrophenolは房水流出抵抗を変えなかった。このことから、房水流出率が必ずしも組織の代謝の活性によって生じるものでないことをも念頭におかねばならない。3線維柱帯内皮細胞をCreanの方法によって組織培養することが出来た。培養細胞は交感神経作動薬(例えば10^<ー3>M epinephrineで3時間培養)に反応したが、その反応は活性酸素(例えば10mM H_2O_2で同時間培養)に対する反応とはまるで異なっていた。4アクチン等の細胞骨格蛋白を染色し、かつ2次元電気泳動法でS=S結合を調べることに成功した。ただし生理的環境下では10^<ー3>M epinephrineや10mM H_2O_2でも変化が少なく種々のinsultsに対して充分な抵抗作用を有することが明らかにされた。5次の点は努力をしたが充二分に明らかにできなかった。すなわち、房水流出率は毛様体の影響をうけるはずであるが、流出率を変化させるはずのprostaglandinsやα拮抗薬等の効果は不明であった。また慢性効果を調べるべきであるが,器官眼培養は技術的に困難であった。これは器官眼からの流出量に比べ,技術上の液の漏れが無視できなかったからである。この(5)以外のことは,一応終了することができた。本研究の目的は,組織培養や眼内潅流の実験によって眼圧調整機構を調べ,房水流出率を賦活することによって、眼圧を下降させる方法を模索することであった。本研究の成果として1、)房水中の存在している活性化酸素やアスコルビン酸が適出ウシ眼の房水流出率と毛様体筋の収縮を濃度依存性に変化させたこと。2)その流出率は1,3ーbis(2ーcahloroethyl)ー1ーnitrosourea(BCNU)や3aminotrizole(3AT)によって著明に上昇するが、3ー4時間後に急激に減少してしまうこと。3,)酸素毒については、流出率は流出路の細胞形態と相関のみられたこと。4,)しかしながら、β_1刺激とβ_2刺激で必ずしも流出率と細胞骨格蛋白の変化(例,SーS結合)が一致していないことがわかった。本研究の今後の問題点は1)in vitroで得られた房水流出率の変化から、以上の物質によってヒトの房水流出率と眼圧が調節されている可能性があるがどうかを調べること。そのためには初期緑内障や患者の房水の検査が必要である。2)房水流出率は、房水産生と異なり人為的にはかえられないというのが通説であるので、異った作用点をもつ代謝毒を利用して、いかなる物質代謝の経路が流出率を変化させるかをスクリ-ニングしたい。

我々は一貫して房水流出率の実験的研究をしてきた。米国国立眼研究所(NEI)の年次報告に「緑内障には房水流出抵抗の改善急務である。」と記されている。微々たるものであるが、昨年に比べ以上の点で研究は進歩した。本年度は摘出ウシ眼の房水流出率におよぼす代謝拮抗物質の作用を調べた。眼内潅流法と組織培養法を組みあわせることによりスクリ-ニングをおこなった。昨年報告したNaFの房水流出率向上効果について新知見を得た。すなわち、作用機序はadenyl cyclaseの抑制でなく、F^-がphospholipase Cを活性化しphosphatidyl inositol4.5biphosphateの水解を促進する。ひいてはIP_3を産生し細胞内Ca濃度が上昇してアクチン等の細胞骨格を障害することがわかった。線維性帯内皮細胞を培養すると、アクチン線維を免疫組織化学的に染色することができた。これはアドレナリン作動薬や過酸化水素などによく反応した。培養生細胞の形態学的反応は昨年と同様であった。平板ゲル電気泳動装置で得られた蛋白分画は生理的環境下では種々のinsltsにほとんど反応しなかった。このことより線維柱帯内皮細胞がinsltsに抵抗性の強い細胞であることが示唆された。活性酸素は高濃度が流出率を下げると考えていたがこの予想は正しくなかった。前房と後房潅流をセットしなおした。前房潅流では前房深度が増加するためか、房水流出は増加した。後房潅流ではほぼ一定の低い流出率が得られた。本研究の目的は、組織培養や眼内潅流の実験によって眼圧調整機構を調べ、房水流出率を賦活することによって眼圧を下降させる方法を模索することであった。いわゆる交感神経作動薬では流出率への効果がほとんどなかったのに、NaFやNーethylmaleimideで非常に大きな効果があったことは興味深い。
次世代ヒト化マウスによるヒト免疫アレルギー疾患の再現

重度免疫不全NOGマウスに遺伝子改良を行い、新たに15系統のNOG亜系統(次世代NOGマウス)を樹立した。ヒト造血幹細胞を移植したのちに、ヒト細胞の発生分化と免疫機能について解析を行った。ヒトIgG産生の亢進を可能とする系統(NOG-pRORgt-gc)、ヒトIgE産生を可能とする系統(TSLP-IL-13)、ヒトHLAを発現する系統(HLA-A 3種類、HLA-DR 2種類)を樹立した。広範なヒト血液細胞を持つヒト化NOG-GM-CSF/IL-3Tgマウスにラクトグロブリン特異的IgE抗体の投与し、その後ラクトグロブリンを経口投与することにより受動的食物アレルギー反応の誘導に成功した。。NOGマウスにおいて抗原特異的IgE反応を誘導するため以下のプロジェクトを行っている。1NOGマウスに欠損するリンパ節の再構築:リンパ節起始細胞(LTi)の分化を調節するROR-γt遺伝子の下流にγc遺伝子を配置したBACトランスジェニックマウスを作製した。B6遺伝背景のマウスでの作製となったために現在NOGマウスに戻し交配中である。scid,γc遺伝子を配置したBACトランスジェニックマウスを作製した。B6遺伝背景のマウスで両遺伝子欠損下においても目視可能なリンパ組織が鼠蹊部、膝下、傍大静脈などに再構築できることを確認している。パイエルパッチについては再構築を確認できていない。2FDCとヒトB細胞の相互作用の回復:FDCが産生するCXCL13ケモカイン遺伝子をヒトホモログに置換したBACトランスジェニックマウスを作製した。脾臓においてmRNAによる遺伝子発現を確認している。3外部T細胞レセプター(TCR)のレトロウイルスによる導入による抗原特異的免疫反応の誘導:ヒトアレルギー患者から単離したHLA-DR4拘束性のβラクトグロブリン(BLG)特異的TCR遺伝子をレトロウイルスによりヒト造血幹細胞(HSC)に導入した。このHSCをNOG HLA-DR4トランスジェニックマウスに移植することにより抗原特異的T細胞を多数保持するヒト化マウスを人為的に作出した。このマウスをBLGで免疫することにより抗原特異的なTh1反応の誘導を確認したが、Th2反応は誘導できなかった。1NOGマウスに欠損するリンパ節の再構築:リンパ節起始細胞(LTi)の分化を調節するROR-gt遺伝子の下流にgc遺伝子を配置したBACトランスジェニックマウスを作製した。ヒト造血幹細胞の移植により著明な腸管リンパ節の肥大が認められ、T細胞数の増加が確認された。また、腸管リンパ節に存在する一部のB細胞の成熟が認められた。ヒト造血幹細胞の移植を行ったところ、T細胞の分化効率が低下しており、B細胞の成熟も促進されていないことが確認された。3IL-7Tgマウスの作製:ヒトT細胞の恒常性を維持する目的でヒトIL-7を発現するNOGマウスを作製した。ヒト造血幹細胞移植によりヒト化は確認できたが、T細胞の発生分化に対しては影響が認められなかった。4ヒトTSLP-IL-13 Tgマウスの作製:Th2反応とクラススイッチ反応の促進を目的として作製を行った。ヒト造血幹細胞の移植後、一部個体において血清中にヒトIgEの存在を確認できた。ヒトTSLP-IL-13Tgマウスの作製により血中にヒトIgEの産生が認められる個体が現れたことでアレルギーの基本反応がヒト化マウス生体内で成立しうることは確認できたが、ヒトTSLPによる副作用と考えられるマウスの胸腺腫が多発し、安定した実験ができなかった。また、CXCL13TgマウスにおいてB細胞とFDCの相互作用によりB細胞ニッチが構築されて分化亢進を促すと考えられたが、T細胞の分化の低下とともにB細胞の分化が促進されない結果となった。2リンパ節起始細胞(LTi)の分化を調節するROR-gt遺伝子の下流にgc遺伝子を配置したBAC Tgマウスを作製した。ヒト造血幹細胞の移植により著明な腸管リンパ節の肥大が認められ、コントロールのNOGマウスに比べて総T細胞数の増加が確認された。成熟B細胞数には有意差はなかった。本マウスの血清中の総IgM量はコントロールNOGマウスとTgマウスとで有意差はなかったが、総IgG量はTgマウスで有意な増加を確認した。このことは回復したリンパ節においてヒトB細胞が抗原非特異的な抗体のクラススイッチを誘導できることを示唆する。3食物アレルギーのモデル化のために、ヒト化IL-3/GM-CSFTg NOGマウスに抗BLG-IgEヒト型抗体を投与した後にBLG抗原を摂餌させ、受動型アレルギー反応を誘導する研究を行った。ヒト型抗BLG-IgE抗体クローンを投与した後に、BLGタンパクを経口投与すると直腸温の急激な低下が認められ受動型食物アレルギー反応が誘導された。

4ヒトIL-6を産生するNOG-hIL-6Tgマウスを作製し、ヒト造血幹細胞の移植を行ったところヒト単球の増加が認められた。このマウスにヒト腫瘍細胞を移植することにより免疫抑制性ミエロイド細胞の分化が誘導でき、これらの細胞は免疫抑制機能を持つことを示した。重度免疫不全NOGマウスに遺伝子改良を行い、新たに15系統のNOG亜系統(次世代NOGマウス)を樹立した。ヒト造血幹細胞を移植したのちに、ヒト細胞の発生分化と免疫機能について解析を行った。ヒトIgG産生の亢進を可能とする系統(NOG-pRORgt-gc)、ヒトIgE産生を可能とする系統(TSLP-IL-13)、ヒトHLAを発現する系統(HLA-A 3種類、HLA-DR 2種類)を樹立した。広範なヒト血液細胞を持つヒト化NOG-GM-CSF/IL-3Tgマウスにラクトグロブリン特異的IgE抗体の投与し、その後ラクトグロブリンを経口投与することにより受動的食物アレルギー反応の誘導に成功した。。現在のところマウス作製は順調に推移している。NOG背景でのBACトランスジェニックの作製が技術的に達成できておらず、B6でのマウス作製となったため戻し交配に時間がかかっている。ヒト化マウス内で外部ヒトTCR遺伝子をヒトHSCに導入することにより抗原特異的な反応の誘導が可能であることを示し、論文報告を行った。今後Th1反応が優位となる環境を如何にTh2反応に誘導するかについて検討したい。一方、ヒト造血幹細胞の入手に困難が生じている。共同研究を行っていた病院から新鮮かつ十分量の臍帯血の提供を受けることができていない。今後は市販の造血幹細胞の購入により研究を進める方向であるが、HLAの適合が問題になる可能性が高い。TSLP-IL-13Tgマウスで発症する胸腺腫を解決するためにマウスIL-7Ra遺伝子を遺伝子編集技術で破壊したマウスを作製済みであるのでこれらを交配する。得られたマウスをもとにIgEの産生について確認するとともにHLATgマウスとの交配を行う。食物アレルギーをモデル化するために、ヒト化IL-3/GM-CSFTg NOGマウスに抗BLG-IgEヒト型抗体を投与した後にBLG抗原を摂餌させ、受動型アレルギー反応を誘導する研究を行う。抗体についてはオランダの共同研究グループから提供を受ける。28年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学最近の研究によりヒト化マウスの作製においてヒトHSCの移植生着性を制御する重要な遺伝子としてsirpαが報告されている。sirpαにはマウス系統間の多型が存在しており、NOD型で生着性が飛躍的に向上する。実際、B10系統でもsirpαがNOD型をもつコンジェニックマウスではヒトHSCが生着する。今後、本研究で作製したマウスを戻し交配する際にsirpαの多型に注目し、遺伝背景を完全に置換する前にヒトHSCを移植し、ヒト化が可能か検討し、マウスの特性を調べたい。ヒトTh2反応を誘導するためのサイトカインとしてIL-4,TSLPなどの遺伝子が重要な役割を果たしている。これらを発現するマウスを作製する。また、ヒトT細胞のホメオスタシスを維持するために必要なヒトIL-7を発現するマウスの樹立を行った。このマウスの特性解析を行う。HLAを適合したHSCの安定確保が困難であることが明らかになった。
日中韓三国間でのトキソプラズマ原虫の全ゲノム解読と病原性解析

安徽医科大学のグループが武漢の野良猫の死骸から分離した採取した組織片をPBSでホモゲナイズ後、ペプシン消化して調整した懸濁液をBALB/cマウスの腹腔に投与し経時的に観察したところ、マウスが衰弱した。そのマウスの腹腔から腹腔滲出液を採取し、原虫特異的抗体を使用した免疫染色を行い、原虫の存在を確認した。続いて、マウスの個体を使った限界希釈を行い逐次株化し、武漢株Aとしゲノム核酸を採取した。武漢株Aのトキソプラズマ及び、北米欧州株I型及びII型トキソプラズマからゲノムDNAを抽出し、Covaris S220を用いて断片化を行った後ライブラリ化し、イルミナMiSeqを用いて250bpペアエンドシークエンスを行い、データを取得した。得られた各ペアリードを、米国NIHでBurrows-Wheller Alignerを用いて、ToxoDB-8.2(トキソプラズマの標準株の全ゲノムデータベース)上のME49株(標準株II型)のレファレンスゲノム上にマップし、得られたbamファイルをソートした。ソートされたreadsをソフトクリップし、Genome Analysis Toolkit (GATK)を用いて、挿入及び欠失がある配列や塩基配列のクオリティスコアの再測定を行い、GATK Haplotype Caller(バリアント)を作成して、SNPを検出した。またREDHORSEを用いて、階層的クラスタリングを作成し、系統樹を作成した。中国における豚コレラの発生によりサンプル採取が遅れているため。中国における豚コレラの発生の終息を待ち、北京、上海、広州地区の市場におけるドブネズミからのサンプル採取を再開する。得られた次世代シークセンスデータをCircos plotを用いて、トキソプラズマの既存の16ハプログループとの進化的な関連を視覚的に解析する。武漢株Aの増殖を、マウス及びヒト由来細胞を使い、非制限培養条件下及び抗トキソプラズマ作用を持つサイトカインであるIFN-γ刺激した制限培養条件下で検討する。さらにマウス骨髄由来マクロファージ感染系におけるIFN-γ誘導性の抗トキソプラズマ因子として重要であるIFN誘導性GTPaseの原虫への動員率の測定と一酸化窒素の濃度を測定する。またヒト細胞においてはトリプトファン分解酵素の活性を検討する。マウス個体に各トキソプラズマ株を感染させ、経時的に血清を採取し、炎症性サイトカイン(IL-1,IL-18,IL-6,IL-12,TNF-α)、臓器中の原虫数、慢性感染時の脳中のシスト数、そして、マウス個体の生存率を測定し、各株を特徴づける。野生型マウスが感受性とならない株については、IFN-γ欠損マウスやGate-16欠損マウス, iNOS欠損マウスで検討する。また、韓国分離株Bと日本分離株CとDについても、次世代シークエンスを全ゲノム配列を決定し、武漢株Aや北米欧州株I型およびII型との間の全ゲノム配列と比較し、分子進化学的な系統樹を作成する。

マウス個体に各トキソプラズマ株を感染させ、経時的に血清を採取し、炎症性サイトカイン(IL-1,IL-18,IL-6,IL-12,TNF-α)、臓器中の原虫数、慢性感染時の脳中のシスト数、そして、マウス個体の生存率を測定し、各株を特徴づける。野生型マウスが感受性とならない株については、IFN-γ欠損マウスやGate-16欠損マウス, iNOS欠損マウスで検討する。また、韓国分離株Bと日本分離株CとDについても、次世代シークエンスを全ゲノム配列を決定し、武漢株Aや北米欧州株I型およびII型との間の全ゲノム配列と比較し、分子進化学的な系統樹を作成する。中国の家畜豚のアフリカ豚コレラの流行によって、2018年度の中国のサンプル収集が十分にできなかったために、2019年度にその分を持ち越した。また次世代シークエンス解析については、所内の追加予算がついたこと、また、データ取得の手法の見直しにより想定したよりも1系統当たりの消費額が少なくて済むことが分かったため、大幅に節約できた。次年度にはより多くの系統の全ゲノム配列決定を行うため持ち越し分は全て使用する予定である。