hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脱細胞化肝臓由来可溶化マトリックスの開発および再生医療技術への応用

本研究は、肝組織構築に対して有効な足場材料の開発を目的とした。足場材料として、細胞に対して最適な微小周囲環境の提供が可能であると考えられる肝臓特異的ECMに着目した。ここでは、この足場材料が増殖因子固定化能を有することで、細胞に対して足場と固定化増殖因子による相乗的なシグナル伝達が可能になることを期待した。このような特徴を有する足場材料により細胞の微小周囲環境を整えることで肝組織の構築を目指した。1.増殖因子固定化可能な肝臓特異的マトリックスの開発:増殖因子は細胞の生存や増殖だけではなく分化や機能発現にも影響を与えるシグナル伝達物質であるが、安定性に欠けるといった問題がある。そこで、増殖因子を足場材料に固定化する試みがなされており、これにより安定性の向上だけではなく細胞への効率的なシグナル伝達が可能になることが期待される。本研究で開発した肝臓特異的ECM(L-ECM)は増殖因子を静電的に固定化することができ、細胞の増殖に対して有効であることが示された。2.上記材料のゲル形成:肝組織工学を達成するためには、三次元的な足場材料が不可欠であると考えられる。なかでも、ゲルは細胞に対して生体内類似環境を与えることが期待できる。本研究で開発したL-ECMは生理的温度およびpHにおいて生じる分子の自発的な架橋によりゲルを形成することが可能であった。したがって、L-ECMの開発により増殖因子固定化可能な肝臓特異的ECMゲルの構築が可能であることを見出した。3.上記材料を用いた肝細胞培養:機能が低下および損失しやすい初代肝細胞を用いた検討により、L-ECMは21日間の培養期間において初代ラット肝細胞の肝特異的機能(アルブミン合成、薬物代謝活性)の向上および維持に対して有効であることが示された。また、異種動物の肝臓特異的ECMでさえも細胞に対して適切な周囲環境を提供できる可能性を見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。
神経系単純ヘルペス感染症患者髄液からのPCRによる1,2型解析

Herpes simplex virus(HSV)神経感染症においては、脳炎はHSV1型、脊髄炎・髄膜炎は2型によるとされる。従来、これらの診断は主として髄液抗体価の検索から推定されているにすぎない。しかし、compromised hostや小児例などでのHSV1,2型の区別は明瞭ではない。最近、導入されたpolymerase chain reaction(PCR)による髄液からのHSV DNA検査は陽性率の高いことが注目されている。さらに、本研究ではHSV1,2型共通DNA片を増幅させ、1,2型のプローベを用いて、hybridizationさせ型同定を行う。HSV脳炎・髄膜炎など神経系感染症における1、2型の役割を明らかにする。1.HSV神経感染症17症例・髄液検索、経時的に髄液を-80°Cに保存。2.PCR増幅DNA片の峻厳ハイブリダイゼーションによるHSV型同定プライマーの設定:外被糖蛋白をコードする遺伝子で、1、2型で共通の配列部分を選択した(U_L44領域、両プライマーでは約30%の塩基が異なる)。増幅DNA片は約800bp長。ハイブリダイゼーション:マイクロプレートを使う方法(Inouye&Hondo,J.Clin.Microbiol.28:1469-1472,1990)で62°C+50%ホルムアルデヒドの峻厳条件下で実施。1、2型プローブでは、各標準株を用い、ビチオン-dUTPをPCRで取り組み込ませて作製した。10例から検出され、HSV1型6例と2型4例同定された。脳幹脳炎1例と髄膜炎2例ではHSV1型であった。逆に、急性成人型脳炎1例においてHSV2型が同定された。急性辺縁系脳炎ではいずれも陰性であった。本研究はHSV神経感染の病態の解明、型識別に有用と結論づけられる。Herpes simplex virus (HSV)神経感染症においては、脳炎はHSV1型、脊髄炎・髄膜炎は2型によるとされる。従来、これらの診断は主として髄液〓体価の検索から確定されているにすぎない。とくに、compromised hostや小児例などでのHSV1,2型の区別は明瞭ではない。最近、導入されたpolymerase chain reaction(PCR)による髄液からのHSV DNA検査は陽性率のたかいことが注目されている。HSV脳炎・髄膜炎など神経系感染症における1,2型の役割を明らかにする。1.HSV神経感染症の13症例・髄液検索、経時的に髄液を-80°Cに保存。2.PCR増幅DNA片の峻厳ハイブンダイゼーションによるHSV型同定プライマーの設定:外被糖蛋白をコードする遺伝子で、1,2型で共通の配列部分を送択したCU_L44領域、両プライマーでは約30%の塩基が異なる)。増幅DNA片は約800bp長、ハイブリタイガーション:マイクロプレートを使う方法(Inouye & Hondo,J.Clin.Microbiol.28:1469,1990で,62°C+50%ホルムアルデヒドの峻厳条件下で実施。1,2型プローグは、各標準株を用い、ビオチン-αUTPをPCRで取り組み込ませて作製した。10例から検出された。

HSV 1型6例と2型4例同定された。1脳幹脳炎例と2髄膜炎例ではHSV 1型であった。逆に、急性成人型脳炎1例においてHSV 2型が同定された。さらに、症例数を増やして検討する。Herpes simplex virus(HSV)神経感染症においては、脳炎はHSV1型、脊髄炎・髄膜炎は2型によるとされる。従来、これらの診断は主として髄液抗体価の検索から推定されているにすぎない。しかし、compromised hostや小児例などでのHSV1,2型の区別は明瞭ではない。最近、導入されたpolymerase chain reaction (PCR)による髄液からのHSV DNA検査は陽性率の高いことが注目されている。さらに、本研究ではHSV1,2型共通DNA片を増幅させ、1,2型のプローベを用いて、hybridizationさせ型同定を行い、HSV脳炎・髄膜炎など神経系感染症における1、2型の役割を明らかにする。17症例の脳炎・髄膜炎の髄液からPCR増幅DNA片の峻厳hybridizationによるHSV1、2型同定を実施した。10例から検出され、HSV1型6例と2型4例同定された。脳幹脳炎1例と髄膜炎2例ではHSV1型であった。逆に、急性成人型脳炎1例においてHSV2型が同定された。急性辺縁系脳炎の3例ではいずれも陰性であった。我々の研究はHSV神経感染症の病態、型識別に有用と結論づけられる。
戦間期「洋行インテリ」の情報共同体--インターネットを活用した情報政治学

平成15-18年度に行われた本研究の中心的課題は、1920-30年代のドイツに滞在した「洋行インテリ」、とりわけそのなかの左派グループ「在独日本人反帝グループ」によって構成された「情報共同体」の特質を、彼らの戦前・戦中・戦後の軌跡をデータベース化し、整理することで、まとめあげることであった。そのデータベースは、ワイマール末期からナチス期にドイツに滞在した有澤広巳・国崎定洞・千田是也・勝本清一郎ら日本人知識人・文化人について、研究代表者が主宰するインターネット上のホームページ「ネチズンカレッジ」内に「1930年代在独日本人反帝グループ参加者・関係者一覧」の特別ページを設け、2006年9月15日現在の最新データを約100人分掲載して、社会的にも公開した。それは同時に本研究の研究成果報告書にも収録したが、研究期間中の成果を総括する過程で見いだしたものは、当初、丸山真男が敗戦直後の日本人「インテリ」の特質として特徴づけた「悔恨共同体」との対比で、「情報共同体」と想定してフィールドワークと事例研究を重ねてきた「洋行インテリ」のつながりが、「共同体」というより「ネットワーク」と特徴づけた方が適切な、地理的広がりと多様性を持っていたことである。戦間期の「情報共同体」は、戦後「悔恨共同体」へと向かわず、縁・閥・派・人脈による「情報ネットワーク」結ばれた、今日のグローバル社会を先取りする現代的性格を有していた。第1年度である平成15年度は、1920-30年代における世界各地の在外日本人コミュニティにおける「洋行インテリ」のデータベース作りを目指したが、その中心であるドイツ・ベルリン及び米国カリフォルニアについては、ほぼ予定通りに重要人物についてのデータ収集と履歴入力を終えることができた。特に初めて取り組んだ米国については、現地調査を行い、ワシントンの米国国立公文書館、米国議会図書館資料、カリフォルニア大学ロスアンジェルス校図書館の資料によって、これまでにない詳細なデータベースを作成することができた。その過程で、新たな重要な知見も得ることができた。ベルリン日本人左派グループと共に「革命的アジア人協会」を構成していたインド独立運動家ヴィレンドラナート・チャットパディアの研究から、彼の1920年代ベルリンでの配偶者である米国人ジャーナリスト・アグネス・スメドレー関係の資料を米国及び中国・上海での日本人コミュニティ・データベースと重ね合わせ、従来から知られていたニューヨークの作家石垣綾子・画家石垣栄太郎夫妻とのつながりのみならず、30年代初頭にベルリン・アメリカの双方を往き来した作家藤森成吉、労働法学者野村平爾と石垣夫妻、さらにはベルリンからモスクワにいったん亡命した演出家佐野碩が1937年ソ連を国外追放になりニューヨークの石垣夫妻に助けを求めること、このネットワークにおける、父がモスクワの片山潜の親友であり、自身はベルリンで国崎定洞・勝本清一郎・藤森成吉らと共に「革命的アジア人協会」組織化の中心となり、兄伊藤道郎がロスアンジェルスにいた演出家千田是也の役割が判明した。今年度調査の大きな副産物は、やはりスメドレー人脈の調査から広がった上海を中心としたゾルゲ事件の国際ネットワークの調査から、野坂参三が毛沢東・蒋介石と交わした未発表手紙4通を発見し、新聞でも大きく取り上げられたことである。第二年度である.平成16年度は、米国の日系移民史・日本人コミュニティ史に集中的に取り組んだ。デンバー大学及びワシントン国立公文書館・議会図書館の調査は、本研究の本来の目的であるコロラド州日本人コミュニティについて貴重な資料を得たほかに、思わぬ副産物をももたらした。一つは、1925-28年にデンバー大学留学中の日本人学生名簿のなかに、1930年に上海でリヒアルド・ゾルゲに尾崎秀実を紹介した謎の米国共産党員鬼頭銀一と、30年代に日本共産党野坂参三のアメリカからの対日工作を助手として助けるジョー小出(本名鵜飼宣道)の二人が、同級生として共に入っていることを発見した。野坂参三らの『国際通信』と、尾崎秀実らのゾルゲ事件が、人的ネットワークで重なり合ったのである。鬼頭銀一・ジョー小出の軌跡を追って、ご遺族にも連絡を取り、聞き取り調査を行った。

そこで、ジョー小出が戦時中に日本人強制収容所から米国戦時情報局(OSS)の対日諜報宣伝(MO、ブラック・プロパガンダ)に加わったことを知り、米国国立公文書館のOSS資料を調査して、真珠湾攻撃直後の1942年春に米国心理戦共同委員会で「天皇を平和のシンボルとして利用する」日本プランが作成されていたことを発見した。「象徴天皇制」について、これまで知られていなかつた米国側重要文書の発見で、邦字・英字新聞で大きく報じられた。それは、雑誌『世界』2004年12月号に発表され、近く単行本になる予定である。第3年度である平成17年度は、中間的成果を、単著及びいくつかの論文のかたちで発表することができた。平成16年度のアメリカでの調査で、米国戦略情報局(OSS)の資料の中に、1942年6月に作成された「日本計画」という戦後日本構想を発見し、それが開戦半年のミッドウェイ海戦段階で早くも「天皇を平和の象徴として利用する」「皇居を爆撃しない」「日本人に戦後の自由と繁栄を保証する」等々の重要な内容を含んでいることを『象徴天皇制の起源米国の心理戦「日本計画」』(平凡社新書)として発表した。OSSは、戦後CIAの前身の米国初の本格的情報機関であったが、戦間期における米国・英国・ソ連・中国・日本の情報戦・情報政治のあり方を、全体として概観し比較することができた。特に重要なのは、狭い意味での諜報活動よりも、米国OSS調査分析部(RA)で行われた社会科学・人文科学の戦争動員であった。経済学・政治学・社会学から民族学・心理学・美学にいたる延べ2000人もの学者を動員し、敵国日本・ドイツ・イタリアのみならず、アジア・アフリカ諸国についても各国の政治・経済・地理から国民性・習俗までを学際的に研究し、戦後のいわゆる地域研究の原型をつくっていた。戦後に著名になる学者たち、W・W・ロストウ、A・シュレジンジャーJr、W・レオンチェフ、S・ヒューズ、E・シルズ、H・マルクーゼ、F・ノイマン、P・スウィージー、J・K・ファアバンク、J・F・エンブリーらの戦争協力の証拠が署名・無署名で多数含まれていた。ほとんどが当時の機密文書で全面公開はようやく2001年であった。その中核を成す「ドノヴァン長官文書」のマイクロフィルムが、日本では国会図書館にもなく、一橋大学図書館と早稲田大学政経研究所にのみ所蔵されていることも判明し、そこには本研究で言う日本人「洋行インテリ」を対日戦に利用した記録も入っていた。平成18年度は、本研究の最終年度にあたり、1920-30年代「洋行インテリ」によって構成された「情報共同体」の特質を、彼らの戦前・戦中・戦後の軌跡をデータベース化し整理することで、まとめあげ総括した。そのうち(1)ワイマール末期からナチス期にドイツに滞在した有澤広巳・国崎定洞・千田是也・勝本清一郎ら日本人知識人・文化人については、研究代表者が主宰するインターネット上のホームページ「ネチズンカレッジ」内に「1930年代在独日本人反帝グループ参加者・関係者一覧」の特別ページを設け、2006年9月15日現在の最新データを約100人分掲載して、社会的にも公開した。同時に、英文及び和文で論文・著書を執筆し、一部はすでに公刊された。
酸化反応における適切な熱的危険性評価手法の構築

本研究では,酸化反応の熱的危険性を適切に評価するために,熱分析に供するための試料容器と酸化物との反応により生成する金属イオンおよび金属微粒子による酸化反応挙動への影響を検討した.対象は3級ピリジン樹脂の硝酸による酸化反応とした.研究の結果,試料容器と酸化剤との反応により生成し,試料容器から脱離した鉄酸化物により,測定対象物質の発熱開始温度及び発熱量の測定に影響を及ぼすことが分かった.また,適切な厚みのガラス容器の試料容器への挿入によって,鉄酸化物を試料に混入することを防止することより,適切な熱的危険性評価ができる可能性を示した.本研究では,酸化反応の熱的危険性を適切に評価するために,熱分析に供するための試料容器と酸化物との反応により生成する金属イオンおよび金属微粒子による酸化反応挙動への影響を検討した.対象は3級ピリジン樹脂の硝酸による酸化反応とした.研究の結果,試料容器と酸化剤との反応により生成し,試料容器から脱離した鉄酸化物により,測定対象物質の発熱開始温度及び発熱量の測定に影響を及ぼすことが分かった.また,適切な厚みのガラス容器の試料容器への挿入によって,鉄酸化物を試料に混入することを防止することより,適切な熱的危険性評価ができる可能性を示した.酸化反応は化学産業の中で一般的に用いられている反応であるが,発熱反応であるために爆発事故の事例が多い.本研究では,酸化剤に対して不活性な容器内での発熱開始温度及び発熱量を得る評価手法を開発するとともに,適切な危険性評価に支障をきたす原因と考えられる金属イオン及び金属微粒子による酸化反応挙動への影響を明らかにする.まず不活性容器内での発熱挙動評価手法の整備を行った.示差型断熱熱量計の試料容器(ニッケルークロム合金製)の内側に各種コーティングを施すとともに,試料容器に複数の厚さのガラス容器を挿入し,容器材質の影響による分解挙動の変化が大きい有機過酸化物の発熱挙動を測定し,その変化を検討した.その結果,セラミックコーティング,ダイアモンドライクカーボンコーティング及び薄いガラス容器は強度に難があった.また,金メッキについては,試料によっては極端に低温から分解し,不活性な条件ではなかった.このことから,適切な厚さのガラス容器を挿入して金属との接触を遮断することにより,容器材質の影響を受けずに発熱挙動の評価ができることがわかった.また,複数の有機過酸化物について一般的に熱的危険性評価に使用されている断熱熱量計との評価結果の比較を行った.その結果,容器材質の影響を受けて分解が活性化する試料を除き,反応初期時の評価結果はよく一致したことから,上記で整備した不活性な容器内での発熱挙動評価手法は,熱的危険性を過小に評価することがないことを確認した.さらに,3級ピリジン樹脂と硝酸との反応について,硝酸を配位した3級ピリジン樹脂の昇温時の反応挙動を検討し,昇温時に脱離した硝酸により3級ピリジン樹脂が酸化されることを明らかにした.上記の評価手法の整備及び反応挙動の解明は,次年度に実施する金属イオン及び微粒子による酸化反応挙動への影響を評価するための基盤となる成果である.酸化反応は化学産業の中で一般的に用いられている反応であるが,発熱反応であるために爆発事故の事例が多い.本研究では,酸化剤に対して不活性な容器内での発熱開始温度及び発熱量を得る評価手法を開発するとともに,金属イオン及び金属微粒子による酸化反応挙動への影響を明らかにする.今年度は,試料容器に入れられた酸化性物質が熱分析の結果に及ぼす影響及び原因を検討することを目的として,硝酸単独の加熱時の熱挙動を測定するとともに,硝酸とステンレス鋼の相互作用による熱挙動を測定した.また,測定後のステンレス鋼容器内側の表面を観察し,熱挙動と表面状態との関係を調べた.その結果,硝酸単体では吸熱のみであったのに対し,硝酸とステンレス鋼が共存すると発熱が検知され,発熱挙動は硝酸濃度及び鋼種によって変化した.また,容器内側表面には鉄およびクロム酸化物が盛り上がるとともに,場所によっては層状にはがれる様子が確認された.また,既往の研究で知見が得られている3級ピリジン樹脂の硝酸による酸化反応の系に,金属イオンおよび微粒子を添加して,当該反応の発熱挙動の変化を検討した.発熱挙動の測定には示差走査熱量計を使用した.金メッキした試料容器に3級ピリジン樹脂と10M硝酸の混合物(重量比;2:8)を充てんし,金属イオン含有溶液水溶液及び金属酸化物を外割で10wt%添加した試料の発熱挙動を測定し,その変化を検討した.その結果,三価の鉄イオンおよび酸化鉄を添加した試料については,より低温側に新たな発熱ピークが出現するとともに,発熱量が大きくなる傾向を示した.以上から,試料容器と酸化剤との反応により生成し,容器からはがれた鉄酸化物により,測定対象物質の発熱開始温度及び発熱量の測定に影響を及ぼすことを明らかにした.上記の知見は,酸化反応の熱的危険性を適切に評価するための基盤となる成果となる.26年度が最終年度であるため、記入しない。化学安全工学26年度が最終年度であるため、記入しない。酸化剤に対して不活性な容器内での発熱挙動評価手法の整備を行うことができた.また複数の有機過酸化物の熱分解反応について,異なる評価手法で得られた熱的危険性に関するパラメータの比較を行い,整備した発熱挙動評価手法により,熱的危険性を過小に評価することがないことを確認した.さらに,硝酸を配位した3級ピリジン樹脂の昇温時の反応挙動を検討し,昇温時に脱離した硝酸により3級ピリジン樹脂が酸化されることが明らかとなった.

これらによって,金属イオン及び微粒子の影響を受けない状態での酸化反応の発熱挙動を検討することが可能となったと考えられ,当初の目的を達成したといえる.今後は,3級ピリジン樹脂の硝酸による酸化反応の系に金属イオンおよび微粒子を添加して発熱挙動を測定し,その変化を把握する.また,生成物の化学分析を行い,昇温時の反応挙動を検討する.それらの知見をもとに,金属イオン及び微粒子の共存によって変化した発熱挙動に寄与する反応機構を明らかにする.なお,不活性な容器内での発熱挙動評価手法の整備を行った分析装置が現在故障しているため,修理が完了するまで,感度が低いが酸化剤に対して不活性な状態での測定が可能な分析装置を代替として,検討を行う予定である.
多機能型ワクチンプラットフォームを基盤としたマラリアワクチンの開発研究

熱帯熱マラリア感染防御ー伝播阻止両機能を搭載したコンポーネントーDNAハイブリッド型BDESワクチンおよび同じ遺伝子カセットをもつHuman adenovirus type5 (AdHu5)を構築し、in vitro機能解析およびin vivoワクチン効果解析を行い、下記の成果を得た。(1)Pfs25-PfCSP融合型BDESワクチンを作製し、ウイルス粒子上にこの融合タンパクが発現・提示されていることをウエスタンブロッティングで確認した。(2)BDESの特長である哺乳類細胞へのtransduction効率を間接蛍光抗体法により確認した。膜非透過条件でも強いシグナルが細胞膜に検出されたことから、効率よく膜表面にPfs25-PfCSP融合型タンパクが提示されていることが明らかとなった。(3)Pfs25-PfCSP融合型AdHu5ワクチンを作製し、この融合タンパクが発現・提示されていることをウエスタンブロッティングおよびFIAで確認した。(4)AdHu5-prime/BDES-boost heterologous免疫法を用いて、マウスへの接種実験を行い、細胞性免疫についてはELISPOT法でPfCSPペプチド特異的なIFN-g産生細胞の存在が確認され、液性免疫についてはELISA法により抗PfCSP,抗Pfs25抗体産生が確認された。(5)感染防御および伝播阻止効率をマウスモデルで評価するために、Pfs25-PfCSP double chimeric transgenic parasitesを作製し、Pfs25, PfCSPの発現を確認した。(5)免疫マウスにPfs25-PfCSP double chimeric transgenic parasitesをチャレンジ感染させ、その感染防御効果を検証中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。熱帯熱マラリア感染防御-伝播阻止両機能を搭載したコンポーネント-DNAハイブリッド型BDES-NVPワクチン作製を完了:熱帯熱マラリア原虫のワクチン候補抗原遺伝子Pfs25とPfCSP両遺伝子をBDES-NVPワクチンに導入し、BDES-Pfs25-PfCSPを構築した。さらに機能評価として、ウエスタンブロッティングによる抗原タンパクの発現確認(コンポーネントワクチン機能解析)、共焦点顕微鏡による動物細胞へのトランスダクション発現確認(DNAワクチン機能解析)を終え、作製したワクチンが十分な機能を有していることを確認した。当初の計画通り、熱帯熱マラリア感染防御-伝播阻止両機能を搭載したコンポーネント-DNAハイブリッド型BDES-NVPワクチンの作製を完了し、その機能解析にも着手している。熱帯熱マラリア感染防御ー伝播阻止両機能を搭載したコンポーネントーDNAハイブリッド型BDESワクチンを構築し、in vitro機能解析およびin vivoワクチン効果解析を行い、下記の成果を得た。(1) Pfs25-PfCSP融合型BDESワクチンを作製し、ウイルス粒子上にこの融合タンパクが発現・提示されていることをウエスタンブロッティングで確認した。(2) BDESの特長である哺乳類細胞へのtransduction効率を間接蛍光抗体法により確認した。(3)マウスへの接種実験を行い、細胞性免疫についてはELISPOT法でPfCSPペプチド特異的なIFN-g産生細胞の存在が確認され、液性免疫についてはELISA法により抗PfCSP,抗Pfs25抗体産生が確認された。熱帯熱マラリア感染防御ー伝播阻止両機能を搭載したコンポーネントーDNAハイブリッド型BDESワクチンの動物接種実験および伝播阻止実験を実施し、効果的ワクチンであることを見出した。in vivo評価:BDES-Pfs25-PfCSPをマウスに接種し、血清を採取してELISA法によりPfCSP、Pfs25に対する抗体価を測定する。ELISA

抗原は大腸菌で発現した組換えPfs25, PfCSPタンパクを用いる(精製済み)。感染防御実験(I):マウスにワクチン接種後、遺伝子組換え原虫PfCSP/Pbが感染したハマダラカで吸血チャレンジする。5-14日後にギムザ染色した血液薄層塗沫標本を作製し、顕微鏡で感染の有無、原虫増殖率を観察・測定し、感染防御効果を評価する。熱帯熱マラリア感染防御ー伝播阻止両機能を搭載したコンポーネントーDNAハイブリッド型BDESワクチンの動物接種実験を再度実施して、データの再現性を検証する。またBDESワクチンに加え、アデノウイルスワクチンも作製し、2つのワクチンを用いたHeterologous prime-boost免疫法をによる感染防御効果を調べ、臨床応用への可能性を探る。29年度が最終年度であるため、記入しない。
甘味関連タンパク質の構造・機能相関解析

タンパク質の多くは無味であるが、甘味を持つタンパク質の存在が複数知られている。ネオクリンは甘味と味覚修飾活性(酸味を甘味に換える活性)を併せ持つユニークなタンパク質である。その分子表面に塩基性アミノ酸が集まっていることに注目し、塩基性ヒスチジン残基をアラニン残基に置換したネオクリン変異体を作成した結果、それらの残基が味覚修飾活性に深く関与していることが明らかになった。ネオクリンは舌上に存在する甘味受容体によって認識されていることから、受容体側を遺伝子学的に改変し、受容体のどの部位がネオクリンと相互作用しているかについても一定の知見を得た。甘味料は舌状に存在する甘味の受容体タンパク質と相互作用することが知られてきており、甘味タンパク質も同じ受容体と相互作用することが既に判明している。本研究では甘味を呈すると同時に味覚修飾活性(酸味を甘味に変換する活性)を有するタンパク質ネオクリンを対象とし、その活性のメカニズムを明らかにすることを試みた。本年は、まずネオクリン分子の表面電荷の重要性を検討した。ネオクリンに存在するヒスチジン残基を全てアラニンに置換したバリアントを作製したところ、この分子は味覚修飾活性を失い、pHとは関係なく甘味を呈する性質を示した。このことから、ヒスチジン残基が味覚修飾活性に重要な役割を果たしていることが示唆された。またこれまでの研究から、ネオクリンの味覚修飾活性にはサブユニット間の柔軟性が重要な役割を果たしている可能性が高く、シュミレーションではpHによってサブユニットの相対的位置が変わる可能性が示唆されてきた。そこで今回は植物から精製したネオクリン分子および上記のバリアントについて、蛍光測定・円二色性偏光(CD)測定を行った。CDスペクトルは植物から精製したネオクリン分子とバリアントの両方についてどの測定pH(pH3.07.0)でも変わらなかったが、蛍光スペクトルは野生型ネオクリンについてはpH依存的に変化することが確認された。ただし、野生型ネオクリンで見られた蛍光スペクトルの変化はバリアントでは観測されず、蛍光スペクトルの変化が味覚修飾活性発現に伴う構造変化と相関しているものと考えられた。ネオクリンの味覚修飾活性がpH依存的な何らかの構造変化を伴っていることが分光学的に測定されたのは今回が初めてであり、今後の甘味タンパク質研究に重要な情報をもたらしたと考えられる。本研究では甘味を呈すると同時に味覚修飾活性(酸味を甘味に変換する活性)を有するタンパク質ネオクリンを研究対象とし、タンパク質の構造および構造変化の面からその活性のメカニズムを明らかにすることを試みた。昨年はネオクリン分子の表面に存在する複数のヒスチジン残基を全てアラニン残基に置換した変異体を作製し、これらのヒスチジン残基の少なくとも一部が味覚修飾活性に重要な役割を果たしているという結果を得た。この変異体では味覚修飾活性が失われると同時に、野生型ネオクリンで観察されたpH依存的な円二色性偏光(CD)の変化・蛍光変化が見られないことが明らかになった。そこで本年は、ネオクリンの表面に5つ存在するヒスチジン残基を1つあるいは複数ずつアラニンに置換した変異型酵素を作製し、その甘味活性と味覚修飾活性を検討した。その結果、2つの活性に関与するヒスチジン残基が異なることが示唆される結果が得られた。また、血液凝集活性試験、細胞毒性試験、DNAマイクロアレイ解析といった手法を用いてネオクリンの安全性を検証した。
直下型地震動を受ける鋼多層骨組の部材歪の予測と制振装置導入による歪応答低減効果

直下型地震では,水平地動にかなりの上下地動が加わる場合がある。本研究では,スパンの長い5層モデル骨組を対象として,3つの記録地震動を増幅したモデル地動を用いて,水平地動のみの場合とそれに上下地動が加わった場合の変位応答,歪応答などの比較検討を行い次のような結果を得た:対象とした骨組,入力地動に関して,1,水平変位時刻歴応答は,水平地動のみを入力した場合と水平地動と上下地動を同時に入力した場合で顕著な差は見られない。2,梁中央の節点は揺れ下がっており,鉛直変位応答は水平地動と上下地動を同時に入力したほうが,水平地動のみを入力した場合より大きくなる。3,梁端および梁中央の歪応答は,タフト,神戸では水平地動と上下地動を同時に入力した方が,水平地動のみを入力した場合より大きくなる箇所が多く,その増大率は無視できない。以上のことから,比較的梁スパンの長い骨組で梁の上下振動が生じやすい場合には,梁の揺れ下がり,それに伴う梁端および梁中央の歪みに上下地動の影響が顕著に現れる可能性があり,上下地動の影響を設計に反映させるには,歪レベルの情報を抽出する必要があることを確認した。現在,鉄骨造骨組の耐震性能アップの手法として,今後かなり積極的に組み込まれるであろう制振システムの効果を,歪応答量の面から評価する応答解析に取り組んでいる。弾塑性履歴型制振システムを骨祖に組み込んだ場合について,水平・鉛直両方向の地震動入力に対する骨組内の歪応答の低減効果などを調べている。最終的には,直下型地震にも有効な制振システムの特性,設置場所などについて検討する予定である。
宗教的資源の観光的活用と世界遺産指定との関係に関する宗教学的研究

世界遺産指定に関わる地域において、宗教を観光資源として活用する動きは非常に強い。これは行政や観光産業の側からの要求であることはもちろんであるが、宗教の側からも、観光を積極的に利用しようという動きも大きい。ただ、当該地域の宗教の位置によって相違が見られる。熊野の事例では神道は積極的であるが、長崎のキリスト教の事例では観光に対して強い懐疑をもっている。また、世界遺産指定を目指す地域では、住民たちが自らの地域の歴史や伝統を改めて自覚し、彼らのアイデンティティを強化している事例が認められる。本年度は、実施計画に沿って、2つの方向性から研究を行った。1つは、本研究の課題、とりわけ世界遺産と観光をめぐる研究動向の理論的把握にむけて、研究会を組織して具体的な事例の報告と関連文献のサーベイを行った。具体的には、研究会3回もち、すでに世界遺産指定となっているロシアのソロフキ修道院、吉野・熊野地域、さらに指定を目指す動きのある四国遍路に関する研究発表を行い、情報交換とそこに看取される理論的な問題について認識を深めた。また、研究分担者の一人は、熊野の基礎的資料を把握するため、新宮市立図書館、田辺市立図書館、和歌山県立紀南図書館、和歌山県立図書館を訪れ、近現代における当該地域の社寺参詣と観光を対象とした文献調査を行なった。もう1つは現地調査の実施である。具体的には、熊野・吉野地域と、指定に向けて準備が急速に進んでいる長崎のカトリック教会群への調査である。前者は、熊野古道の主要部分、熊野那智大社、熊野速玉大社、熊野本宮大社へのフィールドワークを実施した。また、和歌山県世界遺産センターでの指定以降の各社寺の変化や和歌山県としての取り組み、その課題について聞き取り調査を行った。また、指定以降、人気を呼んでいる吉野川下りに乗船している観光ボランティアへの聞き取り調査を行った。さらに、熊野参詣曼荼羅を模して、新しい曼荼羅を作り、現代の熊野比丘を演じているガイドへの聞き取り調査も実施した。もう一つの調査対象である長崎県のカトリック教会群に関しては、長崎市内・島原半島・東彼杵地区(大村市や波佐見町)・西彼杵地区(西海市)のキリシタン関連史跡の観光活用に関する調査と、これに付随して観光活用に伴う様々な問題の倫理的検討について、住民や行政担当者等からの聞き取り調査を実施した。長崎の教会群の調査については、長崎県の長崎市、平戸市において調査を実施した。長崎市ではカトリック教会を母体にしたNPO法人長崎巡礼センターを訪れ、現在の巡礼創出の準備状況や問題点などを聞き取りした。巡礼地の拠点となる長崎、外海、五島市、上五島町の各センターの設置によって、カトリック教会と現地の組織とのコミュニケーションが良くなっていることが理解された。平戸市根獅子地区では、世界遺産の構成要素の可能性がある文化景観の整備状況を担当者に聞き取りを行った。さらに、生月のカクレキリシタン聖地のうち、焼山御堂やガスパル様とそれに隣接する住宅および墓地の現状、西彼杵半島の教会および天正遣欧少年使節に関する史跡について聞き取りを行った。なお、これに関連して、鹿島県のカトリック関連施設と遺跡であるザビエル記念聖堂、福昌寺跡の裏手にあるキリシタン墓地、熊本県の正覚寺キリシタン墓碑群、天草の崎津教会、大江天主堂、天草ロザリオ館、天草キリシタン資料館を訪れ、関係者に聞き取りを行った。吉野・熊野地域については、新宮市の観光協会と、協会に登録している新宮市ガイドの会への聞き取り調査を実施した。さらに、中辺路や雲取峠などの熊野古道の代表的なルートのうち、大雲取越えを実際に歩き、このルートの整備状況について実地検分した。また、この地域の資料を収集と聞き取りために、和歌山県立図書館・和歌山県商工観光労働部観光振興課を訪れた。今年度は、若干予定を変更して、主に長崎を中心に調査を行った。まず、計画通り、五島市と新上五島町の調査を実施した。五島市はカトリック巡礼センターのステーションを訪れて、その担当者に聞き取りをした。さらに、奈留島に渡り、カクレキリシタンの集落とその研究センターを訪れた。新上五島町では、同じく巡礼センターのステーションを訪れ、聞き取り調査を行った。また、同町では、世界遺産指定を見こんで、巡礼者の増加を期待して彼らを収容できるホテルも建設されるようになっており、そのホテルの関係者にも聞き取りを行った。新上五島町としては、巡礼を含めて韓国からの誘致に力を入れていることを実感した。さらに、昨年、調査した熊本県の天草の対岸にある島原半島のキリシタン関連遺跡(原城趾、キリシタン墓石)を訪れ、南島原市役所の担当者にも聞き取り調査を行った。これとは別に、長崎のキリスト教教会群の関連資産の重要な要素であるカクレキリシタンと深く関わる外海と平戸市の根獅子町も、昨年と同様に聞き取り調査を行った。

とりわけ、後者は、自らの先祖の信仰であるカクレキリシタンの伝統を積極的に町おこしに活用し、その地の6名の殉教者に因んで「おろくにんさま」という地酒を造ったことは興味深い。また、平戸において、カクレキリシタンの聖地と呼ばれている安満岳にも登り、頂上付近にある祠の調査を行った。熊野・吉野地域については、熊野古道をさらに調査する予定であったが、結果的に、大型の台風によって甚大な被害を被った、熊野の三つの神社(那智大社、速玉大社、熊野本宮)の現状を見聞するに留まった。熊野川の辺に位置していた世界遺産熊野本宮館が大きな被害を受けたのは痛恨の極みであった。四国については、予算の関係で残念ながら調査することができなかった。後日を期したいと思っている。
骨髄不全症候群症例における免疫機構の解明

本年度は自己免疫疾患的側面の骨髄低形成と腫瘍的側面のクローン性造血という両者を有する骨髄不全症候群において細胞傷害性T細胞(CTL)と制御性T細胞(Treg)が如何に関与して骨髄不全症候群の病態を形成するかを検討した。まず、発作性夜間血色素尿症(PNH)におけるCTLの役割についての検討においてはウイルムス腫瘍遺伝子(WT1)ペプチド特異的HLAクラスI拘束性CTLが増加しており、しかもその攻撃をPNHクローンが相対的に回避することを確認し、さらにCTLがインターフェロンガンマを産生することを見いだした。以上よりPNHにおいてはHLA拘束性WT1ペプチド特異的CTLが誘導され、その攻撃に対してPNHクローンが相対的に残存し拡大するという腫瘍的側面とともに、自己免疫疾患的側面による造血障害機序の一端を示した(Ikeda K et al., Exp Helnatol, in press)。次に、再生不良性貧血(AA)、PNHおよび骨髄異形成症候群(MDS)におけるTregとCTLの関連について検討した。AAにおいてはTreg数・比率および機能の低下を認め、自己反応性CTL増加による骨髄障害の背景になっている可能性が示唆された。逆にMDSにおいてはTreg数・比率および機能の増加傾向を認め、自己反応性CTL減少による異常クローン増加の背景になっている可能性が示唆された(Akutsu K et al., American Society of Hematology,2006)。今後はさらに樹状細胞など免疫制御に関与する他の細胞との関係も含めて詳細に検討していく予定である。
内分泌撹乱物質投与によるラット雌性不妊の誘起とその機構解明に関する研究

外因性内分泌かく乱物質の哺乳類生殖機能への影響を評価する目的で、出生直後のアンドロゲン投与で連続発情(PE)ラットを作出した。このラットに妊卵着床前のホルモン環境を人工的に設定して、子宮内膜の性ホルモン受容体発現ならびに成長因子(EGFとTGF-α)とその受容体発現の変化を免疫組織学に追究し、内分泌かく乱物質の子宮における評価指標の検討を行った。更にその指標を用いて、bisphenol-A(BPA)のラット子宮に及ぼす影響を評価した。正常ラット子宮上皮および間質のPR発現は、P投与3日後に低下するが、投与3日目にE2を加えると、発現が回復した。これに対してPEラットでは、PR発現が低下しており、E2により上皮のPR発現が殆ど消失した。また、正常ラット子宮上皮のER発現は3回のP投与により消失したが、PEラット子宮上皮では発現は殆ど抑制されなかった。成長因子(EGF、TGF-α)とその受容体(EGF-R)発現は、妊娠前期の環境を模した種々の性ホルモン投与に対して大きな変動を示さなかった。出生日から7日間BPA投与を投与したラットは、正常な性周期を示し、性熟後に摘出した卵巣中には、濾胞と黄体を認めた。しかし、卵巣重量は、0.1およびmg投与群で有意に減少し、子宮は、逆にこれらのBPA投与群で有意増加していた。PRおよびER発現に変化は各ホルモン処理後に僅かな変化が認められたが、着床日を模したホルモン処理に対して、対照群と類似した性ホルモン受容体発現を示した。連続発情ラットの子宮は、上皮および間質細胞のホルモン依存性受容体発現が変化し、これが性ホルモンに対する内膜細胞の増殖活性に反映したと考えられる。子宮における内分泌かく乱物質の影響を評価する上で、性ホルモン受容体発現の検索は有用である。周生期のBPA処理は、視床下部-下垂体系の雄化誘導には到らなかったが、成熟後の卵巣および子宮重量に影響した。しかし、これらのラットの性ホルモンに対する子宮内膜の反応性は、正常ラットに近く、検索した生後60日齢における周生期BPA処理の持続効果は少ないと結論される。基礎実験として、周生期の雄性ホルモン処理により春期発動期(約30日齢)以降、卵巣から少量のエストロゲンを持続的に分泌するラットを作り、この動物のが内分泌かくらん化学物質の雌性生殖機能への影響を追究する有用なモデルとなる得るかどうか検討した。生後5日齢の雌ラットにtestosterone propionate(TP)を皮下投与し、60日齢に達した後、除卵巣した。このラットに妊娠初期を模したホルモンを投与して、子宮内膜を調べた。具体的には、3mg progesterone(P)を2-3日間連続投与、その3日目に所謂nidatory estrogen surgeを模した0.2μg estradiol-17β(NE)を投与する。各ホルモン処理後に屠殺して、免疫染色により、PRおよびERの発現を調べ、子宮のPおよびEに対する反応性を連続発情ラットと正常ラットとの間で比較した。正常ラット子宮上皮および間質細胞のPR発現は、P投与3日後でやや低下するが、投与3日目にNEを加えると、発現が回復する。これに対してTP処理連続発情ラットでは、PR発現が低下している上、NEにより上皮のPR発現が殆ど消失する。

上皮および間質細胞のER発現は、正常ラットよりも連続発情ラットで高い。PRはEの誘導蛋白質であるが、内膜上皮細胞のPRはEによりdown-regulateされる。しかし、Pの十分有る環境では逆にPR発現をup-regulateする。一方、連続発情ラットでは、NEのup-regulation効果が見られず、逆にPR発現を抑えた。連続発情ラットにおけるNEのPR発現における無効果は、P投与後における上皮ER発現が対照ラットより高いことによると思われる。連続発情ラット子宮は、Eに対してsensitiveになっており、卵巣除去後に投与したEによる上皮細胞分裂活性が対照ラットより高いことからもこの事は支持される。以上の結果から、連続発情のラットにおける妊卵着床反応の低下(脱落膜種形成能の低下)は、PおよびEに対する子宮上皮細胞の反応性の恒常的変化、特にEに依存するPR発現の変化によると結論付けることが出来、子宮における性ホルモン受容体の発現は、内分泌攪乱物質長期投与に影響を検索する指標となる得ることがわかった。現在、内分泌攪乱物質を投与して、受容体発現を検索している。1.研究目的外因性内分泌かく乱物資の哺乳類生殖機能への影響を評価する目的で、出生直後のアンドロゲン投与で連続発情(PE)ラットを作出した。このラットに妊卵着床前のホルモン環境を人工的に設定して、子宮内膜の性ホルモン受容体発現ならびに成長因子(EGFとTGF-α)とその受容体発現の変化を免疫組織学に追究し、内分泌かく乱物質の子宮における評価指標の検討を行った.更にその指標を用いて、bisphenol-A(BPA)のラット子宮に及ぼす影響を評価した.2.結果(1)PEラットにおける性ホルモン受容体と成長因子の変化正常ラット子宮上皮およぴ間質のPR発現は、P投与3日後に低下するが、投与3日目にE2を加えると、発現が回復した。これに対してPEラットでは、PR発現が低下しており、E2により上皮のPR発現が殆ど消失した。また、正常ラット子宮上皮のER発現は3回のP投与により消失したが、PEラツト子宮上皮では発現は殆ど抑制されなかった.成長因子(EGF、TGF-α)とその受容体(EGF-R)発現は、妊娠前期の環境を模した種々の性ホルモン投与に対して大きな変動を示さなかった。(2)周生期BPA投与の子宮への影響出生日から7日間BPA投与を投与したラットは、正常な性周期を示し、性熟後に摘出した卵巣中には、濾胞と黄体を認めた。しかし、卵巣重量は、0.1およびmg投与群で有意に減少し、子宮は、逆にこれらのBPA投与群で有意増加していた.PRおよぴER発現に変化は各ホルモン処理後に僅かな変化が認められたが、着床日を模したホルモン処理に対して、対照群と類似した性ホルモン受容体発現を示した。3.結論(1)連続発情ラットの子宮は、上皮および間質細胞のホルモン依存性受容体発現が変化し、これが性ホルモンに対する内膜細胞の増殖活性に反映したと考えられる。子宮における内分泌かく乱物質の影響を評価する上で、性ホルモン受容体発現の検索は有用である。(2)周生期のBPA処理は、視床下部-下垂体系の雄化誘導には到らなかったが、成熟後の卵巣および子宮重量に影響した。
肥満による気管支喘息誘発機序の解明と特異的治療法の開発

肥満は気管支喘息の主要なリスク因子であるがその機序は不明であった。本研究は、ω-6脂肪酸が肥満と気管支喘息を繋ぐ鍵分子であるとの仮説を基に、長鎖遊離脂肪酸受容体(FFAR1, FFAR4)の気管平滑筋上での発現、及びその気管平滑筋収縮作用と気道リモデリング作用について検討した。その結果、気管平滑筋上における長鎖遊離脂肪酸受容体群の発現が同定された。またω-6脂肪酸は、気管平滑筋収縮を促進させること、また気道リモデリングを促進することが明らかとなった。これらの結果はω-6長鎖遊離脂肪酸が肥満者に特異的な気管支喘息誘発因子であることを示唆するものである。本年度は気管平滑筋における遊離脂肪酸受容体の同定と気管平滑筋収縮機構を中心に研究を行った。1.RT-PCR法により、気管平滑筋における遊離脂肪酸受容体FFAR1,2,3,GPR120のmRNAレベルでの発現を確認した。2.Westernblot法により、ヒト気管平滑筋組織・細胞、モルモット気管平滑筋組織におけるFFAR1受容体の蛋白レベルでの発現を確認した。3.免疫組織科学染色により、ヒト気管平滑筋組織、及びモルモット気管平滑筋組織におけるFFAR1受容体の蛋白レベルでの発現を確認した。4.FFAR1受容体の天然リガンドである長鎖脂肪酸(オレイン酸、リノレン酸)、及びFFAR1選択的作動薬(GW9508)投与により、細胞内Ca2+濃度が一過性に上昇した。これらの反応は用量依存性(1nM-10μM)に増加した。またこれらの増加はPLC阻害剤(U73122;5μM)、IP3受容体拮抗薬(Xestospongin C;20μM)投与により遮断されたのに対し、電位依存性Ca^<2+>チャネル遮断薬(verapamil;10μM)では遮断されなかった。5.アセチルコリンにより生じるモルモット気管輪収縮作用は、オレイン酸、リノレン酸、またはGW9508の同時投与により、増強された。以上の結果は気管平滑筋上のFFAR1受容体がG_q蛋白及びPLCを介して細胞内Ca^<2+>濃度及びIP_3合成量を増加させ、気管収縮をもたらす可能性を示唆するものである。次年度は遊離脂肪酸を介した気管平滑筋収縮促進機構をさらに詳細に検索する。また、遊離脂肪酸による気道の慢性炎症形成機構と気道リモデリングの解明についても行う予定である。本年度は、気管平滑筋における遊離脂肪酸受容体GPR120の同定と、気管平滑筋収縮機構を中心に研究を行った。1.Western blot法及び免疫組織科学染色により、ヒト気管平滑筋組織、及びモルモット気管平滑筋組織におけるGPR120受容体の蛋白レベルでの発現を確認した。2.FFAR1受容体及びGPR120受容体の天然リガンドである長鎖脂肪酸(オレイン酸、リノレン酸)を、ヒト気管平滑筋細胞に投与することで生じる、細胞内カルシウムイオン濃度の一過性上昇反応は、siRNAによるFFAR1受容体ノックダウンでは有意に抑制されたのに対し、GPR120受容体のノックダウンでは抑制されなかった。以上より、ヒト気管平滑筋細胞においては、長鎖脂肪酸はもっぱらFFAR1受容体に作用することが示唆された。3.オレイン酸、リノレン酸、及びGW9508を、ヒト気管平滑筋細胞に投与することで生じる、細胞内カルシウムイオン濃度の一過性上昇反応は、細胞外カルシウムイオンを枯渇させた場合、20%程度抑制された。また、TRPV1チャネル遮断薬であるcapsazepineを前投与した場合にも、この反応は20%程度抑制された。昨年度得られた結果と総合すると、長鎖脂肪酸により生じる一過性細胞内カルシウムイオン濃度上昇反応は、細胞内カルシウムストアからのカルシウムイオン供給を主な供給源としながらも、細胞外からのカルシウムイオン流入も一部寄与していることが明らかとなった。4.イソプロテレノール投与により生じるモルモット気管輪弛緩作用は、オレイン酸、リノレン酸、またはGW9508の投与により減弱された。次年度は遊離脂肪酸を介した慢性炎症形成機構と気道リモデリングの解明を中心に実施していく予定である。本年度は、遊離脂肪酸受容体の気道リモデリングへの関与を評価する目的で、長鎖遊離脂肪酸(オレイン酸)投与により生じるERK, Akt, P70S6K, S6のリン酸化の細胞内シグナリング機構を、ヒト気管平滑筋細胞において検討した。siRNAでFFAR1をノックダウンしたヒト

気管平滑筋細胞では、オレイン酸投与によるERK、Aktのリン酸化が有意に抑制されたのに対し、同じく長鎖遊離脂肪酸受容体であるFFAR4をノックダウンした場合には、抑制されなかった。現在、遊離脂肪酸受容体FFAR1およびFFAR4を介した気管平滑筋収縮機構については、Am J Physiol誌に論文投稿しrevise中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科麻酔学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り、順調に修展している。当初の予定通り、順調に伸展している。次年度は遊離脂肪酸を介した慢性炎症形成機構と気道リモデリングの解明を中心に実施していく予定である。次年度以降も当初の計画通り、研究を遂行する。オーガンバスシステムであるが、当分野現有の機器をシステムに組み込むことで、当初予定より大幅に安価に購入できた。これにより生じた残余の直接経費を次年度に繰り越した。当該経費については、試薬・抗体類の購入、細胞培養に必要なルーチン倒立顕微鏡の購入に充当予定である。平成24年度からの繰り越し分から、ベンチサイド顕微鏡を購入した。しかし想定より安価に購入できたため、平成25年度分にも、額は減少したものの、次年度使用額が生じた。気道リモデリングの細胞内シグナリング機構について、主にウエスタンブロット法によって評価していく予定である。この方法では、多種・多数の抗体が必要であることから、抗体購入費用に充てる予定である。
野生イネが持つ低栄養耐性分子戦略の解明

本年度は先ず、前年度の成果である、遺伝子-イオンの共発現解析を通じて見出したカリウム欠乏耐性に関与する野生イネ特異的な分子ネットワークの解析を行い、野生イネが持つ低カリウム耐性の分子戦略を明らかにすることを試みた。その結果、野生イネ特異的分子ネットワークが、熱ストレスや冠水ストレス時に誘導される遺伝子群と類似していることを明らかにした。このことは、野生イネが示すカリウム欠乏耐性は熱や冠水ストレスへの応答との関連があること、さらに、そのストレス応答によって野生イネは栽培イネが持たない低カリウム耐性を持つことを示唆する。また本年度は、先進ゲノム支援に採択され、前年度の報告で予算の都合上変更を予定していた、リン欠乏耐性を持つ野生イネ系統(GP)における遺伝子-イオン共発現解析を行うことができた。その結果、リン欠乏時に共発現する遺伝子-イオンの分子ネットワークとして、栽培イネ(T65)で13の、GPで6つのグループ(モジュール)をそれぞれ検出した。これらのモジュールの中で、リンはT65で一つの、GPで2つのモジュールに含まれていた。リン関連モジュールの比較解析から、GPが持つリン関連モジュールの1つは、T65のリン関連モジュールと相同であり、もう一つが野生イネ特異的なモジュールであることを明らかにした。このGP特異的リン関連モジュールは、GPが示すリン欠乏耐性に関連していると考えられる。本年度は、カリウム欠乏応答に引き続き、リン欠乏応答においても遺伝子-イオンの共発現ネットークを描画することができた。本成果は、イオノームとトランスクリプトームの統合解析がイネの栄養応答を解析する上で極めて有効であることを示すとともに、野生イネの低栄養耐性の分子戦略を明らかにするための重要なツールになることを示している。本年度は、遺伝子-イオンの共発現解析を通じて見出したカリウム欠乏耐性に関与する野生イネ特異的な分子ネットワークに関して、その解析から野生イネが持つ低栄養耐性の分子戦略を明らかにできるかが課題であった。幸運なことに、遺伝子-イオン共発現ネットワークは遺伝子発現を元素と関連づけて解析する上で極めて有効であり、野生イネが持つ低カリウム耐性の分子戦略(カリウム欠乏に応答したストレス応答遺伝子群の発現)を明らかにすることができた。現在解析中であるため、実績には含めていないが、熱や冠水とカリウム欠乏の共通点になり得るカイネースを同ネットワークから見出しており、野生イネが持つカリウム欠乏耐性の詳細な分子戦略が解明できると期待している。また、先進ゲノム支援に採択されたことにより、当初の予定通り、低カリウム耐性の遺伝子-イオン共発現ネットワーク解析を実施・野生イネ特異的リン欠乏関連モジュールを同定できたことも本年度の成果として大きい。一方で、イオノームトランスクリプトームとは別に予定していたメタボローム解析やホルモノーム解析についての進行が遅れており、次年度の課題となっている。これらの状況を鑑み、自己点検による評価では「おおむね順調に進展している」を選んだ。次年度は、申請研究の最終年度にあたる。メタボローム解析を実施し、当初の達成目標であった、遺伝子-イオン-メタボロームを統合した、マルチオミクス共発現ネットワークの描画へ力を注ぐとともに、低カリウム耐性野生イネ系統(GK)については、その原因遺伝子の単離を行う。また、低リン耐性野生イネ系統(GP)で同定した野生イネ特異的リン関連モジュールを形成する遺伝子群の解析から、野生イネが持つ低リン耐性の分子戦略の解明を行う。最終的な研究成果は、投稿論文として国際誌に投稿するとともに、論文投稿後には、本研究の大きな成果であるマルチオミクス共発現ネットワークのデータベース化を進めて行きたい。我々はこれまでに、カリウム欠乏に耐性を示す野生イネイントログレッション系統(GK)を単離し、GKでは、野生イネ由来の1遺伝子座により低カリウム耐性が獲得されていることを示した。本年度は、栽培イネ(T65)とGKのカリウム欠乏処理後の時系列トランスクリプトーム、時系列イオノームデータを取得し、遺伝子-イオンの共発現解析を行うことで、カリウム欠乏耐性に関与する分子ネットワークを同定することを試みた。まず、カリウム欠乏時に共発現する遺伝子-イオンの分子ネットワークとして、T65で7つ、GKで5つのグループ(モジュール)をそれぞれ検出した。次に、各モジュールの遺伝子オントロジー解析およびその比較から、T65に特異的な2つのモジュール、GKに特異的な2つのモジュールを見出した。T65に特異的な2つのモジュールはタンパク質合成や細胞分裂に関与する遺伝子で構成されており、カリウム欠乏下でT65の成長が低下していることと一致した。一方で、G27特異的モジュールは光合成や環境ストレス応答に関与する遺伝子で構成されていた。さらに、GKで検出された遺伝子-イオン共発現ネットワークにおいてカリウムは、GK特異的モジュールの内の1つに含まれていた。このことは、イネ植物体内のカリウム濃度の変動と遺伝子発現の変動に野生イネ(GK)特異的な、栽培イネ(T65)が持たない関係性があることを示している。そのため、GKの示す低カリウム耐性はGK特異的モジュールを構成する遺伝子群により制御されると考えられる。本年度同定したカリウム欠乏耐性に関与すると考えられる分子ネットワーク(GK特異的モジュール)の詳細な解析は、次年度以降「野生イネが持つ低栄養耐性分子戦略の解明」を行う上で重要な課題である。