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大正期日本における近代デザイン理念の形成：明治四十四年トリノ博参同と工芸振興運動

平山英三の日記と評論を中心とする国内外の史料をもちいた文献資料の調査研究とトリノ市とローマ市における現地調査によって、明治44年(1911)のトリノ万国博覧会参同と農商務省商品陳列館によって開催された第6回商品改良会との関係を考察した結果、大正初期の日本の工芸振興運動のなかに、美術工芸とはことなる一般工芸ならびに普通工業品の美的価値の向上を目指すデザイン理念があり、それが、昭和戦前期の工芸概念をめぐる議論に重要な基礎を提供し、その後の近代的なデザイン理念の形成につながることがあきらかになった。平成26年度は主として1911年のトリノ万国博覧会への日本の参加と、平山英三のトリノ博に関連したヨーロッパ滞在日記に関して下記の研究調査をおこなった。(1)平山英三のヨーロッパ滞在日記のデジタル資料化と内容の分析・精査(2)トリノ万国博覧会関連資料の収集と分析(3)イタリア共和国トリノ市現地調査上記(1)の実施内容については、明治四二年一二月から明治四五年二月にいたるまで、三冊の小型手帳にしたためられた日記の複写をデジタル・データ化し、その内容について分析・精査をおこなった。その結果、長期にわたる平山のヨーロッパ滞在は、万国博覧会開催地のトリノ市、ローマ市を中心とするものであったが、開催前後の時期をふくめ、開催地にとどまらず二〇世紀初頭のヨーロッパ大陸諸国の家具調度品に関する感想をふくめ、幅広い見聞が記録されていたことが明らかになった。(2)については、日本においてまとめられた事務報告書を中心に、現地イタリアで発行されたガイドブック等を中心に収集するとともに、国内外の公共図書館においてデジタル化資料として公開されたている文献史料を収集し、内容を分析し精査した。その結果、トリノにおいて1902年に開催された第一回現代装飾美術国際博覧会につづいた1911年の万国博覧会当時、建築をふくむ家具デザインについて、アール・ヌーヴォー様式の流行は沈静化し、歴史主義に連なる厳格な装飾様式への回帰と民族的・地域的伝統にもとづく装飾様式の重視がみられるとともに、流行の変化における新規性への関心の高まりがあったことが明らかになった。これは、(3)のトリノ市における現地調査を通じても明らかになった。トリノ万国博覧会におけるこれらの経験が、帰国後の平山英三の商品改良会にみられるアール・ヌーヴォー批判の重要な根拠のひとつであったと指摘できる。平成27年度は平成26年度の研究成果にもとづき、1911年にトリノ万国博覧会と同時に開催されたローマ万国美術博覧会への日本の参加とそのデザイン史的な意義について、平山英三の残した日記を手がかりにして、下記のような研究調査をおこなった。(1)平山英三の自筆日記にみるローマ万国美術博覧会に関する記述の精査(2)ローマ万国美術博覧会に関するローマ現地調査(3)ローマ万国美術博覧会に関する資料(ヨーゼフ・ホフマン関連資料を含む)の収集と分析上記(2)と(3)については、当初の研究計画では、1910年代の東京高等工業学校工業図案科助教授の安田禄造の活動について、そのウィーン留学を中心に研究調査を進める予定であったが、平成26年度における平山英三の自筆ヨーロッパ滞在日記の調査により、トリノ万国博覧会と同時に開催されたローマ万国美術博覧会への日本の参加に関して、平山英三が深く関わっていたことが明らかになり、ウィーンの現地調査にかえて、おこなったものである。(1)と(2)の研究調査の結果、平山英三はトリノ万国博覧会だけでなく、ローマ万国美術博覧会に深く関わることによって、当時のヨーロッパにおける最新の美術・工芸・デザイン・工業製品にふれたことが明らかになるとともに、同じくイタリアに派遣されていた彫刻家の長沼守敬ときわめて親密な交流をおこなっていたことが明らかになった。イタリアにおける平山と長沼の親密な交流は、明治末から大正期にいたる日本における工芸振興運動にすくなからず影響したと考えられる。(3)の研究成果からは、とくに、安田禄造の留学先であったウィーンのクンストゲヴェルベシューレの指導者であったヨーゼフ・ホフマンが建築をふくむ工芸全般について、総合芸術的なアプローチをとっていたとことが明らかになった。平成26年度ならびに平成27年度の平山英三の自筆ヨーロッパ滞在日記の研究調査から、1911年のトリノ万国博覧会とローマ万国美術博覧会において、平山英三と長沼守敬とのあいだに親密な交流があったことが明らかになったが、このことは、従来の日本におけるデザイン史ならびに美術史の研究では全く触れられていなかったものであり、きわめて重要な発見であった。こうした新たな知見にもとづきながら、1911年のトリノ万国博覧会ならびにローマ万国美術博覧会における平山の動向に関して、日本におけるデザイン教育の重要な開拓者のひとりとしてデザイン史的に意義づけられることを、国際会議において研究発表することができた。またこれまでの研究調査の成果から、平山英三の教え子であり、松岡寿の同僚であった安田禄造の昭和初期における工芸をふくむ図案教育全般にかかわる活動に関するデザイン史的研究の新たな視点を獲得することができた。さらにローマ万国美術博覧会場に建設されたヨーゼフ・ホフマンによるオーストリア・パビリオンの様式的特徴は、当時のウィーンにおけるクンストゲヴェルベシューレにみられる建築を含む工芸分野への総合芸術的なアプローチを反映していると考えられ、こうしたアプローチは、当時ウィーンに留学していた東京高等工業学校工業図案科助教授の安田禄造の大正初期から昭和戦前期にいたる工芸観を考察するさいに、重要な視点になると考えられる。

従来の日本における大正期から昭和初期における工芸運動に関する研究では、美術工芸・産業工芸・民芸など個々に分化した動向を取り上げる傾向にあるが、1911年のトリノ万国博覧会ならびにローマ万国美術博覧会への日本の参加について、平山英三・安田禄造らの活動との関連から考察することによって、より総合的なデザイン史的研究の指針を得ることができた。平成28年度は、前年度までの研究成果にもとづき、明治44年(1911)のトリノ万国博覧会ならびにローマ万国美術博覧会に出品協会の理事長として現地に派遣された平山英三の帰国後の活動について、とくに商品改良会を中心とした工芸振興にかかわる活動について、国内における関連史料の調査研究をおこない、平山の大正初期の工芸振興にかかわる評論が、その後の工芸概念をめぐる議論の重要な基礎のひとつであったことを明らかにした。明治45年(1912)にイタリアから帰国した平山は大正元年(1912)に農商務省商品陳列所において開催された第6回商品改良会の審査委員長としてかかわり、日本の商品デザインについて、当時日本国内で流行していたアールヌーヴォーならびにセセッション様式の模倣を厳しく批判した。この批判は、万国博覧会の開催地トリノ、ローマにおける平山の見聞にもとづいていることが、平山の日記から明らかになった。さらに平山の日記からは、平山は万国博覧会期間中をふくめ、会期の前後にイタリアのみならず、ウィーン、パリ、ミュンヘンなどヨーロッパの主要都市を訪問して、自動車・飛行機などの交通機関にくわえて服飾・生活用品にいたるまで、最新のヨーロッパ製品の具体的な様式変化を詳細に記録していたことが読みとれる。商品改良会は、その後、農商務省図案及応用作品展覧会(いわゆる農展)へと発展的に解消するが、この展覧会が振興を目指したのは、いわゆる美術工芸ではなく一般工芸であった。トリノ万国博覧会帰国後の商品改良会をめぐる平山の評論は、大正から昭和戦前期にいたる一般工芸の振興について重要な役割を果たしたと評価できる。平山英三の日記と評論を中心とする国内外の史料をもちいた文献資料の調査研究とトリノ市とローマ市における現地調査によって、明治44年(1911)のトリノ万国博覧会参同と農商務省商品陳列館によって開催された第6回商品改良会との関係を考察した結果、大正初期の日本の工芸振興運動のなかに、美術工芸とはことなる一般工芸ならびに普通工業品の美的価値の向上を目指すデザイン理念があり、それが、昭和戦前期の工芸概念をめぐる議論に重要な基礎を提供し、その後の近代的なデザイン理念の形成につながることがあきらかになった。平山英三のヨーロッパ滞在日記については、当初の計画では、デジタル化した資料を本学図書館等の公共機関を通じて一般公開する予定であったが、資料の提供者の要請にもとづき、デジタル化した平山英三の日記の複写については、一般不特定多数への全面的な公開は取りやめ、公開については学術研究に限定し、口頭ならびに論文発表のさいに一部引用という形をとっておこなうこととした。また日記の内容を精査した結果、トリノの万国博覧会に関する記述にとどまらず、ローマの国際美術博覧会についても詳細な記述があり、イタリア以外のヨーロッパ主要都市であるパリ、ミュンヘン、ウィーン、ブタペストなどについても滞在ホテルなどを中心とした家具調度品・応用美術品に関する詳細な観察が記録されていることが明らかになった。
アクチンストレスファイバーの力学応答に伴う構造変化の高速AFM観察

高速原子間力顕微鏡(高速AFM)で培養動物細胞のイメージングを行う準備段階として下記の成果を得た。1高解像度のイメージングのためのAFMカンチレバー探針の作製方法の確立:AFMイメージングで高解像画像を得るために先端曲率の小さい探針を必要とし、走査電子顕微鏡を用いた電子ビーム堆積法(EBD)を用いてきた。本研究では、先ず探針の作製条件を確立すべく、EBDにおける走査電子顕微鏡の条件(加速電圧、スポット径、作動距離等)の最適条件を見出した。このようにして作製したアモルファスカーボン製の探針を、さらにより先端曲率を小さくしたり、探針再生のための探針完全除去するため、切削手法を試行錯誤した結果、UV・オゾンを用いた方法により、達成することができた。2培養動物細胞表面のイメージング:高速AFMに用いる特製の小さなステージ上で培養動物細胞を培養する方法を確立し、細胞表面構造の動態や細胞骨格様の構造を観察することに成功した。本研究で必要とする外力の導入方法として、イメージング中に一時的にカンチレバーで加える力を強くすることによって細胞に障害を加えることに成功した(障害が回復する過程も観察できたことから生細胞であることも確認できた)。今後は細胞膜を除去した細胞を用いて実験を行うことにより、アクチン細胞骨格に加わる傷害の修復過程の観察をより厳密に制御(アクチン細胞骨格修復に関連するタンパク質の添加)して、アクチン細胞骨格修復過程のタンパク質のダイナミクスを観察する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
小児再生不良性貧血におけるクローン性造血の網羅的遺伝子解析

HLA一致ドナーが得られない小児再生不良性貧血(AA)に対する標準治療は抗胸腺細胞グロブリンとシクロスポリンによる免疫抑制療法(Immunosuppressive therapy; IST)である。骨髄移植が実施できなかった症例においてもISTにより90%以上の長期生存が期待されるが、数年の経過中に約15%の症例ではクローン性造血が生じるとされる。AAの経過中に7番染色体モノソミーを来した2例について、AA、MDS、AML発症時の検体を用いて全エクソーム解析を実施した。その結果、経過中にそれぞれ5つの付加遺伝子変異を検出し、このうちSETBP1変異を両者に認めた。小児AA患者41症例について全エクソーム解析を実施した。複数例に同定された変異遺伝子の中に新規遺伝子X(2例)を認めた。追加検討で小児AA140症例のうち8症(6%)に遺伝子X変異を同定した。遺伝子Xの変異部位は同一であることから、機能獲得型変異であると考えられた。我々は小児AAの57症例を後方視的に解析した。観察期間中に5例がPNHを発症し、10年累積発症率は10.2% (95% CI, 3.6%-20.7%)であった。また、AAからPNHを発症した5例についてAA診断時とPNH発症時の検体をターゲットシーケンス解析した結果、AA診断時にはPIGA遺伝子変異を認めなかったが、PNH発症後にPIGA遺伝子変異を全例で検出した(Narita A, et al., Br J Haematol 2017)。また、AAの経過中に7番染色体モノソミーを来した2例について、AA、MDS、AML発症時の検体を用いて全エクソーム解析を実施した。さらに、小児AAの37症例の継時的に保存された検体を用いてエクソーム解析を実施し、このうち17症例に経過中に何らかの遺伝子変異の出現を認めた。経過中にクローン性造血を来した7例(PNH 5例、7番染色体モノソミー2例)について、AA診断時およびクローン性造血を発症した時点に採取された検体を継時的に解析した。AAからPNHを発症した5例については英文論文として報告できた。さらに、小児AAの長期フォローアップされている検体を用いてエクソーム解析を実施できていることから、おおむね順調に研究は進展していると考えている。今年度と同様の解析を進めつつ、クローン性造血の発症予測を目的とした遺伝子解析の臨床的応用の実現について検討を進める。具体的には、名古屋大学小児科でフォローされているAA患者のうち、これまで造血幹細胞移植が実施されていない症例は50症例ほどである。これらの症例は将来的にPNHまたはMDS/AMLといったクローン性造血疾患を発症するリスクを有している。そこで、これまでに保存されている検体を含めてターゲットシーケンスまたは全エクソームシーケンスを行い、クローン性造血の早期診断における有用性を確認する。さらに、定期的な微小PNH血球モニタリング並びに染色体検査等の臨床情報を遺伝子解析の結果と合わせて評価し、包括的な疾患概念の理解、病態解明を目指す。【理由】次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子解析については、検体の集積に従い解析を実施しているために、一部の研究費について次年度に繰り越して解析を行う。【使用計画】引き続き小児再生不良性貧血の検体を用いて次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子解析を行い、クローン性造血発症の機序の詳細について検討を進める。
細胞死の様式転換を利用した放射線化学増感とその機構の解明

研究の目的を中心にして、ほぼ計画による遂行している。現在までの達成度は約90%と考えられる。平成31年度研究について以下の通りで遂行する。前年度の研究を継続、発展を図るとともに、主に、HeLa細胞を利用し、放射線およびハイパーサーミアの増感効果とその分子機構を探る。次は細胞の形態変化とタンパク質発現より細胞死の様式を決める。その後マイクロアレイ遺伝子解析方法で細胞死の様式を制御する遺伝子を探す。ついで細胞死の様式に関連遺伝子のタンパク質発現を検討する。ウエスタンブロットでタンパク質発現を解析する。細胞内GSH量について、細胞内GSH定量キットを用いて、測定する。ミトコンドリアの膜電位についてTetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)色素を利用してフローサイトメトリーにより検討する。放射線細胞死の増強と細胞死様式を調べるとともに、マイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。(理由)平成31年度主に遺伝子とたんぱく質発現を中心として、そのために一部細胞死と関連する抗体の購入時間を変更した。(使用計画)細胞死のメカニズム解析のため、ほぼ計画どおりで使用する。
カイコにおけるGTP-cyclohydrolase I 遺伝子の発現機構の解析

還元型のプテリジンであるテトラヒドロバイオプテリン(BH_4)は生物に必須の補酵素活性を持つ物質として知られている。一方、昆虫のプテリジンはメラニンやオモクロームとともに体色発現に直接的に関っている。本研究は、このプテリジン生合成の第一段階の反応を触媒し、律速酵素として働いている、GTP-シクロヒドロラーゼI(GTP-CH I)に着目し、GTP-CH Iを通して、昆虫におけるBH_4の生理機能をプテリジン蓄積以外の角度から探ることを目的としている。今年度までに、プテリジン蓄積量には差が認められないが、オモクローム系色素発現及び斑紋の相違により体色が異なるカイコ(支146、カスリ、大造)を使い、発生段階における皮膚中のGTP-CH Iの活性及びmRNAの発現量を比較した。その結果、オモクローム系色素を多量に蓄積し、メラニン色素からなる斑紋が一番大きなカスリでは、他の2種と比較すると全ての発生段階を通して、GTP-CH Iの活性が高いことが明らかになった。さらに、エクダイソン濃度の変動と連動して、カスリが脱皮、蛹化、羽化する時期にGTP-CH I mRNAの強発現が認められた。又、BH_4の生合成の最終段階に働く酵素である、セピアプテリンレダクターゼ(SPR)の活性も、全ての発生段階を通してカスリの方が若干高いこと、GTP-CH I mRNAの強発現が認められた時期近くで、BH_4を含む還元型バイオプテリン量が増加していることが明らかになった。以上のように、カスリにおける、GTP-CH I mRNAの強発現はプテリジン蓄積を目的としたものではなく、オモクローム合成やメラニン形成に関与する、昆虫に特異的なBH_4の補酵素としての役割を示唆するものである。昆虫の体色発現調節機構の分子レベルでの解明を目的として、プテリジン系色素形成の鍵酵素であるGTP-シクロヒドロラーゼI(GTP-CH I)遺伝子に着目し、その遺伝子の発現解析を試みている。今年度までにカイコのGTP-CHI遺伝子断片(275bp)の配列を決定し、これをプローブに用いて、4齢幼虫から羽化直後の成虫まで、1日おきに15段階の各ステージの皮膚を採取し、ノーザンブロット解析を行った。その結果、GTP-CHI遺伝子の発現時期は体液中のエクジステロイド濃度の高い時期と一致していることが明らかになり、GTP-CHI遺伝子は昆虫の脱皮と変態と密接な関わりを持って発現している可能性が示唆された。さらに、カイコの品種によって、GTP-CHI遺伝子の発現量及び発現時期に大きな相違が認められることが明らかになった。又、カイコ初期5齢幼虫のエクジステロイド濃度は非常に低いことが知られているので、この時期のカイコへの20-ヒドロキシエクジソンの投与が皮膚中のGTP-CHImRNAの発現量にどのような影響をもたらすのか、ノーザンブロッティング及びRT-PCR法を用いて定量するため、エクジステロイドの投与時期、時間とともに発現量が微量な遺伝子を検出する方法を検討している。来年度のサンプル調製時には、カイコの品種によるGTP-CHI遺伝子の発現にも相違が認められたので、2種類のカイコを並行して飼育し、エクジステロイドの投与、幼若ホルモンの投与及び2種類の同時投与を行い、GTP-CHImRNAの発現量への影響を調べることで、変態に伴う生物現象発現調節に関する分子生物学的な理解を深めていきたい。
蛍光X線強度の取り出し角分布測定による金属薄膜ならびに基板界面の非破壊分析

1.大気中で非破壊的に薄膜のキャラクタリゼーションが可能である。シュミレーション結果を実験結果にフィットさせることにより、薄膜の膜厚・密度・存在状態・ラフネスなどを求めることができる。2.解析可能な膜厚の範囲は0nmから数100nmであり、長周期的なラフネス(そり・うねり)は実験結果に大きく影響を与えるが、短周期のラフネス(微視的な凸凹)はあまり影響を与えないことが判った。3.蛍光X線強度の取り出し角度分析は、一次X線の試料基板への入射角度に大きく依存することが明らかとなった。よって、一次X線の入射角度と蛍光X線の取り出し角度の二つの角度を制御することにより、より厳密な薄膜の分析が可能であることが判った。4.一次X線の入射角度と蛍光X線の取り出し角度の二つの角度をいずれもX線全反射臨界角度以下に設定することにより、X線の進入深さ、観測深さを数nm以下に限定でき、極最表面の分析が可能である。
日本人に特有な、血清コリンエステラーゼ変異遺伝子の発現とその性状に関する研究

我々はwild typeのヒト血清コリンエステラーゼ(ChE)cDNAを組み込んだpRc/CMVベクターDNAを大腸菌に導入し、コドン330におけるLeuへのL330I、ValへのL330V、SerへのL330S変異体を作成し、それらの組み換え体を確立した。発現ChEはヒト胎児腎臓細胞(293;American Culture Collection CRL 1573)を用いて確認した。Wild体発現ChE(rUU)は正常血清のそれと、変異発現ChE(r330I)はL330I変異のホモ接合体の血清中の性状とほぼ同様であった。基質としてPropionylthiocholine iodide(PTCI),Acetylthiocholine iodide,Butylylthiocholine iodideを用いて動力学的性状を解析し、その性状はF2変異に類似しているが少し弱く、PTCIを基質とした場合に最も顕著にこのF型変異の性状が検出できることを報告した。またr330I,r330V,r330SのChE活性はrUUの48,36,65%であり、DNは92,94,88%,FNは86,89,89%といずれもrUUに比し低下していた。以上の結果からコドン330のロイシンは活性発現及び阻害剤耐性に関与する重要なアミノ酸であることが示された。本研究によりコドン330におけるTTAからATAという一塩基置換が活性の低下・ジブカイン耐性・フッ化ソーダ耐性というF型の表現型を示す原因であることを証明した。従来欧米でFluoride耐性変異はそのDNA変異の違いでによりF1(T243M),F2(G390V)の2種が報告されていたが、我々の報告したL330I変異は日本に特有なF3変異として国際的に認められるようになった。我々はwild typeのヒトChEcDNAを組み込んだpRc/CMVベクターDNAを大腸菌に導入し組換え体を確立してある。さらにL330I変異体を作成しその組み換え体も確立した。発現ChEはヒト胎児腎臓細胞(293;AmericanCulture Collection CRL 1573)を用いて確認した。これら二種の発現ChEを比較した結果、Wild体発現ChEは正常血清のそれと、変異発現ChEはL330I変異(nucleotide no 1201 T-->A)のホモ接合体の血清中の性状とほぼ同様であった。以上のことからコドン330におけるTTAからATAというー塩基置換のみにより活性の低下・ジブカイン耐性・フッ化ソーダ耐性というF型の表現型を示すことが証明された。前述の結果は基質として米国臨床化学会推奨のpopionylthiocholineiodide(PTCI)を用いた実験であった。Acetrylthiocholine iodide(ATCI),Butrylylthiocholineiodide(BTCI)も共に用いて動力学的性状を解析した。それぞれの基質に対するKm;dibucaineNaFに対するK iをMassonらの報告に従い低濃度領域で測定した。Km,Ki値の増加はPTCIを基質とした場合に最も顕著であり、他の基質ではFN,DNの測定による変異の検出は、より困難と推定された。活性低下・阻害剤抵抗性の機序はMassonらのF-2変異の結果と類似したが、その程度はより弱いと推定された。現在プライマーを設計し、日本にて頻度の高いG365R、A539T変異体を作成している。コドン330における他のミッセンスの変異(TTC;Phe,GTA,Val,TCA;Ser)のプライマーも設計し変異体を作成している。

我々は今年までにwild typeのヒトChEcDNAを組み込んだpRc/CMVベクターDNAを大腸菌に導入し、さらにL330I変異体を作成しそれらの組み換え体を確立した。発現ChEはヒト胎児腎臓細胞(293;American Culture Collection CRL 1573)を用いて確認した。Wild体発現ChE(rUU)は正常血清のそれと、変異発現ChE(r330I)はL330I変異のホモ接合体の血清中の性状とほぼ同様であった。これらの結果よりコドン330におけるTTAからATAという一塩基置換のみにより活性の低下・ジブカイン耐性・フッ化ソーダ耐性というF型の表現型を示すことを証明した。また基質としてPropionylthiocholine iodide(PTCI),Acetylthiocholine iodide,Butylylthiocholine iodideを用いて動力学的性状を解析しKm,Ki値の増加は、PTCIを基質とした場合に最も顕著であり、他の基質では、この変異の推定は困難であることを報告した。本年度は、コドン330における他のミッセンスの変異2種(GTA;Val,TCA;Ser)の変異体を作成し、r330Vおよびr330Sを発現することが出来た。r330I,r330V,r330SのChE活性はrUUのそれの48,36,65%であり、DNは92,94,88%,FNは86,89,89%といずれもrUUに比較し低下していた。これらの結果から、コドン330のロイシンは活性発現及び阻害剤耐性に関与する重要なアミノ酸であることが示された。我々はwild typeのヒト血清コリンエステラーゼ(ChE)cDNAを組み込んだpRc/CMVベクターDNAを大腸菌に導入し、コドン330におけるLeuへのL330I、ValへのL330V、SerへのL330S変異体を作成し、それらの組み換え体を確立した。発現ChEはヒト胎児腎臓細胞(293;American Culture Collection CRL1573)を用いて確認した。基質としてPropionylthiocholine iodide(PTCI),Acetylthiocholine iodide,Butylylthiocholine iodideを用いて動力学的性状を解析し、その性状はF2変異に類似しているが少し弱く、PTCIを基質とした場合に最も顕著にこのF型変異の性状が検出できることを報告した。またr330I,r330V,r330SのChE活性はrUUの48,36,65%であり、DNは92,94,88%,FNは86,89,89%といずれもrUUに比し低下していた。以上の結果からコドン330のロイシンは活性発現及び阻害剤耐性に関与する重要なアミノ酸であることが示された。本研究によりコドン330におけるTTAからATAという一塩基置換が活性の低下・ジブカイン耐性・フッ化ソーダ耐性というF型の表現型を示す原因であることを証明した。
未知顔の識別における動機づけの効果の量的・質的検討

家族や友人などの既知顔に比べて,まったく出会ったことのない未知顔は,その記憶だけでなく,記憶を必要としない知覚的な識別においても,著しく正確性に劣る.このような研究知見に反して,我々の社会生活には,パスポートや免許証など,顔写真を用いた個人識別が浸透している.そこで,本研究では,さまざまな認知課題のパフォーマンスを向上させることが明らかとなっている「動機づけ」の効果に焦点を当て,動機づけを高めることによって,顔画像による個人識別の正確性がそもそも改善されうるのか,また,改善されるとすれば,そのプロセスやメカニズムはどのようなものかを明らかにすることを目的とする.研究初年度である平成29年度の実験では,識別の正確性において,全体的な課題成績が高かったため,おそらく天井効果によって,有意な検定結果が得られなかったと考えられる.そこで,2年目の平成30年度の実験では,課題の難易度の調整をはじめ,もう一度,実験方法を中心に,その原因の洗い出しおよび改善を行い追試的実験を行った.具体的には,男女各48名のモノクロ顔写真から,各同性同士の「真顔」と「怒り顔」の24ペア(計48ペア)を作成した.なお,人物の異同判断を行うために,ペアの半数は同じ人物のペア(match試行),残り半分は異なる人物のペア(mismatch試行)を作成した.これらの刺激を用いて,一時的報酬(お菓子)が未知顔の識別成績を向上させることを示したMoore and Johnston (2013)の研究を参考として,本研究では,二次的報酬(金銭的報酬)が未知顔の識別に影響を及ぼしうるかを検討した.その結果,未知顔の識別の正確性および反応時間において,効果量は小さいものの,報酬の効果が示された.研究実績の概要で記述したように,2年目として,当初の計画通りの実験を実施したため,おおむね順調に進展していると言える.顔照合課題において試行ごとに与えられる動機づけの量を操作することによって,そもそも,パフォーマンスが改善されるのか,また,そうであれば,どのようなメカニズムによってパフォーマンスが改善されるかを検討する.そこで,金銭的報酬の大きさに比例して注意課題のパフォーマンスが改善されることを示したEngelmann et al. (2009)の研究を参考に,試行ごとに与えられる金銭的報酬の量を変化させることで,動機づけの効果の量的差異を検討する.家族や友人などの既知顔に比べて,まったく出会ったことのない未知顔は,その記憶だけでなく,記憶を必要としない知覚的な識別においても,著しく正確性に劣る.このような研究知見に反して,我々の社会生活には,パスポートや免許証など,顔写真を用いた個人識別が浸透している.そこで,本研究では,さまざまな認知課題のパフォーマンスを向上させることが明らかとなっている「動機づけ」の効果に焦点を当て,動機づけを高めることによって,顔画像による個人識別の正確性がそもそも改善されうるのか,また,改善されるとすれば,そのプロセスやメカニズムはどのようなものかを明らかにすることを目的とする.研究初年度である平成29年度は,まず,顔照合課題で用いる刺激画像の選定を行った.具体的には,男女各48名のモノクロ顔写真から,各同性同士の「真顔」と「怒り顔」の24ペア(計48ペア)を作成した.なお,人物の異同判断を行うために,ペアの半数は同じ人物のペア(match試行),残り半分は異なる人物のペア(mismatch試行)を作成した.これらの刺激を用いて,一時的報酬(お菓子)が未知顔の識別成績を向上させることを示したMoore and Johnston (2013)の研究を参考として,本研究では,二次的報酬(金銭的報酬)が未知顔の識別に影響を及ぼしうるかを検討した.実験の結果,課題全体の成績水準が高く,識別の正確性においては報酬の効果は示されなかったものの,反応時間においては報酬の効果が示された.具体的には,特に,mismatch試行において,報酬の提示(予期)が反応時間を増大させるという結果が示された.つまり,異なる人物が提示される試行においては,報酬の存在は,実験参加者に,より慎重な判断を促す可能性が示唆された.研究実績の概要で記述したように,研究計画初年度として,当初の計画通りの実験を実施したため,おおむね順調に進展していると言える.家族や友人などの既知顔に比べて,まったく出会ったことのない未知顔は,その記憶だけでなく,記憶を必要としない知覚的な識別においても,著しく正確性に劣る.このような研究知見に反して,我々の社会生活には,パスポートや免許証など,顔写真を用いた個人識別が浸透している.そこで,本研究では,さまざまな認知課題のパフォーマンスを向上させることが明らかとなっている「動機づけ」の効果に焦点を当て,動機づけを高めることによって,顔画像による個人識別の正確性がそもそも改善されうるのか,また,改善されるとすれば,そのプロセスやメカニズムはどのようなものかを明らかにすることを目的とする.研究初年度である平成29年度の実験では,識別の正確性において,全体的な課題成績が高かったため,おそらく天井効果によって,有意な検定結果が得られなかったと考えられる.そこで,2年目の平成30年度の実験では,課題の難易度の調整をはじめ,もう一度,実験方法を中心に,その原因の洗い出しおよび改善を行い追試的実験を行った.具体的には,男女各48名のモノクロ顔写真から,各同性同士の「真顔」と「怒り顔」の24ペア(計48ペア)を作成した.なお,人物の異同判断を行うために,ペアの半数は同じ人物のペア(match試行),残り半分は異なる人物のペア(mismatch試行)を作成した.

これらの刺激を用いて,一時的報酬(お菓子)が未知顔の識別成績を向上させることを示したMoore and Johnston (2013)の研究を参考として,本研究では,二次的報酬(金銭的報酬)が未知顔の識別に影響を及ぼしうるかを検討した.その結果,未知顔の識別の正確性および反応時間において,効果量は小さいものの,報酬の効果が示された.研究実績の概要で記述したように,2年目として,当初の計画通りの実験を実施したため,おおむね順調に進展していると言える.初年度の実験において,識別の正確性において,全体的な課題成績が高かったため,おそらく天井効果によって,有意な検定結果が得られなかったと考えられる.そこで,課題の難易度の調整をはじめ,もう一度,実験方法を中心に,その原因の洗い出しおよび改善を行い,まずは,追試的実験を行う.その後で,当初の計画通り,研究計画2年目に予定している実験を行う.なお,これらの実験において,万が一,実験条件や手続きの設定に不備が見つかった場合には,途中で実験を中止し,当該部分を改善した後,新たにデータを取り直すこととする.顔照合課題において試行ごとに与えられる動機づけの量を操作することによって,そもそも,パフォーマンスが改善されるのか,また,そうであれば,どのようなメカニズムによってパフォーマンスが改善されるかを検討する.そこで,金銭的報酬の大きさに比例して注意課題のパフォーマンスが改善されることを示したEngelmann et al. (2009)の研究を参考に,試行ごとに与えられる金銭的報酬の量を変化させることで,動機づけの効果の量的差異を検討する.
北タイの熱帯山地林における樹木-土壌系の養分維持の機構

熱帯山地林における樹木-土壌系の養分維持機構を明らかにする目的で、1993年11月に調査地をせっていし、その後、1995年3月まで毎月以下の項目について調査を実行した。1.調査地の設定初年度の調査において、タイの北部チェンマイ近郊のコグマ-国立公園内の山地常緑林に調査地の設定を行った。1993年11月に山地集水域の一つの斜面に50mx100mの調査地を設定した。この調査地において日本とタイ側の研究者が共同して以下の項目を測定した。2.森林調査地での植生調査調査地の設定後、タイ側と日本側の研究者が共同して調査地の森林植生の胸腔直径、樹高、樹木の位置の測定を行った。調査結果、調査林分はシイ間マとシイ類により優占される熱帯常緑山地林として記述された。3.斜面地形での土壌、気象条件の測定斜面の下部と尾根部に自記温度計と土壌含水量計を設置して、調査地での土壌温度、土壌含水量の測定をおこなった。土壌温度は、季節的に変動が少なかったが、土壌の含水量は、雨期5月から10月と乾期の11月から4月で明瞭な差が認められた。こうした土壌の環境要因と土壌呼吸量、土壌の窒素代謝の季節変化を考察した(共同観測)。4.森林生態系への外部循環系からの養分加入量の測定斜面の下部から尾根部にかけて、5箇所に降水量測定装置を設定し、降水量と、降水に含まれる養分物質の濃度を2年間にわたって測定した。また、森林からの養分の流失量を河川での養分濃度の測定から明らかにした(岩坪、スントン)。5.森林生態系への落葉による養分循環量調査地に斜面の下部から上部に等間隔に20個のリタータラップを設定し、毎月、落葉を回収することで、落葉の供給量を測定した。また、樹種別の落葉量の様式を検討した。落葉試料を分析することで、落葉による養分の供給量を推定した。また、樹種別の炭素/窒素比から種間での養分の利用効率を検討した。調査地に斜面の下部から上部に等間隔に20個のリタータラップを設定し、毎月、落葉を回収することで、落葉の供給量を測定した。6.落葉分解過程での養分の動態斜面の上部と下部に10x10mの調査地を設定し、森林の優占的な樹種2種の落葉分解の速度を、1994年5月から1995年3月まで毎月、リターバッグ法を用いて測定した。雨期の期間に落葉分解の速度は、斜面の上部に比べ、下部で高い傾向を示したが、乾期には斜面上部でのシロアリによる分解が大きく働いていた。熱帯山地林において落葉の分解は、微生物(菌類)とシロアリにより進行し、両者の分解への寄与は、乾燥の程度の高い尾根でシロアリ、斜面の下部で菌類の寄与の高いことが明らかとなった(武田、スントン)。6.分解過程での落葉からの養分流失量の測定林内の降水量測定地点において、1994年5月から1994年11月までの雨期の期間を通じて、リタバッグに封入した優占的な落葉2種での分解に伴う養分流失量を測定した(仁王、スントン)。落葉からの養分流失の様式を、土壌での落葉分解の養分溶脱期、養分不動化期間、養分の無機化期間との関連で考察した。7.土壌呼吸量の季節変化調査地の斜面の上部と下部に土壌呼吸測定のプロットを設定し、雨期と乾期に土壌呼吸量の測定を待った。土壌呼吸量は、斜面の下部と上部でいずれも明瞭な季節変化を示した(萩原、スントン、ポンサック)。

また、森林からの養分の流失量を河川での養分濃度の測定から明らかにした(岩坪、スントン)。5.森林生態系への落葉による養分循環量調査地に斜面の下部から上部に等間隔に20個のリタータラップを設定し、毎月、落葉を回収することで、落葉の供給量を測定した。また、樹種別の落葉量の様式を検討した。落葉試料を分析することで、落葉による養分の供給量を推定した。また、樹種別の炭素/窒素比から種間での養分の利用効率を検討した。調査地に斜面の下部から上部に等間隔に20個のリタータラップを設定し、毎月、落葉を回収することで、落葉の供給量を測定した。6.落葉分解過程での養分の動態斜面の上部と下部に10x10mの調査地を設定し、森林の優占的な樹種2種の落葉分解の速度を、1994年5月から1995年3月まで毎月、リターバッグ法を用いて測定した。雨期の期間に落葉分解の速度は、斜面の上部に比べ、下部で高い傾向を示したが、乾期には斜面上部でのシロアリによる分解が大きく働いていた。熱帯山地林において落葉の分解は、微生物(菌類)とシロアリにより進行し、両者の分解への寄与は、乾燥の程度の高い尾根でシロアリ、斜面の下部で菌類の寄与の高いことが明らかとなった(武田、スントン)。6.分解過程での落葉からの養分流失量の測定林内の降水量測定地点において、1994年5月から1994年11月までの雨期の期間を通じて、リタバッグに封入した優占的な落葉2種での分解に伴う養分流失量を測定した(仁王、スントン)。落葉からの養分流失の様式を、土壌での落葉分解の養分溶脱期、養分不動化期間、養分の無機化期間との関連で考察した。7.土壌呼吸量の季節変化調査地の斜面の上部と下部に土壌呼吸測定のプロットを設定し、雨期と乾期に土壌呼吸量の測定を待った。土壌呼吸量は、斜面の下部と上部でいずれも明瞭な季節変化を示した(萩原、スントン、ポンサック)。1.1993年10月に,北タイのコグマ-国立公園の常緑山地熱帯林において,研究調査地,(50m×100m)を設定した。2.調査地内の樹木について,胸高直径,樹高を測定した。調査地内での樹木の分布を記述した。3.調査地の斜面上部,中部,下部において土壌の断面調査を行った。土壌の断面にそって土壌サンプルを採集し,土壌の養分分布,蓄積量を測定した。4.調査地において,土壌堆積有機物の分布様式を測定した。土壌の堆積腐植はムル型を示し,堆積量は,5トン/haであった。5.調査地の斜面にそって,下部から上部に向っての下層植生を調査した。また,下層植生を構成する樹木について,個体の葉群分布を調べ,個々の葉に番号を付けて,葉群動態研究の設定を行った。6.調査地の斜面下部から上部までに,落葉落枝(リター)測定用のリタートラップを20個,設置した。10月から毎月,現地の研究者によりリターの回収が行なわれ,リター供給の変化を明らかにした。この測定は2年間にわたって実行される予定である。7.調査地のリタートラップの近くに,降水採集のトラップを設定し,10月から毎月,降水を採水した。採水した降水中の養分の分析を行なった。以上,調査地の設定,定期調査の設定を完了し,リター,降水量の継続的な測定を行った。
静電容量結合法の外科的顎矯正治療への応用

高度な骨格性反対咬合を有する患者の下顎は、一般的に華奢で、下顎枝の前後径も小さく、外科手術を行う際、骨の離断面の接解面積の点より制約を受ける場合が多く、特に下顎の左右非対称を外科手術で治療する場合、左右で離断面部が緊密に接しておらず、治療が長びく。また、最近は、3040才代の顎骨切術併用の患者も増加して、顎間固定期間が長くなり、治療後の後戻りの可能性も多いと考えられる。我々は、微小電流刺激が骨のremodelingに与える影響について研究してきた。これは整形外科領域で難治性骨折の治療に用いられるようになった。この方法をさらにすすめて、電極を骨の中に挿入せず、皮膚の上に置いてピーク間電圧5V、電流510mAで刺激する非侵襲的電気刺激法である静電容量結合法を応用して骨の離断面に電場をかけ、骨の形成およびremodelingを促進し、外科的矯正治療期間の短縮のための基礎的実験および臨床応用をめざした。(1)最も効果的なリモデリングを促進するために、顎骨の最適条件(電流電圧刺激、波形等)を決定した。(2)ヒトの場合、顎骨切術後に皮膚の上におく電極枝の形態と装置の接続についての開発をした。(3)静電容量結合法をさらに臨床応用し、症例数を増やした。(4)現在、骨離面の大きかった患者5人に使用中であるが、臨床結果は6ケ月を必要とする。高度な骨格性反対咬合を有する患者の下顎は一般的に華奢で,下顎枝の前後径も小さく,外科手術を行う際,骨の離断面の接触面積の点より制約を受ける場合が多く,特に下顎の左右非対称を外科手術を治療する場合,左右で離断部が緊密に接しておらず,治療が長びいた.また最近は, 3040才代の顎骨切術併用の患者も増加して,顎間固定期間が長くなり,治療後の後戻りの可能性も多いと考えられている.我々は,微小電流刺激が骨のリモデリングに与える影響について研究してきた.これは整形外科領域で難治性骨折の治療に用いられるようになった.この方法をさらにすすめて,電極を骨の中に挿入せず,皮膚の上に置いてピーク間電圧5V,電流510mAで刺激する非侵襲的電気刺激である静電容量結合法を応用して骨の離断面に電場をかけ,骨の形成およびリモデリングを促進し,外科的矯正治療期間の短縮のための基礎的実験および臨床応用をめざした.基礎的な研究として主として犬の下顎骨を離断し,静電容量結合法による骨のリモデリングの状態を観察した.(1)骨の離断面に電場をかけるための装置の作成した.(2)実験動物に骨折手術を行い,離断面に皮膚の上から装置を装着し,骨形成を経時的に観察した.(3)骨形態計測の手法を用い,形成された骨の組織学的評価を行った.高度な骨格性反対咬合を有する患者の下顎は、一般的に華奢で、下顎枝の前後径も小さく、外科手術を行う際、骨の離断面の接解面積の点より制約を受ける場合が多く、特に下顎の左右非対称を外科手術で治療する場合、左右で離断面部が緊密に接しておらず、治療が長びく。
装飾相補鎖-RNaseH系によるRNAの高選択的切断法の開発

RAaseHはRNA・DNAハイブリドのRNA鎖を加水分解する酵素であり、RNAの領域特異的切断に利用されている。しかし短鎖DNA相補鎖を用いるこの反応では、ハイブリド領域内や近傍の数ヶ所が切断されるため、一般的な使用には到っていない。本研究では、修飾DNA相補鎖をRNaseH反応系に用いてRNAを任意の位置で切断する方法を開発した。2'-0-メチルオリゴリボヌクレオチドの合成と核酸ハイブリド形成能等に関する研究成果から、DNA相補鎖の代わりに短鎖DNA(35mer)の両端もしくは片端に2'-0-メチルオリゴマーが連結したキメラオリゴヌクレオチド(9mer)をデザインして合成した。各種合成オリゴリボヌクレオチド(9、18mer)とキメラ相補鎖のハイブリドに大腸菌RNaseHを作用させると、未修飾相補鎖の使用で観察された数ヶ所での切断が制限されることが判明した。特に4鎖長のデオキシ領域を含むものでは、高選択的切断が起こり、その位置はRNA・DNAハイブリド領域のリボ領域のリボ鎖3'末端に共通していた。キメラ相補鎖は2'-0-メチルオリゴマー領域を任意の長さに設定できるため、高次構造を有するRNAとのハイブリド形成に問題はないと考えられる。実際に鎖長90の人工型RNAとキメラ相補鎖(915mer)をアニーリングした後、酵素反応を行うと、ループおよびステム部分の目的位置が切断された。また本法の適用範囲を探る目的で大腸菌tRNA<met(\)f>を用いて、アンチコドンループとステム、Dループ、アクセプターステムの切断反応を行った(キメラ相補鎖は1120mer)。その結果、アクセプターステムでは目的位置(複数)が効率よく切断されることが明らかとなった。他の領域に対する反応は、1ヶ所のみでの切断を与えず、効率も低下した。この原因は、tRNA中の修飾ヌクレオチドの存在やtRNAの高次構造の部分的保持などによるものと考えられる。前年度の研究において、2′-O-メチルオリゴリボヌクレオチドが連結したDNA4mer(キメラオリゴヌクレオチド)をオリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズさせ、大腸菌RNaseHを作用させると、リボ鎖が位置特異的に1カ所で切断されることが明らかとなった。今年度は、この新規RNA切断法の適用範囲を探る目的で、大腸菌tRNA^<Met>_fを用いて研究を行った。tRNA^<Met>_fのDループ、アンチコドンループ、アンチコドンステム、アクセプターステムの切断を検討するために、各領域に相補的なキメラオリゴマー(1120mer)をホスホロアミダイト法により核酸自動合成機で調製した。RNaseH反応は各キメラ体と末端^<32>P標識したtRNAをアニーリングさせたのち行い、切断部位の解析はゲル電気泳動などにより行った。RNA・DNA(4mer)ハイブリド領域内に修飾ヌクレオチド(tRNA側)を含むようにデザインされたキメラ相補鎖の使用ではtRNAの水解速度が遅く、切断は隣接した23カ所で起こった。しかしアンチコドンループ内でもRNA・DNAハイブリド領域内に2′-O-メチルシチジン(tRNA側)を含まない場合は、水解速度の上昇が観察された。

アクセプターステムとアンチコドンステムでの切断反応を比較すると、前者の方が水解速度は速く(ほぼ100%切断)、しかも切断部位はほとんど1カ所に限定された。一方、後者での切断率は2030%であり、切断部位は2カ所であった。このようにtRNAでは修飾ヌクレオチドの存在やRNAの高次構造が切断反応の効率および位置特異性に影響を与えることが示された。また今まで特異的切断が非常に困難とされたアクセプターステムでも筆者らの方法により切断可能であることが明らかとなった。
人工モノクローナル魚類抗体の迅速作出法の開発およびその応用

本研究は魚類の抗体産生細胞を単離し、得られた細胞由来の遺伝子を用いて抗原に特異的に結合する人工抗体を作出することを目的とした。ヒラメ、ニジマスおよびチョウザメを対象に、種々の抗原で免疫した際の抗体価の上昇を測定し、抹消白血球より抗原を特異的に認識する細胞の分離を試みたところ、チョウザメでのみ病原微生物菌体を認識し、抗体遺伝子を発現する細胞を分離することができた。今後本手法を改良していくことで、魚類抗体遺伝子を用いた人工抗体を作出できると考えている。さらに本研究では、魚類の抗体産生に関する免疫機構に関わる遺伝子群の同定および解析を行い、魚類において抗体価を高めるための手法についても検討した。平成25年度は、ヒラメを魚類病原微生物であるEdwardsiella tardaおよびStreptococcus iniaeのホルマリン不活化菌体、あるいはスカシガイヘモシアニンを用いて免疫し、抗体価の変化をELISA法により解析した。いくつかの実験で、抗体価が上昇しないことがあった。これは個体サイズが影響していると考えられたため、移行の実験には比較的大きめの個体を実験に用いることとした。ヒラメに加えて、比較的抗体価の上昇が確認しやすいニジマスを用いた実験にも着手した。ニジマスを病原微生物Vibrio anguillarum不活化菌体で免疫し、抗体価の上昇を確認した。ヒラメの場合と異なり、ニジマスでは顕著な抗体価の上昇を確認できた。さらに、個体の免疫に伴い脾臓で発現変動する遺伝子群を解析した。多くの魚種では、水温の上昇に伴い抗体価の上昇が顕著となることが報告されている。そこで、ヒラメを異なる水温で飼育し、E. tardaおよびS. iniae不活化菌体で刺激した歳の遺伝子発現動態を解析した。本年度は初期応答に関わるサイトカインであるinterleukin-1beta(IL-1b)およびinterferon gamma(IFNg)について発現解析を行った。上記のサイトカインに加え、本年度はヒラメのケモカイン遺伝子群の整理、および新規サイトカイン遺伝子群であるIL12ファミリー遺伝子群の同定を行った。平成26年度は、Edwardsiella tarda死菌およびスカシガイヘモシアニン(KLH)で免役したヒラメの血球を対象に、発現している抗体重鎖遺伝子の多様性を解析した。各サンプル100弱の配列を解析し比較したところ、免疫後も配列の多様性は高いままであり、抹消白血球における抗体価の上昇に伴うB細胞クローンの増加は観察されなかった。さらに、各抗原で免役した個体の白血球由来の抗体遺伝子を用いて、一本鎖抗体多様性鎖(single chain Fv: scFv)を調製し、ファージディスプレイ法により抗原特異的なscFv断片の単離を試みた。それぞれ個別にscFvを調製し、ファージディスプレイライブラリを作製した。バイオパニング法により抗原特異的に結合するscFv断片の調製を試みたが、抗原特異的なクローンを単離することはできなかった。また、異なる水温で飼育したヒラメをE. tarda死菌で免役した際に脾臓で発現変動する遺伝子を調べるため、マイクロアレイ解析を行った。E. tarda死菌の投与に伴い、多くの遺伝子でmRNA量の変化がみられた。とくに、インターフェロン(IFN)γで発現が誘導されることがほ乳類で報告されている遺伝子において、発現動態への水温の影響がみられた。これまでの研究でI型IFNで発現誘導される遺伝子も水温の影響を受けることが示されている。抗原投与による特異抗体の成立は水温に大きく影響を受けることから、IFNにより制御される遺伝子群が特異抗体の成立に深く関わる可能性が考えられた。このほか、ヒラメにおいて抗原提示や白血球の活性化に関わる種々の遺伝子についてcDNAクローニングを行うとともに、発現解析および機能解析を行った。平成27年度は、魚類の免疫グロブリン陽性細胞の単離を目的として、ヒラメ血中の白血球を対象にヒラメ抗体に対するウサギ抗血清およびマウスモノクローナル抗体を用いて標識を試みた。ヒラメ血中の抗体陽性白血球は全白血球の10%未満であり、その後の解析に供することが難しいことが示された。このことは、様々な魚種のIgM重鎖を認識可能な抗体を用いたウェスタンブロッティング解析において、ヒラメ血清中のIgM量が少ないことと関連していることが示唆された。そこで、上記の抗体を用いた解析で比較的血中のIgM量が多かったコイを対象に、コイ抗体に対するマウスモノクローナル抗体を用いて標識を試みたところ、数十%の細胞が標識された。現在、標識された細胞の単離を試みている。また、ヒラメを対象に、抗原特異的な獲得免疫の成立に関わる分子機構を明らかとするため、I型インターフェロン(IFN)および情報伝達因子群についてcDNAクローニングを行い、塩基配列を決定した。さらに、ほ乳類においてDNAワクチンとして抗原分子との融合分子を合成させることにより抗原提示能を活性化すること知られるLysosome-associated membrane protein-1(LAMP-1)を同定し、魚類病原ウイルスの抗原タンパク質遺伝子との融合遺伝子を調製した。本遺伝子断片を真核生物発現用プラスミドに組み込み個体に接種したところ、顕著な抗体価の上昇が確認された。本研究では、魚類のモノクローナル抗体を人工的に調製することを目的としている。平成27年度は魚類の免疫グロブリン陽性細胞を単離する目的で、免疫グロブリンに対する抗体を用いた魚類白血球の標識を試みた。

さらに、魚類免疫グロブリン重鎖において、多くの魚種間でアミノ酸配列が保存されている領域を見いだし、本領域に対するポリクローナル抗体を調製し解析したところ、魚種ごとに血中の免疫グロブリン量が異なることが示された。とくに、ヒラメでは血中の免疫グロブリン量が少ない傾向が見られたことから、免疫グロブリン陽性細胞の数も異なることが示唆された。一方、魚類の特異抗体が成立する過程に関わる機構を解明するため、I型IFNおよびその情報伝達に関わる種々の遺伝子の同定を行い、各遺伝子の発現動態を解析した。さらに、抗原に対してより特異抗体価を高めるための方法として、ヒラメのLAMP-1遺伝子をクローン化し、本遺伝子を用いた組換えDNAワクチンを開発した。このように、魚類のモノクローナル抗体を単離するための細胞の分離法は徐々に確立されつつあるとともに、抗原に対する特異抗体価を高めるための手法についても検討がなされていることから、本研究は概ね順調に進展しているといえる。平成28年度は、免疫グロブリン産生細胞一細胞よりRNAを抽出しcDNAを合成するための端緒として、少数の細胞から抽出したRNAを鋳型としてPCRにより目的遺伝子を増幅するための手法の開発を試みた。魚類培養細胞を用いた予備実験では、10細胞程度から得られたRNAから合成したcDNAを鋳型として遺伝子断片を増幅することができた。そこで、白血球より抗体産生細胞を分取し同様の実験を試みたが、細胞が少ないと遺伝子を増幅することが出来なかった。現在、実験条件を詳細に検討中である。魚類IgMを検出するための抗体を作製するために、魚類抗体に保存された領域をコードするペプチドおよび組換えタンパク質を用いてウサギを免疫し、抗血清を得た。本抗血清はウエスタンブロット解析では魚類IgMを検出することが可能であるが、ELISA法では魚類IgMと結合しないことが示された。魚類の抗体産生細胞の活性化機構を解析することを目的として、アジュバントを用いて免疫した際の免疫応答についてヒラメを用いて解析した。アジュバントとしてフロイントコンプリートアジュバントを用い、ヒラメを細菌のホルマリン死菌で免疫したところ、菌体に対する抗体価が顕著に上昇した。マイクロアレイを用いた解析により、アジュバントの添加によりインターフェロンγ(IFNγ)遺伝子およびIFNγ応答遺伝子の発現上昇が抑えられることが示された。さらに、次世代シークエンサーを用いた発現遺伝子解析により、抗体産生を制御するものも含め64種類の主要なサイトカイン遺伝子を同定し、これらの遺伝子の網羅的な発現動態を解析するための手法を開発した。本研究では魚類IgMをベースとした人工モノクローナル抗体を調製することを目的としている。平成28年度は、少数の魚類抗体産生細胞からRNAを抽出し、これを鋳型として目的とするIgM遺伝子を増幅するための方法を検討した。培養細胞を用いた検討では目的の遺伝子を増幅することができたことから、さらに条件を検討することにより、抗体産生細胞からIgM遺伝子を増幅することが可能となると期待される。