hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クルマエビの性決定機構の解明

閉鎖循環型飼育下で,クルマエビの雌1×雄1交配を行い,採卵した受精卵を3等分し,18,24,30°Cの異なる水温で種苗生産を行った.各水温区で性比を調べたところ,高水温では雌が多くなる傾向がみられた.高水温区について,既存のRFLPマーカーで解析を行ったが,本研究で作成した家系では当てはまらなかった.引き続き家系を維持し,検定交雑による確認とマーカー開発を行うこととなった.副次的成果として,小型(500L)水槽の閉鎖循環型飼育においても交尾が確認されたことは珍しく,また,両親を生かしたまま行う人工交配についても成功した.今後の育種用家系飼育に貢献できると思われる.昨年度作成した家系では,18°C区のサンプルデータがなかったため,今年度新たに飼育試験を行った.閉鎖循環系飼育を行うため外部フィルターまたは泡沫分離装置を取り付け,陸上水槽(FRP水槽)の底質に浜砂を敷き,エアレーションを入れ設置した.しかし,現環境では交尾する機会が非常に少なく,1×1家系の再生産に時間がかかった.水温はほぼ常温としたが,夏季に30°Cを超える場合は26ー28°Cになるようにクーラーを設定し,冬季も10°C以下または10°C台の場合は2,3日で徐々に加温し,24°Cに設定して卵巣を成熟させ,採卵を行った.生残率はそれぞれの試験および温度区によって異なるが,30°C,24°Cでは成長した.しかし,18°Cでは幼生の変態が遅れ,稚エビに変態できないまま全滅することが明らかになったため,低温区を18°Cから20°Cに変更し,家系作成を行うこととした.前年度作成したクルマエビ家系の親および子供個体からフェノール・クロロホルム法またはDNA抽出キットを用いてゲノムDNAを抽出した.今年度作成した家系についても低水温区の性比結果が出次第ゲノムDNAを抽出する.クルマエビの既存のマーカーを用いて解析を始め,平行して新しくAFLPマーカーを開発するため,キットを用いて解析中である.閉鎖循環型飼育下で,クルマエビの雌1×雄1交配を行い,採卵した受精卵を3等分し,18,24,30°Cの異なる水温で種苗生産を行った.各水温区で性比を調べたところ,高水温では雌が多くなる傾向がみられた.高水温区について,既存のRFLPマーカーで解析を行ったが,本研究で作成した家系では当てはまらなかった.引き続き家系を維持し,検定交雑による確認とマーカー開発を行うこととなった.副次的成果として,小型(500L)水槽の閉鎖循環型飼育においても交尾が確認されたことは珍しく,また,両親を生かしたまま行う人工交配についても成功した.今後の育種用家系飼育に貢献できると思われる.初年度となる平成24年度はクルマエビの解析家系を作出するため飼育下で1×1交配を行い,同じ親の受精卵から低温高温の異なる水温実験区で種苗生産を行った.また外部形態から雌雄判別を行い,性比について検討した.家系作成のため,養殖場より体長150160mmのクルマエビを購入した.当所では掛け流しによる飼育は不可能であるため,閉鎖循環系による飼育環境をまず整備した.FRP水槽に外部フィルターまたは泡沫分離装置を取り付け,水温は常温とし,エアレーションにより通気を行い,1日おきまたは毎日1/41/5の換水を行った.1×1交配家系を作成するするためにオス1個体に対し,メスを複数個体入れ,餌として配合飼料(ヒガシマル,ゴールドプローン)を毎日投与した.交尾栓が確認されたメスについてはポリエチレンタンクに隔離し,産卵誘発のために片眼柄処理を施し,採卵を行った.同じ1×1交配家系から生まれた受精卵を30,24,18°C試験区用に3分割し,珪藻およびアルテミア給餌により飼育を行った.飼育水温による成長差が大きく,また18°C区は成長だけでなく生残が悪かったため,約1ヶ月後に死滅した.30°Cと24°C試験区を約4ヶ月後に取り上げたところ,30°C区で144個体,平均体長108.2mm,24°C区では230個体,平均体長78.1mmであった.形態観察により雌雄判別を行ったところ,オス:メスは30°C区で0.54:0.46,24°C区で0.49:0.51となり,どちらも性比は1:1であった.両親およびサンプリングした30,24°C区の稚エビからゲノムDNAを抽出し,AFLPマーカーによる解析に着手し,引き続き新たな家系作出を行っている.本研究で作成した家系に既存のクルマエビAFLPマーカーを試験したところ,一部うまくいかなかったため,原因究明に時間がかかった.制限酵素の切断の不十分さであることが判明した.

クルマエビDNAは制限酵素による切断が困難であり,予定していた新たなマーカー作成も難航した.原因が解明できたため,今後は本研究で作成した家系をもとに新規マーカーを作成し,解析できる可能性が高くなった.水温区試験の家系により,性比の偏りについて傾向があるため,引き続き家系維持を試み,その検定交雑による確認とマーカー開発が期待されることとなった.家系作成の飼育中に小型水槽では難しかった交尾が確認された.また,掛け合わせたい雌雄の親をどちらも生かしたまま人工交配させることに成功し,クルマエビにおける育種に向け,1×1家系作成ができるようになった.交配に関して,育種を行う上で最重要ポイントでもあったため,本課題中での副次的成果として学会等で公表し,今後のクルマエビ育種試験に貢献できると思われる.水産増殖学,集団生物学,集団遺伝学今年度は研究協力者の在籍する大学において,改築作業が行われたたため,予定していた解析をあまり行うことができなかったが,サンプルの準備はできているので最終年度の解析で成果が得られる予定である.飼育開始当初に1×1交配がみられず,水槽の大きさやエビの密度を変えて試験する期間が長くなり,予定よりも採卵および種苗生産が遅れた.しかし,今回の試験では30,24°C試験区で性比に偏りがみられていないことから,研究計画通り新規AFLPマーカーの開発と並行して,既存のマーカーが使用可能かどうかを試験する.性比の偏りがなく水温による性転換を起こしていないと思われる遺伝的形態的雌の個体と,性比の偏りがあり水温による性転換を起こしていると思われる遺伝的には雌だが形態的には雄のマーカー選抜を行う.性比のコントロールおよび全雌生産の可能性について検討する.平成24年度にサンプリングした個体のゲノムDNAをもとに,既存のクルマエビAFLPマーカーを用いて性比の偏りがみられない家系で使用できるか試験する.それと並行して,新たなAFLPマーカーの開発を行う.現在交配試験を行っている新しく作出する家系において,形態観察により性比の偏りのみられない水温区に対して遺伝マーカーで解析し,性連鎖遺伝マーカーを開発する.また,形態から性比の偏りがみられた水温区については,新しく開発した遺伝マーカーによりTSDかどうかを調べる.今年度は研究協力者の施設にて解析を行う予定であったが,大学の改装に伴い実験室が使用できなかったため,解析用物品購入および旅費の使用を控え,次年度に繰り越すことにした.今年度できなかった解析を次年度行うため,繰り越した予算を使用する.該当なし
温暖地球システムにおける季節変動の解明〜6千年前気候オプティマム期をモデルとして

本研究は,最近の温暖期である6千年前の気候オプティマム期にどのような気候変動とくに季節変動が存在したかを解明することを目的とした.本研究では以下の点を実施した.網走湖において採取され,そのまま未開封で保存されていた湖底堆積物コア9801および9803に関し,(1)X線CT装置による非破壊コア内部構造の計測を行い,年代測定に有効な貝殻片などの層準を明らかにした.(2)未開封のコアを開封,押し出し,半割したあと,9801コアに関し,良好な貝殻片を厳選し,加速器質量分析計による放射性炭素の絶対年代測定を行った.測定はコンパクトAMS : NEC製1.5SDH(パレオ・ラボ)を用いた。得られた^<14>C濃度について同位体分別効果の補正を行った後、^<14>C年代、暦年代を算出した。(3)その結果,9801コアは,最下部付近において,9374±37年であることが明らかとなった.(4)半割されたコアに関し,非破壊蛍光X線コアロガーTATSCAN-F2,非破壊拡散分光コアロガーTATSCAN-S1(海洋研究開発機構)をつかって,コア表面の元素分布および拡散分光特性を明らかにした.(5)6千年前の気候オプティマム期には明瞭なラミナが発達し,珪藻を主とする明色のラミナと,粘土鉱物と有機物が季節単位で互層する暗色のラミナが,層厚47mm程度のラミナセットを構成する.この点で個々のラミナは季節変化を意味する.さらに,ラミナセットの層厚は,1020枚程度のスーパーセットで周期的に変化する.明色ラミナの珪藻の増加は春先の降水量増加によるシリカの流入と珪藻の繁殖のイベントと推測される.今後,さらに変動要因を追求していく必要がある.本研究は,全球平均気温が現在よりも2°C高かったと推定されている,もっとも最近の温暖期である6千年前の気候オプティマム期(Climatic Optimum)にどのような気候変動とくに季節変動が存在したかを解明することを目的とする。具体的には、堆積速度の大きい網走湖湖沼堆積物コア(47mm/1年程度の堆積速度,過去1万年間)を材料として,堆積物に保存された縞々の時間的および地質学的意味を明らかにし,温暖化地球における数年数百年という時間スケールでの季節変動の実態解明にとりくむ。本年度は,1998年に採取された二本の網走湖湖底コアのうち、コアABA9801について,以下の点を実施した,(1)物性(ガンマ線密度,P波伝搬速度,帯磁率)測定を非破壊マルチセンサーコアロガー装置で行った(平野,飯島).(2)堆積構造を乱さないように,2種類(長さ25cm,長さ1m)の特注プラスチックケースを用いて連続試料を採取し,軟X線撮影を行った(坂井).(3)プラスチックケースで採取された連続試料の堆積構造を破壊せずに,a)長さ25cmのプラスチックケースをそのまま凍結乾燥する方法,b)長さ1mのプラスチックケースをそのままt-ブチルアルコールで水分を置換し,樹脂固結させる方法論の検討を行った(平野).(4)非破壊蛍光X線コアロガー,非破壊分光イメージングコアロガーを用いて,元素,分光スペクトルの分布をイメージングための試料の準備を行った(飯島・坂本).当初予定していた、放射性核種^<210>Pb_<ex>,^<137>C_Sの測定(小栗),分子別有機物放射性炭素同位体測定(内田)を行い,コアの年代モデルを構築する(坂本)、については、次年度の課題とした.試料の解析は進行中であり、次年度、予定された分析項目を実施し、研究の地理まとめ、成果発表を行う。(3)その結果,9801コアは,最下部付近において,9374±37年であることが明らかとなった.(4)半割されたコアに関し,非破壊蛍光X線コアロガーTATSCAN-F2,非破壊拡散分光コアロガーTATSCAN-S1(海洋研究開発機構)をつかって,コア表面の元素分布および拡散分光特性を明らかにした.(5)6千年前の気候オプティマム期には明瞭なラミナが発達し,珪藻を主とする明色のラミナと,粘土鉱物と有機物が季節単位で互層する暗色のラミナが,層厚47mm程度のラミナセットを構成する.この点で個々のラミナは季節変化を意味する.

さらに,ラミナセットの層厚は,1020枚程度のスーパーセットで周期的に変化する.明色ラミナの珪藻の増加は春先の降水量増加によるシリカの流入と珪藻の繁殖のイベントと推測される.今後,さらに変動要因を追求していく必要がある.
グリア細胞成長因子のアストロサイト分化誘導機構

申請者らはグリア細胞成長因子(GMF)により未成熟型から成熟型へと分化するアストロサイトの生化学的変化の機序を研究している。これまでの研究で細胞骨格がGMFによるアストロサイト細胞分化に重要な役割を担うことがわかってきた。そこで本研究では培養ラットアストロサイトより主要細胞骨格であるマイクロフィラメントとグリアフィラメントを特異的に脱重合抽出し、これらの細胞骨格画分を用いてinvitroで再構成されたフィラメントの特性とこれらフィラメントの相互作用を検討した。マイクロフィラメント画分(MF)の重合はシアリルコレステロール(SC)存在下でグリアフィラメント画分(GF)により促進されることが新たにわかった。GFがあらかじめ重合されフィラメント形成したものはMF重合促進作用がいじるしく低下したことから、未重合状態のグリアフィラメント画分がマイクロフィラメント重合に作用するものと考えられた。MFとGFの相互作用に関与するタンパク質を検索したところ、ビメンチンがアクチンに直接作用して、マイクロフィラメントの重合を促進することがわかった。形成されたフィラメントを電子顕微鏡観察したところ、SC存在下でビメンチンフィラメントとS1フラグメントで修飾されたアクチンフィラメント(F-アクチン)との結合構造を見いだした。これらの知見からマイクロフィラメントとグリアフィラメントはアクチンとビメンチンとの結合を介して相互作用することが示唆された。
NMDA型及び代謝型グルタミン酸受容体の生理的役割の解明

グルタミン酸受容体は、中枢神経系において高次脳機能や病的状態の神経細胞死に深く関与しており、イオノトロピック型のNMDA受容体とAMPA/カイニン酸受容体及びメタボトロピック受容体(mGluR)から成る。我々のグループは、分子生物学、薬理学、電気生理学などさまざまな手法を用い、グルタミン酸受容体の構造及び機能について明らかにしてきた。本年度は、神経細胞の生存と死におけるNMDA受容体の役割に焦点を当て研究をおこなった。NMDA受容体は、高いカルシウムイオン透過性をもつため、神経細胞の生存と死に深く関わっていると考えられている。我々は、小脳顆粒細胞の初代培養系をモデルとして、以下のことについて明らかにした。1.小脳顆粒細胞では、脱分極刺激又はNMDA刺激によって細胞内Ca^<2+>濃度が高められ、その結果、NMDA受容体のサブユニットの一つであるNR2AサブユニットmRNAの発現が特異的に増加し、NMDA受容体活性が増加することを示した。また、そのとき顆粒細胞の生存率が高められる事を示した。2.脱分極刺激によるNR2Aの発現増加によって、NMDAによる顆粒細胞の細胞死が起こるようになることを示した。以上から、我々は、小脳顆粒細胞の初代培養系において、NMDA受容体の特定のサブユニトの遺伝子発現の調節が、NMDA受容体活性の調節を支配し、そのことが神経細胞の生存と死に深く関与することを明らかにした。
ファイトアレキシン合成系遺伝子の構造と機能の解析

本研究は、ジャガイモのファイトアレキシン合成の鍵酵素である3-Hydroxy-3-methylglutary1 CoA reductase (HMGR)遺伝子の推定プロモーター領域について検討したものである。病原菌接種およびエリシター処理により誘導されるHMG2およびHMG3遺伝子を単離して塩基配列を決定したところ、両ゲノムクローンとも3つのイントロンに分断される構造であった。これらの転写開始点を調べると、両者において翻訳開始コドンからおよそ6070塩基上流に複数の転写開始点が認められた。推定プロモーター領域の全長をルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み、エレクトロポレーション法でジャガイモ塊茎プロトプラストに導入してプロモーター活性を調べた。HMG2の推定プロモーターでは、HWC処理区においてルシフェラーゼ活性の増加が認められた。デリーションクローンを構築してプロモーター活性を調べた結果、alternative oxidaseのプロモーター領域に見い出されたHFS boxおよびエリシター誘導性の防御遺伝子であるフェニルアラニンアンモニア・リアーゼのシスエレメントであるBox Aの関与が示唆された。同様にHMG3の推定プロモーター活性を調べた結果、エリシター誘導性の防御遺伝子であるカルコン合成酵素のプロモーター領域に見い出されたmyb配列およびフェニルアラニンアンモニア・リアーゼのシスエレメントであるBox Pの関与が浮かび上がってきた。また、デリーションの位置を考慮すると、約300bpの繰り返し配列の一ユニットではHWC誘電能を発揮し、この配列が繰り返されると、逆に抑制効果をもたらすことが考えられる。さらに、この繰り返し配列は、プロモーター活性を全体的に上昇させる機能を有するものと思われた。病原菌の攻撃を受けた植物細胞には様々な防御応答が誘導される。中でもファイトアレキシン蓄積が主役を演じていると考えられている。ナス科植物のファイトアレキシンの多くはテルペノイドである。ジャガイモ疫病では、非親和性菌が感染を試みると、セスキテルペノイドファイトアレキシンであるルビミシおよびリシチンが合成誘導される。しかしながら、これらの合成に関与する酵素については一部の遺伝子がクローニングされているにとどまっている。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA還元酵素(HMGR)は3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA(HMG-CoA)からメバロン酸合成を触媒し、イソプレノイド合成経路において重要な役割を果たす。ジャガイモにおけるHMGR遺伝子は、3クラスから成る多重遺伝子族を形成しており、hmg2およびhmg3はエリシター処理や病原菌接種により誘導されることが知られている。疫病菌菌体エリシター(HWC)およびアラキドン酸処理を施したジャガイモ塊茎より12時間後まで全RNAを抽出してノーザン解析したところ、HWC処理区において一過的なhmg2およびhmg3の転写誘導が認められた。さらに親和性菌、非親和性菌接種区においては、両者でmRNAの蓄積が観察された。しかしながら、翻訳途中にあるポリソームRNAを精製し、hmg2またはhmg3に特異的なプローブを用いてノーザン解析したところ、非親和性菌接種区においてのみmRNAの蓄積が確認された。したがって、hmg2およびhmg3は転写後調節によって制御されているものと思われる。hmg3ゲノムクローンの全塩基配列を決定した。hmg3ゲノムクローンは、3つのイントロンに分断される構造をもつ。推定プロモーター領域にはmybおよびP-box様配列が存在し、H-box様配列を2つ含む約300bpの繰り返し配列が認められた。翻訳開始コドンの5′側近傍には、ピリミジンに富む配列が見いだされた。
AR法と数値モデルによる異常出水の発生予知と防災工による出水軽減の効果の研究

a)洪水の数値予測および防災工効果土壌中に浸透した降雨の移動を表すRichardsの不飽和浸透方程式および降雨中の溶解物質(酸性雨)の移動を表すFick型の拡散方程式を、一般座標系(boundary fitted grid)の導入により解く2次元および3次元数値計算スキームを完成した。これにより、任意の複雑な地形での降雨-流出過程や防災工の効果をシミュレートすることが可能となった。また、洪水流出の細部機構、人口的流出の変更の影響を予知することが可能となった。AI(人工知能)システムはもともと論理的に推論を行い結論を導くようにできているので、不確定要素が多く入り込む現地での洪水予測とそれに基づくダム貯水池の管理には適さない。どこでFuzzy理論を応用したFuzzy推論によるエキスパートシステムを作成した。現場データへの適用によりこのシステムが流出予測をかなり的確に行う能力を有していることを示した。c)フィルター分離AR法による洪水のオンライン予測法の現地適用表記の洪水予測法は、非線型現象である洪水流出を23の成分に数値フィルターで分離し、それぞれの流出成分をAR式で予測するもので、現在までの流量時系列から有効降雨時系列も逆推定しうる方法である。今回新たに、相模川、奈半利川にこの方法を適用し、オンライン予測を行った。
地方大学におけるトリスタン実験デ-タの解析

本研究費補助金によって設置された端末は,NTTの通信回線DDXーPによって高エネルギ-物理学研究所(KEK)・トリスタンのホスト計算機に接続され順調に稼動して来た。この3年間における研究成果は下記に示すものである。1.トリスタン実験デ-タの解析重心系エネルギ-60GeVの電子・陽電子衝突による素粒子反応がKEK・VENUS測定器で検出されデ-タが採取された。その中から有効なイベントが粗処理されてホスト計算機に蓄積されている。本端未からこれらデ-タにアクセスして,幾種類ものモンテカルロシミュレ-ションを行いながらデ-タの解析を行った。研究成果は,本端末が実際に関与した2年間で物理の発表論文11編であった。2.CERNーSerupukovーKEK共同実験GAMSデ-タの解析欧州原子核研究所(CERN)とソ連邦高エネルギ-物理学研究所(Serupukov)で実験され採取されたデ-タはKEKのHEPネットワ-クを通して解析が行れた。我々はGAMS測定器が検出した6ケのγ線からメソン共鳴状態の解析を行っているが,現在進行中である。3.研究報告書の作成端未設置に関してまとめを行った。その内容は通信回線,タ-ミナルエミュレ-タ-等の端未ソフトの開発・アレンジを報告するものであり,その仂きを示すために,転送されたグラフィック画面(VENU実験デ-タ)を例示したものである。本年度計画は、1.通信回線としてNTT第一種DDXを設置する。2.現有パソコンにデータ多重装置(PAD)を付設して、高エネルギー物理学研究所(KEK)大型計算機の端末器とする。3.トリスタン実験データの解析をはじめる。であった。1.については、本年度7月に設置された。これはNTTが実施している国内用のデータ通信ネットワークであって、特定通信回線を通して行うパケット交換方式(DDX-P)によるものである。2.については、KEKとの通信に実績のある機種を選んだ。PADの役割は、非パケット型端末器からのデータのやり取りに、パケット化又非パケット化することである。PADのパラメータの設定に多少時間を要したが、NTT及び業者の協力でこれも適切に設定され、KEKとの通信が定常的に行われるようになった。3.については次のことを行った。(1)トリスタン実験データファイル、解析プログラムファイル及び計算出力ファイルをホスト計算機と端末との間に相互に転送可能なプログラム、及びこれら転送されて来るファイルを解読可能な形式に変換するプログラム等の端末ソフトの準備を行った。これにはトリスタン研究グループの協力を得た。(2)トリスタン実験データは豊富な内容を含んでいるので、多方面からの解析が必要である。本研究では、光子-光子による共鳴粒子の発生をテーマとして取り上げている。そのためのモンテカルロ・シミュレーションを開始し、現在進行中である。昨年度本研究費によって設置された通信回線DDX-Pを用いて、高エネルギ-物理学研究所(KEK)に蓄積されているトリスタン実験デ-タの解析を行うと共に、他の高エネルギ-素粒子反応の実験デ-タの解析も行った。1.トリスタン実験デ-タの解析ビ-ムエネルギ-30GeVの電子-陽電子衝突の実験デ-タが逐次KEK大型計算機に蓄積されている。その情報を本端末によって日常的にキャッチしている。又必要に応じてモンテカルロシミュレ-ションを行い、実験デ-タと比較して多くの成果を得た。(「研究発表」参照)進行中のものとして、二光子共鳴生成反応についてこれまでのデ-タの検討を行っている。数10-100GeV陽子又はπメソンによる多重γ線発生の実験が海外協力研究で行われている。[科研費(国際学術研究)メソンスペクトロスコピ-の研究、研究代表者高松邦夫]これまでのサマリ-デ-タがKEKに蓄積されているので、この解析も行っている。

本年度は主として6γイベントの解析を本端末より行い現在進行中である。高エネルギ-物理学研究所(KEK)のホスト計算機に接続された端末器によって,昨年度に引き続いて素粒子実験デ-タの解析を行った。1.トリスタン実験デ-タの解析電磁シャワ-の発展や高エネルギ-ジェット現象の解析のために,モンテカルロ・シミュレ-ションを行い,実験デ-タと比較検討を行った。その他,二光子共鳴生成反応についても解析を行った。2.CERNーSeruprovーKEK共同実験GAMSデ-タの解析CERN及びSeruprov研究所で行った実験で,高エネルギ-陽子又はπ中間子による多重γ線発生の解析を行った。特に6ケのγ線による中間子共鳴の解析を行っているが,現在進行中で未だ結果を得ていない。3.研究報告書の作成本研究の最終年度になるので,端末の設置に関すること(通信回線,端末エミュレ-タ等のソフトの開発・アレンジ)とその成果についてまとめを行った。
インプラント周囲炎の活動性を診断するチェアーサイド検査システムの開発

インプラント周囲炎と診断され,インプラント体を除去した患者のうち同意が得られた2名からインプラント体周囲歯肉を採取し,免疫組織学的検討を行った.また,当科で口腔インプラント治療を受けた患者のうち,3名にインプラント周囲に重度骨吸収が観察された.これらインプラント周囲炎患者に従来の歯周外科治療を行い,治療効果とMMP-8との関連を検討した.さらに,インプラント周囲炎のリスク因子,すなわちオッセオインテグレーション獲得・維持を阻害するリスク因子の同定を目的に臨床疫学的検討を行った.【方法】1.インプラント周囲炎によりインプラント体を除去した2名の患者から採取した歯肉は,通法通り切片を作成し,HE染色ならびに抗MMP-1,-8,-13抗体を用いた免疫染色を行い,コラゲナーゼ産出細胞の局在を観察した.2.インプラント周囲炎患者3名のうち,同意が得られた2名に対し歯周外科を行った.歯周外科施術前後にインプラント周囲溝滲出液(PICF)を採取し,従来行われている歯周検査,規格化レントゲン撮影を行った.PICF中のMMP-8の検出は抗MMP-8モノクロナール抗体を用いたWestern blottingにより行った.3.全リコール患者136名の診療録から,オッセオインテグレーション獲得・維持を阻害すると思われる既知のリスク因子12項目を調査し,多変量解析によりリスク因子の同定を行った.【結果】1.インプラント周囲炎歯肉を用いて免疫組織学的検討を行った結果,炎症性細胞周囲にMMP-8の局在を認めた.2.歯周外科前に検出されたMMP-8は,外科後には検出されなかった.そして,3カ月後のレントゲン所見では,術前と比較して,進行していた骨吸収は抑制もしくは骨添加が認められた.3.多変量解析の結果,オッセオインテグレーション獲得阻害のリスク因子は,上下顎といった埋入部位,喫煙の有無,インプラント体の表面性状であった,一方,維持破壊のリスク因子は,埋入部位とインプラント体の長さであった.インプラント周囲炎と診断され,インプラント体を除去した患者のうち同意が得られた2名からインプラント体周囲歯肉を採取し,免疫組織学的検討を行った.また,当科で口腔インプラント治療を受けた患者のうち,3名にインプラント周囲に重度骨吸収が観察された.これらインプラント周囲炎患者に従来の歯周外科治療を行い,治療効果とMMP-8との関連を検討した.さらに,インプラント周囲炎のリスク因子,すなわちオッセオインテグレーション獲得・維持を阻害するリスク因子の同定を目的に臨床疫学的検討を行った.【方法】1.インプラント周囲炎によりインプラント体を除去した2名の患者から採取した歯肉は,通法通り切片を作成し,HE染色ならびに抗MMP-1,-8,-13抗体を用いた免疫染色を行い,コラゲナーゼ産出細胞の局在を観察した.2.インプラント周囲炎患者3名のうち,同意が得られた2名に対し歯周外科を行った.歯周外科施術前後にインプラント周囲溝滲出液(PICF)を採取し,従来行われている歯周検査,規格化レントゲン撮影を行った.PICF中のMMP-8の検出は抗MMP-8モノクロナール抗体を用いたWestern blottingにより行った.3.全リコール患者136名の診療録から,オッセオインテグレーション獲得・維持を阻害すると思われる既知のリスク因子12項目を調査し,多変量解析によりリスク因子の同定を行った.【結果】1.インプラント周囲炎歯肉を用いて免疫組織学的検討を行った結果,炎症性細胞周囲にMMP-8の局在を認めた.2.歯周外科前に検出されたMMP-8は,外科後には検出されなかった.そして,3カ月後のレントゲン所見では,術前と比較して,進行していた骨吸収は抑制もしくは骨添加が認められた.3.多変量解析の結果,オッセオインテグレーション獲得阻害のリスク因子は,上下顎といった埋入部位,喫煙の有無,インプラント体の表面性状であった,一方,維持破壊のリスク因子は,埋入部位とインプラント体の長さであった.今年度は,引き続き当科のメンテナンスプロトコル(インプラント周囲歯肉溝滲出液(PICF)の採取,歯周病原生細菌に対する末梢血清抗体価の測定,PCR法を用いたPICF中の細菌検査)に従い,リコールを行うとともに,インプラント周囲炎に代表されるインプラント体周囲の骨破壊,すなわちオッセオインテグレーションを破壊するリスク因子を同定することを目的に,臨床疫学的検討を行った.また,インプラント周囲炎と診断され,インプラント体を除去した患者のうち同意が得られた2人からインプラント体周囲歯肉を採取し,免疫組織学的検討を行った.【方法】1.当科で口腔インプラント治療を受けた全患者136人の診療録から,オッセオインテグレーションを破壊すると思われる既知のリスク因子12項目を調査した.2.オッセオインテグレーション破壊の独立したリスク因子の同定は,上部構造装着前後に,すなわちオッセオインテグレーション獲得と維持にわけこれら12項目を予測因子とした多変量解析により行った.3.インプラント周囲炎によりインプラント体を除去した患者から採取した歯肉は,通法通り切片を作成し,HE染色ならびに抗MMP-1,-8,-13抗体を用いた免疫染色を行い、コラゲナーゼ産出細胞の局在を観察した.【結果】

1.多変量解析の結果,オッセオインテグレーション獲得失敗と維持喪失のリスク因子は異なっていた.すなわち,インプラント体周囲の骨破壊のリスクを評価するうえで,オッセオインテグレーション獲得と維持をわける必要性が示唆された.2.インプラント周囲炎歯肉を用いて免疫組織学的検討を行った結果,炎症性細胞周囲にMMP-8の局在を認めた.今後引き続き当科の口腔インプラントリコール患者ならびにインプラント周囲炎患者に対し,PICFならびに末梢血採取を行い,ELISA法によるMMPsの定量化,細菌との関連性の検討を行う予定である.当科のインプラントメンテナンスプロトコルに従いインプラント患者にリコールを行ったところ,3名にインプラント周囲の重度骨吸収が観察された.これらインプラント周囲炎患者に従来の歯周外科治療を行い,臨床検査および分子生物学的手法を用いて治療効果とMMP-8との関連を検討した.さらに,インプラント周囲炎のリスク因子,すなわち上部構造装着後のオッセオインテグレーション維持を破壊するリスク因子の同定を目的に臨床疫学的検討を行った.【方法】1.インプラント周囲炎患者3名のうち研究の主旨を説明し,同意が得られた2名に対し歯周外科を行った.2.歯周外科施術前後にインプラント周囲溝滲出液(PICF)を採取し,従来行われている歯周検査,規格化レントゲン撮影を行った.PICF中のMMP-8の検出は抗MMP-8モノクロナール抗体を用いたWestern blottingにより行った.3.また,全リコール患者136名の診療録から,オッセオインテグレーション維持を破壊すると思われる既知のリスク因子12項目を調査し,多変量解析によりリスク因子の同定を行った.【結果】1.歯周外科前に検出されたMMP-8は,外科後には検出されなかった.そして,3カ月後のレントゲン所見では,術前と比較して,進行していた骨吸収は抑制もしくは骨添加が認められた.2.多変量解析の結果,オッセオインテグレーション維持破壊のリスク因子は,上下顎といった埋入部位とインプラント体の長さであった.本研究は,骨破壊のリスク因子の同定ならびにリスクマーカーの検索を目的に,歯周病学的および臨床疫学的両側面からアプローチしてきた.そして,リスク因子の同定,有力なリスクマーカーの候補を絞ることはできた.今後は,骨吸収の活動性を診断できるチェアーサイド検査キットを使用した多面的なインプラントメインテナンスプロトコルを開発する予定である.
新生される嗅球介在ニューロンの移動を支える血管―神経相互作用の解析

匂いの情報処理を行う嗅球の介在ニューロンは、神経細胞としては例外的に、成体の脳内でも新生することが知られる。新たに生まれた細胞が、生涯に渡って嗅球の既存の神経回路へと組み込まれている。そこで本研究は、成体における嗅球の神経回路新生が、血管と神経とのいかなる相互作用により支えられているのか?という点に着目して解析を行った。嗅球内を移動中の介在ニューロンと周囲の血管との関係を明らかとするため、新生介在ニューロンをレンチウイルスにより蛍光ラベルし、血管を蛍光色素でラベルして、嗅球のスライス培養により、経時変化を観察した。解析の結果、嗅球内を目的地に向けて移動する新生介在ニューロンには、1血管に沿って移動する細胞と、2血管から離れて移動する細胞がいることが明らかとなった。さらに血管に接している新生介在ニューロンの割合を定量した結果、嗅球の周辺部分と比較して、嗅球内側の顆粒細胞層では、血管に接する新生ニューロンの数が有意に少ないことが分かった。これらの結果から、嗅球内の位置や最終的な移動先の違いにより、介在ニューロンの移動方法が異なる可能性が示唆された。さらに、嗅球介在ニューロンの顆粒細胞で特異的にEphAレセプターが発現しており、新生顆粒細胞の移動の制御に必須の役割を果たすことを明らかとした。また、嗅球の神経活動が、血管新生に及ぼす影響についても検討を行った。片側の鼻孔を閉じて神経活動を低下させたマウスでは、鼻腔閉塞を行った側の嗅球で、新生介在ニューロンの数が減少し、その発達も阻害される。興味深いことに私達は、鼻腔閉塞した嗅球で、血管ネットワークの発達が有意に阻害されることを見出した。このような神経活動依存的な血管新生の制御メカニズムとして、嗅球の神経活動依存的に血管形成因子VEGFの発現が制御されることを見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。解析の結果、嗅球内を目的地に向けて移動する新生介在ニューロンには、(1)血管に沿って移動する細胞と、(2)血管から離れて移動する細胞がいることが明らかとなった。これらの結果から、嗅球内の位置や最終的な移動先の違いにより、介在ニューロンの移動方法が異なる可能性が示唆される。現在、介在ニューロンの目的地と移動形態との関係について、さらに詳細な解析を行っている。私達は、鼻腔閉塞した嗅球で、血管ネットワークの発達が有意に阻害されることを見出した。この結果は、嗅球の神経活動依存的に血管の発達を促進するメカニズムの存在を示唆しており、現在詳細を解析している。

このような神経活動依存的な血管新生の制御メカニズムとして、嗅球の神経活動依存的に血管形成因子VEGFの発現が制御されることを見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究により、介在ニューロンの嗅球内の移動形態に2つのパターンがあることや、嗅球内の部位により移動パターンが異なることを明らかとした。今後の課題として、さらに血管と神経との相互作用について、分子レベルの実体を明らかにする必要があると考えている。今後、より長期間のスライス培養を行い、血管と神経との相互作用の詳細について明らかとしていく予定である。
神経再生誘導に於けるNerve Growth Factorの作用(in vivo)

[目的]基底膜が末梢神経の再生に関与していることは周知の事実であるが、この中に含まれるtypeIV collagenをin vivoに応用した実験はこれまでにない。私達はtypeIV collagenに各種神経誘導因子を組み合わせ、末梢神経再生実験を行った。[方法]生後10週のwister系のratの両側坐骨神経を10mm切除した後、硬膜外チュ-ブを用いて神経の両断端を架橋し、チュ-ブ内に約12mmのgapを作製した。これらのチュ-ブ内に何も注入しないものー(1)、typeIV collagenのみ注入したものー(2)、typeIV collagenにlamininを加え注入したものー(3)、typeIV collagenに2.5SーNGFを加え注入したものー(4)、typeIV collagenに7SーNGFを加え注入したものー(5)の各種モデルを作製し、5週および10週で屠殺し、神経の再生状態を肉眼的および組織学的に観察した。[結果]5週では各モデルとも明らかな架橋形成は認められなかった。10週では、(1):再生組織を全く認めなかった。(2):4本中2本に連続性を認め、うち1本は比較的太い再生神経であった。(3)(4)(5):ほぼ全例に連続性を認めたが、特にlamininを加えたモデルでの再生状態が良好であった。組織学的には太い架橋形成のみられたモデルで有髄神経の再生状態が確認できたほか、神経再生時、周囲に肥満細胞(mast cell)が出現することが確認できた。[まとめ]typeIV collagenはそれ自体に神経誘導能があるといわれているが、今回の実験結果からもその可能性が示唆された。typeIV collagen単独よりも各種神経誘導因子との組み合わせにより更に良好な神経の再生が確認できた。肥満細胞は末梢神経再生時出現することより、何らかの機能を果たしている可能性が示唆された。
第三者を通じた議決権行使方法と決議の瑕疵に関する比較法研究

当年度においては日本およびドイツにおける株主総会での第三者を通じた議決権行使制度およびその制限に関する議論の全容を把握することに引き続き努めた。研究目的4に関し、東京地裁平成29年4月13日判決が取締役会の招集通知を欠き法令違反の瑕疵はあるが決議を有効とした事例ではあるが、広い意義における決議の瑕疵とその効力について関係があるものとして検討した。取締役会決議においても否決された決議に瑕疵がある場合、その決議の効力を争う際に株主総会決議と同様の問題が生じうることがわかった。さらに、まとめとして、過年度の研究内容を再度検討し総合することにつとめた。研究目的1234に関し、株主総会での第三者を通じた議決権行使制度およびその制限に関して、日本法における議論の概要をさらに把握することに努めた。文献研究において株主総会における議決権行使のの代理人資格制限の合理性を再度検討し、「株主以外の第三者による総会のかく乱防止」という論拠に関する議論の状況を確認した。さらに、制限方法の相当性の範囲を画するべく会社法上の公開会社と非公開会社についてそれを区別する考え方についての先行研究の内容を引き続き検討した。加えていわゆる定款による議決権代理人資格制限無効説につきその論拠と妥当性をなお検討した。ドイツ法に関しても株式法、有限会社法における議決権代理人資格制限に関する見解、判例を再度確認するとともに、瑕疵ある株主総会決議に関する積極的決議確認に関する訴えについての学説、判例をなお検討し、その法的性質、要件、効果、法的保護の必要性を把握することに努めた。当年度においては、日本及びドイツにおける株主総会での第三者を通じた議決権行使制度および、その制限の沿革に関する資料を収集し、概要を把握することに努めた。ドイツにおける近時の状況について、株式会社に関してかつては代理人資格制限を許す見解が支配的であったが、近時は否定説が有力に主張されている。この度、下級審で再び定款による代理人資格の制限につき否定する決定が下されたところ、さらに連邦通常裁判所は定款による代理人資格の制限を定める株主総会決議の瑕疵がすでに治癒されている場合には、株主からの無効の申し立てを認めないという判断を示した。ドイツのこのような判断に背後にはEUの経済政策の下、株主の権利に関する統一的なルールを国内法に移入しつつあることが考えられる。あらためて制限否定説の論理を再検討するとともに、仮に制限が否定された場合に現在の定款の効力を維持し法的安定性を確保する方策につき検討した。日本においても、株主の代理人資格制限に関する定めは定款におかれる。日本において広く行われている上述の制限に関し、ドイツを参照して直ちに定款自治の範囲を超えるとまではいえないとしても、今後、より好ましい企業統治確保のためになお検討する必要があるであろう。その場合、今回の連邦通常裁判所が示したような、異議申し立て権者の制限等による法的安定性維持の方策もまた必要と考えられる。以上の成果は「ドイツにおける議決権代理人資格制限に関する議論の展開ーヨーロッパ株主権利指針導入後の状況ー」と題する論稿において示される予定である(平成28年度中刊行予定)。当年度は、日本における議決権代理人資格制限に関する研究、ドイツにおける議決権代理人資格制限に関する研究を進めた。日本におけるものよりドイツにおけるものの研究が先行して進捗した。文献研究はおおむね予定よりも進捗している。一方で、予定していたヒアリング調査はなおその具体的内容に付き検討を必要とし、当年度計画通りには進捗しなかった。引き続き次年度以降の実施を計画する。以上より、おおむね順調に進展しているものといえる。当年度においては、日本およびドイツにおける株主総会での第三者を通じた議決権行使制度およびその制限の沿革に関する資料を収集し、概要を把握することに努めた。さらに、日本における瑕疵ある否決の株主総会決議の効力に関し、最高裁判所平成28年3月4日第2小法廷判決が当該論点に関する判断を下したところ、それが本研究の研究目的4「瑕疵ある否決決議の取消可能性とその効力に関し、否決された決議の生成過程に着目した解釈を得る」に関係するものであったため、先行して研究を進めることとなった。最高裁判所は一般に、ある議案を否決する株主総会等の決議によって新たな法律関係が生じることはないし、当該決議を取り消すことによって新たな法律関係が生ずるものでもないから、ある議案を否決する株主総会等の決議の取り消しを請求する訴えは不適法であると解するのが相当である」として、当該論点につき一定の判断を下した。それに対して、否決の決議につき瑕疵が存在する場合をさらに類型ごとに分類し、確かに形成の訴えである取消の訴えが適切ではない場合が存するが、一定の場合になお取り消しうる余地があるかどうかにつき研究を進めた。さらに、必ずしも取消の訴えによらず、決議不存在確認の訴えによることの可能性につき検討した。さらに、否決の決議の効力が否定されたときにどのような法的効果を生じさせることが当事者の合理的期待にかなうかについて研究を進めた。以上の内容は、2017年度内に論稿において公表する予定である。上記のように研究目的4「瑕疵ある否決決議の取消可能性とその効力に関し、否決された決議の生成過程に着目した解釈を得る」を中心に進めた。ドイツ株式法、有限会社法に関する文献研究は計画より遅延している。さらに、予定されているヒアリング調査については、その調査目的、目的達成のための手法も含めて、なお具体的内容につき検討を必要とし、計画通りに進捗しなかった。当年度においては、日本およびドイツにおける株主総会での第三者を通じた議決権行使制度およびその制限に関する概要を把握することに引き続き努めた。日本における東京地裁

平成28年12月15日判決が、株主総会の進行に際して株主権の侵害があったか否かについて争われたものであるが、広い意義での株主総会決議の手続に関するものであって本研究課題との関係があるとして検討した。株主総会の実質化の必要性とその弊害の回避のバランスが問題となると考える。さらに、否決された株主総会決議の積極的決議確認の訴えに関し、ドイツ株式法上の議論を参考にして検討した。株主総会決議の瑕疵を争う方法として、日本法上株主総会決議不存在・無効・取消しの訴えがある。以上の訴えの効果はいずれも生じた決議の効力の存しないことを確定することに向けられている。そこで、不正によって決議が不成立・否決された場合、株主の救済策はいかにあるべきか問題となる。決議の効力が認められなかった場合、たとえそれを不存在・無効・取消しとして効力を否定したとしても、株主の救済にいたらない。株主の救済のためには瑕疵ある決議を取り除くだけでは足りず、「ありうべき決議」の効力を認める必要があるが、そのような効力を認める解釈はいかにあるべきか。以上の問題について、ドイツ株式法の解釈上許容されている積極的決議確認の訴え(Die positive Beschlussfeststellungsklage)を参照し、その法的性質、要件、効果を検討した。法的保護の必要性についてドイツ法上の判例を検討し類型化を試みた。引き続き日本法上の保護の可能性を検討し、仮に積極的決議確認が認められるとしても保護される株主の範囲はそれほど広範なものにならないと考えられるが、保護することの許容性は満たされると解される。以上の研究内容は今後公表予定である。当年度は日本における議決権代理人資格制限に関する研究、ドイツにおける議決権代理人資格制限に関する研究、不存在の決議、瑕疵ある否決の決議の瑕疵と「あるべき決議」の効力を認める解釈についての研究を進めた。当年度は4否決決議を対象とする決議取消の訴えの可否とその効力に関しドイツ株式法、有限会社法に関する文献研究が進捗した。予定されているヒアリング調査については、その調査目的、目的達成のための手法も含めて、なお具体的内容につき検討を必要とし、計画通りに進捗しなかった。当年度においては日本およびドイツにおける株主総会での第三者を通じた議決権行使制度およびその制限に関する議論の全容を把握することに引き続き努めた。研究目的4に関し、東京地裁平成29年4月13日判決が取締役会の招集通知を欠き法令違反の瑕疵はあるが決議を有効とした事例ではあるが、広い意義における決議の瑕疵とその効力について関係があるものとして検討した。取締役会決議においても否決された決議に瑕疵がある場合、その決議の効力を争う際に株主総会決議と同様の問題が生じうることがわかった。さらに、まとめとして、過年度の研究内容を再度検討し総合することにつとめた。
中枢神経系を介した臓器間クロストークによる腎障害進展の分子機構の解明

我々は昨年度までに、遺伝的にレプチンシグナルを欠損するob/obマウスやdb/dbマウスにおいて、一側尿管結紮(UUO)による腎尿細管間質障害が軽減すること、少量のレプチンを脳室内に投与することによりob/obマウスで認められる腎保護効果が消失することを見出している。本年度、その分子機構を明らかにする目的で、以下の検討を行った。中枢神経系を介するレプチンの骨代謝調節作用は神経ペプチドCARTを介することが報告されているため、CARTKOマウスを用いてUUOによる腎障害を惹起したところ、野生型マウスと明らかな差異を認めず、レプチンは骨代謝調節とは異なる経路で末梢の炎症を調節することが示唆された。また、単球走化性因子fMLPを含有するマトリゲルを用いて、in vivo matrigel chemotaxis assayを行った。すなわち、ob/obマウスの皮下にマトリゲルを留置すると、野生型マウスと比較してF4/80陽性細胞の浸潤が有意に抑制され、ob/obマウスに対してレプチンを中枢投与することにより、浸潤細胞は有意に増加した。この際、骨髄におけるF4/80陽性細胞の比率はレプチン中枢投与により変化しなかった。一方、UUOによる腎ケモカイン発現の亢進は、野生型マウスと比較してob/obマウスにおいて有意に抑制されていたが、レプチンの中枢投与により明らかな変化を認めなかった。以上の研究成果より、中枢神経系を介したレプチンの炎症反応調節作用の標的細胞として単球が重要であることが示唆された(論文投稿中)。我々は既に、遺伝的にレプチンシグナルを欠損するob/obマウスやdb/dbマウスにおいて、一側尿管結紮による腎尿細管間質障害が軽減すること、少量のレプチンを脳室内に投与することによりob/obマウスで認められる腎保護効果が消失することを見出している。本年度、この分子機構を明らかにする目的で、以下の検討を行った。レプチン受容体は、単球/マクロファージ、骨髄細胞、腎尿細管上皮細胞などに発現を認めるが、培養マクロファージ(RAW264, J774,腹腔内マクロファージ)や尿細管上皮細胞(mProx24, NRK-52E, LLC-PK1)にレプチンを単独、あるいはTNF-αやLPSなどと共投与しても炎症性サイトカイン産生が誘導されなかった。また、db/dbマウスの骨髄を野生型マウスに移植することにより、骨髄細胞特異的レプチン受容体欠損マウスを作製したが、腎障害の程度に有意な差を認めなかった。以上の成果より、レプチンによる炎症反応は主に視床下部を介した作用であると考えられた。レプチンは、視床下部メラノコルチン系を介して摂食やエネルギー代謝調節に、交感神経系(β2アドレナリン受容体;adrb2)を介して骨量調節に働くことが報告されている。adrb2欠損マウスを用いた検討により、腎尿細管間質障害にadrb2が関与することが明らかになった。骨髄移植による骨髄細胞特異的adrb2欠損マウスでも同様の結果が得られたが、ob/obマウスに対して交感神経作動薬(非特異的βアドレナリン受容体刺激薬isoproterenol, adrb2特異的刺激薬clenbuterol)を脳室内投与しても腎障害の程度に有意の差を認めなかった。以上の研究成果より、中枢神経系を介したレプチンの炎症反応調節作用の分子機構として、骨量調節作用とは異なり、adrb2を介さない経路が重要である可能性が示唆された。
雲仙普賢岳で発生したマグマ水蒸気爆発の岩石学的現象解析

本格的な噴火の開始以前に噴出される火山灰を詳しく調べることによって,マグマの性質や環境を把握でき,近い将来の噴火の様式やそれに伴う災害についての予測が可能となりうる。雲仙普賢岳と似たような火山活動史を持つ九重火山が,約250年ぶりに,1995年10月中旬に噴火した。当初は噴出物にはマグマ物質が含まれず典型的な水蒸気爆発であった。この噴火初期には土砂噴出を行い,その後は,火口拡大を行い火山灰を吹き上げた。12月下旬の噴出物にはマグマ物質が数パーセント以下程度含まれるようになった。雲仙普賢岳では1990年11月中旬に水蒸気爆発がおこり,1991年2月中旬の再噴火ではマグマ物質が火山灰中に含まれるようになった。このマグマ物質は,当初,数パーセント程度だったものが溶岩ドームが出現する同年5月前には約30%程度までに上がっていた。九重火山では10月の噴火が普賢岳の最初の噴火に比べて大きい反面,再噴火以降,噴火の規模が大きくなり,間隔が狭まるなどの傾向は見えていない。また,普賢岳では噴火に先立って構造性の地震が多発したり,連続的な火山性微動が起こっていたが,九重火山では単発的にしか起きていない。この点普賢岳と九重火山とは異なった様相を示している。今回の九重火山の噴火は地下のマグマで加熱された気液混合物が何らかの理由で突然爆発したものである。その後,放出されたマグマ物質の化学分析による解析では,地下数km付近に高温のマグマが存在していることが示唆されるが,マグマの動きを読み取る技術が今後要請される。
幹細胞再生医療のための生物機能改変組織工学技術の開発

ゼラチンにスペルミンやポリエチレンジアミンを化学導入したカチオン化ゼラチンを作製し、コアセルベーション法を用いてそのナノ粒子を作製した。ナノ粒子に核酸(プラスミドDNAやsmall interfering RNA)を組み込み、未分化骨髄間葉系幹細胞とともに培養した。カチオン化ゼラチンナノ粒子は細胞内に取り込まれ、細胞内で核酸を徐放化した。その結果、有意に高い遺伝子発現と発現効果の持続時間の延長が認められた。ゼラチンからなる3次元のスポンジ足場を用いて、核酸含有カチオン化ゼラチンナノ粒子とともに幹細胞培養を行った。その結果、核酸の細胞内徐放化が見られ、遺伝子発現の抑制効果が認められた。本研究の目的は、幹細胞再生医療のための細胞機能を高める組織工学的技術の開発である。本研究では、遺伝子発現期間の制御に重点をおいた非ウイルス性遺伝子導入技術を開発する。生体吸収性ナノ粒子を活用して細胞内で遺伝子を徐放化(徐々に放出)することにより遺伝子発現期間を制御する。遺伝子導入のための非ウイルス性材料として、ゼラチンにスペルミンなどのジアミン化合物を反応させることによって、カチオン化ゼラチンを作製した。カチオン化ゼラチンとプラスミドDNAとを含む水溶液中へ有機溶媒を加えることで、コアセルベーションを形成、プラスミドDNA含有したカチオン化ゼラチンからなるナノ粒子を作製、グルタルアルデヒドによって架橋した。得られたナノ粒子を培養液中に加えた後、未分化骨髄間葉系幹細胞とともに培養、遺伝子発現活性を評価する。カチオン化ゼラチンナノ粒子は期待通り、細胞内に取り込まれ、細胞内でナノ粒子は分解され、それにともないプラスミドDNAが細胞内で徐放された。加えて、ゼラチンに乳酸オリゴマーをグラフトした後、難水溶性の低分子薬物と混合することで、薬物を含有したゼラチンナノ粒子を作製した。そのナノ粒子を幹細胞とともに培養したところ、細胞内で薬物の徐放化され、その薬物効果が長期にわたって維持できることがわかった。遺伝子導入のための非ウイルス性材料として、ゼラチンにスペルミンあるいはポリエチレンイミンなどのジアミン化合物を反応させることによって、カチオン化ゼラチンを作製した。作製条件を選ぶことで、カチオン化ゼラチンから、コアセルベーションを形成、カチオン化ゼラチンからなるナノ粒子を作製した。それをグルタルアルデヒドによって架橋した。得られたナノ粒子をsmall interfering RNA (siRNA)を混合した後、培養液中に加え、未分化骨髄間葉系幹細胞とともに培養、遺伝子発現活性を評価した。カチオン化ゼラチンナノ粒子は期待通り、細胞内に取り込まれ、細胞内でナノ粒子は分解され、それにともない細胞内で徐放されたこのsiRNA含有ナノ粒子を利用することで遺伝子発現の有意な抑制効果が認められた。次に、乳酸オリゴマーをグラフトしたゼラチンと難水溶性の低分子薬物を混合することで、薬物含有したゼラチンナノ粒子を作製した。遺伝子導入のための非ウイルス性材料として、ゼラチンにスペルミンあるいはポリエチレンイミンを化学反応させることによって、カチオン化ゼラチンを作製した。作製条件を選ぶことで、カチオン化ゼラチンからコアセルベーションを形成、カチオン化ゼラチンからなるナノ粒子を作製した。次に、得られたナノ粒子をグルタルアルデヒドによって化学架橋した。ナノ粒子をsmall interfering RNA (siRNA)を混合した後、培養液中に加え、未分化骨髄間葉系幹細胞とともに培養、遺伝子発現活性を評価した。カチオン化ゼラチンナノ粒子は期待通り、細胞内に取り込まれ、細胞内でナノ粒子は分解され、それにともない細胞内で徐放された。このsiRNA含有ナノ粒子を利用することによって遺伝子発現の有意に高い抑制効果と抑制効果の持続期間の延長が認められた。ぜラチンから3次元のスポンジ足場を作製した。これらのスポンジをsiRNA含有カチオン化ゼラチンナノ粒子とともに未分化骨髄間葉系幹細胞の培養を行った。遺伝子発現活性を評価したところ、siRNAの細胞内徐放化が見られ、それにともなう遺伝子発現の抑制効果が認められた。これらの結果は、siRNAの徐放性と遺伝子発現レベル、期間との間によい関連性があることを示している。