hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
革新的なバイオエタノール生産プロセスを実現するスーパーアーミング酵母の創製

1、アーミングテクノロジーを用いたスーパーCBP酵母の創製現在、地球上に豊富に存在する木質系のバイオマスからの効率的なバイオエタノール生産システムの開発が急務となっている。木質系バイオマスは強固な構造を持っているために、その分解には高価なセルラーゼ剤を多量に必要とする。近年、酵素を細胞表層に集積したセルラーゼ発現アーミング酵母によるConsolidated bioprocessing(CBP)の実現が期待されているが、セルロース分解力の強化が課題となっている。糸状菌Trichoderma reeseiなどでは複数種のセルラーゼの発現バランスを調節することによりセルロースを効率的に分解している。昨年度の研究において、酵母におけるセルラーゼの発現バランスを最適化する手法を開発した。本研究ではセルロースの分解力をより向上させるため、Matingという手法を用いることにより、セルラーゼ発現バランス最適化二倍体酵母を創製した。創製した二倍体酵母のセルロース分解活性の測定を行った結果、一倍体酵母と比較して約6倍向上した。次に、セルロース発現バランス最適化二倍体酵母を用い、リン酸膨潤セルロースからのエタノール発酵試験を行った。その結果、発酵開始72時間で、20g/Lのセルロースから7.6g/Lのエタノールを生産することに成功した。さらに、この二倍体酵母を用い、稲ワラからのエタノール発酵試験を行った。その結果、発酵開始72時間で7.5g/Lのエタノールを生産することに成功した。単一の微生物のみで実バイオマスからのエタノール生産に成功したのは、これが初めての報告となる。以上の結果から、本研究で開発したセルラーゼ遺伝子発現バランス最適化手法と、二倍体化法を組み合わせることにより、様々なバイオマスから効率的にエタノールを生産する技術の確立が期待される。1.細胞融合法による新規宿主酵母株の創製木質系バイオマスにはエタノール生産酵母Saccharomyces cerevisiaeが利用不可能なC5糖を多く含むためエタノール収率が低下してしまう。そこで、効率的なC5糖代謝に関与する全ての要素を同時に付与するために、C5糖発酵性酵母Pichia stipitisとS.cerevisiae及び高温発酵性酵母Kluyveromyces marxianusとの細胞融合により、C5糖から効率的にエタノールを生産する新規酵母株の創製を目指した。各融合株をグルコース培地にて数代培養後スクリーニングを行うことにより安定融合株を取得することに成功した。今後は更に融合、スクリーニングを繰り返すことにより、よりC5糖発酵能の優れた酵母の創製が期待される。2.アーミングテクノロジーを用いたスーパーCBP酵母の創製.セルロースを効率的に分解する糸状菌Trichoderma reeseiなどでは10種類以上のセルラーゼ遺伝子を有しており、それらの発現バランスを巧みに調節していることが知られている。そこで、酵母における最適なセルラーゼ種の組合せ、酵素活性バランスの探索を行った。最適なセルラーゼ種の組合せを探索した結果、T.reesei由来EGII、CBHII、及びAspergillus aculeatus由来CBHI、BGLの4種類の組み合わせが最も高いセルロース分解活性を示すことが明らかとなった。さらに、探索した最適な組合せのセルラーゼ種を最適な割合で発現させるカクテルδインテグレーション法を開発し、低い遺伝子導入コピー数で、高いセルロース分解活性を示すアーミング酵母を創製した。本手法は,簡便に多種類の遺伝子を同時に導入可能であり、かつその割合を最適化可能であるという全く新規かつ有用な手法であり、今後多方面への応用が期待される。
クルマエビのビブリオ病:PCR法による病原菌の検出

クルマエビのビブリオ病原因菌Vibrio sp.PJについて、分類学的地位を確立するとともに、リボソームRNAの塩基配列の解析結果に基づきPCR法(ポリメラーゼ連鎖反応)による検出系を確立した。2.経口感染させたクルマエビにおいて、V.penaeicidaは胃、中腸腺およびリンパ様器官で増殖することが分かった。しかし初期増殖部位を特定するためにはPCR法などのより感度の高い検出法が必要と考えられた。3.Vibrio属細菌の16SrRNA塩基配列における保存領域をプライマーとして本菌の可変領域を増幅後、クローニングし、種特異的塩基配列を決定した。4.上記の結果に基づき新たにプライマーを作成し、RT-PCR(逆転写PCR)を行ったところ、目的の増幅産物がV.penaeicidaのすべての菌株から得られたのに対し、他のクルマエビ類病原性Vibrio属細菌のいずれからも該当の産物は得られなかった。従って、本プライマーを用いたPCR法により本菌と他のVibrio属細菌との鑑別が可能となり、PCR法による本菌の検出系が確立された。5.クルマエビからの核酸の抽出法としては、グアニジンイソチオシアネート・クロロホルム法もしくはTween20-フェノール法が優れていることが分かった。6.外見的に健康と思われるクルマエビについて、上記のRT-PCR法と従来の培養法によりV.penaeicidaの検出を試みたところ、明らかにRT-PCR法による検出率のほうが高く、本RT-PCR法が保菌エビの検査法として有効であることが分かった。まず、クルマエビのビブリオ病の原因菌(Vibrio sp.PJ)がこれまでに未報告の新種であることを、生化学的性状などの表現型から再確認するとともに、DNA-DNAホモロジーを調べることにより遺伝学的に確認し、Vibrio penaeicidaなる新種名を提案した。次いで培養法を用いて、経口感染させたクルマエビの各器官におけるビブリオ病原因菌の動態について調べたところ、感染過程は定着、分散、除菌、2次増殖および全身感染の5つのステージからなり、胃、中腸腺およびリンパ様器官が本菌の主たる増殖部位であることが分かった。しかし他の競合菌の存在により、初期の増殖部位を特定することはできず、培養法に代わるより感度の高い検出法が必要と考えられた。そこで、本菌の検出法としてのPCR法(ポリメラーゼ連鎖反応)の確立を目的とし、V.penaeicidaの16SrRNAの特異塩基配列を決定した。すなわち、Vibrio属細菌の塩基配列における保存領域をプライマーとすることにより本菌の可変領域をPCR法にて増幅後、クローニングを行い、V.penaeicidaの種特異的塩基配列を決定した。その結果を基に新たにプライマーを作成しPCRを行ったところ、目的の増幅産物がV.penaeicidaのすべての菌株から得られたのに対し、他のVibrio属細菌のいずれからも認められなかった。従って、本プライマーを用いたPCR法により本菌と他のVivrio属細菌との鑑別が可能となり、PCR法による本菌の検出法が確立された。昨年度の研究により、クルマエビのビブリオ病原因菌Vibrio penaeicidaをRT-PCR(逆転写・ポリメラーゼ連鎖反応)法により特異的に検出しうるプライマーを作成した。本PCR法をクルマエビからのV.penaeicidaの検出に応用するため、以下の検討を行った。1.本菌の感染部位がRnaseなどの酵素を多量に含む肝膵臓であることから、まず、クルマエビの組織ホモジネートからの核酸抽出法について検討した。SDS-フェノール法に比べ、グアニジンイソチオシアネートを用いる方法が優れていることが分かった。しかし、このグアニジンイソチオシアネートは高価であり、また結果の安定性にもやや問題があり、更に検討した結果Tween20-フェノール法が費用の点でも結果の安定度の点でも優れていることが判明した。

2.外見的に健康と思われるクルマエビ30尾について、菌の分離・培養法とRT-PCR法を用いてV.penaeicidaの検出を試みたところ、グアニジンイソチオシアネート法によるPCRの検出率は85.7%であり、培養法による検出率は23.8%であった。Tween20法によるPCRの検出率は20%であったのに対し培養法では7%であった。3.以上のことから、本RT-PCR法はクルマエビのビブリオ病原因菌の検出に有効な方法であることが分かった。ただし、培養法で検出されたのにRT-PCR法で検出されない事例も僅かながらあったので、検出感度あるいは精度については改良の余地があると考えられた。
超小型衛星用多機能推進機の実現

現在その利用の幅が爆発的に拡大する超小型人工衛星であるが,今後,大推力が要求されるミッションに用いることが検討されている.超小型衛星に搭載される推進機の例は少ない上,大推力推進機の例はほぼない.その理由として超小型衛星の容積の小ささと求められる安全性の高さが挙げられる.本研究では安全性が極めて高い水を酸化剤とするハイブリッドロケットを提案し,基礎的な燃焼反応の観測から推進機としての開発までを行う.水は高い安全性に加え,搭載時に常圧で液体状態であるために簡素な構造で高い充填率を達成できるメリットも持つ.さらに水は宇宙での入手可能性が示唆されており,将来的な宇宙開発への応用の期待も高い.現在その利用の幅が爆発的に拡大する超小型人工衛星であるが,今後,大推力が要求されるミッションに用いることが検討されている.超小型衛星に搭載される推進機の例は少ない上,大推力推進機の例はほぼない.その理由として超小型衛星の容積の小ささと求められる安全性の高さが挙げられる.本研究では安全性が極めて高い水を酸化剤とするハイブリッドロケットを提案し,基礎的な燃焼反応の観測から推進機としての開発までを行う.水は高い安全性に加え,搭載時に常圧で液体状態であるために簡素な構造で高い充填率を達成できるメリットも持つ.さらに水は宇宙での入手可能性が示唆されており,将来的な宇宙開発への応用の期待も高い.
銅インジウムカルコゲン化物粉体の低温合成

1.硫化銅インジウムの合成いくつかの銅化合物(塩化銅(I,II)、硫酸銅、酢酸銅、酒石酸銅等)溶液と硫黄源となるチオ尿素及び硫化ナトリウム溶液を50°C,80°Cで反応させた。また、エタノール中での反応や、塩化アンモニウムの添加の影響も調べた。金属濃度0.02-0.1moldm^<-3>の条件で行った。まず単一の金属塩を用いて、硫化物の生成難易度を調べ、単一の硫化物として沈殿しにくい系を調べた。塩化インジウム、塩化銅(II)混合水溶液に硫化ナトリウム溶液を反応(50°C)させた場合の生成物は、結晶構造は同定できなかったが、銅、インジウム、硫黄の各元素をEDXの結果から確認した。しかし同時に生成物にナトリウムも残留していることが判明した。今後は、これを除去する必要があると考えている。2.セレン化銅インジウムの合成塩化銅(I)及び硫酸銅と塩化インジウムの混合水溶液と、二酸化セレン水溶液を上と同様に反応させた。生成した粉体の結晶構造を調べた結果、硫酸銅を用いた場合は、アモルファスであったが、塩化銅(I)を用いた場合は、ブロードな回折線が多かったが、ζ-(Cu2Se)0.14(In2Se3)0.86として報告されているセレン化物との共通性も見られた。EDXの点分析で2種類の生成物中の各金属とセレンの比及び全金属とセレンの比を調べた結果、銅の含有量が平均的に少なかった事に加えて、分析点によるばらつきが大きかった。この結果から、試料の不均一性が明らかになり、混合物であると考えられる。全金属に対するセレンの比は全て1以上であったので、セレンの量については十分であることが確認された。従って、今後は単一相にするための工夫が必要であると考えている。
浄水処理システムへの実装を目指した酸化チタン表面の加工方法の確立

本研究は,光触媒が浄水処理システムへ実装されることを阻んでいる最大の理由である触媒反応の低さを克服するため「酸化チタンの触媒反応効率を高め,アンモニア分解性の向上を図る」ことを目的としている.そのため,セラミック基材上への酸化チタンの修飾と微細凹凸構造の工業的に生産可能な加工方法を確立し,酸化チタン表面における凹凸間での乱反射により触媒反応の効率を高め,処理に多量の塩素が必要であるアンモニアの塩素に頼らない処理システムの構築に寄与するものである.本研究の大きな特徴は,焼結前の酸化チタンと有機物を混合し,焼結時に有機物を燃焼消滅させ酸化チタン表面へ微細凹凸構造を加工することにある.本研究は,光触媒が浄水処理システムへ実装されることを阻んでいる最大の理由である触媒反応の低さを克服するため「酸化チタンの触媒反応効率を高め,アンモニア分解性の向上を図る」ことを目的としている.そのため,セラミック基材上への酸化チタンの修飾と微細凹凸構造の工業的に生産可能な加工方法を確立し,酸化チタン表面における凹凸間での乱反射により触媒反応の効率を高め,処理に多量の塩素が必要であるアンモニアの塩素に頼らない処理システムの構築に寄与するものである.本研究の大きな特徴は,焼結前の酸化チタンと有機物を混合し,焼結時に有機物を燃焼消滅させ酸化チタン表面へ微細凹凸構造を加工することにある.
ド-ピング法を用いた界面走査による超高温複合材料の基礎的研究

本研究では、強化材の表面に化学修飾法や遊星ボールミル法により化学物質をドープして界面結合を操作し、複合体を作製し、その界面の組織や構造と機械的性質の関係を原子的レベルにまでおよんで調べた。結果は以下の通りである。(1)TiO2粒子分散Al複合材料の界面構造の解析:アルカリ金属およびアルカリ土類金属を遊星ボールミルを用いてTiO2粒子にドープし、Alとの複合材料をスクイズキャスト法により作製した。また、その後の熱処理による硬化過程あるいはその促進過程、微細構造の変化を原子的レベルまでの観察により明らかにした。ドープをすることにより、TiO2粒子表面にはアルカリ金属およびアルカリ土類金属とTiの複酸化物層が形成しており、この層を介してAlとTiO2が低温で反応し、Al2O3を形成することが分かった。(2)TiO2とAlの接合:TiO2板表面にNaCO3を溶解させ、焼成する、あるいは、真空蒸着法することによりその表面にNaTi6O13の層を形成させた。この表面改質したTiO2板とAl板との接合を試み、600°Cでの低温で強固な接合を可能とした。(3)α-Al2O3粒子分散Nb複合材料の作製と界面組織の解析:α-Al2O3粒子とNaCO3粒子あるいはCr粒子をボールミルにより混合、焼成することによりAl2O3粒子表面に厚さ数百nm以下のβ-Al2O3層あるいはCr層を形成させる事ができた。これをNbと混合してホットプレス焼結することにより分散性の良い複合材料を得た。(4)α-Al2O3とNbの接合:α-Al2O3板表面にNaCO3によりNa元素を化学修飾させ、焼成する事によりβ-Al2O3層を形成させ、ホットプレスによりNb板との固相接合を行った。β-Al2O3層を薄くすることにより接合強度は上昇した。β-Al2O3層とNbは原子レベルで整合性の良い界面を形成していた。本研究は、強化材の表面に化学修飾やイオン注入等の方法により化学物質をドープして界面結合を操作し、複合体を作製し、その界面の組織や構造と機械的性質の関係を原子的レベルまでおよんで調べるものである。本年度はセラミックス粉末あるいは板にボールミル法や化学修飾法によりNa元素をドープしてその表面を改質し、金属との複合化過程を組織的に明らかにすることを目的とした。以下に得られた結果を示す。(1) TiO2粒子分散Al複合材料の界面構造の解析:NaをドープしたTiO2粒子とAlの複合材料をスクイズキャスト法により作製し、その後の熱処理による微細構造の変化を明らかにした。NaをドープしたTiO2粒子の表面にはNaとTiの複酸化物と思われる層を形成しており、この層を介してAlを反応する事により低温でAl203を形成することがわかった。また、TiとAlは反応して金属間化合物を形成するが、TiとAl金属間化合物同士、Ti-Al金属間化合物とAl203は原子レベルで整合性の良い界面を形成することが分かった。TiO2-Alの接合:TiO2板表面でNaCO3を溶解させることによりTiO2表面にNaTi6O13の層を形成させ、Al板との接合を試みた。その結果、ホットプレス温度600°Cで接合が可能となることが分かった。また、NaTi6O13層を薄くすることにより接合強度は高くなり、破断面もNaTi6O13層からTiO2側に変わることが分かった。

(3)α-A12O3粒子分散Nb複合材料の作製と界面組織の解析:α-Al2O3粒子とNaCO3粒子をボールミルにより混合、焼成することによりAl2O3粒子表面に厚さ数百nm以下のβ-Al2O3層を形成させる事ができた。これをNbと混合してホットプレス焼結することにより複合材料を得た。1500°Cでのホットプレス焼結により得られた複合材料はドープしないものと同等の機械的性質(曲げ強度、硬度)を示すが、その破面のところどころにα-Al2O3粒内でのへき界破壊が見られた。(4)α-Al2O3とNbの接合:α-Al2O3板表面にNaCO3によりNa元素を化学修飾させ、焼成する事によりβ-Al203層を形成させ、ホットプレスによりNb板との固相接合を行った。1400°CのホットプレスでNaを修飾しない接合体と同程度の接合強度を示した。また、β-Al2O3層を薄くすることにより接合強度は上昇した。β-Al2O3層とNbは原子レベルで整合性の良い界面を形成していたが、α-Al203とβ-Al203界面には多くの空隙があることが分かった。本研究は、強化材の表面に化学修飾法や遊星ボールミル法により化学物質をドープして界面結合を操作し、複合体を作製し、その界面の組織や構造と機械的性質の関係を原子的レベルにまでおよんで調べるものである。ここでセラミックス粉末あるいは板にNa元素をドープしてその表面を改質し、機械的性質の優れた複合材料や接合体を得、金属との複合化過程を組織的に明らかにすることを目的とした。以下に得られた結果を示す。(1)TiO2粒子分散Al複合材料の界面構造の解析:アルカリ金属およびアルカリ土類金属を遊星ボールミルを用いてドープしたTiO2粒子とAlの複合材料をスクイズキャスト法により作製し、その後の熱処理による微細構造の変化を明らかにした。アルカリ金属およびアルカリ土類金属をドープしたTiO2粒子の表面にはアルカリ金属およびアルカリ土類金属とTiの複酸化物と思われる層を形成しており、この層を介してAlと反応する事により低温でAl2O3を形成することが分かった。特に、Naは効果的であることが分かった。次にNaドープの場合についてその界面構造の詳細な観察を電子顕微鏡法を用いて解析した。その結果、NaをドープしたTiO2粒子の表面には、Na、Tiの複酸化物を形成し、この複酸化物を介してTiO2とAlの反応が促進することが分かった。(2)TiO2とAlの接合:上記の結果を応用してTiO2とAlの接合を試みた。TiO2表面にNaTi6O13の層を形成させる為に、TiO2板表面にNaCO3を真空蒸着法し、焼成する方法を試みた。本手法はNaTi6O13の層を厚さを制御して形成することが可能であり、実用的であることが分かった。さらに、TiO2板とAl板との接合を試みた。その結果、ホットプレス温度600°Cで接合が可能となることが分かった。(3)α-Al2O3粒子分散Nb複合材料の作製:α-Al2O3粒子とCr粒子をボールミル法により混合し、Al2O3表面にNbとの接合性の良い、Crを均一に付着させた。この粒子を用いて、Nb粉末と混合、ホットプレス焼結を行なうことにより、Al2O3粒子の分散性の良い複合材料を得ることができた。
初期感染防御における血清中の抗菌性レクチンの役割と意義

動物の感染防御には細胞性免疫、液性免疫の両者が主に関与しているが、感染免疫の成立以前には非免疫グロブリン因子、特に複合糖質に親和性を示す血清蛋白質(レクチン)が内在性の防御因子として初期感染防御に深く関わっている。この様なレクチンとしてウシのコングルチェン(Kg)、ヒトおよびラット血清中のマンナン結合蛋白質(MBP),マウス血清中のカルモネラRd型菌倍合蛋白質(RdRF)などが知られている。本研究では獣医学領域で対象とするウシの初期感染防御機構に関与する血清中の非免疫グロブリン防御因子の役割を詳細に解析する目的で、ウシ血清中のKg分子に集点を絞り、検討した。Kg分子に対する特異性の高いポリクロナール抗体は得られにくいため、マウスモノクロナール抗体の作成を試みた。その結果、3種類のモノクロナール抗体を得たが、その抗体活性は低いことが判った。またKg遺伝子の塩基配列に基づいて種々の合成ププチドを抗原としてモノクロナールしゅの抗体の作成を試みたが、現在までのところ有用なモノクロナール抗体は得られていない。得られたモノクロナール抗体を用いて、Kg分子の機能部位の探索を試みたが、抗体活性が低いこと、少数の抗体しか使用できなかったため、機能部位の同定は不充分であった。健常ウシ血清中のKg分子の動態を検討するため、同一個体のウシから3日毎に約3ヶ月半にわたり採取した血清中のKg濃度を測定した。その結果、Kg濃度は生理的・主節的な変化に対して変動することが判った。今後、ウシ血清中の非免疫グロブリン防御因子であるKg分子の抗菌作用(役割)・機能を詳細に検討するために、多数のモノクロナール抗体の作成が必要であると考えられる。
「生体ナノシステム制御」研究終了後取りまとめ

1.平成21年7月に計画班代表及び分担者の成果発表会を東大にて開催した。特定領域研究において、須藤らが世界で初めて成功した活性の高い組換えダイニンの発現や、大岩や真行寺らが進めていた軸糸ダイニンの構造解析、樋口らが明らかにした活性の高い天然ダイニン1分子のステップサイズ・カ・速度、広瀬・真行寺らが明らかにした、ダイニンの微小管に結合したときの構造など、これらの研究成果や前回の全体発表会後に明らかになったことなどの発表があった。2.特定領域全班員(計画班代表・分担と公募代表)から、成果の要点と業績リスト及び、主な論文を送ってもらい、整理し、概要をまとめ、報告書を作成した。3.特定領域のホームページにて、成果を公表した。4.特定領域全班員から集めた成果をまとめ、製本した報告書と論文集を作成し、全班員及び関係者へ郵送した。5.終了後審査に向けて、審査委員にわかり易い図を作成した。7.平成21年11月に「Dynein2009」が須藤を委員長(大岩、真行寺、豊島が実行委員)として開催された。これは世界最大のダイニン会議で、海外から約20名の招待研究者を招いて開催された。本領域研究者も多数参加し、領域の事後発表会としての役割も持つことになった。総括班では「生体ナノシステムの制御」領域の全体的な研究の方針の策定と特定班員の研究結果の報告や新しいプロジェクトの提案や研究動向に対応し新しい方向性を議論する.その新しい方向性をいち早く全体に伝えるために,定期的に研究報告会を開催し,意志の疎通を図った.そのために,研究成果の発表会を毎年2回程度開催した.班員間に技術を伝えるために,顕微鏡実習を3回開いた.特定領域の前半及び最終年のとりまとめとして,国際シンポジウムを開催した.(1)班会議の開催:特定領域研究たちあげのための班会議を11月3日に開催したこの会議には,計画班代表,分担,評価者が東北大学学際センターに集まり,計画班代表が発表会を行った.特にチャレンジングなテーマである細胞への1分子応用について議論がなされた.また,この会議で,全体の研究方向の確認,各計画研究班の研究計画の確認,生体ナノシステムの制御領域の現状の分析などをおこなった.生体ナノシステムの特色として,多くの若き研究者が中心となり,新しい観測システムを開発し,ダイニン分子や細胞運動の,力と関係する制御を研究し,日本の伝統を発展させる.こととして会議がまとめられた.(2)特定班員が中心となり,生物物理学会においてシンポジウムが12月に「微小管の重合・脱重合:原子から細胞そして個体へ」という題名で開催された.内容は精製した微小管の重合・脱重合といった分子レベルのダイナミックスは古くより生物物理学分野で盛んに研究されてきたが,分子レベルの研究と細胞内での重合・脱重合の研究がこれまでうまくかみ合わなかった.そこで原子レベルから個体レベルにわたる,微小管の重合・脱重合の役割を発表&議論するシンポジウムをおこなった.(3)生体運動の合同班会議を利用して,特定班員の発表と,全体会議が開かれた.来年度の予定や2006年に開催予定の国際会議について議論された.(3)ホームページの開設:生物モーターに関する最新情報をホームページで開示を1月より開始した。(1)全体会議の開催:特定領域研究に今年度から公募研究が加わり,この代表者を含めた班会議を9月9,10日に開催した.この会議には,計画班代表,分担,評価者および各研究室のスタッフや学生が東京大学工学部会館に集まり,計画班代表と後部代表が発表会を行った.特にチャレンジングなテーマである細胞への1分子応用について議論がなされた.また,この会議で,全体の研究方向の確認,各計画研究班の研究計画の確認,生体ナノシステムの制御領域の現状の分析などをおこなった.約80名の参加者と44件の発表が行われた.(2)特定班員(広瀬恵子と安永卓生がオーガナイザー)が中心となり,生物物理学会においてシンポジウム「分子モーターシステム:その構造情報の流れと分子メカニズム」が12月に開催された.モータータンパク質の分子レベルの運動メカニズムが議論された.(3)生体運動の合同班会議を利用して,特定班員の発表と,全体会議が開かれた.来年度の予定や2006年に開催予定の国際会議について議論された.(3)ホームページの開設:生物モーターに関する最新情報をホームページで開示を1月より開始した。(4)2月28日に東京大学の理学部真行寺研と工学部の富重研が中心となり,顕微鏡の実習が行われた.特定領域から11名の参加者があり,午前10時より6時まで,顕微鏡の利用説明と実演および体験的な顕微鏡操作を行った.多くの方から,貴重な体験であったとの感想を得た.本領域の目的は,タンパク質分子の制御機能と細胞の制御機能とを関連づけて理解すると同時に,細胞の制御機構を統合的に理解することである.そのために,本領域の目的は,タンパク質分子の制御機能と細胞の制御機能とを関連づけて理解すると同時に,細胞の制御機構を統合的に理解することである.本領域では研究項目を3つに分ける.ナノシステムの構築と制御機構(A01)では,精製した複数の運動タンパク質や制御タンパク質等を用いてナノシステムを再構築し,1種類のナノシステムの運動や制御のメカニズムを解明する.

このために,複雑な運動と制御を観察できる1分子解析法と電顕トモグラフィー法を開発する.高次ナノシステムの制御(A02)では精製したタンパク質だけでなく,細胞内の複数のナノシステムで構成された高次ナノシステムの制御を理解する.特に新しい高次ナノシステムの構築を行い,新しい角度から構造・制御機能を解明する.細胞内ナノシステムの統合(A03)では細胞内の輸送や運動に関与するナノシステムの時空間解析を行い,高次ナノシステムで得られた結果と照らし合わせ統合的な理解をおこなう.高精度で時空間解析するために,新しい3次元イメージング技術の開発を行う.須藤研との共同研究を行っているポスドク1名と事務員1名を雇い,研究と事務の効率化を図った.さらに,次に示す実習や全体会議費用にも充てた.2006年4月14日第2回顕微鏡実習(東北大樋口研)2006年9月1-3日第5回全体・総括班会議国際シンポジウム(宮城県松島町)2007年1月7-9日第6回全体・総括班会議(金沢市)(1)全体会議の開催:特定領域研究に今年度は新しい公募研究が決定し,この代表者を含めた班会議を9月13-14日に開催した.この会議には,計画班代表,分担,評価者および各研究室のスタッフや学生が集まり,計画班代表と後部代表が発表会を行った.また,この会議で,全体の研究方向の確認,各計画研究班の研究計画の確認,生体ナノシステムの制御領域の現状の分析などをおこなった.約70名の参加者と42件の発表が行われた.(2)特定領域の主催で,3つのセミナーが開かれた.1.第2回ダイニン分子研究会6月7日東大駒場参加班員8名,参加者合計約70名(世話人樋口,豊島)2.小セミナー「アクチン・ミオシン:分子と細胞を如何にして結びつけるか」11月10日早稲田大(鈴木団,石川)3.「細胞の種々の機能制御における3種分子モーターの共同的役割について」11月16日東京大学本郷(真行寺世話人).これらのセミナーでモータータンパク質の分子から細胞レベルの運動メカニズムが議論された.(3)1月7-9日.生体運動合同班会議が仙台で開催さえ,樋口が世話人代表を務めた.この合同班会議を利用して,特定班員の発表と,全体会議が開かれた.30名の班員が集まった.来年度の予定や2008年に開催予定の国際会議について議論された.(4)10月1,2日に産総研にて広瀬と安永の指導の元,電子顕微鏡の利用説明と実演および体験的な顕微鏡操作を行った.多くの方から,貴重な体験であったとの感想を得た.1.研究会の開催:平成20年6月にダイニン分子研究会を開催し、ダイニンの構造、機能、制御に関する発表と議論がなされた。これらの発表の多くは世界最先端の研究であった。2.研究報告会の開催:平成20年10月に国際会議を開催し、国内外からの招待講演者の講演が行われた。また、領域の代表者や若手の研究者の発表も活発に行われ、研究の概略図入り予稿集を作成・配布した。平成21年7月には研究班代表及び分担者の成果報告会を開催した。班内での共同研究の進展状況などの報告があり、領域研究終了後もさらなる連携の強化及び発展が期待された。3.班会議の開催:平成21年1月に班会議を開催し、それぞれのプロジェクトの状況及び領域研究終了後の更なる発展の可能性について討議した。4.セミナーの開催:平成20年10月、12月に生命の情報処理に関するセミナーを開催した。多数の若手研究者や分野を越えた参加者があり、この分野の新たな展開を期待させるものがあった。
関節マトリックス破壊マーカーとしての尿中COMPの解析

1.軟骨損傷や変性があると、滑液中のCOMP値が上昇し、分子の小断片化が進む馬軟骨由来COMPに対するモノクローナル抗体14G4は、COMP合成よりむしろ分解の検出に役立ち、滑液中COMP値とその断片化解析の組み合わせによって馬における軟骨破壊を診断できることを明らかにした。抗体14G4は尿中のCOMP断片を検出できること、馬のみならず犬、人、実験小動物のCOMPに交差することも示した。2.血清COMP値は、運動負荷によって変化し、トレーニング期の軟骨損傷の早期診断に役立つ育成馬の血清COMP値は運動直後に上昇、5時間後ピークに達し、24時間以内に基線値に復した。運動前血清値(基線値)は運動能力の高まりと一致して上昇するが、運動負荷後上昇率に差はなかった。運動は関節軟骨→滑液→血液へのCOMP分子の移動を促すだけでなく、トレーニングは安静時の軟骨基質代謝回転を高めることを示した。トレーニングによるCOMP代謝回転の高まりが、病的基質破壊につながる可能性がある。3.馬のOAマーカーとしての尿中COMPの可能性mAb14G4によるOA馬の尿中COMP値は正常と比較して高かった。関節内骨折例では、尿中COMP値の上昇は、滑液中COMP濃度と負の相関を、滑液中のゼラチナーゼ活性と正の相関を示した。骨折直後の急性期には滑液内における酵素活性が低く、基質から遊離した大型COMP分子は関節内に留まり、血液・尿に検出されにくい一方で、OA進行期(慢性期)では、関節内での酵素活性の高まりによってCOMPの小分子化が進み、血液へのCOMP移行が増え、尿中に多く検出されるようになると考えた。尿中COMP値は、OA関節での蛋白分解酵素活性の高まりを反映する指標として役立つ可能性があり、関節内骨折後の急性期には滑液中COMP濃度が高く、次第に低下する一方で、尿中濃度は慢性経過に伴い増加すると考えた。ウマ軟骨由来COMPに対するモノクローナル抗体14G4は、COMPの合成よりむしろ分解の検出に役立つこと、滑液COMP値とその断片化解析の組み合わせによって軟骨破壊の診断に役立つことを報告した(Equine Veterinary Journal 37;31-6)。合わせて、抗体14G4のCOMP認識部位がC^<134>-F^<147>のペプチドであり、尿中に検出されるフラグメントに含まれること、ウマのみならずイヌ、ヒト、ラット、マウスのCOMPとも交差反応があることを示した。(1)14G4が交叉反応する尿中フラグメントはCOMPの分子組成と一致するか?14G4抗体が認識するフラグメントはウマ尿中に複数存在し、その一部はウマのCOMPであることが確認された。他の動物の尿については検討中であるが、尿中に単一の分子サイズで検出されるフラグメントは微量であるため、尿産生量の少ない小動物では尿からの分子解析が困難な状況にある。(2)尿性状の変化が尿中フラグメントの検出感度におよぼす影響因子は何か?尿に検出される14G4陽性フラグメントの量には、日内変動がある。早朝の尿に多く検出できている。運動の前後による差はない。利尿剤投与後に得られる尿サンプルからの検出量は少ない。(3)関節症患者(自然発生性)の尿中COMPは健常なものと差があるか?ヒトのOA患者については、正常ヒト尿との有意な差はなかった。OA動物ではサンプルを収集している段階であり、結果はまだ得られていない。

・イヌにおけるurea-induced synovitisモデル:滑膜炎誘発後48時間で血清COMP値が上昇し120時間から低下したが、それと一致して尿中に検出されるCOMP14G4エピトープも有意に上昇・下降を示した。・Collagen induced arthritis (CIA)モデル:CIA発症と一致し血清COMP値が急激に低下した。尿中COMP値もそれに一致した傾向を示している。供試頭数を増やし、再現性をチェックしている。・RunningによるOAモデル:OA発症と一致した血清および尿中COMP値の変動はわずかである。運動負荷方法について再検討が必要である。馬関節軟骨由来COMPに対するモノクロナール抗体(mAb)14G4の抗原認識部位をもつ分子断片は、馬の尿中からも検出されることから、本研究では、関節症(osteoarthritis,以下OA)のある競走馬の尿中COMP値を測定し、その関節マーカーとしての有用性について検討を行った。【材料と方法】X線検査にてOAと診断され、関節鏡視下手術を実施したサラブレット83頭を対象とし、麻酔導入から手術開始の間に導尿し、輸液や利尿の影響がない条件で尿サンプルを得た。合わせて、関節液と血清も採取した。臨床症状とX線検査でOAがない馬(111頭)から競走直後に尿を採取し、対照として用いた。尿中COMPは、馬関節軟骨から生成したCOMPとmAb14G4で設定したinhibitionELISAにより測定し、尿中クレアチニン濃度で除した補正値として示した。滑液サンプルでは、ゼラチンザイモグラムを行い、分子サイズに基づきマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)-2および-9を区別し、それぞれのバンドの酵素活性をデンシトメトリーにて定量した。OAサンプルを用いて、滑液、血清、および尿中COMP値の相互関係、あるいは尿中COMP値と滑液中MMP-2,9活性との相関関係について統計的検討を行った。【結果】mAb14G4を用いたELISAのinhibition curveの直線下降部は、馬のみならずラット、マウス、イヌおよびヒト尿のサンプル希釈曲線とパラレルに推移した。OA馬の尿中COMP値(1.02±0.75μg/100mg creatinine)は正常馬(0.57±0.29μg/100mg creatinine)と比較して有意に高かった。OAの馬から得られた尿のCOMP値は滑液中の値に対して、負の対数関数で表される相関を示した。また尿中COMP値は、滑液のMMP-2および-9に対して正の有意な相関を示した。【考察】mAb14G4を用いることにより馬の尿中に存在するCOMP断片を検出できた。尿中に検出されるCOMP断片はOA馬で有意に高いこと、それは関節液中のCOMP濃度よりむしろ、その断片化すなわち関節液中のマトリックス分解酵素活性を反映することが明らかとなった。関節症の診断マーカーとして尿中COMPは臨床的に役立つ可能性があることが示唆された。mAb14G4を用いたELISAで測定したOA馬の尿中COMP値は正常と比較して高かった。関節内骨折例では、尿中COMP値の上昇は、関節液中COMP濃度と負の相関を、また関節液中のゼラチナーゼ活性と正の相関を示すことがわかった。
次世代家庭用燃料電池向け改質器・燃料電池触媒プロセス開発

本研究課題は昨年度から引き続き、メタノール改質器用触媒プロセス開発、次世代燃料電池触媒開発である。いずれも、一般家庭用普及に大きく関わる基盤技術開発である。メタノールを燃料に使った燃料電池システムは複数あるが、ここではダイレクトメタノール方式ではなく、改質器-選択酸化-水素燃料電池のシステムを想定し、研究は「改質器触媒プロセス開発」と、最終段階の「燃料電池新規触媒開発」に焦点を当てる。改質器触媒については、Cu-ZnO-Al_2O_3系を軸に昨年度中に進展があった。本年度はPt代替NiもしくはCoにCもしくはBを添加した電極触媒ナノ粒子の開発を主に進めた。3月11日の震災により、4月より実験装置、ガラス器具の修理・買い直し、実験室の復旧等により大幅に研究が遅れた。実験を始められるようになった後、まず昨年度合成に成功したCoB,NiCナノ粒子の合成方法を基に、CoC、NiBナノ粒子の合成を試みた。液相合成によりそれらの粒子を粒径が約1030nmの範囲でカーボン担体上に析出させることに成功した。得られた触媒の表面には反応中の有機物と思われる不純物の付着により、反応が進行しなかった。そこで、UVオゾンへの暴露、焼成処理等により表面の洗浄を行った後、電気化学特性を調査した。得られた起電力はどの粒子でも最大0.5VとPtの半分ほどではあったが、貴金属以外で正極における酸素還元反応を可能にできる事を証明した。現在、さらに起電力を大きくすべく、CやB添加量の増大、粒径の微細化、担持量の制御を行い、起電力の制御を試みている。改質器触媒はCu-ZnO-Al_2O_3系、燃料電池新規触媒はPt代替Ni系PEFC触媒を想定し、電気電導性向上を狙ってITO(スズドープ酸化インジウム)少量添加を含んでいる研究の最大の難所は、(1)改質器のコンパクト化、(2)Pt代替Ni触媒開発の2点であるが、いずれも我々が開発した新規触媒調製法、液相還元選択析出法を採用した。メタノールから水素を得るため、Al2O3に担持したCu-ZnOナノ粒子を液相還元法により調製した。アルミナと親和性を持たせるため、高pH下において調製が必要であることから、錯体の沈殿が生じたため、柵化剤としてクエン酸などの添加により抑制した。またこの錯化剤添加は、粒径を制御するために有効であることも確認され、非常に微細なCuナノ粒子の調製に成功した。Cu-ZnOナノ粒子の調製に成功したため、実際に小型マイクロリアクターを用いて改質器を組み、水素改質能があることを確認した。Pt代替触媒については、CoおよびNiへBもしくはCを添加したCoB,CoC,NiB,NiCナノ粒子の調製を行っている。現在、非晶質のCoBならびにNiCナノ粒子の調製に成功した。電気化学測定を行った所、Pt電極と比べ起電力は低いものの、有することが確認された。現在、CoC,NiBナノ粒子についても調製方法を最適化しており、また調製に成功したCoB、NiCナノ粒子の起電力を向上させるため、合成条件の最適化を合せて行っている。
クラウン化キノン類の合成

本研究は、生体内の酸化還元系に関わる重要な物質であるキノン類とアルカリ金属イオンやアンモニウムイオンを取り込み、運搬する能力を有するクラウンエーテルを同一分子内に兼備した分子の設計、合成及びその機能について検討(評価)することを目的としている。まず原料であるピロガロールの端の水酸基一つを選択的に保護(ベンジルエーテル)した後、残る1,2-ジオール部分に1,ω-ジハロポリエーテルを反応させてクラウンエーテル環(15-クラウン-5,18-クラウン-6等)を形成することに成功した。更に接触水添により保護基をはずしフェノールとした後Fremy-塩により酸化することにより目的とするクラウン化キノンを深赤色の結晶性化合物として得ることに成功した。本化合物は、シクロペンタジエン,テバイン,ブタジエン等、各種ジエン化合物と容易に反応してDiels-Alder付加体を高収率で与えることが判明し、特にブタジエン付加体は、更に脱水素芳香族化することによりクラウン化ナフトキノン類へと導くことが出来た。上記クラウン化キノン類の酸化還元電位をサイクリックボルタンメトリーで測定し、アルカリ金属イオンの及ぼす効果を調べた結果、キノンだけでは見られない著しいイオン取り込みによる電位の変化が観測され、クラウンエーテルとキノンの両官能基が互いに影響し合っていることが判明した。更にこれらクラウン化キノン類とドーパミン、トリプタミン等、脳内アミン類の塩酸塩との相互作用をUV-スペクトルを用いて調べたところ、両者は芳香環部分でのCT-錯体形成とクラウン環部分でのイオン取込みによる二点相互作用を行い、これら生体内アミンを選択的に認識する能力を有していることが判明した。今後、本化合物は、脳の機能にとって重要な脳内アミン類の捕捉・運搬剤としての可能性を秘めている。
イヌバベシア症の病態解析を通じた抗赤血球抗体による溶血メカニズムの解明

イヌバベシア症において、イヌ血清中に抗イヌheat shock protein 70(hsp70)抗体が産生されることが明らかになった。これはバベシア原虫のhsp70とイヌhsp70の構造がよく似ているために引き起こされることが示唆された。イヌhsp70は赤血球膜にも存在するため、抗イヌhsp70抗体は抗赤血球抗体の一種であることが疑われたが、イヌhsp70は赤血球膜の表面には存在せず、この抗体は赤血球膜を傷害しないことが明らかになった。イヌバベシア症における抗赤血球抗体の標的分子はheat shock protein 70 (Hsp70)であるとの仮説の下、平成20年度においてはバベシア原虫のHsp70に対する抗体を作成し、バベシア原虫に感染した赤血球膜表面にHsp70分子が存在するか否かを蛍光免疫染色法を用いて検討した。その結果まず、非感染赤血球の膜表面にはほとんどHsp70分子が存在しないことが明らかになった。続いてバベシア原虫感染赤血.球について検討したところ、1-2匹のバベシア原虫が寄生している赤血球膜表面にはほとんどHsp70分子が存在しなかったものの、多数のバベシア原虫が寄生していると思われる赤血球の膜表面には大量のHsp70分子が存在することが明らかになった。バベシア原虫の赤血球内における発育と増殖は明らかになっていない部分も多いが、赤血球内に侵入した1匹のバベシア原虫が赤血球内で発育し、分裂・増殖をすると仮定すると、多数のバベシア原虫が寄生する赤血球は感染後時間の経過した赤血球であり、Hsp70分子はバベシア原虫の赤血球内での発育と増殖にともない赤血球膜表面に現れてくることが考えられた。このことは、バベシア原虫が寄生にともなって赤血球膜を修飾することを示唆している。また、以前の研究によりイヌバベシア症罹患犬の血清中には抗Hsp70抗体が存在することが明らかになっており、上述の膜表面にHsp70分子が存在する赤血球はこの抗Hsp70抗体の標的になり、抗体の結合した赤血球は免疫機構により排除されると考えられた。以上より、イヌバベシア症で観られる抗赤血球抗体の標的分子のひとっはHsp70であり、これは非感染赤血球においては膜表面にはほとんど存在しないが、バベシア原虫の感染を受け、バベシア原虫の発育・増殖にともなって膜表面に現れてくると考えられた。平成20年度において,イヌ赤血球のうち多数のバベシア原虫が感染しているもののみ、その細胞膜表面にhsp70分子が存在することが明らかになったため、平成21年度にはこのhsp70の出現がバベシア原虫の感染と発育に関連するかどうかを中心に解析を行った。まず、蛍光免疫染色法を用いた観察の結果、赤血球膜表面にhsp70分子が存在する赤血球は16匹以上の極めて多くのバベシア原虫の感染を受けた赤血球のみで、2-8匹程度の感染では赤血球膜表面にhsp70が存存しないことが明らかになった。このことから、バベシア原里が赤血球内で十分に増殖を行い、赤血球膜を破壊して脱出する直前にのみhsp70が細胞膜表面に現れることが示唆された。また、バベシア原虫の感染していない赤血球膜表面にはhsp70は存在せず、またバベシア原虫の培養上清中にはhsp70が存在しなかったことから、バベシア原虫がhsp70分子を分泌し、分泌されたhsp70分子が赤血球膜に結合して抗原となることもない事が明らかになった。さらには、バベシア原虫由来hsp70に対するポリクローナル抗体あるいは市販の抗hsp70抗体が赤血球を傷害し、溶血を引き起こすかどうかをin vitroで観察したところ、抗体の存在により感染赤血球のみならず非感染赤血球もわずかに溶血が亢進し、さらに溶血の程度は感染赤血球と非感染赤血球で差がなかったことから、抗hsp70抗体は感染赤血球を強く傷害することはない事が明らかになった。以上の結果より、バベシア原虫に感染したイヌの血清中には抗hsp70抗体が大量に存在するものの、この抗体は多数の感染を受けた赤血球以外のほとんどの赤血球を標的としないため、赤血球の破壊を引き起こさず、イヌバベシア症において溶血性貧血の悪化には関与していないと考えられた。平成21年度までの研究で、ほとんどの赤血球の膜表面にはhsp70分子は存在せず、バベシア原虫が多数寄生した赤血球のみ、膜表面にhsp70分子が存在することが明らかになり、抗hsp70抗体はバベシア症で検出される抗赤血球膜抗体の一種ではないことが明らかになった。

このため、抗hsp70抗体はバベシア原虫の排除に貢献していることが期待されたので、平成22年度には抗hsp70抗体のバベシア原虫に対する効果を検討し、hsp70のワクチン分子候補としての可能性を考察した。まず、hsp70分子のバベシア原虫における局在を検討したところ、赤血球内寄生型のバベシア原虫では膜表面にはhsp70分子は存在せず細胞内に存在し、赤血球外型のバベシア原虫では膜表面にhsp70分子が存在することが示唆された。昨年度の成績と合わせて、バベシア原虫は赤血球内での発育と増殖が完了したバベシア原虫はその膜表面にhsp70分子が現れ、赤血球外に放出されると考えられ、hsp70分子はバベシア原虫の赤血球内への再侵入に必要な分子であることが予想された。そこで、バベシア原虫を抗hsp70抗体を含んだ培養液を用いて培養を行い、その増殖を観察したところ、使用した25μg/mLの抗hsp70抗体ではバベシア原虫の増殖に変化はなく、抗hsp70抗体はバベシア原虫を中和できないと考えられた。以上の結果から、hsp70分子は赤血球外型バベシア原虫の膜表面に存在するものの、抗hsp70抗体はこの原虫の中和も赤血球への侵入阻害もできず、hsp70分子はバベシア原虫に対するワクチン候補分子としては利用できないと思われた。
インスリン様成長因子が神経芽腫細胞の生存・増殖に果たす役割の解明

インスリン様成長因子受容体はがん細胞の増殖に重要な役目を果たしている。神経芽腫は、インスリン様成長因子に対する増殖反応性から、インスリン様成長因子を自ら産生して増殖できる群、自らは産生することはできないが、インスリン様成長因子が作用することにより増殖できる群、インスリン様成長因子には依存せずに増殖する群に分類された。さらに、神経芽腫の細胞内におけるインスリン様成長因子受容体を介した増殖シグナルの伝達には、複数の経路が用いられていた。これらの結果より、細胞内シグナル伝達を阻害する薬剤を神経芽腫患者の臨床治療に用いる場合には、増殖シグナル伝達の多様性を十分に考慮することが大切であると考えられる。本研究は、神経芽腫細胞におけるインスリン様成長因子(IGF)受容体、およびインスリン受容体を介したシグナルの細胞内シグナル伝達機構を解析し、神経芽腫細胞において、生存・増殖機構として機能しているか否かを明らかにすることを目的としている。平成25年度においては、神経芽腫細胞におけるIGF受容体、およびインスリン受容体の発現解析とIGF、インスリンの存在、非存在下での神経芽腫細胞の生存能と増殖能を検討した。神経芽腫細胞株31種類におけるIGF受容体、およびインスリン受容体の発現に関しては、ウエスタンブロット法にて解析した。その結果、発現の強度には、個々の細胞株の間に差異が認められるものの、検索したすべての神経芽腫細胞には受容体発現が認められた。また、IGF1/2、インスリンの存在、非存在下での神経芽腫細胞の生存・増殖能に関しては、WST-8法を用いて検討した。31種類の神経芽腫細胞のうち、3種類は、IGF1/2、インスリンを含まない無血清培地(RPMI培地)にて増殖が可能であった。また、10種類の神経芽腫細胞は、IGF1/2、インスリンの添加した無血清培地にて、生存、増殖が可能となった。さらに、その他の18種類の神経芽腫細胞は、IGF1/2、インスリンを含む無血清培地では、生存・増殖できず、牛胎児血清の存在下でのみ、生存・増殖が可能であった。以上の結果より、神経芽腫細胞は、IGF、インスリンへの生存・増殖依存性から、3つのグループに分けることが出来ることが明らかとなった。さらに、IGF受容体、およびインスリン受容体の発現強度と、IGF1/2、インスリンの存在、非存在下での神経芽腫細胞の生存・増殖能との間には、相関性は認められす、これらの3つのグループにおいては、IGF受容体、インスリン受容体を介した細胞内シグナル伝達が異なっていることが示唆された。本研究は、神経芽腫細胞におけるインスリン様増殖因子(IGF)受容体、およびインスリン受容体を介したシグナルの細胞内伝達機構を解析し、神経芽腫細胞において、生存・増殖機構として機能しているか否かを明らかにすることを目的としている。神経芽腫細胞は、IGFとインスリンへの生存・増殖依存性から3つのグループ、これらの生存・増殖因子を必要としない無血清培地で生存・増殖可能なグループ(グループ1)、IGF・インスリンを含む無血清培地にて生存・増殖可能なグループ(グループ2)、牛胎児血清の存在下においてのみ生存・増殖可能なグループ(グループ3)に分けられることを明らかになった。さらに、これらの3つのグループ間に、IGF受容体、インスリン受容体の発現強度に差はなかった。さらに、IGF/インスリンの添加により、いずれのグループにおいても、細胞増殖の亢進が認められ、IGF/インスリンの受容体結合を阻害するPicropodophyllin添加により、IGF/インスリンによる増殖は阻害されるとともに、カスパーゼ3の活性化、PARPの断片化が認められ、アポトーシス細胞死が誘導されるとともに、G2/M期での細胞回転のブロックが認められた。また、グループ1の神経芽腫細胞においては、無血清培養に抗IGF1/2中和抗体を添加することにより細胞増殖が有意に抑制され、オートクライン機構が機能していると考えられた。以上の結果より、3つのグループ間においてその依存度には差異が認められるものの、いずれのグループにおいても、IGF/インスリンを介したシグナルが細胞の生存・増殖に強い影響を及ぼしていることが明らかとなった。神経芽腫細胞の増殖におけるIGF/インスリン依存性には差異が認められ、前年度までの検討によって、3つのグループに分類できることが明らかになった(Cancer Science 104:1162, 2013)。今年度においては、神経芽腫細胞のIGF/インスリンによる細胞増殖シグナルは、PI3K-AKT経路の活性化をきたしており、AKT阻害剤であるMK2206の添加によって、神経芽腫の細胞増殖は著しく抑制されることが明らかとなった。さらに、MK2206による細胞増殖阻害作用に対して耐性を獲得した神経芽腫細胞株においては、PDK1を介してmTOR-S6K経路が活性化し細胞増殖が誘導されている細胞群とPDK1に依存しない経路によりmTOR-S6Kが活性化されている2つの細胞群が存在していた。また、両細胞群とも、mTOR阻害剤であるAZD8805により細胞増殖、細胞回転の抑制が誘導された(Cancer Cell Int. 15:91, 2015)。以上の結果より、神経芽腫細胞におけるIGF/インスリン刺激による細胞増殖

シグナルは、AKT-mTOR-S6K経路、PDK1-mTOR-S6K経路、あるいは、その他の経路により活性化されるmTOR-S6K経路のいずれかを介していることが明らかになった。mTOR-S6K経路は、いずれの神経芽腫にも共通する増殖シグナル伝達経路であり、神経芽腫の治療標的となり得ることが示唆された。インスリン様成長因子受容体はがん細胞の増殖に重要な役目を果たしている。神経芽腫は、インスリン様成長因子に対する増殖反応性から、インスリン様成長因子を自ら産生して増殖できる群、自らは産生することはできないが、インスリン様成長因子が作用することにより増殖できる群、インスリン様成長因子には依存せずに増殖する群に分類された。さらに、神経芽腫の細胞内におけるインスリン様成長因子受容体を介した増殖シグナルの伝達には、複数の経路が用いられていた。これらの結果より、細胞内シグナル伝達を阻害する薬剤を神経芽腫患者の臨床治療に用いる場合には、増殖シグナル伝達の多様性を十分に考慮することが大切であると考えられる。平成26年度においては、IGF・インスリンへの生存・増殖依存性により3つのグループに分類される神経芽腫において、その依存性の各グループ間での相違点を当初の予定とおりIGF・インスリンの受容体結合阻害剤を用いて詳細に検討し、明らかにすることができた。さらに、グループ1におけるオートクラインの存在も証明し、神経芽腫における生存・増殖機構としての意義を確認することができた。また、IGF・インスリンによる生存・増殖シグナルの欠如によって、G2/M期での細胞回転のブロックを伴うアポトーシス細胞死が誘導されることを解明することができた。以上より、研究はおおむね順調に進展していると自己評価した。また、IGF・インスリンの各受容体を介した細胞内シグナル伝達機構に関して、3つのグループ間で差異が認められる可能性については、極めて興味ある研究課題であると確認ができたと考える。小児がん平成25、26年度の研究結果により、神経芽腫細胞は、IGFとインスリンへの生存・増殖依存性から3つのグループに分類され、3つのグループすべてにおいて、IGF/インスリンを介したシグナルが神経芽腫細胞の生存・増殖に強い影響を及ぼしていることが明らかとなった。しかし同時に、その依存度には、差異が認められることが示唆された。今後の研究課題としては、IGF受容体、インスリン受容体を介した細胞内シグナル伝達におけるグループ間の相違点を明らかにしたいと考えている。(研究計画1)神経芽腫細胞におけるPI3K/AKT系、MAPK系の活性化:IGF/インスリン刺激によAKT/ERKのリン酸化をウエスタンブロット法により解析する。また、IGF/インスリンの受容体への結合を阻害すること(Picropodophyllin添加)による影響も合わせて検討する。(研究計画2)PI3K/AKT系、MAPK系の阻害による神経芽腫細胞の増殖への影響:IGF/インスリンを含む培養系にAKT/ERK阻害剤を添加し、その増殖抑制効果をWST法を用いて検討する。