hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東南アジアと中東地域を結ぶ「イスラーム」ネットワーク―その社会的背景―

本年度は、主として、過去2年間に行ったフィールド調査(インタビュー、および資料収集)によって得られた情報の精査・分析を行った。具体的には以下の通りである。1)エジプトのインドネシア人留学生コミュニティにおける参与観察、および留学生らを対象に行ったインタビュー調査に基づいて、留学生らが構築する社会的ネットワークの形態の体系化を行った。2)インドネシアにおいて実施したアズハル大学留学経験者へのインタビュー調査に基づいて、資料欠如によって空白となっていた1960年代から1980年代にかけてのインドネシア人留学生コミュニティの実態を明らかにした。さらに、留学経験者の手記の分析、および二次資料の精査を行い、留学コミュニティの変容を再構築し、19世紀後半から現代にかけての中東留学の歴史的変遷を明らかにした。3)インドネシアのイスラーム出版社から入手した翻訳書籍発行状況にかんする資料を分析した。特にアラビア語書籍のインドネシア語翻訳事業に着目し、書籍入手者・編集者・翻訳者の三者関係を洗い出すことで、インドネシア社会におけるイスラーム関連書籍出版の大半にアズハル大学出身者が関与している実態が明らかとなった。4)現在、インドネシア社会において大きな人気を博しているオンライン上での宗教相談に着目し、国内最大の読者を誇るイスラーム系日刊紙(オンライン版)の宗教相談を事例別に分析した。具体的には、宗教相談に関与している人物の洗い出し、数百件の相談内容の分別と分析を行った。本研究は、東南アジアと中東の両地域を移動する留学生によって形成されているイスラームのネットワークの内実を明らかにする。すなわち、これまでの研究では主な対象とされてこなかった留学生による留学先および帰国後の政治・経済的活動に注目することによって、東南アジアと中東における双方向の影響を提示することを目的とした研究であった。具体的には、カイロのアズハル大学に留学経験をもつインドネシア人知識人らが従事する、インドネシアのイスラーム化の実態を明らかにすることを目的とした。これに鑑み、特に本年度は以下の事柄に対して具体的な取り組みをおこなった。第一に、カイロとインドネシアを中心とした、短期間のフィールドワークを複数回行った。アズハル大学参与観察、インタビュー、文献・資料の収集を通じて、留学生らによるビジネス参与、事業の現状把握をした。カイロでは、カイロ・アメリカン大学のMona Abaza氏、カイロ・インドネシア学生協会会長、および在カイロ・インドネシア大使館文化・教育部大使のSlamat Soleh氏より調査協力を獲得し、特に学生協会会長にはコーディネート役として、多くの学生組織の代表とのインタビューをセッティングしてもらった。第二に、現地で収集した定期刊行誌のバックナンバー、行政資料などをもとに文献調査を行なう。特に一年次は定期刊行誌にみられる思想的潮流の分析を中心に、歴史的な変容を考察することを目的としていたが、実際には、留学生がカイロで発見する「多様なインドネシア・イスラーム」が具体的に何を指すのか、というてんを明らかにするための読み込みを行った。その他、対外発表を積極的に行い、国際シンポジウム、国際学会、および国内での研究科において多くの発表を行った。すなわち、現代インドネシア社会のイスラーム化に、留学経験者がいかなる影響を与えているのかを考察することが主たる目的である。具体的には、エジプトのアズハル大学に留学するインドネシア人学生に着目する。今年度は、インドネシアでのフィールド調査を中心に行い、宗教教育に従事しない多様なキャリアを形成するアズハル大学出身者の、社会的意義について明らかにすることを試みた。フィールド調査で得られた定性的データ、および行政資料の精査を通じて明らかになったことは、1)アズハル大学出身者は、出自の多様性、所属組織の相違があるにもかかわらず、アズハル大学出身という共通の属性を共有し、社会的ネットワークに基づいてキャリアの形成を行い、イスラーム化に貢献していること、2)その社会的ネットワークは、アズハル大学留学時代の学生生活の様態に大きく左右されていること、以上である。また、今年度は2010年7月にバルセロナで開催された世界中東学会において口頭発表を行い、その他国際ジャーナル、国内誌への論文投稿を行った。
スキャッフォールド蛋白質の新しい機能

本研究は、スキャッフォールド蛋白質(アダプター蛋白質)の新しい機能、すなわち免疫系においてリガンドとして細胞質型チロシンキナーゼを活性化することや、部位特異的な転写因子制御機構に着目したものである。昨年の報告書にも記載したように、1.スキャッフォールド蛋白質3BP2の機能解析(Qu et al., Biochemistry 2005)、2.スキャッフォールド蛋白質としての機能を有するユビキチンリガーゼCbl-bの機能解析(Qu et al., Blood2004、Enokiet al., J.Pharmacol.Sci.2004)、3.スキャッフォールド蛋白質とヒトの遺伝病との関運(Miah et al., Genes Cells 2004)について報告し、平成16年度の研究計画であるスキャッフォールド蛋白質のノックダウンによる機能解析と同17年度の計画であるヒト遺伝病との関連についての当初の目的はほぼ達成された。本年度は昨年度の成果を更に発展させて、Cbl-bの異常とI型糖尿病との関連について報告した(Qu et al., J.Biochem.2005)。I型糖尿病モデルラットで見出されたCbl-bの遺伝子異常は、カルボキシ末端のスキャッフォールド蛋白質としての機能ドメインを全て欠失する。この変異型Cbl-bをマスト細胞株RBL-2H3に発現させて解析したところ、IgEを介するマスト細胞活性化の部分的抑制が見出された。すなわち、Cbl-bによる脱顆粒と転写因子NF-ATの活性化は抑制されなかったが、サイトカインIL-3、IL-4産生は抑制された。ヒトI型糖尿病の家族症例で見出されたCbl-bの遺伝子異常と機能障害との関連については共同研究を継続しており、今後の課題としたい。3BP2と核内シグナルについては、転写因子との相互作用を見出すには至らなかった。昨年に引き続き、本研究成果をまとめた総説を発表した。本研究は、スキャッフォールド蛋白質(アダプター蛋白質)の新しい機能、すなわち免疫系においてリガンドとして細胞質型チロシンキナーゼを活性化することや、部位特異的な転写因子制御機構を有することに着目したものである。スキャッフォールド蛋白質によるこのような機能は未開拓であり、本年度は肥満細胞・T細胞における転写因子活性化、サイトカイン産生への関与について解析を行った。さらに3BP2遺伝子の異常と蛋白質の機能異常との関連やヒトの遺伝病cherubismの病態への影響について解析し、研究計画をほぼ達成した。1、スキャッフォールド蛋白質3BP2の機能解析:ヒトT細胞を用いてスキャッフォールド蛋白質3BP2のsiRNAによるノックダウンを行い、T細胞受容体を介する転写因子NFAT活性化に3BP2がエッセンシャルな役割を担うことを明らかにした。また3BP2のリン酸化部位であるチロシン183がVav1-Rac1経路を、チロシン446が上流に位置するLckチロシンキナーゼに会合し、それぞれが異なるNFAT活性化シグナルを調節することを明らかにした(Qu et al., Biochemistry 2005)。2、スキャッフォールド蛋白質としての機能を有するユビキチンリガーゼCb1-bの機能解析:脂質ラフトに恒常的に発現するCb1-bキメラ分子を用いて、Cb1-bが肥満細胞活性化の負の調節因子であることや、ユビキチンリガーゼ依存性と非依存性の2つのメカニズムでIgEを介する脱顆粒反応とサイトカイン産生を抑制することを明らかにした(Qu et al., Blood 2004)。また、Cb1-bの標的分子であるスキャッフォールド蛋白質Gab2のチロシンリン酸化を選択的に抑制する薬剤としてフェノキサジン誘導体Phx-1を見出した(Enoki et al.,J.Pharmacol.Sci.2004)。3、スキャッフォールド蛋白質とヒトの遺伝病との関連:ヒトの遺伝病cherubismで同定された変異型3BP2が、チロシンキナーゼLynのリガンドや転写因子NFATの活性化調節因子としての機能を失っていることを見出した。さらに、Cherubismで同定された3BP2遺伝子上の点突然変異の違いにより、細胞内シグナルに対して異なる影響が見られることも同時に明らかにした(Miah et al., Genes Cells 2004)。

本年度は昨年度の成果を更に発展させて、Cbl-bの異常とI型糖尿病との関連について報告した(Qu et al., J.Biochem.2005)。I型糖尿病モデルラットで見出されたCbl-bの遺伝子異常は、カルボキシ末端のスキャッフォールド蛋白質としての機能ドメインを全て欠失する。この変異型Cbl-bをマスト細胞株RBL-2H3に発現させて解析したところ、IgEを介するマスト細胞活性化の部分的抑制が見出された。すなわち、Cbl-bによる脱顆粒と転写因子NF-ATの活性化は抑制されなかったが、サイトカインIL-3、IL-4産生は抑制された。ヒトI型糖尿病の家族症例で見出されたCbl-bの遺伝子異常と機能障害との関連については共同研究を継続しており、今後の課題としたい。3BP2と核内シグナルについては、転写因子との相互作用を見出すには至らなかった。昨年に引き続き、本研究成果をまとめた総説を発表した。
核酸の生体内可視化を目指した19F 核磁気共鳴プローブの開発

生体内で核酸を直接イメージングすることを目指し、19F MRによる核酸イメージングが可能な、新規分子プローブの検出感度の改善を目的に種々のフッ素ラベル剤を合成し機能評価を行った結果、(1)キラル制御された新規フッ素ラベル剤により5倍以上のS/N比の改善、(2)フッ素ラベル剤のマルチラベリングにより2.4倍の検出感度の向上、また、(3)ケミカルシフトレシオ変化型プローブの創成に成功した。核酸類の生体内可視化が可能になれば、疾患マーカー核酸のイメージングによる診断、さらには細胞レベルでは不明であった核酸の新たな機能が明らかになる可能性がある。しかし現在、細胞内核酸イメージングに多用される蛍光プローブでは、生体の光透過性の低さから生体内可視化への適用は困難である。そこで本研究では、シグナル生体透過性が高く、生体バックグラウンドの低い19F核磁気共鳴による核酸可視化プローブの創製を目指すこととした。既に標的DNA存在下でのみフッ素MRシグナルを示す、OFF/ON型のプローブの開発に成功しているが、検出感度の低さ(数μM)が問題であった。平成23度は、検出感度の改善を目的に、「キラル制御された新規フッ素ラベル剤の開発」を試みた。新規ラベル剤((R) or (S)-3-アミノ-1,2-プロパンジオールを使用)でラベルしたプローブと従来型のプローブ(2-アミノ-1,3-プロパンジオール骨格を使用)のS/N比を比較した結果、それぞれ63(R体)、70(S体)、12(従来型)となり、約5.8倍のS/N比の改善に成功した。平成24年度は、上記の改良型核酸検出プローブの検出感度の定量的評価を行い、細胞内核酸検出への応用可能性を評価した。結果、従来型のプローブの最低検出濃度が2.5 μM程度であったのに対して、改良型プローブでは1 1.2 μMで、2倍以上の検出感度改善が見られた。しかしながら数十数百nMしか存在しない細胞内RNAを検出するには更なる検出感度の改善が必要であることがわかった。そこで、新規フッ素ラベル剤を連続的に複数個ラベルした核酸検出プローブを合成したところ、2個連続して導入したプローブで、さらに2.4倍の検出感度向上が見られ(検出限界500 nM程度)、細胞内RNA検出に適用可能なプローブの開発に成功した。今後、細胞内RNA検出に挑戦する。本研究では生体内で核酸を直接イメージングすることを目的とし、生体バックグラウンドの低いフッ素核磁気共鳴(MR)による核酸イメージングが可能な、新規分子プローブの創製を目的としている。既に標的配列を持つDNAが存在するときにのみフッ素MRシグナルを示す、OFF/ON型のプローブの開発に成功しているが、検出感度の低さ(数μM)が問題であった。平成23度は、検出感度および検出精度の改善を目的に、(1)キラル制御された新規フッ素ラベル剤の開発、および(2)レシオ型プローブの創製を試みた。(1)キラル制御された新規フッ素ラベル剤の開発従来型のフッ素ラベル剤(2-アミノ-1,3-プロパンジオールを使用)では、ラベル剤合成時に鏡像異性体が生成していたため、フッ素MRシグナルが2本線となり、検出感度を低下させる一因となっていた。そこで、合成時の鏡像異性体生成を防ぐため、非等価な水酸基を持つリンカーとして(R)あるいは(S)-3-アミノ-1,2-プロパンジオールを用いた。アミノ基に3,5-ビストリフルオロ安息香酸を縮合、トリチル化、アミダイト化を経て、新規フッ素ラベル剤の合成に成功した。各フッ素ラベル剤をオリゴDNAの5'末端に導入し(収率93%以上)、精製後、フッ素NMRを測定した結果、いずれも先鋭な1本線のシグナルを示し、従来型でみられた2本線は観測されなかった。従来型のフッ素ラベル剤でDNAラベル後のS/N比を比較した結果、それぞれ63(R体)、70(S体)、12(従来型)となり、約5.8倍のS/N比の改善に成功した。(2)レシオ型プローブの創製6-アミノヘキサノールリンカーを介して3,5-ビストリフルオロ安息香酸を導入したステムループ型プローブが、標的核酸添加によりフッ素MRシグナルのケミカルシフトを変化させることを見出した。これを用いた核酸の定量イメージングの可能性が示された。H23年度内に、約5.8倍のS/N比の改善に成功したことから数百nMの標的核酸の検出が可能になると期待される。現在、OFF/ON型のプローブについてフッ素ラベルをタンデムに導入することによる検出感度の改善をめざし、プローブの合成を進めており、次年度内に目標の10倍程度の検出感度改善を達成する。また、本プローブによる細胞内RNAの検出に向けたプローブ配列のデザイン・合成にも着手しており、次年度の研究に用いることを予定している。

一方で、レシオ検出型のプローブの可能性を見出したことから、より確度の高い、新しい核酸定量イメージングプローブの開発可能性が示唆された。以上から、おおむね順調に進展していると評価している。23年度の研究成果として、5.8倍の検出感度改善を達成し、さらに標的核酸のレシオイメージングの可能性を見出した。そこで今後は、(1)細胞内標的RNAのOFF/ON検出およびレシオ検出を目指した条件検討を行うとともに、(2)更なる検出感度向上を目指したプローブ開発を行う。最終的に本プローブの細胞内RNA検出能力について評価し、目標を達成する。(1)細胞内標的RNAのOFF/ON検出およびレシオ検出ヒト28S rRNAを標的としたプローブを合成し、白血病細胞HL-60から抽出したRNAを添加したときのフッ素NMR測定結果から、プローブのrRNA検出能力を評価する。また種々のコントロール配列のプローブを導入した場合との比較から、rRNA検出の選択性を評価する。同様に変異型Kras mRNAおよびGAPDH mRNAを標的とするプローブを合成し、膵臓ガン由来細胞から抽出したRNAを添加し、フッ素NMR測定結果から、プローブのmRNA検出能力を評価する。さらに、非細胞系で機能評価し、最適化したプローブを、ストレプトリシンOなどの核酸導入法を用い生細胞(HL-60、Capan-1、BxPC-3など)内に導入する。OFF/ONプローブ(2)更なる検出感度向上を目指したプローブ開発すでに合成に着手しているフッ素ラベル剤を複数導入したプローブの合成が完了し次第、フッ素ラベル導入数と検出感度改善効果の相関を調べ、この手法の有用性を評価する。また、また化学反応に基づく信号増幅系を組込んだ検出・イメージングシステムの構築にも着手し、高感度、高精度なイメージングが可能なプローブの分子設計法、合成法を確立する。23年度末にフッ素ラベル剤合成スキームの変更にともない試薬購入のキャンセルを行ったために小額の未使用額が生じた。24年度はこれをプローブ合成のための経費に組み入れて使用する。また、細胞内RNA検出能力の評価に用いる細胞(HL-60, Capan-1, BxPC-3)の購入費用として240千円、培養に関わるプラスチック消耗品・試薬類として250千円を充当することを計画している。さらにプローブ合成のための溶媒・試薬類として300千円、HPLCによる大量精製用のカラムに160千円を充当し、成果発表・情報収集を目的とした学会発表(日本化学会第93年会)の旅費として100千円を、また、共同研究学生へ支払う謝金として50千円を充当することを計画している。
ＣＯＰＤにおける全身性炎症発現機序の解明

外科手術時に内臓脂肪を採取でき、検討に適した120例を対象とした。COPDと考えられる喫煙歴があり閉塞性換気障害を有した群は、健常喫煙群あるいは非喫煙群に比較して、内臓脂肪の有意なマクロファージの増加は認めなかった。また、COPD群において、血清CRPの高低で比較すると、内臓脂肪マクロファージはCRPが高い例で多い傾向にあったが、有意差はなかった。全体の検討では、多変量解析により%VCとBMIは独立して内臓脂肪マクロファージと相関していた。以上から、内臓脂肪炎症はCOPDの全身性炎症に関与していないと考えられ、また、内臓脂肪炎症は肺機能(肺活量)と関連することが明らかになった。COPDは全身性炎症性疾患と考えられているが、その炎症の由来は明確ではない。本研究の目的は、1)COPDにおける内臓脂肪炎症の関与の有無、2)内臓脂肪炎症と喫煙および肺機能との関連を明らかにすることである。方法として、高知大学病院外科において早期がん等により腹部手術を行った120例において、内臓脂肪、血清を採取し、内臓脂肪マクロファージ(CD68陽性細胞)やリンパ球を検討し、また血清の各種サイトカインを検討した。結果:1喫煙歴があり閉塞性換気障害を有した24例は喫煙者(n=51)あるいは非喫煙者(n=35)に比較して、内臓脂肪の有意なマクロファージの増加は認めなかった。非喫煙閉塞性換気障害も同様であった。閉塞性換気障害群において、血清CRPが高い群(中央値をcut-offとした)において、低い群と比較して、内臓脂肪マクロファージは高い傾向にあったが、有意差はなかった。2今回の検討に用いた120例について、肺機能と血清高感度CRPは%VCと有意な逆相関を認めたが、FEV1/FVCとは関連しなかった。BMIおよび%VCと内臓脂肪マクロファージは有意な相関を認めたが、FEV1/FVCとは関連しなかった。多変量解析により%VCとBMIは独立して内臓脂肪マクロファージと相関していた。以上から、内臓脂肪炎症はCOPDの全身性炎症に関与していないと考えられた。また、内臓脂肪炎症と喫煙は関係しないが、肺機能(肺活量)と関連することが明らかになった。腹部手術時に腹部内臓脂肪および皮下脂肪を採取した。30例程度について腹部と皮下の差異を検討したところ、明らかに腹部脂肪の方が炎症細胞数が多く、皮下脂肪を採取するのは簡単ではあるが、腹部脂肪炎症の代替えにはならないことを明らかにした。また腹部脂肪は現時点で160例で取得し、脂肪組織内のCD68陽性細胞数を検討した。癌患者の場合は術前のCRPが正常であっても進展型であると早期例に比較してCD68陽性細胞は多くなっており、検討から外す必要があると判断した。予備的に厳選した82例で検討すると、閉塞性換気障害のある30例では必ずしもCD68が多くなく、脂肪細胞のサイズも差がなかった。しかし、%FEV1はTNFや他のアディポサイトカインと有意な逆相関を示した。即ち、COPD重症度とこれらのサイトカインは相関する可能性がある。一方で%VCはCD68陽性細胞数と有意な負の相関を認め、BMIや腹囲とも独立した因子となっていた。このことは%VCが低い例では腹部炎症があることを示唆する。我々は以前に%VCと糖尿病発症の関連を報告しているが、%VCの低下は腹部炎症を介して糖尿病発症に関係している可能性が示唆された。これまでに、低体重出生児は後年心血管疾患に罹患しやすいという疫学データから、胎生期ないし出生早期に動脈硬化性疾患への感受性がプログラミングされるという“Barkerの仮説“が知られている。このような児では、正常範囲であっても成人期に肺容量低下が生じるとの報告がある。我々のこれまでの検討で、呼吸機能低下は正常範囲であっても、インスリン抵抗性さらには糖尿病を生じることが明らかになっている。本研究は、腹部脂肪と肺容量の関係から、細胞学的なBarker仮説の解明に寄与するものと考えられる。脂肪採取は順調に進んでおり、研究も特に問題なく進んでいる。今後、脂肪採取をさらに進め、200例を目途とする。約30%に認められる閉塞性換気障害例における種々のアディポサイトカインの意義を例数を増やして検討し、COPDの全身性炎症における腹部炎症の意義を明らかにする。予備的検討で明らかになっている、脂肪サイズ、浸潤炎症細胞数、浸潤程度あるいは血清あるいは培養上清中の液性因子と、喫煙、肺機能との関係を確定したい。また、%VCとCD68陽性細胞の関係をつなぐ分子メカニズムについても、脂肪組織を用いた網羅的なプロテオーム解析(基盤研にて施行)とそれによる候補分子の解析を行う。

血清および培養上清における種々のアディポサイトカインの測定試薬の購入と脂肪組織のプロテオーム解析とそれに基づく候補分子の解析用試薬の購入に充てたい。
ティラピア生殖腺の性分化開始機構の解明とその応用

まず、雄選抜に実用的に利用できるDNAマーカーを開発した。よって、超雄偽雌(YY雌)作製が可能となり、商業的に利用できる安定的超雄(YY雄)大量生産技術を確立した。卵巣分化では、fshシグナルの関与は限定的であり、転写因子foxl2→アロマターゼ発現→雌性ホルモン産生の直線的シグナルによって開始されることが示唆された。精巣分化では、精巣誘導因子gsdfは転写因子dmrt1の下流因子ではなく、それぞれがパラレルに発現することで精巣分化が開始されることを示唆した。gsdfがエストロゲン産生系に影響を与えないことから、性決定因子が雌性ホルモン産生を抑制することで精巣分化が誘導されることが示唆された。(1)濾胞刺激ホルモン(FSH)の卵巣分化誘導または精巣分化抑制に対する関与:1)FSH受容体(fshr)プロモーター下流にレポーターを組み込んだベクターを遺伝的雌(XX)に導入した。レポーターの発現を調べることでfshr発現細胞を特定することが期待される。2)HEK293浮遊細胞系を利用して機能的ティラピア組換えFSHを作製した。今後作製予定のfshrトランスジェニックXYティラピアにin vivoで投与することでアロマターゼ(cyp19a1a)の発現が誘導されるか、または、分泌因子gsdfの発現が抑制されるかどうかの結論が得られる。(2)gsdfの精巣分化誘導機構:1)CMVならびにAGプロモーターを利用したgsdf強制発現系ーXXトランスジェニック魚を作製し、精巣分化が誘導されることを明らかにした。gsdfが精巣分化誘導に十分な因子であることを証明した。2)HEK293浮遊細胞系を利用して機能的ティラピア組換えgsdfを作製した。これをXX仔魚腹腔に投与することで、dmrt1発現が誘導されるか、また、雌性ホルモン(E2)産生が抑制されるのかを明らかにする。同時に、gsdfによって影響を受ける遺伝子発現を調べることができる。(3)XY仔魚への低濃度E2投与による遺伝子発現の変化:孵化後4ー10日目の間300ng/mlのE2でXY仔魚を暴露した場合、gsdf遺伝子発現は高まらないものの、dmrt1遺伝子発現は一旦上昇した後遅れて減少することを示した。この結果は、通常XX雌ではE2がdmrt1ではなくgsdfの発現抑制を通して精巣分化を抑制していることを示唆している。1、濾胞刺激ホルモン(FSH)のティラピア卵巣分化誘導または精巣分化抑制に対する関与:(1)FSH受容体(fshr)プロモーター下流にレポーターを組み込んだベクターを遺伝的雌(XX)に導入し、未分化生殖腺におけるレポーター遺伝子の発現を確認した。未分化生殖腺におけるfshrの発現は示したものの、in situ hybridizationによる発現細胞の特定には至っていない。(2)HEK293浮遊細胞系を利用して作製した機能的ティラピア組換えFSHを高度に精製した。これを用いることで、卵巣および未分化生殖腺においてFSHがcyp19a1a遺伝子の発現を誘導するかどうかを調べることが可能となった。(3)一方、当初の予想とは異なり、翻訳阻害によってFSHおよびfshrダブルノックダウンを施したXX仔魚は全て卵巣に分化した。ノックダウン効果は孵化後10日目まで続くことを確認したが、10日目までの分子的性分化に重要な期間の間、FSHシグナルを抑えても性分化に影響を及ぼすことがないとう疑いが生じた。2、gsdfの精巣分化誘導機構:(1)HEK293浮遊細胞系を利用して作製した機能的ティラピア組換えgsdfを高度に精製した。これをXX仔魚腹腔に投与することで、dmrt1発現が誘導されるか、また、cyp19a1a発現が抑制されるのかを明らかにすることが可能になった。(2)gsdfとdmrt1の発現細胞をXY未分化生殖腺および精巣において詳細に明らかにした。未分化生殖腺では両遺伝子はPGCを取り囲む同一の支持細胞で発現するが、精巣ではgsdfは表層に近いA型精原細胞周囲支持細胞と輸精管に接する体細胞に発現し、dmrt1は全発達段階の精細胞周囲のセルトリ細胞に発現することを明らかにした。この結果から、gsdfがdmrt1と常に共発現していない可能性が初めて示された。1、FSHの卵巣分化誘導機構の解析では、レポーター遺伝子を利用したfshr発現細胞を調べるトランスジェニック魚を作製し、レポーター遺伝子が未分化生殖腺で発現していることが初めて確認された。また、機能的ティラピア組換えFSHが高度に精製され、FSHのcyp19a1a遺伝子発現誘導に対する役割を調べるための準備が整えられた。fshrノックアウトティラピアの作製には至っていないが、翻訳阻害によるFSH、fshrダブルノックダウンXXティラピアが卵巣に分化することが初めて示された。2、これまでに、gsdfの精巣分化誘導の解析では、gsdfが精巣分化誘導に対して十分な因子であることを示した。加えて、機能的ティラピア組換えgsdfを高度に精製することに成功し、その精巣分化誘導メカニズムを調べるための準備を整えた。また、これまで同一細胞に発現すると考えていたgsdfとdmrt1遺伝子が、成熟精巣においては一致しない細胞もあることが新たに解った。この結果から、当初の予想と異なりgsdfとdmrt1の遺伝子発現調節が直列ではなく並列である可能性を考慮して今後の研究を進める必要があると考えられた。

1、濾胞刺激ホルモン(FSH)の性分化への関与:(1)ティラピアFSH受容体を強制発現させたHEK293細胞に組換えFSHを添加して培養し、cAMP応答配列下に組み込んだルシフェラーゼ活性を測定したところ、100ng/ml添加以降から活性上昇が認められ、200ng/mlでは未添加に比べて12倍以上の極めて強い活性が誘導された。(2)組換えFSHを添加してティラピア精巣片を培養したところ、11-ケトテストステロン産生が上昇する傾向が認められ、加えて培養精巣における11β-水酸化酵素mRNA発現が誘導された。これらのことから、作製したティラピア組換えFSHが強いホルモン作用を有するという確証が得られた。2、Gsdfの精巣分化誘導機構:アンドロゲンによって誘導されるメダカXX性転換において、Gsdfが誘導された後、Dmrt1発現が誘導されることにより精巣への分化転換が起こることが明らかとなった。この発現順序はXYティラピアの精巣分化時と同様であり、ティラピアとメダカを通した共通する機構であることが示唆された。3、ティラピア性決定因子の作用解析:ティラピア精巣分化過程においては、amhおよびamhyはいずれもセルトリ細胞系列の細胞ではなく、間充織細胞に特異的に発現することが明らかとなった。amhyが性決定因子であるなら、間充織細胞から精巣分化が制御されるという予想外の結果である。4、ティラピア超雄偽雌の作出:超雄稚魚は通常エストロゲン処理での雌化誘導が困難であったため、超雄候補稚魚に致死量に近い濃度のエストロゲン処理を施した。生残魚から性特異的DNAマーカーを利用してYY魚を選抜し、飼育を続けた結果、1尾が産卵に至った。本課題において、初めて超雄偽雌が作出されたことが強く期待される。今後、XX雄の精子と掛け合わせることで検定を行い、超雄偽雌であることを確定させる。1、FSHの性分化への関与:(1)組換えFSHが生物活性を有することが明らかとなり、組換えFSHの稚魚注入実験へ向けての基盤が整った。(2)FSHおよびFSH受容体のノックダウン実験は孵化後8日目稚魚での検定が残されている。また、FSH受容体ノックアウト実験も未だ成功していない。昨年度、卵質の悪化が生じたため顕微注射後の生残が極端に低下したことが停滞している理由である。現在、卵質は改善されたため引き続き顕微注射実験を行うことで、研究計画にある実験の結果が得られると予想される。2、Gsdfの精巣分化誘導機構:上記と同様の理由で、組換えGsdfの稚魚注入実験およびノックアウト実験が進展していない。改善された卵質の受精卵を用いて引き続き顕微注射実験を行う。3、ティラピア性決定因子の作用解析:ティラピアの性決定因子として強く示唆されているamhyの発現細胞の同定に成功した。現在、amhyの作用および作用機構解析を進めており、順調に進行している。4、ティラピア超雄偽雌の作出:超雄偽雌の作出に成功したことが強く示唆される結果が得られ、大きな前進となった。
黒潮及び黒潮反流の流量・熱流量の測定に関する総合的研究

これまでの黒潮に関する多くの研究は,水温・塩分場の観測データから深層の流れが弱いと仮定して求めた地衝流に基づいており,結果が相対的であった.そこで,流れの直接測定を基にして,黒潮とその沖合の再循環流(黒潮反流)の流量と熱流量を絶対値として求めることを試みた.四国の足摺岬沖に黒潮を横断する観測線を設け,1993年秋から1995年秋まで2年間にわたって集中観測を行った.この測線に沿って,多数の流速計や倒立音響測深器(IES)などを係留したほか,観測船による水温・塩分の断面観測(CTD/XBT観測)や曳航式音響ドプラー流速分布計(ADCP)観測を繰り返し行った.特に,この観測船による繰り返し観測をなるべく頻繁に行うためにASUKA(足摺岬沖黒潮協同観測)と名付けたグループを結成し,多くの研究者との協同観測を実施した.この補助金は,主として,ASUKAグループの活動を支えるために使われた.また,測線を,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせることにより,そのデータの活用を計った.現在も,取得したデータを解析中であり,最終的な結論は得られていないが,いくつかの重要な成果が得られた.最初の1年間の係留した流速計の記録と,その間にASUKAグループが繰り返し行った測線沿いのCTD/XBT観測のデータを組み合わせて,黒潮の絶対的な地衡流の断面分布を求め,その断面積分から絶対流量を求めた.その結果,黒潮の流量が,黒潮の沖合側と沿岸側での水位の差と非常に高い相関をもつことが明らかになった.この関係を使って,TOPEX/POSEIDONの最初の2年間の海面高度計データから,黒潮の絶対流量の時系列を得た.10日毎に得られた流量の推定値は,34から92 Sv (1 Sv=10^6 m^3/sec)の範囲で,時間とともに大きく変化しており,季節変化よりも半年に近い周期の変化の方が卓越している.黒潮の流量のこの2年間の平均値は56Svであった.これまでの黒潮に関する多くの研究は,水温・塩分場の観測データから深層の流れが弱いと仮定して求めた地衝流に基づいており,結果が相対的であった.そこで,流れの直接測定を基にして,黒潮とその沖合の再循環流(黒潮反流)の流量と熱流量を絶対値として求めることを試みた.四国の足摺岬沖に黒潮を横断する観測線を設け,1993年秋から1995年秋まで2年間にわたって集中観測を行った.この測線に沿って,多数の流速計や倒立音響測深器(IES)などを係留したほか,観測船による水温・塩分の断面観測(CTD/XBT観測)や曳航式音響ドプラー流速分布計(ADCP)観測を繰り返し行った.特に,この観測船による繰り返し観測をなるべく頻繁に行うためにASUKA(足摺岬沖黒潮協同観測)と名付けたグループを結成し,多くの研究者との協同観測を実施した.この補助金は,主として,ASUKAグループの活動を支えるために使われた.また,測線を,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせることにより,そのデータの活用を計った.現在も,取得したデータを解析中であり,最終的な結論は得られていないが,いくつかの重要な成果が得られた.最初の1年間の係留した流速計の記録と,その間にASUKAグループが繰り返し行った測線沿いのCTD/XBT観測のデータを組み合わせて,黒潮の絶対的な地衡流の断面分布を求め,その断面積分から絶対流量を求めた.その結果,黒潮の流量が,黒潮の沖合側と沿岸側での水位の差と非常に高い相関をもつことが明らかになった.この関係を使って,TOPEX/POSEIDONの最初の2年間の海面高度計データから,黒潮の絶対流量の時系列を得た.10日毎に得られた流量の推定値は,34から92 Sv (1 Sv=10^6 m^3/sec)の範囲で,時間とともに大きく変化しており,季節変化よりも半年に近い周期の変化の方が卓越している.黒潮の流量のこの2年間の平均値は56Svであった.本年度の7月初めにこの研究計画の最初の全体会議を開き,3年間の研究計画を検討した.10月に,鹿児島大学の敬天丸のKT93-09航海で,四国沖の測線に沿って,流速計33台,IES(倒立音響測深器)8台,ADCP(音響ドプラー流速分布計)2台を設置し,2年間にわたる黒潮および黒潮反流の共同集中観測を開始した.同時に,CTD/XBTによる水温・塩分場の横断観測や,曳航ADCPによる表層流速の横断観測を,大学や官庁の観測航海の機会を利用して,なるべく頻繁に行った.すなわち,CTD/XBT観測は,10月,11月,1月(3回),2月,3月に,また,曳航ADCP観測は,11月,1月,2月に行った.このように,観測船による集中観測は,当初の予想以上に頻繁に行われている.また,TOPEX/Poseidon海面高度計データも順調に入手されている.

このように観測は順調に進んでおり,データが次々に集まりつつあるが,その解析は次年度以降に予定されているので,本年度の研究成果(論文など)はあまりない.ただし,衛星海面高度計データを用いた日本南岸の黒潮流路の変動に関する解析は順調に進展しており,海面高度計データと海面高度の気候学的平均値を用いて近似的に求めた海面での地衡流分布の時間変化が,黒潮流路の変動をかなり正確に促えていることが分かった.次年度はこの集中観測を継続し,さらに黒潮および黒潮反流に関するデータを収集する.そのため10月に,流速計などの係留測器を回収し,新たに同様の測器を再設置する.また1年を通して機会を捉えてなるべく頻繁にこの測線に沿ったCTD/XBT観測と曳航ADCP観測を行う.1993年10月に2年間にわたる黒潮および黒潮反流の共同集中観測[ASUKA」を開始して以来,大学や官庁など観測船によって四国沖での黒潮の流量と熱流量を推定するための観測が繰り返し精力的に行われている.1994年9月には,1993年に設置した流速計を回収し,同様のものを再設置した.得られた最初の1年間の係留流速計の記録と,その間に繰り返し行われたASUKA測船沿いのCTD/XBT観測のデータを組み合わせて,黒潮の絶対的な地衡流を求め,その断面積分から黒潮の絶対流量を求めた.さらに,黒潮の流量が黒潮の両端の水位差と非常に高い相関をもつことが明らかになったので,その関係を使って,人工衛星TOPEX/POSEIDONの海面高度計データから,黒潮の絶対流量の約2年間にわたる時系列を得た.得られた流量の時系列は,平均が56Sv(1Svは106m3/sec),標準偏差が17Svであった.流量の時間変化には年周期変化よりも半年に近い周期の変化が卓越していた.ただしこの流量には,黒潮の南側に存在する高気圧性の暖水渦に伴う局所的な循環の流量も含まれているので,今後,黒潮の正味の通過流の流量を求めるために,この局所的な循環流の流量の時間変化を正しく求める必要がある.1995年11月には,第2年目の係留系が回収され,合わせて2年間にわたる係留流速計データが得られるはずなので,これらの解析をさらに進めたい.同時に,黒潮の流軸位置や流速断面の時間変化に関する解析も行いたいまた今回は使えなかったが,海底に設置してあるIES(倒立音響測探器)の2年間のデータから,黒潮の流量の圧的な変動に関する情報が得られるので,これらを海面高度計データなどと組み合わせて,さらに精度の高い流量の推定を行う予定である.1993年10月に四国沖の黒潮と黒潮反流の協同観測ASUKAを開始して以来,大学や官庁などの観測船によって,黒潮の流量と熱流量を推定するための観測を繰り返し行ってきた.1995年11月に係留流速計とIES(倒立音響測深器)を回収し,2年間の集中観測を成功理に終了した.この間,1994年9月と1995年5月にはASUKA測線全体にわたる,海面から海底までの完全なCTD断面観測を実施した.それを含めて,この集中観測期間中に41回の黒潮横断観測を行った.この観測頻度は一月当り1.6回に相当する.そのうち12回の航海では曳航ADCP(音響ドプラー流速分布計)による表層の流速観測を並行して行った.最初の1年間の係留流速計の記録と,その間に繰り返し行ったCTD/XBT観測のデータを組み合わせて,黒潮の絶対的な地衡流速を求め,その断面積分から黒潮の絶対流量を求めた.さらに,この黒潮の流量が黒潮の両端の水位差と非常に高い相関をもつことが明らかになったので,その関係を使って,人工衛星TOPEX/POSEIDONの海面高度計データから,黒潮の絶対流量の約2年間にわたる時系列を得た.得られた流量は時間的に大きく変化しているが,そのかなりの部分が,黒潮の沖合に移動してくる高気圧性渦(暖水渦)や低気圧性渦(冷水渦)の影響を強く受けていることが分かった.1996年4月にASUKA観測のシンポジウムを開催し,これらの観測成果を公表する.
蛋白質内超高速光反応のコヒーレントダイナミクス

本研究では、光に対し顕著な応答を示す光活性蛋白質の極初期で起こる光分子反応過程を、時間幅7.5フェムト秒(10^-15秒)の超短パルスレーザーを用いた過渡吸収法により検討した。その結果、光合成細菌の目の機能を果たす蛋白質(PYP)の光励起状態における発色団分子の振動モードの観測に初めて成功し、蛋白質の持つ構造が特定の分子振動を誘起することにより超高速異性化を引き起こす一因となることを明らかとした。光活性黄色タンパク質Photoactive Yellow Protein(PYP)は光負走光性を示す好塩菌の視覚機能を果たすと考えられており、その初期過程では発色団(p-クマル酸)のtrans-cis光異性化反応が超高速で起こる。本研究では、sub-10fsレーザーパルスを用いた過渡吸収測定を行い、PYPの光初期異性化ダイナミクスについて検討した。過渡吸収測定には光源としてチタン-サファイアレーザーを非同軸配置でパラメトリック増幅したもの(NOPA,パルス時間幅8fs,中心波長400nm)を励起光およびプローブ光として用いた。その結果、370-400nm付近にはPYPのS_1-S_n吸収が見られ、異性化に伴い寿命約200fsの超高速成分を含む多成分指数関数での吸光度の減衰を示した。またS_1-S_n吸収、および定常吸収のブリーチング領域において吸光度の経時変化に振動数1000cm^<-1>領域の振動成分が付随した。フーリエ解析によりそれらの振動数を求めたところ、主として3種の振動成分(1570cm^<-1>、1159cm^<-1>、537cm^<-1>)が存在する事が分かった。PYPのraman散乱測定結果との比較から、これらの振動成分はp-クマル酸の面内(in-plane)振動(υ_<13>,υ_<25>、υ_<36>,)にそれぞれ対応すると考えられるが、一方でυ_<13>modeの振動数はraman測定値に対して約10cm^<-1>小さく、光励起状態の分子振動を観測しているものと考えられる。光活性タンパク質のsub-10fsのレーザー光源を用いた高時間分解能でのポンプ-プローブ計測について、回転セルを用いた新たな測定光学系を作成して超高速光異性化反応を示す光活性タンパク質PYPの再測定を行い、振動成分の数値を含め前年度の実験結果の再現性を確認した。その結果、以前の測定では観測されなかった低振動数(<500cm^1)の振動成分を新たに観測する事ができた。また、振動モード(γ_<13>)は測定波長により位相がシフトする事が分かった。これらの振動消失時間の算出等から、発色団であるp-クマル酸のC-C二重結合部分の伸縮振動モードがPYPの超高速反応に関わっている可能性が高いことが新たに示された。また再測定の結果を元に振動成分の再解析を進め、強度は低いものの20種以上の振動を新たに同定することができたが、これらの振動モードのうち励起状態での振動であることが明らかなものは少ないことが分かった。超高速光誘起電子移動反応を示すフラビン蛋白質について、FMN結合蛋白質やピロリ菌由来のフラボドキシンを用いてフェムト秒蛍光ダイナミクスの観測を行い、発色団であるイソアロキサジンの励起状態から周囲のアミノ酸(チロシントリプトファン)間で寿命200fs以下の超高速電子移動反応が起こることを新たに見出したが、ポンプ-プローブ計測については蛋白質試料の濃度、高強度レーザーパルス照射による劣化の問題により定量的な結果を得ることができなかった。
スラブ・ユーラシアの変動-自存と共存の条件-

ここでスラブ・ユーラシア地域と呼ぶのは旧ソ連・東欧地域であるが、この地域では古代以来、民族の移動や多民族帝国の形成により複雑な社会・民族構成ができあがり、政治・経済・文化の、あらゆる面にわたって複合的な状況が生まれてきた経緯がある。今世紀には、スラブ・ユーラシアは社会主義体制という共通項を持つようになったが、近年この社会主義体制が崩壊し、この地域では多くの変革が試みられている。スラブ・ユーラシアという地域空間は文明交流圏であり、西欧諸国の近代化をもとに構築された近代化論の価値基準や尺度のみでこの地域空間の変動を分析できない。この研究ではスラブ・ユーラシア地域に起こった『変動』の意味を分析するために、自存と共存という概念を立て、3つの研究項目、つまり「政沿」(政治システムの変草と地域間関係)、「経済」(経済システムの転換と新経済圏の形成)、「文化・民族」(社会変動と自己認識)にそれぞれ3つの計画研究を配置した。現在進行しつつある変動(mutation,change,and alteration)の研究をした結果、この地域における諸価値体系の断続性連続性及び非連続性、あるいは既存の諸価値体系の分解や再構築、または新たな価値体系の導入などのプロセスが理解出来たと同時に、スラブ・ユーラシア地域全体の意味空間の変動の歴史認識を確認することができた。領域研究の初年度でもあり、研究活動の多くの時間がまず研究体制の整備、そして資料の収集に当てられた。収集した資料の予備分析も文献資料をもとに行われたものが多かった。しかし、収集した資料のなかには数値資料も含まれている。しかも、これら数値資料および文献資料の多くが現地調査の結果得られたものである。当初スラブ地域の変動は研究環境の変化をも意味しているのではないかと予測していたが、予測したとおり実証的な研究を現地で行うことが出来ることをこれら資料は物語ってる。今まで、この地での現地調査体験がごく少なかっただけに、その方法論に問題がなかったわけでなく、この段階では、人的および財政的資源の有効利用の点で問われるかもしれない。しかし、多少の非合理的な方法も当初はやむを得ないのではないかと思っている。現地調査に入り込めば入り込むほど資料の山に埋もれ、この地域全体の意味空間の変化を見極めにくくなる様相を呈する。これは変動の最中にいるこの地域を研究する研究者にとって避けがたいプロセスであり、課題でもある。各研究班が入手した資料は各班長が進んで出来る限り迅速に資料一覧表または報告輯(資料編)として公表し、当該重点領域関係者に広く利用されるのが望ましく、現在ではその方向に進んでいると思われる。今年度開催した重点領域関連会議の種類:重点領域研究準備全体会議、計画研究代表者会議、計画研究班会議、国際シンポジウム、市民交流シンポジウム、全体研究報告会、合同会議、全体会議今年度の重点領域関連の出版物:重点領域研究増刊準備号【スラブ-ユーラシアの変動】;ニューズレター【スラブ領域研究回報】、1-6号;【領域研究報告輯】、1-8号;領域研究国際シンポジウム(平成7年7月13/14日開催済)と全体研究報告会(平成8年1月25/26日)の報告集。スラブ・ユーラシア地域に起こった『変動』の意味を分析するために、自在と共存という概念を立て、3つの研究項目、つまり「政治」(政治システムの変革と地域間関係)、「経済」(経済システムの転換と新経済圏の形成)、「文化・民族」(社会変動と自己認識)にそれぞれ3つの計画研究が配置され平成7年度にスタートした。平成8年度は、総括班、計画研究班9、公募研究班13の計23班、参加研究社総数108名(研究協力者も含む、昨年度より33名ほど総数が増加)が研究活動に参加した。平成7年4月から現時点までに25の報告輯と3つの全体研究集会報告集を刊行できた事実は、スラブ・ユーラシア地域での多面的な変動研究が着実に進行していることを物語っている。確かに、25の報告輯のうち7つは資料集に等しく、その他も中間研究報告輯の色彩が強く、しかも全体としてのまとまりが一見弱いようにも見える。しかし、これらの出版物を出してこそ研究成果の見通しをたてることができるだけでなく、このプロセスなしには研究活動の自己革新は期待できないであろう。しかも、出版物の半分近くを欧文で出版した例は他の社会科学系の重点領域研究のなかでも数少なく、とくに研究用に再編された源資料を出版したことは資料の集積地および発信地として、海外の研究機関からも注目され始めている。

現在進行しつつある変動(mutation,change,and alteration)の研究をした結果、この地域における諸価値体系の断続性連続性及び非連続性、あるいは既存の諸価値体系の分解や再構築、または新たな価値体系の導入などのプロセスが理解出来たと同時に、スラブ・ユーラシア地域全体の意味空間の変動の歴史認識を確認することができた。
長い共役三重結合をもったポリマー(カルビン)の合成と物性

SP炭素だけで構成された一次元の共役三重結合から成るポリマー(カルビン)を、1.ポリ塩化ビニリデンの脱塩化水素による方法と、2.ドープしたポリアセチレンの塩素化により得られる立体規則性の塩素化ポリアセチレンを脱塩化水素する方法で合成した。このようにして合成したカルビンの共役三重結合鎖長を、赤外吸収スペクトル、ラマン散乱スペクトル、紫外・可視吸収スペクトルなどで検討した結果、最長の共役三重結合鎖長を生成した反応系は、PVDCまたは塩素化ポリアセチレンをDBUーDMSO系で脱塩化水素したものであった。その長さ(N_<c〓c>)は約1040と推定された。このように長い共役三重結合鎖を有するカルビンは熱や空気に対して極めて不安定であり、容易に三重結合の開裂や架橋反応を起こしたり、数分のうちに酸化されてしまうことがわかった。ポリ塩化ビニリデンおよび塩素化ポリアセチレンを脱塩化水素することによって,カルビンを合成した.また,合成したカルビンの共役三重結合鎖長を推定するため,末端基としてフェニル基,tーブチル基,イソプロパノール基をもつモデル共役三重結合化合物を合成し,紫外,可視吸収スペクトル,赤外吸収スペクトル,ラマン散乱スペクトル,NMRスペクトルなどの測定を行った.最良の脱塩化水素反応は,ポリ塩化ビニリデンまたは塩素化ポリアセチレンをジアザビシクロウンデセン(DBV)を脱塩化水素剤として,ジメチルスルホキサイド(DMSO)を溶媒とする場合であった.この方法により合成したカルビン中の共役三重結合鎖長(Nc一方,この方法で合成されたカルビンの電気伝導度は約10^<-9>S・cm^<-1>であるが,ヨウ素ドーピングにより10^<-3>10^<-1>S・cm^<-1>まで上昇した.SP混成軌道をもつ炭素だけからなる一次元の共役三重結合をもったポリマー(カルビン)-(C〓)x-を次に述べる二つの方法で合成した。すなわち、1.ポリ塩化ビニリデンの脱塩化水素による方法、と2.ポリアセチンレンに三塩化鉄を過剰ドーピングすることによる立体規則的塩素化ポリアセチレンの脱塩化水素による方法、である。脱塩化水素反応は有機強塩基であるDBU(1.8-diazabicyclo〔5,4,0〕undec-7-ene)を用いた。溶媒としてDMFやDMSOなどの極性溶媒を用いると脱塩化水素の反応率が高く、ほぼ100%の脱塩化水素反応を起こすことがわかった。また最適反応温度は室温付近であった。得られたカルビン中の共役鎖長などを決定するために、モデル化合物として種々の末端基を有するR-(C〓C)x-Rを合成し、その吸収スペクトルを対比することで共役鎖長を推定した。これらのモデル化合物の吸収スペクトルは末端基が飽和している場合と不飽和の場合で、かなり異なる挙動を見せた。不飽和結合を含む末端基の場合は、末端基と共役三重結合が互いに共鳴するための吸収極大はエネルギーの低い方向にかなり移動することを見い出した。得られたカルビンの共役三重結合鎖長を赤外吸収スペクトル、ラマン散乱スペクトル、紫外可視吸収スペクトルで検討した結果、最長のポリイン共役鎖長が得られた反応系は、PVDCまたは塩素ポリアセチレンをDBU-DMSOで脱水素したもので、その長さ(Nc〓c)は1040と推定された。このように長い共役三重結合鎖を有するカルビンは熱や空気に対して不安定であり、容易に三重結合の開裂や架僑反応が起きたり、数分のうちに酸化されてしまうことがわかった。
ATP合成酵素によるプロトン駆動力制御

本研究計画班では、1プロトン駆動力形成の理解に基づく機能強化、2プロトン駆動力消費過程の理解に基づくATP合成能力の向上、3還元力の再分配を主眼として、プロトン駆動力制御による光合成の再最適化を最終目標として研究を行っている。本年度は、これについて、下記の通り、研究を進めた。1サイクリック経路を構成するPGR5タンパク質とNDH複合体のそれぞれの発現抑制株を用いて、遠赤色光下におけるCO2固定速度、気孔開度、光化学系Iや光化学系IIの電子伝達速度を解析した。また、シロイヌナズナを用いた変動光環境下における変異体スクリーニングによって複数の候補株を単離し、それらの原因遺伝子の同定を行った。2シアノバクテリアを形質転換し、制御装置に異常をもったATP合成酵素のATP合成活性をリポソーム再構成法によって評価した。また、光合成生物のATP合成酵素特有の制御機構を理解するため、γサブユニットとεサブユニット部分複合体の結晶構造解析を行い、この構造に基づく生化学的解析を行って、論文発表した。得られた結晶構造に基づいて種々の変異タンパク質複合体を作成し、制御サブユニットの構造と機能の関係を生化学および1分子回転観察法により調べた(論文投稿中)。さらに、緑藻を用いたATP合成酵素解析の実験系を確立した。3光合成の機能制御に重要な還元力の伝達経路の機能を解析することを目的として、チオレドキシン還元酵素からチオレドキシンを解した還元力フローの速度論的解析を進めた。また、電子伝達による制御の実体を解明するため、酸化側経路の全体像を明らかにして論文発表した。シアノバクテリアの酸化還元調節を受けている酵素の制御の分子機構を解明し、論文発表した。さらに、細胞内酸化還元状態のリアルタイム測定を可能にする蛍光センサーの構造と機能を明らかにして論文発表した。下記の三項目に関する本年度の進捗状況は下記の通りである。1遠赤色光下における光合成の変動光応答では、遠赤色光の効果は特に弱光時に顕著であることを示した。そして、イネとシロイヌナズナを用いた研究によって、遠赤色光存在下では、NDH複合体が変動光環境におけるプロトン駆動力形成に重要であることを明らかにした。また、変動光環境下における変異体スクリーニングによって、原因遺伝子を複数同定することに成功した。2シアノバクテリアATP合成酵素複合体の結晶構造が明らかになったことで、この構造をもとにして、予想される立体構造変化に制限を加える、構造を削除するなどの変異タンパク質複合体を作成し、その機能を生化学、1分子生化学の両面から検証することが出来たことで、先進的な成果を上げた。3還元力の再分配を理解するため、酸化還元制御の鍵タンパク質であるチオレドキシンに注目し、チオレドキシンへの還元力供給経路、チオレドキシンからの還元力供給経路、および、標的酵素の酸化に必須の因子の解析を進めた。その結果、葉緑体内で働く酸化に重要な新たなタンパク質、および、その酸化経路を発見し、当該分野で先導的な成果を上げた。また、シアノバクテリアの酸化還元調節機構を研究し、新たな酸化還元調節を分子レベルで解明した。1変異体スクリーニングによって原因遺伝子を同定した複数の候補株において、光合成の変動光応答メカニズムを精査する。機能解析センターによるメタボローム解析を含むオミクス解析をさらに進め、変動光環境下において電子伝達系と炭素代謝活性の関係を調べ、光合成再最適化の技術基盤の確立を目指す。2シアノバクテリアから得たATP合成酵素複合体をリポソームに再構成する方法については、結晶構造をベースとして様々な変異タンパク質複合体を作成してこれらの機能評価を行う。また、本年度に確立した緑藻クラミドモナスのATP合成酵素複合体簡易精製法を利用して、光合成機能とリンクした制御機構に変異を持つATP合成酵素の制御と活性の関係を明らかにする。栗栖班と協力してプロトン輸送経路の重要残基を予測し、プロトン輸送の変異株を作成して、その生化学的解析を行う。3新規に発見した酸化因子について、これが葉緑体内でどのように働くのか、その普遍性はあるのか、など生理生化学実験を推進する。シアノバクテリアでは、環境条件の変動に対して酸化還元制御系がどのように応答し、細胞内の恒常性および機能維持に重要な役割を果たしているのかを明らかにする。1プロトン駆動力形成機構を解明するために、リニア経路の律速要因であるシトクロムb6f複合体とATP合成酵素、また、サイクリック経路を構成するPGR5タンパク質とNDH複合体の過剰発現株、発現抑制株、変異株の選抜を行った。また、変動光に対する光合成応答機構を包括的に解明するために、変異体のスクリーニング方法を構築した。2ATP合成酵素によるプロトン駆動力の消費を研究する足がかりとするため、シアノバクテリアを材料として簡便に複合体を調製する準備を進めた。βサブユニットのN末端側にHisタグを導入することで、チラコイド膜を界面活性剤で可溶化後に、ワンステップで高純度の複合体標品を得る手法を確立した。また、光合成生物のATP合成酵素特有の制御機構を理解するため、γサブユニットとεサブユニットについて、それぞれ生化学・構造生物学的な研究を進めた。