hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複合ニアドライ加工システム構築のトライボロジー的アプローチ

なお、本研究の一部成果により、研究補助者の修士2年生(氏名:山田圭祐)が、「ニアドライ方式を用いたチタン合金の旋削加工」のテーマで、平成27年度の日本化学会中国四国支部長賞を受賞した(受賞日:平成28年3月9日)。アルミニウム合金に最適な複合ニアドライ加工システムとして、ポリオールエステルにアルコールを併用した油剤による加湿式MQL加工を提示した。一方、チタン合金に関しては、オイルミストのみを供給するMQL加工、水溶性切削油剤のミストのみを供給するクーラントミスト(CM)加工、MQLとCMを組み合わせた複合ミスト(HM)加工、油剤を大量に使用する湿式(WET)加工の4種類について実用切削性能を評価した結果、とくにCM加工においてWET加工より工具寿命がかなり延長することを究明し、代表的難削材のチタン合金に最適な複合ニアドライ加工システムとしてCM加工を提示した。昨年度、アルミニウム合金のMQL加工に対して最適な複合ニアドライ加工システムとして、ポリオールエステルにアルコールを併用した油剤による加湿式MQL加工を提示し、当初計画より早く本課題の技術開発を達成した。一方、本年度は難削材としてチタン合金を取り上げ、この合金に適する複合ニアドライ加工システムの構築に向けた検討に傾注し、複合ミスト方式の加工液供給装置改良によって、次年度に向け、複合ミスト方式による評価が可能となる態勢を整えるなど、ほぼ予定どおりの進捗で研究を遂行することができた。トライボロジー平成26年度の検討結果を参考に、平成27年度は、改良した複合ミスト方式の加工液供給装置を用いて、引き続き含酸素化合物の実用切削性能を評価し、それらの化学構造と関連づけて検討する。また、切削性能に対する影響因子の絞り込みを行うとともに、ニアドライ加工試験結果から潤滑剤の作用メカニズムを究明する。さらに、以上の成果にもとづいて、難削材のニアドライ加工に優れる油剤とその処理方法を確定し、この加工に最適な複合ニアドライ加工システムを提示する。アルミニウム合金のMQL加工に対しては、最適な複合ニアドライシステムとして、ポリオールエステルにアルコールを併用した油剤による加湿式MQL加工が提示でき、当初計画より早く本課題の技術開発を達成した。このため、次年度以降に関しては、難削材の複合ニアドライ加工システム構築に向けた検討に傾注することが可能となった。予算計画にしたがって適切な使用をした結果として生じた752円の残額について、当該年度内で無理に使い切ることはせず、会計上可能な繰越処理とする選択をしたため。平成25年度の検討結果を参考に、平成26年度は、代表的難削材であるチタン合金用MQL加工油剤の候補となる含酸素化合物の実用切削性能を評価し、それらの化学構造と関連づけて検討する。また、含酸素化合物以外の極性物質の評価も適宜実施する。さらに、複合ミスト方式の適用を種類の異なるチタン合金や他の難削材にも広げることを試み、油剤ミストと水溶液ミストの最適な組み合わせ条件や適切な供給法を検証する。一方、平成27年度は、平成26年度の結果をふまえ、切削性能に対する影響因子の絞り込みを行い、難削材のニアドライ加工試験を実施して、これらのニアドライ加工に適合する潤滑剤の作用メカニズムを究明する。また、以上の成果にもとづいて、難削材のニアドライ加工に優れる油剤とその処理方法を確定するとともに、この加工に最適な複合ニアドライシステムを提示する。
星間乱流の起源の観測的研究

分子雲境界部の12CO高分解能観測から、サイズ数千AUの分子雲微細構造を検出した。微細構造のスペイクトル線幅は典型的に分子雲中で得られるものの半分以下であり、分子雲は均一なガスからなるのではなく、高温低密度に広がった媒質の中にある、低温高密度で熱平衡状態にある微細構造の集合体として存在することを示した。これは理論的二相媒質モデルでよく説明され、その成因として暖かい原子ガスの熱的不安定性が示唆された。これは原子ガスからの分子雲形成という、星間物理学の大きな問題の解決への糸口を示した物で、より高分解能観測の分子および原子ガスの観測的研究へと繋がり、今後のALMAなどでの観測が予定されている。昨年投稿した論文は、24年度末に取り足したデータを加えてリバイズし、ApJ誌に掲載された。一方より高分解能なデータの取得を目指し、ALMAでの観測を提案したが、残念ながら受理されなかった。しかし科学的な評価は十分高く、観測の技術的な問題に対する記述が不十分であったためと考えられる。特に微細な構造からの微弱な信号を、大きな構造からの強い信号と分離し、干渉計で精度よく観測するための説得力のある記述が不十分であった。このようなことを考慮に入れ、特に事前に観測をシミュレーションするなどして改訂し、再度プロポーザルを提出する予定である。また、乱流と共に分子雲の構造形成に大きく影響すると考えられている磁場の観測をするため、南アフリカのIRSF望遠鏡を用い、へびつかい座のフィラメント状分子雲方向にある背景星の近赤外線偏光観測を行った。観測は天候も比較的良好で、フィラメントの広い範囲を観測することができた。これらと電波の観測を組み合わせることで、磁場が星間乱流に対してどの程度卓越し、フィラメント状構造の形成にどのように影響したか調べることを目的としている。近赤外線データは現在解析中で、結果は電波観測で得られるガスの運動と比較し、乱流の量、分子雲の形状、そして磁場の向きが、相互にどう関連するのかを調べる予定である。このフィラメント状分子雲の分子ガスのデータは、25年度中にMOPRA望遠鏡を用いた電波観測を行い取得する予定である。近年の理論モデルから、暖かい中性原子(HI)ガスが圧縮され、熱的不安定性を経験することが、分子ガスの乱流の起源になると示唆されている。これまでのHIガスの観測は空間分解能が低いもののみであったが、黄道面付近の領域でアレシボ300m望遠鏡のアーカイブデータが公開された。そこでこれまで「なんてん」望遠鏡でCOの観測が行われている高銀緯分子雲に対し、HIガスの空間・速度構造を解析した。HI雲は熱的不安定性を経験したと考えられ、複雑な複数の成分に分解されることがわかった。COが検出される成分はそれらの一部のみで、熱的不安定性の結果、高密度な乱流的クランクが形成され、その中で分子ガス形成が進んでいる可能性が高いと考えられる。これらのクランプの速度分散や密度は、星間物理学の大きな問題である星間分子形成のモデルに重要な制限を与えることから、新たな研究に発展する可能性が示された。理論研究者、実験の専門家、多波長の観測的研究者を交えた研究会を主催し、今後の研究を議論した。またMopra望遠鏡に提出した観測提案が受理され、紫外線の影響の少ない高銀緯領域でのCOの高分解能観測行った。さらにこれまで45m望遠鏡で観測した領域において、さらに高分解能のデータを取得する観測提案が、ALMA cycle 2に受理された。本研究を始める基礎となった、単一鏡による分子雲微細構造の検出結果は、今年度論文にまとめられ、ApJ誌に投稿された。レフェリーコメントは好意的な物であったが、データの信頼性に関して疑問が示された。そのため検出スペクトルのS/N比、および速度分解能をあげるため、45m鏡での追観測を行い、その結果をもとに論文を改訂、再投稿した結果、年度をまたいで受理された。この結果はさらに、アメリカ天文学会(AAS meeting)やチリ・サンチャゴでのmini workshopで発表され、他波長の観測的天文学者を含む、海外の研究者からの興味を引くことができた。より高空間分解能のデータを得るため、ALMAに提案した観測は残念ながら受理されなかった。レフェリーからは、理論モデルとのより詳細かつ直接的な比較が求められる、とのコメントが得られた。そのため共同研究者である理論天文学者を訪問し、議論を持った。数値シミュレーションの結果からALMAで得られる結果を予想し、次年度のプロポーザルに反映させる予定である。

また、ASTE望遠鏡を用い、若い原始星からのCI輝線及びCS J=7-6の観測をおこない、原始星からの力学的・化学的フィードバックの効果を調べるデータを得た。いくつかの天体からは、フィードバック効果を示唆する非常に興味深い結果が得られたが、これらが普遍的なものであるのか、天体の年齢に依存するのかなどを調べるため、平成24年度の追観測を申請し、受理された。今年度は、近赤外線の偏光という新しい観測を行い、磁場との比較に必要な基礎データの取得ができた。一方でALMAの観測プロポーザルは残念ながら採択されなかったが、レフェリーからのコメントは決して否定的ではなかったので、技術的側面の再検討を進めている。MOPRA望遠鏡への観測提案は準備中であるが、オーストラリアの天文台でおきた山火事の影響で、前期の観測の実施と後期の観測募集が遅れているという連絡があった。望遠鏡自体には大きなダメージは無く、復旧のめどは立っているとのことであるが、募集はまだアナウンスされていない。24年度中に発表した国際会議では、国内外の研究者の興味を引くことができ、理論研究者との議論がすすんだ。否定的な意見を持つ研究者もいるようであったが、さらに観測データを示すことでより説得力が増し、合意を得られると自信を深めた。単一鏡による低温度分子ガスの観測は、結果をまとめ論文を投稿することもできた。またこの結果をもとに、他波長の研究者との共同研究など、今後の発展も期待され、満足の行く物であった。一方でALMAでの観測提案は受け入れられず、H24年度での再度の提案に向け、準備を始めている。競争倍率は非常に高いため、十分な準備が求められる。一方高温度ガス成分に関しては、まだ基礎データも取得されていないが、今年度ASTE望遠鏡に500 GHzのサブミリ波受信器が搭載されることに合わせ、観測を準備している。光赤外の研究者との共同研究も議論が進んでおり、偏光観測によって、乱流が磁場構造に与える影響や、Hα輝線観測によって電離波面の詳細構造を調査することなどを検討している。今年度はまず、近赤外線のデータ解析を終了させ、分子雲内の磁場構造と、乱流量の比較を行う。特に近赤外線は分子密度が濃い部分を見通すことができ、高密度領域での磁場と乱流が分子雲の構造形成に、どのような影響を与えているのかを調べる。研究代表者は近赤外線の観測は専門ではないが、この分野で経験の豊富な研究者と一緒に観測を行い、さらに解析も協力して進めている。ここで得られた結果を、今年度のALMAのプロポーザルに反映させ、さらに理論モデルとの比較にも取り入れる。数値シミュレーションの専門家である共同研究者との議論をさらに深め、観測データと磁場の効果も取り入れたモデルとの直接的な比較を進める。次年度は研究に理論モデルをより多く取り入れ、より良い観測提案をALMAに提出したい。そのため、理論モデルと観測結果の詳細な比較を行う。さらにASTE望遠鏡によるサブミリ波観測で、高温度ガスの構造の調査を予定している。光赤外の観測に関しては、小型望遠鏡でのHα輝線、OIII輝線のデータがすでに取得されたが、より大型望遠鏡に提案することを検討したい。また偏光観測に関しては、現在国立天文台の研究者と議論を進めており、可能ならば南アの光赤外望遠鏡で観測を実行したい。23年度に購入したPCを、24年度に取得した近赤外線のデータ解析に用いて、基礎的な解析はほぼ終えている。
活性炭との組合せによる嫌気性処理・脱窒処理の新展開に関する研究

活性炭を嫌気性処理及び脱窒処理と組み合わせた場合、新たな方式のプロセスの運転が可能になり、プロセスの安定性が向上することが期待される。それを実験的に検討した結果、以下のような結果が得られた。(1)嫌気性処理:フェノールを含む排水を活性炭を担体として用いた嫌気性流動床プロセスにより処理したところ、流入水の濃度変動を与えても処理水質が悪化することなく良好なメタンへの分解が起きた。これに対して吸着能力のないアンスラサイトを担体にした場合は流出水質が悪化した。このことから活性炭の吸着と脱離がプロセスの安定性向上に大きく寄与していることがわかった。次に、意図的に流入基質の濃度を変動させることによる嫌気性処理の反応効率の向上の可能性が示唆された。更に、炭素の安定同位体C13を用いた実験を行った結果、吸着されていいるフェノールが分解される際には、それが一旦バルク水に脱離した後メタンに転換するのではなく、かなりの部分は活性炭から直接生物膜に供給されていることが示された。すなわち、活性炭表面に付着した生物膜はバルク水側と活性炭側という膜の両側から基質供給を受けることが可能であることがわかった。(2)脱窒処理:有機物源を添加する必要のある脱窒を想定して、連続的に有機物を与えず、間欠的に与える方法で活性炭カラムタイプノ脱窒プロセスを運転した。その結果、活性炭は有機物を一時的に保持でき、有機物が外部から与えられない期間にも活発な脱窒が可能になることがわかった。具体的には。硝酸態窒素を含む水が連続的に流入しているのに対し、一日に一度だけ有機物を添加し、残りの時間は添加しない方式で高い脱窒率を達成できた。また、流入する硝酸態窒素が変動しても活性炭が有機物を保持しているため脱窒への悪影響を避けることができた。活性炭を用いることによって、維持管理の容易な脱窒が実現できると期待される。具体的には。初年度である平成5年度は、本研究の中心が生物実験であるため、実験のスタートアップ、予備実験が中心となり、いくつか興味深い実験結果が得られつつあるが、未だ十分な成果が得られていない。しかしながら、その経過をまとめると以下のようになる。〈嫌気性処理〉フェノールを用いて活性炭を担体とした流動床プロセスを運転した。同時にアンスラサイトを重点材にした流動床プロセスを運転しているが、活性炭をろ材にした場合にはフェノールの毒性が発現することなく分解が起きたのに対し、アンスラサイトではスタートアップに長期間を要し、なかなか負荷を上昇できないことがわかった。活性炭の場合、流入負荷を変動させた場合に活性炭の脱吸着反応によって安定した分解が起きた。作意的に流入する有機物の濃度を変化させる実験を行った結果、活性炭カラムの場合には流出するフェノールの濃度はさほど上昇しないが、アンスラサイトの場合には変動を与えた後直ちに流出濃度が増大した。〈脱窒処理〉連続的に有機物を与えず,間欠的に与える方式で活性炭カラムタイプの脱窒プロセスを運転した。具体的には、連続流で硝酸性窒素を含む水を流入させた場合、一日に一回だけ有機物を投与し残りの期間は有機物を与えないようなモードで運転しても、活性炭の吸着・脱着作用により十分に良好な脱窒の成績を得ることができた。

今年度は特に活性炭を担体として用いた嫌気性流動床プロセスによるフェノールの分解を中心に検討した。本プロセスにおいては流入水の濃度変動を与えても処理水質が悪化することなく良好なメタンへの分解が起きるが、その際の物質収支を活性体への吸着量をソックスレ-抽出で評価した。その結果、高濃度の基質が流入している時には急速にフェノールは活性炭に吸着され、その後の過程で8割程度が脱離してメタンに転換していることが証明できた。次に、意図的に流入基質の濃度を変動させることによる反応速度の向上の有無を調べるため、吸着が起きている際と脱離が起きている際のメタン生成速度をバルク水の基質濃度に対して解析した。その結果、さほど顕著ではないが、脱離期にはバルク中の濃度から予想されるよりは反応速度が大きくなっていることがわかり、意図的な運転によって嫌気性処理の反応効率を向上させることが可能であることが示唆された。更に、この反応速度の向上のメカニズムを明らかにするため、炭素の安定同位対C13を用いた実験を行った。フェノールを吸着させた生物活性炭を流動床から取り出し、バッチ実験を行った。その際、バルク水中のフェノールをC13でラベルしたフェノールに置換し、発生するメタン、残存するフェノール中のC13をGCMSで定量した。その結果、吸着されているフェノールが分解される際には、それが一旦バルク水に脱離した後メタンに転換するのではなく、かなりの部分は活性炭から直接生物膜に供給されていることが示された。すなわち、生物活性炭プロセスにおいて活性炭表面に付着した生物膜はバルク水側と活性炭側という膜の両側から基質供給を受けることが可能であることがわかった。この点は嫌気性生物活性炭の大きな特徴であり、今後この特徴を伸ばすような運転方法の開発が望まれる。
"最強"の電荷輸送性能を有する1・2次元共役分子骨格の探索

有機エレクトロニクス材料は、有機半導体・太陽電池・電界発光材料などのアウトプットを志向し、現在活発に研究が進められているが、どのような分子を設計し、どのように積み上げれば、最終的な素子特性の向上への最短距離となるのかについて、現時点で明確な指針が与えられているとは言い難い。本研究では、これらの材料開発において、最も重要な物性である「電荷輸送性能」に特化して、いま一度、分子積層構造、階層構造・超分子構造制御を行う前の分子そのものの特性を見直し、特に1・2次元共役骨格構造において、どのような構造が電荷輸送に最も適しているかを明らかとし、"最適"な素子構造のための"最強"の電荷輸送性分子骨格の提案をめざし、本年度、時間分解マイクロ波伝導度測定法を用いて、液晶性超分子材料・共役高分子材料の分子内における電荷輸送特性の評価を行った。特に、分子(アニオン)認識型液晶材料の多様な積層構造について、その積層軸ごとの電荷輸送性能を明らかにすることに成功し、コアとなる分子の電荷輸送に対し最適化された超分子集積構造の設計指針を与えると考えられる。一方で、完全被服が共役分子鎖の電荷輸送特性評価に関し、分子間相互作用を完全に抑制したうえでの単分子電荷輸送特性を求め、フェニレンエチニレン骨格および完全固定型チオフェン骨格の本質的分子内電荷移動度を報告した。
歌舞伎症候群解析から広げる全ゲノム対象エピジェネティック解析法の開発

歌舞伎症候群の病態解析・ヒストンメチル化のプロファイリング構築のために,KMT2DおよびKDM6A遺伝子のノックアウト培養細胞構築を図った。CRSPER/Cas9システムをゲノム編集技術として活用した。CRSPER/Cas9のベクターに薬剤耐性遺伝子を組み込み,薬剤スクリーニングを行った後に,ゲノム改変は可能であるが,まだ効率に問題があり,効率ベクターの変更,改変等を行っている。最終的な変異細胞株は取得出来ていない。歌舞伎症候群の新規原因探索を実施した。KMT2DおよびKDM6A遺伝子変異陰性例12名についてはexome解析にて原因変異は見つからなかった。歌舞伎症候群の病態解明のため,細胞内のゲノム全体を対象にしたヒストンのメチル化状態の把握をはかり,プロファイリングを明らかにしておく必要がある。歌舞伎症候群の原因遺伝子は判明したが,細胞機能のどこかの一点だけを修正すれば治療可能な疾患ではないことが解ってきたといってよい。治療への道筋を考えた場合に,どの症状が治療可能なのか・どういった治療薬が必要なのかを考慮する際に,ヒストンのメチル化・アセチル化プロファイリングが必須であると考え,それらを明らかにする事を目標とした。第一に,今後のエピジェネティックプロファイリング作成のために患者の生細胞が必要である。本年度,患者は,新規および既知の患者であるが,再同意取得とMLL2およびKDM6A遺伝子変異解析を行いながら,最も簡便な末梢血からの有核白血球の収集をはかった。末梢白血球10例分を収集し保存した。第二に,ゲノム編集を行い基準線維芽細胞から変異を有する細胞の構築を目指し,CRSPER/Cas9システム活用のための予備的実験を行った。受精卵にRNAを注入した場合には,非常に効率良くゲノム編集が可能であるが,通常の発現ベクターをつかってのトランスフェクッション実験では,ゲノム編集が出来ない。現在,エピジェネティック疾患関連遺伝子変異細胞ライブラリー構築のために,初代培養線維芽細胞においてゲノム編集が可能となるように,ベクターの変更,改変等を行っている。第三に,MLL2およびKDM6A遺伝子変異陰性例12名のexome解析を行った。しかし,患者に共通に認められる変異遺伝子は認められていない。今後,親子トリオにて新生突然変異探索を行っていく。歌舞伎症候群の病態解明のため,細胞内ゲノム全体を対照にしたヒストンのメチル化状態の把握をはかり,プロファイリングを明らかにしておく必要がある。歌舞伎症候群の2つの原因遺伝子は,KMT2DとKDM6Aと判明した。前者はヒストンH3-K9のトリメチル化酵素であり,後者はヒストンH3-K27の脱メチル化酵素であると考えられている。つまり,ヒストンのメチル化修飾異常が歌舞伎症候群の本体である。本研究では,KMT2DとKDM6Aの修飾ターゲットを探索するとともに,培養細胞での実験系構築を図る。本年度も昨年度に引き続き,歌舞伎症候群患者について,既試料の再同意取得と新規試料の末梢有核白血球を取得保存した。第二に,ゲノム編集を行い基準線維芽細胞から変異を有する細胞の構築を目指し,CRSPER/Cas9システム活用のための実験を行った。通常の発現ベクターをつかってのトランスフェクッション実験では,ゲノム編集が出来ない。CRSPER/Cas9のベクターに薬剤耐性遺伝子を組み込み,薬剤スクリーニングを行えば線維芽細胞をクローンとして取得出来る。つまり,ゲノム改変は可能であるが,まだ効率に問題があり,効率ベクターの変更,改変等を行っている。昨年度,KMT2DおよびKDM6A遺伝子変異陰性例12名についてはexome解析にても原因変異は見つからなかった。本年度は,KMT2D (MLL2)の変異解析はイントロンも含めて実施するためにキャプチャー濃縮とパーソナルタイプ次世代シーケンサーを使った解析を実施した。しかし,変異陰性例では,現在までの所イントロンにも変異は無い。歌舞伎症候群の本体は,ヒストンメチル化異常によって引き起こされる病態である可能性が高く,病態解明のため,ゲノム全体を対象にしたヒストンのメチル化状態のプロファイリングを明らかにしておく必要がある。ゲノム編集を行い基準線維芽細胞から変異を有する細胞の構築を目指した。CRSPER/Cas9システム活用し,薬剤耐性クローン選択を行い,ピックアップした時だけ目的部位の欠失したクローンが取得出来る。初期の報告のように薬剤選択しない場合,目的クローンは取得出来ないし,donor DNAを加えての点突然変異ゲノム編集は出来ない。KMT2DとKDM6A遺伝子以外のターゲットの場合にはヒト線維芽細胞でその遺伝子欠失クローンが得られたが,KMT2DとKDM6A遺伝子遺伝子に関して,線維芽細胞からの欠失クローンを得ることは出来なかった。ヒト標準線維芽細胞からモデル細胞をえることが難しいと判断し,モデルマウス個体の作成も本研究に取り入れた。キメラマウスが得られ,交配からES細胞由来のヘテロは得られるもののmutant alleleが伝達されたヘテロ接合マウスが得られず,体外受精でキメラマウスを2匹得ることが出来た。今後の解析に利用するためにコロニー増殖中である。KMT2DおよびKDM6A遺伝子変異陰性例(患者DNAのみ有する)についてはexome解析にても原因変異は見つからず,KMT2Dにはイントロンも含めて原因と思われる変異は同定できない。

全国的に歌舞伎症候群の遺伝子診断を提供しながら,歌舞伎症候群患者変異陰性例の全ゲノム解析に向けての同意取得と試料取得を図り,3例のトリオを入手した。歌舞伎症候群の病態解析・ヒストンメチル化のプロファイリング構築のために,KMT2DおよびKDM6A遺伝子のノックアウト培養細胞構築を図った。CRSPER/Cas9システムをゲノム編集技術として活用した。CRSPER/Cas9のベクターに薬剤耐性遺伝子を組み込み,薬剤スクリーニングを行った後に,ゲノム改変は可能であるが,まだ効率に問題があり,効率ベクターの変更,改変等を行っている。最終的な変異細胞株は取得出来ていない。歌舞伎症候群の新規原因探索を実施した。KMT2DおよびKDM6A遺伝子変異陰性例12名についてはexome解析にて原因変異は見つからなかった。CRISPR/Cas9系の実験で,正常線維芽細胞での編集効率が上がらないため,in vitro実験系の構築が進んでいない。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子遺伝学最終年度に向けて,本研究の柱となっている歌舞伎症候群原因新規遺伝子同定と患者末梢有核白血球を使って,ヒストンメチル化抗体による免疫沈降ー>塩基配列解析(ChIP-Seq解析)を重点的に進める。CRISPR/Cas9系の実験で,正常線維芽細胞での編集効率上昇を目指した基礎実験は引き続き実施するが,in vitro実験からのKMT2Dの制御ターゲット遺伝子の同定は,年度内には結果は得られない可能性がある。歌舞伎症候群患者細胞収集およびexome解析は,順調に進んでいる。一方,線維芽細胞でのゲノム編集に関して技術的に解決すべき問題が起こり多少遅れている。CRISPR/Cas9発現ベクターを導入しても,ゲノムDNA切断が起こっていないようで,発現ベクターのプロモーターを交換している。マウス受精卵では本システムは,働くことから十分に改良可能である。計画が送れているために,CRISPR/Cas9システム立ち上げと免疫沈降-塩基配列決定(ChIP-Seq)の実験が主であり,細胞培養,少量塩基配列決定に費用が充てられた。構成的な変異細胞群のライブラリー作成と次世代シーケンサーの本格的な稼働にまで至らずに,差額が生じている。歌舞伎症候群患者の生細胞(末梢血有核細胞)保存と既知遺伝子(MLL2遺伝子,KDM6A遺伝子)変異陰性例のexome解析は,順調に進めている。現在,CRSPER/Cas9によるゲノム編集を線維芽細胞で利用できるようにすることが,今後のエピジェネティック関連遺伝子病の解析に重要であるので,ベクターの改変等によって当初の目的である「システマティックなゲノム編集によるエピジェネティック関連遺伝子変異細胞株ライブラリーの構築」をはかる。遺伝子群のepigenetics制御に対する役割をin vitroで解析するために正常線維芽細胞に遺伝子変異を導入する。
松山・ブリュンヌ逆転時の連続地磁気三成分の復元

本研究では,隣接した複数のセクションにおけるDRM方位デ-タから,地磁気方位・相対強度を推定する新たな方法を用いて,房総半島における海成層(BMC,BMH,BMYセクション)に記録されたブリュンヌ・松山逆転を解析した.その結果と,これまでに得られている地磁気反転のデ-タとを比較した.さらに,地磁気永年変化との共通性を考察し,非双極子磁場の成因について物理的モデルの可能性を考察した.例えばBMC・BMY両セクションでは方位変化にパタ-ンの類似性はあるものの大きな時間のずれがある.BMCの方がBMYより伏角では約100年,偏角では約200年早く変化している.このようなずれは,両セクションの時間分解能の差異や堆積速度の見積り誤差などでは説明できない.しかし,堆積物の残留磁化はある時間幅の地磁気を重畳したものであるという見地から検討すると,もしBMCの方がより長い時間幅の応答関数をもっていれば,BMYよりも早い時期に磁化の変化が現われてくることになる.そこで,本研究代表者による新しい解析方法を,3つのセクション(BMC・BMH・BMY)に記録されたブリュンヌ・松山逆転時のDRM方位デ-タに適用した.結果的に収束解が存在し,房総地域のブリュンヌ・松山逆転時約900年間にわたる地磁気3成分変化が推定できた.この推定結果とブリュンヌ期地磁気永年変化とを比較してみると,双極子磁場g_1^0と2種類の非双極子磁場主役を占めていたことを示唆する.本研究では,隣接した複数のセクションにおけるDRM方位デ-タから,地磁気方位・相対強度を推定する新たな方法を用いて,房総半島における海成層(BMC,BMH,BMYセクション)に記録されたブリュンヌ・松山逆転を解析した.その結果と,これまでに得られている地磁気反転のデ-タとを比較した.さらに,地磁気永年変化との共通性を考察し,非双極子磁場の成因について物理的モデルの可能性を考察した.例えばBMC・BMY両セクションでは方位変化にパタ-ンの類似性はあるものの大きな時間のずれがある.BMCの方がBMYより伏角では約100年,偏角では約200年早く変化している.このようなずれは,両セクションの時間分解能の差異や堆積速度の見積り誤差などでは説明できない.しかし,堆積物の残留磁化はある時間幅の地磁気を重畳したものであるという見地から検討すると,もしBMCの方がより長い時間幅の応答関数をもっていれば,BMYよりも早い時期に磁化の変化が現われてくることになる.そこで,本研究代表者による新しい解析方法を,3つのセクション(BMC・BMH・BMY)に記録されたブリュンヌ・松山逆転時のDRM方位デ-タに適用した.結果的に収束解が存在し,房総地域のブリュンヌ・松山逆転時約900年間にわたる地磁気3成分変化が推定できた.この推定結果とブリュンヌ期地磁気永年変化とを比較してみると,双極子磁場g_1^0と2種類の非双極子磁場主役を占めていたことを示唆する.
乾燥からの回復過程における島嶼生態系移入樹種の水利用特性の解明

乾燥・降雨に対する小笠原移入樹種の水利用特性を木部構造や機能から明らかにするため、実験的および野外において、乾燥・潅水(降雨)に対する樹幹木部道管内の水分状態および樹幹流速の変化を調べた。また、木部構造と生態的地位との関連性を複数樹種で主成分分析により解析した。その結果、湿性地への移入種であるアカギは、突発的な降雨を利用できない一方、乾性地への移入種であるキバンジロウは、突発的な降雨を在来種に比べて有効に利用していることがあきらかになった。また、このような水利用特性の違いを決定するのは、木部組織のネットワーク構築が要因の一つである可能性が示された。本研究の目的である、島嶼生態系への移入樹種が乾燥および突発的な潅水に対してどのように水を利用しているかを評価するため、平成19年は以下の実験・解析を行った。1.野外における突発的な降雨に対する樹幹流速の変化小笠原の主要な在来種であるウラジロエノキ(先駆樹種)、ヒメツバキ(中間種)と、移入樹種であるアカギ(中間種)の、それぞれの成木における胸高部と先端部の樹幹流速を9月から12月まで測定した。同じ期間、土壌含水率と日射量を測定し、長期間の乾燥および突発的な潅水に対する樹幹流速の変化を調べた。突発的な降雨に対し、在来樹種のウラジロエノキとヒメツバキは先端部の流速が降雨と同時間に急激に増加した。一方、移入樹種のアカギは緩やかに増加した。この事から、在来樹種は降雨に対して感受性が高く、突発的な降雨を効率よく利用する一方、土壌が深いところに侵入するアカギは、降雨を効率よく利用できないことが示唆された。2.乾燥耐性に寄与する木部構造特性の解析小笠原で異なる水分条件に生育する樹種の成長錐サンプルより光学顕微鏡試料を作成し、木部構造(道管断面積など)特性を測定した。これと既存の生理特性(光合成速度など)データとで主成分分析を行った結果、第一主成分の正方向に容積密度が含まれ、負方向に道管平均断面積、光合成速度、葉の浸透ポテンシャルが含まれた。従って第一主成分は「木部の鉛直方向の通導性の指標」と解釈できた。一方、第二主成分の正方向に道管複合指数(=道管総数/道管群数)や放射組織面積率が含まれ、負方向に道管数が含まれた。従って第二主成分は「木部の水平方向のネットワーク構築の指標」と解釈できた。第二主成分までの累積寄与率は68.2%であり、この二成分で各機能タイプを分類することができた。本研究の目的は、乾燥性島嶼生態系への移入樹種が、突発的な降雨に対してどのように水を利用しているかを評価することにある。平成20年は主に以下の実験・解析を行った。(野外実験)小笠原の乾性低木林を構成する主要な在来種であるヒメツバキ、アカテツ、テリハハマボウと乾性低木林への移入樹種であるキバンジロウの、それぞれの灌木で、グラニエセンサーにより樹幹と樹幹流速の測定を開始した。同じ期間、土壌含水率と日射量を測定した。現在も調査を継続中であり、長期間の乾燥および突発的な潅水に対する樹幹流速の変化との関係を明らかにする予定である。(人為的な乾燥-潅水に対するアカギ苗木の水利用特性の解明)土壌の厚い土地へ進入するアカギの苗木に、人工的に乾燥-潅水処理を行い葉および樹幹の水分状態の変化を調べた。その結果、乾燥が進んでも葉の水ポテンシャルは低下せずに落葉した。地上部が枯死する固体もあった。樹幹木部の水分状態を低温走査型電子顕微鏡(cryo-SEM)を用いて観察したところ、乾燥によって道管に空隙が発生し、また潅水してもその空隙は残ったままであった。このことから、アカギは浸透調整能力が低く、また乾燥によるキャビテーションを解消できないことがわかった。従ってアカギは突発的な降雨による潅水を利用する事が出来ないと考えられ、アカギが小笠原の乾燥地に侵入できない原因の一つが示唆された。本研究の目的は、乾燥性の島嶼生態系への移入樹種が、突発的な降雨に対してどのように水を利用しているかを評価することにある。平成21年は主に以下の実験・解析を行った。小笠原の乾性低木林を構成する主要な在来種であるヒメツバキ、アカテツ、テリハハマボウと、乾性低木林への移入樹種であるキバンジロウの、それぞれの灌木で,グラニエセンサーにより樹幹の樹幹流速の測定を行った。

同じ期間、土壌含水率と日射量を測定した。得られたデータのうち,昨年度まで行った室内実験で設定した長期間(15日以上)の乾燥が起きた期間の樹幹流速を解析対象とした。その結果,乾燥時の平均樹幹流速はテリハハマボウ>ヒメツバキ>キバンジロウ>アカテツの順であり,在来種であるテリハハマボウで3.7x10^<-4>mm/hだったのに対し,移入種のキバンジロウは2.5x10^<-4>mm/hであった。一方,突発的な降雨後の平均樹幹流速はテリハハマボウ≒キバンジロウ≒ヒメツバキ>アカテツの順であり,テリハハマボウが3.5x10^<-4>mm/hだったのに対し,キバンジロウは3.2x10^<-4>mm/hであった。このことは,在来種の樹幹流速は水環境変動に対して恒常性を保つのに対し移入種のキバンジロウは,降雨によって樹幹流速を増加あるいは回復できることを示している。昨年までの結果において,キバンジロウは乾燥時に木部通水系のキャビテーションを起こしにくい一方,浸透調節能力が他樹種に比べて高いことがわかっている。これらの結果より,水が制限要因となる乾性低木林においては,キバンジロウは突発的な降雨への反応性を高めることで移入を可能にしていることが明らかになった。
血漿メタボローム解析による口腔がん術後再発・転移診断法の確立

口腔がん術後の再発・転移を示唆する腫瘍マーカーにはSCC抗原があるが、これは正常な扁平上皮にも存在し、がん以外の疾患でも陽性となるなど、その感度は極めて低い。そこで、本研究ではSCC抗原に代わる口腔がんの高感度かつ正確な再発・転移診断法を確立することを目的とする。近年、新たなバイオマーカー検索法として、生体試料に含まれる代謝物を網羅的に定量するメタボローム解析が発展してきた。申請者は、口腔がん患者と健常人の血清を比較し、口腔がんバイオマーカー候補となる代謝物を発見した。本研究では、口腔がん患者の術前術後2年までの経時的な血漿メタボローム解析を行い、再発・転移に関する代謝物を探索する。本研究の成果は、口腔がんの発症機構や治療効果の判定、再発・転移のモニタリング、予後評価につながることが期待される。今年度は、口腔がん患者の術前に加え、術後の血漿を経時的に収集し、非再発・非転移群と再発・転移群に分類し、GC/MSによる分析を行ってきた。また、そこで得られたデータを統計ソフトを用いて多変量解析し、それぞれの群を区別するのに寄与する代謝物の検索を開始している。非再発・非転移群と比較し、再発・転移群のサンプル数が少ないことや、経時的な変化を観察するには収集に時間がかかるなどの問題はあるが、比較的順調に収集できたと思われる。今後もさらに収集を進めることで、がん細胞において有意に変動する代謝物を検索していく予定である。再発・転移症例は、当初の予定より現時点での収集が少ないが、収集分で分析を開始しているため。術後の血漿採取の間隔は、術後1、3、6、9、12、15、18、24ヶ月とし、併せてSCC抗原の測定も行う。その中で、再発・転移症例の血漿メタボローム解析を行い、非再発・非転移群との比較を行う予定である。今年度は、口腔がん患者の術前と術後比較的早期の血漿サンプルを分析することで、血漿中に含まれる代謝物の全体像とその変動を明確にした。ただし、術後サンプル採取時には、全症例で再発・転移を認めていない。がん細胞の代謝は大幅に変動し、血液中からも盛んにグルコースや脂肪酸やグルタミンなどの栄養素を取り込み、脂質、核酸、タンパク合成を行い、様々な中間産物が血液中に排出される。あらかじめ口腔がん患者の術前血漿中に含まれる代謝物を明確にしておくことや、術後の比較的早期の変動を測定することは、次に計画する術後の経時的な分析の際に非常に重要な情報となった。口腔がん患者の術前術後の変動をみる第一段階が終わり、おおむね順調に進展している。その中で、再発・転移症例の血漿メタボローム解析を行い、非再発・転移群との比較を行う予定である。

術後の血漿採取の間隔は、術後1、3、6、9、12、15、18、24ヶ月とし、併せてSCC抗原の測定も行う。その中で、再発・転移症例の血漿メタボローム解析を行い、非再発・非転移群との比較を行う予定である。当初予定していた専用カラムなどの消耗品の購入金額が少なかったためだが、次年度以降に、購入予定である。当初予定していた消耗品の購入金額が少なかったために、次年度使用額が生じた。翌年度、引き続きカラム等の購入を進め、解析を行っていく予定である。
hDREFによる細胞周期調節機構の解明

本研究では、細胞増殖に必須な役割を果たす転写調節因子hDREFの細胞周期における作用点とその役割を明らかにすることを目的に、hDREFの標的遺伝子の同定とhDREFをノックダウンしたときに起こる細胞の表現型の詳細な観察を行い、以下のような成果を得た。(1)hDREF標的遺伝子の同定についてhDREFをノックダウンした細胞で発現に変化のある遺伝子をDNAアレイ解析によって検索し、約200個のhDREFの標的遺伝子候補を得た。これらの遺伝子の中でリボソームたんぱく質をコードする22個の遺伝子がhDREFの主たる標的遺伝子でありかつ、細胞周期を進行させるのに本質的に必要であるかどうかを検証することができた。このことは、hDREFはトータルな細胞内タンパク質合成量を決定する上で重要な役割を担っていることを意味している。今後は、他の候補遺伝子の中で直接hDREFによる発言調節を受ける遺伝子をChIP on chip法などで絞りこむ予定である。(2)hDREFの細胞周期進行における役割について初年度の研究により、hDREFをノックダウンするとG2-M期の細胞が蓄積することを明らかにした。これを受けて、G2-M期に起こる時系列的なイベントのうちどのステップがhDREFのノックダウンにより影響を受けるかをウエスタンブロッティングと細胞の免疫蛍光染色により調べた。その結果、hDREFの枯渇は、M期の極初期で染色体の凝縮が始まる以前に細胞周期の停止をもたらすことが判明した。さらに、核膜周辺と核小体周辺でヘテロクロマチン化が亢進されていることを見つけた。このことは、hDREFがクロマチンの高次な構造変換の制御に関与している可能性を示唆している。今後はその分子メカニズムとG2/M期との関係性を明らかにする必要がある本研究では、細胞増殖に必須な役割を果たす転写調節因子hDREFの細胞周期における作用点とその役割を明らかにすることを目的に、hDREFの標的遺伝子の同定とhDREFをノックダウンしたときに起こる細胞の表現型の詳細な観察を行い、以下のような成果を得た。今後はその分子メカニズムとG2/M期との関係性を明らかにする必要があるhDREFが細胞周期や増殖に与える影響についての解析を行うため、レンチウイルスを用いた効率のよいhDREFのノックダウン系を構築した。また、shRNAを発現するレンチウイルス感染により生じる表現型はhDREFの特異的ノックダウンの結果であることをレスキュー実験により証明した。hDREFをノックダウンした細胞の表現型を詳細に調べた結果、以下のことが判明した。(1)フローサイトメトリー解析により、hDREFの枯渇はS期の細胞集団を減少させ、G2/M期での細胞集団を増加させる。(2)このとき、ピストンH3のM期特異的リン酸化は起こらず、cyclinB1たんぱく質の細胞質での蓄積が起こる。(3)正常細胞で起こるcdc25C脱リン酸化酵素のG2-M期における発現量の上昇が起こらず、cdc25Cにより活性化されるcdc2キナーゼのG2-M特異的活性化も起こらなかった。(4)培地に添加したBrdUを取り込む細胞が消失する。これらのことから、hDREFは細胞周期の複数のステップで必要であることが推測された。特に、G2-M期の移行に関しては、G2-M期の制御因子の発現調節に関与している可能性が示唆された。G1-S期については、G1-S期の進行に必須な遺伝子(ピストンH1遺伝子やリボソームたんぱく質遺伝子)の発現制御において重要な役割を担っているのではないかと推測している。実際に、血清飢餓による同調培養細胞におけるhDREFの発現動態をRT-PCRおよびウエスタンブロット解析により調べると、血清飢餓状態ではhDREFの発現は消失し、血清添加約6時間後から発現が誘導され、S期の初期に最大の発現量を示した。G1-S期、G2-Mの課題である。hDREFの標的遺伝子を明らかにするために行う、チップオンチップ解析の準備を整えた。本研究では、細胞増殖に必須な役割を果たす転写調節因子

hDREFの細胞周期における作用点とその役割を明らかにすることを目的に,hDREFの標的遺伝子の同定とhDREFをノックダウンしたときに起こる細胞の表現型の詳細な観察を行い、以下のような成果を得た。(1)hDREF標的遺伝子の同定についてhDREFをノックダウンした細胞で発現に変化のある遺伝子をDNAアレイ解析によって検索し、約200個のhDREFの標的遺伝子候補を得た。これらの遺伝子の中でリボソームたんぱく質をコードする22個の遺伝子がhDREFの主たる標的遺伝子でありかつ、細胞周期を進行させるのに本質的に必要であるかどうかを検証することができた。このことは、hDREFはトータルな細胞内タンパク質合成量を決定する上で重要な役割を担っていることを意味している。今後は、他の候補遺伝子の中で直接hDREFによる発現調節を受ける遺伝子をChIP on chip法などで絞りこむ予定である。(2)hDREFの細胞周期進行における役割について初年度の研究により、hDREFをノックダウンするとG2-M期の細胞が蓄積することを明らかにした。これを受けて、G2-M期に起こる時系列的なイベントのうちどのステップがhDREFのノックダウンにより影響を受けるかをウエスタンブロッティングと細胞の免疫蛍光染色により調べた。その結果、hDREFの枯渇は、M期の極初期で染色体の凝縮が始まる以前に細胞周期の停止をもたらすことが判明した。さらに、核膜周辺と核小体周辺でヘテロクロマチン化が亢進されていることを見つけた。このことは、hDREFがクロマチンの高次な構造変換の制御に関与している可能性を示唆している。今後はその分子メカニズムとG2/M期との関係性を明らかにする必要がある。
抗炎症性サイトカインの遺伝子療法による関節リウマチの関節破壊抑制の試み

関節リウマチは関節を主座とする慢性炎症性疾患であるが、長年の経過により関節破壊が進行し、日常生活機能が傷害されることから、関節破壊の予防薬の開発が望まれている。この関節破壊には関節局所における破骨細胞が中心的な役割を担っており、破骨細胞の増殖、分化、活性化を抑制する薬剤が抗リウマチ薬としで有望である。本研究ではマウス骨髄細胞を用いてRANKLによる破骨細胞誘導における各種薬剤の作用について検討した。この結果、抗炎症性サイトカインであるIL-4,IL-10が破骨細胞の分化、誘導を抑制すること、またその機序として破骨細胞分化に必須の転写因子であるAP-1、特にc-Fosの発現抑制を介することを明らかにした。また、この結果からIL-4遺伝子療法の可能性をさぐるため、IL-4組み込みアデノ随伴ウイルネ(AAV-IL-4)を作成し破骨細胞に対する効果を検討し、AAV-IL-4はヒト単球の破骨細胞の誘導を強力に抑制することを明らかにし、関節局所におけるAAV-IL-4療法の可能性を示した。さらに最近、新規抗炎症薬として注目されているPPARγアゴニストがTNFαによるヒト単球からの破骨細胞誘導に対して抑制効果があること、その抑制効果には単球走化因子1(MCP-1)の発現抑制が関与していることが明らかにした。この成果は日本リウマチ学会総会、日本骨代謝学会総会にて発表し、英文誌Boneに論文として報告した。破骨細胞の分化を負に調節する薬剤は関節リウマチの骨吸収に対して有効性を発揮する可能性がある。AAV-IL-4およびPPARγアゴニストのリウマチ患者にとって新たな治療法となる可能性がある。(背景、目的)破骨細胞は骨を吸収する唯一の細胞であり、骨粗鬆症や関節リウマチの骨破壊に深く関与している。特に関節リウマチでは関節破壊により患者のQOLが大きく損なわれるため、その進展予防が急務の課題である。我々は今回の研究において、破骨細胞の分化誘導を強力に抑制しうるインターロイキン4(IL-4)に着目して、その遺伝子療法の基礎的研究を行った。まず、毒性が少なく、遺伝子の安定した発現を誘導できるアデノ随伴ウイルスベクター(AAV-helper-Free system, Stratagene)にヒトIL-4遺伝子を組み込み、ヒト末梢血単球に対する感染効率とIL-4の発現とその効果について検討した。(結果)まず、アデノ随伴ウイルス(AAV)の末梢血単核細胞に対する感染効率を検討すると、T、Bリンパ球などの浮遊細胞に対する感染率は低く、デッシュ付着単球、マクロファージに高率に感染を認めた。また、IL-4遺伝子を組み込んだAAV(IL-4-AAV)を単球に感染させるとIL-4の発現が誘導され、上清中に多量のIL-4を認めた。そこで、AAV-IL-4の感染により、単球から破骨細胞への分化を抑制しうるか否かについて検討した。破骨細胞誘導因子であるRANKLとM-CSF存在下でヒト末梢血単球を培養すると5-10日後に象牙切片を吸収しうる破骨細胞が誘導された。AAV-IL-4を感染させるとRANKL/M-CSFによる破骨細胞の誘導が強力に抑制された。次に炎症性骨破壊に重要であるTNFαによる破骨細胞誘導に対する効果を検討すると、同様にAAV-IL-4により強力に抑制された。(結語)この結果は、関節リウマチの関節破壊の治療法としてIL-4の遺伝子療法が有用であることを示している。(第50回日本リウマチ学会に発表予定)関節リウマチの薬物療法の最終的なゴールは関節破壊を予防することである.近年の抗腫瘍壊死因子(TNFα)抗体療法により、関節破壊にはTNFαが深く関与することが明らかになった.

そこで、TNFによる関節破壊(破骨細胞誘導)に対するIL-4遺伝子療法の有効性について基礎的検討を行った.毒性が少なく、遺伝子の安定した発現を誘導できるアデノ随伴ウイルスベクター(AAV-helper-Freesystem, Stratagene)にヒトIL-4遺伝子を組み込み、IL-4-AAVを作成した.IL-4-AAVはヒト末梢血単球に効率よく感染し、IL-4を約12日間発現した.末梢血単球にM-CSF存在下でTNFαを加えると、培養10日前後から破骨細胞が誘導された.この破骨細胞の誘導はRANKLのdecoy receptorであるosteoprotegerinでは抑制されず、RANK-RANKL系の関与は否定的であった.ヒト単球にIL-4-AAVを感染させると、TNFαによる破骨細胞の誘導は強く抑制された.また、TNFαによる破骨細胞誘導に対して抑制効果を有する低分子化合物をスクリーニングしたところ、peroxisome proliferators-activated receptorg(PPARγ)の活性化分子であるciglitazoneが強力に破骨細胞の分化を抑制した.以上より関節リウマチの関節破壊の新たな治療戦略としてIL-4による遺伝子療法とPPARγ活性化分子が有望であると考えられた.(この内容は第50回日本リウマチ学会、第24回日本骨代謝学会で発表した)
ヒト大動脈バリアント内皮細胞(動脈硬化や血管炎の発生進展に及ぼす影響

本来バリアント内皮細胞とは3核以上の大型細胞を言うが、実験的に変性LDLやインタ-ロイキン4、ラジカルを培養液中に添加することにより多核のバリアント内皮細胞を作成することが可能である。またガンマインタ-フェロンや腫瘍壊死因子は細胞骨格の訪構築を起こし、類円形の内皮細胞が紡垂形に変化する。この変化は可逆性であるが、バリアント内皮形成には影響を及ぼさない。この形態変換に際して内皮細胞の透過性を始めとする諸機能も変化する事が考えられるが、これについては今後の研究に待ちたい。若年者由来の大動脈内皮細胞は中年者、高年者の比べはるかにプロスタサイクリン産生量が多い。また免疫組織学的にプロスタサイクリンを染色して上記の結果を確認出来た。また内膜平滑筋細胞は微量のプロスタサイクリンを産生するが、中膜平滑筋細胞には産生能はない。家兎に高脂肪食を投与して作製した動脈硬化病変を覆う内皮細胞は、次第に大型化し、またこれらの動脈から内皮細胞を培養することにより、2核や3核以上の核を有する内皮細胞が動脈硬化の発生初期から存在することが分った。以上のことから、この研究の初期においてはバリアント内皮細胞に関与する因子として動脈硬化と加齢(老化)の両方が関与する事が考えられていたが、動物実験で極めて短期間に出現することから動脈硬化の役割が大きいことが明らかとなった。バリアント内皮細胞と炎症細胞の相互作用については現在研究の途中である。本テ-マとは直接関係ないが、酵素抗体による免疫組織染色法を使って、常通のホルマリン固定・パラフィン包理切片上でエンドセリンの局在を観察することが可能となった。今後エンドセリンが動脈病変に及ぼす作用についても研究を進めて行きたい。1.ヒト大動脈からの内皮細胞の分離と年代別の比較病理解剖時出来るかぎり新鮮な大動脈より内皮細胞培養を行い、出現するバリアント内皮細胞の程度と動脈硬化や加齢との関係を明かにした。バリアント内皮は動脈硬化との関係が深くかつ加齢の影響も受けていることが分かった。実験的に変性LDL、免疫複合体、リンホカイン、ラジカルなどを投与してバリアント内皮細胞を作製することが可能であるが、その数は極めて少数でかつ高濃度の因子が必要である。機序としては隣接細胞の癒合により出現するらしい事が分ってきた。しかし人体内ではこれらの因子は低濃度あることから、これら因子が長期間にわたりお互いに複雑に絡みあって作用して形成されると考えらる。2.プロスタサイクリン若年者、中年者、高年者の大動脈より内皮細胞を分離培養し、培養上清中に放出されるプロスタサイクリンをラジオイムノアッセイ法で測定して比較すると、若年者のプロスタサイクリン産生能は他のグル-プに比較して有意に高い。また免疫組織学的にプロスタサイクリンの定性と局在部位を同定する方法を開発した。この方法を用いて各年代の胸部大動脈の免疫染色程度をみると、10ー20代で最も強く染色され、加齢と共に免疫染色程度が減少した。また内皮細胞のみならず肥厚した内膜平滑筋細胞からも少量産生されていることが分った。しかし中膜平滑筋細胞は免疫染色されず殆ど産生能はないと考えた。以上の事から内皮細胞のプロスタサイクリン産生能は加齢と共に減少することが分った。また肥厚した内膜平滑筋細胞は、高齢者の低下した内皮細胞機能の一部をバックアップする役割を有していることが考えられた。1.バリアント内皮形成因子

本来バリアント内皮細胞とは3核以上の大型細胞を言うが、実験的に変性LDLやインタ-ロイキン4、ラジカルを培養液中に添加することにより多核のバリアント内皮細胞を作成することが可能である。またガンマインタ-フェロンや腫瘍壊死因子は細胞骨格の再構築を起こし、類円形の内皮細胞が紡垂形に変化する。この変化は可逆性であるがバリアント内皮形成には影響を及ぼさない。この形態変換に際して内皮細胞の透過性を始めとする諸機能も変化する事が考えられるが、これについては今後の研究に待ちたい。2.家兎における実験的動脈硬化発生時の内皮細胞の観察家兎に高脂肪食を投与して動脈硬化を発生させ、その病変を超微形態学的に観察すると、表面を覆う内皮細胞は次第に大型化してくることが明らかとなり、またこれらの動脈から内皮細胞を培養するとことにより、2核や3核以上の核を有する内皮細胞が動脈硬化の発生初期から多数存在することが分った。以上のことから、この研究の初期においてはバリアント内皮細胞形成に関与する因子として動脈硬化と加齢(老化)の両方が関与する事が考えられていたが、動物実験で極めて短期間に出現することから動脈硬化によって引き起こされる可能性が強くなった。3.エンドセリンの免疫組織染色法の確立酵素抗体による免疫組織染色法を使って、外科病理や病理解剖例の組織片切上でエンドセリンの局在を観察する事が出来る。通常のホルマリン固定やPLP固定・パラフィン包埋切片が最も結果が良く、アセトン固定を施すと完全に免疫反応が障害される。この方面の研究も今後進めて行きたい。
むだ時間系のQパラメータ・アプローチによるロバスト制御系設計理論の体系化

制御系の目標入力追従特性、外乱除去特性を良くするには感度関数を0に近づけることであり、モデル誤差に対してロバスト安定にするには、相補感度を0に近づけることである。同時に0にできないので低周波数で低感度に、高周波数で相補感度を低くする混合感度仕様を満たす設計が必要となる。むだ時間がない系では、H^∞制御で設計できるが、むだ時間系では実用的な制御器を得ることがむずかしい。本研究では、むだ時間系に対する混合感度問題の実用解を与える設計理論の体系化を行った。はじめに、むだ時間をもたない系に対する自由パラメータQをもつ一般化安定化器を用いた制御系の混合感度仕様を満たす設計理論を整備し、実験で有効性を検証した。つぎに、入力、出力にむだ時間をもつ系に対する、自由パラメータQと状態予測器をもつ一般化安定化器を用いた制御系の混合感度仕様を満たす設計理論を構築し、シミュレーションで有効性を検証した。さらに制御器の低次元化をはかりビジュアルサーボイングの実験装置をつくり、有効性を確認した。これらをまとめ、Qパラメータを用いたむだ時間系の設計理論として体系化した。制御系の設計で、目標入力追従特性、外乱除去特性を良くするには感度関数を0に近づけることであり、モデル誤差に対してロバスト安定にするには、相補感度を0に近づけることである。同時に0にできないので低周波数では低感度に、高周波数では相補感度を低くする混合感度仕様を満たす設計が必要となる。むだ時間がない系では、H^∞制御で解くことができるが、むだ時間系では実用的な解を得ることがむずかしい。本研究では、むだ時間系に対する混合感度問題の実用解を得るために、自由パレメータQと状態予測を含んだ一般化安定化器を用いた解法を検討した。始めに、入力にむだ時間を持つ系の入力側感度、相補感度仕様を満たす設計を提案した。状態予測でむだ時間を補償し、Qの一部分で感度仕様を満たすようにして、状態フィードバックとQの残りの部分による非干渉化とインナー変換で、感度、相補感度の周波数特性を調整し、仕様を満たすようにする方法である。つぎに、出力側混合感度問題の解法を提案した。基本的には入力側混合感度とほぼ同様であるが、感度仕様を満たすQの設計が異なる。制御対象が安定なとき、オブザーバのゲイン行列を0にすることで制御器が簡潔になることを示した。これは内部モデル制御の一般化に相当する。さらに、自由パラメータQを応用して、むだ時間系の制御の原点にあたるスミス法の外乱除去に改善する方法を提案した。つぎに、入力、出力にむだ時間をもつ系に対する、自由パラメータQと状態予測器をもつ一般化安定器を用いた制御系の混合感度仕様を満たす設計理論を構築し、シミュレーションで有効性を検証した。