hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キメラ抗原受容体遺伝子改変iPS細胞由来T細胞の樹立と新規膠芽腫治療法の開発

本研究ではiPS細胞にレンチウイルスベクターを用いてがん変異抗原EGFRvIII特異的CAR遺伝子(EvCAR)を導入し、T細胞へ分化誘導することでiPS細胞由来CAR-T細胞の作製を目指した。樹立したiPS細胞にEvCAR遺伝子を導入することでCAR-iPS細胞を樹立した。CAR-iPS細胞より造血幹細胞を各種サイトカインの存在下およびフィーダーレス条件下で誘導した。OP9⊿1細胞と各種サイトカインの存在下でCD3陽性、CAR陽性細胞を誘導した。本細胞を用いて抗膠芽腫効果を評価でき、その効果が強力であれば、予後不良の膠芽腫に対する新たな治療法となりうる可能性がある。これまでにinduced pluripotent stem(iPS)細胞の培養系の確立とchimeric antigen receptor (CAR)搭載レンチウイルスの作製を行った。iPS細胞はiPS細胞研究所より譲渡を受け、支持細胞(フィーダー細胞)を用いた培養系を確立した後に、人工細胞外マトリックスを用いたフィーダー細胞を用いない培養系を確立した。iPS細胞のT細胞への分化誘導実験はフィーダー細胞、薬品等の整備を行った。iPS細胞の培養系の確立、iPS細胞からのT細胞の分化誘導実験の準備ならびにCAR搭載レンチウイルスの作製は実施したが、iPS細胞への遺伝子導入実験については施設内DNA組換え実験安全委員会への書類提出が遅れたため実施できなかった。iPS細胞(iPSC)にレンチウイルスベクターを用いてがん変異抗原EGFRvIII特異的CAR(EvCAR)遺伝子を導入し、T細胞へ分化誘導することでiPSC由来CAR-T細胞を作製し、その特性解析を行う。EvCAR-iPSCからEvCAR-T細胞が誘導でき、その抗がん効果が強力であれば、予後不良の膠芽腫に対する新たな治療法となりうる可能性がある。また、あらかじめEvCAR-T細胞を大量に準備できれば、臨床応用に向けて大きな利点となる。これまでに、EvCAR搭載レンチウイルスの作製と、iPS細胞研究所より譲渡されたセンダイウイルス誘導性iPSCを用いたフィーダーフリー条件でのiPSCの培養系の確立を行った。平成29年度には、エピソーマルベクターを用いて新たにT細胞由来iPSCを樹立した。樹立したiPSCにレンチウイルスを用いてEvCARを導入し、EvCAR陽性細胞の純度を磁気ビーズを用いて高め、EvCAR-iPSCを樹立した。樹立したiPSCならびにEvCAR-iPSCについて、免疫染色法により幹細胞マーカーの発現を確認した結果、Oct3/4、Nanog、SSEA-4の発現が確認できた。多分化能を評価した結果、筋肉、肝臓、神経細胞が確認でき、三胚葉への分化能が確認できた。EvCAR-iPSCを用いてC310T1/2細胞上およびフィーダーレスでの造血幹細胞(HSC)誘導法を実施した結果、フィーダーレスでのHSC誘導法の方がCD34陽性CD43陽性造血幹細胞の誘導効率が高かった。得られたHSCをOP9delta1細胞上でhSCF、hIL-7、hFlt3L等の存在下で34週間培養を行い、T細胞への誘導を試みた。その結果、誘導効率は低いが、CD3陽性、EvCAR陽性の細胞が確認できた。現在hIL-2、hIL-7、αCD3等の存在下でT細胞の活性化・増幅培養を実施しており、誘導された細胞の特性解析を行う予定である。施設内DNA組換え実験安全委員会での承認後に実験を着実に進めていく予定である。腫瘍免疫学、分子生物学平成28年度の研究進行状況から残金があった。平成28年度に実施できなかった実験に必要な器具等を購入する予定である。
運動レベルの違いによる随意動作習熟過程の神経機構に関する研究

本研究の目的は、運動レベル特有の習熟過程を神経・筋機能の側面より明らかにすることである。並はずれた能力の持ち主-障害者や熟練した競技者-の随意運動を研究することは、運動神経機構の限界を探ることになる。運動レベルを三種(運動機能障害、日常生活動作、スポーツ動作)のグループに分類した。1.運動機能障害のグループ:完全対麻痺者の補装具歩行訓練による歩行訓練を1回1時間、12週間おこなった。歩行リズムに同期した筋電図活動はヒラメ筋に出現したが、トレーニング初期ではほとんど認められなかった。筋電図波形の変容は歩行パターンの変化か、脊髄歩行中枢の入出力特性の変化によるものである。また、身体的なトレーニング効果は頚髄損傷スポーツ選手(C6-7)の交感神経機能に認められた。非スポーツ頚髄損傷者では体位変換試験による自律神経過反射をしめしたが、頚髄損傷スポーツ選手には見られないことから、自律神経調節機能の向上性が示唆される。2.日常生活動作のグループ:電気刺激によるH-反射と、経頭蓋的磁気刺激(TMS)による運動誘発電位(MEP)を手がかりにして、脊髄レベルと大脳皮質レベルに対するトレーニング効果を調べた。トレーニングによって中枢レベルの運動領野からの運動指令の変容と、脊髄レベルの運動単位の同期化が現れ、効率的な運動遂行となる。3.スポーツ動作のグループ:バドミントンスマッシュ動作における上肢と下肢の筋活動を筋電図によって記録した。近位筋はスピードとパワーの発揮に貢献し、遠位筋は打球のタイミングやスマシュのコントロールに貢献する。スマシュのトレーニング効果は、まず近位筋にあらわれ、ついで遠位筋に出現する。本研究の目的は、随意動作を三種(機能不全を伴う動作、日常生活に必須な動作、スポーツにみられる動作)に分類し、各レベル特有の習熟過程を神経・筋機能の側面より明らかにすることである。第1グループ:車椅子スポーツ選手(C58)の膝窩動脈径は健常者に比して萎縮し、安静時血流速度は高値を示すが、血流量に差を認めなかった(矢部)。脊髄損傷者(Th12)の装具を用いた歩行訓練によって下肢筋群の筋放電は増強された。(中澤)。高齢者の上肢運動時のP300は若年者に比して振幅、三角筋に対する腓腹筋の早期活動減少が認められた(藤原勝)。類似した筋放電パターンにおいて、動作前silentperiod(PMSP)の出現した動作は出現しない動作より有意に大きい筋力を発揮した(青木)。第2グループ:日常生活における随意動作を大筋運動と小筋運動の2つに分け、その習熟過程を解析した。小筋運動課題については、上肢の指の繰り返し運動による運動野の興奮性変容過程を運動誘発電位を指標にして解析した。大筋運動課題としての下肢の運動に関しては「H反射」を指標とした解析を進め、動物実験で得られた成熟した運動野でも、運動を繰り返すことによって一過性の可塑的変化の起こり得る現象(reorganization)をヒトについて確認した。第3グループ:初心者にバドミントンスマッシュ練習を数日間行わせると、筋電図が近位筋から遠位筋への順序で熟練者パターンへ変化する(大築)。空手熟練者は一般人に比べて安静立位保持時の身体動揺が小さく、下腿筋のH反射振幅も小さい(森谷)。手と足の同時反応課題を行うと、足の反応時間は手と同時でも変化しないが、手の方は増大する(谷口)。テニス等の打球的当て課題成功の最後のチャンスとなるプレッシャー試行において、心拍数が増加し、筋放電が増大する(藤原素)。本研究の目的は、随意動作を三種(運動機能障害者の随意動作、日常生活における随意動作、スポーツにおける随意動作)に分類し、各レベル特有の習熟過程を神経・筋機能の側面より明らかにすることである。

第1グループ:頚髄損傷スポーツ選手(C6-7)は頚髄損傷非運動群に比して心臓迷走神経活動の増大と自律神経過反射の抑制を示した(矢部)。動作前silentperiod(PMSP)の出現によって、伸張性筋収縮による弾性エネルギー放出による筋力増強が得られた(青木)。対麻痺者の補装具歩行訓練によって脊髄歩行中枢の入出力特性が変化することを明らかにした。(中澤)。バランスボード平衡訓練により、高齢者の上肢運動時のP300は短縮を示し、大腿二頭筋放電の潜時とに相関関係が認められた(藤原勝)。第2グループ:栂指と示指の摘み動作を栂指球筋と第一背側骨間筋の筋電図と運動誘発電位を手がかりにして脳の適応学習を明らかにした(笠井)。示指外転の視標追跡運動を繰り返すことにより、力発揮の円滑化と筋放電量の減少が認められた(小宮山)。健常者・片麻痺患者とも座位・立位間に運動誘発電位に差異が見られず、橈骨手根屈筋運動ニューロンヘの皮質脊髄路性抑制の関与は認められなかった(船瀬)。左右の栂指と示指の精密把握運動をポジトロン断層撮影法によって脳機能局在性を究明した(木下)。第3グループ:バドミントンスマッシュの練習効果は体幹の近位筋から現われ、末梢の筋が最後に完成する階層性の存在を認めた(大築)。武道熟練者の姿勢制御には上位中枢からの抑制が強く働くことをH反射を手掛かりに確認した(森谷)。課題要求度が高いほど主働筋と拮抗筋へのタイミングに関する運動プログラムの乱れが出現した(藤原素)。手と足の同時動作の反応時間と単独の反応時間の比較から注意の分散が両側性機能低下であることを認めた(谷口)。
選択的エストロゲン受容体調節因子(SERM)による動脈硬化予防の作用機構の検討

2)我々のグループでは核内受容体COUP-TFIと特異的な相互作用を有するSUMO化酵素のUbc9およびPIAS1の同定に成功したが、今回ERαの結合蛋白としても同定された。それらのERαによる転写に与える影響を検討した結果、これらの蛋白はERαの転写共役因子(coactivator)としても機能することが明らかとなった。また、最近の報告(EMBO J.2002,21(13):3443-53)にてCOUP-TFIはERαのSer118のリン酸化を介してERαの転写活性化に関与するとの報告があり、Ubc9-PIAS1-COUP-TFI複合体がERα転写を活性化する可能性が示唆された。1.cDNAライブラリーの作製2.ライブラリースクリーニング本年度は、前述のようにまずcDNAライブラリーの作製に加えて、ERに拮抗することが報告されている核内受容体COUP-TFをbaitに用いたCOUP-TF-interacting Proteins(CIPs)のスクリーニングを行った。その結果、2種類の特異性の高いCIP-1,CIP-2が得られて、両者ともにCOUP-TFの新規コリプレッサーとして機能することが示された。本年度のスクリーニングにおいては、偽陽性が少なく、特異性・感受性ともに優れていた。来年度以降は、ERに拮抗する可能性のあるCIP-1,CIP-2の機能解析に加えて、このシステムを用いてSERM結合ER-ineracitng proteinsのスクリーニングを進め、SERM作用発現に重要な転写共役因子をスクリーニングしていく予定である。本年度は、エストロゲンおよびエストロゲン受容体調節因子(SERM)による動脈硬化予防の作用機構を明らかにするために、ヒト心臓cDNA libraryからエストロゲン受容体(ER)-interacting proteinと、並行してER作用を増強する別の核内受容体COUP-TFI-interacting proteinのクローニングを行った。COUP-TFIは、ERαと複合体を形成して、ERαのSer118をMAPK依存性にリン酸化することによりER作用を増強することが示された(Metivier et al. EMBO J.21:3443-3453,2002)。Yeasttwo-hybrid systemを用いて、COUP-TFI-interacting proteinsとして2種類の新規蛋白質の同定に成功した。これらは、COUP-TFI応答性遺伝子の発現に対しては、プロモーター依存性にcorepressorまたはcoactivatorとして機能するbifunctional coregulatorであることが示された。この2種類の新規COUP-TFI coregulatorは、COUP-TFIのみならず、COUP-TFII, SF-1/Ad4BPとも強い相互作用を示し、既報の転写共役因子とは異なるレセプター選択性を示した。また、その転写抑制においては、trichostatin A処理で解除されないことから、trichostatin A非感受性のヒストン脱アセチル酵素の関与が示唆されている。現在、この新規蛋白の機能解析を進めている。さらに、SERM結合ERに相互作用を示す転写共役因子に関しては、さらにスクリーニングを進めていく予定である。2)我々のグループではCOUP-TFIと特異的な相互作用を有するSUMO化酵素のUbc9およびPIAS1の同定に成功したが、これらのERαに対する影響を検討した。その結果、これらの蛋白はERαの転写共役因子(coactivator)としても機能することが明らかとなった。また、EMBO J. (2002 Jull ; 21(13) : 3443-53)にてCOUP-TFIはERαのSer118のリン酸化を介してERαの転写活性化に関与するとの報告があることから、Ubc9-PIAS1-ERα-COUP-TFI complexによる生理学的機能が示唆された。
物理・化学的機能性付与による高機能有機材料表面形成技術の開発

本研究では、構造・機能材料の抜本的な軽量化に向けて、有機材料に新たな機能を付加して適材適所に使用するマルチマテリアル化により新規エンジニアリング部材創成に革新的なブレークスルーをもたらす技術開発を念頭に、化学・物理的機能性付与による高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマの高活性な反応場を用いた有機材料表面への改質および薄膜形成技術の開発と、革新的構造材料創成のための技術確立を目的とする。有機材料の最表面の構造を精密制御し、なおかつその表面に官能基付与した、物理的・化学的に機能性を有する表面改質および薄膜形成技術開発を念頭に、イオン・ラジカル・光を制御した低圧プラズマを生成し、このプラズマと生体材料応用で有望視されているPEEK(ポリエーテルエーテルケトン)との表面相互作用の解明に向けた研究を推進している。本年度は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ制御技術である、イオン・ラジカル制御に加えて表面に微細な構造物を形成するためにスパッタ源を有するプラズマ源を完成させた。また、入射するイオンエネルギーが10eV程度のアルゴン酸素混合プラズマをPEEKに照射することにより、表面の物理的構造が変化することを確認した。これはイオン・ラジカルによるPEEK表面のスパッタ・エッチング効果によるものと推察される。この結果から本装置は物理的な機能を有する有機材料表面への形成を可能にする装置であることがいえる。本研究の成果はプラズマによる様々な有機材料表面の改質・制御技術および物理的構造形成技術の発展に向けた貢献できることを示す結果である。本年度は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ制御技術として、昨年度から作製を進めているイオン・ラジカルを能動的に制御し有機材料への入射束を制御し、なおかつ表面に微細な構造物を形成するためのスパッタ源を有するプラズマ源の開発を行った。またそれと平行して、エンジニアリングプラズチックであるPEEKにイオン・ラジカル入射束を制御したプラズマを照射しPEEKに含まれる有機分子の励起、解離反応過程の解明を目標に研究を進めてきた。まずイオン・ラジカルを能動的に制御するための非平衡プラズマ生成装置を用いてプラズマ照射によるPEEK表面の構造解析を、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて行った。これらの結果、プラズマ照射後のPEEK表面は照射時間を増加させるごとに表面荒さが増大しPEEKの結晶構造に起因すると考えられる微細構造が形成されることが明らかとなった。すでに先行研究でPET(ポリエチレンテレフタレート)へのプラズマ照射実験において、有機材料とプラズマとの相互反応においてミクロな表面構造の形成とマクロな表面構造を形成することがわかっており、PEEKにおいても同様の相互作用が起こっていると推察される。つまり本装置は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ生成に適した装置であることがいえる。これまでの先行研究で得られたPETの実験結果とPEEKと結果を比較しながら有機材料・プラズマ相互作用の材料による相違を明らかにしていくべく研究を推進中である。本年度は昨年度に引き続き非平衡プラズマ源を用いて有機材料表面へのプラズマ表面改質技術の開発と化学的特性の解析を行うとともに、イオン・ラジカルを能動的に制御し有機材料への入射束を制御し、なおかつ表面に微細な構造物を形成するためのスパッタ源を有するプラズマ源を用いて、能動的に任意の微細構造を有する表面形状を形成し物理的特性の解析を行う。物理的特性の解析には引き続きAFMやSEM観察を行うとともに、プラズマから入射するイオン・ラジカルによる表面の化学的な特性の変化を調べるために、光電子分光法(XPS)を用いた化学構造の解析により最表面の化学的特性の変化、および官能基の付与の有無について測定する。また官能基の中でも異材との親和性を考慮して、まずヒドロキシル基やカルボキシル基に着目し、それらの官能基表面への付与について調査する。さらに、非平衡プラズマ源を用いた有機材料表面へのプラズマ表面加工技術の開発と表面特性の解析を行う。バイオミメティクスに代表される生物のもつナノメートルスケールでの3次元微細構造をヒントに、有機材料表面の形状を制御することによる、高機能有機材料表面創製プロセスの実現を目指す。これらの研究で得られた知見を基に、生物のもつ『かたち』を人工的に模倣し、それを工学的な機能材料の開発へと結びつけることによって、生物の機能を超える新しい高機能有機材料の創製を行う。イオン・ラジカル制御した等方性・異方性プラズマエッチングにより有機材料表面へ3次元微細構造を形成し、その表面形状をAFM、およびSEMを用いて評価する。異材との接合・接着を考慮した機能発現に関する物理的化学的特性を検討する。本研究では、構造・機能材料の抜本的な軽量化に向けて、有機材料に新たな機能を付加して適材適所に使用するマルチマテリアル化により、新規エンジニアリング部材創成に革新的なブレークスルーをもたらす技術開発を念頭に、化学・物理的機能性付与による高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマの高活性な反応場を用いた有機材料表面への改質および薄膜形成技術の開発と、革新的構造材料創成のための技術確立を目的とする。有機材料の最表面の構造の精密制御し、その表面に官能基付与し、物理的・化学的に機能性を有する表面改質および薄膜形成技術開発を念頭に、イオン・ラジカル・光を制御した低圧プラズマを生成し、このプラズマと生体材料応用で有望視されているPEEK(ポリエーテルエーテルケトン)との表面相互作用の解明に向けた研究を推進している。

高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ制御技術として、イオン・ラジカル制御に加えて表面に微細な構造物を形成するためにスパッタ源を有するプラズマ源を作製し、その特性を測定した。その結果、基板に入射する粒子種のエネルギーは10eV程度と非常に低いエネルギーであることが明らかとなった。そのことは、本装置を用いることにより表面処理を行う際に有機材料の最表面の損傷を抑制できるこを示唆しており、本装置は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ生成に適した装置であることがいえる。本研究の成果はプラズマによる表面改質制御製膜技術および物理的構造形成技術の発展に向けた貢献が期待される。本年度は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ制御技術として、イオン・ラジカルを能動的に制御し、有機材料への入射束を制御する技術の確立と、これらの技術を用いてプラズマによる有機分子の励起、解離反応過程の解明を目標に研究を進めてきた。まずイオン・ラジカルを能動的に制御するための非平衡プラズマ生成装置の立ち上げとその性能評価を行った。本装置を立ち上げるに当たり、イオン・ラジカル制御に加えて表面に微細な構造物を形成するために、スパッタ源を有するプラズマ源を作製し、その特性を測定した。イオンエネルギーをエネルギー分解型質量分析装置で測定した結果、プラズマ源で生成したイオン、スパッタ源で生成したプラズマから入射する粒子種のエネルギーはともに10eV程度と非常に低エネルギーであることが明らかとなった。すでに先行研究でPET(ポリエチレンテレフタレート)への照射実験において、有機材料とプラズマとの相互反応においてイオンエネルギー10eV以下においては有機材料の最表面の損傷を抑制できることが明らかとなっている事から、本装置は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ生成に適した装置であることがいえる。すでにプラズマとPEEKとの相互作用の解明に関する実験に取りかかっている。まずは先行研究で得られたPETの実験結果とPEEKと結果を比較し、有機材料・プラズマ相互作用の材料による相違を明らかにしていくべく研究を推進中である。本研究では、構造・機能材料の抜本的な軽量化に向けて、有機材料に新たな機能を付加して適材適所に使用するマルチマテリアル化により新規エンジニアリング部材創成に革新的なブレークスルーをもたらす技術開発を念頭に、化学・物理的機能性付与による高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマの高活性な反応場を用いた有機材料表面への改質および薄膜形成技術の開発と、革新的構造材料創成のための技術確立を目的とする。有機材料の最表面の構造を精密制御し、なおかつその表面に官能基付与した、物理的・化学的に機能性を有する表面改質および薄膜形成技術開発を念頭に、イオン・ラジカル・光を制御した低圧プラズマを生成し、このプラズマと生体材料応用で有望視されているPEEK(ポリエーテルエーテルケトン)との表面相互作用の解明に向けた研究を推進している。本年度は高性能・高機能有機材料表面形成のための非平衡プラズマ制御技術である、イオン・ラジカル制御に加えて表面に微細な構造物を形成するためにスパッタ源を有するプラズマ源を完成させた。
哺乳類細胞への6.3T超強磁場の影響

研究目的:本研究では、超強磁場が哺乳動物細胞の増殖、細胞致死あるいは突然変異誘発に影響を及ぼすか否か、ヒト生体試料としての価値が高いTリンパ球を用いて調べる。さらに、我々を取り巻く物理的環境要因として特に重要な放射線との複合影響についても検討する。研究成果および考察:NMRスペクトル装置の超伝導マグネット部に、通常の培養条件と同等な温湿度、CO_2濃度が設定可能な細胞培養スタンドを作成し、6.3Tの定常超強磁場中で長時間連続曝露を可能にした。健常人末梢血より分離したヒトT細胞を6.3T定常磁場中で長期培養し、経時的な細胞数の計数による細胞増殖速度およびコロニ-形成率を調べた。末梢血より分離直後のT細胞は、約3日間の曝露で両指標ともに対照群の約50%と明らかな抑制効果が認められた。しかし、対数増殖期にあるT細胞では、約20時間の曝露で細胞数およびコロニ-形成率ともに対照培養の80%に阻害されるが、その後回復して増殖速度に変化は認められず、6.3Tの磁場環境に適応したものと考えられる。さらに、連続3日間の曝露でも、6チオグアニン抵抗性を遺伝的マ-カ-とした突然変異率は、対照群との間に有意差は認められない。これらは、6.3Tの強磁場でも、その生体影響は器質的変化を伴う不可逆的反応ではなく、一過性的な機能的変化を生ずる作用が主体となるものと考えられる。強定常磁場と他のエネルギ-との重畳効果の可能性として、T細胞の放射線感受性および亜致死障害の回復に対する影響を調べた。2024時間6.3T定常磁場に曝露したT細胞の250kVp X線に対するD_<37>値は1.25Gyで対照の1.78Gyに比し高感受性を示し、また、Go期T細胞の亜致死障害の修復過程(4GyのX線を2分割照射の時間間隔でのみ6.3T定常磁場へ曝露)でも磁場による抑制効果がみられた。
哺乳類の生殖細胞におけるゲノムインプリンティングの再成立の分子機構の解明

哺乳類の個体発生において父親、母親由来のゲノムに機能的な差異をもたらすエピジェネティクメカニズムであるゲノムインプリンティングの情報は、生殖細胞系列において胎児期に消去された後、卵成熟もしくは、精子形成過程で新たに刷り込まれる。PGCクローンマウス胚を用いた以前の研究でday10.5からday12.5までに起るインプリンティング記憶の消去過程は明らかとなった。そこで今回、インプリンティングの消去に続く父親性インプリンティング(Paternal imprinting)の成立過程を明らかにするため、胎児期後期と新生児の精原細胞(Gonocyte)から作製したクローンマウスの初期胚を用いてインプリンティング遺伝子発現パターンについて体系的な解析とともにDMR(Differentially methylated region)のDNAメチル化解析を行い次ぎのような結果を得た。1)父親性インプリンティング領域遺伝子であるMeg3-Dlk1-Meg9,H19-Igf2の発現解析によって、胎児期12.5日のPGCで両親性発現を示していたMeg3,Meg9,H19は、胎児期17.5日を境に雄のPGCまたはGonocyteでその発現が急激に下がっていた。2)Meg3,H19,Ras-grf1の三つの父親性インプリンティング遺伝子におけるDMR(Differentially methylated region)のメチル化解析によって、胎児期17.5日の雄の生殖細胞系列に完全にメチル化が成立されていることを明らかにした。このメチル化のパターンは前述した父親性インプリンティング遺伝子の発現パターンの変化と一致するもので、ゲノムインプリンティング成立機構にDNAのメチル化が重要であることを示している。これらの結果から、精子形成過程でのゲノムインプリンティング記憶の再成立過程が詳細となったので、今後のゲノムインプリンティング分子機構の解明に重要な役割を果たすことが期待される。配偶子形成過程におけるゲノムインプリンティングの再成立制御機構を明らかにするために、卵又は精子の中に存在すると考えられるインプリンティング遺伝子の発現制御に関わる細胞内因子を同定することは重要である。以前の研究で検出された候補因子c10結合蛋白質は、インプリンティング遺伝子の発現制御に必須な領域のH19上流DMR中の1.1kb中のc10配列に結合する卵巣と精巣特異的な蛋白質で、H19近隣に位置するPeg8の繰り返し配列にも結合力を持っている。そこで、今回のc10結合蛋白質精製に差し当たってc10とその結合蛋白質について詳しい解析が必要となり次のような実験を行った。1.H19の1kb cis acting silencerの5'上流まで解析の範囲を広げて、c10結合蛋白質が結合する配列が存在するのか又はc10結合蛋白質以外にも卵と精巣特異的な蛋白質が結合する配列が存在するのかについてGSA方で検討した。2.Igf2のDMD配列においてもc10結合蛋白質との関連性と卵または精巣特異的な蛋白質が結合する配列の存在について検討を行った。その結果、(1)H19 DMRのm1(CTCF binding site)の下流にGSAでc10とcompetitionする配列が存在し、このc10と似た配列を含んだ配列には精巣特異的な蛋白質(複合体)が結合することが確認された。また、m4の下流にもc10と似た配列が存在していることが分かった。(2)Igf2r intron2のimplinting box配列や42bp繰り返し配列やその他の配列を用いたcompetition assayでc10 binding proteinとIgf2rでの相互作用は検出できなかった。しかし、Igf2r DMDの3'terminiに存在するrepeat配列に卵巣特異的な蛋白質が結合することが確認された。これらの結果から、精巣の中でゲノムインプリンティングの再成立が起るpaternal imprinting遺伝子(H19)と卵巣のなかで刷り込みを受けるmaternal imprinting遺伝子(Igf2r)の制御に相互独立的な因子が作用することが考えられる。さらに、この結果は卵と精子で二つの違うゲノムインプリンティングの再成立制御機構が存在することを示唆するので、今後のインプリンティング制御因子の同定に重要な意味を持つと予想される。

このメチル化のパターンは前述した父親性インプリンティング遺伝子の発現パターンの変化と一致するもので、ゲノムインプリンティング成立機構にDNAのメチル化が重要であることを示している。これらの結果から、精子形成過程でのゲノムインプリンティング記憶の再成立過程が詳細となったので、今後のゲノムインプリンティング分子機構の解明に重要な役割を果たすことが期待される。
口腔諸組織の加齢変化に関する研究

1.歯周組織:接合上皮細胞の分裂指数と加齢との相関関係は明らかではなかったが、20歳代前半を過ぎる頃から歯肉退縮、歯根骨吸収、歯根膜線維の粗造化が生じ、接合上皮のびらん、潰傷形成と歯周組織における炎症性反応が広がりと関連性が認められ、歯肉炎、歯周炎、歯周炎の発症、進展には接合上皮の再生力の強弱が影響している。2.顎関節:117下顎頭の非脱灰標本を作製し、検索した結果、生下時から硝子軟骨であった下顎頭関節軟骨は、10歳を過ぎる頃から線維性となり、20歳代から関節各部の実質細胞は減少または消失し、組織再生力は低下すると考えられた。下顎頭の形態異常は20歳代からすでに認められ、加齢にともないその発症頻度は高くなっていた。このような組織変化を示す形態異常例と20歳代後半から発現する下顎頭の加齢変化との関係については今後検討する余地が残されている。3.舌:720例の舌体中央部の標本を作製し、脂肪沈着量、舌深動脈硬化を検索した結果、加齢現象としての脂肪組織量の推移は、発育に伴う脂肪出現に始まり、線維性結合組織部への浸潤、筋線維の委縮、変性、脱落した後の代償性沈着の総和として現れ、その変化は一定の場の量的変化とともに部位的にも変化することがわかった。また、舌深動脈硬化症は内膜肥厚と中膜の退行性変化により生じいずれも時間に対する一定の関数として捉えることができ高齢者では中膜の適応力低下により内膜肥厚を補償できず内腔狭窄が生じるものと考えられた。4.加齢と発癌:若年と老齢ラットを用い加齢に伴う4NQO発癌感受性の変動を検索した結果、老齢群は若年群に比し生存期間が有意に長く、舌癌は若年群で巨大化傾向がみられ、Mitosis index、Brdu labeling indexでは、若年群の舌粘膜上皮は老齢群に比して4NQO投与に伴う増殖性反応が強いことが明らかにされ、4NQOに対するラットの舌発癌の感受性は加齢に伴って減弱することが示唆された。I.人体病理解剖例から摘出した下記口腔諸組織の加齢変化について、組織学的観察を行った。(1)歯周組織: 36顎骨(975歳)の非脱灰組織標本を作製し、プラーク・歯石の付着状態,歯肉溝の形状,歯肉上皮の形態変化および細胞分裂像,炎症の量的・質的所見,歯槽骨の変化ながの形態計測を行ない、加齢と歯周炎の発症,進展との関係を検討した。結果:上皮細胞の分裂指数と加齢との関係は明らかなものはなかった。加齢にともなって、歯肉粘膜にはびらん,潰瘍の発現頻度が高くなっていた。潰瘍形成と炎症の進展とは関連性があると考えられた。(2)顎関節: 84例(090歳)の非脱灰組織標本を作製し、下顎頭,関節円板,側頭骨関節窩,下顎筋突起,内・外翼突筋,および5例の胸鎖関節について、形態計測を含む光顕的観察を行った。結果:生下時から硝子軟骨であった下顎頭関節軟骨は、10歳を過ぎる頃から線維性となる。

20歳代から関節各部の実質細胞は減少または消失し、組織再生力あるいは適応力は低下すると考えられた。実際に、下顎頭の形態異常は20歳代後からすでに認められ、加齢に伴ってその発症頻度は高くなっていた。(3)舌: 320例(0106歳)の舌中央部前額断組織標本を作製し、脂肪沈着量と年齢との関係について光顕的観察を行なった。結果:脂肪は生後1年頃から出現し始め、経年的に増加する。成人期においては、男性に比して女性において沈着量が多かった。この変化は、舌筋の萎縮に対する脂肪の補空性肥大と推測される。1.歯周組織の加齢変化:人体病理剖検例の上・下顎骨(136歯周組織、076歳)の非脱灰組織標本を作製し、加齢と病変(とくに歯肉炎、歯周炎)との関連性について、病理組織学的ならびにX線学的観察を行なっている。接合上皮細胞の分裂指数と上皮層の形態変化指数(1度4度)は、歯肉炎と歯周炎とを鑑別する指標となりうる可能性があることがわかった。また、歯肉上皮のびらん、潰瘍と歯周組織における炎症の拡がりとの間には有意な関連性が認められた。2.顎関節の加齢変化:人体病理剖検例顎関節(145例、091歳)の非脱灰組織標本を作製し、光顕的観察を行った。20歳代後半から加齢に伴って、下顎頭関節面部における増殖層は消失する傾向を示し、軟骨層は線維化し、軟骨下骨および下顎穿皮質骨は徐々に吸収する。関節円板には著変はなかった。顎関節部を支配する動脈(顎動脈、浅側頭動脈)の枝には50歳代から動脈硬化症が比較的顕著となる傾向がみられた。3.舌の加齢変化:加齢に伴って舌は厚さを減じ(とくに60歳代以降)、20歳代以降では固有層、筋層内に脂肪の沈着が加齢的に増加していた。4.加齢と発癌:純系ラット(300匹)にDNBUを1日2回連続投与して舌癌を生じさせた(発癌率95%)。老齢群(生後2年以上)では、発癌時期が遅れ、腫瘤径が小さく、多発する傾向が認められた。1.歯周組織:接合上皮細胞の分裂指数と加齢との相関関係は明らかではなかったが、20歳代前半を過ぎる頃から歯肉退縮、歯槽骨吸収、歯根膜線維の粗造化が生じ、接合上皮のびらん、潰瘍形成と歯周組織における炎症性反応の広がりと関連性が認められ、歯肉炎、歯周炎の発症、進展には接合上皮の再生力の強弱が影響している。2.顎関節:117下顎頭の非脱灰標本を作製し、検索した結果、生下時から硝子軟骨であった下顎頭関節軟骨は、10歳を過ぎる頃から線維性となり、20歳代から関節各部の実質細胞は減少または消失し、組織再生力は低下すると考えられた。下顎頭の形態異常は20歳代からすでに認められ、加齢にともないその発症頻度は高くなっていた。このような組織変化を示す形態異常例と20歳代後半から発現する下顎頭の加齢変化との関係については今後検討する余地が残されている。3.舌:720例の舌体中央部の標本を作製し、脂肪沈着量、舌深動脈硬化を検索した結果、加齢現象としての脂肪組織量の推移は、発育に伴う脂肪出現に始まり、線維性結合組織部への浸潤、筋線維の萎縮、変性、脱落した後の代償性沈着の総和として現れ、その変化は一定の場の量的変化とともに部位的にも変化することがわかった。また、舌深動脈硬化症は内膜肥厚と中膜の退行性変化により生じいずれも時間に対する一定の関数として捉えることができ高齢者では中膜の適応力低下により内膜肥厚を補償できず内腔狭窄が生じるものと考えられた。4.加齢と発癌:若年と老齢ラットを用い加齢に伴う4NQO発癌感受性の変動を検索した結果、老齢群は若年群に比し生存期間が有意に長く、舌癌は若年群で巨大化傾向がみられ、Mitosis index、Brdu labeling indexでは、若年群の舌粘膜上皮は老齢群に比して4NQO投与に伴う増殖性反応が強いことが明らかにされ、4NQOに対するラットの舌発癌の感受性は加齢に伴って減弱することが示唆された。
新規クロルイオンチャネルTMEM16Aを標的とした気道過分泌の病態解明と治療

TMEM16Aは新規カルシウム活性化クロルイオンチャネルであり、気管支喘息において気道分泌や気管支平滑筋収縮に関わっている。本研究では喘息モデルを用いて、抗原チャレンジやカルシウム依存性アゴニストによるクロルイオン輸送の増加がTMEM16A阻害薬によって抑制されること、また免疫染色により杯細胞のapical membraneや粘液周囲にTMEM16Aが局在していることを明らかにした。さらに、クラリスロマイシンによるインターロイキン13誘導培養杯細胞化生におけるTMEM16A抑制作用も見いだした。これらの結果はTMEM16Aが気道過分泌疾患治療における新しい標的となることを示唆する。気道粘膜にはクロルイオンチャネルが存在し、気道被覆層の水分や粘液分泌に深く関わっている。TMEM16A分子は新しく発見されたカルシウム活性化クロルイオンチャネル(CaCC)で、気道分泌や気道収縮に関わっていることが報告されている。本年度は抗原感作モルモット喘息モデルを用いて、抗原チャレンジによる急性気道分泌反応におけるTMEM16Aの役割について検討した。モルモットを卵白アルブミン(OVA)で腹腔内感作後、人工呼吸器を装着して、OVAを吸入チャレンジした。一部のモルモットはTMEM16A阻害薬を前処置した。直ちに気管を取り出し、PAS/AB標本を作製し、PAS/AB陽性の粘液面積を画像解析装置で測定した。2番目の実験として、感作モルモットの気管を摘出し、Ussing chamberにマウントし、voltage clamp装置で短絡電流(Isc)を測定した。chamber内でOVAによるチャレンジを行い、Iscの変化を観察した。TMEM16A阻害薬やCFTR阻害薬などのクロルイオンチャネル阻害薬を前処置してIscへの影響を検討した。次に気管上皮をTMEM16A抗体を用いて免疫染色を行った。対照群として抗原非感作モルモットを用いた。その結果、TMEM16A阻害薬は抗原チャレンジによる粘液分泌を抑制し、またクロルイオン輸送も抑制した。また抗原感作モルモット気管上皮はTMEM16Aの発現がみられ、非感作気管上皮より増強していた。以上のことから、TMEM16AはCaCCとして作用し、抗原誘発による粘液分泌やクロルイオン輸送に関わっていることが示唆された。今後はより詳細な作用機序についても検討をしていく予定である。昨年度はTMEM16Aを中心とするカルシウム活性化クロルイオンチャネル(CaCC)が気管支喘息モデルにおけるクロルイオン分泌に関わっていることを電気生理学的に証明した。本年はさらに、喘息モデルにおけるTMEM16Aの局在について形態学的に検討を加えた。モルモットを卵白アルブミン(OVA)で2回腹腔内感作し、2週間後に気管粘膜を取り出し、凍結切片を作成した。TMEM16A抗体、podoplanin抗体で免疫蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、感作粘膜では杯細胞化生が生じ、apical membraneにTMEM16Aが強く染色された。また基底細胞の増殖をみとめ、ここにもTMEM16Aが強く染色された。非感作粘膜でもTMEM16Aは陽性であったが、全体に発現は弱く、また上皮細胞のapical membraneへの局在は軽度であった。以上のことから、気管粘膜では基底細胞はTMEM16Aを発現し、細胞増殖に関与している可能性があり、さらに感作状態では杯細胞化生上皮のapical membraneへのtraffickingがおこってクロルイオン輸送亢進の準備状態をつくっていることが推測された。このことからTMEM16Aは粘液分泌とともにクロルイオン輸送を介する水分輸送にも関わり、相互に作用することで気道分泌の亢進に寄与していると推測された。昨年度まではモルモット感作喘息モデルでのクロルイオン分泌に関する電気生理学的検討とTMEM16Aの気道粘膜における局在を証明した。今年度はモルモット気道上皮細胞をair-liquid interface法の条件下でIL-13を添加し10日間培養して杯細胞化生モデルを作成し、TMEM16Aの役割を検討した。その結果、Ussing chamber法による電気生理学的検討ではUTPによるCa依存性クロルイオン分泌の亢進と、TMEM16A阻害薬であるniflumic acid、T16Ainh-A01、benzbromaroneによる抑制を確認した。さらにTMEM16A抗体、MUC5AC抗体、αTubulin抗体による蛍光免疫3重染色を行い、共焦点顕微鏡で観察した。その結果、TMEM16Aは特にMUC5AC陽性の杯細胞のapical membraneに局在していることが判明した。一方、αTubulin陽性の線毛細胞への発現は軽微であった。次に気道過分泌の治療にはマクロライドが有効であるので、IL-13誘導性杯細胞化生に対するクラリスロマイシンの効果についても検討した。その結果、クラリスロマイシンはTMEM16Aの発現を抑制し、杯細胞化生を抑制、線毛細胞へ分化誘導した。以上より、喘息モデルでTMEM16Aは杯細胞化生に局在し、Ca依存性クロルイオン分泌亢進に関わり、気道過分泌病態に深く関わっていることが判明した。またTMEM16A阻害薬やマクロライドはTMEM16Aの抑制を通して過分泌治療に有用である可能性が示唆された。

本研究では喘息モデルを用いて、抗原チャレンジやカルシウム依存性アゴニストによるクロルイオン輸送の増加がTMEM16A阻害薬によって抑制されること、また免疫染色により杯細胞のapical membraneや粘液周囲にTMEM16Aが局在していることを明らかにした。さらに、クラリスロマイシンによるインターロイキン13誘導培養杯細胞化生におけるTMEM16A抑制作用も見いだした。これらの結果はTMEM16Aが気道過分泌疾患治療における新しい標的となることを示唆する。形態学的な検討を免疫蛍光3重染色で確認し、TMEM16Aに関する新しい知見が加わった。またモルモット気管の初代培養による杯細胞化生の実験も進行中である。現在までのところ順調に達成されている。呼吸器内科学H27年度はモルモットの気道上皮細胞をair-liquid interface法で培養し杯細胞化生を作成して、クロルイオン輸送におけるTMEM16Aの役割を電気生理学的に証明する。また本年度に方法論が確立できた蛍光免疫3重染色を培養細胞にも応用し、共焦点顕微鏡による観察を通してTMEM16Aの細胞膜の局在やtraffickingの詳細を明らかにする。反復抗原感作モルモット喘息モデルを用いた急性気道分泌反応として粘液分泌とクロルイオン輸送の2点から実験し、現在までのところ順調に達成されている。注文した物品の納入に時間がかかっており、残金を残して次年度に支払いを行うことにした。反復抗原感作モルモット喘息モデルを用いた実験の作用機序の解明の後、H26年度はモルモットの気道上皮細胞をair-liquid interface法で培養し、IL-13による杯細胞化生を作成し、TMEM16Aの発現と分泌機能について解析する。分泌機能はCa依存性のアゴニストであるUTPなどで刺激して粘液分泌とクロルイオン輸送を誘発し、TMEM16A阻害薬の影響について検討する。粘液分泌はムチンであるMUC5ACを指標として解析を行う。残金で抗体を購入予定にしている。注文した物品の納品に時間がかかっており、残金を残し次年度に支払いを行うこととした。残金でELISAキットを購入予定にしている。
消防活動と避難行動の相互影響を考慮した避難安全性評価手法の検討

2018年度は、階段における避難群集の流動と消防隊による消防活動の相互影響を把握する群集避難実験の結果について、詳細に分析した。分析により、実験条件毎に階段内における避難群集の流動量の変化について定量的に違いを把握し、消防隊の歩行速度と合わせ、避難群集の移動方法と合流の有無、消防隊の活動内容によって、消防隊の活動効率と在館者の避難効率に違いが生じることが明らかとなった。加えて、消防機関に対する聞き取り調査により得られた、高層建築物避難時の混雑状況下における消防隊の移動方法に関する想定および対策の回答内容について、分析を行った。地震火災時の非常用エレベーターの使用の有無と対策ならびに避難者で混雑する階段における活動の可否と活動方法等について、消防機関における現状を把握した。この実態把握により、消防機関によって活動方針にばらつきがあるほか、必ずしも具体的な活動方法の想定や明確な基準を有していないことが明らかになった。なお、調査対象および実験想定が一部にとどまったことから、今後さらなる調査・検証が必要であると考えられる。本研究では、大規模施設の混雑状況下で生じる消防活動と避難行動の相互影響について、現状の避難計画と消防活動計画では想定していない現状を把握するとともに、上記相互影響と計画に反映しうる定量的指標について検討した。避難者による混雑状況下での消防活動について、一部消防機関から具体的な方法についての回答も得られたが、消防機関毎の明確な基準や方法ならびに機関同士の統一性は見られなかった。この結果に基づき群集避難実験を行い、消防隊と避難群集の相互影響を把握した。このように、多数の在館者が存在する大規模建築物において、避難者による混雑状況下で消防活動を行う際の消防活動と避難行動の相互影響を考慮した避難安全性評価手法を、避難安全と消防活動効率の観点から検討した。東京都内に存在し多数の在館者を擁する25階建て高層オフィスビルで年に1回実施されている全館避難訓練を調査した。具体的には、避難時の経路となる階段室、階段附室、避難階の屋外および屋外に通じる経路における避難行動に着目し、ビデオカメラ撮影等を通じて、避難時間、歩行速度、流動係数、滞留状況の調査を行った。特に、全ての避難者が集中する階段室内は混雑と滞留が生じることが予想されたため、全ての階の階段室内について天井付近から階段内の様子を撮影するとともに、避難者集団の中に各階12名の観測者を加えることで避難者の歩行状況を調査した。特に混雑が生じていた階段室内の混雑および滞留状況の実態を把握し、滞留の発生メカニズムを解析した。消防機関や自衛消防組織等の消防活動実施者による避難時における活動の現状を把握するため、関連法規の整理と実際の活動状況に関するヒアリング調査を行った。(1)避難時における消防活動に関連する法規の整理:消防法のうち、施設内における災害対応に関する消防活動の法規を整理することで、避難中における消防活動の避難計画に対する位置付けおよび建築基準法の避難計画との齟齬を明確化し、ヒアリング調査の項目に反映した。(2)実際の避難状況下における消防活動実態の調査:大規模施設が集中する全国主要都市圏に存在する5箇所の消防本部を対象に、大規模施設における現地到着後の消防活動実態についてヒアリング調査を行い、避難時の混雑状況下における活動想定の有無と想定している活動内容について把握した。これらをデータベースとして整理した結果、混雑状況における階段の移動や非常用EVの活用、自衛消防組織への避難誘導の委任などの複数事項について、消防本部によりばらつきが見られる結果となった。全国的に同様に行うと考えていた上記活動について、一部消防本部に基づくものだが消防本部によって異なることが明らかとなった。当初の研究計画に従い、本年度は高層建築物の避難訓練調査と避難時の消防活動実態把握のための関連法規の整理とヒアリング調査を実施した。具体的には、実際の高層建築物で行われた避難訓練における避難行動の観測調査を行い、このデータを基に滞留メカニズムについて分析した。また、関連法規の整理とヒアリング調査に基づき避難時の混雑状況下における活動想定の有無と想定している活動内容について把握した。なお、ヒアリング調査は実際に大都市圏の地区を所管する消防本部を訪問して行った。このように、研究は計画に従い、概ね順調に進展している。階段における避難群集の流動と消防隊による消防活動の相互影響を把握するため、避難群集と消防隊を、実空間で行動させる群集避難実験を行った。具体的には、70名程度の被験者と実際に地方消防局に所属する消防職員を用いて、避難時の経路となる階段室、廊下における両者の移動状況を、ビデオカメラ撮影等によって記録した。実験において運搬する消防用ホース等の資機材、や防火衣や空気呼吸器等の装備、移動方法等の消防活動方法については、前年度に主要都市圏の消防本部を対象に実施したヒアリング調査により得られた実際の避難状況下における消防活動実態と当該年度に実施した消防活動訓練の調査に基づき決定した。実験条件として、避難者については異なる階同士による合流の有無、階段の占有状況、消防隊については目的地とする火災階を変更した。実験後、避難時間、歩行速度、流動量、混雑状況および両者がすれ違うことによる回避行動などの分析を通じて、避難群集の避難時間の遅延およびその発生要因、避難群集と消防隊間の対応行動を明らかにした。以上の群集実験結果を分析、考察し、避難経路上で消防活動が行われる際の避難者の安全性と消防隊の活動効率について評価した。

避難と消防活動が同時に行われる状況について、避難と消防活動の相互影響が避難者の流動状況および移動方法の違いにより異なることを明らかにするとともに、災害時の状況と消防活動戦略に応じてとるべき消防活動および避難誘導方法が示唆された。当初の研究計画に従い、本年度は避難群集と消防隊を、実空間で行動させる群集避難実験を実施した。このデータを基に避難群集の流動と消防隊による消防活動の相互影響について分析した。相互影響が避難者の流動状況および移動方法の違いにより異なることを明らかにすることで、避難経路上で消防活動が行われる際の避難者の安全性と消防隊の活動効率について評価した。また、分析により、災害時の状況と消防活動戦略に応じてとるべき消防活動および避難誘導方法が示唆され、次年度の検討に繋がる結果も得られている。このように、研究は計画に従い、概ね順調に進展している。2018年度は、階段における避難群集の流動と消防隊による消防活動の相互影響を把握する群集避難実験の結果について、詳細に分析した。分析により、実験条件毎に階段内における避難群集の流動量の変化について定量的に違いを把握し、消防隊の歩行速度と合わせ、避難群集の移動方法と合流の有無、消防隊の活動内容によって、消防隊の活動効率と在館者の避難効率に違いが生じることが明らかとなった。加えて、消防機関に対する聞き取り調査により得られた、高層建築物避難時の混雑状況下における消防隊の移動方法に関する想定および対策の回答内容について、分析を行った。地震火災時の非常用エレベーターの使用の有無と対策ならびに避難者で混雑する階段における活動の可否と活動方法等について、消防機関における現状を把握した。この実態把握により、消防機関によって活動方針にばらつきがあるほか、必ずしも具体的な活動方法の想定や明確な基準を有していないことが明らかになった。なお、調査対象および実験想定が一部にとどまったことから、今後さらなる調査・検証が必要であると考えられる。本研究では、大規模施設の混雑状況下で生じる消防活動と避難行動の相互影響について、現状の避難計画と消防活動計画では想定していない現状を把握するとともに、上記相互影響と計画に反映しうる定量的指標について検討した。避難者による混雑状況下での消防活動について、一部消防機関から具体的な方法についての回答も得られたが、消防機関毎の明確な基準や方法ならびに機関同士の統一性は見られなかった。この結果に基づき群集避難実験を行い、消防隊と避難群集の相互影響を把握した。このように、多数の在館者が存在する大規模建築物において、避難者による混雑状況下で消防活動を行う際の消防活動と避難行動の相互影響を考慮した避難安全性評価手法を、避難安全と消防活動効率の観点から検討した。研究計画に従い、実大規模の空間における避難者と消防活動実施者の行動を想定した群集避難実験を行う。混雑状況下における両者の移動状況をビデオカメラ等で記録し、これを解析することで避難時間の遅延およびその発生要因、避難群集と消防活動実施者間の対応行動を明らかにする。今年度の調査より、避難時の混雑状況下の階段における消防隊の移動に課題があることや一般的な消防隊の活動方法など、実験想定等に役立つ情報を得ることができた。
エクオリン遺伝子導入による細胞内カルシウム動態の長期連続測定解析法の開発

カルシウム結合蛋白であるエクオリンの遺伝子導入により、生物発光測定を介して生細胞において長期間細胞内カルシウム濃度を測定するシステムの開発を行った。1.エクオリン遺伝子導入トランスジェニックマウスにおける細胞内カルシウム動態の計測アポエクオリン遺伝子を、Neuron Specific Enoraseプロモータの下流に組み込んだマウスの脳組織を用い,カルシウムによる発光の有無、発光量の容量依存性、発光の脳内部位特異性について検討し、大脳組織で小脳や脳幹組織よりもやや強く遷延する発光が観察した。しかし、エクオリン発光の容量依存性が判定できず、また、NSEプロモータ下流へのエクオリン遺伝子挿入が検出できても発光の観察されない例が多かった。2.エクオリン遺伝子導入培養細胞における細胞内カルシウム動態の測定CMVプロモータ下流にアポエクオリン遺伝子を組み込んだ発現ベクターをNIH3T3細胞に導入し,エクオリン遺伝子を高率に発現する株細胞を樹立した。本細胞は10^<-5>M以上のカルシウムに容量依存性にフラッシュ状発光を示した。カルシウム発光標準曲線を作成し、発光量の検出で細胞内カルシウム量判定を可能とした。非刺激時の細胞内カルシウムレベルは測光感度以下であったが、KCl刺激によりフラッシュ状発光を示し、その後のCaCl2による細胞破壊で再び発光が検出できた。考察と結論本細胞株の細胞内にはでは、長期カルシウム発光測定に十分なエクオリンの合成があり、細胞興奮によるカルシウム上昇やその後の低下を定量することが可能である。この細胞は、単独でも細胞内カルシウム動態のリアルタイム検出系として利用できるが、目的とする遺伝子をCo-transfectionすることにより生細胞でのカルシウム動態のアッセイ系として利用できる。これにより、成長分化など長期観察の必要な実験系でもカルシウム胴体測定が可能となる。本年度は以下の実験を行った。実験1:エクオリン遺伝子導入トランスジェニックマウスにおける神経細胞内カルシウム動態の計測。カルシウム結合蛋白であるアポエクオリン遺伝子を、Neuron Specific Enoraseプロモータの下流に組み込んだマウスの脳組織を用い、基質セレンテラジンと反応後、カルシウム添加による発光の有無、発光量の容量依存性、発光の脳内部位特異性について検討した。その結果、トランスジェニックマウスにおいては、大脳組織で小脳や脳幹組織よりもやや強く、かつ遷延する発光が観察された。部位差の成因は不明であり、今後検討したい。ただし、基質と脳組織の反応による化学発光が相当量観察され、エクオリンの発光の容量依存性が判明できなかった。また、NSEプロモータ下流へのエクオリン遺伝子挿入がPCRにて検出できるにも関わらず、発光の観察されない例が多かった。このため、このマウスにおけるアポエクオリン蛋白合成は低いと考えられる。実験2:エクオリン遺伝子導入培養細胞系の樹立トランスジェニックマウス細胞のカルシウム発光が、経時観察可能な量に達さないため、アポエクオリン遺伝子をCMVプロモータの下流に組み込んだベクターを用い培養細胞系の確立を試みた。その結果、NIH3T3細胞への導入で、カルシウム添加で10^2-10^3倍のフラッシュ状発光を示す3細胞系を樹立した。この細胞は、生理的濃度の塩化カリウム刺激にも、容量依存性に発光することが分かった。今回樹立した細胞系での発光は、細胞が独自に合成したカルシウム結合蛋白の発光であるため細胞障害性が全くない。これを利用することにより、生きた細胞での細胞内カルシウム動態観察が、ほぼ無制限に行うこと可能となった。来年度は、さらに、受容体蛋白のco-transfection等により、ホルモンや伝達物質の刺激による細胞内カルシウム動態の研究に応用していきたい。CMVプロモータ下流にアポエクオリン遺伝子を組み込んだ、発現ヘクターをNIH3T3細胞に導入し、エクオリン遺伝子を高率に発現する株細胞を樹立した。