hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波ハプティックセンサ技術を用いた齲蝕リスク評価装置の臨床応用

先行運用実績もある本歯科健康診査結果登録システムを活用すると、効率よく歯単位のデータベース化が可能となり、経時的な歯の状態の変化の評価を実施するには必須の口腔健康の管理システムである。データベースで処理する情報管理システムの確立から、今後の膨大な歯の変化を追跡するための方策が確立した。また、(2)詳細な口腔内齲蝕リスク因子と現在齲蝕罹患歯数との関連の検索では、制作したデータベースの活用を考え、既存の歯科健康診査の結果を解析して、唾液中の成分解析とう蝕リスクの関連を検索した。これは実際の超音波石灰化度測定値を含む口腔内データを入力した際のリスク検出の手法を行ったととに、これまで報告のある因子が抽出されることを確認した。一方で、超音波石灰化度測定器は室温によって基本発振周波数が変動するので校正作業が必要である。しかしながら、当教室所有の超音波石灰化度測定器は室温変化による読み出し値の変動に対する校正作業中に動作が不安手になり、超音波測定子の再制作を余儀なくされた。測定子である超音波ハプティックセンサはオーダーメイドであり、その再制作にはある程度の時間が必要になり、結果的には実験の進行が停滞して計画していた実験の達成度に問題を残した。現在は修理が完了しているので、実験の再開と平成23年度の実験の未完了の部分を至急に完了させて行く予定である。前述のように、当研究室で所有する超音波石灰化度測定器の超音波ハプティックセンサの故障により平成23年度の実験の一部が未完了の状態である。この部分のデータと解析結果は、平成24年度の実験に直接影響を与えるので、平成24年度の8月までに完了させ、同時に平成24年度の実施計画である、(3)抽出された口腔内齲蝕リスク因子による大規模横断調査を同時に実施する。これまでの(2)詳細な口腔内齲蝕リスク因子と現在齲蝕罹患歯数との関連の検索の実験のデータ解析から、(3)抽出された口腔内齲蝕リスク因子による大規模横断調査に必要な基礎的データは一部収集が完了しているので、同時に実施しする(2)詳細な口腔内齲蝕リスク因子と現在齲蝕罹患歯数との関連の検索の実験の結果の統計処理を行いながら、当研究室の実施する歯科健康診査の場で、データ収集を行っていく。以上から、当初の実験計画は以下のように変更を加える。平成23年度実施している、(1)口腔内齲蝕リスク因子の検査法の確立、及び、(2)詳細な口腔内齲蝕リスク因子と現在齲蝕罹患歯数との関連の検索は、平成24年度前期継続実施実施とする。(3)抽出された口腔内齲蝕リスク因子による大規模横断調査の研究は、平成24年度実施実施開始とする。本申請の研究に引き続いて実施する継続研究として、(4)齲蝕リスク評価児童の追跡調査の実験を行う。現在の歯科健康診査のデータベースを考えると、この変更した実験計画は平成24年度に当研究室サイドでは問題なく実施可能であるが、歯科健康診査を実施する場を探す際には、時間的制約を考えて実施しなければならない。平成23年度に実施する予定の実験の内、(1)口腔内齲蝕リスク因子の検査法の確立の実験、(2)詳細な口腔内齲蝕リスク因子と現在齲蝕罹患歯数との関連の検索に関して、積み残しの実験を実施する。即ち、再度超音波石灰化度測定器の動作確認と温度校正を実施した後に、石灰化測定値の読み取り値の正確性を確認した的に、う蝕の発生要因に関する疫学調査調査の調査項目の測定法の確認を行う。
血中小粒子高比重LDL（sdLDL）生成におけるリパーゼの役割

平成30年度はリポ蛋白リパーゼ(LPL)と肝性リパーゼ(HTGL)の酵素活性測定法の自動化の研究を進めた。これまで中性脂肪(TG)代謝の中心的役割を担っているLPLとHTGLの酵素活性測定法には放射性同位元素を含む試薬が必要であった。この方法は研究や少数の検体を対象としており、多数の患者検体の評価を同時に行うことは困難であった。従って放射性同位元素を用いることなく多数の患者検体を同時に処理できる酵素活性測定法の確立が望まれていた。我々はLPLとHTGLそれぞれの酵素活性を放射性同位元素の使用を必要としない比色法を用いて自動化することに成功した。我々の確立した方法では3μLと極少量の患者血漿を用いて10分間という短時間で酵素活性が測定できる。この方法の変動係数(CV)はLPLで1.0-3.6%、HTGLでは1.0-1.1%と良好な結果が得られた。この酵素活性測定を用いて冠動脈カテーテル検査(CAG)を受けた患者血漿を用いてLPLとHTGLの酵素活性の変動を調べた。CAGではカテーテル挿入後にヘパリン投与を行う。LPLとHTGLの濃度はともにヘパリン投与15分後に最大値になり4時間後、24時間後にはヘパリン投与前と同じレベルに戻った。それぞれの酵素活性はヘパリン投与15分後に最大値になりヘパリン投与前、投与4時間後と24時間後では測定感度以下に低下していた。LPLとHTGLのヘパリン投与15分後の酵素活性とヘパリン投与前の酵素濃度はそれぞれ有意な正の相関を示した。この研究成果につき論文発表を行った。研究計画通りに研究協力者の登録が進行しており、必要な例数が集まりつつある。研究協力者から採取した血漿・血清を用いてsdLDL、LDL、HDL、TG、LPL、GHPIHBP1およびHTGLの濃度測定を進めている。平成30年度の実績報告の通り少量の患者血漿を用いて10分間という短い時間でLPLとHTGLそれぞれの酵素活性が測定できる方法の確立に成功した。更にこれらのLPLならびにHTGLの酵素活性測定法を用いて研究協力者の血漿の酵素活性の測定を行った。この成果を研究論文として学術誌に発表した。以上のことから本研究は順調に進展していると考える。当初の研究計画の通り、200名の研究協力者の登録を目指して研究を続ける。協力者の血漿・血清サンプルが一定数になった時点でsdLDL、LDL、HDL、TG、LPL、GHPIHBP1およびHTGLの濃度測定を進め、結果の統計解析を進めていく。研究協力者は既に脂質代謝に影響する薬剤の投与が始まっている例も多く存在するため既往歴、内服薬等、本研究に影響を与えると考えられる情報の収集を進める。情報収集と解析は個人情報管理に留意して注意深く進めていく。血管内皮にはカイロミクロン、VLDLおよびLDL代謝に必須であるLPLやHTGLが結合しているがこれらのリパーゼとリポ蛋白生成の制御機構は明らかでない。本研究ではヘパリン投与によりLPLおよびHTGLが血管内皮細胞から血中に遊離した後の血中sdLDL、LPL、HTGLおよびRLP-C濃度の変動を調べることで血中でのsdLDL生成の制御系を解明し、冠動脈疾患とsdLDL、レムナント、LPLおよびHTGLとの関連を明らかにすることを通じてこれまで我々が提唱してきた「コレステロール逆輸送と独立した血管内皮機能調節による抗動脈硬化作用」を発展させ、血管内皮機能と関連した動脈硬化症発症メカニズムの一つとして「リパーゼによるsdLDL生成制御系の解明」を目指している。平成29年度は研究対象者100名の検体採取を終了した。これらの検体の血中sdLDL、RLP-C、LPLおよびHTGLの測定を終了した。LPLとHTGL濃度はともにヘパリン投与15分後に上昇し、4時間後にヘパリン投与前の濃度に低下した。ヘパリン投与前と15分後のLPL、HTGL濃度の間にはそれぞれ正の相関を認めた。一方でRLP-C、sdLDL-C濃度はともにヘパリン投与15分後に低下し、4時間後にヘパリン投与前の濃度に戻った。LPL濃度はRLP-C、sdLDL-C濃度と逆相関、HDL-C濃度と正の相関を示し、HTGL濃度とRLP-C、sdLDL-C濃度と間に正の相関を認めた。心臓カテーテル検査の結果、67症例が冠動脈疾患(CAD)と診断された。対象症例から糖尿病、維持透析症例を除いた53症例(非CAD24例、CAD29例)で検討した結果、ヘパリン投与前後のHTGL濃度比(post-/pre-heparin ratio)がCAD群で有意に高値を示した。これらの結果を学会で報告し、論文発表も行った。当初の研究計画通り100名の研究協力者から採血を行い、血液サンプルを採取した。採取したサンプルにおけるRLP-C、LPL、HTGLおよびsdLDLの測定を実施した。sdLDL測定では感度以下の濃度の検体が多数認められた。これらの検体をチェックするとフィブリンが多く析出していた。フィブリンが測定に影響している可能性が高いと考え、遠心処理を行い上清中の濃度を測定すると問題なくsdLDL濃度を測定することができた。

このように測定系の問題が新たに発見されたが、遠心処理で測定が可能になることを見出し、問題解決につながった。他の測定項目は問題なく測定できた。従って当初の研究協力者100名の目標を達成できたこと、また予定していた脂質ならびにリパーゼの測定項目が予定通り測定できたこと、更に29年度中に得られた成果を学会で報告し、論文発表している。これらの3点から本研究の初年度の評価はおおむね順調に進展していると判断できる。平成30年度はリポ蛋白リパーゼ(LPL)と肝性リパーゼ(HTGL)の酵素活性測定法の自動化の研究を進めた。これまで中性脂肪(TG)代謝の中心的役割を担っているLPLとHTGLの酵素活性測定法には放射性同位元素を含む試薬が必要であった。この方法は研究や少数の検体を対象としており、多数の患者検体の評価を同時に行うことは困難であった。従って放射性同位元素を用いることなく多数の患者検体を同時に処理できる酵素活性測定法の確立が望まれていた。我々はLPLとHTGLそれぞれの酵素活性を放射性同位元素の使用を必要としない比色法を用いて自動化することに成功した。我々の確立した方法では3μLと極少量の患者血漿を用いて10分間という短時間で酵素活性が測定できる。この方法の変動係数(CV)はLPLで1.0-3.6%、HTGLでは1.0-1.1%と良好な結果が得られた。この酵素活性測定を用いて冠動脈カテーテル検査(CAG)を受けた患者血漿を用いてLPLとHTGLの酵素活性の変動を調べた。CAGではカテーテル挿入後にヘパリン投与を行う。LPLとHTGLの濃度はともにヘパリン投与15分後に最大値になり4時間後、24時間後にはヘパリン投与前と同じレベルに戻った。それぞれの酵素活性はヘパリン投与15分後に最大値になりヘパリン投与前、投与4時間後と24時間後では測定感度以下に低下していた。LPLとHTGLのヘパリン投与15分後の酵素活性とヘパリン投与前の酵素濃度はそれぞれ有意な正の相関を示した。この研究成果につき論文発表を行った。研究計画通りに研究協力者の登録が進行しており、必要な例数が集まりつつある。研究協力者から採取した血漿・血清を用いてsdLDL、LDL、HDL、TG、LPL、GHPIHBP1およびHTGLの濃度測定を進めている。平成30年度の実績報告の通り少量の患者血漿を用いて10分間という短い時間でLPLとHTGLそれぞれの酵素活性が測定できる方法の確立に成功した。更にこれらのLPLならびにHTGLの酵素活性測定法を用いて研究協力者の血漿の酵素活性の測定を行った。この成果を研究論文として学術誌に発表した。以上のことから本研究は順調に進展していると考える。研究計画では29年度と30年度の2年間で200例の研究協力者の登録を目指している。今後も研究協力者の確保に努め、症例数の増加を目指していく。また、測定結果の詳細な解析のために患者情報の採取と解析を進めていく。研究協力者として想定してい対象群は冠動脈疾患の存在が疑われるため既に降圧薬やスタチンなどの脂質代謝を改善する薬を内服しているものが多いため研究協力者の背景を詳細に解析することが必須と考え、患者情報を詳細に収集し検討を進めている。当初の研究計画の通り、200名の研究協力者の登録を目指して研究を続ける。協力者の血漿・血清サンプルが一定数になった時点でsdLDL、LDL、HDL、TG、LPL、GHPIHBP1およびHTGLの濃度測定を進め、結果の統計解析を進めていく。
スライスパッチ法の改良と同法を用いた海馬抑制性ニューロンの作動分子機構の研究

1.海馬ニューロンおよびシナプス形成がほぼ完成する生後16-20日齢のラットより脳切片をノマルスキー顕微鏡下に海馬歯状回の局所性抑制ニューロン(Basket cell)と中継型興奮ニューロン(Granule cell)を同定した。これらのニューロンに対してナイスタチン穿孔パッチ法および通常のパッチ電極法を用いてWhole-cellの電位同定を試みた。2.セロトニン(2-50μM)をY-チューブよりこれらの細胞に局所投与したところ、約90%のBasket cellからは、内向き電流が誘発された。この電流はセロトニン3型受容体に直接カップルする陽イオン選択性チャネルの開口によるものであることが判明した。3.セロトニン3型受容体と他の受容体とを比較するため巨核球のアデノミン2燐酸(ADP)受容体の特性を調べた。ラットまたはモルモットの巨核球において、ADP(1μM-100μM)を小型化したY-チューブ法により投与すると、一過性の内向き電流とゆっくりした外向き電流が誘発された。前者は陽イオンチャネルの開口によるもので、後者はCa^<2+>-依存性K^+チャネルの開口によるものであることが判明した。4.前者について、マウス巨核球を用いて更に詳しく調べたところ、セロトニン3型受容体と共通の特性(陽イオン透過性/速い脱感作/受容体-チャネル複合型分子構造)が見い出された。5.ニューロンと巨核球の間にこのような類縁性が有る事は、受容体の作動分子機構やそれらの分子進化の観点からも極めて興味深い。上述の標本に対し、outside-out法やcell-attached法の改良を試み、受容体分子機構を更に詳しく解析した。1.海馬のニューロンおよびシナプス形成がほぼ完成する生後16-20日齢のラットより脳切片を作った。ノマルスキー顕微鏡下に海馬歯状回の局所性抑制ニューロン(Basket cell)と中継型興奮ニューロン(granule cell)を同定した。ルシファーイエロー(3%)の細胞内染色を行い、ニューロンの同定と突起形態を確認した。2.Whole-cellの電位固定法を用い、これらのニューロンの膜電流記録を行った。両タイプのcellにおいては、自発性のCl^-電流が検出され、これは10μMのビククリンで可逆的に抑制されたので、GABA性の自発性シナプス入力によるものと結論した。3.セロトニン(2-50μM)をY-チューブよりこれらのニューロンに局所投与したところ、約90%のBasket cellからは、内向き電流が誘発された。Granule cellには、この応答は認められず、この受容体は、Basket cellに選択的に発現していると結論した。4.このセロトニン受容体-イオンチャネルの特性として、外液のCa^<2+>のMg^<2+>はOpen channel型ブロックを、クラーレとアトロピンはそれぞれnon-competitive及びcompetitiveブロックを示す事が判明した。5.セロトニン3型受容体と他の受容体とを比較解析するため巨核球のプリン受容体及び海馬分離ニューロンのグリシン受容体の特性を調べた。1.前年度にひきつづいて、海馬ニューロンおよびシナプス形成がほぼ完成する生後16-20日齢のラットより脳切片をノマルスキー顕微鏡下に海馬歯状回の局所性抑制ニューロン(Basket cell)と中継型興奮ニューロン(granule cell)を同定した。これらニューロンに対してナイスタチン穿孔パッチ法および通常のパッチ電極法を用いてWhole-cellの電位同定を試みた。

この電流はセロトニン3型受容体に直接カップルする陽イオン選択性チャネルの開口によるものであることが判明した。3.セロトニン3型受容体と他の受容体とを比較するため巨核球のアデノミン2燐酸(ADP)受容体の特性を調べた。ラットまたはモルモットの巨核球において、ADP(1μM-100μM)を小型化したY-チューブ法により投与すると一過性の内向き電流とゆっくりした外向き電流が誘発された。前者は陽イオンチャネルの開口によるもので、後者はCa^<2+>-依存性K^+チャネルの開口によるものであることが判明した。4.前者につきマウス巨核球を用いて更に詳しく調べたところ、セロトニン3型受容体と共通の特性(陽イオン透過性/速い脱感作/受容体-チャネル複合型分子構造)が見い出された。5.ニューロンと巨核球の間でこのような類縁性は、受容体作動分子機構やその分子進化の観点から極めて興味深い。これらの標本に対し、outside-out法やcell-attachedの改良を試み、受容体分子機構を更に解析した。
ディペンダブルなLSIの動作合成

今年度はシステムレベルからアプリケーションレベルまで,様々なレイヤーから多面的に,様々な故障に対する高信頼システムの設計技術の研究を行った.(1)ソフトエラーに対する耐故障LSI回路の動作合成手法を提案した.演算結果がレジスタに保存されている間に起こるソフトエラーの影響を考慮し,さらに,コスト・性能・信頼性の異なるいくつかの演算器を活用することで,従来の三重化に依らずに,効率良く高信頼LSIを生成する手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.(2)アプリケーションの特徴を最大限活用し,ソフトエラー耐性を保証するための最小限のエラーチェックをソフトウェアで行う手法を提案した.研究成果は学術論文誌に採択済みである.(3}製造ばらつきによるタイミング違反を,ハードウェアとソフトウェアの両面から補完する効率的なプロセッサの拡張手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.研究成果は本分野で最高峰の国際会議の1つであるASPDACで発表した.(4)更に,経年劣化によるタイミング違反をも考慮するよう,(3)の研究を発展させた.研究成果は本分野で最高峰の国際会議の1つであるDATEで発表した.(5)製造ばらつきによる歩留まり低下やタイミング違反を抑えるための,高位合成によるRTL回路の生成アルゴリズムを見直した.研究成果は学術論文誌に採択済みである.さらに,国際会議と国内研究会で発表した.(6)製造歩留まり低下を解決するための,極小プロセッサの提案,および,その評価を行った.本研究成果は国内研究会で発表した.(7)以上の成果について,マルチプロセッサやバイオチップなどの他分野における応用研究を行った.研究成果は国際会議で発表した.今年度はシステムレベルからアプリケーションレベルまで,様々なレイヤーから多面的に高信頼システムの設計技術の研究を行った.(1)ソフトエラーに対する耐故障LSI回路の動作合成手法を提案した.いくつかの演算器は全てのタイミングで使用されているわけではないことに着目し,三重化を構成するために新たに導入する演算器を最小限に抑え,効率良く高信頼LSIを生成する.研究成果は国内研究会および国際会議で発表した.(2)ソフトエラーだけでなく,LSIの製造ばらつきによる歩留りの低下も大きな問題である.信頼性が100%ではないハードウェア資源を活用して,LSI回路全体で高い信頼性を実現する高位合成手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.(3)(2)の手法よりさらに高い抽象度(ソフトウェア)のレベルから,アプリケーションの特徴を活用したアプローチも重要である.画像のパターンマッチングに着目し,少ない情報(ビット数)でマッチング確率を高める手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.(4)チップの微細化が進むにつれ,タイミング収束問題は益々深刻になっている.製造したLSI回路が所望の周波数を満たせない場合,不良品として破棄される(歩留りが低下する>恐れがある-所望の周波数制約を必ず満たし,かつ,LSI製造コスト(面積)を最小化する動作合成手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.本研究についての昨年度の国内研究会における発表が,情報処理学会山下研究記念賞を受賞した.(5)システムのリアルタイム性は最も重要な制約の1つである.近年スマートフォンなどの普及によりリアルタイムで提供したいサービスは益々大規模複雑化しており,ハードウェア・ソフトウェアの切り分けや並列処理技術の向上が必要である.高い並列性を出すとともに,ソフトウェアの再利用性を高めるハードウェア・ソフトウェアの協調設計手法を提案した.研究成果は国際会議2件で発表した.今年度はシステムレベルからアプリケーションレベルまで,様々なレイヤーから多面的に,様々な故障に対する高信頼システムの設計技術の研究を行った.(1)ソフトエラーに対する耐故障LSI回路の動作合成手法を提案した.演算結果がレジスタに保存されている間に起こるソフトエラーの影響を考慮し,さらに,コスト・性能・信頼性の異なるいくつかの演算器を活用することで,従来の三重化に依らずに,効率良く高信頼LSIを生成する手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.(2)アプリケーションの特徴を最大限活用し,ソフトエラー耐性を保証するための最小限のエラーチェックをソフトウェアで行う手法を提案した.研究成果は学術論文誌に採択済みである.(3}製造ばらつきによるタイミング違反を,ハードウェアとソフトウェアの両面から補完する効率的なプロセッサの拡張手法を提案した.研究成果は国際会議で発表した.研究成果は本分野で最高峰の国際会議の1つであるASPDACで発表した.(4)更に,経年劣化によるタイミング違反をも考慮するよう,(3)の研究を発展させた.研究成果は本分野で最高峰の国際会議の1つであるDATEで発表した.(5)製造ばらつきによる歩留まり低下やタイミング違反を抑えるための,高位合成によるRTL回路の生成アルゴリズムを見直した.研究成果は学術論文誌に採択済みである.さらに,国際会議と国内研究会で発表した.(6)製造歩留まり低下を解決するための,極小プロセッサの提案,および,その評価を行った.本研究成果は国内研究会で発表した.(7)以上の成果について,マルチプロセッサやバイオチップなどの他分野における応用研究を行った.研究成果は国際会議で発表した.もともとの研究計画では,ソフトエラーを対象に高信頼LSI回路の設計技術の研究を進めていく予定であったが,ソフトエラーだけでなく製造ばらつきも対象に,システムレベルおよびアプリケーションレベルからの幅広いアプローチで研究を行うことができた.今年度得られた研究成果をまとめ,国内論文誌へ論文を掲載することを目指す.今年度行った幅広い研究から,高信頼システムの構築には,ハードウェアだけでなくソフトウェアも含めたシステム全体の包括的なアプローチが非常に重要であることを再認識した.

今後も様々なレイヤーから多面的なアプローチにより,効率的・効果的に高信頼システムを設計する手法を確立することを目指す.今年度の研究をベースに拡張を行い,DACやDATEなどの一流国際会議での発表を狙う.
異種間キメラによる新たな幹細胞の多分化能評価システムと実験モデルの創成

申請者らが樹立したブタES様細胞とマウスES細胞を用いて、ニワトリ胚およびマウス胚を宿主とした異種間キメラ胚の作製を行った。ブタES様細胞はそれぞれの胚組織とのキメラは形成されず、胚体外組織に分布していた。一方、マウスES細胞とニワトリ胚による異種間キメラ作製では、ニワトリ胚組織の頭部、頚部、心臓にマウスES細胞が多く存在することが分かり、引続きキメラ解析を行っている。さらに興味深いことに、胚体外組織(卵黄曩)に分布したマウスES細胞は効率よくテラトーマを形成することが明らかとなり、少なくともマウス由来の幹細胞では多分化能を評価することが可能と思われる。ブタは家畜であるのみならず、移植・再生医療の研究分野では欠くことの出来ない実験動物に位置づけられている。本研究は、申請者らが樹立したブタES様細胞を用い、マウス胚およびニワトリ胚を宿主に集合胚を作製した後、異種間キメラの作製を行う。これにより、異種間キメラを利用した幹細胞の多分化能評価システムの開発と、新たな実験モデルの創成を目指す。H25年度は、ブタES様細胞にEF1α-EGFP(ブタES-EGFP)およびEF1α-LacZ(ブタES-LacZ)発現ベクターを導入し、安定発現細胞株を樹立した。これらを用いて以下の実験を行った。ブターマウスキメラ胚(in vitro):ブタES-EGFP(5-10細胞)とマウス8細胞期胚で集合胚を作製した後培養すると、マウス胚盤胞内部細胞塊にブタES-EGFP由来の蛍光が確認された。さらに3日間out-growth培養を行った結果、内部細胞塊由来細胞集団にも蛍光が確認された為ブタES-EGFPがマウス胚組織に寄与できることが示唆された。ブターニワトリキメラ胚(ex ovo):まずは条件検討のため、マウスES細胞(マウスES-LacZ)を放卵直後の胚盤葉にインジェクションし、3-5日後に胚を回収してLacZ染色を行った。その結果、インジェクションされる細胞数は多いほどキメラ率が高く(3×10^4 > 1×10^4)、注入量は少ないほど胚発生率が高いことが分かった(0.5 μl > 1.0 μl)。次に、1.5×10^4細胞(0.5 μl)のブタES-LacZをインジェクションし同様に解析を行ったところ、ニワトリ胚組織に分布するブタES様細胞集団を確認することが出来た。本研究は、申請者らが樹立したマウスES細胞、ブタES様細胞を用い、ニワトリ胚およびマウス胚を宿主とした異種間キメラ胚を作製し、異種間キメラを利用した幹細胞の多分化能評価システムの開発と、新たな実験モデルの創成を目指す。H26年度は以下を行った。ブターマウスキメラ胚:EGFP発現ブタES様細胞(pES-EGFP)をマウス胚盤胞期胚にインジェクション(1-20細胞)し、胚移植を行った。発生後期では死滅、発生遅延が頻発するため7日相当胚でのキメラ解析を行った。7日胚の生存率は28%、そのうち蛍光発現率は25%であった。しかし、胚組織にpES-EGFPは確認されず、胚体外組織に数個のpES-EGFPが確認されたのみであった。ブターニワトリキメラ胚: pES-EGFPを放卵直後のニワトリ胚盤葉にインジェクション(4,000細胞)し、培養を行った。3日胚の生存率は44.8%、胚組織での蛍光発現率は30.8%であったが、キメラを構成するpES-EGFP細胞数が少なく、免疫染色によるキメラ解析には進まなかった。マウスーニワトリキメラ胚:マウス胚およびニワトリ胚の発生に対してpES-EGFPの増殖速度が遅いことがネックになっていると考えられた。そこで、EGFP発現マウスES細胞(mES-EGFP)とニワトリ胚における異種間キメラ作製について検討した。7,500細胞を同様にインジェクションしたとき、3日胚と8日胚の生存率はそれぞれ100%と36%、胚組織における蛍光発現率はそれぞれ68%と30%であった。mES-EGFPは特に頭部、頚部、心臓に存在した。さらに、mES-EGFPはニワトリ胚で効率よくテラトーマを形成することが明らかになった。現在、論文化に向けて解析を進めている。

発生工学レポーター遺伝子安定発現細胞株(ブタES-EGFP、ブタES-LacZ)は、カセットベクターにネオマイシン耐性遺伝子がセットになっているため、ネオマイシン類似体であるG418による薬剤選別により安定株の樹立が可能である。しかし実際は、G418耐性であるにもかかわらずGFPやLacZが発現しない細胞株が圧倒的に多く、安定株を樹立するまでにおよそ半年を費やすこととなった。安定株樹立後は、「研究実績の概要」に記述したとおり、H25年度の研究計画はほぼ達成できた。ニワトリ胚は、発生ステージが進むにつれて内在性のβガラクトシダーゼ活性と自家蛍光が強まるため、発生初期(3日胚ー5日胚)におけるキメラ解析を行った。より詳細なキメラ解析を行うためには、器官形成期(6日胚以降)における解析を行う必要がある。次年度は、脂溶性カルボシアニン色素(DiI等)で細胞表面をラベルしたものを使用する予定である。強力な蛍光が期待されるDiIで大まかなキメラ部位を特定した後組織切片を作製し、LacZ染色による詳細な解析を行う。また、ブターマウスキメラ胚をin vivoで解析するため、集合胚を作製した後胚移植し、発生後期で回収し解析する。
イメージング・シミュレーション・オミクスによる骨格形成機構の多角的解析

本研究では、中軸骨格組織形成に関わる重要な分子群をスクリーニング・同定することを目的とした。さらに、候補遺伝子のノックアウトマウスの骨格の解析を進めた。特に進捗のあった成果として、ケモカイン受容体CCR5が骨粗鬆症の発症に重要であることを明らかにした。CCR5はHIV共受容体でありHIV治療標的分子である。CCR5の阻害薬Maravirocおよび抗CCR5中和抗体はヒト培養破骨細胞のアクチンリング形成・骨吸収活性を阻害した。CCR5KOマウスは骨粗鬆症への抵抗性を示した。これらは、CCR5を標的としたHIV治療が骨吸収性疾患に対してもメリットをもたらす可能性を示している。椎間板(線維軟骨)の分化を制御する分子の同定発生期においては、椎間板と椎体は一塊の軟骨として組織分化を始める。椎間板は線維軟骨として軟骨のまま成熟し、椎体は軟骨性化骨を経て椎骨となるが、線維軟骨の分子メカニズムは不明な点が極めて多い。これまで線維軟骨を積極的に誘導する分子は同定されておらず、椎間板を特異的にマーキングするレポーターも存在しない。そこで、本研究提案者らは、多角的解析システムを構築し、いくつかの予備データを得た。マイクロアレイ・スクリーニング解析により、いくつかの成長因子(FCGFs: fibrous cartilage growth factors、仮称)が高発現することが明らかとなった。さらに、これらの成長因子は、予定椎間板領域に特異的に発現することが蛍光免疫染色法により明らかとなった。さらに、成長因子受容体(FCGFR: fibrouscartilage growthfactor receptor、仮称)のノックアウトマウスには、椎体の過形成と椎間板の低形成があることを見出した。これらの過程で、マイクロアレイ解析の新規Validation法や、骨格系細胞の新規のイメージング解析法を構築つつある。本研究では、中軸骨格組織形成機構を理解するために、「椎体・椎間前駆細胞の空間配置」機構と「椎体・椎間の組織分化」機構に焦点をあて、それらに関わる重要な分子群をスクリーニング・同定することを目的とし、以下3つの課題を明らかにして行く。1椎間板(線維軟骨)の分化を制御する分子の同定2骨格形成前駆細胞(椎間板形成細胞群と椎体形成細胞群)の空間的配置メカニズム3椎間板および椎体形成細胞群と周囲神経および血管発生・発達の組織間相互発達メカニズム平成27年度は、これまで解析基盤である「組織学的・細胞分子生物学的解析によるマイクロアレーデータのValidation(検定)」をさらに充実させ、重要分子の同定を進めた。また、候補遺伝子のノックアウトマウスの中軸骨格における表現系を現在解析している。現在の時点での、重要な知見は、骨格発生の初期で発現している分子が、骨格恒常性の維持にも重要であるらいいことが明らかとなってきた点である。平成27年度は、これまで解析基盤である「組織学的・細胞分子生物学的解析によるマイクロアレーデータのValidation(検定)」をさらに充実させ、重要分子の同定を進めた。現在、さらなるデータマイニングを進め、さらなる候補遺伝子を検索中である。また、候補遺伝子のひとつのノックアウトマウスの中軸骨格における表現系を現在解析している。現在の時点での、重要な知見は、骨格発生の初期で発現している分子が、骨格恒常性の維持にも重要であるらしいことが明らかとなってきた点である。今後は、中軸骨格と血管を含めた周辺軟組織との相互発生における、重要分子群の既往調節解明を進めるための、準備を進めている。当初の計画に沿って、概ね順調に進展していると思われる。本研究では、中軸骨格組織形成機構を理解するために、「椎体・椎間板の空間的配置」機構と「椎体・椎間の組織分化」機構に焦点を当て、それらに関わる重要な分子群をスクリーニング・同定することを目的とし、以下の3つの課題を明らかにして行く。(1)椎間板(線維軟骨)の分化を制御する分子の同定(2)骨格形成前駆細胞(椎間板形成細胞群と椎体形成細胞群)の空間配置メカニズム(3)椎間板および椎体形成細胞群と周囲神経および血管発生・発達の組織間相互作用メカニズム平成28年度は、これまでの解析基盤である「組織学的・細胞分子生物学的解析によるマイクロアレイデータValidation(検定)」をさらに充実させ、候補遺伝子のノックアウトマウスの中軸骨格の解析を進めた。その結果、幾つかのCCケモカイン・リガンド(CCL)が、椎間板の発生・発達に重要なことを見い出し、それらの一連の受容体(CCケモカイン受容体:CCR)を遺伝的に闕失したマウス(KOマウス)の椎間板に表現系があることを発見し、これらケモカインシグナルが椎体・椎間板の恒常性維持に必須であることを明らかにした。またさらに、重要な知見として、あるCCRが破骨細胞の機能発現に必須であることを明らかにした。この過程で、CCRを介した細胞内シグナル経路が細胞骨格やシーリング・ゾーンの形成に関わることを明らかにした。さらに、この分子経路が、骨粗鬆症や関節リウマチなど骨吸収性疾患に関与するらしいことも明らかにしつつある。これらの観察は、ケモカインシグナル関連分子が本研究で同定を目的とした分子群であることを分子オミクス解析で明らかにし、さらにKOマウスの表現系からこれらの解析が正しいことをValidationできたことを示していた。これらの成果の一部は、現在論文として投稿中である。

平成28年度の主な進捗は、一連の受容体(CCケモカイン受容体:CCR)が椎間板に表現系があることを観察し、さらに、重要な知見として、あるCCRが破骨細胞の機能発現に必須であることを明らかにした点である。この過程で、CCRを介した細胞内シグナル経路が細胞骨格やシーリング・ゾーンの形成に関わることを明らかにした。さらに、この分子経路が、骨粗鬆症や関節リウマチなど骨吸収性疾患に関与するらしいことも明らかにしつつある。これらの成果は、現在論文として投稿中であり、リバイス対応を急いでいる。本来の椎体・椎間板の分化研究からは多少フォーカスが逸脱したことは否めないが、本研究で明らかにした分子シグナルは、炎症性疾患および骨代謝疾患との関連で重要な薬剤標的シグナルであることも明らかしてきた。これらの成果は、論文として投稿し、現在リバイス対応中である、従って、概ね順調な進展だと思われる。本研究では、中軸骨格組織形成機構を理解するために、「椎体・椎間板の空間的配置」機構と「椎体・椎間の組織分化」機構に焦点を当て、それらに関わる重要な分子群をスクリーニング・同定することを目的とし、さらに、候補遺伝子のノックアウトマウスの骨格の解析を進めた。そのうち特に進捗のあった成果として、ケモカイン受容体CCR5が破骨細胞の機能発現に必須であることを明らかにし、論文として報告した(Lee et al., Nature Communications, 2017)。さらに、本研究成果は、朝日新聞や愛媛新聞、NHKで報道された。以下、骨格系の恒常性維持と病態におけるCCR5の機能に関する知見を概説する。臨床疫学調査からHIV共受容体であるCCR5の機能低下は、リウマチのみならず骨粗鬆症に対しても抵抗性を示すらしいことが報告されてきたが、その実験医学的な裏付けは不明であった。CCR5の機能喪失による骨代謝への影響を調べた結果、CCR5の阻害薬Maravirocおよび抗CCR5中和抗体はヒト培養破骨細胞のアクチンリング形成・骨吸収活性を阻害した。CCR5KOと同腹の野生型マウスを用いた骨粗鬆症モデル実験において、KOマウスでは骨量が減少せず骨粗鬆症への抵抗性を示した。さらに、CCR5はRANKLやインテグリンを介したシグナルと共役して、破骨細胞の細胞骨格と運動性を調節すること、その際、small GTPasesであるRacおよびRhoの活性化が重要かつ必要十分であることを明らかにした。これらの観察結果は、上記の疫学研究を裏付ける結果であり、CCR5を標的としたHIV治療が骨吸収性疾患に対してもメリットをもたらす可能性を示している。中軸骨格や関節における、上記ケモカインおよびケモカイン受容体の機能に関しては、引き続き解析を進めている。本研究では、中軸骨格組織形成に関わる重要な分子群をスクリーニング・同定することを目的とした。さらに、候補遺伝子のノックアウトマウスの骨格の解析を進めた。特に進捗のあった成果として、ケモカイン受容体CCR5が骨粗鬆症の発症に重要であることを明らかにした。CCR5はHIV共受容体でありHIV治療標的分子である。CCR5の阻害薬Maravirocおよび抗CCR
フォトニック結晶としてのコロイド微粒子集合体の光物性

平成10年度12年度の3年度にわたる本研究の最終年度として、下記の研究計画を実施し、いずれについても所期の実績を挙げることができた。[1]粒径10.5μmの各種の単分散テラックス粒子を用い独自の自己組織膜作製技術を確立することができた。[2]このようにして作製された六方細密構造の単層膜での粒子配列構造の規則性を、光学顕微鏡像、原子間力顕微鏡像、レーザー光回析像によって詳細に調べ、配列膜試料の品質評価を行った。その結果として得られた知見を上記の試料作製技術にフィードバックし、さらに品質の向上を計った。[3]配向性がきわめて優れたラテックス単層膜を用い、細心の注意をはらって、従来にない広範な波長範囲にわたる偏光透過スペクトルを測定し、その角度依存性から、フォトニック・バンド構造に関するきわめて詳細な実験データを得ることができた。[4]上記の実験的フォトニック・バンド構造を、ベクトル球面波展開法に基づく精密な理論的計算の結果と比較検討した。実験・理論の結果の間にはきわめてよい一致が見られることが確認された。[5]スペクトル形状に関しては実験と理論の間の不一致を解明するため、実験上では試料品質と測定条件の改良を加え、理論的には基板の影響を考慮したモデルによる計算を行った結果、実測の透過スペクトルの形状が理論計算の結果と、ほぼ完全に一致した。[6]上記の研究成果により、誘電体球よりなる擬2次元フォトニック結晶のフォトニック・バンドに関し、国際的レベルでももっとも精密かつ信頼性の高い知見を得ることができた。本研究の第2年度にあたる平成10年度の研究実績は、以下のごとくである。[1]コロイド微粒子の配列集合体試料の作製技術の確立.誘電体の球状微粒子として、本研究ではポリスチレン微小球(ラテックス)を使用し、市販および独自に合成した粒径0.35.0μmの試料を用い、自己集積法により基板(ガラス、金属)の表面上に規則的に粒子が配列した2次元配列膜を作製してきた。本年度は、従来の方法(ロウ型を用いたバッチ法)の欠点を改善するため、試料容器より適当な濃度のラテックス懸濁液を供給しながら、基板を連続的に移動させ、液に濡れた表面でラテックス微粒子を自己組織的に配列させる方法を工夫した。作製した試料の構造を光学顕微鏡、原子間力顕微鏡により評価し、作製条件を最適化することによって、従来法に比べて遥かに広面積で秩序的配列をもった試料を作製することに成功した。[2]2次元球状微粒子配列膜でのフォトニック・バンド構造の実験的検出と解析.上記の方法によって作製された試料を用いて、配列構造の特定の方向を軸として試料面を回転させながら、広い波長範囲にわたって斜入射偏光透過スペクトルを測定した。その結果、スペクトルに見られる極小、極大構造の位置が偏光方向(s,p偏光状態)に依存して、試料面の回転とともに特有の波長移行を示すことを見出だした。この結果を解析して、単層ラテックス膜でのフォトニック・バンド構造の波長分散を実験的に求めることができた。これは、光波長領域での2次元フォトニック結晶での最初の測定例である。この実験と平行して、同じモデル系でのフォトニック・バンド構造の理論的な計算を行い、実験結果の解析を進めている。水の自然蒸発によって水中に懸濁したコロイド微粒子間に働く引カ的な相互作用を利用して、数μmからサブμmの広い粒径のラテックス・コロイド粒子を、ガラスなどの透明誘電体基盤上に自己組織的に配列させ、広い範囲にわたる規則的な六方細密構造をもつ2次元結晶を作製した。その粒子配列構造を光学顕微鏡、走査型原子間力顕微鏡、レーザー光回折パターンによって詳しく評価した。斜入射光に対する偏光透過スペクトルを広い波長領域にわたって測定し、そのスぺクトル構造から、規則的に配列した透明誘電体微小球よりなる擬

2次元フォトニック結晶のフォトニック・バンド構造を実験的に始めて決定した。他方、ベクトル球面波法による理論的モデルに基づいて、その理論的フォトニック・バンド構造を精密に計算した。実験結果と理論的計算結果は、任意的な調整パラメーターを導入することなく、定量的にきわめてよく一致することを確認した。また、発光性の有機色素を添加したラテックス粒子を混合した2次元配列膜を作製し、走査型光近接場顕微鏡を用いて、規則的に配列したラテックス微拉子の間を伝搬するフォト二ック・バンド・モードの特性を実験的に調べた。その結果は理論モデルによる計算結果と半定量的に一致する。さらに、ミリ波電磁波領域で透明なシリコン窒化物の球状粒子を直鎖状に並べた擬1次元フォトニック結晶を作製し、偏光したミリ波に対する透過スペクトルを測定し、誘電体球よりなる擬1次元フォトニック結晶のフォトニック・バンド効果について実験的知見を得た。3年度にわたる本研究の最終年度として下記の研究計画を実施し、いずれも所期の実績を挙げることができた。[1]粒径10.5μmの各種の単分散ラテックス粒子を用い独自の自己組織膜作製技術を確立することができた。[2]このようにして作製された六方細密構造の単層膜での粒子配列構造の規則性を、光学顕微鏡像、原子間力顕微鏡像、レーザー光回折像によって詳細に調べ、配列膜試料の品質評価を行った。その結果として得られた知見を上記の試料作製技術にフィードバックし、さらに品質の向上を計った。[3]配向性がきわめて優れたラテックス単層膜を用い、細心の注意をはらって、従来にない広範な波長範囲にわたる偏光透過スペクトルを測定し、その角度依存性から、フォトニック・バンド構造に関するきわめて詳細な実験データを得ることができた。[4]上記の実験的フォトニック・バンド構造を、ベクトル球面波展開法に基づく精密な理論的計算の結果と比較検討した。実験・理論の結果の間にはきわめてよい一致が見られることが確認された。[5]スペクトル形状に関しては実験と理論の間の不一致を解明するため、実験上では試料品質と測定条件の改良を加え、理論的には基板の影響を考慮したモデルによる計算を行った結果、実測の透過スペクトルの形状が理論計算の結果と、ほぼ完全に一致した。[6]上記の研究成果により、誘電体球よりなる擬2次元フォトニック結晶のフォトニック結晶でのフォトニック・バンドに関し、国際的レベルでももっとも精密かつ信頼性の高い知見を得ることができた。
数学者によるモデリングの漸次的進行を支える原場面の機能に関する実証的研究

2018年9月25日に,図書『原場面に着目した数学的モデリング能力に関する研究ーフッサール現象学の方法と応用反応分析マップを援用してー』を刊行した。本書は研究代表者がこれまで取り組んできた研究成果をまとめたものであり,問題解決過程の実際を視覚化する方法である応用反応分析マップには解決者の原場面を反映させている。応用反応分析マップでは現実に関係する原場面と数学に関係する原場面を区別しており,本研究課題の核心となる数学の臨界を射程に入れたモデリングの議論が可能となる。埼玉大学教育学部において解析学を担当している教員(専門分野は不等式や力学系)を被験者とするモデリング実験調査の準備を進めた。研究成果の発信について,当初の計画では2019年11月に開催予定の日本数学教育学会第52回秋期研究大会において発表をおこなう予定であったが,2019年6月16日に金沢大学で開催される日本数学教育学会第7回春期研究大会の創成型課題研究「数学的モデリングサイクルと統計的探究プロセスの過程の関連性」において発表をおこなうことにした。既に,論文発表「モデリングにおける数学の臨界を議論する上での諸課題ーWerner Blumが関わる図式における『Grundvorstellungen』や場面モデルに着目してー」の許諾を得ている。当初の計画では,埼玉大学理学部教員(解析学専門)を被験者とするモデリング実験調査をおこなう予定でいたが,被験者を埼玉大学教育学部において解析学を担当している教員(専門分野は不等式や力学系)に変更し,2019年4月に実験調査を実施することになった。以上より,「おおむね順調に進展している」と判断した。新たな被験者を対象とするモデリング実験調査について準備を進めていく。
農業生産の高付加価値化に関する協力研究-チェン・マイ地方を事例に-

本研究の目的は、チェン・マイ地方を対象に、北部タイ地域の農産物の付加価値を高めるためにはどのような改善策が必要かを究明することである。現地のメチョ-大学研究者との事前協議により次の各研究課題を策定し、大学間協力研究を実施した。(1):両国の作物生産における水環境の相違点および対処法(2):熱帯地方における野菜の耐暑性・耐虫性遺伝資源の探索と導入(3):暑熱環境下における家畜生産の問題点、高品質飼料生産の可能性(4):複合化が進むチェン・マイ地方の農業経営のあり方(5):施設園芸におる環境制御本年度は、(1)、(2)、(4)の研究課題について日本から3名の研究分担者を11日間(1995年12月5日12月15日)派遣し、また、タイからはメチョ-大学の3名の研究分担者を、(2)、(5)の研究課題について11日間(1995年9月23日10月3日)、(3)の研究課題について13日間(1995年9月23日10月5日)招へいし、両大学間の協力研究および学術交流を遂行した。1.(1)の課題研究では杉本が、メチョ-大学公開セミナーにおいて、過剰な土壌水分が根の発育阻害を通じて作物の収量および品質を低下させるとの研究成果を発表し、討論会を開催した。また、大学研究圃場、付属農場、園芸試験場などの現地調査を行い、高品質野菜生産の可能性について研究討議を実施した。一方、愛媛大学においては、高瀬が、平野部における地下水の水収支構造の研究から、平野部が都市化するに伴い、チェン・マイ地方でも水収支が不安定化することについて、また、上堂がWateruse efficiencyの研究から、作物の水利用効率に影響する環境要因と、遺伝的体内要因について、学術交流を行った。2.(2)の課題研究では加藤が、野菜・花卉の交配育種について発表し、今後の農産物生産には付加価値の高い新品種の開発が不可欠であるとの観点で討論を進めた。招へい研究分担者KITROONGRUANGは、愛媛大学公開セミナーで、タイ産メロンの地方種と導入種には耐虫性と耐病性に多様性があるとの研究発表を行い、これらに耐性の品種育成過程について討論がなされた。さらに、四国農業試験場でバイテク会議に出席し、応用研究について知見を深めた。3.(3)の課題研究では招へい研究分担者THONGWITTAYAが、アヒル飼育の研究で可消化性植物繊維が生産性向上に寄与することを愛媛大学公開セミナーで発表し、畜産学研究者と討議を重ねた。また、養鶏団地や肉加工工場を現地調査して研究資料を収集した。これらは研究成果の取りまとめに役立ちつつある。4.(4)の課題研究では中安が、日本における農業経営の複合化と農産物の販売戦略について公開発表し、討論会を開催した。また、北部タイの生産農家、チェン・マイ市周辺の選果場、市場・商店を現地調査し、農業経営状況および農産物流通状況を視察した。今後は、タイにおける需要の高度化にも対処すべく、付加価値を高める農産物を開発すること、その生産時期や販売方法に関する調査分析が重要であることなどについて検討会を開催した。5.(5)の課題研究ではタイの研究分担者EANGKOONCHORNが、北部タイでの一般的施設園芸における環境制御について研究発表し討論した。また、愛媛大学の制御化農業実験施設を視察し、久万町の高原野菜生産農家でトマトやピ-マンの生産状況を現地調査し、夜冷温と果実の品質との関係について指針を得た。以上のように、各課題毎の研究はおおむね当初の計画通り遂行された。本研究で得た各研究者の現地経験は、今後の各自の研究活動に、また、一層緊密な協力研究・学術交流にその成果が活かされることが期待される。研究代表者は、この研究期間中に、メチョ-大学研究分担者が推薦した2名の留学生を短期留学推進制度により受け入れることが出来た。さらに、招へい研究者のTHONGWITTAYAは、この研究期間中に、研究分担者の示唆により博士論文を纏め、愛媛大学連合農学研究科に学位を申請し、予備審査を修了したことを付記しておきたい。1.(1)の課題

研究では杉本が、メチョ-大学公開セミナーにおいて、過剰な土壌水分が根の発育阻害を通じて作物の収量および品質を低下させるとの研究成果を発表し、討論会を開催した。また、大学研究圃場、付属農場、園芸試験場などの現地調査を行い、高品質野菜生産の可能性について研究討議を実施した。一方、愛媛大学においては、高瀬が、平野部における地下水の水収支構造の研究から、平野部が都市化するに伴い、チェン・マイ地方でも水収支が不安定化することについて、また、上堂がWateruse efficiencyの研究から、作物の水利用効率に影響する環境要因と、遺伝的体内要因について、学術交流を行った。2.(2)の課題研究では加藤が、野菜・花卉の交配育種について発表し、今後の農産物生産には付加価値の高い新品種の開発が不可欠であるとの観点で討論を進めた。招へい研究分担者KITROONGRUANGは、愛媛大学公開セミナーで、タイ産メロンの地方種と導入種には耐虫性と耐病性に多様性があるとの研究発表を行い、これらに耐性の品種育成過程について討論がなされた。さらに、四国農業試験場でバイテク会議に出席し、応用研究について知見を深めた。3.(3)の課題研究では招へい研究分担者THONGWITTAYAが、アヒル飼育の研究で可消化性植物繊維が生産性向上に寄与することを愛媛大学公開セミナーで発表し、畜産学研究者と討議を重ねた。また、養鶏団地や肉加工工場を現地調査して研究資料を収集した。これらは研究成果の取りまとめに役立ちつつある。4.(4)の課題研究では中安が、日本における農業経営の複合化と農産物の販売戦略について公開発表し、討論会を開催した。また、北部タイの生産農家、チェン・マイ市周辺の選果場、市場・商店を現地調査し、農業経営状況および農産物流通状況を視察した。今後は、タイにおける需要の高度化にも対処すべく、付加価値を高める農産物を開発すること、その生産時期や販売方法に関する調査分析が重要であることなどについて検討会を開催した。5.(5)の課題研究ではタイの研究分担者EANGKOONCHORNが、北部タイでの一般的施設園芸における環境制御について研究発表し討論した。また、愛媛大学の制御化農業実験施設を視察し、久万町の高原野菜生産農家でトマトやピ-マンの生産状況を現地調査し、夜冷温と果実の品質との関係について指針を得た。以上のように、各課題毎の研究はおおむね当初の計画通り遂行された。本研究で得た各研究者の現地経験は、今後の各自の研究活動に、また、一層緊密な協力研究・学術交流にその成果が活かされることが期待される。研究代表者は、この研究期間中に、メチョ-大学研究分担者が推薦した2名の留学生を短期留学推進制度により受け入れることが出来た。さらに、招へい研究者のTHONGWITTAYAは、この研究期間中に、研究分担者の示唆により博士論文を纏め、愛媛大学連合農学研究科に学位を申請し、予備審査を修了したことを付記しておきたい。本研究の目的は、北部タイで求められている農業開発、地域に適した園芸・畜産の生産性改善、農業経営改善について現地の研究者と協力研究することにある。そこで、我国の西南暖地の愛媛県と北部タイのチェン・マイ地方とで気候要因および農業を取り巻く諸環境を比較検討して次の4課題に取り組むことにした。(1)両国の園芸作物生産における水利用・水管理の相違点。(2)熱帯地方における野菜の耐暑性・耐虫性の問題点。(3)暑熱環境下における家畜生産の問題点。(4)複合化が進むチェン・マイ地方の農業経営のあり方。
NMRおよびX線結晶構造解析併用による平滑筋ミオシンの構造機能連関の解析

ミオシンはアクチンとともに筋肉の収縮装置を構成し、そのATPase活性は筋肉においてAPの化学的エネルギーを力学的エネルギーへ変換する過程において主要な役割を果たしている。本研究では、分子問相互作用及び分子のミクロ環境の良いプローブである核磁気共鳴(NMR)、ならびに精密3次元構造解析が可能であるX線結晶構造解析を用いて、平滑筋ミオシンおよびキネシン、ncdについて、それらの3次元構造とATPase反応中間体の高次構造について明らかにし、ミオシンにおける化学エネルギーから力学エネルギーへの変換の機序を原子レベルで詳細に明らかにすることを目的として研究を行った。ミオシン頭部S1とADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性から、平滑筋ミオシンS1についても骨格筋ミオシンS1と同様に、S1・ADP複合体の^<31>PNMRスペクトルが観測できることが明らかとなった。測定の結果、平滑筋ミオシン頭部とADPとの相互作用は、骨格筋ミオシン頭部とADPに比べて相互作用が強く、ADPの^<31>PNMRシグナルのブロードニングが激しいと考えられた。また、ncdおよびキネシンのモータードメインとADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性を観測した結果、骨格筋および平滑筋S1と同じように低温で2種類のコンフォメーションが存在することが明らかとなった。また、ncdについては、ncd・ADP複合体はS1・ADP複合体とは異なり、ADPのα位のリンに由来するシグナルが遊離のものと区別して観測されることが示された。さらに、昆虫細胞を使って平滑筋ミオシン頭部モータードメインの発現系を構築し、野生型とATPase反応中間体を捕捉すると考えられる変異体の調製に成功した。また、ncdのATPase活性に影響を及ぼすネック領域の効果についても明らかにした。ミオシンはアクチンとともに筋肉の収縮装置を構成し、そのATPase活性は筋肉においてATPの化学的エネルギーを力学的エネルギーへ変換する過程において主要な役割を果たしている。ミオシンにおけるエネルギー変換の機序を分子レベルで理解するためには、ミオシンの3次元構造とその動的性質、ならびにATPの加水分解に伴うミオシンの高次構造の変化、とくに反応中間状態におけるミオシンの高次構造を、機能との連関において解明することが重要である。本研究では、分子間相互作用及び分子のミクロ環境の良いプローブである核磁気共鳴(NMR)、精密3次元構造解析が可能であるX線結晶構造解析、ならびにその他の分光法、生化学的手法、蛋白工学的手法を用いて、骨格筋および平滑筋ミオシン、キネシン、およびncdの3次元構造ならびにATPase反応中間体の高次構造について明かにし、それによってミオシンにおける化学エネルギーから力学エネルギーへの変換の機序を原子レベルで詳細に明らかにすることを目的とする。ミオシン頭部S1とADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性から、平滑筋ミオシンS1についても、S1・ADP複合体の^<31>PNMRスペクトルが観測できることが明かとなった。