hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIVの補助受容体利用性のシフトを予測する方法論の確立

HIVはその補助受容体利用からCCR5を利用するR5ウイルスとCXCR4を利用するX4ウイルスに分類され、病態の悪化とともにR5ウイルスからX4ウイルスヘシフトすると考えられている。本研究ではその中間体と考えられているCCR5とCXCR4を利用するR5X4ウイルスに着目してそのシフトに関与するウイルスエンベロープ部位を決定することを目的として研究を行った。まず代表的なR5X4ウイルスでCXCR4利用性優位である89.6株からin vitroでCXCR4阻害剤であるT140の添加によりウイルスに選択圧をかけ、T140に対して約5倍耐性のウイルスを分離した。このウイルスはそのエンベロープのV3領域の11番目のアミノ酸のArginineからSerineへの置換を有していた。そこで89.6株のV3領域の11番の変異ウイルスを作製し、その補助受容体利用と補助受容体阻害剤感受性を検討した。変異株ウイルスも野生株89.6と同様にCCR5とCXCR4を利用するR5X4ウイルスであったが、補助受容体阻害剤に対する感受性から、変異ウイルスはCCR5利用優位のウイルスヘシフトしていることが判明した。次に臨床から分離されたCXCR4利用優位のR5X4株であるKMT株について89.6株と同様にCXCR4阻害剤であるAMD3100耐性ウイルスを分離した。そこでこのウイルスのV3領域近傍のアミノ酸配列を確認したが、野生株のKMT株と同様の配列を示しており、この耐性株はV3領域のアミノ酸置換による補助受容体のシフトを誘導することなく耐性を獲得している可能性が示唆された。このようにシフト誘導能は感染個体内のウイルス株依存的であり、何らかの選択圧の存在下でV3領域の変異を導入してしまうと補助受容体への親和性が低下してしまうため、結果としてシフトがおこりにくい株と、V3領域にアミノ酸置換をおこしてもCXCR4ないしCCR5のいずれかの補助受容体への親和性を保つことが可能である株の存在が示唆され、本研究で開発されたアッセイ系を応用することで、試験管内でシフト誘導能を予測することが可能であることを示した。今回はその中間体と考えられているCCR5とCXCR4を利用するR5X4ウイルスに着目してそのシフトに関与するウイルスエンベロープ部位を決定した。使用した89.6株はCXCR4阻害剤での感染阻害が強く、よりCXCR4利用側にシフトしたウイルスであるが、その補助受容体利用を主に決定しているエンベロープのV3領域の単独アミノ酸置換ウイルスを作製し、そのシフトに関与している部位を決定した。以前の報告からV3領域の11番、24番、25番のアミノ酸がCXCR4利用と関連していると考えられているので、今回は89.6株のV3領域の11番、24番、25番の変異ウイルスを作製し、その補助受容体利用と補助受容体阻害剤感受性を補助受容体発現NP2/CD4細胞株を使用して検討した。いずれの変異株ウイルスも野生株89.6と同様にCCR5とCXCR4を利用するR5X4ウイルスであった。補助受容体阻害剤に対する感受性では、24番および25番の部位の変異体はすべてCCR5阻害剤では阻害されず、CXCR4阻害剤で阻害を受けることから、野生株と同様にCXCR4利用側へシフトしているウイルスであることが示された。

一方11番のアミノ酸変異ウイルスはCCR5阻害剤で阻害され、CXCR4阻害剤で阻害を受けないこと、さらにCCR5低発現細胞への感染効率が相対的に高いことより、CCR5へ比較的強い親和性を有していると考えられ、CCR5利用側へシフトしていることが判明した。以上のデータより89.6株においてはV3領域の11番目のアミノ酸が補助受容体シフトに重要であり、24番ないし25番目のアミノ酸は関与していないことが明らかとなった。HIVはその補助受容体利用からCCR5を利用するR5ウイルスとCXCR4を利用するX4ウイルスに分類され、病態の悪化とともにR5ウイルスからX4ウイルスへシフトすると考えられているが、シフトが観察されないまま病態の悪化する個体も知られており、R5ウイルスからX4ウイルスへのシフトの病態における意義はよくわかっていない。本研究ではその中間体と考えられているCCR5とCXCR4を利用するR5X4ウイルスに着目して、シフトに関与するウイルスエンベロープ部位を決定するとともに病態におけるこれらのR5X4ウイルスの意義について研究を行った。前年度はR5X4ウイルスの代表株である89.6株からCCR5を優位に使用するCXCR4阻害剤耐性株を分離し、CXCR4からCCR5へのシフトに関与している部位がV3領域の11番目のアミノ酸であることを決定した。本年度はさらに臨床から分離されたR5X4株であるKMT株のCXCR4阻害剤耐性株を分離した。分離したウイルスはCXCR4阻害剤であるAMD3100に対し、野生株と比較して約5倍耐性を示した。そこでこのウイルスのV3領域近傍のアミノ酸配列を確認したが、野生株のKMT株と同様の配列を示しており、この耐性株はV3領域のアミノ酸置換による補助受容体のシフトを誘導せず、補助受容体利用は維持したまま耐性を獲得している可能性が示唆された。現在V3領域以外の領域のCXCR4阻害剤耐性に関与する領域を確認中である。このようにシフト誘導能は感染個体内のウイルス株依存的であり、安定した補助受容体利用性を有しシフトがおこりにくい株と、補助受容体利用性が不安定でシフト誘導がおこりやすい株の存在が示唆され、インビトロでシフト誘導能を予測することが可能であることを示した。今後はさらに種々のウイルス株のシフト能力についてさらに検討を重ねていきたい。
アルツハイマー病βアミロイドペプチドのアミノ末端構造の決定と代謝に関する研究

脳に蓄積するアルツハイマー病βアミロイドペプチドは、多様な構造を示す。その意義を検討するため、標準型βアミロイド(1-40/42)以外に、アミノ末端にD体アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、ピログルタミン酸(pyroGlu)を有するものや、16アミノ酸残基のかけたものを識別する抗体を調整した。その結果、生化学的な量において、前痴呆段階老人・ダウン症患者・家族性アルツハイマー病患者・孤発性アルツハイマー病患者の全てに普遍的に存在する分子種は、1(D-Asp)-42および3(pyroGlu)-42であることがはじめて明らかになった。特に量的には、3(pyroGlu)-42が顕著である。さらに、この分子種に対するモノクローナル抗体を樹立し、酵素免疫定量法を確立した。また、修飾型βアミロイドが脳の不溶画分のみならず、可溶画分に蓄積に先行して存在することを確認した。βアミロイド蓄積機構を理解する上できわめて重要な知見であると考えられる。また、本研究によって得られたβアミロイドの構造に関する情報に基づいて、脳内のβアミロイド代謝系の律速過程に関する予測を行った。すなわち、「脳内におけるβアミロイドペプチドの分解過程の律速をアミノペプチダーゼが担う。ある種のアミノペプチダーゼ活性の低下がアミロイド代謝の停留、ひいては、蓄積の促進の促す。」という仮説(「アミノペプチダーゼ仮説」)を提唱した。D体アミノ酸やピログルタミン酸をアミノ末端に有するペプチドは、一般に、主要な細胞質外アミノペプチダーゼに対して耐性であることを根拠としている。本仮説に基づいて、アルツハイマー病の生化学的マーカーを検索したところ、有望な候補を見いだした。将来、アルツハイマー病の予防法の開発へと発展する可能性が期待される。
東南アジア大陸部・西南中国の宗教と社会変容-制度・境域・実践

本プロジェクトは13名の研究分担者と6名の研究協力者(タイ人2、中国人1、カンボジア人1を含む)が参加し、専門とする地域でそれぞれの研究主題にかんする調査を、現地の政府部局、関連研究機関との密接な連繋の下で実施した。その結果、宗教の法制度面にかんする各国の公式・非公式を含む基礎データを蒐集した(タイ、ミャンマー、カンボジア、中国雲南省、ラオス)。さらに、それぞれが自らの調査国の集落や地域でのフィールドワークを実施し、制度の運用と日常生活での実践についての詳細な資料を蓄積することができた。とくに、長らく経験的調査の空白であった社会主義国での宗教と社会にかんする中央の制度と地方での実践にかんするデータを集積・更新できたのは大きな貢献と自負する。研究主題は、タイ、中国、ミャンマー間の地政学的な国境域に焦点をあてたものと、近年の社会変化にともなう一国内の制度・実践の変容に着眼したものに分かれる。移住、開発政策、都市=農村、女性信徒の実践、経典仏教の変遷について新たな知見を得た。また、上座仏教が卓越する大陸部東南アジアでは少数者のキリスト教徒とムスリムについても同様の成果を得た。タイおよびミャンマーの山地民社会でのローカルなレベルでの布教、制度状況、首都と南部のムスリム社会の現況を解明する材料を得た。参加者全員による19本の論文を収める『報告書』は、国境域と一国あるいは制度と生活世界の狭間で多様に変容する宗教の動態を詳細に浮き彫りにしている。同報告書を基礎に、和文と英文で論集を出版公開する計画はすでに進めているが、本プロジェクトの成果の一部は、来る6月の第75回東南アジア史学会大会(名古屋大学)でのパネル報告として初公表される。現地調査は以下のように実施された。8-9月:タイ国家仏教庁と仏教制度改変、カンボジア仏教のサンガ組織と宗教行政法制度(林)、タイのキリスト教組織、北部山岳民社会の教区の実態(西本)、東北タイにおける開発僧の個人史(ピニット)、12-1月:南タイ・ムスリム組織の変容過程(黒田)、タイ=ミャンマー国境のシャン仏教組織とタイ国サンガとの関係(村上)、2-3月:タイと中国で仏教徒の地域間交流の参与観察(林)、ミャンマーのバプテスト、カトリック教会の編成(速水)、タイ・チェンマイからみた西双版納仏教徒との交流(長谷川)、タイ・キリスト教ラフ人集落の宗教実践(西本)について、それぞれ聴取、参与観察、文献蒐集を実施した。併せて、カンボジア・プノンペンおよび市郊外の仏教に関連する古文書(ソテア)、中国西双版納の祭祀文書の蒐集と仏教儀礼変容(楊)に関する調査を実施した。また、研究分担者に同行した研究協力者4名がカンボジア、ミャンマー(8-9月、3月)、中国とタイ(2-3月)で、それぞれ研究関連機関で資料蒐集、集落で開催された儀礼の参与観察に参加した。SARS禍で中止を余儀なくされた渡航の代替処置として、個々の研究主題に関わる文献資料調査を実施するとともに(カンボジア=高橋、ベトナム=柳澤、中国=長谷川)、全体の成果公表に関わるデータベースを検討した。二度の国内研究会では渡航開始前の7月に研究主題と対象地域を検討、2月に調査成果報告を実施した。同会には京都大学東南アジア研究センター客員研究者(米国1、タイ2)も合流、蒐集資料の分析、次年度以降の調査指針を検討した。総括すれば、上記調査対象地の仏教、キリスト、イスラームに関する法制度、組織編成、国境間での信徒間の交流実態、観光化や国策による祭祀の動態について、最新の基礎資料と新しい知見を獲得した点で研究成果としてはもちろん、今後に向けてきわめて順調なすべりだしをすることができたといえる。

8-9月:北タイ地域のキリスト教徒社会と宗教政策(西本)、カンボジア在家女性修行者の組織(高橋)、南タイ・マレーシア北部の仏教徒マイノリティとムスリム社会の変容(黒田)、1-3月:東北タイ地域文化政策と宗教(林)、中国雲南省徳宏地区における仏教制度と宗教政策(長谷川)、同地域における出家行動と仏教徒の活動(林)、カンボジア在家女性修行者の個人史(高橋)、今年度よりの分担者による雲南=北タイの華人ムスリム社会の変容(王)、北タイの漢人社会における移動と宗教と民族意識(兼重)について、それぞれ関連省庁、研究機関および調査対象地域、農村において聴取、参与観察、文献蒐集を実施した。併せて、2月から3月にかけてカンボジア・プノンペンおよびシェムリエップの仏教に関連する古文書(ソテア)、中国雲南省西双版納・徳宏における仏教徒社会の変容(楊)に関する調査、東北タイにおける開発僧の組織(ピニット)に関する調査を行った。また、研究分担者に同行した研究協力者のべ4名がそれぞれミャンマーの仏教サンガ法令、ミャンマーのケントゥンにおけるシャン仏教寺院組織(8-9月)、中国=ビルマ国境の仏教徒の活動、タイ・コラートのヤーモー信仰(3月)について基礎資料の蒐集、儀礼の参与観察を実施した。国内の研究会を二度(7月、2月)開催し、初回は前年度の成果公表と新規分担者を加えての調査研究主題の再検討、二回目は今年度調査成果報告と総括討議を行った。すでに成果の一部を学術雑誌や一般誌上で公開している。今年度を総括すれば、政情不安に陥った南タイ、マレーシアを除いて、これまで蓄積された法制度的資料の検討の上に、国境域での制度状況および実践に関する新たな一次資料蒐集が飛躍的に進めることができた。最終年度にむけて、研究の焦点は、国民国家上の制度から境域、実践における制度状況へと順調に移りつつある。国内研究分担者6名は、それぞれ13回に及ぶ海外渡航調査を実施した。林は東北タイ農村でのタマカーイ運動の展開、長谷川は中国徳宏と西双版納で宗教政策を、村上は北タイ国境域のシャン仏教の制度と実践について、西本は北タイおよびミャンマーのシャン州のキリスト教徒ラフと伝統宗教派ラフの実践を制度変化と共に比較し、兼重は北タイ「難民村」中国語学校の宗教教育、王は北タイ雲南系ムスリムのイスラーム学校を中心にイスラーム地域社会形成に関する調査をそれぞれ実施した。高橋はカンボジア仏教徒社会の女性在俗修行者の宗教実践を精査して詳細な生活史を記録した。いずれも制度と実践の実態と変容過程について各国地域の社会状況を新たに再考する知見を有する一次資料である。初年度より参加の外国人研究者は、2名が任地国において2週間から1カ月の調査を行った。他の1名は京都にてすでに本科研で蒐集した資料の分析と文献研究を行い、近く英文単著として刊行できる草稿を準備した。また、今年度限りではあったが、政情不安で外国人の踏査が困難となったタイのムスリムの動向については、ラージャパット・トンブリー大学のサオワニー氏(タイ=ムスリム協会委員)の参加によって実りある調査成果を得た。研究協力者(日本人4名)は、激増する学内業務で長期の海外渡航が困難になった在職者よりも多くの時間を資料蒐集活動に割いた。小林はカンボジアの宗教行政と仏教サンガの現状、原は経典および仏教書を精査してミャンマー仏教の文字文化の実践を、森はミャンマーのケントゥンにおいて旧暦新年儀礼の参与観察調査を実施した。
アピコンプレクサ類原虫侵入ステージ形成の分子基盤の解明

マラリア原虫オオキネート期のマスター転写因子AP2-Oが直接制御する500以上の標的遺伝子を同定した。その中のアピコンプレクサ類特有の遺伝子群について、GFP発現原虫を作製し目的タンパク質の細胞内局在・発現動態を解析すると共に遺伝子欠損原虫を作製しその機能を解析した。その結果、複数のオオキネート形態形成に関与する新規タンパク質の同定に成功した。加えてマイクロネームタンパク質等侵入ステージ形成に必須の複数の遺伝子を同定した。本研究の成果は同類原虫侵入ステージ形成の共通基盤の解明に繋がると共に、抗原虫薬開発の新たな候補分子情報を提供し感染阻止戦略へ多大な貢献をもたらすものである。AP2-O標的遺伝子群に含まれるアピコンプレクサ類原虫特有の遺伝子群について、マラリア原虫人工染色体を用い目的タンパク質の細胞内局在・発現動態の解析を行った。さらに発現解析でオオキネートでの発現様式が同定された遺伝子に関して、同GFP発現原虫および抗GFP抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析を行い目的タンパク質の詳細な細胞内局在を解析した。さらに発現解析によりオオキネートにおける発現が同定された遺伝子に関して、遺伝子欠損原虫を作製しその表現型を解析した。その結果複数のオオキネート形成に関与する遺伝子を同定した。その結果に基づき、オオキネートにおける発現が同定された遺伝子に関して、遺伝子欠損原虫を作製しその表現型を解析した。その結果、新たにオオキネートの形態形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子に加え、マイクロネームタンパク質やオオシスト形成に関与するタンパク質をコードする、侵入ステージ形成に必要とされるの複数の遺伝子を同定した。マラリア原虫のヒトから蚊への伝播はオオキネートが蚊中腸に侵入することで成立する。宿主侵入ステージの原虫は、アピコンプレクサ類原虫特有の細胞内構造を有し、その形成には同類間で共通した分子基盤が存在すると考えられる。しかしながら侵入ステージ構造形成に関与する分子の同定はこれまでほとんど進んでいない。申請者らはネズミマラリア原虫Plasmodium bergheiを用いたこれまでの研究で、オオキネート期の遺伝子発現を制御するマスター転写因子AP2-O (APETALA2 in ookinete)を発見し、さらにAP2-Oが直接制御する300以上の標的遺伝子を同定した。AP2-O標的遺伝子群に含まれるアピコンプレクサ類特有の遺伝子群について、マラリア原虫人工染色体を用い目的タンパク質の細胞内局在・発現動態の解析を行った。さらに、発現解析によりオオキネートでの発現様式が同定された遺伝子に関して、同GFP発現原虫および抗GFP抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析を行い、目的タンパク質の詳細な細胞内局在を解析した。さらに、これら発現解析によりオオキネートにおける発現が同定された遺伝子に関して、遺伝子欠損原虫を作製し、その表現型を解析した。その結果、複数のオオキネートの形態形成に関与する新規タンパク質をコードする遺伝子を同定した。それに加え、マイクロネームタンパク質やオオシスト形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子等、侵入ステージ形成に必須の複数の遺伝子を同定した。マラリア原虫オオキネートの形態形成の分子基盤を明らかにした本研究の成果は、アピコンプレクサ類原虫の侵入ステージ形成の共通基盤の解明に繋がると共に、抗原虫病薬開発の新たな候補分子情報を提供し感染阻止戦略へ多大な貢献をもたらすものである。標的遺伝子の発現解析および機能解析とも順調に進展している。寄生虫学これまでに解析を行った標的遺伝子群の侵入ステージ形成に果たす役割のさらなる解析を行う。また新たな標的遺伝子に関しても発現および機能解析を行う。これまでに得られた標的遺伝子の発現解析結果から、まずは機能解析を中心に実施し、予定していた詳細な発現解析を次年度にまとめて行うこととした為。これまでに解析を行った標的遺伝子群の侵入ステージ形成に果たす役割のさらなる解析を行う。標的遺伝子に関して、人工染色体および電子顕微鏡を用いた発現解析を行う。さらに遺伝子欠損原虫を作成し標的遺伝子の機能解析を行う。本年度得られた標的遺伝子の発現解析結果からそれらの機能解析を先に行うこととした。予定していた遺伝子群の発現解析を次年度とし、実験の順番が変わり次年度に多くの標的遺伝子解析が必要となったため。標的遺伝子に関して人工染色体および電子顕微鏡を用いた発現解析および機能解析を行う。
定量的プロテオミクスとメタボロミクスの融合による膵癌薬剤感受性予測と耐性克服

膵癌治療の第一選択薬(GEM)の耐性機構の解明のため、膵癌細胞と獲得耐性株を用いて網羅的同時絶対定量法(LC-MS/MS)により、トランスポーター・代謝酵素を網羅的に定量した。GEMによる発育阻止濃度と発現量の相関、耐性株と親株の発現量の差、膵癌組織の発現量と生存期間の相関を検討したところ、GEM耐性機構にGEMリン酸化酵素(デオキシシチジンキナーゼ:dCK)の発現低下が最も寄与していることが明らかになった。膵癌の標準抗癌薬gemcitabine(GEM)に対する感受性を評価するために、細胞株を用いて発育阻止実験を行い50%発育阻害濃度(IC_<50>)を測定した。IC_<50>値は11.61.34×10^6nMの分布を示し,薬剤感受性は通常培養条件下で細胞種により大きく差があることを見出した。また、IC_<50>値相当のGEM添加条件で長期間培養を行い、IC_<50>値2.4×10^4倍のGEM耐性細胞を樹立することに成功した。培養条件下の検証ではあるものの、実地臨床上経験されるGEM「抗腫瘍効果の個体差」や投与後に出現する「獲得耐性」を検討する実験系を確立できた意義は大きいと思われる。高速液体クロマトグラフィー接続型タンデム質量分析装置(LC-MS/MS)を用い、上述の細胞株の膜蛋白85種及びGEM関連代謝酵素15種の計100種の蛋白質発現を測定、測定細胞株の2/3以上で検出可能な蛋白の発現プロファイルを作製することに成功した。膵癌細胞の膜蛋白・GEM関連代謝酵素を広く網羅した、蛋白レベルの発現プロファイルはこれまでに報告がなく、更に上述の感受性データと合わせ解析することで、個々の蛋白分子の発現と感受性の相関や関連蛋白群と感受性の相関を明らかにすることで、本研究の目的である「GEM感受性予測因子の抽出」が実現されると考えている。平成21年度に確立された測定系、LC-MS/MSによるタンパク質同時絶対定量法を用い、GEM感受性の異なる7種類のヒト膵癌細胞株及び10患者の膵癌組織における膜タンパク質、GEM関連代謝酵素計100種類のタンパク質発現プロファイルを明らかにした。ヒト膵癌細胞株において7種類(ENT1,CNT1,CNT2,MRP9,FUPT1,TfR1,MRP8)の膜タンパク質の発現量がIC50値と相関した(p<0.05)。ENT1は核酸トランスポーターであり、GEM取り込みの主要なトランスポーターであると考えられてきた。しかしながら、膵癌細胞株におけるそのタンパク質発現量はIC50値の高いGEM低感受性な細胞程高発現する結果となった。更にENT1は全ての膵癌組織において検出され、無再発生存期間(DFS)の短い症例で高発現する傾向を認めた。ENT1はGEM低感受性のマーカータンパク質の候補となり得る可能性が考えられた。GEM感受性の異なる2種類の細胞株からGEM獲得耐性モデルを作成し、獲得耐性機構を検討した。[5-^3H]Gemcitabineを用い輸送特性を解析すると、GEM獲得耐性膵癌細胞株では[5-^3H]Gemcitabineの濃度が上昇しても細胞内蓄積量が増加しないことが明らかとなった。更に親株では飽和性輸送を介し時間依存的にGEMを細胞内に取り込むのに対し、獲得耐性株では取り込み及び飽和性輸送を認めなかった。これより、膵癌のGEM獲得耐性機構としてGEM取り込みの著明な減少が大きく関与することが示唆された。臨床情報との統合を目指し、まず、膵癌手術治療効果を、血清腫瘍マーカーを用いた評価法(外科的RECIST)で評価する方法を確立し、報告した。腫瘍マーカーによる評価が予後予測・治療効果評価に重要で、GEM感受性の臨床的評価に反映される可能性があり、症例を集積して更に検討することとした。平成22年度までに樹立したGEM獲得耐性膵癌細胞株(PK9-R)とその由来親細胞株(PK-9)を用いて、その感受性差(50%生育阻害阻止濃度で2.8×10^5倍)を生み出す分子メカニズムに迫るため、LC-MS/MSによるGEM代謝関連酵素の網羅的蛋白定量を行った。PK-9Rでは、dCKの細胞内濃度がPK-9の約1/50未満に低下しており、検出限界以下であった。一方で、他の酵素の一部(RRM1,CTPS1,CTPS2)は1.2-1.9倍に増加しており、またENT1,MRP1,MRP4などのトランスポーターの発現も1.4-2,2倍に増加していた。培養条件下で細胞内外のGEMの中間代謝物を測定すると、PK9RではPK9に比べ、細胞外dFdU(GEM不活性化体)が増加・細胞内しており、GEM不活化酵素CDA阻害剤(THU)添加下では、この変化は以降のリン酸化(活性化)代謝体であるdFdCDP,dFdCTPも含め消失した。これらの結果から、GEMの獲得耐性には細胞内リン酸化過程が重要であることが示唆された。

更にPK-9RにdCKを添付することで、リン酸化代謝反応は回復することから、dCK発現の低下がGEM獲得耐性に重要であることが明らかにされた。膵癌GEM治療における上記因子の寄与を明らかにするために、膵癌切除例の腫瘍部から関連因子の蛋白定量を行い、切除後GEM補助療法施行条件での生存期間と蛋白発現の相関を検討した。dCKは生存期間有意な相関(r=0,995)を認め、獲得耐性モデルを用いたin vitroのデータと合わせ、dCKがGEM耐性機序のKey moleculeであると結論した。
レギュローム解析を基盤としたサルモネラC1pXPによる遺伝子発現制御機構の研究

サルモネラのAAA+プロテアーゼClpXPがファゴソーム内で分解している基質候補の探索を目的として、これまでに申請者は、基質の分解を途中で停止させ基質をトラップする系を構築し、トラップした基質サンプルを質量分析にかけ、256の基質候補を得ている。この中で、ファゴソーム条件下で機能すると考えられている転写因子・グローバルレギュレーターを5件(SsrB、PmrD、IscR、Re1A、AcnB)、細胞分裂に関わる3つの候補(ZapC、Bo1A、SeqA)を選び、Hisタグ融合タンパク質発現系を構築した。これらの候補について、野生株とclpX欠損株における細胞内蓄積を比較したところ、PmrDとZapCについて、clpX欠損株における細胞内蓄積が見られた。さらに、タンパク質合成阻害剤を用いて、細胞内でのタンパク質安定性の変化を検討した結果、clpX欠損株においてPmrD及びZapCは安定化することを明らかにした。以降、2つの候補のうち、PmrDに着目して研究を進めた。PmrDは、サルモネラ菌体内でClpXPによって分解制御されていると考えられたため、次にin vitro分解実験の系を構築して、PmrDがClpXPによって直接分解されるかどうかの検討を行った。まず、Hisタグ融合PmrDの精製条件の検討を行い、90%以上の純度での精製条件を確立した。また、ここで得られた精製PmrDを用いて抗PmrD抗体を作成した。現在報告されている幾つかの基質分解条件で分解実験を行ったが、ClpXPによるPmrD分解はin vitroでは起こらなかった。CLpXPの基質の中には、アダプター因子と呼ばれる第3の因子と結合することで、自身の分解速度が大幅に上昇するケースが多数報告されている。PmrDについても、細胞内での安定性実験の結果と、in vitroの系での結果が食い違う理由として、細胞内でPmrDに結合してPmrD分解速度と量を調節する第3の因子の存在が考えられた。また、PmrDはLPS modificationと胆汁酸への感受性に関係することが知られているが、clpX欠損株は胆汁酸に対して感受性となることも明らかにしている。この中で、ファゴソーム条件下で機能すると考えられている転写因子・グローバルレギュレーターを5件(SsrB、PmrD、IscR、RelA、AcnB)、細胞分裂に関わる3つの候補(ZapC、BolA、SeqA)を選び、Hisタグ融合タンパク質発現系を構築した。

まず、Hisタグ融合PmrDの精製条件の検討を行い、90%以上の純度での精製条件を確立した。また、ここで得られた精製PmrDを用いて抗PmrD抗体を作成した。現在報告されている幾つかの基質分解条件で分解実験を行ったが、ClpXPによるPmrD分解はin vitroでは起こらなかった。CLpXPの基質の中には、アダプター因子と呼ばれる第3の因子と結合することで、自身の分解速度が大幅に上昇するケースが多数報告されている。PmrDについても、細胞内での安定性実験の結果と、in vitroの系での結果が食い違う理由として、細胞内でPmrDに結合してPmrD分解速度と量を調節する第3の因子の存在が考えられた。また、PmrDはLPS modificationと胆汁酸への感受性に関係することが知られているが、clpX欠損株は胆汁酸に対して感受性となることも明らかにしている。予定していたトラップ実験からの候補遺伝子の絞り込みを行い、細胞内でClpXPにより制御されている遺伝子をその中から同定した。In vitro分解実験、相互作用実験の系も確立しており、予定していた解析を達成している。
放射線による固相モノメチル置換アルカンの選択的な炭素-水素結合の切断機構

モノメチル置換アルカン(Me-RH)を77Kでγ線照射すると特定な炭素-水素結合の切断が生じ、アルカン中性ラジカル(Me-R・)が生成する。この選択的な炭素-水素結合の切断には、トンネル効果が著しい水素引き抜き反応が密接に関与していると考えられる。このような観点より。ヨウ化水素(HI)あるいはヨウ化重水素(DI)を含む位置選択的に重水素置換された2-メチルヘキサン(2MHX)を77Kで紫外線照射し、HIあるいはDIの光分解によって生成する水素原子(H)や重水素原子(D)による水素引き抜き反応をおこなわせた。その結果、生成するMe-R・の電子スピン共鳴(ESR)吸収を観測し、引き抜き反応を起こす原子の違いやMe-RHの重水素化が、Me-R・の生成に対して如何に影響するかを評価した。さらに、照射する紫外線の波長を選択することにより、引き抜き反応を起こす原子のエネルギーがMe-R・の生成に対して如何に影響するかも検討し、以下の点を明らかにした。1.照射光である紫外線の光子エネルギーは、HIやDIの解離以外に、HやDによるMe-RHからの水素引き抜きに用いられる。この水素引き抜きに必要なエネルギーは、引き抜き反応を起こす原子がHの場合よりもDのほうが高く、またMe-RHの重水素化によっても高くなる。2.生成するMe-R・は、水素引き抜き原子がHかDかには大きく依存しない。3.水素引き抜きを起こす原子のエネルギーは、生成するMe-R・のESR呼吸に影響を及ぼす。すなわち、水素引き抜きを引き起こす原子のエネルギーが異なると、引き抜き位置が変わる可能性を示唆する結果を得た。4.放射線照射で生成するMe-R・のESRとHあるいはDによる水素引き抜きで生成するMe-R・のESRとの比較により、放射線照射で生成するMe-R・には水素引き抜き反応以外の反応で生成する成分がある可能性が強い。現在、さらに詳細に検討するため、波長純度のよい紫外線による照射を準備中であり、その後、他の位置選択的に重水素化されたMe-RHに対しても同様な検討を行う予定である。なお、本研究で購入したガスクロマトグラフ装置は主に、2MHXの純度の決定に用いた。このような観点より。
高周波用ハイドロホンの校正法の提案と実証

直径0.6mmと1mmの小型PVDFハイドロホンの感度校正を二つの手法で行った。その一つは従来の手法、相互校正法であり、他方は音波の非線形伝搬に基づくものである。特に、有限振幅の超音波ビームは媒質の非線形性で波形歪みを引き起こし、そのビーム内に高調波を発生する。個々の高調波成分の大きさは、われわれが音場の正確な記述として提案したモデル式で理論的に予測できる。高調波の音圧は駆動周波数や音源音圧レベルの音源条件に強く依存する。また、基本波周波数でのハイドロホンの音圧対電圧感度応答は相互校正によって決定する。この音源条件が決まれば、高調波の音圧振幅は一義的に決定できる。実験と理論を比較することで2.520MHzの周波数範囲で二つのハイドロホンの校正を行った。その結果、ハイドロホンに附属の校正表と比べて、全体的に1.5dB以内でよく一致した。本研究の目的は,水中での絶対音圧の測定を目的とした高周波用ハイドロホン(およそ,1MHzから10MHz)の新しい校正法の提案とその実証,そして基礎データの収集である.特に医療超音波の分野において,絶対音圧や音響パワーの測定の観点からハイドロホン校正装置は是非必要とされているが,我が国にはそれに該当する装置がない.既存の校正法や新たな校正法として,相互校正法,音響放射圧の利用,超音波の非線高調波歪みの利用,そしてレーザーと音波の相互作用の利用,以上の4つ校正方が考えられる.本研究では,非線形高調波歪みを利用する校正法である.すなわち,超音波の音圧を上げると波形歪みが顕著に現れる.このことは高調波が多く発生することを意味するが,これらの高調波のレベルは音源音圧や駆動周波数といった音源条件で決まり,しかも理論的にきちんと予測できる.平成10年度の成果は,まず,非線形音場の理論予測に適切な精度のよい新たなビームモデル式を提案した.これは,肩平回転楕円体座標系を利用して音波の広がりを補正しながら非線形波動方程式を展開するもので,これで得られたモデル式によって,音源のごく近傍から十分遠方まで,基本波はもちろんのこと高次高調波まで高速に数値計算できるようになった.この成果はJ.Acoust.Soc.Am.の学会誌に報告した(現在,論文受理印刷中).一方,実験装置の試作も進めており,高周波用パワーアンプ,音場の精密測定のための3次元ステージを購入し,現在,組み立てている段階である.次年度から,精密な音場測定を行い,当初提案したスキームに従って高調波の大きさからハイドロホンの校正を行う新しい手法を展開する予定である。ハイドロホンの絶対校正として従来から相互校正法があるが、その他に次に述べる方法を組み合わせて校正値の信頼性を高めることを研究しした。超音波の伝搬で省ずる高調波歪みを利用する。すなわち、音波の振幅を大きくすると波形歪みが発生し、多くの高調波が発生する。このときの各高調波の振幅、特に高次高調波の振幅ほど絶対音圧に大きく依存する。そして、非線形ビーム方程式(モデル式)の理論解と定量的によく一致する。現在、非線形ビームの伝搬を記述する放物方非線形方程式のモデル式(KZKの式ともいわれる)に対する数値結果と実験結果とに第5高調波までにおよそ数dBの差異がある。この差異は、特に放物型への低次近似法に問題があり、さらに近似度を高めることで実験値との差異を極力小さくすることができる。この高次放物近似の導出についてまず研究し、音波ビームの波面によく整合する扁平回転楕円体座標を利用したモデル式が都合がよいことが分かった。そして、水中で2MHzから20MHzの範囲の数点において高調波を利用して校正を行ったところ、ハイドロホンに添付された数値と最大で1.5dB以内で一致した。また、相互校正法も同時に行い、これについては2.5MHzと5MHzの2.点において、やはり添付データと0.5dBで一致した。以上の結果から、音波の非線形高調波を利用した新しいハイドロホン校正法が利用できる基礎データを得ることができた。
淡水魚類の筋肉タンパク質の比較生化学

6種類の淡水魚(ブルーギル、オオクチバス、ハクレン、ニジマス、イワナおよびヤマメ)につき、背側普通筋のタンパク質組成を比較したところ、筋形質タンパク質は6.97.3mgN/g、筋原線維タンパク質は14.417.1mgN/g,アルカリ可溶性タンパク質は0.50.8mgN/g,筋気質タンパク質は0.40.8mnN/gと、いずれの魚類でも同様の組成をしめした。また、非タンパク態窒素は3.74.7mnN/gのレベルにあった。筋形質および筋原線維画分をSDS-ゲル電気泳動に付したところ、前者の泳動パターンには著しい種特異性が認められたが、後者ではミオシン軽鎖付近のバンドに若干の種間差が見られたに過ぎなかった。つぎに背側普通筋につき、00.5Mの種々の濃度のNaCl水溶液でホモジナイズし、遠心分離後の上清のタンパク質濃度およびSDS-ゲル電気泳動パターンを比較した。その結果、タンパク質溶出量は0.1M NaCl付近で最低となり、それ以上の範囲ではNaCl濃度の上昇に伴って増加した。電気泳動パターンから、溶出量の増加はアクトミオシンに由来することが示唆された。海水魚のブリの普通筋につき同様の検討を加えたところ、溶出量のNaCl濃度依存性は00.25M NaClで明らかに異なっており、淡水魚と海水魚では筋原線維タンパク質の溶解性に差があることが示唆された。次に、常法により調製した筋原線維につき、種々の条件下でATPase活性を比較した。その結果、Ca-ATPase活性は、低塩濃度下では0.360.64mumol Pi/min・mg,高塩濃度下では0.060.11mumol Pi/min・mg,Mg-ATPase活性はCa存在下で0.600.66、非存在下で0.020.08mumol Pi/min・mgと、海水魚のものの報告値と同レベルであった。他方、各魚類から常法に従ってミオシンの単離を試みたが、コイを除いては精製過程で若干の分解物を生じ、プロテアーゼに対する感受性が高いことが示唆された。しかし、海水魚のミオシンにも程度の差こそあれ、感受性の高いものがあることが知られており、淡水魚ミオシンの特性とは考えにくい。
バージャー病の病因解明への総括的研究

1.研究目的バージャー病について歯周病など慢性弱毒菌感染という視点から検討する。2.研究方法バージャー病患者の口腔内検査、口腔内(プラーク)細胞の同定、抗体価の測定などを行った。歯周病菌と血小板との反応、歯周病菌と老化内皮細胞との反応などをin vitroにて行った。更に遺伝子的要因を解明する。(倫理面への配慮)コントロールとして採血、口腔内検査を受けられた方には、本学倫理委員会の承認のもとに行う旨承諾して頂いた。3.研究結果臨床的な成果として種々の診断、治療に関する発表、著書発行があった。また、基礎的研究の成果としてバージャー病と歯周病、喫煙との関係がさらに解明された。歯周病菌がどのようにして病変部に運ばれるのかについて血小板がその主役であろうことが判明した。バージャー病患者の歯周病罹患が顕著で高度であることが改めて証明され血清学的にも証明できた。4.考察遺伝子学的要素を研究しているが、歯周病とバージャー病とはともに簡易感染性に共通点があることがHLAからの検討で証明された。若年者の喫煙、血管の攣縮、血小板塊の塞栓、遺伝学的要素などが絡みあってバージャー病が発症するであろう。仮説が究明された。5.結論バージャー病は慢性弱毒菌感染による初期変化から引き起こされる血栓による閉塞性疾患である可能性が高い。仮説が究明された。A.研究目的バージャー病について歯周病など慢性弱毒菌感染という視点から検討する。B.研究方法バージャー病患者の口腔内検査、口腔内(プラーク)細菌の同定、抗体価の測定などを行った。歯周病菌と血小板との反応、歯周病菌と単核球との反応、歯周病菌と老化内皮細胞との反応などをin vitroにて行った.(倫理面への配慮)コントロールとして採血、口腔内検査を受けられた方には、本学倫理委員会の承認のもとに行う旨承諾して頂いた。C.研究結果臨床的な成果として種々の診断、治療に関する発表、著書発行があった。また、基礎的研究の結果としてバージャー病と歯周病、喫煙との関係がさらに解明された。D.考察遺伝学的要素も研究しているが、歯周病とバージャー病とはともに易感染性に共通点があることがHLAからの検討で証明された。若年者の喫煙、血管の攣縮、血小板塊の塞栓、遺伝学的要素などが絡みあってバージャー病が発症するであろう仮説が徐々に究明されつつある。E.結論バージャー病は慢性弱毒菌感染による初期変化から引き起こされる血栓による閉塞性疾患である可能性が高い。

4.考察遺伝子学的要素を研究しているが、歯周病とバージャー病とはともに簡易感染性に共通点があることがHLAからの検討で証明された。若年者の喫煙、血管の攣縮、血小板塊の塞栓、遺伝学的要素などが絡みあってバージャー病が発症するであろう。仮説が究明された。5.結論バージャー病は慢性弱毒菌感染による初期変化から引き起こされる血栓による閉塞性疾患である可能性が高い。
非対称的情報下における先物市場の創造の経済効果

本研究では、先物取引所による先物契約の創造の決定とその経済厚生への影響を分析し、投資家の持つ情報の分布と取引機会の内容に応じて、以下の結果を得た。1.投資家が非対称的情報を持つ場合に関し:(1)新しい先物契約を取引所が創造することで期待取引量が減少するための必要条件を明らかにした。(2)新しい先物契約を創造することで実際に期待取引量が減少してしまう場合があることを示した。(3)投資家の事前の意味での厚生水準は取引所が創造する先物契約の種類が多いほど高いわけではないことを示した。(4)取引量を最大化する取引所は必ずしも投資家に最適な種類と数の先物契約を創造せず、先物契約の種類が過小もしくは過大になる可能性があることを示した。2.投資家は対称的情報を持つが通時的取引が可能である場合に関する従来の研究を発展させ:(1)たとえ投資家の持つ情報が対称的であっても取引量を最大化する取引所は必ずしも投資家に最適な先物契約を創造するわけではないことを示した。(2)先物創造の最適性を動学的枠組みで定義する上での新しい概念を提示した。1.に関する結果は、特に、「取引量が多いから投資家の役に立っている。」という一見もっともらしい直観が、先物契約の創造の効率性という観点からは必ずしも正しくないことを示す。これから、先物取引所の経済的貢献を評価する際に素朴な直観以上の調査が必要であることが示唆され、この意味で重要な政策的含意を持つ。また、2.に関する結果は、以上の懸念が単に情報の非対称性に依拠するものではなく、動学的取引という現実的な視点が導入されると、先物創造の効率性の評価が益々難しいものとなることを示している。
分子プローブによる薬物受容体を介した細胞情報伝達系の研究

生体機能探索形分子プローブ(探索分子)を積極的に活用し、生体における情報の受容・変換・産生機構の解明さらにその制御を行うことは生命科学において最重要課題である。そのためには、まず新しいバイオアッセイ系を確立しリ-ド化合物の発見に努め、次いで今まで蓄積していた分子構造情報を基にして合成化学の協力により優れた探索分子の創成、さらに創薬へと発展させることが望まれる。極めて複雑な生体において、そこに存在する特定の分子が果たす生理的役割を分子レベルで解明するには、生体側にある分子に特異的かつ選択的に作用する薬物が非常に有力な武器となることは論をまたない。ここに見いだされた探索分子へ分子設計を施し、より精密な探索分子を創製できれば、単に細胞内機能のみならず臨床でも使用できる医薬品としても利用されるものも見いだされる。本研究班では上記の考えを踏まえて、3回の班会議と公開講演会で討論し、今後の研究活動を次ぎのように進めることにした。細胞内情報伝達機構を研究するための探索分子の開発にとどまらず、探索分子を効果的に利用して、生体機能を細胞レベルのみならず全体動物(whole animal)や病態モデルにおいても研究する。その成果は単に基礎科学や創薬科学の研究に提供するばかりでなく、臨床の研究者へもすすんで提供し臨床での研究へも役立つよう努力する。そのためには生物系研究グループと有機合成の力をもった化学系研究グループが一致協力して研究を進める必要がる。この観点から細胞情報機構の研究者、有機合成化学者さらに分子設計研究者でわが国の最高水準の研究者を組織する必要がある。そして、わが国の主要疾患である脳機能障害、循環器疾患、癌などを中心にこれらの克服のための学際的基礎科学研究グループを早急に組織することは社会的にも強く要請されるものである。
多次元量子井戸構造の導入による半導体レ-ザの超高速化

本研究は、量子細線やや量子箱などの多次元量子井戸構造を有する半導体レ-ザの超高速化の可能性および極限性能について、理論的・実験的に明らかにすることを目的としている。本年度は、まずMOCVD選択成長によるGaAs量子細線の作製と光学的性質をおこなった。SiO_2パタ-ン上にMOCVDを用いて選択成長をおこなうことにより、一辺200nm程度のGaAs量子細線を作製することに成功した。フォトルミネッセンス(PL)スペクトルの測定により、量子細線に対応する量子準位が明確に存在することがあきらかになった。さらに、GaAs量子細線の磁気を測定しその磁場印加方向依存性を測定した。3種類の磁場印加方向に対して、量子細線からのPLのピ-クの磁場増加に伴う移動の様子から、量子閉じ込めの異方性を明らかにした。これらの結果は、われわれが作製したサンプルには量子細線効果が確かに存在していることを示している。次にGaAs量子細線のピコ秒キャリアダイナミックスを究明した。GaAs量子細線のPLを低温においてピコ秒分光により測定することによりGaAs量子細線中の励起子の寿命がGaAs量子井戸と比べて長いことを初めて見い出した。さらに高励起状態における時間分解PLスペクトルを測定することにより電子温度、キャリア濃度の振舞いを究明した。この結果、量子細線では電子温度は量子井戸と比べて下がりにくいことが明らかになった。また、量子細線のバンド構造を強結合法を用いて求め、量子井戸と大きく異なることを示した。また、この結果に基づき量子状態の断面形状依存性、遷移行列の偏波面依存性を明らかにした。また、歪量子細線レ-ザについてもバンド計算および特性解析をおこなった。
『懐風藻』編纂意図の解明―日本漢文学史の構築に向けて―

現存する日本最古の漢詩集『懐風藻』。同書については、先賢により緻密な出典研究が積み上げられてきた。また近年では、詩作の背景や当時の国際情勢など、多様な視点からの研究が進められている。だが『懐風藻』が、誰によって、なぜ、どのようにして編纂されたのかなど、未だ多くの謎が残されている。本研究は『懐風藻』の詞華集(アンソロジー)としてのあり方に着目し、多角的な視点から、その実態を紐解くものである。また、それを起点として撰集意識や詩作の変遷を辿り、日本漢文学史の構築を目指すものである。
Ent1とEps15に結合する蛋白質POB1による小胞輸送の制御機構

RasとRa1の下流に存在してレセプターのエンドサイトーシスや小胞輸送に関与すると推定される蛋白質POB1の機能を明らかにするため酵母Two-hybrid法によりPOBに結合すると推定された蛋白質、Eps15結合タンパク質Endophilin=SH3GL2、SNAP25結合タンパク質Snapin、アダプタータンパク質Ese2/IntersectinならびにSH3yl1の、POB1との結合定数をRalBPlを対照として測定した。蛋白質全長ないしTwo-hybrid法によって単離された断片より大きな断片を、ヒト胎児脳cDNAライブラリーより再クローニングして大腸菌に発現精製し、POB1を固定化したチップに対する結合を分子間相互作用解析装置(BIACORE X)を使用して測定して得られた結合定数以下に示す。これらの結果からSH3GL2、SnapinならびにEse2は生体内でPOB1と直接相互作用するとは考えにくくSH3yl1は生理的に直接相互作用していることが強く示唆された。Amphyphisin2、TOMIL/SRCASM、Hrs、ベンゾジアゼピン受容体Pap7について解析を続行しつつ、SH3GL2、SnapinならびにEse2発現細胞株の樹立を行っている。RasとRalの下流に存在してレセプターのエンドサイトーシスや小胞輸送に関与すると推定される蛋白質POB1の機能を明らかにするため酵母Two-hybrid法によりPOBに結合すると推定された蛋白質、Eps15結合タンパク質Endophilin=SH3GL2、SNAP25結合タンパク質Snapin、アダプタータンパク質Ese2/IntersectinならびにSH3yl1の、POB1との結合定数をRalBP1を対照として測定した。この結果からSH3GL2、SnapinならびにEse2は生体内でPOB1と直接相互作用するとは考えにくくSH3yl1は生理的に直接相互作用していることが強く示唆された。現在Amphyphisin2、TOM1L/SRCASM、Hrs、ベンゾジアゼピン受容体Pap7について解析を続行している。
真核細胞型RecAファミリーリコンビナーゼによるヘテロ二重鎖形成の分子機構

相同組換えはゲノムの維持と遺伝的多様性の創出に必須な機構で、全ての生物種で保存された重要な生命機能である。DNA鎖交換は相同組換えの中心的な反応であり、進化的に保存されたRecAファミリーリコンビナーゼによって触媒される。しかし、リコンビナーゼによる相同DNA配列認識と鎖交換の反応分子機構は依然として不明である。本研究では、DNA鎖交換反応をリアルタイムで観察する系を用いて、2種類の分裂酵母リコンビナーゼ(Rad51とDmc1)を比較解析することで、この反応の根幹であるヘテロ二重鎖形成の分子機構と真核生物で広く保存されている2種類のリコンビナーゼの本質的な違いの解明を目指す。
高齢期における新しい就労支援システムの構築

高齢者にとって、社会参加はQOLや健康寿命を延ばす為の大切な要素である。しかし、地域との接点のない高齢者、特に男性には社会参加のハードルは高い。よって、就労という形での社会参加を促進するシステムを考案することを目的とした。東京都大田区に開設されたアクティブシニア就業支援センター「いきいきしごとステーション」において、求職者を対象とした縦断調査を行った。その結果、就労支援機関利用者は収入目的の高齢者と生き甲斐目的の高齢者の2種類が存在すると思われる。前者は希望収入の差異等が原因で、求職期間が長期化している可能性がある。また、双方とも社会的孤立および閉じこもりのリスクが高いことが示唆された。本研究では高齢者の総合就労支援システムのモデルとして就業支援センターに着目し、求職高齢者の社会活動および生活状況と就労意識について検討することを目的として、郵送アンケート方式による利用者への縦断調査を実施した。調査期間は2013年1月28日から2014年3月31日で、期間内に初回調査票(BL)を配布した対象者は180名。内128名(73.6%)から回答が得られた。次にその回答者を対象とし2週後に第一回追跡調査(F1)を郵送し103名(91.2%)から回答が得られた。以下同様に所定の間隔期間(4週、8週、12週、以下12週毎)を設定して追跡調査F2、F3、F4、F5を実施し、それぞれ81名、64名、41名、30名の回答が得られた。BL回答者では男性82名(64.1%)、女性46名(35.9%)と男性が有意に多数を占めた。年齢は比較的若く独居率は31.3%である。これは55歳から74歳までの全国平均22.5%と比較して高い。最終学歴も比較的低くいずれの団体にも所属していないものも半数を超える。また年齢が若く主観的健康感が維持されている一方で、年齢が若いほどに暮らし向きに苦労している。今は比較的若く身体的な健康度は維持されているものの、いずれ閉じこもりへと繋がるリスクを抱えている事が伺える。就労支援機関の活用がこれらのリスクの予防に寄与する可能性がある。前職の離職理由については半数が望まないネガティブな離職であったことから、必要に迫られ求職している高齢者が多いが、一方で健康や生きがい、社会とのつながりを求める回答も一定数あった。仕事を選ぶ際に、能力や経験が活かせることが重要であるという回答が最も多く、収入よりも過去の経験等を活かしたい気持ちがある一方、こうした拘りが仕事探しに影響し、強いては雇用のミスマッチにも影響していることも推察される。