hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好酸球性消化管疾患の罹患範囲と病態形成に及ぼす因子の解明

好酸球性消化管疾患は食事や吸入抗原をアレルゲンとし、Th2優位の過剰な免疫応答により消化管に好酸球炎症と機能異常を生じる慢性アレルギー疾患である。病変の罹患範囲により好酸球性食道炎と好酸球性胃腸炎に分類されるが、好酸球性食道炎において男性優位(男女比約4:1)に発症する要因については明らかではない。私共は好酸球性消化管疾患の発症に関わる性差の原因を明らかにすることを目的として本年度は以下の成果を得た。1ヒト食道生検材料を用いた検討:未治療の好酸球性食道炎患者(男性10例、女性4例)の食道生検組織を用いてCAPN14関連遺伝子であるIL-13、IL-33、DSG-1、eotaxin-3などの発現について定量PCRおよび免疫組織学的染色にて検討した。IL-13、IL-33、eotaxin-3の発現は健常コントロール(2例)に比べ有意な発現亢進を認めた。また、食道上皮のバリア機能に関連する蛋白(EDC)であるfilaggrin, involucrinの発現は好酸球性食道炎群において著明な発現低下を認めた。しかしこれらの発現は男女間での有意差は見られず、好酸球浸潤数との関連性も低い結果であった。2食道扁平上皮株を用いたオルガノイド培養系での検討:食道扁平上皮株をcollagen-fibronectin coated Transwellで培養しオルガノイド培養系を確立した。この培養系にIL-13を添加し、濃度依存性にeotaxin-3が誘導されることが確認された。さらにdihydrotestosterone(DHT)およびestradiolを添加することでeotaxin-3の誘導に変化がみられるかについて定量PCRおよび培養上清中の蛋白濃度を評価したところ、DHT投与群においてeotaxin-3の発現の亢進が見られた。一方、estradiol添加によっては有意な変化は認めなかった。好酸球性消化管疾患のうち、好酸球性食道炎は本邦においては内視鏡検査5000例に1例程度に認められる稀な疾患であった。最近5年間において有病率の増加を認めているが、欧米と比較するとまだ低い。臨床的には海外の報告と同様に患者の約8割が男性であり、これは他のアレルギー疾患には見られない特徴であることから、今回発症に関わる性差の要因に着目して検討を進めている。上記のように好酸球性食道炎が男性優位の疾患であるため、女性患者の検討例が目標数(10例)まで達していない。また、生検材料から食道上皮を単離し、3Dマトリゲルを用いてオルガノイド培養系を作成しているが、細胞の維持が困難であり培養条件の調節を行っている状況で、培養系にプロトンポンプ阻害薬を投与し、CAPN14関連因子を中心とした発現解析が男女間で差があるかについては、まだ安定した結果が得られていない。しかしながら、食道扁平上皮株を用いたオルガノイド培養系については確立しており、男性ホルモンであるDHTの投与によりIL-13によるeotaxin-3の誘導がみられることが示されており、この培養系を用いて発症の性差に関わる要因となる可能性についてさらに解析を行っている段階である。これまで好酸球性食道炎の性差に関しては臨床所見を元に解析を行っており、女性例で平均年齢が高いが、アレルギー疾患の併存やH. pylori感染率には差がみられていない。また、高齢になると男女差がなくなることも明らかにしており、性ホルモンが発症の性差に影響していると仮説を立てた。今回の検討で男性ホルモンであるDHTが好酸球性食道炎の発症に重要なケモカインであるeotaxin-3を誘導することが見いだされ、今後さらに男性ホルモンが発症にどのように関連しているかについて検討を進めていく。生検材料を用いたこれまでの検討でCAPN14関連因子の発現に有意な差が認められていないことより、生検材料を用いたオルガノイド培養系の確立が困難であれば引き続き、培養細胞を用いた培養系での検討を進める。培養細胞での検討が推進されれば、好酸球性食道炎モデルマウス(雄性、雌性)を作成、発症後の食道上皮でのCAPN14関連因子での発現検討および性腺除去によって病態がどのように変化するかどうかについての検討も進めていく。

また、食道上皮のバリア機能に関連する蛋白(EDC)であるfilaggrin, involucrinの発現は好酸球性食道炎群において著明な発現低下を認めた。しかしこれらの発現は男女間での有意差は見られず、好酸球浸潤数との関連性も低い結果であった。2食道扁平上皮株を用いたオルガノイド培養系での検討:食道扁平上皮株をcollagen-fibronectin coated Transwellで培養しオルガノイド培養系を確立した。この培養系にIL-13を添加し、濃度依存性にeotaxin-3が誘導されることが確認された。さらにdihydrotestosterone(DHT)およびestradiolを添加することでeotaxin-3の誘導に変化がみられるかについて定量PCRおよび培養上清中の蛋白濃度を評価したところ、DHT投与群においてeotaxin-3の発現の亢進が見られた。一方、estradiol添加によっては有意な変化は認めなかった。好酸球性消化管疾患のうち、好酸球性食道炎は本邦においては内視鏡検査5000例に1例程度に認められる稀な疾患であった。最近5年間において有病率の増加を認めているが、欧米と比較するとまだ低い。臨床的には海外の報告と同様に患者の約8割が男性であり、これは他のアレルギー疾患には見られない特徴であることから、今回発症に関わる性差の要因に着目して検討を進めている。上記のように好酸球性食道炎が男性優位の疾患であるため、女性患者の検討例が目標数(10例)まで達していない。また、生検材料から食道上皮を単離し、3Dマトリゲルを用いてオルガノイド培養系を作成しているが、細胞の維持が困難であり培養条件の調節を行っている状況で、培養系にプロトンポンプ阻害薬を投与し、CAPN14関連因子を中心とした発現解析が男女間で差があるかについては、まだ安定した結果が得られていない。しかしながら、食道扁平上皮株を用いたオルガノイド培養系については確立しており、男性ホルモンであるDHTの投与によりIL-13によるeotaxin-3の誘導がみられることが示されており、この培養系を用いて発症の性差に関わる要因となる可能性についてさらに解析を行っている段階である。これまで好酸球性食道炎の性差に関しては臨床所見を元に解析を行っており、女性例で平均年齢が高いが、アレルギー疾患の併存やH. pylori感染率には差がみられていない。また、高齢になると男女差がなくなることも明らかにしており、性ホルモンが発症の性差に影響していると仮説を立てた。今回の検討で男性ホルモンであるDHTが好酸球性食道炎の発症に重要なケモカインであるeotaxin-3を誘導することが見いだされ、今後さらに男性ホルモンが発症にどのように関連しているかについて検討を進めていく。生検材料を用いたこれまでの検討でCAPN14関連因子の発現に有意な差が認められていないことより、生検材料を用いたオルガノイド培養系の確立が困難であれば引き続き、培養細胞を用いた培養系での検討を進める。培養細胞での検討が推進されれば、好酸球性食道炎モデルマウス(雄性、雌性)を作成、発症後の食道上皮でのCAPN14関連因子での発現検討および性腺除去によって病態がどのように変化するかどうかについての検討も進めていく。(理由)本年度に使用する分子生物学的研究用の試薬、培養用試薬、免疫染色用の抗体、プラスティック器具などについて購入費用を計上していたが、当研究室に保有のものを使用するなどして、必要量が少なくなるなり、購入に要する費用が予定よりも少なくなった。(使用計画)
糖尿病性糸球体硬化のChip-Seq解析と核内受容体を標的とした効率的治療

Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4)活性化による転写因子Smad1を介したIV型コラーゲン(COL4)増加は糖尿病性糸球体硬化の一因である。All-trans retinoic acid (ATRA)はレチノイン酸受容体(RAR)と結合し,レチノイドX受容体(RXR)とヘテロダイマーを形成してレチノイン酸結合配列(RARE)と結合し,様々な遺伝子発現を制御する。ATRAは腎炎モデルで抗糸球体硬化作用を示すが,糖尿病性腎症での影響は未解明なため,検討した。CD-1マウスにストレプトゾトシンを12週齢から投与し,糖尿病を誘発した。16週齢からATRAを週3回腹腔内投与し,24週齢で腎組織を解析し,糸球体硬化とBMP4/pSmad1/COL4発現は改善した。培養マウスメサンギウム細胞にATRAを添加すると,BMP4,COL4発現量は濃度依存的に低下した。培養マウスメサンギウム細胞へのRARαアゴニスト添加はβ,γアゴニスト添加より低濃度からBMP4発現を抑制し, RARαノックダウン細胞ではATRA添加でのBMP4低下作用が減弱した。この効果は特にAGE刺激下において顕著であった。マウスBmp4遺伝子上下流8万塩基からRAREを推定し,2箇所の配列にRAREの可能性があることを見出した。ChIP法にてRAREとRAR,RXRとの結合能を解析し,Bmp4遺伝子exon1上流11488-11501塩基のRAREとRARα,RXRとの結合はatRA添加で誘導された。ルシフェラーゼアッセイを,RAREからBmp4遺伝子exon1を含むベクターと,RARE4塩基置換ベクターを用いて施行し,RAREはATRA添加によるBmp4発現抑制に関与することが示唆された。以上より、ATRAによるBMP4制御が新規糖尿病性腎症治療法開発に有用であることが示唆された。糖尿病性腎症の主要な病理学的所見であるコラーゲンIVの増加は、Bmp4/Smad1軸を介して増強されることがこれまでに見出されている。本研究ではチノイン酸によるBmp4制御を介したコラーゲン発現制御を解析した。CD-1マウス由来メサンギウム細胞を用い、代表的なレチノイン酸であるatRA投与による影響を評価した。レチノイン酸投与はBmp4発現を濃度依存的に減少させ、コラーゲンIV発現もそれに準じた。一般的に、レチノイン酸はその受容体(レチノン酸受容体: RAR)と結合し、遺伝子転写開始点上流または下流のゲノム上に存在するレチノイン酸応答配列と直接結合し、発現制御することが知られている。そこで、マウスゲノム解析を行い、Bmp4遺伝子転写開始点上流約1.1万塩基と5万塩基にそれぞれレチノイン酸応答配列である可能性が示唆される領域が存在することを特定した。同部位とRARとの結合能を、ChIP法にて確認したところ、1.1万塩基上流の領域において、atRA投与にてRARとの結合が誘導されることを見出した。今後、同部位の遺伝子編集を行い、RARとの結合能およびBmp4発現への影響を評価する予定である。レチノイン酸受容体サブクラス特異的アゴニストを用い、3種類のサブクラス(α、β、γ)のうち、RARαが最もBmp4制御に有用である可能性が示唆された。また、それぞれのサブクラスをsiRNA導入にて発現量を減少させた細胞を用いた実験系でも、同様にRARαが最もBmp4制御に有用である可能性が示唆された。ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルマウスを作成し、in vivoでの実験を行う準備を進めている。現在最適なレチノイン酸投与方法について検討中である。atRAがマウスBmp4発現を制御することと、Chip法にてその発現を直接制御する可能性があることを見出した。現在、レチノイン酸応答配列変異細胞を作成中である。また、Bmp4発現に重要なサブクラスを特定した。さらに、in vivoにて糖尿病性マウスへの影響も評価中である。これらのことから、当初の実験計画はおおむね順調に進展していると考える。16週齢からatRAを週3回腹腔内投与し,24週齢で腎組織を解析し,糸球体硬化とBMP4/pSmad1/COL4発現は改善した。培養マウスメサンギウム細胞にatRAを添加すると,BMP4,COL4発現量は濃度依存的に低下した。培養マウスメサンギウム細胞へのRARαアゴニスト添加はβ,γアゴニスト添加より低濃度からBMP4発現を抑制し, RARαノックダウン細胞ではatRA添加でのBMP4低下作用が減弱した。ルシフェラーゼアッセイを,RAREからBmp4遺伝子exon1を含むベクターと,RARE4塩基置換ベクターを用いて施行し,RAREはatRA添加によるBmp

4発現抑制に関与することが示唆された。AtRA投与がマウスBMP4を制御し,糖尿病性糸球体硬化を抑制することを見出した。RARサブタイプのうち,BMP4発現に重要なサブタイプを特定した。さらに,Bmp4遺伝子上流にRAREが存在することが示唆された。これらのことから,当初の実験計画はおおむね順調に進展していると考える。Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4)活性化による転写因子Smad1を介したIV型コラーゲン(COL4)増加は糖尿病性糸球体硬化の一因である。All-trans retinoic acid (ATRA)はレチノイン酸受容体(RAR)と結合し,レチノイドX受容体(RXR)とヘテロダイマーを形成してレチノイン酸結合配列(RARE)と結合し,様々な遺伝子発現を制御する。ATRAは腎炎モデルで抗糸球体硬化作用を示すが,糖尿病性腎症での影響は未解明なため,検討した。CD-1マウスにストレプトゾトシンを12週齢から投与し,糖尿病を誘発した。16週齢からATRAを週3回腹腔内投与し,24週齢で腎組織を解析し,糸球体硬化とBMP4/pSmad1/COL4発現は改善した。培養マウスメサンギウム細胞にATRAを添加すると,BMP4,COL4発現量は濃度依存的に低下した。培養マウスメサンギウム細胞へのRARαアゴニスト添加はβ,γアゴニスト添加より低濃度からBMP4発現を抑制し, RARαノックダウン細胞ではATRA添加でのBMP4低下作用が減弱した。この効果は特にAGE刺激下において顕著であった。マウスBmp4遺伝子上下流8万塩基からRAREを推定し,2箇所の配列にRAREの可能性があることを見出した。ChIP法にてRAREとRAR,RXRとの結合能を解析し,Bmp4遺伝子exon1上流11488-11501塩基のRAREとRARα,RXRとの結合はatRA添加で誘導された。ルシフェラーゼアッセイを,RAREからBmp4遺伝子exon1を含むベクターと,RARE4塩基置換ベクターを用いて施行し,RAREはATRA添加によるBmp4発現抑制に関与することが示唆された。以上より、ATRAによるBMP4制御が新規糖尿病性腎症治療法開発に有用であることが示唆された。レチノイン酸応答配列変異細胞を作成し、RARとの結合能、Bmp4発現およびコラーゲン発現への影響を評価する。糖尿病モデルマウスへの、レチノイン酸投与による影響を評価する。BMP4遺伝子のRARE改変モデル細胞または動物の作成に向けた実験を行う。論文投稿を開始したので,随時必要な追加実験を行う。本実験にて出費を予想した遺伝子組換え細胞の作成やマウスの解析などが、当該年度における出費額としては想定よりも安価であったため。また、実験系として確立するまではなるべく安価に施行できるように実験計画を調整していたため。研究は順調に遂行できている。今年度までの知見を活用し、次年度に遺伝子改変モデル作成を予定したため、今年度の使用額が過剰にならないように留意しながら研究を行ったため次年度使用額が生じた。引き続き遺伝子組み換え細胞作製、動物モデル解析などを継続する。
歯周病菌がフレイルに与える影響の解明を目的とした疫学研究とフレイル予防法の開発

加齢に伴い要介護に移行するフレイルへの対応が重要とされている。本研究では全身疾患と関連していると報告されている歯周病が口腔機能低下とともにフレイル発症にも影響しているかどうかを明らかにすることを目的として行った。昨年度の研究結果では侵襲性歯周病菌である三菌種の総和であるRed complexと舌圧・オーラルディアドコキネシスとの関係は明らかとはならなかったが歯周病菌が口腔機能に何らかの影響を与えていくことが判明した。本年度は対象症例を増加することでフレイルと口腔機能の関係、Red complexの関係について再度検討をおこなった。60歳以上の一般住民を対象とフレイルの有無を評価し、口腔内診査は歯数,歯周病の有無、舌圧、オーラルディアドコキネシス(ODK)を調査した。そこでRed complexが口腔機能を表す舌圧とODKへの影響を検討した。舌圧とODKはすべてにおいて健常群と比較してフレイル群のほうが有意に低値を示した。舌圧とODKに関連する因子を重回帰分析したところ、舌圧のみがRed complex比と有意に関連していたが、ODKには有意差はなかった。フレイルに関連する危険因子をロジスティック解析したところ現在歯数、舌圧、年齢、BMIに有意な関連性を認めた(p<0.05)。フレイルと口腔機能低下およびRed complexに有意傾向を認め、特に現在歯数、年齢、誤嚥が強く相関していた。以上の結果からフレイルの発現には、口腔機能として現在歯数、舌圧が関連し、舌圧にはRed complexが相関していた。口腔機能の低下はフレイル発現の前駆症状であり、口腔機能の維持がフレイル予防の可能性が示唆された。また、Red complexの減少が舌圧低下を防止し、口腔機能低下につながるものと考えられた。本研究課題の目的は歯周病菌がフレイルに与える影響を明らかにすることである。そのため平成28年度は最初に前段階としてフレイルの口腔機能について解析した。対象は60歳以上の自立した地域住民として口腔内の検査項目として歯数、歯周病の状態、咬合支持域、舌苔上の口腔内細菌、舌圧、オーラルディアドコキネシス、全身的調査項目として年齢、BMI、全身筋肉量、握力を測定した。血液検査として食欲調整ホルモンとしてレプチン、炎症性サイトカイン等を測定した。フレイルの診断はフレイル質問票により行った。その結果女性では年齢とODKは何れの発音においても有意に相関していたが男性では舌圧とODKともにフレイル群では何れも低値を示すものの有意差はなかった。よってフレイルの前駆状態としてのオーラルフレイルの診断のための口腔内診査は舌圧測定よりもODKが適している可能が窺えた。さらにフレイルサイクルの1つである食欲の低下に関して脂肪細胞から分泌される食欲抑制作用のあるレプチンがフレイル群で上昇している傾向があることも判明した。また、フレイルの症状として重要な嚥下障害に関して口腔環境との関連性を検討した結果、歯数と口腔乾燥が嚥下障害と有意に関連していることを明らかとした。口腔内細菌はT-RFLP法で全細菌を網羅的に検出しているため結果がでるのに予想以上に時間がかかり、現時点では分析が終了していない。そこで口腔内細菌と炎症性サイトカインに関しては昨年度のデータから統計学的に解析した。その結果、口腔内細菌の総和の中に占めるRed complex比と炎症性サイトカインであるTNF-αが有意に相関していることがわかった。このことより歯周炎からの慢性持続性感染が炎症性サイトカインを介して全身に影響を及ぼすことが予想される。平成28年度のデータが揃ってからRed complexとフレイルに関して統計学的に解析する予定である。本研究の事前準備として行っていた平成27年度の健診において測定していた口腔内細菌と炎症性サイトカインのデータを解析した結果、Red complex比が有意に相関していることが明らかとなった。よって、炎症性サイトカインを介したフレイルのメカニズムに関しては期待できるのではないか予想している。しかし、オーラルフレイルそのものの診断基準は確定されていないため、本研究ではオーラルフレイルの診断基準を確立することも必要であり、今後データの蓄積が必要である。現在までの解析では対象住民において年齢と相関して舌圧とオーラルディアドコキネシスが低下しており、女性においてはフレイルにおいてオーラルディアドコキネシスが有意に低下していることが確認できた。本研究の課題の目的は歯周病菌がフレイルに与える影響を明らかにすることである。男女別に分けて口腔機能評価としての舌圧、滑舌機能(オーラルディアドコキネシス:ODK)を測定してフレイル群と非フレイル群の間で有意差があるかどうか検討したところ、男性では有意な差は認められなかったが、女性では舌圧・ODK(パ、タ、カ)の全てにおいて有意差を認めた。次に口腔内細菌とオーラルフレイルの関係を見るため、侵襲性の歯周病菌としてRed complexに注目した。Red complexは侵襲性歯周病菌であるPorphyromonas.gingivalis(P.g), Treponema. denticola (T.d),Tannerella. forsythia (T.f))の3種類をまとめて呼ぶ総称である。そこでRED complex比と舌圧、ODKの結果を重回帰分析で検討したが、有意な関連性は見出すことが出来なかった。

そこでフレイル群と非フレイル群で舌圧、ODKに有意な相関を認めた女性を対象として口腔内細菌叢の主成分分析(PCA)を試みた。その結果、寄与率20.6%の第1成分においてDialister属、Treponema属、Tannerella属、Eubacterium属、Porphyromonas属が相関係数が0.9以上と極めて高く関連性が窺われた。特にDialister属は重度歯周疾患の病巣から高い頻度で検出され、Tannerella属と会合して分布していることから歯周疾患の重要な関連細菌として注目されている。このように重度歯周病菌とされるDialister属、Tannerella属、Porphyromonas属の他、Treponema属、Eubacterium属ともに歯周病菌として重要な細菌がPCAの結果よりフレイル群の口腔内細菌叢において重要な主成分であることが明らかとなった。オーラルフレイルの評価として口腔機能測定の舌圧、オーラルディアドコキネシスは、全身のフレイルと相関していることが、地域住民の健診結果から確認された。さらに、口腔内細菌叢の関連性を主成分分析して検討した結果、Red complexの関連性は明らかに出来なかったが、主成分分析の結果から歯周病菌がフレイル患者の口腔内細菌叢での主成分であることを明らかにすることが出来た。研究は順調に進んでいるといえる。加齢に伴い要介護に移行するフレイルへの対応が重要とされている。本研究では全身疾患と関連していると報告されている歯周病が口腔機能低下とともにフレイル発症にも影響しているかどうかを明らかにすることを目的として行った。昨年度の研究結果では侵襲性歯周病菌である三菌種の総和であるRed complexと舌圧・オーラルディアドコキネシスとの関係は明らかとはならなかったが歯周病菌が口腔機能に何らかの影響を与えていくことが判明した。本年度は対象症例を増加することでフレイルと口腔機能の関係、Red complexの関係について再度検討をおこなった。60歳以上の一般住民を対象とフレイルの有無を評価し、口腔内診査は歯数,歯周病の有無、舌圧、オーラルディアドコキネシス(ODK)を調査した。そこでRed complexが口腔機能を表す舌圧とODKへの影響を検討した。舌圧とODKはすべてにおいて健常群と比較してフレイル群のほうが有意に低値を示した。舌圧とODKに関連する因子を重回帰分析したところ、舌圧のみがRed complex比と有意に関連していたが、ODKには有意差はなかった。フレイルに関連する危険因子をロジスティック解析したところ現在歯数、舌圧、年齢、BMIに有意な関連性を認めた(p<0.05)。フレイルと口腔機能低下およびRed complexに有意傾向を認め、特に現在歯数、年齢、誤嚥が強く相関していた。以上の結果からフレイルの発現には、口腔機能として現在歯数、舌圧が関連し、舌圧にはRed complexが相関していた。口腔機能の低下はフレイル発現の前駆症状であり、口腔機能の維持がフレイル予防の可能性が示唆された。また、Red complexの減少が舌圧低下を防止し、口腔機能低下につながるものと考えられた。
機能的磁気共鳴画像法を用いた慢性疼痛脳内メカニズムの解明

慢性腰痛における痛みを模した機械的腰部圧迫痛み刺激と機能的磁気共鳴画像法(fMRI)により、島皮質・前運動野・後帯状皮質・前頭皮質など複数の離れた脳領野の賦活が観察された。このうち後帯状皮質は、慢性腰痛患者において有意に強いfMRI信号を呈し、その信号は痛み刺激の強さに依存して増強した。また、慢性腰痛患者における後帯状皮質の賦活は、それを中心に脳の広範囲に広がるdefault mode networkの機能不全に関連する可能性が示唆された。さらに、アロディニアを有する神経障害性疼痛患者では、非疼痛刺激に対する過剰な賦活が大脳辺縁系を含む脳の広範囲にわたって観察された一方、心理社会的要因が強い慢性疼痛患者では、第一次感覚皮質における正常な反応のみが観察された。以上の結果から、慢性疼痛患者においては、疼痛関連脳活動が異常に亢進しており、それが認知機能と密接に関連する脳内ネットワーク機能不全と関連する可能性がある。さらに、fMRIによる疼痛関連脳活動の解析により、神経障害性疼痛と心因性疼痛とを判別できる可能性がある。本年度は、前年度より継続してきた腰痛に関わる脳活動の研究を完成した。機械的腰部圧迫刺激とfMRIにより、過去に報告された疼痛関連脳部位の活性化が観察された。とりわけ、島皮質・前運動野・後帯状皮質・前頭皮質の活動が腰背部深部組織の痛みに関連する活動として興味深い。また、第一次・第二次感覚皮質などの外側侵害受容系が活性化しないのも重要な特徴である。このような腰痛関連脳活動を"low back pain matrix"と名付け、2009年8月に日本麻酔科学会で報告し、国際誌Spineの2009年10月号に掲載した。また、前年度より継続してきた、正中神経切断後慢性疼痛のfMRI縦断研究を押しすすめた。正常では第一次・第二次感覚皮質の単純な賦活として現れる手掌触覚刺激が、患側の手掌では、大脳辺縁系を含む広範な部位の強い脳賦活として現れ、これが異常疼痛感覚であるアロディニアに関連することを見いだした°このことを、上記の腰痛関連脳活動の知見と併せてまとめ、慢性疼痛の診断に用いるfMRIの理論・方法を解説する総説文を「麻酔」誌2009年11月号に掲載した。麻酔において、痛みとは、麻酔深度と循環動態と強く影響する因子である。術中は時々刻々と変化する痛みに対して、麻酔深度を絶えず適切に調節することが、麻酔による循環不全・臓器障害など重篤な副作用を防ぐ上で重要である。このような内容の論説文を、editorialとして国際誌Anesthesia & Analgesiaに投稿し、2010年3月号に掲載された。一方、京都大学ペインクリニックと高次脳機能研究センターと共同ですすめている慢性疼痛のfMRI研究のために、刺激装置および画像解析装置・解析ソフトウェアの整備を順調にすすめた。本年度も慢性腰痛に関わる脳活動の研究を継続した。健常成人6人と慢性腰痛患者7人に対して機械的腰部圧迫刺激を加えながら機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を施行し、疼痛関連脳活動を観察した。その結果、両側後帯状皮質、右島皮質、右前頭皮質、右補足運動野、両側運動前野などに脳活動賦活を認めた。また、腰痛患者においては後帯状皮質の賦活が健常人よりも優位に高く現れ、しかも痛みの強さにより変化することが示された。以上の結果から、後帯状皮質の疼痛関連脳活動が、慢性腰痛の重症度に関連する指標となり得ることが示唆された。この知見は、2011年度国際腰痛学会にて発表予定であり、同時に原著論文作成を進めている。正中神経切断後アロディニアを呈する患者のfMRI所見に関して、日本ペインクリニック学会にて発表した。大脳辺縁系を含む広範な脳領野で痛みに対して過剰反応を呈することを報告した。さらに現在、治療過程における縦断的変化の定量を試みており、その結果を踏まえて同学会誌および国際誌に投稿予定である。今後より多数の慢性疼痛患者、特に代表的な慢性疼痛3疾患(慢性腰痛、複合性局所疼痛症候群、線維筋痛症)の患者に研究参加して頂き、より多面的な脳機能イメージング法を適用するため、複数施設での横断的共同研究を策定した。

具体的には、これまでの伝統的fMRIに加えて、機能的結合性fMRI、voxel-based morphometry、ドパミン受容体標識リガンドを用いた陽電子断層撮影法(PET)を用いる計画である。これにより、慢性疼痛における脳の病態生理学的変化をより詳細に記述できると期待している。その他、次のような講演を学会・研究会・講習会などで行い、最新研究知見の啓蒙に努めた。1)機能的脳画像法を用いた麻酔薬作用機序研究の最新知見を示した。2)痛みの脳研究の様々な知見を説明できる独自のbottom-up/top-downモデルについて紹介し、慢性疼痛研究における有用性を示した。3)薬物投与と心理療法を中心とする疼痛治療外来の現状を紹介し、将来の薬剤開発の方向性を示した。一方、麻薬性鎮痛剤トラマドールが開頭術後患者の痛みと免疫系に及ぼす影響を研究する大学院生を指導し、米国麻酔科学会で発表した。10人の慢性腰痛患者と12人の健常被験者に、腹臥位で腰部圧迫刺激を与えながらfMRIを撮像し、腰痛関連脳部位として前頭皮質・島皮質・後帯状皮質などを同定した。特に、慢性腰痛患者では健常被験者に比べ後帯状皮質の陽性賦活が高い傾向を示すという従前からの知見を確認した。さらに、慢性腰痛患者では、腰部圧迫疼痛刺激を与えたとき、楔前部を中心とするdefault mode network (DMN)の陰性賦活が弱い一方、健常被験者ではDMNの強い陰性賦活を観察した。DMNは、後帯状皮質を中心として離れた複数の脳部位に分布するネットワークであり、注意を要する状態で一様に陰性賦活を呈することが知られている。以上のことから、慢性腰痛患者における後帯状皮質の陽性賦活は、DMNの機能不全に関連する現象であることが推察され、慢性疼痛患者に観察される認知機能障害に関連する可能性があると考えられる。現在国際誌への投稿準備中である。また、複雑性局所疼痛症候群患者2人に対して電気痛み刺激によるfMRIを施行した。アロディニア症状をもつ患者では、患側刺激により大脳辺縁系を含む脳の広い領域で両側性に強い賦活を見せたのに対して、アロディニア症状をもたない患者では、患側刺激による脳賦活が弱く非特異的パターンを呈した。これらの結果は、慢性疼痛の症状・病態により、大脳における過敏もしくは求心路遮断という異なる様相を示すものとして興味深い。すなわち、神経障害性疼痛の要素が強い慢性疼痛においては、内側侵害受容系を中心とする脳領野の過剰反応が観察されるが、神経障害性疼痛の典型的症状を呈さない(心因性要素ないし社会的要素が強い)慢性疼痛では、正常な疼痛関連脳活動を呈する。この対照的な結果を短報として国際誌に報告し、さらに被験者を追加する予定である。これらの知見は、慢性疼痛における(1)特異的脳賦活パターンと脳ネットワーク機能障害の存在、ならびに(2)神経障害性疼痛の診断と治療評価における機能的磁気共鳴画像法の有用性、以上二点を示唆するものである。慢性疼痛の脳内メカニズムを解明するという本研究課題の目的に近付く有意義な成果と考えられる。
メカニカルストレスによる皮膚炎誘導のメカニズムの解明

テープストリッピングによりIL-1β、CXCL-1以外にCXCL-2、CXCL-3の発現がケラチノサイトに誘導されることが明らかとなった。また、テープストリッピング直後にIL-1受容体を皮内注することで、IL-1β、CXCL-1の発現が低下したことから、サイトカイン、ケモカイン誘導においてDAMPsとしてのIL-1αの重要性が示された。一方で、テープストリッピング後の表皮細胞をフローサイトメーターでケラチノサイト、T細胞、ランゲルハンス細胞への分離を試みたが、mRNA解析ができるほどの細胞数を得られなかった。今後、さらなる条件検討を行っていく予定である。ランゲリンDTRマウスなどの遺伝子改変マウスは、現在までに実験を行えるだけの十分量のマウスを確保できず、今後マウスを増やし実験を行っていく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Myd88をシグナル伝達分子として用いるDAMPsであるHMGB-1, IL-1α,IL-33のうちどのDAMPsがどの程度テープストリッピング後のIl1β,Cxcl1の発現上昇に関与するかを明らかとするために,新生児から単離し培養した表皮にHMGB-1, IL-1α,IL-33を添加後にIl1β,Cxcl1のmRNAの発現を測定した。その結果、HMGB-1、IL-1αの添加ではIl1β,Cxcl1のmRNAの発現が有意に増加したが,IL-33の添加ではこれらのサイトカイン,ケモカインの上昇は認めなかった。またHMGB-1とIL-1αの添加によるIl1β,Cxcl1のmRNAの発現上昇の程度に顕著な差はみられなかった。さらにマウスの背部に,HMGB-1, IL-1α,IL-33を皮内注し4時間後の表皮のIl1β,Cxcl1のmRNAの発現を検討したところ,in vtroの添加実験の結果と同様にHMGB-1,IL-1αはIl1β,Cxcl1のmRNAを有意に増加させたが,IL-33による皮内注ではこれらのサイトカイン,ケモカインの発現量に変化はみられなかった。また,同様にHMGB-1とIL-1αの皮内注によるIl1β,Cxcl1のmRNAの発現上昇の程度に顕著な差はみられなかった。以上から,Myd88をシグナル伝達分子として用いるDAMPsであるHMGB-1, IL-1α,IL-33のうち主にHMGB-1とIL-1αがテープストリッピング後のIl1β,Cxcl1の発現上昇に関与すると考えられた。HMGB-1, IL-1α,IL-33による添加または塗布による表皮のIl1β,Cxcl1の発現上昇を検討したが、in vitro, in vivoで同様の結果が得られた。そのため、今後はHMGB-1,IL-1αに関して中和抗体や遺伝子改変マウスを用いることで、それらの分子のメカニカルストレスに対する制御に関して着目していけるようになった。表皮内にはケラチノサイトの他,ランゲルハンス細胞,γδT細胞,αβT細胞などの免疫細胞も存在する。そこでテープストリッピング後の表皮Il1β,Cxcl1の発現上昇におけるこれら各細胞の役割を解明するため,テープストリッピング前後の表皮からケラチノサイト,ランゲルハンス細胞,γδT細胞,αβT細胞をフローサイトメトリー法を用いてそれぞれ単離してmRNAを測定する。さらにそれぞれランゲルハンス細胞,γδT細胞およびT細胞すべてを欠如するLangerin DTAマウス,γδTCR欠損マウスおよびRag1欠損マウスを用いてテープストリッピング後の表皮Il1β,Cxcl1の発現上昇を検証する。またメカニカルストレスで誘導されるDAMPsの放出とそれに引き続くIl1β,Cxcl1の産生が各皮膚疾患に与える影響を明らかとするため、TLR4欠損マウス、IL-1受容体欠損マウスに対して,メカニカルストレスによる皮膚炎モデルを誘導した際の重症度を検証する。またハプテンを用いた接触皮膚炎モデル,およびTLR7のリガンドであるイミキモドを用いた乾癬モデルおよびそれらのモデルにテープストリッピングを加えた場合の皮膚炎の重症度も検証する。ロリクリン欠損マウスはメカニカルストレスに関して感受性が高いとされる。そこで,TLR4欠損マウスやIL-1受容体欠損マウスとロリクリン欠損マウスをかけ合わせ両欠損マウスを作成し,同様に各皮膚炎を誘導した際の重症度を検証することによって,メカニカルストレスにより放出されるDAMPsの各皮膚炎における関与を明らかにする。
芸予地震の総合的再評価

本研究は,倉橋島の南方を震央として1905年6月2日に発生し,広島・呉地域に被害をもたらした芸予地震(M=7 1/4)について,様々な研究領域からの総合的再評価を行い,地域社会の地震防災ための調査研究を行ったものであり,以下のような成果を得た.被害実態調査の面では,震害記録の収集と芸予地震体験者へのアンケート調査を実施し,新聞,被害調査報告,気象台の報告などの収集資料の一部を付録として掲載した.また建物の被害状況の諸要因と,耐震構造の歴史的背景との関連について論じた.芸予地震の震源断層については,まずその存在を確認するため,震源域付近の海域において音波探査による海底断層調査を行った結果,断層は海底まで達せず津波も発生しなかったとの結論が得られた.芸予地震の地震動強度に関しては,断層シミュレーションにより地震動分布を再現し,広島・呉地域での揺れを気象庁震度階VVI程度と推定した.震害を大きく左右する地盤条件に関連しては,常時微動測定と重複反射理論により広島・呉の沖積地盤の固有周期を求め,地盤卓越周期を決定した.また松山市内の液状化発生箇所の推定を試みた結果,液状化が生じていないと推定され,液状化記録が無いことの裏付けを得た.沖積低地の連続試料採取のためのバイブロコアラーの開発も行っている.将来の地震防災に対するアプローチとして,木造家屋の地震応答解析と,鉄筋コンクリート造建物群の震害建物の被害率の算定を行い,注目地域の地盤の固有周期と建物被害の関係を明らかにした.またシミュレーション法による鉄筋コンクリート造建物の耐震信頼度の評価を行い,震害予測の基礎資料とした.さらに,工学的地震危険度解析の結果から,芸予地震の地震域である安芸・伊予灘が,広島地域への地震危険度に対して高い寄与度を有することを明らかにした.本研究は,倉橋島の南方を震央として1905年6月2日に発生し,広島・呉地域に被害をもたらした芸予地震(M=7 1/4)について,様々な研究領域からの総合的再評価を行い,地域社会の地震防災ための調査研究を行ったものであり,以下のような成果を得た.被害実態調査の面では,震害記録の収集と芸予地震体験者へのアンケート調査を実施し,新聞,被害調査報告,気象台の報告などの収集資料の一部を付録として掲載した.また建物の被害状況の諸要因と,耐震構造の歴史的背景との関連について論じた.芸予地震の震源断層については,まずその存在を確認するため,震源域付近の海域において音波探査による海底断層調査を行った結果,断層は海底まで達せず津波も発生しなかったとの結論が得られた.芸予地震の地震動強度に関しては,断層シミュレーションにより地震動分布を再現し,広島・呉地域での揺れを気象庁震度階VVI程度と推定した.震害を大きく左右する地盤条件に関連しては,常時微動測定と重複反射理論により広島・呉の沖積地盤の固有周期を求め,地盤卓越周期を決定した.また松山市内の液状化発生箇所の推定を試みた結果,液状化が生じていないと推定され,液状化記録が無いことの裏付けを得た.沖積低地の連続試料採取のためのバイブロコアラーの開発も行っている.将来の地震防災に対するアプローチとして,木造家屋の地震応答解析と,鉄筋コンクリート造建物群の震害建物の被害率の算定を行い,注目地域の地盤の固有周期と建物被害の関係を明らかにした.またシミュレーション法による鉄筋コンクリート造建物の耐震信頼度の評価を行い,震害予測の基礎資料とした.さらに,工学的地震危険度解析の結果から,芸予地震の地震域である安芸・伊予灘が,広島地域への地震危険度に対して高い寄与度を有することを明らかにした.(1)安芸灘海底の現地調査まず,調査海域として,今村(1905)によって推定されている震源域の中央部にあたる広島県倉橋島の西の海域と,1905年の芸予地震の前後に地震活動が活発で、マグニチュードが6クラスの地震の震源が集中する倉橋島の南の海域に注目した。さらに,芸予地震の被害域から推定される震源域の長軸方向と,この地域に現在発生している地震の発震機構から推定される震源断層の性格から,芸予地震の震源断層はほぼ南北の走向を持つ逆断層であろうと推定した。その推定のもとに調査測線を推定断層の走向に直交するほぼ東西に設定し,小型船を時速5kmで走らせ,搭載した音波地層探査機によって海底を探査した。結果的には,音波探査記録は極めて明瞭であったものの,沖積世の海成層を変位させるような断層は発見できなかった。これより,芸予地震の震源は深く,震源断層は海底まで達せず,津波も発生しなかったとの結論を得た。(2)当時の被害に関するアンケート調査本調査の目的は,西瀬戸内海地方の寺院に残されている記録を広い地域に渡って調査することによって,当時の地震動の強さや津波の発生の有無を推定することにある。今回は浄土真宗本願寺派の1226の寺院に対してアンケート調査を実施した。現時点での回収率は約25%であり,近々整理を開始する予定である。(3)関連資料の発掘調査当時の新聞,呉市や熊野町などの各市町村史,呉鎮守府沿革誌,内務省「明治38年公文雑纂」,防衛庁防衛研究所資料、東京大学地震研究所資料など,芸予地震関連の資料を幅広く収集した。資料の系統的な整理は次年度に行う予定である。(4)広島地域の地震危険度解析芸予地震をはじめ,これまでの歴史地震データに基づいて広島地域を対象とする地震危険度解析を行った。

マグニチュード,震央距離の確率密度関数から,広島地域で想定すべき地震の平均的な姿を導いた。(1)芸予地震を想定した断層破壊シミュレーションによる強震動評価芸予地震の震源と目されている安芸灘の海底を音波探査による昨年度の調査の結果,震源断層は海底まで達しない深い所に位置するとの結論が得られているので,今年度はその成果を踏まえて断層破壊シミュレーションを行い,当時の広島地域における強震動評価を試みた.その結果,広島地域における震度について,ほぼこれまで報告されている値に一致することが明らかになった.この成果は,今後広島地域の防災対策について検討する際に有効に活用できるものと考えている.(2)常時微動観測による地盤危険度マップの作成常時微動の観測結果から得られる疑似伝達スペクトルを用いて盛土や海岸埋め立て地等の地震時の被害を予測,評価しようとの提案に基づき,同手法を芸予地震の際に大きな建物被害を生じた呉市の地盤危険度の評価に適用すべく,同市において常時微動観測を実施した.それにより,同市の地盤危険度マップを作成することができた.この成果も呉地域のこれからの防災計画に活用し得るものである.(3)呉軍港関連施設等の被害調査を通してみる明治期建築の耐震性評価入手できた公刊物等に基づいて呉軍港関連施設等の被害を再調査し,特に画像処理についてはCD-ROM化して資料のストックを試みた.また,わが国における建築分野の耐震工学の系譜を調べ,芸予地震当時の耐震設計の水準について考察した.さらに,広島市内の煉瓦製の煙突の被害について検討するために,構造解析を行い,煙突が立てられていた地域の地盤の固有振動特性と被害との関連について、いくつかの知見を得ることができた.(4)芸予地震に関連する資料の再整理主として昨年度収集した,当時の新聞,各市町村史,呉鎮守府沿革史,内務省「明治38年公文雑編」,防衛庁防衛研究所資料,東京大学地震研究所資料などを系統的に整理し,芸予地震による被害等の様相をより明らかにするよう試みた.
武蔵野市における草の根市民運動のネットワーク形成について

本研究は,ネットワークに関する理論的基礎研究,武蔵野市の市民運動のキー・パーソンから見た運動のネットワーク形成,郵送調査による武蔵野市内の運動体の実態調査,その内の主だった運動体のリーダーに対する面接調査という4つの部分から成り立っている.先ず62年7月までは理論的基礎研究にあて,ネットワーキングとは,草の根運動を中心とした下からの「新しい社会運動」を指すべきであることを明らかにした.続いてコミュニティ・センターを利用している団体をリスト・アップし,武蔵野市における市民運動のキー・パーソンを定め,インタビューを行った.そこから彼らのネットワーキング図を作ると共に,武蔵野市の市民運動団体を整理し, 12月には活動的なグループに対して彼らの活動の実態を把握するための郵送調査を行った.その反応を踏まえて,調査会社に依頼して,主要な運動体のリーダーに対する面接調査を63年の1月から2月にかけて行った.これらの結果,武蔵野市は対外的には市民意識や制度の面で先進的だと思われているが,旧来のムラ的側面を市民活動の中に多く残していること,運動のリーダーたちが固定化する傾向が見られること,運動の担い手が婦人(専業主婦)と老人(停年退職者)に片寄っていること,行政はホンネでは市民運動を胡散臭く思っていることなど否定的な側面も数多く存在することがわかった.しかし一方で,高学歴で(63年で大卒は男性の51%,女性の18%)移動の激しい(転勤族が多い)市民層の存在は,グローバルな世界の動きに敏感でしかも地域で活動するという新しいタイプの運動のリーダーを生み出している.彼らは年齢的には全共闘世代に多い.また運動体どうしが,共通の目標に気付き始め,情報の交換から共同行動,さらには恒常的なネットワーク形成という方向に進みつつあるということも伺える.武蔵野市における市民運動は今後もその展開が大いに注目されよう.本研究は,ネットワークに関する理論的基礎研究,武蔵野市の市民運動のキー・パーソンから見た運動のネットワーク形成,郵送調査による武蔵野市内の運動体の実態調査,その内の主だった運動体のリーダーに対する面接調査という4つの部分から成り立っている.先ず62年7月までは理論的基礎研究にあて,ネットワーキングとは,草の根運動を中心とした下からの「新しい社会運動」を指すべきであることを明らかにした.続いてコミュニティ・センターを利用している団体をリスト・アップし,武蔵野市における市民運動のキー・パーソンを定め,インタビューを行った.そこから彼らのネットワーキング図を作ると共に,武蔵野市の市民運動団体を整理し, 12月には活動的なグループに対して彼らの活動の実態を把握するための郵送調査を行った.その反応を踏まえて,調査会社に依頼して,主要な運動体のリーダーに対する面接調査を63年の1月から2月にかけて行った.これらの結果,武蔵野市は対外的には市民意識や制度の面で先進的だと思われているが,旧来のムラ的側面を市民活動の中に多く残していること,運動のリーダーたちが固定化する傾向が見られること,運動の担い手が婦人(専業主婦)と老人(停年退職者)に片寄っていること,行政はホンネでは市民運動を胡散臭く思っていることなど否定的な側面も数多く存在することがわかった.しかし一方で,高学歴で(63年で大卒は男性の51%,女性の18%)移動の激しい(転勤族が多い)市民層の存在は,グローバルな世界の動きに敏感でしかも地域で活動するという新しいタイプの運動のリーダーを生み出している.彼らは年齢的には全共闘世代に多い.また運動体どうしが,共通の目標に気付き始め,情報の交換から共同行動,さらには恒常的なネットワーク形成という方向に進みつつあるということも伺える.武蔵野市における市民運動は今後もその展開が大いに注目されよう.
α2-アドレナリン受容体細動脈収縮の情報伝達

ラット精巣挙筋細動脈を用いin vitroで、百日咳毒素感受性(抑制性)G蛋白質(G_<PTX>)とATP感受性カリウムチャンネル(K_<ATP>)との間の情報伝達機序を明らかにするため、以下の検討を行った。麻酔下10週齢WKYラットの右精巣挙筋を摘出し、精巣挙筋中心を走行する内径約100μmの細動脈を用い無傷かつ迅速に長さ約2mmを取り出した。摘出細動脈両端より内圧が調節可能なガラスピペットを挿入固定、漕内に懸下し、細動脈径の応答を観察した。前処置をしない場合とアデニールサイクラーゼ阻害薬SQ22,536(1μM:SQ)で細動脈収縮を惹起させ、ニトロプルシッド(1μM:NP)で細動脈径のみSQ使用前に回復させた場合でα2-アドレナリン受容体刺激薬UK-14,304(UK)(10nM10μM)とATP感受性カリウムチャンネル拮抗薬glibenclamide(GLB)(10nM10μM)の濃度反応曲線を比較した。SQでアデニル酸シクラーゼを阻害しても、GLBによる細動脈収縮は影響されなかった。しかしUKによる細動脈収縮は、SQ22,536でアデニル酸シクラーゼを阻害した後は認められなくなった。また細動脈をアデニル酸シクラーゼ刺激薬NKH477(0.1μM:NKH)で拡張させた場合とNPで拡張させた場合のUKとGLBの濃度反応曲線を比較した。NKHでアデニル酸シクラーゼを刺激しても、GLBによる細動脈収縮は影響されなかったが、UKによる細動脈収縮は認められなかった。本検討の結果よりα2-アドレナリン受容体刺激により細動脈が収縮する場合には、G_<PTX>とK_<ATP>間の情報伝達にはアデニル酸シクラーゼ活性の減少による細胞内ATP濃度上昇が関与していることが示唆された。ラット精巣挙筋細動脈を用い、in vitroの体液性因子の影響のない状態で、百日咳毒素感受性(抑制性)G蛋白質(G_<PTX>)とATP感受性カリウムチャンネル(K_<ATP>)との間の情報伝達機序を明らかにするため、以下の検討を行った。前処置をしない場合とアデニールサイクラーゼ阻害薬SQ22,536(0.1μM:SQ)で血管収縮を惹起させ、ニトロプルシッド(0.11μM:NP)で細動脈径のみSQ22,536使用前に回復させた場合でα2-アトレナリン受容体刺激薬UK-14,304(UK)(10nM10μM)とATP感受性カリウムチャンネル拮抗薬glibenclamide(GLB)(10nM10μM)の濃度反応曲線を比較した。SQ22,536でアデニールサイクラーゼを阻害しても、GLBによる細動脈収縮は影響されなかった。しかしUKによる細動脈収縮は、SQ22,536でアデニールサイクラーゼを阻害した後は認められなくなった。G_<PTX>とK_<ATP>間の情報伝達には、イ)G_<PTX>によりアデニールサイクラーゼが阻害されc-AMPの碁質である細胞内ATP濃度が上昇する、ロ)G_<PTX>により

K_<ATP>が直接刺激されるという二つの可能性が考えられる。本検討の結果よりα2-アドレナリン受容体刺激により細動脈が収縮する場合には、G_<PTX>とK_<ATP>間の情報伝達にはアデニールサイクラーゼ活性の減少による細胞内ATP濃度上昇が関与していることが示唆された。ラット精巣挙筋細動脈を用いin vitroで、百日咳毒素感受性(抑制性)G蛋白質(G_<PTX>)とATP感受性カリウムチャンネル(K_<ATP>)との間の情報伝達機序を明らかにするため、以下の検討を行った。麻酔下10週齢WKYラットの右精巣挙筋を摘出し、精巣挙筋中心を走行する内径約100μmの細動脈を用い無傷かつ迅速に長さ約2mmを取り出した。摘出細動脈両端より内圧が調節可能なガラスピペットを挿入固定、漕内に懸下し、細動脈径の応答を観察した。前処置をしない場合とアデニールサイクラーゼ阻害薬SQ22,536(1μM:SQ)で細動脈収縮を惹起させ、ニトロプルシッド(1μM:NP)で細動脈径のみSQ使用前に回復させた場合でα2-アドレナリン受容体刺激薬UK-14,304(UK)(10nM10μM)とATP感受性カリウムチャンネル拮抗薬glibenclamide(GLB)(10nM10μM)の濃度反応曲線を比較した。SQでアデニル酸シクラーゼを阻害しても、GLBによる細動脈収縮は影響されなかった。しかしUKによる細動脈収縮は、SQ22,536でアデニル酸シクラーゼを阻害した後は認められなくなった。また細動脈をアデニル酸シクラーゼ刺激薬NKH477(0.1μM:NKH)で拡張させた場合とNPで拡張させた場合のUKとGLBの濃度反応曲線を比較した。NKHでアデニル酸シクラーゼを刺激しても、GLBによる細動脈収縮は影響されなかったが、UKによる細動脈収縮は認められなかった。本検討の結果よりα2-アドレナリン受容体刺激により細動脈が収縮する場合には、G_<PTX>とK_<ATP>間の情報伝達にはアデニル酸シクラーゼ活性の減少による細胞内ATP濃度上昇が関与していることが示唆された。
磁気マイクロビーズを利用するマイクロアレー免疫測定法の開発

近年、ELISA法に代表される酵素免疫測定法は、複雑なマトリクス中の特定成分を選択的に測定できるので、生体試料から環境試料まで広い分野の分析に用いられるようになっている。申請者らは、抗体を固定化した磁気マイクロビーズを流れの中で用いるイムノアッセイ法を開発し、陰イオン界面活性剤の化学発光検出系に応用し、測定の自動化と測定時間の短縮化に成功している。(1)マウスIgG、ウサギIgGおよびヒトIgGをモデル物質として、SIA法、抗体固定化磁気ビーズならびに蛍光測定法を用いる蛍光/フローイムノアッセイ法を開発した。本法はELISA法やフローサイトメトリーと比較すると、簡便・迅速かつ小型であるといった特徴を持つ。(2)三種類の量子ドット標識抗IgGを用いる、マウスIgG、ウサギIgGおよびヒトIgGの三成分同時フローイムノアッセイを行った。三成分全てを混合した状態においてもそれぞれのピークが確認され、定量測定が可能であると示唆される結果が導き出された。(3)量子ドットを用いる蛍光/フローイムノアッセイ法の基礎が確立された。標識物質、抗体の数を増やすことにより更なる多成分同時測定が可能となる。(4)今後は、異なる抗体を固定化した磁気ビーズの1個1個を識別する技術を開発し、磁気ビーズによるマイクロアレー型のイムノアッセイ法を開発したいと考えている。ハイスループットなイムノアッセイ法として、環境分析のみならず、医療検査、バイオテクノロジーの生産管理などの分野においても熟練した技術者でなくても短時間で容易に分析が可能な分析装置の開発を目指して行きたい。