hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会変動プロセスに関するダイナミックメカニズムの基礎研究

社会変動プロセスに関する研究は実証的研究と理論的研究の2つに大別されるが、先ず理論的アプロ-チとして変動プロセスのダイナミックなとりあつかいを可能とする方法論が探求されねばならなかった。考察の結果微分ゲ-ム(Differential Game)の援用によって特殊社会変動基本モデルに関してのパ-スペクティブをもつことができた。なお一般社会変動モデルについてはまだなお越えねばならないハ-ドルがあり、今後の研究計画において展開していくことになろう。しかしながら、分析の言語としてはいわゆるカタストロフ理論や力学系の理論がその中核を占めることになるという見通しにたっている。また、実証的研究においては、都市と離島の問題を集中的にフィ-ルドワ-クとして社会調査を実施した。都市では歴史的条件のとりあつかい等が当面の課題であったが、都市類型化のなかで変動のメカニズムの構成を探求することができた。離島コミュニティについてのフィ-ルドワ-クは主に小笠原諸島や沖縄・庵美群島を中心に実施した。その結果離島の当面する課題が離島の少くとも3つの変動過種の中で構成されねばならないことが判明した。都市的離島と離島度の高い離島では変動のメカニズムは大きな違いがある。もちろん、ともに内的発展を契機とするよりも外在的誘導による変動がその大部分である。離島間の中に今や格差が生じておりいわゆる南南問題を発生している。都市と離島のダイナミックな関わりについては今後の究明を待たねばならない。フィ-ルドワ-クが地域変動に限られたが社会変動基本モデルの提出にとって、モデルのシンプル化のために1つのケ-ススタディとしての企図されたものである。その他パイロット的研究として組織間のコンフリクトの分析、特に意思決定過程の試みの問題が考察の対象となった。
ブロック共重合体を用いたドメイン配向制御と機能分離による高効率薄膜太陽電池の開発

高分子薄膜太陽電池において、電荷発生から輸送に至る光電変換過程の高効率化を図るためには、薄膜内部における最適な相分離構造の構築と適切な機能分離が重要である。本研究では、多機能性ブロックコポリマーの分子設計と合成を行い、その自己組織化能を利用して太陽電池の薄膜内部における最適な構造の構築と制御を試みた。ポリチオフェンをベースとしたブロックコポリマーの連結部位に電荷分離に有利な官能基を導入した材料を用いた結果、薄膜内部に緻密な相分離構造を形成することができ、さらに薄膜太陽電池デバイスの光電変換効率を向上させることに成功した。本研究では有機薄膜太陽電池の薄膜内部における相分離構造の制御と、相分離ドメインおよびその界面における機能分離を可能とするジャンクション修飾型ジブロックコポリマーの開発を目的としている。特に、ジャンクション部位へ機能性官能基を導入することにより、相分離界面を選択的に機能化することができ、光吸収により生成した励起子から電荷分離が起きる過程の効率を向上させることが可能となる。本年度の研究では、前年度までに合成したジャンクション修飾型ブロックコポリマーの中で特にポリ(3-ヘキシルチオフェン)(P3HT)を正孔輸送性セグメントとして有するポリマーを用いて有機薄膜太陽電池の性能評価を行った結果、分子構造による薄膜内部のモルフォロジーの違いが素子性能に大きく影響を与えることを見出した。ジャンクション修飾型ブロックコポリマーとして、P3HTとポリエチレンオキシド(PEO)またはポリジメチルシロキサン(PDMS)をセグメントとして選択し、さらにジャンクション部位には機能性基としてペリレンジイミドを導入したジブロックコポリマーを合成した。これらの正孔輸送性ポリマーと電子輸送性材料であるフラーレン誘導体のPCBMをブレンドし、薄膜を作製して有機薄膜太陽電池として評価を行った。片方のセグメントにPEOを用いた場合は、PCBMの大きな凝集体が形成したのに対し、PDMSを用いるとPCBMの凝集が10 nm程度に抑えられて均一な相分離構造が得られた。また、ペリレンジイミドをジャンクション部位へ導入することで、従来のブロックコポリマーに比べてより明確かつ緻密な相分離構造が形成された。さらに、これらの構造を反映してペリレンジイミドを導入したP3HTーPDMSからなるブロックコポリマーを用いた素子において開放端電圧の向上が見られ、従来のP3HTを用いた素子に比べて高い光電変換効率を達成することができた。本年度の研究では、ポリチオフェンやポリ(トリアリールアミン)等の正孔輸送性セグメントと、相分離構造制御を担うポリエチレンオキシド(PEO)やポリジメチルシロキサン(PDMS)等のソフトセグメントからなるジブロックコポリマーのジャンクション部位へ機能性官能基としてペリレンジイミドを導入した新規正孔輸送性ジブロックコポリマーの合成を行った。まずポリエチレンオキシドもしくはポリジメチルシロキサンの片末端をペリレンジイミドで修飾し、続いてポリ(3-ヘキシルチオフェン)(P3HT)もしくはポリ(4-ブチルトリフェニルアミン)(PTPA)との鈴木カップリング反応を利用した高分子間カップリングにより、効率的に目的のブロックコポリマーを合成することが可能であった。NMRやIRを用いた構造解析により、ペリレンジイミドがほぼ等量的に導入されていることを確認した。二官能性のポルフィリン誘導体を出発原料として合成し、上記と同様の手法を用いることにより、ジャンクション部位にポルフィリンを修飾したブロックコポリマーの合成も行った。本年度の計画では、ジャンクションへ機能性官能基を導入したブロックコポリマーの合成法の確立することを目的としており、現在の研究の進捗状況においてほぼ達成されている。平成25年度の研究計画では、これまでに合成したジャンクション修飾型ブロックコポリマーの光・電子物性を中心とした薄膜における物性評価を行う。また、電子輸送材料としてフラーレン誘導体であるPCBMとのブレンド薄膜を作成し、相分離構造および光電変換素子としてのデバイス性能評価を行う。これまでの知見により、ポリジメチルシロキサン(PDMS)をソフトセグメントとして有する正孔輸送性ブロックコポリマーを用いた光電変換素子において、正孔輸送性ホモポリマーを用いた素子に比べて優位性が確認されている。そこで、ポリ(3-ヘキシルチオフェン)とポリジメチルシロキサンからなるジャンクション修飾型ブロックコポリマーを用いたデバイスについて集中的に性能評価する予定である。該当なし
19F-NMRによる光架橋反応を用いた核酸類同時検出

核酸類の検出における検出法として蛍光分子を用いた手法が多く報告されている。しかし、蛍光分子はスペクトル域に一定の広がりを有するため、複数の核酸類を同時に検出には蛍光波長の重なりがノイズとして検出されてしまう。本研究では尖鋭なピークをもつ19F NMRに注目し、光架橋による19F NMRのケミカルルシフの変化を利用した核酸類同時検出を行った。2018年度は前年度検討した3種類の光架橋型人工核酸を用い、19F NMRによる3種類のmiRNA(miRNA27a, Let7i, miRNA200a)の同時検出を行った。フッ素源としてトリフルオロチミジン(TFT)を用い、ハイブリダイゼーションチェインリアクション(HCR)を増幅系として組み込んだ。その結果、光照射により標的miRNAに対応した19Fシグナルが検出された。また、反応前とは8 ppm近く大きなシグナル変化が誘起されており、本研究課題の目的である光架橋による電子状態の変化を用いた大きなケミカルシフトの変化と、周辺環境によるケミカルシフトの変化を組み合わせる事により、19 NMRを用いた核酸類の同時検出に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、蛍光分子を用いた場合はスペクトル域に一定の広がりを有するため、複数の核酸類を同時に検出する際には蛍光波長の重なりがノイズとして検出されてしまう。本年度は核酸類の同時検出に利用可能な光応答性核酸群の合成及び、光架橋により誘起されるケミカルシフト変化の評価を行った。新規光応答性人工核酸として3種類の3-ビニルカルバゾール誘導体の合成を行った。各光応答性人工核酸とトリフルオロメチルチミジン(TFT)との光架橋反応を行い、その10F MRシグナルを測定した。その結果、いずれの光応答性人工核酸を用いた場合にも光架橋反応によりTFT由来の19F MRシグナルを8 ppm程度大きく変化出来ることが分かった。さらに、各光応答性人工核酸の有する置換基により変化後のケミカルシフトが変化していることを見出した。既存の3-シアノビニルカルバゾールを合わせ、検討を行った光応答性人工核酸4種類の中から3種類の光応答性人工核酸を用い、混合系で光架橋反応を行った。その結果、3種類の19F NMRシグナルを確認し、これらピークはベースライン分離が可能であることを見出した。光架橋による大きなケミカルシフトの変化とともに、置換基によるケミカルシフトの変化を組み合わせることにより核酸類の同時検出が可能となると考えられる。当初予定していたフッ素源を有する光応答性人工核酸である3-トリフルオロメチルビニルカルバゾールの光架橋反応及び、19F NMR測定によるケミカルシフトの変化を評価したところ、光架橋反応の過程でトリフルオロメチル基の分解が確認されたため、新たな光応答性人工核酸としてOHVK、NH2VK、OMeVKの3種類の光応答人工核酸の合成を行った。各光応答性人工核酸を含むDNAとフッ素を含むトリフルオロメチルチミジン(TFT)を含むDNAを混合し、光照射を行ったところ、光照射前後で8 ppmの大きなケミカルシフトの変化が確認された。OHVKを用いた場合には-70.6 ppm、NH2VKを用いた場合には-71.0 ppm、OMeVKを用いた場合には-71.2 ppmにシグナルを確認した。そのため、これら光応答性人工核酸を用いることにより、核酸類の同時検出が可能となると考えられる。平成29年度の成果より、核酸類同時検出に用いることができる光応答性人工核酸の組み合わせを決定した。当初予定していたフッ素源を有する光応答性人工核酸において、光照射によるフッ素の脱離が確認されたため、新たな設計のもとフッ素源を有する光応答性人工核酸の設計・合成を行う。また、同時検出に利用可能な光応答性人工核酸の組み合わせを見出したため、それらを用いた核酸類の同時検出を行う。

ハイブリダイゼーションチェインリアクション(HCR)を用い、光照射を行った際に標的核酸が存在した場合にのみケミカルシフト変化が誘起される系の構築を行う。現在予定している3種類のmiRNAに対してそれぞれが干渉しない直交性を有する配列設計を行う。それに加え、細胞内での検出に向け、ホスホロチオエイトDNAを合成し、細胞内での同時検出の検討を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
計算集約的経済分析の可能性:大変動・非定常・非線形を前提とした正確な実証分析

金融危機やバブルにみられるように,経済現象において大変動・非定常・非線形な性質が及ぼす影響は非常に大きく,これらの性質が本質的に重要になる.様々な形式の経済データについて,これらの性質を前提とした精確な実証分析を行い,スーパーコンピュータを活用した計算集約的経済分析の手法を提案し,その有効性を検証した.金融危機やバブルにみられるように,経済現象において大変動・非定常・非線形な性質が及ぼす影響は非常に大きく,これらの性質が本質的に重要になる.様々な形式の経済データについて,これらの性質を前提とした精確な実証分析を行い,スーパーコンピュータを活用した計算集約的経済分析の手法を提案し,その有効性を検証した.経済現象において,大変動・非定常・非線形な性質が及ぼす影響は非常に大きく,これらの性質が現象の本質になっている.様々な形式の経済データについて,これらの性質を前提とした精確な実証分析を行い,スーパーコンピュータを活用した計算集約的経済分析の手法を提案し,その有効性を検証した.日本企業約100万社の間の取引関係を表す有向ネットワークデータについて,業種や地域の異質性を考慮した上で統計的有意なつながりの影響を特定するために,各企業のリンク数を保存する条件下で同業種や同じ地域の企業同士でリンクをランダムにつなぎ替えたネットワークを作成し,部分グラフの出現回数を実ネットワークと比較することにより,統計的有意に出現する部分グラフを抽出し,業種や地域に特徴的なネットワーク構造を明らかにした.不動産の物件属性に関する多変量データについて,同じ属性間でデータをランダムに入れ替えたデータを作成し,クラスター分析などの多変量分析の手法で得られる結果を実データと比較し,統計的有意な多変量相関を明らかにした.不動産の空間データについて,二次元空間上の物件分布の特徴を探るために,物件の緯度・経度をランダムに入れ替えたデータを作成し,さまざまな物件属性の統計的有意な空間相関を抽出し,物件分布の空間構造を特定した.ビジネスニュースや新聞などの文字データについて,同じ品詞同士をランダムに入れ替えたデータを作成し,言語処理の手法で得られる結果の統計的吟味を行った.
モノアシルグリセロールリパーゼによる脂質ホメオスタシスの多面的制御メカニズム

本研究では、モノアシルグリセロールリパーゼ(MGL)のエネルギーホメオスタシスにおける役割を明らかにするために、MGL欠損マウスおよびCB1-MGL二重欠損マウスを用いた解析を行った。MGL欠損マウスは特に小腸における脂質吸収が遷延しており、これはカンナビノイド受容体CB1に非依存的な現象であることを見出した。MGL欠損マウスおよびCB1-MGL二重欠損マウスはいずれも脂肪負荷後に摂餌行動の強い抑制が見られることを見出し、これが迷走神経切除により部分的に回復することから迷走神経系による摂食行動の調節にMGLが関与する可能性を示唆することができた。申請者の予備的知見から、MGLがエネルギーホメオスタシスに関わることが分かっていたが、その詳細なメカニズムは不明であった。本研究課題の目的は、遺伝子欠損マウスを用いた多面的な解析によりエネルギーホメオスタシスにおけるMGLの役割を解明することである。すなわち、(1)脂肪吸収がMGLによりどのように調節されるか、(2)MGLが脂肪代謝およびエネルギー消費に関与するかどうか、およびそのメカニズム、(3)MGLにより摂食行動がどのように調節されるか、(4)MGLが脂質性因子の産生を通じて機能する場合にはその脂質因子および産生調節様式、を実施期間中に明らかにすることが目標である。今回、MGLによる脂質吸収メカニズムの解析では、MGL欠損マウスと野生型において、オリーブオイル経口投与後の腸管組織中の脂質成分の比較を経時的に行い、中性脂質(トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド)について、一部の成分について顕著ではないが有意な脂質含量の差異を見出した。計画していたリン脂質の網羅解析については現在のところ顕著な違いを見出すに至っていないが、測定法およびデータ解析法の改良を実施して平成28年度に詳細な解析を行う準備を行う予定である。エネルギー代謝の評価については、2重標識水法を用いたラベリング実験を予備的に実施した結果、標準飼料での飼育環境下においてはMGL欠損マウスと野生型の間に有意な差異は見出すに至らなかった。高脂肪食負荷時におけるエネルギー代謝についてさらに検討を進める予定である。その他、幾つかの実験を計画として提案していたが、マウス数の都合で実施できなかったため、平成28年度に実施を予定している。マウスの繁殖が遅れたため、実験計画に記載した内容のうち実施できていない項目がある。申請者の予備的知見として、MGLが高脂肪食負荷による肥満モデルにおいて肥満の進行が抑制されることからエネルギー代謝に関わることが予想されていたが、その詳細なメカニズムは不明であった。これを踏まえた本研究課題の目的は、遺伝子欠損マウスを用いて多面的な解析を行うことでMGLエネルギーホメオスタシスにおける役割を解明することである。今回、2重水標識法によるマウス個体のエネルギー消費測定において必要となるH2[18O]およびD2O含有量のGCMS測定のための水誘導体化において、トリメチルシリルジアゾメタンを用いた場合にH2[18O]の濃度依存的にD2O測定誤差が生じることを発見し、これを計算により修正する方法を考案した。これにより従来法のジアゾメタンの代わりに安全なトリメチルシリルジアゾメタンを用いることが可能となり、多検体の処理が可能となった。また、リン脂質類のLCMS一斉解析、および脂質代謝物の探索解析を効率よく行うために、データ処理のためのプログラムを新たに開発した。現在これらの成果を論文投稿準備中である。脂質因子探索を行うために解析系の改良が必要であることが確認されたためH28年度はその点に注力した。結果としてマウスを用いた解析が遅れている。本研究課題は、申請者がその予備的知見として、MGLが高脂肪食負荷による肥満モデルにおける肥満抑制に寄与することを見出したことに基づき、MGLによるモノグリセリド代謝がどのようなメカニズムでエネルギー代謝に関わるかを明らかにすることを目的としたものである。マウス個体のエネルギー代謝を明らかにする手法として、2重水標識法によるマウス個体のエネルギー消費測定法の改良を実施した。即ち、H2[18O]およびD2O含有量のGCMS測定のための水誘導体化において、ジアゾメタンの代わりにトリメチルシリルジアゾメタンを用いた場合にH2[18O]の濃度依存的にD2O測定誤差が生じ、これを正確に補正・算出する手法を確立したことを前年度実績報告において記載したが、本年度は、この新しい手法を用いて、MGL欠損マウスと野生型マウスの基底状態におけるエネルギー消費量の比較データを詳細に検討した。その結果、MGL欠損マウスと野生型マウスのエネルギー消費量に有意な違いは見られず、このことから、高脂肪食負荷による肥満モデルにおける肥満抑制は、エネルギー消費量の違いが主たる要因ではないことが明らかとなった。MGL欠損マウスにおいて、摂餌後の摂食行動が野生型マウスに比べて抑制され、これが腸管から迷走神経依存的なメカニズムで引き起こされることなどから、MGL欠損による肥満抑制のメカニズムは、腸管におけるMGLの作用が非常に重要であると考えられた。

MGLの腸管における作用の分子メカニズムについては、本研究課題の実施期間中に明らかにすることが出来なかったが、今後これを明らかにするような研究課題を実施することにより、エネルギー代謝と摂食行動における腸管脂質吸収の重要性を明らかにできると考えられる。本研究では、モノアシルグリセロールリパーゼ(MGL)のエネルギーホメオスタシスにおける役割を明らかにするために、MGL欠損マウスおよびCB1-MGL二重欠損マウスを用いた解析を行った。MGL欠損マウスは特に小腸における脂質吸収が遷延しており、これはカンナビノイド受容体CB1に非依存的な現象であることを見出した。MGL欠損マウスおよびCB1-MGL二重欠損マウスはいずれも脂肪負荷後に摂餌行動の強い抑制が見られることを見出し、これが迷走神経切除により部分的に回復することから迷走神経系による摂食行動の調節にMGLが関与する可能性を示唆することができた。マウスの繁殖については準備が整いつつあるので、計画の遅れを取り戻すべく実験を行う。MGL欠損マウスを用いた脂質吸収に関わる因子探索解析に注力する。組織/細胞特異的MGL欠損マウスについては実施する可能性について当初の計画で言及していたが、現在の進捗からは期間内に適切な標的臓器/細胞の特定が困難と判断し、計画から除外することとした。脂質生化学マウスの繁殖が遅れたことにより実験計画に遅れが生じたため。マウスを用いた実験計画の遂行に少し遅れが生じているため。脂質分析に必要な試薬等の購入およびマウス飼育関連費用に充当する予定である。次年度使用額は当初H28年度を予定していたマウス代謝物探索解析の試薬・器具等の購入に充当し、他の実施計画と共に遂行する予定である。
量子分子動力学法による火炎発光スペクトルと温度場の相関解析

本研究の目的は,炭化水素燃料火炎帯中のC2ラジカル強度比と熱力学的温度の相関を,量子論や分子動力学的に理論的に理解することである.従来の研究や昨年度の研究成果では,自発光の絶対強度や測定系の一般性について議論されていない.そこで,本年度はさまざまな測定系で同一の火炎条件でのC2ラジカルの自発光強度比を測定することで,熱電対で測定された熱力学温度の相関の一般性についてまず調べた.また火炎中に存在する化学種の発光や光吸収と局所的な熱力学的温度の関係を数値解析的に求める手法の確立を目的として,炭化水素燃料火炎中に存在するCOの吸収スペクトルを分子動力学法を用いて解析する手法をさらに発展させた.その計算手法により,局所的な系に温度勾配が存在する場合の影響,系中に微小液滴が存在する場合の影響について計算機実験的に調べた.実験としては,火炎中発光スペクトルのうち,C2スワンバンド中の473.7nm付近の発光強度,516.5nm付近の発光強度,563.6nm付近の発光強度の比を得るために,予混合火炎の局所領域からの光を光ファイバーと分光器を用いて計測した.0.70nm^2とO.08nmの二つの分解をもつ分光器と光電子増倍管およびバンドパスフィルタから構成される分光装置の三つの計測系を用いて,火炎局所領域からの発光を分光計測した.C2スワンバンド中の三つの発光バンド強度比を調べた実験結果より,473.7nm付近の発光強度と563.6nm付近の発光強度比が火炎中の熱力学的温度と相関がよいことが分かった.これらの強度比について量子論的な振動準位の遷移確率を計算し,自発光強度比と振動温度比との関係について理論的に考察した.結論としては,熱電対で計測した熱力学的温度はC2の振動温度とは異なるため,自発光強度比から算出した温度は定量的には熱力学温度とはならないが,温度に関係する一つの重要な指標であるといえる.本年度は,実験による検証として,炭化水素燃料火炎帯中のC2ラジカル強度比と熱力学的温度の相関を調べた.同時に,量子力学によるC2ラジカルの発光過程の理論解析を行い,C2ラジカル強度比とC2ラジカルの振動温度の関係を予測した.また火炎中に存在する化学種の発光や光吸収と局所的な熱力学的温度の関係を数値解析的に求める手法の確立を目的として,炭化水素燃料火炎中に存在するCOの吸収スペクトルを分子動力学法を用いて解析する手法を開発した.実験として,火炎中発光スペクトルのうち,C2スワンバンド中の473.7nm付近の発光強度と516.5nm付近の発光強度の比を得るために,予混合火炎の局所領域からの光を光ファイバーと分光器を用いて計測した.同時に,熱電対を用いて局所の熱力学的温度を測定した.C2ラジカル強度比と局所熱力学温度の関係のできるだけ多くのデータを得るために,バーナ管径,流速,供給酸素濃度,酸素温度,燃料(プロパン,メタン)を変化させた場合を調べた.層流火炎の場合には,量子力学理論解析で予測された温度と強度比の相関がみられた.しかし,熱電対で計測される熱力学的温度とC2ラジカル強度比から算出されるC2ラジカル振動温度は,火炎帯中でC2ラジカルが熱平衡状態にないために同等となることはないが,それらはほぼ等差的な関係にあることが分かった.乱流火炎の局所時系列測定の結果では,測定体積の前後光や測定装置に依存するノイズを除去する物理的な数値処理を行うことにより,乱流火炎中でも熱力学温度とC2ラジカル強度比の間に相関を見出すことができた.次に,火炎中の化学種発光スペクトル計算の前段階として,高温場におけるCOの赤外線吸収スペクトルを分子動力学法を用いて計算した.その結果,場の熱力学温度とCOの吸収スペクトル分布全体に関しては,実験値と定性的な一致がみられた.本研究の目的は,炭化水素燃料火炎帯中のC2ラジカル強度比と熱力学的温度の相関を,量子論や分子動力学的に理論的に理解することである.従来の研究や昨年度の研究成果では,自発光の絶対強度や測定系の一般性について議論されていない.そこで,本年度はさまざまな測定系で同一の火炎条件でのC2ラジカルの自発光強度比を測定することで,熱電対で測定された熱力学温度の相関の一般性についてまず調べた.また火炎中に存在する化学種の発光や光吸収と局所的な熱力学的温度の関係を数値解析的に求める手法の確立を目的として,炭化水素燃料火炎中に存在するCOの吸収スペクトルを分子動力学法を用いて解析する手法をさらに発展させた.その計算手法により,局所的な系に温度勾配が存在する場合の影響,系中に微小液滴が存在する場合の影響について計算機実験的に調べた.実験としては,火炎中発光スペクトルのうち,C2スワンバンド中の473.7nm付近の発光強度,516.5nm付近の発光強度,563.6nm付近の発光強度の比を得るために,予混合火炎の局所領域からの光を光ファイバーと分光器を用いて計測した.0.70nm^2とO.08nmの二つの分解をもつ分光器と光電子増倍管およびバンドパスフィルタから構成される分光装置の三つの計測系を用いて,火炎局所領域からの発光を分光計測した.C2

スワンバンド中の三つの発光バンド強度比を調べた実験結果より,473.7nm付近の発光強度と563.6nm付近の発光強度比が火炎中の熱力学的温度と相関がよいことが分かった.これらの強度比について量子論的な振動準位の遷移確率を計算し,自発光強度比と振動温度比との関係について理論的に考察した.結論としては,熱電対で計測した熱力学的温度はC2の振動温度とは異なるため,自発光強度比から算出した温度は定量的には熱力学温度とはならないが,温度に関係する一つの重要な指標であるといえる.
マウス骨格筋内分子ナノイメージングによる生命機能と階層性の関わりの解明

筋肉は,ミオシンがアクチンに相互作用し,アクチンを筋肉の中心方向に引っ張ることで収縮している.近年のタンパク質1分子計測から,ミオシン1分子の特性(力の大きさ,移動量)が解明されてきたが,こうした分子が集まった筋肉内構造サルコメアにおいて,ミオシンが集合したときにどのように機能しているのかは未だに不明である.1分子の機能の単純和であるのか,あるいは機能が飛躍するのか知るために,マウス骨格筋サルコメア構造内のアクチン先端に局在するトロポモジュリンを遺伝子導入法により発現させて,その先端に蛍光量子ドットを標識できる実験系を構築し,アクチン1本の動態を調べる実験系の開発に成功した.昨年度は,マウス骨格筋内での標的タンパク質の発現には成功したが,その発現効率は極めて低く,研究の進行がやや送れていた.今年度,エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試みたところ,発現効率は飛躍的に向上した.しかしながら,発現レベルの度合いには個体間で大きくばらつきがあった.そこで,安定して高い発現レベルを実現する可能性のある3週齢の若いマウスに対して,エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試みた.3週齢マウスは導入したタンパク質が発現してくる1週間後には体重が倍になり,筋肉もほぼ2倍のサイズになる.そのため,アダルトマウスに比べて筋肉内でのタンパク質の発現が著しく,標的タンパク質の発現レベルも非常に安定して高いことが判明した.そこで今後は,3週齢マウスに対して遺伝子導入を行うことを決定した.本研究の目的達成のためには,ビオチン化されたトロポモジュリンを筋肉内で発現させ,アビジン化量子ドットを修飾させる必要がある.しかし,トロポモジュリンは各アクチン線維の先端のみに局所的に分布するため,発現したトロポモジュリンがビオチン化されているのか?また,ここにアビジン化量子ドットが結合しているのかを把握することは極めて難しい.そこで,サルコメア両端に位置するZ帯に大量に局在するαアクチニンをビオチン化させ,かつGFPを融合させたタンパク質を発現させて,ビオチン化が筋肉内で施されているのか確認した.αアクチンが発現した後,筋肉を固定してピンセットで筋線維を取り出して,アビジン化量子ドットを反応させたところ,GFPで光るαアクチニン局在位置に,量子ドットが選択的に結合していることが確認できた.従って,マウスでのビオチン化タンパク質の発現が可能であることが確認できた.筋肉は,ミオシンがアクチンに相互作用し,アクチンを筋肉の中心方向に引っ張ることで収縮している.近年のタンパク質1分子計測から,ミオシン1分子の特性(力の大きさ,移動量)が解明されてきたが,こうした分子が集まった筋肉内構造サルコメアにおいて,ミオシンが集合したときにどのように機能しているのかは未だに不明である.1分子の機能の単純和であるのか,あるいは機能が飛躍するのか知るために,マウス骨格筋サルコメア構造内のアクチン先端に局在するトロポモジュリンを遺伝子導入法により発現させて,その先端に蛍光量子ドットを標識できる実験系を構築し,アクチン1本の動態を調べる実験系の開発に成功した.本研究では,1)マウスin vivo骨格筋のアクチンフィラメント1本を蛍光標識する方法を構築し,アクチンフィラメントの伸びを求める;2)アクチンフィラメント1本の伸びから,ミオシンフィラメントの発する力を見積り.筋肉全体の発する力と比較することで,ミオシンフィラメントの力発生が上位階層構造体である筋肉の収縮力に対してどのように変調されていくのかを明らかにする.これらを目的として,当該年度では,まず筋肉内に量子ドットを導入する方法,あるいはGFP融合標的タンパク質を発現させる方法を検討した.量子ドットも標的タンパク質の遺伝子も,筋肉内の至る所に分布するコラーゲン繊維膜に絡み取られるようで,効率的に筋肉内へ導入する方法が見つかっていないのが現状である.しかしながら,約10%程度の量子ドットは,観察に用いる共焦点顕微鏡でアクセスできる筋表面付近のサルコメア内に導入されていることが確認できた.これらの量子ドットに高出力グリーンレーザーを照射して,筋弛緩時における量子ドットの揺らぎを計測したところ,7-10nm(10フレーム/秒)であった.今後は,さらに測定精度を上げる工夫をしていく.標的タンパク質の発現については,発現効率は低いが,ほぼ毎回筋肉内の一部に発現が確認され,さらにコラゲナーゼ処理によるコラーゲン繊維の崩壊を施して遺伝子導入したところ,発現効率が若干向上した.今後,エレクトロポレーションや微弱電量による導入効率の向上を検討していく予定である.こうしたin vivo筋肉への量子ドット導入やタンパク質の発現手法の確立は,マウスin vivo分子イメージングの新しい手法として,様々な研究分野への普及が期待できる.また筋肉組織と下位階層構造体の動態を同時に計測できることから,分子,分子集合体,そして組織に至るまでの階層間の機能発現メカニズムをつなぐことができると期待している.本研究の目的は,筋肉サルコメア構造内のアクチンフィラメント1本の動態を直接とらえる実験系を構築し,ミオシン分子から筋細胞(筋繊維)へと階層を超えた機能発現について論じていく.サルコメア内のアクチン1本を可視化するため,アクチンの先端に局在するトロポモジュリンに着目し,GFPとの融合タンパク質をマウス骨格筋内にエレクトロポレーションにより発現させることに成功した.しかしこの蛍光像からアクチン1本の動態を把握することは不可能であった.一方で,筋収縮に伴い標的タンパク質が顕微鏡視野外に移動することをさけるために,リアルタイムフィードバック制御を用いた電動ステージシステムを構築した.

これにより視野XY平面での標的物の追尾は可能になったが,収縮に伴う奥行き方向のフォーカスずれが判明し,これは今後の課題となった.さらに理論モデルから,筋の長さを一定に保った収縮(等尺性収縮)であっても,アクチン1本レベルでは振動している可能性が示唆された.これは,ミオシン分子間の力発生が同期してくる協同性によって起こると予想され,アクチン1本の動態を実験的に調べることの重要性が示唆された.本研究期間内では,アクチン1本を蛍光標識し,その蛍光輝点位置を追従し,アクチン1本の動態を捉えるまでには至らなかった.しかし,その礎となる実験系が構築できたこと,またシミュレーションモデルにより,ミオシン分子間の協同性を理解するうえでも極めて重要な実験であることが示せたことは大きい.今後は,この実験系を礎にして,ビオチン化トロポモジュリンを発現させ,アビジン化量子ドットを投入して,アクチン1本の先端を蛍光標識していく.こうした研究から,分子,分子集合体,そして細胞の機能といった階層を超えた機能発現に対する新しい概念を捻出できると考えており,生命機能の理解としても大いに貢献できる研究になっていくと期待している.生物物理今年度は,マウス骨格筋内での発現系の確立が大幅に進んた.エレクトロポレーションによる遺伝子導入方法,さらに3週齢マウスを使うことにより発現レベルが個体間に差が出ることなく安定した.昨年度とは雲泥の違いと言っても過言ではない.また量子ドットの導入方法についても,高圧ジェットで導入する機器を使うことで,これまで以上により多くの量子ドットが筋表面のコラーゲン膜をとお降り抜けて,深部まで到達していることが確認された.こうしたタンパク質発現方法と量子ドット導入法が確立してきたことにより,最終的な目的であるトロポモジュリンへの量子ドット標識が現実化してきたように思う.当初の計画より遅れている最大の理由は,筋肉内への量子ドットや遺伝子の導入効率を上げる手法が未だに確立できない点に帰する.筋肉は,筋全体を包むコラーゲン線維膜だけでなく,その中の筋繊維束,筋繊維,筋原線維とより下位階層の構造体に至るまでコラーゲン繊維膜に覆われているため,これらの膜を物理的に貫通して量子ドットや遺伝子をサルコメア内へ到達させないとアクチンフィラメントの標識は難しい.この方法を確立することが,本申請研究を成功させる最大のキーポイントである.タンパク質の発現およびビオチン化は確認されたが,今後は生体内で量子ドットを如何に選択的に,ビオチン化された箇所に標識させることが出来るのか検討する必要性がある.生体内に導入した量子ドットが,非特異結合することなくビオチン化サイトに結合する保証はない.そこで,非特異結合がある上でも,ビオチン化サイトに結合した量子ドットの位置検出が可能であるのか検討していく.また,非特異結合を低減する方法についても検討をしていく.収縮中のアクチン線維の伸長を測る場合,はじめは実験系をシンプルにする意味で,筋肉単体を取り出した系で計測を行う方法が好ましい.そのため,顕微鏡上に装着可能な実験チャンバーの開発も行う予定である.
光照射による神経突起成長の制御と神経回路作成

神経様細胞PC12細胞(ラット副腎褐色細胞腫由来細胞)に光を照射することにより、細胞の光レセプターが応答して、神経突起を制御することを世界で初めて見出した。本年度は、PC12細胞に間欠的に光照射を行い、神経突起成長と光照射間隔の関係を特に検討した。さらには神経突起成長に対する光量並びに波長依存性を解析するために、レーザーポインター(670nm)並びにLED発光素子を用いて、単波長の光照射下における神経突起成長(神経突起率)、神経の長さ(神経伸長率)、細胞の扁平(細胞扁平率)をコラーゲン基板上において動画を用いて解析を行った。以下具体的な研究実績を報告する。1.神経突起成長と光照射間隔の関係倒立顕微鏡の光源(主に525nm)を用いて、様々な光間欠照射条件におけるPC12細胞の神経突起率の経時変化を検討した。単位時間当たりの光照射時間を統一する事によって、光を頻繁に照射した条件の方が神経突起成長は制御される事が明らかとなった。この原因として、神経細胞に光照射を行うと、光レセプターが応答して、細胞内シグナル伝達が行われる。その後、所定の時間後にフィードバック機構により神経細胞は元の状態に戻ると考えられる。この場合、光を短間隔で照射した場合には、神経細胞は常に光に応答している状態になるためであると考察した。2.神経突起成長に対する光量並びに波長依存性レーザーポインター、LED発光素子等の単波長の光を神経細胞に照射して、神経突起成長に対する光量並びに波長依存性を検討した。グリーン光を発色するLED発光素子を用いて525nmの光を照射した場合には、神経突起間のシナプス形成を促進する効果を発見した。今回行った実験では、3mm長と驚異的な長さまで神経細胞はシナプス形成していることが明らかとなった。レーザーポインター(670nm)を用いて、神経突起のパターンニングを行うことが可能であった。半導体製造技術の成長と共に、高集積回路並びに高速CPUが我が国を初めとして世界各国で生産されるようになった。この反面、スーパーコンピューターを駆使しても人間の脳で行われているファッジー処理等、生物の脳には半導体電子回路には無い長所を有している。そこで、人間の脳と同様に神経細胞を用いて、情報処理回路を調製することが近年試行されてきている。しかしながら、未だ神経細胞を用いて神経回路を調製することが確立されておらず、さらに人間の脳のように、成長とともに脳が学習並びに進化(神経細胞回路が可変)する可塑性を有する神経回路を作成する着想が提案されてこなかった。本報告者は、神経細胞の樹状突起の伸展状況を経時的に測定するために、顕微鏡下における光照射状態で、長期にわたり神経突起成長をビデオ観察することを試みた。光照射下におけるビデオ観察では、神経細胞の神経突起成長は何回実験を繰り返しても観察されなかった。一方、暗所である細胞培養室内に放置した神経細胞は神経突起の伸展を行なっていた。このことから神経細胞には、光レセプターが存在して、可視光照射下では、神経突起の成長を抑制することに気がつき、光パターン照射することにより神経回路が作成可能であるという本研究の着想を得るに至った。可視光並びに様々な波長の単色光を神経細胞に照射して、神経樹状突起の抑制並びに促進の制御を基礎的に解析を行った。神経様細胞株PC12細胞(ラット副腎褐色種細胞)を細胞培養フラスコ内で増殖させた。神経突起誘発剤である神経成長因子を神経細胞培養フラスコ内に添加した後、可視光並びに様々な波長の単色光(335600nm)照射下で神経突起成長を倒立型顕微鏡で観察を行った。実験で用いた波長の単色光はいずれも神経突起成長を抑制させていた。さらに、可視光を神経細胞にパターン照射して神経回路網を形成することを試みた。様々な波長の単色光を神経細胞に照射して、神経樹状突起の抑制並びに促進の制御を基礎的に解析した。この時、神経突起成長をビデオ撮影を行い、動的神経突起成長も計測した。さらに、可視光並びに様々な波長の単色光を神経細胞にパターン照射して神経回路網を形成することを試みた。具体的研究実績は、1.神経樹状突起の光照射による抑制並びに伸展制御(原担当)神経様細胞株PC12細胞(ラット副腎褐色種細胞)を細胞培養フラスコ内で増殖させた。神経突起誘発剤である神経成長因子(NGF)を神経細胞培養フラスコ内に添加した後、可視光並びに様々な波長の単色光(335600nm)照射下で神経突起成長を倒立型顕微鏡で観察した。この時、神経突起成長をビデオ撮影を行い、動的神経突起成長を計測した。2.神経回路の光パターン照射法による作成(樋口担当)神経様細胞株PC12細胞を細胞培養フラスコ内で増殖させる。光パターン照射のためのステンレス製マスクを神経細胞培養フラスコ内に挿入して、可視光並びに様々な波長の単色光(335600nm)を照射した。特にレーザービームを用いた光パターン照射が効果的であった。神経成長因子(NGF)を神経細胞培養フラスコ内に添加した後、可視光並びに様々な波長の単色光(335600nm)を光マスク下で照射して神経突起成長を倒立型顕微鏡(現有設備)で観察した。神経回路作成のための最適光マスクの検討を行った。

現在、2mm幅の微細スケールまで光パターン照射法により神経回路が作成可能であった。神経様細胞PC12細胞(ラット副腎褐色細胞腫由来細胞)に光を照射することにより、細胞の光レセプターが応答して、神経突起を制御することを世界で初めて見出した。本年度は、PC12細胞に間欠的に光照射を行い、神経突起成長と光照射間隔の関係を特に検討した。さらには神経突起成長に対する光量並びに波長依存性を解析するために、レーザーポインター(670nm)並びにLED発光素子を用いて、単波長の光照射下における神経突起成長(神経突起率)、神経の長さ(神経伸長率)、細胞の扁平(細胞扁平率)をコラーゲン基板上において動画を用いて解析を行った。以下具体的な研究実績を報告する。1.神経突起成長と光照射間隔の関係倒立顕微鏡の光源(主に525nm)を用いて、様々な光間欠照射条件におけるPC12細胞の神経突起率の経時変化を検討した。単位時間当たりの光照射時間を統一する事によって、光を頻繁に照射した条件の方が神経突起成長は制御される事が明らかとなった。この原因として、神経細胞に光照射を行うと、光レセプターが応答して、細胞内シグナル伝達が行われる。その後、所定の時間後にフィードバック機構により神経細胞は元の状態に戻ると考えられる。この場合、光を短間隔で照射した場合には、神経細胞は常に光に応答している状態になるためであると考察した。2.神経突起成長に対する光量並びに波長依存性レーザーポインター、LED発光素子等の単波長の光を神経細胞に照射して、神経突起成長に対する光量並びに波長依存性を検討した。グリーン光を発色するLED発光素子を用いて525nmの光を照射した場合には、神経突起間のシナプス形成を促進する効果を発見した。今回行った実験では、3mm長と驚異的な長さまで神経細胞はシナプス形成していることが明らかとなった。レーザーポインター(670nm)を用いて、神経突起のパターンニングを行うことが可能であった。
チベット仏教僧の思想とネットワークが清代内陸アジア史に与えた影響に関する研究

本年度は、出産育児による採用中断後の四ヶ月のみの活動であったが、これまで取り組んできた17世紀中葉のアムド地方(東北チベット、現中国青海省周辺)のチベット仏教寺院について追加調査を行った。14世紀に創建されたドツァン寺は、明朝帝室との関係が深く、明皇帝から「大国師」の称号を授与されていたことが知られている。清朝史料をみると、ドツァン寺はさらに清朝の時代になっても大国師号を認められており、1653年に順治帝から大国師の印と誥命が贈られ、1697年に子孫がこれを継承していた。翌1698年には、北京のジャサクイ=ダ=ラマであったパージョ寺のメルゲン=チュージェが大国師を授与されている。ドツァン寺やパージョ寺などアムド東部エリアの諸寺院は、互いに座主や学堂長となる人材を出し合うなど、人的繋がりが密接であった。清朝はパージョ寺のメルゲン=チュージェへの封号に際して、同じアムド東部のドツァン寺と明朝の関係を意識したものと考えられる。この調査結果により、歴代チャンキャへと繋がる清代の大国師号の淵源が、明代アムド東部寺院所有の称号にあった可能性が浮上した。また、現地調査によって、アムド屈指の名刹クンブム僧院において、パージョ寺創建者の化身とされる歴代転生僧がガルワと呼ばれる私僧坊を所有していたことがわかった。このガルワはクンブム僧院内に現存する。アムド東端の小寺にすぎなかったパージョ寺がクンブム僧院に転生僧の私僧坊を営むまでになったのは、清朝帝室との密接な関係がパージョ寺のアムドにおける位置づけに影響を与えた結果であると推察される。以上、アムド東部のローカルな事情と清朝初期の施策は、相互に影響を及ぼし合っていたと考えられる。先行研究ではアムド東部地域の重要性が十分に考慮されておらず、今後これらの成果を反映した清朝のチベット政策史及びアムド地域史像を構築する必要がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,次の2項目について調査・研究を行い,(1)については成果を国内外で発表した。(1)清朝乾隆年間のチベット仏教政策において中枢としての機能を果たしたチベット仏教寺院,雍和宮の建立について,同時代の満洲語一次史料及び寺院建立・運営の担い手であった大国師チャンキャ三世ルルペー=ドルジェの伝記(チベット語)等を精査し,雍和宮建立の詳細な経緯とその意義を明らかにした。チベット仏教寺院としての雍和宮開基を発願した清朝側の史料を精査した結果,雍和宮建立にあたっては乾隆帝の強いこだわりによって,住持する僧から仏像制作にあたる職人に至るまで,チベットの大寺院級であることが求められていたことが明らかになった。雍和宮はチベットの文化・人材を吸収する受け皿となり,また発信するという機能を期待されていたのであり,こうした雍和宮の機能は,京師のチベット仏教を興隆させただけでなく,恒常的にチベットの高僧を京師に招請するという,人材確保の道を開かせた。これによって,チベットから招請した高僧を京師の札薩克喇嘛制度の職位に任じ,チベット仏教政策に動員することを可能にしていった。(2)清朝開国初期に京師で活躍したアムド出身のチベット仏教僧たちについて,彼らのルーツや清廷及び内モンゴル諸部との関わりを調査した。現中国青海省民和県での調査を行った結果,彼らの故郷の一つとして『ド・メ仏教史』に記載されるテンパ=タルギェーリンが民和県西溝郷近郊に現存する弘善寺であることを確認した。さらに,該寺には僧たちが清朝皇帝より下賜された文物が保管されていることが分かった。次年度も継続して調査し,成果を発表していく。平成23年度は、多数の大学僧を輩出してきた青海(アムド)地方について、清朝建国初期の状況を特に取り上げた。また、青海地方出身僧が北京や南モンゴルにおいて残した足跡についても特に検証を行った。前年度末3月、18世紀のチベット語史料の情報を基に行った現地調査において、現中国青海省民和県に現存する「弘善寺」というチベット仏教寺院が、清朝開国初期に京師のチベット仏教界と関わりの深い僧たちを多数輩出していた寺であることを確認した。これを踏まえ、平成23年度は、さらに該寺に関する文献の収集・読解を進めるとともに、青海師範大学のジャブ教授らの協力を得て再び弘善寺での現地調査を実施した。その際、弘善寺僧院長らにインタビューを行い、寺の現状と彼らが把握している寺史を聴取することができた。また、寺に現存する康煕帝からの下賜品である御筆の扁額など、貴重な文物資料の閲覧を許された。帰国後、調査結果を清朝側の公文書の内容と対照させるべく、近年刊行されたばかりの同時代満洲語史料『理藩院題本』の精査を行った。その結果、弘善寺が開国初期の清朝チベット仏教界において相当なプレゼンスを有していたことが明らかになった。清初のチベット仏教界についてはこれまで不明な点が多く、ダライラマなど一部の大物高僧の活動及び影響力しか語られてこなかったが、今回の調査によって当時の清朝チベット仏教界における詳細な勢力図が浮かび上がってきた。

その他、平成23年度は清末北京のチベット仏教寺院に関する資料の残存状況の調査を積極的に行い、龍谷大学所蔵の堀賢雄『北京日記』の解析に着手した。大谷探検隊員であった堀が北京滞在中に記した「北京日記」は、未だ本格的な研究がされていない貴重資料であるが、今回の調査で雍和宮やチベット仏教に関する記述が随所にあることを確認した。この「北京日記」解析は、平成24年度も引き続き行っていく。平成24年度は、18世紀におけるチベットと清朝の関係を、清朝側が授与する職位・称号の浸透の程度から検討した。清朝が北京周辺寺院や南モンゴルに駐在するチベット仏教僧に対して授与していた「ジャサクラマ」という職位は、18世紀中葉の乾隆帝の時代になってチベット本土にも導入されるようになった。しかし、その内実を検討してみると、体系的なヒエラルキーとして設置された北京周辺及び南モンゴルにおけるジャサクラマ位とは異なり、それぞれ単独の称号として導入され、清朝皇帝からの恩恵や奨励の1つとして認識されていたにすぎなかった。このような限定的な導入ではあったが、清朝が自ら設けた職位・称号を一体のものとしてチベット仏教の中心地たるチベットにも広げることは、清朝権力の扶植に一役買うものとして積極的に推進されたとみられる。史料としては、前年度までに入手していた清朝側档案史料(検討事案の進行とリアルタイムに作成された一次史料)を主に用い、精度の高い分析を行うことに努めた。その他、本年度が本研究課題の最終年度であることを踏まえ、前年度の報告書で掲げた「専門性の高い個別の研究成果発表に偏らず、大局的な見地から広く研究の意義を公表していく」という目標を達成すべく、本研究課題を包括的に扱った単著の執筆を行った。すでに脱稿し、2013年1月中に刊行される予定である。本年度は、出産育児による採用中断後の四ヶ月のみの活動であったが、これまで取り組んできた17世紀中葉のアムド地方(東北チベット、現中国青海省周辺)のチベット仏教寺院について追加調査を行った。14世紀に創建されたドツァン寺は、明朝帝室との関係が深く、明皇帝から「大国師」の称号を授与されていたことが知られている。清朝史料をみると、ドツァン寺はさらに清朝の時代になっても大国師号を認められており、1653年に順治帝から大国師の印と誥命が贈られ、1697年に子孫がこれを継承していた。翌1698年には、北京のジャサクイ=ダ=ラマであったパージョ寺のメルゲン=チュージェが大国師を授与されている。ドツァン寺やパージョ寺などアムド東部エリアの諸寺院は、互いに座主や学堂長となる人材を出し合うなど、人的繋がりが密接であった。清朝はパージョ寺のメルゲン=チュージェへの封号に際して、同じアムド東部のドツァン寺と明朝の関係を意識したものと考えられる。この調査結果により、歴代チャンキャへと繋がる清代の大国師号の淵源が、明代アムド東部寺院所有の称号にあった可能性が浮上した。また、現地調査によって、アムド屈指の名刹クンブム僧院において、パージョ寺創建者の化身とされる歴代転生僧がガルワと呼ばれる私僧坊を所有していたことがわかった。このガルワはクンブム僧院内に現存する。アムド東端の小寺にすぎなかったパージョ寺がクンブム僧院に転生僧の私僧坊を営むまでになったのは、清朝帝室との密接な関係がパージョ寺のアムドにおける位置づけに影響を与えた結果であると推察される。以上、アムド東部のローカルな事情と清朝初期の施策は、相互に影響を及ぼし合っていたと考えられる。先行研究ではアムド東部地域の重要性が十分に考慮されておらず、今後これらの成果を反映した清朝のチベット政策史及びアムド地域史像を構築する必要がある。
発生工学的手法を用いた免疫グロブリン遺伝子再構成と発現の制御機構の解明

HS1タンパクは、転写制御因子としての性状及びシグナル伝達因子としての性状を有することが示された。B細胞上の抗原受容体、T細胞上の抗原受容体を抗原または受容体に対する抗体で刺激すると、速やかにチロシンキナーゼの活性化とともにHS1タンパクのチロシンリン酸化が起こる。チロシンリン酸化を受けたHS1タンパクは、抗原受容体からのシグナルを担って核へ移行することが示唆された。HS1タンパクの主な機能は、抗原特異的な自己反応性クローンの死滅(アポトーシス)を誘導するシグナルを抗原受容体から核内遺伝子へ直接伝達することにあると考えられた。マウスB細胞株WEHI-231細胞の細胞表面IgM(抗原受容体)を抗IgM抗体で架橋すると、apoptosisに陥り死滅する。WEHI-231細胞の変異株であるM1細胞は、その細胞表面にWEHI-231細胞と同量のsIgMを有しているが、抗IgM抗体で架橋してもapoptosisを起こさず死滅しない。M1細胞を抗IgM抗体で架橋すると、いくつかの細胞内タンパクが、親株のWEHI-231細胞と同様にチロシンリン酸化を受ける。しかし、M1細胞にはHS1タンパクを欠いているためHS1タンパクだけはチロシンリン酸化されなかった。M1細胞にHS1タンパクを発現させると抗IgM抗体によってapoptosisが誘導された。HS1欠損マウスでは、B細胞及びT細胞のどちらにおいても、抗原受容体を介したapoptosisの誘導に異常があり、自己反応性リンパ球クローンの自己抗原による除去に異常を来していることが明らかになった。即ち、in vivoにおいてもHS1タンパクが抗原受容体からのシグナル伝達に直接関与すること、そのシグナルの一つはリンパ球クローンのプログラム細胞死を誘導するものであることが示された。免疫グロブリン(Ig)H鎖遺伝子の再構成、転写制御を司るエンハンサー内に同定されたHE2/μB配列の役割を明かにするため、以下の研究を進めている。ジーンターゲティング法により、マウスES細胞内H鎖遺伝子のμB配列を除去するためのベクターを作製中であるが、μBと置換されたneo耐性遺伝子(neo)を除去する目的で用いるリコンビナーゼとその認識配列として、予定を変更してさらに効率のよいCre及びloxp配列を使用する。そして、2つのloxp間の配列の除去を薬剤選択できるように、HSVtk遺伝子をneoの隣に挿入する。上記ベクターをES細胞に導入し、G418耐性株の中から相同組換え体を選択する。後にキメラマウスでの解析を容易にする目的で、さらに高濃度G418で培養し、相同組換え変異のホモ接合体の作製を試みる。最後にCreの一過性発現によりneo及びtk遺伝子を両染色体上で欠失したES細胞を選択する。この変異ES細胞を、Ig遺伝子再構成機構の破壊されたRAG2欠損マウス由来の胚盤胞に導入し作製したキメラマウスでは、発生するB細胞はすべてES細胞由来となるので、Ig遺伝子再構成や転写を解析することが比較的容易であると思われる。一方、ジーントラップクローニング法に関しては、ジーントラップベクターのB細胞への導入効率が低いこと、HSVtk遺伝子の発現によるGANC感受性化が完全でないこと等の理由で、当初予定したシステムがうまく作動していない。しかし、この方法はX染色体上の転写活性化因子を単離するのに特に有効と考えられ、XidのようにIg発現の異常がX染色体に連鎖する免疫不全マウスも存在することから、IgH鎖エンハンサーを活性化する機構の少なくとも一部がこの方法で解明できるものと期待される。今後、上記の問題点を解決し、研究を進めたい。

HS1タンパクは、転写制御因子としての性状及びシグナル伝達因子としての性状を有することが示された。B細胞上の抗原受容体、T細胞上の抗原受容体を抗原または受容体に対する抗体で刺激すると、速やかにチロシンキナーゼの活性化とともにHS1タンパクのチロシンリン酸化が起こる。チロシンリン酸化を受けたHS1タンパクは、抗原受容体からのシグナルを担って核へ移行することが示唆された。HS1タンパクの主な機能は、抗原特異的な自己反応性クローンの死滅(アポトーシス)を誘導するシグナルを抗原受容体から核内遺伝子へ直接伝達することにあると考えられた。マウスB細胞株WEHI-231細胞の細胞表面IgM(抗原受容体)を抗IgM抗体で架橋すると、apoptosisに陥り死滅する。WEHI-231細胞の変異株であるM1細胞は、その細胞表面にWEHI-231細胞と同量のsIgMを有しているが、抗IgM抗体で架橋してもapoptosisを起こさず死滅しない。M1細胞を抗IgM抗体で架橋すると、いくつかの細胞内タンパクが、親株のWEHI-231細胞と同様にチロシンリン酸化を受ける。しかし、M1細胞にはHS1タンパクを欠いているためHS1タンパクだけはチロシンリン酸化されなかった。M1細胞にHS1タンパクを発現させると抗IgM抗体によってapoptosisが誘導された。HS1欠損マウスでは、B細胞及びT細胞のどちらにおいても、抗原受容体を介したapoptosisの誘導に異常があり、自己反応性リンパ球クローンに自己抗原による除去に異常を来していることが明らかになった。即ち、in vivoにおいてもHS1タンパクが抗原受容体からのシグナル伝達に直接関与すること、そのシグナルの一つはリンパ球クローンのプログラム細胞死を誘導するものであることが示された。