hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的マイクロＲＮＡ発現解析を用いたクルクミンの新たな抗腫瘍機序の解明

ウコンに含まれるクルクミンは抗がん作用を有することが多くの基礎研究で証明されており、副作用の少ない抗がん薬としてがん治療への応用が期待されている。吸収効率が悪く、経口から摂取しても十分な血中濃度が得られないという点が臨床応用に際して一番の問題であった。我々は吸収効率が向上した細粒化クルクミンに着目、その安全性について確認し、現在その治療効果を臨床試験で検討中である。これまでに細粒化クルクミン服用投与によりがん患者さんの生活の質が改善したり、がんの抑制に関係するとされているマイクロRNAの量が上昇するという興味深い結果も観察している。今後さらに症例を積み重ねてその結果の検証を目指している。ウコンに含まれるクルクミンはNF-kappa BやSTAT3の抑制作用を有し、抗腫瘍効果を示すことが多くの基礎研究で証明されており、現在その臨床応用が期待されている。一方バイオアベイラビリティーが低いことが臨床応用に際して一番の弱点であった。我々はバイオアベイラビリティーの向上した細粒化クルクミンのがん患者に対する安全性を調べるために「ゲムシタビンを用いた化学療法に抵抗性となった膵癌、胆道癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法の第I相臨床試験」を計画・実施し(平成24年、25年度)、細粒化クルクミンが従来のクルクミンと比して有害事象の頻度を上昇させることなく血中クルクミン濃度を有意に上昇させること、さらに細粒化クルクミン服用によりEORTC-QLQ C30を用いて評価したQOLが有意に改善することを確認、その成果を国際学術誌に報告した(Kanai et al. Cancer Chemother Pharmacol. 2013Jun; 71(6): 1521-30)。また本研究に付随してクルクミン服用前後に得られた血液検体を用いて網羅的miRNA発現解析を行なった。その結果、基礎研究でがん抑制作用が報告されている複数のマイクロRNAが細粒化クルクミン服用後に末梢血で上昇するという結果が得られている。さらにin vitroの実験で細粒化クルクミンは従来のクルクミンと比してより低濃度で抗腫瘍効果を発揮すること、また細粒化クルクミン刺激によりがんの進行との関係が報告されている複数のmiRNAの発現が変化することを確認している(unpublished data)。以上の結果を受けて「切除不能膵癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法のランダム化第II相臨床試験」を計画、医の倫理委員会の承認を得て、平成25年9月より登録開始を行っている。本試験でも細粒化クルクミン服用前後に血液検体を採取し、クルクミン治療のバイオマーカーとなりうるmiRNAについて探索、同定を目指す。クルクミンの抗腫瘍効果に関してはすでに多くの基礎研究で証明されており、現在その臨床応用が期待されている。申請者らはバイオアベイラビリティーの向上した細粒化クルクミンのがん患者に対する安全性を調べるために「ゲムシタビンを用いた化学療法に抵抗性となった膵癌、胆道癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法の第I相臨床試験」を計画・実施した。平成24年度には最終解析を行い細粒化クルクミンが従来のクルクミンと比して有害事象の頻度を上昇させることなく血中クルクミン濃度を有意に上昇させることを確認、その結果を国際学術誌に報告した(Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Mar 30)。クルクミンの標的分子として報告されているNF-kappa BやStat 3の変化をがん組織を用いて確認するためにはクルクミン内服前後の組織検体が必要となるため患者に対する侵襲も大きく非現実的である。そこで申請者らは末梢血で測定可能であるマイクロRNAに着目し、本研究で得られた血液検体を用い網羅的マイクロRNA発現解析を行なった(n = 6)。細粒化クルクミンの治療効果と相関するマイクロRNAが同定されればクルクミン治療のバイオマーカーとなりうる。クルクミンは基礎研究で膵癌のみならず大腸癌や乳癌など他の多くのがん腫に対してもその抗腫瘍効果を発揮することが報告されており、さらには術後補助療法、発がん予防などに対しても応用が期待であることから本研究は学術的にも推進すべき重要な課題と考える。ウコンに含まれるクルクミンはNF-kappa BやSTAT3の抑制作用を有し、抗がん作用を示すことが多くの基礎研究で証明されており、副作用の少ない抗がん薬としてがん治療への臨床応用が期待されている。バイオアベイラビリティーが低いことが臨床応用に際して一番の弱点であった。我々はバイオアベイラビリティーの向上した細粒化

クルクミンのがん患者に対する安全性を調べるために「ゲムシタビンを用いた化学療法に抵抗性となった膵癌、胆道癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法の第I相臨床試験」を計画・実施し(平成24年、25年度)、細粒化クルクミンが従来のクルクミンと比して有害事象の頻度を上昇させることなく血中クルクミン濃度を有意に上昇させること、さらに細粒化クルクミン服用によりEORTC-QLQ C30を用いて評価したQOLが有意に改善することを確認、その成果を国際学術誌に報告した(Kanai et al. Cancer Chemother Pharmacol. 2013Jun; 71(6): 1521-30)。この結果を受けて、細粒化クルクミンの治療効果を評価するため膵がん患者を対象とし、プラセボを対照としたランダム化第II相多施設共同臨床試験を計画、医の倫理委員会の承認を得て、平成25年9月より開始した。先述したように、これまでに細粒化クルクミン服用によりEORTC-QLQ C30を用いて評価したQOLが有意に改善することや、末梢血を用いた網羅的miRNA発現解析にて前臨床研究で抗がん作用が報告されている複数のmiRNAが細粒化クルクミン服用後に上昇するという興味深い結果も観察している。今後さらに症例を積み重ねてその結果の検証を目指している。臨床薬理学クルクミンのバイオマーカーとなりうる複数のmiRNAが同定されており、現在進行中の臨床試験で得られた検体を用いて懸賞予定である。ゲムシタビンを用いた化学療法に抵抗性となった膵癌、胆道癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法の第I相臨床試験」を計画・実施した。平成24年度には最終解析を行い細粒化クルクミンが従来のクルクミンと比して有害事象の頻度を上昇させることなく血中クルクミン濃度を有意に上昇させることを確認、その結果を国際学術誌に報告している。(Cancer Chemother Pharmacol. 2013 Mar 30)。この第I相臨床試験で得られた血液検体を用い細粒化クルクミン内服前後のマイクロRNAの変化を940種類のヒトマイクロRNAを搭載しているAgilent humanmiRNAmicroarray Rel 14.0を用いて検討した(n = 6)。その結果、基礎研究でがん抑制作用が報告されている複数のマイクロRNAが細粒化クルクミン服用後に末梢血中で上昇するという結果が得られている。さらに上記第I相臨床試験の結果を受けて「切除不能膵癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法のランダム化第II相臨床試験」を計画、すでに医の倫理委員会の承認を得て、平成25年6月より登録開始予定である。本試験でも細粒化クルクミン服用前後に血液検体を採取し、アレイ解析で残った候補マイクロRNAの変化について検証予定である。先述のように平成25年9月より多施設共同で「切除不能膵癌症例に対する細粒化クルクミン補助療法のランダム化第II相臨床試験」を実施している。本試験で得られる細粒化クルクミン服用前後の血液検体を用い、これまでに行った研究でクルクミンのバイオマーカー候補として残ったmiRNAの変化について解析予定である。。
高温・高圧下で金属化した液体Se-Teのホール係数と交流伝導度

液体テルルは半導体に特有な共有結合でつながった鎖状構造を有するが、融点直上で金属的な振る舞いを示す。正符号の熱電能からキャリアーは電子ではなく正孔であると考えられるが、ホール係数の符号は負である。この謎に迫るFriedman.Eminによる理論的考察に従えば、ホール係数の符号は、鎖を構成する原子の幾何学的配置を反映したキャリアーの運動経路に左右される。我々は、液体テルル混合系のホール係数を測定することにより、この系の伝導機構について検討を加えた。中性子散乱実験や密度測定などから、鎖間相互作用が液体テルル混合系で重要であることが明らかにされている。我々は、鎖間相互作用と伝導機構の関係を調べることを目的として、鎖をブリッジさせるべくAsを添加した液体Te・As系と、鎖を孤立させるべくSeを添加した液体Te・Se系のホール係数測定を行った。As.Seを添加すると、ともにホール係数は大きく増加し、また温度上昇と共に急激に減少して液体Teのホール係数の値に近づいていく。液体Teのホール移動度が温度によらずほぼ一定であるのに対し、混合系では大きく温度変化する。電気伝導度とホール係数の両対数プロットを行うと、液体Te-Se系では組成によらずほぼ同じ直線上にのるのに対し、液体Te・As系では2つの領域に別れる。低伝導度領域では組成ごとに異なるホール係数値を示して変化が小さいのに対し、モットの最小金属伝導度を越えて金属領域に入るとホール係数は急激に減少する。これは、液体Te・Se系が半導体領域でも金属領域でも同じ鎖状構造を基本構造としているのに対し、液体Te・As系では低伝導度領域でネットワーク構造、金属領域で鎖状構造とその構造が変化するためと考えている。大型放射光施設において行ったEXAFS測定から求めた配位数の温度変化にもこの傾向が現れている。液体テルルは共有結合でつながった鎖状構造を有するが、融点直上で金属的な振る舞いを示す。熱電能の符号は正であるのでキャリアーは電子ではなく正孔であると考えられるが、ホール係数の符号は負である。この謎に迫るFriedmanEminによる理論的考察に従えば、ホール係数の符号は、鎖を構成する原子の幾何学的配置を反映したキャリアーの運動経路に左右される。我々は、液体テルル混合系のホール係数を測定することにより、この系の伝導機構について検討を加えている。液体特有の磁気流体効果や、試料抵抗による電圧効果を排除して、ホール電圧を直接検出するために、我々は交流磁場(400Gauss,1Hz)、交流電流(0.5A,1kHz)のいわゆる2交流法によりホール係数測定を行っている。高感度のデジタルロックインアンプを用いることにより、ナノボルト・オーダーのホール電圧を直接検出している。試料セルとしては、幅3mm、長さ10mm、厚さ0.10.5mmの試料部を有する石英ガラス製セルを用いている。液体テルル混合系が金属化する際に鎖間相互作用の増加が重要な役割を果していることが、中性子散乱実験や密度測定などから明らかにされている。我々は、Asを添加することにより鎖間相互作用と伝導機構の関係を調べることを目的として、液体TeAs系のホール係数の測定を行った。Asを添加することによりホール係数は大きく増加し、温度の上昇と共に急激に減少して液体Teのホール係数の値に近づいていく。また、液体Teのホール移動度が温度によらずほぼ一定であるのに対し、混合系ではAs濃度の増加に伴って高温側へシフトするピークがみられる。ピーク温度ではモットの最小金属伝導度に近い値を示しており、金属・半導体転移と密接な関係がある。さらに、鎖間相互作用の効果を直接みるために、高圧下でのホール係数の測定を準備中である。
縮合ピリミジン系有機触媒の合成とそれを用いる生体類似酸化還元反応に関する研究

1.以前、我々はより強力な自動循環酸化有機触媒検索中、新しいタイプのNADモデル化合物と考えられるpyridodipyrimidine類が中性条件下単純アルコール類を自動循環的に酸化することを見出した。今回、新しいタイプのフラビンモデル化合物であるpyrimidopteridine類が中性条件下(120°Cで10から25時間加熱)、アルコールやアミン類を酸化して相当するカルボニル化合物やイミン類を20から180回もの触媒回転で自動循環的に酸化することを見出した。2.従来NAD(P)HモデルであるN-alkylnicotinamideやHantzsch ester類によるカルボニル化合物の還元反応は広範囲に渡って研究されてきた。しかしこれらの場合、基質となり得る化合物は電子吸引基と共役した極性カルボニル基や金属と配位したものなど、何らかの形で活性化されているカルボニル化合物に限られていた。1978年、米田らは1,5-dihydro-5-deazaflavinが塩酸やトリフルオロ酢酸等の強いプロトン源の存在下、構造的に活性化されていないカルボニル化合物をアルコール類へほぼ定量的に還元したことを報告した。今回、著者らはこの5-deazaflavin類を触媒として、水素源にギ酸を用いカルボニル化合物をアルコール類に循環的に還元した。合成した触媒の中で3,7-dimethyl-10-p-tolyl-1,5-dihydro-5-deazaflavinがギ酸中120°C50時間の反応条件でベンズアルデヒドをベンジルアルコールへ100%還元し、最も優れた還元触媒であることが判明した。更にこの触媒を用いて、α,β-不飽和カルボニル化合物の還元を行い、α,β-不飽和カルボニル合物の炭素-炭素二重結合を選択的に還元する自動循環還元反応系も確立した。これまで新しいNAD(P)^+モデル化合物の有機触媒として,主に5-デアザフラビン及びピリドジピリミジン類を用いて種々のアルコール類に対する酸化反応を実施し,触媒から換算して対応するカルボニル化合類を数千から数万パーセントの収率で得た。平成5年度は,ピリドジピリミジンの5-アザ類縁化合物であるピリミドプテリジン類を有機触媒として用い,種々のアルコール及びアミン類に対して120°C25時間の反応条件で酸化反応を実施し,対応するカルボニル化合物及びイミン類を数千パーセントの収率で得た。本自動循環酸化反応は一般にクロム酸酸化に代表される有毒な無機系酸化剤等に比べ,無公害で毒性が殆どないと考えられることから,省資源的・環境保全的観点から有用な酸化触媒と考える。一方,5-デアザフラビン類を触媒とするカルボニル化合物(ベンズアルデヒド)のアルコール(ベンジルアルコール)への自動循環還元,即ち,120°C25時間の反応条件で,水素源としてのギ酸で5-デアザフラビンを1,5-ジヒドロ-5-デアザフラビンへと還元し,この還元体でカルボニル化合物をアルコールへ数百から数千パーセントの収率(触媒を基準として)で循環的に還元する還元系も確立した。また,α,β-不飽和カルボニル化合物を基質とした場合は,同様の還元反応条件で,α,β位の二重結合のみが還元された飽和カルボニル化合物のみが特異的に得られた。この際カルボニル基が環元された不飽和アルコール類の生成は全く認められなかった。更に,この自動循環還元系に,ピリドジピリミジン及びピリミドプテリジン類を触媒とする還元反応の反応条件及び種々の応用範囲の検討を現在行っている。

最近、我々は新しいNAD(P)^+モデル化合物としての有機触媒として,5-デアザフラビン及びピリドジピリミジン類を用いて種々のアルコール類に対する酸化反応を実施し,触媒から換算して対応するカルボニル化合類を数千から数万パーセントの収率で得たことを報告した。又、NAD(P)Hモデル化合物とみなし得る1,5-ジヒドロ-5-デアザフラビン類が強力な還元力を持つことを見出し、この還元力を自動循環系に組み入れ、カルボニル化合物をアルコール化合物へ還元することも既に一部報告した。平成5年度に引き続き、本年度はピリドジピリミジンの5-アザ類緑化合物であるピリミドプテリジン類を有機触媒として用い、種々のアルコール及びアミン類に対して120°C25時間の反応条件で酸化反応を実施し、対応するカルボニル化合物及びイミン類を数千パーセントの収率で得、本有機触媒による自動循環酸化反応は概ね完成した。一方、5-デアザフラビン類を触媒とする自動循環還元反応、即ち、120°C25時間の反応条件で,水素源としてのギ酸で5-デアザフラビンを1,5-ジヒドロ-5-デアザフラビンへと還元し、この還元体でα,β-不飽和カルボニル化合物を還元したところ、α,β位の二重結合のみが特異的に還元された飽和カルボニル化合物が数百から数千パーセントの収率(触媒を基準として)で得られた。この循環的に還元する還元反応系は本年度で完成させた。更に、この自動循環還元系に,ピリドジピリミジン及びピリミドプテリジン類の1,5-ジヒドロ化合物を触媒とする還元反応を種々試みたが、1,5-ジヒドロ-5-デアザフラビンよりも還元能力が劣るこたが判り、ピリドジピリミジン及びピリミドプテリジン類を触媒とする自動循環還元反応についてはこれ以上の検討を行わないことにした。
粒子線治療におけるｉｎ　ｖｉｖｏ線量測定を目指した光ファイバ型小型線量計の開発

本研究では、粒子線治療を行う際に体内に挿入し患部周辺の線量測定を行うための小型線量計の開発を行っている。現在線量計素子として用いている光刺激蛍光体は粒子線の高線エネルギー付与(LET)領域において消光現象により感度が低下してしまう。LETは一次粒子の局所的なエネルギー損失を表しているが、LETが同じであっても一次粒子の種類が異なれば消光現象の発生に違いが起きる可能性がある。そこで重粒子線治療装置(HIMAC)において、Eu:BaFBrとCe:CaF2を用いた小型線量計に400 MeV/uのネオン線照射実験を行い、炭素線やヘリウム線照射時の結果と比較した。Eu:BaFBrでは粒子の種類によらず発光効率と平均LETの関係は一つの曲線上に分布した。一方でCe:CaF2の発光効率変化は同様の平均LETであっても粒子により異なる傾きを示した。Ce:CaF2で生じた消光現象の発生過程は粒子により異なっていたことが考えられる。小型線量計は前立腺治療時に尿道に挿入して線量が安全なレベルであると確認することを目的としている。この目的での使用を検討するため実際にHIMACにおいて350 MeV/uの単色エネルギー炭素線の照射実験を行った。水槽中に形成した拡大ブラッグピーク(SOBP)中の一部の線量を下げることで尿道を模擬し、尿道部分に設置した小型線量計が線量変化を測定できるか調査した。今回の実験では治療後の読み出しを想定して積層照射がすべて終了した後で読み出しを行った。小型線量計でも仮想した尿道位置における線量低下を計測することができた。しかし小型線量計の応答変化は電離箱と比較すると小さかった。この理由は変化の成分が高LETとなり、蛍光体の感度低下により変化が小さくなってしまったと考えられる。研究は全体として計画通りに進んでいる。今年度は小型線量計の具体的な使用を想定した実験を行った。得られた測定結果は実際の線量変化よりも小さな変化になったが、読み出し手法を変更すれば十分に線量変化を観測できる可能性がある。また、線量計の構成に関しても医療用の被覆の装着やカテーテルへの挿入など人体への挿入を目指して着実に進展している。蛍光体の感度低下についても今年度は新たな依存性を発見するなど調査が進んでいる。今年度は小型線量計を用いて、積層照射による線量変化測定実験を行った。この実験では小型線量計の応答読み出しを積層照射がすべて終了した後に行った。我々の線量計は照射中にも測定が行える構造である。各層の照射ごとに読み出しを行えば、より感度低下の影響が小さく線量変化が見積もられることが考えられる。そこで、この手法により線量変化を観測できるか調査する。実験はHIMACにおいて炭素線照射を行い読み出しのタイミングなどの検討を行う。小型線量計を安定的に用いるためには放射線耐性を評価する必要がある。昨年度の評価結果では反射材として用いているBaSO4塗料が高線量のγ線照射により反射率が劣化することが分かった。そこで本年度は高線量場においてより良い反射材を探索するためBaSO4以外の反射材について放射線照射による影響を評価する。実験は名古屋大学のCo60γ線照射施設において高線量のγ線照射を行い、照射前後の反射率の変化の観測を行う。小型線量計を炭素線治療場で使用する際に問題である高LET場における光刺激蛍光体の感度低下は、蛍光体内部におけるエネルギー付与密度が低LET場と比較して高くなるためであると考えられる。昨年度に炭素線以外の粒子線について光刺激蛍光体のLET依存性の調査を行ったところ、粒子線の種類によってLETと感度低下の関係が変わることが分かった。この変化は粒子線と垂直方向のエネルギー付与密度の違いが影響していると考えられる。この変化について考察を行うため、より細かなエネルギー付与分布を計算できるマイクロドシメトリーという評価手法を用いることを検討している。今年度はモンテカルロシミュレーションコードPHITSを用いてマイクロドシメトリーの微小なエネルギー付与分布と光刺激蛍光体の感度低下の関係を調査する。本研究では、粒子線治療を行う際に体内に挿入し患部周辺にてリアルタイムで線量測定を行うための小型線量計の開発を行っている。線量計素子として用いている光刺激蛍光体は粒子線の高線エネルギー付与(LET)領域において感度が低下する。感度低下の補正を行うために本研究では、感度低下の程度の蛍光体による違いを用いて補正を行う手法を提案している。今年度は、光刺激蛍光体であるEu:BaFBrとCe:CaF2を一本の光ファイバーの先端に配したハイブリッド線量計及び両者の信号を同時に取得できる読み出しシステムを整備した。作製したハイブリッド線量計に炭素線照射実験を行い、補正の可能性を評価した。また、照射粒子に対する依存性を調査するため小型線量計にヘリウム線と陽子線の照射実験を行った。今回新たに開発した小型線量計では、光ファイバーの先端に二つの光刺激蛍光体を層状に配した。ダイクロイックミラーによる光刺激蛍光弁別システムを構築しそれぞれの信号を取得した。ハイブリッド線量計への炭素線照射実験では二つの光刺激蛍光体は異なる蛍光感度の低下を示した。単色の炭素線により得られた発光効率比と発光効率の関係を用いて、実際の治療場に近い線量分布であるSpread Out Bragg peak (SOBP)を測定した結果の補正を行った。SOBPの前半部分は電離箱に近い値に補正されたが、後半部分において線量計応答が低かった。

SOBPの後半の領域では炭素線が核破砕したフラグメント粒子が多く存在している。その影響から、発光効率と発光効率比の関係が異なってしまったことが考えられる。150 MeV/uヘリウム線と225 MeV陽子線の照射実験を行った。Eu:BaFBrについては発光効率の粒子依存は確認できなかった。しかし、Ce:CaF2ではヘリウム線と炭素線を比較したときにLETと発光効率の関係が粒子により異なって観測された。研究は全体として計画通りに進んでいる。今回新たに構築した二種類の光刺激蛍光体を一本の光ファイバーに配した小型線量計システムでは、二つの光刺激蛍光を別々に取得することができている。そして炭素線に対しては二つの光刺激蛍光が異なる感度変化を示している。これにより二種類の光刺激蛍光体の発光量比を用いた補正方法が実用可能であることが示された。蛍光体感度の照射粒子依存については、詳細なメカニズムなどは解明できてはいない。しかし、ヘリウム線照射により応答のひずみを測定できたことから今後さらに調査することが可能である。以上のことから本研究は着実に進んでいるといえる。本研究では、粒子線治療を行う際に体内に挿入し患部周辺の線量測定を行うための小型線量計の開発を行っている。現在線量計素子として用いている光刺激蛍光体は粒子線の高線エネルギー付与(LET)領域において消光現象により感度が低下してしまう。LETは一次粒子の局所的なエネルギー損失を表しているが、LETが同じであっても一次粒子の種類が異なれば消光現象の発生に違いが起きる可能性がある。そこで重粒子線治療装置(HIMAC)において、Eu:BaFBrとCe:CaF2を用いた小型線量計に400 MeV/uのネオン線照射実験を行い、炭素線やヘリウム線照射時の結果と比較した。Eu:BaFBrでは粒子の種類によらず発光効率と平均LETの関係は一つの曲線上に分布した。一方でCe:CaF2の発光効率変化は同様の平均LETであっても粒子により異なる傾きを示した。Ce:CaF2で生じた消光現象の発生過程は粒子により異なっていたことが考えられる。小型線量計は前立腺治療時に尿道に挿入して線量が安全なレベルであると確認することを目的としている。この目的での使用を検討するため実際にHIMACにおいて350 MeV/uの単色エネルギー炭素線の照射実験を行った。水槽中に形成した拡大ブラッグピーク(SOBP)中の一部の線量を下げることで尿道を模擬し、尿道部分に設置した小型線量計が線量変化を測定できるか調査した。今回の実験では治療後の読み出しを想定して積層照射がすべて終了した後で読み出しを行った。小型線量計でも仮想した尿道位置における線量低下を計測することができた。しかし小型線量計の応答変化は電離箱と比較すると小さかった。この理由は変化の成分が高LETとなり、蛍光体の感度低下により変化が小さくなってしまったと考えられる。今年度は小型線量計の具体的な使用を想定した実験を行った。
モジュールシステムを基礎におくコーディネーションモデルの研究

本年度は、以下のことを行った。・高信頼コンポーネントソフトウェア開発:前年度に引き続き、コンポーネントを組み上げることで高信頼のソフトウェアを開発するための開発法に関する研究を行った。コンポーネントにより作成するソフトウェアの仕様をUMLとOCLで記述し、それらを代数仕様言語CafeOBJに変換し、作成しようとするソフトウェアが望ましい性質等を有している事をCafeOBJシステム支援のもとで検証する。さらに、CafeOBJからJavaプログラムに変換することでプロトタイプを容易に得ることが出来る。・高信頼コンポーネントソフトウェア開発支援ツール:上記開発方法を支援するツールを設計、開発した。いくつかの例題をとおして有効性を確認した。・分散(実時間)システムの仕様記述と検証:分散(実時間)システムのモデル化および検証方法を整理、提案した。提案手法の有効性を示すため、実時間相互排除在アルゴリズム(Fischerプロトコル)等の実時間システムをモデル化および検証の実験を行った。モデルの記述にはCafeOBJを用い、検証はCafeOBJシステム支援のもとで行った。本年度は,以下のことを行った。・コーディネーション言語およびモデルの調査:コーディネーション言語およびモデルの代表例であるLindaについて調査を行い,CafeOBJのモジュールシステムとの簡単な比較を行った。元来並列プログラムを記述するために開発されたため,Lindaの対象とする部品の統合(コーディネーション)は動的な色合いが強い。一方,CafeOBJのモジュールシステムは,静的な(部品の)仕様を組み上げて,より大きい(システムの)仕様を記述するために使われ,静的な側面が強い。両者を融合することでよりよいコーディネーション言語およびモデルを開発できるものと期待できる。新規の特徴としては,これまでのコーディネーション言語およびモデルでは,あまり対象とされていなかった,部品の統合に関する検証を扱える枠組みを提供できるものと思われる。・モジュールシステムのCafeOBJによる仕様記述の解析:我々の研究グループでは,モジュールシステムをより深く理解するためCafeOBJのモジュールシステムの仕様書をCafeOBJで記述し,いくつかの重要と思われる性質について検証を行った。本年度は,この仕様書をもとに,検証のしやすい仕様の記述方法に関する考察を行った。・モジュールシステムを利用した仕様記述:CafeOBJのモジュールシステムを多用して,CafeOBJの簡約戦略である要求駆動E戦略を用いた書換えの操作的意味を記述した。本年度は,以下のことを行った.●高信頼コンポーネントソフトウェア開発:コンポーネントを組み合わせてソフトウェアを開発する方法の信頼性を高めるためのコーディネーションモデル(ソフトウェアアーキテクチャ)として「木アーキテクチャ」を提案した.木アーキテクチャの仕様記述には,詳細化検証の自動化が容易である射影型振舞仕様を用い,これにより,詳細化検証の自動化のみならず,コネクタの自動生成も可能となる.●高信頼コンポーネントソフトウェア開発支援ツール:上記開発方法を支援するツールを設計し,ツールのプロトタイプを作成し,いくつかの例題を用いて開発方法および支援ツールの妥当性を確認した.●分散システムの仕様記述と検証:分散システムの例として鉄道信号システムを取り上げ,CafeOBJで仕様を記述し,記述した仕様を基に,鉄道信号システムの安全性(列車同士の衝突は起こらない)を検証した.仕様記述の際に,鉄道信号システムに登場する各主体(列車,信号機,線路)の仕様をを独立に記述し,それらを部品として組み上げることで鉄道信号システム全体の仕様を記述した.本年度は、以下のことを行った。
新方言の生成過程にみる方言文法と日本語文法史のインターフェース

今年度の主な実績概要は下記のとおりである。1新方言の生成過程に関する研究:前年度に引き続き、本研究課題の主要テーマである日本語文法史の知見を生かした方言文法研究を進めた。鹿児島方言に見られる「あいづち表現ダカラヨ」「確認を表わす終助詞ケ」「同意要求表現セン」について、実施計画に基づいた方言調査をおこなっており、次年度中にその成果を学術論文化したいと考えている。また、平成30年11月におこなわれた「第2回鹿児島方言週間フェスティバル」では鹿児島方言をモチーフとした謎解きイベントを申請者所属のゼミ生とともに実施し、申請者の研究成果を地域貢献活動として社会に還元した。なお、このイベントに関する一連の流れについては先に第14回坂之上言語・文芸研究会(平成30年5月開催)にて口頭発表をおこない、出席者からの助言を賜ったうえで実施にあたった。2研究と大学教育とのつながりを考える研究:第67回西日本国語国文学会(平成29年9月開催)において開催されたシンポジウムのパネリストとしておこなった研究発表の内容を「『小さなことばたち』に目を向けられる学生をそだてるために」(『西日本国語国文学』第5号〈西日本国語国文学会〉)というタイトルで学術論文化した。上記シンポジウムおよび学術論文の主たる目的は日本語日本文学という学問領域と教育との接点を探るものであったが、内容の一部には申請者の方言研究の成果が含まれている。3関連諸学会・研究会への参加:上記西日本国語国文学会や日本語文法学会、筑紫日本語研究会など関連諸学会・研究会へ今年度も積極的に参加し、日本語文法史および方言文法研究に関する最新の知見を学んだ。得られた知見は申請者の研究の進展にとって大いに役立つものであった。「やや遅れている」と判断した理由は下記の2点による。1課題申請時に記載した、新方言に関する調査成果を十分なかたちでは公開できていないこと。いまのところ、鹿児島県方言に関してはかなりの量の聞き取り調査データを得ているが、現時点ではデータをまとめる段階にとどまっており、そのデータの分析結果を公表できる段階に至っていない。2研究実績の概要に記した通り、今年度は研究内容に関する学術論文および学会発表ともそれぞれ2件ずつ公表できたが、申請した研究課題に直接かかわるものとは必ずしも言い難いものも含まれていること。課題最終年度となる令和元年度は、上記のような問題点を改善すべく研究活動にいっそうの時間を割きたい。平成29年度、平成30年度におこなってきた方言調査により得られたデータについては、表計算ソフトExcelを用いて鋭意整理をおこなっている最中である。最終年度となる令和元年度中にはこの成果を積極的に学術論文や学会発表のかたちで公表したいと考えている。「研究実績の概要」欄にも述べた通り、鹿児島方言における「あいづち表現ダカラヨ」「確認を表わす終助詞ケ」「同意要求表現セン」などの比較的若い世代が用いると考えられる文法項目に関してその使用層や意味用法の記述をおこない、その成果を公表したい。また、方言調査で得られたそのほかのデータに関しても日本語学および言語学的分析を加えてゆく予定である。とくに、申請者がこれまで力を注いできた日本語文法史研究の知見を生かして歴史的側面に重点を置いた方言文法研究をおこない、「九州新方言の文法研究」というテーマでまとめ上げたいと考えている。1新方言の生成過程に関する研究:本研究課題の主要テーマである日本語文法史の知見を生かした方言文法研究を進めた。福岡方言のとりたて表現ゲナ・ヤラ、および鹿児島方言のあいづち表現ダカラヨについて、実施計画に基づき方言調査をおこなっており、次年度(平成30年度)中にはその成果の一部を学術論文化する予定である。また、平成29年12月におこなわれた「第2回かごしま弁フェスティバル」では鹿児島方言および薩摩の漂流民ゴンザに関する講演をおこない、申請者の研究成果を地域貢献活動として社会に還元した。2研究と大学教育とのつながりを考える学会発表:平成29年9月開催の第67回西日本国語国文学会において開催されたシンポジウム「学生をそだてる国語国文学の教育」のパネリストとして研究発表をおこなった。シンポジウムの主たる目的は、日本語日本文学という学問領域と教育との接点を探るものであったが、内容の一部には申請者の方言研究の成果も含むものであった。なお、この発表に関する内容は、平成30年7月発行の当該学会誌に学術論文として公開される予定である。3関連諸学会・研究会への参加:上記西日本国語国文学会や日本語文法学会、筑紫日本語研究会など関連諸学会・研究会へ積極的に参加し、日本語文法史および方言文法研究に関する最新の知見を学んだ。次年度以降は、上記のような問題点を改善すべく研究活動にいっそうの時間を割きたい。1申請書類に記載した、新方言に関する調査成果を十分なかたちでは公開できていないこと。いまのところ、鹿児島県方言に関してはかなりの量の聞き取り調査データを得ているが、福岡方言に関しては一部地域の調査にとどまっている。また、現時点ではデータをまとめる段階にとどまっており、そのデータの十分な分析をすすめられていない。2研究内容に関する学会発表については研究実績の概要に記した通り2件公表できたが、学術論文に関しては今年度中の公開ができなかったこと。

1新方言の生成過程に関する研究:前年度に引き続き、本研究課題の主要テーマである日本語文法史の知見を生かした方言文法研究を進めた。鹿児島方言に見られる「あいづち表現ダカラヨ」「確認を表わす終助詞ケ」「同意要求表現セン」について、実施計画に基づいた方言調査をおこなっており、次年度中にその成果を学術論文化したいと考えている。また、平成30年11月におこなわれた「第2回鹿児島方言週間フェスティバル」では鹿児島方言をモチーフとした謎解きイベントを申請者所属のゼミ生とともに実施し、申請者の研究成果を地域貢献活動として社会に還元した。なお、このイベントに関する一連の流れについては先に第14回坂之上言語・文芸研究会(平成30年5月開催)にて口頭発表をおこない、出席者からの助言を賜ったうえで実施にあたった。2研究と大学教育とのつながりを考える研究:第67回西日本国語国文学会(平成29年9月開催)において開催されたシンポジウムのパネリストとしておこなった研究発表の内容を「『小さなことばたち』に目を向けられる学生をそだてるために」(『西日本国語国文学』第5号〈西日本国語国文学会〉)というタイトルで学術論文化した。上記シンポジウムおよび学術論文の主たる目的は日本語日本文学という学問領域と教育との接点を探るものであったが、内容の一部には申請者の方言研究の成果が含まれている。3関連諸学会・研究会への参加:上記西日本国語国文学会や日本語文法学会、筑紫日本語研究会など関連諸学会・研究会へ今年度も積極的に参加し、日本語文法史および方言文法研究に関する最新の知見を学んだ。得られた知見は申請者の研究の進展にとって大いに役立つものであった。「やや遅れている」と判断した理由は下記の2点による。1課題申請時に記載した、新方言に関する調査成果を十分なかたちでは公開できていないこと。いまのところ、鹿児島県方言に関してはかなりの量の聞き取り調査データを得ているが、現時点ではデータをまとめる段階にとどまっており、そのデータの分析結果を公表できる段階に至っていない。2研究実績の概要に記した通り、今年度は研究内容に関する学術論文および学会発表ともそれぞれ2件ずつ公表できたが、申請した研究課題に直接かかわるものとは必ずしも言い難いものも含まれていること。課題最終年度となる令和元年度は、上記のような問題点を改善すべく研究活動にいっそうの時間を割きたい。前述した今年度の方言調査から得られたデータについては、表計算ソフトExcelを用いて鋭意整理をおこなっている最中である。次年度中にはこの成果を学術論文や口頭発表のかたちで公表したいと考えている。たとえば、鹿児島県の新方言のひとつに、同意要求を表す「ダセン」というものがある。これは、「きょうはいい天気ダセン?(=きょうはいい天気だよね?)」「この服いいセン?(=この服いいでしょ?)」といったように用いられるものであるが、これを使用するのは薩摩川内市など一部地域の若年層に限られる。この「ダセン」の分布や用法記述をおこない、その成果を公表予定である。
Rho-Rho-キナーゼは大脳皮質形成過程の細胞機能を制御するか

多層構造を持つ大脳皮質形成過程では、脳室周辺領域で細胞分裂を終えた神経細胞は放射性グリアの放射状繊維を足場にして順次軟膜方向へ移動する。この過程は脳発生過程の一つのモデル系として良く研究されているが、その分子メカニズムについては、ほとんど明らかにされていない。私共はエレクトロポレーション法を脳組織スライス培養と組み合わせることにより、in vivoにおける環境を維持し、経時的変化の観察、遺伝子を時間的空間的に特異的に発現させることを可能にした。一方、私共の研究室では低分子量GTP結合蛋白質RhoのエフェクターとしてRho-キナーゼ及びミオシンフォスファターゼのミオシン結合サブユニット(MBS)を同定している。さらにRhoの下流でRho-キナーゼとMBSが協調してミオシン軽鎖、ERMファミリー蛋白質などのリン酸化レベルを制御し、アクトミオシン系の再構築を引き起こすことも見出している。しかしながら、Rho-Rho-キナーゼが個体レベルの発生や組織形成において果たす役割については不明な点が多い。本研究では上述の手法を用い、大脳皮質形成過程におけるRho-キナーゼ及びその基質の作用機構を明らかにすることを目的とした。本年度、私共は大脳発生期のラット胎仔脳にRho-キナーゼ及びその基質遺伝子をエレクトロポレーション法により導入した後、組織スライス培養を行い、これらの分子が細胞の移動や分化・形態形成に及ぼす影響の解析を行った。その結果Rho-キナーゼの野生型、活性型、不活性型を発現させた神経細胞ではいずれも移動が阻害された。また、Rho-キナーゼの不活性型を発現させた細胞は通常の移動細胞が二極性の二本の突起を持つのに対し複数本の突起を持つ形態を示した。以上の結果からRho-キナーゼが神経細胞の移動や形態形成を制御する可能性が示唆された。従って本年度の研究計画はほぼ達成できたと考えている。この過程は脳発生過程の一つのモデル系として良く研究されているが、その分子メカニズムについては、ほんど明らかにされていない。

以上の結果からRho-キナーゼが神経細胞の移動や形態形成を制御する可能性が示唆された。従って本年度の研究計画はほぼ達成できたと考えている。
銀河中心における高エネルギー粒子加速の研究

この研究課題は銀河中心の高エネルギー現象を解明するために特性X線(特に鉄)と非熱的X線を用いた世界でも初めてのものである。研究の背景には、銀河中心近傍領域1°x2°ほどに広がったプラズマとSgrA*を中心として2′x3′の超高温プラズマの発見がある。それらのプラズマ圧力(温度x密度)は銀河空間のそれを2桁も上回り、定常的な構造でなく、1万年にもわたる連鎖的超新星爆発か銀河中心核の爆発であることが示唆されていた。我々は以上の知見に加え、本研究課題で新たに以下の成果を得た。(1)中心部での新たに多くの超新星残骸候補を発見した。これは銀河中心で過去約1万年ほどにわたる連鎖的超新星爆発を示すものである。(2)新たに非熱的なフィラメント構造を多数発見した。これは系内最高エネルギー宇宙線の起源として最も有力な候補であり、系外宇宙線加速の研究に繋がった。(3)銀河中心から一直線につながるジェット様の非熱的ノットを発見した。この構造解析からこれらノットは1000年程度の過去に間歇的に放射されたことを示した。(4)銀河中心付近から、多数の新X線天体、X線反射星雲候補を発見し、その特性をしらべ銀河中心は近過去(1000年程度の過去)がきわめて活動的であったことを明らかにした。これは(3)の成果とも一致する。(5)硬X線用CCDの開発を進め、X線イベント抽出方法を開発し、実質的な高いエネルギー感度を向上させた。(6)透過型CCDとN型CCDの技術開発を行った。また、それを冷却するための熱構造モデルの試作を行った。ASCA衛星とチャンドラ衛星(公募観測)をもちいた銀河中心のX線の系統的研究プロジェクトを遂行した。さらにX線検出技術開発を併行して行った。その成果は:(a)超高エネルギー電子による非熱的放射の検出=>宇宙線の起源の解明:大マゼラン雲の殻形超新星残骸,DEML241からHard Tailを検出した。我々の銀河系では、超新星残骸RCW86でシンクロトロンX線を検出し、またあたらなシンクロトロンX線超新星残骸AXJ1843.8-0352/G28.6-0.1を発見した。(b)銀河中心付近から、新天体=X線反射星雲候補を発見し、その特性をしらべ銀河中心の過去の活動性を調べた(c)硬X線用CCDの開発を進めた。X線イベント抽出方法を開発し、実質的な高いエネルギー感度を向上させた。(1)日本の「あすか」の観測データの詳細解析により銀河中心付近のX線天体のもっとも高品質なカタログを作り、世界の研究者に資した。(2)米国の「チャンドラ」衛星で銀河中心付近の巨大分子雲を異例に長時間の観測を行い、分子雲の中心付近から初めて大質量の原始星を多数発見した。これは銀河中心のように濃いガスにかくされた領域からX線で星形成活動が探査できる可能性を実証したものである。(3)同じ分子雲付近から、非常に若い超新星残骸を発見した。これは銀河中心付近で頻繁に超新星爆発があったことを示唆する。(4)N型半導体を用いた、硬X線感度が高いCCDを開発し、所期の性能が達成できる見込みが付いた。(1)日本の「あすか」衛星の観測データの総合的解析を行い、銀河中心並びに銀河面から拡散硬X線天体を複数発見した。(2)米国の「チャンドラ」衛星で上記の天体、AX J1843.8-035を詳細観測し、これが新たな非熱的X線放射、すなわち宇宙線加速の超新星残骸であることを解明した。(3)同様に大マゼラン雲中のスーパーバブル30

Dor Cで宇宙線加速が起こっていることを発見した。系外超新星残骸からははじめての発見である。(4)米国の「チャンドラ」衛星で代表的な宇宙線加速の超新星残骸SN1006を詳細観測し、宇宙線加速領域が従来の学説よりはるかに狭いこと。また加速効率がはるかに高いことを発見し、新たな学説を提唱した。(5)米国の「チャンドラ」衛星を用いて原始星からの硬X線放射の系統的研究をおこなった。(6)透過P型CCDの試作に成功した。またN型CCDの試作にも成功し、所期目標空乏層厚300ミクロンを達成した。この研究課題は銀河中心の高エネルギー現象を解明するために特性X線(特に鉄)と非熱的X線を用いた世界でも初めてのものである。研究の背景には、銀河中心近傍領域1°x2°ほどに広がったプラズマとSgrA*を中心として2'x3'の超高温プラズマの発見がある。それらのプラズマ圧力(温度x密度)は銀河空間のそれを2桁も上回り明し、定常的な構造でなく、1万年にもわたる連鎖的超新星爆発か銀河中心核の爆発であることが示唆されていた。我々は以上の知見に加え、研究課題で新たに以下のような成果をあげた。(1)中心部での新たに多くの超新星残骸候補を発見した。これは銀河中心で過去約1万年ほどにわたる連鎖的超新星爆発を示すものである。(2)新たに非熱的なフィラメント構造を多数発見した。これは系内最高エネルギー宇宙線の起源として最も有力な候補であり、系外宇宙線加速の研究に繋がった。(3)銀河中心から一直線につながるジェット様の非熱的ノットを発見した。この構造解析からこれらノットは1000年程度の過去に間歇的に放射されたのであろう。(4)銀河中心付近から、多数の新X線天体、X線反射星雲候補を発見し、その特性をしらべ銀河中心は近過去(1000年程度の過去)がきわめて活動的であったことを明らかにした。これは(3)の成果とも一致する。(5)硬X線用CCDの開発を進め、X線イベント抽出方法を開発し、実質的な高いエネルギー感度を向上させた。透過型CCDとN型CCDの技術開発に成功した。
イネ科植物への窒素固定根粒形成

根粒菌はマメ科植物に根粒を形成し、窒素固定することで宿主植物に窒素栄養を供給することができる。窒素肥料の大幅な使用削減を実現するための手段として、イネ科植物に窒素固定根粒を形成させる研究が世界中で進行中であるが、未だ成功には至っていない。申請者らは一部の根粒菌がエフェクタータンパク質をマメ科植物細胞に注入し、根粒形成シグナルを直接起動することを発見した。本研究では、宿主の根粒形成シグナルを直接起動する根粒菌を利用して、世界で初めてイネ科植物に窒素固定根粒を形成させることを目指す。
メタボリック症候群でのヒト血管ストレス機序解明と遺伝子治療および麻酔薬作用の研究

ヒト大網動脈の血管内皮を除去し、長さ2. 5 mmのリング状標本を作成した。この標本を高濃度ブドウ糖群(25. 5 mmol/L)に60分間暴露すると、ATP感受性カリウムチャネル開口薬による拡張反応および過分極反応は抑制された。高濃度ブドウ糖暴露標本では、血管平滑筋細胞内のスーパーオキシドレベルが増大しており、これには、細胞膜でのNADPH oxidaseサブセットp47phoxタンパク発現とFアクチン比率の増大を伴っていることが明らかとなった。胃癌手術患者を対象とし当該患者より書面で研究参加の承諾をえてから、術前の麻酔科診察時に諸検査を施行しメタボリック症候群の有無を判定した。本年度はメタボリック症候群のない患者を対象とした。手術患者より摘出された大網つきの胃標本を直ちにクレブス液に入れ9°Cに冷却保存した。病理組織標本を確保したのち、残りの大網を摘出2時間以内に和歌山県立医科大学麻酔科学教室に9°Cに冷却のまま搬送した。ただし、等尺性張力変化測定に関しては、日本赤十字社和歌山医療センター内で行った。外径0.8-1.2mmのヒト大網動脈を摘出後、長さ2.5mmのリング状標本とした。正常ブドウ糖群(5.5mmol/L)あるいは高濃度ブドウ糖群(25.5mmol/L)に60分間暴露した後、U46619(3×10^<-8> mol/L)で血管を収縮させ、ATP感受性カリウムチャネル開口薬レブクロマカリム(10^<-8>-10^<-5>mol/L)の用量反応曲線を得た。高濃度ブドウ糖暴露は、この開口薬による拡張反応を有意に抑制した。さらにこれら処置血管に対して、3mol/LのKC1で満たしたガラス電極をマイクロマニュピュレータで保持し観察チャンバーに入れた摘出血管に刺入し、血管平滑筋膜電位を測定した。等尺性張力変化測定の結果に一致し、高濃度ブドウ糖暴露血管ではレブクロマカリムによる過分極反応は有意に抑制された。現在、ヒト血管平滑筋内タンパク発現検討用の血管標本を集積している途中である。メタボリック症候群のない手術患者より摘出された大網つきの胃標本を直ちにクレブス液に入れ9°Cに冷却保存した。外径0.8-1.2mmのヒト大網動脈の血管内皮を除去し、長さ2.5mmのリング状標本を作成した。正常ブドウ糖群(5.5mmol/L)あるいは高濃度ブドウ糖群(25.5mmol/L)に60分間暴露した後、-80°Cで保存した。保存した標本を用いて、後日ヒト血管平滑筋内でのNADPHoxidase各サブセットのタンパク発現レベルを検討した。その結果、高濃度ブドウ糖暴露により、特に細胞内スーパーオキシドの産生の鍵を握ると考えられるp47phoxの細胞膜分画レベルが増大していることが明らかになった。さらに、高濃度ブドウ糖へ60分間暴露した直後の血管をコンパウンドで封埋後、-20°Cに冷却し作成した20μmの厚さのスライス標本では、ヒドロエチジン(2×10^<-6>mol/L)20分間適用後にえられる585nm波長での赤色蛍光が増強しており、これらの血管平滑筋でのスーパーオキシドの産生増大も証明できた。次いで、4%パラホルムアルデヒドで固定した血管スライス標本で、細胞骨格のうちFアクチンフィラメントおよびNADPH oxidaseサブセットp47phoxを免疫組織学的に評価したところ、細胞膜でのp47phoxタンパク発現を裏付ける画像所見をえた。これについては現在画像解析中である。さらに、高濃度ブドウ糖へ60分間暴露した直後の血管で作成した20μmの厚さのスライス標本では、ヒドロエチジン(2×10^<-6>mol/L)20分間適用後にえられる585nm波長での赤色蛍光が増強しており、これらの血管平滑筋でのスーパーオキシドの産生増大も証明できた。

次いで、4%パラホルムアルデヒドで固定した血管スライス標本で、細胞膜構成物質アダプチンおよびNADPHoxidaseサブセットp47phoxを免疫組織学的に評価したところ、細胞膜でのp47phoxタンパク発現を裏付ける画像所見をえた。次いで、同様に作製したスライス標本に、細胞骨格のうちFアクチンフィラメントおよびGアクチンフィラメントを免疫組織学的に評価した。二次抗体に標識する蛍光色素を赤色(Alexa-594)と緑色(Alexa-488)を適宜組み合わせ、共焦点顕微鏡によるライブセルイメージングで、FおよびGアクチンの比率を評価したところ、高濃度ブドウ糖暴露により、Fアクチン比率が高まることが明らかになった。現在その機序を解析中である。
ヒト陰茎の勃起における細胞内情報伝達系の解析-特にNO-_cGMP系のメカニズムについて-

(1)PGP陽性神経は陰茎深動脈、ラセン動脈および動静脈吻合の周囲ならびに陰茎海綿体内小柱と白膜下疎性結合組織内の小血管に密に分布していた。(2)伝達物質についてみると、NOS陽性神経はラセン動脈、動静脈吻合の周囲および陰茎海綿体内小柱に分布していたが、特に陰茎海綿体内小柱内に多かった。VIP陽性神経はPGP陽性神経の分布に類似していた。NPY陽性神経は陰茎深動脈と陰茎海綿体内小柱に多く分布していた。CGRP陽性神経は陰茎海綿体内小柱と白膜下疎性結合組織内に多く分布していた。(3)コラゲナーゼ消化法によりラット、イヌおよびウサギ陰茎海綿体の分離標本作製を試みたが、海綿体内の平滑筋量が少なく解析に必要な標本が作製できなかった(予備実験)。(4)同時に行ったラットの前立腺では容易に十分量の平滑筋細胞を持った標本が作製でき、ノルアドレナリンとATPに対して平滑筋が反応してCaイオンが持続的に上昇し、α1拮抗剤でその上昇が抑制されることが顕微測光画像解析システムにより確認できた(予備実験)。(5)ヒトおよびウマ陰茎海綿体では平滑筋量が多く解析に必要な標本が作製できたが、試料採取から標本作製までの時間が長かったためか顕微測光画像解析システムによる解析はできなかった。すなわち採取24時間後、12時間後、8時間後および6時間後の試料から作製した標本では、細胞内のCaイオンの濃度変化は生じなかった。そのため少なくとも4時間以内に標本作製を終了する必要があると思われた。また、さらに各種伝達物質の分布の違いを考慮した標本を作製するためにはコラゲナーゼ消化法ではなく、ビブラトームにより薄くスライスした生標本を用いるのが適当と思われた。(6)なお、同時にウマ陰茎の血管鋳型を作製し走査電顕で観察したが、ウマ陰茎海綿体の微細血管構築はヒトに類似しており、ラット、イヌおよびウサギのそれとは明らかに異なっていた。これは陰茎骨の有無や海綿体平滑筋量に関係があると思われた。入手し難いヒト標本に代わりウマ標本を利用することが考えられた。