hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
部位特異的組換え酸素による新しいウイルスベクター作製システムの開発改良

また置換反応の精度に関しては、donorプラスミドに挿入したmtを持っているものと持っていないもの(Δmt)を用いてGFP発現ウイルスの生成の有無を調べた。その結果、Δmtを用いたものでも3回目の継代からわずかにGFP発現細胞が確認された。新規に発見された未知遺伝子の機能探索へのウイルスベクターの応用、特にcDNAライブラリーの様に多種類の遺伝子を発現する複数のベクターを効率的に作製する方法として、本研究では部位特異的組換え酵素による「遺伝子置換反応」を応用した全く新しいベクター作製法の開発に向け、E1遺伝子置換型アデノウイルスベクターを例に、置換反応の効率と精度の検討を行った。本法は、Cre発現293細胞で複製しているrecipientウイルスゲノム上のloxP(L)と変異型loxP(V)の間の領域とdonorプラスミドの目的遺伝子を置換する方法であり、得られたウイルスをCre発現細胞で数代継代し目的ウイルスの濃縮を行う。そこで1代目の目的ウイルス生成効率すなわち置換効率を検討した結果、その効率はrecipientウイルスの感染量が少ないほど高いことが明らかになり、細胞あたりのウイルス感染量が0.5では全てのウイルス中の約1/4が目的ウイルスであった。その後4回継代を繰り返すことにより90%以上が目的ウイルスへと濃縮された。またrecipientウイルス上のLとV間は約30kbまで離れても遺伝子置換反応が可能であったものの効率は若干劣る傾向が認められた。一方その精度に関しては、Vを欠失したdonorプラスミドを用いた検討から、1代目のウイルス中には目的のウイルスしか認められなかったものの、そのウイルスを3回継代を繰り返したところマーカーとしてdonorプラスミド上に挿入していたGFPを発現するウイルスが出現した。そこでこのGFP発現ウイルスを限界希釈法で単離して構造解析を行った結果、ウイルス生成の途中のdonorプラスミド挿入段階で非特異的に一部が切り落とされたウイルスと複数のDNA断片が非特異的な組換えを起こしたウイルスであると考えられた。遺伝子置換反応の条件検討により置換反応の効率化を図り継代数を抑制することが出来れば、精度の上昇は可能であると考えている。
周波数可変サブミリ波帯ジャイロトロンの試作とプラズマ散乱計測への応用

1.サブミリ波帯ジャイロトロンの開発に関する研究成果(1)サイクロトロン高調波動作を用いたジャイロトロンの高周波化,サイクロトロン2次及び3次高調波で動作するジャイロトロンの設計を行い,この設計に基ずいて,サブミリ波帯ジャイロトロンを製作した。発振の動作実験を行った結果,設計の段階で最適化したモ-ド(TE_<261>)での高効率の発振が確認された。即ち,2次高調波動作で,周波数383GHz(波長0.783mm),出力約4kW,効率約5%の好結果が得られた。また,3次高調波での単独動作が確認され,TE_<161>モ-ドで周波数354GHz,出力約20Wが得られた。この成果は,将来テラヘルツ帯で動作するジャイロトロンの開発に明るい見通しを与えるものである。上記のサブミリ波帯ジャイロトロンを他の多くのモ-ドで動作させることにより,サイクロトロン基本波で208GHz,2次高調波で402GHzまで周波数を変化させることに成功した。(周波数可変性の検証)(2)サブミり波帯ジャイロトロンにおけるモ-ド竸合の解析と実験,計算機シミュレ-ションによってモ-ド竸合の解析を行った。また,実験による検証を試み,磁場を最適値に設計し,ビ-ム電流を臨界値以下(23A)に抑えることにより2次高調波での単独動作が得られ,シミュレ-ションの結果ともよく一致した。2.ジャイロトロン出力を光源とするプラズマの散乱計測に関する研究成果開発したジャイロトロンと準光学的アンテナを組み合わせて,集光性のよい直線偏光したミリ波ビ-ムを発生し,これを光源としてミリ波散乱計測装置を製作した。この装置を用いて,京大理学部のWTーIIIトカマク装置シドニ-大学のTORTUSトカマク装置及び核融合科学研究所のヘリカル装置CHSの散乱計測を行った。研究目的:本研究では、サイクロトロン高調波における負吸収現象(サイクロトロン高調波メ-ザ-作用)を用いて、比較的高い効率で高出力の発振を得ることによってジャイロトロンの超高周波化を図る、その出力を用いて、1)準光学的回路素子(プラズマへの結合のためのアンテナ、伝送回路素子等)の試作を行い、2)プラズマの高周波加熱時の密度揺動による散乱の計測へ応用することを試みる。研究成果:(1)サブ・ミリ波帯ジャイロトロン用強磁場系の設計と試作、ジャイロトロンは、相対論的効果を有する高速の電子ビ-ムのサイクロトロン基本波及び高調波における負吸収現象によって発振を行う。従って、サブ・ミリ波帯での発振を得るためには、SCマグネットによって発生する強磁場が必要である。磁場の空間分布をジャイロトロンのために最適化したSCマグネットを製作し、12テスラの磁場強度まで発生できるようにした。(2)シミュレ-ションによる電子銃の設計と製作、ジャイロトロンには、磁力線のまわりを旋回運動する相対論的速度(v/c>0.3)をもった電子ビ-ムが必要である。計算機シミュレ-ションによって、ジャイロトロンに最適の電子ビ-ムを得るベく電子銃の設計を行い、これに基ずいて製作した。(3)シミュレ-ションによる空洞共振器の最適設計と製作、発生した電子ビ-ムを磁場によって円筒空洞共振器へ導き、効率よくメ-ザ-作用を行う。

シミュレ-ションによって、共振器内での電子ビ-ムと高周波電場の相互作用を解析し、共振器形状の最適化をおこない、これに基ずいて、共振器の試作を行った。(4)装置全体の製作、電子銃、空洞共振器を真空容器内に封入して、remountable型のジャイロトロンを構成した。(5)試作するサブ・ミリ波帯ジャイロトロンを光源とするプラズマの散乱計測について検討を行った。研究目的:<本研究では,サイクロトロン高調波における負吸収現象(サイクロトロン高調波メ-ザ-作用)を用いて,比較的高い効率で高出力の発振を得ることによってジャイロトロンの超高周波化を図る。その出力を用いて,1)準光学的回路素子(プラズマへの結合のためのアンテナ,伝送回路素子等)の試作を行い,2)プラズマの高周波加熱時の密度揺動による散乱の計測へ応用することを試みる。>___ー研究成果:1.<サイクロトロン高調波動作によるジャイロトロンの高周波化,>___ー平成元年度に製作したジャイロトロンの発振テストを福井大学・8テスラ超伝導マグネットを用いて行い,サイクロトロン2次高調波における単独動作に成功し,最高周誕数402GHz(波長0.75mm),出力1kWの発振に成功した。また,ジャイロトロンの超高周波化に不可欠の3次高調波での単独動作にも成功し,最高周波数354GHzを達成した。本年度購入した高電圧CW電源を用いて,ジャイロトロンの連続動作を可能し,プラズマ散乱計測の光源として利用するための準備を完了した。2.<準光学的アンテナの開発>___ー,開発したミリ波及びサブミリ波ジャイロトロンを光源して,放物面と楕円面をもつ準光学的アンテナの開発研究を行った。アンテナのテストを行い,ジャイロトロンの円形導波管モ-ドを直線偏光モ-ドに変換すると同時に,2次元的集光を得ることが可能なことを検証した。3.<ジャイロトロンを光源とするプラズマ散乱計測装置の製作とCHSへの設置>___ー,開発したサブミリ波ジャイロトロンを光源と準光学的アンテナを結合素子とする散乱計測装置を試作し,核融合科学研究所の主装置CHS(Compact Helical System)に設置して,低周波密度揺動の測定を行う準備を整えた。平成3年度には,本研究の最終目標であるジャイロトロンのプラズマ散乱計測への応用を遂行する予定である。1.サブミリ波帯ジャイロトロンの開発に関する研究成果(1)サイクロトロン高調波動作を用いたジャイロトロンの高周波化,前年度までに開発したサブミリ波ジャイロトロンにおいて,3次高調波での単独動作が確認され,TE_<161>モ-ドで周波数354GHz.出力約20Wが得られた。この成果により,将来テラヘルツ帯で動作するジャイロトロンの開発に明るい見通しが得られた。(2)周波数可変ジャイロトロンの実現,上記のサブミリ波帯ジャイロトロンを他の多くのモ-ドで動作せ,サイクロトロン基本波で208GHz,2次高調波で402GHzまで周波数を変化させることに成功した。(3)サブミリ波帯ジャイロトロンにおけるモ-ド競合の解析と実験,計算機シミュレ-ションによってモ-ド競合の解析を行った。また,サブミリ波帯ジャイロトロンを用いて,実験による検証を試み,磁場強度を最適値に設定し,ビ-ム電流を臨界価以下(2-3A)に抑えることにより,2次高調波での単独動作が得られ,シミュレ-ションの結果ともよく一致した。この成果により,本装置が格好のサブミリ波帯光源となりうる。2.ヘリカル装置でCHS(核融合科学研究所)のサブミリ波散乱計測
加齢黄斑変性マウスモデルを用いた病態メカニズムの解明と治療への応用

加齢黄斑変性の発生機序を解明するために、疾患モデルとなるレーザー誘発脈絡膜血管新生マウスを作成し、脈絡膜新生血管発生に影響を与えると思われる候補遺伝子の解析を行った。更に、マウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを用いて、多発性骨髄腫の治療薬である2-methoxyestradiolの内服での薬物治療が有用であることを明らかにした。加齢黄斑変性の病態メカニズムの解明と新しい治療法の確立のため、マウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを応用して、各種の血管新生抑制作用を有する薬剤を用いてその効果を確認した。その過程で以前から血管新生抑制効果が知られている2-methoxyestradiol(2ME2)に着目した。2ME2は、抗腫瘍効果を持ち、多発性骨髄腫の治療薬として有望であり、また局所投与ではあるがその血管新生抑制効果はすでに報告されている。この2ME2の眼科治療のための内服での全身投与の効果と安全性を検討するため、再現性のあるマウスモデルを用いた内服での全身投与の系を確立し、その効果を確認したところ、生体での螢光眼底撮影検査、脈絡膜伸展標本での組織所見の両方で有意な血管新生抑制効果を確認し、しかも多くの血管新生抑制作用をもつ薬剤の全身投与で認められる体重減少などの重篤な副作用を認めなかった。加齢黄斑変性のより安全な薬物治療を確立していくという点で、今後の臨床への応用が期待できる薬剤で、更に効果的な薬剤投与濃度や方法について検討中である。また、その他の有望な薬剤にっいてもその効果を確認中である。このような加齢黄斑変性のモデルとなるマウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生が、異なる系統でより正確な再現性が得られるように、吸収エネルギーが色素量に影響されないYAGレーザーを用いた淡色系マウスへのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルの確立を試みており、現在再現性の確認など準備段階である。また、新しい眼科遺伝子治療としてリボザイムを用いた網膜下遺伝子発現モデルについても現在in vitroの系で準備段階である。我々は加齢黄斑変性の内服治療薬として、多発性骨髄腫の治療薬である2-methoxyestradio1(2ME2)に着目し、マウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを用いて、有意な脈絡膜血管新生抑制効果を報告した。加齢黄斑変性のより安全な内服での薬物治療を確立していくために、効果的で体重減少などの副作用の少ない薬剤投与濃度や投与方法について引き続き検討中である。あわせて遺伝的な背景の異なるマウス種での治療効果の差とその要因についても検討解析中である。また、この実験系を応用して、同様の作用が期待できるその他の有望な薬剤についても現在その効果を確認申である。このような加齢黄斑変性のモデルとなるマウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生が、同一の系統だけでなく異なる系統においてもより高い再現性が得られるように、吸収エネルギーが眼底の色素量に影響されないYAGレーザーを用いた淡色系マウスへのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルの確立を引き続き試みている。その過程で、マウスの種特異性やマウスの持つ眼底の色素量だけでなく、網膜と網膜色素上皮との接着性,毛様動脈との位置関係や脈絡膜新生血管への流入栄養血管の数などの形態的な要素も脈絡膜血管新生の感受性に大きく関与することが推察された。このような脈絡膜血管新生の感受性を規定する種特異性以外の影響についても解析を進めている。また、新しい眼科遺伝子治療としてリボザイムを用いた網膜下遺伝子発現モデルについても現在in vitroto系で準備段階である。加齢黄斑変性の発生機序を解明するために,モデルマウスでの加齢黄斑変性関連遺伝子の解析とマッピングを行う目的で,異なるさまざまな系統のマウスと, C57BL/6とDBA/2Jの組換え近交系であるBXDマウスを主に用いて,加齢黄斑変性のモデルとなるレーザー誘発脈絡膜血管新生マウスを作成し,発生した脈絡膜新生血管を脈絡膜進展標本(フラットマウント)を作成して測定した。これを表現型に脈絡膜血管新生の量的形質遺伝子座(quantitative trait loci : QTL)解析を行った。Composite interval mappingによって新しいQTLを2番染色体と19番染色体に同定した。同部位には,脈絡膜新生血管発生に影響を与えると思われる複数の候補遺伝子が存在しており,今後この結果をもとに,候補遺伝子の疾患発生への作用機序を解明するとともに,この発生機序に基づいた新しい治療の開発をすすめる計画である。同じくマウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを用いて、加齢黄斑変性のより安全な内服での薬物治療を確立していくために,既に報告した多発性骨髄腫の治療薬である2-methoxyestradiol(2ME2)以外の治療薬についても研究をすすめており,効果的で副作用の少ない薬剤投与濃度や投与方法について引き続き検討中である。また,従来のモデルの問題点である吸収エネルギーが眼底の色素量に影響されないYAGレーザーを用いた淡色系マウスへのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルの確立を引き続き試みている。
婦人科癌の細胞表面ペプチダーゼの機能解析とそれらを分子標的とした増殖、転移の抑制

一方、基礎的な実験では、APA、NEPおよびDPP IVを卵巣癌や子宮体癌に遺伝子導入するとin vitroにおける細胞遊走能や浸潤能が有意に抑制され、このことはこれらの3つのペプチダーゼのそれぞれの基質ペプチドであるAngiotensin II、Endothelin-1、ある種のケモカイン(SDF-1、RANTES)の分解、不活化を介することが判明した。ヌードマウスを用いたIn vivoの卵巣癌腹膜播種モデルにおいても、NEP導入またはDPP IV導入卵巣癌細胞株は、腹膜播種の減少と生存率の延長が認められた。最後にAngiotensin IIはその受容体であるAT1Rを介して、婦人科癌の浸潤や血管新生を著明に促進し、その特異的受容体ブロッカーや分解酵素であるAPAやA-LAPにより、腫瘍の血管新生や進展が抑制されていることが判明した。以上より、細胞表面ペプチダーゼは婦人科腫瘍の進展に正または負に相関し、予後マーカーとして有用であること、さらにこれらのペプチダーゼの遺伝子導入や特異的阻害剤による新規治療の可能性が示唆された。(2)次に子宮頸癌細胞と正常子宮頚部の線維芽細胞とを共培養する実験系において、頸癌細胞におけるAng II分解酵素APAの発現が誘導されること、さらに頚部間質由来のVEGFを含む液性因子によってAPAの発現が促進されることを見い出した。(LabbInvest, in press)(4)上記のAngIIとその分解酵素による浸潤や血管新生の調節機構が、卵巣癌にも存在するかを同様の実験系を用いて現在検討中である。2.絨毛癌の増殖、浸潤における細胞表面ペプチダーゼの役割(2)胎盤形成過程において母体筋層へと浸潤する絨毛外トロホブラストにOxytocin分解酵素であるPlacental leucine aminopeptidase(P-LAP)が発現していること、さらには絨毛癌の浸潤部や転移病巣内の腫瘍性トロホブラストにP-LAPが強発現し、浸潤の制御にかかわっていることを発見した。(Lab Invest 83:1799-1809,2003)1.卵巣癌におけるアンギオテンシンIIタイプ1受容体発現の解析と血管新生因子および予後との相関本研究課題において初年度(平成15年度)には、子宮頸癌、絨毛癌におけるアンギオテンシンIIによる腫瘍の増殖や浸潤の促進とその分解酵素であるAminopeptidaseA(APA)の発現について解析した。本年度は卵巣癌においてもアンギオテンシンIIが腫瘍進展のkeyとなるペプチドとなり得るか、またこれらの受容体および分解酵素(APA)、産生酵素(ACE)の発現の有無について検討した。(1)卵巣腫瘍組織99例(良性14、境界悪性18、浸潤癌67)におけるアンギオテンシIIタイプ1受容体(AT1R)の免疫組織染色を施行したところ、卵巣腫瘍細胞のAT1R陽性率は悪性転化に伴い増加した。APAおよびACEは腫瘍細胞には発現せず、間質の血管内皮に発現した。2.卵巣癌におけるアンギオテンシンIIタイプ1受容体プロッカーの腹膜播種モデルにおける治療効果卵巣癌および子宮頸癌細胞において産生される活性ペプチドであるEndothelin-1が、癌細胞自身に発現する受容体に結合してオートクリン機構を介して癌細胞の遊走、浸潤を促進すること、および癌細胞に発現するEndothelin-1分解ペプチダーゼであるNeutralendopeptidase(NEP/CD10)が、Endothelin-1依存性の浸潤を抑制することを見い出した。In vivoマウスモデルにおいても、NEPを過剰発現させた卵巣癌および子宮頸癌の移植腫瘍の進展は、コントロール株と比較して有意に抑制され、NEPの婦人科癌への導入による遺伝子治療の可能性を示唆した。(Clin Cancer Res 11:,1798-1808,2005; Oncology 69;52-62,2005)2.婦人科癌におけるAngiotensin II、その受容体および分解ペプチダーゼの意義我々は昨年度までの本研究においてAngiotensin II分解ペプチダーゼであるAminopeptidase AおよびA-LAPが婦人科癌に発現して、その増殖や浸潤を制御していることを報告してきた。

本年度の研究においては、卵巣癌組織におけるAngiotensin II受容体の発現量が、卵巣癌の血管新生に有意に正の相関を示し、患者の予後と相関することを見い出し、新たな予後マーカーとしての可能性を示唆した。またAngiotensin II受容体ブロッカーの投与により、マウスにおける卵巣癌腹膜播種を抑制できることをはじめて明らかにした。(Clin Cancer Res 11:2686-2694,2005; Br J Cancer94:552-560,2006)
腎細胞癌腫瘍免疫における芳香族炭化水素受容体発現の意義と機能解析

腎細胞癌切除検体での検討では、男性、喫煙歴あり、組織学的グレードが高い症例は、腫瘍組織でのAhRの発現が有意に高かった。また、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるAhRの発現は、組織学的グレードが高い症例、病理学的病期において、筋層浸潤以上(pT2以上)の症例で高かった。腫瘍内部ではB細胞よりT細胞が有意に存在した。癌死症例においては、細胞傷害性T細胞と比較してヘルパーT細胞が優位に認められ、腫瘍辺縁部ではTILとregulatory T細胞が多く認められた。さらに生存分析では、TILのAhRの発現が高い症例は有意に再発・進展が多かった。腫瘍免疫においてAhRが関与している可能性が示唆された。腎細胞癌に対して施行した腎摘除術による外科切除検体120例を用いて、芳香族炭化水素受容体(Aryl hydrocarbon receptor: AhR)の免疫染色を施行し臨床病理学的に検討を行った。組織学的グレードが高い(G3, G4)症例は、グレードが低い(G1, G2)症例と比較して腫瘍浸潤リンパ球(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)におけるAhRの発現が高かった(p<0.05)。また、病理学的病期(T因子)において、筋層浸潤以上(pT2以上)の症例は筋層浸潤未満(pT1以下)の症例と比較してTILにおけるAhRの発現が高かった(p<0.05)。さらに生存分析では、TILのAhRの発現が高い(50%以上)症例は低い(50%未満)症例と比較して有意に再発・進展が多いことを明らかにした(p<0.05)。さらに外科切除検体の切片を、各種細胞表面マーカー(Foxp3、L26、CD3、CD4、CD8)の抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。外科的切除後に再発を認めずに生存している症例(good prognosis)と腎細胞癌死症例(poor prognosis)とを免疫組織学的に比較検討した。1AhR発現細胞とregulatoryT細胞は癌死症例に多く認められ、特に腫瘍辺縁部でその傾向が強い2症例の予後にかかわらず、B細胞よりもT細胞が優位に認められ、特に腫瘍内部でその傾向が強い3癌死症例では、細胞傷害性T細胞と比較してhelper T細胞が優位に認められた、という知見が得られた。腫瘍免疫を担うリンパ球におけるAhRの発現についての検討はこれまでになされていない。そこで本研究では、腎細胞癌組織のAhRの発現を免疫組織化学的に調べ、リンパ球ごとにAhRの発現を評価し各細胞の機能とAhRの発現との関連を明らかした。腎細胞癌外科切除検体の切片を、各種細胞表面マーカーの抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。細胞表面マーカーは、Foxp3、L26、CD3、CD4、CD8を使用した。検討に用いた組織検体数が不十分なため、症例数を増やしてより信頼性の高い成果を得たほうが良いと思われる。次年度の研究で実施を予定しているセルソーターによるリンパ球サブセット回収など腫瘍免疫に関する実験設備および技術の習得は、当大学医学部先端医科学研究所の河上裕教授のグループの協力を得る。河上教授のグループは腫瘍免疫に関して多くの業績をあげており(Nat Med 4(3):321-327,1998、J Exp Med 203(7): 1651-1656, 2006、Cancer cell 15(3): 195-206, 2009など)本研究で予定している実験系はすでに確立されている。また、サイトカインの測定に必要なELISAアッセイも当教室内の設備で施行可能である。謝金としての経費は、研究成果を投稿する際の校閲に関する費用を予定している。
極域における湖沼・陸上生態系の発達と環境変遷の解明に向けた物質循環研究

湖沼を含む陸域生態系における物質循環と生態系の発達過程を明らかにすることを目的とし、南極から持ち帰った、(1)湖底光合成生物堆積物コア、(2)湖底光合成生物堆積物中の間隙水、(3)湖水、(4)集水域の雪氷水、(5)集水域の生物試料の各種化学分析を行った。試料(1)と(5)については、窒素・炭素・リン含有量・15N安定同位体比・13C安定同位体比・14C年代測定を、試料(2)(4)については、溶存無機栄養塩頚(硝酸、亜硝酸、アンモニウム、リン酸、ケイ酸)・溶存有機炭素・全炭素を分析した。分析の結果、堆積物表層1cm中の間隙水には湖水の2-220倍の溶存無機窒素(硝酸、亜硝酸、アンモニウム)、3-120倍のリン酸が含まれていることが明らかとなり、その濃度は温帯域の富栄養化湖沼と同程度もしくは高いものであった。現場で測定した湖底光合成生物群集の光合成速度と13C安定同位体比との間には有意な正の相関があり、南極の湖底光合成生物群集の13C安定同位体比は光合成速度を反映した値であると考えられた。湖底に到達する光スペクトルのうち、特に全光エネルギーに対する紫外線含有比と13C安定同位体比との間には強い負の相関が見られ、また、集水域面積と紫外線含有比との間にも強い負の相関があった。つまり、集水域面積が大きいほど外部からの紫外線吸収物質流入量が増加し、その結果、水中を透過する光の中に含まれる紫外線量の割合が減少することで湖底の光環境がマイルドになり、光合成生物による一次生産が活発になると考えられた。本研究によって、貧栄養と考えられてきた南極湖沼の湖底には莫大な栄養塩が蓄積されており、栄養制限よりも光による制限を受けていることが明らかになった。長年、湖沼中において光合成生産を決定するものとして最もよく研究されてきたのが栄養塩類であるが、2009年に、貧栄養湖沼の光合成生産は光量で決定されると言う研究が発表された。しかし、単なる光量だけでなく、入射する光の質によって、貧栄養湖沼の光合成生産が左右されるという新たな知見が得られた。平成24年度で辞退のため、平成25年度以降は実施せず。これまで人為的影響がほとんどない、シンプルな生態系が成立している南極の陸域生態系への植生の定着からその後の環境変動に対する植生の変遷史は未だ謎に包まれており、これを知ることは豊かな湖底植生が発見されるまでは不可能と言われて来た。そこで本研究では、栄養供給が極めて乏しい南極の陸域生態系において、炭素・窒素・リンといった物質がどのように循環してきた/いるのか、南極の陸域生態系がどのようにして発達し環境が変遷してきたのかを明らかにすることを目的とし、今後の環境変動に対して生態系がどのように応答し影響を受け変化していくのかを探る。そこで、湖沼を含めた陸域生態系がどのように発達・成立し、環境が変遷してきたのかを明らかにするために、過去にほとんど人為的影響や捕食者等による生物撹乱を受けずに低温環境で保存されてきた湖底堆積物を利用することによって、この課題に取り組んでいる。これまで蓄積して来た南極湖沼の環境情報に加え、地史的情報、植物色素・紫外線防御物質組成情報、炭素・窒素・リンの動態情報を適用させることによって、現在の南極陸域生態系成立に至る上でこれまで未解明であった最終氷期以降の生態系への植物の移入と、その後の環境変動に対する植物組成の応答と変遷、生態系内における物質循環を解明することを目指す。今年度は大まかに、前半の4月11月中旬にかけて南極での現地調査に向けた事前準備、訓練、データ・情報の整理を実施し、後半の11月下旬3月末にかけては第53次日本南極観測隊の夏隊員として南極大陸上での現地調査を実施した。現地では、2湖沼での潜水調査によって湖底堆積物内への地温ロガーの埋設をし、水深ごとに長さ1m以上の堆積物コア賦料を採取した。また、17湖沼において湖沼学的パラメータ(水温、pH、塩分、溶存酸素、濁度、酸化還元電位、クロロフィル)の鉛直プロファイルを取得し、湖水・湖底植物試料の採取を行った。また、氷河末端から流域レベルでの物質循環用試料を80地点から採集した。

現場で測定した湖底光合成生物群集の光合成速度と13C安定同位体比との間には有意な正の相関があり、南極の湖底光合成生物群集の13C安定同位体比は光合成速度を反映した値であると考えられた。湖底に到達する光スペクトルのうち、特に全光エネルギーに対する紫外線含有比と13C安定同位体比との間には強い負の相関が見られ、また、集水域面積と紫外線含有比との間にも強い負の相関があった。つまり、集水域面積が大きいほど外部からの紫外線吸収物質流入量が増加し、その結果、水中を透過する光の中に含まれる紫外線量の割合が減少することで湖底の光環境がマイルドになり、光合成生物による一次生産が活発になると考えられた。本研究によって、貧栄養と考えられてきた南極湖沼の湖底には莫大な栄養塩が蓄積されており、栄養制限よりも光による制限を受けていることが明らかになった。長年、湖沼中において光合成生産を決定するものとして最もよく研究されてきたのが栄養塩類であるが、2009年に、貧栄養湖沼の光合成生産は光量で決定されると言う研究が発表された。しかし、単なる光量だけでなく、入射する光の質によって、貧栄養湖沼の光合成生産が左右されるという新たな知見が得られた。期間の前半(411月)にかけて、これまでに研究代表者が採取し保有している試料を用いて様々な実験や分析方法の検討・確立をし、得られたデータをまとめることによって、南極での現地調査に向けた具体的な計画と準備を実施した。これらの研究成果を学会発表や、学会での企画集会の開催によって、積極的に公表した。また、学会・シンポジウムでの活動だけでなく、以上のデータを国際学術誌へ論文を投稿し、年度内に受理された。後半(12月3月)にかけては、第53次日本南極地域観測隊の夏隊員として、南極大陸上での現地調査を実施した。事前の訓練・準備によって、当初計画していた実施項目のうち、9割程度を完遂できたため、1年度目の研究計画はおおむね順調に進行していると評価した。平成24年度で辞退のため、平成25年度以降は実施せず。本研究課題の1年度目で獲得してきた試料および現場データを用いて、今後は当初の計画通り各種分析(色素分析、年代分析、窒素・炭素安定同位体分析)、および各種実験を実施する。また、1年度目で分析・解析したデータをまとめ、国際学術誌に論文を投稿し、2年度目で分析・解析したデータを積極的に学会・シンポジウム等で発表する。これらの研究成果は順次論文としてまとめ、国際学術誌への投稿準備を行う。2年度目の後半(12月2月ころ)にかけて、南極大陸もしくは南極半島にある外国基地での現地調査を実施する計画であるが、近年の分厚い海氷状況や現地までの旅費の問題等により相手先の受入れ可能性が現時点では不確定である。そのため、相手国の判断によっては、外国基地での現地調査の実施を見送り、データの解析とまとめ作業に専念する計画に変更する。
ネパールの伝統的住宅における温熱・空気環境調査に基づく解析と評価手法

ネパール山岳地帯の伝統的住宅を対象として,冬の温熱環境について換気・熱連成シミュレーションによる改善予測を行い,以下の結果を得た。1.「基本モデル」の室内温熱環境を検討した結果,(1)住宅「モデルII」、(2)壁「モデルA」,(3)風圧係数「日本」,(4)風速補正「有」の組み合わせが最も適切である。2.室温の実測値と計算値のRMSEは1.11.8Kと小さく,伝統的住宅の室内温熱環境を予測することができ,「基本モデル」を用いて伝統的住宅の改善効果を検証できる。3.「基本モデル」の換気回数は19211回/hと大きく,冬に多数の開口部が常時開放されている実態が示された。4.伝統的住宅の開口部配置は,夜間の冷気侵入に役立っていることが,開口部「北側配置モデル」で確認された。5.開口部の気密化により換気量を減少させることで,夜間の平均室温は「基本モデル」より「1F・2Fの隙間面積の削減」では2.15.7K,「開口部開閉の制御」では0.17.2K,「隙間面積の削減」では0.82.6Kそれぞれ上昇する。6.屋根,土間と壁の断熱化により夜間の平均室温は「基本モデル」より「屋根に木板層の設置」では0.2K上昇するが,「土間に木板層の設置」,「1Fの壁に木板層の設置」では室温上昇効果が見られない。しかし,木板層の表面温度は土間や粘土(壁)より高いと推測され,体感的に改善効果があると考えられる。7.「総合改善+薪削減」で薪消費量が60%削減できると共に,夜間の平均室温が1.04.0K上昇する。伝統的住宅の室内温熱環境は自然換気の影響が大きく,開口部の気密化,屋根の断熱化などにより換気量を減少させることで,室内温熱環境改善とエネルギー消費量削減が実現できる。ネパールの5つの地域で夏と冬の室内と半戸外における熱的主観申告調査と温熱環境調査を行い,以下のことを明らかにした。対象とした地域は亜熱帯のBanke(S_A),温帯のBhaktapur(T_B),Dhading(T_C),Kaski(T_D)と冷帯のSolukhumbu郡(C_E)である。1)室内と半戸外における昼間の温冷感申告の「中立」,快適感申告の「快適」,適温感申告の「このままで良い」の出現頻度が地域S_Aの夏を除くと,夏冬とも高く,居住者は温熱環境への溝足度は高いといえる。2)Griffiths法で求めたネパール各地域の中立温度は,夏の室内では亜熱帯S_Aで30.0°C,温帯で23.4(T_D)29.1°C(T_C),冷帯C_Eで21.1°C(C_E)であり,冬の室内では亜熱帯S_Aで16.2°C,温帯で15.2(T_B)24.2°C(T_C),冷帯C_Eで13.4°C(C_E)である。夏の半戸外では亜熱帯S_Aで31.7°C,温帯で24.3°C(T_C),23.8°C(T_D)で参り,冬の半戸外では亜熱帯S_Aで19.9°C,温帯で19.1°C(T_C),20.3°C(T_D)である。冬のT_C(室内のみ)とT_Dを除くと,中立温度は亜熱帯,温帯,冷帯の順に高いことが示された。中立温度は室内で夏8.9K,冬2.8K,半戸外で夏7.9K,冬1.2Kの地域差がある。3)中立温度の季節差は室内では亜熱帯S_Aで13.8K,温帯で4.9(T_C)10.4K(T_B),冷帯C_Eで7.7K,半戸外では亜熱帯S_Aで11.8K,温帯で5.2K(T_C),3.5K(T_D)である。この差のうち約1.5(T_D)6K(C_E)は着衣量と風速(温帯T_Dのみ)による季節差であり,残りは居住者の適応による差と考えられる。4)半戸外の中立温度は亜熱帯S_Aと温帯T_Dでは,夏と冬で0.43.7K室内より高く,温帯T_Cでは夏4.8K,冬5.1K半戸外で室内より低い。半戸外や薪を燃やす室で中立温度が高いことを示している。

4.伝統的住宅の開口部配置は,夜間の冷気侵入に役立っていることが,開口部「北側配置モデル」で確認された。5.開口部の気密化により換気量を減少させることで,夜間の平均室温は「基本モデル」より「1F・2Fの隙間面積の削減」では2.15.7K,「開口部開閉の制御」では0.17.2K,「隙間面積の削減」では0.82.6Kそれぞれ上昇する。6.屋根,土間と壁の断熱化により夜間の平均室温は「基本モデル」より「屋根に木板層の設置」では0.2K上昇するが,「土間に木板層の設置」,「1Fの壁に木板層の設置」では室温上昇効果が見られない。しかし,木板層の表面温度は土間や粘土(壁)より高いと推測され,体感的に改善効果があると考えられる。7.「総合改善+薪削減」で薪消費量が60%削減できると共に,夜間の平均室温が1.04.0K上昇する。伝統的住宅の室内温熱環境は自然換気の影響が大きく,開口部の気密化,屋根の断熱化などにより換気量を減少させることで,室内温熱環境改善とエネルギー消費量削減が実現できる。
妊娠母親ラットのストレスが仔の欲求性機能の発達に及ぼす影響

本研究では、脳の細胞新生と成長後の欲求性機能に対する胎生期ストレスの効果を明らかにすることを目的として,以下の実験を行った。すなわち,胎生期ストレスに曝されたラットをストレス非曝露ラットと比較することによって,(1)辺縁系の細胞新生を作る脳室下帯の細胞新生に違いがあるか,(2)条件性場所選好法においてドーパミン作動性薬物報酬に対する感受性に違いがあるか,(3)ドーパミン作動性薬物に対する移所活動と側坐核ドーパミン放出の反応性に違いがあるか,(4)拘束ストレスに対するストレスホルモン(コルチココステロン)の反応性に違いがあるかの4点について検討した。その結果、胎生期ストレスに曝されたラットは,非ストレスラットに比べて、(1)脳室下帯における新生細胞数が著しく減少し,(2)条件性場所選好試験においてドーパミン作動性薬物報酬に対する高い感受性を示した。しかし,(3)移所活動と側坐核におけるドーパミン放出量の増加および(4)ストレスによる血漿コルチコステロン濃度の増加については有意差を生じるまでには至らなかった。以上のように、胎生期ストレスは仔の脳室下帯における細胞新生を低下させ,成長後の仔の薬物報酬に対する感受性を亢進することが明らかになった。そのメカニズムについては未だ不明であるが,本研究から,妊娠中の母親に対するストレスが仔の欲求性機能の発達障害をもたらす危険因子となりうることが強く示唆された。妊娠15,16,17日目の3日間にわたって,1日0時間(非ストレス群)または,4時間(ストレス群)の拘束ストレスに曝された母親から生まれたそれぞれの仔ラットが,成長後に示す移動行動と自己刺激行動の特徴について検索した。移動行動については、オープンフィールド(縦50cm×横50cm)内にラット(生後9-11週齢)を置き,薬物(methamphetamine;1mg/kg)投与前30分と投与後60分の変化を3日間にわたって測定した。また,自己刺激行動については,内側前脳束の刺激により典型的な反応パターンを示したラット(生後17-26週齢)について,刺激強度を変えながら刺激強度-反応曲線を求め,報酬閾値に対する薬物(SCH23390;0.020.06mt/kg,raclopride;0.0250.06mg/kg)の効果を測定した。その結果,1.自発的な移動行動量とドーパミン作動薬(methamphetamine)により誘発される移動行動量には,非ストレス群(4匹)とストレス群(4匹)の間に有意差は認められなかった。また,2.報酬閾値に対するD_1受容体阻害薬(SCH23390)とD_2受容体阻害薬(raclopride)の効果についても,非ストレス群(4匹)とストレス群(5匹)の間に有意差は認められなかった。以上により,妊娠母親ラットに対する1日4時間×3日間の拘束ストレスはこの成長後の移動行動と自己刺激行動に有意な影響を与えないことが示唆された。母親を介して胎生期に受けたストレスが仔ラット脳の細胞新生にいかなる影響をもたらすかについて検索した。実験動物にはSD系ラットを用いた。ストレスには、300Wの照明下でのボールマンケージによる拘束を用いた。ストレスは、1日45分×3回(午前10時,午後1時および午後4時)を5日間(妊娠13,14,15,16,17日目)にわたって与えた。また、13,15,17日目の3回目の拘束終了後に新生細胞のマーカーであるBrdU (50mg/kg/回×3回)を母親ラットの腹腔内に投与した。仔ラット脳は生後7日目と10日目に取り出し、BrdUを発現した細胞数を免疫組織化学法を用いて調べた。検索対象脳部位は海馬歯状回と側坐核とした。

その結果、拘束ストレスに長期間曝露された母親から生まれた仔ラット(ストレス群)の海馬歯状回と側坐核では、7日後と10日後のいずれにおいても、ストレスに曝されなかった母親から生まれた仔ラット脳(非ストレス群)に比べて、BrdU陽性細胞の発現数が約2/5(海馬歯状回)から1/5(側坐核)にまで減少していた。加えて、ストレス群の仔ラットの副腎重量は非ストレス群に比べてやや重く(約1.11倍)、いっぽう脾臓重量はやや軽い(約0.92倍)ことが明らかになった。今回の研究から、妊娠母親ラットに対する1日45分×3回×5日間(+300Wの照明)の長期にわたる拘束ストレスは仔の海馬と側坐核の細胞新生を著しく抑制することが示唆された。妊娠13から17日目の5日間にわたって,1目45分x3回(ストレス群)または0分(非ストレス群)の拘束ストレスに曝された母親から生まれたそれぞれの仔ラットが成長後に示すコカイン誘発性場所選好とコカイン誘発性移所活動の特徴について検索した。コカイン誘発性場所選好テストには生後78-108日齢のラットを用いた。白、黒、中央灰色の3部屋からなる場所選好テスト箱を用い、装置馴化(15分,2日間)の翌日プレテストを行い、被験動物の各部屋に対する選好のベースラインを測定した(15分,1日間)。プレテストの翌日から3日間にわたって、午前・午後の各2回各30分間の場所条件づけを行った。すなわち、午前は全被験体に生理食塩水を腹腔内投与し、白と黒のうちどちらかの箱に閉じ込めた。また午後はコカイン(0,2.5,5,10mg/kg)を投与し午前と反対側の箱に閉じ込めた。午前と午後の条件づけの間隔は8-10時間とした。場所条件付け期間終了の翌日に、ラットが各々の箱に進入した回数と滞在時間を15分間にわたって測定した。コカイン誘発性移所活動についても生後78-108日齢のラットを用いた。天井に赤外線センサーを取り付けた活動量測定箱(30x30x35cm)を用い、コカイン投与(10mg/kg)投与前3時間と投与後3時間の移所活動量を測定した。その結果、(1)コカイン誘発性場所選好には、非ストレス群とストレス群の間で有意差が認められた。すなわち、ストレス群は低濃度(5mg/kg)のコカインに対しても有意な場所選好を示した。しかしながら、(2)コカイン誘発性移所活動には、両群間で有意差は認められなかった。以上により、妊娠母親ラットに対する1日45分x3回の拘束ストレスは仔の成長後の報酬機能を亢進することが示唆された。
バイオミメティックスエ学に基づいた高機能インプラントの開発

本研究では、インプラントのオッセオインテグレーションと周囲骨の再生に至るプロセスのキーファクターであるフィクスチャー表面における微細トポグラフィーをミクロンオーダーで制御することを目指して、チタン表面に均一な形状を生成する革新的表面機能化手法としてマイクロディンプルインプリントモデルを構築することに成功した。すなわちハニカムフィルムより導出したエッチング用マスクを鏡面加工されたType I純チタン表面に貼付してウェットエッチング法による酸エッチングを行うことで、チタン表面に直径5μmに均一化されたディンプル形状が規則的なピッチで配置された表面を生成することができた。マイクロディンプル化チタンにヒト歯根膜あるいは歯胚由来(STRO-1^+)培養細胞を播種培養したところ、未処理の場合と比べていずれの細胞においてもその増殖が刺激されたのみならず、付着細胞の形状にも変化がみられ、μmでコントロールされた表面トポグラフィーが細胞の挙動に明らかに影響を与えることが示された。細胞が生体内を遊走する際に必要となる足場を確保することが、組織再生を目指した生体材料表面修飾の基本要件である。純チタンインプラントフィクスチャーの粗面加工で、細胞接着を誘導する最適の面粗さはRa:1μmと言われ、それを純チタン表面に生成するためサンドブラストや陽極酸化法などが採用されているが、その微細な形状をμmオーダーで高精細に制御することができず、不均一な微細表面トポグラフィーしか得られなかった。そのため、これまでは細胞接着から硬組織生成に至る顎骨ーフィクスチャー間インターフェースの組織再構成過程に対して再現性をもって制御するには至っていない。本研究では、インプラントのオッセオインテグレーションに至るプロセスのキーファクターであるフィクスチャー表面における微細トポグラフィーをミクロンオーダーで制御し、均一な形状を生成することで、フィクスチャー顎骨間界面において再現性のある組織再生誘導を得る革新的表面機能化手法を考案し、そのプロトタイプとなるマイクロディンプルインプリントモデルを構築した。本学多元物質科学研究所生体機能設計研究分野で開発されたハニカムフィルムより、直径φ5μm、孔間ピッチ約12μmの高精細メッシュフィルムを導出し、これをエッチング用マスクとして、鏡面加工を施したTypeI純チタンに表面に貼付し、ウェットエッチングを実施したところ、ハニカムフィルムのメッシュ形状がエンボスされた結果生成されるディンプル形状が生成された。各ディンプル直径はマスクと同じ直径5μmに均一化されていた。この表面修飾材料に対し、ヒト歯根膜由来培養細胞を播種培養したところ。ディンプル外縁に沿って細胞体を進展させる様子が観察された。その動態は、従来の不規則な粗面上と異なり一定のパターンが認められ、均一化した表面トポグラフィーが播種された細胞の挙動に明らかに影響を与えていた。歯はその歯根表面と歯槽骨と歯根膜を介して接合し、咬合力に対する加重分散を図ることで耐久性を維持している。歯根膜は歯周靭帯とも呼ばれるように、無数のシャーピー線維が歯槽骨から根面に向かいセメント質に埋め込まれている。この様な機能的組織結合はインプラントー顎骨間結合(オッセオインテグレーション)には見られないことから、我々はインプラント表面の機能化により顎骨間との3次元的線維結合を構築することを目指し、純チタン材表面の微細構造(マイクロトポグラフィー)の構築を試み、それに対する生体組織細胞の反応を検証した。まず、10μm厚純チタン薄板に、極めてパルス幅の短いフェムト秒レーザーによる比熱加工により、規則的配列の穿孔アレイを孔径φ20μm、孔間ピッチ50μmにて約40,000個、あるいは同孔径を30μmピッチに約110,000個と、高密度に形成した。次にこれら試料上に対し、ヒト歯胚由来幹細胞を播種、72時間培養後における細胞付着と増殖能を評価した。その結果、まず対照群とした、従来品、孔径φ100μm、孔間ピッチ500μmのチタンメッシュ(Frios®Boneshield,デンツプライ(独))では、材料表面に細胞の付着が殆ど認められなかった一方、試作品試料上では、微細貫通孔をアンカーとして多数の細胞が付着・増殖し。また、その度合いは高密度の高い方が有意に増大した。純チタンは生体親和性素材である一方で、生体組織が有機的に結合するには細胞外マトリクスを模倣した微細構造を構築することが有効と思われる。本研究により、規則的微細構造に反応して、生体組織細胞は付着と増殖を促進させることが明らかとなった。

純チタンの高い生体親和性は疑いないものの、難加工材の側面を持ち特に微細精密機械加工は困難を極める。しかも熱加工で周囲雰囲気に含まれる酸素や他の元素と容易に結合し変性し劣化するため,通常のレーザー加工が適用できなかった。しかし今回パルス幅を極限まで短縮しピークを高めたフェムト秒レーザーで純チタンに熱変性をもたらすことなく、超微細加工が可能となった。最先端加工技術がもたらした有意なマイクロトポグラフィー効果を発見したことは極めて画期的と見られ、その応用によって新たな機能性材料の扉が開かれると期待される。本年度は新たな着想に基づいたフェムト秒レーザーを用いたピアーシングによるチタン表面のマイクロ加工が歯根膜細胞に対し、マイクロトポグラフィー効果を発揮して増殖を誘導することを明らかにした次年度は動物実験により生体内での作用を検証していく予定である。今年度は、実験成果で示したように共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞増殖応答反応の解析のために輝点追跡ソフトならびに解析用の顕微鏡ステージの構築が必要となり、物品費を多く使用せざるを得なくなった。次年度については本年度得られた成果発表を国内外で行う予定であり、その旅費に研究費を使用する予定である。また動物実験を本格的にスタートさせる予定で、特にチタンインプラント周囲の骨造成効果を明らかにしていきたい。
PrCu_2における四重極モーメントによるメタ磁性転移発現機構の研究

希土類金属間化合物PrCu_2のメタ磁性の特徴とその発現機構についての研究を行った.PrCu_2は斜方晶の結晶構造を持ち,結晶場エネルギーは9つの一重項に分裂している.そのためゼロ磁場では極低温まで磁気モーメントを持たない.磁場を加えると励起状態が混ざり合うため磁化が生じるが,磁化困難軸であるc軸に磁場を加えると約10Tでメタ磁性を示す.興味深いことに,このメタ磁性転移の後,磁化困難軸であったc軸は磁化容易軸に転換し,磁化容易軸であったa軸は磁化困難軸に転換する.このメタ磁性についてこれまで,磁化,磁気抵抗,ドハース・ファンアルフェン効果の実験により研究してきたが,本研究ではさらに超音波や熱膨張および磁歪といった弾性的な実験手段により,PrCu_2のメタ磁性を研究した.磁気抵抗やドハースの実験からPrCu_2のメタ磁性では結晶に歪みが生じていることが予想されていたが,歪みゲージを用いた磁歪の測定により,メタ磁性では2%もの大きな歪みを伴っていることを見出した.この時,特にa軸は大きく縮み,c軸は逆に伸びることがわかった.メタ磁性における磁気異方性の転換とac軸の大きな磁歪から,PrCu_2のメタ磁性の発現機構として四重極モーメントが絡んでいることが示唆される.すなわちb軸を主軸とする四重極モーメントがメタ磁性転移の際に回転しているとして,PrCu_2のメタ磁性が理解される.希土類金属間化合物PrCu_2のメタ磁性の特徴とその発現機構についての研究を行った.PrCu_2は斜方晶の結晶構造を持ち,結晶場エネルギーは9つの一重項に分裂している.そのためゼロ磁場では極低温まで磁気モーメントを持たない.磁場を加えると励起状態が混ざり合うため磁化が生じるが,磁化困難軸であるc軸に磁場を加えると約10Tでメタ磁性を示す.興味深いことに,このメタ磁性転移の後,磁化困難軸であったc軸は磁化容易軸に転換し,磁化容易軸であったa軸は磁化困難軸に転換する.このメタ磁性についてこれまで,磁化,磁気抵抗,ドハース・ファンアルフェン効果の実験により研究してきたが,本研究ではさらに超音波や熱膨張および磁歪といった弾性的な実験手段により,PrCu_2のメタ磁性を研究した.磁気抵抗やドハースの実験からPrCu_2のメタ磁性では結晶に歪みが生じていることが予想されていたが,歪みゲージを用いた磁歪の測定により,メタ磁性では2%もの大きな歪みを伴っていることを見出した.この時,特にa軸は大きく縮み,c軸は逆に伸びることがわかった.メタ磁性における磁気異方性の転換とac軸の大きな磁歪から,PrCu_2のメタ磁性の発現機構として四重極モーメントが絡んでいることが示唆される.すなわちb軸を主軸とする四重極モーメントがメタ磁性転移の際に回転しているとして,PrCu_2のメタ磁性が理解される.
16S rRNA genes PCR-RFLPによる口腔細菌叢解析システムの構築

口腔領域の細菌叢の解析手法は、古典的な培養法及び生化学的性状検査法から、PCR法を利用した分子生物学的解析法にシフトしつつある。そこで本研究では16S rRNA genes PCR-RFLP法を齲蝕や歯周病に関連する口腔細菌の同定に応用し、細菌叢解析における有効性について検討した。口腔のグラム陽性菌(Actinomyces属、Streptococcus属など)及びグラム陰性菌(Porphyromonas属、Prevotella属、Fusobacterium属など)の各標準株と臨床分離株を用いた。16S rRNA genesのユニバーサルプライマーを用いてPCRを行ない、得られたPCR産物を制限酵素AluI、Hae IIあるいはHpaIIで処理した。制限酵素断片のアガロース電気泳動像を記録し、各菌種のパターンを、GenBankのデータベースを基に計算した結果と比較した。その結果、各制限酵素処理後の泳動像は、各種の口腔細菌に特異的なパターンを示し、また得られたパターンはデータベースから計算した結果と一致した。以上のことから16S rRNA genes PCR-RFLP法は、口腔細菌の同定に応用可能であり、さらに迅速・簡便であることが判明した。さらに、16S rRNA genes PCR-RFLP法(グループ分け)とシークエンス解析を組み合わせることにより、口腔細菌種同定のスタンダードな方法となりうることが示唆された。口腔の生態系の健康状態を保持し、口腔の病態をモニターするために、歯垢中の細菌を迅速・的確に検出・同定することが重要である。本研究では、口腔の病巣に多い嫌気性菌について、PCR法ならびにPCR-RFLP法を用いて、迅速に同定する方法の開発を行った。1、歯周炎罹患部位(15名)の歯周ポケット内容液を採取し試料とした。試料からgenomic DNAを抽出し、細菌の16S rRNA genesのuniversal primersを用いてPCR増幅を行った。次いで歯周病関連とされる12菌種の菌種特異的primersを用いてnested PCRを行った。15例のポケットからは、P. gingivalisがnested PCRで12例に、通常のPCRで9例に検出され、他の11種類の細菌全てにおいて、nested PCRの方が通常のPCR法よりも検出率が高かった。2、歯肉縁上歯垢(18名)およびS. mutansの標準株の嫌気培養菌体を試料とした。DNAを抽出後、PCR法によるS. mutansおよびS.sobrinusの検出・同定を行った。18例の歯垢から、nested PCRでS. mutans全例に、S. sobrinusは4例に検出されたのに対し、通常のPCRでは、S. mutansは8例に、S.sobrinusは2例にのみ検出された。また、S. mutans菌体DNAを用いて、PCRの検出感度を検討したところ、nested PCRの方が通常のPCR法よりも約1000倍高かった。PCR primersのspecificityについては,PCR-RFLP法(EcoRI)で確認できた。すなわち、得られたRFLPパターンは、GenBankデータベースから得た16S ribosomal RNA遺伝子配列を基に計算・予測したものと一致した。