hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
四肢位置の決定機構に関する研究

3)上記の細胞間相互作用をより明確にするため、二種の細胞集団を隣り合わせて培養し、相互作用を調べるシステムを開発した。このシステムでは、位置価の異なった細胞の相互作用によって、境界面で肢芽細胞からの軟骨分化の顕著な促進や阻害がみられた。現在このシステムで、側板の背腹域の相互作用について解析中である。四肢は側板中胚葉から形成される。四肢は側板中胚葉の背腹境界面に形成される。この境界面はEn-1遺伝子の発現境界でもある。繊維芽細胞成長因子(FGF)は脇腹の側板中胚葉に過剰肢を誘導する。今までの報告では、誘導された四肢は片側の脇腹についてすべて1本であり、2本以上の四肢が誘導されたという報告はなかった。しかし本研究で、FGF2を含むビーズを挿入した場合には、脇腹の部分に片側2本の過剰肢が誘導される事が明らかになった。2本の過剰肢のうち、前側の四肢はほぼ完全だが、後側の四肢は先端部が欠損していた。一方、FGF4やFGF8を含むビーズを入れた場合は、今までの報告と同様、一本の四肢しかできなかった。シグナル分子の遺伝子の発現をin situ hybridizationによって調べた結果、FGFによってfgf10、fgf8、shh発現域が2カ所になることが分かった。shhはビーズ周辺に発現するようになるが、この発現は一時的なもので、肢芽の発達とともに消失した。このため脇腹後側にできた肢芽はZ先端ができなくなると考えられる。さらに体側部背腹の境界面に肢芽、特にAERができる機構を明らかにするため、外胚葉の細胞培養を行った。AERを含む肢芽外胚葉をトリプシン処理で解離し、コラーゲンコートした培養皿上BGJ-液とF-12液を混合した液で培養し、AER状の構造の形成に成功した。この構造はAERのマーカーであるfgf8を発現し、これを用いて解離間充織を覆って再構成肢芽を作ると、軟骨突起の伸長がみられた。またAER由来細胞と非AER由来細胞の間で、培養下に選別が起こり、結果としてAERができることが明らかになった。今後、背側外胚葉と腹側外胚葉の培養を行い、境界部でのAER形成を可能にする中胚葉由来因子が関与する機構を明らかにする必要がある。
反応拡散系の特異極限として実現され得る構造の探求

反応拡散系の特異極限と見なし得る方程式系の範疇に、界面のような空間的特異性を伴わない方程式系は、あるのだろうか?本研究では、数理生物学における準線形拡散方程式に的を絞って、それらを特異極限として導出できる反応拡散系の枠組を調べた。この研究をきっかけに、「準線形拡散の本質的な機構を単純な相互作用と線形拡散だけで表現すること」の可能性と限界がはっきりしてくるものと期待される。本研究の主な成果は、重定・川崎・寺本モデルと呼ばれる「競争的関係にある2種個体群における棲み分け現象」を記述する準線形拡散方程式に対して、その準線形拡散と本質的に同じ構造を持つ反応拡散系を新たに(形式的に)構成できたことである。これらの方程式系に対して、平衡状態の安定性に関するスペクトル解析、および、両者の解の差の時間発展に対するエネルギー評価を行なった結果、少々制限された条件のもとではあるが、前者(重定・川崎・寺本モデル)が後者(反応拡散系)の適当な特異極限として導出できることを、厳密に正当化できた。さらに、その特異極限操作の生物モデルにおける意味を解釈した。以前にも重定らのモデルを近似する反応拡散系の構成を試みたが、その時は生物現象のモデルとは見なし難い反応拡散系しか構成できなかった。今回は、競争相手の混雑度に応じて拡散係数を転換するような構造を、速い拡散状態にある個体の数密度と遅い拡散状態にある個体の数密度が満たす反応拡散系として定式化できたことが、大きな収穫である。また、本研究を進めるための貴重な研究情報を整理する目的で盛岡応用数学小研究集会を3回開催し、そこで集約された成果を研究基礎資料として100部以上の冊子にまとめ、全国の関連分野の研究者に広く配布した。この小研究集会を通して、反応拡散系にまつわるささやかな研究拠点が岩手大学という小回りの効く地方大学に築かれつつある。本研究では「反応拡散系の特異極限になり得る微分方程式はどれほどあるのか?」という問いを探求する。特に、数理生物学においてパターン形成にまつわる現象の数理モデルとして提唱されている準線形拡散方程式(競争系の棲み分け、走化性粘菌の集合体形成、バクテリア・コロニーの生成を記述するモデルなど)に対して、それらと同じ構造を内包した反応拡散系(半線形拡散方程式系)の有無を探求する。そうすることにより、「準線形拡散の本質的な機構を単純な相互作用と線形拡散だけで表現する」ことの可能性と限界がはっきりしてくるものと期待している。研究1年目にあたる本年度は、準線形拡散と似た役割を果たしそうな反応拡散系の候補をいくつか試作し、それらの性質を推測するための第一歩として数値計算を行い、研究の基礎となる事実の集積に努めた。また、それらの系に隠れている代数構造を把握するための予備調査として、反応拡散系に関連する非線形漸化式で決定される数列の函数解析的な側面と代数的な側面を調べて整理した。さらに、本研究を推進するヒントを得るために、反応拡散系およびその周辺分野からパターン形成の数理モデルに造詣の深い研究者を岩手大学に集めて「盛岡応用数学小研究集会」を開催した。この小研究集会では、モデル作成に際しての目の付け所やモデルの解析結果から読み取るべきことにまで踏み込んで、研究紹介および活発な討論をしていただき、その成果を講演録として冊子にまとめた。この冊子は、本研究の基礎資料として役立つのみならず、関連分野の研究者にも有益な情報に充分なり得ると思われるので、100部製作して全国の関連分野の研究者に広く配布した。反応拡散系の特異極限になり得る微分方程式はどれほどあるのか?

本研究では特に数理生物学におけるパターン形成等の数理モデルとして提唱されている準線形拡散方程式のいくつかに対して、それらと同じ構造を内包した反応拡散系(半線形拡散方程式系)の有無を探求する。研究1年目の昨年度に行った基礎的な事実の集積(数理生物学に現れるさまざまな準線形拡散モデルの分類・整理)に基づいて、本年度は「競争系の棲み分け」を記述する準線形拡散モデル(重定・川崎・寺本、1979年)を近似する反応拡散系を新たに構成した。以前にも重定らのモデルを近似する反応拡散系の構成を試みたが、その時は生物現象のモデルとは見なし難い反応拡散系しか構成できなかった。今回は、競争相手の混雑度に応じて拡散係数を転換するような構造を、速い拡散状態にある個体の数密度と遅い拡散状態にある個体の数密度が満たす反応拡散系として定式化できたので、生物現象のモデルとしても十分解釈可能だと思われる。この反応拡散系の特異極限として重定らの準線形拡散モデルを形式的に導出する過程を、仙台および京大・数理研の研究集会にて報告した。目下、研究分担者の協力のもとに関数解析的手法を応用して、この形式的導出の正当化を試みている。一方、この正当化に関連して、時間遅れを伴う競争系の離散モデルである非線形差分方程式に関する懸案の収束問題を研究分担者が解決し、論文として投稿した。また、本研究を推進するヒントを得るため、反応拡散系およびその周辺分野からパターン形成の数理モデルに造詣の深い研究者を岩手大学に集めて「盛岡応用数学小研究集会」を開催し、その講演録を冊子にまとめた。この冊子は、本研究の基礎資料として役立つのみならず、関連分野の研究者にも有益な情報に十分なり得ると思われるので、150部印刷して全国の関連分野の研究者に広く配布した。反応拡散系の特異極限になり得る微分方程式はどれほどあるのか?本研究では特に数理生物学におけるパターン形成等の数理モデルとして提唱されている準線形拡散方程式のいくつかに対して、それらと同じ構造を内包した反応拡散系(半線形拡散方程式系)の有無を探求する。そうすることにより、「準線形拡散の本質的な機構を単純な相互作用と線形拡散だけで表現する」ことの可能性と限界がはっきりしてくるものと期待している。昨年度は「競争系の棲み分け」を記述する準線形拡散モデル(重定・川崎・寺本、1979年)を近似する反応拡散系を構成したが、本年度は重定らの準線形拡散モデルをこの反応拡散系の特異極限として導出できることの数学的正当化を目指した。そのために、研究分担者が開発した関数解析的手法を活用して、平衡状態の安定性に関するスペクトル解析、および、両モデルの解の差の時間発展に対するエネルギー評価をした。その結果、少々制限された条件のもとではあるが、上記の特異極限としての導出を厳密に正当化できた。この結果をまとめた論文は、現在投稿中である。また、本研究の新たな発展の方向性を探る場として、1年目・2年目に引き続き、反応拡散系およびその周辺分野からパターン形成の数理モデルに造詣の深い研究者を岩手大学に集めて「盛岡応用数学小研究集会」を開催し、本研究のアイデアを発展させる可能性などを議論した。この小研究集会の講演内容は関連分野の諸研究の基礎資料としても活用してもらえるように、冊子体にまとめて140部印刷し、全国の関連分野の研究者に広く配布した。
画像処理に基づく雪氷の剥離特性の解明

本研究の目的は,各種材料と雪氷の付着・剥離メカニズムを解明することである.環境温度を-5°Cに制御して氷を材料に付着させ,荷重増加速度をほぼ一定にし,氷が完全に剥離するまでせん断荷重を作用させる実験を行った.氷と材料の界面の微視的映像を倍率100倍のマイクロスコープにより採取し,界面画像データとして記録した.得られた画像データを画像処理によって二値化することにより,次の二つの値によって剥離現象を定量的に評価できるようになった(1)せん断荷重を作用させる前の界面に存在する初期欠陥(空隙)の面積割合(ボイド率).(2)剥離開始後の界面き裂長さ(き裂発生からき裂最前縁までの距離).(1)に関して,ボイド率は材料の表面粗さ,接触角と依存性がある.表面粗さの増加とともにボイド率は増加する傾向がある.これは,表面粗さが大きくなると氷生成時に,水が表面凹凸の凹部分に侵入しにくくなり,気泡状欠陥が生じやすいためと考えられる.ボイド率とせん断剥離荷重の関係では,ボイド率が約3%未満の場合,ボイド率とせん断剥離荷重の相関は少ないが,約3%以上になると,せん断剥離荷重がボイド率の増加とともに減少する傾向が見られた.ただし,本実験ではボイド率の変化する範囲は小さく,今後,ボイド率をさらに広範囲に変化させた実験を行い,ボイド率とせん断剥離荷重の関係をより明確にするとともに,容易に測定できる材料の表面特性値からボイド率を予測する方法等を確立していく必要がある.(2)に関して,荷重増加速度が一定の場合,約0.03秒内という短時間に1mm未満の長さのき裂が発生する.その後のき裂の進展過程は三段階に分けられ,き裂速度が次第に減少する一次領域,き裂速度がほぼ一定となる二次領域を経て,き裂速度が急激に増加する三次領域に移行し,完全剥離へと至る.この進展過程は,特に材料の表面粗さによって変化が見られ,今後さらに検討していくべきである.本研究の目的は,各種材料と雪氷の付着・剥離メカニズムを解明することである.環境温度を-5°Cに制御して氷を材料に付着させ,荷重増加速度をほぼ一定にし,氷が完全に剥離するまでせん断荷重を作用させる実験を行った.氷と材料の界面の微視的映像を倍率100倍のマイクロスコープにより採取し,界面画像データとして記録した.得られた画像データを画像処理によって二値化することにより,次の二つの値によって剥離現象を定量的に評価できるようになった(1)せん断荷重を作用させる前の界面に存在する初期欠陥(空隙)の面積割合(ボイド率).(2)剥離開始後の界面き裂長さ(き裂発生からき裂最前縁までの距離).(1)に関して,ボイド率は材料の表面粗さ,接触角と依存性がある.表面粗さの増加とともにボイド率は増加する傾向がある.これは,表面粗さが大きくなると氷生成時に,水が表面凹凸の凹部分に侵入しにくくなり,気泡状欠陥が生じやすいためと考えられる.ボイド率とせん断剥離荷重の関係では,ボイド率が約3%未満の場合,ボイド率とせん断剥離荷重の相関は少ないが,約3%以上になると,せん断剥離荷重がボイド率の増加とともに減少する傾向が見られた.ただし,本実験ではボイド率の変化する範囲は小さく,今後,ボイド率をさらに広範囲に変化させた実験を行い,ボイド率とせん断剥離荷重の関係をより明確にするとともに,容易に測定できる材料の表面特性値からボイド率を予測する方法等を確立していく必要がある.(2)に関して,荷重増加速度が一定の場合,約0.03秒内という短時間に1mm未満の長さのき裂が発生する.その後のき裂の進展過程は三段階に分けられ,き裂速度が次第に減少する一次領域,き裂速度がほぼ一定となる二次領域を経て,き裂速度が急激に増加する三次領域に移行し,完全剥離へと至る.この進展過程は,特に材料の表面粗さによって変化が見られ,今後さらに検討していくべきである.
土の相変化を伴う土構造物および地盤の脆弱化・破壊機構の解明と予測

本研究課題では、1)土の間隙水と土粒子の運動の把握、2)相変化の遷移過程におけるせん断強度変化の把握、3)土の流動化・流亡現象の予測シミュレータの開発、に取り組んだ。その中では、浸透流によって流動化した非粘着性材料の移動速度式を提案するとともに、浸透流と通常の水の流れ(流体のみによって占められた領域の流れ)を連成計算することを可能にした。平成26年度の研究では限界動水勾配以上の水頭差を鉛直上向き与えた際に動き出す砂粒子の移動速度を実験的に把握することを試みた。これまでの浸透流による土粒子移動に関連する研究では、土粒子の移動が始まる動水勾配や浸透流速を決定/予測することに焦点が当ており、現状では土粒子の移動開始後にどのように土粒子が流出してパイピングや空洞化に発展していくかを予測することが不可能なためである。その実験結果から、土塊が移動する際の浸透モデルと砂粒子の移動速度の予測式を得た。また、流動的に動く土の挙動を解析するためのシミュレータの開発にも取り組んだ。具体的には,オイラー型の支配方程式にSpace-Time有限要素法を適用した数値解析スキームを開発中である。現在のところ、簡単な弾性計算がSpace-Time有限要素法を用いて計算可能となっている。本研究の目的の一つは,土質材料が固体から流体へと遷移する過程を調査することである.流動化した土は,土粒子と間隙水からなる固・液混相流であり,この固・液混相流の運動を把握するには,固相及び液相の移動速度と各相の占有割合(間隙率に対応)の3点を調べる必要がある.また,固体から液体のように流動化する相変化の遷移過程においては,上の3点に加えて摩擦角の変化を知る必要がある.平成27年度は土質材料が相変化をする遷移過程の摩擦角の計測を試みた.実験では,低拘束圧下において土が固体の状態から流体のように挙動する.その間に,固体の状態では存在しているせん断強度(摩擦角)が減少し,失われる.この過程を測定するため,砂を水平方向に運動させる装置を作成した.水平方向の砂の移動では,粒子間もしくは壁面からのせん断力が存在し,それを測定することで流動化に伴う摩擦角の変化を把握できると考えたためである.平成27年度において,試験機メーカーと打ち合わせを行い,試験機を完成させた.テスト試験を行ったところ,一様に砂が流動化する状況を実現することができす,試験機の改良を行った。流動化する土質材料のシミュレータを開発することが,もう一つの目標であったが,これについては,Space-Time有限要素法によりプログラムの作成を行った.Space-Time法は移動メッシュを取り扱うことができるため,流動的に動く材料の挙動を追跡するのに向いていると判断したためである.現在までに,簡単な一次元問題が解析可能となった.研究実績の概要において記載した通り,はじめに作成した実験装置では,一様な砂の流動現象を実現できず,うまく実験ができなかった.そのため,実験装置の改良に時間を要したため,予定よりも少し遅れている状況がある.空洞化や水みちの形成といった土の流亡によって進行する地盤や土構造物の脆弱化は,現在でも予測が非常に困難な現象である.近年の激甚化する豪雨に対して,このような土の流亡に起因する被害を防止・軽減し,ため池堤体などの土構造物や地盤の防災・減災に寄与することが本研究の構想であった.土の流亡は,低拘束圧下の土が浸透流などの作用を受け,流動化することで発生するため,土の相変化に深く関連する.本研究の具体的な目的として,相変化の機構を解明するとともに,土の流亡現象を予測するシミュレータの開発を掲げた.実施した研究内容と結果は次のようである.流動化した土の間隙水と土粒子の運動(固・液混相流)の把握するため,ボイリング時の砂の運動について実験と理論の両側面からその挙動を明らかにした.その結果として,ボイリング後の砂の速度は,一次元問題であれば,砂の透水係数や間隙率をによって解析的に求めることが可能であり,その速度は実験から得れられた関係とよく一致することが確認された.流動化後の土質材料においては,せん断強度がほぼ消失していると考えられる.せん断強度の消失過程もしくは,低応力化での小さなせん断強度の測定が流動化した土の挙動を把握する上では重要となる.本研究課題において,実験装置を自作し,この研究課題に取り組んだが,理想とする実験は実現できなかった.この研究課題については,今後実験方法を変えて,挑戦を試みる.土の流亡現象を再現するシミュレータについては,オイラー型の数値解法による土の流動化・流亡予測シミュレータの開発に取り組んだ.結果として,上述のボイリング時の砂の運動を再現でき、さらにはDarcy流とNavier-Stokes流のカップリングにより,土の流亡・侵食に関わる幅広い流れの数値解析にも成功した.本研究課題では、1)土の間隙水と土粒子の運動の把握、2)相変化の遷移過程におけるせん断強度変化の把握、3)土の流動化・流亡現象の予測シミュレータの開発、に取り組んだ。当初の平成26年度の研究計画は、(1)鉛直上向きに動く砂粒子の移動速度の把握、(2)シミュレータ開発の準備、であった。

平成26年度には予定通り前者の実験を終えるとともに、シミュレータ開発の初期段階を終えた。今年度は,改良した実験装置を利用して実験に取り組む.なお,シミュレータの開発については,順調に進んでおり,このペースで開発を続ける予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。農業農村工学今後の研究は次の2項目となる。(1)水平方向に移動する砂粒子の移動速度と摩擦角の関係を把握する(2)流動化した土の挙動を予測するためのシミュレータ開発これらは、申請段階に示した研究内容と同じであり、当初の計画通り遂行する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は半年間にわたって在外研究を行った。そのため、今年度予定していた実験について一定の成果を得たが、次年度にも引き続き実験を行う。実験消耗品の購入に充てる。
COPD(慢性閉塞性肺疾患)の新規マウスモデル開発と原因遺伝子解明

目的:我々は慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の肺病変部の著明なIL-18の発現を確認した(論文投稿中)。そこでヒト肺サーファクタントプロモーター(SPC)を用いて恒常的に肺特異的発現するIL-18トランスジェニック(TG)マウスを樹立した。方法:マウスIgκ-チェーンの、V-J2-C領域から取り出したシグナルペプチドと、マウスのプロIL-18c DNAを用い、シグナルペプチドを持つ成熟IL-18 c DNAを、PCR法によって取得した。この成熟IL-18 DNAをヒトサーファクタント蛋白のプロモーターSPC、SV40 small Tintronと牛由来ポリAを含む3.7SPC/SV40ベクターで、サブクローニングした。(SPC-IL-18SPとする)。このTGをマウスの受精卵に上注入しTGマウスを作製した。またテトラサイクリン誘導体doxycycline (dox)で誘導させるSPC-Creマウスを用いて肺特異的にdoxでIL-18を誘導するtriple TGマウスを樹立しdoxを4週間飲ませた。結果:このTGマウスの肺にはCD8陽性T細胞や大型の肺胞マクロファージを伴った炎症細胞浸潤と肺胞構造の破壊による肺気腫状の変化が病理学的に見られた。このTGマウスは肺の容量と静肺コンプライアンスの増加、心臓は著明な右心不全と肺高血圧が確認された。また、このTGマウスの肺及び血清中には著明なIL-18の発現とともにIFN-γとIL-5,IL-13がTG(-)マウスに比べ著明に上昇していた。一方、tet-onシステムを用いて4週間マウス肺にIL-18を発現させると間質性肺炎が誘導できた。考察:肺におけるIL-18の慢性の発現がCOPDの病因に関与していることが示唆された。またIL-18やIL-18受容体の阻害薬が新規のCOPD治療薬になる可能性がある。慢性閉塞性肺疾患(以下COPD)及び肺気腫の動物モデルとしてタバコを毎日12時間かつ6ヶ月以上喫煙させて作製する喫煙モデルや気管内へのエラスターゼやパパイン等の投与が古くから知られている。しかしながらこれら古典的COPD及び肺気腫の動物モデルは世界中でほとんど使われていない。そのため新規COPDマウスモデルが求められている。兵庫医大の中西博士や我々によってIL-18はIFN-・産生誘導だけでなくTh2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13etc)を誘導することが判明した。これらの結果は肺に特異的に炎症性サイトカイン(IL-18,IFN-・)を発現すると肺気腫、肺障害が誘導される可能性がある。そこでヒト肺サーファクタントプロモーター(SPC)を用いて恒常的に肺特異的発現する炎症性サイトカインIL-18トランスジェニック(TG)マウスを樹立した。肺に恒常的にIL-18を発現するSPC-IL-18TGマウスの肺は間質部に著明な炎症細胞浸潤及び大型肺胞マクロファージを伴った一部肺胞構造の破壊による肺気腫状の変化が病理学的に見られる。SPC-IL-18TGマウスの心臓は著明な右心不全つまり右心室、右心房の拡大、うっ血と心筋の肥厚が病理学的に見られる。SPC-IL-18TGマウスの肝臓は著明なうっ血が病理学的に見られる。一方、コントロールのマウスにはTGマウスで見られる異常所見が全く見られない。また、このようにして作製したTGマウスは、約5から10週以降に肺気腫及び循環不全(肝不全、心不全)が発症することが確認された。ヒトCOPDの原因はタバコである。我々の研究結果はタバコが原因による肺局所の過剰なIL-18産生がCOPDを誘導及び悪化することが示唆された。将来、caspase-1(ICE)阻害薬やIL-18阻害薬、IL-18受容体阻害薬が新規COPD治療薬になる可能性がある(論文投稿中)。

また、このTGマウスの肺及び血清中には著明なIL-18の発現とともにIFN-γとIL-5,IL-13がTG(-)マウスに比べ著明に上昇していた。一方、tet-onシステムを用いて4週間マウス肺にIL-18を発現させると間質性肺炎が誘導できた。考察:肺におけるIL-18の慢性の発現がCOPDの病因に関与していることが示唆された。またIL-18やIL-18受容体の阻害薬が新規のCOPD治療薬になる可能性がある。
放線菌ストレプトミセス・グリセウスのゲノム解析のための基盤整備

放線菌は多種多様な生理活性物質の生産菌として重要な工業微生物であるとともに、細胞の形態分化のモデル生物として基礎生物学の格好の材料である。我々の大きな目標は、ストレプトマイシン生産菌であるS.griseus IFO 13350株の全ゲノム配列(8Mb)を決定することであるが、その前段階としてS.griseusゲノムの整列化BACライブラリーを作製した。S.griseus染色体DNAをBamHIで部分分解後パルスフィードル電気泳動により分画し、約100kb以上のDNA断片をBACベクター(pBeloBAC11)にクローニングし、1440クローンからなるBACライブラリー(平均インサーション約80kb)を構築した。T7およびSP6RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写により、任意のクローンの挿入DNA両末端に対するdigoxigeninラベルRNAプローブを作製し、BAC DNAを固定したナイロンメンブレンを用いたハイブリダイゼーションにより、そのクローンとオーバーラップするDNAを持つクローンを選択した。総計624クローンを用いてこの操作を繰り返すことによって、174クローンからなる整列化BACライブラリーが構築できた。本整列化BACライブラリーは4つのギャップ領域が存在するものの、ゲノムのほぼ全長をカバーしていると考えられる。現在、染色体DNAのDraI,AseI断片をラベルし、整列化BACクローン群とハイブリダイゼーションを行なうことによって、DraI、AseIによるゲノムの制限酵素地図を作製するとともに、整列化BACクローン群の染色体上での位置の特定を進めている。一方、A-ファクター制御カスケード内の役者を同定するために、カスケード内の転写因子AdpAが結合するDNA断片をゲルシフト-PCR法にて20種以上取得した。取得したDNA断片を含む大きなDNA断片をクローニング、塩基配列決定による遺伝子の同定、A-ファクター依存性の転写の有無を確認した。その中の1つは、外界の環境変化に応答して転写を起こすシグマ因子をコードしていた。このシグマは、二次代謝には関係せず、形態分化にのみ関係していた。
2-アラキドノイルグリセロールによるシナプス伝達調節とその異常

主要な内因性カンナビノイド(以下eCBと略す)であり、シナプスにおける逆行性シナプス伝達を担うことが知られている2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)について、平成25年4月25日までに以下の検討を行った。1.シナプス可塑性の調節: 2-AGの合成酵素DGLαおよび2-AGの受容体であるCB1のノックアウトマウスの側坐核において、NMDA受容体を介するシナプス電流が変化し、シナプス可塑性に影響があるかについて、電気生理学的解析を開始した。2.感覚情報処理: 2-AGシグナルが生後発達期の経験依存的な機能的神経回路形成と感覚情報処理に果たす役割について、大脳バレル皮質の受容野マップ形成を解析するための実験系の検討を行った。3.情動: DGLαノックアウトマウスについて、痛みに伴う負の情動を評価するための行動実験のパラダイムを検討した。4.記憶・学習:2-AGの記憶・学習における役割について、海馬歯状回依存性の非連合学習課題である匂い馴化および空間馴化と、海馬CA1依存的学習であるトレース瞬目反射条件付けに焦点を絞り、DGLαおよびCB1のノックアウトマウスの行動解析と自由行動下での長期増強の解析を行う計画であった。さらに、DGLαノックアウトマウスの歯状回に、ウイルスベクターを用いて、DGLαを興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロン特異的に発現させたマウスで、同様の解析を行うことも計画していた。そこで、具体的な事件パラダイムについての検討を行うとともに、ウイルスベクターの設計を行った。25年度が最終年度であるため、記入しない。
金融市場のボラティリティと金融政策および経済変動との関係

本研究プログラムは,金融市場のボラティリティ期待の形成,金融政策決定会議前後の金融市場の行動,市場ボラティリティと実質経済の間の相互依存性に焦点を当てている.主な実証的研究成果は,モデルフリー・インプライド・ボラティリティ指数が将来の経済変動の重要な金融不安定性および経済不確実性の評価基準であることを示している.大阪大学・金融保険教育研究所が発信するCSF1-VXJボラティリティ指数の有益さは日本経済新聞およびThe Economistの記事で確認できる.ボラティリティ期待の形成の非線形性に関する分析結果に加えて,政策発表が金融政策決定会議の前に生じた過剰なボラティリティを解消し,金融市場を安定させる効果を持つことを示唆している.ボラティリティ期待へのショックは,消費者信頼感の悪化,投資環境指数の低下,金利の期間構造の平坦化を通じて,日本経済景気循環の転換期を示す先行指標に伝達されることになるだろう.総じて,本研究結果は経済不確実性と金融市場ボラティリティおよび経済情報との間の複雑な関連性についての理解を深めることに役立つ.本研究プログラムは,金融市場のボラティリティ期待の形成,金融政策決定会議前後の金融市場の行動,市場ボラティリティと実質経済の間の相互依存性に焦点を当てている.主な実証的研究成果は,モデルフリー・インプライド・ボラティリティ指数が将来の経済変動の重要な金融不安定性および経済不確実性の評価基準であることを示している.大阪大学・金融保険教育研究所が発信するCSF1-VXJボラティリティ指数の有益さは日本経済新聞およびThe Economistの記事で確認できる.ボラティリティ期待の形成の非線形性に関する分析結果に加えて,政策発表が金融政策決定会議の前に生じた過剰なボラティリティを解消し,金融市場を安定させる効果を持つことを示唆している.ボラティリティ期待へのショックは,消費者信頼感の悪化,投資環境指数の低下,金利の期間構造の平坦化を通じて,日本経済景気循環の転換期を示す先行指標に伝達されることになるだろう.総じて,本研究結果は経済不確実性と金融市場ボラティリティおよび経済情報との間の複雑な関連性についての理解を深めることに役立つ.本研究の目的は、金融政策のアナウンス効果が市場の期待ボラティリティにどの程度まで影響を与えるか、市場ボラティリティが、金融危機に際して、資産価格変動にどれほど影響を与えるか、金融市場と経済変動とはどのような相互依存関係にあるか、といった諸問題を検討し、それらの研究を通して金融市場ボラティリティ・金融政策・経済変動を理解することである.A.「中央銀行のPurdahと金融政策決定会合前後のボラティリティの変動」、B.「国際金融市場における期待ボラティリティのダイナミックスと共変動」とC.「金融市場ボラティリティと経済変動の相関」の3つのプロジェクトから成り、1年目の平成21年度においては、計画通り研究を進めることができ、次の成果を得た.プロジェクトAでは、実証分析の発表:中央銀行における"Purdah Rule"と呼ばれる中央銀行の慣習-政策会合前後の期間には沈黙を守るべきという自己規制的慣習-がもつ合理性について検討している.日本銀行における金融政策決定会合に関する公開情報を収集し、実証分析の結果をMonetary Policy Meetings and Market Volatility Anticipations (Maghrebi, 2010)として研究会で発表した.米国金融危機における市場ボラティリティと金融規制についてもMaghrebi (2010)において発表した.プロジェクトBでは、必要なデータの処理と実証分析の発表:Volatility Index Japan VXJボラティリティ指数の統計的な特徴に関する分析結果を、大阪大学の金融・保険教育研究センターのDiscussion Papers (2010)において発表した.韓国および香港株式市場における期待ボラティリティを推計し続け、Volatility波及・流出する経路も分析している.プロジェクトCでは、データの処理と実証分析:金融市場におけるボラティリティと景気循環との関連・メカニズムについて、実証分析を行い、論文を作成している.本研究の目的は、金融政策のアナウンス効果が市場の期待ボラティリティにどの程度まで影響を与えるか、市場ボラティリティが、金融危機に際して、資産価格変動にどれほど影響を与えるか、金融市場と経済変動とはどのような相互依存関係にあるか、といった諸問題を検討し、それらの研究を通して金融市場ボラティリティ・金融政策・経済変動を理解することである.A.「中央銀行のPurdahと金融政策決定会合前後のボラティリティの変動」、B.「国際金融市場における期待ボラティリティのダイナミックスと共変動」とC.「金融市場ボラティリティと経済変動の相関」の3つのプロジェクトから成り、2年目の平成22年度においては、計画通り研究を進めることができ、次の成果を得た.プロジェクトAでは、実証分析の続き:日本銀行における金融政策決定会合に関する分析結果を研究会で発表し(Maghrebi-Kim-Nishina, 2010)、他国における金融政策決定会合に対する期待ボラティリティ反応も分析し続けている.プロジェクトBを完了した:金融危機における期待ボラティリティのダイナミクスに関する分析結果を論文として国際学会(Nishina-Maghrebi-Holmes, 2010)で発表し、査読制付雑誌に投稿した.さらに、VXJ指数に加えて大阪大学の金融・保険教育研究センターのCSFI-VXJ研究グループが提供しているCSFI-

VXJボラティリティ指数をについての計算方法および統計的特性を論文として査読制付雑誌International Journal of Theoretical and Applied Financeにおいて発表した.プロジェクトCでは、データの処理と実証分析の続き:経済変動と金融市場におけるボラティリティとの理論関係を考慮し、計量的推定モデル(Markov-Regime Switching Model等)を推定している.本研究の目的は、金融政策のアナウンス効果が市場の期待ボラティリティにどの程度まで影響を与えるか、市場ボラティリティが、金融危機に際して、資産価格変動にどれほど影響を与えるか、金融市場と経済変動とはどのような相互依存関係にあるか、といった諸問題を検討し、それらの研究を通して金融市場ボラティリティ・金融政策・経済変動を理解することである.A.「中央銀行のPurdahと金融政策決定会合前後のボラティリティの変動」、B.「国際金融市場における期待ボラティリティのダイナミックスと共変動」とC.「金融市場ボラティリティと経済変動の相関」の3つのプロジェクトから成り、本研究プログラムの平成23年度においては、計画通り研究を進めることができ、次の成果を得た.プロジェクトBの2年目での完了.さらに、期待ボラティリティ指数と国際金融危機の影響に関する分析結果を論文として国際学会(Nishina-Maghrebi-Holmes,APAD2011)で発表した.プロジェクトCの完了.内閣府経済社会総合研究所の景気統計を用いて、経済変動を図る景気動向指数(先行系列の消費者態度・長短金利差・投資環境指数)と金融市場ボラティリティ指数との関係を検討した.VAR計量的推定モデルの実証分析結果を論文として発表した(Maghrebi and Holmes,forthcoming).
カテキン利用の三次元抗酸化剤高速再生サイクル設計による生理活性物質の長期酸化防止

本研究では、食品系における生理活性物質β-カロテンの長期酸化防止を達成するため、脂溶性ビタミンEと水溶性ビタミンCに新規な両親媒性カテキンを組み合わせることで抗酸化剤高速再生サイクルを設計することを目的とした。まず、ビタミンEとCの間で生じる反応機構解明のため、界面積既知の油水二相系でのカロテンの酸化実験を行い、初期ビタミンEやC濃度、界面積、気相体積など諸因子の影響を検討した。そして、系内にビタミンEが存在する限りカロテン酸化が抑制されること、ビタミンCがビタミンE消費を抑制あるいは促進する相反効果を有すること、特定の条件下でカロテンの酸化抑制期間が飛躍的に増大することを明らかにした。この酸化抑制期間の増大は、従来ビタミンCによるビタミンEの再生反応によるものと考えられていたが、実際にはビタミンC自身の酸化によって系内酸素が消費され低濃度となっているためであることも解明した。また、各物質自身の酸化、ビタミンEによる抗酸化、ビタミンCによるビタミンEの再生および消費、気相から水相、水相から油相への酸素の物質移動を考慮して構築した速度論モデルは、反応条件に応じてカロテン酸化が促進あるいは抑制されるという相反現象を良好に表現できた。さらに、実際の食品系はoil in waterエマルションなどの分散系であることから、実験系を形状が安定なリボソーム系へと展開させ、油水二相系で解明した反応機構に基づき、リボソーム系でのカロテン酸化を表現可能であることを明らかにした。一方、両親媒性カテキンとカロテン間で生じる反応機構解明のため、不活性な油均相系でカロテンの酸化実験を行い、カテキンがカロテンの酸化抑制と促進の相反効果を有すること、カテキンの構造によってどちらの効果が優勢となるかが異なること、明らかにした。本研究は、生理活性物質としてβ-カロチンを取り上げ、両親媒性抗酸化剤でありカテキンと、脂溶性抗酸化剤ビタミンEや水溶性抗酸化剤ビタミンCの間で生じる反応を明らかにし、目的物質の酸化防止能力を飛躍的に増大できる抗酸化剤高速再生サイクルを設計することを目的とする。本年度は、第一段階として、界面積既知の油水二相系におけるビタミンEとC共存下でのカロチンの酸化実験を行い、ビタミンEとCの間で生じる反応機構の解明に取り組んだ。両抗酸化剤共存下では、ビタミンC初濃度が低い場合にはビタミンE消費が促進されてカロチン酸化の抑制期間が短くなるが、ビタミンC初濃度が高くなると逆にビタミンE消費が抑制されて酸化抑制期間が飛躍的に長くなるという実験的知見を得た。そこで、ビタミンE消費を促進する反応として水相でのビタミンC自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルが油水界面でビタミンEを消費する反応を、ビタミンE消費を抑制する反応として油相に溶解したビタミンCがラジカル化したビタミンEに水素を供与し再生する反応を、それぞれ考慮することによって酸化モデルを構築した。これらの反応および物質移動を考慮したモデルは、前述したビタミンC初濃度に応じてカロチンの酸化が促進ならびに抑制される、相反する2つの現象を良好に表現することができた。また、このモデルを用いてカロチン酸化に及ぼすビタミンE初濃度や油水界面積の影響を検討することにより、酸化抑制期間を増大させるための適切な条件を明らかにした。本研究は、生理活性物質としてβ-カロチンを取り上げ、両親媒性抗酸化剤であるカテキンと、脂溶性抗酸化剤ビタミンEや水溶性抗酸化剤ビタミンCの間で生じる反応を明らかにし、目的物質の酸化防止能力を飛躍的に増大できる抗酸化剤高速再生サイクルを設計することを目的とする。昨年度は、脂溶性抗酸化剤初期濃度を一定とした条件で、水溶性抗酸化剤の初期濃度を増加させると、低濃度では脂溶性抗酸化剤の消費反応が促進されてカロチン酸化の抑制期間が短くなるものの、高濃度では逆に消費が抑制されて酸化抑制期間が著しく増大することを実験と理論の両面から明らかにした。

しかし、高濃度の水溶性抗酸化剤自身の酸化によって反応系内酸素の大半が消費され、この酸素不足が原因でカロチンの酸化抑制期間が増大している可能性があった。そこで本年度は、系内酸素消費による影響がない条件、すなわち、カロチンと脂溶性・水溶性抗酸化剤の各濃度を以前の実験の5分の1とした低濃度条件で酸化実験を行った。そして、脂溶性抗酸化剤濃度が水溶性抗酸化剤を添加しない場合には単調に減少するが、水溶性抗酸化剤と共に添加した場合、その添加濃度によらずに減少が止まる傾向を示し、その結果、カロチン酸化の抑制期間が著しく増大することを実験的に明らかにした。この場合での反応系内酸素消費量は10%程度と僅かであることから、このカロチン酸化の抑制は酸素不足ではないと考えられる。従って、低濃度条件では、ビタミンE自身の濃度が低いためビタミンCによるビタミンEの消費反応の寄与が小さくなって酸化促進効果が生じず、その一方で油相に僅かに溶解したビタミンCによるビタミンEの再生反応が生じてビタミンEの消費が抑制されるために酸化抑制効果のみが発現したと考えられる。本研究は、生理活性物質としてβ-カロテンを取り上げ、両親媒性抗酸化剤カテキン、脂溶性抗駿化剤ビタミンE、水溶性抗酸化剤ビタミンCの各種抗酸化剤の作用機構を明らかにして、目的物質の長期酸化防止を可能とする抗酸化剤高速再生サイクルを設計することを目的とする。前年度までに、閉鎖油水二相系において、ビタミンE初濃度を一定としてビタミンC初濃度を増加させると、低濃度ではビタミンE消費が促進されてカロテン酸化の抑制期間が短くなるものの、高濃度では逆にビタミンE消費が抑制されて酸化抑制期間が著しく増大するという実験的知見を得た。本年度は、この機構を解明するために、反応系内に存在する酸素量に着目し、気相体積を変化させた種々の酸素量条件下で同様の酸化実験を行った。その結果、同じ抗酸化剤濃度条件でも、気相体積が大きい、つまり系内酸素量が多い場合にはビタミンE消費が促進されてカロテン酸化が促進されるが、気相体積が小さい、つまり系内酸素量が少ない場合にはビタミンE消費が抑制されてカロテン酸化が抑制される現象が観察された。そこで、前年度に構築したビタミンEとビタミンC共存下でのカロテン酸化モデルに、さらに各相での酸素消費と気相から油相、油相から水相への酸素の物質移動を考慮することで新たなモデルを構築した。このモデルにより、抗酸化剤初濃度や反応系内酸素量によってカロテン酸化が促進あるいは抑制されるという相反する現象を表現することができ、後者が反応系内酸素の枯渇によるものであることを明らかにできた。さらに、構築したモデルを用いたシミュレーションにより、気液界面積は小さいほど酸化抑制に有効であり、油水界面積には酸化抑制に適切な範囲が存在することを示すことができた。
災害現場における臨時ネットワークを簡易構築するシステムの開発

ネットワークインフラが破壊した災害現場において,無線端末だけで構築できるアドホックネットワークに注目し,簡易に構築するための技術を研究した.効率良く,かつ確実に情報を配信するために,受信端末を1台指定した上で不特定多数の端末に一斉配信する方法を提案し,防犯カメラシステム網において効果を確認した.また,近隣端末との接続状況を詳細に把握できるIPv6を導入し,端末の頻繁な移動にも頑強なシステムを構築した.ネットワークインフラが破壊した災害現場において,無線端末だけで構築できるアドホックネットワークに注目し,簡易に構築するための技術を研究した.効率良く,かつ確実に情報を配信するために,受信端末を1台指定した上で不特定多数の端末に一斉配信する方法を提案し,防犯カメラシステム網において効果を確認した.また,近隣端末との接続状況を詳細に把握できるIPv6を導入し,端末の頻繁な移動にも頑強なシステムを構築した.地震などの災害現場では,救助者による現場情報の共有化が必要である.しかし現場では,既存のインフラは破壊された状態である.よって情報の共有化のために,新しいネットワークの早急な構築が求められる.初年度である平成21年度は調査に重点をおき,各種研究会に参加し,災害支援ツールに必要な条件を調査した.また,災害救助支援ツール作成の基盤として,情報共有のためのネットワークシステムを実装した.具体的には,通常のアドホック無線ネットワークのルーティングプロトコルでは,OSI参照モデルに基づいて各層は他の層に影響を与えないように設計されるのであるが,ここではルーティング層と上位のアプリケーション層を同時に扱うことで,効率の良いネットワークの利用を目指した.アプリケーション側でネットワーク全体に配信したい情報を,ルーティング層でのブロードキャストパケットに付加して,一斉配信を行う.このネットワークシステムでは,無線端末として情報配信端末と情報受信端末を用い,情報配信端末が全体に対して情報配信を行い,その配信情報を受け取った両端末は,その配信情報を転送し続けることでネットワーク全体に対して情報配信を行うことができる.このネットワークを利用して,災害現場におけるトリアージ情報の共有システムを構築した.すなわち,トリアージを行う医師群が情報配信端末を持ち,傷病者へのトリアージ情報を端末に入力すると,ネットワーク全体にその情報が伝達され,情報受信端末を持つレスキュー隊はその情報をみて,どの傷病者を搬送しなければならないかを知ることができるシステムである.今後は,ネットワークの自動構築部分と,トリアージ情報以外の情報共有システム部分の構築を進める予定である.地震などの災害現場では,救助者による現場情報の共有化が必要である.しかし現場では,既存のインフラは破壊された状態であることが多い.特に,2011年3月11日に発生した東日本大震災においては,津波による被害が大きく,被害の全容をつかむのが大変困難であった.よって情報の共有化のために,基地局を用いないネットワークの早急な構築が求められる.2年目である平成22年度はシステムの構築と評価に重点をおいた.まず,情報共有のためのネットワークプロトコルを提案した.このプロトコルでは,経路設定のための情報を交換する際に,共有したい情報も同時に送信し,効率よく情報をネットワーク内の端末で共有することができる.また,各端末が独立して動き回るため,端末の位置情報を求める必要がある.ここでは近距離センサネットワークで用いられるZigBeeを用いて,ベイズ推定による2次元位置推定の研究を行った.次に,ネットワークのセキュリティを高めるために,通信の暗号化に着目した.通信路の暗号化にはWEPやWPAなどの方法が用意されているが,いずれにしても,最初に鍵を安全に交換する必要があり,無線LANとは別の通信路を用意する必要がある.そこでLED照明に情報を重畳する可視光通信と,オーディオ信号に情報を重畳する音響通信の2つを提案し,それぞれシステムを作成し評価した.暗号鍵をディジタル変調することで約1m程度離れても,暗号鍵を正常に受け渡しすることができた.来年度は誤り訂正符号等を導入し,通信距離を長くする必要がある.さらに,作成したアドホックネットワーク上で簡単に情報交換するために,双方向NATを導入することでテレビ電話システムをアドホックネットワークへと対応させた.本年度は,ネットワーク層を中心に研究を進めた.今後は,アプリケーション層を充実させる予定である.地震などの災害現場では,救助者による現場情報の共有化が必要である.しかし災害現場では,既存のインフラが破壊されていることが多く,新たにネットワークを素早く手軽に構築する必要がある.平成23年度はシステムの構築と評価に重点をおいた.まず,基地局を用いないネットワークの一例として防犯カメラシステムを構築した.無線カメラ端末が撮影した画像をお互いの端末に転送し,画像を共有する.いくつかの端末がダウンしても,他の端末が画像を保存しているため,監視画像の確保が容易となる.災害発生時には,避難所などにおいてセキュリティが低下するが,このシステムを用いることで,手軽にセキュリティを高めることができる.また,画像の代わりに他のテキストや音声データを共有することで,避難所間の情報共有システムとしても使う事ができる.少ない送信回数で情報を共有するためには,一斉配信が望ましい.しかし基地局を用いないため通信を管理する存在がおらず,複数の端末の通信が干渉する危険がある.1対1通信の場合は,相手からの返事を得ることで通信が成功したか否かを判断できるが,一斉送信の場合はその方法が使えない.そこで,受信相手を1台決め,その端末との1対1通信を行い,他の端末はその通信を傍受することで少なくとも1台以上の端末に確実に配信する多対一の通信方法を提案した.これにより,低電力低速度の通信システムでも複数端末による画像共有が実現できるようになった.通信プロトコルとして隣接端末の発見に優れているIPv6を導入し,性能の向上を確認した.

副次的な効果として,IPアドレスの枯渇問題にも対応することができ,異なる組織間の通信が容易にできるようになった.無線通信は通信範囲がわかりにくい問題があるため,LED等の光を用いた可視光通信のシステムを構築し,利用可能エリアがわかりやすい通信方法を開発した.以上が今年度の研究成果である.
小学校理科における児童のエネルギー概念構築のための指導方略の研究

本研究の目的は,小学校第3学年及び第4学年理科における児童のエネルギー概念構築のための指導方略を開発し,「磁力」「電気」にかかわる個々の追究活動を核とした授業実践を通して,児童のエネルギー概念の実態と構築のための指導方略を探ることである。本研究の計画に伴い,第3学年理科では「磁石の働き」「電気の通り道」,第4学年理科では「電池の働き」における授業実践を行い,児童の学習記録をとり,授業の評価を行った。第3学年理科「磁石の働き」では,目には見えない磁力について描画法を用い描き表すことを繰り返した。こうした指導方略は,児童の想像力を高め,目には見えない磁力の存在を確かにしていくことになった。また,第3学年理科「電気の通り道」第4学年理科「電池の働き」においても,電気の流れや量を「磁石の働き」での学習経験を用いて描画する児童の姿が多く,電流についての見方や考え方を深めていくことになった。さらに,そうした描画をホワイトボードや黒板を用いて交流することにより,より理解が確かになった。磁力や電気は,目には見えないため,その存在を確かなものとして認知していくことが難しいが,描画を用い,それをもとに実験や交流を行っていくことにより,その存在を理解していくことが容易になると言える。さらに,エネルギー概念を獲得していくためには,児童の想像力を高めることが重要であり,そのためにも描画法が有効である。
ペプチド輸送体の構造と制御・作動機構および生理機能の解明

1.ヒトABC輸送体TAPLの安定発現細胞を構築し観察すると、TAPLはリソゾームに局在した。異なる自家蛍光蛋白質と融合したTAPLを発現させることにより、TAPLはホモ2量体で機能することが示唆された。推定膜貫通領域のうちN末側の4つのセグメントがあれば、TAPLはリソゾームに局在し得ることも示した。TAPLのATP結合に重要な残基を同定し、この残基の変異がTAPL発現酵母の薬剤に対する高感受性を消失させることを示した。2.TAPL遺伝子のゲノム構造及びmRNAの解析から、ヒトで3種類、ラットで4種類のC末側が異なるアイソフォームを見出し、輸送体機能に多様性が生み出される可能性を示唆した。3.モデル生物である線虫を用い、2種のTAPLホモログが腸細胞の細胞内に存在する顆粒膜に発現していることを示した。また、欠損体の性質を解析し、腸内顆粒の形成と維持にこれらのホモログが関与していることを明らかにした。4.大腸癌細胞において、FXYDファミリーのMAT8がNa^+,K^+-ATPaseと細胞膜上に共に局在することを示し、MAT8が膜輸送ナノマシン本体の制御因子である可能性を示唆した。MAT8の膜貫通領域に存在する存されたGly残基に部位特異的変異導入すると、MAT8は細胞内に留まる傾向が見られた。5.蛍光蛋白質との融合蛋白質も含め様々な発現系の構築を通して、蛍光顕微鏡下に輸送体分子とその制御因子を可視化により観察が可能であることを示すことができた。今後、各種変異体を作成し複合体の解離・会合も含め、機能と構造の解明に役立てることが可能な基盤が構築された。[1]ペプチド輸送体新ファミリーTAPLの機能と構造(1)TAPファミリー(TAP1,TAP2,TAPL)間の2量体形成TAP1,2,LのGFP融合蛋白を用い、小胞体を含む小胞輸送系への細胞内局在を明らかにした。更に局在化シグナルを解析する過程で、N末側の膜貫通領域でのファミリー間の相互作用を検出する系を構築した。予想したTAP1とTAP2の相互作用以外に,TAPLがTAPL、TAP1、TAP2とそれぞれ相互作用することが示唆された。TAPLのホモ2量体はTAP1,2とのヘテロ2量体よりも安定に存在する。これらは2量体形成を介しペプチド輸送に多様性を与えることが考えられた。(2)TAPLアイソフォームの構造と発現更にTAPLにはC末端の異なるアイソフォームがラットで4種、ヒトで3種、存在することを3'RACE法及びRT-PCR法により見い出した。またヒトゲノムとの対応からスプライシングによるアイソフォームであることがわかった。ABC輸送体の基質認識や輸送効率がC末端配列に影響される例もあり、これらのアイソフォームが輸送基質や輸送効率、またそれらの制御にどのような影響を与えるかが興味深い。更に精巣セルトリ細胞由来培養細胞(TM4)がTAPLを高発現することを見い出した。(3)生化学的解析に向けたTAPL発現系の構築ラットTAPLとヒトTAPLを構成的に高発現させるハエ由来培養細胞S2細胞株を作成した。次年度の生化学的解析に必要な大量調製が可能になった。[2]一回腹貫通型蛋白Mat-8の機能構造と反応制御Mat-8の細胞外領域、細胞質領域それぞれを用いて酵母ツーハイブリッドによりラット脳発現ライブラリーを用いて相互作用因子のスクリーニングを行った。その結果、細胞内領域に関して8つの候補が得られた。ペプチド輸送体TAPLの機能構造を明らかにするため3つの方向から検討を行い、進展が見られた。1)TAPLはTAP1/TAP2との類似性から、ホモまたはヘテロ2量体を形成すると考えられる。

そこで、3者にタグを連結する形で培養細胞に発現させた。その結果、TAPLはホモダイマーを形成する可能性が示唆された。一方、TAP1がTAPLと相互作用する可能性が示唆された。2)精製標品による反応素過程の解析を目的として、線虫TAPLのカルボキシル末端側、ペプチド結合領域からATP結合領域までを発現するプラスミドを構築し、大腸菌に導入した。大腸菌内では培養温度の如何にかかわらず封入体を形成してしまったため、8000xgの沈殿から可溶化を試みた。トリトンX100(1%)や2M尿素では可溶化できなかった。一方6M塩酸グアニジンや8M尿素では50%程度の可溶化ができた。しかしながら、可溶化後の標品をNiビーズに結合させて精製しようとしたところ、8M尿素による可溶化標品のみビーズに結合した。これらの結果から、8M尿素存在下に可溶化しさらに精製するのが良いということが明らかになった。3)線虫のTAPLファミリーについて機能解析を進めることを目的として、線虫に3種あるファミリーメンバーのうち、2種の遺伝子をクローニングした。この遺伝子にGFP遺伝子を連結し、線虫における発現部位の解析やRNAiを行うコンストラクトを作成した。さらに、一回膜貫通型蛋白Mat-8の機能構造と反応制御を明らかにするため、蛍光タンパクを融合させたTAPLを安定に発現するCHO-K1細胞株を樹立した。この細胞を用いて細包内局在性や胃のプロトンポンプとの相互作用など検討することが可能になった。(1)TAPLの発現系構築:TAPLの生化学的、構造的知見を得るため、大腸菌、酵母、昆虫・哺乳類培養細胞における発現系を構築した。昆虫培養細胞にヒトやラットTAPLを発現させ、膜画分から可溶化後ATP及びADPアガロースを用いヌクレオチド結合の特異性やMg^<2+>依存性を明らかにした。Pループの変異体では、ATP結合能が消失していた。線虫TAPLホモログ(CE1)のABC領域を大腸菌に発現させ、結晶化に向けて大量の部分精製標品を得た。酵母の膜画分へヒトTAPLやMDRを安定発現させ、酵母の増殖を指標に種々薬剤等の排出活性を細胞レベルで評価する系を確立した。(2)TAPLの細胞内局在と2量体形成:異なる自家蛍光タンパクを融合したTAP(1,2)とTAPLを培養細胞に発現させて蛍光パターンを比較し、TAPLはホモ2量体及びTAP1,2とヘテロ2量体を形成し得ることを見出した。膜系への局在と2量体形成には、膜貫通領域のうちでもN末側が重要であった。蛍光タンパク融合型TAPLは小胞体とリソゾームに存在した。昆虫細胞に発現させたTAPLも同様の局在を示した。(3)TAPLの構造多様性と生理機能解析:TAPLの遺伝子やmRNAを解析し、ヒトで3種、ラットで4種のC末の異なるアイソフォームがスプライシングで生じることを示した。ヒトでは、個人間でアイソフォームの発現量に差がみられた。無脊椎動物の線虫には3種のTAPLホモログ遺伝子(CE13)が存在した。個体レベルでの解析に向けて、5'上流を含む遺伝子全長(CE1,CE3)をクローニングし、GFP遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。