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上皮成長因子受容体阻害剤が腫瘍壊死因子の誘導する肺障害を増悪する機序の解明

EGFRは上皮性悪性腫瘍のみではなく正常肺組織でも発現しており、細胞・組織の恒常性維持という役割を担っている。肺がん治療薬として用いられるEGFR阻害剤の急性肺障害が大きな問題となっているが、EGFR阻害剤の正常肺組織に及ぼす影響や肺障害におけるTNF-EGFRシグナルの関与については、これまで明らかにされていない。本研究では、TNFにより誘導されるEGFR受容体のトランス活性化シグナルに焦点を当て、肺組織に特異的にTNFを高発現するSPC-TNFマウスとEGFR発現が生来低下しているEgfr-velマウスを用いて炎症性肺疾患の病態や急性増悪に及ぼす影響を明らかにする。われわれは、現在までに、上皮成長因子受容体(EGFR)が炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)から活性化(トランス活性化)を受けることにより、上皮細胞をアポトーシスから保護していることを報告した。EGFRは、その過剰発現や過剰な活性化が発癌との関連が報告され、多く癌種で治療標的とされている。一方で、EGFRは上皮性悪性腫瘍のみではなく正常肺組織でも発現しており、細胞・組織の恒常性維持という役割を担っている。本研究では、TNFにより誘導されるEGFR受容体のトランス活性化シグナルに焦点を当て、炎症性肺疾患の病態や急性増悪に及ぼす影響を明らかにすることを特色とする。本研究により、EGFR阻害剤の正常肺組織に及ぼす影響と肺障害を誘導する分子機構が明らかになると期待される。さらに、特発性間質性肺炎、肺線維症といった難治性慢性炎症性肺疾患の治療指針に重要な示唆を与える結果が得られるものと考えられる。肺組織で特異的に炎症性サイトカインであるTNFを高発現するトランスジェニックマウスにEGFRの発現が約90%抑制されたEgfr-Velマウスを交配させることで、両者の形質を発現するマウスを作成し、特に肺組織の形態的変化を評価する。申請者らは、増殖因子受容体であるEGFRとErbB2が炎症性サイトカインで強力なアポトーシス誘導能を有する腫瘍壊死因子(TNF)から間接的に活性化(トランス活性化)を受けることにより上皮細胞と組織をTNFにより誘導されるアポトーシスから保護していること、そしてEGFRの下流のAKT活性化が、細胞の生存(アポトーシス回避)に寄与することを報告した(Yamaoka et al. PNAS 2008)。しかしながら、正常組織においては、炎症などによる組織損傷から細胞を保護し再生させる役割を担っていると考えられる。このマウスは、SPC-TNFマウスで観察されるCOPD様病理所見である肺胞隔壁の破壊と末梢気道壁の肥厚に加えて、肺胞中隔への著しいリンパ球やマクロファージの浸潤を認めた。慢性炎症の持続は癌の発生との関連が報告されているが、この新規肺障害モデルマウス(TNF-Egfrvelマウス)では、腫瘍の発生は観察されなかった。申請者らは、これまでSPC-TNFマウスモデルにEGFR阻害剤を投与することで肺組織に著しいアポトーシスと炎症細胞の浸潤、間質の肥厚が生じることを明らかにした。本研究計画では、肺障害発症の分子機序を明らかにし、発症危険因子の同定や発症した際の治療戦略を確立するために、以下の研究項目を予定している。

1EGFR阻害剤をSPC-TNFマウスに投与することにより生じる肺障害の分子生物学的機序を解明する。2新規肺障害マウスモデルを作製し、EGFR阻害剤に誘導される肺障害の治療を臨床的に応用するための戦略を確立する。上記、1については、問題なく進展している。しかし、2は、購入予定であったマウスが、受精卵からの成長に問題が生じ、入手に時間がかかっていたが、昨年8月に納入された。現在、新規肺障害マウスモデルの作成をしており期間内の研究遂行はおおむね順調であると評価している。呼吸器内科学上記に記載した様に、1については、問題なく進展している。しかし、2は、購入予定であったマウス(EGFR wa2マウス)が、受精卵からの成長に問題が生じ、入手できていない。このため、マウスの種類を変更し、Egfr-Velマウスを購入する事とした。新規肺障害モデルマウスの作製において、当初は、SPC-TNFマウスとEGFRwa2マウスを交配させる予定であったが、Jackson研究所において受精卵からの成長に問題が生じた。そのため、よりEGFR発現が抑制されたEgfr-Velマウスを使用し、新規肺障害マウスモデルの作成を遂行中である。申請者らは、これまでSPC-TNFマウスモデルにEGFR阻害剤を投与することで肺組織に著しいアポトーシスと炎症細胞の浸潤、間質の肥厚が生じることを明らかにした。本研究計画では、肺障害発症の分子機序を明らかにし、発症危険因子の同定や発症した際の治療戦略を確立するために、以下の研究項目を予定している。EGFR阻害剤をSPC-TNFマウスに投与することにより生じる肺障害の分子生物学的機序を解明する。新規肺障害マウスモデルを作製し、EGFR阻害剤に誘導される肺障害の治療を臨床的に応用するための戦略を確立する。しかし、2は、購入予定であったマウスが、受精卵からの成長に問題が生じ、入手できていない。このため、現在、他の研究機関よりの譲渡を目的に交渉中である。2は、Jackson研究所より購入予定であったEgfrwa2マウスが、受精卵からの成長に問題が生じ、購入出来なかった。このため、同様にEGFR発現の低下したEgfr-Velマウスに変更した。昨年8月に無事に当該マウスが納入された。現在、新規肺障害マウスモデルを作成中である。上記に記載した様に、1については、問題なく進展している。新規肺障害モデルマウスの作製において、当初は、SPC-TNFマウスとEGFRwa2マウスを交配させるが、肺障害の程度によっては、よりEGFR発現が抑制されたEGFRwa5マウスを使用する予定である。本研究計画の、2新規肺障害マウスモデルを作製し、EGFR阻害剤に誘導される肺障害の治療を臨床的に応用するための戦略を確立する。
社会的公正感の研究(公正判断の意識構造の解明)

2000年10月に英文の報告書を完成させた。英文報告書段階では、たとえば以下のような暫定的な結論が得られている。日本の公正感の時系列的変化について、1)1991年と比較して1997年には、貧困をより社会的な原因に求めるなど、公正感について一定の方向への若干の変動がみられた。しかし、「バブル経済」崩壊・政党の離合集散などの1990年代における社会の大きな変化にも関わらず、公正感の変化はそれほど大きくはなかった。ただし、2)戦後というより長期のスパンで眺めるとき、1990年代における日本社会を不公正と見る者は、著しく増加していると指摘された。公正感の日本的特質については、1)ルールに準拠して判断を行う傾向や、2)ムラ的平等主義などが見いだされ、3)異質な他者との接触がその傾向を促進することが指摘された。また、努力観について、4)「努力万能観を持ち、機会の不平等を認知しない」という意識セットをもつ人がある程度の割合で存在し、また、6)50歳以上の人々に多いと推測された。さらに、マイノリティに関する政策意見形成に関して、1)人びとが想定する世間一般の政策意見、2)マイノリティに対する社会的認知(偏見や差別、不公平に関する認知)、そして、3)保守的な特性(権威主義、政治的保守性、年齢の高さ)の三者が影響力をもつとされた。今後、さらなるデータ分析と、分析結果の含意の検討が必要と考えている。1今年は、主として、公正感に関する全国質問紙調査に力を注いだ。6月から7月にかけて、頻繁な電子メールの往復を通じて、仮説と質問紙を整備した。原案を数次のプリテストにかけ、改訂を続けて調査票を確定した。また、同時に調査の諸準備を進めた。7月8月にかけて、全国120地点の選挙管理委員会と連絡を取り、サンプリングを実施した。8月中旬10月にかけて、全国のいくつかの大学の協力も得て、全国で120地点、1800名を対象とする訪問面接による質問紙調査を行った。11月1月は、回収した調査票の点検・整理の作業にあて、2月末に、職業コードを中心に、コ-デイングと最終点検の合宿研究会を組み、調査票を入力作業に回す所までこぎつけた。データ分析は、来年度の課題となる。2平行して、来年以降の研究計画を検討した。ヒューリステイクスの解明のための心理学的実験、社会保障論的検討のためのヴィネット調査、数理社会学的検討、自由回答調査の検討、社会選択論的検討のためのシミュレーション研究、などである。来年度は、先の質問紙調査の分析を進めながら、その不足を補う形で、これらの手法とその可能性を別途検討していく。昨年度に実施した全国質問紙調査の数値データの入力・データクリーニングを夏までに一応完了させ、データ分析を進められるようにした。これを踏まえ、単純集計と基本属性によるクロス分析を中心に、グラフを多用してA4で6頁ほどの【簡単な結果】を作成・印刷し、調査のアフターケアとして、1100を越す全回答者に郵送した。この全国質問紙調査の数値データの分析を開始し、研究会を開いて簡単な分析を報告しあい、分析テーマの調整・分担を試みた。全体的には、公正感の基本的な心理機構のヒューリスティクスを研究し、公正感の日本的特質、ならびに、時代的特性・時系列的変化を研究しようとしている。より具体的には、1)「収入・資産」の「分布」の不平等、2)「学歴と就職」、特に「能力・努力」、3)価値理念全体の中での公正の位置、4)性別・エスニシティなどの生得的原因に根差す不公正とその解決の方向、5)種々の政治的・経済的公正をめぐる人々の意識などを研究しつつある。また、自由回答項目についても文字データの入力を完成させ、デジタル化した。デジタル化が予想より遅れたためもあり、分析は今後の課題である。

この他、心理学的実験、ヴィネット調査、シミュレーション研究などを、小さな規模でリンクさせて質問紙調査の不足を補う可能性について、検討をはじめている。来年度は、早々に英文での草稿を書き、夏に合評研究会を開き、冬までに英文の報告書にまとめ、研究を世界に発信することを目指している。全国質問紙データの分析を進め、12月の研究会で、英文報告書の大枠が固まった。また、かなりのエネルギーを投入し、調査票の英訳を完成させた。本研究では、全体として、公正感の基本的な心理機構のヒューリスティクスを研究し、公正感の日本的特質、時代的特性、時系列的変化を明らかにしようと試みている。より具体的に、1)「収入・資産」の分布の不平等、2)「能力観・努力観」の日本的特質とその変容、3)価値理念の中での公正の位置、4)性別・エスニシティなどの生得的原因に根ざす不公正とその解決の方向、5)政治的・経済的公正をめぐる人々の意識のあり方、などについても研究を進めており、英文報告書にまとめようとしている。また、報告書に間に合うかどうかは未定であるが、以下の試みも進行中である。第1に、質問紙調査中の自由回答について分析を進めている。第2に、ヴィネット調査の研究を試みている。第3に、心理学的な実験に基づく考察やシミュレーション的研究を追求している。ただし、論文草稿への相互コメント、コメントを受けての再分析・再執筆の他に、英文のチェック作業もあり、英文報告書を予定通りに2000年3月末に刊行できるかどうか、進行中の仕事をどこまで収録できるか、微妙である。
新規歯科材料としての熱応答性ポリウレタンの基礎的研究

昨年度に引き続き、熱応答性ポリウレタンが口腔内での実際の歯磨きの磨耗にどれだけ耐用するかを調べるために、2cmx5cmx2cmの金型を使用し、熱応答性ポリウレタンを金型に入れて80°C1時間の加熱軟化を行った。軟化後に硬化時の硬化収縮をできるだけ抑えるために、金型の上から透明ガラス板で室温で68時間圧接を行い、ゆっくりと冷却させて熱応答性ポリウレタンの実験試料を作製した。試料を作製後に、実際の口腔内での歯磨き状態に近づけるように、歯ブラシ磨耗試験機、歯ブラシ(デントEXスリム2 33M)を使用し、磨耗条件を通常の歯ブラシ指導で推奨される歯ブラシの歯への荷重200gf、電動歯ブラシで歯磨きをした場合の1歯面あたりの平均的なブラッシング回数に近い毎分120回に設定した。磨耗試験を行うための磨耗させる歯ブラシの振り幅を4cmに設定した。歯ブラシ磨耗試験は、計10000回、計20000回、計30000回の3種類を行い、それぞれ5個ずつの試料を使用して、磨耗試験を行った。また、歯ブラシ磨耗試験時に、時間経過とともに歯ブラシの毛先が開き、試料に垂直に毛先が接触しなくなるのを避けるため、各回数10000回ごとに歯ブラシを交換して磨耗試験を行った。各磨耗試験が終了した後に、磨耗させた中心部2cmを切断して切片を作製し、表面粗さ計を使用して磨耗量をそれぞれ計測した。歯ブラシ磨耗試験の結果、各回数での歯ブラシによる熱応答性ポリウレタンの磨耗量は、10000回で0.130mm、20000回で0.091mm、30000回で0.133mmの磨耗量が計測され、歯ブラシ磨耗回数10000回と30000回との差はなかった。以上より、歯ブラシの磨耗による熱応答性ポリウレタンの磨耗量は、磨耗回数30000回まででは、大きな磨耗量の変化は見られなかったため、有用な歯科材料となることが示唆された。熱応答性ポリウレタンが、歯科材料として口腔内で暫間修復物に応用可能な機械的性質を有するかを研究した。まず、熱応答性ポリウレタンを購入し、60°C、80°C、100°Cで加温し、直径6mm、高さ10mmの円柱状の試料を作製し、その後、室温で24時間放冷して硬化させた群と4°Cで急冷して硬化させた群にわけて試料を作製した。この試料を用いて、硬さ試験、圧縮弾性率試験、応力緩和率試験の3種類の機械的性質試験を行った。さらに、口腔内での再利用(再軟化)を想定して、60°Cで加温軟化した試料については、前述の機械的性質試験の1回目終了後に、再度60°Cで再軟化し、同様の機械的性質試験の2回目を行った。対照として、常温重合レジンを使用した。実験結果として、硬さについては、常温重合レジンが最も高く、80°C軟化で24時間放冷して硬化させた群、100°C軟化で24時間放冷して硬化させた群、100°C軟化で4°C急冷して硬化させた群が、60°C軟化で24時間放冷して硬化させた群より硬さが高かった。また、60°Cで再軟化した群の硬さは、1回目に軟化した群とは差がなかった。圧縮弾性率については、常温重合レジンが最も高かったが、熱応答性ポリウレタン群の中での差はなかった。応力緩和率については、全ての群で差はなかった。これらの結果から、熱応答性ポリウレタンは、(1)軟化温度を調整することで硬さを変化させることができること、(2)常温重合レジンより低い硬さと弾性率を持つことから、咬合圧の負担軽減と暫間修復物のアンダーカット部分での撤去が可能となること、(3)応力緩和率が常温重合レジンと差がないことから、粘弾性的性質が近似していること、(4)再軟化しても機械的性質が変化しないことから、再利用が可能なことがわかった。以上のことから、熱応答性ポリウレタンは、口腔内で暫間修復物として応用可能な材料であることが示唆された。

また、歯ブラシ磨耗試験時に、時間経過とともに歯ブラシの毛先が開き、試料に垂直に毛先が接触しなくなるのを避けるため、各回数10000回ごとに歯ブラシを交換して磨耗試験を行った。各磨耗試験が終了した後に、磨耗させた中心部2cmを切断して切片を作製し、表面粗さ計を使用して磨耗量をそれぞれ計測した。歯ブラシ磨耗試験の結果、各回数での歯ブラシによる熱応答性ポリウレタンの磨耗量は、10000回で0.130mm、20000回で0.091mm、30000回で0.133mmの磨耗量が計測され、歯ブラシ磨耗回数10000回と30000回との差はなかった。以上より、歯ブラシの磨耗による熱応答性ポリウレタンの磨耗量は、磨耗回数30000回まででは、大きな磨耗量の変化は見られなかったため、有用な歯科材料となることが示唆された。今年度は、熱応答性ポリウレタンが歯科材料として、口腔内の暫間修復物に応用可能な機械的性質を有するかを検討する予定であった。熱応答性ポリウレタン試料を作製し、硬さ、圧縮弾性率、応力緩和を調べ、歯科材料として口腔内で暫間修復物に応用可能な機械的性質を有することが示唆された。一方、歯ブラシ摩耗試験機による摩耗試験、表面粗さ試験、封鎖性試験が終了しなかった。しかし、すでに摩耗試験、表面粗さ試験については歯ブラシ摩耗試験機の調整を終了し、予備実験が終了している。したがって、次年度より実験開始ができる準備ができているため、おおむね予定は順調に進展していると思われる。機械的性質実験の歯ブラシ摩耗試験、表面粗さ試験、封鎖性試験を継続して行うとともに、今年度の目的である生物学的安定性試験である細胞毒性試験、DNA合成への影響を調べる試験、細菌付着性試験をおこなうための予備実験と本実験の実施を行う。本年度は、歯ブラシ摩耗試験機の購入時の低価格化で大幅な費用削減ができたこと、熱応答性ポリウレタンの試料作製、機械的性質試験のうち硬さ試験、圧縮弾性率試験、応力緩和率試験を行ったが、歯ブラシ摩耗試験機による摩耗試験、表面粗さ試験などが予備実験段階までの進捗だったため、熱応答性ポリウレタン、歯ブラシ、ガラス器具などの消耗品購入が予定より比較的少なくなったことが理由である。次年度は、生物学的安定性試験(細胞毒性、DNA合成阻害など)を行う予定と、機械的性質試験(歯ブラシ摩耗試験、表面粗さ試験、封鎖性試験)を継続実施する予定なので、今年度にあまり購入しなかった熱応答性ポリウレタン、ガラス器具、培地、薬品などの消耗品を大量に使用する予定であること、歯ブラシ摩耗試験機のメンテナンスなどに費用を要すると思われる。
間葉系幹細胞の腫瘍集積性を利用した悪性リンパ腫に対する遺伝子治療法の開発

(1)間葉系幹細胞(MSC: mesenchymal stem cell)の腫瘍集積性を応用した悪性リンパ腫に対する新規治療法の開発研究を行った。可溶型TRAILの腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導を利用した治療ストラテジーの有用性を見出した。(2)MSCの腫瘍集積性を増強するために、腫瘍集積性の分子機構に関する検討を行った。TNF-αによる接着分子の発現誘導、ならびに血管内皮細胞への接着性の亢進がMSCの腫瘍集積性に重要な役割を担っていることを明らかにした。1)ヒト初代培養MSCへの遺伝子導入:ヒト骨髄由来付着細胞をMSCとして用いた.遺伝子導入実験では,nucleofection法を試みたが,遺伝子発現レベルが低かったため,ファイバー改変型(ポリリジンに改変)アデノウイルスベクターについて検討した.この方法で,ヒトMSCへの遺伝子導入効率はほぼ100%を達成することができた.2)リンパ腫細胞株を皮下移植した担癌ヌードマウスへのMSC投与実験:GFP発現MSCをリンパ腫モデルマウスの血管内に投与したところ,腫瘍組織切片中にMSCの存在を認め,腫瘍への集積が確認できた.MSCの対照として線維芽細胞(WI-38)を投与したが,腫瘍集積性は認められなかった.3)ヒトリンパ腫細胞に対する可溶型TRAILの増殖抑制効果に関する検討:リンパ腫細胞(U937,Daudi,Raji,SCC-3,SLVL)の培養系に可溶型TRAILを添加して,増殖抑制効果をXTTassay法で確認した。U937,RajiおよびSLVLでは用量依存的な増殖抑制効果を認めた.この増殖抑制効果は,ピストン脱アセチル化阻害剤(HDAC inhibitor)の併用で増強された.さらに,可溶型TRAIL発現MSCを作製し,リンパ腫モデルマウスの血管内に投与する遺伝子治療実験の準備を進めた.その他,MSCの腫瘍集積性の分子機構については,MSCと線維芽細胞で腫瘍集積性に違いが認められたため,両者の間で増殖因子やケモカインに対する遊走能を比較検討した。1.可溶型TRAIL発現アデノウイルスベクターの構築:ヒトTRAILの細胞外ドメインのN末端側に、ヒトフィブリリン由来分泌シグナル配列、イソロイシンジッパー配列を付与した発現カセットを作製した。イソロイシンジッパーは生理条件下におけるTRAILの三量体形成を促進し、抗腫瘍活性を高めることが報告されている。このカセットをファイバー改変型(ポリリジンに改変)アデノウイルスベクターにin vitorライゲーション法で挿入した。2.MSCの腫瘍集積性の分子機構に関する検討:増殖因子やケモカインに対するMSCと線維芽細胞の遊走能を、トランスウェルを用いてin vitorで比較検討したが、両者の遊走性に違いは認められなかった。担癌モデルマウス(ヒト大腸癌細胞SW480を皮下に接種したヌードマウス)に投与したMSCは、腫瘍組織中で特に腫瘍血管が多く存在する間質領域に集積する傾向を認めた。そこで、血管内皮細胞への接着性を検証したところ、TNF-αで刺激したMSCでは線維芽細胞と比較して内皮細胞への接着性が有意に亢進しており、この接着性はVCAM-1やVLA-4に対する抗体で部分的に阻害された。さらに、天然由来の小分子化合物であるパルテノライドを投与して、腫瘍局所におけるTNF-α産生を低下させた担癌マウスを作製した。このマウスにルシフェラーゼ発現MSCを左心室腔内から投与して腫瘍集積性を生体イメージング装置IVISで経時的に観察すると、パルテノライド投与群では、非投与群と比較してMSCの腫瘍集積性が抑制された。
組織培養法をもちいた網膜神経細胞における神経再生機構の研究

本研究では成熟哺乳動物の網膜神経培養をおこない、特に網膜神経節細胞からの神経再生機構を明らかにすることを目的とした。本年度は成熟哺乳動物としてラットをもちい網膜神経組織を培養し、また同時に視神経切断後の神経節細胞の動向を検討した。麻酔下にて眼窩内で視神経のみを切断した。このとき蛍光色素(Dil)を視神経に注入し網膜神経節細胞を逆行性に標識した。1、3、5、7、11、15日間飼育後、視神経切断を行った眼球を摘出し、一部を蛍光顕微鏡下に観察した。また残りの網膜を組織培養法をもちい培養した。視神経切断後急速に網膜神経節細胞はその細胞数の減少が観察され、切断7日後を境にその減少速度は緩やかとなる結果を得た。また培養下では、切断1、3、5日後に摘出、培養した網膜で視神経節細胞からの再生はほとんど認められず、切断7日後に摘出し培養した網膜において神経突起の顕著な再生が観察された。これら再生神経突起は免疫組織染色にて神経節細胞からの再生突起であることが確認できた。また、切断7日後以降の網膜においても神経再生は促進していた。これらの実験より、視神経切断後に網膜神経節細胞は急速に変性、消失するが切断7日後からその減少速度は緩やかになり、同時に培養下で生存している神経節細胞から神経突起が再生するという結果を得た。成熟哺乳動物の網膜神経節細胞は軸索切断に適応して生存、軸索を再生するために7日間を要するとの新知見を得た。この研究の成果を平成5年6月の日本眼科学会にて概要を報告し、また同年10月の日本臨床眼科学会のシンポジウムにて講演、報告した。現在、この結果をまとめ、神経科学の専門誌に投稿中である。今後はこの培養系をもちい、培養液中に様々な物質を添加して神経再生を解析し、成熟哺乳動物網膜神経細胞の再生における至適な環境を探求することにより、神経再生機構を解明する予定である。
ラピタ人の適応戦略とその社会を探る考古学的研究

2005年6月から7月にかけて、フィジー諸島共和国のビチレブ島にて、University of the South Pacificとフィジー博物館との共同調査で、ボウレワ・ラピタ遺跡を考古学的に発掘し、多くの重要な発見にいたったことが本研究の主要な実績である。そのおもな成果は次のとおりである。1.広範囲に発掘をおこない、遺跡の範囲を確定した。2.フィジーにおける最古の遺跡であることが判明した。3.土器・石器・貝製品など豊富な出土器をえた。4.16柱の埋葬人骨を発見した。5.遺跡構造(住居・貝塚など)を把握した。6.古地理学的調査から、過去の地形や海岸線を復元した。こうした成果により、これまで多くの謎につつまれていたラピタ人の文化や社会、そして彼らの形質的特徴への理解が大きく前進したことはいうまでもない。その成果は国際的にも一級のものであると自負している。すでにその一部は2005年8月にトンガ王国で開催された国際学会"Oceanic Explovations"にて口頭発表・ポスター発表されたが、今後も順次、国際学会誌などにその成果を公表していく予定である。
乳歯切片中の元素分布評価による無機元素曝露および曝露時期評価法の確立

乳歯は、胎児期・乳幼児期にかけて形成し、その形成段階が乳歯切片の顕微鏡画像で観察できる。また、段階的な栄養摂取源の変化が、乳歯中の元素組成にも変化を及ぼすことがわかってきている。さらに、乳歯の形成時期に体内に取り込まれた種々の化学物質の一部は乳歯中に取り込まれることが確認されている。これらの知見から、乳歯切片の観察と化学分析を組み合わせることで、胎児期-乳幼児期の元素曝露・曝露時期を把握できると考えられた。そこで、乳歯切片中の成長線と、元素組成の変化を捉えることで、各時期の形成部位を把握し、かつそれぞれの時期ごとの有害元素レベルの変化を捉えられるかを検討する。
異種粒子混合分散塗布膜の乾燥に伴う粒子積層現象の解明

ナノ粒子が分散した液体塗布膜を高速乾燥させると、乾燥の進行と共に粒子が気液界面に捕捉され、膜表面に粒子濃厚層が形成されることは理論的に知られている。ところが工学的に重要な異種粒子混合系における粒子分布の動的形成過程はほとんど理解されていない。そこで本研究では、粒子径の異なるポリスチレン粒子分散系および二酸化チタンーポリスチレン粒子分散系について、より粒径の小さな蛍光ポリスチレン粒子から発生される蛍光の強度時間変化を追跡することで、厚み方向の粒子分布を決定する新しい手法を開発した。粒子濃厚層内の小粒子充填率を時間の関数として与えると、蛍光強度の実測値と計算値はよく一致した。粒子径の異なる蛍光・非蛍光性ラテックス粒子をカルボキシメチルセルロース水溶液に共分散させた溶液を、親水性表面処理を施したガラス基板上の塗布し、その乾燥過程における蛍光強度の時間変化をリアルタイム計測を行った。その結果、蛍光強度は乾燥過程で明瞭な2段階変化を示すことが観測された。すなわち乾燥初期には時間と共に蛍光強度が徐々に増加するのに対して、乾燥終期にはステップ状の強度増加が見られた。水蒸発に伴う液膜サンプルの質量減少、及び、液膜表面で反射したレーザ光の2次元反射像の時間変化を同時計測したところ、後者のステップ状強度増加が見られる乾燥時刻ではサンプル中に残留する水分量は少なく、サンプル面で明瞭なレーザ光の散乱が生じることが分かった。散乱開始時の2次元反射像が非対称であることから、この散乱は液内の分散粒子によるものではなく、粒子堆積層の内部へ気液界面が侵入する際に生じる湾曲したメニスカスの形成によるものと推察された。これらの事実と推察から、乾燥後期におけるメニスカス湾曲によって毛管圧力が液中に生じ、その負圧によって蛍光粒子が液表面への急激に移流することで、ステップ状の強度増加が現れるものと考えられる。この考察を裏付けるために、蛍光強度の予測モデルを構築し、実験結果と比較検討を行った。モデル化にあたってはランベルトベールの法則が成り立つと仮定し、厚み方向の発光と光吸収を考慮した。濃度分布が急峻な場合には物理的に妥当な強度分布が得られなかったので、厚み方向の座標を2000分割した仮想的な層を考え、各層で光強度の算出を行いそれらの積算する手法を考案した。その結果、乾燥後期に表面近傍の粒子体積分率が増加することを考慮すれば、実験結果と定性的に一致する蛍光強度時間変化が得られることが明らかとなった。前年度までに、密度が等しく粒子径の異なる2種類のラテックス粒子が高分子溶液に共分散した系における粒子積層現象を、実時間蛍光法を用いてリアルタイムで計測することに成功した。その結果、乾燥による膜収縮速度と粒子ブラウン運動速度の比で定義されるペクレ数が100以上の高速乾燥条件において、蛍光強度の増加すなわち小径蛍光粒子の優先的表面偏析が乾燥中に生じること、且つ、乾燥初期の偏析はゆるやかに進行するのに対して後期のそれはある乾燥時刻でステップ的に生じることが明らかになった。しかし過去の理論的研究(Cardinal et al., AIChE J. 2010)によれば粒子積層現象はペクレ数のみならず、粒子沈降速度と膜収縮速度の比である沈降数にも依存することが示唆されている。特に大粒子の密度が小粒子のそれより高い場合には、高沈降数である大粒子が選択的に底面に積層することで、結果的に小粒子の表面偏析を促進するものと予想された。この予想を実験的に実証するために、本年度はラテックス粒子に比べて4倍高い密度を有する二酸化チタン粒子を大径粒子として選択し、密度差による粒子運動の差異が乾燥中の積層構造形成に与える影響を検討した。その結果前年度までの結果とは逆に、乾燥中に蛍光強度が低下する高分子濃度が存在することが明らかとなった。これは小径蛍光粒子が底面に積層することを示唆しており、上述の予想とは逆の結果であった。さらに液中の高分子の存在状態を把握するために粒子表面への高分子鎖の吸着量測定を行ったところ、ラテックス粒子表面とは異なり、二酸化チタン粒子表面には高分子鎖が物理吸着していることがわかった。しかし高分子吸着の事実のみでは上述の蛍光強度低下現象を説明することはできず、次年度以降さらに詳細な検討が必要である。前年度までに構築した計測技術を密度が異なる異種粒子分散系へ適用し、従来の理論的予測では説明できない蛍光強度低下が乾燥中に現れることを見出している。実験事実の理論的な考察にはさらに詳細な検討が必要であるが、これは理論予測とは異なる積層構造が発現していることを示唆しており、乾燥による粒子積層現象を系統的に整理する端緒となる重要な発見であることから、研究はおおむね順調に進展している。前年度に引き続き、真密度が高く粒子径の大きな粒子(以下、大粒子)と、低密度且つ小径の蛍光粒子(以下、小粒子)とが共分散した高分子水溶液薄膜を対象として、その乾燥に伴う粒子積層状態を蛍光強度から定量的に算出したところ、小粒子の表面偏析量がある高分子濃度で極大値を取ることを新たに見出した。この特異な積層挙動のメカニズムを調べるため、高分子成分として分子量の異なるカルボキシメチルセルロースを、大粒子として二酸化チタンナノ粒子をそれぞれ用いた場合について検討を進めたところ、大粒子表面への高分子吸着量は、高分子成分の分子量の増加に伴いべき乗則に従って増加し、高分子鎖は粒子表面でループトレイン型の吸着形態を取ることがわかった。他方、BET測定より得た乾燥後の粒子分散膜の比表面積は、高分子添加量の増加に伴って低下した。

これは、薄膜表面からの光散乱開始時刻、すなわち隣接する分散粒子間にメニスカスが形成される時刻において、粒子体積分率が高分子濃度の増加と共に増加するとの実験事実によく対応しており、高分子濃度の増加に伴って膜内の粒子がより密に充填されることを示している。これらの結果から、低高分子濃度では吸着高分子鎖間の立体反発が支配的であり大粒子は疎な充填構造を取るが、より高濃度では吸着高分子鎖を介したbridging凝集が支配的となり、より密な粒子充填構造へ遷移するものと考えられる。前年度までの成果から、小粒子は大粒子間の間隙を通過して表面へ移流することが明らかであることを考えれば、高分子濃度の増加に伴って大粒子の充填がより密になるためにメニスカス曲率が減少し、より強い毛管圧が発生する結果として、圧力流れによる小粒子の表面への移流がより活発になったものと考えられる。さらに高分子濃度が増加すると、液粘度の増加に伴って移流速度が低下し、小粒子の表面偏析量は逆に低下するものと考えられる。ナノ粒子が分散した液体塗布膜を高速乾燥させると、乾燥の進行と共に粒子が気液界面に捕捉され、膜表面に粒子濃厚層が形成されることは理論的に知られている。ところが工学的に重要な異種粒子混合系における粒子分布の動的形成過程はほとんど理解されていない。そこで本研究では、粒子径の異なるポリスチレン粒子分散系および二酸化チタンーポリスチレン粒子分散系について、より粒径の小さな蛍光ポリスチレン粒子から発生される蛍光の強度時間変化を追跡することで、厚み方向の粒子分布を決定する新しい手法を開発した。粒子濃厚層内の小粒子充填率を時間の関数として与えると、蛍光強度の実測値と計算値はよく一致した。本年度は蛍光強度、乾燥速度、2次元反射像の同時計測により粒子積層構造の発達過程をリアルタイム計測可能なシステムを構築し、乾燥過程において蛍光粒子の2段階偏析が生じることを実証することに成功した。これは従来推察されているに過ぎなかった現象の存在を実験的に明らかにしたものである。更に実測結果を定性的に説明可能な蛍光予測モデルを提案しており、研究は順調に進展している。大径粒子表面への高分子吸着が小粒子の表面偏析を抑制するとの実験結果を物理的に説明するため、高分子吸着量およびその吸着状態が異なる二酸化チタン/ラテックス粒子分散系溶液を調製し、その乾燥中の粒子積層状態を比較検討する。具体的には分子量あるいは分子構造の互いに異なる3種類の高分子を用いて粒子表面における吸着量測定と乾燥実験を進め、吸着量によって大径粒子の液中の充填構造は変化するのか、充填層間の空隙サイズと小径粒子径の比を変化させると積層状態は変化するのか、といった疑問を解決すべく系統的な実験を行う。過去の理論的研究では、粒子積層時には表面偏析層内部で粒子はランダム最密充填構造を取るのに対して、偏析層下部では初期体積分率を保持するとされてきた。しかしながらこの理論を適用して得られた蛍光強度の予測値は、実測値を定量的に表現することが困難であることが平成26年度の研究で明らかとなった。これは液表面で粒子が必ずしも瞬時に最密充填構造に達せず、乾燥初期にはより疎な充填構造を保持した後に、徐々に最密構造へと漸近することを示唆しているものと考えられる。
緑茶飲用と血清脂質に関する疫学的研究

従来からの自衛隊定年退職前健康診断制度を活用して作成した男性自衛官のデータベースに2,500名以上のデータを追加して、48-59歳の7,637名の横断的データベースを作成させた。共通な情報としては、喫煙、飲酒、緑茶飲用、コーヒー飲用及び10食品項目からなる生活習慣要因の情報ならびに広範な医学的検査の結果が整理されている。臨床検査結果としては、血清脂質、血清肝胆系酵素、血清尿酸、75-g経口糖負荷試験の結果、胆嚢超音波検査結果および大腸内視鏡検査結果が含まれる。高脂血症治療中の者などを除き、7,391名のデータを用いて緑茶飲用と血清総コレステロール、HDLコレステロールおよび中性脂肪との関連性を検討した。病院、調査機関、階級、喫煙、飲酒、肥満度、耐糖能およびコーヒー飲用の影響を調整した場合の血清総コレステロールの平均値は、1日あたりの緑茶飲用杯数が0、1-3、4-6、7-9および10杯以上の者で、それぞれ201.9、199.4、197.3、200.0および196.3mg/dlであった(トレンドp=0.0007)。緑茶飲用は血清HDLコレステロールおよび中性脂肪とは関連していなかった。食物要因のうち、牛乳、朝食のパン、みそ汁および生野菜の摂取が血清総コレステロールと統計的に有意にあるいはほぼ有意に関連していた。これらの食物要因を補正した場合、緑茶1日1杯の飲用は血清総コレステロール0.39mg/dl(95%信頼区間0.21-0.80)の低下と関連していた。コーヒー飲用は血清総コレステロール、HDLコレステロールあるいは中性脂肪の値と関連していなかった。このデータベースを用いて、緑茶飲用以外の生活習慣要因と生物学的健康指標との関連性も検討することができた。コーヒーの習慣的飲用者では、肝機能検査値が良好であること、血清尿酸値が低値であること、血圧が低値であることなどもわかった。緑茶ではこのような関連性は認められなかった。緑茶飲用の血清脂質に及ぼす影響を検討するために、男性自衛官を対象とした調査研究のデータ・ベースを用いた統計解析を行うとともに、平成7年から実施している疫学調査を継続実施した。今回新たに解析したのは1991-1992年に札幌、福岡および熊本の自衛隊病院で定年退職前健康診断を受診した2062名の男性自衛官のデータである。喫煙、飲酒、肥満(ケトレー指数と腹囲臀囲比)および運動習慣の影響を補正しても血清総コレステロールおよびLDLコレステロールは緑茶飲用者で低値であった。緑茶を毎日飲まない者の血清総コレステロールおよびLDL-コレステロールはそれぞれ203mg/dlと122mg/dlであったが、1日10杯以上飲んでいる者の血清総コレステロールは196mg/dl、LDL-コレステロールは116mg/dlであった。緑茶飲用は米飯やみそ汁などの日本的な食事習慣と弱い相関を示していたが、これらの食事要因を補正しても緑茶と総コレステロールおよびLDL-コレステロールとの負の関連性は統計的に有意であった。調査に関しては、北部九州の定年退職前男性自衛官を対象にした食事調査と検診データの収集作業を継続し、合わせて血液サンプルを採取した。約1000名の食事データ、血清脂質データおよび血漿サンプルが蓄積された。平成9年度は同様の調査を継続すると同時に、保存血漿を用いてアポ蛋白の測定を行い、飽和脂肪摂取量等の食事要因の影響を十分に考慮して緑茶と脂質代謝との関連性について中間的な統計解析を行う予定である。

緑茶ではこのような関連性は認められなかった。食物要因の影響を十分に調整して緑茶飲用の血清脂質との関連性を検討するために、男性自衛官の調査研究データ・ベースを用いて飽和脂肪の主要な摂取源である肉類および乳製品の摂取量あるいは動物性脂肪の摂取量を推定する統計プログラムを作成した。同時に平成7年から実施している詳細な食事調査を含む疫学調査を継続実施した。1993-1994年の札幌、福岡、熊本および東京の自衛隊病院における定年退職前健康診断の受診者2656名を対象にした調査では多食品の摂取頻度が調査されている。別途実施した食事調査にもとづいて一回あたりの平均摂取量を推定し、主要栄養素と食品群の摂取量を推定することを試みた。予備的解析をおこない、緑茶多飲者で血清総コレステロールおよびLDL-コレステロールが低値であることを確認した。上述の食物・栄養要因を調整して緑茶と血清コレステロールとの関連性を詳細に検討する予定である。平成7年から実施している詳細な食事調査を含む疫学調査に関しては、平成10年2月現在、約1500名について調査を終了し、データの電算化を進めている。ほとんど全員から血液を採取し血漿を保存している。平成10年度は約2000名のデータを新たに解析し、これまでの結果と合わせて総合的な検討をおこない、緑茶と血清脂質に関して最終的な結論を得ることになる。緑茶飲用の血清脂質に及ぼす影響を検討するために必要な疫学調査を実施し、調査資料のデータ・ベース化をおこなった。調査対象は、詳細な医学検査が実施されている定年退職前の自衛官(ほとんどが50歳代前半の男性)である。福岡および熊本の自衛隊病院における受診者について、緑茶飲用習慣を含むライフスタイル調査を実施するとともに、血清脂質検査値(総コレステロール、HDL-コレステロールおよび中性脂肪)などの医学検査データを系統的に収集した。平成7年1月から平成8年12月までの期間に調査した803名については、血液生化学検査値、大腸内視鏡検査結果、腹部超音波検査結果などの医学検査データとライフスタイル調査の結果を統合させたデータ・ベースを完成させた。平成9年1月から平成10年12月までの2年間の調査数は944例であった。これら944名のライフスタイル調査結果および医学検査データの入力作業は終了しているが、エラー・チェックなどのデータ編集が終わっていない。平成7年から平成10までの4年間の合計1747名のデータを用いて緑茶飲用と血清脂質の関連性を詳細に検討することになる。平成7年より以前の自衛官のデータでは、緑茶飲用と血清コレステロールとの間に負の関連性を認めているが、今回は食物・栄養要因を十分に考慮して緑茶飲用と血清コレステロールとの関連性を検討することになる。あわせて、血清コレステロールとの関連性が注目される大腸ポリープや胆石症と緑茶との関連性も検討する予定である。
様々な雑音環境下での変数誤差モデル同定とその応用に関する研究

本研究では,様々な雑音環境下での変数誤差モデルの同定問題について考え,(1)白色雑音下・有色雑音下でのバイアス補償最小2乗法,およびその連続時間系への拡張,(2)白色雑音下・有色雑音下・量子化雑音下・複数の雑音下でのバイアス補償補助変数タイプ法,(3)プレフィルタを用いた最小相関法,拡大ベクトルを用いた最小相関法,などの同定法を提案し,これらの逐次計算アルゴリズムを導出した。また,提案した手法の有効性を数値シミュレーションにより検証し,その有効性を確認した。同時に,(4)Matlab/Simulink xPCTargetによるシステム同定実験環境の構築・アルゴリズム実装,を行い提案手法の応用検討を行い,実対象に対するアルゴリズムの有用性を確認した。従来,変数誤差モデルの同定問題において,入出力観測雑音は白色雑音として扱われることが多く,また,その同定アルゴリズムの多くはオフライン形式である。そのため,観測雑音が有色雑音,非線形誤差,量子化誤差,複数の観測雑音が混入する場合など様々な雑音環境下や実時間処理が求められる実問題での適用は難しいと考えられる。このような背景のもと,本研究では,様々な雑音環境下および実時間処理で適用できるような逐次計算アルゴリズムを用いた変数誤差モデルの同定法を開発し,その応用面での検討を行うことを目的とし研究を行った。具体的には,1)バイアス補償最小2乗法の検討・様々な雑音環境化への拡張,2)変数誤差モデル同定アルゴリズムの検討・逐次計算アルゴリズム開発,3)実問題への応用検討,を行っており,特に今年度の成果は以下に示す通りである。・変数誤差モデルの同定法として有効な方法であると考えられるバイアス補償最小2乗法について検討を行った。また,推定精度などアルゴリズムの性能について数値シミュレーションにより検討を行った。・新たな変数誤差モデル同定手法として,補助変数タイプ推定量の漸近バイアスを補償するという考えに基づいた,バイアス補償補助変数タイプアルゴリズムを提案し検討を行った。また,雑音分散の推定アルゴリズムも提案し,これらの逐次計算アルゴリズムを開発した。提案手法と従来のバイアス補償最小2乗法との比較を行い,数値シミュレーションにより白色雑音下でのパラメータ推定精度についてその有効性を示した。・入出力観測雑音が有色雑音である場合への拡張について検討を行い,提案手法およびバイアス補償最小2乗法の有色雑音下への拡張について検討を行った。具体的には, 1)バイアス補償法の検討・様々な雑音環境下への拡張, 2)変数誤差モデル同定アルゴリズムの検討・逐次計算アルゴリズム開発, 3)実問題への応用検討,を行っており,特に今年度の成果は以下に示す通りである。・前年度提案した「バイアス補償補助変数タイプアルゴリズム」の有色雑音下への拡張について検討を行った。また,雑音共分散の推定アルゴリズムを提案し,逐次計算アルゴリズムを開発した。提案手法と従来手法との比較を行い,数値シミュレーションにより有色雑音下でのパラメータ推定精度についてその有効性を示した。・入出力観測値に量子化誤差が含まれる場合について検討を行い,提案手法の拡張を行った。また,数値シミュレーションにより複数の雑音環境下(量子化誤差および白色雑音環境下)でのパラメータ推定精度についてその有効性を示した。・サンプル値データから連続時間変数誤差モデルを直接同定する問題を考え,バイアス補償法の連続時間系への拡張について検討を行った。具体的には,1)バイアス補償法の検討・様々な雑音環境下への拡張,2)変数誤差モデル同定アルゴリズムの検討

・逐次計算アルゴリズム開発,3)実問題への応用検討,を行っており,特に今年度の成果は以下に示す通りである。■入出力観測値に量子化誤差が含まれる場合について考え,「バイアス補償補助変数タイプアルゴリズム」の拡張を行った。また,逐次計算アルゴリズムを導出し,数値シミュレーションによりその有効性を示した。■サンプル値データから連続時間変数誤差モデルを直接同定する問題を考え,「バイアス補償最小2乗法」の連続時間系への拡張を行った。■変数誤差モデル同定法として,式誤差の相関関数の最小化に基づき導出される,「最小相関法」について検討を行った。より安定な推定値を得るため,「プレフィルタを用いた手法」および「拡大ベクトルを用いる手法」を提案した。また,これらの逐次計算アルゴリズムを導出し,数値シミュレーションによりこれらの有効性を示した。■Matlab/SimulinkのxPC Targetを用いて計測・制御実験環境を構築し,実データに対して提案したアルゴリズムの有効性を検証した。
臓器保存に関する組織Ca^<2+>イオンの動態とカルモジュリンの役割

ラットに門脈頚静脈シャントを作成して肝門部遮断を施行し、遮断解除後の生存率を検討した。正常肝ラット、硬変肝ラット共にCa拮抗剤、calmodulin拮抗剤を投与した群は、有意に生存率が改善した。又、正常肝ラット、硬変肝ラット共にcalmodulin拮抗剤、Ca拮抗剤の投与によって虚血後のATPの減少が加速され、ATPが速く減少するものほど虚血解除後の生存率が大きかった。これは、HPLC、31PーNMR何れの方法でも同様の結果であった。細胞の生命維持のポイントは、細胞内外の電位差の維持にあると考えられ、ATPを有効に利用し、電位差の維持が出来るものほど虚血に対しては耐性が強いと考えられた。又、Ca拮抗剤、calmodulin拮抗剤が虚血時の肝細胞障害の軽減に有効であるのはこれが活性化したフォスフォリパ-ゼA2を活性化する段階を抑制し、細胞内のFFAの増加を妨げるためであろうと考えられた。すなわち、細胞内に増加したFFAはNaーKATPaseを抑制し、ATPの有効利用を妨げるためである。これらに関しては、乳酸の測定、31PーNMRによる各種パラメ-タ-の測定により傍証が得られた。ところが、虚血肝細胞内のCaイオン濃度の増加については5FBAPTAをラットに投与してNMRで測定したところ正確な測定が不可能であった。その原因として1つは、NMRの磁場強度が弱いこと、もう1つは、5FBAPTAの溶解剤が強毒性であり、多量に投与できないことにあった。又、蛍光光度系を用いた細胞内Ca測定装置では10^<ー6>mol程度の濃度までしか測定できず、虚血時の細胞内Caイオン濃度に関しては十分な成果は得られなかった。ラットに門脈頸静脈シヤントを作成して肝門部遮断を施行し、遮断解除後の生存率を検討した。正常肝ラット,硬変肝ラット共にカルシウム拮抗剤、カルモジュリン拮抗剤を投与した群は有意に生存率が改善した。また、正常肝ラット,硬変肝ラット共にカルモジュリン拮抗剤、カルシウム拮抗剤の投与によって虚血後のATPの減少が加速され、ATPが速く減少するものほど虚血解除後の生存率が大きかった。これは、HPLC, ^<31>PーNMRいずれの方法でも同様の結果であった。細胞の生命維持のポイントは細胞内外の電位差の維持にあると考えられ、ATPを有効に利用し、電位差の維持が出来るものほど虚血に対しては耐性が強いと考えられた。また、カルシウム拮抗剤,カルモジュリン拮抗剤が虚血時の肝細胞障害の軽減に有効であるのは、これら活性化したカルモジュリンがフオスフオリパ-ゼA2を活性化する段階を抑制し,細胞内のFFAの増加を妨げるためであろうと考えられた。すなわち,細胞内に増加したFFAはNa^+-K+ATPaseを抑制し、ATPの有効利用を妨げるためである。これらに関しては、乳酸の測定,31PーNMRによる各種パラメ-タ-の測定により傍証が得られた。ところが,虚血細胞でのカルシウムの増加に関しては5FBAPTAをラットに投与してNMRにて測定したところ、正確な測定が不可能であった。その理由として1つは、NMRの磁場強度が弱いこと,もう1つは5FBAPTAの溶解剤が強毒性であり多量に投与できないことにあった。また蛍光光度計を用いた細胞内カルシウム測定装置では10ー6molまでの濃度しか測定できず,虚血時の細胞内カルシウムに関しては現在の所満足のいく結果は得られていない。

平成3年度概要昨年までの研究により、Ca拮抗剤、Calmodulin拮抗剤が、常温肝虚血時の肝疵護に有益であるとの結果を得た。しかし、実際に肝虚血時にCaイオンがどのような変化を示すかは、測定しえなかった。そこで、はたして虚血中の肝細胞の保護にCaが大きな役割を担っているかどうかを知るために、その肝細胞内のCa濃度をin vivoで測定しようと試みた。その測定法にはNMRを用いたが、それでは直接Caイオンを測定できないために、5FーBAPTA AMを門脈系に投与し、これが細胞内Caイオンと結合することを利用して細胞内Caを測定しようと試みた。実験では、虚血によって細胞内のCaイオン濃度が急激に上昇していくのが、観察されたが、実験全体としては再現性に乏しく、Caイオンが、^<19>FーNMRのシグナル上に全く認められないものや、はじめからCaイオンが高濃度のものも存在した。これは、シグナルが弱いこと、磁場強度が弱いこと、5FーBAPTAが水に難溶性であるために特殊な溶解剤を用いているが、これが肝に対し強毒性を持つために静注時にラットの状態が大きく変わること、などが原因として考えられた。以上の理由から、NMRを用いた肝細胞内Caイオンの測定法は未だ確立していない。よって当初期待した結果が求められなかったが、まず、この方法の確立が大きな課題であると考えられた。
下顎頭軟骨の形成、成長、機能維持におけるTen-m/Odz3 の役割に関する研究

下顎頭軟骨は、表層の未分化間葉系細胞が軟骨細胞に分化し成長するが、メカニズムは明らかになっていない。本研究では、1日、1週、3週齢マウスの下顎頭軟骨におけるTen-m/Odz3遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて明らかにした。Ten-m/Odz3遺伝子は、表層の線維層、増殖および成熟軟骨細胞で発現し、肥大軟骨細胞では発現が認められなかった。マウス軟骨細胞前駆細胞株ATDC5細胞でも、Ten-m/Odz3遺伝子は間葉系細胞から軟骨細胞へと分化する初期段階において発現した。以上より、Ten-m/Odz3は下顎頭軟骨の初期分化に関与している可能性が示唆された。顎顔面骨格の一部である下顎頭軟骨は頭蓋骨とともに顎関節を構成し、咀嚼などの複雑な運動に適応しているだけでなく、下顎骨の成長にも寄与しており、長管骨の関節軟骨と成長板軟骨の両方の機能をもつ特徴的な組織である。構造的に四肢の関節軟骨や成長板軟骨が薄い軟骨膜におおわれているのに対し、下顎頭軟骨は間葉系組織でおおわれており、胎生および出生後の下顎骨の成長はこの下顎頭軟骨の表層に存在する未分化な間葉系細胞が軟骨細胞に分化後、内軟骨性骨化が起こることによると考えられている。一方、Ten-m/Odz3遺伝子は、ショウジョウバエの体節形成遺伝子の中のペアルール遺伝子として同定され、ヒトからショウジョウバエまで様々な種で発現が認められており、発生時期における形態形成への関与が考えられている。本研究は下顎頭軟骨の形成、成長、機能維持におけるTen-m/Odz3の役割を検討することを目的としている。本年度は、マウスを用いて、新生仔期と成長期の下顎頭軟骨、大腿骨関節軟骨、大腿骨成長板軟骨におけるTen-m/Odz3の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて観察した。生後1日齢、1週齢、3週齢ICRマウスを麻酔下にてパラホルムアルデヒドによる灌流固定を行い、下顎頭と大腿骨を摘出した。厚さ7μmの薄切切片を作成し、軟骨細胞を層毎に区分するため、ヘマトキシリン-エオジン染色、トルイジンブルー染色、I型、II型、X型コラーゲン遺伝子のin situハイブリダイゼーションを行い、Te-m/Odz3遺伝子の発現パターンをin situハイブリダイゼーションを用いて検索した。その結果、1日、1週齢マウス下顎頭において、Ten-m/Odz3遺伝子はI型コラーゲンが発現する線維層、およびII型コラーゲンが発現する軟骨層で認められたが、3週齢では、線維層における発現が減弱した。大腿骨でも同様であった。顎顔面骨格の一部である下顎頭軟骨は頭蓋骨とともに顎関飾を構成し、咀嚼などの複雑な運動に適応しているだけでなく、下顎骨の成長にも寄与しており、長管骨の関節軟骨と成長板軟骨の両方の機能をもつ特徴的な組織である。本年度は、ラットを用いて、下顎骨骨折治癒過程におけるTen-m/Odz3の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて観察した。骨折後7日、14日にパラホルムアルデヒドによる灌流固定を行い、下顎頭を摘出した。厚さ7μmの薄切切片を作成し、骨折治癒過程をトルイジンブルー染色、I型、II型、X型コラーゲン遺伝子のin situハイブリダイゼーションを行い観察し、Ten-m/Odz3遺伝子の発現パターンをin situハイブリダイゼーションを用いて検索した。その結果、Ten-m/Odz3遺伝子は下顎骨骨折治癒過程において、II型コラーゲンが発現する増殖軟骨細胞で強く発現していた。

構造的に四肢の関節軟骨や成長板軟骨が薄い軟骨膜におおわれているのに対し、下顎頭軟骨は間葉系組織でおおわれており、胎生および出生後の下顎骨の成長はこの下顎頭軟骨の表層に存在する未分化な間葉系細胞が軟骨細胞に分化後、内軟骨性骨化が起こることによると考えられている。一方、Ten-m/Odz3遺伝子は、ショウジョウバエの体節形成遺伝子の中のペアルール遺伝子として同定され、ヒトからショウジョウバエまで様々な種で発現が認められており、発生時期における形態形成への関与が考えられている。本研究は下顎頭軟骨の形成、成長、機能維持におけるTen-m/Odz3の役割を検討することを目的としている。本年度は、1日齢、1週齢、3週齢マウスを用いて、下顎頭軟骨の形成過程におけるTen-m/Odz3遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて観察し、1日齢マウス大腿骨の関節軟骨、成長板軟骨と比較検討した。さらに、マウス軟骨細胞前駆細胞株ATDC5細胞からRNAを抽出し、Ten-m/Odz3遺伝子の発現をRT-PCRにより測定した。その結果、Ten-m/Odz3遺伝子は、I型コラーゲンが発現する線維層、II型コラーゲンが発現する増殖、成熟軟骨細胞で発現し、肥大軟骨細胞では発現が認められなかった。また、ATDC5細胞において、未分化な細胞から軟骨細胞へと分化する初期段階において、Ten-m/Odz3遺伝子の発現を認めた。以上より、Ten-m/Odz3は、軟骨細胞の分化に関与し、下顎頭軟骨の初期分化の調節因子として働いている可能性が示唆され、国際誌であるJ Anatomyに掲載された。