hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子求引性基を持つ新規Z型配位子含有金属錯体の合成とその触媒反応への応用

我々は、Z型配位子の電子受容性が、中心金属の電子密度を下げてそのルイス酸性を向上し、新たな反応性創出をもたらすのではないかと考え、Bourissouらの錯体を参考に、Z型配位子(ホウ素)を有する新規金錯体[Au(DPB)L]X (DPB = diphosphine-borane)を各種合成した。また、その触媒反応を検討したところ、エン-イン体を用いた分子内[2+2]環化付加反応やイン-ジオール体による連続的7-exo型環化反応において、7員環を効率的に構築可能であることを見出している。今回、Z型配位子をもつ金触媒による更なる環化反応を検討したところ、空気中の二酸化炭素を利用した室温下でのプロパルギルアミン誘導体との触媒的環化反応やアルキン酸-アルケンとの分子内[4+2]環化付加反応がそれぞれ進行し、一般の金触媒よりもZ型金触媒を用いた場合に良好な収率で目的の環化体が生成することを見出した。また新たな展開として、Z型配位子は中心金属の電子を受容するため、金属のd電子数や形式酸化数に影響を及ぼす可能性がある。より強いルイス酸性の獲得を目的に、一般的な3価の金にZ型配位子を導入したAu(DPB)Cl3を合成し、そのカチオン性触媒[Au(DPB)](SbF6)3をイン-インドール体と処理したところ、ダイマー型環化体がジアステレオ選択的に得られることを見出した。これは、2つの7員環と1つの5員環に加え、スピロ原子を含む2つの四級炭素を一挙かつ高立体選択的に構築している点に特徴を有している。当初計画とは異なるが、Z型触媒が従来にはない興味深い反応性をしめすことがわかったため。Au(DPB)Cl3の構造を解析すると共に、見出した新規環化反応の論文投稿を行う。またエン-イン体の分子間[2+2]環化付加反応等に適用し、新たな反応性創出を目指す。昨年度まで行っていたZ型配位子に官能基を導入した錯体の合成及び、そのカチオン性触媒を用いたイン-ジオール体の連続的分子内環化反応に関する7員環構築の論文を投稿し、Organometallics誌にて受理された。また、昨年度まで検討していたプロパルギルアミン誘導体のカルボキシル化反応においても、空気中室温下にて目的のオキサゾリジノン誘導体を高収率で合成できることを見出し、基質適用範囲を検討し、現在、論文リバイス中である。更に、イン-ジオール体の連続的分子内環化反応により、8員環の構築が可能であることも新たに見出した。エン-オール体による7-endo-trig型の環化反応が進行することも見出し、7員環環状エーテル構造の構築が可能となった。エン-アルキン酸を用いた分子内環化反応では、形式的な[4+2]環化付加反応が進行し、ラクトン構造を含む二環性化合物の合成が可能であることも見出した。尚、本反応の開発途上で、アルキン酸からの脱炭酸反応、アルキンの水和反応が進行することも明らかとなった。現在、本検討結果については論文投稿準備中である。Z型錯体であるAu(DPB)Clに、超原子価ヨウ素を用いて酸化を試みたところ、金が酸化されたAu(DPB)Cl3様の錯体が得られることも見出しつつあり、今後、構造解析を詳しく行っていく。また、その錯体を用いると、従来とは異なる様式での反応が進行することも初期検討で見出すに至った。また一連の研究成果から、Z型配位子をロジウム触媒へ組み込む新たな戦略の立案に至った。当初予定していた計画とは異なるが、新たな錯体形成や触媒反応への応用展開が可能になりつつあり、電子受容性型配位子の持つ効果が明らかになりつつあるため、当初の計画以上に進展していると判断した我々は、Z型配位子の電子受容性が、中心金属の電子密度を下げてそのルイス酸性を向上し、新たな反応性創出をもたらすのではないかと考え、Bourissouらの錯体を参考に、Z型配位子(ホウ素)を有する新規金錯体[Au(DPB)L]X (DPB = diphosphine-borane)を各種合成した。

これは、2つの7員環と1つの5員環に加え、スピロ原子を含む2つの四級炭素を一挙かつ高立体選択的に構築している点に特徴を有している。当初計画とは異なるが、Z型触媒が従来にはない興味深い反応性をしめすことがわかったため。現在、リバイス中であるプロパルギルアミン誘導体のカルボキシル化反応や論文投稿準備中であるエン-アルキン酸を用いた分子内環化反応の論文アクセプトを目指す。更に、イン-ジオール体の連続的分子内環化反応による8員環構築、エン-オール体の7-endo-trig型の環化反応による7員環環状エーテル構造の構築の条件精査と基質適用範囲を見極める。また、3価のZ型錯体であるAu(DPB)Cl3の構造解析を行い、その触媒を用いた新反応の生成物や反応機構を明らかにしていく。また、新たにRh触媒とZ型配位子を組み込んだ新規錯体を合成し、その錯体の解析や触媒反応としての性質についても明らかにする。Au(DPB)Cl3の構造を解析すると共に、見出した新規環化反応の論文投稿を行う。またエン-イン体の分子間[2+2]環化付加反応等に適用し、新たな反応性創出を目指す。当初予定よりも順調に研究が進行し、必要物品費等に余裕ができたため。次年度以降は、当初予定を上回る研究のさらなる推進のため、次年度使用額分を使用する予定である。
物理から細胞形態に迫る：多細胞モデルの構築と細胞間相互作用の制御

生物を形作る細胞は、機能に適した形態と内部構造を備えている。我々は、この細胞形状と構造の制御機構を明らかにするために、細胞組織における細胞の空間配置と細胞間接着力に着目し、それらの相関関係を、複数の細胞サイズ液滴からなる細胞組織モデルを用いて調べた。細胞の空間配置が関与しない二細胞モデルでは、細胞間接着力が細胞表面の界面張力と、細胞膜と細胞内の高分子との相互作用によって決定されることが示された。一方、多細胞モデルでは、細胞の空間配置と接着力が、細胞内に含まれる高分子の構造形成を介して互いに影響し合うことが分かった。この結果は、細胞組織の形と構造の制御原理が、共依存関係にあることを示唆する。複数の細胞からなる生物は、機能に適した細胞の形とその内部構造を生物全体で制御している。本研究では、生物の形と構造の制御原理において重要となる物理的な細胞間相互作用を、モデル多細胞を用いた実験的研究から解明することを目的とした。細胞膜に多く含まれるリン脂質の単分子膜で覆われた細胞サイズ液滴(エマルション)やリン脂質二分子膜小胞(ベシクル)の内部に生体高分子溶液を封入することで、階層構造を備えた多細胞モデルを構築した。その後、リン脂質膜の膜内相分離や高分子混合溶液の相分離を引き起こし、そこで現れる時空間パターンについて解析を行った。生体高分子溶液を内包した単一細胞モデルとしてのベシクルは、高浸透圧下で高分子溶液が濃縮されるのに伴って膜変形を示すが、そのタイプは内部の粘性率に依存することが分かった。この結果は、学術論文としてまとめると共に、物理学会でシンポジウム講演することにより社会へ広く発信した。また、この単一細胞モデルを集積した多細胞モデルでは、細胞間の吸着面に対して水平・垂直配向した相分離パターンが形成されることが分かってきた。脂質と高分子間に引力相互作用が生じる場合では、その強さに応じて内部構造が変化し、また細胞間吸着力自体も増加する傾向がみられた。平成26年度は、脂質と高分子間の相互作用、細胞間接着力をパラメーターに、多細胞モデル内での相分離パターン形成について明らかにしたい。複数の細胞から成る多細胞生物は、細胞膜を介した細胞間相互作用を感知しながら生命機能を果たしている。本研究では、単一細胞モデルとして用いられてきた細胞サイズ液滴(油中水滴)やリン脂質膜小胞(ベシクル)を集積し、階層構造をもつ多細胞モデルを構築した上で、隣り合う細胞による空間的な束縛条件下での膜変形や膜接着について実験的研究を行う。これにより、生物が複数の細胞形態をいかに制御しているのかという生命の機構を物理的に解明することが本研究の目的である。平成24年度は、脂質単分子膜で覆われた細胞サイズ液滴同士を接着させ、接着力が膜を構成する脂質の種類によってどう変化するかを系統的に調べた。その結果、脂質のアルキル鎖に含まれる炭素数が16よりも小さくなると急激に吸着力が小さくなることを見出した。生体膜には多くの脂質分子が含まれているあ、その殆どの脂質は炭素数16以上の長鎖脂質であることが知られている。上記液滴の接着面には生体膜と同じく脂質二分子膜が形成されていることから、生体膜はその二分子膜構造を安定させるために長鎖脂質を多く含む、と考えることができる。以上の研究結果は、生物物理学会や化学会において報告すると共に、論文投稿中である。また、細胞間に含まれるヒアルロン酸などを液滴内に添加すると、脂質の種類によって接着力が変化することも見出している。さらに、ベシクル内部に生体高分子溶液を内包し、膜内外の浸透圧差によって細胞内濃度まで濃縮する手法や、ベシクル内に生体高分子ゲルからなる階層構造を形成する手法も確立しつつある。平成25年度は、これらを発展させながら細胞数を増加させることで多細胞モデルを実現したい。複数の細胞から成る生物は、細胞の形と内部構造を細胞組織全体で制御している。この形と構造の自己組織的な制御機構を明らかにする上で、我々は細胞の空間配置と細胞間接着力に着目した。この二つの物理的特徴を制御可能とする細胞組織モデルを構築した上で、それらの相関関係を解明することが本研究の目的であった。はじめに、サイズの揃った細胞モデル(脂質単分子膜で覆われた高分子溶液のWOエマルション)を、細管に封入した高分子溶液を遠心力下で先端から放出することにより作成した。その後、マイクロマニュピュレーターを用いて細胞モデルを掴み、適切な配置を維持しながら互いに接着させて、細胞組織モデルを構築した。細胞間接着力は、細胞モデルの表面に働く界面張力と、脂質と細胞内に封入した高分子との相互作用によって制御可能であることが分かった。それゆえ、この細胞組織モデルは、脂質膜と高分子との相互作用を評価するモデル系としても有益なことが示された。

また、二相分離する高分子混合溶液を封入した細胞組織モデルでは、細胞間の接着力がある閾値を超えると、相分離パターンが細胞の空間配置によって支配されることも分かってきた。このことは、細胞が互いに強く膜接着し合うことで、空間配置を介した構造制御が可能となることを強く示唆する。以上の成果は、原著論文として投稿中であり、また生物物理学会や物理学会などでの講演を介して広く発信した。ソフトマター物理生体高分子溶液を内包した多細胞モデルでは、細胞膜と高分子間の相互作用に強く依存した相分離パターンが現れることが分かってきた。高分子が脂質と引力相互作用を示す場合、静電引力が支配する膜界面から数ナノメートルの短距離領域だけでなく、細胞サイズ空間(数十マイクロメートル)に含まれるほぼ全ての高分子が脂質膜近傍へ局在する様子が観察された。また、この局在に伴って細胞間接着力が増加する様子もみられた。一方、このような引力相互作用が存在しない場合、細胞間の吸着面に対して水平・垂直配向した相分離パターンが形成される。しかし、こうした現象を説明する物理的メカニズムは未だ解明できていない。平成26年度内に、こうした多細胞モデルにおける相分離パターン形成の機構について明らかにしたい。均一相状態の脂質単分子膜で覆われた細胞サイズ液滴を接着させた二細胞モデルを構築し、細胞間に働く接着力を定量評価した。その結果、接着力は脂質の疎水基の長さに強く依存し、また安定性は膜の相状態に依存することを見出した。さらに膜内に生体高分子であるヒアルロン酸や糖などを添加すると、膜との相互作用を膜接着力の変化として解析できることを見出している。これらの結果は生物物理学会や化学会で発表し、また脂質のみの結果についてはすでに論文投稿しているため、平成24年度の研究目的を概ね達成することができたと言える。しかし、3個以上のモデル細胞を空間的な配置を維持しながら接着させる技術については改良すべき点が残っており、現在マイクロマニュピュレーターやマイクロ流路を用いた接着を試みている。平成25年度は、この点をクリアしながら階層構造をもつ多細胞モデルの構築を目指したい。遠心機を用いてほぼ同サイズのモデル細胞を多数形成し、それをマイクロ・マニュピュレーターによって規則的に配置・接着させた、多細胞モデルを構築することが可能となった。そこで、細胞数を固定した上でモデル細胞の配置を変えながら細胞間接着力を制御したい。また、高分子混合溶液や脂質の組成を変化させることで、細胞膜と高分子間の相互作用の制御を目指したい。ここで現れる相分離パターンを定量的に解析することで、多細胞モデルにおける内部構造を形の制御機構を、平成26年度内に明らかにしたい。平成25年度は、3個以上のモデル細胞からなる多細胞モデルを構築することを目指す。これまでの実験から膜接着を誘起させるリン脂質PEを50mol%以上含む多成分ベシクルでは、ベシクル同士が容易に膜接着してしまうため、空間配置の制御が困難であることが分かった。そこで、リン脂質PEに加え、膜接着を誘起しないリン脂質PCを混合したベシクルを作成し、それを集積させた後にPCとPEを膜内相分離させて膜接着を引き起こすことを試みる。ベシクルの集積には、マイクロマニュピュレーターとマイクロ流路を用いる。
小胞体ストレスと脂肪肝発症を仲介する小胞体膜タンパク質ILDR2の分子機構の解明

【背景・目的】脂肪肝は2型糖尿病のリスク因子だけでなく、肝硬変や肝がんへ進行するため、その予防・治療法の開発が急務である。我々がQTL解析により同定した新規糖尿病感受性遺伝子Ildr2は、小胞体に局在する膜タンパク質をコードしており、Ildr2の発現低下が脂肪肝発症に関与する。しかし、ILDR2の生理的役割や機能は不明な点が多い。これまでILDR2機能の解明のため、免疫沈降法及びMALDI-TOF-MSを用いてILDR2結合タンパク質、MOBAT7を同定した。MBOAT7はホスファチジルイノシトール(PI)のアシル転移酵素であり、rs641738 Tアリルは脂肪肝のリスクを増大させ、肝臓中PIの変容に関連することが報告されている。そこでILDR2が脂肪肝における肝臓中PI組成の変化に関与するか否かを検討した。【方法】コリン欠乏食を用いた2つのモデルマウス、1. ILDR2-floxマウスにAAV-Creを投与した肝臓特異的ILDR2ノックアウトマウス(LKO-ILDR2)、2. AAV-ILDR2を用いた過剰発現マウス(OX-ILDR2)を作製し解析した。【結果】LKO-ILDR2マウス肝臓は、コントロールと比べ肝中性脂肪が1.6倍有意に増加した。LKO-ILDR2マウスにおいて、分析したほとんどの肝臓中PI分子種はコントロールと比べ増加した。一方、OX-ILDR2マウスでは、有意に減少した。【考察】当初、LKO-ILDR2マウスの肝臓中PI分子種はこれまで報告されているMBOAT7ノックアウトマウスの肝臓中PI分子種の構成と類似すると推測していたが、予想に反した結果となった。ILDR2は直接MOBAT7の活性に変化を与えなかったが、肝臓中のリン脂質の構成にILDR2が関与する可能性があるため、今後さらなるILDR2の役割を解明する必要がある。【背景・目的】非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の発症は、肥満や糖尿病と密接に関連している。中でも、炎症や線維化を伴う脂肪肝は、肝硬変や肝がんのリスクを増大させることから、その予防・治療法の開発が急務である。しかし、ILDR2の生理的役割や機能は不明である。これまで、免疫沈降法及びMALDI-TOF-MSを用いてILDR2結合タンパク質の探索を行い、ホスファチジルイノシトール(PI)のアシル転移酵素であるMBOAT7をILDR2結合タンパク質として同定している。MBOAT7 rs641738 Tアリルは、NAFLDのリスクを増大させ、肝臓中PI (36:4)とPI (38:3)の減少に関連することが報告されている。そこで、ILDR2が脂肪肝とリン脂質の脂肪酸組成の変動に関与するか否かを検討した。【方法】メチオニン・コリン欠乏食を用いた2つのモデルマウス、1. ILDR2-floxマウスにAAV-Creを投与した肝臓特異的ILDR2ノックアウトマウス(LKO-ILDR2)、2. AAV-ILDR2を用いた過剰発現マウス(OX-ILDR2)を作製し解析した。肝臓中リン脂質の脂肪酸組成を調べたところ、LKO-ILDR2マウスは、PI (38:4)がコントロールと比べて有意に減少した。一方、OX-ILDR2マウスは、肝臓中PI (38:4)が有意に増加した。【考察】ILDR2は、MBOAT7を介して肝臓中リン脂質の脂肪酸組成の変動に関与していることが示唆された。ILDR2の機能解明は、リン脂質の組成変化と脂肪肝発症・進展のメカニズム解明に寄与する可能性がある。本研究課題は予定通り実施されている。

LKO-ILDR2マウスにおいて、分析したほとんどの肝臓中PI分子種はコントロールと比べ増加した。一方、OX-ILDR2マウスでは、有意に減少した。【考察】当初、LKO-ILDR2マウスの肝臓中PI分子種はこれまで報告されているMBOAT7ノックアウトマウスの肝臓中PI分子種の構成と類似すると推測していたが、予想に反した結果となった。ILDR2は直接MOBAT7の活性に変化を与えなかったが、肝臓中のリン脂質の構成にILDR2が関与する可能性があるため、今後さらなるILDR2の役割を解明する必要がある。肝臓特異的ILDR2ノックアウトマウスを用い、脂肪肝の発症・進展とリン脂質の関与についてより詳細に解析していく。
胃プロトンポンプ、肝薬物排除ポンプと共役したC1-チャネルの生理学的意義

胃プロトンポンプは胃酸分泌機構の最終段階に位置するポンプである。この酵素にはポンプ機能以外に、塩素イオンチャンネル機能も併せて存在することを1987年我々は発見した。即ち、ポンプとチャンネルの機能が同一分子内に存在する系を発見した。他方多剤薬物排除ポンプにおいて、1992年ポンプと塩素イオンチャネルが同一分子内にあることが英国の学者より発見された。平成5年度においては我々は多剤薬物排除ポンプの機能を正常細胞で観察しうる細胞系を立案した(Transplantation,1983)。またポンプのコンフォメションに与える影響が阻害剤の微妙な構造の違いにより異なることをはじめて明らかにした。(J.Boil.Chem.1993).平成6年度においては胃プロトンポンプの細胞内輸送に与える阻害剤の影響(Biochemical Pharmacology,1994)やこのポンプの膜内におけるトポロジーに関する論文(Biochemical J.,1994)や腸型と胃型のポンプを区別しうるモノクローナル抗体を開発した結果(J.Biochemistry,1994)を発表した。また胃プロトンポンプの構造と機能の研究を分子レベルで行うために、胃H^+,K^+-ATPaseのαおよびβサブユニットの遺伝子を分取し、細胞系に発現させることを試み成功した。今後培養細胞系で、ポンプの機能と塩素イオンチャネルの関係を種々の角度から検討することが可能になった。この酵素にはポンプ機能以外に、塩素イオンチャネル機能も併せて存在することを1987年我々は発見した。ポンプとチャネルが同一分子内に存在することがいかにして可能なのか、またポンプがいかなる機構でイオンを能動輸送しえるのか等を解明する研究を行っている。本年度に発表された我々の論文はこの酵素の構造(Biochemical J.)及び機能(J.Biol.Chem.)に関するものである。更に、第3の塩素イオンチャネルとして、胃酸分泌細胞内に存在する細胞防御にかかわる新規なチャネルを発見し、その細胞内制御機構を明らかにした(J.Physiol.)。他方多剤薬物排除ポンプにおいて、1992年ポンプと塩素イオンチャネルが同一分子内にあることが英国の学者により発見された。我々はこのポンプの機能を正常細胞で観察しうる細胞系を立案した。2個の細胞間に胆細管のモデルになる空間を培養により形成し、ポンプにより運ばれる蛍光性の物質量を顕微鏡下に画像解析により求められることを世界で始めて示した。肝移植において、免疫抑制剤サイクロスポリンの副作用がこのポンプの抑制にあることをこの系を使用して示した。わが国で開発されたFK506にはこの副作用がないことを明らかにした(Transplantation)。この仕事は肝移植の父といわれる米国のStarzl博士より絶賛された。胃プロトンポンプの構造と機能の研究は、現在遺伝子を使うことが可能になるよう研究を展開している。多剤薬物排除ポンプの塩素イオンチャネルについては、パッチクランプ法を使った研究を展開している。即ち、ポンプとチャネルの機能が同一分子内に存在する系を発見した。我々はこのポンプの機能を正常細胞で観察しうる細胞系を立案した(Transplantation,1993)。平成6年度においては胃プロトンポンプの細胞内輸送に与える阻害剤の影響(Biochemical Pharmacology,1994)やこのポンプの膜内におけるトポロジーに関する論文(Biochemical J.,1994)や腸型と胃型のポンプを区別しうるモノクローナル抗体を開発した結果(J,Biochemistry,1994)を発表した。

また胃プロトンポンプの構造と機能の研究を分子レベルで行うために、胃H^+,K^+-ATPaseのαおよびβサブユニットの遺伝子を分取し、細胞系に発現させることを試み成功した。今後培養細胞系で、ポンプの機能と塩素イオンチャネルの関係を種々の角度から検討することが可能になった。
希ガス蛍光を利用したパルス中性子イメージング検出器開発のための基礎研究

ヘリウム/キセノン混合ガスのシンチレーション機構を解明する上で重要な、発光の時間波形、発光量を詳細に調べた。これらのデータは、ヘリウム/キセノン混合ガスを放射線検出器媒体として利用し、検出器開発を行う上でも重要な要素である。混合ガスの全圧とキセノン分圧を変えてシンチレーションの時間波形・発光量を測定した。全圧は1.0MPaと0.657MPa、キセノン分圧は10^2Paから10^6Paの範囲で測定を行った。明らかにしたことを以下に述べる。シンチレーションの立ち上がり時間は4nsec.以下であり、タイミング信号として優れている。測定したシンチレーション光の減衰は、ヘリウムの励起2原子分子の発光寿命(10usec.)より早い。光の減衰には幾つかの成分が存在し、キセノン分圧に依存する成分、依存しない成分がある。発光波形はキセノン分圧のみならず、全圧にも依存する。キセノンへ分配される放射線のエネルギー以上に発光量が大きい。発光波形と併せて考察するとヘリウムからキセノンへのエネルギー移行が起きている。キセノン分圧を増加させていくと発光量は増加していき、1%のキセノン濃度比で純キセノン1気圧と同程度の発光量となる。キセノン分圧が大きくなるとシンチレーションの減衰はキセノン励起2原子分子の寿命(99nsec.)に近づく。これはヘリウムからキセノンへのエネルギー移行過程の時間がキセノン励起2原子分子の寿命より十分短い時間で起きたためである。以上の検出器媒体としての特性に基づき、ヘリウム/キセノン混合ガスチェンバー・マルチアノード光電子増倍管・64chPMT用ヘッドアンプ(preamp、shaper、trigger、ADCが一体となったPMT読み出しユニット)、VMEモジュールからなる2次元位置検出器を開発中である。ヘリウム/キセノン混合ガスのシンチレーション機構を解明する上で重要な、発光スペクトル、発光の時間波形、発光量を調べた。またこれらは、ヘリウム/キセノン混合ガスをシンチレータとして利用する際にも基礎的な特性として重要である。ヘリウム/キセノン混合ガスの発光スペクトルは全圧とキセノン濃度を変えながら、X線発生装置と真空紫外分光器を用いて測定した。全圧10気圧、キセノン濃度0.1%以上において、発光は150nmから200nmの波長範囲にあり、173nm付近にピークを持つことが分かった。また、発光スペクトルの形はキセノン濃度比ばかりでなく、全圧にも依存することが分かった。ヘリウム/キセノン混合ガスの全圧を一定とし、キセノン濃度を変えてシンチレーション波形を測定した結果、シンチレーションの立ち上がりは4n秒以下であり、減衰には幾つかの成分があることが分かった。減衰の成分には、キセノンの濃度に依存する成分、依存しない成分があることが分かった。発光量の測定には放射線源として^<241>Amを用い、α粒子による発光を測定した。測定には発光波長110nmから350nmに感度を持つ光電子増倍管用いた。全圧は1.0MPaと0.657MPaに固定し、全圧に対するキセノン濃度比を0.1%から1%まで変えて測定を行った。キセノン濃度を増加させていくと発光量は増加していき、1%のキセノン濃度比で純キセノン1気圧と同程度の発光量となることが分かった。全圧に対するキセノン濃度比が一定では全圧1.0MPaのほうが発光量は大きいが、キセノン分圧一定では発光量は全圧に依存しないことが分かった。また、放射線エネルギーの検出器媒体への吸収過程を理解するために、放射線による電離収量も同時に測定した。ヘリウム/キセノン混合ガスの全圧とキセノン分圧を変えてシンチレーション波形・発光量を測定した。測定には放射線源として^<241>Amを用い、5.49MeVα粒子による発光を測定した。全圧は1.0MPaと0.657MPa、キセノン分圧は10^3Paから10^5Paの範囲で測定を行った。シンチレーション波形測定の結果、以下のようなことを明らかにした。測定した光の減衰は、ヘリウムの励起2原子分子の発光寿命(10usec.)より早い。発光量測定では以下のようなことを明らかにした。キセノンへ分配されるエネルギー以上に発光量が大きい。以上の検出器媒体としての特性に基づき、ヘリウム/キセノン混合ガス・マルチアノード光電子、増倍管・VMEモジュールからなる2次元位置検出器を開発中である。

ヘリウム/キセノン混合ガスのシンチレーション機構を解明する上で重要な、発光の時間波形、発光量を詳細に調べた。これらのデータは、ヘリウム/キセノン混合ガスを放射線検出器媒体として利用し、検出器開発を行う上でも重要な要素である。混合ガスの全圧とキセノン分圧を変えてシンチレーションの時間波形・発光量を測定した。全圧は1.0MPaと0.657MPa、キセノン分圧は10^2Paから10^6Paの範囲で測定を行った。明らかにしたことを以下に述べる。シンチレーションの立ち上がり時間は4nsec.以下であり、タイミング信号として優れている。測定したシンチレーション光の減衰は、ヘリウムの励起2原子分子の発光寿命(10usec.)より早い。光の減衰には幾つかの成分が存在し、キセノン分圧に依存する成分、依存しない成分がある。発光波形はキセノン分圧のみならず、全圧にも依存する。キセノンへ分配される放射線のエネルギー以上に発光量が大きい。発光波形と併せて考察するとヘリウムからキセノンへのエネルギー移行が起きている。キセノン分圧を増加させていくと発光量は増加していき、1%のキセノン濃度比で純キセノン1気圧と同程度の発光量となる。キセノン分圧が大きくなるとシンチレーションの減衰はキセノン励起2原子分子の寿命(99nsec.)に近づく。これはヘリウムからキセノンへのエネルギー移行過程の時間がキセノン励起2原子分子の寿命より十分短い時間で起きたためである。以上の検出器媒体としての特性に基づき、ヘリウム/キセノン混合ガスチェンバー・マルチアノード光電子増倍管・64chPMT用ヘッドアンプ(preamp、shaper、trigger、ADCが一体となったPMT読み出しユニット)、VMEモジュールからなる2次元位置検出器を開発中である。
mRNA品質管理に関わるタンパク質リン酸化酵素SMG-1の活性制御機構の解明

本年度はSMG-1結合タンパク質として同定したRUVBL1、RUVBL2とSMG-1の関わりについて解析を行った。RUVBL1、RUVBL2は進化的に保存されたATPaseであり、転写、テロメア維持、RNA修飾をはじめ多様な細胞機能に関与する。当初RUVBL1、RUVBL2をSMG-1の結合タンパク質として同定したが、その後の解析からRUVBL1、RUVBL2はSMG-1だけではなく、SMG-1の属するPIKK(Phosphoinositide3-kinase related kinase)ファミリーの全てのタンパク質と相互作用すること、さらに全てのPIKKの量を制御していることが明らかとなった。RUVBL1、RUVBL2の機能阻害は全PIKKタンパク質の減少を引き起こし、PIKK下流のリン酸化シグナルを抑制する。またRUVBL1、RUVBL2によるPIKK量の制御には少なくともmRNAレベルでの制御が介在していること、RUVBL1、RUVBL2のATPase活性が必要であることも明らかにした。さらにRUVBL1、RUVBL2とSMG-1に着目した解析から、RUVBL1、RUVBL2がSMG-1の量の制御とは独立にNMDに関与していることを見出した。RUVBL1、RUVBL2は初期翻訳段階のmRNP(mRNAタンパク質複合体)と相互作用し、NMDにおいて異常mRNAを認識するmRNAサーベイランス複合体の形成を促進する。さらにRUVBL1、RUVBL2のいずれの機能阻害もNMDのレポーターmRNAを安定化する。これらの結果から、RUVBL1、RUVBL2はNMDにおけるSMG-1の機能複合体であるmRNA監視複合体の形成を制御することにより、NMDに必須の役割を果たしていることが明らかとなった。上記の結果から、RUVBL1、RUVBL2がPIKKの量的制御およびNMDにおけるPIKK(SMG-1)の機能複合体の形成制御という2つのレベルでPIKKの機能を制御していることが明らかとなった。PIKKファミリーのタンパク質群はゲノム安定性と遺伝子発現の正確性を保障する役割を担っていることから、PIKKの共通の制御因子の発見は極めて重要な知見であり、ゲノムの維持や遺伝子発現全体の制御に、新しい局面をもたらす研究成果といえる。これらの研究成果はScience Signaling誌に掲載され、"Masters of integrity(無傷性の支配者)"として紹介された。本研究は、タンパク質リン酸化酵素SMG-1の結合タンパク質の解析を通じ、NMD(早期終止コドンを有するmRNAの選択的分解経路)に必須なSMG-1によるUpf1リン酸化の制御機構を解明することを目的としている。平成19年度は新規SMG-1結合タンパク質のうちSMG-1に非常に強く結合する2つの分子、SMG-8、SMG-9を中心に解析を進めた。新規SMG-1結合タンパク質であるSMG-8、SMG-9はSMG-1と非常に強い親和性を有し、細胞内でほとんどのSMG-1はこれらの分子と複合体を形成していることを示す結果を得た。このことから、この2つの分子がSMG-1の酵素活性に関与している可能性を考え、この点についてさらに解析を進めた。SMG-1によるUpf1リン酸化部位を含むペプチド基質を用いたin vitroアッセイ系での解析の結果、SMG-8にSMG-1の酵素活性抑制効果があることを見出した。さらにSMG-9はSMG-1とSMG-8との相互作用を正に制御することで、間接的にSMG-1の活性を抑制する効果があることを見出した。これらの結果は、SMG-1の酵素活性に関わる因子についての初めての知見である。現在、細胞内でNMDがおきる際のSMG-1活性化とSMG-8、SMG-9との関係について解析を進めている。昨年度までにSMG-1に強く結合する2つの新規分子SMG-8,SMG-9を同定し、これらがSMG-1と結合することでその酵素活性を抑制していることをin vitro実験より明らかにした。NMDにおいてSMG-1によるUpf1のリン酸化は必須な過程となっている。このことからSMG-1の活性抑制因子であるSMG-8、SMG-9の機能阻害は、SMG-1の活性化を通じNMDを促進する可能性が考えられた。しかしSMG-8の機能阻害は、予測に反しin vivoにおいてはUpf1のリン酸化を低下させNMDを抑制した。この理由を明らかにするため、SMG-8機能阻害下でのmRNAサーベイランス複合体の状態を解析した。その結果、SMG-8機能阻害下ではSMG-1がナンセンスmRNA上で形成されるmRNAサーベイランス複合体にリクルートされず、Upf1リン酸化がおきる前の状態でmRNAサーベイランス複合体のリモデリングが停止していることを見出した。これによりSMG-8は通常SMG-9とともにSMG-1と安定な複合体を形成し、SMG-1の酵素活性を抑制するだけでなく、NMDにおいてはSMG-1:SMG-8:SMG-9複合体をmRNAサーベイランス複合体ヘリクルートする役割があることが明らかにした。上記の一連の研究成果はGenes&Developmentに掲載された。本年度はSMG-1結合タンパク質として同定したRUVBL

1、RUVBL2とSMG-1の関わりについて解析を行った。RUVBL1、RUVBL2は進化的に保存されたATPaseであり、転写、テロメア維持、RNA修飾をはじめ多様な細胞機能に関与する。当初RUVBL1、RUVBL2をSMG-1の結合タンパク質として同定したが、その後の解析からRUVBL1、RUVBL2はSMG-1だけではなく、SMG-1の属するPIKK(Phosphoinositide3-kinase related kinase)ファミリーの全てのタンパク質と相互作用すること、さらに全てのPIKKの量を制御していることが明らかとなった。RUVBL1、RUVBL2の機能阻害は全PIKKタンパク質の減少を引き起こし、PIKK下流のリン酸化シグナルを抑制する。またRUVBL1、RUVBL2によるPIKK量の制御には少なくともmRNAレベルでの制御が介在していること、RUVBL1、RUVBL2のATPase活性が必要であることも明らかにした。さらにRUVBL1、RUVBL2とSMG-1に着目した解析から、RUVBL1、RUVBL2がSMG-1の量の制御とは独立にNMDに関与していることを見出した。RUVBL1、RUVBL2は初期翻訳段階のmRNP(mRNAタンパク質複合体)と相互作用し、NMDにおいて異常mRNAを認識するmRNAサーベイランス複合体の形成を促進する。さらにRUVBL1、RUVBL2のいずれの機能阻害もNMDのレポーターmRNAを安定化する。これらの結果から、RUVBL1、RUVBL2はNMDにおけるSMG-1の機能複合体であるmRNA監視複合体の形成を制御することにより、NMDに必須の役割を果たしていることが明らかとなった。上記の結果から、RUVBL1、RUVBL2がPIKKの量的制御およびNMDにおけるPIKK(SMG-1)の機能複合体の形成制御という2つのレベルでPIKKの機能を制御していることが明らかとなった。PIKKファミリーのタンパク質群はゲノム安定性と遺伝子発現の正確性を保障する役割を担っていることから、PIKKの共通の制御因子の発見は極めて重要な知見であり、ゲノムの維持や遺伝子発現全体の制御に、新しい局面をもたらす研究成果といえる。これらの研究成果はScience Signaling誌に掲載され、"Masters of integrity(無傷性の支配者)"として紹介された。
歯胚と歯原性腫瘍発生に関与する形態形成誘導因子の遺伝子発現の解析

歯の形態形成と細胞分化は転写調節因子や増殖因子が関与し、連続的な上皮-間葉の相互作用によって制御されている。基底膜は歯胚上皮とそれに隣接する間葉組織との間に介在する細胞外マトリックスとして、それらの相互作用に関与していることが知られている。歯胚基底膜の主要構成成分であるIV型コラーゲンのα1からα6までの6種類のα鎖の歯牙発生過程での局在と消長を免疫組織学的に観察したところ、歯胚上皮基底膜にα鎖の部位および時期特異的な局在と組み合わせが存在することが明らかとなった。特に帽伏期からの内エナメル上皮基底膜には、α4鎖を含む他の臓器には存在が確認されていない特異なα鎖の組み合わせが存在し、その組み合わせが歯胚特異的な形態形成、細胞分化に関与していることが示唆された。最近、上皮と間葉から分泌される多くの増殖因子が基底膜と結合し、濃縮され、基底膜構成成分と共同で器官形成に作用することが明らかにされつつある。そこで次に、各種成長因子の歯牙発生過程における基底膜での局在と消長を免疫組織学的に観察し、IV型コラーゲンの局在、組み合わせとの関連性を検討した。今回検索した増殖因子(BMPs、FGFs、TGF-β)の中で、帽伏期後期以降に基底膜に陽性所見を示すものは検出できなかった。従って、帽伏期後期からの内エナメル上皮基底膜に存在するα4鎖を含む特異なIV型コラーゲンの組み合わせと共同作用する成長因子の存在は明らかにできなかった。しかし、上皮肥厚期と蕾状期においてはFGF-2とTGF-β1が歯胚基底膜に陽性所見を示した。この時期には、IV型コラーゲンα3(IV)α4(IV)α5(IV)の組み合わせが存在することから、この組み合わせとFGF-2、TGF-βの共同作用が初期歯胚形態形成、細胞分化に関与している可能性が考えられた。本研究では,歯胚・骨の各器官誘導因子(Msx1,2,BMP2,4,7)の局在をmRNAレベルでin vivo,in vitroにより,Northen blottingおよびIn situ hybridization法を用いて検討し,それを基に歯原性腫瘍の生物学的性状を検討する。本年度は遺伝子解析法の開発と歯胚分化における骨形成蛋白質(BMP)の作用とエナメル芽細胞の分化について検討した。(1)象牙芽細胞への分化が決定されていない段階に歯乳頭細胞に対するBMPの作用を検討した。BMP部分精製法:骨タンパク質抽出液を濾過濃縮(分画分子量1万から10万)し透析後沈殿物のみを回収した。沈殿物はHeparin-SepharoseカラムとSephacryl S-200ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製されBMP活性画分を得た。BMP溶液の調整法:4mM HCl溶液を用いてBMPを4種類の濃度(0.5,1.0,2.0,4.0μg/μl)に溶解調整した。組織培養:胎生17日のマウス第1大臼歯歯胚を摘出し,1%トリプシンを用いてエナメル上皮と歯乳頭組織を分離した。歯乳頭組織のみを0.5%アガロースと血清を含むBGJ-b培養液中(10μl)に埋入した後、各濃度のBMP溶液(2μl)を添加した。アガロースのゲル化確認後,歯乳頭とBMPを含む半固形状態のブロックをミリポアフィルター上に移しBGJ-b培養液上で6日間浮遊培養した。

培養後の組織はBouin液で固定後,5μmの連続切片を作製しMallory's Alun hematoxylin染色を施し観察した。BMP濃度依存性実験の結果,BMP4.0μgと8.0μg添加群に象牙芽細胞様に伸長した細胞形態と前象牙質様基質の産生を認めた。(村田,永井ら)(2)アメロジェニン遺伝子発現とエナメル芽細胞分化の関係を検討した。エナメル芽細胞のlife spanからアメロジェニン遺伝子の発現と蛋白の局在を見ると,アメロジェニン遺伝子は,4つの発現様式をとっていることがわかった。a)基質形成開始前は胞体全体にみられる。蛋白の局在は認められない。b)基質形成初期は胞体に不均一にみられる。c)基質形成中は胞体全体にみられる。蛋白は主としてエナメル基質に認められる。d)移行期から成熟期初期にかけては胞体に不均一にみられ,次第に消失する。蛋白の局在はエナメル基質および細胞質内に強く認められる。以上の様に,エナメル芽細胞のlife spanにおけるアメロジェニン遺伝子発現は,極めて,変化に富んでいる事が示唆された。(中野,永井ら)上記の研究遂行のため,rhBMP-2および部分精製BMPにより,異所性骨誘導の遺伝子発現を検討し、In situ hybridezation法,Northen blotting法を確立した。(長塚,完山,此内、秦ら)歯の形態形成と細胞分化は転写因子や成長因子が関与し,連続的な上皮-間葉の相互作用によって制御されている。基底膜は歯胚上皮とそれに隣接する間葉組織との間に介在する細胞外マトリックスとしてそれらの相互作用に関与していることが知られている。そこで基底膜の主要構成成分であるIV型コラーゲンに注目し,IV型コラーゲンα1からα6までの6種類のα鎖に対するモノクローナル抗体を用い,歯胚の各発生段階における基底膜IVコラーゲンα鎖の局在と消長を観察し,歯胚の形態形成,細胞分化との関連を観察した結果,以下の結論を得た。1,歯胚の発生段階で,基底膜IVコラーゲンα鎖の組成に違いがあり,α1鎖からα5鎖は,歯胚各上皮基底膜で時期特異的な推移のあることが示された。α6鎖は,歯胚の各発生段階で陰性を示した。2,上皮肥厚期,蕾状期,帽状期初期までの歯胚基底膜ではIVコラーゲンα1鎮,α2鎖以外にα3鎖,α4鎖,α5鎖が認められた。この時期の組み合わせには,恒常的構成成分である[α1(IV)]_2α2(IV)以外に,α3(IV)α4(IV)α5(IV)が存在すると考えられ,これら2通りの組み合わせからなるIV型コラーゲンは,初期歯胚の形態形成に関与している可能性が考えられた。3,帽状期後期から鐘状期にかけて,内エナメル上皮基底膜には,α1鎖,α2鎖のみが認められた。前者には[α1(IV)]_2 α2(IV)と,これまで報告の無いα4(IV)αx(IV)αx(IV)の組み合わせの存在が示唆され,後者には[α1(IV)]_2α2(IV)の組み合わせが存在した。従って,歯胚上皮基底膜にはα鎖の部位特異的な組成と組み合わせが存在し,特に内エナメル上皮基底膜に含まれる,α鎖の特異な組成と組み合わせのV型コラーゲンは歯胚の細胞分化に関与することが示唆された。歯胚基底膜の主要構成成分であるIV型コラーゲンのα1からα6までの6種類のα鎖の歯牙発生過程での局在と消長を免疫組織学的に観察した結果、歯胚上皮基底膜にα鎖の部位および時期特異的な局在と組み合わせが存在することを明らかにした。
造血系細胞におけるmyb遺伝子産物の機能制御

1.myb遺伝子産物は未分化造血系細胞の増殖に必須の役割を荷っていると考えられている。これを明らかにするためIL3依存性でなおかつc-Mybが発現している細胞にMyb結合部位を持つCATレポータープラスミドを導入し、CATの発現がサイトカインIL3によって影響されるかどうかを調べた。その結果c-Mybタンパク量がIL3による刺激の前後で変動しないにもかかわらずその転写活性化能の増大が観察された。従ってIL3による何らかのシグナルがc-Mybタンパクに到達したと考えられる。このシグナルの実体についての解析を試みている。2.我々はc-Mybタンパクがロイシンジッパー構造を介してホモダイマーを形成し自身の転写活性化能を抑制することを明らかにしたが、他にもこのロイシンジッパー構造に結合するタンパクが存在すると考え、ウエスト・ウエスタン法によってクローニングを行っている。
尿細管間質障害の免疫学的機序の解明.-ノックアウトマウスによる検討

進行性腎疾患において尿細管間質障害が重要であることは知られているが、間質における浸潤免疫細胞が果たす役割については明らかではない。そこで我々は、尿細管間質障害における免疫学的機序を明らかにするために、数種のノックアウト(KO)マウスを用いて片側尿管結紮モデル(UUO)を作製し、結紮腎の組織学的な評価を行った.まず、正常マウスにUUOを作製し、間質浸潤細胞のフローサイトメトリーを行ったところ、このモデルにおける浸潤細胞は主としてマクロファージであることが示された。また、CD4KOまたはCD8KOマウスにUUOを作製したところ、対照マウスと比較して腎組織像に差は見られなかった。これらの結果からUUOモデルにおいてはT細胞よりマクロファージが重要な役割を果たしていると考えられた。ところが、ヌードマウスにUUOを作製すると、対照マウスに比較して尿細管間質病変は明らかに軽度であり、やはりT細胞を含めた細胞性免疫、即ちTh1細胞がマクロファージを活性化する系が何らかの関与をしていることが示唆された。Th1細胞のエフェクター分子としてTNF-αが重要であるため、T細胞以外の骨髄由来細胞(マクロファージや多核白血球)がTNF-αレセプターを持たないマウスを、胸腺摘出(ATX)とTNF-αレセプターKOマウスの骨髄移植にて作製し(ATX-BMキメラマウス)、UUOの組織病変を検討したところ、対照マウスに比べ病変がやや軽度であった。以上のことから、尿細管間質病変においてはT細胞から分泌されたTNF-αなどのサイトカインが骨髄由来細胞-主としてマクロファージ-を活性化することが病変の進行に重要な役割を果たしていると考えられた。1.マウスにおける尿細管間質障害モデルの作成:ノックアウトマウスを用いた尿細管間質障害の検討の為に、我々が従来用いてきたアドリアマイシン静注によるネフローゼ発症後腎不全に至るラットモデルのマウス(C57bl/6)への応用を検討した。マウスはラットに比較してアドリアマイシンに耐性が高く、ラットの4倍量(10mg/kg×2回)の投与にてタンパク尿が出現し20mg/kgに容量を増加すると急性腎不全を発症した.マウスにおけるモデル作成には10-15mg/kgが適当と考えられた.2.CD8ノックアウトマウスに尿細管結紮モデルを作成した予備実験では対照マウスと同様の変化が観察され、CD8細胞の尿細管間質障害への関与は小さい事が示唆された.3.CD45ノックアウトマウス(CD45KO)における検討:CD45は膜貫通型チロシン脱リン酸化酵素で、T細胞レセプターを介したシグナル伝達を担うことによりリンパ球の活性化を制御している.このCD45をノックアウトしたマウスにおける腎組織を経時的に検討した.(1)CD45KOマウスの腎臓には生後3週より糸球体のメサンギウム領域に顆粒状の免疫グロブリン(IgA,IgG,IgM)の沈着が認められ、60週まで持続した.電子顕微鏡にてelectrondense depositが傍メサンギウム領域に認められた。(2)光学顕微鏡にてメサンギウム領域の拡大が認められた、しかし60週においても糸球体硬化、尿細管間質線維化は認められなかった.(3)正常C57bl/6マウスへのCD45KOマウスリンパ球の移入実験にて、糸球体における上記同様の病理変化が認められ、リンパ球活性化制御異常が上記の病変をもたらすことが確認された.CD45KOマウスはヒトのメサンギウム増殖性腎炎(IgA腎症)に類似した新たなモデルマウスとなると考えられた.

さらに糸球体への免疫グロブリンの沈着と腎病変の糸球体硬化・間質線維化への進行とは異なる機序が働いている事も示唆された.1.尿細管間質障害モデルの作成ノックアウトマウスの尿細管間質障害の検討のために、まず正常マウスに片側尿管結紮を行うことにより尿細管間質障害モデルを作成した.このモデルでは間質の線維化および著明な細胞浸潤が認められたため、この浸潤細胞の種類を同定する目的でフローサイトメトリーを行った.細胞表面抗原としてCD3(T細胞)、Mac-1(マクロファージ)、Gr-1(顆粒球)を用いた結果では、対照マウスに比較してCD3陽性分画の細胞の増加は見られず、CD3陰性、Mac-1陽性、Gr-1陰性の分画の細胞が2倍程度に増加していた.昨年度施行したCD3の免疫染色の結果(陰性)とあわせると浸潤細胞は主としてマクロファージであると考えられた.2. CD4、CD8ノックアウトマウスにおける検討CD8ノックアウトマウスに尿管結紮モデルを作成した昨年度の実験では、対照マウスとの間に明らかな組織学的な差は見られなかった.そこで今回CD4ノックアウトマウスにおいても同様に尿管結紮モデルを作成したが、間質線維化尋尿細管拡張などの点において対照マウスとの間に組織学的に有意な差は見られなかった.またRT-PCRによる腎組織TGF-βmRNAの発現量の比較においても、CD4あるいはCD8ノックアウトマウスと対照マウスとの間には有意な発現量の差は認められなかった.したがってこのモデルにおいてはCD4、CD8T細胞の尿細管間質障害への関与は小さいことが示唆された.3. CD45ノックアウトマウスにおける検討CD45ノックアウトマウスではT細胞レセプターを介したシグナル伝達が障害されていると考えられる.現在、このマウスに片側尿管結紮を行って尿細管間質障害モデルを作成し、対照マウスとの間で組織学的にその差違を検討している段階である.1)ヌードマウスにおける尿細管間質障害モデルの検討マウスに片側尿管結紮を行うことにより作成した尿細管間質障害モデルにおけるフローサイトメトリーの結果では、尿細管間質への浸潤細胞はT細胞ではなく主としてマクロファージではないかと推測された.そこでこの疾患モデルにおけるT細胞の関与について確認する目的で、胸腺形成が欠損しているためにT細胞が産生されないヌードマウスに片側尿管結紮を行い、その組織病変について検討レた.この結果ヌードマウスでは正常マウスに比較して組織病変(尿細管の拡張、間質細胞浸潤及び線維化)が軽度であった.したがってこの疾患モデルでは細胞性免疫がやはり何らかの関与をしている可能性が示唆され、特にTH1細胞がマクロファージを活性化する系の関与が考えられた.そこでTH1細胞のエフェクター分子として重要なTNF-αとIFN-γの作用をブロックした状態で病変がどう変化するかを迫加検討することとした.2)マクロファージを除去したマウスにおける尿細管間質障害モデルの検討この疾患モデルにおける尿細管間質への浸潤細胞が主としてマクロファージであり、これが尿細管間質病変の形成に重要な役割を果たしているとすれば、これを抑制すれば病変が軽減する可能性がある.そこでCl_2MDP含有リポソームの投与によりマクロファージを除去したマウスに同モデルを作成し、細胞浸潤の程度と線維化病変について組織学的に検討した.この結果ではコントロールマウスと明らかな差は認められなかった.
ビシクロNHC配位子を基盤とした高活性金属触媒の開発

一般的に嵩高い窒素上置換基が導入されるNHCであるが、我々のビシクロNHC配位子は非カルベン炭素上の嵩高いビシクロ骨格が特徴である。本研究ではこの配位子群を遷移金属触媒へ応用し、その特性を調査した。銅触媒では芳香族ブロミドのホウ素化への応用に成功した。その際、立体的に嵩高い基質に対して特に高い有効性を示し、高い安定性と接近容易な活性中心という相反する性質を両立していることが示唆された。ニッケル触媒では第三級アルキル求核剤を用いた熊田-玉尾-コリューカップリングに有効な反応系を確立した。更に取扱容易な触媒前駆体の開発にも成功し、鈴木-宮浦カップリングへの有効性を示した。申請者が独自に設計したビシクロ環を非カルベン炭素上に配置したN-ヘテロ環状カルベン(NHC)配位子は、活性中心を非カルベン炭素上に設けた遮蔽によって保護する事が特徴であり、これまでのNHCに盛んに用いられて来た活性中心近傍に位置する窒素上の置換基を用いて活性中心を遮蔽する設計とは異なる反応性を見せる事を期待した。まず、ビシクロNHC配位子を銅錯体とし、触媒能を評価した。その結果、銅の触媒するハロゲン化芳香族のホウ素化反応へ適用すると既存のNHC配位子群をしのぐ活性を示す事を見出した。特にオルト位に置換基を有する嵩高い基質に対する反応性では顕著な差が見られ、ビシクロNHC配位子が活性中心に反応場となりうる空間を広く確保出来ている事が示された。更に安定な銅錯体の作成にも成功し、結晶構造も明らかとした。本銅錯体は窒素上には比較的小さなイソプロピル基を配しているにも関わらず室温空気中で安定であり、骨格に備えたビシクロ骨格によって高い安定性を享受しているものと考えられる。銅触媒と並行して、ニッケル触媒へ応用し、第三級アルキルGrignard試薬とブロモアレーンとのカップリング反応を効果的に触媒する事を見出した。ビシクロNHC配位子が他の配位子よりも触媒量低減に有効であり、本結果もビシクロ骨格の効率的な遮蔽効果によってもたらされているものと考える。さらに、本反応系に置ける副反応を制御出来る共溶媒も見出した。現在メソ骨格を非対称化した不斉配位子の合成経路も確立し、ライブラリーを構築しながら、各種不斉反応への適用を試みている。メソ型の配位子を活用した銅錯体およびニッケル錯体がそれぞれホウ素化反応、第三級アルキル基導入反応に有効である事を見出した。それぞれの反応において我々が独自に開発した配位子が一般的なNHC配位子よりも高い触媒活性を示し、安定性が高い事を明示する結果を得た。さらに既存のNHCが比較的苦手とする嵩高い基質における反応性が高い事を見出し、独自の配位子設計によってこれまでの設計では困難である反応を実現しうる可能性を見出した。メソ型骨格の非対称化に基づいたキラルな配位子の合成経路も確立し、ライブラリー構築および不斉反応への予備的な適用も開始した。以上、メソ型配位子の特徴を生かした反応開発およびキラル配位子の予備的検討という初年度の計画は概ね達成されていると判断した。本研究では申請者が独自に開発したNHC配位子の立体的特性を生かした高活性金属触媒の開発を目指している。前年度迄に銅錯体を用いて、触媒の安定性と効率を上昇させる嵩高さと、接近を妨げない空いた反応場、という相反する二つの性質を併せ持つという特徴を明らかとした。さらにニッケル錯体を用いた第三級Grignard試薬の熊田ー玉尾ーコリュー(KTC)反応において有効な性質に対する端緒も得ていた。本年度は、KTCカップリングにおいては遷移状態からのベータ水素脱離を抑制する共溶媒としてN-methyl-2-pyrrolidoneが有効である事を見出した。また確立した反応条件においては一般的なNHC配位子の一つであるICyも同様に有効である事も見出したが、我々の配位子を用いた場合は5分の1の触媒量でも有効に機能する事が分かり、銅触媒と同様にニッケル触媒においても高い安定性を付与する機能を発揮している事が明らかとなった。次いで、NHC-Ni触媒の安定前駆体の開発にも応用を展開した。NHC-Ni触媒前駆体として有望である[(NHC)CpCl]錯体に我々の配位子を応用した。得られた錯体の立体構造を明らかとした後、鈴木ー宮浦反応に適用し、既存の類似錯体では実現が困難だった電子豊富で立体的に嵩高い基質を用いた反応を実現した。その際、補助配位子としてトリフェニルフォスフィンが副反応の抑制と反応の加速に有効である事を見出し、0.25mol%の触媒量で10グラムの反応成績体を得る事にも成功した。また、不斉反応場の構築における検討では、二つの反応系において有効なLewis塩基性側鎖を導入した配位子ライブラリー構築を行い、各々の系において85%eeを超える高い不斉収率を得る事が出来る配位子の合成に成功し、反応条件の最適化や基質一般性の確認を今後行う予定である。メソ型の配位子を用いた銅錯体同様にニッケル錯体が、安定性や触媒効率が高い事を見出した。本年度は、制御が困難とされる第三級アルキル置換基を導入する熊田ー玉尾ーコリュー反応、さらに安定なNHC-ニッケル触媒前駆体の開発ならびに鈴木カップリング反応への応用にも成功した。これら二つの成果は論文にて報告した。