hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回転成形による傾斜構造と粒子分散構造を有するプラスチック材料の開発

本研究では、近年の消費傾向である多品種小ロットの生産に適した生計方法である回転成形法を用いて、粉体の流動性や付着性を制御することで、厚み方向の層構造が異なる成形体を得ることを試み、さらに成形体の力学特性を層構造に基づき解析した。その結果、以下のことが明らかになった。結晶性高分子の場合、付着開始温度は材料中の結晶の融点とほぼ一致した。付着性の異なる2種の粉体を用い、その成形条件を選択することで、厚さ方向に異なる層構造を有する成形体を得ることができた。層構造を制御することで、同一組成でありながら幅広く固さや変形挙動の異なる材料を作製することができた。異なる層構造を持つ試料のヤング率は、高柳モデルを元に構築した力学モデルで記述できた。回転成形過程中の粉体の転動過程や付着過程、緻密化過程等をその場観察する目的で、総ガラス製の一軸回転成形機を製作した。また、この回転成形機を用い、ポリオレフィン系の粉体の付着過程をその場観察することで、粉体が型壁面に付着し始める温度は、示唆走査型熱量測定で決定した粉体の融点や動的粘弾性測定で決定した流動開始温度と対応していることを見出した。さらに、付着温度の異なる2種のポリエチレン系粉体を同量混ぜて成形したところ、成形条件によって、厚み方向に異なる層構造が発現することを発見した。2種の粉体を順番に加えた場合、加えた順の2層構造が発現した。また、2種の粉体を同時に加え、2種の粉体の付着開始温度以上の温度で成形した場合は、海島構造を有する1層構造が発現した。さらに、2種の粉体を同時にくわえ、2種の粉体の付着開始温度間で一定時間成形したのち、さらに温度を上昇させて成形する条件では、成形体は3層構造を形成した。さらに、2種のブレンドの成形体を一軸延伸測定を行ったところ、成形体の力学特性は、各々の成分単体の力学特性の中間の性質を示すものの、その応力レベルは、層構造により大きく異なった。また、ブレンドの成形体の弾性率は、その層構造に対応する幾何学的な和で表すことができるとする高柳モデルの推算値と完全に一致した。以上より、粉体の付着温度と成形時の温度プロファイルを制御することで、同組成でありながら異なる層構造を有し、異なる力学特性を示す成形体が得られることが明らかとなった。前年度同様、ガラス製の成形型を用いて付着温度の異なる2種の粉体を同量混ぜて成形した。前年度はゴム系とプラスチック系のポリエチレン系材料を選択したが、本年度では、近年注目されているポリプロピレンとポリエチレンを用いた。前年度同様、成形条件によって厚み方向に異なる層構造が発現した。さらに、2種のブレンドの成形体を一軸延伸測定を行ったところ、成形体の変形初期の力学特性は、各々の成分単体の力学特性の中間の性質を示すものの、その応力レベルは、層構造により大きく異なった。しかしながら、すべての試料でポリプロピレンの降伏後、試料は破断した。これは、降伏時おける各相の体積変化のミスマッチによるものであると考えられる。一方、二相間の界面には強固な結合はなくとも、二種の粉体を同時成形することで、延伸時において層間はく離がほとんど生じないレベルの接着性を付与することができた。これは、粉体レベルでの混合ののち溶融されることで、表面に互いに間入しあった構造を形成し、強固なアンカー効果を生じさせるためであり、回転成形特有のものであることがわかった。回転成形は、金型を惑星運動させてゆっくりと加熱状態で回転させながら、金型に溶融した高分子流体を埋め込ませる手法であり、大型の成形体を製造する上で、最適な手法である。電気自動車のボディーなど、プラスチック系成形体の大型化が注目される中で、最近注目を浴びている。本研究では、われわれの研究室で作成した小型の一軸型の回転成形機を用いて、新しいタイプのブレンド材料の調製を試みた。その中で、この比較的ゆっくりと成形させるという特徴を利用して、本来混ざらないものを混ぜることが可能であることを実証した。

実際には、無極性でプラスチック状のポリエチレン(PE)と極性でゴム状のエチレンメチルメタクリレート(EMMA)樹脂をもちいた。PEの融点とEMMAのガラス転移温度を軸にして、さまざまな温度条件下で回転成形を行いPEマトリック中にEMMA分散状態が大きくことなるさまざまな形態を持つマクロ相分離したポリマーブレンドの調製に成功した。従来のEMMAとPEのブレンドでは、非相溶のため界面の付着性が弱くさらに綺麗に分散できなかった。しかしながら、本回転成形の手法をもちいれば、例えば、数100ミクロンの球状のEMMAを分散させたり、表面から傾斜的にコンポジット相を変化させたり、また完全に2層が貼りあわされたラミネート系のアロイを調製することができた。これは、サブミリオーダーで均一に分散した新しいポリマーブレンドで界面がしっかりとしていることにより、力学物性を大きく変化させることができた。
SITスペクトロビデオヘリオグラフによる太陽面微細磁場の観測研究

1.円偏光観測装置の開発と検定飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡(DST)の垂直分光器用高消光比円偏光解析装置を設計・製作した.本装置は,一次水晶位相板と消光比10^<-5>の直線偏光板を円偏光検出素子とし, SITスペクトロビデオヘリオグラフを受光子とする二次元円偏光成分抽出画像装置である.副次的に純度検定用のウオラストン・プリズムも備えている.現在, DSTの器械的偏光特性の解析を進めているが,従来懸念されていた真空望遠鏡の入射・射出窓の圧力変形による器械的偏向は,本装置の精度では無視できる程度であるが, DST第2・第4鏡による偏光の抜本的補償が必須であることが判った.2.太陽面微細構造の観測的研究DSTにより継続的に観測研究されており,今年度も多くの「若い」双極磁場の浮上事例が観測された.これらの「前駆兆候」がSITスペクトロビデオヘリオグラフによる磁場(円偏光)観測により,どこ迄遡って検出可能か,現在,解析中である.また,太陽静穏領域の微小強磁場域の発見に関しても得られたデータの解析と検定を進めている.3.画像取得・処理系の開発と充実本研究では,リオ・フィルター(狭帯域複屈折干渉フィルター)によるHx単色画像を同時に撮ることが必須であるが, DST附設の西独ツァイス社製Hαフィルター用のプログラマブル・リモートコントロール装置を開発し,実用に供した.これによりHα画像の逐次波長による自動観測が可能となり,磁気鋭敏線によるSITマグネトグラムとの比較データが高密度で得られるようになった.また,今年度飛騨天文台に導入されたVAXシステムに花山天文台の画像処理システム「KIPS」の一部を移植し,現在,総合処理を進めている.1.円偏光観測装置の開発と検定飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡(DST)の垂直分光器用高消光比円偏光解析装置を設計・製作した.本装置は,一次水晶位相板と消光比10^<-5>の直線偏光板を円偏光検出素子とし, SITスペクトロビデオヘリオグラフを受光子とする二次元円偏光成分抽出画像装置である.副次的に純度検定用のウオラストン・プリズムも備えている.現在, DSTの器械的偏光特性の解析を進めているが,従来懸念されていた真空望遠鏡の入射・射出窓の圧力変形による器械的偏向は,本装置の精度では無視できる程度であるが, DST第2・第4鏡による偏光の抜本的補償が必須であることが判った.2.太陽面微細構造の観測的研究DSTにより継続的に観測研究されており,今年度も多くの「若い」双極磁場の浮上事例が観測された.これらの「前駆兆候」がSITスペクトロビデオヘリオグラフによる磁場(円偏光)観測により,どこ迄遡って検出可能か,現在,解析中である.また,太陽静穏領域の微小強磁場域の発見に関しても得られたデータの解析と検定を進めている.3.画像取得・処理系の開発と充実本研究では,リオ・フィルター(狭帯域複屈折干渉フィルター)によるHx単色画像を同時に撮ることが必須であるが, DST附設の西独ツァイス社製Hαフィルター用のプログラマブル・リモートコントロール装置を開発し,実用に供した.これによりHα画像の逐次波長による自動観測が可能となり,磁気鋭敏線によるSITマグネトグラムとの比較データが高密度で得られるようになった.また,今年度飛騨天文台に導入されたVAXシステムに花山天文台の画像処理システム「KIPS」の一部を移植し,現在,総合処理を進めている.
東アジア諸河川の水文資料集の作成とその水文学的特性に関する比較研究

本年度は、日本国内の主要河川(109水系)の水理・水文特性の把握,資料収集および水文資料集作成のための(1)調査研究態勢の確立、(2)今後の研究方針の決定、および(3)既存資料の収集・現地調査を行った。その成果を要約すると以下のようである。今後10年間を目標に日本全国109水系の水文資料集を作成する(一冊/一水系)。最終的な水文資料集には、治水・利水に関する情報のみならず文化、管理組織、レジャー等の様々な観点からの情報が集約されることから、調査研究のキーパーソンとして、本研究組織の構成員、全国のリバーカウンセラ-、地方の若手大学研究員、郷土史家、国、地方自治体の河川管理者等が共同でこれにあたることに決した。各水系ごとに適任者を選定し、定期的な研究会・意見交換会・現地調査を計画的に行う。情報源には国、地方自治体の河川管理者が有する資料・パンフレットや郷土史、書籍、観光情報等の既存資料をあて、それらの体系化を図る。なお、研究代表者の山田は、河川情報公開に関する検討委員会(建設省)委員長であり、こられの情報収集は、情報公開の一環として行われるものである。水文資料集の作成に際しては、情報の質に応じて書簿体とするか、電子情報(インターネットによる公開)に止めるかの選定を行うが、原則的には全て書籍体とする。内容・様式については、全国一律とはせずに努めて地域色を盛り込んだ形で編纂するものとする。
高圧下における近藤絶縁体の輸送現象(ホール効果、電気抵抗)

本研究対象の近藤絶縁体CeRhSbはCeNiSnと共に低温でエネルギーギャップのが開くのに伴う諸物性の大きな変化を生ずる。特にホール効果は著しい変化を生じ重要な知見を与える有用な研究手段である。本研究ではCeRhSbのホール効果が全温度範囲で正であり且つ低温ではエネルギーギャップが開くのに伴う急激な増大を見いだした。本研究ではこの点について電気抵抗と比較して下記のような著しい相違を見いだした。まず電気抵抗ではすでに次のことが知られている:多結晶試料(1)、Mo坩堝で作成したより純良な試料(2)、およびW坩堝で作成した最も純良な試料(3)の3種類の試料について低温での電気抵抗の増大は(1)では最も急激であるのに対し(2)と(3)の単結晶試料ではそれより1桁以上も小さく、しかも(2)より(3)の方が少ない。即ち試料が純良になるほど予想に反し、低温での電気抵抗の増大はかえって小さくなると言う結果が得られている。これに対し、本研究でのホール効果の測定からは次のような結果を得た:第一に(1)の試料及び本研究で作成した試料を含め多結晶試料では(2)、(3)の単結晶試料と低温での急激な増大は殆ど同じオーダーであること。第二に大きな異方性が見られることであり、I//a,H//bの方位の単結晶試料では他の方位の単結晶試料のものより3倍の大きい。第三に異方性の順序であるが、単結晶試料による各方位に対するホール効果の大きさの順序はすでに知られている帯磁率の異方性順序とは異なっていて関連性がないことである。これらの結果から不純物の影響はホール効果においては電気抵抗の場合よりかなり少なく、従って不純物の局在の機構は考え難いと思われる結果を得た。以上の結果は昨年末の重点領域研究会において発表を行った。本研究の手段である高圧下での実験はCeRhSbについて上記の結果をふまえた有益な結果が期待される。ただ実験中に高圧ボンベの予期せぬトラブルの為実験が遅れて本報告には間に合わなかった。現在高圧下の実験は続行中であり近いうちに結論を出す予定である。
ラフパス解析の視点に立った確率微分方程式の解の近似に関する研究

本年度は、多次元の非整数Brown運動により駆動される確率微分方程式の解に対してEuler-丸山近似を考え、その誤差過程の研究を行った。具体的には、誤差過程が一種の中心極限定理を満たすという予想を示すことを目標に研究を進めた。昨年度に得られた「重複積分の差の漸近挙動に関する結果」と「摂動法を用いた誤差解析」を合わせることで先の予想を証明するという方針をとったが、技術的な問題が解決できずに目標を達成することはできなかった。しかし、研究の過程において、予想が相当程度の信頼性を持つことがわかった。以下、詳しく説明していく。摂動法について説明する。摂動法とは、「解の近似過程を元の確率微分方程式の駆動過程を少しずらした確率微分方程式の解として表すこと」がアイデアである。特にずらしとして折れ線を考える。このアイデアは、「誤差過程をもとの確率微分方程式の解の折れ線方向へのMalliavin微分を用いて表す」とも言い換えることができる。昨年度は、この方法により、1次元の確率微分方程式の解の近似の誤差過程に対する極限定理を示した。このアイデアを実行する際には、「どのような折れ線を使えば良いか」が問題となる。特に、適切な折れ線の存在や表現が重要となる。しかし、現段階においては、技術的な困難により折れ線を厳密に構成することは出来ていない。一方で、折れ線の候補となるものの具体的な表示が得られており、そこには重複積分の差が現れる。重複積分の差が現れることは別の形式的な計算からも導かれる。この意味において予想の信頼度が上がったと言える。以上のように、非整数Brown運動により駆動される確率微分方程式の解に対するEuler-丸山近似の近似誤差の漸近挙動を調べる研究を本年度中に完成しなかったことは大変に残念であるが、最終的な段階を迎えているように見える。引き続き研究を行い、結論を導きたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は次の(A)と(B)の結果を得た.(A) Coutin-Qianの条件を満たすGauss過程により駆動されるd次元確率微分方程式の解をWong-Zakai近似を用いて近似した場合の収束の速さの上限を決定した.さらに,非整数Brown運動の場合にこの収束の速さが下限であることを示した.これら結果により,Wong-Zakai近似の誤差の収束の速さを決定することができた.この研究は研究計画の第1ステップであり,Wong-Zakai近似の重み付誤差の収束の証明という最終目標に対して一歩前進した.(B)1次元非整数Brown運動によって駆動される1次元確率微分方程式の解に対して,Euler近似,Milstein近似,Crank-Nicholson近似により近似解の列を構成し,近似手法ごとに最適な収束の速さを決定し,さらに,重み付誤差の0ではない収束先を決定した.本研究は先行研究とは異なる手法(以下,摂動法)を取ることで重み付誤差の収束先を解の方向微分を用いて表示した.この結果は,Neuenkirch-Nourdin(2007), Gradinaru-Nourdin(2009), Naganuma(2015+)を統一的に扱い,さらに拡張する.先行研究では確率微分方程式の解の表示から誤差評価を行うが,ドリフト項が0でない場合に,解の表示から誤差の解析を行うことは容易ではない.とくに近似手法として,Milstein近似やCrank-Nicholson近似などを採用した場合には計算を実行することは困難である.1次元ではあるが,ドリフト付確率微分方程式の近似解の挙動が分かったことは大きな進展であった.また,本研究は他の近似手法に対しても適用が可能であり,今後の進展が期待される.本研究は会田茂樹氏(東北大学)との共同研究である.本年度は、多次元の非整数Brown運動により駆動される確率微分方程式の解に対してEuler-丸山近似を考え、その誤差過程の研究を行った。

以上のように、非整数Brown運動により駆動される確率微分方程式の解に対するEuler-丸山近似の近似誤差の漸近挙動を調べる研究を本年度中に完成しなかったことは大変に残念であるが、最終的な段階を迎えているように見える。引き続き研究を行い、結論を導きたい。当初は,d次元確率微分方程式のWong-Zakai近似を用いた近似解に関して,重み付誤差の収束まで調べる予定であった.しかし,当初のアイデアではそこまで調べること難しく,収束の速さを決定するにとどまった.一方で,1次元確率微分方程式の近似解の性質の摂動法を用いた研究が進んだ.これは当初想定されていなかった研究ではあるが,重み付誤差の収束を調べるという研究の趣旨に合致する.1次元ではあるがドリフト項のついた確率微分方程式の解の近似に関してその重み付誤差の収束が得られたことは大きな進展であった.27年度が最終年度であるため、記入しない。確率微分方程式の近似解の誤差の研究を摂動法を用いて進める.まずは,1次元の場合の研究を完成させる.本年度に得られた結果では,拡散係数の楕円性の仮定の下で重み付誤差の収束を示した.先行研究においては,楕円性の仮定を外した場合の結果も得られている.この状況を鑑みれば,拡散係数の楕円性の仮定なしで結論が成り立つという予想が立つ.まず,1次元の場合に,楕円性に関する仮定を外し,理論を完成させる.つぎに,摂動法を用いた多次元の確率微分方程式の近似解の誤差の研究を行う.今年度に行った1次元確率微分方程式への摂動法の適用により,この手法が多次元の確率微分方程式の近似解の誤差の研究にも応用可能であるという見通しがたった.最大の理由は,解の表示を用いずに誤差の研究ができるという点にある.多次元の場合には一般には解の表示が得られないため,従来1次元のときに行われてきた研究を応用することができない.もし,この研究が成功すれば,Wong-Zakai近似の重み付誤差の収束にも貢献すると考えられる.27年度が最終年度であるため、記入しない。
「PrPC→PrPSc」変換機構とプリオン構築原理のβへリックスモデルからの解析

βへリックス構造を有するP. anserina由来のHet-s蛋白質、E. coli由来のLpxA蛋白質およびlacA蛋白質のそれぞれの遺伝子をクローニングし、これらの蛋白質の立体構造中でβへリックス構造を形成することが知られている部分を幾つか系統的に選び、そのcDNAをマウスの正常型プリオン蛋白質(PrPC)のcDNAへ移植・置換した。また、当初の計画には無かったが、ニワトリ・PrPCとマウス・PrPCの種々のキメラ蛋白質遺伝子(キメラcDNA)を作製した。次いで、マウス馴化プリオンが感染してPrPCから異常型プリオン蛋白質(PrPSc)への変換が持続的に起きているマウス培養細胞(神経芽細胞腫由来)へこれらのcDNAを導入して発現させ、プリオン感染細胞が有する「PrPCからPrPScへの変換能・変換機構」において、発現させた置換体やキメラ体が基質となってPrPSc様の蛋白質凝集体を形成するか否かを調べた。これまでの実験の結果、マウス・PrPCの112から155番目の44個のアミノ酸をニワトリ・PrPCの126から169番目のアミノ酸を配列で置換したキメラが、全長のアミノ酸配列がマウス型のPrPCがPrPScへ変換される効率より低いものの、プロテアーゼK消化に対して抵抗性の凝集体を形成することがわかった。この実験とは別に、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンに対して光架橋反応(Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96: 6020)を試みたところ、プリオンの凝集体構造を考察する手がかりとなる実験データが予想外に得られた。計画どおりにβへリックス含有蛋白質のcDNAクローニングを完了し、移植・キメラ遺伝子を作出した。また、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンを対象として光架橋反応を試み、予想外の興味深い結果を得た。当初の計画に沿って、作製した移植・キメラ蛋白質遺伝子をプリオン持続感染細胞に発現させ、感染細胞が有するPrPC→PrPSc変換能において、人為的に導入したβへリックス等のアミノ酸配列がどのように振る舞うのかについて引き続き系統的に検討する。また、キメラ蛋白質遺伝子を大腸菌や昆虫培養細胞で発現させ、アミロイド凝集体を形成するキメラ蛋白質をチオフラビンTの蛍光染色、プロテアーゼKへの抵抗性、によりスクリーニングしたい。研究計画時には、以上の結果をin vivo実験(マウスへの投与により内在PrPCの凝集が誘起されるかという点の検証)へ繋げたいと考えていたが、その後の情報収集・考察からin vivo系が必ずしも適した実験手法ではないことも考慮される。In vivo系が適さないと判断される場合には、計画書に述べたin vitro系を活用した検討へ繋げる。また前年度において、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンに対して光架橋反応を試みた。次年度も、この光架橋反応や化学反応に基づく解析を進めて、プリオンはどのような凝集状態のPrPScによって構築されているのかという点について、生化学的データに基づく考察を深める。

研究計画時には、以上の結果をin vivo実験(マウスへの投与により内在PrPCの凝集が誘起されるかという点の検証)へ繋げたいと考えていたが、その後の情報収集・考察からin vivo系が必ずしも適した実験手法ではないことも考慮される。In vivo系が適さないと判断される場合には、計画書に述べたin vitro系を活用した検討へ繋げる。また前年度において、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンに対して光架橋反応を試みた。次年度も、この光架橋反応や化学反応に基づく解析を進めて、プリオンはどのような凝集状態のPrPScによって構築されているのかという点について、生化学的データに基づく考察を深める。本年度中に論文掲載に至らなかったため、論文掲載費の予算額が未使用となった。また、研究計画書申請時には開催地が未公表だった学会(アジア太平洋プリオン研究会)が都区内で開催されたため、旅費が不要となった。予備実験の段階において、既製の蛋白質電気泳動ゲルの代わりに自製品の適宜使用、プラスチック製品の再利用、等により消耗品費(物品費)の支出を抑えることができた。使用計画:論文掲載費および試薬などの消耗品費として使用する。
タンパク質相互作用による細胞内塩基除去修復の制御機構

増殖細胞に比べて、増殖停止MEFはMMS抵抗性だが、メチル化塩基除去能は低かった。BER関連タンパク質発現量とメチル化塩基除去効率との関係では、増殖停止MEFやPolβ欠損MEFのAPEXタンパク質量は、WTより低く、MPG量およびPCNA量は、Polβ欠損細胞や増殖停止細胞で大きく低下していた。MPGと相互作用をする13のタンパク質を新たに同定した。このうち、MPGとRPA2との結合は、MMSによるDSB形成に伴って、減少した。DSB形成後のリン酸化により、MPGはRPA2と共局在し、DSBの発生に伴って、PI3K関連キナーゼの作用により解離することを示唆している。本研究は、メチルプリングリコシラーゼ(Mpg)によって開始される塩基除去修復(BER)の制御機構の解明を目的としている。マウス胎児線維芽細胞(MEF)のPolβ欠損株(Polβ-KO)中のBERを野生株(WT)のアルキル化剤(MMS)処理直後の生存率を検討した結果、WTとPolβ-KOの対数増殖(log)期とG0期におけるED50の比はほぼ変わらず、G0期においてもPolβ依存性BERが重要であった。log期のWTとPolβ-KO MEFでは、Polβ-KOにおけるAPE1のmRNA発現はWTの50%以下に抑制されていたが、G0期では差が見られなかった。他のBERタンパク質の発現はWTとPolβ-KOに差は見られず、log期ではPolβ-KO内MpgとApexは著しく減少していた。Polβ-KO中のAPEの減少は、mRNAの発現低下と相関するが、MPGでは分解の更新が示唆される。2から5mM Mg2+存在下で、PolβによるApex活性増強効果が観察された。増強効果は、Apexのturnover rateが最大となる10mM以上のMg2+下では消失したので、生理的Mg2+濃度でのPolβによるApexのturnover増加が示唆された。Polβ-KO /Apex-KD MEFはApex-KD MEFに比べて、高いMMS感受性を示した。免疫共沈法のためにマウスMEFを用いてFLAG-MPG発現系を構築して、MEF抽出液との共沈実験条件を検討している。ヒト精製組換えGST-MPG用いたHeLa細胞抽出液のプルダウン産物と、GST-MPG発現HeLa細胞抽出液のプルダウン産物について質量分析法によりGAPDHをはじめ複数のタンパク質が同定された。本研究はメチルプリングリコシラーゼ(MPG)によって開始される塩基除去修復(BER)の制御機構解明を目的としている。アルキル化剤(MMS)処理後、マウス胎児線維芽細胞(MEF)のPolβ欠損株(Polβ-KO)のBERを野生株(WT)のそれと比較した。Polβ-KOでは、Polβに加えてMpg、ApexおよびPCNAが著しく低下していたため、修復中間体である脱塩基(AP)部位数もWTに比べて有意に少なかった。また、処理24時間後の残存メチル化塩基数は、有意に多かった。Polβ-KO下のlong-patch修復の寄与を、その必須酵素であるFen1を二重にノックダウンしたPolβ-KO/Fen1-KD細胞により検討した。得られたFen1-KD細胞およびPolβ-KO/ Fen1-KD細胞のいずれにおいてもFen1は検出されなかった。Fen1-KD細胞ではFen1-KD細胞ほど顕著ではないが、MS感受性の有意な増加が観察された。一方、Polβ-KO/ Fen1-KD細胞は、Polβ-KO細胞と同程度の感受性であった。Polβ-KO細胞では、BER関連たんぱく質の著しい低下があることから、long-patch修復の寄与も少ないと考えられる。この結果は、コメットアッセイによる両者のBER中間産物量にも差がなかったことと一致する。これに対して、作成したApex-KD細胞のMMS感受性の増加は高濃度領域でのみ見られたのに対して、Polβ-KO/Apex-KD細胞では、Polβ-KOに比べて低濃度領域から有意な感受性増加が認められた。したがって、Apexは、Pol&#61538;関与BERにおけるとは別個の機能を担っていることが考えられる。FLAG-Mpgの強制発現MEFを用いたMpg結合性タンパク質のLC/MS解析により、新たにp53、Rpa1、Rpa2およびHsc70が同定された。N-methylpurine DNA glycosylase (MPG)は、脱アミノやアルキル化プリン塩基などを除去し、突然変異を防止している。本年度の研究では、MPGと細胞内タンパク質との相互作用に基づくBERの制御について、以下の知見を得た。1)ApexノックダウンMEFはMMS感受性の増加が認められたが、Polβ-KO細胞ではより高いApexノックダウンレベルと、MMS感受性増大が認められた。2増殖停止細胞においてBER効率の有意な低下がある一方、MMS生残率はPolβの有無によらず、Wild type細胞に比べて有意に高く、MMSの致死作用は主としてBER中間産物由来のDSBの形成によると考えられる。3)FLAG-MPDをMEFに強制発現し、MMS処理時のMPG複合体領域に集簇するタンパク因子の解析を行った。FLAG-MPGと共沈したタンパク質をSDS-PAGEゲルより回収し、LC-MS/MSにより解析した結果、13種の新奇タンパク質が同定された。このうちDNAJA1、MLH1やproteosome関連因子を含む7種はMMS処理後に結合が増加し、HSC70など含む

5種の共沈にはMMS処理の影響が見られなかった。MMS処理により結合が減少したものは、既知のPCNA以外にRPA2のみが同定された。そこで、MMS処理に伴う、HSC70、RPA2に加えて、MPGとの結合が知られているp53およびPCNAとの結合の変化を調べた結果、MMS濃度(0.250.75 mM)依存的にDSB形成を示すγH2AXが検出された。また、PCNAおよびRPA2の共沈量はMMS濃度に依存して減少し、p53の共沈量は増加した。これらのMMS依存性変化は、同レベルのγH2AXの形成が起こるMMS濃度で比較した場合、Polβ-KO MEFでは大きく減少した。増殖細胞に比べて、増殖停止MEFはMMS抵抗性だが、メチル化塩基除去能は低かった。BER関連タンパク質発現量とメチル化塩基除去効率との関係では、増殖停止MEFやPolβ欠損MEFのAPEXタンパク質量は、WTより低く、MPG量およびPCNA量は、Polβ欠損細胞や増殖停止細胞で大きく低下していた。MPGと相互作用をする13のタンパク質を新たに同定した。このうち、MPGとRPA2との結合は、MMSによるDSB形成に伴って、減少した。DSB形成後のリン酸化により、MPGはRPA2と共局在し、DSBの発生に伴って、PI3K関連キナーゼの作用により解離することを示唆している。リコンビナントGST-Mpgによる、HeLa細胞抽出液中のMpg結合性タンパク質検索により同定されたXRCC1、MBD1およびPCNA等に加えて、FLAG-Mpgの強制発現MEFを用いて新たに4種のタンパク質の同定に成功した。この際、従来用いてきたMALDI/TOFMSに替えて、使用が可能になったLC/MSを解析に用いた。FLAG-Mpg発現MEF抽出液の二次元電気泳動法による解析により、MMS処理後これまでに同定したものに加えて、さらに多くの発現量変化の認められる未同定タンパク質スポットが観察された。これらは同定中である。Apex、Fen1およびPolβノックダウン(KD)MEF株を作出し、さらにPolβ-KO/Apex-KDおよびPolβ-KO/ Fen1-KD MEF株を得て、MMS損傷のBERにおけるその役割について検討を行った。その結果、long-patch BERに必須のFen1がほとんど検出されないFen1-KD MEFでは、MMS濃度1mM以上では、WTに比べてわずかながらも有意な感受性増加を認めたが、Polβ-KO/ Fen1-KD MEFでは、Polβ-KOに比べて有意な増加を示さなかった。この結果より、MEFにおけるlong-patch BERの寄与はPolβ依存性の主経路であるshort-patch BERに比べてはるかに寄与が小さいことが考えられる。これに対して、Polβ-KO/Apex-KD MEFのMMS感受性は低濃度からPolβ-KOに比べて顕著であり、これはPolβ-KOで低下していたApexがさらにApex-KDにより一層著しく低下していたことから、Apexが単に同一の経路に属するPolβの上流タンパクであるという以外の、重要な役割を有することを強く示唆する。
有爪動物カギムシPeripatus心臓の拍動起源と神経支配

有爪動物(Onychophora)カギムシperipatusは環形動物と節足動物をつなぐ幻の動物の近縁動物とも考えられていて、系統進化上で貴重な動物群である。このため比較生理学、神経生物学上興味がもたれる動物であるが、現在までのところほとんど研究されない。本研究では心臓とその神経支配について、主として、すでに調べられてきた周辺の動物群である甲殻類、昆虫類、環形動物、軟体動物との関係のなかで研究を進めることを目的とした。カギムシをオーストラリアに求め、Euperipatoides kanangrensisを取得して研究室で飼育管理し研究に用いた。神経伝達物質または神経修飾物質の面から中枢及び末梢のニューロン構成を明らかにして、ニューロンのマッピングを行うため各種推定伝達物質の抗体を用いて免疫細胞化学的に研究を行った。1.中枢神経系は左右の脳神経節球とそれぞれに続く腹神経索および多数の腹神経索横連合神経からなる。全神経系に亘ってFMRFamide様免疫陽性細胞やそのプロセスを検出した。心臓神経、腸管にも免疫陽性プロセスが認められた。脳神経節中では横連合中に、特に多くの免疫陽性ニューロンが存在した。腸管にも免疫陽性ニューロンの存在が認められた。本研究により有爪動物にFMRFamide様物質が存在するこという最初の知見がえられたことになる。2.神経系全般に亘りセロトニン様免疫陽性ニューロンプロセスが観察された。脳神経節では横連合に陽性プロセスを多く認め、その近くの領域にニューロン細胞体が多く認められた。アンテナには陽性プロセスが認められなかったが、基部の脳糸球体構造に陽性プロセスが観察された。視索には認められなかったが、網膜および視神経節に免疫陽性プロセスが認められた。心臓、輸卵管に免疫陽性プロセスが認められた。これらのことから、セロトニンは感覚、運動神経で神経伝達物質として使われていると推測された。カギムシ(Peripatus sp.)は有爪動物門として分類されている。しかし、かつて環形動物門、節足動物門にも分類上所属したことのある系統進化上問題のある動物である。最近リボゾームRNAの分析から、再びカギムシは昆虫に近縁な節足動物に分類されるべきであるとする説が出された。本研究はこの系統進化上特異な位置を占めるカギムシの特性について生理学的視点から分析することを目的とした。1飼育実験標本としてオーストラリア産カギムシ(Peripatus sp.)を入手した。研究室での飼育を試み、湿度、温度、飼料等の諸条件を試行錯誤的に設定し、現在9ケ月間の飼育を続行できる条件を得た。2組織、免疫細胞化学脳神経節とここから伸びる左右一対の腹神経索を中心として各種推定神経伝達物質抗体を用いてこれらを含有するニューロンの検索を行なった。セロトニン様物質含有ニューロンを脳および神経索上で同定した。グルタミン酸、ヒスタミン、GABAの抗体を用いて同様の実験を行なっている。これらの結果から軟体動物、節足動物との神経機構上の関係を推定する。有爪動物(onychophora)カギムシperipatusは環形動物と節足動物をつなぐ幻の動物の近縁動物とも考えられていて、系統進化のうえで貴重な動物群である。本研究では心臓とその神経支配について、主として、すでに調べられてきた周辺の動物群である甲殻類、昆虫類、環形動物、軟体動物との環形のなかで研究を進めることを目的とした。

神経伝達物質または神経修飾物資の面から中枢及び末梢のニューロン構成を明らかにして、ニューロンのマッピングを行うため各種推定伝達物質の抗体を用いて免疫細胞化学的研究を進める計画をたて、先ず抗FMRFamide抗体を用いて、神経系各所から得たパラフィン切片で検索した。中枢神経系は左右の脳神経節球とそれぞれに続く腹神経索および多数の腹神経索横連合神経からなる。全神経系に亘ってFMRFamide様免疫陽性細胞やそのプロセスを検出した。心臓神経、腸管にも免疫陽性プロセスが認められた。脳神経節中では横連合中に、特に多くの免疫陽性ニューロンが存在した。腸管にも免疫陽性ニューロンの存在が認められた。本研究により有爪動物にFMRFamide様物質が存在するこという最初の知見がえられたことになる。有爪動物カギムシをオーストラリアに求めEuperipatoides kanangrensis、を取得して研究に用いている。昨年神経ペプチドの一種FMR Famideの抗体を用いて全神経系においてFMR Famidd様免疫反応を調べ、ニューロンのマッピングを行った。本年度はこれに続き抗セロトニン(5-HT)抗体をもちいて、光学顕微鏡免疫細胞化学的研究を行った。カギムシ神経系を中心に、光学顕微鏡用の試料として全載標本およびパラフィン切片標本を作成して、セロトニン作動性ニューロンのマッピングを行い次のような結果を得た。1)神経系全般に亘りセロトニン様免疫陽性ニューロンプロセスが観察された。2)脳神経節ではcommissureにセロトニン様免疫陽性ニューロンプロセスを多く認め、その近くの領域にニューロン細胞体が多く認められた。3)アンテナには免疫陽性プロセスが認められなかった。しかし、4)アンテナ基部の脳糸球体構造に免疫陽性神経プロセスが観察された。5)視索には認められなかったが、網膜および視神経節に免疫陽性プロセスが認められた。6)棘足の内に収まる原腎管、小嚢に免疫陽性プロセスが観察された。7)前、中、後腸の壁に壁内外にプロセスを伸ばす双極ニューロンが認められた8)心臓、輸卵管に免疫陽性プロセスが認められた。これらのことから、セロトニンは感覚、運動神経で神経伝達物質として使われていると推測された。
TROGER塩基骨格を不斉識別素子とした大環状化合物および重合体の合成と応用

従来の方法によるエナンチオマーの分割とは異にして,分子内に適当な空孔を有しエナンチオマーの一方と優先的に包接化合物をつくる様な大環状化合物の合成を目指し,その様なキラルなホストとしての大環状化合物の不斉認識素子としてTROGER塩基骨格を分子内構成単位とする化合物の合成を試みた.大環状化合物の分子内空孔の大きさを自由に変えられる様に鎖長の異なるジアミノジフェニルアルカンから出発し,塩酸存在下ホルマリンとのone-pot反応で合成した.特に鎖長n=2の時には高度稀釈條件を全く用いないにもかかわらず高収率で目的物を得た. n=2の〔2.2〕環状TROGER塩基の場合においてメソ体とラセミ体の分離は分別再結晶あるいは高速液体クロマトにより行うことができた.さらにD-(+)-ラクトースカラムによるPRELOGらの方法により,不完全ではあるがラセミ体の分割を行うことができた.空孔の大きさを拡げ,更にホスト分子の溶解性を増すために,〔n.n〕環状TROGER塩基のメチレン鎖部分を種々の鎖長のポリエーテル鎖にした環状TROGER塩基の合成も試みた.メチレン鎖がテトラー,ヘプターおよびデカメチレン鎖に相当するものでは〔4.4〕-,〔7.7〕-および〔10.10〕環状TROGER塩基が得られているが,デカメチレン,トリデカメチレン鎖に相当するものでは単量体の〔10〕-および〔13〕環状TROGER塩基が得られており,稀釈條件を全く用いない環化としては高収率で得られている.なお〔7.7〕環状TROGER塩基においてはCH_2Cl_2との1:1付加体が得られている.従来の方法によるエナンチオマーの分割とは異にして,分子内に適当な空孔を有しエナンチオマーの一方と優先的に包接化合物をつくる様な大環状化合物の合成を目指し,その様なキラルなホストとしての大環状化合物の不斉認識素子としてTROGER塩基骨格を分子内構成単位とする化合物の合成を試みた.大環状化合物の分子内空孔の大きさを自由に変えられる様に鎖長の異なるジアミノジフェニルアルカンから出発し,塩酸存在下ホルマリンとのone-pot反応で合成した.特に鎖長n=2の時には高度稀釈條件を全く用いないにもかかわらず高収率で目的物を得た. n=2の〔2.2〕環状TROGER塩基の場合においてメソ体とラセミ体の分離は分別再結晶あるいは高速液体クロマトにより行うことができた.さらにD-(+)-ラクトースカラムによるPRELOGらの方法により,不完全ではあるがラセミ体の分割を行うことができた.空孔の大きさを拡げ,更にホスト分子の溶解性を増すために,〔n.n〕環状TROGER塩基のメチレン鎖部分を種々の鎖長のポリエーテル鎖にした環状TROGER塩基の合成も試みた.メチレン鎖がテトラー,ヘプターおよびデカメチレン鎖に相当するものでは〔4.4〕-,〔7.7〕-および〔10.10〕環状TROGER塩基が得られているが,デカメチレン,トリデカメチレン鎖に相当するものでは単量体の〔10〕-および〔13〕環状TROGER塩基が得られており,稀釈條件を全く用いない環化としては高収率で得られている.なお〔7.7〕環状TROGER塩基においてはCH_2Cl_2との1:1付加体が得られている.
下顎器官形成期におけるエピジェネティック制御解析

エピジェネティックに制御を行う因子の一つであり、様々な器官形成に関与することが知られているヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)は、ラット胎生期下顎隆起において発現が認められている。下顎隆起由来細胞におけるHDAC阻害剤により、軟骨分化は阻害された。また、下顎隆起器官培養において、メッケル軟骨の大きさが縮小した。さらに、部位特異的Hdac1ノックダウンにより、メッケル軟骨形態の変化が認められた。これらのことから、HDACは、胎生期下顎隆起の形態形成において重要な役割を果たすことが示された顎顔面領域を含め、様々な器官の形態形成は、環境要因やエピジェネティック要因などが相互に関与して制御されている。本研究では、エピジェネティクス要因の一つとしてヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)に注目し、発生期の顎顔面領域のパターン形成、とくに下顎の形態形成におけるエピジェネティック制御を解明することを目的とした。まず、ラット胎生期下顎隆起器官培養への導入に先立って、マウス軟骨前駆細胞株であるATDC5へHdac1 shRNAベクターおよびHdac1 siRNAのトランスフェクションを行い、培養1日後、2日後に細胞よりTotal RNAおよびタンパク質を回収した。得られたTotal RNAを逆転写によりcDNAを作製、リアルタイムPCR解析により、Hdac1のノックダウンを確認した。また、Western blotting法にてHDAC1タンパク量の減少を確認した。また、アセチル化ヒストン抗体を用いてヒストンのアセチル化活性の変化を検討した結果、shRNAベクターを導入して1日後にヒストンH3のアセチル化が増加していた。次に、Hdac1のshRNAベクターおよびsiRNAを胎生期下顎隆起器官培養へ導入を行った。導入は下顎隆起の右側側方部に行い、左側を対照側とした。導入7日後にホールマウントアルシアンブルー染色を行い、メッケル軟骨の形態を観察した。その結果、導入側において、メッケル軟骨の形態異常が認められ、左右非対称の形状を示した。これらのことより、ラット胎生期下顎隆起において、Hdac1はメッケル軟骨の形態形成制御に関わることが示唆された。これらのことから、HDACは、胎生期下顎隆起の形態形成において重要な役割を果たすことが示された顎顔面形態を含め、様々な器官の形態形成において、環境要因、遺伝的要因(SNPなど)、エピジェネティック要因など、複数の因子が相互に関与している。エピジェネティック要因の中でも、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)はヒストンの脱アセチル化を行う酵素であり、遺伝子の転写制御において重要な役割を果たしており、様々な細胞への分化を制御することが報告されつつある。本研究では、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)に注目し、HDACを阻害およびノックダウンする実験系を用いて、HDACの下顎の形態形成を制御する分子メカニズムを解明することを目的とする。胎齢12日目のラットより下顎隆起を摘出し、細胞を分散、播種し、10%FBS添加DMEM培地を用いて下顎隆起細胞の高密度培養を行った。HDAC阻害薬の一つであるトリコスタチンA (TSA)を2nM, 200nM, 20μMの濃度で添加し培養を行い、培養開始7日目にアルシアンブルー染色を行った。その結果、TSA添加によるHDAC阻害により、軟骨ノジュールの形成が抑制された。また、摘出した下顎隆起を器官培養にTSAを500nM, 1μM, 1.5μM, 2μM, 20μM, 200μMの濃度で添加し、培養開始後7日目にホールマウントアルシアンブルー染色を施し、メッケル軟骨の形態を観察した。その結果、TSA添加によるHDAC阻害により、メッケル軟骨の形成が抑制され、1μM以上の濃度においてはメッケル軟骨の形成が完全に消失した。さらに、培養開始後7日目に4%PFA溶液にて培養器官を固定、水平断連続切片を作製し、ヘマトキシリンエオジン染色を行った結果、TSA濃度が1μMでは正常な下顎器官の組織構造が認められないことがわかった。以上の結果より、HDACは胎生期下顎隆起におけるパターン形成において、大変重要な役割を果たしていることが示唆されたHDAC阻害剤であるTSAの添加実験により、下顎隆起のパターン形成におけるHDACの役割の解明が進んでおり、また、HDACのshRNAベクターの作成も終了しているため。HDACのshRNAベクター作成と遺伝子導入:エレクトロポレーション法およびmicroinjection法によりratのshRNAベクターを遺伝子導入する。我々は、すでにpENTR/U6ベクターを用いたshRNAシステムをラット下顎隆起器官培養に適応することにより、目的遺伝子のノックダウンに成功している。培養開始3, 6, 12, 24および48時間後に培養器官よりtotal RNA、およびタンパク質を抽出、収集し、RT-PCR法およびWestern blotting法にてのHDACの遺伝子発現が抑制されていることおよびタンパク量が減少していることを確認する。遺伝子導入は無作為に片側に行い、左右差を検討する。また、蛍光によるHDAC活性測定を行う。

次にHDACはWntシグナル伝達経路およびNotchシグナル伝達経路の調節より、下顎隆起間葉細胞の増殖・分化を制御しているという仮説を立て、WntシグナルおよびNotchシグナル関連遺伝子の発現動態、およびWntシグナルおよびNotchシグナル伝達の検討を細胞培養と器官培養を用いて行う。さらに、ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)による解析として、クロマチン領域のヒストンのアセチル化、転写因子の結合状態を調べることにより、遺伝子の転写制御解析を行う。分化制御因子が結合すると考えられる領域の同定、さらに軟骨分化の制御因子として知られるSox9などの転写因子との関連を検討する。次年度は消耗品のみの使用とする。実験動物、培養用器具と試薬、分子生物学実験用試薬とChIP解析費を計上する予定としている。
静的軸対称真空アインシュタイン方程式の一般解

静的軸対称真空アインシュタイン方程式またはそれと同等なERNST方程式を解けば,回転するブラックホールや中性子星の周りの重力場の嚴密解を得ることができる.従来はいくつかの任意パラメーターを含む特解が求っているにすぎなかった.今年度のこの研究においては一般解を求めるには至らなかったが,一つの任意関数を含む解を導き出すことに成功した.この際数式処理言語REDUCEを援用した.結果は学術雑誌PROGRESS OF THEORETICAL PHYSICSに発表すべく準備中である.任意関数を二個含む解を見いだせば,それが一般解となるので,今後も引き続き一般解を見いだす努力を続ける.静的軸対称真空アインシュタイン方程式またはそれと同等なERNST方程式を解けば,回転するブラックホールや中性子星の周りの重力場の嚴密解を得ることができる.従来はいくつかの任意パラメーターを含む特解が求っているにすぎなかった.今年度のこの研究においては一般解を求めるには至らなかったが,一つの任意関数を含む解を導き出すことに成功した.この際数式処理言語REDUCEを援用した.結果は学術雑誌PROGRESS OF THEORETICAL PHYSICSに発表すべく準備中である.任意関数を二個含む解を見いだせば,それが一般解となるので,今後も引き続き一般解を見いだす努力を続ける.
TUNEL法による口腔扁平上皮癌におけるアポトーシスの観察

【研究目的】口腔扁平上皮癌の放射線および化学療法前後のアポトーシスとその関連抗原および増殖活性を比較し,治療効果および予後との関係を検討した.【材料と方法】放射線および化学療法前後の切除標本16例(生検時および手術時)を使用した.アポトーシスはTUNEL法で可視化し,また,アポトーシス関連抗原は抗P53抗体,増殖活性は抗Ki67抗体を用い,免疫組織化学染色を行った.各々腫瘍細胞1000個を数え,陽性細胞数を%で算出した.【結果】TUNEL陽性率は,放射線および化学療法前で平均1.26%,後で4.48%であり,後者で有意に増加した(P<0.05).他方,P53およびKi67陽性率は有意に減少した(p<0.05).角化度別では,Broders分類grade IおよびIIでは,grade IIIおよびIVより,治療後の腫瘍細胞のTUNEL陽性細胞率が増加した.化学療法別では,代謝拮抗薬と抗癌抗生物質の治療で比較すると,前者において治療後のTUNEL陽性率が有意に増加した.P53陽性腫瘍細胞の比率は,癌死6例(33.8%)の方が予後良好5例(5.0%)より治療前に有意に高値を示した(P<0.05).【まとめ】放射線および化学療法により誘導される腫瘍細胞の排除は,アポトーシスによるものもあることが示唆された.また,高分化癌は低分化癌に比較して,治療後のアポトーシス細胞がより増加した.尚,P53陽性癌細胞は,口腔癌の生物学的悪性度を反映している可能性がある.【研究目的】口腔扁平上皮癌の放射線および化学療法前後のアポトーシスとその関連抗原および増殖活性を比較し,治療効果および予後との関係を検討した.【材料と方法】放射線および化学療法前後の切除標本16例(生検時および手術時)を使用した.アポトーシスはTUNEL法で可視化し,また,アポトーシス関連抗原は抗P53抗体,増殖活性は抗Ki67抗体を用い,免疫組織化学染色を行った.各々腫瘍細胞1000個を数え,陽性細胞数を%で算出した.【結果】TUNEL陽性率は,放射線および化学療法前で平均1.26%,後で4.48%であり,後者で有意に増加した(P<0.05).他方,P53およびKi67陽性率は有意に減少した(p<0.05).角化度別では,Broders分類grade IおよびIIでは,grade IIIおよびIVより,治療後の腫瘍細胞のTUNEL陽性細胞率が増加した.化学療法別では,代謝拮抗薬と抗癌抗生物質の治療で比較すると,前者において治療後のTUNEL陽性率が有意に増加した.P53陽性腫瘍細胞の比率は,癌死6例(33.8%)の方が予後良好5例(5.0%)より治療前に有意に高値を示した(P<0.05).【まとめ】放射線および化学療法により誘導される腫瘍細胞の排除は,アポトーシスによるものもあることが示唆された.また,高分化癌は低分化癌に比較して,治療後のアポトーシス細胞がより増加した.尚,P53陽性癌細胞は,口腔癌の生物学的悪性度を反映している可能性がある.
ヘルペスウイルス増殖におけるアンチセンスＲＮＡによる新規遺伝子発現調節機構の解明

遺伝情報はDNAからmRNAに写し取られる.しかし,mRNAとは反対側のDNA情報もRNAとして転写され,アンチセンスRNAと呼ばれる.本研究では,ウマヘルペスウイルス1型の転写動態解析において見いだされたアンチセンス鎖RNAの機能と意義を明らかにしようとした.感染細胞ではウイルスゲノムに由来するmiRNAがほとんど発現していないことがわかった.一方,宿主由来miRNAは感染後,ウイルス増殖にともなって増減がみられた.ウイルス感染細胞における網羅的な転写開始点解析を実施し,アンチセンス鎖の転写開始点を同定した.感染細胞から2本鎖RNAを抽出したが,塩基配列解読が課題として残された.ヘルペスウイルス感染細胞をモデルとしてポリA保有アンチセンスRNAの意義を遺伝子発現調節機構という視点から解明しようとした.これまでに少なくともウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)感染馬胎児腎臓細胞において,ウイルスに由来するmiRNAはほとんど存在しないことがわかった.そこで,より基礎的な解析としてウイルス由来RNAの転写開始点解析を行った.今年度はCAGE法により,塩基レベルでの転写開始点解析を実施し,詳細な転写開始点マップを作成することができた.その結果,アンチセンス鎖の転写開始点ならびに非コード領域における転写開始点を同定することができた.また,転写開始「点」というよりもある塩基を中心に前後の数塩基を含む転写開始「領域」として同定されることがわかった.アンチセンス鎖はウイルスがコードしている遺伝子のmRNAと同様に感染後に発現時期が制御されている可能性が示された.今年度の成果としてアンチセンス鎖の転写開始領域の同定を行うことができたが,転写開始領域の破壊実験など,アンチセンス鎖がコードするポリA保有転写産物の機能解析には至らなかった.予想以上にヘルペスウイルスの転写動態は複雑であることが明らかとなった.遺伝情報はDNAからmRNAに写し取られる.しかし,mRNAとは反対側のDNA情報もRNAとして転写され,アンチセンスRNAと呼ばれる.本研究では,ウマヘルペスウイルス1型の転写動態解析において見いだされたアンチセンス鎖RNAの機能と意義を明らかにしようとした.感染細胞ではウイルスゲノムに由来するmiRNAがほとんど発現していないことがわかった.一方,宿主由来miRNAは感染後,ウイルス増殖にともなって増減がみられた.ウイルス感染細胞における網羅的な転写開始点解析を実施し,アンチセンス鎖の転写開始点を同定した.感染細胞から2本鎖RNAを抽出したが,塩基配列解読が課題として残された.ヘルペスウイルス感染細胞をモデルとしてポリA保有アンチセンスRNAの意義を遺伝子発現調節機構という視点で解明する.アンチセンス鎖RNAの機能としてマイクロRNA(miRNA)かが近年,注目されている.しかし,機能や意義は不明であるがmiRNA以外のアンチセンス鎖RNAの存在も知られている.本研究では,ウマヘルペスウイルス1型の転写動態解析において見いだされた特定の遺伝子におけるアンチセンス鎖RNAの機能と意義を明らかにしようとするものである.アンチセンス鎖RNAがmRNA安定化を含む正の調節に関与するという仮説のもとに研究を行い,新しい遺伝子制御機構を明らかにすることを到達目標としている.本年度はウイルス感染細胞におけるmiRNA解析を実施した.次世代シーケンサーを用い,感染細胞で発現しているmiRNAを網羅的に解析した.その結果,ウイルスゲノムに由来するmiRNAはほとんど発現していないことがわかった.一方,宿主由来miRNAは感染後,ウイルス増殖にともなって増減がみられた.すなわち,感染後にmiRNA量が減少するmiRNAおよび増加するmiRNAが検出された.これらのmiRNAの変動は何を意味するかについては,まだ不明である.別の視点からアンチセンスRNAの機能を解析するために,ウイルス感染細胞における網羅的な転写開始点解析を実施した.実際の転写開始点の同定には至っていないが,経時的な転写産物の動態を明らかにした.今後,センス鎖およびアンチセンス鎖の転写開始点を同定する予定である.この転写開始点解析の成果をもとに,miRNA以外の機能について解析する予定である.今年度は二つの実験を計画したが,そのうちの一つであるアンチセンス鎖の機能としてmiRNA以外の機能解析の実施には至らなかったが,この実験に先立ち,アンチセンス鎖の転写開始点解析が必要となり,この転写開始点解析を行ったため.予定通りに研究を遂行する.平成24年度で実施できなかった研究も含め,25年度中に研究を遂行する.具体的には,平成24年度に実施できなかったセンス鎖およびアンチセンス鎖の転写開始点解析を実施し,アンチセンス鎖転写プロモーターの同定を行い,破壊実験を実施する.他の実験については計画に沿って実施する.転写開始点解析および破壊実験に使用する.