hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生医療を用いた拡張型心筋症・虚血性心筋症に対する新たな治療戦略の開発

治療への応用の観点から、用いるタンパク、遺伝子、成長因子等の性質を考慮すると、少なくともモニタリングとデリバリーの機能を備えた治療用マイクロデバイスによる心内膜または心外膜直下からのアプローチが不可欠と考えられる。同時に、経血管的・経リンパ管的アプローチが不可欠なため、微小管腔用マイクロデバイスの開発も視野に入れる。そこで、今回,治療用マイクロデバイス開発を視野に入れた動物実験も行うことを検討した。我々は心筋細胞の配列を制御する方法を開発しており、この技術を用い、リンパ管新生インデューサー、VEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカー、VEGFR3-Fcの治療戦略への応用も検討した。循環器内科我々は拡張型心筋症および心筋梗塞モデルマウスにおいて、独自の方法により心機能との関連をさらに詳細に検討したが,予定以上に検討に時間を要した.また,リンパ管新生インデューサーであるVEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカーであるVEGFR3-Fcの治療効果につきさらに検討したが,臨床応用への実験段階で,予定以上に時間を要した.治療への応用の観点から、モニタリングとデリバリーの機能を備えた治療用マイクロデバイスの開発も視野に入れた動物実験も行うことを検討したが,予定以上に時間を要した。リンパ管・微小血管を対象としたマイクロデバイスによりリンパ管を含めた微小循環の測定および解析と微小領域における蛋白や遺伝子発現の測定が可能となるが,開発に予想以上に時間を要した.我々は拡張型心筋症および心筋梗塞モデルマウスにおいて、これらの病態における心臓リンパ管新生調整因子の関与をさらに詳細に解析してきた。今回,我々は独自の方法により心機能との関連をさらに詳細に検討したが,予定以上に検討に時間を要した.また,リンパ管新生インデューサーであるVEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカーであるVEGFR3-Fcの治療効果につきさらに検討したが,臨床応用への実験段階で,予定以上に時間を要した.治療への応用の観点から、モニタリングとデリバリーの機能を備えた治療用マイクロデバイスによる心内膜または心外膜直下からのアプローチが不可欠と考えられ,微小管腔用マイクロデバイスの開発も視野に入れた。そこで、治療用マイクロデバイス開発を視野に入れた動物実験も行うことを検討したが,予定以上に時間を要した。治療用マイクロデバイスには以下に述べるマイクロデバイスを統合したものとなることが予想される。すなわち、マイクロ圧センサー、マイクロサーミスターを応用した微小流量計、血管内マイクロスコープ、マイクロスコープ付マイクロバイオトーム、エレクトロポレーション法による遺伝子導入用マイクロデバイス、および超音波法による遺伝子導入用マイクロデバイス、リアルタイムマイクロプロテインアナライザー等である。心疾患における微小循環の病態は不明な点が多い。
破骨細胞由来の接着タンパクbeta ig-h3による骨吸収・骨形成調節機構を探る

【背景】破骨細胞の分化はRANKLがトリガーとなって進行する。しかし、RANKLによってどのような分子機構から破骨細胞分化がコミットされるかは未解決である。我々は、RANKLで誘導される破骨細胞分化のマスター遺伝子を探索する中からbeta ig-h3(Big-h3)を同定した。本研究は、Big-h3の破骨細胞分化における役割について検討した。【結果・考察】(1)破骨細胞前駆細胞において、RANKL刺激から短時間でBig-h3の発現が誘導された。この発現誘導はTGF-βでもなされ、RANKL+TGF-βで相乗的に増幅された。(2)Big-h3発現はTRAPなどの破骨細胞分化関連分子が発現される前の分化前期に増加した。(3)Big-h3発現は骨芽細胞では認められず破骨細胞に特異的であった。一方、同じくRGD配列を有するオステオポンチンの発現は骨芽細胞同様、破骨細胞にも発現するがRANKL非依存的であった。(4)Big-h3遺伝子をクローニングし、HEK293細胞で強発現し、Big-h3が分泌性のタンパク質であることを確認した。(5)Big-h3はRGD配列を介してインテグリンと結合し細胞機能を制御する。破骨細胞分化と連動して発現するインテグリンはαVβ3であり、抗β3抗体は破骨細胞形成を大きく抑制した。本培養系は破骨細胞前駆細胞しか存在せず、RGD配列含有分子は破骨細胞前駆細胞由来であることから、前駆細胞由来のBig-h3の破骨細胞分化への役割が示唆された。骨代謝において、骨吸収を担当する破骨細胞の分化はRANKLがトリガーとなって進行する。しかし、破骨細胞前駆細胞がRANKLによってどのような分子機構から破骨細胞にコミットされるのか、その分化のマスター遺伝子は何なのかは未解決である。我々は、RANKLで誘導される破骨細胞分化のマスター遺伝子を探索するプロジェクトからbeta ig-h3を同定した。そこで本年度は、主に、beta ig-h3の破骨細胞分化における役割について下記の項目から検索した。(1)破骨細胞前駆細胞において、M-CSF存在下でRANKL刺激から短時間でbeta ig-h3の発現は誘導された。beta ig-h3の発現誘導はRANKLとは別にTGF-βによってもなされた。しかし、その発現誘導はRANKLとTGF-βの共存下で相乗的に著明に増幅された。(2)beta ig-h3の発現は破骨細胞前駆細胞から、TRAPやカルシトニン受容体などの破骨細胞関連分子が発現してくる前の分化前期に増加した。(3)beta ig-h3の発現は骨芽細胞では認められず、破骨細胞に特異的であった。一方、同じく分子内にRGD配列を有するオステオポンチン(OPN)の発現は骨芽細胞、破骨細胞ともにほぼ同等の割合で発現していた。(4)beta ig-h3はRGD配列を介して、細胞に発現しているインテグリンと結合し、細胞機能を制御している。破骨細胞はRGD配列を認識するいくつかのα鎖とβ鎖を発現するが破骨細胞分化と連動するインテグリンはαVβ3であった。そこで、破骨細胞前駆細胞のみからなる破骨細胞形成系に抗β3抗体を加えると著しく破骨細胞形成が抑制された。この培養系には破骨細胞前駆細胞のみしか存在せず、RGD配列有する分子は破骨細胞前駆細胞由来である。また、OPN発現は破骨細胞分化を連動しないことから、破骨細胞前駆細胞由来のbeta ig-h3の破骨細胞分化への役割が大きく示唆された。

しかし、RANKLによってどのような分子機構から破骨細胞分化がコミットされるかは未解決である。我々は、RANKLで誘導される破骨細胞分化のマスター遺伝子を探索する中からbeta ig-h3(Big-h3)を同定した。本研究は、Big-h3の破骨細胞分化における役割について検討した。【結果・考察】(1)破骨細胞前駆細胞において、RANKL刺激から短時間でBig-h3の発現が誘導された。この発現誘導はTGF-βでもなされ、RANKL+TGF-βで相乗的に増幅された。(2)Big-h3発現はTRAPなどの破骨細胞分化関連分子が発現される前の分化前期に増加した。(3)Big-h3発現は骨芽細胞では認められず破骨細胞に特異的であった。一方、同じくRGD配列を有するオステオポンチンの発現は骨芽細胞同様、破骨細胞にも発現するがRANKL非依存的であった。(4)Big-h3遺伝子をクローニングし、HEK293細胞で強発現し、Big-h3が分泌性のタンパク質であることを確認した。(5)Big-h3はRGD配列を介してインテグリンと結合し細胞機能を制御する。破骨細胞分化と連動して発現するインテグリンはαVβ3であり、抗β3抗体は破骨細胞形成を大きく抑制した。本培養系は破骨細胞前駆細胞しか存在せず、RGD配列含有分子は破骨細胞前駆細胞由来であることから、前駆細胞由来のBig-h3の破骨細胞分化への役割が示唆された。
水酸化PCBによる母乳汚染の実態と経年的曝露影響に関する研究

今回分析した母乳試料からはいずれの水酸化PCBも検出されなかった。このことから母乳中に存在する水酸化PCB濃度は報告されている血液中濃度に比べて極めて低いことが推察された。これは、水酸化PCBが血液中において甲状腺ホルモンであるサイロキシン輸送タンパクであるトランスサイレチン(TTR)に結合するなどして母乳には移行し難いことが示唆された。その今回の実験結果から、乳幼児の神経、脳の発達に作用を及ぼす可能性のある水酸化PCBが母乳経由で乳児に移行する危険性はほとんどないことが確認された。平成22年度の研究の中で水酸化PCBの抽出条件の検討を行った結果、中性条件で抽出した場合、酸性条件に比べて抽出効率が約半分程度であることがわかった。異性体によっては中性条件ではほぼ回収されないものも存在した。従って当所に過去から経年的に保存してある中性条件抽出母乳脂肪を分析しても定量的な結果が得られないことがわかった。抽出以降の検討では精製に硝酸銀シリカゲルを使用することで水酸化PCBをPCBと分離できることが確認できた。添加回収試験を行なった結果、対応する内部標準物質が存在する場合は内部標準物質補正回収率で103113%であった。内部標準物質がない異性体について同塩素数の異性体で補正を行い153%(n=3)であった。分析は液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計(LC/MS/MS)を定量に使用した。水酸化PCBを高分解能ガスクロマトグラフ-高分解能質量分析計(HRGC/HRMS)で分析する場合硫酸ジメチルによるメチル化反応を行ったが異性体により反応効率が異なるデメリットがあった。しかし定量下限値は異性体によってはLC/MS/MSより低くとれるためLC/MS/MSとHRGC/HRMSとを併用することとした。当所に保存してある中性条件抽出母乳脂肪(20032008)を分析した結果今回分析した水酸化PCB(4H107、3H138、4H146、4H187、4H172)いずれも検出されなかった。定量下限は0.1ng/gfatであった。前年度の研究の中で確立した塩酸酸性条件(PH=2)における脂肪抽出方法と硫酸および硝酸銀カラム処理による精製操作を使用した母乳中水酸化PCBレベルの調査を行った。試料には2008年度に採取した母乳試料を混合し脂肪抽出処理前の状態で冷凍保存していたもの(100g)を使用した。前処理に際し、併行して添加回収試験を行なった。その結果は、内部標準物質補正した回収率で71107%であった。分析には液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計を使用した。2008年度混合母乳試料を分析した結果、抽出脂肪重量は4.6%で今回分析対象とした水酸化PCB(40H-CB107、30H-CB138、40H-CB146、40H-CB187、40H-CB172)はいずれも検出されなかった。検出下限は2 pg/g wet weightであった。このことから母乳中に存在する水酸化PCB濃度は報告されている血液中濃度に比べて極めて低いことがわかった。これは、水酸化PCBが血液中において甲状腺ホルモンであるサイロキシン輸送タンパクであるトランスサイレチン(TTR)に結合するなどして血中から母乳には移行し難いことが示唆された。母乳中の総PCB濃度は10 ng/g wet weightであった。今回の実験結果から、乳幼児の神経、脳の発達に作用を及ぼす可能性のある水酸化PCBが母乳経由で乳児に移行する危険性はほとんどないことが示唆された。
人工知能によるコンピュータ整形外科手術ナビゲーションシステム

人工膝関節置換術は,同手術を構成する手順が多く(ある機種では27種類),また多数の手術器具(約120種類)を用いる.さらに,人工膝関節の機種別,メーカ別にその手順や使用する器具も異なるため,手術器具を術者に渡す器械出し看護師はもちろん術者やその助手にも大きな負担となっている.同負担が,使用する機種の制限につながり,各患者に最適な機種選択が行えない要因の一つになっている.本研究では,術者がスマートグラスを装着し,術者視点での動画を撮影することで,人工知能がその手術手順を自動認識し,器械出し看護師や助手ら,手術室の全メンバーに情報共有するとともに,次手順や使用する器具,その準備をナビゲーションするシステムを構築している.本年度は,術者視点動画からの手術手順の自動認識法,動画中の手術器具の自動認識法を開発した.手術手順の自動認識法においては,各フレーム画像に対して,まず術者視点が術野を含むか否かを,畳み込みニューラルネットワーク(CNN)によるクラス識別により行う.術野を含むと認識されたフレーム画像は,各手順をクラスとしたCNNによるクラス識別により手順認識が行われる.次に手術器具認識においては,深層学習の1種であるYOLOv3を用いて,手術動画に含まれる手術器具をアノテーションしたもので学習を行い,学習後は自動で動画中の手術器具を検出,認識する手法を提案した.各手法を評価するため手術動画6症例を収集し,うち1例を評価データ,他5例を学習データとしたLOOCV実験を実施した.術野を含むフレーム識別は,学習データは100%,評価データにおいて99.7%の精度であった.手術手技認識については,フレーム毎の評価結果では,複数のCNNモデルを適用した結果VGG16が最も精度が高く32.5%であった.また,手術器具認識精度は38.5%であった.研究計画通り,手術AIナビゲーションシステムを構成する3種類の手法を研究開発した.まず,術野を含むか否かの認識については非常に高精度で,完成の域に至った.つぎに,手技認識及び手術器具認識については,いまだ精度は低いが,方法全体のフレームワークが完成したことから,各ステップで様々な手法を開発・評価できる実験環境が整った.これまでの研究に基づき,今後は手技認識及び手術器具認識の手法開発,および評価が必要である.現在はフレーム単位の認識を行っておりフレーム間の連続性は考慮されていない.さらには,対象とする手術の手順を先見知識としてのモデル化が行えていない.そこで,今後は,隠れマルコフモデル(HMM)やグラフ理論に基づく手術手順のモデル化,またそれに基づく動画としてのシーン認識法を検討する.さらには,手術動画を多数収集し,データ数増加による精度向上を図る.人工膝関節置換術は,同手術を構成する手順が多く(ある機種では27種類),また多数の手術器具(約120種類)を用いる.さらに,人工膝関節の機種別,メーカ別にその手順や使用する器具も異なるため,手術器具を術者に渡す器械出し看護師はもちろん術者やその助手にも大きな負担となっている.同負担が,使用する機種の制限につながり,各患者に最適な機種選択が行えない要因の一つになっている.本研究では,術者がスマートグラスを装着し,術者視点での動画を撮影することで,人工知能がその手術手順を自動認識し,器械出し看護師や助手ら,手術室の全メンバーに情報共有するとともに,次手順や使用する器具,その準備をナビゲーションするシステムを構築している.本年度は,術者視点動画からの手術手順の自動認識法,動画中の手術器具の自動認識法を開発した.手術手順の自動認識法においては,各フレーム画像に対して,まず術者視点が術野を含むか否かを,畳み込みニューラルネットワーク(CNN)によるクラス識別により行う.術野を含むと認識されたフレーム画像は,各手順をクラスとしたCNNによるクラス識別により手順認識が行われる.次に手術器具認識においては,深層学習の1種であるYOLOv3を用いて,手術動画に含まれる手術器具をアノテーションしたもので学習を行い,学習後は自動で動画中の手術器具を検出,認識する手法を提案した.各手法を評価するため手術動画6症例を収集し,うち1例を評価データ,他5例を学習データとしたLOOCV実験を実施した.術野を含むフレーム識別は,学習データは100%,評価データにおいて99.7%の精度であった.手術手技認識については,フレーム毎の評価結果では,複数のCNNモデルを適用した結果VGG16が最も精度が高く32.5%であった.また,手術器具認識精度は38.5%であった.研究計画通り,手術AIナビゲーションシステムを構成する3種類の手法を研究開発した.まず,術野を含むか否かの認識については非常に高精度で,完成の域に至った.つぎに,手技認識及び手術器具認識については,いまだ精度は低いが,方法全体のフレームワークが完成したことから,各ステップで様々な手法を開発・評価できる実験環境が整った.これまでの研究に基づき,今後は手技認識及び手術器具認識の手法開発,および評価が必要である.現在はフレーム単位の認識を行っておりフレーム間の連続性は考慮されていない.さらには,対象とする手術の手順を先見知識としてのモデル化が行えていない.そこで,今後は,隠れマルコフモデル(HMM)やグラフ理論に基づく手術手順のモデル化,またそれに基づく動画としてのシーン認識法を検討する.さらには,手術動画を多数収集し,データ数増加による精度向上を図る.
造血幹細胞自己複製因子の遺伝子クローニングとその臨床応用

造血幹細胞が発生、増幅することが明らかとなったマウスの胎生10.5日のマウス胎児aorta-gonad-mesonephros(AGM)領域からストローマ細胞株の樹立を試みた。すでに複数のストローマ細胞株の樹立に世界で初めて成功し、この内の1つ(AGMA9)は、サイトカイン無添加でマウス及びヒトいずれの造血幹細胞の長期にわたる増殖支持能を持つという画期的なものであった。また、同じAGM領域から造血幹細胞増殖支持能を持たないストローマ細胞株(AGMA7)の樹立にも成功した。AGMA9、AGMA7およびOP9などの既知の数種類のストローマ細胞株よりmRNAを抽出し、RT-PCR法などを用いて各種サイトカインmRNAの発現を検討した。AGMA9から取り出したmRNAからはSCF,SDF-1,OSM,IL-6,HGF,MIP-1γ,Gas6,MCP-3などが検出されたが、M-CSF,EPO,TPO,Flk2/Flt3 ligand,MIP-1αなど未分化造血前駆細胞に作用することが知られているサイトカインのmRNAは検出されなかった。マウスSCF,OSM,IL-6を組み合わせてヒトCD34+CD38-細胞を培養したが、造血前駆細胞の増幅は認められなかった。造血幹細胞増殖支持能を持つAGMA9および持たないAGMA7や弱い活性を認めるOP9よりcDNAライブラリーを作成し、signal sequence trap,gene discovery arrayなどを用いて、A9に発現していてA7に発現していないまたは発現が少ない遺伝子を中心にクローニングを行っている。そのような遺伝子として既に200個以上同定され、未知の遺伝子も数+個同定されている。現在それらの機能解析が進行中である。近年、造血幹細胞のex vivo増幅が世界的に試みられているが未だ成功していない。その主たる要因は造血幹細胞の自己複製にかかわる分子が同定されていないためと考えられる。造血幹細胞自己複製因子について検討するため、胎生9日目のマウス卵黄嚢、胎生10.5日目のAGM領域、胎生12日目の胎児肝から数種類のストローマ細胞株を樹立した。マウス骨髄よりFACSを用いて分離した造血幹細胞の含まれる分画、lin^-Sca-1^+c-Kit^+細胞を、各ストローマ細胞との共培養前後で致死量放射線照射マウスに移植し、骨髄再構築能を見るという方法で骨髄造血幹細胞増幅支持能を持ったストローマ細胞を選別すると、そのうち造血幹細胞の発生部位であるAGM領域から樹立した細胞株(A9)が造血幹細胞の増殖を長期にわたり支持する活性を持っていた。各種ストローマ細胞株とヒト臍帯血より分離した造血幹細胞の含まれる分画、lin^-CD34^+CD38^-細胞をサイトカイン無添加で共培養前後でNOD/SCIDマウスヘ移植し、移植後3ケ月以上経った時点でマウス骨髄、末梢血中に存在するヒト細胞のを種々の単クローン抗体を用いて解析した。A9だけがヒト造血幹細胞の増殖を4週以上の長期にわたって支持できることが明らかとなった。以上の結果はA9は種を越えて造血幹細胞の増殖に関与する分子を発現していることを示している。そこで、造血幹細胞増幅支持能を持ったA9および支持能を持たないA7のそれぞれからmRNAを抽出し、一方向のcDNAライブラリーを作製した。種々の方法を用いて造血幹細胞自己複製因子のクローニングに着手している。現在、4種類の新規遺伝子が同定され、この遺伝子をA7に発現させ造血幹細胞増殖支持活性が獲得できるかどうか検討中である。

造血幹細胞が発生、増幅することが明らかとなったマウスの胎生10.5日のマウス胎児aorta-gonad-mesonephros(AGM)領域からストローマ細胞株の樹立を試みた。すでに複数のストローマ細胞株の樹立に世界で初めて成功し、この内の1つ(AGMA9)は、サイトカイン無添加でマウス及びヒトいずれの造血幹細胞の長期にわたる増殖支持能を持つという画期的なものであった。また、同じAGM領域から造血幹細胞増殖支持能を持たないストローマ細胞株(AGMA7)の樹立にも成功した。AGMA9、AGMA7およびOP9などの既知の数種類のストローマ細胞株よりmRNAを抽出し、RT-PCR法などを用いて各種サイトカインmRNAの発現を検討した。AGMA9から取り出したmRNAからはSCF,SDF-1,OSM,IL-6,HGF,MIP-1γ,Gas6,MCP-3などが検出されたが、M-CSF,EPO,TPO,Flk2/Flt3 ligand,MIP-1αなど未分化造血前駆細胞に作用することが知られているサイトカインのmRNAは検出されなかった。マウスSCF,OSM,IL-6を組み合わせてヒトCD34+CD38-細胞を培養したが、造血前駆細胞の増幅は認められなかった。造血幹細胞増殖支持能を持つAGMA9および持たないAGMA7や弱い活性を認めるOP9よりcDNAライブラリーを作成し、signal sequence trap,gene discovery arrayなどを用いて、A9に発現していてA7に発現していないまたは発現が少ない遺伝子を中心にクローニングを行っている。そのような遺伝子として既に200個以上同定され、未知の遺伝子も数十個同定されている。現在それらの機能解析が進行中である。
血管系疾患予防作用を有するペプチドの網羅的解明

食品タンパク質由来の低分子ペプチドが、高血圧・動脈硬化症発症に深く関わる血管機能に対して潜在的な改善作用を示すかどうかを検討した。その結果、塩基性アミノ酸を有する低分子ペプチドが収縮した血管を弛緩させることが判明した。この血管弛緩作用は降圧剤であるカルシウムブロッカーと同様であり、さらに、動脈硬化を誘発する動物モデルマウスへの投与試験によって、大動脈硬化病変を抑制することを初めて明らかにした。種々の生理作用が明らかにされつつある低分子ペプチドについて、特に高血圧・糖尿病発症に深く関わる血管機能に対する潜在的な作用を組織レベルで評価し、さらにin vivoでの活性発現の前提となる腸管吸収性について、理論的、あるいは迅速評価可能な新たなアッセイシステムの構築を図った。1)腸管吸収ペプチドの吸収・組織蓄積挙動の網羅的解明腸間膜透過後の複数ペプチドの一斉分析を想定して、新たにダブルスイッチング並行カラムHPLC法を開発し、3成分までの分析が70分以内で可能となった。一方、caoco-2膜Ussingシステム法によって、10種類以上のペプチド(ポジティブペプチド;Gly-Sar)を透過性を評価し、PepT1トランスポーターに対する結合親和性及び透過係数ともに、ペプチドの有する疎水性転移自由エネルギーに基づいていることが示唆された。これにより、計算化学によるペプチド透過性評価が可能となるとの知見が得られた。2)同位体標識LC/MS法の構築によるペプチド吸収・組織蓄積挙動の解明:13C-Val、Ile、AlaのFmoc誘導体化合成並びにC末端にTyrを配置したジペプチド体の合成に成功した。13C-NMR測定によって100scan以下での特異的標識体の検出が可能となり、さらにLC-MS/MSでの[M+1m/z]/MeCN-HCOOH(Pos)検出の確認と最適検出条件を設定し得た。これにより、ラット等での吸収動態の特異的検出法の設定に途を開くことができた。3)血管調節機能を有するペプチド体の網羅的解明:67種類に及び各種低分子ペプチドを合成し、SDラット血管標本を用いた血管張力測定を実施し、WHをはじめとするジペプチド群では、血管弛緩性発現にはN末端塩基性アミノ酸残基の重要性が初めて明らかになった。この結果を起点として、ペプチド構造(鎖長等)と活性発現相関の究明に関してのさらなる情報取得を目指す。種々の生理作用が明らかにされつつある低分子ペプチドについて、特に高血圧・糖尿病発症に深く関わる血管機能に対する潜在的な作用を組織レベルで評価し、さらにin vivoでの活性発現の検証とLC-MS/MS法による新たなアッセイシステムの構築を図った。2)血管調節機能を有するペプチド体の網羅的解明:SDラット血管標本を用いた血管張力測定を実施し、血管弛緩性の認められたWHを基本骨格として、さらに高活性なペプチド検索とその作用発現機構の解明を図った。その結果、N末端はHisの存在が必須であること、C末端側ではTrp、さらにトリペプチドでは中間位Argが存在することによりEC50値として1.2mMの弛緩作用を示すことが判明した。構造-活性相関により、ペプチドによる弛緩性発現はジヒドロピリジン系カルシウムチャンネルブロッカーと同様、イミダーゾール環Nのプロトンが大いに関与していることが判明した。3)水溶液系でのタンパク質とペプチドとの立体的相互作用を見積もることを可能とするMDシュミレーション解析法を確立した。すなわち、SYBYL/surflex-dock法を適用することにより、水分子だけでなく塩素イオン存在下でのジペプチドの立体配座を特定し、その安定性を自由エネルギー変化量として見積もることが可能となった。4)アポE欠損マウスに対する3ヶ月にわたる長期WH投与試験を実施し、10mg/kg投与によって有意なenfaceによる抗動脈硬化作用を発見し、ペプチドによる本作用を世界で初めて明らかにし得た。種々の生理作用が明らかにされつつある低分子ペプチドについて、特に高血圧・動脈硬化等の発症に深く関わる血管機能に対する潜在的な作用を組織レベルで評価し、さらにin vivoでの活性発現を検証した。また、前年度に構築したLC-MRM-MS/MS法を用いてジペプチドの吸収挙動を明らかにした。1)同位体標識LC/MS法の構築によるペプチド吸収挙動の解明:13C-Val, Ile, AlaのFmoc誘導体化並びにC末端にTyrを配置した合成ジペプチド体を用いて、新たに構築したLC-MRM-/MS/MS法による血中への吸収挙動を明らかにした。設定した最適イオン化条件において、SHRへの3種ペプチド(30mg/kg)投与後の24時間までの尾静脈採血により得られた血漿を用いて吸収量を測定した結果、いずれも1時間でのCmax(10ng/ml)が認められ、確実に循環系へとintactに吸収されることが判明した。2)血管調節機能を有するペプチド体の網羅的解明:SDラット血管標本を用いた血管張力測定を実施し、血管弛緩性の認められたHRWを用いて、その活性発現要件を明らかにした。その結果、Hisのイミダゾール環をメチル化した場合、Argをシトルリン弛緩した場合において、完全にその弛緩活性が消失した。

従って、低分子ペプチドによる血管弛緩作用の発現にはプロトン化された側鎖Nの存在が極めて重要であることが判明した。3)水溶液系でのタンパク質とペプチドとの立体的相互作用を見積もることを可能とするSYBYL/surflex-dock法を適用することにより、ACE阻害活性の程度をペプチド-ACE結合自由エネルギーから予測できることを初めて明らかにした。4)アポE欠損マウスに対する3ヶ月にわたる長期WH投与試験を実施し、10mg/kg投与によって有意なenfaceによる抗動脈硬化作用を再度確認した。また、その構成アミノ酸のみでは全く作用は認められなかったことから、WHがペプチド体として抗動脈硬化作用を発現していることが明示できた。
蛋白質の弱い相互作用トリガーシステムの解明とその設計提案

本研究では、弱い相互作用(低親和性)を示す蛋白質ー蛋白質間相互作用の分子認識メカニズムを解明することにより、生体分子の秩序を制御する新しい分子設計の提案を試みることを目標としている。この低親和性の相互作用は、熱力学パラメータと速度論パラメータを精密に解析することにより、このパラメータに基づいた分子レベルでの相互作用メカニズムを記述することにより、達成することができると考えている。<OMD蛋白質の相互作用解析>コラーゲンタイプIとOMDとの分子間相互作用とその複合体構造を解明することのより、低親和性相互作用メカニズムの足掛かりを見出すことを試みた。まず物理化学的な解析として、会合定数の温度依存性(lnk/T-1)に関するvan't Hoff解析を行った。その結果、温度の上昇に伴う会合定数の増大が観察され、この相互作用は脱水和を伴う様式を駆動力としたメカニズムであることが明らかとなった。さらに塩濃度の上昇による親和性の低下が観察されたことから、複数の荷電残基をアラニンに変異させたアミノ酸変異体を調製した。その結果、いくつかの荷電残基において、親和性を創出する重要なアミノ酸が含まれていることが明らかとなった。これは、コラーゲンの表面がプラスに帯電していることとOMDがマイナスに帯電していること、さらにコラーゲンにはその分子表面において水分子が取り囲んでいることによって、相互作用の際に有利なエントロピーを獲得していることを示唆する結果であった。以上の成果の一部Nature姉妹紙の学術論文誌にpublishすることができた(Commun Biol. 2018, 1:33.doi: 10.1038/s42003-018-0038-2)。OMDとコラーゲン間の相互作用において、静電的作用による脱水和が駆動力となっていることを見出し、その駆動力がコラーゲンの繊維形成(秩序)に重要な役割を果たしていることが明らかとなった(Commun Biol. 2018, 1:33.doi: 10.1038/s42003-018-0038-2)。一方で、InlAに関する相互作用解析においては、低分子スクリーニングのアッセイ系構築に時間を要しており、2019年度において、制御剤の取得を試みる。2019年度は、分子制御剤のコンセプトを打ち出すために、InlAとEカドヘリンの相互作用解析と阻害剤探索をメインに進める。低分子ライブラリーを活用して、SPRと菌体アッセイを併用して特異的阻害剤を取得し、低親和性相互作用を制御する上での足掛かりとなる相互作用様式を見出す。
伸展圧によって誘導される真珠腫形成と骨破壊分子制御メカニズムの解明

真珠腫は良性疾患であるにもかかわらず側頭骨を徐々に破壊する疾患である。耳小骨の破壊や骨迷路の破壊によって難聴やめまいがおきる。顔面神経管の破壊によって顔面神経麻痺が起きる。さらには頭蓋底破壊によって細菌が頭蓋内に入り脳膿瘍に至り、致命的になることがある。その治療法は外科的治療しかなく、保存的治療は開発されていない。この疾患の主な病態は骨を破壊することであり、保存的治療はその病態を抑制すること重要だと考えられる。しかし骨破壊メカニズムは未だ解明されていないため、保存的治療法は開発されていない。これまで、真珠腫の骨破壊については破骨細胞活性化説、真珠腫組織による骨圧迫説、低pHである真珠腫落屑物と骨との酸腐食反応説などが提唱されている。もっとも頻繁に提唱されているのは破骨細胞活性化説であり、電子顕微鏡下で破骨細胞の存在を示されている。だが破骨細胞の存在を否定する報告もあり、まだcontroversialである。真珠腫で破骨細胞が誘導されていることを仮説を証明するために、破骨細胞の存在と統計的に計測しコントロールの骨と比較した。破骨細胞を誘導する因子(RANKL)について検証したところ、dPCRでその発現が亢進していることがわかり、さらに真珠腫の線維芽細胞でその発現が見られた。またRNAシークエンスを用いることで遺伝子発現の観点から破骨細胞活性化に関わる組織的背景を検証し、その上流因子がELISAで実際に上昇していることを確かめた。我々は中耳真珠腫の骨破壊メカニズムに解明するにあたって、モデルマウスを作成し扁平上皮細胞と線維芽細胞の相互作用に着目した。そのモデルマウスにおいては両細胞間の相互作用により骨破壊が誘導されることが証明されている。さらに我々は真珠腫の発生段階でみられる鼓膜組織の進展刺激が真珠腫の増大あるいは骨破壊へ関与していると仮定し、そのメカニズムについて解明しようとしている。つまりマウスの耳介より扁平上皮細胞と線維芽細胞を単離しシリコンチャンバーの中で培養させ、その培養系に進展刺激を与える実験を行った。また組織への伸展圧も確認するために、まずケラチノサイトの3次元培養系を作成した。さらにモデルマウスと臨床検体を用いて破骨細胞の存在、真珠腫組織でのサイトカイン、増殖因子などもリアルタイムPCR、ELIZA法とRNA-seq法を用いて検証した。伸展刺激を与えた単層培養の扁平上皮細胞及び線維芽細胞からは有為な各種サイトカインや成長因子の増加が見られなかった。その理由として、これまで報告のある伸展刺激の多くは周期的な伸展刺激であり、今回持続伸展刺激をとっているため伸展刺激様式が異なることが理由と考えられる。またマウスからの扁平上皮細胞の安定した培養が困難であることもその要因となっている。扁平上皮細胞の3次元培養についても培養は確立したものの伸展圧を負荷できるまでには至っていない。一方で臨床検体とモデルマウスを用いた実験系からは骨破壊メカニズムの解明に近づいている。つまり、破骨細胞の存在を確認し、それを誘導する因子の存在を確認した。in vitroの実験においても、その因子が線維芽細胞から破骨細胞誘導因子であるRANKLを発現することを確認できた。臨床検体からのRNA-seq法でも皮膚と比較してRANKLの上昇を確認したほか、様々なサイトカインの有為な上昇を確認できた。一方、古くから骨圧迫説は存在していた。また酸腐食反応説が唱えられており真珠腫内容物が低pHであり、真珠腫のmatrixのタイトジャンクションが弱くなり酸によって骨が腐蝕されているという仮説が報告されている。真珠腫の発生段階でみられる鼓膜組織の進展刺激が真珠腫の増大あるいは骨破壊へ関与していると仮定し、そのメカニズムについて解明しようとした。さらに真珠腫で破骨細胞が誘導されていることを仮説を証明するために、破骨細胞の存在と統計的に計測しコントロールの骨と比較した。またRNAシークエンスを用いることで遺伝子発現の観点から破骨細胞活性化に関わる組織的背景を検証した。もともと上皮の進展力が上皮に影響を及ぼしていると仮説を立て、伸展量を用いたin vitroの実験を行っていた。しかし伸展刺激を与えた単層培養の扁平上皮細胞及び線維芽細胞からは有為な各種サイトカインや成長因子の増加が見られなかった。またヒトの扁平上皮細胞の線維芽細胞の共

培養において破骨細胞誘導因子であるRANKLの発現は認めず、伸展刺激を加えても線維芽細胞からRANKLの発現はみられなかった。一方真珠腫の破骨細胞存在について検証し有為に破骨細胞が上昇していた。真珠腫組織からRANKLのmRNAが上昇し、RNAシークエンスで破骨細胞を誘導する遺伝子群が有為に上昇していることを見出した。これは真珠腫における破骨細胞活性化説が正しいことを裏付け、真珠腫の病態解明に近づいたと言える。さらに我々は過去の文献に基づいたコンピュータ解析を行いRANKLの上流について検証しいくつかのサイトカインが候補に上がった。これらをELISAで実際に真珠腫に含まれているかを検証した。それらの候補のうち、IL1bが真珠腫中に多く含まれ、in situ hybridizationで炎症細胞が強く分泌していることがわかった。真珠腫は良性疾患であるにもかかわらず側頭骨を徐々に破壊する疾患である。耳小骨の破壊や骨迷路の破壊によって難聴やめまいがおきる。顔面神経管の破壊によって顔面神経麻痺が起きる。さらには頭蓋底破壊によって細菌が頭蓋内に入り脳膿瘍に至り、致命的になることがある。その治療法は外科的治療しかなく、保存的治療は開発されていない。この疾患の主な病態は骨を破壊することであり、保存的治療はその病態を抑制すること重要だと考えられる。しかし骨破壊メカニズムは未だ解明されていないため、保存的治療法は開発されていない。これまで、真珠腫の骨破壊については破骨細胞活性化説、真珠腫組織による骨圧迫説、低pHである真珠腫落屑物と骨との酸腐食反応説などが提唱されている。もっとも頻繁に提唱されているのは破骨細胞活性化説であり、電子顕微鏡下で破骨細胞の存在を示されている。だが破骨細胞の存在を否定する報告もあり、まだcontroversialである。真珠腫で破骨細胞が誘導されていることを仮説を証明するために、破骨細胞の存在と統計的に計測しコントロールの骨と比較した。破骨細胞を誘導する因子(RANKL)について検証したところ、dPCRでその発現が亢進していることがわかり、さらに真珠腫の線維芽細胞でその発現が見られた。またRNAシークエンスを用いることで遺伝子発現の観点から破骨細胞活性化に関わる組織的背景を検証し、その上流因子がELISAで実際に上昇していることを確かめた。単層培養系における伸展刺激の条件検討を行う。また扁平上皮細胞、線維芽細胞及び両者の3次元培養の伸展負荷実験系を構築する。さらには今年度臨床検体から有為に上昇しているとして得られた中で骨破壊及び組織増殖に関わるサイトカインや成長因子について注目し、伸展負荷実験系において発現があるかを検証する方針である。今後は論文を投稿し、学会で発表してく予定である。3次元構築した扁平上皮細胞に伸展圧を加えるための資材の検証が進まず、その資材に対して当てていた予算が使用できず次年度使用額が生じた。論文校正および投稿費、リバイスの実験費用、学会発表に関わる費用が必要と考えられる。シリコンチャンバーの種類や伸展の条件について検証を進めていく。
抗老化因子Ｋｌｏｔｈｏが肥満改善による動脈伸展性増大に果たす役割

動脈伸展性の低下は心血管疾患のリスクファクターであるが、肥満により動脈伸展性は低下する。一方、肥満者における運動や食習慣の改善は、動脈伸展性を改善する。本研究では、その動脈伸展性の改善のメカニズムの解明を目的として、心血管保護作用を持つことが知られている抗老化タンパクKlothoに着目して研究を行った。本研究は主にヒトにおける検討とマウスにおける検討を行った。平成27年度、28年度にアメリカ、East Carolina Universityでマウスにおける検討を行った。今年度は、日本でヒトにおける検討を行い、さらに、アメリカにおいて、マウスにおける検討の追加実験と新たにヒトにおける検討(共同研究)を行った。マウスにおける検討では、1)肥満モデルマウスにおける長期間の自由運動の動脈およびKlothoへの影響、2)肥満モデルマウスへの腹腔内Klothoタンパク投与の動脈および代謝への影響、3)肥満モデルマウスへの脳室内Klothoタンパク投与の動脈および代謝への影響を検討した。これにより、肥満モデルマウスにおける長期間の自由運動は、様々な組織でのKlothoの遺伝子発現を増加させ、動脈器質に影響する遺伝子、代謝関連遺伝子の発現が変化することを明らかにした。ヒトにおける検討では、1)肥満者および非肥満者における長期間の有酸素性運動の動脈およびKlothoへの影響、2)肥満外科手術後の運動のKlothoおよび代謝パラメーターへの影響を検討した。これにより、肥満者における運動および肥満外科手術後の運動後のKlothoおよび代謝パラメーターの変化に関連があることを明らかにした。アメリカからのサンプルの発送や手続きに予定以上に時間がかかり、全体のスケジュールに遅れが出た。現時点でデータの公表には至っていないが、現在論文3報を執筆中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。肥満者における定期的な運動や食生活改善による動脈伸展性の増大は心血管疾患の予防に有用であると考えられている。また、抗老化因子Klothoの血管保護作用は動脈伸展性の増大に寄与することが示唆されている。そこで、本研究では、生活習慣改善による動脈伸展性増大のメカニズムへのKlothoの関与を明らかにすることを目的とした。この目的の達成のために、2つの検討を予定している。まず、肥満者における定期的な運動と食生活改善が動脈伸展性と血中Klotho濃度に与える影響を検討する(研究1)。さらに、肥満モデルマウスを用いて、自由運動と摂食量制限が組織Klotho発現および動脈伸展性に及ぼす影響を検討する(研究2)。これらの研究遂行のために、本年度はEast Carolina大学、肥満・糖尿病研究所に研究拠点を移し、環境を整備するとともに、実験に必要な技術習得および予備検討を行った。研究1の遂行のために、予備検討として、肥満者および非肥満者における血中Klotho濃度の測定を行い、肥満と血中Klotho濃度に関連があることを確認した。研究2の研究遂行のために、マウスにおける超音波エコーを用いた動脈伸展性の測定、テールカフを用いた血圧測定、呼吸代謝の測定、免疫蛍光染色の技術を習得した。さらに、肥満モデルマウスの主要な組織におけるKlotho発現を遺伝子およびタンパクレベルで測定するとともに、免疫蛍光染色により組織中のKlothoタンパク発現の局在を検出した。これらの予備検討により、使用する肥満モデルマウスおよび測定条件を決定した。今年度の技術習得および予備検討から、本実験の条件を確定したことは、次年度以降の研究遂行のために必要不可欠であり、意義のある進捗であった。今年度は、肥満者における定期的な運動や食生活改善が動脈伸展性を改善するメカニズムへの抗老化遺伝子Klothoの関連を明らかにすることを目的として、肥満者および肥満モデルマウスにおける肥満が血中Klotho濃度および組織Klotho発現に及ぼす影響を検討した。また、ヒトおよび動物を対象として肥満関連の研究を専門的に行っているEast Carolina大学、肥満・糖尿病研究所に研究拠点を移し、環境整備および予備検討を行った。当初の計画では、肥満者における検討を27年度、肥満モデルマウスを用いた検討を28年度以降に行う計画であったが、肥満者における検討の準備(環境整備および予備検討)と同時進行で、肥満モデルマウスを用いた検討の準備(技術習得および予備検討)を進めた。これらの取り組みにより、今後の研究に必要な技術の習得および予備検討が完了したため、本研究は期待通りに研究が進展したと言える。肥満は動脈伸展性を低下させるが、運動や食生活の改善は動脈伸展性を増大させることから、肥満者における運動や食生活の改善は心血管疾患の予防に有効である。抗老化因子Klothoは、様々な血管保護作用を持つが、血中Klothoレベルは肥満により低下し、運動により上昇する。したがって、肥満による血中Klothoレベルの低下は動脈伸展性の低下を招き、肥満者における運動や食生活改善は血中Klothoレベルを増加させ、動脈伸展性の増大に寄与する可能性が考えられる。そこで、本研究では、肥満者における運動および食生活改善が動脈伸展性を増大させるメカニズムへのKlothoの影響を検討することを目的とした。今年度は昨年度から引き続き、米国、East Carolina大学、肥満・糖尿病研究所にて実験を行った。動物実験では、マウスに12週間の高脂肪食給餌により肥満を誘導した肥満モデルマウスを用いて、長期の運動(実験1)、腹腔内Klothoタンパク投与(実験2)、脳室内Klothoタンパク投与(実験3)の代謝、Klotho発現、動脈への影響を検討した。実験1から肥満マウスにおける長期の運動は、腎臓のKlotho発現を増加させることが明らかになった。

さらに、実験2および3から、肥満マウスにおける腹腔内Klotho投与および脳室内Klotho投与は、代謝を変化させることが明らかになった。現在、実験1-3で得られたサンプルおよびデータの解析中である。今年度で動物実験を完了したので、来年度は今年度得られたサンプルおよびデータの解析をする予定である。来年度、これらのサンプルおよびこれまでに取ったデータを解析を行う。これにより、肥満マウスにおける長期の運動が動脈伸展性を改善するメカニズムへのKlothoの作用を明らかにすることが可能であると考えられる。今年度は昨年度と引き続き、米国・East Carolina大学において研究を遂行した。肥満モデルマウスを用いて、長期の運動(実験1)、腹腔内Klothoタンパク投与(実験2)、脳室内Klothoタンパク投与(実験3)の代謝および動脈への影響を検討した。今年度は動物実験の手術方法(脳室内投与のカニューレ装着など)の再検討に時間がかかった。しかし、今年度の動物実験において、サンプルおよび生理学的データの採取が完了した。したがって、本研究はおおむね順調に進展したと言える。動脈伸展性の低下は心血管疾患のリスクファクターであるが、肥満により動脈伸展性は低下する。一方、肥満者における運動や食習慣の改善は、動脈伸展性を改善する。本研究では、その動脈伸展性の改善のメカニズムの解明を目的として、心血管保護作用を持つことが知られている抗老化タンパクKlothoに着目して研究を行った。本研究は主にヒトにおける検討とマウスにおける検討を行った。平成27年度、28年度にアメリカ、East Carolina Universityでマウスにおける検討を行った。今年度は、日本でヒトにおける検討を行い、さらに、アメリカにおいて、マウスにおける検討の追加実験と新たにヒトにおける検討(共同研究)を行った。マウスにおける検討では、1)肥満モデルマウスにおける長期間の自由運動の動脈およびKlothoへの影響、2)肥満モデルマウスへの腹腔内Klothoタンパク投与の動脈および代謝への影響、3)肥満モデルマウスへの脳室内Klothoタンパク投与の動脈および代謝への影響を検討した。これにより、肥満モデルマウスにおける長期間の自由運動は、様々な組織でのKlothoの遺伝子発現を増加させ、動脈器質に影響する遺伝子、代謝関連遺伝子の発現が変化することを明らかにした。ヒトにおける検討では、1)肥満者および非肥満者における長期間の有酸素性運動の動脈およびKlothoへの影響、2)肥満外科手術後の運動のKlothoおよび代謝パラメーターへの影響を検討した。これにより、肥満者における運動および肥満外科手術後の運動後のKlothoおよび代謝パラメーターの変化に関連があることを明らかにした。アメリカからのサンプルの発送や手続きに予定以上に時間がかかり、全体のスケジュールに遅れが出た。
大強度パルス相対論的電子ビーム照射による窒素酸化物及び硫黄酸化物の処理過程の解明

自動車、船舶、製鉄所及び火力発電所などの化石燃料(主に石炭、軽油及び重油など)を大量に燃焼する内燃機関等からの排気ガスの浄化を目標に定めて、大強度パルス相対論的電子ビーム(Pulsed, Intense Relativistic Electron Beam : IREB、電子の運動エネルギー2MeV(ピーク値)、電流値4kA(ピーク値)、パルス幅90ns(FWHM))照射による窒素酸化物(NO_x)及び硫黄酸化物(SO_x)の処理プロセスの解明を実験的及び数値解析的に推進した。まず、IREBの長距離伝搬特性(大気透過特性)を積極的に活用して、電子ビーム源から1.6mの大気を介して遠方に設置されたガス処理チャンバ中のSO_x処理を試みた。模擬排気ガス(SO_2/O_2/N_2混合ガス)にIREBを照射して、SO_2濃度の変化を観測した。IREB照射前の初期SO_2濃度100ppm、ガス圧力270kPaのとき、10回のIREB照射によりSO_2濃度は約40ppmに減少した。このときのSO_2処理エネルギー効率(IREBの単位エネルギー当たりのSO_2処理量)は最大で50g/kWhが得られた。本研究では、さらに、排気ガス処理プロセスに必要不可欠な物質であるオゾン(O_3)のIREB照射による生成特性についても言及した。ガス処理チャンバ中のO_3濃度を測定した結果、排気ガス中のNO_x及びSO_x濃度と同程度のO_3がIREB照射により生成されることを明らかにした。このときのO_3収率(IREBの単位エネルギー当たりのO_3生成量)は1020g/kWhであった。また、IREBの透過性を利用してガス処理チャンバ中に金属箔を配置して積極的に二次電子を発生させてO_3生成量の増加を試みた。その結果、O_3生成量に若干の向上が観測された。ディーゼルエンジンや火力発電所などの化石燃料を燃焼する内燃機関等から排出される排気ガスの浄化を目標に定め、大強度パルス相対論的電子ビーム(Pulsed, Intense Relativistic Electron Beam : PIREB、ピーク電子エネルギー(8160)162MeV、ピーク電流値(8160)164kA、パルス幅(8160)1685ns(FWHM))照射による窒素酸化物(NOx)および硫黄酸化物(SOx)の処理プロセスの解明を実験的および解析的に推進した。PIREBの長距離伝搬特性を積極的に利用して、長距離、大空間および電子ビーム源から遠方領域におけるNOx処理を試みた。長さ1.8mの長いガス処理チャンバ中でのNOx処理実験を試みた。模擬排気ガス(NO/N_2およびNO/O_2/N_2混合ガス)にPIREBを照射して、NOx濃度の変化を観測した。乾燥窒素希釈の模擬排気ガスにおいて、PIREB照射前の初期NO濃度100ppm、排気ガス圧力120kPaのとき、10回のIREB照射により、(8160)1696%のNOx処理に成功した。また、初期NO濃度880ppm、排気ガス圧力120kPaの場合において、NOx処理エネルギー効率(PIREBの単位エネルギー当たりのNOx処理量)の最大値は(8160)16220nmol/Jに達した。一方、乾燥空気希釈の模擬排気ガスでは、排気ガス圧力120kPaの場合、初期NO濃度が200ppm以下のときにNOxの処理が確認された。このとき、NOx処理エネルギー効率の最大値は(8160)16175nmol/Jであった。また、NOの半減期の計算を行った結果、乾燥空気希釈の模擬排気ガスのPIREBによるNOx処理プロセスでは、NOとOおよびO_3との酸化反応によりNO_2が生成されることによりNOx処理が妨げられることが判明した。

このときのO_3収率(IREBの単位エネルギー当たりのO_3生成量)は1020g/kWhであった。また、IREBの透過性を利用してガス処理チャンバ中に金属箔を配置して積極的に二次電子を発生させてO_3生成量の増加を試みた。その結果、O_3生成量に若干の向上が観測された。
正電荷リポソーム包埋ヒトインターフェロン遺伝子を用いた食道癌の遺伝子治療

本研究代表者らは悪性黒色腫や悪性脳腫瘍等の治療に用いられているヒトinterferon-β(hIFN-β)に注目し、IFN-βがヒト食道癌培養細胞に対してもかなりの増殖抑制作用を有することを明らかにしている。食道癌は内視鏡的に腫瘍にアプローチしやすく,遺伝子治療を行うに適した腫瘍である。腫瘍内のIFN-βの濃度を持続的に維持し、IFN-βの副作用を軽減し、より効果的な治療を行うにはIFN-βの遺伝子の導入が有用と考えられる。本研究では正電荷多重膜リポソーム包埋IFN-β遺伝子を用いた食道癌遺伝子治療の有用性を確認した。1 10種類のヒト食道癌培養細胞に対するhIFN-βの増殖抑制作用を確認した。2ヒト食道癌培養細胞に対するhIFN-βと5-fluorouracilの併用効果を確認した。3正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入によるヒト食道癌培養細胞の増殖抑制作用を明らかにした。10種類のヒト食道癌培養細胞に対するhIFN-β遺伝子IC50値は16-176ngDNA/mlであった。4正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子の導入と5-fluorouracilを併用することにより、1/2-1/10の濃度の5-fluorouracilでも同等の増殖抑制効果が得られることを確認した。5ヌードマウス移植ヒト食道癌細胞株を用い、in vivoでの正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入の腫瘍増殖抑制効果を確認した。本研究代表者らは既に悪性黒色腫、悪性脳腫瘍等の治療に用いられているヒトinterferon-β(hIFN-β)に注目し、IFN-βがヒト食道癌培養細胞に対してもかなりの増殖抑制作用を有することを明らかにしている。しかしながら、腫瘍内のIFN-βの濃度を持続的に維持し、IFN-βの副作用を軽減し、より強い抗腫瘍作用を得るには、IFN-β遺伝子の導入が有用と考えられる。本研究の課題はIFN-β遺伝子を用いた食道癌の遺伝子治療の有用性を確認することにあり、平成13年度には以下の点を明らかにした。1.10種類のヒト食道癌培養細胞に対するhIFN-βの増殖抑制作用を確認し、hIFN-βと5-FUとの併用効果も明らかにした(印刷中)。2.正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入による増殖抑制作用をヒト食道癌培養細胞を用いて明確にした。ならびに5-FUの抗腫瘍作用との併用効果についても明らかとした。10種類の食道癌培養細胞に対するhIFN-β遺伝子のIC_<50>値は16-176ng DNA/mlであった。hIFN-β遺伝子導入後、hIFN-βの産生を確認した。さらにhIFN-β遺伝子の導入と5-FUとを併用することにより、1/2から1/10の濃度の5-FUでも同等の細胞増殖抑制効果が得られることを明らかとした。この結果より、hIFN-β遺伝子導入と5-FUの併用療法は増殖抑制効果を増強し、かつ副作用を軽減しうることから、食道癌の治療法として有望と考えられる。3.ヒト食道癌移植モデル動物を用いてhIFN-β遺伝子導入と5-FUの併用効果を検討する研究を進行している。このin vivo実験の結果を基に専用のカテーテルを開発し臨床研究へと進めていくことを検討中である。本研究代表者らは悪性黒色腫や悪性脳腫瘍等の治療に用いられているヒトinterferon-β(hIFN-β)に注目し、IFN-βがヒト食道癌培養細胞に対してもかなりの増殖抑制作用を有し、5-fluorouracilとの併用によりその抗腫瘍効果を増強させることを明らかにしている。

食道癌は内視鏡的に腫瘍にアプローチしやすく、腫瘍内への薬剤投与も容易である。したがって食道腫瘍内のIFN-βの濃度を持続的に維持し、IFN-βの副作用を軽減し、より効果的な治療を行うには正電荷多重膜リポソーム包埋IFN-βの遺伝子の導入が有用と考えられた。本研究では正電荷多重膜リポソーム包埋IFN-β遺伝子を用いた食道癌遺伝子治療の有用性をin vitro, in vivoの実験にて確認した。1ヒト食道癌培養細胞に対する正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入による増殖抑制作用と5-fluorouracilの併用効果により、1/2-1/10の濃度の5-fluorouracilでも同等の増殖抑制効果が得られることをin vitroで確認した。2ヌードマウス移植ヒト食道癌細胞株を用い、in vivoでの正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入による腫瘍内のhIFN-βの発現を確認した。3ヌードマウス移植ヒト食道癌細胞株を用い、in vivoでの正電荷多重膜リポソーム包埋hIFN-β遺伝子導入の腫瘍増殖抑制効果を確認した。