hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
意識内容の表出が困難な患者の意識状態とその脳内機構の解析

本研究では、これまで困難であった意識内容の表出が困難な患者の意識状態を評価し、その背景にある脳内機構を明らかとすることを目的とする。意識内容に着目した研究では、意識障害の患者を対象としfMRI信号を計測解析することで、言語処理に関わる脳機能の段階的評価を行い、またブレイン-マシン・インターフェイス技術を用いることで、一部の無反応覚醒症候群患者の意志表出を可能とした。また覚醒度に着目した研究では、脳波信号から覚醒度を推定する手法を開発し、健常者を対象として、この開発した手法により導出された指標の変化率と、主観的な眠気の指標であるカロリンスカ眠気尺度の変化率との間に強い相関があることを見出した。本研究では、意識内容の表出が困難な患者の意識状態とその背景にある脳内機構を明らかとすることを目的とする。本年度は、意識内容の表出が困難な患者の意識状態に対し、意識内容と覚醒度に着目して脳活動を計測・解析する手法の研究・開発を進めた。意識内容に着目した研究としては、遷延性意識障害の患者を主対象として研究を進めた。まず、対象患者の意識内容の複雑性を評価するために、これまでに開発した言語理解の脳領域を可視化するfMRI課題(Cereb Cortex, 2000)を改変して適用した。その結果、有意な脳活動を観察することが難しかった患者も認められたものの、音声言語を理解していると考えられる患者を見出すことに成功し、その内容を発表した。また、患者の意識内容を表出させることを目指し、これまでに開発したブレイン-マシン・インターフェイス(BMI)技術を用いた研究も開始した。これまでのところ、定常視覚誘発電位(SSVEP)方式のBMI手法を利用し、少数個の判別を行わせる課題を用いてデータを蓄積している。対象は、意識内容の表出が困難である筋萎縮性側索硬化症(ALS)や遷延性意識障害の患者とした。覚醒度に着目した研究としては、脳波を用いて対象者の覚醒度を推定する手法の開発を行った。健常者を対象として脳波変化に着目した独自の指標を検討したところ、その開発した指標が、主観的な眠気の心理評価が可能とされるKarolinska Sleepiness Scaleの変化量との間で強く相関することを見出し、その内容を発表した。意識内容に着目した研究では、意識障害を伴う患者を対象とした神経画像法を用いた実験データの蓄積が進んでおり、また覚醒度に着目した研究においても、健常者を対象としたデータの蓄積が進んでいることから、おおむね順調に進展していると判断した。本研究では、これまで困難であった、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の完全閉じ込め状態等により意識内容の表出が困難な患者の意識状態の評価とその背景にある脳内機構を明らかとすることを目的とする。意識内容に着目した研究としては、意識障害の患者を対象とし、音声刺激を用いた非侵襲脳機能計測実験を行うことにより、音に対する反応と言語に対する反応について、意識障害の患者の言語処理に関わる脳機能が複数のレベルにて評価出来ることを見出し発表した。また、ALS患者を対象とし、ブレイン-マシン・インターフェイス(BMI)を用いた言語指示に対応した意志表出に関する実験を行いその有効性について検討した。これにより、一部の患者では期待値に対して統計的に有意な精度での意思表出が可能であることを示唆する結果を得て発表した。覚醒度に着目した研究としては、脳波を用いて対象の覚醒度を推定する手法について研究を行った。健常者を対象とし、主観的な眠気の指標としてKarolinska Sleepiness scale(KSS)を用い、その指標と今回の研究で開発した手法によって導出される指標について検討を行った。その結果、KSSと開発した手法について、それらの指標の変化と主観的な眠気の変化に強い相関があることが示唆され発表した。今回開発した手法を用いることで覚醒度の変化を継続した脳波計測によって捉えられ、意識の表出が困難な患者においても覚醒度が高いタイミングでBMIを使用することなどが可能となる。これまでの研究を発展させ、fMRIによる脳機能計測や脳波によるBMI技術を利用し、意識内容の表出が困難な患者の意識状態を意識内容と覚醒度とに着目して解析する手法を研究・開発し、その結果を発表する。意識内容に関しては、筋萎縮性側索硬化症(ALS)や遷延性意識障害の患者からのデータの収集・解析を進める。覚醒度に関しては、健常者からのデータに加えて、患者からのデータも収集し、その解析を進める。神経生理学,システム神経科学年度末の学会参加に伴う旅費等の振り込み日が4月となったため次年度4月に当該旅費等の振り込みが行われた
メルト・水溶液・固相間でのゲルマニウムの分配に関する実験的・理論的研究

本研究の目的は、地球を構成する主成分である珪素と化学的な挙動が類似し、珪酸塩の四面体の構造の中に入ると予想されるゲルマニウムの挙動、特に固体と液体の間での分配を調べ、地球内部での物質分化過程にたいして新しい知見を得ることを目的とする。ゲルマニウムは珪素と挙動が似ると同時に、微量元素として解析が行いやすい元素であると考えられることが利点の一つである。2年計画の最終年度に当たる本年は、初年度における1気圧下でのSiO2-MgO(プラスGeO2)系での実験結果を受け、高圧下(7GPa)での融解実験を行って、元素の挙動に対する圧力効果を調べた。実験は名古屋大学理学部のマルチアンビル型高圧発生装置を用いて行った。酸化物の試薬を乾燥(400度、24時間)後に機械的(シリカミル)で十分に混合し、出発物質とした。また、実験後の生成物はEPMAによって分析を行った。その結果、7GPaではforsterite/melt(D fo-m GeO2)は0.35±0.15と1気圧下での0.51±0.08よりも低い値を示すことが分かった。また、7GPa下ではenstatite/melt(D en-m GeO2)は0.56±0.29となることが分かった。これらの結果を既存の熱力学パラメターと合わせて解析を行ったところ、反応の体積変化は7GPaまでの範囲で大きくは変化しないらしいことが分かってきた。しかし、パラメターの中には不確定なもの(メルトの圧縮率など)があり、現在はこれらを逆に実験結果から制約すべく解析を継続しているところである。また、これらの実験的な研究に加え、地球内部特に沈み込み帯におけるメルトと水溶液の挙動を解析するために数値モデルを開発して数値実験を行った。その結果を地震波の情報と比較したところ、東北日本の下ではH2Oは一度背弧側まで沈み込み、その後フロントに戻ってくるような複雑な動きをしていること、などが明らかとなってきた。将来は、ゲルマニウムを含む多くの元素の分配と上記の数値モデルを統合し、火成岩の量と化学組成を同時に予測するモデルの構築を目指す。ゲルマニウムは地球を構成する主成分である硅素と化学的な性質は類似し、珪酸塩の四面体の構造の中に入ると予想される。その意味で地球内部の様々なプロセスにおいて、主成分である硅素と挙動が似ると考えられると同時に、微量元素であるためにヘンリーの法則が成立し、分配の解析が比較的容易である、という稀な元素であると考えられる。本研究では、このゲルマニウムの挙動を、主に溶融実験を通して理解することを目的とする。2年計画の初年度にあたる本年は、1気圧下におけるSiO_<2->MgO系における溶融実験を行ない、珪酸塩鉱物およびガラス中でのGeの定量方法を探ることによって、分配の大まかな挙動を捉えることを目的とした。ゲルマニウムは酸化物の形で系に添加されたが、溶融温度以下で気化するため、白金カプセルに封入して実験を行なった。また、ゲルマニウムの添加量が数百ppmである場合には、EPMAを用いて定量分析が可能であることが分かった。これらの予備実験に基づき、1気圧下での溶融実験を行なった。その結果、(1)ゲルマニウムはフォルステライトおよびエンスタタイトのいずれに対してもメルトにより分配され易いこと、(2)分配係数はこれまでに知られている熱力学的定式化と定数によって説明されうる値であること、が分かった。次年度はこれらの結果を踏まえながら、高圧下での溶融実験により、その挙動と熱力学的考察を進める予定である。

その結果を地震波の情報と比較したところ、東北日本の下ではH2Oは一度背弧側まで沈み込み、その後フロントに戻ってくるような複雑な動きをしていること、などが明らかとなってきた。将来は、ゲルマニウムを含む多くの元素の分配と上記の数値モデルを統合し、火成岩の量と化学組成を同時に予測するモデルの構築を目指す。
動態としての表情認識に関する研究

従来、顔表情の認識を検討する場合、評価刺激として写真やスライドなどの静止画像を用いてきたが、本来的には表情は動きのなかから認識されることの方が自然である。さらに表情の変化それ自体がその人物の認識に影響を及ぼすことも考えられる。本研究は、動的表情の認識特性を検討する前段階として、実験1では表情の変化が人物の既知性判断にどのように影響を及ぼすのかという点について、実験2では静止画像に含まれるどの空間周波数成分が表情認識にとって重要であるかという点について検討した。実験の概要は次の通りである。実験1では短大の教員スタッフの真顔と笑顔の写真を撮影してターゲット刺激とし、これらに有名人や無名人の真顔と笑顔の写真を混ぜて、既知性判断課題を実施し、反応時間を測定した。その結果、短大の教員スタッフの場合、笑顔よりも真顔に対する反応時間が短くなり、一方、有名人の場合は表情による反応時間の違いは見られなかった。実験2では真顔、笑顔、悲しい顔の写真画像をフーリエ解析し、遮断周波数を4水準(5,8,12,15c/fw)設定して、それぞれの水準において高周波カット(low-pass)、低周波カット(high-pass)の画像を再合成して刺激を作成した。これらの刺激を用いて、真顔と笑顔、真顔と悲しい顔の弁別課題を被験者に実施した。その結果、真顔と笑顔の弁別の場合、どの水準においても高周波カット、低周波カットに関わらず、弁別成績は高かったが、真顔と悲しい顔の弁別では、高周波カットにおいて極端に弁別成績が低下した。2つの実験は、1)知っている人物でも、日常の知人と有名人とでは表情の影響が異なること、2)笑顔は低空間周波数情報だけでも認識できるが、悲しい顔は高空間周波数がなければ認識がかなり阻害されることを示している。これらの基礎データを基に、現在、動画像における表情認識を検討中である。
網膜円孔の創傷治癒に対する細胞増殖因子の効果

臨床研究においてEGF (Epidermal growth factor)は、角膜上皮細胞の創傷治癒が促進されていることはすでに報告されており、また、昨年の我々の研究結果でも、自己閉鎖創の創傷治癒過程で強角膜部位に明らかな組織学的な細胞増殖を確認している。また、我々はヒト網膜黄斑円孔にEGFを塗布することにより円孔の組織重点を得、EGFの有効性を発表している(臨床眼科49 : 341343, 1995)。今回も、EGFに着目し成熟有色家兎を用いた人工的網膜円孔の治癒にEGFが効果をもつかどうかを検眼鏡的及び組織学的に調べた。方法は、人工的後部硝子体剥離を作製し、熱加工したガラス管を網膜表層に刺入し約12乳頭経の人工的網膜剥離を生じさせた。この人工的網膜剥離部分にソフトテ-パ-ニードルを用い能動吸引にて感覚網膜を欠損させ人工的網膜円孔を作製した。円孔作製後、液一空気置換術にてを眼内(硝子体)を空気に置き換え細胞増殖因子のEGF(濃度10μg/200μl) 200μlを円孔に滴下した。最後にSF60.2mlを眼内注入し手術を終了した。また、コントロール群として何も滴下しない群も用意した。実験結果は、術後23日で網膜剥離は消失し、術後7日頃に人工的網膜裂孔の辺縁は不明瞭になった。ヒトの網膜裂孔とは明らかに異なる治癒過程を示した。家兎では、網膜創傷治癒の程度が大きいと考えられた。しかし、EGFの効果により創傷治癒機転が促進できたかどうかはEGF滴下群とコントロール群では明確な差は認められなかった。トルイジンブルー染色では網膜欠損部にグリア細胞様の細胞が網膜内層を被覆していた。今後この増殖細胞の検索は今後の課題としたい。
塑性加工の手法による木材のニヤネットシェイプ成形技術開発

低環境負荷・循環型材料である木材のみを素材とした塑性加工の手法による複雑形状製品の成形技術の開発を行った。密閉金型を用い、木材の水分を保持した状態で加熱・圧縮することによって、木材は良好な流動性を示し、金型内に充填後、固形化した成形体が得られることを明らかにした。得られた成形体の密度は約1.35g/cm^3、ビッカース硬さ約20Hvを示した。また、木材のみの射出成形による加工が可能であることを明らかにした。本研究では,木材の成形加工における加工条件,すなわち軟化および破壊(粉砕)状態,そして,その後の流動・固形化のメカニズムを解明すると共に,木材の塑性加工の手法による複雑形状製品の成形技術を確立することを目的としている.平成20年度は,基礎的事項である木材の流動・固形化のメカニズムの解明を行った.(1)木材の軟化・破壊挙動:木材が軟化・破壊→流動→固形化をたどる本成形技術においては,金型内における木材の軟化・破壊状態が重要な因子となる.そこで,木材の切り出し部位(心材,辺材,晩材,早材),寸法・形状,含水率を変化させて,種々の条件(温度,圧力,圧縮方向)で,圧縮成形を行い,木材の軟化・破壊挙動に対する種々の影響因子の影響を明らかにした.(2)木材の流動特性の把握:各種の条件で軟化・破壊された木材に対して,含水率,温度,加工力および静水圧を変化させて成形実験を行い,その流動特性を検討した.その結果,高含水率および高温ほど流動性が高まり低圧力で金型内に充填できることを明らかにした(3)固形化のメカニズムの把握:高含水率および高温ほど流動性が高まり低圧力で金型内に充填できるが,得られた成形体は冷却の際に密度低下や破損が生じた.これを解決するために,成形終期に背圧を負荷する方法を考案し,良好な成形品が得られる加工条件を検討した.その結果,30分の煮沸を行っても形状変化しない固形化した成形品が得られることを明らかにした.(4)成形体の機械的特性の検討:成形体の機械的特性として硬さ試験,かさ密度測定した.成形体は,ほぼ均質で高密度であり,また硬質プラスッチクよりも高い硬度を示した.実用化が可能となる製品を成形する加工条件が確認できた.本研究では,木材の成形加工における加工条件,すなわち軟化および破壊(粉砕)状態,そして,その後の流動・固形化のメカニズムを解明すると共に,木材の塑性加工の手法による複雑形状製品の成形技術を確立することを目的としている.平成21年度は,ホットプレスによる小形複雑形状部品の成形および各種塑性加工法の検討を行った.(1)金型内における木材の流動,固形化状態検討:金型内での流動状態(特に,金型の隅部や方向が変化する部分),および固形化状態(特に形状が変化する部分)での固形化の状態を詳細に調査し,ホットプレスによる成形における問題点を明らかにした.(2)成形体の寸法精度および機械的特性の検討:成形体を半割にして,内部の密度分布および硬さ分布を調査し,成形体の強度に対する成形条件の影響を明らかにした.さらに,成形体を30分間の煮沸実験を行い、形状変化が生じない成形条件を明らかにした.(3)各種塑性加工法の検討:現在,実験で行っているホットプレスによる加工では,「金型への木材の挿入→加熱→加圧(保持)→冷却→成形体の取り出し」の工程をたどる.このため加熱・冷却時間が長くなり,実用化を考慮した場合には生産効率が非常に悪い.そこで,射出成形の利点を考慮して木材の含水率の調整が可能な加熱部と加圧部を分離させた加工装置を試作し,生産効率の向上について検討した.また,木材粉末の固形化が確認されている他の塑性加工手法(押出し加工,逐次押出し加工)について,木材の成形加工の可能性を確認した.本研究は,木材の成形加工における加工条件,すなわち軟化および破壊(粉砕)状態,そして,その後の流動・固形化のメカニズムを解明すると共に,木材の塑性加工の手法による複雑形状製品の成形技術を確立することを目的とする本年度は,実用的な大きさ・形状を有する複雑形状部品の成形を試み,成形の可能性と問題点を検討した1.ホットプレスによる複雑形状部品の成形:複雑部品形状(ワイングラス形状)金型を作製してホットプレス成形を試みた.そして,木材の流動状況,成形品の固形化状態,強度および耐水性を調査し,実用的な形状を有する製品の製造の可能性と問題点について検討した.密度1.30g/cm3以上の耐水性を有する良好な成形体を作製できる適切なホットプレスの加工条件(木材の含水率,成形温度,成形圧力)を明らかにした2.射出成形による成形:木材用の射出成形装置を試作し,射出成形の可能性と問題点を検討した.

この試作の射出成形装置は,コンテナ部(木材の軟化・破壊),ゲート部(コンテナ部と金型部の連結部),固形金型部で構成されている.良好な成形体が得られる加工条件(木材の含水率,コンテナ温度,ゲート部の形状・温度,射出圧力,金型温度,金型の容積,保圧時間等)を調査した.木材がゲート部(直径2mmの穴)を良好に流動するコンテナ部での加工条件(木材の含水率,温度,保持時間)を明らかにした.また,ゲート部を通過し固形金型に流入した材料の固形のための加工条件を明らかにした.成形品は,密度1.30g/cm3以上で耐水性を有しており,木材の射出成形が可能であることが確かめられた
分子性結晶のためのＱＭ／ＭＭ法の開発と結晶内金属錯体の理論化学

本研究の目的は、(1)我々が開発してきた自己無撞着点電荷に基づく周期的QM/MM法で決定するMM結晶モデルを高精度電子状態計算における静電的補正に利用する事、また(2)自己無撞着点電荷に基づく周期的QM/MM法における反応中心とその周囲分子との相互作用について記述精度を向上させる事である。従来のONIOM法では高精度レイヤーの電子状態計算を行う際に周囲分子からの電子的影響を考慮していない点で高精度レイヤーの電子状態の記述に課題が残るが、高精度レイヤー計算において無限周期的MM層からの静電効果を考慮に入れる事で、その点の改善が期待できる。前年度の結晶内の混合原子価化合物に引き続き、本年度は、分子記憶デバイスとして期待されるRuSO2系の結晶内異性化反応と、光照射や加熱を行う事なく単結晶-単結晶相転移を生じさせる事によって発光色を大きく変える金(I)-イソシアニド系について上記QM/MM法を適用した。RuSO2系の結晶では基底構造GSの他に準安定構造としてη2型のMS2とη1型のMS1が存在するが、それらの相対安定性とエネルギー障壁は気相中、溶液中、結晶中の順で大きく異なっていく事が分かった。特に光照射によって生じたMS1構造を加熱によってMS2構造、さらにGS構造へと戻すには、結晶中ではcounterionに加え、隣接するRuSO2分子との静電反発が大きな役割を果たす事が明らかになった。金(I)-イソシアニド系ではPhNC-Au-Phによる単結晶と、ジメチル化した誘導体dimPhNC-Au-Phの単結晶において、吸収・発光スペクトルが相転移によって大きく変化する理由が局所励起LEと金属金属配位子電荷移動励起MMLCTの違いにある事を明らかにした。特にMMLCTは隣り合う2量体のみならず4量体にまで非局在化したSOMO軌道を持つ事が分かり、上記(2)の重要性も示された。本研究の目的は、(1)我々が独自に開発してきた自己無撞着点電荷に基づく周期的QM/MM法で決定するMM結晶モデルを高精度電子状態計算における静電的補正に利用する事、また(2)自己無撞着点電荷に基づく周期的QM/MM法における反応中心部分とその周囲分子との近距離相互作用について記述精度を向上させる事である。従来のONIOM法では高精度レイヤーの電子状態計算を行う際に反応中心部分以外の置換基、官能基、周囲分子からの電子的影響を考慮していない点で高精度レイヤーの電子状態の記述に課題が残るが、高精度レイヤーの電子状態計算において無限周期的MM層からの静電効果を考慮に入れた補正を行う事で、その点の改善が期待できる。そこで本年度は(1)について、電子移動や電荷分離状態を理解するモデルや機能分子として興味深い混合原子価性を示す5配位型Co(III)サレン錯体の高精度電子状態計算において適用した。また比較として溶液中の5配位型Co(III)サレン錯体、また4配位型7族金属(III)および10族金属(II)サレン錯体の混合原子価性について研究を行った。分子性結晶中における5配位型Co(III)サレン錯体のNMR実験からCo(III)サレンとCo(II)サレンラジカルの電子状態が共存している事が明らかにされていたが、この共存は熱平衡由来ではなく擬縮退系の共鳴効果によるものである事が、結晶効果を取り入れたGMC-QDPT法による高精度電子状態計算によって明らかにできた。溶液中でも結晶中と同様に共鳴効果があるという計算結果が得られ、5配位型Co(III)サレン錯体が共鳴効果を示すのか、また根本的に混合原子価性を示すのかという点はz軸上の配位子の強さに大きく依存している事も明らかになり、4配位型金属サレン錯体に比べて5配位型Co(III)サレン錯体の持つ複雑な混合原子価性について議論した。本年度は、予定通り上記の概要(1)に重点をおいて研究を行った。現在、5配位型Co(III)サレン錯体の論文投稿の準備を行っており、同様に周期的QM/MM法によって結晶効果を取り入れた金(I)-イソシアニド錯体の分子性結晶の吸収・発光スペクトルの研究についても論文投稿の準備中である。また概要(2)について、FMO(2)のように二量体相互作用をHF、DFTレベルで記述する事で近距離相互作用の記述精度を向上させた結晶構造の最適化計算手法を計算プログラムとして実装した。したがって、「おおむね順調に進展している」と考えられる。

RuSO2系の結晶では基底構造GSの他に準安定構造としてη2型のMS2とη1型のMS1が存在するが、それらの相対安定性とエネルギー障壁は気相中、溶液中、結晶中の順で大きく異なっていく事が分かった。特に光照射によって生じたMS1構造を加熱によってMS2構造、さらにGS構造へと戻すには、結晶中ではcounterionに加え、隣接するRuSO2分子との静電反発が大きな役割を果たす事が明らかになった。金(I)-イソシアニド系ではPhNC-Au-Phによる単結晶と、ジメチル化した誘導体dimPhNC-Au-Phの単結晶において、吸収・発光スペクトルが相転移によって大きく変化する理由が局所励起LEと金属金属配位子電荷移動励起MMLCTの違いにある事を明らかにした。特にMMLCTは隣り合う2量体のみならず4量体にまで非局在化したSOMO軌道を持つ事が分かり、上記(2)の重要性も示された。今年度は、当初の予定通りに上記の概要(2)について重点をおき、結晶構造最適化における近距離相互作用の記述の更なる改善として二量体相互作用をMP2レベルで記述する事や、対称性を考慮する事によってQM計算のコストの削減を行う予定である。またFMO(2)のように二量体相互作用をQMレベルで評価・補正を行う構造最適化の場合にはCPHFを解く必要が生じるが、現時点で実装した計算プログラムでは一部近似を行っており、この評価の妥当性を調べた上で更なるgradientの精度向上を目指す。近距離相互作用の記述を改善したQM/MMプログラムによって、遷移金属錯体と対イオン分子によって構成されるような分子性結晶について構造最適化を成功させ、更に結晶中での異性化反応などの解析に応用する事を目標とする。例として、結合異性を取り得る二酸化硫黄の配位子とRu(II)原子から構成される遷移金属錯体は、光照射によって金属中心に結合した配位子が構造的方向と結合性の異なる一つ以上の擬安定構造を持ち、その結晶中での特徴から、基底構造を0、擬安定構造を1と見做して、その構造間のスイッチ制御に成功すれば、光学的データ保存の分子デバイスとして利用できると期待されている。このような系の分子性結晶中での熱的異性化、光異性化について、周囲分子との近距離相互作用を取り入れた理論的枠組みによって、スイッチ制御因子についての解析を行う予定である。
加齢に関連する痛みの慢性化機序の解明 -脳由来神経栄養因子の役割とその治療応用-

本研究課題では、神経障害性痛の病態機序における脳由来神経栄養因子(BDNF)の役割について、より高位中枢の海馬に焦点を当て、モデル動物におけるその発現変化と各種行動評価(疼痛、抑うつ、認知機能)との関連性の詳細を調査することを目的とする。疼痛モデルとして、右側L5-6脊髄神経を6-0絹糸で結紮・切断することにより作製する脊髄神経切断(SNL)モデルを用いた。神経障害性痛の病態機序における海馬BDNFの関与を明らかとするために、SNL手術2、5、7、14日後に海馬を摘出し、BDNFの発現変化をmRNAレベル(RT-PCR法)、蛋白レベル(ELISA法)で測定した。その結果、正常群と比較して、SNLラットの海馬BDNFは手術7日目より有意に低下した。海馬BDNFの低下は、SNL手術後の痛覚過敏様行動の発生頻度と有意な相関関係が認められた。また、BDNFの生合成過程の影響を検討するため、成熟型BDNFに加え、うつ病患者で増加することが知られている前駆体型のpro-BDNFの測定も行い、成熟型BDNFと同様の結果が得られた。さらに、神経障害性痛における海馬BDNFの特異性を検討するために、他の疼痛関連部位(前頭前野、脳幹、扁桃体)での変化を検討した。しかし、前頭前野、脳幹、扁桃体では海馬で生じたSNL手術後のBDNF低下は生じなかった。BDNFは海馬でのシナプス伝達の可塑性発現に関与し、学習や記憶の形成に関わる。また、海馬BDNFの低下は、うつ病と関連することが知られている。これらの現象は、海馬BDNFのダウンレギュレーション(脊髄とは逆)が神経障害性痛の病態機序に関連すると同時に、併発する抑うつ、認知機能障害に関与することが推測される。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、海馬でも興奮性作用も示されていることから、海馬の侵害シグナルへの関与が推測される。しかし、神経障害性痛モデルで海馬BDNF蛋白量を検討した今回の研究結果では、海馬BDNF濃度と痛覚過敏様行動に有意な逆相関関係(痛みが強いほどBDNF濃度が低い)が認められた。これらの現象は、海馬BDNFのダウンレギュレーション(他の神経部位とは逆)が神経障害性痛の病態機序に関連すると同時に、併発する抑うつ、認知機能障害に関与することが推測される。また、海馬はBDNFが最も豊富に存在する部位で、血液中に僅かに検出されるBDNF濃度は海馬BDNF濃度と相関することが知られている。今回の結果をより詳細に検証することにより、慢性痛の客観的なバイオマーカーの開発や患者のQOL改善に直結する新規治療法への応用が期待される。今年度の結果を踏まえ、海馬BDNF濃度変化と疼痛・うつ・認知行動試験の相関解析を行う。海馬BDNFは、神経障害性痛時の疼痛のみならず、抑うつ、認知機能においても関連すると考えられる。予備実験においても、神経障害性痛ラットでは、疼痛行動以外にうつ様行動、認知機能障害を生じることを確認している。SNL手術2週間後のこれらの行動異常の程度(疼痛: von Frey試験の逃避行動閾値、pin試験の痛覚過敏様行動の発生頻度、うつ様行動:ショ糖嗜好試験のショ糖嗜好性、認知機能:新奇物体認識試験の新奇物体への嗜好性をそれぞれ指標とする)とその時点における海馬BDNFの発現変化との相関関係を解析することにより、海馬BDNF変化の神経障害性痛ラットの病態への関与を検討する。

これらの現象は、海馬BDNFのダウンレギュレーション(脊髄とは逆)が神経障害性痛の病態機序に関連すると同時に、併発する抑うつ、認知機能障害に関与することが推測される。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、海馬でも興奮性作用も示されていることから、海馬の侵害シグナルへの関与が推測される。しかし、神経障害性痛モデルで海馬BDNF蛋白量を検討した今回の研究結果では、海馬BDNF濃度と痛覚過敏様行動に有意な逆相関関係(痛みが強いほどBDNF濃度が低い)が認められた。BDNFは海馬でのシナプス伝達の可塑性発現に関与し、学習や記憶の形成に関わる。また、海馬BDNFの低下は、うつ病と関連することが知られている。これらの現象は、海馬BDNFのダウンレギュレーション(他の神経部位とは逆)が神経障害性痛の病態機序に関連すると同時に、併発する抑うつ、認知機能障害に関与することが推測される。また、海馬はBDNFが最も豊富に存在する部位で、血液中に僅かに検出されるBDNF濃度は海馬BDNF濃度と相関することが知られている。今回の結果をより詳細に検証することにより、慢性痛の客観的なバイオマーカーの開発や患者のQOL改善に直結する新規治療法への応用が期待される。今年度の結果を踏まえ、海馬BDNF濃度変化と疼痛・うつ・認知行動試験の相関解析を行う。海馬BDNFは、神経障害性痛時の疼痛のみならず、抑うつ、認知機能においても関連すると考えられる。予備実験においても、神経障害性痛ラットでは、疼痛行動以外にうつ様行動、認知機能障害を生じることを確認している。SNL手術2週間後のこれらの行動異常の程度(疼痛: von Frey試験の逃避行動閾値、pin試験の痛覚過敏様行動の発生頻度、うつ様行動:ショ糖嗜好試験のショ糖嗜好性、認知機能:新奇物体認識試験の新奇物体への嗜好性をそれぞれ指標とする)とその時点における海馬BDNFの発現変化との相関関係を解析することにより、海馬BDNF変化の神経障害性痛ラットの病態への関与を検討する。免疫組織試験による前駆体型pro-BDNFの発現変化の評価に使用するための抗体を購入予定であったが、国内在庫がなく海外からの輸入を待つ必要が生じたために次年度使用額が発生した。この金額は次年度初期に予定どおりの抗体購入のために使用する予定である。
新規ペプチドを用いたナノゲルエンジニアリングによる口腔乾燥の標的治療

本研究は,新規に開発された血管誘導性ペプチド(SVVYGLR)をナノゲルエンジニアリングを用いてナノ微粒子化することでDDS(Drug Delivery System)機能を付与し,それを唾液腺に局所投与する標的療法により口腔乾燥症(ドライマウス)治療として唾液分泌機能を再生させることを目的としている.本年度は,本ペプチドの有効性評価の指標となる顎下腺における炎症性サイトカインの変動に対する検討と結紮によるアポトーシス関連遺伝子発現の検討、唾液分泌傷害モデル動物の顎下腺体への局所注射による標的療法(クリップ解除直後に注射し、2週後に摘出)を行った.その結果,IL-1β、IL-6は1週間のクリップ結紮により上昇し、解除後2週でも上昇が認められた。INF-γ、IL-10はクリップ結紮により減少し、解除後1週からやや上昇を認めた。また、結紮によりApi5,Bagl,Bclaf1,Birc5,Bnip3など12のアポトーシス関連遺伝子の発現が認められた。標的治療の結果、ペプチド投与群は対照群に比べ、2週後で腺体重量および萎縮傾向からの回復が認められた。それに伴い、組織像の変化として本ペプチドの有する血管新生作用として、顎下腺体内に毛細血管の増生が認められ、炎症変化の消失や変性からの回復が認められた。このことから、本ペプチドの局所注射は唾液腺組織の再生を促進させた。しかしながら、実際の唾液腺分泌機能の再生は現時点で明らかになっていないが、その可能性は高いものと考えられる。また、ナノゲルによるDDS効果については高用量では認められなかったが、現在低用量での検討行っている。今後、ナノゲルの効果とともに唾液腺分泌機能再生の検討を行い、本治療法の有用性を検証していきたい。本研究は,新規に開発された血管誘導性ペプチド(SVVYGLR)をナノゲルエンジニアリングを用いてナノ微粒子化することでDDS (Drug Delivery System)機能を付与し,それを唾液腺に局所投与する標的療法により口腔乾燥症(ドライマウス)治療として唾液分泌機能を再生させることを目的としている.本年度は,ヒト唾液腺由来細胞(HSG)に対してSVVYGLRペプチドがその増殖や分化などにどのような影響を及ぼすかをin vitroにおいて分子生物学的検討を行った.また,in vivo実験での標的治療を行うための唾液分泌傷害モデル動物の作製を行った.その結果,細胞培養実験において,SVVYGLRペプチドをウェル底面に固定させた実験群は,3%BSAのコントロール群に比較してHSG細胞接着性試験(DNA Assay)および増殖性試験(MTS Assay)では,0.00110μg/mLのいずれの濃度のSVVYGLRペプチドでも有意に接着性ならびに増殖性が促進していた.また,細胞運動性試験では、非作用群と比較して0.01μg/mLで遊走能に有意差を認めた。唾液腺分泌傷害モデル動物の作製については、放射線障害によるマウスのモデル作製において被曝死あるいは分泌障害が生じないという結果となり、照射量と分泌障害とのコントロールが困難であった。そのため,ラットの顎下腺導管をクリップ結紮する分泌障害モデルを作製し、現在、その病態を検討している。その結果,1週間のクリップ結紮により腺体内には著名な粘液様変性とそれに伴う小葉の破壊、炎症性細胞浸潤などが認められた.また、摘出顎下腺重量は結紮群では0.603±0.186gであり、コントロール群の0.383±0.031gに比べ有意に増加し、分泌障害を認めた。
伸張性収縮によるラット下腿三頭筋線維損傷への核DNA酸化機構の役割

本研究では前年度本課題実績として報告した「運動後の活動筋内で生じる核DNA酸化的傷害の増大に対する筋線維膜損傷の関与」について更に詳細な知見を得るため,代謝亢進の要素を除外した注射針刺入による筋線維損傷モデルによる検討を行った.実験にはwistar系雄性ラットの腓腹筋を用い,経皮上より注射針(16G)を筋腹に1回刺入し,刺入直後,1時間後,3時間後,6時間後,24時間後に被験肢と対側肢の被験筋を摘出した(NI群).また,注射針刺入後より1時間の平地走行(10m/min,0deg)を負荷し,直後に摘出したEX-NI群と,注射針刺入直後にコルヒチン(1ml/kg)を腹腔内に投与し,24時間後に摘出したCol-NI群についても被験肢と対側肢で比較を行った.摘出筋は直ちに液体窒素にて凍結し,-80°Cにて保存した.核DNAの酸化的損傷は抽出したデオキシグアノシン(dG)中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)を指標とした.その結果,NI群では非侵襲肢に比して8-OH-dG/dG値が直後に上昇し,1・3・6時間後には変化は認められず,24時間後に再び上昇した.この結果は,これまでに分かったラットのダウンヒル走行(20m/min,-17deg,1時間)実験の結果(運動終了時と24時間後に上昇,3時間後には変化せず)と同様の傾向を示した(昨年度実績報告分).よって,運動時に見られた核DNA酸化障害には筋線維膜損傷の関与が大きいことが示唆された.また,EX-NI群では運動後(刺入1時間後)に非侵襲肢に比して8-OH-dG/dGが上昇したことから運動が膜損傷部位のDNA損傷を増大させる可能性が考えられた.さらに,NI群の24時間後にみられた8-OH-dG/dGの上昇は,Col-NI群では認められなかったことから,回復24時間目以降の核DNA酸化的傷害増加には,炎症反応の関与が大きいことが考えられ,運動中或いは直後とは異なる機序であると推察された.本研究では,運動により誘発された筋のダメ-ジとその回復過程における骨格筋核DNAの酸化的損傷について検討することを目的とした.実験にはwistar系雄性ラット(♂,1011週齢)を用い,トレッドミル(20m/min,60分間連続)により運動パターンによる下腿三頭筋のダメ-ジを比較検討するため,水平走行(勾配0°,L群)と登坂走行運動(勾配+17°,UH群),降坂走行運動(勾配-17°,DH群)を行った.その結果,運動後のヒラメ筋の光顕組織像(hematoxylin & eosin)ではL群よりDH群で筋線維のネクローシス像や横紋の乱れが著しかった.一方,運動後の腓腹筋の活性酸素(ROS)による核DNAの酸化的損傷(8-hydroxy-deoxyguanosine/deoxyguanosine,8-OH-dG/dG)は,L群で変化しなかったが,UH群とDH群では増大(8-OH-dG/dG値が上昇)し特にDH群の値の上昇が著しかった.ヒラメ筋の8-OH-dG/dG値はL群で変化しなかったがDH群で高値を示した.次に,DH群のヒラメ筋と腓腹筋についてDNAの酸化的損傷を検討したところ,運動直後では両筋の8-OH-dG/dG値とも上昇したが,その後3日間の回復過程ではヒラメ筋は2日目で非運動群の値まで回復したが,腓腹筋は3日目まで高値を示した.以上の結果より筋のダメ-ジは運動パターンの影響を強く受けると考えられ,特に降坂走行により多発する筋線維の組織学的損傷とROSによる核DNAの酸化的損傷の関連性が示唆された.また,ヒラメ筋と腓腹筋の回復過程での8-OH-dG/dG値の比較から核DNAの酸化的損傷の修復速度は協働筋の間で異なっていることが推察された.本研究では前年度本課題実績として報告した「運動後の活動筋内で生じる核DNA酸化的傷害の増大に対する筋線維膜損傷の関与」について更に詳細な知見を得るため,代謝亢進の要素を除外した注射針刺入による筋線維損傷モデルによる検討を行った.実験にはwistar系雄性ラットの腓腹筋を用い,経皮上より注射針(16G)を筋腹に1回刺入し,刺入直後,1時間後,3時間後,6時間後,24時間後に被験肢と対側肢の被験筋を摘出した(NI群).また,注射針刺入後より1時間の平地走行(10m/min,0deg)を負荷し,直後に摘出したEX-NI群と,注射針刺入直後にコルヒチン(1ml/kg)を腹腔内に投与し,24時間後に摘出したCol-NI群についても被験肢と対側肢で比較を行った.摘出筋は直ちに液体窒素にて凍結し,-80°Cにて保存した.核DNAの酸化的損傷は抽出したデオキシグアノシン(dG)中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)を指標とした.その結果,NI群では非侵襲肢に比して8-OH-dG/dG値が直後に上昇し,1・3・6時間後には変化は認められず,24時間後に再び上昇した.

この結果は,これまでに分かったラットのダウンヒル走行(20m/min,-17deg,1時間)実験の結果(運動終了時と24時間後に上昇,3時間後には変化せず)と同様の傾向を示した(昨年度実績報告分).よって,運動時に見られた核DNA酸化障害には筋線維膜損傷の関与が大きいことが示唆された.また,EX-NI群では運動後(刺入1時間後)に非侵襲肢に比して8-OH-dG/dGが上昇したことから運動が膜損傷部位のDNA損傷を増大させる可能性が考えられた.さらに,NI群の24時間後にみられた8-OH-dG/dGの上昇は,Col-NI群では認められなかったことから,回復24時間目以降の核DNA酸化的傷害増加には,炎症反応の関与が大きいことが考えられ,運動中或いは直後とは異なる機序であると推察された.
金属酸化物1次元ナノ材料の合成とその応用に関する研究

1.高比表面積TiO_2ナノシートを用いた水の光触媒分解反応による水素生成メソポーラス構造をもつ高比表面積TiO_2ナノシートを130°C、12時間の水熱合成を用いて合成した。300°C、12時間の仮焼(熱処理)を行ったTiO_2ナノシートは市販のTiO_2ナノ粉末(ST-01およびP-25)に比べて5倍以上の高い水素生成能を示した。以上の結果より、本手法により合成させた高比表面積TiO_2ナノシートはエネルギー関連材料として優れた特性を示すことが期待される。2.チタン基板状に作製したフラワー類似構造を有するチタネートおよびチタニアナノワイヤーの特性評価直径約10nmのナノワイヤーから構成される球状フラワー類似構造(花弁類似構造)を有するチタネート(層状チタン酸)およびチタニアナノワイヤーを、金属チタンを出発材料とし150°Cで水熱処理を行うことによりチタン基板上に作製した。走査型電子顕微鏡(SEM)観察より、球状フラワー類似構造体は約2ミクロンの均質な直径を有していることが示された。個々のフラワー類似構造体は直径が約10nmのナノワイヤーより構成され、その構成相(チタネートあるいはチタニア)は水熱処理後の水洗プロセスおよび仮焼(熱処理)により制御可能であることが明らかになった。この合成法は、金属チタン基板上に、チタネートおよびチタニアナノ構造体を極めて簡便に形成することができ、色素増感太陽電池や光触媒への応用が期待できる。熱的安定性に優れた一次元ナノ材料の創製と、形態・サイズの制御と等軸状ナノ粒子との複合化により、新しい三次元構造で高いラフネスファクターをもつ薄膜電極の構築、すなわち焼成プロセスでも構造が安定な各種結晶構造のナノワイヤー・ナノロッド状TiO_2を合成し、色素増感太陽電池用電極として高効率化を図った。具体的には、水熱合成-熱処理複合プロセスで、結晶相と形状・サイズを制御したTiO_2ナノワイヤー・ナノロッドを作製し、市販の酸化チタン微粉末と同様に酸化物半導体電極を作製してそのセル特性を評価した。とりわけ、水熱処理時間を従来の48-120時間程度から24時間程度に短縮することでナノワイヤーの結晶成長を途中の段階で停止させるとともに、酸によるイオン交換処理、大気中での熱処理の最適化により、アナターゼナノワイヤーとやや大きなルチル粒子が混在した生成物を得ることができた。部分ナノワイヤー化TiO_2では、多孔質電極の膜厚が5.6μmと薄いにも関わらず、最も高い性能を示し、6.0%の効率が得られた。短絡電流密度は、11.9mA/cm^2、開放電圧は0.754V、フィルファクターは0.673とそれぞれ比較的高い値が得られた。1D+0Dの部分ナノワイヤー化構造をより微細化してナノロッド/ナノ粒子複合電極とした場合には、7.1%の光電変換効率が得られた。さらに、水熱合成法における結晶成長をより一層進展させて、ナノチューブやナノワイヤーを凌駕する比表面積642m^2/gをもつナノシート状構造体酸化チタンを作製した。このナノシート状構造体酸化チタンを電極として利用した場合の光電変換特性を検討した結果、短絡電流密度の向上が観測され、7.1%の光電変換効率が得られた。また、1Dナノ材料が配列したナノアレイ等の3次元構造を有する電極の構築についても現在検討している。
犬の炎症性腸疾患の病態解明：粘膜バリアとサイトカインバランスの観点から

IBD症例犬の腸粘膜のバリア機能について、細胞接着因子であるタイトジャンクションとアドヘレンスジャンクション(AJ)の腸粘膜病変局所での発現パターンを評価し、AJタンパク質であるE-カドヘリンがIBD症例犬の十二指腸粘膜で発現低下していることを明らかにした。一方、腸粘膜バリア機能の低下の背景として、IL-17をはじめとするヘルパーT細胞サイトカイン(IL-17, IL-4, IFN-gamma, IL-10)の遺伝子発現を解析した結果、IBD症例犬の十二指腸での発現量は、健常犬での発現量と有意な差が認められなかった。まず第一に、当該年度は、犬の炎症性腸疾患症例の十二指腸における細胞接着因子であるクローディン分子とカドヘリン分子の発現解析を行った。発現の解析は、ウェスタンブロット法を用いて、クローディン分子およびカドヘリン分子のタンパク質発現を定量し、健常犬の十二指腸での発現量との比較を行った。その結果、炎症性腸疾患症例犬の十二指腸では、クローディン分子の発現には変化が認められなかったが、カドヘリン分子の発現が有意に低下していることが明らかとなった。これまでに犬の炎症性腸疾患の十二指腸における細胞接着因子のタンパク質発現に関する報告はなされていない。今回の結果は犬の炎症性腸疾患の発症における腸粘膜上皮のバリア機能の変化の一端をはじめて明らかにしたものである。また、犬の炎症性腸疾患の発症における自然免疫の役割を明らかにするために、炎症性腸疾患症例犬の十二指腸におけるマクロファージ由来の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8)の遺伝子発現を解析したところ、健常犬の十二指腸での発現との有意差は認められず、人の炎症性腸疾患の知見とは異なる結果が得られた。このことから、犬の炎症性腸疾患の免疫学的な病態は、人のものとは異なる可能性が示された。また、近年国内のミニチュア・ダックスフントに認められている、大腸の炎症性疾患である、炎症性結直腸ポリープ(ICRP)の結直腸粘膜における炎症性サイトカインの遺伝子発現を行ったところ、すべてのサイトカインの遺伝子発現が上昇しており、特にIL-8の遺伝子発現が顕著に増加していた。そこで、IL-8のタンパク質発現解析を蛍光抗体法で行ったところ、IL-8を産生しているマクロファージが、ICRP症例犬の病変部で有意に増加していることが明らかとなった。この結果から、ICRPの免疫病態は人の炎症性腸疾患と類似した部分があることが明らかとなった。本研究では、犬の炎症性腸疾患(IBD)の発症における腸粘膜バリア機能とサイトカインの役割に着目し解析を行った。まず、腸粘膜のバリア機能については、細胞接着因子であるタイトジャンクション(TJ)とアドヘレンスジャンクション(AJ)の腸粘膜病変局所での発現パターンを評価した。TJタンパクとしては、クローディン-15, -7, -8のタンパク質発現を、AJタンパクとしては、Eーカドヘリン、βーカテニンのタンパク質発現を評価した。その結果、EーカドヘリンのみがIBDの症例犬の十二指腸粘膜で発現低下していることが明らかとなった。一方、少数個体を用いて行った予備実験で、発現の低下傾向が認められていたクローディン-7については、健常犬とIBD症例犬の間で優位な発現量の差は認められなかった。腸粘膜バリア機能低下の背景として、ヒトのIBD患者の腸粘膜で高発現しているサイトカインであるインターロイキン(IL)-17に着目し発現解析を行った。その結果、犬のIBD症例の十二指腸粘膜では、IL-17をはじめとするヘルパーT細胞サイトカイン(IL-17, IL-4, IFN-γ、IL-10)の遺伝子発現量は、健常犬での発現量と有意な差が認められなかった。同様に、炎症性サイトカイン(IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8)の遺伝子発現についても両群間で差は認められなかった。これらのことから、IBD症例犬の十二指腸粘膜におけるEーカドヘリンのタンパク質の発現低下の背景には、ヘルパーT細胞サイトカインや炎症性サイトカイン以外の因子が関与していることが疑われた。これまでの犬のIBDの病態解析では、腸粘膜のバリア機能に着目した研究は数少なく、本研究の重要な成果は、IBD症例犬の十二指腸粘膜での細胞接着因子の発現パターンを初めて明らかにしたことである。本年度は、平成24年度の実験計画としていた、炎症性腸疾患(IBD)症例犬の十二指腸・結腸粘膜におけるインターロイキン-17(IL-17)の遺伝子発現解析および蛋白質検出方法の確立を先行して行った。ヒトのIBDの代表的な疾患であるクローン病や潰瘍性大腸炎ではIL-17が高発現し、その病態の形成に関わることが報告されている。本研究では、IBD症例犬の腸粘膜においてもIL-17の発現上昇が認められるか否かを検討した。

遺伝子発現量を解析するリアルタイムPCRの測定系は既に確立済であったため、まず初めに、犬IL-17の組換え蛋白質を大腸菌にて合成し、ウサギ抗ヒトIL-17ポリクローナル抗体ならびにマウス抗ウシIL-17モノクローナル抗体と組換え犬IL-17との交差性を検討した。その結果、抗ヒトIL-17ポリクローナル抗体が犬IL-17と交差反応を示した。この抗体を用いて犬のリンパ節の免疫染色を行ったところ、IL-17陽性細胞の検出が可能であった。次に、IBD症例犬20頭の十二指腸粘膜ならびに6頭の結腸粘膜について、リアルタイムPCR法を用いてIL-17の遺伝子発現を解析した。その結果、IBD症例犬の十二指腸ならびに結腸のいずれにおいても、IL-17の遺伝子発現量は健常犬と比較して有意な増減は認められなかった。一方、近年国内でミニチュア(M)・ダックスフントに多発している結直腸の炎症性ポリープにおいて同様の解析を行ったところ、症例のポリープ部分ではIL-17の遺伝子発現が有意に増加し、またIL-17陽性細胞が増加していることも上記の抗体を用いた免疫染色により明らかとなった。M・ダックスフントの炎症性ポリープでは、病理組織学的に重度の好中球浸潤が認められ、IL-17が好中球性の炎症を惹起することから、IL-17が炎症性ポリープの病態形成に重要な役割を担うことが示唆された。犬の炎症性腸疾患症例の十二指腸におけるクローディン分子とカドヘリン分子の発現解析については、予備実験ではクローディン7の発現低下の可能性が示唆されていたが、今回の解析の結果クローディン7の発現に有意な変化は認められなかった。しかし、計画書に記載した通り、同時に他のクローディン分子とカドヘリン分子の発現解析も行っており、カドヘリン分子の発現低下が起こっていることを明らかにできた。また、当初の計画のヘルパーT細胞由来のサイトカインの遺伝子の発現解析に加え(昨年度実施)、マクロファージ由来のサイトカインの遺伝子発現についても追加で解析することが可能であった。それに加え、ミニチュア・ダックスフントの炎症性結直腸ポリープの結直腸粘膜における炎症性サイトカインの遺伝子発現解析も実施することが出来た。昨年度は平成24年度に計画していたインターロイキン-17(IL-17)の遺伝子および蛋白質発現解析が順調に進行したため、平成23年度に計画していたクローディン分子の発現解析に先行してIL-17の解析を行った。その結果、(1)タンパク質レベルで犬IL-17の発現解析が可能となり、(2)予定していたIBD症例犬の腸粘膜でのIL-17の遺伝子発現解析が終了し、さらに、(3)近年国内で多発し問題になっているミニチュア・ダックスフントの炎症性ポリープの結直腸粘膜でのIL-17の発現解析まで実施することが出来た。以上の結果より、予定していたIBD症例の解析に加え、炎症性ポリープ症例の解析も実施出来たことから、当初の計画以上に進展したと考えた。次年度(最終年度)の計画では、これまでの症例の解析から得られた知見を、試験管内の実験で証明していくために、犬の腸粘膜上皮細胞の初代培養細胞の培養方法を確立していく予定である。本年度末から培養に必要な試薬や機器を準備しており、次年度初めより、計画書に記載した手法で腸粘膜上皮細胞の初代培養を行っていく予定である。平成24年度は、当初平成23年度に予定していたIBD症例犬の腸粘膜におけるクローディン分子の発現解析を実施する。
パフォーマンスステータス改善のための栄養・物理療法を併用した画期的補助療法の開発

本研究では,グルタミン(GLN)投与及び電気刺激(ES)の併用が,Colon-26(C-26)癌性筋萎縮を防止するかを,グルココルチコイド系の下流因子であるグルタミン合成酵素(GS)の発現に着目して検討した.C-26群では,腓腹筋の重量が減少するとともにGSの発現量が増大した.一方,ES,GLNおよびその併用は,C-26誘因性の腓腹筋の萎縮,GSの発現量の増加を防止しなかった.これらの知見から,本研究で用いた条件では,ES,GLN投与及びそれらの併用のいずれによっても,癌性筋萎縮およびグルココルチコイドシグナリングの活性化は防止されないことが示された.本研究の全体構想は,グルタミン投与と神経ー筋電気刺激を用いたトレーニングの併用が,癌性カヘキシアに及ぼす影響を検討することである.平成27年度には,大腸癌マウスにおいて,グルタミン(GLN)の投与が,癌性筋萎縮に伴うグルタミン合成酵素(GS)の発現量および筋量の低下を抑制するかどうかを検討した.5週齢の雄性CD2F1マウスを,対照(CNT)群とマウス大腸癌細胞株(Colon-26: C-26)を皮下に播種する癌性カヘキシア(C-26)群に分けた.C-26播種後4週間において,C-26群では,除癌体重の減少が速筋である長趾伸筋および遅筋であるヒラメ筋の筋重量低下を伴っていた.また,これらの筋では,GSの発現量の増大が認められた.一方,筋原線維タンパク質であるミオシン重鎖やトロポニンTの選択的な減少は認められなかった.これらの知見から,当該モデルマウスにおいて,癌性筋萎縮がグルココルチコイド誘因性のGS発現量の増大により引き起こされることが示唆された.そこで我々は,CNT群およびC-26群に加え,それらに生理食塩水に溶解した3% L-glutamine(GLN)溶液(500 mg/kg)を毎日投与するCNT+GLN群及びC-26+GLN群を作成し(各群n=6),GLN投与が癌性筋萎縮に及ぼす影響を検討した.C-26播種4週後において,腫瘍の重量は,C-26群とC-26+GLN群の間で差異が認められなかった.したがって,GLN投与は,癌細胞の増殖に影響を及ぼさないものと考えられる.一方,C-26群及びC-26+GLN群では,CNT群に比べ,除癌体重が20%程度減少した.この体重の減少は,長趾伸筋,前脛骨筋,腓腹筋の重量の減少を伴っていた.さらに, CNT群に対し,C-26+GLN群において,ヒラメ筋の重量の低下が認められた.したがって,本研究の結果から,我々の予想に反して,GLNの投与は,癌性筋萎縮を防止しないことが明らかとなった.研究実績の概要に記載した通り,実験結果は我々の予想に反するものであったが,平成27年度に実施する予定であった実験は着実に遂行することができたことから,現在までの達成度として,おおむね順調に進展していると判断した.本研究の全体構想は,グルタミン投与と神経ー筋電気刺激を用いたトレーニングの併用が,癌性カヘキシアに及ぼす影響を検討することであった.初年度である平成27年度には,グルタミン投与が癌性カヘキシアに及ぼす影響を検討したが,有益な効果は認められなかった.そこで,平成28年度では,以下の実験を実施した.【背景】これまでに神経-筋電気刺激(ES)が種々の疾患に伴う筋萎縮を防止することが報告されている.また,癌誘因性の骨格筋タンパク質分解が,筋からのグルタミン(GLN)放出を伴うことが示されている.【目的】本研究では,マウス直腸癌由来細胞株(C-26)の移植モデルマウスを用い,ES,GLN投与及びそれらの併用が,癌性筋萎縮を防止するかを検討した.【方法】CD2F1雄性マウスを以下の8群に分けた;CNT,CNT+ES,CNT+GLN,CNT+ES+GLN,C-26,C-26+ES,C-26+GLN,C-26+ES+GLN.また,ESは左下腿三頭筋に対し,最大底屈トルクの60%の負荷を,2秒刺激/4秒休息で1日3セット,1日おきに負荷した.一方,GLNは,毎日1 g/kgずつ投与した.C-26播種4週間後,活動量を測定するとともに,腓腹筋を採取し実験に供した.【結果】C-26群では,除癌体重及び腓腹筋の筋湿重量が約20%減少するとともに,活動量が低下した.ESはC-26誘因性の腓腹筋の萎縮を防止する傾向を示したが,統計学的な差はなかった.また,GLNの投与は,ES併用の有無に関わらず,腓腹筋の萎縮を防止しなかった.【結論】本研究で用いた条件では,ES,GLN投与及びそれらの併用のいずれによっても,癌性筋萎縮は防止されないことが示された.本研究では,グルタミン(GLN)投与及び電気刺激(ES)の併用が,Colon-26(C-26)癌性筋萎縮を防止するかを,グルココルチコイド系の下流因子であるグルタミン合成酵素(GS)の発現に着目して検討した.C-26群では,腓腹筋の重量が減少するとともにGSの発現量が増大した.

一方,ES,GLNおよびその併用は,C-26誘因性の腓腹筋の萎縮,GSの発現量の増加を防止しなかった.これらの知見から,本研究で用いた条件では,ES,GLN投与及びそれらの併用のいずれによっても,癌性筋萎縮およびグルココルチコイドシグナリングの活性化は防止されないことが示された.前述の通り,C-26マウスにおいて,グルタミンの投与は癌性筋萎縮を抑制しないことが明らかとなった.ただし,神経ー筋電気刺激との併用により効果が得られる可能性が残されていることから,当初の予定通り,平成28年度には,C-26ルマウスにおいて,グルタミン投与と神経ー筋電気刺激の併用が癌性筋萎縮に及ぼす影響を検討することとする.筋機能制御学