hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地球外の縦孔・地下空洞を含む洞窟地形の計測システムと3次元モデルの活用

本申請課題の目的は、未知の洞窟を遠隔もしくは自動で精密に計測する方法・手段の構築にある。そのために、縦孔を含む洞窟内に進入探査するロボット計測システムの開発と実証、定量的な計測結果の活用をテーマとした。工学の分野だけでなく、数多くの理学分野に対して横断的な研究基盤を提供できる。また、月や火星などの他天体の縦孔・地下空洞のロボット探査計画にも貢献できる。平成28年度は、地上移動ロボットに搭載したレーザーセンサー(ライダー、レーザー測域センサー)による移動計測の予備実験を実施し、3次元モデルの作成を行った。また、大口径洞窟や縦孔・類似地形の候補地を予備調査して、実験場所の選定を行った。初期段階の殆どの研究項目は実施している。校舎屋内と近隣の防空壕遺跡「無窮洞」において、地上移動ロボットに搭載したレーザーセンサー(ライダー、レーザー測域センサー)による移動計測実験を実施し、3次元モデルの作成を行った。また、大口径横穴洞窟の福岡県「青龍窟」や熊本県「岩戸洞(神瀬石灰洞窟)」、縦穴・陥没ドリーネの福岡県「牡鹿洞」や沖縄県「通り池」、天然橋の岡山県「羅生門」や広島県「雄橋」など、候補地を踏査して実験場所の選定を行った。近年、JAXAのSELENE(かぐや)、NASAのLROやMROの探査機カメラ画像データによって、月や火星の表面に巨大な溶岩洞窟の「天窓」と推定される縦孔が数多く発見された。縦孔とその底部に推定されている地下空洞には、固体惑星学の宇宙分野にまで裾野を広げた学術成果が期待されている。地表に較べて温度変化が少なく、宇宙線・太陽フレア・紫外線や隕石・デブリからの効果的なシェルターになり得るため、天体観測機器の設置場所として、将来的な探査プロジェクトの基地建設候補地として有望視されている。JAXAでは「UZUME計画」を立ち上げ、地球外の縦孔・地下空洞のロボット探査を目指している。本課題の目的は、遠隔もしくは自動で未知の洞窟を精密に計測する方法・手段の構築にある。地球環境における探査シミュレーション実験によって、縦孔を含む洞窟内に進入する自律ロボット計測システムの開発と実証、定量的な計測データの活用をテーマに据えている。平成28年度までに、地上移動ロボットに搭載したレーザーセンサー(Lidar、LRF)計測の予備実験を実施し、3次元モデルの作成を行った。また、大口径洞窟や縦孔・類似地形の候補地を予備調査して、実験候補場所の選定を行った。平成29年度は、地上移動ロボットに搭載したレーザーセンサー(Lidar)による実際の洞窟で計測実験を行い、計測結果をもとにして洞窟の3次元モデルを作成した。また、希薄ながら大気が存在する火星については、ドローン等の航空機による地表の詳細撮影プロジェクトが計画されている。このことを踏まえて、小型ドローンによる洞口周辺地形撮影の予備実験も行った。殆どの研究項目は実施している。
樹木年輪年代学によるモンスーンアジア過去500年の気候復元

本研究では、モンスーンアジア地帯の過去500年の気候復元を目指し、最初の二年間で年輪試料の採取を、最後の一年でその測定と解析による気候復元を計った。まず年輪試料は日本のほか初年度にはネパールヒマラヤを、次年度にはラオスを中心に行ったほか、これに分担者として採取に参加したカムチャッカの年輪試料を加え、計32サイト分、900本あまりの樹木から採取することができた。この段階では、従来年輪を形成する長寿の樹木を欠き気候復元が不可能とされていた東南アジア(ラオス)において、樹齢千年を超えるFokienia(フッケンヒバ)を探り当て700年におよぶ年輪試料を採取できたことが最大の成果であった。最終年度には、これら試料の年輪幅変動の解析から採取地各地の古気候を復元した。すなわち東ネパール、カンチェンジュンガ地域では過去300年、西ネパール、フムラ地域では285年、カムチャッカ半島クロノツキー地域では420年、同パラツンカ地域では210年、わが国の四国山脈では240年の気候が復元できたが、カムチャッカの復元気候は目下のところ世界で最長である。また、ラオスだけは、現地の不安定な国情などに阻まれ予定量の年輪試料が採取できなかったこととに加え、世界で初めて年輪解析の対象としたFokieniaの年輪解読が困難であったため研究期間中に気候復元がかなわなかったが、過去700年の気候復元が可能なことが明らかになった。またモンスーンアジアを北東-南西に繋ぐこれら各地の気候復元結果を比較・統合した結果、人為による地球温暖化は、高緯度では.1800年代から明瞭に表れているが、緯度の低下に従い発現時期が遅くなるとともに明瞭さも失われ、ヒマラヤ地域では気温に関わる長期の傾向的な変化はまったく認められないことが明らかになった。平成12年9月11月にわたり末田、加藤、小林、安江に研究協力者の尾上を加えた5名が、ネパール西北部のカルナリ河最上流部および同中部のガネッシュヒマールのトリスリ河上流部を探索して、標高30004500m帯で気候復元に適した年輪がまとまって採取可能な森林を同定した。カルナリ地区では計4サイトのモミ(Abies spectabilis)およびトウヒ(Picea smithiana)の立木150本から約300本の年輪試料を、ガネッシュヒマールでは計5サイトのモミ立木200本から約400本の年輪試料を採取した。持ち帰った年輪サンプルは、標準年輪曲線を構築して気候復元に資するため、目下クロスデーティング・年輪構造解析・容積密度解析を行っている。予備的な解析を終えた西北ネパ-ルのサンプルの年輪幅の広狭変動は、樹木間でよく同調しているほか、プレモンスーン期の降水量と相応の相関を示し、少なくとも降水量の復元が可能なことをうかがわせた。また来年度の調査と年輪採取を予定しているラオスへは、研究代表者がネパール調査の帰路に立ち寄り、国立ラオス大学および林野庁と接触して、調査を予定しているベトナム国境地帯への交通手段や経費、宿泊施設、治安状況などについて予備調査を行い、サンプリングにアプローチの困難はあるが樹齢千年を越えるラオスヒノキ(Fokienia hodginsii)のサンプルが得られるという見通しを得た。ネパールとラオスにおいて古気候の復元に供するための樹木年輪を採集するとともに、年輪測定機が無いため一昨年採取したサンプルの測定に難渋していたネパール人研究分担者を招聘し、本学の測定機使用の便宜を諮るとともに、年輪解析の基本を教授した。ネパールでは、一昨年時間切れで取り残したガネッシュヒマールクルのプダンダパス周辺の3サイトから約100本の年輪サンプルを採取した。本年度の調査の主眼

ラオスでは、当初ベトナム国境のカウトレオ地域で年輪採取を予定していたが、現地の対応機関ラオス国立大学を通じた調査許可のルートが機能不全に陥ったため、予定を変更しホアパン省パン岳から予定通りのFokieniaの年輪サンプル130本を採取した。年輪採取の場所は変ったが、当初の目的通り樹齢1000年近いサンプルを大量に採取するとともに、Fokieniaの生育環境を現実に観察できた事で、ラオスおよびその周辺のベトナム、ミャンマーおよび中国雲南省のFokienia生育地をかなりの確率で推定できるようになった。これまで熱帯・亜熱帯地域で構築されている標準年輪曲線は最長でも350年前後しかないので、今回1000年近い年輪が採取できたことは、近隣にFokieniaの他の生息地を推定し得たことと併せて大成功と考えている。ただし、ラオスを含めこれらの候補地は、これまで外国の調査がほとんど入っていないため調査許可取得の手続きが定式化しておらず、不明確で時間を要するうえ、森林の不法伐採なども絡んで第三者の入域を喜ばないなどの問題や、アクセス路に関する情報の整備状況も極めて悪いので、今後の調査はかなり難渋するものと予測される。昨年度および一昨年度にネパール、ラオス、カムチャッカおよびわが国の32サイトから採取した総計900本の樹木の年輪試料を用いて、各採取地標準年輪曲線を作成するとともに、年輪曲線と当該地域の観測気候データの応答解析により年輪成長を支配している気候要因とその作用期間を明らかにした。さらにこうして得られた地域ごとの気候-年輪の応答関係から伝達関数を構築し、東ネパールでは過去300年、西ネパールでは285年、カムチャッカ南部では420年、同中央部では210年、わが国の四国山脈では240年の気候を復元した。このうちカムチャッカの復元気候は目下のところ世界で最長である。また、ラオスだけは気候復元がかなわなかったが、これは現地の不安定な国情などに阻まれ、当初予定していた量の年輪試料が採取できなかったことと、世界で初めて年輪解析の対象としたFokienia(フッケンヒバ)の年輪が必ずしも明瞭とはいえず、その判読に手間取ったためである。しかし、本研究で採取したFokieniaから過去700年の気候復元が可能なことが分ったことは、本年度の最大の成果である。以上の気候復元の成果をもとに、世界の年輪研究のメッカであるアリゾナ大学年輪研究所の前所長で世界の古気候復元に通じたヒューズ博士、アジア地域における気候復元に詳しいインド物理学研究所のラメッシュ博士を招聘し、本研究の成果の地域間比較・検討・統合と世界他地域との比較検討を目的とした国際ワークショップを開催した。その結果、人為による地球温暖化は、高緯度では1800年代から明瞭に表れているが、緯度の低下に従いその発現時期が遅くなるとともに明瞭さも失われ、ヒマラヤ地域では気温に関わる長期の傾向的な変化はまったく認められないことが明らかになった。最後にこれらの成果をまとめて報告書を刊行した。
ビュルガー収集のシーボルト標本による江戸の自然の体系化

江戸時代の後期に来日したシーボルトは、7年間滞在した。シーボルトは植物、動物、鉱物などの自然史試資料など、あらゆる情報や標本を収集した。シーボルトコレクションは、このように、江戸時代の日本の文化、社会、環境などを物証できるただ一つ残されたコレクションとなっている。本研究では、シーボルト鉱物標本に添付されているラベル、またホフマンよる鉱物標本リスト、ビュルガー筆の日本鉱物誌の原稿などの存在を明らかにして、それらの解析を行い、シーボルトの助手であったビュルガーのコレクション形成に果たした役割を明らかにした。また、シーボルトの日本植物誌の元になった植物標本がミュンヘンの州立植物標本館に収蔵されていることを明らかにした。シーボルトは江戸時代の後期に来日し、7年間滞在した。江戸末期から明治初期にかけて、本草学から近代的な自然科学への転換に貢献したのはシーボルトであった。シーボルトは法制、歴史、芸術、民俗などの文化史的試資料や植物、動物、鉱物などの自然史試資料、また気候、測地データなど、あらゆる情報や標本を収集した。シーボルトコレクションは、このように、江戸時代の日本の文化、社会、環境などを物証できるただ一つ残されたコレクションである。本研究はシーボルトのコレクション形成に重要な役割を果たしながら今まで注目されることのなかったビュルガーに着目した。ビュルガーは鉱物標本を収集するばかりでなく、シーボルトの依頼に応じて、「日本鉱物誌」の出版に向けて原稿を準備していた。「日本植物誌」・「日本動物誌」とともに「日本の自然の体系」を完成させる重要な著作であったが、未刊に終わってしまった。本年度はビュルガーの「日本鉱物誌」の手稿の解読と英訳を行い、ビュルガーの自然史観を明らかにした。さらに、ライデンのオランダ国立民族博物館に収蔵されている鉱物に関連した標本群を調査し、薬物・金属・資源などの多くの標本を発掘した。江戸時代に日本人の協力を得てオランダ人が収集したことは間違いないが、ビュルガーに由来するか否かは調査中である。またミュンヘンの州立民族博物館にシーボルトの2回目の来日に際して収集した鉱物関連標本が存在することが確かめられたので、今後の調査の対象とすることとした。シーボルトは「日本植物誌」・「日本動物誌」とともに「日本の自然の体系」を完成させるために「日本鉱物誌」の出版を目指し、そのための標本収集と原稿執筆をビュルガーに依頼したことがわかってきた。ビュルガーは極めて優秀な助手であり、シーボルト追放後も代わりに日本に留まり標本の収集を行い、オランダに送り続けた。本年度の研究から、シーボルコレクションの価値を高めたような重要な標本の多くはビュルガーの収集に代ロコとを明らかにした。ビュルガーの「日本鉱物誌」の手稿の解読と英訳を通じて、ビュルガーの日本の自然の記載や鉱物の分類から、ビュルガーがドイツの鉱物学者ヴェルナーの水生論に基づいた分類体系で鉱物を記載していたことを明らかにした。また、ライデンのオランダ国立民族博物館に収蔵されている鉱物に関連した標本群を調査し、薬物・金属・資源などの多くの標本の記載を行った。またシーボルト収集とされている標本が実はプロムホフやフィッセルといったシーボルト以前のオランダ商館員によって収集された物であり、シーボルトがそれを自分の収集物としていた事実も明らかにした。シーボルトは「日本植物誌」・「日本動物誌」とともに「日本鉱物誌」の出版によって「日本の自然の体系」を完成させることを意図していた。「日本鉱物誌」のために、標本収集と原稿執筆をビュルガーに依頼した。ビュルガーは極めて優秀であり、シーボルト追放後も代わりに日本に留まり鉱物・植物・動物標本の収集を行い、オランダに送り続けた。本年度の研究から、ビュルガーばかりでなく、後の日本学の創始者と目されるホフマンも「日本鉱物誌」に協力したことがわかってきた。ビュルガーは、日本の地質・鉱物について記載を行ったばかりでなく、温泉水の分析、緯度経度の測定、温度・湿度・気圧などの測定を詳細に行った。ドイツの鉱物学者

ヴェルナー著書で勉強したために、水生論に基づいた分類体系で地質・鉱物を記載していたこと、また江戸への参府に当たって、利用したルートが花崗岩などの偏った地質地域しか通過しなかったために、日本の地質が偏った地質分布で記載されていることを明らかにした。また、フロラヤポニカの執筆に当たって用いた重要なタイプ標本がミュンヘンの植物標本館に収蔵されていることを見いだした。現在、その記載を行いつつある。更に、ライデンの自然史博物館にある鉱物標本の一部が、当初は生薬として収集されたが、後年に旧国立地質学鉱物学博物館に移管されたことを明らかにした。その記載が民族学博物館の薬品として行われた事を示す文書を発掘した。江戸時代の後期に来日したシーボルトは、長崎に7年間滞在した。シーボルトは法制、歴史、芸術、民俗などの文化史的試資料や植物、動物、鉱物などの自然史試資料、また気候、測地データなど、あらゆる情報や標本を収集した。シーボルトコレクションは、このように、江戸時代の日本の文化、社会、環境などを物証できるただ一つ残されたコレクションとなっている。シーボルトは「日本植物誌」・「日本動物誌」とともに「日本鉱物誌」の出版によって「日本の自然の体系」を完成させることを意図していた。「日本鉱物誌」のために、標本収集と原稿執筆をビュルガーに依頼した。ビュルガーは極めて優秀であり、シーボルト追放後も代わりに日本に留まり鉱物・植物・動物標本の収集を行い、オランダに送り続けた。本年度はドイツ・ボーフム大学に収蔵されているシーボルト関連文書の調査から、シーボルトのオランダでの協力者で、後にライデン大学の初代日本語教授になったホフマンによる鉱物標本リストを見いだし、解読を行った。ライデンの鉱物標本とホフマンの標本リストを照合し、未発見の鉱物標本が300点以上存在することを初めて明らかにした。また、今まで筆者がわからなかった標本ラベルが、ホフマンの記述をコピーしていることを見いだし、ホフマンの鉱物コレクション形成への貢献を明らかにしたと同時に、ホフマンがビュルガーの記述を基にリストを作成したと考えられることから、ビュルガーの標本台帳が存在した可能性を明らかにした。また、フロラヤポニカの執筆に当たって用いた重要なタイプ標本がミュンヘンの植物標本館に収蔵されており、そのカタログ作りを推進した。更に、ライデンの民族学博物館の自然史関連標本の調査を行い、3種類の標本台帳の解読と標本の記載を行い、成果をカタログとして出版した。ライデン国立民族学博物館に収蔵されている標本には自然史に密接に関わっている標本が多数ある。例えば、生薬(鉱物・植物・動物)や金属素材などで、これらの標本についてカタログ出版を準備中である。また、ミュンヘン植物標本館に収蔵されている日本産植物のタイプ標本のカタログも準備中である。さらに、ビュルガーのシーボルト標本収集への貢献について、総合的な著作の出版に向けて、オランダの出版社ブリルと交渉を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ドイツ・ボーフム大学に収蔵されているシーボルト関連文書には、自然史標本に関する情報が多数存在することがわかった。
筋萎縮性側索硬化症との発症起因の共通性に基づいた緑内障発症機構解析

OPTN相互作用蛋白として見出したSLC4A2が形成する空胞様異常構造および、類縁現象であるOPTNの緑内障E50K変異体が細胞内で形成するOPTN顆粒について、関わるシグナル伝達経路、ALS変異と緑内障変異での形成の違い、細胞内局在について検討を加えた。これらの異常蛋白蓄積現象は、オートファジー誘導により抑制された。この抑制は、ALS原因遺伝子TARDBPの細胞内凝集体形成でも同様にみとめられた。他のALS凝集体にもOPTNが検出される。オートファジー能を超える異常蛋白の過剰蓄積あるいはOPTN変異による自身の機能低下が両疾患の発症機序であり、これを外的に補うことで発症抑制が期待できる。以下に本年度の成果を示す。1.オートファジー惹起:前年度までに報告したHeLaS3でのOPTN変異体E50Kで認められるOPTN顆粒(foci)やSLC4A2との共遺伝子導入での空胞様構造形成の亢進に対する、特定の薬剤(仮称STR )やmTOR阻害剤による抑制の際の、マーカータンパクLC3蛋白量の上昇について、他の神経細胞系の培養細胞株などを用いて検討し、これらの細胞株においても確認した。また、島状に固まった培養細胞集団像もみられ、増殖あるいは接着への影響が示された。生体(正常マウス)でも薬剤の投与の効果を検討した。2.SLC4A2が関与する空胞形成およびfoci形成:共焦点顕微鏡で、fociについて検討し、ゴルジマーカー周辺に存在するが完全に一致はしないこと、また、タイプラプス顕微鏡での経時的な観察により、ゴルジ体の部分分解物を(fociは)起源としないことを示唆する結果を得た。さらに、OPTNの顆粒形成/SLC4A2共存での空胞形成の過程についても、経時的に観察した。3.OPTN自身の性状:報告がある酸化ストレスによるOPTN核移行は再現できなかったが、NRLとの共発現の検討で、常時少量は核内移行しており、それが(論文報告済みのNRLとの結合により)トラップされる可能性を見出した。一方、相同タンパクNEMOに対応する領域が存在しない第2領域を欠く変異体での、刺激なしでの核内局在を、共焦点顕微鏡で確認した。また、OPTNの細胞内での主たる存在様式が高分子複合体であること、酸化ストレスがOPTNを共有結合3量体(cOPTN3)として固定すること、E50K変異OPTNは酸化ストレス刺激なしにcOPTN3を形成することを見出した。これらはfoci形成機序とも関わり得る知見であり、緑内障の発症メカニズムの理解にも有益である(論文投稿中)。1.OPTNの蛋白品質管理の破綻/オートファジー惹起によるレスキュー:(1)緑内障変異のうち症状が重篤であるE50K変異体ではOPTNが一部凝集体(foci)として存在し、空胞形成は極めて顕著に亢進した。この際、fociの空胞周囲への局在が見られ、SLC4A2も共在した。特定の薬剤(仮称STR)処理によって、この空胞の形成は、顕著に抑制され、foci形成も減少した。HeLaS3細胞の他、神経由来細胞Neuro2Aなどにおいても、同傾向がみられた。(2)シグナル伝達関連蛋白について検討を加えた。OPTNの正常型及びE50K変異体での差異は認められなかったが、STRによる空胞形成の低下の際に、PERKリン酸化の低下、WFS1発現の上昇、LC3発現の上昇を認めた。(3)前項の薬剤STRの効果がAP惹起によるものか、すなわちオートファジーを惹起することが当該構造形成を抑制し得るか否かを検討したところ、ラパマイシンによるAP誘導により同様の結果が得られた。また、3-MA処理によるAP阻害により薬剤の効果は抑制された。2.緑内障変異とALS変異の違いの検討:緑内障原因変異H26D、E50K、M98K、H486RおよびALS原因変異Q314L、Q454E、E478G、K557T等を持つFLAGタグ付加OPTN発現プラスミドを作成した。これらをHAタグ付加SLC4A2と共に細胞に導入し、タグ抗体による免疫蛍光法で、顆粒および空胞を観察した。(1)顆粒は、既報告があるE50K以外のH486Rなど緑内障変異でも、顕著に観察された。また、空胞形成についても、緑内障変異に顕著な亢進が見られた。(2)一方、ALS変異では、Q314Lなど一部の変異で顆粒形成が見られたが、一概に顆粒は形成されず、空胞についても、A481Vに微細なモノがみられるのみで、形成は観察されなかった。1.オートファジー経路:OPTNの関する凝集体の発症に関する役割を明らかにするために、STR作用経路の候補としてmTOR経路について検討した。STRおよびmTOR阻害剤による活性化状態は、リン酸化特異的抗体を用いたウエスタンブロットで評価した。mTOR阻害剤は、mTORおよびその経路下流のp70S6Kのリン酸化を阻害した。一方、STRは、これらのリン酸化に影響を与えず、別経路によりオートファジーを活性化することが示唆された。2.オートファジー誘導の確認:マーカー蛋白LC3に対するsiRNAを用いて、これら薬剤による効果が確かにオートファジー活性化によるものであることを確認した。

2種のsiRNAのうち蛋白産生を低下させた1種は、これら薬剤の効果をキャンセルした。3.異常タンパク蓄積:これまでの緑内障性変異による異常タンパク蓄積に加え、TDP-43のALS性凝集体に対して検討を開始した。C端側の断片TDP-25が細胞質に凝集し、これが強い細胞毒性を有すると考えられている。これらに対してオートファジー誘導の効果を検討することで、疾患発症原因の共通性を探る。4.モデル動物を用いた検討:オートファジー誘導による異常タンパク蓄積の軽減が、in vitroでも発症の抑止に働くかについて、家族性ALSの原因遺伝子SOD1、および孤発性のALS患者の原因遺伝子TARDBPの疾患モデルトランスジェニックマウス2系統を用いた検討を実施中である。5.OPTN自身の性状:酸化ストレスで固定されるOPTN共有結合3量体(cOPTN3)の「3量体」は分子量からの演繹であったので、今回、この分子構成について検討を加えた。2種のタグ(FLAGとGFP)付加OPTNを共導入して、PLA法による結合特異的可視化と、この時のHMCの分子量および2種の抗タグ抗体との反応性から、HMCが複数のOPTN分子を含むことを示す結果を得た(PLoS ONE 9(7): e101206, 2014)。1.異常タンパク蓄積に関する効果の検討これまでに見いだしたSTRやmTOR阻害剤のE50K凝集体やSLC4A2と共発現させた場合の空胞形成に対する抑制作用が(他の副次的作用ではなく)確かにオートファジーを介する応答であることを確認するために、マーカー蛋白LC3に対するsiRNAを用いて検討した。さらに、この抑制効果について、上記の緑内障性変異による異常タンパク蓄積に加え、ALS原因遺伝子TDP-43(TARDBP蛋白)の部分断片の発現で培養細胞に形成される凝集体に対しても検討した。Casp3認識部位に基づく短縮体を作成し検討した結果、C端側の切断部位の断片TDP-25が顕著に細胞質に凝集する像が得られた。経時的観察により、凝集体に強い細胞毒性があることが示唆された。STR処理により、TDP-25凝集体のサイズが縮小したものや、細胞質や核にのみTDP-25が存在し、凝集体が完全に消失したものが観察され、(緑内障変異E50K変異による細胞内異常構造に加え本現象についても)改善効果が認められた。2.モデル動物を用いた検討正常マウスSTRのオートファジー誘導の検討をおこない、脳、脊髄、および眼において、STRおよびmTOR阻害剤の処理によるLC3の増加を認めている(筋では認められない)。これを踏まえて、オートファジー誘導による異常タンパク蓄積の軽減が、in vivoでも発症の抑止に働くかについて、家族性ALSの原因遺伝子SOD1、および孤発性のALS患者の原因遺伝子TARDBPの疾患モデルトランスジェニックマウス2系統を用いた予備検討を実施した。効果は、生存期間、発症時期、罹病期間における運動機能(後肢反射テスト、ローターロッドテスト、行動観察などによる)を評価項目とした。STR、mTOR阻害剤投与群に、生存期間の延長と運動機能の改善傾向がみられた。本傾向は、メスよりもオスにより顕著であった。OPTN相互作用蛋白として見出したSLC4A2が形成する空胞様異常構造および、類縁現象であるOPTNの緑内障E50
沖縄における農産物販売戦略としての電子商取引の活用に関する研究

本研究の目的は、情報通信技術の高度利用を基盤とした沖縄県産農産物の出荷・販売システムの構築を可能とする基本要件について検討し提言することである。本研究では、沖縄県産マンゴーを研究対象とするとともに、聞き取り調査や文献調査を主な研究手法として採用した。まず、本研究の初年度である平成13年度では、沖縄県内生産者の販売の現伏、日本国内の農産物の電子商取引の実施・運用動向について現地調査するとともに、沖縄県と地理的に類似するギリシャ島嶼部を対象に農産物の電子商取引に関わる文献を収集・整理した。第二年度である平成14年度では、ギリシャ島嶼部における、電子商取引の導入過程に関する研究の概要、試みの現状等について聞き取り調査を行なった。最終年度の平成15年度では、本年度は過年度に実施した調査及び研究結果の整理、補足調査、研究取りまとめのための打合せを行った。これらの調査の結果、得られた知見は次のとおりである。(1)沖縄県産マンゴー販売の電子商取引市場化に伴い、マンゴー生産者は、(1)市場での探索費用の軽減、(2)適時の数量確保に伴う収穫ピーク時の不利販売の軽減、(3)商物分離による品質の維持、等の経済的便益を享受することが可能である。(2)立ち上げた電子商取引市場がクリティカル・マスの形成を可能とするためには、品質管理や品質表示そしてクレーム処理等に関し、情報化市場参加生産者の上位に位置し一定の強制権限を持った中核的組織が必要である。(3)電子商取引市場の立ち上げを阻害する要因として、当該電子商取引市場が与える安全性や経済的便益以外に、(1)市場における取引主体間の伝統的且つ個別的関係、(2)市場関係者、特に小売店や農業生産者の段階での情報機器や操作スキルの普及水準、がある。(4)このため、電子商取引市場を立ち上げるためには、既存の取引関係を内包し得るような措置を講じる必要があり、また、生産者段階でのIT化の促進を図る必要がある。沖縄農業はその気候条件のために、他地域で栽培できない作物、或いは、栽培不能な時期にある作物を栽培できるという優位性を有しており、花卉屋熱帯果樹は戦略的農産物として位置づけられている。しかし、沖縄農業は、その市場遠隔性と島嶼性による輸送の輻輳化と品質保持の困難等のため、市場における有利販売や産地展開が十分に行えない状況にある。本研究の目的は、このように、気候条件上優位性を有しながらも、その地理的特性のために有利販売や産地展開が困難な沖縄県産農産物に関し、情報通信技術の高度利用を基盤としたマーケティング・システムの構築のための基本要件について検討し提言することである。本年度の研究成果は、以下の通りである。第一に、沖縄県産マンゴーを対象に、沖縄県内生産者の販売の現状、日本国内の農産物ECの動向にっいて主に現地調査等で得られた知見を整理した。その結果、見いだされた課題等は次のとおりである。1.沖縄県産マンゴー販売の情報化市場化に伴い、マンゴー生産者は、(1)市場での探索費用の軽減、(2)適時の数量確保に伴う収穫ピーク時の不利販売の軽減、(3)商物分離による品質の維持、等の経済的便益を享受することが可能である。2.しかし、情報化市場を立ち上げるためには、既存の取引関係を内包し得るような措置を講じる必要があり、また、生産者段階でのIT化の促進を図る必要がある。

3.さらに、クリティカル・マスの形成を可能とするためには、品質管理や品質表示そしてクレーム処理等に関し、情報化市場参加生産者の上位に位置し一定の強制権限を持った中核的組織が必要である。第二に、ギリシャに関わる文献調査の結果、得られた知見は次のとおりである。1.ギリシャにおける養蜂製品の生産量は、国内需要を賄うに十分であるが、他の生産国からの価格競争に巻き込まれている。また、蜂蜜を例にとると、取引関係が極めて個別的であり生産変動に対応して柔軟に供給先をシフトさせることが困難であるとか、的確な品質情報が提供されておらず、同品質の製品であっても価格が異なる等の問題がある。2.そこで、エレクトロニック・コマースを養蜂製品の取引に導入すれば、(1)取引費用の軽減、(2)市場変動への速やかな対応、(3)世界的な取引市場の展開、等の利点があることから、アテネ農業大学の研究者が中心となって、B to Cのエレクトロニック・コマースの実験事例として"Greek Electronic Mall of Hive Products"(GHMHP)が構想されている。3.しかし、(1)市場における取引主体間の関係が伝統的且つ個別的であること、(2)情報機器や操作スキルの普及水準並びにネットワークの整備水準が不十分な状況にあること等から、エレクトロニック・コマースが実運用システムとして稼働している状況には至っていない。第三に、収集した資料及び現地調査結果に基づき、国内における農産物の電子商取引に関わるデータ・ベースの構築に着手した。沖縄県はその気候条件のために、他地域で栽培できない作物、或いは、栽培不能な時期にある作物を栽培できるという優位性を有しており、花卉や熱帯果樹は戦略的農産物として位置づけられている。しかし、沖縄農業は、その市場遠隔性と島嶼性による輸送の服装かと品質保持の困難性等のため、市場における有利販売や産地展開が十分に行えない状況にある。本研究の目的は、このように、気候条件上優位性を有しながらも、その地理的特性のために有利販売や産地展開が困難な沖縄県産農産物に関し、情報通信技術の高度利用を基盤としたマーケティング・システムの構築のための基本要件について検討し提言することである。本年度の研究成果は、以下のとおりである。(以下、ECはエレクトロニック・コマースの略称)第一に、沖縄県と地理的に類似するギリシャ島嶼部における、電子商取引の導入過程に関する研究の概要、試みの現状等について聞き取り調査等で得られた知見を整理した。その結果、見出された課題等は次のとおりである。1.アテネ農業大学の研究者が中心となってギリシャ島嶼部における青果物ECのモデルが構想されている。ギリシャ島嶼部では、その地理的特性のために、産地が小規模分散的であり、従来の商物一体となった流通システムでは取引費用の低減が望めない。しかし、農産物へのECの適用により、取引費用の軽減や市場の需給動向に関する情報の迅速な収集等が可能となり、市場遠隔地で且つ孤立的な農業地域の農産物マーケティング戦略にとって極めて有用な手段となり得る。2.この点については、ギリシャの研究者の中でも十分認識され研究も進められている。しかし、実際には、農産物に関わるECモデルは提案されているものの、ECが実運用システムとして稼働している状況には至っていない。
ナノプラズモニック遺伝子銃の創出

金微粒子の新規な打ち込み方法として、増強局在近接場光生成プラズマ駆動による新規粒子推進を実験実証した。FDTD法を用いた理論計算と実験研究により、推進速度、推進角度、推進された粒子径を調べ、空間拡がりの小さい推進が可能であることを明らかにした。将来展望として、本研究において観察されたレーザー照射による形状変化がない条件をより詳細に調べることで、内包もしくは結合した薬剤分子に影響を与えることなく推進が行えるものと期待される。本研究の目的は、高速増強近接場光を用いてレーザー推進による高分子導入技術(ナノプラズモニック遺伝子銃)を創出することである。平成24年度は、前年度の粒子加速の理論計算および実験研究を継続するとともに、得られた成果を基にして、レーザー照射方式について研究を実施した。レーザー照射時に、粒子下の光強度分布が対を有していれば粒子は基板に対してほぼ垂直に進む。一方、レーザーを斜入射すると、粒子下の光強度分布が変化することにより、推進方向を制御できる。有限差分時間領域法(Finite Difference Time Domain method)により金粒子および誘電体粒子下の光強度分布を計算し、推進速度および推進角度を求めた。プラズモン共鳴過程と粒子質量に対する近接場光エネルギーの関係により、金粒子では200 nm以下の大きさでは推進速度はほとんど変化しない。250 nm以上の粒子径において、基板内部における光エネルギーは増加せず、粒子質量は粒子径の3乗に比例して増加し、推進速度は粒子径の3乗に反比例して減少した。誘電体粒子(ポリスチレン)では、推進速度の極大が存在する。双極、4重極、6重極のモードを形成する粒子径よりも20 nmから30 nmほど小さい粒子において極大を取ることがわかった。基板内部の光エネルギーと粒子体積の比が最も大きくなる場合に推進速度が極大を取ると考えられる。以上より、粒子径を変化させることで推進速度を変化できることを示した。また、レーザー入射角度を変化させることで、推進角度を最大5.5度変化できることを示した。本年度は、フェムト秒レーザによる粒子加速の実験研究を行った。直径200 nmの金微粒子をドナーとなるSi基板に滴下し、スピンコートにより散布した。光源にはTi:Sapphireフェムト秒レーザ(中心波長800 nm、パルス幅80 fs)を使用し、焦点距離300 mmのレンズを用いてドナー基板に集光した。集光スポットは長軸840 μm、短軸680 μmとし、ドナー基板に対して垂直に入射した。ドナー基板とレシーバ基板の間隔は5 mmとした。レーザ照射後、ドナー基板およびレシーバ基板の表面を走査型電子顕微鏡を用いて観察するとともに、エネルギー分散型X線分光装置を用いて元素分析を行ったところ、レシーバ基板上に推進された金微粒子が存在することを確認した。レシーバ基板上には中心に推進された金微粒子が集合体として存在し、周囲に孤立粒子が散逸した。大部分の金微粒子は溶融したと考えられる形状であったものの、レーザ照射前の形状から変化していないものもみられた。次に、レーザ入射角度を20°として実験を行った。レシーバ基板における金微粒子の分布を、電子顕微鏡画像から求めた。レーザの集光径840 μmに対しレシーバ基板上の金微粒子は約1300 μmの範囲に存在していたものの、空間分布の半値全幅はレーザ集光径と同程度であった。有限差分時間領域法(Finite Difference Time Domain method)により計算した推進角度は2.9°であり、実験および計算いずれにおいても空間拡がりの小さい推進が可能であることが明らかになった。以上の成果から、増強局在近接場光生成プラズマ駆動による新規粒子推進を実験実証した。将来展望として、本研究において観察されたレーザ照射による形状変化がない条件につき、より詳細に調べることで、内包もしくは結合した薬剤分子に影響を与えることなく推進が行えるものと期待される。平成23年度は、フェムト秒レーザー励起増強近接場光を利用し、導入分子をコーティングしていない粒子の加速につき理論計算および実験研究を実施した。理論計算では、有限差分時間領域法(Finite Difference Time Domain method)により金粒子および誘電体粒子の推進速度を増強近接場光から求めた。アブレーションに寄与する基板物質の体積を見積り、そこから粒子が受ける運動量を算出して推進速度を算出した。その結果、金粒子では粒子径100 nmから250 nmでは推進速度はほぼ一定であること、粒子径250 nm以上では推進速度が低下することを明らかにした。また、誘電体粒子としてポリスチレン粒子による増強近接場光を計算し、粒子径約800 nmにおいて粒子速度が極大となることを示した。また、複数の誘電体粒子が近接した条件での増強近接場光の分布変化を計算した。

金微粒子は、隣接する粒子との距離により増強近接場光分布が変化することが知られている。粒子間距離が短い場合、増強近接場光は金粒子と基板の接触面よりも粒子間において強く生じる。この分布変化が生じる条件下では、粒子の推進速度は低下すると考えられる。誘電体粒子においても条件により粒子間に増強近接場光が生じることを有限差分時間領域法により明らかにするとともに、粒子推進速度に影響を与えない条件を求めた。理論計算により、推進速度および推進角度を制御できることを示した。理論計算により、金粒子および誘電体粒子の推進速度を増強近接場光から算出した。成果を国際会議および国内会議において発表し好評を得た。当初の計画通り、レーザーパラメータ、粒子速度、導入効率の関係を明らかにすることを目的とし、理論計算および実験研究を進める。当初の計画通り、平成23年度からの基礎研究を継続するとともに、レーザー照射方式の検討に着手する。高分子の細胞内導入の実験的検証を進めるため、細胞培養関連の消耗品を購入。最終年度であるため積極的に成果を発表する。旅費および論文掲載費を計上。繰越研究費(約2万円)は購入した一部消耗品の価格改定により生じた。研究は順調に進展しており、繰越研究費は平成24年度研究費と合わせて主としてレーザー照射方式検討の実験研究に使用する。
C型肝炎ウイルス培養系による感染増殖効率規定因子の解析と新規治療標的候補の探索

C型肝炎ウイルス(HCV)感染症は持続感染化して慢性肝炎から肝硬変、肝臓癌に至る疾患を引き起こす。HCVはプラス鎖RNAをゲノムとするウイルスであり、ウイルスゲノムの変異が多い。ウイルスゲノムの変異がウイルスの持続感染化に関与すると考えられているがその詳細は不明である。HCVの研究はウイルス培養系が存在せず、感染性ウイルスを用いた研究ができなかった。我々が分離したJFH-1株は培養細胞で感染および増殖複製が世界で初めて可能であることを報告した。本研究では、HCVがどのような機構で感染増殖効率を規定しているかを解析し、ウイルス複製増殖に関与する、ウイルス側および宿主側因子を同定した。この研究により、新たな抗ウイルス戦略の標的を探索した。我々が分離したJFH-1株は培養細胞で感染および増殖複製が世界で初めて可能であることを報告した(Wakita T,et al.Nature Medicine 2005)。本研究の目的は、HCVがどのような機構で感染増殖効率を規定しているかを解析して、新たな抗ウイルス戦略の標的を探索することである。本年度の研究成果の概要を述べる。1.試験管内で合成した全長のウイルスRNAを培養細胞中に導入してその複製を解析した。ウイルスRNA導入後、細胞内でウイルスRNAは自律的に複製増殖した。培養上清中に分泌されたウイルスはHuh7細胞を用いて感染力価を定量することができた。この複製増殖にはNS3ヘリカーゼ領域とNS5Bから3'X領域が重要であることが明らかとなった。2.Huh7細胞は肝臓癌由来の培養細胞株でHCVに対する感染感受性を有する。しかし、Huh7細胞には感染感受性の異なる亜細胞株が存在した。この亜細胞株間の感染感受性は細胞表面のCD81の発現によって第一義的に規定されていることが明らかとなった。しかし、さらにRNA複製効率にも差があることから、複数の宿主因子の関与が考えられ、さらに解析中である。3.ヒト肝細胞キメラマウスに培養細胞で作製したHCVを感染させた。感染ウイルスの変異は非常に少なかった。さらに、チンパンジーにもHCVを感染させた。約2ヶ月間ウイルス血症が持続し、感染後2週間目にはウイルス変異は無かったが、7週間後には11カ所の塩基置換を認めた。この変異の意義を解析中であるC型肝炎ウイルス(HCV)感染症は持続感染化して慢性肝炎から肝硬変、肝臓癌に至る疾患を引き起こす。我々が分離したJFH-1株は培養細胞で感染および増殖複製が世界で初めて可能であることを報告したウイルス感染増殖を規定するウイルス遺伝子領域の同定:ウイルス複製にはNS3ヘリカーゼ領域とNS5B-3'X領域が重要であることを昨年度報告した。今年度はさらに、NS3ヘリカーゼ領域がウイルス粒子分泌に重要であることを見いだした。また、NS5Aのリン酸化が感染細胞内でのウイルス粒子形成に重要な役割があることも見いだした。感染効率を規定する因子の解析:現在Huh7細胞だけにおいてHCVは効率よく感染するが、感染感受性を一義的に規定するのはCD81の細胞表面発現であった。他のレセプター候補因子、SR-BIやLDLレセプターなどの発現も検討したが、これらの因子の発現に差はなかった。また、ウイルス膜および細胞膜のラフト構造が感染およびウイルス粒子形成に重要であること、およびコアとNS5aの相互作用がウイルス形成に重要であることが明らかとなった。我々が分離したJFH-1株は培養細胞で感染および増殖複製が世界で初めて可能であることを報告した(<Wakita T>___-,et al.Nature Medicine 2005)。

本研究の目的は、HCVがどのような機構で感染増殖効率を規定しているかを解析して、新たな抗ウイルス戦略の標的を探索することである。1.ウイルス感染増殖を規定するウイルス遺伝子領域の同定:NS3ヘリカーゼ領域とNS5B-3'X領域がウイルス複製に重要であることをこれまでに報告した。今年度はNS5BRNAポリメラーゼ活性がウイルス株により異なることとその責任アミノ酸配列を同定した。また、NS5Bと3'UTR領域のRNA2次構造もRNA複製効率に関与していることを見いだした。2.ウイルス感染増殖を規定する宿主側因子の解析:HCV感染細胞内でウイルス増殖を制御する宿主因子としてCreatinine Kinese B(CKB)を見いだした。CKBはHCVのNS4A蛋白質と結合してウイルスゲノム複製複合体に共局在し、NS3蛋白質のヘリカーゼ活性を制御することによりウイルスゲノム複製に関与する。3.ウイルス側および宿主因子を標的とした抗ウイルス療法の開発:CKBに対するsiRNAおよび阻害剤であるCyclocreatininの感染細胞への投与によりウイルス増殖を抑制できることが確認できた。
DOCK8陽性CD4陽性T細胞が実験的SLEを発症させる機序と治療標的候補の解明

我々は、OVAなどのありふれた抗原をマウスに繰り返し投与することで、実験的に自己免疫疾患が発症するという、「自己臨界点説」を提唱している。またこうして発病したマウスのCD4陽性T細胞を別のマウスに移入することで、自己抗体産生がみられることを示し、このような細胞を(自己抗体産生性T細胞)aiCD4T細胞と命名し、DOCK8陽性T細胞である事を見出した。今回我々は、このaiCD4T細胞(DOCK8陽性T細胞)による自己抗体産生についてより詳しく検討するために以下の検討を行った。1DOCK8のKOマウス及びTgマウスでの表現型の差異:KOマウスとTgマウスを作成し、OVA免疫に対する反応を病理レベルで確認した(結果は外注機関より送付待ち)2OVA免疫後のDOCK8陽性T細胞のTCRレパトアの解析およびOVA免疫マウスによるBCRレパトアの解析:TCRレパトアの解析を行い、その多様性の減少を確認。一方BCRレパトアでは多様性が逆に増えており、またサブセット解析では胚中心B細胞が増加しており、DOCK8陽性T細胞を介したT細胞ヘルプでB細胞が分化・増殖、また体細胞変異によるaffinitymaturationが起こっていると考えられた。3こうしたレパトアのデータから、DOCK8陽性T細胞やそのヘルプによるB細胞のクローンの特徴をコンピュータ上で解析する方法を確立した4また、そうしたレパトアから特徴的なクローンのTCRをクローニングし、α鎖β鎖をP2A配列を介してベクターに導入することでα鎖β鎖を同程度に発現させることが可能であると考え、ベクター設計や条件検討を行った。以上の結果のうち1から3については2018年度日本リウマチ学会および米国免疫学会にて発表を申し込み、採択された。DOCK8陽性T細胞に特徴的なT細胞受容体や、SLE発症マウスに特徴的なB細胞受容体のクローンを見つけ出すコンピュータ上の解析手法の確立は、予定通り行えた。また、その解析結果に基づいて、SLE発症したマウスのDOCK8陽性T細胞に特徴的なT細胞クローンのT細胞受容体配列情報から、人工塩基配列を作成した。予定ではこの塩基配列を用いて遺伝子導入用ベクターを作成し、非免疫マウスのT細胞に導入し、それを再度移入すること、および抗原提示細胞と共培養することで抗原特異性を確認することを予定してた。しかしながら、この遺伝子導入研究はP2レベルであり、九州大学の機関承認を必要とした。我々は、導入遺伝子と使用するベクターなどが固まったのちに、九州大学に遺伝子組み換え実験計画書を提出したが、本年度内に実験に関する許可が下りなかったこと、および我々の研究室が移転することが決まったため、再度遺伝子組み換え実験に関する機関承認を取る必要性が出ていることから、予備実験も、組み換え生物作成に該当しない範囲までしか行うことができなかった。これまでにT細胞受容体およびB細胞受容体レパトアは軽鎖・重鎖(α鎖・β鎖)は別々の情報として得られており、特徴的な配列をそれぞれ抜き出しているがその組み合わせは数十にのぼる。今回組み合わせを容易に変更してベクターを作成できるよう工夫しており、これらの組み合わせについて自己反応性のクローンである可能性の高いものから順に実験を進めていくことにしている。いずれにしても新しい移動先でのP2実験室の稼働が前提であり、そのいかんによっては計画を検討しなおす必要に迫られる場合がある。そうした実験の施設・組織による遅れは可能性を見込んでおり、そのため、本年度は、すでに判明したSLE発症マウスにおけるDOCK8陽性T細胞の重要性と、それのヘルプによるB細胞成熟について(DOCK8陽性T細胞をソートしその後移入した後のB細胞のサブセットやレパトアの検討など)より詳しく検討を行ったのちに、いったんここまでの成果を順次公表していく予定である。すでに判明している内容については2018年度日本リウマチ学会および米国免疫学会にて報告することとした。これらについては検討を進め本年度中の論文としての公表を目指す我々は、OVAなどのありふれた抗原をマウスに繰り返し投与することで、実験的に自己免疫疾患が発症するという、「自己臨界点説」を提唱している。3こうしたレパトアのデータから、DOCK8陽性

T細胞やそのヘルプによるB細胞のクローンの特徴をコンピュータ上で解析する方法を確立した4また、そうしたレパトアから特徴的なクローンのTCRをクローニングし、α鎖β鎖をP2A配列を介してベクターに導入することでα鎖β鎖を同程度に発現させることが可能であると考え、ベクター設計や条件検討を行った。以上の結果のうち1から3については2018年度日本リウマチ学会および米国免疫学会にて発表を申し込み、採択された。DOCK8陽性T細胞に特徴的なT細胞受容体や、SLE発症マウスに特徴的なB細胞受容体のクローンを見つけ出すコンピュータ上の解析手法の確立は、予定通り行えた。また、その解析結果に基づいて、SLE発症したマウスのDOCK8陽性T細胞に特徴的なT細胞クローンのT細胞受容体配列情報から、人工塩基配列を作成した。予定ではこの塩基配列を用いて遺伝子導入用ベクターを作成し、非免疫マウスのT細胞に導入し、それを再度移入すること、および抗原提示細胞と共培養することで抗原特異性を確認することを予定してた。しかしながら、この遺伝子導入研究はP2レベルであり、九州大学の機関承認を必要とした。我々は、導入遺伝子と使用するベクターなどが固まったのちに、九州大学に遺伝子組み換え実験計画書を提出したが、本年度内に実験に関する許可が下りなかったこと、および我々の研究室が移転することが決まったため、再度遺伝子組み換え実験に関する機関承認を取る必要性が出ていることから、予備実験も、組み換え生物作成に該当しない範囲までしか行うことができなかった。これまでにT細胞受容体およびB細胞受容体レパトアは軽鎖・重鎖(α鎖・β鎖)は別々の情報として得られており、特徴的な配列をそれぞれ抜き出しているがその組み合わせは数十にのぼる。今回組み合わせを容易に変更してベクターを作成できるよう工夫しており、これらの組み合わせについて自己反応性のクローンである可能性の高いものから順に実験を進めていくことにしている。いずれにしても新しい移動先でのP2実験室の稼働が前提であり、そのいかんによっては計画を検討しなおす必要に迫られる場合がある。そうした実験の施設・組織による遅れは可能性を見込んでおり、そのため、本年度は、すでに判明したSLE発症マウスにおけるDOCK8陽性T細胞の重要性と、それのヘルプによるB細胞成熟について(DOCK8陽性T細胞をソートしその後移入した後のB細胞のサブセットやレパトアの検討など)より詳しく検討を行ったのちに、いったんここまでの成果を順次公表していく予定である。すでに判明している内容については2018年度日本リウマチ学会および米国免疫学会にて報告することとした。これらについては検討を進め本年度中の論文としての公表を目指す
植物の非宿主抵抗反応への細胞骨格の関与

本研究は、植物の非宿主抵抗性発現へのアクチン繊維の関与を検討するため、以下の実験を行った。1.部分的に解剖したオオムギ子葉鞘系にE.pisi、ウリ類炭そ病菌Colletotrichum lagenarium等を含む約20種の非病原菌を接種した。このうち7種はオオムギ細胞に侵入を試みたので以下の実験に用いた。菌が接種された子葉鞘をサイトカラシン処理したところ、非病原菌は例外なく全て感染可能となった。また、非病原菌が侵入を試みた細胞にはアクチンの急激な配列変化が認められた。2.E.pisiを子葉鞘に接種後、マイクロマニピュレーターを用いて病原菌のE.graminisを同一細胞に移植接種した結果、病原菌の感染率はほぼ0%となり、オオムギ細胞に強い抵抗性が誘導された。一方、非病原菌が侵入に失敗した細胞をサイトカラシン処理後、E.graminisを移植すると感染率は完全に回復し、抵抗性は打破された。3.タバコ、トマト、キュウリ、ダイズを含む双子葉植物4種、およびオオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシを含む単子葉植物5種にE.pisiを接種し、葉、子葉鞘等の組織をサイトカラシン処理した結果、トウモロコシを除く全ての植物にE.pisiは感染可能となった。以上の結果から、非病原菌によってオオムギ細胞に誘導されるアクチン繊維の関与する抵抗性は非宿主抵抗性であることが明らかになると共に、この抵抗性機構が植物種に関わらず普遍的に発現する可能性が強く示唆された。今後、抵抗性発現におけるアクチンの機能およびその制御機構を検討する予定である。
ずり応力による内皮細胞基底膜の安定化

動脈硬化初期病変の発生部位を観察すると、血流による物理的応力が発症要因に関与していることが考えられた。血流によるずり応力が内皮細胞機能を変化させ、層流性ずり応力が作用する動脈硬化に抵抗性の部分では、内皮細胞は緻密な基底膜を有し、内皮細胞下組織にも線維化が見られた。この部分の内皮細胞には細胞骨格が発達し、tight junctionも発達し、透過性が制御されていることが理解された。抗動脈硬化を獲得するため、実験的に層流性ずり応力を内皮細胞に負荷し、内皮細胞の基底膜代謝について検索し以下の結果を得た。1)高い層流性ずりを負荷すると、内皮細胞の基底膜コラーゲン産生が亢進し、基底膜コラーゲンの分解酵素であるMMP2の分泌が抑制された。2)GFPを付加したMMP2を内皮細胞に発現させ、その細胞内動態をレーザー顕微鏡で観察した。MMP2はtransport vessicleを形成し、細胞膜直下に集積していた。<まとめ>動脈硬化の発症には、内皮細胞の基底膜形成能が重要である。層流性ずり応力は内皮細胞の1)基底膜コラーゲンを産生させ、2)基底膜コラーゲン分解酵素のMMP2の分泌を抑制し、3)MMP2の分泌抑制はcaveola形成に関与していることが分かった。<考察>動脈硬化の初期病変には基底膜の脆弱性が関与し、基底膜コラーゲンの代謝が重要である。CaveolaはMMP2のexocytosisだけでなくその他の物質代謝にも関与する重要な装置であり、種々のずり応力下における物質代謝の変動が血管病変の形成のみならず薬剤代謝にも重要であることが類推された。我々は日本人の粥状硬化性病変が学童期から発症することを報告してきた。そのため動脈硬化症の予防には粥状硬化発生早期における対策が必要と考えられる。基底膜形成により内皮細胞は安定化するが、内皮安定化保持作用を有する定常性ずり応力の作用機構の解明は病変発生の予防法に加え、病変評価法の開発の一助にもなると考える。ずり応力を内皮細胞に実験的に負荷し、以下の結果を得た。1)定常流性高ずり応力負荷により、内皮細胞の基底膜コラーゲン産生が亢進し、mRNAレベルも増加した。2)ずり応力負荷により、内皮細胞が産生する基底膜コラーゲン分解酵素であるMMP2の分泌が抑制されていた。このMMP2分泌抑制効果はずり応力負荷を解除するとすぐに回復していた。3)ずり応力負荷によるMMP2分泌抑制はアルブミン添加により濃度依存性に回復した。4)GFPを付加したMMP2を内皮細胞内に遺伝子導入し、内皮細胞のMMP2細胞内輸送を観察すると、ずり応力負荷により細胞膜下にMMP2を含んだtransport vesicleの集積が観察された。5)細胞膜下のvesicleの膜へのfusionにはcaveolaの機能が重要である。Caveola形成阻害物質のfillipinは内皮細胞のMMP2分泌を部分的に抑制していた。血管壁の脂質沈着は血流が乱れた部位に好発し、これらの部位には低ずり応力が負荷している。反対に、分岐の少ない血管では高ずり応力が作用し内皮細胞の機能が安定することが分かった。特に、その機序の一つとして高ずり応力が内皮細胞の基底膜コラーゲン産生を亢進させ、また、MMP2分泌抑制を介してさらに基底膜形成を繊密化することが理解された。日本人の粥状動脈硬化性病変が学童期から発症することを報告してきた。そのため、動脈硬化症の予防には粥状動脈硬化発生早期における対策が重要である。