hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味覚受容体遺伝子多型とインクレチン分泌及び食行動代謝障害との関連解析

味覚受容体遺伝子多型の糖代謝や肥満への関与の有無を明らかにするため、地域一般住民の中・高年者(5074歳)を対象としたコホート集団において遺伝子多型と食事習慣を含む種々の生活習慣や肥満度、糖代謝の指標などとの関連について横断的および縦断的な解析を行った。主成分分析により同定された野菜類、果物、魚貝類などを多く摂取する健康的食事パターンが血清CRP値と負に関連していた。しかし味覚受容体の遺伝子多型と食事パターンや体格指数(BMI)、糖化ヘモグロビン(HbA1c)、さらに新規糖尿病罹患などとは有意な関連は認められなかった。「うま味受容体」、「甘味受容体」、「苦味受容体」などの味覚受容体(Taste receptor)をコードする遺伝子(TAS1R,TAS2R)が同定され、TAS1Rには3つのアイソフォーム(TAS1R1,TAS1R2,TAS1R3)、TAS2Rには20以上のアイソフォームの存在が明らかにされている。「うま味受容体」、「甘味受容体」はそれぞれTAS1R1/TAS1R3、TAS1R2/TAS1R3のヘテロ二量体で構成され受容体として機能する。味覚や食行動を規定する遺伝子と生活習慣病の関連性を明らかにするため、味覚受容体をコードする遺伝子TAS1R、TAS2RのSNP(一塩基多型)について、50歳74歳の地域一般住民の男女約13,000人を対象に種々の生活習慣要因、疾患との関連を検討することを目的として研究を開始した。本年度はTAS1R1の遺伝子多型の中で、アミノ酸変異を伴い、うま味の知覚閾値との関連が報告されているTAS1R1遺伝子の多型T372A(rs34160967)についてTaqMan法を用いてgenotypingを行った。男性(5668名)ではTT型が2111名(37.2%)、TA型が2682名(47.3%)、AA型が875名(15.5%)、女性(6832名)ではTT型が2574名(37.7%)、TA型が3195名(46.8%)、AA型が1063名(15.5%)であり、男女ともにその分布は従来の報告とほぼ同様であった。T372A多型と肥満度(BMI)、ウエスト周囲径ならびに血糖コントロールの指標である糖化ヘモグロビン(HbA1c)との関連について検討を行ったが、遺伝子多型とこれらの生活習慣関連因子の間に統計学的に有意な関連は見られなかった。味覚や食行動を規定する遺伝子と生活習慣病の関連性を明らかにするため、味覚受容体をコードする遺伝子(TAS1R, TAS2R)の遺伝子多型について地域一般住民約13,000人(50歳74歳)からなる生活習慣病予防を目指したコホート研究(九州大学福岡コホート研究)参加者を対象に生活習慣要因、疾患との関連について研究を継続した。本年度は、糖尿病およびその他の主要疾病の罹患把握を目的とした同コホート研究の5年後の二次調査を完了した。調査表による罹患調査とヘモグロビンA1c(HbA1c)の測定を行った。5年間の新規発症の糖尿病(HbA1c 6.5%以上または糖尿病治療薬の新規開始)は491例(約5%)であった。糖尿病新規発症と味覚受容体遺伝子TAS1R1の一塩基多型A372T(rs68757616)ならびにTAS1R3の一塩基多型R757C(rs307377)について検討した。しかしこれらの遺伝子多型と糖尿病発症リスクの間に統計学的に有意な関連は見られなかった。また同コホートにて抗酸化酵素遺伝子多型と2型糖尿病リスクについて検討を行った。その結果、抗酸化酵素遺伝子の一部の一塩基多型と2型糖尿病リスクに関連性を示唆する成績が、特に肥満を有するもので認められた。味覚受容体遺伝子(TAS1R, TAS2R)各々の欠損マウスを作成し、両者を掛け合わせたダブルノックアウトマウスを作成した。様々な栄養素に対するGLP-1及びGIP分泌反応の検討を継続して行った。味覚や食行動を規定する遺伝子と生活習慣病の関連性を明らかにするため、味覚受容体をコードする遺伝子(TAS1R, TAS2R)の遺伝子多型について地域一般住民約13,000人(50歳74歳)を対象に種々の生活習慣要因、疾患との関連について研究を継続した。本年度はアミノ酸変異を伴い、うま味の知覚閾値との関連が報告されているTAS1R3遺伝子の一塩基多型R757C(rs307377)について検討した。

男性(5664名)ではCC型が4310名(76.1%)、CT型が1280名(22.6%)、TT型が74名(1.3%)、女性(6829名)ではCC型が5261名(77.0%)、CT型が1465名(21.5%)、TT型が103名(1.5%)であり、男女ともにその分布は従来の報告とほぼ同様であった。R757C多型と肥満度(BMI)、ウエスト周囲径ならびに糖化ヘモグロビン(HbA1c)との関連について検討を行ったが、遺伝子多型とこれらの生活習慣関連因子の間に統計学的に有意な関連は見られなかった。地域一般住民のうち心血管病等の既往者を除いた約10,000名について、食事パターンと遺伝子多型との関連についても検討した。食物摂取頻度調査表を用いた食事パターン解析により野菜類、果物、魚貝類などを多く摂取するいわゆる健康的食事パターンが同定され、この食事パターンは血清の高感度CRP値と負に関連していた。しかしながら検討した味覚受容体の遺伝子多型(rs34160967、rs307377)と食事パターンの間には有意な関連は認められなかった。味覚受容体遺伝子(TAS1R, TAS2R)、各々の欠損マウスを作成し、両者のダブルノックアウトマウスを掛け合わせで作成した。様々な栄養素に対するGLP-1及びGIP分泌反応の検討を行った。アミノ酸変異を伴うTAS1R1遺伝子の代表的多型について解析をおおむね完了した。25年度が最終年度であるため、記入しない。また食事パターン解析と味覚受容体遺伝子多型との関連についても検討を行った。味覚受容体遺伝子(TAS1R, TAS2R)の欠損マウスにて様々な栄養素に対するインクレチン分泌反応の検討を進めた。
ユビキチン修飾による膜交通と葉緑体形成制御機構の解明

本研究では「ユビキチン修飾による膜交通と葉緑体形成制御機構の解明」を目指し,3研究課題に取組んでいる。H26年度は以下のような成果を得た。本年度の研究実施計画計画2)ユビキチン修飾による膜交通-植物免疫制御機構の解析: ATL31と相互作用するSNAREタンパク質SYP121は,植物の病害抵抗性と深いかかわりを持つ。糸状菌であるうどん粉病菌を植物に感染させると,SYP121欠損変異植物syp121-1では野生型(WT)と較べて抵抗性が劇的に減少するのに対し,ATL31過剰発現植物ATL31oxでは,抵抗性が上昇する。この抵抗性には,パピラという細胞壁の肥厚化が関与している。パピラは,カロース等の細胞壁成分がゴルジ体からの小胞輸送により感染箇所に分泌されることで形成される。解析の結果,i)膜局在型ATL31によるSNAREタンパク質のユビキチン化→ii)パピラ形成部位の決定→iii)細胞壁の肥厚化(パピラ形成)→iv)病原体抵抗性の亢進,という一連の膜交通-植物免疫シグナル伝達制御反応に関する仮説を証明し,論文発表した(Plant Physiol. 2014)。計画3)ユビキチン修飾による葉緑体形成制御機構の解析:植物プロテアソームと相互作用するタンパク質のプロテオーム解析により,複数の葉緑体局体タンパク質が同定された。詳細な研究解析の結果,i)プロテアソームサブユニットRPT2aは,複数の葉緑体タンパク質移行トランジットペプチド(以下cTP)と相互作用すること,また,ii)LTA2のような葉緑体タンパク質は,ユビキチンリガーゼAtCHIPと相互作用すること,等を証明し,論文発表した(J. Proteome Res, 2014)。これにより,ユビキチン修飾による新たな制御機構-タンパク質のオルガネラ移行制御-の可能性を示唆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。H25年度は以下のような成果を得た。計画1)ATL31によるSNAREタンパク質のユビキチン修飾制御機構の解析: ATL31の新規相互作用因子として細胞膜局在型SNAREであるSYP121を同定した。syp121変異体は,atl31変異体と同様に,C/Nストレスに過剰応答した。SYP121は,うどんこ病菌が植物葉に侵入する部位に特異的に集合することで,侵入のバリアーとなる特殊な細胞壁である「パピラ」の形成に重要なはたらきを示す。そこで,ATL31のうどんこ病菌感染時の細胞内局在を観察したところ,通常時は細胞膜にのみ局在しているATL31が,SYP121と同様にうどんこ病菌侵入部位に集合している様子が観察された。次に,うどんこ病菌への抵抗性を検証した結果,ATL31過剰発現体(35S-ATL31)はsyp121変異体とは逆に侵入率が低下しており,それはパピラ形成の速度が増加しているためであった。これらのことから,ATL31はSYP121とともにパピラ形成に関与しており,その結果,C/N応答のみならず,うどんこ病菌への抵抗性に重要なはたらきをもっていることを証明した。これらの知見をまとめて,Plant Physiology誌に発表した。これ以外に,i)SNAREタンパク質SYP42,43と結合し,自身の細胞内局在性や膜交通を制御していること,ii)自身のリン酸化制御を介して14-3-3タンパク質の結合性と分解性を制御していること,を証明した。詳細な研究解析の結果,i)プロテアソームサブユニットRPT2aは,複数の葉緑体タンパク質移行トランジットペプチド(以下cTP)と相互作用すること,また,ii)

LTA2のような葉緑体タンパク質は,ユビキチンリガーゼAtCHIPと相互作用すること,等を証明し,論文発表した(J. Proteome Res, 2014)。これにより,ユビキチン修飾による新たな制御機構-タンパク質のオルガネラ移行制御-の可能性を示唆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ATL31相互作用蛋白質として,14-3-3蛋白質だけでなく,SYP121, SYP42,SYP43棟を探索し,その結合と機能について照明しつつある。計画2)ユビキチン修飾による膜交通-植物免疫制御機構の解析: ATL31と相互作用するSNAREタンパク質SYP121は,植物の病害抵抗性と深いかかわりを持つ。糸状菌であるうどん粉病菌を植物に感染させると,SYP121欠損変異植物syp121-1では野生型(WT)と較べて抵抗性が劇的に減少するのに対し,ATL31過剰発現植物ATL31oxでは,抵抗性が上昇する。この抵抗性には,パピラという細胞壁の肥厚化が関与している。パピラは,カロース等の細胞壁成分がゴルジ体からの小胞輸送により感染箇所に分泌されることで形成される。ATL31各種変異体やSNARE変異体を用いた分子遺伝学的解析,また上記タンパク質の生化学,細胞生物学的解析により,その詳細を解明する。計画3)ユビキチン修飾による葉緑体形成制御機構の解析:植物プロテアソームと相互作用するタンパク質のプロテオーム解析により,複数の葉緑体局体タンパク質が同定された。詳細な研究解析の結果,i)プロテアソームサブユニットRPT2aは,複数の葉緑体タンパク質移行トランジットペプチド(以下cTP)と相互作用すること,また,ii)LTA2のような葉緑体タンパク質は,ユビキチンリガーゼAtCHIPと相互作用すること,等を証明した。核コードの葉緑体タンパク質は移行シグナルであるcTPをHSP70等で保護され,最終的には葉緑体に移行する。しかし,環境変化により葉緑体移行が合目的でなくなった場合には,AtCHIPによりユビキチン修飾を受け,葉緑体に移行せず,プロテアソームにより細胞質で速やかに分解される。現在各種のストレス実験等により,葉緑体タンパク質前駆体の蓄積,あるいはユビキチン化の多様性等についての解析を進めている。最終的には,ユビキチン修飾による新たな制御機構-タンパク質のオルガネラ移行制御-を解明する。
人工ユビキチンリガーゼを活用した迅速・高精度なユビキチン化の検出法の開発

生体内でのタンパク質の品質管理機能を担うユビキチン化は、白血病などのがん疾患と関係が深く、ユビキチン化活性を高感度に検出できれば将来的に疾患の診断・病態把握が可能である。これまでにユビキチン化に関わる酵素であるユビキチンリガーゼ(E3)を人工的に作製し、これを活用することでユビキチン化活性の検出を進めてきた。本申請研究では、簡易検出できる検出システムの構築に向けて、迅速・高精度なイムノクロマトグラフィーで、ユビキチン化活性の検出を検討する。血清サンプルに最適な検出・測定条件を検討し、白血病の診断・病態把握の可能性を調査する。SIAH-1活性部位を移植した人工E3の設計・合成を行ってきた。合成は、Fmoc固相法で行い、グラジエントHPLCにて精製した。合成確認は、質量分析法(AXIMATOF2,島津製)によって行った。透析操作を経てフォールドさせ、円偏光二色性スペクトルで立体構造の形成を行った。本年度では、この人工E3を活用したイムノクロマトグラフィー検出を行うために、金コロイドにユビキチン抗体を付加する条件、膜に抗体を塗布する条件など、必要な各種検討を行った。単離精製したE1、E2、ユビキチンおよび人工的なE3を混合させてユビキチン化を生じさせて、イムノクロマトグラフィーで検出できることが明らかになった。申請で予定していた研究内容は、概ね達成できている申請に基づき、我々独自に開発してきた人工的なE3を用いたイムノクロマトグラフィーの検討をがん細胞で行っていく予定である。これまで開発してきた分子設計技術に基づき(Miyamoto et al, J. Peptide Sci. 2012, Scientific Reports 2014)、急性前骨髄性白血病(APL)に関与するSIAH-1活性部位を移植した人工E3の設計・合成を行った。合成確認は、質量分析法(AXIMA-TOF2,島津製)によって行った。透析操作を経てフォールドさせ、円偏光二色性スペクトルで立体構造の形成の検討を行い、また、人工E3の活性確認は、単離精製したE1、E2(UbcH8)、ユビキチンおよび人工的なE3を混合させてユビキチン化を生じさせ、ウエスタンブロット法で検討した。申請で予定していた研究内容は、概ね達成できている。申請で予定していた研究内容は、概ね達成できている申請に基づき、我々独自に開発してきた人工的なE3を用いたイムノクロマトグラフィーの開発を引き続き行う。申請に基づき、我々独自に開発してきた人工的なE3を用いたイムノクロマトグラフィーの検討をがん細胞で行っていく予定である。理由:予定していたイムノクロマトグラフィー実験技術講習会(試薬含む)にかかる費用等を翌年に変更した。使用計画:謝金、研究試薬等に用いる予定理由:予定していたイムノクロマトグラフィー実験試薬にかかる費用の一部を、翌年に変更した。使用計画:研究試薬等に用いる予定
癌関連硫酸化糖鎖抗原の効率合成法確立と糖鎖抗原を用いる高効率癌ワクチンの新規開発

本年度は、ケラタナーゼII(Kase II)と呼ばれるケラタン硫酸加水分解酵素が触媒する糖転移反応を利用して、癌関連糖鎖抗原(TACA)構造である硫酸化ルイスX(su-Lex)の配列を制御した硫酸化糖鎖の合成を行った。まず、このKase IIの糖転移反応を利用することでシアル酸を非還元末端に導入しかつsu-Lexの配置を制御した硫酸化オリゴ糖が合成可能であることを示した。さらに、Kase II触媒糖転移反応が、硫酸化糖鎖の繰り返し単位を3つ有しながら、su-Lex構造の糖鎖中での位置を制御できる合成法に利用できることも示した。1年目の研究で環酸素原子を硫黄原子に変化した5-チオフコースを導入したルイスyアナログ(5S-Ley)をシート状の分子集合体に担持させた。本年度は、このナノ粒子をマウスに投与することによって5S-Ley自身のみならず、Leyに対しても交差性をもつIgM抗体を産生することを明らかにした。5S-Leyを担持したシート状の分子集合体によって産生する抗体の特異性や抗原との親和性についてさらに調査を進めることで糖の環酸素原子を置換することによる免疫応答に関する利点を明らかにできる可能性がある。さらに、ポリペプチド親水鎖を分子内に2本有するような両親媒性分子(A2B)を設計した。このA2Bの親水部末端にLey抗原を2つ導入することで、大量かつ高密度にLeYを表面に提示する分子集合体(LeY2-A2B-sheet)を調製した。LeY2-A2B-sheetを投与することによって速やかに抗LeyIgMは産生するものの、頻回投与によって免疫応答が抑制され抗体産生が減少した。また、産生した抗体の特異性も変化した。これらの結果から、糖鎖抗原を認識するようなB細胞は、ナノキャリア上の抗原の空間配置を繊細に認識して免疫応答を惹起していると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。癌細胞表面に発現する癌特異的糖鎖は癌関連糖鎖抗原(TACA)を標的とする癌ワクチン研究が活発に行われている。このように癌細胞だけに発現するような抗原であるTACAを標的とするワクチンが開発できれば、TACAが発現する癌細胞の特異機能を阻害し、癌に対する高い治療効果を期待される。一方でTACAには2つの課題が存在する。1つは、効果が期待できる複雑なTACAを簡便に確保する点である。2つ目は、糖鎖は抗原性が低くTACAをワクチン化しても期待する免疫応答を惹起することが難しい点である。そこで本研究では、TACAの効率的合成法確立と高い抗原性を発現させるTACA分子設計開発という上述の課題を解決することを目的とする。本年度では、TACAの効率的合成法確立については酵素であるケラタナーゼII(Kase II)の糖転移反応を利用して、硫酸化LeXと呼ばれるTACAユニットの配列を制御した糖鎖の合成を行った。特に、Kase IIの糖転移反応を利用することで生体内で様々なシグナル伝達に関係するシアル酸を糖鎖の非還元末端に導入した糖鎖及び、Kase IIの糖転移反応を繰り返し利用して複雑で多様な硫酸化TACAの合成を進めた。また高抗原性を発現させる分子設計開発を目指し、5チオフコース誘導体(5S-Fuc)の合成を行った。本年度は、5S-Fucを導入したLewisYと知られる肺癌や乳がんに発現するTACAの合成に成功した。さらに、両親媒性ポリペプチドから調製されるナノ粒子の表面にTACAを提示して、抗体産生を評価した。この結果から、癌ワクチンキャリアとして最適な構造は50nm程度の平面シート構造であることが明らかになった。今後は、この平面シート状のナノ粒子に5S-Fucを導入したLewisYを修飾して、天然にTACAに対する免疫応答の比較を行う。本年度は、Kase IIの糖転移反応を利用し、生体内で様々なシグナル伝達に関係するシアル酸を糖鎖の非還元末端に導入した糖鎖を合成することが可能であることを見出した。また、このKase IIが触媒する糖転移反応を繰り返し利用することで、糖鎖長の長いTACAユニットを含む硫酸化糖鎖の合成を明らかにした。しかしながら、精製方法を確立することが今後の課題となっている。しかしながら本研究を進める中で、糖転移反応におけるKase IIの基質特異性を明らかにすることができた。さらに、チオフコース誘導体(5S-Fuc)を合成するとともに、5S-Fucを導入したLewisY類縁体の合成に成功した。また、天然のLewiYをTACAとして担持した両親媒性ポリペプチドから調製される分子集合体キャリアをマウスに投与した。抗体産生量を評価した結果から、癌ワクチンに最適な分子集合体キャリアの構造を明らかにした。上述した結果は、研究計画に記載した通りの内容であるので、現在までの進捗状況は予定していたものであるといえる。

さらに、Kase II触媒糖転移反応が、硫酸化糖鎖の繰り返し単位を3つ有しながら、su-Lex構造の糖鎖中での位置を制御できる合成法に利用できることも示した。1年目の研究で環酸素原子を硫黄原子に変化した5-チオフコースを導入したルイスyアナログ(5S-Ley)をシート状の分子集合体に担持させた。本年度は、このナノ粒子をマウスに投与することによって5S-Ley自身のみならず、Leyに対しても交差性をもつIgM抗体を産生することを明らかにした。5S-Leyを担持したシート状の分子集合体によって産生する抗体の特異性や抗原との親和性についてさらに調査を進めることで糖の環酸素原子を置換することによる免疫応答に関する利点を明らかにできる可能性がある。さらに、ポリペプチド親水鎖を分子内に2本有するような両親媒性分子(A2B)を設計した。このA2Bの親水部末端にLey抗原を2つ導入することで、大量かつ高密度にLeYを表面に提示する分子集合体(LeY2-A2B-sheet)を調製した。LeY2-A2B-sheetを投与することによって速やかに抗LeyIgMは産生するものの、頻回投与によって免疫応答が抑制され抗体産生が減少した。また、産生した抗体の特異性も変化した。これらの結果から、糖鎖抗原を認識するようなB細胞は、ナノキャリア上の抗原の空間配置を繊細に認識して免疫応答を惹起していると考えられた。Kase IIの糖転移反応を利用して合成した硫酸化糖鎖を分子集合体キャリアへ展開し、TACA提示分子集合体を用いて抗原性を評価する。特に硫酸基、フコース残基が与えるTACAの抗原性の変化について明らかにすることを考えている。5チオフコース誘導体の合成後、申請者らが確立した手法を用いて、5チオ硫酸化LeX誘導体を合成する。続いて、末端アジド化リンカー含有5チオ硫酸化LeX誘導体、および5チオ硫酸化LeXオキサゾリン誘導体の合成を行い、ケラタナーゼIIの糖転移反応を行って擬似TACAの合成を検討する。さらに、合成した5S-Fuc含有擬似TACAを用いて、擬似TACA提示分子集合体を調製し、透過型電子顕微鏡による分子集合体のモルフォロジーの確認、マウスへの投与を行い、癌ワクチンとしての評価を行う。癌ワクチンとしての評価はELISA法用い、購入する抗体との結合強度を調査する。一方で、Kase IIの糖転移反応を利用して合成した硫酸化糖鎖はケラタン硫酸と呼ばれる生理活性糖鎖に分類される。そのケラタン硫酸の生理活性相関を明らかにするために抗ケラタン硫酸抗体との結合親和性を調査することにより、分子レベルでのケラタン硫酸の生体内での役割を明らかにしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規酵素免疫測定法による硫酸抱合型ニューロステロイド分析法の開発

現在注目されている脳内物質としてニューロステロイドがあり,そのなかでもdehydroepiandrosterone3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドに第4世代の神経伝達物質として多大な関心が寄せられている.先に我々はLC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ,いずれの抱合体の存在量もLC/MSの検出下限以下であり,従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから,本法では測定困難なことが判明した.そこで,これらの特徴的官能基(3位サルフェート,17あるいは20位のケトン)から大きく離れた11位に着目,ここにブリッジを導入した新規ハプテンを合成し,極めて特異性の高い抗体を得た.ついで,それを基に簡便で信頼性の高い超高感度な酵素免疫測定法(ELISA)を開発した.なお,これはブリッジヘテロロガス法と遅延添加法を駆使した測定法である.開発した方法を実試料(ラット脳;部位別)へ適用したところ,いずれの抱合体も先に得られたLC/MSによる知見と同様に低濃度であり,血中濃度より低い場合も見られた.以上のようにして開発したELISAはいずれも超高感度で高選択的であったが,実試料においては従来法による値より遥かに低値しか得らなかった.この原因は一概には論じられないが,脳神経化学領域において今後解明すべき大きな課題と考えられる.すなわち,ニューロステロイドの定義である脳内で独自に生合成され脳内に蓄積されるのではなく,単に血液中のそれが脳内に移行しているだけとも考えられた.現在注目されている脳内物質としてニューロステロイドがあり,そのなかでもdehydroepiandrosterone3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドに第4世代の神経伝達物質として多大な関心が寄せられている.先に我々はLC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ,いずれの抱合体の存在量もLC/MSの検出下限以下であり,従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから,本法では測定困難なことが判明した.そこで,これらの特徴的官能基(3位サルフェート,17あるいは20位のケトン)から大きく離れた11位に着目,ここにブリッジを導入した新規ハプテンを合成し,極めて特異性の高い抗体を得た.ついで,それを基に簡便で信頼性の高い超高感度な酵素免疫測定法(ELISA)を開発した.なお,これはブリッジヘテロロガス法と遅延添加法を駆使した測定法である.開発した方法を実試料(ラット脳;部位別)へ適用したところ,いずれの抱合体も先に得られたLC/MSによる知見と同様に低濃度であり,血中濃度より低い場合も見られた.以上のようにして開発したELISAはいずれも超高感度で高選択的であったが,実試料においては従来法による値より遥かに低値しか得らなかった.この原因は一概には論じられないが,脳神経化学領域において今後解明すべき大きな課題と考えられる.すなわち,ニューロステロイドの定義である脳内で独自に生合成され脳内に蓄積されるのではなく,単に血液中のそれが脳内に移行しているだけとも考えられた.現在,注目されている脳内物質として脳内ステロイドホルモン(ニューロステロイド)があり,そのなかでもdehydroepiandrosterone 3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドに多大な関心が寄せられている.特にdehydroepiandrosterone 3-sulfateは,早老性モデルで不治の病である筋緊張性ジストロフィーに極めて有効なことが判明し最近のトピックスとされている.しかし,最近申請者らは,LC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ,いずれの抱合体の存在量もLC/MSの検出下限以下であり,従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから,本法では測定困難なことが判明した.そこで,本年度はdehydroepiandrosterone 3-sulfateの超高感度で高選択的な新規酵素免疫測定法を開発し,本硫酸抱合体の生理的意義解明を企てんとした.まず,dehydroepiandrosteroneの微生物酸化により得られる11α-hydroxy体を出発物質として,11位にブリッジを有するdehydroepiandrosterone 3-sulfateに対する新規ハプテンを合成した.得られたハプテンを複数の家兎に免疫し本硫酸抱合体に特異的ポリクローナル抗体を得た.ついで,得られた抗体を用いて新規酵素免疫測定法(ELISA)を開発したが,これはブリッジヘテロロガス法と遅延添加法を駆使した超高感度,高選択的な測定法であった.現在開発した方法を,実試料(ラット脳)へ適用中であり,その成果が期待される.現在、注目されている脳内物質として脳内ステロイドホルモン(ニューロステロイド)があり、そのなかでもdehydroepiandrosterone 3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドが第4世代の神経伝達物質として多大な関心が寄せられている。しかし、申請者らは、LC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ、いずれの抱合体の存在量もLM/MSの検出下限以下であり、従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから、本法では測定困難な事が判明した。そこで、昨年度はdehydroepiandrosterone 3-sulfateの超高感度で高選択的な新規酵素免疫測定法を開発し、やはり低濃度でしか存在しないことを明らかとした。そこで今年度はpregnenolone 3-sulfateのそれを開発した。

まず、dehydroepiandrosteroneの微生物酸化により得られる11α-hydroxy体を出発物質として、11位にブリッジを有するpregnenolone 3-sulfateに対する新規ハプテンを合成した。得られたハプテンを複数の家兎に免疫し本硫酸抱合体に特異的ポリクローナル抗体を得た。ついで、得られた抗体を用いて新規酵素免疫測定法(ELISA)を開発したが、これはブリッジヘテロロガス法と遅延添加法を駆使した超高感度、高選択的な測定法であった。また、開発した方法を実施料(ラット脳)へ適用したところ、やはり低濃度でありLC/MSのそれと近い値が得られた。21世紀は脳科学の時代であり,脳内物質として注目されているものに神経ステロイド(ニューロステロイド)がある.そのなかでもdehydroepiandrosterone 3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドが第4世代の神経伝達物質として多大な関心が寄せられている.しかし,申請者らは,LC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ,いずれの抱合体の存在量もLC/MSの検出下限以下であり,従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから,本法では測定困難なことが判明した.そこで,1昨年度はdehydroepiandrosterone 3-sulfateの超高感度で高選択的な新規酵素免疫測定法(ELISA)を開発し,やはり低濃度でしか存在しないことを明らかとした.さらに昨年度は抗pregnenolone 3-sulfate抗体を作製し,ブリッジヘテロロガス系,遅延添加法を駆使して高感度,高選択的なELISAを開発した.今年度は本法をラット脳(部位別)へ適用し以下のような成果を得た.すなわち,ラット脳を各部位別に分画し超音波処理,抽出処理後ELISAに付したが,いずれの部位のそれも低濃度であった.因みに血中のそれを本法で測定すると,脳内のそれよりやや高値であった.また,pregnenolone 3-sulfateをip投与後測定した場合には脳内のそれも上昇していた.以上の結果を総合すると,本物質は血流に乗って脳内に運ばれているものと考えられ,脳内で独自に生合成されて蓄積すると定義されているニューロステロイドとしては疑問の残る結果を示した.
分裂酵母の新規細胞間情報交換メカニズムの解明

酵母には、利用しやすい窒素源が環境中に存在すると、利用しにくい窒素源の資化に必要な酵素やトランスポーターの発現が抑制される機構(Nitrogen catabolite repression; NCR)が存在する。本研究で我々は、分裂酵母のアミノ酸要求性変異株が示す「適応生育」の発見から、分裂酵母が極低濃度で作用する不飽和脂肪酸2種を分泌し、それらを介して細胞間情報交換を行い、NCRを解除して窒素代謝を変化させることを明らかにした。また、この脂肪酸を介した細胞間情報交換はアミノ酸トランスポーターAgp3依存的であることがわかった。酵母には、利用しやすい窒素源(アンモニア、グルタミン酸等)を含む環境下では、利用しにくい窒素源(分岐鎖アミノ酸等)の利用・取り込みに必要な酵素やトランスポーターの発現が抑制される窒素源カタボライト抑制という機構が存在する。分裂酵母の分岐鎖アミノ酸要求性変異株(eca39Δ株)はグルタミン酸を含む最小培地では窒素源カタボライト抑制が働くため、分岐鎖アミノ酸が培地に含まれていてもそれらを取り込むことができず生育不可能になる。しかしながら、同様の培地において野生株の近傍にて培養すると、野生株から何らかの物質(分泌ファクター)が分泌され、分岐鎖アミノ酸の取り込み能が回復することにより生育が可能となる「適応生育」現象が見出されていた。これまでに我々は、分泌ファクターの一つとして10-hydroxy-8-octadecenoic acidが含まれることを確認していたが、本年度はさらなる分離および絶対立体配置を含む構造の同定を試み、フェロモン様のナノモルレベルの極低濃度で作用する不飽和脂肪酸2種(10(R)-hydroxy-8(Z)-octadecenoic acidおよび10(R)-acetoxy-8(Z)-octadecenoic acid)を同定し、それらをNitrogen Signaling Factors (NSFs)と命名した。これらの分泌ファクターの全合成にも成功し、また、類縁体の合成も行った。構造類縁体および市販の脂肪酸ライブラリーのスクリーニングの結果、C-8の二重結合およびC-10のR体のアセトキシ基あるいはヒドロキシ基が適応生育誘導活性に必須であることがわかった。また、この適応生育現象にアミノ酸トランスポーターをコードするagp3+が関与することがわかった。分泌ファクター2種の構造を同定した。また全合成にも成功し、類縁体も数種類合成できた。類縁体や市販の脂肪酸ライブラリーをスクリーニングすることで、構造活性相関解析も行った。適応生育に関わるアミノ酸トランスポーターも同定した。以上のことより、本研究課題は計画通り順調に進捗していると評価した。酵母には利用しやすい窒素源(アンモニア、グルタミン酸等)を含む環境下では、利用しにくい窒素源(分岐鎖アミノ酸等)の利用・取り込みに必要な酵素やトランスポーターの発現が抑制される窒素源カタボライト抑制という機構が存在する。我々は分裂酵母の分岐鎖アミノ酸要求性変異株(eca39Δ株)が示す特徴的な適応生育現象を見出したことより、窒素源カタボライト抑制を解除する機能を示す分泌ファクターを同定し、窒素源シグナル因子(Nitrogen Signaling Factor, NSF)と命名した。今年度はNSFの受容体および受容後のシグナル経路に関与する因子のスクリーニングを行った。当初、eca39Δ株を試験株として分裂酵母の約3,000株の遺伝子破壊株との掛け合わせによる二重破壊株を作製する予定だったが、eca39Δ株の生育が遅く取り扱いにくいため、eca39Δ株と同様に適応生育現象を示すロイシン要求性変異株(leu1株)を試験株としてスクリーニングを行った。選抜された遺伝子の中には膜融合や小胞輸送に関与するSNAREタンパク質をコードする遺伝子やヒストンアセチル化酵素の複合体サブユニットをコードする遺伝子が含まれていた。これらはNSF取り込み後のシグナル伝達に関与することが考えられる。また、野生株の近傍にて適応生育したeca39Δ株およびNSF存在下で適応生育したeca39Δ株を用いてマイクロアレイ解析を行い、適応生育後に転写レベルの変化する遺伝子を同定した。さらに、分泌ファクターの生産条件を検討した。異なる窒素源を含む最小培地で野生株を培養し、その培養上清のeca39Δ株回復能を調べたところ、アンモニアよりもグルタミン酸を含む培地で培養した野生株の培養上清において高い活性が見られた。また、培養時の通気量が分泌ファクターの生成に影響をおよぼすこと、定常期の培養上清の活性が高いことを確認した。分泌ファクターNSFの取り込み後の作用機序に関与する因子を、遺伝学的スクリーニングを利用し同定した。加えて、NSFの作用機序を明らかにするためにNSF存在下で適応生育したeca39Δ株において転写レベルの変化する遺伝子を同定した。これらの情報は作用機序解析を進めるうえで非常に重要な知見となる。また、分泌ファクターの生産条件も検討した。以上のことより、本研究課題は計画通り順調に進んでいる。我々はこれまでに、分裂酵母において資化しやすい窒素源(グルタミン酸等)の存在下で窒素源カタボライト抑制機構が働いているにも関わらず、資化しにくい窒素源(分岐鎖アミノ酸等)の利用ができるように窒素代謝を変化させる分裂酵母どうしの細胞間コミュニケーションが存在していることを示してきた。さらに、このコミュニケーションには分裂酵母から分泌される窒素源シグナル因子(Nitrogen Signaling Factor, NSF)が必要であることを見出し、NSFとして脂肪酸化合物2つを同定した。今年度はNSFの細胞毒性を検討した。NSFは高濃度ではeca39Δ株の適応生育を誘導できなかった。

動的光散乱法により高濃度のNSFは溶液中でミセルを形成していることがわかったので、このために細胞内にNSFが入りにくくなり、あるいは作用しにくくなり適応生育誘導ができなくなったのであろうと示唆された。実際に、100 μg/mLの高濃度でも分裂酵母野生株や出芽酵母野生株に対する毒性はみられなかった。また、分裂酵母培養液上清の酢酸エチル抽出物(ここにはNSFを含む)をつかい、様々な放線菌が感受性を示すかどうかを試験したが、顕著に感受性を示すものは見出せなかった。窒素代謝を変化させる細胞間コミュニケーションは分裂酵母(S. pombe)間で発見され、分裂酵母ー出芽酵母(S. cerevisiae)間では観察できない。そこで、「分裂酵母」に分類される別の種であるS. japonicusを入手し細胞間コミュニケーションの存在を確認したが、S. pombeーS. japonicus間でも窒素代謝を変化させる細胞間コミュニケーションは観察されなかった。酵母には、利用しやすい窒素源が環境中に存在すると、利用しにくい窒素源の資化に必要な酵素やトランスポーターの発現が抑制される機構(Nitrogen catabolite repression; NCR)が存在する。本研究で我々は、分裂酵母のアミノ酸要求性変異株が示す「適応生育」の発見から、分裂酵母が極低濃度で作用する不飽和脂肪酸2種を分泌し、それらを介して細胞間情報交換を行い、NCRを解除して窒素代謝を変化させることを明らかにした。また、この脂肪酸を介した細胞間情報交換はアミノ酸トランスポーターAgp3依存的であることがわかった。分泌ファクターを同定できたことから、今後は、分泌ファクターによる代謝・遺伝子発現量変化についての解析や分泌ファクターの受容体および受容後のシグナル経路に関与する因子のスクリーニング、分泌ファクターの生産条件および生産性の検証を行う予定である。H28年度の実験結果をもとに、分泌ファクターNSFの詳細な作用機序解析に取り組む。NSFの受容体をまだ同定できていないことから、受容体候補(Gタンパク質共役受容体、二成分制御系など)について、それぞれ個別にNSFと相互作用があるかどうかを遺伝学的/生化学的手法を用いて調べる。また、分裂酵母が分泌するNSFの他の微生物への影響を確認し、NSFの生物学的意義について検討する。ケミカルバイオロジー分泌ファクターの作用機序の詳細を解明するために外注による解析を計画していたが、サンプル調製が間に合わなかったため。当初、eca39Δ株を試験株として分裂酵母の約3,000株の遺伝子破壊株との掛け合わせによる二重破壊株を作製する予定だったが、ロイシン要求性変異株(leu1株)を試験株とするスクリーニングに変更した。よって、すでに所有しているleu1変異バックグラウンドの約3,000株の遺伝子破壊株を用いたので、掛け合わせに必要な消耗品(プレート、試薬等)の購入が必要なくなったため。作用機序解析は引き続き次年度も行っていくので、その費用に充てる予定。
耳音響放射(OAE)を用いた内リンパ水腫における蝸牛基底板振動特性の解析

(1)蝸牛モデルの作成蝸牛基底板の動きを模擬するため、400セグメントの電送線モデルをコンピュータ上に構築した。大型計算機を使用する予定であったが、RISCチップを搭載したパーソナルコンピュータが十分な速度を発揮したため、これを用いた。電送線が1系統(自由度1)のモデルは安定性が高いが、チューニング特性はあまり良くなく、2系統(自由度2)のモデルは、チューニングは良好であるが、安定が悪く、また演算時間が自由度1のモデルの約100倍必要であった。(2)ヒトの耳音響放射の測定誘発耳音響放射による検討では、内リンパ水腫を病態として持つと思われる症例で聴力低下が軽度のものに、グリセロール負荷を行い、変化を観察した。負荷後は反応波形の周波数が、低い方へシフトする例と、不変であるものが存在した。歪成分耳音響放射での同様な検討では、低音部に反応振幅の増加が見られ、誘発耳音響放射の変化に相応した。対側耳へのノイズ負荷の実験では、健常耳の結果と、本質的な差は見られなかった。(3)動物の耳音響放射の測定モルモットの実験では、誘発耳音響放射の記録が不安定であったため、専ら歪成分耳音響放射を用いた。内リンパ水腫を作成する操作を行うと、耳音響放射の振幅は全周波数で低下を見たが、その程度は低音部の方が強かった。利尿剤投与により、振幅は増大する傾向にあったが、未だ例数が十分でないので、確定するに至っていない。(4)蝸牛モデルのパラメータを利用したフィッティング以上の変化は、1自由度のモデルにより、定性的・一部定量的に再現可能であった。対側音負荷による変化は、外有毛細胞の能動的増幅作用を小さくすることで、また内リンパ水腫耳の変化は、基底板のコンプライアンスを基底板全長にわたり低下させることでシミュレート可能であった。2自由度モデルは、安定を欠くものの、後者に関してはほぼ同様の結果となった。
先行詞または節内に数量詞を含む関係詞節の日英比較研究

本年度は数詞を含む日本語関係詞節に焦点を当てた。目本語では、(1a)のように主節の内容と関係詞節の内容がと因果関係をもっとき、数詞(「1冊」)の「数量詞遊離」が許容されないが、(lb)のように主節の内容と関係詞節の内容が密接に関係しない場合には数量詞遊離が許容される。(1)a.?^*山田は[その後の人生を変える]本を1冊買った。b.山田は[その日発売された]本を1冊買った。(1a)は主節の表す事態(「本を買う(こと)」)が関係詞節の表す事態(「本を買った後の人生が変わる」)に時間的に先行している点で(lb)とは決定的に異なる((lb)は逆の順序)。なぜ主節の表す事態が時間的に関係詞節の表す事態に先行できないのか。これは関係詞節の内容が主節の内容に「依存」していることによると思われる。つまり、数詞「1冊」が遊離するとそれは副詞として主節の述部の一部を構成することになる。そして、その述部が関係詞節の内容を規定するため、結果的に不自然な状況を表してしまうのである。(1b)と(2)について主節と関係詞節の関係をみてみよう。(3)a.1冊の本を買う→1冊の本を買った後の人生を変えるb.その本を1冊買う下→#その本を1冊買った後の人生を変える(3b)は人生を変えるのに本の冊数が関わっているようで一般通念的に想定しづらい状況を表している。つまり、人生を変えるのは本の内容(つまりタイプ)であるから、その点では同じ本を1冊買うか2冊以上買うかというトークン数は問題にしないのが普通である。このように関係詞節の内容が主節の述部に依存した構文である(1a)では数量詞遊離が許容されないのだと考えられる。本年度は制限的関係詞節(制限節)の「指示」の問題に焦点を当てた。具体的には、制限節の先行詞が定名詞になる場合(定関係詞節e.g. the tulip that is yellow)と制限節の先行詞が不定名詞になる場合(不定関係詞節e.g. a tulip that is yellow)の意味的特徴について考察した。安井(2000)はこれらの2種類の制限節の意味的特徴についてつぎの主張をしている。(1)(1)定関係詞節は限定機能をもたない。(2)不定関係詞節の不定冠詞の排他性(exclusiveness)は関係詞節を除いた先行詞の名詞だけに適用される。しかし、つぎの例は(1)の主張の反例となると思われる。花瓶に赤と黄色のチューリップが一本ずつ生けてある状況で黄色のチューリップを指すには定関係詞節を用いなければならない。定名詞thetulipは赤と黄色のチューリップのいずれをも指しうるが、関係詞節によって黄色に限定されている。また、不定関係詞節の不定冠詞の排他性が先行詞の名詞のみに適用するとすれば、a tulip that is yellowはチューリップが複数本ある限り適切となるはずだが、実際には容認されない。したがって、定関係詞節は(不定関係詞節と同様に)限定機能をもち、不定関係詞節の先行詞に含まれる不定冠詞の排他性は先行詞の名詞のみならず、関係詞節を含めた全体に適用されるという結論に達する。本年度は昨年度に引き続き関係詞節の先行詞が定の場合(以下、「定関係詞節」)と先行詞が不定の場合(以下、「不定関係詞節」)の意味的特性について考察した。次のように定関係詞節には不定関係詞節と相補的になるものがある。このことをふまえると次の(a)と(b)の定関係詞節は扱いを変えなければならないと思われる。すなわち、(2a)は関係詞節の内容が先行詞として定名詞を要求するものであり、(2b)はそのような要求をしないものである。また、(1)や(2a)のパタンとは逆に不定関係詞節しか許されない例もある。これらの不定関係詞節も(2b)の不定関係詞節とは区別される必要があると思われる。(4)の不定冠詞は「のうちの一つ」という「部分解釈」を受けるのに対して、(2b)の不定冠詞は「部分解釈」だけでなく、「一つ(だけ)の」という解釈も可能だからである。以上から「吹き出し」・「はみ出し」はどちらも少なくとも2つ以上に下位区分される関係詞節をとらえようとしていることになる。

(1a)は主節の表す事態(「本を買う(こと)」)が関係詞節の表す事態(「本を買った後の人生が変わる」)に時間的に先行している点で(lb)とは決定的に異なる((lb)は逆の順序)。なぜ主節の表す事態が時間的に関係詞節の表す事態に先行できないのか。これは関係詞節の内容が主節の内容に「依存」していることによると思われる。つまり、数詞「1冊」が遊離するとそれは副詞として主節の述部の一部を構成することになる。そして、その述部が関係詞節の内容を規定するため、結果的に不自然な状況を表してしまうのである。(1b)と(2)について主節と関係詞節の関係をみてみよう。(3)a.1冊の本を買う→1冊の本を買った後の人生を変えるb.その本を1冊買う下→#その本を1冊買った後の人生を変える(3b)は人生を変えるのに本の冊数が関わっているようで一般通念的に想定しづらい状況を表している。つまり、人生を変えるのは本の内容(つまりタイプ)であるから、その点では同じ本を1冊買うか2冊以上買うかというトークン数は問題にしないのが普通である。このように関係詞節の内容が主節の述部に依存した構文である(1a)では数量詞遊離が許容されないのだと考えられる。
思春期の身体発育を契機とした不適応行動の発生を助長／抑制する要因の解明

思春期は急激な身体変化を伴う時期である。本研究の目的は,青年の個人要因と社会文化的要因を踏まえながら,思春期の身体発育を契機として不適応行動を発生させるリスクファクターの検討と,不適応行動の予防・抑制に関する要因を検討することであった。その結果,早熟者・晩熟者であることにレジリエンスの低さという個人要因が重なることで不適応行動が助長される可能性が示唆された。また,女子では自分からもしくは声をかけられれば相談できる対象をもつ生徒,男子では声をかけられた時に相談する生徒の学校適応が良好であり,自ら相談できる,あるいは,声をかけられたら相談できる対象を持てることが防御要因になることが示された。思春期は、身体発育や第二次性徴といった急激な身体変化を伴う時期であり、理論的にはこうした急激な身体変化が青年の不安や動揺をもたらすと強調されてきた。しかしながら、実証的研究では、必ずしもすべての青年が不安や動揺しているわけではなく、身体変化を通して自信がもたらされ、自己理解を深めていくことも示されてきている。本課題の目的は、青年の個人要因と社会文化的要因を踏まえながら、身体-心理-社会的相互関係に注目し、思春期の身体発育を契機に不適応行動を発生させる因子を特定していくとともに、不適応行動の予防や抑制する要因を明らかにしようとするものである。平成25年度は昨年に引き続き、思春期の身体発育による心理的影響を探りながら、学校における教師との関係性など社会文化的観点から整理するとともに、青年の不適応行動を助長/抑制する社会文化的要因を探るために、中学生を対象に質問紙調査を実施し、1274名から回答が得た。これまで、思春期の身体発育によって身体への違和感や戸惑いが生じるとされてきたが、全体としては違和感が小さいことが示されたが、違和感を強く抱いている青年は不適応的であった。女子では、周りと同じくらいだと感じている生徒の違和感は低く、周り(同学年の子)と比較して早いもしくは遅いと感じている生徒が違和感をもっていること、男子では早熟な生徒は比較的違和感を持っていることが示された。思春期は、身体発育スパートや第二次性徴を特徴とする時期である。「青年期は疾風怒濤の時期である」と言われるように、理論的には、思春期の身体発育によって青年は不安や混乱に陥ることが強調されてきたが、実証的な知見は十分に得られていない。本課題の目的は、児童・生徒の個人要因や親の信念・ソーシャルサポートなどの社会文化的要因を踏まえながら、身体(生物)ー心理ー社会的相互関係に注目し、思春期の身体発育と不適応行動が関連するための危険因子を特定していくとともに、不適応行動を克服、予防する条件を明らかにしようとするものである。24年度は思春期の身体発育を心理学的に検討する観点の整理を文献および学会・研究会での議論を通して検討した。具体的には、ホルモン分泌を含む生物学的側面による心理的影響、認知機能の発達や自己評価特性などの心理的側面、および不適応行動を助長する社会的要因/サポート要因に焦点を当て、思春期の身体発育による心理的影響を包括的に測定するための質問紙項目の内容を検討した。また、大学生を対象とした質問紙による調査を実施し、初経および月経が心理的側面に与える影響について検討を行った。従来の研究では、「初経に発現」に対しては肯定的・否定的反応が拮抗しているが、「月経」に対しては否定的な反応が大半であることが示されているが、性周期変動によって心理的側面も変動することが示唆された。以上から、思春期の身体発育をライフイベントという「点」としてとらえるだけでなく、変わりゆく身体をどのように受け止めていくかという「包括的」な思春期として捉えていく必要性が示唆された。これについては、一部を学会において発表した。思春期は急激な身体変化を伴う時期であり,身体発育や性的成熟は,本人の意思や希望とは無関係に生じる生物学的成熟であり,そのため,少なからず不安や心理的動揺をもたらすと考えられてきた。青年個人のリスクファクターおよび防御要因の検討から示されたこととして,女子における早熟者および晩熟者のうち,レジリエンスの低い者は,自己の身体に対する違和感が高いことが示され,標準者はレジリエンスの高さに関わらず低い水準であった。

一方,レジリエンスの高い者は早熟・晩熟であっても身体的違和感が低かったことから,多数派から逸脱する早熟・晩熟であることにレジリエンスの低さという個人要因が重なることで不適応行動が助長される可能性が示唆された。また,社会文化的要因による検討では,悩みに対する相談行動を,自ら援助を求める援助要請と,声をかけられれば相談する被援助提案の観点からとらえ,これらの相談行動が学校適応に関連するかを検討した。その結果,女子では教師に対して「自分からも声をかけられても相談しない」生徒の学校適応が悪く,いずれかの相談行動を行う生徒の学校適応は良好であった。一方,男子では,自分から相談するかどうかではなく,声をかけられた時に相談する生徒の学校適応が良好であることが示された。教育心理学平成25年度は、青年への大規模な調査を実施し、今日の日本の青年における身体発育状況および心理的受容度、身体発育に伴う身体的違和感の様子を示すことができており、不適応行動の助長・抑制要因についても徐々に明らかにされている。本研究は、思春期の身体発育と不適応行動が関連するための危険因子を特定するとともに、身体(生物)ー心理ー社会的相互関係に注目し、身体発育を契機に不適応行動が助長されるケースとそうではないケースの比較から両者の差を生み出す要因を見出していくことを目的としている。これまで、思春期の身体発育を心理学的に検討する観点の整理を文献および学会・研究会での議論を通した検討と大学生を対象とした質問紙による調査を実施し、思春期の身体発育による心理的影響を検討する際には、性周期変動を考慮する必要性が示された。こうした結果は、思春期の身体発育をライフイベントという「点」としてのみとらえるのではなく、これまであまり注目されてこなかった「連続性」という包括的にとらえていく必要性が示唆するものである。こうした結果に基づき、児童・生徒用の質問紙項目を選定し、児童・生徒を対象とした質問紙による調査実施の準備を進めている。今後は、これまでに得られているデータをさらに詳細に分析するとともに、これまでに行われた諸研究を概観し、思春期の身体発育による不適応行動の発生・抑制のメカニズムについてまとめる。また、本研究課題の最終目的である社会文化的要因との相互作用を考慮し、思春期を契機とした不適応行動の助長・抑制要因を明らかにする。次年度は、児童・生徒の個人特性による身体発育の影響について検討することを最優先とする。具体的な方法として、児童・生徒を対象とした質問紙調査を実施し、児童・生徒の身体発育の主観的な早晩認知や自己評価、レジリエンスなどの個人特性によって身体発育の受け止め方や不適応行動に差異が現れるか検討する。また、次年度以降、身体発育を契機とした不適応行動を助長/抑制する社会文化的要因として家庭の要因、学校の要因を取り上げ、家庭・学校の要因と個人的要因(身体発育状況など)との相互作用に注目し、適応指標である抑うつ傾向、攻撃性などに差異が生じるか検討していく。具体的には、児童・生徒を対象とした質問紙調査では、家庭の要因として子どもが認知する養育態度・家族機能、子どもが抱く親への信頼感を取り上げる。学校の要因として友人関係、学校満足度に関わる情報を収集する。保護者を対象とした質問紙調査では、親の信念としての性役割態度や親が子どもに抱く信頼感、親が評定する子どもの問題行動等を測定し、思春期の身体発育を契機とした不適応行動を助長/抑制する要因について検討する。データ入力、資料整理等への謝金が予定より少なかったこと、資料収集・成果発表のための旅費が予定よりも少なかったこと等のために当該研究費が発生している。
ヒト胎児性癌細胞の分化誘導におけるN-myc遺伝子の機能と発現調節

ヒト胎児性癌細胞の分化誘導初期にN-myc遺伝子の転写レベルが約1/(10)に一過性に減少し、続いてサイクリンA遺伝子の転写が抑制される。N-myc遺伝子の転写抑制はプロモーター領域に存在するE2Fモチーフに一過性に複合体が形成されなくなるためと分った。E2F転写因子は多くのメンバーより構成されヘテロダイマーとして働くことから、本年度は大腸菌で発現するλZAPIIをベクターとして分化誘導NEC14細胞より調製したcDNAライブラリィより、^<32>P標識E2F-1をプローブとして、それに結合するタンパク質のcDNAを単離、解析した。クローンE2F-BP1はN末端部を若干欠くものの388アミノ酸をコードし、その239279アミノ酸領域にHLHモチーフを持ち、このモチーフを介してE2F-1に結合することが分った。HLHモチーフ内のアミノ酸配列はE2FファミリーよりむしろMycファミリーのMxi1、Madと類似している。そのN末端側はE2F、Mycファミリーのメンバーとは大きく異なり塩基性アミノ酸領域を欠いている。C末端部では酸性アミノ酸領域、pRB結合モチーフを欠くことからE2Fのメンバーとは異なる新しいタイプのE2F結合タンパク質であることが分った。E2F-BP1自身にはDNA結合能はないが、E2F-1、DP1とヘテロダイマーを形成しこれら因子のE2Fモチーフ、TTTGGCGCGへの結合を促進する。またE2Fモチーフを持つN-mycプロモーター、アデノウイルスE2プロモーターをそれぞれ付加したCAT遺伝子の転写を促進することが分った。NEC14細胞内ではE2F-1、DP1以外のメンバーともヘテロダイマーを形成すると推定される。今後はE2F-BP1と結合するE2Fファミリーのメンバーを単離し、分化誘導NEC14細胞におけるN-mycプロモーターの活性調節作用を解析する予定である。