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遺伝子改変メダカを用いたNASH環境下での新規肝発癌モデルの開発

本研究では、メダカを動物モデルとして、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)に伴う肝障害、肝硬変、肝癌発生の過程を検証し、その進展制御のための治療法確立を目的として検討を行なった。本研究助成基金によって、以下の研究成果が得られた。drRメダカモデルを用いて、ヒトNASHの病態を再現するNASHメダカモデルの確立し、肝組織、血液生化学の検討による検証の後に、同メダカモデルを対象として、抗糖尿病薬であるSGLT2阻害剤によるインスリン抵抗性の改善、肝組織内の炎症性変化の改善の有無、脂肪変性の改善などの効果を検証した。また、肝癌に対する血管新生阻害剤のメカニズム及び治療方法を検討することが可能であった。本研究は、メダカを動物モデルとして、非アルコール性脂肪肝炎を背景とする肝発癌メカニズムを解析することを目的としている。平成28年度の本研究助成基金助成金によって、以下の研究成果が得られた。1. drR系統のメダカを用いた、高脂肪食投与によるNASHモデルの確立メダカに高脂肪食を投与し、体重、肝重量、HE染色による肝内脂肪組織、炎症性細胞の浸潤、線維化の変化を確認し、そのモデル確立を確認した。2. NASHに対する治療薬として有効とされる抗糖尿病薬によるNASH進行の制御効果の検証。上記NASHモデルメダカを対象として、これまでにヒトNASHに対して有効とされてきた薬物を投与することにより、上記の変化が制御されることを確認した。上記の通り、メダカモデルによるNASHの確立とその病態制御のメカニズムの検討はおおむね順調に経過しているが、OGG1メダカモデルを用いた高脂肪食投与による短期肝発癌モデルの確立の検証課題において、OGG1メダカの繁殖がやや遅れている。本研究では、メダカを動物モデルとして、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)に伴う肝障害、肝硬変、肝癌発生の過程を検証するとともに、その進展を制御するための治療法の確立を目的として検討を行なった。平成29年度の本研究助成基金によって、以下の研究成果が得られた。平成28年度に確立した、drR系のメダカモデルを用いたNASHモデルメダカを対象として、抗糖尿病薬であるSGLT2阻害剤によるインスリン抵抗性の改善、肝組織内の炎症性変化の改善の有無、脂肪変性の改善などの効果を検証し、その効果を確認した。肝重量体重比は、4週投与後では有意差を認めなかったが、8週投与後でNASH群5.2 %、TOFO群4.7 %でありTOFO群にて有意に上昇が抑制された(P<0.05)。12週投与後では有意差を認めなかった。血液生化学検査では、8週投与後でTGはNASH群3240 mg/dL、TOFO群1960 mg/dL、T-CHOはNASH群370 mg/dL、TOFO群270 mg/dLとなりTOFO群にて血中脂質の上昇が抑制された。ALTは、4週投与後でNASH群420 IU/L、TOFO群190 IU/LとTOFO群でALTの上昇が抑制された。肝組織内の脂肪組織量はImage Jにて定量化し、8週投与後でNASH群30.7 %、TOFO群18.6 %とTOFO群にて脂肪組織量の上昇が有意に抑制された(P<0.01)。12週では脂肪組織量および線維化に有意差を認めなかった。以上より、投与後8週まではTOFOによるNASH進展抑制効果が認められ、SGLT2阻害薬であるTOFOの投与がNASHの進展抑制に有用である可能性が示唆された。OGG1メダカの繁殖を円滑に行い、今後は以下の検討を行なう予定である。1. OGG1メダカモデルに対する高脂肪食投与による肝発癌モデルの確立2.発癌部分の遺伝子変異の蓄積のマイクロアレイによる網羅的な解析、組織学的な特徴の検討。3.これまでに検証したNASH抑制効果を示した薬剤による肝発癌制御機構の検討。消化器病学前述の通り、ナショナルバイオリソースから供与を受けたOGG1メダカの繁殖が緩徐で、肝発癌モデルの解析のために使用を予定していた財源部分を次年度に使用する計画となったため。OGG1メダカの円滑な繁殖を行い、次年度は肝発癌モデルの解析を行なうため、これに予定通り財源を充てる。
５員環環状カーボナート構造を持つ高イオン伝導性高分子の開発

最終年度において、5員環カーボナート構造を持つ炭化水素系ポリマーとして5員環カーボナート基を有するポリシクロペンテンの合成と物性検討を行った。ヒドロキシメチルシクロペンテンにエピクロロヒドリンと水素化ナトリウムを作用させることでエポキシ基を持つシクロペンテンを合成し、エポキシ基に二酸化炭素を付加させることで5員環カーボナート基を持つシクロペンテンモノマー(5CCP)を合成した。得られた5CCPにルテニウムカルベン錯体(グラブス触媒I)を作用させることで数平均分子量100,500、重量平均分子量139,300のポリ(5CCP)を得ることに成功した。また、示差走査熱量分析ならびに熱重量分析の結果、生成ポリマーのガラス転移温度は2°Cで室温では十分に柔軟かつ、200°C以上の耐熱性を有することが明らかとなった。しかしながら、重合反応における収率は30%と低く、目的とするポリマーを効率的に得ることができず、リチウムイオンを添加した際のイオン伝導性を検討することが出来なかった。これは、重合反応のおいて使用した触媒が5員環カーボナート基に対して不安定で重合途中で重合末端が失活するためであると考えられる。今後はカーボナート等の官能基に対してより耐久性が高いと期待されるカルベン錯体(グラブス触媒1I)を使用して重合反応を継続的に検討する必要があると考えている。なお4年間に渡る本研究全般を通して、5員環カーボナート構造を持つポリカルボシランや、ポリシロキサン、ポリビニルエーテル等の柔軟なポリマーにおいて、過剰量のリチウムビストリフルオロメタンスルホニルイミドを添加することで非常に高いイオン伝導性を発現することを見出すことができ、5員環カーボナート構造を持つポリマーの固体高分子電解質としての有用性を明らかにできたことは大きな成果であると考えている。今年度は、繰り返し単位中に2つの5員環環状カーボナート基を有するポリカルボラン(polySBDC)を合成しリチウム塩としてリチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(LiTFSI)、ならびにリチウムトリフルオロメタンスルホン酸(LiOTf)を添加し、イオン伝導測定を行い固体高分子電解質としての性質を検討した。1,1-ジクロロシラシクロブタンのケイ素上に2つのブテニル基を導入した後、エポキシ化とカーボナート化を行いSBDCを合成した。SBDCに酢酸エチル中でKarstedt触媒を作用させてシラシクロブタン環の開環重合を行うことによりpolySBDCを合成した。このポリマーのアセトニトリル溶液に、5員環カーボナート基に対して0.25等量から4等量のLiTFSIを添加して溶媒を蒸発させ24時間以上真空乾燥した後、イオン伝導後測定を行った。その結果、LiTFSIの添加量が増えるとイオン伝導度が上昇する傾向が見られた。LiTFSI添加量が4.0等量の場合、30°CでpolySBDCは0.15mS/cmの高いイオン伝導性を示した。LiTFSIを添加塩とした場合には、高イオン添加量条件下において本材料系は、polymer in salt型の電解質として機能していると考察した。一方、このポリマーにLiOTfを添加してイオン伝導度を測定したところ、LiOTf添加量がカーボナート基に対して0.30.7等量の場合に最も高い値となり、それ以上添加量を増やすと、イオン伝導度は大きく低下した。LiOTfをカーボナートに対して0.4等量添加した場合のイオン伝導度は30°Cで0.51microS/cmであった。このことから、LiOTfを添加塩とした場合にはsalt in polymer型の電解質として作用していると考察された。繰り返し単位中に5員環環状カーボナート構造を2つ持つポリカルボシランを予定通りに合成できた。また、得られた高分子が高リチウム塩添加量下で高いイオン伝導度を示すことを見出すことができた。さらにこの性質はリチウム添加塩の種類によって変化するという新しい性質を見出すことができた。この性質がリチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(LiTFSI)、ならびにリチウムトリフルオロメタンスルホン酸(LiOTf)に特異的な性質であるかどうか、また、ポリカルボシランに対して特異的な性質であるかどうかを明らかにする新しい課題がみつかった。5員環環状カーボナート基を側鎖に持つポリシロキサンに関して、リチウム塩存在下でのイオン伝導性、熱物性などの諸性質を検討した。白金触媒存在下で、ジメトキシメチルシランに4ービニル-1,3-ジオキソラン-2-オンを付加させてることで、2-(1,3-ジオキソラン-2-オニル)エチルジメトキシメチルシラン(MSOC)を合成した。得られたMSOCをモノマーとして、これに触媒としてトリフルオロメタンスルホン酸を添加して50°Cに加熱して重縮合することにより、5員環環状カーボナート基を持つポリシロキサン(polyMSOC)を合成した。GPC測定により得得られたpolyMSOCの数平均分子量と重量平均分子量はポリスチレン換算でそれぞれ、3,300、6,200と見積もられた。得られたポリマーにリチウムトリフルオロメタンスルホナート(LiOTf)、またはリチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(LiTFSI)を添加し、イオン伝導度を測定した。LiOTfを添加した場合は、カーボナート基に対して2.0等量の塩添加量でイオン伝導度が最大となり、30°Cで0.036マイクロS/cmを示した。

一方、LiTFSIを添加した場合は、塩添加量の増加に従いイオン伝導度が上昇し、カーボナート基に対して4.0等量の塩添加量時には、30°Cで77マイクロS/cmの高いイオン伝導度を示した。示差走査熱量分析(DSC)測定の結果から、LiOTfを添加した場合はポリマーのガラス転移温度(Tg)が上昇するのに対して、LiTFSIを添加した場合はTgが低下することがわかった。さらに、熱重量分析(TGA)測定の結果から、LiTFSIを含むpolyMSOCは200°C以上の熱安定性を有することがわかった。本年度は、5員環環状カーボナートをもつ化学的に安定で柔軟なポリマーとして新たにシロキサン系のポリマーを合成することに成功した。さらに、このポリマーにリチウム塩としてリチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(LiTFSI)を過剰量添加すると非常に高いイオン伝導度を発現することを見いだすことができた。この結果は、昨年度検討したカルボシラン系ポリマーの結果と同様の結果であるが、このシロキサン系ポリマーはカルボシラン系ポリマーと比較して合成が容易であり、実用上重要であると期待できる。また、昨年度と今年度の研究データを合わせて考察することで、今後は5員環カーボナート基を持ち、ケイ素原子を含まない通常の柔軟な炭化水素系ポリマーのイオン伝導性について検討すべきであるという新たな研究課題を見出すことができたことは大きな進捗であるといえる。5員環カーボナート基を持つポリビニルエーテルに関して、ポリマーの合成法ならびにリチウム塩存在下でのイオン伝導性、熱物性などの諸性質を検討した。4-ヒドロキシブチルビニルエーテルに水素化ナトリウム存在下でエピクロロヒドリンを作用させることで、エポキシ基を持つブチルビニルエーテルを合成し、さらにリチウム風ブロミド存在下で二酸化炭素を作用させることで5員環カーボナート基を持つビニルエーテルモノマー(CBVE)を合成した。このモノマーをトリフルオロボランエーテル錯体を触媒としてカチオン重合することで目的とするポリビニルエーテル(polyCBVE)を得た。polyCBVEの数平均分子量と重量平均分子量はポリスチレン換算でそれぞれ13,600、28,300と見積もられた。polyCBVEにリチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(LiTFSI)を添加し、イオン伝導度を測定した。その結果、LiTFSIをカーボナート基に対して4等量加えた場合に、30°Cで10マイクロS/cmの比較的高いイオン伝導度を示すことがわかった。このことから、これまでに検討したポリカルボシラン、ポリシロキサンと同様に柔軟な炭化水素系ポリマーにおいても5員環カーボナートを有するポリマーはLiTFSI高添加量条件では高いイオン伝導性を示すことが明らかとなった。また、polyCBVEのガラス転移温度は-40°Cと低く、LiTFSIを添加後も-20°C以下の低い温度が保持されていた。さらに、polyCBVEの5%重量減少温度は211°Cで、耐熱性が低いことは実用上の課題であるとわ認識された。本年度は、5員環カーボナート基を持つ化学的に安定で柔軟なポリマーとしてポリカルボシラン、ポリシロキサンに加え、新たに炭化水素系のポリビニルエーテルを取りあげ、検討を行った。
分子量の制御された定序性高分子の合成法の開発

本研究の目的は、とれまでに報告例のない分子量と分子量分布が制御されたA-B-C型三元定序性高分子の合成方法を確立することである。本年度は、分子量と分子量分布が制御されたA-B型定序性高分子(ポリエステル)へのオキシラン類の挿入反応を用いた主鎖変換について検討を行った。3,3,3-トリフルオロプロピレンオキシドと環状カルボン酸無水物とのリビング的開環交互共重合により合成した分子量と分子量分布の制御されたポリエステルへめフェニルグリシジルエーテル(PGE)の挿入反応は、触媒としてテトラアミルアンモニウムブロミド(TAAB)を用いた場合に、良く進行することが分かった。反応条件について種々検討を行った結果、TAAB(5mol%)、三倍量のPGEを用い、70°Cで72時間反応を行った場合に、PGEの挿入反応は100%進行し、目的のA-B-C型配列順序を有する高分子が生成することが分かった。しかし、副反応としてわずかに加水分解が進行し、分子量が予想よりも小さい高分子が得られた。この反応において、系中に脱水剤を存在させて反応を行うことにより、ある程度副反応が抑制できることが分かった。以上の結果から、A-B型定序性高分子(ポリエステル)合のオキシラン類の挿入反応を用いた主鎖変換がA-B-C型三元定序性高分子の合成方法として有用であることが明らかとなった。本研究の目的は、これまで合成が困難とされてきた分子量とシーケンスが共に制御された高分子の合成方法を確立することである。本年度の研究として、オキシラン類と環状カルボン酸無水物とのリビング的開環交互共重合について検討を行った。フェニルグルシジルエーテル(PGE)のような一般のオキシラン類と環状カルボン酸無水物との開環交互共重合において、触媒としてテトラブチルホスホニウムクロリド(TBPC)を用いることにより、重合が副反応なく、リビング的に進行し、分子量が制御されたポリエステルが得られた。また、3,3,3-トリフルオロプロピレンオキシド(TFPO)や2,3-エポキシプロピオン酸ブチル(BEP)のような電子吸引基の置換したオキシラン類の場合には、触媒としてテトラブチルアンモニウムアセテート(TBAAc)を用いることにより、重合がリビング的に進行し、対応するポリエステルが得られることが分かった。いずれの場合にも、生成ポリマーの分子量分布は約1.1であった。以上の結果から、第四オニウム塩類を触媒に用いたオキシラン類と環状カルボン酸無水物との開環交互重合による分子量と分子量分布が高度に制御されたポリエステルの合成法を確立した。本研究の目的は、これまでに報告例のない分子量と分子量分布が制御されたA-B-C型三元定序性高分子の合成方法を確立することである。3,3,3-トリフルオロプロピレンオキシドと環状カルボン酸無水物とのリビング的開環交互共重合により合成した分子量と分子量分布の制御されたポリエステルへのフェニルグリシジルエーテル(PGE)の挿入反応は、触媒としてテトラアミルアンモニウムブロミド(TAAB)を用いた場合に、良く進行することが分かった。

以上の結果から、A-B型定序性高分子(ポリエステル)へのオキシラン類の挿入反応を用いた主鎖変換がA-B-C型三元定序性高分子の合成方法として有用であることが明らかとなった。
気相キラルセンシングのためのキャビティ・リングダウン装置の試作

本研究の目的はリング型共振器を用いた旋光/円二色分散計の構築である.そのために,先ずはどのような配置のリング型共振器が可能で、かつ効率よく自然光学活性を検出し得るかを探る必要がある.この最初の取り組みとして,2枚の平面鏡と2枚の凹面鏡による一般的なbow-tie型のリング型共振器を組むことから始めた.ナノ秒パルス色素レーザーを利用してこの共振器のリングダウン時間を測定すると,光パルスが共振器内を1700回程度周回していることが分かった.この際に使用した2枚の凹面鏡で構成された直線型ファブリーペロー共振器では光が7500回程度往復するが,リング型共振器ではミラーの数が4枚に増えていることを考慮すれば,妥当な結果であると考えられる.さらに,このリング型共振器を用いたキャビティリングダウン分光により630nm近傍に位置する酸素のb-X(2,0)遷移を大気中で観測したところ,直線型共振器を用いた場合と遜色ないスペクトルが得られることも確認した.次に平面鏡と凹面鏡を組み合わせて光が長方形に周回する配置を試みた.そのような配置はbow-tie型よりも自然光学活性計測に適していると考えられるが,光がうまく周回せず失敗に終わった.今回は通常の凹面鏡を利用していたが,少なくとも光が45度で入射することを考慮して曲率を設計した凹面鏡を使用する必要があると考えられる.そこでbow-tie型の共振器のみに的を絞り,ミラーの配置や構成等を工夫して,自然光学活性を効率の良く検出可能な共振器の配置を見出す作業を進めている.年度内に共振器の偏光特性までを調査する予定であったが,最適なミラー配置の調査に時間がかかっているため進捗に遅れが生じている.当初の方針からの変更はなく,共振器の偏光特性評価によって光学活性計測への応用の可能性を探る.本研究の目的はリング型共振器を用いた旋光/円二色分散計の構築である.そのために,先ずはどのような配置のリング型共振器が可能で、かつ効率よく自然光学活性を検出し得るかを探る必要がある.この最初の取り組みとして,2枚の平面鏡と2枚の凹面鏡による一般的なbow-tie型のリング型共振器を組むことから始めた.ナノ秒パルス色素レーザーを利用してこの共振器のリングダウン時間を測定すると,光パルスが共振器内を1700回程度周回していることが分かった.この際に使用した2枚の凹面鏡で構成された直線型ファブリーペロー共振器では光が7500回程度往復するが,リング型共振器ではミラーの数が4枚に増えていることを考慮すれば,妥当な結果であると考えられる.さらに,このリング型共振器を用いたキャビティリングダウン分光により630nm近傍に位置する酸素のb-X(2,0)遷移を大気中で観測したところ,直線型共振器を用いた場合と遜色ないスペクトルが得られることも確認した.次に平面鏡と凹面鏡を組み合わせて光が長方形に周回する配置を試みた.そのような配置はbow-tie型よりも自然光学活性計測に適していると考えられるが,光がうまく周回せず失敗に終わった.今回は通常の凹面鏡を利用していたが,少なくとも光が45度で入射することを考慮して曲率を設計した凹面鏡を使用する必要があると考えられる.そこでbow-tie型の共振器のみに的を絞り,ミラーの配置や構成等を工夫して,自然光学活性を効率の良く検出可能な共振器の配置を見出す作業を進めている.年度内に共振器の偏光特性までを調査する予定であったが,最適なミラー配置の調査に時間がかかっているため進捗に遅れが生じている.当初の方針からの変更はなく,共振器の偏光特性評価によって光学活性計測への応用の可能性を探る.(理由)研究進捗に多少の遅れがあり,波長板等の光学素子の年内購入を見合わせたために次年度使用額が生じた.(使用計画)当初の予定通り真空系の構築や,光学素子・光検出系の購入を計画している.
大正自由教育における体育について-奈良女子高等師範学校附属小学校を中心として-

大正自由教育における体育の終息過程を研究するため、奈良女子高等師範学校附属小学校(以下「奈良」と略す)の体操科訓導北井柳太郎に関する調査、考察をおこなった。北井に関する史料は群馬県高崎市において履歴書を、「奈良」において指導案、職員会記録などを、そして筑波大学中央図書館及び国立国会図書館では著書、雑誌記事などを収集することができた。当初の研究目的では、北井が文部省の後押しで昭和9年に「奈良」に赴任し、大正自由教育における体育を終息させたことを仮説として提示したが、今回の調査、考察では文部省との経緯を含めた「奈良」赴任の本質的理由は、見出すことができなかった。しかしながら北井は「奈良」赴任以前は、群馬県の小学校訓導であり、この時代に培った体操教材中心の理論と実践を「奈良」にもち込み、大正期は遊戯教材中心であった同校の体育を体操教材を中心に変容していった。つまり大正期から画一的、形式的な体操教材中心の実践を全県的に展開していた群馬の出身者であったことが「奈良」の体育を大きく変容させた要因となっていたのである。また彼は当時日本でも有数の器械体操の選手であり、オリンピック選手並の実力を誇っていた。このことが類い希な実技力、示範力の大きな基盤となっており、「奈良」でも多くの体操教材を自ら実演していた。以上のように北井は「奈良」の体育を教材面から変容させていた人物であり、その背景には大正期の群馬県体育の形態や、また彼独自の実技力などがあった。今後は昭和20年の終戦前後における「奈良」の体育の動向を探り、軍国体育の崩壊期に大正自由教育における体育が復活を遂げ、終戦後の体育再建にどのような役割を果たしていたのかについて検討する方針である。
新しい遺伝子座位(D7S21)で応用されたMVR-PCR法による集団遺伝学的解析

ミニサテライトDNAの1つであるMS31Aのフランキング領域に存在する3箇所の遺伝的多型部位を利用してアリルの繰り返し単位内の変異(a-,t-,O-タイプ)をマッピングするアリル特異的MVR-PCR法を用いて149個の血縁関係のない日本人のアリルを分析したところ、異なるアリルが147種類検出された。ドットマトリックス法によってホモロジーの分析をしたところ、それぞれ部分的に特定のリピート配列を共有する7つのグループに分けられ、99.99%以上の高いヘテロ接合度を示したが、17.4%のアリルは全長50リピート程度の比較的短いものであり、これらの殆どが酷似したリピート配列を持ち、Caucasianのアリルには見られないものであった。これらの短いアリルにはaOaOaで繰り返しが終わる特徴的な構造を持つものが多くみられた。また、繰り返し単位内のa-,t-,O-タイプの組成は、それぞれ49.6%、45.3%、0.9%でa-,t-タイプの比はほとんど同じであった。このグループのアリルの突然変異率は高くないことが予想され、これらのアリルは他のアリル特異的MVR-PCR法が可能で、現在までに多くのアリルが検出されているMS32共に用いるとさらに多くの集団遺伝学的研究、特に日本人集団の起源などの研究にかかさない遺伝情報を与えてくれることがわかった。このように、MS31Aアリルのアリル特異的MVR-PCR法によるマッピングは日本人だけでなく、世界中における民族特異性や相互の関連性について極めて有力な遺伝マーカーになり得るものと期待された。
日本語史基礎資料としての中世仏教者真蹟遺文の総合語彙索引の作成

中世新仏教者真蹟遺文の各文献の語彙索引の作成を行い、総合データベースを構築した。仏教者遺文は真蹟が伝来し、日本語史研究の第一等資料と位置づける。語彙索引作成文献は以下のとおりである。親鸞の西方指南抄、一念多念文意、尊号真像銘文、唯信抄文意、三帖和讃、自筆書状。聖覚の唯信抄。明恵の華厳唯心義。法然の直筆起請文・書状、式子内親王宛書状。恵信尼の自筆書状。証空の自筆書状。熊谷次郎直実の自筆起請文・誓願状。覚如の口伝抄。蓮如の自筆御文、自筆歎異抄、龍谷大学蔵歎異抄、大谷大学蔵歎異抄、自筆紀行文、和歌。一遍の一遍上人語録和歌。聖覚の唯信抄。明恵の華厳唯心義。恵信尼の自筆書状。証空の自筆書状。覚如の口伝抄。作成中の各文献の語彙総索引の修訂作業を以下のように順次行った。(1)親鸞遺文-鎌倉初期写専修寺蔵『西方指南抄』六帖(法蔵館版複製本)第二次稿の再逆引き法然の伝記を親鸞が編纂書写したもので、漢文体、和化漢文体、仮名書き体を含み、両訓も見られる大部の第一級文献である。東本願寺蔵『一念他念文意』一帖(法蔵館版複製本)第三次稿作成親鸞の手になる仮名書き注釈書で、字訓が多く採録され、抄物へと続く注釈書として位置づけられる貴重な文献である。(2)覚如遺文-鎌倉末期写龍谷大学蔵『口伝抄』三帖(原本調査による翻刻)第一次稿の修訂親鸞の曾孫による仮名交じり体のものである。言語の伝承と創造という視点で解明が待たれる文献である。(3)蓮如遺文-室町初期写真蹟「御文』(同朋社版複製本)五十一通第一次稿の修訂第八代による書状である。読み聞かせることを目的として口頭言語を意識したもので、親鸞からの伝承と創造がく見られるものである。(4)総合語彙索引のデータベース化上記作業は、各作品毎の語彙索引稿作成であり、索引の正確を期すため、単独で行ってきた。それは、品詞分解、用例の記載方法等の統一を図るためである。この作業をいつつ、コンピューターに入力し、総合語彙索引のデータベース化も開始している。エクセルを使用して、完成した索引の箇所がち順次入力している。この入力作業には助力を学生に求めている。入力されたものの点検も行って正確を期している。各文献の本文は、所蔵する大学図書館等での直接行った原本調査本、並びに出版されている写真複製本を底本としている。それを独自に翻刻し、それに基づいて語彙総索引を作成している。掲載予定の諸文献は以下のとおりである。(1)親鸞遺文-浄土真宗開祖専修寺蔵『西方指南抄』(法蔵館版、写真複製本)六帖第二次稿の再逆引きと修訂東本願寺蔵『一念多念文意』(法蔵館版、写真複製本)一帖第三次稿の修訂各寺蔵『親鸞自筆書状』(法蔵館版、写真複製本)十二通完成原稿の修訂大谷大学蔵『選択本願念仏集』(大谷大学蔵本の紙焼写真版)一帖完成稿の修訂(2)覚如遺文-浄土真宗第三世龍谷大学蔵『口伝抄』(龍谷大学蔵本の紙焼写真版)三帖一次稿の修訂(3)蓮如遺文-浄土真宗第八世各寺蔵『蓮如自筆御文』(同朋社版)五一通二次稿の修訂(4)日蓮遺文-日蓮宗開祖各寺蔵『日蓮自筆書状』(法蔵館版、複製写真版)三通二次稿の修訂(5)恵信尼遺文-親鸞の妻西本願寺蔵『恵信尼自筆書状』(法蔵館版、写真複製本)十通完成稿の修訂(6)熊谷直実遺文-法然門下清涼寺蔵『熊谷直実自筆誓願状』(二玄社版、写真複製本)二通完成稿の修訂(7)法然遺文-浄土集開祖清涼寺蔵『法然自筆書状』(二玄社版、写真複製本)五通完成稿の修訂

(8)証空遺文-法然門下清涼寺蔵『証空かな書状』(二玄社版、写真複製本)二通完成稿の修訂各文献毎の語彙総索引稿を、コンピューターへ入力を順次行っている、更にそれらを総合した総合語彙索引データベース化作業を試作し作業の完成を目指している。日本語史基礎資料としての中世仏教者真蹟遺文の総合語彙索引の作成を行ってきた。文学作品が後世の転写等の問題を含んでいるのに対し、仏教者遺文は真蹟が伝来し、日本語史研究の第一等資料である。1、各文献の真蹟を、原本調査、並びに複製本を底本にして、語彙総索引を作成した。索引の基準を統一するために、単独で品詞分解、語彙分類、語彙配列を行ってきた。佛教者遺文は複雑な表記があるため、多く手書き原稿で作成した。2、各文献の語彙索引を総合してデータベース化する。完成した各文献の総索引を逐次入力していった。この入力作業には期間内で単独では不可能であるため、助力を学生に求めた。3、作成した、掲載中の中世仏教者遺文の各文献を示す。(1)親鷺(鎌倉初中期)『西方指南抄』六帖、専修寺蔵、『一念多念文意』一帖、東本願寺蔵、『尊号真像銘文』(広本)専修寺蔵、(略本)法雲寺蔵、『三帖和讃』浄土・浄土高僧・正像末法和讃(本文)(左注)、専修寺蔵、『唯信抄文意』(正月十一日本)(正月二十七日本)、専修寺蔵、『自筆書状』十二通、諸寺蔵、(2)聖覚(鎌倉初期)『唯信抄』一帖、専修寺蔵、平仮名本、西本願寺蔵、(3)法然(鎌倉初期)『自筆起請文・仮名書状』五通、清涼寺蔵、興善寺蔵、(4)証空(鎌倉初期)『自筆書状』二通、(5)熊谷次郎直實(鎌倉初期)『誓願状』二通、(6)恵信尼(鎌倉中期)『自筆書状』十通、西本願寺蔵(7)一遍(鎌倉中期)『一遍上人語録和歌』一帖、文化八年版本、(8)日蓮(鎌倉中期)『兵衛志殿御返事』一通、『千日尼御返事』一通、(9)覚如(鎌倉後期)『口伝抄』二帖、龍谷大学蔵、(10)蓮如(室町時代)『自筆御文』五一通、各寺蔵、『自筆紀行文』二通、『和歌』、
放射線治療効果予測のための実用的な腫瘍の低酸素細胞分画測定法の開発

『はじめに』放射線治療前に、ポーラログラフィック酸素センサー(インターメディカル社)を用いて、頭頸部癌や子宮頸部癌の腫瘍内の酸素濃度の測定を行い、腫瘍の低酸素分画との相関を検討した所、腫瘍の低酸素状態の推定にmicrovessel density(MVD)の測定が有効であることが判明した。そこで、舌癌で低線量率組織内照射を施行された症例を用いて、MVDと臨床上の放射線治療効果との関連を検討した。『目的』低線量率組織内照射は、舌癌の治療において、特に早期癌では、極めて有効である。しかし、その有効性の生物学的機序については、解明されていない。そこで、癌組織のmicrovessel density(MVD)とKi-67 indexを測定し、局所制御率との関連を検討する。『方法』1987年から1999年までの間にセシウム137針を用いた低線量率組織内照射を施行された舌癌T1T3、60例を対象とした。照射線量は、6075Gy(67日間)で、一部のT3症例では、組織内照射前に外照射30Gyを施行した。MVDとKi-67 indexは、治療前の生検標本を、それぞれ、抗CD34抗体、抗MIB-1抗体を用いた免疫組織染色にて求めた。MVDは、血管増生が最も著明な部位で、抗CD34抗体により染色された血管数を数えて求めた。Ki-67 indexは、抗MIB-1抗体で染色された細胞の全体の細胞数の比率で求めた。他の臨床及び病理因子と共に、MVDとKi-67 indexと局所制御率との関連を解析した。『結果』単変量解析、多変量解析いずれでも、T stageは局所制御率と有意に相関しており、5年局所制御率は、T1で100%、T2で76.4%、T3で26.9%であった。単変量解析において、Ki-67 indexが低いほうが局所制御率が良好な傾向がみられた。MVDと局所制御率は、全く相関がみられなかった。『考察』Ki-67 index、MVDと局所制御率の関係は、外照射で治療された喉頭癌や食道癌の結果と全く異なっていた。これらより、低線量率組織内照射は、休止期の細胞や低酸素状態の細胞に対して、外照射に比べ、有効である可能性が示唆された。1.腫瘍内酸素分圧の測定及び生検標本の免疫組織染色現在まで、70例の頭頸部癌や子富頸部癌患者の腫瘍内の酸素濃度の測定を、放射線治療前に、ポーラログラフィック酸素センサーを用いて、施行した。酸素分圧測定後に、測定部位より、生検をおこない、また、血液を採取した。70例の腫瘍の酸素分圧は、0mmHgから70mmHgの間に分布していた。必ずしも、腫瘍の大きさと低酸素の程度は相関みられなかった。

生検で得られた腫瘍組織を用いて、ABC法にて免疫組織染色を行い、ORP(oxygen regulated proteins)150、ORP80、ORP100、HIF1(hypoxia-inducible factor 1)、エリスロポイエチン、VEGF(vasculuar endothelial growth factor)、endothelin-1等の低酸素誘導蛋白質の発現をみ、酸素センサーで測定した各腫瘍の低酸素分画と各種の低酸素誘導蛋白質の発現との関係を解析し、その発現が、低酸素分圧と良好な相関を持つ蛋白質を選定する予定である。今年度は、この他に、以下を予定している。2.低酸素誘導蛋白質の血中濃度測定法の確立また。1で得られた血清より、1で挙げた蛋白質の血中濃度を測定し、血中の低酸素誘導蛋白質のうち、酸素センサーで測定した腫瘍の低酸素状態と相関する蛋白質を選定する。特に、最近、頭頸部腫瘍の低酸素状態と良好に相関すると報告されているオステオポンチンについて、検討する。1.腫瘍内酸素分圧の測定及び生検標本の免疫組織染色70例の頭頸部癌や子宮頸部癌患者の腫瘍内の酸素還度の測定を、放射線治療前に、ポーラログラフィック酸素センサーを用いて、施行した。酸素分圧測定後に、測定部位より、生検をおこなった。生検で得られた腫瘍組織を用いて、免疫組織染色を行なった所、癌組織のmicrovessel density(MVD)が低酸素分圧と良好な相関を持つことが認められた。従って、MVDを用いて、以下の研究を施行した。「目的」低線量率組織内照射は、舌癌の治療において、極めて有効である。しかし,その有効性の生物学的機序については、解明されていない。そこで、癌組織のMVDとKi-67 indexを測定し、局所制御率との関連を検討する。「方法」1987年から1999年までの間にセシウム137針を用いた低線量率組織内照射を施行された舌癌T1T3、60例を対象とした。MVDとKi-67 indexは、治療前の生検標本を、それぞれ、抗CD34抗体、抗MIB-1抗体を用いた免疫組織染色にて求めた。MVDは、抗CD34抗体により染色された血管数を数えて求めた。Ki-67 indexは、抗MIB-1抗体で染色された細胞の全体の細胞数の比率で求めた。「結果」単変量解析、多変量解析いずれでも、T stageは局所制御率と有意に相関しており、5年局所制御率は、T1で100%、T2で76.4%、T3で26.9%であった。単変量解析において、Ki-67 indexが低いほうが局所制御率が良好な傾向がみられた。MVDと局所制御率は、全く相関がみられなかった。「考察」Ki-67 index、MVDと局所制御率の関係は、外照射で治療された喉頭癌や食道癌の結果と全く異なっていた。これらより、低線量率組織内照射は、休止期の細胞や低酸素状態の細胞に対して、外照射に比べ有効である可能性が示唆された。
エキノマイシン生合成遺伝子群を用いた非リボソーム依存型ペプチド合成酵素の機能解析

非リボソーム依存型ペプチド合成酵素(NRPS)は、エキノマイシン、サフラマイシンなど多様な構造を有する二次代謝産物の生合成を担う。前年度私は、サフラマイシンNRPSの一つ、SfmC(テトラドメイン、C-A-PCP-R)が単独で一挙に5環性テトラヒドロイソキノリン骨格を組み上げることを発見した。本年度は、SfmCの詳細な反応機構を調べるために、様々な基質アナログ、および、SfmCのドメイン欠損変異体を用いて反応解析を行った。1.アシル鎖の長さが異なる種々のAcyl-L-Ala-Gly-S-CoAを合成し、SfmC反応を調べた。炭素鎖16と14のアシル鎖を持つ基質では変換生成物が得られたが、炭素鎖12以下のアナログでは、収率が極端に低下した。2.反応効率向上を目指し、中間体Acyl-L-Ala-glycinalを化学合成し、これを用いて酵素反応を検討した。結果、CoAエステルを基質とした場合よりも、10倍以上反応効率が向上した。また、炭素鎖12のラウリル酸を結合したCoAエステルでは、反応生成物の収率は極めて低かったが、アルデヒド体Lauroyl-L-Ala-glycinalを用いると、炭素鎖が長いアナログと同程度の活性を示した。このことから、最初のチオエステルの還元反応において、アシル鎖の長さが特に重要な影響を与えることがわかった。3.Pictet-Spengler反応を触媒するドメインを特定するために、二種の変異体、C-A-PCP、もしくは、A-PCP-R tridomainを作成し、反応を解析した。得られた結果から、R-domainがチオエステルの還元を、C-domainがPictet-Spengler反応を触媒することを明らかにした。今回発見した知見は、NRPSの触媒機能の多才性を示すものであり、本研究分野において革新的な成果になると信じる。また、今回開発した手法は、化学-酵素ハイブリッドプロセスによる様々なサフラマイシンアナログの創出が可能であることを提示しており、酵素による有用物質(臨床用抗がん剤エクチナサイジンの前駆体など)の生産の可能性を大きく向上させると期待している。エキノマイシンのペプチド骨格を構築する非リボソーム依存型合成酵素のC末端領域に存在するチオエステラーゼドメインを部分的に発現させ、鎖状基質アナログのマクロラクトン化を検討した。末端をチオエステルとした基質アナログを固相合成し、チオエステラーゼに作用させると低収率ながら目的の環化体が得られた。しかし、加水分解が競争し相当量のカルボン酸が副生した。そこで、環化生成物のDNAへの結合能に着目し、DNAを反応系内に添加して環化生成物を捕捉することで、加水分解を抑制しようと考えた。実際、DNA存在下では、環化生成物の収率が大幅に(3.5倍)向上し、加水分解を5%以下に抑えることができた。更に、種々のアミノ酸や芳香環を導入した基質アナログ群を合成し、酵素的マクロラクトン化を検討した。DNA添加により、加水分解産物の生成が抑制され、環化効率が向上する基質アナログを見出した。また、生成したマクロラクトンが、既知化合物TANDEMと同程度の親和性でDNAに結合することを確認できた。一方、エキノマイシンと同様にNRPSにより構築されるテトラヒドロイソキノリン系抗腫瘍物質SF-1739生合成に関与する遺伝子クラスターの取得を試みた。スクリーニングの結果、全長54kb、28個の遺伝子より構成されるSF-1739生合成遺伝子クラスターの単離に成功した。また、その中に見出された非ヘム鉄性酸化酵素(Cyal6)の機能解析を行なった。酵素反応の結果、Cyal6は、L-アルギニンを基質とし、生成物としてトランス-4,5-ジヒドロ-L-アルギニンを与えることを明らかとした。なお、新規化合物である本生成物は、SF-1739HP生合成中間体として合理的に推定できるものであり、SF-1739HP生合成機構解明に向けて大きく前進することができた。エキノマイシンやSF-1739HPの非リボソーム依存性ペプチド合成酵素(NRPS)を用いた物質生産を目指し、研究に取り組んだ。まず、前年度から取り組んだエキノマイシンチオエステラーゼを用いた酵素的マクロラクトン化の研究成果をChemistry and Biology誌に掲載することができた。一方、前年度の研究を継続し、テトラヒドロイソキノリン化合物SF-1739HPの生合成研究に取り組んだ。まず、デヒドロ-L-アルギニンを生成する酸化酵素Cya16の機能解析を完了した。これにより、SF-1739HPの骨格は、グリコール酸、チロシン誘導体、デヒドロ-L-アルギニンより生合成されることが推定できた。次いで、必要となるNRPSの大量発現を行い、本骨格の酵素合成を検討したが、現在まで成功に至っていない。そこで、この目的を達成するため、SF-1739HPに類似した化合物であるサフラマイシンに着目した。サフラマイシン類の生合成遺伝子群は、1995年に初めて同定されたが、現在まで、テトラヒドロイソキノリン骨格の酵素合成は報告されていない。私は、これまでの実験から得た知見を基に鎖状ペプチドアナログとチロシン誘導体を独自に設計、化学合成した。これらに、非リボソーム依存型ペプチド合成酵素であるSfmCを作用させることで、一挙に5環性のテトラヒドロイソキノリン骨格が構築されることを見出した。

これにより、長年不明であった本骨格の酵素合成を世界で初めて実証することに成功した。一つの酵素が複数の単純な基質から一挙に複雑な骨格を作り上げることは、大変興味深いことであり、本結果は、生合成研究分野において、酵素の新しい可能性を提供するものであると期待する。非リボソーム依存型ペプチド合成酵素(NRPS)は、エキノマイシン、サフラマイシンなど多様な構造を有する二次代謝産物の生合成を担う。前年度私は、サフラマイシンNRPSの一つ、SfmC(テトラドメイン、C-A-PCP-R)が単独で一挙に5環性テトラヒドロイソキノリン骨格を組み上げることを発見した。本年度は、SfmCの詳細な反応機構を調べるために、様々な基質アナログ、および、SfmCのドメイン欠損変異体を用いて反応解析を行った。1.アシル鎖の長さが異なる種々のAcyl-L-Ala-Gly-S-CoAを合成し、SfmC反応を調べた。炭素鎖16と14のアシル鎖を持つ基質では変換生成物が得られたが、炭素鎖12以下のアナログでは、収率が極端に低下した。2.反応効率向上を目指し、中間体Acyl-L-Ala-glycinalを化学合成し、これを用いて酵素反応を検討した。結果、CoAエステルを基質とした場合よりも、10倍以上反応効率が向上した。また、炭素鎖12のラウリル酸を結合したCoAエステルでは、反応生成物の収率は極めて低かったが、アルデヒド体Lauroyl-L-Ala-glycinalを用いると、炭素鎖が長いアナログと同程度の活性を示した。このことから、最初のチオエステルの還元反応において、アシル鎖の長さが特に重要な影響を与えることがわかった。3.Pictet-Spengler反応を触媒するドメインを特定するために、二種の変異体、C-A-PCP、もしくは、A-PCP-R tridomainを作成し、反応を解析した。得られた結果から、R-domainがチオエステルの還元を、C-domainがPictet-Spengler反応を触媒することを明らかにした。今回発見した知見は、NRPSの触媒機能の多才性を示すものであり、本研究分野において革新的な成果になると信じる。また、今回開発した手法は、化学-酵素ハイブリッドプロセスによる様々なサフラマイシンアナログの創出が可能であることを提示しており、酵素による有用物質(臨床用抗がん剤エクチナサイジンの前駆体など)の生産の可能性を大きく向上させると期待している。
すばるFMOSの大規模分光サーベイによるバリオン振動探査

宇宙膨張を加速するダークエネルギーの謎は、現代物理学および天文学上の最大の難問である。超広視野の大規模銀河分光サーベイによるバリオン振動測定は、宇宙物理的な系統誤差が少ないダークエネルギーへのアプローチとして世界的に期待されている。銀河の密度揺らぎのパワースペクトルに現れるバリオン振動スケールは基礎物理過程がよく理解されているので、このスケールを「ものさし」として使うことで、宇宙の幾何学的構造を精密に測定することができる。FMOSを用いてバリオン振動探査を行おうという計画が日英豪のFMOSチームを中心に検討されている(FastSound計画)。平成21年度においては、具体的なサーベイデザインの検討がさらに進んだ。最も大きな進展は、FMOSの試験観測のデータがついに出てきて、実際の感度をもとにターゲット選択を議論できるようになったことである。実際にSXDSやCFHTLSの領域を観測し、サーベイに必要なターゲット選択の手法が実際に有効であることを示すデータが出てきつつある。また、6月のイギリス、オックスフォードでの日英ミーティングでは、バリオン震動の他、赤方偏移空間歪曲を用いた重力理論の制限によるダークエネルギー研究も重要なサイエンス目標として認知された。22年夏と予想される戦略枠プロポーザルの作成に向けて、さらにサーベイデザインの精度を高めてゆく。そのための、様々な系統誤差の検討を行いつつある。たとえば、撮像サーベイにおける測光精度や、FMOSの視野形状などに起因するサーベイ領域の非一様性、FMOSにおけるOH夜光除去に伴う特定の赤方偏移の銀河の欠損などが与える影響を、現実的なシミュレーションなどをもちいて正確に見積もり始めた。宇宙膨張を加速するダークエネルギーの謎は、現代理学および天学上の最大の難問でる。銀河の密度揺らぎのパワースペクトルか現れるバリオン振動スケールは基礎物理過程がよく理解されているので、このスケールを「ものさし」として使うことで、宇宙の幾何学的構造を精密か測定することができる。撮像サーベイのデータから銀河を選択し、実際か分光して銀河の赤方偏移を決定するプロセスを確認し、一般的な成果として論文にまとめ、ジャーナルに投稿した。すでにこれまでの検討から、CFHT-LSデータが、深さと広さ、そして5バンドの測光データの存在などから、撮像データとして有力視されている。このCFHT-LSの銀河を実際にFMOSで観測することで、いくつかの選択法をテストし、成功率の高い方法を確定した。同時に、撮像データセットとして、CFHT-LSが十分かどうかを確認した。CFHT-LSを想定し、詳細なサーベイシミュレーションを行い、予想されるダークエネルギーへの制限精度を観測時間の関数として正確に見積もった。また、様々な系統誤差の検討を行いつつある。たとえば、撮像サーベイにおける測光精度や、FMOSの視野形状などか起因するサーベイ領域の非一様性、FMOSにおけるOH夜光除去に伴う特定の赤方偏移の銀河の欠損などが与える影響を、現実的なシミュレーションなどをもちいて正確に見積もり始めた。また、FMOS試験観測に参加し、実際の観測プロセスを確認する一方、バリオン振動探査計画のチームミーティングをハワイで開催し、有益な議論ができた。
タンパク質コロナと生体分子の相互作用の解明

生体内に取り込まれたナノ粒子はタンパク質と相互作用して「タンパク質コロナ」と呼ばれる複合体構造を形成することが知られている。安全なナノ粒子の開発にはタンパク質コロナの物性の解明が必須である。当該研究ではカーボンナノチューブおよび荷電性のホモポリペプチドをそれぞれナノ粒子とタンパク質のモデルとして利用し、タンパク質コロナの形成に関する基礎知見を得た。特にポリアルギニンがカーボンナノチューブへ強く結合するという知見は、ナノカーボン材料のタンパク質コロナ形成におけるアルギニン残基の重要性を示唆するものであり、芳香環を有するナノ粒子全般におけるタンパク質コロナの形成機構の理解にもつながる成果となった。材料開発において安全性評価が後手に回ることは、材料開発に対する社会的懸念を生む要因となる。ナノ粒子の応用開発も例外ではない。現在、ナノ粒子の安全性を評価する細胞・動物実験が進められているが、その根本原理である分子機構は未解明である。分子機構の解明は、既存のナノ粒子の安全性の理解だけでなく、新規ナノ粒子の安全開発につながる重要な課題である。生体内に取り込まれたナノ粒子はタンパク質と相互作用して「タンパク質コロナ」と呼ばれる構造を形成することが知られている。本研究ではホモポリペプチドとカーボンナノチューブをそれぞれタンパク質とナノ粒子のモデルとして用いることで、タンパク質コロナの形成に関する基礎知見を得た。親水性のホモポリペプチドであるポリアルギニンおよびポリリシンを用いて、溶液中でのカーボンナノチューブの分散性を調べたところ、ポリアルギニン溶液中の分散性の方がポリリシン溶液中に比べて高く、カーボンナノチューブの強い蛍光が観測された。分子動力学計算で各ホモポリペプチドとカーボンナノチューブの結合力を調べたところ、ポリアルギニンとカーボンナノチューブの結合力がポリリシンよりも大きいことが示された。さらに、ポリアルギニンの側鎖末端のグアニジニウム基がカーボンナノチューブの表面と相互作用することが示され、ポリアルギニンに特有な高い結合力は、アルギニンのグアニジニウム基とカーボンナノチューブの疎水性相互作用、ファンデルワールス力、π-π相互作用に起因することが示唆された。当結果はタンパク質の表面の化学構造がカーボンナノチューブとの相互作用に影響を及ぼすことを示している。疎水性のカーボンナノチューブの表面に親水性のホモポリペプチドが結合することは、カーボンナノチューブなどのナノ粒子に特有な現象であると考えられ、タンパク質コロナの形成機構を理解するための重要な知見となった。ナノ粒子の生体安全性を理解するためには、ナノ粒子とタンパク質の複合体(タンパク質コロナ)の形成メカニズムとその生体内動態の理解が必須である。当該年度では、ナノ粒子とタンパク質複合体の形成メカニズム、特にナノ粒子とタンパク質の相互作用の物理化学的性質について調査した。ホモポリペプチドとカーボンナノチューブをそれぞれタンパク質とナノ粒子のモデルとして用いることで、タンパク質とナノ粒子の相互作用に関する基礎知見を得た。親水性のホモポリペプチドであるポリアルギニン・ポリリシン・ポリグルタミン酸とカーボンナノチューブの相互作用を調べたところ、その相互作用はポリアルギニン>ポリリシン>ポリグルタミン酸の順で小さくなることが明らかになった。分子動力学計算で各ホモポリペプチドとカーボンナノチューブの結合力を調べたところ、結合力は実験で得られた上記の順と等しいことが示された。さらに、当計算結果から、ポリアルギニンとポリリシンは側鎖を介してカーボンナノチューブと相互作用する一方、ポリグルタミン酸は主として主鎖を介してカーボンナノチューブと相互作用することが明らかになった。このように相互作用する際のコンフォメーションの違いが、結合力の違いを生み出している。当結果はタンパク質の表面の化学構造がカーボンナノチューブとの結合力に影響を及ぼすことを示している。疎水性のカーボンナノチューブの表面に親水性のホモポリペプチド(ポリアルギニンとポリリシン)も結合することは、カーボンナノチューブというナノサイズの表面に特有な現象であると考えられ、タンパク質コロナの形成機構を理解する上で興味深い。本研究ではタンパク質コロナと生体分子の相互作用を理解することを目的としており、本年度は特にタンパク質コロナの形成メカニズムやその安定性の理解を目標とした。当初、様々なタンパク質を用いて網羅的に調べる予定であったが、実験の煩雑さと得られる結果の複雑さを考慮して、よりシンプルな化学構造のホモポリペプチドを用いることの優位性に着眼した。当判断は、当初の実験計画とは多少異なるものの、研究の目的に対する進捗を考慮すれば、下記の通りむしろ適切なものであった。1.タンパク質コロナの高効率作製:チップ式超音波装置と超遠心分離機を組み合わせることによって、ホモポリペプチドとカーボンナノチューブの複合体の作製を達成した。2.生体模倣系でのタンパク質コロナの立体構造と安定性:ホモポリペプチドの濃度が高くなるにつれて必ずしもカーボンナノチューブの分散性が高まるわけではないことを明らかにした。この結果は、細胞内で見られるいわゆるクラウダー効果を反映していると考えられる。

3.ナノ粒子表面構造の変化によるタンパク質コロナの物性変化:ホモポリペプチドによるカーボンナノチューブ(半径約1nm)の分散性には半径に対する依存性がないことを明らかにした。分子動力学計算を利用することで、分子構造レベルでの相互作用の理解が達成された。本年度の結果からタンパク質のアミノ酸側鎖とカーボンナノチューブの特徴的な相互作用によってタンパク質コロナが形成されることが明らかになった。今後はタンパク質コロナと様々な生体分子との相互作用を調べることにより、生体内でのタンパク質コロナの動態の理解を目指す。当知見によって、ナノ粒子の安全性・有害性を分子レベルからのボトムアップで理解することが可能になる。さらに必要に応じて、分子動力学計算を行う。当初の計画では多数のタンパク質を用いた網羅的な実験を想定したが、上記のように本年度の実験計画の修正によって、代わりにホモポリペプチドを使用した。それに伴ってFT-IR用減衰全反射装置の購入やタンパク質などの消耗品の一部の購入を延期した。代わって、次年度はそれらの研究費を本年度の研究の遂行に必要な設備費と消耗品に主として当てる。
中国積石山地域の消滅の危機に瀕した言語、保安語の調査研究

本研究の目的は、中国の甘粛省臨夏回族自治州積石山保安族東郷族撤拉族自治県大河家鎮甘河灘村と大〓村、劉集郷高李村と肖家村、劉溝郷斜套村等に居住している保安族16,505人(2000年)が話しているモンゴル系の言語、保安語積石山方言を危機言語の観点からフィールド調査を行ったうえで、その調査結果を公刊することにある。それぞれの村で話されている保安語は村の名前にちなみ、甘河灘保安語、大〓保安語、高李保安語、肖家保安語、斜套保安語と呼ばれている。しかし、これらは、言語資料が乏しいことに加え、近年若年層を中心に漢語化が著しい。そのため、遅かれ早かれ消滅の可能性がある言語として、今、詳細な調査が求められている。本年度おこなった主な研究は、下記のとおりである。1.8月に現地調査をおこない、大〓保安語の基礎語彙と民話、甘河灘保安語と肖家保安語と斜套保安語村の基礎語彙と基礎会話を採集。2.大〓保安語の民話など3編が収めた『大〓保安語のテキスト/大〓保安活〓料』の公刊。3.音声資料<<大〓保安話語材>>(CD版)の作成。4.<<大〓保安活〓材料-変化后的"toligaga">>の公刊。5.首都師範大学第二届外国語言学及応用言語学国際検討会(於北京首都師範大学2004年9月17・18日)において、『保安語への取り組み-私の体験から-』という講演発表。6.現地調査からわかったことを一般向けに紹介した「保安族を訪ねて」の連載。本研究の目的は、主として中国の甘粛省臨夏回族自治州積石山保安族東郷族撤拉族自治県大河家鎮大〓村、甘河灘村や劉集郷高李村に居住している保安族12,212人(1990年)が話しているモンゴル系の言語、保安語積石山方言を危機言語の観点からフィールド調査を行い、その調査結果を公刊することにある。この保安語積石山方言は、言語資料が乏しいことに加え、近年若年層を中心に漢語化が著しく、今すぐに消滅するという危険性はないが、遅かれ早かれ消滅の可能性がある言語である。そのため、詳細な調査が求められている。本年度は、平成12年8月と平成14年8月におこなった現地調査に基づき、『大〓保安語と甘河灘保安語のテキスト』を公刊した。ここには、今までTodaeve, B.X(1964)の民話1編などを除けば無かった保安語のテキストとして、大〓保安語のテキスト4編と甘河灘保安語のテキスト1編が国際音声字母(IPA)で表され、形態分析とグロスを施したうえで日本語訳とともに収録されている。また、論文「保安語積石山方言:下位方言と帰属意識-話者の視点からの考察-」では、日常頻繁に使われるいくつかの語が話者がどの村に属しているのかを示す標識としての機能を持っていることを聞き取り調査を通じて明らかにしている。平成14年8月の調査では、そのほかに保安語の文字策定の一環として、筆者が大〓保安語に基づき中国のピンイン式ローマ字を用い作成した保安語の文字を現地でのし様が可能か否かの模索をおこなっている。また、今まで調査がおこなわれていなかった高李保安語についても調査をおこなっている。本研究の目的は、中国の甘粛省臨夏回族自治州積石山保安族東郷族撤拉族自治県大河家鎮甘河灘村、大〓村、高李村等に居住している保安族16,505人(2000年)が話しているモンゴル系の言語、保安語積石山方言を危機言語の観点からフィールド調査を行ったうえで、その調査結果を公刊することにある。この保安語積石山方言は、村の名前にしたがい甘河灘保安語、大〓保安語、高李保安語という下位方言に分けられるが、言語資料が乏しいことに加え、近年若年層を中心に漢語化が著しい。本年度は、新たに収集した資料とこれまでに収集しておきながら未整理であった資料にしたがい、次の4つのことをおこなった。1.「大〓保安語の言語資料」の公刊。大〓保安語の基礎語彙850語と基礎会話を収めている。2.「高李保安語の現状」の報告。これまで誰も調査しておらず、状況がまったくわからなかった高李保安語の現状を整理し、平成15年度日本モンゴル学会秋季大会において報告した。3.「保安族の老爺から採集した話-現代化したトリガガ-」の公刊。採集した保安族の代表的な民話「トリガガ」が、従来知られている「トリガガ」からどのように変容しているのかを論じた。4.「保安族を訪ねて」の連載。現地調査からわかったことを一般向けに書いたものである。