hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高山植物を主とした植物DNA地理学の展開

本研究は高山植物を対象に、起源・伝播経路・分布パターンの成立過程といった生物地理学的課題をDNA情報を導入することによって解明し、DNA地理学に先鞭をつけることを目的としている。この種の研究では対象植物が常に大量に入手できるとは限らず、したがって少量の材料から効率よくDNAを抽出、増殖させる方法が求められる。まず、このような実験方法について研究、実施した。次いで、日本列島をはじめ世界各地から収集した高山植物、42種210試料について葉緑体DNAのtrnLとtrnFの遺伝子間領域、3種34試料についてtrnL遺伝子のイントロン領域の塩基配列を解析したところ、ハクサンチドリでは全分布域にわたって多型は認められず、アキノキリンソウ・コケモモ・ヤナギランなどの植物は、多型はあるものの地理的なまとまりは認められず、イワオウギ・イワツメクサ・ゴゼンタチバナ・ミヤマアズマギクなどでは北海道と本州の集団間にも多型はなく、また、ヒメクワガタやミヤマゼンコなどでは同一種内の変種間にも多型はなく、エゾウスユキソウとハヤチネウスユキソウでは異種間であっても多型は認められず、葉緑体DNAの変異の現れ方は分類群によりさまざまであることが判明した。一方、エゾコザクラ群およびヨツバシオガマ群においてはそれぞれ6および11の葉緑体DNA型が検出され、塩基配列の違いによって最節約樹を作成したところ、ともに広い分布範囲をもつ北方型、中部山岳群に細かく地域的に分化した南方型に大きくわけられるなど、生物地理学的に意義深い情報をうることができた。また、谷川岳でキタゴヨウマツ・ハッコウダゴヨウ・ハイマツの3集団間での遺伝子の動きを解析したところ、花粉はハイマツからキタゴヨウに供給されて浸透交雑が起こり、ハッコウダゴヨウが形成されることを見出した。本研究は隔離効果が強くDNAの種内多型が期待される高山植物を対象に、その起源、伝播経路、分布パターンの成立過程といった生物地理学的課題をDNA情報を導入することによって解明し、DNA植物地理学に先鞭をつけることを目体としている。本年度は既に収集ずみの材料に加え、新たに国内で10数種の材料を収集するとともに、国外の試料については英国王立Kew植物園およびEdinburgh植物園から分譲を受けた。初年度は入手した材料から全DNAを抽出し、17種について葉緑体DNAのtrnLおよびtrnFの遺伝子間領域199428塩基対をPCR法によって増幅、1集団1サンプルにつき塩基配列を決定した。その結果、アキノキリンソウ(16集団)・イワギキョウ(6集団)・エゾコザクラ(14集団)・オオバノヨツバムグラ(3集団)・ガンコウラン(3集団)・キバナコマノツメ(2集団)クロユリ(6集団)・コケモモ(13集団)・トウヤクリンドウ(10集団)・ミツバオウレン(2集団)・モニジカラマツ(2集団)・ヤナギラン(11集団)・ヤマハハコ(4集団)は多かれ少かれ集団間多型を検出できたのに対し、ゴゼンタチバナ(4集団)・コミヤマカタバミ(2集団)・ハクサンチドリ(14集団)・ミヤマキンポウゲ(2集団)では多型は認められなかった。なかでも、エゾコザクラは種内に7塩基対の塩基置換と2個の挿入/欠失が検出され、6種の葉緑体ゲノムが識別され、これらのゲノムの分布が一定の地理的傾向を示したことから、本種が北方から南下し、日本列島各地で順次に分化したことが示唆された。次に、核遺伝子(ITS)の塩基配列を調べたところ、9個のゲノム型が検出された。葉緑体DNAと核DNAの塩基配列から得られた2つの地域系統樹の間には矛盾はなかった。

本研究は隔離効果が強くDNAの種内多型が期待される高山植物を対象に、起源・伝播経路・分布パターンの成立過程といった生物地理学的課題をDNA情報を導入することによって解明し、DNA地理学に先鞭をつけることを目的としている。本年度は昨年度のエゾコザクラによる成果に続き、42種210試料について葉緑体DNAのtrnLとtrnFの遺伝子間領域、3種34試料についてtrnL遺伝子のイントロン領域の塩基配列を解析したところ、アキノキリンソウ・コケモモ・ヤナギランなどの植物は、多型はあるものの地理的なまとまりは認められず、イワオウギ・イワツメクサ・ミヤマアズマギクなどでは北海道と本州の集団間にも多型はなく、また、ヒメクワガタやミヤマゼンコなどでは同一種内の変種間にも多型はなく、エゾウスユキソウとハヤチネウスユキソウでは異種間であっても多型は認められず、葉緑体DNAの変異の現れ方分類群によりさまざまであることが判明した。とこれが、ヨツバシオガマ群においては11の葉緑体DNAの多型が検出され、塩基配列の違いによって最節約樹を作成したところ、ヨツバシオガマは全体として単系統を示すこと、これらは東北・北海道群と中部山岳群に大きく2分されること、東北・北海道群は多分岐ではあるが6群に分けられること、中部山岳群は日本海側山岳、南アルプス・八ヶ岳、白山、御岳、木曽駒ヶ岳の各群に細分され、地域ごとにまとまりのある分化をしていることなど生物地理学的に意義深い情報をうることができた。一方、この種の研究では対象植物が常に大量に入手できるとは限らず、少量の材料から効率よくDNAを抽出、増殖させる方法が求められる。このような実験方法についても研究、実施した。
アルコール摂取量及び期間とチトクロムP4502E1誘導の関係

チトクロムP4502E1(CYP2E1)は,ミクロソームエタノール代謝系に含まれ,飲酒歴が長期にわたる場合やアルコールを大量に摂取した際に誘導されてくることが知られている.しかし,どの程度誘導されてくるかを具体的に評価した報告はほとんど見当たらなかった.そこで,本研究では,CYP2E1誘導の程度を,CYP2E1mRNAの発現量を定量することにより評価する方法を確立し,それを用いて,CYP2E1誘導の程度とアルコールに対する感受性の個人差との相関を検討することを目的とした.ヒトリンパ球に発現しているCYP2E1mRNAは,RT-PCR法により確認可能となった(定量的RT-PCR法)ので,この方法を用いて,飲酒習慣のある男性並びに日常ほとんど飲酒しない男性を対象として,末梢血よりリンパ球を採取し,CYP2E1mRNAの発現量を比較したところ,両者に差異は認められなかった.また,被験者をALDH2の遺伝子型により分類し,末梢血を採取後,直ちに飲酒時のアルコール濃度となるようアルコールを添加し,37°Cで一定時間インキュベートした.その後,同様の方法で,リンパ球を採取し,mRNAを抽出,定量的RT-PCR法を用いてCYP2E1mRNAの発現量を測定したところ,どの群においても差異は認められなかった.すなわち,これまでのところでは,CYP2E1mRNAの発現量は,飲酒習慣の有無,あるいはアルデヒド代謝活性の強弱により変化しないということが示唆された.本研究に付随して,健康成人485名のアルコール代謝酵素の遺伝子型の検出を行い,地域別のアルコール消費量と各酵素の遺伝子型の出現頻度の関係について調べたところ,ALDH2*1の遺伝子の出現頻度のみが,日本列島のほぼ真ん中に位置する近畿,東海,北陸地方出身者において最も低いことが判明した.しかし,地域別アルコール消費量とALDH2*1遺伝子頻度に明らかな相関関係は認められなかった.チトクロムP4502E1(CYP2E1)は,ミクロソームエタノール代謝系に含まれ,飲酒歴が長期にわたる場合やアルコールを大量に摂取した際に誘導されてくることが知られている.しかし,どの程度誘導されてくるかを具体的に評価した報告はほとんど見当たらなかった.そこで,本研究では,CYP2E1誘導の程度を,CYP2E1mRNAの発現量を定量することにより評価する方法を確立し,それを用いて,CYP2E1誘導の程度とアルコールに対する感受性の個人差との相関を検討することを目的とした.ヒトリンパ球に発現しているCYP2E1mRNAは,RT-PCR法により確認可能となった(定量的RT-PCR法)ので,この方法を用いて,飲酒習慣のある男性並びに日常ほとんど飲酒しない男性を対象として,末梢血よりリンパ球を採取し,CYP2E1mRNAの発現量を比較したところ,両者に差異は認められなかった.また,被験者をALDH2の遺伝子型により分類し,末梢血を採取後,直ちに飲酒時のアルコール濃度となるようアルコールを添加し,37°Cで一定時間インキュベートした.その後,同様の方法で,リンパ球を採取し,mRNAを抽出,定量的RT-PCR法を用いてCYP2E1mRNAの発現量を測定したところ,どの群においても差異は認められなかった.すなわち,これまでのところでは,CYP2E1mRNAの発現量は,飲酒習慣の有無,あるいはアルデヒド代謝活性の強弱により変化しないということが示唆された.本研究に付随して,健康成人485名のアルコール代謝酵素の遺伝子型の検出を行い,地域別のアルコール消費量と各酵素の遺伝子型の出現頻度の関係について調べたところ,ALDH2*1の遺伝子の出現頻度のみが,日本列島のほぼ真ん中に位置する近畿,東海,北陸地方出身者において最も低いことが判明した.しかし,地域別アルコール消費量とALDH2*1遺伝子頻度に明らかな相関関係は認められなかった.アルコール感受性に個人差のあることは,これまでALDH2活性の強弱によってのみ説明されてきた.すなわち,活性の弱いタイプのヒトは血中アセトアルデヒド濃度が高くなるため不快症状を呈するというものである.しかし,ALDH2*1/2のheterozygoteは飲酒回数を重ねるうちにアルコールに対する感受性が低くなり,これはCYP2E1が誘導されてくるためであると説明されている.本研究の目的は,チトクロムP-4502El(CYP2E1)誘導の程度を,CYP2E1mRNAの発現量を定量することにより評価する方法を確立し,それを用いてアルコール感受性の個人差とCYP2E1発現量との相関を検討することにある.これまでに,プライマーのデザインや反応条件等を種々検討し,ヒトリンパ球に発現しているCYP2ElmRNAをRT-PCR法を用いて検出する方法を確立した.すなわち,末梢血リンパ球からRNAを抽出し,RT-PCRを行い,CYP2E1mRNAの発現を確認した.またこれと並行して,健康成人約250名のアルコール代謝関連酵素類(CYP2E1,ADH2,ADH3及びALDH2)の遺伝子型を検出してきており,現在さらに継続して例数を増やしている.

今後,培養ヒト末梢リンパ球を用いたin vitloの実験系として以下の実験を計画している.すなわち,リンパ球の供与者を3群(ALDH2*1/1,ALDH2*1/2及びALDH2*2/2)に分け,各々の群の末梢リンパ球を採取・培養し,飲酒時の血中アルコール濃度に準じて,数段階のアルコール濃度となるよう,アルコールを培養液中に負荷した後,経時的にmRNAを抽出,定量的RT-PCR法を用いてCYP2E1mRNAの発現量を測定する.CYP2E1mRNAの(1)発現量,(2)ピークとなるまでの時間,(3)負荷したアルコール濃度との相関,の3点において3群間で比較し検討する.チトクロムP4502E1(CYP2E1)は,ミクロソームエタノール代謝系に含まれ,飲酒歴が長期にわたる場合やアルコールを大量に摂取した際に誘導されてくることが知られている.しかし,どの程度誘導されてくるかを具体的に評価した報告は見当たらなかった.そこで,本研究では,CYP2E1誘導の程度を,CYP2E1mRNAの発現量を定量することにより評価する方法を確立し,それを用いて,CYP2E1誘導の程度とアルコールに対する感受性の個人差との相関を検討することを目的とした.ヒトリンパ球に発現しているCYP2E1mRNAは,RT-PCR法により確認可能となった(定量的RT-PCR法)ので,この方法を用いて,飲酒習慣のある男性並びに日常ほとんど飲酒しない男性を対象として,末梢血よりリンパ球を採取し,CYP2E1mRNAの発現量を比較したところ,両者に差異は認められなかった.また,被験者をALDH2の遺伝子型により1/1型,1/2型,2/2型の3群に分け,それから末梢血を採取し,直ちに飲酒時の数段階のアルコール濃度となるようアルコールを添加し,37°Cで一定時間インキュベートした.その後,同様の方法で,リンパ球を採取し,mRNAを抽出,定量的RT-PCR法を用いてCYP2E1mRNAの発現量を測定したところ,どの群においても差異は認められなかった.すなわち,これまでのところでは,CYP2E1mRNAの発現量は,飲酒習慣の有無,あるいはアルデヒド代謝活性の強弱により変化しないという結論しか得られていない.現在,他の検出法の考案を含め,種々検討をすすめている.
部分構造論理の研究

1.近年ラムダ計算を介して,部分構造論理,直観主義論理,古典論理の研究が一体化しつつある。その中で鹿島(東京工大)と古典論理の自然演繹体系について研究した。鹿島は古典論理の新しい自然演繹体系を発見した。古森はそれを一部改良し体系CKを得た。体系CKは「ならば除去」,「割増」,「場合わけ」の3つの推論規則を持っている。この体系の発見はまったく新しいものであり,部分論理式特性を持つ古典論理の自然演繹体系の最初のもの(結論がいくつもあるのを認めるとParigotのものがある)である。体系CKについては更にChurch-Rosser性などを調べているところである。この結果は,数学で普通に使われている論理についての結果であるので,各方面から注目されている。2.上記の結果は新しい計算方式を生んでいる。その計算方式については上で述べたChurch-Rosser性だけでなく,その意味なども調べている。3.複数の結論を持つ自然演繹体系およびλμ計算とその周辺の研究は,藤田により活発に行なわれ本報告書の研究発表の欄にある二つの論文を生んでいる。4.BB'IW論理の決定問題はrelevant論理最大の未解決問題であるので,研究代表者,分担者全員で解決にあたっているが,問題が難しくみるべく成果は得られていない。5.金沢はカテゴリー文法について,それらの構文論的性質や意味論的性質をより明らかにするよう研究を進め成果を得ている。6.桜井は,ラムダ計算のカテゴリーモデルについての研究を進め,構文論的な性質を証明するためのモデルの構成法について成果を得ている。1.三つの論理式B((β→γ)→(α→β)→α→γ),B′((α→β)→(β→γ)→α→γ),I(α→α)を公理型とし推論規則modusponensを持つ含意論理の体系をP-Wという。P-WはBCK論理より弱い部分構造論理である。体系P-Wでα→βとβ→αの両方が証明できればαとβは全く同じ論理式であるか,というのが有名なP-W問題である。歴史的には,P-W問題は意味論的に1982年にE.P.Martinにより肯定的に解かれたが構文論的な解決を求めてその後も研究が続けられた。廣川によって始められたラムダ計算によるP-W問題への取り組みが古森と永山の協力により最終的に解決したものである。我々の方法では,まずP-W問題が体系P-Wでα→αの証明が唯一かという問題と同値であることを示し,α→αの証明が唯一であることを証明した。このことは我々の研究課題である証明図の唯一性の広がりと重要性を示している。2.上記の結果は部分構造論理において,証明図が唯一であることの面白い御利益を示している。3.複数の結論を持つ自然演鐸体系とλμ計算の関係の研究は,藤田により活発に行なわれ本報告書の研究発表の欄にある三つの論文を生んでいる。4. BB'IW論理の決定問題はrelevant論理最大の未解決問題であるので,研究代表者,分担者全員で解決にあたっているが問題が難しくみるべく成果は得られていない。5.金沢はカテゴリー文法について,それらの構文論的性質や意味論的性質をより明らかにするよう研究を進めている。

体系CKは「ならば除去」,「割増」,「場合わけ」の3つの推論規則を持っている。この体系の発見はまったく新しいものであり,部分論理式特性を持つ古典論理の自然演繹体系の最初のもの(結論がいくつもあるのを認めるとParigotのものがある)である。体系CKについては更にChurch-Rosser性などを調べているところである。この結果は,数学で普通に使われている論理についての結果であるので,各方面から注目されている。2.上記の結果は新しい計算方式を生んでいる。その計算方式については上で述べたChurch-Rosser性だけでなく,その意味なども調べている。3.複数の結論を持つ自然演繹体系およびλμ計算とその周辺の研究は,藤田により活発に行なわれ本報告書の研究発表の欄にある二つの論文を生んでいる。4.BB'TW論理の決定問題はrelevant論理最大の未解決問題であるので,研究代表者,分担者全員で解決にあたっているが,問題が難しくみるべく成果は得られていない。5.金沢はカテゴリー文法について,それらの構文論的性質や意味論的性質をより明らかにするよう研究を進め成果を得ている。6.桜井は,ラムダ計算のカテゴリーモデルについての研究を進め,構文論的な性質を証明するためのモデルの構成法について成果を得ている。
日常刺激の視覚探索における記憶の働きに関する研究

記憶に基づいた注意制御は視覚探索において重要な役割を果たしている。本研究では、自然画像の中の標的を探索する際の記憶の働きについて検討した。その結果、1)探索の難易度は個人間で一致した傾向があり、物理的要因よりも文脈が探索効率に大きく寄与していること、2)画像を学習しても相対的な探索の難易度はほとんど変化しないこと、3)視覚的文脈の短期記憶は学習時に注意を向けられた項目によって構成されていることなどが明らかになった。視覚探索課題は空間的な注意制御メカニズムを検討するために広く用いられてきている課題である。しかし,これまでの研究の多くは,幾何学図形や文宇など,抽象的なオブジェクトを実験刺激として使用してきたため,日常生活場面における注意制御様式に関してはほとんど明らかにされていない。そこで本研究では,これまでの視覚探索に関する知見を日常生活場面に適用していくため,日常生活場面を模した実験刺激(以下,自然画像と呼ぶ)をコンピュータグラフィックス上で作成し,それを用いて視覚探索中の注意制御特性(特に,記憶の働き)を明らかにすることを目的とした。実験では,自然画像を288シーン作成し,シーン内に提示されている標的(ミニカー)の探索課題を実験参加者に課した。その結果,各シーンの探索時間は参加者間でほぼ一致しており,シーンに固有の探索難易度が存在すること,シーン固有の探索難易度は標的の提示位置や大きさ,周辺とのコントラスト,空間周波数などの物理変数では十分に説明できないことが明らかになった。また,各シーンを繰り返し提示したところ,探索時間が有意に短縮されることが明らかになった。これは各自然画像における標的の位置(視覚的文脈)が記憶・学習された結果であると考えられる。自然画像における文脈学習の記憶容量は非常に大きく,240種類の自然画像を用いた場合でも学習が生起すること,各自然画像に対する反応時間の順位はブロック問で有意に一致しており,学習が生起しても相対的な探索難易度はほとんど変化しないこと,学習によって情報処理速度のばらつきが小さくなることなどが明らかになった.これらの成果から,日常生活場面における注意制御には多くの人に共通のパタンがあり,学習によってもほとんど変化しないことが示された。本研究では、これまでの視覚探索に関する知見を日常生活場面に適用していくため、日常生活場面を模した実験刺激(以下,自然画像と呼ぶ)をコンピュータグラフィックス上で作成し、それを用いて視覚探索中の注意制御特性(特に、記憶の働き)を明らかにすることを目的とした。平成20年度は、まず、自然画像461シーンを用いて、シーン内に提示されている標的(ミニカー)の探索課題実験を行った。そのデータから、各シーンの物理的要因(標的の位置、大きさ、周辺とのコントラスト、空間周波数など)がシーンに固有の探索難易度にどの程度影響しているのかを重回帰分析を用いて検討した。その結果、全分散の14%程度が物理的要因で説明できることが明らかになった。また、物理的要因の寄与する傾向は幾何学的図形を刺激として用いた場合と異なることも示された。例えば、幾何学的図形の場合は刺激の右上方に注意が向きやすく、自然画像では中央下方に注意が向きやすい傾向があった。これは、自然画像の場合、床面などに対象が存在しやすいという文脈を反映しているものと考えられる。また、自然画像における視覚的記憶の特性を調べるために、ドット追跡課題(時系列的に提示されるドットを追跡し、そこにあるオブジェクトを記憶する課題)を用いた実験を行った。自然画像をそのまま提示する条件とシーンの文脈を崩した条件を比較した結果、記憶成績に与える文脈の影響は、保持時間に関わらず、ほぼ一定であった。この結果は、文脈がオブジェクトトークンの視覚的記憶の記銘プロセスに強く影響している可能性を示唆している。本年度は、日常生活場面をコンピュータグラフィックス上で作成した実験刺激や風景写真(以下,自然画像と呼ぶ)の記憶成績と注意制御との関係を明らかにする目的で研究を行った。まず、記銘プロセスにおいて注意を向けるべきオブジェクトと無視するべきオブジェクトを操作的に分離し、想起時の文脈一致性の効果を検討した。その結果、記銘時に注意を向けたオブジェクトの配置が想起時に一致していない場合、オブジェクトトークンの再認成績が著しく低下することが明らかになった。一方、記銘時に注意を向けていないオブジェクトの一致性は再認成績にほとんど影響しなかった。これらの結果は、オブジェクトトークンの判断に寄与する自然画像の文脈が、注意を向けられたオブジェクト群から構築されていることを示唆している。次に、シーンそのものの記憶成績に注意が与える影響についても検討した。高速継時視覚提示された自然画像の再認成績を計測した結果、注意に関わる効果は認められなかった。このことは、シーンそのものの再認に寄与する自然画像の文脈の構築には視覚的注意が関与していない可能性を示唆している。以上の研究から、課題や状況(想起時のマッチングに必要とされる表象など)に依存して、レベルの異なる自然画像の文脈が構築されていると考えられる。

本年度までに行った研究成果と合わせて考察すると、視覚探索課題における文脈手掛かり効果のように、シーン全体の文脈に依存した効果は記銘時に注意を必要とせず、系列的視覚探索中に生じるオブジェクトの繰り返し効果のような現象には、記銘時の注意が必要であると推測される。
計測現場で瞬時に周波数特性を調整できる高速高精度な微分推定フィルタの可変構造

これまでに,帯域制限と微分推定を1つのシステムで実現することによりこの問題を解決し,更に,フィルタリングによる処理遅延を低減可能な,低遅延特性を有する低域通過・帯域通過微分器が提案されてきた.本研究計画では,従来よりも耐ノイズ性能の高いディジタル微分器の設計とその可変構造の実現を研究目的とする.具体的には,2019-2020年度において従来提案されているディジタル微分器の可変構造化, 2021-2022年度において少ない次数で従来よりも高い耐ノイズ性能を実現するディジタル微分器の設計とその可変構造化に取り組む.これまでに,帯域制限と微分推定を1つのシステムで実現することによりこの問題を解決し,更に,フィルタリングによる処理遅延を低減可能な,低遅延特性を有する低域通過・帯域通過微分器が提案されてきた.本研究計画では,従来よりも耐ノイズ性能の高いディジタル微分器の設計とその可変構造の実現を研究目的とする.具体的には,2019-2020年度において従来提案されているディジタル微分器の可変構造化, 2021-2022年度において少ない次数で従来よりも高い耐ノイズ性能を実現するディジタル微分器の設計とその可変構造化に取り組む.
癌幹細胞におけるCdk-Pin1経路の活性化機構の解明

我々が樹立した人工癌幹細胞モデル細胞においてCdk-Pin1経路を阻害する化合物のスクリーニングを行い、Withaferin A(WA)を同定した。WAはp21Cip1の発現を誘導することで、Cdk活性を阻害し細胞老化を誘導することで癌幹細胞(CSC)の未分化能および自己複製能を阻害した。さらにWA処理したCSC細胞をヌードマウス皮下に移植したところ、腫瘍形成能が顕著に抑制された。また、Cdkによりリン酸化される機能的タンパク質を同定するため、Pin1を分子プローブに用いたリン酸化プロテオーム解析を試みた結果、数十種類の候補タンパク質を同定した。本研究課題では、我々が独自に開発した人工癌幹細胞モデル細胞を用いて、癌幹細胞(CSC)の悪性化形質の発現や維持に重要な因子を明らかにすることを目的とする。予備実験の結果から、本モデル細胞は正常幹細胞と比較してサイクリン依存性キナーゼ阻害因子(CDKN)の発現が顕著に低下しており、Cdk/サイクリンの定常的な活性化が認められた。また、レトロウイルスベクターを用いてp21Cip1を定常的に発現させたところ、CSCの老化や悪性化形質の減弱が認められたことから、CdkがCSCの悪性化形質の発現や維持に重要な役割を果たすと考えられた。しかしながら、レトロウイルスベクターを用いた強制発現では、発現細胞の薬剤選択に時間がかかること、また発現量の調整が難しいことなどが問題となった。そこで、CSCにおいてp21Cip1の発現を誘導し、CSCを老化に導く化合物のスクリーニングを行った。約130種類の植物由来天然化合物ライブラリーを用いて、CSCの形質をモニターするため細胞増殖・毒性(WST-8 assay)、分化誘導(ALP assay)、自己複製能(Tumor sphere formation assay)についてアッセイを実施した。その結果、化合物AがCSCにおいて経時的にp21Cipの発現量を上昇させること、また細胞毒性が見られない濃度においてCSCの分化を誘導し、自己複製能を抑制することが明らかになった。同時に未分化マーカーおよびEMTマーカーの発現量の低下や、CSCの浸潤能や遊走能の低下も見出され、化合物AがCSCを老化に導くことでの悪性化形質を阻止する可能性が示唆された。さらには、化合物Aを48時間処理したCSCをヌードマウスに移植したところ、腫瘍形成能は顕著に抑制された。本研究課題は、癌幹細胞(CSC)の悪性化形質の発現や維持に重要な役割を果たすサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)やその阻害因子群の機能解明を目的としている。当初、レトロウイルスベクターを用いてCdk-inhibitorp21Cip1の定常発現を試みたが、薬剤選択に時間がかかったため、植物由来天然化合物ライブラリーの中から、CSCにおいてp21Cip1の発現を誘導する薬剤をスクリーニングした。その結果Withaferin A(WA)がCSCにおいてp21Cip1の発現を誘導することがわかった。また、WAはCSCの細胞老化を誘導することで、CSCの悪性化形質および腫瘍形成能を阻害した。WA処理した細胞は細胞老化マーカーであるSenescence-associated beta-galactosidase(SABG)およびリン酸化ヒストンH2A.X陽性を示したが、DNA損傷は見られなかった。WA添加細胞では、12時間後にサイクリンBの一過性上昇の後にその発現が急激に消失し、p21の発現は12時間後から徐々に増加した。一方で、pErk1/2およびpS6の高発現は継続しており、サイクリンD1の発現は48時間後に一過性増加が認められた。この現象は、細胞周期停止と細胞増殖シグナルが同時に活性化される逆説的な状況であり、これが原因でGeroconversionにより細胞老化が引き起こされたことが示唆された。また、Cdkの標的となるリン酸化タンパク質を同定するため、機能的リン酸化タンパク質に結合することが知られているPin1を分子プローブに用いたリン酸化プロテオーム解析を試みた。Pin1と特異的に結合するタンパク質を抽出後、質量分析計によってタンパク質を同定した。現在、取得したタンパク質およびそれらのリン酸化部位について精査中である。分子腫瘍学本研究課題は、CSCの悪性化形質の発現や維持に重要な役割を果たすCdk下流のリン酸化蛋白質の同定とその機能解明を目的としている。本目的を達成するため、Cdk-inhibitorであるp21Cip1を誘導する薬剤の選択を行った。具体的には、約130種類の植物由来天然化合物を用いたスクリーニングにより、p21Cip1の発現を誘導し、CSCを老化に導く化合物Aを見出した。

化合物Aを添加することにより、CSCはp21Cip1を定常的に発現し、それに伴いCSCの特性(自己複製能、未分化能、腫瘍形成能)が失われることを明らかにした。これらの細胞モデル系は、CdkによるCSCの未分化性や悪性化形質の維持における標的因子の特定や機能解析に活用できると考えられる。これまでに、CSCにおいてp21Cip1の発現を誘導する化合物Aを見出した。化合物AはCSCの老化を誘導し、CSCとしての特性を消失させることを明らかにした。今後研究課題としては、本薬剤処理細胞モデル系を用いてp21Cip1-CdkアクシスがCSCの増殖や未分化性の維持、さらには悪性化形質発現にどのような役割を果たすかについてさらに詳細に検討を行う。特に、Cdkの基質となるpRB以外の標的因子について探索を行うことで、新たな標的因子を明らかにする。具体的な手法としては、化合物Aを添加した細胞とコントロール細胞間において、リン酸化タンパク質のプロファイリングを、Pin1を用いたリン酸化プロテオミクスを用いて解析する。同定されたリン酸化蛋白質については、癌幹細胞の悪性化形質の発現や維持における機能的役割について精査するとともに、ヌードマウスを用いた腫瘍形成モデルを用いて検証する。また、当該標的因子のリン酸化特異的抗体を作製し、CSCにおける発現や機能を解析する。ヒト癌組織の免疫染色やイムノブロット等を行い、癌の分化度や悪性度(リンパ節や骨転移の有無、薬剤感受性)などの臨床的パラメーターとの相関の有無についても検討する。また、化合物AによるCSC老化誘導機構について、p21Cip1の発現を調節するmiRNAやsiRNAを投与することで確認を行う。
自己組織化システムを用いた連続音声の適応的分析・認識に関する研究

本研究は、連続音声の適応的分析・認識を目的とした自己組織化情報処理システムの基本アルゴリズム設計と音声入出力を持つUnixシステム上での実現を目指し、基本アルゴリズムでは、新しい時変スペクトル推定の手法の開発を行ない、従来の方法との比較によりその有効性を確認した。また認識部分ではニューラルネットワークで知られている、自己組織化ネットワークを用い、各ノードに高効率のアルゴリズムを導入し、クラスタリング性能や認識性能の向上を考えた。さらに当該年度で、それらの手法を統合し、高度なヒューマンインターフェースをもつソフトウエアシステムとして開発を行なった。本システムの特徴は、従来の方法では難しいとされていた認識の適応性と汎化性を合わせ持つ情報処理システムとして、自己組織化能力を有する適応メディア処理システムを実現していることである。適応性は、音声信号の特徴を獲得するアルゴリズム中に実現し、時変な特徴が精度良く求められることを示した。ここでは、特に時変な特徴とは何か、その表現はどのようにするのが良いか等の、基本的な考え方についても考察し、その成果を幾つかの論文にまとめ発表した。音声の時変分析を行なった後処理として、認識手法の開発も行なった。これは時変な特徴にもっとも適した規範テンプレートを自己組織的に実現する認識システムであり、クラスタリング部では、各規範テンプレート間に適切な位相(距離)を持たせ、汎化能力を向上させた。但し、実験では複数の男性話者に対する母音の認識にとどまっており、子音の認識については現在実験遂行中である。認識システムでの特徴は、時間変動を伴う特徴もクラスタリング可能にするため多層の自己組織化モデルを考えているため、音声が徐々に変化する部分における特徴の認識が効率良く行なわれることが分かったが、そのシステムの特徴をよりよく応用できる認識即ち破裂子音等の分析・認識については現在実験中である。
MA法を活用した粉末治金法による高性能熱電素子材料の開発と実用化

熱電素子材料の性能指数Zは、Z=Q^2/κρ(Q:熱起電力、κ:熱伝導率、ρ:電気抵抗)で表わされ、性能を向上させるためには、Qを増大させ、κ・ρを小さくすることが必要である。本研究では、性能指標Zの大きい熱電材料の開発を目的として、Ni, Cu, Al, Ti, Zr, Nb粉末をβ-feSi_2に添加し、熱伝導率の低下を目的としてSiC微粒子を分散させたβ-feSi_2をMGおよびMA法によって、またCoSb_3についてはMG法によって作製して、それらの試料を900°C、30min, 25Mpaでホットプレスすることによって焼結体を作製し、熱電特性を測定評価した。得られた主な成果を要約すると、以下の通りである。1)MAおよびMG法の活用によって、極めて微細な組織と低熱伝導率を有するβ-FeSi_2およびCoSb_3を熱処理することなく、ホットプレスのみで作製することに成功した。2)CuおよびZrを添加させた場合、β-FeSi_2中に金属相粒子がびさあいに分散し、電気抵抗をが著しく低下し、その結果、性能が飛躍的に向上した。3)FeSi_2にSi及び」Cを添加して、メカニカルアロイング(MA)することによって、β-FeSi_2相中にSic超微粒子を均一・微細に分散させることに成功した。その結果、熱起電力および電気抵抗には殆ど影響することなく熱伝導率を著しく低下させることによって、性能を大幅に向上させることができた。その効果は、Mnを添加したP型β-FeSi_2の場合に顕著であった。4)Co及びMnをドープしたN型およびP型β-FeSi_2へのZrおよびSic複合添加によって性能は向上するが、無添加β-FeSi_2への複合添加の効果やそれぞれの単独添加の効果から期待される効果は得られなかった。これは複合添加によってキャリアー濃度の変動によると考えられる。本年度の研究の結果、MG法およびMA法によってNi,CuおよびCo粉末を添加した微細FeSi_2粉末を作製し、それを900°C、30min間ホットプレスすることによって、半導体相であるβ-FeSi_2相の組織を極めて微細にして熱伝導率を約20%小さくすることに成功すると同時に、β-FeSi_2相中に微細な金属相ε-FeSi粒子を分散させることによって電気抵抗を50%以上も減少させることに成功した。さらに、CuおよびCoの同時添加によって熱起電力Qを増大させることにより、N型β-FeSi_2系熱電材料の性能を大幅に向上させることに成功した。得られた成果を要約すると、以下の通りである。1)Cuはβ-FeSi_2相には固溶せず、ε-FeSi相にのみ固溶する。一方、Coはβ-FeSi_2相にもε-FeSi相にも固溶する。したがって、Cu添加による電気抵抗の減少は、ε-FeSi相の電気抵抗の低下およびε-FeSi相量の増大によるものと考えられる。2)熱起電力QはCu添加によって特に低温領域において増加し、過剰に添加すると減少した。β-FeSi_2相へのCu単独添加は、β-FeSi_2相をP型にするが、Coととの同時添加した場合にはN型となる。

これはCoを固溶したβ-FeSi_2相にはCuが固溶しないことによるものと考えられる。熱電素子材料の性能指数Zは、Z=Q^2/κρ(Q:熱起電力、κ:熱伝導率、ρ:電気抵抗)で表わされ、性能を向上させるためには、Qを増大させ、κ・ρを小さくすることが必要である。本年度の研究では、熱起電力Qが大きい熱電材料の開発を目的として、Zr,Nb,Tiを添加したFeSi_2を、熱伝導率の低下を目的としてSiC粉末を添加したFeSi_2を、MG法およびMA法によって作製し、それを900°C、30min間、25Mpaでホットプレスすることによって焼結体を作製して、熱電特性を測定評価した。得られた成果を要約すると、以下の通りである。1)MA法およびMG法の活用によって、極めて微細な組織を有するβ-FeSi_2を熱処理することなく、ホットプレスのみで作製することに成功した。2)NbおよびTiの添加は、β-FeSi_2の熱電特性の改善に効果はないが、Zrの添加は電気抵抗を飛躍的に低下させる効果を示し、特に高温での性能向上に顕著な効果を示すことが明らかとなった。3)FeSi_2にSiおよびCを添加して、メカニカルアロイング(MA)することによって、β-FeSi_2相中にSiC超微粒子を均一・微細に分散させることに成功し、その結果、熱起電力および電気抵抗には殆ど影響することなく熱伝導率を約50%低下させることによって、性能を大幅に向上させることができた。本年度の研究では、性能指数Zの大きい熱電材料の開発を目的としてZr,Ti,Nbを、熱伝導率の低下を目的としてSiC粉末を添加したFeSi_2をMG法およびMA法によって作製し、それを900°C、30min間、25Mpaでホットプレスすることによって焼結体を作製し、熱電特性を測定評価した。1)MAおよびMG法の活用によって、極めて微細な組織を有するβ-FeSi_2を熱処理することなく、ホットプレスのみで作製することに成功した。2)Zr添加は電気抵抗を飛躍的に低下させる効果を示し、β-FeSi_2の熱電特性、特に高温での性能向上に顕著な効果を示したが、TiおよびNbの添加は殆ど効果を示さなかった。3)FeSi_2にSiおよびCを添加して、メカニカルアイロイング(MA)することによって、β-FeSi_2相中にSiC超微粒子を均一・微細に分散させることに成功し、その結果、熱起電力および電気抵抗には殆ど影響することなく熱伝導率著しく低下させることによって、性能を大幅に向上させることができた。4)Co及びMnをドープしたn型及びp型β-FeSi_2へのZr及びSiCの複合添加によって性能は向上するが、無添加β-FeSi_2への複合添加の効果やそれぞれの単独添加の効果から期待される効果は得られなかった。それは複合添加によるキャリアー濃度の変動によると考えられる。
脳機能改善薬を指向した毒ガエルアルカロイドの合成研究

毒ガエルアルカロイド類の柔軟で効率的な合成研究を実施し、5, 8位置換インドリチジン、1, 4位置換キノリチジンおよび5, 8位置換6, 7-デヒドロインドリチジンの合成を達成した。これにより、数種のアルカロイドの絶対配置、相対配置を確定した。また、提出構造の誤りを指摘し、訂正構造式の提案を行った。さらに、脳内主要ニコチン受容体に対して、これら毒ガエルアルカロイド類がサブタイプ選択的に抑制作用を示すことも明らかにした。17年度は、鍵反応である高立体選択的マイケルタイプの共役付加反応を活用して、鍵中間体の創製に成功した。すなわち、本研究課題において、5、8位置換インドリチジン型毒ガエルアルカロイドの柔軟な合成ルートを実現するために、鍵中間体として想定したラクタム型キラル素子の効率的な合成法を確立した。この鍵中間体であるラクタム型キラル素子を活用することによって、5、8位置換インドリチジン型毒ガエルアルカロイドである(-)-203A,(-)-233Dの最初のキラル合成を達成し、これら天然物の絶対配置を確定することができた。さらに、(-)-231C,(-)-219F,(-)-221Iの最初のキラル合成も行い、未だ不明であったこれら天然物の相対配置を確定することができた。また、同様の手法により、(-)-209Bと(-)-235B"のキラル合成も行い、各種スペクトルデータが文献値と完全に一致することも確認した。同じく相対配置が不明である193Eの提出構造のキラル合成も行ったが、本化合物は合成品と天然物の各種スペクトルデータが一致しなかった。よって、193Eの提出構造が誤りであることが判明したが、訂正構造の確定には至っていない。今後は、上記手法を、1、4位置換キノリチジン型毒ガエルアルカロイドのキラル合成、および極最近報告された6、7-デヒドロタイプの5、8位置換インドリチジン型毒ガエルアルカロイドの合成に適用して、それらのキラル合成を完了すると共に、合成アルカロイドを用いたニコチン受容体抑制活性について検討したいと考えている。脳内に存在するニコチン受容体は,記憶学習をはじめとする様々な生理機能に重要な役割を果たしており,その機能以上が様々な中枢神経系疾患に関わっていることが示唆されている.我々のこれまでの研究において,毒ガエルアルカロイドの一種である235B'が,脳内主要ニコチン受容体であるα4β2受容体を選択的かつ強力にブロックすることが明らかとなり,さらにその作用機序がチャネルの開口部を塞ぐオープンチャネルブロッカーであることが判明し,これは小児期てんかんの一種であるADNFLEの新規治療薬開発における極めて有望なリード化合物になり得ることを示した.そこで,本年度は,上記研究課題に沿った新たな脳機能改善薬を指向した合成研究を行い,毒ガエルアルカロイド類のなかでも最大のサブクラスに属する5,8位置換インドリチジン型毒ガエルアルカロイドであり,8位側鎖がブチル基となった251Nおよび221Kの最初のキラル合成を達成した.さらに,NIH, Daly博士との共同研究によって,未だその相対配置が未確定であった251Nの相対配置を天然物との比較から,明らかにした.(Heterocycles,2006,70,541-548)一方,これまで合成した毒ガエルアルカロイドを用いたニコチン受容体抑制活性について,総括してまとめ,(有機合成化学協会誌,2006,64,49-60)来年度以降において標的とする毒ガエルアルカロイドの設定およびこれまでに開発した柔軟な合成経路を活用することにより,天然物をリード化合物とした新規誘導体ならびに類縁体合成の設計における指針を明らかにした.すでに合成に成功している毒ガエルアルカロイ、ド231C,221Iおよびepi-193Eについて,脳内主要ニコチン受容体に対する抑制効果を検討したところ,231Cはα4β2-ニコチン受容体を選択的(α7に対して6-7倍)に抑制し,また221Iとepi-193Eは逆にα7-ニコチン受容体を選択的(α4β2に対して約6倍)に抑制することが判明した.これらの結果から,インドリチジン骨格の8位の側鎖(231C=Me,221I, epi-193E=Et)がニコチン受容体サブタイプ選択性に大きく関わっていることが明らかとなった.一方,1,4位置換キノリチジンタイプの毒ガエルアルカロイド,233A,235Uおよび251AAの柔軟で効率的な最初のキラル合成にも成功した.さらに,これらのニコチン受容体抑制効果についても検討した結果,残念ながらこれらキノリチジンタイプのアルカロイドはいずれもα4β2-およびα7-ニコチン受容体に対して選択的抑制効果を示さなかった。これらの結果,および先に合成した同じ1,4位置換キノリチジン

骨格を有するepi-207Iがα7-ニコチン受容体を選択的に抑制した結果から,本骨格においては4位側鎖(epi-207I=allyl,233A=4-pentynyl,235U=4-pentenyl,251AA=η-hexyl)が選択的なニコチン受容体抑制活性において重要であるという知見を得た。最近新たに見出されたデヒドロインドリチジンタイプの毒ガエルアルカロイド179および207Eの提出構造の最初のキラル合成を達成した。しかし、合成した化合物は天然物と一致しなかったことから、これら提出構造が誤りであることが判明した。合成した化合物について、ニコチン受容体に対する抑制活性効果を検討したところ、両化合物ともにα7受容体を選択的にブロックした。また毒ガエルアルカロイドと同様のインドリチジン骨格を有するアリから単離されたヒドロキシインドリチジンおよびmonomorine Iのキラル合成にも成功し、前者の絶対配置を確定した。ニコチン受容体抑制活性効果は、ヒドロキシインドリチジンがα4β2受容体を選択的に抑制することも新たに見出した。
アクチン重合調節および殺癌細胞活性を持つスピロ環状アセタール天然物の全合成研究

特異なスピロ環状アセタール構造を有する、ペクテノトキシン2、ゴニオドミンA、プロロセンチンは、それぞれアクチン脱重合活性、抗カビ活性とアクチン重合調節に起因する血管新生阻害活性、および殺癌細胞活性を持ち、医薬品のリード化合物として期待される。これら3つのスピロ環状アセタール天然物の立体選択的・効率的・実用的合成法の完成を目的として研究を行った。平成19年度は以下の成果を上げた。(1)前年度に開拓されたペクテノトキシン2の34員環マクロライド構造構築の合成経路に従い、重要中間体の大量合成を行なった。また、その際、C31-C35フラダメント合成について改良を検討した。(2)プロロセンチのBCD環部構築法を検討した。その結果、内本によるアセチレンアルコールの環化異性化を基盤としたB環合成法と、共役エニノンに対する段階的ヘテロ共役付加を経由するスピロアセタール(CD環)閉環法を開発できた。これらを利用して、単離・構造決定文献記載の立体化学を持つ、プロロセンチンのC8-C35部分の合成に成功した。また、脱保護したC8-C35部分構造を合成し、天然物とNMRデータを比較して、天然物の立体化学についての知見を得た。(3)ゴニオドミンAのマクロライド構造の構築のため、AB環部セグメントとCDE環セグメントの構築を行なった。さらにC26-C36部分の合成に着手し、含有されるF環部分の大量合成を完了した。また、C27位とC29=C30二重結合の立体選択的合成法を検討した。特異なスピロ環状アセタール構造を有する、ペクテノトキシン2(PTX2)、ゴニオドミンA(GDA)、プロロセンチンは、それぞれアクチン脱重合活性、抗カビ活性とアクチン重合調節に起因する血管新生阻害活性、および殺癌細胞活性を持ち、医薬品のリード化合物として期待される。これら3つスピロ環状アセタール天然物の立体選択的・効率的・実用的合成法の完成を目的として研究を行った。平成18年度は以下の成果を上げた。(1)ペクテノトキシン2(PTX2)のスピロ環状アセタール部の立体化学を大環状構造に組み込むことにより立体束縛効果でノンアノマー型に制御する方法を確立した。(2)PTX2の左右のフラグメントの合成を改良し従来より短段階で調製できるようになった。(3)PTX2の左右のフラグメントの連結、アノマー型スピロアセタール化、保護基のトリエチルシリル基への交換を経て、閉環メタセシスにより34員環マクロライド構造を構築した。(4)プロロセンチンのC8-C16、C17-C20、およびC22-C35フラグメントをの合成経路を確立した。(5)ゴニオドミンAの相対立体化学解明のため、ABC環部セグメントに相当する3種類のジアステレオマーを立体選択的に合成し、その相対配置に関する知見を得た。さらに、PTX2ではスピロ環状アセタール部の異性化と脱保護の全合成最終段階を検討した。プロロセンチンでは上記3つのフラグメントの連結による中央部のスピロ環状アセタール部構築に着手した。ゴニオドミンAでは、ABCDE環部の合成を検討し、これをゴニオドミンAと同じ骨格の大環状モデル化合物に誘導して、天然物との比較により全体の相対配置を確認すべく予備的研究を行った。
味細胞株樹立の技術設計および味覚工学創出の基盤解析

初代培養した味蕾細胞の細胞形態と細胞間接着は、培養液の細胞外カルシウムイオンの濃度に依存して大きく変化した。0.5mM以上の高カルシウムイオン濃度条件下では細胞同士が強く結合し、細胞塊を形成した。一方、0.1mM以下の低カルシウムイオン濃度条件下では、細胞は次第に分散し、細長い形をとるようになった。これら2つの細胞状態は、カルシウムイオン特異的、かつ、可逆的であった。この結果から、カルシウムイオンは細胞外において味蕾細胞の形と接着を調節する因子であることが示された。味蕾細胞が接着している基底膜成分に存在するラミニン・サブユニットを分析した。βおよびγサブユニットに関してRT-PCR法および免疫組織化学的方法で解析した結果、β2サブユニットおよびγ1サブユニットが主要な分子種としてラット有郭乳頭基底膜に存在することがわかった。さらに、ラミニンをリガンドとする受容体として機能している可能性があるインテグリンに関して、そのβサブユニットの発現をRT-PCR法で解析したところ、β1、4、および5の3種類の分子が、味蕾細胞を含む上皮細胞層において発現していることが明らかになった。本研究で確立した味蕾初代培養細胞にアデノウィルスベクター系を用いて、効率90%以上で外来遺伝子を導入することに成功した。この方法を用いてα1アドレナリン受容体導入細胞の細胞内カルシウムイオン濃度のリガンド(アドレナリン)応答性を観察した。その結果、導入細胞の約50%においてリガンドに応答した細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された。また、リガンド未添加時において細胞内カルシウムイオン濃度が高い細胞ほど、応答性が高い傾向はあったが、応答性と味細胞マーカーとの存在には余り相関が見られなかった。今後、味細胞を含む味蕾細胞の解析とその応用を行うために有用な実験系となることが期待される。ラット味蕾細胞の初代培養系を確立するため、舌から味蕾をどのような条件で分離するか、シャーレにいかにして接着させるか、培養液は何が最適かの3点について検討した。その結果、味蕾を分離する酵素はコラゲナーゼとエラスターゼの併用が最適であると結論した。接着に関しては、味蕾細胞は単離後、球状の形態をとるためプラスチック(あるいはリジンコートしたガラス等の)シャーレに直接接着しないため、マトリジェルを試みたところ、良い結果を与えることが分かった。培地についてはケラチノサイト用のmKGM培地が適しているという結果を得た。このような条件で少なくとも一週間の初代培養が可能となった。そこで培養味蕾細胞の諸性質を検討したところ、培養味蕾細胞をトリパンブルー(死細胞)とニュートラルレッド(生細胞)染色を行うと、ほとんどが生細胞であることが確認できた。そこで形態観察とともに味蕾特異的な分子群(レセプター、Gタンパク質、PLCβ2、サイトケラチン類など)の発現をin situハイブリあるいは抗体染色で観察したところ、ほとんどの細胞はサイトケラチン8陽性で、そのうち10%程度の細胞はPLCβ2を発現していた。しかもPLCβ2発現細胞の約半分はガストデューシンも発現していた。このような分子の発現状態はin vivoの味蕾細胞のそれらと同様であることから、培養味蕾細胞はネイティーブの味蕾細胞を反映していることが明らかになった。次に培養細胞に遺伝子を導入した。導入方法としてアデノウィルス感染法を用いたところ約90%以上の細胞に遺伝子が導入された。次に、味覚レセプターと構造的に近縁のα1-アドレナリンレセプターを導入したところ、培養細胞の膜に発現し、しかもノルエピネフィリー添加による細胞内カルシウム上昇を測定することができた。この成功は味蕾を用いた味覚工学の創出に具体的な指針を与える成果である。

ラット味蕾細胞の初代培養系を確立するため、舌から味蕾をどのような条件で分離するか、シャーレにいかにして接着させるか、培養液は何が最適かの3点について検討した。その結果、味蕾を分離する酵素はコラゲナーゼとエラスターゼの併用が最適であると結論した。接着に関しては、味蕾細胞は単離後、球状の形態をとるためプラスチック(あるいはリジンコートしたガラス等の)シャーレに直接接着しないため、マトリジェルを試みたところ、良い結果が得られた。培地についてはケラチノサイト用のmKGM培地が適しているという結果を得た。このような条件で少なくとも一週間の初代培養が可能となったので培養味蕾細胞の諸性質を検討した。培養味蕾細胞をトリパンブルー(死細胞)とニュートラルレッド(生細胞)染色を行うと、ほとんどが生細胞であることが確認できた。また、培養細胞の形態観察とともに味蕾特異的な分子群(レセプター、Gタンパク質、PLCβ2、サイトケラチン類など)の発現をin situハイブリダイゼーションや抗体染色で観察したところ、ほとんどの細胞はサイトケラチン8陽性で、そのうち10%程度の細胞はPLCβ2を発現していた。しかもPLCβ2発現細胞の約半分はガストデューシンも発現していた。このような分子の発現状態はin vivoの味蕾細胞のそれらと同様であることから、培養味蕾細胞はネイティーブの味蕾細胞を反映していることが明らかになった。次に培養細胞に遺伝子を導入した。導入方法としてアデノウィルス感染法を用いたところ約90%以上の細胞に遺伝子が導入された。次に、味覚レセプターと構造的に近縁のα1-アドレナリンレセプターを導入したところ、培養細胞の膜上に発現し、しかもノルエピネフィリー添加によって細胞内カルシウム濃度上昇が観察された。本研究は世界で初めて味蕾の初代培養に成功したものである。