hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幹細胞再生医療のための生物機能改変組織工学技術の開発

ゼラチンからなる3次元のスポンジ足場を用いて、核酸含有カチオン化ゼラチンナノ粒子とともに幹細胞培養を行った。その結果、核酸の細胞内徐放化が見られ、遺伝子発現の抑制効果が認められた。プラスミドDNAや薬物を含有したナノ粒子の作製が可能となり、それらの粒子が幹細胞に取り込まれ、細胞内で徐放化されることがわかった。また、徐放パターンがナノ粒子作製条件によって変化でき、薬物活性の継続期間を修飾することもできた。この成果は、ナノ粒子を用いた薬物の細胞内徐放化の有効性を示したものであり、当初の計画には記載していない。27年度が最終年度であるため、記入しない。生体組織工学今年度に得られたプラスミドDNAあるいは低分子薬物を徐放化できるナノ粒子と足場材料とを組み合わせた機能性足場をデザインする。それらの足場で幹細胞を培養し、細胞機能の改変や増強について検討していく。検討はin vitro細胞培養法と動物実験により進める。研究計画の変更あるいは研究を遂行する上での問題点はない。この成果は当初の計画には記載していないものであり、ナノ粒子のプラスミドDNA以外への適用拡大の可能性を示した重要な結果である。今年度に得られたプラスミドDNAあるいは低分子薬物を徐放化できるナノ粒子と足場材料とを組み合わせた機能性足場をデザインする。それらの足場で幹細胞を培養し、細胞機能の改変や増強につて検討していく。
転写開始機構研究に基づく細菌プロモーターの探索法の開発

転写開始は従来、必要な反応を直列に並べたもの(直列経路)とされてきた。近年、いくつかのプロモーターでプロモーターに結合したまま、不活性な複合体を形成する分岐経路が発見された。この分岐した機構では、RNA伸長の過程で、長鎖RNA合成にいたる転写複合体と、短鎖RNAを繰り返し解離(abortive initiation)する複合体(moribund複合体と命名された)との分岐した反応経路をたどる。我々はこの機構が、少なくともin vitroでは一般的な転写開始機構であることを、証明し、さらに、この機構が、細胞内で存在することを以下のように証明した。転写伸長因子と考えられていたGreA,GreBタンパク質が、プロモーターとRNAポリメラーゼとの2体複合体のレベルで、λP_Rプロモータにおけるmoribund complexの形成を押さえて転写を活性化させる開始因子としての作用を持つことを発見した。greAgreB.遺伝子の破壊株を構築したところ、この株は低温感受性で、重金属耐性が低下しており、genome arrayにより二桁以上の遺伝子の発現が野生株と異なっていることが明らかになった。幾つかの遺伝子発現を検討したところ、uncオペロンなど少なくとも3種の転写ユニットはgreA/greB遺伝子依存的に、in vivoとin vitroの両方でレベルが上昇しており、abortive initiationが低下していた。つまり、転写の分岐回路は細胞内でも存在していることが証明された。転写の開始機構が、従来証拠無しに信じられてきた直列モデルを否定し、新しいモデルを証明し、国際的にもmoribund complexやbranched pathwayとして認知された意義は大きい。また、この発見は、90年ごろに我々が開発した、固定化DNAによる転写技術が必須のものであり、一つの技術が生物学的発見に結びついたものである。一群のプロモーターに対して、大腸菌RNAポリメラーゼは、プロモーターに結合したまま、不活性な複合体を形成する。転写開始からRNA伸長の過程で、長鎖RNA合成にいたる転写複合体と、短鎖RNAを繰り返し解離(abortive initiation)する複合体(moribund複合体と命名された)との分岐した反応経路をたどる。後者は短鎖RNAを一定の頻度で合成・解離し、また、数分で基質存在下でも伸長反応を行わないdead-end複合体に変換する。従来この分岐回路が無視されていたため、プロモーターは結合親和性と反応の早さのみで分類されていた。このために、プロモーターを塩基配列から予想することの精度は低く実用的でなかった。分岐経路が実質的に少ないT7A1プロモーターの反応経路の解析から、分岐回路の影響は高塩濃度下で減少することが明らかになった。これを用いて、プロモーターの染色体DNAからの実験的選択法が可能になった。本年度は、年度の後半から認められた経緯から、T7A1プロモーターの反応経路の解析の仕上げと、1,2種のプライマーDNAを用いて、大腸菌クロモゾームDNAの出来るだけ広い領域をPCRにて増幅することを行った。その結果、PCRには、増幅中にゆっくりと温度を上昇させるRamp機働泌須であること、有望なプライマー配列は、大腸菌の全配列で最頻度で出現する10塩基配列のうち、うえから2番目と5番目が有望であることを同定した。また、固定化RNAポリメラーゼを用いるため、β'サブユニットのC末にHisを6つ持つものを構築した。従来、転写のプロモーターの存在や強度を塩基配列から理論的に推定することは成功していない。従来の方式では、最も理想的な唯一のプロモーター配列の存在が仮定され、その配列の類似性だけで、プロモーター強度が推定されてきた。しかし転写開始が、複数の反応ステップから出来ているために、プロモーターには、律速段階が異なるための個性があり、その個性ごとに理想配列があるはずである。

個性としていままで、結合親和性と反応の早さが知られていた。われわれは、λP_Rプロモーター等でプロモーターに結合したまま、不活性な複合体を形成する分岐経路を発見し、この不活化の起こりにくさが第3の個性になることを明らかにした。昨年度は、年度の後半から採用であったため、本年度は昨年度に引き続いて、少数のプライマーにより大腸菌クロモゾームDNAの出来るだけ広い領域をPCRにて、数百bpのDNA断片に写し取るrndom PCRの確立を行った。その結果、昨年度は2種のプライマーで有る程度成功していたものを、一種類だけでPCRには、増幅中にゆっくりと温度を上昇させるRamp機能が必須であること、有望なプライマー配列は、大出来るように改良し、大腸菌のクロモゾームを10等分した位置での増幅率をリアルタイムPCRを用いて定量し、その値が、数十倍以内に収まるようにすることが出来た。この確立された新手法を用いて、固定化されたRNApolymeraseに結合させ、転写の完了に伴って、様々な条件で遊離されるDNA断片のライブラリーを得ることが出来た。このライブラリーはその条件でのプロモーターを含むと考えられ、そのコピー数が、理想的配列への近さに関係すると思われる。従来、転写のプロモーターの存在や強度を塩基配列から理論的に推定することは成功していない。従来の方式では、最も理想的な唯一のプロモーター配列の存在が仮定され,その配列の類似性だけで、プロモーター強度が推定されてきた。しかし転写開始が、複数の反応ステップから出来ているために、プロモーターには、律速段階が異なるための個性があり、その個性ごとに理想配列があるはずである。本年度は、1.昨年度に開発した、単一プライマーを用いたPCRによるゲノムバンク作成法を、大腸菌に応用してゲノムDNA断片ライブラリーを作製した。2.樹脂ビーズに大腸菌RNAポリメラーゼβ'サブユニットC末を固定して(活性は保持される)、ライブラリーを結合だけでなく転写反応の効率で、スクリーンして、4つの条件で2000種類の断片を得た。3.2000種類の断片をプラスミドに挿入し、断片部分の塩基配列を決定した。4.全断片をPCR増幅して、in vitro転写を行い、含まれるプロモーターの強度を観測し、強度順にリストを作成した。5.各条件ごとに、得られた配列の重複度でヒエラルキーをつけ、リストを作成した。今後2つのリストを比較して、実験条件の補正(RNAの長さ、放射性ラベルのされやすさ)を加えて、同一順を出すようなアルゴリズムを求め、プロモーターの強度を決定する要素を抽出する計画である。
偏微分方程式および関連分野の研究

1.双曲型作用素に対する混合問題(初期-境界値問題)のGevrey族における適切性を証明した.また,解の大域的な存在を幾何学的な条件の下で与え,一般論としても局所的存在定理から大域的存在定理を導く方法を確立した.解の構造・性質に関してもいくつかの結果が得られた.2.偏微分作用素の準楕円性のための十分条件(森本氏の条件の拡張)を与え, C^∞及びGevey族における偏微分作用素の準楕円性を調べた. C^∞においては今までにすでに得られていた結果ではあるが,この取り扱いにより準楕円性の本質が少し明瞭になり,今後の研究の一つの方向を与えたものと期待される.3.擬微分作用素のL^2及びL^p有界性を,シンボルの正則性をBesov空間で測って,必要条件に近い仮定の下で証明した.今後の線形及び非線形偏微分方程式への応用が期待される.4.非線形波動方程式及び弾性体の方程式に対する混合問題(Dirichlet問題, Neumann問題等)の解の存在及び一意性に関して,いくつかの結果が得られた.5.確率論においては,マルコフ過程に対する容量測度,ブラウン運動の確率論的取り扱い等の研究を進めた.6.微分幾何学においては, Riemann多様体の等長はめこみ,一般化されたVerorese曲面の特徴付け,球におけるCartan超曲面の特徴付け, complex space forin,自己双対接続及び倉西写像の幾何等の研究を進めた.7.位相幾何学においては,シェイプ理論,無限次元多様体, Heegaardダイアグラム等の研究を進めた.1.双曲型作用素に対する混合問題(初期-境界値問題)のGevrey族における適切性を証明した.また,解の大域的な存在を幾何学的な条件の下で与え,一般論としても局所的存在定理から大域的存在定理を導く方法を確立した.解の構造・性質に関してもいくつかの結果が得られた.2.偏微分作用素の準楕円性のための十分条件(森本氏の条件の拡張)を与え, C^∞及びGevey族における偏微分作用素の準楕円性を調べた. C^∞においては今までにすでに得られていた結果ではあるが,この取り扱いにより準楕円性の本質が少し明瞭になり,今後の研究の一つの方向を与えたものと期待される.3.擬微分作用素のL^2及びL^p有界性を,シンボルの正則性をBesov空間で測って,必要条件に近い仮定の下で証明した.今後の線形及び非線形偏微分方程式への応用が期待される.4.非線形波動方程式及び弾性体の方程式に対する混合問題(Dirichlet問題, Neumann問題等)の解の存在及び一意性に関して,いくつかの結果が得られた.5.確率論においては,マルコフ過程に対する容量測度,ブラウン運動の確率論的取り扱い等の研究を進めた.6.微分幾何学においては, Riemann多様体の等長はめこみ,一般化されたVerorese曲面の特徴付け,球におけるCartan超曲面の特徴付け, complex space forin,自己双対接続及び倉西写像の幾何等の研究を進めた.7.位相幾何学においては,シェイプ理論,無限次元多様体, Heegaardダイアグラム等の研究を進めた.
科学捜査に対応したテキスト依存型自動話者認識システム(FASR)に関する研究

一般に,法科学的手法を用いた話者認識(識別)とは,「声紋」というものを比較することで,容疑者の音声が犯人のものと同じかどうかを判断している。この手法は,信頼性が高いという利点がある反面,一般の人には判りにくいという欠点があり,より判りやすい話者認識法の開発が求められていた。そこで,本研究は,テキスト依存型音声認識の基本的な手法である「DP Matching」を利用し,犯人と容疑者が同一人であるかを数値的に判断できるようなシステムの作成を行い,その有用性について検討を行った。まず,DP Matchingから「容疑者(と想定した人)と明らかに別人の音声」及び「容疑者同士の音声」の確率モデルを作成した。次に,容疑者と犯人(と想定した人)についてもDP Matchingを行い,容疑者と犯人の音声の類似度を算出し,「容疑者の音声と犯人の音声が同じ人のものである確率」と「容疑者と犯人が別人の音声ある確率」を求め,これらの確率の比(尤度比)から容疑者と犯人の音声が同一人のものか評価できるか検討を行った。犯人の音声と容疑者との音声について調べたところ,犯人と容疑者が別人の場合,10^-50.9であるのに対し,犯人と容疑者が同一人の場合,尤度比は110であった。この結果から,本モデルを用いることで容疑者と犯人の音声の識別は可能と考えられ,現鑑定手法の補助的な役割を担うことができると考えられた。なお,犯人と容疑者が同一人である音声について,尤度比が1程度と比較的小さなものがいくつか認められた。これは確率モデルの分散が極めて小さいためと考えられ,母集団を増やすことで改善できると考えられた。
冠動脈スパスムの病因に関する分子生物学的研究

冠動脈スパスムは動脈硬化血管の特定刺激に対する収縮反応の亢進と内皮由来血管弛緩因子(EDRF)を介する拡張反応の低下によって生じると考え実証してきた。(1)健常血管と動脈硬化血管におけるPhosphatidylinositol(PI)代謝回転について検討した。動脈硬化血管のセロトニン(5-HT)による収縮反応と32PiのPIへの取り込みは健常血管に比して著しく亢進していた。一方、ノルエピネフリンによる収縮反応と32PiのPIへの取り込みは差を認めなかった。結論として、動脈硬化血管では5-HT刺激にともなう細胞情報伝達機構の異常が存在し、5-HTに対する収縮反応の亢進を生じていることが判明した。(2)ヒスタミン(HA)はH1受容体を介して家兎胸部大動脈標本の収縮反応と32PiのPIへの取り込みを生じ、また、グアニレ-トシクラ-ゼのinhibitorであるメチレンブ-及び内皮剥離によって収縮反応と32PiのPIへの取り込みは増加した。結論として、HAは血管平滑筋細胞でのPI代謝回転を促進し、血管収縮を生じるが、同時に内皮細胞からEDRFを放出して、収縮反応とPI代謝回転にnegative feedーbackをかけていることが判明した。(3)健常人空腹時血漿より分離したLDL及び酸化LDLのEDRFを介する拡張反応に及ぼす影響について検討した。native LDLはEDRFの反応にほとんど影響しなかったが、酸化LDLはEDRFの拡張反応を抑制した。更に、これら酸化LDLのEDRFを抑制するメカニズムとして、酸化の過程で増加するlysophosphatidylcholine(LPC)が抑制物質であることを発見した。(4)コレステロ-ルが家兎大動脈標本におけるlysophospholipaseの活性を抑制することを証明し、これが動脈硬化血管でLPCが増加している一つの原因であることを明らかにした。(5)動脈硬化血管では内皮依存性拡張反応のみならず心房性利尿ペプチドの拡張反応も障害されており、hANP受容体及び膜結合性グアニレ-トシクラ-ゼレベルでの機能異常が存在することを証明した。冠動脈スパスムは動脈硬化血管のセロトニン(5HT)、ヒスタミン(HA)などの特定刺激に対する収縮反応の亢進と内皮由来拡張因子(EDRF)を介する拡張反応の低下によって生じると考え、従来から実験的に薬理学的、生理学的に実証してきた。本年度は次の2点について検討した。(1)HAによる血管平滑筋細胞でのイノシトールリン脂質代謝回転とEDRFによる制御:家兎大動脈標本を用いて、HAによる収縮反応と^<32>Piのphosphatidylinositol(PI)への取り込みを調べた。HAはH_1受容体を介して濃度依存性に収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを生じ、内膜剥離によって収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを20%、30%増加した。Guanylate cyclase inhibitorのメチレン・ブルーはHAによる収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを増強した。EDRFを産生させるA23187はHAによる収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを抑制した。結論としてHAは血管平滑筋細胞のH_1受容体を介してイノシトールリン脂質代謝回転を促進させ、血管収縮を生じるが、同時に内皮細胞からEDRFを放出してnegative feedbackをかけている事が判明した。

(2)健常血管と動脈硬化血管でのイノシトールリン脂質代謝回転:健常家兎と食飼性高脂血症家兎の大動脈標本を用いて収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを調べた。動脈硬化群はその病変の程度によって中等度と軽度に分けた。健常血管では5HTとノルエピネフリン(NE)は5HT_2とα_1受容体を介して濃度依存性に収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みを生じた。中等度動脈硬化血管の5HTによる収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みは健常血管と軽度動脈硬化血管に比して著しく亢進していた。一方、NEによる収縮反応と^<32>PiのPIへの取り込みは3群間で差を認めなかった。結論として中等度動脈硬化血管は5HTに特異的に共役した細胞情報伝達機構の異常が存在し、5HTに対する収縮反応の亢進を生じていることが判明した。冠動脈スパスムは動脈硬化血管のセロトニンなどの特定刺激に対する収縮反応の亢進と内皮由来弛緩因子(EDRF)を介する拡張反応の低下によって生じると考え実証してきた。本年度は次の点において検討した。(1)低比重リポタン白質(LDL)及び変性LDLの血管拡張反応に及ぼす作用:健常人空腹時血漿より超遠心法によりLDLを分離し、家兎胸部大動脈標本を用いてEDRFを介する拡張反応に対する影響を検討した。LDLはアセチルコリンによるEDRFを介する拡張反応に影響しなかった。一方、動脈硬化の発症への関与で注目されている酸化LDL及びホスホリパ-ゼA2処理LDLがEDRFを介する拡張反応を選択的に抑制し、その原因物質が変性の過程で増加するリゾホスファチジルコリン(LPC)であることを発見した。(2)家兎胸部大動脈リゾホスホリパ-ゼ活性をコレステロ-ルが抑制することを見い出し、これが動脈硬化血管においてLPCが増加する一つのメカニズムであることを照明した。(3)動脈硬化血管におけるヒト心房性利尿ペプチド(hANP)の血管拡張反応:遺伝性高脂血症(WHHL)家兎及び健常家兎の胸部大動脈を用いてhANP、アセチルコリン(ACh)、ニトログリセリンの拡張反応を検討した。動脈硬化血管ではEDRFを介する拡張反応のみならず、血管平滑筋に直接作用するhANPの拡張反応も障害されていた。また、動脈硬化血管ではhANPによるcーGMPの上昇も健常血管に比べて低下していた。一方、平滑筋の可溶性グァニ-トシクラ-ゼを活性化して作用するニトログリセリンの拡張反応は保たれていた。動脈硬化血管においてはEDRFを介する拡張反応のみならず、平滑筋の膜結合性グアニレ-トシクラ-ゼを介して作用するhANPの拡張反応も障害されており、血管のト-ヌスの調節異常が生じていることが判明した。
スギ、ヒノキ人工造林地における雑草木群落の動態

本研究では、スギ、ヒノキ人工造林地における雑草木群落とその動きの実態を生態学的な観点からとらえることを主な目的とし、併せて群落の動きと育林・保育との関係について触れた。調査は、房総南部の東京大学千葉演習林内にあるスギ、ヒノキ造林地(主としてスギ試験場地)を対象に行った。各林地では、群落調査として造林木の成長状態と林分構造、雑草木の成長状態、雑草木群落の種類組成と構造などについて、時間とともに変化する群落の動きを調べた。暖温帯に位置する当調査地の79年生スズキ老齢人工林の下層植生は、常緑性多年生草本と常緑広葉樹が量的に主要な植生となっており、近くの極相林(古い天然生林)に見られる種類の植物が多かった。皆伐後の13年目スギ幼齢造林地では、雑草木の種類が非常に多く、多様性に富む植生となっていた。とくに1年目造林地では、1年生草木(ダンドボロギクなど)、2年生草木;ヒメムカシヨモギなど)の大量の侵入、陽生落葉樹の種類の著しい増加が見られた。27年目造林地では、長草型多年生草本のススキが優占種となっていた。ススキは当地歩における下刈りの最も対象となる主要な植物であり、毎年夏季に1回の割りあいで下刈りを実施しても被度と重量が増加した。1625年生スギ閉鎖若齢人工林では、林内が暗く、林床(地上1m高)の相対照度は0.033%である。雑草木の種類数と量(C^^-×H^^-)は極めて少なかった。林床には、つる植物、ユリ科植物、シダ植物、ラン科植物などに属するごく限られた種類の植物が生存していた。調査結果から、当地域(房総清澄山地)におけるスギ造林地の雑草木群落の特徴(植生パターン、状態、動向など)を大まかであるがとらえることができた。1.目的と方法ここでは、スギ,ヒノキ造林地の雑草木群落とその動きについて遷移の観点からの生態学的な検討を行い、併せて雑草木群落の動きが育林・保育に及ぼす影響について調査することを目的とする。調査は、房総南部の東京大学千葉演習林内の既存のスギ,ヒノキ試験地において、以前から設置していた群落調査のための定置枠を使用し、造林木の成長測定や、雑草木の群落測定を実施する。とくに伐採前後における植生推移や、斜面位置のちがい、下刈りの回数及び植裁密度のちがい、間伐の影響等についての雑草木群落とその動態に注目し、調査・分析を行う。2.結果と今後の計画(1)スギ老齢人工林を伐採した跡地(1年目スギ造林地)の植生は、伐採前と比較して種類数が著しく増加し、種類別に多様性に富んだ植生となっていた。(2)斜面の上部は下部と比べて木本植物(萌芽性の常緑広葉樹など)が量的に多く目立っていた。下部では草本が多い。(3)下刈回数が多くなると、草丈の低い広葉型草本が量的に増加していた。(4)スギ造林木の初期植栽密度が高いと下刈りの最も主要な対象植物であるススキの著しい減少が早期から見られたのに対し、シダ類(コバノカナワラビなど)やつる植物は、漸次増大する傾向が見られた。

今後さらに、遷移の観点からの群落の状態診断(植生のパターン,状態,動向など)を基礎にして、スギ,ヒノキ造林地の雑草木群落の動きの実態を明らかにして行きたいと考える。そこで、現場での群落調査を継続し、資料の収集につとめるとともに群落の比較・解析及び分析等を進めて行く予定である。1.目的と方法スギ,ヒノキ造林地の雑草木群落とその動きについて,遷移の観点からの生態学的な検討を行い,併せて雑草木群落の動きが育林・保育に及ぼす影響について調査することを研究の目的とする.調査は,房総南部の東京大学千葉演習林内のスギ,ヒノキ造林地において,以前から定期的に測定を行ってきた群落調査のための固定枠を使用し,造林木の成長測定や,雑草木の群落調査を実施する.とくに当年度は,スギ老齢人工林皆伐前後の雑草木群落を斜面位置別に調べ,皆伐に伴う雑草木群落の変化を追跡した.また下刈終了時前後における雑草木群落の実態を調べ,群落の動きが育林・保育に及ぼす影響についての生態学的な検討を行った.2.結果と今後の計画(1)暖温帯におけるスギ老齢人工林の下層植生は,多年生草本と常緑広葉樹が量的に主要な植生となっており,近くの極相林に見られる種が多かった.(2)皆伐後のスギ1年目造林地では,多年生草本及び常緑広葉樹の激減傾向が見られたのに対し,反対に1年生草本及び2年生(越年生)草木の大量の侵入,陽生落葉樹の種数の著しい増加が見られた.(3)スギ,ヒノキの幼齢造林地において,毎年夏季に1回の下刈が行われても下刈の最も対象となるススキは被度及び重量が年々増大した.この増大傾向は斜面上部で著しい.苗木の樹高が地上2m以上に成長すると(植栽間隔1.5mの方形植え),ススキの量的減少傾向が見られた.それ故,下刈の終了時の目安は,苗木の樹高が2m以上に達した時と予測される.今後さらに現場での群落調査を継続し,既存の資料との比較・解析を行い,遷移の観点からの群落の状態診断を基礎にして,スギ,ヒノキ造林地の雑草木群落とその動きの実態を調査する.1.目的と方法本研究では、スギ、ヒノキ造林地の雑草木群落とその動きの実態を生態学的な観点から検討することを主な目的とし、併せて群落の動きと育林・保育との関係について考察を試みるものである。調査は、房総南部の東京大学千葉演習林内のおもにスギ造林地(既存のスギ試験地)で行った。当年度においては、スギ幼齢造林地において下刈作業を必要とする時期に下刈りを実行しなかった場合どんな林分になってしまうかについて、14年生スギ造林地の下刈区と放置区における林分の現状を調べた。さらに16年生スギ閉鎖若齢人工林の間伐(第1回目の保育間伐)前後における雑草木群落と動態についての調査を行った。2.結果と検討(1)皆伐後のスギ再造林地では、苗木を植えてから14年間全く無手入れのままに放置しても、スギ造林木の生存率は92%以上と高く、下刈区の生存率と殆ど差がなかった。放置区でのスギ生存率の高い理由は、陽樹性落葉広葉樹(つる植物を除く)との種間競争にかなり耐えて生育できるスギ造林木の生育特性によるものである。(2)しかしスギ造林木の大きさにおいては(H,DBH,BA)、下刈区に比して放置区では非常に劣っていた。また雑木によるスギ造林木の被害は(被圧害、曲り木、幹傷害など)、放置区での立木本数の97%以上となっていたのに対し、下刈区では僅かに3%程度に過ぎなかった。(3)スギ閉鎖若齢人工林の調査では、間伐前後の雑草木群落とその動きは、林分構造に対応した林内の明るさと密接な関連が認められる。すなわち、間伐直後の明るい林分では、おもに陽樹性落葉広葉樹の種数の増大が認められ、また間伐前と後の暗い林分では、つる植物、ユリ科植物、シダ植物、ラン科植物などに属するごく限られた種が見られた。
核多角体病ウイルスの宿主域決定機構の解析

マイマイガ由来のLd652Y細胞で増殖可能なLdMNPVのゲノムに特異的にコードされるHRF-1は、Ld652Y細胞で増殖不可能なAutographacalifornica MNPV (AcMNPV)の増殖を促進する因子として同定された。我々はこれまでに、HRF-1は、AcMNPVだけではなくNPV一般のLd652Y細胞における増殖に必須な因子であること、ならびにNPV感染により誘導される抗ウイルス応答である全タンパク質合成停止を排除することを示した。本研究では、HRF-1による全タンパク質合成停止排除の分子機構の理解を目的とし、HRF-1と相互作用する因子の探索を行なった。本研究は、核多角体病ウイルス(NPV)の宿主域決定の分子機構を理解することを目的としている。マイマイガ由来のLd652Y細胞において増殖可能なLdMNPVのゲノムに特異的にコードされるHRF-1は、Ld652Y細胞においては増殖不可能なAutographa californica MNPV (AcMNPV)の増殖を促進する因子として同定された。本研究では、AcMNPV以外のNPVのLd652Y細胞における増殖もHRF-1によって促進されるか否かを調べた。まず、hrf-1を挿入した組換えHypnantria cunea NPV (HycuNPV)と野生型HycuNPVのLd652Y細胞における増殖を比較した。その結果、野生型HycuNPV感染Ld652Y細胞は、抗ウイルス応答である全タンパク質合成停止を誘導し、子孫ウイルスを全く産生しないのに対し、hrf-1を挿入した組換えHycuNPV感染Ld652Y細胞は、子孫ウイルスを産生することが示された。さらに、HRF-1発現Ld652Y細胞における各種NPVの増殖を調べた結果、Ld652Y細胞においてウイルスDNA複製後にウイルス増殖サイクルが停止するBombyx mori NPV (BmNPV)とSpodoptera exigua MNPV (SeMNPV)のLd652Y細胞における増殖もHRF-1によって促進されることが示された。以上の結果は、Ld652Y細胞におけるNPVの増殖を制限する主要な要因は全タンパク質合成停止であること、および全タンパク質合成停止の排除に関わるHRF-1は、NPVのLd652Y細胞における増殖に必須なウイルス因子であることを示す。現在、HRF-1の作用機構を明らかにするために、HRF-1の細胞内局在の解析ならびにHRF-1と相互作用する細胞因子の同定を行っている。本研究は、核多角体病ウイルス(NPV)の宿主域決定機構を分子レベルで理解することを目的としている。我々はこれまでに、HRF-1はAcMNPVだけではなくNPV一般のLd652Y細胞における増殖に必須な因子であることを明らかにした。また、HRF-1はNPV感染によって誘導される抗ウイルス応答である全タンパク質合成停止を排除する機能をもつことも示している。本研究では、HRF-1が全タンパク質合成停止を排除する分子機構を理解することを目的として、HRF-1と相互作用する因子の探索を行なった。
有用ホンダワラ類の不定胚形成機構の解明―新たな海藻産業の創出をめざして－

有用ホンダワラ類の増養殖を推進するため、季節的な限定と労力のかかる有性生殖を通じた種苗生産に代わり、室内培養下で観察された発生初期(初期葉)上の不定胚形成という特異現象(Yoshida et al.1999)を活用し、その機構を解明することにより新たな種苗生産法を提案することを目的とした。初年度(平成28年度)には材料としたホンダワラ類のうち、熱帯性のヒイラギモクにおいて、24°C以上で培養すると正常な形態形成が妨げられ、初期葉において高率で不定胚形成を誘導できることを明らかにした。29年度は不定胚形成の組織学的機構にアプローチし、初期葉の組織細胞のうち、髄層細胞に何らかの変化が起こって不定胚として分化し、発生が開始されることを明らかにした。最終年度(平成30年度)は不定胚由来の個体が通常環境下で正常な成長を示して種苗として使用しうること、また不定胚由来の個体から新たに不定胚が誘導できる(拡大再生産)ことを明らかにして、種苗生産における効率性を試算した。現時点において安定的に不定胚を誘導できるのはヒイラギモクのみであるが、今後はヒジキや他の有用種においても研究を進め、新産業に繋がる有用ホンダワラ類の新たな種苗生産法を確立したい。有用海藻のホンダワラ類において、初期葉(幼体期に形成される葉)上の不定胚の形成という特異な生活環ループの発見(Yoshida et al. 1999)を受け、同現象の機構解明とそれを活用した新しい種苗生産法を確立し、従来の受精卵由来の種苗生産の季節的制約と労力が隘路となっていたホンダワラ類の増養殖に活路を開くことを目的とする。初年度の平成28年度は、ヤツマタモク(山口県産)とヒイラギモク(宮崎県・愛媛県産)を用いて、不定胚の形成とそれを誘導する環境条件について検討した。宮崎県産のヒイラギモクでは単離した幼胚を複数の水温・光周期の組み合わせで培養した結果、18°Cでは初期葉の形成の後、主枝の形成がみられ通常の形態形成が行われたが、24°Cで培養を継続すると、主枝の形成はみられず初期葉が連続的に形成され、さらにかなりの高率で初期葉上に不定胚の形成とその後の発芽がみられた。したがって、「通常の生活環の進行が阻害されたときに、不定胚の形成が起こる」という仮説を裏付けることができた。一方、ヤツマタモクと愛媛県産ヒイラギモクでは不定胚の形成は見られず、同現象の起こりやすさには種間および産地による相違があるものと考えられた。不定胚由来の発芽体を培養した結果、18°Cではやはり通常の形態形成がみられたのに対し、24°Cでは不定胚の形成がみられ、「拡大再生産」による短期間での大量の種苗生産の可能性が示唆された。今後は不定胚由来の種苗を実際の海域で育成してその健苗性を確認するとともに、不定胚由来の種苗生産の現実性(量的な供給およびそのコスト)についても研究を進める。初年度に、高い確率で不定胚形成を起こすホンダワラ類の種と、その培養条件を特定できたことで、2年目以降の研究が大きく進展する足掛かりを得ることができたと考える。当初計画していた、より多くの種について同現象が起こるかどうかの確認や、不定胚形成の組織学的機構の解明についても取組みを開始しており、ほぼ研究は計画通り進行している。有用ホンダワラ類の増養殖を推進するため、季節的な限定と労力のかかる有性生殖を通じた種苗生産に代わり、室内培養下で確認された発生初期の葉(初期葉)上の不定胚形成現象を活用し、その機構・制御メカニズムを解明することにより、新たな種苗生産法を提案することを目的とする。H28年度は暖海性のホンダワラ類であるヒイラギモクを用いて、培養水温の変換(24°C→18°C)により主枝の形成等の通常の形態形成が進行すること、一方24°Cで培養を継続することにより主枝の形成が阻害され、連続的な初期葉の形成が継続し、やがて藻体は極性を失って、初期葉上に高率で不定胚が形成されることを確認した。H29年度は、ホンダワラ類の他種や異なる産地のヒイラギモクを用いて上記現象を確認するとともに、ヒイラギモクを用いて不定胚形成の組織学的機構を明らかにした。ヒジキ、ヤツマタモク、ノコギリモクについて上記の温度条件で培養したが、不定胚の形成は確認できなかった。一方、ヒイラギモクについては宮崎県産、高知県産のものもともに高率で不定胚形成が観察されたので、ヒイラギモクは同現象が誘因されやすい特性を有する種であると考えられた。培養ヒイラギモクの初期葉を細断し、24°Cで培養を続けた結果、2週間以内に各断片からの不定胚の発芽がみられたが、発芽はすべて断面部、すなわち髄細胞層から発出していた。初期葉を薄くスライスし、葉断面の表層細胞、髄層細胞の経時変化を観察した結果、やはり2週間程度で透明であった髄層細胞部が着色し、細胞内部のオルガネラが明瞭に観察されるようになるとともに、細胞分裂を開始し、葉断面部から細胞塊が盛り上がっていく状態へ変化していった。なお、発芽体を葉片から剥離すると3日で基部から仮根を形成した。

研究は当所の計画通り進められ、ホンダワラ類の初期葉上の不定胚形成に表皮細胞ではなく、髄層細胞が関与している可能性が明らかとなり、同現象の組織学的機構の解明に向けて重要な成果を得ることができたと考える。有用ホンダワラ類の増養殖を推進するため、季節的な限定と労力のかかる有性生殖を通じた種苗生産に代わり、室内培養下で観察された発生初期(初期葉)上の不定胚形成という特異現象(Yoshida et al.1999)を活用し、その機構を解明することにより新たな種苗生産法を提案することを目的とした。初年度(平成28年度)には材料としたホンダワラ類のうち、熱帯性のヒイラギモクにおいて、24°C以上で培養すると正常な形態形成が妨げられ、初期葉において高率で不定胚形成を誘導できることを明らかにした。29年度は不定胚形成の組織学的機構にアプローチし、初期葉の組織細胞のうち、髄層細胞に何らかの変化が起こって不定胚として分化し、発生が開始されることを明らかにした。最終年度(平成30年度)は不定胚由来の個体が通常環境下で正常な成長を示して種苗として使用しうること、また不定胚由来の個体から新たに不定胚が誘導できる(拡大再生産)ことを明らかにして、種苗生産における効率性を試算した。現時点において安定的に不定胚を誘導できるのはヒイラギモクのみであるが、今後はヒジキや他の有用種においても研究を進め、新産業に繋がる有用ホンダワラ類の新たな種苗生産法を確立したい。1.ヒイラギモクを材料として、不定胚形成には初期葉のどの部分の組織(あるいは細胞)が関わっているのか、その組織学的機構を明らかにする。2.不定胚の形成のしやすさにおける種間、種内の違いについて、より広範に実験材料を収集し明らかにする。3.不定胚由来藻体について、さらに不定胚形成誘導条件を与える「拡大再生産」により、一定の期間内でどれだけの種苗量の供給が可能か試行する。4.不定胚由来藻体を屋内外の水槽システムで育成し、その健苗性を確認するとともに、増養殖用の種苗サイズまで育成を行う。不定胚形成の過程で、初期葉の組織細胞にどのような変化が起こっているのか、より詳細な解明を進める。また、残念ながらヒジキなどの有用種では初期葉上の不定胚形成は観察できなかった。引き続き異なる培養条件を適用し、初期葉からの不定胚形成の誘導を試みるとともに、代替としてヒジキの再生産において重要である繊維状根からの再生について組織学的な観察を行い、ヒイラギモクと同様の組織細胞の変化がみられるか確認する。また、ヒイラギモクをモデル生物として、不定胚を通じた種苗生産の有効性、採算性などを試算する。当初は、実験材料であるホンダワラ類の成熟藻体の採集のため、宮崎県への出張が計画されていたが、地元研究者の好意により提供を受けることができ、旅費が未使用のまま残った。最終年度である平成30年度は、実験室内(培養庫)ではなく、屋内外飼育施設において、不定胚によるホンダワラ類の種苗生産の効率性、採算性を試算する比較的規模を拡大した実験を行う予定である。そのため、屋内外施設(水槽)の維持管理にともなう人件費が必要となり、比較的小規模な実験を行ったため予想以上にかからなかった平成29年度分の経費の余剰分を、次年度に活用させていただくこととした。研究の効率をあげるため、不定胚由来の種苗の水槽に育成・管理を担当する補助員を雇用することを計画している。
光子ビームによるエキゾティックな 6 クォーク粒子「ダイバリオン」の研究

6つのクォークからなるエキゾティックな粒子「ダイバリオン」の性質を、重陽子標的に対して2つの中性メソンと重陽子を終状態とする光生成反応で詳細に調べる。ダイバリオンの性質を詳細に調べ、存在するダイバリオンの系統性から、強い力で相互作用するクォーク・グルーオンの複合粒子「ハドロン」がどのように構成されるかを解明することを目指す。
脱細胞化異種半月板移植は同種半月板移植に代替するか

半月板損傷に対する切除後欠損に対し、欧米では同種半月板移植が行われるが、抗原性残存、力学的強度低下などの課題が残る。我々はこれらの課題の解決手段として高静水圧印加処理を用いて半月板の脱細胞化が可能であることを検証し、その最適条件(30°C、1000MPaで高圧処理を10分間行った後、DNase含有溶液で3日間の核酸除去処理を37°Cで実施)による脱細胞化半月板と、同種移植の従来法である凍結融解処理半月板を組織学的、生化学的、生体力学的観点から比較・検証した。具体的には、新鮮ブタ膝内側半月板を用いて、脱細胞化半月板と凍結解凍(半月板を-80°Cで冷凍後、37°Cで2分間温浴し解凍)したものを、未処理群を対照とし、組織学・生化学・生体力学的に解析した。生体適合性についてはブタの背部皮下に脱細胞化半月板および凍結解凍半月板を移植し、移植後3、14、28日で組織を採取し組織学的解析を行った。脱細胞群ではHE染色像で核を認めなかった。safranin-o染色像では凍結解凍群、脱細胞群ともに未処理群と比較し染色性の低下を認めた。脱細胞群のdsDNA重量は未処理群、凍結解凍群と比較し有意に約1%まで減少した(P<0.05)。脱細胞群のGAG定量では凍結解凍群と同等であった。脱細胞化半月板の圧縮応力は、生理的な圧縮強度に関しては未処理群や凍結解凍群と比較し有意差は認めなかったが、overloadでの圧縮応力や繰り返し圧縮後の圧縮応力は脱細胞群で未処理群、凍結解凍群と比較し有意に低下した。半月板移植後の炎症細胞数に関して、脱細胞群は凍結解凍群より少なかった。以上より、脱細胞化半月板のほうが凍結解凍半月板よりも機械的強度に関してわずかに劣るが、免疫学的には優れていることが示された。平成30年度の達成目標である動物への移植実験を施行し、脱細胞化半月板の生体内機能評価を行った。高静水圧印加処理を用いた脱細胞化半月板に関して、組織学的、生化学的、生体力学的解析がまだ十分に行われていない。これらに対してpicrosirius red染色を用いたコラーゲン配列、コラーゲンの定量評価、応力緩和等に関する解析をさらに進める。また移植後の脱細胞化組織への細胞浸潤(再細胞化)がまだ未解明であり、生体内移植実験結果をさらに解析する。変形性膝関節症は主に加齢により関節軟骨が摩耗し、疼痛を生じる病態であり、国内に2,500万人罹患している。新鮮ブタ膝内側半月板を用いて、脱細胞化半月板と(半月板を-80°Cで冷凍後、37°Cで2分間温浴し融解した)凍結融解半月板に関して、未処理群を対照とし、組織学・生化学・生体力学的に解析した。組織学的には脱細胞群ではHE染色像で核を認めなかった。safranin-o染色像では脱細胞群、凍結融解群ともに未処理群と比較し若干の染色性低下を認めた。脱細胞群のdsDNA重量は4.9 ±0.8 ng/mgで、未処理群、凍結融解群と比較し有意に約1%まで減少した(P<0.05)。脱細胞群のGAG定量では未処理群と比較すると劣るが、凍結融解群とは同等であった(P=0.093)。圧縮応力は全群で有意差を認めなかった(P=0.38)。この結果を用いて、次に脱細胞化半月板と凍結融解半月板をブタの背部皮下移植実験を行い、その生体適合性に関して検証するin vivo実験を施行した。現在、その結果について解析中である。平成29年度の達成目標である高静水圧印加処理を用いた脱細胞化半月板作成の最適条件の検証を終了し、現在動物への移植実験まで施行し、その結果の考察を行っている最中である。

生体適合性についてはブタの背部皮下に脱細胞化半月板および凍結解凍半月板を移植し、移植後3、14、28日で組織を採取し組織学的解析を行った。脱細胞群ではHE染色像で核を認めなかった。safranin-o染色像では凍結解凍群、脱細胞群ともに未処理群と比較し染色性の低下を認めた。脱細胞群のdsDNA重量は未処理群、凍結解凍群と比較し有意に約1%まで減少した(P<0.05)。脱細胞群のGAG定量では凍結解凍群と同等であった。脱細胞化半月板の圧縮応力は、生理的な圧縮強度に関しては未処理群や凍結解凍群と比較し有意差は認めなかったが、overloadでの圧縮応力や繰り返し圧縮後の圧縮応力は脱細胞群で未処理群、凍結解凍群と比較し有意に低下した。半月板移植後の炎症細胞数に関して、脱細胞群は凍結解凍群より少なかった。以上より、脱細胞化半月板のほうが凍結解凍半月板よりも機械的強度に関してわずかに劣るが、免疫学的には優れていることが示された。平成30年度の達成目標である動物への移植実験を施行し、脱細胞化半月板の生体内機能評価を行った。脱細胞化ブタ半月板をラットへ移植するxenotransplantation実験を行い、組織の拒絶反応を調べ、その生体適合性を検証する。また、脱細胞化ブタ半月板を他の細胞と共培養を行い、脱細胞化ブタ半月板への細胞の遊走・生着に関する検証を行う。最終的に脱細胞化ブタ半月板をイヌなどの中動物へ移植することでその生体適合性および半月板の生着に関して検証する予定である。高静水圧印加処理を用いた脱細胞化半月板に関して、組織学的、生化学的、生体力学的解析がまだ十分に行われていない。これらに対してpicrosirius red染色を用いたコラーゲン配列、コラーゲンの定量評価、応力緩和等に関する解析をさらに進める。また移植後の脱細胞化組織への細胞浸潤(再細胞化)がまだ未解明であり、生体内移植実験結果をさらに解析する。(未使用額が生じた理由)平成29年度に脱細胞化半月板と、凍結融解処理半月板を組織学的、生化学的、生体力学的観点から比較・検証を行い、平成30年度の学会で発表する予定であったが、解析結果が良好であったため、計画を変更して平成29年度に発表を行ったため、追加の解析に必要な物品購入で未使用額が生じた。(次年度における未使用額の使用計画)このため、追加の解析を平成30年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。2018年度に脱細胞化半月板の生体内機能評価を実施し、2019年度には脱細胞化異種半月板移植の計画を進める予定であったが、解析結果が良好であったため、計画を変更して2018年度に発表を行ったため、2018年度に実施する解析に必要な物品購入で未使用額が生じた。(次年度における未使用額の使用計画)このため、2019年度に脱細胞化半月板の解析をさらに進めることとし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
マイクロパターン電極による細胞機能制御に関する研究

1.マイクロパターン電極の試作本課題補助金により、1mum程度の精度で位置制御を行えるXYZ軸ステージおよび専用コントローラを購入した。既有のパーソナルコンピュータにコントローラを接続して、任意の経路をパーソナルコンピュータ上でプログラムすることができる。現在の問題は、光硬化性樹脂を硬化させるための光学系である。資金不足で紫外線レーザを購入出来なかったため、水銀ランプを光源として、レンズ系でスポットサイズを絞る方法を検討しているが、必要精度にはかなり開きがあるのが現状である。小口径の光ファイバを通して、光源のサイズを小さくする方法を検討する予定である。以上の様に現時点ではマイクロパターン電極の製作には成功していない。2.細胞培養電極の自作の困難のため、某企業に、VLSIプロセスで幅2mumの櫛型電極を試作を依頼し、マウス繊維芽細胞由来のL細胞を、DC数100mVの電圧を印加した電極上で試験的に培養した。現時点では、電圧を印加した場合、細胞の偽足形成を抑制する傾向があるという結果が得られている。確証を得るためには、さらに詳しく検討していく必要があるが、マイクロパターン電極による刺激は細胞の機能制御に有効であると期待している。
耕地環境におけるイネの雑草化機構の生態遺伝学的解析

1.長野県に発生する雑草イネは、出穂後約2週間目から自然脱粒を開始し、脱粒した籾は帯緑籾であっても80%以上の高い発芽能力を有していた。また、脱粒した籾の約0.1%は休眠性(翌春に好適な条件下においても発芽しない能力)を有していた。長野県(須坂市)の圃場において、脱粒した籾の越冬能力を調査した結果、地表面においては15±13%、土壌中では43±33%の籾が翌春まで生存していた。特に、近年(2002年)採取された雑草イネの多くは1970年代に採取された雑草イネよりも越冬能力が高かった。休眠性(出穂後100日目の発芽率で評価)が強いほど、越冬能力が高くなる傾向にあったが、出芽開始時期、出芽最盛期、出芽継続期間等と休眠性との間には一定の関係が見られなかった。以上の結果から、雑草イネの手取りによる防除適期は出穂後2週間以内であり、籾が脱粒した場合には、秋起することなく地表面で越冬させることにより埋土種子化を抑制できることが示唆された。また、近年発生している雑草イネは越冬能力においても難防除化しており、このことが発生拡大の一因となっていることが示唆された。2.岡山県に発生する雑草イネは、特定の栽培品種と生理形態的・遺伝的に極めて類似しているが、収穫期前にほとんどの籾が自然脱粒する特徴を持つことから、イネの脱粒性に関わる遺伝子がqSH1(Konishi et al.2006)およびsh4(Li et al.2006)について雑草イネと栽培品種との比較解析を行った。その結果、雑草イネとそれらに対応する栽培品種(朝日、アケボノ、雄町)は全てqSH1機能型、sh4非機能型であり、雑草イネと栽培品種の間に差異は見られなかった。以上の結果から、雑草イネの自然脱粒性はqSH1、sh4以外の遺伝領域によって制御されていることが示唆された。1.水稲乾田直播栽培が行われている岡山県のH地区において発生した雑草イネ23系統について,ふ毛長,フェノール反応,KC董03反応から日本型・インド型を判別した結果,8地区では日本型(14系統),1地区ではインド型(2系統),2地区では両型(日本型4系統,インド型3系統)の雑草イネが発生していた.さらに.これらの雑草イネの稈長到穂日数,穂首抽出長,籾長幅比の4形質から,クラスター分析を行った結果,いずれかの形質に顕著な特徴をもつ9つのタイプに分けられた.日本型雑草イネの多くは,発生した圃場に作付けきれていた栽培イネ(アケボノおよび雄町)に稈長,出穂日など多くの形質が似ていたが(タイプ1および3),アケボノよりも稈長が約15cm短い系統(タイプ2)や出穂日がアケボノよりも2または3週間早い系統(タイプ5および6)なども存在した.一方,インド型の雑草イネは,発生した圃場に作付けされていた栽培イネとは形態が著しく異なり,アケボノよりも稈長が約30c斑長い系統(タイプ7),あるいは約50c田短い系統(タイプ9)が存在した.これらの雑草イネのタイプを発生地区に対応させると.日本型雑草イネは20km以上離れた地区に発生していたが,インド型雑草イネは半径3km以内のごく限られた地区に発生していた.2.長野県の現地調査では、主に水稲湛水直播栽培を行う地域で、雑草イネの発生圃場の増加が確認された。長野県の雑草イネの発生は,過去30年間で約30km離れた地域へ拡大した.また近年発生する雑草イネは.1970年代よりも稈長が短く、出穂が早く、休眠が深いタイプが優占していた。出穂時の手取り除草が最も一般的な雑草イネの防除方法であったことから、上記の形質め変化は除草のより困難な特性を持つ雑草イネが選抜された結果であると考えられた。1.長野県および岡山県から収集した雑草イネ系統について、雑草化に関わる重要形質である休眠性を調査した。出穂後100日目の発芽調査の結果、播種後30日以内に95%以上の種子が発芽する系統が最も多かった(Type1、全体の約75%)。これに対し、播種直後から発芽を開始するが、Type1よりも発芽が著しく遅延(最長で播種後約200日目に発芽終了)する系統(Type2、約18%)や、播種直後は発芽せず、一定期間を過ぎると徐々に発芽が進む系統(Type3、約7%)が存在した。雑草イネの発生地区ごとに比較すると、長野県・岡山県ともに、発生が著しい地区から採種される雑草イネは休眠が深い傾向にあった。2.岡山県に発生した日本型雑草イネと栽培イネとの類縁性について、栽培イネ130品種が識別可能な15種類のSTSマーカー(新村ら2005)を用いて遺伝解析を行った。その結果、日本型雑草イネの約60%は、栽培品種「アケボノ」とバンドパターンが一致した。

「アケボノ」は雑草イネが発生した圃場の約85%で栽培されていた品種であり、上記の日本型雑草イネの大半は「アケボノ」に形態的にも酷似していた(牛木2005)。さらに、品種「雄町」の栽培圃場から採取され「雄町」とよく似た形態をもつ雑草イネ系統は、「雄町」と同じバンドパターンを示した。以上のことから、岡山に発生する日本型雑草イネの多くは、発生した圃場における栽培品種と形態的に類似しているだけでなく、DNAレベルでも高い相同性を示すことが明らかとなった。1.長野県に発生する雑草イネは、出穂後約2週間目から自然脱粒を開始し、脱粒した籾は帯緑籾であっても80%以上の高い発芽能力を有していた。また、脱粒した籾の約0.1%は休眠性(翌春に好適な条件下においても発芽しない能力)を有していた。長野県(須坂市)の圃場において、脱粒した籾の越冬能力を調査した結果、地表面においては15±13%、土壌中では43±33%の籾が翌春まで生存していた。特に、近年(2002年)採取された雑草イネの多くは1970年代に採取された雑草イネよりも越冬能力が高かった。休眠性(出穂後100日目の発芽率で評価)が強いほど、越冬能力が高くなる傾向にあったが、出芽開始時期、出芽最盛期、出芽継続期間等と休眠性との間には一定の関係が見られなかった。以上の結果から、雑草イネの手取りによる防除適期は出穂後2週間以内であり、籾が脱粒した場合には、秋起することなく地表面で越冬させることにより埋土種子化を抑制できることが示唆された。また、近年発生している雑草イネは越冬能力においても難防除化しており、このことが発生拡大の一因となっていることが示唆された。2.岡山県に発生する雑草イネは、特定の栽培品種と生理形態的・遺伝的に極めて類似しているが、収穫期前にほとんどの籾が自然脱粒する特徴を持つことから、イネの脱粒性に関わる遺伝子がqSH1(Konishi et al.2006)およびsh4(Li et al.2006)について雑草イネと栽培品種との比較解析を行った。その結果、雑草イネとそれらに対応する栽培品種(朝日、アケボノ、雄町)は全てqSH1機能型、sh4非機能型であり、雑草イネと栽培品種の間に差異は見られなかった。以上の結果から、雑草イネの自然脱粒性はqSH1、sh4以外の遺伝領域によって制御されていることが示唆された。
心室性不整脈の発生におけるＳＧＬＴ１の活性化の関与

今回の研究から、急性虚血で誘発される心室性頻脈性不整脈の発生にSGLT1は、細胞内カルシウム過負荷とそれに伴う興奮は伝導速度の低下に関与している可能性が示唆された。さらに慢性的心臓圧負荷によって心筋のSGLT1遺伝子およびタンパク発現が増加していることが証明され、SGLT1遺伝子欠損マウスでは、この慢性的心臓圧負荷で誘発された心筋リモデリング(心筋肥大、左心室筋組織の線維化の増大)、心不全(左室短縮率の低下)および心室性頻脈性不整脈の発症抑制される可能性が示唆された。本研究から、新規抗不整脈薬開発および心不全治療薬としてのSGLT1阻害薬の可能性について新しい知見が得られた。本研究の目的:心筋梗塞や心不全の進展に伴い発生する心室性不整脈は,患者の死亡率を増加させることが知られており,本不整脈の治療法の確立は非常に重要である。本研究では、人の心臓にも発現していて、病的心筋でその発現量が増加していることが明らかにされたナトリウムーグルコース共輸送機構1が、急性および陳旧性心筋梗塞や心不全に伴い発生する心室性不整脈に直接関与しているか検討することである。研究成果:昨年度の結果を踏まえて今年度は、病的心筋でのナトリウムーグルコース共輸送機構1の役割を検討するため、ナトリウムーグルコース共輸送機構1の遺伝子改変マウスを用いた検討を行なった。ナトリウムーグルコース共輸送機構1の遺伝子改変(SGLT1-KO)マウスを用いて大動脈球部を狭窄させた圧負荷心不全マウス(TACマウス)を作成し、昨年同様の実験を行なった。2,4,6週後に心臓超音波をおこない、TACを施行したSGLT1を発現している(WT)マウスとSGLT1-KOマウスでは、後者で左室短縮率の低下が抑制される可能性が示唆された。6週後のマウスにおいて、体表面心電図上、心室性期外収縮発生は、WTマウスと比較して差がなかった。摘出心室筋標本を用いて、Real time RT-PCRをおこない、WTのTACマウスでは心筋においてSGLT1遺伝子の発現量が増加していた。またウエスタンブロット法による心筋でのSGLT1タンパク発現量の定量において、WTのTACマウスではその増加が認められる一方、SGLT1-KOマウスでは蛋白の発現は認められなかった。昨年の結果と今回の結果から、慢性的心臓圧負荷によって誘発させる心不全にSGLT1の発現増加が重要であり、心不全誘発心室性不整脈発生へのSGLT1の関与が疑われる結果を得た。研究の目的:心筋梗塞や心不全の進展に伴い発生する心室性不整脈は,患者の死亡率を増加させることが知られており,本不整脈の治療法の確立は非常に重要である。研究成果:まず大動脈球部を狭窄させた圧負荷心不全マウスを作成した。2,4,6週後に心臓超音波をおこない、正常マウスと比較して圧負荷心不全マウスでは、左室短縮率の低下を確認し心不全が引き起こされていることが示された。圧負荷施行後6週のマウスにおいて体表面心電図上、心室性不整脈の自然発生は、正常マウスと比較して差がなかった。摘出心室筋標本を用いたリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応では、圧負荷心不全マウスで正常マウスと比較してナトリウムーグルコース共輸送機構1遺伝子の発現量が増加していた。ウエスタンブロット法によるアデノシン一リン酸-活性化プオロテインキナーゼ発現量の定量において、圧負荷心不全マウスでは正常マウスと比較してそのの増加が認められた。加えてアデノシン一リン酸-活性化プオロテインキナーゼの活性化因子を投与したマウスでは、正常マウスと比較してナトリウムーグルコース共輸送機構1遺伝子の発現量が増加していることもわかった。意義と重要性:本年度の研究から、慢性的圧負荷による心不全においては、アデノシン一リン酸-活性化プオロテインキナーゼの活性化を介してナトリウムーグルコース共輸送機構1の発現が増加することが示唆された。この結果は、心不全誘発心室性不整脈発生に対するナトリウムーグルコース共輸送機構1の関与についての研究の進展に寄与する重要な知見である。本年度は、昨年同様に正常マウス(WT)とナトリウムーグルコース共輸送機構1の遺伝子改変(SGLT1-KO)