hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
晩発性パーキンソン病原因遺伝子産物タンパク質ネットワークの包括的解析

晩発性パーキンソン病原因遺伝子産物であるLRRK2は、同一分子内にGTPaseドメインとキナーゼドメインを有する巨大なタンパク質である。LRRK2のミスセンス変異により発症するパーキンソン病は優性遺伝形式をとるため、タンパク質の機能獲得による神経変性であると考えられている。我々はLRRK2結合タンパク質の同定から、LRRK2の機能とその破綻による神経変性メカニズムにアプローチした。LRRK2の結合タンパク質LBP1, LBP2は、ドメイン構造からそれぞれユビキチンリガーゼとアダプタータンパク質と考えられる。ショウジョウバエを用いた遺伝的相互作用から、LRRK2,LBP1,LBP2はNotchシグナルのリガンドDelta/Dll1のエンドサイトーシスと小胞輸送を経由した細胞膜へのリサイクリングに関与することが明らかとなった。その結果、細胞膜状で安定化したDelta/Dll1がNotch受容体の機能を阻害(側方抑制)することを観察した。in vivoにおいてLBP1, LBP2を含むLRRK2複合体がNotchシグナルを抑制することを、マウス胚脳およびショウジョウバエの羽の発生により確認した。次に、Notchシグナルの抑制が成熟ドーパミン神経でどのような影響を及ぼすのかをショウジョウバエにおいて観察した。その結果、Notchのノックダウンがドーパミン神経の機能を抑制し、寿命が短縮することを観察した。現在、Notchシグナルが成熟したドーパミン神経の神経活動に関与しているかどうかを解析中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。LRRK2にリンクする晩発性遺伝性パーキンソン病は、孤発性パーキンソン病の多くの特徴を有している。また家族歴のないパーキンソン病患者からもLRRK2変異が見つかることから、LRRK2シグナルの異常がパーキンソン病病理の根幹をなすと考えられる。優性遺伝をとることから、アミノ酸置換に起因する機能獲得変異が神経変性の原因になると考えられているが、その詳細は不明である。LRRK2はキナーゼをコードしておりシグナル伝達に関与すると考えられることから、LRRK2結合タンパク質の同定からLRRK2シグナルの解明を試みた。その結果、複数(約100種類)の結合タンパク質を検出したが、さらにショウジョウバエを用いた機能的スクリーニング行い、2種類の結合タンパク質(LBP1,LBP2)を同定した。LBP1,LBP2のアミノ酸配列およびショウジョウバエを用いた遺伝的解析から、両分子はNotchシグナルに関与する可能性が考えられた。培養細胞共培養系(Notch受容体を発現する細胞とNotchリガンドDLL1を発現する細胞の混合培養)のHesl promoterを用いたレポーターアッセイ、マウス胚へのin uteroelectroporationによる遺伝子導入により、LRRK2/LBP1/LBP2はNotchシグナルを抑制することが示唆された。さらに、LRRK2/LBP1/LBP2の発現が胚の神経発生時において、神経分化を促進することを見出した。この観察が神経変性に関与するか今後検討する予定である。LRRK2結合分子が関与するシグナル伝達がNotchシグナルであることを明らかにし、次年度このシグナルに焦点を絞って解析するための道筋をつけることができた。LRRK2はキナーゼをコードしており、リン酸化を介したシグナル伝達機構があると考えられる。NotchシグナルやLBP1,LBP2複合体の機能制御に、LRRK2キナーゼ活性が必要かどうか検討していく必要がある。また、LRRK2/LBP1/LBP2は、エンドソームに局在することが観察されたが、初期、後期、リサイクリングいずれのエンドソームで機能するかを今後解明していく予定である。
知的電子システムのための科学的LSI製造技術の研究

研究代表者らは、人間のようにしなやかな機能を持つハードウェア、すなわち"フレックスウェア"と呼ばれる新概念の電子回路技術をベ一スにした知的電子システムを世界に先駆けて提唱してきた。本研究では、このシステムの具現化に要求される高精度、高性能半導体製造プロセス技術を、研究代表者らがこれまで世界を先導して開発してきたウルトラクリーン化技術をベースに開発した。まず、科学的な見地から半導体プロセスの問題点を徹底的に究明し、プロセス装置が満たさなければならない条件を明確にした。これをもとに、全く新しい2つのプラズマプロセス装置、すなわちプラズマCVD、酸化、窒化及びレジストアッシング用のラジアルラインスロットアンテナマイクロ波プラズマプロセス装置と、反応性イオンエッチング及びスパッタ成膜用の平衡電子ドリフトマグネトロンプラズマプロセス装置を独自に考案し、開発を行った。本研究で開発したマイクロ波プラズマ励起技術は、高密度で非常に電子温度が低い理想的なプラズマを大口径基板上に均一に生成することができる画期的な技術である。このプラズマ励起技術とウルトラクリーン化技術を導入したプロセス装置を用いて、シリコン表面の酸化や窒化を行う技術を開発した。その結果、基板温度400°Cという低温で基板温度1000°Cの熱酸化膜より優れた特性のゲート酸化膜を形成することに成功した。さらに、次世代の高性能デバイスに必須となる高誘電率ゲート窒化膜を、同様に基板温度400°Cという低温で形成することに成功した。電気的特性においても他の技術を圧倒する高品質ゲート窒化膜が得られており、世界中から注目を集めている。これらの新技術により、全てのプロセスを500°C以下の低温で行うトータル低温化プロセスが初めて可能となり、新構造新材料を多用した超高性能デバイスが核となる知的電子システム実現への道が開かれた。研究代表者らは、人間のようにしなやかな機能を持つハードウエア、すなわち"フレックスウエア"と呼ばれる新概念の電子回路技術をベースにした知的電子システムを世界に先駆けて提案している。知的電子システムを具現化するには、従来のデジタルシステム以上に完全に制御された高精度、高性能半導体プロセス技術が要求される。東北大学研究者は、これまで開発してきたウルトラクリーン化技術をベースに、知的電子システム具現化に不可欠な超高精度プラズマプロセス技術を開発した。科学的な見地からプロセスの問題点を究明した上で、大口径薄膜形成プロセスのためのマイクロ波プラズマ装置、及び大口径反応性イオンエッチングブロセスのための平行平板マグネトロンプラズマ源の開発を行った。マイクロ波プラズマ源については、プラズマパラメータの空間分布を解析し、さらにマイクロ波プラズマの自己均一化現象を解析した。平行平板プラズマについては、電子ドリフトに基づくプラズマ不均一化現象を解明し、補助電極への高周波印加によるプラズマ均一化技術を開発した。これら研究成果を基に、低エネルギーイオン照射による低温高品質薄膜形成技術について研究を継続中である。高品質な極薄ゲート酸化膜、低温直接窒化膜、高電子移動度を有するポリシリコン薄膜形成技術が完成されつつある。米国側研究者は、LSI製造システム全体の観点からプロセス技術に要求される性能を明らかにし、コンタミネーションフリー製造のプロセスインテグレーションの方向を明らかにした。研究代表者らは、人間のようにしなやかな機能をもつハードウェア、すなわち"フレックスウェア"と呼ばれる新概念の電子回路技術をベースにした知的電子システムを世界に先駆けて提唱してきた。本研究では、このシステムの具現化に要求される高精度、高性能半導体製造プロセス技術を、研究代表者らがこれまで世界を先導して開発してきたウルトラクリーン化技術をベースに新たな基幹技術の開発を行った。

これをもとに、全く新しい2つのプラズマプロセス装置、すなわちプラズマCVD、酸化、窒化及びレジストアッシング用のラジアルラインスロットアンテナマイクロ波プラズマプロセス装置と、反応性イオンエッチング及びスパッタ成膜用の平衡電子ドリフトマグネトロンプラズマプロセス装置を独自に考案し、開発を行った。本研究で開発したマイクロ波プラズマ励起技術は、高密度で非常に電子温度が低い理想的なプラズマを大口径基板上に均一に生成することができる画期的な技術である。このプラズマ励起技術とウルトラクリーン化技術を導入したプロセス装置を用いて、シリコン表面の酸化や窒化を行う技術を開発した。その結果、基板温度400°Cという低温で基板温度1000°Cの熱酸化膜より優れた特性のゲート酸化膜を形成することに成功した。さらに、次世代の高性能デバイスに必須となる高誘電率ゲート窒化膜を、同様に基板温度400°Cという低温で形成することに成功した。電気的特性においても他の技術を圧倒する高品質ゲート窒化膜が得られており、世界中から注目を集めている。これらの新技術により、全てのプロセスを500°C以下の低温で行うトータル低温化プロセスが初めて可能となり、新構造新材料を多用した超高性能デバイスが核となる知的電子システム実現への道が開かれた。
マウス肝ミトコンドリアのATPaseインヒビターとその安定化因子の精製

ミトコンドリアのF_1Fo-ATPaseはATPaseインヒビター蛋白とその安定化因子(15K蛋白、9K蛋白)によって活性調節がなされている。ATPaseインヒビターは従来、酵母や牛心筋で研究されてきたが、本研究では最近Gene Targettingなどの遺伝子操作法が確立されつつあるマウスのATPaseインヒビターと安定化因子の精製および構造決定を目的とした。実験に先立ち、まず同じげっ歯類に属するラットの肝からのATPaseインヒビターの精製を試みたが100頭余りのラットからわずかのATPaseインヒビターしか単離されなかった。時を同じくしてアメリカのRouslinら(1993)はラット、マウスを含むげっ歯類にはATPaseインヒビターは非常にわずかしか存在しないとの報告を行った。しかし、Higuchiら(1992)、Pedersenら(1993)は牛のインヒビターのcDNAをプローブとして、ラット肝のインヒビターのcDNAをクローン化した。げっ歯類におけるATPaseインヒビターの作用についてはまだ問題があると思われたので、ラットのATPaseインヒビターのcDNAの微生物での発現およびそのCharactrizationを試みることにした。cDNAはHiguchiらが決定した塩基配列に基づき、ラット肝cDNAライブラリーからPCRによって単離した。pUC119にサブクローニングしたcDNAの塩基配列はHiguchiらのものと完全に一致した。このcDNAを酵母の発現ベクターであるYEp51のGAL10プロモーターの下流にクローニングした後、酵母のATPaseインヒビター欠損株であるD100株へ導入した。しかしこの菌体から熱抽出した蛋白質画分からATPaseインヒビターの活性を検出する事はできなかった。今後酵母の発現系での発現条件の再検討、また大腸菌での発現系の検討を行いたい。
レジン支台築造における直接法と間接法による保持力の研究

本研究では,直接法および間接法で製作したファイバーポスト併用コンポジットレジン支台築造の引き抜き強さの測定,および引き抜き様相の観察を行った.試料の製作にはヒト抜去単根歯歯根を使用し,実際の臨床を想定して実験を行った.使用したファイバーポストは,ジーシーファイバーポスト(ジーシー社製)φ1.4mmで,根管形成は専用ドリルで深さ6mmまで行った.間接法ではこの時点で印象採得を行い,ファイバーポスト併用レジン支台築造体を模型上で製作した.使用した支台築造用および接着用コンポジットレジンはクリアフィルDCコアオートミックス・DCボンドシステム(略号DCB)およびフォトボンドシステム(DCP)(クラレメディカル社製),試作CRコアシステム(トクヤマ社製:ESC),ユニフィルコア(ジーシー社製:UC)の4種類とした.試料数は各条件10試料ずつとした.直接法ではファイバーポストを,間接法では製作したレジン築造体を接着し,試料の完成とした.万能試験機オートグラフAGS-5kNDにてクロスヘッドスピード0.75mm/minで引き抜き試験を行い,引き抜き強さを測定し,また試験後各破折様相に分類した.一元配置分散分析後Tukeyの多重比較を行った結果,直接法では最大値を示したDCBの引き抜き強さに対してDCPとESCとの間に有意な差が認められた.一方,間接法では,DCBとUCに対してDCPとESCとの間に有意な差が認められた.直接法と間接法の引き抜き強さを比較した結果(t検定)ESCとUCでは有意差は認められなかった.また,各条件における破折様相ではレジン/ポストでの界面破壊が一番多く認められた(69/80試料).本研究の結果,接着時のコントロールがしやすく,模型上で形態付与ができるという利点を持つ間接法の有用性が示唆された.本研究では,ファイバーポスト併用コンポジットレジン支台築造の引き抜き強さの測定,および引き抜き様相の観察を行った.試料の製作にはヒト抜去単根歯歯根を使用し,実際の臨床に沿った形で実験を行った.使用したファイバーポストは,ジーシーファイバーポスト(ジーシー社製)φ1.4mmで,根管形成はφ1.6mmの専用ドリルで深さ6mmまで行った.ファイバーポストの接着には,ユニフィルコア(ジーシー社製:略号UC),DCコアオートミックス,パナビアF2.0(クラレメディカル社製:略号DA, PF),スーパーボンドC&B L-type(サンメディカル社製:略号SB)の4種類の接着システムを使用した.試料数は各条件10試料ずつとした.本年度は直接法のみの研究とし,接着1時間後,37°C水中に24時間浸漬した後,万能試験機オートグラフAGS-5kNDにてクロスヘッドスピード0.75mm/minにて引き抜き試験を行い,試験後引き抜いたファイバーポスト表面を肉眼およびデジタルマイクロスコープ(キーエンス社製)にて観察,各破折様相に分類した.引き抜き強さの平均値と標準偏差は,UC245.7N(S.D.50.8), DA220.4N(S.D.50.7), PF136.9N(S.D.52.3), SB217.8N(S.D.51.0)であった.一元配置分散分析後,Tukeyの多重比較を行った結果,パナビアF2.0で接着した群には,他の接着システムを使用した群と比較して有意な差が認められた.また,各条件における破折様相の分類は,UC, DAにおいて20試料中19試料で接着材とポストとの界面破壊を呈していた.PFでは5試料で接着材と象牙質との界面破壊を,残りの5試料で接着材とポストとの界面破壊を呈していた.SBでは8試料で接着材と象牙質との界面破壊を,残りの2試料で他の接着材ではみられなかった接着材の凝集破壊が認められた.来年度は,間接法により製作したファイバーポスト併用コンポジットレジン支台築造の引き抜き試験および引き抜き様相の観察を行い,本年度と比較検討する予定である.本研究では,直接法および間接法で製作したファイバーポスト併用コンポジットレジン支台築造の引き抜き強さの測定,および引き抜き様相の観察を行った.試料の製作にはヒト抜去単根歯歯根を使用し,実際の臨床を想定して実験を行った.使用したファイバーポストは,ジーシーファイバーポスト(ジーシー社製)φ1.4mmで,根管形成は専用ドリルで深さ6mmまで行った.間接法ではこの時点で印象採得を行い,ファイバーポスト併用レジン支台築造体を模型上で製作した.使用した支台築造用および接着用コンポジットレジンはクリアフィルDCコアオートミックス・DCボンドシステム(略号DCB)およびフォトボンドシステム(DCP)(クラレメディカル社製),試作CRコアシステム(トクヤマ社製:ESC),ユニフィルコア(ジーシー社製:UC)の4種類とした.試料数は各条件10試料ずつとした.直接法ではファイバーポストを,間接法では製作したレジン築造体を接着し,試料の完成とした.万能試験機オートグラフAGS-5kNDにてクロスヘッドスピード0.75mm/minで引き抜き試験を行い,引き抜き強さを測定し,また試験後各破折様相に分類した.一元配置分散分析後Tukeyの多重比較を行った結果,直接法では最大値を示したDCBの引き抜き強さに対してDCPとESCとの間に有意な差が認められた.

一方,間接法では,DCBとUCに対してDCPとESCとの間に有意な差が認められた.直接法と間接法の引き抜き強さを比較した結果(t検定)ESCとUCでは有意差は認められなかった.また,各条件における破折様相ではレジン/ポストでの界面破壊が一番多く認められた(69/80試料).本研究の結果,接着時のコントロールがしやすく,模型上で形態付与ができるという利点を持つ間接法の有用性が示唆された.
アモルファス窒化炭素薄膜のすぐれたナノ耐摩耗性機構の解明

【アモルファス窒化炭素薄膜の作製】本研究では,以下の手法を用いて窒化炭素薄膜の作製を行った。(I)シールド型アークイオンプレーティング装置:ターゲットには純度99.999%のグラファイト焼結体を用いた.成膜パラメータとして,導入ガス組成および基板バイアスを制御した.(II)誘導結合型高周波プラズマCVD装置:原料ガスとしてメタンおよび窒素を用い,成膜パラメータとして,基板バイアスを制御した.(III)真空紫外光CVD装置:原料ガスとしてピラジン,ピリミジン等の含窒素複素芳香族分子を用い,成膜パラメータとして原料分子の種類と基板温度を変化させた.【アモルファス窒化炭素薄膜の化学結合状態】経験的分子軌道法を用いて,アモルファス窒化炭素のXPS Nls, Clsスペクトルの化学結合状態解析を行い,さらにIR,ラマン,ESRおよび固体NMRの測定結果を総合して,作製膜の化学結合状態を明らかにした.(I),(II)で作製した試料は,基本的に窒素含有SP^2 C(SP^2 C : N)ネットワークが主体となっており,Nの存在によってその秩序度が低下している.基板バイアスの印加は,Nを選択スパッタリングさせる効果と,-Hや≡N等の終端構造を除去する効果を有する.前者はsp^2 C : Nの秩序度の上昇に伴うグラファイト化を引き起こし,後者はネットワークユニット間の架橋構造を増加させる.一方,(III)で作製した試料は,基本的に光開裂した原料分子フラグメントの重合的結合状態である.基板温度の上昇は,窒素含有フラグメントの脱着のため,窒素組成の低下と成膜速度の大幅な減少を引き起こす.【化学結合状態と機械的特性の相関】秩序度の低いsp2 C : Nネットワークと,それらのネットワークユニット間の架橋結合の存在が,アモルファス窒化炭素の優れた機械的特性の根本であることが明らかとなった.【アモルファス窒化炭素薄膜の作製】本研究では,以下の手法を用いて窒化炭素薄膜の作製を行った。(I)シールド型アークイオンプレーティング装置:ターゲットには純度99.999%のグラファイト焼結体を用いた.成膜パラメータとして,導入ガス組成および基板バイアスを制御した.(II)誘導結合型高周波プラズマCVD装置:原料ガスとしてメタンおよび窒素を用い,成膜パラメータとして,基板バイアスを制御した.(III)真空紫外光CVD装置:原料ガスとしてピラジン,ピリミジン等の含窒素複素芳香族分子を用い,成膜パラメータとして原料分子の種類と基板温度を変化させた.【アモルファス窒化炭素薄膜の化学結合状態】経験的分子軌道法を用いて,アモルファス窒化炭素のXPS Nls, Clsスペクトルの化学結合状態解析を行い,さらにIR,ラマン,ESRおよび固体NMRの測定結果を総合して,作製膜の化学結合状態を明らかにした.(I),(II)で作製した試料は,基本的に窒素含有SP^2 C(SP^2 C : N)ネットワークが主体となっており,Nの存在によってその秩序度が低下している.基板バイアスの印加は,Nを選択スパッタリングさせる効果と,-Hや≡N等の終端構造を除去する効果を有する.前者はsp^2 C : Nの秩序度の上昇に伴うグラファイト化を引き起こし,後者はネットワークユニット間の架橋構造を増加させる.一方,(III)で作製した試料は,基本的に光開裂した原料分子フラグメントの重合的結合状態である.基板温度の上昇は,窒素含有フラグメントの脱着のため,窒素組成の低下と成膜速度の大幅な減少を引き起こす.【化学結合状態と機械的特性の相関】秩序度の低いsp2 C : Nネットワークと,それらのネットワークユニット間の架橋結合の存在が,アモルファス窒化炭素の優れた機械的特性の根本であることが明らかとなった.本年度の研究成果は以下のとおりである。(1)ラマンスペクトル測定システムの構築:アモルファス窒化炭素(a-C:N)薄膜中の化学結合状態,特にC-Nネットワーク中のsp結合組成の分析に必要なラマンスペクトル測定装置および光学アタッチメントを,設備備品として購入した.本格的な測定は来年度以降に行う.(2)a-C:N薄膜の作製:本年度は,シールド型アークイオンプレーティング法において重要な成膜パラメータのひとつである基板バイアスに焦点を当て,作製膜の機械的特性(硬度,耐摩耗特性)および化学結合状態の基板バイアス依存性を調査した.直流バイアス印加時には,バイアス値を0-500Vで変化させ,パルスバイアス印加時には,Duty比を50%一定として,バイアス値を0-500V,周波数を10500Hzにそれぞれ変化させて成膜を行った.炭素源として高純度グラファイトターゲット,窒素源として高純度窒素ガスを用いた.(3)a-C:N薄膜の機械的特性評価:直流バイアスに対しては,0-500Vの範囲において,硬度は-25Vで極大値16.5GPaとなり,バイアス値が高くなるにつれて緩やかに減少した.一方,耐摩耗特性評価における摩耗痕深さは,-150Vで極小を示した.これらの実験結果は,X線光電子分光分析により得られた,作製膜の化学結合状態と相関があり,硬度にはsp^3-C,C-NおよびC=N結合が,耐摩耗特性にはC-N結合が関係していることがわかった.パルスバイアス印加の場合,全体としては直流バイアス印加時とほぼ同様の依存性を示したが,-25Vにおける硬度の鋭い極大ピークを示さなかった.

したがって,本研究で行った成膜条件の範囲内では,バイアス印加をパルス化することによる,機械的特性の向上は認められなかった.(4)a-C:N薄膜の電界電子放射特性評価:作製膜の電界電子放射特性は,成膜時に印加したパルスバイアスの周波数に対して依存性を示した.しきい値電界は,バイアスパルス周波数200Hzにおいて5V/μmの最小値を,また最大電流密度は,同50Hzにおいて20A/cm^2を示した.本年度の研究成果は以下のとおりである.【アモルファス窒化炭素薄膜の作製】シールド型アークイオンプレーティング装置を用いてアモルファス窒化炭素薄膜を作製した.ターゲットには純度99.999%のグラファイト焼結体を用い,シールド板を隔てて基板を設置した.成膜パラメータとして,導入ガス組成および基板バイアスを制御した.【アモルファス窒化炭素薄膜の特性評価】導入ガスとしてAr, Ar/H_2を用いた場合の堆積膜はそれぞれアモルファス炭素,水素化アモルファス炭素となるが,どちらもその機械的特性が基板バイアス値に大きく依存しており,最適バイアス値では高硬度・高耐摩耗性を示す一方,それ以外の基板バイアス条件では,低硬度かつ著しく低い耐摩耗性を示した.導入ガスとしてN_2,N_2/H_2を用いた場合,堆積膜としてそれぞれアモルファス窒化炭素,水素化アモルファス窒化炭素が得られ,その硬度はどちらも基板バイアスに大きく依存せず,10GPa程度を示した.耐摩耗性も同様に基板バイアスに依存せず,アモルファス炭素の最も硬い試料ほどではないが,安定して優れた耐摩耗性を示した.前年度に導入した紫外・可視ラマン分光装置,現有のX線光電子分光装置および赤外吸収分光装置を用いた化学結合状態解析の結果,作製膜の高硬度および高耐摩耗性は,アモルファス炭素系膜ではダイヤモンドライタなsp3結合に,アモルファス窒化炭素系膜では窒素原子の存在に伴うクロスリンク構造形成に由来する可能性が示唆された.【その他の手法によるアモルファス窒化炭素薄膜の作製】シールド型アークイオンプレーティング法以外に,ベンゼン/窒素を原料としたプラズマCVD法およびピラジンを原料とした真空紫外光CVD法による窒化炭素薄膜の作製と特性評価を行い,成膜条件と作製膜の化学結合状態の相関を調査した.本年度の研究成果は以下のとおりである.【アモルファス窒化炭素薄膜の作製】本年度は,以下の手法を用いて窒化炭素薄膜の作製を行った.(I)シールド型アークイオンプレーティング装置:ターゲットには純度99.999%のグラファイト焼結体を用いた.成膜パラメータとして,導入ガス組成および基板バイアスを制御した.(II)誘導結合型高周波プラズマCVD装置:原料ガスとしてメタンおよび窒素を用い,成膜パラメータとして,基板バイアスを制御した.(III)真空紫外光CVD装置:原料ガスとしてピラジン,ピリミジン等の含窒素複素芳香族分子を用い,成膜パラメータとして原料分子の種類と基板温度を変化させた.【アモルファス窒化炭素薄膜の化学結合状態】非経験的分子軌道法を用いて,アモルファス窒化炭素のXPS N1s, C1sスペクトルの化学結合状態解析を行い,さらにIR,ラマン,ESRおよび固体NMRの測定結果を総合して,作製膜の化学結合状態を明らかにした.(I), (II)で作製した試料は,基本的に窒素含有sp^2 C(sp^2 C:N)ネットワークが主体となっており,Nの存在によってその秩序度が低下している.基板バイアスの印加は,Nを選択
新しい大腸がん幹細胞特異的表面マーカーの検証　－マウスからヒトへの展開－

腫瘍幹細胞特異的な細胞マーカーを標的とした大腸癌治療の開発に向けて、まず、Dclk1陽性マウス腸腫瘍幹細胞に特異的に発現している細胞表面マーカーを同定した。この細胞表面マーカーがヒト大腸癌幹細胞マーカーとなりうるかを検証するために、まず、ヒト大腸癌オルガノイドに対して、CRISPR-Cas9でDCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカーの終止コドンの直前に2A-CreERT2をノックインした後、レンチウイルスでCMV-loxp-DsRed-loxp-EGFPベクターを導入した。このようなゲノム編集を行ったオルガノイドに対して、4-OHTを投与してlineage tracingを行うと、DsRedを発現しているオルガノイドの中で、DCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカー陽性細胞はEGFPを発現した。さらに、このEGFP陽性細胞は子孫細胞を供給し、7日後にはオルガノイドの細胞の多くはEGFP陽性細胞で占められるようになった。これらの結果から、DCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカーはヒト大腸癌においても大腸癌幹細胞をマークすることが示された。また、上記の研究と並行して別のアプローチで腫瘍幹細胞を標的とする治療の可能性を探った。その一つとして、正常幹細胞、腫瘍幹細胞の両方に発現しているが、各々における役割が異なる因子を利用する方法を検証した。遺伝子改変マウスを用いたlineage tracingによる解析を行い、腸の正常幹細胞でHes1をknockoutしても正常粘膜は障害されないが、腫瘍幹細胞でHes1をknockoutすると腸腫瘍が退縮することを見出した。腫瘍幹細胞ではHes1 knockout直後にPTENの上昇やアポトーシスを誘導する遺伝子の発現上昇が見られた。これらの結果よりHes1が正常組織を障害しない腫瘍幹細胞治療標的となりうることを報告した。29年度が最終年度であるため、記入しない。Dclk1陽性マウス腸腫瘍幹細胞を最も特異的にソーティングできる細胞表面マーカーの検証を行った。Dclk1-EGFP;ApcMinマウスの腸腫瘍から細胞を採取し、候補となる複数の細胞表面マーカーの抗体を用いてflow cytometryを行い、Dclk1陽性細胞に対する感度、特異度を検証した。抗体の非特異的結合による偽陽性の可能性を除外するため、陽性細胞は全てソーティングし、定量RT-PCRにてDclk1とその細胞表面マーカーの両方の発現が上昇していることを確認した。その結果、有力候補であったTmem176aよりもさらに高い感度、特異度でDclk1陽性細胞をソーティングできる細胞表面マーカーが同定されたため、その抗体を今後の実験に用いることとした。次に、Dclk1陽性細胞がマウス腸腫瘍で幹細胞であることを、ソーティングとスフェロイド培養を用いて検証することにした。Lgr5CreERT2/+; Ctnnb1lox(ex3)/lox(ex3)マウスを作成し、タモキシフェン投与にて腸腫瘍を形成させた後に細胞を採取した。Dclk1陽性細胞特異的細胞表面マーカーの抗体を用いることで、この細胞をLgr5陰性Dclk1陰性細胞、Lgr5陽性Dclk1陰性細胞、Lgr5陰性Dclk1陽性細胞、Lgr5陽性Dclk1陽性細胞の各々の分画に分けてソーティングし、スフェロイド培養を行った。その結果、Dclk1陽性細胞の中でも特に、Lgr5陽性Dclk1陽性細胞が強いスフェロイド形成能を示すことが分かり、腫瘍幹細胞はこの分画に存在している可能性が強く示唆された。マウスを用いた検証を進めることで、より高い感度、特異度でDclk1陽性細胞をソーティングできる細胞表面マーカーを同定した。このマーカーを用いることで、今後はヒト大腸癌での検証が可能になる。昨年度にDclk1陽性マウス腸腫瘍幹細胞を、最も特異的にソーティングできる細胞表面マーカーの検証を行った結果、高い感度、特異度でDclk1陽性細胞をソーティングできる細胞表面マーカーが同定された。また、昨年度に行ったマウス腸腫瘍からのソーティングによる検証では、Dclk1陽性細胞の中でも特に、Lgr5陽性Dclk1陽性細胞が強いスフェロイド形成能を示すことが分かり、腫瘍幹細胞はこの分画に存在している可能性が強く示唆された。これらの結果をもとに、今年度は複数のヒト大腸癌細胞株からDCLK1陽性細胞のソーティングを試みた。また、少数ではあるが、ヒト大腸癌臨床検体からスフェロイド、PDXを樹立して、DCLK1陽性細胞のソーティングを行った。その結果、マウスで検証したDclk1陽性細胞特異的マーカーは、ヒトにおいてもDCLK1陽性細胞に特異的に発現していることが示された。また、ヒト大腸癌におけるDCLK1陽性細胞分画の割合はそれぞれの細胞株によって異なり、DCLK1陽性細胞分画が存在しているものとそうでないものが存在することが示された。現在、DCLK1陽性細胞分画が存在しているPDXを用いて、DCLK1とCD133,CD44などの既知の大腸癌幹細胞マーカーを組み合わせて様々な分画でソーティングを行い、スフィアアッセイや免疫不全マウスへの異種間移植を行っている。今後は、ヒト大腸癌においてDCLK1陽性細胞が腫瘍幹細胞であるのか検証をさらに行っていくとともに、我々が実験に用いているDCLK1陽性細胞特異的表面マーカーの抗体を用いて、ApcMinマウスや、ヒト大腸癌PDXモデルにおいてのin vivoでの抗体治療の可能性を探る予定である。

当初の計画通り、Dclk1陽性マウス腸腫瘍幹細胞を特異的にソーティングできる細胞表面マーカーを同定し、実験を進めている。マウス腸腫瘍のソーティングによる解析では、Dclk1陽性Lgr5陽性細胞が腫瘍幹細胞性を持つことが示された。また、我々の同定した細胞表面マーカーは、ヒト大腸癌におけるDCLK1陽性細胞にも同様に発現していることが確認できたため、ヒト大腸癌臨床検体で検証を進める妥当性が示された。現段階においてはまだ、この細胞表面マーカーがヒト大腸癌での腫瘍幹細胞マーカーとなりうるかは検証中ではあるが、データが蓄積されれば、新たな大腸がん幹細胞特異的マーカーが同定される可能性がある。従って本研究は概ね順調に進展しているものと考えている。腫瘍幹細胞特異的な細胞マーカーを標的とした大腸癌治療の開発に向けて、まず、Dclk1陽性マウス腸腫瘍幹細胞に特異的に発現している細胞表面マーカーを同定した。この細胞表面マーカーがヒト大腸癌幹細胞マーカーとなりうるかを検証するために、まず、ヒト大腸癌オルガノイドに対して、CRISPR-Cas9でDCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカーの終止コドンの直前に2A-CreERT2をノックインした後、レンチウイルスでCMV-loxp-DsRed-loxp-EGFPベクターを導入した。このようなゲノム編集を行ったオルガノイドに対して、4-OHTを投与してlineage tracingを行うと、DsRedを発現しているオルガノイドの中で、DCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカー陽性細胞はEGFPを発現した。さらに、このEGFP陽性細胞は子孫細胞を供給し、7日後にはオルガノイドの細胞の多くはEGFP陽性細胞で占められるようになった。これらの結果から、DCLK1陽性細胞特異的細胞表面マーカーはヒト大腸癌においても大腸癌幹細胞をマークすることが示された。また、上記の研究と並行して別のアプローチで腫瘍幹細胞を標的とする治療の可能性を探った。その一つとして、正常幹細胞、腫瘍幹細胞の両方に発現しているが、各々における役割が異なる因子を利用する方法を検証した。遺伝子改変マウスを用いたlineage tracingによる解析を行い、腸の正常幹細胞でHes1をknockoutしても正常粘膜は障害されないが、腫瘍幹細胞でHes1をknockoutすると腸腫瘍が退縮することを見出した。腫瘍幹細胞ではHes1 knockout直後にPTENの上昇やアポトーシスを誘導する遺伝子の発現上昇が見られた。これらの結果よりHes1が正常組織を障害しない腫瘍幹細胞治療標的となりうることを報告した。今後の予定としては、複数のヒト大腸癌細胞株やヒト大腸癌臨床検体由来のスフェロイドを用いて同様の検証を行い、ヒトにおいてもDCLK1陽性細胞が癌幹細胞性を持つことを検証する。具体的には、DCLK1とCD133,CD44などの既知の大腸癌幹細胞マーカーを組み合わせて様々な分画でソーティングをし、スフィアアッセイや免疫不全マウスへの異種間移植を行う。今後は、ヒト大腸癌においてDCLK1陽性細胞が腫瘍幹細胞となりうるかを、多方面からアプローチして検証していく。
金属微粒子を用いた選択的レーザー脱離イオン化TOF-MSによる複合糖質の機能探索

本研究では"糖鎖提示ナノ微粒子および質量分析計"を用いることで、複合糖質の分子レベでの機能解明すなわち「相互作用相手分子を効率的に探索し、同定する新規方法論」を開発することを目的とした。〈非特異吸着抑制型水溶性糖鎖提示ナノ微粒子の作製〉本研究では、金属表面とチオール基との親和性を利用して金属ナノ微粒子表面修飾を行った。金属ナノ微粒子表面には糖鎖を数百分子程度提示できるため、相互作用相手分子との強い結合力が得られる(糖鎖クラスター効果)。また、アミノオキシ基と糖鎖還元末端との化学選択的反応を利用することであらゆる糖鎖を提示可能なシステムを構築した。これを利用し、糖鎖提示ナノ懲粒子のライブラリー化を行った。標的タンパク質を共有結合で捕捉可能な自殺基質型の糖鎖誘導体を微粒子表面に簡便に提示する方法の開発も合わせて行った。金属-チオール結合がレーザーによって切断されることを利用し、ナノ微粒子表面への糖鎖の提示をMALDI-TOF MSによって評価した。ナノ微粒子への非特異吸着を低減するために、双性イオン型チオール化合物を合成し、これを用いた。作製したすべてのナノ微粒子は高い水溶性および安定性を示した。〈糖鎖相互作用分子の探索および同定方法の確立〉本研究で作製したナノ微粒子は水溶性であるため、相互作用相手分子を捕捉後そのまま各種生化学的アッセイおよびMALDI-TOF MS測定に供することができる。生体試料からの相互作用相手分子(タンパク質)の捕捉においては、ナノ微粒子と試料溶液をインキュベートし洗浄後そのままSDS-PAGEにアプライし、目的のバンドを切り出してプロテオミクスの常法に従ってタンパク質の同定が可能であった。このように、競合糖鎖による溶出が必要なアフィニティークロマトグラフィー等の従来法と比較して、サンプルロスが少ないことによる高感度化、および作業工程の簡素化による大幅な效率化を達成した。糖鎖-磁性微粒子による特異的タンパク質の相互作用解析糖鎖還元末端のアルデヒド基と反応するアミノオキシ基を末端に有し、水溶性のPEGおよび自己組織化能を持つ長鎖アルキルを含むリンカー構造を持つ両新媒性チオール化合物を合成した。合成した化合物はナノ微粒子および銀被覆磁性ナノ微粒子表面に安定に結合することを、MALDI-TOF MSによって確認した。微粒子表面での糖鎖補足官能基密度を制御するために、末端に水酸基をもつ類似のチオール化合物を合成した。これにより金属微粒子表面での糖鎖密度を任意に制御することが可能となった。微粒子表面に提示したアミノオキシ基と遊離の糖鎖との反応により、微粒子表面に糖鎖を提示させた。この糖鎖-金属微粒子を用いて特異的タンパク質のつり上げ実験を行った。マンノペンタオースを結合した磁性微粒子を、マンノース特異的ConA、ガラクトース特異的PNAの混合溶液に加え室温でインキュベート後、磁石によって微粒子を回収した。微粒子をバッファーで洗浄しMALDI-TOF MS測定を行ったところ、ConAのみを選択的につり上げたことを確認した。次につり上げたConAを微粒子上でトリプシン消化し、洗浄後MS測定を行ったところ、マンノース認識部位を含むフラグメントが選択的に検出された。またConAのトリプシン消化物にマンノペンタオース結合磁性微粒子を加えた場合にも、マンノース認識フラグメントが選択的につり上げられた。

本研究によって、磁性微粒子の操作性に加え、質量分析計を用いることで微量分析およびペプチドのシーケンス解析までを短時間で行えることがわかった。したがって作製した糖鎖-磁性微粒子複合体は、ターゲット糖鎖を特異的に認識する化合物のhigh-throughput探索に有効であることが示された。自殺基質を提示した金属微粒子の作成とSLDI-TOF MSによる構造解析機能特異的に標的タンパク質を共有結合で捕捉する自殺基質の性質を利用し、機能選択的なタンパク質探索材料の開発を行った。まず、シアリダーゼにより活性化する自殺基質を微粒子上に固定化し、コレラ菌由来シアリダーゼを作用させ、グアニジン塩酸や高濃度の界面活性剤などタンパク質が十分に変性する条件で洗浄した後、プロテアーゼを作用させ、ペプチドフィンガープリンティング法による捕捉タンパク質の決定を行ったところ、コレラシアリダーゼが優位差を持って検出された。さらに、検出されたペプチド断片のトポロジー解析を行ったところ、別途同定した自殺基質の結合部位周辺のペプチド断片のみが大きく欠損しており、遊離の自殺基質と固定化された自殺基質がコレラシアリダーゼ上の同じ配列を選択的に捕捉していることが示唆された。続いて、侠雑タンパク質が存在する系中でシアリダーゼの捕捉能の評価を行ったところ、侠雑タンパク質も一定量自殺基質に結合することが確認された。その原因を探った結果、シアリダーゼによるグリコシド結合切断に伴うマイケル受容体型構造への構造変化速度の不足により自殺基質の一部が非特異的に侠雑タンパク質とも結合していることが確認された。そこで、自殺基質の活性加速度を高めた新規基本骨格を設計し直し、グリコシド結合切断後に迅速に活性化する基質を得た。生体サンプルの高感度・迅速分析に適した分析法および表面修飾条件の決定非特異的結合による侠雑物由来のピークを最小限にと止め微量生体サンプルの検出限界を高めるため、末端に両性イオン型構造を有し、もう一方の末端にチオール基を有する新規リンカーを開発した。糖鎖相互作用分子の選択的捕捉・分析法の決定双性イオン型表面修飾剤を用い、非特異吸着を抑制した糖鎖修飾金属ナノ微粒子(磁性微粒子、金ナノ微粒子)を調整した。既知タンパク質の混合物および血清を用いて、タンパク質の捕捉する際の各種実験条件、評価法等を検討した。本研究で作製している糖鎖修飾ナノ微粒子は水溶性であるため、微粒子を回収後に捕捉したタンパク質を溶出せずに、微粒子ごとSDS-PAGEに供することができる。このことは、多種類の糖鎖修飾ナノ微粒子を用いた多検体でのスクリーニングに際して大きな利点となる。糖鎖修飾ナノ微粒子のタンパク質選択的捕捉について、SDS-PAGEを用いて評価したところ、糖鎖特異的にタンパク質をエンリッチできることが分かった。ゲルよりタンパク質バンドを切り出し、プロテオミクスの常法に従いタンパク質の同定を行った。糖鎖修飾ナノ微粒子を用いた糖鎖相互作用分子の選択的捕捉・分析の一連のプロトコールを確立した。生体サンプル中の糖鎖相互作用分子の捕捉・機能解析と構造解析マウス脳由来のタンパク質抽出液を用いて、先に確立したプロトコールに従って糖鎖相互作用分子の捕捉を行った。その結果、糖鎖結合性が知られている既知のタンパク質が同定されると同時に、いくつかのタンパク質については本研究によって始めて糖鎖結合性が示唆された。
マイクロマシニング導波管を用いたTHz帯超電導サイドバンド分離ミクサの開発

本研究では、マイクロマシニング導波管を用いたTHz帯超電導サイドバンド分離ミクサの開発を行なっている。サイドバンド分離ミクサに必要不可欠な導波管型90度ハイブリッドカプラーは櫛歯状の構造を持ち高いアスペクト比を持つ。これまでの調査で、導波管壁の垂直度を保ちつつD-RIE(Deep Reactive Ion Etching)を用いたシリコン基板のマイクロマシニングで実現することは難しいことが分かった。また別の問題点として、シリコンの微細構造上に均質な金メッキを施すことも難しいことが分かった。そこで、フォトレジストで作成した構造体に金蒸着等を用いてTHz帯導波管回路を作成した実績を持つチャールマス工科大学(スェーデン)との共同研究を開始した。具体的には研究代表者が800GHz帯において設計を行った導波管型90度ハイブリッドカプラーを、チャールマス工科大学において試作を行った。試作の結果、800GHz帯において導波管型90度ハイブリッドカプラー十分な精度で制作することが可能であることを確認した。この成果を平成20年3月に開かれた応用物理学会で口頭発表を行った。今後は研究代表者が本研究の初年度に2mm帯で既に実証したサイドバンド分離導波管回路をTHz帯でマイクロマシニングにより作成を行う。そして国立天文台で開発しているAIN接合を用いたTHz帯において広帯域特性が期待できるSIS素子と組み合わせ、高感度かつ高帯域なTHz帯超電導サイドバンド分離ミクサの実現を行う。150GHz波帯にて、超伝導ミクサチップの設計及び一体型サイドバンド分離超伝導ミクサユニットの設計、製作及び性能評価を行った。超伝導チップは、周波数同調回路として2つの超伝導接合をインダクタンスを通して並列に接続した共振回路を採用している。これにより、超伝導接合が構造上持つ大きなキャパシタンスを打ち消している。さらに2組の同一の1/4インピーダン変換回路と超伝導接合を、左右の電極に対称に配置した構造を取り、超伝導接合から見た給電点のインピーダンスを半分にすることで、超伝導接合のインピーダンス整合を行なっている。2つの超伝導接合をつなぐインダクタンスは,トランスフォーマと同様に超伝導ストリップ線路で形成している。超伝導ミクサチップは、国立天文台内のクリーンルームにて製作した。一体型サイドバンド分離ミクサユニットは、RF帯90°ハイブリッド、LO同位相分配器、LO用方向性結合器、及び4K冷却電波終端を集積している。さらに、ステップ型インピーダンス変換回路を通して超伝導ミクサもユニット内部に集積した。開発したミクサの受信機性能は、IF:4-8GHz帯で、LO周波数125-163GHzにわたりSSB雑音温度50K以下、サイドバンド比10dB以上を達成しており、同周波数帯のサイドバンド分離ミクサとしては世界最高の部類に属する。この結果、超伝導ミクサチップ及び一体型サイドバンド分離超伝導ミクサユニットのデザインが適切であることが確認された。このミリ波帯での一体型サイドバンド分離超伝導ミクサのデザインを元に、800GHz帯の導波管回路のデザインを行った。導波管回路をD-RIEを行うためにはフォトマスクの作成が必要となるため、フォトマスク作成用CADの導入を行った。本研究では、THz帯の高感度超伝導受信機の開発を行なっている。1THz付近で広帯域動作するSISミクサを作製するためには、20kA cm^<-2>程度の高い臨界電流密度(J_c)を持ったSIS接合が不可欠である。このような高い臨界電流密度と、小さいリーク電流を同時に実現するためには、極めて薄く(1-2nm)、かつ欠陥の少ないSIS障壁層を作製する必要がある。トンネルポテンシャルの低い窒化アルミニウム(AIN)はこのような障壁層の素材として有望であるため、天文台にてNb/Al-AlN/NbのSIS接合を作成して150GHz帯の超伝導素子を作成した。その結果、臨界電流密度は3kA cm^<-2>と低いものの、R_<sg>/R_N>20とリーク電流の少ない高品質の超伝導素子の作成した。この素子を用いて超伝導ミクサの受信機性能試験を行ったところ、145-165GHzに渡り受信機雑音温度(DSB)40K以下と量子限界の6倍以下の性能を示し、AlNを用いた超伝導素子が高感度応答することが実証された。しかしTHz受信機用高臨界電流密度のAlN膜SIS接合で所望の値を得るためには、作製時の窒素プラズマを弱電力条件で維持する必要があることがわかった。そこで、AlN膜の安定した作製プロセスを実現するために、天文台が所有するスパッタ装置の電力条件を高精度制御できる電源出力アッテネータ(減衰器)を導入し、所望の電力を得ることにした。またTHz帯での一体型サイドバンド分離超伝導のデザインを行った。

そこで、フォトレジストで作成した構造体に金蒸着等を用いてTHz帯導波管回路を作成した実績を持つチャールマス工科大学(スェーデン)との共同研究を開始した。具体的には研究代表者が800GHz帯において設計を行った導波管型90度ハイブリッドカプラーを、チャールマス工科大学において試作を行った。試作の結果、800GHz帯において導波管型90度ハイブリッドカプラー十分な精度で制作することが可能であることを確認した。この成果を平成20年3月に開かれた応用物理学会で口頭発表を行った。今後は研究代表者が本研究の初年度に2mm帯で既に実証したサイドバンド分離導波管回路をTHz帯でマイクロマシニングにより作成を行う。そして国立天文台で開発しているAIN接合を用いたTHz帯において広帯域特性が期待できるSIS素子と組み合わせ、高感度かつ高帯域なTHz帯超電導サイドバンド分離ミクサの実現を行う。
哺乳類のフリーズドライ精子における高温耐性獲得に関する研究

マウスのフリーズドライ精子を作製するときに使用する精子処理液(ETBSという)のpHを弱アルカリ付近(8.08.4)に設定するか、またはETBSに含まれるナトリウムイオンをカリウムイオンに代えてフリーズドライすれば、フリーズドライ精子の染色体(DNA)は、高温短期間暴露(40°Cで1週間、50°Cで3日間)または室温長期保存(25°C、18か月)に耐えることができるようになった。本研究の目的は、マウスのフリーズドライ精子(凍結乾燥精子)を高温条件下(例えば日本の夏の気温条件下、3040°C)に1か月程度おいても、その精子にDNAダメージが蓄積しない方法をみつけることである。平成25年度においては、フリーズドライ精子の高温耐性を高めるためのヒントとなる事象を見つけたので、それについて報告する。カルシウムイオンのキレート剤であるEGTAを含むトリス緩衝液(ETBS)を精子のフリーズドライ用溶液として使用し、ETBSのpHを5.0から8.4までの範囲で調整した。これらにマウス精子を懸濁して4°Cで3日間処理した後、フリーズドライした。そのフリーズドライ精子を4°Cで3日間保存した場合、精子のDNAダメージは溶液のpHによらず新鮮精子のそれとほぼ同レベルを示した。一方、50°Cで3日間高温処理すると、ETBSのpHの低下に伴って精子のDNAダメージのレベルが高くなった。さらに中性から弱アルカリ性付近(pH7.48.4)のETBSを用いてフリーズドライした精子を、卵細胞質内精子注入法により未受精卵に注入し、受精卵の染色体を調べた。その結果、4°Cと50°Cに置いたフリーズドライ精子の構造的染色体異常の頻度の差が、ETBSのpHが高くなるにつれて小さくなることが判明した。以上のことから、フリーズドライ精子の高温処理によるDNAダメージの誘発は、フリーズドライ用溶液の低いpHに依存することが示唆された。研究初年度(平成25年度)において、フリーズドライ精子の室温長期保存(1か月以上)を可能にする条件を短期間で探す方法として、フリーズドライ精子を極端に高い温度(50°C)で3日間処理し、コメットアッセイと受精卵の染色体分析法で精子のDNAダメージを調べた。その結果、フリーズドライ精子を作製するときに使用する精子処理液(ETBS: 50 mM EGTA + 100 mMトリス緩衝液)のpHを水酸化ナトリウムの添加によって高めると、高温処理(50°C、3日間)したフリーズドライ精子のDNA(染色体)ダメージが抑制されることが示唆されたことから、平成26年度ではさらに多くの受精卵を用いて染色体分析し、それぞれのpH(5.0、7.4、7.7、8.0、8.2、8.4)ごとに高温処理による染色体異常の誘発率を確定した。高温処理による染色体ダメージをもつ受精卵の頻度は、pH 5.0からpH7.7において100%から56%にまで減少し、弱アルカリ性域のpH8.0以上ではほぼ一定の頻度(pH8.08.4で24%26%)となった。一方、冷蔵(4°C、3日間)したフリーズドライ精子から作製した受精卵では、pH 5.0からpH7.7において99%から31%にまで減少し、pH8.08.4ではほぼ一定の頻度(14%17%)となった。どのpHにおいても高温処理したフリーズドライ精子は冷蔵したものと比べて高い染色体異常誘発頻度を示したが、pH8.0とpH8.2においては両保存温度間で誘発頻度に有意差はなかった(P≧0.05)。なお、弱アルカリ性のpH 8.4で作製したフリーズドライ精子を室温(28°C)で8か月間置いた場合、その精子を注入された受精卵の28%が妊娠18日目の正常胎仔にまで発生できることを確認した。この頻度(28%)は冷蔵で8か月間保存したフリーズドライ精子を用いた場合(55%)のほぼ半分であり、高温処理の染色体分析の結果を反映していた。昨年度までに、マウスのフリーズドライ精子を高温(50°C)で3日間保存したときに誘発される精子DNAダメージおよび構造的染色体異常の誘発頻度は、フリーズドライ精子を作製するときに使用するEGTA/Tris-HCl緩衝液(ETBS)のpHに依存して低下することがわかっている。そこで本年度では、低いpH(7.7)と高いpH(8.2)で作製したフリーズドライ精子を室温(25°C)で1か月間保存し、構造的染色体異常の誘発率を受精卵の第一卵割中期における染色体分析により調べた。その結果、pH8.2では20%、pH7.7では45%の受精卵に染色体ダメージが誘発されていることがわかった。従って、室温長期保存においても、染色体ダメージを抑制するためにはETBSのpHを8.0以上に高くすることが必要と考えられる。また、ETBSに含まれるキレート剤のEGTAを溶解するとき、通常は水酸化ナトリウムを使用するが、本年度では他のアルカリ剤、すなわち水酸化カリウム(KOH)に代えてETBSを調製し(pH 7.7)、フリーズドライ精子を作製した。このフリーズドライ精子を高温保存(50°C、3日間)したところ、従来のETBSで作製したフリーズドライ精子とは異なり、4°C保存サンプルと比較して染色体ダメージの誘発頻度に有意差はなく、しかもこれまでにない低頻度(16%)を示した。KOHで作製したETBS(K-ETBS)は完全にナトリウムイオンフリーであり、これまで使用してきたETBSとは全く違った性質をもつ可能性がある。更に、K-ETBSで作製した

フリーズドライ精子を7か月間、4°Cで冷蔵するが、途中で1週間だけ日本の夏の最高気温付近(40°C)に置いた場合、胚発生率(胚盤胞形成率と胎仔発生率)には影響しなかったことから、K-ETBSはこれまでのETBSよりも効果的にフリーズドライ精子に高温耐性を獲得させる可能性がある。マウスのフリーズドライ精子を作製するときに使用する精子処理液(ETBSという)のpHを弱アルカリ付近(8.08.4)に設定するか、またはETBSに含まれるナトリウムイオンをカリウムイオンに代えてフリーズドライすれば、フリーズドライ精子の染色体(DNA)は、高温短期間暴露(40°Cで1週間、50°Cで3日間)または室温長期保存(25°C、18か月)に耐えることができるようになった。平成26年度では、弱酸性弱アルカリ性のフリーズドライ精子作製用溶液(ETBS)で作製したフリーズドライ精子を高温で短期間処理し、コメットアッセイと染色体分析の結果を確定した。さらに、高温処理に最も強かったpH条件でフリーズドライ精子を作製し、室温長期保存(28°C、8か月間)した。その精子から作製した受精卵の着床後の発生能を確認できた。しかし、室温保存後の染色体分析が現時点で終了していないことと、低いpHで作製したフリーズドライ精子のDNAはなぜ高温処理によるダメージを受けやすいのかについては調べることができなかったことから、予定よりもやや遅れていると判断した。細胞遺伝学水酸化ナトリウム以外の薬剤でpHを調整したフリーズドライ用溶液を用いると、どのような結果が得られるのかを高温処理(50°C、3日間)で調べ、これまでの結果と比べる。高温に対してより強い条件を獲得したと思われる条件でフリーズドライ精子を作製し、それらのサンプルを冷蔵(1か月以上)40°C(1か月)冷蔵(1か月以上)というように、高温条件を間に入れて保存する。この保存方法は、夏季の災害や事故などによる停電が1か月間続いた後、復旧したことを想定している。そのフリーズドライ精子を用いて作製した受精卵の染色体分析および発生能を調べるのが今後の主な課題である。また本年度は、10年前に冷蔵を開始したフリーズドライ精子を用いて受精卵の染色体分析と発生能の解析を行う予定である。低いpHで作製したフリーズドライ精子のDNAはなぜ高温処理によるダメージを受けやすいのかについては、本研究とは別の機会で解決すべき課題かもしれない。しかし、低pH依存性のDNA分解酵素の関与や、低pHと温度に依存した活性酸素分子種の生成の可能性などを視野に入れ、フリーズドライ用溶液に各種イオンや各種キレート剤などを含ませるなど、DNAダメージを抑制するためのアプローチを試みたい。フリーズドライ精子の室温保存によってなぜDNA(染色体)ダメージが蓄積するのか、まずはその原因の候補となる事象を高温処理による短期間実験法によって見つけたことによる。フリーズドライ精子の高温・低pH依存性のDNAダメージ誘発のメカニズムを探るため、既存のフリーズドライ用溶液に様々な分子、例えば各種イオンや別のキレート剤を付加することが今後の研究を推進するために必要と考えている。そして、最良の高温耐性獲得条件をもとに、室温付近(2840°C付近)の保存によって、どの程度までDNAダメージの蓄積を遅延させることが可能なのかを、着床前後の胚発生の観察を含めた解析によって明らかにするのが今後の課題となる。