hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工換気により惹起される肺損傷の発生機序の解明

成熟兎を用い、温生食水を用いて肺洗浄を行いサーファクタント欠乏肺のモデルを作成し、従来の人工換気法(CMV)にて換気を行うことにより惹起される肺損傷につき、肺損傷の少ない高頻度振動換気(HFO)と比較し検討した。以前の検討から、CMVによる肺損傷にPMN、TNFαが関与している事が示されている1.肺胞上皮細胞におけるTNFαの発現肺洗浄モデルを用い、CMV換気後の肺胞上皮におけるTNFαの発現を免疫組織染色で検討した結果、CMV換気後はHFO換気後に比しTNFαの発現が多く、肺胞上皮もTNFα産生に関与していることが判明した。また、同モデルにてin situ hybridizationによる肺胞上皮細胞におけるTNFαmRNAの発現をみた結果CMV換気群ではHFO換気群に比し発現が多いことが判明し、免疫組織染色の同様の結果を得た。2.人工換気によるIL・8産生について同モデルで換気後の肺洗浄液中IL-8濃度を測定したところ、HF0はCMVに比べて低値で、肺組織中のIL-8のWestern-blottingではCMVでHF0に比べて強い反応を示した。免疫組織化学染色でも、CMVでHF0より強く染色された。以上より、IL・8の産生は、CMVに比べてH1F0では抑制される事が示された。CMVによる肺損傷成立には、NF・κBの活性化が関与しているという仮説のもと検討を行った。同モデルで、換気終了後の肺組織におけるNF-κB活性をEMSAで検討した。全肺におけるEMSAでは、CMVではNF-κBの活性化が認められた。それらと比較して、HF0ではNF-κBの活性は軽度であった。以上の結果から、CMVによる肺損傷成立には、NF-κBの活性化が関与していると考えた。われわれは高頻度振動換気(HFO)と従来の換気法(CMV)の比較による過去の研究からCMVによる肺損傷に多核白血球及び各種メディエータが関与していることを指摘し、HFOに比べCMVにおいて換気後のTNFα値が高値であること、CMVによる肺損傷が抗腫瘍壊死因子(TNF)α抗体を気管内投与を行うことで軽減できる事から、TNFαが肺損傷に関与していることを示した。本年度はCMVによる肺損傷とTNFαの関係を明確にするため以下の2つの実験を行った。CMVによる換気で肺損傷にTNFαが関与していることから、TNFαの産生の機序として、人工換気による上皮細胞のshear stressがトリッガーとなりより肺胞上皮中の転写因子NF-κBが活性化されることが誘因であると考え、NF-κBの活性化を阻害するpyrrolidine dithiocarbamateを投与によりCMVによる肺損傷が予防できないかと考えて実験を行った。肺洗浄しサーファクタント欠乏状態とした家兎を用いて実験したが、高カリウム血症、不整脈をきたし1-2時間で死亡したため血液ガスの経過、肺の病変の判定はできなかった。2.免疫組織染色同じ肺洗浄しサーファクタント欠乏状態とした家兎を用い、肺胞上皮におけるTNFαの発現を免疫組織染色を行い検討した。肺損傷の少ないHFOと肺損傷の著明なCMVとを時間を追って比較した。その結果4時間の換気後CMVにて換気した群ではHFOによる換気の群に比しTNFαの発現が多いことが判明し、肺胞上皮もTNFα産生に関与していることが判明した。

昨年までの研究の結果、われわれは高頻度振動換気(HFO)と従来の換気法(CMV)の比較による過去の研究からCMVによる肺損傷に多核白血球及び各種メディエータが関与していることを指摘し、HFOに比べCMVにおいて換気後の抗腫瘍壊死因子(TNF)α値が高値であること、CMVによる肺損傷がTNFα抗体を気管内投与を行うことで軽減できる事から、TNFαが肺損傷に関与していることを示した。本年度も昨年度に引き続きCMVによる肺損傷とTNFαの関係を明確にするため以下の2つの実験を行った肺洗浄しサーファクタント欠乏状態とした家兎を用い、in situ hybridizationによる肺胞上皮細胞におけるTNFαmRNAの発現を、肺損傷の少ないHFOと肺損傷の著明なCMVとを比較した。その結果4時間の換気後CMVにて換気した群ではHFOによる換気の群に比し発現が多いことが判明し、昨年の免疫組織染色によるTNFα発現と同様の結果を得た。2.ラットの肺洗浄モデルの作成昨年度まで家兎の肺洗浄モデルを用いてHFOとCMVとの比較による実験をおこなっていたが、家兎ではメディエータやサイトカインに対する各種抗体が少ないため、動物をラットに変更し、洗浄モデルの作成を行った。最初は家兎と同様4時間の人工換気モデルの作成を目指したが、ラットは家兎に比べ肺洗浄によるストレスに弱く、CMVによる人工換気では2時間以上生存させることは困難であったため、換気時間を2時間とし、換気後2時間の肺洗浄液を用いて比較した。肺洗浄液中の細胞数はHFO、CMVとも有意差なく、両者とも家兎モデルに比し低値で、TNFα値も同様に差が認められなかった。IL-6値は両者とも高値で有意差はないがCMVが高い傾向にあった。昨年度までに、サーファクタント欠乏肺モデルを用い、高頻度振動換気(HFO)と従来の換気法(CMV)の比較により、CMVにより惹起される肺損傷にTNFαが関与していることを示し、人工換気後の肺洗浄液中の多核白血球、肺胞上皮細胞におけるTNFαがCMVで強く発現することを示した。本年度も引き続きCMVによる肺損傷の機序を明確にするため以下の実験を行った。1.人工換気によるIL・8産生について好中球走化活性を有するとされるIL・8の発現がCMVによる肺損傷に関連があるかどうかの検討を行った。家兎のサーファクタント欠乏肺モデルを作成し、HFOまたはCMVにて換気し、人工換気後の気管内洗浄液中IL-8濃度を測定したところ、HF0群はCMV群に比べて有意に低値だった。肺組織中のIL-8をWestern-blottingで確認したところ、CMVでHF0に比べて強い反応を示した。免疫組織化学染色では、CMVではH1FOに比べて強く染色された。以上の結果から、人工換気によるIL・8の産生は、CMVに比べてH1F0では抑制される事が示された。CMVによる肺損傷成立には、NF・κBの活性化が関与しているという仮説のもと検討を行った。1.と同じ肺洗浄しサーファクタント欠乏状態とした家兎を用い、換気終了後の肺組織におけるNF・κB活性をEMSA、Southwestern組織化学で検討した。全肺におけるEMSAでは、CMV1時間、4時間ともにNF・κBの活性化が認められた。それらと比較して、正常肺、HF01時間、4時間ではNF-κBの活性は軽度であった。4時間換気後洗浄肺におけるEMSAでは、CMV, HF0ともにNF-κBの活性化は認められたが、両者間に大きな差はなかった。Southwestem組織化学では、NF-κBの活性を認める肺胞上皮細胞は、いずれの群も多くは認められなかった。
特殊形状の圧電体を用いた発電デバイスの開発

近年、あらゆるものがインターネットにつながるInternet of Things(IoT)関連技術への関心が高まっており、これらを無給電・メンテナンスフリー、かつ無線で情報発信できる自立型のワイヤレスセンサーネットワークへ展開していくために、クリーンな環境エネルギーから電源供給を行なう発電デバイスの開発が注目されている。本研究では、比較的高いエネルギー密度で昼夜問わず発生している低周波振動を用いた発電デバイスを実現するため、低周波振動を効率よく電気エネルギーに変換できる特殊形状を有する3次元構造単結晶の作製技術を構築し、その材料や結晶形状、育成方位、電極配置等を最適化し、より低周波で高効率・小型の発電デバイスを開発することを目的とする。初年度となる平成28年度は、特殊形状としてスプリング形状の場合を取り上げ、単結晶発電素子として最適な圧電材料、結晶方位を探索するために、既存圧電材料定数を用いて有限要素解析によるスプリング振動と発電量の結晶方位依存性を検討した。既存圧電材料の一つである三方晶、点群32に属するCTGS単結晶の定数を用いた解析で、断面が円形のスプリング構造を有する圧電体振動に対する発電量について結晶方位依存性および各定数寄与度を調べた。結果として、Z軸方向がスプリングの巻き軸に平行になる方位で発電量が最大となること、および定数の中で特に圧電定数e14が発電量の増加への寄与が大きいことを明らかにした。また、単結晶3次元形状制御が可能な結晶育成機構を実現するために、独自結晶育成技術であるマイクロ引き下げ装置に回転軸とX/Yステージの移動機構を導入し、さらにその制御ソフトを構築した。構築した装置・制御ソフトの動作実証として、比較的作製が容易なサファイア単結晶を取り上げてスプリング状結晶の作製を試み、その作製に成功した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
高周波共鳴を利用した高速記録磁気メモリーのためのスピンダイナミクスの研究

磁性材料の磁化反転速度と密接に関係がある緩和定数(ダンピング定数α)を知るために、各種磁性材料の単結晶薄膜を作成し、強磁性共鳴法を用いてαの測定を行った。hcp結晶構造のCo、Co合金ではc軸方向でαが最小となる結晶方向依存性を示したのに対し、fcc結晶構造のCo、Ni-Feなどではαは結晶方向に依存せず一定値を示した。磁性層間相互作用の試料では相互作用の増加とともにαが増大した。提案した研究目的を実現するために、本年度は下記の3項目を実施した。1.強磁性共嗚(FMR)装置を用いた磁気緩和現象の計測強磁性体の磁化反転速度を支配するダンピング定数αは、強磁性共鳴曲線の吸収ピーク幅から算出可能である。このピーク幅から得られるαには、材料固有の値と試料の膜構造、結晶性、磁区構造などの外的要因に起因した値が含まれている。まず、外的要因のαの特性を以下の項目につき調べた。(1) 9GHz帯FMRと35Ghz帯FMRを用いて磁気異方性の小さいNi-Fe試料の共鳴曲線の比較を行い、試料が単磁区構造のときαは試料固有の値(α=0.006)を示し、多磁区構造のとき共鳴曲線がブロードとなり、αが0, 01以上の過大な値を示すことが判明した。(2)磁気異方性が大きなFe-Co, Co試料では、磁化容易軸方向でαが最小値(0.02)を示し、結晶方向に依存してαが変化した。(3) Co/Pt人工格子膜のαは、Coが1.8nm以下の膜厚でCo/Pt積層界面の歪みに起因してαが0.02から急激に増大することがわかった。熱擾乱の影響を低減し高感度でFMR測定を行うため、温度調整ユニットを導入した。2.試料作成磁化反転現象に対するPt添加効果の検討を行うため、基本となるCo-Pt薄膜、第3元素X(X=Ti, Cr, Ta等)を添加したCo-Pt/X薄膜を、第3元素添加量、製膜条件(ガス圧、基板温度、熱処理条件)を変化させて作成した。Arガス圧1.5Pa以下で成膜した試料は、膜質、結晶配向性が向上した。本年農作成した試料は、次年度にFMR法でαの測定を行い、添加元素等の観点から比較する予定である。3.強磁性共鳴装置へのレーザー光導入機構の検討試料面にプリズムを固定することで、磁界方向とレーザー光を平行に入射が可能となった、提案した研究目的を実現するために、本年度は下記の2項目を実施した。1.強磁性共鳴(FMR)装置を用いた磁気緩和現象の計測強磁性体の磁化反転速度を支配するダンピング定数αは、強磁性共鳴曲線の吸収ピーク幅から算出可能である。このピーク幅から得られるαには、材料固有の値と試料の磁性膜間に作用する相互作用、試料の膜構造と関係した歪み、などの外的要因に起因した値が含まれており、(1)MgO単結晶基板上に成膜したNi-Fe(001)およびNi-Fe(110)単結晶薄膜試料のFMR共鳴曲線の比較を行い、Ni-Fe(001)試料では結晶方向に依存せずαが一定値(α=0.006)を示したのに対し、Ni-Fe(110)試料では[110]方向で膜成長時の歪みに起因してαが増大することが判明した。(2)Co/Ru人工格子膜では、Co膜間の相互作用がRu膜厚の変化にあわせて強磁性結合と反強磁性結合を周期的に変化するのに対応して、FMR曲線の吸収ピーク幅が反強磁性結合試料では極大値を、強磁性結合試料では極小値をとる周期的な変化をしめすことがわかった。2.試料作成磁化反転現象に対するPt添加効果の検討を行うため、Co-Pt薄膜に第3元素X(X=Cr,Ta,W,V等)を添加したCo-Pt-X薄膜を、第3元素添加量、製膜条件(ガス圧、基板温度、熱処理条件)を変化させて作成した。また、Co-Pt薄膜の規則化温度が、第3元素を添加することにより500-600°Cまで低下することがわかった。提案した研究目的を実現するために、本年度は下記の2項目を実施した。1.強磁性共鳴(FMR)装置を用いた磁気緩和現象の計測強磁陸体の磁化反転速度を支配するダンピング定数αは、強磁性共鳴曲線の吸収ピーク幅から算出可能である。このピーク幅から得られるαには、材料固有の値と試料の磁性膜間に作用する相互作用、試料の膜構造と関係した歪み、などの外的要因に起因した値が含まれている。

(1)hcp,fcc,,bcc構造のCo単結晶薄膜のαを比較すると、fcc-Coのαは結晶方向によらず一定値をとり、Niやパーマロイと同様の結果を示した。hcp-Coでは磁化容易軸であるc軸方向でαが最小値(α=0.02)を、磁化困難軸方向で最大値をとり、また、bcc-Coのαは<100>方向で最小となり、結晶方向に依存した周期的変化を示すことが判った。また、bcc結晶構造のFe-Co合金単結晶薄膜でも同様にαが結晶方向に依存して周期的変化を示した。(2)強磁性層間の磁化が反平行に結合するCo-Fe/Ru/Co-Fe(or Ni-Fe)三層構造膜では、FMR曲線の吸収ピーク幅は各磁性層の吸収ピーク幅となり、Co/Ru人工格子膜で測定されたような結合状態に依存して吸収ピーク幅が変化するような現象は観察されなかった。これは、磁性層間に作用する結合力がCo/Ru試料の場合に比べて小さいことが原因と考えられる。(3)Co-Pt合金ではCr添加量の増加とともにαが増大した。2.試料作成上記に用いる試料を準備するため、RFマグネトロンスパッタリング装置を用いて単結晶薄膜を形成する条件の検討を行った。MgO基板を300°C以上で事前加熱を行い、成膜時のArガスのプロセスガス圧が0.8Pa以下、成膜速度0.1nm/s以下で成膜すると、MgO単結晶基板上にFe-Co,Ni-Feなどの磁性膜がヘテロエピタキシャル成長し単結晶薄膜が形成されることがわかった。
髄液内におけるN-GlcNAc型糖鎖生成機構の解明

髄液に含まれる蛋白質と血清中の蛋白質では糖鎖修飾が大きく異なっており、糖鎖構造の多様性と神経疾患との密接な関わりがクローズアップされている。例えば神経疾患の一つである特発性正常圧水頭症(iNPH)はその簡便な診断法が確立されていなかったが、最近になり髄液中のトランスフェリンの糖鎖構造がiNPHの診断マーカーとなる可能性が報告された。申請者は平成2425年度の公募研究から生まれた融合研究により、髄液中のトランスフェリンの部位特異的な糖鎖解析から、新奇な糖鎖構造であるN-GlcNAc型糖鎖を持つ画分が存在することを見出した(Nagae et al. Glycobiology 2014)。N-GlcNAc型糖鎖はマウスのシナプス後肥厚(Postsynaptic density, PSD)を対象にした最近のプロテオミクス解析でも見出されており、神経系に特有の糖鎖構造である可能性がある。しかしながら、N-GlcNAc型糖鎖の分布や、細胞外画分におけるN-GlcNAc型糖鎖の生成メカニズムは全くといっていいほど不明である。本申請課題は、髄液内に含まれる糖蛋白質の広範な解析によって、N-GlcNAc型糖蛋白質群を同定することを第一の目的とする。さらに第二の目的として髄液におけるN-GlcNAc型糖鎖の生成メカニズムを生化学的手法および情報科学的手法により解析をし、その生理的意義を明らかにする。我々は第一の目的に沿って、これまで質量分析を用いた髄液内の網羅的な糖蛋白質解析によりN-GlcNAc型糖蛋白質を新たに一種類見出した。また第二の目的について、N-GlcNAc型糖鎖の生成が細胞外領域で起きるという作業仮説の下、髄液中の遊離糖鎖の解析を行い、血清と比較して髄液中にはほとんどN型糖鎖の代謝産物は見られないことを見出した。また新規シアル酸代謝産物を同定した。27年度が最終年度であるため、記入しない。髄液は脳と脊髄を循環する体液で、血液とは蛋白質の組成が異なっている。我々は髄液に含まれる蛋白質と血清中の蛋白質の糖鎖修飾の様式の違いに着目している。特に髄液中の糖蛋白質の糖鎖構造と神経疾患との関わりを精力的に研究している。申請者は平成2425年度の公募研究から生まれた融合研究により、髄液中のトランスフェリンの部位特異的な糖鎖解析から、新奇な糖鎖構造であるN-GlcNAc型糖鎖を持つ画分が存在することを見出した。そこで本研究は、髄液内に含まれる糖蛋白質の広範な解析によって、N-GlcNAc型糖蛋白質群を同定することを第一の目的とする。本年度は髄液を用いた網羅的な質量分析(MS/MS分析)によって新たにN-GlcNAc型糖蛋白質の同定に成功した。また髄液中に含まれる高マンノース型糖蛋白質を複数同定し、血清蛋白質との糖鎖代謝の違いを明らかにした。

我々は第一の目的に沿って、これまで質量分析を用いた髄液内の網羅的な糖蛋白質解析によりN-GlcNAc型糖蛋白質を新たに一種類見出した。また第二の目的について、N-GlcNAc型糖鎖の生成が細胞外領域で起きるという作業仮説の下、髄液中の遊離糖鎖の解析を行い、血清と比較して髄液中にはほとんどN型糖鎖の代謝産物は見られないことを見出した。また新規シアル酸代謝産物を同定した。研究計画に基づいて、本年度は研究計画1である「髄液内に含まれるN-GlcNAc型糖鎖構造を持つ糖蛋白質群の探索・同定」を主に行った。髄液から糖蛋白質を抽出もしくは髄液そのものについて質量分析(MS/MS分析)を行い、これまで知られていなかった新しいN-GlcNAc型糖蛋白質を同定することに成功した。この蛋白質Xは血清中にも存在し、その糖鎖構造がこれまで知られてきたが申請者は髄液中にも蛋白質Xが含まれていること、さらに新奇なN-GlcNAc型糖鎖構造を持つことを明らかにした。また未成熟糖鎖と考えられている高マンノース型糖鎖を持つ糖蛋白質についても髄液から網羅的に解析し、複数種類の糖蛋白質が高マンノース型糖鎖構造を持つことを明らかにした。特に興味深いのは免疫系に関わる蛋白質Yがこの糖鎖構造を持つことで、これは血液と髄液とで反応経路が異なることを示唆している。現在、糖鎖構造と生理活性の研究を継続している。また研究計画2の「生化学的・情報科学的手法によるN-GlcNAc型糖鎖生成メカニズムの解明」についても既に研究を進めている。まずN-GlcNAc型糖鎖の生成が髄液中で行われるという作業仮説の元、髄液中に含まれる遊離糖鎖の解析を行った。その結果、血清中とは組成や量に大きな差があることが明らかになった。これまでこうした体液中の遊離糖鎖に関する研究はほとんどなされていない。従って本研究の成果は新規性の高い研究である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画は、1)髄液内に含まれるN-GlcNAc型糖鎖構造を持つ糖蛋白質群の探索・同定、および2)生化学的・情報科学的手法によるN-GlcNAc型糖鎖生成メカニズムの解明、から構成される。当初の研究計画では、項目1については平成26年度に「N-GlcNAc型糖鎖構造の検出法の開発(レクチン法および化学修飾法)」を行い、続く平成27年度に「質量分析による糖蛋白質の同定」を行う予定であった。しかし既に質量分析による糖蛋白質の同定を進めており、新奇糖蛋白質も決定済みである。従って今後は更に研究を推し進めて、より多くの種類のN-GlcNAc型糖蛋白質の同定を目指す予定である。また研究項目2については、平成26年度に「N-GlcNAc型糖鎖修飾部位のコンセンサス情報の抽出」を行い、続く平成27年度に「髄液中に含まれる遊離糖鎖解析および標準基質を用いた髄液内エンドグリコシダーゼ活性の定量」を行う予定であった。しかし髄液中の遊離糖鎖を調べたところ血清とは全く異なる代謝系であることがわかった。特に全く未知の代謝産物を見つけている可能性もあり、体内の新しい糖鎖代謝経路を考える上で重要な知見であると我々は考えている。従って今後も引き続き詳細な遊離糖鎖の解析を進めたい。それと併行する形で、当初の研究計画に掲げたバイオインフォマティクスを用いたN-GlcNAc型糖鎖の生成メカニズムの解明を進めたい。また酵素活性の測定についても順次行う予定である。
細胞及び組織病理の3次元再構築:遺伝性代謝病の発症機構の解明と臨床への応用

リピドーシスは、リソソーム酵素やその関連因子の遺伝的欠陥に基づき、それぞれ特異的な組織や細胞に糖脂質が蓄積する一群の遺伝病である。我々は、リピドーシスの病態を明らかにするため、ボリューム・ビジュアライゼーションを利用して、障害臓器や組織への糖脂質蓄積に伴う変化を立体的に把握することを試みた。対象疾患として、異染性白質ジストロフィー(MLD)とFabry病を選択した。MLDでは、アリルスルファターゼAの活性低下により、脳の白質にガラクトシルスルファチドが蓄積して、強い脳障害が起こる。我々は、MLD患者からルーチンの臨床検査により得られたMRIデータを基に、2種類のボリューム・ビジュアライゼーション法を用いて脳内病変の3次元可視化を行った。volumetricray-castingにより、MLD患者の脳白質全体に渡る病変の拡がりと程度が立体的に表現された。また、isosurfacingにより、脳内の病変の形状と位置が明確にされた。Fabry病では、α-ガラクトシダーゼの活性低下により、グロボトリアオシルセラミドが蓄積し、腎障害が生じる。我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡による断層データを基に、ボリューム・ビジュアライゼーションを利用して生検腎組織の解析を行った。その結果、腎糸球体上皮への基質蓄積の状態を立体的に観察できた。ボリューム・ビジュアライゼーションによる3次元画像の構築は、微妙で繊細な内部病変を理解し、リピドーシスの病態解明や診断・治療の評価などを目的とする基礎および臨床的アプローチに有用と考えられる。遺伝性代謝病の多くに於いて、その病因となる遺伝子変異の大要が明らかになりつつある。しかし、その結果として生じる細胞内の変化や組織での病態の発現機構の解明は、技術的制約のため遅れているのが現状である。遺伝性代謝病の病態を理解するためには、細胞や組織の表面や内部構造の立体的観察が必要となることが多い。本研究は、コンピュータによるボリューム・ビジュアライゼーションを用いて細胞や組織の複雑な構造や疾患による変化を定量的に再構築し、立体映像化及び内部透視化することで把えようとするものである。今年度は、アリルスルファターゼAの活性低下により、脳内に糖脂質スルファチドが蓄積する異染性脳白質ジストロフィー(MLD)を対象とし、頭部MRIデータを基にその脳内病変部の描出を試みた。2歳のMLD患者並びに対照者から、頭部MRIデータをフィルムで得た。このMRI断層画像フイルムをレーザーフイルムリーダーで読み込み、イメージデータをホストコンピュータに転送した。AVSソフトウエアシステムを基に、断層像からボリュームデータの再構成を行った。その際、画像のノイズ除去や標的領域抽出などの処理を行い、2次補間式を用いて画像補間を行った。また、可視化に際しては、(a)T2強調画像によるデータから、volume ray-castingによる表示、(b)T2強調画像データから病変領域を囲む等値面を構成してisosurfacingで表示し、さらに、T1強調画像によるデータから脳室を示す等値面を構成して同時に表示、の2種類の方法を採用した。(a)により、脳内部での病変領域の立体的把握が可能になり、また(b)により、脳内の位置関係がより明らかになった。解析の結果、MLDにおける脳内の白質領域の障害が立体的に把えられた。今後、病態研究や治療の効果判定などへの応用が期待される。遺伝性代謝病の病態を解明するためには、細胞や組織における微妙な構造とその病理学的変化を観察する手段が必要となる。本研究は、コンピュータによるボリューム・ビジュアライゼーションを利用して、組織の内部構造と疾患による変化を定量的に再構築し、立体映像化して解析することを目的として行った。まず、脳白質の変化を来たす代謝疾患である異染性白質ジストロフィーと副腎白質ジストロフィーにおける脳内病変の3次元像再構築を試みた。

通常のMRI検査によって得られた1213枚のT2強調画像断層フィルムデータをレーザーフィルムリーダーで取り込み、TITAN2-600/D510(KGT)に転送した。これを基に、AVS5(Advanced Visual Systems)を用いてボリュームデータの可視化を行った。その際、画像のノイズ除去や標的領域抽出等の処理を行い、2次補間式を用いて画像補間を行った。可視化に際しては、volumetric ray-castingとisosurfacingによる2通りの表示を試みた。前者では、脳内部の病変の拡がりと程度が、後者では、その形状と位置とが明確にされた。この方法により、異染性白質ジストロフィーでの白質全体に渡る変化と副腎白質ジストロフィーでの後部白質に強い特徴的な変化とが立体的に理解できた。Fabry病はα-ガラクトシダーゼの活性低下により、腎などに基質であるグロボトリアオシルセラミドが蓄積する疾患である。我々は、生検腎組織を試料として、基質に対する特異的抗体で蛍光染色を行い、レーザー走査型共焦点顕微鏡で断層データを得た。これを基に、ボリューム・ビジュアライゼーションで腎内部の糖脂質蓄積の状態を解析した。その結果、糸球体の上皮細胞などに糖脂質蓄積が起こることが明確に示された。
学生の確実な看護技術習得をめざした『自己評価・学習システム』の開発

限られた時間で確実な看護技術習得を目指す看護技術教育においては,多人数の学習者を効率的に指導するため,eラーニングやビジュアルテキスト等のデジタル技術を活用した実践が実施されている.本研究では,看護技術演習の授業内および予習・復習に,ICT(Information and Communication Technology)を活用した学習支援を実施・評価した.授業内でのICTによるバーチャルな学習環境での,リアルタイムの学生間相互評価による省察やビジュアルテキストを活用した協同学習が学習動機づけとなり,eラーニングによる予習・復習を促し,看護技術の習得に有効なことを確認した.今年度は,看護技術の到達度の判定基準作成及び学習コンテンツ並びにシステムの整備を中心に研究し,その成果を論文として発表した.今年度の補助金は,主にこの研究を遂行するための文献及びコンテンツ作成のためのパソコンや周辺機器の購入費に充てられた.本学習システムの効果についての論文は,『教育システム情報学会誌』第33号に掲載された.この発表及び論文では,他者評価及び教員によるフィードバックを取り入れた看護技術習得への効果を検討した.結果,他者評価及び教員による誤りを提示する動画のフィードバックにより,学生は自己評価の甘さに気づき,その結果,自己学習における練習時間数の増加につながっていることが明確になった.批判的フィードバックに相当する他者評価では,学生の行動修正に与える影響を検証することで,効果的なフィードバックが可能になることが示唆された.なお,今研究を遂行するにあたり,補助金を用いて看護技術に関連する文献(教本を含む)を多数購するとともに,動画の編集専用のパソコン及び周辺機器を購入した.(1)看護技術別の到達度の判定基準の作成.1対象の看護技術の選定:厚生労働省の「看護師教育の技術項目と卒業時の達成度」から看護技術を選定し,さらに学生が卒業時に一人で提供できるレベルの看護技術の中で,卒業時点でも苦手と感じる技術、「清潔援助」「体位変換の援助」を選定した.2対象の看護技術の評価観点と基準の設定:看護技術系の書籍を分析し評価観点を設定し,ルーブリックの評価表を作成した.3作成した到達度の判定基準に基づき,所属大学のLMS(Learning management system)内にデーターベースを作成・保管した.(2)自己評価システムの開発.1動画配信:ロイロノートで撮影した学生の動画を教員が学内サーバーに登録し直接保存できるようシステム改善を実施予定であったが,ロイロノートの開発が進行し,クラウド内に保存可能となったためこのシステムを活用した.2自己評価システム:(1)の判定基準に沿ったルーブリックの評価を活用し,この評価内容をLMSに組み込むことで,簡易に学生の到達度の把握も可能となった.(3)自己学習支援システム.実践動画や看護技術資料等の学習コンテンツの開発をした.実践動画は,協働学習を支援する内容で検討し作成した.学習履歴の一元管理は学内LMSにより可能となり,試用運用にて活用できることを確認した.(4)検証計画の作成.平成28年度より学生に本システムを利用してもらい,看護技術習得の向上を検証するため,方法/手順/環境準備等の計画を作成した.特にLMSの運用には,試用で判明した不具合や学生アンケートの結果を踏まえ,システム担当者と調整し改善を図った.昨年度の本システム試用により、技術習得を目指すeラーニングの効果的な活用に、学習動機づけが必須と判明し、昨年度作成したシステムに以下の内容を追加した。(1)看護技術の到達度の判断基準:行動面の評価に絞り、より具体的内容にすることで個人差を最小にした。対象の看護技術は「清潔の援助」「体位変換の援助」に加え、「滅菌物の取り扱い」「車椅子移譲」「ベッドメイキング」も作成した。(2)自己評価システム:学習動機づけを目的に、授業内でロイロノートによるタイムリーな相互評価を実施した。(3)自己学習支援システム:動画コンテンツを作成し、LMS(Learning Management System)内で自由に視聴できる環境を整え、運用した。さらに、学習動機づけを目的に、授業内でビジュアルテキストによる協同学習を取り入れた。以上の追加により、タイムリーな相互評価・ビジュアルテキストによる協同学習が学習動機づけとなり、eラーニングの活用が促進し、さらに技術習得率が上昇した。今年度は、昨年度に作成した学習コンテンツ(動画・ビジュアルテキスト・評価表)並びに学習システムを活用し、看護技術の演習を展開した。今年度の補助金は、主にこの演習の展開やデータ収集・分析のための人件費・アプリの使用料に充てられた。本学習システムの概要を、国際学会(2016 2nd international Conference on Learning and Teaching)にて発表し、『International Journal of Learning and Teaching,Vol.3,No.1,March 2017』にWeb上にて公開されている。尚、本研究を遂行するにあたり、補助金を用いて翻訳代・学会参加費・出張費に充てるとともに、演習に必要な書籍を購入した。また、検証された学習システムの教育効果の中間報告書の作成に、製本機・プリンターを購入した。研究の最終年度では、昨年までに開発したシステムの運用の結果、明らかになった課題を改善することであった。看護技術の評価観点と基準は、ルーブリック評価の活用で、行動レベルでの評価が明確になることで、その後の学生の技術改善に活かされた。学生からの評価も9割以上の学生が高評価を示した。しかしながら、学生評価と教員評価の相関が弱いことから、学生の自己評価能力の育成が課題となった。eラーニングコンテンツの利用率は、概ね良好であった。この理由として、授業内のビジュアルテキストによる協同学習やタブレットの導入による学習支援アプリでの仮想空間における相互視聴が、学習動機づけとなった可能性が示唆された。

以上から、学習支援アプリやタブレットを用いた学習環境により可能となった協同学習の効果を検証した。結果、教員や他学生による誤りの指摘の自覚が学習動機づけとなることが確認された。また、ビジュアルテキストを協同で活用することが動機づけとなり復習を促進し成績の上昇が確認された。さらに動画の相互視聴・相互評価による自己の省察が復習を促進し成績の上昇が確認された。限られた時間で確実な看護技術習得を目指す看護技術教育においては,多人数の学習者を効率的に指導するため,eラーニングやビジュアルテキスト等のデジタル技術を活用した実践が実施されている.本研究では,看護技術演習の授業内および予習・復習に,ICT(Information and Communication Technology)を活用した学習支援を実施・評価した.授業内でのICTによるバーチャルな学習環境での,リアルタイムの学生間相互評価による省察やビジュアルテキストを活用した協同学習が学習動機づけとなり,eラーニングによる予習・復習を促し,看護技術の習得に有効なことを確認した.平成28年度は平成27年度に作成した計画に従って検証を進める.検証の対象者は基本的にスマートフォンを活用するが,必要な学生にはiPadを貸し出す.また検証の円滑な進行にむけ,次の支援体制をとる.1教員による助言:教員は学生の学習履歴を閲覧し,適宜アドバイスし,疑問に答える.2再演習の指導体制:学生の学習履歴より再演習が必要な対象者には,適宜実習室が使用できる体制を確立する.3フォローアップ体制の確立:自己評価システムからeラーニングを実施しない対象者の把握と,その対策を実施.4看護技術の習得度の確認:教員による確認.複数の教員による評価の整合性の保持するため,一定レベルの運用手順書を作成し評価を実施.評価内容は事前に作成したルーブリックにより評価を実施する.検証の結果は,国内外の学会にて発表する予定である.平成29年度は、昨年のシステム運用の結果を内外の関連学会にて発表し、学会誌等に公表する予定である。また、継続してシステムを運用し、その学習効果のさらなる検証を進める。看護技術教育本年度の研究成果を国内外に発信するための論文投稿費,さらに学習コンテンツの追加補充に伴う開発費が必要となる。LMS(Learning Management System)の導入でデータの簡易に分析が可能になったことで、補助の人件費が予定よりも少額となった。また、ロイロノートの活用により、動画処理の経費が節約できた。研究者間の会議にかかる費用も、ネット会議等の活用で予定より少額となった。今年度の試用による相互評価並びに学習コンテンツの学習効果について論文化し、7月までにオープンジャーナルに投稿予定である。
重症心身障害児の地域生活を支えるICTシステムと横型および格子型情報ネットワーク

本研究は,重症児(者)の地域生活を支援するために,ICTを活用した縦型情報ネットワークに加えて横型,格子型情報ネットワークを開発することであった。すなわち,縦型情報ネットワークは終日医療・生活相談や幼児期の療育のためであり,横型情報ネットワークは家族間の交流を促したり,重症児施設から地域の医療・福祉資源を支援するものであった。これらの情報ネットワークは,医療・生活・教育資源が重症児(者)や家族と密接に関わることができるように,格子型情報ネットワークへと拡張展開した。本研究成果はICT情報ネットワークが重症児(者)の包括的支援に有用な役割を果たすことを示唆した。重症心身障害児(以下,重症児と略す)とは,重度の知的障害と重度の肢体不自由が重複し,日常的な生活支援のみならず,常に医療的な管理を必要とする人たちである。申請者らは,情報通信技術(ICT)を利用して重症児施設(支援提供者)から地域で生活する在宅重症児(利用者)を支える縦方向(縦割り)の情報ネットワークの研究に10数年間従事してきた。本研究では,まず適切なICTシステムの選択と技術的課題の検討を行う。次いで,支援提供者あるいは利用者がそれぞれ横方向に連携した情報ネットワーク(1重症児家族の交流,および,2重症児施設と地域基幹病院との医療連携),さらに,縦型と横型の情報ネットワークを統合して地域生活を包括的に支援する格子(Grid)型ともいえる情報ネットワークを構築する。そして,これらの実証運用と評価を行い,実用化を図ることを目的とした。本年度は,まず,ICTシステムの選定と技術的課題の検討から始めた。すなわち,本研究ではパソコンにWebカメラを付加し,専用ソフトをインストールすれば簡便に利用できるインターネットテレビ電話(Skype)を導入した。パソコンは据置型だけでなく,タブレット型やスマートフォンなどユビキタスな利用も検討した。また,Skypeはマニュアルがほとんど提供されておらず,一般の利用者が容易に理解できる分かりやすいマニュアルを新たに作成した。次に,横型情報ネットワーク基盤の一つである「ICTを活用した重症児家族の交流」に取り組んだ。具体的には,北海道道北地域に居住する重症児居宅6箇所を対象とし,ICTを活用した家族交流のための情報ネットワークの実証運用を約半年間にわたって継続した。評価は技術的な問題点,交流頻度,時間,交流内容記録の分析と家族のインタビューを手がかりに進めている。本研究は縦型情報メットワークをさらに拡張し,横型さらには格子型情報ネットワークなる支援基盤を構築することを目的とした。具体的には,まず適切なICTシステムの選択と技術的課題の検討を行う。次いで,支援提供者あるいは利用者がそれぞれ横方向に連携した情報ネットワーク((1)重症児家族の交流,および,(2)重症児施設と地域基幹病院との医療連携),さらに,縦型と横型の情報ネットワークを統合して地域生活を包括的に支援する格子(Grid)型ともいえる情報ネットワークを構築する。そして,これらの実証運用と評価を行い,実用化を目指す。昨年度の研究では,ICTシステムとしてインターネットテレビ電話:Skypeを導入するにあたり,パソコンにWebカメラを装着するハードウエアシステムを進めてきた。しかし,最近Skypeアプリが内蔵されたWebカメラが入手できるようになり,これを家庭用テレビに装着すれば,専用リモコンの操作でインターネットテレビ電話を利用できるようになった。このシステムはパソコンに不慣れな人たちでも容易に使用できるので,その利用範囲が格段に広がる。今年度はこのシステムを3家族に導入し,「重症児家族の交流」の実証運用を継続した。また,支援提供者相互の横型情報ネットワークでは小児慢性特定病相談室と重症児施設との医療連携の実証運用をスタートした。本研究では,まず適切なICTシステムの選択と技術的課題の検討を行った。次いで,支援提供者あるいは利用者がそれぞれ横方向に連携した情報ネットワーク(1重症児家族の交流,および,2重症児施設と地域基幹病院との医療連携),さらに,縦型と横型の情報ネットワークを統合して地域生活を包括的に支援する格子(Grid)型ともいえる情報ネットワークを構築した。本年度は,横型(利用者)情報ネットワークの一つのモデルとして,昨年度在宅重症児(者)居宅3箇所に設置したインターネットテレビ電話を利用して家族間交流「お喋り広場」を1ヵ月1回の頻度で継続的に開催した。そこでは,研究代表者も星城大学から,また,研究協力者も重症児施設:北海道療育園から参加し,縦型(支援提供者)・横型(利用者)情報ネットワークを構成する形で参加した。支援提供者相互の横型情報ネットワークでは,小児慢性特定病相談室と北海道療育園との医療連携や生活・療育相談の実証研究を継続した。

これらの成果は現在分析中であり,成果報告書で詳細を報告する予定である。本研究は,重症児(者)の地域生活を支援するために,ICTを活用した縦型情報ネットワークに加えて横型,格子型情報ネットワークを開発することであった。すなわち,縦型情報ネットワークは終日医療・生活相談や幼児期の療育のためであり,横型情報ネットワークは家族間の交流を促したり,重症児施設から地域の医療・福祉資源を支援するものであった。これらの情報ネットワークは,医療・生活・教育資源が重症児(者)や家族と密接に関わることができるように,格子型情報ネットワークへと拡張展開した。本研究成果はICT情報ネットワークが重症児(者)の包括的支援に有用な役割を果たすことを示唆した。本研究はその目的を達成するために4つの個別課題を設定した:1ICTシステムの選択と技術的課題の検討,2重症児家族の交流(利用者同士の横型情報ネットワーク),3重症児施設と地域医療機関との連携(支援提供者同士の横型情報ネットワーク),4包括的支援基盤(格子型情報ネットワーク)。課題1ではSkypeアプリ内蔵型Webカメラを新規導入することによって,パソコンに不慣れな家族の参加を促すことができた。課題2ではパソコンに不慣れな家族を含めて,重症児家族のICT上のコミュニケーションの場を展開でき,普段直接会うことが困難な家族間の交流を深めることができた。課題3では地域医療機関として小児慢性特定病相談室を取り上げ,重症児施設との連携をスタートし,現在実証運用を進めている。報道公開:ITで在宅の教育支援.日本経済新聞2014年10月4日医療福祉工学課題2重症児家族の交流では現在の3家族から5家族程度まで増やし,実証運用のデータを蓄積して実用化への有用性の評価と課題の分析と対策を追究する。また,課題3地域医療機関との連携では,現在進行中の小児慢性特定病相談室に加えて,地域基幹病である市立稚内病院と重症児施設との連携を推進する予定である。さらに,こうした縦型,横型の情報ネットワークを統合して格子型の情報基盤を構築する計画である。本研究では,その目的を達成するために4つの個別課題を設定した:1ICTシステムの選定と技術的課題の検討,2重症児家族の交流:横型情報ネットワーク,3重症児施設と地域基幹病院との連携:横型情報ネットワーク,4包括的支援基盤:格子型情報ネットワーク。課題1は当初の計画を達成できた。課題2の重症児家族の交流は1年間の実証運用の半ばであるが,家族からはICTによってお互いに顔をみながら気楽に話ができることで気持ちが休まり,癒しにつながったとの感想が聞かれた。報道公開:障害児テレビ電話で療育.北海道新聞2014年7月19日課題2について実証運用を継続し,少なくとも1年間にわたるデータを蓄積し,実用化を図るために有用性の客観的評価と課題の分析と対策を進めていく。また,課題3の横型情報ネットワーク:重症児施設と地域基幹病院との連携に着手する予定である。
地域の社会的凝集性、集団的エフィカシーならびに帰属意識が健康リスクを低減する効果

社会的凝集性、集団的エフィカシーならびに帰属意識について、指標分析、キーインフォマントインタビュー、住民調査を実施し、居住地域に対する帰属意識を形成する都市の社会的物理的な環境条件、市区町村レベルの疾病傷病リスクと社会的凝集性、集団的エフィカシーおよび帰属意識を含む地域関連指標との関連と、各要素の寄与を検証した。市区町村レベルの地域健康関連指数を作成し、住民の健康水準と地域指標の関連モデルを得た。全国の市区町村を悪性新生物、糖尿病および脳血管疾患、心疾患、不慮の事故の4分類による健康指標とその差について分析を行い、健康指標水準の差異と健康関連要因指標の差異の関連を明らかにした。全国の市区町村について、総務省、厚生労働省、環境省、文部科学省、警察庁等による統計調査データ、都道府県公開の資料、民間企業やNPO団体等の所有する資料より2000項目以上の指標について複数年分を収集し、データベースを作成した。健康都市連合日本支部の加盟都市において地域保健担当者等へのインタビューを行い社会的凝集性、社会関係資本および帰属意識に関する評価について検討し指標を追加した。市区町村レベルの平均寿命、14歳、6569歳、7579歳での平均余命のいずれかとr二乗で0.1以上の相関を有する地域指数を130種類以上得た。これらの指標よりステップワイズ法により変数を選択し、健康水準の調整済み決定係数が0.8となる住民の健康水準と地域指標の関連モデルを得た。死因別死亡割合に対してEMアルゴリズムによるクラスタ分析を行い、悪性新生物死亡の割合が相対的に高い自治体、不慮の事故、糖尿病および脳血管疾患による死亡の割合が高い自治体、心疾患による死亡の割合が高い治自体などのクラスタに分類できることが示された。健康都市連合日本支部の加盟41都市に対して調査を行い、26都市について医療レセプト関係データ、特定健康診査関係データ、検診・健診関係データ、消防救急関係データ、警察署関係データ、住民を対象とした調査データ、健康都市の活動に関するデータを複数年分収集した。帰属意識、社会関係資本、社会的凝集性に関する測定事例を要約し、過去5年間の指数値の変動を分析した。社会的凝集性、集団的エフィカシーの指標開発:社会的凝集性、集団的エフィカシーを含む社会的関係資、本地域への帰属意識、並びに地域のつながりに関連する概念ついて、昨年度調査および先行研究より質問項目を収集し、整理した。社会的関係資本項目は、近所、友人・知人、親戚とのつきあいや交流および相互信頼度、地域の活動や集まりへの参加度等に分類した。帰属意識には、土地・地域集団・地域文化に対する肯定的な認識、居住地域への愛着、定住意向、ルーツの感覚、地域社会の一員としての認識、地域での生活や交流への好感度を含めた。指標分析:昨年度作成した全国市区町村の健康リスクおよび関連指標のデータベースをもちいて、健康リスク、疾病の組み合わせによるクラスタ分類、健康水準の5年・10年推移の特徴、関連する地域の社会的凝集性、帰属意識についての指標と、それらの寄与について分析を行った。健康リスク・疾病のクラスタについては、悪性新生物、糖尿病および脳血管疾患、心疾患、不慮の事故の4分類をもちいて解析を進めた。帰属意識と町内内/自治会レベルで集計した社会関係資本および社会的凝集性の関連を非線形回帰モデルにより分析し、帰属意識を推進する社会関係資本および社会的凝集性の条件について検討した。上記の社会的凝集性、集団的エフィカシーの指標、健康リスクおよび疾病クラスタをもちいて、次年度に実施を予定している調査地域住民を対象とした自記式質問票を作成した。社会的凝集性、集団的エフィカシーの指標開発を行うとともに、健康リスクおよび疾病の組み合わせによるクラスタ分析、健康水準お年次推移の特徴について解析を進めた。健康指標と健康関連指標との関連について市区町村単位の統計データに基づき分析した。全国の市区町村を健康指標の高低で分類しその差についてOaxaca-Blinder decomposition分析を行った。健康指標の高低には、健康関連要因の差異が有意に関連していることが確認された。さらに、健康関連要因と健康指標との関連性に関して、健康指標が高い市区町村と低い市区町村で違いがあることが示された。市区町村の健康政策立案にあたっては、健康関連指標の改善のみでなく、健康指標の水準の異なる市区町村において、健康関連指標の影響が異なることをふまえて、政策に反映させる必要がある。包括的な健康推進プログラムを展開している自治体において、65歳以上の住民を対象に自記式質問票調査を実施し、予防可能な疾病・傷害の発生と予防技能、社会的凝集性との関連を検証した。住民基本台帳から無作為に抽出された3000名の65歳以上住民に質問紙を郵送し、回答を得た2167名について分析を行った。予防可能な疾病・傷害の発生率は、男性27.0%、女性43.0%であった。疾病・傷害の発生は、男性では同居形態、親族友人との交流が、女性では、親族友人との交流の有無が関連していた。また、独居、近所づきあいがない、親族友人との交流がない高齢者において、性別、年齢にかかわらず、疾病・傷害の予防に関連する対処行動をとっておらず、交流の少ない高齢者における疾病・傷害予防につながる対処行動の選択抑制が示唆された。健康指標の水準の異なる市区町村において、健康水準と健康関連指標との関係が異なること、地域の社会的凝集性、集団的エフィカシー、帰属意識の形成要因が、健康決定要因包括モデルに影響をもたらすことを明らかにした。

包括的な健康推進プログラムの展開にあたっては、これらをふまえた政策の検討が必要である。社会的凝集性、集団的エフィカシーならびに帰属意識について、指標分析、キーインフォマントインタビュー、住民調査を実施し、居住地域に対する帰属意識を形成する都市の社会的物理的な環境条件、市区町村レベルの疾病傷病リスクと社会的凝集性、集団的エフィカシーおよび帰属意識を含む地域関連指標との関連と、各要素の寄与を検証した。市区町村レベルの地域健康関連指数を作成し、住民の健康水準と地域指標の関連モデルを得た。全国の市区町村を悪性新生物、糖尿病および脳血管疾患、心疾患、不慮の事故の4分類による健康指標とその差について分析を行い、健康指標水準の差異と健康関連要因指標の差異の関連を明らかにした。全国の自治体について健康リスクおよび関連する指標についてのデータベースが構築された。健康都市については住民調査データを含むより詳細なデータベースが構築された。健康都市連合日本支部に加盟する包括的な健康推進プログラムを展開している自治体において、住民を対象に、社会的凝集性、集団的エフィカシーの指標開発を行うとともに、健康リスクおよび疾病予防についての自記式質問票調査を実施する。住民調査の結果をデータライン調査データと統合し、地域の社会的凝集性、集団的エフィカシー、帰属意識の形成要因を明らかにし、健康決定要因包括モデルにおける各要因の寄与度を評価する。地域保健全国の自治体のデータベースを分析し、健康リスクおよび疾病の組合せによるクラスタ分類、健康水準の年次推移の特徴、関連する地域の社会的凝集性、集団的エフィカシーならびに帰属意識についての指標とそれらの寄与割合を明らかにし、住民の健康水準の決定メカニズムについての包括的モデルを作成する。健康都市を例として都市の取組みの成果をモデル分析に基づいて示す。市区町村レベルの指標解析に必要なデータについて、自治体が有する住民調査データを自治体の協力により得ることができた。また、一部指標データについつえ、NPO団体等より無償のデータ提供を受けた。健康都市連合日本支部に加盟する自治体より協力が得られ、各自治体の実施する住民調査データを分析に利用することができた。さらにNPO団体等より無償でのデータ提供を受けた。また、指標データの電子化の急速な推進により直接分析に使用できる情報が増加しているため。調査対象自治体において、郵送による質問紙調査を予定している。調査対象自治体についてより長期的に継続したデータ収集を予定している。
微生物細胞膜脂質14C分析に基づく海洋DOC炭素循環と微生物ループとの関連性解明

海洋古細菌(マリンクレンアーキオータ)の代謝に関する情報(従属栄養・化学合計独立栄養の割合)、炭素循環におけるその役割(規模)について知見を得るため、海洋深層水取水施設でのサンプリングの実施し、古細菌(大きさ平均0.5-0.2μm)細胞膜由来テトラエーテル脂質(GTGTs)の放射性炭素の測定を行った。14Cの結果と併せて、現場培養、文献値などを総合した海洋古細菌マリンクレンアーキオータによる海洋における炭素固定量の試算を行った。駿河湾では、48-54%のクレンアーキオータが炭素固定をしているとしているとした場合の計算結果は、1.29Gt C/yrから6.29Gt C/yrと試算された。駿河湾で求められた48-54%のクレンアーキオータが炭素固定をしているとしているとした場合の計算結果は、1.29Gt C/yrから6.29Gt C/yrと試算される。またこの規模は、海洋一次生産量50 Gt C/yrと比較すると約2.5%から13%になる。これは、海洋全層におけるDIC量38000GtCと比べてみると、約数万年規模で交換する規模と計算される。このことは、現在、海洋DOCの放射性炭素年代が6000年以上と古いことを考慮すると海洋DIC物理的プロセスによる交換無しに微生物ループを通じた交換だけで生じて板場合、少なからず極端な計算結果を与えていないことを示唆するものであった。近年、分子生物学的手法の進歩から、非熱水性の古細菌が海洋全層に分布し、それらの古細菌が光合成非依存の化学合成独立栄養を高い活性で行っていることが示唆されるようになった。本研究では、これら海洋古細菌の代謝特性について地球科学的手法を用いて定量的に明らかにすることにより、海洋DOCプールを中心とした炭素循環と海洋微生物ループとの関連性解明のための知見を得る。すなわち、14Cによるマスバランスモデルとボックスモデルを用いて、微生物が用いるDOC炭素のターンオーバー時間を求め、海洋表層の一次生産量と従属栄養・独立栄養として微生物バイオマスが果たす役割について定量的に解明するものである。これまで(A)研究試料の採取、(B)分析方法の検討・確立、(C)微生物バイオマス(rRNA、細胞膜脂質分子(PLFA,GDGTs))の抽出、DOC, DICの14Cの測定に充填を置き研究を進める。試料採取は、外洋における大量海水ろ過を行う前の準備期間の一環として、国内の深層水くみ上げ施設、静岡県清水市の静岡県駿河湾深層取水施設(採水深度397m)で行った。フィルターに補足された微生物膜脂質分子(エーテル脂質GDGTs(分子量ca. 1300)(古細菌起源)、リン脂質脂肪酸(細菌起源))の抽出と同定を行った。海洋微生物の炭素源の解明のため、北極海、北太平洋、駿河湾等で採取した試料から微生物脂質を大量抽出する為のシステムの開発と抽出した微生物脂質の14C測定を行う。また海洋DOCの14C分析のための抽出ラインの製作を行う。14C同位体マスバランスモデルを用いた微生物利用DOC炭素循環に関する知見を得る。北極海で採取された海水試料を用いて、DOCの濃度及びそれらの放射性炭素分析の為の分析用消耗品購入に使用する。また14C分析に関する依頼分析の為の経費に使用する。
ダイナミックな分子デザインと変異集積による制限酵素の改変

酵素タンパク質に対する新規改変手法の方法論の構築を目的に、制限酵素BamHIの耐熱性向上をモデルとして研究を実施。Bacillus amyloliquefaciensH株の染色体DNAを抽出し、制限酵素BamHI遺伝子(bamHIR)と対応する修飾酵素遺伝子(bamHIM)を含むDNA断片を取得したが、大腸菌において一段階でクローニングすることは不可能であった。そこでbamHIMとbamHIRの個別クローニングを検討した。PCRによりbamHIMを含む約1.8kbHindIIIのDNA断片を取得し、これをpUC19に連結してプラスミドpUBMCを構築した。次に本プラスミドをE.coliDH5αMCR株に導入して得られた形質転換株を宿主としてbamHIRのクローニングを行った。PCRにより得たbamHIRを含む約1.4kbHindIIIのDNA断片を低コピーベクターpSTV28に連結し、プラスミドpSBRCを構築した。このpUBMCとpSBRCの2種のプラスミドを保有するE.coliBRの菌体内抽出液には制限酵素BamHI活性が検出され、目的遺伝子のクローニングと大腸菌での発現に成功した。しかし、粗酵素の見かけ上の熱安定性はクローンごとにまちまちであり、また希釈して活性を測定したところ限界希釈濃度に差が認められたため、クローンごとに発現強度の異なることが示唆された。以上より、変異を導入した制限酵素BamHIの解析や正確な評価、ならびにその生産を考慮すると精製ステップを新たに組み入れる必要性のあることが明らかになった。部位特異的変異の導入個所は、報告されている野生型BamHIの三次構造から算出した溶媒露出表面積やB-factor値よりアミノ酸の立体構造上の位置と揺らぎを計算し、二次構造・活性中心を加味して8ヶ所決定した。さらにその候補部位に対して、一般的にタンパク質を安定化すると考えられているアミノ酸の置換をシミュレーションして有効な置換アミノ酸を決定した。