hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内膜輸送系を介した非エンベロープウイルスの細胞外への放出

オートファジー(ATG)遺伝子に対するドミナントネガティブ変異体発現、又はATG遺伝子欠損が、種々のウイルス様粒子の細胞外への産生を負に制御することを明らかにした。また、細胞内における各種ウイルス蛋白質陽性構造体にはオートファゴソームマーカーであるLC3が一部共局在することを確認した。これらの結果は、オートファジーが非エンベロープウイルス放出に何らかの役割を持っていることを示している。申請者はこれまでに、ロタウイルスウイルス様粒子産生系を用いて、ウイルス粒子の放出に、細胞質画分を生体膜で隔離する働きがあるオートファジー経路が関与していることを、ATG遺伝子に対するドミナントネガティブ変異体を用いて明らかにした。また、ウイルス陽性構造体にはオートファゴソームマーカーであるLC3が局在することも確認した。また、申請者らはウイルス感染におけるオートファジーの普遍的な役割を調べるために、各種ATG KOマウス由来MEFに日本脳炎ウイルス(JEV)を感染させてウイルスの増殖を調べた。その結果、ATG3-/-, ATG5-/-, ATG9L1-/-, ATG7-/-, ATG14L-/-, ATG16L1-/-, Beclin-/-細胞を用いた場合、野生型と比較してウイルス増殖能に変化が認められなかったのに対し、FIP200-/-、p62-/-細胞を用いた場合では著しいウイルス価の低下が確認された。さらに、JEVを各種ATG欠損細胞に感染させ、オートファゴソームマーカーであるLC3輝点形成を検出したところ、ATG3-/-, ATG5-/-, ATG7-/-, ATG16L1-/-細胞では、輝点の形成が確認されなかったのに対し、ATG9L1-/-, ATG14L-/-, Beclin-/-, FIP200-/-, p62-/-細胞では野生型細胞とほぼ同等に輝点が形成された。これらの結果から、オートファジー機構のウイルス感染への役割はウイルスのエンベロープの有無により大きくことなり、また特定のウイルス種の増殖においては、オートファジーによるバルク分解機構は必要ではなく、むしろ、まだ明らかになっていない各種ATG因子の新た機能が深く関与している可能性が示された。申請者はこれまでに、ロタウイルスあるいは、HEVの構造蛋白質を全て培養細胞で発現させると、細胞障害を伴わず、ウイルス様粒子(VLP)が大量に産生されることを見いだした。この結果は、非エンベロープウイルスは、従来想定されていた細胞膜を破壊して細胞外出るわけではなく、何らかの膜形態変化を伴う細胞側の機構により能動的に細胞外へ放出されていることを示している。次に、ロタウイルスを材料に用い、VLPの放出が細胞質画分を生体膜で隔離する働きがあるオートファジー経路を介しているかどうか、種々のドミナントネガティブ変異体を用いて解析を行った。その結果、ATG(Autophagy)遺伝子の一つであるULK1の優勢変異体発現によってVLPの放出が著しく抑制されることがわかった。これは、オートファジー機構が非エンベロープウイルスVLP放出に何らかの役割を持っている可能性を示している。現在、申請者らは種々のATGノックアウトマウス由来繊維芽細胞より、ノックアウト細胞株を樹立し、種々の非エンベロープウイルスをin vitroにて感染させ、ウイルスの増殖能を調べている。これまでの解析から、Beclin欠損細胞では野生型細胞と比較すると、コクサッキーウイルスの増殖に大きな変化があること見いだしている。さらに、申請者らは免疫蛍光顕微鏡観察および、免疫電子顕微鏡観察により、細胞内小胞体(Endoplasmic Reticulum: ER)近傍にウイルス抗原陽性の新規構造体が形成されることを見いだした。また、我々はウイルス陽性細胞内構造体にはオートファゴソームマーカーの一つであるLC3と局在することも確認した。近年、オートファゴソーム膜はERに由来するといわれ、この結果は、ウイルス隔離膜がオートファゴソーム類似膜である可能性を示唆している。種々の細胞内メンブレントラフィック、特にオートファジー機構に関与する優勢変異体発現の影響を調べる実験は修了し、ポジティブな結果を得ている。また、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡観察にてウイルス蛋白質陽性構造物がオートファゴソームマーカー陽性であることも見いだしている。現在、種々のATGノックアウトマウスより遺伝子欠損繊維芽細胞株を樹立し、これら細胞へのウイルス感染性及び増殖能を調べることで、詳細な分子機構の解明を目指している段階である。しかしながら、ウイルス蛋白質をベイトとした結合蛋白質の同定や、ウイルスの放出に必要なウイルス側アミノ酸配列の同定などは、まだ解析されておらず、今後、早急に取り組むべき課題といえる。現在、オートファゴソームのウイルス粒子放出への関与を明確にする為に、種々のATGノックアウトマウスより、遺伝子欠損繊維芽細胞の樹立を行っており、今後これらの細胞株を用いてウイルスの増殖を詳細に調べ、ウイルス産生のどの段階でオートファジー機構が関与しているのか解析する予定である。

現在、ATG3-/-、ATG5-/-、ATG7-/-、ATG14L-/-、ATG16L1-/-、Beclin-/-、FIP200-/-、Rubicon-/-ノックアウトマウスより遺伝子欠損繊維芽細胞を得ている。最近、オートファジー機構は宿主細胞の自然免疫機構の作用に直接関与している報告がなされている。従って、オートファジー機構が直接ウイルスの増殖に関与しているか否か証明するためには、自然免疫機構が作用しない条件下でのオートファジー機構の有無による影響を解析しなければならない。現在、申請者らは、自然免疫反応におけるウイルス二本鎖RNAの認識に関与するIPS-1遺伝子とATG16L1遺伝子のダブルノックアウトマウスより遺伝子欠損繊維芽細胞の樹立を行っている。今後これらの細胞にウイルスを感染させ、その増殖能等を調べる予定である。また、ウイルス因子に結合する宿主因子を同定する為に、感染細胞からウイルス構造蛋白質を精製し共精製物のマススペクトロメトリー法による同定を行う。また、結合因子を同定した後は、その結合の生化学的解析を行う。今後、引き続きオートファジー機構とウイルス増殖との関係を調べる為に、遺伝子改変繊維芽細胞株の樹立とin vitro感染系を用いたウイルス増殖の分子機構を解析していく予定である。その為の培養用試薬等に研究費を使用する予定である。また、今後は、ウイルス蛋白質に結合する宿主因子の同定を目的としたプロテオミクス解析を中心に行う予定であり、これら解析に必要な実験消耗品の購入にも研究費を使用する。また、ウイルス粒子放出に必要なウイルス側のアミノ酸配列を同定するために、多くの点変異導入蛋白発現ベクターを作成する必要がある。その為にも、カスタムオリゴDNA合成や、分子生物学的解析に必要な消耗品の購入にも研究費を当てる予定である。
インターネット天文台と計算機シミュレーションの科学教育への応用

本研究では、大島インターネット天文台を用いて、大島商船高専学生に対する物理科目の実験授業実施、近郊小学校児童に対する公開講座実施による科学教育を行っていた。引き続き、インターネット天文台計画を津山から発言できるよう最善を尽くしたい。本研究のもう1つの柱である計算機シミュレーションの科学教育への応用については、数回実験授業を行った。具体的には以下の通りである。1「インターネット天文台」計画第2ステージ津山において「超小型インターネット天文台」の構築作業を行っている。ドーム開閉を伴わないシンプルな構造とするため、球面収差を考慮した1辺80cmの透明アクリル四角錐を載せたアルミケースの中に、口径12.5cmマクストフカセグレン式望遠鏡、小型ファンレスpc(Linux)などを装備している。本科研費による計画内容を噛矢として、今後は、断熱対策や公開へ向けた作業と教育的応用を目指したい。2計算機シミュレーションによる物理現象視覚化コンテンツの作成Flashによる視覚化コンテンツe-Physicsについて、大島商船高専と呉高専で行った実験授業をまとめた。最新の計算機シミュレーションを用いたプログラム開発はこれからであるが、そのための科学的知見を得るため、宇宙初期や中性子星内部で実現される高密度状態に関連する計算機シミュレ「ションをスーパーコンピュータ上で行い、幾つかの研究成果を得ることができた。学生と共に可視化コンテンツ作成を続ける予定である。研究代表者は、高専の物理系科目をより魅力的にするための方策として、宇宙・天文についての教育とJava言語やFlashを用いた計算機シミュレーションによる物理現象の視覚化に注目している。宇宙・天文については、知識のない学生であっても、具体的にイメージし易く興味を引き易い分野である。また、実験では実現することが不可能な物理現象についても、計算機の性能向上につれて、シミュレーションにより探求していくことが可能となってきた。1「大島インターネット天文台」計画第2ステージ2005年10月13日、本校物理実験室において、2年生を対象とした簡単な実験授業を実施し、大島インターネット天文台の動作の様子と太陽望遠鏡による太陽面の観察を行い、簡単なアンケートも実施した。5月13日「天体観測会-小惑星ケレス・パラスが見えるかな?-」、10月17日「天体観測会-ほんの少しですが、部分月食が見えるかな?-」について、それぞれ近郊の小学生に対して公開講座として実施した。さらに、天文台室内モニター用のCCDカメラがモノクロ出力で画像が不鮮明であったため、カラービデオ出力のあるネットワークカメラに変更、調整を行った。2計算機シミュレーションによる物理現象視覚化コンテンツの作成数値計算、コンテンツ配信用のサーバと開発用ノートPCを導入し開発環境を整備した。コンテンツ開発のための最新の科学的知見を得るため、宇宙初期の相転移や中性子星内部の高密度状態に関連する計算機シミュレーションをスーパーコンピュータ上で行い、幾つかの研究成果を得ることができた。また、研究代表者は平成18年4月に津山高専へ転任したが、今後は高専の物理系科目で利用可能な視覚化コンテンツ開発を加速させ、有益な教育プログラム作成まで目指したい。本研究では、大島インターネット天文台を用いて、大島商船高専学生の物理系科目に対する実験授業の実施、近郊小学校児童に対する公開講座の実施による科学教育を行っていた。研究代表者の転任により、天文台の維持・管理が難しくなっている。しかし、21世紀の理科学習ツールとしてのインターネット天文台計画を津山から発信できるよう最善を尽くす。本研究のもう1つの柱である計算機シミュレーションの科学教育へ応用については、幾つか実験授業を行っている。1「インターネット天文台」計画第2ステージ「大島インターネット天文台」は4m×2mスライドルーフ内に口径35cmシュミットカセグレン式望遠鏡を装備し、ネットワーク上のブラウザから操作できるものである。津山からもインターネット天文台計画を進める必要があるが、予算の関係もあり、「超小型インターネット天文台」の構築作業を行っている。ドーム開閉を伴わないシンプルな構造とするため、球面収差を考慮した1辺80cmの透明アクリル四角錐を載せたアルミケースの中に、口径12.5cmマクストフカセグレン式望遠鏡、小型ファンレスPC (Linux)などを装備している。Perlで書かれたプログラムから送信された制御信号をシリアルケーブルで望遠鏡に送り、望遠鏡のCCDカメラからの映像をビデオケーブルでPCに送る方式としている。

Perl制御プログラムチューニング、アルミケース屋上設置、最終調整と実際の利用まで、引き続き作業と教育的利用を行う。2計算機シミュレーションによる物理現象視覚化コンテンツの作成Flashで作成した視覚化コンテンツe-Physicsについて、大島商船高専と呉高専で行った実験授業をまとめた。また、津山高専でもその内容を紹介した。宇宙初期や中性子星内部で実現される超高密度状態について計算機シミュレーションを行っている。今後も、教育的に適切な内容について可視化コンテンツ作成を続ける。
腎へのHepatocyte Growth Factor遺伝子導入の基礎的研究

HVJ-liposome法によるHGF遺伝子の導入を試みた。最大の導入効率を目指し、投与法も筋肉内注射、尿管内注入、腎動脈からの注入、liposomeもanionic、AVE(artificial viral envelope)の二種類、発現ベクターもPUC SR α-HGF、EBNA-HGF、pcDNA3-HGFの三種類を試みた。実験はWister rat5週齢のオスを用いた。筋肉内注射は両側の大腿部に4-6箇所に分けて注射した。尿管内注入は、腎動静脈をクランプ後、尿管よりHVJ-liposome液をゆっくり注入、5分間留置、尿管はそのまま結紮した。腎動脈からの注入は同じく腎動静脈をクランプ後、腎動脈よりHVJ-liposome液を注入、5分間留置の後、腎動脈を修復した。発現の確認は注入から3日後、human HGFに対する抗体を用いたELISA法で行った。HVJ-liposome法は、遺伝子を内包した脂質の外側にHVJウィルスをつけ、細胞と融合し遺伝子を細胞内に送りこむようにしたものであるが、そのなかで今回は生体組織への導入に通常用いられる負電荷を有するanionic liposomeと、新たに開発されたウイルスの細胞膜成分を真似た脂質組成にしたAVE(artificial viral envelope)の二種類を用いた。ベクターも各種プロモーターを含んだ3種類のものを用いた。AVEと2種類のベクターを用いた尿管からの注入による発現実験、腎動脈からの注入を用いた発現実験の結果では、手術を行った対側腎でのHGFの発現と有意な差は認められなかった。腎への侵襲による影響を避けるため、まず筋注モデルにて導入確認を行うこととした。最終的には、pcDNA3-HGFのベクターをAVEで導入した群で最高の発現が認められた。今後はこれを用いて腎障害モデルでHGFの効果を検証したい。1.HGF腎再生作用の確認HGF腎再生作用をin vivoで確認するために、SHR ratにおけるタクロリムス腎毒性の系を用いて検討を行った。SHR ratにおけるタクロリムス腎毒性に対するHGFの腎保護作用、尿細管再生作用については、一部の研究を終了し現在投稿中(Transplantation Internationalis)である。実際には、タクロリムス投与により片側腎摘除後のSHRラットに腎機能障害を生じせしめた。摘除腎動脈断端より残腎動脈にcannulationを行い浸透圧ポンプに接続し、HGFを持続的にrhHGFを腎動脈内投与することによって、腎機能障害を軽減できることを確認した。2.ラット腎阻血による腎障害モデルの作成ラット腎障害モデルの作成のために、腎阻血のみではなく5/6腎摘除腎不全モデルの開発も合わせて施行した。1)5/6腎摘除不全モデル基礎実験を終了し、腎不全を生じうることを確認した(未発表)。片側腎摘除後に、対側腎動脈の腎内分枝を結紮することによって腎機能障害を生じえた。2)腎阻血モデル基礎実験を終了し、阻血時間と腎機能の推移について確認し、腎不全モデルとして利用可能であることを確認した(未発表)。3.リポゾーム法による腎への遺伝子導入Reporter geneを用いた腎潅流による遺伝子導入を試みたが、発現効率が良くないため一時中断している。このため、現在はまず筋肉内発現を目指し、HVJリポゾームを改良中である。具体的には、筋肉内で高発現、長期発現するとされている新しいvectorにHGFcDNAに組み込み、発現を検討中である。HGF遺伝子導入に当たって、どのようなliposomeが適切か?どのようなvectorが適切か?を検討するために、以下の実験を行った。

liposomeでは、anionicとartificial viral envelope(AVE)を、vectorではEBNA、pucSRα、PCMVのそれぞれの組み合わせで筋肉内投与を行い、そのmessennger発現と蛋白発現を検討した。この結果、HGF血中濃度で測定した場合にはAVE liposomeにPCMVのvectorを用いたときにもっとも効率のよい蛋白発現を認めた。したがって、以下の実験はAVE/PCMV11posomeを用いることとした。2腎阻血モデルラットではなくマウスを用い腎動脈を一定時間阻血することによって、腎虚血性変化による腎障害(急性尿細管壊死)を作成した。腎阻血の腎不全モデルに前項で検討したAVE/PCMV liposome法を用いて筋肉内発現によるHGFの腎保護作用を検討した。この結果、まったく有意な腎保護作用を確認しえなかった。投与時期、投与量、投与期間をさまざまに検討したがHGFの腎保護作用を認めなかった。3 5/6腎阻血腎不全モデルHVJ-liposome法による席FGH遺伝子の導入を試みた。最大の導入効率を目指し、投与法も筋肉内注射、尿管内注入、腎動脈からの注入、liposomeもanionic、AVE(artificial viral envelope)の二種類、発現ベクターもPUC SRα-HGF、EBNA-HGF、pcDNA3-HGFの三種類を試みた。実験はWister rat5週齢のオスを用いた。筋肉内注射は両側の大腿部に4-6個所に分けて注射した。尿管内注入は、腎動静脈をクランプ後、尿管よりHVJ-liposome液をゆっくり注入、5分間留置、尿管ほそのまま結紮した。腎動脈からの注入は同じく腎動静脈をクランプ後、腎動脈よりHVJ-liposooe液を注入、5分間留置の後、腎動脈を修復した。発現の確認は注入から3日後、human HGFに対する抗体を用いたELISA法で行った。HVJ-liposome法は、遺伝子を内包した脂質の外側にHVJウィルスをつけ、細胞と融合し遺伝子を細胞内に送りこむようにしたものであるが、そのなかで今回は生体組織への導入に通常用いられる負電荷を有するanionic liposomeと、新たに開発されたウィルスの細胞膜成分を真似た脂質組成にしたAVE(artificial viral eovelope)の二種類を用いた。ベクターも各種プロモーターを含んだ3種類のものを用いた。AVEと2種類のペクターを用いた尿管からの注入による発現実験、腎動脈からの注入を用いた発現実験の結果では、手術を行った対側腎でのHGFの発現と有意な差は誌められなかった。腎への侵襲による影響を避けるため、まず筋注そデルにて導入確認を行うこととした。最終的には、pcDNA3-HGFのベクターをAVEで導入した群で最高の発現が認められたた。今後はこれを用いて腎障害モデルでHGFの効果を検証したい。
正常歯胚ならびに歯原性腫瘍の発生における上皮内細胞の動態に関する病理学的研究

1.歯胚の形成・発育過程におけるmelanocyteの動態について:イヌ胎児の胎生前期中期頃から上下の顎骨内の歯胚周囲の間葉系組織内にmelanocyteの出現がみられ、それより遅れて口腔粘膜上皮内にmelanocyteが出現していた。さらに顎骨内にmelanocyteの出現をみた部位は、口腔粘膜とは皮質骨を介して明らかに離れていた。したがって、胎生期にmelanocyteは顎骨内をmigrationして歯胚周囲に達することが明らかとなった。2.歯の萌出後の顎骨内melanocyteの出現状況と分布に関する検討:検索には永久歯の萌出の完了した犬の顎骨顎骨内にmelanocyteがみられた。これらmelanocyteの出現部位はすべて歯根膜内であった。歯根膜内にmelanocyteをみたのはいずれも上顎で、前歯部に多く出現する傾向にあった。また、歯肉上皮との関連は連続切片によって否定できた。このような報告は未だ内外でなされてなく、新たな発見である。3.ヒト顎骨内の歯原上皮遺残の動態について:顎骨を歯の根尖部から骨体部深層に向かって縦走する脈管神経を容れる細管内に多数の歯原上皮遺残が認められた。これらの歯原上皮遺残はとくに神経線維を伝わって顎骨体部深層にmigrationしていた。また、一部の歯原上皮はかなり細胞活性に富んでいるものと思われ上皮性歯原性腫瘍や非炎症性嚢胞の発生母組織となり得ると考えられた。4.ヒトの歯原性腫瘍と嚢胞に関する臨床病理学的検討:1)間質の著しい骨増生を伴ったエナメル上皮腫例について,2)エナメル上皮歯牙肉腫について,3)歯槽部に限局したエナメル上皮腫について,4)歯原性上皮によって形成される導管様構造について,5)本邦におけるエナメル上皮腫の実態について,6)小児におけるエナメル上皮腫について,7)顎骨内に生ずる非歯原性の扁平上皮癌について1.歯胚の形成・発育過程におけるmelanocyteの動態について:イヌ胎児の胎生前期中期頃から上下の顎骨内の歯胚周囲の間葉系組織内にmelanocyteの出現がみられ、それより遅れて口腔粘膜上皮内にmelanocyteが出現していた。4.ヒトの歯原性腫瘍と嚢胞に関する臨床病理学的検討:1)間質の著しい骨増生を伴ったエナメル上皮腫例について,2)エナメル上皮歯牙肉腫について,3)歯槽部に限局したエナメル上皮腫について,4)歯原性上皮によって形成される導管様構造について,5)本邦におけるエナメル上皮腫の実態について,6)小児におけるエナメル上皮腫について,7)顎骨内に生ずる非歯原性の扁平上皮癌について1.歯胚の形成過程における上皮内細胞の動態に関する組織学的検討:イヌ胎児の歯胚を用いて、エナメル器の形成期と成熟期における上皮内細胞の関与の有無を検討中である。その結果、エナメル器の形成期に、上皮内細胞の一部が粘膜上皮側から形成途上のエナメル器側へ移動してくることを示唆する所見を観察しており、なお、その詳細を検討している。2.エナメル上皮腫と骨組織との関連:歯原性上皮性腫瘍であるエナメル上皮腫の多数例について、間葉成分の動態を中心に検討を加えた結果、一例に間質反応としての高度の骨形成が認められた。この骨形成と腫瘍上皮細胞との直接的な関連はみい出せなかったが、臨床的には顎骨に生ずる線維骨性病変との鑑別が問題となる例であり、英文誌に発表した。3.歯原性混合腫瘍における歯牙硬組織成分の形成:歯原性混合腫瘍のなかで、エナメル上皮線維象牙質腫あるいはエナメル上皮線維象牙質肉腫については、その存在が疑問であった。そこで、硬組織形成性の悪性歯原性混合腫瘍を用いて、連続切片を作製して検討を加えた。その結果、広範囲に象牙質が形成されている症例では、詳細な観察によって同時に多少ともエナメル質が形成されていることを証明した。したがって、エナメル上皮線維象牙質腫(あるいは肉腫)は、エナメル上皮線維歯牙腫(あるいは肉腫)とすべきであることを英文誌に発表した。4.エナメル器に出現する腺管状構造:歯牙腫を用いてその実態を明らかにした(英文誌で印刷中)。

5.その他の歯原性病変に関する英文論文2編。1.歯胚の形成過程における上皮内細胞の存在と分布に関する病理組織学的検討イヌの胎児を用い、通法どうりにパラフィン埋包連続切片を作製し、メラノサイトの出現の有無と、その分布状況について検討を行い、以下のような結果を得た。(1)胎生前期中期頃から口腔粘膜上皮にメラノサイトの出現をみるが、それよりやや遅れて顎骨内の歯胚周囲の間葉組織内にメラノサイトの出現をみた。これらのメラノサイトは、複数の長い細胞質突起を有するが、その数は上皮内に分布するものよりも少なかった。(2)顎骨内の歯胚周囲間葉内組織にメラノサイトの出現をみた部位は、口腔粘膜とは皮質骨を介して明らかに離れていた。したがって、胎生期におけるメラノサイトのmigrationは皮膚や粘膜の上皮に沿ってなされているのみならず、骨内においてもメラノサイトのmigrationがおこっているものと考えられた。このような現象は内外での報告がなく、新たな発見であった。(3)顎骨内の歯胚周囲間葉組織内に出現したメラノサイトと、歯胚上皮、歯堤上皮、退化歯原上皮との直接的な関連は見出せなかった。したがって、歯胚にメラノサイトが接近するのは胎生後期以降と思われた。以上の結果の要旨は第33回歯科基礎医学会(1991年10月,鹿児島)において発表した。2.ヒトの歯原性病変に関する病理学的事項(1)メラノサイトの出現状況とその意義について(第33回歯科基礎医学会(1991年10月,鹿児島)にて発表)。(2)歯原性病変の病理学的特性や鑑別診断等について(裏面論文発表)。1.歯胚の形成過程におけるメラノサイトの存在と分布に関する病理組織学的検討:イヌ胎児を用いて歯胚の形成過程におけるメラノサイトの存在と分布を病理組織学的に検討した。その結果、歯胚の石灰化開始以前に骨内を中枢側からmigrationしてきたメラノサイトは歯胚周囲結合組織に達していた。歯胚の石灰化開始以降の周囲結合組織内のメラノサイトはエナメル器あるいは歯乳頭に接近して移動してくる所見は認められなかった。したがって、正常な状態で歯胚とメラノサイトとの間に何らかの関連があるとすれば、それはサイトカインの様なものを介する間接的なもと推測した。なお、歯胚形成期における周囲メラノサイトの出現状況は上下顎で著しい差は認められなかった。本検討結果は現在論文としてまとめている。2.歯の萌出後の顎骨内メラノサイトの出現状況と分布に関する病理組織学的検討:歯胚形成期に顎骨内に出現したメラノサイトのその後の消長や分布状況を成犬を用いて病理組織学的に検討した。その結果、メラノサイトは歯根膜内に種々の程度に認められ、とくに歯根側1/2根尖部の範囲にわたって多くみられる傾向にあった。また、メラノサイトは歯根膜線維の走行と直交するように細胞質突起を伸長させていた。目下のところ歯根膜内に出現したメラノサイトの生物学的意義にまでは言及できるデータを得てはいないが、これまで内外の文献に記載のない画期的な発見であり、本年4月の日本病理学会総会において発表する予定である。3.顎骨内の歯原上皮遺残と神経線維束との関連に関する病理組織学的検討:ヒトの顎骨を用いて検索中であるが、歯根膜内に残存した歯原上皮遺残は神経線維束を伝わって骨体部のかなり深部にまでmigrationしていくことをみい出し、さらに詳細を検索中である。
頭蓋内主幹動脈閉塞性疾患における分子メカニズムの解明

1.家族性もやもや病におきてRNF213遺伝子に変異が認められた家系の患者の皮膚より、繊維芽細胞を採取し、iPS細胞を作成した。計3系統のiPS細胞が樹立され、筋肉や内皮細胞へ分化に異常が認められた2.もやもや病患者から中大脳動脈片を採取し、病理学的に解析した。小児例、成人例ともに中大脳動脈内皮と中膜に異常が認められ、この病変において頭蓋内血管も障害されていることが示された。脳血管疾患は厚生労働省の人口動態統計における国民年間死亡原因の第3位を長年占めている。しかも、厚生労働省の介護給付費実態調査によると要介護の原因となった疾患の内約3割が脳血管疾患であり、特に男性においてはその割合は4割以上と報告されている。脳血管疾患の半分以上を占める脳梗塞の主な原因の一つにアテローム血栓性脳梗塞があり、頭蓋内血管の狭窄も重要な一因である。しかし、頸動脈疾患や冠血管の動脈硬化による狭窄と比較して、その分子メカニズムに不明な点が多い、そこで今回の研究ではターゲットを頭蓋内主幹動脈とし、狭窄のメカニズムを明らかとし、予防法を開発する。一方、アジア特有の血管疾患としてウイリス動脈輪閉塞症(もやもや病)があり、頭蓋内内頸動脈終末部の狭窄を特徴としている。当疾患の一割から二割は家族性に発生することが知られており、最近その遺伝子解析の結果が明らかとなり、研究も推移している。今回の研究では頭蓋内主幹動脈狭窄を通常の動脈硬化性病変ともやもや病の二つの疾患からアプローチする。京都大学脳神経外科ではこれまでにもやもや病の手術サンプルの免疫組織学的検討により、病変の内膜肥厚と中膜の薄泊化とそのメカニズムにcaspase-3とhypoxia inducing factor-lalfaが関与することを示した。また、共同研究者の小泉は家族性もやもや病患者の遺伝子解析の結果より遺伝子RNF213のp.R4810K多型がもやもや病の感受性を高めることを証明した。もやもや病は、一卵性双生児においても形質が一致しないことがあり、感受性者が人口の2-3%程度いるにもかかわらず頻度はその300-1000分の1であることなど、浸透率が低い現象を見出してきた。本年度は京都大学iPS細胞研究センターのもやもや病患者由来iPS細胞が三系統樹立された。樹立したiPS細胞を用いて、平滑筋細胞および内皮細胞への分化を誘導され、管腔形成能が一部障害されていることが見いだされた。また、もやもや病患者および動脈硬化性病変患者の中大脳動脈、髄液、硬膜などの生体試料を採取し保存しているが、現在までに95サンプルの保存が行われ解析中である。京都大学iPS細胞研究センターの高橋研究室で樹立したiPS細胞を用いて、平滑筋細胞および内皮細胞への分化を誘導した。正常なヒト細胞から樹立したiPS細胞と比較して内皮細胞、血管平滑筋細胞の分化割合、増殖能を評価し、もやもや病由来の内皮細胞は管腔形成能が低下していることが確認された。また、RNF213タンパクを欠損させてマウスでは表現型に異常を認めなかった。また、同タンパクの過剰発現マウスでは、hypoxiaにした際のmicrovesselの濃度に差が認められ、RNF213のangiogenesisにおける関与が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。現在順調に研究は進行している。3名の患者組織より3系統のips細胞が樹立され、内皮細胞に分化することが確認できた。

されには試験管内血管形成モデルを使って管腔形成能があることが確認された。これまでの研究達成について1先行研究により、RNF213遺伝子に変異が認められた家系より京都大学医の倫理委員会の承認を得て繊維芽細胞を取得している。この細胞より京都大学iPS細胞研究センターのiPS細胞を樹立した。2樹立したiPS細胞を用いて、内皮細胞への分化を誘導した。通常の分化した細胞を用いて、epigeneticな解析を行う。正常なヒト細胞から樹立したiPS細胞と比較して内皮細胞、血管平滑筋細胞の分化割合、増殖能を評価した。3動脈硬化性動脈狭窄患者からの血液にRNF213遺伝子の異常が認められるかを、SNP解析により検討した。4もやもや病患者および動脈硬化性病変患者の中大脳動脈、髄液、硬膜などの生体試料を採取し保存した。以上のように研究は進行している。26年度が最終年度であるため、記入しない。今後、研究計画通りに研究を進行させていく予定である。ips細胞から分化させた内皮細胞の機能解析を行う。分化能や増殖能の差異を検討する。さらには今までに成功していない血管平滑筋細胞への分化実験もすすめる。Mysterin knockout miceについても機能解析を行う。今後の研究推進について26年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画通りに予算執行を行う予定である。申請通り、主に動物代や試薬費などの消耗品での使用を考えている。大きな備品などの購入の予定はない。研究計画の一部遅れがあり、研究費使用がずれ込んだため。生体試料(主に中大脳動脈切片)の免疫染色(抗体、試薬)に使用する。
微生物のエンドグリコシダーゼの変異酵素を活用した糖鎖医薬品の開発と調製法の確立

土壌より単離したカビMucorhiemalisが生産する特異的な糖鎖分解酵素(エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ)はタンパク質より加水分解した糖鎖を化合物に付加する活性(糖転移活性)を持っている。この反応を効率良く行う変異酵素を取得して、機能性を持つ糖鎖複合体の合成に用いた。すなわち、反応中間体(オキサゾリン糖鎖誘導体)を合成し、それを基質として用いた変異酵素による効率的な合成方法を開発するとともに、インフルエンザウィルス感染阻害剤などの医薬品の調製に応用した。本研究は微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用することによって糖鎖をミミックした糖鎖複合体を合成し、感染症の抑制効果を持つ糖鎖医薬品を開発して、その調製法を確立することを目的としている。我々はこれまでに糸状菌Mucorhiemalisのエンドグリコシダーゼ(エンドーβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、エンドーM)の特異な糖転移活性を利用することにより、生理活性糖ペプチドなどのさまざまな機能性糖鎖複合体を合成して、難溶性の改善、血中半減期の延長、熱安定性の増加など、期待される機能の付加を行ってきた。しかし、エンドグリコシダーゼは本来、加水分解酵素であるために糖転移反応によってひとたび生成した生成物も直ちに分解されてしまうと言う問題がある。そこで、上記のエンド-Mの糖転移活性を改善するために、活性中心付近のアミノ酸残基に部位特異的変異を導入したところ、加水分解活性が減少する一方、糖転移活性が高められた変異体酵素Y217Fを取得した。そこで、本変異体酵素を用いてヒトインフルエンザウイルス感染阻害剤の効率的な合成を行った。すなわち、ニワトリ卵黄から得たシアロ糖ペプチドを糖鎖供与体とし、p-ニトロフェニールーN-アセチルグルコサミニドをその受容体として、変異体酵素Y217Fを作用させて糖転移反応を行い、得られたシアロ糖鎖複合体を還元アミノ化反応によってキトサンへ多価結合して、シアロ糖鎖ポリマーを得た。この感染阻害剤を用いて、イヌ脾臓細胞(MDCK細胞)へのウイルスの感染の阻害を調べたところ、ヒトインフルエンザA型およびB型ウイルスについて、非常に有効であることがわかった。次いで、最適な阻害剤の作成を検討したところ、バックボーンのキトサンの重合度が500でシアロ糖鎖の付加率が15%の糖鎖複合体が最も効率的な感染阻害剤であることが明らかになった。これは分子モデリングによるヘマグルチニンとの構造的相関性によっても証明された。今年度は主としてエンド-Mの特異なsubstrate assisted catalysis機構に基づいて、オキサゾリン構造を有する糖鎖供与体を用いた糖転移反応を検討するとともに糖転移活性が高められた変異酵素の取得を試みた。すなわち、エンド-Mは酸性アミノ酸からなる酸塩基触媒残基のみを有する一方、基質のN-アセチルグルコサミン残基の2-アセトアミド基が求核残基として機能して、オキサゾリン反応中間体を形成し、酵素反応が進行する。そこで、オキサゾリン反応中間体を基質として糖転移反応を進行させ、加水分解は抑制されるような酵素反応を検討した。まず、ニワトリ卵黄から抽出単離したシアロ複合型糖鎖を有する糖ペプチドにエンド-Mを作用し、遊離したN-アセチルグルコサミン一残基を有するシアロ複合型糖鎖にトリエチルアミンと2-クロロ1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリドを加えて反応することによってエンド-Mの酵素反応中間体であるオキサゾリン糖鎖を化学合成した。昨年度において、加水分解活性は低下しているにもかかわらず、オキサゾリン糖鎖を供与体基質とした場合の糖転移活性は保持されている変異酵素N175Aを取得しているので、本変異酵素を多量に調製し、得られた精製酵素標品を用いてシアロ複合型糖鎖のオキサゾリン中間体を供与体、N-アセチルグルコサミンを付加したエリスロポエチンの部分ペプチドを受容体として糖転移反応を行ったところ、糖転移生成物である糖ペプチドが効率的に生成された。また、本変異酵素を用いて、ヒトインフルエンザウィルスの感染阻害剤を効率的に化学-酵素合成した。次いで、N-175残基について、さまざまなアミノ酸に置換した部位特異的変異酵素を作成して、オキサゾリン糖鎖を用いた糖転移活性を検討したとこう、アスパラギン残基をグルタミン残基に置換したN175Q変異酵素が最も高い糖転移活性を示すことを見出した。本年度はエンド-Mの酵素反応がsubstrate assisted catalysisという特異なメカニズムによって行われることに基づいて、酵素反応中間体であるオキサゾリン糖鎖の簡便な化学合成と変異酵素N175Qの調製、それらを用いた生理活性糖ペプチドの調製について研究を行った。

オキサゾリン糖鎖の調製はニワトリ卵黄より抽出単離したシアロ複合型糖鎖を有する糖ペプチドにエンド-Mを作用して遊離した糖鎖をトリエチルアミン存在下でジメチルイミダゾリニウムクロライド処理した後、ゲルろ過することによって調製した。昨年度の研究により、加水分解活性が抑制されているにもかかわらず、オキサゾリン糖鎖を供与体基質として糖転移反応が進行する部位特異的変異酵素のN175Qについても大量調製した。本変異酵素はpET23bプラスミドベクターに繋いだエンド-Mの遺伝子を鋳型にして、部位特異的変異させた遺伝子をPCRによって増幅させ、それを導入した大腸菌BL21(λDE3)を培養して発現させた後、His-Tagカラムによって精製し調製した。さらに、これらを用いて、血圧降下作用を有する生理活性ペプチドのサブスタンスPおよびPAMP12の糖ペプチドを化学-酵素合成を行った。本反応により生成したサブスタンスPの糖ペプチドの生成収率は98%、PAMP12の糖ペプチドの生成収率は95%であった。PAMP12について、nativeのペプチドと糖鎖を付加した糖ペプチドについてプロナーゼを添加して、その酵素分解に対する安定性を調べたところ、糖ペプチドはプロテアーゼに対する高い抵抗性を示すことを明らかにした。さらに、高マンノース型糖鎖を有するウシ膵臓リボヌクレアーゼBの糖鎖をエンド-Hによって遊離した後、N175Q変異酵素とオキサゾリン糖鎖を用いた糖転移反応によってシアロ複合型糖鎖にリモデリングした。シアロ糖鎖を有するリボヌクレアーゼBについてはESI-TOF MSによって同定した。
ＢＤＮＦエクソンをターゲットとする痛みの評価と遺伝子療法

本研究の主眼は、痛みのニューロモジュレータとして機能する脳由来神経栄養因子(BDNF)を痛みのマーカーとして利用し、BDNFをターゲットとした痛みの遺伝子療法を目指すものであった。本研究を通じて、以下の点が明らかとなった。脊髄レベルでのBDNF発現介入による鎮痛効果は限界があり、ターゲットを「脳レベル」に絞ることで鎮痛効果を得る可能性を示した。さらに、脳内のBDNF発現介入はうつ様行動を変化させ、神経障害性疼痛における臨床応用の可能性を示した。また、鼻腔からのBDNF投与は脳内BDNF発現を効率よく変化させた。本研究の主眼は、痛みのニューロモジュレータとして機能する脳由来神経栄養因子(BDNF)を痛みのマーカーとして利用する。その上で、BDNFをターゲットとした痛みの遺伝子療法を目指すものである。具体的に、当初の平成25年度の予定は(1)BDNFデコイの作成と(2)BDNFのノックダウンの確認であった。我々も目指していた「脊髄レベル」でのBDNFのデコイによるノックダウンを以前所属していた施設で共同研究していたObataらが我々に先駆けて報告したが、その鎮痛効果は臨床で応用するには、はるかに弱いものであった。そこで、本年度は当初の予定を遂行しながら、ターゲットを「脊髄レベル」から「脳レベル」でのBDNFの変化に標的を絞って研究を実施した。本研究の主眼は、神経障害性痛モデルの痛みを新方法により詳細に再評価し、痛みのニューロモジュレータとして機能する脳由来神経栄養因子(BDNF)を痛みのマーカーとして利用する。初年度はラット神経障害性モデル(L5脊髄神経結紮)を作成し、コントロールモデルと痛み行動の違いを詳細に判定した。すなわちvon Frey刺激による反応とピン刺激による反応をそれぞれのモデルで調べ、単なる反射反応、弱い痛み反応、強い痛み反応に分類する研究に着手した。その結果、従来のvon Frey刺激では陽性と判定されるが、ピン刺激では反射反応や弱い痛み反応と評価されるラットがかなりの割合であることが認識され、従来の痛み判定の問題点が明らかとなった。すなわち、従来の基礎研究レベルで痛み反応と評価されたが、真の痛み反応を表現していない動物を使用して、痛み関連物質を研究していた可能性が示唆され、その結果での痛み関連物質の研究や鎮痛薬の開発に問題があった可能性を明らかとした。以上を含めた結果をシンポジウムで学会発表した(2012年度日本麻酔科学会:AnalgesiceffectsかAnimalgesic effectsか?)。また、脊髄レベルおよび脳レベルにおける痛みで特徴的に発現するBDNFエクソンを同定するための予備研究として、MNDAおよびCOXなどの定量研究を実施した。その上で、BDNFをターゲットとした痛みの遺伝子療法を目指すものであった。初年度は「脊髄レベル」でのBDNFのデコイによるノックダウンを目指したが、その鎮痛効果は臨床で応用するには、はるかに弱いものであった。そこで2年目は、ターゲットを「脊髄レベル」から「脳レベル」でのBDNFの変化に標的を絞って研究を実施し、脊髄および脳でのBDNFでの測定を可能とした。また、神経障害性痛モデルのラットでは脳内のBDNF量の変化が見られ、その変化が痛みと同様にうつ様行動に関係していることを見いだした。最終年度は、動物モデルにおける脳内BDNFの発現介入による痛み治療の基礎研究を実施した。効率よく脳内のBDNF濃度を変化させる方法として、鼻腔と脳内への物質移動に着目し、ラットの鼻腔からBDNFの投与を試みた。その効果、ラットの鼻腔投与によるBDNFの濃度の変化に伴い、神経障害性疼痛モデルラットにおいて、疼痛行動とともにうつ様行動の変化を確認した(神経障害性痛モデルラットにおける脳由来神経栄養因子の脳内変化.第7回PMRG 2014)。以上、本研究を通じて、以下の点が明らかとなった。さらに、脳内のBDNF発現介入はうつ様行動を変化させ、鼻腔からのBDNF投与は脳内BDNF発現を効率よく変化させ、神経障害性疼痛における臨床応用の可能性を示した。麻酔科学本年度の当初の予定は(1)BDNFデコイの作成と「脊髄レベル」での(2)BDNFのノックダウンの確認であった。しかし、前年度の研究結果や他家の報告から、脊髄レベルでのBDNFのノックダウンの鎮痛効果は限界があり、ターゲットを「脳レベル」に絞り、研究を継続した。上記を受け、脳でのBDNFでの測定を可能とした。

その結果、神経障害性痛モデルのラットでは脳内のBDNF量の変化が見られ、その変化が痛みと同様にうつ様行動に関係していることを見いだした。また、急性痛では術後痛モデルを作成し、脳における手術侵襲後の痛み関連物質の変化につき報告した。炎症の抑制が急性痛および慢性痛モデルでも脳内のBDNFの発現に大きく関与していることが示唆され、今後脳内のBDNF発現抑制介入が痛み治療として期待される結果を得た。上記の結果は内外の学会で発表した。以上の如く、ターゲットを脊髄から脳レベルへ移行したが、研究計画は概ね予定通りの進捗状況である。平成24年度の当初の計画は以下であった。1)神経障害性痛モデルの作成と痛みの行動の詳細な評価:ラット神経障害デル(L5脊髄神経結紮)において、von Freyフィラメントおよびピン刺激で疼痛反応を詳細に判定し、痛み行動なし、弱い痛み、強い痛み行動群に分類し、痛みの強さ評価を客観的にスコア化する。2)痛み行動の強さと脊髄後根神経節(DRG)での各BDNFエクソンの発現量の関係:1)で分類した群で、取り出したDRGから抽出したBDNFの総量ならびに各エクソンの発現量を測定し、最も痛み行動と相関するエクソンを特定し、痛みの測定マーカーの候補とする。上記計画のうち、1)は達成されているが、2)に関してはBDNFエクソンの発現量の定量までは至っていない。しかし、その基礎部分までは達成できており、ほぼ年間予定どおりの達成度であり、結果として学会発表もできた。本年度の主な研究は、動物モデルにおけるBDNFの発現抑制介入の痛み治療の確立である。今までの研究で、BDNFの脊髄レベルでの遺伝子的ノックダウンの鎮痛効果は限界があることが判明した。さらに、慢性痛でうつ様行動と脳内BDNFレベルの関係が判明しており、最終年度では、さらに動物における脳内BDNFの発現メカニズムを詳しく調べるとともに、うつと同様にヒトにおける痛みとBDNFの関連を明らかにすることである。研究資金はほぼ、予算通りの執行で前年度の繰り越しもない。本年度もターゲットは脊髄レベルから脳レベルに移行するが、予定通りの執行を見込んである。前年度の結果を受け、最も痛み行動と相関するBDNFエクソンを特定し、痛みの測定マーカーの候補とする。この特定したBDNFエクソンをもとにBDNFデコイの作成を次年度の大きな目標とする。具体的方策としては次の段階を計画する。a)特定したBDNFエクソンの転写調節領域を特定する。b)特定した領域からいくつかのフラグメントに分け、DNAデコイ候補を作成する。c)作成したDNAデコイ候補を用い、BDNFプロモータ部の転写活性の抑制を測定する。d)結果を受けて、フラグメントをプラスミドに組み込み、PCRにより増幅、精製、調整する。初年度の経費が約75万円程度未使用となった原因は、第一に機器の購入を今年は見送ったことによるところが大きい。従来からの機器の使用で本年度は乗り切れたが、来年度には新規購入の可能性が大きい。
Death-Educationのため具体的方略の実践・評価(その2)

先行研究:小児(小・中学生)の死の概念発達と生活体験をベースに、「Death-Educationの具体的方略の開発と実践・評価」に取り組んできた。その間にも社会ではいじめ、凶悪犯罪の低年齢化や親子・クラスメートといった身近な人間間で大切な命が絶たれるといった悲劇が起こっている。研究を通して1)死をタブー視し、子どもとの会話を避けている大人社会、2)死別体験を含め身の回りの出来事を、実体験として行動シェマ(ピアジェの認知発達)に取り込めていない子ども、が推測された。目的:死をとおして命の大切さや生(いかに生きるか)について学ぶDeath-Educationの実践・評価と、学校教育への導入を広めることである。Death-Educationの意義・必要性は理解しても、その受け入れとなると躊曙する学校がまだ多く。平成18年秋、S市A小学校で6年生を対象に約半年かけて実施している単元「いのちの授業」(計36時間)のメンバーに加えて頂き(担当は後半の単元:死はいきることを考える)、Death-Educationの実施・評価、さらにディスカッション方式の導入も試みた。教材:難病の心疾患と闘いながら、生きようと頑張った同6年生のドキュメンタリービデオである。研究方法:帰納的記述的方法である。Death-Education前後に提出願ったレポート、および今回Death-Educationの後に初めて導入しクラス毎のフリーディスカッションを録音したテープ、から逐語録を作成、意味を損なわない範囲でコード化、カテゴリー化を図った。結果:「いのちの授業」をとおして(1)命の大切さ(たとえいじめにあっても,自ら命を絶たないでほしい)、(2)健康に生活していることの幸せ・これからの生き方(生きたくても亡くなっていく同年代を通して、当たり前が当たり前でないこと)、さらに殺人や自殺に関して、自分の考えをしっかり表現している。さらに(3)「いのちの授業」を、今まで考えることが無かったテーマと述べ、この授業があって学べたことを良かったと表現している。「ビデオ視聴後のレポート」からは(1)生き方に感動、(2)見習いたい生き方、(3)死の理不尽さ、(4)命、生きることへの再確認、(5)悔いの無い死、(7)支えあう人と人、(8)生き方を通しての贈り物、が抽出された。「フリーディスカッション」は、授業中途切れることが無いくらい活発なやりとりがなされた。自分の言葉で表現したいという欲求、子ども同志が語り合う中、相手の気持ちに共感できる心や能力を有していることを実感した。考察:対象学年を広げ、知識と体験のバランスに着目、小学校カリキュラム全体に位置づくDeath-Educationの構築が急がれる課題である。平成13-15年度報告書でDeath-Educationのための指針および具体的方略の開発と実践・評価-小・中学生を対象とした-を報告した。

平成16年度はDeath-Educationのための指針および具体的方略の開発と実践・評価(その2)の第1段階として、テレビ局・新聞社等からの問い合わせもあり社会問題ともなっている、死の可逆性「死んだ人は生き返ることができる」に着目して、Death-Educationの事前調査および実践・評価を、小学校低学年・高学年、中学生に焦点化し再度分析・検討を重ねた。その結果、子どもの「死の不可逆性」の理解に「変化」あるいは「混乱」が生じていることが示唆された。具体的には、「死ぬことは眠ることと同じで、目がさめるとまた生き返ることができますか」「死んだ人を生き返らせることはできますか」に「はい」あるいは「わからない」と回答した中学生は、合わせると34.1%で小学生より中学生で増加している。「死んだ人は決して生き返らないですか」に「いいえ」あるいは「わからない」と回答した生徒は、合わせると小学校低学年41.8%、高学年47.3%であるが、中学生は51.9%と5割に及び、学年が進むに従って死を可逆的に捉える傾向の増加が示唆された。そのため17年度は、前述した「死の不可逆性の理解」に影響する要因・背景にも着目、これらを含めて、Death-Educationのための指針および具体的方略の開発と実践・評価(その2)を進めていく予定である。16年度において、学年が進むに従って死を可逆的に捉える傾向の増加がみられ、子どもの「死の不可逆性」の理解に「変化」あるいは「混乱」が生じていることが示唆された。そのため17年度は、特に中学生のデータに着目し、「死の不可逆性」の理解に影響する要因・背景について分析を重ねた。その結果、Death-Educationをとおして、命の大切さを再発見するとともに、個としての命の存在から、他者との関係性や命の複雑さへと広がりが見られた。具体的には「生まれたときから体の不自由な人」「病気で苦しんでいる人」「生きたくても生きられないで死んでいく人」の存在を知らなかった自分に気づき、自分の中に命を軽視していた部分を発見している。健康に生まれ、勉強(成績)が唯一であるかのような価値社会で生活する中学生にとって、生まれた時から障害を有し、入退院を重ねながら成長してきた同年齢のU君の体験・命に対する思い・自他の命を粗末にしている同年代への投げかけは、深く・重く響いたことがDeath-Education前・後のレポート内容から確認できた。近藤らは、「いのちの教育」の重要な時期として、小学校高学年10歳から中学校14・15歳の段階を挙げている。この時期は、自分は何のために生きているのか、生きるとは・・・、人間とは・・・等々根源的な問いに対して自問自答する第二の誕生期と言われる。これらの問いに自分なりの答えが見出せず、問題を棚上げしたまま日々生活している生徒も居る。学年が進むに従って死を可逆的に捉える傾向が増し、「死の不可逆性」の理解に「変化」あるいは「混乱」が生じていることが危惧されている背景には、バーチャルな体験が増加する一方、実体験の機会の減少といった現代社会において、中学生になっても根源的な問いに答えを見出せず棚上げ状態で生活している姿が推察される。
ミドリムシから生合成されたβ1,3-グルカンを用いた高強度・高性能繊維の開発

本研究では、プラスチック生産における石油依存および可食系原料の利用から脱却し、真の持続的な物質循環型社会を構築するために、二酸化炭素と水からミドリムシにより生合成される多糖類の一種であるパラミロン(βー1,3-グルカン)を用いて、グルコース単位当たり3つ存在する水酸基をエステル基で化学修飾することにより熱可塑性を付与し、溶融紡糸法により高強度繊維を作製することに成功した。さらに、大型放射光を用いて、パラミロンエステル誘導体の分子鎖構造の解析に成功した。本研究では、プラスチック生産における石油依存および可食系原料の利用から脱却し、真の持続的な物質循環型社会を構築するために、二酸化炭素と水からミドリムシにより生合成される多糖類の一種であるパラミロン(β1,3-グルカン)と微生物が生合成する同じ化学構造を有するカードランを用いて、グルコース単位当たり3つ存在する水酸基をエステル基で化学修飾することにより熱可塑性を付与し、溶融紡糸法により高強度繊維を作製することを目的とする。さらに、大型放射光を用いて、パラミロンおよびカードランエステル誘導体の分子鎖構造および結晶構造を解析すると共に、物性と構造の相関を解明し、より高強度な繊維を開発することを目的としている。本年度は、パラミロンとカードランを2種類の方法でエステル化した。一つは、トリフルオロ無水酢酸(TFAA)とカルボン酸を用いた不均一反応によるエステル化であり、他方は、ジメチルアセトアミド(DMAc)と塩化リチウム(LiCl)にパラミロンあるいはカードランを完全に溶解させた後、無水カルボン酸とピリジンなどの触媒を用いてエステル化を行う方法である。いずれの方法により、アセチル基からラウリル基まで8種類のエステル基を導入することに成功した。合成した8種類のパラミロンエステルおよびカードランエステルについて、熱的性質および機械的性質について測定を行った。熱的性質は、パラミロンエステルとカードランエステルはほとんど同じであり、アセテート誘導体からヘキサノエート誘導体までは結晶性であり、それ以降は非晶性であることが分かった。破壊強度は、分子量の大きかったカードランエステル誘導体の方が大きかった。したがって、カードランエステル誘導体を用いて溶融紡糸繊維の作製を行った。カードランプロピオネートから非常にきれいな溶融紡糸繊維を作製することに成功した。β-1,3結合を有する多糖類であるパラミロンおよびカードランからそれぞれ8種類のエステル誘導体を合成することに成功するとともに、その熱的性質および機械的性質を測定することができた。さらに、一部のエステル誘導体から溶融紡糸繊維を作製することができ、非常に多くの結果を得た。これらの結果については、現在学術論文を執筆中である。さらに、アセテート誘導体からヘキサノエート誘導体までは結晶性、それ以降は非晶性と、置換基により結晶性と非晶性を制御できることも見出した。また、アセテート誘導体は6回らせんの分子鎖構造をとるのに対し、プロピオネートからヘキサノエート誘導体は5回らせん構造をとることも分かった。現在、これらの分子鎖構造について構造解析を遂行中である。本研究では、プラスチック生産における石油依存および可食系原料の利用から脱却し、真の持続的な物質循環型社会を構築するために、二酸化炭素と水からミドリムシにより生合成される多糖類の一種であるパラミロン(βー1,3-グルカン)を用いて、グルコース単位当たり3つ存在する水酸基をエステル基で化学修飾することにより熱可塑性を付与し、溶融紡糸法により高強度繊維を作製することを目的とした。さらに、大型放射光を用いて、パラミロンエステル誘導体の分子鎖構造および結晶構造を解析すると共に、物性と構造の相関を解明し、より高強度な繊維を開発することを目的とした。8種類の長さの異なるエステル基で置換されたパラミロンエステル誘導体の合成に成功した。熱分解温度は、パラミロンの熱分解温度である280度から330度へと上昇し、熱安定性の向上に成功した。短鎖のエステル誘導体は融点が観測できたことから結晶性であり、長鎖の誘導体は融点が観測されなかったことから非晶性であることから、エステル基の長さにより結晶性と非晶性を制御できることが分かった。一方、フィルムの物性については、短鎖の場合は高強度で、長鎖の場合は破壊伸びに優れた性質を示した。短鎖エステル誘導体から溶融紡糸繊維の作製に成功するとともに、X線回折測定の結果、パラミロンエステル誘導体は分子鎖軸方向に5回らせんの対称性を有する、非常に珍しい分子鎖構造をとることが分かった。さらに、射出成型にも成功し、実部材に近いダンベル片の作製にも成功した。(1)エステル置換度の制御による高性能化:均一反応の反応時間をコントロールすることにより、置換度の異なるエステル誘導体を合成する。合成した様々な置換度を有するエステル誘導体の熱的性質、成型加工性を解析すると共に、酵素を用いた酵素加水分解性についても検討を行い、生分解性を有しながら熱成型加工も可能な置換度を決定する。