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日本古代における戒律思想の定着と発展

本研究は、中国より日本へ移入された戒律思想、及びその媒体となる言語表現が、奈良時代末期から平安時代初期の日本文化にいかなる影響を与えたかという点を追究したものである。仏教信者の実践規範となる戒律については、奈良時代においては中国における制度の忠実な導入が重視されていたが、平安時代には必ずしも中国の戒律実践に拘泥しない傾向が顕著となっていく。その主な理由として、空海がもたらしたインドの文字・悉曇が仏教的世界観の発達を促進するとともに、中国文化の相対化をもたらした点が指摘できる。申請者は鑑真一門の将来した戒律思想が日本仏教に与えた影響とその意義を動的・かつ俯瞰的に提示するとともに、従来その断絶面が強調される傾向にあった奈良仏教史・平安仏教史の展開過程を連続的かつ有機的に理解することを目的として、鑑真門流の高弟・法進の戒律思想を8世紀後半から9世紀の日本仏教思想史上に位置付ける準備を行ってきた。平成25年度においては、『新請来経等目録』『秘密曼荼羅十住心論』『梵字悉曇字母并釈義』などを題材に、前年度に検討した最澄とともに平安時代初期の新仏教の潮流を形成した空海の言語観の検討・分析を行った。最澄が自らの思想を「仏教発祥の地インド由来の護国仏教思想」と見なす根拠として機能するインド出身の密教僧・不空の事績は、空海によって初めて日本に将来された『表制集』に基づくものと考えられる。血脈の創出という方法によって不空の法系との接続を果たした最澄に対し、空海は唐における天竺出身僧からの梵語受学という体験を活かし、梵語を超時空的存在たる毘盧遮那如来へと直結し得る〈ほとけのことば〉として観念づけることになった。このような空海の試みは、漢訳仏典を金科玉条とするそれまでの〈仏教先進国〉中国の地位を相対化させるとともに、9世紀以降に活躍する後続の僧(真如・円仁・円珍......)に仏教発祥の地・天竺への憧憬をもたらすこととなった。前近代の日本における有力な世界観のひとつである「三国観」の形成は、かかる言語学的側面からも推進されていったものと理解することができる。平成24年度においては、『顕戒論』『顕戒論縁起』『内証仏法相承血脈譜』などを題材に、これまで法進とは対照的な戒律観を有するとされてきた最澄の戒律思想の検討・分析を行った。その結果、最澄はインド出身の密教僧・不空の事績を拠り所として、自らの大乗戒思想に対して「仏教発祥の地インド由来の護国仏教思想」としての権威付けを試みていたことが明らかとなった。最澄が拠り所とした不空の事績は、空海によって初めて日本に将来された『表制集』に基づくものと考えられる。不空重視の姿勢は空海においても顕著に認められることから、最澄による不空密教重視の姿勢は空海との交友によって徐々に醸成されていったものと考えられる。空海・最澄両名が、8世紀以前の日本においてその存在が知られていなかった不空の存在を重視した理由としては、不空一門が玄宗・粛宗・代宗という唐朝三代の皇帝に厚く帰依されたことに加え、梵語に通達した翻訳僧であった不空から空海の灌頂師・恵果を経て空海に継承された梵語観をも指摘することができよう。実際に翻訳作業に携わったごく一部の僧を除き、中国では梵語から漢語へ翻訳される際に生ずる意味のズレについては無頓着であり、その傾向は8世紀以前の日本においても同様であった。しかし、中国において梵語(真言)による密教受学を果たした空海が帰国することで、梵語を媒介として仏教発祥の地である印度を注目する機運が発生し、それとともに当時斜陽化しつつあった中国仏教を相対視する視点が発生したと考えられる。平成26年度には、過去2年度内の成果をふまえ、学会や研究会等における口頭発表や学術論文といった手段を用いた研究成果の報告を中心とした活動を実施した。日本における仏教受容は、通時代的に概して中国仏教を軌範としてきた。

しかし79世紀に対象を絞って考えてみた場合、中国の風習・風俗に合わせて再構築された〈中国護国仏教〉への準拠を至上命題としていた奈良時代以前と、仏教発祥の地・インドへの志向及び〈中国護国仏教〉の相対化が徐々に兆しを見せつつある平安時代とでは、日本における理想的護国仏教のあり方に大きな断絶面がみえることもまた事実である。その一要因として考えられるのが、8世紀半ばに中国に将来された〈悉曇〉受容という現象であろう。インド出身の僧・不空により密教とともに中国へ将来された〈悉曇〉は、文字通りの「真言」すなわち〈ほとけ〉の口から発せられた真実の言語を余すところなく再現し得る手段とされ、護国思想の中核に据えられた密教思想の伝播に欠くべからざる存在として位置づけられる。このような悉曇を初めて本格的に日本へと将来したのが、唐都・長安にてネイティブの僧侶、般若・牟尼師利から悉曇を、更に不空の高弟・恵果から密教教学を学んだ空海である。空海のもたらした悉曇の知識は仏教発祥の地・インドに対する憧憬とともに、すでに斜陽化の兆しを見せていた中国仏教界を相対視する視点をも日本仏教界にもたらした。また、〈ほとけの言葉〉たる悉曇についての知識は中央集権体制の進展に伴い発達しつつあった朝廷中心の言語観にも影響を与え、和語や漢語を用いて仏教的真理を論じることへの可否について様々な議論をもたらすこととなった。以上の成果は、古代日本における外来思想受容のあり方の本質的意義を問うとともに、言語・文字を用いた異文化間コミュニケーションの思想史的意義を考える手掛かりとして重要な意味をもつものと評価できよう。思想史研究計画の遅れの主な原因としては、以下の二点が指摘できる。一点目としては、事情により平成25年度中に予定していた法進の戒律注釈書に関する史料調査を実現するための時間的な余裕がとれなかったことなどにより、法進の戒律思想に関する分析・検討が滞ってしまったことが挙げられる。二点目としては、研究活動の進展に伴って当初予定していなかった題材を新たに研究対象に加える必要の生じたことが挙げられる。具体的には、不空の密教思想を日本に紹介した空海やそれを継承・発展させた円仁・円珍の事績、および最澄や空海が修学した9世紀初頭の中国仏教思想史や最澄・空海帰国後の日本仏教思想史・日本密教思想史に関する研究の必要性が生じたため、今年度はは当初の計画になかった空海、および日本真言宗における密教観・真言(梵語・言語)観についても研究を進めている。これは日本思想史上大きなテーマの一つである「三国観」の分析にも深く関係する内容であり、本研究の成果を当初の計画よりも普遍的かつ俯瞰的なものとする上で必要不可欠なものであると申請者は考えている(詳細は【今後の研究の推進方策】欄を参照されたい)。以上のような反省をふまえ、平成26年度は計画通りの研究を達成できるよう努力したい。研究計画の遅れの主な原因としては、以下の二点が指摘できる。一点目としては、事情により平成24年度中に予定していた法進の戒律注釈書に関する史料調査を実現するための時間的な余裕がとれなかったことなどにより、法進の戒律思想に関する分析・検討が滞ってしまったことが挙げられる。具体的には、不空の密教思想を日本に紹介した空海の事績、および最澄や空海が修学した9世紀初頭の中国仏教思想史や最澄・空海帰国後の日本仏教思想史・日本密教思想史に関する研究の必要性が生じたため、平成24年度後半以降は当初の計画になかった空海、および日本真言宗における密教観・真言(梵語・言語)観についても研究を進めている。以上のような反省をふまえ、平成25年度は計画通りの研究を達成できるよう努力したい。
多視点３次元観測画像を用いた衣類の仮想展開に関する研究

H29年度は、昨年度開発した単一3次元観測画像からの測地線算出手法を元に、複数観測画像を用いるよう展開するため、測地線算出手法の改良、距離画像境界の3次元再構成精度の向上、距離画像境界特性の識別手法の開発を行った。H28年度に開発した、観測3次元点群から直接的にその表面上の測地線(geodesic line)を算出する手法では、観測領域の境界線上の点を用いて2点間の測地線距離を算出していた。まず、この手法を任意の2点を端点とできるように改良し、複数画像間で対応付けが可能な点を共通端点とすることで、複数距離画像間の測地線情報を同時に解くための基本部分を作成した。また、観測3次元点群の境界が衣類の縁にあたるのか、もしくは、連続的な面が背後に回っている遮蔽境界であるかは、統合の要否を判定する重要な情報であるが、この判定を行うための深層学習を活用した識別手法の開発を指導する学生とともに行い、国際会議で発表した。ステレオビジョンによる複数の三次元形状の復元結果を統合するために、物体境界に於ける復元精度を向上するための高速なweigted median filterを開発した。具体的には、スライディングウィンドウによるヒストグラムの更新とマルチスレッド処理により、VGAクラスのサイズの視差画像に対してビデオレート(30fps)でのフィルタリングを実現した。次年度以降に計画している能動的な観測のために必要なロボット座標系と3次元観測カメラ座標系のキャリブレーションのために、キャリブレーションボードを必要としない、汎用的なキャリブ手法の開発も行った。ロボットハンド自体を活用するため、簡易に効率的にキャリブが行える手法であり、種々のハンドでの実験でその有効性を確かめ、国際会議での発表も行った。当初計画通り、昨年度開発した単一観測データを対象とした測地線算出手法を、複数観測データの統合解析に用いるための展開を行った。複数観測画像にまたがる測地線算出に関しては、要素手法の開発を行った。これに加え、展開時の面の連続性判定の鍵となる、観測3次元点群からの衣類の縁と遮蔽輪郭の識別手法の開発を行い、統合時の有用な基盤手法を確立できた。また、観測データ境界部の3D情報の高精度化や、能動的な観測に必要となるロボットーカメラキャリブ手法も進めることができた。H30年度以降、これらの要素技術を統合し、複数視点を用いた仮想展開手法を構築していく。また、能動的な観測情報の活用の検討も並行して開始する予定である。H28年度は、本研究計画開始年度として、単一3次元観測画像を用い、衣類表面の仮想展開の基盤となる手法の開発を行った。レンジファインダにより得られる3次元点群から、メッシュやボクセルなどの中間記述を構築することなく、直接的にその表面上の測地線(geodesic line)を算出できる手法を開発した。これにより、観測点密度のばらつきや計測ノイズの存在により中間記述の生成自体が難しい衣類観測データに対しても、安定して測地線を算出することが可能となった。また、衣類片側がほぼ全面観測されていることを仮定し、観測領域の境界線上の点を用いて2点間の測地線距離を算出し、この値を平面上に展開したときの各点間の距離の拘束条件として仮想展開する手法の検討を行った。実データを用いた実験を行い、方針の有望性を確認した。3次元観測画像の計測精度を高めるため、時系列ステレオ画像から密なレンジフローを抽出する手法について検討し、対象物体の局所的な形状とカメラの大域的な運動パラメータの2種類の情報を、一方を固定して他方を更新することを交互に繰り返すことによって同時に推定するアルゴリズムを考案し、その実装を開始した。広視野のステレオ画像から至近距離にある対象の3次元形状を復元するための研究を行った。信頼性の向上のために広視野カメラに特有なカメラパラメータを簡便にキャリブレーションできるための原理を発見した。処理の高速化のために、3次元至近空間上に平面を設定し、その近傍にある対象の形状を高速に復元する手法を開発した。以上のように、直接的に手法の実現を支える成果とともに、精度や頑健性向上や将来的な実現性を見据えた成果も得られた。どちらも国際会議での成果発表を行った。当初計画通り、同一観測データを対象とし、「衣類表面の仮想的な平面形状への展開を、観測時の形状における衣類表面上の測地線距離(geodesic distance)に基づき行う」ための頑健な測地線距離算出手法を開発し、今後の展開の基盤手法を獲得した。また、観測3次元データの高精度化、将来的な実用化に重要な広視野の至近距離対象の3次元計測に関してもそれぞれ予定通り進めることができた。

また、観測3次元点群の境界が衣類の縁にあたるのか、もしくは、連続的な面が背後に回っている遮蔽境界であるかは、統合の要否を判定する重要な情報であるが、この判定を行うための深層学習を活用した識別手法の開発を指導する学生とともに行い、国際会議で発表した。ステレオビジョンによる複数の三次元形状の復元結果を統合するために、物体境界に於ける復元精度を向上するための高速なweigted median filterを開発した。具体的には、スライディングウィンドウによるヒストグラムの更新とマルチスレッド処理により、VGAクラスのサイズの視差画像に対してビデオレート(30fps)でのフィルタリングを実現した。次年度以降に計画している能動的な観測のために必要なロボット座標系と3次元観測カメラ座標系のキャリブレーションのために、キャリブレーションボードを必要としない、汎用的なキャリブ手法の開発も行った。ロボットハンド自体を活用するため、簡易に効率的にキャリブが行える手法であり、種々のハンドでの実験でその有効性を確かめ、国際会議での発表も行った。当初計画通り、昨年度開発した単一観測データを対象とした測地線算出手法を、複数観測データの統合解析に用いるための展開を行った。複数観測画像にまたがる測地線算出に関しては、要素手法の開発を行った。これに加え、展開時の面の連続性判定の鍵となる、観測3次元点群からの衣類の縁と遮蔽輪郭の識別手法の開発を行い、統合時の有用な基盤手法を確立できた。また、観測データ境界部の3D情報の高精度化や、能動的な観測に必要となるロボットーカメラキャリブ手法も進めることができた。H29年度以降、複数視点の情報統合を開始するとともに、衣類表面の凹凸による3次元観測データの欠けなど実際的な問題への対処も同時に進めていく。H30年度以降、これらの要素技術を統合し、複数視点を用いた仮想展開手法を構築していく。また、能動的な観測情報の活用の検討も並行して開始する予定である。
Ｆｏｘｅ３下流活性化制御遺伝子を標的にした新規白内障モデルマウスの樹立と応用

本研究では、申請者がrctマウスの白内障発症原因遺伝子として同定したFoxe3を標的として、その下流活性化制御因子の同定、ならびにそれら遺伝子に突然変異を有する新規白内障モデルマウスの樹立を目的とした。下流活性化制御因子の候補となったFgfbp1、Capns2、Aim1lおよびGsta2の4種の遺伝子について理研ENU based gene-driven mutagenesisによる突然変異スクリーニングを行った結果、Fgfbp1では2箇所、Capns2で1箇所、およびAim1lで4箇所の変異を有するDNAを見出した。今後はこれら突然変異を有する個体を復元し、その表現型解析を行う。白内障は罹患率が高い眼疾患である。申請者らは最近先天性白内障を発症するモデルマウスの発症原因が眼球形成において重要な役割をもつ転写因子であるFoxe3の眼球特異的エンハンサー領域の突然変異であることを明らかにした。Foxe3および同一カスケードに存在する転写因子群に生じた突然変異により白内障を発症する例はヒトにおいて数多く報告されていることから、それらに突然変異をもつモデルマウスの樹立を目的として、以下の研究を行った。マイクロアレイおよびqRT-PCR解析によりFoxe3の下流活性化制御因子の候補であるFgfbp1、Capns2、Aim1lおよびGsta2について、Gene-driven mutagenesisによるスクリーニングを行った結果、Fgfbp1では2箇所、Capns2で1箇所、Aim1lでは4箇所のミスセンス変異を有する変異DNAが見出された。さらに、マイクロアレイ解析によって得られた情報を精査するために、85種の遺伝子についてqRT-PCR解析を実施した。その結果、明らかな発現変動を示す新たな20種の遺伝子を同定した。現在は、これら遺伝子群における突然変異マウスの作成を計画している。申請者は白内障を発症するモデルマウスrctの発症原因がFoxe3の眼球特異的エンハンサー領域の突然変異であることを明らかにした。これまでに申請者はrctおいて48種類の発現変動遺伝子および34種類の発現欠失遺伝子を見出している。Foxe3および同一カスケードに存在する転写因子群に生じた突然変異により白内障を発症する例はヒトにおいて数多く報告されていることから、それらに突然変異をもつモデルマウスの樹立を目的として以下の研究を行った。Foxe3の下流活性化制御因子の候補と推測された6種類について、独立サンプル由来RNAを用いたqRT-PCRの反復実験を行った。その結果、Fgfbp1、Capns2、Aim1lおよびGsta2の遺伝子で野生型に比べrctで有意な発現量の減少が認められた。現在、これらの遺伝子についての局在解析を進めている。また、これらの発現変動の再現性が確認された遺伝子のうち、3つについて、Gene-driven mutagenesisにより、マウス変異体のスクリーニングを進めている。それに加え、既知の3つのFoxe3下流活性化制御因子(Dnase2b、PdgfraおよびProx1)の遺伝子発現解析を行った結果、rctにはProx1の発現の局在に野生型との差異が認められた。しかし、Foxe3-/-の解析により示されたCryaaの局在異常は認められず、その局在は野生型と同様であった。以上のことから、rctマウスは既存のFoxe3マウスミュータントとは異なるカスケードによって白内障を発症するものと推測された。また、マイクロアレイ解析により変動が認められた遺伝子について、独立サンプルによるqRT-PCRの反復実験を進めており、現在では19個の遺伝子のうち8個の遺伝子において再現性が認められ、スクリーニングを継続している。研究進捗は当初計画に比べて、やや遅れている。Foxe3の下流活性化制御因子の候補について、in situハイブリダイゼーション解析を進めているが、ファインな結果は得られなかった。そのため、再度のプローブデザインや、用いる試料のパラフィン切片、凍結切片およびホールマウントなど、DIG検出方法などの条件検討を重ねたため、計画よりも進捗が遅延した。現在はホールマウントにおけるin situハイブリダイゼーションにより解析を実施している。また、Gene-drivenミュータジェネシスによる変異体スクリーニングでは、Capns2についてスクリーニング実験を実施した結果、目的の遺伝子に突然変異を有する個体が得られなかった。現在は、再度スクリーニングを行っている。Foxe3下流活性化制御因子の候補における遺伝子発現については、ホールマウントin situハイブリダイゼーションを行い、その後マイクロスライサーを用いて切片を作製することにより詳細な局在を調査する。また、マイクロスライサーによる切片作成の後のホールマウントin situハイブリダイゼーションについても検討する。Gene-drivenミュータジェネシスによる変異体のスクリーニングについては、現在は再度スクリーニングを行っているが、同時に遺伝子の変異探索部位の変更を検討している。

再度のスクリーニングの結果、変異体が見いだせない場合は、ノックアウトマウスによる解析を検討する。さらに、現在はRNA-SeqやChIP-Seqなどの次世代シークエンス技術を用いた網羅的なFOXE3ターゲット遺伝子の同定についても検討しており、これについては申請者の所属する東京農業大学に設置されている生物資源ゲノムセンターとの協力により実施する予定である。次年度予算と合わせて、研究試薬の購入に使用する。
界面構造に起因した新しいショットキーバリア理論の展開

最近の実験で、従来の理論では全く説明ができないショットキーバリア(金属中の電子を半導体中に入れるために必要なエネルギー)の異常が多数観測された。本研究では、量子力学に基づく大型数値計算を行い、界面で特定の原子が結合すること、界面で化合物が発生すること、界面に不純物が偏析すること等がその原因であることを明らかにし、異常を一般的に予言できる新しい理論を構築した。本研究の目的は、第1原理計算を用いて、金属/非金属界面の安定形態(混晶・偏析界面など)を分類し、各界面構造とショットキーバリアの関係を明らかにすることで、界面構造に起因したショットキーバリアの新しい一般モデル理論を構築することである。本年度に得られた知見は以下である。1.金属/酸化物・平坦界面の電子構造:金属/HfO_2、La_2O_3酸化物界面のショットキーバリアは、界面の原子間結合種に強く依存するが金属種には依らないこと、その起源は界面ボンド混成が誘起する分極であることを初めて解明した。これらの結果は、我々が提唱する一般化電荷中性準位モデルの正当性を証明するものである。特に、分極はボンド混成の強さから、バリアは界面ボンド分極の単純和から見積もられることがわかり、モデルの定量化が可能となった。2.金属/Si・化合物化界面の電子構造:界面に形成されるシリサイド化合物の組成はSi基板との格子整合が原因となり限定されること、金属原子とSi間の電子移動を反映してショットキーバリアはシリサイド組成の単調な関数となることを明らかにした。この結果により、ドープしたシリサイド/非金属界面で観測されているバリア異常の起源が初めて解明された。3.金属/Si・偏析界面の電子構造:界面偏析層の原子種をIII族からV族に変化させると、原子軌道エネルギー及びSiとの結合距離を反映してショットキーバリアは単調に変化するが、II族及びVI族の場合には界面混晶化が進みバリアが非線形に大きく変調されることを見出した。これら結果により、界面の秩序・混晶化とショットキーバリアの相関の重要性が明白となり、来年度以降に一般化モデル理論を構築するための基礎が確立された。本研究の目的は、第1原理計算を用いて、金属/非金属界面の安定形態(混晶・偏析界面等)を分類し、各界面構造とショットキーバリアの関係を明らかにすることで、界面構造に起因したショットキーバリアの新しい一般モデル理論を構築することである。1.金属/InN界面における異常ショットキーバリアの起源解明:第一原理計算により金属(Al,Au)/InN界面のショットキーバリアを調べ、InNの電荷中性準位は伝導帯内にあるために界面では金属からInNへ電子が流れ込みバリアの異常が起こること、その原因はInの原子半径が大きくInNの伝導帯幅が非常に大きい点にあること、界面がIn、N極性のいずれでも同じ異常が起こるが無極性界面にすると異常が弱まること、面欠陥である界面だけでなくN空孔点欠陥や転位などの線欠陥近傍でも同様の異常が発生することを明らかにした。これら結果は、従来の理論では説明できなかった金属/InN界面でのバリア異常を初めて解明したものである。2.金属/有機分子固体界面の安定性の検討:界面から侵入した金属原子のオリゴアセン系分子内での拡散の断熱ポテンシャルを調べ、電気陰性度の大きいAuは炭素2重結合に沿って容易に拡散できること、陰性度の小さいAlは炭素環中心に安定化してしまい拡散しにくいこと、この違いは有機分子と金属原子間の電子移動差に基づく結合形態の相違のあることを解明した。これら結果は、有機半導体界面の安定性に関する初めての知見である。3.金属/Si・偏析界面のショットキーバリアの解明:18種類の界面偏析原子の安定性とバリア変調量を調べ、B,P,As等のSiのドーパントは界面に析出しやすいこと、界面原子種がII族からVII族に変化するとショットキーバリアは単調に変化すること、その原因はSiの不対ボンドの終端に伴う電荷中性準位の変化にあることを明らかにした。この結果により、界面析出層のモデル化には半導体の終端効果が重要であることがわかり、次年度に一般化ショットキーバリア理論を構築する大きな足がかりが得られた。本研究の目的は、第一原理計算を用いて、金属/非金属界面の安定形態(混晶・偏析界面等)を分類し、各界面構造とショットキーバリアの関係を明らかにすることで、界面構造に起因したショットキーバリアの新しい一般モデル理論を構築することである。本最終年度に得られた成果は以下である。1.界面シリサイドのドーピング特性の解明:界面シリサイドにおいては、PなどのV族不純物はSiサイトを置換しシリサイドの仕事関数を大きく減少させること、BなどのIII族不純物はSiおよび金属サイトの両サイトを置換し仕事関数を若干増加させること、これらドーピング特性はシリサイドの安定化メカニズムと関係することを解明し、シリサイド界面の実験を初めて解明した。2.金属/Si界面の欠陥構造がつくるショットキーバリアの解明:拡散金属原子置換

・原子空孔・格子間原子等の欠陥の界面近傍での安定性とバリア変調量を調べ、弾性的エネルギー損を減少させるために欠陥は界面から23原子層内に分布しやすいこと、金属状態はSi中へ56原子層侵入するために原子置換及び原子空孔はショットキーバリアを変化させないこと、一方、格子間原子は不対ボンドを生み仕事関数を減少させることを明らかにした。3.界面偏析・界面欠陥に起因する一般化ショットキー理論の構築:界面偏析及び界面欠陥の結果を電子構造の立場から検討し、ショットキーバリアの変調は、前者においては、偏析原子によるSiの不対ボンドの終端とそのボンドへの価電子の充填率によるSiの電荷中性準位の変化で、後者においては、格子間原子が結晶場中で持つ不対ボンドのエネルギー準位の位置で予言できることを示し、強結合モデルを使って理論を一般化した。
モノアミン遺伝子多型よりみた睡眠時ブラキシズムの素因に関する分子遺伝学的研究

本研究は,睡眠時ブラキシズムの発症メカニズムについて遺伝学的見地から解明を試みたものである。すなわち,脳内情報伝達物質であるモノアミン,特にセロトニン神経系の濃度調節機構に関与するトランスポーターの機能と睡眠時ブラキシズムの発症頻度の関連を検討した。同時に,我々が先行研究にて開発した睡眠時ブラキシズムの簡易測定装置の改良,被検者の集積基準についても検討を行った。その結果,軽度ブラキシズム群のセロトニントランスポーターの機能は,重度ブラキシズム群のそれと比較して有為に高い事が分かった。平成20年度の研究目的は,無症状健常者ならびに顎関節内障患者を対象に貼付型ブラキシズム検出装置を用いて重度ブラキシズム群を抽出することである.そのため,一定の期間に,岡山大学医学部・歯学部附属病院・顎関節症・口腔顔面痛み外来を初診受診した連続患者サンプルのうち,包含基準を満たした連続サンプルを対象とした.さらに,比較群として,同時期に補綴科(クラウンブリッジ)を受診した連続患者サンプルも併せて対象とした.これら被検者の内,インフォームドコンセントを行い,同意の得られた全ての連続患者サンプルを研究参加者としてプールした.被検者には,貼付型ブラキシズム測定装置を2個手渡し,自宅で2日間連続して就寝時ブラキシズムの測定を行わせた.郵送にて回収した後,各個人のブラキシズムイベント数を定量化し,初診時の問診データならびに臨床データ(初診時開口量,疼痛の程度)と同様にデータベースに入力した.その結果,被検者集積期間中に本院補綴科ならびに顎関節外来を受診した初診患者は285名であり,包含基準を満たした目的被検者は71名(男性21名,女性50名,平均年齢43.6歳)であった.これらの中から,バイトストリップの未返送6名ならびに2日間ともスコアが得られなかった1名を除外した結果,最終被検者は64名となった(補綴科患者:男性8名/女性21名,顎関節外来患者:男性10名/女性25名).内訳は,補綴科はスコア1.5とスコア3を示す者が多く,ブラキシズムレベルにはばらつきが認められた.一方,顎関節外来のブラキシズムレベルは,スコア2.5,スコア3を示した被検者が全体の約7割弱であり,ブラキシズムレベルが高い被検者が比較的多く観察された.今後は今回検討しきれなかった残存歯数や咬合様式といった交絡要因をマッチングや多変量解析により考慮すると共に,予後との関連についても並行して行う予定である.無症状健常者ならびに顎関節内障患者を対象に貼付型ブラキシズム検出装置を用いたブラキシズムレベルの検討の解析を行った.対象は,平成19年10月17日から平成20年3月19日の期間に,岡山大学病院・顎関節症・口腔顔面痛み外来ならびに補綴科(クラウンブリッジ)を初診受診し包含基準を満たした連続サンプルである.被検者には,貼付型ブラキシズム測定装置を2個手渡し,自宅で2日間連続して就寝時ブラキシズムの測定を行わせ,各個人のブラキシズムイベント数を定量化した。その結果,包含基準を満たした目的被検者は71名,最終被検者は64名となった.内訳は,補綴科はブラキシズムレベルにはばらつきが認められた。一方,顎関節外来のブラキシズムレベルは,スコア2.5,スコア3といったブラキシズムレベルが高い被検者が多く観察された.若年者を対象としたブラキシズム調査の追跡調査を行った.同年の岡山県立一宮高校1年時生全員のうち,ブラキシズム頻度検査ならびに咀嚼筋の圧痛診査を受けた195名を対象に顎顔面筋の圧痛の追跡調査を行った.診査は,十分な圧痛検査の信頼性(κ=0.59)が保証された2名の検者が咀嚼筋の圧痛診査を行った.被検者は,平成17年,19年の圧痛診査より以下の4群(筋痛継続,筋痛消失,筋痛発症,無症状継続)に分けた.これら4群から筋の圧痛発症,圧痛継続に対してブラキシズム頻度を含む各種の予測因子の相対危険度を算出した.その結果,76名を最終被検者とした.これら被検者の圧痛の変動に関して多変量解析を行った結果,性差(女性),一回目診査時の重症度(自覚的,他覚的),ストレスレベルの自覚が有意なリスク因子となった.(相対危険度:0.24,0.26,-0.65,0.65;95%信頼区間:0.03-0.45,0.04-0・49,-0.86--0.44,0.02-1.23).同時に,有志被検者より得た末梢血液中からgenomic DNAを抽出し,セロトニントランスポーターの転写調節部位にある5-HTTLPR遺伝子多型,すなわち転写活性が高い

1型と低いs型の多型の検出を行い,その手技の確立に成功した.選択的セロトニン(5-HT)取り込み阻害剤服用により睡眠時ブラキシズム(SB)頻度が上昇したという報告から,我々は,神経終末の5-HT濃度,すなわち神経終末の5-HT濃度調節を制御するトランスポーター(SERT)の機能の差異がSB発症に何らかの関与をしているという仮説を立てた。そこで本研究では,SB発症頻度と5-HT神経系のSERT機能との関連についてヒトを対象にcase-control studyにて検討を行った。被験者は,本研究に自発的に参加の意思を示した健常者のうち,以下のスクリーニング基準ならびに適格基準を満たした者とした。すなわち,高頻度に睡眠時ブラキシズムを自覚する者,またはほとんど自覚しない者のうち,簡易ブラキシズム測定装置(BiteStrip^<[○!R]>)による連続3日間の測定結果が全てScore 2以上(重度ブラキシズム群)もしくは全てScore 1以下であったもの(軽度ブラキシズム群)とした。ただし,過去6ヶ月以内に中枢性向精神薬,抗うつ薬の服用,喫煙があったもの,実験期間中に飲酒,カフェインの摂食を中止できないものは対象から除外した。これら被検者には,自宅にて3日間連続してブラキシズム測定装置にてブラキシズムレベルを測定させた。このブラキシズム頻度の測定の結果より,重度/軽度ブラキシズム群の適格基準を満たす者を最終被検者とした。3日間のブラキシズム測定装置での計測により適格基準を満たした最終被検者は,最終測定日の翌朝(午前9時)の朝食を摂取する前に前腕より静脈血を採取した。この末梢血中の血小板上のSERT数,血小板数(ELIZA法)およびSERTの5-HT取り込み能([3H]RI assay)の計測,ならびに重度/軽度ブラキシズム群間で比較を行った(岡山大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会承認番号:967)。被検者集積期間に適格基準を満たした重度ブラキシズム群13名(男性/女性:5/8名,平均年齢28.0+/-4.68歳),軽度ブラキシズム群7名(男性/女性;3/4名,平均年齢30.2+/-5.61歳)を最終被検者とした。この2群間の男女比,年齢,総SERT数には有意な差は認められなかった(p=0.85;カイ二乗検定,0.64,0.46:t-検定)。しかし,SERTの5-HT取り込み能を総SERT数で除した値は,軽度ブラキシズム群が重度ブラキシズム群に比べ有意に高い結果となった(12.79+/-1.97,8.27+/-1.91 fmol/105 platelets/min,p<0.001,t-検定)。以上の結果より,睡眠時ブラキシズムの発症頻度にはSERT数の多寡ではなく,SERTの取り込み能の差異が関与している可能性が示唆された。
遷移金属とリン間に多重結合を有する錯体の開発

[Cp(CO)_2(Sn^nBu_3)W{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}]とルイス酸との反応を調べたところ、ホスフェニウム錯体生成後^nBu基がスズからリンに転位して、スタニレン錯体が主生成物となることが分かった。しかし、この反応をNaBPh_4共存下で行うと、ホスファイド錯体Cp(CO)_2W{PN(Me)CH_2CH_2NMe}が生成することが分かった。この反応は見かけ上、スタニル基とメトキシ基が脱離してW-P間の結合次数を1つ増やしている反応で、前例のない興味深い反応である。実際の反応はNaBP_4によりホスフェニウム錯体が1電子還元を受け、この後スズラジカルが脱離して進行していることが明らかになった。ジアミノ置換ホスファイトと14族元素配位子を有するルテニウム錯体である[Cp(CO)(ER_3)Ru{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}](E=C,Si,Ge,Sn)とルイス酸との反応性を検討した。その結果、ER_3がいずれの場合も、まずP上のOMe基が陰イオンとして引き抜かれ、ホスフェニウム錯体が生成する。しかし、その後の反応は14族元素の種類により大きくことなる。ER_3がアルキル基の場合は、それがRuからホスフェニウムのリンへ転位し、シリル基やゲルミル基の場合はホスフェニウム錯体が安定に存在して転位反応は見られない。スタニル基の場合はスズ上のアルキル基がリンに転位して、Ru-Sn間に二重結合をもつスタニレン錯体が生成することが明らかになった。[Cp(CO)(SiMe_2OMe)Fe{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}]錯体は、配位しているPとSi上にOR基を有する。この錯体とルイス酸との反応を調べた結果、Si上のOR基が選択的に引き抜かれ、シリレン錯体が生成することが明らかとなった。タングステン錯体Cp(CO)_2W(Sn^nBu_3)(P{N(Me)CH_2CH_2N(Me)}OMe)(1)とBF_3OEt_2との反応において、系中にNaBPh_4を共存させることによってタングステン-リン間に二重結合性を有するホスファイド錯体Cp(CO)_2W(P{N(Me)CH_2CH_2N(Me)})(2)を定量的に合成することに成功した。この反応では、まず1とBF_3OEt_2との反応によってホスフェニウム錯体[Cp(CO)_2W(Sn^nBu_3)(P{N(Me)CH_2CH_2N(Me)})]+(3)が生成すると考えられる。次にこの錯体にNaBPh_4が1電子還元剤として働き、19電子錯体が生成した後、そこからSn^nBu_3ラジカルが脱離することによって2が生成すると考えられる。この機構はNaBPh_4のかわりに代表的な還元剤であるナトリウムナフタレニドを添加することによっても同様に2が生成することからも支持される。

これに対し、錯体1におけるSn^nBu_3をSnPh_3に代えた錯体4を用いて同様の反応を試みたところホスファイド錯体2は全く得られず、リン上のOMe基がPh基に置換されたCp(CO)_2W(SnPh_3)(P{N(Me)CH_2CH_2N(Me)}Ph])(5)が生成した。これは中間に生成すると考えられるホスフェニウム錯体において素早いPh基のSnからPへの転位が起こり、それによって生成するスタニレン錯体[Cp(CO)_2W(SnPh_2)(P{N(Me)CH_2CH_2N(Me)}Ph)]^+が系中のBPh_4-と反応したものと考えられるジアミノ置換ホスファイトと14族元素配位子を有するルテニウム錯体である[Cp(CO)(ER_3)Ru{PN(Me)CH_2CH_2NMe(0Me)}](E=C,Si,Ge,Sn)とルイス酸との反応性を検討した。その結果、ER_3がいずれの場合も、まずP上のOMe基が陰イオンとして引き抜かれ、ホスフェニウム錯体が生成する。しかし、その後の反応は14族元素の種類により大きくことなる。ER_3がアルキル基の場合は、それがRuからホスフェニウムのリンへ転位し、シリル基やゲルミル基の場合はホスフェニウム錯体が安定に存在して転位反応は見られない。スタニル基の場合はスズ上のアルキル基がリンに転位して、Ru-Sn間に二重結合をもつスタニレン錯体が生成することが明らかになった。[Cp(CO)(SiMe_20Me)Fe{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}]錯体は、配位しているPとSi上にOR基を有する。この錯体とルイス酸との反応において、どちらの0Me基が引き抜かれるかを調べた。ルイス酸として1当量のBF_3・OEt_2を用いると、Si上のOR基が選択的に引き抜かれ、そこにFが導入された錯体[Cp(CO)(SiMe_2F)Fe{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}]が生成した。この錯体に過剰のBF_3・OEt_2を反応させると、リン上のOMe基が引き抜かれ、ホスフェニウム錯体が生成することが分かった。ルイス酸としてBF_3・0Et_2の代わりにMe_3Si0SO_2CF_3を用いて[Cp(CO)(SiMe2OMe)Fe{PN(Me)CH_2CH_2NMe(OMe)}]との反応を行うと、Si上のOMeが選択的に引き抜かれてFeとSi間に二重結合をもつシリレン錯体が生成することが確かめられた。
法医剖検例におけるmyocardial sleeveと心房細動関連死に関する研究

切片作製方向は、縦切片よりも横切片の方が優れていると結論した。染色方法は、hematoxilin-eosin染色及びElastica-Masson染色で十分であると結論した。将来的な検討課題としては、症例数を更に増やし検索を進め、改善点の見直し、スクリーニング精度の向上を図ることであると考えた。(1)切片作成方向では、従来の研究論文通り、縦切片では心筋の伸展距離が、横切片では病変の広がりが、それぞれ特異的に描出された。印象としては、横切片の方がより理解しやすいように感じた。(2)染色方法については、特殊な染色法を用いずとも、hematoxilin-eosinとElastica-Massonで十分に描出でき、なおかつ、線維化や炎症細胞浸潤などの所見も得られることが確認された。以上のようなそれぞれの方法における長所と短所を述べ、集まった国内外の諸先生と議論を交わした。研究の着目や方法については概ね賛同頂き、今後の方針として、(1)症例数を増やすこと(2)統計を含めた対照例との比較検討を行うことで意見の一致を得たものと考えられる。切片作製方向として、縦切片、横切片を設定したが、切片作製にかかわる簡便性および作製された切片の観察に関してより適切と考えられたのは横切片であった。具体的には、(1)一切片の観察のみで、病変の有無及び病変の拡がりが容易に観察され、(2)切片作製時に心筋付着部からの距離をあらかじめ計測しておくことで、心筋の伸展の程度についても把握が可能である、と言う2点が挙げられた。一方、縦切片では、(1)必ず複数切片の作製が必要である点、(2)作製時や標本作製時に必然的に生じうるゆがみによって、隣り合った切片同士でも心筋の伸展の程度についての把握がしばしば困難になる、と言う点が問題となり、個々の症例についての詳細な検索についてはやや有利な点もあるが、多数の剖検例におけるスクリーニングという観点では不向きであると結論した。染色方法としては、研究期間を通してhematoxilin-eosin染色とElastica-Masson染色のみを用いたが、心筋の伸展の程度のほか、炎症細胞浸潤、線維化の有無など、観察に必要と考えられる組織像の検出において不具合は全く生じず、免疫組織染色などと比べて染色方法が格段に容易で安価であるという点においても、スクリーニングとしてはこの2染色方法で十分であると結論した。今後の検討課題としては、症例数を更に増やし検索を進めることであり、更に切片作製を重ねることで浮上すると考えられる改善点などをしっかり見直し、スクリーニング精度の向上を図ることであると考える。
モノリシック集積型高感度ＳＯＩフォトダイオードの開発

本研究目的は,次世代CMOSとして注目されているSOIデバイスに光検出器を同一基板上に実装することである.SOI光検出器の感度を大幅に向上させる技術を開拓するため,本研究では,受光面上に金ナノ粒子を付着した新しいSOI-PINフォトダイオードを開発した.金ナノ粒子付SOI-PINフォトダイオードをモデル化し,SOI内部の光吸収効率を計算することにより,金ナノ粒子の粒径と付着密度を最適化した.さらに感度向上メカニズムを明らかにした.期間中に,金ナノ粒子付きSOIフォトダイオードを開発し,感度特性を計測した.金ナノ粒子の付着により,可視光領域において約2倍の感度向上を実証した.本研究目的は,次世代CMOSとして注目されているSOIデバイスに光検出器を同一基板上に実装することである.SOI上に光検出器を実装した場合,SOIが薄膜であるために光吸収効率が大幅に低減される.SOI光検出器の感度を向上させる技術を開拓するため,本研究では受光面上に金ナノ粒子を付着した新しいSOI-PINフォトダイオードを開発する.初年度に作製デバイスをモデル化し,SOI内部の光吸収効率を計算することにより,金ナノ粒子の粒径と密度を最適化した.計算結果より,SOI膜厚100nmのフォトダイオードに対する感度向上においては,付着金ナノ粒子の粒径は140nm,金ナノ粒子配列周期は240nm(粒子密度:1.7e9 particles/cm2)がそれぞれ最適なパラメータであることが分かった.この最適パラメータをもとに,本年度は,従来よりも大きい金ナノ粒子(粒径150nm)を高密度(6.0e8 particles/cm2)に付着する技術を開発した.新技術により開発した金ナノ粒子付SOIフォトダイオードの感度特性を計測し,金ナノ粒子付着前と比較して約2倍の感度向上を実現した.得られた感度スペクトル結果の計算との整合性を示した.本研究目的は,次世代CMOSとして注目されているSOIデバイスに光検出器を同一基板上に実装することである.SOI光検出器の感度を大幅に向上させる技術を開拓するため,本研究では,受光面上に金ナノ粒子を付着した新しいSOI-PINフォトダイオードを開発した.金ナノ粒子付SOI-PINフォトダイオードをモデル化し,SOI内部の光吸収効率を計算することにより,金ナノ粒子の粒径と付着密度を最適化した.さらに感度向上メカニズムを明らかにした.期間中に,金ナノ粒子付きSOIフォトダイオードを開発し,感度特性を計測した.金ナノ粒子の付着により,可視光領域において約2倍の感度向上を実証した.本研究目的は,次世代CMOSとして注目されているSOIデバイスに光検出器を同一基板上に実装することである.SOI光検出器の感度を大幅に向上させる技術を開拓するため,本研究では受光面上に金ナノ粒子を付着した新しいSOI-PINフォトダイオードを開発する.SOI-PINフォトダイオードの光吸収効率向上のため,デバイス作製および計測だけでなく,シミュレーションによる吸収増大メカニズムの解明と構造最適化を実施する.平成24年度は,(1) SOIフォトダイオードの作製,(2)金ナノ粒子付着密度制御と吸収スペクトルの取得,(3)金ナノ粒子の粒径と密度の最適条件の探索,に取り組んだ.SOIを厚さ100nmに薄膜化すると同時にパターニングを施し,イオン注入によりPINを形成した.受光面積は50ミクロン×50ミクロンを基準として,幅や長さを変えた構造を複数作製した.熱酸化によりSOI表面にシリコン酸化膜を形成後,アルミニウムにて配線することによりフォトダイオードを作製した.シランカップリング剤と金コロイドを用いることにより,金ナノ粒子をシリコン酸化膜上に付着した.金コロイドの濃度,ディップ時間により,金ナノ粒子の付着密度を調べた.SEM観察により,粒子密度と単分散性を確認した.吸収スペクトルを取得し,波長520nm近傍に吸収ピークが現れることを確認した.作製デバイスをモデル化し,SOI内部の光吸収効率を計算することにより,金ナノ粒子の粒径と密度を最適化した.本研究目的は,次世代CMOSとして注目されているSOIデバイスに光検出器を同一基板上に実装することである.SOI光検出器の感度を大幅に向上させる技術を開拓するため,本研究では受光面上に金ナノ粒子を付着した新しいSOI-PINフォトダイオードを開発する.初年度に作製デバイスをモデル化し,SOI内部の光吸収効率を計算することにより,金ナノ粒子の粒径と密度を最適化した.計算結果より,SOI膜厚100nmのフォトダイオードに対する感度向上においては,付着金ナノ粒子の粒径は140nm,金ナノ粒子配列周期は240nmがそれぞれ最適なパラメータであることが分かった.この最適パラメータをもとに,平成25年度は,従来よりも大きい金ナノ粒子(粒径150nm)を高密度(6.0e8 particles/cm2)に付着する技術を開発した.新技術により開発した金ナノ粒子付きSOIフォトダイオードの感度特性を計測し,金ナノ粒子付着前と比較して約2倍の感度向上を実現した.

平成26年度は,単一波長におけるSOIフォトダイオードの感度向上を目的として,周期配列した金ナノ粒子をセンサ上部に作製した.作製手法には電子線リソグラフィによるリフトオフ法を適用した.粒径180nm,周期260nmの金ナノ粒子を作製した結果,波長660nmにおいて局所的に約2.5倍の感度向上を実現した.応用物理金ナノ粒子粒径と密度を最適化し,金ナノ粒子付着によるSOIフォトダイオードの光吸収効率向上メカニズムを明らかにした他,最適条件に即した金ナノ粒子付着技術を新たに開発し,実証するなど,当初の計画にはなかった研究成果を得たため.平成24年度の研究計画を全て遂行し,期待通りの研究成果が得られているため.金ナノ粒子周期配列手法を確立し,単一波長における感度向上の実証を目指す.平成25年度以降は,(1)作製したSOI-PINフォトダイオードのデバイス評価,(2)金ナノ粒子付きSOI-PINフォトダイオードのデバイス評価,(3)金ナノ粒子周期配列手法の確立,に主に取り組む.当初計画していた購入予定物品に対し,当初よりも計画以上に研究成果が得られ,より適切な物品の購入や研究成果投稿料に変更したため,当該助成金が生じた.周期配列金ナノ粒子付SOIフォトダイオードの開発に必要となる物品の購入および,得られた成果を広く世に公表することにより,計画的かつ適切に使用する.平成25年度に計画しているデバイス評価に必要な物品を主に購入する.
糞の窒素および酸素同位体の分析による農作物加害獣の採餌圏マップ作成手法の開発

獣類による農作物加害の増大に伴い、摂食内容を評価する手法が必要とされていることに鑑みて、糞にどの程度農作物が含まれているかを定量的に評価するための技術開発をおこなった。農作物の摂食を評価するために、農作物が野外植物より高い窒素同位体比を示すことを利用する手法が考えられる。しかし、糞は難消化物以外にも獣類自身の代謝物を含み、餌の窒素同位体比が糞の値にどの程度反映されるかは不明である。そこで、重要な加害獣であるシカを対象とし、糞の窒素同位体比の決定要因を解析した。19の動物園よりニホンジカの毛・糞・餌の提供を受け、窒素同位体分析に供した。ほとんどの園で牧草が施与されていた一方、園によって、酵母を含む配合飼料(窒素固定由来の窒素成分≒0‰)、野菜(施肥由来の窒素分> 0‰)、野外植物(< 0‰)を与えていた点で餌組成が異なった。これら試料について、個体の性質(性別・亜種の違い)およびシカ自身の体組織(毛)と餌の窒素同位体比が、糞の窒素同位体比に及ぼす影響を検討した。同じ餌を与えられた単一の動物園由来の37個体の窒素同位体の解析からは、オスの毛窒素同位体比はメスよりも約0.3‰低かった。これに対し、毛の窒素同位体比は動物園間で最大8.5‰最小5.0‰、糞の窒素同位体比は最大7.4‰最小2.1‰の値を示し、性差以上に餌の違いが体組織と糞の窒素同位体比に影響を及ぼしたと考えられた。また、ほぼ同一の窒素同位体比を持つ餌を施与していた園での分析からは、餌に比べて糞は約1.43.4‰高い窒素同位体比を示した。これらの結果から、糞同位体比の決定要因として、飼育条件下における餌の窒素同位体比に起因しない不確実性は2‰以内であり、同一地域内に存在する農作物と野外植物の窒素同位体比がそれ以上に異なっていれば、糞窒素同位体比がシカの農作物摂食の指標となると結論付けた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
狂犬病ウイルスの末梢感染を規定する分子基盤の解明

狂犬病ウイルスは末梢の咬傷部位から中枢神経に侵入し感染動物を発症させるが、その成立機序は不明である。本研究では、野外流行株1088株を神経系細胞で連続継代することで、末梢感染においてのみマウスでの病原性が低下した弱毒株を確立した。解析の結果、その弱毒化にはウイルスGタンパク質へのN型糖鎖の追加が関与していることが示された。このN型糖鎖の追加は、他の実験室馴化株でも認められるが野外流行株では認められないことから、狂犬病ウイルスの末梢感染を規定する一つの因子であることが示唆された。これまで狂犬病ウイルスの病原性に関する研究は,固定毒(野外株の連続継代により得られた実験室馴化株で末梢感染性が野外株に比べ低下)を用いた脳内接種による評価が中心で,狂犬病ウイルスの末梢感染からアプローチによる報告は少なく,かつ末梢感染成立機構についても未解明である.末梢感染性成立機構の解明は,より効果的な狂犬病治療法の確立に役立つと考えられる.本研究では狂犬病ウイルス野外株である1088株から末梢感染性のみが低下した変異株を作出し,親株と変異株で性状比較を行うことで末梢感染成立機構の解明を目指しており,本年度の研究成果について以下に記す.1088株をマウス神経芽細胞腫由来株化細胞であるNA細胞で30代継代した株は,培養上清中のウイルス力価が10^5FFU/mlオーダーから10^8FFU/mlオーダーに上昇しており,NA細胞への馴化が確認された.1088株30代継代株のマウス脳内接種における病原性は,親株および固定毒であるCVS株と変わらなかったが(いずれもLD50は10FFU以下),筋肉内接種における病原性が著しく低下していた.すなわち1088株より末梢感染能欠落変異株を樹立することに成功した.また野外株1088株の末梢感染性は固定毒CVS株に比べて10倍程度高いことも確認された.1088株30代継代株の全塩基配列を決定し,その配列を親株のそれと比較したところ,計7つの塩基置換が認められ,そのうち3つはアミノ酸置換を伴うもので,さらにそのうち2つはGタンパク質に認められた.これらGタンパク質におけるアミノ酸置換は継代の浅い時期から認められ,加えて,アミノ酸置換の出現と培養上清中のウイルス力価の上昇が一致していたことから,これらのアミノ酸変異はNA細胞への馴化に関与すること,さらに1088株のNA細胞への馴化と末梢感染性の低下との間に関連性があることが推察された.昨年度は狂犬病ウイルス街上毒1088株のNA細胞での連続継代により、末梢感染性のみが欠落したNA馴化弱毒変異株(1088-N30株)の確立に成功した。本年度は1088-N30株に認められた変異のうち、Gタンパク質にN型糖鎖の追加をもたらすR196S変異に着目して研究を行い、以下の結果が得られた。限界希釈法によりR196S変異をのみを持つ1088株変異株のクローニングを試み、得られたいくつかのクローンのうち1088-N4#14株を選んで性状解析を行った。1088-N4#14株はR196S変異の他にPタンパク質G61E変異も有していたが、このG61E変異は他の野外分離株でも認められる変異であることから、この変異が末梢感染性に与える影響は小さいと考えられた。この1088-N4#14株は1088-N30株と同様にNA細胞において著しい増殖性の亢進が認められた。さらに1088-N4#14株のマウス脳内接種における病原性は親株および1088-N30株と同程度であったが、マウス筋肉内接種における病原性は親株に比べ低下していた。加えて、両変異株は筋肉内接種時にマウスに対して中和抗体の産生を強く誘導することも確認された。したがって、Gタンパク質へのN型糖鎖追加をもたらす変異が、NA細胞への馴化と末梢感染性の減弱に関与していることが示された。Gタンパク質へのN型糖鎖の追加、NA細胞での増殖性亢進および末梢感染性減弱は、これまでに確立された固定毒(実験室馴化株)でも認められることから、N型糖鎖追加は街上毒の固定毒化に関与するmolecular deteminantの一つであることが示唆された。また、グリコシダーゼや阻害剤を用いた解析により、R196S変異により1088株Gタンパク質に付加される主なN型糖鎖が高マンノース型から混合型もしくは複合型へ変化することを示唆する結果も得られた。

狂犬病ウイルス街上毒1088株とマウス末梢感染において弱毒化したN型糖鎖追加(R196S)変異株(1088-N4#14株および1088-N30株)について、免疫組織化学的解析を経時的に行った。接種後5日目では、いずれの接種群でも症状が認められないにもかかわらず、大脳皮質にウイルス抗原が認められた。接種後8および11日目では、1088株感染ではウイルス抗原が脳全域に分布していたが、1088-N30株感染では、ウイルス抗原は大脳皮質や視床の一部に限局したままであった。1088-N4#14株ではそれらの中間像を示した。昨年度までの結果とあわせると、N型糖鎖追加変異株は依然neuroinvasiveであるが、中枢神経系に侵入する過程で宿主免疫を強く誘導してしまうために、脳内に侵入後はその拡がりが抑制されると考えられた。以上の結果について、報告を行った(Virus Res.165 : 36-45, 2012)。一方、固定毒で認められるN型糖鎖を追加した1088株Gタンパク質発現プラスミドを各種構築し、G遺伝子欠損狂犬病ウイルスを用いたシュードタイプアッセイを行ったところ、その追加は培養細胞におけるビリオン産生を促進させること、特に第194位および247位への追加では顕著であることが分かった。さらに再度1088株のNA細胞での連続継代・クローニングを行ったところ、R196S変異株のみならずD247N変異株(第247位へのN型糖鎖の追加)や新規のN型糖鎖追加変異株が数クローン得られ、いずれもマウス神経系NA細胞での増殖性が亢進していた。従って、Gタンパク質N型糖鎖追加の細胞馴化への関与について普遍性が示唆された。また、各種グリコシダーゼ阻害剤を使用した解析により、第194位および247位へのN型糖鎖追加によるビリオン産生亢進には、N型糖鎖の成熟度が関与していることが示唆された。