hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
病因性mDNA変異を有するがん細胞による寄生性代謝の解析とその制御

病因性ミトコンドリアND6及びCOI遺伝子変異を有するため試験管内では低いATP産生しかできないが、生体内では高い増殖性と転移性を示すマウス肺がん由来P29mtB82M細胞の特徴をエネルギー代謝の面から検討した。その結果、解糖系の亢進、乳酸トランスポーターMCT4による乳酸の積極的排出、間質細胞との寄生性がん代謝、低酸素下における高いグルコースの取込み、高い腫瘍血管新生能による血中グルコースの効率的利用が増殖・転移におけるエネルギー(ATP)確保にとって重要であることが示唆された。また、MCT4を抑制すると細胞死が起こることも判明し、mtDNA制御の転移を抑制するための糸口が示唆された。本研究は、活性酸素種(ROS)を多量に生成する原因となる病因性mtDNAを保有するがん細胞が、寄生性がん代謝(ROSに暴露された間質細胞が産生する高エネルギー代謝産物のがん細胞への供給によるATP産生)の亢進によって、自己及び共存する野生型mtDNA保有がん細胞の増殖、転移に影響を与えるかどうかを検証することを目的としている。本年度は、マウス肺がん由来で野生型mtDNAを保有する低転移性P29細胞及び病因性mtDNA(13891InsC)を保有するP29mtB82M細胞の性状、並びに間質細胞(Balb/c3T3)との共培養系における代謝系やグルコース飢餓における生存率の変化について検討した。P29mtB82M細胞は、P29細胞と比較して、ATP産生能が低く、乳酸及びROSを高産生する。また、P29mtB82M細胞はin vitroにおける増殖速度は遅いが、同系マウス皮下における増殖速度はP29細胞とほぼ同程度であり、高い肺転移能を示した。このことから、in vivoにおいては、腫瘍内微小環境中の何らかの影響がP29mtB82M細胞のエネルギー代謝や増殖,転移に影響を及ぼしていることが推測された。そこで、間質細胞との共培養下でのグルコースの取込みと低グルコース条件下での生存率を検討した。その結果、P29mtB82M細胞はグルコーストランスポーターGLUT3およびラクテートトランスポーターMCT4を高発現しており、単独培養よりも共培養下でグルコース(蛍光性2-deoxyglucose誘導体である2-NDBG)の取込みが亢進されること、低グルコースによる細胞死の誘導に対する抵抗性が亢進されることが明らかになった。これらの結果から、P29mtB82M細胞と間質細胞との相互作用が示唆された。ヒト肺がんや大腸がんにおいてミトコンドリアDNA(mtDNA)の病因性変異が高頻度に認められる。病因性mtDNA変異はエネルギー(ATP)産生の低下を来すが、がん細胞は旺盛に増殖・転移する。我々は、病因性mtDNA保有がん細胞が活性酸素種(ROS)を多量に産生することから、寄生性がん代謝(ROSに暴露された間質細胞が産生する高エネルギー代謝産物のがん細胞への供給によるATP産生)の亢進あるいは相互作用によって、転移するためのエネルギーを得ているのではないかと推測している。マウス肺がん由来で病因性mtDNA(13891InsC)を保有するP29mtB82M細胞は、野生型mtDNAを保有するP29mtP29細胞と比較して、in vitroでのATP産生が低いにもかかわらず、in vivoでは高転移性を示す。P29mtB82M細胞は、P29mtP29細胞と比較して、グルコーストランスポーターの一つであるGlut3および乳酸トランスポーターの一つであるMCT4を高発現しており、解糖系酵素であるHK1、PFK1、PGK1、PKM1の発現も高いことが判った。また、単独培養よりも間質細胞との共培養下でグルコース(蛍光性2-deoxyglucose誘導体である2-NDBG)の取込みが若干亢進されることを明らかにした。さらに、低酸素下でのグルコースの取込みを検討したところ、P29mtP29細胞と比較して、P29mtB82M細胞で顕著な取込みの亢進が認められた。一方、遊離脂肪酸(蛍光性TF2-C12)の取込みを検討したが有意差は認められなかった。これらの結果から、P29mtB82M細胞と間質細胞との相互作用および低酸素環境におけるグルコースの取込みと解糖系の亢進がP29mtB82M細胞のATP産生にとって重要であることが示唆された。一部の病因性mtDNA変異はエネルギー(ATP)産生の低下を来すが、このようなmtDNA変異を有するがん細胞でも転移することを明らかにしている。このモデル細胞系として用いているマウス肺がん由来で病因性mtDNA(13891InsC)を保有するP29mtB82M細胞でも顕著にATP産生が低下しているが、高頻度に肺転移を起こす。このような病因性mtDNA変異を有するがん細胞は、転移に必要なエネルギーを間質細胞との相互作用による寄生性がん代謝で得ている可能性を検証している。本年度は、癌関連線維芽細胞WA-moFibとの共培養系で、グルコースのP29mtB82M細胞への取込みが亢進されることを見出した。

しかし、共培養系においてP29mtB82M細胞中でのATP濃度をATeamを用いてリアルタイムに可視化するFRET解析を行なったが、顕著な細胞内ATP濃度の変動は観察されなかった。従って、解糖系の亢進しているP29mtB82M細胞中では、共培養系によって取り込みが増加したグルコースを効率よく代謝するが、ATP消費速度も早く、顕著な細胞内ATP濃度上昇には至らないのではないかと推察された。一方、P29mtB82M細胞は特異的に乳酸トランスポーターの一つであるMCT4を高発現していることを昨年度に明らかにしたが、MCT4発現をノックダウンすると細胞死が誘導されることが明らかになった。また、興味深いことに、MCT4が細胞膜上のみでなく核内にも存在することが判明した。そこで、mtDNA病因性変異を有するヒト肺がんや大腸がんにおいてMCT4の細胞内局在を調べたところ、高率に核内にも存在することが明らかになった(千葉県癌センター研究所との共同研究)。この核内MCT4がmtDNA病因性変異を有する細胞の転移においてどのような機能を果たしているのかの解明が今後の課題である。病因性ミトコンドリアND6及びCOI遺伝子変異を有するため試験管内では低いATP産生しかできないが、生体内では高い増殖性と転移性を示すマウス肺がん由来P29mtB82M細胞の特徴をエネルギー代謝の面から検討した。その結果、解糖系の亢進、乳酸トランスポーターMCT4による乳酸の積極的排出、間質細胞との寄生性がん代謝、低酸素下における高いグルコースの取込み、高い腫瘍血管新生能による血中グルコースの効率的利用が増殖・転移におけるエネルギー(ATP)確保にとって重要であることが示唆された。また、MCT4を抑制すると細胞死が起こることも判明し、mtDNA制御の転移を抑制するための糸口が示唆された。間質細胞と病因性mtDNA(13891InsC)を保有する肺がん細胞との共培養系においてグルコース代謝の変化が観察されること、低酸素下でのグルコースの取込みに差が認められること、遊離脂肪酸の取込みには変化が認められないこと等が明らかになった。しかし、がん細胞中でのATP濃度をATeamを用いてリアルタイムに可視化するFRET解析のための予備的な実験によるデータ収集を行なったが、満足のいく結果が得られなかったため、研究計画はやや遅れていると判断した。腫瘍生物学今後は、グルコース代謝に焦点を絞った研究を行なう。また、間質細胞として、がん関連線維芽細胞(CAFs)を用いた実験系を使用して実験を行なう予定である。さらに、がん細胞中でのATP濃度をATeamを用いて測定する。マウス肺由来の間質細胞およびヒト膵がんの間質細胞の分離培養が不調であったため、当初予定していた共培養系の樹立ができなかった。しかし、Balb/c3T3細胞と病因性mtDNA(13891InsC)を保有する肺がん細胞との共培養系においてグルコース代謝の変化が観察されたことは今後の研究の展開に重要な手がかりが得られた。来年度への移行期にも円滑に研究が進められるように考慮し、研究費の使用額を計画的に調整したため、次年度使用額が生じた。間質細胞と病因性mtDNA(13891InsC)を保有する肺がん細胞との共培養系において、がん細胞中でのATP濃度を「ATeam」を用いてリアルタイムに可視化すると共に、細胞内のグルコース代謝系の変化について検討する。また、脂質代謝の変化やROSの関与についても検討を加える。当初の研究計画に基づき、消耗品費、論文校閲費に充当する。
ジャスモン酸経路を介する熱帯樹木の新奇イソプレン合成制御機構の解明

地球上の多くの植物は高温や強光などの環境ストレスに応答してイソプレンというガスを放出する。イソプレンは植物に対しては保護作用がある一方において、大気中では間接的に温暖化を促進し、地球環境に重大な影響を及ぼしている可能性が高い。本研究では、主要な熱帯樹種であるクワ科のオオバイヌビワのイソプレン放出に及ぼすホルモン処理及び低温や乾燥等の非生物的ストレスの影響とこれらの外的刺激に対する葉内でのホルモン濃度とシグナル関連遺伝子並びに基質供給代謝系の関連遺伝子の発現変化を解析し、ジャスモン酸経路を介する熱帯樹木の新奇イソプレン合成・放出制御機構を解明する。
出芽酵母におけるストレスで誘導される遺伝子の解析

出芽酵母の第6染色体の整列クローンバンクを利用し,熱ショック,グルコース非存在下での培養,および増殖の定常期のストレス条件下で転写活性の変化する遺伝子を多数同定した。それらの遺伝子のいくつかの塩基配列を決定し,予想されるアミノ酸配列のホモロジー解析,転写開始点の決定,遺伝子破壊などにより解析した。これらの遺伝子のうち,アミノ酸の代謝に関与しているL-アラニン・グリオキシル酸アミノ転移酵素の遺伝子(AGT1)と類似しているVI-A,および,グルコースによって抑制されるものと誘導される遺伝子が交互に並ぶ領域中でもっとも変化の激しいVI-61の二つの遺伝子について詳細に解析した。両遺伝子は酵母の生育にとって必須ではない。両遺伝子の上流部をlacZにつなぎ,異なる培養条件下でβ-ガラクトシダーゼの活性を指標としてストレスに応答するシス配列の同定を進めた。また,より一般的にストレスに応答する遺伝子を同定するために,differential hybridization法によってストレス条件下で発現する遺伝子のmRNAを濃縮し,cDNAバンクを作成し,解析を進めていくための手筈を整えた。
メタデータスキーマを基礎とした持続的なメタデータ生成支援と流通支援環境の構築

セマンティックWeb技術とLinked Open Data(LOD)の普及に伴って,多種多様なコミュニティが作成したメタデータがLODデータセットとしてネットワーク上に公開されるようになってきた.昨今では,政府,地方自治体,図書館,博物館などが作成したLODデータセットが,様々なサービスやアプリケーションの中で利活用されている.しかしながら,LODプロジェクトの活動が始まってから10年が経ち,LODデータセットの中にはあまり利活用されていないものや,更新が行われずメタデータの情報が古くなってしまったもの,また公開が停止されデータセットにアクセスができなくなってしまったものも少なくない.そこで本研究では,メタデータを長期に渡って公開し,利活用性を高めるためには,メタデータのライフサイクル(スキーマ設計,メタデータ作成,メタデータ利活用,維持・運用)を支援する必要があると考え,以下の2つの目標を設けて研究を進めた.(1)メタデータスキーマを基礎とした既存リソースからの持続的なメタデータ作成支援モデルの提案(2) LODデータセットの利活用性向上を目的としたメタデータスキーマを基礎とするメタデータ公開支援モデルの提案平成30年度は,(1)メタデータ抽出のためのメタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法の提案,(2)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ理解支援モデルの検討をおこなった.また,(a)と(b)に基づいた既存リソースからのメタデータ抽出と理解支援のためのプロトタイプを作成し,評価をおこなった.プロトタイプでは,対象とするリソースの追加と修正にあわせた持続的なメタデータ作成機能を検討した.平成30年度は,目的としていた以下のポイントに充填を置いて研究を進めることができた.(a)メタデータ抽出のためのメタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法の提案:メタデータスキーマとリソース中の関連する項目を結びつけるための抽出ルール記述形式の検討をおこなった.本手法の検討は,筆者がこれまでに開発したメタデータスキーマとXPath式を利用したウェブページからのデータ抽出方式に加え,複数のリソース(ウェブページ)に記述されている情報を集約してメタデータを生成する手法の検討をおこなった.平成30年度はHTML形式を対象に検討を進めた.(b)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ理解支援モデルの検討:LODデータセットの利活用性を向上させるために,メタデータに関する知識が少ない利用者がメタデータ記述に使われている語彙やスキーマを理解するための要求要件とその提示方法について調査分析をおこなった.具体的には,LODデータセット中のクラス間関係を記述に用いられているプロパティを中心に分析をおこなった.(c)プロトタイプの作成と評価:(a)と(b)に基づいた既存リソースからのメタデータ抽出と理解支援のためのプロトタイプを作成し,評価をおこなった.プロトタイプでは,対象とするリソースの追加と修正にあわせた持続的なメタデータ作成機能を検討した.平成31年度では,平成30年度の評価に基づき,メタデータ抽出のためのマッピング手法の改善をおこない,限定した利用者にシステムを公開する.平成32年度では,これまでの評価に基づいて,メタデータ抽出手法とシステムの改善をおこない,利用者を限定せずにシステムを公開し運用する.平成31年度は以下のポイントに重点を置いて研究を進める.(1)マッピング手法の改善:平成30年度での評価に基づき,メタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法とシステムの改善を図る.平成31年度は,HTML形式に加えて,RDBや表形式で蓄積されたリソースを対象に改善を進める.(2)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ公開支援モデルの提案:平成30年度でのメタデータ抽出モデル検討およびプロトタイプシステムでの評価に基づき,メタデータの生成から公開までの一連の過程を支援するためのモデルの提案と,そのためのシステム構築をおこなう.(3)システム評価:(1)と(2)において開発したシステムをインターネットに公開し,利用評価をおこなう.平成31年度は,まず限定された協力者に評価を依頼する.セマンティックWeb技術とLinked Open Data(LOD)の普及に伴って,多種多様なコミュニティが作成したメタデータがLODデータセットとしてネットワーク上に公開されるようになってきた.昨今では,政府,地方自治体,図書館,博物館などが作成したLODデータセットが,様々なサービスやアプリケーションの中で利活用されている.しかしながら,LODプロジェクトの活動が始まってから10年が経ち,LODデータセットの中にはあまり利活用されていないものや,更新が行われずメタデータの情報が古くなってしまったもの,また公開が停止されデータセットにアクセスができなくなってしまったものも少なくない.そこで本研究では,メタデータを長期に渡って公開し,利活用性を高めるためには,メタデータのライフサイクル(スキーマ設計,メタデータ作成,メタデータ利活用,維持・運用)を支援する必要があると考え,以下の2つの目標を設けて研究を進めた.(1)メタデータスキーマを基礎とした既存リソースからの持続的なメタデータ作成支援モデルの提案(2) LODデータセットの利活用性向上を目的としたメタデータスキーマを基礎とするメタデータ公開支援モデルの提案平成30年度は,(1)メタデータ抽出のためのメタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法の提案,(2)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ理解支援モデルの検討をおこなった.また,(a)と(b)に基づいた既存リソースからのメタデータ抽出と理解支援のためのプロトタイプを作成し,評価をおこなった.プロトタイプでは,対象とするリソースの追加と修正にあわせた持続的なメタデータ作成機能を検討した.平成30年度は,目的としていた以下のポイントに充填を置いて研究を進めることができた.

(a)メタデータ抽出のためのメタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法の提案:メタデータスキーマとリソース中の関連する項目を結びつけるための抽出ルール記述形式の検討をおこなった.本手法の検討は,筆者がこれまでに開発したメタデータスキーマとXPath式を利用したウェブページからのデータ抽出方式に加え,複数のリソース(ウェブページ)に記述されている情報を集約してメタデータを生成する手法の検討をおこなった.平成30年度はHTML形式を対象に検討を進めた.(b)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ理解支援モデルの検討:LODデータセットの利活用性を向上させるために,メタデータに関する知識が少ない利用者がメタデータ記述に使われている語彙やスキーマを理解するための要求要件とその提示方法について調査分析をおこなった.具体的には,LODデータセット中のクラス間関係を記述に用いられているプロパティを中心に分析をおこなった.(c)プロトタイプの作成と評価:(a)と(b)に基づいた既存リソースからのメタデータ抽出と理解支援のためのプロトタイプを作成し,評価をおこなった.プロトタイプでは,対象とするリソースの追加と修正にあわせた持続的なメタデータ作成機能を検討した.平成31年度では,平成30年度の評価に基づき,メタデータ抽出のためのマッピング手法の改善をおこない,限定した利用者にシステムを公開する.平成32年度では,これまでの評価に基づいて,メタデータ抽出手法とシステムの改善をおこない,利用者を限定せずにシステムを公開し運用する.平成31年度は以下のポイントに重点を置いて研究を進める.(1)マッピング手法の改善:平成30年度での評価に基づき,メタデータスキーマと既存リソースのマッピング手法とシステムの改善を図る.平成31年度は,HTML形式に加えて,RDBや表形式で蓄積されたリソースを対象に改善を進める.(2)メタデータスキーマを基礎とするメタデータ公開支援モデルの提案:平成30年度でのメタデータ抽出モデル検討およびプロトタイプシステムでの評価に基づき,メタデータの生成から公開までの一連の過程を支援するためのモデルの提案と,そのためのシステム構築をおこなう.(3)システム評価:(1)と(2)において開発したシステムをインターネットに公開し,利用評価をおこなう.平成31年度は,まず限定された協力者に評価を依頼する.
ヒト転移因子LINE-1のゲノム伝播機構の解明

多くの真核生物にはレトロトランスポゾンとよばれるゲノム上のある場所から別の場所へと転移する因子が存在し、これらはときにがんなどの疾患の変異原として作用することが分かっているが、その転移機構は依然として不明である。本研究ではこの中でも現生人類で自律的に転移するLINE-1レトロトランスポゾンの転移機構解明に主眼をあて研究を行った。その過程で、1)DNA損傷を認識しこれを修復する多くの因子がLINE-1と物理的に相互作用すること、2)その中でもPARP1、PARP2という因子が転移に重要な働きをしていることが分かり、それらが関与する新たなDNA修復機構のモデルを提唱するに至った。LINE-1 (L1)はヒトゲノムの約17%を占める転移因子で、高頻度で遺伝性疾患を引き起こす変異を伴うと考えられている。このようにL1は現生人類における多様なゲノムバリエーションを生み出す原動力となる一方で、破滅的な遺伝情報の破壊も引き起こす。しかしその転移における基本的な分子機構はよく分かっていない。本研究ではその中でも殆ど未解明の宿主因子によるヒトL1の転移制御機構について研究を行い、将来的には未知のDNA修復メカニズムの発見にもつながると予想され、普遍的なゲノム維持機構解明に向け、新たなアプローチになると期待される。実際、L1と相互作用する宿主因子を調べたところ、機能がよく分かっていないDNA修復因子が複数含まれていることが分かった。それらの機能解析を通して、1)これらの修復タンパク質がL1が引き起こすDNA損傷を特異的に認識すること、2)損傷部位により活性化された修復タンパク質が他の修復タンパク質の集合に関与すること、3)これまでに明らかとされていなかった新規の修復経路の同定に至った。L1が転移する際に、宿主防御機構による様々な抑制制御を受けることが知られているが、上記で明らかにしたDNA修復因子群が、その防御機構の1つであるDNAの脱アミノ化を抑制する活性を持つことも明らかにした。以上の結果から、転移因子が宿主因子を巧妙に利用することで、宿主防御機構から逃れ、現生人類でも転移し続ける分子機構が解明されつつある。また今回発見されたDNA修復メカニズムが、ゲノム恒常性維持にどのように貢献しているのか、新たな重要課題が提示された。当初の予定どおり、L1と宿主因子の相互作用の解析を通じてL1の転移メカニズムを明らかにしつつある。まず第一に宿主DNA修復因子がL1によって生じるDNA損傷を認識すること、またこれによって修復因子が活性化されること、この活性化によって他の修復因子を呼び込むこと、そして呼び込まれた修復因子がL1の転移頻度の上昇に寄与することを明らかにした。このような宿主因子によるカスケード反応の存在は、従来のL1転移機構において全く知られておらず、そのメカニズムの解明に向けて前進した。またさらに、DNAの脱アミノ化反応によってL1の転移は阻害されることが報告されているが、本研究によって同定された新規のL1相互作用因子の中には、これを抑制する活性があることを試験管内の実験によって初めて明らかにした。これは、L1によるDNA損傷時だけではなく、グローバルなゲノム損傷応答とDNAの脱アミノ化が拮抗していることを示唆している。PARP1およびPARP2は、DNA損傷に応答して活性化され、ポリADPリボースを自己および標的タンパク質に付加し、ポリADPリボース結合ドメインを持つ他のDNA損傷修復因子を損傷部位に集積させることでDNA損傷修復を促進する。最初にORF2がポリADPリボシル化されるか否かを検証した。ORF2を発現させた培養細胞から細胞抽出液を回収後、ポリADPリボシル化タンパク質のみを精製し、ここにORF2が含まれるか否かをウェスタンブロットにより調べた結果、ORF2がポリADPリボシル化されていること見出した。これはPARP阻害剤で処理した細胞では全く見られなかったことから、PARP活性に全く依存していることもわかった。そしてORF2のポリADPリボシル化はPARP1ノックダウン細胞でのみ顕著に低下していた。このことから主にPARP1がORF2の修飾を担うことが分かった。今後は、この翻訳後修飾がORF2の活性に与える影響についてさらに解析を行う予定である。次に、PARP活性によってORF2複合体に呼び込まれる因子の探索を行った。その結果一本鎖DNA結合タンパク質に結合するRPAが、PARP阻害剤処理を施した場合のみ、特異的にORF2との相互作用が減弱した。そこでPARP1あるいはPARP2のノックダウン細胞におけるORF2とRPAの相互作用を調べたところ、PARP2ノックダウン細胞でのみ、上記相互作用の減弱が観察された。すなわちPARP2がORF2によって切断されたDNAを認識して活性化しポリADPリボシル化を自身に付与することでRPAが呼び込まれるのではないかと予想された。実際、RPAを一過的にノックダウンした場合もL1転移が低下することが分かった。以上よりPARPファミリーによるL1転移制御機構の一端が明らかとなった。

その過程で、1)DNA損傷を認識しこれを修復する多くの因子がLINE-1と物理的に相互作用すること、2)その中でもPARP1、PARP2という因子が転移に重要な働きをしていることが分かり、それらが関与する新たなDNA修復機構のモデルを提唱するに至った。現段階で、L1が巧妙に宿主防御機構をくぐり抜け転移するメカニズムも分かってきたが、これは従来の構図ーL1と宿主細胞の進化的軍拡競争ーからさらに拡張した議論へと展開するだろう。すなわち、ゲノム恒常性を維持する分子機構の間にも拮抗作用が存在し、そのバランスを制御する分子機構(L1あるいは宿主防御どちらへ比重をかけるのか)を解明することで、生体の恒常性を解く手がかりが得られるだろう。L1と相互作用する因子の中には機能未知の因子が含まれており、質量分析等の解析から、これらの因子はやはりゲノム損傷・複製に関与する可能性が示唆されつつある。今後も宿主因子の制御に基づくL1の転移機構の解明を続けることで、ゲノム恒常性とその破綻によって起こる遺伝的疾患の解明へと繋がる基盤研究を実施して行く予定である。ゲノム生物学
光インターカレーションによるブロンズ生成の研究

1.三酸化タングステン・三酸化モリブデンのペレットを作製し、光インターカレーション反応を試みた。いずれも呈色して水素ブロンズの生成が見られたが、光照射に伴なう発熱による暗反応の寄与が非常に大きく、反応機構の解析には不適当であった。2.酸化スズ-三酸化タングステンの二層薄膜について同様の実験を行なったが、本系ではブロンズ生成が見られなかった。反応条件・前処理等を種々変えてみたが、結果は同じであった。3.以上の結果より、けん濁微粒子と電極とでは反応機構が異なると推定される。用いた酸化物はn型半導体であるが、電極系では酸化物がp型半導体であることが、反応の必須条件であるかも知れない。そうならば、本化合物を単一で用いては、光インターカレーションは期待し得ない。4.この障壁を越えるため、酸化チタン-三酸化タングステンの二層ペレットを作製し、光インターカレーション反応を試みた。光照射により水素ブロンズの生成が確認され、導入された水素量も多い。5.この結果について、両酸化物のバンドギャップはそれぞれ2.9、2.7eV、フラットバンドポテンシャルは-0.4、-0.1Vであるから、層界面においてバンドベンディングの様子が変化し、三酸化タングステンが電気化学反応の上ではp型半導体と同じように振舞っている可能性がある。5の推定については、まだ検討すべき課題が残っている。たとえば、単純な構造の二層ペレットがきちんとしたバンド接合面を形成しているか否か、あるいは酸化チタン側から光照射した場合のみ反応が進行すること等で、これらは上記反応が光インターカレーションであると結論する上で極めて重要である。理想的な二層薄膜を形成する等の実験で確認した上で、学術雑誌に発表する予定である。
都市近郊における長屋門の成立と変容に関する計画学的研究

4)実測調査茨城県美野里町にて長屋門の実測調査を行った。5)長屋門の形態美野里町において実測調査を行った33例をもとに考察する。敷地形状は,間口に対して奥行きが長いものが9割弱を占める。最も多い形状は南面で接道し,南北に長い敷地である。東または西に道路を有する東西に長い形状は9例あり,この場合,長屋門は道路に平行に配置され,母屋が南向きとなる。つまり,母屋は方位を,長屋門は方位よりも接道を優先して建設されている。意匠は,武家の長屋門では漆喰に海鼠壁や簓子(ささらこ)下見板張りを組み合わせた外装が内外を問わずぐるりと仕上げられている。一方で農家の長屋門は,表では海鼠壁や簓子下見板張り,裏手では堅板張りなど内外の外装を使い分けている例が多い。表としての認識は妻面から正面,中央の通り部分は裏面と同じ仕上げとなる傾向があった。長屋門は外観の見栄えを重視して建設されたことがわかる。6)長屋門の用途の変遷長屋門の両側の室空間の用途は,美野里町の55軒中,両方とも納屋のタイプが9軒,片方が納屋でもう一方に居住空間をもつタイプが46軒で,後者が8割以上を占める。居住空間をもつタイプは当初は隠居としての利用が9割以上を占め,隠居者がいないときは貸家に,また,母屋の建替えを行う際に長屋門を一時的な仮住まいとして利用した。こうした長屋門の利用について全国に目を向けると,明治時代には役場や銀行の支店,小学校等の設置が確認でき,屋敷や地域の緩衝空間として機能していたことがわかった。調査時点では,長屋門での隠居は8軒で,多世代居住の減少,長屋門とは別に新たな隠居屋の新築,若夫婦のための新居を造り,親世代は母屋でそのまま生活をするケースの増加で,新たな用途が見出せず,空室や物置等となり,生活上の意味が薄れたものが徐々に増え,昭和50年以降は約4割で見られた。1)データベースの作成文化財リスト、各自治体のHP、文化財修理報告を収集し、長屋門は2004.7現在、国宝1、重要文化財48、都道府県指定文化財・史跡30、登録有形文化財54、市町村指定54、その他38が確認でき、それら225事例を一元化した。一方実地調査で、茨城県美野里町・八郷町の調査で150軒余り、岩手県水沢市で60軒余りの長屋門が確認でき、誌上に載らない物件が相当数あることが推定できた。17年度は、長屋門を取り巻く制度や歴史、データベースをオンライン上で公開したいと考えている。また記録保存として茨城県美野里町の33軒を実測した。2)長屋門の成立過程の把握茨城県美野里町における調査から、関東周辺の藩政期に相給地であった地域での長屋門の成立は、近世後期に帰農した武家や一部の農民の名主層に拡がり、近代になって旧名主層や本家筋で建設されたことが明らかとなった。相給地ではない地区をみると、岩手県水沢市では中世から豪族の屋敷構えとして長屋門があったが、近世は伊達藩の下ほとんど建築されず、近代以降に地主を中心に建設されていた。つまり関東周辺部や胆江地方の長屋門の集積は、近代以降に長屋門が格式の象徴として農民層で流布したと考えられる。一方、武家の長屋門が多く残る山口県萩市では周辺の農村部で長屋門が建てられていない。郷土史家は、萩市は近代以降県域の中心が山口市に移動し、長屋門が武家屋敷の残骸として残り、衰退の象徴となったためではないかといい、様式の流行という視点で合致している。3)長屋門継承の居住者の意向茨城県美野里町で居住者(所有者)の意向調査(57件)を行った。2件で維持費や老朽化から解体を考えていたが、大半は継承したいと述べている。継承は旧態の保存ではなく建替えも3軒で見られ、形式の継承も是認されている。しかし利用実態をみると、旧来の意味(隠居屋・蔵)を失っているものが相当数あり、空き家・物置化している。景観法や登録文化財制度の活用は維持費の一助になると考えられるが、居住者にまだ馴染みがなく、17年度は制度の啓蒙も含めた研究活動を行いたい。

6)長屋門の用途の変遷長屋門の両側の室空間の用途は,美野里町の55軒中,両方とも納屋のタイプが9軒,片方が納屋でもう一方に居住空間をもつタイプが46軒で,後者が8割以上を占める。居住空間をもつタイプは当初は隠居としての利用が9割以上を占め,隠居者がいないときは貸家に,また,母屋の建替えを行う際に長屋門を一時的な仮住まいとして利用した。こうした長屋門の利用について全国に目を向けると,明治時代には役場や銀行の支店,小学校等の設置が確認でき,屋敷や地域の緩衝空間として機能していたことがわかった。調査時点では,長屋門での隠居は8軒で,多世代居住の減少,長屋門とは別に新たな隠居屋の新築,若夫婦のための新居を造り,親世代は母屋でそのまま生活をするケースの増加で,新たな用途が見出せず,空室や物置等となり,生活上の意味が薄れたものが徐々に増え,昭和50年以降は約4割で見られた。
文明開化期における言語表現の継承と変容の研究

1、忠孝思想・歌舞音曲と新体詩の相互連関・初等教育における韻文教育の調査を進めるにあたり、これらを一書のうちに体現している詩選集『纂評新體詩選』(明19)を中心に考察を進めた。(1)新体詩のはじまりにおいて除外されてしまった男女の情愛を、既知の近世的感覚によって新体詩という枠組みのうちに蘇生させようとした試みは、同時期、他に例を見ない。新体詩と長歌、漢詩との関係、東京大学古典講習科との関わりなどを通して照らした。(2)文芸言語による教育の啓蒙のありようについても、当時苛烈をきわめた初等教育のありさまや脱亜論を視野に入れ、示した。(3)キリスト教を題材とする詩篇「耶蘇辨惑一節」の作者外山正一はもとより福沢諭吉ら当時の知識人たちが、宗教と国家の関わりに揺れるありさまを追い、明治初年代の国家主義と、それを反映した知識人たちの文芸言語のありようを照らした。2、小説家・石川淳の祖父、石川省斎が、明治初めの短期間に編纂・出版した漢詩集を追い、<皇朝(日本)>と<詠史>をポイントとした編纂が、かつて昌平黌および和学講談所の修史官として手がけた「令集解」の校本編纂作業を自力で出版するための資金と、書肆との信頼関係獲得にあったと推測。多分に「手段」的側面が強かった漢詩集編纂の仕事は、幕末維新期の知・言葉のあり方を大いに反映したものであったと意味づけた。3、『大日本帝国憲法』の「天皇ハ神聖ニシテ」という主張について考察を展開。1世紀から19世紀にいたる天皇をめぐる表現を通史的に跡づけた。12世紀からの「征夷大将軍」を経た19世紀の王政復古の動きは、すべて神格化された「天皇」との関わりのなかで押し進められ、先の「天皇ハ神聖ニシテ」は7世紀に作られた歌を受けついだ主張であったと結論づけた。上記研究実績は、宮崎・遠山・山口の共著『言葉の文明開化-継承と変容-』(平19・4、学術出版会)として出版をした。本書の特徴は、愛国忠義、教育の啓蒙に加えて、遊里を題材とした詩篇をそれらに対置させたところにある。新体詩のはじまりにおいて除外されてしまった男女の情愛を、既知の近世的感覚によって新体詩という枠組みのうちに蘇生させようとした試みは、同時期、他に例を見ない。ここから、本研究のテーマである文明開化期における言語表現の継承と変容のさまを、新体詩と長歌、漢詩との関係、東京大学古典講習科との関わりなどを通して照らし、論文に示した。また、本書を例とする、文芸言語による教育の啓蒙のありようについても、当時苛烈をきわめた初等教育のありさまや脱亜論を視野に入れ、別に論文に示した。2、政治小説、未来記、翻訳小説・翻案小説といった虚構ジャンルに分類される種類の文章のみならず、法令や建白書、,憲法私案などの公的、政治的文書、学問諸分野の専門書、新聞などの実務的文書、学校

教科書も調査対象に含めて、文明開化期における「散文」の文体的多様性・差異性とそこにある共通性との両面を詳細に調査するという作業を進めるべく、多くの資料をサーヴェイした。その上で、多様性・差異性と共通性とをどのように括り、整理して行くのが適切かという基準設定を行なうべく考察を進めてきた。3、オーストラリア・モナシュ大学日本研究所で行われた日本学研究会に参加し、日本の国学思想および天皇思想をグローバルな視点から捉えるべく考察を進めた。論文「Varieties of Japanese Myths」の執筆を進行させている。1、詩選集『纂評新體詩選』(明19)を中心に前年度からの考察を引き続き進めた。今年度は特に、集中たった一篇置かれたキリスト教を題材とする詩篇「耶蘇辨惑一節」に着目。詩篇の作者外山正一が、詩篇を発表した当時(明16)は、キリスト教排斥を標榜する役割を担っていたものが、『纂評新體詩選』収録時(明19)には、現行のキリスト教に対する世間の無理解をあぶり出す役割を果たすようになった変化を指摘、外山はもとより福沢諭吉ら当時の知識人たちが、宗教と国家の関わりに揺れるありさまを追い、明治初年代の国家主義と、それを反映した知識人たちの文芸言語のありようを照らした。2、小説家・石川淳の祖父、石川省斎が、明治初めの短期間に編纂・出版した漢詩集を追い、それらの編集ポイント(<皇朝(日本)>と<詠史>)が、幕末維新期の漢詩制作・漢詩受容のあり方と不可分であることを指摘。当時の趨勢に棹さした編纂は、幕末期、昌平黌および和学講談所の修史官であった省斎が、そこで手がけた「令集義」の校本編纂作業を、和学所廃止後、自力で出版するために、売れ行きが好調な書物を編集して資金を獲得し、書肆との信頼関係を築いておく必要があったためだろう、との推測を提示。多分に「手段」的側面が強かった漢詩集編纂の仕事は、幕末維新期の知・言葉のあり方を大いに反映したものであったと意味づけた。3、『大日本帝国憲法』の「天皇ハ神聖ニシテ」という主張について考察を展開。1世紀から19世紀にいたる天皇をめぐる表現を通史的に博捜した。12世紀からの「征夷大将軍」を経た19世紀の王政復古の動きは、すべて神格化された「天皇」との関わりのなかで起こり、先の「天皇ハ神聖ニシテ」は7世紀に作られた歌を受けついだ主張であったと結論づけた。上記研究実績は、宮崎・遠山・山口の共著『言葉の文明開化-継承と変容-』(平19・4、学術出版会)として出版をした。
順序付き線形型に基づく安全かつ高速な大規模データ処理の実現

XMLのような木構造を論理構造として持つテキストデータの処理の記述方式としては,その論理的構造に基づいて木構造処理として記述する方式と, 1次元のテキストデータとしての物理構造に即したストリーム処理として記述する方式がある.本研究では,両者の長所をあわせもつ方式として、ユーザには木構造処理のプログラムを記述させ,それをストリーム処理プログラムに自動変換する方式について研究を進めている.本年度の成果は以下のとおり。1. XML用のストリーム処理プログラム生成器X-Pの有効性の評価昨年度までに順序付線形型に基づくXML用のストリーム処理プログラム生成器X-Pの有効性の評価を行った.その結果,不要なバッファリングが挿入されるケースがいくつか見つかった.2.順序付き非線型型を用いた一時的バッファリング従来の変換の枠組みは, (1)木構造処理プログラムPにバッファリングを挿入することにより,入力木に左から順に一度だけアクセスする中間プログラムIに変換し, (2)I中の木構造処理のための各命令をストリーム処理命令に置換えてストリーム処理プログラムTを得る,という2つの変換から構成されていた. (1)の変換では, Iが順序付線形型システムで型付けされるようにソースプログラムPにバッファリングを挿入することによって実現されていた.上記1の評価で浮上した不要なバッファリングの問題は,バッファリング命令がストリームから無制限にアクセスできるメモリへのコピー命令の一種類のみであったことが主要な原因の一つであった.この問題を解決するため,順序付き非線形型を導入することによって一時的バッファリングを実現し,既存の木構造処理プログラムからストリーム処理プログラムへの変換の枠組みを改良した.これにより,不要なバッファリングの問題を改善できることを実験により確認した.本研究では,XMLなどの大規模データ処理のためのプログラムの記述性・保守性と効率とを両立させるため,木構造処理プログラムからストリーム処理プログラムへの順序付き線形型に基づく自動変換の枠組みを研究している.これにより,ユーザは木構造処理を用いてプログラムをわかりやすく記述することができ,一方で実行の際はストリーム処理プログラムに変換した上で走らせることにより,効率よくデータ処理を行うことができる.今年度は,まず昨年度に作成したXML用のストリーム処理プログラム生成器X-Pの第一版の有効性の評価を行った.その結果,いくつかのベンチマークプログラムにおいて,不要なバッファリングが挿入されるという問題点が見つかった.そこで,その問題を解決するため,プログラム中に不要データの除去を行うための命令を挿入する「不要データ除去変換」を新たに定式化した.昨年度までの木構造処理プログラムからストリーム処理プログラムへの変換は,(1)順序付線形型に基づき,木構造処理プログラムにバッファリング命令を挿入して入力木を深さ優先順にちょうど一回ずつ走査するプログラムに変換する,(2)1の変換後のプログラムの木構造処理命令をストリーム処理命令に置換える,の2つのフェーズからなっていたが,この2段階の変換の中間に,上記の不要データ除去変換を追加することにより,ストリーム上のデータを主記憶にバッファリングする際に,必要なデータのみをバッファリングすることが可能となった.この方式に基づいて,昨年度に作成したXML用ストリーム処理プログラム生成器X-Pを改良し,不要なバッファリングの問題を改善できることを実験により確認した.XMLのような木構造を論理構造として持つテキストデータの処理の記述方式としては,その論理的構造に基づいて木構造処理として記述する方式と, 1次元のテキストデータとしての物理構造に即したストリーム処理として記述する方式がある.本研究では,両者の長所をあわせもつ方式として、ユーザには木構造処理のプログラムを記述させ,それをストリーム処理プログラムに自動変換する方式について研究を進めている.本年度の成果は以下のとおり。1. XML用のストリーム処理プログラム生成器X-Pの有効性の評価昨年度までに順序付線形型に基づくXML用のストリーム処理プログラム生成器X-Pの有効性の評価を行った.その結果,不要なバッファリングが挿入されるケースがいくつか見つかった.2.順序付き非線型型を用いた一時的バッファリング従来の変換の枠組みは, (1)木構造処理プログラムPにバッファリングを挿入することにより,入力木に左から順に一度だけアクセスする中間プログラムIに変換し, (2)I中の木構造処理のための各命令をストリーム処理命令に置換えてストリーム処理プログラムTを得る,という2つの変換から構成されていた. (1)の変換では, Iが順序付線形型システムで型付けされるようにソースプログラムPにバッファリングを挿入することによって実現されていた.上記1の評価で浮上した不要なバッファリングの問題は,バッファリング命令がストリームから無制限にアクセスできるメモリへのコピー命令の一種類のみであったことが主要な原因の一つであった.この問題を解決するため,順序付き非線形型を導入することによって一時的バッファリングを実現し,既存の木構造処理プログラムからストリーム処理プログラムへの変換の枠組みを改良した.これにより,不要なバッファリングの問題を改善できることを実験により確認した.
学校週5日制に対応した学習指導を援助する学校心理学的サービスに関する研究-不登校・LD(学習障害)等を中心に-

本研究は,学校週5日制の部分的実施に伴い,現在の学校での子どもたちの学習環境が著しく疎外されつつある現状,つまり新学力観の育成をめざしながらも,カリキュラムが現状維持のままスタートした中での児童生徒,保護者,教師の学習指導面の援助ニーズを解明し,それに基づき,不登校やLD児をはじめとする学習不適応の要因を明らかにするとともに,現在の試験的に学校現場に導入されているスクールカウンセラーに今後必要とされる力量は何かを提案することを目的として行われた。全国各地の小学校・中学校・高等学校の児童生徒1036名,保護者984名,教師431名,計2451名のデータを基に検討した結果,児童生徒では授業内容をよく理解しないまま授業が進むことを悩みの上位に挙げ,教師も授業において補習や個人指導の時間確保が難しい現状を指摘し,特に障害児学級を担当する教師で援助ニーズが大きいことが明らかになった。他方,保護者では授業や学力保障に対する懸念や不安を示していることがわかった。こうした結果から,2002年より学校週5日制が完全実施されるにあたり,学校現場に導入されたスクールカウンセラーの役割の一つとして,児童生徒の学習面の支援体制,例えば,児童生徒の学習カウンセリングや教師の学習指導のコンサルテーションが考えられ,そうした力量を備えたスクールカウンセラーを養成する必要性があることが示唆された。さらに,こうした学習指導のコンサルテーションに有用な知見が学習心理学や認知心理学の領域でどのくらい蓄積されているかもまとめ,とくに援助ニーズに応じたコンサルテーションのためのデータベース蓄積の重要性が指摘された。現在、小・中・高等学校で学校5日制が部分的に実施され,新学力観に基づく学習指導が行われているが,本年度の研究目的は,それによってどのような新しい援助ニーズが生まれたかを検討することにあった。当初の実施計画では,全国各地をカバーする質問紙調査を実施するところまで進める予定であったが,小・中学校等で子どもの実態について不安を抱く教師や保護者が増加していることを考慮し,予備調査として小・中・高校生とその保護者・教師それぞれ40名程度を対象に,学校週5日制の実施に伴いどのような新しい援助ニーズが生まれたかを学習面,心理社会面,進路面について自由記述式の質問紙により調査を行った。本年度は,この予備調査の分析結果を基に項目開発を行ったが,来年度は,それに基づき当初の目的である教科学習指導の問題を明らかにするための質問紙を作成し,全国規模の調査を実施する予定である。現在,小・中・高等学校で学校週5日制が部分的に実施され,新学力観に基づく学習指導が行われているが,本年度の研究目的は,昨年度と同様,それによってどのような新しい援助ニーズが生まれたかを検討することにあった。この目的にしたがって,まず,先行研究がみあたらないことから質問紙調査のための項目開発と実態把握を目的とし,昨年度末に実施した自由記述式の調査データの解析を行った。一部のデータの回収が本年度まで持ち越し,データ入力と解析の進行開始が遅れたため,本年度の成果は,小・中・高校の児童生徒,保護者,教師の計279名より回答のあった446件の自由記述データの分析と,それに基づく質問紙の項目作成の準備をするところまでしか進まなかった。しかし,この調査の分析結果から,学校週5日制実施後,援助ニーズの基になる悩みや困ったことについては,それがない人とある人に二分され,ない人では中高校生と教師が多いことがわかった。一方,悩みや困ったことが多かったのは学習負担の面や授業の面で,前者は生徒・保護者,後者は教師で多いことも明らかとなった。この成果の詳細は,平成11年8月開催の日本教育心理学会総会において発表の予定で,原稿は既に印刷中となっているが,来年度前半に全国規模で実施する予定の調査項目を選定する上で有用な資料となった。

なお,前述の調査結果の解析と同時進行で進めてきた,わが国の教育心理学,認知心理学,カウンセリング心理学等の中で学習指導のコンサルテーションに有用な研究成果の検討については,収集・分析作業が継続中なので,来年度にまとめて公表したい。本年度は,学校心理学的サービスの援助ニーズに対応するわが国の教育心理学,認知心理学を中心とした研究成果をまとめるとともに,前年度に調査を実施した自由記述による児童生徒,保護者,教師の援助ニーズをデータベースとして集団でも実施可能な質問紙を開発し,実施した。北海道,茨城,千葉,大阪府,徳島,香川,6都道府県の小・中・高等学校の児童生徒1038名,その保護者844名,障害児教育担当教師を含む教師210名を対象に調査を行った。これらのデータを分析した結果,児童生徒では授業内容をよく理解しないまま授業が進むことを悩みの上位に挙げ,教師も授業において補習や個人指導の時間確保が難しい現状を指摘していた。他方,保護者では授業や学力保障に対する懸念や不安を示していることがわかった。こうした結果から,2002年より学校週5日制が完全実施されるにあたり,学校現場に導入されたスクールカウンセラーの役割の一つとして,児童生徒の学習面の支援体制,例えば,児童生徒の学習カウンセリングや教師の学習指導のコンサルテーションが考えられ,そうした力量を備えたスクールカウンセラーを養成する必要性があることが示唆された。これらの結果に基づき,最終年度となる本年度は,第1章:序論,第2章:学習指導と学校心理学,第3章:学校週5日制下における学習指導の援助ニーズに関する予備的研究,第4章:児童生徒における学習指導の援助ニーズを中心とした検討,第5章:保護者における学習指導の援助ニーズを中心とした検討,第6章教師における学習指導の援助ニーズを中心とした検討,第7章:障害児担当教師における学習指導の援助ニーズを中心とした検討,第8章:全体のまとめと今後の課題,からなる報告書としてまとめた。
ポリペプチド側鎖の動的組換えによるタンパク質的高次構造および分子認識能の発現

側鎖末端にメチルチオエステル構造を有する水溶性ポリペプチドを合成し、このポリペプチドを多種類の低分子量チオールと水中で共存させた。その結果、チオエステル/チオール間の動的結合組換えの進行が確認され、水中でのポリペプチド側鎖配列の再編成が可能であることが示された。また、側鎖組換えの進行に伴い、ポリペプチドの高次構造が変化することが明らかとなった。さらに、低分子量チオールとして水への溶解性が比較的高い化合物を使用した場合には、組換え反応時の側鎖組成および高次構造を保ちつつコポリペプチドを単離できることが示された。特別な刺激なしで水中での結合組換えが可能なチオエステル/チオール動的共有結合系を用いることにより、水中でのポリペプチド側鎖の動的組換えを行った。まず、ポリ(L-グルタミン酸)とグリシンチオエステルとの縮合反応により、側鎖末端にメチルチオエステル構造を有する水溶性ポリペプチド1を合成した。このポリペプチド1と1種類のチオールを水中で共存させることにより、側鎖の動的組換えの進行およびそれに伴う高次構造変化について検討を行った。その結果、OH基を有するチオール(MB)およびフェニル基を有するチオール(BM)を使用した場合は、側鎖組換え後もポリペプチド1と同じαーへリックス構造が維持されるのに対して、スルホン酸塩構造を有するチオール(MESNA)を用いると高次構造がランダムコイルに変化することが明らかとなった。また、各チオールのポリペプチドへの導入率はMB>MESNA>BMの順となった。MESNAにおける導入率低下は、導入されたスルホン酸塩側鎖間の静電反発が原因と考えられる。一方、BMを用いた組換え系では、BMの導入に伴って水溶性が低下しポリペプチドが析出したため、導入率が低下したものと考えられる。続いて、MB, BM, MESNAを同時に添加して側鎖組換えを行ったところ、ポリペプチド側鎖へのそれぞれのチオールの導入を示すピークが1H-NMRスペクトルにおいて観察され、各チオールの導入が確認された。また、3種類のチオールを同時に添加した系において、組換え反応に伴うポリペプチド主鎖高次構造の変化をCDスペクトルにより追跡したところ、各チオールを1種類ずつ添加した場合とは異なるスペクトル形状を示すことが明らかとなった。この結果は、多種類のチオールを用いたポリペプチド側鎖の動的結合組換えにおいて、側鎖間相互作用が最小化された新たな高次構造が形成されたことを示唆していると考えられる。当初計画において、平成27年度の計画として「1.側鎖にチオエステル構造を有するポリペプチドを合成すること」「2.ポリペプチド側鎖上のチオエステルと1種類のチオールとの組換えを行い、反応の進行と高次構造変化を確認すること」および「3.多様な相互作用が可能な複数のチオールを同時に添加した組換え系において反応の進行と高次構造変化を確認し、新たな高次構造を創出すること」を掲げていた。それに対して、「研究実績の概要」欄に記載したとおり、平成27年度の検討において上記の「1」「3」を概ね達成する成果を得た。よって、「現在までの進捗状況」としては「おおむね順調に進展している」と判断した。側鎖末端にメチルチオエステル構造を有するポリペプチドPGSMを、OH基を有するチオール(MB)、フェニル基を有するチオール(BM)およびスルホン酸塩構造を有するチオール(MESNA)と水中で共存させることにより、側鎖の組換えおよびそれに伴う高次構造変化が起こることを前年度に明らかにした。しかし、この系では低分子量チオール間の溶解性差が大きいため、組換え後の単離時に低分子量チオールを同時に除去することができず、その結果、一部のチオールを除去した段階でさらに組換えが進んでしまう結果となった。そこで今年度は、BMの代わりにピラジル基含有チオール(MP)を用い、PGSM側鎖のチオエステル基と3種の低分子量チオール(MESNA, MB, MP)との動的側鎖組換えが高次構造に及ぼす影響を調査するとともに、側鎖組換え後のポリペプチドの単離について検討を行った。PGSMおよび3種類の低分子量チオールをリン酸緩衝液に溶解させ、1H-NMRスペクトル測定により追跡した結果、側鎖組換え反応によるMESNA、MBおよびMPのポリペプチドへの導入が確認された。また、側鎖組換えに伴う主鎖高次構造の変化をCDスペクトル測定により追跡したところ、反応の進行に伴い主鎖高次構造がα-helix構造から変化していくことが明らかとなった。そこで次に、側鎖組換え後のポリペプチド溶液を塩析しポリペプチドと低分子量チオールとを分離したのちに、ポリペプチドを透析により精製した。単離したポリペプチドの1H-NMRスペクトルより、側鎖組成はメチル基:24%、スルホネート基:9%、OH基:54%、ピラジル基:13%であった。また、単離後のポリペプチドのCDスペクトル形状は組換え反応中のスペクトルと大きく変化しておらず、組換え時の側鎖組成を保ちつつポリペプチドを単離することに成功したことが示唆された。

さらに、低分子量チオールとして水への溶解性が比較的高い化合物を使用した場合には、組換え反応時の側鎖組成および高次構造を保ちつつコポリペプチドを単離できることが示された。平成27年度におおむね当初計画通りの成果を得たので、平成28年度はその成果に基づいた検討を進める。側鎖の動的組換えにより配列および高次構造が最適化されたポリペプチドは、タンパク質的な特性である「転移的な変性挙動」および「変性条件の除去による高次構造の回復」(Anfinsenのドグマ)を示すと考えられるため、「変性→変性条件除去」実験に伴う高次構造の変化および回復をCDスペクトルにより追跡する。変性および変性条件の除去は、変性剤(変性溶媒や尿素など)の添加・除去により行う予定である。ポリペプチド側鎖に導入する官能基の組合せや組換え時間などを最適化し、タンパク質と同様の再フォールディング能を有する系を実現する。また、ターゲット分子存在下において側鎖組換え反応を行うことにより、ターゲット情報をモノマーユニット配列および高次構造に刷り込み、高次構造に基づく分子認識が可能なポリマーを得ることを検討する。ターゲット分子としては、ポリペプチド側鎖との種々の相互作用が期待できるアゾ色素やシアニン色素などを用いる。ポリペプチドー色素間の相互作用は、色素由来の誘起CDスペクトルや、UV・蛍光スペクトルの変化、NMRスペクトルにおけるピークシフトなどにより確認する。機能性高分子の合成および応用平成27年度は、実験系の組み方などについて検討を行った結果、当初計画時に想定していた実験スケールよりも小さなスケールでの実験が可能であることが明らかとなったため、試薬類等の購入に充てる物品費が当初計画よりも少額となった。一方で、旅費等の支出は当初見込みよりもやや大きくなったが、物品費低減の影響の方が大きかったため、次年度使用額が生じることとなった。平成28年度に行う変性実験については最適な条件が現時点では不明であるため、ポリペプチドをはじめとする試薬類を多く購入し、多様な条件について検討を行う必要がある。よって、平成27年度に発生した「次年度使用額」については物品費、特に試薬類の購入に充てる予定である。