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胸腺における「正の選択」の本質を問う

胸腺は、免疫システムの司令塔であるT細胞を分化させるとともに、産生するT細胞が自己に有用かつ寛容になるように選択する器官である。私たちはこれまでに、胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現される胸腺プロテアソームとその構成鎖β5tを同定するとともに、胸腺プロテアソーム依存性「正の選択」は、CD8陽性T細胞の有用レパトア選別のみならず、選別するT細胞の機能を至適化することを見出してきた。そこで本研究では、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、(1)感染・移植・がんに対する免疫応答と免疫記憶の動態相違を比較解析することで、正の選択による機能的至適化の意義を明らかにするとともに、(2)シグナル伝達分子の量と修飾状態を包括的に比較解析することで、正の選択による機能至適化の分子実体を明らかにすることを目的としている。この目的に沿って研究三年目の平成30年度には、まず、上皮細胞系特異的サイクリンD1強制発現マウスを利用することで、胸腺プロテアソームの存在下または不在下の胸腺皮質上皮細胞を対象にしたトランスクリプトームとプロテオームの統合的解析を実現した。その結果、胸腺プロテアソームは、胸腺皮質上皮細胞内でのプロテアソーム総量を高い特異性にて制御する一方で、ストレス応答やオートファジーを含む細胞内シグナルプロセスに包括的に関与していないことが明らかになった。胸腺プロテアソームがMHC会合ペプチドの産生を介してCD8陽性T細胞の「正の選択」を担っている可能性が支持された(投稿中)。また、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、プロテオーム解析やメタボローム解析を行うことで、シグナル伝達分子の量と修飾状態の解析を推進した。これらの解析を推進していくことで、免疫学の中核的重要課題「正の選択とは何か」の解明に寄与し、免疫制御に新技術を与えたい。平成30年度は、胸腺皮質上皮細胞を対象にしたトランスクリプトームとプロテオームの統合的解析を実現することができ、胸腺プロテアソームの存在意義について大きな理解前進がみられたばかりでなく、本研究の大目標である「正の選択とは何か」の解明に向けて大きな進展が得られた。(1)正の選択によるT細胞機能至適化の生体内意義の解析:トランスジェニックTCRが特異的に認識する抗原分子を発現するウイルス、細胞内寄生細菌、アロ移植組織、がん細胞、それぞれに対する免疫応答と免疫記憶の質とマグニチュードを比較解析することで、T細胞の機能を至適化する「正の選択」プロセスが免疫システムによる生体防御にどのように貢献するのか解析を進める。(2)正の選択によるT細胞機能至適化の分子実体の解析:同一TCRを発現しながら胸腺プロテアソーム依存性に機能至適化されたT細胞と胸腺プロテアソーム不在下で機能至適化されなかったT細胞を対象に、シグナル伝達分子の量と修飾状態について、CD5, CD8, CD69など既知のT細胞抗原受容体シグナル調節分子の発現量と細胞内局在の包括的解析を順次進める。また、質量分析計を用いて発現されているタンパク質の網羅的解析を進める。更に、T細胞内での代謝産物についても、包括的にメタボローム解析を進める。これらの実験を推進することで、胸腺プロテアソーム依存性「正の選択」によるT細胞機能至適化の分子実体解明に迫る。胸腺は、免疫システムの司令塔であるT細胞を分化させ、産生するT細胞が自己に有用で寛容になるよう選択する器官である。そこで本研究では、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、1.感染・移植・がんに対する免疫応答と免疫記憶の動態相違を比較解析することで、正の選択による機能的至適化の意義を明らかにし、2.シグナル伝達分子の量と修飾状態を包括的に比較解析することで、正の選択による機能至適化の分子実体を明らかにすることを目的としている。研究初年度の平成28年度には、Rag2欠損マウスに交配したOT-I-TCRトランスジェニックマウス由来のモノクローナルTCR発現CD8陽性T細胞を対象に、感染応答を模倣した免疫応答における正の選択による機能的至適化の意義の解析を開始し、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞はそれぞれ、抗原刺激の様態に応じて発現されるサイトカイン等の応答分子プロフィールが異なることを明らかにした(未発表)。また、種々のがん細胞に対するCD8陽性T細胞依存性の免疫応答計測法の確立に向けた実験を開始した。更に、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、プロテオーム解析等を行うことで、シグナル伝達分子の量と修飾状態の解析を開始した。

平成28年度は、本研究の初年度であったにもかかわらず、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞が、免疫応答において互いに異なるサイトカイン発現プロフィールを示すことを明らかにすることができ、胸腺プロテアソーム依存性のTCR直下シグナルの解明に向けて大きく前進がみられたばかりでなく、本研究の大目標である「正の選択とは何か」の解明に向けて拍車がかかった。胸腺は、免疫システムの司令塔であるT細胞を分化させ、産生するT細胞が自己に有用で寛容になるよう選択する器官である。私たちはこれまでに、胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現される胸腺プロテアソームとその構成鎖β5tを同定するとともに、胸腺プロテアソーム依存性「正の選択」は、CD8陽性T細胞の有用レパトア選別のみならず、選別するT細胞の機能を至適化することを見出してきた。そこで本研究では、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、(1)感染・移植・がんに対する免疫応答と免疫記憶の動態相違を比較解析することで、正の選択による機能的至適化の意義を明らかにし、(2)シグナル伝達分子の量と修飾状態を包括的に比較解析することで、正の選択による機能至適化の分子実体を明らかにすることを目的としている。研究二年目の平成29年度には、Rag2欠損マウスに交配したOT-I-TCRトランスジェニックマウス由来のモノクローナルTCR発現CD8陽性T細胞を対象に、感染応答を模倣した免疫応答における正の選択による機能的至適化の意義の解析を実施し、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞はそれぞれ、抗原刺激の様態に応じて発現されるサイトカイン等の応答分子プロフィールが異なることを明らかにした(未発表)。また、種々のがん細胞に対するCD8陽性T細胞依存性の免疫応答計測法を確立し、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞は、いくつかのがん細胞に対する生体抵抗性に差違をもたらすことを見出した(未発表)。更に、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、プロテオーム解析やメタボローム解析を行うことで、シグナル伝達分子の量と修飾状態の解析を推進した。これらの解析を推進していくことで、免疫学の中核的重要課題「正の選択とは何か」の解明に寄与し、免疫制御に新技術を与えたい。平成29年度は、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞は、いくつかのがん細胞に対する生体抵抗性に差違をもたらすことを明らかにすることができ、生体防御システム全体における胸腺プロテアソーム依存性の存在意義について大きな理解前進がみられたばかりでなく、本研究の大目標である「正の選択とは何か」の解明に向けて拍車がかかった。胸腺は、免疫システムの司令塔であるT細胞を分化させるとともに、産生するT細胞が自己に有用かつ寛容になるように選択する器官である。そこで本研究では、胸腺プロテアソーム依存性または不在下に選択されたT細胞を対象に、(1)感染・移植・がんに対する免疫応答と免疫記憶の動態相違を比較解析することで、正の選択による機能的至適化の意義を明らかにするとともに、(2)シグナル伝達分子の量と修飾状態を包括的に比較解析することで、正の選択による機能至適化の分子実体を明らかにすることを目的としている。この目的に沿って研究三年目の平成30年度には、まず、上皮細胞系特異的サイクリンD1
液中における分子ナノジェット発現機構の解明

昨年度は、これまで成しえなかった液中の分子ナノジェットの移動の様子を直接観察することに世界で初めて成功した。これによると、フィルム状の有機分子がパルスレーザー光を吸収し光励起され、励起状態の有機分子が液体(水など)にエネルギーを与え、衝撃波が発生する。それに引き続きキャビテーションバブルが発生し、それが大きく成長するが、やがてキャビテーションバブルが収縮に転じ、急速に伸縮していき、微小サイズになったバブルの中央部から集束された有機分子がジェットになって噴出し、それが液中に伝搬するということが明らかとなった。しかしながら、この分子ナノジェットがどうして拡散せずに伝搬するのかが大きな疑問であった。これを解明すれば分子ナノジェットをさらに絞り込んだりして制御することが可能となり、数十ナノメートルレベルへの分子固定が実現するであろう。そこで、本年度は、このメカニズムを解明するために以下の実験を行った。1.液体の粘度依存性の実験:水にグルコースを溶解させ粘度を変化させて(0, 0.84, 1.16, 1.50, 2.69m Pa・s)分子ナノジェットに与える影響を時間分解測定した。2.液体のイオン濃度依存性の実験:水に食塩を溶解させ水溶液中の食塩濃度を変化させ(0, 0.1, 1, 10, 25%)、上と同様に、これが分子ナノジェットに与える影響を時間分解測定した。その結果、驚くべきことに、分子ナノジェットの運動は液体の粘度にはほぼ影響を受けないものの、食塩水の濃度に大きく影響を受けることが分かった。これは、分子ナノジェットが水溶液中のイオン濃度に大きく影響されるものであり、クーロン相互作用により分散せずに物質移動することが解明された。イオン濃度を制御することで、分子ナノジェットの集束度の制御可能性が出てきた。我々は最近、パルスレーザーを利用することにより液中において有機分子のナノジェットを発現させることに成功した。しかしながら、その発現機構に関するメカニズムは未だ解明されていない。そこで、本研究では、その発現機構の解明をめざし、ポンププローブ法を用いた時間分解観察により、液中における分子ジェットを直接観察し、その発生メカニズムを解明することを目的とした。本年度、ポンププローブ法を利用した液中分子ナノジェット時間分解可視化システムを構築した。当該研究予算のほぼ全額を使用して購入したICCDカメラにより時間分解の可視化を可能とした。その結果、これまで成しえなかった液中の分子ジェットの移動の様子を直接観察することに世界で初めて成功した。液中での分子ジェットの発現機構は全く予想し得なかった驚くべきものであった。メカニズムは以下のとおりである。1.有機分子フィルムがパルスレーザー光を吸収し、光励起される。2.励起状態の有機分子が液体(水など)にエネルギーを与え、衝撃波が発生する。3.それに引き続きキャビテーションバブルが発生し、それが大きく成長する。4.やがてキャビテーションバブルが収縮に転じ、急速に伸縮していく。5.微小サイズになったバブルの中央部から集束された有機分子がジェットになって噴出し、それが液中に伝搬する。これが液中分子ジェットであることがわかった。このように奇妙なメカニズムによって液中分子ジェットの特異な現象(液中を拡散することなく移動することや、金属基板上に強固に分子を固定したり、分子で金属に穴をあけたりすること)が起こっていることが解明された。分子ジェットの速度も時間分解の撮影データから決定でき、マッハ3という非常に高速度のジェットであることがわかった。
大腸菌の走化性における膜外から膜内へのシグナル伝達機構の構造生物学的解明

研究では、大腸菌走化性分子複合体の結合様式を、各構成蛋白質が正しい全体構造を保持した状態にて、溶液NMR法による構造生物学的解析を行うことにより、膜外から膜内のエフェクター分子にシグナルが伝達される機構を解明することを目的とする。昨年度までに、区分安定同位体標識法を利用して、全長CheAとCheYの相互作用をNMR法により調べた結果、CheAの活性ドメインであるP1ドメインとCheYは、全長ではじめて両者の活性部位同士が直接結合すること、およびその結合が平衡状態にあることを明らかとした。今年度は、上述のP1ドメインとCheYの結合およびその平衡の生物学的な意義について調べるため、変異体を用いた解析を行った。CheY上のP1ドメインとの結合界面上に位置する残基に変異を導入し、CheAとの親和性をITC実験により調べたところ、I20A変異体は、P2ドメイン単独との解離定数は野生型と同等であるが、CheA全長との親和性が低下することが示された。さらに、CheAに対して等量添加して、NMRスペクトルを取得したところ、野生型CheYを添加した際に観測された化学シフト変化が抑制されていた。したがって、120A変異体は、P1ドメインに対する親和性が低下していることが示された。さらに、Phos-tag SDS-PAGE解析を行ったところ、I20A変異体ではリン酸化CheYの生成量が低下していた。以上の結果に基づき、P1ドメインとCheYの結合が平衡状態にあることによって、P1ドメインはCheYだけでなく、ATP結合ドメインであるP4ドメインとも反応し、リン酸をP4ドメインからCheYへと効率的に受け渡すことを可能にしてやると考えた。このような結合様式は、一般に弱い相互作用ネットワークを形成する、シグナル伝達1分子複合体の相互作用様式を解明する上でも重要な知見を与えると考えた。これまでに全長CheAとCheYの詳細な相互作用解析を行い、両者の細胞内における相互作用様式を明らかにすることに成功した。さらに、相互作用様式に変調を与えた変異体では活性が低下することを見出し、相互作用の生物学的意義についても解明することに成功した。これらの達成度から、研究の目的と照らし、当初の計画以上に進展していると判断する。刺激受容下での、細胞内のシグナル伝達機構を明らかとするために、今後は、膜蛋白質MCP存在下において、CheAとCheYの相互作用様式がどのように変化するかを調べる必要がある。本研究では、MCPを再構成高密度リボ蛋白質(rHDL)中に再構成することで、活性を保持した状態で、NMR解析を可能にする方法を既に確立している。今後は、MCP-rHDL存在下において、CheAとCheYの相互作用がどのように変化するかを、NMRを用いて詳細に調べることが期待される。本研究では、大腸菌走化性分子複合体MCP-CheA-CheWの結合様式を、各構成蛋白質が正しい全体構造を保持した状態にて、溶液NMR法による構造生物学的解析を行い、膜外から膜内のエフェクター分子にシグナルが伝達される機構を明らかにすることを目的とする。次に、TarとCheWの相互作用を調べるため、均一[^2H,^<15>N]標識CheWに対し、Tar-rHDLを添加した試料を調製し、蛋白質複合体の相互作用界面を正確に同定できるNMR手法である、transferred cross-saturation実験を行った。その結果、Ile33などを含む連続した界面を、CheW上のTar結合界面として同定した。本結果は、最近報告された、好熱菌のMCPアナログ細胞内領域と、CheW,CheAの一部ドメインの複合体結晶構造とも整合する結果であり、大腸菌MCPの全長を用いた複合体でも同様の複合体結合様式を有していることが示唆された。今後、リガンド存在下でも複合体の結合様式を調べることが可能であると期待される。さらに、本年度ヘルシンキ大学に滞在し、区分標識法により、CheAのドメイン選択的に安定同位体標識を施す方法を確立した。本成果は現在国際誌に投稿中である。また、P3-P5ドメイン選択的側鎖メチル基^<13>C標識法を確立した上で、^1H-^<13>C HMQC測定を行い、高感度でシグナルを検出することに成功した。今後、ATP結合部位周辺の構造変化を高感度で検出できると期待される。本研究では、大腸菌走化性分子複合体の結合様式を、各構成蛋白質が正しい全体構造を保持した状態にて、溶液NMR法による構造生物学的解析を行うことにより、膜外から膜内のエフェクター分子にシグナルが伝達される機構を解明することを目的とする。昨年度までに、区分安定同位体標識法により、全長CheAのPlドメイン選択的に安定同位体標識を施す試料調製法を確立した。今年度は、本標識法を用いて、全長CheAとCheYの相互作用をNMR法により調べた。交差飽和実験の結果、CheAの活性ドメインであるPlドメインとCheYは、切り出したドメイン単独では親和性が弱く、結合できないにもかかわらず、全長では両者の活性部位同士が直接結合することを明らかとした。さらに、全長CheAに対してCheYを滴定するNMR実験を行い、CheA-CheY複合体中で、P1ドメインはCheYと結合した状態と解離した状態の平衡状態にあることを明らかとした。この平衡が存在することによって、PlドメインはCheYだけでなく、ATP結合ドメインであるP4ドメインとも反応し、リン酸をP4ドメインからCheYへと連鎖的に受け渡すことが可能になると考えた。

このような結合様式は、一般に弱い相互作用ネットワークを形成する、シグナル伝達分子複合体の相互作用様式を解明する上でも重要な知見を与えると考えた。また、CheAの活性が膜蛋白質MCPによってどのように制御されるかを調べるためには、CheAのP3-P5ドメインの構造変化様式を調べる必要がある。そこで今年度は、CheAのP3-P5ドメインのIle,Ala,Met側鎖メチルシグナルの、変異体による帰属を試みた。現在までに29残基の帰属に成功した。帰属済みの残基には、ATP結合部位近傍の残基も含まれていた。今後これらの残基を用い、ATP結合部位周辺の構造変化を高感度で検出できると期待される。研究では、大腸菌走化性分子複合体の結合様式を、各構成蛋白質が正しい全体構造を保持した状態にて、溶液NMR法による構造生物学的解析を行うことにより、膜外から膜内のエフェクター分子にシグナルが伝達される機構を解明することを目的とする。昨年度までに、区分安定同位体標識法を利用して、全長CheAとCheYの相互作用をNMR法により調べた結果、CheAの活性ドメインであるP1ドメインとCheYは、全長ではじめて両者の活性部位同士が直接結合すること、およびその結合が平衡状態にあることを明らかとした。今年度は、上述のP1ドメインとCheYの結合およびその平衡の生物学的な意義について調べるため、変異体を用いた解析を行った。CheY上のP1ドメインとの結合界面上に位置する残基に変異を導入し、CheAとの親和性をITC実験により調べたところ、I20A変異体は、P2ドメイン単独との解離定数は野生型と同等であるが、CheA全長との親和性が低下することが示された。さらに、CheAに対して等量添加して、NMRスペクトルを取得したところ、野生型CheYを添加した際に観測された化学シフト変化が抑制されていた。したがって、120A変異体は、P1ドメインに対する親和性が低下していることが示された。さらに、Phos-tag SDS-PAGE解析を行ったところ、I20A変異体ではリン酸化CheYの生成量が低下していた。以上の結果に基づき、P1ドメインとCheYの結合が平衡状態にあることによって、P1ドメインはCheYだけでなく、ATP結合ドメインであるP4ドメインとも反応し、リン酸をP4ドメインからCheYへと効率的に受け渡すことを可能にしてやると考えた。このような結合様式は、一般に弱い相互作用ネットワークを形成する、シグナル伝達1分子複合体の相互作用様式を解明する上でも重要な知見を与えると考えた。膜蛋白質であるMCPを含む複合体での解析を行うにあたり、MCPを脂質二重膜中に再構成し、活性を保持した上で、溶液NMR解析を行うことに成功した。さらに、区分標識法によるCheAのドメイン選択的標識法も確立し、今後膜蛋白質複合体のNMR解析を行う基盤を整備することができた。これらの達成度から、平成23年度の研究計画と照らし、順調に進展していると判断する。全長CheAとCheYの相互作用解析を行い、細胞内における走化性分子複合体の結合様式を明らかにすることに成功した。
高収量・高バイオマスイネ開発のための強稈性遺伝子座の生理機能の解明

倒伏抵抗性は、収量およびバイオマス生産量の高い品種の備えるべき最も重要な農業形質である。倒伏抵抗性に関わる強稈性関連形質の量的形質遺伝子座(QTL)を特定するため、コシヒカリと倒伏抵抗性の大きい品種との戻し交雑自殖系統群(BILs)、染色体断片置換系統(CSSLs)を用いて解析を行った。その結果、強稈性を高める効果のある2つの主要なQTLを特定し、第6染色体のQTLをSTRONG CULM2(SCM2)、第3染色体のQTLをSTRONG CULM3(SCM3)と名付けた。SCM2の原因遺伝子を単離するため、ファインマッピングおよびポジショナルクローニングを行った結果、茎頂分裂組織の細胞増殖に関与し、収量増加に関わる頴花数の増加とともに稈を太くする多面発現性遺伝子APO1を単離した。SCM2はAPO1の機能獲得型の自然変異であり、過剰発現人為突然変異体のような穂数減少、穂の形態異常など収量に対する負の影響はなく、多収、倒伏抵抗性品種の改良に有用なアリルであることがわかった。本研究のようなQTL解析とポシショナルクローニングを結合したアプローチは、今後の倒伏抵抗性の高い多収品種を改良する上で有益なアプローチであることが明らかとなった。水稲の強稈性に関する遺伝子座の生理機能を明らかにするため、準同質遺伝子系統(NIL)を用いて、強稈に関わる要因を太稈性と強稈質性の2つに分け、太稈性では、太稈遺伝子座の染色体領域をもつNILを用いて太稈の形態的特性、形態形成特性を解析し、太稈遺伝子座の生理機能とその関連遺伝子を検討した。強稈質性では、強稈質と密接に関係する細胞壁成分、とくにリグニンに着目し、強稈質遺伝子座の染色体領域をもつNILを用いて、稈の形成過程のリグニンの蓄積、リグニン合成酵素活性および遺伝子発現量の解析を行い、強稈質遺伝子座の生理機構と関連遺伝子を検討した。太稈品種ハバタキの6染色体長腕の断片をもつNILを用いて、太稈に関係する稈の組織、細胞の大きさ、細胞数、成長点での細胞分裂をコシヒカリと比較した結果、この遺伝子座は稈壁の厚さではなく、主に稈の外径を大きくすることに関係し、細胞の大きさではなく細胞数が多く、細胞分裂が盛んに行われることにより稈が太くなることがわかった。強稈質に関係する曲げ応力の遺伝子座は第2染色体短腕に座乗し、中国117号型で曲げ応力が低下するので、この染色体領域を有するNILを用いて、稈の形態形成過程のリグニン蓄積過程におけるリグニン合成酵素の活性、遺伝子発現の変化をNILとコシヒカリの間で比較した結果、NILはコシヒカリに比べてリグニン含有率が小さく、リグニン合成酵素シナミルアルコールデヒドロゲザーゼ活性が小さいことがわかった。さらにこれらの太稈、強稈質に関わる遺伝子の生理機能を解明することにより、高収量・高バイオマス水稲品種の開発に不可欠な強稈性の効率的な付与が可能となる。水稲の強稈性に関する遺伝子座の原因遺伝子と生理機能を明らかにするため、ファインマッピングによって原因遺伝子の特定を行うとともに、太稈性遺伝子座の染色体領域をもつ準同質遺伝子系統NILを用いて太稈の形態的特性、形態形成過程を解析し、太稈遺伝子座の生理機能を解析した。強稈質性では、強稈質と密接に関係する皮層繊維組織とそこに蓄積するリグニンに着目し、染色体断片置換系統を用いて、稈の形成過程の皮層繊維組織の形態的特性、リグニンの蓄積およびリグニン合成酵素遺伝子の発現量の解析を行い、強稈質遺伝子座の生理機構と関連遺伝子を解析した。ファインマッピングにより、太稈品種ババタキの第6染色体長腕の遺伝子座の原因遺伝子は細胞分裂を高める遺伝子であることを特定した。

この遺伝子を含む染色体断片をもつNILを用いて、太稈に関係する桿の組織、細胞の大きさ、細胞数、成長点での細胞分裂をコシヒカリと比較した結果、細胞数が多く、細胞分裂が盛んに行われることにより稈が太くなることを確認した。強稈質に関係する曲げ応力の遺伝子座の染色体領域を有する染色体断片置換系統を用いて、稈の皮層繊維組織、リグニン量を比較した結果、皮層繊維組織の発達、リグニン量に関連する第10染色体の領域を推定した。この強稈質に関わる遺伝子とその生理機能を明らかにし、太稈性と強稈質に関わる遺伝子を解明することにより、高収量・高バイオマス水稲品種の開発に不可欠な強稈性の効率的な付与が可能となる。多収性・高バイオマス生産性を備えた食用、飼料用、バイオエネルギー用など多用途の水稲品種を開発するためには、第1に極強稈性の付与による倒伏抵抗性の飛躍的な向上が不可欠となる。強稈性は複数の遺伝子が関与する量的形質であり、量的形質遺伝子座(QTL)解析により、染色体上の遺伝子座を特定し、個々の遺伝子座の準同質遺伝子系統(NIL)を作出してその生理機能を解析することにより、太稈性や強稈質に関わる分子機構、遺伝子を特定することができる。本年度は、強稈水稲品種の強稈性に関する遺伝子座の原因遺伝子を単離するため、コシヒカリと強桿品種中国117号との第3染色体候補領域が分離する組換え固定系統を用いて、ファインマッピングとマップベースクローニングを行った。その結果,ファインマッピングによって第3染色体の原因遺伝子1つに絞りこみ、遺伝子を単離した。この原因遺伝子を含む染色体領域をもつNILを用いて、強稈性を評価した結果,このNILはコシヒカリより基部節間の稗が太くなることを確認した。さらに、成長点での稈の遣伝子の発現を解析した結果、コシヒカリに比べてNILは中国117号と同様に、この遺伝子の発現量が多いことがわかった。強稈質性では、強稈質と密接に関係する形質に着目し、強稈質遺伝子座の染色体領域をもつ置換系統を用いて、曲げ応力、稈の外周部にある皮層繊維組織の構造の解析を行った。その結果、第8,11染色体に曲げ応力を高める遺伝子座を推定し、第11染色体は曲げ応力とともに、皮層繊維組織を厚くする機能をもつ遺伝子座であることを明らかにした。稈外径を大きくする遺伝子座、皮層繊維組織を厚くする遺伝子座を集積することによって、著しく強稈性を高める品種を効率的に開発することが可能であることを示した。
ナノマシン加工技術による内皮細胞焦点接触力の計測デバイスの開発

細胞は細胞外基質と焦点接着斑と呼ばれるタンパク質の塊状部位によって接触を実現し形態を維持していると考えられている。従って力学的刺激あるいは化学的刺激に対する細胞の応答を知る上で焦点接触力を計測することは重要である。本研究では,シリコンの微細加工技術を用いて微小なセンサを開発し細胞の焦点接触力を測定することを目的とする。最終年度である今年度は,初年度に目指していたピエゾ抵抗型センサ方式を変更し,マイクロポストのたわみから接触力(牽引力)を推定する方式を検討した。まず,アレイ状マイクロポストのデザインを起こしレチクルを製作した。次にシリコンウェハにレチクルのデザインを露光転写した。ウェハをエッチングしレジストを剥離して型を製作した。続いて型にシリコーンポリマーを流し込みカバーガラスを載せた後,加温硬化させた。硬化後,型からカバーガラスごとシリコーンポリマーをはがし細胞外基質を完成させた。マイクロポストのサイズはおよそ直径3μm,高さ10μm,中心間距離8μmである。試料として,当初の予定であった内皮細胞よりも骨格構造により特徴のある平滑筋細胞を用いた。製作した基質上に平滑筋細胞を培養しマイクロポストのたわみを画像処理によって求めた。焦点接着斑の位置を確認し,かつアクチンフィラメントとの関係を把握するために,RFP-FATとGFP-アクチンのベクターを細胞に導入した。その結果,推定された平滑筋細胞の牽引力は11.8nNであり,最大値は81.3nNであった。また,それストレスファイバの分布から推測される力の合成ベクトルと牽引力のベクトルの方向は明らかに一致していた。このことからストレスファイバの発達は細胞の牽引力に支配的であることが考えられた。以上のように,本研究ではマイクロポストを有する細胞外基質デバイスを製作し,細胞底面に発生するミクロな力学環境を解明することに成功した。血管内皮細胞は細胞基質と面ではなく点で接触していることが知られている.これを焦点接触という.焦点接触は細胞骨格成分の一つであるアクチンフィラメントの末端部に多く見られ細胞底面に数多く点在していることから,内皮細胞は焦点接触により形態を維持していると考えられる.したがって,力学刺激に対する内皮細胞の応答機構を知るためには焦点接触力を計測することは非常に重要である.本研究では,シリコンの微細加工技術を用いて微小な力センサを開発し内皮細胞の焦点接触力を測定することを目的とする.研究初年度である今年度は,ピエゾ抵抗を有するカンチレバー型のマイクロセンサアレイの開発を目指した.シリコンにボロンをイオン注入することによりピエゾ抵抗を作り,ウェットエッチングによりセンサを自立させた.その後,電極および配線となるアルミニウムを蒸着した.センサ出力信号を取り出すためホイートストーン回路を形成した.センサの性能を評価するため細胞の接触力を模擬してマイクロピペットによる微小ひずみ負荷実験を行ったが,得られたセンサ出力信号にはノイズが大きく含まれており,現状では十分な力分解能が得られていない.ボロンイオンの注入加速度など条件設定が非常に困難であった.そこで現在はセンサ方式を変更することを検討している.シリコン表面をエッチングしてマイクロポストを製作し,このマイクロポストのたわみを計測することにより接触力を計測する方法である.この場合,配線が不要であるので小さなデザインを作製することができより微小領域の計測が可能である.細胞は細胞外基質と焦点接着斑と呼ばれるタンパク質の塊状部位によって接触を実現し形態を維持していると考えられている。
結晶中の分子間相互作用の制御による新規発光性有機ボロン錯体の創成

平成27年度に引き続き,本年度も[2.2]パラシクロファン部を含む有機ホウ素錯体の発光特性を検討した.特に本年度は,その励起状態の詳細を塩化メチレンとシクロヘキサンの混合溶媒中の蛍光スペクトル測定とその波形分解,および密度汎関数理論計算により精査した.その結果,[2.2]パラシクロファン誘導体は,シクロファン部とホウ素を含む六員環であるジオキサボリニン環との二面角の違いに由来する回転異性体の存在により,二種類の励起状態を有することが明らかとなった.この結果と,昨年度に報告したソルバトフルオロクロミズム特性について,ChemPhotoChem誌に掲載が決定された.また,前述の[2.2]パラシクロファン誘導体の励起状態での分子内電荷移動性に着目し,非対称な分子構造が発光特性に与える影響を検討した.具体的には,[2.2]パラシクロファン誘導体からベンゼン環を一つ取り除いたキシリル誘導体,および,その比較化合物であるo-およびm-トリル誘導体の光物理特性を調査した.その結果,メチル基を二つ有するキシリル誘導体のみが,溶媒極性の上昇に伴い,僅かながらもレッドシフトする発光を示した.すなわち,[2.2]パラシクロファン誘導体と同様に,分子内電荷移動型の励起状態が示唆された.密度汎関数理論計算より,キシリル誘導体の分子軌道分布は,LUMOがキシリル基を除いた分子全体に,HOMOがキシリル基にそれぞれ局在化していた.すなわち,キシリル基以外の分子骨格を電子アクセプター,キシリル基を電子ドナーとする分子内電荷移動型の励起状態が考えられる.これは,二つのメチル基の協同効果であると考えられる.以上の内容は,Photochem. Photobiol. Sci.誌に掲載が決定された.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,二分子のジベンゾイルメタナートボロンジフロリド(1BF2)を[2.2]パラシクロファン骨格で連結した2BF2を新規に合成し,その発光特性および結晶構造を明らかにすることで,分子間相互作用が1BF2の発光特性に及ぼす影響を解明することである.本研究は,1BF2の発光特性を支配する因子を解明するだけでなく,1BF2を基とする有機発光材料の分子設計に対しても,重要な知見を与えることが期待されることから,その意義は大きい.平成26年度は,研究実施計画に従い2BF2の合成を試みたが中間体の合成までしか達成できなかった.しかし,その比較化合物である[2.2]パラシクロファンを1BF2の片側のみに導入した3BF2を新規に合成し,シクロファンの1BF2への導入による発光特性への影響を調べることができた.その結果,溶液中では,溶媒極性により発光特性のみが大きく変化するソルバトフルオロクロミズムを示すことがわかった.密度汎関数理論計算より,これは,3BF2の励起状態が,シクロファン部を電子ドナー,それ以外を電子アクセプターとする分子内電荷移動型であるためと考察した.一方,結晶状態の3BF2は溶液中と類似した発光を示すことがわかった.これは,単結晶X線構造解析の結果より,シクロファン部のかさ高さが分子間相互作用を抑制したためと考えられる.これら3BF2の特徴的な発光特性は,以前より検討してきたアルキル基を1BF2のベンゼン環の4位に置換した誘導体では見られなかったものであり,シクロファン導入の特徴的効果であるといえる.上記の成果は,“[2.2]パラシクロファン骨格を有するジアロイルメタナートホウ素二フッ化物の結晶構造と発光特性"というタイトルでの第41回有機典型元素化学討論会での口頭発表をはじめ,ポスター発表と合わせて合計7件の学会発表を行なった.本研究の目的は,二分子の1BF2を[2.2]パラシクロファン骨格により連結した2BF2の光学特性および結晶構造を明らかにすることで,分子間相互作用が1BF2の発光特性に及ぼす影響を解明することである.本研究は,1BF2の発光特性を支配する因子の解明だけでなく,1BF2を基とする有機発光材料の分子設計に対しても,重要な知見を与えることが期待されることから,その意義は大きい.平成27年度は,2BF2の重要な比較化合物であるシクロファン骨格を1BF2の片側のみに置換した3BF2の発光特性の詳細を検討した.平成26年度に混合溶媒中での結果を報告した,3BF2のソルバトフルオロクロミズム特性を,種々の単一溶媒中で調査した.その結果,溶媒極性の上昇に伴い,蛍光極大波長(λFL)は501 nmから576 nmへと大きく長波長シフトした.さらに,Lippert-Mataga plotにより基底状態と励起状態の双極子モーメントの大きさの差を求めたところ,18.5 Dと比較的大きい値を示した.また,c-C6H12中でのみ,485と501 nmの2つのλFLが観測された.これらの発光種を明らかにするため,c-C6H12中の蛍光スペクトルの波形分解を行ったところ,476 nmと515 nmに極大を有する2つの波形で構成されていることが示唆された.さらに,検出波長を485 nmと501 nmとして蛍光寿命の測定を行ったところ,どちらも10 ns程度とほぼ同じであることがわかった.以上より,3BF2の発光は二つの電荷移動型の励起状態からの発光であることが示唆された.これらの成果は,国内学会4件,国際学会2件の学会発表で報告した.

その内,2015年光化学討論会では英語での口頭発表賞を,第9回有機π電子系シンポジウムではポスター発表賞をそれぞれ受賞した.申請書の研究実施計画では,平成27年度の予定は2BF2の合成および溶液中の発光特性評価であり,実際に合成を試みたが中間体の合成までしか達成できなかった.しかし,その重要な比較化合物である3BF2のソルバトフルオロクロミズム特性の詳細を調査した.その結果,3BF2は基底状態と励起状態の双極子モーメントの大きさの差が,18.5 Dと比較的大きい値を示すことが明らかとなり,さらに,その発光は二つの電荷移動型の励起状態からであることが示唆された.また,3BF2の合成について,昨年度に提案したルートでは困難であることがわかったため,新たに提案したルートでの合成に既に取り組んでいる.以上の理由より,研究実施計画通りではないが,本研究を遂行する上で重要な結果が得られたことから,評価をおおむね順調に進展しているとした.平成27年度に引き続き,本年度も[2.2]パラシクロファン部を含む有機ホウ素錯体の発光特性を検討した.特に本年度は,その励起状態の詳細を塩化メチレンとシクロヘキサンの混合溶媒中の蛍光スペクトル測定とその波形分解,および密度汎関数理論計算により精査した.その結果,[2.2]パラシクロファン誘導体は,シクロファン部とホウ素を含む六員環であるジオキサボリニン環との二面角の違いに由来する回転異性体の存在により,二種類の励起状態を有することが明らかとなった.この結果と,昨年度に報告したソルバトフルオロクロミズム特性について,ChemPhotoChem誌に掲載が決定された.また,前述の[2.2]パラシクロファン誘導体の励起状態での分子内電荷移動性に着目し,非対称な分子構造が発光特性に与える影響を検討した.具体的には,[2.2]パラシクロファン誘導体からベンゼン環を一つ取り除いたキシリル誘導体,および,その比較化合物であるo-およびm-トリル誘導体の光物理特性を調査した.その結果,メチル基を二つ有するキシリル誘導体のみが,溶媒極性の上昇に伴い,僅かながらもレッドシフトする発光を示した.すなわち,[2.2]パラシクロファン誘導体と同様に,分子内電荷移動型の励起状態が示唆された.密度汎関数理論計算より,キシリル誘導体の分子軌道分布は,LUMOがキシリル基を除いた分子全体に,HOMOがキシリル基にそれぞれ局在化していた.すなわち,キシリル基以外の分子骨格を電子アクセプター,キシリル基を電子ドナーとする分子内電荷移動型の励起状態が考えられる.これは,二つのメチル基の協同効果であると考えられる.以上の内容は,Photochem. Photobiol. Sci.誌に掲載が決定された.申請書の研究実施計画では,平成26年度の予定は2BF2の合成および溶液中の発光特性評価であり,実際に合成を試みたが中間体の合成までしか達成できなかった.しかし,その重要な比較化合物である3BF2を新規に合成し,これを用いて[2.2]パラシクロファンの1BF2への導入による発光特性への影響を明らかにすることができた.
感染ステージに応じて宿主生理機能を攪乱するA群レンサ球菌の新規分泌タンパクの同定

A群レンサ球菌は病原性に寄与する分泌タンパク質を数多く有するが、感染ステージ(細胞への付着/侵入/細胞内生存)ごとのそれらの機能は不明な点が多い。本研究では、宿主細胞において本菌の病原性に関与する新規分泌タンパク質候補として42 kDa proteinを同定した。42 kDa proteinは本菌の細胞付着・侵入能を制御するだけでなく、オートファジーの誘導や細胞障害活性の制御することが示唆されたことから、異なる感染ステージごとの本菌の感染動態を明らかにする上で重要な手がかりとなると考えられる。当該年度では、A群レンサ球菌(GAS)の感染動態を制御する新規分泌タンパク質の選定を試みた。分泌タンパク質の多くはシグナル配列を有していることから、GASの全遺伝子配列からシグナル配列を有するタンパク質を検索した。このうち、局在が細胞外であることが予測された6つのタンパク質をコードする遺伝子の欠損株を作製した。液体培地での欠損株の増殖速度は親株と変わらなかったが、ほとんどの欠損株において対数増殖期の生菌数が親株より少なかった。以上より、選定したタンパク質の多くがGASの培地中での生存・増殖において重要であることが示唆された。次に宿主細胞において遺伝子欠損株の付着・侵入・生存率を測定した。6つの遺伝子欠損株のうち、5つの遺伝子欠損株の付着率、侵入率、細胞内生存率は親株であるJRS4株のものと同等であったが、42 kDa protein欠損株の細胞付着率、細胞侵入率および細胞内生存率は親株のものと比べて増加した。以上より、42 kDa proteinは本菌の細胞付着、侵入活性、細胞内での増殖活性を抑制していることが示唆された。細胞質内のGASは、オートファゴソームよって取り囲まれたのち、オートファゴソームとリソソームの融合によって効率的に分解される。42 kDa protein欠損株に対するオートファジーの誘導能を評価したところ、オートファゴソーム形成率は、JRS4のものより減少した。また、形成されるオートファゴソームは、JRS4株のものと比較して巨大であった。一方、オートファゴソームとリソソームの共局在率はJRS4株感染時と同程度であった。以上より、42 kDa proteinは、オートファゴソームとリソソームの融合過程には関与せず、菌への効率的なオートファゴソームのリクルートに関連していること、オートファゴソームの成熟に何らかの影響を与えていることが考えられた。前年度までに、A群レンサ球菌(Group A streptococcus:GAS)の産生する新規分泌タンパク質として42 kDa proteinを見出した。本タンパク質の役割を明らかにするため、欠損株を作製して種々の解析を行ったところ、1)欠損株の宿主細胞への細胞付着率、細胞侵入率および細胞内生存率は親株であるJRS4株のものと比べて顕著に増加する、2)欠損株に対するオートファゴソーム形成率は、JRS4のものより顕著に減少する、3)欠損株に対して形成されるオートファゴソームは、JRS4株のものと比較して巨大なものが観察される、4)欠損株感染時のオートファゴソームとリソソームの共局在率はJRS4株感染時と同程度である、という結果を得た。平成27年度においては、欠損株に対して42 kDa proteinを再導入したノックイン株作製し、上記と同様の解析を行った。ノックイン株の細胞付着・侵入率及び細胞内生存率、ならびにオートファジー誘導能は全て親株であるJRS4株と同程度であったことから、欠損株で得られた解析結果が本タンパク質の機能によるものであることが裏付けられた。次に、42 kDa proteinが宿主細胞内に移行するかを確認するため、百日咳菌由来のCyaAと本タンパク質の融合タンパク質を発現株する菌株を作製した。CyaAは真核細胞のカルモデュリン依存的にcAMPを産生することから、本タンパク質とCyaAの融合タンパク質が宿主細胞へ移行した場合、宿主細胞内において、42 kDa protein依存的にcAMPが産生される。融合タンパク質発現株の感染時のcAMPの産生量はベクターのみを発現した株に比べ顕著に高かったことから、本タンパク質が宿主細胞内に移行していることが示唆された。本研究の目的である「菌の感染動態を制御する新規菌体分泌タンパク質を同定する」ことについては、菌の付着・侵入・細胞内生存に関連し、かつ細胞内でのオートファジーの制御に関わることが予測される42 kDa proteinを見出すことができたことから、半分は達成できたと思われる。現在までに、本タンパク質の機能を明らかにした報告は世の中に存在していないことから、ここまでで観察された本タンパク質を介した種々の事象について、その機構・機序を明らかにすることができれば、その成果は大きなインパクトを持つと考えられる。そのために、本タンパク質の機能解析を詳細に行う必要があり、本タンパク質の分泌性の確認を行うとともに、オートファジーの誘導制御機構の解析を進めていく予定である。

医歯薬学(1)42 kDa proteinが分泌タンパク質であるかの確認を行う。このため、マウスへの免疫によって本タンパク質に対する特異抗体の作製を試みる。GSTタグあるいはHisタグを付加した42 kDa proteinの精製はすでに終了していることから、これらの組換えタンパク質をマウスに免疫し、抗体を取得する予定である。また、42 kDa proteinが宿主細胞内に移行しているかを確認するため、百日咳菌由来のCyaAと本タンパク質の融合タンパク質を発現させた株を作製する。CyaAは真核細胞のカルモデュリン依存的にcAMPを産生することから、42 kDa proteinとCyaAの融合たん白質が宿主細胞へ移行した場合、宿主細胞内において、42 kDa protein依存的にcAMPが産生される。感染細胞内のcAMP濃度を測定するためのELISAアッセイを実施する。(2)42 kDa proteinによるオートファジーの誘導制御機構についての検討を行う。42 kDa protein欠損株感染時のオートファゴソーム形成は阻害されているが、この現象が、欠損株がエンドソーム内に留まっているために起こっているのか、あるいは細胞質に脱出しているにもかかわらず起こっているのかを確認する。このため、エンドソーム膜の損傷時にリクルートされることで知られるGalectin3, 8の発現を観察し、エンドソームから細胞質への菌の移行を観察する。また、オートファゴソームの拡大化についてはRab7等のオートファゴソームの伸長にかかわる分子とリソソームの活性化を観察することで評価する。次年度では抗体作製を予定しており、マウスへの組換タンパク質の免疫を予定している。このため、マウスの購入費および飼育費が必要である。マウスから得られた血清からの抗体精製にも少なくない経費が必要である。また、cAMPの検出に用いるELISAアッセイキットは96ウェルプレート1枚でおよそ6-8万円程度かかり、今年度の予算を次年度へ繰り越すことなくしては、研究費の捻出が困難であると考えた。マウスの購入および飼育費、ならびに抗体精製費。cAMP検出用のELISAアッセイキットの購入費。これに加え、今年度と同様、細胞培養に用いる諸経費(培地、血清、プラスッチック類)、一般試薬購入費(主に抗体)、旅費、英文校正・投稿費を計上する予定である。
デキストラン複合磁性体を用いる超選択的温熱療法の研究

癌に対する温熱療法は第5の治療法として臨床の場で用いられているが,選択的な加温は困難なのが現状である.特に深部臓器ではその加温域を特定する事が難しく、正常組織に対する影響も無視できない.我々は以前よりデキストラン複合磁性体を用いた誘導加温法による選択的温熱療法(以下,HTと略)を研究,報告してきた.今回の研究では臨床応用を目指し,加温装置の改良および以下の研究を行った.1)現有の加温装置では臨床の段階では出力が不足し,また有効な加温のためには温度の自動制御が必須なため,装置を改良しパワーアップとコンピューターによる自動温度制御システムを完成させた.2)臨床例によく似た様々な深部臓器腫瘍モデル(肝,腸管,膀胱)を,ニュージーランド白色家兎とVX-2腫瘍を用いて考案,作成,HTを行い,抗腫瘍効果を検討した.加温方法は新たに腫瘍内投与,バルーン法および腔内投与法を考案した.1回のみのHTではあったが,肝および腸管腫瘍ではHTによる腫瘍の増殖抑制傾向が認められた.腸管腫瘍モデルでは治療効果は認められなかった.3)臨床の場では抗癌剤との併用による治療が行われるため,抗癌剤(MMC)との併用によるHTの抗腫瘍効果を,BALB/cマウスとMeth-A腫瘍を用いて検討した.抗癌剤併用群ではHT単独群と比較して担癌マウスの生存日数の延長が認められた.4)様々な部位の固形腫瘍の加温のために,デキストラン複合磁性体を封入したチューブによる加温法を考案し,その温度特性および加温域の検討を行った.封入体の配置,本数を変更する事により約4cm^2の領域を加温する事ができた.デキストラン複合磁性体を用いた誘導加温法は様々な選択的加温法が考えられ,今後の発展が期待された.臨床応用に向けてさらなる加温法の改良,併用療法の効果についての検討が望まれる.癌に対する温熱療法は第5の治療法として臨床の場で用いられているが,選択的な加温は困難なのが現状である.特に深部臓器ではその加温域を特定する事が難しく、正常組織に対する影響も無視できない.我々は以前よりデキストラン複合磁性体を用いた誘導加温法による選択的温熱療法(以下,HTと略)を研究,報告してきた.今回の研究では臨床応用を目指し,加温装置の改良および以下の研究を行った.1)現有の加温装置では臨床の段階では出力が不足し,また有効な加温のためには温度の自動制御が必須なため,装置を改良しパワーアップとコンピューターによる自動温度制御システムを完成させた.2)臨床例によく似た様々な深部臓器腫瘍モデル(肝,腸管,膀胱)を,ニュージーランド白色家兎とVX-2腫瘍を用いて考案,作成,HTを行い,抗腫瘍効果を検討した.加温方法は新たに腫瘍内投与,バルーン法および腔内投与法を考案した.1回のみのHTではあったが,肝および腸管腫瘍ではHTによる腫瘍の増殖抑制傾向が認められた.腸管腫瘍モデルでは治療効果は認められなかった.3)臨床の場では抗癌剤との併用による治療が行われるため,抗癌剤(MMC)との併用によるHTの抗腫瘍効果を,BALB/cマウスとMeth-A腫瘍を用いて検討した.抗癌剤併用群ではHT単独群と比較して担癌マウスの生存日数の延長が認められた.4)様々な部位の固形腫瘍の加温のために,デキストラン複合磁性体を封入したチューブによる加温法を考案し,その温度特性および加温域の検討を行った.封入体の配置,本数を変更する事により約4cm^2の領域を加温する事ができた.デキストラン複合磁性体を用いた誘導加温法は様々な選択的加温法が考えられ,今後の発展が期待された.臨床応用に向けてさらなる加温法の改良,併用療法の効果についての検討が望まれる.癌細胞に対する温熱療法は第5の癌治療として注目をあびてはいるが、現在の方法は外部より熱を印加する受け身的消極的温熱治療である。新しい積極的な温熱療法として、デキストラン複合磁性体を開発し、これを用いたIntracellular Hyperthermiaを堤唱し研究報告してきた。デキストラン複合磁性体は生体親和性多糖デキストランと超微粒子酸化鉄との複合体である。今回の目的はデキストラン複合磁性体を用いて、Intracellular Hyperthemiaとしての動物実験において示された顕著な効果を基に、実際に臨床応用への可能性をはかることであった。臨床における誘導温熱療法では高出力装置と細かい温度設定が必要であり、装置のバ-ジョン・アップと温度のチェック・記録・制御が重要となり、その統合型コントロ-ルのシステム化のためコンピュ-タを用いたプログラミングが必須の条件である。誘導加温装置は、現有の12kwのものを改良し、20kwまでのパワ-アップを試みたが、目的の出力増強を得ることはできず、補助トランス、固定ステ-ジのオ-ト・コントロ-ル化により、相当のパワ-アップを成し得た。デキストラン複合磁性体とモノクロ-ナル抗体(CEA、CA19ー9及び癌細胞に対する)や蛋白体(TNFなど)、抗癌剤(アドリアマイシン、マイトマイシン、ペプレオマイシンなど)との結合体については、磁性体と薬剤との結合は認められるものの結合した薬剤の活性の低下などの問題点を有し、活性を有したままでの結合法等についてさらなる検討が必要とされた。

管腔臓器腫瘍モデルの作製は、家兎VXー2腫瘍を用いて腫管、膀胱において可能となり、これらを加温するために、バル-ンを用いた新しい加温法を考案し、実験を行ったところ各腫瘍モデルで良好に加温され、新しい加温方法としての期待が持たれた。癌細胞に対する温熱療法は第5の癌治療として注目をあびてはいるが,現在の方法は外部より熱を加える受身的・消極的温熱療法である。新しい積極的な温熱療法として,デキストラン複合磁性体を開発し,これを用いた細胞内加温を提唱し報告してきた。デキストラン複合磁性体は,生体親和性多糖デキストランと磁性酸化鉄との超微粒子複合体である。今回の目的はデキストラン複合磁性体を用いて,細胞内加温法において示された顕著な効果を基に,実際の臨床応用への可能性をはかることであった。前年度は,臨床における誘導温熱療法では高出力装置と細かい温度設定が必要であるため,加温装置の改良と統合型コントロールのためのコンピューター・プログラミングを行った。家兎VX-2腫瘍を用いて腸管,膀胱,肝腫瘍モデルを考案し、実際に加温を行い良好に加温された。またデキストラン複合磁性体と抗癌剤の結合については薬剤の活性の低下の問題点を残していた。今年度の研究では,臨床応用に先立ち,以下の実験を行った。1.ニュージーランド白色家兎VX-2腫瘍を用して腸管,膀胱,肝腫瘍モデルを作製し,これに対しデキストラン複合磁性体を用いたバルーン法,腔内注入法,直接注入法により実際に腫瘍の治療を行い,その治療効果について検討を行った。その結果,膀胱,肝腫瘍モデルの加温群において,腫瘍の消失・縮小は認めなかったものの腫瘍の増大抑制効果が認められた。2.デキストラン複合磁性体と抗癌剤の結合については薬剤の活性の低下の問題点を有しているため,BALB/CマウスのMeth-A腫瘍細胞を用いて,デキストラン複合磁性体による温熱効果と抗癌剤の併用による治療効果を検討した。その結果,温熱・抗癌体併用群において温熱単独群,無治療群と比較してBALB/Cマウスの生存期間の延長を認め,併用効果の有用性が認められた。これらの結果については,6th International Congress on Hyperthermic Oncologyおよび第9回日本ハイパーサーミア学会において発表した。癌細胞に対する温熱療法の現在の方法は,外部より熱を加える受身的・消極的温熱療法である.新しい積極的な温熱療法として,デキストラン複合磁性体を開発し,これを用いた細胞内加温を提唱し報告してきた.デキストラン複合磁性体は,生体親和性多糖デキストランと磁性酸化鉄との超微粒子複合体である.今回の目的はデキストラン複合磁性体を用いて,細胞内加温法において示された顕著な効果を基に,実際の臨床応用への可能性をはかることであった.前年度までに,臨床における誘導温熱療法では高出力装置と細かい温度設定が必要であるため,加温装置の改良と統合型コントロールのためのコンピューター・プログラミングを行った.家兎VX-2腫瘍を用いて腸管,膀胱,肝腫瘍モデルを考案し,実際に加温を行い良好に加温された.抗癌剤の併用実験において併用効果の有用性が認められた.今年度の研究では,臨床応用に先立ち,以下の実験を行った.1)前年度に引続き,臓器モデル腫瘍の治療を行い,その治療効果について検討を行った.その結果,膀胱,肝腫瘍モデルの加温群において,腫瘍の消失・縮小は認めなかったものの腫瘍の増大抑制効果が認められた.腸管腫瘍では抑制効果は認められなかった.
有用微生物における遺伝解析系の確立

本研究は、工業的に重要な微生物を対象として、自然遺伝子交換、組変えDNAなどによる解析系を開発改良すると共に、それらの微生物における遺伝子発現制御の分子機構を解明するため、下記のような広範囲な微生物を対象として遺伝子交換による解析系を確立し、さらに、すでにこれが確立した微生物属では、遺伝子発現の制御機構を解析することを目的として昨年度発足した。今年度の成果のうち主要なもののみを下記に列記する。深沢は、サッカロミセス属酵母におけるmRNAの3'端が正しい位置で終結するために必要な第一次転写産物上の塩基配列をGAL7遺伝子を用いて決定した。東江は、ジゴサッカロミセス属酵母から分離されたプラスミドの1種における安定保持に関与するプラスミド上の配列を明かにした。小林は、枯草菌の胞子形成中期に関与するspoIVC遺伝子に属するシストロンcisAがDNAの部位特異的組変えに関与する酵素の1種であることを類推し、これが胞子形成過程で起こる染色体DNAの再編成を引こ起こし、さらに新たな遺伝子発現に到ることを示唆した。山崎は、枯草菌の遺伝子増幅用ベクターを改良し、これを用いてアルカリ性エステラーゼ遺伝子aleを増幅したが、産物を増量することができなかった。その原因が、ale上流に見いだされた新たなORFの欠落によることが判った。高橋は、ストレプトマイセス属放線菌においては、大腸菌とは異なり主要シグマ因子が3ー4種類存在することを明かにした。小河原は、ストレプトマイセス属放線菌のβーラクタメース遺伝子の上流領域の配列を解析し、比較的近傍(-3Kb以内)および遠方(-12Kb)に発現を上昇させる配列の存在することを見いだした。中沢は、シュウドモナス属菌のrecA遺伝子をクローン化することに成功した。