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反芻家畜乳におけるオリゴ糖ヌクレオチドの探索と腸管機能調整因子としての意義の解明

2018年度はウシ、ヤギの初乳を材料として、オリゴ糖ヌクレオチドの大量調製方法の開発と分離された成分の構造解析を行った。それらより分離された糖質画分をDEAE Sephadex A-50樹脂とギ酸アンモニウム緩衝液による濃度勾配溶出イオン交換クロマトグラフィーによって分画し、脱塩後、順相系HPLCによって各成分の分離・精製を行った。使用したイオン交換クロマトグラフィー条件で、乳に含まれる糖ヌクレオチドと糖-1-リン酸をミルクオリゴ糖と選択的に分離することができた。分離された成分をNMRによる構造解析に供した結果、ウシ初乳からはGlcNAc-1-リン酸, GalNAc-1-リン酸, UDP-Gal, UDP-Glcが、ヤギ初乳からはGlcNAc-1-リン酸, GalNAc-1-リン酸, UDP-Gal, UDP-Glc, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAcが発見されたが、いずれからもオリゴ糖ヌクレオチドは分離されなかった。上皮細胞は、生育培地に上皮成長因子(EGF)の添加しない場合には分化が遅くなることが知られている。本実験では集密の細胞密度に達したヒト未成熟上皮HIEC細胞に、糖ヌクレオチド(UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc)及び糖-1-リン酸(GlcNAc-1-P, Gal-1-P)を0.5 μg/ml 100 μg/mlの濃度で添加し、37°CCO2条件下で培養した。細胞の増殖と分化を顕微鏡観察によって調査した結果、使用した糖ヌクレオチドまた糖-1-リン酸の添加によって細胞の分化促進が観察され、EGFに近い働きを持つことが明らかになった。これらの成分によるこのような働きが発見されたのははじめてであり、初乳に含まれる糖ヌクレオチドや糖-1-リン酸に新生児の腸の成長を成熟するような働きのあることが示唆された。糖ヌクレオチドは通常細胞内に単糖ヌクレオチドとして存在し、ゴルジ体において糖転移酵素のドナーとして糖鎖合成材料として使用される。一方で、若干の哺乳動物種の乳また初乳には機能の解明されていないオリゴ糖ヌクレオチドが発見されている。研究課題の中では最終的にはオリゴ糖ヌクレオチドの機能の解明を目的としながら、まずオリゴ糖ヌクレオチドが広範囲の種の乳に含まれるかの探索を試みた。平成28年度には反芻家畜をターゲットとして、オリゴ糖ヌクレオチドの探索のため、ヒツジ初乳とヤギ初乳、レイヨウのアダックス種の初乳、ならびにラクダ乳の分析を行った。ヒツジ初乳からはオリゴ糖ヌクレオチドとして2種のシアル酸を含む分子種(Neu5Gc(α2-6)Gal(β1-4)GlcNAcα1-UDPならびにNeu5Gc(α2-3)Gal(β1-4)GlcNAcα1-UDP)が、アダックスの初乳からはNeu5Gc(α2-6)Gal(β1-4)GlcNAcα1-UDPが分離され、構造決定された。これまでにオリゴ糖ヌクレオチドは人乳、トナカイ乳、ブタ初乳から発見されているが、シアル酸を含む分子種の発見ははじめてである。ヤギの初乳からはGal(β1-4)GlcNAcα1-UDPが発見されたものの、その量は極めて少なく、シアル酸を含む分子種は発見されなかった。ラクダ乳からはいずれのオリゴ糖ヌクレオチドも発見できなかった。この結果も基づき、オリゴ糖ヌクレオチドは哺乳動物のあらゆる種の乳または初乳に普遍的に存在するのではなくて一部の種に限られること、またオリゴ糖ヌクレオチドの分子種も哺乳類の種によって異なることが明らかとなった。研究計画にある反芻動物種の乳また初乳試料採集を行い、複数の動物種(ヒツジ、アダックス)の初乳の中に新規のシアル酸を含むオリゴ糖ヌクレオチドを発見した。これはオリゴ糖ヌクレオチドが生体成分として種にまたがって存在することを示しており、機能性の存在を予想される点において極めて価値の高い学術成果である。また新規化合物を記載した点において、糖質科学の観点からも重要な成果である。一方で、あらゆる反芻家畜の種の乳にではなく特定の種の乳また初乳に含まれることも示され、種固有の生理的な特徴と進化の観点からも興味がもたれる。新規な成果を生みだしたことから、平成28年度もおおむね順調に進展したということができる。平成28年度にヒツジ初乳から2種のオリゴ糖ヌクレオチド(Neu5Gc(α2-3)Gal(Β1-4)GlcNAcα1-UDPならびにNeu5Gc(α2-6)Gal(Β1-4)GlcNAcα1-UDP)、およびアダックス(レイヨウの一種)初乳から1種(Neu5Gc(α2-6)Gal(Β1-4)GlcNAcα1-UDP)を発見したことに引き続き、オリゴ糖ヌクレイトドが哺乳動物の乳/初乳に普遍的に含まれるかどうかの探索のため、いずれも反芻偶蹄目に属するウシ、水牛、シタツンガ(カモシカの一種)、シカ、キリンの乳/初乳からオリゴ糖ヌクレオチドの探索を行った。

ウシやシカの乳/初乳に単糖と結合した糖ヌクレオチドは発見されたものの、いずれにおいてもオリゴ糖ヌクレオチドは発見できなかった。この結果は、オリゴ糖ヌクレオチドがあらゆる哺乳動物種の乳に普遍的に含まれるのではないことを示唆しているが、一方で単糖と結合した糖ヌクレオチドは広範囲な動物種の乳/初乳に含まれることを示唆した。糖ヌクレオチドは通常細胞内のゴルジ体において、グリコシルトランスフェラーゼに対する糖供与体として糖鎖の合成材料として存在するが、血液、唾液、精漿液、卵胞液、乳などの体液において糖ヌクレオチドが含まれるのは乳のみであり、乳に含まれる糖ヌクレオチドには乳仔の腸管成熟や免疫発達に対する役割のあることが推測された。本研究はオリゴ糖ヌクレオチドが腸管機能調整に果たす役割の解明をめざしているが、今後はオリゴ糖ヌクレオチドに限らず、乳に含まれる糖ヌクレオチドが乳仔の腸管機能成熟に果たす役割の解明を試みる。一方、平成29年度に行った研究において、上の種の乳/初乳に含まれるミルクオリゴ糖に種間差のあることが発見され、進化的な見地から興味深い情報がえられた。それは学術論文としての執筆を進めている。2種の反芻偶蹄目種の初乳に新規物質としてのオリゴ糖ヌクレオチドを発見したが、それは反芻家畜の乳において普遍的に含まれることは証明できなかった。その一方、体液の中で唯一乳/初乳において単糖と結合した糖ヌクレオチドが含まれることを明らかにし、細胞内での糖鎖合成材料としての役割とは異なる乳仔の成長に関わる役割のあることを示唆している。この結果に基づいて、相対的に未成熟な腸管上皮細胞の培養系に糖ヌクレオチドを添加して培養し、細胞透過性の調査やRNASeqによる免疫系に関わる遺伝子発現調節への影響を調査する研究の準備を進めている。2018年度はウシ、ヤギの初乳を材料として、オリゴ糖ヌクレオチドの大量調製方法の開発と分離された成分の構造解析を行った。それらより分離された糖質画分をDEAE Sephadex A-50樹脂とギ酸アンモニウム緩衝液による濃度勾配溶出イオン交換クロマトグラフィーによって分画し、脱塩後、順相系HPLCによって各成分の分離・精製を行った。使用したイオン交換クロマトグラフィー条件で、乳に含まれる糖ヌクレオチドと糖-1-リン酸をミルクオリゴ糖と選択的に分離することができた。分離された成分をNMRによる構造解析に供した結果、ウシ初乳からはGlcNAc-1-リン酸, GalNAc-1-リン酸, UDP-Gal, UDP-Glcが、ヤギ初乳からはGlcNAc-1-リン酸, GalNAc-1-リン酸, UDP-Gal, UDP-Glc, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAcが発見されたが、いずれからもオリゴ糖ヌクレオチドは分離されなかった。上皮細胞は、生育培地に上皮成長因子(EGF)の添加しない場合には分化が遅くなることが知られている。本実験では集密の細胞密度に達したヒト未成熟上皮HIEC細胞に、糖ヌクレオチド(UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc)及び糖-1-リン酸(GlcNAc-1-P, Gal-1-P)を0.5 μg/ml 100 μg/mlの濃度で添加し、37°CCO2条件下で培養した。細胞の増殖と分化を顕微鏡観察によって調査した結果、使用した糖ヌクレオチドまた糖-1-リン酸の添加によって細胞の分化促進が観察され、EGFに近い働きを持つことが明らかになった。これらの成分によるこのような働きが発見されたのははじめてであり、初乳に含まれる糖ヌクレオチドや糖-1-リン酸に新生児の腸の成長を成熟するような働きのあることが示唆された。平成28年度において、ターゲットとする他の反芻動物として水牛(インドネシア産)、ウシ、レイヨウのバーラル種とツタシンガ種、キリンの乳または初乳の採集に成功している。さらにエゾシカの乳の採集計画を立てている。
第一原理計算による蛋白質の構造揺らぎと電子状態の解明

生体内で働いている蛋白質分子は水溶液中で揺らいでいる。それゆえ個々の蛋白質を見たとき、その電子状態、エネルギーバンドや分子軌道等は一定の状態ではなく、時々刻々と変化し揺らいでいるはずである。水中のミオグロビン蛋白質を最終的な目標とし、電子状態がどのように変化しているかを調べ、蛋白質のダイナミックな側面を電子状態の観点から見出すことを目的とする。そのために、古典的なシミュレーション計算から揺らいでいる一連の瞬間的な構造を得る。そして各瞬間的な構造について、蛋白質のための全電子状態計算プログラムProteinDFを利用して電子状態を求めることで、そのダイナミックスを調べる。この時、周囲の水分子の効果を点電荷として取り込んだ近似を行う。全電子状態という大規模計算を行なうため、HITACHI SR8000(1ノード)に、ProteinDFプログラムの移植を行ない、ヘム錯体(bis (imidazole) porphinato iron)等について,テスト計算を行った。Version 0.8bの移植後、最新のversion 0.9.9を入手し移植・テストをしている。一方、周囲の水分子の効果を点電荷として取り込んだ近似計算が実行可能であることを確認した。一連の瞬間的な構造を古典シミュレーションから求めるため、ヘムの高精度力場パラメタについての最近の文献を調査した。現在、プログラムCOSM0S90を使用したヘムの水中シミュレーションを準備している。その結果得られる瞬間的な構造について、水分子の効果を取り込んだ一連の電子状態をProteinDFにより求める。そのため蛋白質全体の電子状態、分子軌道やエネルギーバンドなども時々刻々と変化しているはずである。本研究は水溶媒中のミオグロビン蛋白質を対象とする。揺らいでいる一連の瞬間的な構造について、全電子状態計算プログラムProteinDFを利用することによって、蛋白質の全電子状態を求めることを狙う。構造揺らぎの中で電子状態がどのように変化しているのかを調べ、蛋白質のダイナミックな側面を電子状態の観点から見出すことを目的とする。全電子状態という大規模計算を行なうため、本年度所属学科に導入されたスーパーテクニカルサーバHITACHI SR8000(1ノード)に、ProteinDFプログラムの移植を行なった。SR8000上への移植のために、ProteinDF共同研究を柏木教授・佐藤博士と結び、ソースコード(ProteinDF Version 0.8b)を入手し使用した。種々の分子、ヘム、そして幾つかのポリペプチドについてProteinDFによるテスト計算を行ない、チューニングの課題は残っているが概ね良好な結果を得た。ペプチド鎖エロンゲーション計算も良好に動作することを確認した。しかしながら一方では、PVMライブラリで並列化しているProteinDFプログラムは1ノードのみから成るサーバ上での並列実行が困難であることが判った。従って蛋白質全体の大規模計算を行なうため、東京大学情報基盤センターのSR8000(144ノード)の利用を考えている。今後、並列実行によるスピード計測、チューニング等を行ない、最終的に目的とする蛋白質一水系での全電子状態計算を行なう。
近代市街地形成における方位の役割に関する研究

習俗としての方位と、我が国の市街地形成との関りについて、本年度は、以下のような研究を行った。1.方位の認識が近代において、いつからどのようにして受入れられていたのかを明らかにするために、戦前に刊行された雑誌・書籍から、方位に関する解説を選びだし分析した。約40ほどの解説記事・単行本を収集できたが、その結果年代的には、大正11年前後のものが多いことが明らかになった。これは、関東大震災後の郊外住宅地ブームと重なっている。また、内容的には家相との関連から解くものが多く、実際に家相に関る解説書の類もこの頃に多く出版されており、習俗的な考え方がこの時代に大きな影響力を持っていたことが明らかになった。2.居住者や宅地開発者が実際に方位にどれだけこだわり行動したのかを明らかにする史料を収集し分析した。大阪では、阪急京都線の沿線での宅地開発が遅れたが、これは大阪市の凶相の方角(北東)にあたるためであるとする行政の報告があり、資料や証言なども収集しえた。また京都では、市街の北西の地に早くから郊外住宅地の開発が進んだが、これは吉相によるためであるとする開発者側の証言等も得られた。これらのデータから、関西地区では、郊外住宅地の開発が本格化する大正から昭和にかけて、方位の認識が住宅地形成に少なからず関与していたことが明らかになった。一方、東京では実際に他の地域に比べ、北東地域(現在の足立区や葛飾区)の宅地化は遅れるが、そこに方位の認識が介在していたことをうかがわせる資料を終に見つけることはできなかった。以上のような結果から、市街地形成における方位の認識の影響は、地域的偏りがあることがうかがえる。しかし、このことは、さらに東京や大阪以外の地域での事例も見ていくことが必要となるため、来年度以降の研究課題としていきたい。現在、関西地域での事例を中心にして、これまでの成果をまとめた論文を投稿準備中である。
ポルフィリンの内外に二つの金属をもつ複核錯体の触媒機能

ジホウ素化ポルフィリンに対して、2-ヨードピリジンとの鈴木-宮浦カップリングにより2-ピリジル基を導入し配位子を合成した。こうして得られたβ,β'-ビピリジルポルフィリンにパラジウム(II)および白金(II)塩を作用させるとmeso位のC-H結合切断を伴って収率よくポルフィリンピンサー型金属二核錯体が得られることを見いだした。このポルフィリンピンサー金属二核錯体をポルフィリンとして眺めた場合、非常に珍しい外周部に遷移金属をもつポルフィリンと見ることができる。一方、ピンサー型錯体としては、異種二核ピンサー型錯体と見ることができる。ここで、一方の金属によって触媒活性を担うもう一方の金属上の反応サイトの反応性が変化するのではないかと考えた。中心金属がZn(II), Ni(II), Cu(II)およびフリーベースポルフィリンピンサーパラジウム錯体を合成し、その構造解析と反応性の比較を行った。亜鉛体については結晶構造解析には成功していないが、他のポルフィリンピンサーパラジウム錯体はよく似た構造をとっており、特にパラジウムの配位環境はほぼ同一であった。パラジウム錯化する前のβ,β'-ビピリジルポルフィリンではポルフィリンが平面構造をとっているのに対して、錯化後ではポルフィリン環が大きくゆがんだ構造をとる。一方、パラジウム周りはほぼ理想的な平面四配位構造をとっていることが明らかとなった。ポルフィリンピンサーパラジウム錯体はヨードベンゼンとアクリル酸エステルとのMizoroki-Heck反応に対して触媒活性を示し、その活性はポルフィリンの中心金属に大きく依存することが明らかになった。
日・独・英における歴史学派の役割とその現代的意義に関する研究

本研究は、(1)ドイツ歴史学派を、19世紀後半20世紀初の多様な立揚の総合として把握し、(2)イギリスにおける新古典派経済学形成期に歴史学派の果たした役割、(3)日本における経済学研究の定着後の独自性追究と歴史学派との関係を明らかにし、さらに、(4)歴史学派・オーストリア学派・マーシャル等の方法的関心の現代的可能性を、進化経済学の観点から評価することの4方向から進められた。(1)については、「歴史学派」と総称されるドイツ経済学が、理論研究と歴史的経験的研究の位置付けや、社会科学観・資本主義観・社会主義観などに関して、世代間相違を含む多様性において理解される必要のあること、(2)については、古典派の代表J.S.ミルは、歴史的方法を認めたにもかかわらず、経済学原理に関してリカードウ派の立揚を堅持したために歴史学派の批判の対象となったが、ミルの社会改良主義的側面は歴史学派から高い評価を受けていたことが明らかにされた。(3)については、大正後期の、ドイツ歴史学派を参照先としていた社会政策学会の崩壊という学界の空白状況の下で、それまで自覚的に追究されてこなかった日本の経済社会の特殊性を、歴史研究を基礎に明らかにしようとする潮流が生れたことが明らかにされた。(4)については、19世紀末の「方法論争」に対する低い評価は、当事者たちが当時の知識論や統計学、生物学(進化論)などの発展を踏まえていた点を見逃していること、そこには現代進化経済学の主要論点が数多く含まれていることが明らかにされた。研究代表者・分担者は、本研究の成果を、歴史学派のたんなる比較に留めることなく、これからの経済学の発展に寄与しうるものとして、研究・教育に生かす所存である。交付決定後、研究代表者・研究分担者全員が参加してほぼ月1回の割合で継続的に研究会を開催し、各分担者の研究の進行状況の報告と歴史学派に関する研究の現状について意見交換・討論を行なった。各分担者は、次の通りに研究を進めた。岡部は、日本の経済学導入期における、ドイツ経済学・歴史学派に関する文献を収集した。また、19世紀末20世紀初のドイツにおける方法論争に触発された大正期昭和初期の、経済理論と歴史の関係・その哲学的基礎に関する研究について検討した。江頭は、スタンフォード大学・ウィーン学団研究所・ウィーン大学において資料収集を行ない、歴史学派・オーストリア学派周辺の方法論的議論の実態と、ドイツ語圏への進化論の導入経路とを検討した。佐々木は、イギリス歴史学派に関する研究を,「W.カニンガムにおける理論と歴史」(北海道大学『経済学研究』第55巻第4号,2006年3月)として発表、カニンガムが、(1)歴史的事実の観察には理論的枠組みが必要なこと、(2)個性的出来事の説明が歴史的研究の課題であることを明示し、歴史的方法を彫琢したことを明らかにした。田村は、東京地区・九州地区の諸大学(早稲田大学・立教大学・九州産業大学・九州大学など)、東北大学の各大学所蔵の歴史学派ならびに同時代ドイツの経済学者の文献(原典)を調査、19世紀後半20世紀初のドイツ経済学界における資本主義観について検討した。以上に加えて、2005年10月に、ドイツ在住の歴史学派研究者である竹林史郎氏を招聘、ドイツにおける歴史学派研究の現状について説明を受けるとともに、研究会を開催、「『歴史学派』への問い」と題して氏自身の研究成果の発表と、参加者による討論を行なった。本年度も、昨年度に引き続き、研究分担者が各課題について研究を進めるとともに、ほぼ月1回の割合で継続的に研究会を開催し、各分担者の研究の状況報告と研究課題に関わる研究の現状について意見交換・討論を行なった。

また、岡部・佐々木はドイツに出張し、当地における関連研究について資料収集と意見交換を行い、江頭は、19世紀末20世紀始めのハプスブルグ帝国圏内の知識理論について検討した成果を、平成18年12月20日フランス・ニースで開催されたESHET-JSHET joint seminarで、秋山美佐子氏と共同で報告した。平成19年3月には当研究プロジェクトに西沢保氏を招聘し、マーシャルと歴史学派、日本の導入期の経済学との関連について意見交換を行なった。各分担者の研究の成果は、次の通りであった。岡部は、導入期の日本で強い影響力をもったドイツ歴史学派の方法が、やがて理論研究よりも経済史研究の中で作用し、日本独自の経済学の可能性の探求に至る側面について検討した。田村は、シュモラー没後のドイツ歴史学派の解体の中で、マックス・ヴェーバーが、理論研究よりも歴史研究に重心をおく世代とみられていたことを明らかにした。佐々木は、イギリス歴史学派のウィリアム・アシュレーが、正統派との論争よりも、固有の領域で実質的な研究を進めるべきだとする立場をとっていたことを明らかにした。江頭は、19世紀末20世紀末のハプスブルグ帝国圏における知識理論の萌芽を、経済学方法論に関する議論と対置させて考察した(上記)。本年度は、昨年度までと同様に研究代表者・分担者がそれぞれの課題について研究を進めるとともに、研究期間3年間の最終年度にあたることから、成果のまとめに注力した。関連する研究者2名(Bertram Schefold氏[ドイツ・フランクフルト大学、本研究プロジェクト研究協力者]、野崎敏郎氏[佛教大学])を招聘しての研究会を開催し、関連分野の研究の現状について情報交換・情報収集・意見交換を行なうとともに、各分担者の研究の進捗具合などについても意見交換を行なった。また、岡部・田村は、小林昇氏、住谷一彦氏を訪問し、第二次大戦前後における日本の歴史学派研究についてヒアリングを行なった。さらに、大阪市立大学のゾンバルト文庫・福田徳三文庫を調査した(これらの調査には、研究協力者として成田泰子氏[北海道大学研究生]に同行を願い、補助業務を依頼した)。その他、各自、必要に応じて資料収集等を行なった。岡部は、戦前期日本で、ドイツ歴史学派とは切り離された形で独自経済学の追求が「歴史学派」として始まった点を検討した。田村は、ドイツ歴史学派の世代構成に着目してそれぞれの特徴を析出しつつ、歴史学派の全体像の把握を試みた。佐々木は、イギリス古典経済学の頂点をなすJ.S.ミルにおける歴史的方法と、その後台頭したイギリス歴史学派との関係の解明を試みた。江頭は、歴史学派隆盛と同時期の19世紀末20世紀初のオーストリア、ドイツ、イギリスにおける進化論と経済学との平行関係を、当時の知識論と関連させて考察した。以上の研究成果の主要部分は、『研究成果報告書』にまとめてある。
シロアリセルラーゼの新規発現系の開発とその利用

タカサゴシロアリ腸内共生細菌由来のキシラナーゼNtSymX11については、本年度中に投稿論文を作成・投稿し、Carbohydrate Research誌に掲載された(Carbohydr. Res. 474, 1-7 (2019))。併行して下等シロアリCoptotermes formosanusの腸内に共生する原生生物Holomastigotoidesmirabile由来のキシラナーゼであるCfXyn11-3Aの生産、精製、および酵素学的性質の解析を行った。CfXyn11-3Aはこれまで上記シロアリの腸由来抽出物から精製されており、高い比活性を持つことがわかっていたが、微量しか得られていなかったため、今回組換えタンパク質としての生産を試みた。まず予想成熟体部分を大腸菌を用いてHisタグ付きで生産したが、不溶性画分に認められた。そこでTrigger factorを付加して低温で発現誘導したところ、可溶性画分への生産に成功した。精製タンパク質を用いて活性を測定したところ、本酵素がブナ由来キシランを分解するキシラナーゼ活性を示すこと、生成物がキシロトリオース等であることがわかった。しかし比活性はシロアリ腸抽出物由来の酵素に比べかなり低いことがわかった。この原因が大腸菌菌体内でのフォールディングエラーである可能性を考え、出芽酵母を用いた発現を行った。発現には分泌タンパク質であるαファクターのシグナルおよびプロ配列をキャリアに用いた。しかし、生産されたCfXyn11-3Aの大部分は不溶性画分に認められ、微量生産された可溶性タンパク質を用いても活性の検出には至らなかった。しかし、不溶化したタンパク質が後期ゴルジ体でのプロ配列の切断を受けていることが示唆され、不要化が小胞体ではなく、ゴルジ体以降のオルガネラで起こるという、これまでの常識とは異なる知見が得られた。オオシロアリHodotermopsis sjostedtiの腸内に共生するEucomonympha属原生生物から単離されたcDNAがコードするセロビオヒドロラーゼ(以下EuCBH)の生産を試みた。Aspergillusoryzaeを用いた生産のため、HA-His6タグを付加したEuCBHをα-アミラーゼAmyBとの融合タンパク質として発現させるプラスミドを作製し、形質転換体の菌体および培地画分のタンパク質についてHA抗体を用いたウエスタン解析を行った。その結果、菌体画分においてはAmyBとEuCBHの融合タンパク質の発現が確認された。一方、培地画分についてはNi-NTA樹脂による精製を行ったのち、同様にウエスタン解析を行った。その結果、目的タンパク質のサイズと考えられるバンドが検出された。また、併行して材食性ゴキブリ由来ベータグルコシダーゼ(PaBG1b)、ヘミセルロースとリグニンの間のエステル結合を加水分解する糸状菌由来グルクロン酸エステラーゼ(GE)、およびシロアリ共生原生生物由来のマンナナーゼの生産も行った。その結果、PaBG1bが高い比活性とグルコース耐性などの優良な性質を持つ酵素であること、ある種の糸状菌GEがこれまで報告のあるGEに比べ高い触媒活性を持つ酵素であることを明らかにした。また、GEについて、基質であるグルクロン酸の4-O-メチル基の認識に重要な役割を果たすと考えられる残基の同定に成功した。マンナナーゼについては、サブサイト-5付近に保存されたトリプトファン残基の変異によってkcat値に大きな変化はないものの、Km値が大幅に上昇すること、すなわちこの残基がサブサイト-5における糖の認識に関わることを明らかにした。EuCBHについては発現系の構築が順調に進んでいる。また、生産に成功した他の酵素については、優良な性質を持つことや基質認識機構が明らかになるなどの新知見が得られている。結晶性セルロースの分解において中心的な役割を果たすセロビオヒドロラーゼの一つであるオオシロアリ腸内共生原生生物由来のEuCBHの麹菌を用いた生産を試みた。Aspergillusaculeatus由来のβグルコシダーゼをコードするAabgl1と共発現させたところ、共発現させない場合に比べて多く培養上清への分泌生産が認められた。しかし、キャリアであるαアミラーゼが融合されたままのバンドも検出されたことから、キャリアを用いないコンストラクトでの発現も試みた。その結果、より多量のEuCBHが生産された。これらのサンプルについて活性測定を行ったが、対照株と比較して有意な値を示さず、生産したEuCBHが正しくフォールディングしていない可能性が考えられた。次にタカサゴシロアリ腸内共生細菌由来のキシラナーゼNtSymX11の生産および機能解析を行った。NtSymX11は触媒ドメイン以外に糖質結合モジュールCBM36を2個持つ。様々なコンストラクトを作製して大腸菌で生産したところ、触媒ドメインを持つコンストラクトではキシラン特異的な分解活性が認められ、比活性や安定性の解析から、同じドメイン構造を持つ既知酵素に比べて20倍高い触媒効率を示すことがわかった。一方、CBM36のみでは活性を示さなかった。また、CBM36は酵素の熱やpHに対する安定性を低下させるが、触媒効率を上昇させること、Ca2+が不溶性基質に対する分解活性を上昇させることがわかった。2種類のバイオマス分解酵素の生産と性状解析を行った。EuCBHについては活性が認められなかったが、麹菌での異種タンパク質生産においてキャリアを用いない方が生産量が高い場合があるとの新たな知見が得られた。

NtSymX11については既知酵素に比べ高い触媒能を持つことがわかった。タカサゴシロアリ腸内共生細菌由来のキシラナーゼNtSymX11については、本年度中に投稿論文を作成・投稿し、Carbohydrate Research誌に掲載された(Carbohydr. Res. 474, 1-7 (2019))。併行して下等シロアリCoptotermes formosanusの腸内に共生する原生生物Holomastigotoidesmirabile由来のキシラナーゼであるCfXyn11-3Aの生産、精製、および酵素学的性質の解析を行った。CfXyn11-3Aはこれまで上記シロアリの腸由来抽出物から精製されており、高い比活性を持つことがわかっていたが、微量しか得られていなかったため、今回組換えタンパク質としての生産を試みた。まず予想成熟体部分を大腸菌を用いてHisタグ付きで生産したが、不溶性画分に認められた。そこでTrigger factorを付加して低温で発現誘導したところ、可溶性画分への生産に成功した。精製タンパク質を用いて活性を測定したところ、本酵素がブナ由来キシランを分解するキシラナーゼ活性を示すこと、生成物がキシロトリオース等であることがわかった。しかし比活性はシロアリ腸抽出物由来の酵素に比べかなり低いことがわかった。この原因が大腸菌菌体内でのフォールディングエラーである可能性を考え、出芽酵母を用いた発現を行った。発現には分泌タンパク質であるαファクターのシグナルおよびプロ配列をキャリアに用いた。しかし、生産されたCfXyn11-3Aの大部分は不溶性画分に認められ、微量生産された可溶性タンパク質を用いても活性の検出には至らなかった。しかし、不溶化したタンパク質が後期ゴルジ体でのプロ配列の切断を受けていることが示唆され、不要化が小胞体ではなく、ゴルジ体以降のオルガネラで起こるという、これまでの常識とは異なる知見が得られた。引き続きシロアリおよびその共生微生物、また糸状菌由来のバイオマス分解酵素の生産と性質の解析を行う。GEやマンナナーゼについては必要なら構造解析を行う。また、これらを組み合わせて実バイオマスの分解系の構築を試みる。今後は取得できた酵素を他の酵素と組み合わせ、バイオマスの高効率分解系を構築することを計画している。EuCBHの生産が途上であり、酵素活性の確認に必要な基質や試薬類を次年度に調達する必要が生じたため。また、GEやマンナナーゼの解析が予想外に進展し、構造解析を行う可能性が考えられたため、その分の経費を見込んだ。NtSymX11について投稿論文作成のための追加データを取得するため、その分の経費を見込んだ。追加データが必要になった場合、基質や試薬類を適宜調達する。EuCBHの生産と精製の進行具合を勘案しつつ基質や試薬類を発注する。また、GEやマンナナーゼの構造解析を行う場合は、新たに必要になる器具・試薬類を適宜調達する。
心筋症モデル動物における筋障碍の分子レベルでの研究

特発性心筋症、特にその遺伝子の強いものの実体にせまる為にもっともふさわしい実験動物といわれているジストロフィーハムスターを用いて心筋症発症の病因を探ることを考えた。一方最近問題になっているしかも遺伝子レベルの成因が解明されたデュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因欠損蛋白質であるジストロフィンの抗体をめぐって多くの議論がなされている。ジストロフィーハムスター14.6(BIO)とコントロール心筋の発症強度、弱度についてそれぞれ心筋をミクロゾーム分画、ミオシンB分画、細胞骨格分画に分けた。これら一部は0.1%トライトンメ100処理を行い可溶化分画をとった。これらと共にミトコンドリア分画面もとった。これらをSDSPAGEを行いウェスタンブロットしてメンブラン標本とした。一方56%ゲルを作製200KD以上の分子量蛋白についても存在様式を確かめた。コントロールとジストロフィー心筋のSDSPAGE上の差はミクロゾーム、細胞骨格、ミトコンドリア分画にはみられたが、ミオシンB分画にはほとんどみられなかった。上記3分画にみられた差はむしろコントロールに存在しない分画が心筋症でふえていることが多かった。200KD以上の高分子でははじめにカゼインを加えて蛋白分解酵素のサブストレイトとし分解を防がないと非常に分解し易かった。ミオシンB、細胞骨格分画にコントロールと心筋症間の差がみとめられたので今後も追求していきたい。一方ジストロフィン配列をもとにN端から4分の1ですでに抗体をつくったが、こゝはくり返し配列なので、C端の20残基にリジン枝をつけるフォークメソッドで現在抗体作製中である。C端は唯一のジストロフィンユニーク配列である。
ヒト胚性幹細胞・誘導多能性幹細胞のステロイド産生細胞への分化機構の解明

ヒト胚性幹(ES)細胞・ヒト誘導多能性幹(iPS)細胞をステロイド産生細胞に分化誘導する方法の確立を目指して研究を行った。ヒトES細胞、ヒトiPS細胞をWntシグナルの活性化を介してまず中胚葉系の細胞に分化させ、そののちにステロイド産生細胞分化の主要な制御因子であるsteroidogenic factor-1(SF-1)を遺伝子導入することにより、コルチゾールを産生し副腎皮質に近いステロイド合成酵素発現プロファイルを有する細胞に分化誘導することに成功した。ヒトES/iPS細胞をステロイド産生細胞への分化誘導に当たり、まず胚様体を介した方法を試みた。ヒトES細胞(H9、KhES1)とヒトiPS細胞(201B7)を、14日間浮遊培養を行って胚様体形成を行い、さらに接着培養で分化誘導を行った。RT-PCR、及び培養液中のステロイドホルモンを行ったところ、一部のステロイド合成酵素の発現を認め、培養液中にはプロゲステロンを検出することができた。しかし、同時に胎盤特異的ホルモンであるhCGをも産生しており、副腎皮質・性腺系の細胞ではなく、胎盤のtrophoblastに近い細胞であると考えられた。副腎皮質・性腺系の細胞を得るため、次に、ヒトES細胞、iPS細胞を中胚葉系の細胞に分化させ、更にステロイド産生細胞に分化させうる遺伝子を導入する方法を試みた。ヒトES/iPS細胞を剥離して小塊にしたのち接着培養下でGSK3β阻害薬を添加して培養したところ、FLK-1やPDGFRαを発現する中胚葉系の細胞に分化した。この中胚葉系細胞に対して、ステロイド産生細胞分化のmaster regulatorであるSF-1を導入したところ、RT-PCRで副腎皮質束状層に近いステロイド合成酵素発現プロファイルを示し、培養液中にはコルチゾールをはじめとするステロイドホルモンを検出することができた。これらの細胞はhCGは産生したおらず、この方法で得られたステロイド産生細胞は副腎皮質に近い細胞と考えられた。この方法で得られた細胞は未分化細胞に比較してACTH受容体の上昇を認めるものの、生理的濃度のACTHに対する反応は見られなかった。また、分化後の細胞は増殖能に乏しく、動物への移植に十分な量の細胞を得ることはできなかった。しかしながら、ヒトES/iPS細胞からの副腎皮質に近い細胞への分化誘導への報告は初めてであり、今後再生医療や副腎分化研究への応用が期待される。まず胚様体(embryoid body; EB)を介した方法を試みた。ヒトES細胞ライン(H9およびKhES1)とヒトiPS細胞ライン(201B7)を、14日間浮遊培養を行ってEB形成を行い、その後さらに接着培養で培養して分化させて、各々の過程でRT-PCR、メディウム中のステロイドホルモン測定を行った。14日間のEB形成を行った後に評価したところ、StAR、CYP11A1、HSD3Bなどの一部のステロイド合成酵素の発現を認め、培養液中には微量ながらプロゲステロンを検出することができた。EB形成後、更に10日間接着培養で培養した後の評価では、StAR、CYP11A1、HSD3Bの発現は更に上昇を認め、培養液中のプロゲステロンもEB形成直後より上昇していた。しかしながら、EB形成を介して得られた細胞にはACTH受容体やLH受容体の発現は認めず、ACTHやLHを培養液中に添加して培養してもステロイド合成酵素の遺伝子発現や培養液中のプロゲステロンは変化を認めなかった。さらに、EB形成を介して得られた細胞は同時に胎盤特異的ホルモンであるhCGをも産生しており、副腎皮質・性腺系の細胞ではなく、胎盤のtrophoblastに近い細胞であると考えられた。副腎皮質・性腺系の細胞を得るため、次に、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞を中胚葉系の細胞に分化させ、そこに更にステロイド産生細胞に分化させうる遺伝子を導入する方法を試みた。ヒトES細胞とヒトiPS細胞を剥離して小塊にしたのち接着培養下でGSK3β阻害薬を添加して培養したところ、FLK-1やPDGFRαを発現する中胚葉系の細胞に分化した。さらに、これらの細胞は、中間中胚葉のマーカーであるOsr1も発現していた。現在、これらの中胚葉系の細胞を純化し、さらにステロイド産生細胞に分化誘導する実験を行っている。胚様体(embryoid body; EB)を介した方法で得られたヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来のステロイド産生細胞は、結果として胎盤のtrophoblastに近い細胞であると考えられたが、この実験過程において、細胞のステロイド産生細胞への分化を評価するための、RT-PCR、real time RT-PCR、免疫染色、および培養液中のステロイドホルモンの測定などの実験系を確立することができた。現在行っている中胚葉系への分化を介したステロイド産生細胞への分化誘導実験においても、これらの実験系は応用することができる。

また、現在までにヒトES細胞、ヒトiPS細胞からGSK-3β阻害薬を用いた中胚葉系細胞への分化誘導方法を確立することができたが、他のグループの検討により、ヒト間葉系幹細胞にステロイド産生細胞分化のmaster regulatorであるSF-1を遺伝子導入することにより、副腎皮質・性腺に近いステロイド産生細胞に分化することが報告されている。この方法をヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来の中胚葉系細胞に応用することにより、当初計画していた通り、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞を副腎皮質・性腺に近いステロイド産生細胞に分化誘導することができると考えている。従って、本研究はおおむね順調に進展していると考える。現在、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞にGSK-3β阻害薬を添加することで得られる中胚葉系細胞を純化したうえで遺伝子導入を行って副腎・性腺に近いステロイド産生細胞に分化させる実験を行っている。ステロイド産生細胞分化のmaster regulatorであるSF-1を導入する予定であるが、SF-1を発現させるためのベクターの構築はすでに完了している。中胚葉系細胞の純化は、flow cytometryを用いて未分化マーカー陽性の細胞を除去することを予定している。また、遺伝子導入に当たっては、発現ベクターをlipofection法、もしくはelectroporation法にて行う予定としている。遺伝子導入後の細胞の評価には、RT-PCR法によるステロイド合成酵素の遺伝子発現の確認、免疫染色またはWestern blot法によるステロイド合成酵素のタンパクレベルでの発現の検討、および培養液中のステロイドホルモンの測定を行う。副腎皮質・性腺に近いステロイド産生細胞が得られることが確認できれば、これらの細胞のACTH受容体、LH受容体などの発現を検討し、さらにACTH、LHなどを培養液中に添加してステロイド合成酵素の上昇がみられないか検討を行う。また、ACTH受容体、LH受容体を含めた細胞表面マーカーを利用して、flow cytometryによってステロイド産生細胞の純化・選別を行うことも予定する。さらに、十分量のステロイド産生細胞が得られれば、これらを動物に移植することで、in vivoにおけるヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来のステロイド産生細胞の生存、生着、ならびに効果を検討することができる。この移植実験の際には、拒絶反応を回避しつつ細胞の機能を温存する目的で、高分子加工カプセルなどに細胞を封入することも考えている。Flow cytometry装置、real time RT-PCR装置などの本研究に必要な大型装置はすでに保有しており、また、ヒトES細胞専用取り扱いスペースについてもすでに存在する。このような状況のなかで、研究費は主に細胞培養関連試薬、フローサイトメトリー関連試薬、免疫染色関連試薬、分子生物学関連試薬などの実験消耗品ならびに実験動物費に充当する予定である。特に、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞の培養には、培地なども含めて高価な試薬が多く、細胞培養関連試薬の費用を多めに計上している。また、研究成果に関して国内外の他施設の研究者と議論し、研究成果を国内外に広く発信してゆくため、国内、および海外の学会に出張して学会発表を行う予定としているが、これらの出張費に関しても、本研究費から一部充当する予定である。
クロマチンリモデリング因子CHD8によるアポトーシス制御機構の解明

クロマチンリモデリング因子CHD(Chromodomain-Helicase-DNA binding domain protein)ファミリーに属する酵素群は、クロマチン構造の変化を介して遺伝子発現の制御に関わると考えられているが、特定遺伝子の発現制御における役割は不明であった。最近申請者は、このファミリーの一つであるCHD8が発生早期に高発現し、がん抑制タンパクp53によるアポトーシスを抑制することを発見した[Nishiyama M, et al., Nature Cell Biol.(2009)]。CHD8はp53とヒストンH1との三量体を形成することによって、p53の転写活性能を抑制し、最終的にアポトーシスを阻害する。つまりCHD8はヒストンH1を呼び込むことによってクロマチン構造を変化させ、p53による転写を抑制することによって、細胞運命をアポトーシスから生存へと180度変化させる。CHD8が欠損すると、p53が異常に活性化してアポトーシスが誘導される。CHD8ノックアウトマウスでは胚発生早期に広範なアポトーシスを来たし死亡するが[Nishiyama M, etal., Mol. Cell. Biol. (2004)]、p53を同時欠損させるとアポトーシスが抑制され、この発生停止が回復した。これらの生化学的・遺伝学的知見により、CHD8は既にクロマチン上に結合しているp53すらも抑制できる"抗p53最終機構"を形成していることが判明したクロマチンリモデリング因子CHD(Chromodomain-Helicase-DNA binding domain protein)ファミリーに属する酵素群は、クロマチン構造の変化を介して遺伝子発現の制御に関わると考えられているが、特定遺伝子の発現制御における役割は不明であった。これらの生化学的・遺伝学的知見により、CHD8は既にクロマチン上に結合しているp53すらも抑制できる"抗p53最終機構"を形成していることが判明したp53は細胞周期停止やアポトーシスを誘導する転写因子であると同時に、最も有名な癌抑制遺伝子産物の一つである。p53機能の制御は転写レベルや翻訳後修飾などの観点から研究が進んできたが、申請者は最近p53機能に対するエピジェネティックな制御機構を発見した(投稿中)。クロマチンリモデリング因子CHD(ghromo-Helicase-DNA binding domain protein)は修飾されたヒストンに結合し、ATP依存的なヌクレオソーム形成や移動を行うと考えられている分子ファミリーである。CHDは種を超えて保存されており、ヒトではCHD19の9つのメンバーが存在するが、その機能はまだ不明の点が多い。申請者らはその中の一つCHD8/Duplinについてノックアウトマウスを作製したところ、胎生早期にアポトーシスの異常.な亢進によりマウス胚が死亡することを発見した[NishiyamaM, et. al.,Mol.Cell.Bio1.(2004)]。そこでCHD8の欠損がなぜアポトーシスを引き起こすかという分子機序を解明する過程で、申請者は、CHD8がピストンHlをリクルートすることによってクロマチン構造の変化を起こし、p53の転写活性を抑制することを見出した。さらにp53/CHD8ダブルノックアウトマウスでは、胎生早期におけるアポトーシスが回避され、マウスは延命した。これらの遺伝学的証拠はCHD8がp53の強力かつ生理的な抑制因子であることを示している。つまりCHD8はp53の暴走を防ぐ制御因子であり、その閾値を設定しているものと考えられた。最近申請者は、このファミリーの一つであるCHD8が発生早期に高発現し、がん抑制タンパクp53によるアポトーシスを抑制することを発見した[Niskiyama M, et al., Nature Cell Biol.(2009)]。

CHD8ノックアウトマウスでは胚発生早期に広範なアポトーシスを来たし死亡するが[Nishiyama M, et al., Mol. Cell. Biol.(2004)]、p53を同時欠損させるとアポトーシスが抑制され、この発生停止が回復した。これらの生化学的・遺伝学的知見により、CHD8は既にクロマチン上に結合しているp53すらも抑制できる"抗p53最終機構"を形成していることが判明した。
Neurogenesisに焦点をあてた術後の認知機能障害の発症機序と予防法の解明

手術侵襲が海馬歯状回におけるneurogenesisにどのような影響を与え、それが手術後の学習・記憶障害とどのような関わりを持つか、また手術前からフルオキセチンを投与してneurogenesisを促進すると手術後の学習・記憶障害が軽減するかを調べた。その結果、3か月ラットでは手術侵襲によって海馬歯状回のneurogenesisは低下するとともに、学習・記憶能力が低下したが、フルオキセチンを手術前に投与すると、海馬歯状回のneurogenesisの低下が軽減されるとともに、学習・記憶能力が改善した。これらは、海馬の脳由来神経栄養因子(BDNF)濃度と関連していることが示唆された。手術侵襲が海馬歯状回のsubglanular zone(SGZ)におけるneurogenesisにどのような影響を与えるかを調べるため、3か月のオスのFisher344ラットを腹部手術群、全身麻酔群、コントロール群の3群に分け、腹部手術群は15分間のイソフルランによる全身麻酔中に1分間の開腹手術を、全身麻酔群は15分間のイソフルランによる全身麻酔のみを施行し、術後7日目と14日目の海馬歯状回のSGZのbromodeoxyuridine(BrdU)抗体陽性細胞数とdoublecortin(DCX)抗体陽性細胞数を蛍光免疫染色により観察した。まだ、データの解析を行っていないが、術後7日目では腹部手術群は全身麻酔群とコントロール群に比べてDCX抗体陽性細胞数が少なく、14日目ではやや増加がみられるものの少なかった。全身麻酔群は7日目、14日目ともコントロール群とほぼ同程度であった。BrDU抗体陽性細胞数は1切片で観察される細胞数が少ないため、現段階ではわからない。術後7日目で分化中の新生神経細胞のマーカであるDCX抗体陽性細胞数が減少したということは、増殖期にある新生神経細胞が手術侵襲の影響を受けてアポトーシスを起こすなどした可能性が高い。また、術後14日目にDCX抗体陽性細胞数が増加したということは、術後数日して新生神経細胞の増殖が始まった可能性が高い。今後、BrDU抗体陽性細胞数を解析することで、手術侵襲が海馬のneurogenesisのどの時期に影響を与え、いつから回復が始まるのかが明らかになる。その結果を受けて、今年度は手術侵襲のが学習記憶障害に与える影響について調べた。3か月ラットを腹部手術群、全身麻酔群、コントロール群の3群に分け、腹部手術群では開腹手術を行い、全身麻酔群では全身麻酔15分のみを行った。5日後よりMorris water mazeを施行。5日間のtraining phaseの後、probe trialを行ったところ、腹部手術群が他の2群に比べて、隠されたプラットフォームまでの到達時間がtraining phaseの3日目、4日目で長かった。Probe trialはプラットフォームをどかしてラットがその周辺領域をどの程度泳ぐかを調べるものであるが、これは3群で差はなかった。以上の結果から、3か月ラットにおいて、腹部手術はMorris water mazeにおいて隠されたプラットフォームの位置を周囲の景色から判断できるようになる学習記憶能力を低下させることがわかった。当初は行動試験にY maze spontaneous alterationを予定していたが差が出ず、novel recognition testに変えたところ、それでも差がでなかったため研究の進捗に遅れがでている。最終的に、神経新生(neurogenesis)は学習や遊ぶ環境がある中で過ごすと増加することから、隠されたプラットフォームの位置を周囲の景色から判断できるようになる学習記憶能力を調べるMorris water mazeに変えたところ差がでた。3か月ラットを腹部手術群、腹部手術+fluoxetine投与群、コントロール群の3群に分けて、術後の学習・記憶障害と海馬のneurogenesisに対する手術侵襲の影響とfluoxetineの予防効果を調べた。fluoxetineは飲水に溶解し、10 mg/kg/dayを術前21日間経口投与した。腹部手術はイソフルランを用いた全身麻酔下に、腹部に3 cmの切開を加えた後、回腸を腹腔外に出し拇指と人差し指で3分間擦ることによって行った。その後腹壁と皮膚を縫合・閉鎖し、鎮痛のために創部には0.2%ロピバカインで局所麻酔を行った。全工程を12分間とし、コントロール群は別のケージで12分間過ごした。手術後4日目からMorris Water Mazeを施行し(1日2回のtrainingを5日間行い、その翌日にprobe testを行う)、学習・記憶障害を調べた。また、手術4日目に安楽死させ、脳を摘出。海馬の凍結切片を作成し、Ki67抗体およびDoublecortin抗体を用いて免疫染色を行った。Morris Water mazeにおいて腹部手術群で学習・記憶能力が低下したが、術前にfluoxetineを投与した群では学習・記憶能力が保持された。また、海馬歯状回のSGZのDoublecortin抗体陽性細胞数も、腹部手術群で低下したが、術前にfluoxetineを投与した群ではコントロール群よりは低値だったものの保持された。Ki67抗体陽性細胞数は3群間に差はなかった。今回の結果から、術後の学習・記憶障害にはneurogenesisの低下が関与していることが示唆された。また、術前のfluoxetine投与には術後の学習・記憶障害を軽減する作用があることが示された。現在、海馬の蛋白抽出液を作成し、BDNFなどのneurogenesisに影響を与える因子について解析中である。

その結果、3か月ラットでは手術侵襲によって海馬歯状回のneurogenesisは低下するとともに、学習・記憶能力が低下したが、フルオキセチンを手術前に投与すると、海馬歯状回のneurogenesisの低下が軽減されるとともに、学習・記憶能力が改善した。これらは、海馬の脳由来神経栄養因子(BDNF)濃度と関連していることが示唆された。当初は6か月以降のラットを用いる予定であったが、海馬歯状回のSGZで新生する神経細胞が少なく比較することが難しいと考えられたため、3か月のラットを用いることにした。また、BrDUの腹腔内投与によりラットが死んでしまったり、BrDU抗体による蛍光免疫染色がうまくいかなかったりと、モデルの作成に時間がかかってしまった。手術侵襲が神経新生(Neurogenesis)と学習記憶障害に与える影響に関する結果がようやく出そろったので、現在プロコールに基づく本試験を実施中である。今後はフルオキセチンなどの術前内服の効果などを順次実施していく予定である。周術期管理学モデルの作成が完了したので、nを増やしてデータの解析を行うとともに、学習記憶障害を観察するための行動試験を鋭意実施し、一定の結論を得たいと考える。27年度の計画にあるフルオキセチンの術前内服の効果については、並行して準備を進め、できるだけ早い時期に実施していきたいと考える。今年度はほとんどの時間を行動試験に費やし、組織学的な実験をほとんど行わなかったので、抗体や試薬などをあまり購入しなかった次年度は組織学的な実験を行うため、それに必要な抗体や試薬を購入する予定である。
クローン病治療薬インフリキシマブの薬効発現の変動因子を考慮した投与設計法の構築

インフリキシマブの薬効発現に影響をおよぼすTNFα遺伝子-857C/T多型の影響を解析し、この多型により約1.4倍の転写活性の差が引き起こされることが示唆された。そこで、このTNFα発現量の差をインフリキシマブの速度論モデルに外挿したところ、-857T/Tを有する個体ではより治療効果が低く推移することが示された。以上のことから、構築したモデルに-857C/T多型情報を加味することにより、クローン病に対するインフリキシマブの最適な投与法を構築できる可能性が示された。TNFα遺伝子-857 C>T多型により、TNFα遺伝子の経時的発現にどの程度の違いがみられるかを、定常状態もしくはTNFαの誘導剤存在下において明らかにするするため、申請者は以下の実験を行った。○TNFα遺伝子-857 C>T多型を含む同遺伝子5'-上流領域を組み込んだルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、培養細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことにより、各多型を有するレポータープラスミド間における同遺伝子の転写活性の経時的変化の違いを調べる。-857C/T多型をそれぞれ有するTNFα遺伝子5'-上流領域(-899+181)をPCR法により単離し、ルシフェラーゼアッセイ用ベクターpGL4.12に組み込んだプラスミドを構築し、MEG-01細胞におけるTNFα遺伝子の転写活性の経時的変化を検討した。-857CまたはTを有するTNFα遺伝子の転写活性を比較したところ、concanavalin A (Con A)未処理群、処理群ともに、-857 Tを有する検体において高い転写活性が認められた。また、各検体における転写活性の積算値を算出したところ、-857 Cに比べて-857 Tではそれぞれ約1.4倍(Con A未処理)または約1.4倍(Con A処理)高い値を示した。これらの結果から、細胞モデルにおいては、-857 C>T多型により上述の転写活性の差が引き起こされることが示唆された。認められた差をインフリキシマブの薬効発現モデルに変動パラメータとして組み込むことで、同多型を考慮したクローン病治療における投与設計が可能となることが期待される。TNFα遺伝子-857C/T多型情報を組み入れたインフリキシマブ(IFX)の薬効発現過程に関するモデルの構築上記モデルの構築にあたり、申請者は以下の検討を行った。○TNFα遺伝子-857C/T多型を有する検体におけるTNFα転写活性誘導データ(ルシフェラーゼアッセイにおける時間あたりの発現量相対変化)を効果発現過程に関するPK/PDモデルに外挿し、同多型によりIFXの効果発現がどの程度変化するかをシミュレートする。得られた結果より、TNFα遺伝子-857C/T多型を加味した患者個別のIFX薬物投与計画法を立案する。-857C/T多型をそれぞれ有するTNFα遺伝子5'-上流領域を組み込んだルシフェラーゼレポータープラスミドを用い、MEG-01細胞におけるTNFα遺伝子の転写活性の経時的変化を検討した。48hr後における-857Tの累積転写活性は、約1.33倍-857Cよりも高かった。そこで、多型間でのTNFα発現量の差を1.33倍として、それぞれの薬剤の速度論モデルに外挿したところ、クローン病患者に対するIFX投与のシミュレーションカーブから、-857T/Tを有する個体では-857C/Cを有する個体よりも治療効果が低く推移することが示された。よって、-857T/Tを有する個体が-857C/Cを有する個体と同等の治療効果を得るためには、投与量を調節する必要があることが示唆された。そこで、-857T/Tを有する個体におけるIFXの投与量を変化させたときのフィッティングラインを-857C/Cシミュレーションカーブと比較すると、投与量を約1.4倍に増量したとき、両者はよく一致した。以上のことから、構築したモデルにTNFα遺伝子-857C/T多型情報を加味することにより、両疾患におけるIFXの最適な投与法を構築できる可能性が示された。