hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
米国門戸開放外交の文化的基盤に関する史的研究

本研究は門戸開放通牒の起草過程を探り、米国国務長官ジョン・ヘイの政治顧問であったヘンリ・アダムズ、外交官W・W・ロックヒル、英国の中国海関職員A・E・ヒッピスレーの文書を精査し、女性の国境を越えたネットワークが通牒作成の過程で関係していたことを見いだした。そして、門戸開放通牒の基礎にあった女性たちの反帝国主義の意識は、アダムズのサロンに参加していたエレノア・ローズヴェルトを通じて世界人権宣言に結びついていたこと、またその平和主義は核兵器への恐怖と戦争廃絶運動につながったことを明らかにした。イギリスに長期滞在することができたため、当初の計画では平成27年度に実施する予定であった英国外交官D・リンゼイの文書を一定程度まで収集することができた。また、リンゼイの二人の妻が残した文書もその所在が明らかになり、その一部分を収集した。このように、今年度、英国で翌年度に行う予定の内容を前倒しするかたちで実施した結果、平成27年度の調査旅行の柱の一つであった英国での調査を大幅に縮小できるようになったほか、残りの柱であった米国と日本の資料収集も一部分を縮小することが可能となった。また、これら収集した資料に基づく研究成果として、『ヘンリ・アダムズとその時代』(仮題)という著書を公刊する準備を進め、その原稿を完成させた。今年度に公刊した単著『ヘンリ・アダムズとその時代』はアメリカ国内政治の発展の文脈で議論したものであるため、国際政治全体の中での門戸開放外交の考察が弱くなった。また、その国内政治についても、理論的分析を避けたため、印象主義的な記述になった。より世界的な視野で理論的な分析を行うことで最終成果をとりまとめることを次年度の課題とし、『門戸開放外交とアメリカ民主政』というタイトルで新しい単著の発表を目指すこととする。政治学当初計画に沿って研究を進めていくのと同時に、大量の文書を収集したため、その分析に思った以上の時間がかかるようになった。その分析の大枠を明確にするため、今年度に著作を刊行し、分析枠組みがこれまでの研究に照らして意義があるかどうか、学界の判断を仰ぐこととする。収集した資料が膨大になったため、その分析に大きな時間がかかったこと、また中間成果として単著を発表したことから、海外で資料収集を行うための時間がとれなかった。このため、海外出張の旅費分が次年度に繰り越されることとなった。今年度に行う予定であった海外出張により、資料収集と海外研究者との交流に努め、予算を使用する。
仮想環境の共有による協調作業に関する研究

本年度は,昨年度に試作した協調作業環境を開放型VRおよび没入型VRの双方に対応可能な協調作業環境に改造し,次の2項目について研究を実施した.1.両手間の協調作業を利用した3次元モデラのHMD対応およびHMDとスクリーン型表示装置の違いによる操作性の実験的評価我々は,既に共有仮想環境での具体的協調作業として三次元形状のデザインを念頭に,ブロック玩具を模倣したインタフェースを持つ形状モデラを試作ている.このモデラを,HMDを用いた没入型環境でも動作するものに改良した.また,これにともない大型スクリーンを用いた視点追従型立体表示とHMDを用いた環境の比較検討を,仮想物体操作タスクでのパフォーマンス評価実験を利用して行なった.その結果,作業領域が大型スクリーンの表示範囲に含まれる場合は,スクリーン表示が優れ,作業領域が広い場合は,頭部動作の少ないHMD表示の方がパフォーマンス的に優れるという結果を定量的に得た.2.共有仮想環境での2者間/両手間の協調作業補助手法の実験的評価仮想環境で,一人の作業者が両手を用いて,あるいは二人の作業者がそれぞれ片手を用いて,異なる仮想物体を仮想物体を把持して,それを接合させる作業(接合タスク)において,干渉回避,離散的配置制約の二操作補助手法の組合せが作業効率に与える影響を定量的に評価した.その結果,両操作補助手法とも作業時間の短縮に有効であり,組み合わせることで平均30%程度の作業時間の短縮が可能であること,両操作補助手法を動的に組み合わせることでさらに操作時間の短縮の可能性があることなどを明らかにした.本年度は,昨年度に試作した協調作業環境を開放型VRおよび没入型VRの双方に対応可能な協調作業環境に改造し,次の2項目について研究を実施した.1.両手間の協調作業を利用した3次元モデラのHMD対応およびHMDとスクリーン型表示装置の違いによる操作性の実験的評価我々は,既に共有仮想環境での具体的協調作業として三次元形状のデザインを念頭に,ブロック玩具を模倣したインタフェースを持つ形状モデラを試作ている.このモデラを,HMDを用いた没入型環境でも動作するものに改良した.また,これにともない大型スクリーンを用いた視点追従型立体表示とHMDを用いた環境の比較検討を,仮想物体操作タスクでのパフォーマンス評価実験を利用して行なった.その結果,作業領域が大型スクリーンの表示範囲に含まれる場合は,スクリーン表示が優れ,作業領域が広い場合は,頭部動作の少ないHMD表示の方がパフォーマンス的に優れるという結果を定量的に得た.2.共有仮想環境での2者間/両手間の協調作業補助手法の実験的評価仮想環境で,一人の作業者が両手を用いて,あるいは二人の作業者がそれぞれ片手を用いて,異なる仮想物体を仮想物体を把持して,それを接合させる作業(接合タスク)において,干渉回避,離散的配置制約の二操作補助手法の組合せが作業効率に与える影響を定量的に評価した.その結果,両操作補助手法とも作業時間の短縮に有効であり,組み合わせることで平均30%程度の作業時間の短縮が可能であること,両操作補助手法を動的に組み合わせることでさらに操作時間の短縮の可能性があることなどを明らかにした.
インド洋津波によるスリランカの文化遺産被災状況調査と復興ガイドラインの作成-世界遺産都市ゴールと南部沿岸の歴史的都市の被害状況の解明-

予備調査(2005年1月29日2月6日):スリランカ・イコモス国内委員会と調査内容について打ち合わせ、南岸のベルワラからハンバントタまで200kmの津波被災状況を目視調査し、本調査候補地をマータラ市街及びその近郊に特定した。共同研究を行うルフナ大学のスタッフと作業分担について打ち合わせた。本調査(2005年3月10日26日):マータラ市旧市街および近隣街区で被災調査を実施した。ルフナ大学およびスリランカ側専門家を含め、全体を、建築調査班A・B、街区調査班、GIS班に分けた。建築調査班は、18世紀以降の歴史的建築物計50棟の現状を記録し、うち11棟については詳細な図面作成のための実測を行なった。建築調査班Aでは調査活動を優先し、同Bではスリランカ側との共同作業による調査技術の指導・教育に重点を置いた。実測調査と並行して、スリランカ側研究者を中心に、津波被害に関する居住者への聞き取り調査も実施した。日本側の保存科学研究者は、建築班と共に、被災した歴史的建築物の構法、材料特性を調査・記録した。街区調査班は、マータラ市街の中心街路クマワウンガ・マワタの現状記録を進め、歴史的脈絡に沿った再開発に向けた提案作成の基礎資料を整備した。GIS班は、城壁内の主要街路および微地形の実測を行ない、併せて代表的な歴史的建築物の立面実測に協力した。調査最終日にコロンボで、スリランカ政府都市建設大臣を招いて公開報告会を開催し、調査成果を報告すると共に、前日までに整理した画像資料等をパネルとして展示した。スリランカ側は調査成果を高く評価し、今後、より長期的な共同研究と人材交流を図ることになった。
フィリピン複合民族国家における宗教観と国民形成

本研究は,複合民族国家のダイナミズムを理解する上で,宗教観が果たす基本的な役割をより明確にすることを目的とする.フィリピン共和国では,1986年2月の政変以降の展開された「フィリピン的民主主義」のもとで,新たなる社会的統合(国民統合)が積極的に展開されつつある.この過程で宗教的・霊的な思考様式を背景とする社会的・文化的諸問題が常に浮上し,宗教的多次元性が民族間の対立と相互依存関係に深く関わり続けている.このように,フィリピン国民形成の基層に関わる諸問題は,宗教的・社会的状況を踏まえた上で論議を深化させなければならない.フィリピン社会全体は,社会の面で高度の整合性をもった性格のものでなく,きわめて緩やかな人間関係や社会関係の上に,多次元的な宗教観や価値観が加わって独自の社会的性格をかもしだしている.こうした緩やかな社会的統合に基本的な方向性を与えているものとして宗教意識とその受け皿である彼ら本来の価値体系とがあることが指摘できる.フィリピンでは,16世紀以来のカトリシズムが伝統的なアミニズムの世界と,6,7世紀以来のイスラミズムの世界とに深くかかわり,国民形成の状況をますます複雑にしているつまり,伝統的な東南アジア的宗教観に対し,中近東からのイスラム的宗教観および西欧世界からのカトリック的宗教観とが大きく影響し,その結果フォ-クカトリシズムまたはフォ-クイスラミズムと言われる宗教的状況を生み出している.他方,フィリピン社会においても,はやくから華人が移動定着し,文化の様々な側面に大きな影響を与えてきた.現在フィリピンでは,華人社会は建前としてはおおくがカトリシズムを信仰しているが,その根底には民間道教あるいは儒教倫理と交流する性格をたぶんに保持している.この様な複雑な宗教的・社会的状況のなかで,フィリピン国民形成は多様な側面を抱えながら進行している.各研究分担者は,宗教人類学的および社会人類学的な方法と視座から文献資料の分析もさることながら,現地調査による資料収集と分析を基本的方法として,フィリピン人の国民・国家意識および宗教観の実態を研究した.研究成果は,現在編集中の調査報告書に,その詳細がゆだねられるが,研究報告会やシンポジュムなどで行われた議論の結果は,次の通りである.(1)政変後にみられる政治行動様式と国家意識は,都市部と周辺農村部とも「ウタン・ナロブ(恩)」「パキキサマ(義理)」に代表されるフィリピン社会の価値観が政治行動に強く反映し,国家意識に先行すること.(2)国家レベルの国民形成運動は,伝統的な社会・政治関係であるパトロン・クライエントとネポティズムが錯綜した社会的な価値規範の前に,私的なレベルの問題として取り扱われる傾向があること.(3)華人社会は,総人口の3%を占めるに過ぎないが,フィリピン経済の80%を支配すると言われている.その結果,富の社会的還元を,無償医療などの形で寺院を中心に行い,民族的共生を打ち出しつつ,華人社会の権益の保護はかっている.フィリピン国民としての意識よりは,伝統的華人社会にみられるような同郷,同姓にアイデンティテ-をおく傾向が強い.(4)ミンダナオ島では,第2次世界大戦後,イスラム社会にキリスト教民の移住はじまり,今日ではモザイク状の棲み分けがみられキリスト教民との対立が激しく,国家意識としての「ピィリピノ(フィリピン人)」より,「イスラム」の意識を強く表出させる.TV,映画などのマスメディアによるタガロク語や物質よるフィリピナイゼションを拒否する側面がある.(5)政治がすすめる国民統合に対して,文化的にもっとも遠い距離にあるのが少数民族である.彼らの諸文化の動態的な維持・統合は,政治的・経済的フィリピナイゼイションの前に困難である.その結見すると,共生関係にある多数民との関係は,国民統合の過程で強制的な文化統合の側面をもつ.本研究は,複合民族国家のダイナミズムを理解する上で,宗教観が果たす基本的な役割をより明確にすることを目的とする.フィリピン共和国では,1986年2月の政変以降の展開された「フィリピン的民主主義」のもとで,新たなる社会的統合(国民統合)が積極的に展開されつつある.この過程で宗教的・霊的な思考様式を背景とする社会的・文化的諸問題が常に浮上し,宗教的多次元性が民族間の対立と相互依存関係に深く関わり続けている.このように,フィリピン国民形成の基層に関わる諸問題は,宗教的・社会的状況を踏まえた上で論議を深化させなければならない.フィリピン社会全体は,社会の面で高度の整合性をもった性格のものでなく,きわめて緩やかな人間関係や社会関係の上に,多次元的な宗教観や価値観が加わって独自の社会的性格をかもしだしている.こうした緩やかな社会的統合に基本的な方向性を与えているものとして宗教意識とその受け皿である彼ら本来の価値体系とがあることが指摘できる.フィリピンでは,16世紀以来のカトリシズムが伝統的なアミニズムの世界と,6,7世紀以来のイスラミズムの世界とに深くかかわり,国民形成の状況をますます複雑にしているつまり,伝統的な東南アジア的宗教観に対し,中近東からのイスラム的宗教観および西欧世界からのカトリック的宗教観とが大きく影響し,その結果フォ-クカトリシズムまたはフォ-クイスラミズムと言われる宗教的状況を生み出している.他方,フィリピン社会においても,はやくから華人が移動定着し,文化の様々な側面に大きな影響を与えてきた.

現在フィリピンでは,華人社会は建前としてはおおくがカトリシズムを信仰しているが,その根底には民間道教あるいは儒教倫理と交流する性格をたぶんに保持している.この様な複雑な宗教的・社会的状況のなかで,フィリピン国民形成は多様な側面を抱えながら進行している.各研究分担者は,宗教人類学的および社会人類学的な方法と視座から文献資料の分析もさることながら,現地調査による資料収集と分析を基本的方法として,フィリピン人の国民・国家意識および宗教観の実態を研究した.研究成果は,現在編集中の調査報告書に,その詳細がゆだねられるが,研究報告会やシンポジュムなどで行われた議論の結果は,次の通りである.(1)政変後にみられる政治行動様式と国家意識は,都市部と周辺農村部とも「ウタン・ナロブ(恩)」「パキキサマ(義理)」に代表されるフィリピン社会の価値観が政治行動に強く反映し,国家意識に先行すること.(2)国家レベルの国民形成運動は,伝統的な社会・政治関係であるパトロン・クライエントとネポティズムが錯綜した社会的な価値規範の前に,私的なレベルの問題として取り扱われる傾向があること.(3)華人社会は,総人口の3%を占めるに過ぎないが,フィリピン経済の80%を支配すると言われている.その結果,富の社会的還元を,無償医療などの形で寺院を中心に行い,民族的共生を打ち出しつつ,華人社会の権益の保護はかっている.フィリピン国民としての意識よりは,伝統的華人社会にみられるような同郷,同姓にアイデンティテ-をおく傾向が強い.(4)ミンダナオ島では,第2次世界大戦後,イスラム社会にキリスト教民の移住はじまり,今日ではモザイク状の棲み分けがみられキリスト教民との対立が激しく,国家意識としての「ピィリピノ(フィリピン人)」より,「イスラム」の意識を強く表出させる.TV,映画などのマスメディアによるタガロク語や物質よるフィリピナイゼションを拒否する側面がある.(5)政治がすすめる国民統合に対して,文化的にもっとも遠い距離にあるのが少数民族である.彼らの諸文化の動態的な維持・統合は,政治的・経済的フィリピナイゼイションの前に困難である.その結見すると,共生関係にある多数民との関係は,国民統合の過程で強制的な文化統合の側面をもつ.
酸化チタンと超音波を併用した新しい癌治療への挑戦

近年、抗癌剤と超音波を併用する新しい治療法(音響化学療法)が期待されている。本課題では広く光触媒として使われている酸化チタンの生体応用に着目した。光エネルギーに替わりに超音波で酸化チタンを励起し、その抗腫瘍効果の有無を検討した。対照群に比べ、酸化チタン・超音波併用群は殺細胞数の増加が認められた。また、殺細胞効果は超音波強度・酸化チタン濃度に依存した。酸化チタンの音響化学抗腫瘍効果が確認された。[研究の目的]光触媒として利用されている酸化チタン(TiO2)をリポソーム内に封入し、さらにナノバブル化することで、世界初の酸化チタン封入ナノバブルリポソーム製剤の生成を行う。酸化チタン封入ナノバブルリポソーム製剤と超音波を併用することで、強力な抗腫瘍効果を得られるうえ、骨髄抑制などの重大な副作用のない安全かつ簡便な癌治療の可能性をさぐる。[研究実績]実験計画では酸化チタン封入ナノバブルリポソームの作製;酸化チタンとリポソームをバイアルに入れ、密閉した状態でガスを加え加圧する。それを、高速で振動する撹拌器にかけた。高速で撹拌することによりリポソームの透過性が亢進し、リポソーム内にガスと酸化チタンと封入することができた。一方、酸化チタン封入ナノバブルリポソームを電子顕微鏡下(Freeze-fracture electron microscopy)の観察では明らかナノサイズのマイクロバブルは観察しることはできなかった。リポゾーム製剤(日本油脂製)を用いて、上記と同じ高回転の攪拌を使った処理方法では光学顕微鏡で明らかなマイクロバブルが観察でき、コントロール群と比較し、超音波に殺細効果は認められた。今後はリポゾームと酸化チタンの配合をさらに細かく設定を決め、高速攪拌中の様子を詳しく観察し、最適は条件設定を行うことが必要と思われる。動物実験では酸化チタンの毒性は認められず、細胞にも毒性がないことが確認できた。超音波診断装置を用いてマイクロバブルをはっきり確認することはできなかった。それを、高速で振動する撹拝器にかけた。様々な条件下で作成さえたバブルリポソームの直径を測定する方法が検討された。光散乱光を利用した粒子経測定法がもっとも安定的な結果が得られた。一方、バブルリポソームと酸化チタンを組み合わせた腫瘍実験では、強力集束超音波(HIFU)プローブを使った。モデル細胞としてメラノーマ細胞株(C32)を用いた。PI染色法で細胞の生存率を測定した結果、超音波照射群はコントロール群に比べ細胞破壊効果が著明に認められた。細胞の破片など、超音波とチタンを併用した検体で有意に増加が認められた。細胞は超音波の機械的な応力で破壊され、化学的な細胞殺傷よりも強いことが示唆された。超音波の強度を30V,40V,50Vに増加するほど、細胞殺傷率も増加した。コントロール群に比べ、細胞殺傷率が4倍まで上昇した。本実験では超音波とチタンを併用することでキャビテーションが発生し、それが細胞の機械的な破壊効果へとつながったと推測された。
景観構造と送粉者の行動パターンが稀少植物のジーンフローと絶滅リスクに与える影響

植物のジーンフローや繁殖成功は、景観構造や送粉者の種類の影響を受ける。送粉者の組成は安定ではなく、自然の個体群変動に生態系改変が加わることで大きく変動する可能性がある。生態改変が植物の繁殖精巧に与える影響を理解するには、送粉者の種類と植物の繁殖成功の関係を調べることが不可欠である。そこで今年は、送粉者の種類によって繁殖成功がどう変わるかを、網室内の操作実験によって明らかにする。またその際に植物個体の密度の影響も検討した。エゾエンゴサク、ミツバウツギ、タチギボウシなどのマルハナバチ媒植物を対象に、マルハナバチの種組成が繁殖成功に与える影響を網室による操作実験で調べた。その結果、ハチの種ごとに訪花特性、具体的には訪花の際に雄蕊・雌蕊と接触するかどうか、そして訪花に頻度が変わることが分かった。このことが植物の結実にどのような影響を与えるのかの検討を進めている。まず、一回の訪花において、どれくらいの花粉を雄蕊から持ち去り、どれくらいの花粉を柱頭に運び入れて花粉管が発芽するのかを、ハチの種間で比較している。その結果、花粉管の発芽数とハチの種ごとの訪花特性との関係が明らかになってきた。つぎに、結果率と種子生産量が、ハチの組成によってどのように変わるのかの検討を進めている。さらに、植物の密度の効果の検討も進めている。密度の高い植物パッチと低いパッチがあった場合、訪花に必要なエネルギーは高密度パッチの方が低く、ハチから好まれる可能性がある。しかし、ハチの種間競争が生じると、劣位の種が低密度パッチをより利用するようになり、低密度パッチ内の植物の結果率が上がる可能性がある。このような関係が、現在の解析を進めることで得られるかもしれない。1.北海道千歳は絶滅危惧種(IB類)クロビイタヤの一大分布地だが、近年開発により森林分断化が進んでいる。森林の分断化が進んだとき、断片林冠のジーンフローが制限されると断片林内の近親交配が進み、断片林の局所個体群の更新が妨げられる可能性がある。この影響の強さは、送粉者の種類・自家不和合性の程度・近交弱勢の程度に依存する。これらを明らかにするためにクロビイタヤ3個体の樹上で、訪花昆虫の観察・採集および、強制他家授粉・強制自家授粉・送粉者誘導・送粉者排除・自然条件などの処理区からなる授粉実験を行った。現在この結果を解析中であり、ここからクロビイタヤの送粉者と交配特性が明らかになる。2.千歳のモザイク状景観の約200ha内のクロビイタヤ(dbh>15cm)をすべてマッピングし、そこからサイズの異なる4つのクロビイタヤサブ個体群(個体数4・29・78・118)を選び、58個体の樹冠下に花/種子トラップ、18個体の樹冠にウィンドウトラップを設置し、各1週間ごとに回収した。これらのデータを解析して、以下の設問に答えていく。a)個体群サイズは送粉者アバンダンスに影響するか?b)個体群サイズは種子の被食率・結実率に影響するか?3.現実に起きているジーンフローの水準を調べ、近親交配の程度を調べるために、上記のクロビイタヤ個体すべてと、18のサブ個体群内に落下した種子を各50ずつ採集し、現在DNAを抽出している。これらのDNAを材料に、DNAマイクロサテライトマーカーを用いることで種子の親子判別を行い、花粉散布様式・種子散布様式を明らかにしていく予定である。DNAマイクロサテライトマーカーの開発については実験条件の最適化が終了し、現時点で6個のマーカーができている。生息地の断片化はジーンフローを妨げ、繁殖成功の低下・遺伝的多様性の減少を通じて種の存続に影響を与える可能性があり、希少植物ではとくにその懸念が大きい。今年度は、北海道千歳市郊外の、断片化された大小さまざまな森林に生息している絶滅危倶IB類に指定されているクロビイタヤ(Acer miyabei.var.miyabei)の繁殖成功に森林断片化が及ぼす影響を生態調査と遺伝解析(DNAマイクロサテライト3座による近交係数と他家受粉率)で調べた。繁殖が森林断片化からどのような影響を受けるかは、各繁殖プロセスの空間スケールと密接に関わっているので、開花から種子散布までの各プロセスの空間スケールを検討した。その結果、開花フェノロジーは2km以上という広い範囲で同調しており、断片林間の交配も潜在的に可能であることがわかった。種子の99%は約50m以内に散布されることが分かり、断片林間では種子を介したジーンフローは妨げられていた。クロビイタヤの基本的な繁殖特性を調べた結果、雄・雌・両性個体が存在しており両生個体には雌雄異熟性があり、弱い自家不和合性があった。そのため自家受粉が起こりにくく、成木と種子の近交係数が同程度であることからも集団全体の自家受粉の頻度が小さいことが示唆された。種子の充実率は、母樹から半径50m以内の成木数が減ると顕著に下がった。とくに孤立木の場合には0.01と極端に低い充実率を示す一方で健全種子の他家受粉率は少なくとも0.75以上と高かった。この充実率は、強制自家受粉を行った場合よりも低く無受粉処理の場合と同程度である。ここから、近隣個体が減って他家花粉が得られなくなると受粉そのものに失敗すること、そして小数の健全種子は遠距離交配由来になることが分かった。

また50mという範囲がおもに花粉散布が行われている範囲であり、このスケールでの断片化が充実率低下を通じて繁殖成功を大きく下げることが示唆された。植物のジーンフローや繁殖成功は、景観構造や送粉者の種類の影響を受ける。送粉者の組成は安定ではなく、自然の個体群変動に生態系改変が加わることで大きく変動する可能性がある。生態改変が植物の繁殖精巧に与える影響を理解するには、送粉者の種類と植物の繁殖成功の関係を調べることが不可欠である。そこで今年は、送粉者の種類によって繁殖成功がどう変わるかを、網室内の操作実験によって明らかにする。またその際に植物個体の密度の影響も検討した。エゾエンゴサク、ミツバウツギ、タチギボウシなどのマルハナバチ媒植物を対象に、マルハナバチの種組成が繁殖成功に与える影響を網室による操作実験で調べた。その結果、ハチの種ごとに訪花特性、具体的には訪花の際に雄蕊・雌蕊と接触するかどうか、そして訪花に頻度が変わることが分かった。このことが植物の結実にどのような影響を与えるのかの検討を進めている。まず、一回の訪花において、どれくらいの花粉を雄蕊から持ち去り、どれくらいの花粉を柱頭に運び入れて花粉管が発芽するのかを、ハチの種間で比較している。その結果、花粉管の発芽数とハチの種ごとの訪花特性との関係が明らかになってきた。つぎに、結果率と種子生産量が、ハチの組成によってどのように変わるのかの検討を進めている。さらに、植物の密度の効果の検討も進めている。密度の高い植物パッチと低いパッチがあった場合、訪花に必要なエネルギーは高密度パッチの方が低く、ハチから好まれる可能性がある。しかし、ハチの種間競争が生じると、劣位の種が低密度パッチをより利用するようになり、低密度パッチ内の植物の結果率が上がる可能性がある。このような関係が、現在の解析を進めることで得られるかもしれない。
ミトコンドリア蛋白前駆体の膜透過におけるホスホリパーゼの役割

細胞質中で合成されたミトコンドリア蛋白前駆体は、シグナルをプレシーケンスあるいは、成熟型分子内に持ちミトコンドリアと結合する。膜透過にはATPのエネルギーを利用した前駆体蛋白のunfoldingが必要である。また膜電位差が要求されるが、その役割は不明である。本研究では、ATP合成酵素の活性調節因子であるATPaseインヒビターのプレシーケンスを化学的に合成し、ミトコンドリア膜との相互作用を調べ膜電位差の意義について検討した。プレシーケンス中に含まれる構造のオリゴペプチドはミトコンドリアに特異的に結合し、前駆体の透過を阻害した。その結合には塩基性アミノ酸が不可欠であった。オリゴペプチドはミトコンドリアから脂肪酸を遊離させるが、ホスホリパーゼの活性化が蛋白の膜透過に関与するか否か、現在のところ不明である。むしろ成熟型蛋白の一部を含むプレシーケンスの合成ペプチドで観察されたように極めて短時間のミトコンドリアの脱共役が重要であり、ホスホリパーゼの活性化は二次的なものである可能性が強いと考えられる。合成プレシーケンスによる酸化的燐酸化反応の一時的な脱共役は、ATP合成酵素の別の活性調節因子である15K安定化因子においても観察された。この蛋白は成熟型分子内シグナルをもつと考えられるが、精製標品そのままでは脱共役を起こさないのに対し、尿素で変性させるとインヒビター蛋白のプレシーケンスと同様の一時的脱共役を起こさせた。膜を透過できる前駆体はunfoldした状態であることを考えると、この脱共役は前駆体の透過時に共通するものであり、おそらくH^+の流入と共役した蛋白の移入機構が存在し、これが膜電位差の要求性であると示唆される。大部分のミトコンドリア蛋白は, N末端にpre-piecedをもつ前駆体として細胞質中で合成され,ミトコンドリアに移行する. pre-pieceが前駆体とミトコンドリア膜との結合に必要であることは,多くの蛋白質について明らかにされている.しかし,高分子の蛋白が疎水性のミトコンドリア膜を透過する分子機構は明らかでない.我々は,ミトコンドリアのATPase活性を調節する三種の蛋白因子の前駆体の膜透過を調べてきた.また,親水性の蛋白が膜内に疎水性相互作用により埋まり込むことも示してきた.本研究は,信号であるpre-pieceにより結合した前駆体が膜を通過する過程のミトコンドリア膜の構造変化を明確にする目的で行っている.すでに明らかにしたように,塩基性蛋白は酸性脂質膜と相互作用した際,膜構造がみだされ,たとえば外部からのホスホリパーゼの作用を受けやすなるなどの変化が生ずる.これがミトコンドリア蛋白の膜透過時に生ずるか否かをATPaseインヒビター前駆体に含まれる構造の合成ペプチド,チトクロームCの膜透過型であるアポ蛋白を用いて調べた.その結果,これらの蛋白の結合によりミトコンドリア膜から脂肪酸が遊離することがわかった.この脂肪酸の遊離は限定的であり,短時間で停止する.このような脂肪酸の遊離は膜を透過できない成熟型ATPaseインヒビターやホロチトクロームCでは観察されず,膜透過型蛋白に特異的ある.また,遊離するのはほとんど不飽和脂肪酸であり,ホスホリパーゼA_2の作用であることが示された.以上の結果よ,ミトコンドリア蛋白前駆体がミトコンドリア膜に結合すると膜構造が変化し,局在するホスホリパーゼA_2の活性化が起ると考えられる.ミトコンドリア蛋白の膜透過において,膜に結合した蛋白を遊離させる過程にホスホリパーゼの活性化が関与する可能性がある.細胞質中で合成されたミトコンドリア蛋白前駆体は、シグナルをプレシーケンスあるいは、成熟型分子内に持ちミトコンドリアと結合する。

ミトコンドリア蛋白前駆体に含まれるミトコンドリアの識別構造とミトコンドリア膜との相交作用について、ATP合成酵素の活性調節因子であるATPaseインヒビターを用いて検討した。すでに前駆体のアミノ末端に存在する識別構造(プレシーケンス)の部分的な(7アミノ酸残基)化学合成オリゴペプチドがミトコンドリア膜に特異的に結合し、脂質膜内に埋め込まれること、その際、膜より脂肪酸が遊離することを観察していたが、本研究では全長プレシーケンスを化学的に合成し、ミトコンドリアとの相互作用を調べ、蛋白透過におけるホスホリパーゼの役割を明らかにしようとした。遺伝子構造から決定したATPaseインヒビター蛋白のプレシーケンス部分全長と成熟型蛋白のアミノ末端6残基からなるペプチドを合成した。このペプチドはミトコンドリアの酸化的燐酸化反応を脱共役させることが示された、前述のオリゴペプチドは、脱共役を起こさず、従って脱共役は脂肪酸の遊離によって起こるものではないと考えられる。また、オリゴペプチドあるいはアポチトクロームcで観察された脂肪酸の遊離は、特殊な条件で起こる可能性が強く、膜透過におけるホスホリパーゼの活性化の役割については不明である。全長プレシーケンスによる脱共役は一時的であり短時間内で修復されること、その持続時間は添加したペプチド量に依存することがわかった。このことは別のATP合成酵素の活性調節因子である15K安定化因子についても同様であった。この蛋白はプレシーケンスをもたず、分子内認識配列をもつと考えられるが、精製標品を変性させた場合のみ、ミトコンドリアの脱共役を起こした。膜透過のためには前駆体のunfoldingが必要であることを考え合わせると、ここで観察した脱共役はH-の流入であり、これが前駆体の透過に共役している可能性が強いと結論される。
食品含有成分による細胞死誘導リガンド耐性乳癌細胞の治療効果促進機構の解析

我々が日常摂取している食品成分にも抗癌作用を持つものが存在する。それら成分の内、ビタミンCと不飽和脂肪酸(PUFA)が示す癌細胞増殖抑制メカニズムを解析した。その結果、PUFAは細胞死誘導経路の活性化と同時にオートファジー誘導経路も活性化していた。オートファジーを抑制することでPUFAはより強く細胞死を誘導することを明らかにした。ビタミンCも細胞死誘導とオートファジーを同時に誘導していたが、ビタミンCが誘導するオートファジーは細胞死を誘導するために必要であった。今後、PUFAやビタミンCが誘導する癌細胞死におけるオートファジーの役割を考慮し、治療につなげていく工夫が必要であると考えられる。本研究目的は、我々が日常で摂取する食品に含まれる成分を癌細胞特異的に細胞死を誘導するTNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)と組み合わせる事によりTRAILが誘導する癌細胞特異的な細胞死誘導効果を高め、副作用のない治療法となり得る事を示す事にある。これまでの結果からビタミンCやPUFAは細胞死誘導経路としてのアポトーシスのみならず、細胞内オルガネラの自食経路の一つであるオートファジーも誘導している事が判明した。PUFAはヒト膵臓癌細胞を移植したマウスxenograftモデルにおいて癌細胞の増殖を有意に抑制する事が示された。また、in vivo、invitro両実験系においてPUFAは酸化ストレスを誘導し、癌細胞に細胞死を誘導する事が示された。さらに、電子顕微鏡による解析により、PUFA処理した癌細胞内には細胞内オルガネラを取り囲むオートファゴソーム像が得られた。そこでin vitro実験系において、オートファジーが誘導されている事を抗LC3B抗体を用いた蛍光免疫染色により確認した。オートファジー特異的阻害剤あるいはBeclin1siRNAのトランスフェクションでオートファジーを阻害する事により、PUFAが示す抗腫瘍効果は増強される事が明らかとなり、PUFAが誘導するオートファジーはアポトーシスを阻害している事が示された。現在、PUFAとTRAILの併用により抗腫瘍効果が上昇するかどうかをヒト乳癌培養細胞を用いたin vitro実験系において解析中であり、効果が認められる場合にはマウスxenograftモデルを用いて今後解析する予定である。本年度の予備実験の結果からビタミンCやPUFAは細胞死誘導経路としてのアポトーシスのみならず、細胞内オルガネラの自食経路の一つであるオートファジーも誘導している事が判明した。そこで本年度は不飽和脂肪酸のみで癌細胞に与える影響を解析した。また、in vivo、in vitro両実験系においてPUFAは酸化ストレスを誘導し、癌細胞に細胞死を誘導する事が示された。このPUFAによる抗癌作用の解析結果は論文にまとめ、国際雑誌に投稿した。今後、TRAILとの併用投与による効果を解析していく予定であるが、PUFA単独で誘導する抗腫瘍効果の誘導メカニズムを明らかにした事は今後の解析を行なっていく上で非常に重要であると言える。本年度の研究結果から、ビタミンCはヒト膵臓癌細胞株MIA-PaCa-2を用いたin vitro,およびマウスxenograftモデルの評価により、酸化ストレスを介して細胞死を誘導していることが判明した。また、電子顕微鏡解析により、ビタミンC処理した癌細胞内には細胞内オルガネラを取り囲むオートファゴソームが検出され、オートファジーを誘導している事が判明した。さらにビタミンCはオートファジーを介してヒト膵臓癌細胞に対して細胞死を誘導していた。現在、これらの結果は国際雑誌に投稿中である。これまでの研究から不飽和脂肪酸(PUFA)はヒト膵臓癌細胞を移植したマウスxenograftモデルにおいて癌細胞の増殖を有意に抑制する事が示された。また、in vitro実験系においてPUFAは酸化ストレスを誘導し、癌細胞に細胞死を誘導する事が示された。PUFAも癌細胞に対してオートファジーを誘導していた。そこでin vitro実験系において、オートファジー特異的阻害剤あるいはBeclin1siRNAの

トランスフェクションでオートファジーを阻害すると、PUFAが示す抗腫瘍効果は増強される事が明らかとなり、PUFAが誘導するオートファジーはアポトーシスを阻害している事が示された。この結果は国際雑誌に掲載された。研究期間全体を通じた本研究により、食品含有成分ビタミンCやPUFAにより癌細胞に酸化ストレスを誘導しオートファジーが誘導されることが判明した。特にビタミンCによるオートファジーは細胞死誘導に作用し、今後、癌細胞特異的に細胞死を誘導するTNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)と組み合わせる事によりTRAILが誘導する癌細胞特異的な細胞死誘導効果を高め、副作用のない治療法となり得る事が期待される。分子細胞生物学交付申請時には、平成25年度までにヒト乳癌細胞株を移植したマウスxenograftモデルにおいてビタミンC/TRAILあるいはPUFA/TRAILの併用処理により相乗的な抗腫瘍効果が得られる事を示す予定であった。しかし、ビタミンCあるいはPUFA単独の処理によってアポトーシスのみならず、想定外のオートファジー誘導効果が見られた為、まず始めにこれらの食品含有成分によて誘導されるアポトーシスとオートファジーがどの様な関係にあるかを明らかにする事から取り組んだ。その結果、PUFA処理によって誘導されるオートファジーはアポトーシスを阻害している事が明らかにできた。ビタミンC/TRAILあるいはPUFA/TRAILを併用した場合の抗癌作用の解析という点においては当初の計画よりは遅れているが、単独で処理した場合においての効果をこれまでに明らかにできた事は大きな成果であると判断する。交付申請時には、平成24年度においてヒト乳癌細胞株を移植したマウスxenograftモデルにおいてビタミンC/TRAILあるいはPUFA/TRAILの併用処理により相乗的な抗腫瘍効果が得られる事を示す予定であった。その結果、PUFA処理によって誘導されるされるオートファジーはアポトーシスを阻害している事が明らかにできた。ビタミンC/TRAILあるいはPUFA/TRAILを併用した場合の抗癌作用の解析という点においては当初の計画よりは遅れているが、単独で処理した場合においての効果をこれまでに明らかにできた事により今後の研究の進展は円滑に進むと予想される為、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断する。
新規生合成マシナリー開拓を志向した未利用遺伝子活性化による天然物構造多様性の創出

本研究では,新たな生合成マシナリーを想起させる骨格や修飾様式を有する多様な新規天然物を,糸状菌ゲノム上に数多く存在する未利用生合成遺伝子のエピジェネティック(後天的)な活性化により創出することを目的として行った.エピジェネティック制御に関わる修飾酵素のうち,糸状菌の二次代謝制御に関わることが示唆されているヒストン脱アセチル化酵素(HDAC),ヒストンメチル化酵素,DNAメチル化酵素の各種阻害剤について,二次代謝活性化能を評価した.その結果,Zn2+型HDAC阻害剤であるsberoyl bis-hydroxamic acid (SBHA)とNAD+依存型HDAC阻害剤であるニコチンアミドが最も多くの菌に対して効果を示すことがわかった.これら2種の阻害剤を用いたケミカルエピジェネティクスにより昆虫寄生糸状菌,昆虫内生糸状菌および植物内生糸状菌を網羅的にスクリーニングし,二次代謝物の生産が顕著に活性化される菌種を探索した.ケミカルエピジェネティクスにより二次代謝物の生産が活性化した菌について,天然物探索研究を行い数多くの新規天然物を発見した.シャクヤク内生菌からは,塩素原子を有するベンゾフェノン類の生産が活性化され,生合成機構に興味が持たれる新規二量体の取得に成功した.また,Chaetomium indicumにおいて,SBHAにより休眠型NR-PKS遺伝子の発現を誘導すると,NR-PKSに生産される骨格を起点として,様々な修飾様式を有する新規芳香族ポリケタイドや[4+2]環化付加により形成されることが予想される数種の新規二量体が生産されることを構造レベルで明らかとし,新しい生合成系の発見にすることができた.ケミカルエピジェネティクスにより生産が活性化された二次代謝物の中に,抗HIV活性や抗アデノウィルス活性を有する化合物を見出していた,26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、新たな生合成マシナリーを想起させる骨格や修飾様式を有する多様な新規天然物を、糸状菌ゲノム上に数多く存在する未利用生合成遺伝子のエピジェネティック(後天的)な活性化により創出することを目的とする。初めに、これまでに最適条件を確立している、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤およびDNAメチル化酵素阻害剤条件を用いて、昆虫寄生糸状菌、植物内生糸状菌およびChaetomium属菌を網羅的に探索し、多様な新規骨格天然物の取得を目指した。その結果、Chaetomium indicumより、多様な新規芳香族ポリケチドの取得に成功した。また、二量体構造を有するchaetophenol DやE、多環式のchaetophenol C、スピロラクトン構造を有するspiroindicumide AやBなど、新規骨格を有する化合物が多く見られたことより、本手法の有効性を示すことができた。次に、安定同位体標識化合物を用いた取り込み実験により、これら芳香族化合物の生合成機構を推定し、共通中間体を与える非還元型ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子であるpksCH-2の同定に成功した。さらに、pksCH-2は通常の培養条件下ではほとんど発現していない休眠遺伝子であり、HDAC阻害剤添加によるヒストンアセチル化レベルの上昇をともなうエピジェネティック制御により発現が誘導されることも示した。植物内生糸状菌や昆虫寄生糸状菌についても、いくつかの菌において、阻害剤を用いた二次代謝の活性化に成功しており、現在新規物質取得のため、分画を進めている。今後、さらに多様な微生物資源に対して本手法を適応することで、より多くの新規骨格を有する新規天然物の発見を目指す。

本研究では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた二次代謝活性化法を、多様な糸状菌(遺伝子資源)に適応することで、ユニークな骨格を有する化合物を含め、数多くの新規化合物の取得に成功しており、本手法の有用性を示すことができた。さらに、休眠遺伝子にコードされる新たな生合成マシナリー発見にも有効であることを示した。これまでに、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤だけでも、糸状菌(遺伝子資源)を変化させることで、多様な新規天然物を取得できることを示してきた。一方で、遺伝子発現解析により、発現が誘導される遺伝子は限定的であることもわかってきた。これらのことを考慮して、以下の2つの点を重点的に行う。(1)より多くの植物や昆虫を糸状菌分離源とすることで、より多様な遺伝子資源を取得する、それらに対して二次代謝活性化法を適応することで、新規天然物、特にユニークな骨格を有する化合物の取得を目指す。(2)これまでに、糸状菌二次代謝活性化剤としての有効性を示してきたHDAC阻害剤やDNAメチル化酵素阻害剤とは異なるエピジェネティック因子をターゲットする酵素阻害剤について検討を行う。全体的な転写活性化を期待して、ヘテロクロマチン形成に関わるヒストンメチル化酵素やヒストン脱メチル化酵素阻害剤や、ヒストンアセチル化酵素の活性化剤等を検討する。さらに、最近、特定のHDACも二次代謝物の生産に必須であることが明らかになりつつあることを考慮し、選択性の高いHDAC阻害剤についても検討する。さらに、ターゲットの異なる阻害剤に関しては、併用時の効果についても検討し、より多くの遺伝子発現を誘導できる手法を確率する。
下咽頭癌手術例におけるFAK発現と腫瘍免疫応答についての研究

当初計画していた下咽頭癌FFPE標本からのPD-1,PD-L1の免疫組織染色について、条件設定に難渋しており、評価にまで至っていない。悪性黒色腫はFAKとの関連報告が多く認め、近年PD-1阻害剤により治療成績の向上を認めるが、その多くは皮膚原発の検討である。一方、粘膜悪性黒色腫の頻度は悪性黒色腫のうち0.8-3.7%と非常に稀で頭頸部原発がその半数を占めるとされる(Head Neck 2016; 38: 147-155)。主な治療は手術+術後放射線療法とされるが、まだ標準化には至っていない。局所再発、遠隔転移をきたしやすく、その5年無病生存率は20%未満と予後不良である。日光の暴露との関連はないとされていて(Melanoma Res 2011; 21: 475-482)、白人と比較し日本人において悪性黒色腫全体における割合が高いとされる。これらのことから日本人コホートにおける頭頸部原発粘膜悪性黒色腫が皮膚悪性黒色腫と同様のプロファイルなのか、知見の集積が必要である。下咽頭癌FFPE標本からのPD-1,PD-L1の免疫組織染色について、条件設定に難渋していて、本研究については当初の計画より遅れている。他方、頭頸部粘膜悪性黒色腫の検討については現状では順調であり、第43回日本頭頸部癌学会総会にて口演予定である。頭頸部原発悪性黒色腫の変異検索については年間5例程度の上乗せは可能であり、変異検索の上英文誌投稿の予定である。また、可能であればPD-1の発現および、mutation burdenについても検索できればと考えている。2010年に国立がん研究センター中央病院IRB承認以降、当院で治療を受けた頭頸部原発粘膜悪性黒色腫症例の手術もしくは生検で得られたホルマリン包埋標本からGene RadTM DNA FFPE Kitを使用してDNAを抽出し、次世代シーケンサー(Illumina社、MiSeqTM)にて治療ターゲットとなりうるBRAF、K-RAS、H-RAS、N-RAS、c-Kit、PDGFR、GNAQ、GNA11遺伝子のホットスポットの変異解析を行う。現在順次変異解析中である。主に試薬購入に際し、助成金を使用する予定である。
二重特異性を有する分子認識機能性分子を利用した新規結晶化法の開発

本研究はタンパク質の2箇所の分子表面にランダム配列を導入することで、複数の面で特定のタンパク質分子と特異的相互作用することを可能することを目指した。ラン藻由来Np275-Np276など、天然に存在するタンパク質を改変することで他のタンパク質分子との相互作用を作り出した。全般的にディスプレイ法によるセレクションから回収したDNAを発現させると、可能性が極めて低く、この系で複合体を得ることは困難であった。そのため新たに大腸菌YncEやDIXを利用した系を構築した。YncEも可溶性が低いものしか得られなかったが、DIXでは可溶性が高く、野生型よりも強い相互作用を得ることに成功した。ラン藻Nostoc punctiforme由来のNp275-Np276タンパク質は、ペンタペプチドリピート(PRP)モチーフを有し、PRP領域は四角柱状の構造を持つ。このタンパク質をベースにしたPRPの1つの面上に、24箇所(コドン)のランダム配列を導入した人工PRPのDNAライブラリ作成した。ライブラリ作成は、Np275-Np276遺伝子配列を大腸菌発現系に最適化したものを基に設計したプライマーを用いて行ったAssembly PCRと、PCR産物を制限酵素処理したものをDNAリガーゼによって連結することによって行った。従来よりもDNAリガーゼによる連結箇所を少なくし、PCRによる連結箇所を多くすることで、DNAの収率を高めることに成功した。作成したDNAライブラリから、T7RNAポリメラーゼによるin vitro転写によってmRNAを合成した。得られたmRNAの中から、リボソームディスプレイ法によって、標的足場タンパク質であるホルミルグリシンアミド合成酵素に特定的に結合する産物を生成するものを選択した。ビオチン化したホルミルグリシンアミド合成酵素を結合させたストレプトアビジン固定化磁気ビーズを用いて目的mRNAを回収し、RT-PCRによってcDNAを合成した。次のサイクルにおいて、より特異性の高い産物を生成するmRNAを得るため、cDNAをDNase I処理によって50-100bpにまで断片化したフラグメントから、Assembly PCRによるDNA shufflingによってcDNAの多様性を高めた。産物が実際に標的足場タンパク質に特異的に結合するかどうか調べるため、得られたcDNAをPCRによって増幅し、大腸菌の発現ベクターに挿入し、大腸菌発現系を構築した。本研究はラン藻Nostoc punctiforme由来Np275-Np276をベースにして設計した人工Penta-peptiderepeatprotein (PRP)の表面にランダム配列を導入することで、複数の面で特定のタンパク質分子と特異的相互作用することを可能する。それを利用して、構造を知りたい標的分子と任意の足場タンパク質分子とを連結することで結晶化用巨大足場タンパク質の創製を目指すものである。本年度は人工PRPと相互作用する足場タンパク質との複合体の結晶化を目指した。足場用の標的分子として、H26年度に用いたホルミルグリシンアミド合成酵素は安定性に問題があり、長期保存に向かないことが分かった。そのためH27年度は新しい標的分子として大腸菌由来の4-alpha-glucanotransferase(MalQ)を採用した。MalQは安定で、長期保存が可能であることを確認した。これまでに人工PRPとMalQとの複合体を調製し、その結晶化に取り組んで来たが、現状では結晶は得られていない。一方、従来利用してきたリボソームディスプレイ法ではRNAをテンプレートとして取り扱うため、リボヌクレアーゼに対する感受性が高い。そのためヌクレアーゼ混入に極力注意を払う必要がある。一方、安定性の高いDNAを取り扱うCISディスプレイ法では、ヌクレアーゼ混入に大して過敏に対処する必要がない。CISディスプレイ法を利用することで、取り扱いが従来よりも容易になった。H27年度中にCISディスプレイ法による系を確立することが出来たので、従来よりも迅速に実験を進めることが可能になった。人工PRPと相互作用するscaffoldタンパク質との複合体の調製を行ったが、現状では研究計画で予定していた結晶化に至っていない。人工リピート配列タンパク質を利用した、複数の面を用いて特定のタンパク質分子と特異的相互作用することが可能な足場タンパク質の創製を目指して研究を行ってきた。平成28年度は、平成27年度中に確立したCISディスプレイ法による系を用いて、標的分子に特異的に相互作用する人工足場タンパク質の創製を目指した。従来、足場タンパク質として用いて来た人工Penta-peptiderepeatproteinは、大腸菌発現系において発現量が極めて少なく、標的タンパク質との複合体の結晶化には得られるタンパク質試料の量の面で不適当であることが分かった。そのため、新たにβプロペラフォールドを利用した系とユビキチンフォールドを利用した系を確立し、相互作用の創出を試みた。βプロペラフォールドでは表面、裏面それぞれに複数のループ領域があり、それぞれにランダム配列を導入することが可能である。またユビキチンフォールドタンパク質はβシート構造を持ち、その両端が分子表面となっているので、分子表面の部分にランダム配列を導入することが出来る。βプロペラフォールドタンパク質として大腸菌YncE、ユビキチンフォールドタンパク質としてDIXドメインをテンプレートとして利用した。いずれの新しい系でも大腸菌で良く発現させることが出来ることを確認した。特にDIXドメインを利用した系では標的分子との複合体の調製を行い、X回折実験では低分解能ではあったが、標的分子との複合体の結晶を得ることに成功した。

ラン藻由来Np275-Np276など、天然に存在するタンパク質を改変することで他のタンパク質分子との相互作用を作り出した。全般的にディスプレイ法によるセレクションから回収したDNAを発現させると、可能性が極めて低く、この系で複合体を得ることは困難であった。そのため新たに大腸菌YncEやDIXを利用した系を構築した。YncEも可溶性が低いものしか得られなかったが、DIXでは可溶性が高く、野生型よりも強い相互作用を得ることに成功した。平成26年度中に予定していた、リボソームディスプレイ法による、標的足場タンパク質に結合する人工PRPの遺伝子の調製に成功した。従来利用してきたリボソームディスプレイ法よりも取り扱いが容易なCISディスプレイ法による系を確立することが出来たので、今後はCISディスプレイ法を利用することで従来よりも効率的かつ迅速に実験を行うことが可能になる。それによって、研究計画書に記載した複合体の構造解析に至ることを期待している。構造生物学人工PRPが特異的に標的足場タンパク質に結合するかどうか、大腸菌発現系によって人工PRPを調製し、ホルミルグリシンアミド合成酵素との相互作用をプルダウン法によって調べる。また、人工PRPの裏面にもランダム配列を導入することで、PRPの両面を利用した多重特異性分子を創成する。裏面と相互作用させるタンパク質として、GST, MBPなどの構造既知のタンパク質を利用する。主に2つの理由があり、一つは当初の研究計画よりもやや遅れたことにより、遅れた分の消耗品費を使用しなかったこと、もう一つはCISディスプレイ法の採用により、従来よりもグレードの低い消耗品の利用が可能になったことやヌクレアーゼ混入防止に必要な物品を購入しなくても良くなったことによる。従来よりも効率的なDNAライブラリの作成法の構築に成功し、使用する酵素の種類や量、スピンカラムやその他の樹脂消耗品の使用量を少なくすることができたため、当初の計画よりも少ない予算で実験を進めることができた。当初の研究計画よりもやや遅れた分に相当する費用として利用するほか、可能であれば実験時間短縮に寄与出来る物品の購入に充てる。PCR酵素や逆転写酵素をこれまで用いて来たものよりも高価ではあるが、より高性能のものに置き換えることで、より効率的に実験を進める予定である。
天体衝突が地球表層環境に与える影響の解明:巨大蒸気雲中の化学反応の解析

本研究計画では、K/T巨大衝突蒸気雲中での硫黄酸化物の酸化還元反応プロセスの解明を目的とした実験と理論計算を行った。実験では、Anhydrite(硬石膏、CaSO4)に高出力パルスレーザーを照射することにより、高温高圧の蒸気雲を発生させる。この模擬衝突蒸気雲の化学組成を本計画で導入した四重極質量分析器を用いて測定し、蒸気雲のサイズ・初期温度圧力状態に対するSO2/SO3比の経験的なスケーリング則を求めた。さらに、実験の精度向上と実験条件のダイナミックレンジの拡大を目指した改良を行った。その第一は、真空チェンバーに自動ステージを導入して照射一回ごとに試料の新鮮な面が照射されるシステムを作った。これにより、SO_2/SO_3比の測定誤差を従来の半分程度にまで小さくすることに成功した。さらに、東京大学に新たに導入された大出力パルスレーザー(15J/パルス)を用いてレーザー照射実験を行った。これにより、これまでより約2桁広い実験条件をカバーするSO_3/SO_2比のスケーリング則を決定することが可能となった。一方理論計算からは、今までとは全く違う筋書きに沿った硫酸エアロゾルによる日射遮蔽・気候変動のメカニズムが存在し、それが従来の説よりも継続時間がはるかに長い気候変動を起こした可能性があることがわかった。従来は、衝突地点の硫酸塩岩が蒸発すると硫黄酸化物が生成すると考えられてきた。しかし、実際には主に硫酸塩岩と炭酸塩岩が混合した堆積物として存在しており、衝突蒸気雲内でも硫黄と炭素が結合して硫黄酸化物以外の硫黄を含むガスも放出された可能性が高い。申請者が簡単なモデル計算を行った結果、硫黄と炭素の化合物が放出された場合には、硫黄酸化物の場合よりも圧倒的に長い硫酸エアロゾルによる衝突の冬の継続時間が期待できることがわかった。本年度の研究においては、新規導入した照射装置を用いたレーザー照射実験と硫黄酸化物の酸化反応速度の理論計算を行った。レーザー照射実験においては、照射により生じる高温プリュームが実際の高速衝突蒸気雲の条件を再現しているのか、もしそうならどんな衝突条件の衝突蒸気雲を再現しているのかの2点を調べることに主眼をおいた。従来の高速分光法では温度と化学組成の測定しかできず、圧力の推定ができなかったため蒸気雲の熱力学状態を一意に決定することはできなかった。しかし今回、水素のH_α線幅の高速分光測定による圧力測定法を開発し、この問題に解決の目処をつけた。例えば、これまでの実験で主に使ってきた10^<12>W/sの強度のレーザー照射で発生するプリュームの熱力学状態が、小惑星が5080km/sで地球に衝突した場合に生ずる衝突蒸気雲に対応することが分かった。理論計算においては、文献データを基にSO_2からSO_3への酸化反応の運動論的反応モデルを作り、硫酸塩岩の高温蒸気雲からのSO_3の生成量を推定した。この計算では、レーザー実験で得られるSO_3量の2桁以上も低い値が得られた。これは、これまで文献に報告されている化学反応と異なる高効率反応経路が存在することを示唆する。ただ、文献データに基づいた理論モデルをK/T絶滅事件において起きたとされる直径10kmの巨大隕石の衝突にそのまま適応した場合においても、SO_3の生成比率は非常に高く、発生する硫黄酸化物の約50%程度がSO_3になるという結果を得た。もしレーザー照射実験から示唆されるような未知の酸化反応経路が存在するならばSO_3の発生高率はさらに大幅に大きくなり、硫黄酸化物全体の99%以上を占める可能性も大きくなる。