hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異種トゲウオ間のゲノム不適合と生殖隔離の分子機構

特に、この分子が、SUMOタンパク質が存在するような領域にあることがわかってきた。これまで、近縁種間でのクロマチン制御分子の機能的な差異については、ハエやマウスや植物で報告があるのみであり、実際の野外生物での例としては初めてであると考えられる。現在はこの分子のノックアウトイトヨも解析中であり、来年度にその結果を踏まえて論文発表へと進めて行くことが期待される。また、イトヨの腎臓からとった初代培養細胞を増殖させることにも成功した。この実験システムは、私の研究室において新しい可能性を提供するものであり、非常に貴重に重要な成果と言える。転座領域におけるゲノム上の特徴を明らかにするために、日本海イトヨと太平洋イトヨのゲノムを解読し、ネオ性染色体上のゲノム配列の特徴を明らかにした。また、近縁のイトヨ種間の雑種不妊の候補遺伝子として修飾ヒストンに結合するTRIM類の遺伝子を発見した。この遺伝子は、種間で異なるタイプの修飾ヒストンに結合する。この候補遺伝子の遺伝子操作イトヨの作出に成功した。性染色体融合がどの程度普遍的な現象であるのかを明らかにするために、データベースを作出し解析するとともに、その原因として、メス減数分裂ドライブ、有害融合のdriftと性的葛藤選択の可能性を提唱した。異種トゲウオ間の雑種異常と種分化の研究のモデルとして、北海道東部に生息する汽水トミヨ、淡水トミヨ、エゾトミヨの三種のトゲウオ種群について、遺伝的分化と表現型分化を解析し、これら三種が下流から上流へ棲み分けて共存していること、三種間での交雑が極めて稀にしか生じないことを報告した。また、これら三種が異なる塩分耐性能をもつことを見いだし、下流から上流にかけて生息しているトゲウオの海水耐性が順次低下していくことを見いだした。一方、捕食防御に関わる鱗板(体の側面の骨化組織)の変異は、単純な上流-下流勾配にそった変異はみられず、また、その遺伝基盤は近縁のイトヨ属とは異なる遺伝子で決定されていることが明らかになった。イトヨ属では、Eda遺伝子が鱗板をコントロールしていることが既に知られているが、トミヨ属ではEda遺伝型と鱗板表現型に相関は見られなかった。これらについて論文報告した。全ゲノム解読とQTL解析によって、日本のイトヨ種群の雑種異常の候補遺伝子を複数同定し、現在機能解析中である。ネオ性染色体のゲノム解析を行い、ネオY染色体の退縮が軽微であること、SNPレベルではネオX染色体とネオY染色体間で分化が起こっており、その一部がシス変異によって雌雄間の遺伝子発現差を生み出しているようであること、ネオX染色体の一部の遺伝子は急速進化(非同義置換率の上昇)を示していることを明らかにした。この成果について、現在、論文投稿の準備中である。既に10報以上の査読付き論文が国際雑誌に掲載、あるいは、受理されている。まず、イトヨ種群における雑種異常と種分化の候補遺伝子が既に複数見いだされており、これらの機能解析に取りかかっている。さらに、これらの普遍性を明らかにするためにトミヨやメダカといった別の分類群における研究にも着手した。
宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎで探る深宇宙

宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎを用いて、深宇宙の様々な情報を得るための研究を行った。(1)温度揺らぎの理論計算の精度を詳細の調べ、数値誤差が0.2%以下である計算コードを開発した。このコードの計算結果を温度揺らぎの観測と比較することで、宇宙論パラメターの精密な決定が可能となる。(2)WMAP衛星による温度揺らぎの測定結果を用いて、40万年の時代の重力定数の値に制限を付けた。観測される温度揺らぎの空間パターンは、重力定数に依存する40万年当時の宇宙の膨張速度、大きさと密接な関係があることから制限が付くのである。その結果、最大限でも現在の値と5%以上異なっていてはいけないことを明らかにした。(3)WMAP衛星の示唆する宇宙誕生後1億年の時代での再加熱過程を可能にするモデルを三つ提案した。一つ目は、揺らぎの統計的性質が非ガウス的であり、初期宇宙にすでに大きな密度揺らぎが存在していて、それが再加熱を引き起こすモデル、二つ目は、重い粒子が紫外線を出して崩壊することで、再加熱を引き起こすというモデル、そして最後が、通常考えている断熱的揺らぎ以外に、等曲率揺らぎが存在していて、それが初期構造形成、ひいては再加熱を誘発する、というモデルである。いずれのモデルでも、単純な冷たいダークマターの場合の構造形成シナリオでは不可能な1億年の時期での再加熱過程が可能となることを示した。(4)宇宙マイクロ波背景放射には偏光成分が存在していることに着目し、その偏光ベクトルの磁場によるファラデー回転から、銀河団の磁場の詳細な構造を構築できることを提案した。今年度の研究実績は大きく3つに分けられる。1.宇宙マイクロ波背景放射の偏光成分で、銀河団の磁場を再構成する試み宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎによって生成される偏光成分が銀河団磁場によって受けるファラデー回転効果をもちいて、磁場の強度や性質を知る試みを、銀河団形成の大規模シミュレーションの結果を用いて行った。ここで得られた手法を用いれば、将来の観測によって銀河団磁場の詳細な構造が明らかになる可能性がある。2.スカラー・テンソル重力理論が生成する宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎ一般相対性理論に対抗するほとんど唯一の重力理論である。スカラー・テンソル重力理論の場合に予想される宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎを詳細に計算し、一般相対性理論の場合と比較した。新たな人工衛星の温度揺らぎの観測結果を用いれば、両者の違いから、スカラー・テンソル重力理論に対する、今から約137億年前の制限が得られる。3.水素原子の再イオン化過程宇宙マイクロ波背景放射に新たな温度揺らぎを引き起こす水素原子の再イオン化過程を詳細に検討し、その空間分布の理論計算と、最新の観測結果を比較することで、再イオン化過程に対する新たな知見を得ることに成功した。本年度は、2003年2月に初期成果が報告されたWMAP衛星の結果を受けて、主として宇宙初期での天体形成と、その結果として銀河間空間がどのようにイオン化していくのかについて、集中的に調べた。(1)ガスを含んだ数値シミュレーションにより、初期天体形成過程を詳細に調べた。そこでは特に、化学反応を正確にいれることで、正しい冷却の過程を数値計算に取り入れた。(2)インフレーション期に生成される通常のガウス的性質を持っている密度揺らぎによって生み出される構造では、イオン化はWMAPの観測するような初期には達成しがたい。そこで、より早い時期に、構造が形成可能となる、非ガウス的性質を持っている初期揺らぎの存在によって、WMAPの観測と合うようなイオン化が達成できる可能性について調べた。(3)重たい未知の素粒子が紫外光を出して崩壊する過程が存在すれば、やはり早い時期でのイオン化が達成できる可能性があることを示した。

WMAP、及び将来のさらに精密な衛星計画であるPLANCKによって、宇宙背景放射の温度揺らぎをこれまでにない精度で詳細に観測できるようになりつつある。一方で、温度揺らぎの理論計算に関しては、一般に流布しているコードがブラックボックス的に使われており、その計算精度については、これまであまり詳しい解析がなされていなかった。そこで、国際的な協力のもと、計算精度について非常に詳細に調べた。その結果、0.2%レベルの範囲で、様々な計算コードがよい一致を示していることが明らかになった。本年度は、まず前年度に引き続き、宇宙マイクロ波背景放射の温度分布を詳細に観測したWMAP衛星の成果を受けて、初期宇宙での星・銀河などの形成過程とその結果として銀河間空間がどのようにイオン化していくのかについて、調べた。具体的には、通常の断熱的な揺らぎではなく、等曲率揺らぎが存在している場合について研究を進め、そのような揺らぎの存在によって構造が効率よく形成され、十分に早い時期での宇宙の再イオン化が可能であることを示すとともに、Ly-alpha吸収線系などの観測とも矛盾なくモデルを構築できることを示した。次に、やはりWMAP衛星の成果を用いて、初期宇宙での物理定数、特に重力定数が現在のものと果たして同じである必要があるのかをしらべた。重力定数の時間進化を予想する理論として、スカラー・テンソル重力理論を採用し、その理論に基づく宇宙マイクロ波背景放射の温度揺らぎを計算し、WMAPの結果と比較した。その結果、重力定数は宇宙が誕生して40万年の時代でも現在と5%以上異なった値ではあり得ない、ということを見つけ出した。WMAP衛星の結果、現在の宇宙にはダークエネルギーが主要な成分であることが明らかになった。そのことを受けて、宇宙の未来がどうなるか、特に陽子が崩壊した後に果たしてポジトロニウムと呼ばれる陽子・陽電子で構成されるある種の原子が形成されうるのかどうか調べた。結果は、宇宙の膨張速度が加速していくために、ポジトロニウムを形成しようとする力よりも、宇宙膨張の力が勝り、形成されないことがわかった。
ミクロポーラス反応場における水素化脱硫反応機構と高活性脱硫触媒の設計

本研究では、地球環境改善のための高活性脱硫触媒を開発するために、種々のゼオライト(USY,HZSM-5など)に種々の貴金属(Pt,Rh,Pd,Ru)を担持した触媒を調製し、これらの触媒上でのチオフェンの水素化脱硫反応(HDS)機構を検討した。この結果、USY担持貴金属触媒のHDS活性は貴金属の種類によって大きく変化し、Pt/USY触媒が最も高いHDS活性を示した。この触媒のHDS活性は実用触媒であるCoMo/Al_2O_3触媒よりも高いものであった。Pt/USY触媒のHDS活性は反応時間とともに徐々に低下する傾向を示したが、PtとPdとを組み合わせることにより、HDS活性の低下をかなり改善することができた。一方、HZSM-5担持貴金属においても、担持する貴金属の種類によってHDS活性は大きく変化し、とくにPt/HZSM-5担持貴金属においても脱硫率100%近い活性と長時間安定な活性を示すことが明らかとなった。さらに、Pt/USYおよびPt/HZSM-5触媒上でのチオフェンのHDS反応機構をFT-IRを用いて詳細に検討した。この結果、チオフェンはUSY,HZSM-5細孔内のブレンステッド酸点と強く相互作用して活性化され、一方水素は外表面上のPt上で活性化されてスピルオーバー水素となり、細孔内で活性化されているチオフェンを攻撃してHDS反応が進行することが明らかとなった。
ポスト・ヒューマン時代における「他者の倫理」：レヴィナスと現代仏語圏倫理学研究

本研究では、20世紀フランスで活躍した哲学者であるエマニュエル・レヴィナスの倫理思想に焦点を当てた研究を行なった。レヴィナス哲学の意義についてはこれまで多くの研究があるが、主に哲学史的な観点からのものが多かった。これに対し本研究では、科学技術が進展し従来の「人間」概念が名実ともに変容し「ポスト・ヒューマン」という概念が提示される現代的な文脈のなかで、レヴィナスおよび現代仏語圏の倫理思想がどのように意義を有するかを検討した。国内外での文献収集・精読、専門研究者からのヒヤリング、また現代の幾人かの思想家との比較研究を行なった。その成果は2017年中に単行本として公開予定である。本年は当研究課題にとって1年目となるが、主として研究課題に関連する研究図書・資料の収集および分析と、その成果公表にあてられた。関連図書・資料に関しては、国内で調査・収集を続けたほか、8月にフランス(パリ市)への出張を行ない、当地の各図書館・専門書店において調査・収集を行なった。また、この出張を利用し、フランスの関連分野の研究者との意見交換も行うことができた。研究内容については、第一に近年公刊の『レヴィナス著作集』の精読・翻訳作業を進めている。その成果は、2015年に単行本として公刊される予定である。また、レヴィナス研究会との共催で定期的に研究会を開催し、日本における若手研究者との意見交換を行なった。これらの成果は、第一に、9月に行なわれた日仏哲学会・レヴィナス研究会共催シンポジウムにおける口頭発表で公表した。そこでは、『レヴィナス著作集』第一巻の精読に基づき、そこから戦後のレヴィナス哲学の展開を再解釈する可能性を指摘した。第二に、10月に行なわれた脱構築研究会主催のシンポジウムにおいては、ジャック・デリダとレヴィナスとの接点に関する発表を行なった。第三に、所属する大学内の紀要において、レヴィナスの「人間主義」をあらためて考え直すことを主眼とした論文を執筆した。この論文は、主著『全体性と無限』の読解に基づき、レヴィナスにおける「人間」概念の外延について再考を求めるものであり、当研究課題を今後いっそう展開してゆくための土台となるものである。本年度は科研費研究課題の遂行のために以下を実施した。研究活動としては、第一に、5月15日に、ニース大学名誉教授で物理学・科学哲学を専門とするジャン=マルク・レヴィ=ルブロン氏の来日に合わせ、研究会を開催した。豊橋技術科学大学講師の中村大介氏とともに、現代の科学哲学の課題についての最新の知見を提供いただき活発な議論を行なうことができた。第二に、8月8日に、アーレント研究会シンポジウム「アーレントと現代の科学・技術」にて、ハンナ・アーレントとギュンター・アンダースに関する発表を行った(その後、学会会報にて公刊された)。第三に、8月10日から31日にかけて、フランス・パリに出張し、国立図書館・専門書店等で最新の研究文献を調査・収集・精読することができた。第四に、9月20日の第10回ハイデガー・フォーラムにて、レヴィナスとハイデガーについての研究発表を行い、国内の専門家からの多くのコメントを得た(論文は2016年度に公刊予定)。第五に、1月30日に研究会を主宰し、横地徳広氏の近著『超越のエチカハイデガー・世界戦争・レヴィナス』をめぐる公開討論会を実施した。国内から各分野の研究者を招聘し、有益な議論の場を持つことができた。第六に、2月に早稲田大学および中央大学においてレヴィナスと戦争の問題について発表した。研究成果の公表としては、上のほか、レヴィナスに関しては、斎藤慶典氏・小手川正二郎氏とともにレヴィナスの伝記として最も信頼できる著作であるサロモン・マルカ『評伝レヴィナス生と痕跡』を翻訳出版した。また関連する文献の書評を3本執筆した。現代仏語圏倫理学に関しては、その第一人者とも言えるジャン=ピエール・デュピュイについて、共編著『カタストロフからの哲学』を公刊した。その他、関連する複数の論文の執筆・投稿を行なっており、次年度の公刊が待たれている。申請時に提出した研究実施計画によれば、今年度は、第一に、フランス語圏の現代倫理学研究のうち、技術哲学、科学哲学、思想史、政治思想の四つの軸に関する研究状況の調査、第二に、フランスならびにベルギーにおける関連分野の研究者との意見交換を主たる内容としていた。5月に実施したジャン=マルク・レヴィ=ルブロン氏を招いての研究会は、技術哲学・科学哲学に関する研究目的に沿うものであったし、また8月のフランス短期滞在時は研究状況の調査および関連研究者との意見公刊をすることができた。また、とりわけジャン=ピエール・デュピュイについての著書を共編著のかたちで公刊することができたのは特記すべき成果である。思想史に関しては、レヴィナス哲学を、ハイデガーやアーレント、アンダースとの関係のなかにおいて考察する作業を行った。政治哲学についても、レヴィナスと「戦争」という問題について研究を進め、その成果をシンポジウムにおいて公表した。以上のとおり、研究実施計画におおむね沿ったかたちで順調に研究が遂行されていると考える。本年度は、本研究課題の最終年度にあたり、これまでの研究のとりまとめおよび公表を中心に行った。研究遂行に必要な書籍の購入を行なったほか、8月にフランスに海外出張を行い、現地で文献調査を行うとともに、主にフランス国立図書館において研究のとりまとめ作業を行なった。

日本国内では、これまでの研究についての資料整理および論文執筆を行った。研究成果については、第一に、レヴィナスにとって最も重要な参照・批判先であるハイデガーについて、未公刊資料等の新資料を用いて解明をめざした論文を公刊した。この未公刊資料については、翻訳作業を進め、その一部を共訳のかたちで公刊した(『エマニュエル・レヴィナス著作集2:哲学コレージュ講演集』)。残りの第3巻についても、翻訳をほぼ完了しており、来年度に公刊を予定している。また、レヴィナス思想の要の一つである「ユダヤ性」の問題については、デリダによる当該問題を扱った著作『最後のユダヤ人』の翻訳を公刊し、解説を発表した。本研究課題のもう一つのテーマである「ポスト・ヒューマン」をめぐる問題については、これに関わる現代の科学技術の哲学についてフォローした。その内容・成果としては、レヴィナスと同時代の20世紀ドイツの思想家らが重要だが、まずギュンター・アンダースについては原子爆弾についての倫理的考察に関する論考を『現代思想』を発表、ハンナ・アーレントについては科学技術振興機構においてベルギーにてアーレント思想を科学技術政策との関係で論じるニコル・ルワンドル氏との対話を行ない、ハンス・ヨーナスについては日本におけるヨーナス研究者より専門知識の教示を得た。また、日本の科学研究の現状については池内了氏に講演をしていただき、専門知識の教示を得た。これらの成果の一部はフランス専門誌にて仏語論文を公刊した。本研究では、20世紀フランスで活躍した哲学者であるエマニュエル・レヴィナスの倫理思想に焦点を当てた研究を行なった。レヴィナス哲学の意義についてはこれまで多くの研究があるが、主に哲学史的な観点からのものが多かった。これに対し本研究では、科学技術が進展し従来の「人間」概念が名実ともに変容し「ポスト・ヒューマン」という概念が提示される現代的な文脈のなかで、レヴィナスおよび現代仏語圏の倫理思想がどのように意義を有するかを検討した。国内外での文献収集・精読、専門研究者からのヒヤリング、また現代の幾人かの思想家との比較研究を行なった。その成果は2017年中に単行本として公開予定である。交付申請書に記載した「研究の目的」においては、本年度が当研究課題一年目ということもあり、目的は研究図書・資料の収集・分析およびフランス短期滞在を利用した現地調査に限られていた。これらの目的は十分に達成されたと言えるが、それに加えて、「研究実績の概要」にも記したように、研究課題に密接に関連するものだけでもシンポジウムでの発表2件と論文1件において、研究成果を公表することができた。この点に当初の計画以上の進展が認められる。次年度は最終年度にあたるため、これまでの研究の総まとめを行なう。とりわけ、レヴィナスに関する研究をまとめた単行本を仕上げて公刊することが第一の目的となる。また、第二の目的は、申請書にも記したように、現代フランスを中心的なフィールドとする倫理学研究の成果を取り入れ、「科学技術」と「人間」の関係に焦点を当てた研究を完成させることである。これについては、とりわけ「カタストロフ」という概念を軸に研究のとりまとめを行なっており、その成果についても単行本のかたで公刊することを目指す。
白神山地における社会‐環境問題としての猿害解決を目的とした領域横断的研究

1、ニホンザル生息密度推定:昨年度に引き続き白神山地北東部に生息するニホンザルの捕獲を実施し、捕獲個体の内1頭に新たに発信器を装着し、行動圏推定法による個体数・群れ数の算出を試みた。ここで算出した個体数・群れ数と、当該研究で開発した足跡カウント法によって推定した個体数・群れ数を比較し、当該推定法の精度・確度の更なる検証を行った。その結果、気象条件や調査者によって、雪面に残される足跡カウント数にバイアスが発生しやすいことが明らかになり、当該推定法を実施する際に十分な事前配慮が必要であることが示唆された。2、猿害発生にかかわる社会的要因:当該地域の農家を対象に実施したヒアリング調査(猿害発生農地、耕作放棄地の分布、農家の被害意識・営農意欲など)の取りまとめとデータ解析を継続した。白神山地東部地域において、本種の更なる分布拡大が顕著にみられ、被害も徐々に発生しはじめている現状が明らかになった。一方、被害が本格化する前の地域において、被害の「予防」に対する意識は低い。被害に対する予防的対処の重要性を地域に普及するための啓蒙活動と、人の生活圏へと向かう更なる分布回復を抑制するための積極的な個体群管理手法の確立が望まれる。3、ニホンザル樹皮食が被採食樹木に与える植物生理学的影響:サル樹皮食による植物生理学的な影響評価を行うために、積雪期にサルの樹皮採食の選択性を明らかにするための調査を昨年度に引き続き実施した。その結果、採餌選択性には年変動が大きいことが明らかになった。この年変動は、特定樹種への過度な採食圧の回避(=枯死の回避)に貢献している可能性が示唆された。また、サルに採食された樹木のモニタリングを今年度も継続した結果、サルが最もよく採餌するヤマグワを除き、枯死に至った樹木種は確認されなかった。1生息密度調査:猿害問題に対処するにはニホンザルの生息分布や個体群動態に関する基礎的情報が不可欠である。本研究では白神山地北東部(特に青森県西目屋村)に生息するニホンザル計20頭を捕獲し、内6頭に発信器装着、ラジオテレメトリー法による追跡を実施し、行動圏推定法による群れの絶対密度算出を試みた。また同時に、群れ分布と密度の推定の簡便法として、足跡カウント法によるラインセンサス、さらにはスノーモービルを活用した仕切り法を実施した。行動圏推定法による絶対密度と、簡便法による広域的な推定生息密度には高い相関がみられたことから、簡便法による生息密度推定の有効性を確認することができた。2猿害発生にかかわる社会的要因に関する調査:猿害問題に対処するには、農村の土地利用の変遷や、農家の被害意識の把握も必要である。そこで、青森県西目屋村、鰺ケ沢町、深浦町を中心に、猿害発生農地、耕作放棄地の分布、農家の被害意識などを明らかにする現地調査を実施した。全ての町村において、ここ数年で被害が拡大していた。特に日本海側の集落では生活被害も発生し、サルに対する住民感情は著しく悪化していた。一方で、耕作放棄は急速に発生しており、実質的な被害の「量」の減少は確認された。3サルを中心とした種間関係に関する調査:ブナ帯におけるサルの樹皮食による植物生理学的な影響評価を行うために、積雪期にサルの樹皮採食の選択性を明らかにするための調査を実施した。その結果、人工林内におけるヤマグワの選択的な採餌は顕著で、これまでの採餌によるものと考えられる樹木の枯死も確認された。さらに、広葉樹林内においては、一部の低木に対する積極的な採食圧も確認され、同様に採餌によるものと考えられる枯死木も確認された。今後、継続したモニタリングにより、被採餌植物への影響評価を実施する。1ニホンザル生息密度:白神山地北東部に生息するニホンザル計18頭を捕獲した。その内7頭に発信器装着し、ホームレンジ推定法による個体数・群れ数の算出を試みた。また、個体数・群れ数及びそれらの分布の推定法として昨年度開発した足跡カウント法を広域的な範囲に応用した。その結果、個体数・群れ数密度は、集落近隣の低標高域の二次林で顕著に高まっていることが明らかになった。2猿害発生にかかわる社会的要因:当該地域の農家を対象に実施したヒアリング調査(猿害発生農地、耕作放棄地の分布、農家の被害意識・営農意欲など)を当該年度も継続した。また、これらのデータと農業集落カードをベースに、今後の猿害問題の動向予測を実施した。その結果、近年の人口減少は、各農村集落における離農や都市部への移住を促進させており、中長期的には農業被害問題は沈静化することが予想された。一方で、都市域で生活被害問題(人身被害・家屋侵入)が発生しはじめており、積極的な個体数・群れ数管理を実施しければ、問題は今後拡大・深刻化することが予想された。3ニホンザル樹皮食が被採食樹木に与える植物生理学的影響:昨年度に引き続き、サル樹皮食による植物生理学的な影響評価を行うために、積雪期にサルの樹皮採食の選択性を明らかにするための調査を実施した。また、被採食樹木の継続的なモニタリングも実施した。その結果、選択的な採食が確認されたヤマグワの枯死は確認されたものの、そのほかの樹木への影響は低い可能性が高い。最終的に影響を評価するには、より継続したモニタリングが必要とされる。

1、ニホンザル生息密度推定:昨年度に引き続き白神山地北東部に生息するニホンザルの捕獲を実施し、捕獲個体の内1頭に新たに発信器を装着し、行動圏推定法による個体数・群れ数の算出を試みた。ここで算出した個体数・群れ数と、当該研究で開発した足跡カウント法によって推定した個体数・群れ数を比較し、当該推定法の精度・確度の更なる検証を行った。その結果、気象条件や調査者によって、雪面に残される足跡カウント数にバイアスが発生しやすいことが明らかになり、当該推定法を実施する際に十分な事前配慮が必要であることが示唆された。2、猿害発生にかかわる社会的要因:当該地域の農家を対象に実施したヒアリング調査(猿害発生農地、耕作放棄地の分布、農家の被害意識・営農意欲など)の取りまとめとデータ解析を継続した。白神山地東部地域において、本種の更なる分布拡大が顕著にみられ、被害も徐々に発生しはじめている現状が明らかになった。一方、被害が本格化する前の地域において、被害の「予防」に対する意識は低い。被害に対する予防的対処の重要性を地域に普及するための啓蒙活動と、人の生活圏へと向かう更なる分布回復を抑制するための積極的な個体群管理手法の確立が望まれる。3、ニホンザル樹皮食が被採食樹木に与える植物生理学的影響:サル樹皮食による植物生理学的な影響評価を行うために、積雪期にサルの樹皮採食の選択性を明らかにするための調査を昨年度に引き続き実施した。その結果、採餌選択性には年変動が大きいことが明らかになった。この年変動は、特定樹種への過度な採食圧の回避(=枯死の回避)に貢献している可能性が示唆された。また、サルに採食された樹木のモニタリングを今年度も継続した結果、サルが最もよく採餌するヤマグワを除き、枯死に至った樹木種は確認されなかった。
精神異常惹起物質による特異的発現蛋白の同定とその精神分裂病疾患者死後脳における変化

1、ヒトではフェンサイクリジン投与後の覚醒過程で精神症状が出現することが多いことに着目しフェンサイクリジンの単回投与ラットでは、投与後24時間における効果(遅延性効果)を検討し、まず側座核においてmRNAデイファレンシャル・ディスプレイ法を用いて、変化する数個のmRNAを同定した。2、1で同定されたmRNAをRT-PCRにより増幅し、得られたDNA断片の塩基配列決定したところそのうちの一つが既報告の塩基配列(機能未知)と一致した。3、既報告の塩基配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを用いたNothern blotを行い、フェンサイクリジン投与後24時間ラットの側座核での変化を確認した。現在、cDNAクローニングにより全塩基配列を決定中である。4、以上の研究と平行する形で、特異的抗体を用いた免疫定量により分裂病死後脳における生化学的変化を検討した。細胞内情報伝達系で重要な役割を担うホスフォリパーゼCβの左上側頭回特異的な変化を同定した。健常者でみられる左右半球の非対称性が分裂病患者では失われていたことから、分裂病ではなんらかの神経発達異常がその病態に関与する可能性が示唆された。1、分裂病の陰性症状および再発脆弱性の動物モデルとして、フェンサイクリジンの単回投与ラットおよびメタンフェタミン間欠投与により行動学的に逆耐性を形成したラットを作製し、大脳皮質、辺縁系中心に脳内7部位(内側前頭前野・背外側前頭葉皮質・側座核・前帯状回・線条体・嗅内皮質・海馬)よりmRNAを抽出した。2、ヒトではフェンサイクリジン投与後の覚醒過程で精神症状が出現することが多いことに着目し、フェンサイクリジンの単回投与ラットでは、投与後24時間における効果(遅延性効果)を検討し、まず側座核においてmRNAディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて、変化する数個のmRNAを同定した。これらmRNAをRT-PCRにより増幅し、得られたDNA断片の塩基配列を現在決定中である。3、以上の研究と平行する形で、特異的抗体を用いた免疫定量により分裂病死後脳における生化学的変化を検討した。細胞骨格蛋白であるα-fodrinおよび細胞情報変換因子であるG蛋白の左上側頭回特異的な変化を同定した。4、次年度は、フェンサイクリジン投与によって変化したmRNAから同定された蛋白に対する特異抗体を用いて、分裂病死後脳における変化を検討し、分裂病の神経発達異常仮説をさらに検証する予定である。これらmRNAをRT-PCRにより増幅し、得られたDNA断片の塩基配列決定したところ、そのうちの一つが既報告の塩基配列(機能未知)と一致した。既報告の塩基配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを用いたNothem blotを行い、フェンサイクリジン投与後24時間ラットの側座核での変化を確認した。細胞骨格蛋白であるα-fodrinおよび細胞情報変換因子であるG蛋白、細胞内情報伝達系で重要な役割を担うホスフォリパーゼCβの左上側頭回特異的な変化を同定した。
肝臓の虚血・再潅流障害におけるサイトカインの役割

移植臓器の機能的予後は,臓器摘出から移植後血流再開までの阻血および再灌流時の臓器障害(虚血・再潅流障害)により影響を受ける。われわれは,虚血・再潅流障害におけるサイトカインの関与と,その産生の上位調節機構である細胞内シグナル伝達系に着目し,虚血・再灌流障害発生のメカニズムを明らかにすることを目的に研究を進めてきた。その結果,培養細胞を用いた研究で,虚血・再酸素化によりサイトカイン遺伝子の転写因子NF-κBの活性が増強され,チロシンキナーゼ阻害剤によりその活性化が抑制されることが明らかとなった。さらに,マウスの虚血・再潅流モデルを用いた研究から,肝虚血・再潅流障害に炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-6)が関与し,チロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステイン投与によりサイトカインの産生が抑制されるとともに,肝虚血再潅流障害が軽減されることが明らかとなった。また,細胞内シグナル伝達系に関わるMAP kinase familyのひとつで,アポトーシスとの関連が推察されているJNK(c-Jun N-terminal kinase)に関する研究で,肝虚血時間が短い(虚血障害が軽度な)ほど再灌流後のJNKの活性化は強く,しかも肝細胞のアポトーシスも多く認めた。以上の結果から,サイトカイン産生の制御によって虚血・再灌流障害を軽減できること,また,虚血・再灌流後のJNKの活性化と肝細胞アポトーシスは,細胞障害に対する保護的役割を担っていることが示唆される。1単離肝細胞,類胴壁細胞を用いた虚血・再酸素化実験は,単離細胞のviabilityが一定にならず,実験結果にばらつきが大きいため,実験計画の変更を検討中。2マウスを用いたin vivoの虚血・再灌流実験では以下の知見を得た。(1)炎症性サイトカインであるTNF-α,IL-6の血中濃度は,虚血中には上昇せず,再灌流後に著明な上昇を示した。ピークは両者とも再灌流4時間後であった。(2)免疫組織染像の画像解析では,肝組織中TNF-α再灌流直後に,IL-6は再灌流2時間後に最も増加したが,血中濃度の上昇ほど著明ではなかった。(3)血清ALT値は再灌流後著明に上昇し,また,組織学的にも肝の壊死範囲は再灌流後経時的に増加し,肝細胞障害は進行性であった。(4)上記(1)から(3)の所見は,チロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステイン投与によって有意に抑制された。(5)虚血時間を延長し生存率を検討した実験でも,ゲニステイン投与は生存率の改善をもたらした。以上の実験結果より,肝虚血再灌流障害には炎症性サイトカインであるTNF-α,IL-6の関与が示唆された。また,チロシンキナーゼインヒビターであるゲニステインの投与により肝虚血再灌流後の炎症性サイトカインの上昇が抑制され,肝虚血再灌流障害を軽減されることが明らかとなった。これまでの研究から,(1)虚血・再灌流刺激によってサイトカイン遺伝子の転写因子NF-κBの活性が増強され,これはチロシンキナーゼ阻害剤によって抑制される.(2)肝の虚血・再灌流障害には炎症性サイトカインであるTNF-α,IL-6が関与する.(3)チロシンキナーゼ阻害剤が肝虚血・再灌流障害を抑制する.ことを明らかにした。そこで,細胞内シグナル伝達系に関わるJNK(c-Jun N terminal kinase)(細胞外ストレスに対して活性化し,アポトーシスの誘導に関与することが報告された)と,虚血・再灌流障害との関連に注目し,マウス肝虚血・再灌流モデルにおけるJNKの活性化と肝細胞障害およびアポトーシスについて検討し,以下の結果を得た。

(1)10,15,30分の虚血のみではJNKの活性化は見られなかった。(2)肝障害が最も軽度であった10分虚血群において,再灌流後のJNKの活性化は最も強く認められた。(3)虚血・再灌流後の肝細胞アポトーシスの検討では,10分虚血群でアポトーシス細胞を最も多く認められた。以上の結果から,虚血・再灌流後のJNKの活性化と肝細胞アポトーシスは,細胞障害に対する保護的役割を担っていることが示唆された。
新興・再興感染症を標的とした新規粘膜ワクチンアジュバントの開発

本研究は申請者らが独自に開発した膜融合リポソームを用い、エイズを初めとする新興・再興感染症に対する次世代型ワクチン療法を開発しようとするものである。この研究の成果として、膜融合リポソームを用いることで鼻腔リンパ組織に存在するM細胞、鼻腔上皮細胞、Mac-1陽性細胞へ効率よく抗原送達され、結果として粘膜面および全身面の両部位に抗原特異的抗体産生が誘導されることを確認した。さらにウイルス感染細胞の排除に必要不可欠なCytotoxic T Lymphocyte(CTL)の誘導が、脾臓、頸部リンパ節、腸管膜リンパ節において認められた。また、膜融合リポソームを抗原提示細胞に作用させたところMHC class I、class IIおよびB7.1、B7.2、CD40の発現上昇が認められた。さらに膜融合リポソームは、腹腔浸潤マクロファージに対してIL-12、IL-6及びTNF-α産生を誘導した。さらに膜融合リポソームは鼻粘膜上皮細胞においてメモリーCD8陽性T細胞の誘導、維持に重要なIL-15のmRNAの発現を上昇させた。また、膜融合リポソームを投与した群では鼻腔リンパ組織であるnasal passageにおいてCD8陽性T細胞のメモリーマーカーであるCD44、CD122を高発現したCD8陽性メモリーT細胞群が顕著に増加していた。さらに、CD8陽性T細胞の他のメモリーマーカーとして知られるLy6Cを用いて検討を行った場合においても、膜融合リポソーム投与群においてLy6Cを高発現する細胞群の増加が顕著に認められた。今後は、粘膜ワクチンキャリアーとしての膜融合リポソームの有用性についてさらに詳細に検討を加えていく予定である。抗原を目的とする細胞に送達させるDDS技術、即ち経鼻ワクチンキャリアーとして膜融合リポソームを設計するために、モデル抗原であるニワトリ卵白アルブミン(OVA)を用い免疫誘導能を検討した。その結果、膜融合リポソームを用いることで鼻腔リンパ組織に存在するM細胞、鼻腔上皮細胞、Mac-1陽性細胞へ効率よく抗原送達されることが確認された。またこれらの抗原送達機能を反映し、膜融合リポソームを用いOVAを経鼻免疫することで、鼻腔洗浄液中に感染防御に重要な役割を担っているOVA特異的IgAの誘導が認められた。さらに遠隔の粘膜面である糞便中にもOVA特異的IgAが検出された。これら粘膜面での抗体産生に加え、血清中には多くのOVA特異的IgGの誘導が認められた。さらにその血清中IgGのサブクラスについて検討した結果、2型ヘルパーT細胞誘導型のIgG1に加え、1型ヘルパーT細胞誘導型のIgG2aの誘導も認められた。また、鼻腔固有層、小腸固有層、脾臓中にそれぞれ抗原特異的IgA、IgG産生細胞がELISPOT法により検出され、膜融合リポソームを用いた抗原の経鼻免疫により粘膜面および全身面の両部位に抗原特異的抗体産生が誘導されることを確認した。さらにこれら体液性免疫以外にウイルス感染細胞の排除に必要不可欠なCytotoxic T Lymphocyteの誘導が、脾臓、頸部リンパ節、腸管膜リンパ節において認められた。以上、申請者は膜融合リポソームを粘膜ワクチンキャリアーとして適応し、その有用性を提示してきた。今後はエイズワクチンヘの有用性についてさらに詳細に検討を加えていく予定である。

昨年度は、膜融合リポソームを用いることで鼻腔リンパ組織に存在するM細胞、鼻腔上皮細胞、Mac-1陽性細胞へ効率よく抗原送達され、結果として粘膜面および全身面の両部位に抗原特異的抗体産生が誘導されることを確認した。さらにウイルス感染細胞の排除に必要不可欠なCytotoxic T Lymphocyte (CTL)の誘導が、脾臓、頸部リンパ節、腸管膜リンパ節において認められた。そこで本年度は、膜融合リポソームによる抗原特異的免疫誘導の機構解明を試みた。その結果、膜融合リポソームを抗原提示細胞に作用させたところMHC class I, class IIおよびB7.1、B7.2、CD40の発現上昇が認められた。また、膜融合リポソームは、腹腔浸潤マクロファージに対してCTLを中心とする細胞性免疫を活性化する1型のヘルパーT細胞の誘導に特に重要なIL-12産生を誘導した。またB細胞からの抗体産生を促進させることが可能なIL-6の産生増強や免疫反応を広く活性化するTNF-αの産生も認められた。この結果から、膜融合リポソームによって産生誘導されたこれらのサイトカインが膜融合リポソームによるCTL誘導や抗体産生に寄与しているものと考えられた。また、膜融合リポソームの遺伝子ワクチン及びペプチドワクチンへの応用について、ニワトリ卵白アルブミン(OVA)発現プラスミド及びOVAの抗原ペプチドを用いて検討した結果、OVAと同様にOVA特異的な細胞性免疫並びに液性免疫が誘導されることを明らかにした。今後は、粘膜ワクチンキャリアーとしての膜融合リポソームの有用性についてさらに詳細に検討を加えていく予定である。本研究は申請者らが独自に開発した膜融合リポソームを用い、エイズを初めとする新興・再興感染症に対する次世代型ワクチン療法を開発しようとするものである。これまでの研究で、膜融合リポソームを用いることで鼻腔リンパ組織に存在するM細胞、鼻腔上皮細胞、Mac-1陽性細胞へ効率よく抗原が送達され、結果として粘膜面および全身面の両部位に抗原特異的抗体産生が誘導されることを確認した。さらにウイルス感染細胞の排除に必要不可欠なCytotoxic T Lymphocyte(CTL)の誘導が、脾臓、頸部リンパ節、腸管膜リンパ節において認められた。そこで本年度は、膜融合リポソームの新規粘膜ワクチンアジュバントとしての有用性を評価した。その結果、膜融合リポソームは鼻粘膜上皮細胞においてメモリーCD8陽性T細胞の誘導、維持に重要なIL-15のmRNAの発現を上昇させた。また、膜融合リポソームを投与した群では鼻腔リンパ組織であるnasal passageにおいてCD8陽性T細胞のメモリーマーカーであるCD44、CD122を高発現したCD8陽性メモリーT細胞群が顕著に増加していた。さらに、CD8陽性T細胞の他のメモリーマーカーとして知られるLy6Cを用いて検討を行った場合においても、膜融合リポソーム投与群においてLy6Cを高発現する細胞群の増加が顕著に認められた。以上の結果から、膜融合リポソームにより鼻腔粘膜組織で産生誘導されたIL-15の作用によりCD8陽性メモリーT細胞が積極的に誘導されることが示唆され、膜融合リポソームをワクチンキャリアーとして用いることにより高いワクチン効果を誘導可能であると期待できた。
軟骨細胞のメカノシグナル解明へのinvitro肥大化・変性モデルの樹立と応用

軟骨細胞のメカノシグナル解明を目指し、変形性関節症において起きている軟骨細胞の病的肥大分化および変性を物理的な刺激を用いてin vitroで再現する実験系の確立を目指して検討を行った。各種細胞を用いた静水圧負荷による軟骨細胞変性マーカーの発現検討を行い、マウス軟骨前駆細胞株ATDC5、初代マウス関節軟骨細胞においては変性マーカーの発現誘導に20MPa、1時間の圧負荷が最適であることを突き止めた。前年度は、生理的な圧を負荷すると軟骨細胞の特性が保持され、さらに過度の圧を負荷すると肥大分化・変性が生じるという現象がどのような細胞内変化を介しているのかを探索すべく、静水圧負荷による軟骨細胞の肥大分化を誘導する系の検討をマウス軟骨前駆細胞株や初代軟骨細胞などで重ね、負荷圧や負荷後の培養時間、サンプルの回収時期などについての条件検討を行い、20MPaで30分の圧負荷が軟骨細胞の肥大分化マーカーである基質分解酵素MMP13の発現量を上げることを突き止めた。本年度は前年度に続き、マウスの関節軟骨細胞、ヒトの軟骨細胞株などにて同様に条件検討を行った。その結果、前年度の検討とは異なり、やや低い圧で細胞が反応し、肥大分化マーカーの発現上昇が見られる系を見つけた。現在得られたサンプルをマイクロアレイでの解析に持ち込み、解析中である。この圧負荷による培養軟骨細胞の肥大化・変性誘導系が実現すれば、変形性関節症への関与が示唆される遺伝子に関して、これまでノックアウトマウスなどの作成を介して解析してきたことを、細胞レベルで容易に解析できることから、変形性関節症をより生理的・直接的に研究することが可能となると考えられる。変形性関節症などの運動器変性疾患は高齢者の生活の質を低下させるロコモティブシンドロームの中心的な疾患であり、関節軟骨の変性予防や、修復・再生といった本質的な治療技術は社会的要請となっている。我々は軟骨内骨化の後期にみられる軟骨細胞の肥大分化に類似した現象が変形性関節症においてもみられること、また肥大分化促進分子を抑制することによって変形性関節症の発症・進展を抑えられることを証明した。しかしながら、その主因である過剰なメカニカルストレスが関節軟骨の肥大分化・変性をどのように誘導するかはいまだに不明である。動物モデルでは最新の分子生物学的解析法が応用できないため、さらなる研究にはin vitroのモデルの開発が必要不可欠となっている。我々は軟骨細胞に静水圧を負荷する系を用いることによって、変形性膝関節症患者で実際に起きている軟骨変性を擬似できるような過剰静水圧負荷による軟骨変性のin vitro実験系を確立すべく、本研究を計画した。現在までのところ、過剰な静水圧を負荷することによって、軟骨肥大分化マーカーの発現上昇をモデル化することができた。現在は軟骨細胞株、初代軟骨細胞を用いた基礎実験中であるが、今後このモデルをヒト軟骨細胞に最適化する条件を見つけることができれば、そこから変形性関節症の発生・進行メカニズムを詳細に解明し、予防・治療に向けての戦略を打ち立てることができると考えている。1マウス由来未分化軟骨系・間葉系細胞株(ATDC5, C3H10T1/2)、ヒト由来軟骨系細胞株(OUMS-27, SW1353)およびマウスの初代肋軟骨細胞、関節軟骨細胞を用いて静水圧負荷を行い、圧負荷後に細胞を回収し肥大分化マーカーの発現解析を行った。細胞種によって性質が異なるため、負荷圧、負荷時間、その後の培養期間などのパラメーターの条件検討を行った。その結果、ATDC5、マウス初代関節軟骨細胞においては、過剰圧不可によりMMP13やVEGFAといった肥大分化マーカーの発現量が増加することが判明した。現在は細胞回収後の肥大分化マーカーの発現レベルの解析を行っており、実験系の最適化を目指して条件検討を継続している。また、我々はマウス変形性関節症モデルを用いて、肥大分化マーカーの発現パターンを時間的・空間的に検証しており、この発現パターンとin vitroの肥大分化誘導系モデルでの肥大分化マーカー発現パターンの適合性について検討している。圧負荷時の細胞の分化程度や細胞の種類を適切に選択することによってこの多様性をin vitroで詳細に再現することができれば、変形性関節症の分子メカニズムの多くが解明されうると期待される。我々は圧負荷の条件検討の中で、多様な肥大分化のパターンを獲得することも同時に目指しており、さらに詳細にmRNA、タンパクレベルでの検討も追加してin vivoでの現象との適合性を様々な角度から検証する。これまでのところ、上記のように初年度の実験はおおむね順調に進展している。適度な静水圧を負荷すると軟骨細胞の特性が保持され、さらに過度の圧を負荷すると肥大分化・変性が生じるという現象がどのような細胞内変化を介しているのかを探索すべく、それぞれの圧負荷前後のサンプルを用いて、ChIPシークエンスを用いたエピゲノム情報の解析、マイクロアレイによるcDNA、mRNA、microRNAの解析、プロテインアレイによる蛋白レベルの解析などを行う。

さらに同様のスクリーニングを同一細胞の成長板軟骨細胞の肥大分化系でも行い、骨格形成時の生理的な軟骨内骨化・肥大分化と変形性関節症の発症・進展時の病的な軟骨内骨化・肥大分化との間の共通点、相違点を包括的に解析する。これらのスクリーニングによって、多数の新規遺伝子が変形性関節症の原因候補遺伝子として挙がるものと予想される。これらすべてに関して遺伝子改変マウスを作成することは不可能であるが、細胞レベルであれば容易に行えることから、cDNAあるいはsiRNA/microRNAを組み込んだレトロウイルス・レンチウイルスベクターを作成して候補分子の過剰発現細胞・発現抑制細胞を作出し、圧負荷実験を介してその機能解析を行う。圧耐性に強い影響を有する遺伝子が同定されれば、遺伝子改変マウスの作成などさらなる解析へと繋げていく。初年度と同様に実験試薬等への使用と、研究計画書に記載した通り、今年度はマイクロアレイなどのより高度な遺伝子解析が必要となるため、そちらに対して使用する予定である。
脊椎動物体軸形成機構の解明

脊椎動物の初期発生において、回転対称体の受精卵から体軸を持った個体に成長する過程で最も重要な現象にオーガナイザーの形成がある。しかしながらその分子機構は未解明な点が多く残っている。ゼブラフィッシュにおけるNieuwkoop遺伝子として同定されたbozozok/dharmaは発生初期の卵黄多核層に発現し、細胞非自律的にオーガナイザーを誘導する。Boz/dharmaは核内たんぱく質であることから、オーガナイザー誘導には他の分泌性たんぱく質の存在が推察される。その候補遺伝子としてnodal関連遺伝子であるsquint(sqt)、cyclops(cyc)が考えられたため、これらの遺伝子と。Boz/dharmaとの関係を変異体を用い解析した。Bozとsqtもしくはcycとの二重変異体、boz;sqt;cycの三重変異体を作成したところ、その表現系はboz変異を加えることにより、もとの表現系よりも強い表現系がみとめられた。これらの変異体を分子マーカーを用い詳細に解析すると、オーガナイザー特異的遺伝子goosecoidはnodal関連遺伝子に強く依存するのに対し、別のオーガナイザー特異的遺伝子chordinはboz/dharmaに強く依存した。Nodal関連遺伝子のシグナルが全く機能しない条件下でも、boz/dharmaの過剰発現によりchordinの発現領域の拡大が見られたことから、boz/dharmaの遺伝子の下流にnodal関連遺伝子とは異なる分子機構が存在することが示唆された。以上のことから、オーガナイザーの形成にはboz/dharmaを介する経路とnodal関連遺伝子を介する経路が存在し、その両者が協調的に機能してオーガナイザーを誘導するものと考えられた。
脳死後の心機能低下におけるサバイバル蛋白の役割

ラット脳死モデルを用いて、脳死後の心機能低下のメカニズムを検討した。まず、心機能に関与するphosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)とその下流にあるAktに着目した。脳死に伴いAktのリン酸化が進み、ワルトマニンにてPI3Kを阻害することで、Aktのリン酸化は抑制され、脳死後の心機能の改善が見られた。さらに脳死に伴いフォスフォランバンのリン酸化が認められ、PI3Kの阻害薬であるワルトマニンは脳死に伴うフォスフォランバンのリン酸化の抑制を阻害した。脳死に伴い心筋細胞内においてCaイオンの心筋小胞体への取り込みが阻害され、心不全を招く要因となっていることが示唆された。昨年度は一昨年度の研究を継続した。ラット脳死モデルを用いて、脳死後の循環動態の変化をコンダクタンスカテーテルを用いて、詳細に検討した。一昨年度の実績で脳死ともないphosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)の下流にあるリン酸化酵素であるAktのリン酸化が進むこと、さらにPI3Kを阻害することで、脳死後の心機能の改善が見られたことから,本年度はAktのリン酸化から心機能の低下を招く要因のひとつとして、心筋細胞内で細胞内Caの制御にかかわっているフォスフォランバンに注目して、脳死に伴う変化とPI3K阻害との関係について検討した。結果として、ウエスタンブロッテングを用いたところ、脳死に伴いフォスフォランバンのリン酸化は抑制された。つまり、脳死に伴い心筋細胞内においてCaイオンの心筋小胞体への取り込みが阻害され、心不全を招く要因となっていることが示唆された。さらに、PI3Kの阻害薬であるワルトマニンは脳死に伴うフォスフォランバンのリン酸化は抑制を阻害した。昨年度は一昨年度の研究結果を踏まえ、ラット脳死モデルを用いて、脳死後の循環動態の変化をコンダクタンスカテーテルを用いて、詳細に検討した一昨年の研究成果として、ウエスタンブロッテングを用いたところ、脳死に伴いフォスフォランバンのリン酸化は抑制された。さらに、PI3Kの阻害薬であるワルトマニンは脳死に伴うフォスフォランバンのリン酸化の抑制を阻害した。以上2点の結果からこれに至るより上流の受容体機構を検討した。具体的には脳死に伴い大量に放出されるカテコールアミンのターゲットとしてβ受容体、特にβ2サブタイプの役割に着目した。この受容体サブタイプは心不全のおいて心筋保護的に働く可能性が示唆されていることから脳死に伴う心不全においても一定の役割があるものと推察した。しかし、脳死導入時からβ2受容体阻害を行った場合、いくらかは心不全の改善が認められたものの、ワルトマニンには及ばなかった。またフォスフォランバンのリン酸化は抑制も大きなものではなかった。この結果からβ2受容体の関与は局限的なものと思われた。昨年度はラット脳死モデルを用いて脳死後の循環動態の変化をコンダクタンスカテーテルで詳細に測定し、脳死に伴う心機能不全におけるphosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)の役割について検討した。続いて、脳死後の心筋を摘出し、Western blottingを用いて、PI3Kのターゲット蛋白のひとつであり、サバイバル蛋白という異名があるAktのリン酸化について検討した。結果は以下の通りである。1.PI3Kの阻害剤であるワルトマニンを投与することにより脳死ラットにおける生存率が改善し、血圧の変化はあまり明確ではなかったが、主に脳死2時間以降の心機能(駆出率、dP/dT max)がワルトマニン投与により有意に改善した。2.Aktのリン酸化をwestern blottingにて検討したところ、脳死に伴いAktのリン酸化の増強が認められたもののワルトマニンによりそのリン酸化の増強が阻害された。これらのin vivoおよびin vitroの研究結果から、脳死に伴う心機能不全においてはPI3Kの活性化が関与し、それがAktのリン酸化をもたらすことが明らかとなった。ただし、Aktのリン酸化がどのように心機能不全を招くのかは今後の課題として残った。当初の計画ではサバイバル蛋白といわれるAktのリン酸化(活性化)が脳死に伴う心機能低下を抑制できるとの仮説であったものの、これまでの結果はAktのリン酸化がむしろ心機能を悪化させるとのことであった。もともとの仮説とは結果的に逆の結果となったものの、PI3KおよびAktが脳死後の心機能低下の一翼を担っていることには変わりなく、研究の方向性の修正は必要だが、それも可能な範囲であると思われるので、おおむね順調と考えられる。

脳死における心機能不全をphosphatidylinositol 3-kinaseの阻害薬であるワルトマニンで抑制できたことはこの研究課題においてphosphatidylinositol 3-kinaseがキー蛋白のひとつと考えた実験計画に矛盾のない結果であった。この予想された結果を受けて、今後はphosphatidylinositol 3-kinaseの活性化が具体的にどのようなメカニズムで脳死後の心機能不全に至るかの検討に移りたい。その意味で研究はおおむね順調に進展していると考えている。脳死に伴うAktのリン酸化からフォスフォランバンのリン酸化抑制が脳死後心機能低下の一因であると考えられるので、それにいたる細胞内メカニズムの検討を進めたい。脳死に伴う大量のカテコールアミンの流出が心機能低下の一因であるが、それがどのような経路を経て心機能の低下に至るかについて、その根本であるカテコールアミンがいかなる経路でPI3Kのリン酸化を招くかのについての検討を進める予定である。カテコールアミンの作用が関与する受容体として心筋細胞に発現しているものとして、α1、β1、β2があげられるが、まずはその受容体メカニズムの検討から入る予定である。phosphatidylinositol 3-kinaseの活性化に伴い、Aktのリン酸化が起こることは証明できたので、今後はAktの働きについて焦点を当てて、研究を進めていきたい。Aktはサバイバル蛋白とう異名を持ち、深くアポトーシスに関与していることが知られているが、それは機能の一面にしかすぎず、ほかにも多彩な働きがあることが知られている。Aktのターゲットになるタンパクのひとつとして、筋小胞体のphospholamban (PLB)があり、この蛋白は細胞内のカルシュムハンドリングに深く関与し、心機能とも密接に関係している。そこで、今後の具体的なターゲットとしてPLBに注目して、研究を発展させたいと考えている。実験動物の購入、コンダクタンスカテーテルの購入、さらにはウエスタンブロットの抗体購入、成果発表のための交通費にあてる予定である。脳死ラットにおける循環動態の変化にphospholamban (PLB)がどのように関与しているかの検討を行う。研究経費は実験動物の購入、コンダクタンスカテーテルの購入、さらに脳死に伴うphospholamban (PLB)の変化について検討するため、そのwestern blottingによる評価を確立したいので、抗体等の試薬購入に当てる予定である。