hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無線通信に適した高性能LDPC符号の設計と解析

LDPC符号に関する多くの研究は,無限大の符号長を想定した復号誤り率を求める手法を用いている.しかし,実用上は数百数千の有限の符号長を有するLDPC符号の設計法の確立が求められている.Peeling Algorithm(PA)復号法の復号過程を解析することによって,2元消失通信路におけるLDPC符号のBeliefPropagation(BP)による復号性能を,比較的短い符号長に対しても符号長の関数として良く近似できることが知られている.詳細に規定されたアンサンブルのPA復号法の各復号段階におけるグラフの次数分布の変化を解析し,従来の解析法よりも詳細な次数分布の変化を解析することに成功した.復誤り率の極限値を最適化する設計法から得られるLDPC符号アンサンブルは,チェックノードの次数分布の分散が小さい傾向があり,結合次数分布を規定する効果を活かすことができなかった.しかし,比較的小さな符号長で良い復号性能を示すLDPC符号のチェックノード次数分布はこの傾向を示さず,逆にチェックノード次数分布の分散が大きいことが知られている.このことから,詳細に規定されたアンサンブルを考えることによって,より良いLDPC符号を得ることが期待できる.消失率が十分小さな2元消失通信路においては,LDPC符号の復号誤りはタナーグラフの次数2の変数ノードだけからなるサイクルに対応するビットの誤りが大きく寄与していることが知られている.このようなサイクルから生じる復号誤りを解析し,十分に大きな回数の反復復号を実行した後の復号誤り率を,符号長の関数として導出した.さらに,任意回数の反復復号時の復号誤り率を導出した.さらに,優れた復号性能を有するMulti-Edge type LDPC符号の最も簡単な場合であるTwo-Edge type LDPC符号が,小さい相対重みをもつ符号語の数が符号長に対して指数オーダで減少するための必要十分条件を導出した.無線通信に適した高性能LDPC(Low-Density Parity-Check)符号の設計のために、本年度はLDPC符号の性能解析を行った。LDPC符号の性能解析は、低計算量のBP復号法の性能解析は、Density Evolutionなどの解析方法がある。符号の持つ性能を最大限引き出すことができる最適な復号法である最尤復号法に関しては、復号性能の上界や下界がそれぞれ符号後の重み分布を用いて導出されているが正確な復号性能を求めることはできていない。消失通信路は、一般の2元入力対称出力無記憶通信路のもっとも簡単なモデルであり、LDPC符号の消失通信路に対する性質は、他の通信路にも拡張されることから、消失通信路に関してLDPC符号の性能を解析することが、LDPC符号を用いた通信の鍵となることが知られている。消失通信路の復号性能は、重み分布を拡張したサポート重み分布から、パンクチャド情報関数を介して、復号性能の正確な値を求めることができる。しかし、個々のLDPC符号のサポート重み分布を調べることは難しく、平均サポート重み分布しか知ることができなかった。さらに、従来の方法では、平均サポート重み分布から平均復号性能を求めることができなかったが、従来法で用いていたパンクチャド情報関数を短縮情報関数に置き換えることで、平均サポート重み分布から平均復号性能を求めることができるようになった。また、LDPC符号の平均サポート重み分布を導出し、正確な復号性能の解析をすることに成功した。LDPC符号に関する多くの研究は,無限大の符号長を想定した復号誤り率を求める手法を用いている.しかし,実用上は数百数千の有限の符号長を有するLDPC符号の設計法の確立が求められている.Peeling Algorithm(PA)復号法の復号過程を解析することによって,2元消失通信路におけるLDPC符号のBeliefPropagation(BP)による復号性能を,比較的短い符号長に対しても符号長の関数として良く近似できることが知られている.詳細に規定されたアンサンブルのPA復号法の各復号段階におけるグラフの次数分布の変化を解析し,従来の解析法よりも詳細な次数分布の変化を解析することに成功した.復誤り率の極限値を最適化する設計法から得られるLDPC符号アンサンブルは,チェックノードの次数分布の分散が小さい傾向があり,結合次数分布を規定する効果を活かすことができなかった.しかし,比較的小さな符号長で良い復号性能を示すLDPC符号のチェックノード次数分布はこの傾向を示さず,逆にチェックノード次数分布の分散が大きいことが知られている.このことから,詳細に規定されたアンサンブルを考えることによって,より良いLDPC符号を得ることが期待できる.消失率が十分小さな2元消失通信路においては,LDPC符号の復号誤りはタナーグラフの次数2の変数ノードだけからなるサイクルに対応するビットの誤りが大きく寄与していることが知られている.このようなサイクルから生じる復号誤りを解析し,十分に大きな回数の反復復号を実行した後の復号誤り率を,符号長の関数として導出した.さらに,任意回数の反復復号時の復号誤り率を導出した.さらに,優れた復号性能を有するMulti-Edge type LDPC符号の最も簡単な場合であるTwo-Edge type LDPC符号が,小さい相対重みをもつ符号語の数が符号長に対して指数オーダで減少するための必要十分条件を導出した.
地域における大腸がん罹患の危険因子に関するコホート研究

20年間のコホート研究により、一地域における約28,000名を対象に、大腸がん罹患(結腸がん、直腸がん)と日常生活習慣、推定摂取栄養素との関連を検討した。大腸がん罹患リスクを上昇させる要因としては、糖尿病既往歴、飲酒が示された。食品摂取頻度、推定栄養素については明確な関連が認められなかった。本研究の対象となる長野県佐久地区では、文部科学省の補助による大規模コホート研究のベースライン調査として、平成元年に当時35歳以上であった28042人が、生活習慣調査に回答し、うち約15,000人が平成元年から平成4年に自治体が実施した健診を受診している。さらに、先行研究により、本研究の対象コホート集団ではすでに平成15年12月末までの大腸がん罹患(結腸がん・直腸がん)は把握している。本年度は28042人の基礎コホート集団を対象として、平成16年1月より平成18年末までの大腸がん罹患(結腸がん・直腸がん)罹患状況の調査を行った。また、佐久市役所住民課の協力を得て、この期間の対象コホート集団の転出状況の把握も行った。罹患調査の実施にあたっては佐久市内の医療機関の協力を得て、研究代表者、研究分担者が医療機関を訪問して、現地の研究協力者、研究補助者とともに実施し、個人情報の漏洩には充分の注意をはらって調査を行った。平成16年1月より平成18年末までの大腸がん罹患の罹患調査結果としては、結腸がん86人、直腸がん49人であった。この結果、観察開始時より平成18年12月末までの観察期間中では、結腸がん343人、直腸がん166人罹患が確認された。本研究の対象となる長野県佐久地区において、文部科学省の補助による大規模コホート研究のベースライン調査として、平成元年に当時35歳以上で、生活習慣調査に回答した28042人より、平成18年12月末までの観察期間中に大腸がん(結腸がん361人、直腸がん190人)の罹患データセットの作成が完了した。これら罹患データセットと対象コホート集団よりの転出データをコホート基礎データに連結した。作成したデータを用いて、ベースライン時における33品目の食物摂取頻度より五訂日本食品標準成分表を用いて算出した、エネルギー量、蛋白質、脂肪、炭水化物、ビタミンC、カロテン、食物繊維、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸の個人の推定摂取量について、三分位に分類し第1三分位に対する第2,3三分位の、性・年齢・エネルギー摂取量を調整したハザード比にて、結腸がん及び直腸がん罹患の関連について検討した。結腸がん罹患と有意な関連が認められた推定栄養素は食物繊維(第3三分位HR:1.41)、カロテン(第3三分位HR:1.59)で、摂取量が多くなるとリスクは有意に上昇していた。蛋白質、脂肪、炭水化物、ビタミンC、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸については結腸がん罹患との関連が認められなかった。直腸がん罹患と有意な関連が認められた推定栄養素は炭水化物(第3三分位HR:0.53)、食物繊維(第3三分位HR:2.04)で、炭水化物は摂取量が多くなるとリスクは有意に低下し、食物繊維ではリスクは有意に上昇していた。また、カロテン、不飽和脂肪酸は摂取量が多くなるとリスクは低下する傾向にあったが有意ではなかった。蛋白質、脂肪、ビタミンC、飽和脂肪酸については直腸がん罹患との関連は認められなかった。昨年度に連結が完了した長野県佐久地区のコホート基礎データを用いて、がん家族歴、既往歴(肝臓病、胆・胆のう炎、糖尿病、胃十二指腸潰瘍)と、喫煙習慣、飲酒習慣、緑茶、コーヒー飲用、運動・散歩習慣、便通の状況等の日常生活習慣と結腸がん及び直腸がん罹患の関連について、性・年齢を調整したハザード比により検討した。がん家族歴の有無については、結腸がん、直腸がん罹患ともに関連が認められなかった。既往歴では、糖尿病既往歴ありのものハザード比は、結腸がん1.74、直腸がん2.25と罹患リスクが有意に高値を示した。それに対し、胃十二指腸潰瘍既往歴ありのものは、直腸がんのハザード比が0.54を有意に低い罹患リスクが認められた。喫煙、飲酒習慣について、結腸がん罹患、直腸がん罹患との関連はいずれも認められなかった。しかし、男女別に検討したところ、男性の飲酒習慣に関しては、飲酒習慣なし群に比して習慣あり群のハザード比は結腸がん、直腸がんともに高値を示し、一日飲酒量においても量が多くなるに伴いハザード比は有意に上昇し、量反応関係が認められた。緑茶、コーヒーの飲用については、結腸がん、直腸がん友の罹患との関連は認められなかった。便通の状況について、排便頻度は結腸がん、直腸がん友に関連が認められなかった。一方、下痢傾向のあるものは結腸がんではリスクが上昇し、直腸がんではリスクが低下する傾向が認められたが、いずれも有意な関連はなかった。
cDNAマイクロアレイを用いたラット大量肝切除後肝不全の発症機序の解明

その結果95%(過大量)肝切除モデル群は90%(許容量)肝切除モデル群と比較し、apoptosis関連因子では、Fas, caspase8、IL-18の早期よりの高発現とBcl-2の低発現を認めた。cell proliferation関連因子ではp21の早期からの高発現を認めた。HSPは全体に低発現であった。さらに、肝再生メカニズムを調べるために、マウス70%肝切除モデルを用いて、同様のcDNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、IEgeneとしてIRAK-1やKaryopherin、S期進行に関わる新規遺伝子としてID-2,ID-3,GADDγなどを同定することができた。これらの遺伝子を操作し、新しい肝不全メカニズムの解析に応用したいと考えている。これらを第104回日本外科学会総会に発表し、後者の実験はJ.Hepatologyに本年3月に掲載された。Wistar系雄生812週齢ラットを用い、肝切除率90%、95%のモデルと、対照としての開腹、肝脱転のみのsham operationモデルをぞれぞれ作製した。肝切除後1時間、3時間、6時間、24時間でラットを犠牲死させ、残肝を採取し、AGPC変法にてTotal RNAを抽出、oligo-dTprimerとCy3-dUTP、Cy5-dUTP、super script II reverse transcriptaseを用いmRNAをcDNAに逆転写、ラベリングを行った。それぞれの肝切除群と、対照群よりラベリングしたprobe cDNAを競合的にmuse 40K microarrayにハイブリダイゼーションさせる。MicroarrayのsignalをGene pixを用いてscanningし、Cy3、Cy5のsignal intensityをそれぞれ定量的に測定し、肝切除群と対照群の遺伝子発現プロファイルの差異の情報を得た。実験の再現性を確保するため、同一の条件の実験を2回行った。その結果95%(過大量)肝切除モデル群は90%(許容量)肝切除モデル群と比較し、apoptosis関連因子では、Fas, caspase8、IL-18の早期よりの高発現とBc1-2の低発現を認めた。cell proliferation関連因子ではP21の早期からの高発現を認めた。以上の結果を、5^<th>IHPBAで発表の予定である。その結果95%(過大量)肝切除モデル群は90%(許容量)肝切除モデル群と比較し、apoptosis関連因子では、Fas, caspase8, IL-18の早期よりの高発現とBcl-2の低発現を認めた。以上の結果を、5^<th>IHPBA(第5回国際肝胆膵疾患会議、14年4月、東京)で発表した。その後、得られた結果から、Fasやp21などのRT-PCRによるmRNA発現、免疫組織染色を用いた蛋白発現を検討し、validationとした。その結果95%(過大量)肝切除モデル群は90%(許容量)肝切除モデル群と比較し、apoptosis関連因子では、Fas,caspase8、IL-18の早期よりの高発現とBcl-2の低発現を認めた。これらを第104回日本外科学会総会に発表し、後者の実験はJ.Hepatologyに本年3月に掲載予定である。
間葉系幹細胞の軟骨分化誘導におけるプロテオグリカンの役割

ヒト間葉系幹細胞のペレット培養系において、TGF-βおよびBMP-6処理、さらに超音波刺激の軟骨分化に対する影響を検討した。TGF-β処理によりペレットの軟骨分化誘導が観察されたがBMP-6単独では細胞は分化誘導されなかった。超音波刺激はTGF-β処理したペレットの軟骨分化を促進したが未処理群に対しては効果を示さなかった。BMP-6は軟骨分化したペレットを増大させた。この結果からTGF-β処理は軟骨分化誘導に必須でありその作用を超音波が促進する一方、BMP-6は軟骨分化誘導後のペレットを増大させる働きがあることが示唆された。TGF-βおよびBMP-6に対するグリコサミノグリカンの結合性に関して検討したところ、一定の構造を持つコンドロイチン硫酸鎖がBMP-6と結合することがわかった。軟骨系細胞株N1511を用いて軟骨分化初期段階の同プロテオグリカンの役割を検討した。その結果、分化初期のバーシカン/PG-Mの発現はその後のアグリカンの転写に不可欠であり、その作用は細胞外マトリックスに沈着した同分子のコンドロイチン硫酸鎖によるものであることがわかった。現在、上記の間葉系細胞の軟骨分化過程におけるバーシカン/PG-Mの発現パターンとその役割に関しては検討中である。バーシカン/PG-Mは軟骨分化の初期のみならず持続的に発現し、特に関節軟骨表面にヒアルロン酸、リンクタンパク質と共存することがわかった。軟骨組織の生化学的に検索したところ、軟骨にはバーシカンの会合体も存在することが明らかとなった。軟骨にはアグリカン会合体、バーシカン会合体の2種類が存在し、アグリカンが成長軟骨および関節軟骨の深層に存在するのに対して、バーシカン会合体は関節表面に局在してshear forceに対する抵抗性を与えているものと考えられた。超音波刺激はTGF-β処理したペレットの軟骨分化を促進したが、未処理群に対しては効果を示さなかった。この結果からTGF-β処理は軟骨分化誘導に必須でありその作用を超音波が促進すると考えられた(Tissue Engineering, In Press)。TGF-βによる軟骨分化誘導へのシグナル伝達経路に関しては検討中である。軟骨分化初期の間葉系細胞凝集領域にバーシカン/PG-Mが一過性に強く発現することが知られている。軟骨分化初期段階の同プロテオグリカンの役割を軟骨系N1511細胞を用いて検討した。その結果、分化初期のバーシカン/PG-Mの発現はその後のアグリカンの転写に不可欠であり、その作用は細胞外マトリックスに沈着した同分子のコンドロイチン硫酸鎖によるものであることがわかった(現在、投稿準備中)。バーシカン/PG-Mは軟骨初期のみならず成長後の軟骨にも少量存在することを我々は見いだした。同分子のコア蛋白質はアグリカンのコア蛋白質と同様のドメイン構造を持つことから同分子がプロテオグリカン会合体を形成しうると考え、アグリカン会合体の構成分子であるリンク蛋白、ヒアルロン酸とバーシカン/PG-Mとの結合に関して生化学的検討を行った。その結果、バーシカンG1ドメインのB-B'領域が両者との結合に必要かつ十分であることがわかった。この結合様式はアグリカン会合体の結合様式と異なり2つのプロテオグリカン会合体の生体内における異なった機能を示唆するものとして興味深い(J Biol Chem,278,41205-41212,2003)。ヒト

間葉系幹細胞のペレット培養系において、TGF-βおよびBMP-6処理、さらに超音波刺激の軟骨分化に対する影響を検討した。TGF-β処理によりペレットの軟骨分化誘導が観察されたがBMP-6単独では細胞は分化誘導されなかった。超音波刺激はTGF-β処理したペレットの軟骨分化を促進したが、未処理群に対しては効果を示さなかった。この結果からTGF-β処理は軟骨分化誘導に必須でありその作用を超音波が促進すると考えられた(Tissue Engineering,10,921-929)。TGF-βによる軟骨分化誘導へのシグナル伝達経路に関しては検討中である。軟骨分化初期の間葉系細胞凝集領域にバーシカン/PG-Mが一過性に強く発現することが知られている。軟骨分化初期段階の同プロテオグリカンの役割を軟骨系N1511細胞を用いて検討した。その結果、分化初期のバーシカン/PG-Mの発現はその後のアグリカンの転写に不可欠であり、その作用は細胞外マトリックスに沈着した同分子のコンドロイチン硫酸鎖によるものであることがわかった(J Biol Chem, submitted)。バーシカン/PG-Mはその後、関節軟骨表面に局在することが免疫染色からわかった。この部立ではピアルロン酸、リンクタンパク質も共存していた。さらに軟骨組織を採取して生化学的に検索したところ、軟骨にはバーシカンの会合体も存在することが明らかとなった。軟骨にはアグリカン会合体、バーシカン会合体の2種類が存在し、各々特異的な機能を果たしているものと考えられた(J Biol Chem, submitted)。
放射線異感受性腫瘍における重粒子線照射の抗癌剤併用効果に関する基礎的研究

重粒子線の生物学的特徴は直接DNA2重鎖切断を引き起こす直接効果が主体であり、放射線抵抗性腫瘍に特に有用である。重粒子線治療が今後さらに普及するためには局所進行癌が対象となりその場合、化学療法との併用が必要となる。そこで本研究では重粒子線に抗癌剤を併用した際の増感効果の有無を、p53ステータスの異なるラット卵黄嚢由来で同一細胞由来の放射線異感受性腫瘍を用いて検討し、その機序について分子生物学的に解析した。重粒子線は炭素線290MeV/μでmono peak(LET 80keV/μm)を用いて照射実験を施行した。1)重粒子線の照射効果:X線照射で明らかに異なるNMT-1(放射線高感受性、野生型p53)、NMT-1R(放射線抵抗性、変異型p53)の照射効果は生残率曲線の肩が消失し、RBEがNMT-1、NMT-1Rでそれぞれ1.4,2.2であり重粒子線(炭素線)照射の場合、p53ステータスの相違に関わらず同等であった。2)重粒子線、抗癌剤の併用効果:X線照射で増感がみられ、固形癌に汎用されるcisplatin(DNA架橋形成),etoposide(topoisomerase II阻害剤)でIC50量で併用実験を行ったところ、cisplatinは相加効果のみであったが、etoposideではNMT-1Rにおいて相乗効果(Doの減少)が認められた。この増感様式はX線の場合と異なった(X線の場合、生残率曲線の肩が消失)。3)増感効果のメカニズム:炭素線照射(1,3,5Gy)照射後の12,24,48時間後にアポトーシスの出現頻度ならびに細胞周期変動のG2ブロックの程度を解析したところ、炭素線単独群ならびに炭素線、抗癌剤併用群でいずれの細胞においても差異は認められなかった。よって放射線抵抗性NMT-1Rにおけるetoposide併用での増感効果は細胞死の形態の相違では説明できず、今後DNA修復能等の検討が必要と考えられる。重粒子線照射効果における抗癌剤による増感効果の検討ならびに細胞死の解明(in vitro)ラット卵黄嚢由来で同一細胞由来の放射線高感受性腫瘍(NMT-1)と放射線抵抗性腫瘍(NMT-1R)を用いin vitroで実験を行った。NMT-1は野生型p53を、NMT-1Rは変異型p53を発現している。実験ならびに解析方法を以下に示す。1.重粒子線に対する照射効果はコロニー形成法により細胞生残率曲線を求め、X線に対する場合と比較し生物学的効果比を求め検討した。2.重粒子線と薬剤(抗癌剤)の併用効果に関する検討:抗癌剤は固形癌に汎用されているシスプラチン(架橋形成)とエトポシド(トポイソメラーゼII阻害剤)を用い、それぞれ単独で50%生存となるIC50量を重粒子線照射と併用し増感効果の有無を細胞生存率曲線から求め比較検討した。3.細胞死の機序に関する検討:アポトーシスを指標とし重粒子線照射単独ならびに重粒子線+抗癌剤併用において検討した。アポトーシス出現率はDNA断片化率の測定により求めた。重粒子線照射は1,3,5Gyを用い線量依存性を確認した。また照射後時間による影響は照射12,24,48時間後に検討を行った。

結果1.NMT-1、NMT-1RいずれにおいてもX線と比較して炭素線照射により細胞致死効果は増強し、p53 statesに左右されず照射効果は同等でありた(NMT-1Rにおいて低繖の肩が消失した)。10%生存におけるRBEはそれぞれ1.4,2.2であった。2.シスプラチンの同時併用はNMT-1、NMT-1Rいずれの細胞においても相加効果のみであり、増感効果は認められなかりた。一方エトポシドの併用はNMT-1では相加効果のみでありたが、抵抗性腫瘍のNMT-1RにおいてDOの減少が見られ、明らかな増感効果を示した。その増感の様式は生残率曲線の肩が消失するX線照射の場合の増感様式と異なっていた。3.炭素線照射後のアポトーシス出現が24時間後が最も多く認められ、線量依存性が認められた。また重粒子線単独、重粒子線+シスプラチン、重粒子線+エトポシドいずれの群においてもアポトーシス出現頻度に差異は認められなかった。よってエトポシドによる増感効果の機序はアポトーシス以外の細胞死によることが推測された。前年度の研究でNMT-1、NMTー1RいずれにおいてもX線と比較して炭素線照射により細胞致死効果は増強し、p53 statesに左右されず照射効果は同等であった。シスプラチン(DNA架橋形成)と重粒子線照射の同時併用ではいずれの細胞においても相加効果のみであり、増感効果は認められなかった。一方エトポシド(topoisomerase II阻害剤)と重粒子線照射の併用ではNMT-1では相加効果のみであったが、抵抗性腫瘍のNMT-1RにおいてDOの減少が見られ、明らかな増感効果を示した。よって今年度は重粒子線照射効果における抗癌剤の増感効果の検討ならびに細胞死の解明を行った。方法:ラット卵黄嚢由来で同一細胞由来の放射線高感受性腫瘍(NMT-1:野生型p53)と放射線抵抗性腫瘍(NMT-1R:変異型p53)を用い実験を行った。1.アポトーシスを指標とし重粒子線照射単独ならびに重粒子線+抗癌剤併用において検討した。アポトーシス出現率はDNA断片化率の測定により求めた。重粒子線照射は1,3,5Gyを用い線量依存性を確認した。また照射後時間による影響は照射12,24,48時間後に検討を行った。2,細胞周期の変動すなわちG2ブロックを指標に重粒子線単独ならびに重粒子線・抗癌剤併用後、24、48時間後に検討を行った。結果:重粒子線・エトポシドの併用で1.炭素線照射後のアポトーシス出現が24時間後に最も多く認められ、線量依存性が認められた。しかし重粒子線単独、重粒子線+シスプラチン、重粒子線+エトポシドいずれの群においてアポトーシス出現頻度に差異は認められなかった。2.G2ブロックはいずれの細胞においても線量依存性に認められたが、重粒子線単独群、重粒子線+エトポシドもしくはシスプラチン群の間に差異は認められず増感効果を説明することはできなかった。結論:以上の結果よりDNA架橋形成を引き起こすシスプラチンでは、DNA二重鎖切断という観点から見ると重粒子線に併用してもX線の場合と異なり、増感の余地はない可能性が考えられるが、一方エトポシドの場合はトポイソメラーゼの阻害剤であるため、DNAの高次構造修復に関連することから、X線と異なる相互作用機序で相加効果以上の効果が認められた可能性がある。次年度は遺伝子レベルで重粒子線と抗癌剤の使用について検討する。重粒子線の生物学的特徴は直接DNA2重鎖切断を引き起こす直接効果が主体であり、放射線抵抗性腫瘍に特に有用である。
骨盤臓器の知覚神経機構の研究

膀胱・直腸・生殖器からの知覚は主に副交感神経、すなわち仙髄に投射することが知られている。本研究ではde Groat教授とともにこれまで調べられていなかった女性生殖器の各部分の知覚路について検討し、論文発表を行った。また、ペプチド・アミノ酸が多種この一次知覚線維に含まれ、脊髄後角に投射していることを論文発表および投稿の準備をした。膀胱をモデルに正常・異常の知覚受容体・知覚伝導路・伝達物質の変化について検討した。膀胱では尿が貯留し、ある程度拡張するとその知覚を中枢が受け取り、いわゆる排尿反射を起こす。この疾病として膀胱炎が高頻度に認められるが、これは頻尿・疼痛を伴うことが多いことから、膀胱からの知覚系が変化し、症状を引き起こすと予想された。具体的には感染病原菌に対して動員される白血球より、いわゆるサイトカインが知覚の変化に関与する可能性についてBirder博士,de Groat教授と共同研究した。また、病原菌により尿が酸性化し、膀胱粘膜の知覚受容器の興奮性を増大させ、頻尿・疼痛が起こる可能性についてMorrison教授と検討した。神経ペプチドが多く一次ニューロンに存在したことから、これら伝達物質のあるものは主として中枢側の脊髄で、あるものは末梢側ないし、遠心路のシナプスのある骨盤神経節で作用している可能性について電気生理学的にKeast講師と検討した。実験方法は、(1)ウレタン麻酔ラットの脊髄後根を微細な線維とし、単一線維より膀胱拡張に伴った放電記録による検討,(2)膀胱収縮を指標に随腔内薬物微量投与による検討,(3)急性単離したラット仙部後根神経節細胞にCa^<++>指示薬Fura2を取り込ませ、細胞内Ca^<++>量の増大を指標に疼痛関連物質の検討,(4)摘出骨盤神経節標本での細胞内電位記録における神経ペプチドの影響の検討,(5)骨盤各臓器へのホルマリン刺激により脊髄に起こるc-fos発現の組織化学的検討を行った。三ヶ所の共同研究者のうち、de Groat教授とは初年度Birder博士に来日してもらい、Fura2の研究を中心に行った。本年度は松本助手が大学公費による留学を行い、多類の検討を行った。Morrison教授とは単一線維の実験をそれぞれ独自で行い、本年度2回にわたり結果を比較検討した。結果として、まずサイトカインの1つであるインターロイキン1β(IL1β)は膀胱粘膜部に存在する神経終末ないし神経線維に作用する可能性を発見した。膀胱容量に応じた放電数を後根線維から記録するとIL1β膀胱腔内投与後では閾値,膀胱内圧の低下,同一内圧では放電数の上昇を認めた。また排尿反射の発生する膀胱容量の低下を認めた。さらに、単離した後根神経節細胞の細胞内Ca^<++>量がIL1βで一過性の上昇をきたし、このCa^<++>が細胞内でのCa^<++>の放出であることを明らかにした。また、膀胱内液の酸・塩基性により知覚神経の感受性の変化について後根線維での活動電位記録により検討した。神経伝導速度の122m/sをAδ線維,2m/s以下をC線維として検討するとAδ線維の50%が反応し、全て膀胱の軽度拡張(540cmH_2O)により放電を開始した。C線維の56%がやはり軽度拡張の閾値をもち、8%がより高圧(4160cmH_2O)で放電を開始した。膀胱内を酸性液にかえるとC線維の半数はph4.5で放電開始閾値内圧の低下が認められた。pH3.5液では全例で閾値の低下がおこり、中性液では高閾値であったものが、低閾値となり新たに2本の線維で放電が認められた。pH3.0液では新たに2本の線維で圧力上昇に伴った放電が認められ、最終的に85%の線維で放電が認められた。これに対してAδ線維での放電開始の閾値等について変化が認められなかった。結論として骨盤臓器の1つ膀胱粘膜にある知覚受容体はサイトカインの1つIL1β自体で刺激されたり、酸性液により感受性の変化を起こし、知覚過敏ないし痛覚を起こしやすくなっていることを明らかにした。

神経ペプチドが多く一次ニューロンに存在したことから、これら伝達物質のあるものは主として中枢側の脊髄で、あるものは末梢側ないし、遠心路のシナプスのある骨盤神経節で作用している可能性について電気生理学的にKeast講師と検討した。実験方法は、(1)ウレタン麻酔ラットの脊髄後根を微細な線維とし、単一線維より膀胱拡張に伴った放電記録による検討,(2)膀胱収縮を指標に随腔内薬物微量投与による検討,(3)急性単離したラット仙部後根神経節細胞にCa^<++>指示薬Fura2を取り込ませ、細胞内Ca^<++>量の増大を指標に疼痛関連物質の検討,(4)摘出骨盤神経節標本での細胞内電位記録における神経ペプチドの影響の検討,(5)骨盤各臓器へのホルマリン刺激により脊髄に起こるc-fos発現の組織化学的検討を行った。三ヶ所の共同研究者のうち、de Groat教授とは初年度Birder博士に来日してもらい、Fura2の研究を中心に行った。本年度は松本助手が大学公費による留学を行い、多類の検討を行った。Morrison教授とは単一線維の実験をそれぞれ独自で行い、本年度2回にわたり結果を比較検討した。結果として、まずサイトカインの1つであるインターロイキン1β(IL1β)は膀胱粘膜部に存在する神経終末ないし神経線維に作用する可能性を発見した。膀胱容量に応じた放電数を後根線維から記録するとIL1β膀胱腔内投与後では閾値,膀胱内圧の低下,同一内圧では放電数の上昇を認めた。また排尿反射の発生する膀胱容量の低下を認めた。さらに、単離した後根神経節細胞の細胞内Ca^<++>量がIL1βで一過性の上昇をきたし、このCa^<++>が細胞内でのCa^<++>の放出であることを明らかにした。また、膀胱内液の酸・塩基性により知覚神経の感受性の変化について後根線維での活動電位記録により検討した。神経伝導速度の122m/sをAδ線維,2m/s以下をC線維として検討するとAδ線維の50%が反応し、全て膀胱の軽度拡張(540cmH_2O)により放電を開始した。C線維の56%がやはり軽度拡張の閾値をもち、8%がより高圧(4160cmH_2O)で放電を開始した。膀胱内を酸性液にかえるとC線維の半数はph4.5で放電開始閾値内圧の低下が認められた。pH3.5液では全例で閾値の低下がおこり、中性液では高閾値であったものが、低閾値となり新たに2本の線維で放電が認められた。pH3.0液では新たに2本の線維で圧力上昇に伴った放電が認められ、最終的に85%の線維で放電が認められた。これに対してAδ線維での放電開始の閾値等について変化が認められなかった。結論として骨盤臓器の1つ膀胱粘膜にある知覚受容体はサイトカインの1つIL1β自体で刺激されたり、酸性液により感受性の変化を起こし、知覚過敏ないし痛覚を起こしやすくなっていることを明らかにした。4月より米国ピッツバーグ大学de Groat教授の研究員Birder博士が来日し8月末まで東京で河谷・松本と共同研究を行った。炎症に伴い放出されるインターロイキン1β(IL1β)による,骨盤臓器の一つ膀胱の変化を検討した。その結果,(1)IL1βを膀胱腔内に注入すると,排尿反射をおこす閾値の低下が認められた。(2)IL1βは一次性知覚細胞内のCa^<++>量を一過性に上昇させた。このCa^<++>量の上昇は,ライアノジンで抑制されたが,イベリオトキシン,ウワバイン,ニフェダピンでは抑制されなかったことから細胞内のCa^<++>貯蔵部よりの放出と考えられる。(3)膀胱内腔をIL
アメリカ環境法制における省庁間政策調整の法理と実際-NEPAシステムの包括的研究

本研究は、アメリカ環境法制における省庁間政策調整の法システムについて、(1)その基盤概念として位置づけられる「環境の質」の原型が、1920年代における「保全」概念の内容的拡大に求められるという仮説を構築・提示するとともに、(2)日米における政策調整の法システムの構造を比較して図式化し、図書等で広く社会へ情報発信を行い、さらに、(3)アメリカの法システムでは、生物多様性保全政策の発展過程においても、政策調整が効果的になされてきたこと等を検証した。平成20年度は歴史分析を進め、国内外(ハワイ大学など)で1次・2次資料を収集し、環境をめぐる権限の分散と省庁間紛争の頻発という課題に対して、フランクリン・ルーズベルト政権期の執行部と連邦議会が、いかなる制度的対応を図ったのかを検討し、次のような知見・示唆を得た。(1)当時の執行部は、いくつかの省庁を統合した保全省と大統領府レベルでの諮問委員会の設置をめざしたが、前者は既存の省庁の反発を招き、現実の存在とはならず、後者は国家資源計画委員会として制度化をみたものの、その後議会によって廃止に追い込まれてしまった。とくに後者の歴史については、連邦議会が大統領への権力の集中を嫌った結果であるともいえるが、他方、特定の資源に関する権限や予算を持たない行政機関を支持することが議員にとってのインセンティブにならない、すなわち、「特定の政治的constituencyを持たない」という調整機関の特性を示唆するものであった。(2)一方、連邦議会は、新たな行政機関の創設ではなく、調整の手続(協議)を法律に書き込むという方策を支持し、テイラー放牧法や魚類・野生生物調整法に関連規定が取り込まれた。しかし、かかる協議は、当該制定法のシステム内で、かつ、通常の省庁のみを対象として作用するものであったことから、この仕組みに対して高い評価はなされていない。(3)このように、具体の施策が提案・実施されたという点で、ルーズベルト政権期の制度的対応は、統合(環境保護庁の設置)や調整(環境諮問委員会の設置)の「萌芽」として理解しうるが、それらに対する積極的な評価は少なく、むしろ、その機能不全がニューディール期を形容する「ブローカー政治」システム、すなわち一層の分散を招来する可能性のある政治システムが醸成された要因の一つであることが明らかとなった。平成21年度は構造・実態分析を進め、国内外で1次・2次資料を収集し、環境をめぐる権限の分散と省庁間紛争の頻発という課題に対して、CEQとEPAの連携がどのように機能しているかを検討し、次のような知見・示唆を得た。1.EPAにおいて、いくつかの連邦省庁の関係者と意見交換会を行った結果、連邦省庁がCEQに対して、より一層のリーダーシップの発揮を希望していること等がわかった。かかる希望の背景となっているのが、横並びの複数の省庁に環境をめぐる権限が付与されていることであり、そうした状況で特定の省庁がリーダーシップを取るのは難しいとのことであった。2.一方、CEQでのインタビュー調査からは、同機関が新政権の下で、地球温暖化対策について、一層の省庁間調整を行う等の情報を得た。具体的には、環境影響評価手続において、連邦行為の温暖化への影響をどのように評価するかに関するガイドラインの策定を検討中とのことであった。1.については、既存研究において、NEPAシステムへの「連邦省庁の側からの視点」が明らかにされてこなかったことに鑑みれば、興味深い知見であると考えられる。また、2.は、わが国が省庁レベル(環境省)で対応しがちな問題を、それよりも上位の政治レベルで行っている例であるが、そのように対応する主たる理由は、当該対応が「省庁間調整」の一環であるという事情によるものと考えられる。かかる知見は、権限の分散を前提とした環境行政組織のあり方、具体的には、環境の「司令塔」の整備のあり方という論点の存在を示唆している。最終年度である平成22年度では、これまでの考察結果を総合し、その成果を社会に見えやすい形で発信することを試みた。具体的には、CEQの機能に関するこれまでの考察結果を踏まえ、生物多様姓の確保という具体的な政策課題に着目し、それをめぐる権限の分散と関連政策の未統一という課題に対しても、当該機関(=CEQ)が政府のトップレベルから「司令塔」として効果的な働きかけを行い、調整のとれた政策発展(例:合衆国連邦政府における生態系管理の導入)を促進したこと等を明らかにした(拙著『生物多様性というロジック-環境法の静かな革命』(勁草書房・2010年)として刊行した)。この知見は、わが国の生物多様性管理法制におけるトップの強化のあり方を考える上での具体的な材料となる。さらに、平成22年度には、平成20-21年度にかけて実施した史的分析の結果を、新たに渉猟した資料の分析結果から捉えなおし、CEQとEPAの相互作用を基盤とするアメリカの環境行政組織の原型がニューディール期に現れていたという立論の手掛かりを得ることができた。かかる立論は、これまでのアメリカ環境法・環境政策学研究で看過されていたものであり、その検証作業を進めることが今後の課題として示された。

当該課題については、『環境と正義』(日本環境法律家連盟ニュースレター)掲載の連載記事(拙稿「環境の司令塔の理論と組織」(2011年4月現在も連載中))で予備的なものを示している。
肺癌化学療法への末梢血造血幹細胞移植術(PBSCT)応用の基礎的臨床的研究

切除不能の肺癌に対する治療は放射線療法、化学療法などであるが、白血球減少を中心とした骨髄抑制により治療成績は十分には改善されていない。骨髄移植の代替法としてのPBSCTを肺癌化学療法の治療成績向上のため検討することは重要である。肺癌患者より採取された末梢血造血幹細胞(PBSC)中には増殖可能な癌細胞は15例中1例にもみられなかった。PBSC凍結前後で単核球の生存率、CD34^+細胞比率、CD33-/CD34^+細胞比率、IL-12刺激による各種サイトカインの産生能、CFU-GM数に著変はみられなかった。これまで、2例の小細胞癌患者に末梢血造血幹細胞移植(PBSCT)を実施したが、骨髄機能の迅速な回復がみられている。巨核芽球中の癌遺伝子産物の検討ではRB蛋白、Cyclin A蛋白の発現が造血因子のひとつであるstemcell factor(SCF)により増加し、RBリン酸化パターンの変化がみられた。一方、G-CSFでは巨核芽球の癌遺伝子産物発現に影響を与えなかった。SCFによるRB、Cyclin Aの発現の変化と巨核芽球の分化の間に密接な関連がみとめられた。化学療法後の肺癌患者骨髄造血能の検討では化学療法開始後、2週目で最低となり、4週ないし5週目で治療前の約8割まで回復した。NK細胞活性もほぼ同様のパターンで低下、回復したが、予後の悪い症例では回復しないことが明らかとなった。大量化学療法後のNK細胞活性低下はPBSCの併用により、回復の早期化がみられ、PBSCは造血機能のみならず、抗腫瘍免疫機能のrescueにも有用であることが示唆された。肺癌患者より化学療法後に採取された末梢血造血幹細胞(PBSC)中には増殖可能な癌細胞の存在を二重軟寒天培地にて検討した。2週間の培養では、血液中の肺癌細胞によるコロニーの形成は15例中1例にもみられなかった。また、凍結保存したPBSCは解凍しても、凍結保存前のPBSCと比較し、そのコロニー形成能や細胞表面マーカーの点では著変を認めなかった。特に、凍結前後で単核球の生存率、CD34_+細胞比率、CD33_-/CD34_+細胞比率、IL_-12刺激による各種サイトカインの産生能、CFU_-GM数に著変はみられなかった。これまで、2例の小細癌患者に末梢地造血幹細胞移植(PBSCT)を実施したが、骨髄機能の迅速な回復がみられている。遠隔成績に関してはまだ、評価するのは尚早である。PBSCの造血能についても、コロニー形成試験や表面マーカーによる解析、抗癌剤投与後の骨髄機能の回復を肺癌患者で検討し得た。問題点としては、PBSCの適応となる患者を60歳未満としたので、対象症例が少なく、PBSCの臨床的意義を明らかにするためには、年齢制限を緩めるか、多施設での共同研究が必要であると考えられる。肺癌患者において化学療法により末梢血中に誘導され、apheresisで採取したPBSCは長期間(5ヶ月より9年)凍結保存しても安定であり、コロニー形成試験による評価では、コロニー数(CFU-GM,CFU-GEMM,BFU-E)が凍結前に比べ8割程度までしか減少しないことが確認された。大量化学療法(CDDP 80mg/m2,day 1;VP-16 500mg/m2,day 1,2,3)後にPBSCを併用し、ED-SCLCでは通常経験されない2年生存の患者を経験した(Jpn. J. Clin. Oncol 1995)。巨核芽球中の癌遺伝子産物の検討ではRB蛋白、Cyclin A蛋白の発現が造血因子のひとつであるstem

cell factor(SCF)により増加し、RBリン酸化パターンの変化がみられた。一方、G-CSFでは巨核芽球の癌遺伝子産物発現に影響を与えなかった。SCFによるRB、Cyclin Aの発現の変化と巨核芽球の分化の間に密接な関連がみとめられた(J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1996)。化学療法後の肺癌患者骨髄造血能の検討では化学療法開始後、2週目で最低となり、4週ないし5週目で治療前の約8割まで回復した。NK細胞活性もほぼ同様のパターンで低下、回復したが、予後の悪い症例では回復しないことが明らかとなった。大量化学療法後のNK細胞活性低下はPBSCの併用により、回復の早期化がみられ、PBSCは造血機能のみならず、抗腫瘍免疫機能のrescueにも有用であることが示唆された。
休止期においてＮＥＲ依存的に活性化するＤＮＡ損傷応答機構の解析

休止期のヌクレオチド除去修復に依存して活性化するシグナル伝達経路に着目し、その初期シグナルと生物学的意義の解明を目的として実験を行なった。その結果、その活性化はヌクレオチド除去修復の反応中間体を介して生じる2種類の二次的なDNA損傷に起因しており、致死的な作用が強い二本鎖切断が生じることを明らかにした。また、電離放射線感受性として知られる毛細血管拡張性小脳失調症患者由来の細胞が、休止期においては紫外線にも高感受性であることを示した。さらに、生体から単離した休止期もしくは休止期様の細胞について検討し、同調した培養細胞で観察されるヌクレオチド除去修復依存的な反応が生じることを明らかにした。今年度は、紫外線による塩基損傷がDSBやssDNA等の二次的なDNA損傷に変換されるメカニズムの解明と、生体内での二次的DNA損傷の生成の意義を明らかにすることを目的として実験を行い、以下のような成果を得た。1.紫外線により生じる塩基損傷の生成頻度を考慮すると、直接DSBが生成するとは考えにくく、ヌクレオチド除去修復(NER)によってDNA損傷が除去された後のssDNAギャップ中間体がエキソヌクレアーゼ等によるプロセッシングを経てDSBが生じている可能性が高い。その可能性を検討するために、S期においてDSBの生成に関わる酵素について検討を行なった。まず、最近その関与が報告されたArtemisノックアウト細胞を入手して検討を行ったが、正常細胞と比較して二次的DNA損傷の生成を示すATMの1981番目のリン酸化およびH2AXのリン酸化が低下することはなかった。また、S期において関与するMus81がArtemisの欠損をバックアップしていることを考慮し、Artemisノックアウト細胞にMus81に対するsiRNAを導入して検討を行ったが、これらの酵素の関与を示す結果は得られなかった。しかしながら、siRNAを用いてノックダウンを行った場合、20-30%程度残存するタンパク質が存在し、それらの影響を無視することはできないと考えられる。2.昨年度は生体内の休止期の細胞における反応を調べたが、本年度はゆっくり細胞周期を回っている幹細胞について検討を行った。まず典型的な幹細胞のモデルとして、正常なマウスから骨髄細胞を単離し、ソーティングにより造血幹細胞を得た。この細胞に紫外線を照射したところ、H2AXのリン酸化が観察され、NERを完全に欠損したXPAノックアウトマウスから調製した場合には、その程度は低かった。従って、幹細胞においても休止期の細胞と同様な反応が生じることが考えられる。1.紫外線により生じる塩基損傷の生成頻度を考慮すると、直接DSBが生成するとは考えにくく、ヌクレオチド除去修復(NER)によってDNA損傷が除去された後のssDNAギャップ中間がエキソヌクレアーゼ等によりプロセシングを経てDSBが生じている可能性が高い。その可能性を検討するために、候補として考えられるExo1、Mus81等の酵素についてsiRNAを用いて発現を抑制した時の影響について解析を行なった。まずこれらの酵素の発現について調べたところ、増殖停止と血清飢餓によってG0期に同調することにより、その発現が増殖期と比べて非常に低下することがわかった。さらにsiRNAを用いてノックダウンを行なったが、二次的DNA損傷の生成を示すATMの1981番目のリン酸化およびH2AXのリン酸化には、顕著な影響は見られなかった。2.生体内における休止期の細胞においても培養細胞を用いて観察された反応を同様な反応が生じることを確認するために、修復能が正常なマウスとNERを完全に欠損したXPAノックアウトマウスから胸腺とリンパ節を採取し、単離したTリンパ球に紫外線を照射し、二次的DNA損傷の生成について検討した。その結果、NER反応に依存してH2AXのリン酸化反応が生じることがわかり、生体内の休止期の細胞においても同様な反応が生じることが明らかとなった。また、今後の実験として幹細胞における反応の解析を予定しているが、それにはより少ない細胞で検討する必要があるので、蛍光免疫染色の条件を設定した。二次的DNA損傷によって活性化するDNA損傷応答反応の意義を明らかにするために、活性化するPIKKファミリーの特異的阻害剤を処理した時の影響について検討した。G0期に同調したヒト細胞に、ATM阻害剤もしくはDNA-PK阻害剤を処理し、DSB関連因子の紫外線照射部位への集積について調べた。その結果、DSBのセンサーであるMRE11の集積は、DNA-PK阻害剤ではほとんど影響を受けなかったが、ATM阻害剤の添加により顕著に抑制された。したがって、ATMのキナーゼ活性はMRE11のDNA損傷部位への集積あるいは保持に重要であり、またその欠損がA-T患者

由来細胞のG0期における紫外線感受性の増感原因の一つとして考えられた。昨年度までに、マウスから単離した休止期もしくは休止期様の細胞を用いてNER依存的な反応が生じるか検討を行なってきた。本年度は、NERの生体内における機能として重要な皮膚における反応に注目し、分化誘導を行なったケラチノサイト、そしてマウス個体にUV-Bを照射した時の反応について検討を行なった。塩化カルシウムの添加により分化誘導を行なった正常ヒト由来のケラチノサイトに紫外線を照射すると、H2AXのリン酸化が観察され、またその反応はNERの阻害剤を添加することにより抑制された。NER能が正常なマウスにUV-B紫外線を照射した後に組織切片を作成し、蛍光免疫染色により解析したところ、基底層部分の細胞にH2AXのリン酸化が観察された。またそのリン酸化は、増殖性の指標であるKi-67抗原の染色性に関わらず観察されたことから、皮膚においてもS期に依存した反応と非依存的な反応が存在すると考えられた。今後、NER能を完全に欠損したXPAノックアウトマウスを用いて同様な実験を行い、NER依存性について検討する必要がある。分子細胞生物学本研究計画を遂行する上で鍵となるのが、着目するDNA損傷応答を活性化する二次的DNA損傷生成機構の解明にある。それはNERによってDNA損傷が除去された後に生じたssDNAギャップ中間体が、エンドもしくはエキソヌクレアーゼ等によるプロセシングを経てDSBを生成する可能性が高く、その酵素の同定が極めて重要である。昨年度、静止期の細胞に比較的効率良くsiRNAを導入する条件を決定したが、種々のsiRNAを導入してその発現量の変化について検討してみると、やはり無視できない量のタンパク質が残存しており、そのノックダウンの効果に関してはっきりとした結論が得られないことが大きな要因として挙げられる。また、紫外線照射後の局在性の変化についても検討を進めたが、導入効率や発現量の低さが原因となり、はっきりとした結果が得られていないことも研究を遅らせる原因となっている。そして生体内における反応について検討するには、NERを欠損したノックアウトマウスの解析が必須であったが、なかなか胎児が生まれず、計画していた実験がなかなか進められなかった。本研究計画を遂行する上で鍵となるのが、着目するDNA損傷応答を活性化する二次的DNA損傷生成機構の解明にある。それはNERによってDNA損傷が除去された後に生じたssDNAギャップ中間体が、エキソヌクレアーゼ等によりプロセシングを経てDSBが生成する可能性が高く、その酵素の同定が極めて重要である。本年度は、その候補として考えられるExo1やMus81等の酵素についてsiRNAを用いて発現を抑制した時の影響を解析したが、G0期に同調した場合にはこれらの発現が対数増殖期と比べて著しく低下しており、その発現の正確な把握が非常に難しかったことが計画の遅れた原因として挙げられる。また、静止期の細胞に効率良くsiRNAを導入する条件の決定に、予想よりも多くの時間が必要であったことも要因の一つである。
エキソソームによる子宮内膜の細胞間情報伝達の分子機構と内膜癌化に関する基礎研究

エキソソームは直径数10nmの細胞外分泌小胞であり、新たな細胞間情報伝達分子として注目されている。本研究課題では子宮内膜癌細胞と子宮内膜間質細胞とのエキソソームを介した情報伝達機構につき検討し、内膜癌細胞から内膜間質細胞へとエキソソームを介した機能性small RNAの受け渡しが証明された。子宮内膜癌細胞は、エキソソーム内RNAの授受を介して内膜間質細胞の遺伝子発現を制御している可能性が示唆された。本年度は、子宮内膜癌細胞と子宮内膜間質細胞とのエキソソームを介した細胞間コミュニケーションに関して、特にエキソソーム内包RNAの授受に注目し詳細な検討を行った。1.子宮内膜癌細胞にtargetのshRNAもしくはnon-targetのshRNAを導入し、各shRNAが子宮内膜癌の分泌するエキソソームに取り込まれていることを確認した。それらのエキソソームを子宮内膜間質細胞に添加し、targetのshRNAを含むエキソソームを添加した場合に特異的に子宮内膜間質細胞内でのtarget shRNAの発現上昇とtarget遺伝子に対する発現抑制が観察されることを確認した。この結果から、機能性のshRNAが子宮内膜癌細胞由来のエキソソームを介して子宮内膜間質細胞へと輸送されることが示唆された。2.子宮内膜癌細胞と子宮内膜間質細胞とのmicroRNAの発現プロファイルを比較し、子宮内膜内膜間質細胞の多くは子宮内膜癌細胞とは異なるクラスターに分類されることを明らかにした。3.子宮内膜癌由来のエキソソーム添加による子宮内膜間質細胞でのmicroRNAの発現量の変化を検討した。エキソソーム添加により、子宮内膜間質細胞でのmicroRNAの発現が外来性に増加すること、および、増加したmicroRNAが機能性であることが示唆された。本研究により、子宮内膜癌細胞から子宮内膜間質細胞へとエキソソームを介して機能性のsmall RNAが受け渡されていることが証明された。本年度は子宮内膜癌細胞が分泌するエキソソームについて詳細な検討を行った。1.子宮内膜癌細胞由来のエキソソームの回収:子宮内膜癌細胞が分泌するエキソソームを超遠心にて分離し、電子顕微鏡による大きさ、形態の確認、エキソソームマーカーであるCD63の発現の確認を行った。2.エキソソーム内RNAと細胞内RNAとの発現プロファイルの比較:エキソソームを分泌する子宮内膜癌細胞および分泌されたエキソソームより各々RNAを抽出し、RNAの鎖長分布ならびに発現するRNAの種類についてマイクロアレイを用いて検討した。エキソソームには鎖長の短いRNAが豊富に含まれること、および、microRNAの選択的な取り込みが見られることを明らかにした。3.エキソソームの細胞間授受に関する検討:子宮内膜癌細胞が分泌するエキソソームを蛍光タンパクでラベルした。子宮内膜癌細胞、正常子宮内膜上皮細胞、正常子宮内膜間質細胞、子宮内膜癌間質細胞を用いて、子宮内膜癌が分泌した蛍光ラベル化エキソソームの取り込みの有無を検討した。実験に用いた細胞間で、子宮内膜癌細胞由来エキソソームの受け取りやすさに差があることを明らかにした。以上の結果は、子宮内膜癌細胞が特定の細胞との選択的なエキソソームの受け渡しを通じて、当該細胞の遺伝子発現を調節している可能性を示唆するものである。次年度は、エキソソームを介した子宮内膜関連細胞間の遺伝子発現調節の立証と、その生物学的意義についてさらに検討を行う予定である。当初の予定通り、子宮内膜癌を中心に、エキソソームの回収と内包するRNAについての検討、および、細胞間でのエキソソームの授受に関する検討が順調に進んでいる。子宮内膜癌細胞由来のエキソソームの授受により、受け手側の細胞に生じる変化を中心に検討する。具体的には、遺伝子発現の変化や癌に関連した様々な形質変化(細胞増殖や浸潤能など)について検討し、子宮内膜癌におけるエキソソームを介した細胞間コミュニケーションの意義について明らかにする。当初、外注による受託解析を予定していたマイクロアレイ解析を学内で施行したため差額が生じた。差額分は次年度の消耗品費に充当する予定である。