hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
場の理論に基づくマルチスケール多結晶塑性モデリングに関する研究

前者は,マクロには観測されない応力場のゆらぎを記述し,局所的に応力平衡から逸脱した成分と解釈することができる.一方後者は,局所的にひずみの適合条件からの逸脱の度合いを表し,ひずみ場のゆらぎを記述する.次に最も簡単な二相合金のモデルとして,硬質粒を一定の体積分率で含む多結晶モデル,さらには結晶粒径の分布を系統的に変化させた場合についても同様の解析を行い,上記の各ゆらぎに及ぼす影響を通して,こうした一般の場合の多結晶塑性モデリングへの適用を試みた.本年度はとくに,多結晶の変形挙動に及ぼす結晶粒集団的な多体効果を明らかにすることを目的に,単相および二相の多結晶金属材料の有限要素解析を行った.結晶粒の集合体スケールにおける不均質な変形挙動に対し,その特徴および結晶粒間の相互作用である遠隔効果の影響領域について詳細に検討を加えている.得られた主な結果は以下の通りである.結晶粒数の増加に伴い,巨視的変形応答は一定値に収束するが.各結晶粒の変形応答に大きな変動が見られ,不均質変形が顕著になるが,この傾向は硬質粒を含むことでより顕著になることが明らかとなった.また,その不均質性は硬質粒の分布形態により大きく異なり,応力場の不均質性は主として静水圧応力に反映される.さらに静水圧応力には,同じ結晶方位を持つ結晶粒においても,周囲の結晶粒との相対的な位置関係の変化によりその挙動に大きな差異が生じ,結晶粒の集団挙動を検討する上で,重要な因子の一つであることが示された.また,多結晶体中の個々の結晶粒の変形は遠方に存在する結晶粒群からも影響を受け,その影響領域は結晶粒数にして数百個にも及ぶ.さらに,硬質粒を含むことで影響領域はより大きくなり,強度比や体積分率の変化による材料の不均質性に依存する.これより,多結晶材の変形挙動の評価には,ユニットセル内に最低でも数百個の結晶粒数が必要であり,また,巨視的変形応答のみではなく,微視領域の不均質変形についても評価することが本質的に重要であることを示した.以上に加えて,変形の進行により多結晶体中に縦断して形成される不均質変形構造についても検討を加えている.同不均質構造は,大きくは応力を支持する応力支持構造と塑性変形を担い変形を伝達する変形伝達構造に分けられる.前者は変形初期段階の弾性変形時から形成され,それに遅れて後者が形成される.とくに二相材では,引張方向に配向した硬質粒を繋ぐように応力支持構造が形成され,単相材よりも早期に構造形成が始まる.また変形伝達構造は母相の軟質粒で形成される.以上の知見に基づき,硬質粒の体積分率や分布形態,強度比を変化させることで両不均質構造の形成形態が制御可能であることを指揃した.本年度はとくに,連続体力学モデルで記述が可能な幾何学セル(一般にGNDと呼ばれているものに対応)の数理モデル構築を目指し,微分幾何学的場の理論における曲率テンソルから得られる不適合度テンソルの詳細なモデル化を行った.得られた主な結果は以下の通りである.不適合度テンソルに基づくひずみ勾配項を定式化し,結晶塑性構成式に導入することで,連続体力学的解析結果からスケールを遡って転位配列に関する情報を評価することを試みた.その結果,例えば結晶粒内に,その結晶方位に依存した変調構造が形成されることを見出した.ここでは解析中に出算出されたマクロな塑性ひずみテンソルから不適合度テンソルを求め,それを各すべり系に分解(不適合度項と呼ぶ)することで,微視的構成式における硬化発展モデルに考慮した.不適合度項に現れる正負に跨る変調分布(曲率の正負に対応する符号を考慮している)が,応力およびひずみ分布にも反映された結果である.有効セルサイズ分布にも反映され,本モデルの範疇では,最終的に力学セルサイズの空間分布が求まることになる.例えば,小さい力学セルがバンド状に分布している場合,これはバンド幅に応じてマイクロバンドやマトリクスバンドに相当すると解釈することができる.ただし,物理的に妥当な分解方法には少なくとも3種類考えられ,分解方向により変調構造のパターンが異なる点については,今後更なる検討が必要である.また,不適合度テンソルを純粋な変形部分と回転部分に分離し,各々に対する不適合度を評価できるようにした.さらにFrankベクトルを考慮して純回転部分をさらに分解することで,回位(or転傾:disclination)の3種類を具体的に評価することが可能となった.
免疫チェックポイント阻害剤併用による新規膀胱内BCG注入療法の開発

ている。そのTURBTにより、筋層非浸潤性膀胱癌の治療は著しく改善されてきたが、TURBTだけでは膀胱内再発・進展を完全に防止することはできず、TURBT施行後の再発防止目的で、BCG(bacillus Calmette-Guerin)の膀胱内注入療法が行われている。しかしBCG療法の有用性に関するエビデンスが蓄積されているに関わらず、その激しい副作用故、治療継続が出来ないことが多い。そこで本研究では、BCG+抗PD-1(PD-L1)抗体を使用し、より抗腫瘍効果の高い、またより副作用の少ないBCG治療の確立を目指している。1.我々はすでにBCG+抗PD-1抗体がBCG単独療法よりもより強力な抗腫瘍効果を示すという結果を得ている。2.治療後28日目でその膀胱腫瘍を摘出しコラギナーゼ処理を施し、好中球、リンパ球を抽出。FACSにて実際に抗腫瘍効果に関与する好中球が効率的に誘導されているのかを確認したところ、その誘導に差はなかった。その他、CD8 Tリンパ球、NK細胞などもその誘導数に差はなく、リンパ球、NK細胞の性質が抗腫瘍効果に関与している可能性が示唆された。3. CTL活性(細胞障害性Tリンパ球活性)、NK活性を測定したところ、BCG+抗PD-1抗体がBCG単独療法よりもより強力な活性を示すことが分かり、そのことが抗腫瘍効果の差に表れている可能性が示唆された。抗腫瘍効果マウスにてBCG-抗PD-1抗体とBCG膀胱内注入療法を行い、21日目でマウスの背側に新たな腫瘍を皮下注を行った。この腫瘍を所謂遠隔転移とみなし、その腫瘍径を測定したところ両者においてその差が認められた。その原因検索に現在注力しているが、このことはBCG療法が遠隔転移にも効果を認める可能性が示唆されたからである。当初の予定通り実験計画は遂行できているものと考える。現在までは2018年までに購入済みであった抗体、薬品、マウスのみでほとんどの実験が遂行出来てきたが、今後はマウスの購入、新たな薬品購入などが必要となることが予想される。現在までBCG-抗PD-1抗体ブ治療群においてCD8 Tリンパ球、NK細胞の誘導に差がなかった為、リンパ球の性質に差があることが予想され、分画、細胞数、活性に差があった細胞を抗体を使用しマウス体内から消失させ、その細胞群が本当に抗腫瘍効果に関与しているのかを再度確認する。さらに抗PD-1抗体添加によるメモリータイプCD8+ Tリンパ球の維持機構を解析するため、膀胱注入療法を行ったB6マウスの膀胱、脾臓、リンパ節よりCD8+Tリンパ球をMACSで分離し、さらにCD44highCD62L-Ly6c+(メモリータイプ)とCD44highCD62L+Ly6C-Tリンパ球をセルソーター(FACS vantage)でソーティングしてアポトーシスの有無をDNAフラグメンテーション,ヨウ化プロピジウム染色, hypodiploid DNA量,アネキシン・(フロサイトメーター)にて調べる予定である表在性膀胱癌、すなわち筋層非浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer)は、基本的に初期治療として経尿道的膀胱腫瘍切除術(TURBT)が行われている。そこで本研究では、BCG-抗PD-1(PD-L1)抗体を使用し、より抗腫瘍効果の高い、またより副作用の少ないBCG治療の確立を目指している。1.我々はすでにBCG-抗PD-1抗体がBCGよりもより強力な抗腫瘍効果を示すという結果を得た。その他、CD8 Tリンパ球、NK細胞などもその誘導数に差はなく、の性質が抗腫瘍効果に関与している可能性が示唆された。3.マウスにてBCG-抗PD-1抗体とBCG膀胱内注入療法を行い、21日目でマウスの背側に新たな腫瘍を皮下注を行った。その原因検索に現在注力しているが、このことはBCG療法が遠隔転移にも効果を認める可能性が示唆された。現在までは2017年までに購入済みであった抗体、薬品、マウスのみでほとんどの実験が遂行出来てきたが、今後はマウスの購入、新たな薬品購入などが必要となることが予想される。ている。

しかしBCG療法の有用性に関するエビデンスが蓄積されているに関わらず、その激しい副作用故、治療継続が出来ないことが多い。そこで本研究では、BCG+抗PD-1(PD-L1)抗体を使用し、より抗腫瘍効果の高い、またより副作用の少ないBCG治療の確立を目指している。1.我々はすでにBCG+抗PD-1抗体がBCG単独療法よりもより強力な抗腫瘍効果を示すという結果を得ている。2.治療後28日目でその膀胱腫瘍を摘出しコラギナーゼ処理を施し、好中球、リンパ球を抽出。FACSにて実際に抗腫瘍効果に関与する好中球が効率的に誘導されているのかを確認したところ、その誘導に差はなかった。その他、CD8 Tリンパ球、NK細胞などもその誘導数に差はなく、リンパ球、NK細胞の性質が抗腫瘍効果に関与している可能性が示唆された。3. CTL活性(細胞障害性Tリンパ球活性)、NK活性を測定したところ、BCG+抗PD-1抗体がBCG単独療法よりもより強力な活性を示すことが分かり、そのことが抗腫瘍効果の差に表れている可能性が示唆された。抗腫瘍効果マウスにてBCG-抗PD-1抗体とBCG膀胱内注入療法を行い、21日目でマウスの背側に新たな腫瘍を皮下注を行った。この腫瘍を所謂遠隔転移とみなし、その腫瘍径を測定したところ両者においてその差が認められた。その原因検索に現在注力しているが、このことはBCG療法が遠隔転移にも効果を認める可能性が示唆されたからである。当初の予定通り実験計画は遂行できているものと考える。現在までは2018年までに購入済みであった抗体、薬品、マウスのみでほとんどの実験が遂行出来てきたが、今後はマウスの購入、新たな薬品購入などが必要となることが予想される。現在までBCG-抗PD-1抗体ブ治療群においてCD8 Tリンパ球、NK細胞の誘導に差がなかった為、リンパ球の性質に差があることが予想され、今後はCTL(cytotoxic T lymphocyte)、NK(Natural Ki ller)活性を測定する。その後分画、細胞数、活性に差があった細胞を抗体を使用しマウス体内から消失させ、その細胞群が本当に抗腫瘍効果に関与しているのかを再度確認する。さらに抗PD-1抗体添加によるメモリータイプCD8+ Tリンパ球の維持機構を解析するため、膀胱注入療法を行ったB6マウスの膀胱、脾臓、リンパ節よりCD8+Tリンパ球をMACSで分離し、さらにCD44highCD62L-Ly6c+(メモリータイプ)とCD44highCD62L+Ly6C-Tリンパ球をセルソーター(FACS vantage)でソーティングしてアポトーシスの有無をDNAフラグメンテーション,ヨウ化プロピジウム染色, hypodiploid DNA量,アネキシン・(フロサイトメーター)にて調べる予定である現在までBCG-抗PD-1抗体ブ治療群においてCD8 Tリンパ球、NK細胞の誘導に差がなかった為、リンパ球の性質に差があることが予想され、分画、細胞数、活性に差があった細胞を抗体を使用しマウス体内から消失させ、その細胞群が本当に抗腫瘍効果に関与しているのかを再度確認する。さらに抗PD-1抗体添加によるメモリータイプCD8+ Tリンパ球の維持機構を解析するため、膀胱注入療法を行ったB6マウスの膀胱、脾臓、リンパ節よりCD8+Tリンパ球をMACSで分離し、さらにCD44highCD62L-Ly6c+(メモリータイプ)とCD44highCD
ヒストンメチル化によるPD-L1発現調節の分子機序解明

1肺癌切除検体を用いたPD-L1とEZH2発現の解析九州大学消化器・総合外科にて手術を行った肺腺癌417例について、PD-L1とEZH2の発現をIHCにて解析した。PD-L1については抗PD-L1抗体(クローンSP142、ラビットモノクローナル)を用いた。染色条件は1:100の希釈濃度であり、陽性基準として腫瘍細胞、および腫瘍浸潤免疫細胞が染色されるもの、そして全体の5%以上が染色されるものを陽性と定義した(Herbst RS, et al., Nature, 2014)。また、EZH2については抗EZH2抗体(クローン6A10、マウスモノクローナル)を用いた。染色条件は1:100の希釈濃度であり、陽性基準としてAllred scoreを用い(Allred DC, et al., Mod Pathol, 1998)、0-2を陰性3-8を陽性とした。PD-L1とEZH2の発現は21%、および51%に認められ、さらにPD-L1とEZH2の発現は有意に相関することを示された(P<0.001)。2細胞株におけるEZH2発現調節によるPD-L1発現変化の解析まず、Lu139、PC9、RERF-LC-KJ、EBC-1、RERF-LC-AI、SBC-5、およびA549などの肺癌細胞株におけるEZH2とPD-L1のmRNAレベルでの発現レベルを検討したが、両者に有意な相関は見られなかった。次に、mRNAレベルでのEZH2の発現が高い、Lu139、SBC5、およびRERF-LC-AIを用いて、siRNAによるEZH2ノックダウン(siEZH2)を行い、mRNAレベルでのPD-L1の発現変化を解析した。しかし、EZH2ノックダウンを行わなかった細胞株(ネガティブコントロール)と比して、siEZH2によるPD-L1のmRNAレベルでの発現は有意な変化が見られなかった。上記のごとく、ヒト検体を用いてPD-L1とEZH2の相関関係を示すことができ、同結果をAnnals of Thoracic Surgery, 2019 Feb; 107(2):393-400.に原著として報告した。また、negative resultsではあるが、細胞株を用いた検討も行うことができたため、研究の進捗としては「おおむね順調に進展している」と判断した。当研究では臨床検体レベルにおいてEZH2とPD-L1の有意な相関関係が証明されたが、細胞株を用いた検討では両者の関係は証明できなかった。この理由の一つとして、EZH2によるノンヒストンタンパクとしてのPD-L1のメチル化の可能性が考えられる。これまでに、p53、RB1、およびSTAT3などの癌細胞の発がん・増殖・生存に重要な役割を有するノンヒストンタンパクが、ヒストンメチル化酵素によってアミノ酸残基のメチル化を受け、機能調節を受けることが報告されている(Hamamoto R, et al.,Nat Rev Cancer, 2015)。すなわち、メチル化によって、(1)他の修飾への影響、(2)タンパク同士の結合への影響、(3)タンパクの安定性への影響、(4)タンパクの局在変化、および(5)転写因子のプロモーター領域への結合変化が生じる(表1)。EZH2については、これまでにSTAT3などのノンヒストンタンパクをメチル化することが知られており、EZH2によるPD-L1のメチル化の可能性も考えられるため、今後検討を行う予定である。PD-L1とEZH2の発現は21%、および51%に認められ、また、両者が正の相関を示すことを同定した。すなわち、EZH2陽性症例では49%がPD-L1陽性であったが、EZH2陰性症例では7%のみPD-L1陽性であった(P<0.001)。臨床検体における両者の有意な相関を示した点で意義深く、今後、細胞株の実験を行う際のrationaleとなる可能性がある。上述のごとく、臨床検体を用いてPD-L1とEZH2の有意な相関を示すことができたため。2細胞株におけるEZH2発現調節によるPD-L1発現変化の解析

まず、Lu139、PC9、RERF-LC-KJ、EBC-1、RERF-LC-AI、SBC-5、およびA549などの肺癌細胞株におけるEZH2とPD-L1のmRNAレベルでの発現レベルを検討したが、両者に有意な相関は見られなかった。次に、mRNAレベルでのEZH2の発現が高い、Lu139、SBC5、およびRERF-LC-AIを用いて、siRNAによるEZH2ノックダウン(siEZH2)を行い、mRNAレベルでのPD-L1の発現変化を解析した。しかし、EZH2ノックダウンを行わなかった細胞株(ネガティブコントロール)と比して、siEZH2によるPD-L1のmRNAレベルでの発現は有意な変化が見られなかった。上記のごとく、ヒト検体を用いてPD-L1とEZH2の相関関係を示すことができ、同結果をAnnals of Thoracic Surgery, 2019 Feb; 107(2):393-400.に原著として報告した。また、negative resultsではあるが、細胞株を用いた検討も行うことができたため、研究の進捗としては「おおむね順調に進展している」と判断した。今後、肺腺癌のみならず、肺扁平上皮癌や小細胞肺癌の切除例においても、PD-L1とEZH2の相関を解析する予定である。また、PD-L1とEZH2の相関のメカニズムについても、細胞株を用いた解析などによって明らかにする予定である。当研究では臨床検体レベルにおいてEZH2とPD-L1の有意な相関関係が証明されたが、細胞株を用いた検討では両者の関係は証明できなかった。この理由の一つとして、EZH2によるノンヒストンタンパクとしてのPD-L1のメチル化の可能性が考えられる。これまでに、p53、RB1、およびSTAT3などの癌細胞の発がん・増殖・生存に重要な役割を有するノンヒストンタンパクが、ヒストンメチル化酵素によってアミノ酸残基のメチル化を受け、機能調節を受けることが報告されている(Hamamoto R, et al.,Nat Rev Cancer, 2015)。すなわち、メチル化によって、(1)他の修飾への影響、(2)タンパク同士の結合への影響、(3)タンパクの安定性への影響、(4)タンパクの局在変化、および(5)転写因子のプロモーター領域への結合変化が生じる(表1)。EZH2については、これまでにSTAT3などのノンヒストンタンパクをメチル化することが知られており、EZH2によるPD-L1のメチル化の可能性も考えられるため、今後検討を行う予定である。2018年度の研究使用金額が予定額に満たなかったため。次年度の研究として使用予定である。
光反応に対する固相および界面の効果

本年度の研究は次の4つに分類することができる。1.固相光化学反応、2.吸着相の光化学反応、3.固液界面を介しての光化学反応、4.固体表面光化学反応。1.に関しては、低温共凝縮マトリックス試料中における鉄ペンタカルボニルとエタンの反応、混合単分子累積膜中のカルバゾル基の光化学的性質。2.に関しては、アクリジン吸着種の電子スペクトルに対する吸着剤の影響、シリカ担持バナジウム酸化物のリン光とそのダイナミックス、シリカゲル担持遷移金属酸化物の拡散反射スペクトル、多孔質ガラスに吸着したピレンの電子スペクトル、シリカゲル担持色素の蛍光寿命への圧力および温度効果、CVD法で調整した高分散酸化バナジウム触媒による光酸化反応。3.に関しては、ハロゲン化銀へチロ界面におけるホトキャリヤーの移動、半導体の光触媒作用によるn型シリコンウェハーの暗面上へのポリピロールの酸化的析出、透明導電膜/超微細な導電チャンネルをもつ絶縁膜/半導体接合を用いる高効率太陽電池、湿式太陽電池の新しい理論。4.に関しては、基板上に吸着した有機金属化合物の光分解、レーザアブレーションにより生成した金属原子による化学発光、金属のレーザアブレーションによるイオン分子反応、SiO_2上におけるジシランからの光CVDアモルファスシリコンの初期過程。以上16件の研究が第7回固体・表面光化学討論会(世話人:三重大工学部;佐藤博保)を中心に発表された。
イメージベースト重合メッシュ法による不均質体のノンローカル応力解析とその検証

独自の重合メッシュ法(mesh superposition method)を用い、実際の不均質材料の3次元ミクロ構造モデリングを高分解能X線CTを用いるイメージベース手法により行う新たな「イメージベースト重合メッシュ法」を提案した。この手法は、これまでのマルチスケール法で取り扱うことが不可能であった継手界面や、局部的に集中して現れる塑性域、損傷域の考慮、ひずみ勾配を考慮した問題などのノンローカル問題に適用可能である。具体的に、数マイクロメートルの高分解能で微視形態をとらえ、大規模3次元マルチスケール解析を行う。ミクロモデリングを行うために、モルフォロジー分析法についての研究も行った。マクロモデルでは均質化材料モデルを用いるが、任意の複雑なミクロ構造に対応するため均質化法を適用する。すなわち、均質化法と重合メッシュ法の併用解法といえる。重合メッシュ法においてミクロメッシュとマクロメッシュの相関を表す剛性項のために大規模問題となる点については、RCM法によるリナンバリングが有効であることを見いだした。これにより、本研究においても通常のパソコンで約10万要素の3次元解析が可能となった。適用例として多孔質セラミックスをとりあげ、モルフォロジー分析、ミクロ・マクロモデリング、マクロき裂先端におけるミクロ応力解析を実施した。また、精度検証として、イメージベースモデリング手法の妥当性について計測結果と比較して誤差1%程度という良好な結果を得たほか、2次元重合メッシュ法において界面でのミクロ応力解析の精度検証を行った。これらの精度検証の結果は、今後の提案手法の実用化に向けて貴重なデータとなる。また、得られた3次元ミクロ応力分布の可視化および定量的評価のために、応力ヒストグラムなどが容易に処理できるソフトV-SEMを開発した。イメージペースト重合メッシュ法の開発にあたり、まず、3次元大規模解析を行うため、重合メッシュ法用のソルバーの開発を行った。当初有力と見られた前処理付き共役勾配法について検討したが、種々の前処理法を考案したものの問題により良好な収束が得られなかった。最終的に、外部記憶を用いるアウトコアスカイライン法(プロックスカイライン法)が最適との結論に達し、通常のパソコンに外付けHD(60GB)を付け、約15万要素の大規模解析を実現した。次に、イメージベース手法については、種々のセラミックス多孔体に対し、X線CTによる断層写真からボクセル要素分割を自動的に行うシステムを構築した。その検証のため、従来のマルチスケール法である均質化法を用い、貫通気孔を有するセラミックス多孔体の応力解析を行った。ここで、得られる3次元ミクロ応力分布の評価も重要であるため、専用のビジュアリゼーションソフトの開発に着手した。また、内部の応力分布把握のために立体視のシステムを構築した。さらに、ノンローカル問題においては、微視構造の不均質性を詳細に検討する必要があるとの着想から、微視構造のモルフォロジー分析アルゴリズムを考案し、特に孔の分散状態とミクロ応力集中の相関性について検討した。上記の大規模解析用重合メッシュ法の適用例として、制御された多孔質セラミックス薄膜の界面き裂近傍におけるミクロ応力解析を行った。き裂先端近傍でのマクロな応力勾配の影響を考慮したノンローカル応力解析が可能であることを確認した。多孔質セラミックス以外の適用例として、繊維強化プラスチックについても研究を行い、微視的不均質性に起因するノンローカルな現象を捉えるため、大ひずみ分布のイメージベース計測手法の開発を行い、深絞り成形や真空成形への適用を行い、有効性を確認した。X線CTにより取得した不均質体のミクロ構造モデルを用いて重合メッシュ法によりマルチスケール解析を行おうとするイメージベースト重合メッシュ法の開発にあたり、大規模な3次元解析を通常のコンピュータを用いて行い、ロバスト性と解析精度を両立することができる手法として、RCM法によるリナンバリングと直接法であるブロックスカイライン法をソルバーとするプログラムを開発した.このプログラムを用い、多孔質フィルタ膜と基板界面にマクロき裂を想定した

3次元問題において、き裂先端近傍の高い応力勾配下におけるノンローカルなミクロ応力解析を行い、解析結果の妥当性を検討した.解析規模は、総要素数が約8万ソリッド要素であった.従来のマクロ解析と比較し、気孔率だけでは予測不可能なミクロ応力が発生し、その原因はき裂先端の高い応力勾配と孔のランダム分散の影響であることがわかった.均質化法では、非周期的なミクロ応力分布を考慮することができず、重合メッシュ法がこのようなノンローカル応力問題に有効であることがわかった.さらに、球状多孔質アルミナの実材の高分解能X線CT断層写真を用いたイメージベースト重合メッシュ法の解析について、特にミクロモデリングの検討を行った.ランダムな球状気孔の分散状態を考慮し、均質化のためのユニットセルモデリングと、応力評価用のミクロモデリングを別個に行うことの有効性を確認した.次に、マクロ部材中のミクロモデルの設定について、不均質なモルフォロジーの分析をもとに行うことの重要性を見いだし、モルフォロジー分析と統合したシステム設計を行った.また、精度の観点から、重合メッシュ法における多孔質体のミクロモデリングのノウハウ、積分方法について検討を開始した.解析結果のミクロ応力の可視化手法として、内部状態を把握するためのグラフ表示機能を検討するとともに、立体視を行うためのシステム開発に着手した.独自の重合メッシュ法(mesh superposition method)を用い、実際の不均質材料の3次元ミクロ構造モデリングを高分解能X線CTを用いるイメージベース手法により行う新たな「イメージベースト重合メッシュ法」を提案した。この手法は、これまでのマルチスケール法で取り扱うことが不可能であった継手界面や、局部的に集中して現れる塑性域、損傷域の考慮、ひずみ勾配を考慮した問題などのノンローカル問題に適用可能である。具体的に、数マイクロメートルの高分解能で微視形態をとらえ、大規模3次元マルチスケール解析を行う。ミクロモデリングを行うために、モルフォロジー分析法についての研究も行った。マクロモデルでは均質化材料モデルを用いるが、任意の複雑なミクロ構造に対応するため均質化法を適用する。すなわち、均質化法と重合メッシュ法の併用解法といえる。重合メッシュ法においてミクロメッシュとマクロメッシュの相関を表す剛性項のために大規模問題となる点については、RCM法によるリナンバリングが有効であることを見いだした。これにより、本研究においても通常のパソコンで約10万要素の3次元解析が可能となった。適用例として多孔質セラミックスをとりあげ、モルフォロジー分析、ミクロ・マクロモデリング、マクロき裂先端におけるミクロ応力解析を実施した。
生検膵癌でのRNA結合蛋白－mRNA複合体発現解析と術前病理診断への応用

膵癌組織における発現及び各蛋白発現の組み合わせパターンを免疫組織化学的に評価する。引き続き同一膵癌患者の手術材料に関して同様の免疫組織化学的検討を行い、浸潤進達度・遠隔転移等の臨床病理学的諸因子との関連や、多変量解析による予後評価を行う。これら生検及び手術材料から得られた免疫組織化学的検討結果を比較することで、両者の高一致率を確認し、術前生検による癌関連蛋白発現結果をもちいた評価及び組織診断に基づき、術前及び術直後からの化学・放射線療法の選択適応性の有無を評価確立することで、膵癌術後治療方針決定にも応用可能な生検材料による病理診断の実現を目的とする。
酵母のBCAAアミノ基転移酵素の細胞内局在性とBCAA生合成機構に関する研究

分岐鎖アミノ酸(BCAA;バリン、ロイシン、イソロイシン)は健康機能(筋肉強化、肝機能向上、疲労回復など)を有する必須アミノ酸である。酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、BCAAはミトコンドリア内でBCAAアミノ基転移酵素(BCAT)によって生合成が完了する。BCATにはBat1・Bat2の2種類が存在し、Bat1はミトコンドリアに、Bat2は細胞質にそれぞれ局在する。本研究ではS. cerevisiaeを用い、BCATの細胞内局在性や一次構造の相違が分子機能や生理的役割に及ぼす影響を解明することで、BCAA生合成におけるBCATの重要性を理解することを目的とする。
地域におけるスポーツ環境とモデルクラブの評価に関する研究

平成11年度は、総合型の地域スポーツクラブを立ちあげているクラブのリストアップ作業を進めた。文部省の補助事業だけでなく、県や市独自の補助事業も進められ、また、日本体育協会もスポーツ少年団を核として総合型の補助事業を始めている。これらのいわば新規事業としての総合型クラブに加え、向陽スポーツ文化クラブや垂水団地スポーツ協会などの先駆的な総合型クラブを加え、一覧表を作成した。一覧表にあがった総合型地域スポーツクラブに加え、京都府立体育館と明石市教育委員会の協力を得て、単一種目型クラブに対して、郵送法および配票留置法により質問紙調査を実施した。回収した調査票は、単一種目型クラブと総合型クラブに分けて、データ分析を行い、それぞれの特徴と差異を考察した。自治体のスポーツ環境調査は、全国687市に対して郵送法により調査票を配布した。回収した調査票は、ハードウェア部門、ソフトウェア部門、ヒューマンウェア部門に分けて分析を行った。それぞれの平均値を基にして、偏差値を算出し、部門別と全体による上位の市をリストアップした。最後に、スポーツクラブ調査とスポーツ環境調査の結果を検討し、今後の地域スポーツの振興に関する提言を行った。本研究の目的は、地域におけるスポーツ環境の評価指標を作成し、わが国における地域スポーツクラブ制度を検討することにより、地域におけるスポーツ環境の評価と整備に関する指標を作成することにある。具体的には、先行研究の資料の分析および地域スポーツクラブのモデル事例のフィールドワークにより、スポーツ環境の評価指標を作成する。研究初年度の平成9年度は、データベース検索により先行研究を収集し、スポーツ環境と地域スポーツに関するレビューを行った。また、モデル事例とされているスポーツ都市に関する資料を、(財)健康・体力づくり事業財団が発行している「体力つくり優秀組織表彰受賞組織一覧」から入手し、都道府県別モデル団体・組織一覧を作成した。筆者らが昨年度科研費の補助を受け調査研究した「全国スポーツ・健康関連都市宣言一覧」と合わせて、モデル事例の事業内容を検討した。さらに、モデル事例とされている福岡市や兵庫県五色町、北海道幕別町のフィールドワークを実施し、ヒアリング調査と関係資料を収集した。これらの分析により、スポーツ環境の評価指標を検討し、評価指標の原案を作成し、兵庫県内の自治体の生涯スポーツ担当者に対してプリテストを行い、評価指標原案の修正を行った。地域スポーツクラブ調査においては、既にモデルになっている地域スポーツクラブのフィールドワークを実施した。練馬区学校開放型クラブ、東京都杉並区の向陽スポーツ文化クラブ、京都府立体育館、明石コミュニティセンター、垂水団地スポーツ協会、芦屋市コミュニティスクールのフィールドワークを行い、クラブ代表や担当者からヒアリング調査を実施した。これらの成果と先行研究の検討により、スポーツクラブ調査票を作成し、モデルクラブに対して、郵送法による質問紙調査を実施した。平成10年度は、前年度に作成したスポーツ環境の評価指標を明らかにする調査票により、全国でスポーツ・健康関連の自治体宣言をしている351市町村に対して、郵送法による質問し調査を実施した。回収したデータをスポーツ・健康関連の自治体宣言の先進例としてファイルし分析を進めた。また、前年度の研究成果をモントリオールで開催された国際スポーツ社会学会大会において研究発表を行った。地域スポーツクラブ調査においては、まずこれまでの地域スポーツクラブに関する文献資料を収集し、整理した。そして、地域スポーツクラブのモデル事例を調査し、地域のスポーツ環境の中心となりえるようなモデル事例のパターン化を進めた。先行研究とヒアリング調査をもとにして、クラブの組織と所有施設、クラブの運営の現状と理念を明らかにする調査票を作成した。そして、垂水団地スポーツ協会、向陽スポーツ文化クラブ、京都府立体育館、明石コミュニティセンターの登録クラブ、成岩スポーツクラブ等に対して、郵送法による質問紙調査を実施した。さらに、文部省の総合型地域スポーツクラブの補助事業の指定を受けている半田市成岩スポーツクラブやなみかたスポーツクラブにおいてヒアリング調査を行い、クラブ運営の現状と問題点を検討した。これらの研究成果をまとめ、次年度の研究計画を作成した。

回収した調査票は、単一種目型クラブと総合型クラブに分けて、データ分析を行い、それぞれの特徴と差異を考察した。自治体のスポーツ環境調査は、全国687市に対して郵送法により調査票を配布した。回収した調査票は、ハードウェア部門、ソフトウェア部門、ヒューマンウェア部門に分けて分析を行った。それぞれの平均値を基にして、偏差値を算出し、部門別と全体による上位の市をリストアップした。最後に、スポーツクラブ調査とスポーツ環境調査の結果を検討し、今後の地域スポーツの振興に関する提言を行った。
大腸癌におけるＩＮＧ２遺伝子発現の臨床学的意義の検討

大腸癌におけるING2発現の生物学的意義を解明し、分子標的治療の開発を目的とする。ING2の発現は、免疫組織学的解析で、6割の症例で癌組織での発現が強く認められた。cDNAマイクロアレイの結果、ING2高発現株で、MMP13の発現が上昇していた。またING2高発現細胞で有意に浸潤能が亢進したことから、ING2発現亢進は、MMP13を介した浸潤転移に関与している可能性が示唆された。直腸癌のING2発現と術前化学放射線治療後の病理学的効果を解析した結果、ING2発現が弱い症例で、有意に化学放射線療法の奏効率が高く、進行下部直腸癌の術前化学放射線療法の効果予測に有用である可能性を見出した。本研究では、大腸癌臨床検体を用いて大腸癌におけるING2遺伝子の発現解析と大腸癌培養細胞株を用いてING2遺伝子の転写発現制御また大腸癌における臨床学的意義を解明し、臨床応用可能となりうる分子標的治療の開発を目的とする。(1)大腸癌臨床検体におけるING2遺伝子の発現を調べた。大腸癌臨床検体40例の癌組織と正常組織におけるING2遺伝子のmRNA発現を調べたところ、癌部におけるING2の発現が正常組織のING2発現より有意に亢進していた。この結果から、ING2遺伝子は、発癌や転移浸潤に関与する可能性を見出した。(2) ING2遺伝子の過剰発現により連動する遺伝子群の解析を施行するため、アデノウイルスを用いたING2発現ベクターを作製し、大腸癌培養細胞株にING2遺伝子を過剰発現させ、一過性にING2を過剰発現させた細胞と元の細胞のmRNA発現の差をマイクロアレイを用いて探索した。MMP13などの遺伝子がING2の発現に連動していることが判明した。(1)ヒト培養細胞株に、ING2の発現をアデノウイルスベクターを用いて、ING2を高発現し、連動する遺伝子を調べた結果、HSP70の発現上昇が認められた。このことからING2遺伝子が、抗癌剤耐性や放射線治療耐性に関与していることが見いだされた。下部進行直腸癌に対し、術前化学放射線療法を施行された36例に関して、ING2の発現と化学放射線療法の治療効果について検討した。その結果、ING2の発現が高いと化学放射線療法の治療効果が悪い傾向にあった。(2)上記に関連して、ING2遺伝子の過剰発現により連動する遺伝子群のなかで特にABCトランスポーター71遺伝子について解析した結果、ING2高発現により、ABCA12とABCC10の発現が亢進していた。一方、ABCB1, ABCD4, TAP1, TAP2, SLC15A1はING2高発現により、発現が減弱していた。これらの結果に基づき、今後薬剤耐性との関連を調べる。(1)大腸癌臨床検体を用いて、ING2抗体で組織染色を行い、癌部と非癌部におけるING2の発現を検索した。同一症例で非癌組織に比べて癌組織での発現が亢進している症例は、現在約100例の染色を終了した時点で、約40%に認められている。今後さらに症例を増やし、発現症例の臨床病理学的特徴を検索していく。(2)正常細胞の培養細胞株にING2発現ベクターをアデノウイルスで導入しING2を高発現させると、MMP13の発現が上昇することを既に報告しているが、今回マイクロアレイの解析結果からPAI-1やHSP70の発現も著しく上昇し、ING2の発現と連動していることが示唆された。大腸癌でも癌でのPAI-1やHSP70の発現亢進が報告されており、上記(1)と関連して臨床検体でING2の発現と相関があるか調べていく予定である。本研究では、大腸癌臨床検体を用いて大腸癌におけるING2遺伝子の発現解析と大腸癌培養細胞株を用いてING2遺伝子の転写発現制御、また大腸癌における臨床学的意義を解明し、臨床応用可能となりうる分子標的治療の開発を目的とする。(1)さらに大腸癌臨床検体を追加して、ING2抗体で組織染色を行い、癌部と非癌部におけるING2の発現を検索した。

同一症例で非癌組織に比べて癌組織での発現が亢進している症例は、200例の染色を終了した時点で、約40%に認められた。(2)大腸癌培養細胞株にING2遺伝子を過剰発現させ、遺伝子導入前の細胞株と遺伝子導入しING2を過剰発現細胞の遺伝子発現をマイクロアレイにて検索した。その結果、ING2の発現とともに連動する遺伝子を複数見出した。これら遺伝子についてING2との関連を明らかにしているところである。(3)ING2遺伝子が、大腸癌の化学療法に与える影響や、下部直腸癌の術前化学放射線療法の効果に寄与するかどうか、臨床検体を用いて調べた。化学療法施行前のING2の発現と奏効率に関係について、特に下部直腸癌の術前化学放射線療法の効果と施行前のING2の発現との関連について調べた。ING2の発現が認められる症例で、放射線治療の効果が弱い傾向が見受けられた。本研究では、大腸癌臨床検体を用いて大腸癌におけるING2遺伝子の発現解析と大腸癌培養細胞株を用いてING2遺伝子の転写発現制御また大腸癌における臨床学的意義を解明し、臨床応用可能となりうる分子標的治療の開発を目的とする。(1)さらに大腸癌臨床検体を追加して、ING2抗体で組織染色を行い、癌部と非癌部におけるING2の発現を検索した。同一症例で非癌組織に比べて癌組織での発現が亢進している症例は、200例の染色を終了した時点で、約40%に認められている。今後さらに症例を増やし、発現症例の臨床病理学的特徴を検索していく。(3)ING2遺伝子が、大腸癌の化学療法に与える影響や、下部直腸癌の術前化学放射線療法の効果に寄与するかどうか、臨床検体を用いて調べる。化学療法施行前のING2の発現と奏効率に関係について、特に下部直腸癌の術前化学放射線療法の効果と施行前のING2の発現との関連について調べている。ING2の発現が認められる症例で、放射線治療の効果が弱い傾向が見受けられる。ほぼ計画通りに研究が進行しているから。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、臨床学的にこの遺伝子やこの遺伝子と関連する遺伝子をどのように応用していくか、今後の解析結果を参考にし検討していく。ING2発現と大腸癌の臨床病理学的因子との関連を検索し、in vitroの実験でING2遺伝子の機能を明らかにしていく。さらに、臨床的に予後予測因子や、化学療法、放射線療法などの治療効果予測因子になりうるか調べていく。
内因性免疫によるB型肝炎ウイルス多様性メカニズムの解析と根治的治療への応用

B型肝炎ウイルス(HBV)の治療目標は、炎症の沈静化による肝硬変への進展予防、ならびに肝発がんの制御と考える。現在の治療法では、HBV複製制御による肝炎鎮静化は可能であるが、発がん阻止に関しては十分な効果が得られていないのが現状である。したがって様々な新規治療薬が開発中であるが、未だにHBV産生の鋳型であるcccDNAを制御する治療薬ならびに治療法は未確定である。内因性自然免疫が関与する抗HBV作用の可能性を検討するために、臨床サンプルの集積を行った。合わせてHBV関連肝細胞癌(HCC)のサロゲートマーカー探索ならびにその意義を検討した。HBV感染増殖期である急性肝炎初期血清を短いintervalで採取し、持続感染状態における慢性肝炎のウイルス配列変異率と比較した。20名のB型急性肝炎患者血清を採取し、そのHBV遺伝子型は、Aが13例、Bが2例、Cが5例、であった。次世代シークエンサー(NGS)による経時的なHBV DNA多様性の検討を進めたが、遺伝子型の異なるHBVに対してPCR効率が異なることからgenotype特異的なPrimer設計に難渋した。そこで、HBVゲノム変異によるHCCへの関連性を検討した。HBV関連HCC治療歴を有する62例とHCC治療歴のない369例で、各種ウイルス蛋白量を検討した。結果、HBs抗原高力価よりむしろHBs抗原低力価で発癌例が多く、さらにHBs抗原低値かつHBコア関連抗原高値がHBV関連HCCの高リスク群であることを見出した。HBコア関連抗原量が高値でウイルス複製能力が高いにも関わらず血中HBs抗原低力価となるケースでは、HBs抗原をコードするpreS/S領域のウイルス変異により細胞内小胞体へのウイルス蛋白蓄積を経てERストレス依存性に肝臓がん形成に至る可能性や、宿主ゲノムへのインテグレーションの可能性などが示唆された。B型肝炎ウイルス(HBV)の根絶にはHBV産生の鋳型であるcccDNAを制御することが肝要である。細胞内における内因性抗ウイルス自然免疫のひとつと考えられるAPOBEC蛋白がHBVに作用する可能性について、臨床サンプルを用いて検討した。今年度はHBV DNA多様性を証明するために、HBV感染増殖期である急性肝炎初期血清を短いinterval(連日ないし1,2日間隔)で採取した。これまでに、すでに5名のB型急性肝炎患者血清を採取している。一方で、初年度は次世代シークエンサーの条件検討、ならびに遺伝子型の異なるHBVに対してもPCRが可能となるPrimer設計を行い、検討を進めた。しかしながら、血中ウイルス量(HBV DNA量)が5 logIU/mL未満ではPCR効率が悪く検出能に差を認めることから、より高感度にHBV DNAを検出するPrimer配列を検討中である。現在のPrimerは遺伝子型Cと遺伝子型AのHBV DNAに対するPCR反応は良好であるが、遺伝子型Bに対するPCR反応が不良であることから、再度遺伝子型AからDまでの塩基配列をアライメント作成し、検討を継続しているまた、HBV感染サイクルを再現するHBV感染細胞培養を用いたAPOBEC蛋白の効果検討については、HBV感染培養細胞の長期培養条件を検討した。さらにsiRNAによるノックアウト実験を行うために、APOBECファミリーそれぞれに特異性が高いsiRNA配列を検討し、その効果を検討中である。当初、当施設では毎月12名のB型急性肝炎患者が来院すると予測していたが、本年度は昨年度に比べて患者数が少なくサンプル収集が予定より遅れている。したがって、同時にB型慢性肝炎ないし他の慢性肝疾患の血清、さらに肝生検組織の収集を開始している。また、次世代シークエンサー解析のセットアップにやや時間を費やしているが、徐々に条件検討結果が集積されているため、今後は加速的に解析条件が決まるものと予測する。現行の治療法では、B型肝炎ウイルス(HBV)の根絶は困難である。現在、様々な新規治療薬が開発中であるが、未だにHBV産生の鋳型であるcccDNAを制御する治療薬ならびに治療法は未確定である。細胞内に寄生する病原体であるウイルスなどのPathogenに対する内因性自然免疫のひとつであるAPOBEC蛋白による抗HBV作用の可能性について、臨床サンプルを用いて検討中である。昨年度に引き続き臨床サンプルを収集するために、HBV感染増殖期である急性肝炎初期血清を短いinterval(連日ないし1,2日間隔)で採取している。既に12名のB型急性肝炎患者血清を採取することに成功した。急性肝炎を発症したHBVの遺伝子型は、Genotype Aが8例、Genotype Bが1例、Genotype Cが3例、であった。現在は次世代シークエンサー(NGS)による経時的なHBV DNAの多様性を検討中であるが、遺伝子型の異なるHBVに対してPCR効率が異なることからgenotype特異的なPrimer設計を行い、検討を進めている。また、血中ウイルス量の多寡によってPCR効率が異なることから、PCR条件を含めた検討を進めている。当初NGSはIllumina MiSeqを予定していたが、現在はPacBioによるロングリードデータにより数Kbの配列を一度に解読することが可能かどうか検討を進めている。今後、PacBioによるHBV解析が可能となれば、全長3.2kbの全HBV DNA配列を一度に解析可能となり、感染急性期のHBVゲノム多様性の解析が可能となると考える。また、HBV感染サイクルを再現するHBV感染細胞培養を用いたAPOBEC蛋白の効果検討については、HBV感染培養細胞の長期培養条件を検討中である。同時に、siRNAによるノックアウト実験を行うために、APOBECファミリーそれぞれに特異性が高いsiRNA

配列を設計し、その効果を検討中である。次世代シークエンサー解析のセットアップに時間を要し、特にHBV遺伝子型によるPCR効率の相違を解決することに時間を要している。また、毎月12名のB型急性肝炎患者が来院すると予測していたが、近年は患者数が減少しサンプル収集が遅れていた。また、新たな次世代シークエンサー解析手法の登場により、様々な条件検討が必要となっている。ただし、徐々に臨床検体が集まり、また次世代シークエンス手法の検討も進んでいることから、今後は加速的に解析結果が出るものと予測する。B型肝炎ウイルス(HBV)の治療目標は、炎症の沈静化による肝硬変への進展予防、ならびに肝発がんの制御と考える。現在の治療法では、HBV複製制御による肝炎鎮静化は可能であるが、発がん阻止に関しては十分な効果が得られていないのが現状である。したがって様々な新規治療薬が開発中であるが、未だにHBV産生の鋳型であるcccDNAを制御する治療薬ならびに治療法は未確定である。内因性自然免疫が関与する抗HBV作用の可能性を検討するために、臨床サンプルの集積を行った。合わせてHBV関連肝細胞癌(HCC)のサロゲートマーカー探索ならびにその意義を検討した。HBV感染増殖期である急性肝炎初期血清を短いintervalで採取し、持続感染状態における慢性肝炎のウイルス配列変異率と比較した。20名のB型急性肝炎患者血清を採取し、そのHBV遺伝子型は、Aが13例、Bが2例、Cが5例、であった。次世代シークエンサー(NGS)による経時的なHBV DNA多様性の検討を進めたが、遺伝子型の異なるHBVに対してPCR効率が異なることからgenotype特異的なPrimer設計に難渋した。そこで、HBVゲノム変異によるHCCへの関連性を検討した。HBV関連HCC治療歴を有する62例とHCC治療歴のない369例で、各種ウイルス蛋白量を検討した。結果、HBs抗原高力価よりむしろHBs抗原低力価で発癌例が多く、さらにHBs抗原低値かつHBコア関連抗原高値がHBV関連HCCの高リスク群であることを見出した。HBコア関連抗原量が高値でウイルス複製能力が高いにも関わらず血中HBs抗原低力価となるケースでは、HBs抗原をコードするpreS/S領域のウイルス変異により細胞内小胞体へのウイルス蛋白蓄積を経てERストレス依存性に肝臓がん形成に至る可能性や、宿主ゲノムへのインテグレーションの可能性などが示唆された。当初の予定通り、in vivoとin vitroの実験系を同時並列的に進める。in vivoに関しては、次年度はHBV DNA多様性を検討するための次世代シークエンサー解析セットアップが完了する予定であり、まずはB型急性肝炎の血清サンプルを用いて、ヒトにおけるウイルス多様性を証明する。次に、in vitro実験では、HBV感染培養細胞の長期培養条件を決定し、ウイルス多様性に関与する宿主因子を明らかとする。
拡散的神経情報伝達経路の超微細形態基盤の確立

近年、シナプスを介さない神経伝達物質の拡散による神経情報修飾の重要性が指摘されている。この伝達物質の拡散を支える脳内の細胞間隙について、極低温(-269°C)での急速凍結法・2軸電子線トモグラフィー法・反射電子像解析法を用いて立体的に調べた。その結果、(1)細胞間隙は組織全体の体積の約3.7%であること、(2)シナプス間隙にはナノレベルの構造が存在すること、(3)神経情報伝達で重要な役割を担う、絞輪部(髄鞘に巻かれていない部位)軸索表面の3/4が細胞間隙に接し、1/4がグリア細胞に覆われ、(4)その一部は、軸索内の不要物処理に関与する可能性を示唆する形態を認めた。本研究課題に必須の反射電子像を取得できる走査電子顕微鏡が本学に導入され、他大学施設の利用の必要がなくなったため、初年度と比べ、格段にデータ収集の効率が上がった。一方、液体ヘリウムの入手が極めて困難となり、液体ヘリウムによる新たな凍結試料の作製は1回のみの実施となった。今後、液体ヘリウムの入手環境は改善されない、との見通しであるため、本研究課題においては、これまで作製された試料を最大限に活用し、可能な範囲での研究とならざるを得ない。幸い、初年度に作製した試料の状態が良好であるため、これらの材料を活用することで、最終的には解析に値するデータを得ることができるよう努力したい。本課題の焦点別にのべると、初年度から実施している申請書焦点課題(ii)絞輪部の細胞成分および細胞間隙については、連続切片を基に、ラット視神経において、46か所の絞輪部三次元構造を再構築し、次の新知見を得ることができた。(1)絞輪部軸策周囲を囲む要素は、50%以上が細胞間基質であること、アストロサイト、残りの約25%はミクログリア、NG2陽性細胞などであること。(2)約70%の絞輪部の軸策から、雨だれのような突起が観察され、これらの突起部分には細胞内小器官あるいは膜様構造物が含まれ、これらの突起の80%以上はグリア細胞によって囲まれていた。(3)絞輪部の軸策の直径と絞輪部の長さは特定の関連を持たない。これに続き、焦点課題(iii)シナプス周囲の超微形態の把握についても、2軸トモグラフィーで得られたデータを3次元解析することで、明瞭なシナプス間隙の超微細構築を把握できた。しかし、焦点課題(i)については、超薄切片の厚さ(70nm)が検索対象の構造に対して厚すぎるため、連続的に十分な追跡ができないことが明らかとなり、20-30nmの超薄切の実施の方策を考えている。ラットおよび小型霊長類(コモン・マーモセット)の中枢神経について試料作製を行い以下の実験を実施した。A.【2軸電子線トモグラフィー】比較的厚い切片(200nm)について、2軸トモグラフィー(DEMT)を実施し、細胞間隙を含むシナプス周囲での解析で、シナプス間隙における特有の超微細構造を見出した。また、共同研究において、plasma cellとT細胞の突起の融合をDEMTを用いて証明した(J Electron Microscopy. 62(2) 317-320,2013)。B.【反射電子像の解析】従来の透過電子顕微鏡の試料作製法とは大きく異なるため、以下のとおり新たな条件を設定した。1【超薄連続切片の支持材料の検討】試料台の大きさに合わせてトリミングしたスライドグラス上に連続超薄切片をすくい取る。なお、スライドグラスはスズあるいはオスミウムでコーティングし導電性を確保する。2【特注試料台の作製】同一試料の繰り返し観察のため、観察部位が特定できる特注の走査電子顕微鏡用試料台を設計し作製した。一度電子顕微鏡の試料台から外したサンプルを、再度、観察する際、以前観察した部位の特定が可能となり、観察の効率化と精度向上に貢献できる。3【電子顕微鏡の撮像条件の検討】適性条件を検討し、目的の構造が明瞭に判断できる、20-40万倍での画像取得条件を確定した。4【問題点とその解決策】国内での液体ヘリウムの入手が困難となり、急速凍結については本年度は1回のみ、次年度以降も状況の改善は期待できない。そのため、当研究室で既に作製された標本を活用する。なお、平成25年度、反射電子像を取得できる走査電子顕微鏡が本学に導入されることから、電子顕微鏡室での学外利用は大幅に縮小される見通しである。以上のとおり、初年度の目的であった、電子顕微鏡の試料作製法と撮像条件の基礎が確立できた。

最終年度では、これまでのデータを整理し、不足分について反射電子像を取得できる走査電子顕微鏡を活用し補充実験を実施した。加えて、本テーマに関する最新の国際的情報を得るため、国際学会に参加し、多くの研究者と直接討論する機会を得た。なお、本研究では、初期の目的を必ずしも達成することができなかった事実は認めざるを得ない。しかし、細胞間スペースの三次元構造に焦点を当てたことで、神経機能の根幹にかかわる重要な知見を見出せたことは、当初の目的とは異なるが、神経科学上重要な成果を挙げることができたと考える。【達成できた課題】基盤となる手法の確立である電子顕微鏡の反射電子像の活用による(1)超広領域超微形態解析、(2)連続切片法による超微形態三次元再構築。【達成できなかった課題】液体ヘリウムによる急速凍結手法の活用(細胞間隙の広がりの把握)が液体ヘリウムの不足・高騰によりあきらめざるを得なかった。【期待以上の成果】細胞間隙のうち、神経伝達を修飾しうる重要な構造であるRanvier nodeについての新知見を得た。(1)これまで教科書的には中枢神経のNodeはastrocyteに包まれている、とされてきたが、むしろ細胞外基質(extra cellular matrix)が50%以上であること、(2)70%以上のnodeの軸索に雨だれ状の突起が観察され、内部にdebrisが含まれるものがあり、さらに、これらの多くは隣接するグリアに取り込まれている像を示した。これは、軸索内の不要構造(debris)をnodeにおいてグリア細胞に委ねているという新たなコンセプトを示している可能性がある。(3)nodeにおける軸索の太さとnode長とは相関しないことが明らかとなった。以上については現在論文化中である。また、飛躍的に進んだ超広領域における電子顕微鏡による微細形態解析により、共同研究で進めていた髄鞘化と運動機能のかかわる画期的な研究をScienc誌に発表することができた。神経微細解剖学当初、本課題に必要な機器が本学に設置されていなかったため、他大学施設を利用していた。そのため、十分なデータを取得することができなかったが、本年度、当該機器が学内に整備され、順調にデータ取得を進めることができた。3つの焦点課題のうち、2課題については、ほぼ目的を達成できる段階にある。残り一課題は、本研究期間では達成できない可能性も出てきた。また、世界的な液体ヘリウムの不足により、基礎研究になかなか供給されなかったため、本年度予定した実験回数をこなすことができなかった。しかし、初年度の蓄積もあり、現時点での解析能力を考えると、十分な試料を得ていると考える。初年度は試料作製法の基本的条件を確率することが目標であったので、ほぼ達成できたと考える。今後、補足的な検討が必要な点も考慮し、この区分を選択した。焦点課題(i)については、振動型ダイアモンドナイフ(Ultra-sonic/Diatome)を活用し20-30nmの超薄切の作製を試みる。また、コモン・マーモセットの試料はすでに作製してあるので、最終年度では、これまでラット試料で行った(ii),(iii)の手法と同様に解析を進める予定である。これまで集積した結果の論文作製、学会発表を行う。この際、できる限り、マーモセットのデータにも言及したい。24年度に得られた観察条件に基き、ラットおよびマーモセットの小脳について、さらに観察を続け、データを3次元的に解析して、細胞間隙の連続性について明らかにする。また、データ解析に際しては、多面的なソフトの活用により、新規性のある解析法を目指す。