hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深海産イガイ類の共生細菌認識機構に関する研究

本研究の目的は多細胞動物が特定の細菌を共生者として認識するメカニズムを分子レベルで明らかにすることである.ヒラノマクラは深海底に沈んだ鯨骨に蝟集する二枚貝で,鰓上皮細胞表面に宿す化学合成共生細菌に栄養依存している.本種は深海生物ながら実験室内で長期飼育が可能で,人為操作によって共生細菌を除菌することも,また一度除菌した宿主二枚貝に共生細菌を再獲得させることも可能である.従って,鰓上皮での遺伝子発現を共生細菌の有無で比較することにより共生に関わる因子を推定することを目指し,本研究を実施した.昨年度までの予察的研究によって,ヒラノマクラ鰓上皮細胞では約2万遺伝子が発現しており,そのうち約1700遺伝子が共生細菌を宿した個体(S)に,約2000遺伝子が共生細菌を除菌した個体(AS)に強発現することを確認していた.しかし,予察的研究では共生細菌の完全な除菌を念頭において9週間の抗生物質処理を行ったため,栄養不足から来る影響を十分に評価できなかった.そこで本年度は共生細菌の除菌がほぼ完了する3週間の抗生物質処理を施した個体を用いて発現遺伝子解析の1手法であるHiCEP解析を実施した.その結果,トータルの発現遺伝子数は約18,000個に減少したものの,S, ASそれぞれに強発現する遺伝子数は共に約2千個であった.HiCEPプロファイルピークのシーケンス解析を実施した結果,約28万リードの解析を終了し,解析総塩基数は約3千5百万であった.Sで強発現した遺伝子のなかには細胞骨格系の遺伝子や認識に関わる遺伝子が含まれていた.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は多細胞動物が特定の細菌を共生者として認識するメカニズムを分子レベルで明らかにすることである.ヒラノマクラは深海底に沈んだ鯨骨に蝟集する二枚貝で,鰓上皮細胞表面に宿す化学合成共生細菌に栄養依存している.本種は深海生物ながら実験室内で長期飼育が可能で,人為操作によって共生細菌を除菌することも,また一度除菌した宿主二枚貝に共生細菌を再獲得させることも可能である.従って,鰓上皮での遺伝子発現を共生細菌の有無で比較することにより共生に関わる因子を推定することを目指し,本研究を実施した.昨年度までの予察的研究によって,ヒラノマクラ鰓上皮細胞では約2万遺伝子が発現しており,そのうち約1700遺伝子が共生細菌を宿した個体(S)に,約2000遺伝子が共生細菌を除菌した個体(AS)に強発現することを確認していた.しかし,予察的研究では共生細菌の完全な除菌を念頭において9週間の抗生物質処理を行ったため,栄養不足から来る影響を十分に評価できなかった.そこで本年度は共生細菌の除菌がほぼ完了する3週間の抗生物質処理を施した個体を用いて発現遺伝子解析の1手法であるHiCEP解析を実施した.その結果,トータルの発現遺伝子数は約18,000個に減少したものの,S, ASそれぞれに強発現する遺伝子数は共に約2千個であった.HiCEPプロファイルピークのシーケンス解析を実施した結果,約28万リードの解析を終了し,解析総塩基数は約3千5百万であった.Sで強発現した遺伝子のなかには細胞骨格系の遺伝子や認識に関わる遺伝子が含まれていた.本研究の目的は多細胞動物が特定の細菌を共生者として認識するメカニズムを分子レベルで明らかにすることである.ヒラノマクラは深海底に沈んだ鯨骨に蝟集する二枚貝で,鰓上皮細胞表面に宿す化学合成共生細菌に栄養依存している.本種は深海生物ながら実験室内で長期飼育が可能で,人為操作によって共生細菌を除菌することも,また一度除菌した宿主二枚貝に共生細菌を再獲得させることも可能である.平成24年度はまず,抗生物質を用いたヒラノマクラ共生細菌の除菌を実施した.予備実験では9週間の抗生物質処理により,DNAレベルのPCRにおいて共生細菌の除菌を確認しているが,この場合,宿主は約2ヶ月におよぶ絶食状態を維持することになり,共生関連遺伝子以外にも多くの遺伝子の発現の挙動が変化する可能性が高い.そこで本研究ではできるだけ短時間の抗生物質処理により,除菌ができる条件を検討した.結果,3週間の抗生物質処理により共生細菌の除菌がほぼ可能であることをDNAを鋳型としたPCRにより確認した.この除菌個体および健常個体からトータルRNAを抽出し,HiCEP法を用いた遺伝子発現の比較を実施した.その結果,予備実験と同様に計約2万ピークが出現し,そのうちの約1/4が共生細菌の有無に関係なく発現する遺伝子であった.また共生細菌を持つ健常個体で発現量の多いピークが約2割,除菌個体で高発現する遺伝子も全体の約2割存在し,それらのピークの多くは予備実験の結果と調和的であることが判明した.当初予定していた発現遺伝子解析比較まで実施済みであるため.共生鰓に高発現する遺伝子配列の解読を実施し,その局在をin situハイブリダイゼーション法や免役組織化学的手法を用いて明らかにするとともに,予備実験で確認済みの細菌の認識に関わる分子がターゲットとする細菌側の分子の特定を試みる.以上を通じて,ヒラノマクラと細菌との共生関係の形成・維持に関わる宿主側の遺伝子,タンパク質を特定し,共生システムの分子メカニズムの解明に資する.25年度が最終年度であるため、記入しない。
FunctionalMRIを用いた咀嚼運動と三次元脳内血液動態変化に関する研究

主目的である正常者における習慣的咀嚼運動が脳のどの部位の活性化にもたらす影響については,MRIの撮影手法上,咀嚼は運動によるアーチファクトが大きく,信頼性、再現性の高い撮影を行うことが困難であった.したがって,嚥下運動時の大脳皮質活性部位の検索をfunctional MRIを用いて評価した.その結果,嚥下によって中心前回ならびに中心後回が活性化されることがあきらかとなった.主課題の実験に並行し,MRI(T2強調画像)を用いて8名の正常男性における30秒間の最大噛みしめ時の咬筋内信号強度を測定した.その結果,咬筋内T2信号強度は噛みしめ時に減少し,噛みしめ終了後に噛みしめ前ベースラインを越えて増大した.同じ被験者について同条件で近赤外線分光計を用いて咬筋内血流動態を測定したところ,本装置で測定した咬筋内筋組織内血流動態は,T2信号強度変化と非常に類似した反応を示した(Pearon's r=0.945,P<0.0001).また,交感神経活動増大時の筋組織内T2信号強度変化を測定するため,15名の正常男性を対象として,僧帽筋での信号強度変化を測定した.交感神経活動の増大にはCold Pressor Test (CPT)を用いた.その結果,CPT付加時には僧帽筋内T2信号強度は有意に増大し,付加終了後ベースラインに収束した.この結果は,以前我々が近赤外線分光計を用いて測定したCPT付加時の僧帽筋内血流動態反応と非常に類似していた.以上の筋活動状態ならびに非活動時の筋組織内血流動態変化測定の結果より,筋組織内血流動態はMRIT2強調画像の信号強度を測定することにより,非侵襲的かつ簡便に測定できることが明らかとなった.本結果は,筋組織内血流動態異常がその病態に関与していると推測される慢性筋痛の病態解明にMRIが使用できる可能性を示す所見であると思われる.主目的である正常者における習慣的咀嚼運動が脳のどの部位の活性化にもたらす影響については,MRIの撮影手法上,咀嚼は運動によるアーチファクトが大きく,信頼性、再現性の高い撮影を行うことが困難であった.したがって,嚥下運動時の大脳皮質活性部位の検索をfunctional MRIを用いて評価した.その結果,嚥下によって中心前回ならびに中心後回が活性化されることがあきらかとなった.主課題の実験に並行し,MRI(T2強調画像)を用いて8名の正常男性における30秒間の最大噛みしめ時の咬筋内信号強度を測定した.その結果,咬筋内T2信号強度は噛みしめ時に減少し,噛みしめ終了後に噛みしめ前ベースラインを越えて増大した.同じ被験者について同条件で近赤外線分光計を用いて咬筋内血流動態を測定したところ,本装置で測定した咬筋内筋組織内血流動態は,T2信号強度変化と非常に類似した反応を示した(Pearon's r=0.945,P<0.0001).また,交感神経活動増大時の筋組織内T2信号強度変化を測定するため,15名の正常男性を対象として,僧帽筋での信号強度変化を測定した.交感神経活動の増大にはCold Pressor Test (CPT)を用いた.その結果,CPT付加時には僧帽筋内T2信号強度は有意に増大し,付加終了後ベースラインに収束した.この結果は,以前我々が近赤外線分光計を用いて測定したCPT付加時の僧帽筋内血流動態反応と非常に類似していた.以上の筋活動状態ならびに非活動時の筋組織内血流動態変化測定の結果より,筋組織内血流動態はMRIT2強調画像の信号強度を測定することにより,非侵襲的かつ簡便に測定できることが明らかとなった.本結果は,筋組織内血流動態異常がその病態に関与していると推測される慢性筋痛の病態解明にMRIが使用できる可能性を示す所見であると思われる.磁気共鳴機能画像法(fMRI:functional Magnetic Resonance Imaging)を用いて、歯科領域で最も重要な機能の一つである咀嚼運動が、中枢にもたらす影響を脳血流の観点から解明することを目的として、正常者における習慣的咀嚼運動が脳のどの部位の活性化に影響をもたらすか検討中である。しかし、MRIの撮影手法上、咀嚼は運動によるアーチファクトが大きく、信頼性、再現性の高い撮影を行うことが難しく、現在、実験方法の再検討を行っている。以上の実験に並行し、磁気共鳴画像法(MRI:Magnetic Resonance Imaging)を用いて正常者における噛みしめ時の咬筋組織内血流動態を測定した。本装置で測定された噛みしめ時の咬筋組織内血流動態は、近赤外線装置を用いたこれまでの報告とよく合致していた。すなわち、安静時ベースラインから噛みしめに伴い、water signal intensityは急激に減少し、噛みしめ終了後、反応性の増大現象を示した後、徐々に安静時ベースラインに収束した。以上より、筋肉内血流動態は、従来からの近赤外線測定法と同様にMRIを用いて簡便に測定できることが明らかとなった。そこで、現在、正常者および慢性筋筋膜疼痛患者において、全身の交感神経活動を実験的に増大させた際の、筋組織内血流動態を、筋筋膜疼痛の好発部位である僧帽筋においてMRIで計測中である。

正常者と慢性筋筋膜疼痛患者の安静時血流量のベースラインの比較は、未だ検討されていない。今回の研究で明らかになれば、今後の筋内血流動態の検討ひいては慢性筋筋膜疼痛の機序解明に非常に有益な示唆を与えるものと思われる。磁気共鳴機能画像法(fMRI : functional Magnetic Resonance Imaging)を用いて、歯科領域で最も重要な機能の一つである咀嚼運動が、中枢にもたらす影響を脳血流の観点から解明することを目的として、正常者における習慣的咀嚼運動が脳のどの部位の活性化に影響をもたらすか検討中である。しかし、MRIの撮影手法上、咀噛は運動によるアーチファクトが大きく、信頼性、再現性の高い撮影を行うことが難しく、現在、実験方法の再検討を行っている。以上の実験に並行し、磁気共鳴画像法(MRI : Magnetic Resonance Imaging)を用いて正常者における噛みしめ時の咬筋組織内血流動態を測定した。本装置で測定された噛みしめ時の咬筋組織内血流動態は、近赤外線装置を用いたこれまでの報告とよく合致していた。すなわち、安静時ベースラインから噛みしめに伴い、Water signal intensityは急激に減少し、噛みしめ終了後、反応性の増大現象を示した後、徐々に安静時ベースラインに収束した。以上より、噛みしめ時の筋肉内血流動態は、従来からの近赤外線測定法と同様にMRIを用いて簡便に測定できることが明らかとなった。そこで、全身の交感神経活動を実験的に増大させた際の、筋組織内血流動態を、筋筋膜疼痛の好発部位である僧帽筋においてMRIで計測したところ、同様の結果が得られた。現在は、--正常者と慢性筋筋膜疼痛患者の安静時血流量のベースラインを検討中である。
インターフェロン誘導性宿主因子によるフラビウイルス宿主域決定機序の体系的理解

本研究では、フラビウイルスとI型インターフェロン(IFN)誘導性宿主因子との相互作用に着目することで、フラビウイルス宿主域決定メカニズムを体系的に理解することを目的とする。多くのフラビウイルスにおいて、自然宿主と他の動物種ではウイルス感染感受性が異なることが示唆されているが、この宿主域がどのようなメカニズムで決定されているかは十分に解明されていない。本研究では、フラビウイルスとIFN誘導性宿主因子との相互作用が宿主域決定要因になるのではないかという仮説について、分子ウイルス学的手法を駆使することで検証を進めていく。
酸化ストレスによる認知症発症メカニズムの解明と食品による予防

本研究は神経変性疾患の共通の病理学的特徴である、タンパク質の異常凝集体の形成に酸化ストレス、特に脂質過酸化反応が関与して神経細胞死を引きおこしていることを明らかにし、脂質過酸化反応を食品成分により抑制することで神経変性疾患の発症を予防するための基盤データを得ることを目的としている。これまでにパーキンソン病の凝集体の主要構成タンパク質であるα-シヌクレイン(Syn)に対し、ω-3不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)は、in vitroにおいてタンパク質の重合化反応を促進し、凝集体を形成、この凝集体構成タンパク質にはDHA酸化物(PRL)による修飾が生じていることを明らかにした。そして、DHAが神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に対して濃度依存的に毒性を示し、細胞内活性酸素種の産生増加とともに、細胞内のPRL修飾タンパク質がミトコンドリア、核・膜画分でDHA濃度依存的にPRL修飾タンパク質が顕著に増加していることを報告した。さらに、α-シヌクレイン遺伝子を導入したSH-SY5Y(Syn-SH)細胞もSH-SY5Y細胞と同様にDHA濃度依存的に毒性を示した。蛍光免疫染色法による観察から、DHAを添加したSyn-SH細胞の細胞内にはSynの増加とその凝集体の形成促進が認められた。加えて凝集体形成を促進すると報告されているリン酸化Synの増加が観察された。これらの結果は、神経細胞においてDHAによる酸化ストレス亢進はSyn凝集体形成とともに神経細胞死を促進することを示している。SH-SY5Y細胞にDHAとともに食品成分を添加することでDHAによるタンパク質凝集および神経細胞死が抑制されるかどうか検討したところ、大豆イソフラボンを予め添加して培養したSH-SY5Y細胞においてSyn/DHAによる神経細胞死を抑制することが分かった。しかしながら、DHAによる神経細胞死は抑制しないことから、大豆イソフラボンは抗酸化作用とは異なる機序で神経細胞死を抑制していると考えられた。DHAの脂質過酸化反応による本研究の神経細胞死モデルにおいて、異常タンパク質の凝集体の形成時にリン酸化シヌクレインの増加が観察されたことから、不飽和脂肪酸の脂質過酸化がPD発症メカニズムに関与していることが明らかになった。さらに、神経細胞死を抑制する食品成分をスクリーニングしたところ、従来いわれてきた抗酸化だけではないメカニズムがあることが示された。ヒトの血清の脂質過酸物は生体における酸化ストレスとその消去系のマーカーとなる可能性があり、をELISA法による測定を行ったところ試みた。その結果、血清中の他の脂質成分が阻害している可能性が考えられたためさらなる検討が必要であることが分かり、現在条件を検討中である。本研究では神経変性疾患の共通の病理学的特徴である、タンパク質の異常凝集体の形成に酸化ストレス、特に脂質過酸化反応が関与して神経細胞死を引きおこしていることを明らかにし、脂質過酸化反応を食品成分により抑制することで神経変性疾患の発症を予防するための基盤データを得ることを目的としている。アルツハイマー病およびパーキンソン病の凝集体の主要構成タンパク質であるβ-アミロイドまたはα-シヌクレインに対し、ω-3不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)は、in vitroにおいてタンパク質の重合化反応を促進し、凝集体を形成させ、この凝集体構成タンパク質にはDHA酸化物(PRL)による修飾が生じていることを特異的抗体を用いた分析から明らかにした。さらに、無水物を利用したDHA酸化修飾物生成反応においても同様の結果を得ることができた。しかしながら、DHA-α-シヌクレイン混合物のアミロイド形成をチオフラビン法により検出したところ、DHAは濃度依存的に相対蛍光強度(RFU)値を上昇したが、PRL-α-シヌクレイン混合物では反応物のRFU値は上昇しなかった。これらの結果から、DHAによるタンパク質の重合化の過程ではPRLとは異なる中間体が形成されている可能性があることが示唆された。一方、DHAは神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に対して濃度依存的に毒性を示したが、この時の細胞内のPRL修飾タンパク質をELISA法により測定したところ、ミトコンドリア、核・膜画分ではDHA濃度依存的にPRL修飾タンパク質が顕著に増加していた。細胞質画分における増加はわずかであった。この結果から、ミトコンドリア等の細胞膜を構成するDHAの脂質過酸化反応により生成された酸化脂質は、タンパク質に結合し、構造変化をきたすことで細胞傷害を引き起こすことが示された。今後、DHAとともに食品成分を添加することでDHAによるタンパク質凝集および細胞内の脂質過酸化が抑制されるかどうか検討する予定である。アルツハイマー病およびパーキンソン病の凝集体の主要構成タンパク質であるβ-アミロイドまたはα-シヌクレイン(Syn)に対し、ω-3不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)は、in vitroにおいてタンパク質の重合化反応を促進し、凝集体を形成、この凝集体構成タンパク質にはDHA酸化物(PRL)による修飾が生じていることをこれまでに明らかにしている。DHAは神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に対して濃度依存的に毒性を示し、細胞内活性酸素種の産生増加を増加させた。

DHAを添加した細胞内のPRL修飾タンパク質をELISA法により測定したところ、ミトコンドリア、核・膜画分でDHA濃度依存的にPRL修飾タンパク質が顕著に増加していた。さらに、α-シヌクレイン遺伝子を導入したSH-SY5Y(Syn-SH)細胞もDHAの濃度依存的に毒性を示し、PRL修飾タンパク質がミトコンドリア、核・膜画分で増加することも明らかにした。蛍光免疫染色法による観察から、DHAを添加したSyn-SH細胞の細胞内にはSynタンパク質の増加と凝集体の形成が促進されていた、一部の凝集体は抗PRL抗体に陽性であったため、DHAによる酸化ストレスの亢進がSyn凝集体形成の原因になることが示唆された。今後、Syn-SH細胞にDHAとともに食品成分を添加することでDHAによるタンパク質凝集および細胞内の脂質過酸化が抑制されるかどうか検討する予定である。本研究は神経変性疾患の共通の病理学的特徴である、タンパク質の異常凝集体の形成に酸化ストレス、特に脂質過酸化反応が関与して神経細胞死を引きおこしていることを明らかにし、脂質過酸化反応を食品成分により抑制することで神経変性疾患の発症を予防するための基盤データを得ることを目的としている。これまでにパーキンソン病の凝集体の主要構成タンパク質であるα-シヌクレイン(Syn)に対し、ω-3不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)は、in vitroにおいてタンパク質の重合化反応を促進し、凝集体を形成、この凝集体構成タンパク質にはDHA酸化物(PRL)による修飾が生じていることを明らかにした。そして、DHAが神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に対して濃度依存的に毒性を示し、細胞内活性酸素種の産生増加とともに、細胞内のPRL修飾タンパク質がミトコンドリア、核・膜画分でDHA濃度依存的にPRL修飾タンパク質が顕著に増加していることを報告した。さらに、α-シヌクレイン遺伝子を導入したSH-SY5Y(Syn-SH)細胞もSH-SY5Y細胞と同様にDHA濃度依存的に毒性を示した。蛍光免疫染色法による観察から、DHAを添加したSyn-SH細胞の細胞内にはSynの増加とその凝集体の形成促進が認められた。加えて凝集体形成を促進すると報告されているリン酸化Synの増加が観察された。これらの結果は、神経細胞においてDHAによる酸化ストレス亢進はSyn凝集体形成とともに神経細胞死を促進することを示している。SH-SY5Y細胞にDHAとともに食品成分を添加することでDHAによるタンパク質凝集および神経細胞死が抑制されるかどうか検討したところ、大豆イソフラボンを予め添加して培養したSH-SY5Y細胞においてSyn/DHAによる神経細胞死を抑制することが分かった。しかしながら、DHAによる神経細胞死は抑制しないことから、大豆イソフラボンは抗酸化作用とは異なる機序で神経細胞死を抑制していると考えられた。DHAの脂質過酸化反応による本研究の神経細胞死モデルにおいて、異常タンパク質の凝集体の形成時にリン酸化シヌクレインの増加が観察されたことから、不飽和脂肪酸の脂質過酸化がPD発症メカニズムに関与していることが明らかになった。さらに、神経細胞死を抑制する食品成分をスクリーニングしたところ、従来いわれてきた抗酸化だけではないメカニズムがあることが示された。
ラット脳内に局在するエストロゲンリセプターと生殖機構の発達に関する研究

ラットの脳内におけるエストロゲン受容体(ER)の発現と分布を免疫組織化学とインサイチュウハイブリダイゼイション(ISH)の方法によって検討した。また、視床下部内のER含有神経細胞における各種神経ペプチドとの共存を検討した。まず、ERをコードするcDNAを大腸菌遺伝子に組み込んで、ER-ベータガラクトシダーゼの複合タンパクを作成し、これを用いて家兎の免疫を行い、特異的なポリクローナル抗体を得た。この抗血清から得たガンマグロブリン分画と、ラット子宮組織超遠心上清分画との間で行った免疫沈降試験によって、単一の沈降バンドが得られたことなどから、この抗体はERタンパクを特異的に認識することを確認した。さらに、標識エストロゲンとラット子宮ER分画の結合に対するこの抗血清の影響を検討して、この抗血清はエストロゲンと非結合・結合の両方の状態のERを認識することが明になった。ラット脳の視床下部諸神経核・扁桃体・外側手綱核・中心灰白質等には、新生仔期・成熟期を問わず、ERが存在することを明らかにした。視床下部視束前野・腹内側核・弓状核等で、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(LHRH)とERとの同一ニューロン内共存はないことを確認した。さらに、一部のニューロンでは神経ペプチドとERが共存していること、共存の状態がエストロゲン・プロゲステロン投与によって変化することを見出した。電子顕微鏡を用いた免疫組織化学によって、ERはこれらの細胞の核内に局在し、核小体には欠如していること、細胞質内のER存在は疑わしいことを観察した。また、新生仔期の顔面神経核内側亜核に、ERが一過性に出現し、成熟ラットでは消失する現象を発見した。この事実は、ISHによっても確認した。この現象の持つ生物学的な意味づけは現段階では不明であるが、ERが核内DNAと結合すること等から、神経細胞の分化の関与している可能性がある。ラットのエストロゲン受容体タンパク(ER)に対する抗血清をウサギで作成したので、精製してガンマグロブリンG(IgG)を得、その化学的な性質と結合特異性を検討した。(1)免疫沈降法による検定の結果、IgGはラット子宮から得たエストロゲン受容性タンパクと単一の沈降線を示したこと、(2)抗血清のIgGはラット子宮から得たERと標識エストロゲンとの結合を競合的に阻害することから、ERのエストロゲン結合部位を認識すること、(3)また、このIgGは、ラット子宮から得たERタンパクを予めアイソト-プ標識したエストロゲンと結合させた後の分子とも結合することから、エストロゲン結合部位以外の部分も認識することなどを明らかにした。また、この抗体は、既にいくつかの類似の報告におけるER抗体よりも、ラット組織中のERタンパクをより高い感度で検出した。この抗体を用いて、ラット脳・脳下垂体・子宮等の組織におけるERの分布を免疫組織化学的に検討した。この抗血清を用いて、(1)ラット脳における発生に伴うERタンパクの発現、(2)成熟ラットの神経細胞内のERタンパクと神経ペプチドの共存関係、(3)新生時期にエストロゲン投与を受け、不妊化した雌ラットの脳内のERのタンパクの分布とその程度が正常雌ラットと異なるかどうか、等を検討している。われわれが新たに作製したラットエストロゲン受容体(ER)を特異的に認識する家兎抗血清を用いて、成熟ラットおよび新生仔ラットの脳内におけるERの発現と分布を検討した。また、ER含有ニューロンにおける神経ペプチドの共存を検索した。

新生仔ラット・成熟ラットのいずれについても、ERは視床下部諸神経核・扁桃体・外側手綱核・中心灰白質等に存在した。視床下部視束前野・腹内側核・弓状核におけるER含有ニューロンの一部には、サブスタンスP・ベータエンドルフィンが共存していた。また、この共存の状態は、エストロゲン・プロゲステロン投与によって変化することを見出した。電子顕微鏡を用いた免疫組織化学によって、ERはこれらの細胞の核内に局在し、核小体には欠如していること、細胞質内のER存在は疑わしいことを観察した。また、新生仔期の顔面神経核内側亜核に、ERが一過性に出現し、成熟ラットでは消失する現象を発見した。この事実は、ERをコードするcDNAから作製したcRNAプローブを用いたインシチュウハイブリダイゼイション(ISH)によっても確認した。この現象の持つ生物学的な意味づけは現段階では不明であるが、ERが核内DNAと結合すること等から、神経細胞の分化に関与している可能性がある。
硬X線TDIカメラによる超微細高感度画像取得の実証

SDCCD素子と信号処理用専用アナログASICを用いて、広帯域高感度CCDカメラシステムを完成させた。高エネルギー加速器研究機構にて30-80keVの硬X線照射実験を行った結果、ゲインの線形性、エネルギー分解能、検出効率のいずれについても、概ね期待される性能を得た。また、国立研究開発法人放射線医学総合研究所にある重粒子線がん治療装置HIMACをつかって、SDCCD素子に100MeVの陽子線照射実験をおこなった。従来型CCD素子に比べ、1桁近く優れた放射線耐性を確認した。従来型X線CCDの裏面にCsIシンチレータを貼り付けたSDCCD単体の性能評価と放射線耐性試験を行った。X線CCDの電荷転送効率(Charge Transfer Efficiency:CTE)は、カメラシステムの分光性能を決定づける重要な性能指標である。一般にCCD中の電荷転送路内に、格子欠陥による電荷トラップが存在するためにCTEは1よりもわずかに小さい値を取る(典型的には0.99999)。今回のSDCCDは電荷転送路内にポテンシャル構造を持たせて転送路を狭めることで、CTEを従来素子よりもより1に近づけた(0.999999)。これにより分光性能が従来素子よりも有意に改善していることを実証した。本研究で開発予定の硬X線TDIカメラは、放射線レベルの厳しい環境での使用も想定している。そこで我々は、千葉県の放射線医学総合研究所重粒子線がん治療装置(HIMAC)にて、100MeVの陽子線を素子に照射した。100億個以上の陽子線を照射したが、SDCCDのCTEは、やはり我々が開発した従来型X線CCD(次期X線天文衛星ASTRO-H搭載モデル)と比較しても有意に改善していた。以上の成果により、SDCCDは素子単体で十分な性能を持っていることが実測出来た。X線CCDの信号処理を高速化するためにASICを開発した。我々が本研究以前に開発したASICが、現在軌道上のひとみ衛星搭載CCDカメラに使用されているが、本研究ではそれを以下の点で発展させたものである。一つはアナログデジタル変換を行うデルタシグマモジュレータ回路を二次から四次に高次化することで、雑音整形性能を向上させた。これにより、ひとみ用ASICよりも少ないサンプリング回数で同等の雑音性能を得ることに成功した。また線形性能については積分非線形性が0.1%と、ひとみ用ASIC(0.2%)と比較して有意に向上している。もう一つは、高次化したADC回路により、信号系統ごとのADCの数を一つにすることが出来ている。ひとみ用ASICでは、1ピクセルあたりの信号処理に時間を要したため、各系統に2つのADCを実装し、それらを交互に動作させていた。これは、一枚の画像の中に異なるゲインを持つピクセルが交互に並ぶことを意味している。これによって最終的な天体画像を得るために後段の煩雑な画像処理を要求していた。本研究のASICでは単一のADCで全てのピクセルを処理することが可能なためゲイン補正が不要であり、ASIC出力を復号化すればすぐに画像が得られるようになった。さらに本研究で開発したASICは、低高度地球周回衛星を模擬した放射線損傷試験を行った。放射線損傷には、陽子による経年劣化を受ける損傷と、重粒子による確率的な損傷の二つがあるが、その両方に対して、十分な放射線耐性を持つことが実証できた。以上の開発結果から、硬X線TDI実験を行う準備が整ったと言える。平成27年6月、X線イメージセンサ用高速低雑音信号処理ASIC新規開発のための、X線カメラ概念設計を行ったところ、予想に反し、ASICの回路設計に対する要求を高くせざるを得ないことが判明した。そこで新規ASIC回路を概念設計段階から再検討することになったため、ネットリスト完成までの一連の計画を延期することとした。これに伴い、X線CCDと接続した分光性能評価実験を実施することが出来なかった。申請者は過去、2016年に打ち上げられたX線天文衛星「ひとみ」に搭載されたX線CCDカメラの信号処理用アナログデジタル混在ASICを開発し、地上試験で測定した通りの雑音性能およびエネルギー線形性能を軌道上で実証した。だがこのASICには機能面での課題もあった。CCDセンサは、多数個のピクセルを一つあるいは少数の電荷読出しノードまで転送し、ノードでの信号増幅からADCでのデジタル信号への変換まではシリアル信号処理を行う。明るい天体を観測するためには短時間で画像処理を行う必要があり、そのためにはASICの信号処理速度性能が重要である。「ひとみ」用ASICでは信号処理速度に制限があり、1ピクセル分のデータを処理するのに2ピクセル分の時間を要した。このため、2つのADCが交互に動作するという回路構造にせざるを得なかった。「ひとみ」の画像取得速度にはこれで対応できたが、2つのADCはお互いのゲインが異なるため、CCDで得た画像処理が煩雑になるという問題があった。そこで申請者は、「ひとみ」用ASICで実現した低雑音デルタシグマ型ADCを高次化させた新型ASICを開発した。回路を高次化させることで信号処理速度が向上し、1信号系統当たりのADCが1つになった。本研究では単体での評価試験システムを確立した、複数のASIC素子に対して疑似CCD信号を入力させ、ASIC出力信号に対して計算機内の復号化フィルタを通して波高値を得た。

その結果、雑音性能は従来ASICと同程度であるものの、エネルギー線形性能は2倍向上したことを実測で示した。一方イメージセンサとしては、従来型CCDにCsIシンチレータを張り付けたSDCCDを開発し、その広帯域分光性能と放射線耐性を地上試験で実証した。SDCCD素子と信号処理用専用アナログASICを用いて、広帯域高感度CCDカメラシステムを完成させた。高エネルギー加速器研究機構にて30-80keVの硬X線照射実験を行った結果、ゲインの線形性、エネルギー分解能、検出効率のいずれについても、概ね期待される性能を得た。また、国立研究開発法人放射線医学総合研究所にある重粒子線がん治療装置HIMACをつかって、SDCCD素子に100MeVの陽子線照射実験をおこなった。従来型CCD素子に比べ、1桁近く優れた放射線耐性を確認した。我々が開発した、硬X線TDIカメラの核となるSDCCDセンサが、単体分光性能と放射線耐性の両面において十分な性能を持つことが実測出来た。ASICは平成27年度末までに完成したため、CCDカメラシステムとしての分光性能評価試験を行う。さらに、X線源を移動させた状態で、TDIカメラとしての動作検証を行う予定である。X線天文学SDCCDは素子単体で十分な性能を持っていることが実測出来たので、次はX線発生装置と組み合わせてTDIカメラとしての動作を検証することが課題である。必要なエレクトロニクスは、ASTRO-H衛星用に我々が開発済の物を流用する。一方で治具などの機械部分は新たに作成して実験に臨む。X線CCD信号処理用ASICのカスタムパッケージの納入が予定よりも遅延しているため、支払いを次年度に回す必要が生じた。X線CCD信号処理用ASICのカスタムパッケージに使用する。
Stevens-Johnson症候群の発症機序と病態に関する解析

1.Stevens-Johnson症候群患者の眼表面再建術を施行していない138眼を対象として、他覚的眼所見13項目を4段階のスコアを用いて評価した。このうち輪部上皮(角膜上皮幹細胞)の消失およびマイボーム腺圧出油脂異常が約90%に認められ、また血管侵入、角膜混濁、結膜侵入が視力に対して高い相関を示した。多変量解析により、白内障、輪部上皮の残存程度、角膜上皮障害、上皮欠損、血管侵入、角膜混濁、角化が視力を規定する主な因子であることが明らかとなった。2.Stevens-Johnson症候群発症の素因を検討するため、日本人患者40例の末梢血からDNAを採取してHLA遺伝子型を解析し、コントロール(非発症)群と比較した。患者群ではHLA-A0206が有意に増加、A1101が有意に減少していた。3.SJS患者57名と、健常日本人160名の末梢血よりDNAを抽出し、Toll like receptor3の7つのSNPsを解析したところ、エキソン2に存在するIMS-JST130849G/T(p=0.001,オッズ比4.5)とエキソン4に存在するIMS-JST130843G/A(p=0.046,オッズ比2.2)の2つにおいて有意な差を認め、SJSの発症に自然免疫異常が関与する可能性が示された。4.SJSでは眼表面より高率にMRSAおよびMRCNSを検出する。我々は本研究において、正常ヒトの眼表面に存在する表皮ブドウ球菌がpolyclonalであることを明らかにした。Stevens-Johnson症候群患者の眼表面再建術を施行していない138眼を対象として、輪部上皮残存、生体染色、上皮欠損、結膜侵入、血管侵入・角膜混濁、角化、充血、瞼球癒着、睫毛乱生、皮膚粘膜移行部、マイボーム腺圧出油脂、涙点閉鎖の13項目を4段階のスコアで評価したところ、輪部上皮(角膜上皮幹細胞)の消失およびマイボーム腺圧出油脂異常が約90%に認められた。これら13項目はすべて視力に相関し、特に血管侵入、角膜混濁、結膜侵入が高い相関係数を示した(いずれも0.7以上、P<0.0001)。また多変量解析により、白内障、輪部上皮の残存程度、角膜上皮障害、上皮欠損、血管侵入、角膜混濁、角化が視力を規定する主な因子であることが明らかとなった。また患者涙液を採取し、抗酸化物質であるThioredoxin(TRX)の濃度を測定し、正常眼あるいは他疾患と比較した。涙液中のTRX発現量は、正常眼164.3±104.8(ng/ml,平均±SD)、非炎症眼143.8±82.9であるのに対して、本症候群では3018.1±1992.8と極めて高値であった。免疫染色により、本症候群の瘢痕性結膜上皮とくに最表層にTRXの強い発現を認めた。本症候群の涙液と眼表面に発現するTRXが、酸化ストレスと炎症の制御に関与している可能性が示唆された。Stevens-Johnson症候群患者ならびに健常人の末梢血から単球を分離し、GeneChipによる遺伝子発現解析を行った。その結果、患者と健常人で差のみられた遺伝子が20遺伝子存在した。それらのうち5遺伝子(IL-4R、IL-1α、NFKB IZ、IL-6ST、CXCL7)において、定量PCRにより有意な差を確認した。このことより、Stevens-Johnson症候群に自然免疫応答の異常が関与する可能性を示唆された。Stevens-Johnson症候群(SJS)発症の素因として、これまでに頻度の高いHLAがヨーロッパ、香港から報告されたが、それらは日本人では認められないHLA型であった。

本研究では日本人患者40例の末梢血からDNAを採取してHLA遺伝子型を解析し、コントロール(非発症)群と比較して患者群ではHLA-A0206が有意に増加、A1101が有意に減少していることを明らかにした。一方、患者44例を対象に発症時の症状、薬剤履歴、急性期の眼科治療について聴取した、80%で感冒様症状を伴い、63%において眼充血が発疹より先行していた。また発症1週以内にステロイドが眼局所に投与された群は、非投与群に比べて有意に視力予後が良好であった。眼合併症を伴うSJSは、結膜充血が発疹に先行して発症することが多く、初期のステロイド眼局所投与が視力予後に影響することが明らかとなった。近年、病原体認識機構であるToll like receptor(TLR)が、自然免疫において重要であることが示され、またウイルスに関与するものとしてTLR3が注目されている。そこでSJS患者57名と、健常日本人160名の末梢血よりDNAを抽出し、TLR3の7つのSNPsをダイレクトシークエンス法にて解析した。7つのSNPsのうち、エキソン2に存在するIMS-JST130849G/T(p=0.001,オッズ比4.5)とエキソン4に存在するIMS-JST130843G/A(p=0.046,オッズ比2.2)の2つにおいて有意な差を認め、SJSの発症に自然免疫異常が関与する可能性が示された。
認知行動と経済厚生

有限記憶に基づく消費者行動をモデル化し、それに基づく広告競争を分析し、その経済厚生を、一種の超越的効用によって評価することを目的とする。一般的なモデル分析として、消費項目そのものを記憶の対象とし、広告が忘れられた項目に対する想起作用を持つ情報として作用する状況を設定する。このような設定が意味を持つような設定として、消費者の静学的選好が、動学的に変動するタイプとなるような、消費選択に的を絞る。とくに、いわゆる耐久財型選好をもつ場合について、限界的な項目を対象とするモデルを考えた。そのような状況において、複数の広告は一定比率で一方のみが有効となるような場合についての、価格をも選択肢に含む広告競争を調べた。この場合、消費者の記憶が完全である場合の選好を、厚生基準に取ることが自然となる。静学的分析では、Shapiroが挙げた、Dixit&Normanの厚生基準への批判に相当する状況が出現することが確認された。この設定の下での動学分析は、消費者の記憶が前期の消費に依存する慣性効果を仮定すると、特異解を除いては、十分には展開ができない。これをうけて、一企業のみの広告行動を調べた。この場合、設定として、政治的活動に対するNGO等のキャンペーン競争のモデルとして分析を行った。この場合、慣性効果のひとつの影響として、広告水準の動学パターンは振動型となる。別の試みとして、消費者の選好をランダム型とし、記憶は毎期独立、かつ、価格は所与の場合の企業間広告競争モデルの動学分析を、マルコフ完全均衡により行った。この場合でも、やはり振動型の解が得られる。さらに、比較静学としては、一般的な答えを出せないが、数値分析をも援用した結果、広告の想起作用が非効率になるにつれて、厚生水準が下がるというパターンが確認できた。本研究の中核である、広告競争モデルに関しては、短期モデルについては、分析を例から広げて一般化につとめ、基本的な観察、すなわち、記憶の有界性の下で、広告ゥら広げて一般化につとめ、基本的な観察、すなわち、記憶の有界性の下で、広告の注意喚起効果が経済攻勢にもたらす効果が、事前並びに事後の認知される効用関数の上での効果と、「本来の」効用関数にそった効果とが逆転する可能性が成立する範繧ナの効果と、「本来の」効用関数にそった効果とが逆転する可能性が成立する範囲を調べた。しかし、静学的分析では、注意喚起の効果のみで、他の情報をうち消すという側面をとらえることができない。このために、動学分析への拡張は、不可欠で「う側面をとらえることができない。このために、動学分析への拡張は、不可欠である。動学分析に関しては、動的計画法による解法を念頭においたモデル化を進めており、無限状態空間の想定の下では、線形解が存在することを確認した。ただし、このケーウ限状態空間の想定の下では、線形解が存在することを確認した。ただし、このケースは、一般解へ拡張することが困難であり、離散状態空間の下での、交互ムーブ型のモデル化による解の導出を次のステップとして準備中である。アの他、単一広告主体の場合のモデルの含意を吟味し、その動学化を検討した。このほか、環境経済モデルや、寡占下の企業協調モデルなど、応用可能性のある関連分野についての検討を進めた。本年は基本モデルの動学的な拡張を中心に研究を進めた。とくにこれまでに得られた観察が端点解、ひいては広告費用が低いことに依存していたので、これを一般化することに努めた。

なおも、対称ケースに限られているものの、これまでの厚生に関わる命題が、広い範囲で成立することに加えて、多数均衡、混合戦略、均衡非対称均衡が出現するケースが認められた。とくに非対称均衡等は、動学過程の考察の重要性を示唆するものである。他方、従来の分析との比較の上では、このような一般化には限界があることも認められ、認知面でのモデル拡張の重要性が再確認される。また、これまでに得られた重要な観察結果である、事前事後の厚生基準に関する一種の反例については、その成立範囲が広範であることが確認できた。他方、より広い意味での情報伝達型広告のモデルとは、静学的な設定では共通性が認められるが、上述の観察については、背後の上位選好の存在が主たる理由で、少なくともその結論が共有されうるかどうかは、自明ではない。この点は継続して確認する価値があるものと考えられる。この点に関連して、認識される選好を、逆方向に向けるような記憶変更は、行えないものとしていること、しかし、メッセージが対立メッセージを妨害することはあると考えている点が、それぞれ、一定の影響を及ぼしていることが明らかになった動学面での分析については、逐次形モデルの分析の準備を進めている。この他にも前年から継続している、単純な動学過程の応用可能性について、環境管理の分野でひき続き、有用な結果が得られる見通しが得られた。有限の注目対象にしか、注意を払えない消費者に対する企業間の広告競争を、動学的にとらえるモデルの構築を第一目標とし、それに基づいた厚生比較について検討を加えることを究極のゴールとしていた。とくに、消費者の選好が耐久財型で、さらに企業が価格選択を行えるような枠組みでの動学均衡を検討していたが、方法的な限界から、下記のような設定に限定されることとなった。主たる検討対象とした設定では、消費者の選好は各時点で独立に、確率的に決まる。また、注意対象がいずれの企業の財にあるかも、各時点で独立に、確率的に決まる。そして、各企業の選択肢は、広告水準のみで、価格は一定であるものとされる。このような設定下でのマルコフ完全均衡を特徴付け、完全に陽表的ではないが、解が満たす条件を求めた。単純な設定の中で、重要なファクターは、企業広告が、相手企業の潜在顧客発掘に対する阻害要因としての概能を持たせたことで(非対称性と合わせて)均衡が定常的とはならないための主たる役割を果たす。均衡パスが示す性質は、減衰振動型の安定軌道であり、広告活動の効果に相互依存がある場合の一つのパターンである。当然、初期値が定常値からカイ離している場合の、厚生損失を示唆する。他方、定常水準自体の厚生評価は、社会的に過大でも過小でもある。これは、効用の変化を企業が価格増によって吸収するルートが閉ざされているためで、現在の手法の限界を示す。これらの結果は、IMAI & HORIE "Advertising Competition under Bounded Memories and Random Preferences"(2004) KIERとしてまとめる予定である。平行して、より動学的な依存関係の高いバージョン(選好、記憶とも、過去に依存する)の研究を、今度は、一方のみが戦略的に行動するケースを取り上げて動学的最適化問題として定式化し、解を求めた。予想されるように広告を戦略的に行う主体のシェアには有利に働くが、非戦略的な側の行動にも依存して、やはり厚生分析は、あいまいとなる。
ヒト多能性幹細胞におけるMBTファミリーの役割

ヒトの多能性幹細胞(iPS細胞やES細胞)は、疾患のある組織を健康な組織で置き換える再生医療において、その細胞供給源になると期待されている。本計画では、自然に未分化性が破綻する状況を再現した実験系で見いだされた2つのポリコーム遺伝子(MBTファミリー遺伝子)に焦点をあて、特に未分化ー分化の境界における機能を解析している。未分化状態が自然に破綻する不安定な培養条件(DP)を細胞形態と未分化マーカーの発現を指標に確立し、そのときの細胞の状況をマイクロアレイによって解析した結果、不安定な状態で特異的に発現する遺伝子が多数見いだされた。一般的に、ポリコーム遺伝子群は多能性幹細胞で発現していて、PRC1といった複合体を形成して分化関連遺伝子の発現を抑制することで未分化状態を維持しているとされるが、本研究の対象であるL3MBTL1とFMBT2は、例外的に、不安定化によってその発現が上昇した。そこで、これらの遺伝子をCRISPR-Cas9法を用いてノックアウトした結果、未分化の破綻が著しく促進することを見出した。従って、これらの遺伝子は未分化破綻する状況で発現上昇し、未分化に引き戻すという役割を果たしていると考えられた。この仮説を実証するため、これらの遺伝子をクローン化して、iPS細胞に強制発現させる実験を行っている。その結果、強制発現によって、不安定化は有意に抑制され、上記の仮説が部分的に裏付けられた。さらに、不安定化と分化の違いを明らかにするため、多能性幹細胞を確定的な分化状態に誘導する研究も行い、統合的な解析を行った(論文発表済)。ヒトES細胞やヒトiPS細胞などの多能性幹細胞は、疾患のある組織を健康な組織で置き換える再生医療において、その細胞供給源になると期待されている。本計画では、自然に未分化性が破綻する状況を再現した実験系で見いだされた2つのエピジェネティック遺伝子(ポリコーム遺伝子群に属するMBTファミリー遺伝子)に焦点をあて、特に未分化ー分化の境界における機能を解析する。予備的な研究として、未分化状態が自然に破綻する不安定な培養条件を細胞形態と未分化マーカーの発現を指標に確立し、そのときの細胞の状況をマイクロアレイによって解析した。その結果、明白な分化までは至っていないが、未分化性が不安定になっている状態を人工的に作り出すことに成功し、そこで特異的に発現変化する遺伝子を多数同定した。その中の2つ(L3MBTL1とSFMBT2)がポリコーム遺伝子郡に含まれる遺伝子であった。ポリコームは多能性幹細胞で発現していて、分化関連遺伝子の発現を抑制することで未分化状態を維持しているのが一般的と考えられており、分化(あるいは不安定化)において発現し、その過程で働いているポリコーム遺伝子はほとんど知られてない。そこで、ヒト多能性幹細胞の未分化ー分化(不安定化)間の移行において、PRC1のターゲットが変化するかという点を中心に、不安定化におけるL3MBTL1とSFMBT2の役割について解析を始めた。まず、L3MBTL1とSFMBT2の抗体を準備して、不安定化した多能性幹細胞の免疫染色によって、RNAレベルでの発現変動の確認を行った。そして、ChIP解析によってL3MBTL1とSFMBT2のターゲットとなっている遺伝子の同定と確認を行っている。そして現在、ChIP-Seq解析によって、未分化なヒト多能性幹細胞と不安定化した多能性幹細胞におけるターゲット遺伝子を網羅的に同定する実験を進めている。27年度ではL3MBTL1とSFMBT2のChIP-Seq解析を目標にしているが、まだ完了してない。この実験では抗体の善し悪しに大きく左右されるために、そのチェックに予測困難な時間を要する。今年度は免疫染色によるチェックに時間を要した。ヒト多能性幹細胞(iPS細胞やES細胞)は、疾患のある組織を健康な組織で置き換える再生医療において、その細胞供給源になると期待されている。本計画では、自然に未分化性が破綻する状況を再現した実験系で見いだされた2つのエピジェネティック遺伝子(ポリコーム遺伝子群に属するMBTファミリー遺伝子)に焦点をあて、特に未分化ー分化の境界における機能を解析している。前年度までに、積極的な分化誘導を行わないような培養条件下での多能性幹細胞の振る舞いに焦点を当てた研究を行った。まず、未分化状態が自然に破綻する不安定な培養条件(DP)を細胞形態と未分化マーカーの発現を指標に確立し、そのときの細胞の状況をマイクロアレイによって解析した結果、不安定な状態で特異的に発現する遺伝子が多数見いだされた。そこで、現在、これらの抗体を用いたChIP-Seq解析を進め、他のポリコームとターゲットが異なるのか、あるいは、不安定化に際してターゲットが変化するかという点を中心に分析している。また、不安定化と分化の違いを明らかにするため、多能性幹細胞を確定的な分化状態に誘導する研究も行い、統合的な解析を行った(論文発表済)。さらに、これらと同時並行して、L3MBTL1とSFMBT2をノックアウトする研究を進めている。既に、それらをCRISPR-Casによってこれらの遺伝子を破壊した多能性幹細胞を作製し、現在、その挙動を解析している。

全体の流れとしては、多能性幹細胞の未分化ー分化間の変動におけるChIP-Seqでポリコームのターゲットを解析し、その結果も踏まえながら、L3MBTL1とFMBT2の役割を詳細に研究していくということなる。多能性幹細胞の分化状態を変化させる技法は十分なものとなり、L3MBTL1とFMBT2の役割を解析するためのノックアウト細胞(iPS)も得ることができている。この点は予定以上の進歩と言えるが、L3MBTL1とFMBT2のChIP-Seq解析は予想以上に複雑で、今後も続ける必要がある。ヒトの多能性幹細胞(iPS細胞やES細胞)は、疾患のある組織を健康な組織で置き換える再生医療において、その細胞供給源になると期待されている。本計画では、自然に未分化性が破綻する状況を再現した実験系で見いだされた2つのポリコーム遺伝子(MBTファミリー遺伝子)に焦点をあて、特に未分化ー分化の境界における機能を解析している。事前の研究で、未分化状態が自然に破綻する不安定な培養条件(DP)を細胞形態と未分化マーカーの発現を指標に確立し、そのときの細胞の状況をマイクロアレイによって解析した結果、不安定な状態で特異的に発現する遺伝子が多数見いだされた。一般的に、ポリコーム遺伝子群は多能性幹細胞で発現していて、PRC1といった複合体を形成して分化関連遺伝子の発現を抑制することで未分化状態を維持しているとされるが、本研究の対象であるL3MBTL1とFMBT2は、例外的に、不安定化によってその発現が上昇した。そこで、これらの遺伝子をCRISPR-Cas9法を用いてノックアウトした結果、未分化の破綻が著しく促進することを見出した。従って、これらの遺伝子は未分化破綻する状況で発現上昇し、未分化に引き戻すという役割を果たしていると考えられた。この仮説を実証するため、これらの遺伝子をクローン化して、iPS細胞に強制発現させる実験を行っている。また、抗体を用いたChIP-Seq解析を進め、他のポリコームとターゲットが異なるのか、あるいは、不安定化に際してターゲットが変化するかという点を中心に分析している。さらに、不安定化と分化の違いを明らかにするため、多能性幹細胞を確定的な分化状態に誘導する研究も行い、統合的な解析を行った(論文発表済)。研究全体を通して、多能性幹細胞の分化状態の変化について、そのパターンや要因について知見が深まっている。また、前年度から継続してChIP解析を行い、ターゲットについての研究結果も蓄積している。そして、本年度において大いに進展があったのは、MBTファミリー遺伝子のノックアウト細胞(iPS)を作製した研究で、単独のほかダブルノックアウトの作製も行っている。
化学反応場としてのペプチドループ構造の設計とその機能解析

ループ構造を安定化させる戦略として、(1)ループ構造のN末端とC末端の三次元的な位置を固定すること(2)部分的に逆平行βシート構造をとるようにアミノ酸配列を選択することを行った。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、のちに化学反応性を付加するために、制限酵素EcoRI、EcoRVおよびFokIに共通してみられる、リン酸ジエステル結合の加水分解に関与していると考えられているループ構造部分に由来する25アミノ酸からなる配列を固相法により合成し、用いた。この25残基からなるペプチドは水溶液中ではランダムな構造をとっており、ループ構造を形成して、マグネシウムイオンと結合することはなかった。そこで、このアミノ酸配列のN末端側とC末端側に逆平行βシート構造をとるようにアミノ酸配列を付加した。この14アミノ酸からなる配列はCroタンパク質の二量体形成部位に由来し、二量体形成は各々の単量体のC末端部分での逆平行β-シート形成ならびにフェニルアラニン残基がもう一方の単量体のN末端部分で形成される疎水性ポケットに取り込まれることにより安定化されている。この二量体形成機構をもとにして、Croタンパク質のC末端部分のアミノ酸配列を持ち、N末端部分のアミノ酸で形成される疎水性ポケットのかわりにゲスト包接能を持つシロデキストリン分子をもつ14アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを合成したところ、分子間では二量体が形成されることがわかった。今後、この14アミノ酸を付加したループペプチドの溶液構造を調べる予定である。