hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二相密閉型熱サイフオン内の熱伝達に関する研究

次に、代替フロンであるHCFC123を用いて、熱伝達係数と限界熱流束にのデータを得た。7年度はHFC134a、水、ペンタン、その他の液体を用いた実験を行い、熱伝達係数と限界熱流束について、より広範囲に適用できる整理式を提出する予定である。本年度の研究の反省としては、6年度研究計画調書で購入予定していた圧力計では、管内圧力を充分精度良く測定できないことが分かったために、異なった形式の圧力計を購入した。このため、備品費が14万円程度大きくなったことである。なお、研究成果の発表は7年度にまとめて行う予定である。前年度は内径16mm、蒸発部および凝縮部の長さがいずれも500mmの密閉型熱サイフォンを用い、エタノールおよびフロン123を作動液体として、蒸発部および凝縮部内の熱伝達係数および限界熱流束に関する実験を熱サイフォン内の作動温度が4090°Cの範囲で行った。作動液体は蒸発部内容積の約40%封入した。本年度は作動液体として、フロン134a、水、メタノール、ペンタンおよびヘキサンを用いて、前年度と同じ封入量および管内温度の条件で蒸発部および凝縮部内の熱伝達係数および限界熱流束に関する実験を行った。なお、メタノールの場合は封入量の影響を調べるために、封入量を30,40,50および60%と変化させて実験を行った。得られた結果をまとめると次の通りである。1.蒸発部内の熱伝達係数は従来発表されている井村ら、Grossおよび神永・岡本の式で上記7種類の作動液体の実験データを整理し、各式の妥当性を検討した。その結果すべてのデータを一つの式で整理することはできなかった。2.凝縮部内の熱伝達係数は凝縮液膜上に波が発生することを考慮して導かれた凝縮熱伝達係数の式でほぼ整理できる。しかし、水の場合はすべてのデータが、アルコールおよび炭化水素の場合は管内温度が低いかまたは低熱流束で熱伝達係数は小さな値を示した。3.限界熱流束の実験値は従来発表されている八つの実験式および理論計算式によって整理した結果、Imura et al.,深野らの実験式および甲藤らの理論計算式によって比較的良く整理された。しかし、これらの整理によれば、フロン123、ペンタンおよびヘキサンのデータは水、エタノール、メタノールおよびフロン113のデータよりも約50%大きな値を示した。4.メタノールの封入量を変えた実験によれば、蒸発部壁面温度分布から判断して、封入量は50%程度が最適と予想される。
クロスプライミング機能に関与する樹状細胞の機能的動態の解明

樹状細胞は免疫応答に必須の抗原提示細胞である。樹状細胞は不均一な細胞集団であり、いくつかの機能的に特化したサブセットにより構成されている。マウスにおいて、CD8陽性樹状細胞(CD8+DC)と呼ばれる樹状細胞サブセットは、死滅した細胞を取り込む能力が高い。また、TLR3を発現しており、それにより二本鎖RNAに応答して、IL-12p40を産生すると共に、CD8陽性T細胞の分化能力を増強する。この機能はクロスプライミングと呼ばれ、抗ウイルス免疫、抗がん免疫に非常に重要であると考えられている。しかし、CD8+DCの動態を制御する分子機構については不明の部分が多い。本研究では、CD8+DC特異的発現を示すケモカイン受容体遺伝子Xcr1をDNAマイクロアレイを用いて見出した。ヒトではBDCA3陽性樹状細胞(BDCA3+DC)が、遺伝子発現パターン等からCD8+DCに相当すると考えられているが、ヒトXcr1もBDCA3+DC特異的な発現を示した。Xcr1のリガンドであるXcl1の発現は、NK細胞において恒常的に高く、IL-2の添加によりさらに発現が増強された。また、活性化CD4陽性T細胞にはほとんど発現されていなかったが、CD8陽性T細胞を活性化した場合、迅速で高い発現が誘導された。Xcr1と同様に、Xcl1の発現パターンも、ヒト、マウスにおいてほぼ一致していた。このように、ケモカインシステムXCR1/XCL1は、自然免疫獲得免疫双方の細胞障害性応答に関与している可能性が示唆された。CD8陽性樹状細胞は、死滅した細胞を取り込む能力が高い。しかし、CD8陽性樹状細胞の数は非常に少なく、その生体内での動態、機能的意義は不明の部分が多い。現在、CD8陽性樹状細胞、CD8陰性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞(pDC)、骨髄由来単球様樹状細胞、線維芽細胞の遺伝子発現プロフィールを比較、解析することにより、CD8陽性樹状細胞特異的発現を示す遺伝子Xに焦点を当てている。まず、Xの遺伝子座にYFP(Venus)遺伝子をノックインしたマウスを樹立した。そしてこのマウスの脾臓、リンパ節(鼠径部、膝下部、腸間膜など)のFACS解析を行った。どの組織においても、期待通りにCD8陽性樹状細胞特異的にYFPが検出された。さらに、組織の凍結標本を作製し、免疫組織学的に細胞の局在を検討中である。また、この遺伝子Xのヘテロマウス、あるいはホモマウスを用いて、卵白アルブミン(OVA)の抗原を種々のアジュバント(poly(I:C)などの二本鎖RNA,完全フロイントアジュバント)と共に免疫した後の、OVAと反応するCD8陽性T細胞の頻度、増殖能、IFN-γ産生能などを検討中である。
日本における社会構造を考慮したインフルエンザワクチン接種政策の最適化

初年度は設定した目標それぞれにおいて想定していた進捗が得られた。小児の血清疫学データについてはサンプルの収集、またサブストレインまで含めた分析が困難であるため、既存のデータベースを用いてモデルに投入し分析を行っている。社会的接触行列についても先行研究を参考に予防接種政策を比較検討するためのモデルを構築した。本研究の目的である、日本においてインフルエンザの予防接種をどの年齢群に接種すればより効果的であるか、という課題についてDynamic modelを用いた費用対効果分析を行い、国際学会(International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance, Vienna, Nov 2018)にて発表を行った。欧州の先行研究同様、小児に重点を置いた予防接種政策がより費用対効果が高いという結果であった。この成果をより詳細にしたものを論文化したところであり、投稿先のPeer reviewed journalを共著者と検討中である。インフルエンザによる疾病負荷は日本と欧米の疫学・医療体制の違いもあり、異なることが推測されるため疾病負荷については日本発のエビデンスが発信されることが望ましい。日本独自の医療体制を考慮したインフルエンザの経済的な疾病負荷・経済的損失について分析を行い、成果を原著論文として発表した(BMC Public Health 2019 19:280)。また日本におけるインフルエンザの疾病負荷をより詳細かつ包括的に評価するため、一般家庭を対象としたアンケート調査を実施した。結果は現在集計中であり、国際学会での結果発表・原著論文化を予定している。今年は研究計画の初年度にあたるが、国際学会での発表と英語原著論文の発表を目標とした。上で述べたように国際学会発表・原著論文投稿ともに達成し、また次年度に向けた学会・論文発表の準備も進んでいる。概ね順調に進展していると考える。初年度と同じく、既に論文化された成果をPeer reviewed journal上で発表すること、また初年度に実施した調査の成果をまとめ、その成果も国際学会発表・英語原著論文の形で世に問うことが今後の基本的な方針である。現在実施しているアンケート調査について、2018年度と2019年度の二回にわたりアンケートを実施する予定としている。既に初年度の調査は終了したが、調査費用について初年度の直接費用のみでは賄えなかったため、2019年度に一括での支払いを予定している。そのため2019年度の使用額には2018年度に実施した調査費用が含まれることになり、差額はこれに充当する予定である。
海藻用発現ベクターの開発とそれを利用した海藻ゲノムへの外来遺伝子導入

申請者はこれまでに,不稔性アオサのアクチン遺伝子の全長を含む約12kbpのゲノムDNAの塩基配列解析により,アクチン遺伝子が5つのエクソンと4つのイントロンで構成されていること,翻訳開始および終結コドンがそれぞれ,第2および第5エクソンに存在すること,TATAボックスが転写開始点から30bp上流に,polyA付加配列が終結コドンから100bp下流に位置すること,等を明らかにしている。そこで,終結コドンから3'側約1.5kbpのDNA断片を,クロンテック社製プラスミドベクターpEGFPに含まれるGreen Fluorescent Protein(GFP)レポーター遺伝子の下流に挿入し,pEGFP-ACTを作製した。次いで,第1エクソンからプロモーター領域を含む5'側約1.2kbpのDNA断片,或いは第2エクソンの開始コドンからプロモーター領域を含む5'側約1.4kbpのDNA断片を各々pEGFP-ACTレポーター遺伝子の上流に挿入し,2種類の発現ベクターpEGFP-PSACTおよびpEGFP-PLACTを構築した。次に,構築した2種類の発現ベクターをバイオラッド社製PDS-1000/He Particle Delivery Systemを用いて種々の条件で不稔性アオサ細胞内に導入した。その結果,発現ベクターを直径1.0μmの金製マイクロキャリアにコーティングし,ヘリウム圧1300又は1550psi,サンプル距離6cmの条件で導入した場合に,細胞内に多数のマイクロキャリアが観察された。さらに,導入24時間後の細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ,いずれの発現ベクターを導入した場合でも,GFP由来の蛍光を発する細胞が数個確認された。また,GFP由来の蛍光強度の比較により,pEGFP-PSACTが細胞内でより強い発現性を示すことを明らかにした。今後は,より高効率で安定した形質転換体を得るための導入方法を確立すると共に,Luciferaseレポーター遺伝子を利用したプロモーター活性の測定により,導入外来遺伝子の発現に最適なプロモーター及びpolyA付加シグナル配列を決定する予定である。高等陸上植物では,細胞内に導入した外来遺伝子の発現にβ-アクチン,リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ・スモールサブユニット(RbcS)などのプロモーターが利用されている。本研究では,海藻用発現ベクターのプロモーターとして緑藻不稔性アオサのβ-アクチンおよびRbcS遺伝子に着目し,各遺伝子の5'側および3'側非翻訳領域を含むゲノムDNAの単離を行った。既に申請者は,不稔性アオサβ-アクチンのcDNAクローンを単離している。そこで,まず始めに不稔性アオサcDNAライブラリーからRbcSをコードするcDNAクローンを単離した。β-アクチンおよびRbcSをコードするcDNAをプローブとしたノーザンブロット解析により,明期12時間,暗期12時間の光周期で培養した不稔性アオサにおける両遺伝子の発現量は,光同期に依存して大きく変化することを明らかにした。次に,β-アクチンおよびRbcSをコードするゲノムDNAを単離するために,制限酵素処理で断片化したゲノムDNAの両端にクロンテック社製キットを用いて付属のアダプターを付加し,不稔牲アオサのゲノムライブラリーを構築した。これを鋳型として,β-アクチンおよびRbcSのcDNA塩基配列を参考に作製したプライマーおよび付加アダプターに相補的なプライマーを用いたPCRを行い,増幅DNA断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報を基に新たなプライマーを作製し,ゲノムDNAの上流または下流へPCRによるウォーキングを繰り返し行い,β-アクチンをコードする約12kbpのゲノムDNA,RbcSをコードする約8kbpおよび11kbpの2種類のゲノムDNAの塩基配列を決定した。各遺伝子の構造解析により,不稔性アオサのβ-アクチンおよびRbcS遺伝子はそれぞれ,5および4つのエキソンで構成されていることが明らかとなった。今後は,β-アクチンおよびRbcS遺伝子の5'側および3'側非翻訳領域をそれぞれ,Green Fluorescent Protein(GFP)レポーター遺伝子の上流および下流に挿入した発現ベクターを構築して不稔性アオサに導入し,海藻用発現ベクターに有効なプロモーターおよびターミネーター領域を決定する予定である。

さらに,導入24時間後の細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ,いずれの発現ベクターを導入した場合でも,GFP由来の蛍光を発する細胞が数個確認された。また,GFP由来の蛍光強度の比較により,pEGFP-PSACTが細胞内でより強い発現性を示すことを明らかにした。今後は,より高効率で安定した形質転換体を得るための導入方法を確立すると共に,Luciferaseレポーター遺伝子を利用したプロモーター活性の測定により,導入外来遺伝子の発現に最適なプロモーター及びpolyA付加シグナル配列を決定する予定である。
経験した出来事とその時系列情報を記憶する神経回路基盤

人間や動物にとって、自分が経験した出来事を記憶することは、日常生活を営む上で非常に重要である。申請者はこれまで、ラットの海馬CA1領域において、経験している出来事の情報を表現する「イベント・ニューロン」が存在すること神経生理学実験により発見し、海馬の神経ネットワークにおける出来事とその時系列表現を明らかにしてきた。本研究では、海馬における時系列記憶形成の神経回路メカニズムを解明することを目的とする。海馬および嗅内皮質の神経回路においていかに出来事の時系列情報が形成されるかを、行動実験と電気生理学実験を組み合わせ、行動中に各領域のニューロンの活動を観測することで明らかにしていく。昨年度は、海馬の神経回路でいかに時間経過に対しての順序表現が形成されるかを明らかにしていく研究を行った。まず行動課題として、動物に時間の経過の認識を必要とする行動課題を実行させた。そして、そのときのCA1のニューロンの発火活動を高密度大規模シリコンプローブ電極を用いて計測する実験を行った。ここで、シリコンプローブとは、櫛状に多数の電極を配置した高密度電極で、数十個数百個という多数のニューロンの発火活動を、ミリ秒単位の精密な時間スケールで同時に記録できるデバイスのことである。海馬に高密度シリコンプローブを配置し、海馬領域のニューロンの活動を同時に網羅的に観測することにより、多くの神経活動記録データを得ることができた。昨年度は、海馬の神経回路でいかに時間経過に対しての順序表現が形成されるかを明らかにしていく研究において、行動課題の開発と電気生理学実験において大きな進展があった。とくに、多くのラットから行動中の神経活動記録実験を成功させ、これまで数百個の神経細胞から活動記録データを得ることができた。今後は、上述した行動実験および電気生理学実験の例数を増やすことで、より多くの神経細胞の活動を観測する予定である。また、他の脳領域も同時に記録することで、領域間の相互作用に注目した研究を行っていく予定である。得られた大規模データを統計的数理解析にかけて詳細に分析することにより、注目している神経回路においてどのような情報処理が行われているのかを明らかにする。
小児骨髄系造血悪性腫瘍疾患におけるＲＡＳ変異体細胞モザイクの解析

若年性骨髄単球性白血病(JMML)はまれな小児固有の白血病である。JMMLの原因遺伝子として、PTPN11、NRAS、KRAS、NF1、CBLの体細胞変異が知られているが、同じ遺伝子の生殖細胞系列変異が各種の先天性遺伝疾患の原因ともなる。我々は血液細胞以外の検体(爪・毛髪・口腔粘膜)由来のDNAにおける遺伝子変異の解析を通じて、世界発となる2例のoncogenic NRAS mutationの体細胞モザイク症例2例を同定し、英文誌上(Doisaki S, et al., Blood 2012)で報告した。さらに多数例のJMML症例で解析を行い、合計6例の体細胞モザイクが疑われる症例を同定した。平成24年度・25年度にも継続して新規JMML症例のgermline変異解析用検体(爪・口腔粘膜由来DNA)を収集し、サンガー法・パイロシークエンス法による解析を行い、さらに3例(PTPN11の1例、NRASの2例)の体細胞モザイクが疑われる症例を同定し、合計5例の症例が蓄積した。我々は、JMML遺伝子診断例について、その遺伝子変異が血液細胞のみに認められる体細胞変異(somatic mutation)であるか、そのほかの細胞(爪・毛髪・口腔粘膜細胞など)にも一律に変異が認められる生殖細胞系列変異(germline mutation)であるか確認するため、JMMLと診断された患者の血液細胞以外の検体(爪・毛髪・口腔粘膜)由来のDNAにおける遺伝子変異の解析を行ったところ、偶然にも世界初となる2例のoncogenic NRAS mutationの体細胞モザイク症例を発見した。平成24年度中に、この2症例についてサンガー法、TAクローニング、パイロシークエンス法により統合的に解析し、英文誌上で報告した(Doisaki S, et.al., Blood 2012)。また、新たに約20例のJMML患者のgermline変異解析用検体(爪・口腔粘膜由来DNA)を収集し、サンガー法・パイロシークエンス法による解析を実施したところ、さらに2例(合計4例)のNRAS体細胞モザイク症例の同定に成功した。平成24年度・25年度・26年度にも継続して新規JMML症例のgermline変異解析用検体(爪・口腔粘膜由来DNA)を収集し、サンガー法・パイロシークエンス法による解析を行い、合計6例の体細胞モザイクが疑われる症例を同定し、解析を行った。小児科学平成24年度中に、世界初のNRAS体細胞モザイクを有するJMML2症例についてサンガー法、TAクローニング、パイロシークエンス法により統合的に解析し、一流英文誌上で報告することが出来た(Doisaki S, et al., Blood 2012)。また、新規JMML症例のgermline変異解析用検体(爪・口腔粘膜由来DNA)を収集し、サンガー法・パイロシークエンス法による解析を実施したところ、さらに1例のPTPN11体細胞モザイク症例、2例のNRAS体細胞モザイク症例が疑われる症例を同定した。平成25年時点での達成度としては、おおむね順調に進展していると思われる。平成24年度中に、世界初のNRAS体細胞モザイクを有するJMML2症例についてサンガー法、TAクローニング、パイロシークエンス法により統合的に解析し、一流英文誌上で報告することが出来た(Doisaki S, et.al., Blood 2012)。また、新たに約20例のJMML患者のgermline変異解析用検体(爪・口腔粘膜由来DNA)を収集し、サンガー法・パイロシークエンス法による解析を実施したところ、さらに2例(合計4例)のNRAS体細胞モザイク症例の同定に成功している。平成25年度以降には、さらに多くの症例に対して網羅的解析を行うことが可能と見込まれる。平成24年時点での達成度としては、おおむね順調に進展していると思われる。研究計画時点では、低頻度アリルの体細胞モザイク症例を同定する目的でPCRアンプリコンシークエンスによるディープシークエンスを計画していたが、申請者らの研究であらたに新規遺伝子変異がRAS pathway遺伝子変異に合併するJMML症例が存在することが明らかとなった(Sakaguchi H, et al., Nature Genetics, 2013)ことから、体細胞モザイクの解析においてもこれらの新規同定遺伝子(SETBP1, JAK3)についてディープシークエンスを行うことを計画中である。既に収集した新規JMML患者germline検体について新規同定遺伝子についても解析をすすめるとともに、平成26年度も継続してJMML患者をはじめとする小児骨髄系造血器腫瘍患者のgermline検体(爪・口腔粘膜・線維芽細胞など)を収集し、解析を行う予定である。研究計画時点では、低頻度アリルの体細胞モザイク症例を同定する目的でPCRアンプリコンシークエンスによるディープシークエンスを計画していたが、申請者らの研究で新たに新規遺伝子変異がRAS pathway

遺伝子変異に合併するJMML症例があることが明らかとなった(Nature Genetics, in press)ことから、体細胞モザイクの解析においても複数の遺伝子をディープシークエンスすることが必要となった。PCRアンプリコンシークエンスよりもさらに効率的に複数遺伝子のディープシークエンスを行うことを目的として、アジレント社SureSelectを用いた、JMML関連遺伝子群を捕捉したのち次世代シークエンサーで解析を行う実験系を構築中であり、平成25年度内に運用可能となる予定である。本実験系を用いた網羅的解析により、サンガー法では見いだせなかった低頻度アリルの体細胞モザイク症例の同定が可能となるとともに、体細胞モザイクの存在がJMML患者の臨床像・予後に与える影響について詳細に検討することが可能になると予想される。すでに収集した約20例のJMML患者germline検体について解析するとともに、平成25年度も継続してJMML患者をはじめとする小児骨髄系造血器腫瘍患者のgermline検体(爪・口腔粘膜など)を収集し、解析を行う予定である。既に収集した新規JMML患者germline検体について新規同定遺伝子についても解析をすすめるとともに、平成26年度も継続してJMML患者をはじめとする小児骨髄系造血器腫瘍患者のgermline検体(爪・口腔粘膜・線維芽細胞など)を収集し、次世代シークエンサーを用いた解析を行う予定である。サンガーシークエンス、パイロシークエンス、ターゲットディープシークエンスに用いる消耗品・物品費として60万円、研究成果の学会発表のための旅費に30万円、その他に10万円の使用を計画している。
国語科における主題単元学習の通時的・共時的研究を通した学習モデルの開発

本研究は、国語科教育において、「人間、社会、自然、言語、文化、自己、愛、青春など」抽象的な事柄の追究を構成原理とする「主題単元学習」論の展開とその意義を明らかにする際に、これまで十分に検討の対象とされてこなかった、1戦前の教育営為と主題単元学習の関係、2アメリカでの主題単元学習の展開、3現代的な意義、の追究を行うものである。つまり、国語科における主題単元学習の成立に至るまでの流れやその学習が持つ価値を、通時的、共時的に明らかにすることを通して、現代的な学習モデルの開発を目指す研究である。
妊娠ヒツジ子宮内炎症モデルを用いた胎児皮膚組織における炎症進展機序の解析

早産の主要原因である子宮内炎症がどのように胎児に波及し、どのように影響するかは未だ不明な部分が多いが、我々は妊娠ヒツジを用いて子宮内炎症モデルを作成し、子宮内炎症環境下に胎児皮膚組織が炎症メディエータとして働くことを明らかにした。また、Polymyxin Bという抗生物質を用いて、胎児皮膚組織において炎症性サイトカインのメッセンジャーRNA発現が抑制されることを示した。この結果は、進行しつつある子宮内炎症を沈静化する治療方法の開発の一助になると思われる。当初の計画では、平成25年度にはin vivo実験に移行する予定であったが、現在はそこまで実験を遂行できていない。平成24年度に十分な組織検体数を確保できなかったため、平成25年度にも前年度同様、検体採取ならびに収集を行った。平成24年度には子宮内炎症モデル3例からしか胎仔の皮膚組織を採取できなかったが、平成25年度はG-CSFとLPS(リポポリサッカライド)を羊水腔に投与し人工的に子宮内炎症を作成した「子宮内炎症モデル」2例から、また、G-CSF/LPSを用いなかった「非子宮内炎症モデル」3例から採取保存ができた。学術論文化ならびに学会での発表に耐えうるためにはさらに症例群を増加させる必要があり、現状では計画に比して進行が遅延していると言わざるを得ない。当初の計画より遅れて十分な検体数を確保できなかった理由として、計画通りに健康な妊娠ヒツジの供給を得られなかった(妊娠していないものや週数違いがあった)ことが一因と考えられる。しかしながら、前年度よりは組織検体の収集が進行しており、今後、引き続きの組織検体収集と平行して、皮膚組織腫瘍細胞であるケラチノサイトの細胞培養や、その後に引き続くin vitroでのポリミキシンB負荷実験を行うことができるものと思われる。当初の計画に比較し遂行現状は遅延しているものの、依然、胎児皮膚組織と子宮内炎症の関係性を示唆する重要な発表や論文は公表されておらず、組織標本採取数が十分になり細胞培養実験も遂行できれば、子宮内炎症が胎児ならびに胎児の皮膚組織に与える影響を学術的に解析が可能であると考える。当初の計画では、妊娠110日前後(満期:145日)に胎仔の皮膚細胞採取を行い、皮膚細胞の培養を行う予定であったが、そのプロセスまで到達できなかった。これはヒツジを交配し妊娠を計画的に行う夏期に外気温が非常に上昇したことにより、ヒツジが妊娠に至らず、当初の予定よりも妊娠ヒツジの供給数が少なかったことが原因の一つと考えられる。また、妊娠ヒツジとして供給されたヒツジにおいても、子宮内胎児死亡や子宮内胎児発育遅延によって予定の実験が行えなかったことも要因の一つと思われた。しかしながら、供給された妊娠ヒツジを用いて、子宮内炎症モデルを3例作成し、それらの胎仔より皮膚組織(主に胎仔の耳介)を採取、保存することができた。この子宮内炎症モデルは平成25年度の計画に記載されている方法を用いて作成した子宮内炎症モデルである。つまり、胎仔にカテーテルを留置する手術を行い、その後、そのカテーテルを介して胎仔に顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)製剤を投与し、その後、初回手術時に羊水腔に留置したカテーテルよりリポポリサッカライド(LPS)を投与し作成したものである。当初の計画では妊娠102日での初回手術、また妊娠110日でのサンプル採取を予定していたが、今回サンプリングできた3例においては、推定妊娠90日台、妊娠80日台、妊娠70日台と当初の計画通りの妊娠日数ではなかった。これは、先述した夏期の気温上昇がその一因と思われた。しかしながら、妊娠ヒツジを用いて子宮内炎症モデルを作成し、その胎仔より皮膚組織を採取できたことは、子宮内炎症と皮膚成熟過程の解析へのワンステップであり、今後、その皮膚組織を分子生物学的に解析することによって、炎症に対する皮膚組織の反応、皮膚組織からの各種サイトカイン発現、ならびにそのサイトカインが与える影響の解析へと関連づけられると思われる。まず平成26年度の研究報告であるが、当初の計画では、本年度は平成25年度に施行予定であった基礎手術実験をもとにG-CSFとLPSにて誘導された子宮内炎症モデルにPolymyxin Bを投与し胎仔臀部皮膚組織での炎症性サイトカイン(TLR-2、TLR-4、TLR-6、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-10)のRNA発現量をリアルタイムPCR法にて測定するin vivo実験を計画していたが、当初の予定通りには遂行できなかった。妊娠ヒツジを入手し、G-CSFとLPSにて子宮内炎症モデルを作成することはできたが、予定実験期間を満たす前に胎仔が死亡してしまったり、母獣の健康状態によって実験を遂行できなかったことが、その理由の一つとして挙げられる。

また、炎症性サイトカインのPCR法を遂行するための実験器具ならびに実験試薬の収集に手間取ったことも実験遅延の一因になっていると思われる。次に3年間の研究期間全体としての総括は、当初の研究遂行予定を達成できなかったと言わざるを得ない。これは、初年度から研究予定に比して実験の主義的なミス、実験試薬収集の遅延などがあり反省すべき点である。さらに、最終的な目標であった本研究成果を国内外の学会等で発表し広く周知することはできなかった。しかしながら、この研究期間内に今回の研究の予備実験の意味合いを持つ研究内容(かつて自らが留学先で遂行した今回の研究の予備実験)を査読がある学術論文として発表できたことは、ある一定の実績として意味のあるものと判断する。周産期医学胎児生理学本年度は健康な妊娠ヒツジを予定通りに入手することが出来なかったことが理由と考えられる。また、実験途中で子宮内胎児死亡となってしまい実験計画を中止せざるを得ない症例があったことも実験が遅れている原因の一つと言える。さらに、研究に必要な資材の準備も遅れており、総合的に「遅れている」と自己評価した。本研究の現在までの達成度は、やや遅れている。その理由として、本年度は妊娠ヒツジを予定通りに入手することが出来なかったことが最大の理由と考えられる。通常、飼育ヒツジは夏期に交配を行い、冬期に向けて妊娠継続を行うが、昨年の夏期は非常に暑く、妊娠ヒツジを供給する飼育農家より、交配がうまく行われず例年よりも妊娠したヒツジの数が少なかったとの報告を受けている。また、夏期に妊娠したにもかかわらず経過中に何らかの理由で子宮内胎児死亡や、子宮内胎児発育遅延、あるいは自然流産を発症し、その後計画的ではなく自然妊娠しているヒツジもいる可能性が否定できず、本研究に用いる際に明らかに予定よりも小さい胎仔を実験に用いざるを得ない場面があった。そういった理由から、本年度は計画通りにサンプルを採取できず、相対的に「やや遅れている」という評価になった。平成24年度、ならびに平成25年度の研究進捗状況を鑑み、平成26年度は計画通りに実験を遂行するために、より確実に予定した妊娠日数の妊娠ヒツジを入手する必要があると思われる。そのために、前年度同様に契約牧場における確実な妊娠の確認、同妊娠日数のスペア用妊娠ヒツジの供給を依頼する予定である。また、実験をシリーズとして行う前に契約牧場に赴き、超音波検査を用いて自らの手で妊娠の確認、かつ胎仔の大きさより妊娠日数のチェックを行い、選定した後、実験に用いることを今年度も計画している。さらに、今後はin vitro実験に必要な資材の確保や共同実験室のキャパシティ等判断といった準備も行う予定である。平成24年度の研究進捗状況を鑑み、平成25年度以降は、なるべく計画通りに実験を遂行するために、より確実に予定した妊娠日数の妊娠ヒツジを入手する必要があると思われる。そのために、契約牧場における確実な妊娠の確認、同妊娠日数のスペア用妊娠ヒツジの供給を依頼する予定である。また、実験をシリーズとして行う前に契約牧場に赴き、超音波検査を用いて自らの手で妊娠の確認、かつ胎仔の大きさより妊娠日数のチェックを行い、選定した後、実験に用いることも計画している。
チタン合金のシミュレーション試験によるインプラント材としての特性

本計画初年度に当たる平成7年度は、合金の開発における基礎的な研究を主に行った。まず、第一段階として、チタン-ジルコニウム二元系合金の力学的性質を検討し、三元合金化の際の基本組成を、チタンとジルコニウムの比を1:1とすることに決定した。さらに、この組成にβ相安定化元素のひとつとして知られているニオブを添加したTi-Zr-Nb三元系合金を各種作成し、それらの力学的性質を評価した。実際には溶製とした合金インゴットに均質化熱処理を施したものを用意し、主として硬さ試験と引張試験に供した。さらに、一部の試料については光学顕微鏡による組織観察を行った。これらの結果から、組成と組織の関係ならびに硬さに及ぼす影響について検討し、この新しい合金の力学的性質は従来のチタン優れていることを明らかにした。とくに、強度の向上は主として、ジルコニウムによる固溶体強化と第三元素として添加したニオブによる第二相析出強化によるものと考えられた。この第一段階での結論として、この新しく開発された合金は、従来から使用されているチタン合金より力学的性質に優れ、インプラント材としての条件のひとつを満たすことが明らかとなり、次年度の第二段階で、組織調整のための熱処理の効果も含め、さらに詳細な検討を加えていくこととした。ここまでの成果はJournal of Biomedical Materials Researchや歯科砕材料・器械などの雑誌にすでに投稿、掲載されている。また、成果の一部は第3回歯科チタン国際シンポジウム(1995年8月、シドニー)や日本国内の学会(日本バイオマテリアル学会、日本歯科理工学会など)の講演大会で、日英両グループ連名の共同研究として報告した。平成8年度には、昨年度までに力学的性質を評価したニオブ濃度の異なる各合金に関して、熱処理条件を変化させた試料を用意し、熱処理と組織、さらに力学的性質との関連を詳細に調査した。各合金とも合金溶製後、均質化熱処理を行い、急冷したものを500°C1000°Cの温度範囲で最大24hまでの範囲で行った。すべての試料について、X線回折による構成相の同定や光学顕微鏡による組織観察を行い、一部の試料について透過型電子顕微鏡観察を行った。その結果、β相安定化元素であるニオブを適量添加した合金は、α+β二相組織となる温度で熱処理を行った場合、微細な二相組織が得られ、優れた力学的性質が得られることを見いだした。さらに同時に行った、0.1%乳酸溶液中での浸漬試験ならびにアノード分極試験により、同合金が従来からインプラント材として使用されている各種生体用合金に比べ、優れた耐環境性を有していることが明らかにされた。また、生体における負荷環境をシミュレートした試験法を開発するために、引張応力とねじり応力を同時に負荷する二軸試験、ならびに特殊な生体環境を再現する腐食疲労試験の方法をデザインし、総合的生体材料評価法を開発した。この総合的生体材料評価法は、基礎研究段階から実用段階に移りつつある材料のより具体的な評価法として有効であることから、今後さらにデータを蓄積することによって、新しい評価法として広く利用されていく可能性があることが示唆された。平成8年度の成果の一部は、第5回世界バイオマテリアル会議(1996年5月、トロント)や日本国内の各学協会の講演大会などの場で、両研究グループによる国際共同研究の成果として報告されており、来年度に開催予定の国際会議で最終的な報告を行う計画もある。さらに、すでに投稿中のも含めて、最終的な成果を論文などの形で広く報告する予定である。最後に、この国際共同研究によって得られた成果は上述のような研究実績だけでなく、日英両グループを中心として広く交流の道が開けたことも極めて意義深いものではあったことに言及しておく。この国際共同研究の組織を発展する形で、両グループの所属する研究所間で国際交流協定が締結されたことや、日英の代表的研究者が一堂に会する日英バイオマテリアルn+nミーティングが両グループの主導のもと、1996年11月に東京で開催されたことなどもその一例である。現在検討されている若手研究者の相互訪問なども含め、今後、より幅の広い交流と世界的な規模での貢献が期待される。

ここまでの成果はJournal of Biomedical Materials Researchや歯科砕材料・器械などの雑誌にすでに投稿、掲載されている。また、成果の一部は第3回歯科チタン国際シンポジウム(1995年8月、シドニー)や日本国内の学会(日本バイオマテリアル学会、日本歯科理工学会など)の講演大会で、日英両グループ連名の共同研究として報告した。平成8年度には、昨年度までに力学的性質を評価したニオブ濃度の異なる各合金に関して、熱処理条件を変化させた試料を用意し、熱処理と組織、さらに力学的性質との関連を詳細に調査した。各合金とも合金溶製後、均質化熱処理を行い、急冷したものを500°C1000°Cの温度範囲で最大24hまでの範囲で行った。すべての試料について、X線回折による構成相の同定や光学顕微鏡による組織観察を行い、一部の試料について透過型電子顕微鏡観察を行った。その結果、β相安定化元素であるニオブを適量添加した合金は、α+β二相組織となる温度で熱処理を行った場合、微細な二相組織が得られ、優れた力学的性質が得られることを見いだした。さらに同時に行った、0.1%乳酸溶液中での浸漬試験ならびにアノード分極試験により、同合金が従来からインプラント材として使用されている各種生体用合金に比べ、優れた耐環境性を有していることが明らかにされた。また、生体における負荷環境をシミュレートした試験法を開発するために、引張応力とねじり応力を同時に負荷する二軸試験、ならびに特殊な生体環境を再現する腐食疲労試験の方法をデザインし、総合的生体材料評価法を開発した。この総合的生体材料評価法は、基礎研究段階から実用段階に移りつつある材料のより具体的な評価法として有効であることから、今後さらにデータを蓄積することによって、新しい評価法として広く利用されていく可能性があることが示唆された。平成8年度の成果の一部は、第5回世界バイオマテリアル会議(1996年5月、トロント)や日本国内の各学協会の講演大会などの場で、両研究グループによる国際共同研究の成果として報告されており、来年度に開催予定の国際会議で最終的な報告を行う計画もある。さらに、すでに投稿中のも含めて、最終的な成果を論文などの形で広く報告する予定である。最後に、この国際共同研究によって得られた成果は上述のような研究実績だけでなく、日英両グループを中心として広く交流の道が開けたことも極めて意義深いものではあったことに言及しておく。この国際共同研究の組織を発展する形で、両グループの所属する研究所間で国際交流協定が締結されたことや、日英の代表的研究者が一堂に会する日英バイオマテリアルn+nミーティングが両グループの主導のもと、1996年11月に東京で開催されたことなどもその一例である。現在検討されている若手研究者の相互訪問なども含め、今後、より幅の広い交流と世界的な規模での貢献が期待される。平成7年度は、合金の開発における基礎的な研究を主に行った。まず、第一段階として、チタンとジルコニウムからなる二元合金、ならびにニオブを添加したTi-Zr-Nb三元合金の力学的性質について検討した。三元合金は、チタンとジルコニウムを原子比で等量含む合金にニオブを添加したものを使用した。これらの合金に均質化熱処理を施し、冷間圧延したものを試験片とした。
鍾乳石から過去数千年間の津波履歴を読む

鍾乳石を用いた津波履歴の復元可能性を検討し、東北地方太平洋沿岸部における過去数千年間の津波履歴復元を試みた.東日本大震災で被災した気仙沼市神明崎や港町の洞穴(石灰洞)を精査し、津波が洞穴や鍾乳石に与えた影響や痕跡を明らかにした.採取した鍾乳石の表面には,泥などの砕屑物と共に海棲生物骨格も付着しており,津波の痕跡として残る可能性が考えられた.鍾乳石には内部の複数の成長中断跡が認められるものがあり,過去の津波の影響で形成された可能性を示す.2011年3月の東日本太平洋沖地震津波以来、歴史津波に関する関心が高まっている。869年に起きた貞観地震津波などの歴史津波の研究は東日本太平洋沖地震津波以前から行われていたが、これら歴史津波の存在は陸上に残されている津波堆積物の調査や古文書の記述によって明らかにされてきた。このような従来の手法では、津波堆積物が後世の人的な土地改変などで失われてしまえば津波履歴を認定することができなくなる。しかし、沿岸部で過去数百数千年間ほぼ連続的に成長し、幾度となく津波の影響を受けた鍾乳石には成長様式や化学成分の変化として津波履歴が消去されずに残されていることが期待されるとともに、それらの年代も特定可能である。本研究の目的は、宮城県気仙沼地域を中心とした東北地方太平洋沿岸部の鍾乳石を用いて過去数千年間の津波履歴を明らかにすることである。1年目(平成24年度)には、気仙沼市神明崎の洞穴群および周辺域の洞穴について、各洞穴の洞口標高のオートレベルによる測量や洞内への3.11津波の流入の有無および影響についての調査を実施し、いくつかの洞穴からは鍾乳石も採取した。2年目(平成25年度)には、各洞穴内の測量調査(採取した鍾乳石の標高を含む)を行い、さらに1年目に実施できなかった管弦窟内の測量調査と鍾乳石の採取を行った。また、管弦窟では多量の化石(イノシシやシカの骨など)を含む堆積物を発見した。この堆積物の形成年代は、鍾乳石の形成年代とも密接に関係することから、骨の年代測定を試みたがうまくいかなかった。各洞穴で採取した鍾乳石に残されていることが期待される津波痕跡については現在分析を進めている。神明崎洞穴群における3.11津波の流入とその痕跡についての研究成果を、学会発表および学術雑誌論文として公表した。2011年3月の東日本太平洋沖地震津波依頼,歴史津波に関する関心が高まっている.869年に起きた貞観地震津波などの歴史津波の研究は東日本太平洋沖地震津波以前から行われていたが,これら歴史津波の存在は陸上に残されている津波堆積物の調査や古文書の記述によって明らかにされてきた.このような従来の手法では,津波堆積物が後世の人的な土地改変などで失われてしまえば津波履歴を認定することができなくなる.しかし,沿岸部で過去数百数千年間ほぼ連続的に成長し,幾度となく津波の影響を受けた鍾乳石には成長様式や化学成分の変化として津波履歴が消去されずに残されていることが期待されるとともに,それらの年代も特定可能である.本研究の目的は,宮城県気仙沼地域を中心とした東北地方太平洋沿岸部の鍾乳石を用いて過去数千年間の津波履歴を明らかにすることである.初年度にあたる平成24年度は,気仙沼市神明崎の洞穴群および周辺域の洞穴について,各洞穴の洞口標高のオートレベルによる測量および洞内への3.11津波の流入の有無および影響についての調査を行った.その結果,神明崎の洞穴のうち洞口標高が0-5.4mの5つの洞穴には津波が流入し,8.6mと9.8mの洞穴では津波の影響がないことを確認した.周辺域の2つの洞穴にも3.11津波の流入を確認した.神明崎の洞穴に関しては,各洞穴(洞内の大部分が水没している管弦窟を除く)で鍾乳石を採取した.現在,それらの鍾乳石に津波の痕跡が残されていないかを分析している.また,管弦窟に関しては,ボートを用いた調査を行い,洞奥部の状況を確認するとともに,鍾乳石を採取する計画を立てた.2011年3月の東日本太平洋沖地震津波以来、歴史津波に関する関心が高まっている。

2年目(平成25年度)には、各洞穴内の測量調査(採取した鍾乳石の標高を含む)を行い、さらに1年目に実施できなかった管弦窟内の測量調査と鍾乳石の採取を行った。また,神明崎洞穴群における3.11津波の流入とその痕跡についての研究成果を、学会発表および学術雑誌論文として公表した。3年目(平成26年度)は,各洞穴で採取した鍾乳石に残されていることが期待される津波痕跡については分析を進め,その成果を2つの学会で発表した.しかし,採取した鍾乳石中に認められるイベント層準のウラン・トリウム法による年代測定を実施することができず,補助事業期間を延長して,平成27年度に行うこととした.2011年3月の東日本太平洋沖地震津波以来、歴史津波に関する関心が高まっている。869年に起きた貞観地震津波などの歴史津波の研究は東日本太平洋沖地震津波以前から行われていたが、これら歴史津波の存在は陸上に残されている津波堆積物の調査や古文書の記述によって明らかにされてきた。このような従来の手法では、津波堆積物が後世の人的な土地改変などで失われてしまえば津波履歴を認定することができなくなる。しかし、沿岸部で過去数百数千年間ほぼ連続的に成長し、幾度となく津波の影響を受けた鍾乳石には成長様式や化学成分の変化として津波履歴が消去されずに残されていることが期待されるとともに、それらの年代も特定可能である。本研究の目的は、宮城県気仙沼地域を中心とした東北地方太平洋沿岸部の鍾乳石を用いて過去数千年間の津波履歴を明らかにすることである。気仙沼市神明崎の洞穴群および周辺域の洞穴について、各洞穴の洞口標高のオートレベルによる測量や洞内への3.11津波の流入の有無および影響についての調査を実施し、さらに鍾乳石の採取とそれらの標高を調査した。採取した鍾乳石の内、特に管弦窟から採取したものは、表面に海棲の有孔虫殻を含む泥が付着しており、津波による水没を示唆する結果を得た。また、管弦窟では多量の化石(イノシシやシカの骨など)を含む堆積物を発見した。この堆積物上には採取した鍾乳石をはじめとして複数の鍾乳石が形成されている、堆積物の形成年代と鍾乳石の形成年代とは密接に関係することから、骨の年代測定なども試みた。管弦窟など洞口標高の低い洞内から採取した鍾乳石には、2-3回の明瞭な成長中断や砕屑物を含む層が認められ、津波痕跡である可能性が示唆されたが、形成年代の特定を行うことはできなかった。神明崎洞穴群における3.11津波の流入とその痕跡についての研究成果は、学会発表および学術雑誌論文として公表した。鍾乳石を用いた津波履歴の復元可能性を検討し、東北地方太平洋沿岸部における過去数千年間の津波履歴復元を試みた.東日本大震災で被災した気仙沼市神明崎や港町の洞穴(石灰洞)を精査し、津波が洞穴や鍾乳石に与えた影響や痕跡を明らかにした.採取した鍾乳石の表面には,泥などの砕屑物と共に海棲生物骨格も付着しており,津波の痕跡として残る可能性が考えられた.鍾乳石には内部の複数の成長中断跡が認められるものがあり,過去の津波の影響で形成された可能性を示す.研究対象候補であった9洞穴の事前調査結果に基づき、神明崎の7洞穴を研究対象としそれら洞穴の洞口標高の測量や洞穴内部の測量・記載、津波流入の痕跡調査と調査を行うとともに、鍾乳石を採取した。その結果、当初の予想通り、洞口標高が0-5.4mの5つの洞穴内にはがれきの流入や泥の堆積など津波流入の痕跡が認められ、一方洞口標高が8.6mと9.8mの2洞穴には津波流入の影響がないことを確認できた。地権者の許可を得て、これらの洞穴の一部では鍾乳石を採取してそれら鍾乳石を観察したが、管弦窟で採取した一部の鍾乳石を除く他の鍾乳石の表面には泥などが付着しているというような一目瞭然の津波流入の痕跡は認められなかった。
神経幹細胞と腫瘍溶解ウイルスを用いた悪性脳腫瘍に対するウイルス免疫療法の研究

まず、治療効果同定のためヒトグリオーマモデルマウスを樹立した。既知のU87細胞株の他に、治療抵抗性のグリオーマ幹細胞株をヒト神経膠芽腫検体より樹立し、びまん性浸潤能を組織学的に確認した(hG008株)。同時に抗腫瘍免疫増強作用を有するoncolytic virus (OV)と抗PD1抗体との併用を検討したため、マウスグリオーマ細胞株GL261によるモデルも樹立し、抗PD-1抗体による抗腫瘍効果も確認した。一方で、OVとして、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターの作成に着手した。まず、ドキシサイクリン(Dox)存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。これは、元となるthe Flip-Flop HSV-BACシステムのシャトルプラスミドpFLSe-ICP4からLacZ配列を除去し、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)とtetO反復配列を持つテトラサイクリン応答因子(TRE)配列とを挿入し、更にマーカーとしてmVenus配列をPGKプロモーター下流に組み込んだもので、mVenusとrtTAはIRES配列を挟んでPGKプロモーターで発現し、TREの下流でICP4が発現する様デザインし、このpFLSICP4VIrtTAが、Dox存在下で機能することを確認した。続いて、pFLSICP4VIrtTAとFlip-Flop HSV-BACシステムを用いたウイルス作成のため、Cre-recombinationによりこのexpression cassetteを有するHSV-BAC-shuttle cloneの作製を試み、HSV-BAC(pM24-BAC)側のintegrityはアガロース電気泳動レベルでは問題ないことを確認したが、作製は困難であり、HSV-BAC側に要因が推察された。また、In vitroで各種腫瘍溶解HSVベクター(hrR3, MG18L, d120)のヒトiPS由来NSCに対する細胞障害効果を検証した結果、特に細胞障害性が低いとされるd120でもNSCに対し、感染4日後のIC50は3.66[MOI]であり、障害性は低くはなかった。Tet-on/Tet-off System下のOV搭載に当たり、HSVを用いる場合、Dox非投与下でleakする遺伝子発現に対する対策も必要と推察された。膠芽腫など悪性脳腫瘍は、脳実質内に広範に浸潤するため全摘出が不可能で、腫瘍自身は化学療法・放射線治療に抵抗性のため、既存の治療法が奏功しない。本研究では広く脳内浸潤した脳腫瘍細胞をも標的とするべく神経幹細胞(NSC)をキャリアとし、薬剤(ドキシサイクリン(Dox))存在下でのみ複製開始する変異型HSVベクターを治療分子とした系の治療効果を検討する。引き続き、平成29年度は以下の研究を行った。In vitroでは、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターを作成するべく、Dox存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成し、pFLSICP4VIrtTAが、Dox存在下でICP4発現することをウエスタンブロット法で既に確認した。また、ICP4を欠失した複製不能型HSV(d120)が、pFLSICP4VIrtTAをトランスフェクションしたVero細胞でDox存在下にプラーク形成することも確認した。このpFLSICP4VIrtTAとFlip-Flop HSV-BACシステムを用いて、Dox誘導性に複製開始する腫瘍溶解HSVベクターの作成を進めている。更に、種々のHSVベクター(d120等)のヒトiPS由来神経幹細胞(hNSC)への細胞障害効果を確認した。In vivoでは、ヒト脳腫瘍幹細胞の免疫不全マウスへの脳内移植により、境界不鮮明で浸潤性の高い脳腫瘍を形成すること、腫瘍増大に伴い、脳梁を介して対側半球へ浸潤することを確認した。各種免疫染色での観察でも、右半球では腫瘍細胞の密度が高いが、両半球ともに明らかな腫瘍と正常脳との境界は認めず、非常に浸潤性の高い脳腫瘍モデルであることが確認された。病理学的にもヒト膠芽腫と酷似した像を示すモデルであり、in vivo治療実験に有用であることが示された。研究実施計画に基づき、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターの作成に着手している。Dox存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成しているが、これは、元となるシャトルプラスミドpFLSe-ICP4からLacZ配列を除去し、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)とtetO反復配列を持つテトラサイクリン応答因子(TRE)配列とを挿入し、更にマーカーとしてmVenus配列をPGKプロモーター下流に組み込んだもので、mVenusとrtTAはIRES配列を挟んでPGKプロモーターで発現し、TREの下流でICP4が発現する様デザインしている。このpFLSICP4VIrtTAが、Dox存在下でICP4を実際に発現すること、ICP4を欠失したHSVベクター(d120)が、pFLSICP4VIrtTAをトランスフェクションしたVero細胞でDox存在下にプラークを形成すること等にて、既に機能的にも問題ないことを確認した。pFLSICP4VIrtTAとFlip-Flop HSV-BACシステムを用いたウイルス作成を進めているが、これまでCre-recombinationのステップで予期したHSVベクターが得られず、塩基配列のチェックなどトラブルシューティングを継続している。

In vitroでは、各種HSVベクター(hrR3, MG18L, d120)のヒトiPS由来神経幹細胞(hNSC)に対する細胞障害効果を検証した。hNSCを各HSVベクター(hrR3, MG18L, d120)に感染させ4日後にWST-8を用いてcell viabilityを測定した。予想通り、d120は細胞障害効果の少ないHSVベクターであり、IC50=3.66 [MOI]だった。悪性脳腫瘍は、脳内に広く浸潤して発育する特徴があり、化学療法・放射線治療への抵抗性も加わり、既存の治療法が奏功しない。本研究ではこの広く脳内浸潤した腫瘍細胞をも標的とするべく神経幹細胞(NSC)をキャリアとし、薬剤存在下のみ複製する変異型HSVベクターを治療分子とした系の治療効果を検討する。平成28年度は以下の研究を行った。In vitroでは、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターを作成するべく、まずドキシサイクリン(Dox)存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。pFLSICP4VIrtTAは、in vitro実験系において、Dox存在下でICP4を実際に発現することをウエスタンブロット法で確認した。また、ICP4を欠失した複製不能型HSV(d120)が、pFLSICP4VIrtTAをトランスフェクションしたVero細胞でDox存在下にプラークを形成することを確認した。Flip-Flop HSV-BACシステムを用いて、Dox誘導性に複製開始する腫瘍溶解HSVベクターの作成に進む際の重要なステップが完了した。In vivoでは、ヒト脳腫瘍幹細胞(MGG8)の免疫不全マウスへの脳内移植により、境界が不鮮明で非常に浸潤性の高い脳腫瘍を形成することを確認した。MGG8は腫瘍の増大に伴い、脳梁を介して対側半球へ浸潤し、経過に伴い両側大脳は肉眼的にも著名に腫脹する。Ki67染色や、抗Human nuclear antigen抗体を用いた免疫染色での観察でも、右半球では腫瘍細胞の密度が高いが、両半球ともに明らかな腫瘍と正常脳との境界は認めず、非常に浸潤性の高い脳腫瘍モデルであることが確認された。病理学的にもヒト膠芽腫と酷似した像を示すモデルであり、今後のin vivo治療実験に有用であることが示された。研究実施計画に基づき、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターの作成に着手した。まず、ドキシサイクリン(Dox)存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。これは、元となるthe Flip-Flop HSV-BACシステムのシャトルプラスミドpFLSe-ICP4からLacZ配列を除去し、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)とtetO反復配列を持つテトラサイクリン応答因子(TRE)配列とを挿入し、更にマーカーとしてmVenus配列をPGKプロモーター下流に組み込んだもので、mVenusとrtTAはIRES配列を挟んでPGKプロモーターで発現し、TREの下流でICP4が発現する様デザインしている。