hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
被食防御物質タンニンに対する耐性から見た森林性齧歯類の 生態学的特性の解明

タンニンは様々な植物に含まれる苦みを伴う物質であり,動物による採食からの防御効果を持つ.本研究では,森林に生息する齧歯類の「タンニンに対する耐性」をタンニン結合性唾液タンパク質とタンナーゼ産生細菌を測定することによって解明した.その結果,タンニン耐性の齧歯類種間あるいは種内での違いが,彼らの採餌行動に影響すること,さらに個体数変動に影響することを明らかにした.タンニンは様々な植物に含まれる苦みを伴う物質であり,動物による採食からの防御効果を持つ.本研究では,森林に生息する齧歯類の「タンニンに対する耐性」をタンニン結合性唾液タンパク質とタンナーゼ産生細菌を測定することによって解明した.その結果,タンニン耐性の齧歯類種間あるいは種内での違いが,彼らの採餌行動に影響すること,さらに個体数変動に影響することを明らかにした.1.コナラ属樹木の種子(堅果)は被食防御物質タンニンを多量に含む。そのため,森林性齧歯類のタンニン耐性の違いは,採餌行動や個体群動態,種子散布行動,ひいては樹木の更新過程にも影響を及ぼすと予測される。本課題では,タンニン結合性唾液タンパク質(PRPs)とタンナーゼ産生細菌(TPB)をタンニン耐性の指標として,日本産齧歯類におけるタンニン耐性の種間及び種内変異を解明する。さらに,その違いが対象種の生態にどのような影響を及ぼすかについて検討する。2.岩手県盛岡市近郊における齧歯類4種のタンニン耐性の解明:森林性齧歯類3種[アカネズミ(アカ),ヒメネズミ(ヒメ),ニホンリス(リス)]及び草地性齧歯類1種[ハタネズミ(ハタ)]を対象として,PRPs活性とTPB保有量を明らかにし,タンニンに対する耐性の評価を行った。その結果,TPBはハタが他の3種よりも著しく低いことが判明したが,森林性齧歯類種間では違いが認められなかった。加水分解性タンニンに対するPRPs活性はアカ=ヒメ>リス>ハタであったが,縮合型タンニンに対してはヒメ>アカ=リス>>ハタであるこ判明した。これらの結果は,対象種の食性から予測される結果とは必ずしも一致しなかった。また,アカ,ヒメに関しては,タンニン耐性に著しい種内変異が認められた。3.ニホンリスの堅果利用効率:2個体群のリス(山梨県河口湖及び東京都八王子市高尾)にコナラ堅果のみを供餌し,タンニンによる負の影響を測定した。高尾産のリスは高い死亡率を示し(河口湖産は100%生存),タンニン耐性に著しい種内変異があることが示唆された。この違いは,両地域におけるリスの食性の違いを反映していると考えられた。種子捕食/散布者としての機能評価のため,森林性齧歯類のタンニン耐性の評価を行い,以下の成果を得た.1岩手県盛岡市周辺において,齧歯類4種[アカネズミ(アカ),ヒメネズミ(ヒメ),ハタネズミ(ハタ),ニホンリス(リス)]を対象として,タンニン耐性(タンニン結合性唾液タンパク質及びタンナーゼ産生細菌量)の評価を行った.その結果,アカ,ヒメ,リスは加水分解性/縮合タンニンのいずれに対しても高いタンニン耐性を示すこと,そしてハタは低い耐性を示すことを見出した.また,タンニン耐性に著しい種内変異が存在しすることを発見した.2富士山(以下F,ミズナラが多く分布)および高尾(以下T,コナラ属樹木は少ない)の個体群を用いて,リスのタンニン耐性の種内変異と生息環境との関連を検証した.野外での種子の持ち去り試験では,F群は堅果を高い割合で利用したが,T群は堅果をほとんど利用しなかった.飼育下でコナラ堅果(タンニン含有率約5%)のみを供餌したところ,T群では著しい負の影響を示したが,F群では負の影響は認められなかった.このことは,生息環境の違いによって,リスのタンニン耐性に分化が生じたことを示している.3北海道大学名寄演習林において,アカ,ヒメ,エゾヤチネズミ(ヤチ)を対象として,糞中プロリン濃度からタンニン摂取量の季節変化を推定し,タンニン耐性との関連を検証した.アカ,ヒメでは秋にタンニン摂取量が増加したが,ヤチでは変化がなかった.タンナーゼ産生細菌保有量およびタンナーゼ活性との関連は認められず,タンニン耐性は唾液タンパク質の働きに負うところが大きいことが示唆された.
3次元強化学習による新たなデザインの理解と生成

本研究では,3次元的なデザインに対する感覚を人工知能(ニューラルネット)に理解させ,新たなデザインを創造させることを目的とする.一般的に,新しいデザインの創造は難しいとされるため,人工知能にデザインを理解・創造させることができれば,人々の創作活動支援に有用である.また,囲碁や将棋,ゲームなどでトッププロのプレーヤーを超える性能を見せ,人間が思いもよらないような手を用いることもある強化学習を利用してデザインを創造させることで,創作活動支援のみにとどまらず,デザイナーも想像もしないような全く新しい芸術性を生み出す可能性も秘めている.また,そのために3次元強化学習という新たな学術的テーマに取り組む.本研究では,3次元的なデザインに対する感覚を人工知能(ニューラルネット)に理解させ,新たなデザインを創造させることを目的とする.一般的に,新しいデザインの創造は難しいとされるため,人工知能にデザインを理解・創造させることができれば,人々の創作活動支援に有用である.また,囲碁や将棋,ゲームなどでトッププロのプレーヤーを超える性能を見せ,人間が思いもよらないような手を用いることもある強化学習を利用してデザインを創造させることで,創作活動支援のみにとどまらず,デザイナーも想像もしないような全く新しい芸術性を生み出す可能性も秘めている.また,そのために3次元強化学習という新たな学術的テーマに取り組む.
赤外線新技術による太陽系外惑星研究の展開

高コントラスト赤外線装置を用いて、すばる望遠鏡における戦略枠プロジェクトSEEDSを完了し、直接撮像により4つの惑星と3つの褐色矮星の発見・確認に成功した。また、約30天体の星周円盤の微細構造を描き、太陽系スケールの空隙構造や渦巻腕構造を初めて系統的に解明した。さらに、系外惑星用高精度赤外線ドップラー観測装置の開発を進めた。赤外線新技術により広帯域光周波数コム、新規回折格子、セラミック光学系、低振動真空冷却槽等を開発した。本研究では、高コントラスト赤外線装置を用いて、我々の太陽系の惑星に似た系外惑星を直接撮像すると共に、原始惑星系円盤の詳細構造を描き円盤から惑星が形成される過程を解明し、巨大惑星の多様性の起源とその形成を解明する。さらに、世界最高精度の赤外線ドップラー観測装置を開発し、ハビタブルな地球型系外惑星を多数検出する。そのために、波長校正、分散素子、赤外波面補償光学という赤外線の新技術開発を推進する。これらの間接観測の結果を惑星形成理論と比較し、地球型惑星の起源とその形成を解明する。今年度は、HAT-P-7などのいくつかの恒星のまわりの伴星候補天体(今後の確認が必要)の検出に成功し、さらに、原始惑星系円盤の微細構造の初検出に基づき惑星存在の証拠を示した。この結果は、直接撮像で発見された遠方巨大惑星の形成と関連し、標準的な惑星形成理論に見直しを迫るものである。そのうち、LkCa15とAB Aurについては査読誌に出版し、記者会見を行い、多くのメディアに紹介された。本装置の組み合わせる超補償光学系の望遠鏡試験を行った。また、新規に開発する超高精度分光器IRDの光学設計、速度達成精度の検討、鍵となる分散素子の検討4096x4096素子赤外線検出器の導入検討、実験室における要素光学系評価の準備、天体光・コム光導入のためのファイバー選択、同装置の技術検討チームと同装置を用いたサイエンスワーキンググループを結成し、これらの進捗状況を学会等で報告した。さらに、光周波数コム発生実験を進めその初期結果を公表した。系外惑星大研究会を主催し、100名以上の研究者が参加した。今年度は、SR12 ABのまわりの惑星撮像とSIRIUSのまわりの惑星の制限の結果を出版し、その他いくつかの恒星のまわりの伴星候補天体(今後の確認が必要)の検出に成功した。さらに、残骸円盤HR4796Aのリングの初めての2次元的ズレ検出に基づき、惑星存在の証拠を示した。この結果を査読誌に出版し、プレスリリースを行い、ナショナルジオグラフィックなどのメディアで取り上げられた。数多くの原始惑星系円盤の微細構造を検出し、日米の天文学会で公表した。また、直接撮像プロジェクトSEEDSの中間レビューのための資料作成を進めた。関連する、褐色矮星・超低質量星の観測的研究を行なった。開発的研究としては、新規に開発する超高精度分光器IRDの光学系詳細設計、分光器の鍵となる分散素子の試作、室内実験用プロトタイプ分光器の製作、天体光・コム光導入のためのファイバー実験などの開発を進め、学会等で報告した。サイエンスワーキンググループによるM型星のまわりの惑星の検討を進め、レポートにまとめ、学会等で報告した。光周波数コム発生実験を進め、Hバンドで使用可能なプロトタイプコムを試作した。また、超補償光学系の望遠鏡試験を継続して行った。さらに、世界最高精度の赤外線ドップラー観測装置を開発し、ハビタブルな地球型系外惑星を検出する。そのために、波長校正、分散素子、赤外波面補償光学という赤外線新技術開発を推進する。これらの観測の結果を惑星形成理論と比較し、系外惑星の起源・形成を解明する。今年度は、すばる戦略枠SEEDSプロジェクトと一環として、比較的年老いた太陽型恒星GJ504を周回する惑星の発見を直接撮像により発見し、出版した。これは、進化モデルの不定性に依存し難く、直接観測された惑星の中で最も軽いものののひとつで、確実な惑星であると考えられる。この結果を記者会見し、国内外の400以上のオンラインメディアで紹介された。

昨年度に発見したアンドロメダ座カッパ星を周回する惑星の多色直接撮像を行い、低温天体であることを確認した。プレアデス星団における系外惑星直接探査について出版した。さらに、若い恒星であるRY Tau、SR21のまわりの原始惑星系円盤において従来に未検出の微細構造(立体構造および波長で異なる空隙の見え方の有無)を直接撮像により発見し、出版した。関連する、星形成領域の円偏光と生命のホモキラリティー、低温褐色矮星の観測的研究を継続して推進した。系外惑星に関する国際研究会をハワイ観測所と共に開催し、200人近くの参加者があった。年度中に17編の査読欧文論文を出版し、計4件のプレスリリースを行なった結果、各種メディアで広く取り上げられた。開発的研究としては、本研究で新規に開発中の超高精度分光器IRDの光学系を修正し、従来のJ, Hバンド(1.2-1.7 micron)の同時観測波長域を、Y, J, Hバンド(0.9-1.7 micron)同時観測にまで拡張することに成功し、これに伴って、使用する非線形ファイバーを見直し、波長校正用の光周波数コムの広帯域化アップグレードも進めた。その他、新規に開発した回折格子の評価、天体光・コム光導入のためのファイバーの選択と評価実験、低振動真空冷却槽の製作などの開発を推進し、国内外の学会および国際研究会で報告した。また、サイエンス班によるM型星のまわりの惑星の検討を継続し、すばる望遠鏡への提案としてまとめている。さらに、約1000素子相当の超補償光学系の試験観測を進め、性能向上を確認した。そのための、カメラ部分の改良も行った。本研究では、高コントラスト赤外線装置を用いて、我々の太陽系の惑星に似た系外惑星を直接撮像すると共に、原始惑星系円盤の詳細構造を描き円盤から惑星が形成される過程を解明し、巨大惑星の多様性の起源とその形成を解明する。さらに、世界最高精度の赤外線ドップラー観測装置を開発し、ハビタブルな地球型系外惑星を多数検出する。そのために、波長校正、分散素子、赤外波面補償光学という赤外線新技術開発を推進する。これらの観測の結果を惑星形成理論と比較し、系外惑星の起源・形成を解明する。今年度は、アンドロメダ座カッパ星の巨大惑星を直接撮像により発見し、出版した。2009年に発見したHAT-P-7の伴星候補を直接撮像により確認し、逆行惑星の起源を議論した。その他いくつかの恒星のまわりの伴星候補天体の検出に成功した。PDS70、SAO 206462、MWC480、MWC758、UX Tauなど数多くのG型星およびA型星のまわりの原始惑星系円盤においてギャップやアームなどの微細構造を直接撮像により発見し、日米の天文学会で発表した。関連する、星形成領域の円偏光と生命のホモキラリティー、低温褐色矮星の観測的研究を行なった。年度中に30編以上の査読論文を出版し、計6件のプレスリリースを行なった結果、各種メディアで広く取り上げられた。開発的研究としては、新規に開発する超高精度分光器IRDの光学系最終設計、分光器の性能を左右する回折格子の製作、室内実験用プロトタイプ分光器の製作、天体光・コム光導入のためのファイバー実験、真空冷却槽の製作などの開発を進め、SPIEおよび学会で報告した。専門家による装置設計国際レビューも行った。
先史モンゴロイド集団の拡散地域の自然環境

1.日本列島・東アジア・アメリカ大陸・オセアニアにおける最終氷期以降の古地理・古気候・古生態について今年度までに収集した情報を整理して、古環境の復元を試みた。とくに日本列島を含むアジアについて、最終氷期極相期(約2万年前)における海岸線、氷河・周氷河地形の分布、植物相・動物相などの復元図を作成した。2.東アジアにおける最終氷期の編年と古環境について検討して、先史モンゴロイド集団が極北アジアへ進出・拡散した時期について、復元された古環境と整合的な仮説を提出した。2-1・酸素同位体ステージ3(カルギンスキー亜間氷期)の時期は寒冷気候と温暖気候が1000年周期ではげしくくりかえしていた。シベリア地域におけるマンモス化石の産出年代が3万年前以前と1万5千年前以降のものが多く、2万年前前後のものは少ない。最終氷期極相期(酸素同位体ステージ2)には、寒冷で乾燥した気候が長期にわたって卓越しており、マンモス動物郡もシベリア極北地域から逃避して南下していた可能性があり、その時期に中国東北地方から多数のマンモス化石が産出することもそれを支持する。2-2・このような編年と古環境から、先史モンゴロイド集団は、従来考えられていた時期(2万年前前後)より古いカルギンスキー亜間氷期(ステージ3の温暖気候下)に、極北に進出し、ステージ2の時期には南下あるいは東方に逃避していったのではないか。北アメリカ大陸の無水回廊の存在は、2万1千年前以前および1万2千年前以降に限定される。北アメリカ大陸本上に先住民が2万1千年前以前に到達していた可能性も高いことが示唆された。
プロセッサアレイのフォールトトレランスに関する研究

製造時の欠陥箇所救済技術として、再構成可能なプロセッサアレイモデルの一つである1-1/2トラックスイッチモデルについて、以下のような研究を行った。I.再構成率において最適な再構成アルゴリズムの実現。II.ハードウェアへの実装を意識した、再構成率が高い再構成手法の実現。I.については以下のような結果を得た。(1).従来多く用いられている補償パスに基づく再構成法は、最適な再構成を実現できない。(2).従来考えられている結合パターンは、最適な再構成を実現できない。(3).最適な再構成率を実現できる逐次的ルーティングに基づく再構成手法の提案。逐次的ルーティングに基づく再構成法は、実現可能なルーティングを深さ優先で探索するため、最適な再構成率を実現するために、アレイサイズの指数関数に比例した時間を必要とした。そこでII.に関する研究として、実現可能なルーティングの木を部分的に探索する多項式時間の再構成手法について研究を行い、以下の成果を得た。(1).ルーティング行き詰まりの効果的な判定法の実現。(2).多項式時間の再構成は、アレイサイズが比較的小さな場合にはかなり効果的である。なお、FPGA上への実装による評価については、補償パス法の検証までを行った。今年度は,第一の研究目的である「ハードウェアへの実装を意識した,再構成率が高い再構成アルゴリズムの実現」ということについて研究を行った.その結果,最も単純な再構成可能なプロセッサアレイモデルである,1-1/2トラックスイッチアレイモデルに関して,以下の研究成果を得た.1.従来広く用いられている,補償パスに基づく再構成法では,最適な再構成率を実現することはできないことを示した.2.再構成率において最適な,逐次ルーティングに基づく再構成法を提案した.提案された逐次ルーティングに基づく再構成法は,可能な結合パターンを網羅的に深さ優先で探索するため,その時間計算量アレイサイズの指数関数のオーダを要する.しかしながら,その再構成法は補償パスに基づく再構成法とは異なり,プロセッサ間の結合を決定方法を決定するルーティングについても考慮したものとなっている.今後の研究の展開としては,以下を考えている.1.網羅的手法によらない,多項式時間の逐次ルーティングに基づく再構成法の提案と,その性能評価.2.上記のアルゴリズムを実現するハードウェアの設計とそのハードウェア量の評価.製造時の欠陥箇所救済技術として、再構成可能なプロセッサアレイモデルの一つである1-1/2トラックスイッチモデルについて、以下のような研究を行った。
網膜スライスパッチクランプ法によるChR発現神経節細胞の機能解析

チャネルロドプシンは、視機能再建のツールとして研究されているが、網膜神経伝達機構に関する研究はまだ少ない。本研究は、ラットの網膜の個々の細胞の反応についてスライス標本を用いて電気生理学的に検討することを目的とした。スライス標本作製プロトコールを決定し、細胞直視下で行うスライスパッチクランプ実験系を確立した。ON型双極細胞に特異的に発現するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV-mGluR6-ChR2V)を作製し、ON型双極細胞への発現を確認することができたが、導入効率が低く、スライス標本でのパッチクランプは困難であった。今後は、網膜伸展標本用いた手法により検討する必要があると考えている。光感受性チャネルロドプシンは、近年、新たな視覚再建ツールとして研究されてきている。しかし、オリジナルのチャネルロドプシンでは、培養細胞レベルでの検討は増えてきたが、神経伝達機構に関する研究は少ない。従来、網膜神経伝達機構の解析には正常な網膜が用いられてきたが、正常な網膜では光刺激によって同時に多くの神経細胞が刺激され、その反応は複雑なものとなり、個々の細胞の反応を調べることは容易ではなかった。本研究は視細胞が変性したラットの網膜を用いてスライスパッチクランプの手法を用い、網膜の個々の細胞の反応を見ることを目的としている。平成26年度は、遺伝盲ラットへ投与する変異型アデノ随伴ウイルス(AAV-)を作製した。遺伝子発現に2か月を要するため、投与2か月後にラットから網膜標本を取り出し、確認を行った。次に、スライスパッチクランプシステム実験系の確立を行った。本実験で用いる細胞直視下で行う可視化法では薄いスライス標本を用いるため、よりよいスライド標本の作製が重要になってくる。このため、スライス標本の作製においての様々な条件の検討を行い標本作製のプロトコルを決定した。また、正常なラットの網膜を用いてスライス標本の作成とパッチクランプ技術の習得、記録を行った。今年度は、遺伝盲ラットの網膜へチャネルロドプシン2遺伝子を導入し、予定通りターゲットの細胞を変えながら神経節細胞での光応答の比較を継続して行っていく。光感受性チャネルロドプシンは、近年、新たな視覚再建ツールとして研究されている。しかし、オリジナルのチャネルロドプシンは培養細胞レベルでの検討は増えてきたが、神経伝達機構に関する研究はまだ少ない。チャネルロドプシン2(ChR2)の陽イオン選択的チャネルとして機能するという特徴を利用することにより、神経細胞を特定の波長光で人為的に興奮させることが可能である。即ち、視細胞が存在しない網膜の特定の細胞にChR2を発現させることにより、その細胞以降の神経伝達機構を調べることができる。一方、ChR2を用いた視覚再生という点から見ると、網膜のどの神経細胞にChR2を発現させるかその違いを検討することで、失明者に効果的な視覚を生み出すことができるかを知ることができると考えている。特に視細胞が変性するとOn型双極細胞以降のシナプス構造が変化することが確認されており、ON型双極細胞に特異的に遺伝子導入を行い、双極細胞以降のシグナル伝達を調べることは重要な課題である。そこで、本研究は、ラットの網膜を用いてスライスパッチクランプの手法を用い、網膜の個々の細胞の反応を見ることを目的としている。硝子体内投与で神経節細胞ではなく、双極細胞に選択的に遺伝子を導入することは困難であった。そこで、ON型双極細胞に特異的に発現する、代謝調節型グルタミン酸受容体のプロモーターを用いたアデノ随伴ウイルスベクター(AAV-mGluR6-ChR2V)を作製した。このAAV-mGluR6-ChR2Vも硝子体内投与ではON型双極細胞に導入することができず、網膜下投与によって、導入に成功したものの、導入部位は限局していた。変異型のAAV-mGluR6-ChR2Vを作製したところ、硝子体内投与でより広い範囲に導入が可能となった。今後は、スライス標本でのパッチクランプだけでなく、網膜伸展標本用いた手法により検討する予定である。アデノ随伴ウイルスの作製、スライスパッチクランプシステム実験系の確立とおおむね予定通り進んでいる。電気生理学On双局細胞のみにチャネルロドプシンを導入し発現させ、神経節細胞での応答を調べる実験を継続し、解析するのに十分なデータを集める。次にターゲットを神経節細胞付近に移す。神経節細胞にチャネルロドプシンを導入し、発現させる。投与2か月後に網膜を取り出し、神経節細胞体のみに光を当てたとき、軸索のみに光を当てた場合での応答の違いをみる。おおむね予定通りに進んでいるが、次年度の予算が入ってから購入したい物品があったため。アデノ随伴ウイルスの作成、遺伝盲ラット飼育、パッチクランプの消耗品に使用する。
B型肝炎ウイルスキャリアにおける肝炎発症機序

1.HBs抗原キャリアにおけるHBc抗体価HBs抗原キャリアではHBc抗体価は高抗体価と言われているが、HBe抗原陽性キャリアの10%強はHBc抗体は陰性であり(全例、GPT20単位未満)、30数%は高抗体価ではなく、初診時、GPT20単位未満例に限ると半数例が高抗体価ではなかった。HBe抗原陰性キャリアでは90数%が高抗体価であり、残りの例ではHBs抗原が微量存在する例に限られていた。2.HBs抗原キャリアでみた肝炎とHBc抗体価の関係。初診時、HBc抗体が陰性であった例も、その後の経過観察期間中に陽性化し、肝炎との関連で高抗体価になる例もみられた。HBc抗体価はごく軽度のGPTの上昇(50単位以下)であっても上昇し、GPT異常の期間が短い場合には再びHBc抗体価は下降した。肝炎が持続するB型慢性肝炎でみると、肝炎の増悪にやや遅れて、IgA、IgG、IgM各クラスのHBc抗体が上昇する。とくにIgAの変動が顕著であり、診断時に意義がある。さらにまた、HBs抗原キャリアで、他の原因によって肝細胞の破壊が起きた場合にも、IgA・HBc抗体は軽度ながら上昇した。これらのことからHBc抗体は肝細胞破壊の結果として出現・上昇するものであり、抗体そのものの質的変化はないと考えられた。この点に関して、HBc抗原粒子を用いたinvitroの検討でも質的差は見い出せなかった。詳細な検討を行うにはHBc抗原蛋白を細分化した合成ペプタイドを用いて、HBc抗体の分析を行う必要がある。3.HBs抗原キャリアの病期と肝内HBV RNAの差。HBe抗原陽性の無症候性および症候性のキャリアの間では、肝内のHBV RNAに量的差はあっても質的差は見い出し得なかった。RNA間の相対比に関して、さらに検討が必要であった。
時計遺伝子を基盤とした癌幹細胞ヒエラルキー形成の分子解析

癌には癌幹細胞を頂点とするヒエラルキーが存在し、様々な癌の特性が作り出されている。本研究の目的は、概日リズムの分子基盤である時計遺伝子が癌ヒエラルキー形成メカニズムにおいて果たす役割を解明することである。ヒト乳癌細胞株を用いた解析から、概日リズムの同調因子の1つである副腎由来グルココルチコイドおよび時計遺伝子Per1が癌幹細胞の機能を維持するために重要であることが明らかとなった。本研究成果から、ヒトや動物の癌に対して新しい時間治療の概念を確立し応用していくことができる可能性が考えられた。本研究では、概日リズム(体内時計)の分子基盤である時計遺伝子に着目し、癌幹細胞と下層癌細胞とで異なる概日リズムが発生して、時計遺伝子が分子レベルで癌幹細胞の特性を決定することで癌ヒエラルキーが形成されているのではないかという、これまで全く提唱されていない仮説を立て検証していく。1.腫瘍細胞株における時計遺伝子の発現リズム解析:各種腫瘍細胞株を50%ウマ血清およびデキサメタゾンで刺激し、時計遺伝子の発現リズムを解析した。その結果、50%ウマ血清の刺激により時計遺伝子群の発現リズムが検出された。一方、デキサメタゾンによる刺激では、時計遺伝子の1つであるPer1遺伝子に発現リズムが認められたものの、他の時計遺伝子群に発現リズムは検出されなかった。2.動物由来腫瘍サンプルの収集:次年度、動物由来腫瘍サンプルにおける時計遺伝子の発現を解析するため、自然発症の担癌犬から外科的に切除した各種腫瘍サンプルを収集した。ヒト乳癌由来細胞株であるMCF-7を用いて、癌幹細胞の維持における時計遺伝子の役割について解析した。生体内で臓器および細胞レベルにおける時計遺伝子の発現リズムを同調させる因子として、副腎から産生されるグルココルチコイドがある。そのため、グルココルチコイドを介した時計遺伝子の発現リズムと癌幹細胞の維持について評価した。MCF-7をグルココルチコイドであるヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンで刺激すると、時計遺伝子の1つであるPer1の発現量が、ヒドロコルチゾンおよびデキサメタゾンの濃度および刺激時間依存性に上昇することが明らかになった。次に、in vitroにおいてMCF-7の癌幹細胞を評価するため、MCF-7を非接着条件で培養し、乳癌幹細胞の指標であるマンモスフィア(球状の塊)形成能を評価した。ヒドロコルチゾン存在下でMCF-7を培養すると、Per1発現量が上昇するとともに、MCF-7のマンモスフィア形成能は増加した。一方、siPer1によりPer1の発現量を低下させたMCF-7においては、マンモスフィア形成能が低下していた。これらの結果から、グルココルチコイドによる時計遺伝子Per1の発現リズム制御が、乳癌細胞において癌幹細胞を維持するために重要な因子の1つであることが明らかとなった。臨床獣医学腫瘍細胞から癌幹細胞を分離する手法の確立に時間を要しているため、全体的にやや遅れている。次年度は、腫瘍細胞から癌幹細胞を分離する手法を確立して、予定通りの研究を行う。具体的には、今年度準備したin vitroおよびin vivo実験系、そして自然発症担癌犬から採取した腫瘍サンプルを用いて、時計遺伝子が癌幹細胞に及ぼす生物学的影響について解析する。研究費はほぼ予定通り使用しており、次年度使用額は研究費支出の際に端数として残ったものである。研究計画に沿って研究費を予定通り使用する。
イノシトール燐脂質代謝を介するトランスメンブランコントロール

本研究は、プロテインキナーゼCの発見以来築き上げられたわが国のこの分野における研究基盤の上に立って、トランスメンブランコントロールの分子機序の中、イノシトール燐脂質代謝を介する系にしぼって研究を推進し、細胞の刺激応答機能の総合的理解に近付こうとするものである。本年度は主に、イノシトール燐脂質代謝を介するトランスメンブランコントロールに関与する要因である受容体、G蛋白質、酵素、イノシトール燐脂質の生化学的解析が行われている。分化誘導因子、成長因子受容体(尾形)とトロンボキサンA_2受容体(藤原)の部分精製及び低分子G蛋白質の精製(大沢)に成功した。ヒト血小板膜結合性ホスホリパーゼCが精製され(野沢)、PIP_2及びPIPのモノクローナル抗体を用いた微量定量法が開発された(竹繩)。プロテインキナーゼCは極めて構造の酷似する多数の分子種の集合体であるが、その7種についてcDNAを得、その全構造を決定した。特異的抗体を作成し、各組織より分離分別した分子種との免疫化学的対応に成功した。cDNAを直接COS細胞に発現させて得た酵素との対比と合わせて、各分子種のcDNA構造と酵素蛋白質の対応に成功し、プロテインキナーゼC分子種の構造と機能の関連を解明し、化学的基盤を得た(西塚)。プロテインキナーゼCβI、βII、γサブタイプに対する特異抗体による免疫組織化学により、小脳や海馬等における特定のニューロンに特異的に発現するサブタイプを同定した。免疫電顕法を開発し、細胞内の局在の観察に成功した(田中)。プロテインキナーゼA及びCに強い阻害能をイソキノリンスルフォナミド化合物HAー1077が細胞内カルシウム拮抗作用を示すことを明らかにした(日高)。これら計画班員の研究成果は国内外の学術誌に掲載され、元成元年1月14日に東京で開催された合同班会議で公表され、公募班員を加えて情報交換を行った。
線維芽細胞増殖因子-18(FGF-18)による骨軟骨代謝調節機構

本研究では臨床応用を目指して、FGF-18による骨軟骨代謝調節機構に関する基礎的研究を行なった。マウス頭蓋骨由来初代骨芽細胞および骨芽細胞株MC3T3-E1培養系において、FGF-18は細胞増殖をFGF-2と同程度にまで促進した。分化および基質合成についてはともに著明な抑制効果を示し、この抑制効果もFGF-2と同等であった。この効果は、MAP kinaseであるERKのリン酸化を介するものであり、ERKの抑制物質であるPD98059によって著明に抑制された。新生児マウス肋軟骨より採取した初代軟骨細胞および軟骨細胞株ATDC5の培養系においても、FGF-18はFGF-2と同様に細胞増殖を促進し、分化・基質合成を抑制した。この効果はERK以外に、p38 MAPKのリン酸化を伴っており、PD98059のみならずp38の抑制物質であるSB203580によっても抑制された。また、FGF-18は、マウスの共存培養系において破骨細胞の分化も骨吸収活性も共に促進した。この効果は、一部は直接的にRANKLを誘導することによって、また一部は間接的にCOX-2の誘導・プロスタグランジンの産生を介することによって達成されるものであることが示された(Shimoaka T, et al. J Biol Chem 277:7493-7500, 2002)。なお、in vivoのFGF-18の薬理効果については、リコンビナント標品の供給が未だ十分ではなく、今後の課題として残された。本年度は、in vitroの培養系を用いて骨芽細胞、破骨細胞、および軟骨細胞に対するFGF-18の作用をFGF-2と比較検討した。1.マウス頭蓋骨由来初代骨芽細胞および骨芽細胞株MC3T3-E1培養系において、FGF-18は用量依存的に細胞増殖を対照群の8-10倍にまで促進し、その効果はFGF-2と同等であった。また、培養骨芽細胞をFGF-18で刺激し、細胞内リン酸化シグナルをWestern blottingにて検討したところ、FGFRsと同サイズの蛋白を含む複数の蛋白がリン酸化されていることが明らかとなった。2.マウス骨髄細胞単独培養系、およびマウス頭蓋骨由来骨芽細胞と骨髄細胞との共存培養系におけるTRAP陽性多核破骨細胞形成にて評価したところ、FGF-18は破骨細胞形成を促進した。また、成熟破骨細胞の活性に対する効果を、新生児ウサギ長管骨より分離精製した破骨細胞による象牙片上での吸収窩面積で評価したところ、FGF-18は促進効果を示し、10^<-8>Mでは対照の6.8倍にまで促進した。これらの破骨細胞の分化および活性に対する効果もFGF-2と同程度であった。3.新生児マウス肋軟骨より採取した初代軟骨細胞および軟骨細胞株ATDC5の培養系において、FGF-18は用量依存的に細胞増殖を対照群の2-3倍にまで促進し、その効果はFGF-2と同程度であった。また、FGF-18およびFGF-2投与群では上記mRNAレベルを低下させ、アリザリンレッド染色性を抑制し10^<-8>Mでは全く染色性がなくなった。以上より、FGF-18は培養骨芽細胞および軟骨細胞に対してその増殖を促進し、分化および基質合成を抑制した。また、破骨細胞に対してはその分化、活性ともに促進した。本年度は、骨芽細胞、破骨細胞、および軟骨細胞培養系におけるFGF-18の作用を細胞内シグナル伝達分子との関連から検討した。また、これらをFGF-2およびFGF-10と比較検討した。

分化および基質合成についてはともに著明な抑制効果を示し、この抑制効果もFGF-2と同等であった。この効果は、MAP kinaseであるERKのリン酸化を介するものであり、ERKの抑制物質であるPD98059によって著明に抑制された。新生児マウス肋軟骨より採取した初代軟骨細胞および軟骨細胞株ATDC5の培養系においても、FGF-18はFGF-2と同様に細胞増殖を促進し、分化・基質合成を抑制した。この効果はERK以外に、p38 MAPKのリン酸化を伴っており、PD98059のみならずp38の抑制物質であるSB203580によっても抑制された。以上のことより、FGF-18のシグナルは、骨芽細胞ではERK、軟骨細胞ではERKとp38のリン酸化を介するものであることが明らかとなった。昨年までに、FGF-18は破骨細胞の分化を促進するのみならず、成熟破骨細胞に直接作用してその活性を上昇させることが明らかになっているが、そのシグナル伝達機構に関しては今後の課題である。なお、ここまでの結果は、本年、Journal of Biological Chemistry誌(277 : 7493-7500, 2002)に掲載された。昨年度までの検討で、FGF-18は骨芽細胞および軟骨細胞の増殖促進、分化抑制に働くこと、破骨細胞に関してはその分化も骨吸収活性も共に促進することを報告した。本年度は、それぞれの細胞における分子メカニズムについて検討した。FGF-18の骨芽細胞に対する効果は、MAP kinaseであるERKのリン酸化を介するものであり、ERKの抑制物質であるPD98059によって抑制された。また、軟骨細胞に対する効果は、ERK以外にp38MAPKのリン酸化を伴っており、PD98059のみならずp38の抑制物質であるSB203580によっても抑制された。更に、破骨細胞の分化促進効果については、cyclooxygenase-2(COX-2)の阻害剤であるNS-398およびRANKLのデコイレセプターであるosteoprotegerinにより抑制された。以上より、FGF-18の破骨細胞分化促進は、一部は直接的にRANKLを誘導することによって、また一部は間接的にCOX-2の誘導・プロスタグランジンの産生を介することによって達成されるものであることが示された。この作用はFGF-2と同様であり、FGF-10は破骨細胞に対する効果を示さなかった。なお、臨床応用を目指して、FGF-18の薬理効果を我々が現在までに行ってきたFGF-2の動物実験に基づいて試みたが、FGF-18リコンビナント標品の供給がin vivoの検討には未だ十分ではなく、今後の課題として残された。
自然観測法理論による信号解析法を用いた伝搬電磁波の到達時間決定システム

1.昨年度に引き続き,秋田県内3観測地点に構築した高精度GPS時刻発生装置を装荷した雷放電放射電界観測システムを用いて落雷時電界を観測した。2.データの回収,観測システムの保守点検を定期的に行い,本システムは,順調に動作し無人観測が継続して行われている。3.新しい到達時間決定法として提案している自然観測法理論を用いたパルス信号の変曲点を利用する方法について,数値解析によって,理想的な波形を作成し,この波形に適用することで理論的な精度の検証を行った。その結果,落雷地点と観測地点の距離に誤差及び主放電に重畳する細かいパルス性雑音に関する誤差について,提案法が優れていることを示した。4.本システムによって観測された電界波形を用いて,落雷地点の決定を行った。5.数値解析によって求めた落雷伝搬電磁界の伝搬速度を考慮し,かつ,自然観測法理論を用いたパルス信号の変曲点を利用する到達時間決定法を観測波形に適用し,落雷地点を求めた。また,その精度検証を行った。6.数時間の落雷地点分布の移動を表す図を作成し,定性的な精度の検証を行った。以上のように,本研究では,秋田県内に高精度の落雷電界観測システムを構築した。また,数値解析を用いて落雷電界の理想的な波形を求めて,本研究代表者が提案した自然観測法理論による電磁界の到達時間決定法の有効性を検討した。さらに,数値解析によって明らかとなった条件を考慮し,本観測システムで観測された電解観測波形に対して,本手法を適用し観測実験的に検討した。1.高精度GPS時刻発生装置を装荷した雷放電放射電界観測システムを秋田県内3観測地点に構築し,運用を開始した。本システムは,順調に動作し無人観測が継続して行われている。2.モデル信号について自然観測法理論によるディジタル信号解析法を用い,1)原波形から決定,2)従来の周波数解析を用いて決定,3)自然観測法理論を用いて決定の3つの方法について検討を行った。その結果,本提案法の決定精度が良いことを明らかにした。3.落雷位置決定を行う場合に問題となる雲放電による信号の除去について,自然観測法理論による瞬時解析を用いて検討を行った。結果として,本手法を用いることで90%以上の雲放電を識別できることを明らかにした。4.新しい到達時間決定法として,自然観測法理論を用いた屈折点を利用する方法を提案し,モデル信号に対してその精度の検討を行った。自然観測法理論を用いることで,雑音中のパルスの屈折点を精度よく検出できることを明らかにした。5.数値解析によって,伝搬電磁波について大地の影響を検討し,ピーク時間への効果を報告した。大地の影響により,観測地点間の距離にしたがって誤差が発生することがわかった。ただし,その効果は,本研究で用いている観測地点間ではそれほど問題とはならないこともわかった。6.本システムによって観測された落雷放射電磁波のうち,電離層反射波と自然観測法理論を組み合わせた落雷発生地点までの距離及び電離層の高度の決定法を検討し,自然観測法理論を用いることで,観測された生のデータを用いるよりもばらつきの少ない決定法となることを明らかにした。
直交同時2断面の可能な経食道ドプラ断層プロ-ブによる新らしい血流映像診断法の開発

従来、経食道ドプラ心エコ-図法はきわめて有用な診断法ではあったが、単に横断面のみしか描写しえないという限界があった。初年度(平成元年)において、私どもは世界にさきがけて、直行同時2断面・経食道ドプラ断層プロ-ブ(5MHz,32×32エレメント,外径13.5ミリ)によってサイド・バイ・サイドにバイプレ-ン映像をディスプレイする方法を開発した。これを260例の心臓血管外科手術患者の術前・術中・術後に使用して、その有用性,安全性を確立した。第2年度(平成2年)において、臨床応用を拡大し通算計450例に達した。これらのデ-タを他の診断法や術中所見と対比して、このバイプレ-ン本法の特徴と限界を検討した。僧帽弁逸脱形態の詳細な分折、解離性大動脈瘤におけるエントリ-の正確な検出、心房中隔欠損口のサイズの計測等において特にバイプレ-ンの有用性が顕著であった。一方、この方法の2つの欠点が明らかになった:(1)トランスジュ-サが2個あること、(2)2画面はリアルタイムでなくて、心電図と同期して再生されたものであることなどである。最終の第3年度(平成3年度)において、前述の2つの欠点を解決した:新らしく1個のトランスジュ-サで2個分の働きをするマトリックス・バイプレ-ン・トランスジュ-サと2画面の同時スキャンの干渉を防ぐソフトウェアを開発した。このマトリックス・プロ-ブとリアルタイム・バイプレ-ンのソフトウェアの併用によって、新らしい診断法の開発という最終目標がほぼ達せられたものと考えられた。本法が他の方法ではとうてい得られない情報を提供する特異的な有用性は(1)解離性大動脈瘤の治療方針の決定、(2)僧帽弁逆流の解剖の詳細な分折、(3)先天性心疾患における経力テ-テル的心内修復のモニタなどにおいて特に重要である。国内外において、急速にバイプレ-ン経食道プロ-ブの応用が拡しており、本法が新らしい診断法として確立しつつある。私どもが新らしく開発し、又新らしい工夫をつけ加えた直交同時2断面経食道プロ-ブ(バイプレ-ンTEEプロ-ブ)を260名の心臓血管外科手術患者についてその術前、術中、術後などに実施した。1名のみが嚥下困難であったが、そのほかの259名については、本検査を全く安全に遂行し、かつ良好な画質のバイプレ-ン映像を記録しえた。これらのバイプレ-ン映像と、従来のシングルプレ-ンTEEプロ-ブによる映像を比較検討し、新らしい知見として、(1)大動脈弓及びその分枝の映像化にすぐれていること。(2)上行大動脈の映像視野が拡大したこと、(3)解離性大動脈瘤の病変の3次元的理解に有行であること。(4)僧帽弁逆流評価に正確さを増したこと、(5)僧帽弁形成術を計画する場合には、このバイプレ-ン映像による情報が、心臓外科医にとってきわめて有用であること、(6)左室瘤のある患者の左室壁運動分析、あるいはその左室機能の分析に有利であることなどを実証した。

次にバイプレ-ン映像を本当の実時間で実現するために、超音波ビ-ムを1本おきに2つのトランスジュ-サで交互に送受信するためのソフトウエア(附加回路)を新規開発し、これを12例の臨床例で使用しきわめて良好な成績を得て、このソフトウエアの実用性が確かめられた。しかし、診断距離が9センチ以下という制限があることがその欠点として認められた。犬を使っての動物実験において、上記の実時間回路を附加して、その左室運動をリアルタイム・バイプレ-ンで映像化し、その問題点を検討した。その結果、実時間の有利さは確かめられたが、一方、トランスジュ-サが2ケ横にならんでいるために、食道粘膜との密着度が必ずしも両方のトランスジュ-サにとって同等ではないという欠点があることが判明した。そのために、それぞれの断面で、超音波ビ-ムの透過度が不平等となるという不利を将来解決しなければならない。平成2年度において、私どもが更に新しい工夫をつけ加えた直交同時2断面経食道ドプラ断層(バイプレ-ン)プロ-ブ(アロカUSTー5228ー5特C)を試作・講入し、教室の心臓血管外科患者190例に本法を施行した(平成元年・2年度で本法の施行数の総計は450例に達した)。平成2年度の研究実績のまとめは以下の通りである。(1)190例の経食道バイプレ-ン検査を心臓血管外科手術の術中、術直後、ICUなどにおいて実施し、診断法としての有用性を確認した。特に僧帽弁逸脱形態の詳細な分析、A型、B型の解離性大動脈瘤のエントリ-の正確な描写、又心房中隔欠損口のサイズ測定などにおいて直接に手術方針や術式決定に影響するような重症所見を提供した。いづれの場合も、バイプレ-ン映像では、横断面と同時に長軸断面をディスプレイするという長所によって特異的な診断情報を与えた。(2)同時バイプレ-ン映像を実時間でディスプレイするためのソフトウェアを試作し犬を用いた動物実験と臨床例において検討した。2断面のスキャンニングを行なう場合の互の干渉を防ぐためにビ-ム・ハイ・ビ-ム・スイッチとフレ-ム・バイ・フレ-ム・スイッチの両方を研究したが、結果において後者が臨床的にすぐれていることが判明した。(3)互に1.5ミリ離れた2のトランスジュ-サを装着した現在のバイプレ-ン・プロ-ブを更に進歩させたもの、即ち1個のトランスジュ-サでバイプレ-ン・スキャニングの可能なマトリックス・バイプレ-ン・プロ-ブの試作に着手した。その初期の動物実験と臨床応用に成行し、将来は、マトリックス・バイプレ-ンが本法の標準となる見込みが高いことが示唆された。(4)バイプレ-ン・プロ-ブ、もっぱら成人用のサイズのものを研究した。しかし、一方先天性心疾患、特に複雑心奇形においてバイプレ-ンが有効であることが判明した。小児サイズのバイプレ-ン・プロ-ブの試作とその研究を行なった結果、その実用性を確認した。本年度において、本研究プロジェクトの最終目標である1個のトランスジャ-サでバイプレ-ン映像を可能とするマトリックス・バイプレ-ン経食道プロ-ブを完成し、動物実験と臨床例において、その有用性を確認した。マトリックス・プロ-ブのサイズはシングルプル-ン・プロ-ブと同じ外径13.5ミリであり、臨床使用においてプロ-ブの挿入を安全かつ容易にした。更に外径10mmの小児用マトリックス・プロ-ブをも試作し、その実用性を確認した。一方、ソフト・ウエアの面ではバイプレ-ン映像を同一画面の左右にリアルタイムでディスプレイするためのソフト(フレ-ム・バイ・フレ-ム・スイッチング)を開発した。
膵癌におけるMAPキナーゼ阻害薬耐性機構の解明と新規治療法の確立

私は、膵癌の上皮内癌と浸潤癌のゲノム異常を比較することにより、1膵癌の浸潤過程で8番染色体短腕が欠失すること、2そのゲノム領域に存在するDUSP4遺伝子の発現低下によりMAPキナーゼが活性化すること、3活性化したMAPキナーゼは膵癌細胞の浸潤能を亢進すること、4MAPキナーゼ阻害薬が膵癌治療として有効であることを明らかにした。しかしながら、これまで施行された臨床試験で膵癌患者に対するMAPキナーゼ阻害薬の有効性は示されていなかった。そこで、生体での膵癌細胞に対するMAPキナーゼ阻害薬の効果を検証するために、ヒト膵癌細胞を同所移植した免疫不全マウスを用いて治療実験を施行した。治療群では投与開始直後から腫瘍は増殖が抑制されて2週目ごろには検出限界値以下まで縮小した。しかし、すぐに抗腫瘍効果は消失して、2週目以降は治療群と対照群の腫瘍はほぼ同様な増大傾向を示した。その結果、治療群の生存期間はわずかに延長したものの、最終的には両群のすべてのマウスが癌死に至った。以上の結果から、治療群ではMAPキナーゼ阻害薬耐性獲得に関わる分子機構が早期に発動されることが示唆された。本研究では、耐性獲得機序の解明と耐性克服のための治療法の開発を目的とする。今年度は、早期耐性機構に関わる分子の同定を試みた。癌細胞移植後に治療を開始して30日目に全マウスを屠殺して膵腫瘍を摘出した。各膵腫瘍よりRNAを回収してマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を施行した。その結果、対照群に比べて治療群の膵腫瘍で有意に(4倍以上)発現が変動している12遺伝子が抽出され、耐性関連遺伝子候補とした。当初の本年度の研究項目は以下の通りであった。1.免疫不全マウス(NOD/scid)にヒト膵癌細胞株(MIA PaCa-2)を同所移植3週後に、マウスを2群に分け、治療群に対しMAPキナーゼ阻害薬(PD325901)の経口投与(12.5 mg/kg/mouse/day)を開始する。対照群には同量の溶媒のみを投与する。治療開始30日目に全マウスを屠殺して膵腫瘍を摘出する。各膵腫瘍よりRNAを回収してマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を施行する。対照群に比べて治療群の膵腫瘍で有意に発現が変動している遺伝子を抽出し、耐性関連遺伝子候補とする。2.抽出した耐性関連遺伝子の発現変動を検証する。mRNAレベルの検証は、リアルタイムPCR法で行う。タンパクレベルの検証はWestern blot法および免疫組織化学で行う。3.抽出した耐性関連遺伝子が実際に耐性獲得に関与しているのか、また、移植実験で用いたMIA PaCa-2以外の膵癌細胞株についても同様の耐性機構が働いているのかについて、in vitroの実験系で検討する。耐性獲得腫瘍で発現が亢進している遺伝子についてはsiRNAを用いたノックダウンで、発現が低下している遺伝子についてはレンチウイルスベクターを用いた一過性遺伝子導入で耐性能がキャンセルされるか否かを検証する。このうち1については、移植治療実験で得られた膵腫瘍検体を用いた網羅的発現解析が完了して候補遺伝子を抽出することができた。2についても、全候補遺伝子の発現動態をリアルタイムPCR法で確認し、一部の遺伝子に関してはタンパクの発現レベルをWestern blot法および免疫組織化学で確認した。3については、一部の遺伝子の機能解析を施行済みで、現在、残りの遺伝子について解析中である。1.耐性関連遺伝子の発現変動の検証抽出した12個の耐性関連遺伝子候補の発現変動を検証する。次に、抽出した耐性関連遺伝子が実際に耐性獲得に関与しているのか、また、移植実験で用いたMIA PaCa-2以外の膵癌細胞株についても同様の耐性機構が働いているのかについて、in vitroの実験系で検討する。2.耐性関連シグナルパスウェイの解明耐性に関わる責任遺伝子が同定された場合、その遺伝子によって活性化されるシグナルパスウェイを解明する。耐性関連候補遺伝子のシグナルパスウェイを構成する分子の中で、標的分子となり得る分子を抽出する。もし既に阻害薬あるいは分子標的薬が存在する分子があれば治療の標的分子候補とする。3.耐性制御を併用したMAPキナーゼ標的治療法の開発MAPキナーゼ阻害薬の耐性に関わる分子を阻害することでMAPキナーゼ阻害薬の効果が回復・改善するか否かをin vitroで検証する。次に、併用治療の有効性をin vivoで検証する。同所移植後にマウスを4群に分け、対照群は溶媒のみ投与する。残りの3群は、MAPキナーゼ阻害薬のみ、耐性関連分子阻害のみ、MAPキナーゼ阻害薬と耐性関連分子阻害の併用である。治療開始後の腫瘤の縮小効果や遠隔臓器(肝、肺、脳など)への転移抑制効果、生存期間の延長効果などを比較する。

私は、膵癌の上皮内癌と浸潤癌のゲノム異常を比較することにより、1膵癌の浸潤過程で8番染色体短腕が欠失すること、2そのゲノム領域に存在するDUSP4遺伝子の発現低下によりMAPキナーゼが活性化すること、3活性化したMAPキナーゼは膵癌細胞の浸潤能を亢進すること、4MAPキナーゼ阻害薬が膵癌治療として有効であることを明らかにした。しかしながら、これまで施行された臨床試験で膵癌患者に対するMAPキナーゼ阻害薬の有効性は示されていなかった。そこで、生体での膵癌細胞に対するMAPキナーゼ阻害薬の効果を検証するために、ヒト膵癌細胞を同所移植した免疫不全マウスを用いて治療実験を施行した。治療群では投与開始直後から腫瘍は増殖が抑制されて2週目ごろには検出限界値以下まで縮小した。しかし、すぐに抗腫瘍効果は消失して、2週目以降は治療群と対照群の腫瘍はほぼ同様な増大傾向を示した。その結果、治療群の生存期間はわずかに延長したものの、最終的には両群のすべてのマウスが癌死に至った。以上の結果から、治療群ではMAPキナーゼ阻害薬耐性獲得に関わる分子機構が早期に発動されることが示唆された。本研究では、耐性獲得機序の解明と耐性克服のための治療法の開発を目的とする。今年度は、早期耐性機構に関わる分子の同定を試みた。癌細胞移植後に治療を開始して30日目に全マウスを屠殺して膵腫瘍を摘出した。各膵腫瘍よりRNAを回収してマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を施行した。その結果、対照群に比べて治療群の膵腫瘍で有意に(4倍以上)発現が変動している12遺伝子が抽出され、耐性関連遺伝子候補とした。当初の本年度の研究項目は以下の通りであった。1.免疫不全マウス(NOD/scid)にヒト膵癌細胞株(MIA PaCa-2)を同所移植3週後に、マウスを2群に分け、治療群に対しMAPキナーゼ阻害薬(PD325901)の経口投与(12.5 mg/kg/mouse/day)を開始する。対照群には同量の溶媒のみを投与する。治療開始30日目に全マウスを屠殺して膵腫瘍を摘出する。各膵腫瘍よりRNAを回収してマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を施行する。対照群に比べて治療群の膵腫瘍で有意に発現が変動している遺伝子を抽出し、耐性関連遺伝子候補とする。2.抽出した耐性関連遺伝子の発現変動を検証する。mRNAレベルの検証は、リアルタイムPCR法で行う。タンパクレベルの検証はWestern blot法および免疫組織化学で行う。3.抽出した耐性関連遺伝子が実際に耐性獲得に関与しているのか、また、移植実験で用いたMIA PaCa-2以外の膵癌細胞株についても同様の耐性機構が働いているのかについて、in vitroの実験系で検討する。耐性獲得腫瘍で発現が亢進している遺伝子についてはsiRNAを用いたノックダウンで、発現が低下している遺伝子についてはレンチウイルスベクターを用いた一過性遺伝子導入で耐性能がキャンセルされるか否かを検証する。このうち1については、移植治療実験で得られた膵腫瘍検体を用いた網羅的発現解析が完了して候補遺伝子を抽出することができた。2についても、全候補遺伝子の発現動態をリアルタイムPCR法で確認し、一部の遺伝子に関してはタンパクの発現レベルをWestern blot法および免疫組織化学で確認した。3については、一部の遺伝子の機能解析を施行済みで、現在、残りの遺伝子について解析中である。