hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カタユウレイボヤのオキシトシン/バソプレシン様ペプチドの探索とその分子進化の解析

カタユウレイボヤからのオキシトシン/バソプレシン様ペプチドの探索バソプレシン抗体を用いたアフィニティーカラムを作成し、カタユウレイボヤのオキシトシン/バソプレシン様ペプチド探索を行った。カタユウレイボヤの神経節からペプチド画分を抽出し、それらを抗体アフィニティーカラムと相互作用させて、カラムに結合するものを探索したが、オキシトシン/バソプレシン様ペプチドと推察できるものは存在しなかった。哺乳類のオキシトシン/バソプレシンをコードしている前駆体には、ニューロフィジンというタンパク質もコードされている。この前駆体構造パターンは無脊椎動物であるシマミミズのオキシトシン/バソプレシン様ペプチドの前駆体でも共通であり、進化的に保存性が高い。このニューロフィジン領域の配列を参考に、カタユウレイボヤのゲノムデータベース/ESTデータベースに対して検索をかけたが、オキシトシン/バソプレシン様ペプチド前駆体と推察されるものは同定できなかった。以上の結果から、カタユウレイボヤではオキシトシン/バソプレシン様ペプチドが元来存在していない可能性が考えられる。最近、ナメクジウオという頭索類(カタユウレイボヤは尾索類でどちらも脊索動物)でデータベースの構築が進展しているが、それを用いた検索ではオキシトシン/バソプレシン様ペプチドをコードする遺伝子がナメクジウオで確認されているらしい。最近の進化モデルでは脊椎動物の直系の祖先生物は頭索類であり、尾索類はやや傍系に位置するというものがある。すなわち頭索類から脊椎動物への進化する過程においてオキシトシン/バソプレシン様ペプチドは保存されているが、傍系である尾索類では、尾索類として進化する段階でオキシトシン/バソプレシン様ペプチドが消失していまい、オキシトシン/バソプレシン受容体と相同性の高い受容体だけが痕跡として残存しているのではないかと考えられる。カタユウレイボヤのオキシトシン/バソプレシン様ペプチド受容体のクローニングカタユウレイボヤのESIデータベースより、ヒトオキシトシン受容体およびヒトバソプレシン受容体と高い相同性(約50%)をもつ蛋白質をコードする遺伝子を発見した。この遺伝子が実際にカタユウレイボヤの神経節に存在することをRT-PCRにより確認し、その遺伝子のクローニングに行った。その結果、データベースに登録されている配列とは一部異なるが(第三細胞内ループ領域の一部が欠失したもの)、主要な領域はデータベース配列通りの遺伝子がクローニングされた。カタユウレイボヤにおけるオキシトシン/バソプレシン様ペプチドの探索カタユウレイボヤの神経組織からペプチド画分を抽出し、オキシトシン/バソプレシン様ペプチドの探索を行った。アフリカツメガエルの卵に上記の受容体を発現させ、HPLCにより分画した各サンプルをこの卵に投与し、反応した画分から目的のペプチドを同定しようと試みた。しかし、受容体を発現させてない卵にペプチドHPLC分画を反応させたときに、多くの画分で陽性反応が出たため、この方法でオキシトシン/バソプレシン様ペプチドを特定することは困難だった。次にオキシトシン抗体およびバソプレシン抗体を用いてELISAを行った。その結果、オキシトシン抗体とバソプレシン抗体の双方に対し、陽性の画分があることが見いだされた。現在、抗体アフィニティークロマトグラフィーに用いる抗体を作製中である。抗体の準備が整い次第、この陽性画分から目的のペプチドの単離同定を試みる。ペプチドが同定された後には、ペプチドと受容体の相互作用解析や、ペプチドおよび受容体の発現解析を行う予定である。すなわち頭索類から脊椎動物への進化する過程においてオキシトシン/バソプレシン様ペプチドは保存されているが、傍系である尾索類では、尾索類として進化する段階でオキシトシン/バソプレシン様ペプチドが消失していまい、オキシトシン/
p120RasGAPタンパク質のシグナル伝達制御機構の研究

p120 RasGAPは,低分子量Gタンパク質Rasに特異的に作用し,そのGTP加水分解活性を促進するエフェクター因子である.Rasを不活性化するこの酵素作用は,Rasのもつ細胞増殖や分化といった機能を制御するのに大変重要である.本研究では,RasGAPのnSH2-SH3-cSH2領域における分子内活性制御機構の詳細な解析を進めるために,SH2およびSH3ドメインを1単位として調製した組み換え型RasGAPタンパク質とその標的タンパク質であるp190 RhoGAPのpTyr領域を含む合成ペプチドとの結合をSPR測定により速度論的に解析した.p120 RasGAPは,低分子量Gタンパク質Rasに特異的に作用し,そのGTP加水分解活性を促進するエフェクター因子である.Rasを不活性化するこの酵素作用は,Rasのもつ細胞増殖や分化といった機能を制御するのに大変重要である.本研究では,RasGAPのnSH2-SH3-cSH2領域における分子内活性制御機構の詳細な解析を進めるために,SH2およびSH3ドメインを1単位として調製した組み換え型RasGAPタンパク質とその標的タンパク質であるp190 RhoGAPのpTyr領域を含む合成ペプチドとの結合をSPR測定により速度論的に解析した.p120 RasGAPは,低分子量Gタンパク質Rasに特異的に作用して,そのGTP加水分解活性を促進するタンパク質(GAP ; GTPase activating protein)である.これまでのin vitroの実験では,正常型RasのGTPase活性をおよそ1000倍上昇させ,またin vivoでは,GTP結合型RasをGDP結合型Rasに変換することによりRasを介するシグナルをオフにする"分子スイッチ"としての機能をもっている.RasGAPは,SH(Src homology)2,SH3,PH(Pleckstrin homology)等の細胞内シグナル伝達に関連する幾つかのドメイン構造やRasタンパク質に直接結合しそのGTPase活性の促進に関与するGRD(GAP-related domain)をもっており,これらの部分でRasタンパク質の局在や活性制御に密接に関わっていると考えられている.本研究の代表者は,RasGAPのシグナル伝達に関与すると考えられている幾つかのドメインに注目し,その構造と機能の関係を生化学的および構造生物学的アプローチにより解明することを目的とした研究を進めた.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.1.PCR法によりヒトp120RasGAP遺伝子のクローニングを行った.2.得られた遺伝子をもとに,プロリンに富む領域,N末側およびC末側の2つのSH2ドメイン,ならびにSH3ドメインを適当な組合せで含む7種類のタンパク質を設計し,そのうち3種類の組換え型タンパク質を大腸菌のシステムにより,GSTあるいはヒスチジンタグとの融合タンパク質法で,大量発現させた.現在,高収率,高純度の精製方法の開発を行っている.p120RasGAPは低分子量Gタンパク質Rasに特異的に作用し,そのGTP加水分解活性を促進するエフェクター因子である.Rasを不活性化するこの酵素作用は,Rasのもつ細胞増殖や分化といった機能を制御するのに大変重要である.一方,RasGAPのN末端領域には,細胞内シグナル伝達に関与すると考えられるnSH2-SH3-cSH2領域を存在しており,この領域がアクチンの細胞骨格再構成の役割を担っていると考えている.RasGAP nSH2-SH3-cSH2領域は分子内での活性制御機構が議論され,特にマスクされたRasGAP SH2が,その結合パートナーであるp190 RhoGAPのリン酸化チロシン領域(pTyr)と相互作用する(RasGAP nSH2とRhoGAPのpTyr1105領域,RasGAP cSH2とRhoGAPのpTyr1087領域)ことで,RasGAP SH3が露出し下流因子と結合できるというモデルは興味深い.本研究では,RasGAP nSH2-SH3-cSH2領域における上記モデルの検証ならびに制御機構の詳細な解析を進めることを目的として,各種ドメイン単位で組み換え型タンパク質の調製し,各ドメイン間の結合をSPR測定により速度論的に解析した.RasGAPのnSH2-SH3-cSH2領域をもとに7種類の組み換え型タンパク質を調製した.またRhoGAPのpTyr領域は合成ペプチドを用いた.分子内の活性制御機構を解明する上で,まずRasGAP SH2とRhoGAPのPTyr領域との結合をBIAcoreを用いて速度論的に解析し,各ドメイン間における相互作用の優先性や重要性を推測した.その結果,nSH2-pTyr1105領域の方がcSH2-pTyr1087領域より約30倍強く結合していることがわかった.nSH2-pTyr1087領域およびcSH2-pTyr1105領域という組み合わせで結合を調べてみると,この組み合わせでも結合していることが示され,この場合もnSH2が関与したnSH2-pTyr1087領域の方がcSH2-pTyr1105領域よりも約40倍結合が強かった.この結果から複数の組み合わせで結合することにより,シグナル伝達を制御していることが示唆された.同様な方法でRasGAP nSH2-SH3,SH3-cSH2とRhoGAPペプチドを使い,Kdを測定してみたところ同程度の結合であり,RasGAP SH3の存在がp190 RhoGAPとの結合に影響は与えていないことがわかった.さらに,RasGAP nSH2-SH3-cSH2とpTyr1105領域およびpTyr1087領域2個ヶ所を含む
国連売買条約の知識構造の分析と知識ベースの構築

報告者に与えられた課題は、国連売買条約(以下ではCISGと略称)の知識構造を分析し、それに基づいて同条約に関する知識ベースを構築することである。その作業前提として、平成7年度に引き続き、諸外国で下されたCISGに関する判決例・仲裁判断例の収集・分析作業を行っている。昨年度の研究において摘出したCISGの解釈についての一定の傾向-「重大な契約違反」への該当性や通知義務を厳格に解する傾向、適用される利率の多様性、CISGの普遍的適用など-は、今年度においても確認することができた。また、CISGを重要視する各国の積極姿勢についても同様である。さらに、今年度は、契約の成立、履行期前の契約違反、免責等に関して、注目すべき判決例・仲裁判断例が現れた。その結果、CISGの現実の適用過程の全容がかなり明らかになってきた。その成果の一端は、「1980年国連国際物品売買条約-解釈上の諸傾向を中心として-」日本国際経済法学会年報5号(平成8年10月)および「国連売買条約の展開-その後の判決例-」研究成果報告書(平成9年2月)として発表した。今後は、CISGに関する判決例等の収集・分析作業を継続するとともに、その分析結果をふまえての設例作成作業を行いたい。
骨代謝と糖代謝をつなぐシグナル蛋白質オステオカルシンの構造と機能

骨の形成に役立つタンパク質として知られていたオステオカルシン(OC)が、糖代謝の制御、脂質代謝、男性ホルモンの産生、等多様な活性をもつホルモンであることがわかってきた。骨を刺激すれば健康と若返りが可能と言われている。その重要性にもかかわらず分子メカニズムは不明な点が多い。この研究では、OCは酸性で活性化されることから、酸性でのOCの立体構造をCD、NMR、X線結晶解析で検討した。その結果、OCは酸性でも構造を維持しており、そのため不活性型にならずにホルモン活性を維持できることを明らかにした。オステオカルシン(OC)は骨芽細胞で作られ、骨形成に関与する蛋白質として認識されてきた。最近、OCが膵臓のβ細胞に対してホルモンとして働き、糖代謝をも制御することが提案され、再び脚光を浴びている。OCはγカルボキシグルタミン酸(Gla)と呼ばれるカルシウムイオンにキレート配位する残基をもっている。骨中ではOCはGla型で存在するが、破骨細胞による骨吸収の際には、ハイドロキシアパタイト(HA)を溶解するために酸が分泌され、酸性環境でOC中のGla残基は脱炭酸してGluになる。これが吸収されて血中ではホルモン活性をもつGlu型のOCが存在する。血中には破骨細胞の酵素によってArg19-Arg20の間が切断されたフラグメントが存在する。Ca配位Gla型OCの立体構造はX線結晶解析やNMRによって解かれている。それによればArg19-Arg20周辺はヘリックス構造をとっており、酸性のGla型OCが同様の構造をとっているとすれば、切断が困難となる。その結果切断フラグメントではなく、活性型ホルモンであるGlu型OCの血中濃度が上昇することから、酸性Gla型OCの立体構造を明らかにすることは重要である。ウシOCの天然評品について、酸性Gla型OCのNMRによる立体構造の予備的な結果は我々によって得られていたが、ウシの合成評品を調製し純度の高い試料による構造解析を進めている。一方、ホルモン活性を示すGlu型OCの立体構造も最近X線結晶解析によって解かれたが、これまでの立体構造を持たないという予想に反してGla型OCに類似した構造をとっていることが示された。溶液中でもGlu型OCがGla型OCに類似した構造をとるかはホルモン活性発現機構と関連して重要である。ウシとマウスの合成評品を調製し純度の高い試料による構造解析を進めている。Gla型OCは、Caイオンと結合していないときランダム構造をとるが、Caイオンと結合すると立体構造を形成すると言われてきた。一方、最近の我々のNMRによる酸性状態のGla型OC(Caイオンは外れている)の予備的な研究によれば、酸性状態ではCaイオン結合状態と同じ程度に構造形成していることがわかっている。現在は、固相合成によって得られたウシとマウスの還元型OCを酸化してジスルフィド結合を形成させ、架橋反応の進捗を逆相HPLCによって確認するとともに、高純度の酸化型OC評品を得る作業を行っている。構造解析の第一段階としてCDスペクトルのpH変化および熱変性過程の解析を進めており、熱力学パラメーターの算定を行った。ペルチェ式温度可変セルホルダーを用いることで精密な変性曲線を効率よく取得するシステムを構築した。骨由来ホルモンとして重要なGlu型OCであるが、これまで溶液中では構造をもたないと考えられてきた。最近のX線結晶解析によるGlu型OCのCa配位Gla型OC類似の構造は結晶場の束縛による可能性があり、Glu型OCは溶液中では揺らいだ構造をとっていることが予想される。構造形成を促進するTFE等を加えることによるスペクトル変化の解析から構造形成の取りやすさ(intrinsic helical propensity)の解析を進めている。OCはγカルボキシグルタミン酸(Gla)と呼ばれるカルシウムイオンにキレート配位するアミノ酸残基をもっている。骨中ではOCはGla型で存在するが、破骨細胞による骨吸収の際には、ハイドロキシアパタイト(HA)を溶解するために酸が分泌され、酸性環境でOC中のGla残基は脱炭酸してグルタミン酸(Glu)になる。このGlu型のOCが血中に吸収され、他臓器に作用してホルモン活性を示す。血中には、全長のGlu型OCの他に、破骨細胞の酵素によってArg19-Arg20の間が切断されたフラグメントが存在する。その結果切断フラグメントではなく、活性型ホルモンである全長のGlu型OCの血中濃度が上昇することから、酸性Gla型OCの立体構造を明らかにすることは重要である。我々は、非標識のウシOCの天然評品について、酸性条件化で構造形成することを1次元NMRで示した。更に詳細な解析を行うことが本研究の目的の一つである。

溶液中でもGlu型OCがGla型OCに類似した構造をとるかはホルモン活性発現機構と関連して重要である。安定同位体標識したGlu型OCについて多核多次元NMRによる構造解析を目指す。骨中に存在するGla型OCは、Caイオンと結合しており、αへリックスを含むコンパクトな構造をとることがX線結晶解析とNMRによって明らかになっている。またEDTAでCaイオンを除くとランダム構造になることがCD等によって示されている。一方、我々のNMRによる酸性状態のGla型OC(Caイオンは外れている)の予備的な研究によって、酸性状態ではCaイオン結合状態と同じ程度に構造形成していることがわかっていた。平成27年度は、酸性Gla型OC構造解析の第一段階としてCDスペクトルのpH変化および熱変性過程の解析を進め、熱力学パラメーターの算定を行った。ペルチェ式温度可変セルホルダーを用いることで精密な変性曲線を効率よく取得するシステムを構築した。骨由来ホルモンとして重要なGlu型OCであるが、CDスペクトルから溶液中では構造をもたないと考えられてきた。最近のX線結晶解析では、Ca配位Gla型OC類似の構造をとっていることが示された。X線結晶解析の著者はCDが溶液の濁りや塩濃度の影響を受けて正しくない結果を与えることがあるとしているが、X線結晶解析では結晶場の束縛によって構造が変化する可能性があり、NMRによる溶液中の構造解析やペプチド鎖の運動性解析が必要である。しかしながら、運動性の大きいGla型OCの1H-NMRスペクトルは解析が困難であったことから、Glu型OCではさらに難しいと予想される。この問題を乗り越えるには15Nと13Cで標識して多核多次元NMRを測定することが最も望ましい方法と考えられる。平成28年度は、安定同位体標識のためにGlu型OCを大腸菌で大量発現する条件を探索してきた。困難を極めたが、年度末にやっと良い条件を見出すことができた。オステオカルシン(OC)は骨芽細胞で作られ、骨形成に関与する蛋白質として認識されてきた。最近、OCが膵臓のβ細胞に対してホルモンとして働き、糖代謝をも制御することが提案され、再び脚光を浴びている。OCはγカルボキシグルタミン酸(Gla)と呼ばれるカルシウムイオンにキレート配位するアミノ酸残基をもっている。骨中ではOCはGla型で存在するが、破骨細胞による骨吸収の際には、ハイドロキシアパタイト(HA)を溶解するために酸が分泌され、酸性環境でOC中のGla残基は脱炭酸してグルタミン酸(Glu)になる。このGlu型のOCが血中に吸収され、他臓器に作用してホルモン活性を示すと考えられている。酸性Gla型OCの構造解析のため、CDスペクトルの熱変性過程の測定のためのシステム構築を行い、得られたデータから熱力学パラメーターの算定を行った。安定同位体標識したGlu型OCを用いて多核多次元NMRを測定することにより溶液中での立体構造解析を目指した。多核多次元NMRの測定から距離情報を集めて行った構造計算の結果得られた構造は既に報告されているX線結晶解析の結果と類似していたが、2種類の構造が共存していることが示唆される結果であった。Gla型、Glu型ともに、既知の構造解析情報では、N端領域は自由度の高い構造をとっていることが知られている。
ESI増強重水素標識をキーとする脂質代謝異常症SLOSの新規診断マーカー解析

今年度は当初の計画通りに,SLOSの診断マーカー候補化合物の合成を進めた.特に,コレステロールは各種ステロイドホルモン及び胆汁酸へと変換される過程で側鎖酸化代謝物を経由することが知られている.この知見を基盤として,7-デヒドロコレステロール(7-DHC)の側鎖26位に水酸基を有する26-ヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール(26-OH-7-DHC)を合成の対象とした.本化合物の合成ルートとして,市販の胆汁酸ヒオデオキシコール酸(HDCA)を出発として,1ステロイド側鎖の伸長:すなわちHDCAから6段階で鍵中間体である3,6-(OH)2-27-COOH体を合成.2ステロイド骨格の変換:次いで,この鍵中間体から6段階で3位水酸基の立体配置をβへと反転と,5,7-ジエンの導入,側鎖カルボキシ基の還元を行い,15工程で目的の26-OH-7-DHCの合成を達成した.さらに昨年度合成した7-DHC類縁体が共通して有する共役ジエンに対する新規ESI増強試薬ジエチルアミノメチルフェニル-1,2,4-トリアゾリン-3,5-ジオン(DEMPTAD)のLC/ESI-MS/MSにおける性能評価も行った.その結果,7-DHC及びその酸化成績体を原料とした時に,誘導体化前と比較して250倍の感度向上を達し,S/N ≧5を与える検出限界は注入量当たり250 fgであり,既存の試薬を凌駕した.これと並行して,SLOSモデルラットの作成を行った.すなわち,7-デヒドロコレステロール還元酵素阻害剤AY9944を妊娠ラットに注射し,産まれた仔ラットに定期的にAY9944を注射することでSLOSモデルラットの作成を行った.その後,速やかに血清,肝臓,脳の採取を行った.本年度までにSLOSの診断マーカー候補化合物として申請者が予想している,モノヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール5種の標品合成[4α-, 4β-, 24S-,25-及び26-OH-7-DHC]を達成し,これらの化合物と特異的に反応する新規のESI増強誘導体化試薬DEMPTADも準備できた.さらに現在はこれら化合物のLC/ESI-MS/MS分離条件の検討段階まで到達しているため,概ね順調に進展していると判断する.本申請課題の計画最終年である今年度は,これまで得られた5種のステロイド標品と7-デヒドロコレステロール還元酵素阻害剤であるAY9944を投与して作成したSLOSモデルラット血清,肝臓ホモジナイズ,脳ホモジナイズから診断マーカーの特定とその定量法開発を行う.これらはMS/MSにおいては全く同一の挙動を示すためにMS/MSでは弁別ができない,そこで先ずはLC/ESI-MS/MSにおいてこれら5種の診断マーカー候補化合物のLC分離条件を検討した後,各生体試料中におけるこれらの存否を明らかにし,SLOSモデルラットに特異的に検出されるモノヒドロキシ-7-デヒドロコレステロールのみ網羅的に定量を行う予定である.当初の計画に従い,本年度は申請課題が対象とする先天性Smith-Lemli-Opitz症候群(SLOS)の新規診断マーカーとして期待される24S-ヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール(24S-OH-7-DHC)の合成に着手した.その合成経路としては,比較的に安価に入手可能な市販ヒオデオキシコール酸を出発物質とし,SN2反応を利用して母核ステロイドの構築,すなわち3β-ヒドロキシ-5-エンの合成後,側鎖伸長反応に付し,AD mix-αによるSharpless不斉エポキシ化反応を活用して,24S-ヒドロキシ基の導入をした.最後に1,3-Dibromo-5,5-dimethylhydantoinとAIBN存在下でステロイドのC-7位に臭素を導入し,続くTBAB,TBAFで処理することで5,7-ジエンの導入に成功した.最後にステロイド3位と24位の水酸基の脱保護を行う事で24S-OH-7-DHCの合成を達成した.一方で,コレステロール不全症で高値を示す7-dehydrocholesterol (7-DHC)などのs-cis-ジエン化合物のLC/MS/MS分析に対しては感度向上を目的として種々のCookson型誘導体化試薬が用いられる.先に我々は,高いプロトン親和性(PA)を有するジメチルアミノフェニル基を導入したDAPTADを合成し,これを用いると,ESIでより高感度な応答が得られることを報告した.しかしながら,測定対象によってはさらなる高感度化が必須である.そこで今回,更なる高感度化を目指し,より高いPAを有するジエチルアミノメチルフェニル基を導入した新規Cookson型試薬4-(4-diethylaminomethyl)-1,2,4-triazoline-3,5-dione(DEMPTAD)の合成にも着手し,これにも成功した.当初の計画通り,SLOSの新規バイオマーカー候補化合物の一つである24S-OH-7-DHCの合成に成功した.さらには本研究課題の鍵である高プロトン親和性Cookson型試薬の合成にも着手し始めることができた.いくつかの新規Cookson型誘導体化試薬を合成し,7-DHCと反応させて,LC/ESI-MSによる誘導体化試薬の感度向上能を算出した.その結果と各試薬分子の量子計算から算出されたPAとを比較したところ,両者の間には正の相関があることを見出した.すなわち誘導体化試薬のESI-MSにおける高感度化試薬の効率的なデザインにはPAの導入が有効であることを見出すことができた.

この知見はESIで超高感度検出が要求される場合のESI用誘導体化試薬の効率的なデザインに極めて有効に活用できるため,H30年度から本格的に開始するバイオマーカー候補化合物の最適な高感度化試薬の合成をスムーズに行えるものと考えられるため,現在までの進捗状況は順調であると判断した.今年度は当初の計画通りに,SLOSの診断マーカー候補化合物の合成を進めた.特に,コレステロールは各種ステロイドホルモン及び胆汁酸へと変換される過程で側鎖酸化代謝物を経由することが知られている.この知見を基盤として,7-デヒドロコレステロール(7-DHC)の側鎖26位に水酸基を有する26-ヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール(26-OH-7-DHC)を合成の対象とした.本化合物の合成ルートとして,市販の胆汁酸ヒオデオキシコール酸(HDCA)を出発として,1ステロイド側鎖の伸長:すなわちHDCAから6段階で鍵中間体である3,6-(OH)2-27-COOH体を合成.2ステロイド骨格の変換:次いで,この鍵中間体から6段階で3位水酸基の立体配置をβへと反転と,5,7-ジエンの導入,側鎖カルボキシ基の還元を行い,15工程で目的の26-OH-7-DHCの合成を達成した.さらに昨年度合成した7-DHC類縁体が共通して有する共役ジエンに対する新規ESI増強試薬ジエチルアミノメチルフェニル-1,2,4-トリアゾリン-3,5-ジオン(DEMPTAD)のLC/ESI-MS/MSにおける性能評価も行った.その結果,7-DHC及びその酸化成績体を原料とした時に,誘導体化前と比較して250倍の感度向上を達し,S/N ≧5を与える検出限界は注入量当たり250 fgであり,既存の試薬を凌駕した.これと並行して,SLOSモデルラットの作成を行った.すなわち,7-デヒドロコレステロール還元酵素阻害剤AY9944を妊娠ラットに注射し,産まれた仔ラットに定期的にAY9944を注射することでSLOSモデルラットの作成を行った.その後,速やかに血清,肝臓,脳の採取を行った.本年度までにSLOSの診断マーカー候補化合物として申請者が予想している,モノヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール5種の標品合成[4α-, 4β-, 24S-,25-及び26-OH-7-DHC]を達成し,これらの化合物と特異的に反応する新規のESI増強誘導体化試薬DEMPTADも準備できた.さらに現在はこれら化合物のLC/ESI-MS/MS分離条件の検討段階まで到達しているため,概ね順調に進展していると判断する.先に我々が合成を達成した4α-,4β-OH-7-DHCまたはH29年度に合成した24S-OH-7-DHC,H30年度から合成を開始する3β-OH-5,7-dien-24-oic acid及び3β-OH-5,7-dien-27-oic acidはs-cis-ジエンを有することから,その高選択的・高感度検出にはこれと特異的に反応する1,2,4-triazoline-3,5-dione誘導体(Cookson型試薬)が高感度化試薬として有用と考えられる.より高感度化のために,先にも述べたPAに基づき,試薬分子のPAを量子計算で算出し高いPAを有したものを選択し,かつ重水素導入可能部位を持つ新規試薬をデザイン・開発する.これにはDEMPTADが有望と考えられ,重水素標識アナ.重水素の導入にはアミノメチル安息香酸ブロミドに重水素標識化されたジエチルアミンを作用させて達成する予定である.
TLR-4を介するシグナル伝達系の口腔癌発生への関与

口腔細菌が起こす免疫反応が口腔癌の一つの誘因であり、TLR-4を介したシグナルが口腔内の癌化と深く関わっていると考え口腔内細菌による炎症性反応と口腔癌の関連性を探るためTLR-4を介したシグナル伝達に注目した。TLR-4シグナル伝達分子であるMyD88、及びTLR-4によるシグナルで活性化されるJNK1/2を制御する脱リン酸化酵素である、MAP kinase phosphatase-macrophage(MAPK-M)にターゲットを絞った。MyD88の遺伝子改変マウス及びMKP-Mの遺伝子改変によりMKP-Mを不活化させたマウスを用い、発癌剤4-nitroquinoline 1-oxide(4-NQO)によって口腔癌を誘発した。MyD88遺伝子改変マウスでは、4-NQO誘導性の舌の腫瘍の発生が減少した。さらに、MKP-Mの活性をなくしたマウスでは、コントロールより大きな腫瘍が認められた。そして、これらの舌からtotal RNAを取り出し、逆転写PCRおよびreal time PCRを行ったところ、癌原遺伝子であり、肝細胞増殖因子(HGF)の受容体でもあるc-metの発現が、4NQO処理マウスでは多く認められた。一方MyD88遺伝子改変マウスではc-metの発現は少なく、さらにMKPM遺伝子改変マウス舌ではc-metの発現はさらに多くなっていた。次に、MyD88遺伝子改変マウスの歯肉より線維芽細胞をoutgrowthにより増殖させ培養を行った。そして、癌成長因子でもあるHGFの発現調節をIL1βまたはLPSにて刺激を行った。これら培養線維芽細胞よりmRNAを取り出し、HGF及びc-metの遺伝子発現を検討した。その結果、MyD88遺伝子改変マウス歯肉からとられた線維芽細胞は、IL1やLPSによってHGFやc-metの発現の変化はなかった。一方、コントロールマウス及びMKP-M遺伝子改変マウスより得られた線維芽細胞は、従来の報告通りIL1及びLPSによってHGFの発現上昇が認められた。これらの知見は、MyD88が炎症性サイトカインIL1シグナルやLPSによるTLR-4シグナルの伝達系において重要な役割を果たしていることが確認され、HGFという増殖因子発現上昇においてもMyD88の役割の重要性が示された。以上のことから、口腔癌においても細菌感染による炎症誘発に関わるシグナル伝達分子が何らかの役割を示していることが明らかとなった。そしてその原因の候補となる分子が、癌細胞の増殖因子であるHGFそしてその受容体であり原癌遺伝子でもあるc-metである。本研究では口腔細菌のTLR-4を介した免疫反応が口腔内の癌化と深く関わっていると考え、TLR-4の必須のシグナル伝達分子であるMyD88に注目し、口腔癌発生との関わりを検討した。MyD88ノックアウトマウスを交配によって繁殖させ、PCR法によりMyD88ノックアウトマウスであることを確認した。そして発癌剤をMyD88ノックアウトマウスに数週間飲料水として飲ませた。

肉眼的に口腔内の腫瘍の発生を観察したところ、コントロールマウスでは現れる舌辺縁部の癌形成はMyD88ノックアウトマウスにおいて認められなかった。そして舌を取り出しヘマトキシリン・エオジン染色にて観察したところ、異形成を伴った前癌病変さえも認められなかった。このことから、MyD88は舌癌形成に必要であることが示唆された。次に舌癌で上昇が認められる肝細胞増殖因子HGFのシグナルとMyD88の関係を検討するため、発癌剤で処理をしたMyD88ノックアウトマウスの舌からmRNAを採取し、癌原遺伝子でありHGFの受容体でもあるc-metの誘導、及びHGFの発現を検討した。その結果、それらの増加は認められなかった。このことからMyD88は舌癌におけるHGFのシグナルと深く関わっていることが判明した。そこでMyD88ノックアウトマウスではHGFの産生が増強しない理由を、口腔内常在菌がHGFの産生増強する際に、MyD88が必要との仮説を立てた。すなわちMyD88ノックアウトマウスから線維芽細胞を培養し、細菌刺激によって増強するHGFの産生増強の変化を調べたところ、MyD88ノックアウトマウスの線維芽細胞ではHGF産生が上昇しなかった。以上の結果から、MyD88はHGFシグナルを介して舌癌増殖を促しているものと考えられる。口腔内細菌による炎症性反応と口腔癌の関連性を探るためTLR-4を介したシグナル伝達に注目した。特に、TLRシグナル伝達分子であるMyD88、及びTLR-4によるシグナルで活性化されるJNK1/2を制御する脱リン酸化酵素である、MAP kinase phosphatase-macrophage(MAPK-M)にターゲットを絞った。MyD88の遺伝子改変マウス及びMAP-Mの遺伝子改変によりMKP-Mを不活化させたマウスを用い、発癌剤4-nitroquinoline 1-oxide(4-NQO)によって口腔癌を誘発し、コントロールマウスと比較した。組織学的観察の結果、4-NQOによってコントロールマウスの舌では腫瘍の発生が確認され、また細菌感染のシグナル経路を減弱させた、MyD88遺伝子改変マウスの舌では腫瘍の発生が減少した。さらに、細菌感染のシグナル経路の抑制分子MKP-Mの活性をなくしたマウスでは、コントロールより大きな腫瘍が認められた。そして、これらの舌からtotal RNAを取り出し、逆転写PCRおよびreal time PCRを行ったところ、癌原遺伝子であり、肝細胞増殖因子(HGF)の受容体でもあるc-metの発現が、4NQO処理マウスでは多く認められた。一方MyD88遺伝子改変マウスではc-metの発現は少なく、さらにMKPM遺伝子改変マウスの舌ではc-metの発現はさらに多くなっていた。この現象は組織所見と一致する次に、MyD88ノックアウトマウスの歯肉より線維芽細胞をoutgrowthにより増殖させ培養を行った。
シデロフォアの網羅的多様性解析と難培養性細菌の増殖培養への応用に関する研究

CAS(クロムアズールS含有)培地および我々が開発したHybrid-CAS培地により、多くのグラム陰性菌、陽性菌のシデロフォア産生菌を簡便にスクリーニングする系を確立することができた。それを使って、グラム陰性菌170株およびグラム陽性菌220株を試験したところ、グラム陰性菌88株、グラム陽性菌53株においてシデロフォア産生を検出した。シデロフォア産生率としてはグラム陰性菌が51.8%、グラム陽性菌が24.1%であり、多様なグラム陰性菌がシデロフォアを産生している傾向が見られた。今まで多様なグラム陽性菌でシデロフォア産生をスクリーニングした知見はなく、今回初めて、グラム陰性菌の方がより多くのシデロフォア産生をしていることを明らかにすることができた。また、この中には、これまで知られていなかった嫌気性菌でシデロフォアを産生している菌も含まれており、新知見を見出すことができた。現在分子種の特定を行っている。環境由来のシデロフォア産生の未同定株について、分類学的検討も実施を始めた。16SrRNA配列に基づく分類学的な位置については、Pseudomonas属に近い系統位置を示したが、既存菌種とは類似度が低く、新菌種である可能性が高いことが判った。Pseudomonas属菌は、シデロフォアを産生している事が多く、環境中においても、シデロフォアを産生し、他菌種菌株の発育に影響を与えている可能性が高い。分類学的位置の精査、新分類群であればその正式提案、さらにシデロフォアの分子種決定に着手する予定である。岐阜大学のライブラリーを使用し多様な菌種のシデロフォア産生菌の確認を行う予定であったが、岐阜大学の改組等に伴い菌株保存施設の使用許可を得るのに時間を要している。環境由来のシデロフォア産生の未同定株について、分類学的検討を行う予定であったが昨年度実施のための時間が十分ではなかった。次年度より学生・教員にも参加してもらい、効率良く進める予定である。研究成果が十分に得られていないので、1年間の期間延長を申請し、受理された。次年度は、岐阜大学のライブラリー使用再開について早急に調整し、多様な菌種のシデロフォア産生の確認を行う。環境由来のシデロフォア産生の未同定株について、分類学的な位置の確認、シデロフォアの分子種の特定を行う。難培養性細菌の増殖培養へ応用実験について、海外の研究者を含め情報収集を再度行い、適する実験系を構築し、試験を実施する。シデロフォア産生の有無を検出するための培地について検討を行った。グラム陰性菌ではCAS培地にて検出可能であったが、グラム陽性菌については発育阻害が見られ、CAS法の変法であるO-CASやD-CASなどの有用性について、検討を行っている。鉄除去培地の作成については、鉄結合性ポリマーを利用した鉄除去法を行った。その結果、鉄含有量は、非常に少なくなったが、まだ微量の鉄が残り細菌の発育に差が見られなかったため、さらに鉄キレート剤を培地に添加する方法を実施している。環境からの新規シデロフォア産生菌の検出については、湖水ならびに土壌からの細菌の分離を行っている。数百におよぶクローンを試験した結果、10株程度のシデロフォア産生の新種と思われる菌株が得られており、新規シデロフォア検出の可能性を見出すことが出来た。シデロフォア検出法が、複数必要であることが判り、適する検査法の策定に時間を要した。また鉄除去についても微量残留鉄の問題が有ることが判明した。シデロフォア関連遺伝子のノックアウト株の構築を行った。昨年度の研究において、当講座保有の大腸菌には、Enterobactin遺伝子のみ保有株、さらにSalmochelin遺伝子も同時に保有する株、Enterobactin、Salmochelin、Yersinibactin、Aerobactinの4遺伝子を保有する株が有ることが判っている。そこでEnterobactin遺伝子のみ保有株に対してEnterobactin遺伝子EntCを欠損させた菌株を作成することとした。現在EntC遺伝子の欠損株作成用のベクターがほぼ構築されたので、本年度早々にtransformを行う。シデロフォア産生を確認する最も容易な方法はCAS(クロムアズールS含有)培地上での発育と色調の変化であるが、グラム陽性菌に対してCASは発育阻害を起こすため使用できない。そこでCAS培地と通常の栄養培地を併用したhybrid培地を作成した。種々の栄養培地を試し、最も多様な菌種に対応(発育およびCAS色調変化確認可能)できるhybrid培地を構築することができた。グラム陽性菌でシデロフォア産生確認培地が構築できたことで、グラム陰性菌のみならずグラム陽性菌までの多様な菌種のシデロフォア産生確認を容易に行える様になった。現在30菌種40株程の測定が終わっている。シデロフォア分子の単離生成方法の確立について検討を行った。鉄欠乏状態での培養時間によるシデロフォアの産生量を測定し、最も多量に産生する条件設定を行った。さらに培養上清をフィルターろ過後、イオン交換樹脂を用いたカラム精製を行い、粗抽出物を得ることが出来た。今後HPLCでさらに精製し、NMRによる構造解析まで方法論を確立する。

岐阜大学のライブラリーを使用し多様な菌種のシデロフォア産生菌の確認を行う予定であったが、岐阜大学の改組等に伴い菌株保存施設の使用許可を得るのに時間を要している。今年度早々には許可が得られると期待している。環境由来のシデロフォア産生の未同定株について、分類学的検討を行う予定であったが昨年度実施のための時間が十分ではなかった。今年度より学生・教員にも参加してもらい、効率良く進める予定である。CAS(クロムアズールS含有)培地および我々が開発したHybrid-CAS培地により、多くのグラム陰性菌、陽性菌のシデロフォア産生菌を簡便にスクリーニングする系を確立することができた。それを使って、グラム陰性菌170株およびグラム陽性菌220株を試験したところ、グラム陰性菌88株、グラム陽性菌53株においてシデロフォア産生を検出した。シデロフォア産生率としてはグラム陰性菌が51.8%、グラム陽性菌が24.1%であり、多様なグラム陰性菌がシデロフォアを産生している傾向が見られた。今まで多様なグラム陽性菌でシデロフォア産生をスクリーニングした知見はなく、今回初めて、グラム陰性菌の方がより多くのシデロフォア産生をしていることを明らかにすることができた。また、この中には、これまで知られていなかった嫌気性菌でシデロフォアを産生している菌も含まれており、新知見を見出すことができた。現在分子種の特定を行っている。環境由来のシデロフォア産生の未同定株について、分類学的検討も実施を始めた。16SrRNA配列に基づく分類学的な位置については、Pseudomonas属に近い系統位置を示したが、既存菌種とは類似度が低く、新菌種である可能性が高いことが判った。Pseudomonas属菌は、シデロフォアを産生している事が多く、環境中においても、シデロフォアを産生し、他菌種菌株の発育に影響を与えている可能性が高い。分類学的位置の精査、新分類群であればその正式提案、さらにシデロフォアの分子種決定に着手する予定である。次年度より学生・教員にも参加してもらい、効率良く進める予定である。上述の問題については、ほぼ解決の目処が立ったので、今後精力的に進めていく。一また環境からは既に有用な新種と思われる分離株が得られているので、その分類並びにシデロフォア分子種の特定に進みたい。シデロフォア遺伝子欠損株の構築がほぼできているので、この株を使い、生育状態、鉄獲得状態、他の菌株から供給されるシデロフォアの利用具合などを確認する。グラム陰性・陽性を問わずシデロフォア産生を容易に確認できる方法論が確立できたので、当講座の菌株ライブラリーおよび岐阜大学のライブラリーを使って多くの菌種のシデロフォア産生能を確認する。シデロフォア分子の構造解析の方法論が出来つつあるので、環境由来の未同定株などから産生される新規のシデロフォア分子の構造決定も含め、シデロフォアの多様性について確認していく。研究成果が十分に得られていないので、1年間の期間延長を申請し、受理された。次年度は、岐阜大学のライブラリー使用再開について早急に調整し、多様な菌種のシデロフォア産生の確認を行う。
直接誘導骨芽細胞の疾患モデル動物への応用

顎骨腫瘍手術後の大規模骨欠損や歯周病に伴う歯槽骨吸収による歯牙喪失はQOL(quality of life)を著しく低下させる。近年、線維芽細胞から目的細胞へ直接誘導する技術(ダイレクト・リプログラミング)が報告され、申請者らも骨芽細胞への直接誘導の研究を行ってきている。本技術を最適化した上で、直接誘導による機能的な骨芽細胞を得ることができれば、今後の基礎的知見および臨床応用に生かすことができる。しかし、再生療法として用いるには、単に誘導骨芽細胞を注入するだけでは、細胞局所周辺環境が整っておらず、大規模な骨欠損や炎症性骨吸収部位に対しては十分な効果は得られない上に細胞移植手技も煩雑で失敗のリスクが高くなる。そこで抗炎症効果を併せ持つ誘導骨芽細胞を作成するとともに、適切なスキャホールドを併用して、骨欠損部に移植細胞を留め、誘導骨芽細胞の足場環境の炎症制御し、シンプルな細胞移植手法を開発することを目的とした。昨年度はダイレクト・リプログラミングに適した皮膚線維芽細胞の選定、およびレトロウィルスベクターへの抗炎症性サイトカインIL-10の導入を目標としたが、誘導骨芽細胞自体からの安定した抗炎症作用が認められなかった。今年度は線維芽細胞から抗炎症効果を発揮する骨芽細胞への直接誘導法を昨年度の試行研究から最適化するとともに、昨年度から確立された細胞とスキャホールドの接着方法を用いて、骨生体組織を体外で培養することを目標とする。その結果により大規模骨欠損および炎症性骨吸収疾患にも対応しうる、新たな骨再生細胞移植療法を確立できる可能性がある。レトロウィルスベクターに抗炎症性サイトカインIL-10の導入が困難となっているため。今後の研究方針としてはレトロウィルスにIL-10以外の抗炎症性サイトカインの導入も考慮する。また、レトロウィルスベクター以外にもプラスミドベクターで導入可能か今後精査する。当初購入を予定していた、サイトカン測定キットの購入費が少なく済んだため。
レジオネラ属菌の潜在的リスクからみた高度浄水処理方式の選択

平成30年度では、平静29年度から継続して活性炭内でのレジオネラ再増殖試験に取り組んできたが、レジオネラ属菌感染に対する安全性を考慮し、試験内容を一部変更し、再度粒状活性炭内でのレジオネラ属菌再増殖に関するミニカラム試験を実施した。変更内容はレジオネラを添加した試料水を循環させるカラム試験から、2週間に一度の頻度でカラム内水を交換する方法に変更した。活性炭内へのバイオフィルム形成においては、3本のカラムを作成し、4ヶ月間馴致させた。その後、培養したレジオネラを添加し、1時間吸着操作を行い、その後1本のカラムはレジオネラ量の測定、2本のカラムは長期試験に供した。試験開始1ヶ月後より、交換水のレジオネラ量(遺伝子)を測定した。その結果、試験前の交換水からはほとんどレジオネラ遺伝子が検出されなかったが、試験2週間の交換水からは高濃度のレジオネラ遺伝子量が確認された。2ヶ月半で試験を終了し、活性炭内のレジオネラ量を測定した。その結果、吸着操作時の付着濃度より増殖している傾向が確認された。また、ビーズ破砕法でDNA抽出を行なっているが、超音波の有無で検出された遺伝子量が変化した。以上より、バイオフィルムが形成している粒状活性炭内ではレジオネラが再増殖する可能性が考えられ、さらに増殖は活性炭の表面でなく細孔内であることが推察された。また不活化試験に向けて各処理での試験条件とDAPI(全菌数)、CFDA(細胞内エステラーゼ活性)、PI(膜損傷)の染色条件を確定させた。また、試験方法変更に伴なって得られる再増殖データを踏まえたデータ解析方法について整理した。現在までの進行状況として、粒状活性炭を用いた長期試験について、レジオネラ属菌再増殖の可能性について指摘できた。しかし、試験方法の変更がありVBNC菌体を用いた長期試験は準備段階である。また、オゾン、促進酸化処理、紫外線単独処理の方法については、実験条件・操作手順・レジオネラの染色条件を決定し、データ確保が可能な状況である。数値解析については、その手順について整理できている状況である。以上を踏まえて、おおむね順調に進展していると判断した。2019年度では、活性炭内でのレジオネラ属菌変化(VBNC含む)に関する長期試験を実施し、データの蓄積を行う。オゾン、促進酸化処理(UV/H2O2処理)、紫外線単独処理による菌体状態(培養可能,VBNC)を踏まえた上での各処理によるレジオネラ属菌の変化も把握し、数値解析を行う上で必要な情報を蓄積する。これらの情報を用いて、数値解析により処理プロセス中のレジオネラ属菌の挙動を解析する。平成29年度では活性炭処理でのレジオネラ属菌の再増殖について,その基礎的検討をラボスケール実験を実施した。取り組みとしては、培養したレジオネラ属菌株について各温度条件下で(4°C、20°C、37°C)長期保存し、VBNC状態の菌株の作成を試みた。そしてBCYE寒天培地により培養可能な菌数の変化を確認するとともに、DAPI(全菌数)、CFDA(細胞内エステラーゼ活性)、PI(膜損傷)を用いて、菌体状況の確認を試みた。結果として、培養可能な菌数の減少速度としては37°Cが最も速い結果となったが、VBNC菌株試料の作製においては期間がかかるが、水温が低い条件下の方が確保できる可能性を示した。続いて、活性炭処理でのレジオネラ属菌の再増殖試験について、長期試験を試みた。その中でレジオネラ属菌の活性炭への吸着は確認された。現在長期試験を継続しており、今後増殖状況の確認を継続して行っていく。現在までの進行状況として、VBNC状態の菌株の判定方法とその作製方法について、バッチ試験により整理ができた状況である。その一方で、活性炭を用いた長期試験については吸着の確認はできたものの、活性炭内でのレジオネラ属菌の変化について試験方法の整理が遅れたため、現在進行中の状態となっている。しかし、平成30年度以降のVBNC菌体を用いた長期試験については準備可能な状況であり、また、平成30年度に実施予定であるオゾン、促進酸化処理、紫外線単独処理の方法については、装置の作製が平成29年度に終わり、既に実施可能な状況となっている。

2ヶ月半で試験を終了し、活性炭内のレジオネラ量を測定した。その結果、吸着操作時の付着濃度より増殖している傾向が確認された。また、ビーズ破砕法でDNA抽出を行なっているが、超音波の有無で検出された遺伝子量が変化した。以上より、バイオフィルムが形成している粒状活性炭内ではレジオネラが再増殖する可能性が考えられ、さらに増殖は活性炭の表面でなく細孔内であることが推察された。また不活化試験に向けて各処理での試験条件とDAPI(全菌数)、CFDA(細胞内エステラーゼ活性)、PI(膜損傷)の染色条件を確定させた。また、試験方法変更に伴なって得られる再増殖データを踏まえたデータ解析方法について整理した。現在までの進行状況として、粒状活性炭を用いた長期試験について、レジオネラ属菌再増殖の可能性について指摘できた。しかし、試験方法の変更がありVBNC菌体を用いた長期試験は準備段階である。また、オゾン、促進酸化処理、紫外線単独処理の方法については、実験条件・操作手順・レジオネラの染色条件を決定し、データ確保が可能な状況である。数値解析については、その手順について整理できている状況である。以上を踏まえて、おおむね順調に進展していると判断した。平成30年度では、活性炭内でのレジオネラ属菌の変化に関する長期試験を継続して実施し、データの蓄積を行う。また、最終年度へ向けたVBNC状態の菌株の活性炭内での変化に関する長期試験の開始に向けて試料調整等の準備を行う。また当初の計画通り、オゾン、促進酸化処理(UV/H2O2処理)、紫外線単独処理による菌体状態(培養可能,VBNC)を踏まえた上での各処理によるレジオネラ属菌の変化も把握し、最終年度に行う数値解析を行う上で必要な情報を蓄積する。2019年度では、活性炭内でのレジオネラ属菌変化(VBNC含む)に関する長期試験を実施し、データの蓄積を行う。オゾン、促進酸化処理(UV/H2O2処理)、紫外線単独処理による菌体状態(培養可能,VBNC)を踏まえた上での各処理によるレジオネラ属菌の変化も把握し、数値解析を行う上で必要な情報を蓄積する。これらの情報を用いて、数値解析により処理プロセス中のレジオネラ属菌の挙動を解析する。平成30年度分の必要物品の購入はできており、496円余剰がでた。その分については次年度の物品費(消耗品)の一部として使用予定である。
肺癌における分子標的としての上皮成長因子受容体遺伝子の薬剤感受性の耐性機序の解明

非小細胞肺癌670例,うち腺癌488例のEGFRのExon19delとExon21L858Rの変異を解析し,腺癌の37.7%に変異を認め,女性,非喫煙に多く,女性においてはL858R変異が有意に多いことが認められた。一方,EGFRの下流シグナルに位置するK-ras遺伝子変異は,喫煙者に多いことが示された。予後解析から,EGFR変異は,gefitinib治療効果良好予測因子であること,K-ras遺伝子は,gefitinib治療効果不良の予測因子であり,K-ras変異自体が予後不良因子であることを示した。2.Gefitinibに対する感受性に関する臨床試験と耐性発生機序に関する解析EGFR変異(19del,21L858R)を有する肺癌患者に対し,gefitinibを投与する前向き臨床試験を実施し,19例の登録を終了し解析を行なった。奏効率は63.2%,病勢コントロール率は89.5%,中間無増悪期間は7.1M,中間生存期間は20.0Mであり,EGFR変異例は,治療効果予測因子であるとともに,予後向上に寄与することが示された。Gefitinibが奏効した後に耐性となった7症例の腫瘍の解析で,5例にEGFRのexon20 T790M点突然変異を検出し,獲得耐性を規定する因子であると考えられた。また,19del症例でgefitinib耐性症例の腫瘍からExon20 G796A変異を検出し,in vitro解析でgefitinib耐性を確認し,耐性機序の一つの機序であることを報告した。1.EGFR遺伝子変異の高感度検出法の確立とGefitinib感受性・耐性に関する変異の同定PCRを基本としたmutant-allele specific anmplification法にて、exon21 L858R変異は、正常細胞1000個中に癌細胞1個の感度で検出可能な系を確立した。肺癌469例のEGFR遺伝子変異の解析を行い、腺癌の42.2%に変異を認め、女性、高分化型、非喫煙者もしくは既喫煙者に有意に多く認められ、EGFR変異は喫煙との関係が深いことを報告した。2.EGFR遺伝子変異のGefitinibに対する感受性と耐性機序の解明gefitinibを投与した非小細胞肺癌患者20名の原発肺癌のEGFR遺伝子変異の有無を解析し、9名の腫瘍にEGFR変異を認め、うち6名がexon19欠失で、3名がexon21 L858R点突然変異であった。Gefitinibの奏効率は、変異例9例中7例(77.8%)に対し、野生型症例11例に奏効例はなく、予後も有意に変異例で良好であった。また、gefitinibに奏効した症例で、後に耐性となった4症例の腫瘍のEGFR変異の有無について解析したところ、3例の耐性腫瘍にEGFRのexon207790M点突然変異を検出し、獲得耐性に関与する変異と考えられた。当研究室で樹立した肺癌細胞株21種のEGFR変異を解析し、うち1例にexon19欠失、1例にexon21 L858R点突然変異を認めた。今後これらの肺癌細胞株を用いて、感受性と耐性のin vitro assayに用いる予定である。