hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
持続可能な社会構築を担う学校モデルの探究－韓国農山村の小規模校存続事例に着目して

本研究は、持続可能な社会構築を担う学校モデルを探究するために、小規模校の活性化策を講じている韓国の事例を研究対象にした。韓国の取組みの特徴として、主に1教育福祉原理の導入2学校自律権の拡大3小規模校を支える民間組織の存在の3点を指摘することができる。本研究では、小規模校を支える民間運動組織の「小さな学校教育連帯」を研究対象に据え、連帯が戦略として、人事権や教育課程編成権など自律化政策を活かした学校づくりを進めている点に着眼した。そこで、自律権が行使できる制度的背景として、教員と行政職員の二元体制からなる教職員組織を捉え、公募校長、招聘教員の運用方法の実態を明らかにした。中山間地域における人口減少や地域の空洞化が進行し、学校統廃合がそれに追い打ちをかける状況にある。だが、「田園回帰」と呼ばれる現象も起きている。こうした流れを支援し、循環型の、持続可能な社会を構築するインフラとして学校を機能させていくには、どのような理念、仕組み、方法、組織が必要となるのか。本研究は、小規模校の再生に止まらず、学校と地域双方の革新を図る取組みを展開している韓国の小規模校存続事例に着目し、持続可能な社会構築を担う学校モデルを探究することを目的としている。27年度における日本研究では、1中山間地域の人口社会増地域に関する資料収集及び先行研究のレビュー2中国地方の中山間地域における住民自治の先進事例分析を進めた。住民自治の仕組みを築き、経済、福祉等多様な活動を展開する先進事例が見いだされたが、住民自治が公教育のあり方にも生かされる仕組みにはなっていない。一方、韓国については、1「小さな学校連帯」に加盟している18小学校(2015年4月1日現在)の基本データの収集2「小さな学校連帯」を牽引してきた京畿道広州市の南漢山小学校、忠清南道牙山市の巨山小学校、全羅北道完州郡の三友小学校の事例分析3進歩教育監の小規模校活性化政策の把握に努めた。これらの基礎的な作業を通して、小規模校存続の成功要因として、地域住民、保護者の積極的な学校運営の参加と教員の献身的な努力、そして三者の協働関係が実を結んだ教育プログラムを捉えることができた。今後の課題は、それらを可能にする組織体制の分析を進めることである。加盟校の基本データから、教職員数における事務職員数の占める割合が日本よりも高いことが明らかになった。そのため、事例分析をさらに深め、日本への示唆を得るべく韓国の自律学校政策(人事権・教育課程編成権・予算権の学校への権限委譲)が持つ小規模校対策の側面を検証していく予定である。本研究課題は、3カ年で循環型の、持続可能な社会を構築するインフラとして学校を機能させていくための理念、仕組み、方法、組織を探究することにある。そこで本研究では、2005年に結成された韓国の「小さな学校教育連帯」に着目している。同組織は、小さな学校を守るだけでなく、受験中心の競争的な公立学校をリモデルし、学校と地域双方の革新を目指す民間組織である。27年度は、同組織の基礎的データを収集分析し、現地視察及び調査に入る準備作業を進めることができた。また、日本の「田園回帰」の現状、分散型地域社会を支えるシステムについての研究及び取組み状況の把握に努め、日韓比較を進めるための観点整理を進めることができた。さらに、日韓の共同研究者が情報を共有できるように入手した資料や執筆した報告書の翻訳作業を進め、共同研究を進める態勢を準備することができた。以上の理由から「おおむね順調に進展している」との達成度評価ができる。本研究は、持続可能な社会構築を担う学校モデルを探究することを目的とし、小規模校の再生に止まらず、学校と地域双方の革新を図る取組みを展開している韓国の小規模校存続事例に着目している。韓国政府は小規模校の活性化策として学校自律化策を採用してきたが、本研究では、学校に付与された一定の人事権・教育課程編成権・予算権を駆使して、小さな学校の再生に取り組んできた、「小さな学校教育連帯」(以下連帯と略)の取組みに着目している。連帯は2005年に結成された民間組織で、小さな学校を守るだけではなく、受験中心の競争的な学校から子どもの学びと生活を基軸に据えた学校に再構造化し、革新を図ることを目指してきた。2014年の教育監選挙で政府の統廃合政策に反対する進歩的教育監が多く生まれたことによって、草の根的に取組まれてきた連帯の学校づくりが、「革新学校」として制度化され、全国的な広がりを見せている。そこで、2016年度は、1連帯や「革新学校」の現況2学校自治の実際、を明らかにすることをねらいとして、連帯のモデル校である京畿道広州市にある南漢山小学校、同校を管轄している広州河南教育支援庁、連帯の主要メンバーへのインタビュー調査を実施した。調査によって得られた知見は以下の通りである。革新学校の制度化によって、連帯の教育理念を実現させるための教職員配置や独自の予算措置が可能になっており、そうした学校自治を制度上支えているのが、学校会計制度、校長公募制・教員招聘制、そして学校運営委員会である。さらに、教職員組織は教員と行政職員の二元体制からなっており、それが学校の責任と権限において予算が執行できる学校会計制度を機能させている。

本研究では、韓国の「小さな学校教育連帯」に着目し、27年度は、同組織の基礎的データを収集分析し、現地視察及び調査に入る準備作業を進め、28年度は現地調査を実施することができた。韓国の小規模校の再生は、「学校自治」がキーワードであり、現地調査により、そのための仕組みや組織を具体的に把握することができた。以上の理由から「おおむね順調に進展している」との達成度評価ができる。本研究は、持続可能な社会構築を担う学校モデルを探究するために、学校の小規模校化が進む中で、小規模校の活性化の取組みを進めている韓国の事例を研究対象にした。韓国の小規模校活性化政策の特徴として、1教育福祉原理の導入2学校自律権の拡大3小規模校を支える民間組織の存在の3点を指摘することができる。本研究では、小規模校を支える民間運動組織の「小さな学校教育連帯」(2005年結成、以下「連帯」)を研究対象に据え、連帯が戦略として、人事権や教育課程編成権など自律化政策を活かした学校づくりを進めている点に着眼した。最終年度は、連帯加盟校17校中4校が存在し、革新のベルト化と称してネットワークを構成しているヤンピョン地域に焦点を当て、ベルト化の中心人物である西宗小学校長と西宗中学校長にインタビューを実施し、ベルト化の実態と仕組みを明らかにした。研究期間全体を通した「連帯」のモデル校への訪問調査及び「連帯」代表をはじめとする関係者のインタビュー調査によって、1公募校長、招聘教員の運用方法の実態、2自律権を行使できる制度的背景を明らかにした。1については、連帯が、自律化政策を最大限生かし、自律学校の指定を受け、人事権の裁量を活かして、農村教育に情熱を持っている教員たちが公募校長や招聘教員として一つの学校に集まり、連帯の教育理念を実現させていることを捉えた。2については、教員と行政職員の二元体制からなる教職員組織が背景要因にあることを明らかにした。本研究は、持続可能な社会構築を担う学校モデルを探究するために、小規模校の活性化策を講じている韓国の事例を研究対象にした。韓国の取組みの特徴として、主に1教育福祉原理の導入2学校自律権の拡大3小規模校を支える民間組織の存在の3点を指摘することができる。本研究では、小規模校を支える民間運動組織の「小さな学校教育連帯」を研究対象に据え、連帯が戦略として、人事権や教育課程編成権など自律化政策を活かした学校づくりを進めている点に着眼した。そこで、自律権が行使できる制度的背景として、教員と行政職員の二元体制からなる教職員組織を捉え、公募校長、招聘教員の運用方法の実態を明らかにした。今後の研究推進方策としては、「小さな学校教育連盟」の事例研究を進める。27年度の研究実績から、学校と地域双方の革新が図られている要因として学校の組織体制があることが示唆された。加盟校は自律学校もしくは革新学校指定校でもあるため、学校に一定の人事権・教育課程編成権・予算権が付与されている。加盟校の基本データから、教職員数における事務職員数の占める割合が日本よりも高いことが明らかになった。そのため、学校の組織体制における事務部門にも着目し、研究課題の学校モデルの探究を進める予定である。今後の研究推進方策は、持続可能な社会を構築するインフラとして学校を機能させていくための理念について分析を深めていくことにある。
保護性皮膜志向型の成分設計指針に基づく水素脆化抑制

環境助長割れ環境に対して高い保護性が期待できる酸化物を対象として、水素溶解度が低い酸化物種を調査した。その結果、ステンレス鋼表面に形成しうる酸化物の中では、Cr2O3が最も高い水素透過防止性能を有すると判断した。複数の異なる表面処理ならびに酸化処理を施したステンレス鋼を対象として電気化学的水素透過試験を実施し、酸化皮膜の水素透過抑制効果を評価した。厚さがナノメートル・スケールのCr系酸化物皮膜が形成されることで、水素透過電流が大幅に減少することが明らかになった。また、表面研磨処理条件によって水素透過電流の挙動が異なり、これは形成される酸化皮膜の保護性の違いに起因すると考えられた。本研究は、鉄鋼材料の水素脆化を対象として、使用環境に応じた成分設計に基づく保護性皮膜志向型の新しい材料開発指針を探索し、酸化皮膜の保護性の観点から、耐水素脆化特性に優れた鉄鋼材料成分を提案すると共に、想定された使用環境における水素脆化抑制効果を評価することを目的としている。平成24年度は、環境助長割れ環境に対して高い保護性が期待できる酸化物(例えば、Al2O3、Cr2O3、Fe-Crスピネル系酸化物などを想定)を対象として、文献情報の収集・精査に基づいて水素溶解度が低い酸化物種を調査した。その結果、水素透過防止に寄与する酸化物としてAl2O3またはCr2O3の水素透過防止性能が比較的高く、Al2O3は最大でCr2O3の100倍程度の水素透過防止性能を有すると判断した。よって、今後は上記2種の酸化物が安定維持される化学組成ー環境条件の範囲を検討することが重要と考えられた。平成25年度は、電気化学水素透過試験セルを作製し、複数の異なる表面処理ならびに酸化処理を施したフェライト系ステンレス鋼SUS430を対象として水素透過試験を実施し、酸化皮膜の水素透過抑制効果を評価した。その結果、厚さナノメートル・スケールのCr系酸化皮膜が水素透過電流を大幅に減少させることが明らかとなった。さらに、同一試料において表面研磨処理条件によって形成される酸化皮膜の保護性(緻密性)が異なることが示唆された。すなわち、表面近傍の冷間加工度を適切に調節することで、耐水素脆化特性に優れた鉄鋼材料成分の範囲を拡大することが可能であると考えられた。今年度は、環境助長割れ環境に対して高い保護性が期待できる酸化物(例えば、Al2O3、Cr2O3、Fe-Crスピネル系酸化物などを想定)を対象として、文献情報の収集・精査に基づいて水素溶解度が低い酸化物種を調査した。よって、今後は上記2種の酸化物が安定維持される化学組成ー環境条件の範囲を検討することが重要になると考えられた。また、Cr含有量を制御した複数の炭素鋼に高温水中で形成された酸化皮膜を対象として、グロー放電発光分析手法を用いた皮膜中に含まれる水素量の測定に着手するとともに、透過電子顕微鏡(TEM)を用いた皮膜高解像度観察により、酸化皮膜の緻密性に及ぼす微量Crに関する知見を取得し、安定な保護皮膜が形成・維持される条件について考察した。グロー放電発光分析により、酸化皮膜中は母材と比較して明確に水素濃度が高いことが明らかとなり、これには酸化反応に伴い発生した水素が影響していると考えられた。また、水素量を求めるには基準材が必要であることから、今後は水素量の定量化が課題となる。TEMを用いた皮膜観察結果から、鋼中Cr含有量が高くなるに従い皮膜の緻密性が増す傾向が認められた。環境助長割れ環境に対する高い保護性と高い水素透過防止性能を両立する酸化物の候補の絞り込みについては、効率的に進めることが出来たため目的を達成できたと判断した。また文献調査やグロー放電発光分析結果から、酸化反応により発生した水素の影響、また酸化皮膜のボイド率に及ぼす水蒸気の影響など、今後着目すべき重要な視点を得ることが出来た。今年度に得られた水素溶解度が低い酸化物種あるいは皮膜が形成・安定維持される条件等の知見に基づき、酸化皮膜の保護性の観点から、耐水素脆化特性に優れた鉄鋼材料成分を検討する。この観点からの適正成分を基準として既存合金鋼を分類・選択する、あるいは、必要に応じてボタン溶解法によって任意成分の鋼を溶製するなどして、耐水素脆化特性に優れると予測される材料を準備する。

準備した鋼種に対して、水素脆化が問題となる環境を高温雰囲気炉内に模擬して試料を一定時間暴露した後、昇温脱離あるいはグロー放電発光分析などの分析手法を候補として適用可能な手法を用い、鋼中水素量を測定して水素脆化抑制効果を検証する。また、形成された皮膜の特徴を顕微鏡技術により評価して水素量との関係を検討し、耐水素脆化特性に優れる鋼の材料条件についての知見を得る。次年度使用額は、当初計画より効率的に研究が進捗したため、グロー放電発光分析装置の使用料ならびに分析用消耗品費が抑えられたことにより生じたものであり、次年度以降に実施する昇温脱離あるいはグロー放電発光分析に必要な経費として、平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。
癌骨転移に対する分子標的治療薬の開発

癌骨転移の発症や進行には、破骨細胞による骨破壊が深く関与していることから、抗腫瘍活性と骨吸収阻害活性を併せ持つ薬剤は有用な癌骨転移治療薬になると考えられる。前年度までに、化合物スクリーニングによって、Methy1-gerfelin(M-GFN)が破骨細胞の分化を阻害することで破骨細胞の骨吸収機能を阻害することを見出した。本年度はまず、M-GFNの細胞内標的分子の同定を試み、M-GFNアフィニティープローブや分子生物学的アプローチから、その細胞内標的分子がGlyoxalase I (GLO1)であることを明らかにした。さらに、M-GFNとGLO1の共結晶化に成功し、X線構造解析によってM-GFNのGLO1に対する結合様式を明らかにした。すなわち、M-GFNはGLO1の活性部位においてZnイオンとの配位結合を介して相互作用していた。一方、骨転移を高率に引き起こすことが知られている肺がんなどでは、GLO1がしばしば過剰発現しており、それががんの悪性化や薬剤耐性に寄与していることが報告されている。さらに、そのようながん種においては、GLO1阻害剤が抗腫瘍効果を発揮する。実際、GLO1が過剰発現している肺がん細胞とそうでない肺がん細胞にM-GFNを処理したところ、M-GFNはGLO1過剰発現細胞選択的に細胞死を誘導した。以上のことから、本研究において、M-GFNが破骨細胞の骨吸収を阻害することやGLO1過剰発現肺がん細胞に細胞死を誘導することを見出し、さらにその細胞内標的分子がGLO1であることを明らかにした。今後、GLO1の癌骨転移治療における分子標的としての妥当性を検証するとともに、M-GFNの癌骨転移治療薬としての開発が期待される。今年度はまず、破骨細胞の骨吸収を阻害する化合物のスクリーニングをおこなった。破骨細胞は、マウス骨髄細胞にTGF-βとM-CSFを添加してマクロファージ細胞に分化させ、次いでRANKLとM-CSFを添加することで調製した。天然化合物あるいは合成化合物ライブラリーから、破骨細胞形成阻害あるいは破骨細胞に対する細胞死誘導活性を指標に活性化合物を探索した。その結果、メチルゲルフェリンが破骨細胞形成を阻害することを見出した。象牙切片を用いたピットアッセイにより、メチルゲルフェリンはin vitroで破骨細胞の骨吸収を阻害することが明らかとなった。そこで次に、メチルゲルフェリンの細胞内標的分子の同定を試みた。当研究室で開発された官能基非依存型光親和型低分子固定化法によりメチルゲルフェリンプローブを作製し、マクロファージ細胞の細胞抽出液を使ってプルダウンアッセイをおこなった。メチルゲルフェリンプローブの共沈物をSDS-PAGEやMALDI-TOF/MFなどで解析した結果、メチルゲルフェリンプローブ特異的に共沈するタンパク質として、Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein A、Glyoxalase I及びSterol carrier protein-2の3つを同定した。今後は、これらタンパク質の薬剤ターゲットとしての妥当性を検証し、さらにメチルゲルフェリンの癌細胞に対する効果等を検討していく予定である。
辟疆園杜詩註解研究

本研究は、清朝の比較的はやい杜詩の注釈書、『辟疆園杜詩註解』について版本学的な側面から、また内容的な側面の二方面から分析を試みたものである。版本学的な側面からの調査については、『辟疆園杜詩註解』の版本を日本国内、及び中国においてできるだけ隈無く調査をした。日本国内では、国会図書館・国立公文書館・東洋文庫・尊経閣文庫本・鹿児島大学・慶応大学・京都大学の七館の藏書を、中国国内においては、上海図書館、並びに北京師範大学の藏書を閲覧し得た。これらの版本の特色などについて整理を行った。調査の結果としてはいずれも同一の版本はなく、とりわけ序については、異同がめだった。また扉の有無についても相違があり、従来の版本整理には言及されていないことが調査の結果明らかにすることができた。また和刻本と原書との相違を検討した。双方の大きな違いはやはり和刻本が原書の多くを欠いている点にあった。また序についても、省略されているものがあることが確認できた。結果的に和刻本が何によったのかは判然としなかったが、日本人が『辟疆園杜詩註解』に何らかの価値を見出していたことは、当時の注釈受容を考える上で無視できないことがわかった。注釈者、顧宸について、どのような人物であったのかを調査した。顧宸が当時としては著名な蔵書家の一人であること、そしてそのことが、杜詩に注釈を付する上で大きく役立てられていたことが確認できた。以上のように『辟疆園杜詩註解』が、清初の注釈として注目に値する成果であることを明らかにした。こうした調査内容を第2回日本杜甫学会において考察をまとめ、あわせて発表内容を論文にし、『杜甫研究年報』第二号に掲載することとで、本研究の成果を公にすることができた。初年度は当初の計画通り、国内においては、国立公文書館、及び鹿児島大学図書館に赴き、『辟疆園杜詩註解』の確認を行った。また、上海図書館所蔵の善本『辟疆園杜詩註解』を併せて確認できた。特に上海図書館本には厳沆序があり、日本の諸本には確認できなかった序が見つけられたのは大きな収穫だった。かねて、鹿児島大学図書館藏本を写真版にしようと計画していたが、国立公文書館所蔵本が『域外漢籍珍本文庫第五輯集部』十七に影印され、当初予定してた経費が抑えられた。これらの諸本を整理し、『辟疆園杜詩註解』の成立などがより明確になると思う。また、和刻本との相違を確認するため、大学院生に目録の整理をしてもらった。この調査からかなり、和刻本が原書を省いて成立していることが確認できた。本書の成立については、まず、七言律詩が、ついで五言律詩が上梓されたという経緯が同書に附された李序及び畢序からわかっているが、これまで確認できた諸本からは、後人によって体裁が改められており、成立の経緯がわかりにくくなっていることが確認できた。また、厳序を欠いているものが多いことも確認できた。同書が影印されたことにより、顧宸の注釈方針についても、より詳細に調査がしやすくなった。同書を概観すると、顧宸が頻繁に銭謙益の『銭注杜詩』を引用していることに気がつく。周知のとおり銭謙益の底本は、宋代の杜甫の別集を伝える呉若本であり、こうした点にはやくから顧宸が注目しているのは、注意に値する。今後はこうした顧宸に先行する注釈との関わりを整理することで、顧宸の注釈態度の一端を明らかにするつもりである。当初の予定通り、日本国内、また海外においては、上海図書館に出向いて文献調査できたことにより、書誌学的な知見を得ることができた。また、同書の構成についても、和刻本との比較、及び諸本との比較を通してある程度、整理することができた。ただ、慶応図書館藏本、並びに尊経閣文庫藏本については、調査がすすんでおらず、次年度に持ち越してしまったことは遺憾であった。また、同書所収の杜甫年譜を利用しつつ「杜詩用韻小考ー「農」字についてー」(『旭川国文』29号、2016年)を発表した。ささやかながら、この論文は、この研究を受けて発表された成果の一つである。平成29年度は昨年に引き続き,『辟疆園杜詩註解』を所蔵する尊経閣文庫・慶応大学図書館に出向き,蔵書を実見した。慶応大学図書館藏本は,一帙12冊からなり,合冊がみとめられた。また年譜の末尾に欠葉があったり,紙の質が粗悪だったり,評者や著者の名前が改訂されているなど,後に刷られた版本であることが確認できた。尊経閣文庫所蔵『辟疆園杜詩註解』は,無帙18冊からなる。刷りが美しく,虫食いも少なく,料紙も綺麗で全てにわたり整った作りになっていることが確認できた。上海図書館所蔵本でしか確認できなかった。嚴沆序11葉が1冊目の巻頭に置かれていた。また附属書一部が附されており,これには前田家に所蔵されるに至った経緯などが記されているようだ。

『辟疆園杜詩註解』の版本に関する研究は、以上のようにすすめることができた。『辟疆園杜詩註解』を用いた杜詩読解に関する研究については,「杜詩と棗」と題し,8月29日の語学文学会(於北海道教育大学釧路校)において研究発表を行った。この研究では主に杜甫「又呉郎に呈す」という詩を取り上げたが,この詩を分析するにあたり,顧宸の解釈が後の仇兆鰲に影響を与えたことを指摘した。また第28回中唐文学会大会では「「浮」かんでいるものー杜甫「登岳陽楼」における「乾坤日夜浮」の解釈をめぐってー」(於山形大学)と題して,10月6日発表をした。この発表では,顧宸の注によりながら,「乾坤日夜浮」の再解釈をこころみた。翌年2018年3月24日『杜詩詳注』輪読会において「又呉郎に呈す」をとりあげ,顧宸の注を精読し,仇兆鰲の注との関わりをより明確にすることができた。版本研究という側面からは,尊経閣文庫及び慶応大学図書館という2つの図書館に実際赴き,それぞれの図書館に所蔵された版本の特色を明らかにできた。日本における主だった『辟疆園杜詩註解』の版本調査はおおむねこれで終えたことになる。このように平成29年度では、版本学という側面,顧宸注の側面という2つの側面から一定の研究成果を提示することができた。以上のことから平成29年度はおおむね順調に進展していると判断した。本研究は、清朝の比較的はやい杜詩の注釈書、『辟疆園杜詩註解』について版本学的な側面から、また内容的な側面の二方面から分析を試みたものである。版本学的な側面からの調査については、『辟疆園杜詩註解』の版本を日本国内、及び中国においてできるだけ隈無く調査をした。日本国内では、国会図書館・国立公文書館・東洋文庫・尊経閣文庫本・鹿児島大学・慶応大学・京都大学の七館の藏書を、中国国内においては、上海図書館、並びに北京師範大学の藏書を閲覧し得た。これらの版本の特色などについて整理を行った。調査の結果としてはいずれも同一の版本はなく、とりわけ序については、異同がめだった。また扉の有無についても相違があり、従来の版本整理には言及されていないことが調査の結果明らかにすることができた。また和刻本と原書との相違を検討した。双方の大きな違いはやはり和刻本が原書の多くを欠いている点にあった。また序についても、省略されているものがあることが確認できた。結果的に和刻本が何によったのかは判然としなかったが、日本人が『辟疆園杜詩註解』に何らかの価値を見出していたことは、当時の注釈受容を考える上で無視できないことがわかった。注釈者、顧宸について、どのような人物であったのかを調査した。顧宸が当時としては著名な蔵書家の一人であること、そしてそのことが、杜詩に注釈を付する上で大きく役立てられていたことが確認できた。以上のように『辟疆園杜詩註解』が、清初の注釈として注目に値する成果であることを明らかにした。こうした調査内容を第2回日本杜甫学会において考察をまとめ、あわせて発表内容を論文にし、『杜甫研究年報』第二号に掲載することとで、本研究の成果を公にすることができた。今年度は、東京の慶応大学所蔵本並びに尊経閣文庫藏本の調査をするつもりである。加えて、これらの調査を踏まえ、書誌学的から本書について論じ、紀要などに投稿するつもりでいる。今後は、この文献調査に基づき、『辟疆園杜詩註解』の書誌学的な点をまとめるつもりでいる。あわせて、顧宸の注釈を利用し、杜詩の読解に役立てるつもりである。最終年度にあたる平成30年度は,中国北京にある国家図書館藏本を閲覧し,『辟疆園杜詩註解』の版本に関する調査をまとめ,学会で発表する予定でいる。これまで調査した『辟疆園杜詩註解』は,東洋文庫藏本(2種),国立国会図書館本(2種),上海図書館本(2種),鹿児島大学図書館本,慶応大学図書館本,尊経閣文庫本の合計9本にわたる。
睡眠時無呼吸症候群患者における持続陽圧呼吸療法の交感神経活動抑制効果に関する検討

近年、睡眠時無呼吸症候群(SAS)に対する持続陽圧呼吸(CPAP)療法が心血管イベント抑制効果を認めない事が大規模試験で報告された。しかし、対象患者が軽症であったことが指摘されている。SAS患者は、重症度と交感神経活動の亢進が関連するが、重症例での交感神経活動の評価法は一定した見解がない。申請者施設は、単一筋交感神経活動(single-unit MSNA)を測定できる世界で数少ない施設の一つである。本研究の目的はAHIとsingle-unit MSNAをもとにSAS患者を群分けしCPAP治療前後での冠動脈内プラーク性状及び交感神経活動を評価することでCPAP療法の有効性を再検討することである。
可視・近赤外線6バンド同時精密トランジット観測で探る太陽系外惑星の大気組成

太陽系外惑星は主星のごく近くにあるうえ、主星との明るさの差が大きいため、直接観測を行うことは難しい。多波長同時トランジット観測は数少ない系外惑星の大気組成を研究する手段である。本研究ではすでに稼働している近赤外線3波長同時カメラにさらに可視光での同時観測機能を付け加えることで、より精密に系外惑星の大気組成を研究することが目的である。この開発では、現在使用している近赤外線カメラSIRIUSと同時にIRSF望遠鏡に取り付けるため、装置の小型化が求められた。具体的には、幅360mm、奥行き460mm、高さ120mmのスペースに、近赤外光と可視光を切り分けるダイクロイックミラー以降の光学系とCCDカメラ部分を収める必要があった。このため、天体観測に向いた市販のCCDカメラは大きすぎ、使用することができない。そこで、私たちは、このスペースに収まる多色CCDカメラとその光学系の設計・製作を行った。開発したカメラは、ダイクロイックミラーによる可視・近赤外光の切り分けのあと、補正レンズによりF比を10から8.3に変換し、また、同時に光学収差の補正も行う。SIRIUSと同程度の7.2×7.2分角の視野に対して、IRSF望遠鏡の設置されているサザーランド観測所での典型的なシーイング1秒角に収まる光学像を実現する。さらに、ダイクロイックミラーでSDSSのg'とi'バンドに光を分割し、2つの焦点面を作る。1024×1024画素のCCD素子KAF-1001を用い、画素スケールは0.42秒角となる。このCCDは70mm×100mm×60mmの小型真空冷却容器で冷却され、新たに製作した専用読み出し回路で読み出しが行われる。現時点では実験室での組み上げを行っている。研究期間中に完成に至らなかったが、今後も開発を続け完成させ、次年度以降、系外惑星の多色トランジット観測を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、太陽系外惑星の可視・近赤外線6バンド同時トランジット観測を可能にする多色カメラを開発し、系外惑星の大気組成を研究することである。このカメラの近赤外カメラ部分は、すでにIRSF1.4m望遠鏡用の近赤外線3バンド同時カメラSIRIUSがあるので、これをそのまま利用し、可視光カメラ部分を開発する。そのため、開発期間の短縮とコストの大幅な削減ができる。一方で、既存の観測装置に組み込むことによる別の制約も発生する。SIRIUSと望遠鏡の間には12cmの隙間しかないため、この空間に収まる可視光多色カメラが必要となることである。今年度はこのスペースに収まるCCDカメラモジュールの開発を行った。当初、使用予定であったCCD検出器読み出し回路に不具合がある可能性が発覚しため、読み出し回路の再設計・製作が必要となった。このため、研究費の繰り越しを行い、平成27年度にCCD読み出し回路を作り直した。作り直した読み出し回路は正しく動作し、また、それを用いて、高さ12cmの空間に収まるCCDカメラモジュールを製作することができた。以降について、平成27年度の報告書に記す。CCD検出器の読み出し回路に不具合の可能性が生じたため、CCD検出器読み出し回路の再製作が必要になり、カメラの完成時期が大幅に遅れたため太陽系外惑星は主星のごく近くにあるうえ、主星との明るさの差が大きいため、直接観測を行うことは難しい。
生殖細胞の減数分裂に伴うゲノム制御転換とシグナル応答のシステム解析

生殖幹細胞株の減数分裂移行はRARによる転写制御を介するがRAは生体ではpleiotropicな効果を示し例えば生殖細胞への分化能を持つ多能性幹細胞であるES細胞株では神経分化を誘導する。我々は生殖幹細胞のヒストンH3トリメチル化修飾、RNA pol II、RAR等のChIP-seq解析を進め、生殖幹細胞株とES細胞株の比較によりオープンなクロマチン修飾が両者で極めて類似していること、生殖幹細胞株のH3トリメチル化のbivalent修飾はES細胞と同様に初期発生で働く遺伝子群が占めること、RARは両細胞でターゲットが明瞭に異なり生殖幹細胞株では減数分裂遺伝子群に結合すること等が明らかとなった。減数分裂誘導に伴うRNA発現の変化をマイクロアレイにより調べ上述のエピゲノム修飾等と共に変化する遺伝子群をクラスタリングしプロモーター/エンハンサー領域に共通するシスエレメントのde novoモチーフ抽出を行い哺乳類ゲノム相同性およびシスエレメント間の共起を組み入れた推定により複数の機能候補因子を同定した。一方、nanoLC-MS/MSを用いたoffline-mudpitによるショットガン質量分析により核動態の変化について包括的プロテオームデータの取得を進めた。特に核、クロマチン分画、部位特異的解析について密度勾配、pH、塩濃度、デタージェント、ヌクレアーゼ、超音波破砕等の各種条件を検討すると共に蛋白質複合体の解離を防ぐ為に質量分析を阻害せずターゲット特異性の高いcleavableクロスリンカーを用いる実験条件を定めた。これらの研究により哺乳類の減数分裂誘導の初期過程における分子メカニズム解明へ向けた重要な研究成果を得ると共に新たな実験手法の開発を進める事が出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。生殖細胞は遺伝情報を次世代に伝達し個体発生の起点となる細胞系譜である。生殖細胞ゲノムの安定な保持と伝達は個体、種の継続に重要であると共に、減数分裂による相同遺伝子組換えと1倍体化によって遺伝情報の多様性が生まれる。減数分裂の制御機構の研究は主に酵母等の単細胞生物を用いて行われる一方、多細胞生物においてその分子基盤の解明は進んでいない。研究代表者はマウス生殖幹細胞株が体細胞型増殖から第1減数分裂前期(レプトテン・ザイゴテン期)に同調して移行する培養実験条件を作出した。同実験系は哺乳類減数分裂開始のスイッチ機構とそれに伴う核動態やシグナル伝達を解析する為の非常に有用な実験系となる。平成23年度はクロマチン免疫沈降と,次世代シークエンスを用い生殖幹細胞および初期減数分裂のヒストン修飾、RNAポリメラーゼ、核内レセプター/転写因子の解析を行い、エピゲノム制御、転写制御についてゲノムワイドな網羅的データを取得した。またマイクロアレイを用いたRNA発現解析、nanoLC-MS/MSを用いたoffline-mudpitによるショットガン質量分析により核動態の変化について包括的プロテオームデータの取得を進めた。これらの結果は哺乳類生殖細胞の体細胞型分裂-減数分裂移行を制御するシグナル経路と核動態転換の連携、また哺乳類減数分裂の初期過程における分子メカニズム解明の基盤となる重要な研究成果である。平成23年度はマウス生殖幹細胞株の初期減数分裂誘導の培養実験系を用いてマイクロアレイ、次世代型シークエンス、質量分析等を用いたマルチオミクス解析により、ゲノムワイドな転写制御、エピゲノム制御および核動態について網羅的なdata driven型研究の基盤となる成果を得る事が出来た。これらの結果は当初の研究計画に沿って大凡順調に進展している。マウス生殖幹細胞株、初期減数分裂のマルチオミクス解析を継続すると共に、核動態とシグナル経路のクロストークについてデータマイニングを進める。得られた機能候補分子について発現制御や局在、複合体構成や生化学的活性の検出、遺伝子学的機能の解析を進め、哺乳類減数分裂の初期過程における分子ネットワークの解明を目指す。
幼児における唾液コルチゾールの概日リズム形成に影響する生活環境因子の解明

幼児(4ー6歳)の生活環境因子と唾液コルチゾール濃度の概日リズムの有無との関連性を解明することを目的とした。自立起床でない幼児には概日リズムはなく、概日リズムのある幼児より健康状態は良くないことが示唆された。兄姉がいる、家庭での外遊び、スポーツの習い事の因子は、活動量を高くしたが、概日リズムの有無には関連しなかった。概日リズムのある幼児の食事内容は、ない幼児より、n-6系脂肪酸、n-3系脂肪酸の摂取量は高い傾向がみられ、果実類、し好飲料類の摂取量は有意に低く、藻類、魚介類の摂取量は高い傾向がみられた。唾液コルチゾール濃度の概日リズムの有無は、生体の概日リズムの有無の指標となり、健康状態に関連していると考えられる。本研究は、幼児における唾液コルチゾール濃度の概日リズム形成に影響する生活環境因子を解明し、幼児の健全な発達に寄与することを目的とした。保護者の同意が得られた幼稚園に通う46歳児16名とその母親を対象とした。調査期間は平成26年7月の連続する3日間とし、食事調査、生活習慣、健康状態のアンケート調査を行い、さらに生活活動記録と体重からエネルギー消費量を概算した。唾液は、起床時、登園時、降園時、就寝時の4回採取し、SALIMETRICS社のSalivary Cortisol EIA Kitを用いて唾液コルチゾールを測定した。その結果、カウプ指数により分けたやせぎみ(<14.5)、ふつう、太りぎみ(16.5<)の3群と、唾液コルチゾール濃度の概日リズムの間には、有意な関連がみられ、リズム有群(8名)は、やせぎみまたはふつうであり、リズム無群(8名)は、ふつうまたは太りぎみであった。エネルギー消費量は、リズム有群(1242kcal)ではリズム無群(1523kcal)より有意に低かったことから、唾液コルチゾール濃度の概日リズムは、体格指数やエネルギー消費量に影響をうける可能性が示唆された。また、概日リズム有群では、だるそうにしている頻度も有意に低く、健康状態や自立起床と唾液コルチゾール濃度の概日リズムの有無には関連のある可能性が示唆された。寝る前のおやつは体調に悪影響を及ぼしていたが、食事の摂取時刻と唾液コルチゾールとの間には、有意な関連はみられなかった。今後はさらに、食事内容に注目した解析を進めるとともに、対象人数を増やして検討を進める。本研究では、幼児における唾液コルチゾール濃度の概日リズム形成に影響する生活環境因子を解明し、幼児の健全な発達に寄与することを目的とした。昨年度と同様の調査を継続し、保護者の同意が得られた幼稚園に通う46歳児11名とその母親を対象とした。調査は、平成27年7月の連続する3日間に実施し、食事調査、生活習慣、健康状態のアンケート調査を行い、さらに生活活動記録と体重からエネルギー消費量を概算した。唾液コルチゾール濃度の測定には、起床時、起床時30分後、登園時、降園時、就寝時の5回唾液を採取し、SALIMETRIC社のSalivary Cortisol EIA Kitを用いた。重複している5名分を除いた、2年間の対象者22名分を解析した。兄姉がいる幼児と兄姉のいない幼児との生活習慣、食習慣及び概日リズムの差違について検討したところ、兄姉がいる幼児(11名)の就寝時刻は、いない幼児(11名)より有意に遅かった。平日起床時刻は、兄姉がいる幼児は、いない幼児より有意に遅かった。休日起床時刻と平日睡眠時間には差はなかった。兄姉がいる幼児は、いない幼児よりエネルギー消費量及び摂取量ともに、高い傾向にある一方、テレビゲームで遊ぶことがある割合は高かった。食品群別摂取量をみると、兄姉がいる幼児は、いない幼児より牛乳・乳製品の摂取量は有意に低く、肉の摂取量は有意に高かった。兄姉の有無と唾液コルチゾール濃度の概日リズムの有無には、関連性がみられなかった。兄姉がいることにより、起床や就寝時刻、日中の活動内容、食事内容などに影響を受けていた。それによる体調への悪影響は認められなかったが、兄姉がいる幼児の発達段階に応じた生活習慣の形成には、配慮が必要であることが示唆された。2年間継続した調査を実施したことで、1年目の調査協力者は16名、2年目の調査協力者は11名とデータを蓄積することができた。そのため、目的とする唾液コルチゾール濃度の概日リズム形成と生活習慣因子との解析を進めることが可能となった。起床時及び登園時の唾液コルチゾール濃度は、体格指数、活動量、食品群別摂取量などの影響を受ける可能性のあることを示唆する結果が得られた。昨年度と同様の調査を継続し、保護者の同意が得られた幼稚園に通う45歳児11名(男児8名、女児3名)とその母親を対象とし、平成28年7月の連続する3日間に実施した。食事調査、生活活動記録(誰と、場所、活動内容、時間)、生活習慣、健康状態のアンケート調査を行った。本調査用に作成したメッツ表と体重によりエネルギー消費量を概算し、活動量とした。

唾液コルチゾール濃度は、起床時、登園時、降園時、就寝時の4回採取した唾液を測定し、概日リズムの有無を判定した。家庭生活での遊びについて、活動内容、エネルギー消費量、遊び相手、場所などから解析を行った。その結果、家庭生活における遊びは、幼児によって遊び相手や場所の種類は様々であるが、ほとんどの幼児が3日間とも同じような遊び方をしており、家の中で遊ぶ頻度が高かった。家の中や施設の中に比べて、外遊びでの活動量は高く、特に公園で遊んだ時の活動量が高かった。運動系の習い事があった日の活動量は、他の日の活動量よりも高く、不足する活動量を補っていた。幼児が1人で、あるいは母と遊ぶ時には活動量の低い遊びが多かった。どの幼児も友達と遊ぶ時にはすべて外で遊んでおり、活動量が高くなった。概日リズムの有無は、あり5名、なし5名、欠損値による除外1名であった。幼児の家庭生活での遊びによる活動量や、外遊びの頻度と概日リズムの有無とには、関連性はみられなかった。家庭生活での遊びの活動量や外遊びの頻度が、概日リズムの有無に関連していなかったのは、幼稚園での外遊びやその他の生活習慣による、よい影響である可能性が考えられ、幼稚園での活動の重要性が示唆された。幼児(4ー6歳)の生活環境因子と唾液コルチゾール濃度の概日リズムの有無との関連性を解明することを目的とした。自立起床でない幼児には概日リズムはなく、概日リズムのある幼児より健康状態は良くないことが示唆された。兄姉がいる、家庭での外遊び、スポーツの習い事の因子は、活動量を高くしたが、概日リズムの有無には関連しなかった。概日リズムのある幼児の食事内容は、ない幼児より、n-6系脂肪酸、n-3系脂肪酸の摂取量は高い傾向がみられ、果実類、し好飲料類の摂取量は有意に低く、藻類、魚介類の摂取量は高い傾向がみられた。本年度、研究協力者として16名があり、食事記録、生活活動記録、アンケート調査用紙や唾液の回収率もきわめて良かったため、統計的なデータ解析を進めることが可能となった。希望する研究協力者を対象とした、調査結果に基づく個別支援も実施できた。食事内容と食品成分と唾液コルチゾール濃度の概日リズム形成については解析中である。今後、引き続き研究協力者を募り、データの蓄積を行っていく。概日リズム形成との生活習慣因子との関連については、さらに解析が必要であるため、3年目も、1、2年目と同様の調査を実施し、調査協力者を募り、データの蓄積を試みる。得られたデータにより、起床時及び登園時の唾液コルチゾール濃度との関連性がみられた、体格指数、活動量、栄養素及び食品群別摂取量などに特に着目して、概日リズム形成への影響を解析する。食生活学本研究は、幼児における唾液コルチゾール濃度の概日リズム形成に影響する生活環境因子を解明し、幼児の健全な発達に寄与することを目的とする。平成27年度は、平成26年度と同様の調査を実施することでデータの蓄積を行い、調査結果の一般化をめざす。調査は、保護者の同意が得られた幼稚園に通う46歳児とその母親を対象に、連続する3日間の食事記録と生活活動記録の調査と唾液コルチゾール濃度の測定、ならびに、生活習慣と健康状態のアンケート調査を行う。生活活動記録と体重からエネルギー消費量を概算する。唾液は、起床時、登園時、降園時、就寝時の4回採取し、SALIMETRICS社のSalivary Cortisol EIA Kitを用いて唾液コルチゾールを測定する。
カドミウム体内動態に基づいたカドミウム腎症の発症メカニズムの解明

カドミウム(Cd)の腸管からの吸収には、鉄の輸送担体であるDivalent Metal Transporter 1(DMT1)が関与すると考えられているが、先行研究によりin vivoで、1ppmという低濃度でCdを投与した場合、腸管でのCd吸収にはDMT1以外の輸送系も関与していることが示唆されている。本研究の結果、腸管Cd吸収にはDMT1以外の輸送担体も関与していることが明らかになった。この新たな輸送担体によるCd輸送は、体内の鉄状態に関係なく、低鉄食摂取によりCd取り込みの増加が観察される事から、摂取食物中の鉄量に依存して、発現ないし何らかの輸送能の調節、あるいはCdとFeの輸送における競合阻害がなされていると考えられる。従って、Cd摂取の危険性が高い集団において、鉄の同時投与等の介入が、この輸送担体によるCd輸送を抑制し、Cdによる健康被害を抑制できる可能性が示唆された。カドミウム腎症は、カドミウムに汚染された食品の経口摂取により慢性的に体内に取り込まれたカドミウムが腎臓に集積することにより発症する。しかしどのくらいの経口曝露量でカドミウム腎症が発症するのか疫学的データのみであり、カドミウム摂取基準値の実験科学的な根拠のためにもカドミウムの体内動態の解明とカドミウム腎症の用量-発症関係の解明が必要とされている。本研究の目的は、1.カドミウムの体内動態を解明することにより、慢性的なカドミウム経口曝露のマウス病態モデルの作成方法を確立する。2.確立した病態モデルを用いてカドミウム腎症の指標となる近位尿細管再吸収機能障害(ファンコニ症候群)の発症メカニズムを解明することである。平成17年度は、メタボリックケージを用いた飲料用水への1.0ppmのカドミウム混入により慢性経口カドミウム曝露を行い、カドミウムの尿、便、血液および腸管、肝臓、腎臓への蓄積をフレームレス原子吸光測定装置での定量により曝露期間-蓄積速度関係を明らかにすることを試みた。その結果、肝臓および腎臓中のカドミウム濃度は、投与1目目より上昇をし続けたのに対し、腸管上皮内のカドミウム濃度は2日目に極大値(1日目の347±161%)を示した後、漸減した。このことからカドミウム投与2日目から3日目にかけて、腸管吸収に関わる何らかの因子が変化した可能性が示唆された。現在、それらの因子としてDMT1およびメガリンの関与についてReal-time PCRおよび免疫染色による検討を実施している。今後の方策としては、その他の因子の関与についてマイクロアレイ方を用いた包括的な検討を計画している。また、浸透圧ポンプの埋め込みによる早期カドミウム腎症発症モデルの作成を試みる予定である。人体に対するカドミウムの蓄積を軽減し障害を防ぐためには、腸管からのカドミウム吸収の機構を解明する必要がある。腸管におけるカドミウム取り込みは鉄と亜鉛によって阻害されることが報告されている。Divalent Metal Transporter1(以下DMT1)は哺乳類の腸管刷子縁膜での鉄吸収の主要な輸送体と考えられており、DMT1は電気生理学的にFe^<2+>、Zn^<2+>、Cd^<2+>を輸送することが示されている。鉄欠乏の状態でDMT1の発現が充進することは、鉄欠乏状態でカドミウムの吸収が増加するとの報告に一致しており、DMT1は十二指腸刷子縁膜におけるカドミウム輸送体の候補の1つであるが、DMT1の寄与をin vivoで検討した結果は報告されていない。mkマウスは鉄欠乏性貧血モデルとして発見されたDMT1機能欠損マウスであり、その機能欠損はhomozygote型でおこる。そこで、wild型(wild体)とhomozygote型(homo体)に同じ条件でカドミウムを経口投与したときに、homo体ではDMT1によるカドミウム輸送が起こらないので、カドミウムの吸収が低下すると予想された。しかし、結果的には有意差が無く、その原因としてhomo体の鉄欠乏状態が、他の輸送系の充進など何らかの因子に作用したことが考えられた。

本研究の結果、腸管Cd吸収にはDMT1以外の輸送担体も関与していることが明らかになった。この新たな輸送担体によるCd輸送は、体内の鉄状態に関係なく、低鉄食摂取によりCd取り込みの増加が観察される事から、摂取食物中の鉄量に依存して、発現ないし何らかの輸送能の調節、あるいはCdとFeの輸送における競合阻害がなされていると考えられる。従って、Cd摂取の危険性が高い集団において、鉄の同時投与等の介入が、この輸送担体によるCd輸送を抑制し、Cdによる健康被害を抑制できる可能性が示唆された。
細胞内酸化ストレスに基づくプラズマ生体相互作用の理解

大気圧プラズマと生体の相互作用を考える上で、細胞内酸化ストレスという観点に立ち、プラズマ処理水中に生成される活性種、細胞内へ活性種の浸透、生体高分子との化学反応という点に着目し研究を進めた。プラズマ処理水中に過硝酸という活性窒素種が生成され、ラジカル解離をしたHOO・が細胞内に浸透していることが明らかになった。過硝酸による殺菌を世界で初めて明らかにした。タンパク質の酵素活性の失活過程に関して、活性中心に酸化されやすいアミノ酸残基を有すると速やかに失活することが分かった。従来、タンパク質は活性が低下する実験結果のみであったが、分子シャペロンに関しては活性が向上する場合があることが明らかになった。プラズマ誘起液中科学反応というコンセプトに基づき、溶液中に供給される活性種の診断を進めた。プラズマはヘリウムを用いているが、その周囲のガスや溶存ガスによって、液中い生成される活性種は異なることがわかっており、その物理化学機構に関して検討を進めた。特に我々の研究グループでは、純水にプラズマを照射したプラズマ処理水の研究を進めており、プラズマ処理水を、段階希釈して殺菌力、電子スピン共鳴法によるスーパーオキシドのスピンアダクト生成能力、酸化力を測定する発色試薬による定量、イオンクロマトグラフによるキー活性種の定量などの手法により診断をしている。時間変化ならび温度依存を評価する実験系を構築して化学反応速度論による評価を進めている。プラズマ処理水は雰囲気ガスと溶存ガスにそれぞれ窒素分子が含まれている事が必須であるということがわかってきており、プラズマ処理水中のキー活性種は単純な活性酸素ではなく、活性酸素窒素種であることが推察される。しかし、これまでの液中殺菌の研究で得られた「スーパーオキシドアニオンラジカルが酸解離平衡によりヒドロペルオキシラジカルに変化することで、電気的に中性な活性種になるために殺菌力が向上する」という前提から外れてくる。現時点では活性酸素窒素種がキー活性種であり、そこから活性酸素種のスーパーオキシドが放出されるという、前駆体説を前提に研究を進めている。化学反応速度論的な評価により、この前駆体が直接的に細菌を不活化しているのではなく、前駆体から放出されたスーパーオキシドが殺菌を行っているという結果が得られているものの、電子スピン共鳴法でプラズマ処理水中のスーパーオキシドを液体窒素温度での直接測定を行うと信号が得られなかったことから、活性種がどのような物理化学的な機序により細胞に対して酸化ストレスを与えているのかに関する知見はまだ十分とは言えない。今年度は、研究代表者が研究室の引っ越し、研究分担者が大学へ移動するなどという事があり、最初の数ヶ月は実験研究を十分に行うことが出来なかったものの、夏からは以前よりも研究を進める十分な体制が整った。細胞内酸化ストレスを評価するためには溶液中での活性種の物理化学反応を評価する必要があり、活性種計測ならびにアレイニウスプロットによる評価など化学反応速度論に基づく評価を進めた。細胞内酸化ストレスを、リポソームを人工細胞モデルとして評価する実験を進めているが、研究分担者の白木研究室でその合成方法の検討を行い、十分な再現性で合成することに成功した。しかしながら、白木研究室だけでは測定を予定している分析装置の全てを有しているわけではないために、北野研究室でもリポソームの合成を行える様な技術移転を進め、ロータリーエバポレーターなどの合成装置の導入を行い、合成を行う直前まで準備が進んだ。北野研究室では特に電子スピン共鳴装置を有しているためにスピントラップ剤などの導入を検討しているが、細胞外にスピントラップ剤が存在すると細胞内酸化ストレスのみを評価することができないために、分離を行う必要があり、その手法に関する検討を議論を行いながら進めた。このような細胞内酸化ストレスの評価系の構築に当たって、座古研究室は構造生物学的な立場か実験系の最適化に関して議論を行い、かつ個別での基礎実験を行いながら共同研究を進めた。プラズマ誘起液中化学反応というコンセプトに基づき、溶液中に供給される活性種の診断を進めた。プラズマと生体の相互作用には化学活性種が関わっているが、それぞれの化学種による生体への影響という観点では多くの研究がなされている。プラズマ医療を化学種ベースで新しい研究だと証明するためには、化学種を同定した上でその作用を明らかにしていく必要がある。上記の実験を通じて、プラズマ処理水のキー活性種が過硝酸(HOONO2、PNA: peroxynitric acid)であることが判明した。これまで過硝酸という物質はほとんど着目されておらず、文論ならび特許検索を行っても殺菌に関する文献は見つかっておらず、過硝酸による殺菌を世界で初めて発見したと言える。過硝酸という物質は生体でも他の作用をもたらす可能性を有しており、今後の研究展開が重要である。その基礎的な研究として本申請の研究を進めており、過硝酸が生体高分子に与える影響を生化学的に評価したり、反応速度から計算される活性化エネルギーなどの観点から研究を行っている。

プラズマの医療応用は、多数の物質から構成される生体に対してプラズマから活性種が供給されて化学反応が進む多次元の化学反応系と考える事ができる。そのような化学反応を理解するアプローチとして、それぞれの化学種とそれぞれの物質の化学反応を一つずつクリアーにしていく必要がある。本年度はプラズマ処理水中のキー活性種である過硝酸に重点を置いて研究を進めた。モデルタンパク質としてリゾチームを用い、過硝酸と混合による酵素活性と立体構造の時間変化を評価した。酵素活性は混合から指数関数的に減少しており、その反応速度は温度によって大きく異なった。同様の温度依存特性は殺菌実験でも見られており、擬一次反応による化学反応が支配的であると考えられる。このとき、タンパク質の構造情報を含む円偏光二色性スペクトルのピーク強度が大きく減少しており、酵素活性の減衰と良い相関を示していた。これらの結果から、プラズマ照射と同様に、過硝酸混合処理もアミノ酸残基の化学修飾により引き起こされるマクロな立体構造の変化が酵素活性の失活をもたらしていると推察される。生体という複雑系に対する反応系の理解を高めるために、有機夾雑物存在下での殺菌実験を行った。酸化作用のある殺菌剤は有機夾雑物ならび細菌と同時に反応するが、その反応速度比は殺菌剤ごとに異なると考えられる。殺菌剤としてのリファレンスとして次亜塩素酸を用いて殺菌速度の検証を行った。有機夾雑物としてはウシ血清アルブミンを用いて、菌液と混合しておくことによる殺菌速度の比較を行った結果、次亜塩素酸に比べて過硝酸による殺菌では有機夾雑物を30倍程度高濃度にしても同程度の殺菌作用が得られた。このことは過硝酸は相対的にウシ血清アルブミンとの反応速度が低い事を意味している。大気圧低温プラズマの医療応用に着目が集まっている。プラズマを生体へ照射する際の反応素過程を考えると、生成された活性化学種が細胞内にどのように浸透するのかを評価する事は重要である。プラズマ処理水の殺菌活性が低温でのみ保存され、pH4.8以下にすることで殺菌力が100倍程度に高まる(低pH法)ことを明らかにした。プラズマ処理水中に保存されている物質が過硝酸(HOONO2、Peroxynitric acid)であることを明らかにしたが、この過硝酸という物質による殺菌は世界初であり、この新しい殺菌機構を解明することは重要である。この活性窒素種である過硝酸が、細菌へどのような酸化ストレスを与えて殺菌されるのかという観点に立ち、細胞内酸化ストレスに関する研究を進めた。また、過硝酸溶液は体温下で短い半減時間であるために、生体に対する為害性は低いと考えられているが、生体細胞への酸化ストレスを評価しておくことは、生体の消毒剤利用を考えると重要である。活性窒素種である過硝酸が与える細胞内酸化ストレスを評価するために、人工細胞としてリポソームを合成し、その内部に各種の試薬を入れた実験を行った。