hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の栄養摂取状況と身体活動量の把握方法の確立

1.栄養摂取状況地域在住の5960歳の女性42名について前年度と同じ調査票を用いた栄養素等の摂取状況調査を行った。前年度よりも質問紙の文字の大きさとフォントを工夫し、見やすくなるように質問紙のレイアウトを変更した。項目数が多いため記入に時間がかかることは変わりなかったが、記入漏れの割合は少なくなった。本人の自覚している栄養状態が質問紙から得た栄養素摂取状況を反映していれば、質問紙の簡易化がはかれると考え、質問調査時にカルシウム摂取量などの自己評価を調べた。全体の平均は所要量を超えており、調査票からの結果ではかなり多く摂取している者も見られたが、自己評価で「十分とれている」と回答した者は1名のみであり、「はぼ十分」と「取れていない」が半数ずつであった。「ほぼ十分」と「取れていない」の回答者の摂取量に差はなく、値の範囲もほぼ同じであり、自己評価を用いて摂取量を推定するのは困難と考えられた。2.身体活動量62歳と67歳の高齢者にアクティブトレーサーを2日間装着し、心拍数と加速度の関連を検討した。その結果、加速度が大きい場合でも心拍数が必ずしも高くなるとは限らず、細かい動きによる加速度の変化には心拍の応答が反映されないことが明らかになった。また、対象者の負担軽減のために行動内容が取れなかったため、加速度と心拍数の動きが一致しない場合がどのような行動であるかは把握できなかった。装着中に電極による皮膚の荒れやかゆみなどが生じ、高齢者に長時間装着する時には注意が必要と考えられた。栄養調査の対象者に1週間の活動記録と行動量の自己評価を実施したところ、5段階評価の自己の活動量は1週間の行動記録から求めた日常生活活動強度を反映しており、よく動くと思う者は活動強度が高かった。従って、生活活動強度と自己評価の関連を詳細に検討することにより、自己評価からおおよその活動量が把握できる可能性が示唆された。1.栄養摂取状況調査:本年度は高齢者の栄養摂取状況を把握するために用いることを計画している調査票を60歳以上の女性5名に3回に渡って記入してもらい,合わせて5日間,秤量法による食物摂取調査も実施した.また,5960歳の女性37名にも同様の調査票で栄養素等の摂取状況調査を行い,記入漏れ等を調べた.その結果,調査票の項目数が多く文字が小さいため,高齢者には読みにくく,記入に時間がかかる,慣れるまでは書き漏らしが多いなどの問題点がみつかり,本調査票を用いる場合には説明を十分に行うこと,文字を大きく印刷するがあることが考えられた.食事調査との整合性については現在検討中である.2.身体活動量調査:身体活動量を把握するための質問紙を作るために,高齢者の身体活動量に関する文献研究を行った.Medrineにより過去10年間の文献検索をし,海外の質問紙の項目を調査した.その結果,高齢者の身体活動量を調べる場合には日常生活の動作を中心に,項目数を絞った質問紙が構成されていること,エネルギー消費量に換算する場合には既存の測定値が高齢者の値ではないので注意が必要であること,質問紙の中では高齢者の身体状況が把握されていないことなどが明らかになった。また,地域在住の65歳以上の高齢者34名を対象にジグザグ歩行時間,握力,椅子から立ち上がり歩行し戻って座る時間,ロープくぐり時間,缶にボールを入れる動作時間という,日常生活によくある動作時間等が日常生活状況や身体状況を反映するものであるかを検討した.身体活動に支障のあるものはこれらの動作時間が長くかかること,買い物の頻度や日常的な運動の有無と歩行時間に関連が強いことが明らかになかったが,動作をしている時間を細かく答えることは難しいことなどから日常生活状況の把握が主な動作の有無を聞くだけのものに留まってしまった.従って,測定機等により高齢者の活動状況を負担が少なく客観的に測定する必要性が考えられ,その方法の検討も次年度の課題としたい.1.栄養摂取状況地域在住の5960歳の女性42名について前年度と同じ調査票を用いた栄養素等の摂取状況調査を行った。

装着中に電極による皮膚の荒れやかゆみなどが生じ、高齢者に長時間装着する時には注意が必要と考えられた。栄養調査の対象者に1週間の活動記録と行動量の自己評価を実施したところ、5段階評価の自己の活動量は1週間の行動記録から求めた日常生活活動強度を反映しており、よく動くと思う者は活動強度が高かった。従って、生活活動強度と自己評価の関連を詳細に検討することにより、自己評価からおおよその活動量が把握できる可能性が示唆された。
ヒト精子DNA傷害定量法開発とそれを指標としたDNA損傷精子排除法の確立

ヒト精子DNA損傷、特にDNA2重鎖切断の選択的観察法を開発した。個々の精子のDNA損傷を定量的に観察するため、single cell pulse gelfieldelectrophoresis(SCPFGE)を開発した。装置は位相を90度ずらした2組の電極を有し、3秒インターバルで直交電場(2.0V/cm、10分間)を印加する。表面親水化処理したスライドグラス上に100μg/mlのアフィニティクロマトグラフィ精製トリプシンを含むアガロースに懸濁した細胞(30万/ml)を滴下し、薄膜ゲルを作成した。これを界面活性剤、トリプシン溶液に浸漬して、細胞融解、核蛋白の除去を行った。SCPFGEにより泳動を行うと、1.連続するDNAファイバーが原点から伸展する、2.DNAファイバーの先に断片化DNA、3.鎖長が異なるDNA断片が展開する、4.原点が消失し、高度断片のみを認める、など多様な像が得られた。これまで報告されたアルカリコメット法によるDNA断片化研究は、粒子状の断片化DNA像の有無でDNA損傷を判定していたが、ゲノムDNA(長鎖DNA)はアルカリ処理において、濃度依存性に断片化することが示され、アルカリコメット法はDNA断片化研究には不適であることが示唆された。これにより、本研究が開発したDNA2重鎖切断の選択的観察法とともに、DNA鎖の片側開裂の分別観察法の開発が必要であることが示された。上述したSCPFGEにより射精精液を観察すると、DNA断片化像を呈する精子の比率は20-70%程度であった。本研究で開発した方法を指標としてDNA損傷精子の排除を試みた。Percollを密度勾配担体とする沈降速度差遠心分離法で精子を分離した後、オプチデンツを担体とする沈降平衡法を行うと、精子は2峰性に分布した。上層のDNA損傷比率は1%以下に低下したが、下層ではほとんどがDNA高度断片化像を示した。この結果はDNA損傷に伴い、細胞性状、特に密度が変化することが明らかとなった。上層の精子分画は運動率が高く、先体反応誘起能が高かった。本法により、DNA2重鎖切断精子を分離するという研究目的を達成できた。ヒト精子DNA損傷を定量的に観察する方法の開発を行った。個々の精子のDNA損傷、とくにDNAの非特異的断片化を定量的に解析するための条件検討を行った。アガロース、シーナゲル各07%混合物を熱可溶化した後、細胞を30万/mlとなるように懸濁し、表面親水化処理したスライドグラス上に10μmとなるように薄膜ゲルを作成する。界面活性剤、アフィニティクロマトグラフィ精製トリプシン溶液に浸漬して、細胞融解、核蛋白の除去を行った。パルスフィールド電気泳動法により泳動を行うと、DNAがインタクトな細胞ではDNAファイバーが伸展するが、DNA損傷を有する細胞では糸状の泳動像の先に粒子状の断片化DNAを観察することができた。そのプロファイルは多様であった。従来の細胞電気泳動によるDNA断片化研究は粒子状の断片化DNA像の有無でDNA損傷を判定していたが、本研究で開発した手法では多様なDNA損傷像を観察することができた。すでにヒト

精子DNA断片化へのアポトーシスの関与が報告されている。ヒトリンパ球を部分精製し、アクチノマイシンDを添加して培養することにより、化学的にアポトーシスを誘導し、上記方法にてDNA断片化パターンを解析した。そのDNA断片化像はヒト精子で観察されたパターンと大きく異なっており、DNA断片化が必ずしもアポトーシスによるかは不明であり、さらに詳細な検討を要する。DNA断片化を指標としてヒト精子精製法の検討を行った。上述した細胞電気泳動法により射精精液を観察すると、DNA断片化像を呈する精子の比率は20-70%程度であったが、Percollを密度勾配担体とする沈降速度差遠心分離法で精子を分離した後、イソキサゾールを担体とする沈降平衡法を組み合わせると、その比率は1-3%程度の低下させることができた。さらに詳細な条件検討を行い、精製効率の向上を図る予定である。ヒト精子DNA損傷の定量的観察法を開発した。個々の精子のDNA損傷を定量的に観察するため、single cell pulse gelfieldelectrophoresis (SCPFGE)を開発した。装置は位相を90度ずらした2組の電極を有し、3秒インターバルで直交電場(2.0V/cm、10分間)を印加する。表面親水化処理したスライドグラス上に100μg/mlのアフィニティクロマトグラフィ精製トリプシンを含むアガロースに懸濁した細胞(30万/ml)を滴下し、薄膜ゲルを作成した。これを界面活性剤、トリプシン溶液に浸漬して、細胞融解、核蛋白の除去を行った。SCPFGEにより泳動を行うと、1.連続するDNAファイバーが原点から伸展する、2.DNAファイバーの先に断片化DNA、3.鎖長が異なるDNA断片が展開する、4.原点が消失し、高度断片のみを認める、など多様な像が得られた。これまで報告されたアルカリコメット法によるDNA断片化研究は、粒子状の断片化DNA像の有無でDNA損傷を判定していたが、ゲノムDNA(長鎖DNA)はアルカリ処理において、濃度依存性に断片化することが示され、アルカリコメット法はDNA断片化研究には不適であることが示唆された。上述したSCPFGEにより射精精液を観察すると、DNA断片化像を呈する精子の比率は20-70%程度であった。本研究で開発した方法を指標としてDNA損傷精子の排除を試みた。Percollを密度勾配担体とする沈降速度差遠心分離法で精子を分離した後、オプチデンツを担体とする沈降平衡法を行うと、精子は2峰性に分布した。上層のDNA損傷比率は1%以下に低下したが、下層ではほとんどがDNA高度断片化像を示した。この結果はDNA損傷に伴い、細胞性状、特に密度が変化することが明らかとなった。上層の精子分画は運動率が高く、先体反応誘起能が高かった。さらに電顕による形態観察の結果、超微形態も良好であった。
T細胞の分化と機能を制御するシグナル伝達系の解析

T細胞の活性化と分化のメカニズムをシグナルの観点から解析した。T細胞の機能を制御する分子として、TCR下流にネガティブに働くGab-2とco-stimulationレセプターCTLA-4による制御を解析した。共にTCRシグナルにネガティブに働き、T細胞活性化に伴って発現が誘導されるのでフィードバック抑制を担っている。Gab-2はSHP-2をリクルートし、CD3ζを含め脱リン酸化を促進して抑制する。IL-2レセプターを介する増殖シグナルには正に働くので、活性化T細胞では、発現誘導されたGab-2はTCRシグナルには抑制的に、増殖には促進的に働く。これまでユニークなシグナル分子として解析してきたCASTはコンディショナル欠損マウスの作製に成功し、これからin vivoの機能解析が可能になった。T細胞分化に関しては、TCR-Tg/CD3ζ-KOマウスを用いることにより、TCRシグナルの強さによって、ネガティブ・ポジティブ選択が順序として制御されると共に、CD8/CD4へのコミットメントも同様にTCRシグナルの強さによって規定されることを示した。プレT細胞の分化を調節すると考えられる分子(RIT)をサブトラクションによってクローニングした。RITはDN胸腺細胞のなかでもpTα鎖を発現しているCD25^+DN細胞に最も高く、分化したCD4^+CD8^+細胞には全く発現していなかった。TCR刺激に伴ってプレT細胞ではpTα発現が低下し、逆にTCRα鎖発現が誘導されるが、RIT発現はこれらに完全に相関した。RIT欠損マウス作製のために数匹のキメラマウスが樹立できている。更に、pTα遺伝子のプロモーターを解析し、tandemに存在するE-box配列が、エンハンサーよりも強い活性で重要な役割を果たしていることを見いだした。このE-boxに結合するhelix-loop-helix転写因子が、HEB/E2Aであることを同定した。T細胞抗原レセプター(TCR)を介する活性化シグナルを制御する新たな2つの分子CASTとJak3の役割について解析した。CASTはそのdominant negative型の発現によってNFATの活性化が抑制されたが、更にstable transfectantにおいてはIL-2産生が抑制された。CASTの細胞内分布では、核内に多く存在することが判明し、シグナル伝達系以外の機能を示唆する。Jak3がTCR複合体に会合し、活性化に伴ってリン酸化を受け、dominant negative型は抗原特異的IL-2産生が著しく抑制する。TCRシグナル伝達における位置を解析した。Lck/ZAP-70がJak3のリン酸化を行い、CD3ζやZAP70には影響しないが、LAT,SLP-76,STAMのリン酸化を誘導する。一方、STATのリン酸化に大きな変化は無かった。これらからJak3はTCRシグナル伝達系を担う分子であることが明らかになった。引き続きCTLA-4の発現制御とネガティブシグナルの伝達機構を正常T細胞に種々の変異CTLA-4を導入して解析した。細胞内チロシンモチーフは表面発現に重要でが、IL-2産生のネガティブシグナルの形成には不要で、むしろ細胞膜近傍領域が重要である。T細胞分化におけるシグナルの解析では、CD3γの異なるスプライシング分子pTAC12がプレT細胞に特異的に発現しているのは、転写レベルではなく蛋白レベルの制御であることが判明した。また、TCRシグナルは、ポジティブ/ネガティブ選択の制御のみならず、CD4vsCD8のlineage決定にも関わっていることをin vivoのシステムで証明した。

T細胞抗原受容体(TCR)を介するシグナル伝達系の内で特に抑制性分子Gab2の機能の解析、抑制性レセプターCTLA-4の発現・機能制御の解析、およびT細胞分化に関与する新規分子の解析を進め、T細胞の活性化・分化の調節機構の解明を進めた。(1)抑制性レセプターCTLA-4は、CD4+T細胞の中ではリソソームに局在し、TCR刺激のない場合には短時間で分解されるが、TCR活性化によってリソソームが膜に融合することによってCTLA-4が細胞表面に発現する。実際、リソソーム蛋白も細胞表面に出て、酵素が放出されることも判明した。CTLA-4を介する抑制シグナルは未だ明らかでないが、SHP-2結合部位のないCTLA-4でも抑制活性を有し、その抑制にはrap-1が関与することが判明した。(2)SHP-2結合分子Gab-2はTCR活性化によって活性化されるZAP-70によってリン酸化され、SHP-2のSH2が会合するすることによって、T細胞活性化を抑制することか判明した。Gab-2によってリクルートされたSHP-2は少なくともCD3zリン酸化、MAPK活性化を抑制することが判明した。(3)プレTCRを発現するT細胞分化段階CD25+DN胸腺細胞にのみ発現する分子、RITを、pTa+細胞ムpTa-細胞のサブトラクションによって単離した。RITはロイシンジッパーを有する核蛋白で、他の臓器にはほとんど発現がないことから、胸腺分化に重要な分子であると考えられる。T細胞の活性化と分化のメカニズムをシグナルの観点から解析した。T細胞の機能を制御する分子として、TCR下流にネガティブに働くGab-2とco-stimulationレセプターCTLA-4による制御を解析した。共にTCRシグナルにネガティブに働き、T細胞活性化に伴って発現が誘導されるのでフィードバック抑制を担っている。Gab-2はSHP-2をリクルートし、CD3ζを含め脱リン酸化を促進して抑制する。IL-2レセプターを介する増殖シグナルには正に働くので、活性化T細胞では、発現誘導されたGab-2はTCRシグナルには抑制的に、増殖には促進的に働く。これまでユニークなシグナル分子として解析してきたCASTはコンディショナル欠損マウスの作製に成功し、これからin vivoの機能解析が可能になった。T細胞分化に関しては、TCR-Tg/CD3ζ-KOマウスを用いることにより、TCRシグナルの強さによって、ネガティブ・ポジティブ選択が順序として制御されると共に、CD8/CD4へのコミットメントも同様にTCRシグナルの強さによって規定されることを示した。プレT細胞の分化を調節すると考えられる分子(RIT)をサブトラクションによってクローニングした。RITはDN胸腺細胞のなかでもpTα鎖を発現しているCD25^+DN細胞に最も高く、分化したCD4^+CD8^+細胞には全く発現していなかった。
顎機能異常者と正常者の歯の咬耗状態の比較

研究実績の概要顎機能異常者、とくにブラキシズムを持つ患者の咬耗は顕著であり、さらにその状態を放置すれば、歯のみならず顎関節や筋肉にまでその影響が及んでいることは周知の事実である。しかしその摩耗の程度については、その概略が論ぜられているのみであり、科学的な根拠に立脚した報告は見られない。そこで今回は、顎口腔機能に異常の認められない正常者の歯の咬耗量とその傾向を年代別に測定し、天然歯列の咬耗のGold Standardを作製した。顎機能異常者については、正常者と同様の計測方法を用い、計測結果を正常者と比較検討した。計測方法はMurphyの指数を応用した方法と規格写真撮影により抽出された咬合面と咬粍面の広さの計測結果によって比較した。正常者の計測結果では、咬耗指数は経年的に増加し、その傾向は直線的であった。臨床的咬合面の広さは上顎では大臼歯、中切歯、側切歯、犬歯、小臼歯の順に小さくなり、下顎では大臼歯のみが特異的に咬合面が大きく、その他ではあまり大きな差は見られなかった。咬耗面についても同様の傾向が見られた。すなわち、咬合面に対する咬耗面の割合で歯列全体を観察すると、その傾向には大きな差が見られなかった。顎機能異常者については、臨床的咬合面の大きさの変化は、正常者と変化が見られないが、咬耗面の大きさは上顎前歯部では正常者の2倍を越え、大臼歯部では約1.5倍を示した。下顎では大臼歯部は正常者とほぼ同様の傾向であったが前歯部では上顎と同様、咬耗面積は大きく、正常者の約1.5倍を示した。歯列内での検討では、正常者では上下顎ともに左右の咬耗の程度に大きな差は見られず、その相関は大きかった。顎機能異常者では、上下顎の歯列内での咬耗の程度に大きな差が見られた。なお上下顎ともに左右の相関が見られた歯は上顎の第一大臼歯のみであった。研究申請段階で予定していた被験者数である顎機能異常者50名、正常者30名は顎機能異常者が32名、正常者が81名となった。計測については、すべての歯列模型について、コンピュータの画像として取り扱う祭の最適入力条件の設定がほぼ完了した。この条件を応用して歯列模型を画像としてのデーターベース化が進行中である。顎機能異常者の分類を行うための重要な指標となるMRIについては、顎機能異常者の撮影は終了し、顎関節円板および、下顎頭の位置、形態などの読影結果を画像と併せて入力中である。さらに顎機能異常者の分類を将来の発展性を持たせるため、患者の既往歴、現症などの諸症状から治療に対する症状の変化についてもデータベース化を考慮中である。模型の咬耗面の計測については、顎口腔形態計測システムではなく、Murphyの方法を用いて定量化を行った。さらにこの方法の精度向上のため歯列全体をVASで評価し、その確認作業を行った。画像の処理については、画像処理用コンピュータにて処理を行っており、同ソフト中に付属している画像変換機能によって、歯の咬耗面の抽出を約60%の試料で終了するとともに、残された試料についても歯の咬耗面の抽出を継続している。

試料の収集については、継続中で、本学附属病院に来院した患者の中から顎関節症と診断され、補綴科に来科した患者の中から歯の欠損がみられず、歯冠修復物の少ない患者を試料としている。正常者の試料については、本学学生の中から、条件に該当して、さらに本人の承諾が得られた者の中から試料としている。研究実績の概要顎機能異常者、とくにブラキシズムを持つ患者の咬耗は顕著であり、さらにその状態を放置すれば、歯のみならず顎関節や筋肉にまでその影響が及んでいることは周知の事実である。しかしその摩耗の程度については、その概略が論ぜられているのみであり、科学的な根拠に立脚した報告は見られない。そこで今回は、顎口腔機能に異常の認められない正常者の歯の咬耗量とその傾向を年代別に測定し、天然歯列の咬耗のGold Standardを作製した。顎機能異常者については、正常者と同様の計測方法を用い、計測結果を正常者と比較検討した。計測方法はMurphyの指数を応用した方法と規格写真撮影により抽出された咬合面と咬耗面の広さの計測結果によって比較した。正常者の計測結果では、咬耗指数は経年的に増加し、その傾向は直線的であった。臨床的咬合面の広さは上顎では大臼歯、中切歯、側切歯、犬歯、小臼歯の順に小さくなり、下顎では大臼歯のみが特異的に咬合面が大きく、その他ではあまり大きな差は見られなかった。咬耗面についても同様の傾向が見られた。すなわち、咬合面に対する咬耗面の割合で歯列全体を観察すると、その傾向には大きな差が見られなかった。顎機能異常者については、臨床的咬合面の大きさの変化は、正常者と変化が見られないが、咬耗面の大きさは上顎前歯部では正常者の2倍を越え、大臼歯部では約1.5倍を示した。下顎では大臼歯部は正常者とほぼ同様の傾向であったが前歯部では上顎と同様、咬耗面積は大きく、正常者の約1.5倍を示した。歯列内での検討では、正常者では上下顎ともに左右の咬耗の程度に大きな差は見られず、その相関は大きかった。顎機能異常者では、上下顎の歯列内での咬耗の程度に大きな差が見られた。なお上下顎ともに左右の相関が見られた歯は上顎の第一大臼歯のみであった。
風船把持歩行の効果の謎に迫る：指先感覚情報の“揺らぎ”解析と風船型姿勢制御モデル

初期歩行期乳児に風船の紐を把持させると,初期歩行獲得後の比較的安定した歩行に近似することを示した.平成30年度は,平成29年度に得られた知見からさらに被験者を増やし,立位時の身体重心(COM)と足底圧中心(COP)を計測した結果,風船把持により身体動揺が抑制された.同様に,スペクトル解析を行った結果,風船把持によって高周波帯域の割合が増加したことから,風船把持が体性感覚系にとって有意な姿勢制御戦略に移行させた可能性が示唆された.さらに,最大リアプノフ指数を用いて解析を行った結果,やはり姿勢動揺はカオス性を示しており,COM,COPの縮小は従来研究の知見と一致した.この原因として,風船把持によりサンプルエントロピー値が増加傾向にあったことから,制御系への入力が増え,そのため制御システムがより複雑になったことが考えられる.また,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析の結果,風船を把持することで筋発揮力は増加傾向にあり,風船を把持することで制御戦略が変化し,筋発揮戦略が変化したと考えられる.以上,平成29年度平成30年度にかけて風船把持における人の姿勢制御系への効果の謎に迫った結果,スペクトル解析,複雑系解析,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析に基づいて考察すると,風船把持が立位状態に及ぼす影響として,姿勢制御戦略が体性感覚優位の制御に変化し,姿勢制御システムがより複雑になり,そして姿勢制御の筋活動が効率の良い制御戦略に変化することによって,身体動揺の抑制につながった可能性がり,風船把持による乳幼児の初期歩行支援の有効性の一端を明らかにした.本研究の結果に基づいて,保育等実践現場において初期歩行に遅れのある乳児の風船把持歩行支援として取り組んでいる.1乳幼児の運動学的特徴の解析,2風船型歩行の定量化とモデル化,3歩行支援の有効性の導出,4実践における実用性の検証の4つの構成となっている.平成30年度までに歩行支援の有効性の導出と実践における実用性の検証(3,4)を目標として実施した結果,当初の予定通りに進捗し,現在は引き続き実践現場で風船把持歩行支援に取り組む保育施設等もある.研究については当初の予定通りに進捗し,現在も実践現場で風船把持歩行支援に取り組む保育施設等も増えてきている.しかし,当初の予定の「平成29年度中の成果発表」が業務の都合等もありできなかったため,成果発表のために本研究を1年間延長した.令和1年5月の世界理学療法学術大会にて成果発表を行う予定である.我々は,浮遊風船を初期歩行発現後間もない乳幼児に把持させたところ,身体動揺が減少し歩行距離の延長を示唆した。これは口頭指示が困難な乳幼児に対して効果的なアプローチ法であると考えている。本年度は,風船把持による立位姿勢への影響の特性解明にむけて,成人における風船把持立位姿勢データを用いて各種解析を行い,風船把持の影響の特性を明らかにすることを目的とした。対象は28名(男性10名,女性18名,20.7±1.0歳)とし,タスクは閉眼タンデム立位(アイマスク着用),条件は風船把持(BG),把持なし(NB),施行回数は各条件7施行で静止立位保持を30秒間行わせた。計測には,重心動揺計ForcePlate(サンプリング周波数:5kHz),3次元モーションキャプチャMotive(サンプリング周波数:120Hz),カメラ15台,マーカ点数(全身41点,風船18点)を使用した。解析方法は,スペクトル解析,複雑系解析,最大リアプノフ指数推定法によるカオス解析とした。結果,風船把持によりCOPの変化が抑制されること,風船把持による姿勢動揺の抑制が確認できた。風船把持によるスペクトルの低下,高周波帯の割合が増加が起こっていることから,風船把持により体性感覚系優位な姿勢制御戦略にシフトしていることが明らかとなった。さらに,この姿勢制御はカオス性を有しており,従来の知見とも一致した。本年度は,風船把持立位状態を定量的に計測・評価するシステムを開発するとともに,計測したデータから周波数解析,複雑系解析を行い,風船把持によるスペクトルの低下,高周波帯の割合が増加が起こっていることから,風船把持により体性感覚系優位な姿勢制御戦略にシフトしていることが明らかとなった。初期歩行期乳児に風船の紐を把持させると,初期歩行獲得後の比較的安定した歩行に近似することを示した.平成29年度は,生体の揺らぎを計測するために重心軌跡情報を使って時系列カオス解析を行い,生体の揺らぎの影響による非線形性と決定論的性質を抽出し,身体重心動揺の特徴量を示した.そして,時系列データのリアプノフ解析から軌跡との自己相似性を検証し,風船把持の有無による各指標の差を導出した.さらに浮遊する風船特有の動きを除去した体性感覚情報の揺らぎを検証するために,指先で紐を把持する指先力の揺らぎを計測し,カオス解析をした.立位時の身体重心(COM)と足底圧中心(COP)を計測した結果,風船把持によりCOPの変化が抑制され,姿勢動揺の抑制が確認された.スペクトル解析の結果,風船把持によるスペクトルの低下および高周波帯域の割合が増加し,風船把持により体性感覚系有意な姿勢制御戦略にシフトしていることが明らかとなった.さらに,COM,COP,風船の揺れの最大リアプノフ指数の解析結果,それぞれの指標の姿勢動揺はカオス性を示していることが明らかとなり,COM,COPは従来の知見と一致した.

さらに,風船把持によりサンプルエントロピー値(SampEn)が増加傾向にあったことから,制御系への入力が増え,そのため制御システムがより複雑になったことが考えられる.また,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析の結果,風船を把持することで筋発揮力は増加傾向にあり,風船を把持することで制御戦略が変化し,筋使用戦略が変化したと考えられる.以上,スペクトル解析,複雑系解析,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析結果として,風船把持が立位状態に及ぼす影響として,姿勢制御戦略が体性感覚優位の制御に変化し,姿勢制御システムがより複雑になり,姿勢制御の筋活動が効率の良い制御戦略に変化し,身体動揺の抑制につながった可能性が示唆される.1乳幼児の運動学的特徴の解析,2風船型歩行の定量化とモデル化,3歩行支援の有効性の導出,4実践における実用性の検証の4つの構成となっている.平成29年度までに風船把持歩行定量化システム・歩行モデル構築(1,2)を目標として実施した結果,当初の予定通りに進捗している.初期歩行期乳児に風船の紐を把持させると,初期歩行獲得後の比較的安定した歩行に近似することを示した.平成30年度は,平成29年度に得られた知見からさらに被験者を増やし,立位時の身体重心(COM)と足底圧中心(COP)を計測した結果,風船把持により身体動揺が抑制された.同様に,スペクトル解析を行った結果,風船把持によって高周波帯域の割合が増加したことから,風船把持が体性感覚系にとって有意な姿勢制御戦略に移行させた可能性が示唆された.さらに,最大リアプノフ指数を用いて解析を行った結果,やはり姿勢動揺はカオス性を示しており,COM,COPの縮小は従来研究の知見と一致した.この原因として,風船把持によりサンプルエントロピー値が増加傾向にあったことから,制御系への入力が増え,そのため制御システムがより複雑になったことが考えられる.また,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析の結果,風船を把持することで筋発揮力は増加傾向にあり,風船を把持することで制御戦略が変化し,筋発揮戦略が変化したと考えられる.以上,平成29年度平成30年度にかけて風船把持における人の姿勢制御系への効果の謎に迫った結果,スペクトル解析,複雑系解析,筋骨格モデルを用いた逆動力学解析に基づいて考察すると,風船把持が立位状態に及ぼす影響として,姿勢制御戦略が体性感覚優位の制御に変化し,姿勢制御システムがより複雑になり,そして姿勢制御の筋活動が効率の良い制御戦略に変化することによって,身体動揺の抑制につながった可能性がり,風船把持による乳幼児の初期歩行支援の有効性の一端を明らかにした.本研究の結果に基づいて,保育等実践現場において初期歩行に遅れのある乳児の風船把持歩行支援として取り組んでいる.1乳幼児の運動学的特徴の解析,2風船型歩行の定量化とモデル化,3歩行支援の有効性の導出,4実践における実用性の検証の4つの構成となっている.平成30年度までに歩行支援の有効性の導出と実践における実用性の検証(3,4)を目標として実施した結果,当初の予定通りに進捗し,現在は引き続き実践現場で風船把持歩行支援に取り組む保育施設等もある.今後は浮遊風船把持の特性を考慮したモデル化の検討を行うために,複雑系解析,逆動力学解析を組み合わせるなど,さらなる詳細な検証を行う.平成30年度には,初期歩行期の発達遅延を呈する乳幼児の歩行支援の有効性を導出を目的とし,実践における実用性の検証を行う.
極長鎖セラミドの生成機構および生理的役割の分子レベルでの解明

皮膚角層における極長鎖脂セラミドは、バリア機能の保持に欠くことのできない脂質である。ほ乳類のグリセロ脂質の側鎖が長鎖脂肪酸であるのに対し、セラミドは特徴的に極長鎖脂肪酸を持つが、他の組織に見られない炭素数26以上の極長鎖を持つ皮膚セラミドの機能的役割は、大変興味深い。我々は極長鎖セラミドの生成酵素同定、発現調節機構の解析を通して、セラミドの生体における機能的役割を研究し、脂肪酸伸張酵素ELOVLとセラミド生成酵素CERSの相互の活性調節機構を見いだした。皮膚の分化における極長鎖セラミドの生成に、調整機構として核内転写因子PPARが関与する事、PPARの活性化と生成産物であるセラミドが密接に関連している可能性を示した皮膚角層における極長鎖脂セラミドは、バリア機能の保持に欠くことのできない脂質である。皮膚の分化における極長鎖セラミドの生成に、調整機構として核内転写因子PPARが関与する事、PPARの活性化と生成産物であるセラミドが密接に関連している可能性を示したスフィンゴ脂質セラミドは今日、化粧品などに保湿成分として配合される脂質分子として、一般にも広く知られるようになった。しかしながら、その生合成酵素が初めて明らかにされたのは、まだ10年ほど前のことで、細胞内での生成の分子メカニズムについては未解明の部分も多い。皮膚にはバリア機能に重要なω水酸化セラミドといった他の組織は見られない特徴的なセラミドが存在するが、そのω水酸化を担う酵素等は皮膚機能の改善に重要な役割を果たすと考えられるにもかかわらず、明らかにされていない。我々は、未だ同定されていない酵素蛋白の解析を通して、皮膚におけるセラミドの恒常的な役割の解明に努めている。また、セラミドはそれ自身がPPARを介した皮膚の創傷治癒に関与することが示唆されており、その分子メカニズムについても検討を進めている。加えて細胞膜におけるセラミドの細胞内シグナルに与える影響についても、分子生物学的手法を用い解析を行っている。グリセロ脂質と共に細胞膜の重要な脂質であるセラミドは、その側鎖にグリセロ脂質より長い飽和型の極長鎖脂肪酸を側鎖に持つ特徴がある。このため、セラミド側鎖は細胞膜において疎水性相互作用が強く、長さもあることから細胞膜外層から内層側へ入り込み、細胞膜内層の脂質や脂質修飾した蛋白とも相互作用することで、マイクロドメインの形成に関与すると考えられる。マイクロドメインへのレセプターの集積やシグナル分子の変化を追うことで、極長鎖セラミドの生理的役割を解明する。スフィンゴ脂質セラミドは今日、化粧品などの保湿成分として配合される脂質分子として、一般にも広く知られるようになった。しかしながら、ヒトにおける生合成酵素が明らかになったのは、まだ10年ほど前のことで、細胞内での分子メカニズムについては未解明の部分も多い。ほ乳類の一般的なグリセロ脂質の側鎖が炭素数16もしくは18の長鎖脂肪酸であるのに対し、セラミドは炭素数16の長鎖および炭素数24の特徴的な極長鎖脂肪酸を側鎖に持つが、その組成比は組織により様々である。皮膚には他の組織に見られない炭素数26以上の極長鎖および特徴的な水酸化を受けたセラミドが存在し、これらの機能的役割は大変興味深い。本研究は、セラミドの生成代謝酵素の解析を通して、皮膚におけるセラミドの機能的役割を明らかにする事を目的とする。我々は、皮膚のバリア機能に重要といわれている極長鎖セラミドの生成にセラミド生成酵素3(CERS3)が重要であることを明らかにした。また、側鎖の伸張酵素であるELOVLの解析を行い、極長鎖脂肪酸生成に関与する脂肪酸伸張酵素の活性がCERS3の活性により調節を受けている可能性を示した。また、皮膚に特徴的な水酸化を受けたセラミドであるフィトセラミドが、転写因子PPARの活性化を通して皮膚のセラミドの生成を活性化するフィトセラミドの機能的役割についての知見を得た。皮膚の保湿に重要とされるω水酸化セラミドを生成する新規酵素の解析については、今後も継続した研究が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
CAC発癌における間葉系幹細胞の役割の解明

我々はこれまでに,間質に存在する線維芽細胞から分泌されるTanascin-CがCAC発癌に強く関与していることを示した.この研究成果から,間質系細胞を標的とするCAC予防戦略は極めて有効であることが示唆される.本研究では炎症性発癌におけるMSCの役割に着目し,発癌や進展への関与を明らかにすることを目的とする.CAC発癌は間質細胞の関与が極めて大きいと考えられているが,間質細胞の中でもっとも癌の進展に関与していると言われるMSCに着目した研究はこれまでにない.周囲の微小環境を標的としたCACの発癌予防に繋がる新しい治療戦略を構築することが可能となれば,IBD患者の予後向上に大きく寄与できる.我々はこれまでに,間質に存在する線維芽細胞から分泌されるTanascin-CがCAC発癌に強く関与していることを示した.この研究成果から,間質系細胞を標的とするCAC予防戦略は極めて有効であることが示唆される.本研究では炎症性発癌におけるMSCの役割に着目し,発癌や進展への関与を明らかにすることを目的とする.CAC発癌は間質細胞の関与が極めて大きいと考えられているが,間質細胞の中でもっとも癌の進展に関与していると言われるMSCに着目した研究はこれまでにない.周囲の微小環境を標的としたCACの発癌予防に繋がる新しい治療戦略を構築することが可能となれば,IBD患者の予後向上に大きく寄与できる.
土壌の環境浄化機能の極限値の探求

多段土壌層法を用いて我々がこれまで実現できた土壌の環境浄化機能の持続的な(1週間程度の瞬間値ではない)最大値はC : N : P=2400:240:30t/ha/y(660:66:8g/m^2/日)であり、さらなる改良により極限値はC : N: P=4000:400:40t/ha/y程度は可能と推定される。茶園や野菜園等、すでに環境問題を引き起こしている循環速度の100倍以上の極限浄化速度が推定される。土壌による有機性物質の分解と浄化の場は多様な物理的構造と孔隙分布及び多様な化学的性質を持つ土壌団粒の内外にある。多段土壌層法では、この団粒の発達程度の異なる土壌の利用に通気条件を組み合わせると、外表面通気-未通気系(単粒の粘土やシルトや砂等が多い団粒未発達のマサ土等)、内表面通気-未通気系(黒ボク等の団粒が発達)等、多様な好気嫌気条件を生み出せる。又、団粒の親水性と疎水性は腐植物質の質と量、粉末木炭や活性炭の添加等で制御できる。かくして極めて多様な物理化学性を持つ団粒の場(微生物コンソーシアの活動する場)を作り出すことができる。このため、難分解性の農薬や環境ホルモンやテトラクロロエチレン等の分解機能を向上させることもできる。結論(1)土壌の分解浄化機能の極限値は生物生産(支持)機能に比べて、何故このように格段に大きいのであろうか?その機構を解明するには土壌団粒の物理性と化学性を生物性と関連づけて理解する必要があることは明らかである。(2)その生態学的意義は何か?生産に比べて、浄化分解機能に余裕があることは生態学的にどのような意義があるのであろうか?(3)今後は多段土壌層法で上記のような極限値を示す条件下での優先的微生物群集をFISH法とPCR-DGGE法により同定する予定であり、そのための予備的検討を行った。(1)自然界の土壌中における有機物の現存量(t/ha)と循環速度(t/ha/y)の範囲:1mの深度の1ha当たりの土壌のC:N:Pの現存量は、泥炭土で1200:30:3、黒ボク土で1000:50:25、日本の平均的水田土壌で200:20:10t/ha、陸上生態系の光合成能力(0-30t/ha/y)から推定される循環速度は概略C:N:P=9:0.37:0.03t/ha/y、砂糖キビでは、C:N:P=50:<1.7:<0.2t/ha/y、野菜や茶園ではC:N:P=<25:1:0.2t/ha/y程度の循環速度である。この循環速度(負荷速度)でも地下水深刻な環境問題を引き起こしている。(2)自然土壌や植物生態系の環境浄化機能の大きさ:自然土壌の機能をそのまま利用する欧米のセピテックタンクー土壌トレンチ法の場合、循環速度(浄化速度)はC:N:P=80:6:4t/ha/y、植物浄化システムのビオパークやバイオジオフィルター方式ではC:N:P=55:11:1t/ha/y程度までの浄化能力がある。(3)多段土壌層法による土壌の環境浄化機能の極限値の推定:これまで実現できた土壌の環境浄化機能の持続的な最大値はC:N:P=2400:240:30t/ha/y(660:66:8g/m2/日)であり、改良により極限値はC:N:P=4000:400:40t/ha/y程度と推定され、汚染が深刻な茶園等の循環速度の100倍の極限値である。(4)土壌圏の生態工学の可能性:土壌の環境浄化機能の中心となる生物活性は多様な微生物群の共生コンソーシアとして発揮されている。多段土壌層法では、このような土壌の物理化学性も含めた総体としての環境浄化機能を活性化し、その極限値を探ることを可能にする。多段土壌層法により明らかにされた、土壌の有機物分解浄化機能の極限値は生物生産(支持)機能に比べて、何故このように格段に大きいのであろうか?その生態学的意義は何か?土壌肥科学が「かつて」生物生産機能の向上に果したように、地球環境問題解決のために必要な、土壌の環境浄化機能の理解とその利用に関わる未開拓の研究開発分野が存在する。

多段土壌層法では、この団粒の発達程度の異なる土壌の利用に通気条件を組み合わせると、外表面通気-未通気系(単粒の粘土やシルトや砂等が多い団粒未発達のマサ土等)、内表面通気-未通気系(黒ボク等の団粒が発達)等、多様な好気嫌気条件を生み出せる。又、団粒の親水性と疎水性は腐植物質の質と量、粉末木炭や活性炭の添加等で制御できる。かくして極めて多様な物理化学性を持つ団粒の場(微生物コンソーシアの活動する場)を作り出すことができる。このため、難分解性の農薬や環境ホルモンやテトラクロロエチレン等の分解機能を向上させることもできる。結論(1)土壌の分解浄化機能の極限値は生物生産(支持)機能に比べて、何故このように格段に大きいのであろうか?その機構を解明するには土壌団粒の物理性と化学性を生物性と関連づけて理解する必要があることは明らかである。(2)その生態学的意義は何か?生産に比べて、浄化分解機能に余裕があることは生態学的にどのような意義があるのであろうか?(3)今後は多段土壌層法で上記のような極限値を示す条件下での優先的微生物群集をFISH法とPCR-DGGE法により同定する予定であり、そのための予備的検討を行った。
ＮＩＣＵに長期入院傾向がある子どもの退院調整と在宅医療支援体制のプロモート

本課題では在宅医療を必要とするNICUに入院中および退院後の子どもの家族を支援することを目的として調査を行った。NICUや子どもの地域生活に関わる看護師や医師、子どもの家族にインタビュー調査を行った。また、A県訪問看護ステーション連絡協議会に登録している81施設を対象にアンケート調査を行った。返信があった45施設の回答の結果、015歳までの子どもの訪問看護の経験があったのは27施設(60.0%)であった。さらに市町の支援窓口を確認するため電話調査を行った。これらの結果をもとに、訪問看護ステーションなど支援先の情報をまとめ、在宅医療を必要とする子どもの家族に向けた冊子を作成した。本研究ではNICUに長期入院傾向がある子どもの退院調整と在宅医療支援体制の整備を目指している。1NICUを退院した子どもと家族、2NICUで働く医療職者、3行政機関・支援施設の現状を調査・分析し、その課題を明らかにしたうえで、在宅医療の支援体制を強化することが目的である。現在、看護師と医師などNICUで働く医療職者へのインタビュー調査と分析に取り組んでいる。看護師は、身体的に厳しい状況にある子どもとその家族に対して愛情をもってかかわり、対象を中心とした看護を展開していた。在宅医療が必要な子どもを自宅に連れて帰り養育するという家族の意思と覚悟を慎重に確認していた。子どもが病院から自宅で生活できるよう支援するために自らの課題を認識し、病院と地域をつなぐ多職種間連携の要になる立場にあることを自覚していた。救命集中治療が中心であるNICUにおいては、長期入院児が在宅医療に移行する際に他施設を経由して自宅に帰る場合に、家族への育児や医療的ケアの指導についてそのあり方に戸惑いや困難に感じる様子がうかがえた。子どもの在宅医療体制については、訪問看護ステーション看護師との関わりをもつことなどから、以前に比べると整備されてきていることを感じていた。今後は、対象となる家族、行政機関、訪問看護ステーションなど在宅医療を支える支援施設などへの調査を行う予定である。地域においては、様々な職種メンバーで構成される会議(「小児および重度障害児・者の在宅医療・福祉を充実させるための、あり方連携をざっくばらんに話し合う会」)に参加し情報収集と意見交換を行っている。子どもを対象とした在宅医療支援の実態を明らかにすることを目的に、A県における訪問看護ステーションの調査を行った。A県訪問看護ステーション連絡協議会に登録している81施設を対象に(2015年7月現在の名簿より)、質問紙調査票を郵送した。調査期間は2016年1月22日2月15日であり、所属大学の倫理審査委員会の承認を得て実施した。結果、81施設に郵送し45施設より回答が得られた(回収率55.6%)。施設のスタッフは、看護師のみの施設は17施設であり、看護師と他の専門職種で構成されている施設は22施設(理学療法士・作業療法士・言語療法士21施設、介護士1施設)、事務職員がいる施設は10施設であった。「015歳の子どもの訪問看護の経験」は「経験がある」27施設(60.0%)、「経験がない」10施設(22.2%)、そのうち「経験はないが、小児の訪問看護を受けても良い」4施設)、「今後も受ける予定はない」5施設(11.1%)、「その他」3施設(6.7%)であった。子どもの訪問看護の内容は(平成27年上半期の実績より)、0歳児は14名(平均1.7名)、16歳の幼児は15名(平均2.1名)、612歳の小学生は30名(平均2.0名)、1215歳の中学生は17名(平均1.9名)であった。援助内容は、産後里帰りの期間母親の支援、弁付バッグ・マスク呼吸器で強制補助換気を行いながらの入浴介助、理学療法士によるリハビリテーション、精神的支援、介護指導、気管切開部の管理と入浴介助、吸引、吸入、注入、口腔ケア、胃瘻ケア、ストマ管理、呼吸器やペースメーカー、経鼻栄養の管理、相談の受け入れ、通学準備などであった。「今後も小児訪問看護を引き受ける予定はない」と回答した5つの施設は、スタッフ数5名以下の小規模ステーション、小児看護が未経験、精神疾患や認知症看護を専門としていた。作業時間の確保が困難であったため、新年度に一部計画を移行し、データ入力など業務補助者を確保した。在宅医療を必要とするNICUに入院中または退院後の子どもと家族への支援を目的に調査を行っている。本年度は、A県の訪問看護ステーションの情報と市町の窓口や連絡先を調査した。その内容を整理し、「A県の子どもの在宅医療ー訪問看護ステーションと市町のお問い合わせ先」というタイトルの冊子を作成した。冊子は関連機関や部署に配布しているところである。在宅医療を要する子どもを育てる母親同士の情報交換などから訪問看護につながったという事例の報告もあり、子どもを対象とする訪問看護ステーションなど支援の情報が広く行き渡ることが課題である。在宅医療を受ける子どもの養育において、家族が孤立せず負担が軽減されるよう調査と実践を継続している。訪問看護ステーション情報の整理と冊子作成に、予定以上に時間を要したため。本研究課題では、A県における在宅医療を必要とするNICU(Neonatal Intensive care unit,新生児集中治療室)に入院中および退院後の子どもの家族を支援することを目的として調査を行った。

実態を把握するため、NICUの看護師と医師、子どもの地域生活支援にかかわる看護師、NICUを退院し在宅医療を行う子どもの家族、訪問看護ステーションの看護師にインタビュー調査を行った。NICU看護師のインタビュー調査では、不安定な経過をたどる子どもを心配する両親の状況を把握した上で、子どもと家族を中心とした看護の実践が行われていることを改めて確認した。NICU/GCUから在宅医療につなぐ支援者としての知識や技術をもって多職種間の連携の中心にいる責任を自覚していた。子どもの退院については、在宅医療を必要とする子どもを育てる家族の意思を確認することが最も重要であると認識し、家族を見守り支持的な姿勢で看護を提供していた。また、A県訪問看護ステーション連絡協議会に登録している81施設を対象にアンケート調査を行い45施設より回答を得た(回収率55.6%)。結果、015歳までの子どもの訪問看護の経験があったのは27施設(60.0%)であり、32施設(71.1%)が子どもの訪問看護を行うことが可能であると回答した。さらに市町の支援窓口を確認するため電話調査を行った。これらの結果をもとに、訪問看護ステーションなど支援先の情報をまとめ、在宅医療を必要とする子どもの家族に向けた冊子を作成し、病院などで使用している。本課題では在宅医療を必要とするNICUに入院中および退院後の子どもの家族を支援することを目的として調査を行った。NICUや子どもの地域生活に関わる看護師や医師、子どもの家族にインタビュー調査を行った。また、A県訪問看護ステーション連絡協議会に登録している81施設を対象にアンケート調査を行った。返信があった45施設の回答の結果、015歳までの子どもの訪問看護の経験があったのは27施設(60.0%)であった。これらの結果をもとに、訪問看護ステーションなど支援先の情報をまとめ、在宅医療を必要とする子どもの家族に向けた冊子を作成した。インタビュー調査の協力者が多数あり、データ収集と分析の時間を多く要しているため。本年度に収集した情報をもとに訪問看護ステーションガイドマップを作成し活用・評価を行い、関係各位へのインタビュー調査を実施しまとめる予定である。在宅医療を受ける子どもの家族へのインタビュー調査、訪問看護ステーションの看護師はじめ支援者のインタビュー調査・分析を行い、結果をまとめて終了する予定である。小児看護今後は、対象となる家族、行政機関、訪問看護ステーションなど在宅医療を支える支援施設などへの調査を行う予定である。地域においては、様々な職種のメンバーで構成される会議(「小児および重度障害児・者の在宅医療・福祉を充実させるための、あり方連携をざっくばらんに話し合う会」)に参加し情報収集と意見交換を行っており、地域の小児在宅医療体制の整備に努めたい。調査の進捗状況が遅れているため、次年度使用額が生じた。研究のデータ収集に時間を要して研究計画を1年延期したためである。インタビュー調査対象者のデータ収集中であるため。研究成果の発表準備とその旅費、印刷費用確保のため。インタビュー調査(旅費等)、データ起こし、関連書籍等の購入、報告書の作成に使用する予定である。また、学会報告を予定している。データ収集後の音声データ書き起こし作業に使用するため。
ライブイメージングによるマウス体軸形成機構の解析

本研究においてはライブイメージング観察を第一の方法とし、マウス胚の受精卵から体軸が明確になるまでのステージについての包括的な理解を目指した。核だけでなく、細胞膜、初期胚の前側を蛍光タンパク質で標識するマウスを準備し、受精から体軸形成の時期までの観察方法を開発した。特に細胞の分裂、移動といった細胞の挙動を着床前胚、着床後胚において連続観察を可能とした。A.胚盤胞以降のステージの培養法の確立本研究の最も中心となる技術として、マウス胚を子宮の外で培養し、子宮内と同様の発生を再現することである。胚盤胞から培養を開始し、様々な培地を用いて条件検討を行った。条件検討は、まず培養した胚の形態をマクロで観察し、形の良い物からパラフィン切片を作製した。細胞層の成り立ちや、形態などから至適の条件を探った。B.AVEでVenusを特異的に発現するマウスの開発体軸の前後を判定するためにAVEで発現するCerl遺伝子の発現制御領域に蛍光タンパク質VenusのcDNAをつないだトランスジェニックマウスを確立した。6日目、7日目胚を用いて蛍光タンパク質の局在を確認した所、予定通りAVEが標識されていた。来年度以降は、このマウスをAの培養条件の検討に用いる。C,核を可視化した胚のイメージングによる細胞の分裂、移動パターンの解析ヒストン-EGFPを発現する胚を使って、短期間(一日程度)のイメージングを開始した。5日目胚からスタートし、約一日間培養し、細胞の分裂、移動の状況などを撮影開始した。今後は更にこの情報の解析を進める。D.細胞膜を可視化した胚を使ってのイメージングによる細胞の形の解析上記Cの核を標識したマウスのイメージングと平行して、Lynの膜移行シグナルと融合したVenusを全ての細胞で発現するマウス(既に作製済み)を用いて、同様のステージのイメージングを行うことを計画した。このマウス胚を用いて、撮影を開始したが撮影途中に蛍光タンパク質の細胞内局在が異常になる傾向がみられた。今後は他の蛍光タンパク質を用いる方法、他のタンパク質との融合などを視野に改善を進める。本研究では、胚盤胞から前後軸の形成までのステージにおいて、細胞の分化様式、細胞の形と極性の形成機構、体軸の成立過程の現象について包括的な理解を深めることを目標にしている。本年度は以下の項目について研究を進めた。A.胚盤胞以降のステージの培養法の確立。AVE(前側臓側内胚葉)をGFPで標識したトランスジェニックマウスを用いて、胚盤胞以降のステージの培養法の改善を進めた。胚を培養液中に置くだけでなく、コラーゲンなどの細胞外マトリクス内で発生することも試み、培養液だけよりも胚体部分の形成の改善が認められた。B.核を標識したマウス胚を用いた細胞分裂、移動パターンの解析。全ての核がGFPで標識されたマウス胚を培養し、細胞の挙動を記録した。現在用いている培養、撮影装置ではレンズから遠い部分の画像が不明瞭であるため、装置自身の改良が必要であると判断した。この為、より低倍率での観察に最適化するために、共焦点装置のピンホールサイズを小さくすることにした。C.固定サンプルを用いた胚の形態変化の観察ライブイメージングだけに頼った解析方法では十分な理解に到達できない可能性が高い為、子宮ごと固定した胚の連続切片を作製し、子宮の環境と胚の存在様式の関連を明らかにすることにした。3.5日目、4日目のサンプルを作製し、HE染色した連続切片を連続して撮影した。この結果胚が着床する前の段階からの子宮内でのスペーシングの様式、子宮上皮とコンタクトする場所が同定できた。今後は更に0.5日間隔でデータの蓄積を進める。本研究は、胚盤胞から前後軸の形成までのステージにおいて、細胞の分化様式、細胞の形と極性の形成機構、体軸の成立過程の現象について包括的な理解を深めることを目標として以下を実施した。マウス胚において、胚盤胞が子宮に着床し、体軸が形成される過程は依然として謎が多い。そこでこの時期の培養に取り組んでいる。細胞外マトリクス内で発生させた場合、形態的には子宮内での胚とよく類似した胚が発生したが、依然として正常な形態が得られる確率が低く、培地などを改善する必要がある。核をGFPで標識したトランスジェニックマウス胚を用い、5日目から約24時間の培養を行い、連続的に観察した。観察される細胞の数は数千を超える為、人がマニュアルで解析を進めるのは非常に困難である。そこで、得られた画像から核の場所を計算機により自動認識、追跡する方法の開発に取りかかった。この際に、元の画像の解像度、Zステップ、時間ステップを最適する必要があり、これらのパラメータを細かく振った画像を準備し、自動化への最適条件を検討した。

C.固定サンプルを用いた胚の形態変化の観察胚を培養する際に、胚が発生する子宮内の環境を模倣すること、連続した形態変化の基礎情報を理解する必要がある。そこで子宮毎固定したサンプルを作製し、連続切片を作製、子宮及び胚の状態を観察することを進めた。3.5日から5日までの連続切片を作製し、形態の変化を観察している。着床時の子宮の状況、胚の存在様式が明らかになった。