hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病網膜症における毒性アルデヒド-アクロレインの産生機構

アクロレイン(ACR)は煙草などに含まれる高反応性の不飽和アルデヒドである。これまで外因性の毒性物質として知られていたが、近年、ポリアミンと呼ばれる生体内分子の酸化などにより内因性にも産生されることが明らかとなり、様々な疾患で注目されている。Vascular adhesion protein (VAP)-1は白血球接着分子およびアミン酸化酵素としての機能を有し、炎症と酸化ストレスの双方に関連する分子である。申請者らの予備検討により、糖尿病網膜症患者の硝子体においてACRとVAP-1が共に増加し、両者が正の相関を示すことが明らかになった。しかし、VAP-1がACR産生に関与するかは未だ不明である。本研究の目的は糖尿病網膜症におけるACR産生の機序を解明することである。昨年度までに、組換えヒトVAP-1タンパク(rhVAP-1)がポリアミンの一種であるスペルミンを基質として過酸化水素とACRを生成することが明らかとなっている。本年度の研究により、培養ラット網膜血管内皮細胞TR-iBRB2にスペルミンを添加すると、ACR結合タンパクが増加するという結果を得た。また、VAP-1を過剰発現させたTR-iBRB2を腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)-αで刺激してVAP-1分泌を亢進させると、スペルミン添加による培養上清中のACR生成が増加した。さらに、TR-iBRB2へのACR添加により、抗酸化物質グルタチオンの減少と活性酸素種(reactive oxygen species, ROS)の増加がみられた。rhVAP-1とスペルミンの反応物を添加した場合も、同様にグルタチオンの減少とROSの増加が認められた。これらのことから、VAP-1がスペルミンを基質としてACRを生成し、網膜血管内皮細胞の酸化ストレスを亢進させることが示唆された。交付申請書に記載した平成30年度の研究実施計画のうち、「TR-iBRB2細胞における酸化ストレスの検討」については終了し、検討により学術的意義のある結果を得ていることから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。令和元年度は、肥満2型糖尿病モデル動物であるSpontaneously Diabetic Torii (SDT) fattyラットを用いたin vivo解析を行う。SDTfattyラットにおいて、血清中、硝子体および網膜中のACR結合タンパクとVAP-1を測定し、コントロールであるSprague-Dawley(SD)ラットとの比較を行う。さらに同ラットにおいて眼所見の精査および網膜と血漿中の酸化ストレスマーカーの測定をおこない、SDラットと比較する。もし何らかの変化が見られた場合、ACR阻害剤メスナを点眼、経口または静脈注射により投与し影響を解析する。アクロレインは煙草などに含まれる高反応性の不飽和アルデヒドであり、核酸やタンパクなどに結合してその機能を障害し、酸化ストレスを亢進させる。これまで外因性の毒性物質として知られていたが、近年、ポリアミンと呼ばれる生体内分子の酸化などにより内因性にも産生されることが明らかとなり、酸化ストレスの関与する様々な疾患で注目されている。Vascular adhesion protein (VAP)-1は白血球接着分子およびアミン酸化酵素としての機能を有し、炎症と酸化ストレスの双方に関連する興味深い分子である。申請者らの予備検討により、糖尿病網膜症患者の硝子体においてアクロレインとVAP-1が共に増加し、両者が正の相関を示すことが明らかになった。しかし、VAP-1がアクロレイン産生に関与するかは未だ不明である。本研究の目的は糖尿病網膜症におけるアクロレイン産生の機序を解明することである。本年度の研究により、試験管内で組換えヒトVAP-タンパク(recombinant human VAP-1, rhVAP-1)をポリアミンの一種であるスペルミンと反応させると、濃度依存的に過酸化水素が生成されるという結果を得た。また条件検討により、反応バッファーの至適条件が判明した。この条件においてrhVAP-1とスペルミンを反応させ、血清アルブミンを加えアクロレイン結合タンパクをELISAで測定したところ、rhVAP-1の濃度依存的にアクロレイン結合タンパクが増加した。この反応は、VAP-1特異的阻害剤セミカルバジドにより抑制された。これらの結果は、rhVAP-1がスペルミンを基質として過酸化水素とアクロレインを生成することを示した。さらに、増殖糖尿病網膜症(PDR)患者の線維血管組織において、アクロレイン結合タンパクとVAP-1が血管内皮細胞に共局在するという結果を免疫染色により得た。平成29年度交付申請書に記載した研究計画のうち、「試験管内におけるヒト組換えVAP-1タンパクとポリアミンによるアクロレイン生成の検討」については終了し、検討により学術的意義のある結果を得ていることから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。

しかし、VAP-1がACR産生に関与するかは未だ不明である。本研究の目的は糖尿病網膜症におけるACR産生の機序を解明することである。昨年度までに、組換えヒトVAP-1タンパク(rhVAP-1)がポリアミンの一種であるスペルミンを基質として過酸化水素とACRを生成することが明らかとなっている。本年度の研究により、培養ラット網膜血管内皮細胞TR-iBRB2にスペルミンを添加すると、ACR結合タンパクが増加するという結果を得た。また、VAP-1を過剰発現させたTR-iBRB2を腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)-αで刺激してVAP-1分泌を亢進させると、スペルミン添加による培養上清中のACR生成が増加した。さらに、TR-iBRB2へのACR添加により、抗酸化物質グルタチオンの減少と活性酸素種(reactive oxygen species, ROS)の増加がみられた。rhVAP-1とスペルミンの反応物を添加した場合も、同様にグルタチオンの減少とROSの増加が認められた。これらのことから、VAP-1がスペルミンを基質としてACRを生成し、網膜血管内皮細胞の酸化ストレスを亢進させることが示唆された。交付申請書に記載した平成30年度の研究実施計画のうち、「TR-iBRB2細胞における酸化ストレスの検討」については終了し、検討により学術的意義のある結果を得ていることから、おおむね順調に研究は進展していると自己評価するものである。平成30年度は、培養ラット網膜毛細血管内皮細胞TR-iBRB2を用いて、VAP-1によるアクロレイン生成を検討する。無血清で培養したTR-iBRB2細胞にスペルミンを添加し、アクロレイン結合タンパクをELISA法で解析する。また、TR-iBRB2細胞にVAP-1を遺伝子導入して過剰発現させ、スペルミン添加時のアクロレイン結合タンパクが増加するかをELISA法で解析する。続いて腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)-αやインターロイキン( interleukin, IL)-1βなどの炎症性サイトカインの刺激によりTR-iBRB2細胞からのVAP-1分泌を亢進させ、アクロレイン生成が増加するか検討する。更に、TR-iBRB2細胞にアクロレインを添加し、細胞の酸化ストレス状態を、DNA酸化損傷マーカーである8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)の測定、活性酸素種の測定、抗酸化物質グルタチオン濃度の測定などにより検討し、アクロレインが網膜毛細血管内皮細胞に及ぼす影響を解析する。令和元年度は、肥満2型糖尿病モデル動物であるSpontaneously Diabetic Torii (SDT) fattyラットを用いたin vivo解析を行う。SDTfattyラットにおいて、血清中、硝子体および網膜中のACR結合タンパクとVAP-1を測定し、コントロールであるSprague-Dawley(SD)ラットとの比較を行う。さらに同ラットにおいて眼所見の精査および網膜と血漿中の酸化ストレスマーカーの測定をおこない、SDラットと比較する。
小児1型糖尿病の合併症の実態に関するコホート研究

わが国の小児期発症1型糖尿病の死亡の危険度は同世代の一般人口の10倍以上であった。しかし、医療制度が整備された1985年以降に診断された症例の予後ならびに合併症の累積発症率の詳細は不明である。本研究では、全国調査により196579年もしくは、8591年に登録された症例3505例の、2000年1月1日における合併症ならびに生存状況を追跡した。平成14年度は、症例の主治医に調査票を送付する作業を中心に行った。また、症例が転医していた場合は転医先に調査票を再送付した。平成15年度は、平成14年度の作業を続行し、調査票の返送のない医療機関へ調査票の記入を再度依頼し、さらに電話にてのコンタクトも行い追跡率向上に努めた。現時点において、対象症例3505例中2005例から返答があり、回収率は57.2%であった。生命予後に関しては、1986-90年診断群の死亡率(対10万人年)と標準化死亡比(SMR)はそれぞれ269および7.7で、1965-79年診断群の562および11.5と比較すると、いずれも著明に改善していた。合併症の頻度並びに年次推移についても検討した。網膜光凝固療法施行に関しては、1965-69年診断群では、追跡10年、20年および30年の時点の累積施行率は、それぞれ4.0%、31.0%および73.5%であった。1986-90年診断群では、追跡10年の時点の累積施行率は2.0%で、1965-69年診断群との比較において有意差を認めなかった。腎代償療法(人工透析/腎移植)導入に関しては、1965-69年診断群では、追跡10年、20年および30年の時点の累積導入率は、それぞれ2.1%、19.6%および38.7%であった。1986-90年診断群では、追跡10年の時点の累積導入率は0%であり、腎代償療法施行率は有意に(P<0.0001)低下していた。わが国の小児期発症1型糖尿病(インスリン依存型)の予後は、近年においても著しく不良であり、その死亡率は同世代の一般人口の死亡率の10倍以上であった。しかし、医療制度が整備された1985年以降に診断された症例の予後ならびに合併症の累積発症率の詳細は不明であり、今回の調査を開始した。本研究では、全国調査により196579年ならびに8591年に登録された症例3505例の、2000年1月1日における合併症ならびに生存状況を明らかにすることを目的し、症例の追跡を行っている。平成14年度においては、対象症例の、合併症の進展状況並びに生存状況を、登録されている症例の主治医に調査票を送付し記入を依頼するという作業を中心に行った。その際、症例本人より、主治医を通して書面にての同意を得ることとしていたが、回収率が伸びず、再考を要した。厚生労働省が発表したインフォームドコンセントに関する新しい指針に基づき、口頭同意がえられれば良いように倫理委員会に申請し認定されたため、新しい調査票を発送中である。また、症例が転医していた場合は転医先を主治医から聞き、調査票を再送付するという作業も進行中である。現時点において、対象症例3505例中1464例より反応があり、回収率は40.8%であった。そのうち、合併症状況が判明した症例は、909例(25.9%)である。現時点で、198591年に診断された症例の標準化死亡比(SMR)を求めたところ、その死亡のリスクは一般人口の約3.5倍とほぼ欧米と同レベルに改善していた。調査の回収率の上昇を待って、合併症の解析も行う予定である。

1986-90年診断群では、追跡10年の時点の累積施行率は2.0%で、1965-69年診断群との比較において有意差を認めなかった。腎代償療法(人工透析/腎移植)導入に関しては、1965-69年診断群では、追跡10年、20年および30年の時点の累積導入率は、それぞれ2.1%、19.6%および38.7%であった。1986-90年診断群では、追跡10年の時点の累積導入率は0%であり、腎代償療法施行率は有意に(P<0.0001)低下していた。
抗原性変異インフルエンザウイルス出現の早期発見の決め手

我々は、B型インフルエンザウイルスの抗原性変異を解析してきた。B型インフルエンザウイルスの宿主はヒトが中心で、抗原性変異はヒトの中で発生し変異したウイルスがヒトからヒトへと伝播すると言われている。シーズンを越えて経年的に抗原性変異を観察すると、個人から分離されたウイルス株に従来株と変異株が混在し、その変異株が次のシーズンに優勢になることを発見し報告した。これは、ヒトの生体内でウイルスが変異していく過程をとらえたことを意味する。本研究では、これまで明らかにされていなかった複数のウイルスの混在について、それを識別し比率を測定する方法を開発した。蛍光色素LCGを加えてキャピラリーPCRで増幅した産物を融解温度曲線の変化で観察する方法で、精度よく再現性の高い測定系を確立できた。この方法でインフルエンザ流行シーズン中に分離されたウイルス株での従来株と変異株の混在比率を半定量的に評価したところ、1時間以内に混在比率1対3程度まで混在識別が可能である測定系を開発することができた。本研究で、我々の提唱しているB型インフルエンザの変異株出現からシーズンに伝播する感染拡大モデルが証明できた。この方法は、ウイルスに限らず、細菌などでも遺伝子変異が混在していることが短時間で簡便に検出できることであり、細菌の薬剤耐性化の過程などにもこの解析法を応用する予定である。本研究の目的は、インフルエンザウイルス流行株から分離したウイルスが変異株かどうかを簡単に検出する方法の確立である。通常は、リアルタイムPCR法でプローブを作成しFRETにより増幅した微弱なシグナルを検出する方法が一般的である。問題は、プローブのコストが高く、またプローブ作成の条件が厳密であるため目的の遺伝子多型の条件が合わなければプローブが作成できない。プローブ法以外にはサイバーグリーン色素を混合し遺伝子増幅の後、融解温度曲線をプロットして曲線の変化で観察する方法がある。しかし、サイバーグリーン色素はDNAの2本鎖に結合するが、融解時に均一に色素が遊離せず、2本鎖の他の場所に移動する、色素が偏在する問題がありプローブなしの一塩基多型の検出は困難と思われていた。今回、我々が取り組んでいる検出法は、新しく開発された色素LCGによりプライマーを使う通常のPCRだけで簡便に効率よく遺伝子多型を検出できる。最初、きれいな融解曲線をプロットすることが出来なかったが、いくつかの条件や試薬を変更したところ、問題はDNAポリメラーゼであるTaqのエラー率の高さにあることがわかった。以後、解析が精度よく行われており、B型インフルエンザが大流行したシーズンに分離できたいくつかの流行株において一塩基多型をもつウイルスと元のウイルスが混在したウイルスの存在が証明できた。現在、混合比を検討しているが、ヒトの一塩基多型と異なり、ウイルスの混合率が求められれば、インフルエンザウイルスに感染した個人においてワクチン株と変異を起こした株の両方が混在している事が確実となり、新しい知見となる。以上、計画は順調に進展している。我々は、B型インフルエンザウイルス抗原変異の解析方法研究成果をもとに、HA蛋白に対する特異的なエピトープの抗原変異部位を迅速に診断する方法を開発している。新しい色素LCGによる融解温度曲線法により簡便で迅速にウイルスの抗原変異が解析できることが分かった。解析精度を高めるために4種類のDNAポリメラーゼを用いて検討した結果、最適の酵素を使うことにより感度があがることが分かった。本解析法の特徴は、一塩基の変異が混在している状態が視覚的に識別できること、さらに混在比率が推定できることである。インフルエンザ流行シーズンにおいて臨床材料より分離されたインフルエンザワクチン株およびその変異株を本法で解析したところ、混在比率は1対3まで識別可能であった。インフルエンザ流行期に得られた分離株は多くの場合、一塩基しか変異しておらずそれがアミノ酸置換をともなっている場合が多い。モノクローナル抗体を用いた抗原変異株の解析で中和活性が変化したウイルス分離株を解析すると、ワクチン株と変異株がさまざまな割合で混在している可能性が高いことを報告してきたが、分離ウイルスはクローニングする過程で選択されることから臨床材料から分離直後のウイルスが混在しているかどうかを知るため、本解析法で過去の分離株を調べたところ混在が証明できた。

これは流行期に特定の個人においてワクチン株と変異株が一定の時期に存在することを証明し、変異株がヒトの中で選択されてくる過程を観察していることを示している。B型インフルエンザウイルスはヒト以外の自然宿主はほとんど知られておらず、抗原連続変異は主にヒトの生体内で起こると考えられているため、本解析法によるワクチン株、変異株の混在解析法はインフルエンザHA蛋白の連続抗原変異の解明に重要な方法となるであろう。
新規光応答性多点分子認識素子の開発

分子認識素子に光応答性部位を付与すると分子認識過程を光で読みだすことができる。特に蛍光による読み出しは高感度であることが特徴であり、生体系で重要なカチオンの検出に多用されている。そこで、高感度、高選択的に金属イオンを蛍光で検出できる人工ホスト分子の開発を目的として以下の検討を行った。ピレニルメチル基をもつモノアザクリプタンド誘導体(1)は、光励起されると、窒素原子からピレン環へ光電子移動(PET)が起こり、蛍光発光が阻害される。ここでクリプンド環と錯形成する金属イオンが存在するとPETが阻害され、蛍光強度の増加が観察される。この蛍光認識素子にTritonX-100非イオン界面活性剤ミセル水溶液を共存させると、Ba^<2+>に対して特異的な応答を示すことを見いだした。同様に、ピレン環を末端に有する二本のオキシエチレン型配位性側鎖が同一炭素を起源とする16-クラウン-5誘導体(2)および二本のオキシエチレン型配位性側鎖が異なる炭素に結合し、かつ二本の側鎖の位置関係がtransもしくはcisとなる15-クラウン-5誘導体(3)を合成し、金属イオンとの錯形成挙動を蛍光スペクトル法により検討した。フルオロフォア2,3ともに、モノマー発光に加えて大きなエキシマー発光を示した。これにより、金属イオンを添加する前では、分子内の二つのピレン環がπ-π相互作用により近づいており、分子内エキシマーを形成しやすいことが示された。フルオロフォア2とtrans-3においては、Ca^<2+>濃度が増加するに従って、エキシマー発光が減少し、モノマー発光が増加した。これは、オキシエチレン側鎖の一つが金属イオンとの配位に関与し、分子内エキシマー生成が阻害されたことによると考えられる。配位性側鎖のオキシエチレン鎖長を変えることにより、アルカリ土類金属イオンに対する選択的応答が得られた。そこで、水中で高感度、高選択的に金属イオンを蛍光で検出できる人工ホスト分子の開発を目的として以下の検討を行った。まず、我々が開発した合成法に従い、cis-2,12-ジメチル-2,12-ビス(トシルメチル)-18-クラウン-6とジエタノールアミンから塩基存在下で環化反応を行い、N-未置換モノアザクリプタンドを合成した。さらに2-ピレニルメチルブロミドでN-アルキル化し、対応するピレニルメチル基をもつモノアザクリプタンド誘導体(1)を新たに合成した。化合物1は、光励起されると、窒素原子からピレン環へ光電子移動(PET)が起こり、蛍光発光が阻害される。ここで、クリプンド環と錯形成する金属イオンが存在するとPETが阻害され、蛍光強度の増加が観察される。この機能により、金属イオン選択性を示す蛍光認識素子として利用可能となる。クリプタンドが示す高い錯形成能をもってしても、水中での蛍光強度は低い値にとどまったが、ここにTritonX-100非イオン界面活性剤ミセルを共存させることにより、金属イオンに応答して大きく蛍光強度が増加することがわかった。化合物1は、アルカリ金属イオンとアルカリ土類金属イオンの中ではバリウムイオンに対して特異的に応答した。これは、クリプタンドの環サイズと金属イオンサイズの適合性に対応している。

なお、同じくピレニルメチル基をもつモノアザ18-クラウン-6ではミセル共存下でも蛍光強度の増加は観測されず、錯形成能の強さが重要であることが示唆された。近年、光応答性部位を有するホスト分子を用いて、ゲストの分子認識過程を光学的に検討する研究が注目されている。本研究では、金属イオンを光で高感度に検出する新規機能性分子の開発を目的として、ピレン環を末端に有する二本のオキシエチレン型配位性側鎖が同一炭素を起源とする16-クラウン-5エーテル誘導体(1)および同種の二本のオキシエチレン型配位性側鎖が異なる炭素に結合し、かつ二本の側鎖の位置関係がtransもしくはcisとなる15-クラウン-5エーテル誘導体(2)を合成し、それらホスト化合物の金属イオンとの錯形成挙動を蛍光スペクトル法により検討した。フルオロフォア1,2ともに、モノマー発光に加えて480nm近傍に大きなエキシマー発光を示した。これにより、金属イオンを添加する前では、分子内の二つのピレン環がπ-π相互作用により近づいており、分子内エキシマーを形成しやすいことが示された。これらホスト化合物ではピレン環の接近が比較的容易であると考えられる。各化合物の錯形成能を評価するために、アセトニトリル:クロロホルム=99:1の混合溶媒中、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩と混合して蛍光スペクトルを測定した。フルオロフォア1とtrans-2においては、Ca^<2+>濃度が増加するに従って、エキシマー発光が減少し、モノマー発光が増加した。これは、オキシエチレン側鎖の一つが金属イオンとの配位に関与したために、分子内エキシマー生成が阻害されたものと考えられる。配位性側鎖のオキシエチレン鎖長を変えることにより、アルカリ土類金属イオンに対する選択的応答が得られた。また非環状類縁体(3)では、すべての金属イオンの添加によっても変化がほとんど見られないことから、高い錯形成能を有するクラウン環構造が検出に必要であることがわかった。
魚類の交雑に起因する特異な発生・生殖の分子機構解明と育種応用

1.異種間受精と初期発生:ゼブラフィッシュ雌×スポッテッドダニオ雄雑種雄は異数体精子を形成し、その戻し交配子孫はほぼ致死性であった。キンギョ雌×カワバタモロコ雄二倍体雑種は致死であったが、雑種細胞をキンギョ胞胚に移植した場合、正常仔魚が生じた。この組合わせの三倍体雑種は生存性で、その始原生殖細胞をキンギョに移植した時、増殖が見られた。キンギョ雌×ヒナモロコ雄の二倍体雑種は致死的であったが、三倍体雑種において生存性が回復した。三倍体化したシロザケ雌×アメマスあるいはオショロコマ雄雑種は不妊であったが、カワマスを雄とした場合、生殖腺の発達が見られた。アメマス雌×サクラマス雄二倍体雑種では多く間性生殖腺が見られたが、一部個体は生殖能力を持つ可能性を示した。2.非還元配偶子形成機構:ドジョウB系統染色体に特異的な反復配列ManDra-BをプローブとしたFISH解析に成功し、雑種起源が示された。rDNAプローブと併せて2-color-FISHを行ったところ、減数分裂において倍加した姉妹染色体の間で対合が生じることが判明した。従って、異系統に由来し、対合できない染色体が各々倍加し、遺伝的に同一の姉妹染色体間で対合し、疑似的減数分裂を起こすことによりクローン配偶子が生じることが証明された。さらに、A系統の一部染色体に特異的なManDra-Aプローブおよび5SーrDNA領域に特異的なプローブの開発に成功し、より精密な分子細胞遺伝学的解析が可能となった。3.半クローン生殖:半クローンに特異的な複数の大型中部着糸型を含む染色体構成をマーカーとして、この様な特異的染色体構成が同種交配の繰り返しで遺伝するか否かを調べた結果、2代目で染色体構成が通常の構成に変わったことから、特異的な染色体構成は、母系種との戻し交配第一代目を検出するマーカーになることが示され、集団構造解明が可能になった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.異種間受精と初期発生:異種間受精や遺伝操作のためには、卵の受精能を保持する必要があるので、ゼブラフィッシュでその条件を検討した。その結果、pH8.0のHanks液+0.5%BSAが最も良好な結果を示し、10-30分の間高い受精能を保持した。また、振盪による卵表面の洗浄も受精率向上に効果があった。サケマス類では、異種間受精と受精卵の高温処理による三倍体化を様々な組み合わせで実施した。サクラマス-アメマス間、カラフトマス-サクラマス間雑種および同異質三倍体は生存性で、浮上期をこえて生存した。ヒメマス-サクラマス間雑種では胚は孵化以前にほぼ全滅したが、高温処理群では孵化、浮上する個体があり、異質三倍体化による生存率回復がある程度見られた。ヒメマス-アメマス間、ヒメマス-オショロコマ間交雑は致死性であり、異質三倍体化による生存性回復は見られなかった。2.非還元卵と雑種発生:自然クローン系統維持のため、北海道東部網走地方の3地点(st.1-3)および石川県七尾市5地点よりドジョウを採集した。北海道のst.1と3と石川県5地点では二倍体のみが生じたが、st.2では173尾中に三倍体17個体、二倍体-三倍体モザイク1個体がみられた。mtDNA、核DNAマーカーおよびRAPD-PCRによるDNAフィンガープリント分析の結果、st.1から22尾、st.2から5尾、st.3から2尾のクローン、石川県1地点から1尾のクローンを検出した。st.2の三倍体とモザイクはクローンと類似した遺伝子型を示した。これらの一部を飼育維持し、また交配実験に用いてFISHによる染色体分析、次世代シーケンサによる分析に供した。3.半クローン生殖:半クローン生殖雑種と母系種との交配に由来するスジアイナメと通常のスジアイナメを区別可能なマーカー染色体を見出すことに成功し、機構解明に着手した。ゼブラフィッシュを母系種としてより効率的に異種間交雑や遺伝操作(染色体操作、胚操作など)を行うための、卵の受精能力を保持する条件を明らかにできた。また、サクラマス、カラフトマス、ヒメマス、アメマス等を用いてできるだけ多くの交雑実験を行い、雑種の生存性を明らかにするとともに、異質三倍体化の生存回復効果の存否を確認し、特殊な発生が生じているか否かの検討に着手できた。併せて、次年度の交配実験に向けた凍結保存精子の準備ができた。飼育継代してきた自然クローンおよびその派生系統を強化するため、北海道東部および石川県野生集団より得たドジョウについて倍数性、核とmtDNAの遺伝学的分析からクローン、三倍体等の出現頻度を解明し、研究材料とすることができた。これらとその子孫を用いて、特殊なクローン生殖、減数分裂雑種発生が起こる時期の組織細胞学的、分子生物学的検討に着手するとともに、分離生殖細胞における発現RNAを採取することが可能となった。自然のアイナメ類雑種は通常はクジメ雄との戻し交配で半クローン発生を維持するが、スジアイナメと交配すると純粋なスジアイナメとなる。

この様な戻しスジアイナメと野生集団のスジアイナメを区別可能な染色体マーカー発見に成功し、半クローン生殖の細胞機構解明へのツールを得ることができたのは大きな前進であった。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。1.異種間受精と初期発生:ゼブラフィッシュ雌×パールダニオ雄由来の雑種は二倍体で生存性を示したので、定期的な固定を行い、生殖腺の組織学的観察、生殖関連遺伝子の発現解析の準備を整えた。サケ科のシロザケ雌×アメマス雄等で三倍体化による生存性回復効果を確認した。シロザケ雌×アメマス雄雑種の組織学的観察から、雑種三倍体では純粋種と同様の正常な胚発生が進むが、雑種二倍体では受精後12日以降に胚体の矮小化が顕在化し、受精後21日目にはレンズと眼杯の位置関係が異常な胚と比較的正常な胚の2型が生じることが分った。この差は以降の胚頭部サイズの2型と関係した。眼の形成異常に着目し、それに関与する遺伝子の配列を明らかにし、リアルタイムPCRを用いた発現解析に着手した。2.非還元配偶子形成機構:昨年度に続き、北海道網走地方と石川県能登島地方のドジョウについてクローンの識別を行ったところ、前者では23%がクローンであったのに対し、後者ではクローンの出現率は僅か2%であった。異種精子とUV照射精子を用いた交配実験から能登島地方のクローンも雌性発生により繁殖することが確認できた。染色体操作、人為性転換の手法によりクローン二倍体雌雄およびクローン四倍体雌雄の作出を行った。これらの組織学的観察から、クローンでは卵原・精原細胞の大型化が見られ、非還元配偶子形成との関係が注目された。3.半クローン生殖:スジアイナメを対照として、野生雑種卵巣の組織学的観察を行った結果、対照と同様の像は認められなかった。スジアイナメ、アイナメ、クジメは2n=48で、人為F1雑種は両親種の中間を示すが、野生雑種では特徴的な大型中部着糸型染色体を示した。野生雑種とスジアイナメの戻し交配ではこの特徴的な染色体が引き継がれるが、その個体とスジアイナメの交配子孫では大型染色体が消失し、それとともに半クローン生殖も生じないことが判明した。コイ目魚類についてはゼブラフィッシュ雌×パールダニオ雄雑種が生存性で二倍体雑種であることを確認でき、その標本について生殖腺の組織学的観察と生殖関連遺伝子の発現解析を実施する準備が完了し、本雑種における生殖能力検討に一部着手できた。サケ科では、いくつかの組み合わせで三倍体化による雑種の生存性回復現象を確認することができた。そこで、本機構の分子細胞機構解明のため、特にシロザケ雌×アメマス雄雑種において、発生胚の詳細な組織学的な観察から、眼の形成に関与する遺伝子を候補とする、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析に着手することができた。また、従来の方法に比べて凍結保存精子の運動能力向上が大きく期待されるグルコースとメタノールを保存液とする方法により、種々のサケ科魚類精液の保存が一層進み、次年度以降のより広範囲な交雑実験を可能にした。ドジョウでは北海道網走地方、石川県能登島地方由来の野生型系統、クローン二倍体系統(全雌)、クローン由来三倍体系統を維持するとともに、クローン受精卵・胚の染色体操作と性転換の手法により、クローン二倍体の性転換雄や四倍体クローンを作出した。これらを用いた生殖腺の組織学的観察から、卵原・精原細胞のサイズ変化が見られ、特殊な非還元配偶子形成、減数分裂雑種発生の起こる時期について示唆を得ることができた。
レーザを用いた高速多元画像処理方式による生体細胞蛍光顕微鏡システムの試作研究

本研究の目的はレーザを中心とする光エレクトロニクスおよび画像処理技術を駆使して高感度で空間および時間分解能の優れた新しい生体細胞用螢光顕微鏡システムを試作開発することにある。この目的を具体化するために、まず励起光源にArレーザ、光検出器に高感度SITカメラを用いて単一の生体細胞内の有機色素からの微弱な螢光像をとらえ、イメージプロセッサによりその信号をデジタル処理して、螢光強度分布を定量的に測定できるレーザ光励起螢光顕微鏡の試作開発を行った。次にここで得られた成果と知見をもとに、感度ならびに空間および時間分解能の飛躍的向上とデータ処理の多機能化などの総合的な改善を図り、実用に十分供し得るレーザ光励起高速多元画像処理方式螢光顕微鏡システムの開発研究を進めた。先に試作したシステムと比べると、イメージインテンシファイアを用いたことで検出感度が約600倍、新型イメージプロセッサの採用により空間分解能が横方向8倍、縦方向8倍、時間分解能が約10倍という大幅な向上が得られた。また、臨床医学的に有用な各種有機色素をとりこんだ生体細胞からの螢光強度分布を測定して三次元表示を行い、それら色素の存在部位を明確にしたり、光化学効果により細胞が膨潤死滅していく様子を定量的に表示することに成功するなど本システムが医学・生物学的応用に極めて有効であることを実証した。さらに螢光強度の時間的挙動を検討することの重要性から、新たにレーザ光励起高時間分解螢光顕微鏡システムの試作開発を行った。本システムは約1秒間で+1秒の時間分解能を持つ測定が可能であり、これを用いて細胞内の各種色素の螢光寿命の比較検討を容易に行えることが確認された。以上、本試験研究によりレーザと画像処理技術を用いた新しい生体細胞用螢光顕微鏡システムの試作開発に成功すると共に、生命科学・工学的応用に極めて有用な測定技術を提供することを実証した。
犬バベシア感染にともなう赤血球膜の酸化傷害と貧血

1.犬赤血球膜に結合IgG抗体の競合性固相化ELISAによる定量法を開発した(文献1).すなわち,ELISA用マイクロプレートに適正濃度の犬IgGを固相化し,ブロッキング後,各ウェルに被検体洗浄赤血球または犬精製IgG,およびペルオキシダーゼ標識抗犬IgG/Fabを加え,競合性ELISA反応を行わせて測定した.次に,本法を用いてバベシア感染犬の赤血球膜結合IgG量を測定したところ,正常犬では13.5±4.6ng/mlであったが,一方,ク-ムス試験陽性の重篤な貧血を呈した感染犬では34.0-126.0ng/mlと高く,またク-ムス試験陰性でも感染犬では12.6-30.7ng/mlと正常犬のそれより増加しており,バベシア感染犬の赤血球が脾臓などの網内系細胞に貧食され破壊されやすいことが示唆された(文献2).2.バベシア感染犬赤血球に結合したIgG抗体が赤血球膜のどの部分と結合するか調べるため,実験的にバベシア感染による重篤な貧血症を作出した犬の赤血球から遊離させたIgG抗体を感染前の赤血球膜をSDS-PAGEで分画した各バンドをブロッティングしたものに反応させた.その結果,抽出IgG抗体はバンド3を認識していた(文献3).さらに,感染犬血清中の赤血球抗体は、感染赤血球、ノイラミダーゼまたはフェニルヒドラジンで処理した非感染赤血球に吸収された(文献4).このことから、バベシア観戦時に血清中に上昇する赤血球自己抗体は酸化傷害で変性したバンド3に対する抗体であることが示唆された。Babesiagibsoni感染犬の免疫介在性におこることのより直接的証明として,赤血球膜結合IgG抗体の競合性固相化ELISAによる定量法の開発し,バベシア感染犬赤血球結合IgG量の定量を行った.ELISA用マイクロプレートに適正濃度の犬IgGを固相化し,ブロッキング後,各ウェルに被検洗浄赤血球または段階希釈したIgG,およびペルオキダーゼ標識抗犬IgG/Fabを加え,競合性ELISA反応をおこなわせて測定する方法を確立した.本法より,正常犬,顕性および不顕性のバベシア事前感染犬,実験感染犬の赤血球結合IgG量を算出した.正常犬は13.5【plus-minus】4.6ng/mg/ml,バベシア不顕性感染犬では6.5-17ng/ml.クレーム陰性バベシア顕性感染犬では12.6-30.7ng/ml,ク-ムス陽性を示したバベシア感染犬では34-126ng/mlであった.従来バベシア感染時にク-ムス陰性であっても赤血球結合IgGは正常犬のそれより有意に増加しており,それら赤血球が脾臓などの網内系細胞に貧食され破壊されて貧血が起こることが示唆された.バベシア感染の貧血時に認められたク-ムス試験陽性,球状赤血球,自己凝集などを示したバベシア感染犬の赤血球結合IgG量は人の自己免疫溶血性貧血で報告されていると同じレベルの量のIgGが赤血球に結合していることがわかった.以上のことから本研究によりバベシア感染犬では,正常犬に比較して,赤血球結合IgG抗体が,必ずしもク-ムス陽性を示すほどではなくても有意に増加しており,バベシア感染犬の貧血は免疫介在性機序が関与することが示唆され1.犬赤血球膜に結合IgG抗体の競合性固相化

ELISAによる定量法を開発した(文献1).すなわち,ELISA用マイクロプレートに適正濃度の犬IgGを固相化し,ブロッキング後,各ウェルに被検体洗浄赤血球または犬精製IgG,およびペルオキシダーゼ標識抗犬IgG/Fabを加え,競合性ELISA反応を行わせて測定した.次に,本法を用いてバベシア感染犬の赤血球膜結合IgG量を測定したところ,正常犬では13.5±4.6ng/mlであったが,一方,ク-ムス試験陽性の重篤な貧血を呈した感染犬では34.0-126.0ng/mlと高く,またク-ムス試験陰性でも感染犬では12.6-30.7ng/mlと正常犬のそれより増加しており,バベシア感染犬の赤血球が脾臓などの網膜系細胞に貧食され破壊されやすいことが示唆された(文献2).2.バベシア感染犬赤血球に結合したIgG抗体が赤血球膜のどの部分と結合するか調べるため,実験的にバベシア感染による重篤な貧血症を作出した犬の赤血球から遊離させたIgG抗体を感染前の赤血球膜をSDS-PAGEで分画した各バンドをブロッティングしたものに反応させた.その結果,抽出IgG抗体はバンド3を認識していた(文献3).さらに、感染犬血清中の赤血球抗体は、感染赤血球、ノイラミダーゼまたはフェニルヒドラジンで処理した非感染赤血球に吸収された(文献4).このことから、バベシア感染時に血清中に上昇する赤血球自己抗体は酸化傷害で変性したバンド3に対する抗体であることが示唆された.
超低分子・低コスト・設計自由の人工抗体による抗癌分子標的薬開発システムの構築

癌関連分子への親和性ペプチドを設計し、抗腫瘍効果を検証することを目的として、Hedgehog(Hh)シグナルを対象に、細胞表面受容体であるPtched1に対する親和性ペプチドを合成し、その抗腫瘍効果を検討した。乳癌細胞・膵癌細胞を用いて、合成ペプチドが細胞内Hhシグナル活性を抑制することを確認した。また、この結果、癌細胞の増殖がin vitro, in vivoで抑制されることを証明した。<目的>癌関連分子に対する機能制御能を持つ親和性ペプチドを設計し、抗腫瘍効果を検証することを目的としている。今年度は膵癌細胞を標的にした。乳癌細胞では、Hedgehog(Hh)シグナルが活性化し増殖に必要である。Hhシグナルの細胞表面受容体であるPtched1に対する親和性ペプチドを合成し、その抗腫瘍効果を検討した。<方法と材料>以前、我々は、Ptched1上の特定配列に対するポリクローナル抗体を作成し、この抗体がPtched1のHhシグナルに対する抑制的な効果を安定化しHh依存性癌細胞の増殖を抑制することを報告した。今回、この標的となるPtched1上の配列に対する親和性のある7種のペプチド候補を、バーチャルスクリーニングを用いて決定した。これらのペプチドを乳癌細胞であるMCF-7と共培養した時の細胞数の変化を、MTT assay,フローサイトメトリーにより検証した。また、乳癌細胞株中の癌性幹細胞分画であるCD24-/low,CD44+の割合の変化をフローサイトメトリーにより分析した。乳癌幹細胞分画(CSC)は、マウスへの移植実験で確認された。<結果>7種中3種のペプチドがMTTで乳癌細胞の増殖を抑制することが確認された。これは、フローサイトメトリーでも確認された。これら抗腫瘍効果が望まれるペプチドと共培養環境下の乳癌細胞でのCD24-/low,CD44+分画は、非共培養下と変化を認めなかった。マウスへ移植されたMCF-7のCD24-/low,CD44+分画は、CD24+分画に比較し乳癌細胞が生着しやすい傾向にあった。<考察>考案された複数のペプチド候補が、乳癌細胞の増殖を抑制し、乳癌治療の新たな選択肢になる可能性が示された。CSCへの効果は限定的であることが予想された。(目的)昨年度に合成しHedgehogシグナル抑制効果を確認したPtch1親和性ペプチドによる癌性幹細胞制御の可能性を検討した。昨年低濃度による抑制効果を認めなかったので、濃度増加による効果を試みた。(材料と方法)乳癌細胞株MCF7と我々が同定しているPatched1蛋白親和性ペプチド3種B/C/F、もしくはコントロールペプチドDをMCF7と72時間共培養した。この後、トリプシンで細胞株を回収し、抗CD44+抗体、抗CD24抗体で2重染色を行った後にflowcytometryを行い、乳癌幹細胞分画であるCD44+/CD24^<-/low>の割合変化を検討した。昨年の検討で使用した1μg/mlではペプチドの効果を認めなかったので、今回は濃度増加による効果を確認した。(結果)共培養しない条件下でのCD44+/CD24^<-/low>分画の割合は25%だった。Pathed1親和性ペプチド3種B/C/FをMCF7細胞と共培養しflowcytometryで解析したところ、コントロールペプチドD及びPtch1親和性ペプチドB/C/Fと共培養後のCD44+/CD24^<-/low>分画の割合(%)は、1μg/ml・5μg/mlの各濃度で各々24・24、32・16、29・15だった。(考察)1μg/mlではCD44+/CD24^<-/low>分画の抑制効果がなく、10μg/mlではB/C/F3種のペプチドでCD44+/CD24^<-/low>分画の割合が減少した。Patched1親和性ペプチドは、高濃度でMCF7癌幹細胞分画の制御が可能であることが示された。(目的)前年度までに、我々が設計したPatched1(Ptch1)親和性ペプチドが、Hedgehog(Hh)シグナルに対する抑制効果を持ち、これを通じて膵癌細胞の増殖抑制効果を示すことが明らかにされた。しかし、これらの効果が、設計通りにリガンドとPtch1の結合阻害を通じて機能していることは明らかになっていない。今後、新規の親和性ペプチド合成による新薬開発を目指すためには、当該ペプチドが設計通りに標的蛋白質に対し親和性を有していることを明らかにする必要がある。本ペプチドは非常に低分子でありウエスタンブロッティングが非常に困難であるため、ペプチド投与によりリガンドとPtch1の結合が阻害されることを免疫染色で証明することにより、間接的にペプチドとPtch1の親和性を証明することとした。(材料と方法)

AsPC1細胞(2x104/well)を、24-ウェルプレートのカバーグラス上で一夜培養した後に、10μg/mLのA、B、CまたはGペプチドを含む新しい培地にかえられた。24時間培養後、スライドを8%フォルムアルデヒドで固定し、抗SonicHedgehog(Shh)抗体で染色した。最終的に、レーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡下で視覚化された。(結果)ペプチドB、CおよびGと共培養されたAsPC1細胞の染色レベルはペプチドA(対照ペプチド)と共培養された細胞の染色レベルより低かった。(考察)今回得られた染色結果より、我々が設計した合成ペプチドが有する抗Hhシグナル作用は、ペプチドがPtch1と相互作用することでShhとPtch1の結合部位を阻害するという当初の設計通りの機序で機能していることが予想された。これらの事実より、この親和性ベプチドが癌治療のみでなく、drug deliveryや局在診断の分子プローブとしても有用である可能性を示せた。
上気道拡大反射機構の解明と気道閉塞性の定量測定に関する実験的研究

上気道反射には咳嗽反射、無呼吸反射、喉頭閉鎖反射などの気道防御反射と、それに相反する気道開存反射がある。後者はnegative pressure airway reflex(NPAR)とも呼ばれ、吸息時の気道内陰圧に同期して上気道拡大作用筋が活動することで上気道の開通性保持に重要な役割を果たす。本研究は、NPARの末梢受容器の局在を機能的に明らかにするため、咽頭粘膜に表面麻酔を行った場合の、NPAR発現状態をオトガイ舌筋(GG)活動から検討した。方法は、チオペンタール静脈麻酔下家兎の気管切開孔から肺側と咽頭側に2本の気管内チューブを挿入し、肺側チューブは麻酔器に接続して自発呼吸下で麻酔を維持した。一方、咽頭側チューブ先端には圧センサーを設置し、吸引器に接続することにより、咽頭腔のみに陰圧を負荷できる上気道分離モデルを作製した。咽頭腔に-10cmH_2Oの陰圧を負荷し、この時のGGの筋活動の変化を測定した(対照群)。その後、1%リドカインで咽頭粘膜を表面麻酔し、その直後に同様の陰圧操作を行ってGGの筋活動の変化を測定した(表面麻酔群)。両群の筋電図において陰圧負荷時の整流波形積分値を求め、比較した結果、対照群では、陰圧負荷に同期したGGの筋放電の増加がみられたが、表面麻酔群では、GGの反射的な筋活動が顕著に抑制された。これらの結果より、GGの筋活動の増加は咽頭腔粘膜に存在するmechanoreceptorを介する反射的活動で、リドカインの奏効範囲から予測して、NPARの末梢受容器は咽頭粘膜に存在するものと考えられた。オトガイ舌筋(GG)は、上気道拡大作用筋の1つであり、上気道の開通性を調節している。本研究は、家兎を用いて、咽頭腔に陰圧を負荷した場合のGG活動の変化と、それに対するセボフルランと二酸化炭素(CO_2)吸入の影響を検討した。実験1は、咽頭腔圧測定下で鼻孔あるいは気管を閉塞させ、それによって生じる努力性呼吸運動時のGGの筋電図を記録した。鼻孔閉塞では、浅麻酔(0.7%セボフルラン)において咽頭腔の陰圧に同期する筋活動の増幅がみられ、最大陰圧の絶対値であるpeak pharyngealpressure(Pp)と筋活動の変化率の間に正の相関関係を認めた。しかし、深麻酔(4%セボフルラン)では、Ppが増加しても筋活動の増幅はみられず、両者の相関関係は認められなかった。一方、気管閉塞では浅麻酔でも反射性筋活動は全く消失し、鼻孔閉塞時の反応と大きく異なった。実験2は、気管切開孔を介して自発呼吸で麻酔を維持し、鼻腔・口腔・咽頭腔で1つの閉鎖腔となるような上気道分離モデルを作製した。脱気用シリンジを用いて咽頭腔に陰圧負荷を与え、その時のGGの筋電図を記録した。1%セボフルランおよび1%セボフルラン+CO_2吸入では、陰圧に同期した筋活動の増幅がみられ、特に後者では顕著になる傾向を示した。しかし、4%セボフルランおよび4%セボフルラン+CO_2吸入ではこの反応は消失した。Ppと筋活動の変化率の関係は、1%セボフルランのみが正の相関関係を認めた。以上の結果より、GGの筋活動の増幅は咽頭腔の圧受容器を介する反射機構であることが示唆された。この反射は高炭酸ガス血症で増大するが、セボフルラン深麻酔で強く抑制されると考えられる。オトガイ舌筋(GG)は、上気道拡大作用筋の1つであり、上気道維持機構としてその開通性を調節する作用がある。

本研究は、上気道拡大反射機構の解明を目的として、家兎の上気道分離モデルを作製し、咽頭腔にのみ陰圧を負荷した場合のnegative pressure airway reflex (NPAR)としてのGG活動の変化と、二酸化炭素(CO_2)を咽頭腔に暴露した場合の影響を検討した。実験は、気管切開孔を介して自発呼吸で麻酔を維持し、鼻腔・口腔・咽頭腔で1つの閉鎖腔となるようなモデルを作製した。脱気用吸引ポンプを用いて咽頭腔に20cmH_2O以下の陰圧負荷を与え、その時のGGの筋電図を記録し、圧変化に同期する筋活動をとらえNPARの有無と大きさを定量化するようにした。その後、以下の2実験を行った。実験1:咽頭粘膜表面麻酔によるNPARの変化実験2:上気道へのCO_2暴露時のNPARの変化とmethazolamide (MZ)の影響その結果、実験1では、1%lidocaineによる咽頭粘膜表面麻酔下では、GG筋活動は顕著に抑制され、NPARの末梢受容器が咽頭粘膜内に存在することを示唆した。実験2では、CO_2暴露により筋活動が抑制されたが、MZ投与により抑制が解除された。この時の咽頭粘膜組織pHを検討すると、MZ投与時の方がpH低下度は小さかった。以上の結果より、GGの筋活動の増幅は咽頭粘膜に存在する圧受容器を介する反射機構であることが明らかとなり、同時にCO_2 sensitive receptorの存在も示唆された。MZはCO_2暴露により生じる局所H^+の発生を抑制すると考えられ、NPARのCO_2による抑制機序は、上気道粘膜内に存在するmechanoreceptor周辺のpH変化に起因することも否定できないことが明らかとなった。
脂肪組織由来MCP-1 を介した高脂肪食摂取下の前立腺癌増殖・進展機序の解明

食事の違いによる前立腺癌増殖への影響とそれに関与する血清因子の役割をin vivoおよびex vivoで検討した。前立腺癌LNcaP xengraftモデルにおいて高脂肪食摂取は高炭水化物とcontrol diet摂取より腫瘍増殖を促進した。同時に高脂肪食摂取群で血清MCP-1が有意に上昇した。高脂肪食群ではMCP-1の受容体であるCCR2の腫瘍内発現が亢進し、リン酸化Aktが増加した。また高脂肪食摂取マウス血清で培養した前立腺癌細胞株は細胞増殖が亢進し、これはCCR2を低下させることで阻害された。上記は高脂肪食がMCP-1/CCR2シグナルを介して癌増殖に関与する可能性があることを示唆している。高脂肪食を摂取した前立腺癌細胞株LNCaP xenograftマウスは高炭水化物食およびWestern diet食を摂取したマウスよりも腫瘍増殖が有意に大きかった。また、マウス血清中のInsulin、IGF-I、炎症性サイトカイン(IFN-gamma、IL-10、IL-12p70、IL-6、MCP-1、TNF-alpha, TWEAK)を測定したところ、血清MCP-1は高脂肪食群が他群に比べ有意に高かった。また、Xenograft中のMCP-1受容体CCR2も高脂肪食群で有意に高値であった。高脂肪食マウス血清で培養したLNCaP細胞は、他群に比べて細胞増殖が有意に亢進し、このLNCaP増殖はCCR2 siRNAで強く阻害された。今回の検討で高脂肪食は高炭水化物食やWestern dietより強く前立腺癌の増殖を促進することが明らかとなり、その機序にMCP-1/CCR2シグナルの関与が示唆され、この結果は論文で報告した(Huang M, Prostate, 2012)。また患者血清を用いたMCP-1と前立腺全摘患者の臨床因子や前立腺全摘後の生物学的再発には相関を認めなかったが、現在患者脂肪組織中のMCP-1濃度と臨床因子の関連も引き続き検討中である。我々は脂肪濃度の違う3種類の食餌(高脂肪食、高炭水化物食、コントロール食)を与えた前立腺癌細胞株LNCaP担癌マウスxenograftモデルにおいて、高脂肪食を与えたマウスにおいてxenograft腫瘍増殖がもっとも促進されることを見出した。また3群の血清サイトカインや増殖因子(インスリン、IGF-I, IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF-a, and IL-12p70)を比較すると腫瘍増殖と相関をもって血清MCP-1が上昇することを見出した。それ以外の増殖因子、サイトカインに有意差を認めなかった。またxenograft腫瘍内のCCR2 mRNAレベルが血清MCP-1と腫瘍増殖と同様に高脂肪食群で有意に高値であることがわかった。またin vitroでは3群の食餌で飼育したマウスの血清でホルモン感受性前立腺癌細胞株の増殖能を検討すると高脂肪食マウスの血清で飼育した前立腺癌細胞株の増殖が有意に高く、またCCR2をsiRNAをもちいて発現抑制すると高脂肪食マウス血清での細胞増殖が抑制された。また同時にin vitro, vivoにおいてMCP-1シグナルの下流で活性化すると考えられるAKTのリン酸化が高脂肪食群で亢進していることも確認した。以上in vivo, in vitroの実験から高脂肪食摂取下の前立腺癌進展においてMCP-1/CCR2/AKTシグナルの関与が示唆され、論文化し発表した(Huang M, prostate, 2012).基礎実験では高脂肪食摂取下の前立腺癌増殖へのMCP-1/CCR2シグナルの関与を証明することができ、論文、学会で発表をおこなったため概ね順調に進展していると考えられる。基礎実験では高脂肪食摂取下の前立腺癌増殖へのMCP-1/CCR2シグナルの関与が示唆されたため、現在臨床検体をもちいて上記シグナルと癌増殖の関与、またBMI等の肥満度との関与の検討を施行するため、現在前立腺全摘症例の脂肪組織を採取している。現在まで20例程度の症例から採取したが今後症例を増やしていく予定である。また今後脂肪組織内の上記シグナル関連遺伝子、タンパクの発現と臨床因子の関連を検討していく予定である。検体からのmRNA,タンパク採取。およびmRNA,蛋白レベルを検討するための定量PCR、ウェスタンブロットなどの消耗品。学会、論文成果発表のための旅費。またヒト脂肪細胞を培養し、MCP-1/CCR2シグナルのfunctional解析を考えており、それに使用するための消耗品に主に使用したい。当施設には上記施行するための施設、器材はそろっている。