hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
物理層と意味層の2階層からなるセンサコンテキスト推定技術

また、物理的な行動の分析については、次年度に向けて環境整備と基礎的な発表を国内会議で発表した。行動の意味的な空間の扱いについて、介護施設に置いて介護記録や事故報告書のようなテキストが記録されているため、特に事故記録のデータを全国約80件の施設から入手し、これについてテキストマイニングを行った。これにより、どのような行動を認識すべきかという問題に指針を得ることができた。また、行動認識のためのラベルを集める際のユーザの行動変容について、ゲームと組み合わせることと、同時に偽造を防ぐ手段を考案し、MobiCASE国際会議で発表した。また、介護施設や病院内でのセンサデータの収集を行った。介護施設に置いては3ヶ月、病院内では4週間のデータ収集を行った。これについては、センサデータの可視化について機械学習し、重要な点を取り出す手法をMobiCASE国際会議で発表した。また、物理的な行動の分析についても、映像やモーションキャプチャのような高解像度のセンサから行動を理解するための基礎研究を行った。次年度に向けて、モーションキャプチャにより高解像度のセンシング環境も整えた。行動の意味的な空間の扱いについて、事故報告書の分析を論文誌発表、またラベル入力の行動変容について国際会議発表できたため。また、物理的な行動の分析については、次年度に向けて環境整備と基礎的な発表を国内会議で発表したため。一つは、介護施設に置いて介護記録や事故報告書のようなテキストが記録されているため、特に事故記録のデータを全国約80件の施設から入手し、これについてテキストマイニングを行った。今年度は、これまでより実用的な行動種における行動認識に取り組みながら、システムのスケールアップと精度向上に取り組んだ。6階建ての規模の介護施設において4ヶ月実験を行い、システムの安定性を確認することができた。また28種の行動種について行動認識の精度評価を行った。これらの過程で、低精度のセンサにおける機械学習と評価の問題、学習データ取得における時刻の不正確性の問題、利用者の学習データ提供の動機付けの問題といった課題を発見することができ、これらについて、学習データにデータ欠損を人工的に作る手法(ICIEV国際会議ベストペーパー、PerCom Ph.D Forum
女性の地位向上のための政策に関する国際比較研究:実効性並びに日本における妥当性

本研究では、女性の地位向上のための政策(女性政策)を効果的に行っている3カ国において関係機関の訪問および関係者に対する面接調査により情報を収集・分析し、これら女性政策が、女性の社会参加が遅れている日本でどの程度応用可能であるかについて調査・検討する事を目的とした。調査対象国は、日本以上に女性の年齢階級別労働力率がM字型カーブを描き、女性が結婚・子育て時に仕事をやめる割合が多いが効果的な女性政策を次々と実施して女性の地位向上が目覚しい韓国とアジアで先進的な女性政策を実施しているフィリピン、および一時女性の労働力率が欧米先進国の中では唯一M字型を示していたイギリスの3カ国を調査対象とした。調査結果で明らかになった、女性政策を振興させるための主要要件としては、次の6点が挙げられる。(1)ジェンダーに配慮する最高指導者の存在(2)国会議員との連携とサポート:国会における女性委員会の存在(3)NGOとの連帯とNGOの貢献(4)女性の地位向上のための法制度の充実(5)強力なナショナルマシーナリーの存在(6)効果的なジェンダー研修の実施上記5点の中で特に日本に取り入れが可能であり、特に効果があがると思われるものは、(3)と(6)である。日本には残念ながら女性NGOの強力な連合体が存在しない。NGOが効果的な活動をして、政府に発言力を持つためには、様々なGOがメンバーとなるネットワークを構築することがNGOにとって急務である。さらに、効果的なジェンダー研修は政府職員の意識改革の上で有効であるが、日本ではモデル的なプログラムも開発されていない。公務員研修での取り入れもおざなりな状況である。日本に最も適したジェンダー研修プログラムを開発し、国/地方自治体ともに実施していくことが急務であろう。アジアでは最も効果的に女性政策を推進しているフィリピン女性の役割委員会(NCRFW)の行っている女性政策の実効性について調査した。フィリピン政府の幹部女性職員、代表的NGO、ならびに国会議員、研究者等合計20名を対象として聞き取り調査を行った。また、地域における女性政策の普及状況を調査するため、ダバオ市の北東部のタクロン市を訪問し、市長、市役所のジェンダーと開発(GAD)グループなどから情報収集を行った。面接の質問項目は、NCRFWの行っているジェンダーの主流化が国の政策全体ならびグラスルーツの女性たちにどのような影響を与えたか、その限界、連携の実態、「女性の開発と国家建設法」(以下女性法)の効果と限界、30年間の女性行動計画「フィリピンジェンダー対応計画」の評価などである。政府関係者については、GADと比較的関わりの薄いエネルギー省及び環境・自然資源省の他、人事委員会の副事務総長に面接。エネルギー省でも、女性法で定められた省予算の5%をGADの推進に使うという方針に苦労しながら対応。一方、環境・自然資源省には、熱心にGADに取り組んでいる女性幹部職員の貢献もあり極めて活発で、人事委員会は女性幹部公務員の増加に積極的に取り組んでいた。行政関係者、専門家共にNCRFWを高く評価している。NCRFWに協力的である場合とない場合により、NGOの評価は大きく分かれたが、日本のように地方自治体に女性政策担当が設置されていないことも反映し、全体的にグラスルーツの女性たちにリーチアウトできていない(そのシステムがない)という意見であった。ダバオ市では、市の予算の6%をGADに割り当てるという女性条例を1996年に制定。女性の市民グループが原案を策定し、策定の過程ですべての自治組織で公聴会を開催し意見を徴収しており、日本における男女平等条例策定に参考となる。

韓国では、1998年の金現大統領の就任に伴い、女性の地位向上だけを専管事項としていた第2女性省を政府全体の行政改革の関係で廃止し、大統領直属の女性問題特別委員会を設置した。同時に6省(行政内務、保健福祉、労働、教育、法務、農林)に女性政策担当官を課長とする女性政策課を設立した。今回は1998年のフィリピンの調査に引き続き、大統領女性特別委員会及び6省の女性政策課がどのような成果をあげているか、そしてそれが日本にどの程度応用可能であるかの調査である。女性政策課はほとんどの場合、局より高い位置にある企画管理室に置かれ、省内の政策や事業にジェンダーの視点が欠けていないか監視できるようなシステムになっている。行政内務省と保健福祉省では、省内組織もしくは学識経験者も含めた組織を設置し、ジェンダートレーニングも開発実施するなど、効果的に行われていた。両省の女性政策担当官は2人とも女性問題を専門としていた。法務省の担当官は検事であるが、ジェンダーの主流化に就いても理解していない状況であった。いずれもジェンダーの主流化を目的に設置されたはずであるが、事業内容などは担当官が計画しなければならない。これらから女性政策担当官に誰が任命されているかにより、成果には大きな差がでているように思えた。女性問題特別委員会では委員長は大臣レベルで閣議にも出席できるすが、決議権がないとか副大臣がいないので実質的な審議をする副大臣会議に出席できないという理由で、女性団体から女性省を設置するよう強い要求がでて、大統領は今年の所信表明演説で女性省を設置すると言う約束をしたという。財政難なのでいつ実現するかわからないということであったが、今後の動きに注目したい。平成10年度フィリピン、平成11年度韓国に引き続き、最終年の平成12年度はイギリスにおける女性政策について、関係省庁の担当者、NGO、専門家などにインタビュー調査して何が日本に参考になるか検討した。イギリスでは、1997年の労働党内閣成立に伴い、女性問題担当大臣が任命され、女性問題内閣小委員会が設置された。さらにその事務局として新たに女性部が設置された。女性部は、女性担当大臣が社会福祉大臣であったときは社会福祉省、現在の女性担当大臣は上院議長であるため、内閣府に設置されている。職員数37名で、各省庁からの派遣や契約職員が多い。女性部最大の問題点は、根拠となる法律を持たないことである。女性問題の法律として、イギリスは国際的にも先駆者的な存在であり、1970年に同一賃金法、1975年に性差別禁止法を制定し、同時に機会均等委員会を設置している。しかし、これらの法律は教育雇用省の管轄で、女性部には移っていない。1997年に女性部が設置されたとき、教育雇用省から女性部に移ったのはNGOの国内連合体である女性国内委員会と一部の事業だけである。女性政策に関して、女性部と教育雇用省の競争は日本の旧労働省と総理府の関係に酷似している。根拠法を持たない女性部は、広報・啓発を中心に三万人集会を行ったり、各省庁のジェンダーの主流化を進めるためのプロジェクトを実施している。
エチレン受容体遺伝子の転写調節機構の解明

植物はエチレン生合成と感受性を調節して、エチレンの効果を調節している。従って、植物のエチレン生合成や感受性を解明し、それらが制御できれば諸形質の分子育種が可能になる。エチレン生合成は、先駆的研究によりその生合成経路や関連遺伝子が明らかになり、それらの遺伝子を使って生合成が制御できることも報告されている。一方、エチレン感受性は、シロイヌナズナ変異体を使った研究からエチレン受容体遺伝子と関連遺伝子が単離されている。本グループでは、メロンからエチレン受容体遺伝子(Cm-ERS1,Cm-ETR1)を単離した。解析の結果、これらの遺伝子がmRNA及びタンパク質レベルで発現制御を受けていること、その発現制御がエチレン感受性制御において重要な役割を果たしていることを示唆してきた。従って、エチレン受容体の発現調節機構を解明することが、エチレン感受性調節機構を解明する上で重要である。本年度は、前年度に引続いてCm-ERS1のプロモーター解析を行った。加えて、Cm-ETR1のプロモーターについてもシス領域の同定を試みた。以下の結果が得られた。1、Cm-ETR1のプロモーターの解析:中間報告の結果に従ってさらにCm-ERS1のプロモーター領域の-1500-1100、-1500-1000、-500-150と-400-150部分をPCRにより増幅し、それぞれにGUSもしくはGFP遺伝子に繋げて発現ベクターを構築した。これらをパーティクルガンによりタバコ或いはメロンの葉に打ち込み、プローモーター領域の活性を調べた。その結果、-1100-1000または-500-400間にシス領域があると考えられた。しかし、発現量の変化はコントロールに比べてわずかでシス領域による発現量の増加だと判断するには至らなかった。今後これらの領域とGUS遺伝子を植物に形質転換させ、安定した条件でさらに発現量の変化を検討するともにゲルモビリティーシフト法によるシス領域の絞り込みとone-hybrid法による転写調節因子の同定が必要である。2、Cm-ETR1プロモーターの解析:Cm-ERS1プロモーターと同様に欠失実験を行い、-300-260にシス領域があることが判明した。さらに、ゲルモビリティーシフト法を組み合わせた欠失実験により、シス領域を23塩基まで絞り込むことができた。データベース検索の結果、この領域には温度制御と光制御に関与するシス配列が存在した。ゲルモビリティーシフト法の結果、この領域に結合する2つの転写因子が発現しているこども明らかになった。現在、同定したシス領域をベイトにone-hybrid法による転写調節因子のスクリーニングを行っている。それにより、エチレン受容体遺伝子の転写調節因子が世界で初めて単離されるものと期待される。従って、植物のエチレン生合成や感受性を解明し、それらが制御できれば、諸形質の分子育種が可能になる。本グループでは、メロンからエチレン受容体遺伝子(Cm-ERS1、Cm-ETR1)を単離した。本研究では、メロン果実の発育初期段階に強く発現するCm-ERS1遺伝子の発現調節機構を解明するため、同遺伝子のプロモーター領域の欠失実験によるシス領域の同定を試みた。1、実験方法:1.5kbのCm-ERS1のプロモーター領域をPCRにより-1500位-150位、-1000位-150位、-500位-150位、-300位-150位、-1500位-1000位の5部分に分けてそれぞれ増幅し、それぞれにGUSもしくはGFP遺伝子に繋げて発現ベクターを構築した。これらをパーティクルガンによりタバコ或いはメロンの葉に打ち込み、24時間後にGFPの発現細胞数或いはGUS遺伝子の発現量によりプロモーター領域の活性を調べた。2、結果:-1500位-1000位までの領域を含んだベクター以外を構築した発現ベクターでGFPとGUS遺伝子の発現が確認された。その中で、-500位-150位までの領域を含んだベクターで相対的に強い発現が見られた。この結果は同じ発現ベクターを導入した形質転換タバコでの発現レベルとほぼ一致した。このことから、Cm-ERS1のプロモーターの-500位-300位の間にひとつのシス因子が存在することが明らかになった。3、今後の予定:シス領域を20塩基まで絞り込み、one-hybrid法により発現調節領域に結合する転写調節因子を同定する。得られたクローンの塩基配列を決定し、構造解析を行う。

一方、エチレン感受性は、シロイヌナズナ変異体を使った研究からエチレン受容体遺伝子と関連遺伝子が単離されている。本グループでは、メロンからエチレン受容体遺伝子(Cm-ERS1,Cm-ETR1)を単離した。解析の結果、これらの遺伝子がmRNA及びタンパク質レベルで発現制御を受けていること、その発現制御がエチレン感受性制御において重要な役割を果たしていることを示唆してきた。従って、エチレン受容体の発現調節機構を解明することが、エチレン感受性調節機構を解明する上で重要である。本年度は、前年度に引続いてCm-ERS1のプロモーター解析を行った。加えて、Cm-ETR1のプロモーターについてもシス領域の同定を試みた。以下の結果が得られた。1、Cm-ETR1のプロモーターの解析:中間報告の結果に従ってさらにCm-ERS1のプロモーター領域の-1500-1100、-1500-1000、-500-150と-400-150部分をPCRにより増幅し、それぞれにGUSもしくはGFP遺伝子に繋げて発現ベクターを構築した。これらをパーティクルガンによりタバコ或いはメロンの葉に打ち込み、プローモーター領域の活性を調べた。その結果、-1100-1000または-500-400間にシス領域があると考えられた。しかし、発現量の変化はコントロールに比べてわずかでシス領域による発現量の増加だと判断するには至らなかった。今後これらの領域とGUS遺伝子を植物に形質転換させ、安定した条件でさらに発現量の変化を検討するともにゲルモビリティーシフト法によるシス領域の絞り込みとone-hybrid法による転写調節因子の同定が必要である。2、Cm-ETR1プロモーターの解析:Cm-ERS1プロモーターと同様に欠失実験を行い、-300-260にシス領域があることが判明した。さらに、ゲルモビリティーシフト法を組み合わせた欠失実験により、シス領域を23塩基まで絞り込むことができた。データベース検索の結果、この領域には温度制御と光制御に関与するシス配列が存在した。ゲルモビリティーシフト法の結果、この領域に結合する2つの転写因子が発現しているこども明らかになった。現在、同定したシス領域をベイトにone-hybrid法による転写調節因子のスクリーニングを行っている。それにより、エチレン受容体遺伝子の転写調節因子が世界で初めて単離されるものと期待される。
アルペン・アドリア地域を範例とする境界化の権力に対する住民の戦略的実践の研究

冷戦の終結とグローバル化の進展とともに、政治的秩序という観点において国境の重要性は逆説的に注目を浴びている。歴史叙述における国民国家という既存の単位も疑義に付され、空間を囲い込み移動を管理する「境界化」の権力、境界を超える「透過性」の条件に関する議論を歴史的に叙述することが求められている。本研究は、境界変動の激しい地域で、住民がどのように事態に対応し、どのような記憶を蓄積したか、そこにどのような力が働いたかを、ローカルおよびトランスローカルなレベルで明らかにすることを目的とする。
地盤材料の出砂現象予測シミュレータの開発

本研究では,まず浸透流による砂地盤の内部浸食や資源開発時の出砂のメカニズムおよび空洞化に至るまでの地盤の挙動を解明することを目的として模型実験を行い,出砂に関する構成モデルである発生条件式と出砂速度式を提案した.次に,分解時の土骨格挙動の構成式,出砂限界式,出砂速度式を取り入れた出砂現象予測シミュレータを開発した.またハイドレート分解挙動と出砂現象を連成させた解析手法を提案した.開発した解析手法を,地盤の空洞化の進展やそれに伴う不安定化の問題に適用し細粒分の出砂に伴う地盤内部の空洞化や,それによる変形挙動を再現した.さらに,メタンハイドレート生産状況を模擬したシミュレーションを行った.地盤の出砂現象は,地盤内部の土粒子が浸透流の作用により剥離し移動する現象であり,地盤力学では内部浸食現象として捉えられる.河川堤防,護岸構造物や地下埋設物の周辺地盤では,内部浸食による地盤内部の劣化の進展が、種々のメカニズムにより局所破壊現象(パイピング)や空洞化を引き起こし,地盤の破壊現象の主な要因の一つとなっている.一方,資源工学の分野では,石油や天然ガス等の資源開発時に化石燃料の回収と同時に,岩盤層が乱されて生じた砂粒子が回収される現象は出砂現象と呼ばれ,生産井の寿命や生産性を決める重要な要因となっている.本研究は,分解時の土骨格挙動の構成式,出砂限界式,出砂速度式を取り入れた出砂現象予測シミュレータを開発することを目的とする.初年度である平成27年度は,予測解析に用いる地盤内部の出砂限界および出砂速度式を提案した.また,定式化した出砂限界式,出砂速度式を取り入れた出砂現象予測シミュレータを開発した.浸食され浮遊した土粒子は液相とともに運動すると仮定し,土砂輸送問題として取り扱うことができる.本研究では,多相混合体理論に基づき,内部浸食の発生条件式を導いた.地盤を土粒子,移流土粒子,間隙流体から構成されると仮定し,移流土粒子は間隙流体と一体となって運動するとした.また,開発した予測解析法を既往の下向き浸透流による浸食試験に適用し,浸食速度係数を変えた場合の浸食土量について比較した.出砂構成式の提案と多相連成解析法への導入を行った.また既往の実験データを用いて解析手法の検証を行った.初年度予定していた模型試験は次年度行うこととし,次年度実施予定の解析手法への導入を先行して行った.全体としておおむね順調に進展していると考えている.本研究では,地盤の内部浸食挙動(細粒分の流出を伴う空洞化,資源開発時の出砂現象等)のメカニズムの解明と出砂現象予測シミュレータの開発を目的としている。この予測解析法には、従来の流体-土連成解析手法に,出砂限界式・出砂速度式などの出砂に関する構成式を取り入れる必要がある。本年度は,地下水位上昇時の空洞化現象を再現するため,側面に浸透水を供給するための水槽を有する土槽を用いて不飽和地盤の内部浸食試験を行い,飽和度・粒度などによる浸食特性の違い,浸食土量・地表面沈下量の関係等について検証した。その結果,比較的均一な粒径からなる砂試料では,水槽からの浸潤に伴い開口部から浸食土が流出し,ゆるみ領域が開口部周辺から上方向に広がって開口部鉛直上方に空洞が形成された。また流動化が一旦沈静化した後,細粒土が継続して浸食される現象(サフュージョン)が観測された。次に,空気-水-土三相系の浸透-変形連成解析手法に内部侵食による土粒子の剥離と移動を考慮して拡張した手法を開発し,上述の模型試験の再現シミュレーションを行った。本シミュレーションでは,地下水の浸潤に伴う地盤の飽和化,開口部付近での浸食や,それに起因する地盤のゆるみやすべり,沈下といった空洞形成の初期段階を表現し,スリットの開口が土のすべりやゆるみに進展する条件を探ることを目的としている。解析の結果,緩い砂を想定した場合,開口部上方のゆるみや沈下,せん断帯(せん断ひずみの集中)の形成など,定性的に実験結果に近い挙動が再現された。一方で正のダイレイタンシー傾向の強い密な砂の場合は,ゆるみ領域は開口部周辺に限られ明確なせん断帯は形成されず,地盤条件による影響がみられた。地下水位上昇時の浸食挙動を検討するため、模型試験を行った。また、昨年度開発した解析手法を用いて模型試験の再現解析により解析手法の妥当性について検証した。全体としておおむね順調に進展していると考えている。本研究では,資源開発時の出砂現象や内部浸食挙動(細粒分の流出を伴う空洞化)のメカニズムの解明と出砂現象予測シミュレータの開発を目的としていた。本年度は,地下水位上昇時の空洞化現象を再現するため,不飽和地盤の内部浸食に関する模型試験を行った。本年度は特に初期水位,水位上昇のタイミングに着目し,浸食特性の違いや浸食土量・地表面沈下量の関係等について検証した。その結果,粒度分布がよく細粒分を含む砂試料の場合,長期的に細粒分流出が継続することにより,ゆるみや空洞化に進展する可能性が示された。また,空気-水-土三相系の浸透-変形連成解析手法に内部侵食による土粒子の剥離と移動を考慮して拡張した手法を開発し,まず上述の模型試験の再現シミュレーションを行った。本シミュレーションでは,地下水の浸潤に伴う地盤の飽和化,開口部付近での浸食や,それに起因する地盤のゆるみやすべり,沈下といった空洞形成の初期段階を再現した。

緩い砂を想定した場合,開口部上方のゆるみや沈下,せん断帯(せん断ひずみの集中)の形成など,定性的に実験結果に近い挙動が再現された。さらに,メタンハイドレート資源開発時を想定した分解-変形-浸食連成解析手法を開発し,一次元軸対称モデルを用いて減圧時のメタンガス生産に伴う出砂現象のシミュレーションを行った。その結果,出砂を考慮した場合,透水性の増大により分解挙動が進みやすくなりガス生産量が増大するという傾向が得られた。本研究では,まず浸透流による砂地盤の内部浸食や資源開発時の出砂のメカニズムおよび空洞化に至るまでの地盤の挙動を解明することを目的として模型実験を行い,出砂に関する構成モデルである発生条件式と出砂速度式を提案した.次に,分解時の土骨格挙動の構成式,出砂限界式,出砂速度式を取り入れた出砂現象予測シミュレータを開発した.またハイドレート分解挙動と出砂現象を連成させた解析手法を提案した.開発した解析手法を,地盤の空洞化の進展やそれに伴う不安定化の問題に適用し細粒分の出砂に伴う地盤内部の空洞化や,それによる変形挙動を再現した.さらに,メタンハイドレート生産状況を模擬したシミュレーションを行った.一次元あるいは二次元浸食試験を行い,浸食土量の計測とX線CT等を用いた浸食挙動の可視化を行い,現象のメカニズムの解明とともに内部浸食モデルの妥当性について検討する.また,提案した解析手法を用いて,河川堤防の浸食現象やメタンハイドレート生産時のシミュレーションを行う予定である.当初予定していたエックス線装置による可視化については、模型の大きさと装置のエックス線透過性能から難しいと考えられるため、アクリル製土槽を用いて表面の土粒子を画僧解析により追跡するなどの手法により、内部浸食による地盤変形を可視化することとする。また、シミュレータについては、開発した手法を河川堤防断面に適用し、浸透流による細粒分流出に伴う破壊現象の再現を試みる。地盤工学平成27年度は実験は簡易試験のみとし、次年度に実施予定であった解析手法の開発を先行して実施した。そのため実験装置購入用の物品費が未使用となっている。購入予定であった物品が未購入のため。初年度に実施予定であった浸食試験を実施するため、模型試験装置を購入する。模型試験装置の改良・購入、解析用ソフトのため使用する。
眼科臨床応用のための遺伝子治療法(薬物産生遺伝子治療)の開発

血管新生特異的な増殖因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の受容体Flt-1を過剰発現するアデノウイルスベクターを作成し、これを用いて血管新生を抑制すると、実験的マウス眼瞼悪性黒色腫の増殖は明らかに抑制されたが、同部に皮膚潰瘍が形成された(Shiose S,et al.Invest Ophthalmol Vis Sci,2000)。また、加齢黄斑変性の網膜下血管新生モデルラットにたいして同じシステムを用いると、網膜下血管新生は確かに抑制されたが、網膜が激しく障害された(Honda M,et al.Gene Therapy,2000)。つまり、血管新生とは、視力障害など生体に害をおよぼすだけでなく、逆に創傷治癒には欠くべからざる現象なのである。当初考えたように血管内皮細胞のみを制御しても、治療のためにはむしろ障害となることがわかったので、創傷治癒過程の炎症、線維化をおさえていわゆる「きれいな創傷治癒」を行うために、組織プラスミノーゲンアクチベーター(Sakamoto T et al,Hum Gene Ther,1999)や、トランスフォーミング増殖因子(TGF-b)を抑制するアデノウイルスベクターを作成した(Sakamoto T et al.Gene Therapy,2000)。この治療により、線維化ならびに血管新生も少ない角膜創傷治癒が可能となった。また、実験的肝硬変の抑制も可能であった(Uenoh et al,Hum Gene ther,2999)。血管新生現象は近年の遺伝子操作技術で可能となったが、生体にとって有益な創傷治癒は、さらに様々な現象を制御することが必要でありさらなる研究が必要である。調和のとれた組織リモデリングの研究予備実験の結果、血管新生のみを抑制しても病巣の線維化が起こり視力障害が残ることが分かった。つまり、良好な視力維持のためには調和のとれた創傷治癒(リモデリング)が必要である。そこで、TGF-betaを制御して創傷治癒を改善する試みを行った。TGF-betaレセプター分泌型アデノウイルスAdCATbを製作した。これはミンク肺胞上皮細胞によるTGF-beta活性測定系でTGF-betaの活性を特異的に抑制した。AdCATbを投与すると、マウス角膜創傷治癒過程において、角膜血管新生のみならず角膜の線維化が抑制された。特に、マクロファージを中心とした炎症細胞の浸潤が著しく抑制され炎症性ケモカインのMCP-1の発現が減少しており、角膜の透明性は維持された。次に、眼内創傷治癒モデルの一つである家兎増殖性硝子体網膜症(PVR)モデルにも同様のAdCATbを投与した。すると、同様にPVRが抑制された。以上のことから、TGF-betaの過剰発現が過度の眼内線維化や血管新生を起こすことが分かったため、TGF-beta1産生抑制作用のある薬物tranilastを、家兎PVRモデルに投与して効果を見たところPVRを抑制した。以上から、調和のとれた眼内創傷治癒にはTGF-betaの制御が必要であることが分かった。遺伝子導入の研究硝子体切除後のアデノウイルスベクター投与を行うと神経網膜に高率に遺伝子導入可能なことが分かった。また、電気パルスで全く炎症を起こさない角膜へのnaked DNAの導入が可能であることが分かった。
女性アスリートの外傷と障害の分析と予防のためのトレーニングプログラムの開発

本研究では現状で女性アスリートが行っているトレーニング方法やその問題点等について把握し、これを分析することにより女性アスリートに特化したトレーニング方法を提案する。(1)平成29年度に開始した。現在、システマティックレビューはほぼ完成した。この結果そのものが今回のプロジェクト、すなわち「女性アスリートの外傷と障害の分析と予防のためのトレーニングプログラムの開発」のプロトコール決定に重要な役割を演じる。同時に女性アスリートのスポーツチームにアンケート調査を行った。さらにシステマティックレビューの結果とアンケート調査結果を基に共同研究者間で討議を行い、最終的なプロトコールを決定した。(2)既に、慶應義塾大学医学部の倫理委員会にプロトコールを提出し、許可を得ている。また、実際の女性アスリートのスポーツチームにプロトコールを提示し、参加の承諾を得た。チームは東京周辺のチームを中心とし、承諾の得られたチームから参加選手のベースラインとなる基礎的運動能力(筋力、柔軟性等)の測定を行っている。参加選手のデータが得られた後、各チームは今回のプログラム参加チームとコントロールプログラム参加チームに無作為に分け、トレーニングを開始している。参加期間中、定期的にモニターを行い、外傷や障害の有無を観察する。当初は参加団体のリクルートに苦労したが、現在は順調にリクルートも終了し、計画したプロとコール通りに進んでいる。その後に最終的な結果を判定する予定ある。共同研究者Dr Macznikの来日を待って、2017年11月に本プロジェクトを開始した。まず、共同研究者Dr Macznikの日本における研究の規則、倫理規定等の理解を促すため、3日間のJSPSオリエンテーションに参加し、CITI JAPAN PROGRAMのE-learning courseを受講した。更に、日本におけるスポーツ医学の現状を理解するため、慶應義塾大学スポーツ医学総合センター主催の慶應スポーツ医・科学ミーティングや月例の研究打合せに参加し、更に国立スポーツ科学センター(JISS)や慶應スポーツ研究センターの見学を行った。次いで、本年度のプロジェクトとして、スポーツ外傷リスクについての過去の論文をピックアップし、これを解析することにより、本プロジェクト、すなわち「女性アスリートの外傷と障害の分析と予防のためのトレーニングプログラムの開発」について、現状での問題点と今後の方向性を決定することとした。そこで、共同研究者Dr Macznikを中心にシステマティックレビューを開始した。現在、「女性アスリートのトレーニングとバイオメカニクス」について、共同研究者間での最終調整中である。更に次年度以降に行う、実際のトレーニングプログラムの介入研究プロトコールの最終調整を行っている。トレーニング機材として最も頻用されている「セラバンド」を購入し、女性アスリートのトレーニングに必要なバンドの弾性率、バンドの牽引範囲や回数等について、パイロットスタディーを行っている。共同研究者Dr Macznikは2017年11月の来日後4ヶ月で日本における研究の規則、倫理規定等の理解を深め、日本におけるスポーツ医学の現状を概ね理解している。また、本プロジェクト、すなわち「女性アスリートの外傷と障害の分析と予防のためのトレーニングプログラムの開発」に必要な「女性アスリートのトレーニングとバイオメカニクス」についてのシステマティックレビューを進め、現在、投稿に向けて最終調整中である。更に、次年度以降に行う、実際のトレーニングプログラムの介入研究プロトコールのパイロットスタディーを行って最終調整を行っている。まず、現在最終調整を行っているシステマティックレビューを完成させ、投稿する。その結果そのものが今回のプロジェクト、すなわち「女性アスリートの外傷と障害の分析と予防のためのトレーニングプログラムの開発」のプロトコール決定に重要な役割を演じる。次いで、女性アスリートのスポーツチーム(現在、バスケット、バレーボール、テニスの合計6チームにプロトコールの概略を説明して参加の可能性を打診中)にアンケート調査を行う。システマティックレビューの結果とアンケート調査結果を基に共同研究者間で討議を行い、最終的なプロトコールを決定する。次いで、慶應義塾大学医学部の倫理委員会にプロトコールを提出し、許可を得る。倫理委員会の許可を得次第、実際の女性アスリートのスポーツチームにプロトコールを提示し、参加の承諾を得る。チームは東京周辺のチームを中心とし、承諾の得られたチームから参加選手のベースラインとなる基礎的運動能力(筋力、柔軟性等)の測定を行う。

参加選手のデータが得られた後、各チームは今回のプログラム参加チームとコントロールプログラム参加チームに無作為に分け、トレーニングを開始する。参加期間中、定期的にモニターを行い、外傷や障害の有無を観察する。介入終了後、再度参加選手の基礎的運動能力(筋力、柔軟性等)の測定を再度行い。更に介入後のスポーツ外傷や障害の発生頻度を分析する。その後に最終的な結果を判定する予定ある。
受精における細胞外ユビキチン-プロテアソームシステムの解明

精子ユビキチン-プロテアソームシステムは、マボヤ精子の卵外被通過の際に精子通過口を開けるライシンとして機能している事をすでに報告している。本研究では、このライシン系を構成する分子の同定に焦点を当てて研究を行った。当初、マボヤ精子抽出液あるいは精子浸出液(精子の活性化に伴って放出される画分)から卵黄膜をユビキチン化する酵素を精製することを試みたが、構造解析を行うのに十分な量が得られないことが判明した。そこで、ゲノムドラフト配列がすでに決定されているカタユウレイボヤを用いて、精巣で発現しているユビキチンリガーゼ(E3)とユビキチンコンジュゲーティング酵素(E2)を検索した。まず、RINGドメインを有するE3候補分子のなかから精巣で比較的強く発現している遺伝子モデルを2つ選び、精巣での発現の有無をRT-PCRで確認した。一方の分子(ci100130063)は、分子量86Kのタンパク質で、RINGドメインの他にTRPドメインとLONドメインを有していた。もう一方(ci100137400)は分子量57Kで、RINGドメインの他にFERMドメインも有していた。両者に対する抗体を作製し、精子における発現を解析した結果、ユウレイボヤ精子における発現量は低く、また交差反応する複数のバンドが検出された。一方、マボヤ精子を用いて同様の実験を行ったところ、この抗体が認識するタンパク質が存在することが確認された。E2の候補分子に関しても、遺伝子モデルから探索し、精巣で高発現している複数の酵素をRT-PCR法により確認した。ここで得られた酵素が、実際に受精の場で機能しているか否かは今後の課題である。3年間の上記研究課題における初年度の研究に関して、当初の計画をほぼ遂行したので報告する。我々は、原索動物マボヤの2種類の精子トリプシン様酵素(アクロシンとスペルモシン)と精子プロテアソームが、精子の卵黄膜通過に重要な役割を果たすことを明らかにしているが、その中でも精子プロテアソームは、卵黄膜に直接精子通過口をあけるライシンとして機能することを報告している。しかし、プロテアソームの活性だけでは卵黄膜成分を分解するのに十分ではなく、細胞外で卵黄膜をユビキチン化する活性が欠かせないことを突き止めた。そこでまず、この細胞外で機能する新規ユビキチン化酵素群の単離と性状解析を試みた。マボヤ精子は、卵黄膜上で精子反応と呼ばれる先体反応に相当する反応を引き起こす。その精子反応後の遠心上清(精子浸出液)中に、卵黄膜成分VC70をユビキチン化する酵素活性が検出された。そこでこの酵素を陰イオン交換クロマトグラフィー、ユビキチン-アガロースによるアフィニティクロマトグラフィー、密度勾配遠心分離により精製した。本精製酵素は、分子量700Kの高分子量複合体を形成しており、VC70を特異的にユビキチン化する。また、その活性発現には海水条件である10 mM Ca^<2+>が必要であり、細胞内ではなく確かに細胞外の海水中で活性を発現しうることが示された。さらに、本酵素の至適pHは8付近であり、これも海水中で機能しうることを示している。ユビキチン化の反応には、遊離のユビキチンと細胞外ATPが必要となるが、いずれも受精時に精子・卵懸濁液から細胞外に放出されること、また精子浸出液中にもこれらが存在することを見いだした。細胞外のATPをアピラーゼによって分解すると、マボヤの受精が阻害されることも見いだし、細胞外ATPが確かにマボヤの受精に重要な役割を果たすことが確認された。上記研究課題について、今年度の実験計画をほぼ完了したので報告する。

原索動物マボヤの2種類の精子トリプシン様酵素(アクロシンとスペルモシン)と精子プロテアソームが、精子の卵黄膜通過に重要な役割を果たすこと、また卵黄膜に直接精子通過口をあけるいわゆるライシンとして機能する分子は、精子由来のユビキチン-プロテアソームシステムであることをすでに報告している。この細胞外で機能する新規ユビキチン酵素群を精子浸出液から精製することを試みたところ、分子量700kDaで、海水条件下でも活性を発現するという特性があることが示された。しかし、精製酵素は微量しか得られないため、N末端配列を決定することは困難である。そこで、カタユウレイボヤのゲノムデータベースをもとにして、精巣で発現しているRingドメイン含有分子(ユビキチンリガーゼ候補分子)を探索することにした。データベースからの探索に先だって、カタユウレイボヤの受精にユビキチン化が関わっているか否かを解析した。マルチユビキチン鎖を特異的に認識する単クローン抗体FK2を用いて、カタユウレイボヤの受精前後における卵黄膜のユビキチン化について検討した。その結果、この抗体は未受精卵の卵黄膜にも多少反応するが、受精後に強く反応することが示された。またこの抗体は、カタユウレイボヤの受精を濃度依存的に阻害することも示された。これらの結果は、カタユウレイボヤにおいても受精時に卵黄膜のユビキチン化が起こり、それが受精に関わることを示している。次に、このユビキチンリガーゼ反応に関わる候補分子をデータベース上から探索し、2つの候補分子を得た。現在このGST融合タンパク質を精製し、ユビキチン化反応を有するか否か、またこの抗体は受精を阻害するか否かを検討中である。精子ユビキチン-プロテアソームシステムは、マボヤ精子の卵外被通過の際に精子通過口を開けるライシンとして機能している事をすでに報告している。本研究では、このライシン系を構成する分子の同定に焦点を当てて研究を行った。当初、マボヤ精子抽出液あるいは精子浸出液(精子の活性化に伴って放出される画分)から卵黄膜をユビキチン化する酵素を精製することを試みたが、構造解析を行うのに十分な量が得られないことが判明した。そこで、ゲノムドラフト配列がすでに決定されているカタユウレイボヤを用いて、精巣で発現しているユビキチンリガーゼ(E3)とユビキチンコンジュゲーティング酵素(E2)を検索した。まず、RINGドメインを有するE3候補分子のなかから精巣で比較的強く発現している遺伝子モデルを2つ選び、精巣での発現の有無をRT-PCRで確認した。一方の分子(ci100130063)は、分子量86Kのタンパク質で、RINGドメインの他にTRPドメインとLONドメインを有していた。もう一方(ci100137400)は分子量57Kで、RINGドメインの他にFERMドメインも有していた。両者に対する抗体を作製し、精子における発現を解析した結果、ユウレイボヤ精子における発現量は低く、また交差反応する複数のバンドが検出された。一方、マボヤ精子を用いて同様の実験を行ったところ、この抗体が認識するタンパク質が存在することが確認された。E2の候補分子に関しても、遺伝子モデルから探索し、精巣で高発現している複数の酵素をRT-PCR法により確認した。ここで得られた酵素が、実際に受精の場で機能しているか否かは今後の課題である。
活性化リンパ球特異的な抑制法の開発

自己免疫疾患もアレルギーも過剰に活性化されたT細胞が引き起こす。こうした抑制の効かない活性化T細胞の特異的な抑制が望まれるが、実際には、今の免疫抑制剤は全てのT細胞を抑制してしまう。本研究では、活性化T細胞だけを抑制できる方法の開発を目指す。自然免疫は、ウイルス細菌などをパターン認識しIFNなどを産生させる。T細胞にもこれらの受容体(TLRやSTING等)を発現し、活性化シグナルを誘導する。T細胞を、STINGリガンド・環状ジペプチドで刺激すると、増殖が抑制された。この抑制は活性化T細胞のみで、無刺激のT細胞には影響がなく、STINGリガンドは、活性化T細胞を特異的に抑制できる薬剤になる可能性を示した。本研究は、STINGリガンドがT細胞を抑制するメカニズムを解析することを目的とし、その抑制メカニズムから誘導されるより良い抑制剤の開発を目指した。(1)STINGリガンドの内、生理的なcGAMP, c-di-GMP (AMP)はTCR刺激と一緒に加えると広い濃度(0.1-10mM)でT細胞の増殖を抑制したが、DMXAAは高濃度では細胞死を誘導した。増殖抑制の誘導は、T細胞が増殖を開始する24hr以降で誘導されたが、IL-2に依存しない初期の増殖には影響しなかった。(2)T細胞の増殖阻害は誘導されるが、細胞死は誘導しないことから、細胞周期阻害が誘導されていた。実際細胞周期関連分子、サイクリンやCdkキナーゼの発現抑制が誘導され、逆に抑制分子p21,p27は発現昂進された。更に、細胞増殖抑制を誘導する活性化シグナルを解析した結果、mTOR経路の活性化抑制が誘導されることが判明した。STINGリガンドによるTCRシグナルとの共刺激によって、TCR刺激で誘導されるmTOR活性化が抑制さて、細胞周期阻害が誘導されて、増殖の抑制に至ることが明らかになった。T細胞の抗原刺激と共にSTINGを活性化すると、T細胞の増殖抑制が誘導されることからそのメカニズムの解析を進めた。活性化T細胞でのみ増殖抑制が誘導され、目指した活性化T細胞特異的な抑制方法の開発に繋がるものと思われる。生理的なSTINGリガンドによって生理的濃度で誘導されることも判明した。更に抑制メカニズムとしては、STING刺激で、T細胞では予想外にmTOR活性化が抑制されることが判明し、そのために細胞周期の阻害が起こり増殖抑制につながっていることが解った。更に、STINGとTCRの共刺激によってT細胞からもI型インターフェロンが産生されるという驚くべき結果を得た。この結果から、自然免疫系で既に解っているI型インターフェロン産生を誘導するシグナルに関与する分子群TBK1/IKKe, IRF3/IRF7などの関与について、各分子の欠損マウスを用いて解析する必要も出てきた。STINGの活性化でT細胞の増殖阻害が誘導されるメカニズムとして、mTOR経路の活性化抑制を見つけたことから、mTORシグナルを制御するRaptorなどの分子の欠損マウスを用いて解析する必要がでてきた。また、STING刺激でT細胞からもI型インターフェロンが産生される予備的結果を得たことから、自然免疫系で既に解っているI型インターフェロン産生を誘導するシグナルに関与する分子群TBK1/IKKe, IRF3/IRF7などの分子の欠損マウスを用いて解析する必要も出てきた。そのために期間を延長指せていただき、これらの種々の遺伝子欠損マウスを入手してコロニーを得た上で解析する。研究推進の内容としては、上記した種々欠損マウスを用いたシグナル経路の解析を行う。STING

リガンドによるTCRシグナルとの共刺激によって、TCR刺激で誘導されるmTOR活性化が抑制されて、細胞周期阻害が誘導されて、増殖の抑制に至ることが明らかになった。T細胞の抗原刺激と共にSTINGを活性化すると、T細胞の増殖抑制が誘導されることからそのメカニズムの解析を進めた。活性化T細胞でのみ増殖抑制が誘導され、目指した活性化T細胞特異的な抑制方法の開発に繋がるものと思われる。生理的なSTINGリガンドによって生理的濃度で誘導されることも判明した。更にお抑制メカニズムとしては、STING刺激で、T細胞では予想外にmTOR活性化が抑制されることが判明し、そのために細胞周期の阻害が起こり増殖抑制につながっていることが解った。自己免疫疾患もアレルギーも過剰に活性化されたT細胞が引き起こす。こうした抑制の効かない活性化T細胞の特異的な抑制が望まれるが、実際には、今の免疫抑制剤は全てのT細胞を抑制してしまう。本研究では、活性化T細胞だけを抑制できる方法の開発を目指す。自然免疫は、ウイルス細菌などをパターン認識しIFNなどを産生させる。T細胞にもこれらの受容体(TLRやSTING等)を発現し、活性化シグナルを誘導する。T細胞を、STINGリガンド・環状ジペプチドで刺激すると、増殖が抑制された。この抑制は活性化T細胞のみで、無刺激のT細胞には影響がなく、STINGリガンドは、活性化T細胞を特異的に抑制できる薬剤になる可能性を示した。本研究は、STINGリガンドがT細胞を抑制するメカニズムを解析することを目的とし、その抑制メカニズムから誘導されるより良い抑制剤の開発を目指した。(1)STINGリガンドの内、生理的なcGAMP, c-di-GMP (AMP)はTCR刺激と一緒に加えると広い濃度(0.1-10mM)でT細胞の増殖を抑制したが、DMXAAは高濃度では細胞死を誘導した。増殖抑制の誘導は、T細胞が増殖を開始する24hr以降で誘導されたが、IL-2に依存しない初期の増殖には影響しなかった。(2)T細胞の増殖阻害は誘導されるが、細胞死は誘導しないことから、細胞周期阻害が誘導されていた。実際細胞周期関連分子、サイクリンやCdkキナーゼの発現抑制が誘導され、逆に抑制分子p21,p27は発現昂進された。更に、細胞増殖抑制を誘導する活性化シグナルを解析した結果、mTOR経路の活性化抑制が誘導されることが判明した。STINGリガンドによるTCRシグナルとの共刺激によって、TCR刺激で誘導されるmTOR活性化が抑制さて、細胞周期阻害が誘導されて、増殖の抑制に至ることが明らかになった。更に抑制メカニズムとしては、STING刺激で、T細胞では予想外にmTOR活性化が抑制されることが判明し、そのために細胞周期の阻害が起こり増殖抑制につながっていることが解った。更に、STINGとTCRの共刺激によってT細胞からもI型インターフェロンが産生されるという驚くべき結果を得た。
新規NF-KB活性阻害剤(DHMEQ)の小腸虚血再灌流障害に対する治療効果

Nuclear factor-κB (NF-κB)は炎症惹起因子である敗血症、活性酸素などの刺激により腸管で活性化されることが知られている。このNF-κBの核内への移行を阻害する新規NF-KB活性阻害剤(DHMEQ)を用いたラット小腸虚血再灌流障害に対するNF-κB阻害作用の効果について検討した。その結果、ラット60分小腸虚血再灌流障害モデルにおいてDHMEQ治療群は無治療群と比較して、生存日数の有意な延長を認め、再灌流後の小腸組織血流量を良好に維持できた。また、DHMEQ治療群は炎症性サイトカインであるTNF-αとIL-6の産生を有意に抑え、病理組織学的に小腸および遠隔臓器である肺障害をも軽減できた。翌年度は、これらの知見から潰瘍性大腸炎のモデルであるマウスDSS誘発大腸炎モデルに対してもDHMEQの治療効果が期待できると判断し、その有効性について検討した。結果、DHMEQ治療群はコントロール群と比較して炎症性サイトカインであるIL-8を有意に抑制し、臨床症状である血便の改善を認めた。以上より、DHMEQはラット小腸虚血再灌流障害およびマウスDSS誘発大腸炎モデルに対して抗炎症効果を示したとの結論を得た。〔背景〕Nuclear factor-κB(NF-κB)は炎症惹起因子である敗血症、活性酸素などの刺激により腸管で活性化されることが知られており、炎症反応に関わるサイトカイン、接着因子、ケモカイン、growthfactor、や炎症誘導酵素であるcyclooxygenase-2、NO合成の誘導などに関わっている。本実験では、NF-κBの核内への移行を阻害するDHMEQを用いたラット小腸虚血再灌流障害に対するNF-κB阻害作用の効果について検討した。〔方法〕体重250300gの雄性ラットを用いた60分の小腸虚血再灌流モデルを作成した。実験群はコントロールを無治療群とし、治療群は血流遮断1時間前と再灌流5分前にDHMEQ(10mg/kg)を腹腔内投与した。動物生存日数とレーザードプラー血流量計による小腸組織血血流量、血清TNF-αとIL-6の測定および小腸と遠隔臓器である肺障害の程度について病理組織学的に検討した。〔結果〕ラットの60分小腸虚血再灌流障害モデルにおいてDHMEQ治療群は無治療群と比較して、生存日数の有意な延長を認め、再灌流後の小腸組織血流量を良好に維持できた。〔結語〕DHMEQはラットの小腸虚血再灌流障害において抑制効果を示した。以上の研究成果をH19年度の日本小腸移植研究会で発表し、英文雑誌であるJournal of Surgical Researchに投稿し受理された。〔背景〕NF-κBの核内への移行を阻害するDHMEQはラットの小腸虚血再灌流障害において抑制効果を示し、これまでに平成19年度の日本小腸移植研究会で発表し、平成20年度のJournal of Surgical Researchl49, 69-75に掲載された。H20年度は当初、大動物実験を予定していたが予算の都合から小動物を用いた炎症性腸炎モデルを用いてDHMEQの効果を検討した。〔方法〕In vitro : HT29株をLPSで刺激しIL-8をELISA法で測定、DHMEQを添加しIL-8産生抑制効果を検討した。In vo : c57/BL/6マウスに2または3%のDSSを飲水させて大腸炎を誘発した。無治療群をコントロール群、治療群はDHMEQ(20mg/kg)を連日腹腔内投与、また対象治療群として5-ASA(100mg/kg)を連日直腸内投与し、大腸炎抑制効果を検討した。〔結果〕DHMEQは2.5μg/ml以上でIL-8産生を有意に抑制した。コントロール群では、3%DSS飲水4日目で4/6例、5日目で全例が肉眼的血便を呈したが、DHMEQ投与群のそれは2/6例であった。

一方、5-ASA投与群はコントロール群に対して改善を認めなかった。2%DSSモデルでも同様の傾向が認められた。〔結語〕DHMEQはマウスDSS誘発大腸炎に対して抑制効果を認めた。以上の内容は、平成21年度の日本外科学会と米国のDDWにおいて抄録が採択され発表予定である。
タンパク質機能ポケットへの二波長光反応性蛍光トランスファー技術の開発

蛍光可視化は高い空間的分解能を持つためタンパク質の挙動解析に多用されるが、シグナル解析等に有効な機能部位への蛍光化法は少ない。今回、光照射のみで標的タンパク質を捕捉し、さらに切断と同時に機能部位に蛍光基を形成する、新しい光アフィニティーラベル化法を開発した。小分子からタンパク質に至る生体分子相互作用系で実証し、さらにその蛍光ラベルタンパク質を用いた基質結合解析に成功した。生体分子の蛍光可視化は相互作用解析に重要な技術であるが、その相互作用部位に直接蛍光ラベル化する技術は少ない。本提案は光アフィニティークロスリンクを基盤技術として、二段階の光照射によりリガンド分子から結合タンパク質の結合部位へ蛍光基をトランスファーすることでリガンド分子結合等を評価する手法の確立を目的とする。初年度では本技術開発の基盤化合物である桂皮酸型光反応性ユニットについて、ジメトキシフェニルジアジリン化合物からアミノ基指向性誘導体に誘導することに成功した。さらに、以下の3つの生体分子相互作用系に適応したリガンドに導入して光反応性プローブ合成を進めた。1)ATP結合によるリン酸化や構造変化は細胞内シグナルのドライビングフォースとなるため、その結合解析や核酸受容体のプロテオミクス的解析を行うことは重要である。リン酸化阻害剤であるγS-ATPに光反応ユニットを導入することで光反応性ATP誘導体作製に成功した。2)DNA損傷に関わるタンパク質複合体解析を目的とする。光反応ユニットをDNA損傷剤である白金化合物に導入し、それが結合したDNAプローブを作成した。本系では、光シスートランス異性化によるクマリン形成、さらに照射波長や反応温度を制御することで2つの光反応(ジアジリンによる光クロスリンク反応と光シスートランス異性化を経由したクマリン形成反応)を区別することが可能であることを見出した。3)タンパク質間相互作用系の結合評価を目指す。上記アミン指向性誘導体を用いてリゾチーム表面に存在するリシン残基に導入し、光反応性リゾチームを作製した。相互作用分子としてリゾチーム抗体を用いて光クロスリンクを検討したところ、軽鎖へのクロスリンクを確認した。本課題は、タンパク質機能部位に直接蛍光ラベルを光照射のみで構築する技術の開発であり、相互作用タンパク質の蛍光イメージングや基質結合解析への応用を目的とする。光アフィニティーラベル法を利用して、まず結合タンパク質を光捕捉し、さらに二段階目の光照射により、クロスリンクした基質分子を解離させつつ相互作用部位を蛍光化する。初年度は光反応性ユニットであるジヒドロキシ桂皮酸型ジアジリン誘導体を作成し、それを導入して光反応性のATP、DNA、タンパク質プローブを作成した。本年度は各プローブの光化学特性評価を行いながら、それぞれの結合タンパク質への蛍光移植システムの検証を行った。1)安定性を向上させたリン酸アミド型ATPプローブを作成した。光照射によるクマリン形成を確認した後、ATP結合タンパク質であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)の蛍光化に応用した。光クロスリンクとクマリン形成を照射波長と反応温度により制御することでGDHの特異的蛍光ラベル化を達成した。2)光反応性白金錯体を導入したDNAプローブを数種作成し、NA損傷部位に親和性の高いHMGB(高速移動群)タンパク質を蛍光ラベルした。3)初年度に光反応性リゾチームによるリゾチーム抗体軽鎖へのラベルを確認したので、次にB細胞を用いて細胞膜表面に発現したリゾチーム抗体へのラベル化を評価した。光クロスリンクを0°Cで行った後では細胞は無蛍光性であったが、照射波長を変更し37°Cにしたところ、B細胞のみからクマリン由来の蛍光の増加が確認された。以上の結果から、細胞膜タンパク質の特異的蛍光ラベルを、細胞レベルで達成できた。本課題は相互作用タンパク質の機能部位に蛍光ラベルを光照射のみで構築する技術開発であり、相互作用解析への応用等を目的とする。まず結合タンパク質を光捕捉し、さらに二段階目の光照射でクロスリンクした基質分子を解離させつつ相互作用部位に蛍光基クマリンを形成させる、独自のアフィニティーラベル法である。これまでに光反応性ユニットを導入したATP、DNA、タンパク質プローブを作成し、各結合タンパク質への蛍光ラベルを行った。最終年度では本ラベル法の汎用性を評価し、結合解析法への展開を行った。1)置換基を変えた光反応性ユニットを導入したATPプローブでは、反応時間の短縮など総合的なラベル効率が大幅に向上した。このプローブを用いてATP加水分解酵素やプロテインキナーゼ、分子モータータンパク質複合体の特異的蛍光ラベル化に成功し、多様なATP結合タンパク質への本手法の汎用性を実証した。2)光反応性白金錯体を導入したDNAプローブでクロスリンクしたHMGB(高速移動群)タンパク質を、ビオチン-アビジン系を利用して担体に選択的に捕捉することで蛍光化HMGBの精製を行った。二段階目の光照射では、HMGBのクマリンラベル化と同時に、精製担体から選択的に、かつ簡便・温和に切断し溶出させることができた。さらに、単離した蛍光化HMGBの損傷DNAへの結合活性を、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)法により評価することに成功した。

3)光反応性リゾチームを用いて細胞表面に発現したリゾチーム抗体を蛍光ラベルし、相互作用タンパク質間での蛍光基移植、および細胞レベルで手法論の汎用性を示した。以上、他に類を見ない相互作用部位への光化学的蛍光トランスファー技術を確立し、その汎用性を実証し、さらに蛍光ラベル化タンパク質を使った結合解析法を構築した。