hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精子抗原ペプチド発現微生物を用いた遺伝子経粘膜ワクチンの開発

主任研究者らは、これまで蓄積してきた抗精子抗体(精子不動化抗体)による免疫性不妊症の研究成果に基づき、精子抗原を利用した避妊ワクチンの開発を試みた。すなわち、すでに精子不動化抗体の対応抗原である可能性が示唆されているrSMP-BをコードしているrSMPをターゲットとして以下の実験を行った。(1)ラットの精巣cDNAライブラリをrSMPに対するプライマを用いてPCRを行なった。オートシークエンサーを用いたPCR産物の塩基配列は、rSMP-Bをコードしている遺伝子として既に報告されているRSD-1と3個のアミノ酸が異なっていることが明らかとなった。(2)(1)で得られたrSMPをベクターに組込み、大腸菌へ形質転換した。6クローンのインサートチェックを行い、塩基配列をみたところ1クローンのみmutationを認めなかった。(3)(2)で得られたクローンを鋳型として発現用クローンの作成をおこなった。制限酵素部位をもつプライマでPCRを行い、そのPCR産物を制限酵素で切断して2種類の発現ベクター(pcDNA、p3xFLAG)に組み込み大腸菌に形質転換した。それぞれ12個のコロニーのインサートチェックを行ったところ、すべてにmutationがあることが明らかとなった。今後、さらにスクリーニングをおこなう予定であるが、rSMPの発現クローンが作成できれば、培養細胞に導入して発現部位の確認をおこなうとともに遺伝子銃を用いた基礎的実験を開始する。主任研究者らは,これまで蓄積してきた抗精子抗体(精子不動化抗体)による免疫性不妊症の研究成果に基づき,精子抗原rSMP-Bを利用した避妊ワクチンの開発を試みた.現在までに,精子不動化抗体の対応抗原の一つと思われるrSMP-BをコードしているrSMPをターゲットとして以下の結果を得ている.(1)ラットの精巣ライブラリーをもとにPCRをおこなったところ,rSMP-Bをコードしている遺伝子として既に報告されているRSD-1と3個のアミノ酸が異なっていることが明らかとなった.(2)(1)で得られたrSMPをベクターに組み込み,大腸菌へ形質転換した.6クローンのインサートチェックを行い,塩基配列を見たところmutationを認めない1クローンを得た.本年度は以上の成果を元に以下の実験を行った.(3)(2)で得られたクローンを鋳型として発現用クローンの作成を行った.制限酵素部位を持つプライマーでPCRを行い,そのPCR産物を制限酵素で切断して2種類の発現ベクター(pcDNA, P3xFLAG-CMV14)に組み込み大腸菌に形質転換した.それぞれ24個のコロニーのインサートチェックを行ったところ,mutationのない3クローンが得られた.(4)発現実験のスクリーニングのために用いる抗rSMP抗体を,家兎に精子抗原ペプチドrSMP-229およびrSMP230を免疫することにより作成した.(5)(3)で得られたrSMP発現ベクターを,ヒト培養細胞Human Embrionic Kidney 293 (HEK293)に導入し,発現実験を行った.
スギ免疫療法におけるヒノキ花粉症非奏功例に対する新規主要抗原cha o 3の関与

本研究では、スギ花粉標準化エキスを用いたアレルゲン免疫療法を施行した際のヒノキ花粉症に対する効果を、免疫学的手法を用いて検討することで、ヒノキ花粉症に効果がない原因に、ヒノキ花粉の新規主要抗原であるCha o 3が関与していることを明らかにすることを目的として開始した。スギ舌下免疫療法(SLIT)開始後12年のスギ・ヒノキ花粉症患者82人(SLIT群)、SLITを施行していないスギ・ヒノキ花粉症患者25人(non-SLIT群)、花粉症のない患者20人(Healthy Control:HC)から非飛散期の末梢血を採取し、PBMCと血清を分離・採取した。PBMCにCry j 1(スギ花粉主要アレルゲンコンポーネント)、Cha o 1・Cha o 3(ヒノキ花粉主要アレルゲンコンポーネント)で刺激して上清を採取し、サイトカインを測定した。今回の結果から、スギSLITではスギ抗原(Cry j 1)特異的なIL-10産生は誘導されるが、Cha o 3だけでなく、交差反応性をもつとされるヒノキ抗原(Cha o 1)特異的なIL-10産生も誘導されないことが示された。SLITの効果にはIL-10を産生する制御性T細胞や制御性B細胞が大きく関わっているとされるため、スギSLITではヒノキ花粉症に効果がない可能性が示された。PBMCを刺激した時のサイトカイン産生の検討では、スギSLITの効果がヒノキ花粉症に対して十分でない要因として、Cha o3特異的に効果が減弱するわけではなく、Cry j 1と交差反応性をもつCha o1刺激時にも効果が減弱することを示した。これは当初予期していた結果ではなかったが、スギSLITの効果がヒノキ花粉症に効果が充分でないためヒノキ花粉を追加したSLITの必要性を探る、という当初の最終目標にたがうものではなく、むしろ肯定する結果であると考える。さらにスギSLITの効果がヒノキ花粉症には十分でないことを確認するために、研究実施計画に基づき、3群での血清の免疫グロブリンの濃度の差を検討する。また、実際の症状との相関を確認することが必要となるため、好塩基球刺激試験を用いた比較試験も行う予定である。最終的には、SLITの効果を予測する因子を明らかにするために、マイクロアレイ法を用いて網羅的に解析する予定である。
言語の脳内メカニズムに関する研究バイリンガルの事象関連電位

本研究の目的は、言語処理過程に関わる脳内のメカニズムを知るために、バイリンガルの被験者を用いて、反応時間および、脳波の事象関連電位の後期陰性成分のN400の振幅変動について検討を行うものであった。以下にその概要を述べる。(1)二つの言語間の干渉効果を、反応時間を指標としたプライミング実験により測定した。具体的には、日本語と英語のバイリンガルの者と、英語を専攻する大学生を被験者として、日本語と英語をプライムとして、二つの単語間の意味的関連性と、言語間のスイッチング(プライムが日本語か英語か)が、後のターゲットの語彙判断に及ぼす影響を検討した。また、言語処理過程のなかでも刺激処理の初期に生起すると考えられている自動的処理過程とそれよりも遅れて生起すると考えられている注意的処理過程とを比較するため、プライムとターゲットとの間の刺激呈示時間差(SOA)を、150MSおよび750MSとの場合について実験を行なった。結果、英語を専攻する大学生ではSOAによりプライミング効果に差異があった。しかし、バイリンガルの被験者では、英語と日本語との間では、言語情報処理に差異は認められなかった。このことから、バイリンガルの被験者では、英語を専攻する大学生に比較して、二つの言語が自動的に処理されていることが示唆される。(2)プライミング実験における言語情報処理過程の脳内メカニズムを調べるため、事象関連電位の測定を行なった。事象関連電位のN400の振幅変動については、バイリンガルの被験者では、二つの言語間で差異は認められなかった。このことから、バイリンガルの被験者の言語処理は、二つの言語間で同程度に自動的であることが、脳内メカニズムの段階からも確認されたと言えるだろう。
腫瘍血管新生制御による超低侵襲型次世代粒子線癌治療技術の研究

本研究では、腫瘍血管制御による低侵襲粒子線癌治療法の開発を目的とし、NFSa線維肉腫細胞を後ろ脚に移植した腫瘍マウスを用いて、陽子線照射と腫瘍血管遮断剤AVE8062を併用し、本治療法の有効性を検証した。マウスによる治療的実験を実施するために、東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンター(CYRIC)に小動物用粒子線治療装置を開発した。また、CYRICのAVFサイクロトロンより得られる治療用の80MeV陽子線の動物腫瘍における放射線生物学的効果を評価するために、イヌ由来の扁平上皮癌細胞に対する照射実験を行った。その結果、コバルト60ガンマ線に対する陽子線の放射線生物学的効果比は、ブラッグピーク付近において1.41.5、拡大ブラッグピークにおいて1.1であり、ガンマ線よりも大きな細胞致死効果を示した。マウスによる動物実験において、陽子線治療(15Gy、または30Gyの80MeV陽子線単回照射)では、線量に応じた顕著な腫瘍体積の減少および増加遅延の結果が得られたが、AVE8062処置(5mg/kg、または10mg/kgの単回腹腔投与)では、コントロールと大きな違いは見られなかった。陽子線治療とAVE8062の併用治療(陽子線照射の1時間後にAVE8062処置)でも陽子線単独の場合と比べて、同程度あるいはやや大きな効果が示唆される結果であった。今回の実験結果は、AVE8062の抗腫瘍効果が投与法などの原因により十分に得られなかったことによると考えられる。陽子線照射とAVE8062処置の併用治療のプロトコルを最適化すれば、より大きな抗腫瘍効果が期待される。本研究では、腫瘍血管新生阻害効果と粒子線照射の優れた線量分布の特徴を最大限に活用する新しい低線量・低副作用の粒子線治療技術の開発を目的としている。全体の研究計画は、初年度(平成17年度)に粒子線治療装置の開発、平成18年度から平成19年度(最終年度)にかけて、本研究で目指す粒子線治療の動物実験の実施となっている。平成17年度では、この新しい粒子線治療の研究をラット等の小動物を用いて行うための粒子線治療実験用照射システムの開発を行った。照射システムは、粒子線を水平・垂直偏向できる水平・垂直用ワブラー電磁石及び電源、がん形状に一致した深部線量分布を形成するためのリッジフィルター、線量計測システム、及び、全体システム制御系から成る。開発した照射システムは、東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターに設置された。さらに、照射システムと80MeV陽子線を用いて治療用ビーム形成の基礎実験を実施した。本研究では従来の粒子線治療法と新しい治療法の効果を比較検証する必要があるので、ビーム形成の基礎実験では、先ず、従来の粒子線照射を想定したビーム形成を行った。加速器からのペンシルビームを癌全体に一様に照射するために、ワブラー電磁石により最大直径約10cmの一様照射野を得た。また、癌の深さ方向も一様に高線量で照射できるように、リッジフィルターによって最大約4cm幅までの各種拡大ブラックピークの形成にも成功した。一様照射の強度平坦度と拡大ブラックピークの深部線量分布の平坦度は、ともに±2.54%の範囲であり粒子線治療研究を実施するために必要な精度が確保できている。従って、現在、今後計画している粒子線治療の動物実験が可能な状況に達しており、本研究で提唱する血管新生阻害薬と粒子線治療の利点を融合した低線量・低副作用の治療研究を実施していく予定である。本研究では、平成17年度からの3年間において、腫瘍血管新生阻害効果と粒子線治療の相乗効果を最大限に活用する新しい低線量・低副作用の粒子線治療技術の開発をめざしている。

平成18年度では、前年度に開発・完成した粒子線治療実験用照射システムを用いて、ラットなど動物実験実施に必要なエネルギーフィルターの開発、3次元腫瘍形状に一致した高線量域を形成できるスポットビームスキャニング照射技術開発、動物粒子線治療用の治療計画システムの開発、動物由来の悪性腫瘍細胞を用いた陽子線照射実験など、本研究の最終目的の治療実験ための基礎研究開発を行った。小動物実験用のエネルギーフィルター開発では、ラットから小型犬までの動物に移植する腫瘍標的の大きさを想定して、5mmから20mmまで5mm間隔で4種類の拡大ブラッグピークを形成できる各種リッジフィルターを開発し、治療に必要な精度の約5%平坦度の各種拡大ブラッグピーク形成に成功した。一方、スポットビームスキャニング照射法によって体内3次元高線量域を自在に形成することにも成功し、ワブラー法で困難な症例においても精密な粒子線治療実験の実施が可能となった.さらに、動物治療実験において目的通りの吸収線量分布を標的体積に投与するために、動物のX線CT画像を利用した小動物用粒子線治療計画システムを開発した。また、標的駆動装置などの動物用治療関連機器の開発も行った。治療実験の基礎となる生物学的データとして、動物由来の悪性黒色腫や扁平上皮癌等の細胞を用いて陽子線の照射実験を行い、細胞生存率の吸収線量依存性のデータからイヌなどの悪性腫瘍に対する陽子線の生物学的効果比を取得した。動物の細胞に対する陽子線の生物学的効果比は過去に報告がなく初めてのデータである。来年度は本研究の最終年度であり、本研究で提唱する低侵襲粒子線治療の動物実験を行い研究成果をまとめる。本研究は、陽子線治療と腫瘍血管標的薬剤の相乗効果による低線量・低副作用癌治療法の開発を目的とし、腫瘍細胞を移植したマウスを用いて、陽子線照射と腫瘍血管遮断剤AVE8062を併用し、本治療法の有効性を検証した。動物実験を以下の条件で実施した。C3H/Heマウスの大腿骨付近に線維肉腫細胞を移植し、直径10mm程度の腫瘍塊が形成されたものを用いる。治療条件は、陽子線照射群(拡大ブラッグピーク、15Gy、または30Gy)、AVE8062処置群(5、または10mg/kg、照射1時間後に腹腔投与)、陽子線照射+AVE8062両処置群のいずれも単回処置とし、無治療の比較対照群とともに、線量、薬剤投与量を指標とした腫瘍体積の経過観察を実施した。実験の結果、陽子線治療単独条件において、15Gy照射群では照射後4日に腫瘍体積が最少値となった後に増加し、30Gy照射群では4日目以降も腫瘍体積が減少し7日目に最小値をとり、陽子線単回照射による線量に応じた抗腫瘍効果が得られた。AVE8062単独処置群では、期間全体としては比較対照群とほぼ同等の単調な増加傾向となったが、10mg/kg投与群は投与後5日程度まで比較対照群と比べて腫瘍体積の増加が抑制される傾向が見られた。今回の薬剤投与条件は腹腔内投与であり、血中薬剤濃度の上昇がにぶく、腫瘍血管遮断効果が不十分であったと考えられる。陽子線15GyとAVE8062併用処置群では、陽子線15Gy+AVE8062 10mg/kg併用処置群において、治療後5日目までの腫瘍体積減少が陽子線15Gy単独群よりもやや大きく、両治療の相乗効果を示す傾向が得られた。治療プロトコル最適化により、さらなる抗腫瘍効果が示唆される。
３次元プリンティング用セメントモルタルの時間依存構成則および一般化解析手法の構築

建設業における設計・施工を劇的に転換しうる技術として,セメント系材料を積層造形する3Dプリンティング(3DP)技術が注目を集めている.積層方式では,"積層性"(積層可能な最大高さ,積層にともなう下層部の圧密沈下量)を的確に予測・評価することが重要である.本研究は,使用材料,配合,環境条件をパラメータとした3DP用セメントモルタルの時間依存構成則を構築し,積層性に関する一般化予測手法の開発を目指す.構成則の構築では,回転式粘度計と一面せん断試験機を用いた実験的研究を行う.提案モデルの検証のため,大型3Dプリンタにより構造体を作製し,施工中の沈下量をデジタル画像相関法で測定して,解析値と比較する.建設業における設計・施工を劇的に転換しうる技術として,セメント系材料を積層造形する3Dプリンティング(3DP)技術が注目を集めている.積層方式では,"積層性"(積層可能な最大高さ,積層にともなう下層部の圧密沈下量)を的確に予測・評価することが重要である.本研究は,使用材料,配合,環境条件をパラメータとした3DP用セメントモルタルの時間依存構成則を構築し,積層性に関する一般化予測手法の開発を目指す.構成則の構築では,回転式粘度計と一面せん断試験機を用いた実験的研究を行う.提案モデルの検証のため,大型3Dプリンタにより構造体を作製し,施工中の沈下量をデジタル画像相関法で測定して,解析値と比較する.
視覚認識モデルを用いた人間の行動パターンに関する研究

人間の視覚プロセスは、工学的画像センサで正確にデータ取得できない不完全画像(歪、欠損あるいは不整合を含む画像を指す)に対し、それがありふれた対象を示しているならば深い推論を行わずに直感的にかつ瞬時に対象を認識できる場合ある。このような視覚プロセスの工学的実現化に関し検討することが本研究の目的である。人間の視覚プロセスの実現化として、次の3つの機能、[i]主観的輪郭線のイメージング、[ii]生理学的に検証されているNeuronal-Code、[iii]複数の視覚チャンネル、に関する機能を重要と考え、これらの工学的実現化の可能性について検討を行った。初めに、主観的輪郭線のイメージングに関する検討として、種々の不全多角形図形に対するアンケート調査から人間の視覚プロセスには、奥行き情報と縦線分が重要な意味を持つことがわかった。他の視覚プロセス機能[ii],[iii]に関しては新たに堤案する階層型ニュートラルネットワークで実現可能との知見を得た。この事実を考慮して、通路図形に対する主観的輪郭線を生成する機能を特定することを行い、視覚モデルのプロトタイプ構築を試みた。本視覚モデルの適用対象として実画像から得られる不完全画像の直線通路透視図形を取り上げ、視覚モデル構成要素に関する構築方法の検討・評価を行った。この結果、屋内の直線通路に関しては良好な認識結果が認められた。また、本モデルは高速処理が可能であるとの利点を有している。さらに、提案する視覚モデルを実画像への適用実験から、通路領域における人間の行動パターンを表現するモデル開発に関する「浅い通路認識に基づく運転モデル」の研究に貢献できるとの知見を得ている。
患者体内中での「陽子線線量の観える化」観測技法の研究

本研究の核となるActivity分布活用線量分布推定法の研究開発は、その手法の考案と知財化(特願2018-141693)を行った。また、提案手法に基づく機能の仕様策定及びデモソフトウェア作成を行った。Activity分布活用線量分布推定法の機能を検証するために、190MeVのMONO及びSOBP50mmの陽子線をポリエチレン及び水ターゲットへ照射実験を行い、Beam ON-LINE PET system(BOLPs)によるActivity分布実測データを取得した。計算による陽子線線量分布データ及び実測により取得したActivity分布データを用いることで、考案したActivity分布活用線量分布推定法を機能化したデモソフトウェアにより深部及び側方の2次元陽子線線量分布から2次元Activity分布データを導出した。更に、生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法の研究開発においは、MLEM(Maximum Likelihood Expectation Maximization)法を活用したActivity分布の高速計算処理機能の仕様策定とデモソフトウェア作成、陽子線線量分布計算データとActivity分布実測データによる機能検証を実施した。高精度陽子線線量計算アルゴリズムの研究開発においては、Activity分布活用線量分布推定に必要である高精度で患者体内中の陽子線線量分布の計算を可能とするGEANT4モンテカルロシミュレーションをベースとするPTSIMの機能を整備した。また、本研究で開発された様々な技術を統合した患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築に向けた仕様を考案した。システムの最終検証用に人体模擬ファントムを整備し、デモ照射実験とデモデータを取得した。本研究では、陽子線治療において患者体内中の組織構成要素である様々な原子核と入射陽子の間に起こる標的原子核反応より生成される種々のポジトロン放出核からの消滅ガンマ線の革新的計測・可視化技術を用いることで、患者体内中での「陽子線線量の観える化」観測技法を研究開発し、腫瘍へ陽子線が的確に照射されていることを確認出来る高精度陽子線治療法の実現を目指している。Activity分布活用線量分布推定法の研究成果として、その手法を知財化することができた。また、Activity分布活用線量分布推定法の機能を搭載したデモソフトウェアの作成及び機能の検証に必要なBOLPsによる複数回の陽子線照射実験の実施と多くのActivity分布実測データ取得を実施できた。生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法については、Activity分布のペンシルビームカーネル化とMLEM法を組み合わせた新たな処理法の有用性を示唆することができた。また、Activity分布活用線量分布推定機能、生成ポジトロン放出核分布高速計算処理機能、高精度陽子線線量計算アルゴリズムを搭載したActivity分布活用線量分布推定システムとBOLPsを統合させた患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築に向けて、人体模擬ファントムによるデモ照射実験とデモデータを取得することができた。現在までの研究の進捗状況としては、機能のデモソフトウェア作成、多くの実験データ取得、デモソフトウェア動作検証など、当初の研究計画よりも早いペースで実施することができている。3年間の研究期間内に、患者体内中での「陽子線線量の観える化」観測技法の研究に関する、Activity分布活用線量分布推定法の研究開発、生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法の研究開発、高精度陽子線線量計算アルゴリズムの研究開発、患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築と総合試験を行う。Activity分布活用線量分布推定法の研究開発においては、考案し知財化した手法を機能化したソフトウェア開発を行う。その機能化ソフトウェアは、患者体表面陽子線照射条件に伴う3次元陽子線線量分布及びActivity分布計算データ及びBOLPsによるActivity分布計測データを活用し、Activity分布計算データと計測データの差分情報から患者体内中での陽子線線量分布を推定する。生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法の研究開発ではMLEM法による計算処理法及び生成核種半減期の時間依存性を考慮したActivity分布形状変化の処理法を確立する。高精度陽子線線量計算アルゴリズムの研究開発では構築済みのPTSIM-GEANT4モンテカルロシミュレーションによる陽子線線量分布算出及び計算精度の検証を実施する。また、本研究で開発された様々な技術を統合した患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築に向けた仕様を完成させる。また、実際の患者への陽子線治療を想定し、人体模擬ファントムを用いた陽子線照射実験を行うことで、治療計画による陽子線線量分布計算データ及びBOLPsによるActivity分布実測データを取得する。

高精度陽子線線量計算アルゴリズムの研究開発においては、Activity分布活用線量分布推定に必要である高精度で患者体内中の陽子線線量分布の計算を可能とするGEANT4モンテカルロシミュレーションをベースとするPTSIMの機能を整備した。また、本研究で開発された様々な技術を統合した患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築に向けた仕様を考案した。システムの最終検証用に人体模擬ファントムを整備し、デモ照射実験とデモデータを取得した。本研究では、陽子線治療において患者体内中の組織構成要素である様々な原子核と入射陽子の間に起こる標的原子核反応より生成される種々のポジトロン放出核からの消滅ガンマ線の革新的計測・可視化技術を用いることで、患者体内中での「陽子線線量の観える化」観測技法を研究開発し、腫瘍へ陽子線が的確に照射されていることを確認出来る高精度陽子線治療法の実現を目指している。Activity分布活用線量分布推定法の研究成果として、その手法を知財化することができた。また、Activity分布活用線量分布推定法の機能を搭載したデモソフトウェアの作成及び機能の検証に必要なBOLPsによる複数回の陽子線照射実験の実施と多くのActivity分布実測データ取得を実施できた。生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法については、Activity分布のペンシルビームカーネル化とMLEM法を組み合わせた新たな処理法の有用性を示唆することができた。また、Activity分布活用線量分布推定機能、生成ポジトロン放出核分布高速計算処理機能、高精度陽子線線量計算アルゴリズムを搭載したActivity分布活用線量分布推定システムとBOLPsを統合させた患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築に向けて、人体模擬ファントムによるデモ照射実験とデモデータを取得することができた。現在までの研究の進捗状況としては、機能のデモソフトウェア作成、多くの実験データ取得、デモソフトウェア動作検証など、当初の研究計画よりも早いペースで実施することができている。3年間の研究期間内に、患者体内中での「陽子線線量の観える化」観測技法の研究に関する、Activity分布活用線量分布推定法の研究開発、生成ポジトロン放出核分布高速計算処理法の研究開発、高精度陽子線線量計算アルゴリズムの研究開発、患者体内中陽子線線量分布観測システム:pDose-BOLPsの構築と総合試験を行う。Activity分布活用線量分布推定法の研究開発においては、考案し知財化した手法を機能化したソフトウェア開発を行う。その機能化
インフルエンザウイルス感染によるIgA分泌機構解明

鼻腔粘膜へインフルエンザウイルス(IAV)が感染すると、粘膜上にウイルス特異的IgA抗体が分泌される。このIgA抗体は感染そのものを阻止するので、ウイルス防御においてとても重要である。そこで本研究ではIgA抗体誘導において、どのような因子が重要か明らかにすることを目的とした。外科的手術により血流を共有させた並体結合マウスを用いた実験より、IAV特異的IgA分泌には鼻粘膜へのウイルス感染の痕跡が重要であることが分かった。更に詳細な解析の結果、IgA分泌には粘膜上の同種抗原が重要な因子であることも明らかにできた。インフルエンザウイルス感染によって鼻粘膜上に誘導される特異的IgA抗体は、ウイルス感染そのものを防御する。よって感染によってどのようにウイルス特異的IgA抗体が誘導されるのかを理解することは、効果的なワクチン開発に不可欠である。本研究では並体結合マウス(外科的に2匹のマウスを結合させて血流を共有させたマウス)を用いた解析により、ウイルス感染によるIgA抗体応答の誘導メカニズムを明らかにすることを目的とした。マウスに非致死量のインフルエンザウイルス(A/PR8)を感染させ、もう一方のマウスには炎症誘導物質(IL-1β、LPS、CTB+LPS)または抗原(HA)を投与した。同時にそれらマウスを並体結合し、結合から4週後に鼻腔洗浄液中のウイルス特異的なIgA抗体レベルをELISA法により測定した。その結果、抗原を投与した場合のみウイルス特異的なIgA抗体が並体結合マウス間で同レベル分泌されていた。よって特異的IgA抗体分泌には粘膜における抗原が重要であることが示唆された。次に、感染マウス由来の免疫細胞と抗原(HA)投与マウス由来の免疫細胞のどちらが重要か確かめる実験を行った。感染マウスから脾細胞を採取し、γ線処理(免疫細胞が破壊された)マウスに移入した。さらに抗原を鼻粘膜に投与した。その結果、有意なレベルのIgA抗体が検出された。よってIgA抗体が分泌には、感染マウス由来の免疫細胞が重要であることが示唆された。さらにどの免疫細胞が重要かを確かめる実験を行った。感染マウス脾細胞からB細胞、樹状細胞、CD4T細胞、CD8T細胞を精製し、B細胞とそれぞれの細胞を組み合わせてγ線処理マウスに移入し抗原を投与した。その結果、B細胞とCD4T細胞を移入した場合のみ有意にIgA抗体が検出された。よって、特異的IgA抗体分泌にはCD4T細胞が重要であることが示唆された。[目的]鼻腔粘膜へインフルエンザウイルス(IAV)が感染すると、粘膜上にIAV特異的IgA抗体が分泌される。このIgA抗体は感染そのものを阻止するので、IAV防御においてとても重要である。[結果:IgA誘導には同種抗原が重要]まず並体結合マウス(外科的に2匹のマウスを結合させて血流を共有させたマウス)を用いた解析を行った。このマウスモデルを用いることで、全身性免疫(血流を循環する)と局所性免疫(血流を循環しない)を区別して解析できる。IAV感染マウスと非感染マウスを並体結合させた実験では、感染マウスのみ特異的IgAが鼻腔粘膜上で検出された。よってIgA誘導のためには粘膜での感染履歴が重要であることが分かった。つづいて、感染履歴のない非感染並体結合マウスにどのような因子を投与したらIgAが誘導されるか解析を行った。その結果、LPSなどの炎症誘導物質の経鼻投与では有意なIgAレベルは検出できなかった。一方で同種抗原(HA)を経鼻投与した場合では感染マウスと同レベルのIgAが検出された。このことは、感染マウス(ドナー)の脾細胞を非感染マウス(レシピエント)に移入し、HAを経鼻投与する実験系においても再現できた。よってIgA誘導には粘膜における同種抗原が重要であることが分かった。同様の現象がヒト免疫細胞でも見られるかも検証した。健常人末梢血からリンパ球を精製し、それを、ヒト化マウスモデルとしてよく用いられるNOGマウス(レシピエント)に移入して抗原(ヒト用ワクチン)を経鼻投与した。その結果、非投与群に比べ抗原投与群で有意にIgAが検出された。[意義]抗原投与によるIgA誘導メカニズムをさらに解析することで、ワクチン開発にも貢献できるような知見が得られると考えられる。当該年度の一番の目的は、IgA抗体分泌に重要な因子を見つけることであった。当初の計画通り、炎症誘導物質を検討したが有意な結果は得られなかった。しかし予想外に、抗原投与だけで有意なIgA抗体が検出された。このことからIgA抗体分泌には抗原が重要であることを明らかに出来た。

またIgA抗体分泌に重要な細胞として、強力な抗原提示細胞である樹状細胞に注目していた。しかし予想外に樹状細胞ではなくCD4T細胞がIgA抗体分泌に重要であることが分かった。以上の結果は、インフルエンザウイルス感染によるIgA分泌機構を明らかにするうえで大きな成果と考えらえる。よって本研究はおおむね順調に進展していると評価した。感染免疫1.IgA抗体誘導に重要なケモカインXの同定と応用:当初の計画通りIgA抗体誘導に重要なケモカインX同定とそれを経鼻ワクチンに応用することを目指す。IgA抗体に重要な細胞はCD4T細胞であったので、文献からCD4T細胞に関連するケモカインを調べそれらがIgA抗体誘導に重要か確認する。具体的には、感染マウスから脾細胞を採取し、γ線処理マウスに移入し抗原(HA)を投与する。細胞移入からDay1, Day3, Day5, Day7, Day14で鼻腔粘膜もしくはNALTを回収し、組織中で上昇しているケモカインをリアルタイムPCRで解析する。有意に検出できたケモカインに関して、さらに定量ELISAで解析を行う。有意なケモカインを同定できたら経鼻ワクチンと併用し、アジュバントとして有効か検討する。2.ヒトリンパ球での解析:これまでマウスで明らかにしてきたことを、ヒトの細胞でも同様の現象が起こるか解析する。具体的には健常人から末梢血を採取しヒトリンパ球を精製する。それを超免疫不全マウス(NOGマウス)に移入し抗原(ワクチン)を投与する。細胞移入から2週間後に鼻腔洗浄液を回収し、特異的なIgA抗体が誘導されるか解析を行う。すでに倫理委員会に実験計画書を提出しており、承認されている(承認番号:26-54-1009)。3.自然免疫系との関連性:これまで明らかにしてきたことに関して、自然免疫系との関連性を解析する。具体的にはCRISPR-Cas9システムを用いて、Myd88ノックアウトBalb/cマウスを作製する。ノックアウトマウス作製のための材料や設備は整っている。Myd88ノックアウトマウスにインフルエンザウイルス(A/PR8)を感染させ、4週間後脾細胞を採取する。それを野生型マウスに移入し抗原を投与する。その2週間後、鼻腔洗浄液を回収し特異的IgA抗体レベルを解析する。
HIV感染によるCD4陽性T細胞減少機序の分子免疫学的解析

HIV感染患者の免疫不全はCD4陽性T細胞の消失が主因と考えられている。果して、CD4陽性の細胞がいかなる機序によって減少するのかを調べる目的で、ヒトにおいて、ウイルス感染細胞を融解すると考えられているキラ-T細胞並びにNK細胞の細胞融解機序を解析した。NKと標的との結合に関する分子として、NCAMの同定を行い、血液幹細胞をはじめとするNCAMを表現した細胞がNKの標的となることを明らかにした。また、キラ-活性の増強機序に関しては、IL-2Rβを介するシグナルの重要性を明らかにし、in vivoにおける非特異的なキラ-活性増強機序を考察する手段を得た。また、CD4陽性細胞を融解すると考えられるT細胞で、CD8細胞の産出する細胞融解物質パ-フォリンを示標として解析するための初段として、パ-フォリンに対するモノクロ-ナル抗体の作製に成功した。得られたモノクロ-ナル抗体を用いて、NK細胞に加えてCD8陽性細胞群の特定の亜群のみが標的融解物質を産出していることを明らかにした。そして、パ-フォリンの合成能が、IL-2レセプタ-を介したシグナルによって高まり、IL-2によってキラ-細胞が活性化される細胞内の機序を明らかにした。また、マウスのCD4の解析を通じて、ヒトCD4のシグナル伝達機序に関する知見を得るため、CD4のエピト-プのうち、今まで得られなかった部分に対するモノクロ-ナル抗体を作製することに成功し、米国のLittman博士の協力を得て、CD4の機能に関与するエピト-プの解析を行っている。
米英独における評価の高い歴史授業の収集・分析とそのデータベース化

本調査を通じて,これまで日本の歴史教育研究で分析・検討されていた外国の歴史カリキュラム,教育プログラム等のいくつかについて,授業の事実に基づいた考察が可能となり,論文や学会等で諸報告がなされた。また,日本の歴史教育研究者および歴史教師が諸外国の実際の歴史授業に接することも容易になった。本調査で作成した資料は,Web等を通じて教育センターの講習会や大学の講義等で活用されつある。本調査が,日本の歴史授業の「鎖国」的な状態を解消する端緒になることを期待したい。平成24年度は,評価の高いカリキュラムや教科書に基づいた授業を,および評価の高い歴史授業者の授業について,実践の記録,収集を行い,それを公表するためのWebページを開設した。具体的には,アメリカにおいて3校(中学校・高等学校)4名の教師を対象に,21時間分の授業,イギリスにおいて6校(高等学校)6名の教師を対象に,17時間分の授業,ドイツにおいて4校(中学校・高等学校)4名の教師を対象に17時間分の授業を記録,収集した。さらに,その知見を生かして,学会発表及び論文作成等を行った。現在は,今年度の訪問先を選定するとともに,24年度の分析結果をWebに公開する作業を行っている。平成25年度は平成26年度に引き続き,評価の高いカリキュラムや教科書に基づいた授業,または評価の高い歴史授業者の授業について,実践の記録・収集を行い,それを整理した。具体的には,アメリカにおいて4校(中学校・高等学校),イギリスにおいて2校,ドイツにおいて4校において授業を記録,収集した。そして,採取した授業のうち,Web公開の許可を得ることができた実践について,本科研のWebページに掲載した。また,収集した授業から得た知見を生かして論文作成等を行ったり,記録した授業を大学の講義や教員研修に使用したりした。現在は,今年度の訪問先を選定するとともに,未掲載の取材授業のWeb公開にむけた作業を急いでいる。日本の歴史教育研究においては諸外国の授業実践に着目した研究が乏しい。また,日本の歴史教師は諸外国で行われている歴史実践についての情報をほとんど持たない。こういった状況を改善するために,諸外国の優れた歴史授業実践を収集・分析し,広く公開することがこの調査の目的であり,具体的には,次の二つの取組を行った。1米英独を中心に,注目すべきカリキュラム,教育プログラム,教科書等を背景にした歴史授業実践,または各国で優秀な実践者として評価されている歴史教師の授業実践をビデオ等に記録し,授業者への聞き取り等の資料収集を行う。2収集した授業実践は,第三者による利用と批判的検討を可能とするために,日本語による書き起こしを作成し,聞き取りや授業資料等の諸情報とともに整理・分析して,Webに公開する。さらに,授業者から,授業の録画映像の公開許諾を得られたものについては,これも公開する。また,授業者の意向により授業記録がWebに公開ができなかった実践についても,論文や学会発表の資料等を通してその成果を公開する。なお,本調査は本年度で終了するが,これからも様々な機会を通じて得られた評価の高い諸外国の歴史授業実践の記録をWebに追加掲載していきたい。Web(http://www.nier.go.jp/history_lessons/)を是非,多くの歴史教育研究者および歴史教師の方々に継続的にご覧頂きたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。歴史教育26年度が最終年度であるため、記入しない。米英独の優れた歴史授業の収集が着実に進行しており,データベースとして公開するためのWEBページも開設できた。米英独の優れた歴史授業の収集が着実に進行しており,データベースとして公開するためのWebページも開設できた。ただし,採取した授業の整理等が多少遅れ気味であるため,最終年度に向けて急ぐ必要がある。(1)米・英・独で,それぞれ年2回の海外調査を実施し,授業を収集する。(2)収集した授業実践の分析・類型化,データベース化。(3)学会誌等への成果公表,データベースの宣伝,学会での発表。1米・英・独での海外調査を実施し,授業を収集する。2収集した授業実践の分析・類型化,データベース化をおこなう。特に,この作業が遅れ気味なので,拍車をかける。3学会誌等への成果公表,データベースの宣伝,学会での発表を行う。特に,Web公開が許可されなかった収集事例については,2月の兵庫教育大学で行われる社会系教科教育学会でのラウンドテーブル等を利用した公開を考えている。

26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度計画したにも関わらず,先方の学校の都合等で実施できなかった調査を実施するために使用する。1翻訳等にかかる代金が予定より少し安くなったため,残金が生じた。1翻訳代金等の支出を計画的に行い,無駄の無い調査を行いたい。
産業廃棄物の有効利用を目的とした路床構築法に関する実験的研究

本研究では,現在道路事業を中心として検討が進められている『供用性能が高く,かつ,長寿命化が図れるアスファルトコンクリート舗装』に必要な「支持力の大きな路床」を効率的に構築するための一つの方策として,路上混合方式により軟弱な在来路床土に予めセメントを付着させた砕石(セメント付着砕石)と自硬性を有する産業廃棄物(フライアッシュ)とを混ぜ合わせることを提案し,この方法による路床改善効果を確かめる目的で,室内試験において種々の配合条件のもとで作製した混合材料の締固め,支持力(CBR),強度(一軸圧縮強さ)および変形(体積収縮,膨張)の各特性について詳細に調べてみることにした。以下に,研究期間である平成6年度に得られた主要な結果を列挙する。(1)セメント付着砕石の使用により,路上混合方式の短所とされている「混合むら」の発生をかなり低減することができるようになると判断される。また,フライアッシュの混入は粉塵抑制の面では不利な要件となるが,一方において,安定材の添加量を減じるという経済的効果が見込めるようになる。(2)CBR試験における吸水膨張量ならびに一軸圧縮試験における体積膨張量(水中養生時)の測定結果をみるかぎり,セメント付着砕石およびフライアッシュを混合した改良路床に地下水が長期間作用しても,路床が舗装を押し上げて路面の平坦性を損なう恐れは極めて少ないと推断される。(3)空気中3日,水中4日の養生期間を経た混合材料のCBRと一軸圧縮強さquとの間には直線関係が成立し,CBRはquの4.54.8倍の大きさに相当する。したがって,本研究で取り扱った改良路床に対しては「路床材」としての観点より,品質規格の評価にあたっては支持力のみならず強度も考慮に含める必要があるものと考えられる。
自殺者における心理学的剖検と遺族のケアについて

自殺予防の観点から,心理学的剖検は自死遺族のケアも同時に行えるため,その意義は極めて大きい。本研究では,当院が精神科救急医療・身体救急医療の双方を有するために心理学的剖検および遣族ケアの需要もあると考え,自殺者の心理学的剖検と遺族のケアを行うことを目的とし研究を開始した。横浜市立大学附属市民総合医療センターの高度救命救急センターに自殺企図にて搬送され,亡くなられた方のご遺族に「遺族へのパンフレット」をスタッフより渡した。パンフレットには,通常の悲嘆反応と複雑性悲嘆反応の差が記されており,精神科医が相談に応じる体制を説明し相談先も載せた。本研究期間中の搬送された自殺者総数は34名で,うちご遺族自身から相談があったのは5例であった。5例中2例は正常な悲嘆反応であり相談のみの対応となった。残りの3例は治療が必要であると判断され,主に不眠と自責感が強く罪業感も目立った。自死された方の生前の症状に同化する傾向も認めた。悲嘆は長期にわたり複雑性悲嘆を呈した。記念日には動揺し易く,イベントに対する対処能力が低下しており,容易に不安・混乱に陥り短絡的となり,希死念慮を抱く場合もあった。この上うに自死遺族への精神科的ケアの重要性があらためて専門的にも確認きれた。一方でご遺族自身からの相談が少なく,利用経路の問題も考えられたため,H19年度はこちらよりご遺族に電話連絡をさせて頂いた。連絡先が判明したご遺族の内,趣旨への同意を頂いた5例ともケアの必要性を感じていなかった。回避や否認の傾向も窺われた。結論として第一に,自死遺族ケア利用への障害の高さと病院で行うことへの限界が浮き彫りにされた。第二には,複雑性悲嘆を呈する自死遺族もおり,その治療は困難で長期化する場合があり,改めて精神科医療の重要性も示された。微々たる例数ではあるが,自死遺族ケアの在り方および方法への示唆となりうると考えられた。自殺予防の観点から,自殺の背景を研究する心理学的剖検の重要性が注目されている。心理学的剖検では、自殺遺族のこころのケアも同時に行えるため、その意義は極めて大きい。本研究では、当院が精神科救急医療・身体救急医療の双方を有するために心理学的剖検および遺族ケアの需要もあると考え,自殺者の心理学的剖検と遺族のケアを行うことを目的とし研究を開始した。横浜市立大学附属市民総合医療センターの高度救命救急センターに自殺企図にて搬送され,亡くなられた方のご遺族に「遺族へのパンフレット」をスタッフより渡すこととした.パンフレットには,通常の悲嘆反応と複雑性悲嘆反応の差が記されており,精神科医が相談に応じる体制を説明し,相談先も載せた.その結果,ご遺族自身からの連絡はこの1年間で3例あった.3例共に複雑性悲観を示し,相談の結果治療が必要であると判断され,治療継続となっている.主に不眠と自責感が強く,子供を亡くされたご遺族の方は後を追いたいという気持ちのあまり,希死念慮を持たれていた.希死念慮とまでいかなくても,生前の自死された方の症状をなぞらえて自分に罰を与えるかのように,同化した症状を呈する傾向も認めた.このように自殺遺族への精神科的ケアの重要性があらためて専門的にも確認された.現在本活動について報告の準備を進めている.しかし,連絡を待つ形では今年度のようにあまりにも例数が少ないため,次年度はこちらから時期をみて連絡を行う予定である.また,パンフレットの配布率も低いことが判明したため,スタッフに再度協力を依頼していく予定でもある.また,欧州自殺予防学会に参加し,研究の手法も含め最新の知見に触れ,国際的交流も行え非常に有意義であらた.相談ケースをデータベース化するため,解析機器およびソフトウェアを購入した.今年度は例数を増やすことに努め,遺族ケアの手法を見出すようにしていく予定である.自殺予防の観点から,心理学的剖検は自死遺族のケアも同時に行えるため,その意義は極めて大きい。

一方でご遺族自身からの相談が少なく,利用経路の問題も考えられたため,H19年度はこちらよりご遺族に電話連絡をさせて頂いた。連絡先が判明したご遺族の内,趣旨への同意を頂いた5例ともケアの必要性を感じていなかった。回避や否認の傾向も窺われた。結論として第一に,自死遺族ケア利用への障害の高さと病院で行うことへの限界が浮き彫りにされた。第二には,複雑性悲嘆を呈する自死遺族もおり,その治療は困難で長期化する場合があり,改めて精神科医療の重要性も示された。微々たる例数ではあるが,自死遺族ケアの在り方および方法への示唆となりうると考えられた。
甲状腺ホルモン不応症の発症機序・変異受容体のドシナントネガティブ作用機構の解明

甲状腺ホルモン不応症(RTH)の発症機序として、変異T3受容体(TR)が正常TRの機能を阻害する、いわゆるdominant negative作用が考えられており、この作用には変異TRの二量体形成能の保存が必要であることが報告されている。今回我々は、ホルモン結合能が欠如しているにもかかわらずdominant negative作用を示さない2種の変異TR、R316Hとb^<^>422(427iPSRD)について、そのホモ二量体およびヘテロ二量体形成能をgel mobility shift assayにて検討した。Assayに用いた正常および変異TRとRXRaはbaculovirus-insect cell(Sf9 cell)システムで発現させて調製した。R316Hは一人の重症な患者と、同じ家系の二人の正常者に発見されており、dominant negative作用を持たない。b^<^>422は4アミノ酸残基の挿入によって人工的に二量体形成領域を破壊した変異TRである。R316Hはホモ二量体およびRXRaとのヘテロ二量体を正常TRと同等に形成したが、b^<^>422ではホモ二量体、ヘテロ二量体のいずれの形成も著しく低下していた。R316HがT3を結合せず、かつホモ二量体、ヘテロ二量体を形成して標的DNAに結合できるにもかかわらずdominant negative作用を有さないことは、変異受容体による二量体の形成がdominant negative作用の発現に必要ではあっても十分ではないことを示すものである。甲状腺ホルモン受容体の転写活性化機構として従来のヘテロ二量体形成以外に基本転写因子との相互作用の存在を示唆するものと考えられる。
フリーズドライ体細胞および精子を用いたウシ生産技術の確立

本研究では、新たなバイオリソース保存技術を提案することを目的として、ウシ細胞(体細胞および精子)における凍結乾燥保存技術を確立し、凍結乾燥細胞由来の産子生産を目指した。その結果、凍結乾燥後-30°Cで保存した場合、長期間DNAを保存し、凍結乾燥細胞を用いた核移植および凍結乾燥精子を用いた顕微授精によって安定的に胚盤胞を作出することが可能となった。しかし、作出した胚盤胞の受胚雌牛への胚移植では、産子生産には至らなかった。本研究では、ウシFD体細胞のDNA損傷細胞数を調査し、フリーズドライ(以下、FD)細胞の核移植を実施した。次に、FD後に細胞内に存在するタンパク質の同定をおこなった。最後に卵丘卵母細胞複合体の形態の違いが核移植後の発生能に与える影響を検討した。その結果、DNA損傷細胞の割合は、FD直後では2%、FD後1年では10%となった。FD後に存在するタンパク質はビメンチン等の細胞骨格タンパク質であった。培養細胞およびFD直後、FD後1週間、1ヶ月間および1年間保存した細胞を用いた核移植での卵割率はそれぞれ50、52、50、50、49%、胚盤胞発生率は25、15、17、16、15%となり、それぞれ有意な差は認められなかった。卵丘細胞が緊密に付着および膨潤した卵丘卵母細胞複合体それぞれの核移植後の卵割率は51および90%、胚盤胞発生率は15および40%となり、卵丘細胞が膨潤した卵丘卵母細胞複合体が有意に高い割合となった。以上本研究より、FD体細胞及び精子を用いて効率的に胚盤胞を作出する技術を開発することが可能となった。特に、体細胞では1年間の保存期間でも作出効率が低下しないことから、FD後の体細胞の核DNAが長期間その発生能を維持できることが明らかとなった。また、FD後に発現量が増加するタンパク質は細胞骨格系のものであることが判明し、これらの利用による常温保存の可能性が示唆された。体細胞では、フリーズドライ(以下、FD)緩衝液の種類、および体外発生培養液の交換時期が、核移植後の発生に与える影響を検討した。さらに、初期発生にかかわる遺伝子の発現量を核移植(NT)および体外受精(IVF)胚で比較した。その結果、m-EGTAおよびNa-EGTAで調整したFD細胞のDNA損傷細胞割合は、それぞれ12および24%となり有意な差が認められた(P<0.05)。核移植後の胚盤胞発生率は20および0%となり、有意な差は認められなかったがNa-EGTAでは胚盤胞作出には至らなかった。さらに、Day2およびDay3区の胚盤胞発生率には有意な差は認められなかったものの(20% vs. 25%)、Day3区では胚盤胞の質の向上が認められた。また、NTおよびIVF胚のOct4の発現量には有意な差は認められなかったが、IFN-tauにおいてNTがIVFに比べ有意に低い値を示した。精子では、FD後の精子DNAの損傷を抑制する条件についての検討をおこなった。細胞膜透過液で1時間処理した後に10 mM DTT添加細胞膜透過液で30分間処理し、さらに4 mMジヨードサリチル酸リチウム添加細胞膜透過液で15分間処理することで、細胞膜の強固な精子でもコメットアッセイによる評価が可能となった。パーコール密度勾配遠心法によって回収した精子ではDNA損傷は観察されず、通常の遠心法では16.7%の損傷が確認された。Na-EGTAでは損傷は観察されず、m-EGTAでは1.67%の損傷が確認された緩慢凍結では損傷は観察されず、液体窒素による急速凍結では1.7%の損傷が確認された。GSH処理では損傷は観察されず、DTT処理では25%の損傷が確認された。以上より、ウシ融解精子をパーコール密度勾配遠心法によって洗浄し、GSHによる前処理後Na-EGTAに浮遊させ、緩慢に凍結し乾燥することでDNA損傷を抑制した凍結乾燥精子を調整することが可能となった。さらに、これらのFD精子を顕微授精することで8.5%の胚盤胞期胚発生率が認められた。精子および体細胞でフリーズドライ後のDNA損傷が認められない技術を開発しており、恒常的に胚の作出が可能となっている。【目的】我々は、絶滅が危惧される褐毛和種高知系の遺伝資源保存を目的として、凍結乾燥と核移植技術を組み合わせたクローン作出を試みている。これまでの研究により、凍結乾燥後ー30°Cで保存したウシ体細胞は長期保存してもDNA損傷が少なく、核移植後の胚盤胞作出に成功している。しかし、ウシ体細胞の凍結乾燥保存を実用化するためには室温で長期間保存することが必要だと考えられる。そこで本研究では、凍結乾燥後の保存温度および期間が細胞のDNA損傷に与える影響を調査した。さらに、凍結乾燥緩衝液への不凍たんぱく質(Antifreeze protein、以下AFP)の添加が細胞の保存性に与える効果を検討した。【材料と方法】細胞は褐毛和種高知系の耳片から樹立した線維芽細胞を供試し、DNA損傷細胞の割合はアルカリコメットアッセイ法により評価した。実験1:凍結乾燥後に細胞は0、10、20、および30°Cで5日間保存をした。さらに、凍結乾燥直後、20°Cで3、4、5、6および7日間保存した。

実験2:凍結乾燥緩衝液にAFPI、AFPIIIをそれぞれ0、0.5、1、10および50%添加し、凍結乾燥後5日間20°Cで保存した。【結果】実験1:凍結乾燥後、保存温度の上昇にしたがってDNA損傷細胞の割合も増加し、10°Cと20°Cの間に有意な差が認められた。(p<0.05)。20°Cで保存した場合、3日目まではDNA損傷の増加は認められないが4日目以降に増加した。実験2:無添加区と比較して、0.5および1%AFPI添加区、および0.5%AFPIII添加区でDNA損傷が有意に低下した(p<0.05)。以上本研究より、凍結乾燥後のウシ体細胞は保存温度が上昇し保存期間が延長することでDNA損傷が増加することが明らかとなった。さらに、AFPIおよびAFPIIIの凍結乾燥緩衝液への添加によって室温保存の可能性が示唆された。本研究では、新たなバイオリソース保存技術を提案することを目的として、ウシ細胞(体細胞および精子)における凍結乾燥保存技術を確立し、凍結乾燥細胞由来の産子生産を目指した。その結果、凍結乾燥後-30°Cで保存した場合、長期間DNAを保存し、凍結乾燥細胞を用いた核移植および凍結乾燥精子を用いた顕微授精によって安定的に胚盤胞を作出することが可能となった。しかし、作出した胚盤胞の受胚雌牛への胚移植では、産子生産には至らなかった。本年度はフリーズドライ体細胞および精子による効率的な胚盤胞作出技術の開発に重点を置いたために、胚の解析、胚移植試験、および自動化技術の開発がやや予定よりも遅れている。しかし、本年度の試験によって効率的な胚作成技術が開発されたために、今後、研究計画の遂行が加速することが見込まれる。フリーズドライ精子及びたい細胞由来の胚盤胞期胚を胚移植し、その体外発生能を評価する。また実用化に向けて、細胞の注入操作の自動化技術を開発する。28年度が最終年度であるため、記入しない。家畜繁殖学1細胞FD技術の最適化の検討:前年度に引き続き、長期常温保存を実現するFD技術を開発する。2FD細胞由来胚の効率的な作出法の検討:卵子へ体細胞および精子を注入する制御システムの構成を最適化し、作製したデバイスを用いてシステムを構築する。3FD細胞由来のウシ胚の評価:高品質胚の評価法を開発し、FD体細胞による核移植胚およびFD精子による顕微授精胚における正常発生胚の作出条件を検討し、胚移植前の胚の選抜に利用する。4FD細胞由来のウシ胚の移植・産子の評価:核移植および顕微授精で作出した胚盤胞を随時受胚雌へ移植する。核移植後の初期化機構は未だ解明されておらず、体細胞核移植由来の産子生産は低率である。移植した胚に対する産子の割合は一般的な動物では23%であるが、ウシでは520%と他の動物よりもクローン生産効率が高い。しかし、FD細胞をドナー細胞として用いることでDNAへの損傷が少なからず存在し、またクローン作出に必要な核の初期化が卵細胞質内で十分に行われないことも予想され、これらのことが原因で産子に結びつかない可能性が考えられる。そこで本年度は特に3の正常性の評価に重点を置き、正常な産子の生産を目指す。本年度得られた成果を、最終年度に論文投稿を予定したため。胚移植に供試する受胚牛が、計画的に準備できずに予定していた回収の移植試験が実施できなかったため論文投稿における校閲および投稿費に使用する。