hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固液界面のナノ反応解析のための単一分子感度・ナノメータ空間分解能のラマン分光法

銀ナノ粒子について、手法の汎用性拡大のために、p-安息香酸を用いてプロトン解離の制御により、静電的相互作用とともに、van der Waals力による近接状態形成に成功した。(2)ギャップモードに関して、これまでのナノ粒子等の局在プラズモンを利用したSERS研究では大きな増強が得られていない白金や鉄系遷移金属系に適用し、銀・金系と同様に10^8-10^9の巨大増強を得ることに成功した。(3)ギャップモードプラズモンと伝搬性プラズモンとの複合に関して、詳細な実験と理論計算により、1分子感度ナノラマンイメージングの実現性を確かめた。(4)プローブ形成に関して、再現性よく30-50 nm径の銀ナノ粒子をプローブチップ先端に形成する手法を開発し、ギャップモードにより10^5-10^6倍のチップ増強ラマン測定に成功した。新規プローブ形成法として、収束イオンビーム加工を開始し、AFMカンチレバー先端に20 nm径の金属チップ形成に成功し、さらに先鋭化する見通しを得た。[2]全期間を通して、固液界面のナノラマンイメージングの実現のために、(1)金属ナノ粒子を、分析目的分子との相互作用を利用した近接安定化の手法を開発し、色素分子、DNA塩基、チオール系化学種の捕捉と状態分析に成功した。(2)ナノラマンイメージング用プローブの問題点を改善し、再現性よく1個のナノ粒子をチップ先端に形成する手法を開発した。入射・集光系の高効率化により、信号検出効率を約100倍改善できた。今後の固液界面の局所反応解析のために着実な研究成果が得られた。「1分子感度ラマン分光に関する溶液中金属ナノ粒子近接化法の確立」が極めて順調に進み、溶液中の種々の化学種の金属ナノ粒子との静電的及び化学的相互作用によるナノギャップへの捕捉と、1分子感度ラマン分光による状態分析が実現できるようになった。このため、色素だけでなく、DNA塩基や、軽金属イオン、重金属イオンなどの溶液中での存在状態や金属表面との相互作用が、この手法により明らかになりつつある。また、「金属ナノ粒子をプローブとして利用するナノラマンイメージング」についても、最適形状・誘電体チップの影響など詳細が明らかになってきた。金属ナノ粒子のチップへの固定法についても、実験的な検討を進め順調な進展が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.1分子感度ラマン分光に関する溶液中金属ナノ粒子近接化法の確立溶液中のより幅広い化学種に対して、金属ナノ粒子近接化による1分子感度ラマン分光を実現し、基礎化学のみならず応用展開を図る。例えば、サイズや電荷の異なる金属イオンやハロゲン化物イオン等の水溶液中での水和構造・イオン間相互作用について、この手法での検討を行う。水和によるイオン電荷の遮蔽や、第1水和構造の物理化学的意味をあきらかにする。また、金属ナノ粒子表面にチオール化した生体分子を固定し、重金属イオンと生体分子の相互作用の1分子感度での解析を通して、自然水中の重金属の生体への影響について、詳しい知見を得る。2.金属ナノ粒子をプローブとして用いるナノラマンイメージングAFMチップ先端への1個の金属ナノ粒子固定法について、(a)チップの表面修飾法、タッピング条件の精密制御などを行い、金属ナノ粒子の安定な固定条件について研究を進める。
三次元培養皮膚におけるエクリン汗腺の再現

我々の研究目的は、皮膚再生医療を推進する三次元培養皮膚の作製法を改良することである。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し報告している。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。しかしながら未だ三次元培養皮膚内での付属器の再生には至っておらず、今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、表皮及び真皮内に付属器(汗腺、毛包、脂腺)を再現することは非常に重要な課題である。我々は三次元培養皮膚内にエクリン汗腺の構築(表皮内汗管、真皮内汗管、真皮内汗腺分泌部)を最終目的とする。これまで、臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養し、エクリン汗腺由来細胞の性質の検討をした。真皮内汗管細胞に対して増殖促進、抑制する因子の条件を検討し、エクリン汗腺由来細胞の増殖能、また、エクリン汗腺由来の他分化能について、現在検討中である。我々はこれまで角化細胞の無血清培養法の開発、培養表皮シート自己移植の有効性の検討および保存液開発に伴うセンター化の確立を達成している。これら培養表皮シート移植法の開発と並行して、三次元培養皮膚作製法の確立、臨床応用における有用性の検討の結果、三次元培養皮膚は培養表皮シートと比較して生着性に優れていることを見いだしている。今回我々が提案するこの研究の最大の目的は、既存の培養法を使用して三次元培養皮膚を作製するのみならず、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる品質の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すものである。我々は、皮膚再生医療を推進する目的のために三次元培養皮膚の作製法を改良することを目的とする。まず、二次元培養系においてNCL-SG3細胞による汗管(導管)構造への分化誘導を試みた。最適の増殖培養環境について培養液や添加因子、さらには培養条件を検討した。細胞成長因子の測定、サイトカイン、細胞成長因子刺激時の遺伝子発現などを指標とする。この結果を踏まえて臨床検体より得られたエクリン汗腺細胞を用いた同様の検討を行い、二次元培養系における汗管構造の構築を試みている。次に、二次元培養系での汗管構造の構築に成功したのち、LSE内(表皮内)での汗管構造構築を試みている。この時にNCL-SG3細胞及びエクリン汗腺細胞(真皮内導管細胞・腺房細胞)を用いて、I型コラーゲンゲル内に包埋培養を行い、これをLSE内に挿入し腺管形成の誘導を試みている。具体的には、(1)エクリン汗腺由来細胞の増殖能の検討:継代数を同じにしたNCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞を6ウェルプレートに同じ細胞数で播種し、培養4-7日後に細胞数を測定する。細胞数の測定結果をもって増殖能が高いか低いかを確認する。また、同じ継代数の細胞をシャーレに播種し、コンフルエントになった時点で継代を繰り返し、何回継代可能かについて検討することで長期的な細胞増殖能を推定する。(2)エクリン汗腺由来の他分化能についての検討:NCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞をそれぞれ培養し、分化誘導培地に変更しその形態的変化を解析する。具体的には、角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンなど)を免疫染色することにより角化について検討する。脂肪細胞誘導培地に変更後、脂肪染色にて陽性細胞が得られるかについて検討する。骨分化誘導培地に変更し、アルカリフォスファターゼ染色陽性の骨細胞へ分化する能力を維持しているか検討する平成30年度までに検討不十分な事項について再検討しつつ研究を遂行する。(1)臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養について最適条件かどうか再検討する。(2)エクリン汗腺由来細胞の性質の再検討する。具体的には、サイトカイン・細胞成長因子刺激後経時的にRNAを回収し、主にサイトカイン・細胞成長因子の遺伝子発現についてmicro array解析、real-time PCR法にて比較検討する。(3)エクリン汗腺由来細胞の増殖能の再検討する。具体的には、継代数を同じにしたNCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞を細胞数の測定結果をもって増殖能が高いかを再確認する。(4)エクリン汗腺由来の他分化能についての検討する。具体的には、NCL-SG3細胞、真皮内汗管細胞・腺房細胞をそれぞれ培養し、分化誘導培地に変更しその形態的変化を再解析する。角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンなど)を免疫染色することにより角化についも再検討する。我々の研究目的は、三次元培養皮膚内にエクリン汗腺の構築(表皮内汗管、真皮内汗管、真皮内汗腺分泌部)を最終目的とする。今現在、三次元培養皮膚内での付属器の再生には至っておらず、今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、表皮及び真皮内に付属器(汗腺、毛包、脂腺)を再現することは非常に重要な課題である。エクリン汗腺由来細胞(NCL-SG3細胞、臨床材料より分離した真皮内汗管細胞・腺房細胞)が幹細胞としての増殖能力を有しているかについて明らかにする。

また、角化細胞、脂肪細胞、骨分化誘導培地などに変更し、多分化能を有するかについて検討する。分離培養された真皮内汗管細胞・腺房細胞を長期間培養し、その培養条件を適切な時期に変更し、さらに細胞成長因子などを添加する方法や、conditioned mediumを用いる方法、さらには角化細胞あるいは線維芽細胞との供培養の系を用いることで表皮内汗管、真皮内汗管へ分化誘導する系を確立する。これら汗腺細胞とI型コラーゲンゲルを用いて真皮成分の再構築を行い、真皮内で汗管・腺房への分化を誘導できるか検討する。作成された培養皮膚が正常皮膚とどの程度近似しているかについては形態学的、免疫組織学的な確認を試みた。平成29年度は、次の2つの項目について検討した。(1)臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養(2)エクリン汗腺由来細胞の性質の検討、である。Biedermannらの手法を基づき、手術時に得られた真皮内汗管細胞・腺房細胞から分離培養を試みた。そして、エクリン汗腺由来細胞をそれぞれ培養し、分子生物学的および免疫学的検討(ELISA法、micro array解析、real-time PCR法など)を用いて検討を試みた。(1)臨床検体からの真皮内導管細胞・腺房細胞の分離培養Biedermannらの手法を基に手術時に得られた真皮内汗管細胞・腺房細胞を生理食塩水にて洗浄し、ハサミやメスを用いて細切する。滅菌三角フラスコに移し、0.1%コラゲナーゼ/ダルベッコ変法MEM培地を注入し、37°Cにて60-90分反応させる。この際に時々撹拌し、コラゲナーゼが十分に作用するようにする。反応液を遠心管に移し、1000回転にて5分間遠心する。上清を除去し細胞を10%FCS添加DMEMにて懸濁しシャーレに播種、37°C5%CO2にて培養をする。付着した細胞が増殖しコンフルエントとなった時点で継代を繰り返し、適宜凍結保存した。コラゲナーゼの反応の条件など、ほぼ条件が確立しつつある。(2)エクリン汗腺由来細胞の性質の検討エクリン汗腺由来細胞をそれぞれ培養し、経時的に培養上清を回収する。培養上清中のサイトカイン・細胞成長因子についてELISA法を用いて、解析している。さらに真皮内汗管細胞に対して増殖促進、抑制する因子を数種類選び(bFGF, TGF-beta, PDGFなど)、培養液に添加し、刺激後のサイトカイン・細胞成長因子についてもELISA法を用いて解析する。サイトカイン・細胞成長因子刺激後経時的にRNAを回収し、主にサイトカイン・細胞成長因子の遺伝子発現についてmicro array解析、real-time PCR法にて比較検討する。今現在、サンプル回収を行ない、解析を行なっている。我々の研究目的は、皮膚再生医療を推進する三次元培養皮膚の作製法を改良することである。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し報告している。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。
無機ナノシートの格子エネルギーを利用した有機分子の高圧物性の常圧での実現

無機ナノシートの層間に取り込まれた平面性の低いカチオン性有機分子の平面性は、溶液の状態で高圧にしたときと同様に向上する。そこで本研究では、無機ナノシート層間を一軸性の高圧力環境場としてとらえ、層間に取り込まれた有機分子に作用する一軸性の圧力場を定量化すること、またその圧力場を制御可能とすることを目指した。その結果、ナノシートの層間に取り込まれた有機分子に作用する力は、静水圧に換算すると、1 GPaオーダーの圧力に相当することがわかった。さらに、粘土鉱物の層電荷を変えること、および空間占有率を変えることで、この圧力場を0.51.8 GPaの範囲で制御することができた。本研究は、無機層状化合物の層間という環境が層間に取り込まれた有機化合物に及ぼす1圧力場を定量的に理解し、2圧力を自在に制御する方法論を確立すること、および、3無機層状化合物の層間に有機化合物を挟み込むことで、高圧で顕著に生じる物性を常圧の環境下でも発現させることを目的としている。平成24年度までの研究で、無機層状化合物の層間環境が生み出す圧力場の生成メカニズムを定量的に理解することができ、圧力場を0.52GPaの間で自在に制御できるようになった。平成25年度は、無機層状化合物の層間環境を外部刺激により変化させ、圧力場の変化に起因する物性変化を外部刺激により誘起する手法を探索した。モデル化合物としては、これまでの研究で層間距離の変化に応じて吸収や蛍光の色が変化するビフェニルの誘導体を選んだ。無機層状化合物の一種である粘土鉱物の層間隔は、水などの極性の液体の加除により伸縮する。そこでこの粘土鉱物の性質を利用し、粘土鉱物とビフェニル誘導体とからなるハイブリッドに、ジメチルスルホキシドやエチレングリコールのような揮発性の低い有機液体を加えることで層間距離を拡げた。その結果、ビフェニル誘導体が示す蛍光色が緑色からオレンジ色へと変化した。この色の変化は、層間環境場を高圧の状態から低圧の状態に変化させたときの色の変化と対応しており、層間距離の拡大により取り込まれた分子に作用する圧力場が弱くなることで蛍光色が変化することが裏付けられた。また、この変化は可逆的で、揮発性・極性が共に高いエタノールのような有機液体でジメチルスルホキシドやエチレングリコールを洗い流すと、層間距離が元に戻り高圧の環境場が再現されることも明らかにした。その他、指で押す程度の圧力でも色調が変化するハイブリッド材料の創出にも成功しており、現在そのメカニズムの解明を進めている。本研究は、1無機層状化合物の層間という環境が生み出す圧力場を定量的に理解し、2層間に取り込まれた有機分子に作用する圧力を自在に制御する方法論を確立すること、および、3高圧で顕著に生じる物性を、無機層状化合物の層間に挟み込むことで常圧の環境下でも実現できるようにすることを目的としている。平成24年度は、無機ナノシートの層間に挟み込まれた有機物に作用する圧力の定量化、および圧力場の制御に関する研究を進めた。圧力をモニターする化合物としては、常圧では歪んでいるものの、圧力を高くするにつれて分子の平面性が高くなることが知られているビフェニルの誘導体を選んだ。ビフェニルは、分子の平面性が高くなると、可視光の吸収や蛍光の波長がレッドシフトすること、歪みに起因した赤外吸収モードが消失する。このビフェニルの特性を利用して、無機ナノシートの一種である粘土鉱物の層間に挟み込まれたビフェニル誘導体と、溶液状態でダイヤモンドアンビルセル中に封入した試料との分光学的挙動を比較することで、粘土層間に挟み込まれたビフェニルに作用している圧力を定量化した。その結果、粘土層間に挟み込まれたビフェニル誘導体は、1GPa程度の高圧の溶液中に存在するときと同様の平面性を取ることが明らかとなった。この知見は、X線回折測定により見積もった層間隙の大きさとも一致した。次に、層間に挟み込むビフェニル誘導体の量、および粘土鉱物の層電荷を変化させることで、1分子に作用する圧力場の制御を試みた。その結果、この圧力場は0.52GPaの間で自在に変化させられることが明らかとなった。本研究は、無機ナノシートの層間に取り込まれた有機化合物が、無機ナノシートの格子エネルギーにより受ける1圧力環境場を定量的に理解し、2圧力を自在に制御する方法論を確立すること、および、3無機ナノシートの層間に有機化合物を挟み込むことにより、高圧下に特異的な物性を常圧下で引き出すことを目的としている。平成25年度までの研究で、当初の目的は達成した。

得られた知見に基づき、研究をさらに発展させ、無機ナノシートの層間環境を液体の注入/除去という外部刺激により変化させると、圧力環境場も変調でき、高圧環境場に特異的な物性と、常圧環境での物性との間を簡単にスイッチングできることを新たに示すこともできた。平成26年度は、無機ナノシートの層間環境に変調を与え、結果として圧力環境場をスイッチできる方法をさらに多彩にすることに取り組んだ。まず、新たな外部刺激の方法として、指で押す程度の圧力に着目した。無機ナノシートの一種である粘土鉱物と、水溶性のポリマー、圧力応答性の物質との三元系を作製したところ、指で押す・試料を引っ張るなどの外部刺激により色調が変化する材料を新たに開発することができた。また、これまで、層間環境を液体の注入/除去により変化させることが可能な系では、不揮発性の有機溶剤を注入/除去しなければ色調を安定に変化させることが出来なかった。そこで本年度の研究では、人体に無害で環境にも優しい水の注入/除去により色調が変化する系の創出にも挑んだ。その結果、圧力応答性の化合物の水に対する親和性を高めれば、水をかけるだけで色が変化し、水を乾燥すると色が元に戻る系が作製できることを見いだした。機能物性化学当初の計画はほぼ達成し、計画には含まれていなかった「外部刺激による圧力環境場の制御」に関する研究も進められている。当初計画において、平成24年度は目標1無機層状化合物の層間という環境が生み出す圧力場の定量的な理解を達成する予定であった。実際にはこれに加え、平成25年度以降に達成予定の目標2層間に取り込まれた有機分子に作用する圧力を自在に制御する方法論の確立もほぼ成し遂げることができた。以上のように、当初計画を前倒しして順調に研究が進展している。外部刺激による圧力環境場の制御に関する研究の中でも、指で押す程度の圧力で色調が変化するハイブリッド材料については産業界からの関心が高い。しかしながら、そのメカニズムは未解明であるため、産業上の要請がある物質を自在に作製できるには至っていない。そこで、今後はこの色調変化のメカニズム解明に向けた研究を推進していく。圧力場の制御方法として、当初計画したゲストの量、ホストの層電荷、共存イオンのサイズに加え、揮発性の低いDMSOなどの溶媒を層間に注入することも有効であることを見いだした。そこで、当初の計画に加え、溶媒の注入によりゲスト分子に作用する圧力場を制御する方法論の確立に向けた研究も進め、より高い次元で目的が達成できるようにする。前年度1月に発注した機器の納品が年度内に完了しなかったため。発注した機器は4月に納品されており、その支払いに使用する。ダイヤモンドアンビルを破損しない限り高額な物品はこれ以上必要としないが、ナノシートおよび層間に挟み込む色素の合成に必要な薬品、溶剤、ガラス器具等は購入する必要がある。また、分光学的挙動の評価に必要な光学部品も購入する。当初の計画以上の成果が生まれつつあるので、それら成果を国内外の学会で積極的に発信していく。そのための旅費にも研究費を使用する。
アート錯体型アリル遷移金属反応剤の新反応性を基盤とするヘテロ環状化合物の合成

1.アート錯体型アリルマシガン反応剤がアレンと高効率かっ高位置選択的に反応することを見いだした。興味深いことにアレンの末端炭素にアリル基が導入され、ビニル金属種が得られる。触媒量の塩化マンガンと塩化アリルマグネシウムを組み合わせて用いても反応は効率良く進行することが明らかになった。生成したビニル金属種は種々の求電子剤と反応し、炭素-炭素結合生成や官能基化を行うことができる。また、1,1-二置換アレンを用いても多置換側の末端炭素にアリル基が攻撃するので、4級炭素の構築も可能である。さらに、オレフィン部分をもつアレンを用いる高立体選択的に環化反応が進行することも見いだした。2.α-クロロオキシムエーテルにかさ高いリチウムアミドを作用させた後、Grignard反応剤を作用させると、一段階で三置換ピリミジンが収率良く得られること、を見いだした。Grignard反応剤を使い分けることで、ピリミジンの2位にアルキル、アルケニル、アリール基など様々な置換基を簡便に導入できることが明かとなった。また、α-クロロオキシムエーテルとα-クロロオキシムトシラートを用いることにより、非対称型のピリミジンも合成できることを明らかにした。1.アート錯体型アリル金属反応剤と1,6-ジイン類との反応では金属上のアリル配位子が三炭素成分として生成物に取り込まれ、マンガンの場合には七員環、クロムの場合には六員環を持つビシクロ化合物が一挙に生成することを既に報告している。今回、1,6-エンイン類を基質としてとりあげ、クロムアート錯体との反応について検討したところ、アリル基の導入を伴つて五員環形成反応が効率良く進行することが明らかとなった。さらに、触媒量の塩化クロムの存在下、1,6-エンインに塩化メタリルマグネシウムを作用させると、炭素-マグネシウムをもつ環化体が得られることを見いだした。この有機マグネシウム種は種々の求電子剤と反応させることにより、炭素-炭素結合生成反応や官能基導入反応に利用できることを明らかにした。さらに、アート錯体型アリルクロム反応剤はアレンとも反応することを見いだした。オレフィン部分をもつアレンとメタリルクロムアート錯体を反応させるとメタリル基のアレンへの付加を伴った環化反応が進行し、五員環化合物が得られることを見いだした。2.α,α-ジブロモオキシムエーテルにGrignard反応剤を作用させると、一段階で三置換ピリミジンが収率良く得られることを見いだした。THF中、低温でα,α-ジブロモケトンのオキシムメチルエーテルに様々なGrignard反応剤を反応させると、ピリミジンの2位にアルキル、アルケニル、アリール基を簡便に導入できることが明かとなった。一方、Grignard反応剤としてアリルマグネシウムクロリドを用いると、ジアリルアジリジンが収率よく得られることも発見した。
分子キラリティの電子状態理論

1983年に原子核と電子の間のパリティ非保存相互作用が原因でLアミノ酸がDアミノ酸に比べて安定であるとの理論研究がTranter等により報告されて以来、この相互作用と分子キラリティとの因果関係が注目されている。本研究では、我々が開発したSOCSCF法を用いてスピン-軌道相互作用を取り込んだ波動関数を求め、水溶液中でのコンフォメーシーョン解析を詳細に行って、L-アラニン、D-グリセルアルデヒドの水溶液中におけるパリティ非保存相互作用エネルギーを見積もり、L体とD体の安定性を決定した。SOC SCF法では、スピン-軌道相互作用(SOC)演算子も含めたハミルトン演算子を使い、一般化スピン-軌道で作られた単一スレータ行列式波動関数を求めるハートリー・フォックSCF方程式を解く。基底関数依存性、スピン-軌道相互作用のパリティ非保存相互作用エネルギーへの関わり合い、分子のコンフォメーション変化に対する値などを根拠にし、計算方法を吟味し、適切な計算方法を提案した。水溶液中におけるアラニン、グリセルアルデヒドの配座解析を詳細に行って、パリティ非保存相互作用エネルギー差を計算した。溶媒効果は連続体モデルとモンテカルロシミュレーションにより水分子の配置を決めて量子化学計算に取り入れるMC/MO法を併用した。アラニンではL体はD体に比べて不安定であるとの結論を得た。グリセルアルデヒドの水和体はD体がL体より安定であることが示された。アラニンのL体がD体に比べて不安定であることは、特定の配座の計算結果から結論したTranter等の結果と相反するもので、注目すべき研究成果である。本研究では、我々が開発したSOCSCF法を用いてスピン-軌道相互作用を取り込んだ波動関数を求め、水溶液中でのコンフォメーション解析を詳細に行って、L-アラニン、D-グリセルアルデヒドの水溶液中におけるパリティ非保存相互作用エネルギーを見積もり、L体とD体の安定性を決定した。SOCSCF法では、スピン-軌道相互作用(SOC)演算子も含めたハミルトン演算子を使い、一般化スピン-軌道で作られた単一スレータ行列式波動関数を求めるハートリー・フォックSCF方程式を解く。基底関数依存性、スピン-軌道相互作用のパリティ非保存相互作用エネルギーへの関わり合い、分子のコンフォメーション変化に対する値、などを根拠にし、計算方法を吟味し、適切な計算方法を提案した。水溶液中におけるアラニン、グリセルアルデヒドの配座解析を詳細に行って、パリティ非保存相互作用エネルギー差を計算し、アミノ酸と糖におけるL体とD体の安定性を決めた。これは特定の配座の計算結果から結論したTranter等の結果と相反するものである。平成14年度は、我々が開発したSOC SCF MO法を用いてスピン-軌道相互作用を取り込んだ波動関数を求め、水溶液中でのコンフォメーション解析を詳細に行って、L-アラニン、D-グリセルアルデヒドの水溶液中におけるパリティ非保存相互作用エネルギーを見積もり、L体とD体の安定性を決定した。その際、水溶液中のアラニンの配座解析を詳細に行って、連続体モデルによる溶媒効果を取り入れてパリティ非保存相互作用エネルギー差を計算し、L体はD体に比べて不安定であるとの結論を得た。本年度は、溶媒の効果を更に詳細に取り入れるため、モンテカルロ(MC)法とMO法を組み合わせたMC/MO SOC-SCF法を用いて水溶液中でのパリティ非保存相互作用エネルギー差を計算した。

様々なコンフォメーションに対して、アラニンの周りの水分子を10個まで順次取り入れて計算を行い、エネルギー加重平均を取ることにより、L-体とD-体のエネルギー差を見積もり、連続体モデルの場合と同様に、L-アラニンはD-アラニンに比べて不安定であるとの結論を得た。これは特定の配座の計算結果から結論したTranter等の結果と相反するものであり、注目すべき研究成果である。
粒子の衝突帯電における電荷移動プロフィールのマイクロ秒分割による解析

誘電体が金属壁に衝突するときに生じる電荷の移動について、弾性変形の影響を含めて詳細に検討するため、デジタル・オシロスコープと高速カメラを組み込んだシステムを構築した。本システムでは、球形誘電体が金属壁に接近・衝突・反発するという一連の運動において、衝突壁および通過型ファラデーケージから得られる電位プロフィールをデジタル・オシロスコープで検出することが可能であり、この電気信号を高速カメラのトリガーにも利用しているので、電位プロフィールとデジタル画像のタイミングを完全に一致させられる。電位プロフィールならびに衝突変形時のデジタル画像は1マイクロ秒の間隔でコンピューターに取得でき、データーはコンピューターで解析・評価される。得られた成果は以下のとおりである。1)誘電体と衝突板との電荷の移動は弾性変形の緩和の過程内で完了することが分かった。2)電位プロフィールは誘電体の電荷、位置、および速度に依存するが、電位プロフィールの時間積分によって得られる極大値あるいは極小値は、球体の位置および速度の影響を受けない。すなわち、誘電体が保持する電荷のみによって決まる。また、誘電体の初期電荷および衝突帯電による電荷移動量は、衝突前後の極大値あるいは極小値の差を用いて計算できる。3)繰り返し衝突によって誘電体に蓄積する電荷は、ある限界値に漸近する。この限界値は帯電と緩和の平衡によって決まる値であり、誘電体の帯電過程は、初期電荷と電荷の緩和効果を考慮することによって説明できる。4)衝突帯電による電荷の移動量は、弾性変形における最大接触面積に比例し、弾性理論を導入することによって解析することが可能である。粉体のハンドリングにおいて、粒子は装置壁と衝突し帯電する。粒子の帯電は輸送管の閉塞、粉塵爆発といった工業的にはネガティブな現象を引き起こすばかりではなく、近年では静電気粉体塗装といった有効利用も行われている。しかし、このような諸問題を解決するためには、帯電の原因、とくに衝突帯電機構を解明することが重要である。衝突帯電機構は衝突素過程に大きく依存していると考えられる。具体的には、粒子の接近時および離脱時に生じる誘導電荷、衝突時の粒子・ターゲット壁面の変形状態、接触面積および圧力などの経時変化、接触電位差、に依存していると考えられ、これらを総合的に考慮しながら衝突時の電荷移動を解明する必要がある。しかし、従前の研究は、衝突前・衝突後における帯電量の変化を計測したものがほとんどであり、衝突時に微弱で瞬時に完了する電荷移動そのものを計測した例は少ない。本研究では、超高速電流測定システムを開発し、定量的な衝突帯電機構の検討を行うことを目的とした。<実験装置の試作と性能評価>粒子を金属ターゲットに衝突させたとき、金属ターゲットに誘起される電荷は微弱でありかつマイクロ秒オーダーで変化するためこれを捉えることは非常に困難を伴う。そのため次のような測定装置を試作した。金属ターゲットは超高速電流プリアンプを介してアースされている。超高速電流プリアンプの信号は、バンドパスフィルターを介してコンピュータに接続された超高速デジタルオシロにとりこまれ、デジタルデータとしてパソコンに保存される。本測定装置によって金属ターゲットに微弱で瞬時に誘起される電荷を時々刻々捉えることができる。つまり粒子の接近時および離脱時に生じる誘導電荷、衝突時の粒子・ターゲット間の電荷移動を時々刻々捉えることがほぼ可能となった。これを用いて実際にピンボール程度の球から数百ミクロンの粒子の衝突実験を行い性能を評価した。<基礎物性の測定>帯電特性評価のための基礎物性として、試料粒子および金属ターゲットの接触電位差、粒子の力学的強度を測定し、粒子の接触状態と電荷移動を関係づける理論を構築するための準備を行った。粒子が壁に衝突するときの電荷の移動について詳細に解析するため、ポリブタジエン製の弾性球と鋼製ターゲットを用いて衝突実験を行った。球体が重力によって壁に接近し、衝突・反発するという一連の運動における電位プロフィールをデジタルオシロスコープで測定し、衝突時の弾性変形の様子を高速カメラで撮影した。なお、高速カメラのトリガーには、デジタル・オシロスコープの出力信号を用いており、電位プロフィールと画像を完全に一致きせることができる。

衝突時間は3ミリ秒以下であり、1マイクロ秒の間隔でデジタルデーターを取得することが可能である。得られた結論は以下のとおりである。1.球体と衝突板との電荷の移動は弾性変形の緩和の過程内で完了する。2.電位プロフィールは球体の電荷、位置、および速度に依存するが、電位プロフィールの時間積分によって得られる極大値あるいは極小値は、球体の位置および速度の影響を受けない。すなわち、球体が保持する電荷のみによって決まる。球体の初期電荷および衝突帯電による電荷移動量は、衝突前後の極大値あるいは極小値の差を用いて計算できる。3.繰り返し衝突によって球体に蓄積する電荷は、ある限界値に漸近する。この限界値は帯電と緩和の平衡によって決まる値であり、球体の帯電過程は、初期電荷と電荷の緩和効果を考慮することによって説明できる。4.衝突帯電による電荷の移動量は、弾性変形における最大接触面積に比例し、弾性理論を導入することによって解析することが可能である。
Assisted Reading ―多読への架け橋―

近年、多読が普及する一方で、多読に効果的に取り組めない学習者や、上級者であっても、外国語による読書を愉しむレベルにまで到達するケースは少ない(Taguchi, 2017)。本研究の目的は、読みの流暢さの発達を促すAssisted Reading(AR)(Taguchi et al., 2016)の効果検証を行うことである。研究代表者は、Repeated Reading (RR)を導入する際に研究者・教師に労力と時間の負担がかかるため、科研費によりRRのオンラインプログラム(仮称Web R2)をIT企業の支援を受けて開発し、一般公開の準備を進めている。この教材を使用し、「音声」と「繰り返し」という、リーディングを支援する「足場掛け(scaffolding)」を提供し、自立し、外国語による読書を愉しむ第二言語の読み手を育成する方法を検証する。2016年に英語非専攻の大学1年生を対象に予備研究を実施し、1)黙読平均語数が101.36wpm (SD=9.16)から130.96wpm (SD=12.49)に、2)理解度も46.00% (SD=5.19)から59.20 (SD=7.16)に伸びたこと、また、理解度の高い上位グループと下位グループの伸長パターンの違いの分析から、伸び率が緩やかな下位グループに対し、上位グループでは、加速度的な上昇パターンが観察されたことから、Web R2の研究利用が可能であることを認識した。2018年度は、Web R2と多読テキストPager Turnersを併用し、ARの効果検証を進める予定であった。しかし、コンテンツを提供予定であったテキサス工科大学グレタ・ゴーサッチ教授のコンテンツ準備が時間を要した。予算の都合から、コンテンツ準備とシステム改善を同時に行わなければならなかったため、2019年度に先送りすることとなった。本プロジェクトには、長年読みの流暢さの研究に関わり、優れた研究成果を上げている2人のアメリカ人が研究協力者として参加している。研究代表者の長年の共同研究者であるテキサス工科大学Greta Gorsuch教授、そして、第一言語と第二言語の読みの流暢さの研究に長年携わり、読みと第二言語習得との関係について優れた著作のあるNationalLouis大学のKristin Lems教授である。現在のWeb R2のコンテンツは限られており、多様な学習者のレベルや興味に対応できていないため、テキサス工科大学Greta Gorsuch教授と共に、コンテンツ拡充を進めている。さらに、語彙研究で著名なPaul Nation NZビクトリア大学名誉教授が作成したSpeed Reading教材も開発者の許諾を得て、本プロジェクトで使用することが可能となったため、その音声データを作成済みである。本プロジェクトでは、コンテンツの拡充とプログラムの改良を図り、プロジェクトHPを通して、他の研究者が無料で使用できるように一般公開をする予定である。コンテンツの拡充の準備状況については、Paul Nation NZ国立ビクトリア大学名誉教授とその同僚が作成したSpeed Reading教材テキストについては使用許諾に基づき、ナレーション音声データを既に作成してある。また、共同研究者のテキサス工科大学Greta Gorsuch教授が自ら作成したテキスト、及び録音した音声データがあるが、まだ作成途中であり、すべての作品の完成までにはもう少しの時間を要する見込みである。システムの改善とコンテンツの拡充はすべて準備が整った段階で技術支援を得ているIT企業に依頼をするのが予算執行上望ましいので、2018年度に計画をしていた作業を2019年度に先送りし、実施することにした。現在Web R2に搭載の準備を進めている拡充のためのコンテンツについては、上述したようにPaul Nation NZ国立ビクトリア大学名誉教授とその同僚が作成した"Asian and Pacific Speed Readings for ESL Learners" (Quinn, Nation, and Millett, 2007)と研究代表者の共同研究者であり、本プロジェクトの研究協力者であるテキサス工科大学グレタ・ゴーサッチ教授が作成するストーリー、及びそれに付随するテキスト音声である。前者は英語を母語とし、音声吹き込みの経験豊かなアメリカ人女性に依頼し、既に完成済みである。後者はグレタ・ゴーサッチ教授自身がアメリカAudible社のナレーションを担当するプロのナレーターであるので、自身が創作した作品を自身で録音することができる。完成には2, 3か月要する見込みであり、費用を抑えるために、その完成を待ってシステム改善とコンテンツ拡充を一度に進める予定である。この改善・拡充したオンラインプログラムと市販の多読テキストを併用し、Assisted Reading(AR)の効果検証を行う。研究代表者は、Repeated Readingのオンラインプログラム(仮称Web R2)について、これまでの運用から読みの回数の設定、コンテンツ拡充が複雑であることなど、幅広い運用レベルや興味を持つ学習者に対応できない問題点が生じてきた。多用な学習者を擁する授業での活用への利便性を高めるためにシステムの改良とコンテンツの拡充を行い、その後、改良・拡充したプログラムを試行運用し、バグ等を修正した上で、研究データの収集・分析を行う予定である。

この教材を使用し、「音声」と「繰り返し」という、リーディングを支援する「足場掛け(scaffolding)」を提供し、自立し、外国語による読書を愉しむ第二言語の読み手を育成する方法を検証する。2016年に英語非専攻の大学1年生を対象に予備研究を実施し、1)黙読平均語数が101.36wpm (SD=9.16)から130.96wpm (SD=12.49)に、2)理解度も46.00% (SD=5.19)から59.20 (SD=7.16)に伸びたこと、また、理解度の高い上位グループと下位グループの伸長パターンの違いの分析から、伸び率が緩やかな下位グループに対し、上位グループでは、加速度的な上昇パターンが観察されたことから、Web R2の研究利用が可能であることを認識した。2018年度は、Web R2と多読テキストPager Turnersを併用し、ARの効果検証を進める予定であった。しかし、コンテンツを提供予定であったテキサス工科大学グレタ・ゴーサッチ教授のコンテンツ準備が時間を要した。予算の都合から、コンテンツ準備とシステム改善を同時に行わなければならなかったため、2019年度に先送りすることとなった。本プロジェクトには、長年読みの流暢さの研究に関わり、優れた研究成果を上げている2人のアメリカ人が研究協力者として参加している。研究代表者の長年の共同研究者であるテキサス工科大学Greta Gorsuch教授、そして、第一言語と第二言語の読みの流暢さの研究に長年携わり、読みと第二言語習得との関係について優れた著作のあるNationalLouis大学のKristin Lems教授である。現在のWeb R2のコンテンツは限られており、多様な学習者のレベルや興味に対応できていないため、テキサス工科大学Greta Gorsuch教授と共に、コンテンツ拡充を進めている。さらに、語彙研究で著名なPaul Nation NZビクトリア大学名誉教授が作成したSpeed Reading教材も開発者の許諾を得て、本プロジェクトで使用することが可能となったため、その音声データを作成済みである。本プロジェクトでは、コンテンツの拡充とプログラムの改良を図り、プロジェクトHPを通して、他の研究者が無料で使用できるように一般公開をする予定である。コンテンツの拡充の準備状況については、Paul Nation NZ国立ビクトリア大学名誉教授とその同僚が作成したSpeed Reading教材テキストについては使用許諾に基づき、ナレーション音声データを既に作成してある。また、共同研究者のテキサス工科大学Greta Gorsuch教授が自ら作成したテキスト、及び録音した音声データがあるが、まだ作成途中であり、すべての作品の完成までにはもう少しの時間を要する見込みである。
ストイキオメトリックLiNbO_3,LiTaO_3の2次非線形光学定数の精密測定

本研究は,最近開発された高品質ストイキオメトリックLiNbO_3およびLiTaO_3の2次非線形光学定数を,波長分散まで含めて精密に測定し,その値を明らかにすることを目的として行った。研究期間内で基本波波長1.06および1.31μmでストイキオメトリックLiNbO_3に対して測定を行った。試料はオキサイド社および日立金属でそれぞれ作製した無添加およびMgO添加のものを用いた。これらを厚さ100μm程度で約0.15°のテーパーのついたウェッジ状に加工研磨し,ビーム径数十μmの基本波を垂直に入射しながら試料をテーパー方向に数μmずつ動かすことにより,第2高調波パワーの試料厚さ依存性(Makerフリンジ)を測定した(ウェッジ法)。得られた測定データに対して多重反射効果を考慮した解析を行うことにより,非線形光学定数を求めた。ストイキオメトリックLiNbO_3では,測定データを解析する際に必須となる屈折率の正確な値が明らかになっていない。ウェッジ法では用いた試料のウェッジ角が正確に求まれば,Makerフリンジ1周期分の試料の移動距離からコヒーレンス長を見積もり,そこから屈折率を決定することができるが,ウェッジ角を10^<-3>の精度で直接測定するのは困難である。そこで,常光線・異常光線それぞれの偏光方向で試料内での多重反射による干渉周期測定と,クロスニコル配置における透過パワーの試料移動距離依存性の測定を複数の波長で行うことにより,ウェッジ角と屈折率の両方を同時に求めた。その結果,±5%以内の精度で2次非線形光学定数を求めることができ,基本波波長1.064,1.31μmともストイキオメトリックLiNbO_3はコングルエント組成のものと誤差の範囲で一致することが明らかになった。本研究は,最近開発された高品質ストイキオメトリックLiNbO_3およびLiTaO_3の2次非線形光学定数を,波長分散まで含めて正確に測定することを目的としている。今年度はストイキオメトリックLiNbO_3について,基本波波長1.06および1.31μmで測定を行った。試料はオキサイド社および日立金属でそれぞれ作製した無添加およびMgO添加ストイキオメトリックLiNbO_3を用いた。これらを厚さ100μm程度で約0.15°のテーパーのついた形状に加工研磨し,ビーム径数十μmの基本波を垂直に入射しながら試料をテーパー方向に数μmずつ動かすことにより,第2高調波パワーの試料厚さ依存性(メーカーフリンジ)を測定した。基本波光源として波長1.06μmのQスイッチNd:YAGレーザおよび1.31μmのDFBレーザを用い,絶対測定もしくはコングルエントLiNbO_3を参照物質とした相対測定を行った。ストイキオメトリックLiNbO_3については,屈折率はこれまで限られた波長でしか測定されておらず,またその精度もそれ程高いとは言えない。したがって,非線形光学定数の測定に先立ち,それぞれの基本波波長におけるコヒーレンス長を測定し,間接的に屈折率を求めることによって文献値の屈折率データの補正を行った。d_<33>とd_<31>のそれぞれについて測定を行った結果,1.06と1.31μmいずれの波長においても,ストイキオメトリックLiNbO_3の非線形光学定数はコングルエントLiNbO_3と誤差(±8%)の範囲内で等しくなった。来年度は屈折率を見積もる過程での誤差を小さくして測定精度を高めるとともに,LiTaO_3の測定も行う。

また,短波長での測定も行い,第2高調波が吸収端に近くなる波長でのストイキオメトリックおよびコングルエントLiNbO_3,LiTaO_3の非線形光学定数について比較する予定である。本研究は,最近になって高品質な結晶が開発されたストイキオメトリック組成のLiNbO_3とLiTaO_3の2次非線形光学定数を精密に測定し,その値を明らかにすることを目的として行った。昨年度は基本波波長1.31μmと1.064μmで測定を行ったが,測定データを解析する際に必須となる屈折率の正確な値がストイキオメトリック組成の材料では明らかになっておらず,得られた非線形光学定数の値の誤差が大きいことが問題となった。LiTaO_3は試料のサイズが小さく現状での誤差の改善は困難であったが,LiNbO_3は試料サイズが大きく精度向上が可能なため,本年度はストイキオメトリックLiNbO_3の屈折率を同定すべく各種測定を行い,正確な値を用いて再度解析を行うことにより,非線形光学定数を高精度に求めることを目指した。本研究ではウェッジ法により非線形光学定数の測定を行った。したがって,用いた試料のウェッジ角が正確に求まれば,Makerフリンジ1周期分の試料の移動距離からコヒーレンス長を見積もり,そこから屈折率を決定することができるが,ウェッジ角を10^<-3>の精度で直接測定するのは困難である。そこで,常光線・異常光線それぞれの偏光方向で試料内での多重反射による干渉周期測定と,クロスニコル配置における透過パワーの試料移動距離依存性の測定を複数の波長で行うことにより,ウェッジ角と屈折率の両方を同時に求めた。その結果,±5%以内の精度で2次非線形光学定数を求めることが可能となり,再度解析を行ったところ,基本波波長1.31μm,1.064μmともコングルエント組成のものと誤差の範囲で一致することがわかった。また,フォトリフラクティブ効果の耐性が大きいMgO添加のストイキオメトリックLiNbO_3の測定も行い,無添加のものと誤差の範囲内で一致することが明らかとなった。
遺伝子改変マウスモデルにおける顎顔面発生異常と細胞分子レベルでの発症機序の解明

本研究では、特定の遺伝子欠損に起因する口腔顎顔面領域の表現型異常を病理組織学的に検索するとともに、その背景をなす遺伝子欠損に随伴した分子間ネットワークの破綻を調べることにより、口腔顎顔面奇形の細胞分子レベルでの発症機序の解明をめざす。とりわけ、顎顔面領域の多彩な表現型変異のうちで、(1)先天性奇形のうちでも発症頻度の高い口蓋裂と、(2)メッケル軟骨・下顎骨体の形成異常、(3)複雑な組織発生・構造を示す顎関節部の形成障害、および(4)舌の初期発生と異常に注目した。最終年度にあたり、前年度までに設計したRT-PCRおよびリアルタイムPCR用のプローべ80種類を用いて、異なる胎生時期のマウス二次口蓋突起と舌原基での遺伝子発現ネットワークの解析を完了した。さらに、レーザ顕微切断法(Laser-capture microdissection)による口蓋突起上皮でのsnailおよびRhoファミリー、舌筋形成における筋芽細胞分化のマスター遺伝子(Pax3、Myf5、myogenin)のmRNA発現について解析した。遺伝子改変モデルとして、TGFβ3、δEF1、Endothelinlの欠損マウスに加えてKlotho(-/-)の解析を完了した。これらの動物モデルでの顎顔面の発生・成長を視覚的に捉えるため、アリザリンレッド・アルシアンブルー二重染色による骨格標本、エックス線μCT画像、連続染色標本での立体構築像、血管造影による立体画像法を確立し、異なる胎生日齢でのマウス頭蓋全体および諸器官(鯰弓、舌、顎関節、メッケル軟骨、歯胚)を3次元動画観察できるデータベースを構築した。これらの画像情報については、平成16年度に購入したサーバに保管し、その一部はWebサイト(http://www.ndu.ac.jp/pathhome)に掲載している。頭蓋顔面部の形態形成には多数の遺伝子(その転写産物)が関与しており、それらの発現は時間的・空間的に精妙に制御されている。単独あるいは複数の遺伝子変異、あるいは外来性の催奇形因子(環境要因)の影響によって、形態形成の途上でこれら遺伝子の発現ネットワークの調和が破綻すると、表現型の異常(先天性奇形)を引き起こす。今回の申請課題では、顎顔面領域の多彩な表現型変異のうちで、(1)先天性奇形のうちでも発症頻度の高い口蓋裂(関連する一次口蓋や下顎突起の癒合不全)と、(2)メッケル軟骨・下顎骨体の形成異常、とりわけ複雑な組織発生・構造を示す顎関節部の形成障害に注目する。本年度においては、マイクロダイセクション装置(ライカ)を購入し、二次口蓋突起の先端被覆上皮(MEE細胞)と隣接する間葉細胞とを分離し、細胞移住能に関与するRhoファミリー遺伝子群と細胞接着因子のmRNA発現を調べている。これまでに10細胞集団からのmRNA抽出とRT-PCRにより、再現性のある結果が得られることを確かめた。また、骨格標本での観察に加えて、アルカリフォスファターゼ活性(酵素組織化学)と軟骨基質プロテオグリカン(免疫染色)を指標として、野生型マウスでのメッケル軟骨と顎関節原基(細胞集団の同定)の発生時期と胎生時期での組織構築の推移を明らかにした。次年度において、組織連続標本から3次元立体構築を実施し、組織発生部位の特定と周辺組織器官との立体配座と組織容積の定量的な解析を継続する。遺伝子変異型マウスとして、δ-crystallin E2-box factor1欠損モデルとendothelin-1欠損モデルでの二次口蓋形成異常の検討を完了した。鰓弓、二次口蓋突起、顎関節原基の器官培養実験を継続しており、GFP発現マウス試料の培養実験では、上皮間葉間での相互作用と形質転換を検討している。

頭蓋顔面部の形態形成には多数の遺伝子(その転写産物)が関与しており、それらの発現は時間的・空間的に精妙に制御されている。本年度においては、野生型マウスとこれまで系統交配してきたエンドセリン1ノックアウトマウスについて、胎生9日目より生誕後4日目までの胎仔・新生仔の骨格標本(アルシャンブルー・アリザリンレッド二重染色)を作製し、全身骨格と頭部骨格の画像データベースを構築、ネット上に公開する準備を進めている。初年度に購入したmicrodissection装置を用いて、E10-14の舌器官、E13.5-E16の一次と二次口蓋の上皮と間葉、E14-17のメッケル軟骨原基および同時期の顎関節原基について、細胞集団の顕微分離を継続している。本年度に別課題の科研費援助で購入したリアルタイムPCRでの遺伝子発現ネットワークの検索に向けて、総数60種のプローベの設計とリアルタイムPCR条件決めを実施した。二次口蓋上皮でのRhoファミリー関連遺伝子の発現として、構成的発現を示す遺伝子群(n-wasp, lim-kinese2, p160 rock, ezrin, profilin 1)と、発生時期特異的な発現を示す遺伝子群(cdc42,snail, lutheran)を区別し、上皮間葉転換に関連してsnailの発現上昇とlutheranの発現減衰を確かめている。また、舌の発生時期でのmyoD、myf5、shh、HGF、chordin、nogginの変動を調べた。メッケル軟骨の発生と下顎骨、顎関節の形態形成に関連して、連続薄切標本(アルカリフォスファターゼ酵素組織化学とビクトリアブルー・HE重染色、von Kossa染色の併用)から立体構築像を作成、メッケル軟骨の石灰化部位と吸収開始部位、顎関節原基と下顎頭膜内骨化との空間的関連について解析を進めている。本研究では、特定の遺伝子欠損に起因する口腔顎顔面領域の表現型異常を病理組織学的に検索するとともに、その背景をなす遺伝子欠損に随伴した分子間ネットワークの破綻を調べることにより、口腔顎顔面奇形の細胞分子レベルでの発症機序の解明をめざす。とりわけ、顎顔面領域の多彩な表現型変異のうちで、(1)先天性奇形のうちでも発症頻度の高い口蓋裂と、(2)メッケル軟骨・下顎骨体の形成異常、(3)複雑な組織発生・構造を示す顎関節部の形成障害、および(4)舌の初期発生と異常に注目している。本年度においては、二次口蓋突起と舌原基での遺伝子発現ネットワークを定量解析する目的で、65種類の標的遺伝子についてリアルタイムPCR用のプローベを設計し、異なる胎生時期のマウス試料でのRT-PCRを完了した。また、レーザ顕微切断法(Laser-capture microdissection)で採取した口蓋突起上皮でのsnailおよびRhoファミリー、および舌前駆細胞から筋芽細胞でのマスター遺伝子(Pax3、Myf5、MyoD、myogenin)のmRNA発現についても解析した。頭蓋顔面領域に多彩な形成異常をもたらすエンドセリン1(ET-1)欠損マウスおよび対照としての野生型マウスについて、連続薄切標本からの立体構築に基づく観察法を確立した。
Neuropeptide Y Y3受容体の遺伝子配列の決定

神経原性肺水腫における血管透過性亢進機序を解明するため、neuropeptide Y (NPY) Y3受容体のDNA配列を調べる実験系、血管内皮細胞を使った実験系、そして中枢神経系特に延髄におけるNOの変動に伴う発生率の変化を検討する実験系を用いた。既にneuropeptide Yは、フィブリン肺水腫などの神経原性肺水腫の発生において血管透過性を亢進させる交感-神経終末から放出される重要な神経伝達物質であることを示した。その関与するNPY Y3 receptorは、現在まだ遺伝子配列が決定されていない。そのため、有効な薬物の開発に支障を来している。今年度そのクローニングを開始した。ラットの延髄と肺からmRNAを抽出してcDNA作成後、ZAP Express VectorにligateしてZAP発現ライブラリーを作成した。大腸菌株に感染させ寒天培地上でプラークを形成させた。NPYおよび抗NPY抗体さらにリガンドPYYと抗PYY抗体との反応性からクローニングを進行中である。ラットの大動脈内皮細胞を単離して培養を行った。血管透過性の変化は、内皮細胞を直径0.5ミクロンの穴のある培養皿の上で培養して蛍光色素でラベルしたアルブミンの通過量によって検討した。また、一方では内皮細胞に発現する血管内皮細胞成長因子VEGF mRNAおよびその蛋白量をPCR, western blottingにて検討した。環在注射麻酔剤(ketamine, propofol, thiopental)、神経伝達物質(neuropeptide Y, norepinephrine, acetylcholine)、その他の生体内物質について、諸指標の変化から血管透過性に影響する物質の薬理学的検討を行っている。ketamine, thiopentalの通常用いられている濃度は透過性を亢進させるVEGF放出量を増加させた。延髄におけるNO放出量の増加は、フィブリン肺水腫発生率を増加させることが昨年度報告したが、今年度ではさらに迷走神経切断2週間後にbNOS発現量の増加が顕著であり、そのような時フィブリン肺水腫の発生率は有意に抑制されることが分かった。しかし、水腫液中の蛋白濃度は発生率の時間経過とは異なった経時的変動を示した。今年度さらに延髄のNO遊離を増加させる興奮性神経伝達物質L-glutamate, aspartateの影響を調べている。脳脊髄液中へのNO遊離の増加が見られ、フィブリン肺水腫の発生率は完全に抑制された。NOS阻害剤のL-NAMEの前処置によって元に戻った。現在さらに関与する受容体について調べている。クローニングの準備状況:neuropeptide Y受容体のサブタイプの一つであるY3-受容体(遺伝子シークエンスはまだ解明されていない)が、肺内血管内皮細胞に存在し肺血管透過性の亢進に強く関与している可能性を従来多くの実験で示唆してきたところであり、クローニングに成功すれば直接的にこの仮説を実証する事になる。そのため、現在クローニングの準備を行っており、次のようなステップを考え試薬や必要備品を整備している。1.肺をクレプスヘンゼライト液にて体動脈から還流して、そこへトリプシン(場合によってコラーゲネイス)を投与する。15-30分で剥離された細胞を集め、cDNAライブラリーを作成する。その一部の細胞培養は内皮細胞の確認などのために行う。3.λ-ZAP II、ampicilinにて目的蛋白を合成する機能を持っている。このλ-ZAP IIを大腸菌Y1090に感染させる。LB-Ampプレート上に捲き42度4時間培養を行い、各プラークが直径0.5mmになる事を確認した後ニトロセルロース膜を乗せ2-3時間の培養後それに転写させる。4.目的蛋白発現の大腸菌の釣菌は、ニトロセルロース膜上で次のようにプラークを同定する事によって行う。(1)スキムミルク1時間ブロッキング、(2)NPY・PYY4度インキュベーション、(3)NPY・PYY各ウサギ・山羊抗体の結合、(4)異なる標識を持つ2つの2次抗体結合、(5)発光法によりNPY結合・PYY非結合のプラークを確認する。5.陽性ファージ液を用いてさらに4次スクリーニングまで行う。陽性コロニーから融合蛋白を抽出し、western blottingで再確認する。ファージDNAを精製する。EcoR1で精製したDNAを切断、電気泳動にて挿入したDNAの大きさを確認する。6.DNAシークエンサーにてDNA配列を決定する。これらの一連の操作を行い、次年度以降早急に結論を得たいと考えている。