hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規スクリーニング系によるNO調節性エピゲノム制御酵素の単離同定

本研究では,抗体アレイとNO結合タンパク質を特異的に検出するビオチンスイッチ法をハイブリッドさせた新規スクリーニング方法によって,新規NO調節性酵素の単離を試みた.加えて,特異的抗体を用いて,NO標的タンパク質の絞り込みスクリーニングを行うことで,エピゲノム制御酵素に対するNOの効果を検討した.その結果,種々の酵素がNOの標的となり,Sーニトロシル化修飾を受けることを明らかにした.本研究では,抗体アレイとNO結合タンパク質を特異的に検出するビオチンスイッチ法をハイブリッドさせた新規スクリーニング方法によって,新規NO調節性酵素の単離を試みた.加えて,特異的抗体を用いて,NO標的タンパク質の絞り込みスクリーニングを行うことで,エピゲノム制御酵素に対するNOの効果を検討した.その結果,種々の酵素がNOの標的となり,Sーニトロシル化修飾を受けることを明らかにした.初年度はエピゲノム制御酵素を多く含む核内タンパク質に対する抗体がスポットされているアレイを使用して,網羅的なNO基質タンパク質の単離同定を目指した.さらに,ヒットした候補タンパク質に関して細胞レベルで本当にNO結合性を有しているか否か検討することを目的とした.その結果,HDACをはじめとする数種の候補がヒットした.つぎにNO感受性に関してビオチンスイッチ法を駆使して検討した.この際に,細胞種によっても各候補タンパク質の発現量が異なることから,ヒト神経細胞/グリア細胞/血管内皮細胞/胃上皮細胞などに対して外来性のNOドナーを処理し,Sーニトロシル化反応の濃度依存性から判断した.このアッセイから,スクリーニングで得た候補タンパク質はすべてNOによって酸化されることがわかったが,NOに対する感受性はそれぞれ異なることがわかった.以上の結果を踏まえて,候補タンパク質AおよびBについてさらなる解析を進めている.両者は上記の結果から低濃度NOによって特異的にSーニトロシル化されることがわかっている.そこで,まずNO結合部位の同定を試みたところ,予想されるシステイン残基を特異的にSーニトロシル化すること,さらに,この部位をセリン残基に置換した変異体ではまったくSーニトロシル化が起こらないことを明らかにした.また,酵素活性に対するSーニトロシル化の影響を検討したところ,NOの濃度依存的に活性が抑制されることを明らかにした.本研究の目的は,一酸化窒素(NO)結合性(S-ニトロシル化)タンパク質の網羅的スクリーニングを行い,その標的タンパク質の質的変化を明らかにすることであった.申請者が独自に開発した抗体アレイを使用したスクリーニング法によって,新たに50種の新規基質の単離に成功した.その中にこれまでに報告のないエピゲノム制御酵素が数種含まれていることを見出した.そこで,ヒストン脱アセチル化酵素について詳細な検討を行い,以下の知見を得た.ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)には多くのサブタイプがあるが,今回新たにHDAC6がNOの標的であることを明らかにした.HDAC6は細胞外あるいは細胞内から発生するNOによってもSーニトロシル化されることを見いだした.リコンビナントHDAC6を使用して,その酵素活性に対するNOの効果を調べたところ,有意な抑制作用が観察された.さらに,HDAC6の基質として知られているαーチュブリンのアセチル化に対する影響を検討したところ,NO処理によってHDAC6活性が抑制された結果,チュブリンのアセチル化修飾が増加することがわかった.この増加はNO阻害薬によって減少することも確認した.したがって,NOはエピゲノム制御酵素として知られている種々の酵素をSーニトロシル化修飾することでを活性調節していることが新たに分かった.これまで同定されてきたHDAC2に関しては,Sーニトロシル化は惹起するものの,酵素活性には直接影響しないことが分かっている.今回見いだしたHDAC6はHDAC2とは異なり,酵素活性を直接阻害することで基質修飾(アセチル化)に影響を及ぼすことが明らかとなった.HDAC6は変性タンパク質やユビキチン化タンパク質の無毒化などにも関わり,パーキンソン病などの神経変性疾患発症との関連性が指摘されている.今後は,神経細胞死におけるSーニトロシル化HDAC6の病態生理的役割を解明することが重要と思われる.薬学系薬理独自に開発したスクリーニングを実施し,この中から目的のエピジェネティクス関連酵素の同定に成功した.それらのサブタイプを含めて十数種の候補に対して,細胞内での挙動を検討し,候補タンパク質が真にNOの基質であることを確認出来たことは今後の研究を展開する上で非常に大きい成果と考えている.さらに,研究の方向性を決定する上で,新規性を求めることは当然であるが,研究遂行のしやすさも大きなファクターであると考え,NO要求性について検討して,候補タンパク質の絞り込みを計った.その結果,現在,低濃度のNOによって修飾される2つの異なるエピゲノム制御酵素をピックアップし,これらについて修飾部位,酵素活性について詳細な調査を行い,すでに成果を挙げつている.これらの知見はこれまでにまったく報告が無いことから,病態形成との因果関係が明らかにあればインパクトのある成果として評価されると考えている.2年目は,当該エピゲノム制御酵素がNOによって影響を受けた際に.ゲノム上にどのような変化がもたらされるのかを調査する.そのためには,まず標的遺伝子発現量の変化を捉えなくてはならないため,mRNA発現量をDNAチップなどを使用して解析する必要がある.この解析を進めた上で,変化のあった遺伝子の上流におけるゲノム修飾の有無を種々の方法から明らかにする予定である.さらには,既存/新規抗がん薬はエピゲノム修飾酵素に対してデザインされているものもあることから,NOによる作用との違いを薬理学的に調べる予定である.
ストレス応答におけるCa^<2+>とCa^<2+>依存性タンパク質の役割

本研究の目的は、ストレス応答初期過程におけるシグナル伝達の分子機構をCa^<2+>シグナルを中心に、酵母を用いて解き明かすことである。前年度までに、Ca^<2+>の流入に欠損を持つmid1変異株、およびCa^<2+>シグナルの受容また又は伝達に欠損をもつと予想されるmid2変異株とmid5変異株の分子生物学的解析を行った。その中で、本年度は、mid1変異株とmid2変異株に関して解析の最終段階を完了し、それぞれ論文発表した。一方、mid5変異株に関しては次の研究成果を得た。まず、mid5変異株は性フェロモンの作用によりshmooと呼ばれる細胞に分化した後死ぬだけでなく、栄養飢餓ストレスの条件下でも死に易いことを明らかにした。また、MID5遺伝子は哺乳類のMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MEKK)と相同な酵素をコードしているBCK1遺伝子と同一であることを明らかにした。興味深いことに、これまで他の研究グループにより、PKC1→BCK1→MKK1&2→MPK1というMAPキナーゼカスケードが存在し、浸透圧の調節に機能することが示されていた。しかし、細胞増殖を停止させるという意味でのストレスである、性フェロモンの作用時や栄養飢餓の状態において、このカスケードを構成するキナーゼ群が機能しているかどうか調べられていなかった。そこでそれを調べた結果、MID5(BCK1)遺伝子の下流ではたらくMKK1&2遺伝子あるいはMPK1遺伝子の欠損株はそれぞれ、性フェロモン存在下および栄養飢餓時においてmid5変異株と同じく死に易いことを明らかにした。以上の結果から、このカスケードは上記のストレス時に機能するものと考えられる。
テルペンおよびヌクレオシド系抗生物質生合成マシナリーの解明とエンジニアリング

Streptomyces sp.SANK60404株のゲノム解析の結果、ゲラニルゲラニルジリン酸(GGPP)合成酵素と隣接して存在するテルペン環化酵素を2つ見出した。これらの推定テルペン環化酵素の組換えタンパク質を調製し、GGPPを基質に用いた酵素反応産物の構造解析を行った結果、nephthenolとcembrene Cのイソプロピリデン異性体とcembrene Aに加えて15員環骨格の新規炭化水素化合物が得られた。一方、Streptomyces sp.OM-6519株のゲノム解析からは、メバロン酸経路遺伝子群、GGPP合成酵素、シトクロームP450、テルペン環化酵素と相同性の高い配列がクラスターを形成していることを見出した。この推定テルペン環化酵素もGGPPを基質に用いた酵素反応でのみ生成物が確認でき、その反応産物は、5-8-5員環骨格を持つ新規炭化水素化合物cyclooctat-7,10(14)-dieneであることを明らかにした。いずれも、新規なジテルペン環化酵素であることが明らかにすることができた。さらに、SANK60404株の生産するヌクレオシド系抗生物質A-94964の生合成遺伝子クラスターの一部を含むと考えられるcontigを同定した。その一部の領域を含むDNAをプローブとしてSANK60404ゲノムライブラリーから約40kbpの遺伝子断片を含むコスミドを取得した。本コスミドをプロトプラスト/PEG法によりStreptomyces albus G153株に導入し、その形質転換株の培養液をHPLCおよびLC-MS/MSを用いて分析したところ、A-94964およびその類縁体の生産が確認されたことから、このコスミドはA-94964の生合成に必要な全ての遺伝子を含むと結論し、その全塩基配列を決定した。その結果、このコスミドには30個のORFからなる遺伝子群があり、その中にはI型PKS/FASホモログが存在することが判明した。次に、このI型PKS/FASホモログを破壊したコスミドを作製し、そのコスミドを導入したS. albus G153形質転換体の培養液を分析したところ、A-94964およびその類縁体の生産性は失われていた。以上の結果から、I型PKS/FASホモログがA-94964の脂肪側鎖の合成に関わっていることが示唆された。これは、I型PKS/FASホモログがヌクレオシド系抗生物質の生合成に関与している初めての例である。
単一心筋細胞のNa-Ca交換電流の性質について

今年度は、3つの事をした。1つめは、岡崎の生理学研究所から山形大学医学部薬理学教室に赴任して、パッチクランプ装置を完成した。2つめは、研究課題の一つであった、「心筋のNa-Ca交換は同時型かピンポン型か」の問いに答える為、モルモット単一心室筋細胞でNa-Ca交換電流の大きさを、様々なイオン条件下で測る実験を行い、そのデ-タの解析を、統計用コンピュ-タ-ソフトSASを用いて、詳細に行った。細胞内Naの濃度を高くすると、細胞外CaのNa交換担体に対する親和性は、低くなる(CaのKm値は、大きくなる)。この結果は、同時型の3型のうち2型、即ちKm=Kd型とKm<Kd型を否定し、ピンポン型か、同時型の残りの1型、即ちKm>Kd型を支持する。これら後2者のうちどちらかを決定するのは、Km/lmax値である。この値は、細胞内Naの濃度が高くなると、小さくなる傾向を示したので、同時型(Km>Kd)のように見える。しかし、その値が小さく、信頼限界が、異なる細胞内Na濃度間で大部分重なってしまうため、Km/lmax値に有意差があると断定できない。従って、ピンポン型か同時型のうちのKm>Kd型のどちらかを結論付けることが困難であった。そこでこの問題は、引き続き次年度に別の実験方法で調べることにした。ここまでの経過は、論文にまとめ、Journal of General physiologyに投稿し、受理された。3つめは、心筋では、Kイオンは、Na-Ca交換で運ばれていないことを明らかにした。これは、眼の桿体細胞のNa-Ca交換とは、異なる性質である。これについては、Pflugers Archievにショ-トコミュニケ-ションとして発表した。
イオン輸送タンパク質における動的構造変化の解析

本研究は高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を光駆動プロトンポンプタンパク質、バクテリオロドプシン(bR)に適用し、bRが光を受容し機能する際に起こる構造変化を直接観察し、どのような構造変化を起こすのかを明らかにすることが目的である。1.bRは暗状態で570nm程度に極大吸収をもち、光で開始される反応サイクル中に、410nm程度に極大吸収をもつ中間体(M中間体)を生成する。本年度は、緑色の光(532nm)と、青色の光(408nm)を照射することで、高速AFMで観察されたbRの構造変化がどの中間体に由来するのかを明らかにした。最初に,緑色の光照射(532nm)によってbRの構造変化が開始される。この構造変化したbRに冑色の光(408nm)を照射すると、構造が元の状態へ戻る様子が観察された。この結果は観察されたbRの構造変化は光反応サイクル中に生成されるM中間体であるという直接的証拠であると共に、タンパク質表面で起こる大きな構造変化は、タンパク質内部に位置する小さな発色団の異性化状態で決められていると結論できる。2.bRのAsp85をThrやSerに置換したbR変異体D85T,D85SはC^-ポンプになることが知られている。そこで、C^-をポンプするbR変異体D85Sに対して高速AFMを適用し、プロトンとは逆向きに.C^-をポンプする際に起こる構造変化を直接可視化することを試みた。その結果、低C^-濃度下での高速AFM観察により細胞外表面で構造が変化する様子が観察された。C^-結合型の細胞外表面は固い構造をとるように見えるが、非結合型の場合は緩い構造をとるように見える。プロトンポンプタンパク質の場合、プロトンは細胞質から取り込まれ、構造変化は細胞質表面に限られる。一方、C^-ポンプタンパク質の場合、C^-は細胞外から取り込まれ、構造変化は細胞外表面で起こる。イオンを取り込む側と、構造変化する部位には相関があり、これらの結果はイオンポンプタンパク質において、大きな構造変化はイオンを取り込む部位に必要であると結論できる。本研究は高速原子間力顕微鏡(高速AFM)をイオン輸送タンパク質であるバクテリオロドプシン(光駆動プロトンポンプ)に適用し、バクテリオロドプシンが光を受けて機能を発現する際の構造変化を直接計測(可視化)し、どのような構造変化を起こすのかを明らかにすることが目的である。1.バクテリオロドプシン変異体には、暗状態でもpH変化により、構造変化を起こすタンパク質(D85N,D85N/D96N)が報告されている。D85N変異体は、中性pHでは野生型の基底状態と同様の構造を示すが、アルカリpH(pH>10)では野生型の光励起中間体であるM中間体と同様の構造を示すことが知られている。また、D85N/D96N変異体は中性pHで既に野生型のM中間体と同様の構造を示す。そこで1年目は、これら変異タンパク質の高速AFM計測を行い、どのような条件(走査範囲nmやpixel数)で、どのようなAFM画像(空間分解能nm)を得ることができれば、基底状態と中間体状態の2つの構造が区別できるのかを調べた。最初にAFM画像の空間分解能と密接に関係しているTipの改良に取り組んだ。AFMはカンチレバーに取り付けられたTipの先端で試料表面をなぞり凹凸情報をイメージングするため、Tip先端が鋭いほど空間分解能の高い画像が得られる。そのため、バクテリオロドプシン1分子を認識できるほど先端の鋭いTipを再現よく作成できる条件を検討した。さらにAFMデータのノイズをできるだけ少なくするため、高速AFM用スキャナーに改良を加えた。これらの工夫により、走査範囲30×30nm,200pixelsの条件でAFM計測を行えば、バクテリオロドプシンの2つの構造(基底状態と中間体状態)を明確に区別できることが分かった。特に、アルカリpHでのD85Nバクテリオロドプシン1分子は、中性pHと比べて、タンパク質の中心から外側へ開いている構造が確認できた。また、D85N/D96N変異タンパク質も同様に外側へ開いている構造を観測することができた。本研究は高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を光駆動プロトンポンプタンパク質であるバクテリオロドプシン(bR)に適用し、bRが光を受けて機能を発現する際の構造変化を直接可視化し、どのような構造変化を起こすのかを明らかにすることが目的である。1.野生型bRの光反応サイクルは約10msであり、高速AFMでも、その構造変化を明瞭に捉えることは難しい。そこで、光反応サイクルが野生型に比べて1000倍程度遅いD96NbR変異体を用いた。1 frame/secの高速AFM観察の結果、細胞質表面で光照射によって各bR分子が3量体の中心から外側に開く構造変化が明瞭に観察された。この構造変化は光を切った後、数秒で元の状態に戻り、光に応答して繰り返し観察される高い再現性を示した。その一方で、細胞外表面は光照射による顕著な構造変化は観察されなかった。7本のα-ヘリックス(AG)の原子モデルと比較すると、高速AFMで観察された構造変化はE-Fループの変位と考えられる。bRの光反応サイクルはpHに依存し、アルカリ環境下では光反応サイクルが長くなることが知られている。

そこで、pH7,8,9で高速AFM観察を行い励起状態(構造変化している状態)の寿命を比較した。その結果、分光測定の結果と同様にpHに依存して励起寿命が長くなった。この結果は、高速AFMで観察された構造変化が探針・試料間接触によるアーティファクトでないことを示しており、真にbRの機能(光駆動プロトンポンプ)と関係した構造変化であると結論できる。2.励起する光の強度を変えることで、反応するbRの分子数をコントロールした。その結果、周りのbR分子の状態によって、励起寿命が変化する協同性を示すことが分かった。この協同性は、3量体内の分予間で起こるのではなく、隣り合う3量体に属するbR分子間で起こる。興味深いことに、この協同性は、全bR分子の挙動を平均化した解析では打ち消されるが、個々のbR分子の振る舞いを高速AFMで詳細に解析することで分かってきた新事実である。本研究は高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を光駆動プロトンポンプタンパク質、バクテリオロドプシン(bR)に適用し、bRが光を受容し機能する際に起こる構造変化を直接観察し、どのような構造変化を起こすのかを明らかにすることが目的である。1.bRは暗状態で570nm程度に極大吸収をもち、光で開始される反応サイクル中に、410nm程度に極大吸収をもつ中間体(M中間体)を生成する。本年度は、緑色の光(532nm)と、青色の光(408nm)を照射することで、高速AFMで観察されたbRの構造変化がどの中間体に由来するのかを明らかにした。最初に,緑色の光照射(532nm)によってbRの構造変化が開始される。この構造変化したbRに冑色の光(408nm)を照射すると、構造が元の状態へ戻る様子が観察された。この結果は観察されたbRの構造変化は光反応サイクル中に生成されるM中間体であるという直接的証拠であると共に、タンパク質表面で起こる大きな構造変化は、タンパク質内部に位置する小さな発色団の異性化状態で決められていると結論できる。2.bRのAsp85をThrやSerに置換したbR変異体D85T,D85SはC^-ポンプになることが知られている。そこで、C^-をポンプするbR変異体D85Sに対して高速AFMを適用し、プロトンとは逆向きに.C^-をポンプする際に起こる構造変化を直接可視化することを試みた。その結果、低C^-濃度下での高速AFM観察により細胞外表面で構造が変化する様子が観察された。C^-結合型の細胞外表面は固い構造をとるように見えるが、非結合型の場合は緩い構造をとるように見える。プロトンポンプタンパク質の場合、プロトンは細胞質から取り込まれ、構造変化は細胞質表面に限られる。一方、C^-ポンプタンパク質の場合、C^-は細胞外から取り込まれ、構造変化は細胞外表面で起こる。イオンを取り込む側と、構造変化する部位には相関があり、これらの結果はイオンポンプタンパク質において、大きな構造変化はイオンを取り込む部位に必要であると結論できる。
手動運転車との混在を考慮した交通工学的視点での自動運転車の効率性・安全性評価

幹線道路における自動運転車の走行を想定し,自動運転車と手動運転車の混在環境,自動運転と手動運転の切り替えの可能性を視野に入れ,自動運転車が交通流の安全性・効率性に及ぼす影響を把握することを目指して,分析の方法論を開発する.研究初年度は以下の3テーマについて取り組んできた.すなわち,(1)自動運転車の発展段階と想定される機能・性能に関する調査,(2)画像データを活用した車両挙動のモデル化と自動運転特性の反映,(3)自動運転車・手動運転車混在環境下における運転挙動に関する室内実験である.(1)については,自動運転車の挙動特性を概括するため,その発展段階と機能・性能に関して,主として文献調査を実施した.レベル3の自動運転を想定して,特に自動運転から手動運転への移行時における課題に対処するための模擬走行実験を実施することとした.(2)については,サグ部を対象とした交通流画像から個車情報を用いた渋滞発生要因の分析を実施し,渋滞発生の可能性が高い状況として車線利用の偏りに着目した.(3)では,ドライビングシミュレータを利用した室内実験の設計を行った.(1)で示したとおりにレベル3の自動運転を想定し,TOR(Take Over Request)発生時の安全かつ円滑な運転の引継上の課題を明らかにするための模擬走行実験を設計し,予備実験を実施した.予備実験の結果を踏まえて,本線交通量の大小,自動運転時のセカンドタスクの有無,周辺交通状況に関する情報提供の有無を実験設計の主要因として,本実験の設計に取り組むこととした.研究初年度の実施項目の中で,自動運転車・手動運転車混在環境下における運転挙動に関する室内実験については,レベル3の自動運転に対象を絞り,TOR発生時の運転挙動の分析を試みる模擬走行実験とすることを決定し,既に実験設計についても細部を詰め,予備実験も実施してきており,当初計画上回る進捗状況である.一方,画像データを活用した車両挙動のモデル化については,個別車両の挙動の分析・モデル化に十分な精度を確保できるデータの入手に時間を要したこともあり,当初予定よりは少し遅れてはいる.各テーマの実施状況に多少差異はあるが総合的に見れば,ほぼ予定取りの計画で進捗していると判断できる.研究2カ年目の2019年度は,自動運転システムからドライバーに運転を委ねる権限移譲要求(Take Over Request:TOR)発生時の模擬走行実験をドライビングシミュレータを用いて実施する.実験の設計などは初年度に相当程度固まっているので,できるだけ早期に実験実施および分析を行う予定である.一方,画像データを活用した車両挙動のモデル化については,上述の通り初年度のデータ入手の遅れがあったが,本年度は学生による研究補助の体制も手厚くして,遅れを取り戻す計画としている.幹線道路における自動運転車の走行を想定し,自動運転車と手動運転車の混在環境,自動運転と手動運転の切り替えの可能性を視野に入れ,自動運転車が交通流の安全性・効率性に及ぼす影響を把握することを目指して,分析の方法論を開発する.研究初年度は以下の3テーマについて取り組んできた.すなわち,(1)自動運転車の発展段階と想定される機能・性能に関する調査,(2)画像データを活用した車両挙動のモデル化と自動運転特性の反映,(3)自動運転車・手動運転車混在環境下における運転挙動に関する室内実験である.(1)については,自動運転車の挙動特性を概括するため,その発展段階と機能・性能に関して,主として文献調査を実施した.レベル3の自動運転を想定して,特に自動運転から手動運転への移行時における課題に対処するための模擬走行実験を実施することとした.(2)については,サグ部を対象とした交通流画像から個車情報を用いた渋滞発生要因の分析を実施し,渋滞発生の可能性が高い状況として車線利用の偏りに着目した.(3)では,ドライビングシミュレータを利用した室内実験の設計を行った.(1)で示したとおりにレベル3の自動運転を想定し,TOR(Take Over Request)発生時の安全かつ円滑な運転の引継上の課題を明らかにするための模擬走行実験を設計し,予備実験を実施した.予備実験の結果を踏まえて,本線交通量の大小,自動運転時のセカンドタスクの有無,周辺交通状況に関する情報提供の有無を実験設計の主要因として,本実験の設計に取り組むこととした.研究初年度の実施項目の中で,自動運転車・手動運転車混在環境下における運転挙動に関する室内実験については,レベル3の自動運転に対象を絞り,TOR発生時の運転挙動の分析を試みる模擬走行実験とすることを決定し,既に実験設計についても細部を詰め,予備実験も実施してきており,当初計画上回る進捗状況である.一方,画像データを活用した車両挙動のモデル化については,個別車両の挙動の分析・モデル化に十分な精度を確保できるデータの入手に時間を要したこともあり,当初予定よりは少し遅れてはいる.各テーマの実施状況に多少差異はあるが総合的に見れば,ほぼ予定取りの計画で進捗していると判断できる.研究2カ年目の2019年度は,自動運転システムからドライバーに運転を委ねる権限移譲要求(Take Over Request:TOR)発生時の模擬走行実験をドライビングシミュレータを用いて実施する.実験の設計などは初年度に相当程度固まっているので,できるだけ早期に実験実施および分析を行う予定である.一方,画像データを活用した車両挙動のモデル化については,上述の通り初年度のデータ入手の遅れがあったが,本年度は学生による研究補助の体制も手厚くして,遅れを取り戻す計画としている.
音楽演奏における熟達化の認知心理学的研究

対人コミュニケーションの研究から、送り手が「受け手のメンタルモデル」を持つことの重要さが指摘されているが、演奏者のアイディアを聞き手に伝えることが求められる音楽演奏領域でも、「聞き手のメンタルモデル」ないしはそれと同等の機能を持つ何らかの装置の獲得が欠かせないだろう。本研究では「音楽演奏におけるメンタルモデルの構成と利用」に焦点を当て、メンタルモデルが熟達に伴ってどのように獲得されるか、メンタルモデル構成による演奏の変化はあるか、どのような訓練がメンタルモデルの利用を含むreflectiveな練習態度の獲得を促すかを検討した。主な結果は以下のとおりである。(1)大学生を対象に行ったピアノの練習過程の分析から、卒然達者は彼らの演奏を「演奏が聞き手にどう聞こえるか」という観点からreflectiveにチェックするが、初級者はそのような作業をほとんど行わないことが明らかになった。(2)職業的ピアニストに複数の異なる聞き手を想定させ演奏させた実験からは、彼らが想定された聞き手が持っていると考えられる特徴に合う形に演奏を(意図せずに)調整していることが明らかになった。これらの結果は、熟達に伴って「聞き手のメンタルモデル」の獲得・利用が進むことを示唆している。(3)ピアノの準熟達者の大学生に、ビデオに録画されたチェロの演奏に合わせて伴奏することを求めた実験では、ぎこちない伴奏しかできない者は映像や記憶に頼った調整を試みていたのに対して、優れた伴奏をした者は映像に頼ることなく演奏からチェロ奏者の呼吸を読み取り、自分の演奏を適切に調整できていたことが明らかになった。この結果は、優れた伴奏者が適切なメンタルモデルを構成・利用していることを示唆している。(4)「reflectiveな練習態度」は、楽曲の構造特徴に注目するよう教示した比較的短期間の訓練によって強めることが可能であることが、音楽科大学生を対象とした実験から明らかになった。「他者のメンタルモデル」の獲得と利用が熟達に伴ってどのように進展するかについて検討するため、初級者が弾ける程度の難易度の曲を用意して、大学生のピアノ初級者と準熟達者に練習が完成したと思えるまで練習をしてもらい、その間20分毎に練習目的とねらいを報告させた。分析の結果、初級者達は正確でスムースな演奏が練習の目的で、演奏表現についての言及はほとんどないだけでなく、それを考えるのは自分の仕事ではないと考えていたことが明らかになった。それに対して準熟達者達は、理解した楽曲構造にふさわしい演奏表現を工夫するために多くの探索と熟考を繰り返し、工夫の効果を確かめるために「演奏が聴き手にどう聴こえるか」という観点でチェックしていた。さらに熟達者についてのデータを得るため、職業的ピアニストとして訓練を受けた2人の演奏者に「演奏会のアンコール曲としての演奏」と「幼稚園児の誕生会での演奏」という2つの場面を想定した演奏を求め、異なった複数の聴き手を想定することによる演奏の違いが検討された。コンピュータに取り込んだデータを音量の指標であるvelocityの値について分析したところ、(1)演奏会場面での演奏は幼稚園場面よりもフレーズと音量の増減の対応が丁寧で、フレーズの始まりと終わりはより小さな音量で、中程はより大きな音量で演奏された、(2)演奏会場面での演奏では、フレーズに対応した音量の増減によってバス旋律や内声部の旋律を伴奏から浮き上がって聴こえるような工夫があり、曲の複層的な構造が表現された、など、2人の演奏者に共通した特徴がみられた。これらの結果は(準)熟達者達が「聴き手を想定して演奏をtuneする」という操作を行っていることを示しており、熟達が進むにつれて「聴き手のメンタルモデル」が獲得されることを示唆している。

昨年度の研究成果(ピアノ演奏領域では熟達に伴って「他者のメンタルモデル」の獲得と利用が進展し聴き手の特徴に合わせた演奏調整が行われること)をふまえて、今年度は新たに合奏を取り上げ、相手の演奏に合わせて自分の演奏を調整するという形のinteractivenessについて検討するための材料作成と予備的実験を行った。合奏では相手の演奏を聴いてからそれに合わせて自分の演奏を調整していたのではタイムラグが生じる。タイムラグなしにタイミングを同期させるために不可欠な「合奏相手のメンタルモデル」の形成が、熟達に伴うかを検討することを目的としている。具体的には、短時間の練習で正確な演奏が可能でかつビデオのモニターを見ながら演奏できる程度の難易度の2曲(グノーの「アヴェ・マリア」とサン・サーンスの「白鳥」)について、チェロの熟達者の演奏をビデオ並びにDAT収録し、ビデオに収録されたチェロ奏者の演奏に合わせて、伴奏部分をピアノで演奏させる実験を行った。実験の参加者は大学生のピアノの準熟達者で、合奏経験の豊かな学生と比較的経験の少ない学生各2名である。演奏はハードディスクレコーディング装置およびマイク(いずれも平成15年度購入済み)を用いて録音した。演奏終了後、合奏時に考えたことを口頭で報告させるとともに、チェロの演奏表現並びに伴奏の際に心がけたことを楽譜上に記載させた。なおチェロの演奏については、データの分析からそれぞれの音符の立ち上がりのタイミングを決め、伴奏部分とのタイミングのずれを求められるよう、データを整えた。合奏実験については、合奏経験の多い演奏者はテンポがフレーズ内で大きく変化するチェロの演奏にあった調整が可能なこと、それに対して経験の少ない演奏者は調整が不十分なことが明らかになった。なお、昨年度の研究成果については論文にまとめて学会誌に投稿し、修正採択された。ピアノ演奏におけるメンタルモデルの役割を検討した昨年度までの研究(ピアノ演奏の熟達者は聴き手のメンタルモデルを形成・利用し、聴き手の特性に合わせた演奏の調整を行う)をふまえ、今年度は合奏場面における演奏の調整を取り上げた。タイミングの同期のためには、合奏相手のメンタルモデルを形成してこれからなされるであろう演奏を予測し、「予測された他者の演奏」に対して自分の演奏計画を調整しなければならない。合奏の上手な演奏者とそうでない演奏者では、演奏の仕方ならびに演奏方略にどのような違いがあるかを検討するため、比較的短時間の練習で正確な演奏ができる程度の難易度の曲(サン・サーンス作曲「白鳥」と、フォーレ作曲「夢の後に」)について、チェロの熟達者の演奏をビデオに収録し、モニターに再生されたチェロ奏者の演奏に合わせてピアノ専攻大学生に伴奏部分をピアノで5回ずつ演奏させた。伴奏はハードディスクレコーディング装置およびマイク(いずれも平成15年度購入済み)によって録音した。演奏終了後、伴奏時に考えたことを口頭報告させた。「白鳥」について経験豊かな評定者が評価した結果、1名は「優れた伴奏者」、7名は「ぎこちない伴奏者」と定評された。伴奏経験が多くても「ぎこちない」と評定された3名の演奏者は、「相手が(伴奏に)合わせてくれないので難しかった」と報告した。
日本語音声教育支援システムの評価と改善-授業実践における利用とその分析を通して-

本年度は国内外の現場教師と連携し,実際の現場において本システムの利用を通した評価を行うと同時に,その本システムを利用した音声教育実践の検討と分析を行ってきた。また,前年度に引き続き,日本語音声教育を中心に音声データベース,CAI,CALL,音声分析ソフトなどを収集・試用し,音声教育へのコンピュータ利用可能性の観点から現状と問題点を整理・分析することを通して,本システムの評価を行った。その結果,音声教育支援のためのコンピュータの機能として大きく(1)音声の検索・整理・分析,(2)聞き取り・発音練習,(3)比較,(4)視覚化,(5)合成,(6)評価が整理され,本システムでは特に(4)が(2)(3)と組み合わされた形で配備されており,授業実践においては教師の適切な支援により,学習者のメタ認知を効果的に促し得るものとして評価された。具体的には,学習者が自律的に自身の発音・聞き取り上の問題点を改善するための認知過程,つまり「問題点の認知と分析→改善のための試行錯誤→修正」の過程において,教師が本システムを活用することにより,学習者による認知対象の観察と制御を支援し,学習者のメタ認知を活性化する事例を見出すことができた。しかし,コンピュータの効果的な利用に際しては,各現場において上記機能をいつ,何のためにどのように利用するのか、コース・デザインの中で考えることが大前提であることが改めて指摘される。場当たり的にあるリソースを安易に利用するのでは意味がなく,体系的・計画的・継続的な音声教育のどこにどのように組み込んでいくのかが十分に検討されなければならない。音声教育の理念的な検討が不十分であることが,コンピュータの音声教育への利用に向けた大きな課題である。本研究の目的は,以下の3点である。1.開発した日本語音声教育支援システムを国内外の教師と連携し,授業実践での利用を通して評価する。2.1の現場における具体的な利用方法や授業の分析を通して,音声教育におけるコンピュータ利用のあり方,教師の役割について検討する。3.1,2を踏まえて日本語音声教育支援システムを改善し,音声教育の実践と研究に関する提案を行う。本年度は,国内の現場教師と連携し,実際の現場において本システムの利用を通した評価を行っている。具体的には,インタビューやアンケートの手法を用いて,教師と学習者を対象に本システムの利用を通したフィードバックを得た。さらに,本システムの記録機能やテープ,ビデオ等によって,授業実践の録音・録画を試みている。これによって,本システムを利用した音声教育実践の検討と授業分析を行うためのデータが収集され,特に本システムを利用している場面での教師と学習者の発話や行動を中心に機能等でカテゴリー化し,教師の教育観や本システムの利用方法,学習者の反応や学習上の変化,態度変容等について縦断的に分析することが可能になる。1.本年度は現場教師と連携し,実際の現場において本システムの利用を通した評価を行うと同時に,その本システムを利用した音声教育実践の検討と分析を行ってきた。その結果,日本語教育の現場では本システムを組み込むような音声教育のためのコース・デザインがほとんどない現状が明らかになった。そのため,メインとなる日本語コースとは別の個別指導場面における利用例が多く,計画的,継続的,体系的な指導場面での評価が得にくい状況にあった。そこで,本システム中の使用機能を固定した上で,現場での使用目的を会話,スピーチ,聴解,発音などのコースで,個別あるいは全体のクラス形態で,学習者が聞き取れない対象,学習者自身による自己評価が低い対象などについて,本システムによる支援場面を主にデータ収集し,分析する方向で進めていくこととした。
カエル卵細胞へのmRNA注入による光受容分子の電気生理学的研究

アフリカツメガエル卵母細胞に夜行性動物の網膜から抽出したmRNAを注入すれば,視細胞に存在し光受容に関与している物質が翻訳,発現されると予想される.この様にして発現された光受容分子の機能を主に電気生理学的方法を用いて検討するための卵母細胞によるmRNA翻訳システムを作製する事が今年度の目標であった.まず卵母細胞の電気生理学的記録・測定システムを今年度予算で購入したコンピューター, A-Dコンバーターと現有する微小電極用増幅器および膜電位固定用増幅器とを接続して組み立て,実験制御およびデーター記録を行うプログラムを開発した.次に, mRNA注射実験にさきだちシステムのシストをかねて卵母細胞自身の電気的性質や培養条件を求める実験を開始した.日本産のツメガエルは機械的外傷に弱かったので摘出方法を機械的なものからコラゲナーゼをもちいた方法に変更した.卵母細胞培養液として広く使用されているBarth液を単離直後より使用しても膜電位,膜抵抗を保つことはできなかったので培養方法についても検討を加えた結果23日間は卵母細胞を培養できるようになった.そこで, 50羽のヒヨコ網膜よりmRNAをグアニジンSCN法で抽出し,試作した微量注射装置で卵母細胞一個あたり50nlづつ注射した後24時間培養したところ,視細胞からの光情報伝達に関与している神経伝達物質の一つであるγ-アミノ酪酸(GABA)に対する応答が出現した.投与されたGABAの濃度に応じて卵母細胞は膜抵抗の減少を伴った脱分極をしめした.この応答の逆転電位は-20mVであった.また,応答の振幅がGABA投与開始直後に最大となった後指数関数的に減少し数分以内にほぼ消失する特微的な脱感作が観察された.このような応答の特性は,以前から中枢細胞系で知られていたGABA受容体の性質と一致する.このように今年度作製したmRNA翻訳システムは予定どおり作動し,正常に機能する受容体タンパクを卵母細胞の上に再構成する事ができることがわかった.アフリカツメガエル卵母細胞に夜行性動物の網膜から抽出したmRNAを注入すれば,視細胞に存在し光受容に関与している物質が翻訳,発現されると予想される.この様にして発現された光受容分子の機能を主に電気生理学的方法を用いて検討するための卵母細胞によるmRNA翻訳システムを作製する事が今年度の目標であった.まず卵母細胞の電気生理学的記録・測定システムを今年度予算で購入したコンピューター, A-Dコンバーターと現有する微小電極用増幅器および膜電位固定用増幅器とを接続して組み立て,実験制御およびデーター記録を行うプログラムを開発した.次に, mRNA注射実験にさきだちシステムのシストをかねて卵母細胞自身の電気的性質や培養条件を求める実験を開始した.日本産のツメガエルは機械的外傷に弱かったので摘出方法を機械的なものからコラゲナーゼをもちいた方法に変更した.卵母細胞培養液として広く使用されているBarth液を単離直後より使用しても膜電位,膜抵抗を保つことはできなかったので培養方法についても検討を加えた結果23日間は卵母細胞を培養できるようになった.そこで, 50羽のヒヨコ網膜よりmRNAをグアニジンSCN法で抽出し,試作した微量注射装置で卵母細胞一個あたり50nlづつ注射した後24時間培養したところ,視細胞からの光情報伝達に関与している神経伝達物質の一つであるγ-アミノ酪酸(GABA)に対する応答が出現した.投与されたGABAの濃度に応じて卵母細胞は膜抵抗の減少を伴った脱分極をしめした.この応答の逆転電位は-20mVであった.また,応答の振幅がGABA投与開始直後に最大となった後指数関数的に減少し数分以内にほぼ消失する特微的な脱感作が観察された.このような応答の特性は,以前から中枢細胞系で知られていたGABA受容体の性質と一致する.このように今年度作製したmRNA翻訳システムは予定どおり作動し,正常に機能する受容体タンパクを卵母細胞の上に再構成する事ができることがわかった.
リンパ節転移巣の微小循環特性の解析とそれに基づく抗癌剤到達亢進の研究

アンギオテンシンII(A II)による昇圧は腫瘍血流のみを増加せしめ、また降圧剤による一定の低血圧は腫瘍血流のみを停止せしめるが、この腫瘍血管の特性の利用は抗癌剤の新しいデリバリ-・システムの開発を可能にしてきた。この腫瘍血管特性は血流のみならず、腫瘍の所属リンパ節に流入するリンパ流にも大きな影響をもたらす。本研究は昇圧および降圧によりリンパ節転移巣におけるリンパ流の変化の定量とドラッグ・デリバリ-について検討したものである。ラットの耳介に腫瘍を移植し作成した頚部リンパ節転移巣において、A II昇圧時およびSNP降圧時の血流とリンパ流とを電解式水素ガスクリアランス法の変法を工夫して計測した。昇圧によりリンパ節転移巣の血流は他臓器での増殖巣におけると同様に増加するが、昇圧12分後にリンパ流の増量が認められた。しかし、転移巣に流入するリンパ流量は耳介の腫瘍の大きさと転移巣の大きさとの関係により異なった。また、降圧時には腫瘍血流は殆ど停止し、リンパ流も著明にに減少した。昇圧時には、血行性とリンパ行性の相加により、リンパ節転移巣への抗癌剤の到達量の亢進がみられ、化学療法効果の増強が認められた。昇圧と降圧の組み合わせによる薬剤の組織内濃度×滞留時間の検討は原発巣では完了したが、リンパ節転移巣においては検討中である。腫瘍血管形成の研究と腫瘍の微小循環学的解析を基礎的に行っているが、本研究はそれらの研究成果と相俟ってリンパ節転移巣の対策に貢献するものと考える。とくに、リンパ節転移巣を標的とする術前化学療法に有用といえる。
難治性疼痛に対する新規治療薬ならびに特異的治療法の開発

Morphineの鎮痛作用が神経障害性疼痛において著しく低下する原因を解明すると共に、神経障害性疼痛に対しても極めて有効な新規鎮痛薬としてamidino-TAPAを開発し、その鎮痛作用が神経障害性疼痛においても維持されるメカニズムを解明した。また、神経障害性疼痛発症時に特異的に低下するμ受容体スプライスバリアントを一過性に補充することによる、神経障害性疼痛に対するジーンセラピーの確立を試みた。難治性疼痛は、神経障害性疼痛、癌性疼痛、炎症性慢性疼痛など、その制御が困難な激しい疼痛の総称であり、morphineに対して抵抗性を示すことが特徴である。実際に、座骨神経結紮神経障害性終痛モデルマウス(Seltzerモデル)を用い、脊髄くも膜下腔内(i.t.)投与によるmorphineの抗侵害作用をvon Freyフィラメント法によって評価したところ、morphineの抗侵害作用は神経結紮側足において著しく低下し、神経障害性疼痛のmorphineに対する抵抗性が確認された。これに対し、近年研究代表者らが開発した新規鎮痛薬amidino-TAPAのi.t.投与による抗侵害作用は、神経結紮側足においても完全に維持されており、amidino-TAPAは神経障害性疼痛に対しても極めて有効である事が明らかとなった。また、morphineとamdino-TAPAのi.t.投与による抗侵害作用の発現に関わる脊髄μオピオイド受容体スプライスバリアントを、μオピオイド受容体DNAの各exon選択的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用い、tail-flick法およびvon Freyフィラメント法において検討した結果、molphineの抗侵害作用はtail-flick法、von Freyフィラメント法ともにexon-1含有μオピオイド受容体スプライスバリアントのみを介して発現するのに対し、amidino-TAPAの抗侵害作用は、tail-flick法、von Freyフィラメント法ともにexon-1含有μオピオイド受容体スプライスバリアント、MOR-1J、MOR-1KおよびMOR-1Lを介して発現することが明らかとなった。現在、神経障害性疼痛に対するamidino-TAPAのi.t.投与による抗侵害作用の発現における、各μオピオイド受容体スプライスバリアントの関与を、同様にvon Freyフィラメント法を用いて解析中である。平成19年度に研究代表者らは、神経障害性疼痛の発症時にはmorphineの鎮痛作用は著しく減弱する一方、新規鎮痛薬amidino-TAPAの鎮痛作用は維持されていることを発見した。そこで、神経障害性疼痛下におけるamidino-TAPAの鎮痛作用の発現に関わるμオピオイド受容体スプライスバリアントを、μオピオイド受容体DNAのexon選択的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用い検討した結果、amidino-TAPAの鎮痛作用はexon-1含有スプライスバリアント、MOR-1J、MOR-1KおよびMOR-1Lを介して発現していることが明らかとなった。また神経障害性疼痛発症時における、脊髄後角ならびに脊髄後根神経節における各スプライスバリアントの発現量の変化を、RT-PCR法を用い坐骨神経結紮後経日的に測定した結果、脊髄後根神経節においては坐骨神経結紮後exon-1含有スプライスバリアントの発現量に著しい低下が認められたが、MOR-1KおよびMOR-1Lの発現量には変化は認められなかった。一方、脊髄後角における各スプライスバリアントの発現量には、坐骨神経結紮後全く変動は認められなかった。平成19年度に明らかとなった様に、morphineの鎮痛作用はexon-1含有スプライスバリアントのみを介して発現することから、神経障害性疼痛発症時にmorphineの鎮痛作用が減弱するのは、1次知覚神経終末のexon-1含有スプライスバリアントの発現が低下することに基づくことが明らかとなった。一方、1次知覚神経終末のMOR-1KおよびMOR-1Lの発現量は坐骨神経結紮後も変化しないため、神経障害性疼痛発症時においてもamidino-TAPAの鎮痛作用は維持されることが明らかとなった。また、炎症性慢性疼痛発症時におけるmorphineの鎮痛効力の変化を検討した結果、炎症性慢性疼痛下においては、圧刺激に対するmorphineの鎮痛作用は炎症側・非炎症側共に著しく減弱する一方、熱刺激に対する鎮痛作用は炎症側において逆に増強されることが明らかとなった。現在、炎症性慢性疼痛発症時における、各スプライスバリアントの発現量の変動を検討中である。脱髄性自己免疫疾患である多発性硬化症は、種々の神経機能障害に先立ち激しい疼痛を引き起こし、この疼痛(多発性硬化症疼痛)は、神経障害性疼痛や炎症性慢性疼痛と同様にmorphineに抵抗性を示すことから、難治性疼痛の一種とされている。一方平成19年度に研究代表者らは、新規鎮痛薬amidino-TAPAが神経障害性疼痛に対しても極めて有効であることを明らかにしている。そこで、同じ難治性疼痛である多発性硬化症疼痛に対する、amidino-TAPAの有効性を検討した。

その結果、多発性硬化症疼痛モデルマウスにおいては、morphineの脊髄鎮痛作用はほとんど発現せず、臨床と同様に著しいmorphine抵抗性が認められた。これに対しamidino-TAPAの脊髄鎮痛作用は、幾分その効果は減弱されるが、多発性硬化症疼痛モデルマウスにおいても十分に発現することが明らかとなった。平成20年度に研究代表者らは、神経障害性疼痛時に脊髄後根神経節におけるexon-1含有μ受容体スプライスバリアントmRNAの低下が生じており、一次知覚神経終末におけるexon-1含有μ受容体スプライスバリアント(morphine感受性μ受容体スプライスバリアント)の発現低下が、神経障害性疼痛におけるmorphine抵抗性の原因であることを見いだしている。そこで、代表的exon-1含有μ受容体スプライスバリアントであるMOR-1の遺伝子を脊髄に局所的に補充することによる、神経障害性疼痛のジーンセラピーの開発を試みた。マウス脊髄から抽出したRNAより、MOR-1の完全長cDNAをクローニングし、シークエンス解析によりその核酸配列が正しいことを確認した後、非ウィルス性遺伝子導入試薬を用いて、MOR-1のcDNAを脊髄くも膜下腔内投与によりマウス脊髄に導入した。MOR-1のcDNAを導入後、腰髄を採取してWestern Blotting法によりμ受容体量の変化を測定した結果、MOR-1のcDNAの導入によりμ受容体が増加していることが確認された。現在、神経障害性疼痛モデルマウスに同様にMOR-1のcDNAを導入することにより、神経障害性疼痛におけるmorphine抵抗性が消失するか検討中である。
顕著な抗ウイルス活性を示すユーディストシン類の合成研究

本研究では、高い抗ウイルス活性を示すユーディストミン類の効率的かつ実用的な合成手法の確立を目指して検討を行った。多くの基礎的な合成経路の探索研究を経て、まず初めに、研究代表者らが開発したオルトアルケニルチオアニリドのラジカル環化によるインドール形成反応を鍵反応として用いる合成経路の検討を行った。7員環オキサチアゼピン部分の立体選択的な構築は、ベータラクタムの渡環したオキサチアゼピン環の構築を経て高立体選択的に行うことができた。望みのチオアミドを有する環化前駆体は得られたが、残念ながらインドール骨格の構築は実現できなかった。本研究の過程において、1級アミンからN-アルキルヒドロキシルアミンへの新規変換法を見い出すことができた。さらなる検討の結果、高ジアステレオ選択的Pictet-Spengler反応と、オキサチアゼピン骨格の新規構築法を確立することによって(-)-ユーディストミンCの全合成を達成することができた。まず、インドール部位をMacorらの分子内Heck反応による方法で得た。次に光延反応によりメチルチオメチル基で保護されたヒドロキシルアミン誘導体へと変換した。ここで、GarnerアルデヒドとのPictet-Spengler反応を行ったところ、ジクロロ酢酸存在下高ジアステレオ選択的(11:1)に望みのβ-カルボリン誘導体が生成した。オキサチアゼピン環の構築は、メチルチオメチル基のスルフリルクロリドによるクロル体への変換と、続くチオアセテートの合成、そしてメシラートを有する環化前駆体を用いた閉環反応によって行った。最後にBBr_3によりBoc基の除去とメチルエーテルの切断を行い、(-)-ユーディストミンCの全合成を完了した。本年度は、まず、7員環オキサチアゼピン骨格の構築法のモデル反応を行った。2-インドリルエタノールに対して、窒素原子をニトロベンゼンスルホニル基で活性化し酸素原子をメチルチオメチル基で保護したヒドロキシルアミンを光延反応で導入した。次に、この化合物と3-シロキシピオンアルデヒドとをピクテットシュペングラー反応により縮合させN-メチルチオメトキシテトラヒドロβ-カルボリン骨格を構築した。続いて、メチルチオメチルエーテル基を塩化スルフリルで処理することによってクロロメチルエーテル基へと変換し、このものとチオ酢酸のナトリウム塩を反応させることによって、アセテートとして保護されたチオール部位を導入することに成功した。続いて、シロキシ基をメシルオキシ基へと変換し、アセテートを加メタノール分解すると望みの環化反応が進行し7員環オキサチアゼピン骨格を構築することに成功した。以上の様にモデル反応の基質での7員環骨格の構築に成功したので、次にセリンより導いたGarnerアルデヒドのピクテットシュペングラー反応を用いて環化前駆体となるN-メチルチオメトキシテトラヒドロβ-カルボリン骨格を検討した、問題となるピクテットシュペングラー反応のジアステレオ選択性は、用いる酸および溶媒の種類によって大きな影響を受け、ブレンスデット酸としてクロル酢酸を溶媒としてはトルエンを用いることでもっとも高い選択性で望みのジアステレオマーを与えることが判明した。現在、これらの予備的検討をもとにユーディストミンCの全合成研究を行っている。ジクロロ酢酸を用いたジアステレオ選択的Pictet-Spengler反応と、オキサチアゼピン骨格の新規構築法を確立することによって(-)-eudistomin Cの全合成を達成することができた。インドールユニットをMacorらの分子内Heck反応を利用したインドール合成法を用いて行った。延反応を用いてヒドロキシルアミン誘導体に変換しインドールユニットを合成することができた。

次に、モデル基質でのGarnerアルデヒドを用いたジアステレオ選択的pictet-Spengler反応の検討をふまえてPictet-Spengler反応を行ったところ、ジクロロ酢酸を触媒として用いることで、11:1のジアステレオ選択比でβ-カルボリン誘導体を得ることができた。さらに、インドールの窒素をACE基(α-chloroethoxycarbonyl)で保護し、メチルチオ基をSO_2Cl_2で酸化してクロル体へと導いた。次に酢酸を作用させ、チオアセテートを高収率で得ることができた。さらにアセトニドの除去、続いて一級水酸基のメシル化を経て、環化前駆体とした。環化反応は、メタノール中K_2CO_3存在下加熱還流すると速やかに進行し、同時にACE基も除去され、オキサチアゼピン体を良好な収率で得ることができた。この際、チオホルムアルデヒドが脱離してヒドロキシルアミンとなった後、Oからの環化反応が進行して五員環化合物を与えるのではないかと危惧したが、チオールはPTLCで速やかに精製することにより、単離も可能な程度安定な化合物であった。最後にBBr_3によりBoc基の除去とメチルエーテルの切断を行い、(-)-Eudistomin Cの全合成を完了した。