hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎不全による記憶障害に対する酸化ストレスの影響および苔状線維の変化とEPOの効果

尿毒症性脳障害の一因は,酸化ストレスによる神経細胞傷害であり,これにより学習・記憶障害に至ると考えられる。造血作用のないCarbamylated erythropoietin (CEPO)と抗酸化剤Tempol (TMP)は,この機序を抑制することにより脳保護効果を発揮していると考えられる。【背景・目的】慢性腎不全患者は記憶や学習などの高次脳機能が障害されているが、その病態については不明な点が多い。動物モデルにおいて、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン(rHuEPO)の有効性が数多く報告されており、rHuEPOの脳保護作用の機序として、活性酸素産生を抑制することが明らかにされている。今回、我々は造血作用のないCEPOの慢性腎不全モデルマウスに対する脳保護効果の検討を行った。【方法】マウス(C57BL/6J雄、8週齢)に片腎摘および片腎部分焼灼を行い、腎不全モデルマウスを作製した。偽薬投与対象群(P-Cont群)、CEPO投与対象群(C-Cont群)、偽薬投与腎不全群(P-CRF群)、CEPO投与腎不全群(C-CRF群)の4群を作製した。8週間の経過観察後にマウスの高次脳機能を評価するために、放射状水迷路試験(RAWM試験)を施行した。脳組織の酸化ストレスを評価するために脳海馬における8オキソデオキシグアニン(8-OHdG;酸化DNA損傷マーカー)の免疫組織化学染色を行った。【考察・結論】尿毒症性脳障害の一因は,酸化ストレスによる神経細胞傷害であり、これにより学習・記憶障害に至ると考えられる。CEPOは,この機序を抑制することにより脳保護効果を発揮していると考えられる.【背景・目的】腎不全患者は高次脳機能が障害されているが、その病態は不明な点が多い。今回、我々は造血作用のないCEPOの腎不全モデルマウスに対する脳保護効果の検討を行った。8週間後にマウスの高次脳機能を評価するために、放射状水迷路試験(RAWM試験)を施行した。脳組織の酸化ストレスを評価するために脳海馬の8オキソデオキシグアニン(8-OHdG;酸化DNA損傷マーカー)の免疫組織化学染色を行った。【結果】P-Cont群とC-Cont群およびP-CRF群とC-CRF群の血清尿素窒素は同等であった。また、P-CRF群とC-CRF群のヘマトクリット値に差はなかった。RAWM試験の結果では、P-CRF群はP-Cont、C-Cont群に対して有意にエラー回数が多く、C-CRF群はP-CRF群に対して有意にエラー回数が少なく、CEPO投与による高次脳機能の改善を認めた。脳海馬の神経細胞におけるHE染色では、P-CRF群で変性神経細胞数が有意に多く、C-CRF群はCont群と同等であった。また、同部位の免疫組織化学染色では、P-CRF群の8-OHdGの有意な蓄積とC-CRF群の8-OHdGの抑制を観察した。CEPOは,この機序を抑制することにより脳保護効果を発揮していると考えられる.【背景・目的】慢性腎不全患者は記憶や学習などの高次脳機能が障害されているが、その病態については不明な点が多い。今回、我々は造血作用のないCEPOおよび抗酸化薬Tempol (TMP)の慢性腎不全モデルマウスに対する脳保護効果の検討を行った。偽薬投与対象群(Cont-P群)、CEPO投与対象群(Cont-C群)、TMP投与対象群(Cont-T群)、偽薬投与腎不全群(CRF-P群)、CEPO投与腎不全群(CRF-C群)、TMP投与腎不全(CRF-T)の6群を作製した。8週間後にマウスの脳機能を評価するために、放射状水迷路試験(RAWM試験)を施行した。【結果】

各CRF群の血清尿素窒素は同等であった。RAWM試験では、CRF-P群は各Cont群に対して有意にエラー回数が多く、CRF-CおよびCRF-T群はP-CRF群に対して有意にェラー回数が少なく、CEPOおよび投与による高次脳機能の改善を認めた。脳海馬の神経細胞におけるHE染色では、CRF-P群で変性神経細胞数が有意に多く、CRF-C群はCont群と同等であった。また、同部位の免疫組織化学染色では、CRF-P群の8-OHdGの有意な蓄積とCRF-CおよびCRF-T群の8-OHdGの抑制を観察した。【考察・結論】尿毒症性脳障害の一因は,酸化ストレスによる神経細胞傷害であり、これにより学習・記憶障害に至ると考えられる。CEPOとTMPは,この機序を抑制することにより脳保護効果を発揮していると考えられる。
授業改善についての教師の意識の変容過程の研究-指導法見直しに対する教師の抵抗と受容の軌跡-

子ども同士の話し合いについて非現実的な期待を持つ教師集団に指導者が説得をして実証的な授業比較研究をした結果、どの学級でも、話し合い授業は子どもが各個に学習するのに較べると、内容の理解は深まらないことが明らかになった。この事実に直面した教師のその後の授業と考え方とを追跡した.面接を通して、次の4型が区別できた.A予想外の結果に驚いて、更に別の単元で追試し、同じ結果を得て認識を改める。B一律に話し合いをさせることに問題があると考え、子どもに小集団の話し合いか各個学習かを選ばせる.C授業には話し合いが不可欠とし、話し合いの方法を変えて続ける.効果確認はしない.D各個に学習する効果の優位性は認めつゝも、学校教育は集団で学習することに意義があるから、授業には子どものかかわり合う場・話し合いが必要であると主張し続ける.A型は少数で、C・D型が多数である。A型以外の教師の多くに、授業は各教師が自分で最善と信ずる方法で行なうべきであり、複数の方法を比較することは教師の倫理に反するという意識が残っており、比較検討は止めて、別の主題に移っている科学的研究の方法を習慣としていない教師の指導法の選択・決定はその効果についての現実的指標よりも、教師の好みや、所属する教育団体の主義主張の影響によるところが大であることがわかった.子ども同士の話し合いについて非現実的な期待を持つ教師集団に指導者が説得をして実証的な授業比較研究をした結果、どの学級でも、話し合い授業は子どもが各個に学習するのに較べると、内容の理解は深まらないことが明らかになった。A型以外の教師の多くに、授業は各教師が自分で最善と信ずる方法で行なうべきであり、複数の方法を比較することは教師の倫理に反するという意識が残っており、比較検討は止めて、別の主題に移っている科学的研究の方法を習慣としていない教師の指導法の選択・決定はその効果についての現実的指標よりも、教師の好みや、所属する教育団体の主義主張の影響によるところが大であることがわかった.
中世王家の成立と院政-王家構成員の分析を中心とした政治史、制度史的研究-

(1)院政期における王家関係諸制度の分析かつて通説の位置を占めていた「院庁政治論」が否定されて久しい。院庁が国政機関としての機能を保有していないことが明らかにされたことに伴い、研究史上における院庁の意義は相対的に低下し、その結果、院庁を始めとする王家家政機関分析は、近年摂関家における家政機関の分析が進展したことに比して、断絶している感がある。そうした研究の陥穽をうめるべく、女院庁・中宮職等の王家家政機関に対する制度史的研究に着手した。1女院庁以下に設けられた諸「所」の具体的機能および分掌・統属関係2立后・女院号宣下の儀礼構造全体および儀礼構成要素各々(請奏・庁始・吉書・所宛・分配等)3立后に伴う待遇(立后時の皇后宮請奏から、「あるべきもの」とされた律令制的給付を遡及的に復元)4中宮職の古代中世への変容の過程(職から庁へ)5女院の年官・年爵・封戸の給付実態とその辞退の意義について等の解明を行い、継続中である。(2)日本史研究の国際化推進にむけて本年もアメリカにおける日本史研究の拠点の一つであるUCLA(カリフォルニア大学ロサンゼルス校)およびUSC(南カリフォルニア大学)で、日本史研究を行う研究者と情報交換をはかり、海外における日本史研究の現状把握につとめた。また、中世前期の公家日記である『吉記』寿永元年8月19日条の英訳も継続中である。Kanbun reading group(2006年4月28日、於南カリフォルニア大学)において口頭報告を行った。自身の研究テーマの一つである王家(天皇家)研究に関連する立后記事を選択して、史料用語および本文の英訳を行った。(1)院政期王家(天皇家)の存在形態の解明と定義化王家構成員の院政期的特質を抽出することにより、諸構成員の関係性が天皇を基軸とするものから、院を基軸とするものへと変容したことを論じ、院の「家」としての「王家」の成立を提唱した。また同時に、氏としての王家全体と、その中に形成された「王家」を弁別して、これまで研究史上不明確であった王家の概念規定を行った。(2)王家構成員による政務運営の諸相解明これまで政治性が問われてこなかった新院・国母等の院政参画を実証し、(1)で明らかにした王家構成員による院政運営の実態を指摘した。(3)日本史研究の国際化推進にむけてアメリカにおける日本史研究拠点の一つであるUCLAに所属し、蔵書・所蔵典籍を調査して、海外における日本史研究環境の把握に努めた。日本史という学問領域に限定せず、広く日本学の研究集会に参加して、日本学の一分肢としての日本史受容のあり方に触れた。また、今後課題としている日本史史料の英訳にむけて、漢文ワークショップ等に参加した。(1)中世王家の成立過程の解明これまでの研究では、主に白河院政以降の王家構成員の在り方を検討し、院の「家」としての「王家」成立を論じてきた。そこでは、院政期「王家」とそれ以前の王家をある種対比的に扱ってきたが、当然のことながらそうした変化は劇的に生起する訳ではない。また院政研究においても、白河親政・堀河親政期に関する研究は、白河院政確立期以降に比して実態解明が進んでいない。そこで、今年度は、前代である摂関期から、「王家」が成立していく過渡的段階の王家の在り方の解明に努めた。(2)院政期における後宮制度分析これまで検討してきた国母の政治参加や、皇女の立后の機能的・理念的意義など、王家の女性構成員の「実態」解明に加え、三后(および女院)という地位につくことに伴う律令制的給付の問題や后位附属機関(中宮職・女院庁)設置と運用の在り方といった制度的側面の検討に着手した。(3)日本史研究の国際化推進にむけてアメリカにおける日本史研究の拠点の一つであるUCLA(カリフォルニア大学ロサンゼルス校)およびUSC(南カリフォルニア大学)で、日本史研究を行う研究者と情報交換をはかり、海外における日本史研究の現状把握につとめた。特に、USCにおける漢文ワークショップに参加し、在外研究者の史料講読能力育成の在り方とその現状について学んだ。(4)日本中世史史料の英訳上記した漢文ワークショップへの参加を通じて、海外においては比較的研究蓄積の少ない公家社会研究の進展のためには、基幹となる情報ソースのますますの充実が課題であることを実感し、中世前期の公家日記である『吉記』の史料英訳に着手した。その際、自身の研究テーマの一つである王家(天皇家)研究に関連する立后記事を選択して、史料用語および本文の英訳を行った。報告の際には、背後にある後宮制度全般の紹介にも留意した。1女院庁以下に設けられた諸「所」の具体的機能および分掌・統属関係

2立后・女院号宣下の儀礼構造全体および儀礼構成要素各々(請奏・庁始・吉書・所宛・分配等)3立后に伴う待遇(立后時の皇后宮請奏から、「あるべきもの」とされた律令制的給付を遡及的に復元)4中宮職の古代中世への変容の過程(職から庁へ)5女院の年官・年爵・封戸の給付実態とその辞退の意義について等の解明を行い、継続中である。(2)日本史研究の国際化推進にむけて本年もアメリカにおける日本史研究の拠点の一つであるUCLA(カリフォルニア大学ロサンゼルス校)およびUSC(南カリフォルニア大学)で、日本史研究を行う研究者と情報交換をはかり、海外における日本史研究の現状把握につとめた。また、中世前期の公家日記である『吉記』寿永元年8月19日条の英訳も継続中である。Kanbun reading group(2006年4月28日、於南カリフォルニア大学)において口頭報告を行った。自身の研究テーマの一つである王家(天皇家)研究に関連する立后記事を選択して、史料用語および本文の英訳を行った。
固体系拡散モンテカルロ法の開発

以下につき成果を論文に出版した:固体周期系量子モンテカルロ計算によるダイアモンド固体の基礎物性計算、固体標準模型上のハバードのUパラメタの成因、ポルフィリン遷移金属錯体の擬ポテンシャル高精度計算、フラグメント法とQMC法を組合わせた方法論の開発。スピン偏極下での多体摂動法による励起スペクトル。以下は進行中の題目である:一様媒質に埋込まれた原子の計算、珪素固体の基礎物性計算。AlN, GaN, InNなど窒化物のバンドギャップ評価。本年度の主要な研究業績としては、ダイアモンド固体における第一原理量子モンテカルロ計算、特に量子拡散モンテカルロ計算の安定な計算遂行を実現したことである。究極的な精密汎用法としての量子拡散モンテカルロ法は、その着想自体は至って明快であるが、数値的に安定な収束計算を実現するのは大変困難である。具体的には擬ポテンシャルや基底関数系といった個々の部材に従来計算よりも細心の注意を払う必要がある。これは多次元空間中の局所エネルギーを直接サンプリングするという技法に依っているからである。局所エネルギーは厳密解に対しては空間一様ではあるものの、これは多電子間の会合や核への接近に伴うクーロン相互作用の発散を波動関数のカスプで補償する「発散の、発散による打ち消し」による有限値であるため、数値的に此を実現するには細心の注意を要するのである。本年度は第一原理量子モンテカルロ法の研究コミュニティで新たに開発が進んでいる量子モンテカルロ用途に数値的安定性のよい擬ポテンシャルを採用し、また基底関数系にも最近実装がなされた局所スプライン基底を採用することでダイアモンド固体の基底エネルギーを効率よく計算し格子定数への滑らかな依存性を再現することで各種弾性特性を精度良く算定することに成功した。また今年度は設備面として24cpu並列相当の新型デュアルコア・デュアルCPU型の並列クラスタ計算機の導入に集中的に予算を投下し、2月より旧来機への代替に向け稼働を開始している。量子モンテカルロ法、特に拡散モンテカルロ法は、電子相関を精密に扱う汎用法としては最も精密な手法である。従来法に較べ多大な計算コストを要するが、「1.扱う対象系が大きくなっても計算コストの増加がなだらかである事」、「2.掛けたコストだけ確実に精度が上がる事」、といった利点を持つ。この手法では量子力学的な(虚)時間発展を真面目に計算して、初期試行関数が含んでいる基底状態以外の成分を虚時間減衰させる事で数値的に純化するという方策を用いる。実装上いくつかの制約はあるものの、枠組みとしては汎用手順で数値的厳密解にも到達出来る形式を与えている。固体周期系を対象とした最も直接的な研究としては、昨年度のダイアモンド固体に引き続き、シリコン結晶のエネルギー体積曲線計算を基とした基礎物性に関する精密計算を遂行し、ダイアモンド構造からβスズ構造への転移圧のより精密な定量的再現を目指している。また「beyond LDA」へのより直接的な貢献を念頭に置き、非一様性を考慮した交換相関ポテンシャル構築を最終的な狙いとして、一様媒質に埋め込まれた孤立原子系に対する計算基盤構築も順調に進行している。今年度中には、埋込系の試行関数生成、DMC計算、DMC電荷密度からの交換相関ポテンシャル構築という一連の基盤が全て構築を完了し、計算成果が蓄積されつつある。この他、擬ポテンシャルQMC計算の基盤として、ポルフィリン遷移金属錯体をベンチマークとした擬ポテンシャルのキャリブレーション計算を行った。また生体分子系のような空間的に疎な物質系を効率良く扱う方策であるフラグメント法をQMC法に組み合わせた方法論を開発し、その成果を発表した。固体周期系を対象とした最も直接的な研究として、昨年度より進めているシリコン固体の構造転移圧計算を遂行している。当該年度中にバックフロー自由度の変分最適化が成功し、従前のスレータ行列式による節固定近似を超えた試行関数レベルでの拡散モンテカルロ法統計蓄積計算が順調に進行している。第一原理計算による構造転移圧予見につき、バックフロー自由度を考慮した多体波動関数の改良が、実験との一致を如何に改善するかに注目し研究を進めている。また、当該年度中までに、軌道関数の局所スプライン化、バックフロー自由度の最適化、擬ポテンシャルの局所近似の改良といった重要な要素技術が確立され、固体周期系の拡散モンテカルロ法につき一連の安定計算基盤が確保された。これらを受け、現在、AIN, GaN, InNといった一連の窒化物のバンドギャップ評価に対する拡散モンテカルロ法計算を進行中である。また、励起状態に関係した研究課題として、T-matrixの手法を用いて電子相関を摂動論により考察する際に、スピン分極の自由度をも含め、励起スペクトルの導出することに成功した。ここでの対象は種々の大きさを持つアルカリ金属クラスターで、原子が奇数個の場合にはスピン分極が重要である。手法自体に関連した事項としては、遷移金属元素の擬ポテンシャル記述に関する方法論検証的な事例として、典型的生体分子であるポルフィリン金属錯体を取り扱った研究成果が当該年度中に論文として出版された。
表面力測定を用いたタンパク質相互作用の直接評価法の確立

本研究は,タンパク質分子を二次元面上に配向させて並べ,その相互作用を表面力測定より評価し,タンパク質分子間の相互作用を研究する新しい方法論を確立し,統合的ゲノム研究に続くプロテオーム研究の基盤となる研究法,解析技術を提出することを目的としている.今年度の研究成果は次のようである.(1)二次元表面に組織化したタンパク質間の相互作用測定ポリヒスチジン修飾した,RNAポリメラーゼのSigmaAサブユニットと転写調節因子であるSpo0Aを,LB法により別々のガラス表面に配向を揃えて固定化し,それら表面間に働く相互作用をコロイドプローブ原子間力顕微鏡を用いて直接測定した.SigmaA/Spo0A間の相互作用測定においては,同一表面間の相互作用測定より見積もった表面電荷からは説明のできない付加的な引力が観測され,SigmaA/Spo0A間の特異的な相互作用を直接測定することに成功した.また,結合力ヒストグラムから,結合力に複数のピークがあることを見いだした.この離散的な結合力は,SigmaA/Spo0A間の結合部位が数箇所あることに起因していると考えている.(2)プレニルトランスフェラーゼIIの相互作用この酵素は,単独では触媒機能を持たない2種類のタンパク質(サブユニットI及びII)からなり,基質(ファルネシルニリン酸)存在下で会合体を形成し,酵素としての機能を発現する.サブユニットI及びIIを(1)と同様にガラス表面に固定化し,媒質中の基質とMg^<2+>の有無に着目し,相互作用を直接測定した.基質あるいはMg^<2+>が存在するときは斥力のみが観測されたが,基質とMg^<2+>が共に存在するときのみ接着力を観測した.このことより,基質とMg^<2+>を介してサブユニットI及びIIが特異的に結合することを初めて直接的に明らかにした.本研究は,タンパク質分子を二次元面上に配向させて並べ,その相互作用を表面力測定より評価し,タンパク質分子間の相互作用を研究する新しい方法論を確立し,統合的ゲノム研究に続くプロテオーム研究の基盤となる研究法,解析技術を提出することを目的としている.今年度の研究成果は次のようである.(1)二次元表面に組織化したタンパク質間の相互作用測定ポリヒスチジン修飾した,RNAポリメラーゼのSigmaAサブユニットと転写調節因子であるSpo0Aを,LB法により別々のガラス表面に配向を揃えて固定化し,それら表面間に働く相互作用をコロイドプローブ原子間力顕微鏡を用いて直接測定した.SigmaA/Spo0A間の相互作用測定においては,同一表面間の相互作用測定より見積もった表面電荷からは説明のできない付加的な引力が観測され,SigmaA/Spo0A間の特異的な相互作用を直接測定することに成功した.また,結合力ヒストグラムから,結合力に複数のピークがあることを見いだした.この離散的な結合力は,SigmaA/Spo0A間の結合部位が数箇所あることに起因していると考えている.(2)プレニルトランスフェラーゼIIの相互作用この酵素は,単独では触媒機能を持たない2種類のタンパク質(サブユニットI及びII)からなり,基質(ファルネシルニリン酸)存在下で会合体を形成し,酵素としての機能を発現する.サブユニットI及びIIを(1)と同様にガラス表面に固定化し,媒質中の基質とMg^<2+>の有無に着目し,相互作用を直接測定した.基質あるいはMg^<2+>が存在するときは斥力のみが観測されたが,基質とMg^<2+>が共に存在するときのみ接着力を観測した.このことより,基質とMg^<2+>を介してサブユニットI及びIIが特異的に結合することを初めて直接的に明らかにした.
光ディスクによる教育のための映像デ-タの保存と利用に関する研究

光ディスクのための映像保存システムの調査を行ったが1億円前後のものはあるが、これは我々の使用対象ではない。このため34万円前後のシステムの設計を行った。これは300万画素のCCDを使用するものであるが、平成5年度中には試行品の作成が可能な状況にある。本研究はこれらのシステムの開発を今後行うべきであると考える。本研究では植物映像の収集を行ったがハ-ドウェアの性能が満足されないため植物分類に関する資料として結果をまとめた。これは1991年4月に出版した身の辺りの植物5,000冊を主として札幌市内の小学校で教材として使用した。1992年8月には北海道新聞社から植物教材図鑑「山の花」を出版する。現在編集作業を行っている。本システムはデジタルカメラの発展により計画に大きな変更がある。それは今までのスキャナ-を使用するよりもデジタルカメラを使用した方が光ディスクでの入力出力のプロセスと鮮明度が著しく向上するからである。このため12日には東京で各紙システムの調査を行った。このシステムについて開発者といろいろ打合わせを行った。おそらく平成4年度中には本研究にマッチしたシステムが市販されるであろう。デジタルカメラは高精度のものが平成3年中に市販されるが、光ディスクへの入力システムは現在開発中であることがわかった。したがって本システムの完成はデジタルカメラとそのスキャナ-の開発を持って行うこととした。デ-タベ-スのための映像収集は主として本州の常緑樹と草木についてで行った。
神経栄養因子欠乏による神経細胞死の機序

神経細胞は発生過程でその約50%の細胞が脱落する事が知られており、これを自然に起こる神経細胞死と呼んでいる。この神経細胞死は、標的細胞により分泌される神経栄養因子の限定的供給による競合過程の結果であると考える根拠が蓄積されている。特に最近種々の系においてこの細胞死が積極的な過程からなることが示唆され、プログラム神経細胞死として、そのカスケードの解明が重要な課題となっている。ラット新生児上頸神経節神経節細胞を1週間NGF存在化で培養した後、培地中に抗NGF抗体を加えNGFを除去すると、細胞死が起こり、死細胞の割合は2日後には80-90%に達すること、シクロヘキシミド(CHX)やアクチノマイシンD(ACD)により細胞死は阻止されることから最も良いモデルと考えられる。しかし、細胞内カスケードや細胞死関連蛋白質(DAP)を同定、単離するにはもっと多量に試料を調整出来るシステムが望ましい。我々はPC12細胞をNGF処理して分化させるとNGF除去に応答して細胞死が起こることを見いだした。この細胞死はACD、FGF、cAMP、高K+培地で抑えられるが、EGFやTPA等では抑えられないので、血清除去によるPC12細胞死とは異なり、transcription依存的であり、モデルとして有用と考えた。NGF除去により引き起こされる細胞内カスケードを調べる目的で、NGF除去後経時的に細胞を可溶化し、SDS-PAGEを行い、抗phosohotyrosine抗体を用いてWestern Blottingを行うと、p120,p90,p73,p53の主要なチロシンリン酸化蛋白質に脱リン酸化が起こることが判った。NGFを加えた時に顕著に活性化されることが知られているMAPKp44、p42活性は低く、このカスケードは関与していないと思われる。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationする方法で自己リン酸化能を調べると、NGF除去に伴って主要なリン酸化活性(Ser/Thr)が徐々に減少することが判った。これらの脱リン酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この脱リン酸化反応経過はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると考えられる。
ヒト遺伝病とリボソーム蛋白遺伝子の変異

リボソームは翻訳の場において、蛋白質の合成工場として重要な役割を担っており、安定したリボソームの供給は、細胞の維持、増殖または各種のシグナルに応じた蛋白質の生産に必須と考えられる。このようなリボソームの生体における重要性から、我々はリボソーム蛋白(rp)遺伝子の変異が、なんらかのヒト疾患の原因になっている可能性があるのではないかと考えている。本研究では、これら遺伝子をヒト染色体にマッピングし、今後の疾患遺伝子の同定に向けた基盤の構築を行った。rp遺伝子をヒト染色体にマップするために、まず各々の遺伝子に特異的なSTS(sequence tagged site)の作成を試みた。新たに開発した"introntrapping"法にて、80種類のrp遺伝子のうち74種について、目的のSTSを得た。このSTSを用いて、まずハイブリッドマッピングパネルにより染色体を決定した。次に、YACコンティグとRH(radiation hybrid)パネルを使用して、正確な染色体上の位置を調べた。最後に、これら結果をすべて統合して、非常に高精度なrp遺伝子のヒト染色体マップを完成させた。最終的にマップされた73種の遺伝子は、7番と21番を除くすべての染色体にマップされ、また各々の染色体上でも、互いに離れて存在していることが確認された。原核生物で見られるrp遺伝子のオペロンのような、遺伝子クラスターは認められなかった。ただし19番染色体は例外で、12種もの遺伝子がマップされており、何らかのクラスター構造が示唆され、rp遺伝子の協調的な発現機構という点で興味深いと思われた。完成したマップは、Whitehead研究所/MITゲノムセンターのSTSマップに準拠しているため、非常に精度が高くまた互換性も良いものとなり、rp遺伝子と遺伝性疾患との関連を研究する上で、強力な手がかりになると考えられる。今後はこのマップを基盤として、Positional Candidate法による疾患遺伝子の同定を目指したい。我々はリボソーム蛋白(rp)遺伝子の変異が、種々のヒト遺伝病を引き起こす可能性があると考え、これらを明らかにするために現在rp遺伝子群の高精度染色体地図の作製を行っている。今年度に得られた結果の概要は以下の通りである。1.ヒトリボソーム蛋白(rp)遺伝子のシークエンスに関するデータベースを構築し、これを用いて個々のrp遺伝子に対するSTS(sequence tagged site)を作製した。これらSTSをPCRのプローブとして用い、ハイブリッドマッピングパネルにより個々のrp遺伝子をヒト染色体にマップした。その結果、80種類あるrp遺伝子のうち71種について、その染色体を決定できた。これは、今までにマップが報告されているものが18種しかないことを考慮すると、たいへん大きな成果と考えられる。2.酵母人工染色体(YAC)ライブラリーをPCRによりスクリーニングし、46種のrp遺伝子についてそのYACクローンを得た。最終的にrp遺伝子をインサートとして持つクローンの数は100種以上に達し、これらクローンの情報をもとにいくつかのrp遺伝子について詳細な染色体マッピングができた。3.Radiation Hybrid Mappingパネルを、前述のrp遺伝子のSTSをプライマーとしたPCR法によりスクリーニングした。その結果56種の遺伝子についてRHマップの結果が得られ、ヒト染色体にマップできた。またこれらは、前述のYACを用いたマッピングの結果と合わせることにより、より信頼度の高いマッピングとなった。

このようなリボソームの生体における重要性から、我々はリボソーム蛋白(rp)遺伝子の変異が、なんらかのヒト疾患の原因になっている可能性があるのではないかと考えている。本研究では、これら遺伝子をヒト染色体にマッピングし、今後の疾患遺伝子の同体に向けた基盤の構築を行った。rp遺伝子をヒト染色体にマップするために、まず各々の遺伝子に特異的なSTS(sequence tagged site)の作成を試みた。新たに開発した"introntrapping"法にて、80種類のrp遺伝子のうち74種について、目的のSTSを得た。このSTSを用いて、まずハイブリッドマッピングパネルにより染色体を決定した。次に、YACコンティグとRH(radiation hybrid)パネルを使用して、正確な染色体上の位置を調べた。最後に、これら結果をすべて統合して、非常に高精度なrp遺伝子のヒト染色体マップを完成させた。最終的にマップされた73種の遺伝子は、7番と21番を除くすべての染色体にマップされ、また各々の染色体上でも、互いに離れて存在していることが確認された。原核生物で見られるrp遺伝子のオペロンのような、遺伝子クラスターは認められなかった。ただし19番染色体は例外で、12種もの遺伝子がマップされており、何らかのクラスター構造が示唆され、rp遺伝子の協調的な発現機構という点で興味深いと思われた。完成したマップは、Whitehead研究所/MITゲノムセンターのSTSマップに準拠しているため、非常に精度が高くまた互換性も良いものとなり、rp遺伝子と遺伝性疾患との関連を研究する上で、強力な手がかりになると考えられる。今後はこのマップを基盤として、Positional Candidate法による疾患遺伝子の同定を目指したい。
ニューロン・ミクログリア相関による機能的神経回路形成の分子基盤の解明

本研究では、機能的神経回路形成におけるミクログリアの役割、特にシナプス刈り込みにおける機能を明らかにすることを目的に解析を行った。脳発達期におけるシナプス刈り込み現象が明確である霊長類マーモセットを用いた検討を中心に行った。正常マーモセット脳では、シナプスピーク期である生後3ヶ月齢と刈り込みにあたる生後6ヶ月齢ではミクログリアの機能的関与が異なる可能性が示された。また、自閉症モデルマーモセットを用いた解析では、ヒト自閉症患者で見られる行動異常とシナプス刈り込み不全が再現されることが示された。この刈り込み異常にはミクログリアの機能が起因していると考えられる。1)マーモセットにおけるシナプス形成に関する解析...マーモセットのシナプス形成時期を明らかにするため、大脳皮質第III層の錐体細胞におけるスパインの総数を経時的に計測した結果、生後3ヶ月でピークに達し、その後減少していくことが判明した。このことは、霊長類でみられるシナプスの刈り込みの分子基盤を解析して行く上で、非常に重要な知見である。2)脳発達過程における遺伝子発現解析/(1)マウスにおける遺伝子発現解析...主にミクログリア機能分子であるサイトカインやケモカイン、またその受容体に着目し、プライマーアレイ(約250遺伝子)を用いた定量PCR法により脳発達過程(生後1日、2週齢、4週齢)の大脳皮質における遺伝子発現を解析した結果、生後発現が高くその後低下する遺伝子や生後2週齢から発現が増加する遺伝子など、発現プロファイルの異なる遺伝子を確認した。(2)マーモセットにおける遺伝子発現解析...生後直後(0日)、2ヶ月齢、3ヶ月齢、6ヶ月齢の大脳皮質において、ジーンチップを用いた解析からシナプスの数的変化と同調した発現を示す遺伝子やシナプス形成がピークである3ヶ月齢から発現が顕著に増加する遺伝子など、複数の発現パターンを示す遺伝子群を取得することができた。3)脳発達過程のミクログリアの形態解析/(1)マウスにおけるミクログリアの形態解析...生後2週齢においては大脳皮質灰白質のほぼ全域に、生後3週齢において突起の先端がブートン様の丸い構造を示す特徴的な形態が、4週齢以降、成体でみられるラミファイド型のミクログリアに成熟することを確認した。(2)マーモセットにおけるミクログリアの形態解析...生後3ヶ月齢において突起の先端がブートン様の丸い形態を示すミクログリアが観察され、この構造体は生後6ヶ月齢では減少し、ラミファイド型のミクログリアが多くみられるようになった。本研究では、脳発達期における明確なシナプス数の変動が観察されるマーモセットおよび分子生物学的ハンドリングが容易であるマウスを用いて、機能的な神経回路形成におけるミクログリアの機能の解明を目的としている。マウスを用いた解析においては、分子発現解析についてプライマーアレイや独自で作製したプライマーセットを用いてミクログリア機能分子約300種類の発現変動を定量PCRで解析し、脳発達過程の発現プロファイルを作成した。特にシナプス形成期に発現が変動する分子の中で、シナプス情報伝達に関わることが推定される分子であるrantes(CCL5)に着目し詳細な発現解析を行った。大脳皮質および海馬において、rantesの発現は生後2週齢から3週齢にかけて上昇するがその後減少、一方、胎児期のバルプロ酸(VPA)の曝露は生後の脳発達における興奮性のシナプス情報伝達に異常を惹起することが報告されている。そこでVPAによる病態マウスにおけるrantesの発現を検討した結果、野生型マウスでは発現が減少する生後4週齢において有意な発現亢進がみられ、特に海馬においては雌雄ともにコントロールと比べ約10倍の発現亢進が見られた。マーモセットを用いた解析においては、本年度は生後1.5、3、6ヶ月齢のマーモセットを用いて、大脳皮質12野の神経細胞樹状突起スパインの密度を解析したところ、生後3ヶ月齢でピークに達し、6ヶ月齢で減少することが確認された。ミクログリアの皮質単位カラム内密度は生後2-3ヶ月齢でピークに達し、生後6ヶ月齢及び成体では減少していた。形態学的には生後3ヶ月齢の大脳皮質ではミクログリアの突起の先端が特徴的なブートン様構造のものが多く、そこから細い突起が伸びてスパインに触れる様子が観察された。ブートン様構造のミクログリア突起と接するスパイン数も生後3ヶ月齢でピークに達し生後6ヶ月齢では減少していた。ヒトを含む霊長類では、新生児期からシナプスの急速な増大が生じ小児期にピークに達する。その後成人となる過程で神経活動依存的なシナプスの成熟に伴い必要なシナプスだけが残される“シナプス刈り込み"が起こり、成熟脳へと発達する。近年シナプスの形成・成熟にミクログリアが関与していることが示唆されているが、その詳細な機序は明らかにされていない。そこで本研究では明確な刈り込みが観察されるマーモセットを用いて、機能的な神経回路成熟に対するミクログリアの機能とその調節分子の解明を目指している。我々はこれまでに正常発達マーモセットの発達過程におけるミクログリアの挙動を解析した。抗Iba1抗体を用いた免疫組織化学的解析により、前頭前皮質12野において生後2-3ヶ月齢でミクログリア密度がピークになることを示した。また、細胞内色素注入法によるニューロンの可視化技術と抗Iba1抗体を用いた免疫組織化学的解析との組み合わせにより、ニューロンとミクログリアの形態学的相互作用について詳細に観察を行なった。生後2-3ヶ月齢ではスパイン数もピークになることが示された。

生後3ヶ月齢ではブートン状構造のミクログリア突起が多く観察され、ブートン状構造ミクログリア突起と接するスパイン数は生後3ヶ月齢で最大になることを見出した。一方スティック状構造のミクログリア突起と接するスパイン数は生後6ヶ月齢で最大であった。以上の結果から、生後3ヶ月齢と6ヶ月齢ではミクログリアが異なる機能を発揮している可能性が考えられた。近年注目されているシナプスの形成・成熟へのミクログリアの関与の可能性を、霊長類であるマーモセットを用いて示すことができた。生後発達過程においてマーモセットはヒトと同じシナプス数変動パターンを示すため、マーモセットで得られた知見は機能的神経回路形成を理解する上で極めて重要である。我々はこれまでに、マーモセットは生後3ヶ月齢でスパイン数がピークとなり生後6ヶ月齢では減少することを報告しているが、ミクログリア密度の変化がスパイン数の変化とパラレルであること、生後3ヶ月齢と6ヶ月齢でミクログリアの機能が異なる可能性が示されたことは、神経回路形成のメカニズムを解明する上で大きな進展である。ヒトを含む霊長類では、新生児期及び小児期にシナプスの急速な増大が生じ小児期にピークに達する。その後児童期、青年期、成人となる過程で神経活動依存的なシナプスの成熟に伴い必要なシナプスだけ残される「シナプス刈り込み」が起こり、成熟脳へと発達する。小型実験動物として汎用されるマウスやラットなどの齧歯類ではシナプスの過剰形成と刈り込みの時期が重なっているため明確な刈り込みを観察できないが、ヒトと同様にシナプスの過剰形成が行われた後に刈り込みが行われるマーモセットを用いて解析することは、神経回路形成の分子基盤を理解する上で非常に重要である。近年シナプスの形成・成熟にミクログリアが関与していることが示唆されているが、その詳細な機序は明らかにされていない。そこで本研究では、明確な刈り込みが観察されるマーモセットを用いて機能的な神経回路成熟に対するミクログリアの機能とその調節分子の解明を目指している。我々はこれまでに正常発達マーモセットの発達過程におけるミクログリアの挙動を解析し、前頭前皮質12野において生後2-3ヶ月齢でスパイン数及びミクログリア密度がピークになること、生後3ヶ月齢ではブートン状構造のミクログリア突起が多く観察されること、ブートン状構造ミクログリア突起と接するスパイン数が生後3ヶ月齢で最大になることなどを明らかにしている。平成28年度は胎生期バルプロ酸暴露により自閉症様モデルマーモセットを作製し、ヒト自閉症症状を行動学的に再現できることと、ニューロンのシナプス密度の増加と刈り込み異常を見いだした。この自閉症様モデルマーモセットを用いてミクログリアの形態学的解析を行ったところ、ミクログリア密度の低下、突起の形態異常、ブートン状構造ミクログリア突起数の減少などが明らかになり、ミクログリアの機能異常がシナプス除去に影響を与えている可能性が考えられた。近年、ヒトを含む霊長類の生後発達過程で見られる「オーバーシュート型」シナプス形成が様々な精神疾患で異常をきたしていることが報告されている。例えば自閉症スペクトラム障害患者の脳では、シナプス数の増加率が大きくその後の刈り込みが少ないため、過剰なシナプスが維持されていると考えられる。
抗体固定化温度応答性表面を用いた細胞選別マイクロ流体デバイスの開発

温度応答性高分子が温度変化に応答してコンフォメーション変化することを利用して、特定抗原を有する細胞を選択的に吸着したのち、温度変化のみで細胞脱着する抗体固定化温度応答性高分子修飾表面を設計した。CD90陽性Ty-82細胞とCD90陰性K562細胞の混合物を37°Cで抗ヒトCD90抗体固定化温度応答性表面に接触させると、Ty-82細胞が選択的に接着した。接着したTy-82細胞は、温度低下とせん断応力付加より回収、濃縮することができた。マイクロ流体デバイスと組み合わせることによって、せん断応力および温度変化を同時に制御する、より精密な細胞分離システムの構築が期待される。本研究では、温度応答性高分子が温度変化に応答してコンフォメーション変化することを利用して、特定抗原を有する細胞を選択的に吸着したのち、温度変化のみで細胞脱着する抗体固定化温度応答性高分子修飾表面を設計する。さらに、細胞の接着/脱着挙動を動的に解析するために、マイクロ流体技術を用いてせん断応力および温度変化の影響を解明する。これらを通じて、真に臨床応用可能な細胞選別システムの開発を目指す。当該年度は、温度応答性高分子修飾培養皿の表面に抗ヒトCD90抗体を固定化し、温度変化に応答した細胞接着/脱着を検討した。具体的には、カルボキシル基を有するpoly(N-isopropylacrylamide-co-2-carboxyisopropylacrylamide)[poly(IPAAm-co-CIPAAm)]修飾表面に抗CD90抗体を固定化した。直接固定法、PEGスペーサー固定法、アフィニティー固定法により3種類の表面を調製した。ヒト胸腺由来細胞の接着性はアフィニティー固定表面で最も高く、残り2つは同程度であった。一方、低温処理により脱着したヒト皮膚線維芽細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、アフィニティー固定表面から回収した細胞に抗体およびストレプトアビジンが高頻度で残存していたが、直接固定表面とPEGスペーサー固定表面から回収した細胞には抗体等は付着していなかった。以上のことから、抗体固定化方法を最適化することにより、抗体フリーの状態で細胞を接着/脱着制御可能であることがあきらかになった。当該年度は、抗体固定化温度応答性表面の細胞接着性評価と、マイクロ流体デバイスの構築を行った。まず、平成25年度に確立した手法で抗ヒトCD90抗体を固定化した温度応答性高分子修飾培養皿を作製した。CD90を発現するTy-82細胞とCD90を発現しないK562細胞の懸濁液(混合比3:7)を培養皿上に播種し、37°Cで3時間インキュベートした。非接着の細胞を回収するためゆっくりと培養液を除去し、20°Cで2時間インキュベートしたのち、ピペッティングすることでせん断応力をかけて細胞を回収した。フローサイトメトリーによりCD90発現細胞の存在比率を測定したところ、細胞播種前の懸濁液は33%であったのに対し、ピペッティングで回収した細胞懸濁液は76%であった。抗ヒトCD90抗体のアフィニティー相互作用によってTy-82細胞が選択的に接着し、その結果、ピペッティングで回収した細胞懸濁液中のTy-82細胞が濃縮されたことが示唆された。また、本年度に作製したマイクロ流体デバイスと組み合わせることによって、せん断応力および温度変化を同時に制御する、より精密な細胞分離システムの構築が期待される。生体材料抗体固定化温度応答性表面の設計と細胞接着性評価に関して概ね予定通り進んでいる。具体的には、温度変化によってアフィニティー相互作用を変化させ、接着した細胞を非浸襲的に回収することができた。さらに、抗体固定化方法を最適化することにより、抗体フリーの状態で細胞を接着/脱着制御可能であることをあきらかにすることができた。1.抗体固定化温度応答性表面の設計当初の計画では、表面開始原子移動ラジカル重合法による温度応答性高分子ブラシ表面の調製を行う予定であったが、抗体固定化方法を最適化することができたため、今後は同手法を用いた研究を推進することとする。2.抗体固定化温度応答性表面の細胞接着性評価抗体固定化温度応答性表面と細胞との相互作用をあきらかにするために、温度を変化させたときの細胞接着性を評価する。具体的には、脂肪組織から採取した初代培養の接着性についての検討を行う。

3.マイクロ流体デバイスを用いた評価抗体固定化温度応答性高分子修飾表面を有するマイクロ流路デバイスを作製し、抗原ー抗体間アフィニティーの強さおよび動的挙動を精密かつ定量的に解析する。具体的には、一定温度に制御されたマイクロ流路内抗体固定化温度応答性高分子表面への抗原吸着挙動をリアルタイムに測定し、解離定数(Kd)を推定するとともに、温度変化させた際の抗原吸着/脱着挙動の動的変化を解析する。また、抗体固定化温度応答性高分子表面に細胞を接着させた後、マイクロ流路内の液体の流速を変化させ、細胞の脱着挙動を観察することで、せん断応力と細胞脱着の関係性について詳細に評価を行う。上記解析結果をもとに、細胞の混合物から標的細胞のみを選択的に接着させ、さらに温度低下により脱着させる細胞選別システムの構築を行う。当初計画に比べて試薬の購入が少量で、物品費が当初よりも少額になったため。細胞分離実験のための抗体固定化温度応答性表面作製の際の試薬(主に抗体など)の購入費用に充当する予定である。
配糖体分子によって引き起こされる植物就眠運動の分子機構

マメ科植物には、夜に葉を閉じ、朝には再び葉を開く就眠運動というユニークな現象が見られる。就眠運動に関する最古の記録は、紀元前アレキサンダー大王の時代に遡り、進化論のダーウィンが晩年、膨大な観察研究を行った。昨年度ノーベル生理学医学賞の対象となった生物時計は、植物の就眠運動の観察から発見された。しかし、就眠運動の分子機構は、現在まで全く不明であり、関連する分子すら見つかっていなかった。東北大院理・院生命の上田らは、就眠運動を引き起こす分子(イオンチャネル)を初めて発見し、それらが葉の上面側と下面側の細胞で不均等に発現することで、葉の動きが生まれることを初めて明らかにした。マメ科植物の就眠運動は、ダーウィン以来の謎である。我々は、就眠運動研究のスタンダード植物として用いられる大型草本アメリカネムノキを対象として、就眠運動の研究を行っている。アメリカネムノキの就眠運動を引き起こすジャスモン酸グルコシドは、葉の付け根部分に存在する運動細胞に作用して、その収縮を引きおこす。この際、細胞内ではROS産生が起こり、これが外向きカリウムチャネルに作用することで、細胞の収縮が誘導されることが明らかになった。外向きカリウムチャネルはユニークなKineticsを有しており、これがマメ科植物に特有の就眠運動という現象に深く関与していることが示唆された。進化論のダーウィン以来の謎とされる就眠運動については、アメリカネムノキ(Samanea saman)をスタンダード植物として多くの生物学的研究が行われている。申請者等は、JAGが植物運動細胞にセカンドメッセンジャーとして活性酸素種(ROS)の発生を引き起こすことを明らかにし、運動細胞のトランスクリプトーム解析から放出型カリウムチャネルSPORK2を就眠運動に関与するチャネルと推定した。本研究において、SPORK2がユニークな速度論的性質を持つ外向きカリウムチャネルであることを解明し、運動細胞のパッチクランプ実験から、アメリカネムノキの就眠運動に主に寄与することを示した。これを実証するための非モデル生物であるアメリカネムノキでのノックアウト実験系の構築、ならびにモデル生物系への展開と生物種普遍性を証明するための予備実験を行った。JAGによるSPORK2チャネルの活性化機構へと研究を展開する。また、非モデル生物であるアメリカネムノキでのノックアウト実験系の構築、ならびにモデル生物系への展開と生物種普遍性を証明するための予備実験を行っており、順調に成果を得ている。マメ科植物は、朝に葉を開き、夜には葉を畳んで「眠る」日周性の葉のリズム運動(就眠運動)を行う。アメリカネムノキ(Samanea saman)は、古くから就眠運動研究のスタンダード植物として用いられてきた。既に我々は、葉の開閉運動に寄与するイオンチャネルを同定している(及川貴也ら,第58回日本植物生理学会年会, PF-53(2017))。今回我々は、このイオンチャネル発現の日周性変動から、これらのチャネルによる「葉を開く」運動の制御機構の解明を目指した。また、先行研究において同定された、アメリカネムノキの覚醒物質cis-p-coumaroylagmatineを基に合成した蛍光プローブを用いて、この化合物が葉の運動に関与する仕組みの解明を目指した。「葉を開く」運動には、葉の付け根部分に存在する運動細胞の、下面側と上面側の膨張/収縮が関与する。葉の運動とイオンチャネルの関連を明らかにするため、上下両面の各運動細胞におけるイオンチャネル遺伝子の経時的発現量解析を行った。その結果、アニオンチャネルSsSLAH1は、葉を開く時間帯においてのみ、下面側での発現量が上面側を大きく上回った。これにより、下面側のみでアニオンの放出が起こり、運動細胞が収縮する。一方、上面側では、SsSLAH1の発現量が低いため、収縮は起こらない。このように、下面側が上面側よりも相対的に縮むことで、「葉を開く」ことが明らかになった。続いて、葉の運動と覚醒物質の関連を明らかにするため、cis-p-coumaroylagmatineにRhodamineを修飾した蛍光プローブの合成と運動細胞の標識を行った。その結果、上面側運動細胞の核に特異的なRhodamineの蛍光を得た。以上より、覚醒物質は、SsSLAH1の上面側特異的な発現抑制に関与し、葉を開かせると推定される。これまでに、ジャスモン酸グルコシドが、アポトーシス非依存的な機構でカリウムチャネルを活性化して細胞収縮を誘導することを明らかにした。

また、細胞収縮の主役がユニークなkineticsをもつ外向きカリウムチャネルであることも明らかにし、その進化的分布についても検討した。これは、就眠運動という現象がなぜマメ科植物に固有の生物現象であるのかを解明する手がかりとなる発見である。今後は、SPORK2発現量の概日性リズムに従った変動と、その生理的意味に関する研究を進めるとともに、ジャスモン酸グルコシドによるその活性化を検討する。また、トランスクリプトーム解析から、SPORK2遺伝子の発現に伴って発現変動する輸送体遺伝子を発見しており、これがジャスモン酸グルコシドに対する輸送活性を示すとの予備実験結果を得ている。これは、ジャスモン酸グルコシドとSPORK2活性化の間の強い相関を示すデータであるため、これについても今後検討を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。天然物有機化学今後は、外向きカリウムチャネルの活性化機構に関する詳細な検討が必要である。ROSによる外向きカリウムチャネルの活性化は、アポトーシスに伴う細胞収縮との関係から広く研究されているが、我々の系はアポトーシス非依存的であり、既存の活性化機構とは異なる作用機構が推定されている。ROS産生機構の詳細と共に、検討を行いたい。昨年度研究において、アメリカネムノキにおける遺伝子破壊実験に関する予備検討を行ったが、既存の方法ではいずれも実験が成功せず、新規方法論の開拓を行う必要が生じた。また、これと並行して、2015年末に新規公開されたモデル植物データベースにおいて、SPORK2とホモロジーの高いイオンチャネルが含まれることが分かった。これらの事由から、モデル植物におけるホモロガス遺伝子の破壊実験、ならびに新規なウィルスベクターによるRNAi実験の二通りの方法でのSPORK2のヴァリデーション実験を行うことになったが、いずれも準備に長時間を要するため、年度内に実験が開始できなかったため、次年度使用額が生じた。研究の進展に伴い、新たに昆虫細胞を用いるタンパク質発現系の構築が必要となった。しかし、タンパク質発現には思ったよりも時間が掛かることが分かり、年度内に予定していた実験を次年度に繰り越すことになった。モデル植物におけるホモロガス遺伝子の破壊実験、ならびに新規なウィルスベクターによるRNAi実験の二通りの方法でのSPORK2のヴァリデーション実験に関する準備は、いずれも既に昨年度中に完了しており、既に植物の育成を開始した。このため、遺伝子変異植物体が得られ次第、これを用いた実験を速やかに行い、年度内に全ての研究費を使用する予定である。消耗品費用(主として発現タンパク質の作成費用など)に使用する予定です。