hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クリプトコックス感染におけるC型レクチン受容体の糖鎖認識機構の解明

本研究は、世界エイズ死因第2位であるクリプトコックス感染症に着目し、近年注目を浴びているC型レクチン受容体との糖鎖認識機序を明らかにすることで自然免疫における真菌の感染認識機構を理解する目的で行われた。近年、東北大学医学系研究科の川上グループらは、クリプトコックス感染においてDectin-2がTh2サイトカインとムチンの産生に関わることを明らかにし(Nakamura et al. Infect. Immun. 2015)、クリプトコックスの認識にDectin-2が関与することが推測された。私はこれまでの検討により、クリプトコックスのDectin-2リガンドがクリプトコックス菌体表面ではなく細胞壁内にあることを突きとめ、そのリガンドがMannoseを含む構造体であることを明らかにした。本研究ではリガンドのより詳細な構造を解析するとともに、Dectin-2KOマウス由来の骨髄由来樹状細胞(BM-DCs)を用いてサイトカイン産生能を解析することでより生体に近い免疫応答を観察した。Dectin-2のプラスミドを発現した2B4-NFAT-GFP reportercellを種々のサンプルで刺激しGFPの発現をフローサイトメーターで解析すると、クリプトコックス菌体のβグルカナーゼ処理上清中に強いGFP活性があることが確認された。さらに、糖を選択的に結合させるコンカナバリンA(ConA)を用いたアフィニティクロマトグラフィーでβグルカナーゼ処理上清内のConA結合画分を粗精製することで、ConA結合画分中にβグルカナーゼ処理上清よりも強いGFP活性が得られることが確認された。加えて、Dectin-2KOマウスから採取したBM-DCsとConA結合画分を24時間共培養し、培養上清中の炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-12p40)をELISA法により測定すると、Dectin-2KOマウスでは野生型マウスと比較しこれらサイトカインの産生が有意に低下することが確認された。本研究によりクリプトコックス内のDectin-2リガンドはConAに結合する糖を主成分とする構造であることが示唆された。粗精製されたConA結合画分は、Dectin-2を介してTh1関連サイトカインの産生を誘導することが明らかになり、Dectin-2がクリプトコックスの感染防御に関与することが示唆された。リガンドの正確な構造を明らかにするため、ConA結合画分を用いた糖鎖構造の詳細な解析が今後必要と考えられた。
鉄基層状組織合金のキンク変形とミルフィーユ条件の一般化

ミルフィーユ条件の一般化を目指して,LPSO型Mg合金以外でキンク変形が発現する材料を探索する.とくに,汎用的な構造用金属材料である鉄鋼材料に限定し,その層状組織であるパーライトを基本に,母相と第2相の結晶構造,層の間隔,母相/第2相比を広範に変化させた複数の鉄基層状組織合金を準備する.そして,これらの圧縮変形挙動を調査することで,鉄鋼材料におけるキンク変形の発現有無ならびに発現条件を明らかにする.ミルフィーユ条件の一般化を目指して,LPSO型Mg合金以外でキンク変形が発現する材料を探索する.とくに,汎用的な構造用金属材料である鉄鋼材料に限定し,その層状組織であるパーライトを基本に,母相と第2相の結晶構造,層の間隔,母相/第2相比を広範に変化させた複数の鉄基層状組織合金を準備する.そして,これらの圧縮変形挙動を調査することで,鉄鋼材料におけるキンク変形の発現有無ならびに発現条件を明らかにする.
イオン液体を用いた生体のSEM観察試料作製技術の確立

植物組織等の生体試料をSEM観察する際は、試料が絶縁体且つ含水であるため、通常は前処理として固定、脱水、金属コーティングを行わなければならない。しかし脱水操作は手間と時間がかかる。室温で導電性を持ち蒸気圧も極めて低い液体であるイオン液体は、真空中でも液体状態を維持するので、試料中に含まれる水分をイオン液体と置き換えることが出来れば、脱水による組織の変形を防ぐことが出来る可能性がある。本研究では、イオン液体を用いた生体試料の簡便なSEM観察技術の確立を目指した。本研究では、タマネギの鱗茎をグルタルアルデヒドで固定したものを試料とし、イオン液体溶液に浸漬させたものを卓上走査型電子顕微鏡で観察し、通常のエタノールによる脱水処理及びt-ブチルアルコールによる真空乾燥を行ったものと比較した。イオン液体は親水性の酢酸1-エチル-3-メチルイミダゾリウムを用いた。試料を浸漬させるイオン液体溶液については、下記の条件の検討を行った。1、イオン液体の濃度10%,20%,30%,40%の各溶液について比較した。2、イオン液体溶液中の有機溶媒(エタノール)の有無の影響溶媒が、水のみのものと、水:エタノール=1:1のものとを比較した。3、試料の浸漬時間浸漬時間を30分、60分、120分として、比較した。上記の実験の結果、浸漬時間については差が見られなかった。溶媒にエタノールを含むほうが、試料の変形は大きくなるようである。イオン液体の濃度が高いほうが試料表面の凹凸が保持される傾向が見られた。いずれの条件でも通常の脱水乾燥処理と比較して、試料が大きく変形しており、実用できるものでは無かった。
脈動流場におけるくぼみ付き流路内のカオス混合と物質移動促進

流れのはく離と流体振動を利用した物質移動促進は層流域で有効であることが最近報告されている。その機構は流体振動によって引き起こされるカオス混合が関与していると推察されているが、カオス混合と物質移動が定量的にどのような関係にあるかは不明であり、本研究では2次元キャビティ流れを対象として数値シミュレーションによって検討した。その結果、カオス混合は外部から加えたある速度振動数で最大となることを見い出した。これに対して物質移動は過渡的状態ではカオス混合と良好に相関付けられるが、定常状態では必ずしも対応しないことがわかった。これはカオス混合が流体の動的挙動に強く依存しているためであると考えられる。またカオス混合は乱流混合とは異なり、流れ自身を乱流へ遷移させずに混合が促進されるため、注入したエネルギーに対して高い移動促進率が得られる可能性がある。そこで本研究では実用装置を念頭におき、脈動流場におけるくぼみ付き流路内の移動促進効果を実験的に検討した。その結果、低レイノルズ数域でも高い移動促進効果が得られ、設計に役立つ相関式を提案した。また、高レイノルズ数域では移動促進率は加えた流量振動数に依存し、流路自身の流れの不安定性に強く関連することが示唆された。この詳細は今後の検討課題としたい。
イタリアにおける新合理主義デザイン―ガエ・アウレンティの思想と実践

本研究課題「イタリアにおける新合理主義デザイン-ガエ・アウレンティの思想と実践」を遂行するための具体的な方法として、5つの軸を設けて分析を進めることを計画した。すなわち、1、アウレンティの思想形成、2、プロダクト・デザイン、3、ミュージアムデザイン、4、舞台設計、5、インスタレーションと新合理主義である。本年度は研究成果をまとめる最終年度にあたり、そのいずれの軸について並行して研究を行い、論文執筆、およびその後の書籍出版を計画するまでの資料整理を行った。これらの研究を進めた結果、日本ではいまだ試みられていないイタリアの戦後建築の概念的な推移、また当時の証言を多く含むものとして注目できる建築批評雑誌『カサベラ』等の全体的な論調の変遷、執筆者たちの個々の性質などを明らかにすることができた。これら研究結果は主に1、2、5の軸にそれぞれ反映された。また、第二次世界大戦以降のイタリア建築界でもっとも注目すべき新合理主義建築、およびそこから影響されるデザイン理論が、どのようなものであるかの内実を新旧それぞれの合理主義の時代背景を比較、考察することによって明らかにすることができた。また、アウレンティはそのような時代の中の新合理主義世代の建築家兼デザイナーであることを本研究では位置付け、彼女のミュージアムデザインにこそ、その具体的な作例が挙げられることを明らかにした。新合理主義建築は、当時のイタリア政府にとって急務であった都市計画の発展の中で生まれてきた潮流であるが、アウレンティは、その思想を美術館設計の中でも転用し、美術館の中の都市計画という新たな美術館像と新合理主義の概念を生み出したのである、ということを本研究では明らかにし、都市計画と美術館設計との新たな関連性を指摘したことに本研究の重要性は認められるところである。本研究を進めるにあたり今年度は、8月に中国の北京大学で開かれた国際美学会と9月にベルギーのブリュッセルロイヤルアカデミー内で開かれたデザイン史デザイン学国際会議に参加し、それぞれ口頭発表を行った。また10月以降は、ミラノにある建築家ガエ・アウレンティの事務所を訪問し、ミラノ工科大学図書館、ミラノトリエンナーレ事務局内資料室を中心に、現地での資料収集を行った。まず8月の国際美学会では、アウレンティが設計した1964年ミラノトリエンナーレ、イタリア部門展示空間の設計案を取り上げた。ここでは、60年代当時からイタリア現代美術の動向の中でも散見できる「インスタレーション・アート」とアウレンティにおける「建築的インスタレーション」とも呼ぶべき展示空間設計との親近性を検討した。次に、デザイン史デザイン学国際会議では、1988年ニューヨーク、ソロモングッゲンハイム美術館で開かれた展覧会の展示空間設計を主な事例として取り上げた。ここでは「インスタレーション」という現代美術的な視点や枠組みとの比較検討をするだけでなく、展示空間内の内部空間を建築的構造物によってどのように構築させていくかという、アウレンティにおける内部空間に対するデザイン手法が確立していることを明らかにした。以上のように、アウレンティにおける内部空間への着目及び建築的志向性は、「展示空間設計」の仕事をこなす中で確立したと考えられる。このことからも本年度は、本研究の課題でもあるアウレンティにとっての新合理主義的な思考を一部明らかにすることができ、またその実践例を詳細に検討することができた。また、アウレンティにとっての新合理主義的な思考と手法を探ることは、その他のアウレンティの仕事でもある舞台設計や美術館設計の事例を検討するために重要な意義があると言える。
時分割ＤＸＡＦＳ－ＰＥＥＭの開発と固体表面上の光励起－電子移動過程の直接観測

平成25年度は、酸化タングステンの光励起状態について、茨城県つくば市のフォトンファクトリー、及び兵庫県佐用郡佐用町のX線自由電子レーザーSACLAを用いて、時分割XAFS測定を行った。フォトンファクトリーの実験では、WO3の懸濁液に400nmのレーザーを照射し、その時のWL3吸収端のXAFSスペクトルの変化を観測した。SALCAの実験では、放射光での100psの時間分解能に対して、フェムト秒の時間領域で起こる変化の観測を試みた。フォトンファクトリーの実験では、WL3吸収端が光照射前後で顕著な変化が観測された。これは、光吸収によりWO3で励起電子が生じたことに由来するものと考えられた。一方SACLAの実験では、芳しい結果が得られなかったが、フェムト秒のX線を使った実験でのノウハウが得られた。SACLAの実験については、実験を継続してゆく必要がある。このように、平成25年度は不均一系における光励起状態観測実験に従事した。本年度フォトンファクトリーの実験で得られた結果から、光触媒などの固体触媒上での電子移動について、XAFSを用いることで固体触媒の光励起状態の局所構造変化・電子状態の変化が明らかになった。本研究課題の目標であった、固体触媒表面上での電子移動過程の解明に向けて、XAFSを用いることの有効性が確認された。X線をプローブとするPEEMであれば、電子移動の時空間情報が得られることが期待される。光触媒の光励起過程について、時分割XAFS測定によってその励起状態の観測に成功したから。この手法では光触媒の励起状態の観測は出来ていなかったが、今回はじめて成功した。XAFSでは局所構造変化を明らかにできるため、今後発展が期待されるから。本研究課題は、平成25年度で終了となった(研究代表者が常勤職となったため)。しかしながら、今後もXAFSによる光励起過程の観測を継続する。今後は助触媒へのキャリアの移動について、検討を行う。
in situ PCR法による肺癌発癌過程における遺伝子異常局在の病理学的な解明

in situ PCR法は,細胞内で目的の遺伝子をPCRの技法を用いて増幅させ,その後in situ hybridizationにより検出するもので,従来検出限界以下だった遺伝子のin situでの同定に期待が持たれている.1細胞あたり1コピーの遺伝子の存在をも顕微鏡下に同定できるこの技術はこれまでの病理診断や発癌過程の推論などを根本から変革してしまう可能性を持っている.また,早期診断や前癌病変の診断等の臨床への応用も幅広く考え得る.今回我々は,肺癌における遺伝子変化,特に従来in situ hybrization法で検出し得なかった点突然変異を、in situ PCR法により細胞1個のレベルで同定することを試みた.in situ PCRは,遺伝子やプライマーが異なれば大きく条件が変わると考えられており,また,その条件が非常に多岐に亘る.本年度の研究によって,標本の固定法(緩衝ホルマリン,パラホルムアルデヒド,エタノール,グルタールアルデヒド),前処置法(プロテイナーゼK,ペプシン),プライマーの選定(ミスマッチプライマー,ダブルミスマッチプライマー),PCRの条件(種々の温度およびサイクル数),シグナルの検出(染色)法(RI標識,ジゴキシゲニン)に加えて,in situ hybridizationの条件(ハイブリ溶液の組成,温度,時間)と後固定法の条件(固定液,時間)を確立することができ,K-ras遺伝子の点突然変異を細胞単位で検出することに成功した.in situ PCR法は,細胞内で目的の遺伝子をPCRの技法を用いて増幅させ,その後in situ hybridizationにより検出するもので,従来検出限界以下だった遺伝子のin situでの同定に期待が持たれている.1細胞あたり1コピーの遺伝子の存在をも顕微鏡下に同定できるこの技術はこれまでの病理診断や発癌過程の推論などを根本から変革してしまう可能性を持っている.また,早期診断や前癌病変の診断等の臨床への応用も幅広く考え得る.今回我々は,肺癌における遺伝子変化,特に従来in situ hybrization法で検出し得なかった点突然変異を、in situ PCR法により細胞1個のレベルで同定することを試みた.in situ PCRは,遺伝子やプライマーが異なれば大きく条件が変わると考えられており,また,その条件が非常に多岐に亘る.本年度の研究によって,標本の固定法(緩衝ホルマリン,パラホルムアルデヒド,エタノール,グルタールアルデヒド),前処置法(プロテイナーゼK,ペプシン),プライマーの選定(ミスマッチプライマー,ダブルミスマッチプライマー),PCRの条件(種々の温度およびサイクル数),シグナルの検出(染色)法(RI標識,ジゴキシゲニン)に加えて,in situ hybridizationの条件(ハイブリ溶液の組成,温度,時間)と後固定法の条件(固定液,時間)を確立することができ,K-ras遺伝子の点突然変異を細胞単位で検出することに成功した.
老化を基礎とする疾患の発症・進展の予防を目的とした薬物の脳内移行特性の解明と応用

本研究は,老化を基礎とする疾患の発症や進展の予防を目的として,いくつかの薬物の脳内移行性を特徴付けた.(1)ウシ脳毛細血管内皮細胞へのクルクミンの浸透は,HPLC-UV法において検出限界のため測定できなかった.(2)ウシ脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]フルバスタチンの輸送には,担体介在機構が関与していることがわかった.(3)ラット脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]アマンタジンの輸送には,何らかの有機カチオンに感受性のある輸送システムが関与していることがわかった.アマンタジンをラット大脳内微量注入60分後に約50%が比較的緩やかに消失していることがわかった.(4)パーキンソン病態においてはレボドパのトランスポーター介在輸送効率がわずかながら減少することが示唆された.ヒト脳毛細血管内皮細胞ならびにマウス脳灌流技術を用いた実験から,(5)マジンドールの脳内取り込みに単純拡散機構とP-糖タンパク質の関与すること,(6)アマンタジンの血液脳関門輸送にP-糖タンパク質の影響がないことをそれぞれ明らかにした.(7)74歳以下と75歳以上の群,男性と女性の群,および薬物の総服用量が8g以上(8-96g)の群で,スルファメトキサゾール-トリメトプリム配合剤(SMX-TMP合剤)投与後に血清クレアチニン(SCr)の有意な上昇が認められた(P<0.05).8g以上(平均29.8g)の総服用量の群で18.4%のSCrの有意な上昇が認められた(P=0.002)が,7g以下(平均5.3g)の群ではわずか4.5%の上昇であった.これらの結果より,投与期間の総服用量が約30g(トリメトプリムとして約2.4g)のとき,SCrは20%程度まで上昇する傾向が明らかになり,本剤投与後のSCrの上昇には,年齢や性別の因子よりも総服用量が主に影響を及ぼすと考えられた.本研究は,老化を基礎とする疾患の発症や進展の予防を目的として,いくつかの薬物の脳内移行性を特徴付けた.(1)ウシ脳毛細血管内皮細胞へのクルクミンの浸透は,HPLC-UV法において検出限界のため測定できなかった.(2)ウシ脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]フルバスタチンの輸送には,担体介在機構が関与していることがわかった.(3)ラット脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]アマンタジンの輸送には,何らかの有機カチオンに感受性のある輸送システムが関与していることがわかった.アマンタジンをラット大脳内微量注入60分後に約50%が比較的緩やかに消失していることがわかった.(4)パーキンソン病態においてはレボドパのトランスポーター介在輸送効率がわずかながら減少することが示唆された.ヒト脳毛細血管内皮細胞ならびにマウス脳灌流技術を用いた実験から,(5)マジンドールの脳内取り込みに単純拡散機構とP-糖タンパク質の関与すること,(6)アマンタジンの血液脳関門輸送にP-糖タンパク質の影響がないことをそれぞれ明らかにした.(7)74歳以下と75歳以上の群,男性と女性の群,および薬物の総服用量が8g以上(8-96g)の群で,スルファメトキサゾール-トリメトプリム配合剤(SMX-TMP合剤)投与後に血清クレアチニン(SCr)の有意な上昇が認められた(P<0.05).8g以上(平均29.8g)の総服用量の群で18.4%のSCrの有意な上昇が認められた(P=0.002)が,7g以下(平均5.3g)の群ではわずか4.5%の上昇であった.これらの結果より,投与期間の総服用量が約30g(トリメトプリムとして約2.4g)のとき,SCrは20%程度まで上昇する傾向が明らかになり,本剤投与後のSCrの上昇には,年齢や性別の因子よりも総服用量が主に影響を及ぼすと考えられた.本研究は,老化を基礎とする疾患の発症や進展の予防を目的として,いくつかの薬物の脳内移行性を特徴付けた.(1)ウシ脳毛細血管内皮細胞へのクルクミンの浸透は,HPLC-UV法において検出限界のため測定できなかった.(2)ウシ脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]フルバスタチンの輸送には,担体介在機構が関与していることがわかった.(3)ラット脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]アマンタジンの輸送には,何らかの有機カチオンに感受性のある輸送システムが関与していることがわかった.アマンタジンをラット大脳内微量注入60分後に約50%が比較的緩やかに消失していることがわかった.(4)パーキンソン病態においてはレボドパのトランスポーター介在輸送効率がわずかながら減少することが示唆された.ヒト脳毛細血管内皮細胞ならびにマウス脳灌流技術を用いた実験から,(5)マジンドールの脳内取り込みに単純拡散機構とP-糖タンパク質の関与すること,(6)アマンタジンの血液脳関門輸送にP-糖タンパク質の影響がないことをそれぞれ明らかにした.

(7)74歳以下と75歳以上の群,男性と女性の群,および薬物の総服用量が8g以上(8-96g)の群で,スルファメトキサゾール-トリメトプリム配合剤(SMX-TMP合剤)投与後に血清クレアチニン(SCr)の有意な上昇が認められた(P<0.05).8g以上(平均29.8g)の総服用量の群で18.4%のSCrの有意な上昇が認められた(P=0.002)が,7g以下(平均5.3g)の群ではわずか4.5%の上昇であった.これらの結果より,投与期間の総服用量が約30g(トリメトプリムとして約2.4g)のとき,SCrは20%程度まで上昇する傾向が明らかになり,本剤投与後のSCrの上昇には,年齢や性別の因子よりも総服用量が主に影響を及ぼすと考えられた.本研究は,老化を基礎とする疾患の発症や進展の予防を目的として,いくつかの薬物の脳内移行性を特徴付けた.(1)ウシ脳毛細血管内皮細胞へのクルクミンの浸透は,HPLC-UV法において検出限界のため測定できなかった.(2)ウシ脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]フルバスタチンの輸送には,担体介在機構が関与していることがわかった.(3)ラット脳毛細血管内皮細胞へ[3^H]アマンタジンの輸送には,何らかの有機カチオンに感受性のある輸送システムが関与していることがわかった.アマンタジンをラット大脳内微量注入60分後に約50%が比較的緩やかに消失していることがわかった.(4)パーキンソン病態においてはレボドパのトランスポーター介在輸送効率がわずかながら減少することが示唆された.ヒト脳毛細血管内皮細胞ならびにマウス脳灌流技術を用いた実験から,(5)マジンドールの脳内取り込みに単純拡散機構とP-糖タンパク質の関与すること,(6)アマンタジンの血液脳関門輸送にP-糖タンパク質の影響がないことをそれぞれ明らかにした.(7)74歳以下と75歳以上の群,男性と女性の群,および薬物の総服用量が8g以上(8-96g)の群で,スルファメトキサゾール-トリメトプリム配合剤(SMX-TMP合剤)投与後に血清クレアチニン(SCr)の有意な上昇が認められた(P<0.05).8g以上(平均29.8g)の総服用量の群で18.4%のSCrの有意な上昇が認められた(P=0.002)が,7g以下(平均5.3g)の群ではわずか4.5%の上昇であった.これらの結果より,投与期間の総服用量が約30g(トリメトプリムとして約2.4g)のとき,SCrは20%程度まで上昇する傾向が明らかになり,本剤投与後のSCrの上昇には,年齢や性別の因子よりも総服用量が主に影響を及ぼすと考えられた.本研究は,1)老化を基礎とする疾患の発症・進展の予防を目的にその候補物質の脳内移行性,2)老化を基礎とする疾患時における薬物の脳内移行の変化について,2つの側面からアプローチを行った.1)クルクミンはアルツハイマー病マウスの脳におけるβアミロイドの蓄積を抑制し、アミロイド斑を減少させることが示されており,老化を基礎とする疾患の進展を遅延させる可能性を有する物質として注目されている.そこで,ウシ脳毛細血管内皮細胞を用いて,クルクミンの脳内移行性について検討した.常法に従って細胞を3日間培養後,クルクミン(50-250μM)を含有させた細胞外溶液ならびに培養液を使用して1分24時間の取り込み実験を行い,細胞内クルクミン濃度をHPLCで定量した.その結果,いずれの濃度あるいはいずれの取り込み時間においても,細胞内に取り込まれたクルクミンは検出限界以下であった.したがって,血液中のクルクミンが脳内に移行する量は極めて微量である可能性が示唆された.2)パーキンソン病(PD)は,脳の黒質線条体などの神経細胞が傷害され主に運動機能や知的機能などが損なわれ,高齢者に多い病気であるとともに,活性酸素が関与すると考えられている老化に関連する病態である.そこで、PD治療薬の1つであるレボドパ(L-DOPA)のL型中性アミノ酸トランスポーター(LATI)を介した脳内取り込み
市販お茶製品摂取による組織中フッ素濃度

高濃度にフッ素(F)が含まれているお茶の葉を粉末にした製品が,「食べるお茶」として市販されている。これらを毎日摂取することはF摂取量の増大はもちろん,お茶の葉中の多有機質中Fが胃酸によってionic Fへと遊離,吸収される事も著者の成績から明らかである。しかし,これらの製品を摂取した場合の各組織へのF分布についての報告は少ない。本研究は,摂取されたお茶の葉中の多有機質中のFがionic Fへと遊離し,体内にどのように分布されるかを検討する事を目的とした。比較対象としてionic Fのみの缶入りお茶製品(緑茶,ウーロン茶)の2群を設けたが,動物数を少なくするために対照群および通常の飼料群は設けず,先に行った低F飼料の成績と比較検討した。1.平均体重増加量に投与群間の差はみられず,粉末茶および缶入りお茶製品による影響はなかった。2.血漿中へのionic Fの増加が,粉末茶および缶入り製品ともに認められ,粉末茶中の多有機質中のFがionic Fとして血漿中に移行した事が推察された。ただし,通常飼料群と比較した場合にはいずれも有意に低い値であった。3.硬組織(大腿骨,切歯)中のionic Fは,血漿中ionic Fと同様の傾向であったが,血漿中ionic Fとの相関では,高い相関がみられたのは緑茶群のみであった(r=0.85)。4.軟組織中のionic Fは,各投与群とも対照群と比べ高い値を示し,また通常飼料群との比較でも高い値を示す投与群がほとんどであった。5.缶入り製品の投与群の方が,粉末茶投与群に比べ硬・軟組織中の蓄積量が高い傾向を示している事は,粉末茶中の多有機質中Fで摂取するよりもionic Fで摂取した方が蓄積量が高くなる可能性が示唆されるが,例数が少ないのでさらに検討が必要である。お茶の葉を粉末にした製品(食べるお茶)が市販されているが,お茶の葉には高濃度にフッ素(F)が含まれていることは明らかである。これらを毎日摂取することはF摂取量の増大はもちろん,お茶の葉中の多有機質中Fが胃酸によってionic Fへと遊離,吸収される事も,著者の人工胃液や人工腸液による成績から明らかである。そこで本研究では,お茶の葉中の多有機質中Fから遊離したionic Fの動態について,抹茶および「食べるお茶」製品によるラットの投与実験を低F飼料で行い,組織中へのF分布を検討した。『実験』1)動物実験;SD系雄ラット3週齢(1群6匹),4週間の予備飼育後,投与4週間後に屠殺。2)群および飼料;「食べるお茶」2製品(No.1,No2の2群),抹茶(No.1,No2の2群),缶入りお茶製品(緑茶,ウ-ロン茶の2群)の計6群。飼育はいずれも低F飼料で飼育。なお,動物数を少なくするために対照群および通常の飼料群は設けなかったが,先に行った低F飼料での成績と比較検討する^<a)>。そのため飼育期間等の条件は同じに設定した。3)投与量;粉末茶は「食べるお茶」のふりかけ量を参考に15μgF/kg・wt/dayになるように蒸留水に懸濁して作成し,1日1回胃ゾンデによる強制経口投与した。なお,F濃度の低い「食べるお茶」No.2は2μgF/kg・wt/dayとした。缶入り製品は自由摂取とした。4)F測定;IE法またはDiff法。『結果』1)平均体重増加量;飼育

6群間で差はみられず,F投与および缶入りお茶製品による影響はみられなかった。2)血漿中ionic F濃度;各群とも,先に行った低F飼料での投与実験の対照群と比べ高い値であったが,有意差は缶入りのウ-ロン茶群の1群でのみであった。また通常飼料群とではいずれも有意差がみられた。硬組織中のionic F濃度については,現在検討中である。a)古山公英,他:有機および無機フッ素投与ラットの組織中フッ素濃度,ジフルニサルとNaF投与その2.口腔衛生会誌,43;470-471,1994.高濃度にフッ素(F)が含まれるお茶の粉末製品(食べるお茶)が市販されているが,これらを摂取した場合のFの各組織への分布についての報告は少ない。昨年度,低F飼料によるこれら製品の投与実験(ラット)を行い,血漿中ionic F濃度や投与による体重増加への影響を報告した。本研究では,硬組織および軟組織中のionic F濃度について検討した。『方法』F測定:1)硬組織(切歯,大腿骨);85°Cにて乾燥後,粉砕し粉末状とした。この粉末試料数10mgをポチエチレンチューブに秤量し,4mlの25%塩酸を加え軽く攪拌した後,4時間室温にて放置し溶解した。この溶液1mlを用いイオン電極法によりionic Fを測定した。2)軟組織(脳,肝,腎);各試料をホモジネートにより均一化した。この試料12gを秤量し,ヘキサメチルジシロキサン飽和の過塩素酸により微量拡散後,イオン電極法によりionic Fを測定した。ただし,脳,腎については試料数が少ないので群単位でホモジネートした。『結果』1)硬組織;大腿骨および切歯中のionic F濃度では,ほとんどの投与群で対照群に比べ有意に高い蓄積量であった。ただし,抹茶No.2の投与群の切歯中のionic F濃度でのみ差がみられなかった。通常飼料群と比較した場合には,いずれの群も有意に低い値であった。血漿中ionic F濃度との関係では,緑茶投与群でのみr=0.85と高い相関がみられた。2)軟組織;脳および腎臓中のionic F濃度では,各投与群とも対照群と比べ高い値を示した。また通常飼料群との比較では,高い値を示す投与群がほとんどであった。ionic Fそのものの投与である缶入り製品で,抹茶や「食べるお茶」に比べ高い値を示し,お茶製品中にある多有機質中Fで摂取するよりもionic Fで摂取した方が蓄積量が軟組織では高くなる可能性が示唆された。
東アジア高度経済成長の歴史的起源ー連続・断絶論から東アジア経済圏論へ

本研究では、主に次の三点の学問的成果をあげることができた。(1)我々は日本、韓国、台湾の高度経済成長という現象を、相互に深く関連した一つの歴史的変動として捉えた。(2)国際的な共同研究としての優位性を活かして、各国の新資料を相互に組み合わせて実証的分析に取り組んだ。(3)当時の韓国と台湾の重要な個別産業をとりあげ、一国の産業分析にとどまらない多面的な視点から具体的に解明した。研究期間中には、2度のシンポジウムを開催した他、8度の国際共同研究会を開催し、学界にインパクトを与え、日本・韓国・台湾の研究交流を促進した。研究成果は、論文集としてまとめ日本のみでなく、韓国、台湾での出版を追求する。初年度は、交付申請書の「研究実施計画」に記載した通り、研究の基礎となる資料の調査収集とその初歩的整理、データベースの設計・構築を最優先作業とした。これに加えて、三度の国際共同研究会を開催した。以下、資料調査、研究会の順に概要を述べる。米国への資料調査は次の通りである。(1)米国国立公文書館への資料調査(2011年6月17日7月17日、林采成):戦後アメリカの対外経済政策の主軸であった国務省関連資料を中心として調査した。(2)米国国立公文書館への資料(2011年8月29日9月7日、湊照宏、許世融、圖左篤樹):戦後のアメリカ援助局の対台湾援助に関する資料収集を行った。以上の他に、圖左・堀内が台湾、堀・福岡が韓国、袈錫満が日本の外交史料館でそれぞれ短期の資料調査を行った。国際共同研究会の概要は次の通りである。(1)全体研究会(2011年8月78日、京都大学):研究プロジェクトの三国のメンバーが集合し、それぞれの研究について報告し、各々の研究分担について相談を行った。(2)韓国・台湾の造船業史研究会(2012年1月7日、京都大学):袈錫満が韓国造船業の育成政策を検討し、試行錯誤の末、国営方式の限界が認識されたことを明らかにした。また、堀内・堀・裴が『台湾造船公司の研究』を書評し、著者の洪紹洋氏、祖父江利衛氏を招いて討論を行った。日本の造船業と韓国・台湾の造船業の比較を通じて、韓国・台湾造船業の60年代までの類似性と70年代以降の分岐が研究課題として浮き彫りになった。(3)繊維業史研究会(2012年3月24日、京都大学):柳尚潤氏(韓国から招聘)が50年代における米国による対韓人絹糸援助の意義を検討し、福岡が60年代の韓国繊維産業の輸出産業化は、日系商社の第三国貿易の進展という側面があったことを明らかにした。議論の結果、1950年代か、ら60年代の輸出産業化への転換がどのように行われたのか、と課題認識が共有された。共同研究の最終年度である平成25年度は、交付申請書の「研究実施計画」に記載した通り、資料調査収集活動、3国比較を念頭においた分野別研究会の開催、成果発表という3つの活動を柱として研究を行った。以下、順に概要を述べる。資料調査収集活動については、堀内が2月に台湾で機械産業に関する資料を収集したほか、研究協力者の林采成が7月に台湾でアメリカの台湾援助に関する資料収集を、ベ錫満が10月に日本で戦後日本造船産業に関する資料調査を行った。国際共同研究会は2回開催された。(1)全体研究会(8月22ー23日、京都大学):研究プロジェクトの3国のメンバー全員(9名)が参加し、各自の研究について報告し、集中的に討論をおこなった。(2)「戦後韓国台湾における金融・資本市場の形成」に関する研究会(10月27日、京都大学):李明輝(韓国梨花女子大学より招聘)が1960年代農漁村高利債整理事業に関する報告、湊照宏が台湾資本市場成立史に関する報告を行い、堀和生によるコメントの後、活発な討論が行われた。研究成果の学界への発表については、現代日本経済史研究会と合同で「東アジアの資本主義史に関するシンポジウムー認識の長いスパンと広い視野ー」(8月24日、京都大学みずほホール)を開催した。発表者と表題は以下の通り。堀和生「東アジア資本主義は設定できるか」、林采成「戦後東アジアの経済発展とアメリカ」、金子文夫(横浜市立大学)「東アジアにおける商品と資本の移動」、原朗(東京大学名誉教授)「東アジアの資本主義と欧米帝国主義」。

また、松野周治(立命館大学)、柳沢遊(慶応義塾大学)、富澤芳亜(島根大学)のそれぞれアジア、日本、中国の経済史を代表する研究者からコメントがあり、フロアからの発言も含めて活発な議論が交わされた。なお、3年間の共同研究の総括として、最終報告書を編集中であり、3国で論文集として出版する予定である。共同研究の2年目である平成24年度は、交付申請書の「研究実施計画」に記載した通り、資料調査収集活動、3国比較を念頭においた分野別の研究会の開催、中間的な成果の学界への発表を柱として研究を行った。以下、順に概要を述べる。資料調査については、各メンバーが研究対象地域、日本、韓国、台湾で短期間の資料調査を繰り返し行った。国際共同研究会は下記の通り3回開催された。(1)米国の戦後構想・政策と東アジアに関する研究会(2012年6月16日、京都大学):共同研究の海外メンバーである林采成が米国の東アジア経済政策、趙祐志が米国の対台湾経済政策に関して報告した。(2)全体研究会(2012年8月2223日、京都大学):研究プロジェクトの3国のメンバーが集合し、それぞれの研究について報告し、各々の研究分担について議論した。(3)企業成長の3国比較に関する研究会:(2013年3月2日、京都大学):朴二澤(高麗大学校韓国より招聘)が20世紀前半日本、朝鮮、台湾の企業成長について報告した。中間成果の学界への発表については、2012年8月24日に社会経済史学会近畿部会の夏季セミナー(大阪市立大学文化交流センター)において、シンポジウム形式で本研究の中間報告を行った。内容は下記の通りである。全体テーマ:「東アジアにおける復興から高度成長ー日本、韓国、台湾の経済的変容ー」。2発表者と内容:堀和生「戦後東アジアにおける高度成長」、林采成「米国の戦後東アジア経済政策」、福岡正章「韓国・台湾の繊維産業」、堀内義隆「台湾・韓国の機械産業」、裴錫満「韓国・台湾の造船産業」。3武田晴人(東京大学)、李榮薫(ソウル大学)、黄紹恆(交通大学)という3国の学界を代表する経済史研究者からコメントを受けた他、フロアの参加者からの質問も含めて、その後の本研究の展開に関わる貴重な意見を得ることができた。初年度の重点課題とした資料の調査収集に関して、二度の米国国立公文書館への調査を含め、各メンバーによる各国での資料調査が行われ、順調に進展していると評価できる。また、国際共同研究という点からも、三度の研究会を開催することができ、活発な討論が行われたことから、順調な成果があげられたと評価できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。(理由)共同研究2年目において柱とした3つの活動はおおむね順調に達成されたと評価できる。資料調査収集活動に関しては、初年度に行った米国における資料調査を本年度は行うことができなかったが、各メンバーによる日本、韓国、台湾における資料調査は活発に行われた。また、3度の国際共同研究会が開催され、中間成果の学界への発表も行い、活発な討論がなされたことからみて、順調な成果があげられたと評価できる。各メンバーの研究成果は、個別の論文として随時公表している。昨年度に引き続き、米国での資料調査・収集を行う。また、研究成果の中間報告のための国際共同研究会を複数回、日本で開催する。具体的には、戦後米国の対アジア経済政策に関連した研究会を行う予定である。また、8月には、社会経済史学会の夏季セミナーにおいて、本研究課題に関する中間研究成果報告を行う。第一に、引き続き、米国ならびに研究対象国における資料調査収集を行う。
ナメクジにおける視覚情報伝達の投射様式の解明

ナメクジの球状レンズ眼の網膜には、約300個の視細胞が存在する。ナメクジはこの眼を用いて、視野内における明暗差などを認識できることが知られている。一方、網膜上の位置によって、視細胞から脳に向けた投射に用いられている神経伝達物質が異なることが、これまでの代表者らの実験結果により明らかとなっている。これらの観察結果は、ナメクジでは、視野内における光源の位置情報が、脳へ向けた神経伝達物質の種類、ないしは神経伝達物質の種類に応じた投射様式によりコードされている可能性を示唆している。本研究では、この可能性を検証すべく、組織化学的手法と電気生理学的手法を用いて解析を行う。
薬害を防止するための代謝拮抗パラメーターを用いる評価系の理論構築

ヒト、ブタの肝臓、小腸粘膜を用いたニトログリセリン(GTN)の代謝について、その代謝に重要なグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の分子種の同定を行った。その結果、動物種に関係なく、肝臓中にはGSTaが主であり、小腸ではGSTmが主であることを明らかにした。GTNの代謝は、GSTaにより1,2-GDNが生成し、GSTmで1,3-GDNが産生された。Caco-2細胞がGSTmを発現し、ヒト小腸で観察されるGTNの代謝の結果をCaco-2細胞で観察できることをつきとめた。また、アルカリフォスファターゼ、スクラーゼ、エステラーゼをCaco-2細胞は産生し、エステル型薬物(プロドラッグを含む)の代謝パターンが、ヒトの小腸粘膜の結果とほぼ一致することを見い出した。インドメタシンのアミド結合を水解する酵素は、ブタの肝臓ミクロソームに局在する非常に不安定なカルボキシエステラーゼであることを明かにした(km:68μM,Vmax:9nmol/mg protein/min)。この酵素はマウスのES-maleと高い相同性を有しており、通常エステラーゼの基質として用いられるa-ナフチルアセテートやp-ニトロアセテートは水解しなく、アニラセタム以外の市販のアミドまたはエステル結合に対しては何ら水解作用を示さなかった。ヒトではインドメタシンの代謝物としてアミド結合の水解物が検出されているので、ブタと同様に現在までに報告されていない不安定なエステラーゼに属する酵素の存在が推定され、その役割を明かにすることによってアミド結合を有する薬物の代謝を予測し、相互作用を検討することができるものと考えられる。さらにプランルカストのヒトとラットの代謝様式が異なることを明かにするため、プランルカストを基質としてその酵素を精製した結果、従来から知られている肝臓ミクロゾーム画分のカルボキシエステラーゼ(hydrolase B)で代謝されていることを酵素化学的に証明した。この酵素は、ヒトの肝臓中の酵素とその基質特異性が異なり、プランルカストの代謝に種差が生じたものと考えられた。ヒト・ブタの肝臓,小腸粘膜を用いたニトログリセリン(GTN)の代謝について,その代謝に重要なグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の分子種の同定を行った。その結果,動物種に関係なく,肝臓中にはGSTαが主であり,小腸ではGSTμが主であることを明らかにした。GTNの代謝は,GSTαにより,1,2-GDNが生成し,GSTμで1,3GDNが産生された。Caco-2細胞がGSTμを発現し,ヒト小腸で観察されるGTNの代謝の結果をCaco-2細胞で観察できることをつきとめた。またアルカリフォスファターゼ,スクラーゼ,エステラーゼをCaco-2細胞は産生し,エステル型薬物(プロドラッグを含む)の代謝パターンが,ヒトの小腸粘膜の結果とほぼ一致することを見い出した。しかし,HepG2ならびにChang liver細胞は,ヒト肝臓中のGSTおよびエステラーゼ含量に比してそれらの活性が低く,直接的には培養細胞を利用することができないことも検討した。インドメタシンのアミド結合を水解する酵素は、ブタの肝臓ミクロソームに局在する非常に不安定なカルボキシエステラーゼであることを明かにした(km : 68 μM, Vmax : 9 nmol/mg protein/min)。

この酵素はマウスのES-maleと高い相同性を有しており、通常エステラーゼの基質として用いられるα-ナフチルアセテートやp-ニトロアセテートは水解しなく、アニラセタム以外の市販のアミドまたはエステル結合に対しては何ら水解作用を示さなかった。ヒトではインドメタシンの代謝物としてアミド結合の水解物が検出されているので、ブタと同様に現在までに報告されていない不安定なエステラーゼに属する酵素の存在が推定され、その役割を明かにすることによってアミド結合を有する薬物の代謝を予測し、相互作用を検討することができるものと考えられる。さらにプランルカストのヒトとラットの代謝様式が異なることを明かにするため、プランルカストを基質としてその酵素を精製した結果、従来から知られている肝臓ミクロゾーム画分のカルボキシエステラーゼ(hydrolase B)で代謝されていることを酵素化学的に証明した。この酵素は、ヒトの肝臓中の酵素とその基質特異性が異なり、プランルカストの代謝に種差が生じたものと考えられた。また、hydrolase Bはアニラセタムのアミド結合にはほとんど作用しなく、プランルカストに対して高い親和性(km :61μM)と高い反応速度定数(Vmax : 234 nmol/mg protein/min)を示した。
哺乳類の安定的な精子形成を支える幹細胞集団の特定

マウスの精子幹細胞を特定することを目的として、in vivoライブイメージングとパルスラベル法を用いて組織非侵襲的にGFRα1発現精原細胞の運命を単一細胞レベルで解析した。その結果、形態の異なる不均一な細胞集団がマウス精子形成を支える幹細胞であることが示唆された。本研究は、精子形成幹細胞の特定を目指して、幹細胞の最有力候補と考えられるGFRα1を発現するAsingle型精原細胞(As)の挙動に着目した。古典的にAsは2つのパターンの分裂を行うと考えられている。一つ目は分裂後に2個の新しいAsが生まれる分裂、そして2つ目は分裂後に生まれた2個の細胞が細い細胞間橋でつながったApaired型精原細胞(Apr)になる分裂である。前者は、一般的に精子形成幹細胞の「自己複製」、そして後者は一方向的な「分化」を意味すると考えられている。この記載が正しい場合、定常状態においては、理論上これらの2つの現象は頻度が同じであり(細胞死がない場合)、このつり合いによってAsの数が一定に保たれているはずである。しかしながら実際のところ、これらの分裂現象はその頻度はおろか、本当に生体内で起こっているか否かについても全く不明である。この課題の検証には、時間を超えてAsの細胞系譜を追う実験系の開発が必須であると考え、本年度では、まず精巣におけるGFRα1発現細胞のライブイメージング技術を確立した。具体的には、GFRα1発現細胞をGFP標識する蛍光マウス(免疫組織化学法により全てのGFRα1発現細胞を蛍光標識していることを確認したもの)を用いて蛍光顕微鏡下でAsの生体内での挙動を追跡する系を立ち上げた。同系で取得した画像データについては、PCに取り込んで映像化および映像解析を行い、細胞系譜の定量的データを取得した。次に、確立した実験・解析系を用いてAsの分裂後の細胞系譜を追跡した。その結果、観察したAsの分裂は、95%以上がAs⇒Aprであった。この結果は、従来「自己複製」と考えられていたAs⇒2×Asが実際にはほとんど起こっていないこと、さらには既存の概念以外にAsを維持するメカニズムが存在する可能性を強く示唆するものである。本研究の目的は、ほ乳類の精子形成を支える精子形成幹細胞の特定である。平成22年度において、精子形成幹細胞の最有力候補と考えられてきたGFRα1を発現するAsingle型未分化型精原細胞(As)は、教科書的に幹細胞の自己複製様式と考えられている厳密な非対称分裂を行っていない可能性が示された。さらに、実際には、Asは分裂後に不完全分裂により2つの娘細胞が細い細胞間橋で連結したApaired(Apr)やAaligned(Aal)になり、その後、細胞間橋の断片化により、再びAsに逆戻りすることが示唆された。定常状態における組織幹細胞とは、自己複製能と分細胞の生産能力によって定義づけられるものである。前述の成果と併せて考えると、「AsだけでなくAprとAalを加えた未分化型精原細胞集団をまとめて幹細胞として機能する」可能性が高いように思われる。平成23年度においては、この可能性を検証するため、GFRα1を発現するAs、AbrそしてAalの細胞集団を任意の時期に不可逆的にパルス標識し、その細胞が長期間にわたって組織幹細胞として機能し続けるか否かを検証するための実験系をくみ上げた。すでに、ラベル後1か月までの実験結果を得ており、この間標識した細胞集団は確かに幹細胞として機能し続ける(自己複製と分化細胞の生産を両立する)という明確な証拠を得た。現在、6カ月1年間という長期間にわたっても幹細胞として機能し続けるか否かについて実験継続中である。実験条件の至適化にかかわる予備的実験は完了しており、約半年後には全ての結果が得られる予定である。この実験の結果、仮説が正しければ、着目した細胞群が精子形成幹細胞であるという明確な機能的証明となり、本研究の目的を達成することになる。本研究は、マウスの精子形成を支える精子形成幹細胞の特定を目的としている。平成22-23年度において、in vivoライブイメージング法を用いて、幹細胞候補と考えられたGFRα1を発現するAsingle型未分化型精原細胞(As)が、細胞分裂時の不完全分裂によって娘細胞同士が細胞間橋で連結したApaired(Apr)やAalinged(Aal)と呼ばれる合胞体構造になること、そして失われたAsは合胞体(AprおよびAal)の細胞間橋の断片化によって新たに補われることを明らかにした。以上の結果は、形態的に不均一なGFRα1+ As、Apr、Aalが分裂に伴う合胞体の伸長と断片化を繰り返しながら集団として維持される可能性を示唆するものであった。しかし、技術的な限界から、ライブイメージングは個々の細胞を2-3日間しか連続観察することができず、同法だけでは長期間の幹細胞機能の実験的検証は不可能である。これに対し、平成23年度にはGFRα1+ As、Apr、Aal集団を標識し、その運命を追跡する系を確立した(パルスラベル法)。

平成23-24年度においては、同法を利用して、GFRα1+ As、Apr、Aal集団が、長期間の精子形成を支える幹細胞集団であるか否かを検証した。その結果、同細胞集団は、確かに、1年以上の間、自己複製しながら精子生産を継続する集団であることが示された。以上の3年間の結果から、マウスの精子形成幹細胞は、GFRα1遺伝子を発現したAs、Apr、Aalによって構成される細胞集団であるという結論を下すに至った。目標としていた生体内における精子形成幹細胞の特定を十分に達成することができたものと考えている。同知見は、畜産動物・ヒトにおける幹細胞制御機構の理解の基盤を提供するものである。平成22,23年度の成果から、本研究の目的である「精子形成幹細胞の特定」を達成しつつある。また、平成24年度(最終年度)研究遂行に必要となる実験材料の準備や予備実験についても既におおむね終了しており、最終年度内の確実な目的達成のめどもついている。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き着目した細胞集団の幹細胞としての機能的解析を推し進める。この内容は、申請時の計画とは異なる。これは、平成22,23年度の研究成果から、計画時の仮説が覆ったため、目的の達成のために計画を練り直したためである。今後も、予想外の結果が得られることも想定しながら、目的の達成に向けて研究を着実に遂行する。
ブタ精子幹細胞の単離・濃縮法および移植法の開発

クローンブタの作製が2000年に成功して以降、体細胞核移植技術は遺伝子改変技術と合わせて異種移植、生体組織工学、動物疾患モデルなどの様々な生物医学研究分野に応用されているが、その効率は依然として低い。新たな手法として、実験動物であるマウスでは精子幹細胞を利用した遺伝子組換え技術が考案されており、その技術を家畜に応用することを目的として、本課題をスタートした。本課題では、ブタ精子幹細胞特異的バイオマーカーを明らかにし、それらを指標としてブタ精子幹細胞の効率的な単離・濃縮法の開発に取り組んだ。初年度である25年度では,必要となる周辺技術の開発を進めることを目的として以下2つの課題に取り組んだ。《1ブタ精子幹細胞の単離・濃縮法の開発》ブタの精巣から細胞を分散・単離する手法を検討した。野生型交雑種のブタ新生仔(生後4週未満)の精巣を材料として実験を実施した。細切した精巣組織片を,collagenase,hyaluronidase,DNaseI等の細胞分散酵素を含んだ培養液中で処理すると,85%以上の生存した精巣細胞が回収された。また,酵素処理後にvortex処理すると細胞が効率的に分散され,また溶血剤で処理しても精巣細胞の生存率に大きな影響がないことがわかった。《2レシピエントブタの移植前処理法の開発》ドナー精子幹細胞の生着効率を高めるためには,レシピエント精巣内の精子幹細胞数を減少させ,外来細胞が生着可能なスペースを確保する必要がある。そのため,精子幹細胞を死滅させることが知られるbusulfanでレシピエントブタを事前に処置した後,ドナー細胞の移植を試みる予定である。しかし,busulfanは同時に免疫抑制作用を有して造血系細胞にも影響を及ぼす。そのため,野生型交雑種のブタ新生仔(生後1-2週)を用いてブタにおけるbusulfanの至適投薬量を検討した。マウスやヒトにおける知見を参考に,総投与量(体重1kGあたりでbusulfan投与量を調整),1回の投与量, 1日の投与量をかえ,数パターンの投薬スケジュールを試行した。その結果,午前,午後に1回ずつ2日間,1回の投与量1mG/kG (計4回,総投与量4mG/kG)では,投薬開始10日後に白血球数および血小板数が正常値の半分程度に減少し,その後の継続飼育で25日後にそれらが正常値に戻ることがわかった。また,その条件で投薬した試験群は致死となることはなかった。本年度は以下2つの課題を実施した。『ブタ精巣成熟過程における生殖細胞系列の動態の観察』様々な生後齢の精巣(生後直後(生後3日)から成豚(6ヶ月齢))をサンプルとし,減数分裂期細胞特異的遺伝子(Haspin, SYCP3, DMC1)の発現時期を定量RT-PCRを用いて調べた。いずれの遺伝子も3ヶ月齢以降の精巣から発現が観察された。組織学的観察では,3ヶ月齢の精巣精細管内では生殖細胞の多層化が始まり,4ヶ月齢の精巣では造精が起こっていることがわかった。また,哺乳類で生殖細胞や幹細胞に特異的に発現すると報告されている遺伝子数種のタンパク質レベルでの発現を免疫組織化学的に調べた。その結果,PGP9.5は生後直後から成豚の精細管中の生殖細胞に発現がみられた。また4ヶ月以上の精巣では精細管壁に沿って局在しており,それらの一部は,分裂期細胞特異的に発現するKi67 positiveな細胞であった。生殖幹細胞が局在するnicheは精細管壁であるという定説を考慮すると,PGP9.5(+)/Ki67(+)細胞が分裂・増殖中のブタ精子幹細胞であると判断してよいと考える。以上の結果から,ブタ精巣の成熟過程においては一貫してPGP9.5が精子幹細胞のマーカーとなりうることが示唆された。『ブタ精子幹細胞の単離・濃縮法の開発』昨年度,酵素処理,溶血処理を用いて,ブタ精巣組織から精巣細胞を効率的に単離する方法を考案した。上述のPGP9.5をマーカーとして,単離細胞のうち,どの程度の割合で精子幹細胞が含まれているかを調べた。様々な生後齢の精巣(生後3日から6ヶ月齢)を用いて実験を実施した。その結果,いずれの生後齢の精巣からも,単離細胞のうちの0.5%程度(もしくはそれ以下)がPGP9.5(+)細胞であることがわかった。ブタ精巣を免疫組織科学的的に観察することによってPGP9.5がブタの精子幹細胞のマーカーとなりうること、また、酵素処理や溶血処理を用いてブタ精巣からの効率的な細胞単離が可能であることなどが昨年度までの研究によって明らかとなった。本年度はこれまでの成果を踏まえ、PGP9.5を指標としてブタ精子幹細胞の単離・濃縮法の開発に取り組んだ。発育段階の異なるブタの精巣(生後1,2,3,4,5および6ヶ月齢)を実験材料としてブタ精子幹細胞の濃縮を試みた結果、いずれの発育段階の精巣を用いても90%程度の生存率で細胞が回収可能であった。その一方、単位重量あたりの回収細胞数は造成後の精巣(4ヶ月齢以上)より造成前の精巣(3ヶ月齢以上)が多いことが分かった。