hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然免疫からアレルギーにわたるマスト細胞の活性化機構の分子的解明とその制御

1.高親和性IgE受容体(FcεRI)β鎖による抑制性シグナルFcεRIβ鎖ITAM変異体では、抗原刺激後のLynやSHIPとの会合が著しく低下する。一方、NF-κBおよびERK, P38 MAPKの活性化が亢進していた。また、β鎖細胞内ドメインC末端側領域が、マスト細胞の活性化を正に制御していることが明らかになった。転写因子MZF-1が第4イントロン中のエレメントを介してヒトFcεRIβ鎖遺伝子の発現を抑制した。yeast two hybrid法によりヒトcDNAライブラリーから単離・同定したMZF-1結合因子のうち、FHL3が抑制性の補因子として機能した。さらに、MZF-1/FHL3複合体によるβ鎖遺伝子の発現抑制がGM-CSF存在下で増強される可能性を示した。3.マスト細胞におけるTLRのシグナル伝達LPS刺激によるNF-κB活性化経路が2つ存在することを明らかにした。PKRを介した経路が、LPSによるMyD88非依存のNF-κB活性化に関与していた。4.活性酸素によるマスト細胞活性化調節機構FcεRI活性化により産生されるH_2O_2がLAT、PLCγのチロシンリン酸化を増強して、Ca^<2+>ストアの枯渇と細胞膜上のCa^<2+>チャネル(store-operated channels, SOCs)を介するCa^<2+>流入を制御することを示した。FcεRI活性化によるH_2O_2産生経路には、FcεRIβ鎖を必要とし、フラボタンパク質に依存する経路と、β鎖を必要とせず、ミトコンドリアの電子伝達系によるスーパーオキシド産生に由来する経路が存在した。さらに、直接的なH_2O_2産生がCa^<2+>ストアの枯渇に重要であるのに対して、ミトコンドリアでのスーパーオキシド/H_2O_2産生は、SOCsの持続に関与することが示唆された。β鎖変異体では,抗原刺激後のLynとの会合が著しく低下しており,下流のSyk, LATなどのシグナル伝達分子の活性化の低下が認められた.しかしながら,β鎖変異体はSHIP, SHP1およびSHP2のフォスファターゼとの会合・活性化が低下しており,これらが抑制性シグナルの破綻に結びついていると考えられる.β鎖変異体トランスジェニックマウスはファウンダーマウスとβ鎖-/-マウスとの掛け合わせを進行させている段階である.b)マスト細胞の脱顆粒に関与する細胞骨格の構成に影響を及ぼす因子の解析MacGAP高発現RBL.2H3細胞は著明な細胞死を引き起こすために,現状では解析に用いることが不可能である.現在,発現誘導を任意に制御できる系(Tet-ON)への切換えを行っている.c)活性酸素によるマスト細胞活性化調節機構の解明β鎖とLATの抗原刺激によるチロシンリン酸化は,FcεRIの凝集に附随して産生されるレベルのH_2O_2によって最も強く誘導され,それ以上では逆に減弱した.さらに,NADP(H)oxidase活性の阻害およびH_2O_2の選択的な消去によってこれらの分子のリン酸化は消失した.以上から,細胞内の活性酸素レベルによりマスト細胞の刺激に対する感受性が調節されることが示唆された.レポーターアッセイによりヒトFcεRIβ鎖遺伝子全領域のうち数カ所の領域が転写制御活性を有することを見いだした.このうちの第4イントロン中の領域について詳細なマッピングを行いシスエレメントを同定し,このエレメントにMZF-1が結合することをゲルシフトアッセイにより確認した.

さらに,ヒトマスト細胞株へのMZF-1アンチセンスの導入によりβ鎖mRNA量が上昇し,MZF-1がこのエレメントを介してβ鎖遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった.TLR4の情報伝達に係わることが知られているIRAK及びTRAF6のdcminant negative(D/N)体の過剰発現は,LPS刺激によるNF-kB活性化を抑制した.しかし,その上流に位置するMyD88-D/N体の過剰発現は顕著な抑制効果を示さなかった.一方,MyD88非依存的なNF-kBの活性化経路として知られるPKRのD/N体はNF-kBを有意に抑制し,また,PKRの阻害剤である2-aminoprorineはLPSによるNF-kBの活性化を抑制した.1.高親和性IgE受容体(FcεRI)β鎖による抑制性シグナルの分子的解析β鎖ITAM変異体では、NF-κBおよびERK、p38MAPKの活性化が亢進していることが明らかになった。また、β鎖細胞内ドメインC末端側の6アミノ酸残基から成る領域は、マスト細胞の活性化を正に制御していることが明らかになった。β鎖ITAM変異体Tgは引き続きβ鎖欠損マウスとの掛け合わせを進めている。2.活性酸素によるマスト細胞活性化調節機構の解明FcεRIの凝集によって惹起されるH_2O_2産生におけるリピッドラフトの関与を解析したところ、抗原刺激によるH_2O_2産生に伴って、FcεRIβ鎖,Lyn, LATがリピッドラフトのより高密度画分にシフトし、H_2O_2産生はリピッドラフト構造の破壊によって著しく低下することがわかった。FcεRIβ鎖ならびにLATを介さないでマスト細胞を活性化するthapsigargin刺激では、これらの現象はみられなかった。これらの結果から、リピッドラフトがFcεRIの凝集によるH_2O_2産生に関与することが示唆された。3.FcεRIβ鎖遺伝子の発現制御機構の解明平成15年度に、転写因子MZF-1が第4イントロン中のエレメントを介してヒトFcεRIβ鎖遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。yeast two hybrid法によりヒトcDNAライブラリーから単離・同定したMZF-1結合因子のうち、FHL3がMZF-1と結合して抑制性の補因子として機能することを明らかにした。さらに、MZF-1/FHL3複合体によるβ鎖遺伝子の発現抑制がGM-CSF存在下で増強される可能性を示した。4.マスト細胞におけるToll-like receptors(TLR)を介したシグナル伝達機構LPSによるTLR4を介したマスト細胞の活性化において、PKR(dsRNA-activated protein kinase)を介した経路が、MyD88を迂回するシグナル伝達に深く関与していることを明らかにした。
神経標識物質を用いた脊髄神経の層的構造の解明

本研究の目的は、脊髄神経の本幹横断面に識別される神経線維の配列とmotoneuron poolsの前角における層的配列の関係を明らかにすることであった。神経標識物質として、コレラトキシンサブユニットBを用いた。神経標識物質の注入部位での漏出を防ぐため、これをラテックスビーズに吸着させたものを用いた。実験はネコ20体40側を用い、頭側・尾側後鋸筋、内・外肋間筋、内・外腹斜筋に注入した。頭側後鋸筋と尾側後鋸筋は、体軸に沿って同様の位置に配列する筋であるが、頭側後鋸筋は外肋間神経の支配神経(浅助間神経)に、尾側後鋸筋は内肋間筋同様に肋間神経本幹から直接それぞれ支配される。頭側後鋸筋に注入した例では、標識神経細胞が前角腹側の中央に局在していた。尾側後鋸筋に注入した例では、標識神経細胞は前角腹側の外側(腹外側核)に位置していた。また、外肋間筋と内肋間筋に注入した結果、前角腹側の中央と外側にそれぞれ標識神経細胞が検出された。すなわち前角における運動神経細胞の位置は、筋の存在位置ではなく、筋の支配神経と関連することが推測された。そこで、外側皮枝前枝から筋枝(壁外枝)を受け外肋間筋相当と考えられてきた外腹斜筋と、内肋間筋相当と考えられている内腹斜筋に注入した。その結果、内腹斜筋の標識神経細胞は内肋間筋同様に前角腹側の外側に位置していた。しかし外腹斜筋の標識神経細胞は、外肋間筋と内腹斜筋それぞれの神経細胞の存在部位の中間に分布していた。以上の所見から、脊髄前角における運動神経細胞の配列は、単に支配される筋の体幹での位置ではなく、その支配神経の分岐様式(順)に対応すると考えられた。なお、脊髄神経の横断面における注入筋支配の軸索は、標識されなかった。
舶用液体水素タンク内部における熱流動現象の解明 -計測・数値解析-

本研究では、極低温液体である液体水素を海上輸送するための基盤技術の確立を目指して、海上輸送時における舶用液体水素タンク内部のスロッシングに伴う熱流動現象について解明する。本年度では、主に以下の研究成果を得た。1.超伝導液面センサーの静的・動的液面検知特性:平成29年度に構築した超伝導液面センサーの液面検知特性実験システムを用いて、5本の超伝導液面センサーの大気圧下・加圧下における静的・動的液面検知特性を調べた。静的液面検知特性では、液面検知特性に対する圧力の影響について明らかにした。動的液面検知特性に関しては、液面検知誤差が最も小さくなる最適ヒーター入力値を明らかにした。2.液体水素海上輸送実験:本研究では、神戸大学海事科学研究科附属練習船深江丸の後部甲板に液体水素実験システムを構築し、世界初となる外洋での液体水素海上輸送実験を行った。実験では、輸送時における液体水素タンク内部の液面・温度・圧力、タンクに加わる加速度を同時計測するとともに、船体動揺(ピッチ角・ロール角)、船速等の計測を行った。実験では、神戸大学深江キャンパスを出港後、1泊2日で外洋において、Z試験等によって船体を揺動させて、揺動時における液体水素タンク内部のスロッシングを計測した。3.熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いた熱流体解析:平成30年度は、平成29年度に引き続き、STAR-CCM+を用いて、基本的な熱流体解析モデルの構築を行った。液体水素海上輸送実験が、深江丸の航海スケジュール上、平成30年度末に行ったため、実験データとの比較による詳細な数値解析は次年度に行う。当初の計画通り、超伝導液面センサーの静的・動的液面検知特性を明らかにすることに成功し、液体水素タンク内部のスロッシングを液面センサーによって検知することが可能であることを明らかにすることができた。また、当初の計画通り、深江丸による世界初の外洋での液体水素海上輸送実験に成功し、液体水素タンク内部のスロッシングを計測することができた。数値解析においては、実験データの再現には到達していないが、海上輸送実験を予定通り行うことが出来たため、上記の評価とした。今後の推進方策として、まず平成30年度に行った液体水素海上輸送実験で得られたデータの解析を行う。その後、熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いて、海上輸送実験で使用した液体水素タンクをモデル化し、実験結果の再現を行う。また、実験結果を精度よく再現するために、メッシュ形状、解析条件等を変更し、解析モデルの最適化を行う。さらに、タンク形状、断熱条件等を変更し、タンク形状によるスロッシングに伴う熱流動現象への影響や断熱性能の差による影響についても調べる。1.液体水素タンク内部の温度分布計測システムの構築:本研究では、液体水素タンク内部の温度分布を測定するために、CCS温度計を購入し、温度計の較正試験を行った。較正試験では、較正試験装置を製作し、計測ソフトであるLabVIEWを用いて4 Kから300 Kまで較正可能なプログラムを構築した。本研究では、6個のCCS温度計を較正した後、すべての温度計を液体水素タンク内部に設置し、液体窒素、液体水素をタンク内部に満たして作動試験を行い、良好な結果を得た。2.超伝導液面センサーの液面検知特性実験システムの構築:超伝導液面センサーの液面検知特性を評価するために、光学観測窓付クライオスタット内部に5本の超伝導液面センサーを取り付け、光学観測窓から高速度カメラを用いて液面を観測し、各液面位置におけるセンサー出力を同時計測できるシステムの構築を行った。また、加圧下における液面検知特性を明らかにするために、圧力調整器を用いて、クライオスタット内部の圧力をコントロールするためのシステムを構築した。液体窒素による予備試験を行った結果、0.3 MPaGまで精度よく圧力を一定に保持することができたので、超伝導液面センサーの圧力下での特性評価実験が可能となった。3.熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いた熱流体解析:本年度は、STAR-CCM+を用いて、基本的な熱流体解析モデルの構築を行った。その結果、メッシュ形状、物理モデル等の違いによる解析精度、解析時間に関する知見を得た。当初の計画通り、液体水素タンク内部の温度分布計測システムの構築に成功し、液体水素タンク内部の温度分布計測が可能となった。また、超伝導液面センサーの液面検知特性実験システムの構築に成功し、超伝導液面センサーの大気圧下、加圧下における静的・動的液面検知特性の評価実験が行える段階に到達した。数値解析においても、基本的な熱流体解析モデルの構築が整っている。

動的液面検知特性に関しては、液面検知誤差が最も小さくなる最適ヒーター入力値を明らかにした。2.液体水素海上輸送実験:本研究では、神戸大学海事科学研究科附属練習船深江丸の後部甲板に液体水素実験システムを構築し、世界初となる外洋での液体水素海上輸送実験を行った。実験では、輸送時における液体水素タンク内部の液面・温度・圧力、タンクに加わる加速度を同時計測するとともに、船体動揺(ピッチ角・ロール角)、船速等の計測を行った。実験では、神戸大学深江キャンパスを出港後、1泊2日で外洋において、Z試験等によって船体を揺動させて、揺動時における液体水素タンク内部のスロッシングを計測した。3.熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いた熱流体解析:平成30年度は、平成29年度に引き続き、STAR-CCM+を用いて、基本的な熱流体解析モデルの構築を行った。液体水素海上輸送実験が、深江丸の航海スケジュール上、平成30年度末に行ったため、実験データとの比較による詳細な数値解析は次年度に行う。当初の計画通り、超伝導液面センサーの静的・動的液面検知特性を明らかにすることに成功し、液体水素タンク内部のスロッシングを液面センサーによって検知することが可能であることを明らかにすることができた。また、当初の計画通り、深江丸による世界初の外洋での液体水素海上輸送実験に成功し、液体水素タンク内部のスロッシングを計測することができた。数値解析においては、実験データの再現には到達していないが、海上輸送実験を予定通り行うことが出来たため、上記の評価とした。今後の推進方策として、まず、平成29年度に構築を終えた超伝導液面センサーの液面検知特性実験システムを使用し、超伝導液面センサーの静的・動的液面検知特性を大気圧下、加圧下の両方で調べる。その後、較正を行ったCCS温度計、超伝導液面センサーを使用して、神戸大学海事科学研究科附属練習船深江丸の後部甲板に液体水素実験システムを構築し、液体水素海上輸送実験を行う。実験では、航海中における液体水素タンク内部の液面・温度・圧力、船体動揺等を同時計測し、スロッシング時における液体水素タンク内部の熱流動現象を実験的に明らかにする。さらに、熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いて、スロッシング時における液体水素タンク内部の温度・圧力解析を行う。今後の推進方策として、まず平成30年度に行った液体水素海上輸送実験で得られたデータの解析を行う。その後、熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を用いて、海上輸送実験で使用した液体水素タンクをモデル化し、実験結果の再現を行う。また、実験結果を精度よく再現するために、メッシュ形状、解析条件等を変更し、解析モデルの最適化を行う。さらに、タンク形状、断熱条件等を変更し、タンク形状によるスロッシングに伴う熱流動現象への影響や断熱性能の差による影響についても調べる。液体水素タンク内部の温度分布計測をするためのCCS温度計が当初予定していた額より低価格で購入することができたため、次年度使用額が生じることになった。
腎糸球体上皮細胞表面機能分子の細胞生物学的解析

蛋白尿惹起単クローン抗体5-1-6の対応抗原(p51)は発生時に活発に合成が行われており,成熟ラットでの合成が極めて微量であることが判明したので,生後1日令ラット腎糸球体から再度cDNAライブラリーの作製を行いCOS細胞を用いて5-1-6によるクローニングを継続した。が,まだp51の分子構造を明らかにするに至っていない。p51の病的過程における動態検索からは以下のような知見を得た。5-1-6静注によりラットに蛋白尿が惹起されるが、その極期においてすら、スリット膜の形態学的変化は電顕レベルでも殆ど認められない。然しp51や密着結合蛋白であるZO-1の免疫組織化学による染色性は、蛋白尿の極期に著明に減少することが判明した。Immunoblotによる検索でも、この時期のラット腎糸球体由来ZO-1バンドは減少していた。これらの結果から、p51はどうやらZO-1と密接に関連を持ち、これらの蛋白分子はスリット膜の構造を保つうえには不要かもしれないが、バリアーとしての役割を演じるためには不可欠のものであることが結論づけられた。更にタイロシンのリン酸化がこの両分子の動態に関連を有するか否かを検討したがそれを示唆する結果は得られなかった。またin vitroでの単離糸球体によるp51の5-1-6との反応後動態検索では、蛋白尿につながると思われるp51のredistributionはNaN3で抑制されエネルギー依存性の反応であることが判明した。現在Ca^<++>や細胞骨格の動態に影響を有するagentを活用することから、蛋白尿発現機序の解明をはかりつつある。蛋白尿惹起単クローン抗体5-1-6の対応抗原(p51)は発生時に活発に合成が行われており、成熟ラットでの合成が極めて微量であることが判明したので、生後1日令ラット腎糸球体から再度cDNAライブラリーの作製を行いCOS細胞を用いて5-1-6によるクローニングを継続した。が、まだp51の分子構造を明らかにするに至っていない。
ダイオキシ関連物質の環境動態と生物影響

ダイオキシン関連物質の環境動態を明らかにするために各種貝類,鶏,豚,牛,牛乳,人体脂および臓器等約90検体の分析を行った。その結果、ムラサキイガイ中のPCDDs濃度は採取地が大阪湾北港,岬町,汚染の少ないと思われる北海道噴火湾・利尻島の順に低い残留濃度を示した。なお、市販のアサリ,シジミ,カキからも検出され、その異性体成分率も類似していた。他方、大都市,地方都市で採取した人体脂分析値は大都市居住者に高く、特にHex,Hep,Oct-CDDsの高塩素化物の残留濃度が高い傾向が認められた。その際、同一人の肝臓中のTCDD濃度は脂肪中に比べて相対的に低い値を示していた。何れにせよ、ムラサキイガイ,人体脂肪試料共に残留濃度に地域差を認め、PCDD汚染が人間活動と密接な関係にあることをうかがわせている。なお、牛乳,牛肉,鶏肉からもPCDDsを検出し、比較的寿命の短い鶏の汚染経路の解明が食物連鎖解明の糸口となると考えられる。
ストロンチウム含有生体活性ガラスによる新規骨補填材の開発

生体内で骨形成を促進するSrは,骨粗鬆症の薬として使われている.骨補填材骨と一体化するため骨補填材として使われるガラスにSrを添加して作製した試作ガラス粒子は,骨再生を促進する可能性があることが示唆された.ガラスから骨組織内へSrが徐放されるためと考えられる.試作ガラス粒子を硬化させ骨内欠損部を埋めるために酸と練和して硬化体を作製した.γ-ポリグルタミン酸を使用した場合は骨欠損部から硬化体が流出しやすいが,骨形成を促進する可能性が示唆された.2各Sr含有試作BAGの骨形成能評価;雄性SD系ラット(12週14週齢)36匹を使用した。頭頂骨に直径9mmの骨欠損を作製し、各Sr含有BAG粒子を埋入した。何も埋入しないものを対照とした。骨欠損部の骨形成状態をマイクロCT(Skyscan)で経時的(1ヵ月から6ヵ月)に、かつin vivoで検索した。対照では術後6カ月で欠損部辺縁からの骨形成を認めるのみだったが、SrO群では、術後3カ月でもBAG粒子周囲の不透過像に変化はなく粒子を核とした骨形成像は見られなかったので、今回の実験系ではBAG粒子は骨伝導性を示さなかったと考えられる。Sr添加BAG(Sr0,Sr20,Sr50,Sr75,Sr100)はいずれも埋入後エックス線透過性が亢進した後、エックス線不透過像が骨縁から独立した部位に出現してきた。特にSr75およびSr100では、粒子周囲にエックス線不透過像の著しい増加を認めたので、骨の新生が生じている可能性が示唆される。Srは間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化させる働きがあることが報告されており、欠損部位の肉芽組織中に骨芽細胞を誘導したためと考えられる。以上からBAGにSrを含有させることにより、BAGの骨形成能を亢進させる可能性が期待できる。ストロンチウムを含有する生体活性ガラス(以下Sr-BAG)を組成の一つとするセメントを作製するために、硬化機序として、BAG粒子とポリグルタミン酸(以下PGA)とのキレート反応を利用した。ガラス粒子をセメントの組成の一部として使用することで、粒子の拡散を防ぎ欠損部封鎖性の向上が期待できる。BAG粒子中のCaOを75重量%および100重量%の割合でSrOを置換し、各々Sr75およびSr100とした。Srを含有しないBAG粒子をSr0とした。粒子径40μm以下。ラットの左右頭頂骨に骨欠損を作り、BAG粒子とPGA(5%wt)との錬和物を埋入した。骨欠損部に何も埋入しないものを対照とした。術後1ヵ月・2ヵ月・3ヵ月および4ヵ月にセメント周囲の新生骨形成状態を観察した。対照群およびSr0群では、実験期間内に欠損部周囲から反応性の新生骨形成を認めたが、欠損部中央での新生骨形成はなかった。Sr-BAGであるSr75群およびSr100群の一部では、術後2ヵ月に新生骨形成を認め、3ヵ月、4ヵ月と経つにつれ新生骨は増大した。新生骨形成の機序としてSr-BAGから放出されたSrイオンの影響が最も考えられるが、欠損部の出血がコントロール出来ていないと、BAG-PGAペーストは血液や組織液と接触する部分で溶解し、BAG粒子が流失してしまい骨形成が生じない可能性がある。Sr-BAGをSr徐放体と考え、生体内での溶解性を改善したペーストを作り出せるようPGAの濃度や練和条件を策定する必要がある。研究期間全体の成果;Sr-BAG粒子を単体およびセメントとして骨欠損部に埋入したところ、Sr0では欠損部内に新生骨形成を認めなかったがSr-BAGでは新生骨形成を認めた。BAGから放出されるSrイオンにより骨形成が促進されることから、Sr-BAGを用いた新しい骨補填材開発の可能性が示唆された。生体内で骨形成を促進するSrは,骨粗鬆症の薬として使われている.骨補填材骨と一体化するため骨補填材として使われるガラスにSrを添加して作製した試作ガラス粒子は,骨再生を促進する可能性があることが示唆された.ガラスから骨組織内へSrが徐放されるためと考えられる.試作ガラス粒子を硬化させ骨内欠損部を埋めるために酸と練和して硬化体を作製した.γ-ポリグルタミン酸を使用した場合は骨欠損部から硬化体が流出しやすいが,骨形成を促進する可能性が示唆された.試作Sr含有BAGを溶融法によって合成した。ガラスはCaO-SiO2-P2O5系であり、CaOとSrOとを0%、20%、50%、75%、100%置換させた。溶融ガラスを内径10mmの鋳型に流し込みロッド状に固化させ、厚さ1mmに切断した。対照としてハイドロキシアパタイト(HA)をディスク状に焼結させたものを使用した。7週齢SD系ラットの背部に4か所の切開線を入れ皮下にポケットを作成し、右側ポケットに試作BAG-Sr0%およびBAG-Sr20%のdiscを、左側にはHA discを埋入した。術後4週で屠殺し、4%PFAで固定後、パラフィン包埋しパラフィン切片を作製した。

切片にHE染色を施し鏡検したところ、BAG-Sr0%およびBAG-Sr20%のdisc周囲は線維性結合組織で被覆され、強い炎症性細胞浸潤を認めなかった。また異物巨細胞の出現もほとんど認めなかった。これはHA discと同じ所見であった。以上より試作BAG-Sr0%およびBAG-Sr20%が良好な生体親和性を持つことが明らかになった。当初ラットの頭蓋骨にcritical sizeとして直径8mmの骨欠損を作った。マイクロCTを使用した検索で、処置後1カ月では試作BAG-Sr0%はほとんど溶解せず欠損部に残っているのに対し、試作BAG-Sr75%はほとんど溶解し欠損部に残っていなかった。処置後6カ月では試作BAG-Sr75%埋入群では、粒子状の石灰化物が骨欠損部に多数生じ欠損部辺縁から骨の増生が著明に認められた。HE染色を施したパラフィン切片標本では、処置後1カ月の試作BAG-Sr0%粒子は、立方形の細胞に周囲を囲まれ、亀裂が生じている粒子ではエオジン好性の物質が亀裂を満たしている所見が認められたが、硬組織の形成は認められなかった。・骨欠損部での骨新生が予想以上に遅く、6か月まで実験期間を延長した。光学顕微鏡用標本の作製も脱灰操作に時間がかかった。(ガラスの粒子を薄切するのは難しい)。・当初骨欠損のcritical sizeを直径5mmとしていたが、文献で8mmにすべきという報告があったので実験をやり直したため。・骨欠損部での骨の新生が予想以上に遅く、3か月以上経過しないと骨形成が認められなかったので実験期間が長くなったため。ガラスと酸のキレート反応で硬化する試作骨セメントの骨との親和性を検討する。;ガラス粒子としてSr含有BAGを用い酸としてポリグルタミン酸を用いる。ラットの頭蓋骨に骨欠損を形成し、試作骨セメントを埋入し経時的にマイクロCTで骨形成状態を検索する。光顕標本を作製し周囲骨組織との親和性を定量する。対照として、MMA/PMMAレジンを用いる。・骨欠損のcritical sizeを直径7-8mmとし、欠損部に何も入れない対照群、試作BAG-Sr0%、BAG-Sr50%、BAG-Sr75%およびBAG-Sr100%を埋入した実験群につき、HE標本を作製する。骨の形成量をマイクロCTを用いて計測比較する。・ガラス周囲に出現する多核巨細胞の由来を免疫組織化学的に検索する。該当なし設備備品は充足しているので、主に実験動物の購入、飼育費および試薬、実験機材の購入に使用する予定である。
ネコ肥満の早期遺伝子診断法の開発

近年のヒトの全ゲノム関連解析の結果、肥満に関連するSNPが数多く発見されているが、ネコでは皆無に等しい.本研究は肥満に関与する遊離脂肪酸の特異的受容体(FFAR1 / GPR40およびFFAR4 / GPR120)のネコでの機能解析を行うとともに、同遺伝子に存在するSNPが肥満に関与するか否かを検討した。結果、ネコGPR40は他動物と異なる21アミノ酸残基が付加され、特異なC末端構造であることが明らかとなった他、申請者が共同研究を行った結果、肥満イヌのGPR120遺伝子中にSNPが存在し、貴重なマーカーとして有用であることから、ネコでもSNP検出は更なる検討が必要であることが示唆された。GPR120はリガンドが不明なGタンパク質共役型受容体であったが、近年、ω-3遊離脂肪酸(DHAやEPA)に代表される遊離脂肪酸の特異的な受容体であることが明らかとなり、SNPがヒトの肥満に関与することが知られている。ネコはヒトの肥満および2型糖尿病のモデル動物として期待されていることから、申請者は遊離脂肪酸受容体(GPR120/O3FAR1)の遺伝子クローニングを行った。ネコGPR120発現ベクターを作成、HEK293に一過性でネコGPR120を発現させることに成功した。同細胞株に対し、各種遊離脂肪酸に対する細胞内カルシウムやcAMP濃度上昇をモニターし、親和性測定行っているが非常に反応が小さく、その他因子のモニター法を含めて検討している。この他、ネコGPR120を含む新規肥満候補遺伝子SNPの探索を行っている。長大なゲノムから疾病に関連するSNPを探索するためには大規模なゲノムシーケンス等を行う必要があるが、申請者は迅速かつ簡便にSNPをスクリーニングするためにRFLP法を改良したサーベイヤー法を用いて検出を行っている.正確なSNP部位はシークエンス解析を行う必要があるが、迅速・低コストでSNPの有無が判明する.ネコGPR120は長大なゲノム構造を有することがcDNAクローニングの結果とネコゲノムデータベースを用いた解析により明らかとなっている。現在、特にGPR120のエクソン部位を中心として肥満ネコ(>50頭)と正常ネコ(>50頭)群間で有意なSNPの検出に努めている。有意なSNPを検出できた場合、そのPCR断片を各個体精製、BigDye Terminator v3.1にて反応および精製、ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzerにてシークエンス解析を行い、SNPを特定する予定である。GPR120はリガンド不明なGタンパク質共役型受容体であったが、近年、ω-3遊離脂肪酸(DHAやEPA)に代表される遊離脂肪酸の特異的な受容体であることが明らかとなり、SNPがヒトの肥満に関与することが知られている。ネコはヒトの肥満および2型糖尿病のモデル動物として期待されていることから、申請者はGPR120の遺伝子クローニングを行い、全長cDNAおよびネコ各組織における特異なmRNA発現様式を明らかにした。同研究実績は2015年4月14日現在、Asian Journal of Animal and Veterinary Advancesに投稿し審査中である。また同遺伝子上SNP検出を正常および肥満ネコゲノムDNAを用いて検索しているが、有意なSNPを検出するに至っていない。GPR120と同じく、他のGタンパク質共役型遊離脂肪酸受容体の遺伝子クローニングも行っており、現在進行中である。ネコ同受容体は他動物とは異なる遺伝子配列を有しており、ネコGPR120と共に哺乳類発現ベクターを用いた安定発現細胞株の樹立にも努めている。肥満に関与する遊離脂肪酸の特異的受容体(FFAR1 / GPR40およびFFAR4 / GPR120)のネコでの機能解析を行うとともに、同遺伝子に存在するSNPが肥満に関与するか否かを検討した。結果、ネコGPR40は他動物と異なる特殊な21アミノ酸残基が付加され、特異なC末端構造であることが明らかとなった他、申請者が共同研究を行った結果、肥満イヌのGPR120遺伝子中にSNPが存在することを明らかにした。同SNPは肥満犬を遺伝子診断により発見する貴重なマーカーとして有用であることが示唆された。今後、肥満ネコのSNP検出は更なる検討が必要であることが示唆された。分子内分泌学引き続きSNP検出を行い、ネコ肥満早期診断のための基盤形成を行う。この他、新規遊離脂肪酸受容体の遺伝子クローニングを行い、GPR120との機能を比較解析する。GPR120を発現させたHEK293細胞を用いた情報伝達経路検出に問題があり、他の情報伝達経路を含めた測定法を検討中であるため。ネコGPR120の機能解析を継続して行い、同時に遺伝子上に存在して肥満に関与すると考えられるSNPの検出に努める。

当該年度の研究計画に基づいて研究を行っていたが、細胞内シグナル伝達検出のための試薬の購入を一時見合わせる必要が生じたため。具体的にはルシフェラーゼアッセイの際の活性検出試薬を当初予定していたDual-Glo Luciferase assay systemからより感度の高いDual-Luc Luficerase assay systemに変更し、GloMax-Multi+Detection Systemで全自動測定する。現在のところ、同測定条件で支障がないことを確認している。
マイクロサージャリー技術の脊髄再生医療における可能性の追求

血流をもった末梢神経の移植を脊髄切断部位に行うと、短期間で神経膠細胞の生着、線維性瘢痕の抑制に関して有意な効果を認められる。今回長期的な観察を行ったところ、血管付き神経移植のラットは全て体重を支えられるほど良好に後肢機能が回復したが、血行を持たない神経移植をしたラットでは同様な後肢機能の回復はみられなかった。それぞれの群の再生軸索の密度を測定したところ、両群に明らかな有意差が確認できた。【目的】血管柄付き神経移植の中枢神経への応用における長期的評価。【方法】これまでの実験で、血流をもった末梢神経の移植を脊髄切断部位に行い、組織学的に評価を行ったところ、短期間で既に神経膠細胞の生着、線維性瘢痕の抑制に関して有意な効果をもつことが証明された。今回は6匹のラットで3ヶ月の長期フォローを行った。【結果】血管付き神経移植のラットは全て体重を支えられるほど良好に後肢機能が回復したが、血行を持たない神経移植をしたラットでは同様な後肢機能の回復はみられなかった。また、ニューロフィラメント染色においてそれぞれの群の再生軸索の密度を測定したところ、両群に明らかな有意差が確認できた。【総括】マイクロサージャリーによる血行を有した末梢神経の移植は、ラットの脊髄損傷モデルにおいて機能的にも組織学的にも画期的な治療効果をもたらすことが確認された。【目的】血管柄付き神経移植は、シュワン細胞が高率に生着するため従来の神経移植に比べて優れた神経再生が得られることが判明している。これまで当科では様々な症例に対して血管柄付き神経移植を行い、良好な結果を得ている。【方法】現在我々はこの技術、概念の中枢神経への応用を検討しており、これまでの実験で、血流をもった末梢神経の移植を脊髄切断部位に行い、組織学的に評価を行ったところ、短期間のフォロー(10日間)で既に神経膠細胞の生着、線維性瘢痕の抑制に関して有意な効果をもつことが証明された。今回は3ヶ月の長期フォローを行うことで組織学的評価だけでなく、機能的を評価も行うこととした。【結果】血管付き神経移植のラットは3匹中3匹で体重を支えられるほど良好な後肢機能が回復したが、フリーで神経移植したラットでは同様な後肢機能はみられなかった。短期間での観察において既に血管柄付きの移植をした場合はシュワン細胞の非常に良好な生着が得られ、4型コラーゲンの免疫染色から線維性瘢痕が優位に抑えられていることが分かっているが、線維性瘢痕の制御は、中枢神経再生の問題点を克服する重要なポイントであることが再生医療の分野でも指摘され続けており、マイクロサージャリーによる血行を有した神経の移植はこの問題のブレイクスルーになり得ると考えられた。【総括】今回の長期的なフォローにおける、神経膠細胞、線維性瘢痕、グリア瘢痕、ニューロフィラメントなどの組織学的評価について調査し、機能回復に至ったメカニズムについて検討した。我々は血管付き神経移植の中枢神経への応用を検討したが、今回は3ヶ月の長期フォローを行うことで組織学的評価だけでなく、機能的評価も行った。血管付き神経移植のラットは3匹中3匹で体重を支えられるほど良好な後肢機能が回復したが、フリーで神経移植したラットでは同様な後肢機能はみられなかったことを確認し、組織学的検討でも、線維性瘢痕、ニューロフィラメント染色において優位な差が出たことを確認した。良好な再生が確認された血管付き神経移植群に対して、良好に再生された機能や神経組織のメカニズムについて更なる解明を進めるとともに、臨床応用を目指して大動物における同実験計画を組み立てて行く。投薬薬剤、免疫染色のための各種薬品、行動観察記録用の電子機器、実験動物購入費、飼育費、実験成果報告のための学会出張費など。
希土類錯体を前駆体とする新しい材料化プロセスの開発

本研究班では、分子・原子レベルで高度に規定された希土類錯体を前駆体とする新しい材料化プロセスを開発することを目的としている。今年度に得られた成果は以下の通りである。(1)希土類塩化物とアルミニウム塩化物などとの気相錯体の形成を利用し、希土類の主要原料であるバストネサイトからの同元素の気相抽出および輸送プロセスについて検討を加え、同プロセスが希土類の分離精製に有効であることを明らかにした。また、希土類錯体を無機-有機混合マトリックス内に導入した複合型蛍光体を作製し、これらが良好な発光特性を示すことを明らかにした。(2)希土類錯体を前駆体として希土類ラブドフェン化合物を合成すると共に、応用としてその薄膜の蛍光特性を測定し、新規蛍光材料としての可能性を検討した。(3)希土類錯体とピッチとの複合体を水蒸気賦活することにより、メソポア領域の細孔が発達した活性炭繊維を昨年に続き作製すると共に、これらの生成機構ならびに吸着特性を明らかにすることに成功した。(4)希土類-遷移金属系二核錯体を合成し、金属イオン同士の磁気的相互作用を明らかにした。その結果、GdCu錯体の磁性は分子内の強磁性的相互作用により説明できると結論された。(6)希土類錯体とサリチルアルデヒドとの反応を調べ、希土類による反応性および反応生成物の違いを明らかにし、より効率的な希土類相互分離の可能性を明らかにした。本研究では、分子レベルで高度に規定された希土類錯体を前駆体とする新しい材料化プロセスを開発することを目的としている。本年度に得られた成果は以下の通りである。1.希土類錯体を経由する新しい相互分離法希土類塩化物と塩化アルミニウムあるいは塩化アルカリとの間に生成する気相錯体の形成反応を利用し、生成した錯体を気相輸送することで、従来湿式法で行われていた希土類の相互分離を乾式法で行うことに成功した。2.高温水溶液中の希土類EDTA錯体の解離・分解反応を利用する希土類リン酸塩の材料化La(EDTA)^-などの希土類錯体を含む高温リン酸水溶液中での均一沈殿反応を利用し、粒子サイズの揃った希土類リン酸塩単分散粉末を作製することに成功した。3.希土類金属錯体を用いたメソポア活性炭の合成と特異な吸着作用希土類錯体とピッチとの複合体を高温水蒸気中で処理することにより、フミン質やデキストランなどの巨大分子に選択的な吸着作用を示す活性炭が得られた。4.d-f元素系二核および多核錯体による希土類の機能発現コンパートメントを配位子とする銅(II)-ランタニドおよびパラジウム(II)-ランタニド錯体を合成し、その基礎物性を明らかにした。また、これらの錯体を熱分解することで、高い機能と性能を有する複合酸化物の合成が可能となった。5.希土類錯体を用いた光化学ホールバーニング2価のサマリウムイオンの錯体を出発原料とし、気相法などの特殊合成法を用いることにより、ホウ酸塩ガラスとケイ酸塩ガラスをベースとした高特性光化学ホールバーニング材料を開発することに成功した。1.希土類錯体を前駆体する新しい材料化プロセスの開発希土類塩化物と塩化カリウムとの間に生成する気相錯体の構造を、高温質量分析装置を用いて決定することに成功した。また、希土類錯体をシリカと有機成分の複合体であるORMOSILマトリックス内へ導入することで、従来の無機蛍光体に匹敵する発光輝度を有する蛍光体を開発することに成功した。2.高温水溶液中の希土類EDTA錯体の解離・分解反応を利用する希土類リン酸塩の材料化希土類錯体を含む高温リン酸水溶液中での均一沈殿反応を利用し、今年度は中・重希土において、粒子サイズの揃った希土類リン酸塩単分散粉末を作製することに成功した。3.希土類金属錯体を用いたメソポア活性炭の合成と特異な吸着作用希土類錯体とピッチとの複合体を高温水蒸気中で処理することにより、メソポアの割合の極めて高い活性炭を開発することに成功した。また、これらの活性炭はビタミンB_<12>や発癌の原因となるトリハロメタンに対し、高い吸着特性を有することが明らかとなった。

(3)希土類錯体とピッチとの複合体を水蒸気賦活することにより、メソポア領域の細孔が発達した活性炭繊維を昨年に続き作製すると共に、これらの生成機構ならびに吸着特性を明らかにすることに成功した。(4)希土類-遷移金属系二核錯体を合成し、金属イオン同士の磁気的相互作用を明らかにした。その結果、GdCu錯体の磁性は分子内の強磁性的相互作用により説明できると結論された。(6)希土類錯体とサリチルアルデヒドとの反応を調べ、希土類による反応性および反応生成物の違いを明らかにし、より効率的な希土類相互分離の可能性を明らかにした。
図像資料分析による漢代神仙思想の歴史的展開の研究

前年度の実地調査において収集した山東地方の画像石資料を基礎として、出版物に掲載された画像石図像のスキャン作業と整理作業を本年度は特に推進し、大量の資料のデータベース化をはかった。主要な画像石の著作物に関してはおおむねデジタルデータ化を完了することができた。その整理作業を通じ、山東地域での神仙図像の表現、祠堂画像石の配置に関しては細かい地域性の違いがより明確となってきた。その一方で西王母と東王父を対置するという共通性も確認できた。今後、神獣鏡図像との対比によって、さらにその違いと共通性と信仰との関わりについて検討を進める。江西省海昏侯墓(前漢)における近年の調査において、鏡匣に西王母とともに東王父が表現されていることが明らかにされ、従来の神仙の出現過程に対する見解(西王母が単独で出現し、後漢代に東王父と対になる)に対して大幅な見直しが図られている。一部の写真や短文の報告など断片的なものしか明らかにされておらず、図像の詳細など不明な点が多いが、本研究の根幹に関わる重要資料として情報収集に努めた。また山東の調査過程で生まれた新たな着眼点、いわゆる胡人の図像と信仰との関係について、新たな資料収集・調査に着手した。2年間の調査・資料収集と基礎的な整理作業を通じて、各地域毎の画像石図像表現や配置法の特色、変遷についておおむね把握することができた。当初の計画では四川や山東を神仙図像の発信地として重視してきたが、初現地として河南や陝西が想定されること、海昏侯墓の画像資料出現など、その展開過程については再検討が必要となっている。次年度の実地調査を通じて解決を図りたい。資料蓄積や地域・年代ごとの整理という当初の目的は達成している。しかし神仙図像の変遷に対する評価を大きく変える新資料(海昏侯墓出土の鏡匣)が出現し、本研究の目的とも大きく関わるが、現段階で公表されている情報が断片的であり、資料として本格的に活用することが困難な状況にある。この新資料を盛り込んで、変遷観やその背景に対して新たな検討が必要となっている。1山東省ほか中国の実地調査をさらに推進し、漢代画像資料の収集と墳墓でのその使われ方の実態について把握に努める。2蓄積した資料をもとに地域性を考慮した神仙図像の変遷過程について現段階でのまとめを行う。3海昏侯墓資料の情報収集に努める。4図像の地域性や変容過程と神仙思想との関わりについて、分担者を協力者をまじえて議論を深める。新資料もふくめた神仙図像の総合的な変遷観を確立し、その背景となる神仙思想の変化についても検討を深めた上で論文製作・発表を進める。本年度は、8月の中国河北省調査と3月の山東省調査を中心に現地の資料収集、アルバイトの補助による既刊図録の画像資料収集、それらの整理・検討作業を推進した。また関連図書の入手にも努めた。とくに山東省の調査では、山東大学の協力も受け、各地の主要な漢墓および博物館を訪れることができ、大量の画像石資料を見学・観察することができた。なかでも棗荘市博物館、滕州漢画像石館、山東博物館、武氏祠で見学できた資料は多く、平面的な図像だけでなく、側面や厚さ、石材なども検討でき、祠堂や墳墓での使用状況を復元できる材料を得ることができた。著名な武氏祠の画像石は、拓本ではうかがい知れない画像の細かな部分の観察が実現した。河北省の調査では特に前漢後漢の諸侯墓の標識資料となる満城漢墓ほか中山国王の墓の資料を実見できた。前漢代の神仙像は数が限られており、どの階層からその普及が始まったのかという課題を考えるに至った。こうした現地調査を通じ、本研究で主題としている、画像表現の地域性について確認できたことも大きな収穫である。山東では想定していたより小さな領域ごとの地域差が大きいことを認識した。これまで議論されている工人の活動に加え、画像石の使用法や役割とからめて検討する必要がある。神仙表現も拓本でみる以上に、地域性が強いことを理解した。系譜的な位置づけが必要である。また現地の研究者との交流の機会も得ることができ、年代論や評価についての新たな知見も得ることができた。とくに年代研究の重要性を強調していた点において、共通の問題意識を確認した。大量の資料の整理は今年度中には終了せず、年代・地域を重視した整理作業を継続する。念願の山東省調査では、想定以上に多数の画像貴資料を調査することができた。各地に大規模な博物館や展示施設がオープンしていたことが幸いした。その多くで画像石の立体形状を確認できたのも収穫である。現地の専門の研究者との交流もでき、計画以上に資料収集、知見の増大をはかることができた。

今後、神獣鏡図像との対比によって、さらにその違いと共通性と信仰との関わりについて検討を進める。江西省海昏侯墓(前漢)における近年の調査において、鏡匣に西王母とともに東王父が表現されていることが明らかにされ、従来の神仙の出現過程に対する見解(西王母が単独で出現し、後漢代に東王父と対になる)に対して大幅な見直しが図られている。一部の写真や短文の報告など断片的なものしか明らかにされておらず、図像の詳細など不明な点が多いが、本研究の根幹に関わる重要資料として情報収集に努めた。また山東の調査過程で生まれた新たな着眼点、いわゆる胡人の図像と信仰との関係について、新たな資料収集・調査に着手した。2年間の調査・資料収集と基礎的な整理作業を通じて、各地域毎の画像石図像表現や配置法の特色、変遷についておおむね把握することができた。当初の計画では四川や山東を神仙図像の発信地として重視してきたが、初現地として河南や陝西が想定されること、海昏侯墓の画像資料出現など、その展開過程については再検討が必要となっている。次年度の実地調査を通じて解決を図りたい。資料蓄積や地域・年代ごとの整理という当初の目的は達成している。しかし神仙図像の変遷に対する評価を大きく変える新資料(海昏侯墓出土の鏡匣)が出現し、本研究の目的とも大きく関わるが、現段階で公表されている情報が断片的であり、資料として本格的に活用することが困難な状況にある。この新資料を盛り込んで、変遷観やその背景に対して新たな検討が必要となっている。得られた資料が膨大であるだけに、その整理が急務である。とくに地域性や年代に関しては、計画時の想定以上に利用可能な資料が多数あることも判明し、この基礎作業の重要性を改めて認識した。昨年度の調査資料をカード化し、神仙図像を中心とした画像の年代や地域性について具体的に研究を進める。また祠堂や墳墓の構造と画像石との関係について、中国の研究における認識が深まっていることが確認できたので、その成果を広く吸収し、機能に応じた画像表現についても検討を行う。山東ではまだいくつかの鍵となる資料を調査することにより、他地域との比較において核となる変遷観、地域性の基本を確認できるものと考えている。それを元に他地域との比較を広く進めてゆく。1山東省ほか中国の実地調査をさらに推進し、漢代画像資料の収集と墳墓でのその使われ方の実態について把握に努める。2蓄積した資料をもとに地域性を考慮した神仙図像の変遷過程について現段階でのまとめを行う。3海昏侯墓資料の情報収集に努める。4図像の地域性や変容過程と神仙思想との関わりについて、分担者を協力者をまじえて議論を深める。新資料もふくめた神仙図像の総合的な変遷観を確立し、その背景となる神仙思想の変化についても検討を深めた上で論文製作・発表を進める。
石灰化組織特異的である骨シアロタンパク質の細胞内局在とその分泌経路の検討

骨の石灰化初期に重要なタンパク質であると期待されている骨シアロタンパク質(BSP)の石灰化機構の解明を目的とした。そのために転写調節機構だけでなく、その後どのように分泌されるかという細胞内動態を解明することを試みた。研究期間内に筋芽細胞であるC2C12細胞が骨誘導因子(BMP-2)によってBSPの転写調節が上昇するメカニズムと実際にBSPがタンパク質として発現することを明らかにした。現在ひきつづき細胞内動態という輸送経路の詳細な解析を続けている。骨の石灰化初期に発現する骨シアロタンパク質(BSP)は石灰化に重要なタンパク質である。BSPは細胞外マトリックスに存在すため、BSPの機能を解明するためにはタンパク質合成後の翻訳後修飾だけでなく、タンパク質の細胞内輸送経路、さらには分泌後の生理作用といった項目を検討していくことが必要となる。本研究はBSPの細胞外への分泌経路に焦点を当て、形態的手法を用いてBSPの細胞内輸送経路を同定することを目的とした。筋芽細胞(C2C12細胞)におけるBSP mRNAの発現は,6,12,24時間,2,4,6日目と経過時的に増加していた。タンパク質の発現を検討するにあたり、BSPを常に発現している骨芽細胞様細胞(MC3T3E-1細胞)を用いウェスタンブロッティング法のための基礎実験を行った。抗体はImmundiagnostik社のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて,希釈濃度の検討を行った。非特異的な結合を示すバンドが多いため,更なる検討が必要である。次に,BMP-2存在下(12,24時間、2,4,6日間)で筋芽細胞(C2C12細胞)でのBSPのタンパク量発現を経時的な変化を検討する予定である。細胞内局在を観察するためには,蛍光ラベルしたBSPの発現を共焦点レーザー顕微鏡により検討している。ここでも同様に骨芽細胞様細胞を用いた基礎実験を進めている。骨の石灰化初期に発現する骨シアロタンパク質(BSP)は石灰化の重要なタンパク質であると期待されている。BSPが細胞外マトリックスであるため、石灰化機構の解明には転写調節機構だけでなく、刺激後の細胞内シグナル伝達機構やタンパク質合成後の翻訳後修飾、輸送経路、さらには分泌後の生理作用といった項目をひとつずつ検討していくことが必要となる。そこで本研究はBSPの細胞外への分泌経路に焦点を当て、形態的手法を用いてBSPの細胞内輸送経路を同定することを目的とした。骨誘導因子(BMP-2)存在下で筋芽細胞(C2C12細胞)は骨芽細胞様に変化する。この過程において、BSPの局在を形態的に観察するために、蛍光ラベルしたBSPの発現を共焦点レーザー顕微鏡により検討した。BMP-2処理群では24時間後より細胞の形態が変化し、BSP抗体に染まる点状の構造物が観察された。ウエスタンブロット法においてはBMP-2処理48時間後よりBSP抗体の発現が認められた。一方、転写調節はC2C12細胞のBMP-2により筋芽細胞への転写因子であるMyoDmRNAの発現を抑制し、代わってRunx2mRNAを発現し、オステオカルシンmRNAやBSPmRNAの発現を誘導した。さらにゲルシフトアッセイにより発現調節は転写因子であるSmad1,Runx2がBSPプロモーター配列に存在するHOX配列、あるいはFRE配列に結合することが明らかとなった。これらの結果は筋芽細胞様細胞C2C12細胞が骨誘導因子BMP-2により骨芽細胞に分化したことを示している。今後,電子顕微鏡を用いて詳細なBSPの細胞内輸送経路を調査していきたい。
科学的根拠に基づく小児肥満の指標のカットオフ値の探索

小児肥満は世界中で増加傾向にあり、非常に深刻な小児公衆衛生上の問題がある、日本では古典的には読字の指標を用いており、WHOやCDCが使用する肥満の定義と異なるが、科学的根拠の乏しい指標であるという問題点がある。今回の研究では、日米のん大規模入院診療情報データベースを使用・解析し、小児肥満が急性疾患の入院後アウトカムに及ぼす影響を定量化することを目的にカットオフ値を探索することである。小児肥満が急性期疾患に与える影響を複数のデータベースを用いて日米比較を行いながら調査した。日本国内のデータベースでは、小児肥満はRSウイルス感染症、インフルエンザ感染症、気管支喘息発作の重症化(集中治療など)や再入院と関連していたのが判明した。RSウイルス感染症に関しては、1歳未満の小児に、インフルエンザ感染症は全年齢、気管支ぜんそく発作の重症化は3歳以上の小児を対象に解析を行った。また、アメリカのデータを使用し、同様の調査をおこなっているが、同じく気道感染症や尿路感染症、気管支喘息発作の重症化と関連していることが判明した。気道および尿路感染症に関しては全年齢の小児を対象に、気管支喘息発作に関しては3歳以上の小児を対象に解析を行った。日本の小児においてもWHOの提唱する肥満のカットオフ値が汎用性があるのが判明しており、今後の予定としてはローレル指数やKaup指数、肥満度といった指標に同様の妥当性があるかを評価する必要がある。アメリカのデータベース取得に時間を要したため、研究の進行状況はやや遅れている。WHOの提唱する肥満の指標の使用による妥当性は高いことが判明している。今後の研究では、日本が読字に用いている肥満の指標が同様に当てはまるのか否かを慎重に妥当性を検証する予定である。小児肥満は世界中で増加傾向にあり、非常に深刻な小児公衆衛生の問題である。しかし、CDC, WHO,日本小児内分泌学会が提唱する小児肥満の定義はそれぞれ異なり、いずれも臨床的なアウトカムに基づいた科学的根拠に乏しい。本研究は、日米の大規模入院診療情報データベースを解析し、小児肥満が急性疾患の入院後アウトカムに及ぼす影響を定量化する。さらに、小児肥満の定義として妥当な肥満/過体重の指標(BMI, weight-for-length,肥満度)のカットオフ値を探索する。日米国の医療ビッグデータを使用して小児入院患者において、肥満が入院後アウトカムにどのような影響を与えるかの一部の解析を行った。日本のデータベースを用いた研究では、小児喘息、小児インフルエンザおよびRSウイルス感染症の入院患者で行った。いずれも小児肥満は再入院率や重症化の危険因子であることが判明した。米国のデータベースでも小児肺炎、尿路感染症において解析を行った。小児肥満は小児肺炎および尿路感染症の重症化の危険因子であった。データの取得に時間を要したため、予想より大幅に遅れている。今後は残りの疾患について解析を続け、最終的には小児肥満の指標とカットオフ値の探索を行う予定である。今年度も日本の小児での肺炎や尿路感染症の解析を行い、小児肥満が重症化や再入院率にどのように影響を与えているかを確認する。米国についてはデータベースの取得に時間を要したため再入院率の検討が不十分であるため、今後は喘息や肺炎、尿路感染症や胃腸炎など比較的コモンな疾患にフォーカスして再入院率の検討を行っていく。当初予定していたデータ購入は研究協力者より無償で譲渡できた。また、データ取得および管理の遅れのため、当該年度は研究および論文発表を集中的に行ったため、国際学会を含め学会発表はできず、結果として旅費などに使用する費用が不必要であった。米国のデータベースの申請・購入が遅れたため、次年度使用額が生じた。こちらのデータベースは早急に購入する予定である。