hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗アンドロゲン剤の食道癌臨床応用に関するラット発癌実験を用いた研究

[研究目的]本研究の目的は,食道組織中に男性ホルモン受容体蛋白が存在すること,および男性ホルモン受容体蛋白阻害剤が実験食道癌にたいして発癌抑制効果,治療効果,発癌予防効果が認められることを明らかにし,食道癌治療におけるホルモン療法を確立する点にある.[研究実績]AMN10週投与による発癌率におよぼすFlutamide10週投与の効果を検討した結果以下の結果を得た.AMN10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで54.5%(n=11),去勢雄性ラットで27.2%(n=11)であり,AMN10週投与後10週経過時の発癌率は非去勢雄性ラットで82.7%(n=29),去勢雄性ラットで62.5%(n=32)であり,AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで60.6%(n=32),去勢雄性ラットで47.0%(n=34)と,Flutamideを投与した去勢雄性ラットの発癌率がFlutamideを投与していない非去勢雄性ラットに比べ有意に低値を示した(P<0.01).[おわりに]今回行った化学発癌物質を用いた実験食道癌発癌実験ならびに抗男性ホルモン剤を用いた発癌抑制実験の結果,AMN投与ラット実験食道癌において抗男性ホルモン剤の一つであるFlutamideの発癌抑制効果が認められたことから,食道癌に対する治療効果が抗男性ホルモン剤に認められる可能性が示唆されたものと考えられた.食道癌の新しい治療法を考える上において,抗男性ホルモン剤を用いた治療実験を進めることは今後の重要な研究課題であり,意義のあるものと考えられた.[研究目的]本研究の目的は,食道組織中に男性ホルモン受容体蛋白が存在すること,および男性ホルモン受容体蛋白阻害剤が実験食道癌にたいして発癌抑制効果,治療効果,発癌予防効果が認められることを明らかにし,食道癌治療におけるホルモン療法を確立する点にある.[研究実績]AMN10週投与による発癌率におよぼすFlutamide10週投与の効果を検討した結果以下の結果を得た.AMN10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで54.5%(n=11),去勢雄性ラットで27.2%(n=11)であり,AMN10週投与後10週経過時の発癌率は非去勢雄性ラットで82.7%(n=29),去勢雄性ラットで62.5%(n=32)であり,AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで60.6%(n=32),去勢雄性ラットで47.0%(n=34)と,Flutamideを投与した去勢雄性ラットの発癌率がFlutamideを投与していない非去勢雄性ラットに比べ有意に低値を示した(P<0.01).[おわりに]今回行った化学発癌物質を用いた実験食道癌発癌実験ならびに抗男性ホルモン剤を用いた発癌抑制実験の結果,AMN投与ラット実験食道癌において抗男性ホルモン剤の一つであるFlutamideの発癌抑制効果が認められたことから,食道癌に対する治療効果が抗男性ホルモン剤に認められる可能性が示唆されたものと考えられた.食道癌の新しい治療法を考える上において,抗男性ホルモン剤を用いた治療実験を進めることは今後の重要な研究課題であり,意義のあるものと考えられた.[研究目的]食道癌の発生頻度および切除術術後の予後における性差の要因の一つとしてアンドロゲン受容体に着目し,発癌実験系におけるアンドロゲン受容体蛋白阻害剤を用いた治療実験を行なった.[研究実績]1.AMN10週投与による発癌率AMN10週投与時の発癌率は,非去勢ラットで54.5%(n=11),去勢ラットで27.2%(n=11)と去勢による低下傾向がみられた.2.AMN10週投与後10週経過時の発癌率AMN10週投与後10週経過時の発癌率は,非去勢ラットで88.2%(n=17),去勢ラットで75.0%(n=20)と去訴による低下傾向がみられなかった.AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率は,非去勢ラットで54.1%(n=24),去勢ラットで52.1%(n=23)と去勢による低下傾向がみられず,いずれもAMN10週投与後10週経過時の非去勢ラットの発癌率88.2%(n=17)に比べ有意に発癌率が低下した(P〈0.05).以上よりAMNラット実験食道癌において抗アンドロゲン剤の一つであるFlutamideの発癌抑制効果が認められたことから,食道癌に対する治療効果がFlutamideに認められる可能性が示唆された.[研究目的]食道癌の発生頻度が女性に比べ男性に高く、男性例の切除術術後の予後が女性に比べ不良であるという性差の要因の一つとして扁平上皮の存在するアンドロゲン受容体に着目し、発癌実験系におけるアンドロゲン受容体蛋白阻害剤を用いた治療実験を行った。[研究実績]平成3年度はおもにラット発癌実験ならびに発癌実験系における治療実験を行った。

1.AMN10週投与後10週経過時の発癌率AMN10週投与後10週経過時の発癌率は,非去勢ラットで82.7%(n=29),去勢ラットで62.5%(n=32)と去勢による低下傾向がみられなかった.2.AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率は,非去勢ラットで60.6%(n=32),去勢ラットで47.0%(n=34)と去勢による低下傾向がみられず、AMN10週投与後10週経過時の非去勢ラットの発癌率82.7%(n=29)に比べAMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率が去勢ラットにおいて有意に低下した(p<0.05).以上よりAMNラット実験食道癌において抗アンドロゲン剤の一つであるFlutamideの発癌抑制効果が認められたことから,食道癌に対する治療効果がFlutamideに認められる可能性が示唆された.[研究実績]平成5年度は引続きラット発癌実験系における治療実験を行った。AMN10週投与による発癌率におよぼすFlutamide10週投与の効果を検討した結果以下の結果を得た。AMN10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで54.5%(n=11),去勢雄性ラットで27.2%(n=11)であり,AMN10週投与後10週経過時の発癌率は非去勢雄性ラットで82.7%(n=29),去勢雄性ラットで62.5%(n=32)であり,AMN10週投与後Flutamide10週投与時の発癌率は非去勢雄性ラットで60.6%(n=32),去勢雄性ラットで47.0%(n=34)と,Flutamideを投与した去勢雄性ラットの発癌率がFlutamideを投与していない非去勢雄性ラットに比べ有意に低値を示した(P<0.01).[おわりに]今回行った化学発癌物質に用いた実験食道癌発癌実験ならびに抗男性ホルモン剤を用いた発癌抑制実験の結果,AMN投与ラット実験食道癌において抗男性ホルモン剤の一つであるFlutamideの発癌抑制効果が認められたことから,食道癌に対する治療効果が抗男性ホルモン剤に認められる可能性が示唆されたものと考えられた。
ケミカルジェネティクスに基づいた多能性幹細胞の心筋分化機構の解明

本研究は、心筋分化促進化合物KY02111の作用機序を明らかにすることで、多能性幹細胞の心筋分化機構を解明することを目的としている。昨年度までに、KY02111の結合タンパク質として、タンパク質Xを同定し、KY02111がタンパク質Xと心筋分化に関わるタンパク質Yの結合を阻害することを見出していた。そこで本年度は、その作用機序のさらなる解明を試みた。まず、タンパク質Xまたはタンパク質YをノックアウトしたiPS細胞の作製を、CRISPR-Cas9システムを用いて試みた。しかし、残念ながら、それらをノックアウトした細胞を得ることができなかった。一方、新学術領域「先端モデル動物支援プラットフォーム分子プロファイリング支援活動」でのKY02111の生理活性評価により、KY02111がTGFβ刺激によるN-カドヘリンの発現を抑制することが見出され、KY02111がTGFβシグナルに影響を及ぼすことが示唆された。RNAi法によりタンパク質X、あるいはタンパク質YをノックダウンしてもTGFβ刺激によるN-カドヘリンの発現の抑制が認められた。さらに、SMAD4はTGFβシグナルにおいて重要なシグナル伝達因子の一つであるが、KY02111の添加、あるいはタンパク質Yのノックダウンにより、SMAD4の発現量の低下が認められた。また、KY02111の誘導体についても検討したところ、TGFβシグナルの阻害活性と心筋分化促進活性に相関が認められた。TGFβシグナルが抑制されると、中胚葉系細胞から心筋細胞への分化が促進されることがこれまでに報告されている。以上の結果より、KY02111はタンパク質Xとタンパク質Yの結合を阻害することでタンパク質Yを不活性化し、SMAD4の発現量を低下させることでTGFβシグナルを抑制し、心筋分化を促進することが示唆された。これまでに、KY02111の結合タンパク質として、タンパク質Xを同定していた。そこで、平成29年度は、KY02111のタンパク質Xの機能に及ぼす影響について検討した。まず、KY02111及びその誘導体のタンパク質Xとの結合能をサーマルシフトアッセイにより評価した。その結果、タンパク質Xとの結合能と心筋分化促進活性に強い相関が認められた。従って、KY02111により誘導される心筋分化において、タンパク質Xは重要な役割を果たしていることが強く示唆された。また、タンパク質Xの欠損変異体を作製し、KY02111の結合サイトの同定も行なった。一方、タンパク質Xは酵素活性を有するが、KY02111はタンパク質Xの酵素活性を試験管内、及び細胞内で阻害しなかった。そこで、タンパク質Xのタンパク質間相互作用について検討した。データベースに登録されているタンパク質Xの結合タンパク質の中で、タンパク質Yに着目した。タンパク質Yに変異が生じると、正常な心筋分化が生じず、機能不全が生じることが報告されており、タンパク質Yも心筋分化において重要な役割を果たしていると考えられている。免疫沈降法により、細胞内でタンパク質Xとタンパク質Yが結合していることが確認でき、またこの結合はKY02111の添加により阻害された。さらに、KY02111の誘導体の中で、KY02111と同様に心筋分化促進活性を有する化合物はタンパク質Xとタンパク質Yの結合を阻害したのに対し、心筋分化促進活性を有さない誘導体は結合を阻害しなかった。以上の結果より、KY02111はタンパク質Xに結合し、タンパク質Xとタンパク質Yの結合を阻害することで心筋分化を促進することが示唆された。平成29年度の目的としていた、KY02111のタンパク質Xの機能に及ぼす影響を明らかにすることができたから。

以上の結果より、KY02111はタンパク質Xとタンパク質Yの結合を阻害することでタンパク質Yを不活性化し、SMAD4の発現量を低下させることでTGFβシグナルを抑制し、心筋分化を促進することが示唆された。平成29年度の結果から、「KY02111の結合タンパク質として同定したタンパク質Xは、タンパク質Yに結合してその機能を抑制しているが、KY02111がタンパク質Xに結合して、その結合を阻害することで、タンパク質Yが活性し、心筋分化が促進される」という可能性が考えられた。そこで平成30年度は、この仮説を検証する。具体的には、まずタンパク質Xあるいはタンパク質YをCRISPR-Cas9システムによりノックアウトした多能性幹細胞を樹立する。次に、樹立したノックアウト細胞で、KY02111の心筋分化促進活性に変化が生じるか検討し、上記の仮説が正しいか検証する。研究当初は、KY02111がタンパク質Xの酵素活性を阻害することを想定していた。そこでKY02111の様々な誘導体についても酵素活性への影響を検討することを考慮して、試験管内、及び細胞レベルでの酵素活性を測定するための経費を計上していた。しかし、予想に反して、KY02111はタンパク質Xの酵素活性を阻害しなかったため、他の誘導体での酵素阻害活性について検討する必要がなくなり、その予算を次年度に繰り越した。繰り越した予算は、遺伝子をノックアウトした多能性幹細胞の樹立、及びKY02111の心筋分化促進活性に及ぼす影響への検証に充てる。
海氷生態系モデル化のためのエネルギー・物質循環過程の研究

海洋が凍結して出来た海氷が海面を覆うと、海と大気との接触が断たれ、大気海洋間の熱・運動量・物質輸送交換は海氷を通して行われる。この海氷生成により急激に海洋環境が変化するが、その特徴的な海氷生態系のモデルを構築するために、海氷生成から融解までのエネルギー輸送過程とそれに伴う生物生産過程の変動、物質循環過程を明らかにするための観測を行なった。初年度(平成5年度)は、(1)モデル化した海域、サロマ湖で、気象タワーを用いて、通年の海面境界層の観測を行ない、大気-海洋(海氷)面を通してのエネルギー輸送過程の季節変動の観測を行なった。(2)結氷期のサロマ湖(1994年1月から4月)において、海氷の成長から融解までの海氷下の海洋構造の観測を行なった。(3)同時にセジメント・トラップを海氷直下に設置し、アイス・アルジ-、動植物プランクトン、また沈降物質フラックスの日周や潮汐変動を調べた。二年度(平成6年度)は、(1)初年度の観測結果から、海氷底部に生息しているアイス・アルジ-は海氷中のブライン・チャンネルや海氷-海洋境界面過程と密接な関係があることがわかった。更に、(2)アイス・アルジ-の鉛直輸送量は、1)夜間に、2)昼間の海水温上昇期に、3)夜間から昼間に移行する時期に、4)融解が始まる時期に急激に、増大することなどがわかったが、更に検証を進める必要があり、(3)前年度と同様の観測を、1995年2月から3月に結氷したサロマ湖で行った。また、(4)結氷期前から融解期の終了までの(1994年12月から1995年5月までを予定)、セジメント・トラップによる沈降物質フラックスと流速計・水温・塩分センサーによる海洋構造の連続観測は現在も断続中である。海水が凍結して出来た海氷が海面を覆うと、海と大気との接触が断たれ、大気海洋間の熱・運動量・物質輸送交換は海氷を通して行なわれる。この海氷生成による海洋環境の変動は海洋生物相に如何に影響を及ぼしているのだろうか。海氷生成による生物相の適応条件は何か。また、海氷生成、融解により、物質循環はどのように行なわれるのか。本研究では、典型的な季節海氷域であるオホーツク海の氷縁海域に当たる北海道沿岸と、汽水湖であるサロマ湖をモデル海域として、海氷生態系のモデル構築のために、海氷生成から融解までのエネルギー輸送過程とそれに伴う生物生産過程の変動、物質循環過程を明らかにすることを目的に、次の観測を行なった:1.沿岸定着氷域、氷縁海での観測:1994年冬期1月から3月に氷海域気象・海象観測システム周辺の結氷海域において、結氷期から融解期までの大気-海洋(海氷)面の熱、運動量等のエネルギー・フラックスや、日射量の連続観測を行なった。同時に、流氷レーダにより沿岸海域およびタワー周辺の流氷状況および分布の観測を行なった。また、随時沿岸水の採水を行ない、クロロフィルa等の分布を調べた。2.モデル化した海域、サロマ湖での観測:1994年2月下旬から3月上旬にかけサロマ湖の海氷の下に3次元超音波流速計、高性能水温・塩分センサーを設置し、海氷の成長、融解過程における熱、運動量、塩フラックスの変動を測定した。同時にアイス・アルジーや動植物の分布の調査、また物質フラックスの日周や潮汐変動を調べるためにセジメント・トラップを設置した。

更に、海氷の生長や積雪による日射の変動を調べるための測定も行なっている。3.海氷の融解期(5月頃まで)までの測定を行うために、1.は全部、2.は一部測定を継続中である。初年度(平成5年度)は、サロマ湖をモデル海域として、海氷生成から融解までのエネルギー輸送過程とそれに伴う生物生産過程の変動、物質循環過程を明らかにすることを目的に、1994年1月から4月まで結氷したサロマ湖において、海氷の成長から融解までの海氷下の海洋構造の観測を行なった。同時に、セジメント・トラップを海氷直下に設置し、アイス・アルジ-、動植物プランクトン、また物質フラックスの日周や潮汐変動を調べた。従って、本年度(平成6年度)は、(1)観測されたデータの解析、分析を行ない、結果の検討を行なった。海氷底部に生息しているアイス・アルジ-の鉛直輸送量と海氷、海洋構造との関係では、アイス・アルジ-の鉛直輸送量は、1)夜間に、2)昼間に海水温上昇期に、3)夜間から昼間に移行する時期に、更に、4)融解が始まる時期に急激に、増大することなどがわかった。これは、海氷底部に到達する光量、アイス・アルジ-による光の吸収量、海氷中のブライン・チャンネルの形状、成長や移動過程などの変化によって引き起こされたものと思われるが、更に検証を進める必要がある。(2)前年度と同様の観測を、1995年2月から3月に結氷したサロマ湖で行なった。また、結氷期前から融解期の終了までの(1994年12月から1995年5月までを予定)、セジメント・トラップによる物質フラックスと流速計・水温・塩分センサーによる海洋構造の連続観測は現在も継続中である。
持続的農民システム形成における女性の役割に関する地理学的研究

日本でも諸外国でも持続的発展の可能性のある農業と農村社会の具体的な内容と、それが形成されるための地域的条件を明らかにすることが、現代の重要な課題となっている。持続的農村を実現するためには、そこに居住する住民の良好な人間的結びつき、すなわち活力のある農村コミュニティの存在が不可欠である。そのためには、地元に根付いている女性の役割が極めて大きい。この研究は女性の活動に着目して、持続的農村の地域的条件を探ることを目的とした。全体として、(1)既存の文献の検討、(2)統計的な分析、(3)事例研究という3つの側面から研究を進めたが、特に事例研究に中心をおいた。結論としては、農村の人的なつながりやコミュニティが持続的農村の基本的な要素であり、それらをどのように維持したり、再編したりするかが農村の持続性実現にとって重要であることがわかった。しかし、近年農村の人的な結びつきが希薄となり、コミュニティも弱体化し、このことが農村の持続的性格を弱くするように働くようになった。このような状況のなかで、農村の伝統的な組織を土台にして新たな人的なつながりや組織がつくられたり、営農集団や趣味の会などの機能的な組織がつくられたりしている。また、農産物を通じた農家と都市住民との交流や、機能的な組織が既存の村落の領域を越えて構築されるなど、農村の社会的・文化的基盤は、人的なつながりやコミュニティの空間的な範囲を柔軟に、かつ広域的に広げることで再編されたりしている。このような農村の組織やコミュニティの再編の際には、女性が極めて重要な役割を果たしてきており、女性の動向によって農村が持続的性格をもつようになるか、そうではなくなるかが決まることが多いことが、われわれの今回の研究で明らかになった。本年は研究の初年度であるが、(1)既存の文献の検討、(2)統計的な分析、そして(3)事例調査という3つの側面から研究を進めた。まず、研究代表者は持続的農村システムと女性農業者に関する内外の文献を収集し、それを検討しつつある。持続的農村システムに関する研究は多いが、必ずしも概念的な整理がなされておらず、また具体的研究が少ない。また、西ヨーロッパや北アメリカ、オーストラリアなどでは、女性が主体的に農業経営や農村コミュニティの活性化にかかわってきている。統計的な分析については、研究分担者の森本が、市町村レベルでの全国規模の分析と農業集落レベルの関東地方の分析を進めている。これによって兼業化と農業労働力の高齢化・女性化が同時に進行していることがわかった。1970年代には女性労働力によって農業は大きく支えられていたが、農業労働力の高齢化が進むにつれて、女性の役割は相対的に低下している。また、研究代表者と分担者は各地でそれぞれ地域調査を始め、すでにいくつかの研究成果を発表した。研究代表者は富山平野と甲府盆地、茨城県常陸太田市、茨城県守谷町などで、農村の維持機構と女性の役割について調査した。甲府盆地の専業的果樹農村では、農業経営を継続的に維持するために女性が大きな役割を果たしていることが明らかになった。研究分担者の佐々木は新潟平野と清里高原において調査し、特に後者では地域イメージが農村の観光地化を促進したことを明らかにした。斎藤は福岡県朝倉町において万能ネギ栽培に関わる女性農業者について調べた。森本も常陸太田市の山間農村のコミュニティ活性化に取り組む農村女性の活動について分析を進めた。昨年度に引き続き、(1)既存の文献の検討、(2)統計的な分析、そして(3)事例調査という3つの側面から研究を進めたが、本年度は事例調査に中心をおいた。まず、研究代表者は持続的農村システムと女性農業者に関する文献の検討を継続した。

統計的な分析については、研究分担者の森本が、市町村レベルで生産農業所得統計と旧市区町村カードを用いて全国規模の分析を進めた。1960年代と1970年代には女性労働力によって日本農業は大きく支えられていたが、農業労働力の高齢化が進むにつれて、女性農業就業者の役割は相対的に低下している。しかし、農村社会の中で女性が現実に果たす役割が大きく、特に農外就業が強く浸透した都市周辺地域ではその傾向が強いことがわかった。また、研究代表者と分担者は各地でそれぞれ地域調査を実施し、昨年に引き続いていくつかの研究成果を発表した。研究代表者は富山平野と、茨城県のひたちなか市と守谷町などで、農村の維持機構と女性の役割について調査した。守谷町の女性農業クラブの活動については、ポルトガルで開催された持続的農村システムに関する国際シンポジュウムで発表し、内外の専門家と意見を交換することができた。また、ポルトガルにおける持続的農村実現の取り組みと女性の役割について情報を収集した。研究分担者の斎藤と森本は関東地方の軽種馬生産について持続的農業という観点からまとめ、また、斎藤は千葉県や福岡県で農村調査を行うとともに、ブラジルやアメリカ合衆国での調査結果と日本の状況を比較検討した。森本も昨年に引き続き常陸太田市の山間農村のコミュニティ活性化に取り組む農村女性の活動について分析を進めた。松井はつくば市豊里地区において、女性の宗教活動について調査し、年齢別に複数の講集団が組織され、これが農村コミュニティの持続性実現に大きく係わっていることを明らかにした。本年度は最終年度であるので、昨年までの調査・研究結果をまとめる方向で作業を進めた。まず「既存の文献の検討」であるが、研究代表者が日本および欧米の文献に基づき、持続的農村システムの主要な論点を整理し、さらに日本の農業・農村地理学のここ20年間の動向も整理した。「統計的な分析」については、主として研究分担者の森本が農業生産所得統計や旧市町村カードを用いて全国規模の分析を進めてきたが、特に全国の縮図ともいえる関東地方において女性農業就業者の分布とそれに関係する様々な要素の地図分析をまとめた。それによると女性農業就業者率が高い地域は、農業が相対的に盛んであることがわかった。現代の農村社会では、経済活動でも社会的・文化的活動においても、女性の役割が重要である。「事例調査」については、研究代表者は富山平野と茨城県のひたちなか市と守谷町、甲府盆地での研究成果をまとめた。富山県黒部川扇状地の農村のコミュニティ活動と女性の役割については、カナダのサイモンフレーザー大学で開催された持続的農村システムに関する国際シンポジュウムで発表し、内外の専門家の助言を得ることができた。また、カナダの大平原と南オンタリオにおいて、持続的農村形成における女性の役割についての情報を収集した。研究分担者の斎藤は、東京のつまみ菜などの集約的野菜栽培を調査する一方、愛媛県松山市周辺の農村や長野県松本盆地での農村の調査を通して、女性の役割を検討する一方、北アメリカの大平原やカリフォルニアでの調査を進めた。森本はひたちなか市のほしいも生産農村で事例調査を実施した。松井はひたちなか市やつくば市の農村において、女性のパーソナルネットワークや宗教活動を通して、コミュニティの中での役割を明らかにした。
サブテラヘルツ超高速スピン波伝搬の観測

本年度はスピン波伝搬を空間、時間分解で測定するためのポンプ・プローブ法を用いた空間、時間分解磁気光学カー効果装置の立ち上げを行った.装置の自動計測システムの構築を行い,まずPy薄膜を用いてスピン波伝搬の観測を試みた.ポンプ光によってスピン波を励起し,そのポンプ光が励起したスピン波の波束を明瞭に観測した.スピン波の波束の振幅,群速度を定量的に評価し,線形化LLG方程式を用いた理論計算結果との比較を行った.実験結果は定量的によく説明できることがわかり,ポンプ光による減磁気が励起したスピン波であることがわかった.この成果を国際学会で発表し(2015 International Conference on Solid State Devices and Materials),また学術雑誌に投稿した(S. Iihama et al., arXiv : 1601.0724v1).27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず我々はスピン波伝搬を空間分解、時間分解で観測するためのpump-probe法測定装置を構築した。構築した光学系を用いてパーマロイ薄膜におけるスピン波の波束の伝搬を観測した。また観測したスピン波の波束は磁化の方向に対して伝搬が異方的であり、理論から予測されるスピン波の分散関係から説明できる結果となった。この結果を応用物理学会、スピン変換年次報告会において学会発表を行った。垂直磁気異方性材料をスピン波の導波路として使用することはゼロ磁場での動作や、スピン波の分散関係の等方性から曲がった導波路での伝搬を可能にする。しかしながら垂直磁化膜を用いたスピン波伝搬の観測の報告は一つもない。垂直磁化膜でのスピン波伝搬を可能にするためには大きな飽和磁化かつ小さな磁気摩擦定数を持つ材料が必要である。その特性を満たす材料としてL10-FePdが挙げられる。我々は高品位FePd薄膜の作製に取りかかり、バルクと同程度の磁気特性を有するFePd薄膜の作製に成功した。そのFePd薄膜を用いて磁化才差運動(スピン波)の時間分解測定を行った結果、長時間持続磁化才差運動(スピン波)を観測した。得られた磁気摩擦定数は報告されている垂直磁化膜の中で最小であり、この結果を応用物理学会、日本磁気学会で学会発表するとともに、Applied Physics Letters, Journal of Magnetic Society Japanの学術雑誌に論文を投稿しこの結果を報告した。本年度はスピン波伝搬を空間、時間分解で測定するためのポンプ・プローブ法を用いた空間、時間分解磁気光学カー効果装置の立ち上げを行った.装置の自動計測システムの構築を行い,まずPy薄膜を用いてスピン波伝搬の観測を試みた.ポンプ光によってスピン波を励起し,そのポンプ光が励起したスピン波の波束を明瞭に観測した.スピン波の波束の振幅,群速度を定量的に評価し,線形化LLG方程式を用いた理論計算結果との比較を行った.実験結果は定量的によく説明できることがわかり,ポンプ光による減磁気が励起したスピン波であることがわかった.この成果を国際学会で発表し(2015 International Conference on Solid State Devices and Materials),また学術雑誌に投稿した(S. Iihama et al., arXiv : 1601.0724v1).スピン波伝搬を空間分解かつ時間分解で観測する測定装置を構築し、パーマロイ薄膜においてスピン波伝搬を観測することができたため、順調に進展している。またFePd薄膜が小さな磁気摩擦定数を持つ材料であることもわかったため、研究を遂行する材料の点に関してもおおむね順調に進展していると言える。まず、観測したパーマロイ薄膜におけるスピン波伝搬を系統的に測定しかつ理論計算結果と比較することにより、実験結果の現象論的理解を行う。また次に作製に成功した高品位垂直磁化FePd薄膜において、構築した空間分解、時間分解磁気光学カー効果を用いてスピン波伝搬の観測を試みる。
宮中における近世御会和歌の諸本調査に基づく総合的研究

当初の計画では、近世全体を網羅するだけの御会和歌資料を収集し、その分析を行なう。それらをもとに御会開催年月日・御会出席者・歌題・講師・読師・奉行等の御会データベースを作成し、さらに、関連資料データベースを作成するという予定であった。資料の収集に関しては、宮内庁書陵部や国会図書館を始めとした図書館において、主な御会和歌資料を収集することができたが、一点が40冊などといった大部のものであるため、完全に近世全体を網羅することはできていない。しかし、数年間の空白期間はあるものの、近世の初期から最後までに渡る資料は収集できている。御会データベースは、当初の予定を途中で変更して、全文入力に切り替えたために、作業は遅く、現在において公開できる状態には至っていない。そこで、今年度の成果報告としては、とりあえず、御会名・御会開催年月日・掲載資料名・天皇・院を記載した簡略御会和歌データベースを作成し、近世のく全体を網羅することにした。関連資料については、現在判明している御会和歌資料についてのデータベースを作成し、これも報告書に掲載した。まだまだ不十分で、これもまた、経過的な資料としてまとめたもので、今後とも補充していく予定である。以上が現在における研究成果であるが、大部の資料であるため、この研究をもとにして、今後もライフワークとして資料収集、データベース入力作業を継続していき、できるだけ早い時期に御会データベースを公開していきたい。今後は、そのために、他の研究者との相互協力が必要となると思われる当初の計画では、近世全体を網羅するだけの御会和歌資料を収集し、その分析を行なう。今後は、そのために、他の研究者との相互協力が必要となると思われる内閣文庫・国立国会図書館に所蔵している御会和歌資料を調査し、『近代御会和歌』(内閣文庫25冊本)『和歌御会』(国会図書館40冊本)『内裏和歌御会・仙洞和歌御会』(国会図書館74冊本)を紙焼写真・電子複写の形で収集した。一部の蔵書が大量なため、予算の関係上、これ以上の収集はできなかった。来年度以降、収集資料を増やして行く予定である。また、新潟・長野両県における、御会和歌周辺資料を調査した。宮中から転写して大名家などに流出したと思われるため、そうした流通の跡をたどるべく、資料調査を行なったが、残念ながら本年度は、それを跡づける資料は発見できなかった。来年度以降も、流通過程を物語る資料の発掘につとめたい。一方、御会データベースの形式を調え、「資料名・年月日・御会名・歌題・詠者・講師・読師・奉行」を1レコードとすることにした。また、できうれば、歌そのものも入力できればということも考慮に加えることにした。さらに、全国御会和歌資料現存データベースを作成する必要を感じ、現在、進行中である。単年度の零本資料も多く、かなりの数にのぼるため、いまだ完成に至っていないが、来年度中には完成させる予定である。現在のところ、資料の調査・収集を基本としており、いまだ成果を出すには至っていないが、来年度以降、随時論文の形式で発表していく予定である。前年度に引き続き、国会図書館・刈谷文庫に所蔵されている御会和歌集を調査し収集した。具体的には前年度、予算の都合上残ってしまった国会図書館所蔵『内裏和歌御会・仙洞和歌御会』の一部と刈谷文庫所蔵の『元文集』(写本三冊)『寛保集』(写本五冊)『延享集』(写本六冊)を収集した。また、御会和歌の周辺資料については、内閣文庫のもの以外に、いまだ有効な資料を見出せていない。御会和歌データベースについては、国書総目録や図書館目録を利用して全国御会和歌資料現存データベースを不完全ながらも作成した。これは、書名・所蔵・掲載年度(和暦・西暦)を記したものである。その結果、やはり一級資料だと思われる宮内庁書陵部のものを調査すべきことが判明し、来年度以降は、書陵部を中心に調査をおこなうことにした。また、現存データベースについても、もれているものが多いと思われるので、来年度以降完成に向けて進めていきたい。資料の内容を入力する御会データベースについては、書陵部所蔵の『公宴続歌』の近世部分を入力した。

また、それとともに、他の収集資料についても複写を行い、謝金をともなう入力協力によって随時入力を進めていった。内容入力は時間がかかるため、今後は当初の予定通り、御会和歌名・歌題名・役人名・出詠者名などの概略データベースの作成を先行させることも必要だと考えている。以上が本年度の実績概要だが、資料が膨大なこともあって、未だに調査・収集、データベース作成が中心となっており、成果を出すには至っていない。しかし、来年度は作業を進めていきながら、関連論文を作成し公表していく予定である。今年度の資料収集は宮内庁書陵部を中心に行なった。書陵部には御会関係資料がまことに多く、そのうち、以下の資料を紙焼にて複写収集しただけで、予算が終わった。来年度もさらに調査する必要がある。●禁裏和歌御会留慶長一天保江戸写24冊葉(函)973(号) (葉室家伝来の写本。慶長から天保までの主に御会始を中心とする記録。)●□禁裏御会写元文元-延享五江戸写24冊(御)150 588(御所に伝来した写本で、元文元年七夕御会から延享五年六月二六日洞裏玉津島社御法楽まで。)●公宴御会和歌寛延元-宝暦十江戸写11冊(御)501 863(御所伝来の写本。延享五年正月二四日の和歌御会始から、宝暦十年十二月二五日の内々聖廟御法楽まで。)●公宴御会和歌宝暦六-十一写6冊(鷹)105(鷹司家伝来の写本で、宝暦六年正月二十四日の和歌御会始から宝暦十年十二月二十四日月次御会まで。)御会和歌データベースは少しずつ内容を増やしているが、やはり、書陵部のものの確認が必要だと思われる。来年度も継続して行なう。御会データベースについては、大量のもので遅々として進まないが、少しでも入力を進めるべく努力している。以上が本年度の実績概要だが、今年度もまだ成果を出すには至っていない。来年度は研究終了の年であり、全体を把握することができるよう、より一層の研究を進めていきたいと考えている。今年度の資料収集は宮内庁書陵部所蔵の『公宴御会和歌』(23冊401/1)、賀茂神社三手文庫所蔵の『御会集』(17冊)、バークレー大学三井文庫所蔵の『御会集』を収集した。宮内庁書陵部には、まだまだ調査すべき資料が多く残されており、補助金の年限は過ぎたものの、今後も個人的に調査を進めていく予定である。御会データベースは、少しずつ進めているが、個人の力では遅々として進まず、まだまだ公開できる量には達していない。当初の目的では、御会開催年月日・御会出席者・歌題・講師・奉行等のデータを作成する予定であったが、途中より、どうせなら和歌本文をも合わせて、全てを入力したデータベースを作成した方が、今後の研究のためにはよかろうと考え、そちらの入力に切り替えたため、作成できた御会データベースは全体から考えると極一部であり、公開できる量には達していない。そのため、急遽、以前に作成していた御会和歌年表をこの4年間で拡充したものを報告書に掲載した。御会データベースについては、今後も地道に入力を続け、いずれ、きちんとした形で公開する予定である。
加齢指標タンパクを介した歯周病と動脈硬化症の関連性の解明

加齢と心臓疾患の原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ十分に解明されていない。そこで、加齢指標タンパク質(SMP30)を介した、歯周病と動脈硬化症との関連性を評価することを目的とした。歯周炎誘導性動脈硬化症亢進モデルを検討した結果、肝臓においてSMP30の発現が確認でき、加齢と共に減少が認められた。歯肉上皮細胞は抗SMP30抗体に陽性であったが、加齢に伴うSMP30の減少は見られなかった.また、加齢と共に血中SAA量も増加し、経時的に動脈硬化病巣面積比率の増加が認められた。以上より、加齢により、動脈硬化は進行し、歯周病の発症と進行に関与している可能性が示唆された。加齢と心臓血管疾患の原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ十分に解明されていない.そこで,加齢指標タンパク質(SMP30)を用い,動脈硬化症との関連性を評価する.また,歯周病と動脈硬化症の関係が注目を浴びているが,歯周病も生活習慣病としての側面を持ち,加齢がその発症と進行に関与すると報告されている.そこで,本研究ではSMP30を指標として,加齢を介した歯周病と動脈硬化症との関係を解明するために本実験を開始した.本年度は,歯周炎誘導性動脈硬化症亢進モデルの作製を実施した:当施設で繁殖,継代させた生後20週齢,40週齢,60週齢,80週齢のApoEノックアウトマウス,C57BL/6マウス各群32匹.16匹ずつ歯周病原菌経口感染群,非感染群の2群に分け,感染群にはPorphyromonas gingivalis(p.g.)を研究開始時に経口感染(2日毎1x10の9乗CFU,6回)させ,マウスは,20週,40週で各群4匹ずつ安楽死させた.心臓から鼠径部までの大動脈を摘出し,2匹は液体窒素にて瞬間凍結後,-80°Cフリーザーにて保存,2匹は固定液中で組織用試料とした.肝臓,大動脈におけるSMP30の発現をWestern Blot法,免疫染色,リアルタイムPCR法にて解析した.動脈硬化症の発症,進行の検索:大動脈の内腔を開いてOil red-O染色にて動脈硬化病巣面積比率を求めた.また,20週,40週のC57BL/6マウスにおいても上記と同様に実験を行った.以上より,肝臓におけるSMP30の発現は確認できたが,大動脈においては発現が確認できなかった.ApoEノックアウトマウスでは、動脈硬化巣が観察され,経時的に動脈硬化病巣面積比率の増加が認められた.加齢と心臓血管疾患の原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ十分に解明されていない.そこで,加齢指標タンパク質(SMP30)を用い,動脈硬化症との関連性を評価する.また,歯周病と動脈硬化症の関係が注目を浴びているが,歯周病も生活習慣病としての側面を持ち,加齢がその発症と進行に関与すると報告されている.そこで,本研究ではSMP30を指標として,加齢を介した歯周病と動脈硬化症との関係を解明するために本実験を開始した.本年度は,昨年度に引き続き、マウスを60週齢、80週齢で各群4匹ずつ安楽死させた.心臓から鼠径部までの大動脈を摘出し,2匹は液体窒素にて瞬間凍結後,-80°Cフリーザーにて保存,2匹は固定液中で組織用試料とした.肝臓,大動脈におけるSMP30の発現をWestern Blot法,免疫染色,リアルタイムPCR法にて解析した.動脈硬化症の発症,進行の検索:大動脈の内腔を開いてOil red-O染色にて動脈硬化病巣面積比率を求めた.また,60週,80週のC57BL/6マウスにおいても上記と同様に実験を行った.以上より,肝臓におけるSMP30の発現は確認できたが,大動脈においては発現が確認できなかった.ApoEノックアウトマウスでは、動脈硬化巣が観察され,経時的に動脈硬化病巣面積比率の増加が認められた.加齢と心臓血管疾患の原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ十分に解明されていない.そこで,加齢指標タンパク質(SMP30)を用い,動脈硬化症との関連性を評価する.また,歯周病と動脈硬化症の関係が注目を浴びているが,歯周病も生活習慣病としての側面を持ち,加齢がその発症と進行に関与すると報告されている.そこで,本研究ではSMP30を指標として,加齢を介した歯周病と動脈硬化症との関係を解明するために本実験を開始した.最終年度は,歯周炎誘導性動脈硬化症亢進モデルの作製を実施した:当施設で繁殖,継代させた生後20週齢,40週齢,60週齢,80週齢のApoEノックアウトマウス,C57BL/6マウス各群32匹.16匹ずつ歯周病原菌経口感染群,非感染群の2群に分け,感染群にはPorphyromonas gingivalis(p.g.)を研究開始時に経口感染(2日毎1x10の9乗CFU,6回)させ,マウスは,20週,40週で各群4匹ずつ安楽死させた.

心臓から鼠径部までの大動脈を摘出し,2匹は液体窒素にて瞬間凍結後,-80°Cフリーザーにて保存,2匹は固定液中で組織用試料とした.肝臓,大動脈におけるSMP30の発現をWestern Blot法,免疫染色,リアルタイムPCR法にて解析した.動脈硬化症の発症,進行の検索:大動脈の内腔を開いてOil red-O染色にて動脈硬化病巣面積比率を求めた.また,20週,40週のC57BL/6マウスにおいても上記と同様に実験を行った.以上より,肝臓におけるSMP30の発現は確認できたが,大動脈においては発現が確認できなかった.ApoEノックアウトマウスでは、動脈硬化巣が観察され,経時的に動脈硬化病巣面積比率の増加が認められた.加齢と心臓疾患の原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ十分に解明されていない。そこで、加齢指標タンパク質(SMP30)を介した、歯周病と動脈硬化症との関連性を評価することを目的とした。歯周炎誘導性動脈硬化症亢進モデルを検討した結果、肝臓においてSMP30の発現が確認でき、加齢と共に減少が認められた。歯肉上皮細胞は抗SMP30抗体に陽性であったが、加齢に伴うSMP30の減少は見られなかった.また、加齢と共に血中SAA量も増加し、経時的に動脈硬化病巣面積比率の増加が認められた。以上より、加齢により、動脈硬化は進行し、歯周病の発症と進行に関与している可能性が示唆された。当該年度では,SMP30の歯周組織における局在と,加齢に伴う量的変化を各臓器で比較検討し,SMP30を介した歯周病と動脈硬化症の関連性を解明する目的を計画した.そのため,ApoEノックアウト,C57BL/6マウス各群において,上顎骨を摘出し連続組織切片を作製し,リアルタイムPCR法,抗SMP30抗体を用いた免疫組織染色にて確認の予定だったが,肝臓,大動脈におけるSMP30の解析の結果にばらつきが見られたため,上顎骨の切片の作製まで至っていない.しかしながら,実験系は確立しているため,順次解析を行っていく予定である.以上より予定されている実験の遂行に支障はないと考える.歯学20週齢,40週齢,60週齢,80週齢に対して平成26年度と同様に,計測,解析を進めていく.(1)動脈硬化症の発症,進行の検索(2)各群,各週齢においての肝臓,大動脈での加齢指標タンパク質SMP30の発現,発現量をWestern Blot法,免疫染色,リアルタイムPCR法にて測定し,加齢に伴うSMP30の減少程度を評価する.(3) (2)の結果より,ApoEノックアウト,C57BL/6マウスとの比較で,動脈硬化病変程度とSMP30との相関関係を評価する.(4)p.g.菌感染群,非感染群において,歯周組織におけるSMP-30の発現,肝臓での加齢指標タンパク質SMP30の発現の変化を評価,検討する.多変量線形重回帰分析で相関関係が出れば,動脈硬化の程度を2群に分けて,これを従属変数とし,肝臓,大動脈でのSMP30タンパク発現量,歯周組織SMP30タンパク量を各々独立変数にしてROC解析を行い,動脈硬化程度の予測可能程度を検討する.以上の事より,老化バイオマーカーとしての加齢指標たんぱく質SMP30の変化,また,動脈硬化,歯周炎との相関関係より,(1)歯周炎発症におけるエイジングの影響にて検討する.(2)P.g.菌経口感染マウスモデルにおける,SMP30を介した,歯周病と動脈硬化症との関係を解明する.25年度では,SMP30の歯周組織における局在と,加齢に伴う量的変化を各臓器で比較検討し,SMP30を介した歯周病と動脈硬化症の関連性を解明する目的を計画した.そのため,ApoEノックアウト,C57BL/6マウス各群において,上顎骨を摘出し連続組織切片を作製し,リアルタイムPCR法,抗SMP30抗体を用いた免疫組織染色にて確認の予定だったが,肝臓,大動脈におけるSMP30の解析の結果にばらつきが見られたため,上顎骨の切片の作製まで至っていない.しかしながら,実験系は確立しているため,順次解析を行っていく予定である.以上より予定されている実験の遂行に支障はないと考える.消耗品が定価より安価にて購入できたため次年度使用額が生じた。
疾患関連コピー数多型解析の基盤整備

コピー数多型解析においては1.3M CNアレイを用いて、HapMapサンプルのCEUおよびYRIの60 trio(180人)のデータの取得を行いさらに高精度なCNVの遺伝学的性質の解析を行った。プローブ間隔中央値765bpの解析では2人種集団において6184個のCNVが同定され、全ゲノムで224Mbp(0.08%)をカバーしていた。ゲノム上におけるサイズの中央値は12.7Kbpであり、500Kアレイを用いた解析(中央値31.4Kbp)に比較して精度の高い(細かい)解析結果が得られたと考えられる。新規のCNVが大部分を占める一方で、500Kアレイを用いた解析で得られたCNV領域は1.3M CNアレイを用いた解析ではほとんど検出することが可能であった。CEU, YRIの集団で5%以上の頻度をもつCNVがそれぞれ133個、187個が同定され、CYP4V2, CYP21A2など薬剤感受性の遺伝子で人種間によって大きな頻度差があるものが見つかった。この解析においてはマイクロアレイにおいてdiploidのコピー数として検出されるデータから、ハプロイドごとの構成を推定するアルゴリズムを開発し、CNVのアレルと周囲のSNPとの連鎖不均衡の関係の詳細な解析を行った。Bi-allelic CNVを全体としてみるとtri-allelic CNVの法が周囲のSNPとより強い連鎖不均衡の状態にあった。Bi-allelic CNVにおいてdeletion alleleの頻度によって周囲のSNPとの連鎖不均衡が強く相関していることが分かった。こうしたcommon deletion alleleは周辺のSNPによってtagが可能であるが、これらを含めてSNPによってtag可能なCNVは全体でわずかであり、大部分のCNVは直接コピー数を測定する必要があることが判明した。癌解析においては肝転移を認めた大腸癌症例19例及び肝転移のない大腸癌14症例について、SNPアレイを用いたゲノムワイド遺伝子コピー数解析を行った。肝転移の有無に関わらず14の染色体腕で増加や欠失が見られた一方、肝転移群では20p13-p12.1、20q11.21-q13.33の染色体増加と、6q14.1-q25.1のヘテロ接合性消失(LOH)が高頻度に見られた。また、同一症例の原発大腸癌と肝転移癌組織の染色体異常を比較したところ、大部分は共通の染色体異常が維持されていたが、原発巣のみで見られる遺伝子コピー数変異もしばしば見つかったことから、癌細胞の不均質性に由来すると考えられた。また大脳半球の分離不全を伴う先天疾患である全前脳症(HPE)の解析も行った。これまでSHH, SIX3などの神経発生にかかわる遺伝子の変異などが見つかっているが、これらの遺伝子に変異が見つからず原因がはっきりしないものも多い。既知の原因遺伝子に変異の見られないHPEの症例について、1.3M_CNアレイを用いて高密度のゲノムコピー数解析を行ったところ6q22.31-q23.2の領域にっいて10.4Mbpの大きな欠失が同定された。このアレイは中央値765bpでプローブが配置されているために切断点(break point)の正確な評価が可能であり、切断点にまたがる遺伝子EYA4を同定した。EYA4はHPEの既知の原因である転写因子SIX3に共役因子として結合し前脳の発生に関わることを示すことが可能であった1)Real-time PCRは特定の領域においてCNVを検出するために通常使われるが、複雑なゲノム領域において1コピーの差を正確に測定することは難しい。この問題を解決するためにNanofluidic chipによるデジタルPCRを試みた。ゲノムのサンプルを段階的に希釈して、TaqManの試薬とともにそれぞれ6nLの容量をもつ約10000個の微小区画に流し込む。テンプレートが入った区画のみPCR後シグナルが得られるため、シグナルの得られる微小区画の数によってテンプレートの濃度がデジタルカウント可能である。重要な薬剤の代謝遺伝子であり、コピー数多型の見られるCYP2D6についてNanofluidic chipを使ったデジタルPCRによりコピー数を測定し、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイとの比較を行った。デジタルPCRは、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイに比して定量性にすぐれ配列の類似したCYP2D7とも明瞭に区別して測定できた。2)ゲノムワイドにおける正確な絶対コピー数探索を可能な技術を確立するために、Illumina Genome Analyzerによる配列Tagの出現頻度を計測することによりコピー数のデジタルカウントを試みた。HCT116細胞株のゲノムを断片化し、138M個の配列Tag(5Gbp相当)の配列を3Kbp間隔で集計すると、従来のSNP6.0 arrayに比して高解像度のコピー数情報が得られ、マイクロアレイでは検出できなかった微小な増幅、欠失が観測された。

新規のCNVが大部分を占める一方で、500Kアレイを用いた解析で得られたCNV領域は1.3M CNアレイを用いた解析ではほとんど検出することが可能であった。CEU, YRIの集団で5%以上の頻度をもつCNVがそれぞれ133個、187個が同定され、CYP4V2, CYP21A2など薬剤感受性の遺伝子で人種間によって大きな頻度差があるものが見つかった。この解析においてはマイクロアレイにおいてdiploidのコピー数として検出されるデータから、ハプロイドごとの構成を推定するアルゴリズムを開発し、CNVのアレルと周囲のSNPとの連鎖不均衡の関係の詳細な解析を行った。Bi-allelic CNVを全体としてみるとtri-allelic CNVの法が周囲のSNPとより強い連鎖不均衡の状態にあった。Bi-allelic CNVにおいてdeletion alleleの頻度によって周囲のSNPとの連鎖不均衡が強く相関していることが分かった。こうしたcommon deletion alleleは周辺のSNPによってtagが可能であるが、これらを含めてSNPによってtag可能なCNVは全体でわずかであり、大部分のCNVは直接コピー数を測定する必要があることが判明した。癌解析においては肝転移を認めた大腸癌症例19例及び肝転移のない大腸癌14症例について、SNPアレイを用いたゲノムワイド遺伝子コピー数解析を行った。肝転移の有無に関わらず14の染色体腕で増加や欠失が見られた一方、肝転移群では20p13-p12.1、20q11.21-q13.33の染色体増加と、6q14.1-q25.1のヘテロ接合性消失(LOH)が高頻度に見られた。また、同一症例の原発大腸癌と肝転移癌組織の染色体異常を比較したところ、大部分は共通の染色体異常が維持されていたが、原発巣のみで見られる遺伝子コピー数変異もしばしば見つかったことから、癌細胞の不均質性に由来すると考えられた。また大脳半球の分離不全を伴う先天疾患である全前脳症(HPE)の解析も行った。これまでSHH, SIX3などの神経発生にかかわる遺伝子の変異などが見つかっているが、これらの遺伝子に変異が見つからず原因がはっきりしないものも多い。既知の原因遺伝子に変異の見られないHPEの症例について、1.3M_CNアレイを用いて高密度のゲノムコピー数解析を行ったところ6q22.31-q23.2の領域にっいて10.4Mbpの大きな欠失が同定された。このアレイは中央値765bpでプローブが配置されているために切断点(break point)の正確な評価が可能であり、切断点にまたがる遺伝子EYA4を同定した。EYA4はHPEの既知の原因である転写因子SIX3に共役因子として結合し前脳の発生に関わることを示すことが可能であった
部位特異的組換え酸素による新しいウイルスベクター作製システムの開発改良

新規に発見された未知遺伝子の機能探索へのウイルスベクターの応用、特にcDNAライブラリーの様に多種類の遺伝子を発現する複数のベクターを効率的に作製する方法として、本研究では部位特異的組換え酵素による「遺伝子置換反応」を応用した全く新しいベクター作製法の開発に向け、E1遺伝子置換型アデノウイルスベクターを例に、置換反応の効率と精度の検討を行った。本法は、Cre発現293細胞で複製しているrecipientウイルスゲノム上のloxP(L)と変異型loxP(V)の間の領域とdonorプラスミドの目的遺伝子を置換する方法であり、得られたウイルスをCre発現細胞で数代継代し目的ウイルスの濃縮を行う。そこで1代目の目的ウイルス生成効率すなわち置換効率を検討した結果、その効率はrecipientウイルスの感染量が少ないほど高いことが明らかになり、細胞あたりのウイルス感染量が0.5では全てのウイルス中の約1/4が目的ウイルスであった。その後4回継代を繰り返すことにより90%以上が目的ウイルスへと濃縮された。またrecipientウイルス上のLとV間は約30kbまで離れても遺伝子置換反応が可能であったものの効率は若干劣る傾向が認められた。一方その精度に関しては、Vを欠失したdonorプラスミドを用いた検討から、1代目のウイルス中には目的のウイルスしか認められなかったものの、そのウイルスを3回継代を繰り返したところマーカーとしてdonorプラスミド上に挿入していたGFPを発現するウイルスが出現した。そこでこのGFP発現ウイルスを限界希釈法で単離して構造解析を行った結果、ウイルス生成の途中のdonorプラスミド挿入段階で非特異的に一部が切り落とされたウイルスと複数のDNA断片が非特異的な組換えを起こしたウイルスであると考えられた。遺伝子置換反応の条件検討により置換反応の効率化を図り継代数を抑制することが出来れば、精度の上昇は可能であると考えている。近年多くの基礎研究に応用されているアデノウイルスベクターの効率的な新規作製法の開発に向け、本年度は部位特異的組換え酵素の遺伝子置換反応を応用した作製法の効率と精度について解析を加えた。この作製法には、ウイルスパッケージングシグナル(Ψ)を組換え酵素の本来の標的配列(wt)で挟み、その下流に遺伝子と標的配列とは組換えを起こさない変異型標的配列(mt)を挿入したrecipientウイルスとΨと目的遺伝子をwtとmtで挟んだdonorプラスミドを用いる。この両者を組換え酵素発現293細胞に導入すると、293細胞内で複製しているrecipientウイルスゲノム上にdonorプラスミドからΨと目的遺伝子が置換され、目的ウイルスが生成する。recipientウイルスの混入はΨの両側に挿入されたwtにより最小限に抑えることが可能である。この置換効率の最適化には、高い活性を有する組換え酵素発現293細胞の樹立化、recipientウイルス、donorプラスミドの導入量の検討が必要である。本研究ではまずCreを用いてE1置換型ベクターの作製を行った。目的遺伝子としては生成の確認が容易なGFPを選んだ。その結果、本研究で作製したCre発現293細胞は、今までの報告と同様に約80%と高い組換え効率を示した。またrecipientウイルスに挿入する遺伝子として、ウイルスパッケージングサイズのほぼ上限のLacZとGFPとほぼ同サイズのFLPを挿入したウイルスを作製し、目的ウイルス生成効率を比較したところ、LacZの方がFLPよりも効率が高いことが判明した。recipientウイルスの感染量はMOI 0.51.0、donorプラスミドは3μgが至適であり、最適化された条件化では、わずか3回のウイルス継代で約90%が目的ウイルスであった。