hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
寄せ場的労働市場の拡散と不安定就労問題に関する社会学的研究

次に,現代の不安定就労問題の実態を明らかにするために,前年度の調査を引き続き行い、とりわけても東京を中心としたフィールド調査を行った。具体的には、現代的な労働・雇用問題の実態へと迫るために、サービス業労働者や女性労働者が抱えている問題に関して、労働条件・雇用形態の詳細・生活上抱えている問題などを調査し、さらに、非正規の雇用実態に迫るために実体的な社会空間とウェブ空間を分けて調査を行った。結果、寄せ場的労働市場の拡散は,正規労働者間においても経済的格差だけでなく、文化的セグリゲーションをもたらしており、非正規労働者の多くが多様な困難を抱えているにもかかわらず、そうした困難が社会問題として顕在化しにくく、個人的な問題として対処せざるをえない状況にあることが明らかになった。これらの実態を明らかにすべく、本研究の総括的なまとめに取り組んでいきたい。本研究の最終年として、総括的なまとめに取り組んだ。その際、フィールド調査で得たデータを分析する理論的枠組みを検討した。寄せ場的労働市場の拡散は,正規労働者間においても経済的格差だけでなく、文化的セグリゲーションをもたらしており、非正規労働者の多くが抱えている多様な困難を社会問題として顕在化させていくためには、個人的な問題として潜在化している労働過程と生活過程の問題を質的に捉えていくことの重要性が浮かび上がってきた。つまり、寄せ場的労働市場の拡散という問題構成は、「三人に一人が非正規雇用」というような量的な状況を指摘することで不可視化されていく社会的状況に対して、質的な次元で現実を可視化していかねばならないことが明らかとなった。すなわち、ポストフォーディズム期の現代資本主義下において、労働市場のフレキシブル化が資本の要請となっているのは、消費主義のフレキシブルな需要に対応するのとパラレルに進行しており、労働/消費の場面で起こっている「労働力/消費力の再編」を社会的排除という視角で捉えていくことが、寄せ場的労働市場の拡散を明らかにすることに繋がっていくのである。
妊婦末梢血中への胎児由来細胞の移行と妊娠悪阻との関与について

母体血漿中に胎児由来のDNAが浮遊している事が報告されている。この胎児由来DNA量は妊娠中毒症や早産、また、胎児がDown症の症例で増加すると報告されている。今回、妊娠初期の胎児由来DNA量をY染色体特異的なDYS14遺伝子を定量することで評価した。302例の妊婦で検討したところ、男児妊娠例139例中135例でDYS14遺伝子を同定した。女児妊娠例ではDYS14遺伝子は検出されなかった。この胎児性別検査法のSensitivity:97.2%、Specificity:100%、Positive predictive value:100%、Negativepredictive value:97.5%と精度の高い検査法であることがわかった。また、この検討で妊娠9-14週頃の症例が妊娠16週以降の症例に比較して胎児DNA量のばらつきが大きいことを見出した。妊娠9-14週で高値を示した症例について臨床的な背景、その後の妊娠合併症の発現について検討をおこなったが、妊娠中毒症や早産などとの関与はなかった。しかし、妊娠悪阻症状の強い患者が多かったことから、その関与について検討を行った。その結果、妊娠悪阻にて入院した症例は、妊娠悪阻症状を認めなかった症例にに比較し、有意に母体血漿中胎児DNA量が高値を示すことがわかった。また、母体血漿中beta-hCG濃度と胎児DNA濃度が有意に正の相関を示した。このことから、妊娠絨毛の活発な母体脱落膜への侵入などが母体の免疫系を刺激し、母児境界で両者の鬩ぎ合いが起こっていて、その結果として母体血漿中胎児DNA量が増加すると考えられた。この結果は妊娠のその病態を理解する上で重要な所見であると考えられた。
ホストーゲスト分子認識を基礎とする中性分子センサ-の開発

1.膜界面で有機ゲストを取り込みうる疎水性内孔を持つβーシクロデキストリン誘導性1__のLB膜をグラシ-カ-ボン電極上に直接累積することにより、新しいタイプのLB膜型センサ-を作製した。種々の有機アニオンとのホスト-ゲスト錯体形成に伴う膜分子間の間隙におけるマ-カ-イオン透過性の変化をサイクリックボルタンメトリ-により調べたところ、特にフタル酸の位置異性体に関して,シクロデキストリンの内孔への取り込みによる形状識別効果を反映した興味深い選択性が観測された。一方,中性ゲストであるカテコ-ル関連化合物に関しては,レゾルシノ-ルに対して比較的強い応答が観測された。2.シクロデキストリンの長鎖アルキル型誘導体が単分子チャンネル機能を示す可能性を確かめるために,ホスト2__を水溶液上に展開し適当な表面圧をかけて圧縮した単分子膜について,ホストーゲスト錯体形成に伴うマ-カ-物質の膜透過性変化を,直接的なサイクリックボルタンメトリ-により調べた。その結果,シクロデキストリンに取り込まれる中性ゲスト(シクロヘキサ)ール)が下層水溶液中に存在すると,チャンネルブロック機構により,膜透過性の制御が起こることが示された。3.中性分子を取り込む純人工ホストであるシクロファンの長鎖アルキル型誘導体3__,4__を合成し,配向膜形成能,膜界面でのゲスト取り込み能,膜透過性制御能に関する基礎検討を開始した。
状況映像におけるプライバシ保護手法の開発

本研究は、双方向映像通信を利用したコミュニケーションにおいて,効果的に状況映像を伝えつつ,かつプライバシの保護手法を確立することを目的としている.具体的には,(1)状況映像の中から個々の人物像を実時間で自動的に抽出・認識・追跡する手法を確立し,(2)個々の人物像の細部を加工し隠蔽表示が可能とする制御機能を実現し,(3)プライバシ保護機能を組み込んだ双方向映像通信システムを構築して運用実験を行い,システムの有効性を確認することである.研究実績:(1)動画像処理装置IMPA-VISINを利用した人物像の実時間抽出手法の確立背景差分法と移動方向コードを組合せてビデオ映像から人物像を実時間で自動的に抽出する手法を確立した.(2)IDバッジを利用した人物の認識実験名札サイズの紙に印刷してIDバッジを作成し,認識用のビットパターンを決めて,画素の輝度の差を利用してビットパターンをIDバッジの背景から抽出し,ラベリング処理を行って,ビットパターンのコードを認識する実験システムを構築した.(3)人物の顔画像を利用した人物の認識実験多重解像度モザイク化処理を利用し,正面顔から12×12,合計144次元の顔部品特徴ベクトルを求め,それらから顔辞書を作成した.入力映像から実時間で自動的に正面顔を抽出し,モザイク化処理を施して顔辞書と照合し,人物を認識するシステムを構築した.(4)同一人物の追跡と人物隠蔽実験上記の(1)の抽出結果を利用して,人物像のラベリング処理をし,フレーム間での変化を追いつつ,同一人物を追跡しながら隠蔽表示できるシステムを構築した.隠蔽表示方法としては,シルエット表示,名前付きシルエット表示,名札シルエット表示及び透明人間表示を用いた.上記の(2)又は(3)と組み合わせて,識別した人物の名前と各隠蔽表示方法で,状況映像における人物のプライバシ保護手法を開発した.さらに,運用実験を行いシステムの有効性を確認した.(5)2000年9月13日に長岡技術科学大学で開催された電子情報通信学会オフィスシステム研究会で研究成果を発表した.本研究は、双方向映像通信を利用したコミュニケーションにおいて,効果的に状況映像を伝えつつ,かつプライバシの保護手法を確立することを目的としている.具体的には,(1)状況映像の中から個々の人物像を実時間で自動的に抽出・認識・追跡する手法を確立し,(2)個々の人物像の細部を加工し隠蔽表示が可能とする制御機能を実現し,(3)プライバシ保護機能を組み込んだ双方向映像通信システムを構築して運用実験を行い,システムの有効性を確認することである.これまでの研究実績背景差分法と移動方向コードを組合せてビデオ映像から人物像を実時間で自動的に抽出する手法を確立した.(2)IDバッジを利用した人物の認識実験名札サイズの紙に印刷してIDバッジを作成し,認識用のビットパターンを決めて,画素の輝度の差を利用してビットパターンをIDバッジの背景から抽出し,ラベリング処理を行って,ビットパターンのコードを認識する実験システムを構築した.(3)人物の顔画像を利用した人物の認識実験多重解像度モザイク化処理を利用し,正面顔から12×12,合計144次元の顔部品特徴ベクトルを求め,それらから顔辞書を作成した.入力映像から実時間で自動的に正面顔を抽出し,モザイク化処理を施して顔辞書と照合し,人物を認識するシステムを構築した.(4)同一人物の追跡と人物隠蔽実験上記の(1)の抽出結果を利用して,人物像のラベリング処理をし,フレーム間での変化を追いつつ,同一人物を追跡しながら隠蔽表示できるシステムを構築した.隠蔽表示方法としては,シルエット表示,名前付きシルエット表示,名札シルエット表示及び透明人間表示を用いた.上記の(2)又は(3)と組合わせて,識別した人物の名前と各隠蔽表示方法で,状況映像における人物のプライバシ保護手法を開発した.(5)2000年9月13日に長岡技術科学大学で開催された電子情報通信学会オフィスシステム研究会で研究成果を発表した.(6)プライバシ保護機能を組み込んだ双方向映像通信システムを構築し,運用実験を行い,システムの有効性を確認する予定である.本研究は、双方向映像通信を利用したコミュニケーションにおいて,効果的に状況映像を伝えつつ,かつプライバシの保護手法を確立することを目的としている.具体的には,(1)状況映像の中から個々の人物像を実時間で自動的に抽出・認識・追跡する手法を確立し,(2)個々の人物像の細部を加工し隠蔽表示が可能とする制御機能を実現し,(3)プライバシ保護機能を組み込んだ双方向映像通信システムを構築して運用実験を行い,システムの有効性を確認することである.研究実績:(1)動画像処理装置IMPA-VISINを利用した人物像の実時間抽出手法の確立背景差分法と移動方向コードを組合せてビデオ映像から人物像を実時間で自動的に抽出する手法を確立した.(2)IDバッジを利用した人物の認識実験名札サイズの紙に印刷してIDバッジを作成し,認識用のビットパターンを決めて,画素の輝度の差を利用してビットパターンをIDバッジの背景から抽出し,ラベリング処理を行って,ビットパターンのコードを認識する実験システムを構築した.(3)人物の顔画像を利用した人物の認識実験多重解像度モザイク化処理を利用し,正面顔から12×12,合計144次元の顔部品特徴ベクトルを求め,それらから顔辞書を作成した.入力映像から実時間で自動的に正面顔を抽出し,モザイク化処理を施して顔辞書と照合し,人物を認識するシステムを構築した.

(4)同一人物の追跡と人物隠蔽実験上記の(1)の抽出結果を利用して,人物像のラベリング処理をし,フレーム間での変化を追いつつ,同一人物を追跡しながら隠蔽表示できるシステムを構築した.隠蔽表示方法としては,シルエット表示,名前付きシルエット表示,名札シルエット表示及び透明人間表示を用いた.上記の(2)又は(3)と組み合わせて,識別した人物の名前と各隠蔽表示方法で,状況映像における人物のプライバシ保護手法を開発した.さらに,運用実験を行いシステムの有効性を確認した.(5)2000年9月13日に長岡技術科学大学で開催された電子情報通信学会オフィスシステム研究会で研究成果を発表した.
マウスにおけるパスツレラ症の診断および菌の病原性に関する研究

本研究は、マウスのパスツレラ症の病因であるPasteurella pneumotropicaの輸送培地および形態学的性状に焦点を絞り、各種培地における本菌の生存性と電子顕微鏡観察による本菌の構造を明らかにするために実施した。まず、本症の診断方法確立のための研究の一環として、本菌の輸送培地について検討した結果、、本菌の輸送培地としてL-15輸送培地が最適であることが明らかとなった。すなわち、用いたATCCマウス株、マウス分離株およびラット分離株のいずれの株においても、保存開始から7日間経過しても10^5から10^6個の菌数が本培地において維持されており、菌数の低下はほとんど認められなかった。次に、本菌の諸性状とマウスに対する病原性との関係を検討するために、前述した3株の菌の電子顕微鏡観察を実施した。その結果、いずれの菌もグラム陰性菌に特有の構造を有していたが、マウス由来株とラット由来株では形態に違いが認められた。マウス由来株では多くの菌において細胞の構造が良く保持されていたが、ラット由来株においては苗の死滅している像が多く観察された。このことは、人工培地の環境に対する両菌株の生存性あるいは増殖性に差があることを示唆してると考えられた。また、線毛様構造が観察された。さらに、Pasteurella multocidaで用いられているフェリチン法(Jacquesとfoiry,1987)をこれらの菌株に応用したところ、細胞壁の外側にP.multocidaとは明らかに異なる構造物が観察された。続けて、これらの菌株について糖の分解性などの生物学的・生化学的性状を調べたところ、マウスおよびラット分離株はJawetzの生物型に属することが明らかとなった。また、ラクトースの分解性において菌株間で相違が認められた。本研究は、マウスにおけるパスツレラ症の診断法を確立するとともに、Pasteurella pneumotropicaのマウスに対する病因的意義を明確にすることを目的としている。そこで、まづ本菌の分離方法を確立するために、近隣の2、3の施設におけるマウスの糞便からの本菌分離状況を、TGNブロスとNKBT培地を用いた三日月ら(1987)、クリンダマイシン加血液寒天培地を用いたBootら(1995)、GNブロスと血液寒天培地を用いたWeiglerら(1996)およびブレインハートインフュージョンブロスと血液寒天培地を用いたWangら(1996)の方法で比較検討した。その結果、分離陽性個体が少なかったために上記4つの方法の比較はできなかった。このことから、本菌の分離方法の比較検討には、さらに多くの施設において多数の検体を採取することが必要であると考えられた。そのためには、糞便から本菌を分離するための輸送培地の開発が不可欠である。そこで、本菌の輸送培地について検討した。輸送培地としては、私共が以前に行ったウサギ鼻腔からのPasteurella multocida分離のための輸送培地の研究(Kawamoto et al.J.Clin.Microbiol.1997)およびその後のP.multocidaの長期培養の研究に基づき、キャリブレアー培地、L-15培地、リン酸培地を用いた。分離菌株を用いた実験結果では、いづれの培地においても、保存開始から7日間経過しても10^7から10^4個の菌数が維持されており、本菌の輸送培地として有用であることが示唆された。現在、糞便材料を用いた実験を実施中である。

いっぽう、本菌の形態学的、生物・生化学的ならびに血清学的性状とマウスに対する病原性との関係を明らかにする目的で、本菌の形態、糖の分解性および血清学的諸性状を現在調べている。本研究は、マウスのパスツレラ症の診断方法を確立するとともに、Pasteurella pneumotropicaのマウスに対する病因的意義を明らかにすることを目的としている。本症の診断方法確立のための研究の一環として、昨年度に行われた本菌の輸送培地についての検討の結果、キャリブレアー培地、L-15培地およびリン酸培地が有用であることが示唆された。今年度は、さらに詳細な検討を加えたところ、本菌の輸送培地としてL-15培地が最適であることが明らかとなった。すなわち、用いたATCCマウス株、マウス分離株およびラット分離株のいずれの株においても、保存開始から7日間経過しても10^5から10^6個の菌数が本培地において維持されており、菌数の低下はほとんど認められなかった。次に、本菌の諸性状とマウスに対する病原性との関係を検討するために、前述した3株の菌の電子顕微鏡観察を実施した。その結果、いずれの菌もグラム陰性菌に特有の構造を有していたが、マウス由来株とラット由来株では形態に違いが認められた。マウス由来株では多くの菌において細胞の構造が良く保持されていたが、ラット由来株においては菌の死滅している像が多く観察された。このことは、人工培地の環境に対する両菌株の生存性あるいは増殖性に差があることを示唆してると考えられた。また、線毛様構造が観察された。さらに、Pasteurella multocidaで用いられているフェリチン法(Jacquesとfoiry,1987)をこれらの菌株に応用したところ、細胞壁の外側にP.multocidaとは明らかに異なる構造物が観察された。続けて、これらの菌株について糖の分解性などの生物学的・生化学的性状を調べたところ、いくつかの性状において菌株間で相違が認められた。
がん微小環境のメタボリックストレス応答を標的とする難治性がん治療のための創薬研究

1)低栄養選択的な細胞毒性を有する化合物の創薬化学的研究として、フェンホルミンをリードとする構造活性相関研究を行い、リードの活性を大きく上回る新規誘導体の開発に成功した。本化合物の標的タンパク質探索のためのプローブ分子設計のための誘導体合成をおこない、プローブ分子設計の指針を得た。2)がん微小環境ストレスの可視化のためのプローブの開発として、新規鉄(II)蛍光プローブの開発に成功し、低酸素ストレス下でがん細胞において二価鉄が上昇することを見出した。がんの二価鉄の変動を捉えた初めての例である。3)がんの代謝リプログラミングを標的とするS. barbata(半枝蓮)エキスの成分検索を行った。本研究は、がん微小環境に特異的な低酸素及び低栄養ストレスへの適応応答系に着目し、これをがん攻略のための普遍的な標的に据えた微小環境モジュレータを創製し、臨床を指向した創薬研究を展開するものである。本年度は、プロポリス由来のケイヒ酸誘導体及びビグアニド誘導体のphenforminをリードとして構造展開を行い、低酸素及び低栄養ストレス応答に対する影響を低酸素応答性あるいは低栄養ERストレス応答性ルシフェラーゼアッセイによって評価した。結果、微小環境モジュレータとして有望な、リードの活性を上回る有望候補化合物を複数見いだすことに成功した。すなわち、ケイヒ酸誘導体のリード化合物より、新規チアゾリジンジオン誘導体を得、このものは、HIF-1阻害作用、VEGF分泌阻害作用を介する強い血管新生阻害作用を示すことが明らかになった。一方、phenforminにおける、芳香環の置換基の検討において、Me基又はCl基を導入したところHIF-1抑制及びunfolded protein response (UPR)抑制の増強が認められ、特にο-位にCl基を導入した場合に、約70倍という非常に強い低栄養選択的細胞毒性を示し、HIF-1応答及びUPR抑制と、血管新生阻害おいても、活性の増強が認められた。現在さらなる構造最適化を検討中である。また、我々が開発した低酸素トキシンにより、卵巣がん細胞においてがん幹細胞マーカーが抑制されることが明らかになった。さらに、現在開発中の鉄(II)特異的蛍光プローブにより、新たに低酸素細胞を検出できる可能性が示唆された。がん微小環境のストレス応答として、低酸素及び低栄養ストレス応答系のHIF-1シグナル並びにUnfoldedprotein response(UPR)シグナル系の活性化に着目したルシフェラーゼアッセイ及び低栄養特異的細胞毒性を指標として、ビグアニド誘導体の構造活性相関研究を展開してきた。一昨年に得られた候補化合物は、リード化合物であるphenforminの活性を大きく上回ったが、その後、さらなる活性の増強に成功した。本化合物は、低酸素によるHIF-1タンパク質の発現誘導を阻害し、グルコース飢餓によるGRP78の発現誘導も阻害することがわかった。さらに、強い血管新生阻害作用が認められた。そこで、本化合物を基盤とするアフィニティプローブの設計・合成に着手したところである。また、in vivo転移抑制作用及び抗腫瘍活性を評価するため、いくつかの有望な候補化合物のスケールアップ合成をおこなった。新規シードの天然物からの探索を目指して、半枝蓮抽出物の分離精製を行い、水溶性または脂溶性の異なる種々の画分の精製を完了した。一方、これまでのルシフェラーゼアッセイの他に、新しい効率的な評価系として、がん微小環境ストレスに応答して異なる色の蛍光蛋白質を発現する細胞株の樹立にむけて、ベクターの作成を開始した。卵巣癌および肝臓癌細胞を用いた、3次元培養法を確立し、がん微小環境モデルとしてスフェロイドを作成することができるようになった。N-oxide系低酸素トキシンや上記の微小環境モジュレータを用いて、スフェロイドにおける活性の解析を開始した。この際、我々が開発したFe(II)特異的蛍光プローブにより、低酸素部位でFe(II)が活性化していることが示唆されたことから、新たにがん微小環境における鉄代謝についても今後検討する計画である。昨年度に得られた有望候補化合物をもとに、標的タンパク質同定のためのプローブ設計を行うべく、リンカー導入部位の検討を行ったところ、芳香環及びビグアニド基にアルキル基を導入した場合には、低栄養選択毒性及びUPR阻害活性、HIF-1阻害活性が消失することが判明した。一方、二級アミノ基にアルキル基を導入した場合には、活性は減弱したものの、いずれの生物活性も認められたことから、リンカー導入部位として二級窒素を選択した。そこで、二級窒素基にリンカー接続の足がかりになる種々の置換基を導入した化合物の合成を達成した。今後は蛍光タグ、またはビオチンタグ及びマグネティックビーズとの縮合を行い、低栄養ストレスで誘導した細胞エキス等を用いて標的探索を実施する予定である。

我々が開発した二価鉄蛍光プローブイメージングにより、がん細胞において低酸素ストレス下で二価鉄イオンが増加することを見出したことから、低酸素における鉄の輸送、代謝にかかわる種々のタンパク質の発現変動について解析を行っている。さらに、Scutellaria barbata(半枝蓮)エキスの分画により、種々のフラボノイドの単離を達成した。がんの代謝リプログラミングを標的とする癌治療薬の開発を目指して、これらの分画及び化合物のスクリーニングとして、がん細胞の解糖系エネルギー代謝による乳酸発生量とミトコンドリアの酸化的リン酸化による酸素消費量の解析を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。創薬化学26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度、リード化合物の構造展開でより作用の強い微小環境モジュレータを見いだしたことから、これをプローブとして、標的タンパク質の同定を行う。あらたなシード物質探索に関しては、計画書に記載の生薬エキスから各種分画を既に得ており、今後スクリーニングを実施する予定。蛍光蛋白質による、微小環境モジュレータスクリーニングシステムの構築については未解決であるので25年度に実施する。最近ビグアニド系糖尿病薬のメトホルミンの抗腫瘍活性が注目を集めている。一方、我々は本研究で、メトホルミンより強い作用を有するビグアニド系微小環境モジュレータの開発に成功したことから、その標的分子探索を行う意義はますます高くなった。しかしながら、昨年度にバイオプローブ化の候補としていた化合物より強い活性を有する候補物質を新たに見いだしたことから、アフィニティプローブの分子設計を変更したため、予定より若干の遅れが出た。本年度にこの分子を完成させ、がん微小環境のストレスで誘導される新規標的タンパクの同定に取り組む予定である。また、低酸素及びERストレスに応答して色の異なる蛍光蛋白質を発現する細胞株の樹立のための、ベクターの組み替えが完了していないことから、医学部森重等の協力の下、組み換え実験に熟達したスタッフ及び学生を動員して集中的に進める予定である。本年度にさらに有望な活性化合物を見いだしたことから、これをもとに標的探索プローブを設計合成することにした。また、計画していた蛍光スクリーニングシステムについては、さらに方法を見直して、蛍光、化学発光ダブル検出システムを考案し、現在作成に取りかかっている。新規微小環境モジュレータの探索も引き続き継続していく。ビグアニド系微小環境モジュレータの標的分子の探索と作用機構解明:メトホルミンはAMPKの活性化を通して、がんのエネルギー代謝の再構築にも寄与することが示唆されている。そこで、我々の見いだした新規ビグアニド誘導体をバイオプローブとしてがん微小環境で変化するタンパク質群の中から標的分子を見いだすことができれば、初期の目的であるがん微小環境のメタボリックストレスに関与する分子が同定できると期待される。同時にトリB細胞由来DT40
口唇口蓋裂における吸啜機能の経時的変化の分析

本研究では口唇口蓋裂児における吸啜運動の特徴と、口唇形成術前後、術後3ヶ月における口腔周囲筋活動の筋協調パターンの変化について検討することを目的に、筋電図積分値移動曲線を用いて解析を行ったので報告する。被検児は口唇形成術を施した片側性完全唇顎口蓋裂児(CLP群)とした。機能検査は哺乳床を装着した状態で、口唇形成術前後、3ヶ月後の計3回実施した。また同様の乳首を使用し全身、口腔内に異常を認めない健常乳児と比較検討した。口腔周囲筋活動は、左右側頭筋、咬筋、唇裂とは反対側の口輪筋、健側と同側の舌骨上筋群の計6筋に電極を貼付し、波形を分析した。計測項目は1吸啜サイクル時間、ピーク時筋活動量、ピーク時間と割合、積分値移動曲線による筋協調パターンおよび経日的変化とした。結果から得られた考察について記す。健常児群では、舌骨上筋群を大きく活動させて口腔内陰圧を形成するのに対し、CLP群は口唇形成術後も口腔と鼻腔が交通しているという形態的特徴から、舌の動きが異なることが推察された。本研究では1吸啜サイクル時間が健常児群より短かったのは、哺乳床を装着することで口腔内容積が小さくなり、人工乳の1回の取り込み量が少なくなったためと考えられた。またCLP群口輪筋が最も大きく活動しており、特に術後で顕著であった。これは口腔内を陰圧にするために、口唇形成術を終えた口輪筋に強く張力がかかったためと考えられた。健常児群の舌骨上筋群の活動のピークは後半に位置するが、CLP児は舌運動が小さく、蠕動運動も顕著でなく、口蓋帆挙筋による鼻咽腔閉鎖ができないため、口輪筋から陰圧形成する力が加わることで舌骨上筋群の活動は小さく、ピークが中盤に位置することが考えられた。また筋電図積分値移動曲線を用いることで視覚的にも明瞭に筋活動のピーク位置が観察できるようになった。口唇口蓋裂児の出生は、我が国では500人に1人であり、臨床で口唇口蓋裂を有する患者と遭遇することは少なくない。この児たちは、新生児期に十分に吸啜が行えないために口腔機能の発達は遅れ、健常児にキャッチアップするには口唇から口蓋の閉鎖術が施行され、また歯列・咬合が改善された後々まで影響する。これまでの本教室での研究から、乳児期の吸啜運動は全身発達のみならず口腔機能の発達、とりわけ咀嚼行動の始まりとしての重要な意義があり、乳児期では十分に吸啜運動を行わせることが口腔機能の発達を促進する上でも重要であることが分かってきた。一方、口蓋裂の研究は、国外においては形態的研究や視診による評価が主であり、吸啜機能障害の臨床に即した筋電図や吸引圧の変化まで観察している研究は少ない。共同研究機関である藤田保健衛生大学病院においても口唇口蓋裂児の手術が多く行われているものの口腔周囲筋活動等の機能検査は行われていなかった。これまで口唇口蓋裂児の吸啜運動を観察し明らかな傾向がみられた点は、1)糖液哺乳時の1吸啜サイクル時間は,術前に比べ術後の方が有意に長くなり、陽圧相時間と陰圧相時間に分け検討すると陰圧相時間が有意に長くなっていたこと、2)筋活動は、健側と患側の側頭筋,患側の口輪筋において術後が有意に増大していたこと、3)吸引圧は口唇形成術後3か月が術前に比べ大きくなっていたこと、などが挙げられていた。しかし、口唇口蓋裂乳児の被検者数は十分ではなく、口唇形成術前後における吸啜機能改善の効果についてさらに検討すること、また育児支援の観点から口唇口蓋裂児の保護者にも筋活動や筋協調パターンの変化についても視覚的で判りやすい、新たな分析法積分値移動曲線法を用いて口唇口蓋裂児の吸啜機能改善の客観的評価法を確立することを、新たな目的とするに至った。今年度は被験者の確保を主に行い術前、術後の機能検査を行った。共同研究機関である藤田保健衛生大学病院において片側性唇顎口蓋裂児を対象に計測を行っている。藤田保健衛生大学病院口唇口蓋裂センターでは多くの口唇口蓋裂児が来院するが、全口蓋裂患者のうち、片側性唇顎口蓋裂児の割合が最も多いため検査対象とした。現在、三名の新規の初診患者の口唇形成術前の機能検査(筋電図検査、吸引圧検査)を行った。また初診時および機能検査実施時には出生時の体重や分娩状況、全身疾患の有無などの問診と哺乳状況などについてのアンケートを行った。初回の検査は口唇形成術前に行うが、生後1か月と出生直後であり保護者が口唇口蓋裂という先天異常に対して様々な感情が入り混じっている時期であるため、検査について承諾していただくまでに時間がかかった方も多く見られた。また口唇口蓋裂だけでなく様々な合併症を有していたり、手術前に体調を崩してしまう患児もおり、スムーズに被験者が集まらないのが現状である。また対象となる患児がいつ来院するかわからないため研究以外の職務で患児と入れ違いになるケースも多く今後は被験者の確保が大きな課題となる。

本研究では口唇口蓋裂児における吸啜運動の特徴と、口唇形成術前後、術後3ヶ月における口腔周囲筋活動の筋協調パターンの変化について検討することを目的に、筋電図積分値移動曲線を用いて解析を行ったので報告する。被検児は口唇形成術を施した片側性完全唇顎口蓋裂児(CLP群)とした。機能検査は哺乳床を装着した状態で、口唇形成術前後、3ヶ月後の計3回実施した。また同様の乳首を使用し全身、口腔内に異常を認めない健常乳児と比較検討した。口腔周囲筋活動は、左右側頭筋、咬筋、唇裂とは反対側の口輪筋、健側と同側の舌骨上筋群の計6筋に電極を貼付し、波形を分析した。計測項目は1吸啜サイクル時間、ピーク時筋活動量、ピーク時間と割合、積分値移動曲線による筋協調パターンおよび経日的変化とした。結果から得られた考察について記す。健常児群では、舌骨上筋群を大きく活動させて口腔内陰圧を形成するのに対し、CLP群は口唇形成術後も口腔と鼻腔が交通しているという形態的特徴から、舌の動きが異なることが推察された。本研究では1吸啜サイクル時間が健常児群より短かったのは、哺乳床を装着することで口腔内容積が小さくなり、人工乳の1回の取り込み量が少なくなったためと考えられた。またCLP群口輪筋が最も大きく活動しており、特に術後で顕著であった。これは口腔内を陰圧にするために、口唇形成術を終えた口輪筋に強く張力がかかったためと考えられた。健常児群の舌骨上筋群の活動のピークは後半に位置するが、CLP児は舌運動が小さく、蠕動運動も顕著でなく、口蓋帆挙筋による鼻咽腔閉鎖ができないため、口輪筋から陰圧形成する力が加わることで舌骨上筋群の活動は小さく、ピークが中盤に位置することが考えられた。また筋電図積分値移動曲線を用いることで視覚的にも明瞭に筋活動のピーク位置が観察できるようになった。今後の研究の推進方策としては、被験者の確保のために共同研究機関である藤田保健衛生大学病院に出向する日にちを多くすることが必要と思われる。また患児の保護者に研究内容を理解していただく必要もあるため、書面だけでなく今まで行ってきた検査時の写真などを使用し、より分かりやすい説明媒体を作成する必要がある。検査の体制としては、機器などで省略できるものがないため現行体制で行う予定である。また検査を行う人員については朝日大学、共同研究機関である藤田保健衛生大学ともに余力がないため現行体制で行う。当初想定していた被験者数を確保することができなかったため、共同研究機関先である藤田保健衛生大学への出張回数が減ったことにより、残額が生じた。次年度は、共同研究機関先との連携を密にし、昨年度引き続き被験者数を確保し、本研究に協力いただけるよう遂行する計画である。
先進材料の強度評価における線形切欠力学の応用に関する総合的研究

研究目的を遂行するために,以下の4つの分野について研究を行い,以下の結果を得た。(I)線形切欠力学の適用限界の明確化と概念の拡張線形切欠力学の適用限界が定式化され,さらに大規模降伏以後の使用が可能なようにその概念が拡張された。(II)新金属材料への線形切欠力学の適用従来の旧素材に加えて,チタンやチタン合金,HIP焼結材料,セラミックスコーティングなどの表面改質材の切欠き材の疲労強度評価に対して線形切欠力学が適用され,その妥当性が確認されたとともに,それらの結果はエクスパートシステムに用いるデータベースのデータとした。(III)先進材料への線形切欠力学の適用繊維強化プラスチックスやファインセラミックスなどの先進材料切欠き材の疲労強度,高温強度および脆性・延性破壊に対して線形切欠力学が適用され,その妥当性が確認されたとともに,それらの結果はエクスパートシステムに用いるデータベースのデータとした。(IV)残留応力と線形切欠力学の関連残留応力を定量的に計測する方法を開発・確立することにより,残留応力と線形切欠力学を関連づけた。本総合研究グループは、平成4年度はグループごとに以下の重要な結果を得た。I)線形の切欠力学は新たにプラスチックス基及び金属基複合材料の切欠材のクライテリオンとして採用され、その有効性が示された。II)セラミックスなどのぜい性材料についても、その試験片作製方法を工夫することにより理想的切欠試験片が作製可能であり、その強度評価法として線形切欠力学が有効であることが示されつつある。III)線形切欠力学の適用限界について、理論的及び実験的研究がなされそれが明確にされつつある。IV)高マンガン鋼やチタン合金などの先進金属材料についても、線形切欠力学の適用について研究中である。全体的に各グループとも当初の計画通りに順調に研究が進行中である。上記の結果を基に、平成5年2月に会議を開き、研究分担者相互で活発な討論を行った。それによると、各グループともさらに研究を進めるとともに、全体を有機的につなげ、主要な実用先進工業材料についての切欠敏感性をデータベースとしてまとめ、エキスパートシステムを構築することにした。研究目的を遂行するために,以下の4つの分野について研究を行い,結果を得た。(IV)残留応力と線形切欠力学との関連残留応力を定量的に計測する方法を開発・確立することにより,残留応力と線形切欠力学を関連づけた。
日本のイネ品種の地域適応性に関わる出穂期QTLの単離

イネの開花時期(出穂期)は品種の地域適応性を決定する重要な農業形質である。本研究では、日本晴とコシヒカリから見出された新規の出穂期QTL(Hd16およびHd17)の遺伝子単離を進め、形質転換体を用いた相補性試験により見出した候補遺伝子がHd16であると証明し、Hd17については候補遺伝子を推定した。また、出穂期遺伝子を異なる組み合わせで持つ系統群を用いて遺伝子間相互作用の存在を明らかにした。イネの開花時期(出穂期)は品種の地域適応性を決定する重要な農業形質であり、出穂期遺伝子の組み合わせが育成品種の地域ごとの出穂特性を決めていると考えられる。日本晴とコシヒカリから見出された新規の出穂期QTL(Hd16およびHd17)の遺伝子単離を進めるために、戻し交雑後代の約3,000個体について、Hd16候補領域内で組換えが生じている65個体を選抜し出穂期の後代検定を行った。さらにコシヒカリBACライブラリーからこの領域をカバーする5つのBACクローンを選抜して塩基配列を解読し、日本晴とコシヒカリ間で42個の挿入欠失変異(Inde1)や一塩基置換(SNP)を検出した。これらの多型をDNAマーカー化し組み換え個体を解析するとともに後代検定の結果と合わせることによって、Hd16の候補領域を321kbに絞り込んだ。Hd16の候補領域内で日本晴とコシヒカリ間で非同義置換を起こす変異は1ヶ所だけであり、この変異を含む遺伝子がHd16の候補と考えられた。また、Hd17の候補ゲノム領域をカバーするコシヒカリBACクローンを選抜し、塩基配列を解読した。塩基配列情報を利用し新たなDNAマーカーを作成して、さらに候補ゲノム領域を限定した。その結果、Hd17の候補ゲノム領域は76.7kbに絞り込まれた。この候補領域内には18ヵ所のSNPまたはIndelが存在し、RAP2で予測された9個のORFsのうち3個のORFs内に多型が生じていた。Hd16およびHd17について、農業生物資源研究所が所有する約5万系統のTos17変異体パネルをスクリーニングしたが、候補遺伝子の変異体は検出できなかった。Hd16についてはさらに農業生物資源研究所が所有する炭素イオンビーム照射変異体パネル(約1万4千個体)からスクリーニングしたが、候補遺伝子の変異体は検出できなかった。日本晴とコシヒカリから見出された新規の出穂期QTL(Hd16およびHd17)の遺伝子単離を進あるために、Hd16の候補遺伝子を含む約10.7kbpの日本晴ゲノム断片を導入したコシヒカリの形質転換体を作出した。T_0世代の形質転換体は短日条件下で出穂が促進し、長日条件下で出穂が遅延した。日本晴のT_0世代のRNAi形質転換体は短日条件下で出穂期が遅延し、長日条件下で出穂期が促進した。これらの結果から、候補遺伝子がHd16であると証明できた。現在作出した形質転換体についてT_1世代における後代検定を進めている。Hd16と他の出穂期遺伝子を異なるアリル組み合わせで持つ置換系統群について出穂調査を行い、Hd16とHd1およびHd6の組み合わせでは出穂期が相加的に変化し、Hd16とHd2の組み合わせではHd2が機能欠損型になるとHd16の効果の差が見えなくなった。従って、Hd16とHd2の間には遺伝的な相互作用が存在すると考えられた。また、Hd17に関しては、連鎖解析によって候補ゲノム領域をさらに隈定できた。候補ゲノム領域中の2つの予測遺伝子についてRNAi形質転換体を作出して機能証明に取り組んだが、候補遺伝子特異的な発現抑制個体を作出できなかった。
流体－構造連成解析を用いた小児睡眠時無呼吸症候群の通気障害評価システムの構築

小児閉塞型睡眠時無呼吸症候群(OSAS)は閉塞部位がかなり異なるので、手術の成功率は必ずしも高くない。コンピューター断層撮影(CT)からの形態学的な所見は、上気道で正確に機能的な閉塞部位と必ずしも一致しない。従って、全部の上気道の特定の閉塞部位の検出方法を確立することが必要になる。我々は、流体構造相互作用分析によって、OSAS小児の上気道モデルで、閉塞部位を調べた。我々は、気道モデルをFSI分析と結合している新しい方法を確立した。この方法は閉塞部位を位置づけることができて、空気圧力と速度の大きさをシミュレーションすることができる。そして、単独で、形態学的な評価でより正確に換気状態を評価する。今年度は小児の閉塞性睡眠時無呼吸症候群の新しい気道通気状態の評価システムとして流体ー構造連成解析を用いた解析システムの確立を行った。その結果、咽頭気道部での流体ー構造連成解析を用いた解析プロトタイプモデルを作成できた。また、上顎側方拡大を用いた研究も行い、鼻腔通気障害の改善、舌位の改善、咽頭気道拡大効果があることを示すことができ、小児閉塞性睡眠時無呼吸症候群の改善メカニズムを明らかにすることができた。閉塞性睡眠時無呼吸症候群の治療には、小児の場合、アデノイド口蓋扁桃除去が第一選択とされるが、その治療結果は必ずしも良好なものでない。一方、上顎骨側方急速拡大の有効性を示唆する報告があるものの、十分なエビデンスが得られているとは言えない。これらの理由として、気道の閉塞部位にはばらつきがあり、その閉塞の原因が、必ずしもアデノイドや口蓋扁桃肥大だけではないことが考えられる。そこで、小児OSASについて、未だ確立されていない気道の通気障害部位の特定方法、ならびに歯科的対応による通気障害の治療予測モデルの作製方法の確立を目的に研究を行った。その結果、1流体シミュレーションは上気道通気障害の有無と障害部位の特定に有効であることが示された。2上顎急速拡大がこれまで考えられてきた以上に、鼻腔通気状態の改善に有効であることが示唆された。3鼻閉により、咽頭部の吸気時の陰圧が強くなり、気道収縮を起こしやすくなること、RMEにより鼻腔通気状態を改善することで吸気時の咽頭部の陰圧は軽減し、気道収縮が起きにくくなる可能性が示された。これら結果はRMEの小児OSASに対する作用機序の一要因として考えられるだけでなく、咽頭部に通気障害を認めても、原因は鼻腔にある可能性を示し、上気道全体の通気状態評価の有用性を示す結果と考えた。(第37回日本睡眠学会(ベストプレゼンテーション賞受賞), 2012年6月,横浜市)これらの結果は小児OSASについて、未だ確立されていない気道の通気障害部位の特定方法、ならびに歯科的対応による通気障害の治療予測モデルの作製方法の確立に有用なものと考える。24年度は歯科的治療である上顎骨急速拡大により、鼻腔抵抗値が下がり、その結果、咽頭部の吸気時陰圧が軽減され、無呼吸症状に有効であることを示すことができた。このことは当初の計画である、通気障害評価システムの構築に役立つものとなった。また、上記研究は医科系の全国規模の大きな学会(第37回日本睡眠学会、パシフィコ横浜、大会参加者2000人以上、演題数300演題)で表彰を受け(表彰演題10題、医科以外での表彰は本研究のみ)、客観的にも評価を受けたため。1.上顎側方急速拡大と下顎前方誘導による上気道形態および通気状態の変化の解析上顎側方拡大量や下顎前方誘導量と上気道形態の計測データ、ならびに流体ー構造連成解析による通気状態のデータとの関連を調べ、各治療による気道形態と通気状態の変化の予測値を得る。2.治療後の予測モデルと実際の治療後との通気状態の比較検討治療前の3次元気道データから、各治療による形態変化の予測値を参考に、FEMメッシュモーフィングソフトウェアMeshWorks/ Morpher®(CDAJ社製:既存物品)を用いてメッシュモーフィングを行い、上気道の治療後の予測モデルを作製する(図9)。その後、実際の治療後のモデルを使用した形態との流体ー構造連成解析の結果を比較検討し、治療後の予測モデルの有効性を向上させる。次年度使用額が204,640円となった。その理由はデータ収集とその解析に時間がかかり、該当年度での学会発表予定を次年度に変更したため、次年度使用額が0以上になった。次年度はこれら得られたデータの解析結果を積極的に学会発表等で発信していきたい。
転写因子AP-1を分子標的とした敗血症治療とその作用機序の解明

8-12週齢の雄性BALB-Cマウスに盲腸結紮穿孔(cecum ligation and puncture:CLP)を行い,敗血症を生じさせた.EMSAゲルシフトアッセイにより,AP-1活性はCLP後時間とともに肺組織において顕著に上昇することが認められ,AP-1デコイ核酸をCLPマウスに投与しておくと,敗血症誘発性の肺AP-1活性刺激は大きく低下した.CLP後24時間の肺組織および大動脈において,デス受容体であるTNF-R1,Fas,DR4,DR5の膜表面への発現は増加し,デス受容体経路のアダプター蛋白であるFADDの発現も増加した.肺組織におけるこれらの変化は,AP-1デコイ核酸導入により著名に抑制された.TUNELおよびDNA ladderアッセイにより,CLP誘発性敗血症により肺組織のみならず大動脈,脾臓においてアポトーシスが有意に増加しており,肺でのアポトーシス増加はAP-1デコイ核酸投与により阻止された。アポトーシスのみならず,炎症反応もAP-1デコイ核酸導入により抑えられた.すなわち,炎症性受容体や炎症物質であるIL-1R,IL-6R,HMGB-1,gp130の発現は,LPS刺激をしたマウスの肺組織において著名に増加したが,AP-1デコイにより減弱した.LPS 10mg/kgを投与したマウスの生存率は,無処置だと48時間以内にすべて死亡したが,AP-1デコイ核酸により著名に改善した。以上の結果から,AP-1活性をブロックしてデス受容体ならびにアポトーシス関連蛋白ならびに炎症性関連物質の発現を抑える転写因子デコイを用いた戦略は敗血症にとって新しい治療方法であることが示唆される.さらに,AP-1により転写されることが見出されたデスシグナルで重要な役割を担っているFADD遺伝子をノックダウンしたところ,CLPマウスにみられる急性肺傷害や血管内皮障害所見は有意に治療効果が認められ,結果的に生存率も著明に改善した.このことは,FADD siRNAは敗血症治療の効果的な治療戦略として有用であるかもしれない.8-12週齢の雄性BALB-Cマウスに盲腸結紮穿孔(cecum ligation and puncture:CLP)を行い,敗血症を生じさせた.EMSAゲルシフトアッセイにより,AP-1活性はCLP後時間とともに肺組織において顕著に上昇することが認められ,AP-1デコイ核酸をCLPマウスに投与しておくと,敗血症誘発性の肺AP-1活性刺激は大きく低下した.CLP後24時間の肺組織および大動脈において,デス受容体であるTNF-R1,Fas,DR4,DR5の膜表面への発現は増加し,デス受容体経路のアダプター蛋白であるFADDの発現も増加した.肺組織におけるこれらの変化は,AP-1デコイ核酸導入により著名に抑制された.TUNELおよびDNA ladderアッセイにより,CLP誘発性敗血症により肺組織のみならず大動脈,脾臓においてアポトーシスが有意に増加しており,肺でのアポトーシス増加はAP-1デコイ核酸投与により阻止された。以上の結果から,AP-1活性をブロックしてデス受容体ならびにアポトーシス関連蛋白ならびに炎症性関連物質の発現を抑える転写因子デコイを用いた戦略は敗血症にとって新しい治療方法であることが示唆される.さらに,AP-1により転写されることが見出されたデスシグナルで重要な役割を担っているFADD遺伝子をノックダウンしたところ,CLPマウスにみられる急性肺傷害や血管内皮障害所見は有意に治療効果が認められ,結果的に生存率も著明に改善した.このことは,FADD siRNAは敗血症治療の効果的な治療戦略として有用であるかもしれない.8-12週齢の雄性BALB-Cマウスに盲腸結紮穿孔(cecum ligation and puncture: CLP)を行い,敗血症を生じさせた。EMSAゲルシフトアッセイにより,AP-1活性はCLP後24時間での肺組織において顕著に上昇することが認められ,AP-1デコイ核酸をCLPマウスに投与しておくと,敗血症誘発性の肺AP-1活性刺激は大きく低下した。CLP後24時間の肺において,デス受容体であるTNF-R1, Fas, DR4, DR5の膜表面への発現は増加し,デス受容体経路のアダプター蛋白であるFADDの発現も増加し,caspase-8とcaspase-3が活性化していることをWestern blot解析により観察したが,AP-1デコイ核酸導入により著名に抑制された。TUNELおよびDNA ladderアッセイにより,CLP誘発性敗血症により肺組織においてアポトーシスが有意に増加しており,それはAP-1デコイ核酸投与により阻止された。さらに,CLPマウスにみられる肺血管透過性の亢進,低酸素血症,組織学的な肺の損傷もすべてAP-1デコイ核酸導入により抑えられた。

最終的に,CLPマウスの生存率は,AP-1デコイ核酸により有意に改善した。以上の結果から,AP-1活性をブロックしてデス受容体ならびに関連蛋白の発現を抑える転写因子デコイを用いた戦略は敗血症に有用な新しい治療方法であることが示唆される。8-12週齢の雄性BALB-Cマウスに盲腸結紮穿孔(cecum ligation and puncture:CLP)を行い,敗血症を生じさせた。EMSAゲルシフトアッセイにより,AP-1活性はCLP後24時間での肺組織において顕著に上昇することが認められ,AP-1デコイ核酸をCLPマウスに投与しておくと,敗血症誘発性の肺AP-1活性刺激は大きく低下した。GLP後24時間の肺組織および大動脈において,デス受容体であるTNF-R1,Fas,DR4,DR5の膜表面への発現は増加し,デス受容体経路のアダプター蛋白であるFADDの発現も増加し,caspase-8とcaspase-3が活性化していることをWestern blot解析により観察した。肺組織におけるこれらの変化は,AP-1デコイ核酸導入により著名に抑制された。TUNELおよびDNA ladderアッセイにより,CLP誘発性敗血症により肺組織のみならず大動脈,牌臓においてアポトーシスが有意に増加しており,肺でのアポトーシス増加はAP-1デコイ核酸投与により阻止された。さらに.CLPマウスにみられる肺血管透過性の亢進,低酸素血症,組織学的な肺の損傷もすべてAP-1デコイ核酸導入により抑えられた。CLP後24時間の肺組織および大動脈において,デス受容体であるTNF-R1,Fas,DR4,DR5の膜表面への発現は増加し,デス受容体経路のアダプター蛋白であるFADDの発現も増加した。TUNELおよびDNA ladderアッセイにより,CLP誘発性敗血症により肺組織のみならず大動脈,脾臓においてアポトーシスが有意に増加しており,肺でのアポトーシス増加はAP-1デコイ核酸投与により阻止された。アポトーシスのみならず,炎症反応もAP-1デコイ核酸導入により抑えられた。すなわち,炎症性受容体や炎症物質であるIL-1R,IL-6R,HMGB-1,gp130の発現は,LPS刺激をしたマウスの肺組織において著名に増加したが,AP-1デコイにより減弱した.
高度好熱菌におけるタンパク質アシル化修飾による代謝調節に関する研究

ロイシン生合成初発酵素の2-isopropylmalate synthase (IPMS)について、これまでに明らかにしてきた、可逆的なアセチル化による活性調節機構に関しての投稿論文が受理された。またスクシニル化修飾を受ける3-isopropylmalate dehydrogenase (IPMDH)の(脱)スクシニル化機構の解析を行い、少なくとも非酵素的にスクシニルCoAを基質としてスクシニル化が進行することが分かった。さらに、T. thermophilusのリジン脱アシル化酵素(KDAC)破壊株の解析から、in vivoでIPMDHの脱スクシニル化を担うKDACを同定した。T. thermophilus内で高度にアセチル化されているCoA transferase (CoAT)はNAD+結合タンパク質との相互作用によってNAD+依存的に活性が調節される。この相互作用様式や活性調節機構の解明のためX線結晶構造解析を行っているが、結晶は得られるものの構造決定には至っていない。この制御機構の生理的役割を明らかにするため、CoATの基質となる短鎖脂肪酸の定量系を確立した。また同じくCoA体代謝に関連し、アセチル化による制御が広く知られているアセチルCoA合成酵素(ACS)についても、T. thermophilusの持つ4つのホモログに関して機能解析を行い、うち1つのホモログがACS活性を持たないことが分かった。また、各遺伝子破壊株の解析から、アセチル化以外の活性制御機構の存在を示唆するデータも得ている。ロイシン生合成酵素のタンパク質アシル化修飾による活性調節機構において、初発酵素2-isopropylmalate synthase (IPMS)のアセチル化による活性調節機構に関して論文を発表した。活性中心のリジン残基がスクシニル化修飾されることが見いだされている3-isopropylmalate dehydrogenase (IPMDH)に関して、細胞内で脱スクシニル化を担う酵素を同定できた。しかしながら、スクシニル化レベルに差のあるIPMDH間で活性の違いは見られておらず、スクシニル化と活性調節の関係は見いだせていない。CoA体代謝酵素の調節機構に関しては、CoA transferase (CoAT)と相互作用するNAD+結合タンパク質との複合体の結晶構造解析を進めているが、構造決定には至っていない。また、CoATの生理機能の解明のため、菌体内の短鎖脂肪酸やNAD+/NADH比の定量法の確立を進めている。アセチルCoA合成酵素(ACS)に関しては、T. thermophilusが持つ4つのACSホモログのin vitroでの機能解析から、4つのうち1つのACSホモログを除いて、ACS活性を持つことが分かった。さらに、それぞれの遺伝子破壊株を作製し、その生育実験から、アセチル化とは別の活性制御機構が存在することを示唆するデータを得ている。ロイシン生合成酵素IPMDHのスクシニル化による活性調節に関しては、これまでスクシニル化による活性への影響は見られていない。これまでin vitroでの非酵素的なスクシニル化反応によってIPMDHをスクシニル化し機能解析を行ってきたが、T. thermophilus内ではタンパク質リジンアシル化酵素(KAT)によってスクシニル化修飾されている可能性もあるため、IPMDHをスクシニル化するKATの探索を行い、スクシニル化による活性への影響を調べていく。また、プロテオーム解析により同定されているその他のスクシニル化される代謝酵素に関しても、スクシニル化による活性調節の有無について検討する。CoATと相互作用タンパク質との複合体の結晶構造解析については、これまで結晶は得られているが、構造解析には至っていないため、発現・精製方法の刷新やホモログタンパク質を用いた結晶化などを検討していく。また、CoATやその制御の生理的意義を明らかにするため、培養時期や培地条件などによる短鎖脂肪酸、アセチルCoA、NAD+/NADH比などの代謝産物の分析を行う。それと共に、CoATが触媒する可逆的な反応の方向性について詳細に解析することでCoATの生体内での役割に関する知見を得る予定である。また、T. thermophilus内に4つホモログが存在するアセチルCoA合成酵素(ACS)について、これまでの機能解析から1つのホモログが別のホモログの活性発現を制御している可能性が示唆されている。このため、酵素レベルでの制御にとらわれず、遺伝子発現解析なども行い、これまでに知られているアセチル化による制御とは異なるACSの制御機構を明らかにしていきたい。・アセチル化を受けるロイシン生合成の初発酵素である2-isopropylmalate synthase (IPMS)について、そのアセチル化および脱アセチル化機構を解析した。アセチル化はacetyl-CoAを基質として少なくとも非酵素的に進行し、脱アセチル化はT. thermophilusの持つリジン脱アセチル化酵素(KDAC)ホモログのうち一つが担うことがわかった。非酵素的なアセチル化によりIPMS活性は低下し、アセチル化IPMSをKDACにより脱アセチル化すると、活性が回復することが示された。変異体解析により、この可逆的なアセチル化による活性調節には、IPMSの触媒やロイシンによるフィードバック阻害に重要であるリンカードメイン中のリジン残基が重要であることが示唆された。・スクシニル化を受けるロイシン生合成酵素の3-isopropylmalate dehydrogenase(IPMDH)についてもスクシニル化修飾を受けるリジン残基について修飾模倣変異を用いた活性測定を行い、IPMDH活性のスクシニル化による調節に重要であると考えられるリジン残基を特定した。CoAtransferase (CoAT)はアセチル化を受けるとともに、alanine dehydrogenaseホモログ(ADLP)と相互作用し、ADLPとNAD+共存下で活性阻害を受ける。