hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
潜在記憶・無意識の観点から見た生活景の認知特性

本研究は,認知科学的な基盤と、認知科学ではほとんど取り扱わない複雑な現象である景観現象とを、より良いまちづくりのために融合させ工学的な成果を得ようとするいわば学際研究である。そのため、実践的な景観まちづくりを展開しつつ、街並み景観認識研究の蓄積が豊富な研究代表者(平野)が全体を統括し,その一方で、認知科学分野の中でも、応用的な研究実績を積み上げて来ている気鋭の研究分担者(和田)が認知科学研究の蓄積に基づき、無意識的な景観認知特性を解明するための検証方法、実験計画、解析方法などを分担する形で研究を開始した.まず,初年度は慣れ親しんだ景観の記憶特性について取り組んだ.具体的には,Nickersonらの成果(Raymond Nickersonら、"Long-term memory fora common object"Cognitive Psychology July 1979)を参照しつつ、慣れ親しんだ街並み(具体的には被験者の自宅とその周辺)について、描画に基づく再生試験を行い、どのようなものなら再生可能であるのかについて解明を進めた.描画による再生試験は様々なバイアスが想定される扱いにくい実験である。まず、描画能力の個人差が大きなバイアスを産むことが想定されるので、被験者には「自宅」という特別なものと想定される対象も再生してもらい、それとの比較も行った.その結果,自宅とその周辺の記憶の再生には大きな差があり,見ているだけの「周辺」と,実際に使っている「自宅」との差が示唆された.さらに「干渉」現象から生活景を見るべく試論的な展開を図った.人間の記憶の複雑さや,被験者個人の個別事情(今回は「自宅」と言う被験者ごとに異なる刺激を用いている)のために.結果は,総論的な結論に留まり,仔細な認知の癖に踏む込むことができなかった.普遍的な観点による「慣れ親しんだ景観への反応」を解明する方法論を探っていく必要があり,H30は試験的に「干渉」について展開を図った.しかしながら,そもそもあまり強い干渉が観察されず,総論的な成果に留まっている.見慣れた風景の場合「干渉」が小さいのではないかと言う仮説に基づき,研究を展開したが,それを一層深めていく.本研究は,認知科学的な基盤と、認知科学ではほとんど取り扱わない複雑な現象である景観現象とを、より良いまちづくりのために融合させ工学的な成果を得ようとするいわば学際研究である。まず、描画能力の個人差が大きなバイアスを産むことが想定されるので、被験者には「自宅」という特別なものと想定される対象も再生してもらい、それとの比較も行った.その結果,自宅とその周辺の記憶の再生には大きな差があり,見ているだけの「周辺」と,実際に使っている「自宅」との差が示唆された.さらに「干渉」現象から生活景を見るべく試論的な展開を図った.人間の記憶の複雑さや,被験者個人の個別事情(今回は「自宅」と言う被験者ごとに異なる刺激を用いている)のために.結果は,総論的な結論に留まり,仔細な認知の癖に踏む込むことができなかった.普遍的な観点による「慣れ親しんだ景観への反応」を解明する方法論を探っていく必要があり,H30は試験的に「干渉」について展開を図った.しかしながら,そもそもあまり強い干渉が観察されず,総論的な成果に留まっている.見慣れた風景の場合「干渉」が小さいのではないかと言う仮説に基づき,研究を展開したが,それを一層深めていく.
Entamoeba dispar感染に関する細胞生物学的、疫学的、臨床的研究

従来単一種とされていた赤痢アメーバが病原性のEntamoeba histolyticaと非病原性のEntamoeba disparと異なった二種に分けられてより、E. disarのもつ生物学的、臨床的な意義、疫学的な分布は早急に解決すべき問題として挙げられた。本研究はこの点を主題としている。研究の結果、以下に述べる成果を得た。(1)それまで極めて困難であったE. disparの無菌培養系の作成に高温、及び過酸化水素で処理され、生物活性を全く失ったCrithidia fasciculataを使用する事で成功した。(2)E. histolytica、E. disparの鑑別に有用なモノクロナル抗体を開発し、そのFab断片をも組み替え蛋白として作成できた。(3)両種のアメーバの生物学的な性状を明らかにするため、主に含硫アミノ酸代謝の生化学的、分子生物学的検討を行なった。まずATP sulfurylaseの遺伝子をE. histolyticaからクローニングし、組み替え蛋白を作成して性状を調べた。その結果この酵素はSynechocystis sp.の酵素などと相同性が高く、またE. disparからcysteinesyntnaseの遺伝子のクローニングを行い、二種のisoformが存在し、何れも植物の酵素に類似していることを見いだした。更に両種アメーバよりcysteine合成系の調節酵素であるserine acetyltransferaseの遺伝子をクローニングして性状を比較検討した。これらの一連の研究によりアメーバには真核細胞として初めてcyteineの合成経路が存在しており、アメーバの酵素は種々の細菌や植物の酵素と類似していることが判明した。また両種アメーバの間にも塩基組成の差が見られた。(4)E. histolytica、E. invadensをモデルとして種々の阻害剤が増殖その他に影響を及ぼすかどうか検討し、dinitroaniline系化合物やcytochalasin Dが発育阻害や嚢子形成阻害を起こすことを見いだした。(5)各種施設の感染者から分離したアメーバの同定を行ない、無症状であるにもかかわらず、E. histolytica感染が多い事を見いだした。本年度はEntamoeba dispar感染に関して研究を行い、以下のような成果を得た。(1)E.disparの無菌培養系の改良については6-phosphogluconate(6-PG)がYI-S medium中での増殖に必須である事がわかり、完全な無菌化に成功した。また6-PGおよびグルコース-6ーリン酸の代謝に関する酵素系に予備的な検討を加えた。(2)電顕的に検討し、E.disparとE.histolyticaとの間にはglycogen particleの分布に大きな差異がある事が明らかになった。前者では細胞内小器官が中心に位置し、周辺をglycogen particleが取り囲んでいる像が得られた。後者ではglycogen particleは細胞質内に一様に分布していた。またグリコーゲンの含有量に関しても両者の間には大きな差異があり、前者の方が蛋白質の単位濃度あたり数倍高い含有量を示した。(3)E.disparに特異的なモノクローナル抗体(ED-17)はE.disparとCrithidia fasciculataとのmonoxenic cultureで評価したが、食胞内で処理されつつあるCrithidiaの周辺に免疫電顕によって抗原が見いだされた。またこのモノクローナル抗体はE.histolytica特異的なモノクローナル抗体と併用することによって、両者の混合感染をも的確に評価できる事が明らかになった。

(5)両種のアメーバのDNA polymeraseに関して比較検討したが、酵素学的な性質に大きな差異は見いだせず、似通った性質を持つことが明らかになった。(6)E.histolyticaとE.disparのcodon usageをE.invadensと比較検討した結果、前2者は類似していたが、E.invadensとは有意な差異がある事が判明した。(1) Entamoeba disparの培養システムの改良:従来のYI-S mediumを基礎として、これにso-dium gluconate、dihydroxyacetoneをそれぞれ0.5%、0.1%の最終濃度で加えたYIGADHA-Smediumを開発した。この培地によって4株のE.disparの完全な無菌培養が可能となった。更に予備的な段階であるが、YIGADHA-S mediumにコンドロイチン硫酸を0.1%の濃度で添加することによって、E.disparの増殖をCrithidia fasciculataが共存するmonoxenic cul-tureにおけるのと同様なレベルにまで引き上げることができた。(2) E.disparの性状に関する分子レベルでの検討:従来の研究によってシステイン合成酵素遺伝子の塩基配列を明らかにし、E.histolticaとE.disparの間には数%の差異が存在することを明らかにした。今年度はやはりシステイン合成系の酵素であるATP sulfrylaseとSerine-acetyl transferaseの遺伝子をクローニングし塩基配列を明らかにした。その結果やはり塩基配列に差異が見られ、最も変異の激しい部分を利用してPCRによるサブポピュレーションの同定方法の開発も行なった。またDNA polymeraseの性状などに関しても検討を加えた。(3) E.disparのvirulenceに関する検討:上記の培地で完全に無菌条件下で培養した栄養型虫体を用いてハムスター肝に直接注射して肝膿瘍形成を見た。その結果免疫機能が正常な場合は何ら病変が形成されなかった。現在、種々の免疫不全を有するtransgenic mouseやknock out mouseに対して感染実験を試みている。(4) E.disparの分布に関する疫学的検討:わが国のハイリスク集団におけるE.dispar感染の実態を明らかにするために、男性同性愛者と各種収容施設の入居者に対して血清反応および糞便内のアメーバを標的にしたPCRとモノクローナル抗体によるサンドイッチELISAを併用して調査を始めている。
メンタルヘルスと就業状態に関する職域コホート研究

研究の目的職場における精神疾患のもたらす社会的損失は主としてabsenteeism(病欠)ではなく,presenteeism(疾病就業)によるものである.本研究では企業従業員を対象にして,メンタルヘルスの不調に伴うabsenteeismとpresenteeismおよび,その発生に関与すると思われる要因を網羅的に調べることにより,absenteeismとpresenteeismの発生メカニズムの全体像を明らかにする.本研究では,大規模コホート研究(Genomic Cohort focused on Psychosocial factors, G-COP Study)の一部として調査を施行するが,一部のサンプルについては,ベースライン調査以外に,アウトカムであるabsenteeismとpresenteeismおよび,アウトカムに影響を与えうる曝露要因について,前向きに毎年測定を行うことで,各種要因の経時的な変動を考慮に入れた解析を可能とする.平成30年度と同じ事業所にて,第2回調査と同じ質問紙を用いて,第3回調査を行う.さらに,これまで得られた質問紙および健診データを用いて,absenteeismとpresenteeismの発生メカニズムを明らかにすべく予備的な解析を行う.absenteeismとpresenteeismの発生メカニズムを解明するために,会社従業員を対象としたコホート研究を立ち上げ,平成29年度は約2000人のベースライン調査を行った.ベースライン調査では,質問紙法によりabsenteeism/presenteeismおよび,性別・年齢・勤務時間・メンタルヘルス・パーソナリティなどの個人要因,雇用形態・職種・休業保証の種類・休んだ際の代替可能性・職場のサポート状況などの職場要因を測定した.岐阜健康管理センターを拠点とし,一般健診受診者を対象に本研究のベースライン調査を行った.ベースライン調査では,質問紙法により,absenteeism/presenteeismおよび,性別・年齢・勤務時間・メンタルヘルス・パーソナリティなどの個人要因,雇用形態・職種・休業保証の種類・休んだ際の代替可能性・職場のサポート状況などの職場要因を測定した.研究の目的職場における精神疾患のもたらす社会的損失は主としてabsenteeism(病欠)ではなく,presenteeism(疾病就業)によるものである.本研究では企業従業員を対象にして,メンタルヘルスの不調に伴うabsenteeismとpresenteeismおよび,その発生に関与すると思われる要因を網羅的に調べることにより,absenteeismとpresenteeismの発生メカニズムの全体像を明らかにする.本研究では,大規模コホート研究(Genomic Cohort focused on Psychosocial factors, G-COP Study)の一部として調査を施行するが,一部のサンプルについては,ベースライン調査以外に,アウトカムであるabsenteeismとpresenteeismおよび,アウトカムに影響を与えうる曝露要因について,前向きに毎年測定を行うことで,各種要因の経時的な変動を考慮に入れた解析を可能とする.目標人数の3000人に達するまで,ベースライン調査を継続し,平成30年度中にベースライン調査を完了する予定である.すでにベースライン調査を終えた被験者に対しては,2年目以降の追跡調査を始める.追跡調査では,ベースライン調査に用いた質問項目のうち,absenteeism/presenteeismの発生および,抑うつ・不安とアルコール依存性などについて調べる.平成30年度と同じ事業所にて,第2回調査と同じ質問紙を用いて,第3回調査を行う.さらに,これまで得られた質問紙および健診データを用いて,absenteeismとpresenteeismの発生メカニズムを明らかにすべく予備的な解析を行う.研究参加者募集を行っている健診センターにて、出張企業健診での参加者募集を体系的に行う準備が予定より遅れた。そのため使用経費が予定より減った。次年度より予定通り募集をするため、検体処理費、データ入力費が次年度(以降)かかる見込みである。ベースライン調査への参加者数が,予定数に満たなかったため.
都市・地域経済モデルのもとでの公的部門の行動様式と望ましい運営形態の分析

本研究は,民間の経済活動が,規模の経済性や外部効果等のために,特定の地域に集積していくような経済下における公的部門のあり方について,中央政府と地方政府の関係,地方政府間の関係,政府部門と企業部門の関係に留意しながら,解明していくことを目的としている。本年度は,地方政府間の競争によって,どのような結果がもたらされるかを考察し,中央,地方政府,企業部門の役割分担について考察した。具体的には,次のような分析を行った。(1)地方政府どうしが,規模の経済性をもつ産業の誘致をめぐって,課税や補助を用いて競争を行う結果,どのような事態がもたらされるかについて,理論およびシミュレーション的な分析を試みた。地域間で財や生産要素の往来がスムーズではない経済では,投資補助による産業誘致の競争は激しくなる。結果として,経済全体でみると,投資が促されて,経済成長率が高くなる。しかしながら,地域間の往来が自由になってくると,投資補助は低下し,十分な水準の投資が促されなくなっていく。(2)地方政府が,自らが提供する公共サービスを,一定の投資的活動によって改善させ,多くの企業や人口を呼び込むことができるとするなら,より良い公共サービスを提供しようとする地方政府の間に競争が起こり得るが,その結果,経済全体にどのような事態がもたらされるかを考察した。他地域がすでに公共サービスの改善を実現している場合,より小さな努力で,自らの地域も公共サービスを改善できるとするなら,地域間競争のもとで実現する公共サービス改善のための投資の水準は,適正な水準からはずれてくる。地方政府どうしを競争させるのがかならずしも望ましいとは限らず,中央政府による介入が期待されることとなる。本研究は,民間の経済活動が,規模の経済性や外部効果等のために,特定の地域に集積していくような状況下において,公共サービスの運営と供給,およびそれに必要な社会資本の整備に携わっている公営企業部門あり方について,中央や地方の政府部門との課税や補助,規制等を通じた関係に留意しながら,解明していくことを目的としている.平成17年度(研究計画1年目)は,民間経済主体が特定地域に集積していく可能性のある状況下においては,各地域の地方政府や公営企業などの公的部門の意思決定はどのようになるか,そして,それによって地域間分業がどのようになるか,実現される分業体制は規範的に見てどのように評価できるかについて,都市・地域経済モデルの枠組みを用いながら,理論的分析を試みた.都市部と地方部において供給される輸送インフラ・輸送サービスなどの社会資本・公共サービスの水準は,一意には定まらないこと,特に地方部においては過大な社会資本・公共サービスが供給され,それによって,希ではあるが,正の確率で,都市と地方の分業体制が逆転する可能性があることが明らかにされた.しかしながら,そうした逆転の可能性があるために,都市部において十分な社会資本・公共サービスの水準が確保され得ることが明らかにされた.地方部の社会資本・公共サービス供給をより望ましい水準に抑え込むなら,今度は都市部で十分な社会資本・公共サービスの供給が達成されなくなる.本研究は,民間の経済活動が,規模の経済性や外部効果等のために,特定の地域に集積していくような状況下において,公共サービスの運営と供給およびそれに必要な社会資本の整備に携わっている公的部門あり方について,中央政府と地方政府の関係,政府部門と公営企業との関係-課税や補助・規制等を通じた関係-に留意しながら,解明していくことを目的としている.地方政府が採用する公共政策の質が,その地域の企業や住民の質に依存して決まってくる時,採用される公共政策の地域間の差異,およびそこに立地する企業や住民の差異が,どのような動向を辿るのかについて検討した.ある条件下では,規模の経済性を前提としない場合でも,集積が発生すること-限定された地域だけが,質の高い民間経済主体を引き付け,質の高い公共政策を採用するようになる-ことを明らかにした.こうした理論的な分析の成果は,論文"Migration in search of good government"にまとめられている.その地域内における社会資本・公共サービスの供給が,地方政府に委ねられている場合,都市部においては多くの社会資本が供給される一方で,地方部においては少ない社会資本しか供給されず,都市と地方の産業構造や人口等は固定化されてしまう.しかしながら,これらの地域の結びつきが強まっていくにつれ,小さい確率ではあるが,地方が非常に大きな社会資本を供給し,産業構造や人口等が変動する可能性があることを明らかにした.こうした社会資本の供給量が,社会的に望ましい水準からどの方向に乖離するかを解析的に明らかにする一方で,都市・地域の逆転現象がどのくらいの確率で生じ得るのかを,シミュレーションを援用しながら考察した.こうした理論的な分析の成果は,論文"Providing publicinfrastructure competition and neweconomic geography"としてまとめ,現在投稿中である.本研究は,民間の経済活動が,規模の経済性や外部効果等のために,特定の地域に集積していくような経済下における公的部門のあり方について,中央政府と地方政府の関係,地方政府間の関係,政府部門と企業部門の関係に留意しながら,解明していくことを目的としている。

地域間で財や生産要素の往来がスムーズではない経済では,投資補助による産業誘致の競争は激しくなる。結果として,経済全体でみると,投資が促されて,経済成長率が高くなる。しかしながら,地域間の往来が自由になってくると,投資補助は低下し,十分な水準の投資が促されなくなっていく。(2)地方政府が,自らが提供する公共サービスを,一定の投資的活動によって改善させ,多くの企業や人口を呼び込むことができるとするなら,より良い公共サービスを提供しようとする地方政府の間に競争が起こり得るが,その結果,経済全体にどのような事態がもたらされるかを考察した。他地域がすでに公共サービスの改善を実現している場合,より小さな努力で,自らの地域も公共サービスを改善できるとするなら,地域間競争のもとで実現する公共サービス改善のための投資の水準は,適正な水準からはずれてくる。地方政府どうしを競争させるのがかならずしも望ましいとは限らず,中央政府による介入が期待されることとなる。
イオンビーム生物影響の原因となる二本鎖切断末端に関する研究

これまで放射線生物影響に関与する最も重要なDNA損傷として二本鎖切断(DSB)が研究されてきたが、放射線によって誘発される「生物影響に関与するDSB」の分子的実体は分かっていない。昨年度に引き続き、本年度はDSB生成機構及びDSB末端の化学構造を調べる研究を進めた。DSB生成機構における研究においては、本研究課題が目指す粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを利用した放射線DNA損傷評価のために、電子及びイオンの飛跡構造解析モードを開発している。本年度は、細胞への電子線照射実験により得られた様々な種類のDNA損傷収量を、PHITSの電子飛跡構造解析モードを利用して電離・励起の頻度から評価することに成功した。本研究成果は学術誌に投稿する準備段階にある。さらに、イオンの飛跡構造解析モードの開発にも成功した。また、様々なイオン種、エネルギーのイオン飛跡周辺の二次電子による動経方向線量を計算できる簡便式をPHITSに組み込んだ。これらの開発した計算コードを用い、イオンビーム照射後DNA損傷生成にかかわる現象のシミュレーションを進めている。DSB末端の化学構造を調べる研究では、放射線誘発DNA損傷収率を調べるため、Heイオンビーム、及び、対照となるガンマ線をプラスミドDNA水溶液に照射し、DSB、一本鎖切断(SSB)、塩基損傷(8-oxoG)、脱塩基部位の収率を調べた。現在までのところ各DNA損傷収率の線質依存性は得られていない。一方、本研究課題においては、放射線誘発DSB末端構造に関する情報を得るため、非相同末端結合に関与するKuタンパク質のDSB末端への結合の程度を調べる。本年度はプラスミドDNAに各種放射線を照射した後、電気泳動によってDSBによって線状化したプラスミドを分画し、Kuタンパク質結合実験に供するための放射線誘発DSB末端を大量精製した。電子線・イオンビーム照射後のエネルギー付与に関して、計算コードを高精度化・高度化することができている。また、線質の異なる放射線を用いてDNA損傷収率を測定する実験、及び、修復酵素によるDSB末端認識を調べる実験を進めている。研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後はDNA損傷生成機構の詳細に迫るため、イオン飛跡構造解析モードのエネルギー適用範囲を大幅に拡張する。また、拡張した飛跡構造解析モードを利用して、イオン照射実験により得られるDNA損傷の種類や収量を評価し、放射線生物影響を誘発すると考えられているDNAの二本鎖切断における末端構造のシミュレーション予測に着手する予定である。一方、DSB末端構造の解析においては、(1)電離・励起の空間分布が極めて密となる線質の放射線を用いたDNA損傷収率、及び、(2)これまで考慮してこなかった酸化型の脱塩基部位を含むDNA損傷収率、を測定しDSB末端の化学構造に関する知見を得る。また異なる線質の放射線誘発DSB末端に対するKuタンパク質の結合の程度を調べることにより、DSB末端構造の化学・修復特性に関する情報を得る予定である。放射線生物影響に関与する最も重要なDNA損傷として二本鎖切断(DSB)が精力的に研究されてきた。しかしながら、放射線による「生物影響に関与するDSB」の分子的実体は分かっておらず、放射線、特にイオンビーム生物影響メカニズムの詳細は不明な点が多い。本研究課題ではイオンビームによるDSB生成機構、DSB末端の化学構造、さらには化学構造に依存する生物作用を明らかにすることを目的に研究を進める。本年度は、DSB生成機構及びDSB末端の化学構造調べる研究を進めた。DSB生成機構における研究においては、イオンビーム照射後に分子の電離によって生じる分子イオンが作り出す電場が二次電子をどのように束縛するのかを計算し、またその時生じる電場を表す簡易式の導出を行った。また、本研究課題が目指す粒子・重イオン輸送計算コード(PHITS)を利用した放射線DNA損傷評価のために、電子飛跡構造コードを開発し、PHITSに実装した。これにより、これまで困難であった空間ナノスケールにおける低エネルギー電子の微視的挙動がPHITSでも計算可能になった。これらの結果により、イオンビーム照射直後のエネルギー付与の詳細(サブnmレベルでの高精度な線量分布)を明らかにする準備が整った。DSB末端の化学構造を調べる研究では、イオンビーム、及び、対照となるガンマ線を照射することを可能とする照射ホルダーを作成し、細胞内と同程度のラジカル捕捉能を持つ水溶液中におけるプラスミドDNAに生じるDSBの収率を調べる実験に着手した。一方、DSB末端構造を調べるため、非相同末端結合に関与するKuタンパク質がDSB末端を認識・結合する程度を調べる実験系を立ち上げた。今年度は、Ku-DNA結合実験における実験パラメーターを決定した。イオンビーム照射後のエネルギー付与に関して、シミュレーションを高精度化することができた。また、線質の異なる放射線を用いてDSB収率を測定する実験、及び、修復酵素によるDSB末端認識を調べる実験系をも確立することができた。これまで放射線生物影響に関与する最も重要なDNA損傷として二本鎖切断(DSB)が研究されてきた。しかしながら、放射線によって誘発される「生物影響に関与するDSB」の分子的実体は分かっておらず、放射線、特にイオンビーム生物影響メカニズムの詳細は不明な点が多い。昨年度に引き続き、本年度はDSB生成機構及びDSB末端の化学構造調べる研究を進めた。

DSB生成機構における研究においては、様々なイオン種・エネルギーのイオンビーム照射後に分子の電離によって生じる分子イオンが作り出す電場が二次電子を束縛する状態を計算し、その時生じる電場と動径方向の距離の関係式を導出した。また、粒子・重イオン輸送計算コード(PHITS)を利用した放射線DNA損傷評価に関して、低エネルギー電子の飛跡構造計算機能に対する様々な出力機能を開発した。この機能により、DNA二本鎖切断生成に関わる電離や電子的励起の衝突分布が評価可能となった。さらに、イオン飛跡周辺の動経方向線量を計算できる簡便式をPHITSに組み込むアルゴリズムを考案した。これらの開発した計算コードを用い、イオンビーム照射後DNA損傷生成にかかわる現象のシミュレーションを進めた。DSB末端の化学構造を調べる研究では、イオンビーム、及び、対照となるガンマ線をプラスミドDNA水溶液に照射し、細胞内と同程度のラジカル捕捉能を持つ水溶液中におけるに生じるDSB、一本鎖切断(SSB)、塩基損傷(8-oxoG)、脱塩基部位の収率を調べる実験を開始した。一方、DSB末端構造を調べるため、非相同末端結合に関与するKuタンパク質がDSB末端を認識・結合する程度を調べる実験を行い、Kuが制限酵素切断されたDSB末端を有するlinearのプラスミドDNAに特異的に結合することを見出した。イオンビーム照射後のエネルギー付与に関して、計算コードを高精度化・高度化することができている。また、線質の異なる放射線を用いてDSB収率を測定する実験、及び、修復酵素によるDSB末端認識を調べる実験を開始した。研究はおおむね順調に進展していると考えている。これまで放射線生物影響に関与する最も重要なDNA損傷として二本鎖切断(DSB)が研究されてきたが、放射線によって誘発される「生物影響に関与するDSB」の分子的実体は分かっていない。昨年度に引き続き、本年度はDSB生成機構及びDSB末端の化学構造を調べる研究を進めた。DSB生成機構における研究においては、本研究課題が目指す粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを利用した放射線DNA損傷評価のために、電子及びイオンの飛跡構造解析モードを開発している。本年度は、細胞への電子線照射実験により得られた様々な種類のDNA損傷収量を、PHITSの電子飛跡構造解析モードを利用して電離・励起の頻度から評価することに成功した。本研究成果は学術誌に投稿する準備段階にある。さらに、イオンの飛跡構造解析モードの開発にも成功した。また、様々なイオン種、エネルギーのイオン飛跡周辺の二次電子による動経方向線量を計算できる簡便式をPHITSに組み込んだ。これらの開発した計算コードを用い、イオンビーム照射後DNA損傷生成にかかわる現象のシミュレーションを進めている。DSB末端の化学構造を調べる研究では、放射線誘発DNA損傷収率を調べるため、Heイオンビーム、及び、対照となるガンマ線をプラスミドDNA水溶液に照射し、DSB、一本鎖切断(SSB)、塩基損傷(8-oxoG)、脱塩基部位の収率を調べた。現在までのところ各DNA損傷収率の線質依存性は得られていない。
含ケイ素高輝度蛍光剤を活用した蛍光応答型高精度ゲノム解析プローブの開発

ケイ素官能基(シリル基)が結合することで蛍光発光が増大した種々のピレンあるいはペリレンを合成し、さらに、これらを「ダンベル類似構造」を形成する一部自己相補的DNA中の特異的な位置に導入した蛍光DNAプローブを合成した。こうしたプローブの幾つかは単独で存在する場合には殆ど蛍光を発しなかったが、完全に相補的なDNA存在時には顕著な蛍光シグナルを与えた。一方、適切な条件下(低塩濃度等)においては、一塩基ミスマッチを持つ相補鎖存在下では蛍光増大は殆ど見られないことが判明した。以上のことから、これらが標的鎖の一塩基の違いを識別できる特異性の高い遺伝子検出プローブとして有用であることが分かった。5'-末端のA残基にシリル化ピレンが結合する一方、3'-末端には光励起電子移動によってシリル化ピレンを強く消光するC-残基を持ち、これらがダンベル型高次構造中で隣接する一連の蛍光性オリゴDNAを合成した。これらのオリゴDNAが形成するダンベル型高次構造の熱安定性は、ステム部分の鎖長に依存し、さらにステム部分へのC-5ポリアミンあるいはC-5アントラキノン結合デオキシウリジン誘導体の導入が、熱安定性を大きく向上させることが分かった。一方、完全相補鎖との二重鎖の融解温度(Tm値)はダンベル型構造のそれより1015度程上昇した。これに対して様々な位置に一塩基ミスマッチを挿入した相補鎖との二重鎖では、ミスマッチの位置により変化するものの、全て完全相補鎖に比べて1015度程低下した。さらに、相補鎖非存在時、完全相補鎖存在時、ミスマッチ相補鎖存在時における蛍光性オリゴDNAの蛍光シグナルを測定した結果、得られた一連の蛍光性オリゴDNAは、相補鎖非存在時には全て微弱な蛍光シグナルを発するものの、完全相補鎖存在時にはそのシグナルが10倍60倍に増強することが判明した。これに対してミスマッチ相補鎖存在下での蛍光シグナルの増強は6倍35倍と幅があった。詳しい研究により、この蛍光回復にはC-残基とシリル化ピレンステムの近接を実現するステム部分の熱安定性、ステム部分に導入したアントラキノンによる光励起電子移動効果などが関与していることが判明した。以上の成果は2本の査読付き論文として発表した。クリック反応を応用してオリゴDNA中にシリル化ピレン結合ユニットを導入するため、アジド基を持つ新規なシリル化ピレン誘導体の合成に成功した。合わせて、蛍光量子収率が大幅に向上した、シアノ基を持つ新たなシリル化ピレン誘導体の合成に成功した。これらの成果の一部は査読付き論文として発表した。1ケイ素原子に2つのイソプロピル基又は2つのフェニル基が結合した、新規なシリル化ピレン誘導体を合成した。イソプロピル基が結合したシリル化ピレン誘導体の蛍光特性は、対応するこれまでに開発した2つのメチル基を持つシリル化ピレン誘導体と大きな相違は見られなかった。一方、フェニル基が結合したシリル化ピレン誘導体では、アルキル基が結合した他のシリル化ピレン誘導体の蛍光量子収率が、未修飾ピレンの約2倍に留まったのに対し、約2.7倍と大きく向上する事が判明した。これらの新規シリル化ピレンはホスホロアミダイト体へと誘導した後、オリゴDNAの5'-末端に導入した。イソプロピル基を持つシリル化ピレン修飾オリゴDNAの蛍光シグナル変化に関しては、メチル基を持つ修飾オリゴと大きな相違は見られなかったが、フェニル基を持つシリル化ピレン修飾オリゴでは、完全相補鎖存在時の蛍光強度が、修飾オリゴ単独の場合に比べ約2040倍に増大し、さらにこのような変化が目視によっても確認出来るなど、プローブとしての性能向上が見られた。2ヒトパピロマウイルス遺伝子診断用プローブとして、C-5アントラキノン結合デオキシウリジン残基及びC-5シリル化ペリレン結合デオキシウリジン残基を併せ持つモレキュラービーコンプローブを作製し、強毒型パピロマウイルス遺伝子に対応するオリゴDNAとの二重鎖形成と蛍光シグナル変化について研究した。その結果、作製したプローブは標的DNA存在下でのみ蛍光シグナルを発する事を確認した。本年度は新たな構造を持つ新規なシリル化ピレン誘導体を開発し、更にその蛍光特性を研究する中で、ケイ素原子の置換基としてフェニル基を用いる事で蛍光量子収率を更に向上させる事が出来ると言う新知見を得た。また、得られた新規シリル化ピレンを5-末端に結合した修飾DNAでは、完全相補鎖存在時の蛍光強度が、修飾オリゴ単独の場合に比べ約2040倍に増大し、さらにこのような変化が目視によっても確認出来るなど、プローブとしての性能向上が見られることを明らかに出来た。これらの新たな知見は、当初目指して来た、ダンベル型高次構造を持つ実用的なDNAプローブの開発に寄与する結果と言える。これらの結果の一部は、査読付き論文として発表する事ができた。また、当初は28年度実施予定であった、ヒトパピロマウイルス遺伝子診断プローブの開発に向けた実験を、27年度に前倒しで実施する事が出来た。実験の結果、作製したプローブは標的DNA存在下でのみ蛍光シグナルを発する事を確認することができた。

一方、エキシマー発光を利用するシリル化ピレン結合DNAプローブの開発に付いては、その合成原料となる、クリック反応に適用可能な、アジド基を持つシリル化ピレン誘導体の合成に成功したものの、その収率には問題が有り、これを用いたDNA合成には至らなかった。1平成26年度研究において開発した、シアノ基を持つ高発光型シリル化ピレンについて、置換位置の異なる2種類のシアノ基修飾シリル化ピレンを合成し、これらを当初計画に従ってクリック反応を用いてオリゴDNA中に導入可能な、アジド基結合型誘導体へと変換した。これらを予めアルキニル基を持つ非ヌクレオシド性スカホールドを3'末端付近及び5'末端に導入した修飾DNAと反応させて、ステム中の隣接した2カ所にシアノ基修飾シリル化ピレンを持つ2種類のモレキュラービーコンプローブを作成した。これらのプローブでは相補鎖非存在下で観察される顕著なエキシマー発光が、相補鎖存在下でのみ大きく減少することが観察された。2平成27年度に引き続き、ヒトパピローマウイルス遺伝子診断用プローブとして、C-5位アントラキノン結合デオキシウリジン残基及びC-5シリル化ペリレン結合デオキシウリジン残基を併せ持つモレキューラービーコンプローブについて、強毒性のHPV16及びHPV18のそれぞれに相補的な2種のプローブを合成し、標的DNA存在下及び非存在下での蛍光挙動を測定した。その結果いずれのプローブも標的存在下でのみその蛍光強度が大きく(1426倍)増強することを確認した。また、HPV16用プローブとHPV18用プローブ何れにおいても、蛍光の増大は特異的標的鎖存在下の場合だけであり、他の標的との交差反応を示さない、特異性の高いプローブであることを確認した。以上の成果に付いては国内及び国際学会で発表した。ケイ素官能基(シリル基)が結合することで蛍光発光が増大した種々のピレンあるいはペリレンを合成し、さらに、これらを「ダンベル類似構造」を形成する一部自己相補的DNA中の特異的な位置に導入した蛍光DNAプローブを合成した。こうしたプローブの幾つかは単独で存在する場合には殆ど蛍光を発しなかったが、完全に相補的なDNA存在時には顕著な蛍光シグナルを与えた。一方、適切な条件下(低塩濃度等)においては、一塩基ミスマッチを持つ相補鎖存在下では蛍光増大は殆ど見られないことが判明した。以上のことから、これらが標的鎖の一塩基の違いを識別できる特異性の高い遺伝子検出プローブとして有用であることが分かった。本年度当初計画では、5'-末端のA残基にシリル化ピレンが結合する一方、3'-末端には光励起電子移動によってシリル化ピレンを強く消光するC-残基を持ち、これらがダンベル型高次構造中で隣接する一連の蛍光性オリゴDNAの合成を計画した。さらに、27年度においてダンベル構造や完全相補鎖、一塩基ミスマッチ相補鎖などとの二重鎖の熱安定性の解明、並びに相補鎖非存在時、完全相補鎖存在時、ミスマッチ相補鎖存在時における蛍光性オリゴDNAの蛍光シグナルの変化について解析する計画であった。実際には本年度の研究において必要となる一連の蛍光性オリゴDNAの合成に成功し、更にこれらを用いて27年度において実施予定であった一連の研究を26年度中に実施することができた。さらにこれらの成果を2本の査読付き論文として刊行することができた。26年度中に計画していたクリック反応を応用してオリゴDNA中にシリル化ピレン結合ユニットを導入するため、アジド基を持つ新規なシリル化ピレン誘導体の合成については、計画通り実行することができた。
気相内拡散の改善による肺内ガス交換促進の研究

本年度の研究に於て、気相内拡散の改善による肺内ガス交換の促進効果を検討する上で重要な基礎的問題である次の二点を検討した。即ち、1.気相内拡散が副行換気路を介するガス交換にどのように影響するか、2.生体で気相内拡散に対する重力の影響は認められか、である。イ.摘出犬肺葉を30cw【H_2】Oの圧で拡張し、一つの区域気管支にカテーテルを楔入させる。気管支よりHeとS【F_6】の混合気を流し込み、副行換気路を介してカテーテルに流出する気流中のHe,S【F_6】濃度をマス・スペクトロメーターで検出する。流量を5段階に変えて検討すると、すべての流量で常にS【F_6】の濃度はHeの濃度よりも大であった。このことは、拡散し易いHeが、副行換気路を介して流路の周囲の肺胞により多く拡散するためと考えられた。モデル解析で、副行換気路を介する拡散抵抗を計算すると、未梢気道閉塞時に副行換気路を介するガス交換に占める気相内拡散の役割は無視しえないことが示された。2.私共はガラス管分岐モデルの実験で、気流先端部の分散がHeとS【F_6】で異なるTaylor分散が、分岐角の方向で異り、それが重力の影響であることを示した(J.Appl,Physiol,52:14761486,1982)。生体に於ても同様の影響が認められるか否かを検討するため、生犬に気管内カニューレを捜入し、区域気管支に逆行性カテーテルを楔入させ、吸気にHeとS【F_6】のボラスを注入して、逆行性カテーテルの部分でHeとS【F_6】の分散の程度を測定した。その結果、S【F_6】の分散が体位変換で影響されること、その影響は遅い流量で大きく,且つ臥位よりも立体で、下葉よりも上葉で大きいことが示された。これらの結果より、気道内の吸気の分散には重力の影響があり、その程度は重いガスで、下向きの流れで大きいことが示唆された。
子宮内膜症の卵巣明細胞癌、類内膜腺癌への悪性化メカニズムの解明

子宮内膜症は性成熟期女性に高発する良性疾患であり、日常臨床で頻繁に遭遇する。近年、子宮内膜症は増加傾向にあり、その要因は生活環境、食生活、ストレスなど様々である。子宮内膜症増加に伴う問題は、性成熟期女性の月経困難症、不妊症の原因の一つになる他、特に近年子宮内膜症の内膜上皮細胞には、病理学的に細胞形態は良性でも、遺伝子レベルでは染色体異常(特に17q染色体の異常、Loss of Heterozygosity)が頻発していると報告されており、これは重要項目である。その理由は、卵巣癌の中でも子宮内膜症の合併が高率であると報告されている卵巣明細胞癌(OCCA)及び卵巣類内膜腺癌(OEMC)は、既存の卵巣上皮細胞からではなく異所性病変である子宮内膜症が発生源となっている可能性が高いとされており、子宮内膜症は細胞の性質によって、前癌病変となる可能性が否定できないと思われる。以上の背景より、今回の課題では子宮内膜症を合併するOCCA,OEMC組織中の、形態的には良性の子宮内膜症(END)をへて、良悪性の境界的形態をもつ異型細胞(Aty)へと変化し、非浸潤癌から浸潤癌(Ca)へと連続して変化する4症例について、ステロイドホルモン(Estrogen Receptor(ER),Progesterone Receptor(PR))感受性を免疫組織学的に検討した。その結果、OEMCではEND,Aty,Ca全ての部位に染色性が認識されたが、OCCAのCa部位では全く染色性は認められず、Aty部位で僅かに認識され、END部位では他のEND細胞と同様に認識された。さらに形態学的に良性の子宮内膜症細胞でも、卵巣嚢腫中またはOCCA,OEMCに伴って出現する細胞では、遺伝子レベルで違いが検出されるかをp53遺伝子について、子宮内膜症細胞のみマイクロダイセクション法にて単離し、シークエンス解析した。その結果、形態学的には良性に見える子宮内膜症細胞でも、卵巣嚢腫中及びOEMCに出現する子宮内膜症細胞にはp53遺伝子に変異は検出されなかったが、OCCAに伴って出現する細胞には13例中4例に変異が検出され、そのうち2症例は2箇所に変異が検出された。これらの結果より、子宮内膜症から発生するとされているOCCA,OEMCは、ステロイドホルモン感受性からの離脱や、病理細胞形態学的には良性でも遺伝子レベルでの違いが、良性、悪性及び性質の異なる別の組織型の腫瘍へと変化する一つの要因になっているのではないかと推察された。子宮内膜症は性成熟期女性に高発する良性疾患であり、性成熟期の女性の月経困難症、不妊症の原因疾患として日常臨床で頻繁に遭遇する。近年、子宮内膜症の内膜上皮細胞には、病理学的に細胞形態は良性でも、遺伝子レベルでは染色体異常(特に17q染色体の異常、Loss of Heterozygosity)が頻発していることや、卵巣癌の中でも卵巣明細胞癌(OCCA)及び卵巣類内膜腺癌(OEMC)には子宮内膜症の合併が高率であることから、これら組織型の癌は既存の卵巣上皮細胞から発生しているのではなく、異所性病変である子宮内膜症がその発生源となっている可能性が高いことが考えられる。以上の背景から今回の課題では、子宮内膜症を合併するOCCA,OEMCの組織であり、その組織が形態的に良性の子宮内膜症(END)をへて、良悪性の境界的形態をもつ異型細胞(Aty)へと変化し、非浸潤癌から浸潤癌(Ca)へと連続して変化する組織切片のみ各4症例について、連続した組織のそれぞれの細胞性に、どのような違いが見られるかを免疫組織学的に検討した。その結果、ステロイドホルモン感受性については、Estrogen Receptor(ER)とProgesterone Receptor(PR)は、OEMCではEND,Aty Caすべての部位に強く染色性が認識されるにも関わらず、OCCAではCaは全く認められなかった。しかし興味深いことに、OCCAのCaでは見られないステロイドホルモンレセプターの染色は、Atyではやや認識され、ENDでは他のEND細胞と同様に認識された。これより子宮内膜症から発生する両腫瘍は、ステロイドホルモン感受性からの離脱が発生母地は同様であるにも関わらず、性質の異なる別の組織型へと変化する一つの要因になっているのではないかと推察された。またEGFR、c-erbB-2の染色性の比較では、OCCAではEGFRがCaにやや強く見られ、c-erbB-2はOCCA、OEMCの両方に染色される傾向にあったことから、これらの結果をHerceptinやIressa(Gefitinib)感受性について考察する必要があると思われた。その理由は、卵巣癌の中でも子宮内膜症の合併が高率であると報告されている卵巣明細胞

癌(OCCA)及び卵巣類内膜腺癌(OEMC)は、既存の卵巣上皮細胞からではなく異所性病変である子宮内膜症が発生源となっている可能性が高いとされており、子宮内膜症は細胞の性質によって、前癌病変となる可能性が否定できないと思われる。以上の背景より、今回の課題では子宮内膜症を合併するOCCA,OEMC組織中の、形態的には良性の子宮内膜症(END)をへて、良悪性の境界的形態をもつ異型細胞(Aty)へと変化し、非浸潤癌から浸潤癌(Ca)へと連続して変化する4症例について、ステロイドホルモン(Estrogen Receptor(ER),Progesterone Receptor(PR))感受性を免疫組織学的に検討した。その結果、OEMCではEND,Aty,Ca全ての部位に染色性が認識されたが、OCCAのCa部位では全く染色性は認められず、Aty部位で僅かに認識され、END部位では他のEND細胞と同様に認識された。さらに形態学的に良性の子宮内膜症細胞でも、卵巣嚢腫中またはOCCA,OEMCに伴って出現する細胞では、遺伝子レベルで違いが検出されるかをp53遺伝子について、子宮内膜症細胞のみマイクロダイセクション法にて単離し、シークエンス解析した。その結果、形態学的には良性に見える子宮内膜症細胞でも、卵巣嚢腫中及びOEMCに出現する子宮内膜症細胞にはp53遺伝子に変異は検出されなかったが、OCCAに伴って出現する細胞には13例中4例に変異が検出され、そのうち2症例は2箇所に変異が検出された。これらの結果より、子宮内膜症から発生するとされているOCCA,OEMCは、ステロイドホルモン感受性からの離脱や、病理細胞形態学的には良性でも遺伝子レベルでの違いが、良性、悪性及び性質の異なる別の組織型の腫瘍へと変化する一つの要因になっているのではないかと推察された。
高い情報生存能力を実現するためのオペレーティング・システム

本研究の目的は、第1に、並列世界モデルに基づくオペレーティング・システム(世界OS)を実現し、重要なデータの保護と破壊からの迅速な回復を可能にすることである。本研究の第2の目的は、システム・コールのレベルでアクセス制御を強化するためのラッパ/リファレンスモニタSysGuardを作成することである。SysGuardでは、システム・コールの入口、または、出口において、システム・コールの引数やプロセスの属性を参照して、付加的なアクセス制御を行うことができる。本年度は、世界OSを、Solarisシステム上で動作するサーバとして完成させた。完成させたシステムにおいて、World Wide WebサーバApacheを動作させ、その動作を監視することができる。これにより、Apacheがたとえ攻撃を受けてデータが破壊されたとしても、並列世界モデルにおける世界を観測することで、どのデータが破壊されたかを即座に知ることができる。さらに、世界を削除することで、即座に回復させることができる。SysGuardは、Linuxにおいて動作している。今年度は、SysGuardにおいて、ガードと呼ばれるアクセス制御を強化するためのカーネル内モジュールをいくつか開発した。その中には、DoS攻撃からサーバを保護するもの、バックドア・プログラムの実行を防ぐもの、ネットワーク・アクセスを制限するものなどがある。今後はこれらの2つのシステムを統合的に利用可能にしたい。本研究の目的は、並列世界モデルを用いて重要なデータを保護すること、および、たとえ破壊されたとしても高速に回復させることである。ここで世界とは、独立したファイル・システムを持つプロセスの実行環境である。並列世界モデルでは、1つのシステムの中でそのような実行環境を複数提供する。本研究では、データが破壊される可能性がある作業を、新たな世界を作成し、その内部で実行させる。作業後、データの破壊の有無を調べ、破壊されていた時には、世界を削除することで高速に回復させる。そうでない時には世界を融合することにより、反映させる。さらに、重要なサービスを提供しているプログラムを独立した世界で動作させ、外の世界との通信や相互作用を監視することで、データの破壊を未然に防ぐ。本年度は、提案システムの構成要素のうち、世界サーバ、ファイル・サーバ、および、プロセス・サーバを、Linuxのカーネル内部、および、Solarisのカーネル外部で実現した。従来の世界サーバは、世界間の依存関係に強い制約があったが、本研究ではこれを緩和することで、攻撃による更新を含んだ世界のみを削除することを可能にした。ファイル・サーバには、任意の世界の内容を外界から観測可能にする機能を設け、破壊の有無を確認しやすくした。プロセス・サーバでは、異なる世界に属するプロセス間の通信の監視機能を強化した。たとえば、遠隔の利用者からの攻撃を受け、特権利用者の権限が奪われたとしても、利用者の位地情報を利用したアクセス制御を行なうことで、被害の拡大を防ぐことが可能になった。
テーラーメイド栄養を目指した分子基盤研究

がんや糖尿病などの多因子疾患の発症には、食事が大きく影響する。多因子疾患予防のために、個人の遺伝的体質を考慮したテーラーメイド栄養が重要となってくる。よって本研究は、テーラーメイド栄養の実践を目指し、その基盤となる成果を得ることを目的としている。遺伝的体質は、ゲノムのわずかな違い(一塩基多型: SNP)に起因する。われわれはこれまで、日本人においてゲノムワイドな解析を行い、食物摂取および食嗜好に関与するSNPsを同定してきた。本研究では、これらのSNPsがどのように食物摂取や食嗜好に影響するのかを、食事調査やその対象者の尿や血液を用いて、またSNPを入れたマウスを作成して検証していく。
長期の食事習慣と骨の粗鬆化との関係についての実践的研究

本研究は、過去に栄養摂取状態を調べた地域を再調査することによって「長期の栄養摂取状況」と「骨の粗鬆化」についての関係を明らかにする目的で、全国でも有数の長寿地域である山口県熊毛郡平生町を調査地域として、15年前に栄養摂取状況を調べた住民のうち再調査が可能な女性(38才から85才までの者)約60名の、栄養摂取状況の調査(秤量法)と骨密度の測定(Runar社製、Achillesによる超音波測定法)、および肥満度(インピーダンス法)、血液分析(栄養成分と女性ホルモン)を行った。その結果、閉経前後によるエストロゲンの減少と骨強度(SOS値、BUA値)とは強い相関がみられ、従来の報告を裏付けた。また、肥満度と骨強度の間にも有為な相関が認められた。一方、栄養摂取状況と骨強度の関係では、注目されるCaと骨強度の間には有為な相関は検出されず、単一のミネラル成分と骨パラメーターとの間にはいずれも関連がみられなかった。しかし、動物性タンパク質の摂取量と骨強度、あるいは、動物性脂質摂取量と骨強度の間には有為な相関が認められ、栄養摂取状況が骨強度に強く影響を及ぼすことが示唆された。また、発育ビタミンとも呼ばれるVB_2と骨強度との間に有為な関連がみられたことはこれまでに報告が無く、興味深い結果であるが、詳細についてはいまだ不明な点が多い。
マウス由来株化セメント芽細胞の樹立とその性質の解明

矯正治療による歯根吸収は、臨床上大きな問題の1つである。しかしながら、歯根吸収が過度に進行する機序については現在までほとんど明らかにされていない。その一因としては、セメント質を構成するセメント細胞、セメント芽細胞の分離培養が困難で、これらの細胞の機能や吸収調節機構における破歯細胞との相互作用などを詳細に解析することができていないことが挙げられる。そこで本研究では、SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスを用いて、マウス由来セメント芽細胞の株細胞を樹立することを目的とした。昨年度までに、SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスの下顎骨臼歯からセメント芽細胞が比較的多く含まれる組織片を採取し、細胞を分離することができた。限界希釈法によりクローニングを行ったが、細胞の増殖能が思わしくなかったため、今年度は、実験手技に注意しながら、再度クローニングを行った。SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスの下顎骨臼歯から分離し凍結保存してあった細胞群を用いて限界希釈法にて再度クローニングを行った。実験方法としては、まず、96穴プレートに細胞をうすく播種し、各穴に1個の細胞が選択されるようにした。顕微鏡下で細胞数を確認し、1個の細胞が分離できた穴をマークし、さらに培養を行った。今回は7日毎に培養液の交換を行い、細胞に極力ダメージを与えないように注意しながら培養を行っていたが、やはり細胞の増殖が思わしくなく、十分な細胞数を得ることができなかった。今回も残念ながら、クローニングは不成功という結果になってしまった。海外の報告では、既にいくつかの株化セメント芽細胞の樹立がなされており、今後はそれらの細胞株を入手できるかどうかについても検討してみたい。そこで本研究では、SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスを用いて、マウス由来セメント芽細胞の株細胞を樹立することを目的とする。今年度は、SV40T-antigen導入トランスジェニックマウスを用いて、セメント芽細胞群の分離を行った。SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスの下顎骨を採取し、そこから臼歯を抜歯した。歯根膜内に存在する不均一な細胞群の中から、マイナー成分であるセメント芽細胞をクローニングすることは困難であることが予想されため、まず、実体顕微鏡下でセメント質と思われる部分を切り出した。さらに、0.1%Collagenase中で37°C恒温槽にて30分間インキュベートし、1000rpmで2分遠心することで、表面の歯根膜線維芽細胞などを取り除き、セメント芽細胞が比較的多く含まれる組織片を採取した。培養皿に播き10%血清を含むα-MEM培地にて培養した。組織片より細胞がoutogrowthするまで、週2回から3回の培地交換を行いながら培養を続けた。3週間培養後、Outogrowthしてきた細胞を回収した。さらに、数回継代し、十分な細胞数が得られた。以後の実験に使用する細胞は凍結保存した。今後、限界希釈法にてクローニングを行い、数種類の細胞株を選択していく予定である。そこで本研究では、SV40 T-anigen導入トランスジェニックマウスを用いて、マウス由来セメント芽細胞の株細胞を樹立することを目的としている。そこで今年度は、限界希釈法にてクローニングを行い、数種類の細胞株を選択することをを試みた。まず、SV40 T-antigen導入トランスジェニックマウスの下顎骨臼歯から分離された細胞を数回の継代し、十分な細胞数を得た後、凍結保存した。次にそれらの細胞を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。マークした穴の細胞がコンフルエントになるまで培養を行い、さらに細胞数を増やす予定であったが、細胞の増殖能が思わしくなく、クローニングに失敗した。原因は培養液を3日ごとに交換していたが、交換する間隔が早すぎてオートクラインによる増殖因子等の作用を取り除いてしまったこと、または、実験手技の未熟さで、細胞にダメージを与えてしまったことなどが考えられる。今後再度クローニングを行ってみる予定である。