hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射光を用いた動的X線溶液散乱法による植物ウイルスの形成速度測定

シンクロトロン放射光の強力な光源(放射光X線)を利用して、溶液散乱法により、生理条件に最も近い状態で、タバコモザイク病ウイルスとキュウリ緑斑病ウイルスを、その構成要素であるリボ核酸と外被タンパク質から、感染性のあるウイルス粒子が再構成される機構と成長速度の研究を行った。その目的は、高速度で経時的に散乱測定を行い、ウイルス形成のメカニズムを構造学的見地から速度論的に解明することにある。実験は、放射光X線を用いて、温度ジャンプ装置と、時分割X線小角散乱法を組み合わせて測定を行い、温度により会合が生じる性質を利用して、形成の時間過程を観察した。同様にストップトフロー装置を用いてイオン強度のジャンプを生じさせて、形成過程を測定する。これらの散乱データを解析し回転半径や分子量及び散乱曲線の時間的変化から、成長過程の粒子形態と大きさを定めた。また、粒子の成長の時間変化の速度論的解析から、A-蛋白と20Sディスク平衡定数を定め、粒子の成長と崩壊に対する速度定数から成長速度を求めた。この方法により、従来の電子顕微鏡等では、ある瞬間の乾燥した形態しか観測できなかったものが、連続測定により溶液中での成長速度を決定することが初めて可能になった。その他に、植物ウイルスの形成過程を観察するには、低温クエンチングの手法も利用した。この方法は、例えば20°Cで再構成反応が進行中の溶液から、反応開始後0、1、2、・・・・・、30、45分と経過した時点でそれぞれ一定量の溶液を取り出し、ただちに5°Cに冷やせば反応が停止し、各過程の溶液が利用できる。そこで、これらの液を5°CでX線散乱測定を行い、RNAとタンパク質からの、タバコモザイクウイルスやキュウリ緑斑ウイルスの再構成の時間的過程を観察できた。平成三年度においては、既存の空気圧送式X線小角散乱用温度ジャンプ装置をシリンジ圧送式の温度ジャンプ装置に改造し、安定に秒以下の高次構造変化が観測できるようにした。またこの装置を、高エネルギ-物理学研究所放射光実験施設の、ビ-ムラインBLー10Cの酵素回折計SAXES(溶液用小角X線散乱測定装置)に組み込んでの装置テストを行い、良好な結果を得た。温度ジャンプ装置とストップドフロ-装置との性能テストでは、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス外被蛋白質の温度ジャンプによる再構成過程(温度ジャンプ装置)、RNA存在下でのタバコモザイク病ウイルス外被蛋白質の再構成過程(ストップドフロ-装置)を時分割小角X線散乱により観察した。これまで得られた結果を総合すると、温度ジャンプ装置を使った実験では、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス外被蛋白質は、タバコモザイク病ウイルスの場合とは異なって、まずAータンパク質一層よりなる円盤状のユニットを形成し、それが二層ディスクにより、さらに積み重なって円柱状のウイルスが形成されるらしいことが分かった。ストップドフロ-装置を使った実験では、2種の溶液の混合に時間差があり、装置調製段階であるが、予備実験の結果から、散乱結果をクラツキ-プロットする事により、ウイルスの成長と同時にRNAが外被タンパク質に取り込まれていく様子が、ほぼ定量的に解析できることがわかった。平成四年度においては、温度ジャンプ装置、ストップドフロー装置の改良と性能テストを中心に、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス外被蛋白質の温度ジャンプによる再構成過程(温度ジャンプ装置)、RNA存在下でのタバコモザイク病ウイルス外被蛋白質の再構成過程(ストップドフロー装置)を時分割小角X線散乱により観察した。これまで得られた結果を総合すると、温度ジャンプ装置を使った実験では、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス外被蛋白質は、タバコモザイク病ウイルスの場合とは異なって、まだA-タンパク質一層よりなる円盤状のユニットを形成し、それが二層ディスクになり、さらに積み重なって円柱状のウイルスが形成されるらしいことが分かった。

ストップドフロー装置を使った実験では、2種の溶液の混合に時間差があり、装置調製段階であるが、予備実験の結果から、散乱結果をクラツキープロットする事により、ウイルスの成長と同時にRNAが外被タンパク質に取り込まれていく様子が、ほぼ定量的に解析できることが分かった。これまでの研究は、装置のテストと静的実験による解析法の確立に主力が注がれていたが、それらの問題はこれで解決した。このため、平成五年度には、ストップトフロー法と温度ジャンプ法による動的実験に主力を注ぎ、実験データを精力的に収集し、その構造学的速度論的解析を行い、研究を完成させる。特にキュウリモザイク病ウイルスに付いての実験を中心に行い、量的に充分満足できる成果を得、タバコモザイクウイルスとの特性の差を解明する。シンクロトロン放射光の強力な光源(放射光X線)を利用して、溶液散乱法により、生理条件に最も近い状態で、タバコモザイク病ウイルスとキュウリ緑斑病ウイルスを、その構成要素であるリボ核酸と外被タンパク質から、感染性のあるウイルス粒子が再構成される機構と成長速度の研究を行った。その目的は、高速度で経時的に散乱測定を行い、ウイルス形成のメカニズムを構造学的見地から速度論的に解明することにある。実験は、放射光X線を用いて、温度ジャンプ装置と、時分割X線小角散乱法を組み合わせて測定を行い、温度により会合が生じる性質を利用して、形成の時間過程を観察した。同様にストップトフロー装置を用いてイオン強度のジャンプを生じさせて、形成過程を測定する。これらの散乱データを解析し回転半径や分子量及び散乱曲線の時間的変化から、成長過程の粒子形態と大きさを定めた。また、粒子の成長の時間変化の速度論的解析から、A-蛋白と20Sディスク平衡定数を定め、粒子の成長と崩壊に対する速度定数から成長速度を求めた。この方法により、従来の電子顕微鏡等では、ある瞬間の乾燥した形態しか観測できなかったものが、連続測定により溶液中での成長速度を決定することが初めて可能になった。その他に、植物ウイルスの形成過程を観察するには、低温クエンチングの手法も利用した。この方法は、例えば20°Cで再構成反応が進行中の溶液から、反応開始後0、1、2、.....、30、45分と経過した時点でそれぞれ一定量の溶液を取り出し、ただちに5°Cに冷やせば反応が停止し、各過程の溶液が利用できる。そこで、これらの液を5°CでX線散乱測定を行い、RNAとタンパク質からの、タバコモザイクウイルスやキュウリ緑斑ウイルスの再構成の時間的過程を観察できた。
ペプチド工学に基づいた人工転写因子による、新規癌予防法の開発

近年、癌抑制遺伝子p53の失活が発癌の引き金になっていることが明らかにされた。変異したp53蛋白質に代わってp53下流遺伝子p21の転写を促進するような人工転写因子を開発し、癌予防への応用を試みた。本研究では、二本鎖DNAに結合して三重鎖を形成することができるTFOに転写活性化能を持つペプチド配列を融合させて、三重鎖形成領域の転写を活性化できる『人工転写因子』の作製法を確立し、人工転写因子を使った転写活性化システムの構築が可能かを検証した。しかしながら、変異したp53を元通りにすることは困難である。そこで、p53タンパク質に代わって、p53下流遺伝子p21の転写を促進するような人工転写因子を開発し、癌予防に応用することにした。平成19年度においてはまず、人工転写因子モデルとするオリゴヌクレオチドとペプチドのコンジュゲートを行った。プロモーター領域のDNA配列に特異的に結合し、三本鎖を形成できる天然型オリゴヌクレオチド(TFO)の末端をチオール化したものと、転写活性化プロリンリッチ配列と膜透過性TAT配列を有するマレイミド化ペプチドとをマイケル付加反応を利用してコンジュゲートさせた。負電荷を帯びたリン酸基をもつオリゴヌクレオチドと、塩基性のTAT配列を有するペプチドのコンジュゲートは、静電的作用による凝集効果で沈殿しやすく精製が困難との報告がなされているが、検討の結果、今回作製したコンジュゲートはDEAE陰イオン交換クロマトグラフィにより効率的に精製できることを確認し、人工転写因子モデルを作製する方法を確立することができた。次に、作製した人工転写因子モデルが転写活性化能を有するか、レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイ法にて検証したが、転写活性化能は認められなかった。そこで、天然核酸の形の自由度を拘束することにより三重鎖形成能を高め、かつヌクレアーゼ耐性をも獲得した人工核酸BNA(bridged nucleic acid)を利用することにした。現在、BNA含有TFOとペプチドをコンジュゲートする条件を検討中である。近年の研究により、癌抑制遺伝子p53の失活が発癌の引き金になっていることが明らかにされた。そこで、p53蛋白質に代わってp53下流遺伝子P21の転写を促進するような人工転写因子を開発し、癌予防に応用することにした。平成19年度において、プロモーター領域のDNA配列に特異的に結合し三重鎖を形成できるオリゴヌクレオチド(TFO)を転写活性化プロリンリッチ配列と膜透過性TAT配列を有するペプチドとコンジュゲートすることによって、人工転写因子モデルの作製法を確立した。しかしながら、レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼ法にて転写活性化能は認められなかった。そこで平成20年度においては、天然核酸の“形の自由度"を拘束することにより、標的となるDNAやRNAに対する結合親和性を高め、かつヌクレアーゼ(核酸分解酵素)耐性をも獲得する架橋構造を核酸分子内に持つ人工核酸BNA(bridged nucleic acid)を用いた人工転写因子モデルを作製した。オリゴヌクレオチドとペプチド間のリンカーの長さ、オリゴヌクレオチドに対するペプチドの向き、転写活性化ペプチド配列といった点を考慮し、BNA型人工転写因子モデルを種々作製することに成功した。ゲルシフト法により、これらの転写因子モデルは従来の天然型モデルに比べてはるかに効率的に標的DNA配列と三重鎖を形成できることを確認した。平成19年度同様にルシフェラーゼ法にて転写活性化能を評価したが、作製した転写因子モデルの中に転写活性能を有するものを見出すことはできなかった。
大規模な実用に耐えうる双方向グラフ変換の統合的基盤技術の構築

本研究は、大規模な実用に耐えうる双方向グラフ変換のための双方向変換言語の実現を目指して、まず、双方向変換の本質がPutback変換(逆反映変換)である理論を示し、それに基づいた双方向変換の振る舞いを完全に記述しRoundtrip性質を保証できるBiGULの実現に成功した。また、多様なグラフ構造に対応可能な有力な双方向変換を開発し、モデル駆動開発で広く用いられているモデル変換言語ATLの双方向化を行った。さらに、実証研究として、ユーザ向けのソースプログラムとシステム実現向けの抽象構文木の間の双方向変換を開発するためのBiYaccシステムなどを開発し、双方向変換の有効性を確認した。本研究の目標は、双方向変換の予測性と信頼性の確保と拡張可能性及び効率化を達成し、大規模な実用に堪えうる双方向変換技術基盤を構築することである。この目標を達成するために、初年度は、これまでの研究成果を踏まえ、大規模な実用に耐えうる双方向グラフ変換のための双方向変換言語の設計方針を中心に研究に取り組み、次の研究成果を挙げた。(1)双方向変換モデルの拡張:双方向変換は順変換と逆変換の組であるが、順変換に対して一般に複数存在する逆変換がそれぞれどのような意味(計算の振る舞い)を持つのかが不明確である。この課題について、ソースとビューの間の双方向変換の本質がPutback変換(ビューを用いてソースを更新する変換)であることを示した。つまり、ビューによるソース更新を行うPutback変換さえあれば、ソースからビューへの生成方法が唯一に決まりputback変換の定義から導出可能であるということである。また、プログラマに分かりやすい表示的あるいは宣言的な意味論を与える。(2)グラフモデル拡張とグラフ変換言語の設計:様々な種類のグラフモデルを扱うため、分岐において順序のあるグラフについて実装の強化、評価を行った。応用毎のグラフの等価性に対応すべく、同型等価性と値等価性の取扱いに対応した言語設計と実装を行った。(3)双方向変換言語の実装の効率化:本年度は、双方向変換の対象となるソースとビューに対して、一方の差分データが与えられたときに、self-adjustingライブラリによってその差分データをもう一方に自動的に反映させる手法を研究し、漸進的更新を行うプロトタイプシステムを作成した。本研究の目標は、双方向変換の予測性と信頼性の確保と拡張可能性・効率化を達成し、大規模な実用に堪えうる双方向変換技術基盤の構築にある。目標達成のため、前年の成果をベースに、大規模な実用に耐えうる双方向グラフ変換のための双方向変換言語の設計とその効率的な実装を中心に研究を進め、実用的双方向変換システムへ応用も試み、次の研究成果を得た。(1)前年、双方向変換(view updating機構)の本質はPutback変換であることを示した。今年度は、その理論に基づき、putback変換を簡潔に記述できる言語BiFluxを提案し設計した。(2)順序付きグラフの構造再帰に基づく変換に双方向変換の意味を与えた。順序が入ることで複雑になった構造再帰の双方向変換ステップを、枝毎の変換からノード単位に重点を移して単純化した他、記述能力拡張部分(兄弟枝の再整列)についても組化変換とbulk意味論の適用により双方向化できることを示した。(3)最終目標のグラフ構造に対する双方向変換プログラムの検証に向けて、既存の双方向変換の枠組みの形式手法のための定式化を行った。具体的には定理証明支援系であるCoqを用い、双方向変換において重要な性質のwell- behavednessと我々の提案したputback-basedの正当性に対し形式証明を与えた。(4)双方向変換において効率性は、実用化への重要な要素である。今年度は、木構造を対象とした問合せの効率化に取り組みスキーマ情報を考慮した融合変換の適用可能性を考察し、nested-relational DTDというスキーマを持つデータは融合変換の適用が可能であると判明した。また、並列化についてはグラフ構造におけるPageRank値やk-means値などを繰り返しMapReduce計算モデルで求める際の効率化について差分計算が適用できると判明した。昨年の成果をベースに、実用に耐えうる双方向変換のための双方向変換言語の効率的な実装を中心に、領域特有言語の双方向化、双方向変換による自己適応システムのモヂュール化、双方向変換のソフトウエア工学への応用を行い、次の成果を得た。1.双方向変換言語のRoundtripの検証:昨年実装した双方向変換言語BiFluxの双方向的振舞を完全に検証するため、core言語BiGULを設計し効率的に実現した。これによりBiFluxを十分定義でき、更に定理証明器Agdaの検証により、BiGULで記述される双方向変換はRoundtrip性質が保証される。また、グラフ構造に対する双方向変換プログラムに対し、より一般的な形式的検証の前段階として、定理証明支援系であるCoqを用い、木構造データの変換を形式的モデルである木トランスデューサで定義し、基本的な定理に対し証明を進めた。2.双方向化:グラフ変換の双方向化にあたりトレース情報の管理はスケーラビリティ達成の鍵の一つとなる。本年は、従来ノード毎に格納され変換段数増加に伴い空間計算量を増やしていたトレース情報について、言語設計段階でソースターゲット間マップに移行させ、順変換が複数合成されている場合の更新の影響範囲の明確化に繋げた。また、BiGULを用いてより強力な双方向変換システムの構築に成功した。3.グラフ問合せの効率化:特殊なグラフ(木構造)を対象に与えられた構造(木パターン)を満たすような結果をある順番でソートするような問合せの最適化に取り組んだ。

全てのノードをソートして出力する問合せを用意し、そこに木パターンから抽出した条件を埋め込んだ問合せの構成に基づく最適化に取り組み、有効性を確かめた。更に、スキーマ情報を用いて与えられた問合せに対し、より効率的な問合せの構成が可能となる枠組みについて、スキーマのクラスも同定しながら研究を進めた。Putbackに基づく双方向変換のためのCore言語を正しく効率的に実現できたため、研究は順調に進んでおり、当初の計画より早く応用研究に進むことができるようになった。最終年度は目標達成のため、今までの成果を基に、高信頼な双方向変換のための双方向変換言語の効率的な実装を行い、本研究の有効性の評価を行い今後の課題を明確にした。具体的には、次の成果をあげた。(A)双方向変換の効率的な実装(1)BiGULの静的解析による効率化:今まで開発してきた逆変換を軸とした双方向変換言語BiGULの静的解析により動的な検査を削減する効率化手法を開発した。それにより、BiGULエンジンはTGGやQVTなどよりはるかに速く、時には100倍以上速いことがBX2017で発表予定の比較研究でわかった。(2) provenance情報による双方向更新の効率的な実装:グラフ変換の代数であるUnCALにおいて、従来更新の種類毎に定義していたprovenance情報を、一定の条件の下で任意の更新の伝搬に利用できるよう一般化し、provenanceの合成および追跡演算を定式化した。(B)実証研究として、ユーザ向けソースプログラムとシステム実現向け抽象構文木の間の双方向変換を開発するためのBiYaccシステムと、プログラム開発手法への応用システムを開発し、双方向変換の有効性を確認した。(1)BiYaccシステムの開発:パーサーとプリンターはコンパイラにおける重要な二つの部品である。我々は、双方向変換の原理に基づき、両者を同時に記述できる領域特有言語BiYaccを提案、その記述からパーサーとプリンターを自動的に生成するシステムを開発、その有用性をTiger言語のパーサーとプリンターの自動生成を通じて示した。(2)プログラム開発手法への応用:双方向変換の実用的側面を考慮した双方向変換の形式化を試みた。特に既存の双方向変換の枠組みで実現できなかった例として、定理証明支援系を利用したプログラム開発手法へ応用を行い、複数の双方向変換を組み合わせた新しい手法を提案し、同時にその形式化も行った。本研究は、大規模な実用に耐えうる双方向グラフ変換のための双方向変換言語の実現を目指して、まず、双方向変換の本質がPutback変換(逆反映変換)である理論を示し、それに基づいた双方向変換の振る舞いを完全に記述しRoundtrip性質を保証できるBiGULの実現に成功した。また、多様なグラフ構造に対応可能な有力な双方向変換を開発し、モデル駆動開発で広く用いられているモデル変換言語ATLの双方向化を行った。さらに、実証研究として、ユーザ向けのソースプログラムとシステム実現向けの抽象構文木の間の双方向変換を開発するためのBiYaccシステムなどを開発し、双方向変換の有効性を確認した。
癌遺伝子産物・癌抑制遺伝子産物による悪性リンパ腫の放射線感受性制御機構

核内セリン・スレオニンキナーゼであるChk2は、DNA損傷に伴い活性化し、細胞周期チェックポイント制御、DNA損傷修復または細胞死の決定において重要な役割を担うと考えられている。我々はDNA損傷時にp53依存的に発現誘導される核内タンパク質ホスファターゼWip1がChk2と機能的に共役することを見出している。今回、Wip1によるChk2の制御にWip1 N末端側領域及びChk2 SQ/TQドメインが重要な役割を果たしていること、Wip1の発現を抑制することにより放射線照射に伴う細胞死が促進されること等を示し、Chk2、Wip1の関与するDNA損傷応答の分子機構の一端を明らかにした。これまでに放射線抵抗性のリンパ腫細胞株において、Chk2遺伝子の発現が顕著に減弱していることを見出している。放射線抵抗性リンパ腫細胞株におけるChk2遺伝子の発現抑制機構の解明のため、Chk2遺伝子のシークエンス解析を行ったところChk2遺伝子のORF領域に対応するexonsには変異は認められなかったが、DNAメチル化阻害剤5-azacytidine及び脱アセチル化酵素阻害剤Trichostatin AおよびSodium butylate処理によりChk2遺伝子の発現が誘導された。また、放射線抵抗性リンパ腫細胞株におけるChk2遺伝子の発現抑制機構の解明のためChipアッセイを行い、Chk2遺伝子プロモーター領域においてヒストンK9のメチル化が亢進していること、ならびにヒストンH3,H4のアセチル化のレベルが低下していることを見出した。このことかち、放射線抵抗性リンパ腫細胞株におけるChk2遺伝子の発現抑制は、Chk2遺伝子領域におけるepigenetic制御によるものと考えられた。
台湾における外国籍配偶者の母語に関するフォーマル教育とインフォーマル教育

2019年度から外国籍配偶者の東南アジア言語を学校の義務教育段階でフォーマル教育として取り入れることが定められている。本研究では、外国籍配偶者の母語に関するフォーマル教育(学校内での制度化された教育)とインフォーマル教育の両者に焦点を当てて、潜在的なさまざまな問題や課題を明らかにする。具体的には、母語のフォーマル教育のため、学校側の具体的な準備作業やカリキュラムや授業実施などの情報を収集して校長や母語教師などにインタビューする。一方、この母語政策の契機によって、国際結婚家庭へどのぐらい影響を与えるか、家庭内の言葉使用や母語教育では、どのような変化が起きるか、インタビューを通して明らかにする。1)「台湾の『たいまつプログラム』における教育方法ー母語教育現場の教師と生徒の声ー」:生徒の母語学習時間が足りない、また、児童生徒に適切な母語教材が必要だという教師の声が高まっている。一方、「たいまつプログラム」の母語課程を受けた徒をインタビューした結果、家庭内で母語で会話する頻度が増えたりするという現状が明らかになった。2)「国際結婚家庭における母親の母語継承に関する価値観ー台湾でインタビューからみえてきた現状と課題ー」:台湾における国際結婚家庭での、東南アジア出身の母親が、家庭内でどのような意識で母語を捉えているのかインタビューから明らかにした。母親自身が母語に対して高い意識をもち積極的に継承していこうとしても、台湾の夫やその家族、あるいは、台湾社会における偏見によって葛藤している様子が浮かびあがってきた。<以下発表>3)「グローバル化による台湾の子どもの言語教育に対する一考察」:以前「たいまつプログラム」という東南アジア言語の母語教育コースでは、教材問題、教員不足、教員養成問題、生徒のやる気の問題などが教職員に指摘されている。一方、「新住民言語」の導入が、子どもの学習上の負担になるという心配が募ると考えられる。4)「台湾のマイノリティ言語教育における教師の質に関する考察」:「新住民言語」の教員養成、英語や郷土言語などの教員養成課程に比べ不十分だと考えられる。今後、小中高とも「新住民言語」課程が実施されるので、授業目的と到達目標はより明確することが必要であることが指摘された。5)「台湾における子どもの言語教育にみる外国籍配偶者の母語に関する過去と現在の変化」:「たいまつプログラム」という東南アジア言語の母語教育コースが導入されたことによって、現在使用され始めた家庭が増えてきた。一方で、授業外で勉強する場合はどうか、宿題の確認や支援などの問題が浮上すると考えられる。2018年度には、申請者は、本研究課題にかかわる様々の視点からの研究調査を行い、その後、3回の学会や研究会で発表した。それぞれは、「台湾のマイノリティ言語教育における教師の質に関する考察」、「台湾における子どもの言語教育にみる外国籍配偶者の母語に関する過去と現在の変化」、「異なる「声」をどう分析に活かすかー台湾の国際結婚における継承言語の事例からー」という各視点で本研究課題を明らかにした。また、現在、台湾における子どもの言語教育に関する現状を「グローバル化による台湾の子どもの言語教育に対する一考察」というトピックを通して、公開講演を行った。さらに、「台湾の『たいまつプログラム』における教育方法ー母語教育現場の教師と生徒の声ー」の論文が掲載されていることだけではなく、『アジアの質的心理学ー日韓中台越クロストークー』という書籍には、第11章の「国際結婚家庭における母親の母語継承に関する価値観ー台湾でインタビューからみえてきた現状と課題ー」の執筆を担当し、出版された。以上の理由で、2018年度には、本研究課題に対しておおむね順調に進展していると考える。2019年度は、以前、「たいまつプログラム」を実施した経験がある四つの小学校(都市と過疎地)を選定して、校長や行政職員や母語教師などと事前に協力の約束を取り付け、彼らを訪問する。「新住民言語」のフォーマル教育が始まる前、いわゆる準備段階では学校側の具体的な準備作業、教員採用、カリキュラム、授業の実施方法などの情報を収集する。具体的に二つの研究調査の方向から進行する。1)台湾教育部は、2019年度より、小学校における「新住民言語」選択科目が3,338クラスを開設する予定を立てた。そして、2,664名「新住民言語」教師を求めようとする。しかし、2015年の「たいまつプルグラム」という母語教育コースの終了から2019年の授業開設まで、わずかの3-4年の間、2,500名以上の専門の「新住民言語」教師という人材を養成して求めるのに、懸念があると思われる。そのため、「新住民言語」を教える教師に関する採用・教員養成、免許・資格の取得などのプロセスを明らかにすることは、一つ目の研究調査の方向を行う。2)「新住民言語」のフォーマル教育のため、それぞれの学校の関係教職員にインタビューを通して、授業の到達目標や実施方法や期待などを明らかにすることは、もう一つの研究を行う。それによって、各学校の「新住民言語」授業の実施に対する想いや態度を考察し、共通や相違なところを明らかにすることができる。一方、インフォーマル教育において、「新住民言語」の母語授業が始まった後、家庭内の母語使用状況、また、これまでの母語継承意識と行動について、どのような変化が起きるか、国際結婚家庭のメンバー(親、子どもなど)にインタビューをして、明らかにする。上記の二つ研究方向へ、2019年度の推進方策として研究を進めていきたとと考える。

本研究では、外国籍配偶者の母語に関するフォーマル教育(学校内での制度化された教育)とインフォーマル教育の両者に焦点を当てて、潜在的なさまざまな問題や課題を明らかにする。具体的には、母語のフォーマル教育のため、学校側の具体的な準備作業やカリキュラムや授業実施などの情報を収集して校長や母語教師などにインタビューする。一方、この母語政策の契機によって、国際結婚家庭へどのぐらい影響を与えるか、家庭内の言葉使用や母語教育では、どのような変化が起きるか、インタビューを通して明らかにする。1)「台湾の『たいまつプログラム』における教育方法ー母語教育現場の教師と生徒の声ー」:生徒の母語学習時間が足りない、また、児童生徒に適切な母語教材が必要だという教師の声が高まっている。一方、「たいまつプログラム」の母語課程を受けた徒をインタビューした結果、家庭内で母語で会話する頻度が増えたりするという現状が明らかになった。2)「国際結婚家庭における母親の母語継承に関する価値観ー台湾でインタビューからみえてきた現状と課題ー」:台湾における国際結婚家庭での、東南アジア出身の母親が、家庭内でどのような意識で母語を捉えているのかインタビューから明らかにした。母親自身が母語に対して高い意識をもち積極的に継承していこうとしても、台湾の夫やその家族、あるいは、台湾社会における偏見によって葛藤している様子が浮かびあがってきた。<以下発表>3)「グローバル化による台湾の子どもの言語教育に対する一考察」:以前「たいまつプログラム」という東南アジア言語の母語教育コースでは、教材問題、教員不足、教員養成問題、生徒のやる気の問題などが教職員に指摘されている。一方、「新住民言語」の導入が、子どもの学習上の負担になるという心配が募ると考えられる。4)「台湾のマイノリティ言語教育における教師の質に関する考察」:「新住民言語」の教員養成、英語や郷土言語などの教員養成課程に比べ不十分だと考えられる。今後、小中高とも「新住民言語」課程が実施されるので、授業目的と到達目標はより明確することが必要であることが指摘された。5)「台湾における子どもの言語教育にみる外国籍配偶者の母語に関する過去と現在の変化」:「たいまつプログラム」という東南アジア言語の母語教育コースが導入されたことによって、現在使用され始めた家庭が増えてきた。一方で、授業外で勉強する場合はどうか、宿題の確認や支援などの問題が浮上すると考えられる。2018年度には、申請者は、本研究課題にかかわる様々の視点からの研究調査を行い、その後、3回の学会や研究会で発表した。それぞれは、「台湾のマイノリティ言語教育における教師の質に関する考察」、「台湾における子どもの言語教育にみる外国籍配偶者の母語に関する過去と現在の変化」、「異なる「声」をどう分析に活かすかー台湾の国際結婚における継承言語の事例からー」という各視点で本研究課題を明らかにした。
進化分子工学を利用した蛍光性ＲＮＡの獲得

本研究では、ランダム配列を有するRNAライブラリーを細胞内で発現させ、蛍光性の細胞を取得することによって、生体内で自発的に蛍光を発する新規RNA配列を獲得することを目指す。細胞内の蛍光性分子FMN(フラビンモノヌクレオチド)と結合するRNA群をin vitroで作成し、大腸菌内で発現させた。10000000クローンについて蛍光特性を解析したものの、現時点では蛍光性RNAを獲得できていない。RNAライブラリーとしては、ランダムなRNA配列50-100塩基程度を有する短いRNA配列を用いる。初めに、細胞内でRNAを発現させる系として、大腸菌内にてRNAを大量に発現させる系を検討した。従来の報告例をもとに大量にタンパク質を発現するpETシステムをベースに種々の検討を行ったが、RNAの発現量が少ないことから、当初計画の変更を余儀なくされた。そこで別の文献例などを参考に、別のRNA発現系を検討する事にした。プロモーターには恒常的に発現するlppプロモーター、構造足場(スキャフォールド)としてtRNAを用いた。tRNA(Met)およびtRNA(Lys)をスキャフォールドとして短いRNAを発現させたところ、特にtRNA(Lys)において大量にRNAを発現させられる事が分かった。大腸菌の5S rRNAよりも多く、10000分子/細胞以上のRNA発現が見られており、今後はこの系を使ったライブラリーの構築を行う。さらに、蛍光性のRNAとして機能が発揮されるためには、エネルギー的に比較的安定な構造を取る必要があるものと考えられる。そこで、完全にランダムな配列を出発点として進化分子工学を行うのではなく、ある程度の安定性を有する構造を出発点として、ライブラリーを作製する。安定性を有する構造としては、G-quadruplesや細胞内の低蛍光性低分子に結合するRNA分子群を想定し、進化分子工学を行う。実際には、RNA自体が構造変化によって蛍光を発する可能性は極めて低いものと考えられる。そこで、完全にランダムな配列を出発点として進化分子工学を行うのではなく、限定的なスキャフォールドを出発点として、ライブラリーを作製する。まず、細胞内でRNAを発現させる系としては、大腸菌内にてRNAを大量に発現させる系を検討した。当初、誘導型のT7RNAポリメラーゼを利用したRNA発現系によりステム-ループ型RNAの発現を試みたが、発現量が少ないことが確認された。そこで、恒常的に発現するプロモーターを使用し、細胞内で安定的にRNAが蓄積できるように周辺配列としてtRNAを用いた。tRNA(Lys)を周辺配列として短いRNAを発現させたところ、1細胞あたり10000分子以上のRNAを発現できる事を確認した。次に、細胞内において普遍的に存在する蛍光性低分子のFMN(フラビンモノヌクレオチド)に結合するRNAのライブラリーをスキャフォールドとすることとした。in vitroセレクションの手順を3回繰り返すことによって、固相化したFMNに親和性の高いRNAライブラリーを取得し、これをスキャフォールドとして用いた。最終的に、FMN親和性RNAライブラリーをtRNAのアンチコドン領域に挿入し、大腸菌内で発現させた。約10^7の大腸菌クローンについて、フラビン含有培地において蛍光特性の変化を解析したが、現状では有為な蛍光変化が生じたクローンは見つかっていない。今後、出発ライブラリーサイズの増加や、FMN以外の蛍光性低分子について検討が必要であると思われる。本研究では、ランダム配列を有するRNAライブラリーを大腸菌内で発現させ、蛍光性の大腸菌を取得することによって、生体内で自発的に蛍光を発する新規RNA配列を獲得することを目指す。始めに、大腸菌内で短いRNAを高発現させる系の検討を行った。大腸菌内にて大量の遺伝子を発現させる最も有名な系としては、pETシステムが知られている。pETシステムでは、T7 RNAポリメラーゼをコードする大腸菌株BL21(DE3)とT7プロモーターを搭載したプラスミドを利用する。そこで短いRNAを発現する様に新規設計したプラスミド(pT7-Z)を用いて、BL21(DE3)に形質転換し、IPTGにて発現誘導を行った。しかしながら、種々条件において目的の短いRNAの発現が見られなかった。大腸菌内でのRNAの分解が原因と考えられたため、RNA分解酵素変異株であるBL21(DE3)Star株を用いてさらに条件検討をおこなったが、目的の短いRNAの発現はほとんど見られなかった。そこで文献例などを参考に、別のRNA発現系を検討する事にした。tRNAは大腸菌内においてRNA分解酵素から逃れる事が知られており、tRNAと融合させた短いRNAは、大腸菌内にて蓄積される事が期待される。

tRNA(Met)およびtRNA(Lys)をスキャフォールドとして短いRNAを発現させたところ、特にtRNA(Lys)において大量にRNAを発現させられる事が分かった。大腸菌の5S rRNAよりも多く、10000分子/細胞以上のRNA発現が見られており、今後はこの系を使ったライブラリーの構築を行う。従来の報告例をもとに大量にタンパク質を発現するpETシステムをベースにRNA発現系の検討を行ったが、実際にはRNAの発現量が少なく、別のRNA発現系の検討を余儀なくされた。また、研究所内の職制が変更されたことに伴い、研究以外の業務が著しく増加したため、研究に割ける時間が減ってしまった。大腸菌内でRNAを大量に発現させる系の検討にやや時間を取られたが、その分、期待以上の系を作製する事ができた。今後は予定通り、ライブラリーの構築とスクリーニングを進めて行く。引き続き、ランダム配列を有するRNAライブラリーを大腸菌内で発現させ、蛍光性の大腸菌を取得することによって、生体内で自発的に蛍光を発する新規RNA配列を獲得することを目指す。ある程度の安定性を有する構造を出発点として、ライブラリーを作製する。具体的には、フラビン類などの細胞内蛍光性低分子に結合するRNA分子群を試験管内にて取得し、これを進化分子工学の出発点とする。RNA高発現系をベースとして、大腸菌内でランダムなRNA配列を発生させ、蛍光性の大腸菌を取得する。同時並行で、細胞内微蛍光性低分子と結合するRNAをSELEXにより取得したものを初期構造として、上記スクリーニングを行う。RNAライブラリーを試験管内で構築し、大腸菌内で発現させ、生体内で自発的に蛍光を発する新規RNA配列を獲得するために必要となる試薬消耗品を購入する。また関連する研究について、学会にて情報収集するための旅費を計上する。上記計画研究のために、試薬消耗品費、学会参加および旅費を計画した内訳の中で執行する。
酸化的ストレスおよびレドックス変化によるヘムオキシゲナーゼ誘導への情報伝達機構

ヘム分解の律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO)の二つの分子種の内,HO-1は酸化的ストレスに対する生体側応答の重要な指標とも考えられている.我々は,グルタチオン低下剤であるフォロンがHO-1遺伝子発現を引き起こすに際して転写因子であるAP-1のDNA結合活性の上昇を介すること、またこの活性化には,肝臓のグルタチオン減少が深く関与している知見を得ていた。平成9年度には,フォロンによるグルタチオン減少が,Jun N-terminal Kinase(JNK)活性化を引き起こし,続いてAP-1結合活性上昇,最終的にHO-1遺伝子転写活性上昇へと収束することを明らかにした.急激なグルタチオン減少の結果生じた酸化的ストレスが何らかの内因性ストレス関連因子を誘発させ,その結果JNK活性化など一連の情報伝達が活性化されている可能性も否定できない.そこでストレス性のサイトカインであるIL-1に着目し,グルタチオン減少により生ずるHO-1誘導にIL-1が関与しているかノックアウトマウスを用いて検討した.IL-1α,βノックアウトマウスにフォロンを投与しその4時間後に肝臓、腎臓、肺でのHO-1遺伝子発現を検討したところ、いずれの臓器においてもコントロールマウスとほぼ同程度のHO-1遺伝子発現が認められた。この事は、フォロンによるHO-1遺伝子発現誘導作用には、少なくともIL-1は関与していないことが示唆された。ところで、エンドトキシンlipopolysaccharide(LPS)は、マクロファージ活性化やサイトカイン産生など様々な生理活性をもつ。LPSによるHO-1誘導は、LPSにより産生されたIL-1が引き金となって生じると報告されている。そこで、IL-1ノックアウトマウスを用いてLPSによる効果を検討したところHO-1遺伝子発現は対照動物と同様に認められ、必ずしもIL-1のみを介したpathwayだけがHO-1遺伝子発現に働いているわけではないことが明らかになった。GSH低下剤フォロンによるHO-1遺伝子発現は転写因子AP-1が関与しているが、本年度はフォロンによるGSH低下がこのAP-1のDNA結合活性上昇に寄与しているのかについてラットを用いて検討した。GSH合成阻害剤であるBSO前投与は、フォロンにより生じたラット肝臓のGSH減少をさらに減少させた。この時、HO-1とc-jun遺伝子発現およびAP-1結合活性はフォロン単独投与の場合より増強されていた。次にフォロンによるGSH減少緩和の目的で、GSHイソプロピルエステル(GIP)を前投与して同様の検討をした。GIP前投与は、フォロンによる肝臓のGSH減少を緩和させた。この時、HO-1とc-jun遺伝子発現およびAP-1結合活性はフォロン単独投与の場合より減弱されていた。以上のことより、フォロンによるHO-1およびc-jun遺伝子発現は、本化合物により生じたGSH減少が転写因子AP-1のDNA結合活性を促進していることが明らかになった。次にAP-1の構成一因子であるJunタンパクのリン酸化(Ser73)に注目した。フォロンは、ラット肝臓においてリン酸化Junタンパク量を増加させた。BSOやGIPの前処置はこのフォロンによるリン酸化Junタンパク量をそれぞれ増強、減弱させた。この様に、フォロンによるGSH減少はJunタンパク質をリン酸化させることが明らかになったので、リン酸化酵素Jun N-Terminal Kinase(JNK)の活性を測定した。フォロン投与30分後よりわずかに活性上昇が認められ、2時間後には著しいJNK活性上昇が認められた。以上の結果、フォロンによるGSH低下はJNKへと細胞内シグナルが伝わり、Junタンパクリン酸化、AP-1結合活性上昇そしてターゲット遺伝子発現を導くことが明らかになった。HO-1は、酸化的ストレスが原因と考えられているような様々な病態とも関連している酵素である。そこで来年度は病態におけるHO-1の役割について検討を進める。そこで、IL-1ノックアウトマウスを用いてLPSによる効果を検討したところHO-

1遺伝子発現は対照動物と同様に認められ、必ずしもIL-1のみを介したpathwayだけがHO-1遺伝子発現に働いているわけではないことが明らかになった。
排他的国民教育から包摂的市民教育への質的、制度的転換の模索－欧州審議会の教育支援

また、欧州審議会(The Council of Europe、ストラスブール)のPestalozzi事務局を訪問し、このプログラムの責任者であるJ.フーバー氏らにインタビューを行い、欧州審議会の先導する包摂的市民性教育、異文化間教育に関わる理論的課題を確認すると共に、欧州審議会におけるこの分野の関係資料を収集した。また、10月には、ドイツ連邦政治教育センターへの訪問調査、資料収集を行うとともに、デュッセルドルフでの移民支援NGOの指導員(シュミット氏)に対して、移民支援に携わる教員研修プログラムに関するインタビュー調査、さらにブレーメン大学教授カラカソグルー氏への訪問・インタビューを行い、ドイツにおける新しい市民性教育に関する理論的到達点を確認し、研究資料の収集を行った。初年度の調査研究では、こうした訪問調査、資料収集により、市民性教育等に関するヨーロッパ地区での最新の知見を得、同時に多くの貴重な資料を収集することができた。当初から予定していた、包摂的市民性教育に関する研究者、国際機関(欧州審議会・欧州評議会、Council of Europe)、ドイツ政治教育センター等への訪問、資料収集を行うことができたこと、さらに当該分野の研究員、大学所属の研究者へのインタビュー調査、研究交流を実施することにより順調に資料収集ができている。また、文献資料だけで無く、国際機関や大学で作成されている資料、報告書等、出版によらない研究資料の入手も進んでおり、研究テーマである市民性教育の資料が調いつつある。さらに、研究テーマに関連するワークショップや研究会に実際に参加できたことで、実践家の持っている課題意識、具体的な事例を収集することができていることは、現地調査の成功の故であると評価できる。基本的には計画段階で予定していた研究を進めていくことで成果が得られると考えている。すなわち、初年度として、基礎資料や知見の収集が順調に進んでいることから、引き続き、関連する国際機関や研究機関を訪問し、当該分野の最先端の動きを確認し、新しい知見を見いだすために資料の補充を行う。また、この間に培ってきた研究者とのネットワークを活かして、知見の革新、資料の収集を行う。また、海外の事例を集めるだけで無く、関連分野の研究団体の主催する研究大会に参加し、研究発表を行うなどして知見の交流を行い、日本社会の市民性教育、教員養成に関連、示唆を得ることのできる知見を深めるよう試みる。
Lats1キナーゼを介した新規EMT-MET制御機構の解明

がんの転移過程において、上皮間葉転換(EMT)と間葉上皮転換(MET)は重要なステップである。様々なEMTのメカニズムが報告されているが、間葉系の表現型を維持する機構については不明な点が多い。今回我々はHippo pathwayの構成因子であるLATS1キナーゼが、高悪性度の間葉系様乳癌細胞(MDA-MB-231細胞)において、ZEB1のS939をリン酸化し、E-cadherin (上皮マーカー)の発現を抑制することで、間葉系の維持を促進することを明らかにした。Lats1はHippo pathwayのなかでも中心的な役割を担うSer/Thrキナーゼであり、Hippo pathwayが上皮細胞におけるEMTを制御することは報告されてきたが、間葉系細胞においてその役割は不明であった。そこで、申請者らは悪性度の高い間葉系様乳がん細胞であるMDA-MB-231細胞においてLats1をノックダウンしたところ、上皮マーカーであるE-cadherinの発現が上昇するというMET様の現象を見出し、さらにE-cadherinの転写調節をおこなうZEB1、RbをLats1がリン酸化することを明らかにした。これにより、間葉系様乳がん細胞ではHippo pathwayとは別に、ZEB1、Rbのリン酸化を介したE-cadherinの発現制御機構があると予測されたためその新規EMT-MET制御機構を明らかにする目的で、平成27年度は1Lats1によるZEB1、Rbのリン酸化部位の決定とリン酸化抗体の作製2MDA-MB-231におけるHippo pathwayのかかわり3非リン酸化型およびリン酸化模倣型変異体の作製とE-cadherin発現調節への寄与を確認した。1の結果Lats1がリン酸化する部位をそれぞれ一か所ずつ決定でき、特異的リン酸化抗体の作製が完了した。2ではMDA-MB-231細胞において各種タンパクのノックダウンによってMst2-Lats1-Yap経路はほとんど機能していないことが明らかとなった。3の結果、ZEB1非リン酸化型変異体の導入によってE-cadherinが上昇し、リン酸化模倣型変異体の導入によってE-cadherinの発現が減少した。以上の結果から、悪性度の高い間葉系様乳がん細胞においては、Hippo pathwayとは別の経路、Lats1-ZEB1経路によってE-cadherinの発現が調節されていることが明らかとなった。新規に決定したリン酸化部位に対する抗体を作製したところ、その品質が極めて優良で、組織染色にも使用できることがわかった。この結果をふまえ、臨床検体を用いて組織染色を行う段階にまで至っており、予想以上に良い結果を得始めている。また、本研究の成果を2015.12.14に開催された分子生物学会生化学会合同大会において口頭発表したところ、若手優秀発表賞に選出された。以上のことから、当初の計画以上に進展しているといえる。Hippo pathwayは、細胞増殖に関わる遺伝子の転写を抑制するシグナル経路で、がんにおいてこの経路が破綻している場合が数多く報告されている。Hippo pathwayで中心的な役割を担う因子が、LATS1, LATS2キナーゼである。一方でLATS1/2はHippo pathway非依存的に、様々な基質をリン酸化することによって細胞周期、DNA損傷応答などを制御している点で、がんにおいて重要な因子であると考えられる。申請者は昨年度までに、LATS1/2の新規基質としてZEB1(CDH1の転写抑制因子)を発見し、高悪性度の間様系様乳がん細胞(MDA-MB-231細胞(MM-231))において、LATS1によるZEB1のリン酸化がCDH1の発現抑制を亢進させることを明らかにしており、LATS1が間様系細胞の性質(CDH1の発現量が低い)を維持するために必要であることを予測していた。今年度は、リン酸化ZEB1がCDH1の転写抑制に寄与するメカニズムを明らかにするため、リン酸化ZEB1のタンパク安定性について検討した。MM-231にZEB1リン酸化模倣型変異体とZEB1非リン酸化型変異体を導入し、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを添加した結果、ZEB1リン酸化模倣型変異体は非リン酸化型変異体よりもタンパク安定性が高いことが明らかとなった。さらに、MM-231を用いてLATS1をノックダウンすると、内在性のZEB1タンパクが不安定となった。以上より、LATS1/2によるZEB1のリン酸化は、タンパク安定性を亢進させ、CDH1の転写抑制を行うことが明らかとなった。さらに、悪性度の高い乳がん患者では悪性度の低い患者よりも、ZEB1のリン酸化が亢進していることも明らかとなり、高悪性度の乳がんにおいてはZEB1のリン酸化が悪性度の維持に重要であることが示唆された。

平成27年度の結果をふまえ、平成28年度では1ZEB1のリン酸化の意義を詳細に解析すること、2ZEB1のリン酸化が実際の乳癌患者においての発現がみられるか、また悪性度の違いによって差がみられるかどうか、3マウスモデルの作製を試みる予定である。さらに4乳癌細胞だけではなく、他の癌種(口腔癌・悪性中皮腫など)においてもZEB1のリン酸化状態を確認する。これまでにLats2がSnailをリン酸化し、そのタンパク安定性を制御するという報告があるので、1についてはZEB1のリン酸化がタンパク安定性に寄与するかどうかを優先的に確認する予定である。その他に、リン酸化部位がZnフィンガーのリンカー部分であることから、DNAの結合能にも影響することが予測されるので、そちらも考慮する。総合生物
低酸素応答性転写因子HIF-1αの癌診断・治療への応用

申請者らは,HIF-1α蛋白の酸素分圧応答性蛋白質分解領域(ODDDまたはN-TAD)を同定し,その機能的構造について詳細に検討してきた。これらの結果をもとにして,ヒト検体においてHIF-1α遺伝子に機能的変化を伴う多型が存在するか,口腔癌患者および対照健常者検体を用いてN-TADをコードするHIF-1α遺伝子exon12領域における遺伝子多型をDHPLC法やSequence法にてスクリーニングした。その結果,582番目のProlineがSerineへ置換するP582S型アリルと588番目のAlanineがThreonineに置換するA588T型アリルを有する遺伝子型が見出された。それぞれの遺伝子型HIF-1α発現ベクターを作製し,COS7細胞に一過性に発現させ,HRE誘導Luciferaseレポーター実験にて検討したところ,興味深い事に,アミノ酸置換型HIF-1α蛋白は,野生型に比べて非常に強い転写活性化能を示した。分子病理および疫学的解析により,活性型の遺伝子アリルを持つ患者(ヘテロ)の腫瘍は,野性型(ホモ)に比して,有意に多くの腫瘍内血管を有すること,初診時腫瘍径が大きいことが明らかとなった(現在投稿中)。以上より,HIF-1α遺伝子の転写活性化能に違いが認められる遺伝子多型が固形癌の血管新生,増殖や進展に関与することが示唆され,HIF-1α遺伝子多型が癌の診断に,そしてHIF-1α機能制御が癌の制御に結びつく可能性が示された。現在,HRE-Luciferaseレポーター実験のシステムを用いて,HIF-1α機能を標的とした薬剤のスクリーニングを行っており,今後のそれら薬剤の口腔癌細胞へおよぼす影響を,in vitro実験系により解析し,臨床化学療法,さらに予防への応用展開を目指している。我々は,HIF-1α蛋白の酸素分圧応答性蛋白質分解領域(oxgen-dependent degradation domain ; ODDD)を同定し,その機能的構造について詳細に検討してきた。これらの結果をもとにして,ヒト検体においてHIF-1α遺伝子に機能的変化を伴う多型が存在するか,口腔癌患者検体を用いてODDDをコードするHIF-1α遺伝子exon12領域における遺伝子多型をスクリーニングした。広島大学医学部ヒトゲノム研究倫理審査委員会において承認された,口腔癌患者55名より採取,保存されている末梢血単核球由来genomic DNAを鋳型とし,特異的PrimerによりHIF-1α遺伝子exon12領域を増幅した。遺伝子多型のスクリーニングは,最近開発されたdenaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)法を用いて行った。その結果,14名(25.5%)に遺伝子多型の存在が示唆された。DHPLC法の有用性も合わせて検討するため,全ての検体についてDirect-Sequenceを行い,塩基配列の確認をした。その結果,DHPLC法で遺伝子多型が示唆された検体全てにおいて,アミノ酸置換を伴う多型を新たに見いだした。それらは,582番目のProlineがSerineへ置換するtype I(18.2%)と588番目のAlanineがThreonineに置換するtypeII(7.3%)に大別された。臨床病理学的解析の結果,HIF-1α機能制御に遺伝子多型等の遺伝子側要因が関わり,それによる機能亢進が腫瘍増殖に関わっている可能性が示唆された(現在投稿中)。現在,in vitro実験系を用いたHIF-1α変異体の機能解析が進行中である。

これらの結果をもとにして,ヒト検体においてHIF-1α遺伝子に機能的変化を伴う多型が存在するか,口腔癌患者および対照健常者検体を用いてN-TADをコードするHIF-1α遺伝子exon12領域における遺伝子多型をDHPLC法やSequence法にてスクリーニングした。その結果,582番目のProlineがSerineへ置換するP582Sと588番目のAlanineがThreonineに置換するA588T遺伝子型が見出された。それぞれの遺伝子型HIF-1α発現ベクターを作製し,COS7細胞に一過性に発現させ,HRE誘導Lucferase reporter assayにて検討したところ,興味深い事に,アミノ酸置換型HIF-1α蛋白は,野生型に比べて非常に強い転写活性化能を示した。分子病理および疫学的解析により,活性型の遺伝子アリルを持つ患者(ヘテロ)の腫瘍は,野性型(ホモ)に比して,有意に多くの腫瘍内血管を有すること,初診時腫瘍径が大きいことが明らかとなった(現在投稿中)。以上より,HIF-1α遺伝子の転写活性化能に違いが認められる遺伝子多型が固形癌の血管新生,増殖や進展に関与することが示唆され,HIF-1α遺伝子多型が癌の診断に,そしてHIF-1α機能制御が癌の制御に結びつく可能性が示された。