hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有限群のベキ零部分群複体と付随するクイバーの表現

その応用として,一般指標の間に成り立つ合同式を新たに証明した.以上の研究成果は数学専門誌に現在投稿中である.異なる素数p, qに対してp-部分群複体とq-部分群複体の関係を調べることが,本研究の目的の一つである.そのための手段として,有限群Gの非自明なベキ零部分群全体N(G)からなる部分群複体が極めて重要であると我々は考えている. 29年度の研究では,その足掛かりとして,有限非可解群Gに対するホモロジーHn(N(G))の構造を決定した.ホモロジーは複体に付随する基本的な量であり,即ち,基礎となる情報の収集が順調であることを示している.一方,上記の事柄と平行して, p-ブラウアー指標とq-ブラウアー指標の関係を調べることも極めて重要な研究課題である. 29年度の研究では,一般p-ブラウアー指標全体からなる指標環の概念を含む, cf(Ln(G))やBn(G)を新たに導入した.これによりp- q-ブラウアー指標を同時に考察することが出来る数学的な足場が整えられたことになる.以上の理由から本研究は概ね順調に進展していると判断するものである.本研究の主対象は,有限群の非自明なベキ零部分群全体からなる部分群複体である.まず一つの素数pに対するp-部分群複体の研究成果は筆者のものも含めて多数存在している.次の段階は,異なる素数p,qに対してp-部分群複体とq-部分群複体を同時に考察し,それらを比較することである.そこでp-部分群の自然な拡張であるベキ零部分群に着目するのである.同じ考え方により,有限群Gのp-表現とq-表現を同時に考察し,それらを比較することも関連する重要な研究課題である.以上を踏まえて, 30年度はp-ブラウアー指標環Z[IBrp(G)]を取り扱った.Z[IBrp(G)]と一般指標環Z[Irr(G)]を介して,対応する分解行列,射影指標,カルタン行列などの基本的な数学的対象がある.そこでZ[Irr(G)]を経由してZ[IBrp(G)]とZ[IBrq(G)]を結ぶ行列Mでカルタン行列の類似物を新たに導入した.ここで言う類似物とは,カルタン行列の拡張概念ではなく,カルタン行列と同じ考え方で定義した行列ということである.行列Mはクイバーの表現を用いて定式化出来る.即ちさらなる一般化の余地を残している.具体的な研究成果としてMの全ての成分は群Gのシローp-部分群の位数で割り切れることを証明した.さらにMの固有値とその固有空間を全て決定した.行列Mに関する研究をもう少し掘り下げた後に,全てをまとめた結果を研究論文として数学専門誌に投稿する予定である.p-複体とq-複体,或いはp-表現とq-表現を同時に考察し,その二つを比較したい.その足掛かりとしてp-ブラウアー指標環Z[IBrp(G)]とq-ブラウアー指標環Z[IBrq(G)]を結ぶ行列Mでカルタン行列の類似物を導入することが出来た.このことは今後の研究に大きな推進力を与える.通常のカルタン行列はその単因子とp-ブロックの不足群Dなどが関係している.このDはGのRadical p-部分群であり, p-複体の理論に於いて中心的な役割を果たす部分群である.一方,本研究課題の中で,我々はRadical p-部分群複体Bp(G)の拡張Lπ(G)を既に導入している.そこでMとLπ(G)に属する部分群との関係にも大きな興味が注がれる.以上の理由から,本研究は概ね順調に進展していると判断するものである.29年度の研究成果を踏まえて, N(G)やそれに関連する複体の可縮性やホモトピーの性質を追求する.特にp-部分群複体の可縮性はクイレン予想として良く知られている.そこで,一般に素数の集合πに対してπー部分群複体やベキ零πー部分群複体の可縮性を考察し,同時にそれらとホモトピー同値になるような極小部分複体を特定する.加えてp-複体とq-複体の貼り合せを数学的に考察する.一方, 29年度の指標に関する研究では,一般指標環Z[Irr(G)]をLn(G)で制限したcf(Ln(G))の部分環Bn(G)を取り扱った. Ln(G)は見方を変えれば,一変数の群G上の方程式X^n=1の解集合である.
超微小逆位配列をマーカーとして用いる新しいゲノム進化学の構築

本研究は、ゲノムに起こる超微小逆位が生物に普遍的な現象であるかを検証するとともに、超微小逆位の現象を実験的に検証し発生頻度を測定することを目的とする。まず、計算機を用いて真核生物、古細菌、真正細菌の10系統について近縁種間や株間で比較ゲノム解析を行ったところ、10系統全てにおいて超微小逆位が同定された。したがって、超微小逆位は生物に普遍的なゲノム構造変化であることが強く示された。次に、マウスの超微小逆位のホットスポット候補領域について多数のマウス精子のゲノム配列を決定することにより、超微小逆位の発生頻度の測定を試みた。この解析は現在進行中であり、成果は論文等で発表予定である。まず、真核生物、古細菌、真正細菌の9系統のゲノム配列データを公共データベースから取得し、近縁種間や株間の全ゲノムアラインメントを作成して超微小逆位を探索したところ、9系統全てにおいて超微小逆位が同定された。この結果から、超微小逆位は生物に普遍的なゲノム構造変化であることが強く示された。次に、17系統のマウスの全ゲノムならびにマウスのがん組織のゲノムの全配列データを比較解析することにより、超微小逆位のホットスポットと考えられる領域を360カ所同定した。これらのホットスポット領域に実際に起きた超微小逆位を検出するため、多数のマウス精子ゲノムからホットスポット領域のゲノム配列を次世代シーケンサーで解読する実験を試みた。本研究の配列解析から、生殖系列での減数分裂が超微小逆位を起こすメカニズムの有力な候補に挙げられている。そこで、野生型マウスおよび減数分裂の表現型の変異を持つマウスの精子を用い、150カ所のホットスポット領域のゲノム配列を次世代シーケンサーで解読した。現在は以上の結果を論文発表すべく、実験結果の計算機による解析を進めている。これと並行して、ゲノム配列データから超微小逆位を検出するための計算機プログラムを改良し、より高い精度とともに、次世代シーケンサーを用いた解析に適する処理速度を得ることに成功した。以上の超微小逆位に関する研究成果は、2013年10月のCold Spring Harbor LaboratoryのGenome Informatics会議や、2014年3月の生殖系列の新規変異に関する国際シンポジウムにて、発表した。本研究では、バクテリアからヒトまでの広範な生物種のゲノム配列データの計算機解析により超微小逆位を同定し、超微小逆位が普遍的な進化現象であるという仮説を検証する。次に、超微小逆位および近傍領域の配列と構造の特徴を精査し、精子ゲノムに対するリシークエンスを通じてde novo超微小逆位を同定することにより、超微小逆位が生じる分子機構を解明する。以上を通じて、全く新しい分子進化・集団遺伝マーカーである超微小逆位の生物学的意義を明らかにし、同時にゲノム最小レベルの構造変化が生物進化にどのような影響を与えたかを明らかにすることをめざす。平成24年度は、計算機による高精度な超微小逆位検出法の開発を行った。申請者らが以前に開発した逆位同定プログラムを全面的に改良し、最小レベルの配列長(5-7 bp)をもつ逆位の同定精度を高めた。ここでは、逆位を考慮したペアワイズアラインメントのためのソフトウエアを新たに作成し、逆位ペナルティなどの超微小逆位を同定するための最適なパラメータ設定を決めた。このプログラムの精度評価を計算機シミュレーションにより実施し、擬陽性が著しく減少されることを確認した。このプログラムを用いて、バクテリアからヒトまでゲノムが解読されているさまざまな系統の近縁種群および種内集団に超微小逆位を同定した。その結果、大腸菌、酵母、ハエ、イネ等を含め、調べた全ての系統で近縁種アラインメント内に超微小逆位がみつかった。これにより、超微小逆位が幅広い生物に普遍的な現象であることを示すことができた。また、超微小逆位のホットスポット候補領域の探索を試みた。研究代表者が平成24年度中に研究機関の移動を行ったことにより、研究の進展がやや遅れた。前年度の遅れを取り戻し、研究を加速していく。特に以下の2点を実施する。(1)超微小逆位が生じる生成機構の解明超微小逆位の配列および近隣領域のゲノム構造を解析し、バクテリアからヒトまで普遍的なあるいは系統特異的な配列・ゲノム構造を抽出する。具体的には、超微小逆位および近隣領域に特異的な塩基組成、保存モチーフ、配列構造、染色体における位置、転移因子等を同定する。

また、申請者らの最近の研究で示された「超微小逆位とゲノム構造の不安定性との相関」が普遍的特徴であるかを検証する。そして、あらゆる生物に共通な超微小逆位を特徴づける配列構造に基づいて、超微小逆位が起きる可能性が最も高い領域を特定する。さらに公共データベース中のゲノム配列データによる検証を行い、超微小逆位のホットスポット候補領域を絞り込む。(2)超微小逆位が生じる生成機構の解明前年度に引き続き超微小逆位の生成機構に関する解析を実施する。特に、超微小逆位が実際に起きていることを実験的に証明するため、マウスゲノムにおける超微小逆位のホットスポット候補領域について、マウス体細胞ゲノムと精子ゲノムを用いてターゲットリシークエンスし、精子ゲノムに起きたde novo超微小逆位を同定してその発生頻度を推定する。超微小逆位の多くはショートリードの1配列内に収まると考えられるため、次世代シークエンサを用いた大規模解析を行う。超微小逆位のホットスポット候補領域に対象を絞り込んで精子ゲノムの大量配列決定を行うことにより、1世代間での比較による超微小逆位を観察する。本解析のサンプル調整およびターゲットリシークエンスには、受託解析サービスを用いる。次年度は特に超微小逆位のホットスポットの特定のための情報解析と、ゲノム配列決定実験による逆位の同定のために予算を使用する計画である。また、研究成果の発表のための論文投稿費や研究発表旅費としても使用する。なお、研究分担者に次年度予算の一部を配分する。
Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　ｃｏｍｐｌｅｘに内在する低温耐性の解明と低温耐性Ｃ４作物改変

サトウキビ、ススキおよび両者の雑種であるミスケーンのそれぞれの植物体を低温処理し、葉のサンプルからRNAを抽出・シークエンスを行い、遺伝子発現に関するトランスクリプトームデータを解析した。NOIseqソフトで発現変動遺伝子(DEGs)を検出した。2倍以上で確率0.8以上を有意なDEGsとした。Rのphyperソフトを用いて遺伝子オントロジーと経路を決めた。false discovery rate (FDA)が0.001以下を、遺伝子として同定した。その結果、低温によるDEGsを同定し、シグナルトランスダクションおよび低温環境適応遺伝子を明らかにできた。雑種ミスケーンにおいて1,061個のDEGsは低温環境に適応するものであった。ミスケーン、サトウキビの低温環境に関するDEGsは、それぞれ、963個、856個であった。ストレス応答に関連する転写因子、WRKY, NAC, MYB, HSFのDEGsを同定した。これらの転写因子は低温ストレス応答性を示すものであった。ABA非依存低温シグナルトランスダクション経路、ABA代謝合成経路、C4光合成経路における遺伝子発現に関して、ミスケーンはススキと同じ挙動を示した。これらの遺伝子転写量の高発現は低温耐性を強化するものとして考えられた。定量リアルタイムPCR解析から、光合成経路の一つ、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ(PPDK)の転写パターンに関して、ミスケーンはススキと同様に高い遺伝子発現を示した。そのため、ミスケーンは低温環境での光合成量が多いのは、ススキ由来のPPDK遺伝子が少なくとも関与していることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。わが国在来種であるススキ属は、C4植物の中で最も低温環境に適応し、低温下での光合成能力が高いなどの優れた特性を有するが、そのメカニズムの全貌はいまだに明らかにされていない。そこで、ススキ属の中で特に低温耐性に優れるオギと低温適応性のない代表的なC4植物のサトウキビ品種との間で作出した属間雑種個体(ミスケーン)およびオギとススキの両親系統を供試し、RNA sequencing (RNA-seq)によるトランスクリプトーム解析を行った。オギ(系統:都城)、サトウキビ(KR06-139)およびミスケーン(JM14-72)の個体を株分けし、ポットに移植し、温室で生育させた。各供試系統は3個体とした。人工気象器にポットを移して生育させた。常温処理(26°C/18°C、14h明/10h暗)と低温処理(15°C/10°C、14h明/10h暗)を設けた。幼齢の葉を採取してRNAを抽出し、IlluminaのTruSeq Stranded Total RNAサンプル調製キットの手順に従って、RNAライブラリー調製を行った後、Illumina HiSeqでシークエンスを行った。RNAシークエンスの結果、163.41Gb塩基対をリードし、アセンブルにより、207,033個のunigeneを得た。Unigeneの全長、平均長、N50、GC量は、それぞれ248.821,469bp、1,201bp、1,871bp、51.3%であった。Unigeneをアノーテーションしたところ、ソルガム(64.3%)、トウモロコシ(14.7%)、アワ(7.0%)、イネ(2.6%)であった。ミスケーンではサトウキビ由来遺伝子が110,942個、オギ由来遺伝子が71,567個であった。現在、低温シグナル伝達因子等の低温耐性関連遺伝子の発現量にについて、オギ、サトウキビ、ミスケーンの各系統間での違いを解析中である。ススキ属植物で低温耐性に優れるオギと低温耐性に劣るサトウキビ品種の雑種(ミスケーン)について、当初の計画通り、植物体の低温処理法ならびに最適RNA抽出法とRNAライブラリー調製法を確立することができた。抽出したRNAから調製したRNAライブラリーはIllumina HiSeqでシークエンスができて、低温耐性遺伝子に関するトランスクリプトーム解析できる多くのunigenesが得られた。

定量リアルタイムPCR解析から、光合成経路の一つ、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ(PPDK)の転写パターンに関して、ミスケーンはススキと同様に高い遺伝子発現を示した。そのため、ミスケーンは低温環境での光合成量が多いのは、ススキ由来のPPDK遺伝子が少なくとも関与していることが示唆された。シークエンスされたデータを整理して、配列データを解析ソフトで処理する。既存ゲノム情報を活用しながらリファレンスゲノムへのアライメントを行う。供試サンプル間で、リード数を数え、正規化した数値をもとに統計検定を行い、発現差異を調べる。アノーテーションと遺伝子オントロジーデータベースを利用しながら、低温条件で活性する遺伝子群を明らかにする。代謝産物に関わる候補遺伝子群をリスト化する。これらの一連のトランスクリプトーム解析から、ススキ属において低温適応性を強化している遺伝子群を研究終了時までに明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
新規開発した自然発症てんかんラットの長期維持法とその薬理学的応用法の確立

自然発症てんかんラット(SER:zi/zi,tm/tm)はkyo:wistarラット由来のtremorラットヘテロ型(tm/t)とSD系ラット由来のzitterラットホモ型(Zi/Zi)を交配してえられる。SERの増殖長期維持法と薬理学的応用法を確立すると共にSERのてんかん様発作発現に関与すると考えられる神経伝達物質の脳内動態につき研究を行った。SERは無菌環境下でZitterホモ、tremorヘテロ因子(zi/zi,tm/+)をもつもの同志を交配し、1/4の割合でえられている。離乳後、非無菌室に移し、生育させる至適条件がえられた。室温23±2゚C,室温55±5%、自由水摂取、隔離飼育、防音に近いことなどの条件下で、平均寿命はSER雌雄においてそれぞれ、15.7および16.5週であり、対照としたkyo:wistarラットでは20週以内に死亡するものはなかった。0.1%フェノバルビタ-ル混入飼育を自由に摂取させた場合、血中フェノバルビタ-ル濃度はほぼヒトでの有効濃度相当量がえられ、けいれん発作も抑制され、かつSER雌雄の平均寿命は延長した(雌19.1週、雄19.1週)。しかし、脳波記録を行って確かめた欠神様発作はフェノバルビタ-ルにより抑制されなかった。SERは短命であるがほぼ16週まで維持でき、発作の発現する1016週の間に研究に使用でき、抗てんかん薬の長期効果を検討する上で有用なモデルとなることが確かめられた。さらに、てんかん様発作と脳内カテコルアミン動態とを検討し、発作の発症する1012週令のSERとZitterラットではtremorラットとkyo:wistarラットよりも尾状核においてド-パミンが減少し、視床、視床下部、中脳、小脳、橋延髄においてノルアドレナリンが増加していた。しかし、発作発症前の5週令SERおよびzitterラットではこのような変化は認められなかった。また、このようなカテコラミンの変化はzi遺伝子に伴うものであった。これらから、SERのてんかん様発作はカテコラミンの動態に関連していると考えられた。tremorヘテロ(tm/+)とZitterホモ(Zi/Zi)ラットを交配してえられる二重突然変異体の自然発症てんかんラット(Zi/Zi、tm/tm、SER)の長期維持法と薬理学的応用法を確立するための研究を行った。(Zi/Zi、tm/t)同志の交配により1/4の割合でSERがえられ、現在の環境条件下(室温23±2°C湿度55±5%、自由摂水食、コンベンションルーム)において平均寿命はオス16.5週、メス15.7週となっている。SERの強直性けいれん発作および欠神様発作の両発作が生育過程のどの時期から発現するかを欠神様発作については生後4週後に大脳皮質に慢性電極を設置して脳波記録を行い、強直性けいれんについてはビデオフィルムに記録し観察した。強直性けいれんは生後7週より15%の動物でおこりはじめ、12週より全例がおこるようになった。(平均出現回数0.2回/分)。欠神様発作は脳波上5ー7Hz棘除波結合が出現することから判定した結果、生後5週より25%の動物でおこり、6週以降は全例の動物でおこった。

一方、0.1%フェノバルビタール含有飼料を投与することにより、これらの発作が抑制しうるか否かを検討した。フェノバルビタール含有飼料を生後7週より投与したところ、強直性けいれんは生後9週まで完全に抑制され、16週までは発作回数は有意に減少した。その後は発作回数が増加したが、平均寿命は延長した(オス22.3週、メス19.1週)。しかし、欠神様発作はフェノバール摂取によって影響を受けなかった。以上の結果は、現在の飼育条件下で短命ではあるが、比較的一定した生育がえられ、均一的な両発作をおこすことが示された。フェノバールの長期摂取効果は、けいれん発作を抑制するが欠神発作には無効というヒトでの効果とも一致し、SERは、抗てんかん薬の長期効果を検討する上で有用なモデルと考えられる。前年度でほぼ確立した増殖ならびに維持方法により、自然発症てんかんラット(SER;Zi/Zi,tm/tm)の生発をはかり、その方法の妥当性と薬理学的応用法を確立すると共に、この動物における脳内のカテコ-ルアミン動態について検討を加えた。今年度のSERは雌雄それぞれ10匹と対照群としてKyo:Wistar雌雄それぞれ10匹を用い、前年度にえた至適飼育条件下で成育と行動を観察した。SERの平均寿命は雌雄それぞれ15.7±2.2および14.0±2.5週であり、Kyo:Wistar群では20週以内に死亡するものはなかった。体重増加もほぼ同様であった。SERに対する0.1%フェノバルビタ-ル含有飼料を自由摂取させた場合の結果もほぼ同様であったことから、抗てんかん薬の飼料混入摂取法も妥当な方法と考えられた。さらにこのようにして生育させたSERにおいて脳内ド-パミンおよびノルアドレナリン含量につき、その親系統のZitterラット(Zi/Zi),tremorラット(tm/tm)およびKyo:Wistarラットのそれと比較検討した。てんかん様発作を発症する1012週のSERおよびZitterラットの尾状核において、ド-パミンがtremorおよびKyo:Wistarラットの尾状核におけるよりも減少していた。しかし、てんかん発作を発症する以前の5週ではこの減少は認められなかった。また、その他の部位ではド-パミン含量に差はみられなかった。一方、ノルアドレナリン含量は1012週のSERおよびZitterラットの視床-視床下部、中脳、小脳橋-延髄においてtremorおよびKyo:Wistarラットより増加しており、5週のSERとzitterではこのような増加は認められなかった。またBNラットを用いバッククロスによる遺伝学的検索を行い、ド-パミン増加とノルアドレナリン減少はZi遺伝子に伴うことが見い出された。これらのことからてんかん様発作はド-パミンの増加とノルアドレナリンの増加が関与するのではないかと考えられた。
神経伝達物質放出における律速段階の解明

主な成果は次のようなものである。(1)聴覚系カリックス型シナプスにおいて伝達物質放出の律速段階として、伝達物質放出部位再利用過程(Sakaba et al., 2013, PNAS)とシナプス小胞の分子プライミング(Lipstein et al., 2013, Neuron)の双方が重要であることが示唆された。(2)抑制性プルキンエ細胞出力シナプスで、シナプス前終末での活動電位振幅の減衰がシナプス伝達を短期的に抑圧するというメカニズムを明らかにした(Kawaguchi and Sakaba, 2015)。興奮性シナプスのように伝達物質放出機構が短期抑圧を規定していないことが示唆された。申請書に記載したとおり、大型のグルタミン酸作動性シナプスである聴覚系のカリックス型シナプスを用いて、伝達物質放出機構の分子メカニズム、とくに短期シナプス可塑性を決定する律速段階の同定を目指す研究と、より小型の大脳、小脳などのシナプスでみられる短期シナプス可塑性の多様性を媒介する分子機構を調べる研究を遂行した。具体的には、前者では、(1)カリックスにおけるエンドサイトーシス関連タンパク質のうち、インターセクチン1がエンドサイトーシスではなく、むしろ伝達物質放出に関与するとの示唆を予備実験で得たので、ノックアウトマウスやSTED顕微鏡などを用いて分子の分布と機能との対応を明らかにした(論文印刷中)。(2)シナプス前終末タンパク質Munc13-1が、カルモジュリンと協同してシナプス短期可塑性にどのような役割を果たすかについて、ノックイン動物を用いて解析した(論文改訂中)。(3)また、カリックス型シナプスにおいて、カルシウムチャネルとエンドサイトーシス機構がどのように共在しているかについて検討した(論文準備中)。(4)シナプス前終末タンパク質の動態の可視化について準備的な研究をカリックス型シナプスで行った。後者に関しては、(5)小脳抑制性シナプスにおいて、シナプス伝達特性に関して、詳細な生理学的な解析をおこなった。(6)これに加えて、小脳において比較的小型の抑制性シナプス前終末からの直接の電気記録に成功し、興奮性シナプスのモデルであるカリックス型シナプスの特性と比較して、抑制性シナプスでどのような違いがあるかを調べる土台ができた。本年度は昨年度の研究を継続しながら、いくつかの新たな試みが成功した。(1)本年度は昨年度からの研究を継続し、エンドサイトーシスに関連するIntersectinがシナプス小胞の伝達物質放出部位への動員、つまりエキソサイトーシスにも関与することを示した(Sakaba et al., 2013)。また、カリックス型シナプスで、カルシウムがカルモジュリンを活性化し、さらにそれがMunc13を活性化することでシナプス小胞の動員をすることをノックインマウスを使って証明することができた(Lipstein et al., 2013)。これによって、シナプス小胞の動員に、いわゆるドッキング、プライミングの過程(Munc13)と、エンドサイトーシスによる小胞タンパク質の伝達物質放出部位からの除去(Intersectin)の双方が重要であることが示唆された。(2)カリックス型シナプスにおいて、シナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミンと膜の動態を同時測定できるようになった。エキソサイトーシス、エンドサイトーシス時に双方の動態に違いがあるかどうか、調べている。(3)カリックス型シナプスにおいて、全反射蛍光顕微鏡を用いてシナプス小胞1個の動態を直接モニターできることができるようになった。中枢シナプス前終末では初めての試みであり、現在、定量的な解析とデータのとりまとめを急いでいる。(4)プルキンエ細胞の小型のシナプス前終末から直接電気記録ができるようになり、抑制性のシナプス伝達が興奮性のシナプス伝達がどのように違うかを興奮性カリックス型シナプスとの比較によって検討している。本年度は、2つの研究結果を公刊した。カリックス型シナプス前終末で刺激後のシナプス小胞エンドサイトーシスの速度を膜容量測定法で測定し、そのCa依存性について調べた。前終末にはP8-11の段階でP/Q, N, Rの3タイプのCaチャネルが存在する。エキソサイトーシスは主にP/Q型Caチャネルを介したCa流入によって惹起される。一方で、エンドサイトーシスはR型チャネルを介したCa流入によって惹起されやすいことがわかった。また、P14以降になるとN, R型チャネルが終末膜から消失していくが、このときのエンドサイトーシスはP/Q型チャネルによって媒介されることがわかった(Midorikawa et al., 2014)。カリックス型シナプスはグルタミン酸作動性の興奮性シナプスであるが、連発刺激によってシナプス応答は短期的に抑圧される。この抑圧は主に、即時伝達物質放出可能なシナプス小胞の枯渇によっておこると考えられている。

一方で抑制性シナプスでも短期抑圧が観察されるが、刺激周波数依存性などで興奮性シナプスと挙動が異なる。しかし、短期抑圧に関して、何が決定要因なのかはわかっていなかった。これを調べるべく、小脳プルキンエ細胞シナプス前終末からの直接記録を培養、スライス標本で試みた。この結果、軸索を活動電位が安定して伝播するが、終末付近で活動電位の振幅が減衰すること、これによって頻回刺激中の伝達物質放出量が減少し、シナプス応答が抑圧されることを見出した(Kawaguchi and Sakaba, 2015)。本研究から、興奮性、抑制性シナプスの短期可塑性のメカニズムが異なること、活動電位は軸索を安定して伝播すると考えられてきたが、軸索終末付近では必ずしもそうではない可能性が示唆された。伝達物質放出メカニズムと軸索の電気的特性に関して、今後、研究を発展させたいと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。申請書に書いた内容は、予定通り実験を遂行し、さらに一部は論文投稿、改訂の段階まで来ているので、予定より早く進行している。また、カルシウムチャネルとエンドサイトーシスの関係、抑制性終末からの直接記録のように、予想外の発見、技術開発によって研究の着想が得られた。したがって、当初の計画を上回って研究が進んでいる。昨年度に続いて論文公刊をおこなっている。全反射蛍光顕微鏡を使って、1個のシナプス小胞の動態を直接可視化できたこと、また抑制性シナプス前終末からの直接記録が可能になったことは技術的な観点からも当初の計画以上の進展である。申請書に書かれた内容にそって進捗しており、25年度も申請書に従った研究内容で問題ない。現在の研究を維持することで問題ないと考えているが、仕事がまとまり次第、論文公刊を速やかに進めることが大事である。24年度は消耗品などの使用を極力、工夫、節約したこと、論文掲載費用は25年度支払になったことにより、本事業の基金分に残額が生じた。研究室の活動の活発化、研究の予想以上の進展に伴い、25年度以降、主として多細胞、あるいは軸索、軸索終末からの同時多点記録のための装置整備、イメージングなどの光学的手法における蛍光プローブなどの消耗品の使用のため、本事業の経費が当初予定よりも増加する。これらの状況のもと、基金分、補助金双方、研究計画にそって適切に利用する。平成24年度の繰り越し分およびは平成25年度分は、物品費(設備備品)を中心として、消耗品などに使用したが、工夫して消耗品を節約したため、物品費が比較的少額で済んだ。結果として、部分的に物品費を次年度に繰り越すことになった。研究自体は研究計画によって、予定以上に進んでおり、問題はなかった。研究室の活動の活発化、研究の予想以上の進展に伴い、電気生理学に加えて、蛍光プローブの併用、改変タンパク質の導入など、26年度は本事業の経費について分子生物学関連が当初予定よりも増加する。
マルチスケール格子乱流中のスカラー輸送のメカニズム解明と革新的混合促進の実現

初期条件や境界条件が異なる熱や濃度の混合促進および物質拡散を目的とした多目的最適化手法による大小様々な格子から構成されるマルチスケール格子形状の最適化を行う.データマイニングや機械学習といった情報技術や理論解析を用いて,物質拡散および混合促進と格子形状や流れ場の関係性評価を行い,その関係性を整理する.また,粒子の分散過程に基づいたラグランジュ的統一解析により,乱流輸送現象のメカニズム解明を試みる.初期条件や境界条件が異なる熱や濃度の混合促進および物質拡散を目的とした多目的最適化手法による大小様々な格子から構成されるマルチスケール格子形状の最適化を行う.データマイニングや機械学習といった情報技術や理論解析を用いて,物質拡散および混合促進と格子形状や流れ場の関係性評価を行い,その関係性を整理する.また,粒子の分散過程に基づいたラグランジュ的統一解析により,乱流輸送現象のメカニズム解明を試みる.
非圧縮性粘性流体の局所構造に対する数学解析

水などの非圧縮性流体の運動においてはその渦度場が重要な役割を果たすことが知られている.本研究では,この渦度場に関連した非線形偏微分方程式を中心としてその数学解析を行った.特に乱流中で普遍的に表れる微細な渦管構造と関連したある定常な流れの安定性解析輸送項を伴う分数冪拡散方程式の基本解の研究2次元半空間における渦度方程式の研究と高レイノルズ数極限への応用などについて研究を行い,それぞれのテーマにおいて成果を挙げることができた.本研究で得られたこうした成果は、偏微分方程式の解析や乱流における複雑な局所構造の解明に大きく貢献するものである。研究計画に基づき、非圧縮性粘性流体の局所構造を念頭においた下記の研究を行った。軸対称性が仮定された場合、3次元Navier-Stokes方程式の解は仮に爆発したとしてもその爆発は軸付近でのみ起こることが知られている。本研究では軸付近での爆発rateに対する上からの評価を得るために解の重み付き評価を行った。その結果、エネルギーが有界な一般の弱解に対し、既存の結果を大幅に改良する評価を得ることができた。本研究の成果は現在論文としてまとめており、近く公表する予定である。2.輸送項のついたFractional熱方程式の基本解の研究消散型準地衡流方程式のように、非圧縮性粘性流体に関連した方程式にはその主要部が分数幕のラプラシアンで記述され、かつ輸送項を伴うような方程式がある。このような方程式の解の局所的な性質を調べるため、大阪大学の三浦英之氏との共同研究により、対応する基本解の各点減衰評価およびヘルダー連続性評価を得た。3.スケール不変性を有する半群理論の構築発展方程式の解の挙動において、しばしば自己相似解と呼ばれるあるスケール変換に対して不変な解が重要な役割を果たすことが知られている。本研究では、スケール変換不変な発展方程式の解の漸近挙動を線形作用素の半群理論をもとに考察し(九州大学の隠居良行氏との共同研究)、さらにスケール不変性を有する半群の生成作用素の定義域やスペクトルを調べ、いくつかの基本的な性質を導出した。線形作用素の半群理論は既に成熟したものであるが、本研究はこれに新たな知見を与えるものである。本研究の成果の一部は論文として現在投稿中である。1.輸送項のついた分数階熱方程式の基本解の研究消散型準地衡流方程式のように、非圧縮性粘性流体に関連した方程式には分数冪の拡散効果と速度場による輸送効果が取り入れられた方程式がある。このような方程式の解の局所的な性質を調べるため、大阪大学の三浦英之氏との共同研究を行なった。本研究の成果は2本の論文にまとめられ、現在投稿中である。2.二次元外部領域におけるNavier-Stokes方程式の解の時間大域的挙動の研究二次元外部領域におけるNavier-Stokes方程式は,期待される解の時間減衰が高次元の場合よりも遅く,時間大域的な解の振る舞いを調べる上で特有の難しさがあることが知られている.本研究では,Fourier Institute(Grenoble)のTh.Gallay氏と共同研究を行い,初期渦度場が十分早く空間遠方で減衰し,かつ総渦量が小さいときには,解が時間無限大でOseen渦に漸近することを証明した.これは全平面における既存の結果の自然な拡張となっているが,証明自体は新しいアイデアに基づいており,今後さらなる発展が期待される。研究成果は現在論文としてまとめられ,現在投稿中である.3.二次元半空間における渦度方程式の数学解析非自明な境界がある場合,非圧縮性粘性流体の渦度場は,その複雑な境界条件から二次元であっても数学的にはこれまでほとんど研究されてこなかった.本研究では,二次元半空間の場合の渦度場の数学解析を行った.特に,高レイノルズ数の極限での渦度場の振る舞いを調べ,初期時刻において渦度場が境界から離れた場所にある場合は,領域内部ではEuler流の渦度場に収束し,境界付近ではPrandt1流で記述される渦線を形成することを厳密に証明することに成功した.これは高レイノルズ数における流体の数学解析として非常に大きな成果であり,近く論文として公表する予定である.水などの非圧縮性流体の運動においてはその渦度場が重要な役割を果たすことが知られている.本研究ではこの渦度場に関連した非線形偏微分方程式を中心としてその数学解析を行い,以下のような成果を挙げることができた.1.輸送項のついた分数階熱方程式の基本解の研究:消散型準地衡流方程式のように、非圧縮性粘性流体に関連した方程式には分数冪の拡散効果と速度場による輸送効果が取り入れられた方程式がある。

このような方程式の解の局所的な性質を調べるため、方程式の基本解に対する各点評価やヘルダー連続性について大阪大学の三浦英之氏との共同研究を行なった。本研究成果は論文にまとめられ,その一部は査読付き国際誌に掲載された.2.二次元外部領域におけるNavier-Stokes方程式の解の時間大域的挙動の研究:二次元外部領域におけるNavier-Stokes方程式について,Fourier Institute (Grenoble)のTh.Gallay氏と共同研究を行い,初期渦度場の総渦量が十分小さいときには,解が時間無限大でOseen渦に漸近することを証明した.本研究成果は論文としてまとめられ,査読付き国際誌に受理された.3.二次元半空間における渦度方程式の数学解析:本研究では,二次元半空間の場合の渦度場の数学解析を行った.特に,高レイノルズ数の極限での渦度場の振る舞いを調べ,初期時刻において渦度場が境界から離れた場所にある場合は,領域内部ではEuler流の渦度場に収束し,境界付近ではPrandtl流で記述される渦線を形成することを厳密に証明することに成功した.これは高レイノルズ数における流体の数学解析として大きな成果である.本研究成果は論文としてまとめられ,現在査読付き国際誌に投稿中である.非自明な境界がある場合における非圧縮性粘性流体の渦度場の数学解析において大きな進展があった.特に,粘性零極限における渦度場の挙動を調べることは数学的にも工学的にも重要であり,この問題において成果が出たことは当初の予想をはるかに上回るものである.24年度が最終年度であるため、記入しない。非自明な境界がある場合における非圧縮性粘性流体の渦度場の数学解析をさらに進め,渦度場の記述する流体の局所構造の解明を目指す.特に外部領域などより物理的に重要な場合や,境界層が剥離しうる場合の数学解析は極めて重要であり,国内外の研究者とも連携しながら研究を進めていく必要がある.そのため,今年度は海外等出張を多く予定している.24年度が最終年度であるため、記入しない。
胸腺内膵島移植による移植膵の免疫寛容誘導の研究

1.ラット膵島胸腺内移植による移植膵の生着延長効果:ラット膵島を胸腺内同種移植後,抗リンパ球血清(ALS)を1回投与のみで,3週間後にラット膵(膵島と同系)を頸部に同種移植し,生着を検討した.胸腺の組織学的検討では拒絶反応はみられず,良好な形態を保持し,非免疫抑制下での膵島の生着が確認された.しかしながら,膵島移植後3週に行った,頸部への膵臓移植では,実験群の膵の生着日数は対照群と比較して有意な生着延長効果を示さず,全例拒絶された.2.千葉大式膵島分離法の考案,開発:メカニカルチョッパー,独自に考案,作成した2段階自動膵臓消化装置, COBE2991細胞分離装置を組み合わせた千葉大式膵島分離法考案した.ビーグル犬を用い,本分離法にて膵島分離を行った.従来法に比較して,収量,純度,インスリン分泌能は飛躍的に向上し,膵島自家移植実験にて,全例血糖値の正常化が得られた.本分離法は臨床膵島移植の実現に重要と考えられた.3.温阻血障害膵よりの膵島分離の可能性:ビーグル犬を用いて心停止後30分の膵を摘出,死体内強制灌流をした灌流群と非灌流群を作成.各々の膵島収量,純度,インスリン分泌能を測定,温阻血を加えない新鮮群と比較した.温阻血を加えた灌流群,非灌流群では収量,純度ともに新鮮群に比較して低下したが,灌流群で得られた膵島は良好なインスリン分泌能を有しており,臨床応用可能と考えられた.1.ラット膵島胸腺内移植による移植膵の生着延長効果:ラット膵島を胸腺内同種移植後,抗リンパ球血清(ALS)を1回投与のみで,3週間後にラット膵(膵島と同系)を頸部に同種移植し,生着を検討した.胸腺の組織学的検討では拒絶反応はみられず,良好な形態を保持し,非免疫抑制下での膵島の生着が確認された.しかしながら,膵島移植後3週に行った,頸部への膵臓移植では,実験群の膵の生着日数は対照群と比較して有意な生着延長効果を示さず,全例拒絶された.2.千葉大式膵島分離法の考案,開発:メカニカルチョッパー,独自に考案,作成した2段階自動膵臓消化装置, COBE2991細胞分離装置を組み合わせた千葉大式膵島分離法考案した.ビーグル犬を用い,本分離法にて膵島分離を行った.従来法に比較して,収量,純度,インスリン分泌能は飛躍的に向上し,膵島自家移植実験にて,全例血糖値の正常化が得られた.本分離法は臨床膵島移植の実現に重要と考えられた.3.温阻血障害膵よりの膵島分離の可能性:ビーグル犬を用いて心停止後30分の膵を摘出,死体内強制灌流をした灌流群と非灌流群を作成.各々の膵島収量,純度,インスリン分泌能を測定,温阻血を加えない新鮮群と比較した.温阻血を加えた灌流群,非灌流群では収量,純度ともに新鮮群に比較して低下したが,灌流群で得られた膵島は良好なインスリン分泌能を有しており,臨床応用可能と考えられた.平成10年度は研究計画に沿って以下の検討を行った。1.ラット膵島の胸腺内同種移植ラット膵島を用いて胸腺内同種移植を行い,免疫隔離部位としての有効性につき検討した.同種移植された膵島は,移植時のALS一回投与にて,100日以上の生着が得られ,また胸腺の組織像にて正常な形態を保った膵島がみられ,胸腺の免疫隔離部位としての有効性が確認された.2.ラット膵島胸腺内移植による移植膵の生着延長効果ラット膵島を胸腺内同種移植後,3週間後にラット膵(膵島と同系)を頚部に同種移植し,生着を検討した.実験群の膵の生着日数は対照群と比較して有意な生着延長効果を示さなかった.現在,膵島のみでなく外分泌細胞も含めた胸腺内移植を先行させてから膵移植を行い,効果につき検討中である.3.マウス同系膵島移植におけるVEGFコラーゲンマトリックスの生着促進効果マウス膵島移植モデルにて,VEGFコラーゲンマトリックスにてコーティングした膵島を作成し,同系移植した.本法により,少ない膵島数での血糖正常化が得られ,移植膵島の構築保護,移植膵島への血管新生が促進された.1.ラット膵島胸腺内移植による移植膵の生着延長効果:ラット膵島を胸腺内同種移植後,抗リンパ球血清(ALS)を1回投与のみで,3週間後にラット膵(膵島と同系)を頸部に同種移植し,生着を検討した.胸腺の組織学的検討では拒絶反応はみられず,良好な形態を保持し,非免疫抑制下での膵島の生着が確認された.しかしながら,膵島移植後3週に行った,頸部への膵臓移植では,実験群の膵の生着日数は対照群と比較して有意な生着延長効果を示さず,全例拒絶された.2.千葉大式膵島分離法の考案,開発:メカニカルチョッパー,独自に考案,作成した2段階自動膵臓消化装置,COBE2991細胞分離装置を組み合わせた千葉大式膵島分離法考案した.ビーグル犬を用い,本分離法にて膵島分離を行った.

従来法に比較して,収量,純度,インスリン分泌能は飛躍的に向上し,膵島自家移植実験にて,全例血糖値の正常化が得られた.本分離法は臨床膵島移植の実現に重要と考えられた.3.温阻血障害膵よりの膵島分離の可能性:ビーグル犬を用いて心停止後30分の膵を摘出,死体内強制灌流をした灌流群と非灌流群を作成.各々の膵島収量,純度,インスリン分泌能を測定,温阻血を加えない新鮮群と比較した.温阻血を加えた灌流群,非灌流群では収量,純度ともに新鮮群に比較して低下したが,灌流群で得られた膵島は良好なインスリン分泌能を有しており,臨床応用可能と考えられた.
生理活性因子AGFの抗肥満作用機序解明と寿命延長作用の検討

直接的に充分な効果と安全性を備えた抗肥満薬は存在しない。しかしながら、肥満は世界的に増加傾向にあり、その進展に伴って心血管疾患や2型糖尿病などの肥満関連疾患の増加、それらによる健康寿命の短縮、医療経済的負担の増加など、様々な問題が生じる。我々はメタボリックシンドロームなどとの関連が示唆される新たな生理活性因子であるアンジオポエチン様タンパクファミリーの一つであるAGF(angiopoietin-related growth factor)に着目し、これまでAGFの抗肥満作用を明らかにしてきた。本研究ではAGFの抗肥満作用の機序と、寿命延長に対する効果について検討した。本研究ではメタボリックシンドロームなどに関係する新たな生理活性因子であるアンジオポエチン様タンパクファミリーの一つであるAGF(angiopoietin-related growth factor)の機能解析を目的としている。主に肝臓から分泌され、末梢のエネルギー代謝に重要な骨格筋や脂肪組織でのエネルギー消費亢進などによる抗肥満作用が示唆されており、またアンギオポエチンと同様に血管内皮細胞に作用して血管新生および血流促進作用を有し、肥満に伴うメタボリックシンドロームを改善しながら、血管にも作用することで心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化性疾患の予防にもなると考えられる。抗肥満効果の検証として、AGF過剰発現マウスのエネルギー消費量を間接熱量測定法にて評価し、野生型マウスに比してエネルギー消費量は増加を認め、X線CT検査においては、内臓および皮下脂肪の減少を認め、体重減少の要因と考えられた。高脂肪食負荷試験においても、AGF過剰発現マウスでは、体重増加の抑制を認めた。さらに、肥満2型糖尿病モデルマウスであるLeprdb/LeprdbマウスにAGFを全身性に過剰発現させたマウス(CAG-AGF;Leprdb/Leprdb)を作成し、AGFの作用を検証した。摂餌量は同等だが、Leprdb/Leprdbマウスに比較し、CAG-AGF;Leprdb/Leprdbマウスは体重の減少を認め、インスリン感受性も改善した。また、間接熱量測定において、野生型マウスに比しLeprdb/Leprdbマウスはエネルギー消費量が減少したが、CAG-AGF;Leprdb/LeprdbマウスではLeprdb/Leprdbマウスよりも有意に高値を示し、高度な肥満に対してもAGFの抗肥満作用は有効であると考えられた。AGFの中枢神経系への作用については脳室内投与法の検討を行なっており、また視床下部への導入するAAVベクターも準備中である。AGF受容体の探索、同定においては、AGFと結合する蛋白を架橋するクロスリンカーの選定を行っている。AGF発現を誘導する化合物の探索にあたっては、AGF遺伝子と、遺伝子発現調節領域を充分に含むAGFのBACクローンを用い、大腸菌内の相同組み換えによってAGF遺伝子のexon2内のOpen Reading Frameにルシフェラーゼ遺伝子を挿入して、3T3L1などのAGF発現細胞にトランスフェクションすることでルシフェラーゼ分泌安定株を作成中である。AGFの特に骨格筋や脂肪組織など末梢組織への作用機序の解析を中心に検討していく予定である。ex vivoや、初代培養骨格筋細胞・脂肪細胞、C2C12、3T3L1などを用いて、Flux analyzerによる代謝状態の評価を行い、メタボロームやプロテオーム解析を合わせて行うことで標的分子の同定を試みる。寿命に対する作用として、AGF過剰発現マウスの骨格筋、脂肪組織、肝臓などにおけるFoxO1の発現や細胞内分布、SIRT1活性の評価や細胞・組織老化の評価などを行いつつ、長期飼育において生存率が改善されるか観察を行なう。代謝学
肝阻血再灌流障害における肝カルシウム代謝の一酸化窒素(NO)発現に及ぼす効果

1)多彩な生理活性を持つ一酸化窒素(Nitric Oxide;NO)が、肝阻血再潅流障害に対してどのように関与しているかを検討するために、1989年に開発されたNO発生剤で、強力な血管拡張作用と血小板凝集抑制作用を併せ持つ、FK409を使用し以下の方法で現在実験中である。2)SDラット(400g)の60分常温下肝阻血モデルを用いて、FK409を再潅流直前に投与した群と対照群について検討した。上記2群において、肝阻血前、阻血直後、再潅流直前、再潅流直後、再潅流後30分、60分、90分、120分、180分、360分の時点で、平均血圧と肝組織微小循環血液量を測定すると、対照群と比較してFK409投与群では、再潅流後の肝組織微小循環血液量が明らかに改善した。これはNOが肝阻血再潅流障害に対して保護的に働く可能性があることをを示唆している。また,阻血前、再潅流直前、再潅流後1、3、6時間の時点で動物を犠牲死させ、血液及び肝組織を採取し、NO生成の指標として(a)血清中NO代謝産物、(b)肝組織中c-GMP生成量の定量、また肝障害の指標として(c)静脈血中GOT、GPT、LDHの測定、(d)肝組織の光顕像の評価を行っているが、現時点では、n(動物数)が少ないせいもあり、有意差は得られていない。さらにfreeradical生成の指標として(e)肝組織中MDAの定量を行う予定である。NOの代謝産物である亜硝酸塩、硝酸塩の測定はGriess法を用い、肝組織中c-GMP生成量の測定にはc-GMP ElAkitを用いて現在測定中である。3)FK409を用いてNOを発生させることにより肝阻血再潅流障害が軽減されることが示されつつあり、今後同様の実験解析を進める予定である。
臓器移植後移植片拒絶反応におけるHSP90の役割の解明および新規治療の開発

マウス異所性心移植モデルにおいて、レシピエントに対するHSP90阻害剤である17DMAGの腹腔内投与により、同種移植片の生着期間が有意に延長することを確認した。移植片中の炎症性サイトカインの産生低下、およびT細胞プライミングが抑制されていることが明らかとなった。また、移植片ではHLA class I抗原の発現が低下し、一方、MHC class IIの発現に変化がないことを見いだした。HSP90阻害剤による移植片生着延長効果のメカニズムとして、1)免疫細胞の増殖抑制、2)移植片での抗原提示の抑制、の二通りが考えられた。さらに、移植片の摘出時に17DMAGを還流し心移植を行い、その後はレシピエントに治療を行わず観察したところ、レシピエントに対する治療と同様に、5-7日間の移植片生着延長効果を認めた。このモデルにおいても、移植片組織内への好中球、樹状細胞などの炎症細胞浸潤の抑制、炎症性サイトカインであるIL-6産生の抑制が見られた。またMHC class I分子のmRNAレベルでの発現亢進が見られた。炎症性サイトカインの動きとしては、IL-2とIl-12p40は5日目に著明に抑制が見られた。一方、INFg、IL-1b、TNFaでは抑制は見られなかった。この結果から、HSP90阻害による移植片生着延長効果の主たるメカニズムは上記の2)であることが示唆された。17DMAGによる移植片灌流処置は単に虚血再灌流傷害の抑制や自然免疫の抑制だけでなく獲得免疫の抑制効果も見られると考えられ、同種臓器移植における治療戦略として有望であるものと考えられた。マウス心移植モデルにおける研究は概ね計画通りに進んでいる。HSP90阻害剤移植片灌流の研究が望ましい所見を得ているため、この研究を重点的に進めた。一方、マウス腎移植は手技が安定せず、一定の結果が得られていない。また臨床検体を用いた免疫染色については、拒絶反応を認めた症例がなかったために、研究が進んでいない。MHC class II不一致移植モデル、F1交雑種使用移植モデルの作成も行っていない。総じて、当初の研究計画よりはやや遅れているものと判断する。マウス腎移植を行い、研究を進めていく。また、HSP90阻害剤移植片灌流の研究では有望な結果が得られているので、当初の予定よりも重点的に研究を進めていく。現在のマウス心移植の検体数を増やし、また解析項目を増やし、論文とするための十分なデータを蓄積し、発表のための準備を進めていく。MHC完全不一致マウス心移植モデルにおいて、HSP90阻害剤であるgeldanamycin誘導体・17DMAGの投与の効果を検証した。レシピエントに対する17DMAGの投与により、生着期間は有意に延長した(11.0日vs 7.0日、p<0.001)。組織所見の評価では、17DMAG投与群において炎症細胞浸潤、血管炎、心筋傷害が抑制されていた。また免疫染色にて、移植片におけるMHC class Iの発現が抑制されており、これが拒絶反応抑制の機序の1つと推察された。一方では、MHC class IIの発現の抑制は明らかではなかった。上記の結果を受け、ドナー心摘出後に17DMAGにて還流し、同様の心移植を行い、生着延長効果を検証した。このモデルではレシピエントは治療を行わなかった。結果、生着期間は14.0日で、無治療群に比べ有意に延長しており、レシピエント治療群と同等の生着期間が得られた。組織所見は、好中球および樹状細胞の浸潤が抑制されていた。リアルタイムRT-PCRでの検討では、IL-6の発現が低下している傾向が見られた。移植手術に用いる機材が、当初の予算よりも高額であったため、不足分の財源確保が必要となり、結果、購入が遅れた。元来所持していた機材にて実験を行っていたが、効率が上がらず、実験の開始が遅延した。17

DMAGによる移植片灌流処置は単に虚血再灌流傷害の抑制や自然免疫の抑制だけでなく獲得免疫の抑制効果も見られると考えられ、同種臓器移植における治療戦略として有望であるものと考えられた。マウス心移植モデルにおける研究は概ね計画通りに進んでいる。HSP90阻害剤移植片灌流の研究が望ましい所見を得ているため、この研究を重点的に進めた。一方、マウス腎移植は手技が安定せず、一定の結果が得られていない。また臨床検体を用いた免疫染色については、拒絶反応を認めた症例がなかったために、研究が進んでいない。MHC class II不一致移植モデル、F1交雑種使用移植モデルの作成も行っていない。総じて、当初の研究計画よりはやや遅れているものと判断する。研究開始段階での仮説は矛盾なく、予定の研究の推進が可能と考える。平成29年度予定の研究の進捗は60%程度であるが、まず今年度、これを完遂させる。合わせて、平成30年度に予定している臨床検体を用いた研究につき準備を進めていく。マウス腎移植を行い、研究を進めていく。また、HSP90阻害剤移植片灌流の研究では有望な結果が得られているので、当初の予定よりも重点的に研究を進めていく。現在のマウス心移植の検体数を増やし、また解析項目を増やし、論文とするための十分なデータを蓄積し、発表のための準備を進めていく。
家族性先天性心疾患家系における全エクソーム解析による原因遺伝子の探索

先天性心疾患は頻度が高く、生命予後に大きな影響を与えるが、多くは多因子遺伝である一方で、一部家族性に発症する例がある。家族性の先天性心疾患では、家系内で心疾患の種類が異なる場合も多く、候補遺伝子の特定を困難にする要因の一つであると考えられる。本研究の目的は家系内で同一の先天性心疾患の家系(心室中隔欠損症家系と房室中隔欠損症家系)の原因遺伝子を次世代シークエンサーによる全エクソーム解析で同定することである。本研究の成果は、心臓の中隔が欠損する心室中隔欠損症、房室中隔欠損症の発症機序や病態の解明と、疾患の適切な管理と遺伝カウンセリングにつながると考えられる。
平滑筋細胞における流体力学的作用と血管作動物質の生成の機序

本研究では動脈硬化発生・進展のメカニズムの解明、ならびに予防・治療法の確立を究極の目標に置き、主に生体流体力学の視点から、血管中膜に存在する平滑筋細胞が受ける流体力学的せん断応力が細胞の生理活性機能に与える影響を明らかにすることを目的として(1)せん断応力の影響を考慮した平滑筋細胞における物質反応・輸送機構の数値シミュレーションモデルの構築(2)流体力学的せん断応力に対するカルシウムイオンチャネルの刺激応答の詳細を明らかにする実験を行っている。(1)に関しては十分にコンセンサスの得られた反応・輸送機構のモデルが得られていないため、手探りの状態で特定の生理活性物質(低脂肪リポ蛋白:LDL)に対する現象論的モデルを構築しシミュレーションを行った。その結果、特に流れの影響を強く受けやすい血管の内弾性板近傍に位置する平滑筋細胞では、LDL吸収速度が大きく増加することが判明した。逆にATPなどの低分子量の物質ではほとんど流れによる影響を受けないことも分かった。(2)の実験ではカルシウムイオン濃度の測定にセレンテラジンという発光蛋白質を蛍光標識に使ったフォトン・カウンティング法を用いて、せん断応力刺激が「ON」と「OFF」それぞれの状態での平滑筋細胞の生理的応答・機能の違いについて調べている。この研究は現在も遂行中であり、現時点では、細胞表面の局所的なせん断応力分布が細胞機能に大きな影響を及ぼす可能性があることが分かってきている。その事を明確にするためには、今後、カルシウム濃度変化を画像として捕えるカルシウムイメージング法について別途検討する必要性が浮き彫りになってきている。本研究では血管平滑筋細胞に作用するせん断応力の大きさ、並びに分布状態が細胞の生理学的・代謝学的機能に及ぼす影響を実験的,数値解析的に解明することを目的としている。交付申請書に記載された研究計画に基づき本年度は以下の検討を行った。遂行予定の実験条件を元にコンピューターによる数値解析を行った.計算は複雑な幾何形状を持つ血管組織内部のモデリングを行う為、解適合座標系を用いて流れの基礎方程式を離散化し,血管平滑筋細胞周囲の流れ・反応・濃度場の数値解析を行った。計算対象となる生化学物質には動脈硬化のイニシエーションと密接な関係を持つ平滑筋細胞の内膜遊走・増殖を促進する作用を持つ低比重リポ蛋白とアデノシン3リン酸を選定し、さらにこれらの生化学物質が内弾性板を経て血管内腔から浸透するという状況を想定した。計算結果から、平滑筋細胞表面での生化学物質の輸送機構の詳細が明らかになった。特に低比重リポ蛋白が平滑筋細胞表面で受容体を介して細胞内部に取りこまれる過程においては、内弾性板の障害等が重要となることが明らかになった。その一方で、本研究の最終目的である細胞内シグナル伝達とせん断応力との関係を明らかにする上で必要な現象論的モデルの構築が必要であることが判明した。新たな課題として、このモデルの構築に向けた詳細な数値解析と実験の遂行が浮かび上がった。