hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日中ブラキシズム是正指導としての行動変容法の効果を客観的に定量評価する

「咀嚼筋痛患者に行動変容法を行うと,終日の筋活動量が減少し咬筋の硬さが低下する」との仮説を立てた.その仮説を検証するために,咀嚼筋痛障害を有する顎関節症患者を対象にランダム化比較試験を行い,介入群(行動変容法群)と非介入群の治療経過について超音波診断および終日の筋電図測定により定量的に評価することとした.本年度は,終日筋電図測定と超音波診断装置による筋の硬さ測定による,行動変容法の効果を評価するための実験のフローの確認と修正をおこなった.筋電図測定,超音波診断,治療開始,終了の時期や期間といった実験のフローを設定するために,学内及び院内から健常者および筋痛患者のボランティアを募集し実験を行った.筋痛患者に対しては,行動変容法,理学療法やスプリント療法などの治療法を行い,超音波診断装置を用いて治療前後に咬筋硬さを測定した.また,携帯型筋電計を用いて筋電図測定を行った.治療効果について,他覚的評価として開口量と終日筋電図および超音波診断装置を用いた筋硬度,自覚的症状の改善として疼痛・生活支障度のVAS値の経時的な記録を行った.健常者における測定結果について分析を行った.健常者における咬筋のせん断弾性波伝搬速度(Vs)は,健常者1.25m/sであった.開口量は,健常者43.0mmであった.咬筋の厚みは,9.57mmであった.健常者における咬筋の前縁・中央・後縁のせん断弾性波伝搬速度(Vs)の差はなかった.学内及び院内からボランティアを募集し実験・測定を行った.健常者の被検者数が想定よりも多く,分析・統計処理がやや遅れている.初年度の分析・統計処理を引き続き行う.超音波診断装置及び筋電図測定を用いた評価について研究の結果を補綴学会,顎関節学会にて発表し検討を行う.咀嚼筋障害患者への行動変容法の効果について,超音波診断装置および筋電図測定装置を使用し判定するために,実際の患者での行動変容法の治療効果を判定する研究に移行する.当院受診した患者から被験者を抽出し,行動変容法を行う.超音波診断装置及び筋電図測定装置を用いて治療効果を比較し検討する.「咀嚼筋痛患者に行動変容法を行うと,終日の筋活動量が減少し咬筋の硬さが低下する」との仮説を立てた.その仮説を検証するために,咀嚼筋痛障害を有する顎関節症患者を対象にランダム化比較試験を行い,介入群(行動変容法群)と非介入群の治療経過について超音波診断および終日の筋電図測定により定量的に評価することとした.本年度は,終日筋電図測定と超音波診断装置による筋の硬さ測定による,行動変容法の効果を評価するための実験のフローの確認と修正をおこなった.筋電図測定,超音波診断,治療開始,終了の時期や期間といった実験のフローを設定するために,学内及び院内から健常者および筋痛患者のボランティアを募集し実験を行った.筋痛患者に対しては,行動変容法,理学療法やスプリント療法などの治療法を行い,超音波診断装置を用いて治療前後に咬筋硬さを測定した.また,携帯型筋電計を用いて筋電図測定を行った.治療効果について,他覚的評価として開口量と終日筋電図および超音波診断装置を用いた筋硬度,自覚的症状の改善として疼痛・生活支障度のVAS値の経時的な記録を行った.健常者における測定結果について分析を行った.健常者における咬筋のせん断弾性波伝搬速度(Vs)は,健常者1.25m/sであった.開口量は,健常者43.0mmであった.咬筋の厚みは,9.57mmであった.健常者における咬筋の前縁・中央・後縁のせん断弾性波伝搬速度(Vs)の差はなかった.学内及び院内からボランティアを募集し実験・測定を行った.健常者の被検者数が想定よりも多く,分析・統計処理がやや遅れている.初年度の分析・統計処理を引き続き行う.超音波診断装置及び筋電図測定を用いた評価について研究の結果を補綴学会,顎関節学会にて発表し検討を行う.咀嚼筋障害患者への行動変容法の効果について,超音波診断装置および筋電図測定装置を使用し判定するために,実際の患者での行動変容法の治療効果を判定する研究に移行する.当院受診した患者から被験者を抽出し,行動変容法を行う.超音波診断装置及び筋電図測定装置を用いて治療効果を比較し検討する.人件費・謝金の額が少なく研究を遂行できたため,次年度使用額が生じた.翌年度分の謝金として被検者数を増加することで使用を予定している.
細胞骨格関連蛋白質Fhod3から見た補助人工心臓治療後の左室リモデリング効果

細胞骨格関連蛋白質の1つであるFhod3に注目し、Fhod3の心筋細胞内での発現の増減を評価することで、臨床的な心不全の程度との相関を解析する試みを行う。ヒト心筋サンプルを用いて、VAD治療前後における心筋細胞レベルでのFhod3およびFhod3に関係する細胞内蛋白質の発現量の変化を解析し、VADによる治療効果を分子生物学的側面から評価することを本研究の目的とする。ここから得られた知見は、Fhod3が新たな抗心不全薬もしくは新たな心不全のバイオマーカーとなりうる可能性に繋がるものであると考える。
O-結合型糖鎖を用いたde novoタンパク質設計に関する研究

ヒト由来ムチンやヒト由来IgA1ヒンジ領域の糖ペプチドPSTPPTPSPSTPPTPSPSをマイクロ波照射雰囲気化で合成し、立体構造解析を行った。下線で示した残基にN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)および、core1構造(Gal-GalNAc)を有する糖ペプチドを合成した。その結果、糖を有しないペプチドでは9つのプロリンがcis-transの異性体を形成し、ペプチド全体として複数のコンフォマーを形成していたが、糖鎖修飾(特に2糖core1構造)を付加することによって、cis-transの異性化反応が大きく抑制され、トランス体がメインに存在していることが明らかとなった。糖鎖修飾されたセリンまたはスレオニンは、そのC末端側に存在するプロリンの異性化反応を大きく抑制することが明らかとなった。一般的なペプチド固相合成はC末端側から合成するが、その際、最初の残基がプロリンであるとき、次のアミノ酸をカップリング後の脱保護反応において環状ジペプチド構造(ジケトピペラジン構造)を形成してしまい、アミノ酸伸長が止まって収率が大きく低下することが知られている。これは、プロリンがシス体を形成するためであるが、本研究で得られた知見をもとに、2番目のアミノ酸を糖アミノ酸に置換したところ、プロリンはトランス体に固定され、ジケトピペラジン構造の形成を抑制し、アミノ酸伸長が起きた。本研究の結果として、糖鎖がC末端側の隣に存在するプロリンをトランス体として維持する効果があること(cis-trans異性化反応の速度を落とす)、C末端にプロリンが有する場合におけるFmoc固相ペプチド合成法に関してPCT出願を行った。本研究における第一の目標として、天然に存在するタンパク質由来の糖ペプチドの立体構造解析から行なうた。ヒト由来の糖タンパク質ムチン(MUC)は、その発現量や修飾される糖鎖構造が疾患によって異なり、疾患バイオマーカーとして利用することが期待されているため、ムチンのファミリーの1つであるMUC4のタンデムリピート配列を化学的に合成し、ライブラリー化を遂行した。本研究を申請する段階では大腸癌マーカーとして期待されるMUC5ACも予定していたが、現在のところ、有用な疾患マーカーが皆無というても過言ではない膵癌のマーカーになりうるMUC4を重点的に行うこととした。糖ペプチドの合成は、電磁波照射下で行う迅速な合成方法を確立し、糖鎖伸長は糖転移酵素を用いた温和な条件下で行った。また、メタノール代謝酵母であるPhichia pastrisを宿主として用いることにようて、ペプチド鎖に直接N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を転移する酵素であるppGalNAc-T2の大量発現にも成功し、それを用いた糖転移反応から基質特異性と立体構造変化の追跡を行うことに成功した。立体構造解析においても超高感度プローブを装着した核磁気共鳴(NMR)装置によって行い、迅速に行うことができた。この立体構造解析情報から、O-結合型糖鎖がペプチドの立体構造に及ぼす影響や、その構造安定化要因を抽出することができた。以上の結果で、本年度に行うべき研究の目標を達成することができた。また本年度は、糖鎖を認識するタンパク質の立体構造解明や、ガン細胞における糖鎖の役割の解明にも着手し、それらを誌上発表することができた。ヒト由来IgAlヒンジ領域の糖ペプチドPSTPPTPSPSTPPTPSPSをマイクロ波照射雰囲気化で合成し、立体構造解析を行った。下線で示した残基にN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)および、corel構造(Gal-GalNAc)を有する糖ペプチドを合成した。その結果、糖を有しないペプチドでは9つのプロリンがcis-transの異性体を形成し、ペプチド全体として複数のコンフォマーを形成していたが、糖鎖修飾(特に2糖corel構造)を付加することによって、cis-transの異性化反応が大きく抑制され、トランス体がメインに存在していることが明らかとなった。

糖鎖修飾されたセリンまたはスレオニンは、そのC末端側に存在するプロリンの異性化反応を大きく抑制することが明らかとなった。一般的なペプチド固相合成はC末端側から合成するが、その際、最初の残基がプロリンであるとき、次のアミノ酸をカップリング後の脱保護反応において環状ジペプチド構造(ジケトピペラジン構造)を形成してしまい、アミノ酸伸長が止まって収率が大きく低下することが知られている。これは、プロリンがシス体を形成するためであるが、本研究で得られた知見をもとに、2番目のアミノ酸を糖アミノ酸に置換したところ、プロリンはトランス体に固定され、ジケトピペラジン構造の形成を抑制し、アミノ酸伸長が起きた。本研究の結果として、糖鎖がC末端側の隣に存在するプロリンをトランス体として維持する効果があること(cis-trans異性化反応の速度を落とす)、C末端にプロリンが有する場合におけるFmoc固相ペプチド合成法に関してPCT出願を行った。
新規カテキン誘導体浸透マスクによるインフルエンザ予防効果の検討

本研究では茶カテキンの抗インフルエンザ作用に着目し、天然型カテキン浸透マスク、次いで天然型カテキンより感染抑制作用を高め新たに開発したカテキン誘導体浸透マスクによるインフルエンザ予防効果をランダム化比較試験により検討した。両試験とも、医療福祉施設従事者を対象とし、試験開始前に十分なインフォームドコンセントを得た後、適格基準を満たす被験者をカテキンマスク群または非カテキンマスク群に二重盲検下でランダムに割付け、冬季インフルエンザ流行シーズン連続60日間、マスクを着用し追跡調査した。その結果、特記すべき有害事象は認めなかったが、いすれの試験もインフルエンザの発症に有意な群間差は認められなかった。インフルエンザは毎年、流行を繰り返す感染力が非常に強い重症の急性上気道感染症であり、その予防対策は公衆衛生的に極めて重要である。インフルエンザの予防対策としてはワクチンの接種、抗インフルエンザ薬の予防的投与、手洗い、マスクの着用、うがいといった方法があるが、いずれも完全に感染を阻止できない現状がある。本研究では、基礎研究で示されている茶カテキンのインフルエンザ感染抑制効果に着目し、初年度は、天然型カテキンを浸透させたマスクの着用によるインフルエンザ予防効果を、医療福祉従事者を対象としたランダム化比較試験により探索的に検討した。医療福祉3施設の職員(成人)235名から試験開始前に十分なインフォームドコンセントによる文書同意を得た後、適格基準を満たした234名を天然型カテキン浸透マスク群(カテキンマスク群;118名)または非カテキン浸透マスク群(対照マスク群;116名)にランダムに割付け、2016年1月初旬3月初旬の冬季インフルエンザ流行シーズンに、連続60日間マスクを着用し追跡調査した。ランダム化は評価に影響を及ぼす可能性のある因子として施設を考慮し、層別置換ブロック法で行なった。使用した天然型カテキン浸透マスク及び非カテキン浸透マスクは不織布で製作し、形状、重量、色、臭い、触感等を同一とし、盲検性を確保した。なお、本臨床試験は研究開始前に、静岡県立大学倫理審査委員会の承認を得て、臨床試験事前登録を行ってから実施した。追跡の結果、インフルエンザの発症はカテキンマスク群4名(3.4%)、対照マスク群2名(1.7%)であり、群間で統計学的に有意な差は認めなかった(P=0.68)。インフルエンザ以外の急性上気道炎の発症はカテキンマスク群28名(23.7%)、対照マスク群26名(22.4%)であり群間で有意な差は認めなかった(P=0.88)。試験期間中、重篤な有害事象及び試験の遂行に影響を与える不具合は認めなかった。当初の目標被験者数は250名であり、実際に文書同意が得られた人数は235名と被験者募集も順調で、ほぼ目標に近い被験者数となった。試験中のマスクの着用による重篤な有害事象や試験の遂行に影響を与える不具合も発生せず、安全に実施し得た点は満足のいく結果だったといえる。マスク着用期間も予定通り60日間、インフルエンザの最も流行するシーズンである1月初旬から3月初旬に各施設で一斉に実施できた。調査票の回収、記入漏れや不整合箇所の再調査も順調に進み、予定通りキーオープン、統計解析と進むことができた。本研究では、基礎研究で示されている茶カテキンのインフルエンザ感染抑制効果に着目し、昨年度は天然型カテキンを浸透させたマスクの着用によるインフルエンザ予防効果をランダム化比較試験により検討した。その結果は、対照群(非カテキン浸透マスク)と比較し有意な差には至らなかった。そこで今年度は、天然型カテキンより感染抑制作用を高め、新たに開発し最適化したカテキン誘導体を浸透させたマスクの着用によるインフルエンザ予防効果を、ランダム化比較試験により探索的に検討した。医療福祉3施設の職員(成人)248名をリクルートし、試験開始前に十分なインフォームドコンセントによる文書同意を246名から得た後、適格基準を満たす被験者をカテキン誘導体浸透マスク群または非カテキン浸透マスク群にランダムに割付け、2017年1月初旬3月初旬の冬季インフルエンザ流行シーズンに連続60日間、マスクを着用し追跡調査した。適格基準に合致した241名のうち、中途脱落3名を除き238名が試験を継続した。調査票はモニタリングを行い、記載漏れや不整合個所を再調査した。報告書作成の現在、調査票の回収が終了した段階であり、今後、コンピュータのデータシートへのデータ入力、データのクリーンニングを行った後、データ固定、キーオープンし統計解析に入る予定である。当初の目標被験者数は250名であり、実際に文書同意が得られた人数は246名と被験者募集も順調で、ほぼ目標に近い被験者数となった。試験中のマスクの着用による重篤な有害事象や試験の遂行に影響を与える不具合も発生せず、安全に実施し得た点は満足のいく結果だったと言える。

調査票の回収、記入漏れや不整合箇所の再調査も順調に進んだ。本研究では茶カテキンの抗インフルエンザ作用に着目し、初年度、天然型カテキンを浸透させたマスクの着用によるインフルエンザ予防効果をランダム化比較試験により検討した。その結果、対照(非カテキン浸透マスク)群と比較し有意な差には至らなかった。そこで平成28年度から、天然型カテキンより感染抑制作用を高め新たに開発し最適化したカテキン誘導体浸透マスクの着用によるインフルエンザ予防効果を、ランダム化比較試験により探索的に検討した。医療福祉3施設の職員(成人)に対し、試験開始前に十分なインフォームドコンセントによる文書同意を得た後、適格基準を満たす被験者をカテキン誘導体マスク群または非カテキンマスク群に二重盲検下でランダムに割付け、2017年1月初旬3月初旬の冬季インフルエンザ流行シーズンに連続60日間、マスクを着用し追跡調査した。ランダム化は評価に影響を及ぼす可能性のある因子として施設を考慮し、層別置換ブロック法で行なった。なお、本臨床試験は研究開始前に、静岡県立大学倫理審査委員会の承認を得て、臨床試験事前登録を行ってから実施した。参加同意が得られ適格基準を満たした243名のうち、238名が試験を完遂した(カテキン誘導体マスク群:120名、非カテキンマスク群:118名)。試験期間中、特記すべき有害事象は認めなかった。13名がインフルエンザ様症状を発症したが、群間で有意な差は認められなかった(カテキン誘導体マスク群: 7名, 5.8%、非カテキンマスク群: 6名, 5.1%)。55名が急性上気道炎症状を発症したが、群間で有意な差は認められなかった(カテキン誘導体マスク群: 23名, 19.2%、非カテキンマスク群: 32名, 27.2%)。本研究では茶カテキンの抗インフルエンザ作用に着目し、天然型カテキン浸透マスク、次いで天然型カテキンより感染抑制作用を高め新たに開発したカテキン誘導体浸透マスクによるインフルエンザ予防効果をランダム化比較試験により検討した。両試験とも、医療福祉施設従事者を対象とし、試験開始前に十分なインフォームドコンセントを得た後、適格基準を満たす被験者をカテキンマスク群または非カテキンマスク群に二重盲検下でランダムに割付け、冬季インフルエンザ流行シーズン連続60日間、マスクを着用し追跡調査した。その結果、特記すべき有害事象は認めなかったが、いすれの試験もインフルエンザの発症に有意な群間差は認められなかった。平成27年度の結果を踏まえ、平成28年度は、天然型カテキンよりも抗インフルエンザ感染抑制作用を高めた新たに開発し最適化したカテキン誘導体を浸透させたマスクの着用によるインフルエンザ発症・伝播予防効果並びに症状軽減効果を並行群間二重盲検ランダム化比較試験により検討する。当初、カテキン誘導体浸透マスクとの比較は、天然型カテキン浸透マスク、非カテキン浸透マスクの3群を予定していたが、平成27年度に実施した天然型カテキン浸透マスクと非カテキン浸透マスクの比較において差が見出されていない結果となったことから、試験デザインの再検討を行う予定である。
腸内の神経前駆細胞の移動を支える血管組織

本研究では、腸管神経系発生過程における神経-血管相互作用を細胞・分子レベルで解析した。マウスの腸管神経前駆細胞および血管を可視化し、生体イメージングを行うことにより、腸管神経系発生過程における細胞の振る舞いを観察した。その結果、発生過程で腸管がループ状に並ぶ時期に、血管(腸間膜)を足場に小腸から大腸へ「近道移動」する神経前駆細胞を発見した。「近道移動」する細胞は大腸の神経系の主要な細胞源であり、近道移動の障害がヒルシュスプルング病(先天性の腸管神経欠損)を誘導する可能性を突き止めた。また、「近道移動」を誘導するシグナルの一つは大腸壁に発現する神経栄養因子GDNFであることを発見した。大腸神経系は、発生過程で小腸と大腸が血管を挟んで平行に並ぶ時期に、小腸壁から遊離して血管を足場に大腸まで近道移動する腸管神経堤細胞集団(trans-mesenteric ENCC, tmENCC)により形成される。すなわち大腸神経系の発生は神経系と血管系の協調した発生に依存する。tmENCCの移動機構の解明には、tmENCCの細胞の振る舞いや遺伝子発現を多角的に解析し、他の腸管神経堤細胞との違いを詳細に比較検討する必要がある。また、多色タイムラプスイメージングにより、腸管神経系と血管の形成過程を同時に可視化する必要がある。これらの目的のために、Brainbow遺伝子カセットをエンドセリン受容体Bの遺伝子発現調節領域下に発現するトランスジェニックマウス(2^<nd> Brainbowマウス)を作製し、個々の腸管神経堤細胞を全て可視化することを試みている。現在、founderマウスを得て、目的の蛍光タンパクが腸管神経堤細胞に特異的に発現していることを確認している。血管内皮細胞を可視化できるFlk1-GFPマウスは共同研究者より入手した。また、腸管神経堤に発現する遺伝子群をマイクロアレイ法により多数同定した。この中から、insitu hybiridization法によるスクリーニングで、tmENCCに特異的に発現する遺伝子群の同定を試みている。現在までに数十の遺伝子発現解析を終了した。そのうちMAPKシグナル経路を負に制御するDusp6の遺伝子発現がtmENCC以外のENCCにのみ認められることを見出している。この結果はtmENCC移動には一定量のMAPKシグナルの活性化が維持されることが必要である可能性を示唆している。大腸神経系は、発生過程で小腸と大腸が血管を挟んで平行に並ぶ時期に、小腸壁から遊離して血管を足場に大腸まで近道移動する腸管神経堤細胞(trans-mesenteric ENCC, tmENCC)により形成される。腸管血管の形成とtmENCCの移動の関連を明らかにするために、腸管血管の分岐異常を呈する1. CXCR4(ケモカインSDF1/CXCL12の受容体)ノックアウトマウスを解析した。その結果、一部の胎児において大腸側に移動するが減少していることを見いだした。しかし、CXCR4の発現はtmENCCを含む全ての腸管神経堤細胞に認められず、血管内皮細胞に限局していた。また、多色タイムラプスイメージングにより血管内皮と腸管神経堤細胞の発生を同時に観察したところ、2種間の細胞の移動パターンには直接的な関連は見いだせなかった。以上の結果は、CXCR4を介したケモカインのシグナルは直接に腸管神経堤細胞に影響せず、腸管血管の正常発生を誘導することでtmENCCの移動を間接的に支持している可能性を示唆している。また、これらの結果は、CXCR4のノックアウト腸管における遺伝子発現変化を解析することにより、血管由来のtmENCC移動制御因子を同定出来る可能性を示唆していた。腸管神経系は、神経前駆細胞が腸管壁を移動しながら腸管全長にわたって覆うことにより形成される。我々は、発生過程で腸管が一過性にヘアピン状に折れ曲がる時期に、神経前駆細胞が血管を足場に小腸から大腸へ近道移動することを発見した。この近道移動する前駆細胞は、大腸の神経系の主要な構成細胞であり、近道移動の障害が大腸末端での神経細胞の欠損(ヒルシュスプルング病)の誘因になる可能性を疾患モデルマウスを用いて明らかにした。また、近道移動に必要なシグナルとして神経栄養因子GDNFを同定した。さらに、ケモカイン受容体CXCR4欠損マウスでは近道移動が障害され、これは血管発生障害による非細胞自律性の表現形であることを見出した(以上、Nature Neuroscience誌に報告)。

本年度は、血管由来の近道移動関連因子の探索を遺伝子発現プロファイリングにて行った。現在、候補遺伝子の機能解析に向けてin situ hybridizationなどでの組織解析を計画中である。また、腸管神経系を先天的に欠損するヒルシュスプルング病モデルマウスにおいて、近道移動する細胞が減少するが、この細胞の分化状態などを詳細に解析した。さらに、腸管神経前駆細胞においてGDNFシグナルがどのように伝達されるかを解明するために、GDNFシグナル受容体であるRETの細胞内局在と輸送を生体レベルで解析出来る遺伝子改変マウスを作成した。このマウスの組織解析により、RET受容体は膜に局在するのみでなく、細胞内を活発に小胞輸送されていることが明らかになった。また、小胞輸送されるRETはGDNFと結合した形で輸送されること、輸送を障害すると神経前駆細胞の移動能が障害されることも明らかとなった。今後、このシステムを応用して、近道移動する神経前駆細胞におけるRETの細胞内局在や輸送について解析を進めて行く予定である。腸管神経系は、神経前駆細胞が腸管壁を移動しながら腸管全長にわたって覆うことにより形成される。我々は、発生過程で腸管が一過性にヘアピン状に折れ曲がる時期に、神経前駆細胞が血管を足場に小腸から大腸へ近道移動することを発見した。この近道移動する前駆細胞は、大腸の神経系の主要な構成細胞であり、近道移動の障害が大腸末端での神経細胞の欠損(ヒルシュスプルング病)の誘因になる可能性を疾患モデルマウスを用いて明らかにした。また、近道移動に必要なシグナルとして神経栄養因子GDNFを同定した。さらに、ケモカイン受容体CXCR4欠損マウスでは近道移動が障害され、これは血管発生障害による非細胞自律性の表現形であることを見出した(以上、Nature Neuroscience誌に報告)。本年度は、血管由来の近道移動関連因子の探索を遺伝子発現プロファイリングにて行ったが、まだ最終的な分子同定には至っていない。しかしながら、研究過程において、腸管神経前駆細胞に関して以下の大きな進展があった。1.GDNF受容体であるRETの細胞内輸送を可視化する遺伝子改変マウスの作成に成功し、移動中の神経前駆細胞においてRETが極性を持った輸送をされていること、また、細胞外基質によりRETの細胞内局在が変化することを突き止めた(論文投稿準備中)。2.血管に沿って腸管に投射する外来性神経線維とともに腸管壁に侵入するシュワン細胞の一部が、生後に腸管神経細胞に系譜転換することを発見した。血管ー神経の相互作用により神経系が形成される新たな場を見出した(under revision)。腸管神経系は、神経前駆細胞が移動しながら腸管壁を全長にわたって覆うことにより形成される。申請者は、ライブセルイメージングにより、発生過程で小腸と大腸が血管を挟んで平行に並ぶ時期に、血管(腸間膜)を足場に、小腸から大腸に近道移動する前駆細胞を発見し、この細胞群が大腸神経系の主要な構成細胞であることを見出した。実験的に腸間膜を切除して近道移動を部分的に障害すると、大腸神経系の形成が遅れることから、大腸における神経形成は前駆細胞の近道移動により効率的に進行することが明らかとなった。
チミジンホスホリラーゼの生物活性の分子機構の解明

2デオキシ-D-リボースはチミジンホスホリラーゼ(TP)によるチミジンの代謝物の一つである。これまで我々は2デオキシ-D-リボースが血管新生活性を持っていることを見いだしてきた。初年度までに、2デオキシ-D-リボースの光学異性体である2デオキシ-L-リボースを作用させると、TPあるいは2デオキシ-D-リボースがもつin vitroの血管内皮細胞の管腔形成の促進、牛大動脈内皮細胞の遊走能の亢進、血管新生活性の作用を抑制することを見いだして、今年度はさらにTP強制発現ヒト癌細胞を移植したヌードマウスにデオキシ-L-リボースを経口投与して、対照群に比べて有為に腫瘍の増殖を抑制すること、また、脾静脈からTP強制発現ヒト癌細胞を肝転移させる転移実験モデルで転移病巣を有為に低下させることを明らかにした。これらのことから2デオキシ-D-リボースの構造を認識する分子を介して、多彩な機能を発揮させていることがさらに裏付けられた。また、2デオキシ-L-リボースが持つTPの生物活性を抑制作用を利用して新たな抗腫瘍薬剤として用いることができる可能性が示された。TPの発現細胞において低酸素に対して抵抗性であることを見いだしていたがさらに詳細に検討した。デオキシ-D-リボースを加えることで低酸素下でのHIF1αの安定化されるが妨げられること,p38MAPキナーゼの活性化が抑制されることを見いだした。現在、デオキシ-D-リボースが直接に作用する分子が何かを検討中である。TPのノックアウトマウス(TPKO)とTP/UP(ウリジンホスホリラーゼ)ダブルノックアウトマウス(TP/UPKO)を作成した。これらのマウスは雌雄とも妊娠可能で、形態的異常、体重減少などは見られない。TPKOにおいては肝臓でのみTP活性が失われていた。UPKOにおいては肝臓以外のすべての組織でTP活性が欠失していたTP/UPKOマウスでは各臓器ともTP活性が検出されなかった。血中のチミジン濃度は野性型と比較しTPKOは約2倍、TP/UPKOは約5倍であった。1999年にNishinoらはTPがヒトの神経筋疾患であるMNGE(Mitochondrial NeurogastroIntestinal Encephalomyopathy)の原因遺伝子であると報告した。10ヶ月齢の野性型マウスとTP/UPKOの骨格筋ではMNGIEに特徴的所見られなかったが、脳ではTP/UPKOにMRIのT2強調画像で高いシグナルが認められ、また、電顕写真での変化を見いだしており、TP/UPKOはTPの生理的役割の解析とともに、白質脳症のモデルマウスとして病因の解析に有用である可能性がある。2デオキシ-D-リボースはTPによるチミジンの代謝物の一つである。

今回、2デオキシ-D-リボースの光学異性体である2デオキシ-L-リボースを作用させると、TPあるいは2デオキシ-D-リボースがもつin vitroの血管内皮細胞の管腔形成の促進、牛大動脈内皮細胞の遊走能の亢進作用を抑制できること。また、血管新生活性をラット角膜法、マウスの背部皮下法でも2デオキシ-D-リボースあるいはTPのもつ血管新生活性をデオキシ-L-リボースが抑制することを見いだした。これらのことから2デオキシ-D-リボースの構造を認識する分子を介して、多彩な機能を発揮させていると考えられた。また、2デオキシ-L-リボースが持つTPの生物活性を抑制作用を利用して新たな抗癌剤として用いることができないか検討している。2デオキシ-D-リボースにメチル基を導入して2種類の誘導体を合成した。これらは何れも牛大動脈内皮細胞の遊走能促進作用を持っていた。今後はこれらの誘導体を用いてさらに強力な作用を持つ誘導体を合成することと、担体への結合などの方法を用いて、直接に反応する分子を単離する方向で検討中である。TPの発現細胞において抗癌剤、紫外線、低酸素に対して抵抗性であることを見いだしていたがさらに詳細に検討した。抗癌剤(アドリアマイシン、VP16、シスプラチン)に対する抵抗性は、酵素活性のない変異体TP発現細胞でも抗癌剤誘導性のアポトーシスに抵抗性であること、TPの強力な阻害剤である、TPIを加えてもこの抵抗性は変化しないこと、以上の2点から酵素活性が関与しないことが判明した。このことは基質以外にTPと直接結合する分子の存在を予想させる結果であり。ツーハイブリッド・シテムでTPに直接結合する分子の検索を行っている。、KB細胞のTP発現細胞と非発現細胞の間でDNAアレイを用いて解析した。葉酸レセプターやインターフェロン誘導性蛋白質56などが上昇し逆にHSP70、カルレティクリンなどが低かった。現在、個別の遺伝子の発現変化による意義があるのかどうか検討している。TPのノックアウトマウスを作成した。雌雄との妊娠可能であり,8月齢まで形態的異常は見られておらず,体重増加も野生型と差が見られない。ピリミジンの代謝に関しては予想された結果を得ている。また、TPマウスでのTP活性は肝臓以外では多くは保たれておりウリジンホスホリラーゼ(UP)が多くの臓器でTP活性を補償していることが示唆された。1999年にNIshinoらはTPはヒトの神経筋疾患であるMIN GIE(Mitochondrial NeurogastroIntestinal Encephalomyopathy)の原因遺伝子と報告した。TPノックアウトマウスは,6月齢の一例で筋肉のトリクロームゴモリ染色でRagged red fibersが観察され,また,succinate dehydroganaseで強く染色される部分があることからMNGIEに見られる変化が起こっている可能性がある。今後さらに月齢を重ねたマウスとその数例とをふやすことで有為であるかどうかの検討をしていく。さらに,TPとUPのダブルノックアウトマウスに用いた解析をあわせて進めていく。2デオキシ-D-リボースはチミジンホスホリラーゼ(TP)によるチミジンの代謝物の一つである。
ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白機能の調節に関する研究

ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(NHE)には、いくつかのisoformが存在すると推定されている。上皮細胞では一般的にamiloride低感受性のNHE-3は上皮側に、amiloride高感受性のNHE-1は基底側膜に発現していると信じられている。我々は腎尿細管由来の培養上皮細胞(OK細胞、LLC-PK1細胞)をモデルとして上皮側、基底側膜のNHEの特性ならびにその作用の調節について検討を行なった。OK細胞には主に上皮側にNHE-3が発現していることがよく知られているが、我々は基底側膜にもNHEが発現していることを明らかにした。基底側膜のNHEは、amilorideに対する感受性および副甲状腺ホルモン(PTH)に対する反応から、上皮側のものと同様にNHE-3である可能性が高いと考えている。即ち、ある条件ではNHE-3が基底側膜にも発現しうると考えられる訳である。但し、NHE活性の細胞内[H^+]に対する反応が上皮側と基底側では異なることから、OK細胞のNHEは上皮細胞における局在に伴い機能が多少異なる可能性が示唆された。一方、我々が単離したヒトNHE-1cDNAをOK細胞に移入すると、基底側膜にのみ発現したことから、NHE-1自体には基底側膜へとtargetされるsignalが内在していると考えられた。LLC-PK1細胞には両側にNHE活性が発現しており、上皮側NHEは基底側NHEよりはamilorideに対する感受性が低いが、OK細胞よりはamiloride高感受性である。LLC-PK1細胞にNHE-1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを移入すると、基底側のNHE活性のみが低下したことから、LLC-PK1細胞においては基底側膜のNHEのみがNHE-1であり、上皮側にNHE-1が混入してはいないと考えられる。ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(NHE)には薬理学的検索から、いくつかのアイソフォームが存在すると推定されていた。最近、それらのものと思われるcDNAがクローニングされた。上皮細胞においては、上皮側膜のNHEはアミロライドに対して感受性が低く、一方、基底側膜のNHEは非上皮細胞一般に認められるNHEと同様にアミロライドに対して感受性が高いことが知られていた。即ち、アミロライド低感受性のアイソフォームは上皮側へ、アミロライド高感受性のアイリフォームは基底側へとターゲットされると思われるわけであるが、直接的証明はなされていない。アイソフォームが異なれば、その機能調節が異なるので、腎由来培養細胞における上皮側、基底側膜のNHEが実際にそのcDNAが異なるアイソフォームであるかどうかの解析を行った。腎尿細管由来培養細胞であるOK細胞に、私達がクローニングしたヒトのアミロライド高感受性NHE(NHE-1)cDNAを移入して、上皮側、基底側のNHE活性をpH感受性の色素を用いて分離測定した結果、移入したヒトのNHE-1は基底側膜で発現していることが明かとなった。すなわちヒトのNHE-1自体に上皮細胞において基底側膜へとターゲットされるシグナルが内在しているものと思われる。一方、尿細管由来の他の培養細胞であるLLC-PK1細胞においては、LLC-PK1細胞のNHE-1のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させると、基底側膜のNHE活性のみが低下すると思われる結果を得ている。このことは、LLC-PK1細胞の基底側膜のNHEはNHE-1であり、上皮側のものはcDNAが異なるアイソフォームであることを意味する。即ち、尿細管由来の培養上皮細胞においては、上皮側、基底側のNHEはそのcDNAが異なるアイソフォームであると思われる。

上皮細胞では一般的に上皮側にamiloride低感受性の基底側膜にamiloride高感受性のNHEが発現していると信じられている。NHEは様々な要因によってその活性が細胞特異的に、またisoform特異的に調節されている。そこで申請者は、培養上皮細胞をモデルとして上皮側、基底側膜のNHEの特性ならびにその作用の調節について検討を行なった。培養腎細胞であるOK細胞には主に上皮側にアミロライド低感受性のNHEが発現しているが、我々が単離したヒトアミロライド高感受性NHE(NHE-1)cDNAをOK細胞に移入すると、基底側膜にのみ発現した。このことはNHE-1自体に基底側膜へとtargetされるsignalが内在していることを示唆する。さらにOK細胞の基底側膜のNHEが上皮側NHEに比べてアミロライドにより抵抗性であることが明かとなった。これは、これまでの定説に全く反することである。さらに、OK細胞では上皮側、基底側のNHE活性の細胞内H^+に対する感受性が異なることが明かとなった。現在さらに詳細な検討を行っている。LLC-PK1細胞には基底側膜にアミロライド高感受性、上皮側には低感受性のNHEが発現していると考えられているがこれらが異なるmRNAに由来するものかどうか不明であった。LLC-PK1細胞にNHE-1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトすると、基底側のNHE活性のみが低下した。即ち、LLC-PK1細胞においては基底側膜のNHEのみがNHE-1であり、上皮側のNHEは異なるisoformであると思われる。ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(NHE)には、いくつかのisoformが存在すると推定されている。上皮細胞では一般的にamiloride低感受性のNHE-3は上皮側に、amiloride高感受性のNHE-1は基底側膜に発現していると信じられている。我々は腎尿細管由来の培養上皮細胞であるOK細胞をモデルとして上皮側、基底側膜のNHEの特性ならびにその作用の調節について検討を行なった。OK細胞には主に上皮側にNHE-3が発現していることがよく知られているが、我々は基底側膜にもNa依存性のpH調節機構が存在することを見いだし、それがNHEであることを明らかにした。基底側膜のNHEはamilorideに対する感受性が低く、副甲状腺ホルモン(PTH)により最大活性が抑制された。これらの特性は上皮側NHEと同様であることから、OK細胞には上皮側および基底側の両側にNHE-3が発現している可能性が高いと考えている。即ちある条件下ではNHE-3は基底側膜にも発現しうると思われる。但し、NHE活性の細胞内[H^+]に対する感受性が上皮側と基底側では多少異なることから、上皮細胞における局在が異なるとその機能が多少異なる可能性が示唆された。一方、メタロチオネインプロモーターの制御下に組み込んだヒトNHE-1cDNAをOK細胞に移入し、亜鉛を用いて急性に発現されると基底側にのみNHE-1活性が発現したことから、NHE-1にはOK細胞において基底側にtargetされるシグナルが内在していると考えられる。
アッシリア浮彫の石材分析から挑む産地同定と復元

本年度の主な研究活動は、1第2回英国調査、2第3回英国調査、3美術史・文献研究、4研究会、から成る。1前年度の調査に引き続き、第2回目の大英博物館調査を行った(45月:安間・申・辻・渡辺・テイラー・ブレアトン・クイン)。博物館地下に置かれた浮彫のほか、ギャラリーの展示品(人面有翼牡牛像・「ラキシュの戦い」浮彫図など)に使われた石材の化学組成を明らかにするため、携帯型蛍光X線分析装置をつかった非破壊分析ならびに帯磁率を測定した。また「ティル・トゥーバの戦い」浮彫図の表面にみえる微化石について撮影を行い、微化石の専門家に意見を求め、大型底生有孔虫Alveolinidae科であることが判明した。種を特定するため、浮彫の試料採取を申請した。調査後、大英博物館へすべてのデータを提供した。2第3回目の英国調査では、大英博物館・アシュモリアン美術館・バーミンガム博物館において浮彫調査を行った(8月:安間・申・渡辺・ブレアトン・コリンズ・鷲津)。大英博物館では、前回までアクセス不可能だった「ティル・トゥーバの戦い」浮彫上段部分ならびに左半分を成す浮彫石板について分析を行った。アシュモリアン美術館では、前回訪問時に特別展に貸し出されていてアクセスできなかった浮彫について非破壊分析を行なった他、浮彫9点からサンプル採取を行った。バーミンガム博物館では、倉庫に置かれた浮彫とギャラリーに置かれた浮彫について非破壊分析を行った。調査後、各関係機関へすべてのデータを提供した。3大英博物館収蔵浮彫のライオン狩り浮彫について、美術史・文献学的研究をミュンヘン大学ならびにウィーン大学研究者と共同で行い、国際学会等で発表した(7月:渡辺・ノヴォトニー・ゼルツ)。古代メソポタミアに少なくとも異なる2種類のライオンが生息していたことが明らかになった。4研究会を開催して今後の研究について意見交換した(12月)。調査許可取得が極めて困難な大英博物館において多数の浮彫調査を行うことができ、またアシュモリアン美術館では試料採取が実現したため。これまでに行った調査では、ニネヴェ出土の浮彫について十分な量の調査ができたが、ニムルド出土浮彫のデータがまだ少ないため、今後はニムルド浮彫の調査を中心に進め、石材の違いを明らかにする。ニネヴェ南西宮殿第33室出土浮彫の微化石を含む石材について、推定される原産地であるトルコ南東部の石切場から岩石試料を入手できるよう、多方面に働きかける予定である。浮彫の美術史・文献学的研究については、引き続きニネヴェ北宮殿出土浮彫の国際共同研究に挑む。本年度の活動は、1研究・調査手法の検討、2美術館等への調査申請、3調査(国内・海外)、4美術史・文献研究、を中心に進めた。1浮彫石材の分析方法については、科学的成果が上がる手法の追究と同時に、対象が文化財として極めて価値の高い遺物であることから、対象にダメージを与えず、不慮の事故を予防する手段について慎重に検討した(6月「アッシリア浮彫石材・産地同定手法セミナー(筑波大学)」:安間・中野・申・山田・昆・池端・丸岡・渡辺)。調査開始前にも具体的な分析の段取り・分担・試料採取の準備等について打合せを行った(11月:安間・申・渡辺)。2岡山オリエント美術館、MIHO MUSEUIM、大英博物館、アシュモリアン美術館、バーミンガム美術館、モードリン・コレッジ(オックスフォード)、フィッツウィリアム美術館(ケンブリッジ)、デンマーク国立美術館の関係者に研究概要を説明し、国内(2件)・海外(4件)の美術館に調査申請書を提出した。バーミンガム美術館学芸員の鷲津氏と打合せを行い(3月:ロンドン)、デンマーク国立美術館調査申請について関係者(ヘレ・ラスムセン・ブリシュ)に聞き取り調査を行った(9・10・2・3月:コペンハーゲン・オーフス)。3岡山オリエント美術館収蔵の浮彫を非破壊分析で調査した(11月:安間・申・辻・渡辺)。調査後に改善点を検討し、MIHO MUSEUMの浮彫調査に活かした(12月:安間・申・辻・渡辺)。国内調査を基盤に、大英博物館・アシュモリアン美術館・モードリン・コレッジで浮彫調査を実施した(3月:安間・申・辻・渡辺・テイラー・ブレアトン・コリンズ)。調査後、各関係機関へ写真を含むすべてのデータを提供した。4浮彫の美術史・文献学的研究をミュンヘン大学と共同で行い、国際学会等で発表した(5・7月:渡辺・ノヴォトニー)。調査許可取得が極めて困難な大英博物館について、2018年秋に予定される特別展に向けた共同研究を提案したことにより、博物館側の協力が得られ、研究初年度から相当数の浮彫調査が実現したため。また「ティル・トゥーバの戦い」

浮彫図の表面にみえる微化石について撮影を行い、微化石の専門家に意見を求め、大型底生有孔虫Alveolinidae科であることが判明した。種を特定するため、浮彫の試料採取を申請した。調査後、大英博物館へすべてのデータを提供した。2第3回目の英国調査では、大英博物館・アシュモリアン美術館・バーミンガム博物館において浮彫調査を行った(8月:安間・申・渡辺・ブレアトン・コリンズ・鷲津)。大英博物館では、前回までアクセス不可能だった「ティル・トゥーバの戦い」浮彫上段部分ならびに左半分を成す浮彫石板について分析を行った。アシュモリアン美術館では、前回訪問時に特別展に貸し出されていてアクセスできなかった浮彫について非破壊分析を行なった他、浮彫9点からサンプル採取を行った。バーミンガム博物館では、倉庫に置かれた浮彫とギャラリーに置かれた浮彫について非破壊分析を行った。調査後、各関係機関へすべてのデータを提供した。3大英博物館収蔵浮彫のライオン狩り浮彫について、美術史・文献学的研究をミュンヘン大学ならびにウィーン大学研究者と共同で行い、国際学会等で発表した(7月:渡辺・ノヴォトニー・ゼルツ)。古代メソポタミアに少なくとも異なる2種類のライオンが生息していたことが明らかになった。4研究会を開催して今後の研究について意見交換した(12月)。調査許可取得が極めて困難な大英博物館において多数の浮彫調査を行うことができ、またアシュモリアン美術館では試料採取が実現したため。大英博物館ならびにアシュモリアン美術館における調査では、非破壊分析に加えて新たに試料採取の申請を行い、詳細な分析を目指す。大英博物館の特別展に向けて、調査した浮彫のデータを整理し、展示に活かせる状態で提供する。浮彫の美術史・文献学的研究について新たなテーマに挑み、出土状況が不明な浮彫を特定して石材分析へつなげる。これまでに行った調査では、ニネヴェ出土の浮彫について十分な量の調査ができたが、ニムルド出土浮彫のデータがまだ少ないため、今後はニムルド浮彫の調査を中心に進め、石材の違いを明らかにする。ニネヴェ南西宮殿第33室出土浮彫の微化石を含む石材について、推定される原産地であるトルコ南東部の石切場から岩石試料を入手できるよう、多方面に働きかける予定である。浮彫の美術史・文献学的研究については、引き続きニネヴェ北宮殿出土浮彫の国際共同研究に挑む。
ソフト再結晶化法による配位アシンメトリー材料の創成

酢酸のように競争的に配位する分子を共存させた状態で熱処理することで、比較的穏やかな条件で平衡性を高めた条件でその場再結晶化する技術を開発し、SURMOFナノシートのその場再結晶化法を開発した。この技術をさらに発展させ、二次元にとどまらず、キャピラリィなどの限定された空間中での結晶化を検討する。面内、面間、基板表面にアシンメトリーを導入した新たなアシンメトリー配位高分子を開発する。対称性の崩れた表面・空間を基盤とした再結晶化によって、多孔性配位高分子材料に様々なアシンメトリーの導入を試みる。
新磁性分野の創生:キラル磁性体に関する企画調査

分子性固体では、「柔軟な分子・結晶構造設計にもとづく磁気環境制御」が容易に推進できる。本研究計画では、「キラル分子・磁性・光」をキーワードとし、理論、実験両面からキラル磁気環境の発現機構・意義を解明し、基礎理論を打ち立てるとともに特異な磁気光学効果の機構を確立する。このため、物理・化学、理論・実験の壁を積極的に取り払った広く深い研究連携体制を整え、新磁性分野の確立を目指す。このような連携は、現在のところ我が国でのみ可能なものである。この連携を活かし、未来のIT産業を支える光アイソレータ、信号分波器、超高密度磁気光記録デバイス等への応用・磁気光エレクトロニクスに基礎研究の立場で貢献することも目指して研究者の連携を図ることを目的とした。本研究計画では研究目的に従い以下のように研究体制を整え、研究者相互の研究方法、進めかたに関する以下の議論を密に行う。・不斉磁気光学効果(井上、岸根、有馬、中村、秋田)光学活性とファラデー効果の両方を備えるキラル磁性体、強誘電強磁性体に特有の効果で、今まで透明な分子強磁性体、分子フェリ磁性体で確認されたことがないため、理論、実験系が密に議論する必要がある。測定手法、必要機器、分子設計等について議論を行う。・キラル磁気構造(井上、菊地、岸根、秋光、大隅、細越)キラル磁気構造の観測・決定は、基礎科学的にキラル磁性体の最も重要な特徴であり、観測例はもとより、理論的考察もほとんどなされていない。しかしながらキラル磁性体の持つ非対称な電場によって、キラル磁気構造をとる可能性が高い。理論、実験系が測定手法、必要機器、分子設計等について密に議論する。・キラル磁気ダイナミックス(井上、菊地、岸根、山田、坂井、藤山、細越)キラル磁性体で予測していなかった特徴的に見られる遅い磁化ダイナミックスを観測している。このダイナミクスは、コニカルスピンオーダーの反転に伴うものと考えられ、この予測が正しければ、新しい物理現象として興味が持たれる。この現象に関しても、理論家との議論を重ねることにより、解明して行く。また、7月にメンバー全員と他の研究者を加えて研究会を開き、全体として深く議論を進めた。その結果数多くの共同研究がスタートしている。
中心体局在がスイッチとなる新規細胞増殖制御機構の解明

最近報告者は、細胞間接着の鍵となる蛋白質Albatross(InokoらJCB2008)が、増殖時の中心小体複製と紡錘体形成、飢餓時の一次線毛形成の全てに寄与する示唆を得た。本研究では、この中心体Albatrossによる細胞増殖寄与の分子基盤が、1中心小体複製の主要な蛋白質との結合、2紡錘体形成の主要な分裂期キナーゼとの結合、にあることを明らかにした。以上のことからAlbatrossは中心体の微小管動態を統合する初めての蛋白質である。Albatrossは増殖と分化のbi-playerなのである。合わせて中心体連結として細胞周期制御に寄与するRootletin線維の非染色可視化にも成功した。2012年に申請者は、細胞増殖と休止が中心体上の一次線毛動態によって切り替わる全く新しいしくみを、Trichopleinの中心体局在の有無に基づく分子機構とともに示した(Inoko et al.JCB 2012)。最近、Trichoplein類似蛋白質であるAlbatross(Sugimoto, Inoko et al.JCB 2012)の中心体局在もTrichopleinとは全く違う仕組みで細胞増殖のスイッチとなることを示す予備結果を得た。中心体にAlbatrossが局在することで細胞周期進行が保証されており、その局在の有無が細胞周期進行のスイッチとなっている可能性がある。本研究の第一目的は、この中心体Albatrossによる細胞増殖制御機構の分子基盤の詳細な解析である。また、類縁分子群として中心体と上皮細胞間を遷移する「TPHD分子群」も含めた解析補完を進める。その最終目標は、細胞周期スイッチと上皮分化制御を統合する新しいタイプの分子群の分子基盤の解明にある。平成26年度は、以下の細胞生物学的実験を行い、Albatrossが関わる細胞周期制御現象について分子レベルでの相関を明らかにすることができた。(1)中心体Albatrossのノックダウンで正常二倍体細胞の中心小体複製に影響が出ることがわかった。また、生化学実験により、この機能上重要な結合分子も数種に絞り込むことができた。(2)Albatrossノックダウンに伴う細胞周期停止についてはG2/M停止であることが分子マーカーより明らかになったが、この分子基盤の同定には細胞周期エンジンおよびブレーキ(チェックポイント)の両面からの標的分子の決定が必要であり、慎重な探索を進めている。以上のことより、少なくともAlbatrossが、細胞周期進行に必要な中心体機能を統合するこれまでにない重要な蛋白質であることが明らかになってきた。平成27年度は、Albatrossが関わる細胞周期制御現象について特にその中心小体近位端局在での分子相関をさらに強固にすることができた。また、生化学実験により、この機能上重要な結合分子も絞り込むことができた。(2)Albatrossノックダウンに伴う細胞周期停止についてはG2/M停止であることが分子マーカーより明らかになったが、この分子基盤には分裂期キナーゼによる微小管ダイナミクスの強い相関が確認できた。(3)これらの表現型はレスキュー実験でも確認できた。以上のことより、少なくともAlbatrossが、細胞周期進行に必要な中心体ダイナミクスを統合するこれまでにない重要な蛋白質であることが明らかになってきた。Albatross遺伝子ノックダウンの表現型から推測された、細胞周期進行や中心体複製に必要な分子群との重要な相互作用がin vitroおよびレスキュー実験で確認できた。2012年に報告者は、細胞増殖と休止が中心体上の一次線毛動態によって切り替わる全く新しいしくみを、Trichopleinの中心体局在の有無に基づく分子機構と共に示した(InokoらJCB 2012,猪子ら化学と生物2013)。最近、Trichoplein類似蛋白質であるAlbatross(InokoらJCB2008)の中心体局在もTrichopleinとは全く違う仕組みで細胞周期進行を保証している示唆を得た。すなわちAlbatrossは増殖時の中心小体複製と紡錘体形成、飢餓時の一次線毛形成のすべてに寄与する初めてのたんぱく質であるという発見であった。本研究では、この中心体Albatrossによる細胞増殖寄与の詳細な分子基盤解析を行ってきた。H28年度は、中心小体複製の分子基盤が主要な蛋白質との結合にあること、紡錘体形成の分子基盤が主要な分裂期キナーゼの結合にあることを明らかにした。

また、Albatross変異体解析により、その責任配列も明らかにすることができた。以上のことから細胞間接着の鍵を握るAlbatross(InokoらJCB2008)は増殖細胞の中心体ではあらゆる微小管動態を統合する初めてのたんぱく質であるという確固たる確証に至った。まさにAlbatrossは増殖と分化のbi-playerである。この分子基盤が中心体固有の分化現象である気管線毛形成にあてはまるかを今後検討することは、高次分化を紐解く上でさらに有意義であると考える。同様に、中心体連結として細胞周期制御に寄与し、線毛根としての感覚寄与も示すRootletin線維の新型顕微鏡による非染色可視化に成功した。これは筑波大加納英明准教授との医工学共同責任研究成果として、多くのWebニュースに取り上げられた。本技術は広範な生物感覚構造が可視化できることから、眼病診断や生物感覚研究への応用が期待される。最近報告者は、細胞間接着の鍵となる蛋白質Albatross(InokoらJCB2008)が、増殖時の中心小体複製と紡錘体形成、飢餓時の一次線毛形成の全てに寄与する示唆を得た。本研究では、この中心体Albatrossによる細胞増殖寄与の分子基盤が、1中心小体複製の主要な蛋白質との結合、2紡錘体形成の主要な分裂期キナーゼとの結合、にあることを明らかにした。以上のことからAlbatrossは中心体の微小管動態を統合する初めての蛋白質である。Albatrossは増殖と分化のbi-playerなのである。合わせて中心体連結として細胞周期制御に寄与するRootletin線維の非染色可視化にも成功した。Albatross遺伝子ノックダウンの表現型から推測された、細胞周期進行や中心体複製に必要な分子群との重要な相互作用がin vitroでもいくつか確認できた。Albatross蛋白質の中心体機能解析の基盤となる標的機能蛋白質との相関序列を、in vitroだけでなく、相互ノックダウンおよび断片レスキューによる現象相関、細胞レベルの蛋白質局在変化など、多方面から確認する。現在、中心小体複製および微小管ダイナミクスを統合する重要分子として論文投稿の準備中である。細胞周期と相関する中心体連結や線毛根として生物感覚に関わる非常に小さな構造であるRootletinフィラメントが新型の分光顕微鏡で非染色可視化出来ることを分子生物学に証明し、多くのWebニユースで取り上げられた。これは筑波大・加納英明准教授との医工学共同責任研究成果である。細胞生物学Albatross蛋白質の中心体機能解析の基盤となる標的機能蛋白質との相関序列を、in vitroだけでなく、相互ノックダウンによる現象相関、細胞レベルの蛋白質局在変化など、多方面から確認する。最終的には中心小体複製、あるいは細胞周期制御を含めたいずれかの解析段階での機能報告としての論文投稿を計画中である。病態代謝研究会および武田科学振興財団に申請した研究計画で助成金を得たため、そちらの成果報告に向けた実験が発生し、結果的に次年度使用額が生じた。