hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造岩鉱物の熱力学的な性質のデータベースの充実とその応用

天然の鉄に富む泥質変成岩において、全く新しい変成反応を発見した。これは、石英と白雲母の存在下においてクロリトイドと緑泥石が反応して紅柱石を黒雲母が生じる反応である。またこの反応の温度は、石英と白雲母の存在下で緑泥石が分解消滅して菫青石、黒雲母、紅柱石が生じる反応よりも低温側にあることを見出した。泥質変成岩はKFMASH系でよく近似されるが、スピアーとチェニー(1988)やパウエルとホランド(1990)によるKFMASH系のデータベースに基くとこの反応は存在しないことになる。不一致の原因は、これまでざくろ石の安定領域が過大評価されていたことにあるらしい。これまでのデータベースにはFASH系の合成実験のデータが充分にとり入れられていない。斜方角閃石の安定領域に関するグリーブとフォーセット(1976)の重要な実験が無視されていたために、鉄ざくろ石の安定領域が過大評価されていたのである。これを考慮すると、基準としてよく用いられている、鉄十字石と石英が反応して鉄ざくろ石と紅柱石が生じる反応は準安定な反応にすぎないことがわかる。これまで泥質変成岩と白雲母を含まない斜方角閃石を変成岩とは全く別々に取り扱われてきたが、本研究によりはじめて統一的な相平衡図により、予盾なく説明されることになった。本年度、万国地質学会議において発表を行った。塩基性変成岩に関しては、中国の古生代衡突帯における、ダイヤモンドやコーサイトを含む超高圧変成岩の鉱物組合せの解析を行い、通説に反し、高圧高温においても緑簾石等の含水鉱物が安定に存在するという新知見を得た。これまでのデータ・ベースのどこを改定すべきかは今後の問題である。
へき地小規模校における児童の問題解決能力育成を図るためのシステムについての研究

へき地小規模校における児童の問題解決能力育成を図るためのシステムの開発を行った。この開発したシステムを北海道内の小学校を用いて実践的に検証を行った。今までの総合的な学習の時間等で行われてきた児童の研究発表のスタイルを見直し、児童の自ら見いだした課題を基に問題の解決から成果発表を行わさせるためのシステムを取り入れることで、児童が自らの研究を自信を持って発表する姿や、課題解決が次の課題を見いだし、課題解決する楽しさを実感する児童の姿を見ることができた。これらのシステムを指導する教師の評価から本システムの有効性を検証することができた。本研究はアラスカ大学フェバンクス校の協力を得て、アラスカ州で行われているサイエンスフェアの実施状況とその実施のためのシステムを研究した。結果、児童の問題解決能力の育成を図るモデルとして有効な情報を得ることができた。この情報をもとに日本で取り組むことができるよう取り組み方法を検討し、研究の発表を「研究ボード」1枚に収める方法とそのボードにどのようにまとめていくか、その研究の評価方法を検証するために、研究初年度より、モデル学級を設定し、釧路管内標茶町教育委員会の協力のもと、標茶小学校5年生で行った。研究2年目には、研究ボードを開発し、ボードを用いた児童自身の研究(ジュニア研究)が本格化した。3年の研究の末、1つのモデルとしてジュニア研究・釧路湿原サイエンスフェアを実施できるようになり、児童自身の課題把握から問題解決を行うプロセスを踏んだ「ジュニア研究」発表会及び研究展示会を実施できるまでなった。また、このシステムを用いたジュニア研究は1年目は1校、2年目は3校、そして3年目は釧路管内3校、根室管内1校、十勝管内3校まで広がりつつある。その取り組みは小規模校だけでなく、大規模校の児童の問題解決能力の育成に寄与できるものになった。平成27年度の1校の調査をもとに、アラスカ大学教育学部フェアバンクス校の協力を得て、サイエンスフェアを実施している小学校・中学校4校(Pearl Creek Elementary、Two Rivers K-8、Watershed Charter、Effie Kokrine Charter)を平成28年9月に訪問し、児童・生徒の取り組み状況を調査した。サイエンスフェアの取り組みは、個人、グループ、学級と様々な取り組みがなされ、各学校独自の指導がなされていることがわかってきた。また、サイエンスフェア独自の発表用のボードを入手するとともに、取り組み方法、指導法や評価表等の資料を収集した。さらに実際に実施したサイエンスフェアの資料についても記録することができた。また、指導者にもインタービューし、指導者の思いを聴取した。この中で、科学教育の現状についてや、学校独自の科学教育の取り組みについても聴取を行った。これらを調査後、資料等の翻訳、実施状況の把握を行った。この調査の成果については「地学に関する自由研究評価表の作成アラスカ州「サイエンスフェア」の取り組みから」として日本地学教育学会において発表した。評価表を基に、サイエンスフェアの評価表の日本での活用方法を探った。北海道環境財団(NPO)と連携し、北海道釧路管内小学校での試験的な活用法を探った。評価表を用いて自由研究発表会の資料の評価を行った。しかし、取り組み方法等に課題が有り、成果を挙げることには至っていない。その後、日本での活用を考慮したサイエンスフェアの評価表作成を行い、その運用を検討しているところである。研究発表1件を行った。また、小学校の自由研究発表会でサイエンスフェアで用いている評価表を日本向けに翻訳、改良して自由研究の評価を行い、日本でのサイエンスフェアの運用について検討することができた。しかし、日本の自由研究において、サイエンスフェアのモデル的な運用を行うことができる学校の見通しがまだ立っていない。釧路管内の2小学校においてサイエンスフェアを試験的に実施し、自由研究発表の実践的検証を行った。平成28年度に入手したサイエンスフェア発表用のボードをもとに、観音開きの「自由研究ボード」を平成29年度に開発し、段ボール加工業者に発注した。この自由研究ボードを、2校での研究発表に使用した。この際、自由研究ボードに記載させる内容は、問題解決の流れに沿った内容となるように、形式の見本を提示した。このことにより、児童の研究の内容や方法が変わって来たことが伺えた。この研究発表ボードの開発と成果については平成30年度に学会で発表する。さらに、実践校を増やし、平成30年度はへき地小規模校も視野に入れていく予定である。平成28年度のサイエンスフェアを実施している小学校・中学校の調査を受けて、29年度はアラスカフェアバンクス校の協力を得て、各学校大会の上位大会である「サイエンスフェアフェアバンクス大会」の取り組みの視察及びその状況を調査した。サイエンスフェアフェアバンクス大会における審査、審査結果の表示及び表彰式、さらに実施後の学校を視察した。このことより、上位大会のシステムや運営方法が明らかとなった。また、審査の状況を審査員や運営者に聞き取ることでどのように審査を行っているかがわかり、サイエンスフェアの実施方法が明らかとなった。この実施方法については、現在論文執筆中である。各学校におけるサイエンスフェアの取り組みとともに、現在、この上位大会の実施方法を北海道環境財団等のNPOと連携しながら探っている状況である。平成29年度は、地学教育学会において、上位大会実施については、地域の科学イベントでの可能性があることを地学教育学会で発表した。今後は、上位大会を設け、自由研究の発表の場を確保することで、本研究の「児童の問題解決能力育成を図るためのシステム」が作り上げられる。自由研究ボードの製作が地元の業者の協力があり独自の自由研究発表ボードが完成した。

この自由研究ボードの開発により、自由研究の実施校において活用が図られ、ボードを使うことによって児童の問題解決能力の育成に寄与できることがわかってきた。この状況及び成果について平成30年度に学会で発表を行う。しかし、当初見込んでいた羅臼町での取り組みが行われていない。学校において新しい事を導入することへの抵抗が大きく、現在、実施の方向を手探りしている状況である。アラスカ州フェアバンクス地区における学校のサイエンスフェアの取り組みとともに、その上位大会であるフェアバンクス・ノーススター教育区サイエンスフェアを視察し、その実施方法や評価方法について検討することができた。この成果について論文執筆中である。しかし、アラスカ州アンカレッジ地区のサイエンスフェアの取り組みについては、29年度はフェアバンクス地区の上位大会の調査に追われたため実施していない。次年度の課題である。へき地小規模校における児童の問題解決能力育成を図るためのシステムの開発を行った。この開発したシステムを北海道内の小学校を用いて実践的に検証を行った。今までの総合的な学習の時間等で行われてきた児童の研究発表のスタイルを見直し、児童の自ら見いだした課題を基に問題の解決から成果発表を行わさせるためのシステムを取り入れることで、児童が自らの研究を自信を持って発表する姿や、課題解決が次の課題を見いだし、課題解決する楽しさを実感する児童の姿を見ることができた。これらのシステムを指導する教師の評価から本システムの有効性を検証することができた。本研究はアラスカ大学フェバンクス校の協力を得て、アラスカ州で行われているサイエンスフェアの実施状況とその実施のためのシステムを研究した。結果、児童の問題解決能力の育成を図るモデルとして有効な情報を得ることができた。この情報をもとに日本で取り組むことができるよう取り組み方法を検討し、研究の発表を「研究ボード」1枚に収める方法とそのボードにどのようにまとめていくか、その研究の評価方法を検証するために、研究初年度より、モデル学級を設定し、釧路管内標茶町教育委員会の協力のもと、標茶小学校5年生で行った。研究2年目には、研究ボードを開発し、ボードを用いた児童自身の研究(ジュニア研究)が本格化した。3年の研究の末、1つのモデルとしてジュニア研究・釧路湿原サイエンスフェアを実施できるようになり、児童自身の課題把握から問題解決を行うプロセスを踏んだ「ジュニア研究」発表会及び研究展示会を実施できるまでなった。また、このシステムを用いたジュニア研究は1年目は1校、2年目は3校、そして3年目は釧路管内3校、根室管内1校、十勝管内3校まで広がりつつある。その取り組みは小規模校だけでなく、大規模校の児童の問題解決能力の育成に寄与できるものになった。アラスカ州におけるサイエンスフェアの実施
トランスメンブランコントロール機構の基礎的研究

1.重点領域研究の立案。トランスメンブランコントロール機構に関する基礎的知見を一層広げ、深めるための方策を検討することが本研究の目的である。昭和61年9月16日および同年12月15日の二回、いずれも東京において班会議を開き、新しい実験手技、海外の最新の知見などに関する情報交換を行い、研究推進の具体的方策について討議した。とくに、昨年度に計画、作成した「重点領域研究」重点領域申請書の構想について、詳細な点まで反省、再検討を加え、その結果、(1)細胞増殖等、長期に瓦る効果のトランスメンブランコントロールについては、短期的効果のそれと密接に関係しており、共通する過程も多いと考えられるので、昨年は計画の一部に加えたが、少なくとも研究方法等において異なった側面も多いので、問題をしぼるために、今回の計画からは除外する、(2)カルシウムをセカンドメッセンジャーとする過程は、何と言ってもトランスメンブランコントロール機構の最重要過程なので、その研究計画を充実させる、の2点に関して修正し、その修正された構想に基づいて新たに昭和63年度発足重点領域申請書を作成し、昭和62年3月、文部省に申請した。2.シンポジウムの開催。また、昭和61年12月15日には、東京大学医学部構堂において、シンポジウム「トランスメンブランコントロール」を開催し、(1)発生分化過程とイオンチャンネル〔高橋国太郎〕、(2)アセチルコリンとCカイネース[栗山煕]、(3)アドレノセプターを介する心筋収縮性制御機構[遠藤政夫]、(4)脳情報伝達-遺伝子移入再構成系による一解析[野村靖幸]、(5)血小板のトランスメンブランコントロール[日高弘義]、(6)細胞膜裏打ち構造とその【Ca^(2+)】制御[祖父江憲治]、の6題の興味ある講演が行われ、活発な討論と相まって、出席したこの分野の研究者に大きな刺激を与えた。
高反応性有機ホウ素反応剤の複雑な系での活用

本研究では,今まで研究対象から外されていた立体障害の大きな基質に対して高反応性有機ホウ素反応剤を適応し,その選択性や反応性を検討した。(2)σ面対称をもつπ-アリルニッケルを生じるシクロヘキセニルアセテートとオルト位にキラル中心のあるアリールホウ素反応剤との反応では,そのキラル中心によってπ-アリル部位の反応位置が効率よく不斉誘導(>90%ds)されることを初めて見いだした。(3)γ位にシリルオキシ基を有するシスブロミドとアルケニル基とのカップリング反応をホウ素反応剤を用いて行ったところ,シスートランス共役ジエンが収率よく合成できた。この反応を活用して10,11-dihydro-LTB_4やこれに類似した天然物が合成できた。(4)海洋グラム陰性菌に対して抗菌活性を示すkorormicinの立体化学を全合成により決定するため,可能な4つのdiastereomerを有機ホウ素反応剤とのカップリング反応を用いて合成した。そして,それぞれのジアステレオマーの旋光度を測定したところ,(5S,3′R,9′S,10′R)-体が天然のものと一致した。(5)Δ^7-PGA_1メチルエステルの合成にも成功した。この合成の際,エノンのαdash位でのアルドール反応について合成上有用な知見が得られた。この研究課題では以下の2つのことを明らかにした。γ位にシリルオキシ基を有するシスブロミドが光学活性体として容易に入手できることから,これに注目した。しかし,シリルオキシ基がかさ高く,かつ臭素原子が脱離基として中程度の反応性しか示さないことから従来のカップリング反応剤は使えず,有機合成に活用された例は少なかった。しかし,ホウ素反応剤を使うと収率よくdihydro-LTB_4のシス-トランス共役ジエン構造を合成できた。さらに,この反応を利用して類似のdihydro-LTB_4体(10,11-dihydro-LTB_4amide,10,11-dihydro-LTB_3,10,11一dihydro-12-oxo-LTB_4)も合成できた。合成したdihydro-LTB_4は共役トリエン構造をもつLTB_4そのものよりも化学的安定性に優れており,生化学的研究に役立つものと考えられる。(2)キラルなホウ素反応剤を用いる基質の立体制御σ面対称をもつπ-アリルニッケルを生じるシクロヘキセニルアセテートとオルト位にキラル中心のあるアリールボレートとの反応を行ったところ,そのキラル中心によりπ-アリル部位の反応位置が高度に選択(ds>90%)されることを見いだした。近年,人工妊娠中絶薬(RU486)が開発され,話題となっている。この分子は19-ノルステロイド(19位メチル基の無いタイプ)の11位にρ-(NMe_2)C_6H_4基を有しており,19-ノルステロイドから合成されている。しかし,19-ノルステロイドは非天然型であり,天然型(19位メチル基のついているタイプ)への移行が望まれる。しかし,現行法は11-置換天然型ステロイドには対応していない。そこで我々はこの目的を達成するため,モデル化合物として8-acetoxy-octalone-Δ^<1(9)>-2(1)を選び,我々の開発したボレートを用いてこの化合物の8位に芳香環を立体選択的に導入する反応を検討した。最近,カルボニル基を含む反応剤がいくつか開発されている。しかし,アリルカップリング反応に適した試薬の開発は遅れていた。我々は,カルボニル基を含むアルケニルあるいはアリールホウ酸の2,3-ブタンジオールエステルにMeZnClを作用させるとMe基がホウ素原子と選択的に反応し,有機ホウ素反応剤が調製できることを見出した。こうして調製した有機ホウ素反応剤はニッケル触媒存在下,種々の第二級アリルエステルと反応しカップリング生成物を高収率で与えた。つぎに,海洋グラム陰性菌に対してのみ選択的かつ強力な抗菌活性を示すkorormicinの立体化学を合成により決定する研究を行った。

まず,korormicinをラクトン部分,アミド部分,エボキ基を含む有機ホウ素反応剤部分に分けて考えた。そして,可能な4つのdiastereomerを合成するため,ラクトン部分はS体を,その他のフラグメントは両エナンチオマーを光学純度高く合成した。ラクトン部分とアミド部分を縮合し,生じた2種類の中間体を有機ホウ素反応剤キーステップとする方法で縮合するとkorormicinが合成できた。こうして合成した4つのジアステレオマーの旋光度を測定したところ,(5S,3'R,9'S,10'R)-体が天然のものと一致した。また,delta7-PG A1メチルエステルの合成にも成功した。この合成の際,エノンのαdash位でのアルドール反応について合成上有用な知見が得られた。
白血球分化における細胞接着分子セレクチンの糖鎖リガンド発現の転写制御機構

セレクチンを介した細胞接着はこれまで炎症における白血球の炎症局所への動員で重要な役割を演じるとされてきたが、ノックアウトマウスを用いた成績などから、非炎症時においても恒常的に各種の血液細胞を体内のしかるべき組織へ運搬しホーミングさせるホメオスタティックな機能を持つ事が明らかになってきた。セレクチンの糖鎖リガンドは従来からsialyl Lewis x(sLe^x)とされている。この糖鎖は顆粒球・単球系細胞では構成的に発現され、リンパ球系細胞では一部の特定のサブセットを除き陰性であるが、活性化刺激により発現が強く誘導される。こうした細胞系統特異的でかつ細胞の活性化状態に依存したsLexの発現は、これを合成するフコース転移酵素の7番目のisozyme(Fuc-T VII)によって調節される。我々は成人T細胞性白血病細胞においてsLe^x発現の異常な亢進を見出し解析したところ、成人T細胞性白血病細胞の病因ウイルスHTLV-1のコードするTax蛋白質が、Fuc-T VII遺伝子5′-調節領域のCRE様配列を介して転写を異常に促進する事が判明した。GCリッチ領域に挟まれた独特のこのCRE様サイトは刺激による転写誘導に関与し、既知のCREB/ATFファミリー以外の転写因子が結合する可能性が高い。この遺伝子の調節領域にはGATAおよびMZFなどの転写因子結合サイトも存在し、これらは細胞系統特異的発現に関連すると思われたのでさらに解析を進めた。また我々は通常のsLe^xのほかに、硫酸化sLe^xがセレクチンの重要な糖鎖リガンドである事を見出した。sLe^xが主として炎症時にはたらくリガンドであるのに対して、硫酸化sLe^xは平常時に各種の血液細胞を体内の諸組織ヘホーミングさせる際に主要なリガンドとして機能する。現在までに、ナイーブT細胞の二次リンパ装置へのホーミング、ヘルパーメモリーT細胞のα_4β_7インテグリン陽性サブセットの腸管特異的ホーミング、CCR4陽性サブセントの皮膚特異的ホーミングにおいて硫酸化sLe^xがセレクチンの主要リガンドであることを明らかにした。また末梢血CD34陽性幹細胞や樹状細胞の前駆細胞にもこの糖鎖の存在を示す予備データを得ている。血液細胞で硫酸化sLe^xの発現を規定する硫酸基転移酵素の発現機構の検討した。
利益概念と会計の職能に関する制度的および概念的研究

本研究では、利益概念と会計の職能の関係に焦点を当て、会計基準等の制度的な観点と、会計理論上の概念フレームワークの観点の2つの観点から、両者の相互関係について調査研究を行った。具体的には、イギリス、日本および国際会計基準および概念フレームワークを取り上げ、それらと利益概念との関係を検討した。日本の会計基準のうち、商法系統に属するものは、利害調整機能を志向し、実現利益概念を採っている。これに対して、証券取引法系統に属するものは、情報提供を志向しているが、利益概念としては実現利益概念を採っている。このことは、日本独自の概念フレームワークからも明確に窺える。国際会計基準が予定していると思われる会計職能は、企業価値の推定に役立つ情報の提供というよりも、企業価値そのものの計算にあること、また利益概念としては、これまでの実現概念を放棄し、企業価値の期首期末の差額としての利益であるとの知見を得た。イギリスの会計基準(財務報告基準)は、基本的に情報提供機能を志向している。しかし、純利益のような特定の数値に意味を持たせるのではなく、収益費用として計上されたそれぞれの項目に意味を持たせる情報セットアプローチを採っている。この点は、世界的に見ても初めての試みであり、今後、このアプローチが支持されていくのか否か、注視していく必要がある。以上のことから、つぎのような知見を得た。すなわち、会計職能と利益概念との関係が1対1の対応関係にあるのではなく、1対多の対応があり得ることを示唆するものである。本年度は、まず商法、企業会計原則および最近設定された会計基準を取り上げ、それぞれが予定していると思われる会計職能と利益概念を分析検討した。商法は伝統的に利害調整職能を重視し、配当可能限度額の計算の目的から、実現利益の計算を軸としてきた。しかし、本年の商法改正は、従来の利害調整職能を重視する姿勢とは異質の改正を含んでいると解されている。すなわち、法定準備金の減少手続が新たに設けられたことと、減資差益が法定準備金から削除され、その結果として配当可能限度額に算入されることになったことである。しかし、実質的な減資と解すれば、上記の改正を利害調整の変質と解す必要のないことの知見を得た。つぎに、わが国で企業会計の憲法とされてきた企業会計原則を分析した。その結果、企業会計原則は情報提供職能を重視し、収益費用アプローチを採り、実現利益の計算を重視していることを確認した。取益費用アプローチは、評価ではなく、配分を基本的なコンセプトとし、意思決定情報として有用な純利益の計算を重視している。最後に、最近設定された会計基準として、「固定資産の減損に係る会計基準の設定に関する意見書」を取り上げて、分析検討した。わが国の減損会計基準は、一般にいわれているような時価主義会計ではなく、固定資産について従来から行われてきた配分に基づいた会計処理基準であることの知見を得た。以上の結果、わが国の会計制度は、一般的にいわれているように原価主義から時価主義へと転換が行われたわけではなく、従来の取得原価主義会計の枠組みの中で説明が可能であることの知見を得た。本年度は、イギリスと国際会計基準を取り上げる予定であったが、結果的には国際会計基準のみを検討対象とし、それが予定していると思われる会計職能と利益概念を分析検討した。本年度は、国際会計基準のうち、公正価値評価の流れの拡大と位置づけられる基準と、自己創設のれんの積極的な計上と位置づけられる基準等を取り上げて検討対象とした。得られた知見はつぎのとおりである。まず、前者の流れとして、金融商品会計、投資不動産会計および業績報告を取り上げた。金融商品はかつては原価評価ないし低価評価が原則であったが、近年では一部の金融商品については時価評価されることになった。

これを起点とした時価評価の流れは拡大し、投資不動産についても時価評価が許容されることになった。さらに、現在業績プロジェクトでは、それ以外の項目にも時価評価の対象を広げることが検討されている。後者の流れとして、企業結合会計(公開草案)では、のれんの非償却・減損処理が提案されているが、それは結果として企業結合後の自己創設のれんにつながるごとになる。さらに、企業結合フェーズ2では、より積極的に被買収企業の自己創設のれんの計上を求めようとしている。これら2つの流れから、国際会計基準が予定していると思われる会計職能は、企業価値の推定に役立つ情報提供というよりも、企業価値そのものの計算にあること、また利益概念としては、これまでの実現概念を放棄し、企業価値の機首期末の差額としての利益であることを明らかにした。本年度は、イギリスを検討対象とし、それが予定していると思われる会計職能と利益概念を分析検討した。また、わが国で初めて概念フレームワークが公表されたので、これも分析検討の対象とした。イギリスで財務会計基準委員会が公表している会計基準(財務報告基準)は、基本的に情報提供機能を志向している。しかし、イギリスの会計基準の中で非常に特徴的なことは、固定資産について時価評価が許容されていることと、純利益のような特定の数値に意味を持たせるのではなく、収益費用として計上されたそれぞれの項目に意味を持たせる情報セットアプローチを採っていることである。特に、後者の点は、世界的に見ても初めての試みであり、今後、このアプローチが支持されていくのか否か、注視していく必要がある。また、わが国で初めて公表された概念フレームワークは、基本的には海外の概念フレームワークと同じ構成を採っているが、いくつかの点で異なることが明らかとなった。1つは、経営者の役割は事実の報告であり、投資家の役割は将来の予測であることを明確に述べている点である。2つは、資産負債の評価を原価なり時価なりに統一することが財務報告の目的に役立つのではなく、それらを必要に応じて使い分けることのほうが、財務報告の目的に適うことを明確にしている点である。以上のことから、つぎのような知見を得た。すなわち、会計職能と利益概念との関係が1対1の対応関係にあるのではなく、1対多の対応があり得ることを示唆するものである。
細胞内膜系における脂質非対称性制御機構の解析

生体膜は脂質二重層を形成し、それを構成するリン脂質は非対称に分布している。ホスファチジルセリン(PS)は、細胞膜では内層(細胞質側)に多く存在しているが、ERやゴルジ体では内腔側を向いており、細胞膜とは異なる脂質非対称性制御機構の存在が示唆される。本研究では、細胞内PS局在に異常が生じる酵母変異株をPSプローブであるGFP-Lact-C2を用いてスクリーニングし、得られた因子を解析することにより、内膜系の脂質非対称性制御機構の解明を目指した。生育に必須ではない約4,500遺伝子のスクリーニングを行った結果、46の遺伝子を同定し、その機能とGFP-Lact-C2の局在から6つのグループ(初期エンドソーム-TGN経路、後期エンドソーム-TGN経路、multivesicular body (MVB)経路、クラスリンを介した輸送、ミトコンドリア関連、液胞融合)に分類した。これらのうち、後期エンドソームからトランスゴルジ網(TGN)への逆行輸送を仲介するレトロマー複合体に着目し、細胞内PS輸送への関与について検討した。レトロマー複合体の欠損株では、GFP-Lact-C2は液胞膜に局在しており、レトロマー複合体が後期エンドソームからTGNへPSを選択的に輸送する可能性が考えられた。また、レトロマー複合体のVps5とVps17はPSを含むリポソームと結合し、その結合はVps5とVps17のBARドメインの持つ正電荷と負電荷を持つ脂質との電荷を介した結合であることが示唆された。さらに、Vps5とVps17は、PS依存的にリポソームをチューブ状に変形させた。これらの結果から、レトロマー複合体の構成因子であるVps5とVps17がPSと電荷により結合し、後期エンドソームからTGNへPSを輸送する可能性が示唆された。本研究では、PSプローブであるGFP-Lact-C2を用いて、細胞内PS局在に異常が生じる変異株をスクリーニングし、得られた因子を解析することにより、内膜系の脂質非対称性制御機構の解明を目指す。今年度は、生育に必須でない遺伝子欠損株セットを用いて、細胞内PS局在に異常が生じる変異のスクリーニングを行った。今年度中に全非必須遺伝子(約4,500遺伝子)の解析を終了し、その結果、46遺伝子を同定し、遺伝子の機能とGFP-Lact-C2の局在から6つのグループ(EE-TGN経路、LE-TGN経路、ミトコンドリア機能、ESCRT complex、液胞融合、クラスリンを介した輸送)に分類した。また、同定された因子のうち、後期エンドソーム(LE)からトランスゴルジ網(TGN)への逆行輸送を仲介するレトロマー複合体に着目し、細胞内PS輸送への関与について検討を行った。また、レトロマー複合体のVps5とVps17はPS依存的にリポソームと結合し、その結合にはVps5とVps17のBARドメインの持つ正電荷アミノ酸が重要であった。これらの結果から、レトロマー複合体の構成因子であるVps5とVps17が、負電荷を持つPSと電荷により結合し、後期エンドソームからTGNへPSを輸送する可能性が示唆された。

これらの結果から、レトロマー複合体の構成因子であるVps5とVps17がPSと電荷により結合し、後期エンドソームからTGNへPSを輸送する可能性が示唆された。今年度行う予定であった酵母遺伝子欠損株セットを用いたPS局在に異常が生じる変異株のスクリーニングをすべて終了することができ、次年度に繋がる結果を得た。また、スクリーニングにより得られたLE-TGN経路に関わる因子の解析を順調に進めることができた。スクリーニングにより同定された因子の解析を、LE-TGN経路に関わる因子を中心に行う。具体的には、レトロマー複合体のVps5とVps17がPS以外の脂質(PE, PI, PA等)と結合するかを、Liposome flotation assayにより調べる。また、Vps5とVps17はチューブ構造を形成することが知られているため、形成されたチューブ構造にPSが多く分布しているかをin vitro tubulation assayにより解析する。また、PSとの結合が低下したVps5,Vps17変異体を用いて、in vivoにおけるCPY分泌、細胞内PSの局在への影響を調べる。当初の計画では、次年度、PS局在に異常が生じる変異株のスクリーニングを必須遺伝子に対して行うことを予定していたが、酵母遺伝子欠損株セットを用いた非必須遺伝子に対して行ったスクリーニングにより、興味深い因子が得られたため、そちらの解析を優先して進めていくことに変更した。
血管内皮細胞カドヘリン複合体結合蛋白質の同定と生理機能の解明

細胞間接触による血管内皮細胞増殖の抑制は、内皮細胞を機能的成熟に導く重要な機構である。本研究では、(1)細胞間接触の受容から核における増殖制御に至る細胞質及び核内シグナル伝達系(Ca情報、蛋白質リン酸化あるいは脱リン酸化酵素、転写因子、細胞周期制御蚤白質など)を分子細胞生物学的に解明すること、(2)細胞接着因子の一つ内皮型カドヘリンとその機構複合体の形成に関与する構造を、ツーハイブリッド法を用いて明らかにすることを目的として研究を行った。1.培養内皮細胞の増殖及び細胞周期を、Bromod eoxyuridine(BrdU)の取り込みで評価する方法を確立した。コンフルエントの細胞は、BrdU陽性細胞の割合は0.1%であり、細胞間接触の完成した時期の内皮細胞は増殖を停止していることが明かとなった(Hirano et al.,1999)。2.静止期にある培養内皮細胞及び生体内皮細胞(大動脈弁条片)における、Ca情報伝達機構を明らかにし、血管緊張調節における内皮細胞内Ca情報伝達の役割を明らかにした(Ihara et al.,1999;Kawasaki et al.,1999)3.内皮細胞cDNAライブラリーからミオシン脱リン酸化酵素調節サブユニット(MYPT1)をクローニングした(Hirano et al.,1999)。初めに平滑筋で同定されたMYPT1と相同性が高く、また、細胞増殖の停止に伴い細胞内局在が変化することを明らかにした(Hirano et al.,1999)。4.静止期にある内皮細胞から作製したcDNAライブラリーから、サイクリン依存性キナーゼ阻害蛋白質p27^<kip1>の新規分子種を世界で初めて発見し、細胞間接触による内皮細胞増殖抑制に関与する核内情報伝達分子の一つを見出した(投稿中)。5.内皮型カドヘリン、プラコグロビン、βカテニンを、内皮細胞ライブラリーからクローニングした。ツーハイブリツド法を用いて、プラコグロビン及びβカテニンとの結合に関与する内皮型カドヘリンの機能構造を明らかにした(投塙準備中)。細胞間接触による血管内皮細胞の増殖制御機構に関して、(1)細胞間接触の感知から核における増殖制御に至る細胞シグナル伝達系を、蛋白質リン酸化、遺伝子発現など、細胞生物学的な面から明らかにし、その伝達機構(蛋白質リン酸化あるいは脱リン酸化酵素、転写因子など)を分子生物学的に解明する、(2)ツーハイブリッド法を用いて、内皮型カドヘリンやその複合体と結合する蛋白質を、内皮細胞から同定することを目的に研究を行っている。初年度の研究実績は、以下の様である。1.培養内皮細胞の増殖及び細胞周期の評価法を確立した。Bromodeoxyuridine(BrdU)の取り込みを定量化して、内皮細胞の増殖性を解析した。増殖期の内皮細胞を、BrdUで1、4、8、12、24時間ラベルすると、BrdU陽性細胞の割合は、40、55、57、75、90%であった。一方、コンフルエントの細胞は、いずれの時間においても、BrdU陽性細胞の割合は0.1%であり、細胞間接触の完成した時期の内皮細胞は増殖を停止していることが明かとなった(Hirano et al.,1999)。2.内皮細胞ミオシン脱リン酸化酵素を同定した。初めに平滑筋で同定されたミオシン脱リン酸化酵素調節サブユニット(MYPT1)が内皮細胞にも発現し、細胞増殖の停止に伴い細胞内局在が変化することを明らかにした(Hirano et al.,1999)。増殖が盛んな時期の内皮細胞では、MYPT1はストレスファイバーと同様の分布を示したが、コンフルエントの時期では、細胞膜直下に局在した(Hirano et al.,1999)。また、プラークハイブリダイゼーションにより内皮細胞cDNAライブラリー検索を行い、平滑筋のMYPT1と相同性の高い蛋白質であることを明らかにした(Hirano et al.,1999)。3.内皮型カドヘリン、プラコグロビン、βカテニンを、内皮細胞ライブラリーからクローニングした。ツーハイブリッド法を用いて、ブラコグロビンとβカテニンは、内皮型カドヘリンの同じ細胞質領域に結合することを明らかにした(未発表)。

2.静止期にある培養内皮細胞及び生体内皮細胞(大動脈弁条片)における、Ca情報伝達機構を明らかにし、血管緊張調節における内皮細胞内Ca情報伝達の役割を明らかにした(Ihara et al.,1999;Kawasaki et al.,1999)3.内皮細胞cDNAライブラリーからミオシン脱リン酸化酵素調節サブユニット(MYPT1)をクローニングした(Hirano et al.,1999)。初めに平滑筋で同定されたMYPT1と相同性が高く、また、細胞増殖の停止に伴い細胞内局在が変化することを明らかにした(Hirano et al.,1999)。4.静止期にある内皮細胞から作製したcDNAライブラリーから、サイクリン依存性キナーゼ阻害蛋白質p27^<kip1>の新規分子種を世界で初めて発見し、細胞間接触による内皮細胞増殖抑制に関与する核内情報伝達分子の一つを見出した(投稿中)。5.内皮型カドヘリン、プラコグロビン、βカテニンを、内皮細胞ライブラリーからクローニングした。ツーハイブリツド法を用いて、プラコグロビン及びβカテニンとの結合に関与する内皮型カドヘリンの機能構造を明らかにした(投塙準備中)。
糖尿病血管壁細胞におけるプロテインキナーゼC活性とギャップ接合機能異常

糖尿病患者の増加とともに、最も重要な合併症である血管障害の成因の解明および管理・治療の確立が急務となっている。ギャップ接合は細胞内より直接隣接細胞に、イオン、情報伝達物質などの低分子物質を輸送する膜チャンネルであり、このような細胞間コミュニケーション機能を介して細胞増殖、分化、電気的カップリングに関与し組織の恒常性の維持に重要な役割を果たしていることが近年明らかにされてきている。本研究により、培養血管壁細胞のギャップ接合機能が高グルコース培養により抑制されること、またこのギャップ接合機能の抑制がPKC活性の活性化によって惹起されていることが示された。また、血管平滑筋細胞におけるギャップ接合の主要構成蛋白であるコネクシン-43は、リン酸化状態(PO)と非リン酸化状態(P1、P2、P3)で存在することを確認した。高グルコース培養により、PKC活性化剤TPA添加と同様に、リン酸化バンドの増加と非リン酸化バンドの減少を認め、高グルコースによりPKC活性化を介してコネクシン-43のリン酸化がもたらされることが示された。ギャップ接合は、細胞間コミュニケーション機能により、細胞増殖の制御や血管収縮の調節に関与していることが推定されており、高グルコースにより惹起されたギャップ接合機能の異常は糖尿病血管壁の恒常性に異常をきたし、血管障害の発症、進展に関与していると考えられた。本研究では、糖尿病ラットを作成しその生理的意義が最も明らかになっている心筋におけるギャップ接合の動態とその機能異常についてさらに検討を加えた。糖尿病ラットの心筋では、高グルコース培養における血管壁細胞と同様なコネクシン-43燐酸化バンドの増強を認めた。また、糖尿病ラットにおける心電図QRS幅の延長を認め、心筋組織のギャップ接合機能低下による電気伝導障害が推定された。我々は、糖尿病ラットにおける心筋PKC活性進、特にPKCβアイソフォームの特異的活性亢進を報告している。そこで、近年糖尿病性血管障害の治療薬の可能性が注目されているPKCβ特異的阻害薬LY333531の効果を検討した。LY333531は糖尿病ラットにみられたQRS幅の延長を正常レベルまで改善する所見を認めた。以上より、コネクシン-43の燐酸化亢進およびそれによって惹起される伝導障害はPKCβの活性亢進によることが示唆された。近年GJ機能低下による伝導障害と不整脈や心筋収縮力の関連が注目されており、糖尿病心筋におけるGJ機能低下は糖尿病患者にみられる高頻度の不整脈の発症や心筋収縮力の低下の成因となっている可能性が示唆された。

糖尿病血管合併症の成因としてプロテインキナーゼC(PKC)の活性亢進は、研究代表者(井口)ばかりでなく、国内外の他の研究者によりも検討され確立されつつあるが、PKCの活性亢進がどのような血管壁機能の変化をもたらし糖尿病血管障害の成因と結びつくかについては明らかにされていない。本研究では、PKCによる制御が推定されるギャップ接合(GJ)を介した細胞間コミュニケーション機能の糖尿病血管壁細胞における異常と血管合併症の成因としての意義を確立する。培養血管内皮細胞や平滑筋細胞のGJ機能は、高グルコース(HG)条件下(400mg/dlグルコース)24時間または48時間の培養で、100mg/dlグルコース条件下に比し有意に抑制された。HG条件下で構成蛋白コネクシンー43(Cx)の発現量は変動を認めなかったが、Cxの燐酸化亢進を認めた。HG条件下でのGJ機能抑制やCx燐酸化亢進は、PKCインヒビターにより回復した。ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットの心筋の検討でも、対照ラットに比しCxの燐酸化亢進を認めた。さらに、糖尿病ラットでは、心室内伝導を反映する心電図上のQRS幅は有意に延長し、心室内伝導障害が示唆された。PKCβ阻害薬の投与により、糖尿病心筋Cxの燐酸化亢進は改善し、同時にQRS幅の延長も改善された。高グルコースによるGJ機能の低下は,糖尿病血管壁の種々の機能異常を惹起する可能性が示唆された。我々はこれまでの研究で、高ブドウ糖培養による血管平滑筋細胞ギャップ接合(CJ)機能の低下とその機序としてプロテインキナーゼC(PKC)活性亢進を介した構成蛋白コネクシン(Cx)のリン酸化亢進を報告した。更に、ストレプトゾトシン誘発糖尿病(DM)ラットの心筋組織におけるCxの燐酸化動態について検討を行い、DMラット心筋における興奮伝導障害との関連を検討した。糖尿病心筋では、PKCβアイソフォームの活性化を介してGJ構成蛋白コネクシン-43の燐酸化が亢進し、心筋伝導障害を惹起することを示した。糖尿病患者にみられる不整脈の高頻度発症や心筋収縮力の低下と心筋GJ機能の低下の関連が推定された。また、インスリン抵抗性状態おける動脈硬化症発症進展との関連を検討するため、インスリン抵抗性や肥満で増加する遊離脂肪酸に着目し、脂肪酸の血管壁PKC活性に及ぼす効果を検討した。飽和遊離脂肪酸は血管壁細胞のdenovo合成のジアシルグリセロールを増加させPKCを活性化させる新知見を得た。今後、更にGJ機能との関連を検討する予定である。これまでの研究において、培養血管壁細胞の系や糖尿病ラットモデルを用いた検討により、糖尿病血管壁におけるPKC活性の亢進にもとずくギャップ接合蛋白コネクシン43の燐酸化亢進とそれによって惹起されるギャップ接合機能の低下を明らかにした。また、ギャップ接合機能の低下により糖尿病ラット心筋における伝導障害がおこることを明らかにした。このモデルの系を用いて、PKCβ阻害薬の効果を検討した。PKCβ阻害薬は、糖尿病心筋におけるコネクシン43の燐酸化亢進を改善すると同時に伝導障害を改善した。また、ギャップ接合を化活性化することが知られているイルソグラジン投与でも、伝導障害が改善することを明らかにした。以上より、培養系のみならず、in vivoの検討でも、糖尿病心血管壁細胞では、PKC特にβアイソフォームの活性化を介してギャップ接合機能の低下を認め、細胞間コミュニケーションの障害を認めることを明らかにした。
がん抑制遺伝子FATを分子標的とする口腔癌の阻害薬の開発と臨床応用

ヒト口腔扁平上皮がん組織から発見したがん抑制遺伝子と考えられるFAT遺伝子の臨床応用を目指す基盤研究を行っている。完全長cDNAを組み込んだ巨大ベクターを2種類(5'末端にHis-TagとGFP-Tagを付けた)作成を完了し、大腸菌に蛋白を発現させるも、Western解析では検出されなかった。原因としてmRNAまではできるがすぐ分解された(5'にTagを付けたため)か、巨大蛋白のため宿主側の影響が考えられた。一方、同時並行的に進めていたマウスFATのWesternブロットによる検出に関して、弱いながらも500kD付近にバンドを検出した。また免疫組織化学では、ラットを用いてFAT蛋白のモノクローナル抗体を作成しIsotypingにて、IgG2bであることを確認した。細胞内での挙動を見るために、作成した抗体を用いて免疫染色法やWesternを解析を進めてきたが、正常口腔上皮組織において膜周辺に染色される蛋白を同定している。これはアミノ酸配列から予想されたカドヘリンスーパーファミリーとしての細胞接着機能を有する可能性を示唆している。口腔がんの検体数、細胞株数を多数収集してFAT遺伝子変異の頻度、臨床データとの相関を調査しているがまだ収集数が不足しており、統計解析には至っていない。パラフィン包埋組織からの簡易DNA抽出キットやゲノムメチル化分析キットを購入して解析予定である。また機能解析のためにFAT遺伝子ホモ欠失のある2つの培養ヒト口腔癌細胞株に、完全長cDNA遺伝子をトランスフェクションにて導入して細胞のレスキュー実験を計画して現在5'側にTagのないベクターにてWestern解析を行う予定であったが、今年度はできていない。まず経費節減のため、FATモノクローナル抗体を自作した。ヒトFAT蛋白C末端の膜貫通領域よりややC末側の19アミノ酸をペプチド合成し、架橋、水溶化してラットの足背に注射後、鼠経リンパ節とヒト由来ミエローマ細胞からハイブリドーマを作成し、シングレコロニーを選引していき、シングルクローンを5種得た。ELISAに使える力確認実験を行い、ELISAが司能であった。モノクローナル抗体のチェックのため、ハイブリドーマ細包上清のアイソタイピングを行ったところ(マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット使用)、IgG1とIgG2bの2本のバンドが検出された。予備実験ながら得られたモノクローナル抗体5種の内、1つを用いで病理組織の抗FAT抗体の免疫染色を行ってみると、薄いながらも細胞膜が染まっており、FATが細胞接着に関連する蛋白である可能性が出てきた。今後、最適条件などを決めながら各種病理組織(がん、炎症、外傷など)におけるFAT発現の分布などをみる予定である。ヒト完全長cDNAは、自作困難のため、TAKARAに作成受託した。具体的作製手順としては、まずFATを発現している既製品Human Kidney Quick-Clone cDNAライブラリーからFAT遺伝子を3断片ずつPCRで合成し、断片にエラーガないか会長をシークエンスして碓認しながらそれらを結合する。エキソン2内で5か所、エキソン6内で1か所、データベースと異なる1塩基変異がみられた。この変異に関して、エキソン2の1か所はアミノ酸は不変(サイレント変異)だが他はすべてミスセンス変異であった。従って、このヒトFAT完全長cDNAベクターは5か所に変異があり、未完成なので、次年度に受託作成をひき続き(初年度は予算不足)、行う予定である。研究費の大半は、巨大FAT cDNAベクターの受託作成費と独力のモノクローナル坑体作成費に要した。
骨肉腫に対する化学療法剤を用いた免疫学的抗腫瘍活性誘導の機序

ラット骨肉腫を脛骨近位骨内に移植し、担骨肉腫ラットを作成した。化学療法が担骨肉腫ラットにおいて抗腫瘍活性を誘導できるか否かにつき以下の検討を行った。骨内に骨肉腫を移植されたラットは4週後には肺への遠隔転移を高率に起こした。下肢骨に骨肉腫を移植し、移植1週、2週後にメソトレキセート、アドリアマイシンを用いた化学療法を施行し、移植後3週で患肢を切断した(術前化療群)。一方、骨肉腫を同様の方法で骨肉移植した1日後に切断し、腫瘍移植後1、2週で化学療法を施行した群(術後化療群)を設定した。すなわち化学療法開始時期を一致させ、その前後で患肢切断を行うことにより原発腫瘍の存在が肺転移巣形成に及ぼす影響を観察した。術後化療群の肺は骨肉腫からの多数の転移結節が明らかであったのに対して、術前化療群では単発の小転移結節のみであった。術後化療群では早期の患肢切断による原発巣からの新たな肺転移巣形成の可能性がないにもかかわらず転移結節は多く、逆に担癌状態における化学療法の方が肺転移巣に対する治療的効果が高かった。化学療法を施さない場合、腫瘍移植6週後において患肢切断群は患肢未処理群より肺転移結節数が多かった。一方、術前化療群の肺転移巣の病理組織学的検索では、小転移巣周辺にリンパ球浸潤は認められなかった。これらのことより、原発腫瘍を生体内に残した状態で行う化学療法の治療効果は腫瘍への直接抗腫瘍活性のみでなく、患肢に存在する原発腫瘍からの何らかの液性因子による間接的坑腫瘍効果に依存していることが示唆された。
制御性T細胞におけるRunx転写因子の標的遺伝子探索

Runx転写因子の制御性T細胞における役割の解明とRunx転写因子の標的遺伝子探索を目的に研究を行った。制御性T細胞特異的なRunx転写因子の機能不全により胃炎を始めとする自己免疫の発症とFoxp3転写因子の発現低下が見られた。これらの結果はRunx転写因子がTreg細胞の機能に重要な役割を果たしていることを示す。そこで、Runx転写因子が発現を制御する標的遺伝子探索を行い、Runx転写因子がFoxp3、IL-4ならびにIL-10遺伝子座に結合することを見出した。制御性T細胞におけるRunx転写因子の機能解明は、新たな治療方法ならびに治療薬の開発に繋がる研究成果と言える。Runxファミリーはαサブユニットおよびβサブユニットで2量体を形成する転写因子であり細胞の発生・分化過程において極めて重要かつ多様な役割を持つと考えられている。哺乳類ではRunx1、Runx2およびRunx3のαユニットとCBFβのβユニットが知られている。興味深いことに、京都大学の坂口らはFoxp3転写因子の機能発現にはRunx1との会合が重要であることを報告した。一方、申請者はRunx転写因子のβユニットのCBFβ2を欠損するマウスでは、喘息様疾患ならびに腸炎を自然発症することを発見した。これら発見を基に、申請者のグループは坂口らと共同研究を行い、Treg細胞特異的にRunx転写因子を欠損するマウスを作成した。その結果、Treg細胞特異的なRunx転写因子の機能不全により胃炎を始めとする自己免疫の発症とFoxp3転写因子の発現低下が見られた。これらの結果はRunx転写因子はTreg細胞の機能に重要な役割を果たしていることを示す。従って、その詳細な機序を明らかにするためにクロマチン免疫沈降法(Chromatin immunoprecipitation ; ChIP)とタイリングアレイと組み合わせたChIP on chip法によりTreg細胞におけるRunx転写因子の標的遺伝子の探索を行った。その結果、Runx転写因子がFoxP3転写因子遺伝子座に結合し、その発現を直接制御していることが明らかになった。また、Runx転写因子欠損細胞にFoxP3転写因子を導入するとTreg細胞の機能が回復した。従って、Runx転写因子はFoxP3転写因子遺伝子の発現を直接制御することによりTreg細胞の機能を誘導することが明らかになった。この結果は既に論文として報告した(Immunity, JEM)。従って、その詳細な機序を明らかにするために遺伝子発現様式とクロマチン免疫沈降法(Chromatin immunoprecipitation ; ChIP)とタイリングアレイと組み合わせたChIP on chip法によりTreg細胞におけるRunx転写因子の標的遺伝子の探索を行った。その結果、いくつかの候補遺伝子を見出すことが出来た。今後、Treg細胞におけるそれら候補遺伝子の役割を詳細に検討する予定である。

これらの結果はRunx転写因子がTreg細胞の機能に重要な役割を果たしていることを示す。従って、その詳細な機序を明らかにするために遺伝子発現様式とクロマチン免疫沈降法(chromatin immunoprecipitation;ChIP)とタイリングアレイと組み合わせたChIP on chip法によりTreg細胞におけるRunx転写因子の標的遺伝子の探索を行った。その結果、いくつかの候補遺伝子を見出すことが出来た。これら候補遺伝子をクローニングし、レトロウイルスを用いてナイーブT細胞に導入して、Treg細胞の機能を得ることが出来るかを検討したところ、残念ながら、候補遺伝子を単独で導入してもTreg細胞の機能を発揮することがなかった。このことから、候補遺伝子単独ではTreg細胞の機能発揮には十分ではなく、複数の遺伝子によってTreg細胞の機能が制御されていることが示唆された。
微生物イソプレノイド生合成遺伝子資源の機能開発と応用

1.筆者はこれまでに、イソプレノイド化合物の共通出発原料であるイソペンテニル2リン酸の生合成経路としてMEP経路とメバロン酸経路を併せ持つ放線菌は、例外なくイソプレノイド化合物を生産し、更にそれらの生合成遺伝子群は、メバロン酸経路遺伝子群近傍に存在することを見出した。本方法論を駆使し、Streptomyces sp.KO-3988株からイソプレノイド-ポリケタイド融合化合物として初めての例となるfuraquinocin A生合成遺伝子群、および原核生物起源として初めて3-hydroxypimara-9(11),15-diene生合成遺伝子群を取得した。さらに、後者の生合成に関与する2つのジテルペン環化酵素{ent-copalyl diphosphate生合成酵素(CDPS)とpimaradiene生合成酵素(PMDS)}を組換え酵素として発現させ酵素学的諸性質を詳細に検討した。その結果、CDPSは基質であるgeranylgeranyl diphosphate(GGDP)を環化しent-copalyl diphosphateへと変換し、次いでPMDSがpimara-9(11),15-dieneへと変換することを明らかにした。また、両酵素の詳細な酵素学的諸性質を検討し以下の結果を得た。CDPS:至適温度35°C、至適pH 5.5、Km 13.7μM±1.0、Vmax 36.4±0.9、金属要求性、Mgで高活性。PMDS:至適温度30°C、至適pH 7.0、Km 2.57μM±0.2、Vmax 0.96±0.014、金属要求性、Mg、Coで高活性。2.放線菌Nocardia brasiliensis IFM 0406株が生産するbrasilicardin A(BC)は、ジテルペン、アミノ酸、糖、芳香環からなるユニークな天然生理活性物質である。その生合成を明らかにする第一歩として、生合成遺伝子クラスターの取得・解析を行った。IFM 0406株はメバロン酸経路を有さないため上記方法論は使えない。そこで、BCがジテルペン骨格を有することを利用し、最初にGGDP生合成遺伝子を取得した後、周辺領域を探索することにより11の遺伝子群からなるBCの推定生合成遺伝子クラスターを取得した。これらが実際にBCの生合成に関与することを証明するため、異種宿主であるS.lividansに導入した結果、2つの特異的化合物が生産された。LC-MSで解析した結果、これら化合物はBC関連化合物と推定されたことから、取得した遺伝子群はBC生合成遺伝子群と推定された。放線菌が生産する以下の2つのイソプレノイドの生合成に関与するイソプレノイドサイクラーゼ遺伝子の取得と解析を行った。1.Copalyl diphosphate