hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国市場進出日系企業の戦略的ガバナンスの研究-上司と部下関係の国際比較研究

本研究は、中国進出日系企業のコーポレート・ガバナンスについて、競合関係にある中国の民営企業と国営企業との比較研究の視点より分析したものである。具体的な研究調査活動としては、平成16年度に、中国所開大学国際商学院と、ついで平成17年度は同商学院、及び人民大学との共同研究として、アンケート調査を中心にして進められた。本研究の特徴としては、日系企業について、同じ中国市場の競合関係にある中国民営企業や国営企業との比較研究の視点から進められた点があげられる。その成果としては、調査地域が一部に限られ、また、アンケート調査のサンプル数にも制限が生じたため、期待した統計解析上の優位のある結果が得られなかったが、予想外の成果として、中国民営企業が進めている競争優位戦略のなかで、その学習能力として、信頼関係を構築する能力やネゴシエーションカを高く評価している点が析出されたことがあげられる。すなわち、今後の日系企業の問題点の一つとして、中国民営企業と競争するためには、その学習能力として信頼関係やネゴシエーションカを向上させる経営戦略が重要であることがあげられる。今回の研究調査は、当初から膨大な中国市場の特性について、一般的な特徴を見出すことは難しいことが予測されていたが、実際に調査研究を進めた2年間の研究結果として、前述のようにその難しい点が実証されることになった。したがって、今回の調査研究に見られる成果は、むしろ、さらに今後の中国企業を研究する場合に必要とされる、実証研究の一つの仮説としての視点からみて、意義ある内容であることが指摘される。1.中国進出日系企業への「上司と部下関係」に関するアンケート調査票の項目について、(i)組織コミットメント、(ii)職務満足度、(iii)職場、(iv)組織の支援、(v)上司と部下関係、(vi)組織ビジョン、(vii)人事制度等について、合計132項目の質問票を作成し、その中国語訳作成を作成した。次に、日本語版との整合性を図るため、中国語版を日本語に訳し、オリジナルの日本語版に一致させる改定を行なった。2.平成16年5-6月中国北京と天津地区の日系企業に対する予備調査の実施し、その質問票により、本研修の調査目的の内容が取得できることが判明した。その結果、本調査を実施する計画を進めた。3平成16年7-12月の間、アンケート調査を中心にした研究を、中国南開大学に委託調査の形にて依頼し、(イ)日系企業と、(ロ)中国民営企業に対し調査を実施した。その結果、日系企業6社、中国民営企業7社、合計サンプル数320を収集した。現在その調査データの統計分析を実施中である。4.平行して、中国民営企業の成功した事例、例えば、「レンソウ・グループ」(IBMのコンピュータ事業を買収取得)等の経営発展の歴史的展開を調査した結果、興味深い内容が分析された。例えば、同グループでは、創業者のカリスマ経営の弊害から脱却するために、中間管理者への権限の委譲と組織の簡素化を実施した。しかし、その結果は、当初の意図に反し、一部組織の独走が起こり、あたかも、「ガン細胞の繁殖」ように、組織全体に弊害が生じるようになった。つまり、全社の経営戦略に基づいた中間管理者の組織運営が必要とされ、同時にその経営スキルの開発が不可欠とされる事例である。本件は、中国民営企業の経営発展にみられる一つの経営事例である。本研究は、中国進出日系企業のコーポレート・ガバナンスについて、競合関係にある中国の民営企業と国営企業との比較研究の視点より分析するものである。実際には、期間や地域の制約、また、アンケート調査の対象企業の制約など、当初の予想以上の困難な制約条件により、仮説を十分検証する成果を得ることは難しい結果となった。また、主題に関して「上司と部下関係」と言う新しい研究視点からの分析を試みたが、対象企業の限られた数とサンプル数により、統計解説の優位性を得ることもできなかった。

その優位性が見られない点について考察すると、一つは、調査対象の地域が限定されていたこと、二つは、サンプル数が少ないこと、三つは、対象企業の経営規模が比較的小規模の企業であり、創業以来の経営年数が比較的に短く、内部の経営制度的な確立が遅れている点、などである。今回調査の結論として、一つには、中国の民営企業、国営企業、日系企業の経営上の問題点を研究するために、おのおの調査企業の地域とサンプル数を増やし、新たに多面的角度から更なる研究が必要である。そして、二つには、その調査結果を加味したうえで、3群を比較した経営上の問題点についての分析が必要であることが考えられる。
牛ふん堆肥における大腸菌の残存および再増殖機構の解明

牛糞堆積堆肥の各部位における大腸菌の残存性を調べるとともに、大腸菌の再増殖に影響を及ぼす栄養成分とその栄養成分の利用に競合的に働く細菌群を解析した。大腸菌は高温になる堆積物内部では死滅するが、堆肥頭頂部で長期間残存する傾向にあった。堆肥中で長期間残存していた大腸菌は、牛糞由来の大腸菌よりも熱に強い性質を示した。大腸菌は堆肥にグルコースを添加することで増加する傾向にあったが、トウモロコシ粉末や菌の遺体の添加では増加は認められなかった。堆肥中でグルコース、トウモロコシおよび菌の遺体を取り込んで増殖する細菌類をStableisotopeprobing法により特定した。牛ふん堆肥化過程における堆積物各部位の大腸菌の消長と大腸菌再汚染リスクの評価を実施した。牛ふんと低質牧草の混合物26.8tを堆積し、堆積物の中央部および両端の表層から50cmの部位に温度センサーを設置し、2週間に1回の割合で堆肥の切り返しとサンプリングを行った。堆積物内部の温度センサー設置部位では期間を通じて大腸菌は検出限界以下であったが、温度上昇の少ない頭頂部および底部の堆肥、また切り返し後の堆肥において大腸菌が検出されたことから、切り返し作業によって大腸菌の再汚染が起きる可能性が示唆された。堆肥化開始後から14週間後には、いずれのサンプリング部位からも大腸菌は検出されなくなった。外的要因による大腸菌の汚染リスクとして堆肥舎内および周辺部の鳥獣の糞から、またホイールローダーのバケット部の拭き取りによる大腸菌の検出を試みた。目視による観察、堆肥舎内に残された足跡などから、堆肥舎内には、すずめ、カラス、タヌキ、アライグマなどの鳥獣が侵入していることが考えられたが、鳥類以外の糞は確認することができなかった。堆肥の切り返しに用いられるホイールローダーのバケット部には、多いときで100 CFU/100cm2程度の大腸菌が検出される場合もあり、再汚染リスクの1つであると考えられた。堆肥化開始後から12週間後のサンプルに残存していた大腸菌株について、BOX A1Rプライマーを用いたREP-PCRを行い、大腸菌の遺伝子型の分類を行った。異なる遺伝子型をもつ代表的な4株について、堆肥化前の牛ふん中から分離した大腸菌4株とLB培地中での37、47°C培養における12h後の濁度(OD600)を比較した結果、37°C培養では同程度の値であったが、47°C培養では堆肥残存株が有意に高い値を示し、堆肥残存株は高温域における増殖能が高い傾向が認められた。牛糞中に未消化物として排出される可能性があるデンプンやセルロースの構成単糖であるグルコースを堆肥に添加した時の大腸菌の動態と、堆肥中の細菌群によるグルコースの取り込みをStable Isotope Probing(SIP)法を用いて評価した。麦稈と牛糞を混合して2ヶ月間堆積した牛糞堆肥に、前年度分離した長期間にわたり堆肥中で残存していた大腸菌3株を培養、それぞれが同じ菌数になるように混合した大腸菌液を堆肥に添加するとともに、1)13C-標識グルコースを堆肥乾物当り0.5%添加、2)非標識グルコースを堆肥乾物当り0.5%添加、3)グルコース無添加の3つの区を設定した。堆肥水分は60%に調整し、30°Cで24時間の培養を行った。24時間後の大腸菌数および大腸菌群数を計数するとともに、堆肥からRNAを抽出し、トリフルオロ酢酸セシウムを用いた平衡密度勾配遠心分離処理を行い、グルコースの資化によって13C-標識されたRNAを回収した。回収したRNAについて、RT-PCR後にT-RFLP法による細菌群集の解析を行った。10^3 CFU/gの割合で堆肥に添加した大腸菌数は、24時間後に13C-グルコースおよび非標識グルコース添加区において46倍程度に、無添加区において2倍程度に増加した。また大腸菌群数は、13C-グルコースおよび非標識グルコース添加区において2030倍程度に、無添加区において4倍程度まで増加した。RNAサンプルを平衡密度勾配遠心分離処理後、13C-グルコース添加区のBuoyant Density (BD)値が1.79g/mL以上となった"重い"分画から回収したRNAにおいて、T-RFLPプロファイル上の276bpおよび395bpの周辺に特徴的なピークが認められた。これらのピークは、グルコースを特異的に資化した細菌に由来すると考えられることから、現在その解析を進めている。堆肥中で大腸菌が再増殖する際に利用する基質、また大腸菌の基質利用に対して競合的に働く細菌群を明らかにするため、堆肥に13C標識をしたトウモロコシ子実(未消化飼料のモデル)、グルコース(デンプンやセルロースの構成単糖)、または菌体バイオマス(堆肥化で死滅した微生物の体構成成分のモデル)を添加し、大腸菌の動態と堆肥中の細菌群によるこれら13C標識基質の取り込みをStable Isotope Probing(SIP)法により解析した。初年度に分離した長期間にわたり堆肥中で残存していた3株の大腸菌を同じ菌数になるように混合し、13C標識基質を添加したそれぞれの牛糞堆肥へ接種した。培養期間については、グルコースは1日、菌体バイオマスは3日、トウモロコシ子実は5日間とし、培養前後の大腸菌の増減を希釈平板法で測定した。

グルコースの添加により、大腸菌数は培養前に比較して4倍程度まで増加したが、菌体バイオマスおよびトウモロコシ子実の添加では、大腸菌数に大きな変化は認められなかった。13C標識基質の取り込みをSIP法により解析した結果、グルコースにおいてはPhyllobacteriaceae科およびMycobacterium属細菌による顕著な取り込みが認められた。菌体バイオマスにおいては、Sphingobium属およびSimplicispira属細菌による取り込みが顕著であった。後者は活性汚泥からの分離例があり、菌体バイオマスが豊富な環境中に生息する細菌が堆肥中においても積極的に菌体成分を利用していると考えられた。トウモロコシ子実においては、生デンプンの分解能をもつStreptomyces属細菌の取り込みが顕著であった。グルコースの添加は大腸菌数を増加させる傾向にあったが、いずれの基質においても大腸菌に対して競合的に基質を利用する細菌群の存在が明らかになった。牛糞堆積堆肥の各部位における大腸菌の残存性を調べるとともに、大腸菌の再増殖に影響を及ぼす栄養成分とその栄養成分の利用に競合的に働く細菌群を解析した。大腸菌は高温になる堆積物内部では死滅するが、堆肥頭頂部で長期間残存する傾向にあった。堆肥中で長期間残存していた大腸菌は、牛糞由来の大腸菌よりも熱に強い性質を示した。大腸菌は堆肥にグルコースを添加することで増加する傾向にあったが、トウモロコシ粉末や菌の遺体の添加では増加は認められなかった。堆肥中でグルコース、トウモロコシおよび菌の遺体を取り込んで増殖する細菌類をStableisotopeprobing法により特定した。前年度に分離した大腸菌株を用い、堆肥中における易分解性炭素源存在下での大腸菌の動態と炭素源を特異的に資化している細菌群をSIP法により特定した。畜産学・草地学、微生物生態学大腸菌が堆肥中で再増殖する際に利用する基質を明らかにするため、25年度に分離した堆肥中で長期間にわたり残存しやすい大腸菌株を用い、安定同位体標識したトウモロコシ種子または死菌体を堆肥に添加し、SIP法によりそれぞれの炭素基質の基質取り込みの有無を解析する。堆肥化過程における大腸菌の残存部位とその消長を明らかにし、堆肥化の高温条件においても長期間残存していた複数の大腸菌株を得ることができた。次年度使用額597,332円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。大腸菌が堆肥中で再増殖する際に利用する基質を明らかにするため、25年度に分離した堆肥中で残存しやすい大腸菌株を用い、安定同位体標識した基質(13C-グルコース等)を堆肥に添加し、SIP(Stable Isotope Probing)法による基質取り込みの解析を行う。次年度の研究費は、交付申請時の計画通り使用する。次年度使用額597,332円は単位重量当りの価格が非常に高価な安定同位体標識試薬、および外注分析費用に充当する。次年度使用額259,612円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり使用する。次年度使用額259,612円は単位重量当りの価格が非常に高額な安定同位体標識試薬の購入に充当する。
腰部脊柱管狭窄症における肥厚した黄色靭帯の組織構造を画像化する新規診断装置の開発

高解像度で三次元弾性イメージングが可能な装置である三次元高周波超音波顕微鏡装置を黄色靭帯の観察用に改良を加え、組織の超音波特性と組織像との比較検討を行い、黄色靭帯組織の弾性の画像化とともに弾性の低下に関わる因子を同定する。また光音響現象を利用し組織に特異的なイメージングが可能な装置である光音響顕微鏡装置を黄色靭帯の観察用に改良を加え、組織の光音響特性と組織像との比較検討を行い、弾性の低下に関わる因子の画像化を検討する。
ポストゲノムにおける魚類サイトカイン遺伝子群の発現解析と生理機能に関する研究

これまでの研究経過概要トラフグおよびゼブラフィッシュのゲノムデータベースからサイトカイン遺伝子群の配列情報を収集し、多くの魚類新規サイトカイン遺伝子の単離・同定に成功した。その中でウイルスの感染防御に重要な役割を果たすと考えられるIL-12およびIFN-γについては、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現量の測定系を確立した。また魚類サイトカインの生理機能を解析するため、昆虫細胞を用いて組換えトラフグIL-12を作製するとともに、トラフグIL-12のアミノ酸配列をもとに合成したオリゴペプチドを抗原としてウサギに免役し、抗トラフグIL-12抗血清を得た。感染・発病に伴う一連のサイトカイン遺伝子群の発現動態を解明するため、トラフグロ白症ウイルス感染後のIL-12およびIFN-γ遺伝子の発現動態を解析した結果、感染後のリンパ器官においてIL-12およびIFN-γのmRNA量の増加が認められ、ウイルス感染でこれらのサイトカイン遺伝子の発現が誘導されることが明らかとなった。本年度の研究経過概要トラフグIL-12の生理作用をin vitroで解析するために、トラフグの末梢血白血球を分離し、培養する系を確立した。この末梢血白血球培養系に組換えトラフグIL-12の産生する昆虫細胞の培養上清を添加して、IFN-γ遺伝子の発現が誘導されるか否かを調べた。しかしながら、昆虫細胞の培養上清のみでも、IFN-γ遺伝子の発現が誘導されたため、IL-12によるIFN-γ遺伝子の発現誘導活性を調べることができなかった。今後は、培養上清から組換えトラフグIL-12を精製し、培地成分を除去した標品を調整する必要があることが明らかとなった。フグのサイトカイン遺伝子群のcDNAクローニングと定量PCR系の確立:トラフグゲノムデータベースから、サイトカイン遺伝子群の配列情報を収集し、それらの部分塩基配列を基に、リンパ器官(腎臓)からRT-PCRにより一連のサイトカイン遺伝子群の単離を行った。これまでに11種類のサイトカイン遺伝子群(IL-1β,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12,IL-21,TNF-α,IFN-α/β,IFN-γ,TGF-β)のcDNAが単離できた。この結果、魚類にも哺乳類サイトカインと相同な遺伝子群が存在することが示唆された。また感染-発病に伴う発現動態解析を行うため、各サイトカイン遺伝子の定量PCR系の確立を試みた。まず、ウイルス感染防除に重要な働きを果たすと考えられる、IL-12、IFN-γについて定量PCR系を確立した。フグサイトカイン遺伝子群の発現ベクターの構築と発現系の確立:魚類サイトカインの生理機能を解析するための組換え魚類サイトカインを得るため、まずC-末端がわにHis-tagを付加したフグIL-12遺伝子を昆虫細胞用の発現ベクターに組み込んだ発現ベクターを構築した。次に、無血清培地に順化したHigh Fiveに遺伝子導入し、薬剤添加により選択を行い、導入安定株を作製した。安定株の培養上清からNi-カラムによるアフィニティクロマトグラフィーを行い、培養液中に分泌された組換えフグIL-12を濃縮・精製した。その結果、培養上清中に500ng/mLの組換えフグIL-12を産生する細胞株が得られた。1)感染・発病に伴う一連のサイトカイン遺伝子の体系的な発現動態解析感染・発病に伴う一連のサイトカイン遺伝子群の発現動態を解明するため、ウイルス感染症のモデルとしてトラフグ口白症ウイルスの人為感染実験を行い、感染から発病までのリンパ器官におけるインターロイキン-12(IL-12)およびインターフェロン-γ(INF-γ)遺伝子の発現動態を解析した。その結果、人為感染後のリンパ器官においてIL-12およびINF-γのmRNA量の増加が認められた。また、この結果は、これまでのIL-12およびのINF-γの遺伝子発現がploy(I:C)刺激(ウイルス感染の模倣剤)でのみ誘導されという結果と一致し、本来のウイルス感染でもこれらのサイトカインの遺伝子発現が誘導されることが確認された。2)組換え体を用いた、魚類の免疫応答におけるサイトカインの機能解析魚類サイトカインの生理機能を解明するため、前年度に組換えフグIL-12の産生系を確立した。本年度は、IL-12に対する特異抗体を作成するため、トラフグIL-12のアミノ酸配列をもとに合成したオリゴペプチドを抗原としてウサギに免役し、抗フグIL-12抗血清を得た。得られた本抗血清は、組換えフグIL-12と反応することが確認された。前年度に得られた組換えフグIL-12に加えて、フグIL-12対する特異抗体が得られ、今後の魚類サイトカインの生理機能をタンパク質レベルでも解析するための準備が整った。

感染・発病に伴う一連のサイトカイン遺伝子群の発現動態を解明するため、トラフグロ白症ウイルス感染後のIL-12およびIFN-γ遺伝子の発現動態を解析した結果、感染後のリンパ器官においてIL-12およびIFN-γのmRNA量の増加が認められ、ウイルス感染でこれらのサイトカイン遺伝子の発現が誘導されることが明らかとなった。本年度の研究経過概要トラフグIL-12の生理作用をin vitroで解析するために、トラフグの末梢血白血球を分離し、培養する系を確立した。この末梢血白血球培養系に組換えトラフグIL-12の産生する昆虫細胞の培養上清を添加して、IFN-γ遺伝子の発現が誘導されるか否かを調べた。しかしながら、昆虫細胞の培養上清のみでも、IFN-γ遺伝子の発現が誘導されたため、IL-12によるIFN-γ遺伝子の発現誘導活性を調べることができなかった。今後は、培養上清から組換えトラフグIL-12を精製し、培地成分を除去した標品を調整する必要があることが明らかとなった。
遷移金属錯体触媒を用いる第14族元素の新規導入反応

本研究では,ケイ素とスズ間に直接結合を有するシリルスタナン類(R3SiSiR′3),炭化水素置換基のみを有するジシラン類(R3SiSiR′3;ただし,RおよびR′は炭化水素置換基),ジスタナン類(R3SnSnR′3)を遷移金属錯体触媒存在下においてビス-ジエンと反応させた。本研究においては,中心金属の選択,配位子の電子的性質等が反応に大きな影響を与えると考えられるので,これらの影響を主として検討し,生成物を最も高収率,高選択的に与える触媒系を探索した。その結果,0価パラジウム中心にジベンジリデンアセトンのような配位力の弱い配位子を有する錯体が高い触媒活性を示すことを明らかにした。ジスタナンとの反応においては,位置ならびに立体選択的に反応は進行し,五員環にアリルスタニル基がトランスに結合し,オレフィンの立体化学はE体の生成物が選択的に得られた。アリルスズ側鎖の立体化学は生成物を脱スズプロトン化した生成物のX線結晶構造解析により決定した。ジシランとの反応においては,用いるビス-ジエンの種類によって反応の選択性は大きく変わり,位置選択性は高いものの一部立体選択性が低下した。シリルスタナンとの反応においては,位置ならびに立体選択性とも低下した。本反応においてはまず低原子価パラジウム錯体中心とビス-ジエンとの反応によりビスπ-アリル中間体が生成した後,反応が進行するものと考えられる。本反応はビス-ジエン類がジスタナン,シリルスタナンと反応した最初の例である。
地球温暖化時における河川流量変化の予測と対応策に関する検討

地球温暖化によって水災害の発生や水資源が変化する可能性のある流域を検出することを目的とし、日本列島全域を対象とする分布型流出モデルを構築して、将来の河川流量の変化を分析した。流出計算の入力データは、気象庁気象研究所の全球20km格子大気モデルによって計算された気候推計情報である。主要な分析結果として以下を得た。1)時間最大流量、日渇水流量、月平均流量について、明瞭な変化が見られる流域が存在した。2)上記の変化は大きな地域性が見られた。3) 21世紀末ではその変化が明瞭となる傾向にあった。1)日本全域を対象とした温暖化時の流量変動予測日本全域を約1kmグリッドで表現する水文予測モデルを開発した。このモデルは1km分解能で日本全国の河川流量を、キネマティックウェーブモデルを用いて計算するモデルであり、斜面部と河道部の流れは等値粗度によって区別する。この流出モデルへの入力は、気象研究所から提供される水文気象データのうち、気象研究所の超高分解能大気大循環モデルが出力する空間分解能20km、時間分解能1日の表面流出量と地中流出量とを用いる。現在気候、近未来、21世紀末の上記の流出量データを用いて、日本全流域を対象とする河川流量計算を実施し、河川流量計算によって得られた流況曲線をもとに、河川流況の変化を分析した。その結果、年平均流量では将来に渡って大きな変化は見られないが、年最大流量や渇水流量、融雪期間の最大流量や融雪流出の発生時期は、流域によって大きく変化する可能性があることが見出された。2)特徴流域における河川流況の変化分析上記の分析で、流域ごとに将来の流況が大きく変化する可能性が見出された。そこで、それらの流域のなかで融雪流出に関して流況変化の可能性がある最上川流域、豪雨による洪水流出に関して変化の可能性がある吉野川流域を対象とし、ダム制御の効果を含んだより詳細な分布型流出モデルを構成し、気象研究所から提供される温暖化推計情報を用いて、将来の河川流量を計算し、現在機構における流況と比較した。その結果、最上川流域では21世紀末には春季の融雪量の減少と冬季の降雨量の増加によって現在の融雪流出のピークである4月の河川流量が大きく減少し、1月から2月の流量が増加して結果として1月から5月の流況が平滑化される可能性があること、吉野川流域では年最大24時間雨量などの短時間の降水極値の値が増加し、低頻度の洪水ピーク流量が増大する可能性があることなどが見出された。気象庁気象研究所によって提供される温暖化実験気象水文データ(現気候:1979年から2004年、近未来:2015年から2039年、将来:2075年から2099年の合計75年間)を用いて、日本の全河川流域を対象とする河川流量予測計算を実施し、温暖化時の流量変化の可能性を空間的に示し、それをもとに治水・利水に対して、将来、注意を要する河川流域を検出し、治水安全度・利水安全度を維持するための対応的な方策を例示することを目的としている。平成21年度は、平成20年度に開発した日本全国分布型流出モデルを用い、日本全域の河川流域を対象として、約1km分解能で75年分の流出計算を実施した。用いた温暖化推計情報は、気象研究所から提供された水文気象データのうち、気象研究所の気象・水文モデルが出力する空間分解能20km、時間分解能1日の表面流出量と地中流出量である。現在気候、近未来、将来の合計75年間、日本全流域を対象とする河川流量計算を実施し、その計算結果を用いて、日本全国の河川流況の変化を3期間ごとに整理して、3期間の流況の変化を約4kmの空間分解能で統計的に分析した。分析した水文量は、年最大流量や渇水流量の平均値および分散の変化、さまざまな再現期間の年最大流量や渇水流量の変化などである。それらの分析結果を地図上にまとめ、日本全河川流域の流況の変化可能性を示す空間分布図を作成した。河川流況の変化には大きな地域性があり、将来、洪水リスクの高まる可能性のある流域、渇水リスクの高まる可能性のある流域を空間的に示すことができるようになった。気象庁気象研究所によって提供される将来気候推計情報(現在気候実験:1978年から2002年、近未来気候実験:2015年から2039年、21世紀末気候実験:2075年から2099年の合計75年間)を用いて、日本の全河川流域を対象とする河川流量の75年間の連続計算を1km空間分解能で実施し、温暖化時の流量変化の可能性を空間的に示した。また、それをもとに治水・利水に対して、将来、注意を要する河川流域を検出した。具体的には以下を実施した。1)日本全域を対象とした温暖化時の連続流量

計算:気象研究所の大気大循環モデルによって計算される将来気候推計情報の中で、空間分解能20km、時間分解能1日の表面流出量と地中流出量を入力データとし、本研究で開発した1km空間分解能の日本列島全域を対象とした分布型流出モデルを用いて全国の河川流量を計算し、約4kmの空間分解能ごとに計算した流量データを記録した。2)河川流量の変化特性の分析:1)で得た日本全河川流域の流量データを分析し、約4kmのグリッドごとに、年最大時間流量を抽出し、平均値や標準偏差の変化特性を分析した。また、抽出した年最大時間流量に一般化極値分布を当てはめて100年確率年最大時間流量を算定し、その変化を分析した。また、渇水を対象として年355日目流量(渇水流量)を抽出し、平均値や標準偏差の変化特性を分析した。また、抽出した渇水流量にワイブル分布を当てはめて10年確率の渇水流量を算定し、その変化を分析した。3)流量変化可能性の空間分布図の作成と要注意流域の検出:以上の分析結果を空間的な分布図として示した。その結果、時間最大流量、日渇水流量、月平均流量のそれぞれについて明瞭な変化が見られる流域が存在すること、上記の変化は日本列島全域で一様に現れるのではなく大きな地域性が見られること、近未来気候実験で上記の変化が見られ21世紀末気候実験では一層その変化が明瞭となる傾向にあることが分かった。
血液疾患に対するrAAVを用いた遺伝子治療:基礎から臨床へ

Adeno-associate virus(AAV)は広くヒト細胞に感染するものの毒性が少ないため、遺伝子治療のベクターとして期待されている。しかし血液細胞への応用は進んでいないため、基礎的な検討を1995年から開始し、MOI<1の低値での実験であったため導入効率は不良であったが、慢性骨髄性白血病急性転化〉急性骨髄性白血病〉急性リンパ芽球性白血病の細胞株の順に導入効率に各1桁の差が認められたことをを報告した。さらに骨髄移植への応用をめざしT細胞への遺伝子導入をめざし本研究を開始した。また、基礎研究からの倫理的な面を押さえることをもう一つの目標として研究を申請した。1) AAV導入効率の改良:リコンビナントAAVの白血病細胞への導入効率を改善するためにセシウムクロライド法を取り入れ検討したところ最大で100倍の濃縮が可能となった。これを用い各種血液細胞へのAAVの導入効率をT、Bリンパ球、好中球系、単球系、幹細胞由来の白血病細胞へのネオ耐性遺伝子の導入効率を白血病コロニー法および限界希釈法を用いて検討したところMO110で最大70%の細胞に導入できた。さらにゲノムに組み込まれていることをサザン法やFISHで確認した。2)正常ヒトリンパ球の培養:正常リンパ球の培養と増幅についてはOKT3とIL-2を組み合わせ7日間で20倍に増殖する系を確立した。培養後90%以上がCD8陽性細胞であった。現在ヒトフィダー細胞を用いてCD4陽性細胞培養について検討中である。3) AAVベクターによるヒトリンパ球への遺伝子導入:我々の作成したrAAV/Tk/NeをMOI=10000で導入したところ、遺伝子導入効率は平均25%であった。同時に行った旧GTl社GITklSvNaでの導入効率はMOl=10でほぼ90%と良好であった。さらに導入後G418培地で7日間培養後ガンシクロビルを添加したところ両方とも100%の細胞が死滅したことより、導入された遺伝子の発現は良好であったと考えられた。AAVベクターの導入効率はレトロウイルスベクターに比して低かったが、今後は臨床におけるリンパ球への遺伝子導入をめざした基礎データの蓄積を行っていく必要がある。4) AAVベクターによるシステム開発:現在我々が利用できるAAVプラスミドはクローニングサイトが一箇所であり、またマーカー遺伝子も組み込まれておらず、プロモーターを変更しにくいなどの問題点がある。これらの問題を解決するために本年度は本研究室独自のプラスミドの作成に時間を費やしてきた。基本はマーカー遺伝子はネオ耐性遺伝子、GFP遺伝子、LacZ遺伝子を5'側と3'側に組み込んだものを6つ作成し、新たにCMVのプロモーターを使ったものを作成した。血球細胞を標的細胞として、遺伝子導入をAAVを用いて行い、これまでより効率の遺伝子導入の結果を得た。ー方、改良すべき点も少なからず認められ,今後さらに効率的な遺伝導入法の確立が待たれる。

基本はマーカー遺伝子はネオ耐性遺伝子、GFP遺伝子、LacZ遺伝子を5'側と3'側に組み込んだものを6つ作成し、新たにCMVのプロモーターを使ったものを作成した。血球細胞を標的細胞として、遺伝子導入をAAVを用いて行い、これまでより効率の遺伝子導入の結果を得た。ー方、改良すべき点も少なからず認められ,今後さらに効率的な遺伝導入法の確立が待たれる。AAVによる遺伝子治療を実現していくうえでの課題として、1)大量培養と濃縮法の確立2)野生株のアデノウイルスを使用3)パッケージングラインの確立がある。本年度までに多層式カルチャーフラスコの使用とセシウムクラライド濃度勾配法の確立と共同研究しているカンパニ-と共同研究で1)2)は解決できた。さらに3)についても近く共同研究者により完成する見込みであり、実用にむけてのインフラは整いつつある。その他の課題として現在我々が利用できるAAVプラスミドはクローニングサイトが一箇所であり、またマーカー遺伝子も組み込まれておらず、プロモーターを変更しにくいなどの問題点がある。これらの問題を解決するために本年度は本研究室独自のプラスミドの作成に時間を費やしてきた。骨髄ドナーのTリンパ球への自殺遺伝子の導入としては、正常リンパ球の培養と増幅についての検討ではOKT3とIL-2を組み合わせ7日間で20倍増殖する系を確立した。また我々の作成したrAAV/Tk/Neotと共同研究者より供与されたレトロウイルスベクターとの比較をおこなったところAAVベクターの導入効率はレトロウイルスベクターに比較して低かった。次年度も同様な実験を行い、臨床におけるリンパ球への遺伝子導入をめざした基礎データの蓄積を行っていきたい。Adeno-associate virus(AAV)は広くヒト細胞に感染するものの毒性が少ないため、遺伝子治療のベクターとして期待されている。しかし血液細胞への応用は進んでいないため、基礎的な検討を1995年から開始し、MOI<1の低値での実験であったため導入効率は不良であったが、慢性骨髄性白血病急性転化>急性骨髄性白血病>急性リンパ芽球性白血病の細胞株の順に導入効率に各1桁の差が認められたことをを報告した。さらに骨髄移植への応用をめざしT細胞への遺伝子導入をめざし本研究を開始した。また、基礎研究からの倫理的な面を押さえることをもう一つの目標として研究を申請した。1) AAV導入効率の改良:リコンビナントAAVの白血病細胞への導入効率を改善するためにセシウムクロライド法を取り入れ検討したところ最大で100倍の濃縮が可能となった。これを用い各種血液細胞へのAAVの導入効率をT、Bリンパ球、好中球系、単球系、幹細胞由来の白血病細胞へのネオ耐性遺伝子の導入効率を白血病コロニー法および限界希釈法を用いて検討したところMOI10で最大70%の細胞に導入できた。さらにゲノムに組み込まれていることをサザン法やFISHで確認した。
親権制限と未成年者後見制度に関する研究

本研究の目的は、親権制限制度と子どもの福祉もしくは子どもの最善の利益をいかに保証するかという制度がドイツにおいてどのように構築されているかを明らかにし、それと日本法とを比較検討することにある。親権と子どもの福祉が対立する典型的な場合として子どもの虐待の場合を題材にした。いかなる場合に、どういう手続により父母もしくはその一方は親権制限を受け、さらにどんな法的取扱いがなされるべきかを明らかにした。以上の点は親の側から見ると親としての権利制限という意味合いをもつものである。他方、保護される子どもの視点から問題を考えてみることが必要である。ドイツでは、子どもを保護すると、中長期的な処遇計画が立案される。そして、子どもは原則として個人家庭である里親養育に委ねられる。そのため、里親・里子・子どもの法的関係が明確にされていなくてはならない。この点について里親委託に関する法的規整について、ドイツ法における状況を明らかにした。これらの法的取扱いの基本には、節目ごとの司法判断とアメリカ法でいうところのパーマネンシープランニングに基づいた時間を区切っての対応という特色をみてとることができる。これら対応は、子どもの時間感覚に即した取扱いをするとともに、親にとっては一見すると強力な権利制限を受けるように見えるが、結局は親が親であり続けるためにはどうしたらいいか、そのためにどのような支援が必要なのかを定めたものであるといえる。そして、親の権利制限も必要に応じたものになっており、それに対応する形で、後見制度、保護制度が設けられており、多くの場合少年局や民間団体がその任に当たっているのである。初年度の研究は、親権制限制度に関する文献研究とドイツでの聞き取り調査を行った。親権(ドイツ民法では親権という用語はすでに1979年法により廃止されていて、代わって配慮権という用語が用いられている。用語の変更は、単なる言葉だけではなくて、当然その内容の変化も伴っていることに注意)制限制度について、まずは、どんなときに親権制限が問題になるかという典型的な場合として児童虐待についての法的対応をドイツの民法とKinder und Jugendhilfegesetz(以下ではKJHGと略称する)について見た。その結果明らかになったことは、次のような点である。ドイツでは、児童虐待について、アメリカや日本のように、虐待防止法のような特別法によって対応しているのではなくて一般の児童保護法制の中で対応しているということである。一般の児童保護法制とは、民法の親の配慮法規定とKJHGである。あえていえば、KJHGは、日本の児童福祉法に対応する。KJHGのいくつかある特色の一つは、強制という契機を持っていないということである。強制という要素が加わるときには、必ず司法判断が下される。司法判断を求めるかどうかの尺度も、また裁判所が判断を下す基準も民法1666条が規定している子どもの福祉が危険にさらされているかどうかである。そして、親が原因となる作為・不作為により子どもの福祉が危険にさらされているということになると、その作為・不作為に親の故意過失とは無関係に、必要な親の配慮権制限が行われるということである。ここで注意しなくてはならないのは、配慮権制限の捉え方が日本とドイツでは異なるということである。ドイツで必要に応じて配慮権が制限されるのは、親の権利を尊重して、できるかぎり親子関係を断ち切らないために行われるのである。例えば、親の居所指定権だけを制限し、養育家庭(里親)に委託しつつ、実親には養育家庭を訪問しての子どもとの接し方を学ばさせることにより最終的には親子統合を図っていくというふうにである。このような対応を可能にしているのは、法制度の上だけではなく、ソーシャルワーカーの専門性がきわめて高いということ、さらに里親制度が活用されているからである。今年度は、研究計画の2年度目に当たる。昨年度行ったドイツでの聞き取り調査をふまえて今年度は、ドイツ法についての文献研究を中心に研究を進めた。

今年度研究の中心に置かれたのは「子どもの福祉」確保の緊急性とその緊急性に法的保護手続きがしっかりと対応しているのかどうかということである。具体的には次の通りである。すなわち、親権制限を伴うような子どもの保護が必要な場合、子どもの時間感覚を考えると、親権制限の必要性に関する司法判断は迅速になされる必要がある。他方で、親権制限(たとえば、親権の一時的な停止や親権喪失)は、親の権利の制限という側面ももつので、その判断は証拠に基づいて慎重に行われねばならないという要請も存在する。この場合の判断基準は子どもの精神的・身体的・情緒的な福祉を阻害するかどうかに置いてその阻害の事実もしくは可能性に基づいて判断せねばならない。この判断が迅速になされねばならないのは、子どもが親から一時的に引き離されている期間は極力短くなければならないからである。日本で児童虐待防止法の施行に伴って一時保護は2ヶ月以内とするようにという指針が出されたが、2ヶ月では長すぎるといわざるをえない。さらに、この一時保護期間中、ならびに、親権制限が行われた後、法的な保護者が存在しないならば、それは子どもの権利を確保したり、代位行使したりする者がいないということで、子どもは法的に無権利状態に置かれることにもなる。法的に無権利状態に置かないために未成年者後見制度が利用・拡充されねばならないのである。さらに、未成年後見についても、私人の後見人を探すのが困難であることを考えると、公的後見制度、場合によっては成年後見制度にならって団体後見制度の創設の必要性が高いという結論を得るまでに至った。今年度は、本研究計画の最終年度にあたる。したがって、3年間の研究成果の取りまとめを行った。本研究はドイツ民法と児童ならびに少年援助法による親権制限と子どもの福祉の保護制度を総合的に把握し、それを踏まえて日本法の未整備状態を浮き彫りにするものとなった。ドイツ法では、基本法に親の権利条項が設けられていることもあり、民法上の親の配慮権(日本法でいうと親権に近い)に制限が加えられても、それは親としての権利を否定されたことにはならない。親の配慮権の制限は子の福祉・安全を確保するために必要かつその限りでのみ行われなくてはならないのである。親の配慮権制限も、親に対する制裁的意味をもって行われるのではなくて、親サイドから見れば、親であり続けるために必要であるがゆえに行われるのだといってもよい。そして、子どもの時間感覚を基本にすえて、親子の絆が断ち切られるような事態に至ると、今度は全面的な親の配慮権の剥奪が裁判所によって宣告されるのである。このときには、基本法上の親の権利も剥奪されるということになる。法律上親であることを実親にやめてもらうということである。このような一連の流れの中で、ドイツ法では親の配慮権制限のあり方は細分化されている。財産管理権だけが制限される時もあれば、居所指定権だけが制限される時、あるいは、配慮権が全面的に剥奪される時もある。それぞれの制限の程度に応じて、子の法的保護制度が設けられている。
ダイレクトリプログラミングで作製された“iHep細胞”の機能的成熟誘導とその応用

我々は、マウスの線維芽細胞に2つの転写因子を導入することで、肝細胞の性質をもったiHep細胞を作製することに成功した。iHep細胞は肝細胞の形態的特徴や遺伝子・タンパク質発現を有し、肝細胞特有の機能をもったまま培養下での増殖や維持、凍結保存が可能であった。また、肝機能不全で死に至る高チロシン血症モデルマウスの肝臓へiHep細胞を移植すると、肝細胞として障害を受けた肝臓組織を機能的に再構築し、マウスの致死率を大幅に減少させた。このように、iHep細胞は医療・創薬への応用が強く期待される細胞といえるが、その機能レベルは生体の肝細胞よりも低い。そこで本研究では、iHep細胞の機能的成熟を誘導する方法を開発するとともにその分子機構の解明を目指して研究を行った。平成30年度では、確立した培養条件によるiHep細胞の機能的成熟度やシグナル伝達経路の解析をさらに進めた。その結果、細胞凝集塊形成によるHippoシグナルの活性化、並びにHnf1αを筆頭とする肝細胞分化関連転写因子の活性化が、iHep細胞の成熟化を強く促進することを見出した(Yamamoto et al., Cell Rep., 2018)。また、iHep細胞の発展的研究として、肝細胞へのダイレクトリプログラミング技術をがん治療に応用できないかと考え、これまでの研究で重要性が明らかになった肝細胞分化誘導因子セット(HNF4A、FOXA3、HNF1A)をヒトの肝がん細胞に導入した。その結果、肝がん細胞の長期的な増殖阻害やがん形質の消失、並びに肝細胞分化マーカーの発現上昇が認められた(Takashima et al., Cancer Sci., 2018)。このことから、ダイレクトリプログラミング技術を利用した肝がん細胞の肝細胞化が、肝がんの治療や制御に有効であることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。肝臓を構成する肝細胞は移植医療や創薬研究において利用価値の高い細胞だが、生体組織から採取できる細胞数には限界があり、培養下での増殖や維持も難しい。この問題に対し、我々は、マウスの線維芽細胞に2つの転写因子を導入することで、肝細胞の性質をもった細胞(induced hepatocyte-like cells: iHep細胞)を作製すること(ダイレクトリプログラミング)に成功した。作製したiHep細胞は肝細胞の形態的特徴や遺伝子・タンパク質発現を有し、肝細胞特有の機能をもったまま培養下での増殖や維持、凍結保存が可能であった。また、肝機能不全で死に至る高チロシン血症モデルマウスの肝臓へiHep細胞を移植すると、肝細胞として障害を受けた肝臓組織を機能的に再構築し、マウスの致死率を大幅に減少させることが可能であった。このように、皮膚から作製できて増殖や保存が可能なiHep細胞は、ヒトに応用された場合、機能的な肝細胞として医療への応用が期待できる。iHep細胞はその特徴として未熟な性質を有し、培養下において増殖能が高いため、医療応用に必要な細胞を用意できるメリットを有する。しかしながら、その反面、肝機能レベルが生体肝臓の肝細胞よりも低い。そのため、iHep細胞を真に医療の現場で利用するためには、iHep細胞の二次的な分化誘導、すなわち肝細胞としての機能的成熟を誘導する必要がある。そこで本研究では、iHep細胞の機能的成熟を誘導する方法を開発するとともにその分子機構の解明を目指して研究を行う。平成28年度では、iHep細胞の培養方法を再検討し、最も効果的にiHep細胞の機能的成熟を誘導できる条件を見出した。また、当該方法においてiHep細胞が成熟する際に重要なシグナル伝達経路のひとつを明らかにした。これまでの研究では、iHep細胞の機能的成熟を誘導可能な培養条件が確立されただけでなく、iHep細胞が成熟する際に重要なシグナル伝達経路の解析も進んでいる。このことから、iHep細胞の機能的成熟誘導とその分子機構の解明に向けておおむね順調に研究が進んでいるといえる。

また、iHep細胞の発展的研究として、肝細胞へのダイレクトリプログラミング技術をがん治療に応用できないかと考え、これまでの研究で重要性が明らかになった肝細胞分化誘導因子セット(HNF4A、FOXA3、HNF1A)をヒトの肝がん細胞に導入した。その結果、肝がん細胞の長期的な増殖阻害やがん形質の消失、並びに肝細胞分化マーカーの発現上昇が認められた(Takashima et al., Cancer Sci., 2018)。このことから、ダイレクトリプログラミング技術を利用した肝がん細胞の肝細胞化が、肝がんの治療や制御に有効であることが示唆された。今後は、生体内外の解析系を用いてiHep細胞の機能的成熟度をさらに詳しく解析するとともに、同定したシグナル伝達経路の解析を進めることで、iHep細胞の機能的成熟をもたらす分子機構の解明を目指す。また、得られた情報をヒトiHep細胞に応用し、医療応用への展開を模索していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
介在物分布による地震波エンベロープ形成の研究

リソスフェアに含まれるランダムな小規模不均質構造のモデルとして介在物分布を考え、それによる地震波エンベロープ(包絡形)形成を理論と数値実験の両面から検討した.その結果、実験結果を定量的に再現できる理論や、エンベロープの形状を規定するモデルパラメータ等を確認し、実際の観測エンベロープへの介在物分布モデルの適用可能性を示した.また不均質構造の不連続性がエンベロープ形成に及ぼす影響について若干の知見を得た.リソスフェアに含まれるランダムな小規模不均質構造のモデルとして介在物分布を考え、それによる地震波エンベロープ(包絡形)形成を理論と数値実験の両面から検討した.その結果、実験結果を定量的に再現できる理論や、エンベロープの形状を規定するモデルパラメータ等を確認し、実際の観測エンベロープへの介在物分布モデルの適用可能性を示した.また不均質構造の不連続性がエンベロープ形成に及ぼす影響について若干の知見を得た.平成19年度は、まず介在物分布による地震波の散乱に関して、申請者が以前に展開した理論の一般化をおこなった。申請者は以前、周囲との弾性的コントラストが低い介在物分布による地震波の散乱減衰に関して、「ランダム媒質の理論」と「離散的散乱体の理論」が等価であることを理論的に示したが、実際には2次元SH波散乱という限定的な(実質的にスカラー波散乱と同等の)場合を扱ったに過ぎなかった。本研究では、同理論を3次元弾性波散乱に拡張し、P波-S波間の変換散乱の効果も含める形で一般化した。その結果、上記の等価性が現実的な3次元弾性波散乱についても成り立つことを示すとともに、その等価性が成り立つための条件を具体的に求めることに成功した。また、各介在物のサイズが冪乗則に従って確率分布する場合には、過去の研究から示唆されたリソスフェアの空間パワースペクトルと同様の性質(波数の34乗に反比例)を持ち得ることを明らかにした。次に、介在物分布モデルによる波動伝播の数値シミュレーションをおこない、波形のエンベロープを実験的に求めた。得られた波形に関しては、低速度の介在物が高速度のものに比べてコーダ波を強く励起する傾向が認められた。モデルパラメータを変化させながらシミュレーションを繰り返すことにより、その特性の抽出を試みたが、諸般の事情により計算プログラムの実装が予定より遅れたため、計算結果の整理が当該年度内には終了しなかったので、次年度に持ち越すこととした。平成20年度は、前年度におこなった介在物分布モデルによる波動伝播の数値シミュレーションについて、新たにシミュレーション事例を追加した上で、その平均波形やエンベロープを既存の諸理論と比較した。シミュレーションでは、周囲の媒質と速度や密度の異なる円形介在物のランダム分布による2次元SH波の多重散乱過程を厳密に再現した。まず、シミュレーション波形群のアンサンブル平均に関してFoldy理論とBeltzer-Brauner理論との比較をおこなった。前者の理論は平均波形(それゆえ主要動エンベロープ)を記述する古典的理論として知られているが、高速度介在物が存在する場合に因果律を破ることが指摘されており、その点を改善したものが後者の理論である。比較の結果、予想に反して、平均波形は介在物の性質によらず常にFoldy理論で記述可能であることがわかった。このことは、個々の波形が因果的でも、その平均は因果律を満たすとは限らないことを示唆し、その理由の解明は今後の課題である。次に、波形群から二乗平均平方根エンベロープを求め、コーダ(後続波)エンベロープを記述するいくつかの理論との比較をおこなった。その結果、研究代表者が以前に研究対象とした空隙の場合に比べ、いずれの理論も適用範囲が狭いことが示された。このことは、周囲とのコントラストが強い空隙に比べ、低コントラストの介在物では散乱の異方性が強いため、便宜上等方散乱を仮定する諸理論ではコーダエンベロープを定量的に記述できないことを示唆する。ただし現実のリソスフェアと同程度の弱い不均質性を仮定するなら、コーダエンベロープの形状を表すパラメータであるコーダQについては、単純な1次等方散乱理論でも比較的よく説明できることも示された。なお、研究成果の一部に関する雑誌論文をまもなく投稿予定である。
巨核球の分化機構の解析-巨核球分離培養の血小板放出機序と特異的造血因子の検討

7/8年度の報告1)PPFバイオアッセイ法によるトロンボポエチン(TPO)活性の検定:a)IL-6,EpoのPPF活性の増幅効果が確認されているブタ血管内皮細胞(PEC)株を使って巨核球との共生培養を有血清下で行ったところ、IL-6,Epoと同様にTPOに対しても著しいPPF活性の増幅効果が、1pg/ml10ng/mlまで幅広い濃度範囲にわたって認められた。b)PPFに対する各種造血因子の相乗効果については、これまでIL-6とEpoの間に低濃度においてPPFに対する相乗効果があることを認めた(Path Inter Vo1.46,968-976,1996)が、今回、TPOとIL-6,TPOとEpoの間にはPPFに対する相乗効果は認められなかった。c)ラットIL-3では、IL-3とEpoの間でPPFを促進させる“相乗効果"を認めたが、IL-3とTPO,IL-3とIL-6の間には認められなかった。間質細胞および血管内皮細胞と巨核球の共生培養におけるPPFの“促進効果"の機序については、Mycoplasma感染の問題などで、予定した実験計画を消化していない。PPFの電子顕微鏡による観察では、TPO,IL-6,Epoの各刺激因子間で巨核球の微細形態とPPFの構造上の質的差異は認められなかった。分離膜形成の量的差異はありそうである。PPFの形成過程で分離膜が解離することにより、細胞質が糸状にほぐれるものと考えられるが、培養では分離膜の発達が不完全なことが糸状のPPFになる原因かと推測される。昨年度の実験手技を使い、免疫ビーズ法でラット骨髄巨核球を精製分離し以下の検索を行った。1)Proplatelet Process Formation(PPF)バイオアッセイ法によるトロンボポエチン(TPO)活性の検定:1994年に新しく開発されたc-Mpl ligandのトロンボポエチン(PTO)とIL-6,Epoを比較する為に、これまでにIL-6,EpoのPPF活性の増幅効果が確認されているブタ血管内皮細胞(PEC)株を使って巨核球との共生培養を有血清下で行ったところ、IL-6,Epoと同様にTPOに対しても著しいPPF活性の増幅効果が、1pg/ml10ng/mlまで幅広い濃度範囲にわたって認められた。2)血清添加が必要か否かを決める為同様の実験を、顕著なPPFを示すことの出来る無血清培養下において検討したところPPFは顕著であったが、更にウシ胎児血清(FCS)を添加したところFCS添加の濃度依存性は明確には観察できなかった。従って当初考えていた『血清因子が必要である』という点に疑問が生じてきている。今後の課題である。3)KD細胞株に関してはMycoplasmaの感染が示唆され、PPFアッセイへの供与が困難な事態となった。従って他の同種の細胞株で検討している。4)PPFの電顕(TEM)観察では、PPFの形成過程で分離膜が解離することにより、細胞質が糸状にほぐれるものと考えられた。昨年度にひきつづき、免疫ビーズ法によるラット骨髄巨核球の精製分離・培養及び巨核球、前血小板(Proplatelet)の電顕観察を行った。最近、キリンビール社より入手したラットリコンビナント型IL-3について、IL-3とEpoの間ではPPFを相乗的に促進させる′′相乗効果′′を認めたが、IL-3とTPO,IL-3とIL-6の間には認められなかった。2)間質細胞および血管内皮細胞と巨核球の共生培養がIL-6.Epoと同様にTPOのPPF活性をもさらに促進させる′′促進効果′′の機序については、Mycoplasma感染の問題などで、当初に予定した実験計画を消化していない。

3)PPFの電子顕微鏡(TEM)による観察ではTPO,IL-6,Epoの各々の存在下においてPPFは顕著に産生されたが、各刺激因子間で巨核球とPPFの構造上の差異は認められなかった。分離膜形成の量的差異はありそうだが、形態学的な質的差はないと思われる。
各種淡水環境における酸性降下物汚染洗浄化機能、特に硫酸還元能に関する基礎的検討

酸性降下物による環境への影響を評価する上で、降下汚染物質に対する環境の自己浄化能の評価は重要である。降下物の主要な酸性汚染物質は硫酸と硝酸であるが、硫酸は生物的に代謝されにくく、環境への影響という点で特に注目される汚染物質である。自然環境下では、硫酸は主要には硫酸還元細菌による異化的硫酸還元作用で除去される。それ故、硫酸還元能の評価は酸性降下物汚染に対する環境の自己浄化能力を評価する上で重要である。本研究は、各種淡水環境の硫酸汚染浄化能力評価のための簡便法として、硫酸イオンのHPLC分析に基づく硫酸還元活性測定法の開発を目的に行った。本研究の結果は以下の通りである。1.MOPSで緩衝化した、硫酸塩、乳酸等の有機酸、還元剤のシステイン、及び酸化還元指示薬のレザズリンを含む硫酸還元活性測定液に試料を懸濁し、酸素除去窒素ガス下で保温し、硫酸イオン濃度の低下を追跡することで、試料の硫酸還元活性を再現性良く測定できた。その場合、少なくとも保温12時間までは、硫酸還元はほぼ一定の速度で進行した。保温温度10°Cと20°Cでは硫酸還元活性はそれぞれ30°Cでの活性の約10%と40%であった。2.硫酸還元活性の測定値は菌濃度に比例し、細胞当たりや菌体タンパク質当たりに換算した活性は、Desulfovibrio vulgarisとDesulfovibrio desulfuricansの各基準菌株を含む3菌株の硫酸還元細菌で、それぞれの菌株に固有の値を示した。3.嫌気消化都市下水汚泥と淡水池底泥の1リットル当たりの硫酸還元活性(μmol/h/L)は、30°Cでそれぞれ約5.6と326であり、淡水池底泥における硫酸還元活性と硫酸還元細菌の生息密度は深層部とともに好気層に隣接する深さ1517cmまでの層で高い傾向が見られた。淡水池1m^2当たりの底泥の硫酸還元能は夏期には46.7mmol/dayに達するものと概算された。1.硫酸イオンの微量分析による硫酸還元活性測定法について検討した。その結果、電子供与体としての乳酸-Na等(約1mM)、Na_2SO_4(0.2-0.5mM)、還元剤としてのシステイン-HCl(0.5mg/ml)、酸化還元指示薬であるレサズリン(1μg/ml)およびMOPS緩衝液(10mM、pH7.0)よりなる硫酸還元活性測定液に、O_2除去N_2ガス下で試料を懸濁し、30°Cで嫌気的に振盪保温した後、硫酸イオンをHPLC分析することで、硫酸還元をかなり定量性良く測定することができた。保温時間は12時間程度までが適当であった。2.硫酸還元活性測定液を用いて、嫌気消化下水汚泥からの硫酸還元細菌分離菌株の純培養で細胞当りの硫酸還元活性(1時間当りの硫酸還元量)を測定したところ、30°Cで0.27μmoles/10^8cells/hであった。一方、嫌気消化下水汚泥の硫酸還元活性は汚泥1000cm^3当り、30°Cで2.46μmoles/hであり、硫酸還元細菌の細胞当りの活性は0.55μmoles/10^8cells/hと純培養菌の活性の約2倍であったが、概ね対応するものであった。