hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イントロンにコードされる低分子核小体RNA

近年、核小体に存在する低分子RNA(snoRNA)が、脊椎動物において他の遺伝子のイントロン内にコードされていることが発見され、このRNAはリボソームの成熟過程でrRNAのリボースのメチル化またはウリジン残基のシュードウリジル化のためのガイドとして働いていることが明かになった。しかし、snoRNA遺伝子が入り込んでいる宿主遺伝子については、多くはリボソーム蛋白質(rp)遺伝子であるということ以外、なぜ、どのようにしてそこに挿入されたのか、ほとんど研究は行われていない。そこで本研究では、細菌人工染色体(BAC)を用い、ヒトrp遺伝子に内在するsnoRNA遺伝子の系統的な解析を試みた。[結果]1.細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを使って、rp遺伝子(snoRNA遺伝子を内在する)を迅速にクローニングする方法を開発し、80種類のrp遺伝子のうち75個の遺伝子のクローニングに成功した。2.これらBACクローンのシーケンスを行い、配列が未決定のrp遺伝子52個のうち11個の全塩基配列を決定し、28個について部分配列を決定した。残りの遺伝子についても、引き続き塩基配列の決定を行っており、このまま進めば、平成12年度の初めまでにほぼすべての配列が決定できると考えられる。3.これまでの配列決定の過程で、新たに3個のsnoRNA遺伝子の宿主を同定した。今後は、引き続きrp遺伝子内のsnoRNA遺伝子を同定するとともに、snoRNA遺伝子で宿主遺伝子が未決定のものを同様な方法でクローニングし、その宿主の解析も進めたい。
幾何学的函数論の多面的研究

幾何学的函数論における典型的な問題は幾何的に記述される平面内の(単連結)領域と,単位円板からその領域への等角写像の解析的性質との関係を調べることです.ビーベルバッハはa_0=0, a_1=1と正規化された単位円板上の解析函数f(z)=a_0+a_1z+a_2z^2+...がある領域への等角写像ならば|a_n|≦nであることを予想しました.それは70年後にドブランジュにより示されました.本研究ではたとえば,係数a_nの2倍が整数であるような等角写像は全部で21個に限ることを示しました.a_nがすべて整数の場合は9個に限ることは知られていたので,12個増えることになります.幾何学的函数論における典型的な問題は幾何的に記述される平面内の(単連結)領域と,単位円板からその領域への等角写像の解析的性質との関係を調べることです.ビーベルバッハはa_0=0, a_1=1と正規化された単位円板上の解析函数f(z)=a_0+a_1z+a_2z^2+...がある領域への等角写像ならば|a_n|≦nであることを予想しました.それは70年後にドブランジュにより示されました.本研究ではたとえば,係数a_nの2倍が整数であるような等角写像は全部で21個に限ることを示しました.a_nがすべて整数の場合は9個に限ることは知られていたので,12個増えることになります.今年度は以下に述べるようにいくつかのテーマに沿って研究を行った.1.退化ベルトラミ方程式の同相解の研究.佐官氏,Gutlyanskii氏と共同で,半円環のmodulus(対数容量の逆数に相当)を定義し,写像による歪曲度を調べることにより境界での連続度について精密な結果を得ることができた.本研究については,研究代表者がインド工科大やマカオ大学における国際集会で発表を行った.2. Yong Chan Kim氏と共同で単葉函数のベキ変形の研究を行った.これは既知の積分変換から自然に導かれる変形であるが,これまで組織的に研究されたことはなかった.この変形の一部が正則運動を与えることから,今後はタイヒミュラー空間への応用が期待される.これについてはzf'(z)/f(z)の変動領域と密接な関わりがあることがわかり,現在は柳原氏連絡を取りながら研究を続けているところである.3. Seong-AKim氏,Kyunghyun Cho氏らとの共同研究において高階のシュワルツ補題について研究を行った.これは高階不変微分や高階不変シュワルツ微分などの評価への応用が見込まれ,今後さらなる研究を行う必要がある.また,Nevanlinna-Pickの補間問題とも密接な関係があり,今後その方面への応用も期待される.これら以外にも,函数論分科会が所掌する研究集会やセミナーを企画・援助するなどし,研究分担者や他の研究者らと研究討論を行った.今年度は震災の影響で大きな予定変更もあったが,以下のように研究を行った.1.Yong Chan Kim氏と共同で単葉函数のベキ変形の研究を継続した.与えられた函数に対して,そのベキ変形が単葉となるような指数の集合の函数論的な性質を調べた.研究結果がある程度まとまったので,論文にまとめて現在投稿中である.またこの研究の過程で,zf'(z)/f(z)の絶対値を用いた新たな単葉性判定法を発見した.この判定法については,現在も研究を進めており論文執筆を準備しているところである.2.加藤崇生氏,王利梅氏との共同研究において,近接凸函数のzf'(z)/f(z)の変動領域を研究した.点を固定した場合の変動領域は既にBiernackiによってなされていたが,あまり明示的ではなかった.我々は明示的な形でこれを与え,その応用として全変動領域を決定することができた.また,この結果は上記ベキ変形の研究にも応用を持つ.3.Seong-AKim氏,Kyunghyun Cho氏らとの共同研究において高階不変シュワルツ微分や高階のシュワルツ補題について研究を引き続き行った.今年度は特にグルンスキー係数やベキ行列との関連について研究を進めた.これら以外にも,函数論分科会が所掌する研究集会やセミナーを企画・援助するなどし,特に12月には広島にて第19回有限無限次元複素解析国際会議を開催した.1.研究代表者は,原点においてf(0)=0と正規化された単連結領域上の正則函数f(z)に対して,zf'(z)/f(z)が1に十分近いことが単葉性を導くための必要十分条件が領域が擬円板であるという予想を研究した.同様の結果はf'(z)に対してはAnderson, Becker, Gevirtzらによって既に示されており,その類似と言えるものであるが,まだ完全な形で証明できておらず,引き続き研究を行っているところである.(Yong Chan Kim氏との共同研究)2.加藤崇雄氏,王利梅氏との共同研究の応用として,close-to-convex函数に関するある種の極値問題を考察した.これについては,現在論文としてまとめているところである.(王利梅氏との共同研究)3. Vuorinen氏から提起された問題として,四辺形の外部の等角写像の具体的な形,および対辺を結ぶ曲線族の極値的長さを具体的に表す問題を考えた.

これについては,台形の場合には,Appel超幾何函数を用いて表示できることが分かったが,現在はある種の単調性や評価など,質的な結果を目指して研究を継続中である.4. 2013年9月には予定通り,仙台において幾何学的函数論に関する国際研究集会を行い,国内はもとよりドイツ,韓国などから多くの研究者が集まり,有意義な研究討論ができた.現在は集会記録として論文集を編集し,東北大学大学院情報科学研究科のジャーナルから特別号として刊行すべく準備を進めている段階である.1.研究代表者はYong Chan Kim氏との共同研究において,単位円板上で定義された正則函数f(z)に関して,zf'(z)/f(z)の絶対値による新たな単葉性判定法を提案し,その最良定数に関する評価を行った.2.また,研究代表者は,O. Roth氏らと錐特異性を持つリーマン面上の(完備)双曲計量の存在と一意性について研究を行い,特に2つの錐特異点の距離の下限を錐角を用いて表すことに成功した.存在については十分一般的な条件が得られているが,一意性についてはまだ部分的にしか解決していないので,今後の課題である.3.さらに,研究代表者は高階シュワルツ微分のノルム評価を単位円板の場合に行った.特に,Aharonovによって得られていた単葉性のための必要十分条件を高階シュワルツ微分を用いて言い換え,それにより単葉函数に対して各階のノルムが満たすべき不等式を導いた.さらに,その定数の最良性についても議論を行ったが,まだ満足のいく形とは言えないので,それも今後の研究課題となっている.4.研究代表者と,加藤崇生氏,Li-mei Wang氏との共同体制による近接凸函数の変動領域の研究を今年度も引き続き行い,証明の簡略化などにより理論がかなりすっきりとしてきた.現在は論文を投稿し,修正指示を受けて再投稿を終えた段階である.研究代表者は,大学院生・ポストドクター・研究分担者らと共同で平成26年度に以下のような研究を行った.1.一様完全集合の特徴付けについて.複素平面内の閉集合の一様完全性は双曲密度と境界までのユークリッド距離の積が下から正の定数で押さえられることにより特徴付けられる.球面幾何を用いることにより,リーマン球面内の閉集合の一様完全性の類似の特徴付けを得た.2.穴あき球面の双曲距離の評価.リーマン球面から3点以上の点を抜いて得られるリーマン面の双曲密度はある程度定量的に評価されているが,誘導される双曲距離については十分良い評価があるとは言えない.そこで,点の配置から定まるある種の量を用いて,定量的に双曲距離を別の比較的初等的に表される距離関数で上下から評価することに成功した(張担然氏との共同研究).3.面積不等式の精密化.Gronwall-Bieberbachの面積定理は,函数がリーマン球面に擬等角拡張される場合に最大歪曲度を用いて精密化できることをLehtoは示していた.一方,極が一般の位置の場合にも面積定理はChichraにより一般化されていたが,さらに擬等角拡張を持つ場合にも同様に精密化でき,等号を満たす函数およびその時の擬等角拡張を完全に決定した(Bhowmik氏,Satpati氏との共同研究)4.位数αの凸函数の研究.Brickman et.al.による予想(1973年)を解決し,その応用としてある種の極値問題を解いた.また,Styer-Wright(1973年)の結果を改良して位数3/5以上の凸函数の平均が星状であることを示した(王利梅氏との共同研究)
枯草菌胞子形成過程における二量体リボソームの形成と分解の制御機構

胞子形成期の初期に70Sリボソームが不活性化され,次に休眠促進因子(Hibernationpromotingfactor,Hpf)によりダイマーリボソームが形成される。中期にはrRNAが切断・分解され始め,胞子形成過程の進行につれ後期にはダイマーリボソームが分解され消失することを見出した。胞子形成開始期には,hpfの〓H依存のプロモーターから,強く転写が誘導されていた。1.リボソーム二量体化に必須なyvyD遺伝子の転写制御アミノ酸飢餓等の緊縮応答時に不活性化された70SリボソームがYvyDタンパク質によりダイマーリボソームを形成することを見出した。これらのリボソームの不活化と二量体化は、胞子形成期の初期の細胞や非胞子形成培地で培養した時に定常期の細胞でも観察された。不活化された70Sリボソームのダイマー形成に必須であるyvyD遺伝子は、シグマBとシグマHにより認識される二つのプロモーターを持っているが、緊縮応答時と胞子形成期の細胞ではもっぱらシグマHのプロモーターから転写される。一方、LB培地のような非胞子形成培地で培養した定常期の細胞ではシグマBとシグマHの両方のプロモーターからの転写が認められた。しかしながら、シグマHとシグマBの両破壊株では両プロモーターの間から新たな転写が開始されることを見出した。今後このプロモーターを認識するシグマ因子を同定する。2.rRNA遺伝子の新規突然変異株の単離の試み枯草菌にはrRNAオペロンが10個存在しているため、rRNA遺伝子の突然変異株を単離することは非常に困難であった。しかし、我々は最近構築した1コピーのrRNAオペロンのみを持つrRNAオペロン多重欠失変異株を利用して、rRNA遺伝子の突然変異株の単離を試みた。選択マーカーとして16SrRNA遺伝子にはストレプトマイシン耐性変異str-6を、23SrRNs遺伝子にはエリスロマイシン耐性変異ery-7を利用した。その結果、16SrRNA遺伝子からは、Ts遠位株が、そして23SrRNA遺伝子からはSpo-変異株を得ることができた。枯草菌の野生株を胞子形成培地にて培養し、対数増殖期(OD_<600>≒・0.2)と、胞子形成開始(To,OD_<600>≒1.2)から1、2、3、4、5、6、7、8時間後(T_1、T_2、T_3、T_4、T_5、T_6、T_7、T_8)の細胞を集め、これらの細胞をフレンチプレスにより破壊後、低速遠心して未破壊細胞と残渣を除いて調製した粗抽出液を用いて10%・40%ショ糖密度勾配超遠心法によりリボソームのプロファイルを求めた。その結果、胞子形成過程初期(T_1T_2)に最もダイマーリボソームが多く形成され、その後胞子形成が進行するにつれてダイマーリボソームの量が減少し、消失していくことを見出した。次に、胞子形成過程To、T_1、T_2、T_3、T_4のダイマーリボソームからそれぞれrRNAを精製し、1.5%アガロースゲルで電気泳動を行い、胞子形成過程の進行に伴いダイマーリボソームの23SrRNA、16SrRNAが分解されることを明らかにした。rRNAの分解が始まる時期であるT_2のダイマーリボソームの16SrRNAに着目し、3'RACE解析を用いて16SrRNAの切断部位の解析を行った。その結果、データベース上の16SrRNAの5'末端から数えて1458番目1461番目のUに富んだ領域で切断を受けていることが明らかとなった。σ_H破壊株におけるrRNAの分解を野生株と比較したところ、明らかな遅延が認められた。対数増殖期には70Sリボソームの状態で存在するが、胞子形成過程の初期には16SrRNAが切断されたダイマーリボソームが形成される。同時にσ_HによりYhcR、EndoA等の複数のRNaseが発現し、胞子形成過程の進行と共にrRNAが分解され、その結果母細胞のダイマーリボソームがすべて分解されて消失するものと考えられる。この際に生じたアミノ酸やリボヌクレオチドは母細胞における生合成の材料として利用されるものと考えられる。胞子形成期の初期に70Sリボソームが不活性化され,次に休眠促進因子(Hibernation promoting factor, Hpf)によりダイマーリボソームが形成される.中期にはrRNAが切断・分解され始め,胞子形成過程の進行につれ後期にはダイマーリボソームが分解され消失することを見出した.このhpf遺伝子は胞子形成開始に活性化されるシグマHとストレス応答時に活性化されるシグマBの2つのプロモーターを持ち,胞子形成開始期には, hpfのシグマH依存のプロモーターから強く転写が誘導されていた.

栄養増殖期の細胞でHpfを過剰発現させても70Sリボソームのダイマーは形成されないことから,まず70Sリボソームが何らかの因子により不活性型70Sリボソームとなり,次にHpfによりダイマーリボソームが形成されると考えられる.胞子形成過程の進行に伴い母細胞で形成されたダイマーリボソームの16SrRNAが特異的な部位で切断され,後期にはダイマーリボソームが分解される.これらの分解物は,胞子形成期後期に大量に合成されるスポアコートタンパク質の合成に再利用されるものと考えられる.一方,非胞子形成培地(LB)の定常期の細胞において形成されるダイマーリボソームは,胞子形成初期の細胞と異なり,ストレス応答時に活性化されるシグマBによりhpfの転写が行われていることを見出した.従って,胞子形成を開始しない定常期の細胞では,既知の反応経路とは異なる経路でhpfの転写制御,つまりダイマーリボゾーム形成の制御,が行われていることが示唆された.胞子形成過程の初期に形成された不活性なダイマーリボソームの16SrRNAの切断箇所を同定できたのは非常に幸運であり、大いなる前進であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。16SrRNAの切断箇所の同定とその機能を知るために、切断箇所の欠失変異と塩基変異を導入した変異株を作成し、これらの胞子形成能や増殖能などの表現型とダイマーリボソームの形成能と16SrRNAのパターンを調べる。また胞子形成期初期に機能すると考えられるendoAをコードする遺伝子の欠失変異株の作成とその変異株におけるダイマーリボソーム形成能と16SrRNAの切断パターンを検証する。
高速遠心成形マイクロ波焼成によるネットシェイプ超高強度ファインセラミックスの作製

田島らの考案した高速遠心成形法によるアルミナは、低温かつ短時間で焼成が完了し,均質な組織と優れた強度を持つ.そこで本研究では,焼成方法の改善による焼成体の機械的特性の更なる向上を目指して,新しい焼成方法として佐治らによって提案されている28MHzマイクロ波誘電加熱炉を使用した遠心成形アルミナの焼成を試みた.以下に結果を示す.1.安定に加熱することが出来る試料の設置方法並びに加熱プログラムを見いだした.これによって,非常に高い加熱速度で(従来の10倍)かつ,ほとんど温度勾配の無いままに加熱することが出来るようになった.2.試料自体が直接に発熱するマイクロ波焼成においては,真空中における焼成が容易であることが見いだされた.さらに,真空中の焼成によって今までにない優れた特性を持った焼成体が得られることが確認された.3.真空中におけるマイクロ波焼成では,従来の焼成方法に比べて約50K低い温度で十分に緻密化することが見いだされた.さらに,これにより同じ密度でも,より結晶粒径の細かい焼成体を得ることができるようになった.4.上記の焼成法によって得られた焼成体は,4点曲げにおいて1140MPaの強度(3点曲げ換算で約1360MPa)を持っていることが確認された.これは今までに報告されたアルミナの強度としては,世界最高の値である.さらに,ビッカース硬さも,従来の焼成体に比べて約50MPa高い値が得られた.5.破壊靱性値に関しては,従来の焼成方法による焼成体に比べて特に改善はされなかった.6.以上より,本研究によって高速遠心成形マイクロ波焼成によるネットシェイプ超高強度ファインセラミックスの作製が可能なことが証明された.田島らの考案した高速遠心成形法によるアルミナは、低温かつ短時間で焼成が完了し,均質な組織と優れた強度を持つ.そこで本研究では,焼成方法の改善による焼成体の機械的特性の更なる向上を目指して,新しい焼成方法として佐治らによって提案されている28MHzマイクロ波誘電加熱炉を使用した遠心成形アルミナの焼成を試みた.以下に結果を示す.1.安定に加熱することが出来る試料の設置方法並びに加熱プログラムを見いだした.これによって,非常に高い加熱速度で(従来の10倍)かつ,ほとんど温度勾配の無いままに加熱することが出来るようになった.2.試料自体が直接に発熱するマイクロ波焼成においては,真空中における焼成が容易であることが見いだされた.さらに,真空中の焼成によって今までにない優れた特性を持った焼成体が得られることが確認された.3.真空中におけるマイクロ波焼成では,従来の焼成方法に比べて約50K低い温度で十分に緻密化することが見いだされた.さらに,これにより同じ密度でも,より結晶粒径の細かい焼成体を得ることができるようになった.4.上記の焼成法によって得られた焼成体は,4点曲げにおいて1140MPaの強度(3点曲げ換算で約1360MPa)を持っていることが確認された.これは今までに報告されたアルミナの強度としては,世界最高の値である.さらに,ビッカース硬さも,従来の焼成体に比べて約50MPa高い値が得られた.5.破壊靱性値に関しては,従来の焼成方法による焼成体に比べて特に改善はされなかった.6.以上より,本研究によって高速遠心成形マイクロ波焼成によるネットシェイプ超高強度ファインセラミックスの作製が可能なことが証明された.田島らの考案した高速遠心成形法によるアルミナは,低温かつ短時間で焼成が完了し,均質な組織と優れた強度を持つ.そこで本研究では,焼成方法の改善による焼成体の機械的特性の更なる向上を目指して,新しい焼成方法として佐治らによって提案されている28MHzマイクロ波誘電加熱炉を使用した遠心成形アルミナの焼成を試みた.以下に結果を示す.1.安定に加熱することが出来る試料の設置方法並びに加熱プログラムを見いだした.これによって,非常に高い加熱速度で(従来の10倍)かつ,ほとんど温度匂配の無いままに加熱することが出来るようになった.2.試料自体が直接に発熱するマイクロ波焼成においては,真空中における焼成が容易であることが見いだされた.さらに,真空中の焼成によって今までにない優れた特性を持った焼成体が得られることが確認された.3.真空中におけるマイクロ波焼成では,従来の焼成方法に比べて約50K低い温度で十分に緻密化することが見いだされた.さらに,これにより同じ密度でも,より結晶粒径の細かい焼成体を得ることができるようになった.4.上記の焼成法によって得られた焼成体は,4点曲げにおいて1140MPaの強度(3点曲げ換算で約1360MPa)を持っていることが確認された.これは今までに報告されたアルミナの強度としては,世界最高の値である.さらに,ビッカース硬さも,従来の焼成体に比べて約50MPa高い値が得られた.5.破壊靱性値に関しては,従来の焼成方法による焼成体に比べて特に改善はされなかった.6.以上より,本研究によって高速遠心形成マイクロ波焼成によるネットシェイプ超高強度ファインセラミックスの作製が可能なことが証明された.
炎症性サイトカイン刺激後の破骨細胞形成を伴う歯根嚢胞拡大の分子機構の解明

歯根嚢胞は,IL-1などの炎症性サイトカイン刺激によって根尖周囲骨の吸収が起こり,拡大すると考えられている。そこで,本研究では,骨形成と骨吸収の両方の立場からIL-1の影響を細胞生物学的に調べた。まず骨形成に及ぼすIL-1αの影響を調べたところ,骨芽細胞は,アルカリホスファターゼの活性低下およびI型コラーゲンの発現抑制によって,骨形成能が低下することが明らかになった。破骨細胞の形成は,骨芽細胞が発現するRANKLと破骨細胞前駆細胞が発現するLANKL受容体(RANK)を介する細胞間相互作用によって行われ,RANKの発現は骨芽細胞が産生するM-CSFによって増加する』また,骨芽細胞はRANKLに対するおとりの受容体(OPG)を産生し,破骨細胞前駆細胞との細胞間相互作用を抑制して破骨細胞の形成を調節している。本研究結果から,IL-1αは,M-CSFとPGE_2の産生促進およびOPGの産生抑制によって,破骨細胞形成に積極的に関与していることが明らかになった。次に,骨芽細胞による骨マトリックスタンパク代謝に及ぼすIL-1αの影響を調べた。その結果,IL-1αは骨芽細胞によるMMP, tPAおよびuPAの産生増加とPAI-1の産生低下によって骨マトリックス代謝を促進し,かつ分解系に傾けることが示唆された。さらに,破骨細胞の機能発現に着目し,骨吸収関連酵素である炭酸脱水酵素II型(CAII),カテプシンKおよびMMP-9の発現に及ぼすIL-1α,RANKLおよびM-CSFの影響を調べた。その結果,IL-1α存在下での破骨細胞の骨吸収関連酵素の産生は,M-CSFではなくRANKLによって誘導されることが明らかになった。以上のことより,IL-1αは,骨芽細胞による骨形成を抑制するとともに,破骨細胞の形成と機能発現を促進することによって,歯根嚢胞の拡大が起こることが示唆された。目的:歯根嚢胞および根尖性歯周炎の拡大機構に及ぼすIL-1αの影響を骨芽細胞による骨形成能の視点から明らかにするために,骨芽細胞のin vitroにおける石灰化nodule形成と,その形成に必要な酵素および細胞外マトリックスタンパク(ECMP)の遺伝子発現に及ぼすIL-1αの影響を調べた。また,軟骨細胞のECMPの遺伝子発現に及ぼすIL-1αの影響も併せて検討した。方法:骨芽細胞としては,ラット骨肉種由来の株化骨芽細胞(ROS 17/2.8)を,また軟骨細胞としては,ヒト軟骨腫由来の株化軟骨細胞(OUMS-27)を用いた。細胞を刺激する際のIL-1αの濃度は0100 U/mlとし,培養期間は10または14日間とした。石灰化nodule形成はアリザリン赤染色によって,ECMPの遺伝子発現は半定量的またはreal-time RT-PCR法によって調べた。結果:IL-1α添加によって骨芽細胞による石灰化nodule形成の時期が遅れ,また石灰化nodule中のカルシウム量はコントロールと比べて低い値を示した。アルカリホスファターゼ(ALPase)活性値は,14日間の培養期間中すべてにおいてIL-1αによって有意に低下した。この所見は,石灰化物を形成しない軟骨細胞においても同様であった。

ECMPの遺伝子発現では,骨芽細胞のtype I collagenの発現は10日間の培養期間中すべてにおいてIL-1αによって有意に低下し,培養初期にのみ発現したbone sialoproteinもIL-1αによって低下する傾向を示した。一方,osteopontinの発現は10日間の培養期間中すべてにおいてIL-1αによって有意に上昇した。軟骨細胞のtype II collagen, aggrecanおよびlink proteinの発現は,IL-1αの濃度依存的に有意に低下し,その作用機序はBMP-2のautocrine作用による受容体の発現低下に伴って起こることが認められた。結論:IL-1αは骨芽細胞のALPase活性値およびtype I collagenの産生低下を介して骨形成を抑制することが示唆された。また,IL-1αによる骨形成の阻害が,歯根嚢胞の拡大を助長することが示唆された。我々は,IL-1が骨形成を抑制するとともに骨吸収を誘導し,この現象が歯根嚢胞や根尖性歯周炎の拡大に関与すると考え,すでにIL-1αがROS 17/2.8細胞の石灰化nodule形成を抑制することを報告した。そこで今回,RANK-RANKL signaling systemに着目し,ROS細胞を用いて,まずM-CSFとOPG発現およびPGE_2産生に及ぼすIL-1αの影響を調べた。次いで,破骨細胞前駆細胞としてマウス単球RAW264.7を用いて,IL-1α刺激を受けたROS細胞と単球によるRANK-RANKL signaling systemを介する破骨細胞様細胞(OC)形成に及ぼすIL-1αの間接的な影響を調べた。その結果,ROS細胞のM-CSF発現とPGE_2産生はIL-1α刺激によって有意に上昇したが,OPG発現は低下し,RANKL発現は検出されなかった。単球にsoluble RANKLを含むIL-1α刺激後のROS細胞の培養上清を加えて培養すると,TRAP染色陽性かつ多核のOCが多数観察された。以上の結果から,骨芽細胞がIL-1αによつて刺激されると,単球のM-CSFとPGE_2の産生促進,およびOPGの産生抑制によって,IL-1αが骨芽細胞を介してOCの形成に積極的に関与していることが示唆された(Life Sci 77(6),2005)。次いで,骨タンパクの分解とその調節機構に着目し,ROS細胞のMMPs,TIMPs,PAsおよびPAI-1の発現に及ぼすIL-1αの影響について調べた。その結果,IL-1αはMMPs,tPAおよびuPAの産生増加とPAI-1の産生低下によって骨タンパク代謝を促進させるとともに,その代謝を分解系に傾けることが示唆された(Life Sci 78(17),2006)。また,この傾向は,IL-1βによって刺激された軟骨細胞においても同様に認められた(Life Sci 77(25),2005)。以上のことから,IL-1αは骨芽細胞を介するOC形成促進と骨芽細胞自身による骨有機質の分解によって骨吸収を誘導し,歯根嚢胞や根尖性歯周炎の拡大に積極的に関与していることが示唆された。破骨細胞の形成は,骨芽細胞由来のRANKLと破骨細胞前駆細胞のRANKL受容体(RANK)を介する細胞間相互作用によって行われる。また,歯根嚢胞は,種々の炎症性サイトカインによって破骨細胞の形成が促進され,嚢胞周囲骨の吸収が起こり拡大すると考えられている。
RIガイド手術における小型半導体ガンマカメラの有用性

本研究に導入した臨床普及型RIガイド手術用半導体ガンマカメラの基本性能はエネルギー分解能に優れており、Tc-99m 30MBqを入れたS字のファントームでは2秒の撮像時間で通常のシンチカメラよりも明瞭に描出が可能と感度および解像力にも優れたものであった。この小型半導体ガンマカメラの臨床における有用性の研究は共同研究施設ごとに各倫理委員会の承認を得てインフォームドコンセントの得られた患者に対して行われた。頭頸部疾患116症例に対しシンチグラフィ(骨シンチ87例、唾液腺シンチ21例、リンパシンチ8例)を小型半導体ガンマカメラおよび高分解能角形ガンマカメラを用いて行った。症例は悪性腫瘍67例、良性腫瘍4例、唾液腺腫瘍5例、唾石症4例、口腔内乾燥症6例、シェーグレン症候群4例、骨髄炎9例、顎関節症6例、その他11例である。小型半導体ガンマカメラでは短時間に良好な画像を得ることが出来た。また半定量的指標としてRI集積部位と正常部位のcount比(T/BG比)を算出したところ小型半導体ガンマカメラによる値は短時間でシンチカメラによる値とは同じであった。さらに乳癌(浜松医科大学:30-60秒撮像、慶應義塾大学:60秒撮像)、食道癌(慶應義塾大学:30秒撮像)、喉頭癌(慶應義塾大学:30秒撮像)、歯肉癌(東京医科歯科大学:30-60秒撮像、日本歯科大学:15-30秒撮像)および舌癌(日本歯科大学:15-30秒撮像)のセンチネルリンパ節イメージングを行ったところリンパ節が明瞭に描出された。また、乳癌(浜松医科大学:投与後24時間、30秒撮像)、喉頭癌(慶應義塾大学:投与後19時間、30秒撮像)では投与翌日の術中においてもセンチネルリンパ節を描出することができた。歯肉癌(日本歯科大学:投与後24時間、30秒撮像)および舌癌(目本歯科大学:投与後24時間、30秒撮像)においても投与翌日にリンパ節を描出することができた。このように小型半導体ガンマカメラは小型、軽量で取り扱いに優れるとともにリンパ節の描出や検出に利用可能で、センチネルリンパ節シンチグラフィ等の臨床応用に十分な性能を持っており、さらに骨病変の検出や局在性の診断能を向上させることができると考える。本研究のため臨床普及型RIガイド手術用半導体ガンマカメラを導入した。その基本性能は以下のようである。通常のシンチレーションカメラでは識別できない1.8mmピッチのバーファントームで良好な解像度を得ることができた。エネルギー分解能は1素子で3.5%(Tc-99m、140keV)であった。Tc-99m 30MBqを入れたS字のファントームでは2秒の撮像時間で通常のシンチカメラよりも明瞭に描出が可能であった。センチネルリンパ節シュミレーションではTc-99m 100MBqの原発部位注入としてその0.15%、0.15MBqを直径5mmと10mmの球形容器中にそれぞれ入れて水槽中で撮像したが明瞭な画像を得ることができた。また24時間後でも描出は可能であった。

さらにshine throughのシュミレーションでは直径15mmの容器に100MBqを入れて注入部位とし、センチネルリンパ節とみたてた直径5mmの容器には0.15MBqを入れ容器間距離を2cm、コリメータ表面からの深さを10mmとし、時間を5秒で撮像したところこのradioactivityを識別できた。24時間後では容器間距離45mmで深さ30mmのシュミレーション部を60秒の撮像時間で識別可能であった。インフォームドコンセントが得られた頭頚部癌患者を対象にリンパ節シンチグラフィで臨床試用(本学倫理委員会で承認)した。原発部位の周囲健常部の粘膜下に74MBqのTC-99mフィチン酸を4カ所に分けて注入した。局所注入後2、4時間では撮像時間5秒程度で明瞭にhot nodeを描出可能であった。24時間後においてもhot nodeを描出は可能であり、センチネルリンパ節バイオプシーへの臨床応用に十分な性能を持っていると考えられる。RIガイド手術における有用性を検証するため国内の共同研究施設(浜松医科大学、東京医科歯科大学、慶応義塾大学)との研究会議を開催して共同研究の詳細な内容について討議を行い、研究のプロトコールを構築するとともに海外の協力施設(Canniesburn Hospital(イギリス、グラスゴー)、The Netherlands Cancer Institute(オランダ、アムステルダム))との研究会議を開催して共同研究体制を確立した。本研究のため導入した臨床普及型RIガイド手術用半導体ガンマカメラの基本性能は解像力およびエネルギー分解能に優れており、Tc-99m 30MBqを入れたS字のファントームでは2秒の撮像時間で通常のシンチカメラよりも明瞭に描出が可能であった。本小型半導体ガンマカメラの有用性について動物を用いて検討した。健常な日本白色系家兎6羽を対象として、その頚部、前肢、後肢にTc-99m phytate注射液を18.5MBqづつ投与してリンパシンチグラフィを小型半導体ガンマカメラおよび高分解能角形ガンマカメラを用いて行ったところ、リンパシンチグラフィにより家兎の頚部領域、前肢領域、後肢領域の集積リンパ節が明瞭に認められた。その撮像時間は高分解能角形ガンマカメラで600秒程度のところ、小型半導体ガンマカメラでは15秒と短時間で画像を得ることができた。集積リンパ節の数は頚部領域のリンパ節がもっとも多く描出された。2時間後のstatic imageが最も明瞭に集積リンパを描出できた。dynamicリンパシンチグラフィでは頚部領域において最も多くリンパ流が確認できた。また、RI集積部位を摘出、フルオロ・イメージアナライザーにてオートラジオグラフィを施行し、そのイメージで集積を確認したのちオートウェルガンマシステムにて摘出物中のRI集積量を定量的に計測したところ注入のTc-99m phytateに対して一リンパ節あたりの平均集積%は0.15%であり臨床における集積%と類似した割合であり、家兎を用いた実験モデルは有用であることも検証された。以上よりリンパ節の描出、検出に利用可能で、センチネルリンパ節シンチグラフィ等の臨床応用に十分な性能を持っていると考えられた。現在、臨床における有用性の研究のため共同研究施設(浜松医科大学、東京医科歯科大学、慶応義塾大学、Canniesburn Hospital(イギリス)、The Netherlands Cancer Institute(オランダ)、John Wayne Cancer Center(アメリカ)との研究会議を開催して共同研究の詳細な内容について討議を行った。
暑熱環境における高齢者の熱中症予防に関する基礎的研究

【目的】本研究は、平成10年から平成14年の過去5年間にA市近郊のB地域における熱中症発生時の救急車救急搬送データを解析して、熱中症発症に関する対象者及び環境条件などについて検討を行った。【方法】B地域における平成10年から平成14年の各年の6月から9月までの熱中症の発生件数、発生日時、年齢、性別、発生場所などについて調査を行った。救急搬送データに関しては個人のプライバシーに配慮した。熱中症発生時の環境条件は、気象庁のホームページの地上気象観測日原簿より気温、湿度、風速の情報を収集した。【結果】B地域における過去5年間の熱中症総発生件数は60件であり、平成10年11件、平成11年6件、平成12年6件、平成13年13件、平成14年22件であった。性別による熱中症発生件数は5年間で男性44人、女性16人であった。年齢階級別にみた発生件数では、10代14人、20代6人、30代11人、40代5人、50代6人、70代7人、80代5人、90代1人であり、10代の発生件数が最も多く、次いで30代が多かった。発生場所ごとにみた発生件数は、屋外22件、屋内25件、不明(学校関連施設など)11件であった。気温別の熱中症発生件数は、気温29°C代並びに30°C代では1件ずつの発生しかみられないものの、31°C代以降、気温上昇に伴って発生件数も増加傾向を示しており、特に35°C代に最も多く、13件の熱中症が発生している。さらに、屋外での熱中症発生が最も多かったのは気温34°C代で5件の発生があり、屋内での発生が最も多かったのは35°C代で8件の発生であった。熱中症発生時の気温と年齢との関連では、一定の熱中症発生傾向はみられず、さらに性別に関しても気温との関連は示されなかった。【目的】心拍変動は従来、呼吸や循環器等の自律神経機能の評価として用いられてきたが、本研究では高齢者と若年者を対象にして、心拍変動が温熱的負担の評価になりえるかについて検討を行った。【方法】実験は25°C、50%RHの常温室、35°C、50%RHの暑熱曝露室の2室で行った。被験者は男子とし高齢者12名、若年者12名である。実験開始後30分間は常温室に、その後暑熱曝露室に60分間滞在した後、常温室に戻った。心拍数はホルター心拍計を用い、心拍変動のスペクトル分析によりLF(低周波成分;0.039-0.148Hz)、HF(高周波成分;0.148-0.398Hz)を求めた。その他に直腸温、皮膚温、体重減少量、主観申告を測定した。【結果】HFは4050分の値以外はLFと同様に若年者の方が有意に高い値を示した。常温室では若年者のHFの値が高齢者と比較して高い傾向を示したが、暑熱曝露室ではHFが減少し、LF/HFが高くなり交感神経が優位となった。高齢者のHFは大きな変化がなく、LF/HFは暑熱曝露中に若年者よりも遅れて上昇することが示された。直腸温は暑熱曝露終了時、若年者は0.07°Cの上昇、高齢者は0.20°Cの上昇を示し有意な差が認められた。体重減少量は、高齢者は140gに対し若年者は180gとなり有意な差を示した。暑熱曝露時の快適感は、若年者が高齢者に比べて不快とする申告をした。全身及び局所温冷感も若年者がより暑いとする申告をした。【結論】環境が35°C、50%RHの暑熱曝露では、高齢者の体温は上昇するが、自律神経バランスの適応が遅れ、発汗量が少ないためにうつ熱状態になりやすい。さらに高齢者は温度感受性も低下し、暑さへの適応行動は若年者よりも遅れる。今後、さらに例数を増やし、心拍変動と暑熱曝露時の体温との関係を明らかにして心拍変動が熱中症予防の指標になりえるかについて検討を行う必要がある。

年齢階級別にみた発生件数では、10代14人、20代6人、30代11人、40代5人、50代6人、70代7人、80代5人、90代1人であり、10代の発生件数が最も多く、次いで30代が多かった。発生場所ごとにみた発生件数は、屋外22件、屋内25件、不明(学校関連施設など)11件であった。気温別の熱中症発生件数は、気温29°C代並びに30°C代では1件ずつの発生しかみられないものの、31°C代以降、気温上昇に伴って発生件数も増加傾向を示しており、特に35°C代に最も多く、13件の熱中症が発生している。さらに、屋外での熱中症発生が最も多かったのは気温34°C代で5件の発生があり、屋内での発生が最も多かったのは35°C代で8件の発生であった。熱中症発生時の気温と年齢との関連では、一定の熱中症発生傾向はみられず、さらに性別に関しても気温との関連は示されなかった。
受動性に基づく歩行ロボットの視覚フィードバック制御に関する研究

ロボットの技術はすでに高いレベルに達ししており,その高い技術力を集約することで実現される医療用の手術支援ロボットや2足歩行ロボットなど,産業界以外での活躍が目立ち始めてきている.このように高い技術力がある反面,現状ではその裏づけをする理論的な研究や体系付けられた学問としての成熟度は不十分であり,技術力をより高めていくためには,理論的な裏づけをされたロボットの機構や制御系設計の提案が期待されている.本研究の目的は,周囲の状況が変化する場合を想定した歩行ロボットを視覚フィードバックシステムとみなし,制御則を提案することにあった.前年度は,まず歩行ロボットを視覚フィードバックシステムとして捉え,数学的にモデリングすることを検討した.得られた数学モデルに基づき,制御系設計のための問題設定をおこなった.そして,計算用のソフトウェアであるMatlabとSimulinkと三次元仮想空間を構築するためのプログラミング言語であるVRMLによる三次元シミュレータと歩行ロボットのプロトタイプを製作の準備をおこなった.本年度は,16自由度を有する2足歩行ロボットのプロトタイプを製作し制御則を実装した.具体的には,段差の有無の判断に視覚情報を用いることで,2足歩行ロボットに周囲の状況を自律的に判断させて段差を昇降させた.提案する方法により,段差の位置が変化しても歩行距離を自律的に変化させ,適切に昇降することが確認されている.そして,結果を系統的に検証するために,その平均的傾向とあわせて,最悪の状態でどのような振る舞いをするかについても十分に注意して検討を進めた.ロボットは技術的にはすでに高いレベルに達し,その高い技術を集約することで実現される医療用の手術支援ロボットやz足歩行ロボットなど,産業界以外での活躍が目立ち始めてきている.このように高い技術力がある反面,現状ではその裏づけをする理論的な研究や体系付けられた学問としての成熟度は不十分であり,技術力をより高めていくためには,理論的な裏づけをされたロボットの機構や制御系設計の提案が期待されている.本研究の目的は,周囲の状況が変化する場合を想定した歩行ロボットを視覚フィードバックシステムとみなし,制御則を提案することにあった.本年度は,2足歩行ロボットに視覚フィードバック制御則を適用するために,従来提案していた位置ベース法による受動性に基づく制御則を,画像ベース法による受動性に基づく制御則へと展開した.具体的には,3次元空間中で定義していた偏差およびエネルギー関数を画像面上で定義し,理論的に安定性が補償される制御則を構成した.この画像ベース法での制御則は,位置ベース法での制御則と本質的な枠組みを変えていないため,状況によって簡単に切り替えることやそれぞれの方法の欠点を補うために2つの方法を融合することも可能となる.提案する方法を計算用のソフトウェアであるMatlabとSimulinkと三次元仮想空間を構築するためのプログラミング言語であるVRML(Virtual Reality Modeling Language)を用いたシミュレータで数値シミュレーションすることで,その有効性を検証した.また,実験の準備として12自由度を有する2足歩行ロボットの下半身部のプロトタイプを製作した.ロボットの技術はすでに高いレベルに達ししており,その高い技術力を集約することで実現される医療用の手術支援ロボットや2足歩行ロボットなど,産業界以外での活躍が目立ち始めてきている.このように高い技術力がある反面,現状ではその裏づけをする理論的な研究や体系付けられた学問としての成熟度は不十分であり,技術力をより高めていくためには,理論的な裏づけをされたロボットの機構や制御系設計の提案が期待されている.本研究の目的は,周囲の状況が変化する場合を想定した歩行ロボットを視覚フィードバックシステムとみなし,制御則を提案することにあった.前年度は,まず歩行ロボットを視覚フィードバックシステムとして捉え,数学的にモデリングすることを検討した.得られた数学モデルに基づき,制御系設計のための問題設定をおこなった.そして,計算用のソフトウェアであるMatlabとSimulinkと三次元仮想空間を構築するためのプログラミング言語であるVRMLによる三次元シミュレータと歩行ロボットのプロトタイプを製作の準備をおこなった.本年度は,16自由度を有する2足歩行ロボットのプロトタイプを製作し制御則を実装した.具体的には,段差の有無の判断に視覚情報を用いることで,2足歩行ロボットに周囲の状況を自律的に判断させて段差を昇降させた.提案する方法により,段差の位置が変化しても歩行距離を自律的に変化させ,適切に昇降することが確認されている.そして,結果を系統的に検証するために,その平均的傾向とあわせて,最悪の状態でどのような振る舞いをするかについても十分に注意して検討を進めた.
メダカ精原幹細胞の同定、単離、及び培養系の確立

精原幹細胞のマーカーとしてRetが有力だったため,まず、A型精原細胞でRetを発現する細胞を同定した。この細胞が精原幹細胞であることを検証するため,精原幹細胞をBrdUで標識した。メダカ成体にBrdUを暴露し、一ヶ月後に精巣内におけるBrdU標識細胞を検出したところ、精巣壁近くに少数の精原幹細胞と思われる標識を確認できた。Ret発現A型精原細胞が精原幹細胞であることのより確実な検証法として、細胞移植実験の実施を計画した。移植実験の条件検討を行なうため、以下の実験を実施した。1)セルソーターで精原幹細胞を含むと考えられるSP細胞分画を分取、2)この分画に含まれる細胞を蛍光色素PKH26で標識、標識細胞を他個体の精巣に移植。以上の実験の結果、標識細胞はホスト精巣内で精子形成を起こすことが判明した。本実験系を用いて、Ret発現A型精原細胞の移植実験を実施した。抗Ret抗体を用いてA型精原細胞のソーティングを試みたが,十分な量の細胞が得られなかったため、Retプロモーターで駆動する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニックメダカを作製を試みた。フォスミドベクターの作成に成功、このベクターを1細胞期のHdrRにインジェクションすることによって、トランスジェニックメダカを作製を試みた。しかしHdrRの生育が悪く、十分量のメダカを準備することが困難であった。精原幹細胞の培養系の確立については、メダカセルトリ細胞由来フィーダー細胞(Mtp1)のクローン化に成功し、様々な性質を持つ新たなフィーダー細胞株の作出に成功した。また,新たに培養系に添加するサイトカインとしてGDNFa,GDNFb,IL-11bをクローニングし、発現バキュロウイルスを作製した。機能的なリコンビナントタンパク質の精製が困難を極め、十分量のタンパク質を得ることができなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。精原幹細胞の同定のため、Ret発現A型精原細胞が精原細胞であるかをBrdUパルスチェイス法で検証した。結果、成体のメダカをBrdUでラベルしたものとRet発現A型精原細胞が同一の細胞であることが分かり、Retを発現している細胞が精原幹細胞である可能性が高いことが分かった。より確実な検証として細胞移植実験を行なうため、蛍光色素でラベルしたSP細胞分画を他個体の精巣に直接移植し精子形成が進行することがわかり、移植技術の確立がなされた。また、精原幹細胞の単離として既に作製済みの抗Ret抗体を用いてRet発現A型精原細胞をソーティングできるか検証したところ、得られる細胞数が少なく、十分な結果が得られなかった。Retタンパク質は壊れやすく不安定な膜タンパク質であり、ソーティング可能な抗体を作るのは困難だと考えられる。よってRetプロモーターで駆動する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するBACトランスジェニックメダカを作製するべく、遺伝子組み換え用のベクターを作製した。さらに、精原幹細胞の培養系の確立に際し、これまでクローニングできていなかったメダカセルトリ細胞由来フィーダー細胞(Mtp1)をクローニングした。クローニングした各フィーダー細胞の性質を調べたところ、それぞれサイトカインの発現が大きく異なり、これらのフィーダー細胞を組み合わせることでよりよい培養環境を作り出すことが可能となった。加えて新たに添加するサイトカインとしてRetのリガンドであるGDNFaとGDNFb、またLIFと同じくp53-KOメダカで発現の高かったIL-6ファミリーに属するIL-11bをクローニングした。今後バキュロウイルスを作製して、培養系に加えることで精原幹細胞の培養系の確立を進めて行く。精原幹細胞の培養を目指すために細胞増殖、分化因子の研究を進めている。p53ノックアウトメダカ精巣では精原細胞の割合が大きくなっている。また各種細胞増殖因子の発現が異なっている。これをもとに精原細胞の増殖分化に作用する因子の同定を試みている。これまでの研究からp53ノックアウトメダカ精巣では精原細胞の割合とLIFの遺伝子発現が亢進していることがわかっており、LIFリコンビナントタンパク質を精原細胞培養系に添加したところ、精原細胞数が有意に増加した。一方で精原細胞には幹細胞的な性質を持つA型精原細胞と分化型のB型精原細胞とがある。これまで培養下ではA型精原細胞とB型精原細胞は明確な分子マーカーがメダカではなかったため判別が困難であった。今回piwiがメダカのA型精原細胞で特に発現することがわかった。そこで、LIFがどの型の精原細胞に作用しているのかをpiwiやsycp3の抗体を用いて詳細な細胞集団のトレース実験を行ったところ、LIFはB型精原細胞の増殖に寄与していることがわかった。また、他の細胞増殖、分化因子の候補としてIL-11に着目している。p53ノックアウトメダカ精巣ではIL-11bの発現亢進がみられ、この遺伝子のクローニングを終え、リコンビナントタンパク質を作製している。GDNFa,bについてはリコンビナントタンパク質を作製するバキュロウイルスが完成した。精原幹細胞の培養評価に使用する幹細胞の移植技術の確立は昨年度までに構築したが、細胞を培養したのちに、生体のメダカ精巣に移植する実験は十分に行くことができなかった。

精原幹細胞のマーカーとしてRetが有力だったため,まず、A型精原細胞でRetを発現する細胞を同定した。この細胞が精原幹細胞であることを検証するため,精原幹細胞をBrdUで標識した。メダカ成体にBrdUを暴露し、一ヶ月後に精巣内におけるBrdU標識細胞を検出したところ、精巣壁近くに少数の精原幹細胞と思われる標識を確認できた。Ret発現A型精原細胞が精原幹細胞であることのより確実な検証法として、細胞移植実験の実施を計画した。移植実験の条件検討を行なうため、以下の実験を実施した。1)セルソーターで精原幹細胞を含むと考えられるSP細胞分画を分取、2)この分画に含まれる細胞を蛍光色素PKH26で標識、標識細胞を他個体の精巣に移植。以上の実験の結果、標識細胞はホスト精巣内で精子形成を起こすことが判明した。本実験系を用いて、Ret発現A型精原細胞の移植実験を実施した。抗Ret抗体を用いてA型精原細胞のソーティングを試みたが,十分な量の細胞が得られなかったため、Retプロモーターで駆動する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニックメダカを作製を試みた。フォスミドベクターの作成に成功、このベクターを1細胞期のHdrRにインジェクションすることによって、トランスジェニックメダカを作製を試みた。しかしHdrRの生育が悪く、十分量のメダカを準備することが困難であった。精原幹細胞の培養系の確立については、メダカセルトリ細胞由来フィーダー細胞(Mtp1)のクローン化に成功し、様々な性質を持つ新たなフィーダー細胞株の作出に成功した。また,新たに培養系に添加するサイトカインとしてGDNFa,GDNFb,IL-11bをクローニングし、発現バキュロウイルスを作製した。機能的なリコンビナントタンパク質の精製が困難を極め、十分量のタンパク質を得ることができなかった。培養下においてA型精原細胞とB型精原細胞を明瞭に区別方法がこれまでなく、具体的にLIFがどこに作用しているのかを突き詰めることが困難だった。このため候補タンパク質の詳細な機能における研究が遅れた。また、他の候補タンパク質の効果の検証については機能的なリコンビナントタンパク質を精製することが難しく難航している。培養と移植については移植に使う近交系メダカであるHd-rRの生育が悪いことと上記のリコンビナントタンパク質の十分な確保が間に合わなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。in vitroでのリコンビナントタンパク質の効果の検証に必要だった分子マーカーがそろったので、具体的にこれまで作出したリコンビナントタンパク質の効果を順次検証していく。in vitroでのデータがそろい次第移植における幹細胞への効果の検証を行い、精原幹細胞の培養確立を目指す。精原幹細胞の同定として、移植による証明はまだ成されておらず、研究は遅れている。一方で当初できるとは思われていなかったフィーダー細胞のクローニングが完了した。また、他のサイトカインのクローニングにも成功している。よって総合的におおむね研究は進展していると言える。精原幹細胞の同定の為にトランスジェニックメダカを作る必要があり、これを最重要として進めて行く。トフンスジェニックメダカができれば、単離については容易である。