hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非等方・非平衡リアルプラズマにおける体積再結合過程の解明

プラズマを構成する電子は一つ一つは様々な運動エネルギーを持ってプラズマ中を飛び交っています。電子の全体としてのエネルギー分布が熱平衡の場合とそうでない場合とで、電子が衝突して生じるプラズマの発光や電離・再結合の過程がどのように変化するのかをエネルギー分布を計測する実験を通じて明らかにし、プラズマの発光からエネルギー分布を予測するモデルの構築を試みます。得られる成果は、より合理的で確実な核融合炉の設計のために活用されることが期待されます。
頭頸部悪性腫瘍の増殖・浸潤抑制による効果的治療法の開発

(1)17例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてNCAMの発現を免疫組織化学的に検索したところ,12例(70.6%)の癌細胞に陽性所見を認めた.NCAMは腫瘍細胞膜に陽性反応を示し,篩状構造および管腔様構造において散在性,あるいは集簇性に陽性細胞が認められ,特に神経周囲性浸潤した腫瘍細胞に陽性所見を認めた,その発現頻度と臨床病理学的因子との相関関係は特に認められなかったが,腺様嚢胞癌におけるNCAMの発現は高頻度であり,腫瘍の進展に大きく関与していることが示唆された.(2)唾液腺腫瘍細胞株HSGから自発的なNF-κBおよびCYLD発現を認めた.HSG細胞にTNF-αを作用させた際,NF-κB・CYLD発現の増強を認めた,cimetidine (CIM)の作用によりNF-κBの活性抑制を認めたが、CYLDに変化はなかった,またNCAMの発現量も減少した.ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてNF-κBの活性動態は,TNF-α刺激後4時間で最大となり,CIMの作用で減少した.(3)ヒト正常神経細胞とHSG細胞を共培養したところ,共焦点レーザー顕微鏡にて高率に接着していることを確認した.さらにHSG細胞に10^<-4>MのCIMを作用させた上で神経細胞と共培養したところ,HSG細胞の神経細胞への接着阻害効果を認めた.(4)10^<-4>MのCIMは,ヌードマウスに播種・形成したHSG腫瘍塊を縮小させた.(5)17例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてCYLDおよびNF-κB関連因子の発現を免疫組織化学的に検索したところ,CYLDは10例(58.8%)に,NF-κBは12例(70.6%)に,IκBaは13例(76.5%)に,IKKaは14例(82.4%)に,IKKβは4例(23.5%)においてそれぞれ発現を認めた.CYLDの発現が検出されなかった症例においては、CYLD遺伝子に何らかの変異が起こった可能性が示唆された.現在まで10例の腺様嚢胞癌症例についてCYLDの全20exonの遺伝子変異の検索を終えているが,変異は認められなかった.以上の結果から,NCAMを発現している腫瘍においてCIMの作用によりNF-κBの活性抑制,NCAMの発現低下が起こり,腫瘍死を誘導することが示唆された.(1)17例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてNCAMの発現を免疫組織化学的に検索したところ,12例(70.6%)の癌細胞に陽性所見を認めた.NCAMは腫瘍細胞膜に陽性反応を示し,篩状構造および管腔様構造において散在性,あるいは集簇性に陽性細胞が認められ,特に神経周囲性浸潤した腫瘍細胞に陽性所見を認めた,その発現頻度と臨床病理学的因子との相関関係は特に認められなかったが,腺様嚢胞癌におけるNCAMの発現は高頻度であり,腫瘍の進展に大きく関与していることが示唆された.(2)唾液腺腫瘍細胞株HSGから自発的なNF-κBおよびCYLD発現を認めた.HSG細胞にTNF-αを作用させた際,NF-κB・CYLD発現の増強を認めた,cimetidine (CIM)の作用によりNF-κBの活性抑制を認めたが、CYLDに変化はなかった,またNCAMの発現量も減少した.ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてNF-κBの活性動態は,TNF-α刺激後4時間で最大となり,CIMの作用で減少した.(3)ヒト正常神経細胞とHSG細胞を共培養したところ,共焦点レーザー顕微鏡にて高率に接着していることを確認した.さらにHSG細胞に10^<-4>MのCIMを作用させた上で神経細胞と共培養したところ,HSG細胞の神経細胞への接着阻害効果を認めた.(4)10^<-4>MのCIMは,ヌードマウスに播種・形成したHSG腫瘍塊を縮小させた.(5)17例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてCYLDおよびNF-κB関連因子の発現を免疫組織化学的に検索したところ,CYLDは10例(58.8%)に,NF-κBは12例(70.6%)に,IκBaは13例(76.5%)に,IKKaは14例(82.4%)に,IKKβは4例(23.5%)においてそれぞれ発現を認めた.CYLDの発現が検出されなかった症例においては、CYLD遺伝子に何らかの変異が起こった可能性が示唆された.現在まで10例の腺様嚢胞癌症例についてCYLDの全20exonの遺伝子変異の検索を終えているが,変異は認められなかった.以上の結果から,NCAMを発現している腫瘍においてCIMの作用によりNF-κBの活性抑制,NCAMの発現低下が起こり,腫瘍死を誘導することが示唆された.(1)頭頸部領域に発生した13例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてNCAMの発現を免疫組織化学的に検索したところ,9例(692%)の癌細胞にNCAMに対する陽性所見を認めた.NCAMは腫瘍細胞の細胞膜に陽性反応を示し,腺様嚢胞癌組織中の篩状構造および管腔様構造において散在性,あるいは集簇性に陽性細胞が認められ,特に神経周囲性浸潤した腫瘍細胞に陽性所見を認めた.

その発現頻度と臨床病理学的因子との相関関係は特に認められなかったが,腺様嚢胞癌におけるNCAMの発現は高頻度であり,腫瘍の進展に大きく関与していることが示唆された.(2)HSG細胞から自発的なNCAM遺伝子および蛋白発現を認めた.HSG細胞に抗NCAM抗体あるいはrhNCAMを作用させた際,抗体やrhNCAMの濃度増加に伴い遺伝子および蛋白レベルでNCAM発現の減少を認めた.またヒト頭頸部扁平上皮癌由来株化細胞HSC-2,-3およびCa9-22からのNCAM発現は検出されなかった.さらにMTT解析において,抗NCAM抗体やrhNCAMの濃度増加に伴いHSG生細胞数の減少を認めた.ところがヒト頭頸部扁平上皮癌由来株化細胞の生細胞数減少は認められなかった.(3)ヒト正常神経細胞とHSG細胞を共培養したところ,共焦点レーザー顕微鏡にて高率に接着していることが確認できた.さらにHSG細胞に抗NCAM抗体あるいはrhNCAMを直接作用させた上でヒト正常神経細胞と共培養したところ,HSG細胞がアポトーシスに陥ってしまった.(4)ヌードマウスにHSG細胞を播種・腫瘍形成した後,抗NCAM抗体を作用させたところ,腫瘍組織の縮小を認めた.(5)13例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてCYLDおよびNF-kBの発現を免疫組織化学的に検索したところ,9例(69.2%)においてNF-kBの過剰発現を認めた.しかしCYLDの発現は,腫瘍組織中にほとんど検出されなかった.このことはCYLD遺伝子に何らかの変異が起こった結果を示唆している.今後CYLD遺伝子変異の検索を中心に行っていく予定である.またTNF-a刺激したHSY細胞においてCYLD蛋白の発現をWestern blot法にて確認した.この細胞を用いて今後,NF-kBの発現動態を検索する.(1)頭頸部領域に発生した13例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてNCAMの発現を免疫組織化学的に検索したところ,9例(69.2%)の癌細胞にNCAMに対する陽性所見を認めた.NCAMは腫瘍細胞の細胞膜に陽性反応を示し,腺様嚢胞癌組織中の篩状構造および管腔様構造において散在性,あるいは集蔟性に陽性細胞が認められ,特に神経周囲性浸潤した腫瘍細胞に陽性所見を認めた.その発現頻度と臨床病理学的因子との相関関係は特に認められなかったが,腺様嚢胞癌におけるNCAMの発現は高頻度であり,腫瘍の進展に大きく関与していることが示唆された.(2)唾液腺腫瘍細胞株HSGから自発的なNF-kBおよびCYLD遺伝子・蛋白発現を認めた.HSG細胞にTNF-aを作用させた際,遺伝子・蛋白レベルでNF-kBとCYLD発現の増強を認めた.さらにcimetidineを作用させた際,NF-kBタンパクの活性抑制を認めたが、CYLD発現に変化はなかった.今後,NF-kBの発現動態についてさらに検索を進める予定である.MTT解析において,10^<-4>MのcimetidineにてHSG生細胞数の減少を認めた.(3)ヒト正常神経細胞とHSG細胞を共培養したところ,共焦点レーザー顕微鏡にて高率に接着していることが確認できた.さらにHSG細胞に10^<-4>Mのcimetidineを直接作用させた上でヒト正常神経細胞を共培養したところ,HSG細胞がアポトーシスに陥ってしまった.(4)ヌードマウスにHSG細胞を播種・腫瘍形成した後,10^<-4>Mのcimetidineを作用させたところ,腫瘍組織の縮小を認めた.(5)13例の腺様嚢胞癌患者の生検材料においてCYLDおよびNF-kBの発現を免疫組織化学的に検索したところ,9例(69.2%)においてCYLDの、また8例(61.5%)においてNF-kBの過剰発現を認めた.
ASDの安静時脳機能結合評価と介入法の検討：より良い治療効果を得るために

近年、科学技術の向上により、認知・行動・感情に加えて、脳活動もセルフ・モニタリングすることが可能になってきた。自身の脳活動をリアルタイムにモニタリングしながらコントロールするニューロフィードバック(Neurofeedback: NF)は、望ましい脳機能活動をフィードバックすることで、覚醒やリラクセーションといった心身相関を脳が自然と学習する手法である。NFは、症状・感情のモニタリングや自己報告が難しい神経発達症の大人や子どもにも適応可能である。しかし、NFは欧米を中心として臨床上の有効性が経験的に示されているものの、研究としてのエビデンスは少ない。うつ病や不安障害といった精神疾患や自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder: ASD)に代表されるような神経発達症においては、何もしていない状態での脳機能結合(Default Mode Network: DMN)の活動が、健常者のものとは異なることが指摘されてきた。本研究の目的は、安静時におけるDMN領域の脳機能結合の差異を明らかにし、新たなNF手法の開発を行うことである。今年度は、EEGおよびfMRIの測定および解析技術の習得に専念した。EEGおよびfMRIの解析により、MADにおけるNFのターゲットとなり得る脳領域が特定された。これらの領域は、DMNを構成する領域であり、先行研究の知見とも一致する。サンプル数の問題があり、今年度はMADの解析を中心に行ったが、ASDのリクルートも同時に進めている。当初、EEGを用いたNF手法を開発する計画であったが、今年度の研究により特定された脳領域が深部であったため、より空間解像度に優れたfMRIを用いたNF手法を開発する予定である。モダリティの変更はあるものの、従来の計画通り、fMRIと同時にEEGを測定することにより、fMRIによるNFで得られた知見をEEGによるNF手法の開発へと還元させることが期待できる。将来的にはより簡便なEEGを用いたNF手法の開発へと発展させていく計画で研究を進めている。平成31年度は、特定された脳領域をターゲットとしたNF手法の開発を行うとともに、習得した解析技術を用いてASDのデータ解析も進めていく。当初の予定では、平成30年度に安静時EEG計測器およびNF用ソフトフェアを購入する予定であったが、平成30年度の研究結果に基づいて、まずはfMRIによるNF手法を開発することになった。EEG関連の測定は当面既存の設備を用い、平成31年度の研究の進展をみて最適な機器を購入する予定である。
頭頸部腫瘍切除に伴う下顎骨付着筋の切断が及ぼす下顎位偏位、歯列変形への影響

下顎腫瘍切除後の再建方法は,腫瘍の伸展範囲や患者の全身状態などにより異なってくる.下顎骨区域切除後は,腓骨,肩甲骨,腸骨稜等の血管柄付遊離骨移植と再建プレートを用いた再建方法が第一選択であり,形態・機能において良好な結果を示している.近年,デジタル技術の進化発展により,CTデータから3Dモデルを作製し,再建プレート,下顎骨切除ガイドや腓骨採取ガイド作製などが可能となり,より正確な形態回復や手術時間の短縮に大きく貢献している.下顎腫瘍切除後の再建術の発展により,良好な下顎骨の形態回復がされる様になってきている.この様に,外科的再建術の発展により,下顎骨の形態回復はされているものの,実際臨床の現場では,下顎位の偏位や歯列変形などにより,咀嚼・嚥下・発音・審美障害を生じている患者が多く存在する.下顎骨腫瘍切除に伴い下顎に付着する筋肉が切断されると,筋肉のバランスがくずれ,下顎位の偏位や下顎歯列の変形が生じる場合がある.これら症例は,術後創傷治癒過程においての顎間固定や顎間牽引などの咬合管理が必要である.しかし,腫瘍切除に伴う下顎付着筋切断が及ぼす下顎位偏位や歯列変形への影響についての報告はなく,おのおの歯科医は経験に基づいた咬合管理を行わざるを得ないというのが実情である.そこで本研究では,腫瘍切除に伴う下顎骨付着筋(咀嚼筋・舌骨上筋群)の切断が及ぼす下顎位偏位,歯列変形,咬合力変化への影響について調査し,これらを最小限にとどめる効果的な顎間固定や顎間牽引方法などの術後咬合管理の検討を行う.これまで,頭頸部腫瘍手術予定の患者を被験者とし,手術前・後の上下顎印象採得,咬合採得,それらの3Dデータ取り込み,を行っている.これまで、頭頸部腫瘍手術予定の患者を被験者とし、手術前、および手術後経過観察時の上下顎印象採得、咬合採得、それらの3Dデータ取り込み、を行っている。術後の経過観察時のデータの解析もすすめている。引き続き、頭頸部腫瘍手術予定の患者の手術前・後の上下顎印象採得、咬合採得、それらの3Dデータ取り込みを行い、さらにデータの解析もすすめる。下顎腫瘍切除後の再建方法は,腫瘍の伸展範囲や患者の全身状態などにより異なってくる.下顎骨区域切除後は,腓骨,肩甲骨,腸骨稜等の血管柄付遊離骨移植と再建プレートを用いた再建方法が第一選択であり,形態・機能において良好な結果を示している.近年,デジタル技術の進化発展により,CTデータから3Dモデルを作製し,再建プレート,下顎骨切除ガイドや腓骨採取ガイド作製などが可能となり,より正確な形態回復や手術時間の短縮に大きく貢献している.下顎腫瘍切除後の再建術の発展により,良好な下顎骨の形態回復がされる様になってきている.

この様に,外科的再建術の発展により,下顎骨の形態回復はされているものの,実際臨床の現場では,下顎位の偏位や歯列変形などにより,咀嚼・嚥下・発音・審美障害を生じている患者が多く存在する.下顎骨腫瘍切除に伴い下顎に付着する筋肉が切断されると,筋肉のバランスがくずれ,下顎位の偏位や下顎歯列の変形が生じる場合がある.これら症例は,術後創傷治癒過程においての顎間固定や顎間牽引などの咬合管理が必要である.しかし,腫瘍切除に伴う下顎付着筋切断が及ぼす下顎位偏位や歯列変形への影響についての報告はなく,おのおの歯科医は経験に基づいた咬合管理を行わざるを得ないというのが実情である.そこで本研究では,腫瘍切除に伴う下顎骨付着筋(咀嚼筋・舌骨上筋群)の切断が及ぼす下顎位偏位,歯列変形,咬合力変化への影響について調査し,これらを最小限にとどめる効果的な顎間固定や顎間牽引方法などの術後咬合管理の検討を行う.これまで,頭頸部腫瘍手術予定の患者を被験者とし,手術前・後の上下顎印象採得,咬合採得,それらの3Dデータ取り込み,を行っている.これまで、頭頸部腫瘍手術予定の患者を被験者とし、手術前、および手術後経過観察時の上下顎印象採得、咬合採得、それらの3Dデータ取り込み、を行っている。術後の経過観察時のデータの解析もすすめている。引き続き、頭頸部腫瘍手術予定の患者の手術前・後の上下顎印象採得、咬合採得、それらの3Dデータ取り込みを行い、さらにデータの解析もすすめる。頭頸部腫瘍手術予定の患者を被験者とし,手術前,および手術後経過観察時の上下顎印象採得,咬合採得,それらの3Dデータ取得中である.今年度は取得データが一定目標数以下であったため,解析を行わなかった.次年度は,被験者数を増やし,今年度被験者の手術後経過観察時のデータ取得予定であるため,これら解析を行う予定である.よって,当該年度購入予定のパーソナルコンピューター(データ解析に使用)を次年度購入としたため.頭頸部腫瘍手術予定の患者を被検者とし、手術前、手術後経過観察時の上下顎印象採得、咬合採得、それらのデータ取得中である。当該年度は、被検者数を増やし、データの解析、および、得られた結果についての発表等を行う予定である。
インテリジェントガイドによる工作機械サーボ特性の改善に関する研究

1.接触型インテリジェントガイド評価実験装置の設計・製作ガイドレール側面からブレーキシューで接触圧力を加えることによって,テーブルとガイドの間の摺動抵抗を動的に制御することが出来る直動案内機構を提案し,評価実験装置を設計・製作した.アクチュエータには油圧シリンダを用い,油圧制御にはデジタル制御された高速電磁弁を用いた.この油圧制御系を送り駆動系に組み込み,特に工作機械の高速化,高加速化において,サーボ系の安定性や軌跡精度に悪影響を及ぼす構造振動の減衰特性向上を図った.油圧制御系の帯域が最大60Hzと限界があるものの,それ以下の低周波数の構造振動に関しては適切な減衰を負荷し,応答性を向上できることを実験にて確認した.2.ボールねじ送り駆動系のための減衰制御理論の比較検証機械の構造振動やボールねじの縦振動など送り駆動系の振動要因に対し,テーブル速度とモータ速度の差速度をフィードバックことによって減衰特性を改善する手法の検証を行った.特に差速度をサーボモータの制御系にフィードバックする手法と,テーブルに直接制御力を与える手法の理論的な比較検証を行った.テーブルに直接制御力を与えるために,上記の接触型インテリジェントガイドを用いることができる.評価用のテストスタンドを用いて,様々な直接速度フィードバック,相対速度フィードバック手法を実装し,それらの比較検証を理論的・実験的に行った.1.接触型インテリジェントガイド評価実験装置の設計・製作ガイドレール側面からブレーキシューで接触圧力を加えることによって,テーブルとガイドの間の摺動抵抗を動的に制御することが出来る直動案内機構を提案し,評価実験装置を設計・製作した.アクチュエータには油圧シリンダを用い,油圧制御にはデジタル制御された高速電磁弁を用いた.この油圧制御系を送り駆動系に組み込み,特に工作機械の高速化,高加速化において,サーボ系の安定性や軌跡精度に悪影響を及ぼす構造振動の減衰特性向上を図った.油圧制御系の帯域が最大60Hzと限界があるものの,それ以下の低周波数の構造振動に関しては適切な減衰を負荷し,応答性を向上できることを実験にて確認した.2.ボールねじ送り駆動系のための減衰制御理論の比較検証機械の構造振動やボールねじの縦振動など送り駆動系の振動要因に対し,テーブル速度とモータ速度の差速度をフィードバックことによって減衰特性を改善する手法の検証を行った.特に差速度をサーボモータの制御系にフィードバックする手法と,テーブルに直接制御力を与える手法の理論的な比較検証を行った.テーブルに直接制御力を与えるために,上記の接触型インテリジェントガイドを用いることができる.評価用のテストスタンドを用いて,様々な直接速度フィードバック,相対速度フィードバック手法を実装し,それらの比較検証を理論的・実験的に行った.1.接触型インテリジェントガイドと評価実験装置の設計・製作ガイドレール側面よりブレーキシューで圧力を与えるシステムを設計・製作した.アクチュエータには油圧シリンダを用い,油圧制御にはデジタル制御された高速電磁弁を用いた.この油圧制御系を送り駆動系に組み込み,テーブル速度油圧力までの応答性を確認したところ,60Hzまでの周波数応答が確保できることを確認した.2.電磁力を用いた非接触型インテリジェントガイドによる減衰制御理論の調査と検証リニアモータを用いた非接触型のしゅう動抵抗制御装置をボールねじ送り系に実装した装置を用いて減衰制御理論の調査と検証を平行して行った。ボールねじ縦振動に起因する振動に関してはテーブル速度とモータ速度の差速度をフィードバックするシステムが有効に減衰を付加できることをシミュレーションと実験にて確認した.1.接触型インテリジェントガイド評価実験装置の設計・製作ガイドレール側面からブレーキシューで接触圧力を加えることによって,テ-ブルとガイドの間の摺動抵抗を動的に制御することが出来る直動案内機構を提案し,評価実験装置を設計・製作した.アクチュエータには油圧シリンダを用い,油圧制御にはデジタル制御された高速電磁弁を用いた.この油圧制御系を送り駆動系に組み込み,特に工作機械の高速化,高加速化において,サーボ系の安定性や軌跡精度に悪影響を及ぼす構造振動の減衰特性向上を図った.油圧制御系の帯域が最大60Hzと限界があるものの,それ以下の低周波数の構造振動に関しては適切な減衰を負荷し,応答性を向上できることを実験にて確認した.2.ボールねじ送り駆動系のための減衰制御理論の比較検証機械の構造振動やボールねじの縦振動など送り駆動系の振動要因に対し,テーブル速度とモータ速度の差速度をフィードバックことによって減衰特性を改善する手法の検証を行った.特に差速度をサーボモータの制御系にフィードバックする手法と,テーブルに直接制御力を与える手法の理論的な比較検証を行った.テーブルに直接制御力を与える手法として,上記の接触型インテリジェントガイドの他に,リニアモータを用いた非接触式の摺動抵抗制御装置も開発し,評価実験装置を用いてその効果を確認し,接触型インテリジェントガイドとの比較を行った.
近世仏教を見直す－天台宗を中心に－

日本の近世仏教思想史の研究を新たな段階に進めるためには、従来着手されてきた個別事象の解明だけでは不十分である。中央の目立った事件だけでなく、より広い基盤となる地方寺院の動向を探る必要がある。思想史の方面で扱われることの乏しかった地方寺院の知的状況について、今回の研究で滋賀県の天台寺院の蔵書調査を実施したことで、一定の理解を得ることができた。24年度は前年度に続き、天台宗史料の調査を重点的に行った。24年7月2122日、9月30日10月1日、10月2021日の3回にわたり、滋賀県米原市の地方寺院の近世文書/聖教の調査を実施し、在地寺院の宗教活動や宗派内の動向を探った。その際に、研究協力者の松本公一、大島薫、青柳周一、朴澤直秀、井上智勝、梅田千尋、東幸代、藤田和敏、松金直美、武部愛子、青谷美羽、川嶋美喜子、望月良親、林晃弘の諸氏の協力を得た。また24年10月15日に大島薫・井上ひろ美両氏と打ち合わせの機会を持ち、調査対象となる史料の保存や管理に関する意見を交換した。その他、24年12月25日に国立国会図書館、25年2月15日に国会図書館と国学院大学図書館において史料調査を実施した。そうした経緯を経て、近世中後期の地方寺院の実態や、同時期の宗教思想のあり方について、認識を深めることができた。新たな認識にもとづく成果報告として、24年9月9日の日本山岳修験学会大峰山学術大会において口頭発表を行った。また、同年9月14日には中国・蘭州大学の「日本語・日本文化研究会」において、日本近世仏教研究の現状と課題に関する報告を行い、日本人研究者3名に加え、中国人の日本研究者3名と議論を行った。さらに、日本語を学ぶ学生約80名との学術的交流や、蘭州大学敦煌学研究所の視察も実施した。来年度は現地調査を継続するとともに、二つの口頭発表を論文としてまとめる予定である。平成25年度も前年度に続き、天台宗史料の調査を重点的に行った。25年7月27-28日、8月30-9月1日、12月7-8日の3度にわたり、研究代表者と研究協力者のべ24人が参加して滋賀県米原市の地方寺院の近世文書/聖教史料の調査を実施し、在地寺院の宗教活動や宗派内の動向を探った。その際に、研究協力者の青柳周一、井上智勝、梅田千尋、朴澤直秀、望月良親、松金直美、青谷美羽、藤田和敏、林晃弘、松本公一、大島薫、川嶋美貴子、万波寿子の諸氏の協力を得た。また、25年5月1日に東京、26年3月8日に京都で、研究協力者たちと打ち合わせの機会を持った。関連する史料の調査のため、25年6月28日に米国コロンビア大学図書館、7月2日に同プリンストン大学図書館等で史料調査を行い、またハルオ=シラネ教授、ジャクリーン=ストーン教授などと学術的な意見交換を行い、加えて近い将来に本科研の研究成果報告を行うための情報交換などを行った。26年2月22日は名古屋においても、成果報告のための情報交換を行った。以上の研究活動の成果について、二三年後を目安に史料集や個別論文の形で公開する予定であり、現在準備を進めている。平成23年度は、近世仏教研究の基礎として、天台宗史料の調査を重点的に行った。23年7月30-31日と10月22-23日には、滋賀県米原市の地方寺院の近世文書を調査し、在地寺院の宗教活動や宗派内のネットワークを探った。その際に、研究協力者の松本公一、青柳周一、朴澤直秀、井上智勝、梅田千尋、東幸代、藤田和敏、松金直美、青谷美羽、川嶋美貴子の諸氏の助力を仰いだ。23年9月4-5日・11月13日・24年1月23日、3月5日には、史料所蔵機関(叡山文庫、大津歴史博物館、東京大学史料編纂所、身延文庫)において関連する天台宗史料の調査を行った。あわせて、マイクロフィルム撮影や電子複写により複製を作成した。成果報告として、23年8月には中国における国際会議(社会科学院日本研究所主催)で「日本近世仏教が注目した明代仏教」の題で発表を行い、日本における近世仏教が中国仏教の影響をうけていた側面について中国人研究者と意見交換を行った。また24年3月には米国アジア研究協会(AAS)の大会において、15-16世紀日本における神仏関係と政治権力に関するパネルに加わり、中世後期から近世にかけての天台寺院における神道と仏教のあり方について"Tendai Shinto in the Muromachi Period: The Changing Aspects of Sanno Gongen"の題で報告し、他の報告者(原田正俊、三枝暁子、Christopher.Mayo)や参加した研究者と討論を行った。史料調査は順調に進んでいるが、それを生かした従来説の検討に十分な時間が割けない状況であった。

来年度はその点を意識的に改善していきたい。史料の収集は進んでいるが、分析やデータ整理をさらに進める必要がある。地方の近世寺院の動向について、成菩提院の近世史料の調査・分析を進めるとともに、比叡山延暦寺や東叡山寛永寺という中央の大寺院の動向を調査し、中央と地方の寺院の動向を立体的に分析する作業を進めたい。地方の近世寺院の一例として、成菩提院の近世史料収集を進める。目録化は順調に進んでいるが、データを整理し、分析を行い、他の地域の事例と比較するといった作業を進めていきたい。引き続き史料調査のための旅費や謝金を支出するとともに、その成果を公開するための学会発表や史料翻刻のための経費も使用する。引き続き史料調査を中心とし、史料整理や成果公開も続けていくため、旅費や謝金を支出する予定である。
抗腫瘍活性を有する新規天然物の独創的・実用的合成法の開発

我々は初めてのepoxyquinol A, Bの不斉全合成を達成しているが、大量合成に不向きな反応が含まれていた。すなわちこれまでは不斉補助基を有するアクリル酸誘導体とフランのDiels-Alder反応を鍵反応としていたが、高価な不斉補助基を当量必要とする問題があった。そこで、新たに効率的な光学活性epoxyquinol A, Bの合成法の開発を行った。塩化アクリロイルが反応の高いジエノフィルであることに着目し、フランと塩化アクリロイルのDiels-Alder反応が収率よく進行することを見い出し、さらに数段階を経てシクロヘキサノール誘導体に導いた。シクロヘキサノール誘導体に対し、リパーゼを用いる速度論的な光学分割が効率的に進行する条件を見い出し、大量合成に適したepoxyquinol A, Bの合成法を確立した。一方、epoxyquinol A, Bの合成の鍵反応は以下の3連続反応である。すなわち、モノマーの1級アルコールの酸化、6π-electrocyclization、Diels-Alder反応による2量化反応である。これら一連の反応により、複雑な骨格を有するepoxyquinol A, Bが一挙に構築される。モノマーの水酸基が反応に非常に重要な役割を果たしていることが実験的に明かとなった。すなわち、2級水酸基がないとepoxyquinol A型の生成物しか与えないが、水酸基があるとepoxyquinol Bも生成する。また、メタノールなどの極性溶媒を用いるとepoxyquinol Bの生成が減少する。計算化学を利用して、本反応の反応機構を詳細に検討したところ、分子内の水酸基が分子間水素結合を形成することより、反応が活性化されると同時に、反応のパスが変わるためepoxyquinol Bが生成することが明らかになった。新規天然物を合成する為には新しい反応が必要になる。特に光学活性体の合成を行うには良好な収率、不斉収率で進行する触媒的な不斉反応の開発が望まれている。本年度、我々は入手容易なプロリンを用いる不斉触媒アルドール反応を試みた。既にList等はプロリンを用いるアルデヒド、ケトン間のアルドール反応を報告しているが、不斉収率において改善の余地が残されていた。我々は氷化高圧法を不斉アルドール反応に適用することにより、常圧、室温よりも高い収率、不斉収率で生成物が得られることを見いだした。また、プロリンから容易に合成することのできるジアミンが不斉Baylis-Hillman反応の良好な触媒になることを見いだした。Baylis-Hillmanはアミン触媒を用いるカルボニル化合物と電子不足オレフィンとの反応であり、多官能基化された化合物が得られ、合成的に重要な反応である。通常触媒としては塩基性部位と酸性部位を合わせ持つアミン化合物が用いられるが、我々は酸性成分を持たないジアミンが良好な触媒になることを明らかにした。我々は既に強い血管新生阻害活性を有するepoxyquinol A,Bの全合成を達成している。これらの化合物は2H-pyran誘導体の[4+2]型Diels-Alder反応によって生成すると考えられているが、合成の過程で、epoxyquinol A,Bの他にepoxyquinol Cおよびepoxytwinol Aという化合物が得られることを見いだした。epoxyquinol CはDiels-Alder反応によって生成するが、epoxytwinol Aは形式的には[4+4]付加環化反応が進行して生成した化合物と考えられる。これまでの[4+4]付加環化反応は光による反応、または遷移金属を用いる反応が知られているが、熱的に進行する[4+4]付加環化反応はWoodward-Hoffmann則によると禁制であり、その例はほとんど知られていない。今回、この熱的な[4+4]付加環化反応のメカニズムを計算化学的なアプローチを用いて検討した。その結果、本反応が3つの段階からなるビラジカルを経由する反応である事を明らかにした。すなわち、第一段階ではC8-C8'に結合が生成すると同時にビラジカル中間体が生成する。次にC8-C8'結合を軸として回転する。最後にC1-C1'結合が生成するというものである。中間体のラジカルは共役により、また水素結合により安定化されており、これが、通常は困難とされている[4+4]反応が進行した理由と考えられる。我々は既に強い血管新生阻害活性を有するepoxyquinol A, Bの全合成を達成している。これらの化合物は2H-pyran誘導体の[4+2]型Diels-Alder反応によって生成すると考えられているが、合成の過程で、epoxyquinol A, Bの他にepoxyquinol Cおよびepoxytwinol Aという化合物が得られた。既に、この[4+4]付加環化反応がビラジカルを経由することを計算化学的に明らかにした。本年度は、ビラジカルを実験的に証明するためにESR等を利用して反応の追跡を行った。種々条件を変えて測定を行ったが、残念なことにビラジカルの生成を裏づける結果は得られなかった。しかし、2量化反応の検討中に、epoxyquinol A, Bの生成比が、反応条件によって異なり、天然から単離される場合の生成比と大きく異なる事を見出した。水中、緩衝溶液中、さらに、脂質2重膜存在下で2量化反応を試みたが、いずれにおいても、その生成比は天然とは異なることが明らかになった。

この結果は、2量化反応に酵素が関与する可能性を示唆している。また、epoxyquinol A, Bの受容体蛋白質の単離、精製を行うために、epoxyquinol A, Bの分子プローブの作成を行った。すなわち、epoxyquinol Bのケトンを利用し、オキシムを介して、ビオチンと共有結合を形成させた。現在、epoxyquinol Bのビオチン誘導体を利用して、受容体蛋白質の単離を検討している。
温室効果気体の発生・吸収源の高精度分離評価を目指した同位体連続観測手法の開発

赤外分光法による高精度CO_2同位体連続観測装置の開発を行った。同位体測定に適した各同位体の吸収線波長を選定し、それらの波長の中赤外光を射出できる分布帰還型量子カスケードレーザを光源とする試作器を製作した。当装置を用いて、吸収線スペクトルを得ることができ、各同位体の吸収線を同定することができた。同位体測定のために適した装置の基本構成を製作することができたが、現場における高精度連続観測のためには、さらなる改良が必要であることが示唆された。本研究では、レーザ光源を用いた赤外吸収法による、観測現場で無人連続測定が可能な高精度CO_2同位体連続観測手法の開発を目標とする。今年度は、研究開始当初、初年度の短い実施期間で研究を効率的に推進するために、キャビティリングダウン法を採用している近赤外域のレーザ光源を搭載した市販のCO_2の同位体連続測定装置を購入し、それをべースとして改造することを計画していたが、詳細に検討した結果、高精度化のために必要な中赤外域のレーザ光源を搭載できるように、市販の装置を改造するのは困難であると判断されたため、新たに装置の設計および使用する部品の選定作業を行った。高精度化のためには、CO_2の各同位体についてどの吸収線を用いて測定を行うかが極めて重要であり、光源に使用する中赤外レーザの波長はそれに基づいて決定される。光源には、極めて狭い波長域を持ち安定した出力が得られる分布帰還型(DFB)量子カスケードレーザが、本研究目的に適しているが、メーカに製造を依頼する際、当レーザは波長の可変範囲が狭いので、波長仕様を詳細に決めておく必要がある。このため、HITRANデータベースを基に検討を進めるとともに、中赤外域(4.3μm域)のCO_2吸収線付近の波長域で波長可変であり、波長幅がDFBレーザより広いチューナブル量子カスケードレーザを用い、検出器として選定したMCT赤外検出器と組み合わせて実験を行って、上記データベースから選定された吸収線の中から最適な吸収線を選ぶ作業を開始した。また、本装置で使用する吸収セル部の設計を進め、高精度・高感度分析のために、セル内面についてCO_2吸収線波長域(4.3μm域)における光吸収ができるだけ小さい材質を選定して、吸収光路長を長く取れるように構造の検討を行った。本研究では、観測現場で無人連続測定が可能なレーザ光源を用いた赤外吸収法による高精度CO_2同位体連続観測手法の開発を目標とする。今年度は、装置の設計および使用する部品の選定作業を継続して行った。光源に使用する分布帰還型(DFB)量子カスケードレーザの波長仕様を決定するために、HITRANデータベースを基に検討を進めるとともに、中赤外域(4.3μm域)のCO_2吸収線付近の波長域で波長可変であり、波長幅がDFBレーザより広いチューナブル量子カスケードレーザを用い、MCT(HgCdTe)赤外検出器と組み合わせて実験を行った。その結果、(1)CO_2の^<12>C^<16>O_2、^<13>C^<16>O_2および^<12>C^<18>O^<16>Oの各吸収線の波長が近く、(2)相互に干渉が起こっておらず、(3)吸収線強度が十分に強く、(4)濃度で重み付けした赤外吸収量の大きさが比較的近い、といった条件を満たす、同位体比測定のために適した各同位体の吸収線波長を決定することができた。この結果に基づいて、同位体測定に適した波長の赤外光を射出できるDFBレーザをメーカに依頼して試作機を製作した。また、本装置で使用する測定セル部の設計を進め、高精度・高感度分析のために、セル内面についてCO_2吸収線波長域(4.3μm域)における光吸収ができるだけ小さい材質を選定し、吸収光路長を長く取れるように構造の検討を継続して行った。さらに、高精度の測定のために、セル内に導入される試料流量やセル内圧力をパソコンを介して厳密に制御できるモジュールを検討し、メーカに依頼して製作した。製作されたものについて、問題点を改善するために、モジュール毎に性能試験を開始した。今年度は、装置を製作し、その性能試験を行い、装置の改良を進めた。昨年度の試験結果に基づいて決定した、同位体比測定のために適した各同位体の吸収線波長の中赤外光を射出できるDFBレーザの製作をメーカに依頼した。レーザ光の波長を高精度に制御できるように、駆動電源及び発振部温度を高精度に制御できるモジュールを製作した。

光源光量の変動をモニタできる機構を装備し、光源-光学セル間の空間での光量の変動を抑えるために、空間部を真空にできる構造に改造した。さらにセル内に導入される試料流量やセル内圧力を厳密に制御できる機構を装備した。CO_2の吸収線強度が強いことを考慮して、近赤外レーザを利用した市販の同位体連続測定装置が採用しているキャビティリングダウン方式は採用せず、構造が単純な多重反射吸収方式を採用した光学セルとした。製作されたDFBレーザは、開発途上のものであり、レーザ光の波長を高速で切り替えようとすると、発振素子が故障してしまう問題が生じた。このため、低速で波長を変更して性能試験を行った。大気レベル濃度の通常のCO_2の標準ガスと^<13>CO_2の割合が高い標準ガスを光学セルに導入して、減衰光の強度を測定し、各同位体の吸収線スペクトルを得ることができた。また、HITRANデータベースと比較することにより、同位体の吸収線を同定することができた。得られた結果より、同位体測定のために適した構成の装置を製作できたことが確認できたが、現場における高精度連続観測のためには、波長を高速に変更しても問題を生じない構造に改良されたDFBレーザを入手し、高感度測定のためにさらに光学セル内圧力を最適化すること等が、必要であることが示唆された。
計量テキスト分析を用いた中国共産党の政治宣伝に対する研究

本研究の目的は新聞の政治宣伝に対して計量テキスト分析を行い、新聞が党を社会問題解決の主体として描いていることを発見することで、現代中国における党の変容を明らかにすることである。先行研究は中国共産党による柔軟な支配のメカニズムを強調してきた。一方で、現実では習近平政権が強硬な支配に転換するなど、中国をいかに捉えるかが問題となっている。本研究では計量テキスト分析の手法を用いる。以上から、権威主義体制であっても政権を持続させるために人々の支持を得る必要があることを実証し比較政治学に貢献する。さらに、中国を研究するための新しい手法として計量テキスト分析の有効性を示し政治学に貢献することを目指す。
細胞内情報伝達におけるチロシン蛋白質燐酸化酵素とセリン蛋白質燐酸化酵素の役割

細胞内情報伝達に於けるチロシン蛋白質燐酸化酵素とセリン蛋白質燐酸化酵素の役割に関して計画年度内では以下の点について明らかにした。脾臓に於ける細胞質チロシンキナ-ゼ(CPTKー40)の完全精製に成功し多くの興味ある性質を明らかにした。既ちポリアミン、ヘパリン、イオン強度、膜燐脂質などによってCPTKー40の活性は変動するが、用いる基質によってその効果は著しくことなる。これらの結果は様々な効果剤は酵素のみならず基質側にも作用していることを示している。生理的基質の検索では、細胞質画分とミクロゾ-ム画分および核画分の順に多くの蛋白質のチロシン残基が燐酸化される。特に多い細胞質画分を各臓器毎に調べたところ、脾臓についで脳、精巣に多く見いだされた。一方血小板刺激後に於けるチロシン残基の燐酸化反応について、トロンビンやコラ-ゲンで刺激したところ、135K、124Kと76Kが燐酸化された。この燐酸化反応とセロトニンの放出反応はほぼ一致しており両者に密接な関係があることを示している。またチロシンホスファタ-ゼの阻害剤であるバナジン酸で刺激しても蛋白質のチロシン残基に燐酸化が起こり同時に血小板が凝集することから、やはりチロシン燐酸化反応は血小板の活性化と密接に関係していることが明らかとなった。血小板の活性化においては47Kと20Kのセリン残基の燐酸化が重要であることが言われているので、今後セリン残基とチロシン残基の燐酸化の関係を明らかにしたい。Cキナ-ゼのNaイオンとpHによる蛋白質分解酵素を介した活性化機構において、分子量80Kの部分活性化酵素の同定に合功した。この酸素はCキナ-ゼのほんの一部が切断され活性化を示すものであり、生理的に起こりうる反応か否かを明らかにしたい。またCキナ-ゼの肝臓に於ける生理的基質を検索したところ、細胞質画分よりも顆粒画分に多いことを明らかにした。近年セリン残基を燐酸化するCキナ-ゼが、細胞内情報伝達に重要な役割を演じていることが明らかになった。一方インスリンや上皮成長因子の受容体に蛋白質のチロシン残基を燐酸化するチロシンキナ-ゼが存在することも明らかにされ、チロシンキナ-ゼと細胞内情報伝達の関係も注目を集めている。我々はこのようなCキナ-ゼとチロシンキナ-ゼの細胞内情報伝達における作用を明確にするために、特に本年度はチロシンキナ-ゼの解析に重点をおいておこなった。まず細胞質に存在するチロシンキナ-ゼについて最も多く存在する脾臓より完全精製に成功した。このチロシンキナ-ゼ(CPTK-40)は分子量が40,000であり自己燐酸化能をもっている。自己燐酸化反応は細胞内反応でありこの反応によって活性は促進する。またセリンキナ-ゼには見られぬATPのγ位の燐酸と交換反応を示す。ポリ塩基性アミノ酸によって活性は著しく変動し、用いる基質によって活性が左右される。このことはポリ塩基性アミノ酸が酵素のみならず基質にも働いている可能性を示すものであり、生体内においてこのような物質によってこの酵素の活性が制御されている可能性がある。

また細胞膜に存在する燐脂質によっても活性が変動し、膜の燐脂質がこのキナ-ゼの活性に重要な役割を演じていることが推測され興味深い現象である。pp60^<src>の抗体とは反応せずまったく新しいタイプのチロシンキナ-ゼと思われる。一方血小板をスロンビンやコラ-ゲンで刺激したところチロシン残基が特異的に燐酸化されることを明らかにした。135K、124K、76Kの蛋白質のチロシン残基が燐酸化される。これらの蛋白質の局在性、機能等については不明であるが、セロトニン放出反応との関係を含め今後解明していきたい。次年度はさらにこのチロシンキナ-ゼとCキナ-ゼの関係を明らかにするとともに、2つの酵素の細胞内情報伝達における役割を明らかにしたい。細胞内情報伝達に於けるチロシン蛋白質燐酸化酵素とセリン蛋白質燐酸化酵素の役割に関して今年度は以下の点について明らかにした。細胞質チロシンキナ-ゼ(CPTKー40)について生理的基質の検索を行なったところ、細胞質画分とミクロゾ-ム画分および核画分の順に多くの蛋白質のチロシン残基が燐酸化されることを明らかにした。しかしミトコンドリア画分にはあまり基質がないようである。特に多い細胞質画分を各臓器毎に調べたところ、脾臓についで脳、精巣に多く見いだされた。このうち約5、5万の蛋白質は抗体との反応性からチュブリンであることが判明した。CPTKー40のcDNAのクロ-ニングはほぼ成功したが、N末付近に一抹の不安が残るので公表を差し控えている。しかし明かとなったアミノ酸配列の一部を用いてペプチドを合成しCPTKー40の抗原として用い抗CPTKー40の抗体産生を試みたところ反応性の高い抗体が得られた。現在この抗体を用いて種々の実験を行なっており次年度はこれらの成果が公表できると期待している。一方血小板刺激後に於けるチロシン残基の燐酸化反応についてチロシンホスファタ-ゼの阻害剤であるバナジン酸を用いて検索したところ、多くの蛋白質のチロシン残基に燐酸化が起こることを明かとした。バナジン酸を加えると同時に血小板が凝集することから、やはりチロシン燐酸化反応は血小板の活性化と密接に関係していることが明かとなった。血小板の活性化においては47Kと20Kのセリン残基の燐酸化が重要であることが言われているので、今後セリン残基とチロシン残基の燐酸化の関係を明らかにせねばならないと考えている。Cキナ-ゼのNaイオンとpHによる蛋白質分解酵素を介した活性化機構において、分子量80Kの部分活性化酵素の同定に成功した。この酵素はCキナ-ゼのほんの一部が切断され活性化を示すものであり、生理的に起こりうる反応か否かを明らかにしていきたい。
肺高血圧に対する新しい遺伝子導入法の開発

本年度の目的はPPHモデルであるモノクロタリン(MCT)誘発性肺高血圧ラットに対しNaked DNA法用いてPGIS遺伝子・COX-1遺伝子を効率よく遺伝子導入し、その効果を検討する事である。(1)遺伝子導入法の確立:遺伝子導入3日前にbnpivacaine2.5μl/gを大腿四頭筋に筋注、PGIS遺伝子・COX-1遺伝子を同時導入、血清中・筋肉中の6-kelo-PGF1αを計測し、その効果を検討した。遺伝子量依存性に導入効果が増大する事を確認後、適正な比率を決定した。(2)遺伝子導入効果の検討:MCT皮下注1週間後より遺伝子導入した群は有意に血行動態・右室肥大・肺血管リモデリングを改善し、生存率も改善した。しかしながらMCT皮下注3週間後から遺伝子導入した群でその効果は不十分であった。Naked DNA法を用いたPGIS遺伝子・COX-1遺伝子導入は、肺高血圧の進行制御効果は認められたが完成された肺高血圧の改善効果は不十分であった。そこで現在、完成された肺高血圧を改善させる遺伝子治療の開発を種々鋭意検討中である。1)肺高血圧モデルの作製:肺高血圧モデルを作製のためにwistar系ラットにモノクロタリン60mg/kgを一回皮下注した。対照群には生食を同量皮下注した。2)血行動態の評価:麻酔下に右内頚動脈、右外頚静脈からそれぞれカニュレーションし、water-filled法で体血圧、右室圧を計測した。3)心血管リモデリングの評価:心臓・肺を生食灌流固定後に摘出し、心室肥大の指標として左右室重量/体重比を用い、内膜肥厚の指標として肺切片標本における末梢肺動脈内膜を外径25-50um,51-100umの2群に分け、% wall thickness(=[(medial thickness×2)/external diameter]×100)を計測、算出し評価・検討した。モノクロタリン投与3週間後には右室圧が増大、右室肥大や肺血管内膜の肥厚が進行している事を確認、肺高血圧モデルの作製に成功した。また正常ラットの血行動態を確認し、肺高血圧ラットの体血圧、左室肥大は正常ラットと同等である事を確認した。今後、遺伝子治療により血行動態や心血管リモデリングにどの様な影響を及ぼすか、また遺伝子治療による副作用がないか検討する予定である。4)肺高血圧ラットの生存率の検討:肺高血圧ラットの生命生予後を検討した。モノクロタリンによる肺高血圧の進行により32日目までに全例死亡した。今後は遺伝子治療により生命予後を改善させるか検討する予定である。
ＤＮＡオリガミを用いた新規免疫アジュバントの開発

本申請研究では,DNAオリガミの技術を利用し,ウイルス由来の単鎖DNA配列に免疫アジュバントとして最適な二次元構造を付与することを目的とする.ウイルス由来DNA配列中には,Toll様受容体に認識されるCpGモチーフが高頻度に認められる.しかしながら,DNA鎖は生理的条件下では,主としてスーパーコイル状に折り畳まれており,外界に露出する配列は全長に比して極めて少ない.そこで,DNAオリガミ技術を利用して,多数のCpGモチーフを外界に露出させたDNAの二次元構造体を作製した.そして,細胞実験および小動物を用いた免疫実験から,免疫アジュバントとして最適なCpGモチーフの二次元構造を決定した.(1)前年度に選出したDNAオリガミ体を市販の23価肺炎球菌ワクチン(ニューモバックス)と混合した.各種の混合比で調整した「ワクチン=DNAオリガミ液」を準備し,マウス皮下に接種した.隔週ごとに採血を行い,肺炎球菌に対する抗体価の上昇をELISA法で測定した【寺尾・中田】.(2)抗体価の上昇を確認した後,マウスから脾臓細胞を摘出し,標的細胞株p815に対する細胞傷害性T細胞活性を測定した【川端・住友】.(3)抗肺炎球菌の抗体価が上昇した血清を肺胞上皮細胞株の培養上清に添加し,肺炎球菌の上皮細胞侵入に対する阻害能を検索した【川端・住友】.また,同抗血清を用いて,23価の肺炎球菌に対する抗体価の上昇パターンをWestern blot法で解析した【寺尾・中田】.(4)免疫増強を確認できるDNAオリガミが決定し,致死量の肺炎球菌をマウスに感染させた.そして,経日的にマウスの生存数を記録し,感染防御効果を算出した.(5)得られた結果は,研究代表者自身が学会および学術誌で専門家を対象に報告した.そして,申請者が作成する研究室のホームページから,リアルタイムで広く国民に発信した(http://web.dent.osaka-u.ac.jp/mcrbio/)【寺尾】.本申請研究では,DNAオリガミの技術を利用し,ウイルス由来の単鎖DNA配列に免疫アジュバントとして最適な二次元構造を付与することを目的とする.ウイルス由来DNA配列中には,Toll様受容体に認識されるCpGモチーフが高頻度に認められる.しかしながら,DNA鎖は生理的条件下では,主としてスーパーコイル状に折り畳まれており,外界に露出する配列は全長に比して極めて少ない.そこで,DNAオリガミ技術を利用して,多数のCpGモチーフを外界に露出させたDNAの二次元構造体を作製した.そして,細胞実験および小動物を用いた免疫実験から,免疫アジュバントとして最適なCpGモチーフの二次元構造を決定した.申請計画に従い,計画初年度はワクチンのアジュバント活性を向上させる可能性のあるDNA配列を外界に露出させたDNAオリガミ体を復習種類構築することを目指した.はじめに,一本鎖DNAであるM13mp18を購入し,内在する1カ所のヘアピンループ(20 nt)を含む73 ntの領域をBsrBIで消化し,この操作で得られた7,176 ntのDNAを鋳型鎖にすることで,鋳型DNAの内部構造に左右されないDNAオリガミをパーソナルコンピュータおよび専用ソフトウエアを用いてデザインした.続いて,二本鎖DNAを理論上平面構造を保持させるために,16もしくは32塩基のオリゴヌクレオチドを鋳型と相補的にデザインした.約7,000 ntの鋳型DNAに対し,約200本の短鎖オリゴヌクレオチドの「留め金鎖」を決定することが出来た.次に,鋳型M13mp18 DNAと留め金DNAの混合比を検討し(質量比で1:11:1,000),両者を混合し,95°Cに加熱後,20°Cまで2時間24時間かけて緩やかに冷却し(この課程を実施するために専用のサーマルサイクラーを購入した),得られた反応DNA鎖を原子間力顕微鏡で観察した.そして,至適の混合比と冷却時間を決定した.現在までに,上記の工程を5回以上繰り返し,最終的にアジュバント活性誘導配列を外界に露出させたDNAオリガミ体を3形態構築し,細胞実験やマウス動物実験モデルに供するための大量合成に取り組んでいる.研究計画で提唱した仮説を裏付けるような,M13DNAを鋳型とし,36-merのDNAオリゴ体200種類で7000ntのDNAを任意に折り畳むことができた.さらに,アジュバント効果を有すると推定する平面デザイン通のDNAオリガミ体を三種類構築できたことから,おおむね当初の計画通りに進展していると考える.(1)前年度に選出したDNAオリガミ体を市販の23価肺炎球菌ワクチン(ニューモバックス)と混合する.各種の混合比で調整した「ワクチン=DNAオリガミ液」を準備し,マウス後脚に接種する.隔週ごとに採血を行い,肺炎球菌に対する抗体価の上昇をELISA法で測定する(寺尾・中田).(2)抗体価の上昇を確認した後,マウスから脾臓細胞を摘出し,標的細胞株p815に対する細胞傷害性T細胞活性を測定する(川端・住友).(3)抗肺炎球菌の抗体価が上昇した血清を肺胞上皮細胞株の培養上清に添加し,肺炎球菌の上皮細胞侵入に対する阻害能を検索する(川端・住友).また,同抗血清を用いて,23価の肺炎球菌に対する抗体価の上昇パターンをWestern blot法で解析する(寺尾・中田).(4)免疫増強を確認できるDNAオリガミが決定できれば,致死量の肺炎球菌をマウス口腔から感染させる.そして,経

日的にマウスの生存数を記録し,感染防御効果を算出する.死亡したマウス、および30日以上生存したマウスから,肺・脾臓・腎臓・肝臓・心臓を摘出し,滅菌した磨砕装置で各組織をPBSと混和する.混和液を血液寒天培地へ接種し,翌日に生育した菌数を算定する.そして,各臓器へ伝播した肺炎球菌の数を組織重量比で算出する(寺尾・中田).(5)最後に,懸念される副反応である抗DNA抗体の産生量を測定する.手順(1)で採取したマウス血液と抗DNA抗体価測定用のELISAキットで定量する(川端・住友).得られた結果は,研究代表者自身が学会および学術誌で専門家を対象に報告する.そして,申請者が作成する研究室のホームページから,リアルタイムで広く国民に発信する(http://web.dent.osaka-u.ac.jp/mcrbio/)(寺尾).動物実験を実施予定であるため,実験動物費を申請する(ディスポーザブル飼育ケージ代も含む).実験機器は購入せず,動物実験で得られた試料を解析するための試薬およびプラスチック器具を購入する計画である.また,最終的な実験成果を発表するために,国内および国際学会への参加旅費を計上する.そして,全研究成果を英文の学術雑誌へ投稿するために,英語論文の英文校正費と校正者との通信連絡費,および印刷費を計上する.