hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高速液体クロマトグラフィーによる金属錯体の分離のための新手法

すなわち、本研究により、新たな金属錯体のクロマトグラフィーを提案することが出来た。前年度に合成した中性塩基結合シリカゲルを固定相とするHPLC用分離カラムを作製し、試料としてZn^<||>、Co^<||>、Ni^<||>、Cu^<||>の4種類の金属-テトラフェニルポルフィリン錯体(TPP)を用いて、順相系でカラムの評価を試みた。合成したカラムは、4,5-ジヒドロイミダゾリル結合シリカ(4,5-DHIPS)、2-(2-ピリジル)エチル結合シリカ(2-PES)、2-(4-ピリジル)エチル結合シリカ(4-PES)の3種類であり、さらに、対照として市販のアミノプロピル基結合シリカ(APS)もカラムに充填して用いた。移動相としてシクロヘキサン-トルエン混合溶媒を用いて、これら4種類の金属-TPP錯体の保持挙動を検討した。その結果、たとえば、Zn^<||>TPP錯体に関して、カラムによる保持の強さは2-PES≪4,5-DHIPAPS<4-PESの順となった。2-PESカラムにはTPP錯体はほとんど保持されなかった。2-PESと4-PESとピリジル基のnの塩基性はほぼ等しいと考えられるが、2-PESでは、エチル基による立体障害のために金属イオンへの配位能力は低いと考えられる。また、以前、Zn^<||>TPP錯体を固定相とするGCにおいて、N含有化合物の保持挙動が調べられているが、本研究の固定相のアナログ化合物の保持の強さは2-メチルピリジン<エチルアミン<4-メチルピリジンと報告されており、上記の順序と一致した。一方、これらのカラムにおいて、錯体間の保持されやすさは、Ni^<||>-TPPCu^<||>-TPP<Zn^<||>-TPPCo^<||>-TPPとなった。この順序はこれらのTPP錯体におけるピリジンの付加錯体生成定数の順序に一致した。これらのことから、これらのカラムにおけるTPP錯体の保持機構は、試料のTPP錯体と固定相の中性塩基との間の配位相互作用に基づいていると結論される。前年度に引き続き、報告者らが合成した中性塩基結合シリカゲルを固定相とするHPLC用分離カラムにより、新たにMn^<III>、V^<IV>,Fe^<III>の3種類の金属・テトラフェニルポルフィリン錯体(TPP)を用いて、順相系でカラムの評価を試みた。合成したカラムは、4,5ジヒドロイミダゾリル結合シリカ(4,5・DHIPS)、2・(2・ビリジル)エチル結合シリカ(2・PES)、2・(4・ピリジル)エチル結合シリカ(4・PES)の3種類であり、さらに、対照として市販のアミノプロピル基結合シリカ(APS)もカラムに充填して用いた。移動相としてシクロヘキサン・トルエン混合溶媒を用いて、これら3種類、および昨年に引き続きZn^<II>,Co^<II>,Cu^<II>の4種類の金属・TPP錯体の保持挙動を検討した。その結果、Ni^<II>、Cu^<II>、V^<IV>、Fe^<III>-TPP錯体はこれらカラムにほとんど保持されなかった。一方、他の3種類の錯体は強く保持され、その程度はZn^<II>・TPPCo^<II>TPP_< Mn^<III>・TPPの順となった。またカラムによる保持の強さはMn^<III>・TPPに関しても2・PES_<<<>4.5・DHIPAPS_<4・PESであり、2PESカラムにはほとんど保持されなかった。2・PESと4・PESのビリジル基のNの塩基性はほぼ等しいと考えられるが、2・PESでは、エチル基による立体障害のために金属イオンへの配位能力は低いと考えられる。
遺伝子配置情報に基づくゲノム構造比較法の開発

既に開発した環状ゲノム比較法に更に改良を加え、ゲノム間の遺伝子配置の類似性について統計的有意性を推定することができるようにした。19種細菌ゲノムのorthologous遺伝子の配置情報を既存のデータベースから収集し、この方法によって、各ゲノム間でorthologous遺伝子の配置の数理的特性を解析した。その結果、ランダムな配置に対して相対的位置が統計的有意に維持された遺伝子群の存在が明らかになった。さらに、真正細菌ゲノム間で最も類似な配置を実現する方向は、2つのゲノムの複製開始・終止点が一致する方向であった。最近、近縁細菌のゲノム比較によって、複製点を対称軸とした遺伝子の移動が遺伝子再配置において最も頻繁に起こる遺伝子移動のパターンの一つである事が報告されている。この報告は、我々の方法の解析結果を支持する。複製点に対する対称移動が再配置の駆動力であれば、最も類似な配置は複製点が一致する方向で実現される可能性が高いからである。線形ゲノム比較のために、関連遺伝子のクロモゾーム上の配置を比較する方法のプロトタイプを開発した。この方法によって、酵母ゲノム上の重複遺伝子について、それらの種類と位置を考慮して16の酵母クロモゾームを比較した結果、7つのクラスターにクロモゾームが分類された。このことは、従来提唱されている、現在の酵母ゲノムが2倍体であるという仮説を支持すると共に、祖先型のクロモゾーム・ペアを具体的に示唆する。このように、従来の遺伝子配列比較に基づくボトムアップのアプローチに加え、遺伝子配置に基づくトップダウンのアプローチの開発は、ゲノム比較において新しい巨視的な観点を提供し、新しい知見を得ることができた。また、環状ゲノム比較の方法を更に多数のゲノム間の多様な関連遺伝子群に適用すると共に、線形ゲノム比較においても巨視的且つ網羅的な方法を開発・改良する必要性を示唆する。
上丘-視床下核投射の形態学的研究

上丘は黒質網様部の出力先として,大脳基底核の回路および機能を考える上で,きわめて重要な構造である.本研究では,ラット上丘(Superior Colliculus)に順行性標識物質であるPHA-Lを注入し,標識終末の分布を検討した.ネンブタール麻酔下のラットの上丘にPHA-Lを電気泳動を用いて注入し,1週間の生存期間の後,灌流固定し,凍結切片作成後免疫組織化学的にPHA-Lを検出した.その結果,これまで知られていなかった,視床下核(Subthalamic nucleus)に終止する上丘出力線維の存在が見いだされた.さらに,上丘の様々な部位にPHA-Lを注入することにより,上丘視床下核投射の起始細胞が,上丘深層の尾側半に多く存在することが明らかになった.また,逆行性標識物質であるFulorogolod(FG)の視床下核内への注入により,上記の所見を確認することができた.今回明らかになった上丘視床下核投射は,眼球運動に際しての上丘深層ニューロンの活動後に,視床下核に対して興奮性に作用し,眼球運動後に活動する視床下核のニューロンが多く存在するという,既に知られている電気生理学的事実の基礎となる投射と考えられる.また,大脳基底核出力核すなわち,淡蒼球内節や黒質網様部の出力先から大脳基底核へのフィードバック系の一部を,脚橋被蓋核や視床髄板内核と共になしていると考えられる.上丘は黒質網様部の出力先として,大脳基底核の回路および機能を考える上で,きわめて重要な構造である.本研究では,ラット上丘(Superior Colliculus)に順行性標識物質であるPHA-Lを注入し,標識終末の分布を検討した.ネンブタール麻酔下のラットの上丘にPHA-Lを電気泳動を用いて注入し,1週間の生存期間の後,灌流固定し,凍結切片作成後免疫組織化学的にPHA-Lを検出した.その結果,これまで知られていなかった,視床下核(Subthalamic nucleus)に終止する上丘出力線維の存在が見いだされた.さらに,上丘の様々な部位にPHA-Lを注入することにより,上丘視床下核投射の起始細胞が,上丘深層の尾側半に多く存在することが明らかになった.また,逆行性標識物質であるFulorogolod(FG)の視床下核内への注入により,上記の所見を確認することができた.今回明らかになった上丘視床下核投射は,眼球運動に際しての上丘深層ニューロンの活動後に,視床下核に対して興奮性に作用し,眼球運動後に活動する視床下核のニューロンが多く存在するという,既に知られている電気生理学的事実の基礎となる投射と考えられる.また,大脳基底核出力核すなわち,淡蒼球内節や黒質網様部の出力先から大脳基底核へのフィードバック系の一部を,脚橋被蓋核や視床髄板内核と共になしていると考えられる.
言語・文化調査に基づくイラワジ・サルウィン流域諸民族の歴史の解明

メコン河流域に比べて資料の乏しいイラワジ河流域およびサルウィン河流域諸民族の言語・文化データを大量に収集することに成功し、大きな成果を収めた。集められたデータの分析から、カレン系民族の古い歴史の解明に道が開け、言語(民族)接触による北方モン・クメール系民族間の違いの由来が明らかになり、カチン社会の成立過程についても解明できる可能性が出てきた。本研究によって、長年進めてきた、言語をその話し手の社会や文化と関連付けて研究することの意義・有効性がますます明白になった。計画初年度に最初に手掛けた調査として、中国雲南省の徳宏州及びそれに隣接する保山地区、臨滄地区でサルウィン流域系のタイ系民族、ワ系を中心とした北方モンクメール系民族の言語・文化調査を行った。この調査では、徳宏タイ語で書かれた文献資料を収集・分類・整理する中で、徳宏タイ語で書かれた年代記を発見し、その解読に着手した。こうした年代記は、タイ系民族自身が自分たちの歴史をどのように見ているのか、また、自分たち以外の民族に対してどのような考えを持っているのかを知る上で重要な手掛かりになるはずであり、これまでの漢語資料からは得ることができない貴重な情報を提供してくれるはずである。さらに、タイ系民族と深い関係を持つ北方モンクメール系民族のワ族を中心に、それに近いパラウン族も含めて口頭伝承を幅広く収集し、言語学的資料として音韻論的分析、統語論的分析を行うと共に、口頭伝承が持つ歴史的・文化的な意味について今後の研究を進める上で貴重な資料を収集できた。次に手掛けた調査は、中国雲南省のシプソンパンナーで、主にプランの言語・文化資料を収集した。こうして収集された資料から、プラン族に言語・文化面でたくさんの異なるグループが存在する理由を、タイ系民族との接触関係から解明できないか現在検討を進めている。本年度最後に行った調査地はタイ王国で、ビルマからの難民を対象にイラワジ流域系の民族であるカレン、ラワシ、カチン系民族の言語・文化調査を行った。この調査からは、カレン系言語とラワン系言語の間にかなり深い関係があることが分かり、イラワジ流域で展開された民族移動の歴史について、今後の調査研究によって、これまでの常識を覆すことができる可能性も出てきた。計画第二年度の本年は、代表者の新谷、分担者のダニエルス、協力者の山田がそれぞれの重点分野に集中した現地調査を行った。ダニエルスは中国雲南省徳宏地区において、サルウィン系のタイ系言語であるタイ・マオ語で書かれた年代記の翻訳に努め、現地のタイ系民族から見たモン・クメール系民族およびチベット・ビルマ系民族に対する概念の分析を進めた。また、こうしたタイ・マオ語で書かれた文献の記述内容を確認するとともに、メコン河流域のタイ系民族との違いを明らかにすべく入念な文化調査も実施した。こうした調査により、タイ社会における非タイ系民族、特にモン・クメール系民族の重要性が明らかになるとともに、メコン流域のタイ系民族との距離感も明らかになってきた。山田は主にパラウク・ワ族の民話を収集し、その翻訳を通じて、ダニエルスとは反対に、モン・クメール系民族から見たタイ系民族に対する概念の分析に努めた。両名の調査は、これまでほとんど重視されてこなかったタイ系民族と非タイ系民族との密接な関係を明らかにできた点で大きな収穫であった。新谷は10月に泰緬国境のタイ側でミャンマーからの難民を相手にカレン系の言語2種、モン・クメール系言語1種の調査を行った。更に12月から1月にかけてミャンマー国内でチン系言語9種の調査を行った。これらの言語はいずれも、これまでデータが少ないか全くなかった言語であり、こうしたデータ収集により、イラワジ系統のチン族、カレン族との間の関係、更には、サルウィン流域のモン・クメール系民族との接触経緯などを明らかにできる展望が開けてきた。昨年度までの調査で、同じタイ系民族であり、かつ、言語がきわめて類似していながら、サルウィン流域とメコン流域の間では大きな文化的な溝があることが分かった。本年度はこうした溝の解明を目指して、従来のイラワジ・サルウィン流域に加え、メコン流域の言語および文化の調査も実施した。その結果、イラワジ流域の言語としては、新たにチン諸語2言語、ブラカロン諸語2言語、ラワン系言語3言語の合計7言語の調査ができた。また、サルウィン流域の言語としてはモン・クメール系の3言語の調査を行った。更にメコン流域の言語として、モン・クメール系のプラン語の調査を行い、サルウィンとメコンの中間に位置するワ語の調査も行った。こうした言語調査と並行して、雲南省の徳宏地区で現存するタイ系言語で書かれた文献の解読を進め、文化調査を行った。ナム・カムでは、パラウンが自身で考案したと思われる文字で歴史史料を執筆している情報を入手し、パラウンが自己の歴史を書いていた可能性があることが判明した。

以上の調査によりいくつかの新しい知見が得られた。まず、同じ北方モン・クメール系で相互に近い言語であるパラウン、ワ、プランの3言語は、パラウンがサルウィン流域のタイ語の影響を強く受けているのに対し、プランはメコン流域のタイ語の強い影響下でその特徴を出してきた言語である。一方、ワ語はその中間にあって、パラウンやプランに比べてタイ語の影響が少ない言語である。このような3言語(民族)の分化は彼らの地理的分布によっても裏付けられる。すなわち、西から東に、また、北から南に、おおむねパラウン・ワ・プランの順に分布している。同じように、サルウィン河のモン・クメール系言語であるカノ語、リアン語にブラカロン語の影響がみられることから、ブラカロン系民族がイラワジ河の東にかなり広く広がっていたことが想定される。計画最終年度の本年度は、まず、中国雲南省の徳宏地区を中心にした調査で、サルウィン系タイ語で書かれた文書の解読を進め、メコン系タイとの歴史的・文化的相違を一層明確にすることができた。イラワジ流域での調査からは、カレン系言語の全体像を把握することのできる32種の言語・方言を網羅した比較語彙集を完成させた。この中の半数程度はこれまで全くデータのなかったか全く知られていなかった言語・方言であり、世界的にきわめて貴重な成果となっている。また、チン系言語、ナガ系言語、ラワン系言語、カチン系言語、北方モンクメール系言語の調査も進め、タイ文化圏における言語データを一層充実させることができた。こうした調査の中で、長年言われてきた「カチン語群」というグループが全く成り立たない語群であることが明確になるとともに、カチン社会がサルウィン系のタイであるシャン社会にきわめて似た構造を持つ社会であることも次第にはっきりしてきた。同時に、今回調査のできたナガ系の3種の言語は、相互に隔たりがきわめて大きく、彼らをナガ族としているものは一体何なのか、今後解明しなくてはならない課題も浮かび上がってきた。一方、その3種のナガ語の一つ、シャンケ語は明らかにジンポ語との関係が認められ、カチン社会の成り立ちに関して大きなヒントが得られた。つまり、ジンポ族がイラワジ上流域に進出し、先住民族を包摂しながら現在のようなカチン社会を形成していったのではないかと考えられる可能性がある。こうした成り立ちはサルウィン河流域で、シャン族が先住民族を包摂しながらシャン社会を形成していった過程とも類似している。想定を超える数の新しい言語データが得られ、タイ系言語で書かれた文献の解読作業もほぼ順調に進展している。また、言語・文化接触による民族の分化についても新しい知見が得られている。タイ文化圏の中で大河の重要性がはっきりし、そうした大河文化圏を裏付ける言語・文化調査も進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。タイ文化圏の中での大河流域文化圏の存在を、さらなる言語・文化調査によって一層明確にするとともに、このような文化圏がタイ文化圏および近隣地域を含めた地域の歴史にどのような影響を与えたかを考えることによって、新たな歴史研究に道を開くことを目指している。また、タイ文化圏の言語データの収集ですでに世界で圧倒的な地位を占めているが、さらなる現地調査によってこの地位を一層強固なものにし、我が国をこの地域の研究における世界的な中心にすることを目指している。
デクスメデトミジン血中濃度測定法の確立

鎮静薬として用いられるデクスメデトミジンの血中濃度測定法の確立を行った。陰イオン化学イオン化法を用いてデクスメデトミジンの抽出法を確定した。内部標準物質をしてジアゼパムが有効であることを確認した。検量線の作成,バリデーションを行い,GC-MSを用いてのデクスメデトミジンの定量化を確立した。本研究の主題は,「GC-MSを利用してデクスメデトミジンの血中濃度測定を可能とする」ことであり,デクスメデトミジンの定量法の確立を行い,日本人における血中濃度を予測するパラメータの解析を行うことである。研究の手順として,(1)デクスメデトミジンの抽出法を確立する。(2)内標準物質を決定する。(3)デクスメデトミジンの検量線を作成する。(4)測定法の最終バリデートを行う。の4つを行うが,本年度は(3)までを行った。(1)デクスメデトミジンの抽出法の確立デクスメデトメジン(DEX)は誘導体化を行うことで、GC-MSに注入することが可能となる。誘導体化試として、0.5%pentafluorobenzoyl chloride(PFB-CL)ヘキサン溶液を利用した。DEXを1mLに希釈し、1M炭酸水素ナトリウム1mLにてアルカリ化した。誘導化試薬としてヘキサン6mL、PFBCL5mcLを注入し、常温で撹拌・遠心を行い有機層と無機層に分離した。この過程によりデクスメデトミジンが有機層に移動することが確認できた。有機層に移動されたデクスメデトミジンをGC-MSに注入するための乾燥・乾固は,遠心エバポレータで可能なことが確認できた。(2)内部標準物質の決定デクスメデトミジンの定量を行うために,同条件で有機層に移動し、GC-MSで検出できる内部標準物質の同定と条件を制定することが必要であった。内部標準物質としてミダゾラムとジアゼパムを用いた。ジアゼパムは,DEX測定と同条件で検出が可能であり、内部標準物質としての利用が可能であることが確認できた。ミダゾラムでは,tailingを来しており、精度は十分ではなかった。(3)デクスメデトミジンの検量線の作成0.1,1.0,10ng/mLのデクスメデトミジン標準溶液を準備し、GC-MSのピーク面積を計算し、回帰直線を決定し相関係数を算出した。研究の手順として,(1)デクスメデトミジンの抽出法を確立する(2)内標準物質を決定する(3)デクスメデトミジンの検量線を作成する(4)測定法の最終バリデートを行う。誘導体化試として、0.5%pentafluorobenzoyl chloride (PFB-CL)ヘキサン溶液を利用した。(4)測定法の最終バリデート低濃度デクスメデトミジン標準溶液を用いて検出限界を求め,各種濃度の溶液を用い精度を算出した。引き続きin vivo studyとしてPCを用いたTarget-controlled infusionを行い,実測値と予測血中濃度の整合性の評価を行ったが多少のバラつきがあり,検体数を増やして追加測定を施行中である。
視覚野ニューロン活動の刺激文脈依存的調節のネットワークメカニズム

本研究は、刺激文脈依存的な一次視覚野(V1)ニューロン活動の抑制性修飾現象のメカニズムについて、ニューロンおよびネットワークレベルの入出力特性を厳密に解析することにより明らかにすることを目的として行った。具体的には、この抑制性修飾作用の原因として、観察下のニューロンの受容野外に受容野をもち共通の刺激方位、空間周波数などの刺激特徴に反応するニューロン群からなる機能的ネットワークが皮質内GABA抑制をドライブすることによって受容野刺激に対する反応を抑制する、という可能性を実験的に検討した。実験は、麻酔・非動化したネコのV1ニューロンを電気生理学的に記録し、受容野周囲刺激の呈示により、受容野刺激に対する反応が強い抑制性修飾を受ける細胞において、抑制性神経伝達物質GABAの受容体選択的拮抗薬であるビククリンの微小イオン泳動投与microiontophoresisを行うことにより、局所的に皮質内抑制を遮断したときの効果を調べた。ニューロンの受容野を中心として様々の大きさのサイン波状に輝度変化する縞刺激sinusoidal gratingに対する応答を調べ、ビククリン投与中とコントロール時の刺激サイズ-反応強度関数を比較した。その結果、皮質内抑制の遮断は、ニューロンの反応性を増強し、また刺激選択性の低下をもたらしたが、24例のニューロンのいずれにおいても、受容野外刺激による抑制性修飾はほとんど影響を受けなかった。このことは、皮質内抑制が修飾現象の主たる原因であるという可能性を否定し、興奮性ネットワークにおける活動低下を示唆するものである。
中和剤、昇圧剤その他薬剤組合せの工夫による癌化学療法効果増強

要約〕(1)いわゆる昇圧化学療法の治療効果を更に増強させるために、強心剤及び血管作用薬の併用を検討し改良型昇圧化学療法を提出した。(2)また一方、従来の2経路化学療法と昇圧療法を併用することにより局所癌療法として極めてすぐれた化学療法が開発出来た。1)小豆大に発育させたマウス乳癌に対し、アンギオテンシン【II】昇圧時に制癌剤DDP又はCQを投与すると通常の化学療法に比して明らかに制癌効果が増強する。この昇圧化学療法に対してトランスオキソカンファー又はアミノフィリン等の強心剤を併用したところ、副作用の増強なしに更に一層の制癌効果の増強(腫瘍縮少率として56倍)が得られた。この効果は強心剤に限らず、血管拡張剤であるニトロプルシッドナトリウム又はパパベリンによっても同様であった事から、腫瘍血流に対する相対的有利条件が得られたものであると解釈出来る。このことは培養条件に於いては、上記薬剤の相剰効果が得られない事からも支持される。現在、これら薬剤の投与タイミング、投与薬液量等を基本的に検討している。2)従来我々の開発になる2経路癌化学療法を更に一層効果的にするためにアンギオテンシン【II】の併用を工夫してみた。ラット下肢に大きく育てた(小指頭大)癌に対して今回の「2経路昇圧化学療法」を施したところ、DDPの毒性は上げずに、明らかにこの治療群は抜群の制癌効果を示した。上記1),2),の基礎実験成績は、いづれも従来の癌化学療法の治験では見られなかった成績であり、すでに臨床試験も患者の症例を選んで開始して、かなりの手答えが出始めている。
ショウジョウバエmiRNA経路における翻訳抑制機構の生化学的解析

近年、21-24塩基長の小分子RNAによる標的遺伝子のサイレンシング機構が広く注目されている。small RNAの中で最もよく知られているものとしてsmall interfering RNA (siRNA)とmicroRNA (miRNA)がある。siRNAおよびmiRNAは最終的にエフェクター複合体であるRNA-induced silencing complex (RISC)へと取り込まれ、機能する。このRISCの核をなすのがArgonaute(Ago)サブファミリーに属するタンパク質である。Ago2-RISCの形成過程ではまず初めにsiRNA二本鎖がAgo2へと受け渡される。これを「siRNA二本鎖の積み込み」と呼ぶ。その後、siRNA二本鎖のうち一方のRNA鎖が残りもう一方のRNA鎖が分解された後、成熟したAgo2-RISCとなる。この過程を「siRNA二本鎖の巻き戻し」と呼ぶ。これまでの知見によりAgo2への「siRNA二本鎖の積み込み」にはATPが必要であることが分かっていた。しかしながら,一体ATPがどんな因子によって消費されているのかといったことは明らかとなっていなかった。そこで、ATPを消費しAgo2への「siRNA二本鎖の積み込み」を担う因子を同定することを目的として研究を行った。結果として、Ago2結合因子としてHsc70/Hsp90シャペロンマシナリーを同定し、Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーがショウジョウバエおよびヒトの「小分子RNA二本鎖の積み込み」反応に必要であることを発見した。Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーはATPを消費しつつ結合したタンパク質の構造を変化させ、そのタンパク質の成熟化を促すことがよく知られている。この結果により「小分子RNA二本鎖の積み込み」とは、Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーがATPを消費しつつAgoの構造を、小分子RNA二本鎖を取り込めない構造から取り込める構造へと変化させる反応である、というモデルを考えることができる。この研究では、Agoへの「小分子RNA二本鎖の積み込み」にHsc70/Hsp90シャペロンマシナリーが「必要」であるということを示した。しかしながら、その逆に一体どんな因子によって「十分に」Agoへの「小分子RNA二本鎖の積み込み」、が起こるのか、といったことは解明されておらず,今後のさらなる研究が望まれる。近年、21-24塩基長のsmall RNAによる標的遺伝子制御機構が広く注目されている。代表的なsmall RNAであるmiRNAは、その配列と部分相補的な配列を複数個もつmRNAの翻訳を抑制し標的遺伝子の発現を制御する。miRNAは最終的にArgonauteタンパク質(Ago)に取り込まれ機能することが知られている。miRNAによって疾患を含めた非常に重要な生物学的機能が制御されていることから、miRNAによる翻訳抑制のメカニズムの解明は早期に望まれる。しかしながら、これまでの報告は実験条件により全く異なった結果を示しており、明確な結論は得られていない。これらの報告では生物種によって数個存在するAgoタンパク質の種類による違いに関してほとんど解析されてこなかったことから、我々は「Agoごとに翻訳抑制の作用機序が異なることによって矛盾した結果が生じているのではないか」という仮説を立てた。ショウジョウバエにはAgoが2種類存在する(Ago1およびAgo2)が、本研究においてショウジョウバエ胚抽出液を用いることによって、Ago1とAgo2による効果を厳密にコントロールし、翻訳抑制を再現することができるin vitro系を構築することに成功した。その結果、Ago1とAgo2の両方が翻訳抑制を引き起こすことができ、その翻訳抑制の様式に明確な違いがあることが分かった。Ago1は「cap構造の認識段階以後」を阻害するのに加え、同時に標的mRNAのpoly(A)鎖の短縮を促進することで翻訳の開始の効率を低下させる。また両方の経路にAgo1結合タンパク質であるGW182が必要である。これに対してAgo2は翻訳開始因子eIF4Eに結合し、翻訳開始因子eIF4GとeIF4Eとの結合を阻害することで「cap構造の認識段階」を阻害する。この結果はこれまでの矛盾する報告を説明できるだけでなく、Agoによる翻訳抑制の様式を明確にしたもである。今後はヒトに存在する4つのAgoによる翻訳抑制の様式にも大きな違いがあるのかどうか検証してゆきたい。近年、21-24塩基長のsmall RNAによる標的遺伝子のサイレンシング機構が広く注目されている。small RNAの中で最もよく知られているものとしてsmall interfering RNA(siRNA)とmicroRNA(miRNA)がある。siRNAは完全に相補的な配列を持つmRNAを切断することで、またmiRNAは部分相補的な配列を複数個もつmRNAの翻訳を抑制することで、それぞれ標的遺伝子の発現を負に制御する。miRNAおよびsiRNAは最終的にエフェクター複合体であるRNA-induced silencing complex(RISC)へと取り込まれる。このRISCの核をなすのがArgonaute(Ago)サブファミリーに属するタンパク質(Ago)である。私はこれまでの特別研究員としての研究で、ショウジョウバエがもつ2種類のAgo(Ago1とAgo2)がそれぞれ翻訳抑制を引き起こすことを示し、そのメカニズムが全く異なるということを示すことができた。また、この研究の過程で、Ago2をショウジョウバエS2細胞で発現させ、免疫沈降法で精製することが可能になった。これを用いることによって以下のような実験を計画している。

これを「siRNA二本鎖の積み込み」と呼ぶ。これまでの知見によりAgo2への「siRNA二本鎖の積み込み」にはDicer-2/R2D2ヘテロダイマーが必要であることが分かっていた。しかしながら、これまでの試行実験により、siRNA二本鎖のAgo2への積み込みにはDicer-2/R2D2だけでは不十分であり、それ以外の新規因子が必要である、ということが分かってきた。今後は古典的なカラムクロマトグラフィーの手法を用い、生化学的にこの因子を精製、同定することを目指していきたいと考えている。近年、21-24塩基長の小分子RNAによる標的遺伝子のサイレンシング機構が広く注目されている。small RNAの中で最もよく知られているものとしてsmall interfering RNA (siRNA)とmicroRNA (miRNA)がある。siRNAおよびmiRNAは最終的にエフェクター複合体であるRNA-induced silencing complex (RISC)へと取り込まれ、機能する。このRISCの核をなすのがArgonaute(Ago)サブファミリーに属するタンパク質である。Ago2-RISCの形成過程ではまず初めにsiRNA二本鎖がAgo2へと受け渡される。その後、siRNA二本鎖のうち一方のRNA鎖が残りもう一方のRNA鎖が分解された後、成熟したAgo2-RISCとなる。この過程を「siRNA二本鎖の巻き戻し」と呼ぶ。これまでの知見によりAgo2への「siRNA二本鎖の積み込み」にはATPが必要であることが分かっていた。しかしながら,一体ATPがどんな因子によって消費されているのかといったことは明らかとなっていなかった。そこで、ATPを消費しAgo2への「siRNA二本鎖の積み込み」を担う因子を同定することを目的として研究を行った。結果として、Ago2結合因子としてHsc70/Hsp90シャペロンマシナリーを同定し、Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーがショウジョウバエおよびヒトの「小分子RNA二本鎖の積み込み」反応に必要であることを発見した。Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーはATPを消費しつつ結合したタンパク質の構造を変化させ、そのタンパク質の成熟化を促すことがよく知られている。この結果により「小分子RNA二本鎖の積み込み」とは、Hsc70/Hsp90シャペロンマシナリーがATPを消費しつつAgoの構造を、小分子RNA二本鎖を取り込めない構造から取り込める構造へと変化させる反応である、というモデルを考えることができる。この研究では、Agoへの「小分子RNA二本鎖の積み込み」にHsc70/Hsp90シャペロンマシナリーが「必要」であるということを示した。
中枢神経系構築の分子機構

ショウジョウバエの杯期の中枢神経系は、正中線に沿って形成されるmidline cellとニューロブラスト由来の神経細胞及びグリア細胞からできている。前年度までの研究でニューロブラストの形成が、液性因子Hedgehogやホメオボックス遺伝子engrailed等のsegment polarity遺伝子間の共同的働きにより調節されていることを示したが、本年度の研究によって、正中線細胞形成にもHedgehogが基本的な役割を果たしていることが分かった。Hedgehogの温度感受性株を利用し様々な時期にHedgehogを不活性化させたり、逆に活性化させることでHedgehogを必要とする時期を特定した。Hedgehogは、ニュートブラスト形成の場合と同様、発生後3-4時間のごく短い期間だけ必要であることが分かった。Hedgehogは、中枢神経系では殆ど発現していないので、表皮細胞由来であると推定できるが、表皮クチクラ形成に必要なHedgehogとは異なる制御を受けていると考えられる。アクソンの伸展にNADPH-diaphorase活性が関わっていることが最近の研究で分かってきた。そこで、将来的な研究に備えて、diaphorase機能的ホモローグであり、様々なニトロ化合物を還元する大腸菌のnitroreductase(NfsA)について基本的な分子生物学的・生化学的な性質を調べ、現在ハエで形質転換体を作ることを試みている。ショウジョウバエの中枢神経系構築において、segment polarity遺伝子hedgehogの果たす役割について詳細に検討した。ショウジョウバエの中枢神経系ventral gangliaは、neuroectodermの一部の細胞が神経芽細胞として陥入することにより形成される。hedgehogは、neuroectoderm及び神経芽細胞層中で縞状に発現し、蛋白質を分泌する。様々な神経芽細胞の遺伝子マーカーを用いた実験から、Hedgehog蛋白質は、2つのhedgehog発現神経芽細胞列内の一列及び最隣接列、計3列での神経芽細胞形成に必須であり、その不在により後S1神経芽細胞の形成が完全に阻害されることが分かった。S1神経芽細胞及び他の列での神経芽細胞形成には全く影響はない。温度感受性変異株を用いたシフトアップ、シフトダウン、一過的発現及び一過的不活性化実験により、Hedgehog蛋白質の必要かつ十分な作用は、神経芽細胞陥入の2時間程前の1時間であり、neuroectoderm細胞に対するものであることが分かった。第5列で発現するwinglessとhedgehogの相乗効果も調べた。この結果、神経芽細胞NB7-3形成において、hedgehogとwinglessが、相保補的かつredundantな働きをすること及び、全6列の神経芽細胞の形成は、hedgehog,winglessからの分泌シグナルの分布の違いにより制御されているらしいことが判明した。Hedgehogは、autocrine及びparacrineとして機能し、また表皮形成の場合と異なりhedgehog発現とwingless発現は、互いに独立していた。neuroectoderm由来の神経芽細胞のみならず、正中線細胞の形成もneuroectodermからのhedgehogによりコントロールされていた。ショウジョウバエの中枢神経系は、体節構造からなっている。また各半体節を構成する神経細胞やグリア細胞は、分化の始めに形成される半体節当たり約30個のニューロブロストのいずれかの子孫であり、それらの子孫細胞は細胞系譜依存的に分化することが知られている。従って中枢神経系構築の基本原理を理解するには、個々のニューロブラストの体節上の位置や性質がどのようにして決められているのかを調べ、またそこからどのような子孫細胞が生じてくるのかを調べ、それらの結果を加算していけばよい。本研究の端緒は、ステロイドホルモン受容体遺伝子の一種、eagleが、前後軸に沿った4例(ニューロブラストの列は半体節当たり全部で6列ある)から一つづつの、4種のニューロブラスト、NB6-4,7-3,2-5,3-3で特異的に発現しているとの発見にある。大腸菌lacZ遺伝子をeagleエンハンサーの下流につなぎトランスジェニックバエを構築し、まずそれぞれのニューロブラストから生じる子孫細胞の特定とアクソン形成過程を解析し、次いで、前後軸方向の位置情報とニューロブラスト形成との関係を調べた。

前者の研究から、NB6-4の最終子孫細胞は、特異的な一対のグリアであること、NB7-3の子孫は、たった4つの神経細胞であり、恐らくそのうちの2つは、セロトニンニューロンであること、NB2-5,NB3-3は、梯子状神経を構築する上で重要であり、また一部は運動性ニューロンと機能していることが見出された。後者の研究は、主として分泌性のモルフォゲンをコードしているhedgehog遺伝子の機能を中心に行われた。hedgehogは、第1列と第5列(NB6-4,2-4)のニューロブラスト形成に必須であり、オートクリンとしてもパラクリンとしても機能していた。詳細な結果は省くが、互いに独立なhedgehog,wingless,engrailed,gooseberryという4つのsegment polarity遺伝子の組み合わせにより、各例のニューロブラストの特性や形成が決められていることが明らかとなった。ショウジョウバエの杯期の中枢神経系は、正中線に沿って形成されるmidline cellとニューロブラスト由来の神経細胞及びグリア細胞からできている。前年度までの研究でニューロブラストの形成が、液性因子Hedgehogやホメオボックス遺伝子engrailed等のsegment polarity遺伝子間の共同的働きにより調節されていることを示したが、本年度の研究によって、正中線細胞形成にもHedgehogが基本的な役割を果たしていることが分かった。Hedgehogの温度感受性株を利用し様々な時期にHedgehogを不活性化させたり、逆に活性化させることでHedgehogを必要とする時期を特定した。Hedgehogは、ニューロブラスト形成の場合と同様、発生後3-4時間のごく短い期間だけ必要であることが分かった。Hedgehogは、中枢神経系では殆ど発現していないので、表皮細胞由来であると推定されるが、表皮クチクラ形成に必要なHedgehogとは異なる制御を受けていると考えられる。アクソンの伸展にNADPH-diaphorase活性が関わっていることが最近の研究で分かってきた。そこで、将来的な研究に備えて、diaphoraseの機能的ホモローグであり、様々なニトロ化合物を還元する大腸菌のnitroreductase(NfsA)について基本的な分子生物学的・生化学的な性質を調べ、現在ハエで形質転換体を作ることを試みている。
高齢者の配偶者喪失による悲嘆過程とサポートシステムの影響

配偶者と死別した高齢者の悲嘆と対処行動、サポートシステムの影響を明らかにする目的で独自に作成した質問紙を用いて調査を実施した。結果は統計パッケージを用いて量的分析を行った。対象者は55名(男性10名、女性45名)で、平均年齢は70.8歳、死別後の期間は534ヶ月、ひとり暮らしをしている者は28名である。このうち16名には面接調査も実施し、面接内容の質的な分析を行った。量的分析の結果、(1)対象者全体としては特に強いうつ傾向は認めない(2)悲嘆項目の分析結果によれば、死別後の悲嘆は時間経過とともに解決される傾向にある。(3)頼りにしている人は「子供」が圧倒的に多く、(4)家族と同居している人は、していない人よりもうつスケール得点は低く悲嘆過程は解決に向かっている、という結果が得られた。質的分析の結果、対象者が用いていた配偶者との死別に対するコーピング様式は、(1)ものの見方を変える、(2)気持ちの区切りをつける、(3)故人とのつながりを維持する、(4)流れにまかせる、(5)気分転換をはかる、(6)感情を表出する、(7)自分なりの行き方を見いだす、(8)苦痛を伴う感情が起こる状況を避ける、の8様式があった。以上より、配偶者と死別した高齢者は様々なコーピングを用いて悲嘆を乗り越えようとしており、時間の経過とともに解決に向かう傾向にあるが、子供などからの日常的、持続的な物質的、情緒的サポートによってよりスムーズに解決に向かうと考えられ、ソーシャルサポートの重要性が示唆された。1.独自の質問紙の作成配偶者と死別した高齢者の悲嘆と対処行動、およびそれに対するサポートシステムの影響を明らかにする目的で質問紙を作成し、4名の被検者に面接を行い、質問紙への回答を求め、質問紙の妥当性を検討し、質問紙を一部修正した。2.プレテストの実施プレテストの実施においては、対象者の選定に困難を極めた。協力が得られた医療機関などを通じて、61名の配偶者と死別した者に調査への協力を依頼したが、協力を承諾した者は16名(26.2%)に留まった。近年専門職者間では、死の臨床研究会、死の準備教育などを通じて、「死を考えることは如何に生きるかを考えること」という考え方が浸透し、マスメディアを通じても死をタブ-視する傾向は少なくなってきたといわれている。しかし、今回プレテストを実施するにあたり、対象者の選定に困難を極めたことは、日本文化において「死」は、依然としてタブ-視されている現実を表していると考える。3.プレテスト結果の分析プレテストは対象者と面接を行い、作成した質問紙への回答を求めながら、配偶者との死別後の悲嘆と対処行動およびサポートシステムについて自由に語ってもらった。面接内容の逐語的な記録物は質的な分析を行い、質問紙への回答は量的な分析を行っている。その結果、終末期に配偶者を十分介護できた満足感が大きい者は、死別後の悲嘆回復がスムーズであり、死別前の予期的悲嘆の段階での家族への援助の重要性を再認識している。1.質問紙の修正平成6年度のプレテストの結果に基づき、配偶者と死別した高齢者の悲嘆と対処行動、およびそれに対するサポートシステムの影響を調査するための質問項目の修正を一部行った。2.本調査の実施複数の医療機関、老人施設に研究への協力を依頼し、配偶者との死別後3年以内の高齢者に研究者が作成した質問紙を用いて調査を行った。対象者は55名で、男性10名、女性45名、平均年齢70.8歳、調査時における配偶者との死別後期間は534ケ月、ひとり暮らしをしている者は28名であった。

3.調査結果のまとめ本調査のデータはSPSS統計パッケージを用いて統計処理を行った。その結果、以下のような結果を得た。(1)老人用うつスケールの得点によれば、対象者全体としては特に強いうつ傾向は認めない。(2)悲嘆項目の分析結果によれば、配偶者との死別後の悲嘆は、時間経過とともに解決される傾向にある。(3)頼りにしている人は物質的にも情緒的にも「子供」が圧倒的に多く、同居家族の有無による差違はない。(4)家族と同居している人は、していない人よりもうつスケール得点は低く悲嘆過程は解決に向かっていく傾向がある。これは家族の存在がソーシャルサポートとして機能し、対象者が死別後の悲嘆を乗り越えることによい影響を与えているためと考えられる。これらの結果より、配偶者と死別した高齢者の悲嘆過程は、子供などからの日常的、持続的な物質的、情緒的サポートによってよりスムーズに解決に向かうと考える。
本邦における肺高血圧症患者に対する外来呼吸リハビリテーションの確立

本研級は、肺高血圧症(PH)患者に対する呼吸リハビリテーション(呼吸リハ)の効果、安全性、改善の機序の解明、疾患特異的アプローチの構築を目的とした前向き研究である。平成30年度の1年間で、呼吸リハを実施したPH症例を数例蓄積した。各患者において、呼吸リハの前後で運動耐容能、健康関連QOL、身体活動量の改善を認めた。また、呼吸リハ前後で、心エコーの三尖弁圧較差(TRPG)に増悪がなく、安全性が示唆された。また、PH患者における6分間歩行試験中の心拍数、SpO2の推移を評価し、重症例の方が、軽症例と比較して心拍応答(心拍数上昇に時間を要する)が低下することが明らかとなった。本研究については、学会発表(Inagaki T, et al.第58回日本呼吸器学会学術講演会)、論文投稿を下記のように行いpublishされた。さらに、本研究の経過・取り組みについて、第24回日本心臓リハビリテーション学会、第28回日本呼吸ケア・リハビリテーション学会のシンポジウムで発表し、下記のようにに投稿を行った。稲垣武,寺田二郎,川田奈緒子,杉浦寿彦,坂尾誠一郎,田邉信宏,巽浩一郎:特集肺高血圧症に対するリハビリテーション肺高血圧症センター・肺移植認定施設における経験心臓リハビリテーション24,2018年,197201.また、症例蓄積の中で経験した肺移植患者の呼吸リハビリテーションの経験について、第35回日本肺および心肺移植研究会で報告した。上述したように、この1年間で呼吸リハを実施したPH症例を数例蓄積した。全例有害事象なく安全に経過し、改善効果も認めた。治療を変更してしまう例も存在するため、症例の蓄積に少し時間を要しているが研究自体は進行している。今後もPH患者に対する呼吸リハの症例数を蓄積し、改善効果・安全性の確認を行う。特に、身体機能の改善の機序の明確化、安全管理方法の確立、疾患特異的アプローチの構築が望まれる。また、6分間歩行試験中の心拍数・SpO2の解析の継続により、COPDや間質性肺炎から生じた2次性肺高血圧症(III群PH)患者の呼吸・循環応答の特徴、重症度による違い、手術や薬物療法を行うことによる心拍応答の変化についても明らかにしたい。本研究は、肺高血圧症(PH)患者に対する呼吸リハビリテーション(呼吸リハ)の効果、安全性、改善の機序の解明、疾患特異的アプローチの構築を目的とした前向き研究である。平成29年度の1年間で、呼吸リハを実施したPH症例を数例蓄積した。本研究については、学会発表、論文投稿を下記のように行なった。稲垣武,寺田二郎,矢幅美鈴,他:慢性血栓塞栓性肺高血圧症における6分間歩行試験中の脈拍数・SpO2の変化と関連する因子について;第27回日本呼吸ケア・リハビリテーション学会2017年11月17-18日上述したように、この1年間で、呼吸リハを実施したPH症例を数例蓄積した。異なる酸素投与条件下に運動負荷試験を施行し、その際に心拍出量を測定することで疾患特異的アプローチの構築を目指したかったが、平成29年度は十分なデータ収集を行うことができなかった。

今後もPH患者に対する呼吸リハの症例数を蓄積し、改善効果・安全性の確認を行う。特に、身体機能の改善と心エコーやバイオマーカー、心拍出量との関係性の検討による改善の機序の明確化、安全管理方法の確立、疾患特異的アプローチの構築が望まれる。また、6分間歩行試験中の心拍数・SpO2の解析の継続により、COPDや間質性肺炎から生じた2次性肺高血圧症(III群PH)患者の呼吸・循環応答の特徴、重症度による違いも明らかにしていきたい。特に、身体機能の改善の機序の明確化、安全管理方法の確立、疾患特異的アプローチの構築が望まれる。また、6分間歩行試験中の心拍数・SpO2の解析の継続により、COPDや間質性肺炎から生じた2次性肺高血圧症(III群PH)患者の呼吸・循環応答の特徴、重症度による違い、手術や薬物療法を行うことによる心拍応答の変化についても明らかにしたい。呼吸リハビリテーション実施症例数が予定より少なかったため、呼吸訓練器具やマウスフィルターが予定より消耗しなかった。また、Nicasシステムを用いた運動負荷試験も当該年度は実施できていないため、電極の購入を行わなかった。したがって、予定していた身体活動量計等に加えて、呼吸訓練器具(POWER Breathe MEDIC)とそのマウスフィルター、Nicasシステムの電極を症例数に応じて追加する予定である。症例数が若干少なかったため、訓練器具や評価物品の費用が少なくなった。また、シンポジウムでの発表の交通費・宿泊費は学会側が負担してくれた。
夜間頻尿の時間生物学的研究

ラットの排尿のFrequency/VolumeChart記録を確立し,夜間(活動時)は頻回排尿,昼間(睡眠時)は排尿間隔延長という明らかなサーカディアンリズムを確認できた.睡眠薬をもちいた時間生物学的検討により,睡眠薬が睡眠時のみ最大膀胱容量を増大させることから,膀胱容量は睡眠深度に関連していることが推測された.臨床においてもゾルピデムが,夜間頻尿に対し有効であることが報告されている*.このことは,ラットで認めた睡眠深度増加による膀胱容量増大効果が,ヒトにおいてもあてはまる可能性を示唆する.抗ムスカリン薬のプロピベリンのラット排尿に対する薬効は,雌では膀胱抑制に働くものの,雄では不変で性差を認めた.Okaらによれば,脳障害モデルの頻尿ラット(雄)では,プロピベリンが有意に膀胱活動を抑制することを我々と同様の実験系で示している.雄ラットでは,プロピベリンは過活動性の病的膀胱にのみ薬効を示し,正常膀胱には効果を有しないと推測された.ラットにおいては,侵襲のない排尿記録を用いて,高い確率で膀胱出口部閉塞の診断が可能であることがわかった.BOOを有するラットは,利尿時に1回排尿量の増大よりは排尿回数を増すことで対応するため,特徴的排尿記録を示すと思われる.ヒトにおける排尿は恣意的排尿等があるため,単純に臨床応用が可能かどうかは今後の課題であるが,排尿記録という非侵襲的検査により,膀胱出口部閉塞診断の可能性が発見されたことは意義深いものと思われる.ラットの排尿のFrequency/VolumeChart記録を確立し,夜間(活動時)は頻回排尿,昼間(睡眠時)は排尿間隔延長という明らかなサーカディアンリズムを確認できた.睡眠薬をもちいた時間生物学的検討により,睡眠薬が睡眠時のみ最大膀胱容量を増大させることから,膀胱容量は睡眠深度に関連していることが推測された.臨床においてもゾルピデムが,夜間頻尿に対し有効であることが報告されている*.このことは,ラットで認めた睡眠深度増加による膀胱容量増大効果が,ヒトにおいてもあてはまる可能性を示唆する.抗ムスカリン薬のプロピベリンのラット排尿に対する薬効は,雌では膀胱抑制に働くものの,雄では不変で性差を認めた.Okaらによれば,脳障害モデルの頻尿ラット(雄)では,プロピベリンが有意に膀胱活動を抑制することを我々と同様の実験系で示している.雄ラットでは,プロピベリンは過活動性の病的膀胱にのみ薬効を示し,正常膀胱には効果を有しないと推測された.ラットにおいては,侵襲のない排尿記録を用いて,高い確率で膀胱出口部閉塞の診断が可能であることがわかった.BOOを有するラットは,利尿時に1回排尿量の増大よりは排尿回数を増すことで対応するため,特徴的排尿記録を示すと思われる.ヒトにおける排尿は恣意的排尿等があるため,単純に臨床応用が可能かどうかは今後の課題であるが,排尿記録という非侵襲的検査により,膀胱出口部閉塞診断の可能性が発見されたことは意義深いものと思われる.代謝ケージを用い,SDラットの24時間排尿記録(Frequency/Volume Chart)を確立した.概略はラットを代謝ケージに入れ,自由飲水とし,排尿された尿量を電子天秤で10秒ごとに測定,このデジタルデータをパソコンに保存することで24時間の正確なF/V chartを得た.飲水量も水ボトルの重量を24時間自動計測することで記録した.ラットを明期(=昼)12時間,暗期(=夜)12時間の明暗条件下で数日間飼育した後,代謝ケージで排尿記録を行うと,明期(睡眠中)には排尿回数が減少し,暗期(覚醒活動時)に頻回の排尿を行うパターンが観察された.これは夜行性動物であるラットの排尿のcircadian rhythmと考えられる.排尿回数は明期が平均5.12±2.94,暗期が平均11.85±3.96で両者間に有意差を認めた.平均排尿量は明期が平均1.57±2.16,暗期が平均0.98±0.58でこれも両者間に有意差を認めた.時間生物薬の排尿におよぼす影響を,現在広く用いられている睡眠薬の酒石酸ゾルピデムを使って検討した.SDラットに明期の開始時に酒石酸ゾルピデム2mg/Kgを経口投与すると,明期の排尿回数に変化はないものの最大排尿量をオスで約130%,オスで約170%増大させた.なお暗期の排尿パターンには変化を認めなかった.一方,暗期の開始時に酒石酸ゾルピデム2mg/Kgを経口投与しても排尿の各種パラメーターに有意な変化は終日認めなかった.酒石酸ゾルピデムがラットの睡眠深度を変化させることはEEGを用いた検討からも報告されており,睡眠深度の変化が膀胱尿道機能に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された.昨年度の本研究で,代謝ケージを用いたSDラットの24時間排尿記録(Frequency/Volume Chart)により,明期(睡眠中)には大きな1回排尿量で排尿回数が減少し,暗期(覚醒活動時)に小さな1回排尿量で頻回の排尿を行う,ラットの排尿のサーカディアンリズムを確認できた.

本年度は前立腺肥大症をmimicする閉塞膀胱ラットを作成し,24時間排尿記録を行った.継続中の実験で,統計学的処理を行うまでに至っていないが,睡眠中の排尿回数が増加する傾向をつかんでおり,夜間頻尿モデルになるのではないかと考えている.このモデルが確立すれば,予定していた時間生物薬を投与し,夜間頻尿に対する薬効を評価する予定である.また,本年度は排尿障害のない正常覚醒ラットの排尿パターンにおよぼす塩酸プロベリン(抗コリン剤)の効果について検討を行った.塩酸プロピベリンのラット排尿に対する薬効は,雌では膀胱抑制に働くものの,雄では不変で性差を認めた.Okaらによれば,脳障害モデルの頻尿ラット(雄)では,塩酸プロピベリンが有意に膀胱活動を抑制することを我々と同様の実験系で示している.雄ラットでは,塩酸プロピベリンは過活動性の病的膀胱にのみ薬効を示し,正常膀胱には効果を有しないと推測された.さらにまた,dehydrotestosteron(DHT)投与による前立腺肥大症モデルラットを作成し,ヨーロッパを中心に広く用いられているTadenan(Pygeum africanum抽出液)のラット排尿パターンに及ぼす影響を検討した.これによればTadenanはDHTによる膀胱刺激症状を有意に抑制した.昨年度作成した実験的ラット閉塞膀胱モデルの排尿パターンの解析を,24時間排尿記録(Frequency Volume Chart)により引き続き検討した.その結果閉塞作成後6週で,ラットの睡眠期のみに1回排尿量が減少し排尿回数が増加する排尿パターンの変化を認め,ヒトの夜間頻尿を模倣する動物実験モデルとして確立することができた.またこれらのラットにおいて,ウレタン麻酔下にPressure Flow Study(PFS)を施行し,sham群と比べhigh pressure, low flowであることを確認した.さらにまた摘出膀胱湿重量がsham群と比べ閉塞膀胱ラットでは有意に増加していることも確認できた.したがって,われわれの作成した夜間頻尿モデルは明らかにpartial bladder outlet obstructionを有することが確認された.すなわち臨床的BPHに随伴する夜間頻尿のモデルを確立したと考えられる.昨年度は正常ラットに睡眠薬などの時間生物薬を投与し,睡眠期排尿パターンの変化を検討したが,本年度は前述したラット夜間頻尿モデルに酒石酸ゾルピデムや抗コリン剤などの投与を試みている.これらについては現在のところ実験を継続中で結果を示すに至っていない.さらにまた,夜間多尿による夜間頻尿の病態をラットで実現すべく,明期に入る約3時間前に飲水をsucrose入りのtap waterに変更し睡眠期のラットに利尿をつけた.結果は正常ラットも閉塞膀胱ラットもともに睡眠期の排尿回数が有意に増加した.しかし,正常ラットにおいては1回排尿量の増加も伴い,排尿回数の増加は閉塞膀胱ラットのそれよりも抑えられていた.すなわち閉塞に伴う蓄尿障害の合併は夜間多尿に伴う夜間頻尿の増悪因子と考えられる.