hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AGEs生成に着目した低糖質食による動脈硬化発症リスクの検討

本研究は、非肥満状態における低糖質食(LC)および中鎖脂肪酸を含むLC食(MCT-LC)の摂取が及ぼす影響を、実験モデルマウスを用いて検討した。LC食は、体重および血糖値に影響を与えず、腎糸球体の肥大と細動脈の硝子化を伴う腎重量の増加を示した。MCT-LC食では、副睾丸周囲脂肪重量の抑制および脂肪細胞面積の肥大抑制効果が認められた。また、腎臓ではケトン体より生成されるAGEsのNε-(carboxyethyl)lysineが、MCT-LC食で有意に低下した。非肥満状態におけるLC食は、肥満抑制はなく、脂質代謝低下や腎臓への負担増大などで生活習慣病を誘発リスクが高まることが示された。これまで、低糖質食(LC食)は血糖値を抑制し、AGEs生成を抑えるとの考えから、糖尿病、動脈硬化などの生活習慣病予防に有効であるとの報告が多くなされてきた。しかしLC食では脂肪摂取量の増加や糖質不足による脂肪酸β酸化の促進から、ケトン体生成や酸化ストレス増大が終末糖化産物(AGEs)生成を誘発する可能性も推測される。よって本研究では、LC食およびケトン体生成が増大する中鎖脂肪酸LC食(MCT-LC)がAGEs生成や生活習慣病発症に与える影響を検討し、その安全性について解析することを目的とした。今年度はLC食および中鎖脂肪酸LC食の短期的摂取による、生体内ケトン体およびAGEs生成への影響を検討した。6週齢C57BL6/JマウスにControl食(糖質60%、大豆油20%)、LC食(糖質20%、大豆油20%、ラード25%)、MCT-LC食(糖質20%、大豆油20%、MCT油25%)をそれぞれ2週間自由摂取させ解剖を行った。MCT-LC食はLC食に比し血糖値上昇の抑制効果が確認されたが、体重や内臓脂肪抑制については有意な影響が認められなかった。ケトン体、AGEsについては、測定手技の確立が必要であり、動脈硬化への影響については今後さらなる検討が必要である。一方、精巣上体脂肪組織においてLC群で有意に減少する糖転移酵素のmRNAがいくつか発見された。糖転移酵素はたんぱく質の糖鎖付加を調節し様々な生体機能調節に重要な役割を果たす。今後は、LC食およびMCT-LC食のAGEs生成を含めた動脈硬化への影響に加え、糖転移酵素の活性低下との関連についても解析を進める予定である。LC食では血中ケトン体が高値となることが予想されたが、実験飼料組成(糖質・脂質含有量)や絶食時間等が影響し、有意な変化を得ることが出来なかった。またAGEs測定については個体差が大きく、安定した測定手技を得るのに時間を費やしたことも、予定よりも実験計画を遅らせている。一方で、内臓脂肪において発見された糖転移酵素発現低下は興味深く、今後検討を進めていきたいと考えている。近年、新たな食事療法として注目される低糖質食(LC)や中鎖脂肪酸(MCT)は、体脂肪抑制効果あるとして注目される一方で、酸化ストレスや腎機能への悪影響など安全性が危惧されている。H26にはLC食および中鎖脂肪酸含有LC食(MCT-LC)の短期的な影響を検討した。本年度(H27)は、LC食および中鎖脂肪酸含有LC食(MCT-LC)の長期的摂取が腎機能に与える影響について、組織学的観察を含め解析を行った。【方法】6週齢のC57BL6/j雄マウスにControl食(糖質60%、大豆油20%)、LC食(糖質20%、大豆油20%、ラード25%)、MCT-LC食(糖質20%、大豆油20%、MCT油25%)をそれぞれ12週間自由摂取させ解剖を行った。【結果】体重では各群間に有意な変化がない一方で、副睾丸周囲脂肪重量は、MCT-LC群がControl群に比し有意に低値を示した。随時血清中のケトン体レベルは、LC群およびMCT-LC群が有意に高い値を示し、低糖質食の摂取は慢性的にケトン体生成が高まっていることが確認された。一方で空腹時血清中のケトン体レベルはMCT-LC群が最も低値となり、絶食時におけるケトン体の利用率が高まっていることが推測された。血中グルコースは、各群間に有意な差異を認めなかった。また、腎臓重量は、LC群およびMCT-LC群で有意に高く、特にMCT-LC群では顕著な腎臓の肥大が見られた。腎臓の組織学的観察において、LC群およびMCT-LC群で糸球体小血管の肥大および硝子化が認められた。【結語】低糖質食の長期的摂取において、体重抑制効果は認められなかったが、低糖質食と中鎖脂肪酸の同時摂取は、長期的な内臓脂肪の蓄積抑制効果があることが示された。一方で、低糖質食は、腎臓の組織的な変化をもたらし、腎機能を低下させる可能性が示された。AGEs測定について、安定した測定手技を得ることが困難であり、検討に時間がかかっているため。食事療法として注目される低糖質食(LC食)の生体への安全性については不明な点が多く、特に非肥満状態での影響については充分な検討がなされていない。よって本研究では、非肥満状態でのLC食の摂取が、生体に与える影響を検討することを目的とし研究を行った。

H26、27年度はLC食および中鎖脂肪酸含有LC食(MCT-LC食)の短期的および長期的摂取の影響について、体重変化、内臓脂肪蓄積量、腎臓について検討を行った。その結果、LC食では体重抑制および内臓脂肪蓄積量に有意な効果を認めなかった。一方でMCT-LC食は、内臓脂肪蓄積に対し長期的な抑制効果が認めた。また、LC食、MCT-LC食では糸球体小血管の肥大および硝子化を伴う腎臓の増大化が示された。本年度(H28)は、前年度で変化が認められた腎臓および脂肪組織の機能変化について、糖化最終産物(AGEs)生成を含め、さらに詳細に組織学的解析を行った。腎臓のAGEs生成量は、N-epsilon-(carboxyethyl)lysineはMCT-LC食で低下し、N-epsilon-(carboxymethyl)lysineはLC食による著しい低下が見られた。内臓脂肪組織(副睾丸周囲脂肪組織)の脂肪細胞では、LC食で肥大傾向がみられると同時にアディポサイトカイン分泌についても変化を認めた。以上の結果より、非肥満状態でのLC食の長期的摂取は、体重や内臓脂肪蓄積には抑制効果は認められず、腎臓では組織的変化やAGEs生成変化から腎機能を低下させる可能性が示された。一方で、LC食と同時に中鎖脂肪酸を同時摂取することで、非肥満状態においても長期的な内臓脂肪の蓄積抑制効果をもたらす可能性が示された。本研究は、非肥満状態における低糖質食(LC)および中鎖脂肪酸を含むLC食(MCT-LC)の摂取が及ぼす影響を、実験モデルマウスを用いて検討した。LC食は、体重および血糖値に影響を与えず、腎糸球体の肥大と細動脈の硝子化を伴う腎重量の増加を示した。MCT-LC食では、副睾丸周囲脂肪重量の抑制および脂肪細胞面積の肥大抑制効果が認められた。また、腎臓ではケトン体より生成されるAGEsのNε-(carboxyethyl)lysineが、MCT-LC食で有意に低下した。非肥満状態におけるLC食は、肥満抑制はなく、脂質代謝低下や腎臓への負担増大などで生活習慣病を誘発リスクが高まることが示された。LC食およびMCT-LC食によるケトン体生成への影響を解析するため、時間軸を追った血中ケトン体の測定を行い、絶食後に血中ケトン体がピークとなる時間を検討する。さらに、LC食およびMCT-LC食の短期および長期的摂取による変化について比較検討を行なう。また、AGEsの測定については、安定した測定方法を検討し、LC食およびMCT-LC食による影響を解析する。一方で、H27年度に発見されたLC食マウスの精巣上体脂肪組織においてmRNAが有意に減少した糖転移酵素が、アディポサイトカイン産生や糖代謝等影響する可能性があり、それら項目が動脈硬化に与える影響についても解析を進めていく予定である。本年度認められた、低糖質食による腎臓の組織学的変化をさらに詳細な解析を進める予定である。具体的には、腎機能の指標とされる血中バイオマーカーの測定と、AGEs生成との関連を検討するために、抗AGEs抗体を用いた免疫染色や腎臓中AGEsの測定実施を計画している。なお、低糖質食によるAGEs生成の増加が認められた場合は、抗糖化食品成分の摂取がLC食による腎機能変化の抑制が可能かについて、検討する予定である。栄養学、栄養生理学、栄養生化学次年度は当初計画に加え、内臓脂肪の糖移転酵素発現低下について実験を実施することに伴い、予算確保のため次年度に繰り越すこととした。AGEsの安定した測定法の検討に時間を費やし、抗糖化食品成分の投与を行う実験計画が進行できなかったため。
臨床分離株におけるプラスミド性ニューキノロン耐性遺伝子の分離頻度と薬剤感受性

プラスミド性フルオロキノロン耐性遺伝子の分離頻度を調べるために、国立感染症研究所細菌第二部に保存してある大腸菌を対象としてPCR法を用いて耐性遺伝子の保有状況を調べた。2002年から2006年に送付された751株を対象とした。PCR法による検査の結果qnrを保有する菌株は見つからず、qepAを保有する菌株は2株であった。このことから日本の医療現場から分離されるプラスミド性フルオロキノロン耐性遺伝子を保有する大腸菌はまれである可能性が高い。平成19年度の研究においてプラスミド性フルオロキノロン耐性遺伝子の分離頻度を調べる前段階として国立感染症研究所細菌第二部に保存してある大腸菌を対象としてPCR法を用いて耐性遺伝子の保有状況を調べた。PCR法による検査の結果qnrを保有する菌株は見つからず,qepAを保有する菌株は2株であった。今後の研究においては菌株採取期間を設定し,大腸菌およびその他の腸内細菌科の菌種についても検討を行う。平成20年度の研究においてプラスミド性フルオロキノロン耐性遺伝子保有菌株を一般の臨床現場でもスクリーニングするために簡便な検査方法の開発をおこなった。平成19年度の研究においてプラスミド性フルオロキノロン耐性遺伝子の一つであるqepAをPCR法を用いて検出するためのプライマーを設計したが、qepAのGC含量が非常に高いため(72%)PCRのアニーリング温度を6065°Cと高めに設定する必要があり、反応産物も199bp程度にしかならなかった。平成20年度は一般の臨床検査室でも検査が行えるよう、PCR法に用いるサーマルサイクラーのような特殊な実験機器が必要ないLAMP法による検出系の開発を行うこととした。LAMP法では複数のプライマーを設計する必要があり、qepAについて作成を試みた。qepA保有株4株を対象としてプライマーの性能を調べたが、設計したプライマーではqepAを検出することができなかった。この原因にはPCR法と同じくqepAのGC含量が高いため、十分なLAMP法による反応産物の生成が行われないためだと考えられた。これらの結果から、来年度は引き続きLAMP法などの分子生物学的な検出方法による検出系の開発を試みるとともに特異的な抗体を作成するなど免疫学的な手法などについても検討し、新たなスクリーニング法を開発する予定である。また所属する部署には多数の臨床分離されたグラム陰性菌が保管してあるが、分離率を調べるためには同一の期間に同一の条件で収集した菌株が必要となるため、平成21年度には全国の医療機関から検出方法の検討と合わせて菌株の収集も行う予定である。前年度までに、PCR法によってプラスミド性ニューキノロン耐性遺伝子の分離頻度を国立感染症研究所細菌第二部に保存してある大腸菌を対象として調べたプラスミド性ニューキノロン耐性遺伝子による最小発育濃度の変化は非常に小さいため、従来の方法ではこれらの遺伝子を保持する臨床菌株をスクリーニングすることは不可能である。PCR法によりスクリーニングは可能ではあるが、一般の医療機関の検査室で実施することは難しいことから、平成21年度はサーマルサイクラー等の特殊な機器は必要ないLAMP法を用いた検査法を構築することとした。この結果、プラスミド性ニューキノロン耐性のうち、薬剤排出ポンプタンパクをコードするQepA遺伝子を検出するためのプライマーセットを作成することができた。
一卵性双生児摂食障害発症不一致例におけるゲノム差異の検出

本研究の目的は,一卵性双生児摂食障害不一致例の発症者と非発症者のゲノムをRLGS法により比較し,ゲノムの差異を検出し,差異を示したDNA断片の染色体上の位置をマッピングして摂食障害に関連する遺伝子の一部を解明することである.研究の方法としてRLGS法を用いるが,この方法は標準制限酵素Not I認識部位の3%強をディスプレイするに過ぎないので現在山下(1998)が開発した非RIゲノム比較解析法の技法を現在習得中である.また,一卵性双生児には約3/4に血管吻合による相互のゲノムの交叉が否定できないため、末梢血ばかりでなく口腔粘膜から抽出したDNAの解析も検討中である.本年度は一卵性双生児で一方が摂食障害に罹患し,他方が罹患していない症例を診察する機会を得たので採血を行い,血液からフェノール法によりDNAを抽出した.来年度にRLGS法によってゲノムの差異の有無について検討する予定である.本研究の目的は,一卵性双生児摂食障害不一致例の発症者と非発症者のゲノムをRLGS法により比較し,ゲノムの差異を検出し,差異を示したDNA断片の染色体上の位置をマッピングして摂食障害に関連する遺伝子の一部を解明することである.研究の方法としてRLGS法を用いるが,この方法は標準制限酵素Not I認識部位の3%強をディスプレイするに過ぎないので現在山下(1998)が開発した非RIゲノム比較解析法の技法を現在習得中である.また,一卵性双生児には約3/4に血管吻合による相互のゲノムの交叉が否定できないため、末梢血ばかりでなく口腔粘膜から抽出したDNAの解析も検討中である.本年度は一卵性双生児で一方が摂食障害に罹患し,他方が罹患していない症例を診察する機会を得たので採血を行い,血液からフェノール法によりDNAを抽出した.来年度にRLGS法によってゲノムの差異の有無について検討する予定である.
TLR3応答制御におけるmTORC2の脂質センサーとしての機能の解析

代謝と免疫応答は密接に関わっており、その連携基盤の解明は重要な課題である。我々は、これまでに代謝センサーmTORの複合体であるmTORC2が自然免疫受容体TLR3の応答制御機構のマスター遺伝子であることを示した。しかし、mTORC2は何を認識するのか不明瞭であった。申請者の予備的結果により、mTORC2が脂肪酸を認識することでTLR3応答を制御していることが示唆された。本研究ではTLR3応答をアウトプットにすることでmTORC2が脂質センサーであることを検証し、細胞生存に必要な代謝物である脂肪酸がmTORC2を通して免疫応答の許容または禁止を制御するという新たなスキームを確立する。
サルコペニア概念を参考にした高齢者口腔機能低下モデルの検討に関する調査研究

本研究の基礎資料を得るため東京都健康長寿医療センター研究所が主催する健康調査事業に参加した65歳以上の高齢者を対象に実態調査が行われた。咀嚼機能評価として咀嚼力判定ガムを用いたところ、咀嚼良好群は466名、咀嚼不良群は318名であった。また咀嚼機能と低栄養についてロジスティック回帰分析を行った結果、有意な関わりを示した(栄養良好群: 0、低栄養群: 1、OR:0.770、95% CI:0.297-0.986)。この研究は2017年老年医学会にて発表を行った。また口腔機能の低下とサルコペニアの関連が注目されてきているなか、栄養摂取に関連する咀嚼筋の筋量を測定する意義は大きいと考え、千葉県柏市における地域在住高齢者53名を対象に追加の調査を行った。咬筋のMRI撮影およびノギスによる測定と超音波画像計測装置を用いて咬筋体積の計測をし、更に咬筋体積を簡易に推定する方法を開発しMRIによる咬筋体積と比較することで妥当性の検証を行った。また推定咬筋体積とサルコペニアの関連についても検討した。ノギスと超音波画像計測装置による推定咬筋体積は、MRIによる咬筋体積と有意な相関(r=0.903)を認め、簡易評価法として十分な結果が得られた。男性では非サルコペニアとプレサルコペニアに差はなかったが、サルコペニアでは有意に低かった。一方、女性ではプレサルコペニアの段階から有意に低く、サルコペニアでは更に低値を示した。以上よりサルコペニアが疑われる高齢者、特に女性においては咬筋量の減少も疑い簡易評価法を用いて評価する必要性が示唆された。この研究は2018年老年歯科医学会にて発表予定である。これらの調査・研究を元に、来年度、高齢者口腔機能低下モデルの作成を行う予定であったが、平成30年3月をもって現在の職を辞することとなったため研究中断の運びとなった。(1)地域在住高齢者を対象とした調査の実施東京都健康長寿医療センター研究所が主催する健康調査事業に参加している東京都板橋区在住の65歳以上の高齢者を対象に実態調査を行った。老年症候群の早期発見、早期治療のための包括的健診の案内を郵送し、東京都板橋区内の9つの町丁目在住の65歳85歳の男女に、施設入居者と過去の当研究における介入研究等参加者を除いた約7,000名に対し行われた。このうち約1300名から参加希望があり、実際の来場者は約700名であった。調査項目は1.口腔関連項目:現在歯数、機能歯数、咬合力、咀嚼機能、咬筋・側頭筋触診、超音波による咬筋の厚み計測、咬筋の高さと横幅の測定、口腔機能スクリーニング検査(水飲みテスト、反復唾液嚥下テストなど)、口腔清掃状態。2.身体機能検査:通常歩行速度、握力。3.身体組成:身長、体重、四肢骨格筋量。4.認知機能検査。5.うつ尺度。6.生活機能:老研式活動能力指標、基本チェックリスト。7.栄養指標:採血データ、食品多様性スコア、簡易栄養状態評価を用いた。(2)実際の臨床現場に即した調査項目の選定今回、行った調査項目をもとに高齢者口腔機能低下モデルによる口腔機能低下と、他の項目との関連性の検討を行った。また都市部在住高齢者だけでは対象者の選定に偏りが考えられたため、加えて地方在住の高齢者についても調査を行った。更に臨床でも応用できるような、より簡便な口腔関連項目を用いて高齢者口腔機能低下モデルを評価できるか、評価項目の再検討をおこなうための意見交換を、実際に臨床を行っている歯科医師や歯科衛生士と行った。今回、研究対象とした調査は毎年、東京都健康長寿医療センター研究所が主催して行っているものであり、例年通り実施された。高齢者口腔機能低下モデル作成のために臨床応用しやすい検査項目の選定の意見交換を行った。実際の選定については翌年以降の調査でも追加の資料を集めた後で再度検討となったため選定に至っていないが、全体を通してはおおむね順調に進展している。

ノギスと超音波画像計測装置による推定咬筋体積は、MRIによる咬筋体積と有意な相関(r=0.903)を認め、簡易評価法として十分な結果が得られた。男性では非サルコペニアとプレサルコペニアに差はなかったが、サルコペニアでは有意に低かった。一方、女性ではプレサルコペニアの段階から有意に低く、サルコペニアでは更に低値を示した。以上よりサルコペニアが疑われる高齢者、特に女性においては咬筋量の減少も疑い簡易評価法を用いて評価する必要性が示唆された。この研究は2018年老年歯科医学会にて発表予定である。これらの調査・研究を元に、来年度、高齢者口腔機能低下モデルの作成を行う予定であったが、平成30年3月をもって現在の職を辞することとなったため研究中断の運びとなった。平成28年度に引き続き調査を継続し、統計学的手法を用い調査内容の検討と問題点の検出を行い、より簡便に計測できる高齢者口腔機能低下モデル項目の選定を行っていく。また前年度に来場した対象者の中から、高齢者口腔機能低下モデルによって口腔機能低下と判定されたものの摂食嚥下障害や栄養状態低下の経年変化を観察・検証する。更にこれらの研究内容の実施状況を学会等で発表を行っていく予定である。平成28年度は、全身の運動機能と口腔関連項目の測定を行い、横断における高齢者口腔機能低下モデルの有病率と関連因子の検討に関する意見交換を行った。ただ調査員の確保が困難であり、当初予定していた人員よりも少ない人数で調査を行ったため、平成28年度の使用額が予定額に到達せず、次年度使用額が生じた。引き続き、調査を実施するための物品の購入、調査員の人件費、交通費への使用と、また研究成果を学会等に発表も検討しており、旅費などに研究費利用を検討している。
超臨界流体プラズマ法による新規カーボンナノ材料の創製

誘電体バリア放電、および、直流放電をベースにしたCO_2およびXe超臨界流体プラズマのな発生を行い、リサージュ測定からその電子密度が10^<18-22>cm^<-3>という超高密度であることを明らかにした。またCO_2超臨界プラズマの顕微ラマン分光より、ラマンピークの低波長側へのシフトが見られ、通常考えられる、温度の上昇による効果とは逆のシフトであり、分子の形態の変化が示唆された。またカーボン系ナノ構造物質合成プロセスへの応用を行った。scCO_2中でのプラズマプロセスでは特に、プロセスの温度、圧力依存性や、周波数依存性を精緻に調べ、SCFプラズマプロセスの知見を深めた。結果、適用したアーク、DBD、どちらの放電形態においても、scCO_2中でのプラズマプロセスにより、CO_2を炭素源としてカーボンナノチューブ、カーボンナノホーン等、多量のカーボン系ナノ構造物質の合成に無触媒、低いプロセス雰囲気温度で成功し、新たな反応経路を利用した物質合成に実現した。特に3kHzの交流電圧を印加したDBD法の際に、多量のナノ構造物質の合成に成功した。SCF中でのプロセスと比較するために高圧ガス中、および液体中でのプロセスも行なったが、高圧ガス中ではほぼアモルファスカーボンの合成しか確認されず、SCFよりも高密度となる液体中でのプロセスにおいても、部分的にナノチューブ等のナノ構造物質の合成は確認されたが、SCF中でのプロセスに比べると少量で、ナノ構造物質が密集した集合体も確認されなかった。これは、ゆらぎの大きいSCF中でのプロセスにおいては、ナノ構造物質の合成に適した条件(密度、種となるクラスターの大きさ等)となる点が存在しやすい、もしくは特異な雰囲気であるSCFとプラズマとの界面において、これらナノ構造物質の合成に優位に働く特殊なメカニズムが存在するのではないかと推測される。
作物の高二酸化炭素濃度応答に及ぼす無機窒素形態の影響の解明

本研究では、将来の高CO2濃度環境で作物生産を向上させ、品質を確保する適応型肥培管理の開発を念頭に、無機窒素形態に対する反応が異なる作物種において、アンモニアあるいは硝酸を単独で供給した場合に高CO2に対する応答性が異なるかどうかを調査した。高CO2による乾物生産の促進は、好アンモニア性のイネでは硝酸供給下よりもアンモニア供給下で顕著であったが、好硝酸性のエンドウとホウレンソウでは反対に硝酸供給下で顕著であった。高CO2による体内窒素含量の低下は、ホウレンソウでのみ、アンモニア供給下よりも硝酸供給下で顕著に見られた。この窒素含量の低下には窒素吸収よりむしろ葉の硝酸還元能の低下が関与していた。近年、将来の高CO2濃度条件においては植物のNO3-利用が抑制される為、肥料としてのNH4+の重要度が増すと報告された。本研究では高CO2を高度利用する施肥法の方向性を示す為に、数種の作物の高CO2応答に及ぼすNO3-、NH4+施用の影響を明らかにする。本年度は、以下の2点について結果を得た。1.通常CO2および高CO2と、硫安区、硝カル区および尿素区を設け、組み合わせ6条件でエンドウとホウレンソウを栽培し、栄養生長期の乾物重、粗タンパク含量、葉のNO3-濃度、NH4+濃度、硝酸還元酵素(NR)、亜硝酸還元酵素(NiR)、グルタミン合成酵素(GS)活性を調査した。両種において、硝カル区、尿素区では高CO2による地上部重の増加が見られたが、硫安区ではCO2の影響が見られなかった。尿素区や硫安区の値が硝カル区のそれを上回ることは無かった。粗タンパク含量に関しては、ホウレンソウでは硝カル区でのみ高CO2による低下が見られ、エンドウでは硝カル区と尿素区で高CO2による低下が観察された。ホウレンソウでは硝カル区において、高CO2により葉NO3-濃度が上昇し、NRとNiR活性が低下した。エンドウではそれらにCO2の影響は見られなかった。エンドウでは高CO2下でNH4+濃度が低下し、GS活性が増加した。一方、ホウレンソウではそれらにCO2の影響は無かった。以上のように、窒素代謝の高CO2応答には明確な種間差が存在し、「高CO2条件においてはNO3-利用が抑制される為、NH4+の重要度が増す」とは必ずしも言えないと結論した。2.溢泌液中の窒素濃度計測による窒素吸収速度の評価法については、溢泌液を十分な量を得ることが出来ないことが分かった。その代替として重窒素を利用した手法を適用した。また、同化箱法による葉からのNH3放出の計測システムを作成し、作物2種に適用した。近年、将来の高CO2濃度環境においては、植物による硝酸態窒素の利用が抑制されるため、アンモニア態窒素の重要度が増すと報告された。本研究では、将来のCO2濃度環境に適応する施肥法の方向性を示す為に、異なる作物種における高CO2濃度応答に及ぼすアンモニア、硝酸施用の影響を明らかにする。本年度は、以下の結果を得た。1)乾物生産・窒素蓄積の高CO2濃度応答に及ぼす無機窒素形態の影響解明:好アンモニア性のイネ、好硝酸性のダイズ、エンドウおよびホウレンソウを、通常CO2濃度区(AMB、約390ppm)と高CO2濃度区(ELV、約590ppm)、硝酸カルシウムを施用した硝カル区と硫安を施用した硫安区の組み合わせ4条件で栽培し、播種後4050日目に、地上部重、粗タンパク含量、葉の硝酸濃度を調査した。4種の地上部重は、無機窒素形態に関係なく、ELVで増加し、その増加は、イネ、エンドウでは硝カル区より硫安区で大きかったが、ダイズ、ホウレンソウでは、硝カル区で大きかった。また、ホウレンソウでは、硫安区で地上部重は著しく低かった。粗タンパク含量は、イネ、エンドウでは、窒素形態に関係なく、ELVで低下した。ホウレンソウでは、硫安区でELVの効果は見られなかったが、硝カル区で著しい低下が見られた。ダイズでは、ELVによる増減は見られなかった。イネ、ホウレンソウでは、硝カル区の葉硝酸濃度がELVで増加したが、ダイズ、エンドウでは、反対に低下した。以上のように、ELVで、硝酸利用が阻害されるので、アンモニア態窒素の重要性が増すとは必ずしも言えなかった。2)窒素吸収、同化および放出の評価法の確立:生葉における光呼吸速度および硝酸還元活性の推定法をホウレンソウに適用できた。葉の硝酸、亜硝酸還元酵素活性の測定条件を決定した。

近年、将来の高CO2濃度([CO2])においては「植物の硝酸利用が抑制される為、肥料としてのアンモニア態窒素の重要度が増す」と提案された(Bloomら、2010、Science)。本研究では将来増加する[CO2]を高度利用する施肥法の方向性を示す為に、数種作物の乾物生産や窒素濃度の高[CO2]応答に硝酸およびアンモニア態窒素がどのような影響をおよぼすのかを調査し、高[CO2]下で見られる窒素濃度の低下と吸水や窒素吸収能の関係性について解析した。エンドウとホウレンソウを対象に、通常[CO2]および高[CO2]と、アンモニア供給区および硝酸供給区を組み合わせた条件で水耕栽培し、栄養成長期の乾物生産、窒素濃度を調査するとともに、水耕液中に15Nでラベルされたアンモニア態と硝酸態窒素を添加し、24時間の吸水速度と15N吸収速度を調査した。これまでに得た結果と同様に、両種において硝酸供給区でのみ高[CO2]による乾物重の増加が確認された。窒素濃度は、エンドウでは両窒素供給区で[CO2]の影響を受けなかったが、ホウレンソウでは硝酸供給区でのみ高[CO2]による低下が見られた。個体当たりの吸水速度は、エンドウでは[CO2]の影響を受けなかったが、ホウレンソウでは硝酸供給区でのみ高[CO2]による増加が見られた。個体当たりの15N吸収速度は、両種において硝酸供給区でのみ高[CO2]により増加した。これまでに、ホウレンソウにおいて、硝酸供給区で高[CO2]により葉の硝酸還元活性が低下し、硝酸濃度が上昇することを明らかにした。本種における高[CO2]下での窒素濃度の低下は、吸水や窒素吸収量の低下では説明できず、硝酸還元能の低下あるいは炭素蓄積による希釈に因るものと考えられた。本年度の結果もまた「高[CO2]においては硝酸利用が抑制される為、アンモニア態窒素の重要度が増す」を支持しなかった。作物学、農業気象学研究実績の概要にあげた1)は、当初の実施計画に予定していたものであり、高[CO2]下では、硝酸窒素利用が阻害されるので、NH4+の重要性が増すという説は多くの作物種を対象に一般化できないと結論した。また、NO3-還元やNH4+同化の高[CO2]応答には明確な種間差があることを見出した。2)に関しては、当初予定していた窒素吸収の評価手法の確立には至らなかったが、別手法を試行した。NH3放出の評価法については確立できたので、おおむね順調に進展していると判断した。研究実績の概要にあげた項目1)は、当初の実施計画に予定していたものであり、ここでは、数種作物を用いて、高CO2濃度下では、硝酸窒素利用が阻害されるので、アンモニア態窒素の重要性が増すという説は、必ずしも支持されないことを明らかにし、これから公表していく予定である。項目2)に関しては、当初予定していた窒素吸収や放出の評価法の適用、確立までには至らなかった。ホウレンソウでの高CO2による粗タンパク含量低下には、NRとNiR活性抑制が部分的に関与していると考えられた。2014年度は、ホウレンソウとエンドウの窒素吸収およびNH3放出の高CO2応答に及ぼす無機窒素形態の影響を解析し、高[CO2]による粗タンパク含量の低下への窒素吸収とNH3放出の関与について精査する。両種を対象に、通常[CO2]および高[CO2]と、NH4+区とNO3-区(窒素源はそれぞれNH4ClとKNO3とした水耕条件)の組み合わせ6条件で栽培し、栄養生長期の地上部重、地下部重、粗タンパク含量(ケルダール法)、蒸散速度(重量法)、窒素吸収速度(15N分析)、光合成速度、NH3放出速度(同化箱法)を調査する。2013年度は、以下の2項目について実施する。
宇宙からの地球観測技術教育プログラムの構築と実践的研究

人工衛星に搭載されたセンサを用いた宇宙からの観測によって地球環境の全容が明らかにされつつある。本研究課題では、地球観測技術の仕組みを理解しつつ地球環境問題を科学技術的な側面から考察できる人材の育成をねらいとし、「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」の構築を行うとともに、地球観測用電波を学習者自身で識別できる教材・教具を開発し、本教育プログラムの部分的な教育実践に基づきその有用性を検証した。砂漠化や森林破壊などの広域的な環境変化、火山活動や地震による地殻変動などの地球環境の状態は、宇宙からの全球的な観測によりその全容が明らかにされつつある。本研究課題では、地球観測技術の仕組みを理解しつつ地球環境問題を科学技術的な側面から考察できる人材の育成をねらいとし、中学生以上を対象として教育実践可能な「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」の構築と検証・評価を目的とする。平成24年度は、これまで研究開発してきた人工衛星による地球観測をリアルタイムで体感できる学習支援機器である電波観測教材を用いた「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」の授業実践を計画し、研究用合成開口レーダ(SAR)を搭載した人工衛星である欧州宇宙機関(ESA)の人工衛星ENVISATを利用する予定であった。ところが,ENVISATは平成24年4月に運用を終了し、日本またはESAの研究用SARを搭載した人工衛星がすべて利用できなくなった。そのため、平成24年度は擬似的にSAR信号を生成する電子回路を開発し、電波観測教材を制御するためのソフトウェアを用いてレーダ波を識別できることを確認するとともに、教育的な配慮に基づき地球観測技術を視覚的かつ直感的に分かりやすく実習できるようにソフトウェアを改良した。さらに、教材となるレーダ波を受信するためのホーン型アンテナを中学生が製作できるように設計し、LまたはCバンドの電波を送受信可能な無線機を用いて実験できる環境を整備した。平成25年度は、当初教育利用を計画していた研究用合成開口レーダを搭載した人工衛星が運用体制とならず「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」を教育実践することができなかったが、立案した本プログラムの学習指導内容を模擬授業として実施できるようにした。研究用合成開口レーダを搭載する人工衛星として平成26年4月にヨーロッパ宇宙機関によって打ち上げ予定のSentinelー1(Cバンド)、及び、平成26年5月に宇宙航空研究開発機構によって打ち上げ予定の陸域観測技術衛星2号(ALOSー2、Lバンド)を対象とする学習支援機器と教育用ソフトウェアを開発した。疑似合成開口レーダ波発生装置を用いることによって、開発した学習支援機器による合成開口レーダの電波の識別の可能性が示唆された。さらに、教材となる合成開口レーダの電波を受信するためのホーン型アンテナを中学生が製作できるように設計・試作し、LまたはCバンドの電波を送受信可能な無線機による実験設備を整備した。研究用合成開口レーダを搭載した人工衛星の利用ができなくなったため「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」の教育実践に基づく有用性と課題を明らかにすることができなかった。Sentinelー1やALOSー2等の運用体制が整備された後、本プログラムを教育実践し、その有用性と課題を明らかにするとともに、学校教員等に対して啓発する予定である。平成23年度は、これまでの地球観測技術の教育利用とその研究成果を省察するとともに地球環境問題を取り上げた教育に関する文献調査を行った。中学校を訪問し地球環境問題を取り上げた教育実践事例、地球観測技術の教育利用例などについて聞き取り調査を行い、学校に導入されている教育用コンピュータシステムの現況を調査した。これらの結果を参考として研究開発する教育用ソフトウェア環境の仕様を定めた。地球環境問題と宇宙からの地球観測技術教育に関する学校教員に対する意識調査を行った結果から具体的な学習指導内容と時間数を定め「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」を構築した。本教育プログラムの教育実践に必要とされる教材・教具のうち、人工衛星による地球観測をリアルタイムで体感できる学習支援機器である電波観測教材を開発・製作した。本教材を用いて電波観測を行う研究授業を中学校において実践し、教育利用できることを確認した。教育用ソフトウェア環境は、地球観測技術を視覚的かつ直感的に分かりやすく実習できる点を重視し研究開発した。

授業実践時に用いる予定であった人工衛星の運用が終了し、その代替え手段として擬似SAR信号発生器と無線機を用いることとしたため。研究目的を達成するために立案した平成23年度の研究実施計画が妥当であったため。当初予定していた研究用SARを搭載した人工衛星の利用ができなくなったため「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」を模擬授業として実践し、その有用性と課題を明らかにする。さらに、平成25年度中に宇宙航空研究開発機構(JAXA)によって運用開始される予定の陸域観測技術衛星2号(ALOSー2)に搭載されるSARを教育利用する場合に必要となる学習支援機器と教育用ソフトウェア環境の改良点も示す。「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」を学校教員に対して啓発するために、本研究で得られた成果をまとめ学術雑誌に論文投稿するとともに、公開可能な教材・教具をインターネットなどを通して開示する。これまでに研究開発した学習支援機器を用いて地球観測用電波等の観測実験を行い、アンテナの形状を学習者が製作しやすいように設計するとともに、学習者が地球観測技術を体感できるような伝達方法を研究する。「宇宙からの地球観測技術教育プログラム」の詳細な学習指導計画を立案するとともに、教示用資料と学習ワークシートなどを開発する。本プログラムに従った教育を中学校において実践し、教育実践の前後で地球環境問題と地球観測技術関する学習者に対する意識調査を実施する。研究費のうち物品費は人工衛星による地球観測をリアルタイムで体感できる学習支援機器の実験に基づく改良とアンテナの設計製作用に当てる。物品費を除く研究費は、国内外学会などにおける研究成果の公表のための旅費、資料整理と研究補助のための謝金、教育用ソフトウェアの開発費に当てる。物品費を除く研究費は、国内外学会などにおける研究成果の公表のための旅費、研究補助等のための謝金、教育用ソフトウェアの開発費に当てる。
シャコ貝と渦鞭毛藻の共生に関わる因子の探策

沖縄産シャコ貝(ヒメジャコ、Tridacna crocea)の外套膜に共生する渦鞭毛藻(Symbiodinium属)の種類を明らかにするために、まず株化された渦鞭毛藻を用いて分子系統解析法の確立を行なった。藻体よりゲノムDNAを抽出後、5.8SrRNAのITS領域および18SrRNAのV1領域をPCRにより増幅し、ダイレクト・シークエンス法により配列を決定した。続いて、分子系統解析ソフトPhylipを使用して、近隣接合法(NJ)により渦鞭毛藻の系統関係を解析した。その結果、これまで未知であった株の系統が明かとなった。この方法を用いて、つぎに実際のシャコ貝にどのような種類の渦鞭毛藻が共生しているのかを調べた。これまで、シャコ貝には複数種の渦鞭毛藻が共生していることはわかっていたが、どのような種がどのくらいの割合で共生しているのかは不明であった。そこで、ヒメジャコの外套膜より取り出した藻体を用いてDNAを抽出し、PCRを行なった。続いて、このPCR産物をプラスミドベクターに組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションした。現在は、得られてきたコロニーに対しコロニーPCRを行ない、ひとつひとつのコロニーがどの種類の渦鞭毛藻に由来したDNAを持っているかを制限酵素とシークエンスを併用して決定する方法を確立している。また、渦鞭毛藻の系統に対応して興味深い低分子化合物がさまざま産生されていることが明らかになってきた。その中には、新規化合物であるzooxanthellamide類やzooxanthellactoneなども含まれる。これらの化合物が共生過鞭毛藻に特異的であることから、何らかの共生現象に関わっている可能性が期待される。沖縄産シャコ貝(ヒメジャコ、Tridacna crocea)の外套膜内に共生する植物性プランクトン(渦鞭毛藻)類の単離とフラスコ培養の系を確立した。同時に、入手した沖縄産イワスナギンチャク(Palythoa tuberculosa)からも同様に、共生する渦鞭毛藻を単離することに成功した。こうして得られた共生渦鞭毛藻を今後の実験に使ってゆく。また、研究代表者らの研究施設ではすでに幾つかの渦鞭毛藻ストック株が幾つかあるので、これらも合わせて実験に使用する。単離した渦鞭毛藻は、その遺伝的な関係を調べるために分子系統解析を行う。具体的には、small subunit ribosomal RNA geneの配列の一部をPCRで増幅し、その配列を解析する。そのための効率的なDNA抽出法を検討した。その結果、藻体を海砂と共に液体窒素で凍結したあと、凍ったまま乳鉢ですりつぶし、それから通常のDNA抽出を行うとよいことが明かとなった。DNAの抽出には植物細胞用のDNA抽出キットの使用が効果的であることも判った。つぎに、これらの渦鞭毛藻およびホストの側からのタンパク質と低分子化合物の抽出法の検討を行った。その結果、タンパク質は界面活性剤CHAPSと尿素を用いると比較的再現性のよい抽出ができることがわかった。また、藻類の破砕には瑪瑙の乳鉢を用いるのが効果的であることが判った。低分子化合物の抽出には70%エタノール中で破砕する方法を検討した。今後、こうして得られたタンパク質成分および低分子有機化合物成分の網羅的な探索により、共生現象に関わる因子をさがし出す。
医療保険制度形成の比較歴史分析

本研究の目的は、日本やフランスをはじめとした先進諸国において医療保険制度が異なる形で制度化された政治的理由・社会構造上の理由を解明することである。従来の医療保険制度形成史の研究において必ずしも重視されてこなかった医師の団体とその選好の形成過程、農業部門の構造といった諸要因の国際的異同に着目することで、医療保険制度の国際的多様性の理解を深めることに貢献した。本研究の目的は、日本やフランスなどの先進諸国において医療保険制度が異なる形で制度化された政治的理由・社会構造上の理由を解明することである。一度確立された医療保険制度のあり方はその後の医療保険政策の展開に強い影響を与えており、最近の政策展開をより深く理解するためにも、制度形成期の研究に取り組む必要がある。本年度は、主として因果モデルのとりまとめに先立つ情報基盤の整備に注力した。(1)先行研究のサーベイ医療保険制度の形成および医療政治に関する古典的研究・最新の研究双方のサーベイを行い、到達点と課題を整理した。この際、日本とフランスに関する研究のみではなく、ドイツ、イギリス、スウェーデン、アメリカなどに関する研究や複数国を扱った研究をもレビューすることで、国際的な異同を生み出すと思われる変数の予備的調査を行った。また、比較歴史分析に関する方法論について、最新の文献を吸収することで、方法論的枠組みの洗練に努めた。(2)予備的な資料調査日本とフランスについて、20世紀前半の政府・議会・医師組織の資料を読解することで、両国における最初の公的医療保険制度の導入過程を調査した。この際に、政府・議会は医療保険制度をどのように設計しようとしたのか(加入者の範囲・用いる財源など)、医師の団体が公的医療保険制度に対してどのような対応をとろうとしたのかにとくに注目した。以上の調査を通じて、主たる先行研究や一次資料の所在と内容について情報基盤の構築を進めることができた。また、医療保険制度形成の国際的な異同を生み出した要因について、差し当たりの因果関係のモデルを構築した。次年度以降は、公的医療保険による医師に対する統制が強い国と弱い国が存在する原因および公的医療保険制度の保険者の設計が国によって異なるものとなった原因の解明に取り組んでいきたい。研究計画に基づき、主たる先行研究や一次資料の所在と内容に関する情報基盤の構築について大きく前進することができた。本年度は主として公的医療保険による医師に対する統制が強い国と弱い国が存在する原因の解明に取り組んだ。公的な医療保険制度の発達を経験した先進諸国のなかには、日本やドイツのように公的医療保険による医師に対する統制が相対的に強い国と、アメリカやフランスのように公的医療保険による医師に対する統制が相対的に弱い国が見られる(国内にも医療機関による差異がある)。こうした国際的な分岐が生じたメカニズムを明らかにする上で、本研究では、医師が公的医療保険制度による診療や報酬に対する統制に必ず反対すると想定する立場をとらず、各国の医師が公的医療保険制度に対してどのような選好を形成していったのかを経験的に明らかにすることを目指している。そこでまず、日本、フランス、ドイツ、イギリス、アメリカといった国々の医師と医療保険に関する先行研究を検討し、医師同士の市場競争に否定的で公的医療保障の給付を重視する平等志向の医師組織と、医師同士の競争・格差に肯定的で公的医療保障の給付を軽視する医師組織の2パターンを識別した。その上で、前者の例としての日本の医師組織と後者の例としてのフランスの医師組織について、19世紀後半以降の医師組織の形成期から、第二次世界大戦後の公的医療保険の完成期にかけての時期に、医師組織が公的医療保険制度に対してとった姿勢に着目して、資料収集と分析を行った。こうした分析を通じて、日本医師会が公的医療保険制度による統制を受容し、フランスの医師組合が統制回避に努めてきたプロセスの解明を進めることができた。また、公的医療保険制度の設計が国によって職域保険型・地域保険型・折衷型といった異なる形態をとった原因の解明にも着手し、フランスの職域型医療保険、日本の折衷型医療保険の成立過程について資料収集と分析に取り組んだ。研究計画に基づき、日本とフランスの歴史研究とその他の国々をも視野に入れた分析枠組みの構築について前進することができた。第一の研究課題は、公的医療保険による医師に対する統制が強い国(日本・ドイツ)と弱い国(アメリカ・フランス)が存在する理由を明らかにすることであり、公的医療保険制度の登場に対して医師の団体がどのような態度をとり、どのように組織化されていったのかに着目しつつ、先進諸国において公的医療保険と医師との関係がどのように制度化されていったのかを分析した。最終年度には、日本の場合に関して国際会議(第13回社会保障国際論壇)にて報告を行い、日本およびフランスの場合について所属機関の紀要(『フランス文化研究』)に論文を発表した。第二の研究課題は、公的医療保険制度の設計が職域保険型(独仏)・地域保険型(北欧)・折衷型(日本)など、国によって異なる形態をとった原因の解明であり、各国の社会構造、とりわけ農業部門のあり方(農業の経営規模など)がもたらす影響を重視した国際比較研究に取り組んだ。非農業部門の賃金労働者を中心に据えた諸研究とは異なる角度から社会保障制度の成立過程をとらえなおすことにこのアプローチの意義がある。最終年度には、とくにフランスの職域型医療保険と日本の折衷型医療保険の成立過程(主に両大戦間期と第二次大戦後)の研究に上記の視点から取り組んだ。

研究計画に従い、本研究では、これまでの医療保険制度形成史の研究において必ずしも重視されてこなかった医師の団体とその選好の形成過程、農業部門の影響といった諸要因の国際的異同に着目することで、医療保険制度の国際的多様性をとらえなおす作業を前進させることができた。本研究の目的は、日本やフランスをはじめとした先進諸国において医療保険制度が異なる形で制度化された政治的理由・社会構造上の理由を解明することである。従来の医療保険制度形成史の研究において必ずしも重視されてこなかった医師の団体とその選好の形成過程、農業部門の構造といった諸要因の国際的異同に着目することで、医療保険制度の国際的多様性の理解を深めることに貢献した。各国の医療保険や、比較社会科学の専門家との交流に熱心に取り組むことで、一次資料に関する情報共有や適切な因果モデルの構築に努めていきたい。本年度は概ね当初の予定通りに研究を進めることができたが、成果報告の機会が小規模な研究会に限られてしまった。次年度においては論文の投稿や学会発表の形で成果を公表しフィードバックを得ていきたい。比較政治学所属機関の備品が充実しており、予定よりも物品費の使用を抑制できたため。所属研究機関の備品が充実しており、予定よりも物品費の使用を抑制できたため。老朽化している備品があり、次年度以降買い替えていく予定。次年度には所属機関が変わるため、必要が生じた備品を購入する予定である。
遷移金属-炭素多重結合の反応制御に基づく環状有機金属化合物の創製と応用

本研究では,末端アセチレンと遷移金属との反応によって生じるビニリデン金属錯体の反応制御を機軸とした,新規有機金属錯体合成と新規有機変換反応の開発を行った。反応制御法として電子環状反応とシグマトロピー転位を利用した環化反応をデザインし,その検討を行った。本年度成果を以下にまとめた。■α-ピラニリデン金属錯体および(2-フリル)カルベン錯体の新規合成法の開発(Z)-β-エチニル-α,β-不飽和エステル1と各種6族金属錯体[M(CO)_5L(M=Cr,Mo,W;L=THF or Et_3N)]を室温で反応させると,ビニリデン錯体2が発生し,続く分子内環化を駆動力としてα-ピラニリデン金属錯体3がそれぞれ62%,35%,63%の単離収率で得られた。1とクロムおよびモリブデン錯体との反応では,トリエチルアミンの添加によって初めて3が生成することが明らかとなった。このことは,トリエチルアミンがビニリデン錯体2の生成を促進していることを示している。また,アミド類との反応も同様に進行し,対応するα-ピラニリデン金属錯体を与えた。一方,(Z)-β-エチニル-α,β-不飽和ケトン4と各種6族金属錯体は,室温で速やかに反応し,(2-フリル)カルベン錯体5を良好な収率で与えた。5は,ビニリデン錯体ではなくアルキン錯体から直接生成していると考えられる。■シス-1-アシル-2-エチニルシクロプロパンの接触的芳香族化反応シス-1-アシル-2-エチニルシクロプロパン6は,トリエチルアミン共存下,触媒量のM(CO)_5(THF)錯体(M=Cr, W)と室温で反応し,オルト置換フェノールに定量的に変換された。6のアシル部がエステル,アミドの基質では,反応は全く進行しなかった。本反応は,ビニリデン金属錯体7が関与する[3,3]シグマトロピー転位反応により生成する7員環Fischer型カルベン錯体8を経て進行したと考えられる。
自己抗体産生を抑制するＥｇｒ２発現制御性Ｔ細胞のマウス，ヒト双方向性の解析

本研究において、申請者らが同定した新規制御性T細胞LAG3+Tregが、抑制性サイトカインTGF-beta3を産生することにより、B細胞応答を抑制しマウス全身性自己免疫疾患を抑制することを見出した。またTGF-beta3が複数のB細胞シグナルを抑制して、PD-1と協働して機能することも見出した。ヒトLAG3+Tregが自己免疫疾患患者で減少していることも明らかとなり、本研究は自己免疫疾患の新しい治療戦略の開発につながると期待される。本研究では(1)LAG3Treg機能に重要なEgr2の誘導機構、(2)LAG3Tregの抗体産生抑制機構、(3)ヒトLAG3Tregの機能、の解析を目的としている。まずサイトカインIL-27によるEgr2誘導におけるSTATの関与を検討した。STAT1欠損マウス及びT細胞特異的STAT3欠損マウスのCD4陽性T細胞をIL-27で刺激すると、STAT1欠損ではEgr2の誘導は低下しなかったが、STAT3欠損では低下した。さらにT細胞特異的STAT3欠損マウス脾臓では、LAG3negがほとんど見られなかった。このことからEgr2およびLAG3Tregの誘導にSTAT3が必須であることが判明した。そしてEgr2欠損CD4陽性T細胞ではIL27刺激時にIFN-γとIL-17の産生が亢進しており、Egr2はT細胞の炎症性サイトカイン産生も抑制していることが明らかとなった。またJAK阻害薬tofacitinibはLAG3Tregに類似したCD4陽性Egr2陽性PD-L1陽性T細胞を誘導するが、このCD4陽性Egr2陽性PD-L1陽性T細胞をSLEモデルマウスNZBIWF1マウスに移入すると、抗2本鎖DNA抗体産生が抑制され、さらに腎炎が改善することが判明した。この結果からEgr2とPD-L1の発現誘導と、抗体産生および全身性自己免疫疾患の抑制の関連が示唆された。Egr2はIL-17発現、Th17細胞分化およびFollicular helper T(TFH)細胞分化に重要な転写因子Batfに結合し、Batfの機能を阻害することが報告されている。ここまでの成果により、Egr2の発現誘導によりT細胞自身の炎症性サイトカイン産生が抑制されるとともに、Egr2が高発現する場合には抗体産生を抑制する制御性のCD4陽性T細胞に分化誘導されることが明らかとなった。すなわち、Egr2誘導が自己免疫疾患に対する治療戦略の一つになりうることが示された。本研究により、LAG3+Tregに抗体産生を強力に抑制する活性があり、SLEモデルマウスMRL/lprに、Fas遺伝子の変異の無いMRL/+マウス由来のLAG3+Tregを少数移入すると、自己抗体産生、腎炎などの病態が著明に改善されることが判明した。対照的に、FoxP3+Tregを移入しても病態は改善しなかった。さらにB6マウス由来のLAG3+Tregは、マウスを能動免疫した後の胚中心B細胞の分化と阻害抗体産生を抑制することを明らかとした。そして申請者らは、TGF-betaファミリー分子の一つであるTGF-beta3がLAG3+Tregの抑制機能を担っていることを突き止めた(Okamura,T etal.,Nat Commun. 2015;6:6329.)。TGF-beta3は刺激B細胞のSTAT6, Syk, NF-kBのリン酸化を抑制し、PD-1と共同してB細胞機能を抑制した。サイトカインではIL-27がEgr2とSTAT3依存性にTGF-beta3を誘導した。ヒト末梢血のCD4陽性CD25陰性LAG3陽性の細胞集団は、培養後にEgr2, IL-10, TGF-beta3を高発現し、試験管内の抗体産生を抑制する活性を持つ。この細胞集団はSLE患者では減少していることから、自己免疫疾患の病態との関連が推測された。今後LAG3+TregとTGF-beta3の機能解析により、自己免疫疾患の新規治療につながることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。アレルギー・リウマチ学26年度が最終年度であるため、記入しない。ここまでの研究で、Egr2の発現誘導によりT細胞自身の炎症性サイトカイン産生が抑制されるとともに、Egr2が高発現する場合には抗体産生を抑制する制御性のCD4陽性T細胞に分化誘導されることを明らかにできた。この結果はEgr2誘導が自己免疫疾患に対する治療戦略の一つになりうることを示しており、今後の研究の方向性を支持する結果が得られたと言える。本研究により、B細胞を抑制するT細胞由来のサイトカインとして、これまで知られていなかったTGF-beta3を同定することができた。TGF-beta3のB細胞抑制能は非常に強力であり、この同定は自己抗体産生機構の解明に大きな手掛かりとなると考えられる。

TGF-beta1はB細胞機能を抑制する一方で線維化を促進してしまう性質があり、このことが治療応用を妨げていた。ラット気道に投与した場合、TGF-beta1は肺線維化を誘導するのに対しTGF-beta3は線維化を誘導しないことが報告されている。またリコンビナントTGF-beta3の投与により皮膚の線維化が抑制できるなどの知見もあり、TGF-beta3に線維化抑制作用があることによりTGF-beta1よりも治療応用しやすい可能性がある。今後LAG3TregのTGF-beta3産生機構を解明すること、またTGF-beat3そのものの機能解析により、自己抗体を介する自己免疫疾患の治療戦略が構築できる可能性がある。従来TGF-betaファミリー分子の中で、TGF-beta1がT細胞が産生する優位なサイトカインだと考えられてきたが、今回の知見は実際にはTGF-beta3が有意である可能性を示唆している。このことは今後T細胞・B細胞の免疫応答を考える際にTGF-beat3を考慮することの重要性を示しており、適応免疫研究に与える影響は大きいことが予想される。26年度が最終年度であるため、記入しない。今後はLAG3Tregの抗体産生抑制の分子機構を解明する。特にEgr2に制御される抑制性分子に着目して次世代シークエンスによる解析を行う。またヒトLAG3Tregの機能解析を進め、マウスLAG3Tregとの差異やヒト自己免疫疾患患者における修飾について検索する。これらの知見を組み合わせて、ヒト自己免疫疾患の発症メカニズムの一端を明らかにして、新規治療戦略開発の基盤とする。今後はLAG3TregによるTGF-beta3産生の分子機構を解明する。これまでの解析ではEgr2とFasがLAG3Tregの抗体産生抑制能に必須であり、Egr2とFasのTGF-beta3産生への関与を検討する。またLAG3Tregで発現量の高い転写因子の中から、TGF-beta3の転写そのものをコントロールしている転写因子の同定を試みる。これらの研究は生体内でTGF-beta3の産生を誘導する治療戦略の確立につながると考えられる。またTGF-beta3そのものによるSLEモデルマウスの治療が可能かどうか検討する。具体的にはMRL/lprマウスにTGF-beta3を発現するpCAGGSベクターを投与し、TGF-beta1と比較して治療効果を検討しつつ臓器の線維化が誘導されるかどうかについても評価する。さらにサイトカインそのものは半減期が短く治療応用しにくいことから、TGF-beat3をB細胞を標的として半減期が長くなるように修飾することによる創薬の妥当性を、マウスモデルで検討する。すでにヒトにおいてもLAG3陽性で抗体産生を抑制する細胞集団を同定しているが、この細胞集団がTGF-beta3を産生するかどうか、産生するとすればその分子機構がマウスと同様かどうかを検討する。またヒトB細胞に対するヒトTGF-beat3の効果がマウスと同様かについても細胞内シグナルを含め評価する。