hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国斉梁時代の「艶詩」の新研究

中国南朝斉梁時代には艶詩の制作が流行したが、隋代以降、斉梁の艶詩は儒教思想から乖離したものであるとして厳しく批判されてきた。しかし、本研究の成果から、南朝梁の蕭綱らの艶詩作品とその制作を支えた思想の両者ともに伝統的な儒教思想に基づくものであったことが確認された。この成果は、蕭綱らの艶詩が儒教思想から乖離したものである、という従来の説に再考を促すものである。中国南朝時代に流行した「艶詩」群の一つである楽府「白紵舞歌」には宴席上の舞が描かれるが、そこに鳥の比喩が用いられることが多い。同時期のその他の作品でも同様である。本年度はまずこの特徴的比喩の淵源を辿った。その結果、その比喩は祭祀歌を淵源とすることが判明した。祭祀において、神霊を降臨させる舞を舞う者は鳥の羽を身につけており、その様子は古代祭祀歌にも歌われていた。祭祀においては神霊を降臨させて饗応し、祭祀する側の人々が和合し、福祥を得ることが目的とされた。現存最古の「白紵舞歌」の舞の描写にも鳥の比喩が見られると同時に、この舞は神霊を降臨させ、人々は和合する、という句も見える。以上のことから、「白紵舞歌」の舞の描写における鳥の比喩とは、作中の舞に祭祀における舞を重ね合わせ、作品が制作されたであろう宴あるいは王朝の人々の和合を言祝ぐものであったと考えられる。上記の作品の他にも、.南朝時代の「艶詩」の中には祭祀および祭祀歌を淵源とする作品が見られる。例えば、南朝梁の詩人、徐勉が残した「迎客曲」「送客曲」という一組の作品である。研究の結果、各々の作品の淵源は祭祀歌の「迎神歌」「送神歌」であることが判明した。従来、宗教社会学の研究において、祭祀を含む儀礼とは、日常とは異なる場であると考えられてきた。また、徐勉の伝記が伝えるエピソードから、彼が宴についてもただの娯楽や一行事として捉えるのではなく、日常と隔絶した特別な場と捉えていたことが分かる。彼の「迎客曲」「送客曲」には、宴と日常との間に一線を引こうとする彼の思想が表れていると考えられる。更に重要なのは、そのような宴の場で多くの「艶詩」が制作されたことである。従来の研究では南朝時代の「艶詩」はそれまでの詩歌や文化の「伝統」から乖離した頽廃的なものとして考えられてきたが、本年度の研究成果はその説に大いに再考を促すものである。今年度はまず前年度に新たな研究課題として浮上した徐勉の「迎客曲」「送客曲」の研究論文を完成させた。論文の内容の大筋は前年度の「研究実績の概要」に記したことと変わらないが、前年度の口頭発表の際に受けた指摘や、論文査読者の指摘を元に修正を加えた部分がある。次に、今年度の主な研究課題として設定した南朝時代の「艶詩」の代表的作品群の一つである楽府「洛陽道」「長安道」の研究に着手した。作品から特徴的表現を抽出したところ、それらの中に同じく大都市を舞台とした三国魏・曹植の「名都篇」という作品を典拠とする表現を発見した。このことから、南朝時代の「洛陽道」「長安道」研究のためには、それらに大きな影響を与えたと考えられる曹植「名都篇」の主題について研究する必要性が生じた。そこでこの作品に関する先行研究の言説の当否を検討し、そこからこの作品の特徴的表現やモチーフの淵源を調査し、この作品の主題を再検討した。その結果、この作品は作者の在りし日の友人たちと遊楽を享受した日々を回想してそれを作中の登場人物たちに投影し、そのような幸福な時間の再来への願いを結晶化させたものであると考えられる。曹植「名都篇」末尾に見られる「都に還る」というモチーフは後世の「洛陽道」に継承されている。それに対して「長安道」では「都に留まる」という伝統的なモチーフが見られる。双方とも都を定点とし、人流の固定点・帰着点とする認識をその根底に持つと考えられる。それに対して、南朝時代に流行した民間の歌謡に見られる地方都市は人が頻繁に出入りするという流動性が強調されている。しかし、南朝梁の詩人による民間歌謡の模擬作品に見られる地方都市は、人流の固定点・帰着点として描かれており、その性質が根本から変更されている。この変更は「"俗"の"雅"化」と言える。これまで南朝「艶詩」はむしろ「俗」を志向するものと考えられていたが、上記の結果はその説に修正を促すものである。今年度、本研究者がまず取り組んだのは、桑摘みの女性が主人公である楽府「陌上桑」の南北朝時代の模擬作品の研究である。

南朝梁陳期の詩人である張正見が制作した「艶歌行」は、『楽府詩集』では「陌上桑」系列の作品群に属している。この作品に見られる「夫の帰宅」という特徴的要素は他の陳代詩人の「陌上桑」の模擬作品には見られず、青年期に張正見が所属していた文学集団の領袖、梁の蕭綱の模擬作品に始まるものであった。そして、この要素は夫婦の幸福を頌するものであり、夫婦など家族の幸福を象徴的に描くことは、国家の平和を祈念するものであった。以上のような梁代文学の傾向が張正見の「艶歌行」にも影響を与えたと考えられる。今年度、本研究者が次に取り組んだのが梁の蕭綱における「言志」の意味の再検討である。死の直前、幽閉中に蕭綱が制作した作品として詩歌「被幽述志」一首と「連珠」三首が残されている。これらの作品に見られる特徴的表現から、蕭綱の思想の根幹は儒教にあったことが理解される。彼にとって死は儒教の王国である梁朝からの退去であり、文学活動を共にした文学集団のメンバーとの別れであった。そのことを題材とした詩歌には「述志」という題名が付された。本研究と本研究者の以前の研究の成果から、蕭綱にとって「言志」とは「儒教思想を共有する集団と自分との位置関係を示す」ことであり、平時に文学集団のメンバーと制作した艶詩も、メンバーから引き離されて幽閉中に制作された「被幽述志」も、両極端ではあるが彼にとって「言志」作品であった。そしてこの「言志」は伝統的な儒教の文学思想に違反するものではなかったと位置づけることができる。まずは前年度に引き続いて「長安道」に関する問題について考察した。南朝時代に流行した民間の歌謡に見られる地方都市では、人が頻繁に出入りするという流動性が強調されている。しかし、南朝梁の蕭綱による民間歌謡の模擬作品に見られる地方都市は、「長安道」などで描かれた古都・長安と同じく、人流の固定点・帰着点として描かれており、その性質が根本から変更されている。この変更は人の流動化を厭い、人が滞留する都市こそが好ましい場所であるという知識人の伝統的認識に由来している。これは“俗"なる民間歌謡に知識人の伝統的な“雅"なモチーフを組み込んだものであり、「“俗"の“雅"化」と言える。これは、南朝「艶詩」が「雅の俗化」であるという説に修正を促すものである。次に取り組んだのは、桑摘みの女性が主人公である楽府「陌上桑」の南北朝時代の模擬作品の研究である。王褒の模擬作品には、楽府「相逢行」に見られた「妻の居る豪邸に帰宅する裕福な兄弟」というモチーフが組み込まれている。青年期に王褒が所属していた文学集団の領袖、蕭綱の「陌上桑」模擬作品や他の作品にも「夫の帰宅」という「相逢行」と共通するモチーフが見出される。このモチーフは「陌上桑」の原典には無く、蕭綱より上の世代の詩人、例えば沈約の模擬作品にも見られない。これは「艶歌行」という楽府の古辞と蕭綱の模擬作品にも見られるが、「陌上桑」とその模擬作品も「艶歌」と題されることがあるため、蕭綱の「陌上桑」の模擬作品にも「夫の帰宅」が組み込まれたと考えられる。他にも蕭綱たちの文学集団の間では「相逢行」などのように幸福を言祝ぐ作品が好んで制作された。以上のような文学の傾向が王褒の「陌上桑」模擬作品にも反映されていると考えられる。今年度の研究対象「洛陽道」「長安道」の他に関連する別の作品「名都篇」の研究をする必要が生じたが、「名都篇」の研究を通すことによって「洛陽道」「長安道」の問題を解くための重要な視点を得ることができ、見通しが立ったため。25年度が最終年度であるため、記入しない。楽府「陌上桑」の模擬作品の発展過程は複雑であったが、幾つかの作品に共通して見られる特徴的なモチーフを抽出できたことによって、問題解決の見通しが立ったため。今年度はまず曹植「名都篇」研究を受けて「洛陽道」「長安道」研究を完成させる。
神経・免疫系による腸管恒常性維持制御機構とその破綻

腸管神経細胞の増加により上皮バリア機構の破綻と腸内フローラの異常をきたすことを明らかにした。Ncx KOマウスを用いて腸内細菌層の解析を行った。培養法により好気性菌が増加しており、16SrRNA法、メタゲノム解析によりEnterobacteriaceaeが増加しておりdysbiosisの状態であることが確認された。またNcx KOマウスにおいては、病原性の高いNO還元酵素(NorV)遺伝子を持つ腸内細菌が有意に増加していた。さらに、Ncx KOマウス糞便を野生型マウスに移植したところDSS腸炎が悪化した。以上より腸管神経は腸内細菌叢制御にとっても重要な役割をしていることが示された。腸管神経細胞が増加している遺伝子改変マウス(Ncx KOマウス、Kif26a KOマウス)を用いて腸管上皮細胞の構築、腸内フローラ、腸管免疫についての解析を行った。(1) Ncx KOマウス腸管神経節においては一酸化窒素(NO)産生ニューロンが増加している。Ncx KOマウスにおいては腸管神経細胞由来のNOが上皮細胞に作用し、β-cateninのSNO化、E-cadherinのジャンクションからの解離をきたし上皮細胞バリア機能が破綻するとの仮説をたてた。この仮説の検証のために以下の実験を行った。(a)Ncx KOマウスの腸管上皮細胞におけるS-nitrosylationについてウエスタンブロットにて解析したところS-nitrosylationされた蛋白が増加していた。(b)nNOS特異的な阻害剤L-NPAをNcx KOマウスに投与しE-cadherinの発現および腸管透過性について解析したところ、L-NPA投与によりE-cadherinの発現は増加した。(c)抗ニトロチロシン抗体によりNcx KOマウスの腸管を免疫染色しNO産生について解析したところ、一部の上皮細胞において濃く染色される細胞が見いだされた。(3)同じケージ内で飼育しているNcx KOおよび野生型マウスの糞便より経時的にDNAを抽出する。各細菌特異的な16SrRNAのプライマーを用いquantitative real-time PCRを行い腸内細菌フローラについて質的・量的な解析を行ったところKOマウスにおいてはEnterobacteriaceaeの増加、およびBifidobacteriumの減少傾向が認められた。以上の結果よりNcx KOマウス、Kif26a KOマウスともに腸内フローラにおいてdysbiosisが起きていることが示唆され、腸管神経細胞増加にともなうNOによるものであることが推測された。腸管神経系に異常をきたす遺伝子組換えマウス(Ncx KOマウス)を用いて腸管神経・免疫系・腸内細菌叢の相互作用についての解析を行った。Ncx KOマウスにおいてはNO産生腸管神経の増加により上皮細胞内蛋白のNOによるニトロシル化が認められた。そのためcadherin蛋白の減少により腸管の透過性亢進によりDSS腸炎感受性が高くなっていた。またcadherin減少は神経細胞由来nNOS阻害剤により回復した。このことより腸管神経由来の過剰のNOにより上皮バリアの障害がみられることが明らかとなった。さらに腸内細菌叢についてマッコンキー培地および16SrRNAにより解析したところ、Ncx KOマウスにおいて野生型に比較してEnterobacteriaceaeが約10100倍増加していた。また、その中でも一酸化窒素還元酵素NORVをもつものがKOマウスにおいて増加していた。次に野生型マウスに抗生物質を投与し腸内を無菌状態にした後に野生型マウスより採取した糞便あるいはNcx KOマウスより採取した糞便を経口投与した。1週間後にDSSを投与し腸炎を誘導すると、KOマウス糞便を投与した群において体重減少、血便が著明に認められた。以上の結果より腸管神経過剰によりNcx KOマウス腸管においてはdysbiosisを呈していることが明らかとなった。また腸管神経由来のNOによりNORVを持つNOの殺菌作用に耐性であるvirulentな細菌が選択的に増え腸炎悪化の原因となっている可能性が示唆された。腸管神経系は胎生期に神経堤細胞より分化・定着し、腸管蠕動運動、分泌、吸収などを制御している。一方腸管には免疫系・上皮バリアなどにより腸内細菌叢と相互作用を保ちながら恒常性維持に関与しているが、腸管神経系と上皮バリア、免疫系、及び腸内細菌叢との相互作用についての詳細は知られていない。我々は腸管神経系に異常をきたす遺伝子組換えマウス(Ncx KOマウス、Kif26a KOマウス)を用いて腸管神経系と上皮バリア、免疫系及び腸内細菌叢との相互作用を明らかにした。Ncx KOマウスは腸管神経の増加をきたす。一酸化窒素(NO)産生ニュウロンの増加が認められ、その合成酵素であるnNOSの発現が上昇していた。このマウスにおいて、腸管透過性の亢進、上皮細胞においてE-カドへリンの発現減少が認められそれらはnNOSの阻害剤により改善した。このことより神経細胞由来NOが上皮バリア制御にかかわっていることが明らかとなった。一方腸内細菌層を16SrRNA法で調べたところEnterobacteriaceaeの増加、および一酸化窒素還元酵素であるNORV陽性の細菌の増加が認められ、Dysbiosisの状態であることが明らかとなった。

Ncx KOマウスの糞便を野生型マウスに移植し、DSS腸炎を発症させたところ、野生型マウス糞便移植群に比較して重症化したこと、抗生物質使用により症状が改善していること、などからNcx KOマウス腸内細菌は野生型と比較してより病原性の高いものであることが示唆された。一方同じく腸管神経細胞の増加しているKif26a KOマウスにおいても同様に腸内細菌解析の結果Enterobacteriacedaeが増加しておりDysbiosisであることが示唆された。今後さらに腸内細菌についての検討を進める予定である。腸管神経細胞の増加により上皮バリア機構の破綻と腸内フローラの異常をきたすことを明らかにした。Ncx KOマウスを用いて腸内細菌層の解析を行った。培養法により好気性菌が増加しており、16SrRNA法、メタゲノム解析によりEnterobacteriaceaeが増加しておりdysbiosisの状態であることが確認された。またNcx KOマウスにおいては、病原性の高いNO還元酵素(NorV)遺伝子を持つ腸内細菌が有意に増加していた。さらに、Ncx KOマウス糞便を野生型マウスに移植したところDSS腸炎が悪化した。以上より腸管神経は腸内細菌叢制御にとっても重要な役割をしていることが示された。本研究により腸管上皮細胞バリア機構維持および腸内細菌叢の制御に腸管神経由来一酸化窒素(NO)が重要な役割を担っていることが明らかにされた。腸管ホメオスタシスの維持に腸管神経の数のみならずそこから産生されるNOの量が腸内細菌叢のバランス維持に重要であることを明らかにした。これらの成果は第43回日本免疫学会学術集会(京都)において口演発表した。従って当初の計画通りほぼ順調に進展している。分子生物学、発生工学26年度までの結果をまとめ論文投稿するとともに、並行して免疫系の解析を進める。また同様に腸管神経細胞が増加する遺伝子組換えマウス(Kif26a KOマウス)を用いて腸管上皮バリア機構、腸内細菌叢、腸管免疫系の解析をすすめ、両者の表現型の共通点および異なる点について明らかにする。これにより腸管内ホメオスタシスの維持における腸管神経系の重要性についてより深く理解を進める。腸管上皮細胞のバリア機構の低下が腸管神経増加にともなうNOによるものであることが明らかとなった。また、腸管神経細胞増加によりdysbiosisをおこすことも明らかとなった。これらの成果は第42回日本免疫学会において講演発表を行った。Ncx KOマウスにおける上皮細胞バリアと神経細胞増加の関連がほぼ明らかとなったが、腸内フローラとの関連についてもより詳細に詰めていく予定である。次世代シークエンサーを用いた腸内細菌層の解析も視野にいれ進めていく予定である。また、免疫系の異常についても今後重点を置いて解析する。同様の表現系を持つKif26a KOマウス、Nczfヘテロマウスについても解析を進め、腸管神経系と腸管免疫、腸管バリア機構の相互関係について分子レベルで明らかにする。消耗品の一部が他の経費により購入できたため。試薬等消耗品の購入に使用する。
トキソプラズマ性網脈絡膜炎発症機序の基礎的研究

我々は細胞内寄生原虫であるトキソプラズマ原虫感染細胞がトキソプラズマ原虫抗原をT_3細胞に提示することを世界で始めて報告し、またT細胞エピトープのアミノ酸解析に成功した。さらに、我々はトキソプラズマ症に見られる網脈絡膜炎の発症機序には、他のブドウ膜炎、例えばヘルペスウイルス性ブドウ膜炎や自己免疫性ブドウ膜炎(サルコイドーシス、Vogt-Koyanagi-Harada病)との間に共通した発症機序が存在することを明らかにした。トキソプラズマ性網脈絡膜炎およびヘルペスウイルス性ブドウ膜炎や自己免疫性ブドウ膜炎には共にCD4+細胞傷害性T細胞およびこのT細胞が産生するγインターフェロンとIL-6が重要な役割を演じていることが明らかになり、このCD4+細胞傷害性T細胞は興味あることにメラノサイトによって誘導活性化されることが分かった。これらのCD4+細胞傷害性T細胞の認識する抗原はそれぞれ、トキソプラズマ原虫感染メラノサイト宿主細胞やヘルペスウイルス感染メラノサイト宿主細胞、あるいは自己メラノサイトがHLA-DR分子によって提示する抗原を認識していることが明らかになった。さらに、これらのCD4+細胞傷害性T細胞が産生するγインターフェロンやIL-6がメラノサイトの抗原提示能力を増幅し、抗原虫作用や抗ウイルス作用を増幅すると共に炎症における憎悪因子として機能することが明らかになった。また、トキソプラズマ症における炎症発症機序解明に必要な細胞・組織内トキソプラズマ原虫を定量的に同定する方法として、トキソプラズマ原虫特異的遺伝子SAG1遺伝子を標的遺伝子とした競合性定量性PCR法を確立した。この競合性定量性PCR法による解析によってトキソプラズマ原虫が神経系細胞・組織にトロピズムを示すことが明らかになった。以上本研究によって、トキソプラズマ性網脈絡膜炎の発症には、トキソプラズマ原虫側要因と宿主側要因が関与していることが明らかになった。我々は細胞内寄生原中であるトキソプラズマ原虫感染細胞がトキソプラズマ原虫抗原をT細胞に提示することを世界で初めて報告し、またT細胞エピトープのアミノ酸解析に成功した(J.Parasitol.80:260,1994)。さらに、我々はヘルペスウイルス性ブドウ膜炎や自己免疫性ブドウ膜炎(サルコイドーシス、Vogt-小柳-原田病)の発症にγインターフェロンが重要な役割を演じていること、またブドウ膜メラノサイトが抗原提示細胞としてあるいは標的細胞として機能しCD4^+細胞傷害性T細胞を誘導していることを明らかにした(Invest.OphthaL.Vis.Sci.35;33,1994,Current Eye Res.14;425,1995)。そしてトキソプラズマ症患者抹消血中白血球からもトキソプラズマ原虫感染メラノーマによってCD4^+細胞傷害性T細胞が誘導されることを明らかにした(J.Immunol.150:290,1995)。さらに、これらCD4^+細胞傷害性T細胞がγ-IFNやIL-6を抗原特異的に産生することが明らかになった(Jpn.J.Parasitol.44;210,1995)。今後、これらのリンフォカインがトキソプラズマ性網脈絡膜炎発症にどのような役割を演じるかについての解析を進めている。トキソプラズマ原虫を定量的に同定する競合性PCR法として、トキソプラズマ原虫1parasiteあたり1copyを持つSAG1遺伝子の一部を欠損させたcompetitorを作成し、競合性定量性PCR法の開発に成功した(Jpn.J.Parasitol.44;183,1995)。

現在、競合性定量性遺伝子測定法によりトキソプラズマ原虫を同定し、トキソプラズマ原虫の臓器内、組織内、細胞内動向について解析を加え(論文投稿中)、トキソプラズマ性網脈絡膜炎患者および感染実験動物の炎症組織局所に存在する免疫細胞の解析を行い、網脈絡膜炎の発症における役割について明らかにしつつある。我々は細胞内寄生原虫であるトキソプラズマ原虫感染細胞がトキソプラズマ原虫抗原をT細胞に提示することを世界で始めて報告し、またT細胞エピトープのアミノ酸解析に成功した。さらに、我々はトキソプラズマ症に見られる網脈絡膜炎の発症機序には、他のブドウ膜炎、例えばヘルペスウイルス性ブドウ膜炎や自己免疫性ブドウ膜炎(サルコイドーシス、Vogt-Koyanagi-Harada病)との間に共通した発症機序が存在することを明らかにした。トキソプラズマ性網脈絡膜炎およびヘルペスウイルス性ブドウ膜炎や自己免疫性ブドウ膜炎には共にCD4+細胞傷害性T細胞およびこのT細胞が産生するγインターフェロンとIL-6が重要な役割を演じていることが明らかになり、このCD4+細胞傷害性T細胞は興味あることにメラノサイトによって誘導活性化されることが分かった。これらのCD4+細胞傷害性T細胞の認識する抗原はそれぞれ、トキソプラズマ原虫感染メラノサイト宿主細胞やヘルペスウイルス感染メラノサイト宿主細胞、あるいは自己メラノサイトがHLA-DR分子によって提示する抗原を認識していることが明らかになった。さらに、これらのCD4+細胞傷害性T細胞が産生するγインターフェロンやIL-6がメラノサイトの抗原提示能力を増幅し、抗原虫作用や抗ウイルス作用を増幅すると共に炎症における憎悪因子として機能することが明らかになった。また、トキソプラズマ症における炎症発症機序解明に必要な細胞・組織内トキソプラズマ原虫を定量的に同定する方法として、トキソプラズマ原虫特異的遺伝子SAG1遺伝子を標的遺伝子とした競合性定量性PCR法を確立した。この競合性定量性PCR法による解析によってトキソプラズマ原虫が神経系細胞・組織にトロピズムを示すことが明らかになった。以上本研究によって、トキソプラズマ性網脈絡膜炎の発症には、トキソプラズマ原虫側要因と宿主側要因が関与していることが明らかになった。
新しい免疫抑制剤FK506を用いた異種間の骨移植に関する研究

整形外科の分野において、骨移植の破壊された骨格機能再建のための最も重要な手段のひとつとして行われてきた。現在、骨移植の白家骨移植が主体であるが、今後は同種骨移植、異種骨移殖の方向に展開されるものと思われる。特に骨移植供給源として動物の骨を用いることが可能になれば、供給不足の問題は解決されることになる。しかしそのためには免疫学的な問題が解決されなければならない。そこで我々は、新しく開発された免疫抑制剤FK506を用いて、異種骨を中心とした骨形成の研究を行った。異種骨材料として家兎腸骨を、レシピエントとしてラットを用いた。FK506の免疫抑制剤効果は異種皮膚移植片の生着期間とした。ドナーの腸骨は、筋肉内移植と骨内移植の2通りと行った。FKの授与量は0.32mg/100gの3、7、14間授与である。その結果、FK授与量に比例して異種皮膚生着期間の延長が認められたその期間内においては、異種骨周囲へのリンパ球を中心とした小円形細胞の沈潤は抑制され、しかも骨形成も認められ、免疫抑制効果が認められた。以上の点より、異種皮膚移植を行いFK授与で皮膚が生着している期間を免疫抑制期間と考えると、その期間においては異種骨に対する拒絶反応も抑制され、骨形成、骨伝導も生じることが判明した。整形外科の分野において骨移植は骨格機能再建のための最も重要な手段のひとつであるが,その多くは自家骨移植として行われてきた。しかし,大量の移植骨を必要とするときには量的な制約を免れ得ない。また,同種骨移植は法的,社会的に問題があり採取が困難である。異種骨を移植しようとする試みは従来より主に実験的に行われてきたが,その強い抗原性のために必ずしも良好な結果は得られていない。一方,強力な免疫抑制効果を有するといわれるFK506(FK)は他の臓器移植の分野では大いに注目されている。今回,我々はこのFKを用いて異種骨を中心とした骨形成の研究を行うとともに,FKの骨形成,骨代謝に及ぼす影響について検討した。実験用動物(家兎,ラット)を用い移植実験を行った。即ち,ラットの腸骨を家兎背筋肉,腸骨内に移植し,異種骨移植とし,これと対照にするために自家骨移植群も作成した。またラットの腹部皮膚を家兎背部に移植した。それぞれの群にFK投与群,非投与群を設け骨移植については組織学的に検討し,皮膚移植については移植片の生着日数をみることで免疫抑制効果を判定した。FK投与群では異種骨移植であっても筋肉内においてリンパ球の侵潤は著明に抑えられ骨形成を認めた。自家骨移植においても骨形成は障害なく認められた。腸骨内移植ではFKを投与すると異種骨であっても再生血行を認め,添加骨形成を移植骨骨梁に認めた。また,皮膚移植ではFKを投与するとその投与量に応じて生着日数の延長を認めた。整形外科の分野において、骨移植は破壊された骨格機能再建のための最も重要な手段のひとつとして行われてきた。現在、骨移植は自家骨移植が主体であるが、今後は同種骨移植、異種骨移植の方向に展間されるものと思われる。FK506の免疫抑制効果は異種皮膚移植骨の生着期間とした。ドナーの腸骨は、筋肉内移植と骨内移植の2通りを行った、FKの投与量は、0.32mg/100gの3.7、14間投与である。

その結果、FK投与量に比例して異種皮膚生着期間の延長が認められその期間内においては、異種骨周囲へのリンパ球を中心とした小円形細胞の浸潤は抑制され、しかも骨形成も認められた。骨内移植においては臨床側よりの血管侵入、骨形成が認められ、免疫抑制効果が認められた。以上の点より、異種皮膚移植を介いFK投与で皮膚が生着している期間を、免疫抑制期間と考えると、その期間においては異種骨に対する拒絶反応も抑制され、骨形成、骨伝導も生じることが判明した。
NA塩基配列に基く三胚葉性動物の起源と初期進化の推定

本年は、多細胞動物の初期進化を考える上で欠くことのできない重要な動物であるが,その系統的位置については様々な異論が提出されている中生動物ニハイチュウに焦点を絞って、18SリボソームDNA(18s rDNA)の塩基配列に基づく解析によりその系統的位置を推定した。2種のニハイチュウ(アオリイカニハイチュウ,トガリニハイチュウ)について,ゲノムDNAより18s rDNAに特異的なプライマーを用いてほぼ全長にあたる約2000塩基対のDNA断片をPCR法で増幅し、ジデオキシ法により塩基配列を決定した。そのデータにDNAデータバンクから引用した菌類、原生生物、植物、二胚葉性動物(海綿、刺胞、有櫛動物)、三胚葉性動物(左右相称動物=節足、軟体、脊椎動物ほか)の配列を合わせて,近隣結合法、最節約法、最尤法により系統樹を作成した。いずれの系統樹においても,三胚葉性動物は二胚葉性動物その他の生物グループに対して別個にまとまった単系統グループを形成した。ニハイチュウ類はいづれの系統樹においても三胚葉性動物のグループ内に位置していた。三胚葉性動物の集合内部においては、ニハイチュウは原始的扁形動物である無腸目とグループを形成した。この結果は近隣結合法および最節約法で作成した系統樹において高い確率(100%)で支持された。本研究の結果は、ニハイチュウ類は三胚葉性動物に属することを示ており、その簡単な体制は寄生生活の結果二次的に生じたものである可能性を示唆している。
前立腺癌造骨性骨転移に関わる形態形成遺伝子群の解析

前立腺癌におけるBMP-6の遺伝子発現調節機構について検討した。まず前立腺癌培養細胞株DU-145,LNCap,PC-3,PC-3Mにおいて、Norhtern blotによりBMP-6mRNA発現の差を見い出した。これらの培養細胞にBMP-6遺伝子プロモータを導入しても転写活性は同レベルであり、プロモータ領域のCpGメチル化によってBMP-6遺伝子発現が制御されることを明らかにした。さらに11例の前立腺癌症例についてin situ hybridizationを行い、原発巣と転移巣とにおけるBMP-6,BMP-2mRNA発現を解析した。原発巣において分化度の高い症例ではBMP-2mRNAの発現レベルが高いのに対して、BMP-6mRNAは低分化型腺癌の症例に高率に発現し、他臓器の転移浸潤部位ではBMP-6の発現レベルが高くなる傾向を認めた。BMP-6mRNA発現レベルと対応させて、原発巣および転移巣の標本からmicro dissectionにて腫瘍組織を切り出してBMP-6遺伝子5'側上流領域のCpGメチル化を解析した。原発巣の腫瘍において検出されるBMP-6遺伝子プロモータ領域のSp1結合配列周辺のCpGメチル化が、浸潤転移病巣においては脱メチル化を示していることを明らかにした。このように、腫瘍の増殖・進展の過程で生じるCpGメチル化の変化により付加的な遺伝子発現あるいは遺伝子発現の抑制を来たし、転移浸潤に関わる腫瘍の生物学的特性をもたらす可能性が示唆された。以上の成果は、英文誌Journal of Bone and Mineral Researchに報告し印刷中である。また、成果の一部は第89回日本病理学会総会ワークショップ、第23回IAP総会シンポジウムにて発表した。前立腺癌培養細胞株におけるBMP発現の調節機構につき以下のような検討を行った。(1)レポーター遺伝子による検討:申請者等がクローニングしたヒトBMP-3,5,6,8遺伝子の5'側上流領域をレポーター遺伝子を含むPlasmid(PGL-3,Promega)に結合し、種々の前立腺癌培養細胞株に遺伝子導入した。その結果、BMP-6遺伝子プロモータ活性において、steady-stateの発現とルシフェラーゼ活性との比較においてepigeneticalな制御機構の存在が明らかとなった。さらにBMP-6プロモータに存在するCpGメチル化とBMP-6遺伝子発現、alternative splicingとの関連を細胞株、病理組織切片を用いて検討し、Spl結合領域周辺のメチル化・脱メチル化が癌の進展・組織型と密接に関連していることが明らかとなった。(2)活性型Shh蛋白の前立腺癌培養細胞株に及ぼす影響:ShhはN末端側に生物活性があり、通常の大腸菌を利用したリコンビナント蛋白を作成・精製することが困難なためShhのcDNAをSV40プロモータと結合したプラスミドを遺伝子導入した細胞株を作成し、培養上清中に活性型Shhが産生される系を作成した。現在、この活性型Shh蛋白を前立腺癌細胞株、PC-3、PC-3M等に作用させ、各前立腺癌細胞株において特に各BMP遺伝子発現に及ぼす効果を検討中である。(3)前立腺癌におけるShh受容体(Patched)の変化を検討する:各培養細胞株において活性型Shhの受容体Patchedの変異の有無を検討したが、前立腺癌においてはShhおよびPatchedともに低発現で遺伝子異常は認めなかった。(4)前立腺癌におけるBMP受容体シグナル伝達系の中で、とくにdpc4遺伝子変異について検討する:遺伝子プロモータ領域内のdpc4変異をスクリーニングし現在臨床病理学的解析を行い、子宮内膜癌において転写因子結合部位に欠失を発見した。
心筋梗塞での細胞外マトリックスの合成および分解の制御機構の解明

心筋の線維化には細胞外マトリックス(ECM)の合成と分解の均衡の破綻が示唆されている。本研究では心筋梗塞や心筋症モデル動物を用い、線維化の進展とMatrixmetaloproteinase(MMP)活性とTissue inhibitor of MMP(TIMP)活性について研究を行った。ラットの心筋梗塞巣ではMMP-9が1週間以内に発現を認め、梗塞後12週間で心筋のMMP-13,-2,-3の発現増加を認めた。一方、TIMP-1,-2の発現は1週間では亢進を認めたが、以後減少した。TIMP-3,-4の発現には変化を認めなかった。非梗塞部では何れのMMPが梗塞後14週間で時間依存性に増加し、34週間で定状状態に達した。MMP-13/TIMP-1とMMP-2/TIMP-2は梗塞域では12週目に亢進するが、非梗塞域ではこの変化は認めなかった。また、ECMの分解にはMMP活性がTissue necrosis factor-α(TNFα),Interleukin-1β(IL-1β)などのサイトカインや種々の増殖因子に影響されることから、心筋梗塞線維化にこれらのサイトカインがどのように関与しているか検討した。その結果、TNFαの遺伝子、蛋白量の発現と免疫組織染色では、MMP-9の発現に先立ち強く発現することを認めた。従って、好中球から遊離されるTNFαの発現は線維芽細胞からのMMP-9の誘導と深い関係があり、心筋線維化への発生に関与している可能性が推察された。現在、TNFαの受容体可溶性部分が心筋梗塞サイズの減少効果があることを確認していることから、遺伝子治療への応用を検討している。心筋梗塞(MI)では梗塞部心筋の線維化と非梗塞部の肥大が知られている。しかし、本病態における細胞外matrix成分のリモデリング過程は不明である。本研究では梗塞心筋と非梗塞部のMMP活性とTissue inhibitors(TIMP)活性について検討した。雄性Wistarラットの左冠動脈を結紮しMIを作成し、結紮後1、2、7、14、28日後に心臓を摘出し梗塞部(IF,n=8)と非梗塞部位(NIF,n=8)に分けた。両群の組織中のhydroxyprolone(HP)量とcollagen(CL)(I型,III型)のmRNA(Northern blot)およびfibronectin(FN)のmRNAを求めた。Collagenの分解に関するMMP-1,MMP-2,MMP-3,TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3活性はimmunoblotにて、mRNAの発現はRT-PCR法で求めた。TIMP/MMPと比として表し、梗塞サイズはTTC染色により求めた。その結果(1)IFは冠結紮後1日目でCL-I,CL-IIIのmRNAは増加し2日目がそれぞれ結紮前に比べて約4倍に発現増加した。CL-Iが以後漸減したが、CL-IIIの増加は28日目まで続いた。FNの淡白とmRNAの発現は7日目(約4倍)が最大であった。TIMP-1/MMP-1,TIMP-2/MMP-2が梗塞後は28日まで有意な増加を示したのに対してTIMP-3/MMP-3は変化しなかった。(2)NIFはCL-I,CL-III、FNともにmRNAは2日目が最大発現を示し以後漸減した。しかし、CL-IIIとFNの発現は28日目まで続いた。TIMP-1/MMP-1,TIMP-2/MMP-2は冠結紮後有意な変化を認めなかった。

以上より、心筋梗塞部の線維化には細胞外matrix成分の合成と分解の双方の亢進がみられるが、非梗塞部の肥大にはmatrix成分の合成が分解より亢進していると推察される。上記の知見は1998年10月の国際心臓研究学会、1999年3月の日本循環器学会学術集会に発表した。現在、国際学会誌に投稿中である。心筋の線維化には細胞外マトリックス(ECM)の合成と分解の均衡の破綻が示唆されている。本研究では心筋梗塞や心筋症モデル動物を用い、線維化の進展とMatrix metaloproteinase(MMP)活性とTissue inhibitor of MMP(TIMP)活性について研究を行った。ラットの心筋梗塞巣ではMMP-9が1週間以内に発現を認め、梗塞後12週間で心筋のMMP-13,-2,-3の発現増加を認めた。一方、TIMP-1,-2の発現は1週間では亢進を認めたが、以後減少した。TIMP-3,-4の発現には変化を認めなかった。非梗塞部では何れのMMPが梗塞後14週間で時間依存性に増加し、34週間で定状状態に達した。MMP-13/TIMP-1とMMP-2/TIMP-2は梗塞域では12週目に亢進するが、非梗塞域ではこの変化は認めなかった。また、ECMの分解にはMMP活性がTissue necrosis factor-α(TNFα),Interleukin-1β(IL-1β)などのサイトカインや種々の増殖因子に影響されることから、心筋梗塞線維化にこれらのサイトカインがどのように関与しているか検討した。その結果、TNFαの遺伝子、蛋白量の発現と免疫組織染色では、MMP-9の発現に先立ち強く発現することを認めた。従って、好中球から遊離されるTNFαの発現は線維芽細胞からのMMP-9の誘導と深い関係があり、心筋線維化への発生に関与している可能性が推察された。現在、TNFαの受容体可溶性部分が心筋梗塞サイズの減少効果があることを確認していることから、遺伝子治療への応用を検討している。
ストレスと歯周疾患全身疾患に関する総合的研究

歯周病の発症と進行に対してストレスが与える影響を調べるために、臨床的および基礎的なチームアプローチにより研究を執り行った。横田は、心理学的に測定したストレス尺度と歯周疾患の状態やウ蝕の発生状況との関係の分析を行った。この結果、心理的な尺度と歯周病の病態の間には直接の相関関係はみられず、不安傾向の強いものが喫煙習慣を有する傾向が認められた。多変量解析モデルを用いて分析すると、心理因子→喫煙→歯周炎の増悪というシナリオも想定できた。川浪らは、多数の糖尿病患者について、糖尿病の罹患状態と歯周病の状態、ストレスの状態を調査し、その関係について多変量解析を用いて分析を行っている。現在まで200名以上の糖尿病患者の内科的データや生活環境などのアンケート結果、歯周病に関する検査データを収集し、回帰モデルの作成を試みている。吉成が拘束ストレスを与えた歯周炎誘発ラットモデルを用いて、実験群ではコントロールと比して低体重、血糖値の上昇、ACTH・カテコールアミンの上昇などの所見と、根分岐部の骨吸収の進行を観察している。辰巳は、ストレスによって血清中のglucocorticoidの上昇とNK細胞活性の低下が認められることに着目し、マウス骨髄細胞からの破骨細胞形成系を用い,Dexamethasoneの刺激により出現したTRAP陽性多核細胞を測定した。その結果、Dexamethasoneが直接破骨細胞形成を促進し,歯槽骨吸収機構に関与する可能性が示唆され,精神的ストレスが歯周疾患の進行に影響を及ぼすことが示唆された。木戸は、ストレスによる免疫系の調節機構に関連する因子として知られているsubstance Pの、骨芽細胞培養系でのP.gingivalis由来LPS存在下での炎症性サイトカイン発現への影響を調べ、substance Pがサイトカイン発現を増強し、骨芽細胞の分化抑制に働くことを明らかにした。横田を中心として、心理学的特性が歯周治療への受診行動やホームケアの実行与える影響について検討を行った。患者の心理学的特性によって引き起こされる歯科恐怖や口腔の健康に対する関心のなさは、患者が口腔清掃を怠る理由の一つであるように、患者のパーソナリティーは、歯科治療に対するコンプライアンスを獲得するうえで重要な役割を果たしている。今回の研究として、不安尺度と口腔衛生状態との間の関係の分析を、臨床データを用いて行った。その結果、状態不安の低不安群は、高不安群と比較して初回診査時のPCRは有意に高値を示し、初診時の不安尺度は初診の口腔衛生状態に影響を与えていることが分かった。しかし、その後の口腔衛生指導に伴う口腔衛生状態の改善には影響を与えず、歯周治療に対するコンプライアンスを獲得するには、口腔の健康管理に関する関心や歯科医院への受診行動が、初診時の不安よりも重要というとがわかった。次年度は、さらに他の歯周病学インデックスと心理学的な要因との関連について調べることを予定している。共同研究者の加藤は、歯周病の重症化を招きやすいと考えられる糖尿病と歯周病の関連について調べるために、臨床データを蓄積中である。同じく共同研究者の吉成は、拘束ストレスを与えた歯周炎誘発ラットモデルを用いて、ストレスが歯周組織に与える影響を病理組織学的に検索中である。辰巳はdexamethasoneおよびその代謝産物が歯槽骨破壊に与える影響について培養系を用いて検討を行っている。木戸は、骨粗鬆症患者で上昇することの多い副甲状腺ホルモン(PTH)の骨芽細胞への影響を調べるため、骨芽細胞の培養系を用いて各種ホルモンに与える影響を検討している。ストレスの歯周病の臨床的な側面に与える影響を調べるために、横田は、心理学的に測定したストレス尺度と歯周疾患の状態やウ蝕の発生状況との関係の分析を行った。

この結果、心理的な尺度と歯周病の病態の間には直接の相関関係はみられず、不安傾向の強いものが喫煙習慣を有する傾向が認められた。多変量解析モデルを用いて分析すると、心理因子→喫煙→歯周炎の増悪というシナリオも想定できた。加藤らは、多数の糖尿病患者について、糖尿病の罹患状態と歯周病の状態、ストレスの状態を調査し、その関係について多変量解析を用いて分析を行っている。現在まで200名以上の糖尿病患者の内科的データや生活環境などのアンケート結果、歯周病に関する検査データを収集し、回帰モデルの作成を試みている。吉成が拘束ストレスを与えた歯周炎誘発ラットモデルを用いて、実験群ではコントロールと比して低体重、血糖値の上昇、ACTH・カテコールアミンの上昇などの所見と、根分岐部の骨吸収の進行を観察している。また、基礎的な側面からの研究として、辰已はストレスによって血清中のglucocorticoidの上昇とNK細胞活性の低下が認められることに着目し、マウス骨髄細胞からの破骨細胞形成系を用い,Dexamethasoneの刺激により出現したTRAP陽性多核細胞を測定した。その結果、Dexamethasoneが直接破骨細胞形成を促進し,歯槽骨吸収機構に関与する可能性が示唆され,精神的ストレスが歯周疾患の進行に影響を及ぼすことが示唆された。木戸は、ストレスによる免疫系の調節機構に関連する因子として知られているsubstance Pの、骨芽細胞培養系でのP.gingivalis由来LPS存在下での炎症性サイトカイン発現への影響を調べ、substance Pがサイトカイン発現を増強し、骨芽細胞の分化抑制に働くことを明らかにした。歯周病の発症と進行に対してストレスが与える影響を調べるために、臨床的および基礎的なチームアプローチにより研究を執り行った。横田は、心理学的に測定したストレス尺度と歯周疾患の状態やウ蝕の発生状況との関係の分析を行った。川浪らは、多数の糖尿病患者について、糖尿病の罹患状態と歯周病の状態、ストレスの状態を調査し、その関係について多変量解析を用いて分析を行っている。辰巳は、ストレスによって血清中のglucocorticoidの上昇とNK細胞活性の低下が認められることに着目し、マウス骨髄細胞からの破骨細胞形成系を用い,Dexamethasoneの刺激により出現したTRAP陽性多核細胞を測定した。
身体トレーニングによる骨格筋のDNA転写活性化が糖代謝能に与える影響に関する研究

DNAの転写補助因子であるPGC-1αが身体運動により増加する機序を明らかにするために本実験を行った。まず、56週齢のSD系のラットをトレッドミルで6時間,低強度(分速13m)の走行運動させたところ、運動後のグリコーゲン濃度が有意に低下した後肢筋(ヒラメ筋,足底筋)ではPGC-1α濃度が増加したが、グリコーゲン濃度が変化しなかった前肢筋(epitrochlearisと三頭筋)ではPGC-1α濃度に変化は見られなかった。一方、6時間の低強度(無負荷)水泳後では逆に、グリコーゲン濃度が低下した前肢筋(epitrochlearisと三頭筋)では、PGC-1α濃度が増加したが、グリコーゲン濃度に変化が見られなかった後肢のヒラメ筋や足底筋では、PGC-1α蛋白質濃度に変化が見られなかった。これらの結果より、身体運動により動員された筋にのみPGC-1αの発現が見られることが明らかになった。次に身体運動により骨格筋のPGC-1α濃度が増加する生化学的機序を明らかにするための実験・研究を行った。摘出したepitrochlearisを試験管内で電気刺激した6h時間後にPGC-1αのmRNAが増加した。また、試験管内でepitrochlearisを、AICAR(AMPKの活性化剤)及びカフェイン(筋小胞体からのカルシウム放出を引き起こす)で18時間インキュベーションするとepitrochlearisのPGC-1αのmRNA及びタンパク質濃度が有意に増加した。一方、ヒラメ筋のPGC-1α濃度はAICARでのインキュベーションでは増加しなかったが、カフェインでは増加した。この結果は、身体運動による骨格筋のPGC-1α増加には、エネルギー準位の低下によるAMPKの活性化とカルシウム濃度の増加という少なくとも2つの機序があり、その関与は筋線維組成によることが示唆している。身体運動による生活習慣病の予防・治療による健康増進効果は誰もが認めることである。しかし、その機序はほとんど明らかではない。本研究では、骨格筋の糖代謝能を律速していると考えられている糖担体GLUT-4の身体運動・トレーニングによる発現量の増加の機序に関与している可能性のあるPGC-1 (peroxisome proliferator-activated receptor γcoactivator-1)の身体運動による発現量増加の機序を解明することを目的とした。【方法】(1)実験1.56週齢のSD系雄ラットに無負荷で3時間の水泳運動を45分の休憩を挟み2回、計6時間水泳運動を行わせた。運終了動直後にこれらのラットから前肢筋のepitrochlearisと後肢筋のヒラメ筋を摘出し、核分画抽出後、ウエスタンブロット法によりPGC-1量を測定した。(2)実験2.4-5週齢のSD系雄ラットからepitrochlearisを取り出し、AMPKの活性化剤であるAICAR(2mM))で、18時間インキュベーションし、その時のPGC-1のmRNA濃度をRT-PCR法で測定した。【結果】(1)実験1.6時間の水泳運動後、主働筋epitrochlearisのPGC-1濃度は75%増加したが、非活動筋ヒラメ筋のPGC-1濃度は変化しなかった。(2)実験2.AICARで18時間インキュベーションしたepitrochlearisのPGC-1のmRNA濃度はAICAR非添加の場合に比べて7倍高かった。【考察及び結論】

身体運動後のPGC-1の発現が身体運動中に動員される筋にのみ観察されるという結果は、PGC-1の発現が、交感神経系の活動のように体全体に及ぼされるものではなく、活動する筋内で惹起される情報伝達系が関与していることを示唆していると考えられる。また、実験2の結果は活動筋に特異的PGC-1の発現の機序として、運動により上昇するAMPKの活性が関与していることを示唆していると考えられた。身体運動によりPGC-1αの蛋白濃度が増加する機序を明らかにするために本実験を行った。まず、56週齢のSD系のラットをトレッドミルで6時間,低強度(分速13m)の走行運動させたところ、運動後のグリコーゲン濃度が有意に低下した後肢筋(ヒラメ筋,足底筋)ではPGC-1α濃度が増加したが、グリコーゲン濃度が変化しなかった前肢筋(epitrochlearisと三頭筋)ではPGC-1α濃度に変化は見られなかった。一方、6時間の低強度(無負荷)水泳後では逆に、グリコーゲン濃度が低下した前肢筋(epitrochlearisと三頭筋)では、PGC-1α濃度が増加したが、グリコーゲン濃度に変化が見られなかった後肢のヒラメ筋や足底筋では、PGC-1α蛋白質濃度に変化が見られなかった。これらの結果より、身体運動により動員された筋にのみPGC-1αの発現が見られることが明らかになった。次に身体運動により骨格筋のPGC-1α濃度が増加する生化学的機序を明らかにするための実験・研究を行った。摘出したepitrochlearisを試験管内でAICAR(AMPKの活性化剤)及びカフェイン(筋小胞体からのカルシウム放出を引き起こす)で18時間インキュベーションするとepitrochlearisのPGC-1α濃度が有意に増加した。一方、ヒラメ筋のPGC-1α濃度はAICARでのインキュベーションでは増加しなかったが、カフェインでは増加した。この結果は、身体運動による骨格筋のPGC-1α増加には、エネルギー準位の低下によるAMPKの活性化とカルシウム濃度の増加という少なくとも2つの機序があり、その関与は筋線維組成によることが示唆している。
翻訳の終結機構の解明

特定領域(2)(翻訳の終結機構の解明)翻訳のメカニズムは解明されたとされている。しかし、分子メカニズムに関しては実に不明な点が多く見いだされる。特に、翻訳終結から開始へのプロセスに関しては、むしろ推定の域を出ないものが多い。私達は、大腸菌の翻訳因子やリボソームを完全に精製し、再構築したPURE(Protein synthesizing system Using Recombinant Elemehts)システムを完成させることに成功している。PUREシステムによって翻訳のすべてのプロセスを、試験管のなかで行うことが可能であるばかりではなく、すべてのプロセスのスナッブショットを取ることが可能である。本研究では、RF1とRF2による終止コドンのデコーディングの機構をPUREシステムにより明らかにすることを目標としている。14年度は、PUREシステムを用いた実験系によって、RF1とRF2の、ペブチドアンチコドン部位に変異を導入し、これらのRFの終止コドンの解読の特性を解析した。その結果、これらのペプチドアンチコドンの領域は、終止コドンの解読特性には関与しないことが示唆された。同時にRRFは、翻訳終結後のリボソーム・mRNA複合体を解消のプロセスの解析を行った。その結果RRFは、リボソームを従来考えられていた30S、50Sの解離した形ではなく、70Sの状態で解離させることが示された。また、70Sの各サブユニットへの解離はIF3によっておこることが示された。
２次性てんかん予防治療における漢方療法の可能性―脳内炎症の観点からの基礎的検討ー

目的:重積発作(SE)後早期の脳内炎症関連遺伝子が誘導されたため、SE後の脳内炎症関連分子を網羅的に解析した。成績と考察:SE後2日まで炎症マーカーのPentraxin3の発現が顕著に増加していた。SE前と比べSE後に検出可能な20種すべてのサイトカイン発現量が増加し、特にIL-6,17,23,33,TNF-αは4倍以上上昇した。ケモカインも同様にSE後に10種類のケモカイン発現上昇が観察され,特にSE2日でCCL2,5,12,CXCL1,10で顕著であった。この結果は、脳内ミクログリアまたは浸潤マクロファージ/単球の関与が示唆された。そこで、予備的に海馬内のこれらの細胞(CD45/CD11b陽性)をFACSで観察した。この結果、特にSE2日後にマクロファージ/単球の海馬内浸潤が観察された。つまり、SEご早期には脳内炎症が発症し、それにはマイクログリアまたは浸潤マクロファージ/単球が関与しSE誘発サイトカインストームが出現することが示唆された。つまり、SE後早期の脳内炎症のサイトカインストームを制御する(例えば五苓散投与)ことでSE後自発てんかん発作発症を抑制する可能性を示した。重積発作(SE)後てんかん原性期早期での脳内炎症関連遺伝子が誘導されることを前年度に報告した。本年度の研究では、まだ五苓散の影響に関しては行っていないが、重積直後からの脳内炎症関連分子、特にタンパク質レベルでの変化を抗体アレーを用いたプロテオーム法で網羅的に解析した。その結果から脳内炎症に関与する細胞を調べるためFACS解析の予備的検討を行った。海馬内のこれらの細胞をFACSでCD45/CD11b発現細胞の動態を観察した。この結果特にSE2日後にマクロファージ/単球の浸潤が確認された。一方、PILO誘発重積発作後の脳波に対する五苓散の検討を行っているが、24時間ビデオ脳波装置が1台であるため数例検討できただけである。PILO-SE後の脳波は動物の個体差が大きく解析途中であり、例数を増やしている。重積後の脳内炎症に関与する細胞動態をFACS解析で明らかにする。重積直後からの五苓散投与の影響を脳内炎症関連遺伝子レベル、分子レベルでの変化をそれぞれ遺伝子解析、抗体アレーを用いたプロテオーム解析法で網羅的に、さらにFACS解析で炎症関連細胞に対する影響を検討する。海馬内のこれらの細胞のFACS解析はCD45/CD11b発現細胞だけの動態を観察しただけであるため、様々の細胞動態(T細胞など)を様々な抗体を用いて検討する。また、対照薬として抗てんかん薬、抗炎症薬も併せて検討する必要がある。24時間ビデオ脳波は、着実に例数を増やすのと、測定期間も自発けいれん発作の有無を調べるために長期間観察することを予定している。世界的な高齢社会を迎え、脳卒中、アルツハイマー病など脳器質性病変を原因とするてんかん発症率が、上昇し続けている。てんかん発作は、日常生活に大変な不安をもたらしQOL低下を招くため、てんかん発症予防は大変重要な課題である。すでに脳神経外科領域で臨床適用されている五苓散のけいれん発作後の脳内浮腫抑制効果を見いだした。そこで、本研究課題は、漢方薬のてんかん予防治療への可能性について脳内炎症の観点から臨床適用に直結する基礎的検討を行う。平成29年度においては、まず高齢者症候性てんかんの中で一番多い側頭葉てんかんの代表的モデルとしてピロカルピン投与後全身けいれんを5回重積(SE)させることで作製した。その後、自発けいれん発作(SRS、ヒトでのてんかん)が出現するまでの間の脳波を24時間ビデオ脳波で測定した。ジアゼパムでSEけいれん発作を終息することができるが、その後も脳波上臨床においても最近注目されている非けいれん発作(突発性スパイク波含む)がSRS出現まで継続的に出現していた。この非けいれん発作波に対して、漢方薬Goresan300 mg/kg連続経口投与において顕著な抑制は認められず、SRSの出現も認められた。つまり、現時点ではてんかん発症を予防することは難しいと考えてる。しかし、まだ例数が少ないため、次年度において更に詳細な検討を行う。また脳内炎症に対する漢方薬の影響を検討するために、脳内炎症関連分子の網羅的解析を行った。本年度では、SE後6時間、2日目の脳内炎症分子発現を行ったところ、SE後早期から炎症性、抗炎症性サイトカイン、ケモカインの発現上昇が観察され、サイトカインストームが起きていることが認められた。このことは、脳内炎症を制御するためには、総合的な脳内炎症の制御方法が必要であることが考えられる。その観点から、漢方薬の有用性について次年度行う。脳波長期間測定に関しては、24時間ビデオ脳波測定装置が1台しかないため、例数を増やすのが困難な状態である。しかし、重積発作により死亡する動物数も減少したため、一匹一匹着実に測定していく。また、脳内炎症関連分子の測定も、動物間のばらつきが非常に大きいため、まとまった結果が得られにくかった。しかし、コントロール動物ではある一定の結果が得られたので、薬物に対しても検討していく。