hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鎌倉時代聞書類を中心とした語彙総合データベース構築に基づく体系的記述

鎌倉時代の法談聞書類の内、解脱聞義聴集記、華厳信種義聞集記を中心に原本通りの厳密な電子化テキストを作成して、データベースの構築に着手した。聞書類は、純粋に「聞書」のみで成立しているものは皆無であり、何らかの編集の手が加えられ、大半が大幅な増補が加えられている。解脱聞義聴集記、華厳信種義聞集記も例外ではなく、電子化テキストの作成並びにデータベース化においては、これらの情報も付加していった。又、単に語論レベルのデータベースに留まるのではなく、コピュラ文を中心とする注釈形式の問題、問答体の問題を始めとした構文論的観点からの考察にも利用し得るコンテクスト形式のデータベースの構築を行った。また、高山寺、神奈川県立金澤文庫所蔵の法談聞書類の調査も行い、写真版に基づいて、電子化テキストの作成を継続させた。具体的には、高山寺蔵観智記の再調査、並びに、称名寺蔵(金澤文庫保管)止観心要聞書鎌倉時代写本、同菩提心論聞見鈔鎌倉時代写本、同菩提心論見聞鎌倉時代写本などである。成立基盤となる寺院毎の学問活動の個性が色濃く反映しており、東大寺、高山寺、称名寺等が、相互に如何なる相違を有しているかという点も非常に重要なポイントとなる。従って、用語のみならず内部構造(文章構成)の問題、関係学僧の事績の整理なども行った。未だ網羅的なデータベースとまではいかないが、課題として、これらの複眼的な視点に基づいたデータベースの構築を継続させることによって、同時代の他資料との違い、室町時代以降の抄物との異同といった未解決の問題について、非常に有効な手がかりが得られるものと期待される。本年度は、高山寺蔵「観智記」等の新たな鎌倉時代聞書類の記述的研究を実施し、総合的な語彙データベースの基盤作りを行った。高山寺所蔵の「觀智記」三帖(重文第二部第41号13)は、鎌倉時代中期書写と推定される明恵上人高辮(11781232)の講説に基づく聞書類である。明恵の最晩年期にあたる寛喜二年(1230)、寛喜三年(1231)に行われた講説に基づくもので、片仮名交り文を主体とする。編纂、書写に関する奥書を持たず具体的な年代は分明でないが、明恵上人講説による聞書類の編纂が明恵存命中に行われた例はなく、本文の片仮名字体の特徴と総合して考えると、本資料の成立、書写は明恵上人の示寂する貞永元年(1232)より後で、それからさほど下らない時期と見るのが妥当であろう。本資料の原典は、「成就妙法蓮華経王瑜迦観智儀軌」であって、明恵関係法談聞書類の中で儀軌を対象とする現存唯一の資料である。「観智儀軌」は773年に不空三蔵が大日経や金剛頂経に基づき法華経を儀軌化したものとされるもので、台密で特に尊重されたという。「観智儀軌」を対象とする一貫した講説は少なくとも寛喜2年、3年において複数回行われ、その際の聞書を取捨選択しつつ編纂したものが現存の「観智記」である。本資料に種々の注目すべき中世語的言語事象が認められることは筆者が既に指摘した通りであり、国語史的に極めて高い価値を有するが、明恵の事績をより明らかにし得る新資料であると共に、明恵教学と「観智儀軌」との接点を示す唯一の文献として殊に日本仏教史学、日本思想史学等の諸分野においても極めて有益な資料となる。本年度は、その資料的価値に鑑みて、「観智記」の全文の翻刻を解題、図版数枚と共に雑誌上に公開した(「実践国文学」61号、平成14年3月)。

未だ網羅的なデータベースとまではいかないが、課題として、これらの複眼的な視点に基づいたデータベースの構築を継続させることによって、同時代の他資料との違い、室町時代以降の抄物との異同といった未解決の問題について、非常に有効な手がかりが得られるものと期待される。
亜鉛フィンガードメインUBZファミリーのユビキチン結合特異性の解明

新規ユビキチン結合ドメインUBZ(Ub-binding zinc finger)は8つのグループからなるファミリーを形成する。UBZファミリーのうちタイプ3とタイプ4のグループはDNA修復に関与するタンパク質に見出される。一方、タイプ1およびタイプ5のグループは、転写因子NF-κBの活性制御に関与するタンパク質の中に見出される。本研究ではこれらのDNA修復と転写制御に関わるUBZドメインと種々のユビキチン鎖との相互作用の特異性を解析し、結晶構造解析によりそれらのユビキチン鎖結合特異性の違いを分子レベルで解明することを目的とする。UBZドメインはいずれも30アミノ酸程度の短い配列のため、結晶化が困難であった。そこで平成21年度に結晶成長を助けるために緑色蛍光タンパク質(GFP)をタグとして付加した状態での精製・結晶化を検討したところ、タイプ1に属するTAX1BP1のUBZドメインについて、GFPと融合させた状態での結晶化に成功し、構造解析を行うことができた。平成22年度はGFP融合法を他のUBZドメインに適用し、GFP-UBZ融合タンパク質単独での結晶化ならびにユビキチンとの共結晶化を試みた。その結果タイプ4に属するWrnip1のUBZドメインのGFP融合タンパク質とユビキチンの複合体の結晶を得ることに成功した。これまでpolηおよびNEMOのUBZドメインについてはNMR構造が報告されており、そのC末端のヘリックスがユビキチンと結合することが示唆されていた。しかしながら今回のGFP融合法を用いたWrnip1のUBZドメインとユビキチンとの複合体の結晶構造解析の結果、ユビキチンはpolηやNEMOのUBZドメインの予想されていた結合面とは全く異なる新しい面で結合していた。細胞内でポリユビキチン鎖の連結様式の違いがどのように識別されるかは、ユビキチンシグナリングを理解する上で根本的な問題である。UBZ(Ub-binding zinc finger)ドメインはDNA修復や転写制御に関わるタンパク質に存在する新規ユビキチン結合ドメインであるが、30アミノ酸程度の短い配列であるにも関わらず、8つのグループに分類され、ユビキチン鎖の結合の種類に対して異なる親和性を示すものがある。平成21年度には複数のUBZドメインについてモノユビキチンとの相互作用をプルダウン実験で検出し、表面プラズモン共鳴やマイクロ熱量計などにより結合定数を求めた。そしてそれらの結晶化を試みたが、UBZドメインはいずれも30アミノ酸程度の短い配列のため、結晶化が非常に困難であった。そこで結晶成長を助けるためにメチル化などの化学修飾、タンパク質表面のアミノ酸置換、タグを付加した状態での精製・結晶化などを検討したところ、タイプ1に属するTAXIBP1のUBZドメインについて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグと融合させた状態で結晶化することができ、構造解析に成功した。
魚類卵の卵膜硬化カスケード

ニジマスの単離未受精卵卵膜から2種類のTGase、P1、P2を精製した。P1は76および82kDaの2種類のタンパク質から成るが両者のアミノ酸組成に差違はない。P2は76kDaの均一なタンパク質であった。P1は低イオン強度でのみ活性が発現する性質を持つ。ニジマス卵が淡水中で受精し、淡水中で速やかに卵膜硬化することを考慮すればP1が卵付活後の卵膜硬化に重要な意味を持つのであろう。卵付活後TGase活性は卵膜と可溶性の2つの画分にみられた。卵膜のTGaseは、抗P1抗体と反応し、そのサイズは48kDaで、活性も増加していた。一方、可溶性画分のTGaseは抗P2抗体とのみ反応した。P2は卵膜から囲卵腔へと遊離するのであろう。すなわち、付活後Plは卵膜に留まった状態でタンパク質分解酵素によって加工を受け、活性化され、卵膜タンパク質の中の局限された部分を架橋する。一方、P2は囲卵腔に遊離し卵膜全体に作用して卵膜タンパク質全般を架橋するのであろう。硬化卵膜の中には、GL含量が多くProやGln残基の多い特別な領域とそれ以外の2つ領域がある。卵膜硬化はこのような2種類のTGaseの協同作用の結果である。P2 TGaseの遊離はEDTAおよびleupeptin感受性proteinaseによる。ニジマス卵の卵膜硬化はTGaseによる架橋反応だけによっているのではない。TGaseの基質である卵膜タンパク質(49、56、65kDa)の変化をも伴っている。すなわち、49kDaタンパク質の42kDaへの低分子化反応である。この反応に関与する酵素はEDTA感受性の金属proteinaseであり、それが活性を持つにはleupeptin感受性proteinaseが必要であった。メダカ卵においても基本的に同様なメカニズムで卵膜は硬化する。このように、魚類卵の卵膜硬化は、硬化酵素TGase、EDTAおよびleupepetin感受性proteinase、基質としての卵膜タンパク質の関与する複雑な反応系であり、付活後卵細胞から分泌されるCa^<2+>イオンにより自動的に進行するひとつの"cascade"を成したものである。メダカやニジマス等の魚類卵の卵膜硬化は、卵膜構成タンパク質の金属プロテアーゼによる限定分解と、トランスグルタミナーゼ(TGase)による高分子化(重合)反応の2つの反応が関与する。このカスケード系を理解するために、交付申請書に記載した3つの具体的な研究を行なった。その成果を交付申請書に従って以下に記載する。(1)ニジマス未受精卵の単離卵膜の生理食塩水抽出液中にTGase活性が見られることはすでに分かっていた。この抽出液を出発材料として各種のカラムクロマトグラフィーを用いて2種類のTGase(P1、P2)を精製し、生化学的・酵素学的な性質を調べた。一般に知られているTGaseとほぼ同様の性質を持っていたが、P1 TGaseは特徴的で低イオン強度でのみその活性が発現するものであった。

これは、卵が淡水中で受精反応を行ない、淡水中で速やかな卵膜硬化反応を進行させることを考慮すると、好都合な性質である。この成果の一部はすでに発表されている(Ha and Iuchi,1997;Ha and Iuchi、1997)。(2)メダカ卵の卵膜硬化の過程で金属プロテアーゼによる構成タンパク質の限定分解が起こることはすでに報告した(Ha and Iuchi,1996)。ニジマス卵においても同様に金属プロテアーゼが関与するという事実が判明した。今後その精製と性格付けを試みたい。(3)新しい発見があった。それは、卵付活後TGaseがある種のプロテアーゼにより限定分解され、同時にその活性が上昇するらしいことである。これは、上記のTGase、金属プロテアーゼの他に卵膜硬化カスケードの新しい成員が発見されたことを意味し、今後、このプロテアーゼの精製を試み、これら成員間の相互作用を調べる予定である。メダカやニジマス等の魚類卵の卵膜硬化は、卵膜構成タンパク質の金属プロテアーゼによる限定分解と、トランスグルタミナーゼ(TGase)による高分子化反応の2つの反応が関与する。このカスケード系を理解するために、交付申請書に記載した3つの具体的な研究を行い、以下の研究成果が得られた。(1)ニジマス未受精卵卵膜から2種類のTGase(P1、P2)を精製し、酵素学的性質、タンパク化学的性質を調べた。P1(82および76kDa)は淡水のような低イオン強度下でのみ活性をあらわし、P2(76kDa)はイオン強度に関係なく活性を持っていた。受精後の速やかな卵膜硬化が起こるためにはP1が特に重要であろう。アミノ酸組成を比較すると、P1とP2は新規なTGaseであると考えられた。(2)抗体を利用して卵付活後のTGaseの挙動を調べてみた。P1は48kDaタンパク質になり卵付活後も卵膜に留まっていた。一方、P2は卵膜より遊離することが分かった。48kDaTGaseは卵膜タンパク質を局所的に重合し、遊離するP2は囲卵腔の中をめぐって卵膜全体に作用し卵膜硬化に関与するのであろう。(3)メダカ卵でもTGaseにより卵膜硬化が起こる。TGaseは未受精卵卵膜に局在しているが、ニジマス卵と異なり、種々の溶媒を用いても抽出不可能であった。卵付活後の挙動を調べると、TGaseには2種類あり、一方は卵膜に留まり、他方は卵膜より遊離することが分かった。これらの変化には、leupeptin感受性、および、EDTA感受性タンパク質分解酵素が関与している。以上のように、単純そうに見える卵膜硬化の現象は、2種類のTGaseと少なくとも2種類のタンパク質分解酵素が関与し、付活後卵細胞より分泌されるCa^<2+>イオンをトリガーとして起こることが明らかとなった。
発癌機構における上皮と間質の相互作用の研究

上皮と間質の相互作用は、腫瘍の成長と悪性化を制御する重要な要素である。我々は様々なモデルマウスに発生する腫瘍を解析し以下のような知見を得た。Apc遺伝子ノックアウトマウスに形成される直径1mm以上のポリープでは、PGE_2合成に重要なCOX-2とmPGESの発現が間質の線維芽細胞において増加すること、VEGFの発現が誘導され血管形成が増加することを示した。さらに、PGE_2受容体のEP2遺伝子を欠損させるとポリープ数が激減すること、EP2の欠損したポリープではCOX-2およびVEGFの発現誘導が抑制されることを明らかにした.またLkb1, Smad4, Cdx2遺伝子の各ノックアウトマウスにそれぞれ発生する胃幽門部、十二指腸、大腸の過誤腫性腫瘍でもCOX-2とmPGESの発現が間質細胞で誘導されることを示した。以上の結果から、原因遺伝子に関わらず腸管腫瘍の成長には間質の線維芽細胞によるPGE_2の産生とEP2受容体を介した血管新生の促進が重要であることが示された。一方で、COX-2とmPGESを胃粘膜上皮に発現するトランスジェニックマウスではマクロファージの浸潤を伴う過形成性腫瘍が胃に発生すること、これがCOX-2阻害薬や抗生物質により抑制されることを見出し、PGE_2と胃粘膜細菌によって集籏・活性化したマクロファージが上皮細胞の増殖を促進することを明らかにした。間質の線維芽細胞やマクロファージは腫瘍の成長に加え、その悪性化にも関わることが示唆されている。我々はApc/Smad4複合変異マウスに生じるポリープでは癌化上皮細胞が間質増生を伴って浸潤することを見出したが、浸潤部周囲に存在する間質細胞は線維芽細胞やマクロファージではないことが明らかとなり、大腸癌が浸潤する初期段階では従来の報告とは異なる間質細胞が関与している可能性が示された。我々は先に家族性大腸ポリープ症のモデルとしてApc遺伝子ノックアウトマウスを作出し、この系を用いてCOX-2が腸ポリープ形成に重要な役割を果たすことを証明した。また、COX-2阻害薬を用いた化学療法への戦略を確立した。本年はCOX-2の上流に位置するフォスフォリパーゼA2と下流に位置するPGE_2受容体の役割について検討した。細胞質型フォスフォリパーゼA2(cPLA2)が小腸において著しく誘導されていることを見いだしたので、ApcノクアウトマウスとcPLA2遺伝子ノックアウトマウスを交配して複合変異マウスを作出したところ、小腸のポリープの大きさに著名な減少を認めた。一方、大腸では分泌型フォスフォリパーゼA2(sPLA2)の活性が高いことが認められ、sPLA2がアラキドン酸の供給をになっていることが示唆された。アラキドン酸代謝経路のなかでCOX-2は酵素学的に律速段階に位置しているが、生理的条件下では基質アラキドン酸の供給制御が主要な役割を果たしており、今回得られた知見はcPLA2活性が腸ポリープ形成の修飾因子として重要であることを示している。COX-2の下流に位置するPGE2受容体には、EP1、EP2、EP3、EP4の4種類が知られている。これら受容体のノックアウトマウスとApc遺伝子ノックアウトマウスとの交配により複合変異マウスを作出し、腸管に発生するポリープを解析したところ、EP2変異マウスでポリープの数および大きさの有意な減少が認められた。

また、EP2遺伝子変異マウスのポリープではCOX-2遺伝子の発現誘導が見られず、EP2を介したPGE2のシグナルがポリープでのCOX-2発現誘導に必須であることを示した。したがってPGE_2受容体であるEP2は、COX-2の発現を自己増幅することで重要な生体反応を媒介しているという、極めて新しい概念が確立されたと言える。1.家族性大腸ポリープ症のモデルであるApcノックアウトマウスの腸管全域には多発性にポリープが自然発生する。これまでの研究により、間質でのCOX-2発現誘導が腫瘍細胞増殖に重要であること、およびTGF-βシグナルの遮断が悪性化に関与していることを明らかにした。以上の現象における分子機序を明らかにする目的で、以下の研究を行なった。(1)Apc遺伝子とPGE_2受容体各遺伝子の複合ノックアウトマウスを作製し解析した結果、間質でのEP2受容体を介したシグナルがポジティブフィードバック機構によりCOX-2の発現レベルを維持しており、さらにVEGFの発現を誘導して血管新生に関与していることを明らかにした。(2)Smad2はTGF-βシグナルに関わる因子であり、Smad4とともに腫瘍抑制因子の可能性が指摘されている。そこでSmad2 Apc複合ノックアウトマウスを作製して解析した結果、Smad2欠損はポリープ発生に影響を及ぼさなかった。したがってTGF-βの腫瘍細胞増殖抑制性作用はSmad2に依存していないことが明らかとなった。2.あらたな腫瘍発生モデルとしてLkb1ノックアウトマウスを作出した。このマウスでは胃および小腸の過誤腫性ポリープと肝細胞がんを発生した。消化管ポリープではβ-catenin局在変化などのWnt経路の活性化が認められず、Apc遺伝子変異とは異なる分子機序での腫瘍発生が示唆された。今後、ApcおよびLkb1双方の変異マウスを比較解析し、共通した間質側からの作用の解明を行う。肝がんではLkb1遺伝子のLOHが認められ、Lkb1のがん抑制遺伝子としての機能が示唆された。同時に、肝がん発生に重要とされるβ-catenin変異をコンディショナルに導入したが肝腫瘍は発生せず、Wnt経路の活性化だけでは肝がん発生に至らないことを明らかにした。上皮と間質の相互作用は、腫瘍の成長と悪性化を制御する重要なファクターである。我々は腸管ポリープにおいて、間質でのプロスタグランジン生成や、腫瘍細胞でのTGF-βシグナルの遮断が及ぼす影響とその分子機序について以下のような知見を得た。In vitro実験ではCOX-2が低酸素状態で誘導されるという報告があるが、Apc遺伝子ノックアウトマウスのポリープにおいて低酸素状態は観察されなかった。このポリープ組織でのCOX-1、COX-2、mPGESの局在を調べたところ、これらが主に線維芽細胞で発現しており、ポリープ発生初期ではCOX-1が、直径1mm以上のポリープではCOX-2が、それぞれ腫瘍細胞の増殖に重要なことが示唆された。さらにCOX-2の発現をリアルタイムで観察するため、COX-2遺伝子座に変異型ドーパミンレセプター遺伝子を導入した新たなモデルマウスを作製した。Apc^<Δ716>/Smad4複合変異マウスは浸潤性の高い悪性腺がんを発症し、良性腫瘍の悪性化モデルとして非常に有用であるが、脆弱で系統維持が困難であった。そこで人工授精及び卵巣移植によってこれを解決し解析に必要な動物数を確保した。
マウス初代培養細胞を用いた肺腺がんの遺伝的再構成

マウス肺由来正常3D培養細胞を用いた遺伝的再構成(レンチウィルスによるがん抑制遺伝子shRNA等の遺伝子導入)によるin vitro肺発がんモデルの構築を目指した。培養条件を検討し、シグナル伝達関連因子の阻害剤XとII型肺胞上皮細胞の誘導効果を持つ成長因子Yを添加した無血清培地に決定した。化学物質の肺発がん性のin vitro評価系への応用では、肺発がん性物質Cを陽性対象として、化学物質暴露と組合せた既存の細胞生存性試験による用量設定が可能だった。複数回暴露後に、ヌードマウス皮下腫瘍の異型性の進展を認め、異型性の変化が発がん性評価の指標となりうることを示した。正常小腸3次元(3D)培養細胞においては、「in vitro発がん再構成」の手法を既に確立していたが、肝臓組織より樹立した胆管細胞(肝内胆管由来)においても、3D培養が可能であり、レンチウィルスによる遺伝子導入と組み合わせた「in vitro発がん再構成」を確認した。様々な臓器で、3D培養細胞を用いた「in vitro発がん再構成」が可能と考えられた。正常肺3D培養細胞を用いた遺伝的再構成によるin vitro肺発がんモデルの構築のために、まず、多様な細胞種の培養を可能にする培養条件を検討した。EGF添加無血清培地に、あるシグナル伝達関連因子の阻害物質である低分子化合物Xを添加して培養し、遺伝的再構成を行った後に、ヌードマウス皮下での腫瘍形成能を解析した。Kras変異(LSL-KrasG12D)マウス由来の正常肺3D培養細胞を、Cre recombinaseを導入してKrasを活性化させた後に、がん抑制遺伝子のshRNA (shGeneA)を導入すると腫瘍が形成された。更に、低分子化合物Xの種々な濃度、及びII型肺胞上皮細胞の誘導が報告されている成長因子Yの有無で培養し、3D培養細胞の形態の組織学的解析から、条件検討を行った。成長因子Yの添加により、細胞増殖が昂進すると共に、II型肺胞上皮細胞のマーカーが陽性の細胞数が増加したので、成長因子Yは添加して培養することにした。現在、低分子化合物Xの有無の2条件で、遺伝的再構成(陰性コントロール、Krasの活性化のみ、Krasの活性化+shGeneAの3パターン)を行い、ヌードマウス皮下での腫瘍形成能の獲得を検討中である。平成27年度に、まず、この2条件で形成されるヌードマウス皮下腫瘍を組織学的に解析し、培養条件を確定する。正常小腸3次元(3D)培養細胞において、「in vitro発がん再構成」の手法を既に確立し、肝内胆管由来細胞でも、3D培養が可能であり、in vitro発がん再構成を確認した。このように、様々な正常臓器由来の3D培養細胞で「in vitro発がん再構成」が可能と考えられ、肺を用いて、正常3D培養細胞を用いた遺伝的再構成によるin vitro肺発がんモデルの構築を目指した。3D培養の条件検討において、EGF添加無血清培地への、あるシグナル伝達関連因子の阻害物質である低分子化合物XとII型肺胞上皮細胞の誘導の報告がある成長因子Yの添加が有効であると平成26年度に報告した。本年度は、低分子化合物Xの2条件で、遺伝的再構成[陰性コントロール、Krasの活性化のみ、Krasの活性化に加えてがん抑制遺伝子AのshRNAによる抑制(Krasの活性化+shGeneA)]を行い、ヌードマウス皮下での腫瘍形成能を解析した。Xが低濃度の条件で、Krasの活性化のみでは、異型性を獲得せず、Krasの活性化+shGeneAの遺伝的再構成を行うと、異型性を獲得することを見出し、この培養条件を用いることにした。化学物質の肺発がん性のin vitro評価系への応用には、用量設定が重要である。経時的変化も観察可能な既存の96 well baseの細胞生存性試験が、マトリゲルを基材とする肺3D培養細胞にも応用可能なことを見出した。肺3D培養細胞への化学物質の暴露方法を確立し、実際、大気汚染物質である、タバコ煙中に含まれる発がん物質Bを肺3D培養細胞に暴露させると、用量依存的に細胞生存性に影響した。化学物質の細胞生存性への影響と、化学物質に暴露させた細胞のヌードマウス皮下での腫瘍形成能との関連を解析する必要があるが、化学物質の細胞生存性への影響は、用量設定の指標に十分なりうると考える。本年度は、正常肺組織の3D培養条件を決定した。また、Krasの活性化に加えてがん抑制遺伝子AのshRNAによる抑制の遺伝的再構成を行うと、ヌードマウス皮下に異型性のある腫瘍を誘発したので、「遺伝的再構成によるin vitro発がんモデル」は構築できたと考える。細胞への化学物質暴露と組み合わせた化学物質の肺発がん性のin vitro評価系の構築への応用」に関しては、用量設定に、既存の96 well baseの細胞生存性試験が応用可能であることを見出し、肺3D培養細胞への化学物質の暴露方法も確立した。ハイスループットに用量設定ができる可能性を示した。しかし、「肺発がん分子機構の解明のためのがん遺伝子候補の発がんへの影響の解析」や「遺伝的再構成した細胞を用いた遺伝子発現解析からの発がん関連要因の候補の探索」に関しては、進まなかったので、「遅れている」とした。

このように、様々な正常臓器由来の3D培養細胞で、「in vitro発がん再構成」が可能と考えられ、肺を用いて、正常3D培養細胞を用いた遺伝的再構成によるin vitro肺発がんモデルの構築を目指した。3D培養条件の検討では、EGF添加無血清培地への、あるシグナル伝達関連因子の阻害剤XとII型肺胞上皮細胞の誘導効果がある成長因子Yの添加が有効であり、Krasの活性化に加え、がん抑制遺伝子AのshRNAを導入する遺伝的再構成により、異型性を獲得することを見出し、この培養条件を用いることにした。「細胞への化学物質暴露と組み合わせた化学物質の肺発がん性のin vitro評価系の構築への応用」に関しては、用量設定のために、経時的変化も観察可能な既存の96 well baseの細胞生存性試験が、マトリゲルを基材とする肺3D培養細胞にも応用可能であり、化学物質の活性化のためのS9 mix添加条件も検討した。大気汚染物質であり、タバコ煙中に含まれ、肺発がん性を示す物質Bを陽性対象とし、肺3D培養細胞に暴露させると、用量依存的に細胞生存性に影響を与えた。平成28年度は、物質Bを肺3D培養細胞に複数回暴露し、ヌードマウス皮下での腫瘍形成を解析した。未処理の肺3D培養細胞も、皮下に単層の円形腺管構造を形成して残存するが、Bを暴露させた場合には、構造が不定形となり、腺管周囲にも上皮由来細胞の浸潤が認められ、異型性の憎悪が認められた。in vitro肺発がんモデルでの評価の指標の一つとして、異型性の変化が有効であることが示された。マウス肺由来正常3D培養細胞を用いた遺伝的再構成(レンチウィルスによるがん抑制遺伝子shRNA等の遺伝子導入)によるin vitro肺発がんモデルの構築を目指した。培養条件を検討し、シグナル伝達関連因子の阻害剤XとII型肺胞上皮細胞の誘導効果を持つ成長因子Yを添加した無血清培地に決定した。化学物質の肺発がん性のin vitro評価系への応用では、肺発がん性物質Cを陽性対象として、化学物質暴露と組合せた既存の細胞生存性試験による用量設定が可能だった。複数回暴露後に、ヌードマウス皮下腫瘍の異型性の進展を認め、異型性の変化が発がん性評価の指標となりうることを示した。1年目は、多様な細胞種の培養を可能にする培養条件を検討した過程までだったので、「少し遅れている」とした。それは、肺組織中の気道上皮細胞のみならず、多様な細胞種の培養は、特に肺腺がんを誘発するモデルの構築には必要不可欠と考え、詳細に検討したためである。正常肺組織の3D培養の条件の確立は、これ以降の実験の基本となるものであり、非常に重要である。平成26年度の段階で、ほぼ2条件に絞り込み、現在、遺伝的再構成によるヌードマウスでの皮下腫瘍形成能の解析中であり、その解析結果から、培養条件を確定し、以降の実験を行う予定である。正常肺3D培養の方法は確立し、「遺伝的再構成によるin vitro発がんモデル」は構築できたので、以後、下記の解析を行う。また、最終年度であるので、これらの結果を取りまとめて、論文発表を行うことを目指す。1.化学物質の肺発がん性のin vitro評価系への応用:モデル化合物を用いて、化学物質の細胞生存性への影響と、化学物質に暴露させた細胞のヌードマウス皮下での腫瘍形成能との関連を解析する。
一次元多核金属錯体における異種遷移金属間の結合に関する研究

近年高分子の主鎖に炭素以外の元素を組み入れる多くの研究が行われている。しかしながら主鎖を全て遷移金属にしたポリマーはこれまで合成されていない。本研究ではこの目的のために2核モリブデン錯体をモノマーとして用いることにより(Mo_-Mo_-Ni)ユニットが繰り返し並んだ錯体の合成を行った。さらにオリゴマーのモデル化合物として3核および4核金属錯体の合成についても報告する。モノマーとして用いた2核モリブデン錯体は6-ジフェニルホスフィノ-2-ピリドン(1)(=pyphosH)配位子とMo_2(OAc)_4をNaOMe存在下、配位子交換反応させMo_2(pyphos)_4(2)として単離した。この錯体の構造上の特徴は両端に三級ホスフィンがトランス配置で存在し、ここにさらに金属が配位できる空間があることである。その結果、モリブデンと直接相互作用できる他の金属を導入することができる。2とNi(cod)_2(cod=1,5-cyclooctadiene)をトルエン中1:1の割合で反応させると紫色微結晶が得られた。生成物は(Mo_-Mo_-Ni)ユニットが繰り返された高分子化合物と考えられる。しかしこの化合物はあらゆる溶媒に不溶であり同定が困難なためオリゴマーの合成を行い多核化反応を検討した。ホスフィンに配位できる単核錯体MLmL ́nと錯体2を反応させ、Mo-Mo4重結合の両端に金属が結合したM-Mo-Mo-M型の四核錯体(3)を得ることができた。Mとして白金やパラジウムの4核錯体のX線結晶構造解析を行ない、4個の金属原子が一直線上に並んでおりMo-M結合があるこを明らかにした。
電子スペクトルによる回転異性体の研究

従来,回転異性体の研究は赤外,ラマンの振動スペクトルやマイクロ波吸収等の回転スペクトルによってなされてきたが,すべて電子基低状態における異性体間のわづかなスペクトル差を検出し同定するもので,これらの方法の複雑な多原子分子への適用はすでに限界に達しており,新しい観点からのアプローチが望まれていた.本研究は現状を打破し,回転異性体研究の新たな発展をうながすものとして,電子スペクトルの利用を提唱し,種々の芳香族分子の回転異性体に適用した.超音速ジェットで生成した極低温孤立分子について種々のレーザー分子分光法を適用し,多くの置換ベンゼンの回転異性体が電子スペクトルによって容易に分離して観測されることを示した.これは電子スペクトルが複雑な分子の異性体分離に極めて有効であることをはじめて立証したもので,その意義は極めて大きい.さらに各回転異性体をレーザー二重共鳴分光法によって選択的にイオン化し,これら異性体のイオン化ポテンシャルを正確に求めた.その結果,異性体内間のイオン化ポテンシャルの差は200cm-1にも及びイオン化による異性体分離の可能性が示唆された.また,超音速ジェット条件下でこれら異性体と種々の溶媒分子間の錯体形成を研究した結果,各異性体は溶媒分子と選択的な錯体形成をすることが見いだされた.これは回転異性体の選択的化学反応に通じるものであり,その成果は内,外から注目されている.さらに回転異性体における分子内大振隔振動ふ分子内水素結合が解明され,エネルギー緩和機構等について貴重な知見が得られた.以上の成果は初期の目的を完全に達成し,電子スペクトルが回転異性体研究の最有力手段である事を明確に示したものである.従来,回転異性体の研究は赤外,ラマンの振動スペクトルやマイクロ波吸収等の回転スペクトルによってなされてきたが,すべて電子基低状態における異性体間のわづかなスペクトル差を検出し同定するもので,これらの方法の複雑な多原子分子への適用はすでに限界に達しており,新しい観点からのアプローチが望まれていた.本研究は現状を打破し,回転異性体研究の新たな発展をうながすものとして,電子スペクトルの利用を提唱し,種々の芳香族分子の回転異性体に適用した.超音速ジェットで生成した極低温孤立分子について種々のレーザー分子分光法を適用し,多くの置換ベンゼンの回転異性体が電子スペクトルによって容易に分離して観測されることを示した.これは電子スペクトルが複雑な分子の異性体分離に極めて有効であることをはじめて立証したもので,その意義は極めて大きい.さらに各回転異性体をレーザー二重共鳴分光法によって選択的にイオン化し,これら異性体のイオン化ポテンシャルを正確に求めた.その結果,異性体内間のイオン化ポテンシャルの差は200cm-1にも及びイオン化による異性体分離の可能性が示唆された.また,超音速ジェット条件下でこれら異性体と種々の溶媒分子間の錯体形成を研究した結果,各異性体は溶媒分子と選択的な錯体形成をすることが見いだされた.これは回転異性体の選択的化学反応に通じるものであり,その成果は内,外から注目されている.さらに回転異性体における分子内大振隔振動ふ分子内水素結合が解明され,エネルギー緩和機構等について貴重な知見が得られた.以上の成果は初期の目的を完全に達成し,電子スペクトルが回転異性体研究の最有力手段である事を明確に示したものである.従来、回転異性体の研究は赤外、ラマンの振動スペクトルやマイクロ波吸収等の回転スペクトルによってなされてきたが、すべて電子基底状態における異性体間のわずかなスペクトル差を検出し同定するもので、これらの方法の複雑な多原子分子への適用はすでに限界に達しており、新しい観点からのアプローチが切に望まれている。本研究は現状を打破し、回転異性体の新しい発展をうながすものとして、回転異性体の電子状態、イオン状態に注目し、これら状態間の差掫利用して異性体の同定を行なうとともに、励起電子状態、イオン状態における回転異性体の静的、動的挙動を解明することを目的とする。我々は超音速ジェットの極低温孤立分子条件下で種々のレーザー分子分光法を駆使して多くの置換ベンゼンの回転異性体の検出に成功した。本年度はとくにパラージメトオキシベンゼンにおけるシス、トランス回転異性体の構造、反応性について集中的に研究を行った。この分子の【S_o】→【S_i】吸收スペクトルを蛍光励起分光法、多光子イオン化分光法を用いて測定し、1光子吸收スペクトルと2光子吸收スペクトルの比較からシス、トランス異性体の電子状態をはじめて同定した。さらに二波長分光法により、これら異性体のイオン化ポテンジャルの精密測定を行った。その結果、S状態、イオン状態においてこれら異性体は200【Cm^-1】のエネルギー差を有することが明らかとなり、異性体の同定、分離に電子スペクトルが極めて有効であることを立證した。さらに超音速ジェット条件でこれら異性体と種々の溶媒分子間の錯体形成を研究した結果、シス、トランス異性体は無極性溶媒分子と錯体をつくるが、有極性溶媒分子はトランス異性体とのみ錯体を形成することを見いだした。このような回転異性体の選択的錯体形成は、回転異性体の選択的化学反応に通じるものであり、その成果は内、外から大いに注目されている。前年度までの研究で、ベンゼン誘導体をはじめとする複雑な多原子分子の回転異性体が、超音速ジェットレーザー分子分光法を利用した電子スペクトルで容易に分離、同定することができ、電子励起エネルギー,イオン化ポテンシャルが回転異性体間で大きく異なることを示した。

本年度はさらに研究を発展し、回転異性体の反応選択性について研究し注目すべき結果を得た。ジメトオキシベンゼンのシス体,トランス体のそれぞれについて、超音速ジェット中で各種溶媒分子との間にファン・デル・ワールス錯体の生成を試みた。その結果、シス体は有極性溶媒分子と錯体をつくるが、トランス体は錯体を生成しない事が明らかとなった。この結果は回転異性体の選択的反応性をはじめて明らかにしたもので、その意義は極めて大きい。さらに、メタ-クレゾールについてOH基の配向によるシス体,トランス体を電子スペクトルで分離、同定し、各異性体の基底電子状態,励起電子状態イオン状態について詳しい研究を行った。その結果、両異性体とも【CH_3】基の内部回転ポテンシァルが状態により大きく変化する事を見出した。すなわち、基底電子状態では【CH_3】基の内部回転障壁は20【cm^(-1)】程度と小さいが、励起電子状態及びイオン状態では200300【cm^(-1)】と大きくなる事が分った。これは【CH_3】基の超共軛が電子励起に伴って著るしい増加を示すものであり、分子の反応性に及ぼす超共軛効果の役割を理解するうえで極めて重要な結果と言える。
清酒・酒米市場の変化と酒造業の経営対応

清酒はわが国において長期にわたって接続しつづけてきたが、第二次世界大戦後、ビール、焼酎、ワインなど他の酒類産業が発展し、清酒市場は相対的にも絶対的にも縮小をよぎなくされた。縮小化された清酒市場において、清酒製造業の競争も強まり、二極分化が進行しつつある。大規模メーカーでは装置産業化、大量生産化が志向され、自社操業度を高め、おけ取引からも撤退している。中小規模メーカーでは、鋳造好適米の使用比率を高め、また、純米酒、吟釀酒など品質志向を強め、高附加価値化を図っている。こうした傾向は、実態分析を実施した広島県西条地区の酒造業にも見られた。大規模メーカーに属するA酒造においては、旧来の杜氏組織から脱却し、最新式の酒造設備を開発・整備し、コンピュータ制御による一貫作業体系を完成させ、年間生産体制を整えている。中小規模メーカーであるE酒造では純米酒へのこだわりが強く、農業生産者グループと契約し、有機・天日干した原料米を用いた清酒を製造している。バブル形材の崩壊、低経済成長下での酒類市場をめぐる競争が強まる中で、こうした二極分化の方向は一層促進されるものといえよう。
高齢者の社会的孤立を抑制する物理エージェントの研究

少子高齢社会における深刻な問題のひとつに、高齢者を始めとする人々の社会的な孤立がある。本研究では、人々をつなぎ、人々に安心感を与える物理エージェント技術を開発して、この社会的問題に対するソリューションを提示することを目指す。物理エージェントのソフトウェア・ハードウェアに関する要素技術側面から、技術の導入側面に至るまで、幅広い側面における研究を行う。フィールド実験や調査によって技術検証や知見収集を行い、物理エージェントの設計指針を明らかにする。高齢者をはじめとする人々の社会的な孤立は、少子高齢社会における深刻な問題の一つである。本研究では、人々をつなぎ、人々に安心感を与える物理エージェント技術を開発し、この社会的問題に対するソリューションを提示する。要素技術側面から技術の社会導入に至るまで、幅広い側面における物理エージェントの設計指針を明確化して世界に発信する。高齢者の社会的な孤立を防ぐ物理エージェントのあるべき特性を多角的に検討し、その具体的な設計指針を示す点に学術的意義がある。本研究成果により、社会的な孤立を防ぐソリューションの提示、および得られたソリューションの伝道師(アクティブシニア・エバンジェリスト)として、最新技術に詳しくアクティブな高齢者を活用する社会的な仕組みの創出が期待される。
有機スズによる腹足類のインポセックス誘導:レチノイドX受容体関与説の高度化

イボニシ(Thais clavigera)を中心に、RXRに関する生物学的特徴と、ペニス及び輸精管の分化・成長・形態形成との関係を解析した。イボニシRXRには2つのアイソフォームが存在し、両者で転写活性能が異なること、並びに9-cisレチノイン酸(9cRA)、トリブチルスズ(TBT)及びトリフェニルスズ(TPT)により転写活性の誘導がみられることなどを明らかにした。イボニシとバイ(Babylonia japonica)における生殖腺の分化及び生殖輸管の発達を組織学的に調べ、明らかにした。イボニシの神経ペプチドに関する基礎知見を得た。イボニシとバイにおける脊椎動物様ステロイドの検出を試みるとともに、ステロイド受容体が見出されないこと、アロマターゼ阻害剤とテストステロンでインポセックスの発症・増進が見られないことを明らかにした。イボニシRXRに関する生物学的特徴と、ペニス及び輸精管の分化・成長・形態形成との関係を解析する一環として、RXRサブタイプ及びその他の核内受容体の探索を行った結果、イボニシRXRにはバリアントが2つ存在することがわかった。これらの配列を用い、reporter gene assayを行った結果、9-cisレチノイン酸(9cRA)に対する転写活性を示した。この系を用い、トリブチルスズ(TBT)及びトリフェニルスズ(TPT)での転写活性を測定したところ、いずれの有機スズを用いた場合でも9cRAと概ね同等の転写活性を示すことが明らかとなった。また、ほ乳類のRXRを用いた研究より、生体内に存在しRXRのリガンドとなりうる物質として、ドコサヘキサエン酸(DHA)が知られているが、今回の系でDHAを用いた場合ではほとんど転写活性が見られなかった(但し、高濃度のDHA(10^<-4>M)では細胞毒性が出るため、転写活性は測定不能)。また、イボニシRXRの特異抗体を作製し、immuno-blotting等により検討した結果、抗体価が高く、イボニシRXRを特異的に検出することを確認した。また、イボニシ組織を用いたwestern blotting及び免疫染色法で、組織中のRXRタンパクも認識した。さらに、イボニシからRAR類似配列の部分断片を得ており、全長のクローニングに向けた検討を進めている。一方、イボニシ神経ペプチド前駆体遺伝子を新たに7種クローニングし、前駆体蛋白質の一次構造を明らかにした。イボニシにおいても多種多様なペプチドが協同して生理機能を制御することが示唆され、イボニシの神経系における神経ペプチドの構造と機能が当初の想像以上に複雑で多様なものであることがわかった。クローニングした前駆体遺伝子の神経系における発現細胞をin situ hybridization法により明らかにした。前鯛類におけるレチノイドX受容体(RXR)を介したインポセックスの誘導機構を解析した。イボニシRXR遺伝子に関する生物学的性状決定と、ペニス及び輸精管の分化・成長・形態形成との関係を解析する一環として、RXRサブタイプ及びその他の核内受容体の探索を行った結果、イボニシRXRには2つのアイソフォームが存在することを明らかにした。これらの配列を用いてレポータージーンアッセイを行った結果、9-cisレチノイン酸(9cRA)、トリブチルスズ(TBT)及びトリフェニルスズ(TPT)やRXR特異的アゴニストにより転写活性の誘導がみられた。また、これまでに我々が作成したイボニシRXRの特異抗体を用い、immuno-blotting法によりペニス組織でのRXRタンパクの発現解析も行った。前鯉類のRXR遺伝子の機能同定に関し、他種のRXR遺伝子を用いてレポータージーンアッセイ法による機能解析も行った。バイ及びヨーロッパチヂミボラよりRXR遺伝子を単離し9cRA、TBT、TPTなどを用いた転写活性誘導を調べた。イボニシから単離同定した神経ペプチドの前駆体遺伝子をクローニングし、APGWamide、Thais-enterin related peptides、Thais excitatory peptideの3種で2つの前駆体蛋白質の存在を明らかにし、それらの遺伝子のイボニシ中枢神経系における発現をin situ hybridization (ISH)法で再検討した。発現量が少ない前駆体遺伝子の発現解析のため、オリゴDNAプローブを用いたISHでは明確なシグナルが確認できなかったLeucokinin様ペプチド前駆体遺伝子についてRNAプローブを用いたISHを試みた。抗APGWamide抗体による免疫染色の結果、イボニシのペニスの輸精管に沿って走向する神経東内に免疫陽性の神経繊維があることがわかった。1.ヒトRXRアゴニスト及びアンタゴニストによるイボニシのインポセックス誘導・増進に及ぼす影響イボニシ(Thais clavigera)

RXRを用いたレポータージーンアッセイを行った結果、ヒトRXR特異的アゴニストにより転写活性の誘導が認められた。また、イボニシRXRレポータージーンアッセイで9-cisレチノイン酸(9cRA)、トリブチルスズ(TBT)及びトリフェニルスズ(TPT)により誘導される転写活性をヒトRXR特異的アンタゴニストが阻害することが確かめられた。一方、ヒトRXRアゴニスト物質の筋肉注射試験及びアンタゴニスト物質の流水式連続曝露試験を行い、それぞれがイボニシのインポセックス誘導及び増進に及ぼす影響を調べた。現在、再実験が進行中である。2.イボニシ以外の前鰓類のRXRのクローニングと転写活性能前鰓のRXR遺伝子の機能同定に関して、イボニシ以外の前鰓類としてヨーロッパチヂミボラ(Nucella lapillus)及びバイ(Babylonia japonica)を用いてRXRのクローニングを行った。その結果、いずれの種においても、イボニシで報告されたのと同様のアイソフォームが存在することが確認された。これらのRXR遺伝子を用いてレポータージーンアッセイ法により機能検討を行った結果、いずれのRXR遺伝子を用いたアッセイにおいても9cRA存在下で転写活性が認められた。また、有機スズであるTBT、TPTなどを用いた転写活性誘導実験においても、イボニシRXRを用いた場合と同様の転写活性誘導が認められた。3.イボニシにおけるペニス神経細胞の同定と機能解析に向けた神経細胞の初代培養の試みアメフラシ神経細胞の初代培養法に基づきイボニシ神経細胞の単離と培養を試みたが、20°Cで一晩静置後の細胞の器底への付着は見られなかった。
インスリン抵抗性に起因する病態の改善を目指した医薬品のレドクス恒常性維持機構

生活習慣と社会環境の変化にともなって,インスリン抵抗性から糖尿病に移行する比率が急速に増加している.申請者はインスリン抵抗性とレドクス恒常性との関連性から,細胞外において抗酸化能を発揮する唯一のSODアイソザイムであるEC-SODのレベルとインスリン抵抗性病態との関連性に着目し,(1)インスリン抵抗性の指標としてのEC-SOD測定の有用性を明らかにすること,(2)EC-SOD変動のメカニズムの解明を目的とし,本研究に着手した.1.糖尿病患者の血漿中EC-SODレベル糖尿病患者の血漿中EC-SOD濃度が,空腹時血糖値,body mass index(BMI),インスリン抵抗性指数(HOMA-R)との間に有意な負の相関性を示し,血漿中アディポネクチン濃度との間には有意な正の相関性を示したこと,並びに塩酸ピオグリタゾン治療開始により血漿中EC-SOD濃度は有意に上昇した.ヒト線維芽細胞,平滑筋細胞の培養細胞系を用いた実験において,インスリン抵抗性改善薬である塩酸ピオグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体(転写因子PPARγリガンド)は,EC-SOD発現に対し影響を及ぼさなかった.しかし,インスリン抵抗性に関連する転写因子であるC/EBPβのエンハンサーであるprolactinは培養細胞におけるEC-SODの発現を有意に亢進させた.一方,インスリン抵抗性発現の原因と言われているTNF-αはEC-SODの発現を有意に低下させたが,TNF-α抗体の共存下ではその作用は抑制された.以上のように,血清中EC-SODレベルはインスリン抵抗性病態を反映する有用な指標となることが示唆された.また,インスリン抵抗性病態における血中EC-SODレベルの低下は,TNF-αによる発現抑制による可能性が示唆された.生活習慣と社会環境の変化にともなって,インスリン抵抗性から糖尿病に移行する比率が急速に増加している.申請者はインスリン抵抗性とレドクス恒常性との関連性から,細胞外において抗酸化能を発揮する唯一のSODアイソザイムであるEC-SODのレベルとインスリン抵抗性病態との関連性に着目し,(1)インスリン抵抗性の指標としてのEC-SOD測定の有用性を明らかにすること,(2)EC-SOD変動のメカニズムの解明を目的とし,本研究に着手した.1.糖尿病患者の血漿中EC-SODレベル糖尿病患者の血漿中EC-SOD濃度が,空腹時血糖値,body mass index(BMI),インスリン抵抗性指数(HOMA-R)との間に有意な負の相関性を示し,血漿中アディポネクチン濃度との間には有意な正の相関性を示したこと,並びに塩酸ピオグリタゾン治療開始により血漿中EC-SOD濃度は有意に上昇した.ヒト線維芽細胞,平滑筋細胞の培養細胞系を用いた実験において,インスリン抵抗性改善薬である塩酸ピオグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体(転写因子PPARγリガンド)は,EC-SOD発現に対し影響を及ぼさなかった.しかし,インスリン抵抗性に関連する転写因子であるC/EBPβのエンハンサーであるprolactinは培養細胞におけるEC-SODの発現を有意に亢進させた.一方,インスリン抵抗性発現の原因と言われているTNF-αはEC-SODの発現を有意に低下させたが,TNF-α抗体の共存下ではその作用は抑制された.以上のように,血清中EC-SODレベルはインスリン抵抗性病態を反映する有用な指標となることが示唆された.また,インスリン抵抗性病態における血中EC-SODレベルの低下は,TNF-αによる発現抑制による可能性が示唆された.生活習慣と社会環境の変化にともなって,インスリン抵抗性から糖尿病に移行する比率が急速に増加している.糖尿病はひとたび発症すると治癒することはなく,合併症を引き起こしたり,動脈硬化性疾患の発症・進展を促進するため患者のQOLを著しく低下させるのみではなく医療経済学的にも大きな負担を社会に強いることになる.申請者はインスリン抵抗性とレドクス恒常性との関連性から,細胞外において抗酸化能を発揮する唯一のSODアイソザイムであるEC-SODのレベルとインスリン抵抗性病態との関連性に着目し,(1)インスリン抵抗性の指標としてのEC-SOD測定,(2)インスリン抵抗性改善薬の適正使用のための評価法としてのEC-SOD測定の有用性を明らかにすることを目的とし,本研究に着手した.1.糖尿病患者の血漿中EC-SODレベル糖尿病患者の血漿中EC-SOD濃度は,空腹時血糖値,body mass index(BMI),インスリン抵抗性指数(HOMA-R)との間に有意な負の相関性を示し,一方,血漿中アディポネクチン濃度との間には有意な正の相関性を示した.EC-SODと総コレステロール,HDL-コレステロール,LDL-コレステロール,トリグリセリドなどの脂質パラメーターとの間には有意な関連性が認められなかった.2.塩酸ピオグリタゾン治療による血漿中EC-SODレベルの変動19名の患者において,塩酸ピオグリタゾン治療開始約3ヶ月後には,血漿中EC-SOD濃度は有意に上昇した.また,血漿中アディポネクチン濃度も有意に上昇した.一方,塩酸ピオグリタゾンの投与を受けていない患者の場合,EC-SOD,アディポネクチンとも有意な変動は認められなかった.以上のように,血清中EC-SODレベルはインスリン抵抗性病態において有意に低下すること,塩酸ピオグリタゾンによる病態改善の有用な指標となることが判明した.生活習慣と社会環境の変化にともなって,インスリン抵抗性から糖尿病に移行する比率が急速に増加している.

申請者はインスリン抵抗性とレドクス恒常性との関連性から,細胞外において抗酸化能を発揮する唯一のSODアイソザイムであるEC-SODのレベルとインスリン抵抗性病態との関連性に着目して本研究に着手し,昨年度は,糖尿病患者の血漿中EC-SOD濃度が,空腹時血糖値,body mass index (BMI),インスリン抵抗性指数(HOMA-R)との間に有意な負の相関性を示し,血漿中アディポネクチン濃度との間には有意な正の相関性を示したこと,並びに塩酸ピオグリタゾン治療開始により血漿中EC-SOD濃度は有意に上昇したことから,血清中EC-SODレベルはインスリン抵抗性病態を反映する有用な指標となることを報告した.本年度は,これらの観察結果のメカニズムを解明する目的で,in vitro培養細胞系におけるEC-SODの発現調節機構について検討した.1.培養ヒト線維芽細胞,平滑筋細胞におけるEC-SODの発現に及ぼす医薬品の影響:上記のような臨床上の観察にも関わらず,培養細胞系を用いた実験において,インスリン抵抗性改善薬である塩酸ピオグリタゾン,トログリタゾン,シグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体(転写因子PPARγリガンド)は,EC-SOD発現に対し影響を及ぼさなかった.また,アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるバルサルタンもEC-SOD発現を変動させなかった.2.培養ヒト線維芽細胞,平滑筋細胞におけるEC-SODの発現調節機構:インスリン抵抗性に関連する転写因子であるC/EBPβのエンハンサーであるprolactinは培養細胞におけるEC-SODの発現を有意に亢進させた.一方,インスリン抵抗性発現の原因と言われているTNF-αはEC-SODの発現を有意に低下させたが,TNF-α抗体の共存下ではその作用は抑制された.また,この結果はレポーター遺伝子の発現量測定によっても確認された.さらに,インスリン抵抗性改善薬を始めとする多くの薬物の代謝に関わるCYPの発現調節機構についても新たな知見が得られた.以上の結果より,インスリン抵抗性病態における血中EC-SODレベルの低下は,TNF-αによる発現抑制による可能性が示唆された.