hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯髄幹細胞と歯根膜幹細胞を用いた機能的歯根再生の実現

大型実験用動物であるイヌの歯から組織幹細胞である歯髄幹細胞と歯根膜幹細胞を分離し、これらの細胞が免疫不全マウスへの移植実験で、それぞれ硬組織を形成する能力を有していることを確認した。ヒトのエナメル質形成細胞の成熟は、周囲に存在する間葉細胞が制御していることを証明した。高脂血症治療薬であるスタチンは、歯髄幹細胞の増殖や分化を制御することで象牙質の形成を促進し、歯科治療薬として応用しうることを示した。本研究課題はヒト抜去歯から細胞を分離し,その分化を制御するメカニズムをふまえた上での歯の歯根部分の再生を目指したものである.平成19年度は,所属機関である岡山大学倫理委員会の許可を得て,ヒト抜去歯からの細胞の分離を始めた.今回分離を行った細胞は,研究代表者らによってすでに同定されている歯乳頭由来幹細胞(Stem Cells from Apical Papilla;SCAP),歯髄幹細胞(Dental Pulp Stem Cell;DPSC)のみではなく,これらの細胞が分離できる歯よりもさらに幼弱な(おおよそ歯冠形成期から歯根形成初期までの)智歯の間葉組織から細胞を分離することに成功した.歯根未完成の歯から分離できるSCAPが歯根完成後の歯から分離できるDPSCよりも増殖能,組織再生能に優れることを鑑みると,今回分離した幼弱な歯由来の間葉系細胞は,再生医療への応用の見地に立つとさらに優れた性質を待つ可能性がある.現在,その遺伝子発現プロファイルと免疫不全動物を用いた移植実験系での組織再生能を検討中である.また,同じ幼弱な智歯から分離した歯に関連した上皮細胞と共培養することによる,遺伝子発現の変化を確認中であり,上皮間葉相互作用の観点に立った分化制御因子の同定を目指している.本研究課題はヒト抜去歯から細胞を分離し,その分化を制御するメカニズムをふまえた上での歯の歯根部分の再生を目指したものである.平成20年度は,前年度に引き続き,所属機関である岡山大学倫理委員会の許可を得て,ヒト抜去歯からの細胞の分離を継続した.歯冠形成期にあるヒト抜去歯から得た歯胚間葉細胞を分離培養し,これらの細胞が象牙質シアロホスホタンパクを遺伝子レベルで発現していることを確認した.同時に抜歯時に得られる歯小嚢組織からもvimentin遺伝子を発現する間葉細胞を分離した.この歯小嚢間葉細胞は,歯根膜・セメント質を形成する細胞とされており,我々の結果でも骨系遺伝子の発現は認めるものの,象牙芽細胞系の象牙質シアロホスホタンパクの発現は認めなかった.これら,歯胚間葉細胞と歯小嚢間葉細胞は,歯小嚢から分離した上皮細胞と共培養した場合,上皮細胞のエナメル芽細胞分化関連遺伝子の発現に対し,それぞれ異なる影響を持つことを明らかにした.また,平成20年度はイヌからの間葉系細胞の分離を行い,歯随ならびに歯根膜からの細胞分離に成功した.現在,これらの細胞がin vitroで骨系分化可能な細胞であることを確認済みである.1.ヒト抜去歯から分離した細胞の分化メカニズムの解明ヒト歯小嚢組織から分離したcytokeratin 14陽性細胞群の,口腔間葉細胞と歯胚間葉細胞との共培養系におけるamelogenin遺伝子の発現レベルを,定量RT-PCR法で解析した.その結果,歯小嚢組織由来上皮細胞を歯胚間葉細胞と混合して共培養すると,そのamelogenin遺伝子の発現は促進されることを確認した.この遺伝子の発現促進はメンブレンを用いた分離共培養では認められなかった.さらには,口腔間葉細胞との共培養での遺伝子発現の促進効果はほとんど認められないことから,この発現促進効果は歯胚間葉細胞特有であり,上皮細胞と間葉細胞の物理的な接触を介して行われているものと推測された.また,歯小嚢組織上でアメロブラスチン抗体を用いて免疫組織化学染色を行い,形態学的に分泌期エナメル芽細胞と推測される細胞はアメロブラスチン陽性であることを確認した.2.ビーグル犬モデルを用いた歯根再生研究イヌ抜去歯から分離した歯髄細胞と歯根膜細胞の硬組織形成能を確認するため,HAならびにbTCPキャリアと共に免疫不全マウス背部皮下に移植した.その結果,両細胞ともに硬組織形成能力を有していることを確認した.歯根再生研究においてもHAとbTCPを使用した.2種のキャリアを歯根形態に調整し,細胞を播種し,イヌ顎骨に移植した.1頭あたりの移植体は4本とし,HA2個,bTCP2個とした.すべての移植体内部には歯髄細胞を播種し,それぞれの2個のうち1個は歯根膜細胞の細胞シートで被覆し顎骨に形成した移植窩へ移植した.免疫学的な拒絶の可能性を考慮し,歯根再生実験はすべて自家細胞移植とした.イヌ顎骨へ移植した再生歯根をレントゲン的に評価したところ,bTCPはおおよそ8週程度で吸収像を認めた.一方,HAには吸収像を認めなかった.レントゲン的には硬組織形成を認めなかった.
EMTとニッチの制御を目指した高分子ミセルを用いた難治性卵巣癌に対する治療の開発

強い自己複製能と腫瘍形成能を有する癌幹細胞(CSCs)が、浸潤・転移する過程において、EMTの現象を起こしていることが報告されており、我々はCSCsのマーカーとしてCD24が、卵巣癌の予後不良因子であることを見出した。そこで、CD24陽性分画を選択的に治療標的とするため、抗CD24抗体を外郭に結合させたCDDP内包高分子ミセルを作成し、卵巣癌腹膜播種モデルマウスに尾静脈より投与したところ、CDDP単剤投与群と比べて、有意な生存期間の延長を認め、CD24をターゲットにした治療の有用性が示唆された。さらに、組織内のCDDP濃度の検討もおこなったところ、CDDP単剤の治療と比較すると、腎組織内のCDDP濃度は高分子ミセル群では約4分の1以下に抑えらており、腎毒性の軽減も期待できることが判明した。これらの結果を現在論文作成中である。次に、CD24とEMTとの関連を検討するため、CD24の発現の有無でmicroRNAの発現の相違を検討することとした。CD24の発現で卵巣癌細胞株を分画し、それぞれの細胞分画から抽出したmicrRNAをマイクロアレイに提出した。今後はCD24陽性分画で特異的なmicroRNAとその意義について検証する予定である。来年度中にmicroRNAの同定とその機能解析を行える予定であるため。提出したマイクロアレイの結果をもとに、CD24特異的なmicroRNAを検出し、CD24がEMTを起こしやすい機序との関連を検討するとともに、予後判定因子や治療としての応用法を検討する予定である。「EMTとニッチの制御を目指した高分子ミセルを用いた難治性卵巣癌に対する治療の開発」本研究は卵巣癌の浸潤・転移に重要な上皮・間葉形態転換(Epithelial-Mesenchymal Transition: EMT)現象の制御のみならず、癌周囲の微小環境(ニッチ)に関与する免疫細胞の制御を目的としている。そのために、EMT化細胞の表現マーカーに対する抗体を外郭に結合させたシスプラチン(CDDP)内包高分子ミセルを作成し、さらにミセル内にニッチ制御因子も内包させ、癌の浸潤を効率よく抑制させるドラッグデリバリーシステム(DDS)の開発を考案した。平成29年度:1) ET-2 siRNAのレンチウイルス発現ベクターの構築を、Endothelin-2 (NM_001956)に対するsiRNA配列をsiDirect softwareで検索し、off-targetを受けにくい配列を3つ選別した。レンチウイルス発現ベクターに選別したsiRNAを挿入後レンチウイルスに形質導入した。同時にscramble RNAを挿入したコントロールベクターを形質導入したレンチウイルスを作成した。次に卵巣癌細胞株(Caov-3 , A2780, RMG-1 , TOV-112D, OV-90に上記レンチウイルスを感染させ細胞に上記DNAを組み込んだ。2)高分子ミセルを形成する親水性ブロックとしては生体適合性に優れるポリエチレングリコールを、コアを形成する疎水性ブロックとしてはポリアスパラ銀酸を用いたキャリアーポリマーを作成した。疎水性側鎖に-COOH基を残しシスプラチンと錯体形成ののち内包させ、同時にETAR選択的阻害剤Zibotentan、BQ-123、もしくはETBR選択的阻害剤BQ-788も内包させた。分画分子量1,000の透析膜を用いて精製水に対する透析により数十nm径にそろえ、抗CD24抗体をシェルに共結合させることで、CD24抗体を外郭に結合させた高分子ミセルを作成した。研究室および実験器具・機器において研究の進捗に関する問題はない強い自己複製能と腫瘍形成能を有する癌幹細胞(CSCs)が、浸潤・転移する過程において、EMTの現象を起こしていることが報告されており、我々はCSCsのマーカーとしてCD24が、卵巣癌の予後不良因子であることを見出した。平成30年度はマクロファージを用いたニッチ制御の分子細胞学的メカニズムについての検討を中心に行う予定である。具体的にはヒト単球細胞株THP-1からマクロファージへの分化誘導を行うためにヒト単球細胞株THP-1はATCC社から購入し、M1、M2マクロファージに分極させた後にチャンバーを用いた卵巣がん細胞株との共培養によって卵巣癌から分泌されたET-2によるマクロファージの遊走能促進作用がM1マクロファージおよびM2マクロファージのどちらに優位か、そしてマクロファージのETAR/ETBR

どちらを介しているのかを明らかにすることで、ETAR/ ETBR阻害剤による卵巣癌ーマクロファージ連携の破綻、つまりニッチ制御の分子細胞学的メカニズムを明らかにする予定である。その実験準備として実験器具および細胞は随時準備しており研究を遂行するにあたって問題がないと考える。提出したマイクロアレイの結果をもとに、CD24特異的なmicroRNAを検出し、CD24がEMTを起こしやすい機序との関連を検討するとともに、予後判定因子や治療としての応用法を検討する予定である。
家畜に流産をおこす病原体の臓器向性を規定する体内伝播様式の解明

細胞内寄生性病原体が母体に感染し胎児へと感染する際の挙動について以下のことが明らかになった。まず雌性生殖器への指向性が強い病原体に関しても、母体血流中の感染細胞が必ずしも胎盤にとどまりやすいわけではなかった。これは胎盤の最表層の細胞で接着分子の発現が抑制されているためであると思われる。局所的にこのような細胞が剥離することが病原体の伝達に重要な役割を果たしている可能性が高い。トキソプラズマに感染したリンパ球、単球においてCD44発現上昇があり、一部の細胞種においてはスプライシングパターンが変化することが開らかになった。CD44を介した白血球の吸着においては、その発現量だけでは無くスプライシングパターンも重要であることが(主要細胞の転移などの分腎の研究で)知られており、本原虫の電波においても同様の事象が怒っている可能性が示唆された。また感染細胞はヒアルロン酸への吸着能力が増強した。各種インテグリンの発現レベルには有意差は認められなかった、このようなヒアルロン酸への接着能力の変化が、宿主体内における感染白血球の挙動に影響するかどうか評価するための評価系を作製した。これにより短時間の間に特定臓器に流れ込み定着する白血球総数と感染白血球数を評価できるようになった。なお、各種白血球において原虫の増殖速度が異なったため、これに影響を受けないよう灘定条件を定める必要があったので予定より実験期間が長引いたが、最終的には解決することが出来た。このようにしてあらたに開発したこれらの手法を用いててウス体内における感染白血球の挙動を調査したところ、旧制感染気に置いて、感染白血球が肺にとどまりやすいことが明らかになった。この現象がヒアルロン酸を介したものか否かは現時点でははっきりしておらず来年度以降に明らかにすべき課題である。一方で、今回新に開発した手法で観察した「胎盤における母体由来感染白血球の挙動」が実際の感染とは異なるように見受けられた。マウスモデルを用い、循環血流中から各臓器へ移行した白血球数ならびに感染白血球数を定量化できる実験モデルを確立した。これを用いて、トキソプラズマ感染白血球が定着し易い臓器とそうでない臓器を見出すことができた。胎盤については、同腹であっても組織中の感染白血球がばらばらであり、一定の傾向が見られなかった。このことは胎盤組織の局所的な変化により、母体血流中の感染白血球の臓器内定着効率に大きな変化がもたらされることを示唆している。現時点では、具体的な「局所的な変化」仮名にであるのかは分からない。そこで母体血流にさらされている栄養膜巨細胞の変化であるのかそれ以外の変化であるのかを追及するため、in vitroで胎盤幹細胞から栄養膜巨細胞を分化させ、得られた細胞に対して感染白血球の吸着が起こるか否か検証した。他の細胞に比べて吸着の程度は小さく、当該細胞はバリアとして機能している可能性が示唆された。今後は、各種炎症性サイトカイン等によってどのような変化が起こるか検証する必要がある。同様の現象が反芻動物でも見られるか否かを証するため、妊娠ヒツジをもちいた感染実験の準備を完了し、以下の条件等を確定した。1)妊娠動物の移送ストレスによる流産を防止するための移送法の確定。2)病原体接種後、採材までの適切な期間の確定。3)えられた胎盤組織からの感染白血球の検出方法の確定。4)ヒツジ白血球表面におけるCD44分子発現パターンの確認。動物や人間に流産をおこす病原体の多くはいったん母体に感染し、母体血流中の細胞(白血球)にのって胎盤・胎児へ侵入する。したがって母体から胎児への垂直感染が成立するには、母体血流中の感染白血球が胎盤に流入後に胎盤組織にとどまる必要がある。すなわちこれらの病原体が母体から胎児へと侵入する過程で以下の現象が起こるものと考えられる。1母体に感染が成立することで母体由来の炎症性サイトカインが血流にのり胎盤に流入、2炎症性サイトカインの影響により胎盤表面で感染白血球の付着を助ける接着分子が発現、3母体血流中の感染白血球が胎盤表面に接着し垂直感染が成立。本研究でマウスを用いて上記の過程を検証したところ、生体内では培養細胞系とは異なった現象が起こっていた。すなわち、母体由来のサイトカインが胎盤に流入した場合であっても、母体血流に直接さらされている胎盤の最表層においては接着分子の発現が起こらなかった。また必ずしも胎盤において他臓器に比べて感染白血球がとどまりやすいわけでもなかった。母体血流に直接触れない第二層以下の細胞には接着細胞の発現がみられたため、最表層の部分的剥離が病原体の垂直感染に大きな役割をもつものと考えられる。

昨年度までに、トキソプラズマ感染白血球の表面においてさまざまな分子の発現量が変化することが明らかとなったが、このうち感染白血球のヒアルロン酸への吸着についてはCD44が主たる役割を果たしていることが分かった。詳細は以下の通り。1)CD44ノックアウトマウスの白血球はトキソプラズマに感染してもヒアルロン酸への吸着能力を増さない。2)感染白血球を抗CD44抗体で処理するとヒアルロン酸への吸着力が減少する。いっぽう、マウスの栄養膜巨細胞ではヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現レベルが内皮細胞や繊維芽細胞に比べて著しく低いことが明らかになった。さらにサイトカイン刺激による発現誘導も認められなかった。母体由来の感染白血球がCD44とヒアルロン酸を介して吸着しているとしてもそれは栄養膜巨細胞表面ではないことが示唆された。以上のことから、昨年度までに胎盤組織で観察された母体由来感染白血球の集合像は、栄養膜巨細胞表面への吸着ではなく、血管内皮や露出した細胞外マトリクスをターゲットとしている可能性が示唆される。そこでこの点を精査するため胎盤から内皮細胞を樹立することを試み形態的に内皮細胞とおもわれる細胞の樹立に成功した。現在マーカー分子の発現パターンをチェックしている。さらに母体はGFP陽性、胎児は陰性という組み合わせの妊娠マウスから採取した胎盤で同様の細胞を樹立したところ、GFP陽性細胞と陰性細胞の両方がえられ、それぞれ母体(脱落膜)由来、胎児(絨毛膜)由来の細胞と思われた。来年度に向けてその正常を検討する。最終年度までに反芻動物でデータを得るための環境を準備することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度、反芻動物を用いた検証に予定以上の時間がかかったために計画がずれ込んでいる。しかし昨年度の停滞以降、順調にしんこうしているため最終的には目標を達成できる見込み。反芻動物を用いた実験を行うための緒条件が確定したため、妊娠ヒツジを用いて胎盤内に流入する感染白血球の挙動を明らかにする実験を本格的に開始する。具体的には、妊娠ヒツジの子宮動脈から蛍光染色した感染細胞を移入し、胎盤のどの部分に定着するのか組織学的に検討する。あわせて当該部位で感染白血球の定着に寄与する分子を検索する。感染白血球の全身伝播における白血球側の要因としてCD44の重要性が示された。そこで今後は生体内におけるCD44の機能を集中的に検証する。さらに妊娠ヒツジを用いた検証を行い、反芻動物における感染白血球の挙動とマウスのそれを比較検討する。また血液絨網胎盤においては、栄養膜巨細胞は感染白血球の侵入門戸というより、むしろバリアとして機能していることが示唆された。そこで血液絨網胎盤における虫体の侵入門戸となる部位について検証を進める。
二光子顕微鏡と光操作による単一神経・グリア回路網の活動伝播様式の可視化

本研究では、多点走査型2光子顕微鏡と2光子励起を用いたオプトジェネティクスの手法により、オータプス初代培養標本における神経・グリア回路網の活動伝搬様式を時空間的に可視化・解析する新規イメージング手法の構築を目的とする。平成30年度では、まずオータプス初代培養標本の培養系・観察条件の最適化、遺伝子導入法の検証を行った。観察視野下に収まるような任意の範囲に複数のアストロサイトを島状に培養し、各アストロサイトアイランドに単一、もしくは複数の神経細胞を共培養した自己投射型の初代神経細胞を培養する系を確立した。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて神経細胞にCa2+センサータンパク質を発現させ、オータプス初代培養標本における自発的な神経細胞内カルシウム濃度変動の伝搬様式を多点走査型2光子顕微鏡によりライブイメージングすることに成功した。また細胞活動を光操作するため、多点走査型2光子顕微鏡に2種類の近赤外フェムト秒パルスレーザーを独立に観察試料に照射できる仕様とし、一方のビームを用いて任意の単一細胞を光刺激するための二光子励起光学系を構築した。さらに、オータプス初代培養標本における活動伝搬や、それに伴ったスパインヘッドなどの超微細形態の変化を可視化するために、当研究室で開発した2光子STED顕微鏡の活用を試みた。その結果、固定サンプルではあるが、初代神経細胞におけるプレシナプスタンパク質Bassoonの局在を100 nm以下の空間分解能で観察することに成功した(論文投稿中)。オータプス初代培養標本の超解像ライブイメージングへの応用が期待された。平成30年度は計画通りに、光刺激用光学系の構築、オータプス初代培養標本の最適化、プローブの選定、遺伝子導入法、観察条件の検討を行った。光刺激の条件検討については同年度中に完了する計画であったが、実際にはそこまで至らなかった。一方で2光子STED顕微鏡の活用など当初の計画以上に進んでいる部分もあり、研究計画全体としてはおおむね順調に進展している。光刺激の条件検討を引き続き進める。オータプス初代培養標本の局所光刺激により特定の細胞を活性化させ、その活動が神経・グリア回路網を伝播する様式を包括的・時空間的にライブイメージング解析する。当初の計画よりも、血清など細胞培養関係試薬の使用を節約して研究を進めることができたため、物品費が減額した。また計上していた旅費については、本年度内に開催される学会にて成果発表するだけのデータを得られなかったため、次年度に繰越した。次年度助成金については、細胞培養関係試薬、光学部品、イメージング用プローブなどの消耗品の購入に使用する。また成果発表のための旅費(FOM2019参加など)、論文投稿料に使用する。
膵液胆汁灌流システムを用いた.胃手術ラットの膵外分泌能の検討

膵液胆汁灌流システムを用いた各種胃手術の膵外分泌能に関する実験的検討(目的)胃手術による膵外分泌機能への影響はその減酸効果,消化管ホルモンの変化,迷走神経遮断による影響等が考えられ一般に低下すると云われているが一定の見解を得られていない。そこで我々は、膵液胆汁瘻を作成した覚醒ラットに胃切除術,又は迷走神経切除術を付加しその膵外分泌機能を検討したので報告する。(方法)250300gのWistar系雄性ラットを用いて,次の3群に分けて膵液胆汁瘻モデルを作成した。コントロール群(以下C群),胃全摘群(以下GX群),全幹迷切群(以下TV群)各群作成後4日目に以下の実験を行なった。基礎分泌を測定後CCK刺激としてセルレイン1μg/kg静注,食事刺激としてハイネックスR2mlを十二指腸内に注入しその反応を測定した。(結果)基礎分泌においてはC群に比べGX群,TV群は、低下傾向を認め特にタンパク分泌では、有意に低値を示した。刺激による反応を変化率からみるとCCK刺激では、タンパク分泌においてC群に比べGX群、TV群が有意に上昇した。食事刺激では膵液量,タンパク分泌量膵液アミラーゼ分泌量共にG群V群が有意に高値を示した。(結語)膵外分泌能には、胃内外分泌及び迷走神経系の調節機構があり、それらの非支配下では各種膵外分泌刺激に対し過剰反応を示す環境にある事が示唆された。
ヒトCD34陽性細胞移植NOGマウスを用いた経膣/経皮ウイルス感染モデルの開発

ヒトCD34陽性細胞移植NOGマウスでは脾臓内にヒト樹状細胞が生存していることが確認された。またNOGマウス皮膚では創傷治癒過程において骨髄に移植したヒトCD34陽性細胞が皮膚内樹状細胞に分化することが確認された。これらの実験結果から、ヒトCD34陽性細胞移植NOGマウスが経膣/経皮ウイルス感染モデルとして応用可能なことが示唆された。ヒト化NOGマウス経膣HIV感染モデルの作成と同モデルにおけるCCR5阻害薬のHIV感染予防効果の検討まず経膣HIV感染モデルの作成を第1の目的とする。ここで問題となるのは膣内粘膜の創傷をいかに作るかという点であるが、ケミカルピーリングに頻用されるグリコール酸を正常マウス膣内に注入した実験において、膣内粘膜の完全欠損およびその再生を確認している。また、従来のSCIDマウス体表にヒト皮膚を移植するだけのモデルでは、植皮片とSCIDマウスリンパ管との交通が観察されないためヒト皮内LC/DCが所属リンパ節に遊走できず、ヒト皮膚における感染制御システムの検討は不可能であったが、この系ではHIVに感染した膣内粘膜LCがリンパ節に遊走することが十分期待できる。これらの手法をヒト化NOGマウスに応用することで、膣内に曝露されたHIVは再生膣粘膜内ヒトLCに感染し、さらに感染LCがリンパ節に遊走することで、リンパ節内ヒトT細胞へHIVが播種され、AIDSを発症することが期待される。ヒト化NOGマウス皮膚におけるヒト樹状細胞の解析:ヒトCD34陽性血液幹細胞からDCへのin vivoでの分化が観察されたが、移植3か月後のヒト化NOGマウス皮膚にはヒトLC/DCは存在しなかった。そこで、ヒト化NOGマウス背部皮膚に皮膚欠損を作成し、1か月後その創傷治癒後の組織を免疫染色して、表皮/真皮内にヒトLCおよびDCを観察すると表皮内にMHC class II陽性のヒトLCが観察された。また、我々は、正常マウス膣粘膜を損傷させるためにグリコール酸を膣内に注入した実験において、粘膜の完全欠損およびその再生をした。さらに、ヒト化NOGマウス膣内にグリコール酸を注入し粘膜創傷を作成し、4週後に創傷治癒後の組織を抗hCD11c/Langerin抗体で組織染色し、ヒト化NOGマウス膣粘膜内のヒトLC/DCの再構成を確認すると、粘膜内に抗hCD11c/Langerin抗体陽性のヒトLCが確認された。<ヒト化NOGマウスにおける経膣HIV感染モデルの作成実験>まず、ヒト化NOGマウス皮膚におけるヒト樹状細胞の解析を行なった。ヒトCD34陽性血液幹細胞をNOGマウスに移植し、移植後4-12週間後の脾臓内のヒト細胞を検討した。脾臓内のMHC class II陽性細胞群にヒトCD11c陽性細胞が同定された。このことより、ヒトCD34陽性血液幹細胞がin vivoで樹状細胞に分化し得ることが確認された。しかし、移植3か月後のヒト化NOGマウス皮膚にはヒトLCを含む樹状細胞は存在しなかった。そこで、ヒト化NOGマウス背部皮膚に皮膚欠損を作成し、1か月後その創傷治癒後の組織を免疫染色して、表皮/真皮内にヒトLCおよびDCを観察した結果、再生上皮化した表皮の中にMHC class II陽性のランゲルハンス細胞(LC)が存在することがわかった。これらの結果をヒト化NOGマウスに応用すれば、創傷治癒後の膣内に曝露されたHIVは再生膣粘膜内ヒトLCに感染し、さらに感染LCがリンパ節に遊走することで、リンパ節内ヒトT細胞へHIVが播種され、AIDSを発症することが期待される。そこで、ヒト化NOGマウスの膣粘膜に創傷を作る実験をおこなった。まず、ヒト皮膚のケミカルピーリングに頻用されるグリコール酸を正常マウス膣内に注入し、粘膜の再生過程を経時的に病理学的に検討するため、グリコール酸注入1,3,7日後に摘出した膣内粘膜上皮を観察した。しかし、予想に反し、粘膜上皮の欠損は認められなかった。現在、フェノールなどより強力なケミカルピーリング剤を用いて膣粘膜に創傷を作る実験を継続して行なっている。ヒト化NOGマウス皮膚におけるヒト樹状細胞の解析:予備実験においてヒトCD34血胞からDCへのin vivoでの分化が観察されたことから、ヒト化NOGマウスの背部にヒト皮膚(表皮+真皮)を移植し、3か月後に移植皮膚片を切除し、ヒトランゲルハンス細胞(LC)あるいはヒト樹状細胞(DC)の存在を蛍光免疫染色にて検討したが、LCおよびDCは存在しなかった。そこで、ヒト化NOGマウス背部皮膚に皮膚欠損を作成し、1か月後にその創傷治癒後の組織を免疫染色して検討したところ、ヒトHLA-DR陽性のヒトDCが真皮内に観察された。

このことから、ヒト化NOGマウスでは創傷治癒過程においてヒトCD34陽性血液幹細胞由来の真皮樹状細胞が誘導可能であることが示された。ヒト化NOGマウス膣のヒトLC/DC再構成実験:我々は、正常マウス膣粘膜を損傷させるためにグリコール酸を膣内に注入した実験において、粘膜の完全欠損およびその再生を確認している。そこで、ヒト化NOGマウス膣内にグリコール酸を注入し粘膜創傷を作成し、4週後に創傷治癒後の組織を蛍光免疫染色にて検討した。しかし、同膣粘膜組織内にヒトLC/DCの再構成を確認することはできなかった。経膣HIV感染モデルにおけるCCR5阻害薬のHIV感染予防効果の検討:上記の如く、膣粘膜創傷後のヒトマウス膣にヒトLC/DCを再構成できなかったため、経膣HIV感染・AIDS発症の有無およびCCR5阻害薬のHIV感染予防効果の検討はできなかった。しかし、ヒト化NOGマウス皮膚におけるヒト樹状細胞の再構築は上記の如く可能であったことより、現在モデルを経膣感染から経皮膚感染へと変更し、体表の創傷治癒後皮膚にHIVを曝露したところ、真皮内ヒト樹状細胞がHIVに感染することが確認できた。
圧電PZT薄膜の超多層積層成膜およびMEMSデバイスへの応用

PZT(チタン酸ジルコン酸鉛)薄膜と電極薄膜をシリコン基板上において交互に超多層積層させ、MEMS(微小電気機械システム)プロセス技術と組み合わせることによって、ハイスループット・高機能なアクチュエータを創出することを目的とした。成膜最適条件を見出し、良好な特性の4層以上の積層構造が得られることが確認できた。一方、応用デバイスについても検討を行い、例として積層PZT薄膜による超音波トランスデューサが、低電圧で強い超音波を送信可能であることを確認した。さらに、人に触覚刺激を与える触覚デバイスが圧電MEMSで実現可能であることを示した。本研究は、PZT(チタン酸ジルコン酸鉛)薄膜と金属薄膜をシリコン基板上において交互に超多層積層し、MEMS(微小電気機械システム)プロセス技術と組み合わせることによって、ハイスループット・極めて高機能なアクチュエータを創出することを目的としている。初年度は、これまでに実現している2層積層PZTの厚膜化および特性評価を基礎とし、多層成膜を試みた。まず2層積層について、成膜温度、薄膜厚、下地・中間電極の厚さなどに着目し、成膜結果との因果関係について評価を行った。また、成膜後の分極処理やアニール処理の影響・効果についても評価を行った結果、最適条件で各層の特性がそろった良好な圧電薄膜が得られていることが確認できた(Journal of Microeng. Micromech. 25 055001 (2015))。この知見を応用した多層成膜では、単層厚さ2.3umで4層および6層のPZT薄膜を4インチシリコンウエハ上に形成した。評価のため、これらの多層PZTのみで自立する片持ちはりを、フォトリソグラフィおよびドライエッチングを中心としたMEMSプロセスにより試作した。電流電圧特性や分極電界特性、駆動試験などの各種評価結果より、これらの薄膜は全ての層が一致した良好な圧電特性を有し、かつ大きなリークも無いことが確認できた。また、4層のアクチュエータでは各単層駆動の変位の和として変位が得られることが確認できた。変位から逆算すると、電圧あたり極めて大きな発生力が得られることが分かり、これを活かしたMEMSデバイスの試作を今後実施していく予定である。なお、6層成膜では薄膜中の残留応力が大きくなったために基板との密着性に問題があることが分かった。これについても対策を検討していく。チタン酸ジルコン酸鉛(PZT)薄膜と電極膜の多層積層構造の実現を目指している。初年度にすでに6層のPZT膜の積層に成功し、各層が良好な圧電・強誘電特性を有していることを確認している。今年度は、さらなる多層化に向けた残留応力の抑制のための条件検討を中心に行った。低温スパッタリング成膜やアニール処理の特性に及ぼす影響などを明らかにし、従来の半分程度の残留応力でPZT薄膜が成膜可能であることが確認できた。また、この多層積層PZT薄膜のデバイス応用についても検討を行った。人に振動刺激を伝達可能なMEMS圧電ハプティクスデバイスの実現可能性についての調査を行い、PZT薄膜であっても人が十分に近く可能な振動刺激を与えることが可能であることを明らかにした。具体的な調査に際しては、大きな運動エネルギを生じることを可能にするために樹脂とPZT薄膜の積層MEMS構造を試作し、実体顕微鏡でも観察可能なほど大きな変位で共振駆動をさせた。指とデバイスとの接触状態が一定になるよう配置したところ、被験者全員が振動を感知した。本デバイスは従来の筐体を振動させるハプティクスデバイスと異なり、直接刺激であることから低消費電力化が可能であり、電源に限りがあるウェアラブルデバイスに利用可能であると考えられる。他にも、ジャイロのようなアクチュエータを伴うMEMSデバイスにおける振動の自由度を向上させるための側面方向アクチュエータの基礎的評価も行った。当初より有していたPZT薄膜の2層成膜技術がより多層にもそのまま適用できたため、初年度より計画以上に進んでいる。現段階では応用デバイス開発による積層技術の有効性検証も順調に進んでいる。本研究は、PZT(チタン酸ジルコン酸鉛)薄膜と金属薄膜をシリコン基板上において交互に超多層積層させ、MEMS(微小電気機械システム)プロセス技術と組み合わせることによって、ハイスループット・極めて高機能なアクチュエータを創出することを目的としている。研究開始時点で既に達成していた、スパッタ法により形成する2層積層PZTの厚膜化および特性評価を基礎とし、成膜条件や下地、中間電極の厚さなどに着目し、成膜結果との因果関係について評価を行った。

さらに成膜後の分極処理やアニール処理の影響・効果についても評価を行った結果、最適条件を見出して良好な特性の積層構造が得られることが確認できた。さらに4層、6層と積層数を増加させることに成功し、良好な圧電特性・密着性を保ったままMEMSバッチプロセスに適用可能であることが確認できた。しかしながら、さらに積層数を増加させると、残留応力が原因で膜剥がれが生じ、この原因が電極層に起因することが明らかになった。この結果、現段階では6層程度の積層が限界であることが確認できた。さらなる積層のためには電極材料の再検討などが必要であると考える。一方、多層PZT薄膜のデバイス応用についても検討を行った。積層PZT薄膜による超音波トランスデューサが、非常に低い電圧で強い超音波を発信可能であり、有用であることを確認した。さらに、樹脂とPZT薄膜の積層構造についても検討を行い、mmオーダの寸法を持つ積層構造アクチュエータが、90度以上の大変位で破損せずに動作可能であることが確認でき、これを人に触覚刺激を与えるハプティックデバイスに利用可能であることを確認した。圧電薄膜を用いたMEMSハプティックデバイスは他に例がなく、今後、ウェアラブル機器に搭載可能なほど小型・低消費電力のデバイス実現が期待できる。当初より有していた2層PZT薄膜の積層技術についての知見が、予想を超えて多層積層に対して有用であったため、27年度に実施する予定であった多層成膜を1年前倒しで達成することができた。なお、成膜の自動化のための装置改造を当初予定していたが、膜が薄くなると良好な特性が得られないことが分かり、現段階では積層数については達成した46層以上を考えていない。より薄い膜における成膜条件については別途検討する。MEMSハプティクスデバイスを一つのアプリケーションターゲットと定め、研究を推進する。すでに基礎検討は今年度実施できたので、最適設計を行うことでこれまでにない優れたデバイスの実現を目指す。当初の予定よりも早く多層成膜を実現できたので、これを利用したMEMS応用を行い、この有用性を確認していく予定である。また、得られた成果の積極的な発信を行うつもりである。次年度使用額が33円多いのは、初年度の残端数である。33円は端数であるため、使用計画についての変更はない。
マングローブ主要構成種の地下部生産・分解プロセスと立地環境の関係

ミクロネシア連邦ポンペイ島と西表島のマングローブ林において、主要樹種の細根蓄積・分解速度を明らかにした。また、根圏の窒素固定機能について検討した。1年間の蓄積量は、ポンペイ島ではいずれの樹種も4050 t/ha程度であったが、一部陸側で25 t/ha前後と少ない樹種も見られた。西表島では49 t/haであった。1年間の根リター残存率は、ポンペイ島のヤエヤマヒルギ海側プロットで8 %と極端に低く、他は4085%であった。西表島では5060%であった。窒素固定反応の活性化エネルギーは、すべての調査木で根近傍の方が非近傍より高かった。ポンペイ島の窒素固定活性は、他地域と比べ最も高かった。マングローブ林は、地上部のみならず地下部においても多量の有機物を蓄積することによって、炭素蓄積の場としての重要な役割を果たしている。本研究は、マングローブ林の地下部有機物蓄積機能を、その主要な供給源である根の生産・分解プロセスに注目し、樹種別、立地環境別に明らかにすることを目的とする。H25年度は、ポンペイ島においては海側群落であるRhizophora stylosa林とSonneratia alba林に、西表島ではR. stylosa林に、根の生産・分解速度を観測調査するため、イングロースコアおよびリターバッグを設置した。ポンペイ島では、これら群落内に森林動態モニタリングのための固定プロットが既に設置されており、立地環境も明らかにされているため、それぞれの林内の地盤高の異なる2か所(海側と陸側)に試験地を設置した。西表島では、R. stylosa林内に、ポンペイ島同様に海側と陸側の2か所に試験地を設置した。併せて、地上部生産量と森林動態を明らかにするための固定プロットを設置し、立地環境(地盤高分布、冠水頻度、土壌水EC等)と地上部現存量を明らかにした。さらに、その林分の立地形成過程、マングローブ堆積物の層相・層厚、空間分布、地下部炭素蓄積量を明らかにするため、ジオスライサーおよびピートサンプラーを用い、堆積構造を明らかにするとともに、放射性炭素年代測定試料およびCN分析試料を採取した。また、窒素固定メカニズムを明らかにするため、西表島の試験地において土壌および土壌水の各種化学特性および土壌の窒素固定活性を測定した。ミクロネシア連邦ポンペイではBruguiera gymnorrhiza林とXylocarpus granatum林に、西表島ではB. gymnorrhiza林に、根の生産・分解速度を観測調査するためのイングロースコアとリターバッグを設置した。また、ポンペイ島ではRhizophora apiculataの地下部生産量を明らかにすると共に、それぞれの地域に昨年度設置した試験地で、イングロースコアとリターバッグの回収を行った。西表島では、仲間川低地において、マングローブ林背後の淡水湿地から得られたマングローブ堆積物中の木片に対して14C年代測定を行い、マングローブ林の立地変動を明らかにした。また、船浦湾のマングローブ堆積物の年代測定も実施した。その結果、ポンペイ島のR. apiculataの細根は深度80cm以上に達し、深度60cmまでの年間細根生産量は、地上部リター生産量の40%以上に上る、6.5 Mg ha-1 yr-1に達することが明らかになった。西表島のRhizophora stylosa林の深度40 cmまでの年間細根生産量は,海側地点(年冠水時間割合47.4%)と陸側地点(同27.3%)で、それぞれ5.24±0.72 Mg ha-1 yr-1、6.90±0.79 Mg ha-1 yr-1と見積もられた。イングロースコア設置後1年経過時点の生根量は、両地点間に有意な差はみられなかったが、枯死根量は、陸側地点で有意に高い値が得られた。西表島仲間川下流低地では、マングローブ泥炭の分布範囲から3500 cal BP頃には現マングローブ林陸側林縁部から約2 km上流側に、1200 cal BP頃には同約1.5 km上流側にR. stylosa林が分布していたものと推定され、1310 cal BP以降、2回の地盤隆起によってマングローブ林は海側に前進したことが明らかになった。ミクロネシア連邦ポンペイ島において、陸側群落であるオヒルギ林とホウガンヒルギ林で設置後1年目の、海側群落であるヤエヤマヒルギ林とマヤプシキ林では設置後2年目のイングロースコアとリターバッグの回収を行った。西表島においては、オヒルギ林で設置後1年目の、ヤエヤマヒルギ林で設置後2年目のイングロースコアとリターバッグの回収を行った。また、ヤエヤマヒルギの根近傍窒素固定バクテリアの酵素機能が非近傍のものと異なるのかを検証した。ポンペイ島では、マヤプシキ林の海側と陸側、ヤエヤマヒルギ林の海側の1年目のデータ整理が終了した。マヤプシキ林は合計細根蓄積量に海側と陸側で有意差は見られなかったが、生根量は海側で有意に多く、死根量は陸側で有意に多かった。マヤプシキとヤエヤマヒルギの海側同士で比較すると、合計蓄積量はヤエヤマヒルギの方が多く、生根量はマヤプシキが、死根量はヤエヤマヒルギが有意に多かった。

1年後の細根残存率はマヤプシキ林の両地点とヤエヤマヒルギ林の陸側は深さ10cm、30cmのいずれにおいても50%前後で大差は見られなかったのに対し、ヤエヤマヒルギ林の海側の深さ10cmのみ約8%と極端に低かった。西表島の年間細根蓄積量は、ヤエヤマヒルギ林、オヒルギ林共に、陸側で有意に多かったが、樹種間の差は認められなかった。生根量は、両者とも地点間で有意差は認められなかったが、樹種間ではヤエヤマヒルギ林が有意に多かった。生根割合は、いずれも陸側で高く、樹種間ではヤエヤマヒルギの方が高かった。窒素固定反応の活性化エネルギーは、各調査木の根近傍と根近傍外で異なっており、すべての調査木において、根近傍の方が根近傍外より高く、窒素固定バクテリアの酵素特性が根近傍と非近傍で異なることが明らかになった。ポンペイ島のフタバナヒルギ林で設置・回収したイングロースコアの分析に当たり、死根量を計測していなかったため、新たに設置し直した。ミクロネシア連邦ポンペイ島では、フタバナヒルギ林で設置後1年目の、オヒルギ林とホウガンヒルギ林で設置後2年目のイングロースコアと根リターバッグの回収を行った。西表島では、オヒルギ林で設置後2年目のイングロースコアと根リターバッグの回収を行った。また、これまでに回収したすべてのイングロースコアの分析を行った。ポンペイ島では、本研究期間内にフタバナヒルギ林の2年目、ヤエヤマヒルギ林の陸側2年目のイングロースコアデータが得られなかったため1年目のデータで比較すると、フタバナヒルギの死根と生根死根合計、マヤプシキの生根と生根死根合計、およびオヒルギの生根死根合計で海側の方が陸側より有意に多かった。樹種間では海側の生根と死根、陸側の死根、および陸側の生根死根合計で有意差が認められた。海側の生根はマヤプシキが他の樹種より有意に多かった。陸側の死根ではヤエヤマヒルギがオヒルギ、マヤプシキ、フタバナヒルギより多い傾向にあり、陸側の生根死根合計ではヤエヤマヒルギとホウガンヒルギがオヒルギ、マヤプシキ、フタバナヒルギより多い傾向にあった。また、海側の死根は、マヤプシキがヤエヤマヒルギ、オヒルギ、ホウガンヒルギより有意に少なかった。西表島では、1年目、2年目共、ヤエヤマヒルギ、オヒルギのいずれも海側と陸側で有意差は認められなかったが、樹種間では2年目の陸側生根でヤエヤマヒルギの方がオヒルギより有意に多かった。標高がほぼ等しいヤエヤマヒルギの陸側とオヒルギの海側では有意差は認められなかったが、ヤエヤマヒルギの海側とオヒルギの陸側でヤエヤマヒルギの方が有意に多かった。ヤエヤマヒルギとオヒルギについて、熱帯湿潤環境下のポンペイ島と亜熱帯環境下の西表島の1年目の生根死根合計で比較すると、ヤエヤマヒルギで約7倍、オヒルギで47倍ポンペイ島の方が多かった。ミクロネシア連邦ポンペイ島と西表島のマングローブ林において、主要樹種の細根蓄積・分解速度を明らかにした。また、根圏の窒素固定機能について検討した。1年間の蓄積量は、ポンペイ島ではいずれの樹種も4050 t/ha程度であったが、一部陸側で25 t/ha前後と少ない樹種も見られた。西表島では49 t/haであった。1年間の根リター残存率は、ポンペイ島のヤエヤマヒルギ海側プロットで8 %と極端に低く、他は4085%であった。西表島では5060%であった。窒素固定反応の活性化エネルギーは、すべての調査木で根近傍の方が非近傍より高かった。ポンペイ島の窒素固定活性は、他地域と比べ最も高かった。
生物活性海洋天然物質の化学的研究

海洋生物は海水中という特異な環境に生息することから、その代謝産物には、陸上生物の代謝産物に比べて予想もできないほど新規な化学構造を有し多様な生物活性を示す天然物質の存在が期待される。本研究では、沖繩サンゴ礁域および南太平洋パラオ諸島で採集した海綿類の産生成分の検索を行ない、以下の成果を得た。1.沖繩県座間味島で採集した海綿Theonellaswinhoeiからバフンウニ受精卵卵割阻害活性を有する5種の生物活性トリデカペプチドラクトン類テオネラペプトリドIa,Ib,Ic,IdおよびIe単離した。いずれもD-アミノ酸やN-メチルアミノ酸の含量比が高く、新たにN-メチルアミノ酸と通常アミノ酸がまとめて一斉に分析できるHPLCによるアミノ酸分析法を考案し、それらの全化学構造を解明した。これらテオネラペプトリド類は、中程度の細胞毒性を示す他、IdはNa^+、K^+-ATPase阻害活性ならびにイオノフォア活性を示した。2.パラオ産海綿Asteropus sarasinosumの産生成分の検索を行い、海綿動物からは初めてサポニン成分を単離し、それらの全化学構造を解明した。サラシノシドA_1,A_2,A_3,B_1,B_2,B_3,C_1,C_2,およびC_3と命令したこれら9種類のサポニン成分は14ーノルラノスタン骨格のアグリコンを有し、糖鎖構造の中にNーアセチルグルコサミンとN-アセチルガラクトサミンを含む珍しいオリゴ配糖体で、顕著な魚毒活性とヒトデ受精卵卵割阻害活性を示した。3.沖縄県新城島で採集したXestaspongia属海綿から顕著な血管拡張作用を有するアルカロイド類を単離し、それらの化学構造を解明した。アラグスポンジンBHおよびJと命名した8種類のアルカロイド類は、2個のオキサキノリチジン環がメチレン鎖でつながった大環状構造を有する。海洋生物は,その種類の豊富さと多様さに加え,未開拓な面が多いこと,および生活環境が陸上とは大きく異なることなどから,陸上生物由来のものとはかけ離れた特異な化学構造をもち,新規な生物活性を示す二次代謝産物の生産が期待される.本研究において,沖縄県慶良間諸島および八重山諸島のサンゴ礁に生息する種々の海綿動物(スポンジ)および腔腸動物(特に花虫綱:根生目,ウミトサカ目)を採集し,それらの産生する生物活性物質の探索研究を行った.また,比較成分研究として,南太平洋パラオ諸島産のサンゴ礁生物を入手しその産生成分の検索を行なった.その結果,沖縄県座間味島で採集したTheonella属海綿からバフンウニの受精卵卵割阻害活性を有するテオネラペプトリドIa,Ib,Ic,IdおよびIeと命名した5種のトリデカペプチドラクトン類を単離し,これまでにIdとIeの全化学構造を解明した.いずれもDーアミノ酸やNーメチルアミノ酸の含量比が高く, N末端にメトキシアセチル基を有するなど特異な化学構造を有する脂溶性オリゴペプチドであった.

これまでに,これらテオネラペプトリド類が中程度の細胞毒性を示す他, IdがNa^+,K^+ーATPase阻害活性ならびにイオノフォア活性などの生物活性を有することが判明している.また,パラオ産海綿Asteropus sarasinosumの産生成分の検索を行い,海綿動物からは初めてサポニン成分を単離し,それらの化学構造を解明した.サラシノシドA.ナ_<1.ニ>,A.ナ_<2.ニ>,A.ナ_<3.ニ>,B.ナ_<1.ニ>,B.ナ_<2.ニ>,B.ナ_<3.ニ>,C.ナ_<1.ニ>,C.ナ_<2.ニ>およびC.ナ_<3.ニ>と命名したこれら9種類のサポニン成分は14ーノルラノスタン骨格のアグリコンを有し,糖鎖構造中にNーアセチルグルコサミンとNーアセチルガラクトサミンを含む非常に珍しいタイプのオリゴ配糖体で,顕著な魚毒活性とヒトデ受精卵に対する強い卵割阻害活性を示した.今後,採集した他の海洋生物についても引き続き,生物活性物質探索研究を行なう.広く暖海域に分布するサンゴ礁には様々な種類の生物群が生息し、これらのサンゴ礁生物は海水中という特異な環境に生息することから、その代謝成分には、陸上生物の代謝産物に比べて予想もできないほど新規な化学構造を有し多様な生物活性を示す天然物質の存在が期待される。本研究では、昨年度に引き続き、沖繩県慶良間諸島および八重山諸島のサンゴ礁域で採集した海綿動物および南太平洋パラオ諸島産海綿の産生成分の検索を行なった。その結果、沖繩県座間味島で採集したTheonella属海綿から5種の生物活性トリデカペプチドラクトン類テオネラペプトリドIa、Ib、Ic、IdおよびIeを単離しているが、新たにNーメチルアミノ酸と通常アミノ酸がまとめて一斉に分析でき、あわせてCD測定によりそれらの絶対構造も解析できるHPLCによるアミノ酸分析法を考案し、まだ未明であった微量成分のIa、IbおよびIcの全化学構造を解明した。さらに、同種の海綿から顕著な抗腫瘍活性を有する4種のマクロリド類を得、それらの平面構造を解明するとともに、現在それらの立体構造を検討している。また、沖繩県新城島のサンゴ礁で採集したXestospongia属海綿から血管拡張作用を有する大環状アルカロイド類を単離し、それらの化学構造を解明した。アラグスポンジンBHおよびJと命名した8種のアルカロイド類は、2個の1ーオキサキノリチジン環がメチレン鎖でつながった大環状構造を有し、光学活性HPLCカラムを用いた分析からエナンチオマーの共存が判明した場合も含め、それらの絶対構造の解明を行なった。また、パラオ産Luffariella属海綿の産生成分の検索を行ない、その脂溶性画分から生物活性セスタテルペンのマノアライドとその類縁体を得、未明であったマノアライドの絶対構造を明らかにするとともに、水溶性画分から数種の異常ヌクレオシドを単離し、それらの化学構造を解明した。
ヒト・フィラリア・プロテアーゼ阻害剤開発のためのポストゲノム戦略

1)ヒト・フィラリア寄生虫であるマレー糸状虫(Brugia malayi)より各種プロテアーゼのcDNAの系統的なクローニングを試み,5種類の全長cDNA,14種類の部分配列を得た.この他,EST databaseを検索し,重複したクローンの統合・編集を行うことにより,さらに30種を越えるプロテアーゼ様配列を見出した,これらについて,今後クローニングを行う.2)得られたcDNAのうち,アスパラギン酸プロテアーゼ2種について,大腸菌中で発現させた.インクルージョン・ボディより変性剤を用いて可溶化し,変性条件下で精製後,リフォールデイングして酸性プロテアーゼの活性を得た.また抗体を調製してフィラリア寄生虫の免疫染色を行い,BmAsp2は生殖巣と体壁,BmAsp3は消化管に存在することを明らかにした.今後は,線虫類のコドンに適した無細胞蛋白質発現系の構築を行い,各種プロテアーゼを発現・解析する.3)C.elegansのプロテアーゼ様配列を持つ遺伝子130種類について,RNAi法による検索を行った.23個の遺伝子で胚あるいは幼虫期での致死が見られ,また,数個の遺伝子について形態形成や生殖巣の形成における影響が見出された.今後,C.elegansの結果を参考にB.malayiの生活環に重要なプロテアーゼを明らかにし,阻害剤開発へと展開する.1)ヒト・フィラリア寄生虫であるマレー糸状虫(Brugia malayi)より各種プロテアーゼのcDNAの系統的なクローニングを試み,5種類の全長cDNA,14種類の部分配列を得た.この他,EST databaseを検索し,重複したクローンの統合・編集を行うことにより,さらに30種を越えるプロテアーゼ様配列を見出した,これらについて,今後クローニングを行う.2)得られたcDNAのうち,アスパラギン酸プロテアーゼ2種について,大腸菌中で発現させた.インクルージョン・ボディより変性剤を用いて可溶化し,変性条件下で精製後,リフォールデイングして酸性プロテアーゼの活性を得た.また抗体を調製してフィラリア寄生虫の免疫染色を行い,BmAsp2は生殖巣と体壁,BmAsp3は消化管に存在することを明らかにした.今後は,線虫類のコドンに適した無細胞蛋白質発現系の構築を行い,各種プロテアーゼを発現・解析する.3)C.elegansのプロテアーゼ様配列を持つ遺伝子130種類について,RNAi法による検索を行った.23個の遺伝子で胚あるいは幼虫期での致死が見られ,また,数個の遺伝子について形態形成や生殖巣の形成における影響が見出された.今後,C.elegansの結果を参考にB.malayiの生活環に重要なプロテアーゼを明らかにし,阻害剤開発へと展開する.ヒト・フィラリア症の制圧薬を開発することを目標に,ヒト寄生フィラリアに由来する各種のプロテアーゼについて,系統的かつ網羅的にcDNAクローニングを行った.現在までに,アスパラギン酸プロテアーゼ全長2種,部分配列1種,システインプロテアーゼのファミリーC1全長3種,部分配列4種,ファミリーC2部分配列1種,ファミリーC12部分配列2種,ファミリーC19部分配列1種,金属プロテアーゼのファミリーM12部分配列2種,ファミリーM16部分配列3種を得た.アスパラギン酸プロテアーゼの全長2種に関して,大腸菌によるタンパク質の発現を行い,不溶性画分を可溶化・リフォールディングすることにより活性酵素を得た.また,抗体を調製した.システインプロテアーゼ・ファミリーC1の1種についても大腸菌での発現を行った.ファミリーC1のプロテアーゼはフィラリア寄生虫Brugiaと自由生活線虫C.elegansとが進化的に分岐した後に遺伝子重複により多様化したと考えられ,また,cDNAクローンの塩基配列からalternative splicingによる多様化の可能性も推測される.部分配列をクローニングした金属プロテアーゼ・ファミリー16のうちの一つについて,そのC.elegansにおけるホモログに対しRNAiによる機能解析を行ったが,顕著な影響を検出できていない.さらに,系統的なcDNAクローニング,タンパク質の異宿主発現,C.elegansにおけるホモログの機能解析を現在進めている.1)C.elegansプロテアーゼの機能検索:C.elegansのプロテアーゼをコードすると考えられるESTクローン約130種類について,RNAiを行い,その阻害が致死的な影響をもたらすプロテアーゼをスクリーニングした.その結果,RNAiを行うことにより致死を示す遺伝子を23個見出した.このうち17個は26Sプロテアソームのサブユニットである.また,形態に以上を示すもの1種類を見出した.また,個々の遺伝子に対してRNAiを行ったときは正常であるが,複数同時に行うことにより致死を示す遺伝子群,生殖巣形成に異常の現れる遺伝子群をそれぞれ一つずつ見出した.2)抗体の調製:C.elegans由来プロテアーゼ,フィラリア寄生虫由来プロテアーゼを大腸菌で発現させ抗体を調製した.このうちアスパラギン酸プロテアーゼについて,フィラリア寄生虫における組織分布を免疫染色により解析し,B.malayiよりクローニングした2種類のアスパラギン酸プロテアーゼが異なる組織に分布していることを明らかにした.4)酵素学的解析:C.elegansにおいてRNAi表現型が致死であったシステインプロテアーゼは,すでにフィラリア寄生虫からクローニングしていたものと相同性があった.これらのプロテアーゼの発現系構築を試み,C.elegans由来プロテアーゼについて活性を確認した.