hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオンチャネル詳細構造解明に向けた単粒子解析技術の開発と複合体の構造解明

イオンチャネルやトランスポーター等の膜タンパク質の構造情報を得ることは、神経伝達や筋収縮、心拍のペースメーキング等に関する機構を理解し、関連疾病に対する画期的新薬を開発する上で不可欠である。我々は難結晶性タンパク質の構造解明に向けて、精製タンパク質の電子顕微鏡画像から情報学的に3次元構造を再構築する単粒子解析法の技術開発と構造解析を推進してきた。単粒子解析法を用いて、Ca^<2+>放出活性化Ca^<2+>(CRAC)チャネルの本体として近年同定されたOrai1陽イオンチャネルの構造解析を行った。動物細胞発現系を用いてOrai1タンパク質を発現・精製し、生化学検討から生理機能単位が四量体であることを突き止めた。電顕画像を元に三次元構造を21Å分解能で再構成し、高さ150Å、幅95Åの水滴形構造を持ち、小胞体膜上でCa^<2+>枯渇を感受するSTIM1と相互作用可能な細長い細胞質ドメインが示された。更に、細胞内で酸化ストレスセンサーとして働くKeap-1の構造解析を行い、サクランボ形の2つの房にβ・プロペラの数Å径の穴に相当する小さな貫通部分が見出された。周囲に存在するSH基で酸化ストレスを感知する機構が推察された。またタンパク質構造解析にもとづく薬物の作用機序解明も重要である。我々は喘息治療薬として開発が進められていたピラゾール化合物をリードにTRPC3チャネルを特異的に抑制する誘導体を見出し、その作用機序を電子顕微鏡を用いて検討した。光架橋と金粒子ラベルを組み合わせてTRPC3に結合したピラゾール誘導体を観察することで、単分子レベルでの薬物結合の可視化に成功し、細胞膜直下部を標的としていることを証明した。1.約9万枚のクライオ電子顕微鏡粒子画像から3次元構造構築したP2×2受容体は、ATP受容体型チャネルとして痛覚等に関する情報を伝達する。我々は以前、負染色電顕画像を用いて2次元平均化による可視化に成功し、全体として花瓶の様な形であること、また上部平均画像の三回対称性から3量体構造であることを直接的に証明した(2005,BBRC)。今回の解折からはP2×2受容体は細胞膜を挟んだ上下に隙間の多い緩やかなサブユニット構造を持ち、イオンやATP分子の取り込み、排出等に役立つことが想定された。また細胞膜を貫通するポアと推定される部分には部分的狭窄が認められ、電気生理学的研究から推定される構造と一致した。軽い接触が激しい痛覚として感じられる異痛症や、通常の暖かさを暑さに感じてしまう遺伝病等の解明にも役立つことが期待される。2.嚢胞性線維症(CF:cystic fibrosis)は体内のあらゆる組織で粘膜分泌阻害を引き起こす重篤な遺伝病であり、特に白人幼児の死亡原因の第一位を占める。これはABCトランスポーターに属する陰イオンチャネルCFTR(cystic fibrosis transmembrane regulator)の遺伝子変化で発症する。我々は正常ヒトCFTRタンパク質の精製法を確立し、負染色電子顕微鏡単粒子解析から3次元構造を明らかにした。その結果CFTRは細胞膜直下に分子内外をつなぐ開口部を持つ、卵型の構造をした分子であることが示された(J.Biol.Chem.)。疾病原因解明のみならず正常な組織におけるCFTRの機能解明にも役立つことが期待される。3.その他、プロテアーゼ阻害を通じて癌の悪性化を抑えるRECKタンパク質や、CRACチャネルの本体として機能するORAI1チャネル(J.Biol.Chem.,印刷中)等の重要な膜タンパク質の構造解明を行った。
中世英国写本と修道院

本報告書「中世英国写本と修道院」は三部からなる。第三部は「補遺」として、近い将来に本研究を総合的にまとめるための資料を、多くはそのまま、そして一部は分析して提示した。即ち、「関連系統写本対照の欄外書き込み/僧院敷地内の空間構成要素の配置例/ヨーロッパ中世写本およびインキュナビュラ零葉/仏塔(五重塔・三重塔)/Sir Walter Scott作のバラッドTheEve of St Johon(『聖ヨハネ前夜祭』)の邦訳の試み」を提示した。尚、以上の考察と分析説明を支えるためのカラー写真50点余りを掲げた。平成16年度科研費補助金「基盤研究(C)(2)」により貴重な図書関係資料を用意することができ、収集したデータを大きく膨らませながら、目的達成のための分析を行うことができた。すなわち、テーマ「中世英国写本と修道院」遂行に当たって、中性にイングランド北部に建てられた修道院の廃墟と、スコットランドとの境界線をなしているツウイード川流域に残る修道院遺跡と跡地を確認し、カルトージオ修道会をはじめとする各会派の活動を文献を活用しながら把握するよう試みた。また、ウルガタの「詩篇」および「時祷書」羊皮紙単葉を入手し、翻刻(transcriptions)を行い、英訳・邦訳を付し、中世英国社会におこる修道院と一般大衆との関わりを考察した。修道院敷地内の空間構成要素とその配置につて、わが国の寺社境内の場合との建築学的比較を行い、両者の特性の明示を試み、その際にカラー写真による視覚的提示も試みた。また、ヨーロッパに源流を求め得る修道会派については、たとえば、仏グルノーブル山中のラ・グランド・シャトルーズ修道院(1084年創建)など、実見踏査の際に入手した資料に基づく分析と裏付けを行った。英国内修道院に関しては、マウンド・グレイス小修道院でニコラス・ラブ(13??1424)の手により成立した(c.1410)Mirror of the Blessed Life of Jesus Christの研究は世界に残存する写本約50点との比較を行いながら継続中。(2)僧院敷地内の空間構成要素の配置を図示した。国内寺社に関しては仏塔(三重塔、五重塔、多宝搭)と塔頭を、英仏の寺院・大聖堂の尖塔との比較の要素の一つとした。(3)英国ノース・ヨークシャーの都市ヨークの北約60kmに位置する廃墟カルトージオ修道会Mount Grace Priory(1398-1539)で成立した写本Myrrour of the Blessed Lyf of Jesu Christ(c.1410)研究を継続できた。また、仏国南東部の都市グルノーブルの北約30kmに位置するドフィネ・アルプスの山間に、同修道会の母院ラ・グランド・シャルトルーズ修道院(創建1084年)を訪れた際に入手した資料も活用できた。(4)イングランドとスコットランドの境界となって流れるツウィード川流域の修道院跡地と廃墟、およびBerwick-upon-Tweed地方沖合の「聖なる島/Lindisfarne Island」を実見した際に収集した資料をもとに、現地で撮影した写真を多用しながら写本The Lindisfarne Gospels「リンディスファーン福音書」(成立c.698?)の意義と特性を明らかにする分析を試みた。
黄疸ラットの遺伝子治療の試み。ラット肝臓のビリルビン:UDPー酸転移酵素cDNAのクロ-ニング

4-ニトロフェノ-ル:UDPGTのcDNAに対応する40-merのオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ-ブとしてラット肝臓cDNAライブラリ-のスクリ-ニングをおこなった。その結果、4-ニトロフェノ-ル:UDPGTのcDNAと極めて似た構造を持つcDNAが単離できた。このcDNAはラットでこれまで単離された他の3個のUDPGTのcDNAとの間にも塩基配列の類似性が存在した。これまでの解析から明らかとなったこのcDNAの構造がCunnラットでみられる2つのアイソエンザイムの異常を都合よく説明することから、これがビリルビンを基質ととするUDPGTのcDNAと考え解析を進めている。
DNA損傷を指標とした食品に照射された放射線の検出

PCRとは、DNA分子の特定の領域または全体を、さまざまなDNAポリメラーゼを利用して量的に増幅する手法のことである。PCR法の原理から、鋳型となるDNAに放射線照射による損傷があれば、ポリメラーゼ連鎖反応を阻害すると考えられる。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応でのDNA合成効率から、鋳型として機能する未損傷のDNA量を評価できると考えられる。食品のモデルとして、乾燥したオーストラリア産牛肉(ビーフジャーキー、以後サンプルB)および熱加工済みの国産豚肉(ロースハム、以後サンプルP)を用いた。大阪大学産業科学研究所のコバルト60を用い、食品サンプルにガンマ線を5kGy、10kGy室温照射した。照射後、QIAGEN社のDNA精製キットを用いて、食品サンプルからDNAを精製し、TE緩衝液で4ng/μlとなるように希釈した。サンプルBおよびサンプルPについて、1wellあたり4 ngのDNAに対し、リアルタイムPCRを行い、鋳型として機能する未損傷のDNA量を評価した。リアルタイムPCRの際の蛍光色素としSYBRGreenを用いた。DNA量の評価には、Bio-Rad社、DNA定量ソフトウェアCFX Managerを用いた。5kGy、10kGyのガンマ線照射によりサンプルBおよびサンプルPともに未損傷DNAは低下し、1020%程度に減少することが明らかとなった。10kGyでは有意に0Gy(未照射)と差があり、照射済食品を識別できることが示された。本手法は、従来法と比較して、サンプルの取り扱い、運用コスト、操作の熟練が必要でない等、多くの利点がある。今後、試験対象(部位、品種、サンプル保存方法等)を増やし、適応性の検証を進めていく計画である。リアルタイムPCR法で肉類の食品照射を検知ことが可能でることが確かめられた。本手法の課題としては、実際に使用する現場を想定した場合、未照射のサンプルをどのように定義するかを考える必要がある。ひとつの解決法として、アルカリ反応やDNase(DNAを切断する酵素)によりDNAを化学的に切断し、その追加のDNA切断による未損傷のDNA量の差分を評価することで、照射線量を評価する方法は有効であるかもしれない(すなわち、照射食品のDNAであれば、このような化学処理による未損傷DNAの減少の幅が少なく、未照射食品との差が明確になると考えられる。また、PCRの領域を工夫する事で照射食品特有のDNA切断を評価することが可能であるかもしれない。本実験では200bp程度の領域を増幅領域としたが、このほかに150bp、100bpの利用域もそれぞれPCRを行い、DNA合成量を評価する。放射線によるDNA損傷はポアソン分布に従うランダムな反応であるため、DNA合成する領域が大きくなればそれだけPCR反応は阻害されることが予想される。一方、未照射の食品のDNAであれば、PCRの領域によらず一定のDNA合成が可能となる。すなわち、PCRの領域(DNAの長さ)に依存する結果が得られることが照射食品の証拠となると考えられる。

ひとつの解決法として、アルカリ反応やDNase(DNAを切断する酵素)によりDNAを化学的に切断し、その追加のDNA切断による未損傷のDNA量の差分を評価することで、照射線量を評価する方法は有効であるかもしれない(すなわち、照射食品のDNAであれば、このような化学処理による未損傷DNAの減少の幅が少なく、未照射食品との差が明確になると考えられる。また、PCRの領域を工夫する事で照射食品特有のDNA切断を評価することが可能であるかもしれない。本実験では200bp程度の領域を増幅領域としたが、このほかに150bp、100bpの利用域もそれぞれPCRを行い、DNA合成量を評価する。放射線によるDNA損傷はポアソン分布に従うランダムな反応であるため、DNA合成する領域が大きくなればそれだけPCR反応は阻害されることが予想される。一方、未照射の食品のDNAであれば、PCRの領域によらず一定のDNA合成が可能となる。すなわち、PCRの領域(DNAの長さ)に依存する結果が得られることが照射食品の証拠となると考えられる。初年度リアルタイムPCR装置を購入した。新しい装置での条件設定を行った後に、実際の照射試料の解析を行ったがガンマ線照射施設の改修等で十分な試料の作成が出来なかった。そこで初年度は条件設定を厳密におこなうこととして、実際の試料の解析を次年度に回した。
エンドトキシン肺障害に対する顆粒球コロニー形成刺激因子(G-CSF)投与の影響

新生仔豚を用いた急性肺障害モデルの作成を行った。研究の目的は、顆粒球コロニー形成刺激因子(G-CSF)がエンドトキシンによる肺障害に与える影響を評価することであるが、2年間の研究期間の初年度には、G-CSF非投与群を主とした実験を行い、エンドトキシンの経気道的投与量を変化させ、体血圧、心拍、動脈血ガス分析、呼吸機能、末梢血細胞数、気管支肺洗浄液(BALF)中遊離細胞数などの経時変化をみた。エンドトキシン投与量は5,10および20mg/3ml saline/kgの3種類の濃度設定で行い、いずれの群においても急性肺障害(acute respiratory distress syndrome;ARDS)の病変を作り出すことができたが、10および20mg/3ml saline/kg投与群の中には急性肺出血やショックを呈し実験続行が困難な症例もあり、エンドトキシンの投与量は5mg/3ml saline/kgが適当と判断した。エンドトキシン投与60分後より、末梢好中球数の著減、血液ガス所見の悪化(とりわけpHの低下とPCO_2の上昇)が認められ、また摘出肺標本では炎症反応による強度の発赤を認め、適度な急性肺障害モデルの作成は成功した。最終年度に当たる本年度は、予め仔豚にG-CSFを投与した後に上記と同様にエンドトキシン投与を行った。G-CSF投与群では、非投与群と同様の経過をたどるものの、60分以降の血液ガス所見の悪化、呼吸機能の低下等、全体に変化が劇的であり、また解剖時の肉眼的な肺出血の増大も認められた。しかし、統計学的に有意なものかの判定については症例数が不十分であり、今後症例を追加し検討を行う予定である。また摘出した肺の病理組織診断を追加行うこととした。豚新生仔を用いた、急性肺障害モデルの作成を試みた。本研究の目的は,顆粒球コロニー形成刺激因子(G-CSF)がエンドトキシン肺障害に与える影響を評価することであるが、2年間の研究期間の初年度にあたる本年度は、顆粒球コロニー形成刺激因子(G-CSF)非投与群(コントロール群)を主とした検討を行った。これまでに、生後512時間の体重10001200gの豚新生仔11頭を対象に実験を行った。ペントバルビタールで静脈麻酔をした後、気管切開により気管チューブを挿入し、臭化パンクロニウムを投与し自発呼吸を消去させ、time cycled pressure limited ventilator装着。エンドトキシンを経気道的に投与し、体血圧、心拍、動脈血酸素分圧、動脈血ガス分析、呼吸機能、末梢血細胞、気管支肺胞洗浄液(BALF)中遊離細胞数、等を投与180分後まで測定した。エンドトキシン投与量の設定のために、20mg/3mlsaline/kg、10mg/3mlsaline/kgおよび5mg/3mlsaline/kgと3種類の濃度で試行した。いずれの群においても急性肺障害(acute respiratory destress syndrome;ARDS)の病変を作り出すことはできたが、急性肺出血やショックを呈するものがあり、エンドトキシンの投与量は5mg/3mlsaline/kgが適当と判断した。これまでの研究では、エンドトキシン投与60分後より、末梢血好中球数の著滅。血液ガス所見の悪化(とりわけpHの低下とPCO_2の上昇)が認められ、また、摘出肺標本では、炎症反応によると思われる強度の発赤を認め、適度な急性肺障害モデルの作成は成功した。現在、設定投与量よるコントロール群およびG-GSF投与群の比較実験を継続しており、症例数を増やすとともに、統計学的解析を進めている。
巨大コロイド結晶の電気光学効果の発現機構

ポリスチレンやシリカ等の単分散コロイド粒子により構成されるコロイド結晶において、電気光学効果の発現機構をコロイド結晶の構造や粘弾性特性から調査した。具体的にはまず、発現された巨大コロイド結晶のキャラクタリゼーションにより結晶の格子定数等を確定した後、時間分割高速反射スペクトル測定による非線形光学効果の測定、そして静的・動的光散乱測定によるコロイド粒子の運動モード評価を行った。散乱光強度の角度分布から求められる静的構造因子、散乱光強度の時間相関関数から得られる見かけの拡散係数を、コロイド粒子濃度を変化させながら測定した。これらの結果以下の事実が明らかとなった。1.コロイド結晶は3つの粒子運動モードを持つが、それぞれの運動モードが周波数分散を持ち、印加電場に協奏的に応答する。2.コロイド粒子が持つ電気二重層が非線形的な分極を起こす。つまり通常の誘電体における非線形分極と同様に、μmに近い粒子間隔を持つコロイド結晶においては、今回のようなかなり低い印加電場でも非線形応答を示す場合がある。3.結晶格子間隔の電場による変化が、ブラッグ反射ピークの波長シフトを引き起こし、観測光学系の波長感度分散とのかねあいで二次高調波として観測される。この後さらに、電極付セルによるフォトニクス素子、具体的には高調波発生用非線形素子、電場変調素子、位相可変偏光板、チューナブルフィルター、波長変換表示素子等としての実用度評価も行った。コロイド結晶に対する印加電場は、コロイド結晶の格子定数の変化を引き起こすため、以下のような電気光学効果が現れた。(i)波長選択効果:一般にコロイド結晶を構成するコロイド粒子は負に帯電しているため、電場印加によって粒子間隔の伸縮がおこる。これによりブラッグピークは短波長または長波長シフトする。これはすなわち電場印加により反射光の波長選択ができるということを意味し、ディスプレーとしての基本的な特性を満足する。(ii)位相差発生効果:コロイド結晶の構成粒子はその電気二重層も含めるとミクロンオーダーの大きさとなるため、速い周波数変化に対しては位相遅れを生じる。位相遅れの度合いはコロイド結晶の結晶弾性率と密接に対応している。(iii)波形変換効果:結晶に矩形波を印加して反射光強度の時間変化を観察したところ、応答波形は三角波となった。コロイド粒子と水しか存在しない非常にシンプルなコロイド結晶系に、このような波形変換能力があることが示された。(iv)高調波発生効果:電極に正弦波を印加してその周波数や電場強度を変化させると、ほぼ完全な2次高調波を応答波形として得ることができた。高速反射スペクトル測定装置による時間分割測定で、コロイド結晶の2つの結晶構造、面心立方格子(fcc)と体心立方格子(bcc)の存在が高調波発生の一因であることが判明した。さらに、コロイド粒子自体にも電場応答の非線形性があることがわかった。(v)波動伝搬効果:コロイド結晶の電場印加による運動は、電極間の実際に電場が印加されているところより遥かに遠くでも観測された。これはコロイド結晶に粘弾性的性質があるためにおこると考えられる。(vi)残響効果:コロイド結晶には、電場印加を止めてもその周波数での運動をしばらく続ける残響効果があることが示された。

2.コロイド粒子が持つ電気二重層が非線形的な分極を起こす。つまり通常の誘電体における非線形分極と同様に、μmに近い粒子間隔を持つコロイド結晶においては、今回のようなかなり低い印加電場でも非線形応答を示す場合がある。3.結晶格子間隔の電場による変化が、ブラッグ反射ピークの波長シフトを引き起こし、観測光学系の波長感度分散とのかねあいで二次高調波として観測される。この後さらに、電極付セルによるフォトニクス素子、具体的には高調波発生用非線形素子、電場変調素子、位相可変偏光板、チューナブルフィルター、波長変換表示素子等としての実用度評価も行った。
胚発生の開始を制御するカルシウムシグナル経路

動物の卵では受精時に細胞質のCa^<2+>濃度が一過的に上昇するが、Ca^<2+>の卵賦活における機能的役割については不明な点が多い。本研究では、無尾両生類アフリカツメガエルの卵抽出液の無細胞系、単離表層を用いて、(i)停止した減数分裂周期の再開におけるカルシニューリン(CaN)の基質、(ii) Ca^<2+>依存的な卵表層の賦活収縮の制御機構の2点について検討した。その結果、分裂期停止の解除をもたらすサイクリンBタンパク質分解の誘起にはErp1およびCdc20の脱リン酸化が関与することが示唆された。また、卵表層の構成タンパク質を卵成熟前後、賦活前後で比較し、卵成熟期にアニリンが量的に増加しリン酸化されることが判明した。この成果は、卵表層の生化学的解析への道を拓くものでもある。本研究は、動物の受精卵における、カルシウム/カルモジュリン(Ca^<2+>/CaM)依存性のタンパク質脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)の生理的役割の解明、および、Ca^<2+>/CaM依存性タンパク質キナーゼタイプII (CaMKII)とCaNの活性制御の相互連関性の解析、の2つを通じて、動物の受精卵において胚発生の開始を制御しているカルシウムシグナル経路の分子基盤解明への手掛かりを得ることを目的としている。本年度は、受精に依る卵の賦活の際に、CaNによって化学修飾を受ける蛋白質のうち、特に表層蛋白質に着目して、その分子的実体を検索した。未受精卵の単離表層をγ^<32>P-ATPを含む成熟未受精卵抽出液中でインキュベーションした後、リン酸化蛋白質をSDS-PAGE/オートラジオグラフィーで解析した。その結果、単離表層中の蛋白質がリン酸化されることが確認され、単離表層中のリン酸化酵素の少なくとも一部が活性状態を保ち、その基質も存在していることが示された。また、そのリン酸化パターンは卵抽出液のものとは明らかに異なり、表層特異的なリン酸化が検出できていることが示唆された。また、恒常活性化型CaNで処理することにより、リン酸化標識された表層蛋白質が脱リン酸化されることが確認された。その主なものとして、32Kおよび95KDaの移動度を示すものが含まれていたが、その同定は今後の課題である。これらの結果は、卵抽出液と単離表層を組み合わせることで、卵の賦活時にCaNやCaMKIIによって修飾される表層蛋白質の生化学的解析に道が拓かれたことを示している。本研究は、動物の受精卵における、カルシウム/カルモジュリン(Ca^<2+>/CaM)依存性のタンパク質脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)の生理的役割の解明、および、活性制御の相互連関性の解析、の2つを通じて、動物の受精卵において胚発生の開始を制御しているカルシウムシグナル経路の分子基盤解明への手掛かりを得ることを目的としている。平成21年度は、申請者の異動(東京工業大学から名古屋大学)による研究室の移設や実験室の改修などにより、放射性同位元素を用いた解析的実験をすることができず、予定していた、受精直後の卵に見られる賦活収縮時に化学的修飾状態(特にリン酸化状態)が変化する細胞骨格蛋白質の検索が充分にはなされなかった。その代わり、申請者らが開発した方法により調製した卵細胞の単離表層に含まれる細胞骨格(特にアクチンフィラメント)の制御蛋白質のウエスタン解析を行い、賦活反応前後の差異を検討した。その結果、アクチンフィラメントを細胞膜に結合させるのに重要と考えられるモエシンについては変化が検出できなかったが、収縮環形成に制御的役割を果たすと考えられているアニリンについては、電気泳動の移動度が賦活後の増加するのが認められた。また、定量ウエスタン解析の結果、卵に含まれるアニリンのうち、約12%が表層に局在し、その割合は、賦活前後で変化しなかった。以上の結果は、申請者らの調製した卵の単離表層を用いたウエスタン解析によって、表層細胞骨格系の制御因子を定量、定性的に調べることが可能であることを示している。アフリカツメガエル卵母細胞の単離表層構成蛋白質を電気泳動的に解析した結果、これまでの7M尿素による抽出法では、この処理によって蛋白質の電気泳動上の異動度の変化が起こることが示され、この方法が適切ではないことが示唆された。そでまず、表層蛋白質の回収を視野に入れて卵母細胞表層の単離法に改良を加えた。

接着剥離法により単離した表層を、緩衝液中で充分に洗浄した後、界面活性剤、次いで5M尿素で抽出を行い、最後に電気泳動用のサンプルバッファーで残りの成分を可溶化する3段階抽出法を確立した。各段階の抽出物について、成熟前、減数第一分裂期、成熟後の各卵母細胞間の電気泳動法比較を行ったところ、界面活性剤抽出成分および尿素抽出成分に、卵成熟前後で泳動上の異動度が変化する成分がいくつか見いだされた。受精直後の卵に見られる賦活収縮の調節因子を調べるため、アクチン結合蛋白質anillin、formin、moesin、cortactinに対するウサギ抗血清を作製し、卵成熟期のそれらの動態をウエスタン法によって解析した。その結果、anillinについては、卵成熟の前後で卵細胞質中の量が約2倍に増加すること、また、単離表層に含まれる量は4倍に増加することが示された。この結果は、卵成熟期に新規合成されるanillinが優先的に表層に蓄積されることを示した。そこで、その生理的意義を調べるため、アンチセンスオリゴを用いてanillinの新規合成を抑制したが、特に影響は見られなかった。また、いずれの蛋白質についても、賦活前後では、量、電気泳動上の異動度に目立った変化はなく、成熟卵の賦活収縮との関連性は示されなかった。anillinについては、間期に異動度がわずかに増加するのが見られたが、フォスファターゼ処理後の異動度変化の解析から、これは細胞周期依存的なリン酸化によるものであることが示された。
阪神大震災における災害ボランティア団体の組織化過程に関する研究

本研究は、阪神・淡路大震災後の「ボランティア・ブーム」は、未曾有の災害を契機とする突発的偶発事ではなく、戦後の日本社会を通低する組織・集団編成原理の(段階的)変容過程の必然的帰結であることを、大規模な聞き取り調査、種々の資料の内容分析を通して明らかにした。調査の対象は、国内では、大阪YMCA、朝日新聞厚生文化事業団、とよなか国際交流協会、西宮市、芦屋市、尼崎市、兵庫県、社会福祉協議会(兵庫県、神戸市)、松下電器、東芝、コープなど、多岐にわたった。また、比較対照のため、国外でも、スイス災害救援センター、バ-ゼル災害救援ユニットなどで聞き取りを実施した。この結果、第1に、社会構造に占めるボランティア団体・NGO団体(以下、ボ団体)の位置に着目して、社会を、以下の5つの類型化しうることを見いだした。すなわち、(1)行政、企業という2大セクターが社会の中核を占め、ボ団体は周縁にとどまる「周縁型」の社会、(2)ボ団体が、2大セクターの機能を補完する「補完型」、(3)ボ団体が、独立したセクターとなる「第3セクター型」、(4)既存社会セクターの(一時的)機能麻痺により、言わば、う社会全域がボランティア化する「溶融型」、(5)ボ団体が相互に、また2大セクターに属する組織・集団と緩やかに連結した「連結型」、である。第2に、上記の枠組みに依拠して、以下のことを明らかにした。すなわち、戦後50年を経て、被災直前には、「周縁型」から「補完型」へと移行していたと考えられる日本社会(被災地)は、震災直後から、一時的に「溶融型」を体験した。現在、ボランティアに関わる種々の論点は、結局のところ、今後の日本のボランティアを、われわれが提起する「第3セクター型(民中心)」「補完型(産官中心)」「連結型(相互連動)」のいずれとして構想するか、に帰着する。
新規層状超伝導体の合成と特性

先に、当研究者らは、層状結晶β-ZrNClの層間にリチウムをインターカレートし、窒化物層に電子をドープすると、超伝導体となることを見出し、報告した。この発見は、窒化物層は銅酸化物系超伝導体におけるCuO_2層と同様に、超伝導の優れたマトリックスとなる事を示唆している。本研究では、β-ZrNClと同形の一連の層状窒化物について、高温超伝導の可能性について検討すると共に、窒化物を中心に、新規層状超伝導体の合成を試みた。β-ZrNClと同形のβ-HfNClへのリチウムインターカレーションを行い、26.5Kに臨界温度を有する新規高温超伝導体となることを見出した。6面体加圧高圧合成装置を用い、標記のすべての組み合わせについて、β-型層状結晶の合成に成功した。高圧合成した試料を含めて、すべてのβ-型層状結晶へのリチウムのインターカレーションを行い、超伝導体となることを明らかにした。超伝導の臨界温度は窒化物層の種類によりほぼ決定され、ハロゲンイオンの置換による効果は少ない。FeOCl型構造のα-型層状窒化物TiNClの層間にピリジン分子がインターカレーションすることを見出し、約6Kで超伝導体となることを明らかにした。有機塩基のインターカレーションにより超伝導が発現した最初の物質として注目できる。4。窒化物超伝導薄膜の合成と特性評価レーザーアブレーション法により、Si(111)およびSi(100)基板上にZrN(100)およびZrN(111)薄膜を合成した。ZrN/Si_3N_4人工超格子の作成に成功しており、電子ドープの可能性について検討を行っている。4。1.目的当研究者らは、最近、新たな層状窒化物系超伝導体の開発に成功し、インターカレーションによって、約13Kの比較的高温で超伝導体となることを見い出した。この化合物はCdCl_2型構造を有するβ-ZrNClで、塩素原子よりなる最密パッキング層の間に、ZrNの2重層がサンドイッチされている。本研究では、これら一連の層状結晶およびその層間化合物を取り上げ、高い超伝導臨界温度と構造および組成の関係を詳細に調べ、超伝導と構造の次元性の関連性を解明する。超伝導は層間にインターカレーションしたアルカリ金属からZrN層への電子移動によってもたらされると考えられるが、その電子ドープ量はアルカリ金属の反応量によって制御できる。ドープ量および結晶構造と超伝導特性の関連性を実験化学的に明らかにしたい。2.研究成果の概要β-HfNClを合成し、リチウムのインターカレーションを行った.約26Kの臨界温度を有する層状窒化物超伝導体となることを見いだした.これは、合金系超伝導体で報告のあるどの臨界温度よりも高い値であり、新規高温超伝導体に位置づけられる物質である.(ii)α型層状窒化物TiNClへのピリジンのインターカレーションを行った.TiNCl1モル当たり1/3モルのピリジンがインターカレーションし、約4Kで超伝導体となることを見いだした.α型層状格子も超伝導のマトリックスとなり得ること、有機塩基による電子ドープによっても超伝導が実現できることを明らかにした.(iii)MNCl(M=Zr,Hf)超伝導薄膜の合成と光物性測定KrFエキシマレーザーによる超高真空アブレーション装置を組み立て、薄膜作成の準備を行った.引き続き、窒化物薄膜の作成を行う予定である.層状結晶β-HfNClはZrN2重層を有し、窒化物層は塩素原子の細密パッキング層の間にサンドイッチされている。

当研究者は先に、結晶層間にリチウムをインターカレートし、窒化物層に電子をドープすると、約26Kの超伝導体となることを報告した。この発見は窒化物層は、銅酸化物系超伝導体におけるCuO_2層と同様に、高温超伝導の優れたマトリックスとなる事を示唆しており、注目される。本年度は、新規層状窒化物の合成とインターカレーションによる超伝導の可能性について検討した。6面体加圧高圧合成装置を用い、β-HfNClだけでなく、標記のすべての組み合わせについて、β-型層状結晶の合成に成功した。β-型層状結晶は当初、α-型層状結晶の高温型多形と考えられたが、構造化学的な考察から、β-型構造はα-型相の高密度相であることを明らかにした。高圧合成した試料を含めて、すべてのβ-型層状結晶へのリチウムのインターカレーションを行い、超伝導体となることを明らかにした。超伝導の臨界温度は窒化物層の種類によりほぼ決定され、ハロゲンイオンの置換による効果は少ない。FeOCL型構造のα-型層状窒化物TiNClの層間にピリジン分子がインターカレーションすることを見出した。ピリジンは拡散機構で層間に取り込まれ、約6Kで超伝導体となることを明らかにした。有機塩基のインターカレーションにより超伝導が発現した最初の物質として注目できる。4。窒化物超伝導薄膜の合成と特性評価レーザーアブレーション法により、Si(111)およびSi(100)基板上にZrN(100)およびZrN(111)薄膜を合成した。ZrN/Si_3N_4人工超格子の作成に成功しており、電子ドープの可能性について検討を行っている。
蛋白質リン酸化酵素型光受容体の作用機作に関する共同研究

1シロイヌナズナの強光による葉緑体光定位運動が欠損した突然変異体を我々が独自に開発した方法により選抜し、その原因遺伝子を調べた結果、シロイヌナズナの光屈性の青色光受容体であるNPH1のホモログのNPL1であることが判明した。2NPH1、NPL1の突然変異体を掛け合わせ、両方が欠損した二重突然変異を作製し、生理現象を調べた結果、青色光によって誘導される葉緑体光定位運動、光屈性ともに欠損していること、すなわち両現象はこの二つの遺伝子によって制御されていることが分かった。3NPH1は調べた全光強度において葉緑体の集合運動を制御しており、NPL1は弱光においては集合運動を、強光においては葉緑体の逃避反応の光受容体であることが分かった。4フィトクロムとNPH1のキメラ遺伝子であるホウライシダのPHY3は、2カ所のLOV配列にフラビン(FMN)を各々1分子ずつ結合しており、赤色光と青色光を吸収する特殊な光受容体である可能性をしめした。5PHY3は高等なシダ植物に広く存在する光受容体であることが系統的な解析から判明した。6PHY3は赤色光によって誘導される葉緑体運動と光屈性の光受容体であることが、複数の突然変異体の解析と、今回新たに開発したシダにおけるジーンサイレンシング法によって明らかになった。7ホウライシダのNPL1遺伝子を単離し、ジーンサイレンシング法によりその機能を解析した結果、NPL1はシロイヌナズナ同様シダの青色光による強光反応の光受容体として働いていることが分かった。1、シダ植物Adiantumの胞子体から得たmRNAのcDNAから、NPH1遺伝子の保存領域に対する合成プローブを作成してPCRを行い、シダNPH1遺伝子のcDNA断片をクローニングした。現在このフラグメントを使用し、遺伝子のクローニングをしている。2、上でクローニングしたシダNPH1蛋白質が実際に光受容体として機能し得るかどうかを調べるため、LOVドメインのみを大腸菌内で大量発現させ、できたペプチドに結合する推定色素団を探索中である。3、PHY3の作用機作を調べるために充分な材料を得る目的で、PHY3遺伝子を昆虫細胞内で大量に発現させるバキュロビールス系の改良を行っており、ほぼめどがついた。この蛋白質を抗原として、抗体作成も可能になる。また、来年度はPHY3におけるリン酸化が光によって誘導できるか否か、さらに赤色光、青色光のどちらが有効であるかの実験が可能になった。4、シダのPHY3遺伝子をシロイヌナズナに導入し、赤色光による光屈性が起こるか否かを調べた。PHY3のC末端側の構造はシロイヌナズナのNPH1のC末端側に極めて類似しているので、高等植物中でも作用を持つ可能性があったが、PHY3遺伝子導入植物20系統を調べた現在までのところでは、赤色光によって光屈性が誘導された植物はない。1シダ植物におけるフィトクロム3(PHY3)遺伝子の系統学的分布をPCR法により調べた。その結果、系統的に古い種類には存在せず、比較的新しい遺伝子であることが判明した。2PHY3遺伝子を昆虫細胞内で大量に発現させ、フィトクロム色素前駆物質のフィコシアノビリンを結合させたphy3蛋白質の光によるリン酸化反応を調べた。現在までのところはっきりした差は見られていない。3シダPHY3およびNPH1のLOVドメインを大腸菌内で大量に発現させ解析した結果、flavin monocleotide(FMN)が結合していることが判明し、青色光を吸収しうる光受容体であることが強く示唆された。4two hybrid法によりPHY3に結合する機能蛋白質と思われる遺伝子が複数単離された。5NPH1の欠損したシロイヌナズナの突然変異体にPHY3を導入して発現させた組み換え体に赤色光または青色光を照射し、光屈性に対する効果を調べたが、どちらの光でも屈性は誘導できなかった。

1シロイヌナズナの強光による葉緑体光定位運動が欠損した突然変異体を我々が独自に開発した方法により選抜し、その原因遺伝子を調べた結果、シロイヌナズナの光屈性の青色光受容体であるNPH1のホモログのNPL1であることが判明した。2NPH1、NPL1の突然変異体を掛け合わせ、両方が欠損した二重突然変異を作製し、生理現象を調べた結果、青色光によって誘導される葉緑体光定位運動、光屈性ともに欠損していること、すなわち両現象はこの二つの遺伝子によって制御されていることが分かった。3NPH1は調べた全光強度において葉緑体の集合運動を制御しており、NPL1は弱光においては集合運動を、強光においては葉緑体の逃避反応の光受容体であることが分かった。4フィトクロムとNPH1のキメラ遺伝子であるホウライシダのPHY3は、赤色光によって誘導される葉緑体運動と光屈性の光受容体であることが、複数の突然変異体の解析と、今回新たに開発したシダにおけるジーンサイレンシング法によって明らかになった。5ホウライシダのNPL1遺伝子を単離し、ジーンサイレンシング法によりその機能を解析した結果、NPL1はシロイヌナズナ同様シダの青色光による強光反応の光受容体として働いていることが分かった。6昆虫細胞中でバキュロビールスの系によって発現させたphy3タンパク質の光によるリン酸化を試みたが、現在のところ成功していない。
小児口腔のバイオフィルム解析によるオーダーメイド治療の確立

齲蝕は歯面に付着するバイオフィルム(デンタルプラーク(pl))によって生ずる。したがって,原因菌(MS:S.mutans(S.m)とS.sobrinus(S.s))を含めたplの解析は重要である。今回我々は,酸による環境の変化によるplおよびMSの変化について着目し,検討を行った。その結果,plのCariostat値(CAT21R)とpl中のS.m菌の比率は相関する傾向が見られた。また,MSのうち耐産生能が高い株はF-ATPaseの発現量が2倍程度高いことが示された。従って,酸環境とplの状態,及び菌の性状には深い関連があることが示唆された。小児の齲蝕予防を実践する上で、齲蝕原性菌の齲蝕誘発能を調べることは非常に重要である。さらに、同種の齲蝕原性菌であっても口腔環境によって齲蝕発現性が異なることが指摘されている。今年度は、研究実施計画に基づき、臨床分離株の分離と菌の耐酸性について検討を行い、菌の齲蝕リスクを判定するための評価系の構築を行った。(1)プラークからのミュータンスレンサ球菌の分離広島大学病院小児歯科診療室を受診した小児のうち、保護者と小児にプラークの採取について十分な説明を行い、同意の得られた417歳の80名を対象とし、50株を超える臨床分離株の分離を行った。(2)分離菌株の耐酸性能についての検討分離菌株をBHI液体培地にて培養後、pH7.0及びpH4.0(低pH条件)のリン酸緩衝液中に懸濁し、37°Cで1時間インキュベーションを行った。その後、懸濁液をBHI寒天培地に播種して37°Cにて培養を行った。2日後、生菌数をカウントすることにより生存率を算出した。その結果、高齲蝕者株、低-無齲蝕者株を得ることが出来た。また、同時に酸に耐性の高耐酸性株、低耐酸性株を得ることが出来た。(3)菌の齲蝕リスク判定評価系の構築菌の増殖に関与する各遺伝子(Aml、F-ATPase)、齲蝕原性に関与する遺伝子(GTFB)に特異的なリアルタイムPCR用のプライマーの作成を行い、遺伝子解析による評価系の構築を行った。このような成果をふまえ、最終年度となる来年度は臨床分離株における各遺伝子の発現について、さらなる検討を行っていきたい。齲蝕原因菌(MS)およびデンタルプラーク(p1)の性状は,環境により影響を受けることが明らかとなってきており,近年,それらに関連する遺伝子領域についても明らかになってきた。今回,我々は,環境の変化(特に酸)について着目し,小児におけるp1とMSの変化について検討を行った。まず,プラークに含まれるS.mutans(以下S.m), S. sobrinus(以下S.s)の量について, Yoshidaらの報告を参照し,リアルタイムPCR法を用いて定量的な検討を行った。その結果,対象者の100%からS. mが, 60%からS. sが検出された。また,齲蝕経験歯率とplに含まれる菌数との関係を比較した結果,相関係数はS.mで0.25, S. sで0.54であった。一方, Cariostat値とplに含まれる菌数との関係は,相関係数がS. mで0.003, S. sで0.12となり共に低かった。次に,臨床より分離したMSを用いて,耐酸性能とそれに関わる遺伝子の発現について検討を行った。まず,臨床分離株について, pH5の緩衝液中での生存率を検討したところ, plのCariostat値と関連があることが明らかになった。次に, Kunhertらの報告を参照し,耐酸性能が高い株と,低い株について, pH5(酸性)とpH7(中性)に調整したBHI液体培地中でのF-ATPaseのmRNAの発現について,リアルタイムRT-PCR法を用い,各5株ずつ検討を行った。その結果,酸性環境下におけるF-ATPase遺伝子のm-RNA発現量は,中性環境下に比べ高耐酸性株群では30%上昇したが,低耐酸性群では33%減少した。以上より,齲蝕経験歯率とMSの菌数は相関する傾向が見られた。しかし, plの酸産生能と細菌量は,相関しない傾向が見られた。また, MSのうち耐産生能が高い株はF-ATPaseの発現量が2倍程度高いことが示された。従って,酸産生能は菌量ではなく, MSの性状と関係が深い可能性が示された。
精密らせん高分子合成法に立脚した高効率発光・電荷輸送・エネルギー捕集材料の開発

側鎖にピレン部位を導入したポリキノキサリンを合成し、その蛍光発光特性と円二色性が溶媒依存的に変化することを見出した。また、側鎖としてクロロオクチル基と(S)-2-メチルブチル基を有するポリキノキサリンを合成することで、可視光領域に選択反射を有するポリキノキサリン薄膜の作成にも成功した。さらに、この選択反射光の掌性を異なる溶媒蒸気によるアニーリングによって可逆に制御することにも成功した。近年、有機電子材料を応用した電子・光デバイスの研究開発が活発に行われている。これらの有機半導体デバイスは、軽量かつフレキシブルに成型することができるなど、多くの利点を有している。一方で、タンパク質やDNA等の生体高分子は、精緻な高次構造制御により情報伝達・分子認識・物質輸送などの高度な機能発現を達成している。このような概念に基づいた有機電子材料の高機能化についても検討が進められており、繰り返し単位のシークエンス制御や一方向巻きらせんへの構造制御によって、新たな電子・光機能の発現が試みられている。本研究では、らせん配列の高度制御に基づいた有機電子材料の高機能化に関する方法論の確立を目的として研究を行なった。具体的には、まず初めに側鎖にイミダゾリウム塩を有するポリキノキサリンの合成を行い、続いて得られた新規ポリキノキサリンの電子・光機能評価について検討した。クロロアルコキシ基とキラルアルコキシ基をそれぞれ有するジイソニトリルベンゼン誘導体を合成し、有機ニッケル錯体を開始剤として共重合を行うことで、側鎖にクロロアルキル基を有し、主鎖にらせん不斉を有するポリキノキサリンを合成した。重合反応はリビング的に進行し、開始剤とモノマーの比によって分子量を精密に制御することができた。さらに高分子反応によってイミダゾリウム塩構造の側鎖への導入に成功した。得られたポリマーのクロロホルム溶液は円偏光二色性を示し、そのスペクトルから主鎖は左巻き構造(らせん方向過剰率:84%)をとっていることが分かった。このポリマーのフィルムを作成したところ青色の構造色を示し、紫外可視反射スペクトル測定の結果、400nm付近に明確な選択反射を示した。これは、導入したイミダゾリウム塩によってポリマー鎖間の相互作用が強まることで自己組織化し、キラルネマチック液晶性を発現したためであると考えられる。近年、電子・光デバイスを指向した有機機能材料に関する研究開発が活発に行われている。これらは従来の無機系材料と比較して、軽量かつフレキシブルに成型することができ、我々の未来の生活を支える重要な技術である。生体高分子では一次構造制御に加え、さらに二次構造であるらせんの巻き方向・ピッチを制御することでさらに高次構造制御を行っている。本研究では、らせん構造の高度制御に基づいた高機能材料の開発を目的とし、一方向巻きらせんポリマーとしてポリ(キノキサリン-2,3-ジイル)に着目し研究を行なった。まず、キラル側鎖を有するポリキノキサリンに対して、機能性部位としてイミダゾリウム塩部位を側鎖に導入したところ、溶液状態での紫外可視吸収スペクトルは可視領域に吸収を持たないが、フィルム状態では青紫色の選択反射を示すポリキノキサリンの合成に成功した。これは、側鎖として導入したイミダゾリウム塩部位によって自己組織化が促進され、コレステリック状の構造が誘起された為であると考えられる。さらに検討を進めた結果、イミダゾリウム塩部位に代えてクロロオクチルオキシ基を側鎖として導入することで、安定な構造色を発現するポリキノキサリンの合成に成功した。このポリキノキサリンについて、キラル側鎖を部分的にアキラルな側鎖に代えることで選択反射波長を青色から、緑色、赤色へと制御可能であることも見出した。この構造色は常温・空気中で長期間安定であり、表示材料や光学材料として有望であると考えられる。
口腔癌の顎骨浸潤に対するビスフォスフォネートの応用に関する研究-放射線治療との併用効果ならびに骨への障害について-

口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴から口腔領域悪性腫瘍の骨への浸潤破壊はしばしば認められ,治療法や手術範囲の決定,また予後を左右する大きな負の要因である.申請者は癌の骨への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,強力な骨吸収阻害剤である新世代ビスフォスフォネート(BP)による破骨細胞性骨吸収の抑制が癌の顎骨浸潤や顎骨での増殖を抑制することを示し,臨床応用への基礎的検討を進めている.本研究ではBP投与と放射線療法(RT)との併用療法の臨床応用への可能性を探るべく,BP投与に対するRTの骨への影響を検討した.対照群,RT群,BP投与群,RT+BP投与併用群の4群に分けて検討した.RTは隔日,一回2Gy(総量10Gy)の分割照射を行い,BPは1日1回6μgを週4回皮下注射し,14日後に大腿骨をX線学的,組織学的に検討した.RT群は,対照群,BP投与群に比べ体重減少を認めたが,併用群との間に差は認めず,この体重減少は放射線宿酔による食餌量の低下や骨髄障害に起因したものと考えられた.X線学的にはBP投与に対するRTの影響は認めなかった.組織学的には,RT群で骨髄腔内の骨髄細胞は消失し出血と空胞変性を認めたが骨梁は保たれ骨芽細胞も維持されていた.BP投与群では,骨端部において多数の骨梁新生と破骨細胞の消失を認めた.一方,RT+BP投与併用群にはこの両者の所見が認められたが,骨端部の骨梁新生は,BP投与群より僅かに抑制された.すなわちRTは,BPによる骨梁新生をやや抑制するものの明確な放射線性骨壊死を惹起するなどの影響はないことが示唆された.以上より,癌による骨破壊を抑制するBPの効果は,従来用いられている癌細胞を直接標的とした放射線照射による影響をうけず,併用療法による癌の顎骨への浸潤破壊に対する抑制効果が期待される.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴から口腔領域悪性腫瘍の骨への浸潤破壊はしばしば認められ,治療法や手術範囲の決定,また予後を左右する大きな負の要因である.申請者は癌の骨への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,強力な骨吸収阻害剤である新世代ビスフォスフォネート(BP)による破骨細胞性骨吸収の抑制が癌の顎骨浸潤や顎骨での増殖を抑制することを示し,臨床応用への基礎的検討を進めている.本研究ではBP投与と放射線療法(RT)との併用療法の臨床応用への可能性を探るべく,BP投与に対するRTの骨への影響を検討した.対照群,RT群,BP投与群,RT+BP投与併用群の4群に分けて検討した.RTは隔日,一回2Gy(総量10Gy)の分割照射を行い,BPは1日1回6μgを週4回皮下注射し,14日後に大腿骨をX線学的,組織学的に検討した.RT群は,対照群,BP投与群に比べ体重減少を認めたが,併用群との間に差は認めず,この体重減少は放射線宿酔による食餌量の低下や骨髄障害に起因したものと考えられた.X線学的にはBP投与に対するRTの影響は認めなかった.組織学的には,RT群で骨髄腔内の骨髄細胞は消失し出血と空胞変性を認めたが骨梁は保たれ骨芽細胞も維持されていた.BP投与群では,骨端部において多数の骨梁新生と破骨細胞の消失を認めた.一方,RT+BP投与併用群にはこの両者の所見が認められたが,骨端部の骨梁新生は,BP投与群より僅かに抑制された.すなわちRTは,BPによる骨梁新生をやや抑制するものの明確な放射線性骨壊死を惹起するなどの影響はないことが示唆された.以上より,癌による骨破壊を抑制するBPの効果は,従来用いられている癌細胞を直接標的とした放射線照射による影響をうけず,併用療法による癌の顎骨への浸潤破壊に対する抑制効果が期待される.
脱分化脂肪細胞（DFAT）を用いた細胞シートによる排尿筋低活動治療の確立

本研究は、申請者が現在まで行ってきた正常下部尿路機能および下部尿路機能障害に関する基礎研究手法を用いて、脱分化脂肪細胞(dedifferentiated fat cell:DFAT)を用いた細胞シートの排尿筋低活動に対する有効性を包括的に明らかにし、本治療法を臨床応用レベルまで展開するための研究基盤を確立することが目的である。平成30年度は、DFAT細胞シートの作製に引き続き取り組んだ。2% isoflurane麻酔下に雌Sprague-Dawley(SD)ラットより脂肪組織を採取し、浮遊層を採取することにより成熟脂肪細胞を単離し、この成熟脂肪細胞を天井培養法で培養し培養1週間後にフラスコを反転し付着培養することでDFATを急速に増殖し、次にUpCellおよびCellShifterを使用してDFAT細胞シートを作製する方法でDFAT細胞シート作製を試みた。排尿筋低活動ラットモデルでのDFAT細胞シートの効果をみるために移植後の各タイミング(移植1、2、4週間後)での膀胱組織検査、膀胱内圧測定を行うため長期にわたり定期的に安定した細胞シートの作製が必要でありその準備を行った。また、本研究では排尿筋低活動ラットモデルとして膀胱凍結障害ラットモデルを用いるため、凍結障害の範囲や程度を様々にかえてそれぞれのモデルでの膀胱内圧測定を行い、安定した膀胱凍結障害モデルの作製を試みた。次年度はこれまでに確立した細胞シートを用いて、排尿筋低活動ラットモデルの膀胱機能障害に対するDFAT細胞シートの効果を検討する実験を進める予定である。平成30年度はDFAT細胞シート作製の確立および、排尿筋低活動ラットモデルの作製および低活動膀胱ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行う予定であったが、DFAT細胞シート作製と排尿筋低活動ラットモデル作製の確立に時間を要したため、排尿筋低活動ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行うまで実験を進めることができなかった。2019年度は平成29年度および平成30年度の研究結果を踏まえて、1実験モデルの作製とモデルへのDFAT細胞シート移植、2DFAT細胞シート膀胱移植による膀胱排尿筋再生の組織学的解析と遺伝子発現解析を行う。具体的には、以下の実験を行う。1実験モデルの作製とモデルへのDFAT細胞シート移植:12週齢雌ヌードラットを使用する。2% isoflurane麻酔下にヌードラットの膀胱に凍結傷害を与えてモデルを作製する。モデル作製3日後、凍結傷害部位にDFAT細胞シートを貼付し移植する。2DFAT細胞シート膀胱移植による膀胱排尿筋再生の組織学的解析と遺伝子発現解析:GFP抗体と平滑筋特異的抗体を用いた組織学的解析と遺伝子解析を行う。計画している具体的な研究項目は、1筋原性排尿筋低活動モデルの膀胱機能障害に対するDFAT細胞シートの有効性の解明、2神経原性排尿筋低活動モデルの膀胱機能障害に対するDFAT細胞シートの有効性の解明、の2つである。平成29年度は、DFAT細胞シートの作製に取り組んだ。2% isoflurane麻酔下に雌Sprague-Dawley(SD)ラットより脂肪組織を採取し、浮遊層を採取することにより成熟脂肪細胞を単離し、この成熟脂肪細胞を天井培養法で培養し、培養1週間後にフラスコを反転し付着培養することでDFATを急速に増殖し、次にUpCellおよびCellShifterを使用してDFAT細胞シートを作製する方法で、DFAT細胞シート作製を試みた。しかし、脂肪細胞のコラゲナーゼ処理や、天井培養法の条件設定が難しく、移植に十分なDFATを得ることが当初困難であったため、上記の条件設定を変更しながら、適切なDFAT細胞シート作製を試みた。最終的には安定して細胞シートを作製することが可能な状況となってきたため、来年度以降、予定していた研究を遂行できる状況にあると考えている。平成29年度は、DFAT細胞シート作製の確立および、排尿筋低活動ラットモデルの作製およびモデルへのDFAT細胞シート移植を行う予定であったが、DFAT細胞シート作製の確立に時間を要したため、排尿筋低活動ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行うまで実験を進めることができなかった。

また、本研究では排尿筋低活動ラットモデルとして膀胱凍結障害ラットモデルを用いるため、凍結障害の範囲や程度を様々にかえてそれぞれのモデルでの膀胱内圧測定を行い、安定した膀胱凍結障害モデルの作製を試みた。次年度はこれまでに確立した細胞シートを用いて、排尿筋低活動ラットモデルの膀胱機能障害に対するDFAT細胞シートの効果を検討する実験を進める予定である。平成30年度はDFAT細胞シート作製の確立および、排尿筋低活動ラットモデルの作製および低活動膀胱ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行う予定であったが、DFAT細胞シート作製と排尿筋低活動ラットモデル作製の確立に時間を要したため、排尿筋低活動ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行うまで実験を進めることができなかった。平成30年度以降は、1実験モデルの作製とモデルへのDFAT細胞シート移植、2DFAT細胞シート膀胱移植による膀胱排尿筋再生の組織学的解析と遺伝子発現解析を行う。具体的には、以下の実験を行う。1実験モデルの作製とモデルへのDFAT細胞シート移植:12週齢雌ヌードラットを使用する。2% isoflurane麻酔下にヌードラットの膀胱に凍結傷害を与えてモデルを作製する。モデル作製3日後、凍結傷害部位にDFAT細胞シートを貼付し移植する。2DFAT細胞シート膀胱移植による膀胱排尿筋再生の組織学的解析と遺伝子発現解析:GFP抗体と平滑筋特異的抗体を用いた組織学的解析と遺伝子解析を行う。2019年度は平成29年度および平成30年度の研究結果を踏まえて、1実験モデルの作製とモデルへのDFAT細胞シート移植、2DFAT細胞シート膀胱移植による膀胱排尿筋再生の組織学的解析と遺伝子発現解析を行う。(理由)消耗品として購入を予定していた試薬、ガラス・プラスチック容器などは、既に購入していた物品で実験を遂行することが可能であったため、購入を差し控えた。購入を予定していたトランスデューサーについて、既存の機種でも十分に対応可能であることが判明したため、購入を差し控えた。これらの理由により次年度使用額が生じた。(使用計画)平成30年度以降の経費の主要な用途は消耗品であり、実験動物、試薬、ガラス・プラスチック容器を購入する計画である。平成30年度はDFAT細胞シート作製の確立および、排尿筋低活動ラットモデルの作製および低活動膀胱ラットモデルへのDFAT細胞シート移植を行う予定であったが、DFAT細胞シート作製と排尿筋低活動ラットモデル作製の確立に時間を要した。