hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セクレトーム解析に基づいた前がん病態からがん進展過程におけるがん間質の役割の解明

これまでに、多発性骨髄腫(MM)患者から採取した骨髄間質細胞を用いて、がん微小環境における「がん間質」の機能解明を目指して研究を行ってきた。本研究では、がんの発育・進展に寄与するがん間質細胞の本質を明らかにすべく、MM患者由来間質細胞の網羅的分泌因子の解析を行い、機能的がん間質に特異的な因子を同定し、さらにこの特異的因子の発現を指標に健常者由来間質細胞から「がん間質細胞」の誘導モデル系を構築してがん間質化メカニズムの解明を目指した。初年度である本年度は、多発性骨髄腫患者由来BMSCsと前がん病態であるMGUS(意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症)患者由来BMSCs、および健常者由来BMSCsの特徴を比較するために、形態観察、細胞表面マーカー解析を比較し、さらにがん間質細胞の機能を特徴付ける分泌性因子を同定するために、マイクロアレイを用いたそれぞれのBMSCsにおける遺伝子発現解析とPCRアレイを用いたmiRNA発現解析、培養上清を回収して質量分析LC-MS/MSを用いてプロテオーム解析を行った。その結果、形態や細胞表面マーカーについては健常者由来BMSCsと患者由来BMSCsでの相違は見受けられなかったが、遺伝子発現プロファイルとmiRNA発現プロファイルには相違が見られた。特に、MM細胞株と共培養を行なってその増殖を促進することが可能なタイプのMM患者由来およびMGUS患者由来BMSCsに特徴的な発現を示すエクソソームmiRNAがmiR-10aであることを見い出した。このmiR-10aはMM患者由来およびMGUS患者由来BMSCsの細胞内では低発現であり、エクソソーム分泌経路を利用して細胞外に排出している可能性が考えられた。この排出されたmiR-10aが豊富に含有されるエクソソームをMM細胞株(RPMI8226, U266)に点火するとその細胞増殖が促進された。患者由来骨髄血の採取および保存が血液内科学分野の協力のもとスムーズに行えていた。また、骨髄血からのBMSCsの回収技術や間質細胞からのエクソソーム抽出技術は本研究がスタートする前から長年にわたって行なって確立されており、miRNA profilingと網羅解析データに関しても非常に安定化していたことが大きな要因である。患者由来BMSCsが培養下でもCAFとしての機能を有していることから、がん間質へと誘導したBMSCsは共培養から単独培養に移行してもその機能は維持されると予想される。従って、誘導前の正常BMSCsとがん間質化誘導BMSCsの遺伝子発現解析および細胞内、エクソソーム内のmiRNAの変化を解析する。miR-10aを含むMM細胞株の増殖を誘導する機能を有する分泌因子を指標に、健常者由来BMSCから機能的ながん間質細胞を誘導するモデル系を確立する。さらに、がん間質の発生機序を分子レベルで明らかにし、がん間質化を阻害する、またはがん間質の正常化を試み、がん間質を標的とした新規治療法の開発を目指す。BMSCsの加齢性変化を踏まえ、MM細胞株と共培養して高齢健常者由来BMSCsのがん間質化を試みる。共培養系(直接接触型、カルチャーインサートを用いた非接触型)および共培養日数(1-2週間、1ヶ月)を検討する。がん間質特異的な分泌因子の発現・分泌を指標にがん間質化をモニタリングする。マトリゲルを用いて腫瘍細胞と混合してヌードマウス皮下に移植し、生体内での挙動を確認する。

患者由来骨髄血の採取および保存が血液内科学分野の協力のもとスムーズに行えていた。また、骨髄血からのBMSCsの回収技術や間質細胞からのエクソソーム抽出技術は本研究がスタートする前から長年にわたって行なって確立されており、miRNA profilingと網羅解析データに関しても非常に安定化していたことが大きな要因である。患者由来BMSCsが培養下でもCAFとしての機能を有していることから、がん間質へと誘導したBMSCsは共培養から単独培養に移行してもその機能は維持されると予想される。従って、誘導前の正常BMSCsとがん間質化誘導BMSCsの遺伝子発現解析および細胞内、エクソソーム内のmiRNAの変化を解析する。miR-10aを含むMM細胞株の増殖を誘導する機能を有する分泌因子を指標に、健常者由来BMSCから機能的ながん間質細胞を誘導するモデル系を確立する。さらに、がん間質の発生機序を分子レベルで明らかにし、がん間質化を阻害する、またはがん間質の正常化を試み、がん間質を標的とした新規治療法の開発を目指す。BMSCsの加齢性変化を踏まえ、MM細胞株と共培養して高齢健常者由来BMSCsのがん間質化を試みる。共培養系(直接接触型、カルチャーインサートを用いた非接触型)および共培養日数(1-2週間、1ヶ月)を検討する。がん間質特異的な分泌因子の発現・分泌を指標にがん間質化をモニタリングする。マトリゲルを用いて腫瘍細胞と混合してヌードマウス皮下に移植し、生体内での挙動を確認する。研究成果について投稿し、投稿に関する費用に充当する予定であったが、年度内(H30年度)に採択されなかったため、差額が生じた。
インターロイキン1beta遺伝子上流の電離放射線応答モチーフ構造の検索

強力なラジオプロテクターであるインターロイキン(IL)-1betaの遺伝子近傍領域には、造血系細胞特異的な電離放射線に対する急性応答モチーフ構造の存在することを筆者らは示唆してきた。マウスIL-1beta遺伝子領域の標記構造同定を目的として、本研究計画では第一にアッセイ法確立、第二にモチーフ構造同定を試みた。当該目的のためのアッセイ法を確立するためには、まず放射線応答能の高い造血系ライン化細胞を決定し、これを用いてCATアッセイおよび核抽出物調製の条件検討を行う必要がある。まず6種類のライン化細胞の検討の結果、電離放射線照射がホルボルエステル等の刺激より優位なIL-1beta遺伝子発現誘導が見られたマウス骨髄性白血病細胞ラインであるL-8704細胞を選択した。また、この細胞における外来遺伝子導入効率はリポソーム法が適していた。この系を利用して、血液細胞特異的な放射線に対する急性応答モチーフを検索するために、まずCATレポーターアッセイのためにマウスIL-1beta遺伝子の転写開始点の上流200から8000塩基を連結した8種類のプラスミドを構築し、L-8704細胞にトランジェントおよび安定導入して分析を行った。トランジェント導入では非誘導発現の寄与が大きく、誘導領域を限定できなかったが、安定導入の結果約6000から4000塩基上流に弱い発現誘導領域の存在することが示唆された。そこでこの領域の制限断片混合物についてL-8704細胞の核抽出物でゲル電気泳動移動度シフト法を行ったところ、蛋白質結合領域が少なくとも20か所以上見出だされた。本研究により造血細胞に特異的な電離放射線に対する急性応答モチーフの検索法を確立し、その存在領域および多数のモチーフ構造による複雑な調節が示されたので、今後の課題である塩基配列レベルでのモチーフ決定のための足掛かりとすることができた。
一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間

一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間は、まだ全体像がつかめておらず、適切な定義すら分かっていなかった。一方、Morrey-Campanato空間の特別な場合であることが知られているHolder(Lipschitz)空間は、Hardy空間の相対空間であることが知られている。昨年度までの研究で、Hardy空間を一般化した函数空間でかつその相対空間が一般化Morrey-Campanato空間となるものを定義し、その空間のひとつの性質を明らかにした。また他の空間との比較のため、Orlicz-Morrey空間を定義してその性質の一端を調べるとともに、Orlicz空間、Lorentz空間、アマルガム空間などについて、今まで知られていなかった性質を明らかにした。今年度は、さらに以下の成果を得た。1.この一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間を、通常のユークリッド空間上だけでなく、Homogeneous型空間上でも定義し、その定義がユークリッド空間からHomogeneous型空間への自然な拡張であることを確認した。すなわち、Homogeneous型空間上のHardy空間が、この研究により、一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間に拡張できることがわかった。2.Orlicz-Morrey空間の基本的性質をさらに調べるとともに、この函数空間上での極大作用素の有界性に関する必要十分条件を得、さらに特異積分作用素の有界性についても証明した。3.Homogeneous型空間上の一般化Morrey-Campanato空間の定義と、分数べき極大作用素、分数べき微分作用素、分数べき積分作用素の有界性との関係を明らかにした。これは今後、Homogeneous型空間上で定義された一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間において、作用素の有界性を考察する際に重要な手がかりになると期待される。一般化Morrey-Campanato空間の前相対空間は、まだ全体像がつかめておらず、適切な定義すら分かっていない。そこで、新たな空間を定義し、その空間と、これまで知られている空間の性質を調べて、比較することによって、研究を進めた。1.Hardy空間の相対空間は、Holder(Lipschitz)空間であることが良く知られている。Holder空間は、Morrey-Campanato空間の特別な場合である。そこで、Hardy空間を一般化した函数空間でかつその相対空間が一般化Morrey-Campanato空間となるものを定義し、その空間のひとつの性質を明らかにした。Hardy空間は元はアトム分解できることが知られており、しかもコンパクトサポートを持つ元は、コンパクトな範囲にサポートが納まるアトムだけで分解できることが知られている。この研究では、ここで定義した函数空間でもこうしたことが可能であることを、構成的に証明した。2.一般化Morrey-Campanato空間をより精密に調べるため、Orlicz-Morrey空間を定義し、極大作用素や、分数べき積分作用素を一般化した作用素の有界性について、調査した。3.Morrey空間の一般化や、それと関係の深いOrlicz空間、Lorentz空間、アマルガム空間などについて、今まで知られていなかった次の性質を明らかにした。(1)函数の合成積による分解に関する性質。(2)特異積分作用素の有界性。
注目領域一致制御と面対称復元手法による立体視システムの開発

本研究では、はじめに、2つのカメラ間のキャリブレーション問題に取り組んだ。ステレオ視の場合であれば、2つのカメラ間の位置関係は平行関係であり、キャリブレーション問題は、5組の対応点の画像座標の関係から導かれる非線形連立方程式を解くことによって解決できる。しかし、本研究では、2つのカメラ間は面対称関係であり、ステレオ視の場合より条件はゆるいはずである。そこで、まず、ステレオ視と面対称関係との関係を整理し、ステレオ視も大きくいえば面対称関係の特異な場合であることから、対応点組は最低3組でよいことを実験的に示した。実験では、コンピュータシミュレーションによって、撮影位置の異なった画像を生成し、対応点組3点から未知パラメータを探索した。さらに、誤差に対する実験も行い、誤差を含む場合は4点組以上の対応点が望ましいことを示した。次に、注目点の抽出を行った。この注目点は左右画像間の対応づけにも利用できはずである。対応づけはエッジ付近でのみ対応がつくわけであるから、両画像に対しラプラシアンガウシアンフイルターによって、エッジを抽出する。このフイルターのぼかしのパラメータとエッジ処理におけるしきい値を変化させることによってエッジの絞り込みを行った。現在、その絞り込まれた点に視線を移動するプログラムを作成し、注視するメカニズムを達成している。
障害児(者)を分け隔てなく診療する医師を育成する教育・研修に関する実証的研究

心身の発達に障害のある人(障害児(者))を分け隔てなく診療する医師の育成に向けた短期間の教育・研修の効果を検討した。意図的な行動の生起を説明・予測する『計画的行動理論』(Ajzen, 1991)に基づく質問紙を作成し、障害児(者)専門医療機関での一日間の実習に参加するA大学医学科の5年生全員に記入を依頼した。得られた回答を分析した結果、一日間という比較的短期間の実習でも障害児(者)を分け隔てなく診療する可能性を高める効果があること、この効果は実習前の障害児(者)医療に対する態度等に関わらず期待できることが示された。「障害のある人は必要な医療の提供を拒否される傾向が障害のない人の3倍近い」とした世界健康調査を受け、WHO(2011)は今後の方向性として、保健医療分野の専門家教育に障害関連の情報を含める必要があると発表した。しかし現状では、心身の発達に障害のある児・者(障害児(者))に関する医療教育を全員に行っている機関は限られている。また、これが実際の診療行動の生起に寄与するかは検証されていない。我々は意図的行動の生起可能性の説明・予測に用いられている『計画的行動理論』(Ajzen, 1991)に基づいて、障害児(者)医療に関する1日間の臨床実習により、医学生が将来に障害児(者)を分け隔てなく診療する可能性が高まるのか検討することとした。まずは先行研究を参考に、計画的行動理論に基づいて、障害児(者)を分け隔てなく診療する行動に関する質問紙を作成した。この質問紙を使用して、医学科5年生を対象に、見学、講義、患児および保護者との面談等で構成した実習の前後に調査を実施した。7段階評定の回答を点数化し、計画的行動理論における4つの行動予測因子(行動に対する意図、態度、主観的規範、コントロール感)について実習前後の点数を比較したところ、1日間の実習でも障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の生起可能性を高められることを示す結果を得た。医学生全員が同様の実習を受けることは、インクルーシブな医療環境の構築に有効であることが示唆された。「障害のある人は必要な医療の提供を拒否される傾向が障害のない人の3倍近い」とした世界健康調査を受け、WHOは今後の方向性として、保険医療分野の専門家教育に障害関連の情報を含める必要があると発表した。我々は意図的行動の生起を説明・予測する『計画的行動理論』に基づいて、障害児(者)医療に関する1日間の臨床実習により、医学生が将来に障害児(者)を分け隔てなく診療する可能性が高まるのか検討することとした。医学科5年生を対象に、見学、講義。患者および家族との面談等で構成した臨床実習の前後に、同一の内容の質問紙(回答は7段階評定)に記入を求めた。また、実習後は自由記述による感想の記入も求めた。7段階評定の回答を点数化し、計画的行動理論における4つの行動予測因子(意図、態度、主観的規範、コントロール感)の前後の点数を比較した結果から、1日間の実習でも障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の生起可能性を高められることを確認した。感想文の分析からは、実習生が「生の意味への問い」「障害児(者)医療に関わる可能性と将来像への意識」「障害児(者)医療の重要性と現状への戸惑いや疑問」「障害児(者)との接し方の理解」「大学病院での実習との違いと障害児(者)医療現場での臨床実習の意義」等を感じたことが示唆された。多変量解析を用いて要因間の関係にアプローチしたが、サンプルサイズの影響が疑われる結果の不安定性が認められ、成果発表を1年間見送ることにした。心身の発達に障害のある人(障害児(者))が地域で生活していくためには、障害のある子どもの診療を専門的に行える医師や医療機関のみならず、より身近な地域で、また成人後にも各科の診療が受けられるよう、一般の医師の役割も重要である。しかし現状では時間的な制約等から医学教育に障害児(者)への医療に関する情報は必ずしも含まれておらず、診療にとまどいや抵抗感をもつ医師は少なくない。我々は意図的行動の生起を説明・予測する『計画的行動理論』を用いて、障害児(者)医療に関する比較的短時間の実習にも障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の生起可能性を高める効果があるか、効率的な教育はどのようか検討した。医学科5年生に、障害児(者)専門医療機関における見学、講義、患者および家族との面談等で構成した1日間の臨床実習の前後に、計画的行動理論に基づき作成した障害児者を分け隔てなく診療する行動に対する考えを問う質問紙(7段階評定)の記入を求めた。この回答を構造方程式モデリングの手法を用いて分析した。結果、障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の前提となる「意図」の強さを規定する3要因(態度、主観的規範、コントロール感)のうち、行動に対する個人的な「態度」や、社会的要請の強さの認識等を反映する「主観的規範」以上に、行動の実行可能感や難易感を反映する「コントロール感」が、意図の強さに大きく影響していた。

これは実際に経験させたり、それを通して自信を持たせる教育が、障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の生起可能性を高めるのに特に重要なことを示すものと考えた。また、実習前に比べ実習後にすべての因子平均が上昇しており、比較的短期間の実習にも、障害児(者)を分け隔てなく診療する行動を一定程度促進する効果があることを確認した。安定した多変量解析結果を得るのに想定以上のサンプルサイズが必要だったため、データ収集期間を延長した。心身の発達に障害のある人(障害児(者))が地域で生活していくためには、障害のある子どもの診療を専門的に行える医師や医療機関のみならず、より身近な地域で、また成人後にも各科の診療が受けられるよう、一般の医師の役割も重要である。しかし現状では、医学教育の課程で障害児(者)への医療に関する教育を受ける機会は保障されておらず、診療にとまどいや抵抗感をもつ医師は少なくない。我々は意図的行動の生起を説明・予測する『計画的行動理論』を用いて、障害児(者)医療に関する比較的短時間の実習にも障害児(者)を分け隔てなく診療する行動の生起可能性を高める効果があるか検討してきた。最終年度は、実習前の各学生の障害児(者)医療に対する態度や認識等が実習の効果に影響するか検討した。A大学の医学科5年生に、障害児(者)専門医療機関における見学、講義、患者および家族との面談等で構成した1日間の臨床実習の前後に、計画的行動理論に基づき作成した障害児者を分け隔てなく診療する行動に対する考えを問う質問紙(7段階評定)の記入を求めた。回答を点数化し、対応のあるt検定により、実習後には実習前に比べ障害児(者)を分け隔てなく診療する意図(intention)が高まったことを確認した。また、構造方程式モデリングにより、実習前に障害児(者)を分け隔てなく診療することに対する自信や実行可能感が低かった学生の方が、実習後に診療意図がより大きく上昇する傾向にあったこと、実習前における各学生の障害児(者)を分け隔てなく診療することに対する態度や社会的な要請に関する認識は、意図の上昇の程度にあまり影響していなかったことがわかった。これらのことは、実習には、障害児(者)医療に必ずしも積極的ではなかった学生に対しても、将来に障害児(者)を分け隔てなく診療する可能性を高める効果があったことを示している。心身の発達に障害のある人(障害児(者))を分け隔てなく診療する医師の育成に向けた短期間の教育・研修の効果を検討した。意図的な行動の生起を説明・予測する『計画的行動理論』(Ajzen, 1991)に基づく質問紙を作成し、障害児(者)専門医療機関での一日間の実習に参加するA大学医学科の5年生全員に記入を依頼した。得られた回答を分析した結果、一日間という比較的短期間の実習でも障害児(者)を分け隔てなく診療する可能性を高める効果があること、この効果は実習前の障害児(者)医療に対する態度等に関わらず期待できることが示された。まずは現在用いているプログラムに効果があることが確認できた。今後、効果の要因やよりよいプログラムの詳細にアプローチしていく基盤が確保できた。今年度に収集できる見込みの回答を加えることで、より安定した多変量解析の結果を得られる見込みである。この他、追跡調査の実施を予定している。本研究で観察された「意図」に対する「コントロール感の」影響の大きさが、一定程度の「態度」や「主観的規範」を前提とするのか否かを、これらの点数が比較的高い/低い回答者の比較等から検討したいと考えている。特別支援教育外部の研究者から、効果が一時的なものでないか確認するのが望ましいと指摘があり、学籍番号記入式にするなど、追跡可能な形式でデータを収集することを検討している。
自然免疫応答の賦活化を基盤とした膵癌新規薬物併用療法の開発

自然免疫逃避機構に関与する腫瘍のMIC(MHC classIrelated chain)A/B発現の増強効果に着目した。切除標本を用いた検討にて術前化学療法(Gemcitabine:GEM)を施行すると癌細胞のMICA発現が増強し、周囲に免疫担当細胞の浸潤が高率に認められた。また膵癌細胞株を用いた検討では低濃度GEMにValpronic acid(VPA)を付加すると、MICA/Bの発現が増強され、またγδT細胞による傷害活性の向上が認められた。さらに可溶性MICA/Bの増加を抑制することが示された。以上よりGEM+VPA療法は免疫逃避機構を解除する可能性が示唆される。難治性固形癌の一つである膵癌に対する集学的治療の一つとして免疫細胞療法が行われ、一定の成績は得られているものの未だ満足できる成績ではない。申請者らは免疫逃避機構に関与するMICA(MHC classIrelated chain A)発現の低下および可溶性MICAの出現に着目し、自然免疫機能を賦活化するとともに腫瘍細胞の免疫逃避機構を抑制する新たな細胞療法を含めた膵癌に対する集学的治療法の開発を目的として研究を計画した。また近年、Gemcitabine(GEM)には殺細胞効果以外に腫瘍上のMICAを増加させることが報告されている。初年度である当該年度は膵癌患者の切除標本を用いて術前化学療法(GEM+S-1)を行った(NAC)群とコントロール(Cont)群に分けて、腫瘍細胞のMICAの発現および腫瘍周囲のNKG2DおよびCD16陽性リンパ球(NK細胞、CD8+αβT細胞およびγδT細胞)の発現を検討した。腫瘍でのMICAの発現、腫瘍周囲のNKG2DおよびCD16陽性リンパ球浸潤はいずれもCont群に比べてNAC群では高率であった。最終年である当該年度は症例数を追加し、また膵癌細胞株での可溶性MICA/Bの影響を検討した。術前化学療法(GEM+S-1)(NAC)群と術前化学療法非施行群(Cont)群に分けて検討すると、NAC群ではCont群に比べて癌細胞膜上でのMICAの発現および腫瘍周囲のCD16陽性リンパ球の浸潤度が有意に高率で、NACにより免疫担当細胞の誘導が認められた。また膵癌細胞株では低濃度GEMにVPAを付加することにより、細胞上のMICA/Bの発現がさらに増強し、γδT細胞傷害活性の向上が認められた。また可溶性MICA/Bの減少も認められ、GEM+VPA併用療法は腫瘍免疫逃避機構を解除する一翼を担う可能性が示唆された。肝胆膵外科膵癌細胞株およびヒト膵癌切除標本を用いて病理組織学的・分子生物学的に検討を行っている。膵癌患者での末梢血単核球(特にγδT細胞)をフローサイトメーターを用いて解析する。また膵癌細胞株をGEM、VPAを負荷し、MICA/Bの発現増強効果を検討する。分子生物学的検討のために購入予定であった試薬の一部の購入を来年度に先送りしたため。フローサイトメーターを含めた分子生物学的検討を行う。次年度使用額はその際の試薬購入に使用する。
小規模漁業地域におけるリーダーシップ、および社会的団結力の生成メカニズムの研究

本研究の目的は、持続可能な小規模漁業のために必要とされるリーダーシップや社会団結力がどのような社会的、文化的、地理的要因から生成されるのか明らかにすることであり、まずはその分析に供する漁業者の漁獲行動などの情報収集が必要である。その情報収集には、漁業者の漁獲行動など一連の情報を聞き取り調査する質問票などの調査デザインを確定する必要がある。そこで2018年度は、パイロットサーベイ先であるソロモン諸島に入り、ソロモン諸島国立大学海洋学部長Kofi博士の協力を得て、漁業の全体像を理解するために、政府水産省、NGO/国際機関であるSIDT, Workd Fish, WWF, UNDO, JICAにおいてインタビュー調査を実施した。また、個別漁村へのアクセスにはKofi博士とSIDT所員の現地コーディネーターの協力を得て、西ガダルカナル地方のベラフエ地区を訪ね、6漁村集落の漁業者にインタビューなどフィールドワークを実施し、どのように漁業を営み、漁獲、他の漁業者との協力関係、漁船や漁具、資源管理、漁の規範づくりの方法、地元の慣習制度などについての情報を収集した。調査の結果、1)漁民は簡素は船と漁具しか持たず、2)伝統的慣習制度Wantokの役割が漁業における規範作りに大きな役割を果たしていることがわかり、また3)漁獲物は、家庭消費と他者への寄付に加え、販売も最近では行われてきていることが明らかになった。これらの知見得た地域を調査対象地と決定し、また現地同行した小規模漁業のソーシャルキャピタルに詳しいオーストラリアタスマニア大学Yamazaki博士の協力を得ながら、2019年度に予定する本調査のデザインを確定し、そのための質問票の構成までを決定した。本研究では、主にソロモン諸島の小規模漁業漁村を対象にして現地調査を進めていくが、現地大学研究者やコーディネーターなしには成し得ない。ソロモン諸島国立大学Kofi博士をはじめ、同大学スタッフとの交流・合同現地調査もでき、次年度の調査への協力も得られており、研究チーム体制は順調に築けてきている。当初計画の通り、2019年度は、ソロモン諸島ガダルカナル州西ガダルカナル一帯にある複数漁村の漁業者を対象とした本調査を実施し、本研究目的を達成するために必要な供試データを収集していくことを主な活動とする。そのため、まずは質問票を2018年度の現地聞き取り調査に基づいて完成させ、ソロモン諸島国立大学スタッフで構成する調査チームとともに何回かに分けて現地調査をしていく。また得られたデータを用いて、2019年度は特に社会的慣習制度Wantokが、漁業における漁業者間協力関係をどのように生成し、それが現金収入や消費のための漁獲行動にどのように影響しているのかについて分析する。
インターカレーション化合物A×MP2O8・nH2Oの機能性材料としての応用の検討

WOP_2O_7を還元することにより,層間に任意の量の腸イオンをインターカレートすることを試みた結果,陽イオン一個が層間で占める面積を,広い範囲で制御できるようになった.得られた化合物の層間の陽イオンを,他の金属イオンを,他の金属イオンおよび直鎖のアルキルアンモニウムイオンでイオン交換した.多くの場合,交換率は80%以上であった.得られた金属イオンによるイオン交換体の層間距離は,層間に水分子を含まない場合には層間の金属イオンの大きさにあまり依存せず,層間の水分子とホスト層との水素結合により層間距離が決定されているものと考えられる.アルキルアンモニウムでイオン交換した交換した場合,層の持つ不電荷量の小さな場合には,アンモニウムイオンとして以外に一部が,中性のアミン分子として取り込まれていることによると考えられる.アンモニウムイオンとアミン分子は,層間において互いに接し,層に対してほぼ垂直に配列していると考えられる.WOP_2O_7およびMOO_2P_2O_6には,ホスト層を還元することなくアミン分子がインターカレートした. MOO_2P_2O_6を用いた場合,炭素数の小さなアミンについてはイオン交換の場合と同様の層間でのアミン分子の配列が考えられたが,炭素数が大きい場合にはイオン交換の場合とは異なる配列を考えなければならなかった.MOO_2P_2O_6よりの化合物については,その詳細を現在検討中である.また、層の負電荷を酸化反応により制御する試みを、層状化合物LiNbO_2およびLi_<2MOO_3>を用いて行った。その結果、Li/Nbの比は1.0から0.5のLiMoの比は2.0から1.23のの範囲で制御が可能であった。本年度は、電気的に中性な層からなる構造のピロリン酸オクソタングステン(【WOP_2】【O_7】)のWイオンを化学的に還元し、層に生じた負電荷の量にに対応した量の陽イオンが化合物の電気的中性を保つため層間に入ったインターカレーション化合物の合成を行った。この時、還元の程度を制御することにより、層間の陽イオン量を任意に調節することを試みた。出発物質の【WOP_2】【O_7】は、【WO_3】と【(NH_4)_2】【HPO_4】の粉末の混合物を、約250°Cでアンモニアを分解させた後、650°Cで加熱することにより合成した。還元剤として用いたのは、【Na_2】【S_2】【O_4】、Sn【Cl_2】および金属Znなどであった。【Na_2】【S_2】【O_4】は、0.11Mの濃度範囲の水溶液とし、Sn【Cl_2】は0.1Mの塩酸酸性の水溶液とし、室温から90°Cまでの温度範囲で、148時間の反応を行った。Znによる還元は、Zn粉末と出発物質との混合物に塩酸を流す方法で行った。いずれの還元剤を用いても、生成物の層間距離は出発物質のそれよりも増加しており、化学分析等の結果により層間に陽イオンと水の入ったインターカレーション化合物【A^(m+)】【H_y】【[WOP_2O_7]^((mx+y)-)】・n【H_2】Oが生成したことがわかった。【Na_2】【S_2】【O_4】で還元した場合には、生成物は【Na_x】[【WOP_2】【O_7】]・【nH_2】Oであり、xの範囲は1.40.8であった。

層間距離は、10.811.5【A!°】であった。また、Sn【CH_2】によっては【Sn^(2+)】Hy[【WOP_2】【O_7】]・【nH_2】Oが生成した。(2x+y)の値は0.460.80の範囲で変化したが、層間距離は合成条件により変化せず12.2【A!°】であった。金属Znによる還元では、還元量がSn【Cl_2】の場合と同程度ものが得られた。電価1価当りの占める面積は、【Na_x】[【WOP_2】【O_7】]・【nH_2】O(x=1.41)において13【A°^2】で、Sn【Cl_2】による還元によっては39【A°^2】のものが得られた。これは粘土鉱物に匹敵するものであり、【WOP_2】【O_7】を出発物質としたインターカレーションにより広い範囲で電荷密度を制御できることがわかった。
獲得免疫の成立過程におけるIL-7レセプターの機能

本研究の目的は、末梢T細胞がTCRからの刺激を受けた後にIL-7Rの発現が低下する分子機構を解明することにある。まず、末梢のT細胞におけるIL-7Rの発現の動態を調べた。正常マウスの脾臓T細胞を抗CD4・抗CD8・抗IL-7R抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにて解析した。その結果、CD4T細胞およびCD8T細胞のいずれの分画においても大部分の細胞がIL-7Rを発現していた。次に、TCR刺激後のIL-7Rの発現の変化を調べた。脾臓T細胞を固相化抗CD3抗体で刺激し、16時間後に細胞を回収し解析した。その結果、刺激しない細胞ではIL-7Rが高いレベルで発現していたが、抗CD3抗体で刺激した細胞ではIL-7Rの発現がほとんど見られなかった。同様の結果は、胸腺細胞においても認められた。胸腺細胞の各分画におけるIL-7Rの発現を解析すると、IL-7RはCD4(-)CD8(-)DN分画とSP分画で発現していたが、DP分画ではまったく発現が見られなかった。さらに、RAG2ノックアウトに抗CD3抗体を投与すると、4日後に胸腺細胞がDN分画からDP分画へと進むにつれ、IL-7Rの発現も消失した。以上のことから、プレTCR/TCRシグナルによってIL-7Rの発現が低下することが示された。次に、このIL-7Rの発現の低下がどのレベルで起こっているかを明らかにする目的で、IL-7Rα鎖の転写を調べた。胸腺細胞の各分画を磁気ビーズとセルソーターを用いて単離し、半定量的RT-PCR法にてmRNAのレベルを解析した。その結果、IL-7Rα鎖のmRNAがDP分画で顕著に低下していることが明らかになった。以上の結果から、プレTCR/TCRシグナルによってIL-7Rの発現が低下し、それが転写のレベルで誘導されることが明らかとなった。現在、IL-7Rα鎖遺伝子のプロモーター領域の機能解析を進めている。
シスプラチン排出ポンプの構造と機能の研究

我々は、シスプラチン耐性細胞KCP-4をヒト癌KB細胞より分離した。KCP-4細胞はシスプラチンをATP依存性に排出するポンプを発現していること、そのポンプはグルタチオン抱合体排出ポンプ(GS-X pump)であることを示唆する実験結果を得た。一方、Jedlitschkyらは、P-糖蛋白質の関与しない多剤耐性細胞で過剰発現しているMRPが、グルタチオン抱合体排出ポンプであることを報告した。セファランチン存在下にKB細胞より分離したアドリアマイシン(ADM)耐性細胞(C-A120,C-A500)もMRPを発現しており、多剤耐性であった。我々は、KCP-4細胞で発現しているGS-X pumpがMRPかどうかについて検討を行った。MRPを発現する多剤耐性細胞としては、KB-3-1細胞より樹立したC-A120細胞を用いた。KCP-4細胞においてはslot blot法で親株に比べMRPmRNAの発現亢進を認めず、immunoblottingでもMRPを検出できなかった。また、KCP-4細胞はシスプラチンには耐性を示すがADM,VCRには耐性を示さなかった。以上よりKCP-4細胞で認められるGS-X pumpはMRPではないことが示唆された。つぎに、KCP-4細胞およびC-A120細胞より調製したmembrane vesicleによるLTC_4輸送の比較検討を行った。C-A120vesicleによる[^3H]LTC_4輸送反応は、最初の5分間で急速に進行するが、KCP-4 vesicleでは比較的なだらかな反応曲線を示した。LTC_4に対するKm値、ATPに対するKm値がKCP-4 vesicleとC-A120 vesicleでは異なっていた。またLTC_4輸送の阻害実験では、LTD_4はC-A120 vesicleへのLTC_4の取り込みをより強く阻害し、DNP-SGはKCP-4vesicleへのLTC_4の取り込みをより強く阻害した。シスプラチン耐性KCP-4細胞とMRP発現C-A120細胞は、いずれも重金属(アンチモン.ヒ素)に交差耐性を示し、グルタチオン抱合されたアンチモンがこれらの細胞から排出されることを示唆する結果を得た。以上の結果よりKCP-4細胞で発現しているGS-X pumpはMRPと異なる分子であるがよく似た機能を有するATP依存性の輸送ポンプであると考えられた。我々がKB細胞から分離したシスプラチン耐性株KCP-4は、シスプラチンに63倍耐性であり、シスプラチンの細胞内蓄積は親株KB細胞に比較して1/3-1/5に減少していた。KCP-4細胞ではシスプラチンを細胞外へ能動的に排出する機能が亢進していた。

Ishikawaらは、最近マウス白血病L1210細胞にグルタチオン抱合体をATP-依存症に排出するGS-Xポンプが発現し、シスプラチンのグルタチオン抱合体(GS-platium)を能動的に排出することを報告した(J.Biol.Chem.268,20116-20125)。そこで我々はKCP-4細胞で発現しているシスプラチン排出ポンプがGS-Xポンプと同一であるか否かを調べた。KB細胞とKCP-4細胞からmembrane vesicleを分離しATPの存在下、非存在下で[^3H]GS-platinumの取り込みを調べた。KCP-4細胞由来のvesicleでは、明らかにATP依存性のGS-X platinumの取り込みが認められた。KB細胞由来のvesicleでも認められたがKCP-4vesicleに比較して低量であった。GS-Xポンプの基質であるロイコトリエンC4(LTC4)は、KCP-4細胞由来のmembrane veicleにより輸送され、その輸送はGS-platinumにより阻害された(J.Natl.Cancer Inst.86,1781-1784,1994)。最近、Jedlitschkyらはヒト白血病HL60細胞由来のAdriamycin耐性株HL60/ADR由来のmembrane vesicleが、ATP存在下でHL60細胞由来のmembrane vesicleに比較して25倍も多くのLTC4を取り込むことを見出している。HL60/ADRのMDR associated protein(MRP)が[^3H]LTC4でフォトラベルされることも示した。そこで、MRPが我々のシスプラチン耐性株で過剰発現しているか否かをスロットブロット法とイムノプロット法で調べたが、いずれの方法でもMRPの過剰発現は認めなかった。これらの結果より、KCP-4細胞ではGS-Xポンプが、それとよく似たポンプの発現が亢進し、シスプラチンのグルタチオン抱合体を細胞外へ排出している可能性が示唆された。我々は、シスプラチン耐性細胞KCP-4をヒト癌KB細胞より分離した。KCP-4細胞はシスプラチンをATP依存性に排出するポンプを発現していること、そのポンプはグルタチオン抱合体排出ポンプ(GS-X pump)であることを示唆する実験結果を得た。一方、Jedlitschkyらは、P-糖蛋白質の関与しない多剤耐性細胞で過剰発現しているMRPが、グルタチオン抱合体排出ポンプであることを報告した。KCP-4細胞で発現しているGS-X pumpがMRPかどうかについて検討を行った。MRPを発現する多剤耐性細胞としては、KB-3-1細胞より樹立したC-A120細胞を用いた。KCP-4細胞においてはslot blot法で親株に比べMRPmRNAの発現亢進を認めず、immunoblottingでもMRPを検出できなかった。また、KCP-4細胞はシスプラチンには耐性を示すがADM,VCRには耐性を示さなかった。以上よりKCP-4細胞で認められるGS-X pumpはMRPではないことが示唆された。つぎに、KCP-4細胞およびC-A120細胞より調製したmembrane vesicleによるLTC_4輸送の比較検討を行った。C-A120vesicleによる[^3H]LTC_4輸送反応は、最初の5分間で急速に進行するが、KCP-4 vesicleでは比較的なだらかな反応曲線を示した。LTC_4に対するKm値、ATPに対するKm値がKCP-4 vesicleとC-A120 vesicleでは異なっていた。
微生物における転写調節系の比較ゲノミクス・プロテオミクス

ゲノム配列が公開されているバクテリア44種を対象として、転写因子と想定されるORFを網羅的に計6,000個余り収集し、50種類以上のファミリーに分類した。代表的な生物種については、大腸菌が約270個、枯草菌が約240個、ラン藻Synechocystisが約55個などであった。どの分類群に属するかによらず、転写因子の総数とゲノムサイズとの間には明らかな相関が見られた。ただしラン藻(2種)とマイコバクテリウム(2種)では、ゲノムサイズあたりの転写因子の数が他に比べて少ない傾向がみられた。またゲノムサイズが1.5M以下のクラミジア、マイコプラズマなどのバクテリア種では転写因子の数は極端に少なかった。アミノ酸配列に基づいた系統解析の結果などから、多くの転写因子ファミリーは相当に古い起原を持つと推定された。一方では、配列の類似性から一義的にオーソログを定義できるのは、例外的なケースを除けば、近縁のバクテリア種(プロテオバクテリアγ群、同α群、低GCグラム陽性菌など)の間に限られた。したがって進化の過程で転写因子の構造そのものは高度に保存されてきたものの、具体的な機能(標的遺伝子)は種内での遺伝子重複や水平伝達などの過程で比較的柔軟に獲得されてきたものと推測された。個々の転写因子の内在性、外来性を評価する目的で、コドンの使用パターンについて多変量解析を行なった結果、外来性の程度は転写因子ファミリー間で大きく異なることがわかった。転写因子のin vitroでの配列特異的なDNA結合能を利用して、ゲノムライブラリから転写因子の標的配列を選択する方法を開発した。この方法を使ってCRPの新たな標的遺伝子を10個以上同定することができた。これらの成果をデータベースとしてWeb上で公開する準備を進めている。またそのためのプラットホームとして構築した微生物ゲノムの検索・解析ツールをMicrobial Genome Work-bench(http://comtraf.lab.nig.ac.jp/mgw/)として公開した。
内因性生理活性物質の概日性レベル変動と生物現象

アメリカネムノキは就眠運動を行うが,その分子機構はほとんど明らかになっていない.本研究では,アメリカネムノキの就眠物質の微量測定法を確立し,就眠運動に伴うその濃度変化を測定した.さらに,就眠運動に関わると考えられる遺伝子群の全長配列の単離を行い,qPCR法を用いて,それらの発現様式を解析した.アメリカネムノキは就眠運動を行うが,その分子機構はほとんど明らかになっていない.本研究では,アメリカネムノキの就眠物質の微量測定法を確立し,就眠運動に伴うその濃度変化を測定した.さらに,就眠運動に関わると考えられる遺伝子群の全長配列の単離を行い,qPCR法を用いて,それらの発現様式を解析した.ジャスモン酸グリコシドは,アメリカネムノキの就眠運動を誘導する化合物である.それゆえ,植物体内におけるジャスモン酸グリコシド量とそのアグリコン量の変化が,この就眠運動を引き起こしていると考えられる.本研究では,これらのグリコシド生合成・加水分解機構を分子レベルで明らかにすることを試みた.まず,ジャスモン酸グリコシドとそのアグリコン,ジャスモン酸のESI-LCMS/MSの条件検討を行い,それぞれを同時に検出することが可能になった.また,内部標準物質として,重水素標識体を使用した.これらの測定法を用いて,アメリカネムノキの様々な部位のジャスモン酸グリコシドとそのアグリコン,ジャスモン酸含量測定を試みた.これまで,アメリカネムノキの葉枕部分の細胞膜の外にジャスモン酸グリコシドが局在していることが報告されている.まず,細胞外(導管液中)のジャスモン酸グリコシド量とそのアグリコン量の変化が重要だと考え,経時的に導管液を取り測定した.しかしながら,これらを検出することはできなかった.そこで,幼植物の地上部全体のジャスモン酸グリコシドとそのアグリコン,ジャスモン酸を測定した.ジャスモン酸グリコシドのみ検出され,葉が閉じる時間に濃度が増加することを見出した.就眠運動の初期には,細胞内のカルシウムの濃度変化が重要である.そこで,機械刺激応答カルシウムチャネルであるMCAは,アメリカネムノキの就眠運動に重要な役割を果たしていると考えられる.そこで,他の植物に保存されているMCAのDNA配列情報をもとに,アメリカネムノキの全長DNAの単離した.また同時に,RNA量の内部標準遺伝子としてTubulinの断片配列の単離に成功した.ジャスモン酸グリコシドは,アメリカネムノキの就眠運動を誘導する化合物である.それゆえ,植物体内におけるジャスモン酸グリコシド量とそのアグリコン量の変化が,この就眠運動を引き起こしていると考えられる.さらに,この就眠運動にカルシウムチャネルとカリウムチャネルが直接関わることから,これらの分子機構を明らかにする必用もある.本研究では,これらのグリコシド生合成・加水分解機構や,それに関わるチャネルを分子レベルで明らかにすることを試みた.昨年まで,アメリカネムノキの機械刺激応答カルシウムチャネルであるSsMCA1の全長とRNA量の内部標準遺伝子としてTubulinの断片配列の単離に成功している.引き続きMCAの相同性の高い遺伝子の全長の単離を試み,さらにSsMCA2の全長配列を明らかにした.これらの配列情報をもとに特異的なプライマーを作製し,定量的PCR法を行った.その結果,体積が収縮する細胞では,細胞の収縮と共に発現の減少し,体積が膨張する細胞では発現が増加していた.以上から,カルシウムチャネルの発現変化と就眠運動には関連性があると考えられる.カルシウムチャネルに加え,アメリカネムノキからカリウムチャネルの単離も行った.これまでカリウム吸収型チャネルSPICK1とSPICK2,放出型チャネルSPORK1の全長配列が報告されている.今回我々は,SPICK1とSPICK2に加え,SPICK3,SPICK4とSPORK2,SPORK3の全長の単離に成功した.これらの遺伝子発現解析を行い,SPICK2がアメリカネムノキの主要なカリウムチャネルであることや,収縮細胞ではSPORKの発現量が高く,膨張細胞ではSPICKの発現が高いことを明らかにした.ESI-LCMS/MSによるジャスモン酸グリコシドとそのアグリコン,ジャスモン酸含量の測定は,地上部に限られたが,就眠運動に関わるネムノキにおけるMCAやTubulinの発現解析を先行して行うことができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。ジャスモン酸グリコシドは,アメリカネムノキ全体で生合成されている可能性が高いため,地上部の様々な部位別に測定を行う.特に葉枕部分の収縮する細胞と伸張する細胞を分けて,これらの部位でジャスモン酸グリコシド濃度に変化がないかを調べる.また,就眠運動に大きな役割を果たすであろうMCAチャネルの機能解析や,より詳細な発現解析を行いたいと考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
抗生活習慣病因子アディポネクチンの受容体アゴニスト・発現増加剤・切断活生化剤探索

肥満によってアディポネクチン(Ad)が低下することが、メタボリックシンドロームの少なくとも大きな原因の1つになっていると考えられている。AdはN末側のコラーゲンドメインとC末側のglobularドメインよりなる。我々は以前、globular Adは100分の1低い濃度で全長のAdと同等に代謝改善作用に重要なAMPキナーゼを活性化し(Nat.Med.8:1288,2002)、in vivoで糖・脂質代謝を改善させることを報告した(Nat.Med.7:941,2001;.JBC,2003)。Lodishらのグループは、Adが切断されて出来るC末側のglobular Adが実際にヒト血中に存在することを報告した。今年度、本研究において、我々は単球系の培養細胞から炎症などの刺激によって分泌される好中球エラスターゼがAdを切断して、globular Adを生成しうることを見出した(Endocrinology 146:790,2005)。しかしながら我々の検討では実際の血中には、globular Adは多く見積もっても全長の約1000分の1以下しか存在しないと考えられたので、生体内におけるこの好中球エラスターゼによるAdの切断の意義は慎重に検討していく必要があるものと考えられた。肥満に伴ってAdが低下してしまうメカニズムに関しては、その低下に関わる転写因子を今年度同定した(投稿準備中)。我々はさらに、肥満・インスリン抵抗性に伴って高活性型である高分子量型(HMW)Adがとりわけ低下してくること、それをPPARγアゴニストが回復させることを見出した(Diabetes 54:3358,2005)。我々は先に、Ad受容体(AdipoR)1とAdipoR2を同定し,AMPキナーゼ、及びPPARαの活性化などを介し、脂肪酸燃焼や糖取込み促進作用を伝達していることを示し(Nature 423:762,2003)、さらに肥満・2型糖尿病のモデルマウスにおいては、AdipoRの発現量が低下し、Ad感受性の低下が存在することを報告してきた(J.Biol.Chem.279:30817,2004)。今年度は、トマトやポテト、ピーマンや唐辛子に含まれるオスモチンがglobular Adと立体構造上高いホモロジーを有し、mammalianの骨格筋細胞において、AdipoRを介して、代謝作用に重要なAMPキナーゼを活性化することを報告した(Molecular Cell,17:171,2005)。さらに肥満で低下したAdipoRをPPARαアゴニストが回復させることを見出した(Diabetes 54:3358,2005)。
組み換え弱毒ヘリコバクター・ピロリ菌を用いたワクチン用生菌ベクターの開発

新たな抗原デリバリーシステムの候補として、ヘリコバクター・ピロリ菌(ピロリ菌)を遺伝子改変させ、外来遺伝子断片を挿入すると同時に、病原性を減じた組み換えピロリ菌を作成することで、ワクチンのベクターとして利用する。さらにピロリ菌を個体に免疫した際の応答を、自然感染時に引き起こされるそれとの違いからマウスを用いた感染モデル系で解析し、ワクチン投与に伴う宿主の免疫学的応答を検討した。これまでの研究でその候補として、1)ピロリ菌の外膜蛋白Omp29遺伝子と2)ピロリ菌の病原遺伝子の最右翼であるcagPAIを対象に、これらの遺伝子を破壊、もしくはこれら遺伝子内にin frameに挿入することで、外来遺伝子産物をピロリ菌々体内発現させることを目的とした。前者Omp29遺伝子内にGFP遺伝子を挿入した組み換え菌を作成することには成功したが、GFP蛋白の発現効率は菌体1個あたり1コピーのためか、検出効率が著しく悪く、発現のためにはプロモーターの選択や多コピーの遺伝子挿入の必要があると考えられた。一方、昨年度の研究でcagPAI遺伝子全長をクロラムフェニコール遺伝子で置き換えたノックアウト株を作成し、外来遺伝子挿入のためのユニット作成を試みているが、現在までその作成には至っていない。次にピロリ菌の投与による感染マウスの免疫応答についての解析では、菌体をワクチンとして生体に投与した場合に引き起こされる応答に関して幾つかの知見が得られた。1)ピロリ菌を生後まもなく(乳幼児期)に実験感染させることにより、胃内で明らかな炎症反応が惹起される為には、少なくとも母親からの授乳期間を過ぎた離乳後における感染と、それに伴うIFN-γを主体とするTh1型サイトカインの誘導が欠かせないこと。2)ピロリ菌の菌体蛋白可溶性抗原を非経口的に免疫後に生菌をチャレンジ感染させると、18週までの観察で生着菌量に差は認めないものの、感染群では強い組織学的胃炎が生じ、免疫群では炎症細胞浸潤が抑制されていた。これはTh1系サイトカインのIL-2、IFN-γの産生の抑制と、T細胞増殖の抑制シグナルCTLA-4分子が有意な発現の増多を示す事を明らかにした。抗CTLA-4抗体のin vivo投与では、脾細胞培養上清中のTh2サイトカインはTh1系に比べより早期に強力に誘導されており、感染初期におけるCTLA-4の発現がTh1系細胞により強い抑制効果を示し胃炎を抑制したためと考えられた。ピロリ菌の病原性を担う遺伝子内に、外来遺伝子を挿入し蛋白として発現させるベクターとして用いる上で、どのような遺伝子が組み換え部位として最適なのかを検討することを今年度の目的とした。我々がこれまでにクローニングし、その構造解析を行った分子量29KDaの外膜蛋白をコードするOmp29遺伝子の構造は、菌株により互いにほぼ同じ配列を示す短い770bpの長さを有するものと、保存された配列の間に5'末端から180bpの位置に、762bp1264bpと種々の長さで保存性の低い配列が挿入された構造を示す長いサイズ群に大別された。挿入されている762bp1264bpと種々の長さを示す保存性の低い配列の5'及び3'末端には17bpから成る同方向配列が各々確認された。また各遺伝子のORF構造は770bp群では単一ORFであるのに対し、長いサイズ群では数個のORFに分断されていた。このことから組み換えOmp29蛋白に対するウサギ抗血清を用いたimmunoblotでは、単一のORFから成る770bp群では29kDaの位置に反応が見られたが、長いサイズ群ではORFが分断されているために反応は認めなかった。しかし遺伝子組み換え技術により、一本のORFとして内部に700bp1200bp前後の外来挿入配列を組み込み発現させることは可能であり、ベクターとして用いるために、Omp29遺伝子は最適の構造をしていると考えられた。現在Omp29遺伝子の受け入れ遺伝子配列の間に狂犬病ウイルスN蛋白のcDNAをin frameで挿入し、一本のORFとして発現しうるか否かを確認中であり、in vitroでの発現が確認されれば、その後マウスに組み換え菌を感染させることで経口免役し、その後に生ウイルスをチャレンジ感染させ感染防御効果を確認することとする。

次にピロリ菌の投与による感染マウスの免疫応答についての解析では、菌体をワクチンとして生体に投与した場合に引き起こされる応答に関して幾つかの知見が得られた。1)ピロリ菌を生後まもなく(乳幼児期)に実験感染させることにより、胃内で明らかな炎症反応が惹起される為には、少なくとも母親からの授乳期間を過ぎた離乳後における感染と、それに伴うIFN-γを主体とするTh1型サイトカインの誘導が欠かせないこと。2)ピロリ菌の菌体蛋白可溶性抗原を非経口的に免疫後に生菌をチャレンジ感染させると、18週までの観察で生着菌量に差は認めないものの、感染群では強い組織学的胃炎が生じ、免疫群では炎症細胞浸潤が抑制されていた。これはTh1系サイトカインのIL-2、IFN-γの産生の抑制と、T細胞増殖の抑制シグナルCTLA-4分子が有意な発現の増多を示す事を明らかにした。抗CTLA-4抗体のin vivo投与では、脾細胞培養上清中のTh2サイトカインはTh1系に比べより早期に強力に誘導されており、感染初期におけるCTLA-4の発現がTh1系細胞により強い抑制効果を示し胃炎を抑制したためと考えられた。新たな抗原デリバリーシステムの候補として、胃内持続生着菌であるヘリコバクター・ピロリ菌(ピロリ菌)を非病原化させワクチンのベクターとして利用することが本研究の目的である。弱毒化させた細菌を常時体内に生着させることで異種抗原を体内で恒常的に産生させ、全身的・局所的な免疫を賦与するためには、より低い病原性と全身的、局所的に高い免疫原性を賦与できるように工夫する必要がある。昨年度の検討で、H. pyloriの外膜蛋白Omp29遺伝子が外来遺伝子挿入配列をとして適した構造をしていると考えられた、選択マーカーとしてGFP遺伝子の遺伝子発現ユニットを挿入し組み換え体の選別を行った。しかし、選択した挿入遺伝子の発現に用いるプロモーターが不適切なためかこれらの遺伝子にコードされる蛋白の発現を確認することはできなかった。次に現在ピロリ菌の病原遺伝子の最右翼として知られるcag PAIを遺伝子挿入の標的部位とする試みを行った。cag PAIはピロリ菌の胃粘膜上皮への接着と病原性の発現において、細胞内への毒素関連蛋白の注入による細胞内シグナルのかく乱に重要な役割を担っていることが注目されており、この遺伝子群の機能を喪失させることは菌自体の毒性を減じることにもつながる。今回cag PAI遺伝子のほぼ全長を欠落させ、クロラムフェニコール遺伝子で置き換えたノックアウト株(親株は標準株である43504株、シドニー株)の作成に成功した。今後はこの薬剤耐性遺伝子の前あるいは後に、適切なプロモーターと共に小ペプチドを発現できるORFのユニットを挿入した組み換え菌の作成に取りかかり、ウイルスの感染防御抗原遺伝子の発現が可能なで病原性を減弱、喪失させた組み換え弱毒ピロリ菌を構築し、これが全身的、局所的に有効な免疫応答を誘導し得るか否かを検討し、生菌ワクチンベクターとして応用が可能になるかを検討する。新たな抗原デリバリーシステムの候補として、ヘリコバクター・ピロリ菌(ピロリ菌)を遺伝子改変させ、外来遺伝子断片を挿入すると同時に、病原性を減じた組み換えピロリ菌を作成することで、ワクチンのベクターとして利用する。