hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然免疫系におけるＨＭＧＢタンパク質を中心とした新規核酸認識機構の解明

核酸を用いたプルダウンと遺伝子発現ノックダウンによるスクリーニングにより核酸認識候補分子として同定されたNAS1タンパク質について、本研究の一連の解析において、上皮細胞においてウイルスの複製に正に寄与することが示唆される知見が得られた。NAS1 KOのMEFにおいては、野生型に比べ、I型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)感染させた場合の培養上清中への複製ウイルスの放出が10%未満にとどまった。またHSV-1感染時のNAS1の細胞内での動態を、抗NAS1抗体を用いた免疫染色により解析したところ、通常は核内に圧倒的に多く存在するNAS1が、HSV-1感染細胞においては細胞質にも移行し、細胞膜付近に至るまでドット状の分布を示すことがわかった。また、この現象はHSV-1が核内において複製され、細胞外へ放出されるタイムコースと一致する。RNAウイルスの感染時にはストレス顆粒(SG)と呼ばれるタンパク質と核酸との複合体が細胞質において形成されることが知られている。そこでNAS1のSGへの関与を免疫染色で検討したところ、SGのマーカー分子であるG3bp1とNAS1は共局在しないことから、既知のSGには関与しないことが示唆された。すなわち細胞内には、HSV-1のような核内で複製するDNAウイルスにとって複製に不可欠の未知の複合体が存在し、これにNAS1が関与している可能性が考えられる。また、NAS1はスプライシング因子として知られる分子であり、またその全身性欠損は胎生致死であることから、細胞内で生存に不可欠の分子がウイルスの複製に逆に利用されている例と捉えられよう。このような感染時の現象の分子メカニズムを明らかにすることで、特異性の高い、すなわち副作用の少ない抗ウイルス薬の開発にも有用であると考えられる26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内核酸認識に関与する候補分子としてスクリーニングから得られた分子のうち,コンディショナル遺伝子欠損(cKO)マウスを作製した2つの分子(ここではNAS1,NAS2とする)について,全身性にCreリコンビナーゼを発現するCAG-Creマウスと掛け合わせを行い、全身性遺伝子欠損(KO)をした場合の致死性、及び免疫応答への影響を検討した。NAS2遺伝子については、遺伝子欠損アリルをヘテロにもつ親同士を掛合わせ、メンデルの法則に則った割合で野生型ホモ、ヘテロ、KOホモのF1マウスが得られた。NAS1について、KOホモのマウスは、胎生13日目には同法則に沿った個体数が存在するが、4週齢では予想される個体数の1割に留まり、生後4週までの死亡率の高さ及び生体におけるNASlの重要性が示唆された。NAS1 KOマウスの免疫細胞(脾細胞と骨髄細胞)の分化を検討した所、野生型と大きな差は無かった。しかし、NASIKOマウスの骨髄細胞由来樹状細胞(BMDC)では、炎症性サイトカインIL-12p40の遺伝子発現誘導が野生型より著明に減弱した。NAS1 KO BMDCでは野生型に比べ、免疫担当細胞においてIL-12p40を誘導する転写因子IRF5の核内への移行が減弱していることがわかり、NAS1は主に核内に存在するにも拘らず転写因子の核移行を制御していることが示唆された。また感染実験より、NAS1 KOマウスは野生型に比ベリステリア感染に脆弱であることがわかった。一方NAS1野生型、KOそれぞれの胎児から調製した線維芽細胞では、細胞内核酸に対する自然免疫応答はほぼ同程度であった。これらは、NAS1が免疫担当細胞において特に重要な役割を果たすことを示唆する。NAS1については、免疫担当細胞における機能について更に深く追究する必要性、また全身性遺伝子欠損マウスの致死性の高さから、免疫担当細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウス(Lysozyme_Cre及びCD11c-Creマウス)との掛け合わせが急務であり、現在進めている。細胞内核酸認識に関与する候補分子として、マウス胎児由来線維芽細胞におけるスクリーニングから得られたタンパク質30種類のうち、2つの分子(ここではNAS1, NAS2とする)について、コンディショナル遺伝子欠損(cKO)マウスを用いた解析を行った。まず全身でCreリコンビナーゼを発現するCAG-Creマウスと掛け合わせて得た全身性遺伝子欠損(KO)マウス由来細胞を調製し、細胞内に核酸を導入する刺激を行ったところ、NAS2遺伝子欠損マウス由来細胞においては、野生型マウス由来細胞と同様に核酸誘導性のI型インターフェロン(IFN-b)、及び炎症性サイトカイン(IL-6, IL-12p40)の発現誘導が起こることが明らかになり、NAS2は核酸認識受容体コンプレックスとして機能していない可能性が示唆されたため、当該年度のその後の研究はNAS1に絞って行った。NAS1については、全身性遺伝子欠損マウスのバッククロスを継続して進めたところ、C57BL/6バックグラウンドでは、NAS1遺伝子欠損マウスは胎生致死であることが明らかになった。全身性遺伝子欠損マウスによる検討では、骨髄細胞由来樹状細胞を核酸刺激した際の転写因子IRF5の核への移行が、NAS1遺伝子欠損マウス由来細胞では50%程度低下していたため、ミエロイド系細胞において細胞種特異的に遺伝子欠損を行う目的で、Floxed-NAS1マウスとLysozyme-Creマウスとの掛け合わせを開始した。

IRF5によって誘導されるIL-12p40はTh1応答を誘導するサイトカインIL-12のコンポーネントであるので、得られたミエロイド系細胞特異的遺伝子欠損マウスを、Th1免疫応答のモデルの一つであるリステリア感染に供し、その応答を評価した。ところが、ミエロイド系細胞特異的NAS1遺伝子欠損マウスにおいても、野生型マウスにくらべ、ほぼ同等の生存率を示した。核酸を用いたプルダウンと遺伝子発現ノックダウンによるスクリーニングにより核酸認識候補分子として同定されたNAS1タンパク質について、本研究の一連の解析において、上皮細胞においてウイルスの複製に正に寄与することが示唆される知見が得られた。NAS1 KOのMEFにおいては、野生型に比べ、I型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)感染させた場合の培養上清中への複製ウイルスの放出が10%未満にとどまった。またHSV-1感染時のNAS1の細胞内での動態を、抗NAS1抗体を用いた免疫染色により解析したところ、通常は核内に圧倒的に多く存在するNAS1が、HSV-1感染細胞においては細胞質にも移行し、細胞膜付近に至るまでドット状の分布を示すことがわかった。また、この現象はHSV-1が核内において複製され、細胞外へ放出されるタイムコースと一致する。RNAウイルスの感染時にはストレス顆粒(SG)と呼ばれるタンパク質と核酸との複合体が細胞質において形成されることが知られている。そこでNAS1のSGへの関与を免疫染色で検討したところ、SGのマーカー分子であるG3bp1とNAS1は共局在しないことから、既知のSGには関与しないことが示唆された。すなわち細胞内には、HSV-1のような核内で複製するDNAウイルスにとって複製に不可欠の未知の複合体が存在し、これにNAS1が関与している可能性が考えられる。また、NAS1はスプライシング因子として知られる分子であり、またその全身性欠損は胎生致死であることから、細胞内で生存に不可欠の分子がウイルスの複製に逆に利用されている例と捉えられよう。このような感染時の現象の分子メカニズムを明らかにすることで、特異性の高い、すなわち副作用の少ない抗ウイルス薬の開発にも有用であると考えられる26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。NAS1については、その全身性KOマウス由来細胞及びその個体を用いた解析により、NAS1が免疫担当細胞特異的な機能をもつこと、個体レベルでKOマウスがバクテリア感染に脆弱であることを明らかにすることができた。また、免疫担当細胞以外における機能としては、線維芽細胞においてのみI型単純ヘルペスウイルスの複製に正に寄与することも明らかにしており、細胞内核酸認識分子のスクリーニングの段階では想定していなかったNASIの機能を多角的に解析し、多くの知見を得ることに成功した。これまでのところ合成核酸を用いた自然免疫応答の解析において、NAS1の関与を示す結果を得られてはいないが、当該年度はコンディショナルノックアウトマウスを用いた感染モデルの検討を開始することが出来た点で、ある程度の進展が見られていると考えることができる。
気分障害における視床下部-下垂体-副腎皮質系連遺伝子の研究

感情障害への間与が知られている視床下部-下垂体-副腎皮質系(HPA-axis)の中で作用するNR3C1、FKBP5、ACEおよびGABA6を抗うつ薬(Fluvoxamine)反応性を予測する候補伝子として解析を行ったが、有意な関連は確認できなかった。セロと任トランスポーター多型(5HTTLPR)と抗うつ薬反応性の関連も現在、解析中である。今後も引き続き数の解析方法で遺伝子型を確認していく。申請者は気分障害の疾患感受性遺伝子および薬物反応性を予測しりる遺伝子多型の検索を目的とし、以前から気分障害との関運が示唆されている視床下部-下垂体-副腎皮質系に関与する遺伝子を疾患感受性候補遺伝子として、研究を進めている。申請者は視床下部-下垂体-副腎皮質系に関与するNR3C1、FKBP5、ACEおよびGABA6を抗うつ薬(Fluvoxamine)反応性を予測する候補遣伝子として解析を行ったが、日本人気分障害愚者の抗うつ薬反応性との有意な関連は確認できなかった。これは民族間で気分障害の疾患感受性遺伝子が異なる可能性があると考えられる。その後も上記の遺伝子以外に、セロトニントランスポーターなどの視床下部-下垂体-副腎皮質系カスケード内に存在する種々の分子を候補遺伝子として、十分なサンプル数の日本人気分障害患者を対象に楽理遺伝学的研究を行ってきた。この際、gene-wideな検討を行うためにも国際HapMap Proiectで公開されているデータベースを参考にし、連鎖不平衡を考慮しながら滴切なSNPを選択して解析を行っているが、未だ再現性を認める強い関連を示した結果は得られていない。今後も視床下部-下垂体-副腎皮質系が関与する分子を候補遺伝子として研究を進めていき、関連が認められた遺伝子に対しては発現実験や認知機能のendphenotypeなどの検討も併せて行っていきたい。また、アリル頻度が低い遺伝子多型でも十分な検出力を有する解析が行えるように、更にサンプル収集に努めていく。1998年以降、我が国における自殺者は毎年3万人前後で推移し、自殺防止体制の充実か急務とすっている。自殺者の約30%が何らかの精神疾患に罹患しているといわれており、中でもうつ病への適切な治療介入の必要性が指摘されている。うつ病を始めとする感情障害の発症機序は未だに解明されていないが、これらの疾患には何らかの遺伝的要因が関与すると考えられており、原因遺伝子の検索が望まれている。また抗うつ薬に対する臨床効果や副作用の発現には個体差があり、より効果的で安全な治療を行うために治療反応性や副作用発現を予測する生物学的マーカーの同定も切望されている。申請者は気分障害の疾患感受性遺伝子および薬物反応性を予測しうる遺伝子多型の検索を目的として、研究を進めてきた。これまで、抗うつ剤や気分安定薬が作用する分子や、気分障害の神経可塑性仮説に基づいた神経伸長に関与する分子を候補遺伝子として選択し、それらの遺伝子多型と感情障害および薬物反応性との関連を検討してきた。前々年度は感情障害への関与が知られている視床下部-下垂体-副腎皮質系(HPA-axis)の中で作用するNR3C1、FKBP5、ACEおよびGABA6を抗うつ薬(Fluvoxamine)反応性を予測する候補遺伝子として解析を行ったが、有意な関連は確認できなかった。昨年度は抗うつ薬の作用部位であり、HPA-axisにも影響を及ぼすセロトニントランスポーター多型(5HTTLPR)を候補遺伝子として、十分なサンプル数の日本人気分障害患者を対象に薬理遺伝学的研究を行った。5HTTLPRは以前から抗うつ薬の反応性や気分障害との関連が示唆されているが、Nakamura(Molecular Psychiatry(5):32-38)やSakai(Neuroscience Letter(327):13-16)らが指摘しているように5HTTLPRの多型は単純にL型とS型に分類できるものではなく、またYonan(Psychiatric Genetics(16):31-34)らが報告しているようにPCRの条件次第で遺伝子型の結果が誤って判別される事がある。そのため5HTTLPRの遺伝子解析には多大なる時間と労力が必要であり、現在も解析中である。今後も引き続き5THHLPRの遺伝子解析を行っていくだけでなく、GeneChipなど複数の解析方法でも遺伝子型を確認し、関連が認められた際には発現実験や認知機能などのendphenotypeの検討も併せて行っていきたい。
有機鉛試薬の創製とそれを利用する新規有機合成反応の開発

有機鉛試薬を合成反応へ応用するため検討を加え以下の研究成果が得られた。1)(E)-1-アルケニルケトンの実用的合成法は、ケトベンジルエステルへの鉛試薬による側鎖導入後、W-2Raney Niによる還元的脱ベンジルオキシカルボニル化により達成できた。この反応は共役エノンや飽和ケトンの副生を伴うことなく、対応するα-アルケニルケトンが高収率で得られた。この方法の問題点としては還元的脱炭酸法にある。この改良法としてアリルエステルを用いてアルケニル基導入後のPd(0)の触媒的使用による脱炭酸法を検討し成功した。2)(Z)-1-アルケニル試薬を鉛試薬とするアルケニル化反応は進行しない.それ故,鉛試薬がE/Z混合していてもE型試薬のみ反応し対応する(E)-アルケニル体のみが得られる.それ故、(Z)-アルケニル導入は、i)α-アルキニル化、ii)Lindlar法を適用した部分還元による(Z)-アルケニル基への変換、iii)脱炭酸の三段階で行った。このようにしてα-(Z)-及び(E)-1-アルケニルケトンの選択的合成法が確立できた。3)アルキニル基導入は、意外にもアルキニルリチウムを用いて調製した鉛試薬でも反応は収率良く進行することが判明した。Co2(CO)8を用いるアセチレン部の保護を利用して脱炭酸、脱保護の組み合わせでアルキニルケトン合成についても確立できた。この反応は生物活性物質合成など応用面の拡大を現在計っている。
雄の性分化と性成熟に働くクルマエビ造雄腺の作用機構の解明

クルマエビにおいて、雄の性分化と性成熟に関与すると考えられている造雄腺ホルモンの作用機構を調べた。造雄腺ホルモン遺伝子の発現量は成熟が進むにつれて増加し、造雄腺ホルモンが精子形成に関与していることが示唆された。雄エビから両眼柄を除去すると、造雄腺細胞の肥大と精巣重量の増加が見られたことから、造雄腺は眼柄神経節から分泌される因子により抑制的に調節されていると考えられた。精巣で発現している遺伝子を解析した結果、両眼柄除去により肥大化した精巣で発現が増加する遺伝子が見つかった。これらの遺伝子は造雄腺ホルモンの作用によって発現が変化したと考えられた。1.造雄腺ホルモンの合成部位の特定:クルマエビ造雄腺ホルモンのcDNAを鋳型にしてプローブを作り、in situ hybridization法により造雄腺ホルモン遺伝子が発現している部位を調べた。その結果、精巣から延びる輸精管の末端部にある貯精嚢の先端部分が陽性反応を示した。それ以外の部位に明瞭な陽性反応はなかった。陽性反応を示した細胞群は、楕円形の核を持つ直径数マイクロメートルの細胞からなっていた。組織学的特徴によりクルマエビ類の造雄腺を調べた研究では、輸精管の中間部に造雄腺が付着しているとする報告もあれば貯精嚢に付着しているとする報告もあり、クルマエビ類における造雄腺の存在部位は不明瞭であった。本研究でin situ hybridization法を使って造雄腺ホルモン遺伝子の発現部位を特定したことにより、クルマエビ造雄腺が主として貯精嚢の先端部に存在することが明らかになった。この成果を利用することで、造雄腺を確実に特定して造雄腺ホルモン遺伝子発現定量のためのサンプリングや造雄腺移植などの実験が実施できる。2.造雄腺ホルモン発現量の定量:造雄腺ホルモンの遺伝子発現量を定量PCRで測定して発現量と精子形成との関連を明らかにするために、精子形成開始前の未熟期と精子形成が進んでいる成熟期の雄クルマエビから造雄腺ホルモン合成部位である貯精嚢先端部をRNA抽出用サンプルとして集めた。26年度もサンプリングを継続し、充分なサンプルが集まった時点で発現量の測定を行う。3.造雄腺移植:造雄腺移植の予備実験として、雄エビから摘出した貯精嚢を雌稚エビの頭胸部腹面に移植して生残率を調べた。移植100日後に半数が生残していた。造雄腺ホルモン合成部位である貯精嚢先端部を雄エビから雌エビに移植して実験可能と判断できた。26年度に本格的な移植実験を開始する。1.造雄腺ホルモン発現量の定量造雄腺ホルモンの遺伝子発現量と雄の繁殖活性との関連を明らかにするため、飼育下の雄クルマエビから貯精嚢先端部を3月、6月、8月に集め、RNA抽出して逆転写定量PCRを行った。各月の雄エビの平均体重は5.6, 13, 19 gであった。どの月でも精子形成が行われ、貯精嚢内には精子が蓄積されていた。貯精嚢の大きさは3月から8月にかけて大きくなり、精子形成が活発になっていると考えられた。造雄腺1個あたりの造雄腺ホルモン遺伝子発現量は3月、6月、8月と増加し、8月は3月の約45倍になっていた。さらに、天然雄クルマエビ(体重45 g)の造雄腺ホルモン遺伝子発現量は8月の飼育エビより2倍近く高かった。以上から、成長にともない造雄腺ホルモン遺伝子発現量が増加することが明らかになった。その増加量は、体重の増加より大きく、体サイズが大きいほど造雄腺ホルモン遺伝子発現活性が高まると考えられた。体サイズが大きいほど生殖腺指数が高く貯精嚢も大きいため、造雄腺ホルモン遺伝子発現量と雄の繁殖活性との間に正の相関があると考えられた。そのため、造雄腺ホルモンが合成され血中量が高まることで雄の繁殖活性が高まることが示唆される。2.造雄腺移植外部形態から雌であることが明らかに判別できるサイズの雌稚エビを使って、雄エビから摘出した貯精嚢を移植した。対照区には雄の筋肉を移植した。50日間飼育し、腹肢の二次性徴を観察したが、雄の特徴は現れなかった。移植する雌稚エビのステージと影響を調べるマーカーを検討する必要がある。造雄腺を介した精巣発達の調節機構を明らかにするため、雄クルマエビから両眼柄を除去して影響を調べた。両眼柄の除去後、造雄腺細胞の肥大と細胞数増加が見られた。また、精巣重量が増加した。これらの結果から、眼柄を除去したことで、造雄腺を抑制するホルモンが眼柄神経節から分泌されなくなって造雄腺の活性が高まり、増加した造雄腺ホルモンの作用によって精巣が発達したと考えられた。次に、造雄腺の作用を明らかにするために、雄クルマエビから造雄腺を除去して影響を調べた。有意差はなかったが造雄腺除去区の精巣重量が対照区より小さくなる傾向があった。また、雌クルマエビに雄エビから摘出した造雄腺を移植し、卵巣の卵黄タンパク前駆物質の遺伝子発現量への影響をしらべたが、対照区との間に有意差はなく、造雄腺ホルモンが雌を雄へ性分化させる作用は不明であった。造雄腺ホルモンの作用により、精巣内で発現が変化する遺伝子を同定するために、両眼柄切除により肥大化した精巣と正常の精巣を使って発現解析をし、両者の発現遺伝子を比較した。

その結果、肥大化した精巣において発現量が有意に変化している遺伝子が多数見つかった。その中には精子形成に関わるダイニンなどが含まれていた。両眼柄除去により、造雄腺の機能が亢進するため、分泌量が高まった造雄腺ホルモンの作用で遺伝子発現が変化したと考えられた。これらの遺伝子は造雄腺ホルモンの作用マーカーとして利用できる可能性がある。クルマエビにおいて、雄の性分化と性成熟に関与すると考えられている造雄腺ホルモンの作用機構を調べた。造雄腺ホルモン遺伝子の発現量は成熟が進むにつれて増加し、造雄腺ホルモンが精子形成に関与していることが示唆された。雄エビから両眼柄を除去すると、造雄腺細胞の肥大と精巣重量の増加が見られたことから、造雄腺は眼柄神経節から分泌される因子により抑制的に調節されていると考えられた。精巣で発現している遺伝子を解析した結果、両眼柄除去により肥大化した精巣で発現が増加する遺伝子が見つかった。これらの遺伝子は造雄腺ホルモンの作用によって発現が変化したと考えられた。おおむね順調当初計画していた、造雄腺ホルモン遺伝子発現量と雄の生殖活性との相関を明らかにできたため、「おおむね順調に進展」と判断した。造雄腺移植については実施したものの効果がでていない。当初からある程度の困難を想定して3年かけて取り組む計画なので、改善して3年目にも取り組む。甲殻類生理学26年度に雌稚エビへの造雄腺移植を実施したが効果が得られなかった。27年度では、外部形態だけでなく、ビテロジェニン遺伝子発現量をマーカーとして造雄腺移植の影響を調べる。当初計画していた、造雄腺ホルモンの合成部位の特定、造雄腺ホルモン発現定量、造雄腺移植の3種類の実験について予定通り実施できたため、「おおむね順調に進展」と判断した。26年度に支出を予定していた賃金と遺伝子解析の外部委託費を使用しなかったため。25年度に研究全体の基礎となる造雄腺ホルモン合成部位の特定ができたため、26年度では、本格的な移植実験を実施して移植の影響を調べ、さらに造雄腺ホルモンの発現定量をして発現量と精子形成の関連を明らかにする。繰り越した次年度使用額を27年度助成金に加え、検体数を増やしてクルマエビ精巣等の発現遺伝子解析を行い、クルマエビ造雄腺ホルモンの影響を受ける遺伝子の特定を行う。
中近世移行期における近世城下町の形成に関する建築・都市史的研究

本研究は、中近世移行期の城下町に注目し、形成過程とその特質を解明することを目的とした。具体的には、織田信長の家臣が越前国に建設した城下町ー大野城下町・北庄城下町をとりあげ、両城下町の建設過程、空間的・社会的特質、および織田政権の建設した城下町における位置づけについて検討を加えた。その結果、1両城下町は、織田信長の建設した安土城下町と同様、既存の町場を城下へ統合し城郭を中心とする一元的な空間構造を達成していたこと、2既存の町場に居住する商工業者を城下へ集住させ、社会的な一元化を実現したこと、3かかる構造を有する城下町が織田政権による城下町建設の到達点のひとつであったことが明らかとなった。本研究は、中近世移行期の城下町に注目し、都市空間の変容過程とその特質を解明することを目的としている。平成26年度は、織田政権による城下町建設をとりあげ、1城下町形成過程、2城下町における寺社の配置、3既存の都市との諸関係、4地域の政治社会構造について文献・絵画史料の調査・収集を進めるとともに、5中近世移行期の城下町形成に関する研究支援データベースの構築を行うことを計画していた。こうした研究の目的・計画にもとづき、26年度は、北陸地方の城下町、とりわけ織田信長の家臣である金森長近の建設した大野城下町を分析の対象に選んだ。現在の大野城下町は、直線道路が碁盤目状に通り、長方形街区・短冊形地割を持つ非常に整った形態を持つ。こうした城下町の形態が、仮に長近段階で完成していたならば、羽柴秀吉長浜城下町とともに、織田政権の建設した城下町のなかでも非常に先進的な形態を持つとすることができる。すなわち、大野城下町の形成過程を明らかにすることは、織田政権の城下町建設において非常に重要な意味を持つと考えられる。そこで、大野城下町について、以下の点について検討を行った。1)戦国期における大野盆地の政治・宗教的環境、2)大野盆地における都市・町場の様相、3)金森長近による大野城下町の建設過程、4)城下町における寺町の形成過程、5)北庄・長浜など、同時期に建設が進められた織田政権の城下町との比較その結果、戦国期の大野盆地には、亥山城と、それに近接した町場(=土橋町)が所在するとともに、その周辺には寺院が点在していたこと、城下町の長方形街区の形成が明らかとなるのは、慶長年間まで降ること、寺町の本格的な成立も、寛永期まで待たなければならないことが解明できた。本研究は、中近世移行期の城下町に注目し、都市空間の変容過程とその特質を明らかにすることを目的とする。平成27年度は、1大野城下町の形成について論文を執筆すること、2北庄・長浜など大野城下町と同時期に建設された城下町の形成過程について史料調査・収集を進めること、3豊臣政権による城下町建設に関する史料の調査・収集を行うこと、4中近世移行期の城下町形成に関する研究支援データベースの充実を図ることを計画していた。こうした研究の目的・計画にもとづき本年度は、1について論文「中近世移行期における大野城下町の形成についてー織豊系城下町の成立に関する覚書ー」を執筆した。さらに、2については、織田信長の家臣である柴田勝家の建設した北庄城下町を分析の対象に選び、織豊系城下町としての特質について検討した。これにより、織田政権の城下町建設の到達点、および空間構造の特質が、より具体的に明らかになったと考える。また、3については、羽柴秀吉が信長の家臣であった時代に建設した長浜城下町・姫路城下町について、史料の調査・収集を進めた。4については、これまで史料の調査・収集を行った城下町、および信長の建設した安土城下町に関する情報をPCに打ち込み、データベースを構築した。平成27年度は、大野城下町の形成に関する論文の執筆、織豊政権による城下町建設に関する史料調査・収集、研究支援データベースの構築を目的としていた。こうした作業は、おおむね順調に進められており、織田政権による城下町建設の特質を明らかにする段階まで到達できたと考えている。本研究は、中近世移行期における近世城下町の形成過程について、1城下における諸身分の集住、2寺社の配置、3城下町形成と既存の都市との関係という視点から、新たな理論の構築を試みたものである。具体的には、織田信長・豊臣秀吉の建設した織豊系城下町に注目し検討を行った。研究を進めるなかで、織田信長の家臣団の建設した城下町が、織豊系城下町の成立において重要な役割を果たしたのではないかとの見通しを立て、越前国の大野城下町・北庄城下町について詳細な分析を行った。その結果、以下の点が明らかとなった。すなわち、大野城下町は、既存の町場である土橋町を移転させ、空間的・社会的に一元化した城下町として建設されたこと、北庄城下町は、足羽三ヶ庄という既存の町場を城下に取り込むかたちで建設され、信長の安土城下町と同様、空間的・社会的な一元化が進んだということである。これらのことから、織田政権の建設した城下町のなかで安土城下町のみが突出して先進的であったのではなく、同時期の大野城下町・北庄城下町も同じ特徴を有していたことが明らかとなった。さらに、北庄城下町では、家臣団・直属商工業者からなる給人居住域と、直属商工業者も居住する市町が隣接して設けられ、前者は惣構で囲繞されていた。こうした空間構造は安土城下町、さらには羽柴秀吉の長浜城下町などにも共通しており、織田政権の城下町のひとつの到達点とすることができる。本研究では、かかる城下町を「移行期町郭外型」に分類し、近世城下町の萌芽として評価した。

具体的には、織田信長の家臣が越前国に建設した城下町ー大野城下町・北庄城下町をとりあげ、両城下町の建設過程、空間的・社会的特質、および織田政権の建設した城下町における位置づけについて検討を加えた。その結果、1両城下町は、織田信長の建設した安土城下町と同様、既存の町場を城下へ統合し城郭を中心とする一元的な空間構造を達成していたこと、2既存の町場に居住する商工業者を城下へ集住させ、社会的な一元化を実現したこと、3かかる構造を有する城下町が織田政権による城下町建設の到達点のひとつであったことが明らかとなった。平成26年度は、織田政権による城下町建設に関する史料調査・収集、地域の政治・宗教的環境などの確認、研究支援データベースの構築を主たる目的としていた。こうした作業はおおむね順調に進められており、まだ十分ではないものの、大野城下町の形成過程、織田政権の城下町建設における位置づけについて見通しを得られるところまで到達できたと考えている。今年度は、以下の作業を進める予定である。1)北庄城下町の形成について論文を執筆する。2)豊臣政権の城下町形成について、特徴を解明する。3)研究のとりまとめとして、織豊政権の城下町建設、および空間構造の特質を明らかにする。都市史本年度は、以下の作業を進める予定である。1)大野城下町の形成について論文を執筆すること2)北庄・長浜など大野城下町と同時期に建設された城下町の形成過程について史料調査・収集をさらに進めること3)豊臣政権による城下町建設に関する史料の調査・収集4)研究支援データベースの充実校務の都合上、史料調査に関わる旅費を計画通りに使用できなかったため。繰り越した助成金については、昨年度十分に行えなかった史料調査・収集を実施するため、旅費に配分する予定である。本年度の配分助成金については、基本的に計画書に沿って執行する予定である。
メタボリック症候群への生活習慣教育の総合評価：メタボシミュレータ利用とメタ分析

本研究は、メタボリックシンドローム(MetS)改善のための生活習慣改善教育効果の評価に関する研究として、メタアナリシスを実施することを目的とした。本研究での研究仮説は「生活習慣教育プログラムに基づく教育を行った群は、それを行わなかった対照群に比べてMetSからの改善および診断基準の個別要素の改善が見られる。」とした。この評価研究をさらに深め発展させるため、特に階層的メタアナリシスの方法論の検討および最終文献レビュー、公表バイアスの検討、メタアナリシスの実施、MetSへの生活習慣教育の効果の総合的評価を実施した。本研究は、メタボリックシンドローム(MeTS)改善のための生活習慣病予防のための教育効果の評価に関する研究として、システマティックレビューとメタアナリシスを実施する。本研究での研究仮説は「生活習慣教育プログラムに基づく教育を行った群は、それを行わなかった対照群に比べてメタボリックシンドローム(MeTS)からの改善がみられ、また、その診断基準の個別のリスクファクターの改善が見られる。」とした。この評価研究をさらに深め発展させることを目的として、今年度は特に以下に焦点を当て、研究を遂行した。すなわち、平成24年度前半ではRCT研究を対象としてさらに文献レビューを行い、メタボリック・シミュレータによるメタボリックシンドロームの統一的評価を用いたメタアナリシスの実施を行い、単変量および多変量メタアナリシスによる分析を試みた。生活習慣教育に関連した文献では診断基準の項目が揃っている文献が未だ少なく、多変量メタアナリシスを実施するにはまだ問題点が残された。これらを踏まえた上でメタボリックシンドローム(MeTS)改善のための生活習慣病予防のための教育効果の評価に関するメタアナリシスを実施し、国内外の学会で発表し、結果の一部について論文を国際誌BMC Medicineに発表し、Commentaryとしても取り上げられ、さらにhighly accessedが付き、高い評価を受けた。本研究は、メタボリックシンドローム(MeTS)改善のための生活習慣病予防のための教育効果の評価に関する研究として、システマティックレビューとメタアナリシスを実施することを目的とした。」とした。そしてこの評価研究を、特に多変量メタアナリシスおよびネットワーク・メタアナリシスの方法論のレビューを行うとともに、実際のデータでの解析への応用という観点から、検討した。具体的には階層的メタアナリシスの方法論の検討、最終文献レビュー、Publication biasの検討、メタアナリシスの実施、メタボリックシンドロームへの生活習慣教育の効果の総合的評価を実施した。多変量メタアナリシスについては、固定効果モデルによる分析では"borrow of strength"の効果を認めたが、変量効果モデルではまだ解が得られなかった。今後は固定効果モデルによる分析でのバイアスや変量効果モデルの適用等について、さらに検討する必要がある。他方、ネットワーク・メタアナリシはメタアナリシスの方法論として、近年、様々な分野で用いられつつある。そこでネットワーク・メタアナリシスの方法論の理論的検討を行ったところ、一致性の問題など、まだ検討すべき事項があることがわかった。この点も含めて、応用に関しての検討は今後の課題である。以上の結果は国際学会(国際臨床統計学会)等に発表し、結果の一部について論文の作成を行い、国際誌に投稿した。」とした。」とした。すなわち、平成23年度前半ではRCT研究を対象として文献レビューを行い、メタボリック・シミュレータのメタアナリシスへの適用に関する方法論の検討および多変量メタアナリシス、ネットワークメタアナリシスに関する方法論のレビューを行い、その一部についてSASを用いた解析プログラムの作成を行った。さらに後半ではメタボリック・シミュレータによるメタボリックシンドロームの統一的評価を用いたメタアナリシスの実施を行い、単変量および多変量メタアナリシスによる分析を試みた。多変量メタアナリシスはまだその性質も十分に検討されているとはいえず、いくつかの問題点が考えられた。以上の結果を国際学会(国際臨床統計学会)に発表し、結果の一部について論文の作成を行、国際誌に投稿する準備を行った。予定した内容についてほぼ達成でき、その成果もBMC Medicine誌に論文発表し,Commentaryにも取り上げられ、Highy Accessの高い評価を受けることができていることから、おおむね順調に進展していると判断した。

予定した内容についてほぼ達成でき、その成果も論文発表する準備段階に至っていることから、おおむね順調に進展していると判断した。前半では文献レビューを続けるとともに、多変量メタアナリシスをシミュレーテッドデータを利用して検討し、さらにその性質について更なる検討を行う。研究成果は国際学会などにおいても発表していく。前半ではRCT研究対象とした文献レビューを続けるとともに、多変量メタアナリシス、ネットワークメタアナリシスに関する方法を取り入れたメタアナリシスについて、その性質・特徴を分析することを図る。特に後半では相関構造やデータの分布状況との関連を,シミュレーションデータなども利用して検討し、単変量メタアナリシスと多変量メタアナリシスの実施上の問題点などについて明確にするよう図る。研究成果は国際学会などにおいて発表していく。研究費の主な支出として、文献レビューや資料整理のための人件費にあてる。また、研究成果を発表するための海外旅費1名分に使用する予定である。本年度の研究費の主な支出として、文献レビューを行い、資料を整理するための人件費にあてる。なお、繰り越した14,374円については人件費の不足分にあてる予定である。
保健機能の発現を的確評価するための難消化性糖質の統一定量法の確立に関する研究

これまでの研究より、我々が提案しているAOAC改良変法には、難消化性オリゴ糖の中でもβ-グリコシド結合を有するオリゴ糖(2糖類)を正確に定量できない可能性を見出した。H30年度は、この問題点が何に起因するか明らかにし、我々が提案する難消化性糖質定量法の定量法としての利用可能範囲を明確にすることを目的とした。実験は、定量法の問題点と成り得る可能性として下記の3つ1結合様式、2重合度、3酵素添加unit量が挙げられたため、それらを検証した。H30年度を含めた研究成果として、本研究で提案している難消化性糖質定量法は、重合度が3以上のきわめて加水分解を受けない糖質を包括的に定量できることが明らかになった。本研究で提案している定量法の優れている点は、他の定量法と比較して加水分解できる糖質は、全て加水分解して除去し、加水分解できない糖質を選択的に定量できることである。食物繊維の定義は、ヒトの消化酵素で消化されない総体とされており、一般的には重合度が3以上とされている。それゆえ、本研究で提案する定量法は、前述の定義に則した包括的な定量法といえる。また、我々の提案する定量法は、食品分析法としてだけでなく、新規に開発された糖質を消化性糖質か難消化性糖質であるか分類することも可能であり、定量法を応用的に利用でき、生産者の一助と成り得る。一方、研究期間を通して懸案事項であったブタ小腸粘膜酵素の精製ならびに安定供給は、「BIOtech 2017第16回バイオ・ライフサイエンス研究展」に出展した際に、できたコネクションを基にしてパートナリング提携を目指したが、実現できなかった。今後、本研究成果を普及するためには、我々が提案する定量法の肝となるブタ小腸粘膜酵素の精製ならびに安定供給が重要となる。平成28年度は、申請した研究計画通り、ブタ小腸粘膜からの糖質消化酵素の単離・調製ならびにラットを用いたin vivo実験を主に実施した。また、in vivo実験によって得られた実験結果と我々が提案している分析方法によって得られた実験結果を比較し、分析方法の妥当性についても併せて評価した。ブタ小腸粘膜からの糖質消化酵素の単離・調製については、H28年度ならびにH29年度に実験に必要とする量は確保することができている。しかしながら、今後の実験計画を考慮すると、酵素源を安定して確保可能な状態にし、さらに大量調製する必要がある。ラットを用いたin vivo実験では、急性投与した食物繊維素材4種類が糞中に食物繊維として、どの程度、検出されるか、食物繊維定量公定法(AOAC method 2009.01)ならびに汎用性が高い糖質定量法(フェノール硫酸法)の2種類を用いて評価した。ラットを用いたin vivo実験から得られた結果は、ヒトを対象とした実験で得られた先行研究の結果と同様な傾向を示した。また、食物繊維定量公定法ならびに汎用性が高い糖質定量法のいずれの方法を用いて分析しても得られる結果に差異がないことを明らかにした。一方、我々が提案する分析法とラットを用いたin vivo実験の結果を比較すると、in vivo実験で得られた結果は、我々が提案している分析法によって得られた数値よりも低くなった。これは、ラットの腸内細菌による発酵が影響していることが予測された。それゆえ、今後は、ラットを用いたin vivo実験をさらに改良する必要があることが示された。平成28年度に予定していた研究計画はおおむね問題なく実施できている。したがって、順調に申請した研究課題は進展している。通年、ブタ小腸粘膜からの糖質消化酵素の単離・調製は継続して取り組まなければならないが、H29年度に実験に必要とする量は確保することができている。しかしながら、今後の実験計画を考慮すると、酵素源を安定して確保し、さらに大量調製する必要がある。したがって、今後は、名古屋市食肉衛生検査場などからブタ小腸の提供・購入できるようにする必要がある。H29年度は、名古屋市食肉衛生検査場からブタ小腸の提供・購入が可能になり、酵素源を安定して確保することが可能になった。しかしながら、「BIO tech 2017第16回バイオ・ライフサイエンス研究展」に出展し、酵素の安定供給を目指してパートナリング提携を目指しているが、提携先が決まっていない状況である。これに関しては、引き続き、酵素の安定供給に向けて提携先を検討する必要がある。一方、H30年度に計画していたが、申請者が提案するAOAC改良変法を用いたレジスタントスターチの定量をH29年度に実施することができた。RSには、RS 1(細胞壁などで物理的に消化されないRS)、RS 2(消化耐性を持つデンプン粒)、RS 3(老化デンプン)ならびにRS 4(加工デンプン)などに分類が異なる。本研究では、4種類の異なる分類のRSを測定試料とし、AOAC改良変法を用いてRSが正確に定量できるか否かを検討した。その結果として、我々が提案する改良変法は、RSの公定法でもあるAOAC 2009.01法といずれのRS素材を対象とした場合も同等であることが明らかになった。つまり、我々が提案する改良変法は、低分子の難消化性オリゴ糖素材だけでなく、高分子の食物繊維素材ならびにRS素材においても正確に定量できる可能性が示された。これらの研究成果は、平成29年度日本栄養・食糧学会ならびに日本食物繊維学会で発表した。

これまでの研究成果より、我々が提案しているAOAC改良変法は、難消化性オリゴ糖の中でもβ-グリコシド結合を有するオリゴ糖(2糖類)に関して正確に定量できない可能性が残っているが、それ以外の難消化性オリゴ糖は問題なく、測定することができる。また、高分子の食物繊維およびレジスタントスターチに関しても正確に定量できることを明らかにしてきた。我々が提案しているAOAC改良変法が難消化性糖質定量法として確立するためには、測定結果の妥当性ならびに信頼性などを更に評価・蓄積していく必要がある。また、酵素源の確保や安定供給など解決しなければならない問題は山積しているが、それについては、本年も引き続き、取り組む予定である。これまでの研究より、我々が提案しているAOAC改良変法には、難消化性オリゴ糖の中でもβ-グリコシド結合を有するオリゴ糖(2糖類)を正確に定量できない可能性を見出した。H30年度は、この問題点が何に起因するか明らかにし、我々が提案する難消化性糖質定量法の定量法としての利用可能範囲を明確にすることを目的とした。実験は、定量法の問題点と成り得る可能性として下記の3つ1結合様式、2重合度、3酵素添加unit量が挙げられたため、それらを検証した。H30年度を含めた研究成果として、本研究で提案している難消化性糖質定量法は、重合度が3以上のきわめて加水分解を受けない糖質を包括的に定量できることが明らかになった。本研究で提案している定量法の優れている点は、他の定量法と比較して加水分解できる糖質は、全て加水分解して除去し、加水分解できない糖質を選択的に定量できることである。食物繊維の定義は、ヒトの消化酵素で消化されない総体とされており、一般的には重合度が3以上とされている。それゆえ、本研究で提案する定量法は、前述の定義に則した包括的な定量法といえる。また、我々の提案する定量法は、食品分析法としてだけでなく、新規に開発された糖質を消化性糖質か難消化性糖質であるか分類することも可能であり、定量法を応用的に利用でき、生産者の一助と成り得る。一方、研究期間を通して懸案事項であったブタ小腸粘膜酵素の精製ならびに安定供給は、「BIOtech 2017第16回バイオ・ライフサイエンス研究展」に出展した際に、できたコネクションを基にしてパートナリング提携を目指したが、実現できなかった。今後、本研究成果を普及するためには、我々が提案する定量法の肝となるブタ小腸粘膜酵素の精製ならびに安定供給が重要となる。申請した研究課題に取り組むために必要な設備等は整っているが、本研究課題の要である「酵素源」の安定供給が困難な状況にある。本年度は、「BIO tech 2017第16回バイオ・ライフサイエンス研究展」に出展し、酵素の安定供給を目指してパートナリング提携を目標に活動を実施する予定である。本年度も引き続き、「BIO tech 2017第16回バイオ・ライフサイエンス研究展」に出展した際に、できたコネクションを基にしてパートナリング提携を推進する予定である。また、我々が提案するAOAC改良変法には、難消化性オリゴ糖の中でもβ-グリコシド結合を有するオリゴ糖(2糖類)に関して正確に定量できない可能性が残っている。
単繊維基板をツールとした細胞内への新規物質導入法の探索

本研究では、ナノファイバーと細胞の強い相互作用を利用した遺伝子導入用のツールの開発を試みると共に、ファイバーの1次元の連続性と細胞の走化性を利用した遺伝子導入法の開発を試みた。FBSを走化性因子した流路を構築し、単繊維上での遺伝子導入を、GFP-Hela細胞に対して、GFP-siRNAを導入するモデルでGFPの消光を指標として遺伝子導入状況を評価するシステムを構築した。現時点では、細胞の繊維上への進展とGFPの消光が確認されているが、一部細胞死も認められ、当初の目論見の高効率に遺伝子導入の順番を制御できるツールを完成することはできていない。今後、更なる検討を進めてゆく所存である。単繊維基板をツールとした細胞内への新規物質導入法の探索に関する研究を行うため、本年度は、ツールとなる流路デバイスの設計と試作を繰り返し行った。3Dプリンターを用いてデバイスの構築を試みたが、解像度が悪く思うような流路デバイスの構築に難渋したため、既存のセパラブル培養皿を改良して、単繊維を固定できる流路ツールへの改良を進めた。テュアルペリスタリックポンプを用いて流路内への培養液の送液、廃液の制御条件と細胞の走化性を制御するための血清の滴下条件などの検討を進めている。現時点では、わずかな細胞の移動は観察されているが十分に最適化された条件は見つかっておらず、今後更なる検討を進めるためにパラメーターの見直しなどを行っている。特に細胞の移動に関して基材表面の状態が大きく影響を与える状況が示唆されている。そのため、走化性因子としての血清の添加位置と添加量などを変えるとともに、基材としてガラス、細胞培養用ポリスチレンなどを鋭意検討したが、最適な条件の選定には至っていない。一方、細胞を自走させ、導入する遺伝子を保持するための単繊維足場の作製のための電界紡糸条件の検討を行い、モデル材料として100mg/mlのPGA/HFIP溶液を用いて、ディスクタイプのコレクター上への紡糸を行い繊維を回収する手法を開発し、直径60ミクロン程度のマルチフィラメントの単繊維を回収することが可能であった。ここで回収された単繊維は、上記で試作した流路デバイスへ組み込むことも可能であった。当初予定していたように、本年度は、遺伝子導入のための新規ツールとして用いる単繊維基板を組み込んだフローシステム構築の要素技術構築を行い、3Dプリンターの精度不足などにより進捗が滞った時期もあったが、代替えのデバイスを調達、改良を加えることで乗り切り、システム化の可能性が示唆される段階まで研究を進めることができた。PGA及びシルクフィブロインのナノファイバーの配向集合体で、細胞のファイバーに沿った伸展を比較的安定的に得られる条件(材料・繊維密度)が得られてきたので、最終年度は、これらの材料を用いて細胞の走化性を得られるか、システムデバイス作りを進めた。具体的には、初年度作製の還流型の細胞培養用フローチャンバーへ上記ファイバー基材を組み込み、還流液の上流側からFBSを一定量添加することで下流側に向けてFBSの濃度勾配が生じるシステムを作り、下流側に播種細胞を置くことで、FBSリッチな上流方向への細胞移動が観察されるかどうかをタイムラプス型の蛍光顕微鏡を用いて評価するシステムである。試作チャンバーを用いて再度チャレンジしたが、やはり、残念ながら細胞の十分な走化性は得られなかった。そこで、ファイバー上での導入効率を向上させるために、パッションフルール様構造を持つコアシェル型ナノ粒子(内部にポリエチレンイミンとGFPターゲットのsiRNAを内包しシェルがシリカで構成されるナノ粒子とポリグリコール酸(PGA)のナノファイバーのコンポジットを作製し、GFP-Hela細胞の進展、移動及びGFPの消光に関して評価を行った結果、細胞の初期的なファイバー上への進展とGFPの消光が確認されたが併せて細胞毒性のための細胞死も認められ、残念ながら当初の目論見の高効率に遺伝子導入の順番を制御できるツールを完成することはできなかった。しかしながら、ナノファイバー上では、細胞が大きく変形し、細胞膜から核までの距離が通常より近接した状態をとり、核への物質移行が有利な状態になっている可能性は共焦点レーザー顕微鏡の観察等で確認出来た。これは、今回企図したデバイスの完成まではいたらなかったが、他の走化性因子添加や新たな流路設計を行うことで細胞の移動を自在に制御できれば新遺伝子導入法の可能性が示唆された。はじめにモノフィラメント単繊維ナノファイバー上において細胞の接着制御を試みたが、再現性に乏しく、制御が難しい状況であった。そこで、ナノファイバーからなるマルチフィラメント単繊維を作製して、その上での細胞挙動を観察した。初めに、昨年度の継続としてPGAのマルチフィラメントの作製しその上に細胞を播種して状況を観察した。細胞としては、血管内皮細胞とGFP-Helaを検討対象とした。PGAマルチフィラメント上に細胞の付着が認められたが、細胞のマルチフィラメント内への潜り込み等が観察され、これらの影響で細胞の顕著な移動は観察されなかった。そのため、高分子素材をPGAから細胞接着性が比較的弱い絹フィブロインを用いて検討を行った。比較試験として行った疎なフィブロインナノファイバーへの細胞接着試験では、疎なナノファイバー上でファイバーに沿った形で特にGFP-Hela細胞の進展が観察された。細胞-基材相互作用が比較的弱いことは、細胞の走化性は有利に働くと考え、フィブロインナノファイバーからなるマルチフィラメント単繊維を作製して細胞の接着、移動に関して検討した。

初期的に細胞は付着するが、培養を続けると細胞は、フィブロインマルチファイバー上から離脱してしまいデバイス化に向けては更なる工夫、改良が必要な状況にある。これらの結果から、マルチフィラメントの単繊維よりは、PEG化した基材の上に形成する配向性を持た疎なファイバーシートの方が有効性が高いことが確認された。これらを用いて最終年度のデバイス化に用いることとする。初めに、昨年度の継続としてPGAのマルチフィラメントの作製しその上に細胞を播種して状況を観察した。PGAマルチフィラメント上に細胞の付着が認められたが、細胞のマルチフィラメント内への潜り込み等が観察され、これらの影響で細胞の顕著な移動は観察されなかった。そのため、高分子素材をPGAから細胞接着性が比較的弱い絹フィブロインを用いて検討を行った。フィブロイン100mg/mlのHFIP溶液を調製し、印可電圧10kV、送液速度0.3ml/hr、電極間距離18cmの条件で、電解紡糸のコレクターを円盤状の者を使用し、1-2分間紡糸を行うことで円盤エッジ上に形成するナノファイバーを回収し、紙縒り状に成型することで作製した。その結果、直径約0.6-3μm程度のファイバーの集合体でマルチフィラメント化して得られた単繊維の直径は約40μmであった。このマルチフィラメント単繊維ファイバーへ血管内皮細胞を播種して細胞接着状態をSEMにて観察を行ったところ、細胞の離脱が観察されたため、再度、絹フィブロイン材料としてPEG化した基材の上に形成する配向性を持た疎なファイバーシートに関して検討を進めた結果、繊維に沿った細胞の進展が確認され、デバイス化には有効性が高いことが確認された。この材料を用いて最終年度にデバイス化と遺伝子導入挙動の検討を進める方針が見いだされた。本研究では、ナノファイバーと細胞の強い相互作用を利用した遺伝子導入用のツールの開発を試みると共に、ファイバーの1次元の連続性と細胞の走化性を利用した遺伝子導入法の開発を試みた。FBSを走化性因子した流路を構築し、単繊維上での遺伝子導入を、GFP-Hela細胞に対して、GFP-siRNAを導入するモデルでGFPの消光を指標として遺伝子導入状況を評価するシステムを構築した。現時点では、細胞の繊維上への進展とGFPの消光が確認されているが、一部細胞死も認められ、当初の目論見の高効率に遺伝子導入の順番を制御できるツールを完成することはできていない。今後、更なる検討を進めてゆく所存である。昨年度に引き続き、遺伝子導入システムに最適な素材の検討とその単繊維化技術の構築を行う。また、作製した単繊維のフローシステムへの組み込みを行い、デバイス化を進めるとともに、そのシステムに最適な培養条件や細胞の走化に最適な条件設定を行いシステム化を進めるとともに、システムの稼働性を検証する。モデルとして1遺伝子を選定して、本システムの遺伝子導入効率の検討を行う。細胞のファイバーに沿った進展を比較的安定的に得られるような材料と繊維密度が得られてきたので、細胞の走化性を得られるシステム作りを進める。
再生医療を用いた拡張型心筋症・虚血性心筋症に対する新たな治療戦略の開発

我々は拡張型心筋症および心筋梗塞モデルマウスにおいて、リンパ管新生インデューサーであるVEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカーであるVEGFR3-Fcの治療効果につき検討し,臨床応用可能な心臓リンパ管新生調整因子による治療法をマウスモデルにおいて確立し,臨床応用に向け,これらの治療法をより発展させた.さらに,治療用マイクロデバイス開発を視野に入れた動物実験も行うことを検討した。我々は心筋細胞の配列を制御する方法を開発しており、この技術を用い、リンパ管新生インデューサー、VEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカー、VEGFR3-Fcの治療戦略への応用も検討した。我々は拡張型心筋症および心筋梗塞モデルマウスにおいて、リンパ管を特異的に同定する抗VEGF-R3抗体および抗Podoplanin抗体により、心臓リンパ管の存在を明らかとしてきた。そして、これらのモデルマウスを用い、これらの病態における心臓リンパ管新生調整因子の関与をさらに詳細に解析してきた。今回,我々は独自の方法により心機能との関連をさらに詳細に検討した。我々は経冠動脈的にアデノウイルスベクターを心臓へ導入するためのマイクロバルーンを開発し、リンパ管新生インデューサーであるVEGF-C156S及びリンパ管新生ブロッカーであるVEGFR3-Fcの治療効果につきさらに検討し,臨床応用可能な心臓リンパ管新生調整因子による治療法をマウスモデルにおいて確立し,今回,臨床応用に向け,これらの治療法をより発展させてきた.VEGFR-3ノックアウトマウスは心外膜液貯留等のため胎生9.5日で致死となることからも、心臓リンパ管は心疾患の治療ターゲットとなることが示唆されてきた。治療への応用の観点から、用いるタンパク、遺伝子、成長因子等の性質を考慮すると、少なくともモニタリングとデリバリーの機能を備えた治療用マイクロデバイスによる心内膜または心外膜直下からのアプローチが不可欠と考えられる。同時に、経血管的・経リンパ管的アプローチが不可欠なため、微小管腔用マイクロデバイスの開発も視野に入れる。そこで、今回,治療用マイクロデバイス開発を視野に入れた動物実験も行うことを検討した。