hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糸状菌の菌糸形態の形成メカニズムの解明及び有用物質生産への応用

本研究では、顕微鏡の標本台の上で実験ができるフロースルーチャンバーの製作を完成し、チャンバーの上で胞子を発芽させ、一定時間間隔でデータをとり、画像解析装置により解析ができるようになった。これによって、発芽してからの菌糸の伸張速度、枝分かれ頻度、先端数の変化などのデータをオンラインでコンピューターに収集することができた。栄養源濃度、C/N比をさまざまに変化させたところ、菌糸伸長速度、先端伸長速度はともに炭素濃度が10g/1以下では最大を保った。また、分岐形成速度は炭素濃度が1g/1以上、つまり炭素枯渇でなければ一定であった。分岐形成速度は、先端伸長速度と菌糸伸長速度がそれぞれ臨界値以内であるならばそれぞれの速度に依存せず一定であった。フロースルーチャンバーを用いた実験から得られたデータをAspergillus oryzaeと比較すると、M.alpinaは菌糸の伸長および分岐形成はA.oryzaeに比べて早いが、一つの先端からの菌糸の伸長はA.oryzaeとほぼ同じであった。ミクロ的な形態とペレット形成について、M.alpinaの場合、菌糸伸長速度、先端形成速度がともに高いと、ペレット形態からしだいにパルプ状の小さなペレットが形成されるという傾向が見られた。対照的に、菌糸伸長速度と先端形成速度が低いときは、小さなフィラメント状の形態から大きなペレットが形成された。さらに菌糸伸長速度、先端形成速度が大きくなるにつれて脂肪酸生産性も増加した。よって、ミクロ的な形態を知ることにより、マクロ的な形態、さらには生産性までも予測が可能となった。これにより実際の培養の最適化を行うこともできるようになるであろう。以上の結果から、菌糸は伸長、および分岐を行い、これを繰り返しながら増殖することがわかった。よって菌糸の伸長、分岐形成にはさらに核動きが重要であるので、今後核の分裂とともに細胞周期を制御することによって菌糸形態をコントロールすることが可能であると考えられる。顕微鏡の標本台の上で実験ができるフロースルーチャンバーの製作を完成した。チャンバーの上で胞子を発芽させ、15分ないし30分間隔でデータをとり、画像解析装置により解析ができるようになった。チャンバー内の酸素や栄養源の律速を防ぐため酸素飽和状態の新鮮培地を一定流速で連続的に供給するシステムを構築した。更に、培養チャンバー温度の制御のためにスライドガラスの下に温度制御の可能な特殊ホットプレートを設置した。これによって、発芽してからの菌糸の伸張速度、枝分かれ頻度、尖端数の変化などのデータをオンラインでコンピューターに収集することができた。この装置の有効性を確証するため、Mortierella alpinaを用いたところ、菌糸形態の形成に関わるパラメーターの定量的な計測が可能となり、パラメーターの測定に関する標準誤差は5%以下であった。本研究によって(1)通常では7日以上かかるが、この装置を用いると12時間後胞子の発芽が始まり、12時間測定することによって糸状菌の菌糸形態における環境の変化の影響を迅速に調べることができ、菌糸形態を予測するパラメーターを得ることができること、(2)培地の炭素源に対する窒素源の比率(C/N比)が菌糸形態を変化させる大きな原因であることが明らかになった。例えば、培養中窒素の比が高くなるほど、菌糸の増殖が旺盛になるが、逆に培地中炭素源の濃度が高くなるほど、菌糸の増殖速度が減少し、ペレットの形態をとることが明らかとなった。(3)更にペレット形態を形成した場合、ペレット内部構造を明らかにした。

ペレットの内部は菌糸が密集していると知られてきたが、本研究によって、M.alpinaの場合ペレット内部が空洞であることが確認できた。顕微鏡の標本台の上で実験ができるフロースルーチャンバーの製作を完成し、チャンバーの上で胞子を発芽させ、一定時間間隔でデータをとり、画像解析装置により解析ができるようになった。これによって、発芽してからの菌糸の伸張速度、枝分かれ頻度、先端数の変化などのデータをオンラインでコンピューターに収集することができた。本研究によってM.alpinaの培養における菌糸形態を直接調べるために、さまざまな栄養源濃度、C/N比条件を変化させた。(1)菌糸伸長速度、先端伸長速度はともに炭素濃度が10g/L以下では最大を保ち、C/N比には依存していなかった。また、分岐形成速度は炭素濃度が1g/L以上、炭素枯渇でなければ一定であった。さらに菌糸伸長速度と先端形成速度は、C/N比、栄養源濃度に関わらず直線的な関係を示した。分岐形成速度は、先端伸長速度と菌糸伸長速度がそれぞれ臨界値以内であるならばそれぞれの速度に依存せず一定であったが、臨界値以上になると減少した。臨界値付近で菌糸内において代謝の変化が起こっているのではないかと考えられる。(2)菌糸形態形成におけるアミノ酸組成の影響を調べた。グルタミン酸あるいはアルギニンの影響が大きく、特に菌糸の伸長にはアリギニンが、菌糸の先端形成にはグルタミン酸がそれぞれ深く関与していることが確認できた。(3)ミクロ的な形態とペレット形成についての比較も行った場合、菌糸伸長速度、先端形成速度がともに高いとき、ペレット形態からしだいにパルプ状の小さなペレットが形成されるという傾向が見られた。対照的に、菌糸伸長速度と先端形成速度が低いときは、小さなフィラメント状の形態から大きなペレットが形成された。本研究によって、ミクロ的な形態を知ることにより、マクロ的な形態の予測が可能となり、今後これにより実際の培養中菌糸形態の最適化を行うことも可能となった。
カルシウムイオンによる酵素活性の調節機構

プロテアーゼを中心としたカルシウム依存性酵素をとりあげ、活性制御機構の分子レベルの研究、タンパク質代謝に対するカルシウムイオンの効果、プロテアーゼが触媒する限定分解によって引きおこされる種々の酵素やタンパク質の機能の変換の分子機構の解明、等を目ざし大別して以下の4項の研究を行った。1.中心課題のカルシウムプロテアーゼに関しては、cDNAのクローニングにより、ヒト、ウサギ、ブタの酵素について80Kサブユニットや30Kサブユニットの構造を明らかにし、両サブユニットのC末端側に各1モルのカルモデュリン様カルシウム結合タンパク質ドメインが存在することを決定した。また、このプロテアーゼの活性を制御する重要な因子であるインヒビターの研究を進める一方、カルシウムプロテアーゼの生体内機能の解明をめざし、特異抗体を使った細胞内分布の解析、血小板における機能の解析等についても多くの基礎的な知見を蓄積しつつある。2.カルシウムは血液凝固系因子の活性化においても極めて重要で、その活性化機構の究明のため種々の凝固系因子を精製し、その構造を解析した。特に、プロトロンビンのカルシウムを結合するγ-カルボキシグルタミン酸のドメインが、N末端側に存在することを証明した。3.ウニの精子のアミノペプチダーゼ、ジャガイモのホスホリラーゼキナーゼのカルシウムによる活性化機構の検討も行った。また、酵母からカルモデュリン様のタンパク質を精製し、その性質を検討した。4.ラットのGTP結合Nタンパク質を介する情報伝達系において、【G_5】,Gi,【G_o】タンパク質のcDNAをクローニングし、そのアミノ酸配列を決定し、この系を用いて、GTP結合タンパク質やカルシウム、カルシウム結合タンパク質などが情報伝達系でどのように作用するかの解析をはじめた。
フライト環境下における電磁ヒートシールド効果に関する研究

宇宙から地上への帰還時などの大気圏突入飛行において,加熱から機体を保護するための革新的な技術として電磁ヒートシールドが提案されている.本研究は,この電磁ヒートシールドの効果の予測精度を高めるために,空気プラズマ気流中での効果を実験計測することを目的としている.このための計測装置の新規開発を行い,空気プラズマ気流中においても電磁ヒートシールドの効果が発生することを確認した.本研究は,大気圏再突入機の熱防御法として提案されている電磁ヒートシールドについて,実際のフライト環境に近い気流条件下における実験計測と,その結果を用いた数値シミュレーションの検証を目的としており,本年度は,実験計測に向けた計測系の構築とその予備試験,および数値計算環境の構築を行った.実験計測では,JAXA宇宙科学研究所の大口径ICP加熱器を使用することを想定しているが,この装置において電磁ヒートシールド効果を検証するために必要な計測系はこれまでに整備されていないため,その計測系の設計・製作・検証を行い,次年度以降の実際のデータ取得に向けた知見を蓄えた.特に,実験装置から発せられる高温ガスやノイズにより,計測系に悪影響を与える懸念があったが,予備試験の結果として問題無く動作することが確かめられた.ここで得られた知見は,このICP加熱器を拡充する上での知見となり得るものである.数値シミュレーションについては,ICP加熱器実験における流れ場を模擬するための準備を進めた.具体的には,数値計算に必要な環境の構築を行い,これまでに研究代表者が開発した計算コードの改修を行った.その結果として,本年度に導入した最新のGPGPU計算環境下において,高い計算性能を発揮できることを確認した.本研究では,条件の異なる多数ケースの計算を実施していくことになるため,計算性能の高い環境を構築することは,今後の研究の推進につながるものである.本研究は,大気突入機の熱防御法として提案されている電磁ヒートシールドについて,実際のフライト環境に近い気流条件下における実験計測と,その結果を用いた数値シミュレーションの検証を目的としており,本年度は,実験計測に向けた予備試験,および実際のフライトを模した数値シミュレーションを行った.実験計測では,JAXA宇宙科学研究所の大口径ICP加熱器を使用して,電磁ヒートシールド効果による抗力増大効果の計測を試みた.模型内部に磁石を設置することで,電磁ヒートシールド効果により抗力が増大するが,このICP加熱器においても抗力が増大するという結果が得られた.ただし,ICP加熱器のプラズマ気流に計測系を曝したところ,センサの動作が不安定となったため,十分な検証が行えておらず,今後改善させていく.また,ICP加熱器だけでなく,追加としてアーク加熱風洞を用いた実験の準備も進めた.数値シミュレーションについては,ICP加熱器実験における流れ場の模擬に向けた準備を進めると同時に,実際のフライトを模した計算を先行して実施した.実際のカプセル開発を想定した磁場配置を検討し,そのときに予測される効果について計算し,考察を行った.これにより,より実際に近いフライト環境を模した計算を行うための計算環境が構築された.当初の計画では,本年度内に実験計測によるデータ取得,および数値シミュレーションとの比較を実施する予定であったが,計測系に問題が生じ,その解決に至っておらず,そのため数値シミュレーションとの比較も行えていない.本研究ではJAXA宇宙科学研究所の大口径ICP加熱器が作る空気プラズマを用いて電磁ヒートシールド効果を検証することを目指しているが,実際に実験を行ったところ問題に直面した.この実験装置を使用している研究者のアドバイスを得つつ,対応を試みているが,実験装置が遠隔地であるため実験機会が限られ,十分な対応に至っていない.しかし,参考データではあるものの,抗力増大効果を示唆するデータがすでに得られており,対応が完了し次第,電磁ヒートシールド効果の検証に用いられるデータを取得できると考えている.以上の理由により,達成度としては「やや遅れている」とした.本研究は,大気突入機の熱防御法として提案されている電磁ヒートシールドについて,実際のフライト環境に近い気流条件下における実験計測と,その結果を用いた数値シミュレーションの検証を目的としている.本年度は,JAXA宇宙科学研究所の大口径ICP加熱器を用いて,電磁ヒートシールド効果による抗力増大効果の計測を行った.まず,昨年度に見られた不安定なセンサ出力については,プラズマ気流により治具が加熱されることで計測系の特性が変化したためと判明し,計測系を改良することで解消させた.その上で抗力測定を行い,模型内部に磁石を設置することで,ICP加熱器による空気プラズマ気流中においても抗力が増大する結果を得た.予備試験として行ったアーク加熱風洞実験では,模型形状を変えて抗力を計測し,ノーズ半径による抗力増大効果への影響を明らかにした.ただし,同様の試験をICP加熱器で行うには至らなかった.これらの計測結果は,電磁ヒートシールド効果の数値シミュレーションの検証を行う上で有益である.しかし,数値シミュレーションについては,当該設備の改修に伴い計算に必要な条件が得られていないため,検証ができていない.研究期間全体を通して以下の成果を得た.(1)ICP加熱器における抗力測定装置の開発.(2)空気プラズマ気流中での電磁ヒートシールド効果による抗力増大効果の実証.(3)ノーズ半径による抗力増大効果への影響の計測.(4)実機を想定した磁場配置による効果についての数値シミュレーションを用いた検証.当該ICP加熱器ではこれまで抗力測定が行われておらず,そのための装置を開発した.過去の実験計測では,アルゴンプラズマが主に使われており,空気プラズマにおいても同様の効果が発生することを実証した.ノーズ半径は大気突入機の重要な設計パラメータの一つであり,これと抗力増大効果との関係を実験により検証した.

宇宙から地上への帰還時などの大気圏突入飛行において,加熱から機体を保護するための革新的な技術として電磁ヒートシールドが提案されている.本研究は,この電磁ヒートシールドの効果の予測精度を高めるために,空気プラズマ気流中での効果を実験計測することを目的としている.このための計測装置の新規開発を行い,空気プラズマ気流中においても電磁ヒートシールドの効果が発生することを確認した.実験計測について,当初の計画では本年度内にデータ取得を開始する予定であったが,計測系の具体的な設計を行うのに時間を要してしまい,予備試験を行うに留まっている.本研究ではJAXA宇宙科学研究所の大口径ICP加熱器が作る空気プラズマを用いて電磁ヒートシールド効果を検証することを目指しているが,この実験装置は近年導入された装置であるため,たびたび改修が繰り返されており,年度当初の段階で計測系を設計するために必要な情報が十分ではなかった.また,研究代表者が年度途中で遠隔地へ異動となった関係で,実験スケジュールを組むのに苦慮し,十分な実験機会を得ることができなかったことが理由として挙げられる.とはいえ計測系についてはすでに構築済であり,今後これを用いてデータ取得を行うことができると考えている.以上の理由により,達成度としては「やや遅れている」とした.本年度に引き続き,ICP加熱器を用いた実験計測を行うとともに,数値シミュレーションとの比較を行うことで,電磁ヒートシールド効果に関する知見の蓄積を図っていく.また,研究期間の最終年度であるため,成果をまとめ,その発信にも努める.また,ICP加熱器実験と平行して,岡山大学で整備されたアーク加熱風洞を用いた実験も進めていく.このアーク加熱風洞で生成されたプラズマ気流の条件を実フライト環境に近づけることを試み,その気流条件下での電磁ヒートシールド効果の計測データを得ることを目指す.これにより,実験データの蓄積を促進していく.宇宙工学・高速流体力学本年度に引き続き,ICP加熱器を用いた実験計測を行うとともに,数値シミュレーションとの比較を行うことで,電磁ヒートシールド効果に関する知見の蓄積を図っていく.本年度に構築した計測系を用いてデータ取得を進め,数値シミュレーションによる予測値との比較を行う.ただし,ICP加熱器実験と平行して,岡山大学で整備を進めているアーク加熱風洞を用いた実験も進めていく.これを用いて,ICP加熱器実験において懸念される実験機会の少なさを補完する形で,計測系の検証とデータ取得を試みる.なお,このアーク加熱風洞はアルゴンプラズマ気流を生成する装置であるが,これに窒素を加えた気流を作ることで,気流条件を実フライト環境に近づけることを試みる.一方,数値シミュレーションについては,実験データとの比較・検証を待たずに,実フライト環境下における電磁ヒートシールド効果についての検討も進めていく.実験計測に使用する計測系の整備
アコヤガイ赤化大量死原因物質の解明

この数年アコヤガイの赤化に続いて生じる大量死が問題となっているが,これまでに報告のあるプランクトン「ヘテロカプサ」種に起因するものとは異なっている.この大量死の原因と,この現象に関わる物質の解明を目指して研究を展開した.まず,アコヤガイの赤化現象に注目して分離を進め,赤色色素alloxanthinを単離した.しかし,この物質は稚貝に対して影響を与えないため,大量死の原因物質ではなく,結果として体内に蓄積されたものと推定した.さらに病貝の観察を行なった結果,血リンパ球の崩壊が観測された.そこで血球の崩壊活性と,稚貝に対する致死活性を調査した.また,活性試験に用いる稚貝は,共同研究者により今年度水温を制御することで,通年で同じサイズの個体を得ることに成功した.活性を指標として病貝抽出物の分画を進めた結果,殺稚貝活性物質の一つとして2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propaneを得ている.また,この物質以外にも精製を行なっている.さらに水層の分画を進めた結果,有機層から得られた活性画分と同一の極性画分に活性が集中している事を確認した.また病貝には健康貝と比較して多量に蓄積される白色結晶を確認した.この結晶を精製した結果,これまでにコレステロール及びその類縁化合物4種を確認している.また,今回の大量死では,死後に腐敗臭がしないことも特徴としてあげられる.これまでに,病貝抽出物抽出物には,嫌気性菌に対して,1ppm程度で成長を阻害する活性を確認した.さらに,養殖現場では海が荒れた後には海水が白濁し,その後に貝の症状が悪化することが観察されている.これまでに,愛媛県南予地方の養殖地周辺にて採集した白い潮の濃縮物が殺稚貝活性を示すことを確認しており,その精製と共に他の海水との比較を進めている.この数年アコヤガイの赤化に続いて生じる大量死が問題となっているが,これまでに報告のあるプランクトン「ヘテロカプサ」種に起因するものとは異なっている.この大量死の原因と,この現象に関わる物質の解明を目指して研究を展開した.まず,アコヤガイの赤化現象に注目して分離を進め,赤色色素alloxanthinを単離した.しかし,この物質は稚貝に対して影響を与えないため,大量死の原因物質ではなく,結果として体内に蓄積されたものと推定した.さらに病貝の観察を行なった結果,血リンパ球の崩壊が観測された.そこで血球の崩壊活性と,稚貝に対する致死活性を調査した.また,活性試験に用いる稚貝は,共同研究者により今年度水温を制御することで,通年で同じサイズの個体を得ることに成功した.活性を指標として病貝抽出物の分画を進めた結果,殺稚貝活性物質の一つとして2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propaneを得ている.また,この物質以外にも精製を行なっている.さらに水層の分画を進めた結果,有機層から得られた活性画分と同一の極性画分に活性が集中している事を確認した.また病貝には健康貝と比較して多量に蓄積される白色結晶を確認した.この結晶を精製した結果,これまでにコレステロール及びその類縁化合物4種を確認している.また,今回の大量死では,死後に腐敗臭がしないことも特徴としてあげられる.これまでに,病貝抽出物抽出物には,嫌気性菌に対して,1ppm程度で成長を阻害する活性を確認した.さらに,養殖現場では海が荒れた後には海水が白濁し,その後に貝の症状が悪化することが観察されている.これまでに,愛媛県南予地方の養殖地周辺にて採集した白い潮の濃縮物が殺稚貝活性を示すことを確認しており,その精製と共に他の海水との比較を進めている.
「再潅流と骨格筋細胞移植」は虚血心臓を不可逆的機能障害から救えるか?

1.初年度と次年度の研究実績から、第3年度の到達目標を、骨格筋細胞移植を前提として、"アダルト・ラット心筋細胞と骨格筋細胞の混合培養を行い、特に心筋細胞の生理特性の変化の有無を検討する"こととした.二年間の心筋培養研究により、通常培養法による伸展接着心筋細胞では、(1)個々の細胞レベルでの自動収縮運動は見られるが周辺細胞との同調収縮運動が見られない、(2)二週間以上の長期生存が困難である、(3)心筋細胞培養条件が骨格筋細胞培養条件に適さない、ことが判明し、これらの欠点を克服しうる心筋培養法を新たに確立する必要があった.そのため、従来の平面培養方式をやめ三次元培養方式に切り替えた.研究初期には、培養細胞が空胞変性を含む病理変化を来して死滅したため培養液及び添加物を検討し、最終的に三次元培養を可能にした.その結果、(1)培養液を週に一度交換するだけで二ヶ月以上の生存が可能になった、(2)多数のギャップ結合が細胞間に出現し、細胞塊としての同調収縮運動が得られた.この細胞塊をfunctioning clusterと称しすることにした.2.三次元培養法でアダルト・ラット心筋細胞と骨格筋芽細胞の混合培養を行った.実験系の簡略化のために骨格筋芽細胞としてL6細胞を使用した.混合培養を行うため両細胞の混合最適細胞数を決定し、この条件で混合培養を行ったところ、10日前後でL6細胞の外観が心筋細胞様に変化した.3.本研究は心損傷・障害に対処しうる再生医療研究につながり、最終目的は心筋組織の再構築である.現在の到達段階においても、三次元培養細胞塊はより劣悪な条件下での生存が可能で、細胞移植の臨床応用に適した細胞塊であると考えている.1.初年度と次年度の研究実績から、第3年度の到達目標を、骨格筋細胞移植を前提として、"アダルト・ラット心筋細胞と骨格筋細胞の混合培養を行い、特に心筋細胞の生理特性の変化の有無を検討する"こととした.二年間の心筋培養研究により、通常培養法による伸展接着心筋細胞では、(1)個々の細胞レベルでの自動収縮運動は見られるが周辺細胞との同調収縮運動が見られない、(2)二週間以上の長期生存が困難である、(3)心筋細胞培養条件が骨格筋細胞培養条件に適さない、ことが判明し、これらの欠点を克服しうる心筋培養法を新たに確立する必要があった.そのため、従来の平面培養方式をやめ三次元培養方式に切り替えた.研究初期には、培養細胞が空胞変性を含む病理変化を来して死滅したため培養液及び添加物を検討し、最終的に三次元培養を可能にした.その結果、(1)培養液を週に一度交換するだけで二ヶ月以上の生存が可能になった、(2)多数のギャップ結合が細胞間に出現し、細胞塊としての同調収縮運動が得られた.この細胞塊をfunctioning clusterと称しすることにした.2.三次元培養法でアダルト・ラット心筋細胞と骨格筋芽細胞の混合培養を行った.実験系の簡略化のために骨格筋芽細胞としてL6細胞を使用した.混合培養を行うため両細胞の混合最適細胞数を決定し、この条件で混合培養を行ったところ、10日前後でL6細胞の外観が心筋細胞様に変化した.3.本研究は心損傷・障害に対処しうる再生医療研究につながり、最終目的は心筋組織の再構築である.現在の到達段階においても、三次元培養細胞塊はより劣悪な条件下での生存が可能で、細胞移植の臨床応用に適した細胞塊であると考えている.初年度の課題としてラット心筋細胞培養に着手した。心筋細胞培養の基本的手技は、癌細胞培養法および心筋細胞培養を行っている論文を参考にした。この方法の問題点として癌細胞培養と異なり心筋細胞は1)培養可能心筋の回収率が悪いこと、2)培養心筋細胞の長期間(2週間)生存が困難なことの2点が明らかになった。とりわけ2)が問題で、結果的に45日間の生存であったため、当初目標としていた"骨格筋との混合培養時の相互作用"を観察するための2週間の培養期間に達し得なかった。その原因として「心筋採取時とトリプシン処理時に起きる心筋障害」が考えられた。そこで細胞培養初期段階で既に細胞が死亡していたり、生存細胞の短期間死亡が起こったものと推測した。心筋細胞の分離過程での心筋障害を可及的に軽減するために、培養手技の検証を行うとともに心筋保護液を使用して新停止させた心筋細胞を用いる等の工夫を施し、現在1週間程度の心筋細胞培養期間の延長を観るに至った。一方骨格筋細胞は心筋細胞と比較して、採取時の虚血には強いが、個々の細胞の分離が比較的困難であったため現在よりよい分離法を比較検討中である。昨年の到達目標の一つは培養心筋細胞の生存期間の延長問題で有った。昨年は心筋細胞の分離過程の見直しにより一週間ほどの生存期間の延長に成功した(つまり3週間ほど生存させえるようになった)。操作の都合上更なる寿命の延長が必要とされ、今年度は培養条件の工夫によりさらにその延長が可能になった。無血清培地では心筋細胞は一ヶ月ほど生存することが知られているが伸展接着心筋細胞の寿命は2-4週間であった。培養条件を検討した結果、マトリゲルの使用により伸展接着細胞でも平均一ヶ月から、長命な細胞では二ヶ月の生存が可能になった。

今年度の達成目標の一つは骨格筋のより良い分離方法の検討および培養系の確立であった。骨格筋サテライト細胞を調整する際にはフィブロブラストなど骨格筋を構成する様々な細胞の混入が避けられないが、クローニングの繰り返しにより純度の高い未分化の細胞の恒常的な培養に成功した。また未分化の状態で細胞数を増加させることが最終目標の達成に必須で有ったため検討を行った結果、bFGF,5-azacytidine等の併用により分化を押さえた状態で増殖を促し、細胞数を増やすように培養系をコントロールできるようになった。次のステップとして心筋細胞および骨格筋未分化細胞の三次元混合培養を行った。肝細胞はポリィウレタンフォームのなかで三次元培養したとき、スフェロイドを形成し細胞相互の連携が構築されると言われている。心筋細胞で試みてみたが、成功しなかった。また非接着性の担体を幾つか試してみたがどれもうまくいかなかった。他に非接着面上でのマトリゲルの併用、コラーゲンスポンジの利用、V字形の培養面上での高密度培養によるスフェロイド形成の促進等他の条件を試みようとしている段階である。従って動物実験には未だ至っていない。1.初年度と次年度の研究実績から、第3年度の到達目標を、骨格筋細胞移植を前提として、"アダルト・ラット心筋細胞と骨格筋細胞の混合培養を行い、特に心筋細胞の生理特性の変化の有無を検討する"こととした.二年間の心筋培養研究により、通常培養法による伸展接着心筋細胞では、(1)個々の細胞レベルでの自動収縮運動は見られるが周辺細胞との同調収縮運動が見られない、(2)二週間以上の長期生存が困難である、(3)心筋細胞培養条件が骨格筋細胞培養条件に適さない、ことが判明し、これらの欠点を克服しうる心筋培養法を新たに確立する必要があった.そのため、従来の平面培養方式をやめ三次元培養方式に切り替えた.研究初期には、培養細胞が空胞変性を含む病理変化を来して死滅したため培養液及び添加物を検討し、最終的に三次元培養を可能にした.その結果、(1)培養液を週に一度交換するだけで二ヶ月以上の生存が可能になった、(2)多数のギャップ結合が細胞間に出現し、細胞塊としての同調収縮運動が得られた.この細胞塊をfunctioning clusterと称しすることにした.2.三次元培養法でアダルト・ラット心筋細胞と骨格筋芽細胞の混合培養を行った.実験系の簡略化のために骨格筋芽細胞としてL6細胞を使用した.混合培養を行うため両細胞の混合最適細胞数を決定し、この条件で混合培養を行ったところ、10日前後でL6細胞の外観が心筋細胞様に変化した.3.本研究は心損傷・障害に対処しうる再生医療研究につながり、最終目的は心筋組織の再構築である.現在の到達段階においても、三次元培養細胞塊はより劣悪な条件下での生存が可能で、細胞移植の臨床応用に適した細胞塊であると考えている.
特別養護老人ホーム職員への死生学教育プログラムの開発と効果測定

介護保険導入以来、特別養護老人ホームでの看取りが積極的に行われる一方、死に向き合う教育を受けてこなかった職員は、戸惑い無力感を感じている。本研究では、特養職員を対象とした死生学教育プログラムを開発、実施し、その効果を測定した。研修前後で職員の死に対する態度に有意な差がみられ、下位概念である「死の不安」は軽減し、「死の積極的受容」は高くなった。死生学教育の効果として、職員が未知であり恐怖であった死を積極的に受け入れていく傾向が明らかになった。本研究は、「対人援助職の現場での専門職者の死生観を構築する必要性」に焦点を当て、福祉専門職者(特別養護老人ホーム看取り介護スタッフ)への死生学教育プログラムを開発し、効果測定することを目的としたものである。4年間の研究計画は、(1)死生学教育プログラムの前提となるニーズ調査(平成20年度)、(2)死生学教育プログラムの開発(平成21年度前半)とプログラム実施(平成21年度後半-22年度)、(3)死生学教育プログラムの効果測定(平成23年度)である。本研究は、福祉施設現場における現場専門職者を対象とした死生学教育プログラム開発と実施を目的とする。平成17年度より厚生労働省が介護保険での「看取り加算」を認めたことから、多くの特別養護老人ホーム(以下特養)が施設内看取りに積極的になっている。しかし、現場では目の前で起こる人の死をどう受け止めるかについて、死生観教育がなされておらず、多くの福祉専門職者は無力感からバーンアウト(離職)してしまう。この傾向は熱心なスタッフほど高い。その結果、サービスの質が低下し、高齢者のQOLが低下するという悪循環が起こっている。このような状況から特養現場では、死生学教育に対するニーズが高まり具体的プログラムが求められている。本年は4年計画の初年度として、プログラム開発のための基礎調査を行った。具体的な内容は次のとおりである。(1)フォーカスグループによるニーズ調査:特養の福祉専門職者を対象としたフォーカスグループにおいてニーズ調査を行った。参加者は、看取り介護をしている特養職員、看取り経験のある経験年数3年以上の職員とし、異なる施設・職種(福祉士・介護・看護・施設長)から8名。フォーカスグループでは、具体的看取り場面において不安な点(主観的客観的問題点)、必要とするサポート、自分自身の死の受け止め方、これまでに受けたターミナルケア教育、これまでの看取りの経験から学んだこと等についてディスカッションを行った。(2)特養職員の看取りニーズの分析:フォーカスグループから出されたニーズを、個人的ニーズ、対人関係(対利用者・家族)ニーズ、対施設ニーズ、教育的ニーズなどのタイプごとに分類した。これによって、死生学教育が焦点を当てるポイントが明確にされた。これをもとに21年度は、特養における死生学教育プログラムの開発(たたき台)を開発する予定である。平成21年度の計画に従い、特別養護老人ホームで看取りに関わる看護・福祉・介護専門職者を対象とした死生観教育を実施した。参加者は、大阪社会福祉協議会老人施設部会に所属する施設(約400施設)で看取り経験をしている福祉専門職者で施設長から推薦された40名。平成22年1月から2月かけて3回(3日間)計15時間の研修を実施し、効果測定を行った。測定に用いられた死生観尺度は、「死の恐怖」「積極的受容」「中立的受容」「回避的受容」の4領域を測定するものであり、教育の効果として「死の恐怖」得点の減少、「積極的受容」得点増加、「中立的受容」得点は変化なし、「回避的受容」得点の減少が期待された。研修の前後で4領域の得点の平均値に差があるかどうか検討するために、t検定を行った。結果は次の通り。「死の恐怖」(平均値の差=-3,t(70)=2.736, p=.008)「積極的受容」(平均値の差=2,t(70)=3.334,p=.001)「中立的受容」(平均値の差=.285,t(72)=.495,p=.622)「回避的受容」(平均値の差=.510,t(72)=.557,p=.579)。死生観教育の効果として期待された「死の恐怖」「積極的受容」については有意差が確認されたが、「中立的受容」「回避的受容」については有意差が確認されなかった。「中立的受容」と「回避的受容」の両尺度については開発段階より信頼性が乏しいとされ、今後の効果測定から除外することも検討する必要があると考える。

本研究は「対人援助職の現場での専門職者の死生観を構築する必要性」に焦点を当て,福祉専門職者としての特別養護老人ホーム看取り介護スタッフへの死生学教育プログラムを開発し,教育実践とその効果測定を目的とするものである.研究計画は(1)死生学教育プログラム開発(平成20年度-21年度前半),(2)プログラム実施(平成21年度後半-22年度)(3)死生学教育プログラムの効果測定(平成23年度)である.22年度は,開発された教育プログラムの実施(2回目)を行った.対象者は,大阪社会福祉協議会老人施設部会に所属する施設(約400施設)で看取り経験をしている福祉専門職者のうち研修希望者で,さらに施設長から推薦された32名。平成23年1月に3回(3日間)計15時間の研修を実施した.21年度の調査結果から,効果測定に用いる尺度(看取り介護者の態度尺度)を新たに開発し研修前後に用いた.看取り介護者の態度尺度は「死にゆく利用者への具体的態度」「利用者の死と痛みへの理解」「利用者・自身の死生観の必要性」の3領域を測定するものである.死生観教育の実施前後で3領域の因子得点の平均値に差があるかどうか検討するためt検定を行った.結果は次の通り:「死にゆく利用者への具体的態度」(平均値の差=.645,t(57)=2.723,p=.009),「利用者の死と痛みへの理解」(平均値の差=1.079,t(57)=5.136,p=.000),「利用者・自身の死生観の必要性」(平均値の差=.742,t(57)=3.315,p=.002).死生観教育の効果として期待された「死にゆく利用者への具体的態度」「利用者の死と痛みへの理解」「利用者・自身の死生観の必要性」の全ての領域について有意差が確認され,死生学教育の効果が実証された.平成23年度の計画に従い、特別養護老人ホームで看取りに関わる看護・福祉・介護専門職者を対象とした死生観教育を実施した。参加者は、大阪社会福祉協議会老人施設部会に所属する施設(約400施設)で看取り経験をしている福祉専門職者で、施設長から推薦された28名。平成24年1月に3回(3日間)計15時間の研修を実施し、効果測定を行った。第3回目の教育プログラム対象者は、第1,2回目に比べてターミナルケアに対する動機と経験の高い者とした。測定に用いられた尺度は、平成21年度、22年度のものと同じ「死に対する態度尺度」である。本尺度は、「死の恐怖」「積極的受容」「中立的受容」「回避的受容」の4領域を測定するものである。教育プログラム実施前後に同じ尺度を用いてプログラムの効果測定を行った。教育前後における4領域の因子得点の平均値の差の検定結果(t検定)は、次の通りであった。「死の恐怖」(平均値の差=2.772,t(21)=1.987,p=.060)「積極的受容」(平均値の差=-1.772, t(21)=2.401, p=.026)、「中立的受容」(平均値の差=.045,t(21)=.495,p=.960)、「回避的受容」(平均値の差=-.682, t(21)=1.050, p=.306)。死生観教育の効果として期待された「死の恐怖」は有意傾向、「積極的受容」については有意差が確認され、「中立的受容」「回避的受容」については有意差が確認されなかった。過去2回と今回の効果測定ともに、看取りスタッフの「死の恐怖」と「死の積極的受容」について、死生観教育プログラム実施前後で期待される変化が統計的に確認された。本プログラムは、特別養護老人ホームで看取りに関わる看護・福祉・介護専門職者らの死の恐怖を緩和させ、利用者の死に対して積極的に受容していく態度を促進させる効果があることが明らかとなった。
欧米とアジア諸国における科学教育拠点国としての日本の役割に関する研究交流準備

1.前回開催された、基盤研究Cの「日本の科学教育関連学会とICASE・PMEとの研究交流準備」の研究代表者である神戸大学発達科学部教授野上智行教授を初めとして,科学教育学会の理事や今回の研究分担者とメールや数回の会合を経て、日本の科学教育関係領域の国際化のための具体的な方略を立てた。2.その第一段階として、「科学教育拠点国」になるため、本研究交流準備に関わる、「国際会議」の案内と日本科学教育学会の英文の案内をホームページで公開を行った。この英文のホームページにより、約20数件の海外からの照会があった。一方で,「国際会議」が本研究テーマの主題に対してより示唆に富んだものとなるため、招聘者5人と密接な話し合いをメールを通して行った。4.上記の事業を通して,平成13年度以降に日本国内で開催される科学教育に関する国際共同研究のあり方を検討した。これによれば、日本の科学教育研究者がより多く海外に赴くことは必要十分条件である一方、より重要なことは、海外からの多くの研究者が日本で開催される科学教育関連学会に参加し,尚一層国際交流を深める機会を持つ努力をすることである。さらに、わが国に対する理数科教育支援の要望は強く、よりシステマテックな人的支援が必要である。
茶ポリフェノール成分による肝線維化と脂肪性肝炎の改善効果に関する研究

緑茶成分の慢性肝疾患への臨床応用に主眼をおいて計画を実行した。慢性肝疾患への緑茶成分の臨床的有用性を検討するために、ウイルス性慢性肝炎患者に対する緑茶カテキン高含有飲料の肝機能改善効果に関する無作為化比較治験、および緑茶カテキン高含有飲料の非アルコール性脂肪性肝疾患(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease)改善効果に関する無作為化比較治験を施行した。3群(A群カテキン高含有飲料茶カテキン1080mg/day、B群カテキン低含有飲料茶カテキン200mg/day、C群カテキンほぼ無含有飲料)の中から無作為に割付したひとつの群の飲料をウイルス性慢性肝炎では24週、非アルコール性脂肪性肝疾患では12週継続投与を行った。評価として、体重、BMI、体脂肪率、肝機能の血液生化学データ(ALT, AST, LDH)、酸化ストレスのマーカーである尿中イソプラスタン値、肝CT値の測定を行い比較した。C型ウイルス性慢性肝炎患者に対する治験では各データとも各群間で有意な差は認められなかったが、非アルコール性脂肪性肝疾患患者に対する治験では、カテキン高含有飲料群において他の郡に比較し有意に肝機能データ(AST)、酸化ストレスマーカー、肝脂肪の軽減によると考えられる肝CT値の改善が認められた。以上より、緑茶成分カテキン高含有飲料により非アルコール性脂肪性肝疾患患者では肝脂肪沈着の軽減とASTに代表される肝臓の炎症指標の改善が認められ、カテキン高含有飲料の定期的な摂取が非アルコール性脂肪性肝疾患の治療に有用であることが示された。緑茶にはカテキン類と称されるポリフェノール成分が含まれており、その抗腫瘍作用や抗動脈硬化作用が注目を集めている。本年度の研究では、dimethylnitrosamine(DMN)により誘導した実験的ラット肝硬変に対するin vivoによるEGCGの肝線維化進展抑制効果を検討した。9週齢のラットにDMNを投与し、21日間で硬変肝を作成した(LC群)。一部のラットには同時にEGCG 10mg/kgを連日静脈内投与した(EGCG群)。血液生化学としてAST、ALT、LDH、総蛋白、アルブミン、総ビリルビンについて検討した。ヘマトキシリン・エオジン染色およびアザン染色にて肝組織学的変化を検討した。次に、免疫組織染色で肝内α-smooth muscle actin(α-SMA)発現細胞の局在と、酸化的ストレスの評価のため4-hydroxynonenal(HNE)と8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(OHdG)発現細胞の局在を検討した。さらに肝組織中の線維成分のmRNA発現量を検討した。その結果、血液生化学的検討ではLC群に比べ、EGCG群では血清AST、ALTおよび総ビリルビン値の低下を認めた。組織学的検討ではLC群の肝組織で偽小葉形成とそれを取り囲む繊維束が観察され、類洞に沿ってα-SMA陽性細胞(HSC)が多く観察されたが、EGCG群ではそれらの変化はきわめて軽度であった。LC群ではHNEとOHdGの陽性細胞は主に類洞内や線維束内に観察されたが、EGCG群ではそれらの陽性細胞は少数であった。肝組織のI・III型コラーゲンとファイブロネクチンのmRNA発現量はLC群に比べEGCG群で有意に減少していた。今回の検討から、EGCGの投与により肝硬変ラットモデルの肝線維化進行が抑制され、その機序として肝星細胞の増殖抑制や細胞外基質産生抑制効果とともに肝非実質細胞への抗酸化作用の関与が示唆された。本研究の最終年度にあたり、緑茶成分の慢性肝疾患への臨床応用に主眼をおいて計画を実行した。慢性肝疾患への緑茶成分の臨床的有用性を検討するために、ウイルス性慢性肝炎患者に対する緑茶カテキン高含有飲料の肝機能改善効果に関する無作為化比較治験、および緑茶カテキン

高含有飲料の非アルコール性脂肪性肝疾患(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease)改善効果に関する無作為化比較治験を施行した。3群(A群カテキン高含有飲料茶カテキン1080mg/day、B群カテキン低含有飲料茶カテキン200mg/day、C群カテキンほぼ無含有飲料)の中から無作為に割付したひとつの群の飲料をウイルス性慢性肝炎では24週、非アルコール性脂肪性肝疾患では12週継続投与を行った。評価として、体重、BMI、体脂肪率、肝機能の血液生化学データ(ALT, AST, LDH)、酸化ストレスのマーカーである尿中イソプラスタン値、肝CT値の測定を行い比較した。C型ウイルス性慢性肝炎患者に対する治験では各データとも各群間で有意な差は認められなかったが、非アルコール性脂肪性肝疾患患者に対する治験では、カテキン高含有飲料群において他の郡に比較し有意に肝機能データ(AST)、酸化ストレスマーカー、肝脂肪の軽減によると考えられる肝CT値の改善が認められた。以上より、緑茶成分カテキン高含有飲料により非アルコール性脂肪性肝疾患患者では肝脂肪沈着の軽減とASTに代表される肝臓の炎症指標の改善が認められ、カテキン高含有飲料の定期的な摂取が非アルコール性脂肪性肝疾患の治療に有用であることが示された。
舌痛症を画像診断する～脳機能画像を用いて

舌痛症患者は末梢の神経障害などの異常は少なく、心理社会的要因の大きい疾患である可能性が示唆された。心理的な痛みや生理的な違和感の自身の舌を異常な状態と解釈し、反芻して舌のことを考え、筋緊張などを併発して悪循環していく、認知行動モデルが考えられた。破局的思考、状態不安、状態怒りなどの認知特性が強いものほど、この認知行動モデルに当てはまる可能性が考えられた。脳機能画像の評価でも、否定的な感情に伴い前帯状回などの活動が強く表れ、痛みに感情が影響しやすい可能性が考えられた。舌痛症は、口腔顔面痛外来を受診する患者において最も多い疾患の一つである。その病態については、微細な神経障害性疼痛や心理社会的要因によるものなど諸説あるが明確ではなく、治療法も一様ではない。また長期慢性化し難治性となるもの、日常生活に多大なる支障をきたす場合も多く、その病態理解と、治療法確立は急務であると考えられる。今回、我々は舌痛症患者の認知行動モデルとして考えられる、破局的思考(痛みの反芻、無力感、拡大視)、がん恐怖などに注目し、質問紙によりこれらの評価を行ったところ、健康対照群に比べ、破局的思考やがん恐怖、不安、怒りなどが有意に強いことが証明された。さらに、これらの認知特性に則した情動賦活試験を作成し、f-MRIでの評価を行う予定である。具体的な情動賦活試験としては、口腔内への痛み刺激と、視覚的情動刺激(快・不快刺激)を同時に与える試験や、気ぞらしを教示した状態で口腔内と他部位にさまざまな痛み刺激を与えた際の注意機能の試験を作成した。この情動賦活による行動実験では、健康対照群に比べて、舌痛症患者群では、痛みは情動による影響を受けやすく、他部位に比べて口腔内には注意が向きやすい傾向があることが分かってきた。今後は、情動賦活試験を行いながらのf-MRI撮像を行い、脳機能画像での評価を行っていく。また、作用機序の違う2つの投薬治療(神経障害性疼痛に対するプレガバリンと心理的要因に対するデュロキセチン)による効果からの病態評価、認知行動療法の治療効果の評価も並行してデータを集積している。今後はこの治療前後の脳機能画像評価も含め検討している。舌痛症患者の病態における心理的要因や認知行動モデルを確立するために、まず破局的思考(痛みの反芻、無力感、拡大視)や不安、怒り、癌恐怖などについての質問紙調査を行ったところ、健康ボランティアに比べ有意に患者群で破局的思考や不安、怒りが強く、また、破局的思考や不安が強い患者ほどに普段の舌の痛みを強く感じていることが判明した。次に、この認知特性に則した情動賦活試験として、怒り顔と中性表情の視覚刺激と、強弱2種類の電気刺激をランダムな組み合わせで与え、主観的な痛みの強さの評価を行う課題を作成し、健康ボランティアで行ったところ、怒り顔から受ける情動刺激は主観的な痛みを優位に増強させることが判った。そこで、慢性的な頭痛を有するボランティアを対象に、この情動賦活試験と、上述の質問紙調査、日常の頭痛強度の主観的評価を行い、比較検討を行ったところ、破局的思考や不安は日常の頭痛強度とは相関して強くなる傾向にあったが、怒り顔による痛みの増強とは有意な相関は示さなかった。このことは、今回の情動賦活刺激は慢性痛よりも急性痛に類似した電気刺激となるためで、破局的思考や不安の情動は慢性痛により影響する感情・認知であることが考えられた。現在は、舌痛症患者を対象にf-MRI撮像下で、この情動賦活試験を行い、脳機能的にはどのように変化しているかを検討している。また長期慢性化した疼痛疾患患者では、痛みは身体的要因のみならず社会・心理的側面と密接に関連し、その評価と治療にあたっては、新たな評価法が必要である。これらを解明するために、(1)作用機序の違う2つの投薬治療(神経障害性疼痛に対するプレガバリンと心理的要因に対するデュロキセチン)によりその病態を探り、(2)情動下における物理的刺激課題を用いた状態でのfunctional-MRI撮影により脳活動の違いを検討し、(3)認知行動療法を行い、そのすべての有効性を測るためにその前後における心理・社会的尺度、脳機能画像を測定することによって比較検討する。

現在は、研究の対象となる、舌痛症患者の器質因の除去のため、カンジダ筋の培養検査、唾液定量検査・ガムテスト、口腔内器質因の検索(義歯の状態・金属補綴物)、金属アレルギー検査、サーモグラフィーによる温度検査、レーザードップラー血流量計による血流量計検査、Aβ、Aδ、C神経線維ごとの電気刺激閾値検査、血液検査(Zn、Fe、エストロゲン、プロゲステロン、HbA1c、血中proBDNF)の検査を行い、研究対象の抽出を行っている。さらに、これら対象のfunctional-MRI撮影時の、情動化の物理刺激課題として、画像として喜びの刺激を行うときには強い電流刺激、悲しみの刺激を行うときには弱い電流刺激というように、情動とは逆の強さの電流刺激を行う、情動賦活試験を作成し、まずは健康ボランティアでの撮影を始めるところである。舌痛症は、口腔顔面痛外来を受診する患者において最も多い疾患の一つである。その病態については、微細な神経障害性疼痛や心理社会的要因によるものなど諸説あるが明確ではなく、治療法も一様ではない。また長期慢性化し難治性となるもの、日常生活に多大なる支障をきたす場合も多く、その病態理解と、治療法確立は急務であると考えられる。また長期慢性化した疼痛疾患患者では、痛みは身体的要因のみならず社会・心理的側面と密接に関連し、その評価と治療にあたっては、新たな評価法が必要である。本研究ではこれらを解明するために,心理質問紙による患者の認知特性について評価、検討を行い、さらに、情動下における物理的刺激課題を用いた状態でのfunctional-MRI撮像により脳活動の違いを評価・検討した。心理質問紙による検査では、患者群では、破局的思考(不安・無力感・拡大視)、特性不安、特性怒り、怒りの抑制、怒りの表出、認知的不安、逃避回避、恐怖が有意に高く、これらの認知特性が非器質的な舌痛のひとつの誘因になっている可能性が示唆された。functional-MRIによる情動・物理刺激課題としては、怒り顔の表情写真と電気刺激を組み合わせた課題を行った。健常ボランティア群でも患者群でも、怒り顔の表情写真によって不安、怒りなどの感情が惹起され、主観的な痛みも増強し、脳活動としても、前帯状回や前頭前野、視床の活動が高まることが判ったが、患者群で、より情動刺激に伴い痛みが強くなることが判った。この結果より、舌痛症患者は感情の変化に伴い、痛みの増強が起こりやすい可能性が示唆された。歯科麻酔学舌痛症の病態理解という点で、舌痛症群で質問紙による心理的評価が、健康対照群と比較して行え、特異的な変化が認められたので、進展していると考えられるが、この認知行動モデルに則した、情動賦活試験作成に試作を繰り返したため時間を要し、現時点ではやや進行は遅れている。現在の情動賦活試験での脳機能画像評価がうまくいけば、今後の進展は円滑に行えると思われる。情動賦活試験の試作を繰り返し、時間を要したため、期間延長する形となった。f-MRI撮像に同意してもらえる対象患者が無事に集まれば、今後は遅滞なく進んでいくと考えられる。現在は、対象となる患者を抽出し、器質因を除外する検査まで進展している。情動賦活試験の作成に時間を要したため、MRI撮影開始まで時間を要したが、今後健康ボランティアから開始し、特異的な変化が認められれは、すぐに対象患者でも撮影が始められる。ベースの対象の選定のための、器質因除去の検査を充実させることや、情動賦活試験作成に時間を要したが、MRI撮影が開始すれば順調に進んでいくと思われる。舌痛症の認知行動モデルに則した情動賦活試験下での脳機能画像評価を行っていく。
ショウジョウバエを用いたハンチントン病病態研究

ハンチントン病はCAGリピート病であり、遺伝性脊髄小脳失調症を含む一群の疾患(ポリグルタミン病と呼ばれる)のひとつである。本疾患群ではポリグルタミン凝集体形成が病態の形成に重要な役割を話していると考えられている。本研究ではショウジョウバエを用いてポリグルタミン病のモデルをハンチンチンエクソン1+EGFPを発現することによって作成する。この可視化したモデルを用いることにより、遺伝学的手法を用いてこのポリグルタミンによって引き起こされる病態を制御する因子を探索する。本年度:昨年度作成したショウジョウバエ神経系細胞にハンチンチンエクソン1とGFPの融合蛋白を発現する系とショウジョウバエ個体レベルを作成した。この細胞系を用いてRNAi libraryによって凝集体形成に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。1)ArrayScanによって大量の遺伝子のスクリーニングを効率よく行えるようにした。2)7000余の遺伝子をスクリーニングし、うち400遺伝子(絞り込んだもので100)に凝集体に影響を与える可能性があると判断した。3)これを機能よって分別し、関連するカスケードを細胞レベル、個体レベルの系で検討している。従来言われているシャペロン系や、プロテアソーム系は候補としてあげられているが、これ以外のカスケードについてはどのような機序で関与しているか詳細な解析が必要である。現在解析中の系ではカスケードの主要な作用点に近い遺伝子がこのスクリーニング系では検出される傾向があるようである。本疾患群ではポリグルタミン凝集体形成が病態の形成に重要な役割を果していると考えられている。本年度:ショウジョウバエにおけるポリグルタミン発現による細胞毒性の検討のため、ハンチンチンエクソン1とGFPの融合蛋白を、発現する系を細胞系とショウジョウバエ個体レベルで作成した。1)細胞レベルでは発現は誘導できるようにして、蛋白発現のコントロールを可能とした。2)細胞レベルではGFP蛍光を用いて凝集体形成をモニターする系についてArrayScanを用いて確立した。3)個体レベルでは視細胞にGFP蛍光を発する凝集体を形成するようにして、観察を容易にした。現在個体レベルで他のポリグルタミン病においてポリグルタミン毒性を抑制、ないし促進するといわれている遺伝子に関して、我々の系において検討を行った。従来の報告とほぼ同じ結果であるが一部異なる結果を得ているものもあり、これが疾患遺伝子の差によるものか、系の違いによるものか検討を加えている。