hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視・聴・嗅覚受容器における脂質の役割を、脂肪酸結合蛋白の機能解析を通して追究する

FABPとE-FABPを標識として初めて容易に可能なことが判明した。この所見から、従来は内在性ミクログリアと外来性マクロファージの明確な区別が不可能なことから未詳の種々の脳における病的反応の解明にこれら二種のFABP抗体の有用性が強く示唆された。これらの所見を踏まえて、今後は聴覚受容器におけるFABPsの発現局在解析を今後遂行する。成熟マウスの内耳ラセン器構成細胞におけるFABP分子種の発現局在を免疫組織化学的に精査した。内耳の蝸牛管ではH-FABPが内外柱細胞と外指節細胞に発現し、B-FABPが境界細胞とヘンセン細胞およびラセン板縁とラセン隆起の線維芽細胞に発現局在した。これらは全て支持細胞の一種であるが、内外の有毛細胞はいずれのFABPをも発現しなかった。内耳の支持細胞がいくつかの生理活性分子を発現することは最近報告されている。ある種のチャンネルに加えてシクロオキシゲナーゼがヘンセン・ダイテルス細胞に、プロスタノイド受容体が指節細胞とヘンセン細胞とラセン靭帯線維芽細胞に発現することが報告され、これらは細胞内や膜の脂肪酸を含む脂肪代謝関連分子と関係が深い。また、内耳の支持細胞は非哺乳類では有毛細胞の幹細胞であることが最近報告され、内耳でのB-FABP遺伝子発現がCOUP-TF1転写因子で制御されることも報告されている。哺乳類脳ではB-FABPがグリア細胞に発現し、海馬ではニューロンとグリアの幹細胞とみなされるラジアルグリアにB-FABPが発現することも知られている。よって、今回明らかにされた内耳支持細胞にB-,H-のFABPが発現することは、脂肪酸を含めた細胞内脂肪環境が聴覚受容の有毛細胞の機能に影響を与える可能性を充分に示唆する。しかし、本研究で予備的にB-,H-FABP遺伝子ノックアウトマウスでの型の如くの聴覚テストでは未だ明確な異常は検出されなかった。今後は検出条件と刺激条件を種々変えて何らかの聴覚障害の有無を調べる予定である。加えて、リンパ節ではB-FABPが網状細胞に局在すること、そして、この遺伝子欠損マウスではCD4細胞の構成割合が野生型に比して有意に大きいことを明らかにした。この所見から、B-FABPが網状細胞を介してT細胞のホメオスターシスの維持に関与することが示唆された。
環境ストレスが微細藻類の遺伝的変異に与える影響

集団中の遺伝的変異は集団が人為的環境ストレスにどれだけ適応できるかを決める要因となる。集団内の変異の維持は、変異の供給源の存在や、集団サイズそのものによっても影響を受ける。本研究では、人為的な環境ストレスとして除草剤を選び、これに高濃度に暴露される水田藻類であるミカヅキモ集団内の変異の程度を、アロザイムや除草剤ストレスの有無などから検討することを目的とした。まず微細藻類群集が除草剤の影響を受けて耐性群集に変化する事実を、実験水田を用いた研究で確認した。比較的大きなストレスのかかる水田では、耐性群集への移行が種組成の変化だけではなく、耐性系統への入れ替わりによっても起こることが確認された。琉球諸島には、除草剤を使用する水田と、放棄水田や低層湿地など、除草剤の影響が及ばない環境とが数多く残されていた。ここから採取したミカヅキモの遺伝的変異を調べることによって、除草剤ストレスが遺伝的多様性に与える影響を推測することができた。現在ではほとんど水田耕作が行われておらず、ミカヅキモにとって好適な生息場はほとんどが放棄された湿地状態になっている沖縄本島の集団には中立遺伝子の変異が残されており、除草剤による集団サイズの縮小や選択がおこらなかった集団であると考えられた。一方、八重諸島では、現在でも盛んに水田耕作が行われており、除草剤を用いた水田管理が行われていた。このような水田に生息した集団はアロザイム変異が見られず、除草剤によって選択された集団である可能性を示唆した。この様に、除草剤ストレスが集団の遺伝的変異を減少させている可能性が示された。また、アロザイム変異だけでは集団内の変異の検出に限界があることがわかり、より多くの集団内変異を検出する手法としてマイクロサテライト変異を利用するため、そのプライマーの開発を試み、その手法を検討した。接合藻ミカヅキモ(Closterium ehrenbergii)のクローン培養株から細胞を集め、粗酵素を抽出し、アクリルアミドゲル電気泳動と活性染色法により15酵素のアロザイム変異の検出を試みた。これらのうちホスホグルコムターゼ(PGM)、ホスホグルコースイソメラーゼ(PGI)、6ホスホグルコン酸脱水素酵素(6PGD)、NADP依存イソクエン酸脱水素酵素(IDH)、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)の5酵素について判別可能なバンドが得られた。半数体生物であるミカヅキモでは、何量体の酵素であれ1遺伝子座につき1本のバンドしか現れないはずだが、2本ないしそれ以上のバンドが現れ、今後遺伝解析や遺伝子重複の解析を行う必要が認められた。遺伝解析を行っていないためパターン認識によってどの程度の変異があるかを調べた。ミカヅキモコンプレックス(互いに近縁な交配群のまとまり)には現在11の交配群があるが、PGM.PGI.6PGDには交配群内の変異が認められ、IDHとAATには主として交配群間の変異がみられた。田植え直後の水田や放棄水田、放棄イ草田などから採集した20集団から、各集団につき20から100個体を分離しクローン培養を確立した。これらの集団のうち交配型プラスとマイナスの比が1対1に分離した9集団についてPGMとPGIの変異を比較した。田植え直後の水田から採取した集団はどちらの酵素についても単型的であったが、放棄水田や放棄イ草田から採取した集団はPGMだけか両方の酵素について多型的であった。

この結果はアロザイムのような適応中立形質の変異の多様さと除草剤耐性のような適応形質の変異の程度との関連を示唆したため、今後は、より多くの遺伝子座の変異を検出する方法を見つけるとともに、アロザイム変異の多様さと除草剤耐性のような適応形質の変異の程度の関係を調べる必要があることがわかった。前年度に調べたアロザイムの遺伝解析を、ホスホグルコムターゼ(PGM)、ホスホグルコースイソメラーゼ(PGI)、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)について行ったところ、AATのみが明瞭なメンデル遺伝を示し、他の酵素の遺伝解析はできなかった。そこで、より多くの遺伝的変異を見つけるためにマイクロサテライトに注目した。マイクロサテライトは、2ないし数塩基の単純な繰り返し配列で、個体間、あるいは集団内で豊富な繰り返し数の変異があることがすでにかなり多くの動植物で知られている。マイクロサテライト配列自体はどの生物にもあるといわれているが、ミカヅキモではプライマーが知られていないためすぐに解析に使えないが、優れた遺伝マーカーとなるため、まずそのプライマーの検索を行った。頻度は一般に動物より植物の方が少ないと考えられているため、ゲノムDNAを抽出、制限酵素による消化の後、適当な処理を施し、他の生物から予想して設計したマイクロサテライト配列をプライマーとして用い、ゲノムDNA断片中のマイクロサテライト配列の濃縮を行った。その後、サザーンブロットを行い、11種類の標識したマイクロサテライト(設計した配列)による交雑を行い、ゲノムDNA中にどのような種類のマイクロサテライト配列があるのかを推定した。その結果、2塩基の繰り返し配列及び3塩基中2塩基が同じ繰り返し配列の存在が確認された。一方で、マイクロサテライト配列を利用して濃縮したゲノムDNA断片をベクターに取り込み、トランスフォーメーションし、ライブラリーを作った。マイクロサテライトのプライマーを決める見通しだったが、変異の検出に関しては今後の問題である。前年度に引き続き、より多くの遺伝的変異を見つけるためにマイクロサテライトのプライマーの検索を行った。マイクロサテライト配列はどの生物にも共通して見られる2ないし数塩基の単純な繰り返し配列であるが、その両脇の特異的な配列をプライマーとして用いて特定の遺伝子と同様にPCRによって増幅し、変異を検出することができる。本研究の対象生物であるミカヅキモではプライマーが知られていないため、そのプライマーの検索を行っている。マイクロサテライト部位は種レベル以下の構成単位の遺伝的変異を検出するほとんど唯一の、優れたマーカーであるため、時間を要しても検索する必要があった。シャジク藻綱に属するミカヅキモは、系統的に比較的高等植物に近いため、高等植物のマイクロサテライト配列を参考にして、独自に設計したマイクロサテライト配列を利用し、ゲノムDNAの制限酵素断片中のマイクロサテライト配列を含む断片の割合を増やすといった方法を用いた。この方法を利用して作製したライブラリーを、アンピシリン添加培地にまき、培養してコロニーを形成させた。コロニーを膜に転写し、アルカリ変成、UV固定を行った後、^<32>Pで標識した15種類の、独自に設計したマイクロサテライトオリゴマーと反応させた。^<32>Pで標識したマイクロサテライトオリゴマーと結合し、ラベルされたコロニーを分離し、200mLのアンピシリン添加LB培地で一晩培養した。増殖した菌を集め、DNAを抽出・精製した。抽出したDNAはその一部を制限酵素で切断し、インサートの有無を確認した。
タイ労働法における国際標準化と現実の乖離に関する研究

「法と現実」との乖離を埋める課題は、法律学にとって古典的な課題であるが、タイのような経済発展を急速に進めている国の場合、この課題には2つの側面がある。1つは、国内法と現実との関係の側面であり、もう1つは、国際的な基準と現実との関係の側面である。とくに、グローバリゼーションが進展している状況の下では、国際的側面が重要である。グローバリゼーションの視点からタイ労働法の動向を見た場合、労働団体法と労働保護法の分野で大きな違いがあるように思われる。労働保護法の分野では、98年の労働保護法の制定に見られるように、ILO基準との整合性が図られており、その意味で、国際労働基準との一致が追求されている。しかし、労働団体法の分野では、近年の労働法改革において労働組合の保護を強化する方向には向いていない。その理由は、グローバリゼーションの中で影響力を高めてきた企業家が、労働組合は国際的な経済競争を勝ち抜く上で障害になると評価しているからだと思われる。では、現実の変化に対応し、「法と現実」との乖離を埋めるための労働法改革はどのような方向に向かうのか。1997年の通貨危機の経験を通じて、再度、伝統的な規範の評価が認められる。しかし、それは開発法制への回帰ではなく、協調的労使関係への回帰であるように思われる。その装置が1999年の労働関係法改正草案が新たに定めた合同協議委員会である。また、企業自体が大きくなっている条件の下で、むしろ交渉や協議を通じた労使関係の方が合理的だと考えられつつあるように思われる。さらに紛争解決手続を一層丁寧に規定しようとしている。このような労働法改革の帰趨は、タイ労働法が開発法制を清算し国際標準化を達成するかどうかを占うことになる。タイは創立当初からILOのメンバーであり、最初の労働法である1956年の労働法を制定するときILOの援助を受けるなど、労働法の国際標準化に早くから取り組んできた。しかし、タイはILOのコアの7条約のうち29号条約・165号条約(強制労働の廃止)と100号条約(同一報酬)を批准しているだけである。とくに、団結権に関する条約は批准していない。そして1998年に保護を強化した労働保護法の制定が行われたが、労働団体法については規制を強化する法案が政府で議論されている。このような逆の態度となる理由は、(1)労働条件保護の規制は、いわば使用者として共通の負担を背負わせるものであること、(2)劣悪な労働条件は経済全体の回復にとってもマイナスであること、(3)ILOの労働条件基準はタイで受容できるレベルであること、などによる。それに対して、労働組合の結成を促進するような立法は使用者に共通の問題となるより、かなり個別的な問題である。したがって、労働組合を保護する立法については使用者からの反対が強い。とくに、1999年末に労働側が独自の立法提案をするに至っては、国会での立法に向けた議論は困難が予想される。労使間の対立や国民の間での争点をわざわざ提供するのは経済危機の下では決して得策ではない。このように、一方で労働保護が強化されているが、他方で労働組合に対する保護は後退する可能性があるなど、タイの労働法が全体として国際基準に一致させる方向に向かっているとはいえない。グローバル化の矛盾は、まずもって労働者に対して現れるから、その解決のために労働法の改革が課題である。近年のタイの労働立法は、1998年の労働保護法に見られるように、ILO基準との整合性を図ることに目的のひとつがあり、その意味で、国際標準化が進んでいるといえる。

しかし、それは労働保護法の分野について言えることであって、労働団体法の場合には、必ずしも同様の方向に向かっているとは言えない。その大きな要因は、グローバリゼーションである。つまり、グローバリゼーションの下で力量を付けてきた企業家層が労働組合に親和的ではない態度を取る傾向が認められるからである。では、労働法改革はどのような方向に向かうのか。1997年の通貨危機の経験を通じて、再度、伝統的な規範の評価が認められる。しかし、それは開発法への回帰ではなく、協調的労使関係への回帰であるように思われる。その装置が労働関係法改正草案が新たに定めた合同協議委員会である。また、分散的で弱小な組織ではなく、企業自体が大きくなっている条件の下で、むしろ交渉や協議を通じた労使関係の方が合理的だと考えられつつあるように思われる。さらに紛争解決手続を一層丁寧に規定しようとしている。しかし、これだけでは不十分である。三者構成機関は、上記のように協調的労使関係のための装置であったが、他方で、機関の代表選挙が一組合一票方式のため労働組合を少数乱立させる役割も果たしてきた。これらも同時に改革することなしには、上記の政策目標は達成しがたいと思われる。
異常状況下でのI_K電流ブロッカーの頻度依存性効果

致死性不整脈の治療薬として最も注目をあびているクラスIII群の頻度依存性効果を調べた。0.2HZ刺激下では新しいIII群薬セマチライドは静止電位,立ち上がり速度に影響を与えることなく,活動電位持続時間(APD)を10μMでは28%,30μMでは55%,100μMでは74%と濃度依存性に延長した。2.5Hz刺激に変えたとき、30μMではAPDは10%前後の延長効果にとどまり、本剤がAPDに対して逆頻度依存性をしめした。本剤はI_K電流を10mVより脱分極側でI_K電流を40-60%抑制し、そのI_K電流の抑制は長いパルスより短いパルスで強く、主として速く活性化するI_<Kr>を抑え、遅く活性化するI_<KS>への影響は少ない。その際、Ca電流I_<K1>電流には影響はなかった。頻拍時には興奮終了から次の興奮迄の拡張期間隔は短いので本剤の結合の状態依存性を調べた。I_Kを充分活性化後、種々の拡張期間隔でパルスを与えると、本剤存在下では拡張期間隔の延長に伴いI_Kは強く抑制され、静止状態に強い親和性を示した。頻拍時に活性化する電流の一つに一過性外向き電流時にカフェイン感受性電流が知られており、頻拍時のAPD短縮に寄与している。そこで2.5Hz,150拍のパルスを与え、その最終拍のカフェイン感受性電流に対する本剤の効果をみた。薬剤投与前後で差は認められなかった。以上よりAPD延長効果が本剤に抵抗性のI_<KS>が頻拍時に活性化すること、静止状態への薬剤の親和性、カフェイン感受性一過性外向き電流への無効なことなどが寄与することがわかった。頻拍性不整脈中に本剤の投与が有効であるので、異常環境下の頻拍時の本剤の効果を調べた。pKaは7.6なので、pH6.8,pH7.4,pH7.8でのAPD延長効果をみた。0.2Hz刺激下で30μMはpH6.8で13%/n=30)pH7.4で21%(n=18),pH7.8で34%(n=10)の延長効果を示したが、各群間には有意差はなかった。0.2Hzより2.5Hzに刺激を与えたときのAPD短縮率はpH7.4で25%,pH6.8で23%に対して、薬剤存在下では20%,と13%と酸性側で薬剤のAPD延長効果が増強した。すなわち異常下では薬剤の効果が異なることがわかった。しかし虚血類似条件下や他のIII群薬の効果を検討するには至らなかった。
強固上皮付着を目指した液中プラズマ放電ナノ・ディンプル付与金属インプラントの開発

脆弱なインプラント-上皮付着能により惹起されるインプラント周囲炎は、時としてインプラント除去に至らしめる。本研究は近年開発され、未だ研究対象になっていない液中プラズマ放電によるナノディンプル付与チタン(液中放電Tiと呼ぶ)を作製し、チタンと口腔粘膜上皮細胞の付着状態を2次元および3次元培養にて検討を行った。結果、液中プラズマ放電により、Ti表面に一様なナノオーダーディンプルを付与させることができた。また、その表面には細胞増殖、細胞親和性が認められ、細胞の付着も良好であった。さらに、液中放電Tiと上皮との付着環境が悪くとも、上皮と剥離することなく付着しているのが確認された。本研究では近年開発され、未だ研究対象になっていない液中プラズマ放電によるナノディンプルチタン(液中放電Tiと呼ぶ)に着目した。液中放電Tiが口腔粘膜上皮細胞の付着をより強固にすることを実証し、ナノディンプル加工がインプラント周囲炎の防御に有益であることを示し、新たな歯科用金属インプラント開発を行うことを目標とした。Ti板では表面に均一なディンプルが出来ないことから、Tiチューブを採用し、全表面にマイクロ単位の凹凸が少ない一様なナノオーダーのディンプルを付与することに成功した。またマッピング分析を行ったところ、表面の酸化層の他にリンやカリウムも存在していた。次に、液中放電Ti表面上にヒト口腔粘膜上皮細胞を播種した2次元培養にて、細胞親和性、増殖、細胞剥離試験から接着能を検討した。液中放電Tiの細胞増殖は対照の鏡面Tiよりも弱いものの、細胞親和性が認められた。また細胞接着では、対照より液中放電Tiの方が、長時間細胞が基板上に存在したことが確認できた。3次元培養では、細胞剥離を促すようにするための炎症惹起状態培養での鏡面Ti板と上皮を確認すると、基板から上皮が離れているようであった。それに対し、液中放電Tiと上皮を確認すると処理表面と上皮が接しているように見られた。以上の結果から、液中プラズマ放電ナノディンプル付与Tiは、その表面の形態、性状から上皮細胞と強固に接着し、その細胞増殖までも抑制してしまうことが考えられた。しかし、液中放電Ti処理表面と上皮との接着は、問題なく接着されていたことが観察された。これらのことから、液中放電Tiは、上皮細胞、上皮と強固に接着することが示唆された。1.液中プラズマ放電ナノディンプル付与チタンの作製(1)チタン板にプラズマ放電をかけたが、板の辺縁にスパークが生じ、板の全面にナノディンプルを付与することが出来なかった。このため、チタン板の代わりにチタンチューブを用いてプラズマ処理を行ったところ、辺縁がないことから、スパークを生じさせずに、チタン表面全体に表面に均一なナノディンプルを作製することが出来た。(2)液中プラズマ放電の電圧、電流、処理時間条件を変えて、チタンチューブを処理したところ、ディンプル付与表面の性状やディンプル作製量に差が生じた。2.プラズマ放電処理されたチタン表面の形態、性状の解析(1)走査型顕微鏡では、221V, 2.6Aでプラズマ処理10分では、221V, 2.6Aでプラズマ処理5分より、ナノ単位のディンプル量が多く、マイクロ単位の凹凸が少なかった。(2)ディンプル付与表面に対し、元素マッピング分析を行ったところ、表面の酸化層の他にカリウムやリンも存在した。これは、プラズマ処理に用いた電解液がチタン表面に組み込まれたと考えられる。3.ヒト口腔粘膜上皮細胞を用いたナノディンプル付与チタン上での培養における細胞親和性の確認(1)チタンチューブを細断することで、湾曲の少ない細胞培養基材を作製し、これを用い、細胞培養を行った。(2)当初、細胞播種数を1.5×104cells/cm2としたが、細胞播種集が少なすぎたため細胞増殖を確認することが出来なかった。そこで、最適細胞播種数を変更し6×104cells/cm2で培養を試みたところ、ナノディンプル付与チタンはヒト口腔粘膜上皮細胞に対し、親和性があり、細胞増殖も認められた。一番の理由は、基板作製に多大な時間を弄したことにある。1.実験計画を立てた当初、チタン板を用いて行う予定であったが、予想外にナノディンプル付与が出来ず、最適基板を探すのに時間を費やした。2.最適基板を見つけたものの、細胞培養を行うには形態が不適切であったため、細胞培養に適切な形態を模索および作製するために時間が費やされた。この2点を解決するのに約10か月近く要した。

そのため、初年度に行う予定であった、ヒト口腔粘膜上皮細胞を用いた2次元培養の着手が遅れてしまった。以上のことから、現在までの達成度は、やや遅れていると判断した。現在、細胞培養に用いるナノディンプル付与チタンの培養基板作成法を確立したため、細胞培養に障害がなければ、非常にスピーディーに細胞培養実験を進めることが可能となった。また、3次元培養に関してチタンチューブの形態を壊すことなく培養に用いることが出来るので、3次元培養用の培養基板の作製に時間を費やさずに行える。今後は、1.通常培養および炎症惹起状態での2次元培養(1)形態学的分析(2)細胞増殖、細胞代謝活性の分析(3)細胞接着に関与する細胞骨格と接着分子発現の分析2.通常培養および炎症惹起状態での2次元培養(1)形態学的分析(2)細胞接着に関与する細胞骨格と接着分子発現の分析を行い、学会、論文発表を行う。次年度研究費総額に対し、以下の割合で使用予定とする。1.物品費(金属基板作製材料、細胞培養試薬、抗体・試薬類、細胞培養器具類など):65%2.旅費(学会参加など):25%3.その他(論文投稿など):10%
インクレチンシグナルによる膵β細胞障害阻止と膵β細胞再生の試み

インクレチン投与により膵β細胞のアポトーシスが抑制され、小胞体ストレスマーカーとミトコンドリア由来活性酸素の抑制が認められた。またPDX-1陽性細胞を単離抽出し、網羅的遺伝子発現解析を行っており、新規膵β細胞分化因子の同定を目指す。インクレチンによる膵β細胞障害阻止機構および膵β細胞再生機構を明らかにする。2型糖尿病モデルマウスでインスリン分泌障害を来すdb/dbマウスに、インクレチンの一種でglucagon like peptide-1(GLP-1)のアナログであるexendin-4を投与する。1.インスリン分泌低下を示す14週齢のオスdb/dbマウス16匹を2群に分けた。2.コントロール群8匹を生理食塩水投与群とし、ex-4群8匹をexendin-4投与群とした。4. ex-4群では30μg/kg/dayのexendin-4を持続皮下注できるよう設定し、コントロール群では同volumeの生理食塩水を持続皮下注できるようにした。5.現在、投与1週間が経過しており、順調に実験が進んでいる。6.実験は4週間を予定しており、その後、糖代謝の検討、膵島を単離して(1)小胞体ストレスの関与をみるため分子シャペロン(Bip、IRE1α、calnexin、calreticulin etc)の発現をRNAおよび蛋白レベルで検討する。(2)酸化ストレスの関与をみるためにミトコンドリア活性酸素種の有無をMitotracker Red CC-1染色de検討する。現在の実験途中の状況にあるため、十分な考察ができていないが、実験が順調に推移しインクレチンによる膵β細胞障害阻止機構および膵β細胞再生機構を明らかにできると考えている。1.2型糖尿病モデルマウスにおける細胞再生の誘導と細胞傷害機構の解析ンスリン分泌が低下する高齢db/dbマウスにex-4を持続皮下投与(30μg/kg/day)するとコントロール群に比して、空腹時血糖値・随時血糖値が低下し、血中インスリン値が増加した。また体重減少が抑制された。膵β細胞において小胞体ストレス分子のうちBipとIRE1α発現はex-4群にて有意に低下した。Calnexinとcalreticulinは不変であった。またアポトーシス関連旨分子であるCHOP, caspase-12,cleaved-caspasc-3発現はex-4群で低下した。酸化ストレスマーカーであるMitotracker Red CC-1の蛍光強度はex-4群で低下し、再生膵においてPDX-1発現の増強が観察された。PDX-1 promotor-eGFP TgマウスにSTZ投与にて糖尿病を誘発した。この糖尿病マウスにex-4を投与することにより糖代謝・インスリン分泌力が改善した。再生膵にはPDX-1陽性緑色蛍光が強く観察され、これらを単離し、網羅的遺伝子発現解析により新規膵β細胞再生・分化因子の同定をめざしている。
埋立人口島の残留沈下・側方変形特性とその防止工法に関する研究

近年,我国ではウォーターフロント開発がめざましく,臨海埋立地や沿岸埋立人口島の建設がさかんに行われているが,一方では,埋立造成地盤の残留沈下,側方変形に起因する構造物被害が顕在化している。このため,埋立造成地盤の残留沈下と側方変形を的確に予測し,確実な対策をこうじること重要となってきている。本研究は,大規模埋立人口島の多次元残留変形機構を解明し,その結果に基づいて残留沈下・側方変形の予測手法とその防止工法を確立することを目的として,平成3年度平成4年度にわたって実施された。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。(1)有限要素法による埋立人口島の数値シミュレーションを実施し,その結果と実測挙動から,大規模埋立人口島の多次元残留変形機構を明らかにした。(2)残留沈下・側方変形特性に基づいて,大がかりな解析を行うことなく埋立人口島の残留変形,特に残留側方変形を予測するための簡易予測手法を提案し,その適用性を実測挙動,数値シミュレーション結果により明らかにした。(3)埋立人口島の多次元残留変形機構に基づいて,残留変形を低減するための埋立人口島造成工法を提案し,これらを実際の埋立人口島造成に適用した場合の数値シミュレーションを実施し,その有効性を検討した。本研究は,大規模埋立人工島の残留沈下・側方変形機構を解明し,その予測手法を確立するとともに残留変形を低減する造成工法および早期有効利用技術の開発のための基礎的検討を行うことを目的としているが,平成3年度に行った研究によって得られた新たな知見等の成果は以下のとおりである。1.まず,大阪湾における埋立人工島の工事記録,土質調査資料,実測デ-タを調査収集し,埋立人工島の残留変形挙動を把握するとともに,埋立完了後に生じた残留沈下・側方変形と地盤条件,締切護岸構造,海底地盤改良工法,埋立材料,埋立方法,埋立履歴との関連性を分析した。その結果,多くのケ-スで埋立地盤の側方変形量と海底地盤面の不等沈下勾配の間に強い相関性のあることが明らかになり,マクロな多次元変形機構が確認された。2.調査収集した埋立人工島について,提案する弾粘塑性多次元圧密有限要素解析法により実際の造成過程を忠実に考慮した数値シミュレ-ションを行い,シミュレ-ション手法の妥当性を明らかにするとともに,海底地盤の応力状態と残留変形挙動との関係を明らかにした。3.残留変形機構に基づいて,残留変形を低減するための埋立人工島造成工法(締切護岸形式,海底地盤改良工法,埋立方法)を提案し,数値シミュレ-ションによってその有効性を確認した。以上が今年度の研究成果であるが,次年度ではこれらの結果を踏まえて,1.大がかりな解析を行うことなく,圧密試験結果および一軸試験結果(あるいは三軸試験結果)を用いて残留変形を予測する簡便予測法を開発する。このような予測法は実務において重要な意義を持つものである。2.提案する残留変形を低減するための埋立人工島造成工法を実験に適用する場合の技術的問題点を検討するとともに,不可避な残留変形については埋立人工島の利用計画等のソフト面との複合的対策によって対応する必要があり,このための早期有効利用技術の開発を行う。
環境感応型高分子ゲルを用いた酵素活性制御に関する研究

1.感温性ゲルの物理化学的構造と動特性:主鎖濃度、架橋剤濃度の異なる種々のN-イソプロピルアクリルアミドゲル(感性ゲル)を合成し、種々の温度場におけるゲルの膨潤収縮体積を測定した。種々の温度操作におけるゲルネットワークの拡散速度を理論モデルによって定量化した。ゲルの物理的構造は主鎖濃度、架橋度に強く依存することが分かった。収縮過程において、主鎖濃度および架橋度の低いゲルは濃度刺激に対して急激に表面にスキン相を形成する結果、応答速度は極めて小さくなることが分かった。すなわち、収縮過程におけるゲルの応答性は、温度操作(伝熱過程)に依存する。膨潤過程におるゲルの応答性は、温度操作にたいする依存性は小さく、ゲルネットワーク固有の拡散速度に支配されていることが分かった。ゲルの化学的構造特性として、親疎水的バランス変化をモデル有機分子の吸着量から定量化した。ゲル近傍ならびにゲル内においてゲルが疎水化する高温域において疎水的な分子はゲルに引き寄せられ吸着されることを明らかにした。この吸着過程はゲル粒子の境膜物質移動過程が律速することが分かった。2.ゲルの動的挙動と固定化酵素の活性:ゲル内に固定化されたインベルターゼの活性に及ぼす温度刺激の効果を検討した。温度操作によりゲルの網目孔径を制御し、基質のゲル内流入を調整することによって、酵素活性を制御できることが分かった。激応答型高分子ゲルに固定化した酵素活性に及ぼすゲルの動的挙動の効果を検討した。この結果、ゲルの動的挙動を制御する(温度スイングによりゲルを脈動させる)ことによって、酵素活性の制御・向上を図ることが可能であると分かった。酵素活性に及ぼすゲルの操作条件として、次の操作が有効であると分かった。(1)ゲルの膨潤収縮の幅。(2)ゲルの収縮状態の時間。(3)ゲルの膨潤・収縮速度。従って、膨潤収縮挙動が三角波を描くような脈動を起こすことが酵素活性向上の最適条件となることが示唆された。これらの結果から、スキン相を形成せず、応答速度ならびに膨潤収縮の変位の大きなゲルの分子設計、応答速度を速くする操作条件に関する知見を得た。種々の構造(網目密度、架橋度)物理構造:空間サイズ・ディメンジョン)を有するN-イソプロピルアクリルアミド(感温性高分子)ゲルを合成し、種々の環境操作条件における応答挙動について検討した。N-イソプロピルアクリルアミドゲル粒子を自作の溶液流通型充填セル内に投入し、このセル内に蒸留水を循環させながら上限ならびに下限温度を設定して環境温度をスイングさせた。温度ならびに時間に依存したゲルの膨潤体積をゲル粒子充填層の充填高さから測定し、環境操作に依存したゲルの応答性を明らかにした。ゲルの応答性についてはゲルネットワークの見掛けの拡散係数によって評価した。ここで、ゲルの体積相転移温度を横切るように温度をスイングさせた場合(case1)、ゲルの体積相転移温度よりも低温域において温度をスイングさせた場合(case2)について検討した。case1:ゲルの架橋密度が高い場合には、(1)降温時(ゲルの膨潤時)は、ゲルネットワークの見かけの拡散係数は降温速度依存性が小さくほぼ一定の値となる。(2)昇温時(ゲルの収縮時)は、ゲルネットワークの見かけの拡散係数は膨潤時に比べ大きな値となり、また、昇温速度の増加とともに増加することが明らかとなった。

一方、ゲルの架橋密度が低い場合には、昇温時(ゲルの収縮時)のゲルネットワークの見かけの拡散係数は昇温速度の上昇とともに小さくなることがわかった。この様に、収縮時のゲルネットワークの見かけの拡散係数が架橋密度に依存して異なる傾向となることは、収縮時にゲル表面にスキン相を形成するか否かに係わっていることがわかった。case2:ゲルネットワークの見かけの拡散係数は膨潤時及び収縮時ともに同程度の値となり、収縮時の見かけの拡散係数が小さくなることがわかった。これらの結果から、感温性高分子ゲルの膨潤挙動の温度操作において、収縮時のゲルの応答速度は膨潤時に比べて制御が容易であることがわかった。感温性ゲルであるN-イソプロピルアクリルアミドゲル内に固定化されたインベルターゼの活性に及ぼす温度刺激の効果を検討した。N-イソプロピルアクリルアミドのモノマー溶液中にインベルターゼを導入し、pH=4のフタル酸緩衝溶液中でラジカル重合により酵素固定したゲル粒子を合成した。ゲルの粒径は425μm以下であった。本ゲル粒子を所定量の蔗糖溶液中に投入し、定温もしくは温度スイング下で酵素活性の測定を行った。酵素の活性は、プロダクトのグルコースをグルコーステストワコ-により定量化することによって求めた。温度操作によりゲルの網目孔径を制御し、基質のゲル内流入を調整することによって、酵素活性を制御できることが分かった。固定化酵素の活性に及ぼすゲルの動的挙動の効果を検討した。この結果、ゲルの動的挙動を制御する(温度スイングによりゲルを脈動させる)ことによって、酵素活性の制御・向上を図ることが可能であると分かった。酵素活性に及ぼすゲルの操作条件として、次の操作が有効であると分かった。1)ゲルの膨潤収縮の幅。2)ゲルの収縮状態の時間。3)ゲルの膨潤・収縮速度。従って、膨潤収縮挙動が三角波を描くような脈動を起こすことが酵素活性向上の最適条件となることが示唆された。これらの結果から、スキン相を形成せず、応答速度ならびに膨潤収縮の変位の大きなゲルの分子設計、応答速度を速くする操作条件に関する知見を得た。
悪質商法による大学生の詐欺被害を防ぐためのスマートフォンゲームアプリの開発と評価

大学生に起こりうる問題の一つに,違法または不当な手段で商取引をすることで消費者に被害をもたらす悪質商法の問題がある。本研究の目的は,悪質商法による大学生の被害を未然に防ぐための学習ツールとしてスマートフォン用ゲームアプリを開発し,それをプレイすることで悪質商法から身を守るための知識が習得されるかを実験によって明らかにすることである。さらに,そのゲームアプリを悪質商法対策を目的とした書籍やパンフレットなどの既存の学習ツールと比較し,学生がどの程度利用したいと思うかなどの印象評定を行う。本研究で開発する学習ツールによって,悪質商法による大学生の被害が減少することが期待される。
過酸化チタン・ナノ粒子とX線照射の併用による細胞損傷促進機構の解明

本研究では「過酸化チタン/放射線併用治療法」の提案を行い、がん細胞の効率的な死滅誘導の機構の解析を行った。本研究の実施によって、我々が見出した過酸化チタンナノ粒子の抗腫瘍効果を試験管レベル、および培養細胞レベルでも確認することができた。さらには、担癌マウスを用いた挙動解析でも、がん組織等への蓄積も見いだされた。今後は、これらの結果を踏まえて、過酸化チタンナノ粒子の抗腫瘍効果を多様な培養細胞にて実施していくと同時に、その詳細な死滅機構を明らかにしていきたいと計画している。研究目的を遂行するために、本年度は以下の3項目について検討を行った。[1]過酸化チタンへの標的機能の賦与:過酸化チタン表面へのタンパク質の化学修飾導入を行うため、カルボキシル基を多数有するポリアクリル酸を表面修飾することに成功した。これまでにもポリアクリル酸の修飾には成功していたが、放射線照射に応じてラジカルの生成を可能にする過酸化チタンの状態を維持した形でポリアクリル酸修飾することに成功した。また、修飾するための遺伝子組み換え抗体の生産にも成功した。次年度は、これらの部品を用いて、標的機能を有する過酸化チタンナノ粒子による細胞損傷を目指す。[2]過酸化チタンの体内挙動解析:これまでに過酸化チタンをナノ粒子として構築する事に成功しており、特異的な送達を検討するには、体内での挙動の解析が重要となってくる。そこで、培養細胞とマウス個体レベルでの挙動解析を試みた。培養細胞レベルでは、過酸化チタンナノ粒子は、細胞膜近傍に多く蓄積している事が明らかとなった。マウスに関しては、ヌードマウスを用いての実験計画を神戸大学動物実験委員会に申請し承認を得た。次年度は、ヌードマウスを用いた挙動解析を進めていく計画である。[3]過酸化チタンからのラジカルによる細胞損傷機構の解明:過酸化チタンから発生するラジカルに関しては、その機構がこれまで明らかに出来ていない。今年度は、ラジカル主の発生に寄与していると考えられる過酸化水素の存在に関して検証を行った。その結果、過酸化チタン粒子から、常時、低濃度の過酸化水素が溶出している事が明らかになった。過酸化水素は、現在、放射線照射療法における増感剤として利用されており、臨床応用の経験も多い。この知見に倣うと、我々の治療システムにおいては、過酸化水素が過酸化チタン粒子より遊離し、放射線照射によるがん細胞死滅への機構に関与している事が明らかになった市販二酸化チタンナノ粒子であるTiO2(STS-01)を原料とし、ポリアクリル酸(PAA)と混合し、水熱処理することでポリアクリル酸二酸化チタンナノ粒子(PAA-TiO2)を作製した。これに過酸化水素を加えて過酸化することで、ポリアクリル酸修飾過酸化チタンナノ粒子(PAA-TiOx)を作製した。これら2つのナノ粒子と過酸化水素を培養細胞(HeLa細胞及びMIAPaCa-2細胞)に添加し、24時間後、WSTアッセイを用いて細胞生存率の測定を行った。未処理の細胞群と比較すると、両方の細胞株において、PAA-TiO2およびPAA-TiOx粒子0.1mg/mlにおいてほとんど毒性を示さなかった。また高濃度の添加においては、PAA-TiO2よりもPAA-TiOxで高い細胞毒性を示した。これは、PAA-TiOxの表面に存在していた過酸化水素が細胞内に導入されたことに起因していると考えられる。同様に、培養細胞にPAA-TiO2及びPAA-TiOxナノ粒子を添加、24時間後にX線照射を行い、そのさらに24時間後にWSTアッセイを行い、細胞生存率を測定した。細胞ダメージに対する感受性の低いHeLa細胞では、PAA-TiOxとX線の相乗効果はさほど見られなかった。感受性の高いMIAPaCa-2細胞では、PAA-TiOx 0.1 mg/mlとX線照射では相乗効果が見られた。我々が構築した無機-有機ハイブリッドナノ粒子であるポリアクリル酸修飾過酸化チタンナノ粒子は放射線で励起可能であり、すでに特許も成立している(特許2010-032055,米国:US 8, 580, 312, B2)。本ナノ粒子は放射線増感効果を持ち、純水中に放射線照射した場合に対して数倍数十倍のラジカルを生成する。そのため、担がんマウスを用いたin vivo毒性試験では、粒子単体の毒性は無く、粒子と放射線照射を併用した場合にのみ抗腫瘍効果が認められている。さらには、粒径に応じてがん組織への特異的相つの傾向も悪人する事が出来た。さらに、ナノ粒子キャリアとしてB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる中空粒子“バイオナノカプセル(BNC)"の作製に成功しており、この粒子を改変することでヒト肝細胞やすい臓がん細胞へ薬剤の特異的な導入に成功している(Y. Nishimura, et al.,J. Nanobiotechnology, 2013)。今後は、これらの研究成果を活用することで、過酸化チタンナノ粒子【=ハイブリナノ粒子】をBNCに包含して“スーパー"ハイブリナノ粒子とすることで、静脈注射を用いた非侵襲的な腫瘍送達が可能となると期待される。

さらには、担癌マウスを用いた挙動解析でも、がん組織等への蓄積も見いだされた。今後は、これらの結果を踏まえて、過酸化チタンナノ粒子の抗腫瘍効果を多様な培養細胞にて実施していくと同時に、その詳細な死滅機構を明らかにしていきたいと計画している。2年次に計画していた研究項目をおよそ達成できているため。生物化学工学次年度は最終年度であり、これまでの実績をベースにヌードマウスでの評価を実施する計画であり、おおむね、研究計画に則って実施できていると判断する。今年度計画した3つの項目について、ほぼ予定の範疇で実験が進行しているため。次年度のマウス購入費としての研究計画に従って、繰り下げた。昨年度、本研究のマウス実験に関して、神戸大学の動物実験委員会の承認があり、マウス実験を進める事が可能となった。次年度は、マウス体内での動態解析を、積極的に進める計画である。研究計画に従い、マウスの購入費として計上する。初年度、マウス実験を行う計画であったが、マウスを用いた実験計画書の提出が遅延して、実験承認が降りた段階で、期限になったしまったため。次年度、マウスを用いた動態実験を計画いに従い遂行する計画であり、その際に執行を計画している。
劇症1型糖尿病患者血清の蛋白質間相互作用解析を用いた新規インスリン様分子の同定

劇症1型糖尿病は、発症時より内因性インスリンが枯渇するため、血糖管理に難渋する。少量の外来性インスリンにて血糖コントロールが良好な稀有な劇症1型糖尿病患者の血清中に、未知のインスリン様物質が存在する、という作業仮説を立て、その分子の同定を試みた。予備実験として、組み換えインスリン受容体とインスリンとのタンパク質間相互作用分析を行い、最終産物中のインスリンの確認を試みたが、期待した結果が得られなかった。タンパク質間相互作用分析の手法を用いて血清中のインスリン様物質を検出するために,組換えインスリン受容体を作成した.FLAGエピトープタグを付けたインスリン受容体(rIR-FLAG))のcDNAを,BHK細胞株に,遺伝子導入用カチオン性脂質(Lipofectamine 2000 ; Invitrogen^R)を用いて遺伝子導入した.薬剤選択にて増殖が得られたコロニーをピックアップし,培養上清中のrIR-FLAGの発現を確認しながら継代し,安定発現クローンを得た.最終的に,rIR-FLAGが培養上清中にmg/Lのオーダーで分泌される安定発現細胞株を得ることができた.rIR-FLAG安定発現BHK細胞を,血清フリーの培地(DMEM)で24時間以上インキュベーションし,上清を回収,100倍に濃縮し,rIR-FLAGタンパクとして-80°Cで保存した.2.タンパク質間相互作用分析予備実験として,rIR-FLAGをbaitにインスリンをpreyとする免疫共沈降(Co-immunoprecipitation ; Co-IP)を検討した.インスリンをrIR-FLAGと抗FLAGM2抗体(Sigma^R)でCo-IPし,ウエスタンブロットにてインスリンの確認作業を行ったところ,最終産物にインスリンが得られたが,同時に銀染色をおこなったところインスリン以外に多数の夾雑タンパクも認められた.この結果を踏まえて,Co-IP以外のタンパク質間相互作用分析(アフィニティークロマトグラフィー,ファー・ウエスタンブロット等)も加えて,血清中のインスリン様物質の検出に最適な分析方法を検討中である.BHK細胞株に遺伝子導入したrIR-FLAGの分泌タンパクを得ることが出来たため、これを培養し、上清を100倍に濃縮した。しかし、100倍濃縮後でも、rIR-FLAGの濃度は0.1mg/ml程度であった。BaitとしてのrIR-FLAGは1mg/ml以上必要であることが判明したため、rIR-FLAGのplasmid vectorを組み込んだ組み換えウイルスを作製し、カイコ幼虫に感染させてその体液から大量にrIR-FLAGを回収するという方法を試みた。感染カイコ幼虫の体液中で、rIR-FLAGのmRNAレベルの発現は確認できたが、タンパクの発現には至らなかったため、は1mg/ml以上のrIR-FLAGを得ることは出来なかった。2.タンパク間相互作用分析インスリンとrIR-FLAGとのタンパク質間相互作用分析の予備実験を、アフィニティークロマトグラフィー、Far-Westernプロット法、Pull-down法を用いて行った。アフィニティークロマトグラフィー、Far-Westernプロット法ではインスリンの確認は不可であった。抗FLAG M2affinitybeadsを用いてインスリンとrIR-FLAGをpull-downしたところ、最終産物におけるインスリンの確認が、インスリンが高濃度である際には成功することもあったが、再現性のある結果は得られなかった。予備実験の結果を踏まえて、当該患者血清を使用してのタンパク質間相互作用分析にまでは至っていない。大腸菌を利用して、組み換えインスリン受容体(FLAGエピトープタグを付けたインスリン受容体(以下rIR-FLAG))のタンパク質の大量発現を試みた。具体的には、発現ベクターにrIR-FLAGのcDNAを連結し発現プラスミドを作製した後に、大量培養し、集菌後に超音波破砕した。しかしながら、可溶性部分にrIR-FLAGの目的タンパクを得ることが不可であった。誘導時間で用いる薬剤の濃度を下げたり、誘導時間を短くする等の工夫をしても、不溶性画分でのタンパクの生産が避けられなかった。したがって不溶性画分を精製し、尿素等の変性剤で可溶化した結果、GST融合タンパク(fIR-FLAG-GSTタンパク)を得ることができた。2.タンパク質間相互作用分析上記の大腸菌由来のrIR-FLAG-GSTタンパクを用いて、インスリンとのタンパク質間相互作用分析の予備実験を、FLAGに加えてGSTのタグを利用したアフィニティークロマトグラフィー、Far-Westernブロット法、Pull-down法を用いて行った。しかしながら、最終産物におけるインスリンの確認が出来なかった。rIR-FLAG自体の分子量が約210万と高分子のため、大腸菌での発現系だと封入体の生成が避けられないのでは、と考えられた。封入体からタンパクを得るためには、変性剤等を使用せざるを得ない。こうした変性剤等の使用により、活性を保った状態でrIR-FLAG-GSTタンパクを得ることは難しいのではないかと推測した。以上の予備実験の結果を踏まえて、当該患者血清を使用してのタンパク質間相互作用分析にまでは至っていない。
肝線維化に伴う脾腫は単なるうっ血なのか？：肝線維化進展と脾臓の免疫調節機能の関連

肝線維化に伴う脾腫はうっ血が主因とされているが、免疫機構については不明である。本研究では、線維肝の脾臓で抗菌蛋白リポカイン2 (Lcn2)の強発現を認めた。また、このLcn2は肝在住マクロファージであるKupffer細胞の活性抑制作用がある上に、線維化誘導前の脾摘で門脈血中のLcn2が減少し、肝線維化の増悪を認めた。一方、この脾摘による変化は腸管滅菌で認めなくなった。以上より、肝線維化進展における脾臓はLcn2を分泌し門脈を介して腸内細菌によるKupffer細胞の過剰活性を抑制し肝線維化進展を阻止する役割を有することが考えられた。進化の過程で温存されているが、未知である脾臓の一端が分かった。これまでの研究結果より四塩化炭素による肝線維化モデルにおいて脾臓におけるリポカリン2(Lcn2)の発現増強を認めていた。二重蛍光免疫染色にて脾臓内のGr1陽性細胞にLcn2の発現を認め、線維肝マウスの脾臓ではGr1+Lcn2+細胞の著明な増加を認めた。一方、リコンビナントLcn2(rLcn2)を初代培養肝星細胞に添加してもその後の肝星細胞の活性化に違いはなかったものの、単離した肝マクロファージをLPS単独添加またはLPS+rLcn2添加で比較するとLPS+rLcn2添加群で有意にTnf-α, CCl2mRNAの発現低下を認めた。当初の計画ではLcn2の細胞内シグナルを明らかにする予定であったが、同時に腸管滅菌の効果も検証した。研究計画に示した通りアンピリシン、ネオマイシン、バンコマイシン、メトロンダゾールによる腸管滅菌後に脾摘を行い四塩化炭素による肝線維化モデルを作成したところ、脾摘群および非脾摘群で肝線維化の程度に差は認めず、また門脈内のLcn2濃度も同レベルであった。以上より、脾臓におけるLcn2はGr1陽性細胞に発現し、それは肝マクロファージに特異的に作用することが考えられた。また、腸管滅菌は脾摘による肝線維化進展への影響を阻止した。脾臓由来のLcn2はgut-derived productsによる肝マクロファージの過剰活性を減弱し肝線維化進展を抑制することが考えられた。肝線維化進展において脾臓は、腸-肝相関に対する肝臓の免疫寛容状態の維持に重要な役割を担っていることが示唆された。肝マクロファージ細胞内シグナルの解析についてはやや難渋しているものの、腸管滅菌モデルの解析を先行させ基本的なメカニズムについては明らかとなってきた。肝線維化に伴い脾臓におけるリポカリン2の発現増強が、門脈を介して肝在住マクロファージであるKupffer細胞の過剰活性を抑制し、肝線維化進展を阻止する役割を担っていることをin vivoおよびin vitroの研究結果より明らかにしてきた。一方、腸管滅菌を行うと脾臓のこのような作用は認められなかった。以上のことから肝線維化に伴い増加する腸内細菌由来のgut-derived productが上腸間膜静脈から門脈を通りKupffer細胞を活性化させ炎症および肝星細胞の活性化から肝線維化を増悪させるものの、門脈に流入するもう一つの静脈である脾静脈から脾臓由来のリポカイン2が肝内へ入り、肝線維化を抑えていることが分かった。すわなち、腸-肝相関だけではなく、腸-脾-肝相関のバランス変化が肝線維化進展に重要な役割を担っていることが考えられた。これらを論文化し、受理された(現在発行手続き中)。また、リポカイン2は腎臓でも発現しているが、少なくとも今回用いた四塩化炭素による肝線維化モデルでは変化は認めなかった。一度まとめて論文化し投稿したが、再投稿にあたり追加実験を課せられ時間を要した。肝硬変に伴う脾腫はうっ血が原因とされているが、そもそも脾臓は免疫調節臓器と言われ古来より脾臓の触診は患者の病態を把握するうえで重要な診察方法であった。また、脾臓と腸管の静脈系のみが門脈を介して肝臓に流入しその他の臓器は大循環へ直接流入する。このようなことから我々は腸管由来の外来抗原に対する肝臓の免疫寛容に対して脾臓が何らかの役割を持ち、かつそれらの機構が肝線維化進展にも関連することを仮説とし研究を進めた。四塩化炭素投与による肝線維化モデルにおいて脾臓では抗菌蛋白であるリポカイン2の発現増強を認めた。また、脾組織中ではうっ血だけではなくリポカリン2を発現するGr1陽性細胞の増加を認めた。一方、あらかじめ脾摘を行い四塩化炭素による肝線維化を誘発すると肝線維化が増悪した。またこの時門脈中のリポカイン2濃度は非脾摘群と比べ有意に低下していた。すなわち肝線維化進展において脾臓のリポカリン2が進展抑制に働くことが考えられた。肝在住マクロファージであるクッパー細胞の過剰活性は線維芽細胞である肝星細胞を活性化し肝線維化を惹起する。リポカイン2は他モデルでマクロファージの活性を抑制する報告があることから、本研究でも肝内よりクッパー細胞を単離しリポカイン2を添加した。リポカイン2添加群ではTNF-αの低下を認めた。他方、リポカイン2は肝星細胞の活性には関係がなかった。

さらに、リポカイン2が抗菌蛋白であることから腸管滅菌下で同様の脾摘モデルを作成し肝線維化を誘発すると非脾摘群と比べ変化がなかった。以上のことから脾臓由来のリポカイン2はg腸管由来の外来抗原による肝内マクロファージの過剰活性を減弱し肝線維化進展を抑制することが考えられた。肝線維化進展において脾臓は、腸-肝相関に対する肝臓の免疫寛容状態の維持に重要な役割を担っていることが示唆された。肝線維化に伴う脾腫はうっ血が主因とされているが、免疫機構については不明である。本研究では、線維肝の脾臓で抗菌蛋白リポカイン2 (Lcn2)の強発現を認めた。また、このLcn2は肝在住マクロファージであるKupffer細胞の活性抑制作用がある上に、線維化誘導前の脾摘で門脈血中のLcn2が減少し、肝線維化の増悪を認めた。一方、この脾摘による変化は腸管滅菌で認めなくなった。以上より、肝線維化進展における脾臓はLcn2を分泌し門脈を介して腸内細菌によるKupffer細胞の過剰活性を抑制し肝線維化進展を阻止する役割を有することが考えられた。進化の過程で温存されているが、未知である脾臓の一端が分かった。肝マクロファージ細胞内シグナルの解析やLcn2ノックアウトマウスを用いた実験を計画しているが、一度研究結果をまとめて投稿する予定である。肝マクロファージ内のシグナル解析やリポカイン2ノックアウトマウスを用いて、リポカイン2のKupffer細胞における役割について明らかにする。消化器内科学共用の消耗品をできるだけ用い、経費削減に努めた。共用の消耗品をできるだけ使用し、費用の削減に努めた。今後の実験(ノックアウトマウス購入およびマウス搬送費等)に使用予定である。実験動物の作成や試薬の購入に使用予定
ＦＧＦ‐２により誘導される血管新生への歯根膜細胞の関与

本研究課題ではFGF-2局所投与により誘導される歯周組織再生メカニズムを、血管新生の観点から検討した。FGF-2は歯根膜細胞からのVEGF-A産生を誘導した。また、FGF-2とVEGF-Aの共刺激により歯根膜細胞の遊走能は協調的に亢進した。さらにタイムラプス解析より歯根膜細胞は管腔形成する血管内皮細胞に寄り添うように遊走した。これらの結果よりVEGF-Aの誘導、歯根膜細胞と血管内皮細胞の細胞間相互作用は、FGF-2局所投与部の血管新生により歯周組織再生に適した環境を整えている可能性が示唆された。1)塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)刺激により、歯根膜細胞における血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の発現およびVEGF Receptor1のmRNA発現を濃度依存的に誘導した。2)VEGFはFGF-2による、マウス歯根膜細胞(MPDL22)の増殖を促進した。また、VEGF単独刺激で著明な変化を及ぼさなかった、FGF-2とVEGFの共刺激により、MPDL22の遊走能は相乗的に亢進した。3)FGF-2とVEGFの共刺激は、血管内皮細胞(bEnd5)の管腔形成を促進させた。また、MPDL22と共培養することによりbEnd5の著明な管腔形成が観察された。さらに、bEnd5とMPDL22共培養時のVEGF産生量は、それぞれの細胞単独時と比べて相乗的に上昇した。同共培養にて亢進した血管管腔形成は、VEGF中和抗体存在下で阻害された。共培養時の細胞を共焦点顕微鏡にて観察したところ、管腔形成を行うbEnd5の周囲にMPDL22が周皮細胞様に結合する像を認めた。同様の実験をTime-laps assay法にて観察すると、MPDL22がbEnd5の管腔形成を裏打ちするように遊走・配列することを示唆する像が得られた。加えて、FGF-2とVEGF共刺激時のMPDL22の表面抗原分子の変化を検討したところ、周皮細胞マーカーであるNG2分子の発現が上昇した。4)3次元培養で歯根膜細胞および血管内皮細胞を共培養する際には、画一化された条件設定が必要である。筆者はコラーゲンゲルを96Well plateに用い、歯根膜細胞と血管内皮細胞の比率が1対4、計15000/wellで播種し、24時間後に観察した際に最も効率的に管腔形成能の評価が可能であることを見出した。生体内の成熟血管で見られる周皮細胞と血管内皮細胞との比率は1対1から1対10と報告されており、この比率も範囲内である。1)塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)刺激により、ヒト歯根膜細胞における血管内皮細胞増殖因子(VEGF-A)の発現およびVEGF受容体のmRNA発現は濃度依存的に増強した。2)FGF-2とVEGF-A共刺激時のマウス歯根膜細胞(MPDL22)の表面抗原分子をフローサイトメトリー法にて解析したところ、ペリサイトマーカーの1つであるNG2分子の発現上昇を認めた。平成24年の研究実施計画に準じた研究を行うことが出来た。25年度が最終年度であるため、記入しない。3次元培養で歯根膜細胞および血管内皮細胞を共に培養し、動態を解析するためには、画一化された条件設定が必要不可欠である。今後は、今回の研究により得られた最適条件下で実験を行い、平成25年度の計画に準じて共培養時の細胞動態を詳細に解析してゆく予定である。