hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高圧下におけるXAFS及びXRDの同時測定

非対称形状のダイアモンド製アンビルとBe製ガスケットを装着した小型高圧発生装置(非対称ペア型DAC)により,まったく同一の加圧状態にある極微量の試料からX線吸収微細構造(XAFS)スペクトルとX線回折(XRD)パターンを一度に測定する技術を開発した.我々が考案した非対称ペア型DACでは,片側の極薄ダイヤモンドを貫いて放射光(文科省高エネルギー加速器研究機構;BL12Cを使用)を試料に入射し,これと直交方向に放出される蛍光X線をBeガスケットを通して半導体検出器で測定する.そのため,ダイヤモンドによるX線の吸収や回折の影響を本質的に除去した測定が可能であり,さらに高圧セル構造に数々の改良を加えることで,最大約7GPaの高圧力を加えた合金試料から通常の透過法に匹敵する高S/N比のCe-L_3殻XAFSスペクトル測定が実現できた.この測定を,結晶構造が異なるだけで全く相反する電気抵抗の圧力依存性を示すCe_3Al合金のα相とβ相に適用した結果,いずれの相中のCeも7GPa程度までは完全に3価の状態を保つことが明らかとなった。この結果は,価数変化を伴うとする従来の高密度近藤効果の発現機構では説明できず,今後高圧下での結晶学的情報や帯磁率測定などを行って解明していく必要があろう.一方,高圧XRD測定については,入射X線11.4keV,ビーム径0.2×0.2mm^2,カメラ長7cm,露光時間60分にて自作平板カメラ(富士イメージングプレート:IP)で記録した.まだ,角度分解能やカメラ長の補正法などに改良の余地はあるものの,高圧XAFS測定と同一の非対称ペア型DACにより放射光XAFSビームラインにて高圧X線回折パターンを得ることができるようになり,高圧XAFS+XRD同時測定が可能となった.申請者らが開発した『非対称ペア型ダイヤモンドアンビルセル(DAC)』とイメージングプレート(IP)を装填した自作平板カメラを、文部科学省高エネルギー加速器研究機構の放射光ビームライン(BL12C)に設置し、まったく同じ加圧状態にある試料からX線吸収微細構造(XAFS)スペクトルとX線回折(XRD)パターンを一度に測定することを試みた。本年度はまず、ベリリウム製ガスケット形状など高圧セル構造に改良を加えることで、最大約7GPaの高圧力を加えた合金粉末試料からCe-L_3殻XAFS測定が定常的に行えるようになった。この測定を、わずかの加圧で顕著な高密度近藤効果が現れるCe_3Al合金のβ相に適用した結果、7GPa程度まではβ相中のCeはほぼ3価の状態を保つことが明らかとなった。この結果は、価数変化に起因するとする従来の高密度近藤効果の発現機構では説明できない極めて興味深いものである。さらに結晶構造が異なるα相についても同様の実験を行って、発現機構解明をめざす予定である。一方、高圧XRD測定については、10keV程度の高エネルギー放射光をIPを用いて10分程度露光することで、高圧XANES測定と同一のDACからX線回折パターンが得られることが明らかとなった。しかしながら、直径0.2mmφのガスケット孔中にセットできる粉末試料は極く微量であるため、スリットで形状を整えただけの放射光ビーム(0.3mm角程度)では、散漫な回折線しか得られない。今後、コリメータの導入などを行うことで体積収縮率など定量的解析が可能な高圧XRD測定が可能になるものと期待できる。この結果は,価数変化を伴うとする従来の高密度近藤効果の発現機構では説明できず,今後高圧下での結晶学的情報や帯磁率測定などを行って解明していく必要があろう.一方,高圧XRD測定については,入射X線11.4keV,ビーム径0.2×0.2mm^2,カメラ長7cm,露光時間60分にて自作平板カメラ(富士イメージングプレート:IP)で記録した.まだ,角度分解能やカメラ長の補正法などに改良の余地はあるものの,高圧XAFS測定と同一の非対称ペア型DACにより放射光XAFSビームラインにて高圧X線回折パターンを得ることができるようになり,高圧XAFS+XRD同時測定が可能となった.
高血圧患者における副腎アルドステロン産生の検討

本研究により,一部の本態性高血圧症患者で正常より上昇しているアルドステロン自律産生が,APCCの遺伝子変異に起因し既存の薬剤によって正常化される可能性があることが示されることになる。この結果に基づき,PAが顕在化する前段階における特異的治療が可能となり高血圧合併症の予防につながる可能性がある。
コミュニケーションとしての英語教育:大学レベルにおける韓国と日本の比較研究

研究課題を体系的に、又、組織的に取り組むにあたり、文献のうえでの調査研究を国会図書館で行なった。その目的は以下の通りである。1)日本における外国語教育の歴史。2)日本における言語学、および言語研究の内容と提起された諸理論。3)研究課題に関する社会言語学の流れ。4)研究課題に関する心理言語学の流れ。5)研究課題に関する教育理論とその適応。上記5項目の考察をもとにして、次のステップのために韓国をの比較・対比用に共通項、顕著な特徴ごとにファイルに納める作業を行なった。
内湾域における休眠期細胞形成性植物プランクトンの生態戦略に関する研究

三重県英虞湾において,以前開発した「プランクトン発生捕捉チャンバー(PETチャンバー)」を用いて植物プランクトンの現場海底からの発芽細胞を捕捉した。その結果,珪藻類で29属58種,渦鞭毛藻類(有殻類)で19属55種の海底からの発芽細胞を捉えることに成功した。また,特に珪藻類のいくつかの種で海底からの発芽挙動と水柱中における栄養細胞の出現との関係を明らかにし,個体群形成おける生態戦略を解明することができた。時空間的に環境の変化が激しい沿岸・内湾を生息場としている植物プランクトンの中には,生活史の一時期に休眠して不適な環境を海底上で生残するステージ(以下,"休眠期細胞"と呼ぶ)を持つ種が多く知られている.休眠期細胞は栄養細胞増殖の種(たね)としての役割を果たすため,そういった種の生態を解明するためには,プランクトン群を構成する栄養細胞の季節消長だけでなく,海底に存在する休眠期細胞の発芽動態に関する研究が必要である.本研究では,典型的な内湾域である三重県英虞湾をモデル海域として同湾における植物プランクトンの現場海底からの発芽を季節的に追跡し,同時に栄養細胞の季節消長を調べることによって,様々な種における個体群形成機構ならびに生態戦略を明らかにすることを目指す.平成18年度においては,上記の研究目的のため,まず英虞湾内に一定点を設けた.その定点において,以前開発した「プランクトン発生捕捉チャンバー」を用いた海底からの発芽細胞の実測調査を行うとともに,水柱中にプランクトン群として出現する栄養細胞の現存量を季節的に調べた.また同時に,水温・塩分や水中光強度,栄養塩といった物理化学的環境要因を測定した.調査頻度は毎月1回であった.発芽調査を行った結果,これまでに珪藻類(9属14種)や渦鞭毛藻類(2属2種)の海底からの発芽を捉えることに成功している.現在も,検鏡中であるので今後これらの種数はさらに増加する可能性がある.来年度は,平成18年度に得られたサンプルの観察と解析を進めるとともに,さらに同様の調査を継続する.これらの調査・研究により,今後,様々な植物プランクトンの休眠期細胞の発芽挙動と栄養細胞の季節的消長,さらには両者(発芽と栄養細胞)の数的関係を明らかにしてゆく予定である.時空間的に環境の変化が激しい沿岸、内湾を生息場としている植物プランクトンの中には,生活史の一時期に休眠して不適な環境を海底上で生残するステージ(以下,"休眠期細胞"と呼ぶ)を持つ種が多く知られている。休眠期細胞は栄養細胞増殖の種(たね)としての役割を果たすため,そういった種の生態を解明するためには,プランクトン群を構成する栄養細胞の季節消長だけでなく,海底に存在する休眠期細胞の発芽動態に関する研究が必要である。本研究では,典型的な内湾域である三重県英虞湾をモデル海域として,同湾における植物プランクトンの現場海底からの発芽を季節的に追跡し,同時に栄養細胞の季節消長を調べることによって,様々な種における個体群形成機構ならびに生態戦略を明らかにすることを目指す。上記の研究目的のため,今年度は昨年度に引き続き,英虞湾内に設けた一定点において,以前開発した「プランクトン発生捕捉チャンバー」を用いた海底からの発芽細胞の実測調査を継続して行った。また,水柱中にプランクトン群として出現する栄養細胞の季節消長も調べた。同時に,水温、塩分や水中光強度,溶存酸素,栄養塩といった物理、化学的環境要因を測定した。調査頻度は毎月1回であった。発芽調査を行った結果,これまでに珪藻類で16属28種,渦鞭毛藻類で10属23種の海底からの発芽を捉えることに成功している.珪藻類と渦鞭毛藻類で最も多く見られた分類群は,それぞれChaetoceros属とProtoperidinium属であった。来年度は,これまでに得られたサンプルの観察を進めるとともに,さらに同様の調査を夏季まで継続する。併せてデータの解析を行い,様々な植物プランクトンにおける休眠期細胞の発芽挙動と栄養細胞の季節的消長,さらには両者(発芽と栄養細胞)の数的関係を明らかにし,最終的に上記研究目的を達成する予定である。時空間的に環境の変化が激しい沿岸・内湾域を生息場としている植物プランクトンの中には,生活史の一時期に休眠して不適な環境を海底上で生残するステージ(以下,“休眠期細胞"と呼ぶ)を持つ種が多く知られている。

本研究では,典型的な内湾域である三重県英虞湾をモデル海域として,同湾における植物プランクトンの現場海底からの発芽を季節的に追跡し,同時に栄養細胞の季節消長を調べることによって,それらの個体群形成機構ならびに生態戦略を明らかにすることを目指した。上記の研究目的のため,昨年度までと同様に,英虞湾内に設けた一定点において,以前開発した「プランクトン発生捕捉チャンバー」を用いて海底からの発芽細胞の実測調査を行った。また,水柱中にプランクトン群として出現する栄養細胞の季節消長も調べた。同時に,水温・塩分や水中光強度,溶存酸素,栄養塩といった物理・化学的環境要因を測定した。なお,これらの調査は2008年7月まで行い,その頻度は毎月1回であった。これまでの全発芽調査により,珪藻類で29属58種,渦鞭毛藻類で19属55種の海底からの発芽細胞を捉えることに成功した。珪藻類と渦鞭毛藻類で最も多く見られた分類群は,それぞれChaetoceros属とProtoperidinium属であった。海底からの発芽挙動と水柱中での栄養細胞出現との関係については特に珪藻類において詳細に検討した。その結果,珪藻類の多くは日和見的に発芽することにより個体群形成を有利に進めるという生態戦略を持つことを明らかにした。
潜在的機能発現をめざした非標準計算論に基づく創造的情報処理システムの研究

ヒトの脳においては、進化の過程で、`意識'という潜在的機能を創生し、限られた資源の中で効率的な学習と記憶を実現させ、いわゆる`天才'の創造的思考能力をも獲得したと考えられる。このような潜在的機能の発現原理を数理的に追求することは、創造的思考を可能とする次世代情報処理システム(創造的情報処理システム)開発の要である。本研究課題では、このようなシステム構築の観点から、これまでの非標準計算論を基盤にして、潜在的機能発現手法をさらに模索し、データマイニングや画像処理システムなどへのそれらの導入を計り、従来性能とは異なる高効率機能がそこに創発されていないかを探ることによって、創造的情報処理システム研究を行ってきた。この研究の主な成果としては、1.四元数体系導入による離散値状態離散値時間型ホップフィールドニューラルネットワークの想起特性としての多重項を見出し得たこと、2.量子ビットニューラルネットワークのシステム応用拡大として、カラーナイトビジョンシステムやデータマイニングシステムにおける実用性を示し得たこと、3.ブロック学習SOMの創造的情報処理実応用として動体追跡画像処理システムを開発し得たこと、4.認知交代の双方向連想記憶モデルを詳細に調べ、その妥当性を明らかにできたこと、5.カオス強化学習スキームによる群行動の潜在的機能創発を様々な角度から検討し得たこと、6.確率的セルによって、非同期セルオートマトン上で故障箇所の自律的認識と不活性化及び自己修復機能発現を可能にし得るアルゴリズムを構築し得たこと、などである。これらの研究成果を国内外に広く発表することができ、当初の研究計画は達成できたものと考えている。しかし、Clifford代数などの数学的視点からの追求、量子状態のプロッホ表現及びセルラー型ニューラルネットワークなどへの導入による性能向上効果の評価などは、今後さらに追求するべき課題と考えている。本研究課題では、潜在的機能の発現原理を数理的に追及し、次世代の創造的情報処理システムの開発研究を行うことを目指しているが、当該年度においては、その端緒を得るために、非標準計算論手法の検討に関する研究を実施し、主に以下の研究成果を得た。(a)システムの複素数化並びに四元数化と非標準計算論の組み合わせがもたらす効果の検討:多元数体系導入がもたらす性能向上効果の中に、潜在的機能発現の機構が潜んでいないかを検討することを目指して、四元数及び量子ビットに基づいたニューラルネットワークを構築し、カラーナイトビジョン能力を有する色画像処理や符号化問題・データ分類などをベンチマークとして性能向上効果を評価した。(b)非線形現象に起因する潜在的機能発現の検討:カオスや確率共振、引き込み、結合振動子などを考慮したニューラルネットワークの性能向上の効果や従来記述できなった問題に対する記述可能性から潜在的機能発現を議論した。また、強化学習におけるカオス導入がもたらす学習効果や強化学習スキームによる群行動の創発からも潜在的機能発現を検討した。(c)局所的な相互作用からの潜在的機能発現の検討:非同期セルオートマトンを非標準計算論の観点から議論し、非同期セルオートマトン上で故障箇所の自律的認識と不活性化及び複製機能や障害物回避などの形成が可能な局所的規則を見出し、その中での潜在的機能発現を検討した。さらに非標準計算論の理論形式の存在意義を、より高次の観点からも模索する計画であったが、これは今後の課題として残ったものの、(a)(b)(c)に関する研究成果の一部を国内外に発表し得た点では、当初の研究計画は達成したものと考えている。

平成17年度においては、昨年度からの研究を継続発展させて、1.潜在的機能発現をめざした非標準計算論手法の検討課題をさらに深めるとともに、これらの研究で得られた成果を国内外に広く発表し、これらを基盤として、2.認知現象記述におけるモデルの有効性の検討、及び3.創造的情報処理システムとしての応用をめざして研究を遂行してきた。その結果、主に以下に示す新たな研究成果を得ることができた。まず、1及び2.に関しては、(1)多元数体系導入がもたらす性能向上効果の中に、潜在的機能発現の機構が潜んでいないかをさらに追求するとともに、システム応用も企てるために、量子ビットニューラルネットワークをアイリス識別問題やカラーナイトビジョンにおける色画像処理に適用し、実システムとしての性能を評価した。また四元数ニューラルネットワークの相互結合型の構築を試み、その特異な連想想起特性を見出すことができた。これらの成果の一部はIJCNN2006国際会議で発表予定であるが、それらの性能についての詳細は今後の検討課題である。(2)SOMに関しては、ブロック学習SOMを提案し、従来型では困難であった追加学習を簡単に実現し得る成果を得るとともに、医療情報支援システムなどへの適用をも検討した。(3)認知現象における機構解明の難題の一つである結合問題に、結合振動子の引き込み効果を考慮したニューラルネットワークを構築して適用し、そのモデルの有効性を示すことができた。(4)強化学習におけるカオス導入がもたらす学習効果や強化学習スキームによる群行動の創発からも引き続き潜在的機能発現を検討したが、モデルの結果の有効性を示すことができた。(5)非同期セルオートマトン(ACA)上で故障箇所の自律的認識と不活性化及び複製機能や障害物回避などの形成が可能な局所的規則を見出しうるACAシステムを構築して、その中での潜在的機能発現とシステムの高信頼性、フォールトトレラントについて検討した。3.の応用に関しては、1及び2.の研究と並行させてその段階で得られた有用なモデルのシステム応用、例えば、カラーナイトビジョン、医療情報データマイニングを試みてきたが、実際的な実用に供するためのさらなる工夫が必要であり、来年度以降の課題である。また、理論形式の妥当性のより高次の観点からの証明、およびClifford代数など、数学的道具立ての検討は、今後さらに追求するべき課題となっている。しかしながら、研究発表成果リストに示したように、今年度の研究成果としては上記の研究成果を国内外に広く発表することができ、当初の研究計画は達成できたものと考えている。平成18年度においては、これまでの研究を継続発展させ、提案してきた計算論の基本性能をより詳細に明らかにしその理論的基盤を固めるとともに、創造的情報処理システムとしてのシステム応用を企てた。また、本年度は本課題の最終年度でもあるので、これまでに得られた研究成果を可能な限り国内外に発表してきた。本年度に新たに得られた主な結果を以下に示す。1.四元数体系導入によるホップフィールドニューラルネットワークの特異な連想想起特性としての潜在的機能発現を明らかにし、その効果に基づく創造的情報処理システム応用を企て、その手法の離散値状態離散値時間型での妥当性を示し、多重項の存在など興味ある結果を得ることができた。
軟骨細胞の分化と機能に関する組織細胞化学的研究

当該研究では,軟骨細胞の機能的な分化の解明に焦点をあて,これまでに,in vivoにおける軟骨組織の細胞増殖能や糖鎖合成能について,組織化学的な手法を用いて検討を行ってきた。本研究の目的は,当初の研究計画ならびに方法に沿って遂行されつつある。すなわち,平成8年度には成長ホルモンが軟骨細胞のプロテオグリカンの糖鎖合成に著しい影響をおよぼすことを報告した(Jpn J Oral Boil,38:132-138,1996)。また,軟骨細胞は,とくに増殖細胞層において,成長ホルモンの制御を受けていることを明らかにした(J Histochem Cytochem,44:713-720,1996)。続いて,ラット成長板軟骨では,成長ホルモンによって誘導される軟骨細胞の増殖と基質成分の産生が密接に相関することを報告した(第37回歯科基礎医学会,東京)。さらに,腫瘍組織では,軟骨肉腫の発育・増殖には,EGF,IGF-I,FGFなどの成長因子のはたす役割が重要であることも報告した(第84回日本病理学会,名古屋)。このように,軟骨細胞の発育過程におけるin vivoでの代謝系の変化については,基礎的なデータが集積しつつある。近年,IN situハイブリダイゼーションやPCR法の開発によって,細胞の遺伝子情報の解析が可能になってきた。今後は,本研究の目的に的確に対応してゆくために,これらの方法を導入し,生体移植性の軟骨肉腫細胞や卵巣摘出動物等の実験動物を使用して,組織細胞化学的,分子生物学的な検討を行ってゆきたい。当該研究では,これまでに,in vivoにおける軟骨組織の細胞増殖能や,糖鎖合成能について,組織化学的な手法を用いて検討を行ってきた。本研究目的は,当初の研究計画ならびに方法に沿って遂行されつつある。すなわち,平成7年度には,上皮細胞の成長因子であるEGFが軟骨組織にも存在し,このものが成長ホルモンによって調節されていることを明らかにし得た(Cell Tissue Res., 278:279-282,1994)。また,下顎頭軟骨では,成長ホルモンによって誘導される軟骨細胞の増殖と基質成分,とくにプロテオグリカンの産生が密接に相関することを報告した(第37回歯科基礎医学会,東京)。さらに,生体移植性の軟骨肉腫細胞の発育・増殖には,EGF,FGF,IGF-Iなどの成長因子のはたす役割が重要であることも確認できた(第84回日本病理学会,名古屋)。このように,軟骨細胞の成長過程におけるin vivoでの代謝系の変化については,基本的なデータが集積しつつある。現在は,軟骨細胞のプロテオグリカン合成過程における複合糖鎖の硫酸化(軟骨型プロテオグリカンの産生)に焦点を絞り,電顕組織化学的に検討しており,この研究結果の一部は,論文(Jpn. J. Oral Biol., 38:132-138,1996)として公表した。今後は,成熟軟骨ならびに軟骨肉腫などの病的軟骨由来の培養細胞を,酵素やホルモンで処理し,in vitroの環境における軟骨細胞の機能的変化について,生化学的,組織化学的な検索を行う予定である。当該研究では,in vivoにおける軟骨組織の細胞増殖能や,基質合成能に関する知見を基礎データとして,軟骨組織の代謝に重要な役割を演じている各種の成長因子が,軟骨細胞の機能的な分化のステージとどのような関連をもって発現されるかを,組織化学的な手法を用いて検討を行ってきた。すなわち,平成7年度には,上皮細胞の成長因子であるEGFが軟骨組織にも存在し,このものが成長ホルモンによって調節されていることを報告した(Cell Tissue Res.,278:279-282,1994)。また,生体移植性の軟骨肉腫細胞の発育・増殖には,EGF,FGF,IGF-Iなどの成長因子のはたす役割が重要であることも確認した(第84回日本病理学会,名古屋,1995)。

平成8年度には,成長ホルモンが軟骨細胞のプロテオグリカン糖鎖の合成に著しい影響をおよぼすことを明らかにした(Jpn.J.Oral Biol.,38:132-138,1996)。さらに,成長ホルモンは,軟骨組織の増殖層の細胞増殖活性を特異的に誘導することを証明した(J.Histochem.Cytochem.,44:713-720,1996)。このように,軟骨細胞の成長・発育過程におけるin vivoでの細胞代謝系の変化については,基本的データが集積されつつある。現在は,骨系統疾患モデル動物(骨粗鬆症ラット)を使用して,エストロゲン欠乏の軟骨組織におよぼす影響を生化学的,組織化学的に検討しており,この研究結果の一部は第10回国際組織細胞化学会(京都,1996)および第9回軟骨代謝学会(浜松,1997)において発表した。今後は,本研究の目的に的確に対応してゆくために,生体移植性の軟骨肉腫細胞や,培養した胎生期の軟骨組織を使用して,分子生物学的な検討を行ってゆきたい。当該研究では,軟骨細胞の機能的な分化にともなう分泌合成系の変化に注目し,軟骨組織における細胞増殖能や,基質合成能に関する組織細胞化学的な知見を基礎的データとして,軟骨細胞の発育,成長,病態などについて検討してきた。すなわち,平成7年度には,上皮系細胞の成長因子であるEGFが軟骨細胞にも存在し,この代謝が成長ホルモンによって調節されていることを明らかにした(Cell Tissue Res,278,1994)。また,平成8年度には,成長ホルモンが軟骨細胞のプロテオグリカンの糖鎖合成に著しい影響を及ぼすことを報告した(Jpn J Oral Biol,38,1996)。さらに,成長ホルモンは,軟骨組織の増殖層の細胞増殖活性を特異的に誘導することを,画像解析法を用いて証明した(J Histochem Cytochem,44,1996)。現在は,骨系統疾患モデル動物(骨粗鬆症ラット)や生体移植性の軟骨肉腫細胞などを使用して,エストロゲン欠乏の軟骨組織におよぼす影響を,生化学的,組織細胞科学的に検討しており,これらの研究結果の一部は第10回国際組織細胞化学会(京都,1996)ならびに第9会軟骨代謝学会(浜松,1997)において発表した。最近では,In situハイブリダイゼーション法やPCR法の応用によって,さまざまな細胞内遺伝子産物の定量化が可能になってきた。本研究においても,今後,これらの手法を積極的に導入し,軟骨細胞の機能的な発育の究明や,病態時における軟骨組織の分子生物学的な背景を明らかにしてゆきたい。
転写因子NF-κB、p65サブユニットのリン酸化による機能調節機構の解明

転写因子NF-κBは、炎症の発症や進行、免疫系細胞の分化など様々な生命現象に深く関与する。NF-κBは無刺激状態では活性抑制タンパク質であるIκBと結合して細胞質に留まっている。細胞が刺激を受けると、IκBはIκBキナーゼ(IKK)複合体(IKKα,IKKβ,NEMO)によってリン酸化され、分解される。その結果、NF-κBは核へ移行し、標的遺伝子の発現を調節する。近年、この「IκBのリン酸化」→「NF-κBのDNAへの結合」=「NF-κBの活性化」という図式だけでなく、p65サブユニットの幾つかのセリン残基(276,311,529,534番目)のリン酸化が転写活性を調節することが報告されている。我々は、生体内におけるS276のリン酸化の役割を明らかにするためにS276をアラニンに置換したノックインマウスを作出し、解析した。S276Aマウスは、リンパ管と血管の分離が不完全であり、胎生18.5日頃にリンパ管への出血のために死亡すると考えられる。しかし、胎児の中には胎生14.5日頃にはすでに死亡し吸収されているものも存在し、表現形に多様性が見られた(論文投稿準備中)。S276の重要性が唱えられる一方で、IKKβが534番目(ヒトでは536番目)のセリン(S534)をリン酸化し、NF-κBの転写を促進するという報告が蓄積している。我々はS276同様に534番目のセリン残基をアラニンに置換したノックインマウスを作出することを試み、S534AノックインマウスのコンストラクトをES細胞へトランスフェクションした。G418耐性クローンの選別を行い、3種類の陽性クローンを得たが、すべてのクローンで染色体異常(染色体数:41)が認められた。そこで新たにES細胞へトランスフェクションし、3つの陽性クローンを得た。今後、カリオタイピングを行い、正常な染色体をもつクローンでCreリコンビナーゼによる、ネオマイシン耐性遺伝子の除去を計画している。NF-κBは炎症、免疫系細胞の分化や機能、さらに種々の細胞の癌化などの様々な生命現象に深く関わる転写調節因子である。NF-κBはN末側にRel homology domainと呼ばれる構造を有する5つの転写因子(p50,p52,p65,cRel,RelB)の総称であり、ホモまたはヘテロダイマーを形成する。NF-κBは無刺激状態では活性抑制タンパク質であるIκBと結合した状態で細胞質中に留まっているが、サイトカインなどの刺激を受けるとIκBはIκBキナーゼ(IKK)複合体(工KKα,IKKβ,NEMO)によってリン酸化され、プロテアソームによって分解される。IκBの分解によりフリーとなったNF-κBは核へと移行し、標的遺伝子のプロモーター領域に存在する特異的配列に結合し、標的遺伝子の発現を調節する。近年、NF-kBの活性化を調節する新たな制御機構として、p65サブユニットのセリン残基のリン酸化と転写活性の関連が注目されている。そこで我々は生体内におけるp65セリン残基のリン酸化の役割を明らかにすることを目的とし、p65の276番目のセリン残基をアラニンに変換したノックインマウス(S276A)を作製した。S276A

マウスは胎生致死であった。p65欠損マウスは胎生14.5日に肝細胞のアポトーシスによって胎生致死となる。しかし、S276Aマウスでは胎生14.5日には既に死亡し、吸収されているもの、また眼の欠損が認められるものなど表現型に多様性が認められた。S276Aヘテロ接合体を交配させ、経時的に胎仔を摘出したところ、死因はリンパ管と血管の分離不全によるリンパ管への出血によるものと考えられた。S276Aマウス胎仔と同腹の野生型胎仔から線維芽細胞を調製した。線維芽細胞をTNFαやLPSで刺激したところ、S276Aではp65の核移行とDNAの結合は正常に認められたが、NF-κBの転写活性の著しい抑制が認められた。さらに野生型線維芽細胞ではTNFαやLPSで刺激すると、コアクチベーターCBPとの会合が認められたが、S276A線維芽細胞をTNFαやLPSで刺激してもCBPとの会合は認められなかった。また、276番目のセリン残基以外にも534番目のセリン残基のリン酸化の重要性が報告されており、S534Aノックインマウス作製の為のコンストラクトを作製し、ES細胞へのトランスフェクションを行なった。現在、G418耐性クローンの選別を行なっている。転写因子NF-κBは、炎症の発症や進行、免疫系細胞の分化など様々な生命現象に深く関与する。NF-κBは無刺激状態では活性抑制タンパク質であるIκBと結合して細胞質に留まっている。細胞が刺激を受けると、IκBはIκBキナーゼ(IKK)複合体(IKKα,IKKβ,NEMO)によってリン酸化され、分解される。その結果、NF-κBは核へ移行し、標的遺伝子の発現を調節する。近年、この「IκBのリン酸化」→「NF-κBのDNAへの結合」=「NF-κBの活性化」という図式だけでなく、p65サブユニットの幾つかのセリン残基(276,311,529,534番目)のリン酸化が転写活性を調節することが報告されている。我々は、生体内におけるS276のリン酸化の役割を明らかにするためにS276をアラニンに置換したノックインマウスを作出し、解析した。S276Aマウスは、リンパ管と血管の分離が不完全であり、胎生18.5日頃にリンパ管への出血のために死亡すると考えられる。しかし、胎児の中には胎生14.5日頃にはすでに死亡し吸収されているものも存在し、表現形に多様性が見られた(論文投稿準備中)。S276の重要性が唱えられる一方で、IKKβが534番目(ヒトでは536番目)のセリン(S534)をリン酸化し、NF-κBの転写を促進するという報告が蓄積している。我々はS276同様に534番目のセリン残基をアラニンに置換したノックインマウスを作出することを試み、S534AノックインマウスのコンストラクトをES細胞へトランスフェクションした。G418耐性クローンの選別を行い、3種類の陽性クローンを得たが、すべてのクローンで染色体異常(染色体数:41)が認められた。そこで新たにES細胞へトランスフェクションし、3つの陽性クローンを得た。今後、カリオタイピングを行い、正常な染色体をもつクローンでCreリコンビナーゼによる、ネオマイシン耐性遺伝子の除去を計画している。
頭頸部微小癌を見逃さない：新規蛍光プローブによる微小癌同定法の確立

本研究は、最新の蛍光色素プローブ、プロテオグリーンを用いて、頭頸部微小癌を可視化できるのかを検証し、将来的に手術による癌の取り残しを無くすことを目指した研究である。プロテオグリーンにより、頭頸部癌の一部で可視化に成功した。しかし、多くの腫瘍では正常な腺組織、線維性結合組織、軟骨、リンパ球などが可視化され、腫瘍部が可視化されなく、今後の課題を残した。頭頸部癌では、各種治療が開発されている現在でも、外科治療がゴールドスタンダードである。手術では病変を遺残すれば再発し、逆に大きく切除した場合には手術侵襲が大きくなり術後のQOLが低下するという問題がある。切除マージンは、個々の病態に応じた距離で設定するが、ルゴール(複方ヨード・グリセリン)を用いた観察を参考にすることが多い。しかし、ルゴール染色は色落ちしやすく、微小病変(5 mm以下)を検出できないという問題点がある。最近、癌細胞を特異的に光らせる蛍光色素プロテオグリーンが開発された。プロテオグリーンは、多くの癌細胞で発現が亢進しているガンマーグルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)の酵素反応を標的とする試薬で、癌組織にスプレー後5分ほどで癌部が緑色の蛍光を発する。プロテオグリーンは、癌細胞自体が蛍光を発するため、1 mm以下の微小癌も発見することができる。平成28年度は頭頸部癌手術切除検体を用いて、癌部のプロテオグリーンによる可視化有無、癌部と正常組織の境界判定を検討し、どの癌種で有効であるのかリストを作成に取り組んだ。これまでのところ、扁平上皮癌では癌部とプロテオグリーンによる可視化位置が完全に一致しているものがいくつか見られた。しかし、腺組織を多く含んでいる領域では、正常な腺組織はGGT活性がもともと高いことから、正常部と癌部の境界がわからなくなってしまうことがわかった。さらに現在、プロテオグリーンを使用した検体を用いて薄切切片を作製し、抗GGT抗体を用いた免疫染色とHE染色を行いプロテオグリーンの有用性について精査している。当初予定していた研究項目について、順調に研究を進めることができた。そこで、本研究は、最新の蛍光色素プローブを用いて、頭頸部微小癌を可視化できるのかを検証し、将来的に手術による癌の取り残しを無くすことを目指した研究である。平成29年度は、28年度に引き続き、頭頸部腫瘍のフォルマリン固定パラフィン包埋組織を用い、薄切切片を作製し、抗Gamma-glutamyltransferase 1(GGT1)抗体を用いて免疫染色とHE染色を行った。用いた頭頸部腫瘍は、口腔癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、副鼻腔癌、原発不明癌、耳下腺腫瘍で、組織型は扁平上皮癌、腺房細胞癌、多形腺腫であった。GGT1発現細胞と腫瘍部は一致せず、またGGT1の発現は非常に低かった。また腫瘍部の細胞核のヘマトキシリンの染まりが非常に弱いことから、術前の化学療法または放射線の影響で細胞の状態が良くなく、GGT1の発現と癌の関連を正確に評価できないと考えられた。今後、術前の生検検体を用いて、再度GGT1の免疫染色をやり、評価することにしている。平成28年に引き続き、平成29年はリスト化する癌種を増やす予定である。また現在使用しているプロテオグリーンはGGTで反応する蛍光試薬であるが、癌種によってはGGTでは可視化することができないことが明らかとなった。そのため、今後はその他の生体分子にも着目し、可視化に取り組む予定である。頭頸部癌主研究者に加え3名の分担者に少額の残金が生じた。少額で使用できず来年度の予算と合わせて執行予定である消耗品の購入に充填する。
脱占領期のメディアにおける文学者の美術言説と海外体験に関する基礎的研究

本研究は、脱占領期の文化状況が激変しながら海外渡航制限が続く中での西洋文化受容の問題を、海外体験を経てメディアを通じ、文化の発信源となった、文学者による美術言説に焦点をあてて検討・究明することを目的とする。渡航制限下で新聞社特派員として渡欧し、新聞・雑誌を舞台に西洋文化の発信者となった文学者の美術言説(批評・随筆等)を体系的に調査・検討し、実相を究明することで、〈戦後〉文化生成過程解明の研究基盤の構築を目指す。
有機アミン／酸化亜鉛ナノコンポジットの合成と有機太陽電池への応用

本研究室ではこれまでに、金属酸化物やアミノ化合物を用いた様々な電子捕集層や捕集電極を開発し、これらを用いた高耐久な素子の大気下作製に成功している。酸化亜鉛は電子捕集層として広く用いられているが、膜表面及び膜中に水酸基が存在しており、水酸基由来のエネルギー準位が光励起により生じた電子のトラップ準位となると考えられている。近年、アミノ化合物を酸化亜鉛に混ぜ込むことで水酸基由来のトラップが減少し、電荷モビリティや素子性能が向上したことが報告されている。そこで本研究では種々アミノ化合物を酸化亜鉛に混ぜ込んだナノ複合体膜を電子捕集層に用いることで、高性能かつ高耐久な素子の作製を試みた。洗浄済みのITO基板上に、sol-gel法により酸化亜鉛/アミンナノ複合体膜を製膜した。その後、有機発電層としてP3HT:PCBM、正孔捕集層としてPEDOT:PSSをスピンコート法により順に製膜し、正孔捕集極としてAuを真空蒸着した。最後に熱アニールを兼ねて被覆材の熱圧着を施すことで素子の完成とした。この素子に擬似太陽光(AM1.5G-100 mW cm-2)を照射しながら電流-電圧(I-V)曲線を測定し、性能評価を行った。白色光照射120分後における各素子の光電変換特性は、ZnOを電子捕集層に用いた素子のPCEは3.12 %であったが、PEI(B)を混ぜ込んだ素子ではJSC値の増加が見られ、PCEが1割程度増加した。BAPではJSC値や素子性能の向上は見られず、分子量が低分子であるためにナノ複合体膜中のBAPの残存率が低く、その結果BAPが十分に機能していないことが示唆された。また原子間力顕微鏡でZnO:PEI(B)ナノ複合体膜表面を観察したところ膜の表面形状の変化が観察され、これによる光閉じ込め効果が期待されこのことがJSC値の向上に大きく寄与していると考察した。アミン材料と酸化亜鉛源を混合した前駆体溶液から作製された電子捕集材料を用いることで従来の酸化亜鉛膜より性能が向上したためアミン残存率と電池特性の関係を調査し、またX線分析を用いてアミン材料や酸化亜鉛の電子状態や結晶性などのキャラクタリゼーションを進める。大まかな予算として、ポリ3ヘキシルチオフェン5g...15万円/g、その他、発電材料および電池材料一式...50万、学会旅費...20万円、論文投稿および英文校閲...10万円などを予定本研究室ではこれまでに、金属酸化物やアミノ化合物を用いた様々な電子捕集層や捕集電極を開発し、これらを用いた高耐久な素子の大気下作製に成功している。有機発電材料費が高額のため、次年度予算と合わせての購入を予定しているため。大まかな予算として、ポリ3ヘキシルチオフェン5g...15万円/g、その他、発電材料および電池材料一式...50万、学会旅費...20万円、論文投稿および英文校閲...10万円などを予定
嫌気条件における遺伝情報の転写制御機構

大腸菌の染色体DNAを制限酵素で切断後、プラスミッドpUC118に組み込んでtorR遺伝子をクローン化した(pKS7)が、3.4キロ塩基対(kbp)の染色体DNA断片が組み込まれている。torR突然変異を持つHM177株をpUC118およびpKS7で形質転換した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、2種類のタンパク質がコードされていた。即ち、TMAO呼吸培養で最も強く、次いで硝酸呼吸培養、発酵培養でも合成されるが酸素呼吸では合成されない52kDaタンパク質と、上記4つの培養条件で等しく合成される27kDaタンパク質である。エクソヌクレアーゼIIIを用いたデレッションで何れかのタンパク質を合成できないプラスミッドを作成した結果、52kDaタンパク質を発現するプラスミッドpKS7D3のみがHM177株のtorR変異を回復した。硝酸還元酵素の遺伝子オペロンnarGHJIなどの2成分系転写調節因子をコードするnarXとnarLのlacZ融合遺伝子をHM177株に形質導入し、さらにpKS7で形質転換して作成した株は、narX-lacZ、narL-lacZともに硝酸呼吸条件でのみX-galを分解した。即ち、TorRタンパク質はnarXLオペロンの転写制御に働くことを示している。52kDaのTorRタンパク質は対数増殖の後期に入ると合成量が少なくなり、torR遺伝子の転写を自己制御している可能性が高い。従って、上記のpKS7DはTorRタンパク質の大量生産に使えなかった。今後の研究方向として、3.4kbpのDNA上に適当な制限酵素切断部位が見つからないため、部位特異的変異を導入して自己制御領域を破壊することにより蛋白の大量生産を可能にし、精製タンパク質の性質を当初の計画通りに解明したい。
温度感受性変異株tsFT101細胞の温熱耐性および熱ショック蛋白誘導の解析

細胞レベル・DNAレベルの温度受容、温熱耐性の機構解明の糸口として、マウス乳ガン由来のFM3A細胞から分離された温度感受性変異株tsFT101細胞に着目した。この細胞は、33°Cでは正常の細胞分裂がおこり増殖するが、39°Cでは減数分裂は正常におこるものの、細胞質分裂が特異的に阻害されるため、細胞が多核化するという温度依存性の特性を有する。温度感受性変異株の熱耐性と熱ショック蛋白(hsp)誘導の検討から温度感受性変異の機構を検討することを本年度の研究目的とした。FM3A細胞および温度感受性変異株であるtsFT101細胞を、37°Cおよび39°Cに設定した2器の炭酸ガス培養器(5%CO_2)を用いて浮遊培養した。tsFT101細胞を33°Cから39°Cの各温度にて培養し、増殖率および多核細胞率を検討したところ、増殖率は37°Cにピークを有す上に凸の曲線を呈した。また、33°Cから38°Cまでは多核細胞はほとんど認めず(数%以下)、39°Cではじめて増加(60%以上)した。細胞レベルの温熱耐性をコロニー・フォーメーション・アッセイにて検討した。tsFT101細胞は、FM3A細胞にくらべ、37°C・39°C両条件下とも、温熱高感受性(低耐性)であった。45°C15分間の熱処理によりFM3A細胞では熱耐性が誘導されたが、39°C培養tsFT101細胞では、ほとんど熱耐性の誘導を認めなかった。また、同様の熱処理をした細胞から蛋白を可溶化・抽出し、電気泳動後抗hsp70抗体を用いてウエスタン・ブロッティングを行い、熱ショック蛋白(hsp70)の発現を検討した。構成型のhsp72は、いずれの細胞でもほぼ同様に発現していたが、誘導型hsp70の誘導はFM3A細胞では見られたものの、39°C培養tsFT101細胞では、極わずかであり、この結果は、温熱耐性の誘導結果と一致した。今後、この細胞を用いて、熱ショック蛋白と温熱耐性との関係、さらには、この細胞の温度感受性変異の機構の解明を目指して行きたい。
ミトコンドリアの放射線感受性に及ぼす影響についての検討

【目的】悪性腫瘍を放射線で制御しようとするとき,その腫瘍細胞の放射線感受性は治療成績に大きく影響する.一般的に核・細胞質比の大きな細胞は放射線に感受性であり,細胞質が大きく,細胞質内にミトコンドリアの多い細胞か抵抗性であると言われてきた.事実,ミトコンドリアを多く含む筋肉や神経細胞から発生した悪性腫瘍は放射線に抵抗性であることが多い.【材料と方法】ミトコンドリアDNAを有する細胞株(HelaS3)とその細胞を処理しミトコンドリアDNAを不活化した細胞株(ρ^09A),更にその細胞にミトコンドリアDNAを移植した細胞株(TTIII)の3種類を用いた.小動物放射線照射装置(STABILIPAN2,シーメンス社製)を用いて照射しコロニーアッセイ法により生存率を検討した.またフローサイトメーターを用いてアポトーシスの出現について検討した.【結果】それぞれの細胞株のdoubling timeはHelaS3で約21時間,ρ^09Aで約32時間,TTIIIで約24時間であった.それぞれの細胞株の放射線に対する感受性はρ^09A細胞株でやや低い傾向があったもののそれらの間に明らかな有意差は認められなかった.またどの細胞株も照射によりアポトーシスの出現はわずかであり,それらの間に明らかな差はないと思われた.【結論】今回の検討ではミトコンドリアDNAの状態による放射線感受性には明らかな差異は認められなかった.またアポトーシスについてはどの細胞株もその出現度が低く,差が明らかにならなかった.しかし,アポトーシスにいたる経路における分子生物学的な解析あるいはMnSODについての解析など時間の関係で検討できなかった部分については未知であり今後更なる検討が必要と思われた.【目的】悪性腫瘍を放射線で制御しようとするとき,その腫瘍細胞の放射線感受性は治療成績に大きく影響する.一般的に核・細胞質比の大きな細胞は放射線に感受性であり,細胞質が大きく,細胞質内にミトコンドリアの多い細胞が抵抗性であると言われてきた.事実,ミトコンドリアを多く含む筋肉や神経細胞から発生した悪性腫瘍は放射線に抵抗性であることが多い.【材料と方法】(1)放射線感受性とミトコンドリアを介するアポトーシスの関係現在,ヒト肺腺癌細胞株,ヒト乳癌細胞株,ヒト子宮癌細胞株を用いてそれぞれの放射線感受性をコロニー法を用いて検討した.また放射線感受性の指標となると言われているアポトーシスの発現をフローサイトメトリーを使用した方法とラダー法で検索し,コロニー法による放射線感受性との関連を確認している.アポトーシスにはミトコンドリアを介する経路とミトコンドリアを介さない経路が存在するが,放射線照射した後の細胞のミトコンドリア膜電位をフローサイトメトリーで観察することによりそのアポトーシスの発現頻度と膜電位変化の関係観察中である.今後はそれぞれの細胞のアポトーシスがどの経路優位なのかをタンパクの発現を見ることで検索したい.(2)ミトコンドリアDNA不活性細胞株の作成ある濃度の臭化エチジウムを含む培養液中で培養することによりミトコンドリアDNAを不活化した細胞が作成できることが知られている.現在,上記実験で用いている細胞株からそれぞれのミトコンドリアDNAを不活化した細胞を作成中である.【経過】ヒト腫瘍細胞の放射線感受性とアポトーシスの発現にはある程度の関連があることが示唆された.今後はミトコンドリアDNAを介したアポトーシス発現の程度とミトコンドリアDNAが不活化されたとき放射線感受性やアポトーシスの発現にどのような影響がでるのかを検討する予定である.【目的】悪性腫瘍を放射線で制御しようとするとき,その腫瘍細胞の放射線感受性は治療成績に大きく影響する.一般的に核・細胞質比の大きな細胞は放射線に感受性であり,細胞質が大きく,細胞質内にミトコンドリアの多い細胞か抵抗性であると言われてきた.事実,ミトコンドリアを多く含む筋肉や神経細胞から発生した悪性腫瘍は放射線に抵抗性であることが多い.【材料と方法】ミトコンドリアDNAを有する細胞株(HelaS3)とその細胞を処理しミトコンドリアDNAを不活化した細胞株(ρ^09A),更にその細胞にミトコンドリアDNAを移植した細胞株(TTIII)の3種類を用いた.小動物放射線照射装置(STABILIPAN2,シーメンス社製)を用いて照射しコロニーアッセイ法により生存率を検討した.またフローサイトメーターを用いてアポトーシスの出現について検討した.【結果】それぞれの細胞株のdoubling timeはHelaS3で約21時間,ρ^09Aで約32時間,TTIIIで約24時間であった.それぞれの細胞株の放射線に対する感受性はρ^09A細胞株でやや低い傾向があったもののそれらの間に明らかな有意差は認められなかった.またどの細胞株も照射によりアポトーシスの出現はわずかであり,それらの間に明らかな差はないと思われた.【結論】今回の検討ではミトコンドリアDNAの状態による放射線感受性には明らかな差異は認められなかった.またアポトーシスについてはどの細胞株もその出現度が低く,差が明らかにならなかった.しかし,アポトーシスにいたる経路における分子生物学的な解析あるいはMnSODについての解析など時間の関係で検討できなかった部分については未知であり今後更なる検討が必要と思われた.
軟骨細胞におけるウロテンシンⅡとそのアナログ（URP）の新しい機能の解明

本申請研究では、軟骨細胞におけるUII/URPの生理機能とその作用機序を明らかにし、さらには指肢の発生や再生、軟骨疾患との関連性を探ることを目標として行った。その結果、軟骨のUTR発現レベルは軟骨形成初期に高く、成熟軟骨では低いことが解った。培養下の軟骨組織へのUII処理により軟骨基質であるII型コラーゲンとTGF-β1の遺伝子発現が有意に増加した。肢切断後のスパイク(軟骨組織)形成がUTRアンタゴニストの処理により抑制された。以上の結果から、UII-UTR系は軟骨組織の形成に関与している可能性が示唆された。ウロテンシンIIの軟骨組織での機能を明らかにすることを目的として、平成25年度は両生類のアフリカツメガエルとマウス軟骨前駆培養細胞に対するウロテンシンIIの作用の解析を行った。アフリカツメガエルの成長段階における軟骨組織でのウロテンシンII受容体(UTR)の遺伝子発現レベルを解析した結果、UTR遺伝子の発現レベルは成熟個体(生後1年)に比べて変態直後の幼若個体(生後2-3ヶ月)で高いことが示された。幼若個体の胸部軟骨組織を単離し、組織培養下においてウロテンシンIIがトランスフォーミング増殖因子(TGF-β1)や軟骨基質の1つである2型コラーゲン(Col2)に及ぼす影響を解析した。その結果、両生類の軟骨組織へのUII添加は、TGF-β1とCol2の遺伝子発現を増加させ、その作用はUTRアンタゴニスのurantideの前処理によって抑制された。また、生体において軟骨形成に及ぼすウロテンシンIIの作用を解析するため、肢を切断した幼若個体の肢の基部にurantideを継時的に投与し、その後のスパイク肢形成を対照群と比較した。その結果、Urantide投与個体のスパイク形成は、salineを投与した対照群に比べて遅延し、さらに軟骨組織の伸長も対照群に比べて有意に短かった。本年度の研究において、アフリカツメガエルの胸部軟骨において、UII-UTR系は軟骨基質の形成に関わるTGF-β1とCol2a1の発現を上方調節したこと、切断肢へのUrantide投与がスパイクの軟骨の伸長を遅延させたことから、UII-UTR系は軟骨組織の成長に寄与している可能性が示唆された。また、これまでに、マウス軟骨前駆細胞にUTRを安定発現させた細胞株を樹立し、この細胞を用いて、ウロテンシンIIの軟骨細胞への作用について解析を開始した。ウロテンシンIIの軟骨組織での機能を明らかにすることを目的として、平成26年度はマウス軟骨培養細胞の機能解析を進めるとともに、UTRをノックアウトしたカエルの作製に取り組んだ。マウスの軟骨培養細胞(ATDC5)において内在のUTR発現をRT-PCRにより確認したところ、ATDC5にUTRの発現が検出されなかった。そこで、マウスUTR遺伝子をATDC5にトランスフェクションしてUTR安定発現細胞株を樹立した。発現させたUTRが機能的であるか否かを確認するため、カルシウム動員アッセイを行ったが、ATDC5ではUTRを介したシグナル応答が見られなかった。UTRを発現させた他の培養細胞ではシグナル応答が確認されたため、おそらくATDC5にはUTRを介したシグナル伝達系が備わっていない、あるいは細胞の形質変化により失われた可能性が考えられた。そこで、UTRを介した機能をin vivoで直接的に調べるため、遺伝子に特異的に変異を導入することができるTALENを用いてアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の受精卵にTALEN mRNAをインジェクションした。得られた幼生の尾から抽出したDNAをもとにUTR遺伝子に変異が導入されているかどうかをジェノタイピングによって確認した。その結果、TALENをインジェクションした約1/4の胚でUTR遺伝子に変異が導入されていることがわかった。現在、変異が導入された個体の表現型の解析を行っている。これまでの研究では、ウロテンシンII(UII)-UT受容体(UTR)系による軟骨機能を解析するためにマウス軟骨培養細胞(ATDC5)を用いて実験を行っていたが、作成したUTR安定発現細胞株はUIIによる細胞内応答を示さなかったため、ATDC5にはUTRを介したシグナル伝達系が備わっていない、あるいは細胞の形質変化により消失した可能性が考えられた。そこで、平成27年度はゲノム編集技術TALENによりUIIおよびUTR遺伝子に変異を導入したノックアウト個体の作出を行った。当初はアフリカツメガエルを用いて行っていたが、ゲノムセットが偽4倍体のため複数の受容体遺伝子の存在が示唆されたため、2倍体のネッタイツメガエルを用いた作成に切り替えた。その後、数塩基が欠失したノックアウト個体を得て、系統化のために交配を繰り返している。また、ツメガエルのスパイク肢を用いた解析において、再生肢の増殖中の軟骨細胞にUTRが高発現していることを確認した。これまでの研究により、UII-UTR系が軟骨細胞の機能調節に関与している可能性が示されている。

以上の結果から、UII-UTR系は軟骨組織の形成に関与している可能性が示唆された。当初予定していたマウス軟骨培養細胞ATDC5での機能解析が実験に用いた軟骨培養細胞の形質が原因で思うように実施できなかったため、個体レベルでの機能解析に切り替えた。比較内分泌学平成27年度の研究では、UTRをノックアウトしたツメガエルと正常個体の軟骨形成過程を比較して、UII-UTR系が軟骨形成にどのように関与しているのかについて精査する。また、UIIおよびUTRをノックアウトしたメダカのヒレ(軟骨)の再生を観察することで軟骨形成におけるUII-UTR系の関与が系統学的に下位に位置する魚類にも存在するか否かを明らかにしていく。マウス軟骨培養細胞を用いた解析はUTR安定発現細胞株の樹立に時間がかかったため少し遅れているが、両生類での解析では、ウロテンシンIIが軟骨基質の産生を増加させ、軟骨形成に関与していることを明らかにすることができた。平成26年度の研究では、マウス軟骨培養細胞を用いた機能解析を進めるとともに、UTRをノックアウトしたアフリカツメガエル個体の作製に取り組み、ウロテンシンIIの個体レベルでの作用について解析を行う。
マウス胎児皮膚を用いたExfoliative toxinの表皮剥奪機序の解明

材料と方法II以下の前処置後の鉄コロイド染色による、表皮及び毛嚢の陰性荷電(NC)部位観察。a前処置なしb.ヒアルロニダーゼc.コンドロイチナーゼABC、ケラタナーゼ、ヘパリチナーゼそれぞれ単独、及び3者併用。IV鉄コロイド染色を用いた、N2表皮NC部位の電子顕微鏡による観察。結果I ETにより、E1415ではsuprabasallayerに裂隙を生じ、以後、顆粒層の形成形勢に伴い、同層へ移動してゆき、N2では、顆粒層のみに認められた。IIa表皮でのNCは、E14,15では全層に分布するが、以後、基底層では減弱し、皮膚の成熟とともに、顆粒層に集中していった。また、E16以後の毛乳頭の細胞間に強いNC出現を認めた。IIbヒアルロニダーゼ処理にて、表皮のNCには変化なかったが、毛乳頭の陰性荷電は、ほぼ消失した。IIc毛乳頭の陰性荷電は、コドロイチナーゼABC、ケラタナ-ザ、ヘパリチナーゼそれぞれ単独処理では変化を認めなかったが、3者併用時、及び、ヒアルロニダーゼ処理後、著明な減弱を認めた。なお、表皮では著変を認めなかった。III PEIにより、E15ではsuprbasal、N2では顆粒層に裂隙を形成した。IV表皮全層の細胞内外に、鉄コロイド粒子が瀰漫性に沈着、特異的なNC部位を認めることはできなかった。毛乳頭では、細胞間に特異的な鉄コロイド粒子の沈着を認めた。マウス胎児皮膚の分化に伴い,ET感受性部位が変化していくことが観察された。すなわち,(1)ETによる表皮裂隙形成は,胎生13日では認められなかった。(2)胎生14,15日では基底層直上に,(3)胎生1618日では有棘層顆粒層に認められた。(4)生後2日になると裂隙形成は顆粒層に限局するようになった。マウス胎児皮膚の分化に伴い,表皮内陰性荷電の分布が変化していくことが観察された。(1)表皮内陰性荷電は胎生13日ではほとんど認められなかった。(2)胎生14,15日では表皮全層に,(3)胎生1618日では基底層以外の全層に認められた。(4)生後2日になると陰性荷電は顆粒層に限局するようになった。表皮内陰性荷電が表皮細胞間の接着に関与している可能性が示唆された。すなわち,陽性に荷電した粒子であるポリエチレンイミンを表皮内に浸透させたところ,(1)胎生15日の表皮では基底層直上に,(2)生後2日の表皮では顆粒層に裂隙形成が認められた。以上の結果より,ETによる表皮裂隙形成と表皮内陰性荷電分布が胎生期皮膚の分化と密接な関連を有していることが明らかとなった。表皮内陰性荷電が細胞間の接着に関与している可能性が示唆され,さらにETによる表皮裂隙形成部位と表皮内陰性荷電分布とがほぼ一致することから両者の密接な関係も示唆された。問題点としては,両者の関係を論じるにはまだデータが不足している点である。今後は電顕的観察を行い,両者の関係につき更に検討していく予定である。〈材料と方法〉I胎生1318日(E13E18)、生後2日(N2)、生後6ケ月(N6m)のマウスの皮膚を用い、以下のadの前処置後、鉄コロイド染色を行い、陰性荷電(NC)部位を観察した。a.前処置なしb.37°C、及び60°Cにてメチレーションc.ヒアルロニダーゼd.ヘパリチナーゼ・コンドロイチナーゼABC・ケラタナーゼそれぞれ単独、及び3剤併用。