hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
産業および地域保健における神経,精神,行動障害とその評価法に関する研究

今回の研究では、各種有害化学物質および物理学的環境因子に暴露する作業者集団と中毒・職業病・成人病患者で、末梢神経(神経伝導速度、「神経伝導速度分布」)、中枢および脳神経(事象関連電位、短潜時体性感覚誘発電位、聴覚誘発電位、視覚誘発電位、平衡機能検査)、自律神経(心電図R-R間隔変動)、精神・行動(神経行動テスト)、感情・ストレス(質問紙法、誘発電位誘発電位)の各種の神経・精神・行動機能の測定を行ない、以下の成果を得た。1)鉛、混合有機溶剤、スチレン、局所振動等に暴露する明らかな神経徴候のない作業者集団で、末梢神経の伝導の障害を見出し、さらにこの障害は伝導が速い神経線維の方が遅い神経線維より強く起こることを明らかにした。同様の障害を、糖尿病およびアルコール依存症患者でも観察した。2)同じくこれらの作業者および患者で、事象関連電位または各種誘発電位の潜時の遅延を見出した。また、自律神経機能の低下を明らかにした。3)スチレンに暴露する作業者で神経行動テスト得点の低下を見出した。4)混合有機溶剤等に暴露する作業者集団で、平衡機能の障害を明らかにした。5)職場での技能労働者(男子)の精神障害の発生に影響を与える主要な社会心理的因子は、(1)仕事への不満、不適合と(2)人間関係の障害であり、仕事量の影響は少ないことを明らかにした。さらに、コンピューター技術者の労働ストレス、精神症状および性格傾向に影響を与える主要な疫学因子は年齢であり、コンピューター作業自体の影響は少ないことを観察した。6)ストレスチェックリスト(SCL-86)、感情プロフィール検査(POMS)などの質問紙法の日本語版の標準化を行ない、正常値および信頼性・妥当性を明らかにした。7)鉛および2.5ヘキサンジオン中毒動物で、末梢神経軸索内輸送および脊髄エネルギー代謝の障害を明らかにした。8)脳血管障害患者の三次予防のための地域ケアシステムに関する疫学調査により、(1)地域住民の脳血管障害予防事業への参加促進、(2)効果的な事業内容、および(3)他の事業との連携等について、ガイドラインを明らかにした。産業および地域保健領域の神経、精神、行動障害とその評価法に関し、本年度は以下の成果を得た。1)多種の重金属曝露による末梢神経機能に及ぼす影響を調べるために、鉛、亜鉛および銅の同時曝露作業者の橈骨および正中神経伝導速度を測定したところ、両速度とも低下をしたが、亜鉛および銅は鉛の神経障害に対し拮抗作用を示した。2)年齢、心拍数、性、喫煙、飲酒の自律神経機能に及ぼす影響を調べるために健常人の心電図RR間隔変動を測定したところ、年齢および心拍数が有意の影響を及ぼすことがわかった。3)慢性の職業性鉛曝露および飲酒による末梢神経機能に及ぼす影響を調べるために鉛作業者およびアルコ-ル依存者の末梢神経伝導速度および速度分布(DCV)を測定したところ、ともに伝導速度の速い神経線維のほうが影響を受けやすいことがわかった。4)生活習慣および職場ストレスが抑うつ症状に及ぼす影響を検討するために企業従業員および工場作業者を対象に質問紙調査を実施したところ、睡眠時間1日6時間以下、毎日三回食事を食べない場合、飲酒習慣のない場合、作業ペ-スのコントロ-ル、職場の人間関係および職務の不適性が抑うつ症状と有意に関連していた。5)職場における問題飲酒行動の頻度およびその基本的属性との関連を調べるために企業従業員のうち現在飲酒者を対象に質問紙調査を実施したところ、問題飲酒行動の頻度は男性で15%、女性で6%であり、また低学歴、職種および一週間飲酒量が問題飲酒行動と関連することが示された。6)職場ストレスが血圧、ヘモグロビンA1c、医師受診率、抑うつ症状およびうつ病の発症に及ぼす影響を5つの研究デ-タを基に検討したところ職務不満足がヘモグロビンA1c、抑うつ症状、うつ病および医師受診率と関連を示した。

6)ストレスチェックリスト(SCL-86)、感情プロフィール検査(POMS)などの質問紙法の日本語版の標準化を行ない、正常値および信頼性・妥当性を明らかにした。7)鉛および2.5ヘキサンジオン中毒動物で、末梢神経軸索内輸送および脊髄エネルギー代謝の障害を明らかにした。8)脳血管障害患者の三次予防のための地域ケアシステムに関する疫学調査により、(1)地域住民の脳血管障害予防事業への参加促進、(2)効果的な事業内容、および(3)他の事業との連携等について、ガイドラインを明らかにした。
出生後早期発現遺伝子群による心筋細胞増殖制御およびその分子機序の検討

心筋細胞の増殖能が失われる出生後早期に発現が変化する遺伝子群のうち、細胞増殖制御に関わる候補遺伝子を同定し、その分子機能の検討を行った。心臓での経時的発現変化を示す遺伝子群の一部は非心筋細胞由来であった。心筋細胞に発現し出生後経時的に発現低下を認める遺伝子のうち、CRP1(Cysteine and Glycine Rich Protein 1)は培養細胞(H9C2:ratcardiomyoblast cell line)において、ノックダウン、過剰発現の系ともに増殖能に促進的に働く結果を示した。CRP1のファミリー分子で心筋細胞に継続的に発現し、心発生に必須であるMLP(Muscle LIM Protein)とは増殖能および遺伝子発現制御においてCRP1は異なる作用を持つことを見出し、CRP1の発現はMLPの作用を修飾する可能性が示唆された。このような胎生期から出生後早期に限定的な遺伝子発現は増殖能を含めた心筋細胞機能の違いに関与すると考えられる。MLPは心筋症を来すヒト変異が知られ、一アミノ酸変異により心筋細胞の病的異常を来すが、分子病態は不明であることから、MLPの一連のヒト変異体ベクターを作成・検討し、培養細胞レベルで細胞内局在の異常を認めることを見出した。さらにCRP1、CRP2についてもヒト変異体の検討を行い、CRP1のヒト変異体で分子機能異常を持つものを新たに見出した。MLPの心筋細胞における分子病態やCRP1のヒト変異の病的意義については不明であることから、さらなる分子病態の検討は心血管系疾患の発症メカニズムおよび疾患における遺伝的要因の意義の理解を進める上で重要と考えられる。出生後早期以降に心筋細胞での発現が低下し、かつ、細胞増殖制御に関与する遺伝子群を成体での心筋細胞増殖制御関与の候補遺伝子として同定した。その一つCRP1の分子学的意義をin vitroで検討した。CRP1は心筋のストレス応答に重要なnuclear shuttling蛋白であるmuscle LIM protein (MLP)のファミリー遺伝子であり、アミノ酸配列で約70%の相同性を有する。MLPは遺伝子異常によりマウスおよびヒトで心筋症を来すことが報告されている。出生後早期以前ではCRP1がMLPと同時に発現することでMLPの作用に変化を与えているのではないかと考え、CRP1、MLPの分子機能および両者の違いを検討した。まずCRP1とMLPのH9C2細胞への過剰発現の結果、cell survivalにおいて両者での有意な差を見出した。さらにMLPの種々の点変異体ベクターについても作成、複数のベクター間で過剰発現系での検討を行い、(1)核移行の異常、(2)細胞質局在の増加、(3) cell toxicityに違いが見られることを見出した。CRP1とMLPは(2)と(3)の点で異なる分子機能を示すことを見出した。このことから、CRP1の共存によってMLPの作用が修飾されることにより、CRP1発現が異なる出生後早期以前とそれ以後の心筋細胞でストレス応答様式が異なる可能性が示唆され、これが増殖性の違いにも影響する可能性があると考えられる。MLPはサルコメアへの結合、多量体の形成を介して働くことが報告されていることから、今後、CRP1とMLPの結合蛋白や多量体形成での差異、増殖への関与等さらに分子機序の検討を進める。候補遺伝子の中から、出生後早期の心筋細胞形質に関して有意に細胞機能に影響する遺伝子を見出すことができ、その分子機序として同因子の細胞内動態やcell survivalでの変化を来すことを同定できた。増殖調節機構への関与を含め、さらに詳細なin vitroでの分子機序の検討は必要であるが、出生前後で心筋細胞に影響を及ぼす遺伝子とその作用点の概要をつかめたという点で、概ね良好に研究が進捗していると考えられる。CRP1は出生後早期以降に心筋細胞での発現が低下し、かつ、細胞増殖に関与する遺伝子の一つである。ファミリー遺伝子であるmuscle LIM protein (MLP)、CRP2とともに心血管疾患の病態にも関与する分子である為、細胞増殖制御での意義を含めこれらの分子機能をin vitroで検討した。MLPは心筋のストレス応答に重要なnuclear shuttling蛋白で、CRP1とアミノ酸配列で約70%の相同性を有する。MLPは遺伝子異常によりマウス及びヒトで心筋症を来すことが報告されている。また、動脈損傷時の内膜増生の調節にCRP1とCRP2(約80%の相同性)の関与がノックアウトマウスの解析から知られている。心発生過程においてはCRP1、CRP2、MLPが部位時期特異的に複合的に発現しており、相互にシグナル調節の修飾を行うのではないかと考えられるので、これらの分子機能及び相互の違いを検討した。まずCRP1とMLPの過剰発現はH9C2細胞のcell survivalに有意な差を認めた。次に心筋症を来す点変異を含め、各分子で種々の変異体ベクターを作成、過剰発現系での検討の結果、核移行と細胞質局在の点で3分子間及び変異体で違いがあることを見出した。核及び細胞質への異常局在を示す変異体も同定した。また肥大マーカー、平滑筋マーカー、AP-1下流遺伝子の一つで遺伝子発現レベルにも違いが見られた。CRP1、CRP2、MLPは相同性の高い分子であるが、核・細胞質移行、下流遺伝子調節での違いを見出した。各発現量のパターンによって細胞機能調節に働くであろうと考えられ、増殖分化や病態形成に関わるメカニズムをさらに検討する。

さらに内在性の変異体での検討を行う為、Crispr-Cas9システムを用いCell lineでの点変異体を作製中である。ES細胞由来心筋細胞でも同様の変異体解析を検討する。CRP1、CRP2、MLPはともに心血管疾患の病態にも関与する分子であり、実験データから分子間の違いや点変異により分子機能が異なることが見出された。病態形成や発生過程で増殖を含めた細胞機能調節への関与が示唆され、さらなる分子機序の検討が病因病態解明に必要と考えられる。当初、点変異マウスの作製・解析を計画しているが、未だ技術的に難易度が高いことから、まずES細胞・iPS細胞由来分化心筋において点変異ラインを作製・検討を行うこととした。これにより複数の変異細胞ラインを作製・解析できる利点もある。現状、病態に関与しうる分子の作用点の概要やそれに関わる変異体も見出すことができ、in vitroでの検討については概ね良好に研究が進捗していると考えられる。心筋細胞の増殖能が失われる出生後早期に発現が変化する遺伝子群のうち、細胞増殖制御に関わる候補遺伝子を同定し、その分子機能の検討を行った。心臓での経時的発現変化を示す遺伝子群の一部は非心筋細胞由来であった。心筋細胞に発現し出生後経時的に発現低下を認める遺伝子のうち、CRP1(Cysteine and Glycine Rich Protein 1)は培養細胞(H9C2:ratcardiomyoblast cell line)において、ノックダウン、過剰発現の系ともに増殖能に促進的に働く結果を示した。CRP1のファミリー分子で心筋細胞に継続的に発現し、心発生に必須であるMLP(Muscle LIM Protein)とは増殖能および遺伝子発現制御においてCRP1は異なる作用を持つことを見出し、CRP1の発現はMLPの作用を修飾する可能性が示唆された。このような胎生期から出生後早期に限定的な遺伝子発現は増殖能を含めた心筋細胞機能の違いに関与すると考えられる。MLPは心筋症を来すヒト変異が知られ、一アミノ酸変異により心筋細胞の病的異常を来すが、分子病態は不明であることから、MLPの一連のヒト変異体ベクターを作成・検討し、培養細胞レベルで細胞内局在の異常を認めることを見出した。さらにCRP1、CRP2についてもヒト変異体の検討を行い、CRP1のヒト変異体で分子機能異常を持つものを新たに見出した。MLPの心筋細胞における分子病態やCRP1のヒト変異の病的意義については不明であることから、さらなる分子病態の検討は心血管系疾患の発症メカニズムおよび疾患における遺伝的要因の意義の理解を進める上で重要と考えられる。CRP1とMLPの細胞増殖制御における意義とその分子機序につきin vitro、in vivoにおいてさらに詳しく検討を進め、出生後早期以前と成体期での心筋細胞の増殖制御機構の違いを検討する。また、作成した点変異遺伝子の中には分子機能の変化が見られるものがあった。これらには心筋症を来すものも含まれるが、疾患発症に到る分子機序は未だ不明であることから、同変異によるCRP1, MLPの分子機能の変化についても検討し、その病因を検討する。また、他の候補遺伝子についても同様の検討を行い、細胞形質に対する影響を検討していく。
琉球列島の海底洞窟における大型ベントスの個体群維持機構に関する研究

琉球列島のサンゴ礁浅海域の海底洞窟に生息する大型ベントス(主に海綿類,貝類,甲殻類)を対象として,(1)海底洞窟環境調査(洞内の地形および物理化学環境の特性の解明),(2)海底洞窟性動物の群集構造および生態分布調査,(3)海底洞窟性動物の生活史特性調査,に関する研究を実施した。本年度(H30年度)は最終年度にあたるため,研究メンバー全員による合同調査は実施せず,不足データの収集と各調査のまとめを進めた。「(1)海底洞窟環境調査」については,前年度までに取りまとめを行った各洞窟の洞窟形態図を元に,底質,水温・塩分データを加え,各洞窟の環境特性について解析を行った。「(2)海底洞窟性動物調査」については,前年度までに採集した生物の種同定作業を進め,生物相リストを作成した。本年度(H30年度)は,甲殻類のコエビ下目(オトヒメエビ類)の1新種,タナイス目の1新属新種,棘皮動物のクモヒトデ類の1新種の新種記載を行った(論文3編)。また,琉球列島の海底洞窟から得られたクモヒトデ類とヤドカリ類についての生物相記録報告や,その他洞窟性十脚目甲殻類の新産地記録などを含め,計14編の論文発表と7題の学会発表を行った。さらに,「(1)海底洞窟環境調査」と「(2)海底洞窟性動物調査」で得られたデータを用いて,各洞窟における海底洞窟性動物の群集構造の解析を行い,学会発表を行った。「(3)海底洞窟性動物の生活史特性調査」については,採集した甲殻類標本の一部種(リュウグウモエビ類)を用いたDNA分析(集団解析)を行い,これら海底洞窟種の分散過程について検討した。琉球列島のサンゴ礁浅海域の海底洞窟に生息する大型ベントス(主に海綿類,貝類,甲殻類)を対象として,1海底洞窟環境調査(洞内の地形および物理化学環境の特性の解明),2海底洞窟性動物の群集構造および生態分布調査,3海底洞窟性動物の生活史特性調査,に関する研究を実施した。初年度(H28年度)は,沖縄島宜名真の海底鍾乳洞(以降,宜名真洞窟とする),伊江島北東部の海底洞窟(以降,伊江島洞窟とする),宮古諸島下地島の海底洞窟(以降,下地島洞窟とする)の計3カ所において調査を実施した。「1海底洞窟環境調査」については,宜名真洞窟および伊江島洞窟において,洞窟地形断面図および平面図を作成し,洞窟内の水温および塩分を記録するためのデータロガーを設置した(水温ロガーについては1年間の記録中であるが,塩分ロガーについては数日間のみ設置して回収した)。塩分ロガーの計測結果からは,宜名真洞窟および下地島洞窟の最奥部は,塩分が低く,アンキアライン(陸封潮溜まり)環境であることが確認された。「2海底洞窟性動物調査」については,宜名真洞窟,伊江島洞窟,下地島洞窟において採集調査を行った。現在,同定作業と各洞窟における生物相リスト作成を進めているが,甲殻類については,少なくともコエビ下目(エビ類)において4未記載種,短尾下目(カニ類)において1未記載種および1日本初記録種,テルモスバエナ目において1未記載種が含まれており,記載作業を進めている(テルモスバエナ目甲殻類については論文を投稿中である)。また,海綿類においても多種の未記載種および国内未記録種が含まれており,特に硬骨海綿類について,2未記載種を確認し,現在,記載作業を進めている。「3海底洞窟性動物の生活史特性調査」については,これまで採集された標本の分子遺伝的解析を進め,海底洞窟生物の遺伝情報の収集およびデータベース化を進めている。初年度(H28年度)調査では,当初沖縄島および伊江島における洞窟調査を予定していたが,天候・海況にも恵まれたため,宮古諸島下地島においても調査を実施することができた。ただし,各調査地での調査洞窟数は当初計画では23箇所を予定していたが,予想以上に作業に時間を要したため,各調査地での調査洞窟数は1箇所ずつとした。本申請研究で予定していた調査項目(1海底洞窟環境調査,2海底洞窟性動物の群集構造および生態分布調査,3海底洞窟性動物の生活史特性調査)の3点のうち,「1海底洞窟環境調査」については,予定していた洞窟地形断面図および平面図およびデータロガー(水温および塩分計測)の設置をすべて終了した。「2海底洞窟性動物の群集構造および生態分布調査」については,各調査洞窟内動物の種構成リストは順調に進んでおり,多数の未記載種および国内未記録種を発見することができた。一方,洞内における群集構造と生態分布調査については,次年度(H29)に調査を予定している。「3海底洞窟性動物の生活史特性調査」については,採集した標本を基に,遺伝学的手法を用いた各種解析を開始した。一方,採集動物の個体分析(体サイズ計測,性査定,生殖器官や生殖巣の発達状況,食性など)については,採集した標本の分析を次年度(H29)に予定している。

本年度(H29年度)は,沖縄島,伊江島,宮古諸島下地島の計3カ所の海底洞窟において調査を実施した。「(1)海底洞窟環境調査」については,各洞窟の洞窟地形断面図および平面図に関する情報を追加し,一定の完成をみた。「(2)海底洞窟性動物調査」については,(1)で作成した洞窟地形図を利用し,海底洞窟内における生物生態分布調査を実施した。また,各洞窟において採集した生物の種同定作業を進め,生物相リストを作成した。本年度(H29年度)の特筆すべき成果として,甲殻類のコエビ下目(テッポウエビ類)の1新種(Caligoneus cavernicola),テルモスバエナ目の1新種(Halosbaena okinawaensis),棘皮動物のクモヒトデ類の2新種(Ophiolepis cavitata, Ophiozonella cavernalis)の新種記載を行った。また,稀少甲殻類の新産地情報についての報告を2編行った(コエビ類のBresilia rufioculusとアミ類のHeteromysoides simplexの記録)。「(3)海底洞窟性動物の生活史特性調査」については,採集した甲殻類標本の抱卵個体について,卵数・卵サイズの計測を行い,一部の種については孵化幼生を記録した。また,採集された海底洞窟生物の遺伝情報の収集およびデータベース化(バーコーディング)を進め,さらに,これらの情報を利用した環境DNA解析を行うため各洞窟における海水の取水を行った。本年度(H29年度)調査では,当初三ヶ年での調査を予定していた沖縄島,伊江島,宮古諸島下地島における野外調査を前倒しし,全て完了した。しかし,当初研究計画で予定していた久米島の海底洞窟については,水深が深く,洞窟内部が狭いため,複数の研究者による共同調査が実施しにくいことが判明した。また,安全管理上の懸念(危険性が高い)もあるため,久米島の調査は行わないこととした。その代わり,当初研究計画では予定していなかった海底洞窟における環境DNA解析を行うこととし,沖縄島,伊江島,宮古諸島下地島の3カ所の海底洞窟にて採水調査を行った。琉球列島のサンゴ礁浅海域の海底洞窟に生息する大型ベントス(主に海綿類,貝類,甲殻類)を対象として,(1)海底洞窟環境調査(洞内の地形および物理化学環境の特性の解明),(2)海底洞窟性動物の群集構造および生態分布調査,(3)海底洞窟性動物の生活史特性調査,に関する研究を実施した。本年度(H30年度)は最終年度にあたるため,研究メンバー全員による合同調査は実施せず,不足データの収集と各調査のまとめを進めた。「(1)海底洞窟環境調査」については,前年度までに取りまとめを行った各洞窟の洞窟形態図を元に,底質,水温・塩分データを加え,各洞窟の環境特性について解析を行った。「(2)海底洞窟性動物調査」については,前年度までに採集した生物の種同定作業を進め,生物相リストを作成した。本年度(H30年度)は,甲殻類のコエビ下目(オトヒメエビ類)の1新種,タナイス目の1新属新種,棘皮動物のクモヒトデ類の1新種の新種記載を行った(論文3編)。また,琉球列島の海底洞窟から得られたクモヒトデ類とヤドカリ類についての生物相記録報告や,その他洞窟性十脚目甲殻類の新産地記録などを含め,計14編の論文発表と7題の学会発表を行った。さらに,「(1)海底洞窟環境調査」と「(2)海底洞窟性動物調査」で得られたデータを用いて,各洞窟における海底洞窟性動物の群集構造の解析を行い,学会発表を行った。「(3)海底洞窟性動物の生活史特性調査」については,採集した甲殻類標本の一部種(リュウグウモエビ類)を用いたDNA分析(集団解析)を行い,これら海底洞窟種の分散過程について検討した。
理科授業における社会・文化的相互作用に関する基礎的研究

理科授業における社会・文化的相互作用の実態を解明するために、3つの調査を実施した。対象は、教師、学習者(児童)の共同的活動、共同的な活動が含まれた理科授業であり、それぞれの対象に状況論的な観点から個別的にアプローチした。調査1では、教師の構成している「教室」「教師」「児童」の文化的モデルをメタファ生成法により分析した。対象は小学校教師201名(男子126名、女子75名、経験年数平均11年)であった。調査2では、実際の授業場面において、児童が二人で行う共同的なコンセプトマップの作成過程を分析した。対象は小学校6年生の3クラス、51ペア、計102名(男子45名、女子57名)であった。調査3では、授業場面における教師=児童の関係の変化を参加観察法によって分析した。対象の授業は、2名のベテラン教師の理科授業であり、各3時間をVTRで記録し、教師と児童の発話を分析した。結果の概要は次の5点にまとめられた。(1)教師全体の約60%が「教室」「教師」「児童」を伝達モデルで捉えていることがわかった。(2)しかしながら、教師一人の中では、モデルは必ずしも一貫せず、伝達モデルと対話モデルが混在する傾向にあった。(3)二人で行われたコンセプトマップの作成過程では、認知的内生的意義、外生的意義が一人のときよりも強く認識され、ネガティヴな感情も減少していた。(4)初心者と熟達者の児童ペアでは、熟達者としての児童が初心者の相手から知識を取り入れるケースも頻繁に観察された。(5)日常において伝達的な授業をしている教師であっても、コンセプトマップを利用した共同的な授業の中では伝達的な関係が崩れる傾向にあった。
もやもや病におけるエピジェネティクス解析-発症メカニズム解明にむけて-

本研究では、もやもや病患者の頭蓋内・外の血管から抽出したRNAサンプルを用いて(1)マイクロアレイによる網羅的発現解析を実施、(2)RNF213やPENK143-183との関連を検証。さらに(3)エピジェネティクス解析による転写調節機構とパスウェイ解析をもとに、もやもや病発症に関与する特異的遺伝子を同定。最終的に(4)もやもや病の動物モデルを作成することを目的とした。血管の微小検体からのRNA抽出の方法論の確立を目指したが困難であった。一方、我々は脳脊髄液中に含まれるRNAを対象としてマイクロアレイを用いた発現解析を行ったが最終的には有意な結果が得られなかった。今年度はMMD患者浅側頭動脈・中大脳動脈検体を用いたmicroarrayによる発現解析を中心に研究を進め、さらにsanger sequenceを用いたRNF213の変異検索により、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)やThe Database forAnnotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)などの公開されている解析プログラムを使用して、もやもや病患者における発現異常と遺伝子異常の関連を明らかにする予定であった。しかしながら最初のステップである、1mmにも満たない中大脳動脈の微量な手術検体からのRNA採取が十分なクオリティーを保つことができなかった。そのため、その方法論について再検討を要した。最終的には、microbeedsを用いる方法からTrizolを用いる方法に変更することにより、RINは不十分ながら、microarrayには堪えうるクオリティを担保することができるようになった。さらにRNF213遺伝子異常はMMD患者において高頻度に認められるが必ずしも全例で認められるわけではないことと、12-13%の遺伝性が認められるため、患者血液より白血球を採取しgerm lineにおけるRNF213遺伝子変異を確認する予定であった。しかしこちらについても白血球からのRNA抽出についてプロテアーゼ等の使用量が定まらず、予備実験を繰り返したが、方法論を確立できていない。浅側頭動脈、中大脳動脈のサンプル数については十分確保されている。しかし、とくに中大脳動脈のサンプルは1mmにも満たない微小なものであり、RNA抽出のクオリティが保たれず、方法論の見直しを要することとなった。そこでmicrobeedsを使用した方法から、trizolを使用した方法への変更を行ったところ、RINの改善が認められた。今年度は昨年度に引き続いて、もやもや病(MMD)患者の浅側頭動脈・中大脳動脈の微小検体からRNAを抽出し、マイクロアレイを実施することを目標とした。さらにGene Set Enrichment Analysis (GSEA)やThe Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)などの公開されている解析プログラムを使用して、MMDにおける異常発現と遺伝子異常の関連を明らかにする予定であった。浅側頭動脈の検体サイズは10mm程度あるため、十分なRNA量を採取しRINも十分であった。一方、中大脳動脈の検体は1mm未満であることが多く、RNA抽出はやはり不十分であり、RINも解析に堪えうる値は得ることができなかった。一方、今回の研究計画としては上げていなかったが、当グループでは脳脊髄液からのタンパク抽出・10kDa以下の網羅的解析(プロテオミクス)には精通しており、RNA抽出も可能と考えている。血液検体でのMMD患者におけるmiRNA発現プロファイルについてはこれまでわずかな報告はあるが、脳脊髄液でのmiRNA解析は報告がないため、今年度はそちらについても行っていく予定である。血液検体の白血球からのRNA抽出に関しては、やはりプロテアーゼ等の使用量が定まっておらず、方法が確立できていないため、さらに予備実験を繰り返す予定である。MMDに対する脳血行再建術は定期的に施行しており、浅側頭動脈・中大脳動脈・血液・脳脊髄液のサンプル数としては十分である。ただし、RNA抽出段階において充分量を確保することが方法論として確立していないのが問題である。本研究では、もやもや病患者の頭蓋内・外の血管から抽出したRNAサンプルを用いて(1)マイクロアレイによる網羅的発現解析を実施、(2)RNF 213変異や申請者らが同定した、もやもや病脳脊髄液中にに有意に高発現するペプチドとの関連を検証。さらにgerm line変異を確認し、(3)エピジェネティクス解析による転写調節機構とパスウェイ解析をもとに、もやもや病発症に関与する特異的遺伝子を同定。研究はその計画通り浅側頭動脈・中大脳動脈検体を用いたマイクロアレイによる発現解析の方法の確立から開始した。中大脳動脈検体は手術の際に採取するが、1x1mm以下の極少量でありRNA抽出において確実な方法は確立されておらず、各種抽出キットや試薬による実験を繰り返して検証した。微小検体からの確実なRNA抽出については本実験系にとって必須である。中大脳動脈検体は直ちにRNA laterへ保存しRNA分解を防ぎtRNAをTRIZOLおよびproteinase Kにより抽出した。しかしながら、質的および量的評価でRNA解析に耐えるクオリティのRNAは現在のところ得られていない。一方、我々は以前より脳脊髄液の網羅的発現解析を行い、特に小児のもやもや病患者において、Proenkephalin 143-183が有意に発現の増加がみられることを発見した。

今回、もやもや病患者の頭蓋内・外の血管から抽出したRNAサンプルだけではなく、脳脊髄液中に含まれるRNAも対象としてマイクロアレイを用いた発現解析を行い、頭蓋内の他の疾患ともやもや病患者の2サンプルずつでの比較により予備検証を行うことでエピジェネティクス解析を行ったが、現在有意な結果が得られていない。本研究では、もやもや病患者の頭蓋内・外の血管から抽出したRNAサンプルを用いて(1)マイクロアレイによる網羅的発現解析を実施、(2)RNF213やPENK143-183との関連を検証。さらに(3)エピジェネティクス解析による転写調節機構とパスウェイ解析をもとに、もやもや病発症に関与する特異的遺伝子を同定。最終的に(4)もやもや病の動物モデルを作成することを目的とした。血管の微小検体からのRNA抽出の方法論の確立を目指したが困難であった。一方、我々は脳脊髄液中に含まれるRNAを対象としてマイクロアレイを用いた発現解析を行ったが最終的には有意な結果が得られなかった。浅側頭動脈、中大脳動脈のサンプルtrizolを使用した方法への変更を行ったことにより、microarrayによる発現解析は可能であると考えられる。一方、白血球からのgerm lineにおけるRNF213遺伝子変異の確認についてはRNA抽出段階での方法論が未確立であり、予備実験を繰り返すことで、その確立を目指す。脳脊髄液におけるmiRNA解析については研究計画書では記載していなかったものの、微小な中大脳動脈からのRNA抽出よりも結果が得られる可能性が高いと考えている。一方、one cellからのRNA抽出も可能との報告もあり、当科の他の研究グループにも相談して解決策を模索する。脳神経外科浅側頭動脈・中大脳動脈検体を用いたmicroarrayによる発現解析においては、微小検体からのRNA抽出が必須の手技である。しかし、とくに中大脳動脈のサンプルは1mmx1mm以下の極めて微小なものであり、抽出に困難を極めた。それにより研究計画に遅れを生じたため、計画通りには各種キットや試薬購入は行われなかった。よって次年度使用額を生じたものである。今年度中も、中大脳動脈微小検体からのRNA抽出に関する予備実験を繰り返したが、次のステップに進むための充分量を得ることができなかった。本来、今年度はエピジェネティック異常を発見するための、メチル化解析、miRNA解析、ncRNA解析を行い、助成金を使用する予定であったが、それが未施行に終わったため、次年度使用額が生じた。浅側頭動脈・中大脳動脈検体ともにもやもや病に対する手術の際に検体を得る。その際にRNA laterへの浸透、4°Covernight保存したうえで、tRNAをTRIZOLおよびproteinase Kにより抽出する。よって、経費の使用計画としては、RNAの効率的な抽出に必要な保存液等の薬剤を中心に使用する予定である。
溶液NMRを用いたフロリゲン複合体の立体構造解析

フロリゲンは花成を誘導する植物ホルモンとして同定されたタンパク質である。フロリゲンは受容体14-3-3及び転写因子FDとともにフロリゲン活性化複合体(FAC)を形成し、花芽形成遺伝子を発現させて花成を誘導する。近年、フロリゲンはFD以外の転写因子とFAC様複合体を形成することで、花成以外にも様々な光周性の反応を制御することが明らかになりつつある。本研究では、FACを形成するタンパク質の構造特性を明らかにし、フロリゲン機能多様性への理解を深めるために、溶液NMR法を用いた高分子量タンパク質解析法を開発するとともに、分子量およそ11万のFACの構造研究に取り組んだ。まずFAC複合体構成因子のうち、14-3-3の解析を行なった。14-3-3は分子量5.5万と溶液NMR法で解析するには非常に高分子量である。高分子量タンパク質は信号数が多いため、NMRスペクトルが複雑化する。そこで本研究では、アミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを用い、13Cで編集することで高い選択性でアミノ酸選択的1H-15N相関スペクトルを得る測定法を開発した。この測定法を利用することで14-3-3の80.1%の主鎖帰属を達成することができた。また、アミノ酸選択的13C,15N標識14-3-3サンプルのHSQC、HCCH-TOCSY、13C-NOESYスペクトルを測定し、側鎖の情報も得た。次にフロリゲンの解析を行った。フロリゲンは分子量2万と比較的小型であるものの、あまり良好なNMRスペクトルが得られず、常法では構造決定が困難であった。そこで常磁性緩和促進(PRE)を利用した構造決定法を用い、フロリゲンの立体構造を決定した。さらに、FAC-DNA4者複合体のサンプルを調製し、中性子散乱の測定を行ない、FACの分子形状に関する情報を得た。本研究では、FACを形成するタンパク質の構造特性を明らかにし、フロリゲンの機能多様性への理解を深めるために、溶液NMR法による高分子量タンパク質解析法を開発するとともに、分子量およそ11万のFACの立体構造解析を目指している。平成28年度には、FAC構成因子のうち、分子量およそ5.5万の14-3-3の解析を進めた。14-3-3は分子量およそ5.5万と高分子量であるものの、重水素標識および高分子量タンパク質で感度の良いTROSY法を用いることで、NMR信号が観測できることが分かった。そこで、これらの手法を用い、主鎖化学シフトの帰属に必要な一連の3次元NMRスペクトルを測定した。得られたスペクトルを用い、主鎖化学シフトの帰属を実施したが、高分子量であるために信号の消失や重なりが多く、帰属率及び帰属の精度が不十分であった。そこで、帰属をさらに進めるためにアミノ酸選択標識法の利用を試みた。計7種類のアミノ酸について選択標識サンプルを作成し、主鎖アミド基のスペクトルを測定し、これらを用いてさらに帰属を行った。その結果、78%の主鎖信号の帰属を達成することができた。本研究では、溶液NMR法による高分子量タンパク質の解析法を開発するとともに、分子量11万のFACの立体構造解析を目指している。平成28年度には、FAC構成因子のうち、分子量5.5万のフロリゲン受容体の解析に集中した。フロリゲン受容体はそれだけでも高分子量であるため解析が困難であり、平成28年度中には構造情報を得るには至らなかった。しかしながら、アミノ酸選択標識体の活用という工夫をすることで、大部分の主鎖帰属を達成することができ、今後の解析を進めるに当たっての足掛かりを得ることができた。本研究では、FACを形成するタンパク質の構造特性を明らかにし、フロリゲンの機能多様性への理解を深めるために、溶液NMR法を用いた高分子量タンパク質解析法を開発するとともに、分子量およそ11万のFACの立体構造解析を目指している。平成29年度には、FAC構成因子のうち、分子量およそ5.5万の14-3-3の解析を進めた。まず、平成28年度に実施した14-3-3の主鎖の帰属をさらに進めるために、アミノ酸選択的13C,15N標識の利用を試みた。アミノ酸選択的15N標識は、アミノ酸の種類によっては選択性が低いという問題があるが、13Cは高い選択性でアミノ酸選択的標識をすることができる。そこで、アミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを用い、13Cで編集することでアミノ酸選択的1H-15N相関スペクトルを得る測定法を開発した。

この測定法は高分子量タンパク質であっても比較的感度が良く、実際に4種のアミノ酸について14-3-3の1H-15N相関スペクトルを得ることができた。得られたスペクトルを参照して主鎖の帰属を進めたところ、80.1%の主鎖帰属を達成することができた。また、側鎖の帰属をするため、cell-freeでアミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを調製し、HSQC、HCCH-TOCSY、13C-NOESYスペクトルの測定を行った。平成28年12月から平成29年11月まで、出産・育児のために研究を中断したために、予定よりも研究が遅れている。フロリゲンは花成を誘導する植物ホルモンとして同定されたタンパク質である。フロリゲンは受容体14-3-3及び転写因子FDとともにフロリゲン活性化複合体(FAC)を形成し、花芽形成遺伝子を発現させて花成を誘導する。近年、フロリゲンはFD以外の転写因子とFAC様複合体を形成することで、花成以外にも様々な光周性の反応を制御することが明らかになりつつある。本研究では、FACを形成するタンパク質の構造特性を明らかにし、フロリゲン機能多様性への理解を深めるために、溶液NMR法を用いた高分子量タンパク質解析法を開発するとともに、分子量およそ11万のFACの構造研究に取り組んだ。まずFAC複合体構成因子のうち、14-3-3の解析を行なった。14-3-3は分子量5.5万と溶液NMR法で解析するには非常に高分子量である。高分子量タンパク質は信号数が多いため、NMRスペクトルが複雑化する。そこで本研究では、アミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを用い、13Cで編集することで高い選択性でアミノ酸選択的1H-15N相関スペクトルを得る測定法を開発した。この測定法を利用することで14-3-3の80.1%の主鎖帰属を達成することができた。また、アミノ酸選択的13C,15N標識14-3-3サンプルのHSQC、HCCH-TOCSY、13C-NOESYスペクトルを測定し、側鎖の情報も得た。次にフロリゲンの解析を行った。フロリゲンは分子量2万と比較的小型であるものの、あまり良好なNMRスペクトルが得られず、常法では構造決定が困難であった。そこで常磁性緩和促進(PRE)を利用した構造決定法を用い、フロリゲンの立体構造を決定した。さらに、FAC-DNA4者複合体のサンプルを調製し、中性子散乱の測定を行ない、FACの分子形状に関する情報を得た。今後は溶液NMR法による高分子量タンパク質の解析法を開発し、それをフロリゲン受容体に適用することでさらにフロリゲン受容体の解析を進める。また、FACが安定に存在する条件を検討し、FACについて構造情報の取得を試みる予定である。14-3-3の側鎖帰属のために測定したスペクトルは、ある程度の信号は得られたものの、構造決定には不十分であった。今後、標識法や測定法を検討し、側鎖の解析を進める。また、高分子量タンパク質の解析法を開発し、それを14-3-3に適用し、立体構造解析を進める。FACの他の構成因子についても構造解析を進める。さらに、FACが安定に存在する条件を検討し、FACの構造情報の取得を試みる。出産育児のために約1年間研究を中断していたため、次年度使用額が生じた。助成金は主にサンプル調製のための消耗品に当てる。また、学会参加および研究打ち合わせのための旅費に当てる。
膜蛋白質を用いた高感度脂質二分子膜型センサーの構築

イオンチャンネル蛋白質が持つ顕著なシグナル増幅能を目的化学物質の高感度センシングの原理とする脂質二分子膜型センサーの一般化のための基礎研究を行い,以下の知見を得た。1.ラット小脳のシナプス後膜より単離精製されるグルタミン酸受容体イオンチャンネル蛋白質(GluR)を埋め込んだ脂質二分子膜のアゴニスト選択性を,そのサブタイプを特定した上で精密に評価するための基礎検討を行った。NMDAサブタイプのみが活性となるような実験条件下で,代表的な数種類のアゴニストについて,チャンネル透過イオン(Ga^<2+>及びNa^+)の総量に基づくアゴニスト選択性を評価し,その選択性の序列がbindingaffinityによる選択性の序列と一致すること,ただし選択性の幅は著しく狭くなっていることを明らかにした。さらに,Ca^<2+>の透過量に基づくアゴニスト選択性を,GluRを埋め込んだリポソーム系に対する薄層ポテンシオメトリーにより評価し,NMDAサブタイプについて平膜系と同様なアゴニスト選択性を見出した。GluRが膜を介して生起する信号(イオン透過量)の大きさを指標とする本研究のアプローチは,従来のbinding affinityを指標とする方法とは異なり,生理適合性のある選択性を評価しうる新しい方法である。2.電気ウナギの発電器官より単離精製される電位作動性ナトリウムイオンチャンネル蛋白質を,種々の目的化学物質に対する選択的膜電位変化を生起する人工レセプターと一緒に埋め込んだハイブリッド型の脂質二分子膜型センサーの作製を目指した基礎検討を行った。上記蛋白質をバリノマイシンと共存させた平面脂質二分子膜を調製し,ハイブリッド膜において前者のイオンチャンネル機能が保持されることを確認したが,溶液中に低濃度のK^+イオンを加ると膜抵抗が大きく低下し,膜電位変化を伴うチャンネル電流の変化を確実に測定することが可能な電気回路と測定系について検討を行う必要性が明らかとなった。生体膜中のイオンチャンネル蛋白質が持つ顕著なシグナル増幅能を、目的化学物質の高感度センシングの新しい原理として一般化することを目的として種々の基礎検討を行なった結果、以下のような知見を得た。(1)ラット小脳シナプス膜よりグルタミン酸受容性イオンチャンネル蛋白質(GluR)を純度・収率良く単離精製するためには、特にグルタミン酸を吸着させたグラスファイバーによるアフィニティー濾過において、洗浄前処理が重要であることが見出された。(2)単離精製されたGluRをリポリーム融合法または単分子膜貼り合わせ法により平面脂質二分子膜に埋め込み、右図のような実験系において、グルタミン酸の添加に伴うチャンネル電流の観測を試みた。その結果、チャンネル電流特有の矩形波が観測され、GluRの埋め込みが確認された。ただし現段階では再現性に問題があり、より確実な埋め込みのためには加える蛋白質の濃度と量、リポリームの融合のための溶液条件と放置時間を始めとする各種条件の検討が必要であることが明らかとなった。(3)電気ウナギの発電器官より電位作動性イオンチャンネル蛋白質を単離精製するための基礎検討を行い、純度の高い目的蛋白質を得るためには、特異的抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製が有効であることが明らかとなった。(4)上記蛋白質をK^+イオンレセプターであるバリノマイシンと共に平面脂質二分子膜に埋め込み、K^+イオンの添加に伴う膜電位変化により生起されるチャンネル電流の観測を試みたが、電位固定回路の中で膜電位変化が補償されてしまうことが問題点として明らかとなった。

生体膜中のイオンチャンネル蛋白質が持つ顕著なシグナル増幅能を,目的化学物質の高感度センシングの新しい原理として一般化することを目的として,ラット小脳シナプス膜より単離精製されるグルタミン酸作動性イオンチャンネル蛋白質(GluR)及び電気ウナギの発電器官より単離精製される電位作動性ナトリウムイオンチャンネル蛋白質に関して,次の基礎検討を行った。(1)単離精製されたGluRをリポソーム融合法または単分子膜貼り合わせ法により平面脂質二分子膜に埋め込み,グルタミン酸の添加に伴うチャンネル電流の観測を行った。現段階では再現性に問題があり,高いチャンネル活性を発現させるためには,GluRの抽出における精製法,特にアフィニティークロマトグラフィーにおける担体の選択,細胞膜脂質との分離における周辺脂質の保持,リポソーム融合によるGluRの埋め込みのための溶液条件などをさらに検討することが必要であることが示された。(2)他種のレセプター蛋白質によるGluRの活性化に基づくセンサー感度の向上のための基礎検討として,calmodulinをGluRと共存させた新しいタイプの平面脂質二分子膜センサーの作製のための検討を開始した。(3)電位作動性ナトリウムイオンチャンネル蛋白質を純度良く単離するために,特異的抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製法の検討を行った。
クメール帝国地方拠点の都市遺跡と寺院遺構に関する研究

本研究では,9世紀から15世紀にかけて繁栄した古代クメール帝国の辺境を含む国土の諸相と周辺諸国との地勢的関係の解明を目的として,往時の主要な街道沿いに造営された地方拠点に関する建築・地形・岩石・美術史・考古学調査を行った。コー・ケー,ベン・メアレアの二大遺跡群を中心とした複数の地方拠点における詳細な記録作業を通じて,寺院の設計手法と都市構造の分析を進めると共に,保存修復計画策定に資する基礎資料を作成した。本研究は、9世紀から15世紀にかけて繁栄したクメール帝国の辺境を含む国土の諸相と周辺諸国との地勢的関係の解明を目的として、当時の主要な街道に沿って造営された地方拠点に関する建築学的・地形学的・岩石学的調査を行うものである。特に首都アンコールより東及び北東へ延びる街道沿いには、いまだ十分に調査のなされていないクメールの重要な都市遺跡・寺院遺構が多数存在している。本研究では、GPS/TPSを用いたこれらの広域的な記録作業(地形図・遺構分布図・平面図・目録・写真記録等)を通して、将来的な保存修復に資する基礎資料を作成するものであり、アンコールを中心としたクメール帝国の領土拡大の様相解明に向けた一助となることを目指している。本研究は、915世紀に繁栄したアンコール王朝の辺境を含む国土の様相と周辺諸国との地勢的関係の解明を目的として、当時の主要な街道に沿ってつくられた地方都市遺跡を対象に、建築学的・考古学的・地理学的調査を実施し、基礎データ収集と資料作成を行うものである。当該地域の研究は、従来アンコール地域(王都)とその周辺に限定して進められてきたが、本研究は、クメールの都市形態と建築の歴史た関する従来の知見を大幅に拡大し、今後の調査研究および保存修復に資する基礎資料を構築することを目指す。さらにこの目標に加え、いまだ十分な調査研究が行われていないこれら地方都市遺跡の史的価値を正当に評価し、調査資料を広く一般に公開することによって、放置されている文化財建造物の保全への道を開き、ひいては同国の観光開発の一助となることを目指している。初年度は、10世紀前半にアンコールより遷都したコー・ケーの都市遺構を調査対象とし、GPS及びトータルステーションによる測量を中心とした現地調査を実施した。地雷撤去作業の進捗と共に近年新たに発見された寺院遺構を含め、UTM座標系における各遺構の位置データ収集、平面図作成のためのTS計測、空中写真分析のためのGCP取得等を行い、周辺環境情報(道路、水利施設、水田etc.)を含む最新の遺跡群全域地図及び各遺構図面をCADソフトで作成している。また遺跡保存計画策定に向けた現状目録・リスクマップの作成に向け、遺構情報・現状写真・古写真等を収集・整理しデータベース化を進めている。本研究は,915世紀にわたり,現在のカンボジア王国を中心として繁栄したアンコール王朝を対象に,辺境を含む国土の様相と周辺諸国との地勢的関係の解明を目的として,当時の主要な街道に沿ってつくられた地方都市遺跡に注目し,建築学的・考古学的・地理学的調査を行うことで学術的な基礎資料の収集と作成を行う。当該地域を対象とした100年の研究史は,従来アンコール地域(王都)とその周辺に限定して進められてきた。しかし,本研究は,地方に散在する都市遺跡,寺院遺跡の調査を通じてクメール時代の都市形態と建築の歴史に関する従来の知見を拡大することを目的としており,現在はその途上にある。今後,調査研究および遺跡の保存修復事業に資する基礎資料の構築を目指すとともに,十分な調査研究が行われてこなかった当該の地方都市,寺院遺跡の史的価値,学術的価値を正当に評価しうる調査資料を蓄積し,一般に公開することによって,クメール王朝の歴史の解明をめざし,放置されている文化財建造物の保全への道を開くとともに,同国の観光開発の一助となることを目指している。平成20年度は,国内作業として19年度に収集したコー・ケー遺跡群のデータの整理作業を進め,あらたに発見した遺構を加えて遺跡目録を更新した。また,夏季,冬季,春季の3度の現地調査を行い,広域のGPS調査,遺跡の実測調査を進めた。また,これらの調査資料に基づいて,主要遺構の平面図を作成し,空中写真分析とGPS調査資料に基づいて,コー・ケー遺跡群の分布状態を示した地図を作成した。同時に,遺構の精査資料に基づいて,造営尺度の実長を求めて分析を進め,平行して伽藍の寸法計画,遺構の寸法計画の分析と設計手法の解明を進めた。なお,年度の当初予定していたプレア・ヴィヘア州の遺構調査は,タイ国との国境地帯が軍事的に不安定な状態となったため,現地調査計画を大幅に縮小せざるを得なかった。本年度は、コー・ケー及びベン・メアレアを対象とした現地調査を実施した。コー・ケーでは、初年度から進めてきた地形調査及び建築・土木・水利遺構に関するGPS/TPSを用いた広域的実測調査を継続して行い、これまでに確認された全127の遺構に関する現状目録、及び主要34遺構の実測平面図、灌漑用池ラバール及び北方の土手断面図、遺跡群全域図を作成した。

主要寺院の伽藍配置と寸法計画に関する分析考察、及び都市全域の地形及び水利構造と遺跡分布に関する分析考察に基づき、古代都市チョック・ガルギャーの都市的・建築的特質の一部を明らかとし、それらの成果を調査報告書及び雑誌論文等で発表した。さらに美術史的調査としてアン・クナの記録作業、台座遺構の実測等を行い、類似遺構との比較考察を進めている。ベン・メアレアでは、昨年度に引き続き、主に第一及び第二回廊内の全建物に関するTPSと手測りによる実測調査、及び周辺遺構の現状確認と写真記録、TPSと手測りによる実測調査を行った。これにより、既存図面はほぼ全面的に更新されることになり、周辺遺構を含めた同寺院の広域的配置計画が明らかとなりつつある。さらに補足調査として、プラサート・ニャック・ブオス、チュアン・スラム等、プレア・ヴィヘア州北部の14遺構に関する悉皆調査を行った。同地域における寺院建築の造営過程や伽藍配置、建築型式等に関する研究に向け、現地での基礎的な情報収集を行っている。最終年度である2010年度は、これまでに調査を進めてきたコー・ケー、ベン・メアレアにおける最終的な遺構及び地形測量と、考古学的表採及び発掘調査を中心に行った。コー・ケーでは、Pr.Balang等の複数の砂岩造祠堂とKK10と称してきた台座遺構のクリアランス、及び王宮趾と目されてきたAndong Preng周辺の表採及び発掘調査を行い、出土した遺物と建物趾の痕跡から、遺構の性格をより明確なものとした。ベン・メアレアでは、主要寺院遺構の実測を完了し、バライの土塁及び周辺の地形測量をもとに、遺跡群全域図を作成した。また、同中央寺院の南西区域において表採調査を実施し、18の地点でクメール粗製土器・陶器及び瓦類、中国陶磁器、ヴェトナム陶磁器といった800点近くの遺物が発見されたことから、このあたりが往時の生活圏であったと推測するに至った。その他、チャウ・スレイ・ビボールにおける実測図作成、及びアンコールからベン・メアレアを経由してコンポン・スヴァイのプレア・カーンに至る王道沿いの宿駅遺構に関する実測と細部意匠、散乱遺物の記録を行い、アンコールと地方拠点との関係について建築・岩石・美術史的な観点より、編年考察と設計手法の比較分析を中心に総合的な考察を行った。また、タ・ムエン・トムやプノン・サンダックなど、北部山岳地域の遺構を対象とした悉皆調査を行い、広域的に分布する遺構の全容解明に向けた保全計画と今後の展望を示した。
徳之島方言辞典作成のための研究

奄美方言に属する徳之島の浅間方言について、インフォーマント岡村隆博氏との対面調査および通信により、以下のことを行った。1.見出し語リストの作成と用例の収集イ.『徳之島二千文』からの単語の切り出し、『浅間基礎語彙表』とのつき合わせを行い、『徳之島二千文』の単語について、今までの語彙調査から漏れているものを拾い出し、意味を確定した。ロ.『徳之島二千文』を基礎にした、動詞・形容詞などの活用表の作成・整備。判明していた活用のパターンから逸脱した用言を見つけることができ、それによって活用のタイプをより詳細に記述することが可能になった。ハ.用例の整理。新たな用例の収集。『徳之島二千文』の注釈の精密化。ニ.身体語彙の調査を行い、あらたに多くの語彙項目を得た。また、助詞について、『徳之島二千文』からリストアップし、用例を対面調査で集めた。また,それ以外からも助詞を聞き出した。ホ.『徳之島二千文』以外にインフォーマントの岡村隆博氏が作成したデータと今までに集積したデータのつき合わせを行い、データの矛盾点を整理しつつ多くの語彙項目を得た。2.音声・映像データの収集スタジオを使用して『徳之島二千文』のすべてを質の高い録音で記録した。この過程で、『徳之島二千文』のデータの点検・校正を行うことができた。辞典に収録するための映像についても、現地調査のほか、スタジオで高品質のビデオで岡村氏が基礎語彙を発音しているところを録画した。3.音声・映像データの電子化と編集音声・映像データを必要な単位に分けて電子化し、リンクを貼ってブラウザーから見たい映像、聞きたい音を自由に楽しめるようにした。この成果の一部は平成17年11月の日本語学会でデモンストレーションとして公開した。4.報告書の作成以上にもとづき、動詞の活用と『徳之島二千文』のコーパスを中心に報告書を作成した。ハ.用例の整理。新たな用例の収集。奄美方言に属する徳之島の浅間方言について、方言辞典の作成の準備のために以下のことを行った。1.見出し語リストの作成と用例の収集にむけた作業イ.『徳之島二千文』からの単語の切り出し、『浅間基礎語彙表』とのつき合わせロ.『徳之島二千文』を基礎にした、動詞・形容詞などの活用表の作成。これは特に『徳之島二千文』では欠けている特定の動詞の特定の活用形を対面調査によって補充したり、『徳之島二千文』にはなかった動詞について活用形を対面調査で聞き出したりした。ある動詞がどの活用のタイプに属するかを知るためにはどれだけの活用形を調べればいいか分かってきつつある。ハ.用例の整理。新たな用例の収集。ニ.身体語彙、特に頭部を表わす語彙について集中的に調査を行い、あらたに多くの語彙項目を得た。また、これらの語彙項目の意味についてくわしく調べることができた。ホ.助詞について、『徳之島二千文』からリストアップし、用例を対面調査で集めた。また、『徳之島二千文』にないものも奄美の他地域の先行研究を参考にして、できるだけ多く聞き出した。ヘ.『徳之島二千文』以外にインフォーマントの岡村隆博氏が作成したデータと今までに集積したデータのつき合わせを行い、データの矛盾点を整理しつつ多くの語彙項目を得た。