hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
犬脊髄損傷症例に対する幹細胞・嗅神経鞘細胞同時自家移植による脊髄再生療法の検討

本研究では犬の自然発症した脊髄損傷症例へ鼻粘膜由来幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞を同時移植し、その有用性を評価することを最終目的とし、犬の鼻粘膜から幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞の抽出を試みた。結果は経鼻腔内視鏡を用いて移植に必要な細胞を採取することは可能であったが、一部の犬で培養細胞中に鼻粘膜由来細菌の感染が認められたため、安全面から移植材料としてはさらなる検討が必要であると考えられた。そこで安全性や利便性が保障されている脱分化脂肪細胞(DFAT)を用いて脊髄損傷モデルマウスへの移植を実施し、その有用性と安全性を評価した。結果、DFAT移植群ではコントロール群と比較して有意に歩行機能が改善した。本研究目的は、犬の自然発症した脊髄損傷症例へ鼻粘膜由来幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞を同時に移植し、脊髄機能回復に関する有用性を検討することである。これらの計画の中で、平成25年度においては、1.犬の嗅粘膜内における幹細胞の同定を病理組織学的ならびに細胞培養下で実施すること(実験1)、2.脊髄損傷モデルマウスへの犬嗅粘膜由来嗅神経細胞ならびに幹細胞の移植による脊髄再生能の有用性について検討すること(実験2)を目的とした。実験1に関しては実験計画通り、学生実習後に安楽死処置された犬10頭から経鼻腔内視鏡を用いて嗅粘膜を採材した。採取したサンプルは病理組織学的検査ならびに細胞培養に供した。病理組織学的検査のため嗅粘膜は4%PFAに48時間浸漬し、その後、30%グルコースへ24時間浸漬した後、OCTコンパウンドにて凍結切片を作製した。免疫染色学的検索のため、嗅神経鞘細胞の同定のためにp75抗体、S100抗体ならびにGFAP抗体を標識し、幹細胞の同定のためにnestin,ダブルコルチン(DCX)抗体を実施した。細胞培養は酵素処理した粘膜をneuriglinならびにforskolin加DMEM培地にて21日培養した後、チャンバースライドへと継代し、同様の免疫染色を実施した。その結果、嗅粘膜組織において嗅神経鞘細胞ならびに幹細胞と考えられる組織像が得られた。また培養した細胞においても幹細胞を示唆する抗体発現が得られた。しかし4頭から採取した嗅粘膜細胞培養において感染が認められたため、追加実験を行う必要性が考えられた。したがって実験2に関しては実験1が終了した後に実施する予定である。本研究目的は犬の自然発症した脊髄損傷症例へ鼻粘膜由来幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞を同時移植し、脊髄機能回復に関する有用性を検討することであり、初年度(昨年度)に遂行できなかった1.犬の嗅粘膜由来嗅神経細胞の培養に伴う感染の危険性に関して検討を行い(実験1)、2.脊髄損傷モデルマウスへの移植を行った(実験2)。実験1に関しては実験計画通り、学生実習後に安楽死処置がとられた犬10頭から内視鏡を用いて経鼻腔的に鼻粘膜を採取し、常法通りに初代培養を行い、3週間の時点で、発育細胞の検討と細菌のコンタミネーション(感染)の評価を行った。その結果、4頭で細菌あるいは酵母の発育が認められたため、移植細胞源としての鼻粘膜の安全性に対する再検討が必要であると考えられた。実験2に関しては、移植細胞の安全性の観点から、他の組織由来幹細胞あるいは同等の細胞による移植実験を行った。その際、安全性ならびに利便性にも保障されている脱分化脂肪細胞(DFAT)あるいは脂肪由来幹細胞の使用を検討し、当該年度は脱分化脂肪細胞(DFAT)を脊髄損傷モデルマウスへ移植し、その安全性と脊髄機能改善の評価を行った。脊髄損傷モデルマウス12頭を作成し、6頭はコントロールとして細胞を移植せず、6頭には細胞移植を実施したところ、細胞を移植した群において、コントロールと比較して有意に運動機能が改善した結果が得られた。また組織学的にも再生像を認め、その有用性が証明された。さらに癌化や感染等の合併症も認められなかったことから犬の脊髄損傷症例に対する新たな治療法としての可能性が示唆された。本研究目的は犬の自然発症した脊髄損傷症例に対し、嗅粘膜鞘細胞ならびに鼻粘膜由来幹細胞同時移植による脊髄機能回復に関する有用性を検討することであり、昨年度に引き続き犬の嗅粘膜由来嗅神経鞘細胞の抽出および感染のコントロールの検討(実験1)、嗅粘膜由来細胞に代わるDFAT移植による歩行機能改善のメカニズムの解明(実験2)、そして適応症例を抽出するために自然発症した犬の椎間板ヘルニアの症例における予後不良因子の検討(実験3)を行った。実験1に関しては昨年度実施した方法にゲンタマイシン加生理食塩水にて鼻腔内を洗浄し、経鼻腔内視鏡により嗅粘膜を採取し、従来通りの初代培養を実施した。その結果、犬10頭から採取した嗅粘膜から抽出した嗅粘膜鞘細胞ならびに嗅粘膜由来幹細胞の初代培養において8頭で感染が認められなかった。実験2では昨年度、脊髄損傷モデルマウスへマウス由来DFATを移植したところ移植をしていないマウスと比較し、移植群では神経機能が有意に改善したことが判明した。そこでDFAT移植による機能再生のメカニズムを解明するため、病理組織学的な検索を行った。移植した群においてDFATが髄鞘マーカーを発現していることが判明し、髄鞘再生に関与していることが示唆された。また、移植群では脊髄損傷後に形成される空胞やグリア瘢痕の大きさが、コントロール群と比較すると有意に縮小していることがわかった。

実験3では予後不良因子を呈する椎間板ヘルニア症例において脳脊髄液検査が、予後に関連するかいなか検討した。脳脊髄液の一般性状、細胞数、細胞種類、キサントクロミーの有無、ミエリンベーシック蛋白(MBP)とニューロン特異的エステラーゼ(NSE)の測定を行った。その結果、MRI画像や重症度で予後不良因子をもつ群において出血を示唆するキサントクロミーが全ての症例で認められ、さらにコントロール群と比較しMBP、NSEの値が有意に高値を示した。本研究では犬の自然発症した脊髄損傷症例へ鼻粘膜由来幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞を同時移植し、その有用性を評価することを最終目的とし、犬の鼻粘膜から幹細胞ならびに嗅神経鞘細胞の抽出を試みた。結果は経鼻腔内視鏡を用いて移植に必要な細胞を採取することは可能であったが、一部の犬で培養細胞中に鼻粘膜由来細菌の感染が認められたため、安全面から移植材料としてはさらなる検討が必要であると考えられた。そこで安全性や利便性が保障されている脱分化脂肪細胞(DFAT)を用いて脊髄損傷モデルマウスへの移植を実施し、その有用性と安全性を評価した。結果、DFAT移植群ではコントロール群と比較して有意に歩行機能が改善した。当該年度は初年度に遅れた再実験ならびに追加実験を実施し、その結果を検討したところ、犬の嗅粘膜由来嗅神経鞘細胞ならびに幹細胞は常時、採取できる可能性は示唆されたが、感染をコントロールすることが重要であることが判明した。同時に他の移植細胞となる可能性がある脱分化脂肪細胞を脊髄損傷モデルマウスへ移植し、その有用性と安全性を評価したところ、コントロール群として移植群では有意に歩行機能が改善され、さらに移植に伴う弊害は認められなかった。したがって、おおむね当初の研究目的と同等まで研究結果が得られている状況ではあるが、当該年度の研究結果に伴い、犬の嗅粘膜の感染コントロールという新たな課題に対する検討を実施する必要がある。細胞移植による脊髄再生医療今回の結果から、犬の鼻粘膜使用には培養細胞環境の感染が重大なリスクとして生じた。したがって、採取時に採取器具等の滅菌、採取したサンプルの取り扱い、抗生物質の選択を再度検討し、改善方法を検討する。また同時に、今回有用性が示された脱分化脂肪細胞に関して犬からも同様に採取が可能か、そして犬脂肪由来脱分化脂肪細胞を脊髄損傷モデルマウスへと移植し、その効果判定を実施する。本年度は他の理由で安楽死処置がとられた犬から嗅粘膜を採取し、病理組織検索ならびに初代培養を実施したが、当初予定した頭数の嗅粘膜から細胞培養することができなかった。その理由としてサンプルの感染が挙げられる。犬の場合、鼻腔には細菌が常在しており、安楽死処置がとられた段階で免疫力がなくなり、細菌が増殖する。したがって安楽死後すぐにサンプルを採取しないと消毒や滅菌を実施しても感染のコントロールが困難な場合がある。改善点として安楽死後、迅速に嗅粘膜組織を摘出することはもちろん、摘出前に器具の滅菌ならびに滅菌操作を徹底し、また鼻腔を抗生物質加生理食塩水で徹底的に洗浄することが挙げられる。また、同様の研究を行っているブリストル大学Dr. Grangerやアイオワ州立大学Prof. Jefferyに対策や今後の注意点について意見を交換し実験を推進する。
持続的な乾燥地農業を支える根圏微生物群集とは何か

本研究では土壌劣化の影響下にある乾燥地において、AM菌と根圏細菌の群集構造解析を通し、有用菌の探索や土壌劣化に伴う微生物群集構造の変化を捉えることを目的とした。トルコアンカラにて土壌劣化の程度が異なる3地域における自然植生に注目し、多年草3種、一年草4種の7植物種について、AM菌および根圏細菌群集構造のアンプリコンシーケンス解析を行った。細根抽出DNAを鋳型に糸状菌ユニバーサルプライマーのみを使用したアンプリコンシーケンス解析では、AM菌DNAの増幅量が十分ではなかったため、1st PCRとしてAM菌のLSU-ITS-SSU領域を増幅させ、2nd PCRでITS領域を増幅させる方法を試みた結果、AM菌DNAを優先的に解析できることが示された。春季では多様なAM菌が検出されたが、一部の試料で著しく低いAM菌多様性が示された。このことに関して、今後プライマーの選択性等について再び検討する必要があると考えられる。また、現地土壌の培養及び保存は現在アンカラ大学にて継続しており、今後、現地の研究協力者と協働で資源化を進める予定である。細菌群集組成については、地点・植物種間で多少の変動は見られるものの、門レベルではFirmicutes門、Proteobacteria門、Actinobacteria門が優占しており、属レベルではBacillus属、Rubrobacter属が優占していた。今後、Bacillus属およびRubrobacter属に注目することで乾燥地農業に貢献し得るPGPRの獲得につながることが期待される。細菌群集組成を比較した結果、土壌劣化の程度が大きい地点では他とは異なる群集構造を示し、この傾向は特に春季で大きかった。今後、試料採取回数を増やし、経時変化を捉えることで、乾燥地における土壌微生物の季節的変動と環境要因との関係を明らかにできるものと考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、根圏微生物を生かした持続的な乾燥地農業の発展を目指し、トルコ中央部の砂漠化の影響を受けた自然植生を対象に、1)土壌の乾燥ストレスが土着アーバスキュラー菌根菌(AM菌)群集と細菌叢へ与える影響を網羅的に解析し、2)乾燥地農業・土壌劣化対策に応用可能な有用AM菌種を選抜し、胞子を確保して資源化すること、の2点を目的とする。平成27年6月にトルコアンカラ東部のHasanoglanおよびKalecikの土壌劣化の程度の異なる6地点において夏季植生の試料採取および植生と土壌劣化の程度の把握を行った。試料植物は多年草のAstragalus、Verbascum、Artemisia及び一年草のFestuca、Aegilops、Stipa、Bromusの計7種とした。また、AstragalusやVerbascum等の多年草植物に関してもAM菌の根への感染及び共生器官の形成があることを、染色法を用いて現地で確認した。採取した植物細根及び根圏土壌から全DNAを抽出し、土壌抽出DNAからは細菌DNAを、植物細根抽出DNAからはAM菌DNAをPCRにて増幅させた。土壌抽出DNAを鋳型に、細菌の16S rRNA遺伝子を対象とした定量PCRを行った結果、Atragalus属の植物根圏では細菌の存在量(DNAのコピー数)が他に比べてやや低い傾向が示されたが、その他の植物間や地点間では現在のところ大きな差は見られていない。今後、平成28年4月中旬にトルコにて春季植生の試料採取を行い、既に採取した夏季植生と土壌微生物菌叢の季節変動の有無について、次世代シーケンサーを用いたアンプリコンシーケンス解析による検討を行い、微生物同士の相互関係や有用種の推定を行う。平成28年度中に、現地でAM菌胞子の単離および資源化を行う予定である。砂漠化の影響下にある土壌における根圏細菌及び共生糸状菌(AM菌)の群集構造を解析するに当たり、土壌劣化の程度の異なる複数地点を決定し、その土壌理化学性や植生の分析から研究に適切であると判断できた。AM菌群集を本学所有のIllumina社製次世代シーケンサーMiseqを用いて解析するに当たり、PCR増幅の際の適切なプライマーペアの探索、あるいは作成が必要となったが、既存のプライマーペアの組み合わせで十分な菌叢解析が行える可能性が示唆され、現在検討中であるが、研究期間内に解析法の確立が十分に期待できる。当初の予定では平成27年度中に2度の試料採取を行う予定であったが、27年夏におけるトルコアンカラの治安悪化を受けて、2度目の採取は一時延期となった。しかし、28年4月に春季植生として試料採取が完了しており、微生物群集の季節変動について十分な検討が行えることとなった。今後、夏季までに次世代シーケンス解析を完了させ、トルコの情勢を注視しつつ、AM菌胞子の資源化を行うことで、研究計画の完遂が期待できる。

細根抽出DNAを鋳型に糸状菌ユニバーサルプライマーのみを使用したアンプリコンシーケンス解析では、AM菌DNAの増幅量が十分ではなかったため、1st PCRとしてAM菌のLSU-ITS-SSU領域を増幅させ、2nd PCRでITS領域を増幅させる方法を試みた結果、AM菌DNAを優先的に解析できることが示された。春季では多様なAM菌が検出されたが、一部の試料で著しく低いAM菌多様性が示された。このことに関して、今後プライマーの選択性等について再び検討する必要があると考えられる。また、現地土壌の培養及び保存は現在アンカラ大学にて継続しており、今後、現地の研究協力者と協働で資源化を進める予定である。細菌群集組成については、地点・植物種間で多少の変動は見られるものの、門レベルではFirmicutes門、Proteobacteria門、Actinobacteria門が優占しており、属レベルではBacillus属、Rubrobacter属が優占していた。今後、Bacillus属およびRubrobacter属に注目することで乾燥地農業に貢献し得るPGPRの獲得につながることが期待される。細菌群集組成を比較した結果、土壌劣化の程度が大きい地点では他とは異なる群集構造を示し、この傾向は特に春季で大きかった。今後、試料採取回数を増やし、経時変化を捉えることで、乾燥地における土壌微生物の季節的変動と環境要因との関係を明らかにできるものと考えられる。Illumina社製次世代シーケンサーMiseqを用いてAM菌群集のアンプリコンシーケンス解析を行う方法について検討を進める。最も検出効率が良かった方法を用いて春季・夏季植生におけるAM菌叢及び根圏細菌叢について網羅的解析を行う。ネットワーク解析等を用いてAM菌と根圏細菌叢や土壌劣化との関係について考察を行い、有用種の推定等を行う。トルコにおいて、現地AM菌の培養は継続しているが、今後それらについて菌種ごとに分離培養を行い、生物資源として保存する。近年トルコの情勢が不安定である為、渡航の時期については慎重に検討する必要がある。仮にトルコの治安がさらに悪化するようであれば渡航を取りやめざるを得ないが、現地研究協力者にAM菌の分離培養法については指導済みである為、その際には現地の協力を得ることで対応策とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
小脳顆粒細胞のマイグレーションを制御する分子機構の解析

中枢神経系ニューロンが脳内を正しい方向に細胞移動するためには、個々のニューロンが細胞極性を獲得することが不可欠である。本研究では発生中90度の方向転換を挟み二相性の移動を示す小脳顆粒細胞を用いて、中枢神経系ニューロンの移動極性を決定する細胞内因性機構の解明を目指した。まず顆粒細胞の方向転換を再構成した培養下の顆粒細胞にGFPを強制発現させ、移動のダイナミクスをタイムラプス共焦点顕微鏡で詳細に追跡した。その結果、二相性の移動は各々将来軸索と樹状突起に分化する性質の異なる先導突起に導かれ、大脳皮質で報告された異なるダイナミクス(Somal translocationとlocomotion)を介して起ることが明らかになった。また方向転換の起る時期の顆粒細胞で特異的に発現する分子として一回膜貫通型の新規タンパク質DNER(Delta/Notch-like EGF-related Receptor)を同定した。DNERタンパク質は中枢神経系ニューロンの樹状突起に局在するが、これがDNERの細胞内領域のチロシン基モチーフとクラスリン被覆小胞蛋白質AP-1の結合に一部依存する事が明らかになった。さらに、分散およびスライス培養系を用いた解析により、DNERは中枢神経系ニューロンの細胞間相互作用に関与するシグナル分子であり、海馬錐体細胞や小脳プルキンエ細胞などの樹状突起のパターン形成に重要な役割を担う事を示唆する結果を得た。本研究では小脳顆粒細胞を用いて中枢神経系ニューロンの移動極性を決定する細胞内因性機構の解明を目指した。顆粒細胞は内在性プログラムに従い90度方向を変えて移動する。まず移動中の顆粒細胞の極性変換を司る細胞機構を明らかにするため、方向転換を再構成した培養下の顆粒細胞にGFPを強制発現させ、移動に伴う形態変化をタイムラプス共焦点顕微鏡で詳細に追跡し、顆粒細胞の軸索および樹状突起の形成と発達のダイナミクスを解析した。顆粒細胞では双極性の軸索がまず発達し、細胞体が方向を変えて移動した後に樹状突起の発達が起ると考えられてきたが、実際には軸索形成ののち移動しながら神経突起が徐々に伸長して樹状突起に分化していくことが明らかになった。また極性転換の前後で先端突起の特性が大きく異なり、前者は伸長して軸索に分化するが、後者は樹状突起に分化することが明らかになった。また顆粒細胞の方向転換を制御する分子を同定するため、方向転換の起る時期の顆粒細胞で特異的に発現する分子をPCR subtractionにより単離した。その結果、細胞外に神経細胞分化に重要な役割をもつNotchシグナル分子のNotchやDeltaと相同のEGFモチーフを持つ一回膜貫通型の新規タンパク質DNER(Delta/Notch-like EGF-related Receptor)を同定した。DNERmRNAは発生中と成体の脳で特異的に発現し、タンパク質は中枢神経系ニューロンの樹状突起に局在することが明らかになった。また顆粒細胞では、方向転換後の先端突起に特異的に発現しており、DNERが中枢神経系ニューロンの樹状突起や先端突起の形成や機能に何らかの役割を持つ事が示唆された。
地域包括支援センターの高齢者虐待対応を促進する為のグループインタビューによる研究

本研究は2か所の体制が異なる行政において、全委託型地域包括支援センターの社会福祉士、保健師、主任介護支援専門員と行政職員を対象に、それぞれ4職種別のフォーカスグループインタビュー調査を実施した。その結果、行政と地域包括支援センター間に高齢者虐待対応に関する異なる課題と共通の課題があることが分かった。本研究では、これら共通課題を「行政の内部体制」・「委託型地域包括支援センターの内部体制」・「行政と地域包括支援センターの連携・協働体制」・「地域包括支援センターを取り巻く地域体制」・「国レベルの政策」の5項目に分類し、各項目の対応策を「高齢者虐待対応体制の推進に向けての提言(案)」として示した。本研究は、量的調査では明らかにならなかった市町村と地域包括支援センターの高齢者虐対応に関する認識の相違を、フォーカスグループインタビュー調査により明らかにして、地域包括支援センターにおける高齢者虐待対応の促進に貢献することを目的としている。平成23年度のX市Y行政区に引き続き、市区町村においてフォーカスグループインタビューを実施した。今年度はZ特別区の20か所の地域包括支援センター職員と行政職員に対象に、1社会福祉士職グループ、2保健師職グループ、3主任ケアマネジャー職グループ、4行政職員グループで実施した。昨年のY区は行政職員も多く各地域包括支援センターの担当者を配し、月1回の3種別会議を行政を交えて開催していた。今年度のZ区は、20か所の地域包括支援センターを数人の行政職員が担当していて、全地域包括支援センターの職種別定例会議の開催がなかった。このように昨年度とは異なる体制の市町村を選び調査を実施した。フォーカスグループインタビューは、平成24年11月3日11月30日の間に4回実施した。参加者は、1社会福祉士職グループ30名、2保健師職グループ21名、3主任ケアマネジャー職グループ20名、4行政職9名であった。各グループの参加者が多かったため、56名のグループに分けインタビューガイドをもとに実施し、司会者も各回3名を配し、この研究で招集した委員会の委員等に依頼した。調査対象者に対しては個人情報に関しての保護の説明や目的等を説明後、録音の許可を得て実施した。実施後のインタビュー調査に参加しての意識に関する郵送質問紙調査を3月に実施した。今回の調査から、行政と地域包括支援センターの体制による高齢者虐待対応の違いが明らかになり、市町村ごとの課題と体制整備促進のための対応も個々に考えることの必要性が示唆された。本研究は、2つのエリア内の全地域包括支援センター(委託型)3職種別グループ(社会福祉士、保健師、主任介護支援専門員)、行政担当者に対してのフォーカスグループインタビュー調査を実施して地域包括支援センターと行政との高齢者虐待対応における現状と課題を明らかにし、是正案を提示し高齢者虐待対応促進に貢献することを目的とした。半構造的インタビューガイドを用いたグループインタビュー法により、所要時間60分で1回、各グループを10名以下に調整して実施した。インタビュー前に、フェイスシートと市町村における高齢者虐待防止対応のための体制整備等についての自記式質問紙調査を実施した。さらに、調査実施後約3カ月の時点で、インタビュー調査後の高齢者虐待対応の変化や気付きに関する郵送自記式質問紙調査を実施した。これらの調査に関しては調査内容を説明し同意を得たうえで実施し、人権及び権利に十分注意して実施した。調査から、エリアや各地域包括支援センターが抱える地域独自の課題と共通課題があることが示唆された。本研究では、共通の課題を「行政の内部体制」・「委託型地域包括支援センターの内部体制」・「行政と地域包括支援センターの連携・協働体制」・「地域包括支援センターを取り巻く地域体制」・「国レベルの政策」の5項目に分類し、高齢者虐待対応体制の推進に向けての提言(案)を示した。また、行政と地域包括支援センターの業務量の軽減策として、NPOや独立型社会福祉士、専門職等の退職者の活用などを提案した。今後の課題は、より多くの市町村で同様の調査を実施し、普遍化できる提言にすることと、各地域包括支援センターの高齢者虐待対応のノウハウをネット上で共有できるシステムの開発等である。研究成果は、市町村の参考にしていただくため論文発表や学会発表の他に報告書を作成し、全都道府県の高齢者虐待担当部署、首都圏の一部市町村に配布した。本研究は、高齢者虐待対応に関するグループインタビューを、(1)全地域包括支援センター職員、(2)3職種別職員、(3)行政職員の3層を対象に実施し、地域包括支援センター間、地域包括支援センター内職員間、地域包括支援センター職員と行政職員間の高齢者虐待対応の認識の相違、地域包括支援センター職員の不安要因等を把握し、改善策等を提案し、地域包括支援センターの高齢者虐待対応の促進に貢献することを目的としている。グループインタビュー調査実施するに当たり、録音の必要性を説明して全員の許可を得てから実施した。

参加者に番号を振り分けてテープ起こしの際、発言者はすべて番号で処理してデータ化し、個人・自治体等が特定されないように統計処理を行った。データは研究、研究発表(学会発表・論文)等にのみ使用することを説明し、人権、個人情報の扱いには十分注意して実施した。23年度のグループインタビューは、A市B行政区に実施し、概要は以下の通りである。(1)実施期間:23年11月12月、(2)対象:8ヵ所の地域包括支援センター職員、社会福祉士、主任ケアマネジャー、保健師、行政職員、(3)回数:12回。現在分析を行っている。グループインタビュー時に参加者対象に、厚生労働省が毎年実施している「高齢者虐待の防止、高齢者の養護者に対する支援等に関する法律に基づく対応状況等に関する調査」「市町村における高齢者虐待防止対応のための体制整備等について」の質問項目について自記式質問し調査を実施し、個人の認識の相違を把握した。グループインタビュー調査実施約3カ月後の平成24年3月に、「高齢者虐待対応に関するグループインタビュー調査後の評価アンケート」をグループインタビュー参加者全員を対象に自記式質問紙郵送調査を実施し、インタビュー後の個人および地域包括支援センター、行政内の高齢者虐待対応に関する意識変化を把握し、現在集計中である。第一に、平成23年度、平成24年度ともに市町村に対するフォーカスグループインタビューが実施できたことからおおむね順調といえる。全地域包括支援センターの3職種職員が対象のため、いろいろな市町村に打診したが、断られた。昨年は、毎月定例の職種別の会議を開催している市町村で調査者と各会議の日程調整で済んだため、フォーカスグループインタビュー調査を受け入れてもらえた。しかし、今年度は昨年度より地域包括支援センター数が多く定例会議を実施していない市町村での調査を検討していたため、全地域包括支援センターの3職種を1か所に集めることへの各地域包括支援センターの同意と、日程調整が不可能という理由で断られた。そのような状況の中、行政主体で3職種別の研修会を開催するという市町村に承諾していただき、研修会の一部の時間をいただいてインタビュー調査ができた。フォーカスグループインタビュー調査の市町村への依頼からも、行政と地域包括支援センターとの関係を把握することができた。第二に、3月時点でインタビュー調査のテープ起こしが完了しているからである。ただ、フォーカスグループ実施時期が遅れたため、分析に関して当初予定より遅れている。また、同様にインタビュー調査の実施が11月末までかかったため、インタビュー調査実施3ヶ月後のフォーカスグループインタビュー参加後の郵送質問紙調査も3月22日締め切りに設定したが、まだ未返却の地域包括支援センターがあり集計することができず、遅れている状態である。以上の点から、本研究は、おおむね順調に進展しているといえる。平成23年5月に科研費の交付申請書類を提出後、研究委員会の委員の委嘱、日程調整等を行って7月に第1回の委員会を開催して、調査準備を開始した。
血清バイオマーカーTYMPによる胃癌XP療法の効果予測とモニタリング

切除不能進行・再発胃癌に対する標準治療は、国内ではTS-1+CDDP(SP)療法およびTS-1+l-OHP療法であり、海外ではカペシタビン+CDDP(XP)療法である。近年、韓国で報告されたClassic試験の結果から本邦ではXP療法は胃癌の補助化学療法に適応拡大された。カペシタビンの標的酵素であるThymidine phosphorylase (TYMP)は血小板由来内皮細胞増殖因子と同一分子として知られ、腫瘍内の発現レベルが高いと予後不良であることがしられている。しかしながらTYMP活性の高い腫瘍に対してはカペシタビンは有効を示すことも報告されている。本研究では、胃癌症例を対象として血清TYMP値とXP療法の有効性との関連性を解析し、血清TYMP値によるXP療法の効果予測・治療モニタリングを行うことを目的とする。そこでまずは血清TYMP値が腫瘍組織でのTYMP発現の代用マーカーとなりうるかを検討すべく患者同意済みの保存している胃癌症例103例の手術標本に対してSIGMA-ALDRICH社製のRabbit polyclonal anti-TYMPを用いて染色した。また103例中、血清保存している78例に対してMyBioSource社製のThymidine phosphorylase(TP), ELISA kitを用いて血清TYMPを測定した。特殊な組織型1例を除く77例を対象に血清TYMPと腫瘍の免疫組織型染色によるTYMPの発現との関連性を検討した結果、低分化および印環細胞癌において高・中分化型腺癌よりも血清TYMP値が有意に高いことを認めたが腫瘍内のTYMP発現との関連性は認めなかった。しかしながら以前の食道癌におけるわれわれの研究において血小板数と予後との関連性が示唆されたが今回、胃癌の免疫染色を行うことで胃癌組織でのTYMPの発現と血小板数に関連性があることが示唆されTYMPの高発現と血小板数高値は予後が不良であることが示唆された。切除不能進行・再発胃癌に対する標準治療は、国内ではTS-1+CDDP(SP)療法であり、海外ではカペシタビン+CDDP(XP)療法である。カペシタビンの標的酵素であるThymidine phosphorylase (TYMP)の腫瘍内の発現レベルが高いと化学療法抵抗性であることが多いが、TYMP活性の高い腫瘍に対してはXP療法がSP療法よりも有効である可能性がある。本研究では、胃癌症例を対象として血清TYMP値とXP療法の有効性との関連性を解析し、血清TYMP値によるXP治療の効果予測・治療モニタリングを行うことを目的とする。患者同意済みにて保存してある血清ならびに手術標本を用いて、血清TYMP値と癌組織TYMP値発現レベルとの相関関係を検討した。前向き試験として進行再発胃癌患者のXP療法の効果と血清値との相関を検討する(目標症例数は70例)。試験計画を倫理委員会へ申請して承認を得た。多施設での倫理手続きを終了した。順次、症例登録を開始している。切除不能進行・再発胃癌に対する標準治療は、国内ではTS-1+CDDP(SP)療法およびTS-1+l-OHP(SOX)療法であり、海外ではカペシタビン+CDDP(XP)療法である。近年、韓国で報告されたClassic試験の結果から本邦ではXP療法は胃癌術後補助化学療法に適応拡大された。また前向き試験として進行再発胃癌患者のXP療法の効果と血清値との相関を検討する(目標症例数は70例)目的で現在、院内および多施設共同研究として順次、症例登録を開始している。血清症例ならびに切除標本にの研究に関してはおおむね順調に進行している。臨床研究に関しては胃癌の標準治療であるSP療法およびXP療法は入院での治療を余技なくされていた。しかし平成26年10月にSOX療法は公知申請され、平成27年3月20日に胃癌に対して保険適応拡大をうけたことにより患者サイドから入院よりは外来での治療を希望されるケースが多くなったため前向き試験における患者登録が十分行えない状況である。

また103例中、血清保存している78例に対してMyBioSource社製のThymidine phosphorylase(TP), ELISA kitを用いて血清TYMPを測定した。特殊な組織型1例を除く77例を対象に血清TYMPと腫瘍の免疫組織型染色によるTYMPの発現との関連性を検討した結果、低分化および印環細胞癌において高・中分化型腺癌よりも血清TYMP値が有意に高いことを認めたが腫瘍内のTYMP発現との関連性は認めなかった。また前向き試験として進行再発胃癌患者のXP療法の効果と血清TYMP値、腫瘍TYMP発現との関連性を検討する(目標症例数70例)目的で、院内で順次、症例を登録している。血清症例ならびに切除標本の研究においてはおおむね順調に進行している。臨床研究に関しては従来、SP療法もXP療法も入院での治療を余儀なくされていた。しかしながら平成26年10月にSOX療法が公知申請され、平成27年3月20日に保険適応拡大を受けたことより外来での治療が可能となったことで前向き試験に登録患者が十分に行えない状況である。切除不能進行・再発胃癌に対する標準治療は、国内ではTS-1+CDDP(SP)療法およびTS-1+l-OHP療法であり、海外ではカペシタビン+CDDP(XP)療法である。近年、韓国で報告されたClassic試験の結果から本邦ではXP療法は胃癌の補助化学療法に適応拡大された。カペシタビンの標的酵素であるThymidine phosphorylase (TYMP)は血小板由来内皮細胞増殖因子と同一分子として知られ、腫瘍内の発現レベルが高いと予後不良であることがしられている。しかしながらTYMP活性の高い腫瘍に対してはカペシタビンは有効を示すことも報告されている。本研究では、胃癌症例を対象として血清TYMP値とXP療法の有効性との関連性を解析し、血清TYMP値によるXP療法の効果予測・治療モニタリングを行うことを目的とする。そこでまずは血清TYMP値が腫瘍組織でのTYMP発現の代用マーカーとなりうるかを検討すべく患者同意済みの保存している胃癌症例103例の手術標本に対してSIGMA-ALDRICH社製のRabbit polyclonal anti-TYMPを用いて染色した。しかしながら以前の食道癌におけるわれわれの研究において血小板数と予後との関連性が示唆されたが今回、胃癌の免疫染色を行うことで胃癌組織でのTYMPの発現と血小板数に関連性があることが示唆されTYMPの高発現と血小板数高値は予後が不良であることが示唆された。血清症例ならびに切除標本の研究においてはおおむね順調に終了した。
肺の微小血管内皮細胞のcDNA作製と特異プローブの検討

肺微小血管内皮細胞を標識プローブにより機能的側面から解析する目的で研究を遂行してきた。微小環境で組織ホメオスターシスを維持するため毛細血管は臓器、組織特異性の高い機能を備えている。しかし、呼吸中枢である肺胞毛細血管の機能形態学的研究はほとんど進んでいない。われわれは肺胞壁のsingle capillary unitに注目しその特徴を理解すべく電子顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡と、レーザ-マイクロダイセクション法により肺胞壁のみを採取しRT-PCR法でmRNAの発現を分析した。その結果、1)肺胞毛細血管内皮細胞は通常標識される凝固因子von Willebrand factor(vWf)を発現せず抗凝固因子(トロンボモジュリン;TM)が優位に出現し、2)肺胞傷害や腫瘍細胞の肺胞壁への浸潤に際し、これらの標識因子の発現は逆転しvWfが単独に発現した。その際、肺胞壁は線維化傾向を示し内皮細胞は本来のガス交換機能と異なる新たな修復機能を発揮した。3)興味ある標識プローブとしてprotease-activated receptor(PAR)と称するG-protein受容体とそのリガンドであるthrombinその他のserine proteaseがある。この受容体の活性化により内皮細胞はTMを消失させvWfの産生を促された。またVEGFとの相乗作用で増生傾向を獲得した。4)同時に肺胞壁の線維芽細胞も活性化される可能性を確認した。従来より肺胞壁の修復過程には上皮細胞や炎症細胞がその主役を果たすと見なされてきたが、この研究により内皮細胞はきわめて多彩で重要な機能を発揮する事実を証明することが出来た。当グループはこれらの研究から、肺の修復機序の最終段階である肺線維症の発生に関しても、少なくも傷害当初において肺胞毛細血管が重要な役割を果たすものと見てこの領域で研究課題を展開させつつある。初年度における計画は、肺の微小血管における内皮細胞の部位別特異性を検討することにあった。免疫組織学的な新しい分類法の作成を試みた結果次の特徴を見いだすことが出来た。すなわち、内皮細胞の細胞膜に存在する抗凝固タンパクであるthrombomodulin(TM)と、細胞質に存在する凝固タンパクであるvon Willebrand factor(vWf)とを標識にして蛍光抗体二重染色法にて観察することで内皮細胞を明らかに分類することが出来た。1)肺動脈系の微小血管である肺胞毛細血管の内皮細胞はTM優位型の発現を、2)結合組織(気管支動脈系)の微小血管の内皮細胞はvWf優位型の、3)両者の境界にある微小血管内皮細胞は、TM/vWfのモザイク型発現を示した。この特徴はこれまでに知られておらず、TM,vWfは内皮細胞を分類する最も容易な標識となることを知り得た。また、in vitro系での内皮細胞の培養法も、通常の培養液の代わりにMatrigel Matrixを用いることで、肺動脈、肺微小血管、気管支動脈に類似する大動脈などそれぞれの内皮細胞系が、上記標識抗体に対してin vivoにおける表現型を再現する事実を見いだした。病的変化(肺腺癌、肺線維症)での発現型の転換機序を研究するための格好のモデルを創りあげたことになる。今後この基本的手技を用いて特異プローブ作製に向かう予定である。

肺微小血管内皮細胞を、細胞膜に存在する抗凝固タンパクであるthrombomodulin(TM)と、細胞質の凝固タンパクであるvon Willebrand factor(vWf)を標識にして蛍光抗体二重染色法を実施すると、肺胞毛細血管の内皮細胞はTM優位型、結合組織(気管支動脈系)の微小血管はvWf優位型、両者の境界にある微小血管はTM/vWfのモザイク型に発現した。肺癌においては、肺胞毛細血管内皮細胞が気管支微小血管型に転換する。その過程でmosaic-like patternであるjuxta-alveolar microvesselの内皮細胞の表現型を経過する事実を明らかにした。従来より、原発性肺腺癌が気管支動脈から栄養を受け取るとの推測がある。そしてVEGFの発現が肺胞壁に浸潤転移した癌細胞に豊富でその受容体のKDRがその肺胞壁で高度に発現していることをmicrodissectionした組織の発現するmRNA量から把握した。さらに肺胞毛細血管の内皮細胞核に増殖細胞核抗原が発現していることから、浸潤領域の内皮細胞が分裂して増生する事実を明確にした。電子顕微鏡的観察によりcapillary sproutingが起きていることを明らかにした。癌細胞による血管新生とその内皮細胞の性格の転換を明らかにした仕事である。現在、内皮細胞に存在する抗凝固因子thrombomodulinが消失すると同時に内皮細胞の増生反応が発生するメカニズムに注目している。thrombomodulinはthrombinの受容体としての機能を持つ一方、thrombinにはprotease activated receptor(PAR)といわれる受容体もある。この受容体PARの活性化の過程でthrombomodulinが何らかの機能的干渉作用をする可能性があり、現在その点で検索中である。内皮細胞は病変の発現とともに積極的な作用をしている可能性があり病因論の設定上重要なポイントである。特発性間質性肺疾患、膠原病肺、過敏性肺炎など間質性肺疾患の研究を上皮細胞や線維芽細胞のレベルから血管系の変化に注目してきた。この領域での形態学的研究は未だ緒についたところであり多くの困難が付きまとうものの次のような仮説の元に諸課題に一定の解決策を見出すことが出来た。1)肺腺癌で肺胞壁の基本構造を保存した原発性肺腺癌では、肺胞に間質性線維化を伴うことがまれでない。この点に注目し血管の正常との違いを検索した。2)正常ならびに肺癌のヒト肺微小血管内皮細胞、肺脈内皮細胞、肺小静脈、気管支循環系微小血管内皮細胞などを目標に、Vascular endothelial growth factor-(VEGF)receptor(KDR,Flt)、thrombomodulin,von Willebrand factorなどの抗体を用いconfocal laser scanning microscopeにて免疫組織学的にその性状を明らかにした。3)laser capturemicrodissection法により、正常ならびに原発性肺腺癌細胞の浸潤した肺胞壁をそれぞれ別個に採取した。正常肺胞からは毛細血管、周皮細胞、線維芽細胞、肺胞上皮細胞を取り出した。担癌肺胞壁はさらに腺癌細胞が加わった細胞構成をなす。これらのRNAから、cDNAを作成してRT-PCRを実施し、VEGFのisoformを分析した。またKDR,Fltの発現量を算定した。その結果、担癌肺胞壁では内皮細胞が活発に成長因子
細胞周期における染色体複製ライセンス化因子の制御機構の解析

細胞周期において、染色体の複製が正確に、そして一回のみ行われることにより遺伝情報が維持される。我々は、分裂酵母においてライセンス化因子Cdc18とCdt1の高発現が、過剰複製を起こすことを発見した。さらに、ヒト細胞においても、Cdt1を高発現すると、4C以上のDNAを有す細胞が誘導されることを示した。そこで、Cdt1タンパク質の分解制御が、ゲノムの維持において重要な働きをしていると考え、その分解機構の解明を行い、次のような結果を得た。1)、細胞周期のS期に入ると、Cdt1はユビキチン-プロテアソーム系により分解される。Cdt1のN末100アミノ酸を持つ領域を9myc融合タンパク質として発現すると、本来なら安定な9mycタンパク質が、S期で分解されるようになり、この領域をせばめていくことにより、N末に分解に関わるドメインが2カ所存在することを明らかにした。ドメイン1は、最初の10アミノ酸を含む領域で、ドメイン2は、約20-100アミノ酸を含む領域である。2)、各ドメインを認識してユビキチン化に関与する酵素E3を明らかにするため、各種E3に対するsiRNAを導入することにより、ドメイン1にはDDB1-Cul4が、ドメイン2には、SCF-Skp2が関与することを明らかにした。また、DDB1-Cul4系は、S期のみ機能するが、SCF-Skp2は、S期のみならずG2期においても機能することを見いだした。3)、Cdt1は、UV照射などのDNA損傷を受けたときも速やかに分解される。この分解には、ドメイン1を認識するDDB1-Cul4系によることを明らかにした。4)、DNA複製時やDNA損傷後のDDB1-Cul4系による分解には、Cdt1のN末に結合するPCNAが関わることを明らかにした。さらに、ヒト細胞においても、N末を除いたヒトCdt1は、非常に安定化して高発現すると、4C以上のDNAを有す細胞が誘導されることを示した。1、細胞周期のS期に入ると、Cdt1はユビキチン-プロテアソーム系により分解される。G1後期からS期にかけて機能するSkp2-Cul1ユビキチン化因子が、Cdt1に結合することから、この因子により分解されると予想した。しかし、Skp2ノックアウト細胞、siRNAでSkp2の発現を抑制した細胞においても、Cdt1が分解されることが分かった。Cdt1のN末32アミノ酸を持つ領域を9myc融合タンパク質として発現すると、本来なら安定な9mycタンノミク質が、S期で分解されるようになることから、この領域にS期における分解に関る配列があると結論した。2、細胞をUV照射するとCdt1が、素早く分解されることを見つけていた。さらに、DNAアルキル化剤MMSや酸化剤menadione処理によっても、分解がおこることを確かめた。DNAダメージにより活性化されるDDB1を含むユビキチン化酵素複合体の関与を調べるため、siRNAによりDDB1の発現を押さえるとCdt1の分解が抑制されることが分かった。さらに、Cdt1のN末32アミノ酸領域にこの分解に預かる配列が存在することを明らかにした。同じ領域が、S期における分解に関るが、DDB1の発現を押さえた細胞でも、分解されることから別の因子の関与が示唆された。
ヒト口腔粘膜上皮幹細胞の同定とその細胞動態に関する研究

ヒト口腔粘膜上皮組織における基底細胞の階層性を検討し、幹細胞を同定して、その動態を明らかにする目的で、低親和性神経成長因子受容体(75kd nerve growth factor low-affinity receptor、NGFR)を用いて研究を行った。横浜市立大学医学部口腔外科で採取されたヒト口腔粘膜を対象として、凍結標本では、抗ヒトNGFR抗体を用いた間接法によりFITC標識を行い、共焦点レーザー顕微鏡によってその蛍光強度を測定した。ホルマリン固定・パラフィン包埋組織では、マイクロウエーブ法を加えたストレプトアビジン法により、同抗体陽性細胞を同定して、その数・分布を検索した。同時にintegrinβ1、細胞増殖活性を示すMIB1、増殖抑制因子としてp53・p21Cip1などを免疫組織化学的手法にて、またアポトーシスをTUNEL法にて同定して、比較検討した。検討の結果、抗NGFR抗体陽性細胞は、ヒト口腔粘膜基底細胞層にのみ存在し、強陽性細胞が数個連続して集簇して認められた。部位・組織構築により陽性細胞の分布は異なっていた。舌背部の粘膜上皮基底細胞においては、一次乳頭の乳頭部口腔側最浅部位に強陽性細胞が集簇するのに対し、二次乳頭では上皮脚の先端部に集簇していた。歯肉においては、強陽性細胞の集簇が、上皮脚先端部もしくは乳頭部口腔側最浅部位のいずれかに認められた。上皮脚の発達の悪い頬粘膜では、6-10細胞の強陽性細胞の集簇が周期的に存在していた。上皮基底層の破壊と角化の亢進という相反する変化を示す口腔扁平苔癬の上皮組織においては、細胞増殖活性の上昇と伴に、p53・p21Cip1による細胞周期制御が起こり、アポトーシスの増加も認められた。抗NGFR抗体強陽性細胞の中には、MIB1陽性を示す細胞が少数認められ、同細胞の増殖活性が亢進していることが明らかになった。ヒト口腔粘膜上皮組織における基底細胞の段層性について検討し,その幹細胞を同定する目的で,低親和性神経成長因子受容体(75kd nerve growth factor low-affinityreceptor,NGFR)を幹細胞のマーカーとして用いて研究を行った.横浜市立大学医学部口腔外科で採取されたヒト口腔粘膜健常上皮の凍結標本を対象として,抗ヒトNGFR抗体を用いた免疫組織化学間接法によりFITC標識を行い,共焦点レーザー顕微鏡によってその蛍光強度を測定し,抗ヒトNGFR抗体陽性細胞を同定して,その数・分布を検索した.検討の結果,抗NGFR抗体陽性細胞は,ヒト口腔粘膜基底細胞層にのみ存在し,強陽性細胞が数個連続して集簇して認められた.さらに,ヒト口腔粘膜では,その部位・組織構築により,陽性細胞の分布が異なることが明らかとなった.すなわち,舌背部の粘膜上皮においては,一次乳頭の乳頭部口腔側最浅部位に強陽性細胞が集簇するのに対し,発達した上皮脚の先端部の基底細胞では抗NGFR抗体陰性であった.一方,二次乳頭では,この関係が逆となっていた.歯肉においては,抗NGFR抗体強陽性細胞の集簇は,上皮脚先端部と乳頭部口腔側最浅部位のいずれかに認められた.上皮脚の発達の悪い頬粘膜では,6-10細胞の抗NGFR抗体強陽性細胞の集簇が,基底膜に沿って周期的に存在していた.

現在、健常粘膜および口腔粘膜疾患を対象に,組織切片上にて抗NGFR抗体と同時に,細胞増殖マーカー・細胞接着因子・成長因子等の検索を併せて行い,ヒト口腔粘膜上皮組織幹細胞とその動態,およびその細胞系列の特性を検討している.ヒト口腔粘膜上皮における基底細胞の階層性および組織幹細胞について検討し,その動態を明らかにする目的で、免疫組織化学を手法とした研究を行った。横浜市立大学医学部口腔外科で採取されたヒト口腔粘膜健常上皮および病変組織を対象とし,低親和性神経成長因子受容体(75kd nerve growth factor low-affinityreceptor,NGFR)を幹細胞のマーカーとして検討した。凍結切片では,抗ヒトNGFR抗体を用いた間接法によりFITC標識を行い,共焦点レーザー顕微鏡によって,一方ホルマリン固定・パラフィン包埋された組織では,microwave法を施行し,同抗体を用いたストレプトアビジン法により陽性細胞を同定して,その数・分布を検索した。同時に皮膚の幹細胞マーカーとされるintegrin β1,細胞増殖活性のマーカーとしてMIB1,および増殖抑制因子のp53,p21Cip1などの免疫組織化学染色を行い,またTUNEL法によりアポトーシスを同定して,比較検討した。検討の結果、抗NGFR抗体陽性細胞は、ヒト口腔粘膜では基底細胞層にのみ存在し,強陽性細胞が数個連続して集簇して認められ,部位・組織構築により陽性細胞の分布が異なることが明らかとなった。一方integrin β1は,ヒト口腔粘膜では基底上層にも分布し,またホルマリン固定・パラフィン包埋組織ではその陽性細胞の同定が困難であった。上皮基底層の破壊と亢進という相反する変化を同時に認める疾患である口腔扁平苔癬においては,細胞増殖活性の上昇と伴に,p53・p21Cip1による細胞周期制御が起こり,一部の細胞にはアポトーシスが認められた。扁平苔癬におけるNGFR強陽性細胞は,TUNEL陽性を示さず,MIB1陽性を示す細胞が少数認められ,同細胞の増殖活性が亢進することが明らかとなった。
生体分子シグナルに応答するバイオハイブリッドゲルの合成と生医学的応用

生休分子シグナルに応答するバイオハイブリッドゲルの合成として,(a)生体分子架橋ゲルの合成,および(b)生体分子インプリントゲルの合成を試み,次のような結果を得た。(a)生体分子架橋ゲルの合成側鎖グルコースを有するポリマーと糖鎖結合タンパク質のレクチンとの複合体をゲル架橋点として導入することによって可逆的にグルコースに応答して膨潤するグルコース応答性ゲルを合成した。また,抗原抗休複合体を架橋点として導入したバイオハイブリッドゲルは特定の抗原が存在すると膨潤する抗原応答性を示した。さらに,この抗原応答性ゲルのネットワーク構造と抗原応答性挙動との関係を解明した。この抗原応答性ゲルを用いることによって抗原濃度に応答した薬物放出制御も可能であることが明らかとなった。一方,標的DNAと一塩基ミスマッチDNAを二重鎖形成させ,その後にゲルネットワークに導入することによって,DNA応答性ゲルも合成することができた。このゲルは,標的DNAと一塩基ミスマッチDNAを見分けて異なる応答性を示すことから,一塩基多型(SNP)認識能を有することも明らかになった。(b)生体分子インプリントゲルの合成肝癌マーカーとして知られている糖タンパク質(α-フェトプロテイン;AFP)をターゲット分子として用いて,その糖鎖部位を認識するレクチンとペプチド部位を認識する抗体とをリガンドとして用いた分子インプリント法によってAFPインプリントゲルを合成した。このゲルは鋳型分子と同様の糖タンパク質が存在すると収縮するが,類似の糖タンパク質の場合には膨潤して全く異なる応答性を示すことがわかった。また,内分泌境乱化学物質の疑いのあるビスフェノールA(BPA)に対するリガンドとしてシクロデキストリンを用いた分子インプリント法によってBPA応答性ゲルも合成できた。さらに,標的DNAを鋳型分子,その相補的DNAをリガンド分子として用いた分子インプリント法によってDNA応答性ゲルを合成した。このゲルは,標的DNA存在下で次第に収縮し,異なる配列を有するDNAに対しては全く異なる応答挙動を示すことがわかった。生体分子シグナルに応答するバイオハイブリッドゲルの合成として,(a)生体分子架橋ゲルの合成,および(b)生体分子インプリントゲルの合成を試み,次のような結果を得た。(a)生体分子架橋ゲルの合成抗原および抗体を化学修飾することによってビニル基を導入した後,抗原抗体結合を形成させた状態でアクリルアミドと架橋剤と共に重合することにより,抗原抗体ゲルを合成した。その際,抗原および抗体の化学修飾条件やゲル調製条件について検討し,十分に強度のある抗原抗体ゲルを合成する方法を明らかにした。また,得られた抗原抗体ゲルを抗原水溶液に浸漬した結果,ゲルは次第に膨潤し,その膨潤率の変化は外部溶液中の抗原濃度に強く依存した。したがって,抗原抗体ゲルは抗原濃度に応答して体積を変化させる抗原応答性ゲルであることが明らかとなった。(b)生体分子インプリントゲルの合成肝癌マーカーとして知られている糖タンパク質(α-フェトプロテイン;AFP)をターゲット分子として用いて,その糖鎖部位を認識するレクチンとペプチド部位を認識する抗体とを化学修飾することにより生体分子リガンドを合成した。次に,ターゲット分子であるAFPとビニル基導入生体分子リガンドとを結合させた状態でアクリルアミドと架橋剤と共に重合させてゲル化した後に,所定の方法でAFPを除去することによってAFPインプリントゲルを合成した。その際,レクチンおよび抗体にビニル基を導入する条件や生体分子インプリント法によってゲルを調製する条件について詳細に検討した。このようにして得られたAFPインプリントゲルをAFP水溶液中に浸漬すると次第に膨潤し,その膨潤率はAFP濃度に強く依存した。

したがって,AFPインプリントゲルは肝癌マーカーであるAFPを特異的に,認識して収縮する肝癌マーカー応答性を示すことが明らかとなった。生体分子シグナルに応答するバイオハイブリッドゲルの合成として,(a)生体分子架橋ゲルの合成,および(b)生体分子インプリントゲルの合成を試み,次のような結果を得た。(a)生体分子架橋ゲルの合成抗原および抗体を化学修飾することによってビニル基を導入した後,抗原抗体結合を形成させた状態でアクリルアミドと架橋剤と共に重合することによって抗原抗体結合を架橋点として有するバイオハイブリッドゲルの合成方法を確立した。さらに,このような抗原抗体ゲルが抗原溶液中で架橋密度が減少することによって膨潤することが明らかとなった。また,ゲル内に導入する抗原抗体複合体量によってその抗原応答性が大きく影響されることが明らかとなった。また,糖結合タンパク質であるレクチンにビニル基を導入した後,側鎖糖を有するモノマーと架橋剤を共重合することによって,グルコース濃度に応答して可逆的に膨潤収縮するグルコース応答性ゲルを合成することに成功した。(b)生体分子インプリントゲルの合成肝癌マーカーとして知られている糖タンパク質(α-フェトプロテイン;AFP)をターゲット分子として用いて,その糖鎖部位を認識するレクチンとペプチド部位を認識する抗体とをリガンドとして用いた分子インプリント法によってAFPインプリントゲルを合成した。このゲルはAFPの存在を感知して収縮する肝癌マーカー応答性を示すことが明らかとなった。また,このときのゲル弾性率を測定した結果,AFPインプリントゲルの応答性は,AFP存在下でゲル架橋密度が減少するためであることが示された。さらに,内分泌攪乱化学物質の疑いのあるビスフェノールA(BPA)に対するリガンドとしてシクロデキストリンを用いた分子インプリント法によってBPA応答性を示す分子インプリントゲルの合成にも成功した。(a)生体分子架橋ゲルの合成DNAを化学修飾することによってアクリロイル基を導入した後,二重鎖DNAを形成させた状態でアクリルアミドと架橋剤と共に重合することによって二重鎖DNAを架橋点として有するバイオハイブリッドゲルの合成に成功した。このような二重鎖DNA架橋ゲルは,標的DNA溶液中で架橋密度が減少することによって膨潤することが明らかとなった。また,この二重鎖DNA架橋ゲルは標的DNAや一塩基ミスマッチDNAに対して異なる膨潤挙動を示し,一塩基多型(SNP)認識できることがわかった。一方,抗原抗体複合体を架橋点として導入した抗原応答性ゲルの架橋構造と抗原応答挙動との関係についても詳細に検討し,ゲル構造設計の重要性を示すことができた。