hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
飛翔多型をもつ甲虫類の全球的分散と種多様化

(1)分析試料のサンプリング:オサムシ亜科,ハンミョウ亜科の系統的位置を推定するのに重要なムカシゴミムシ科をアメリカ合衆国西海岸において採集した.ハンミョウ亜科で未入手であった,Megacephala属とTricondyla属のサンプルを,南アフリカ,ベトナムの共同研究者の協力のもと採集した.(3)UCEシーケンスによる分子系統解析:近年開発された,UCE (Ultra-Conserved Element)を対象とした系統解析では,エタノール固定された標本から得られる微量のゲノムDNAからでも比較的多数のDNAシーケンスデータを取得でき,頑強な系統樹を得ることができる.この手法を試みるために,オサムシ亜科の約100個体からDNA抽出を行った.シーケンスは次年度に行う.(4)移動分散と集団遺伝学的分化:移動能力と集団分化の関係を解明するために,ツツキノコムシ科甲虫のOctotemnus属を対象として,分散能力,寄主キノコ利用(スペシャリスト,ジェネラリスト)に関連した集団遺伝学的分化パターンの違いを解明した.対象とした種群の分類学的再検討も行った(大学院生小林卓也との共同研究).得られた成果は論文として発表した.4年目までに,分析対象の甲虫3グループとその外群について,必須的な分類群の分析対象種を入手することができた.またこれまでのRNAシーケンスに基づく系統解析に加えて,UCEを対象とした手法でより多くの種を含む系統解析を行う目処もたっている.最終年度において,これらの系統解析結果に基づいて全球的分散・多様化過程を推定する目処がたっていることから,順調に進展していると言える.(1)シーケンスデータの取得:最終年度の前半において,オサムシ亜科のUCEのライブラリー作成を行い,シーケンスを行う.個体数は最大192を予定している.また,RNAシーケンスについては,今年度シーケンスが間に合わなかった少数のサンプルについて早期にデータを取得する.(2)分子系統解析:RNAシーケンスについてオーソロガスな遺伝子をまとめたシーケンスマトリクスを作成し,最尤法系統解析を行うとともに,複数の年代更正点を用いて分岐年代推定を行う.また分散・分断の歴史,後翅退化に関する形質復元を行い,各系統群の全球的分散と飛翔能力退化,種多様化の過程を推定する.UCEシーケンスの解析も同様に行い,とくにオサムシ亜科の属レベルの多様化の歴史を推定する.(3)論文作成:解析データに基づき論文を作成する.最終年度内の投稿をめざす.本研究では世界各地に分布するオサムシ亜科,ハンミョウ科,ヒラタシデムシ亜科の代表種についてRNAシーケンスを主とした分子系統解析を行う.精度の高い分子系統樹構築と,分岐年代推定によって,大陸間の移動年代を推定し,飛翔能力退化(後翅の退化)と大陸間分散・種多様化の関係を解明することを目的としている.このため世界各地で採集を行い,RNAlaterで固定したサンプルを収集することがまず必要である.本年度はチリ南部,オーストラリア・クィーンズランド州,南アフリカ,マダガスカル,および日本国内において採集を行った.オサムシ亜科については,チリオサムシ族,オーストラリアオサムシ族を含め,すべての族の種を得ることができた.またハンミョウ科についてもすべての族の種を少なくとも1種は確保した.ヒラタシデムシ亜科については,12属のうち3属を除く属の種を確保した.本年度得られたサンプルのうち,オサムシ亜科(11種)とヒラタシデムシ亜科(10種)の合計21種(21個体)について,Illumina HiSeq4000によるペアエンドシーケンスを行った.得られたRNAシーケンスデータから,オーソロガスな遺伝子領域の配列を抽出して系統解析用のマトリクスを構築し,予備的な系統樹を作成する予定である.チリ,オーストラリア,南アフリカ,マダガスカルにおいて必須的な分類群を確保することができた.またRNAシーケンスにおいても,2つのグループの代表種を概ねシーケンスすることができ,予備的な系統解析が可能になった.(1)RNA分析試料のサンプリング7月にアメリカ,ワシントン州,アリゾナ州においてサンプリングを行い,Carabus, Calosoma, Cychrus, Scaphinotus, Sphaeroderus属のオサムシ亜科,Omus, Amblycheilaなどのハンミョウ亜科,Heterosilphaなどのヒラタシデムシ亜科を得た.11月末12月初めにニュージーランド,北島においてサンプリングを行い,固有種のオサムシ亜科Maoripamborus fairburni,ハンミョウ亜科Neocicicindela tuberculataを得た.11月および3月に,南アフリカにおいて,ハンミョウ亜科,オサムシ亜科カタビロオサムシ亜族のサンプリングを行った.この他,海外の研究協力者・共同研究者から,分析に用いるRNA抽出用のサンプルを入手した.(2)RNAシーケンスによる分子系統解析これまでに得られたサンプルのうち,今年度はオサムシ亜科14種,ハンミョウ亜科25種,ヒラタシデムシ亜科2種,合計41個体について,Illumina HiSeqによるpaired endライブラリーのシーケンスを行った.前年度にシーケンスしたデータもあわせて,Trinityによるアセンブル・contig作成と,Yang & Smithの方法にしたがって,アミノ酸配列に基づくオーソロガスな遺伝子の探索・配列マトリクスの作成を行い,最尤法による系統解析を試みた.その結果,それぞれの亜科について,枝の支持率が高い(ブートストラップ値100%)系統樹が得られた.

オサムシ亜科,ヒラタシデムシ亜科については,少数の遺伝子を用いた分子系統解析で得られている系統関係とほぼ同じ結果が得られているが,ハンミョウ亜科については,その中の族,亜族の関係について,一部従来の知見とは異なる結果が得られている.これにはデー分析の手法的な問題も含まれている可能性があり,今後,解析方法を洗練させていく必要がある.分析試料の収集,RNAシーケンスによる系統解析データの取得とも着実に進んでいる.また,RNAシーケンスのオーソロガスな遺伝子の探索,分子系統解析についても,これまでに取得したデータで予備的な解析が成功している.(1)分析試料のサンプリング12月にイタリア,サルディニア島,スペイン,テネリフェ島でサンプリングを行い,系統解析において分岐年代のカリブレーションに用いるCarabus geneiとCarabus abbreviatus,およびこれまでサンプルがなかったHeterotemna属のヒラタシデムシを採集した.ハンミョウ亜科についてはアジア,アフリカ,ニューカレドニアにおいてサンプリングを行った.この他,アルメニアの共同研究者を通して,未入手であったAclypea属のヒラタシデムシ,カタビロオサムシ亜族のCalosoma属Callisthenes亜属,およびオサムシ亜族数種(Carabus属Procerus, Tribax, Lipaster, Sphodristocarabus)のサンプルを入手した.(2)RNAシーケンスによる分子系統解析これまでに得られたサンプルのうち,今年度はオサムシ亜科カタビロオサムシ亜族2種・オサムシ亜族1種,ハンミョウ亜科19種,外群のオサムシ科5種(マルクビゴミムシ亜科,ホソクビゴミムシ亜科,ヒョウタンゴミムシ亜科,ゴモクムシ亜科),合計27個体について,Illumina HiSeqによるpaired endライブラリーのシーケンスを行った.前年度にシーケンスしたデータもあわせて,Trinityによるアセンブル・contig作成と,Yang & Smithの方法にしたがって,アミノ酸配列に基づくオーソロガスな遺伝子の探索・配列マトリクスの作成を行い,最尤法による系統解析を行った.3年目までに,分析対象の甲虫3グループに着いて,必須的な分類群の分析対象種をほとんど入手することができた.残りの2年間で,さらに重要な種を採集し、分子系統解析を行って全球的分散・多様化過程を推定する目処がたっていることから,順調に進展していると言える.(1)分析試料のサンプリング:オサムシ亜科,ハンミョウ亜科の系統的位置を推定するのに重要なムカシゴミムシ科をアメリカ合衆国西海岸において採集した.ハンミョウ亜科で未入手であった,Megacephala属とTricondyla属のサンプルを,南アフリカ,ベトナムの共同研究者の協力のもと採集した.(3)UCEシーケンスによる分子系統解析:近年開発された,UCE (Ultra-Conserved Element)を対象とした系統解析では,エタノール固定された標本から得られる微量のゲノムDNAからでも比較的多数のDNAシーケンスデータを取得でき,頑強な系統樹を得ることができる.
日本への農産物輸出による熱帯アジアの耕地土壌劣化を減速するための実証的研究

本研究では、日本向けのアスパラガス栽培に特化した村でのアスパラガス作が環境にどのような負荷をもたらしているのかを評価しようと試みた。タイ国ナコンパトム県ナコンパトム郡ノングールアム村では、14年前からアスパラガス栽培を行ってきた。現地は年平均気温26°C、降水量1000mmで、当時、灌漑水路が整備されたところであった。この地方ではアスパラガスの収穫は周年可能で、2ヶ月収穫1ヶ月休止の3ヶ月サイクルで毎年4作の収穫を行う。このため窒素施肥が重要な作業で、周年栽培の影響もあり、1 haあたり4001000 kgの窒素を15-15-15の高度化成肥料として施用していた。アスパラガス収穫物として耕地から持ち去られる窒素は施肥窒素の約4%程度で、96%の窒素は畑に残存した。使用開始8年のアスパラガス畑の地下部をボーリングして深さ1mまでの土壌を採取して硝酸イオン濃度を測定したところ、地表とほぼ同じ濃度の硝酸イオンが地下100cmまで検出された。しかし1.2mくらいで消失しており、この深さは地下水位と一致した。この科研費を受領した4年間にわたって村内の掘り抜き井戸26本から毎月1回地下水を採取して硝酸イオン濃度を継続的に測定した。この村でのアスパラガス栽培は村の北側で始まり、次第に南部に広がっている。北側の井戸水の硝酸態窒素濃度はここ4年は平衡、減少にあるが、南部の井戸では漸増していた。北部の減少は化学肥料の価格高騰と有機栽培への移行によるものかもしれない。土壌の残留農薬についても定量を行い、熱帯の気候条件では分解が速いと推測した。日本向けアスパラガス栽培に特化したタイ国ナコンパトム県ノングールアム村の土壌環境について調査を継続している。特に地下水の硝酸態窒素濃度の追跡は本科研費の援助を受けて毎月一回のサンプリング6年間継続している。硝酸態窒素は施肥に起因すると考えられるが、村の北側では減少傾向に、村の南側では増加傾向にあった。アスパラガス栽培が導入された約10年前、生産は主に北側で行われていたが最近になって南側に拡大してきた。特に生産歴の長い農家に減肥の意識が高まりつつあることを反映しているのかもしれない。しばらく測定を継続する。環境中の硝酸態窒素を低減するため、減肥栽培を進めた。しかし施肥量を減らすとアスパラガス収量が低下するため、生産者の抵抗は強い。しかし昨今の原油価格の高騰をうけて窒素化学肥料の価格も高騰している。そこで肥料代を節約できる減肥と鶏糞、豚糞などのリサイクル肥料に対する関心が高まってきた。今後、これらリサイクル肥料のアスパラガスに対する肥料効果を評価するシステムを作る必要がある。残留農薬も調査のための予備的なサンプリングを進めた。村内の農業資材店で販売されていた農薬のうち、残留規制値の定められた殺虫剤は村内のため池、土壌中からはほとんど検出されなかった。半減期が熱帯気候下では短いことも考えられた。しかし、それ以外の農薬もかなり販売されていたので、来年はこれらの農薬について分析を進める予定である。この地方ではアスパラガスの収穫は周年可能で、2ケ月収穫1ケ月休止の3ケ月サイクルで毎年4作の収穫を行う。

このため窒素施肥が重要な作業で、周年栽培の影響もあり、1 haあたり4001000kgの窒素を15-15-15の高度化成肥料として施用していた。アスパラガス収穫物として耕地から持ち去られる窒素は施肥窒素の約4%程度で、96%の窒素は畑に残存した。使用開始8年のアスパラガス畑の地下部をボーリングして深さ1mまでの土壌を採取して硝酸イオン濃度を測定したところ、地表とほぼ同じ濃度の硝酸イオンが地下100cmまで検出された。しかし1.2mくらいで消失しており、この深さは地下水位と一致した。村内の掘り抜き井戸26本から地下水を採取して硝酸イオン濃度を測定したところ、ほとんどの井戸から飲用に適さないとされる10ppm以上の硝酸態窒素を検出した。この科研費を受領した4年間にわたって地下水硝酸態窒素濃度を追跡したところ、地下水の硝酸態窒素はゆっくりではあるが次第に低下しつつある。化学肥料の価格高騰と有機栽培への移行が化学肥料減肥をもたらしたのかもしれない。土壌の残留農薬についても定量を行ったが、クロルピリフォスやアバメクチンは痕跡程度しか検出されなかった。熱帯の気候条件では分解が速いと推測した。
新規微小管形成中心タンパク質による減数分裂期染色体分配制御機構の解明

減数分裂期における紡錘体形成の異常は不妊やダウン症などの先天性疾患の原因となりうることが知られているが、未だ原因は解明されていない。本研究は減数分裂期において紡錘体形成を制御する因子の探索を試みてきた。そこで卵母細胞における紡錘体形成に機能していることが報告されているPlk4の機能と特性の解明に焦点を当てた。昨年度の解析により、Plk4が自己集合する特性を持つことが明らかになっていた。今年度はさらにPlk4の自己集合特性と機能の解明を試みた。その中で、Plk4は自己集合により液滴状の構造体をつくる特性を持つことがわかった。Plk4集合体は互いに融合し、動的な代謝回転を示した。またPlk4の不活性化変異体や非自己リン酸化型変異体を観察すると、野生型とは異なり固いゲル状の自己集合体を形成することが明らかになった。これらの結果は細胞内と試験管内の両方で観察されたことから、Plk4は自己リン酸化によって自己集合体の物性を変える自己組織化特性を持つと結論づけた。さらにPlk4の物性の変化が微小管形成中心の一つである中心体の形成に影響を与えるかどうかを調べた。その結果、Plk4の物性が固い凝集体になるほど中心体の数が過剰に増加し、紡錘体の形成に異常が生じることがわかった。これらの結果から、Plk4の自己集合体の物性は適切な紡錘体形成のために制御される必要があることが明らかになった。これらの成果は論文としてまとめ、掲載受理された。現在は減数分裂期の紡錘体形成にPlk4の物性が影響するかどうかを引き続き調べている。特に卵母細胞では個体の年齢に伴い細胞質の老化が進み、染色体分配エラーの頻度が上昇することが知られている。Plk4自己集合体の物性も卵母細胞の老化に伴って変化する可能性があるため、細胞老化とPlk4の物性の関係、そして紡錘体形成への影響について解析を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。減数分裂における染色体分配の異常は、不妊やダウン症などの先天性疾患の原因となることが明らかになっているが、哺乳動物の生殖細胞を用いた遺伝学的・生化学的な解析が困難なことから,その原因の究明は遅れている。そこで、本研究ではマウスの生殖細胞において減数分裂を制御する新規因子の同定を試みている.これまでの解析により、生殖細胞特異的な発現を示し、微小管形成中心に局在する機能未知のタンパク質MSP1(仮称)を同定した。そこで、MSP1の特徴を探るために相互作用因子の探索を行った。その結果,MSP1と、Centriolar satelliteタンパク質の構成因子であるCEP72の相互作用が明らかになった。また、MSP1はCEP72と同様にCentriolar satellitesに局在した。これらの結果から、MSP1は新規Centriolar satelliteタンパク質であることが示唆された。しかし、Msp1欠損マウスを作製した結果、Msp1欠損マウスは妊娠可能であり、生殖細胞の紡錘体形成および染色体の整列・分配に顕著な異常は観察されなかった。これらの結果から,MSP1は減数分裂に必須でないことが示唆された。そのため、それ以上の解析は断念した。次に、減数分裂に必須の新規因子を同定するために,マウスの精巣と卵巣で高発現する機能未知の遺伝子に焦点を当てた。マウスの各臓器のmRNA発現を定量したRNA-seqのデータを利用して、精巣と卵巣でmRNA発現が高い機能未知の遺伝子を選別し、それらの遺伝子がコードするタンパク質のマウス生殖細胞内における網羅的な局在解析を行った。その結果、紡錘体や微小管形成中心に局在する因子が複数同定された。現在、それらの遺伝子を欠損するマウスを作製し、同定された遺伝子が減数分裂期の染色体分配に必須の機能を持つか検証している。Msp1遺伝子欠損マウスに明らかな表現型はなかったものの、MSP1の相互作用因子の同定や詳細な局在解析により、MSP1が新規centriolar satelliteタンパク質であることを見出した。また、減数分裂特異的な遺伝子の網羅的な局在解析から、紡錘体や微小管形成中心に局在する新規因子を複数同定したことから、今後の進展が期待できる。減数分裂期における染色体分配の異常は、不妊やダウン症などの先天性疾患の原因となりうることが知られているが、その原因の究明は遅れている。また、近年、ヒト卵母細胞の減数分裂において紡錘体が不安定化していることが報告されているが、その原因は明らかになっていない。本研究では、卵母細胞における紡錘体形成機構と不安定性の原因の解明を目的とした。そこで、近年卵母細胞の紡錘体形成に機能することが報告されたタンパク質Polo-like kinase 4(Plk4)に焦点を当てた。Plk4は、体細胞における中心体の複製に必須であることが知られているが、紡錘体形成にどのように機能するのかは明らかになっていない。また、Plk4のリン酸化活性が正常な紡錘体形成に必要とされているが、リン酸化活性がどのように働いているのかはわかっていない。現在の解析により、Plk4が自己凝集する生化学的性質を見出し、さらにその自己凝集が自己リン酸化によって解除されることが明らかになった。

同様に細胞内において、Plk4は非リン酸化状態で自己凝集により静的な動態を示すが、自己リン酸化により動的になることがわかった。さらに、過剰に自己凝集するPlk4変異体をヒト体細胞に発現させると、中心体数が異常に増加することがわかった。この結果から、Plk4の自己集合制御は、正常な中心体に重要であることが示唆された。今回明らかにしたPlk4の性質が卵母細胞の紡錘体形成に関与するのではないかと考え、さらなる解析を進めている。Plk4の解析を進める中で、Plk4の自己凝集の性質とその自己リン酸化制御という予期せぬ発見があった。近年、微小管形成中心タンパク質や微小管結合タンパク質による自己集合の性質は紡錘体形成に関与するという報告が相次いでいるため、Plk4もそれらのタンパク質と同様に紡錘体形成に重要な機能を持つ可能性がある。実際、体細胞においてPlk4の過剰な自己集合を誘導すると、過剰な中心体複製が起こることを明らかにした。現在卵母細胞におけるPlk4の働きを解析中であり、さらなる研究の発展が期待できるため。減数分裂期における紡錘体形成の異常は不妊やダウン症などの先天性疾患の原因となりうることが知られているが、未だ原因は解明されていない。本研究は減数分裂期において紡錘体形成を制御する因子の探索を試みてきた。そこで卵母細胞における紡錘体形成に機能していることが報告されているPlk4の機能と特性の解明に焦点を当てた。昨年度の解析により、Plk4が自己集合する特性を持つことが明らかになっていた。今年度はさらにPlk4の自己集合特性と機能の解明を試みた。その中で、Plk4は自己集合により液滴状の構造体をつくる特性を持つことがわかった。Plk4集合体は互いに融合し、動的な代謝回転を示した。またPlk4の不活性化変異体や非自己リン酸化型変異体を観察すると、野生型とは異なり固いゲル状の自己集合体を形成することが明らかになった。これらの結果は細胞内と試験管内の両方で観察されたことから、Plk4は自己リン酸化によって自己集合体の物性を変える自己組織化特性を持つと結論づけた。さらにPlk4の物性の変化が微小管形成中心の一つである中心体の形成に影響を与えるかどうかを調べた。その結果、Plk4の物性が固い凝集体になるほど中心体の数が過剰に増加し、紡錘体の形成に異常が生じることがわかった。これらの結果から、Plk4の自己集合体の物性は適切な紡錘体形成のために制御される必要があることが明らかになった。これらの成果は論文としてまとめ、掲載受理された。現在は減数分裂期の紡錘体形成にPlk4の物性が影響するかどうかを引き続き調べている。特に卵母細胞では個体の年齢に伴い細胞質の老化が進み、染色体分配エラーの頻度が上昇することが知られている。Plk4自己集合体の物性も卵母細胞の老化に伴って変化する可能性があるため、細胞老化とPlk4の物性の関係、そして紡錘体形成への影響について解析を進めている。同定した新規因子の欠損マウスを作製し、生殖細胞の減数分裂期における表現型を解析する。また、新規因子の相互作用因子の探索により、各タンパク質の働きを分子レベルで明らかにする。まず、Plk4の自己凝集が卵母細胞の減数分裂においてどのように機能するのかどうか、Plk4の変異体を卵母細胞に発現させることで検証する。
断層破砕帯の鉱物化シミュレーションと断層強度モニタリング手法の開発

断層の強度回復メカニズムを調べるため、断層のクラック閉鎖(鉱物化)による強度回復過程のモデリング(数値シミュレーション)と、実際の地震断層の強度回復過程の観測を行った。(1)断層の強度回復モデリングでは、マイクロフォーカスXーCTを用いて、天然のフラクチャーを含む岩石試料の3次元デジタルモデルを作成し、そのデジタルモデルに対して格子ボルツマン法(LBM)による間隙流体シミュレーションを実施した。フラクチャーシステムを含んだ岩石モデルは巨大になるため、Graphics Processing Unitを用いた大規模計算を実施した。その間隙流体挙動から、移流拡散方程式を用いた手法で、岩石内部の鉱物化をモデリングした。最後に弾性変形シミュレーションを、開口したフラクチャーモデルと鉱物沈殿したフラクチャーモデルに適用し、鉱物化によるフラクチャーの閉鎖が断層の強度や浸透率に与える影響を定量化した。その結果、クラックの閉鎖様式や鉱物化の種類によって、断層の強度回復や浸透率は大きく異なることが分かった。一方、流体挙動を考慮した鉱物化モデリングでは計算時間が長く実用的ではないので、ランダムウォークという確率論に基づく鉱物化モデリング手法の開発も行った。(2)実際の断層回復過程を調べるために、地震波干渉法を用いた手法により、2016年熊本地震の断層を伝わる弾性波速度(断層強度)の変化を調べた。その結果、地震発生時に、断層や火山周辺で弾性波速度の急激な低下がみられた。断層周辺の弾性波速度の低下は、断層周辺のダメージや間隙水圧が増加に伴うクラックの形成で説明できる。地震後は、弾性波速度が徐々に増加する傾向(断層の強度回復プロセス)を検出することができた。現在、この断層強度の回復プロセス(弾性波速度の回復プロセス)を、断層のモデリング結果(数値シミュレーション結果)と比較しながら解釈を行っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。断層強度回復のメカニズムの一つに鉱物沈殿がある。断層破砕帯は比較的短い時間で鉱物によってシールされ、その強度を増していくと考えられるが、断層内部の鉱物の発達過程は未解明な部分が多い。本研究では、間隙流体シミュレーションと鉱物化モデリングを断層破砕帯に適用し、破砕帯内部の鉱物沈殿や、それに伴う断層強化(回復過程)を再現する。平成27年度に実施した研究は次の通りである。(1)天然のフラクチャーを含む岩石試料を取得した。本研究では、四国の中央構造線で取得された岩石試料と、延岡衝上断層の岩石コア試料を対象とすることとした。そのフラクチャーの形状を、マイクロフォーカスXーCTで抽出し、フラクチャーの3次元デジタルモデルを作成した。また、過去の研究で使用したフラクチャーモデルを使うこととした。(2)間隙流体シミュレーションを、3次元デジタル間隙モデルやフラクチャーモデルに適用するために、格子ボルツマン法(LBM)のプログラムコードの最適化を実施した。一方で、計算領域内でフラクチャー(間隙)が占める割合が小さいため、計算領域を間隙部(フラクチャー部)に制限することで、効率的に計算を実施した。(3)我々のグループが開発した鉱物化モデル(移流拡散方程式を解いて砂岩内部の鉱物化を再現するモデル)を拡張することで、断層破砕帯に対応した鉱物モデリング手法の開発を試みた。この研究は、平成28年度も継続する。(4)弾性波動シミュレーションを、開口したフラクチャーモデルと鉱物沈殿したフラクチャーモデルに適用し、鉱物化が、断層強度や弾性波速度に与える影響を評価した。ほぼ計画通りに進んでいるが、鉱物化モデリングの部分が予想していたよりも難しく、平成27年度に終了しなかった(平成28年度も継続して実施する)。

平成28年度は、基本的に当初の研究計画に従って研究を進める。一方、(計画書には書いていないが)本研究で得られた断層強度の回復過程を、実際の地震活動(本震余震)と比較することも試みることとした。28年度が最終年度であるため、記入しない。
多様な公共性を担保するパブリックスペース・マネジメント手法構築

公共空間利用に求められる価値観は、公平性の一律原則から、公平性や効率性、寛容性等を包含する「公共性」概念へ成熟しつつある。一方で、公共空間での「稼ぐ」取組みがムーブメント的に広がり、「公共性」=「経済的公平性」との偏った捉え方となっていないだろうか。1経済的効率性2機会的平等性3行為的寛容性等の多面的観点で公共性を評価する方法を確立することを目指す。さらに、エリア内に多様な公共性を備えた公共空間が存在することで、利用者の満足度が高まり、ひいては地域の価値を高め都市の魅力にもなり得る。よって最終目的は、エリア単位で多様な公共性を担保する公共空間利用をマネジメントする手法を提案することである。
ヘモグロビンのサブユニットに4量体系形成以前から用意されている構造変化の機構

1)脊椎動物の系統樹の分岐点のまわりで、Hb(ヘモグロビン)の立体構造と機能の変化を見るために使うHbの候補を選んだ。硬骨魚類のクロマグロ、軟骨魚類のアカエイ、脊椎動物と無脊椎動物の中間的存在である円口類の日本産のカワヤツメウナギ、Hbを持つ無脊椎動物で脊椎動物に最も近い棘皮動物のシロナマコである。これら4種の動物からHbを取るルートと技術を確立した。2)アカエイにはα鎖、β鎖とも1種しかなかった。cDNAから1次構造を決め、酸素平衡曲線を測定し、「タンパク質立体構造の構築原理」ワークショップのポスターで発表した。CO結合型の結晶、deoxy(配位子非結合)型の結晶、deoxy型結晶にあとからCOを結合させた結晶をつくり、X線結晶解析を開始した。2Åくらいまで回析点が得られている。3)シロナマコのHbは、グロビンが3種あり、O_2、COの結合能を保持したまま、分離精製を試みているが、まだ中途である。配位子非結合型の4量体の結晶を得ることが目標となる。4)日本産のカワヤツメウナギのHbは、物理化学的性質はよく調べられており、4量体がより安定なので、これを手に入れ、配位子非結合型の結晶が得られた。2.8Åくらいまでの回析点が得られている。5)硬骨魚類のクロマグロのHbは、nativeなままで、α鎖とβ鎖に単離することができる。他の動物のHbの単離鎖との解離会合の実験に使えることもあって、平行して取り上げることにした。血液を手に入れ、単離鎖に割れることを確認した。6)Hbの系統樹を、立体構造と機能でたどろうとする計画に、当面必要な試料は揃ったし、結晶化も順調である。
上皮細胞層の細胞間認識機構を担うカルシウムの新しい役割の解明

発がんの超初期段階では、正常な上皮細胞層に、がん原性遺伝子変異が生じ、正常細胞と変異細胞が共存する上皮細胞層となる。この時、正常細胞と変異細胞の境界で細胞非自律的な変化が生じ、正常細胞に囲まれた変異細胞は、上皮細胞層から排除される(apical extrusion)。免疫系細胞が関与しないこの排除現象(apical extrusion)は、EDAC(Epithelial Defense Against Cancer)と呼ばれ、上皮正常細胞には、隣接する変異細胞を排除する機能が備わっていることを示唆している。しかし、正常細胞はどのように排除対象となる変異細胞を認識しているのか、そのメカニズムは明らかになっていない。本研究では、細胞内セカンドメッセンジャーとして働く細胞内カルシウム(Ca2+)に着目した。これまでに報告されている細胞間コミュニケーションは、主に化学的な刺激やメディエーターによるものがほとんどであり、波動(振動)という物理的なパラメーターの関与は知られていない。本研究の目的は、波動(振動)を介した全く新しい形の細胞間コミュニケーションを明らかにすることである。がん原性変異であるRasV12変異細胞が上皮細胞層にモザイク状に生じた時、まず、RasV12変異細胞で細胞内カルシウム濃度が増加し、連続して周囲の正常細胞において、同心円状に一過性の急激なカルシウム濃度の増加・伝搬が生じる現象(カルシウムウェーブ)を発見した。この現象は、周囲正常細胞のアクチン局在の変化を介して、apical extrusionを促進することにより、上皮恒常性維持に寄与していることが示唆されました。このことから、カルシウムウェーブは、上皮組織における新たな細胞間コミュニケーションである可能性が見出されたことは、本研究の重要な成果の1つであると思われる。発がんの超初期段階では、上皮細胞層にがん原性遺伝子変異が生じ、正常細胞と変異細胞が共存する上皮細胞層となる。この時、正常細胞と変異細胞の境界で細胞非自律的な変化が生じ、正常細胞に囲まれた変異細胞は、上皮細胞層から排除(apical extrusion)される。しかし、排除対象となる変異細胞を周囲の正常細胞はどのように認識しているのか、その認識メカニズムは明らかになっていない。本研究では、新たな細胞間認識メカニズムの探索を目指し、細胞内情報伝達物質(セカンドメッセンジャー)として働く細胞内カルシウム(Ca2+)に着目した。まず、イヌ腎上皮細胞株であるMDCK細胞にカルシウムインジケーターを恒常発現させたMDCK-GCaMP6S細胞を用いて、正常細胞(MDCK-GCaMP6S)とRasV12変異細胞を50:1の比率で混合培養すると、正常細胞に囲まれたRasV12変異細胞は、上皮細胞層から排除(apical extrusion)される。この現象の過程におけるカルシウムシグナルの変化をタイムラプスで観察したところ、排除されるRasV12変異細胞の周囲で、非常にダイナミックなカルシウムの伝搬(カルシウムウェーブ)が観察された。始めに、RasV12変異細胞内でカルシウム濃度が増加し、連続して、同心円状に周囲の複数の正常細胞に渡って、カルシウム濃度の増加の伝搬が見られた。今後は、この変異細胞周囲の正常細胞で観察されたカルシウムウェーブのメカニズムの解明、並びに変異細胞排除との関係を明らかにしていく。変異細胞周囲の正常細胞で観察されたカルシウムウェーブを詳細に解析したところ、変異細胞の排除プロセスが開始する直前で生じることが明らかになっている。また、カルシウムウェーブが生じたRasV12変異細胞の方が、ウェーブが見られなかった変異細胞よりも、排除される割合が有意に高かったことから、カルシウムウェーブは、RasV12変異細胞の排除現象に関与していることが示唆された。現在は、カルシウムウェーブの発生メカニズム並びに、その生物学的な意義を明らかにすべく研究を進めており、これまでのところ研究は順調に推移していると考えている。

このことから、カルシウムウェーブは、上皮組織における新たな細胞間コミュニケーションである可能性が見出されたことは、本研究の重要な成果の1つであると思われる。細胞内カルシウム濃度の調節は、主に3つのチャネルによって制御されていることが知られている。細胞膜カルシウムチャネル・小胞体膜受容体チャネル・ギャップ結合の3つである。これらの阻害剤を用いた実験、並びにそのノックダウン細胞を樹立し、その発生メカニズムを明らかにする予定である。また、カルシウムウェーブの下流因子の探索であるが、これまでの我々のデータから、カルシウムウェーブが生じた直後に、RasV12変異細胞が、頂端側(apical)すなわち、排除される側に移動することが観察されていることから、アクチンやミオシンといった細胞骨格に必須のタンパク質への影響があるのではないかと考えている。既に、アクチンを同時に観察するために、MDCK-GCaMP-Lifeact細胞株や、ミオシンを同時に観察するために、MDCK-GCaMP-MLC(Myosin-Light-CHain)といった細胞株を樹立しており、カルシウムウェーブが惹起する細胞骨格系の変化をイメージングにより調べる予定である。年度末に生じたイメージング機器の使用料並びに解析用PCの納入が次年度経費に計上される予定であるため。
悪意ある攻撃に対してデータの安全性を保障する高信頼多重化データ管理方式の研究

クォーラムシステム(quorum system)はノードを要素とする特殊な集合族であり,ネットワーク上の多重化データを管理する機構として用いられている.この概念を拡張し,データの改竄等の悪意ある攻撃(ビザンチン(Byzantine)故障)に耐えられる様にしたビザンチンクォーラムシステムが注目を集めている.本研究では,攻撃されるノード数の上限とネットワークの構成要素の故障確率を入力として,どのノードが攻撃されたとしても攻撃されたノード数が与えられた値以下であれば,データが改竄されたり不整合を起こしたりしないことを保証し,かつ,ユーザがデータを利用できる確率(可用性)を最大にするビザンチンクォーラムシステムを出力するアルゴリズムを開発した.具体的には,データの可用性に関して最適なビザンチンクォーラムシステムを求める問題を,整数計画問題として定式化することに成功した.このことにより,分枝限定法を用いて最適なシステムを構成することが可能となった.実際に,この問題を解くプログラムを完成させ,適用実験を行った.その結果,攻撃されるノードが1台か2台の場合であれば,全体で約10台までのサーバ集合を対象として最適なシステムが導出できることが分かった.また,提案手法によって得られる最適なビザンチンクォーラムシステムが,既存のシステムに比べどの程度優れているのかを定量的に評価した.その結果,各サーバの信頼性に幅がある場合,提案手法と従来の構成法とでの得られる可用性の差が特に大きくなることが分かった.また,この評価結果に基づいて既存の構成法であるThresholdの改変案を提案し,同様な比較評価によって提案法で得られる最適値に極めて近い可用性が得られる場合があることを示した.ネットワーク上の複数の計算ノードにデータの複製を配置するデータ多重化は,ノードや通信リンクの故障の影響を防ぐための基本的な技術である.ビザンチンクォーラムシステムはノードを要素とする特殊な集合族であり,データの改竄等の悪意ある攻撃(ビザンチン故障)に耐性を有する多重化データ管理機構の実現に用いられる.本研究では,データの安全性を保証した上で可用性最大のビザンチンクォーラムシステムを構成する方法を開発することを目的としている.具体的な手順は,まずこの問題を定式化し,その後に,計算機によって問題を解くためのプログラムを開発する.平成12年度においては,下記の1,2の段階を完了した.1.0-1整数計画問題としての定式化可用性最大のビザンチンクォーラムシステムを求める問題を,数理計画法の一種である0-1整数計画法の問題として定式化する方法について理論的な考察を行った.具体的には,交差条件等のビザンチンクォーラムシステムが満たすべき条件を0-1整数計画問題における制約式で表現することによって,定式化が可能なことが分かった.2.0-1整数計画問題への自動変換プログラムの開発1.で得られた0-1整数計画問題への定式化手法をプログラムとして実装した.具体的には,入力されたシステムに対応する0-1整数計画問題を,良く知られた解析ソフトウェアLINDOの入力として自動的に出力するプログラムを開発した.プログラム言語としてはC言語を用い,開発は備品として購入した計算機を用いて行った.平成13年度では,実装した提案手法が現実的にどの程度の規模のシステムに対して適用可能か,必要な計算時間やメモリ量に関する評価実験によって明らかにする.更に,既存のヒューリスティックによって得られたビザンチンクォーラムシステムを用いた場合との信頼性や負荷に関する比較評価を定量的に行う.クォーラムシステム(quorum system)はノードを要素とする特殊な集合族であり,ネットワーク上の多重化データを管理する機構として用いられている.この概念を拡張し,データの改竄等の悪意ある攻撃(ビザンチン(Byzantine)故障)に耐えられる様にしたビザンチンクォーラムシステムが注目を集めている.本研究では,攻撃されるノード数の上限とネットワークの構成要素の故障確率を入力として,どのノードが攻撃されたとしても攻撃されたノード数が与えられた値以下であれば,データが改竄されたり不整合を起こしたりしないことを保証し,かつ,ユーザがデータを利用できる確率(可用性)を最大にするビザンチンクォーラムシステムを出力するアルゴリズムを開発した.具体的には,データの可用性に関して最適なビザンチンクォーラムシステムを求める問題を,整数計画問題として定式化することに成功した.このことにより,分枝限定法を用いて最適なシステムを構成することが可能となった.実際に,この問題を解くプログラムを完成させ,適用実験を行った.その結果,攻撃されるノードが1台か2台の場合であれば,全体で約10台までのサーバ集合を対象として最適なシステムが導出できることが分かった.また,提案手法によって得られる最適なビザンチンクォーラムシステムが,既存のシステムに比べどの程度優れているのかを定量的に評価した.その結果,各サーバの信頼性に幅がある場合,提案手法と従来の構成法とでの得られる可用性の差が特に大きくなることが分かった.また,この評価結果に基づいて既存の構成法であるThresholdの改変案を提案し,同様な比較評価によって提案法で得られる最適値に極めて近い可用性が得られる場合があることを示した.
ニューログロビンを中心とした虚血応答システム活性化による脊髄保護に関する研究

胸腹部大動脈手術の重篤な合併症の一つである対麻痺は大動脈遮断中の脊髄虚血が主な原因と考えられている。多くの薬物による脊髄保護効果が動物実験で報告されているが、脊髄虚血から脊髄を保護する臨床応用可能な方法は未だに確立されていない。近年、内因性の保護機構活性化による中枢神経保護が注目されている。本研究では、内因性の保護機構活性化による脊髄保護の一つと考えられるニューログロビンの活性化による脊髄保護について検討した。臨床応用可能と考えられるバルプロ酸によるニューログロビンの活性化による脊髄保護を検討したが、脊髄保護効果はほとんど認められないと思われる。2013年度はNeuroglobinの脊髄保護における役割の基礎データとして、脊髄に対する様々なearly ischemic preconditioning(IPC)の方法の脊髄保護効果を比較した。すなわち、短時間の非侵襲的な脊髄虚血、腎臓または大腿の短時間虚血(remote IPC)の脊髄保護効果を家兎一過性脊髄虚血モデルを用いて比較した。【方法】家兎を4群(各n=6)に分けた。イソフルランとフェンタニルによる全身麻酔下に、左腎動脈直下の腹部大動脈をテーピングした。AO群は大動脈を、RA群は左腎動脈を5分間遮断-15分間再灌流-5分間遮断した。TH群は両大腿を10分間駆血-10分間再灌流-10分間駆血した。3群とも最終処置から30分後に大動脈を15分間遮断した。対照群は15分間の大動脈遮断のみ行った。閉創後、麻酔から覚醒させて7日間後肢運動機能を5段階で評価した。その後、HE染色により腰部脊髄(L5)腹側の正常神経細胞数を計測した。【結果】再灌流7日後の後肢運動機能は、AO群(4:5羽、3:1羽)が対照群(2:2羽、0:4羽)に比較し有意に良好であった。一方、RA群(4:1羽、0:5羽)とTH群(4:1羽、3:1羽、0:4羽)は対照群と比較し、有意差はなかった。正常神経細胞数(平均値±標準偏差)はAO群74±9、RA群10±13、TH群25±2、対照群8±7とAO群が他の全ての群に比較し有意に多かった。【まとめ】大動脈短時間遮断を1度だけ行うIPCの脊髄保護効果は弱いと報告されているが、2回繰り返すことで強い保護効果があることが判明した。一方、remote IPCの保護効果は認められなかった。家兎一過性脊髄虚血モデルを用いて脊髄において、ニューログロビンの誘導作用が報告されているバルプロ酸の神経保護効果を検討した。【方法】家兎を4群(各n=6 )に分けた。自発呼吸下にイソフルラン3 %を吸入させ、それぞれバルプロ酸(生理食塩水に溶解)30 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg、生理食塩水(対照群)を投与し、家兎を一旦覚醒させた。その12時間後、イソフルランとフェンタニルによる全身麻酔下に、左腎動脈直下の大動脈を15分間遮断した。再灌流直後、それぞれ12時間前と同様に薬剤を投与した。再灌流後7日間、後肢運動機能を5段階で評価した。その後、HE染色により腰部脊髄( L5 )腹側の正常神経細胞数を計測した。クルスカルワリス検定、マン・ホイットニーU検定を用い、P<0.05で有意とした。【結果】再灌流48時間では300mg/kg群で後肢運動機能が対照群と比較し、良好な傾向が見られたが有意差はなかった。再灌流7日後の後肢運動機能・正常神経細胞数(平均値±標準偏差)は、30 mg/kg群(2:1匹、0:5匹・18±11)、100 mg/kg群(1:3匹、0:3匹・13±9)、300 mg/kg群(4:1匹、1:4匹、0:1匹・22±24)となり、対照群は(1:1匹、0:5匹・22±20)であった。7日後の後肢運動機能と腰部脊髄腹側正常神経細胞数において対照群と他の3群で明らかな有意差を認めなかった。【結語】本モデルではバルプロ酸の脊髄保護効果は認められなかった。バルプロ酸の投与量は臨床使用量からみると30 mg/kgが最大量と考えられるが、300 mg/kgでも保護効果がみられなかったことより、この投与法による保護効果は期待できないと考えられる。麻酔科学ニューロ

グロビンを中心とした虚血応答システム活性化による脊髄保護の研究を行う予定であるが、今まで報告されている虚血耐性誘導の方法がどの程度の保護効果であるかを踏まえた上で、課題研究を行う必要があると考えた。そこで、今まで自ら行ったことがないearly ischemic preconditioningの脊髄保護効果について検討を行ったため、研究全体の進行が計画に比較するとやや遅れている。しかし、2013年度得られた結果は、予想外に興味深い結果であり、今後の研究遂行の上で大きな基礎データとなった。2013年度のearly ischemic preconditioningに関する研究結果で、短時間の大動脈遮断を2回繰り返すことで、強力な脊髄保護効果があることが判明した。
トヨタと日産の労働現場の比較研究-現場職制経験者に焦点をあてて-

トヨタは、生産現場を緊密かつ巧妙に統合していると言われてきた。そのトヨタは「日本的経営」の代表例として扱われることが多いが、他の日本企業との比較研究は存在せず、それがトヨタに限った話なのかどうかは定かではない。そこで本研究は現場の中核層に焦点をあてて、トヨタと日産の統合力の実態を比較した。確かにトヨタは、管理の貫徹度が高い。工場の隅々までそして現場の「末端」にまで管理の手と眼差しが入り込んでいる。しかし、それは、トヨタに特異な管理制度によるだけでなく、長年かけて築き上げてきた文化によるところが大きい。また、統合力が強いトヨタでも、反統合の現象が多く見受けられ、それが現在問題になっている「品質」に少なからず影響を及ぼしていると考えられる。トヨタと日産の現場の参与観察を踏まえて,本年度は,現場経験の長い労働者への聞き取り調査を始めた。前者では,一時点から職場構造を明らかにしたのに対して,後者では,いわば「定点観測」してきた労働者に話を伺うことにより,職場の通時的な把握・分析を行う。両社の長期勤務者に話を伺うと,参与観察同様,トヨタの労働者は職場に強く「統合」されていることが分かる。日産の労働者は,会社に対して一定の「距離」を置いている様子が見られた。もちろん,トヨタと日産の労働者と一口にいっても,様々な労働者がいるが,全社レベルで共通する特徴が浮かび上がった。トヨタの場合は,「学園卒」の役割が大きい。彼らが職場の中心となり,他の労働者を現場に統合する上で非常に大きな役割を果たしている。トヨタ学園卒の重要性に関しては,周知の事実であるが,時代により,職場で求められている役割に違いがあることも分かった。日産は,「組織統合」が現場の「統合」に少なからず影響を与えてきたと考えられる。日産とプリンスの合併と,ルノー傘下への組み入れである。それぞれ1966年と1999年に行われた「統合」が'現場レベル'に重要な影響を及ぼしてきたことが,労働者の話から想像される。具体的に言えば,資本の論理による統合は,現場の「融合」を意味するわけではなく,むしろ看過ぞきない「軋礫」や「歪み」を引き起こしてきた。組織合併が,日産の現場の「力学」や文化に強い影響を与えてきたのではないかという仮説の導出が,本年度の研究成果である。トヨタと日産でそれぞれ長期間働いてきた現場職制(経験者)に聞き取り調査を行った。長い間職場生活を送る中で経験し、身に付け、構築してきた、管理側と労働者側との関係、労働者同士の関係をうかがい、職場における統合と反統合の実態を明らかにした。本年度は、主に日産の従業員から話を聞いた。日産は、1966年に旧プリンスと合併した。両社の組合の母体が異なったために、組合間で熾烈な対立が生じたが、その後、日産労組が旧全金プリンスの労働者を飲み込む形で現在に至る。合併当時の「第一組合」の動向については、これまで2, 3の研究者が検証してきたが、労働者の視点からみた、合併による現場への影響は全く明らかにされていない。そこで筆者は、その点に焦点を絞り、労働者から聞き取りを行った。本年度は、彼(女)らが合併以後、どのような会社人生を送ってきたのかを克明に追い、とりわけ現場にていかなる「扱い」を受けてきたのかを語っていただいた。1993年に経営側と旧全金プリンスとが'「和解」をするまでは、旧全金プリンスに所属し続けた労働者の多くは、仕事は制限され、教育機会は奪われ、職場の飲み会には参加させてもらえず、他の労働者から隔離された生活を強いられた。露骨に差別的な扱いを受けてきたのである。「和解」の後は、形式的には「平等」になったものの、わだかまりが完全になくなったわけではない。合併から40年以上が経ち、いまや旧全金プリンス所属の日産労働者は、ほとんど残っていない。日産全体において、彼らの直接的な影響力は限られたものである。だが、資本の論理による合併、日産労組、そして労労対立の「傷跡」は文化として生き続けている。本年度の研究成果は、トヨタと日産の現場の「求心力」を養成工とキャリア形成の観点から比較検証した点にある。トヨタの現場を強く統合してきた要因として、「トヨタ学園」卒は有名である。戦後直後の大争議に際して、養成工が中心となって労使協調路線へと転換する役割を果たし、今現在も、中卒から「トヨタマン」に育て上げられる学園卒が現場のリーダーとして活躍している。

ところが、このような養成学校は日産にも存在する。トヨタだけに限った話ではないのだ。日産も、設立直後に養成学校を建て、長らく中卒の生徒を育成してきた。しかし、80年代後半から、高卒入社を社内選抜し、学校へ送り込む方式へ変えた。中学卒業直後と高卒数年後とでは、主体形成の時期だけに、とりわけ企業イデオロギーの精神的な影響に大きな違いが現れる。もちろん、トヨタでも、数からみれば、製造現場を支えているのは高卒技能員である。高卒進学率の上昇に伴い、60年代後半から、多くの高卒技能員を採用するようになった。トヨタは、「モノづくりは人づくり」と標榜するように、高卒を中心とした長期雇用者に対する教育制度を充実させてきた。それは、先行研究が強調してきたOJTだけでなく、むしろOFF-J-Tの豊富さが目をひく。日産にも同じような教育制度が存在し、現場労働者のランクを上げながら技能・知識を高める制度が確かめられた。しかし、日産の現場から昇進できるポストは、例外を除いて係長(トヨタの工長)までであり、トヨタは課長、次長、部長まで到達することができる。また、日産の末端職制は55歳には役職を解かれ、人によっては外に出される。このようなシステムは、現場労働者の「やる気」を大いに減退させる。
慢性肺組織傷害の発生とその進展機構ー培養肺細胞の力学的特性からのアプロ-チー

本年度は先ずフィブロネクチンでcoatingした厚さ20μmのシリコンゴム上に人胎児肺線維芽細胞(HELF)をconfluentに生着させることを第一の目標とした。100μg牛フィブロネクチン/ml phosphateーbuffered saline(pH7.4)で4°Covernight incubateされた培養dishを用いる事でこの目標は達成された。次に最終目標である細胞シ-トの応力ー歪曲線に及ぼすHELFの影響の測定を行った(Fibronectinーcoatedシリコン膜上にHELFが生着した系を細胞シ-トと呼ぶ)。細胞シ-トをド-ム状にinflateーdeflateして歪を与えド-ム内の圧(応力)とド-ムの容積変化(歪)を記録しXーY座標にプロットし圧ー量曲線とした。細胞シ-トの圧ー量曲線に及ぼすHELFの影響を測定する前に以下の実験を施行した。1.シリコン膜のみの圧ー量曲線の測定。2.シリコン膜上にフィブロネクチンがcoatingされた系(Fibronectinーcoatedシリコン膜)の圧ー量曲線の評価。3.Fibronectinーcoatedシリコン膜に及ぼすトリプシンの影響の観察。その結果、シリコン膜のみの圧量曲線はヒステレシスを呈せず本実験で与えられた歪の範囲内では歪の程度を種々に変えても同一の軌跡上を伸縮した。しかしfibronectinーcoatedシリコン膜のー圧量曲線はヒステレシスル-プを示した。このヒステレシスル-プは0.3%トリプシン+2.5mMEDTAによる処理によっても変化を受けなかった。細胞シ-トも又ヒステレシスを呈した。細胞シ-トのヒステレシスル-プはトリプシン・EDTA処理によって縮小する傾向が観察された。今後は品質の均一な培養dishを作成し検討を重ねる必要がある。以下の点に主眼を置いて実験を行った。1.20μ、50μのシリコン膜上でのラット線維芽細胞の生育の仕方の差についての検討。2.よりcofluentにシリコン膜上に線維芽細胞を生育させる方法の検討。3.超薄シリコン膜の力学的特性の検討、4.Latexゴム上に線維芽細胞の培養が可能か否かの検討。結果。1に付いて;理由は不明であるが20よりも50μの膜上に生育し易い傾向にあった。2に付いて;平坦な20μのシリコン膜上にRBMI-1640培養液を用いて培養した場合膜に付着せず浮遊する細胞が出現する。しかしこれらの浮遊細胞をシリコン膜無しの培養シャ-レに移して培養すると付着増殖した。即ち、浮遊細胞も十分なviabilityを有していた。シリコン膜への付着を増加させるため牛胎児血清(FCS)で一昼夜incubationした培養系を使用した。FCS無処理の時よりも細胞は密に付着増殖した。しかし、よりconfluentな生育が必要であった。200μg/mlの牛(fibronect溶液で一昼夜処理を行った膜上で培養した。FCS-coatingの時よりも満足すべき結果であった。現在線維芽細胞と同種のラットfibronectionで検討を重ねている。3について;20μのシリコン膜は実験装置内では極めてcompliantでほぼ完全な弾性体として動作した。即ち、直径6センチの膜を10mlの温水でド-ム状に変形させた時の内圧は僅かに1.6cmH_20であり、ド-ムの体積-内圧曲線はヒステレシスを示さなかった。この装置で得たい情報は細胞がシリコン膜上で接線方向に歪を与えられたときの応力である。

この応力を正確に知るためにシリコン膜に1mm間隔に突起を有するもの、膜の表面が波型にうねっているものを作成しその特性を検討している。4について;ゴムは可能な限り薄い方が望ましいためシリコンに代わるものとして20ミクロンのlatexゴムを使用してみたがlatexゴム上では細胞は生育しなかった。本年度は1.フィブロネクチンでcoatingした20μのシリコンゴムに成熟ラット肺の線維芽細胞をconfluentに生育させる方法の確立、2.線維芽細胞がシリコンゴムの表面に生育していることにより発生する張力の測定を計画した。しかし、成熟ラット肺から取り出した線維芽細胞はフィブロネクチンによるcoatingの仕方を種々に変えてもシリコンゴム上にconfluentに生育させる事ができなかった。線維芽細胞をラットから取り出してからの培養継代数、線維芽細胞を取り出す際のトリプシンを使用の有無、シリコンゴムを固定した実験シャ-レに細胞を移してからのパッサ-ジ間隔なども種々に変えて検討したが結果は不満足であった。シリコンゴムの表面を波型にしたり、表面に突起をつけたシリコンゴムも作成し検討を加えたが結果は同様に不満足であった。そこで、人の死胎児肺より分離した線維芽細胞で同様の検討を行った。100μg/mlの牛フィブロネクチン溶液で実験シャ-レを一晩coatingし線維芽細胞を牛胎児血清10%添加RBMIー1640培養液に10^6/mlの濃度で播種したところ成熟ラット肺線維芽細胞よりははるかに満足できるconfluentな生育状態がえられた。生育とた細胞のviabilityも充分であり、シリコンゴムの変形によっても細胞は脱落しなかった。この状態で培養液のパッサ-ジを繰り返した場合、シリコン膜上に生育した線維芽細胞を増殖させ更にconfluentな状態を作成しようと試みているが現在までのところ成功していない。この問題と同時に今後はラット胎児肺線維芽細胞帯で検討を続ける。