hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先細ノズル流れのチョークに関する研究と微小流量用臨界流量計への応用

チョーク現象を利用して質量流量を測定する装置に臨界流量計がある.臨界流量計は2003年に国際規格や国内規格が制定され,最近では半導体産業などの分野において臨界流量計を用いた微小流量の測定が検討されている。しかるに,ノズル直径を極めて小さくすると境界層の影響が無視できなくなるが,これに関してはこれまでほとんど研究されていない.ゆえに,本研究はチョーク現象に及ぼす境界層の影響を解明することを目的とし,圧縮性や粘性及び希薄気体効果を考慮に入れた解析的研究を行う.本研究では大気吸込み式風胴を用いて測定を行った.測定にはノズル幅36mm,長さ100mm,高さ5mmの直管を取り付けた矩形先細ノズルを用いた.ノズル上流には熱式質量流量計を設置して質量流量の測定を行った。また,圧力・流量測定と同時にシュリーレン法を用いて流れ場の可視化を行った.流れがチョークした後のシュリーレン可視化結果から,ノズル出口近傍でマッハ波が確認でき流れが超音速であることが分った.マッハ波より算出したマッハ数と壁面静圧測定より求めたマッハ数の比較検討した結果,ノズル出口より4mm上流の位置において約5%の誤差があった.この誤差は,壁面静圧は断面にわたって一定であると仮定して解析していることが原因であると考えられる.次に,管内の境界層排除厚さの分布を求めた.その結果,境界層排除厚さはノズル出口よりも上流で最も厚く,その後ノズル出口に向かって減少している.ゆえに,境界層排除厚さが最大となる位置で流れは音速となり,その後は流路が増加することで流れが超音速となることが分った.これらの研究成果を基に国内外のシンポジウムや学会等で口頭発表を行った.また,研究全体をとりまとめ学位論文を完成させ,臨界流量計に関する現在の国際規格及び国内規格を微小流量に適用できるよう成果をまとめ基礎資料の作成を行った.チョーク現象を利用して質量流量を測定する装置に臨界流量計がある.臨界流量計は高精度であるが,微小流量測定のため直径を極めて小さくすると境界層の影響が無視できなくなる.しかし,これに関してはこれまでほとんど研究されておらず,全く分かっていない.ゆえに,流れのチョークに及ぼす粘性の影響を解明し,微小流量測定を可能にすることを目的とする.今年度は,圧力・流量測定と同時にシュリーレン法を用いて管内の流れを可視化し,数値データと併せて考察を行う.本研究では,大気吸込み式風胴を用いて測定を行った.測定には,ノズル幅36mm,長さ100mm,高さ5mmの直管を取り付けた矩形先細ノズルを用いた.ノズル上流には熱式質量流量計を設置して質量流量の測定を行った.また,圧力・流量測定と同時にシュリーレン法を用いて流れ場の可視化を行った.測定より理論質量流量と実際の質量流量の比である流出係数は0.945であり,境界層により流量が約6%減少していることが分った.また,圧力測定より得られたマッハ数は,ノズル出口よりも上流で1となる事が分った.これは,シュリーレン可視化結果においても,ノズル出口より上流で垂直衝撃波の発生を確認した事からも説明できる.他にも,流れがチョークした後に発生したマッハ波より,ノズル出口に向かって流れは加速し、ノズル出口では超音速となる事が分った.この結果から,ノズル出口より上流で流れの有効断面積が最小となっている事が考えられる.以上より,圧力・流量測定と流れの可視化によってノズル出口近傍におけるチョークのメカニズムを明らかにした.チョーク現象を利用して質量流量を測定する装置に臨界流量計がある.臨界流量計は2003年に国際規格や国内規格が制定され,最近では半導体産業などの分野において臨界流量計を用いた微小流量の測定が検討されている。また,圧力・流量測定と同時にシュリーレン法を用いて流れ場の可視化を行った.流れがチョークした後のシュリーレン可視化結果から,ノズル出口近傍でマッハ波が確認でき流れが超音速であることが分った.マッハ波より算出したマッハ数と壁面静圧測定より求めたマッハ数の比較検討した結果,ノズル出口より4mm上流の位置において約5%の誤差があった.この誤差は,壁面静圧は断面にわたって一定であると仮定して解析していることが原因であると考えられる.次に,管内の境界層排除厚さの分布を求めた.その結果,境界層排除厚さはノズル出口よりも上流で最も厚く,その後ノズル出口に向かって減少している.ゆえに,境界層排除厚さが最大となる位置で流れは音速となり,その後は流路が増加することで流れが超音速となることが分った.これらの研究成果を基に国内外のシンポジウムや学会等で口頭発表を行った.また,研究全体をとりまとめ学位論文を完成させ,臨界流量計に関する現在の国際規格及び国内規格を微小流量に適用できるよう成果をまとめ基礎資料の作成を行った.
転倒リスク評価のためのヒト立位安定性と歩行安定性の定量評価

本研究ではヒトの転倒に対して,生体力学的側面に焦点をあて,転倒に至るメカニズムの解明とヒト歩行安定性および立位安定性との関連を明らかにする.これにより安全な力学的歩行アシスト装置等の福祉機器の設計に寄与するとともに,高齢者で問題となっている転倒事故の対応策に関する学術的貢献を目指す.このため,特にヒトが本来有する立位安定性と歩行安定性を定量的に評価し,これに関与する要因を力学モデル構築により明らかにすることを目的とする.本研究ではヒトの転倒に対して,生体力学的側面に焦点をあて,転倒に至るメカニズムの解明とヒト歩行安定性および立位安定性との関連を明らかにする.これにより安全な力学的歩行アシスト装置等の福祉機器の設計に寄与するとともに,高齢者で問題となっている転倒事故の対応策に関する学術的貢献を目指す.このため,特にヒトが本来有する立位安定性と歩行安定性を定量的に評価し,これに関与する要因を力学モデル構築により明らかにすることを目的とする.
白色腐朽菌およびその酵素による医薬品・身体ケア製品起源物質の分解と無毒化

白色腐朽菌および白色腐朽菌の産生するリグニン分解酵素は、ブチルパラベン類(防腐剤)、ジクロフェナク(抗炎症剤)、メフェナム酸(抗炎症剤)およびトリクロサン(抗菌剤)の分解と毒性除去に有効であることを明らかにした。さらに、リグニン分解酵素は、現行の下水処理における除去効率が10%以下である難分解性のカルバマゼピン(抗てんかん剤)をも分解しうることを見いだした。1.白色腐朽菌によるパラベン類の分解とエストロゲン様活性除去iso-ブチルパラベン(iso-BP)はビスフェノールA(BPA)よりも約10倍高いエストロゲン様活性を有しており、n-ブチルパラベン(n-BP)はiso-BPと比べるとエストロゲン様活性は若干低いものの、ノニルフェノールとBPAの中間的な活性を有していることを確認した。次いで、カワラタケ(Trametes versicolor)を用いて低窒素-高炭素濃度(LN-HC)条件下でiso-BPおよびn-BPを処理した結果、両化合物とも2日間の処理で約99%の減少が認められ、エストロゲン様活性も処理2日でほぼ完全に除去された。2.白色腐朽菌によるメフェナム酸およびジクロフェナックの分解と毒性除去メフェナム酸(Mef)およびジクロフェナック(Dic)は、水圏生態系において藻類よりも甲殻類に対して影響を及ぼしやすいことを明らかとした。Phanerocaete sordida YK-624株を用い、DicおよびMefをLN-HC条件下で処理した結果、Dicについては処理3日目で約90%減少し、処理6日目には完全な消失が認められた。一方、Mefは処理日数の経過に応じて徐々に減少し、処理6日目には約90%の減少が確認された。また、DicとMefの減少に伴い甲殻類に対する毒性も除去された。1.白色腐朽菌によるメフェナム酸およびジクロフェナクの分解と毒性除去昨年度、白色腐朽菌Phanerochaetesordida YK-624株を用いて、抗炎症剤であるジクロフェナク(DCF)およびメフェナム酸(MFA)を処理した結果、効率的なDCFとMFAの減少が認められ、甲殻類に対する毒性も除去されることを確認した。そこで本年度は、代謝物の構造決定を試み、DCFの代謝物は4'-hydroxydiclofenac、5-hydroxydiclofenacおよび4',5-dihydroxydiclofenacであることを明らかにした。さらに、MFAは3'-hydroxymethylmefenamic acid、3'-hydroxymethyl-5-hydroxymefenamic acid、3'-hydroxymethyl-6'-hydroxylmefenamic acidおよび3'-carboxymefenamic acidに変換されることも見出した。以上の結果から、DCFおよびMFAは水酸化によって代謝されていることが判明し、リグニン分解酵素の産生も全処理期間を通してごく僅かであったことと合わせて考えると、両物質の代謝には菌体内酵素であるシトクロムP450(CYP)の関与が推察された。そこで、CYP阻害剤を添加したところ、DCFおよびMFA減少の抑制が認められ、この結果はCYPの関与をさらに強く示唆した。2.リグニン分解酵素によるカルバマゼピンの分解抗てんかん剤のカルバマゼピン(CBZP)については、リグニン分解酵素処理による分解は認められないと報告されてきたが、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HBT)を共存させるラッカーゼ処理(48時間反応)においては約60%のCBZP除去が認められた。1.リグニン分解酵素によるカルバマゼピンの分解とその分解産物カルバマゼピン(CBZP)は抗てんかん薬として使用されているが、現行の下水処理による除去率は10%以下であり、極めて生分解を受けにくいとされている。CBZPをリグニン分解酵素で処理した結果、ラッカーゼ(Lac)単独処理での分解は認められなかったが、Lac-HBT処理においては24時間後に約22%の減少が確認され、MnP処理においても約14%の減少が認められた。なお、Lac-HBT処理時におけるLac活性の減少挙動を追跡したところ、処理8時間後に残存するLac活性は10%以下であり、Lacの失活が認められた。そこで、処理8時間毎にLacおよびHBTを新たに添加する繰り返し処理を試みた結果、処理48時間で約60%のCBZP除去率が得られた。また、Lac-HBT処理において分解産物の蓄積が認められ、それらは9(10H)-acridoneと10,11-dihydro-10,11-epoxycarbamazepineであった。2.リグニン分解酵素によるトリクロサンの分解と無毒化ラッカーゼ(Lac)およびマンガンペルオキシダーゼ(MnP)を用いて、抗菌剤であるトリクロサン(TCS)を処理した結果、MnP処理がTCS分解に最も優れており、1時間のMnP処理でほぼ完全な分解が認められた。
聾学校における体験的活動を取り入れたインターネット活用による数学共同学習

【研究目的】進学率の向上,理工系企業への就職者の増加など,社会や生徒・保護者のニーズの変化により,聴覚障害生徒が将来,社会参加し自立して生活し自己実現を果たしていくためには,数学に関する知識・技能だけではなく,数学的な見方・考え方を身に付けることが必要であり重要である.しかし,聴覚障害生徒は,数的経験不足や日本語習得や抽象的・論理的思考力の発達などに課題があり,数学指導においては様々な工夫や配慮が必要である.また,聾学校の在籍生徒数が減少傾向にあり,学習集団の固定化や少人数化により生徒の役割や考え方が固定化して学習活動に深まりが出ない.そこで,本研究では,(1)聴覚障害生徒の不足しがちな数的経験を促すような体験的活動を取り入れたインターネット活用による数学共同学習を提案し実践すること,(2)聴覚障害生徒の数的経験を促進し多様な考え方を引き出し,数学的な見方・考え方を育成すること,(3)本実践の有効性を明らかにし成果を全国の聾学校に普及することの3点を目的とした.【研究方法】筆者が所属する宮城県立ろう学校と東京都,大阪府,新潟県,北海道の公立聾学校などに協力を依頼し,聴覚障害生徒の数的経験を促すような体験的活動(実験・観察・製作・操作等)を取り入れたインターネット(テレビ会議,メール,チャットなど)活用による数学共同学習を実施し,共同学習の内容や生徒の学習活動の様子,アンケート調査により,教材と実践を評価した.【研究成果】(1)体験的教材は,次の観点から開発を行った.(1)直接体験的教材(生徒が実験や観察を行うもの,実験や観察など),(2)操作的教材(生徒が実際に操作するもの,パズルやゲーム,製作など),(3)視覚的教材(生徒に視覚的に理解を促すもの,アニメーションやビデオクリップなど).(2)実践を評価した結果,次の成果を得た.(1)適切な学習集団の確保,(2)生徒の多様な見方・考え方の促進,(3)不足しがちな数的な経験を質的・量的に促進,(4)生徒の興味・関心・意欲の向上,(5)聴覚障害生徒の数学的な見方・考え方の育成.【研究目的】進学率の向上,理工系企業への就職者の増加など,社会や生徒・保護者のニーズの変化により,聴覚障害生徒が将来,社会参加し自立して生活し自己実現を果たしていくためには,数学に関する知識・技能だけではなく,数学的な見方・考え方を身に付けることが必要であり重要である.しかし,聴覚障害生徒は,数的経験不足や日本語習得や抽象的・論理的思考力の発達などに課題があり,数学指導においては様々な工夫や配慮が必要である.また,聾学校の在籍生徒数が減少傾向にあり,学習集団の固定化や少人数化により生徒の役割や考え方が固定化して学習活動に深まりが出ない.そこで,本研究では,(1)聴覚障害生徒の不足しがちな数的経験を促すような体験的活動を取り入れたインターネット活用による数学共同学習を提案し実践すること,(2)聴覚障害生徒の数的経験を促進し多様な考え方を引き出し,数学的な見方・考え方を育成すること,(3)本実践の有効性を明らかにし成果を全国の聾学校に普及することの3点を目的とした.【研究方法】筆者が所属する宮城県立ろう学校と東京都,大阪府,新潟県,北海道の公立聾学校などに協力を依頼し,聴覚障害生徒の数的経験を促すような体験的活動(実験・観察・製作・操作等)を取り入れたインターネット(テレビ会議,メール,チャットなど)活用による数学共同学習を実施し,共同学習の内容や生徒の学習活動の様子,アンケート調査により,教材と実践を評価した.【研究成果】(1)体験的教材は,次の観点から開発を行った.(1)直接体験的教材(生徒が実験や観察を行うもの,実験や観察など),(2)操作的教材(生徒が実際に操作するもの,パズルやゲーム,製作など),(3)視覚的教材(生徒に視覚的に理解を促すもの,アニメーションやビデオクリップなど).(2)実践を評価した結果,次の成果を得た.(1)適切な学習集団の確保,(2)生徒の多様な見方・考え方の促進,(3)不足しがちな数的な経験を質的・量的に促進,(4)生徒の興味・関心・意欲の向上,(5)聴覚障害生徒の数学的な見方・考え方の育成.
穀類乾燥機最適設計のための穀粒ダイナミックスの研究

穀類乾燥機をコンピュータ・シミュレーションによって最適設計をするための穀粒ダイナミックス、すなわち、穀粒および乾燥空気の流動の研究であり、新しい学問分野の構築である。本研究は2次元空間における穀粒ダイナミックスの理論およびシミュレーションの確立である。本年度は並流型循環式乾燥機のモデルを作製し、空気流動特性を実験的に明らかにして、さらに有限要素法(ガレァーキン法)によるシミュレーションを行い、実験結果とよい一致を見た。実験装置は、容量45cm×45cm×高さ100cmで、風は上部吐出ダクトから下部排出ダクトに、圧送ブロアおよび吸引ブロアによって流れる。正面のアクリル板に175個の細孔をあけて、デジタルマノメータで静圧を測定し、この測定結果から2次元の等圧曲線を求めた。流線の方向は、等圧曲線に直交するものとし、速度の大きさは圧力損失から逆算した。また、流線をコンゴレッド・アンモニア法で可視化計測した。これは、上記等圧線から求めた流線ベクトルと一致していた。さらに、実験と同じ境界条件を与え、有限要素法を使ったコンピュータ・シミュレーションで、等圧線及び流線ベクトルをて計算し、実験結果から求めた等圧線および流線ベクトルともコンゴレッド・アンモニア法で計測した流線とも一致していることが確認された。本研究ではこの他に、穀粒ダイナミックスの一分野として、インペラ式籾すり機中の籾の流動を計算によって明らかにするための、籾粒の運動方程式が得られた。現在、この解を数値計算で求めることを試みている。通風乾燥機中の穀粒の流動及び空気流動を2次元的に解析し,そのモデルを作ることが本研究の目的である.先ず基礎実験として,推積穀粒の静力学特性,すなわち,せん断試験によって内部まさつ角と付着力を密度を変えて計測し,密度との関係で明きらかにできた.また,推積穀物中の通風抵抗(圧力損失)を計測し,各種モデルのパラメタと空隙率の関係で明きらかにした.更に,実際の乾燥機中での2次元的挙動を解析するために,並流型乾燥機を模した実験装置を作製し,籾を作って流動挙動と圧力損失を測定した.穀粒の流動挙動については,穀粒の流動中の姿勢は,穀粒同志のモーメントに規制されるという新しい知見を得た.更に一般化された流動モデルを現在考察中である.次に,同じ実験装置に穀粒(籾)を推積させ,ダクトからブロアで送風し,約300箇所の測定で静圧を測定した.この結果を東北大大計センターで等圧曲線を求め,流線を描出した.空気流線を求めるためのモデルの作製を行っている.一方,穀粒の乾燥特性については,球モデルがほヾ完成し,シミュレーションプログラムも出来上がっている.穀類乾燥機をコンピュータ・シミュレーションによって最適設計をするための穀粒ダイナミックス、すなわち、穀粒および乾燥空気の流動の研究であり、新しい学問分野の構築である。
理科授業支援システムの開発

本研究は、理科授業を行う際に教師が必要としている指導技術について、短く編集したビデオ映像とその授業の指導案を検索し視聴できるCD-ROMの開発を行い、教師の理科授業を支援していくことを目的とした。本年度は、研究の最終年度であり、次の点について行った。1.小学校理科授業ビデオの撮影これまでの授業に加え、本年度は追加補充のために新たに3つの小学校理科授業を撮影するとともに、その授業の単元計画、指導案を入手した。2.ビデオ内容の編集と整理、検索システム整備本年度撮影した授業とともに、平成14・15年度に撮影し編集およびカテゴリー化した授業場面について、ホームページ形式で検索できるように再カテゴリー化を行った。検索システムは、小学校の理科を中心にし、a.単元名で検索し、その授業を時間的順序で見ていくことができる、b.導入、予想、観察・実験といった問題解決の場面ごとにビデオの検索ができる、c.コミュニケーション、机間指導、観察・実験、表現活動、教育機器の活用、教師の説明、設備や施設の利用、評価といった教師が必要とする指導場面ごとにビデオを検索できるものである。ビデオは、視聴しやすいように、一つの場面を3分程度とした。また、子どものプライバシー保護の観点から、映像を処理し、個人が特定されないようにした。これまでに収録した授業及び場面を精選し、採用したのは、小学校においては、18の授業、中学校では、4つの授業と観察・実験場面5つである。CD-ROMの理科教育関係者への配布は、映像処理についての授業者への内容確認になお時間が必要であるため、平成17年5月頃になる予定である。3.報告書およびCD-ROMの利用マニュアルの作成平成14・15年度に行った、教師の理科授業において指導を難しく感じる場面のアンケート調査結果、および開発したCD-ROMの利用マニュアルを含めた報告書を冊子にした。本研究は、理科授業を行う際に教師が必要としている指導技術について、短く編集したビデオ映像とその授業の指導案を検索し視聴できるCD-ROMの開発を行い、教師の理科授業を支援していくことを目的としている。本年度は、教師が必要としている指導技術を明らかにするため、小学校教師および教員養成の学生を対象に、理科授業において指導を難しく感じる場面について、アンケート調査により明らかにした。その結果、教師、学生ともに、子どもに対応した指導の変更、考えを促す発問、発言や意見交換の活性化、実験方法の考案、結果が予想と違うときの理由の考案などについて、指導を難しいと感じていた。これらの場面に留意しながら、理科の学習場面におけるベテランの教師の指導技術について、VTRに収録し抽出を行った。本年度は、小学校理科の9つの授業を収録し、その授業についての指導案を入手した。また、授業によっては授業の整理会が行われ、そこで適切であると評価された教師の指導を、優れた指導技術を抽出する際の参考とした。さらに、過去2年において、指導案を入手している授業について、参考になる授業を7つあげることができた。これらの授業について、優れていると考えられる指導技術の場面を抽出し、コンピュータにより編集した。各場面については、テロップなどによる解説を付け加えた。また、子どもが特定できるような場面については画像処理を行い、プライバシーに配慮した。映像と指導案を学習場面や学年、学習内容の領域で検索しやすいように、ホームページ形式の枠組みを作成した。本年度は、次の3点について行った。(1)昨年度収録した小学校ビデオ内容のカテゴリー化と検索のための書式設定小学校の教師のアンケート結果を参考に、昨年度収録し編集したビデオについて、ホームページ形式で検索できるようにカテゴリー化した。一つは、抽出した授業場面をその単元の展開に合わせて検索できるもの。一つは、問題解決の場面ごとにいろいろな単元のビデオを検索できるもの。一つは、教師が指導を難しく思うことや、教師がうまく工夫している学習場面などをトピックスから検索できるものである。(2)中学校教師の指導場面の意識についての調査教師が必要としている指導場面を明らかにするため、理科授業において指導を難しく感じる場面について、昨年度小学校教師に実施した質問紙調査を、中学校理科教師を対象に実施した。その結果、実験方法の考案、発言や意見交換の活性化、考えの発表などについて、指導を難しいと感じていた。また、教師の指導についての意識を、生徒の活動に対する指導、教師の解説、生徒の思考や表現およびそれに対する対応といった大きく3つのカテゴリーに分類することができた。(3)理科授業の収録小学校の理科授業について、昨年度に引き続き、3つの授業について、追加収録を行った。また、中学校の理科の授業について、4つの授業を収録し、その授業についての指導案を入手した。これらの授業について、優れていると考えられる指導技術の場面を抽出し、コンピュータにより編集を行った。2.ビデオ内容の編集と整理、検索システム整備

本年度撮影した授業とともに、平成14・15年度に撮影し編集およびカテゴリー化した授業場面について、ホームページ形式で検索できるように再カテゴリー化を行った。検索システムは、小学校の理科を中心にし、a.単元名で検索し、その授業を時間的順序で見ていくことができる、b.導入、予想、観察・実験といった問題解決の場面ごとにビデオの検索ができる、c.コミュニケーション、机間指導、観察・実験、表現活動、教育機器の活用、教師の説明、設備や施設の利用、評価といった教師が必要とする指導場面ごとにビデオを検索できるものである。ビデオは、視聴しやすいように、一つの場面を3分程度とした。また、子どものプライバシー保護の観点から、映像を処理し、個人が特定されないようにした。これまでに収録した授業及び場面を精選し、採用したのは、小学校においては、18の授業、中学校では、4つの授業と観察・実験場面5つである。CD-ROMの理科教育関係者への配布は、映像処理についての授業者への内容確認になお時間が必要であるため、平成17年5月頃になる予定である。3.報告書およびCD-ROMの利用マニュアルの作成平成14・15年度に行った、教師の理科授業において指導を難しく感じる場面のアンケート調査結果、および開発したCD-ROMの利用マニュアルを含めた報告書を冊子にした。
大腸癌におけるPI3K経路の解析と新規分子標的治療薬の検討

これまでに我々は、Rapamycin誘導体が大腸癌細胞に対し増殖抑制作用を有することを報告していたが、今回Temsirolimusが大腸癌細胞の細胞周期をG1期で停止させること, G1期の進行に必要なcyclin D1蛋白の産生を抑制すること,また低酸素下で培養された大腸癌細胞において腫瘍血管新生に重要な働きを持つHypoxia-induciblefactor-alpha蛋白の産生を抑制することを明らかとした。Temsirolimusの大腸癌に対する具体的な作用機序は,他剤との併用療法で薬剤選択根拠となりうるため,本研究の意義は高いものと考えられる。8種の大腸癌細胞株(LoVo,CaRI,SW480,DLD-1,HT-29,CaCo-2,colo205,WiDr)を用いて、PI3K-Akt経路の阻害剤LY 294002処理を種々の用量(最終濃度0-10μM)にて行い、細胞株の増殖への影響はMTSアッセイで解析した。LoVoとCaR1では低濃度のLY 294002でも増殖抑制が認められた。これは、過去に報告したmTOR阻害剤であるラパマイシンでの有意な増殖抑制がこの2種で認められた結果に一致する所見である。その他の細胞株では高濃度のLY-294002の投与でようやく増殖の抑制がみられるか、ほとんど抑制がかからなかった。同様にMAPキナーぜ阻害剤であるPD 98059を40μMまでの最終濃度で上記8種の大腸癌細胞株を処理して、増殖への影響をMTSアッセイで解析した。SW480,colo205,WiDR,HT-29においては低濃度のLY-294002で著明な増殖抑制が認められたが、他の細胞株ではほとんど増殖の抑制がかからなかった。LY-294002またはラパマイシンとPD 98059の2系統の阻害剤で、in vitroの増殖抑制がみられた大腸癌細胞株はなかった。Scartozziらの報告(Br J Cancer, 2007)では、大腸癌の臨床検体を免疫組織学的に検討し、MAPキナーゼ経路は活性化されていると思われる症例(リン酸化p44/p42染色陽性)、PI3K-Akt経路の活性化が見られる症例(リン酸化Akt染色陽性)はそれぞれ75%存在すると報告されている。両方の染色がともに陽性である比率については報告されていないが、少なくとも50%はともに陽性であったことを意味しており、大腸癌の発育進展に関して2つのシグナル伝達経路が相互排他的である可能性は低いと推定される。実際にラパマイシン,PD 98059処理をした大腸癌細胞が、互いの経路に活性化などの影響を及ぼすかを、ウエスタンブロッティング法で検証した。まず上記の8種の大腸癌細胞株について、100nMのラパマイシンで24時間処理を行い、回収した細胞より蛋白を抽出し、抗リン酸化p44/p42抗体を用いて発現を調べた。上記8種の大腸癌細胞株で発現量に違いはあるものの、LY-294002処理と0.1%エタノール処理(対照)の間でリン酸化p44/p42の量に差がみられた細胞株はなかった。同じく大腸癌細胞株について、20μMのPD-98059で24時間処理を行い、回収した細胞より蛋白を抽出し、抗リン酸化Akt抗体を用いて発現を調べたが、対照(0.1%DMSO)に比べてリン酸化Aktの発現量に変化が生じた細胞株は認められなかった。以上のin vitroの検討結果から、大腸癌の発育進展においては、MAPキナーゼ経路、PI3K-Akt経路の活性化は独立して生じる事象であることが推定される。進行大腸癌においては、手術に加えて化学療法を行うことが標準治療となっており、加えて最近では抗VEGF抗体bevacizumabや受容体型チロシンキナーゼ阻害剤cetuximabが本邦でも承認された。これらの治療によく反応する患者群が存在する一方で、依然として治療抵抗性を示す群が半数を占めているのが現状である。癌発育進展に関わるシグナル伝達経路が多岐にわたるためであり、従って各シグナル伝達経路の下流で働く分子を標的とした治療薬の開発、臨床応用が必要と考えられる。今回我々の着目するPI3K-Akt-mTORシグナル伝達経路は、ras-MAPキナーゼ経路と同様、チロシンキナーゼ型受容体の下流にある経路であり、蛋白の転写調節、細胞周期制御、血管新生、アポトーシス制御など多様な細胞機能を司る。大腸癌細胞株(CaRI, HT-29,など)において、比較的上流に存在するPI3Kの阻害剤LY-294002, wortmannin処理を行い、細胞株の増殖への影響を観察した。細胞増殖曲線、MTSアッセイ、細胞周期解析などで検討を行った。さらにAkt,リン酸化Akt,リン酸化mTOR, S6K、リン酸化S6Kのレベルをウエスタンブロッティング法で検討した。

mTOR阻害剤であるRapamycin誘導体は抗腫瘍効果として腫瘍増殖抑制作用や腫瘍血管新生抑制作用を有することが報告されており、現在すでに腎細胞癌で臨床応用されている。本研究ではRapamycin誘導体の一つであるTemsirolimusの大腸癌に対する効果を,単剤および他剤との併用療法の両面で評価することが目的である。これまでに我々はinvitroの実験系において、Rapamycin誘導体が大腸癌細胞に対し増殖抑制作用を有することを報告していたが、今回さらにinvitroの実験において、Temsirolimusが大腸癌細胞の細胞周期をG1期で停止させること,G1期の進行に必要なcyclin D1蛋白の産生を抑制すること,また低酸素下で培養された大腸癌細胞において腫瘍血管新生に重要な働きを持つHypoxia-induciblefactor-alpha蛋白の産生を抑制することを明らかとした。今回明らかとなったTemsirolimusの大腸癌に対する具体的な作用機序は,他剤との併用療法で他の薬剤を選択する根拠となりうるため,本研究の意義は高いものと考えられる。In vivoの実験においても,マウス皮下腫瘍モデルを用いてTemsirolimusが腫瘍の増殖を抑制すること,この効果の一部が腫瘍細胞の増殖を抑制すること,腫瘍切片を用いた免疫染色法にて腫瘍血管新生の抑制によることを明らかとした。Temsirolimusのもう一方の作用である免疫抑制作用に関しては,上記のIn vivoの実験においてTemsirolimus投与群と非投与群問で,末梢血中の白血球数など血液学的に差がないこと,脾臓中の白血球分画に変化がないことを確認した。以上よりIn vitro,In vivo両面の検討において,重大な有害事象が生じない投与量において,Temsirolimus単剤で大腸癌の抑制作用を有することを明らかとした。大腸癌に対するRapamycin誘導体の抗腫瘍効果に関する研究はまだ十分ではなく,本研究の結果が今後本薬剤を臨床応用する時に重要な根拠となりうると思われる。
破骨細胞の自己管理システムと新規化合物による分化制御の分子機構の解明

破骨細胞は骨吸収によりカルシウムなどのミネラル成分の動員を行い、合目的かつ系統的に骨合成とのバランスを厳密に調節することにより骨代謝の恒常性を維持している。研究代表者はこれまで骨吸収に必須の破骨細胞マーカーであるカテプシンK遺伝子の発現がp38MAPキナーゼによる転写因子NFATc1を介した多段階制御とその破骨細胞分化の特異性決定機構を明らかにした。本研究では新規薬剤5-S-GADが破骨細胞分化誘導因子RANKLを介したp38MAPキナーゼ上流の活性酸素を誘導するNADPHファミリー,Nox1を標的として破骨細胞の分化を阻害するのみならず、選択的にNoxファミリーを抑制し骨吸収を調節することを見出した。さらに代表者は転写因子Pax6の過剰発現によりTRAP遺伝子の発現ならびに破骨細胞分化が抑制されること、転写制御因子Stat3結合因子PIAS3発現トランスジェニックマウスが大理石骨病を発症する原因としてPIAS3が転写因子MITFと結合して転写活性能が阻害された結果c-fos,NFATc1の発現が抑制されることが明らかとなった。以上より、破骨細胞内転写制御因子であるPax6やPIAS3は過剰な骨破壊が起こらないよう自身の細胞を監視し破骨細胞の自己管理システムに寄与し正常な骨代謝の平衡状態を調節していることが強く示唆された。マクロファージから不可避的に産生される活性酸素は,貪食殺菌による生体防御システムに重要であるが,マクロファージ系を前駆細胞とする破骨細胞の分化との相関については不明な点が多い。そこで我々は昆虫Sarcophaga peregrinaから抽出された抗菌物質5-S-GADが破骨細胞への分化を強力に阻害することを見出した。さらに,破骨細胞分化に活性酸素の産生が必須であること,活性酸素の生成酵素NADPHオキシダーゼNox2が5-s-GADの標的である可能性を明らかにした。5-s-GADによる破骨細胞分化抑制の分子機構を解明するため,RANKL刺激により誘導される様々な破骨細胞マーカー遺伝子の発現を調べたところ、カテプシンK、TRAP、OSCARおよびマスター転写因子NFATc1遺伝子のmRNA発現が顕著に抑制された。この一連の遺伝子発現に必要なp38MAPキナーゼのリン酸化の低下を5-s-GAD処理により認め,MAPキナーゼ上流の分化初期段階において5-S-GADが作用していることが示唆された。重要なことは,5-s-GAD同様,破骨細胞分化が分化初期で活性酸素生成に関与するNADPHオキシダーゼ阻害剤DPIやカタラーゼによって強力に阻害され,この結果は破骨細胞分化に活性酸素の生成が必須であることを示した。実際,RANKL刺激がマクロファージ細胞内の活性酸素濃度を一過性に上昇させ,5-S-GAD添加による阻害が観察された。マクロファージに発現するNADPHオキシダーゼを調べたところ,Nox2の優位な発現を認め,破骨細胞の分化においてNox2依存性の活性酸素の発現が5-s-GADにより抑制されることを見出した。これらの結果より破骨細胞分化に関わる活性酸素生成酵素を標的とする新たな分子標的の調節による破骨細胞が原因となる骨代謝疾患の予防・治療法の可能性が期待される。破骨細胞は骨吸収によるカルシウムなどのミネラル成分の動員を行い、合目的かつ系統的に骨合成とのバランスを厳密に調整することにより骨代謝の恒常性を維持している。しかし、病的な骨破壊の亢進による骨代謝維持機構の破錠の結果、高齢化に伴う医療費の増大で深刻化している骨粗鬆症などの骨代謝疾患を引き起こす。従って、新規薬剤または細胞内因子を介した破骨細胞制御の分子機序解明は、過剰な骨破壊を阻止するために骨代謝に関わる分子標的の同定による新たな骨代謝疾患の治療戦略を考慮する上で重要な課題である。研究代表者はこれまで骨吸収に必須の破骨細胞マーカーであるカテプシンK遺伝子の発現がp38MAPキナーゼによるNFATc1を介した多段階制御とその破骨細胞分化の特異性決定機構を明らかにした。本研究では新規薬剤5-S-GADが活性酵素を誘導するNADPH

ファミリーであるNox1を標的として破骨細胞の分化を阻害するのみならず、選択的にNox1ファミリーを抑制し骨吸収を調節することを見出した。さらに代表者は転写因子Pax6の過剰発現によりTRAP遺伝子の発現ならびに破骨細胞分化が抑制されること、共同研究によりStat3結合因子PIAS3発現トランスジェニックマウスが大理石骨病を発症する原因としてPIAS3が転写因子MITFとして結合して転写活性能が阻害された結果c-fos、NFATc1の発現が抑制されることが明らかになった。以上の結果より、破骨細胞内因子であるPax6やPIAS3は過剰な骨破壊が起こらないよう自身の細胞を監視し破骨細胞の自己管理システムに寄与し正常な骨代謝の平衡状態を調節していることが強く示唆された。
薬剤耐性の克服を目指した新規抗HIV性ヌクレオシドの合成と核酸医薬への展開

はじめに、4'-置換4'-チオヌクレオシド合成について検討を行った。L-アラビノースを出発原料とし、5-チオピラノシド誘導体を合成し、3,4位をアセタールで保護した。得られたアセタール体の2位をメシル化後、ホルムアルデヒドと炭酸カリウムと処理することで縮環とアルドール反応を同時に行った。同反応終了後、さらに水素化ホウ素ナトリウムで処理し、目的とする4-ヒドロキシメチル-4-チオリボース誘導体を得た。縮環/アルドール反応の再現性が乏しかった点については、条件の最適化を行い、最終的に加える炭酸カリウムの量を3等量に増やし、反応時間を延長することによりアセタール体から75%の収率で目的物を得ることが出来た。生じたジオール部を保護し酸化によりスルホキシド体へ誘導した後、当研究室で開発したPummerer型チオグリコシル化反応に付したところ、目的とする4'-チオヌクレオシド誘導体を良好な収率で得ることができ、そのアノマー生成比はβ:α= 1.8:1であった。Pummerer型チオグリコシル化反応の立体選択性の改善を目指し、2,3位のアセタール保護をイソプロピリデンからペンチリデンに変更したスルホキシド誘導体を合成した。同誘導体のPummerer型チオグリコシル化反応により、目的とする4'-チオヌクレオシド誘導体が収率77%、β:α= 5:1で得られ、立体選択性の改善に成功した。第2のプロジェクトである、5'-チオピラノヌクレオシドの合成について、糖部となるジヒドロピラン誘導体の合成に着手した。チオ酢酸エチルとアセトキシブタジエンのヘテロDiels-Alder反応と引き続く還元反応とジオール部の保護を行い、目的とするジヒドロピラン誘導体を合成した。当初の計画通り、予定していた4'-置換4'-チオヌクレオシドの合成を達成することが出来た。また、5'-チオピラノヌクレオシドに関してもヘテロDiels-Alder反応による原料合成の目途を付けることが出来た。4'-置換4'-チオヌクレオシド合成の鍵段階のひとつであるPummerer型チオグリコシル化反応により得られる合成中間体から、糖部ヒドロキシ基の選択的保護、さらに4'位ヒドキシメチル基のトシル化と引き続く環化反応により、最終目的物の合成を目指す。一方、5'-チオピラノヌクレオシドについては、得られた中間体を次の反応の基質となるスルホキシド体へ変換し、Pummerer型チオグリコシル化反応の条件を検討する。当初予定していたエバポレーターの購入について、交換を予定していた機材が、まだ使用可能と判断されたため、交換時期を先送りしたため。
高齢者と子どもの世代間交流を用いたコミュニティ・ビルディング支援プログラムの開発

核家族化の進展と地域社会の希薄化より世代が孤立し、地域の世代間交流が推奨されているが、世代間交流による地域づくりの概念は不明である。本研究の目的は、世代間交流によるコミュニティ・ビルディングの概念を明らかにし、その評価法とコミュニティ・ビルディング支援プログラムを開発することである。ハイブリッドモデルを用いた概念分析の結果、【理解】【協働】【連帯感】【次世代育成】【持続可能な社会】の属性が明らかになった。これらを取り入れ、大学を拠点に育児中の母親と地域在住高齢者の多世代交流プログラムを立ち上げた。その過程には大学と高齢者と母子の支援機関との協働があった。世代間交流効果の検証が今後の課題である。本研究は、日本における世代間交流を用いたコミュニティ・ビルディングの概念を明らかにしその評価法の確立とモデルとなる支援プログラムの開発を目的とするものである。文献から概念に関する記述を抜粋し、内容分析した。その結果、概念に関する記述では「普段接触の少ない年齢や文化的なグループ間の新しいつながりや相互尊重と友情」「個別に対応していた公的・私的組織における大きな協働」「社会保障やヘルスケアの改正、環境保全」「年齢や文化を超えたつながりの機会をつくり地域意識を育てる」「社会全体で支える家庭と子育て」などがあった。これらから世代間交流における地域づくり概念には、多世代への偏見の打破と世代間の友情からなる【理解】、世代毎に対応していた公的・私的機関の【協働】、市民参加と地域意識を促進する【連帯感】、地域による【次世代育成】、全てのライフステージにある人が互いに学べる【持続可能な社会】の5つのカテゴリーが抽出された。さらに国際学会であるGenerations Unitedの学会に参加し意見交換したところ、認知症の人の居場所を多世代で創設することが地域づくりにつながるとの知見を得てすべての世代をケアできるシステム作りの属性があると考えられた。平成27年度計画にあった文献検討後のフィールドワークに関して、フィールドとの調整が困難であったため。本研究は、日本における世代間交流を用いたコミュニティ・ビルディングの概念を明らかにし、その評価法と確立とモデルとなる支援プログラムの開発を目的とするものである。平成28年度はコミュニティのニーズに見合う世代間交流プログラムの立ち上げを検討した。コミュニティのニーズとして見出されたものは、子育て世代、とくに未就学児の母親の孤立ならびに独居高齢者の孤立であり、地域住民が持つ大学への期待として学生との交流により、自分たちも学びたいという希望があることが分かった。そのため、大学を拠点として、地域で支えあう交流の居場所づくりとして、水引を用いた講座型多世代交流プログラムを立ち上げ、試験運用を行った。本プログラムの目的は子育て中の母親と高齢者、学生が一緒に水引を学ぶことによって、楽しみや生きがい、仲間作りにつなげ、地域での連帯感を育むことである。月1回の開催を行い、参加者は7名17名で述べ54名となった。年齢は0歳児3歳、看護学科の学生、子育て世代、中高年と多様であった。地域の高齢者からは、学生や若い人と交流してエネルギーをもらえる、子育て世代からは、子育てに追われていたが、子どもと一緒に参加でき、新しいことを学ぶのは久しぶりで嬉しかった、学生からは、地域住民が集える場作りの重要性を感じたなどの感想が得られ、自主的な参加の希望が出されるようになった。立ち上げのプロセスとして、水引講師やボランティアとのつながりをつくる、学生たちの結束を高める、近隣住民とのつながりをつくる、子育て世代へのアプローチとして保健センターの協力を得るなどがあった。次年度に向け、世代間交流プログラムにより地域づくりの波及効果があった先進事例の視察を計画し、世代間交流を用いたコミュニティビルディングの概念の洗練とその評価指標を検討し、地域に根ざした多世代交流型水引講座の効果評価を進めることが課題である。地域のニーズに見合う多世代交流型水引講座を立ち上げることができ、その試験運用も7か月間行ったため、平成29年度から本格的に始動できると考える。他の地域づくりを念頭に置いた世代間交流のフィールドの選定もできた。「世代間交流を用いたコミュニティビルディング」の概念分析で明らかになった5つの要素、すなわち「世代間の理解」「協働」「連帯感」「次世代育成」「持続可能な社会」を理念として、大学を拠点とした地域で支えあう交流の居場所づくりとして平成28年度に立ち上げた多世代交流型プログラムの効果評価を行った。対象者は、子育て中の母親3名、中高年6名の計9名であり、世代性関心、地域コミットメント、孤独感、健康保持・ストレス対処能力、抑うつについて、初回、プログラム開始後6か月後、12か月後の3時点で比較した。結果は、世代性関心の下位尺度である「創造性」が初回20.1点から12か月後に22.1点と有意に増加がみられた(t=-2.4、p=0.040)。それ以外の項目では変化がみられなかった。プログラムにより対象者が得られた質的な評価では、子どもを見てもらえる環境で新たなことに挑戦できる、多世代の声が聞こえて楽しい、普段とは異なる環境で教えてもらったりする中でリラックスできるなどがあった。さらに、「世代間交流を用いたコミュニティビルディング」の概念を洗練させるため、地域づくりを念頭においた世代間交流プログラムの視察を行ったところ、様々な世代へのケアを提供する施設や企業、住民を巻き込み、地域住民も支援者も自分の力を人のために発揮できる仕組みを作ること、それにより生きがいや世代を超えた連帯感が生まれ、互いに見守りあう地域になること、との見解を得ることが出来た。

核家族化の進展と地域社会の希薄化より世代が孤立し、地域の世代間交流が推奨されているが、世代間交流による地域づくりの概念は不明である。本研究の目的は、世代間交流によるコミュニティ・ビルディングの概念を明らかにし、その評価法とコミュニティ・ビルディング支援プログラムを開発することである。ハイブリッドモデルを用いた概念分析の結果、【理解】【協働】【連帯感】【次世代育成】【持続可能な社会】の属性が明らかになった。これらを取り入れ、大学を拠点に育児中の母親と地域在住高齢者の多世代交流プログラムを立ち上げた。その過程には大学と高齢者と母子の支援機関との協働があった。世代間交流効果の検証が今後の課題である。文献検討後のフィールドワークについて平成28年度前期に計画し概念の洗練化をする予定である。次年度は最終年度となるため、世代間交流により地域づくりの波及効果のあった先進事例の視察を進め、世代間交流を用いたコミュニティビルディングの概念の洗練とその評価指標を検討する。また地域に根ざした多世代交流型水引講座を本格的に始動し、介入研究としてその効果評価を実施する。さらにその結果を学会等で発表する。公衆衛生看護学予定していたフィールドワークが、フィールドとの日程調整が合わずに延期となったため。富山県の世代間交流プログラムの視察について、先方の予定がH28年度中は一杯で、実現できなかった。また地域との協働のプロセスを経て、世代間交流プログラムを立ち上げたが、試験運用に留まり、データ収集は次年度に行う計画としたため。平成28年度前期にフィールドと再調整を行い、フィールドワークを行う予定である。富山県の世代間交流プログラムほか、埼玉県、東京都の世代間交流による地域づくり先進例の視察を進める。次年度は最終年度のため、立ち上げた多世代交流型水引講座の参加者の心身の健康に関するデータ収集ならびに解析のため、PCの購入とアルバイト謝金などを支出する。また研究成果を日本公衆衛生学会にて発表する。
Dclk1を標的とした癌幹細胞に対する新しい核酸医薬の開発

癌幹細胞は、自己複製能・造腫瘍能・多分化能を有し、抗癌剤や放射線治療に抵抗性を示し再発・転移を繰り返す原因となる。CD44, CD133などの細胞表面マーカーが癌幹細胞の絞り込みに使われるが、この方法では相当数の非癌細胞も混じることが問題となっている。癌幹細胞の治療開発には、癌細胞集団の中で極めて少数である真の癌幹細胞を同定する必要があるが、少数の細胞しか得られないということが治療薬剤開発の障壁となっている。私達は癌幹細胞濃縮法を開発し、少数の癌幹細胞をstemnessを維持したまま段階的にスケールアップすることに成功した。これにより癌幹細胞を用いた各種のアッセイが可能となり、治療剤候補の選出、治療効果の評価などが容易となった。本研究では、正常幹細胞には発現せず癌幹細胞特異的に発現するDclk1を標的とするmicroRNA(miRNA)候補をin silicoでピックアップし、Dclk1を標的とした癌幹細胞に対する新しい核酸医薬の開発を目的とした。大腸癌の親株とODC degron systemを導入した癌幹細胞モデル細胞に32種類のmiRNAをふりかけ、親株のみならず癌幹細胞モデル細胞の増殖をよく抑制したmiRNAが4種類得られ、この中で大腸癌での報告のないmiR-1291に注目した。miR-1291をHCT116, HT29, DLD1大腸癌細胞に作用させると、いずれの細胞でも浸潤能、遊走能、コロニー形成能の低下を認めた。またmiR-1291をHCT116に作用させると、qRT-PCRおよびwestern blottingによってDclk1 mRNAとDclk1蛋白の低下を確認できた。正常幹細胞には発現せず癌幹細胞特異的に発現するDclk1を標的とするmicroRNA(miRNA)候補をin silicoで選択し、in vitroで32種類のmiRNAについて抗腫瘍効果を示すかどうかを検討した。大腸癌細胞株に対し、miR-1291は抗腫瘍効果を示した。miR-1291添加によりDclk1の蛋白、mRNA発現が低下したことからDclk1 mRNAの3'UTR領域との直接結合をルシフェレースレポーターアッセイで確認する。更に癌幹細胞濃縮法によって得られた癌幹細胞集団にこのmiR-1291を作用させ、細胞増殖、浸潤能、遊走能、コロニー形成能などの抗腫瘍効果とともに各種の癌幹細胞マーカー発現やROS産生、抗癌剤感抵抗性などの癌幹細胞性質への影響を調べて研究を完成させる予定である。
エンドサイトーシスレセプターの発現と機能を制御するアダプター分子の機能解析

腎臓におけるタンパク質の再吸収はエンドサイトーシス受容体であるメガリンを中心分子として、アダプター分子による制御を受けている。本研究では新規に2種類のアダプター分子を同定した。1つはメガリンの刷子縁膜から初期エンドソームへの輸送に関与してリガンド取込みの速度を調節し、もう一方はメガリンのリサイクリングエンドソームから刷子縁膜へのリサイクルを増加させ、リガンドの取込みを増幅させる可能性が見出された。本研究により、これまで細胞内局在や生理機能がほとんど解明されていなかった分子について、その詳細な局在情報および生理機能を明らかにすることができた。腎臓におけるタンパク質の再吸収は、エンドサイトーシス受容体であるメガリンを中心分子として制御されている。メガリンによるエンドサイトーシスには、メガリンの細胞質領域で相互作用するアダプター分子が必須である。本研究では、メガリンによるエンドサイトーシスの制御に必要な細胞質におけるタンパク質相互作用に着目し、新規に4種類のアダプター分子の候補(A, L, N, S)を同定した。前年度までに、ブタ近位尿細管上皮細胞LLC-PK1細胞を用いた強制発現系において、共免疫沈降法によりメガリンとアダプター分子候補LおよびSがメガリンと相互作用することを示し、密度勾配遠心分離によりLは初期エンドソーム、Sはリサイクリングエンドソームの含まれる画分に濃縮されることを示した。本年度は、メガリンとアダプター分子複合体の細胞内局在を検証するため、メガリンとアダプター分子の共発現細胞にて、分子間相互作用を可視化することができるin situ proximity ligation assayを行い、Lはアピカル膜と初期エンドソームにて、Sはアピカル膜とリサイクリングエンドソームにてメガリンと複合体を形成することを明らかにした。さらに、Lもしくは、Sを強制発現させたLLC-PK1細胞において、メガリンのリガンドであるレチノール結合タンパク質(RBP)の細胞内への取込みを調べた。その結果、Mockに比べ、Lでは約3倍、Sでは約5倍RBPの取込み量が増加することが明らかとなった。以上の結果から、Lはメガリンのアピカル膜から初期エンドソームへの輸送に関与してリガンド取込みの速度を調節し、Sはメガリンのリサイクリングエンドソームからアピカル膜へのリサイクルを増加させ、結果としてリガンドの取込みを増幅させる可能性が見出された。腎臓におけるタンパク質の再吸収は、エンドサイトーシス受容体メガリンを中心的機能分子として制御されている。しかし、メガリンの発現や機能制御には、メガリンの細胞質領域で相互作用するアダプター分子が必須である。このようなアダプター分子が欠けると、エンドサイトーシス不全に陥り、やがて慢性腎不全となり、透析を余儀なくされる。研究代表者は、メガリンの発現、機能制御に必要な細胞質領域におけるタンパク質相互作用に着目し、質量分析を用い、アダプター分子の候補を新たに4種類のタンパク質(A, L, N, S)を同定した。これらのうち、L, N, Sの3種類は、未だ明確な細胞内局在や生理機能が報告されていない分子である。はじめに、メガリンの細胞質領域とアダプター候補分子との相互作用を検証するため、ビオチン化メガリン細胞質領域およびアダプター候補分子(LまたはS)の3xFLAGタグ融合タンパク質をブタ近位尿細管細胞LLC-PK1細胞に共発現させ、ストレプトアビジンビーズによる共免疫沈降を行った。この際、C末端側に3xFLAGタグを含むアダプター候補分子よりもN末端側にタグを含む融合タンパク質として発現させた方が、L, Sいずれの場合も共沈する効率が高かった。このことから、いずれの相互作用分子も、よりC末端側に近い領域でメガリン細胞質領域と相互作用することが示唆された。また、正常マウス腎臓におけるL, Sの発現と細胞内局在を検証するため、マウス腎臓のホモジェネートについて密度勾配遠心分離を行った。Lは初期エンドソーム、Sはリサイクリングエンドソームの含まれるフラクションに、それぞれメガリンとともに濃縮されるという結果が得られた。このことから、Lはメガリンの初期エンドソームへの輸送に、Sはリサイクリングエンドソームから細胞膜へのリサイクリングに関与する可能性が見出された。本研究開始年度である平成24年度に代表者は、当初、研究に必要な設備の整った研究所から有機合成を主体とする研究室に研究の場を移した。そのため、本研究の実施に必要な生化学的な実験設備・器具、細胞培養設備などを整える必要があった。当初、細胞培養は、片道2時間要する前所属の研究所に出入りさせて頂き、実施してきたが、大学における講義などを担当しながら、代表者自身で研究を推進することにも限界があった。そのため、当初の予定よりも達成度はやや遅れてしまっている。細胞培養設備については、現所属研究室の主宰者の協力を得て、昨年度末に整えることができた。

一方、ライブセルイメージングに必要な共焦点顕微鏡を本学では所有しておらず、他の研究機関で使用させて頂く必要がある。そこで、前所属研究所よりも近傍の東大駒場キャンパス内の細胞生物学を基礎とする研究室にて、共焦点顕微鏡を使用させて頂く許可を得た。そのため、平成24年度よりも、円滑にイメージング技術を用いた研究が可能となると考えている。平成25年度には、siRNAを用いたノックダウン実験を予定しており、幾つかのデザインでノックダウンの効果を比較する必要がある。そのため、平成24年度の助成金を繰り越し、より効率の良いsiRNAを得ようと考えている。