hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞侵入性細菌毒素による歯周病態モデルの構築と歯周病予防法への応用

歯周疾患の特徴の1つとして、炎症が慢性化することが挙げられるが、報告者のグループは、歯周疾患の慢性化機序について歯周病原性細菌Actinobacillus actinomycetemcomitans菌(A.a菌)の産生する細胞膨化致死毒素(Cytolethal Distending Toxin;CDT)に注目し研究を行い、その成果を数編の国際誌に発表した。福岡県京築地区において80歳高齢者の口腔内状況と全身状態に関する追跡調査を実施したところ、80歳時の咀嚼可能食品数が少ないほど、4年後生存率が低いことが明らかとなった。また、死亡原因は心臓血管障害と有意に相関関係が認められた。咀嚼機能の喪失は歯周疾患が原因であるものが半数とされており、歯周疾患に伴う歯周組織の破壊に伴い、A.a菌などの歯周病原性細菌が血流を通じて心臓や血管の局所で感染・障害を起こすことが心臓血管障害の誘因であると示唆された。CDTは血管内皮細胞を障害することから、心臓や血管の歯原性病巣感染における発症機構に関わっていると考えられた。また、CDTが細胞にアポトーシスを誘導することを応用して、連続的に細胞に超音波を細胞に照射することで細胞膜の透過性を一時的に向上させることにより、細胞内へ薬物や遺伝子、アミノ酸などを取り込ませる技術であるSonoporationを用いてCDTをガン細胞に注入することで、ガン細胞にCDTの活性サブユニットCdtBを発現させ増殖抑制させる方法を試行した。ヒト歯肉扁平上皮ガン細胞株Ca9-22及び同細胞を移植したnude KSN/slcマウスを用いて実験したところin vitroおよびin vivoで顕著に増殖が抑制された。歯周疾患の特徴の1つとして、炎症が慢性化することが挙げられるが、報告者のグループは、歯周疾患の慢性化機序について歯周病原性細菌Actinobacillusactinomycetemcomitans菌の産生する細胞膨化致死毒素(Cytolethal Distending Toxin ; CDT)に注目し研究を行い、その成果を数編の国際誌に発表した。今回の研究で我々は、ヒト単球型細胞株U937細胞を用いて、同菌が産生するCDTによる細胞毒性の発現機序について解析を加えた。リコンンビナントCDT(rCDT)は、1μg/mlで18時間後にU937の細胞周期をG_2/M期で停止させ、24時間後にはアポトーシスを誘導した。rCDTが誘導するアポトーシスでは、カスペース-9が活性化し、その後カスペース-3とカスペース-6の活性化が観察された。また、18時間後にはカスペース-6の活性に依存して核タンパクであるラミンが分解された。また、カスペース-9の活性を阻害した細胞ではrCDTによるアポトーシスは顕著に減少したが、G_2/Mでの細胞周期停止に変化は認められなかった。また我々は、CDTが細胞にアポトーシスを誘導することに着目し、口腔ガンの治療法として、sonoporationによりガン細胞にCDTの活性サブユニットCdtBを発現させ増殖抑制させる方法を試行した。ヒト歯肉扁平上皮ガン細胞株Ca9-22及び同細胞を移植したnude KSN/slcマウスを用いて実験したところ、sonoporationによりCdtB発現ベクターを注入したCa9-22は、in vitroおよびin vivoで顕著に増殖が抑制されたとともに、アポトーシスによる細胞死が観察された。歯周疾患の特徴の1つとして、炎症が慢性化することが挙げられるが、報告者のグループは、歯周疾患の慢性化機序について歯周病原性細菌Actinobacillus actinomycetemcomitans

菌(A.a菌)の産生する細胞膨化致死毒素(Cytolethal Distending Toxin;CDT)に注目し研究を行い、その成果を数編の国際誌に発表した。福岡県京築地区において80歳高齢者の口腔内状況と全身状態に関すう追跡調査を実施したところ、80歳時の咀嚼可能食品数が少ないほど、4年後生存率が低いことが明らかとなった。また、死亡原因は心臓血管障害と有意に相関関係が認められた。咀嚼機能の喪失は歯周疾患が原因であるものが半数とされており、歯周疾患に伴う歯周組織の破壊に伴い、A.a菌などの歯周病原性細菌が血流を通じて心臓や血管の局所で感染・障害を起こすことが心臓血管障害の誘因であると示唆された。CDTは血管内皮細胞を障害することから、心臓や血管の歯原性病巣感染における発症機構に関わっていると考えられた。また、CDTが細胞にアポトーシスを誘導することを応用して、連続的に細胞に超音波を細胞に照射することで細胞膜の透過性を一時的に向上させることにより、細胞内へ薬物や遺伝子、アミノ酸などを取り込ませる技術であるSonoporationを用いてCDTをガン細胞に注入することで、ガン細胞にCDTの活性サブユニットCdtBを発現させ増殖抑制させる方法を試行した。ヒト歯肉扁平上皮ガン細胞株Ca9-22及び同細胞を移植したnude KSN/slcマウスを用いて実験したところin vitroおよびin vivoで顕著に増殖が抑制された。
水素分子の生体内生理活性機序の解明

目的:生体内水素分子(H2)の挙動に関する基礎的検討として腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出されること,生体内ROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与することを検証することを目的とした.成果:9週齢のSPF-SD雄ラットを麻酔・人工呼吸下にて血圧・動脈血ガスが安定した状態で呼気と動脈血を採取した後,ただちに開腹/開胸し,腸管・肝臓・肺・心の各臓器を摘出した.腸管は十二指腸上端と直腸下端を結サツ後,糞便が漏れないように一塊として摘出した.各臓器は生理食塩水で洗浄後,放出量はアルミバッグに摘出した臓器を封入し,一度バッグ内のガスを抜いた後に一定量の純空気を入れ保持後,ガス分析を行った.臓器内含有量の計測は肺,肝,上部小腸,下部・上部結腸をガスタイトチューブ内に迅速に封入,粉砕後,遠心分離を行い,ヘッドスペースのガス分析を行った.さらに血液中の低分子ガス濃度の勾配をみる目的で,大動脈,右心室腔,肝静脈,門脈の順に迅速に血液を採取し,密閉ガラス瓶内に封入,震盪後,ヘッドスペースのガス濃度から血液H2濃度を算出した.H2の各臓器での単位重量当りの含有量は,肺に比べ,肝臓,腸と上昇し,腸の中では,上部結腸が一番高く,バクテリアが多く存在しているためと考えた.さらに血液中のH2濃度を門脈血,肝静脈,右心室腔内,大動脈にわたるカスケードをみたところ,H2分子は血流の走行に沿って有意な低下を示し,特に呼気により腸内発酵水素の大部分は呼気に放出されていることが分かった.門脈と肝静脈血の前後におけるH2濃度の低下は門脈・肝静脈の血流比から推定される低下分よりはるかに大きく,肝臓内での水素分子が活性酸素により一部が消去されたことが推測された.当初予定は,腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出されること,生体内ROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与することを検証することを目的としたが,肝臓内での水素分子の一部消去の機序を明らかにする予定であったが,現象は確認できたが,その詳細な機序については解決できなかったため本研究は(1)生体内水素分子の挙動に関するin vitro,in vivo基礎的検討,(2)「ROSー抗酸化バランスにかかわる内因性H2の役割」を中心に酸化ストレスが関わる疾患モデルを用いた詳細な検証,(3)心不全病態モデルならびに(4)生活習慣におけるROS-抗酸化ストレスのバランス評価を検討することにあった.平成28年度は(1)生体内水素分子の挙動に関する基礎的検討として,「仮説1:腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出される」ならびに「仮説2:生体内のROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与する」を検証することを目的とした.初年度に達成できなかった項目をさらに推進させ,免疫組織化学的な検索と分子機序の解明を行う,in vivo動物実験中における臓器表面からの活性酸素種を計測するためのレーザー誘起蛍光法に必要な特殊チャンバーの制作費(オーダーメードの特注品と周辺消耗品費)の購入に充当させる.目的:生体内水素分子(H2)の挙動に関する基礎的検討として腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出されること,生体内ROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与することを検証することを目的とした.成果:9週齢のSPF-SD雄ラットを麻酔・人工呼吸下にて血圧・動脈血ガスが安定した状態で呼気と動脈血を採取した後,ただちに開腹/開胸し,腸管・肝臓・肺・心の各臓器を摘出した.腸管は十二指腸上端と直腸下端を結サツ後,糞便が漏れないように一塊として摘出した.各臓器は生理食塩水で洗浄後,放出量はアルミバッグに摘出した臓器を封入し,一度バッグ内のガスを抜いた後に一定量の純空気を入れ保持後,ガス分析を行った.臓器内含有量の計測は肺,肝,上部小腸,下部・上部結腸をガスタイトチューブ内に迅速に封入,粉砕後,遠心分離を行い,ヘッドスペースのガス分析を行った.さらに血液中の低分子ガス濃度の勾配をみる目的で,大動脈,右心室腔,肝静脈,門脈の順に迅速に血液を採取し,密閉ガラス瓶内に封入,震盪後,ヘッドスペースのガス濃度から血液H2濃度を算出した.H2の各臓器での単位重量当りの含有量は,肺に比べ,肝臓,腸と上昇し,腸の中では,上部結腸が一番高く,バクテリアが多く存在しているためと考えた.

さらに血液中のH2濃度を門脈血,肝静脈,右心室腔内,大動脈にわたるカスケードをみたところ,H2分子は血流の走行に沿って有意な低下を示し,特に呼気により腸内発酵水素の大部分は呼気に放出されていることが分かった.門脈と肝静脈血の前後におけるH2濃度の低下は門脈・肝静脈の血流比から推定される低下分よりはるかに大きく,肝臓内での水素分子が活性酸素により一部が消去されたことが推測された.当初予定は,腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出されること,生体内ROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与することを検証することを目的としたが,肝臓内での水素分子の一部消去の機序を明らかにする予定であったが,現象は確認できたが,その詳細な機序については解決できなかったため本研究は(1)生体内水素分子の挙動に関するin vitro,in vivo基礎的検討,(2)「ROSー抗酸化バランスにかかわる内因性H2の役割」を中心に酸化ストレスが関わる疾患モデルを用いた詳細な検証,(3)心不全病態モデルならびに(4)生活習慣におけるROS-抗酸化ストレスのバランス評価を検討することにあった.平成28年度は(1)生体内水素分子の挙動に関する基礎的検討として,「仮説1:腸内嫌気性発酵性の内因性H2には未知の運搬物質が存在し,一部は能動的に肝臓内で抱合貯蔵され必要に応じて放出される」ならびに「仮説2:生体内のROS-抗酸化バランスにおいて腸内嫌気性発酵性H2は内因性抗酸化物質として抗酸化機序に関与する」を検証することを目的とした.初年度に達成できなかった項目をさらに推進させ,免疫組織化学的な検索と分子機序の解明を行う,平成28年度は既存の実験設備消耗品を用いて研究計画を遂行したが,途中,実験システムを改良するための物品購入が必要になったものの年度内購入が難しく,次年度に購入予定となったためin vivo動物実験中における臓器表面からの活性酸素種を計測するためのレーザー誘起蛍光法に必要な特殊チャンバーの制作費(オーダーメードの特注品と周辺消耗品費)の購入に充当させる.
MicroRNAによる種々の細胞レベルでの関節リウマチの病態修飾の試み

関節リウマチ患者由来滑膜細胞(RA-FLS)はmiR-218の強制発現により骨芽細胞へ分化を認めた。また、この骨芽細胞への分化はmiR-218のRA-FLSにおける標的遺伝子であるROBO1の発現抑制および、Wnt-β/カテニン経路の抑制因子であるDKK1の分泌を抑制することによりもたらされていることが示唆された。MTXはRA-FLSにおいて、miR-887の発現を増強しており、microRNAを介した作用機序が示唆された。さらに、このmiR-887をRAーFLSに強制発現したところGM-CSF、MIP-1αの分泌抑制および浸潤能の減弱を認め、miR-887による新規治療の可能性が示唆された。我々が以前の研究により同定したmicroRNA-218(miR-218)による関節リウマチ患者由来滑膜線維芽細胞(RASF)の骨芽細胞分化誘導に関して引き続き研究を行った。miR-218は単独でRASFを骨芽細胞へ分化誘導可能であり、骨芽細胞分化の過程においては短時間での発現上昇後に引き続き発現低下を認めることが明らかとなった。miR-218の機能解析ではそのRASFにおける標的遺伝子としてROBO1が抽出された。このROBO1をsiRNAを用いノックダウンしたところ、RASFからのDKK-1の分泌低下を認め、miR-218はROBO1/DKK1を介してRASFに骨芽細胞分化誘導をもたらしていると思われた。次に、RA治療における代表的薬剤であるMTX、トファシチニブのRASFに対するmicroRNAを介した作用についての検討を行った。miRNAアレイを用いたMTX刺激後の変動miRNAプロファイリングによりRASFではMTX投与によりmiR-887の発現が上昇することが明らかとなった。次にこのmiR-887のRASFでの機能解析を行った。マルチプレックスアッセイによりmiR-887の強制発現により抑制される炎症性サイトカイン、ケモカインの解析では、miR-887によるRASFからのTNF-α、GM-CSF、CCL4の分泌低下が明らかとなり、なかでもGM-CSF分泌の強力な抑制が明らかとなった。さらに浸潤能についてスクラッチアッセイにより解析を行ったところ、miR-887により浸潤能の抑制を認め、miR-887はRASFの機能制御を介したRAの新たな治療法となる可能性が示唆された。トファシチニブ刺激においてもmiR-181bの発現上昇が明らかとなり、今後はmiR-181bについても同様に解析予定である。骨芽細胞誘導、MTX刺激、トファシチニブ刺激による変動microRNAの同定は終了し、その機能解析も順調に進行しているため。本研究にてこれまでに同定した関節リウマチ患者由来滑膜細胞(RASF)関連microRNA(miRNA)としては骨芽細胞分化誘導関連でのmiR-218、MTXの薬剤応答に関連するものとしてmiR-887、トファシチニブの薬剤応答に関連のmiR-181bがある。本年度もこれらmiRNAについて継続して研究を行った。RASFでの骨芽細胞分化誘導培地での培養ではmiR-218が12時間後より発現上昇を認め、1週間後より低下し、3週間後まで低下が持続していた。このmiR-218をRASFに強制発現したところ通常培地においても骨芽細胞へ分化可能であった。さらにRASFにおけるmiR-218の機能解析では標的遺伝子がROBO1であることが明らかとなり、ROBO1発現低下がWntシグナルの強力な抑制因子であるDKK1の分泌低下をもたらし骨芽細胞分化誘導を引き起こしていることが明らかとなった。MTXはRASFに作用し浸潤能の抑制や炎症性サイトカイン分泌の低下をもたらし関節リウマチの病態抑制に寄与している可能性が以前より示唆されていたがその機序は明らかでなかった。近年、様々な薬剤によるmiRNAの発現変動が報告され、MTXにおいても同様の機序を想定し研究を行った。MTXの投与によりRASFでのmiR-887の発現上昇を認めた。miR-887をlipofectamineを用いRASFに強制発現させ、LPSで刺激し、multiplex bead array assay法によりサイトカイン・ケモカインの産生を測定したところ、GM-SCF、CCL4、TNF-α、MIP1-αの分泌低下を認めた。また、scratch assayにおいて浸潤能の低下をも認めた。同様にトファシチニブの投与ではmiR-181の発現上昇を認め、現在同miRNAのRASFの機能解析中である。同定された治療薬関連microRNAの機能解析をすすめるとともに、異なる細胞への影響として軟骨細胞分化や、miR-887強制発現RASF共

培養による単球頚細胞の破骨細胞分化への影響を解析する。リウマチ・膠原病内科学薬剤関連microRNAの機能解析は終了しておらず、試薬などの購入の必要がある。また、論文作成に伴う印刷費、研究発表も継続していくため、費用は必要である。当該年度では実験の進捗にあわせ試薬購入を行ったため次年度使用額が生じた。研究発表に伴う旅費など
脳虚血における分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質(SLPI)の役割

まずIn vitroにおいて、脳虚血時に脳内のグルコース代謝動態がどのように変化するか検討した。低酸素負荷はアストログリアにおいてBip発現を誘導せずNrf2核移行とpentosephosphatepathwayの活性化を惹起することが明らかとなった。さらに、アストログリア、ニューロンの虚血再灌流傷害に対するsecretory leukoprotease inhibitor(SLPI)の効果を検討した。アストログリアでは低酸素/無グルコース負荷中にSLPIを添加してもcell viabilityに変化を認めなかったが、ニューロンではSLPIの添加によりAlamar Blue(AB)還元の上昇を認めた。脳虚血時のSLPIに対する反応はニューロンとアストログリアで異なる可能性が示唆された。本年度は、SLPI投与の影響をみる前段階として、in vitro、in vivo脳虚血モデルにおいて正常脳細胞、脳組織がどのような影響をうけるかについての基礎実験を行った。In vitroにおいては、低酸素、無グルコース環境下でアストロサイトのグルコース代謝動態がどのように変化するかについて検討を行った。SDラットの新生仔大脳皮質よりアストログリアを調整し、培養21日目に低O_2/無Glucose負荷後のPentose Phosphate Pathway(PPP)活性、活性酸素(ROS)産生率を測定した。ERストレス評価のためBip発現、Nrf2核移行について免疫組織学的に検討した。低O_2負荷直後のPPP活性は亢進し、再O_2後12h後まで持続、ROS発生率はsham群以下に低下した。低O_2+無Glucose負荷/再O_2+Glc後にPPP活性化は観察されなかった。免疫染色結果より、PO_2変化はBip発現を誘導せずNrf2核移行とPPP活性化を惹起することがわかり、脳虚血再灌流時には高Glucose環境とは異なるPPP活性制御メカニズムが存在する可能性が示唆された。In vivoのシステムにおいては、C57BL/6Jマウスの左頭頂側頭葉上に頭窓を作成、尾静脈のカテーテルからFITCラベル赤血球を静注後、約50μmの深さにおける脳局所微小循環を頭窓を通して蛍光生体顕微鏡を用いて観察、ビデオカメラに連続記録した。脳虚血前、FITCラベル赤血球が微小血管内を一定方向に流れている様子が明瞭に観察されたが、脳虚血直後には血管内を流れる赤血球の数が著明に減少し、しばしば血管内で停滞し、前大脳動脈から逆流した。脳虚血後、総頸動脈における結紮の解除により一部順向性の血流が回復し、さらに塞栓糸の解除によりほぼ完全な血流の再開通が確認された。その翌日には、脳血流はやや減少し、再還流障害が示唆された。まず、in vitro脳虚血モデルにおいて正常脳細胞、脳組織がどのような影響をうけるかについての基礎実験を行った。培養液中のグルコース濃度の変化がSDラットの新生仔大脳皮質由来アストロサイト、E16ラット皮質線状体由来ユユーロンのエネルギー代謝に与える影響を検討した。ニューロンにおいては細胞外グルコース濃度の変化はエネルギー代謝に影響を与えなかったが、アストロサイトにおいては細胞外グルコース濃度の上昇により、oxidative metabolismの抑制が認められた。さらに、アストロサイト、ニューロンの虚血再灌流傷害に対する分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質(SLPI)の効果を検討するために、低酸素/無グルコース負荷中の培養液にSLPIを添加しcell viabilityに対する効果を検討した。ニューロンについては2時間、アストログリアについては6時間低酸素/無グルコース負荷を行い、その後培養液を通常のメディウムに交換、通常のインキュベーターに静置し再灌流を行った。再灌流後ニューロンは6時間、アストロサイトは24時間後にviabiity評価のためのAlamar Blue(AB)アッセイを行った。アストロサイトでは低酸素/無グルコース負荷中にSLPIを添加してもcellviabilityに変化を認めなかったが、ニューロンではSLPIの添加によりAB還元の上昇を認めた。脳虚血時のSLPIに対する反応はニューロンとアストロサイトで異なる可能性が示唆された。
ミニチュア・ダックスフンドに好発する非再生性貧血の病態解明

本邦のミニチュア・ダックスフンドには、原因不明の非再生性貧血が好発する。従来、貧血の原因は分化後期の赤芽球に対する免疫反応と理解されてきたが、罹患犬は免疫抑制療法への反応が極めて乏しいことから、その病態が自己免疫反応のみに規定されるとは考えにくい。本研究では、貧血の原因をTGF-βシグナル異常に起因する造血障害としてとらえ、病態解明を目指す。脾臓摘出によって造血能が劇的に回復するという知見を基に、脾臓におけるTGF-βの過剰産生の有無、および骨髄におけるTGF-β制御因子の異常発現の有無を遺伝子レベル、タンパク質レベルで明らかにする。
組織線維化に寄与する架橋修飾因子の網羅的解析および線維化抑制剤の開発

肝線維症の病態進展に伴うタンパク質架橋形成の役割の解明を目指し、肝線維化動物モデルを用いて、平成30年度は以下の2点の研究課題を遂行した。(1)肝線維化において活性上昇するTGaseにより特異的に架橋される基質として、K18およびK8が同定され、前年度までの研究においてK18およびK8の組換えタンパク質は試験管内でTGaseにより架橋されることを見出している。本年はこの実験系を用いてTGase活性よる架橋の評価に用いられる基質ペプチドや一級アミンがK18およびK8に特異的に取り込まれるLysおよびGlnの候補サイトを同定した。また、胆管結紮処置による線維化肝において特異的に基質となるK18およびK8が、胆汁うっ滞を模した胆汁の主要な構成成分であるグリコケノデオキシコール酸(GCDCA)を処理したヒト肝実質細胞株において、有意にTGaseの基質になることが確認されたことから、in vivoで観察された肝組織で起こる現象がin vitroでの肝実質細胞由来の細胞でも再現されることが明らかになった。現在は同細胞株を用いて、GCDCA処理時に架橋修飾されるK18およびK8の細胞死制御機構に関わる分子メカニズムを明らかにするための研究を進めている。(2)抗線維化作用を持つ国内既承認薬であるピルフェニドンの作用標的因子探索については、肺線維芽細胞の細胞抽出液を用いてビオチンプローブ化したピルフェニドンに結合する因子をアビジンレジンにより精製し、候補標的タンパク質を同定した。これらの候補因子については、ピルフェニドンが結合した場合の機能変換、またこれが組織線維化もしくは線維芽細胞の活性化とどのように関わるかは不明なため、引き続きこれらについて検討を行う予定である。肝線維症の病態進展に伴うタンパク質架橋形成の役割の解明を目指し、肝線維化動物モデルを用いて、平成28年度は以下の2点の研究課題を遂行した。(1)線維化肝の組織抽出液とビオチン標識したTGaseアイソザイム特異的な基質ペプチドとを反応させ、モノアビジン結合ビーズによるアフィニティー精製によりタンパク質を分画した後、質量分析を用いて基質タンパク質の網羅的同定を行った。得られた基質タンパク質のうち、サイトケラチン8および18に着目し、これらの標的基質の生化学的解析のために組換えタンパク質を取得した。(2)組織線維化抑制剤として有用な創薬シーズの創出を行うため、トランスグルタミナーゼの新規活性阻害剤における抗線維化作用の評価を行った。マウス線維化モデルでの評価を行ったところ、既存の競合活性阻害剤よりも低濃度で有意な抗線維化作用を示すことが認められた。さらに生化学的な解析から、トランスグルタミナーゼのファミリーにおいて、TG2に対して有意に阻害効果を示すものの、他のアイソザイムに関しても活性抑制効果を見せた。また、抗線維化作用を持つ国内既承認薬であるピルフェニドンの作用標的探索について、28年度は20種類以上もの類縁体化合物を作製・評価した構造活性相関解析により、ピルフェニドンの線維化抑制活性に影響しない置換基を決定し、標的因子同定のための化合物のプローブ化を行った。さらにこれを用いて、予備段階ではあるものの標的タンパク質の同定にも成功している。研究計画に記載した28年度の目的や目標とする成果に見合った実験を遂行し、結果を得ているため肝線維症の病態進展に伴うタンパク質架橋形成の役割の解明を目指し、肝線維化動物モデルを用いて、平成29年度は以下の2点の研究課題を遂行した。(1)質量分析により同定された線維化肝特異的にTGaseにより架橋される標的基質タンパク質について、架橋修飾による機能変換と肝線維化の増悪に対する影響を検証する。胆管結紮処置により胆汁うっ滞を引き起こして誘導させた肝線維化モデルにおいて、K18およびK8のタンパク質を検出したところ、これらの発現量が上昇すると共に、架橋された高分子量域のK18、K8の複合体が検出された。さらにK8およびK18はTGaseアイソザイムの一つである組織型TGase (TG2)よりもむしろ表皮型TGase (TG1)と共局在することが新たに分かった。K18およびK8の組換えタンパク質を用いた検討によりTGase活性よる架橋の評価に用いられる基質ペプチドや一級アミンがK18およびK8に特異的に取り込まれることが分かった。K18およびK8と複合体を形成するタンパク質の同定を目指し、これらの組換えタンパク質を抗原としたポリクローナル抗体についても併せて作製した。また、胆汁うっ滞を模した胆汁の主要な構成成分であるグリコケノデオキシコール酸を処理した肝実質細胞株において、誘導される肝細胞の細胞死はTG1およびTG2の発現抑制により一部軽減されることが分かった。(2)抗線維化作用を持つ国内既承認薬であるピルフェニドンの作用標的探索について、各種反応条件設定を行った後に、候補標的タンパク質を同定した。現在これらの候補因子が本当にピルフェニドンに結合するかどうか、また候補因子の活性変化が本当に線維化に関与するかどうかについて検証中である。研究計画に記載した29年度の目的や目標とする成果に見合った実験を遂行し、結果を得ているため肝線維症の病態進展に伴うタンパク質架橋形成の役割の解明を目指し、肝線維化動物モデルを用いて、平成30年度は以下の2点の研究課題を遂行した。

(1)肝線維化において活性上昇するTGaseにより特異的に架橋される基質として、K18およびK8が同定され、前年度までの研究においてK18およびK8の組換えタンパク質は試験管内でTGaseにより架橋されることを見出している。本年はこの実験系を用いてTGase活性よる架橋の評価に用いられる基質ペプチドや一級アミンがK18およびK8に特異的に取り込まれるLysおよびGlnの候補サイトを同定した。また、胆管結紮処置による線維化肝において特異的に基質となるK18およびK8が、胆汁うっ滞を模した胆汁の主要な構成成分であるグリコケノデオキシコール酸(GCDCA)を処理したヒト肝実質細胞株において、有意にTGaseの基質になることが確認されたことから、in vivoで観察された肝組織で起こる現象がin vitroでの肝実質細胞由来の細胞でも再現されることが明らかになった。現在は同細胞株を用いて、GCDCA処理時に架橋修飾されるK18およびK8の細胞死制御機構に関わる分子メカニズムを明らかにするための研究を進めている。(2)抗線維化作用を持つ国内既承認薬であるピルフェニドンの作用標的因子探索については、肺線維芽細胞の細胞抽出液を用いてビオチンプローブ化したピルフェニドンに結合する因子をアビジンレジンにより精製し、候補標的タンパク質を同定した。これらの候補因子については、ピルフェニドンが結合した場合の機能変換、またこれが組織線維化もしくは線維芽細胞の活性化とどのように関わるかは不明なため、引き続きこれらについて検討を行う予定である。トランスグルタミナーゼアイソザイム特異的に架橋された基質タンパク質の同定法として、当初は従来の方法およびiTRAQ(比較定量解析)による定量解析を行う予定であったが、従来の優位差が顕著な場合にのみ同定可能な方法で十分に候補タンパク質が得られたため、iTRAQを用いた同定手法は進めず、先行して他の研究を進めた。また、この過程で候補タンパク質であったALDH2がコントロールのサンプルでも同定されたため、新規基質タンパク質の候補からは除外することにした。肝線維化におけるK18およびK8の機能解析において、新たに線維化の誘導に伴い局在が変化することを見出したので、今後はこの局在変化と肝細胞死・線維化への影響についても検討していきたい。今後の研究の推進方策に記載の理由により、実験遂行の流れを少し変更したため、28年度の研究費使用額に変更が生じた。今後の研究の推進方策に記載の理由により、実験遂行の流れを少し変更したため、29年度の研究費使用額に変更が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせて、全体の研究計画遂行のために必要な装置・消耗品に使用する。質量分析に基づく比較定量解析のために次年度使用する予定であるが、他方法で十分な成果が得られた場合には、全体の研究計画遂行のために必要な装置・消耗品に使用する。
腸球菌薬剤耐性プラスミドのフェロモン非依存性高頻度接合伝達系の分子遺伝学的研究

平成14年度までの研究でpMG1プラスミドの全塩基配列の決定を行い、その結果を用い転写産物の解析を行ったところtra遺伝子群は複数の転写単位によって成り立っていた。また、ORF20遺伝子への挿入によって下流の多くの遺伝子が一切転写されなくなった。これまでの結果を踏まえ今回の研究(平成1516年度)において以下の4点を明らかにした。1)ORF20の直前には強力なプロモーターがあり、その活性はORF20::Tn917挿入変異株においては著しく低下した。一方、クローン化されたORF20プロモーター活性はtransに供給されるORF20によって上昇した。これらの結果からORF20は自身のプロモーターからの転写促進因子である事がわかった。また、tra領域の転写単位をRT-PCRとノーザン・ハイブリダイゼーションによって正確に決定した結果、ORF1315、ORF1619、ORF2043、ORF4449の4つの転写単位がある事がわかった。2)ORF20の上流にある転写単位における挿入変異によってORF20の転写が増大する事がわかっていた。この負の調節遺伝子を特定するためにORF20からの転写の抑制が解除される突然変異を相補し、再びORF20の転写抑制をかける事がわかっているクローン化された断片(ORF1319を含む)に対してtransposon mutagenesisを行ったところORF13から始まる転写が必要でORF15以降は必要ない事がわかった。また、ORF13単独では相補しない事からORF14からORF15直前までの領域が必要である事が明らかになった。3)DNA断片をクローニングベクターにクローン化し、pMG1によって可動化されるかどうかを調べる事によりoriT領域を決定したところORF44の直前に存在する約180bpの領域がoriT活性を持つ事が明らかになった。4)受容菌としての能力を欠いた突然変異体と親株から細胞表層蛋白質を抽出し、2次元電気泳動を行い、蛋白質産生パターンを比較する事により供与菌・受容菌間の相互作用に関与する蛋白質を明らかにすることを試みてきたが現在までのところ親株と突然変異体の蛋白質産生パターンに明確な違いが観察されなかった。pMG1プラスミドは腸球菌から分離されたゲンタミシン耐性プラスミドであり、これまで報告されていない接合伝達系を持つ事が示唆されたことからこのプラスミドの接合伝達系について研究を行ってきた。一番大きな転写単位をコントロールする遺伝子(ORF20)があり、この遺伝子への挿入によって下流の多くの遺伝子が一切転写されなくなった。また、この遺伝子がtrans働いて下流の1つの転写単位をコントロールしている事が示唆されていた。これまでの結果を踏まえ平成15年度においては以下の3点を明らかにした。(1)DNA塩基配列から得られる情報を元に予測されるプロモーター配列をクローン化しLacZ遺伝子とのfusionを構築し腸球菌において実際の活性を調べたところ、ORF20の直前には強力なプロモーターがあった。

そしてその活性はORF20::Tn917挿入変異株においては著しく低下した。一方、ORF20::Tn917変異によって影響を受けていた他の転写単位に属する遺伝子の転写がクローン化されtransに供給されるORF20によって回復しなかった。これらの結果から他の転写単位に対して如朋に働くと考えられる正の調節因子はORF20それ自体ではなく、ORF20プロモーターによって転写される遺伝子の産物である事が明らかになった。(2)ORF20の上流にある転写単位における挿入変異によってORF20の転写が増大する事が知られていたが、この変異によってORF20の調節を受けないORF44より下流の遺伝子の転写が増大する事も明らかになった。この結果から抑制的に働く因子はtra遺伝子全体の発現に関与している事が強く示唆された。(3)DNA断片をクローニングベクターにクローン化し、pMG1によって可動化されるかどうかを調べる事によりoriT領域を決定したところORF44の直前に存在する約180bpの領域がoriT活性を持つ事が明らかになった。1)平成15年度までに行われた研究からpMG1プラスミドのtra遺伝子群の発現調節に関与する正の調節遺伝子としてORF20が同定された。さらにこのORF20の転写を負に調節している遺伝子がORF1319の領域にある事がわかっていた。今年度、この負の調節遺伝子を特定するためにORF20からの転写の抑制が解除される突然変異を相補し、再びORF20の転写抑制をかける事がわかっているクローン化された断片(ORF1319を含む)に対してin vitro transposon mutagenesisを行い、ORF20に対する抑制が解除されるかどうか調べたところORF13から始まる転写が必要でORF15以降は必要ない事がわかった。また、ORF13単独では突然変異を相補しない事からORF14からORF15直前までの領域が必要である事が明らかになった。2)tra領域の転写単位についてはノーザン・ハイブリダイゼーションの実験からすでに大まかな転写単位は推測されていたが、このたびRT-PCRとノーザン・ハイブリダイゼーションによってより正確に決定した。その結果、隣の転写単位に少し流れ込む事が観察される場合もあるがORF1315、ORF1619、ORF2043、ORF4449の4つの転写単位がある事がわかった。3)受容菌としての能力を欠いた突然変異体と親株から細胞表層蛋白質を抽出し、2次元電気泳動を行い、蛋白質産生パターンを比較する事により供与菌・受容菌間の相互作用に関与する蛋白質を明らかにすることを試みてきたが現在までのところ親株と突然変異体の蛋白質産生パターンに明確な違いが観察されなかった。
インドネシア伝統的糖尿病足潰瘍管理法の感染制御と治癒効果に関する海外調査

本研究は、糖尿病足潰瘍の治癒を遷延化させる要因の一つである感染を制御する新たな方策を求めて、従来の感染抑制作用を有する外用薬や抗菌作用を有する銀含有創傷被覆材剤とは異なる創傷管理が普及しているインドネシアにおいて調査した。まず、インドネシアカリマンタン島・ポンティアナックにある創傷ケア専門クリニックにて調査を実施した。薬剤や創傷被覆材とは異なる局所管理法として、蜂蜜、ならびにナマコ抽出物をガーゼに浸透させ創部を被覆していた。41名の糖尿病足潰瘍の創部を2週間毎12週間まで追跡調査した。患者の平均年齢は蜂蜜群56.2±9.2歳、ナマコ抽出物群52.2±12.0歳であった。性別(男性)は、蜂蜜群42.9%、ナマコ抽出物群28.6%であった。糖尿病のコントロールを示すHbA1cが10以上の者は、蜂蜜群81.0%、ナマコ抽出物群85.7%であった。糖尿病足潰瘍状態を示すスコアの中央値は、蜂蜜群30点、ナマコ抽出物群27点であった。両群の創傷治癒日数をカプラン・マイヤー法で比較した結果、有意差はなかった(p=0.79、ログランク検定)。その後、治癒遅延を引き起こす創傷周囲に浸軟生じる糖尿病足潰瘍に絞って調査を継続した。その結果、追跡4週間後の治癒率は、蜂蜜8.6%、ナマコ抽出物群19.3%であった。両群の創傷治癒日数をカプラン・マイヤー法で比較した結果、有意差を認めた(p=0.001、ログランク検定)。次に、ナツメヤシ抽出物を蜂蜜に溶解したものをガーゼに浸透させる局所管理法について調査を行った。追跡8週間後の治癒率は、蜂蜜群10%、ナツメヤシ抽出物群23.3%であった。創面および創滲出液性状の分子生物学的変化からTNF-α、創面のバイオフィルムの存在について、さらに検討を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、糖尿病足潰瘍の治癒を遷延化させる要因の一つである感染を制御する新たな方策を求めて従来の薬剤や創傷被覆材とは異なる創傷管理が普及しているインドネシアにおいて調査を行い、その創傷治癒効果を検証することを目的にしている。創傷治癒効果は、肉眼的所見の変化、創面および創滲出液性状の分子生物学的変化、創面のバイオフィルムの存在から判定する。インドネシアは島嶼国で国土面積が日本の4倍と広大で、かつ多民族国家である。このため島別に調査を実施する計画である。平成28年度はインドネシアカリマンタン島・ポンティアナックにある創傷ケア専門クリニックにて調査を実施した。薬剤や創傷被覆材とは異なる局所管理法として、蜂蜜またはナマコ抽出物をガーゼに浸透させ創部を被覆していた。41名の糖尿病足潰瘍患者の創部を2週間毎12週間まで追跡調査した。患者の平均年齢は、蜂蜜群56.2±9.2歳、ナマコ抽出物群52.2±12.0歳、性別(男)は、蜂蜜群42.9%、ナマコ抽出物群28.6%であった。糖尿病のコントロールを示すHbA1cが10以上の者は、蜂蜜群81.0%、ナマコ群85.7%であった。糖尿病足潰瘍スケールの中央値は、蜂蜜群30点、ナマコ抽出物群27点、創傷部位は、蜂蜜群において足指23.8%、踵部23.8%が多く、ナマコ抽出物群において足指33.3%、足背部23.8%の順であった。両群の創傷治癒日数をカプラン・マイヤー法で比較した。ログランクテストを用いたグループ間の比較でp=0.79であった。平成28年度にインドネシアカリマンタン島・ポンティアナックにある創傷ケア専門クリニックにて調査を行った。これまでに創傷治癒に関する統計学的解析は完了し、蜂蜜またはナマコ抽出物使用に治癒期間に有意な差がなかった。今後は、感染徴候を示す評価項目、炎症・感染、壊死組織について解析を行う。次に、創面のバイオフィルムの存在に関するムコ多糖類の染色(蜂蜜群88検体、ナマコ抽出物群99検体)を行い、感染制御効果について検討する。さらに、既に創面ブロティング法を用いてニトロセルロースメンブレンにて採取済みの蜂蜜群88検体、ナマコ抽出物群99検体について、感染時に起こるタンパク質分解酵素MMP-2 MMP-9、炎症マーカーTNF-αを実験室にて解析をすすめる。これまでにこれらの分子生物学解析手法について、分担研究者とミーティングを行った。本研究は、糖尿病足潰瘍の治癒を遷延化させる要因の一つである感染を制御する新たな方策を求めて、従来の感染抑制作用を有する外用薬や抗菌作用を有する銀含有創傷被覆材剤とは異なる創傷管理が普及しているインドネシアにおいて調査を行い、その創傷治癒効果を検証することを目的にしている。

41名の糖尿病足潰瘍の創部を2週間毎12週間まで追跡調査した。患者の平均年齢は蜂蜜群56.2±9.2歳、ナマコ抽出物群52.2±12.0歳であった。性別(男性)は、蜂蜜群42.9%、ナマコ抽出物群28.6%であった。糖尿病のコントロールを示すHbA1cが10以上の者は、蜂蜜群81.0%、ナマコ抽出物群85.7%であった。糖尿病足潰瘍状態を示すスコアの中央値は、蜂蜜群30点、ナマコ抽出物群27点であった。両群の創傷治癒日数をカプラン・マイヤー法で比較した結果、有意差はなかった(p=0.79、ログランク検定)。平成29年度は、創面ブロティング法を用いてニトロセルロースメンブレンに付着させた滲出液中の分子生物学的解析、創面のバイオフィルム存在の検討のため細菌の細胞壁を構成するムコ多糖類の染色を行った。さらに、創状態がより重症の症例に対する層化解析を行った。また、蜂蜜、ナマコ抽出物以外の局所管理法ついての調査を実施した。創面ブロティング法にて分析したのは局所炎症反応を示すTNF-αならびに創部肉芽組織を破壊することで増生を抑止するMMP-2、MMP-9である。免疫染色するためにこれら3種のたんぱく質の一次抗体を使用した。その後PBSによりメンブレンを水和させ、化学発光基質endogenous alkaline phosphateならびにendogenous peroxidaseにより染色した。目標タンパク質であるTNF-α、MMP-2、MMP-9を検出するために二次抗体を使用した。その後、化学発光検出専用撮影装置にてデジタル画像データとして保存した。画像から目的とするバンドの発光強度を数値化して定量分析を行った。創面のバイオフィルム検出を以下の方法で行った。創面の滲出液を吸着させたニトロセルロースメンブレンをPBSで水和させた。次に定法に従いreversible protein染色キットを使用して、総たんぱく質量計測のための脱色を行った。次に、細菌の細胞壁を構成するムコ多糖類を同定するためにRuthenium redを使用しメンブレンを染色した。バイオフィルムの判定は質的に染色反応陽性(バイオフィルムの存在あり)、染色反応陰性(バイオフィルムの存在ない)を2名の研究者で実施した。昨年度収集した糖尿病足潰瘍のメンブレンを用いて、調査開始時から4週間後のバイオフィルム同定状況の変化を分析した。蜂蜜群は、陽性から陰性に変化した創は10件中9件、ナマコ抽出物群は10件中7件であり、両群に有意差はなかった。また、ナマコ抽出物群では調査開始時と比べ8週、10週、12週のTNF-αが有意低下したが、蜂蜜群においては有意な低下はなかった。MMP-2、MMP-9は両群とも調査開始時と同等の強度で推移した。平成29年8月より、創状態が悪い糖尿病性足潰瘍として、創周囲に浸軟がある創を対象に調査をさらに継続した。平成29年度末で、蜂蜜群20名、ナマコ抽出物群18名となっている。本研究は、糖尿病足潰瘍の治癒を遷延化させる要因の一つである感染を制御する新たな方策を求めて、従来の感染抑制作用を有する外用薬や抗菌作用を有する銀含有創傷被覆材剤とは異なる創傷管理が普及しているインドネシアにおいて調査した。まず、インドネシアカリマンタン島・ポンティアナックにある創傷ケア専門クリニックにて調査を実施した。薬剤や創傷被覆材とは異なる局所管理法として、蜂蜜、ならびにナマコ抽出物をガーゼに浸透させ創部を被覆していた。患者の平均年齢は蜂蜜群56.2±9.2歳、ナマコ抽出
多環芳香族炭火水素によるPPARα標的遺伝子の発現抑制およびその分子機構

3-メチルコランスレン(MC)などの多環芳香族炭化水素(PAH)は,脂質代謝異常および脂肪肝を引き起こすことが報告されている.しかし,その毒性発現機構についてははとんど解明されていない.そこで.我々はDNAマイクロアレイを用いて無処置のマウスとMCを投与したマウスの肝における遺伝子の発現パターンを比較し,PAHにより発現が変化する遺伝子について検討した.その結果,多くの脂質代謝酵素遺伝子の発現がPAHにより抑制されることを明らかにした.興味深い事に,これらの遺伝子は共通して核内レセプターperoxisome proliferators-activated receptor α(PPARα)の標的遺伝子であった.このことより,PAHによる脂質代謝酵素遺伝子の発現抑制は,PPARαシグナル伝達の抑制により生じている可能性が考えられた.そこで,申請者は,PAHによるPPARαシグナル伝達機構への影響について検討した.その結果,PAHによりPPARαシグナル伝達が抑制されることを明らかにした.また,興味深いことに,この抑制はPAHと結合し活性化する転写因子・芳香族炭化水素受容体(AhR)を介していることが明らかとなった.次に,PAHによるAhRを介したPPARαシグナル伝達の抑制機構について解析を行ったところ,PPARαシグナル伝達系を構成している因子であるretinoid X receptor α(RXRα)のmRNAおよびタンパク質量の減少が重要であることを明らかにした.このRXRαの減少はAhRに依存的な現象であったことより,PAHによる脂質代謝酵素遺伝子の発現抑制およびPPARαシグナル伝達の抑制はAhRを介したRXRαの抑制が原因である可能性が考えられた。現在,この抑制機構に関するさらなる詳細な解析を行なっている.3-メチルコランスレン(MC)などの多環芳香族炭化水素(PAH)は,脂質代謝異常および脂肪肝を引き起こすことが報告されている.しかし,その毒性発現機構についてははとんど解明されていない.そこで.我々はDNAマイクロアレイを用いて無処置のマウスとMCを投与したマウスの肝における遺伝子の発現パターンを比較し,PAHにより発現が変化する遺伝子について検討した.その結果,多くの脂質代謝酵素遺伝子の発現がPAHにより抑制されることを明らかにした.興味深い事に,これらの遺伝子は共通して核内レセプターperoxisome proliferators-activated receptor α(PPARα)の標的遺伝子であった.このことより,PAHによる脂質代謝酵素遺伝子の発現抑制は,PPARαシグナル伝達の抑制により生じている可能性が考えられた.そこで,申請者は,PAHによるPPARαシグナル伝達機構への影響について検討した.その結果,PAHによりPPARαシグナル伝達が抑制されることを明らかにした.また,興味深いことに,この抑制はPAHと結合し活性化する転写因子・芳香族炭化水素受容体(AhR)を介していることが明らかとなった.次に,PAHによるAhRを介したPPARαシグナル伝達の抑制機構について解析を行ったところ,PPARαシグナル伝達系を構成している因子であるretinoid X receptor α(RXRα)のmRNAおよびタンパク質量の減少が重要であることを明らかにした.このRXRαの減少はAhRに依存的な現象であったことより,PAHによる脂質代謝酵素遺伝子の発現抑制およびPPARαシグナル伝達の抑制はAhRを介したRXRαの抑制が原因である可能性が考えられた。現在,この抑制機構に関するさらなる詳細な解析を行なっている.
健康食品(長鎖不飽和脂肪酸など)による神経・循環器系影響の客観的 評価法の確立

「健康食品」(生理機能への良好影響をうたって販売されている食品)は安全性と効果を確認した上で使用する必要がある。効果を確認するためには、客観的に数値として測定できる、感度のいい方法が必要になる。健康食品の一例として魚油に多く含まれて神経機能に影響する可能性があると言われるドコサヘキサエン酸(DHA)を取上げ、摂取した人への影響について、心電図を利用する方法と手のふるえの強さを測定する方法とを用いて検討した。その結果、DHAを摂取した時に、異なった脂肪酸であるアラキドン酸という物質が手のふるえを抑える影響を及ぼしている可能性が見出された。「健康食品」(生理機能への良好影響をうたって販売されている食品)の摂取が期待されている通りの効果を示すかどうかを検証する目的で、機関の倫理委員会の承認後にインフォームドコンセントを得て次に示す介入研究を行なった。健常な20歳代男女にドコサヘキサエン酸(DHA)を主成分とする市販健康食品を毎日6週間摂取してもらった介入群と摂取しなかった対照群とで、摂取前、摂取後、さらに摂取終了の6週間後の3回、心拍RR間隔に基づく自律神経機能と手のふるえなどの神経運動機能を測定した。DHAはふだんの食事でも主に魚から摂取していることから、簡易食事頻度の聞き取りと検査時3回の採血による血清DHA濃度測定とによって曝露量の正確な把握に備えた。研究計画では60名を対象とする予定であったが、一人にっき採血を含む検査3回分の謝金が足りず、本年度は42名までの測定しかできなかった。次年度は残りの18名をデータに加え、ひきつづいてエイコサペンタエン酸について検討を行なう。この他、当研究は「健康食品」一般の客観的評価法確立を目指している。化学毒性物質等のリスク評価において欧州食品安全機関(EFSA)はこれまで伝統的に用いられてきた無毒性量(NOAEL)の代わりにベンチマークドース(BMD)法を使うことを勧告しているが、これを「健康食品」の効果の評価に用いる可能性について検討した。その結果、EFSAの方法で得られる基準点は臨床的基準値に必ずしも対応しない低い数値になる可能性があるため注意が必要であることが知られた。「健康食品」(生理機能への良好影響をうたって販売されている食品)の摂取が期待されている通りの効果を示すかどうかを検証し、その他の健康食品の影響検討法にも応用をはかる目的で、機関の倫理委員会の承認後インフォームドコンセントを得て次に示す介入研究を行なった。健常な20歳代男女60名を対象としてドコサヘキサエン酸(DHA)を主成分とする市販健康食品を毎日6週間摂取してもらった介入群と摂取しなかった対照群とをランダムに設定し、摂取前、摂取後、摂取終了後6週間経過時の3回、心拍RR間隔に基づく自律神経機能と手のふるえなどの神経運動機能を測定した。検査時3回の採血による血清DHA濃度は介入群で摂取後に上昇し、摂取終了6週間後に回復していた。またアラキドン酸とジホモーγ-リノレン酸は摂取後に減少していた。この間に肝機能への影響は認められず、体重も変化しなかった。手のふるえと反応時間の測定を行なって神経運動系への影響を検討したところ、これらの変化は認められず、血清中脂肪酸濃度との間に関連も認められなかった。一方、心拍RR間隔に基づく自律神経機能では副交感神経の活動レベルを反映する指標とエイコサペンタエン酸/アラキドン酸比との間に正の関連が認められた。心臓自律神経機能は長鎖不飽和脂肪酸の冠血管疾患予防作用にかんして注目されており、さらに用量を増やして効果の確認、ベンチマークドース法を用いた臨界濃度の推定、作用機序の考察を加える必要がある。曝露量の正確な把握を行なうために血清中DHA濃度測定も行なった。最終的に対照群30人、用量を変えた介入群各32、29、30人の計121人の対象者を得ることができた。血中DHA濃度(平均)は摂取前85.0mg/Lであったところ摂取終了時に最も高い群で139.2mg/Lとなっていた。

摂取の効果は血清生化学的指標、手のふるえ強度とその周波数解析結果、反応時間では認めることはできなかったが、心拍RR間隔に基づく指標と心筋の状況を反映すると考えられる指標(QTc)とで影響を捉えられることが知られた。現時点で生理的意義を明確にすることは難しいと思われるが、客観的に得られる指標にもとづいて食品成分の効果を検討する目的への応用にこれらの方法は有望であると考えられる。現在解析結果について論文を準備中である。この他、習慣として摂取する魚の簡易頻度について聞き取りを行なっていたため、これと血清中DHA濃度との関連についても学会報告で結果を公表する予定である。対象者に6週の摂取期間を含め期日の決まった3回の測定を依頼する必要があるために、研究期間の設定が困難である。また、生理的影響の程度が予想より限定的であったことから、摂取量を増した検討を追加する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。過去年度と同じ母集団について、DHA摂取量を増やして自律神経系と運動神経系への影響検討を続行する。また、脈波伝導速度により血管系への影響を、色覚検査により網膜への影響を検討する。脂肪酸増減の生理的意義を考察するとともに、ベンチマークドース法による臨界濃度推定を行なって、DHA健康食品の影響評価法を論文にまとめる。