hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規エナミノシクロヘキサンジオン系化合物の植物白化機構の解析

クロロフィル生合成系においてプロトポルフィリノーゲン酸化酵素(プロトックス)を阻害する除草剤は、植物細胞内に光増感作用を有するプロトポルフィリンIX(プロトIX)を蓄積して光要求型の除草作用を示す。そこで、本研究では申請者らが見出した、植物に対しての光要求型白化作用を有するエナミノシクロヘキサンジオン系化合物(ECD)の作用機作の追求と植物への影響の解析を行い、新しい植物成長制御技術開発の基本的知見を得ることを目的とした。プロトックス阻害剤抵抗生タバコ培養細胞に対して、ECDは野生型の細胞に対する効果と同様の光要求生白化作用を有していた。一方、EDC処理に伴い抵抗性細胞でも野生型の場合と同様にポルフィリン環10位に水酸基が置換したクロロフィル誘導体が蓄積してきた。この化合物は明暗両条件下で、およびECDの光要求性白化作用をうち消す効果を示す一重項酸素消去剤の存在下においてもECD処理により誘導されてくる。以上の結果は、ECDの作用が既存のプロトックス阻害剤とは異なること、ECD処理により蓄積されるクロロフィル誘導体が活性発現の要因であることを示している。またECDは高濃度では植物に対してわずかながらであるが除草活性を示した。このことは今後の構造改変により新しい除草剤のリード化合物を得ることができる可能性を示している。またその作用機作はECD処理に蓄積されてくる水酸化クロロフィルの光増感作用が原因である可能性がある。ECDは低濃度では植物に対して形態上に影響を与えなかったが、葉緑体関連光誘導性遺伝子の発現を暗所においても促進した。この結果は化合物自身はまた蓄積されてくる水酸化クロロフィル等のクロロフィル誘導体がプラスチッドシグナルである可能性を示唆しており、葉緑体関連光誘導性遺伝子機構を研究するための新しい方法論を提示するきっかけとなった。申請者らが見いだした光要求型白化作用を有するエナミノシクロヘキサンジオン系化合物(ECD)の作用機作を明らかにすることと、同じく申請者らが見いだしたプロトックス阻害剤に対して抵抗性を有するタバコ培養細胞の抵抗性発現機構を明らかにすることを試みた。その結果ECD処理した細胞中には10位に水酸基が置換した光増感性クロロフィルが蓄積してくることを明らかにした。また、プロトックス阻害剤抵抗性タバコ培養細胞に対して、ECDは野生型の細胞に対する効果と同様の光要求性白化効果を有しおり野生型の場合と同様にポルフィリン環10位に水酸基が置換したクロロフィル誘導体が蓄積してきた。この化合物は明暗両条件下で、およびECDの光要求性白化作用を打ち消す効果を示す一重項酸素消去剤の存在下においてもECD処理により誘導されてくる。以上の結果は、ECDの作用が既存のプロトックス阻害剤とは異ること、ECD処理により蓄積されるクロロフィル誘導体が活性発現の要因であることを示している。プロトックス阻害剤抵抗性タバコ培養細胞の各葉緑体型、ミトコンドリア型プロトックス遺伝子の塩基配列を調べたところ、野生型の配列と同一であった。ノザン解析の結果では、ミトコンドリア型のみが野生株に比較して10倍程度の増加を示していた。プロトックス阻害剤存在下で培養した細胞の葉緑体はプロトックス阻害剤の著しい影響を受けて形態が変化していたが、ミトコンドリアには形態異常は観察されなかった。この結果はミトコンドリアはプロトックスの過剰発現により阻害剤に影響を受けないことを示している。以上より、阻害剤の作用により蓄積する光増感物質であるプロトポルフィリノーゲンがミトコンドリアで消費され、その結果プロトックス阻害剤抵抗性を示していると考えられた。これは全く新しい抵抗性発現機構である。

この結果は化合物自身はまた蓄積されてくる水酸化クロロフィル等のクロロフィル誘導体がプラスチッドシグナルである可能性を示唆しており、葉緑体関連光誘導性遺伝子機構を研究するための新しい方法論を提示するきっかけとなった。クロロフィル生合成系においてプロトポルフィリノーゲン酸化酵素(プロトックス)を阻害する除草剤は、植物細胞内に光増感作用を有するプロトポルフィリンIX(プロトIX)を蓄積して光要求型の除草作用を示す。そこで、本研究では申請者らが見いだした、植物に対して光要求型白化作用を有するエナミノシクロヘキサンジオン系化合物(ECD)の作用機作の追究と植物への影響の解析を行い、新しい植物成長制御技術開発の基礎的知見を得ることを目的とした。プロトックス阻害剤抵抗性タバコ培養細胞に対して、ECDは野生型の細胞に対する効果と同様の光要求性白化効果を有していた。一方、ECD処理にともない抵抗性細胞でも野生型の場合と同様にポルフィリン環10位に水酸基が置換したクロロフィル誘導体が蓄積してきた。この化合物は明暗両条件下で、およびECDの光要求性白化作用を打ち消す効果を示す一重項酸素消去剤の存在下においてもECD処理により誘導されてくる。以上の結果は、ECDの作用が既存のプロトックス阻害剤とは異ること、ECD処理により蓄積されるクロロフィル誘導体が活性発現の要因であることを示している。またECDは高濃度では植物に対してわずかながらであるが除草活性を示した。このことは今後の構造改変により新しい除草剤のリード化合物を得ることができる可能性を示している。またその作用機作はECD処理により蓄積されてくる水酸化クロロフィルの光増感作用が原因である可能性がある。ECDは低濃度では植物に対して形態上に影響を与えなかったが、葉緑体関連光誘導性遺伝子の発現を暗所においても促進した。この結果は化合物自身または蓄積されてくる水酸化クロロフィル等のクロロフィル誘導体がプラスチッドシグナルである可能性を示唆しており、葉緑体関連遺伝子発現機構を研究するための新しい方法論を提示する切っ掛けとなった。
ＡＴＰアーゼによる活性酸素生成制御機構の解明：環境変動に屈強なイネ作出を目指して

<研究目的>本年度は、「葉緑体局在型ATPアーゼにおけるH+流出活性抑制の分子メカニズムの解明」を目的とし、イネを用いて葉緑体局在型ATPアーゼの基質となる無機リン酸(Pi)の量の変動と、ATPアーゼのH+流出活性の相関解析を行った。<実験材料および方法>野生型イネとルビスコ過剰生産イネ、及びルビスコ発現抑制イネを用い、これらの植物を5つの水耕Pi施肥条件(低Pi、標準Pi、標準2倍量Pi、標準3倍量Pi、標準4倍量Pi、標準5倍量Pi)で生育させた。発芽後70日目のイネ葉身の完全展開葉を用いて、各種解析を進めた。<結果及び考察>イネを異なるPi施肥条件で生育させた結果、イネ葉身には施肥量に応じたPiの蓄積が確認できた。葉身において、光合成駆動時の葉緑体局在型のATPアーゼの回転活性測定を行った結果、ATPアーゼの基質であるPiは十分に蓄積しているにもかかわらず、Pi施肥量の増加は、ATPアーゼのH+流出活性を低下させた。この時、CO2固定速度を評価すると、Piの施肥量の増加は、特にルビスコのカルボキシレーション反応に律速される光合成反応を抑制した。事実として単離ルビスコを用いた測定では、Pi施肥濃度の上昇に伴ってルビスコの活性化が抑制されていた。また、ルビスコの発現抑制イネにおいては、野生型イネおよびルビスコ過剰生産イネと比較して葉緑体局在型のATPアーゼのH+流出活性は、有意に低下することを確認した。この結果は、葉緑体局在型のATPアーゼのH+流出活性は、カルビンベンソンサイクル活性と強い相関があり、先行研究で示された葉緑体内部のPiによる制御よりも、むしろ葉緑体内部のATP/ADP比に強く依存する可能性が見出された。これらの結果に関しては、日本植物生理学会にて口頭発表を行い、研究成果の報告を行った。また、本成果は論文の執筆を開始しており、論文投稿予定をしている。上記の結果に加え、本研究の遂行により明らかになった高Pi施肥条件下におけるイネの光合成活性低下は、1917年に初めて報告された植物における「Pi毒性」のメカニズムを説明できる可能性が高い(Shive, 1917)。多量なPiの施肥は植物を枯死させるが、その分子メカニズムは未だ明らかでない。今回、高Pi条件下ではルビスコの活性化が大きく抑制され、葉緑体におけるATPアーゼのH+流出活性を抑制したことから、高Pi条件では光合成の抑制に伴って、植物にとって毒である活性酸素種(ROS)の発生が光合成電子伝達反応において促進され、Pi毒性が誘導されている可能性が考えられた。実際、発芽後70日目におけるイネの乾燥重量は、標準Pi施肥条件と比較して、Pi施肥量が増加するにつれて低下し、特に葉鞘の生育が抑制されることを確認した。mRNAの発現解析により、ROSの生成状況を確認すると高Pi施肥条件では、ROS蓄積が確認され、この原因としては抗酸化能力に重要なスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の内、特に銅/亜鉛型のSOD活性の活性低下であることを見出した。銅/亜鉛型SODのmRNA量および葉内金属量の解析の結果、両者は葉内に標準Pi施肥条件と比較して十分量が存在していたことから、高Pi施肥条件では銅/亜鉛型SODの翻訳段階でタンパク質の形成阻害が起きていることが示唆された。つまり、高Pi施肥条件下においては、ルビスコの活性低下に始まるROS発生の促進と、葉内金属利用効率の低下が銅/亜鉛型SODの活性を抑止することにより、ROSが蓄積し、イネの生育低下と枯死を誘導している可能性が考えられた。これらの結果は、植物におけるPi毒性を新規に説明する結果である。当該研究結果に関しても、論文の執筆を開始しており、論文投稿予定をしている。本年度は研究計画に記載している2番目の課題である「葉緑体局在ATPアーゼのH+流出活性制御改変がイネ収量に与える影響の解析」を遂行する。植物における葉緑体局在型ATPアーゼのH+流出活性制御は、光や温度、二酸化炭素濃度といった環境要因の変動に応答し、植物において毒物である活性酸素種の生成が促進されるような条件では、H+流出活性が低下する。この背景から、葉緑体局在型ATPアーゼのH+流出活性制御は、野外環境下における作物の生産性に影響を与える可能性がある。しかしながら、ATPアーゼのH+流出活性制御の変化が野外環境下での作物の生産性に与える影響を解析した例はない。そこで、昨年度より作成を行っているイネにおける葉緑体局在ATPアーゼγサブユニット改変によるH+流出活性変異体の生育解析、および生理解析を進める。葉緑体局在型ATPシンターゼのH+流出活性改変がイネの生産性に与える影響に関しては、受入研究者のグループが所有する人工気象室および、野外温室にてイネを生育させ、イネ乾燥重量および、種子の100粒重、1株あたりの穂数・籾数、分げつ数、単位葉、相対成長速度の評価を行う。これと同時に、生育中における葉緑体局在型ATPアーゼの活性と光合成への影響を解析するために、発芽後、1週間ごとに植物個体全体におけるCO2固定速度とクロロフィル蛍光による光合成活性評価が可能な携帯型光合成解析装置を用いて、イネの光合成評価とイネの葉におけるATPアーゼのH+流出活性評価を評価する。

その際、植物個体をサンプリングし、単位葉面積当たりの乾燥重量、クロロフィル定量、窒素量を測定する。また、イネにおける活性酸素種による酸化傷害の状態を確認する為にウェスタンブロット解析によってカルボニル化タンパク質の蓄積量、および酸化ストレスマーカーである遺伝子の発現量の評価も生育の進行に伴って行う。<研究目的>本年度は、「葉緑体局在型ATPアーゼにおけるH+流出活性抑制の分子メカニズムの解明」を目的とし、イネを用いて葉緑体局在型ATPアーゼの基質となる無機リン酸(Pi)の量の変動と、ATPアーゼのH+流出活性の相関解析を行った。<実験材料および方法>野生型イネとルビスコ過剰生産イネ、及びルビスコ発現抑制イネを用い、これらの植物を5つの水耕Pi施肥条件(低Pi、標準Pi、標準2倍量Pi、標準3倍量Pi、標準4倍量Pi、標準5倍量Pi)で生育させた。発芽後70日目のイネ葉身の完全展開葉を用いて、各種解析を進めた。<結果及び考察>イネを異なるPi施肥条件で生育させた結果、イネ葉身には施肥量に応じたPiの蓄積が確認できた。葉身において、光合成駆動時の葉緑体局在型のATPアーゼの回転活性測定を行った結果、ATPアーゼの基質であるPiは十分に蓄積しているにもかかわらず、Pi施肥量の増加は、ATPアーゼのH+流出活性を低下させた。この時、CO2固定速度を評価すると、Piの施肥量の増加は、特にルビスコのカルボキシレーション反応に律速される光合成反応を抑制した。事実として単離ルビスコを用いた測定では、Pi施肥濃度の上昇に伴ってルビスコの活性化が抑制されていた。また、ルビスコの発現抑制イネにおいては、野生型イネおよびルビスコ過剰生産イネと比較して葉緑体局在型のATPアーゼのH+流出活性は、有意に低下することを確認した。この結果は、葉緑体局在型のATPアーゼのH+流出活性は、カルビンベンソンサイクル活性と強い相関があり、先行研究で示された葉緑体内部のPiによる制御よりも、むしろ葉緑体内部のATP/ADP比に強く依存する可能性が見出された。これらの結果に関しては、日本植物生理学会にて口頭発表を行い、研究成果の報告を行った。また、本成果は論文の執筆を開始しており、論文投稿予定をしている。上記の結果に加え、本研究の遂行により明らかになった高Pi施肥条件下におけるイネの光合成活性低下は、1917年に初めて報告された植物における「Pi毒性」のメカニズムを説明できる可能性が高い(Shive, 1917)。多量なPiの施肥は植物を枯死させるが、その分子メカニズムは未だ明らかでない。今回、高Pi条件下ではルビスコの活性化が大きく抑制され、葉緑体におけるATPアーゼのH+流出活性を抑制したことから、高Pi条件では光合成の抑制に伴って、植物にとって毒である活性酸素種(ROS)の発生が光合成電子伝達反応において促進され、Pi毒性が誘導されている可能性が考えられた。実際、発芽後70日目におけるイネの乾燥重量は、標準Pi施肥条件と比較して、Pi施肥量が増加するにつれて低下し、特に葉鞘の生育が抑制されることを確認した。mRNAの発現解析により、ROSの生成状況を確認すると高Pi施肥条件では、ROS蓄積が確認され、この原因としては抗酸化能力に重要なスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の内、特に銅/亜鉛型のSOD活性の活性低下であることを見出した。
RNAヘリケースA複合体機能異常として発がん機構の解析 ―第三年度―

DNAのメチル化はエピジェネティックな遺伝子発現調節機構の一つであり、細胞のがん化、分化などに重要な役割を担っていると考えられている。その代表的標的配列cAMP responsive element (CRE)は多くの遺伝子のプロモーター上に存在し、cAMPによる遺伝子発現調節にて重要な役割を担っている。本研究では、メチル化されたCREに結合する因子としてMBD2に着目し、メチル化CREにおける転写制御機構の解析を試みた(MBD2はスプライシングによりMBD2aとMBD2bの二つのアイソフォームからなる転写抑制因子である)。MBD2a, MBD2bはともにメチル化されたCREの転写を抑制した。一方で、予想に反して、MBD2aのみがメチル化していないCREからの遺伝子発現を活性化した。結合実験により、MBD2aはCREB転写装置の構成因子であるRNAヘリケースA(RHA)と選択的に結合し、さらに、MBD2aとRHAは協調的にCREB依存的な転写を活性化した。また、RHAと結合しているMBD2aは、転写コリプッレサーであるHistone deacetylase 1とは複合体を形成していなかった。以上の結果から、MBD2aは転写抑制複合体と相互作用して転写を抑制するだけでなく、転写活性化複合体としても作用しうる可能性が示された。
地中熱利用システム普及による地下熱環境への影響予測と監視手法の確立

地中熱利用システムは、地球温暖化対策や都市のヒートアイランドの抑制など環境負荷低減効果があり、政策的な支援もあって今後急速な普及が予測されている。一方、地中の人為的な採排熱による環境への影響も懸念されているが、これまで地下熱環境への評価はほとんどなされていない。本研究では、関東平野を対象に自然状態の地下環境を把握する調査を実施し、これを基に環境負荷を最小化する最適設置法およびシステム普及に伴う地下熱環境の変化を監視するための地下熱監視手法を検討することを目的とした。本成果を活用することにより長期的な都市計画やエネルギー政策の立案に役立つ適切なシステムの普及支援が可能となる。地下温度変化を監視する方法として、地盤沈下観測井などの内部に精密な温度計を設置することでその変化をモニタリングする手法があり、これまで地下温暖化を把握する研究で用いられている。そこでこの方法を地中熱システムによる温度の監視にも活用可能かを本研究で検討した。具体的には数値実験を活用し地中熱利用システムによる熱拡散シミュレーションを行った。この検討には、関東平野で測定した自然状態の地下温度データも基礎情報として活用した。その結果、地中熱システムによる影響は、120日間の運転では熱交換井から数メートルの範囲に留まることが分かった。一般に地盤沈下観測井は熱交換井から数km以上離れたところに位置しているためこの手法で監視することは難しい。そこでこの手法に代わる方法を本研究で新たに提案した。その方法は地中熱交換のU字パイプ内の出入口温度と流量をモニターし、地中へ排熱または採熱を熱源による熱量で監視し、場所ごとに適正な基準を設ける方法である。将来的には無線通信回線を通じて影響を監視するデータセンターへ逐次情報を送信することで広域的な地中の熱環境の監視も可能である。地中熱利用システムは、地球温暖化対策や都市のヒートアイランドの抑制など環境負荷低減効果があり、また政策的な支援もあって今後急速な普及が予測されている。一方、地中の人為的な採排熱による環境への影響も懸念されているが、これまで広域的な評価はなされていない。地中熱利用に関する評価を行ううえで「地質情報」、「地下水特性」、「地下温度情報」を知ることが重要である。このうち地下温度情報の整備が遅れている。本研究では関東平野を対象として地下の熱環境調査を行う。地下の熱環境を調べるもっとも直接的な方法は、深さ数十メートルから数百メートルの地下水観測井で地下の温度分布を計測することである。本年度は関東中央部の埼玉県において6地点の観測井(川口、八潮、三芳、熊谷、戸田、和光)で地下温度調査を実施した。調査深度は平均200mであり、地中熱利用システムのための評価として十分な深度まで測定することができた。測定は分解能0.001Kの温度センサーを用いて、12m間隔で温度が平衡状態に達し安定したことを確認して計測値とした。実際にはパソコンと連動するデジタルマルチメータを用いてパソコン上でリアルタイムの温度変動を監視しながら計測した。また和光と戸田については、温度の長期的な振る舞いを計測するためのロガーも設置した。他の地点については、既存研究のデータを収集し、データ整理した。また地中への熱負荷を考えるうえで、地表の熱需要も調べる必要があることから23地点の観測井小屋近傍で大気温度のモニタリングを開始した。今後は、関東中央部だけではなく、その周辺地域に対象地域を広げて既存データの収集や新規の調査を行う予定である。本研究の主たるモデル地域は、関東平野であるが、地域間の違いを明らかにするため国内では大阪平野、海外ではバンコク平野なども比較地域とし地下の熱環境についてのデータ収集や解析を進めている。おおむね順調に進展している。初年度は地下温度に関する項目の調査や情報収集を主として計画し、この目的を達する調査を行うことができた。また、既存研究によるデータも十分に収集でき今後の評価に活用する予定である。地中熱ヒートポンプは海外では広く普及しつつあり、アメリカや中国、ヨーロッパで導入件数が多いが、日本ではまだ2000台程度と少ない。例えば人口規模や面積が比較的日本に近いドイツでは、既に21万台相当が導入されている。一方、地中熱システムの増加による地中への人為的な採排熱による環境への影響も懸念されているが、これまで広域的な地下熱環境への評価はなされていない。本研究では、関東平野を対象に地下環境調査を実施し、システムの普及に伴う今後50年間の地下の熱環境の変化を予測する。そしてこの結果を基に環境負荷を最小化する最適設置法およびシステム普及に伴う地下熱環境の変化を監視するための地下熱監視手法を確立する。地中熱利用に関する評価を行ううえで「地質情報」、「地下水特性」、「地下温度情報」を知ることが重要であるが、特に地下温度情報の整備が遅れている。本研究では関東平野を対象として地下温度構造を把握し、地中熱利用システムが多数普及した場合を想定した将来的な熱の広がりを推定する。本年度、地下温度構造の推定に必要不可欠な、地表面温度の解析を行った。地表温度として気温などを利用することもできるが、これはあくまで点データにすぎない。そこで本研究では、人工衛星画像を用いた解析を行うことで面的な地表面温度を得た。用いた画像はNASAの人工衛星であるTERA/AQUAによって得られたMODISデータを活用した。さらに地表付近で気温測定を本研究で実施している妻沼観測井付近の外気温と人工衛星解析によって得られた時系列的なデータと比較したところ、整合的な傾向が得られた。

以上の検討によって人工衛星によって得られたデータを地下温度構造推定の上面の境界条件として活用できることが確かめられた。最終年度に関東平野における地下温度構造を評価する予定である。本研究を進めるうえで必要な調査データを蓄積し、また地下温度構造のシミュレーションを行うための上端の境界条件である地表温度も衛星画像を活用することで求めることができた。本年度の成果を活用することで、次の段階である地下温度構造の推定および将来予測につなげられる。地中熱利用システムは、地球温暖化対策や都市のヒートアイランドの抑制など環境負荷低減効果があり、政策的な支援もあって今後急速な普及が予測されている。一方、地中の人為的な採排熱による環境への影響も懸念されているが、これまで地下熱環境への評価はほとんどなされていない。本研究では、関東平野を対象に自然状態の地下環境を把握する調査を実施し、これを基に環境負荷を最小化する最適設置法およびシステム普及に伴う地下熱環境の変化を監視するための地下熱監視手法を検討することを目的とした。本成果を活用することにより長期的な都市計画やエネルギー政策の立案に役立つ適切なシステムの普及支援が可能となる。地下温度変化を監視する方法として、地盤沈下観測井などの内部に精密な温度計を設置することでその変化をモニタリングする手法があり、これまで地下温暖化を把握する研究で用いられている。そこでこの方法を地中熱システムによる温度の監視にも活用可能かを本研究で検討した。具体的には数値実験を活用し地中熱利用システムによる熱拡散シミュレーションを行った。この検討には、関東平野で測定した自然状態の地下温度データも基礎情報として活用した。その結果、地中熱システムによる影響は、120日間の運転では熱交換井から数メートルの範囲に留まることが分かった。一般に地盤沈下観測井は熱交換井から数km以上離れたところに位置しているためこの手法で監視することは難しい。そこでこの手法に代わる方法を本研究で新たに提案した。その方法は地中熱交換のU字パイプ内の出入口温度と流量をモニターし、地中へ排熱または採熱を熱源による熱量で監視し、場所ごとに適正な基準を設ける方法である。将来的には無線通信回線を通じて影響を監視するデータセンターへ逐次情報を送信することで広域的な地中の熱環境の監視も可能である。地中熱利用システムの熱的影響を評価するうえで、広域的な地下水流動・熱輸送解析を行うことが重要である。次年度は、関東平野全域を対象としてこの解析を行う。関東平野における地下水流動解析については小泉他の既存研究があり、本研究はこれをベースとしたモデルを作成する。ただし既存研究には、熱輸送についての解析項目が含まれていないため、本研究で新たに解析を行う。地下水・熱輸送解析をおこなうためには、基礎データの収集が必要不可欠であることから、今年度前半で1関東平野における地下水位データ(国土交通省や環境省、自治体等)2井戸の揚水量データ(自治体等)等を収集する。また最終年度の評価では社会的な視点から評価を行う予定であることから1社会統計データ(土地利用、人口分布等)
KL-6分子測定法の樹立と間質性肺炎における臨床的有用性に関する研究

昨年度には、KL-6分子上に存在してKL-6抗体の認識する抗原決定基とは異なる抗原決定基に反応するモノクローナル抗体を樹立し選択していたが、今年度は、その内のHK-7抗体を最終的に選択して間質性肺炎の臨床診断における有用性について検討を加えた。HK-7抗体はIgMに属し、KL-6分子の糖鎖ではなく、蛋白部分に結合活性を有していることが示唆された。また、HK-7抗体を固相抗体としKL-6抗体を標識抗体としてサンドイッチ酵素抗体法によって検出されるKL-6亜分子をPEP-76分子と命名した。具体的な測定法はKL-6分子の測定法と同じく、96穴の酵素抗体法用のマイクロテストプレートを用い、HK-7抗体の濃度は10μl/mlで行った。KL-6抗体はKL-6分子の測定系と同じ濃度で使用した。すべての測定において、標準抗原を同時に測定し、検体中のPEP-76抗原値を標準化し、KL-6血に換算してその値はU/mlで表した。健常者51名、特発性間質性肺炎患者13名、サルコイドーシス患者12名から得た血清中のPEP-76抗原値を測定した。健常者におけるPEP-76値は中央値0.9(0.9-3.9)U/ml、特発性間質性肺炎患者では中央値54(0.9-580)U/ml、サルコイドーシスでは中央値1(0.9-13)U/mlであった。推計学的に特発性間質性肺炎とサルコイドーシスではいずれも健常者に比して有意に高値を呈した。健常者の値の対数値の分布から対数値の平均値+2SD値の実数値2.7U/mlを正常上限値とした。PEP-76の健常者のおける陽性率は5.9%、特発性間質性肺炎で92%、サルコイドーシスで33%であった。同一患者でのKL-6の陽性率に比し、特に特発性間質性肺炎での陽性率が高かった。以上の結果から、PEP-76は間質性肺炎の新たな血清マーカーとして有望であると思われた。KL-6は、私達の作製したマウスモノクローナル抗体であるKL-6抗体により検出されるものである。KL-6は、高分子の糖タンパクであり、KL-6抗体はそのシアロ糖鎖に結合する。「国際肺癌研究協会(IASLC)の第3回肺細胞抗原に関するワークショプ」において、膨大な数の病理組織および各種培養細胞に対するKL-6抗体の反応性から、KL-6はクラスター9に分類された(Int J Cancer,Suppl 8,1994)。クラスター9はMUC1(ヒトムチンの1)であるが、ヒトのムチンは現在まで7種が知られており、MUC17は命名されている。しかしながら、IASLCの成績は、あくまで免疫組織細胞学的検討によるものであって、KL-6分子そのものを検討したものではない。平成6年度には、抗体アフィニティーカラムとHPLCを用いて癌患者腹水からKL-6分子を精製した。精製KL-6分子のアミノ酸分析と糖分析の結果は、過去にMUC1として報告されているHMFG-1やDF3分子と類似しており、分析化学的にも、KL-6はMUC1であることが判明した。

ムチンには多数の糖鎖が結合しているため、KL-6もまた極めて多様な亜分子から構成されていることを報告してきており、すでにKL-6分子中、癌細胞特異性の高い分子としてLISA-6とCAM123-6が存在することも報告している。平成6年度には、KL-6分子の中で、間質性肺炎において、より特異的に発現される亜分子に反応するマウスモノクローナル抗体を作製する目的で、間質性肺炎患者の剖検肺および生検肺をBALB/cマウスに免疫し、その脾細胞とマウス骨髄腫細胞を細胞融合し、融合細胞を作製した。今後、血清中のKL-6との反応性を検討していく。昨年度には、KL-6分子上に存在してKL-6抗体の認識する抗原決定基とは異なる抗原決定基に反応するモノクローナル抗体を樹立し選択していたが、今年度は、その内のHK-7抗体を最終的に選択して間質性肺炎の臨床診断における有用性について検討を加えた。HK-7抗体はIgMに属し、KL-6分子の糖鎖ではなく、蛋白部分に結合活性を有していることが示唆された。また、HK-7抗体を固相抗体としKL-6抗体を標識抗体としてサンドイッチ酵素抗体法によって検出されるKL-6亜分子をPEP-76分子と命名した。具体的な測定法はKL-6分子の測定法と同じく、96穴の酵素抗体法用のマイクロテストプレートを用い、HK-7抗体の濃度は10μl/mlで行った。KL-6抗体はKL-6分子の測定系と同じ濃度で使用した。すべての測定において、標準抗原を同時に測定し、検体中のPEP-76抗原値を標準化し、KL-6血に換算してその値はU/mlで表した。健常者51名、特発性間質性肺炎患者13名、サルコイドーシス患者12名から得た血清中のPEP-76抗原値を測定した。健常者におけるPEP-76値は中央値0.9(0.9-3.9)U/ml、特発性間質性肺炎患者では中央値54(0.9-580)U/ml、サルコイドーシスでは中央値1(0.9-13)U/mlであった。推計学的に特発性間質性肺炎とサルコイドーシスではいずれも健常者に比して有意に高値を呈した。健常者の値の対数値の分布から対数値の平均値+2SD値の実数値2.7U/mlを正常上限値とした。PEP-76の健常者のおける陽性率は5.9%、特発性間質性肺炎で92%、サルコイドーシスで33%であった。同一患者でのKL-6の陽性率に比し、特に特発性間質性肺炎での陽性率が高かった。以上の結果から、PEP-76は間質性肺炎の新たな血清マーカーとして有望であると思われた。
前頭連合野-運動野神経回路における行動系列学習機構のモデル解析

脳神経系は学習・訓練によって感覚刺激に対して数百ミリ秒で適切な行動を生成できるようになる.この高速情報処理を可能にする神経機構として我々は細胞の発火潜時の差による競争機構の仮説を提唱してきた.本年度は仮説から導かれる予測を考察し実験データとの対応を検討した.実験データ(Oram and Perrett 1992):無麻酔サルに異なる顔の写真を見せて計測した上側頭溝の細胞応答.モデル:実験でのサルの課題は視覚形状認識である.視覚神経路の側頭葉腹側路V1-V2/V3-V4-PIT-CIT-AIT-STPaのモデルを構成した.シミュレーション:サルは実験開始以前に顔の視覚刺激を学習していたと仮定し、まずモデルに学習をさせる,すなわちV1野の細胞集団配列を異なる6パタンで興奮させながら領野間結合を強化する.STPa野の細胞が有為な応答を示すようになった時点で実験と同様の細胞応答記録を行った.結果:〔予測1〕本仮説は,刺激に興奮する感覚野の細胞群からその刺激で求められる行動を生起する運動野の細胞群への神経路が学習で強化され,神経興奮は強化された経路を最初に伝播すると考える.仮説が正しいならば各領野では強化経路を伝わる最大応答が最初に現われなければならない.この予測はシミュレーションとサル実験データの両方で裏付けられた.〔予測2〕脳内には感覚刺激による神経興奮以外に多様なノイズが存在する.神経情報処理機構はこのノイズに対する頑健性をもつことが必要である.本仮説では神経系が細胞集団の発火割合を変数として信号を伝えるとする.この頑健性をモデルで確かめた.すなわち,シミュレーションではすべての細胞の活動の同時記録ができる.すべての細胞が9ヘルツの自発発火をする系で異なる感覚野刺激による細胞集団間の発火潜時の差は試行毎に不変であった.脳神経系は学習・訓練によって感覚刺激に対して数百ミリ秒で適切な行動を生成できるようになる.この高速情報処理を可能にする神経機構として我々は細胞の発火潜時の差による競争機構の仮説を提唱してきた.本年度は仮説から導かれる予測を考察し実験データとの対応を検討した.実験データ(Oram and Perrett 1992):無麻酔サルに異なる顔の写真を見せて計測した上側頭溝の細胞応答.モデル:実験でのサルの課題は視覚形状認識である.視覚神経路の側頭葉腹側路V1-V2/V3-V4-PIT-CIT-AIT-STPaのモデルを構成した.シミュレーション:サルは実験開始以前に顔の視覚刺激を学習していたと仮定し、まずモデルに学習をさせる,すなわちV1野の細胞集団配列を異なる6パタンで興奮させながら領野間結合を強化する.STPa野の細胞が有為な応答を示すようになった時点で実験と同様の細胞応答記録を行った.結果:〔予測1〕本仮説は,刺激に興奮する感覚野の細胞群からその刺激で求められる行動を生起する運動野の細胞群への神経路が学習で強化され,神経興奮は強化された経路を最初に伝播すると考える.仮説が正しいならば各領野では強化経路を伝わる最大応答が最初に現われなければならない.この予測はシミュレーションとサル実験データの両方で裏付けられた.〔予測2〕脳内には感覚刺激による神経興奮以外に多様なノイズが存在する.神経情報処理機構はこのノイズに対する頑健性をもつことが必要である.本仮説では神経系が細胞集団の発火割合を変数として信号を伝えるとする.この頑健性をモデルで確かめた.すなわち,シミュレーションではすべての細胞の活動の同時記録ができる.すべての細胞が9ヘルツの自発発火をする系で異なる感覚野刺激による細胞集団間の発火潜時の差は試行毎に不変であった.
眼球反射と随意眼球運動の学習の脳内機構とその関連分子の検索

小脳のシナプス伝達可塑性や神経回路形成に異常が認められる3種類の遺伝子操作マウス(神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)欠損マウス、代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)欠損マウス、C-キナーゼγサブユニット(PKC-γ)欠損マウス)を用いて、前庭動眼反射(VOR)や視機性眼球反応(OKR)の動特性と適応の評価を行った。nNOS欠損マウスとmGluR1欠損マウスでは、眼球反射の動特性は野生型マウスと差はなかったが、適応は消失しており、スライス標本における長期抑圧の消失の報告に対応すると解釈された。PKC-γ欠損マウスでは、眼球反射の動特性に異常が見られるとともに、反射の適応が減弱していた。PKC-γ欠損マウスでは長期抑圧は正常との報告があり、眼球反射の適応の異常の原因として、小脳以外の脳部位の異常も考えられ、現在生理学的及び解剖学的に検討中である。小脳が運動記憶の保持の場であることを検証するために、サルの小脳片葉をシャットダウンした時に眼球反射の適応が影響されるか調べた。前庭動眼反射の適応のパラダイムを用いて利得に適応を生じさせた直後、両側片葉に10%塩酸リドカインを局所注入し活動をシャットダウンしたが、1例目のサルでは、シャットダウンしない場合に比べ利得の低下が速やかにおこることが観察された。現在さらに例を追加し同じ現象が観察されるかどうか検討中である。
19世紀ドイツ中等技術教育の制度的発展とその地域比較に関する研究

平成18年度の研究により明らかとなったことは次の点である。1.19世紀バーデン小営業政策は、経済的自由主義原則のもと、職業教育を軸に展開された。教育をつうじた市民層の育成とそれを基盤とした経済の近代化が目指され、1834年に営業教育が開始された。2.1840年代には、「中間層保全」論が台頭するが、経済過程への直接の国家介入は排除され中間層保全という政治的目的は概ね経済的自由主義の枠のなかで追求された。3.中間層保全論の思想的基盤をなしたのは、この地の経済に支配的な小農・小営業を社会的基盤とする「西南ドイツ自由主義」であった。それは、封建的身分制社会の解体を強烈に指向したが、その後に来る市民社会の実質的担い手を小農民・小営業者等からなる中間層に求め、彼らの経済的基盤を掘り崩すと考えちれた営業自由の全面導入に反対した。しかしその政策提案は、従前のツンフト制度への復帰を指向する保守主義者のそれではなく、むしろ中間層の近代的経済発展過程への適応を促すという意図に基づくものであった。4.西南ドイツ自由主義を思想的基盤とする中間層保全論が1840年代に直面したのは、18世紀後半から続く全ヨーロッパ的人口増加を背景とする、農村を舞台とした小営業の拡大とその窮乏化という事態であり、その解決こそがバーデン小営業政策には求められていた。平成16年度の研究により明らかとなったことは次の点である。1,バーデン中等技術教育の発展はとりわけ営業補習学校において顕著であり、主として手工業者から構成される営業協会がその設置・運営主体となった。営業協会に結集した手工業者は伝統的徒弟制度の制度的厳格さや既存の手工業的技能に固執する傾向が弱く、新技術・技能に対して積極的な教育需要をもった。こうして営業協会により推進された営業補習学校設立運動に、政府は19世紀後半に入ると積極的に関与するようになり、バーデンの営業補習学校は質的量的な発展をみた。2,これに対してザクセンでは、営業協会等の手工業者団体は職業学校の設立を推進したものの、政府はこれに積極的に関与することはなかった。そのため職種を越えた技術教育の場である営業補習学校は普及せず、営業団体を設立母体とする職業専門学校が発展することになった。3,ヴュルテンベルクの場合には、政府は職業教育の担い手として営業協会を産業振興政策の中に意識的に取り込み、体系的な中等技術教育制度を構築した。4,こうして南ドイツの各領邦には、職業教育に対する政府の関与の仕方に差はあるものの19世紀後半から本格的に営業補習学校、専門学校を発展させることになった。営業補習学校では一般的に製図教育が重視され、これと技術的関連性の強い職種において重要な教育的意義をもった。専門学校の場合、各領邦ごとにその組織的教育的実態は多様であるが、バイエルン、ザクセンでは補習学校への通学義務の免除措置として専門学校への通学が定められ、製図技術を必要としない様々な職種にも専門学校が普及した。平成17年度の研究により明らかとなったことは次の点である。1.1830年代に始まるバーデン営業教育(中等技術教育)は、「営業学校」と「徒弟作業場」をつうじて既存の手工業徒弟制度を近代的に再編し、19世紀末ドイツ中間層政策の展開に実践的基盤を提供した。2.しかし、前三月革命期バーデンの営業教育・政策は、通説に反して、反自由主義(ツンフト擁護)的性格のものではなく、教育をつうじて市民層を育成し、これを基盤にバーデン経済の近代化を目指す当地の経済的自由主義に、一つの思想的基盤を見いだすことができる。3.さらに、18世紀末以来の全ヨーロッパ的過剰人口問題は、バーデンにおいては「農・工業の縺れ合い」、農村小営業の拡大として現象し、このことが当地の営業教育・政策展開の重要な社会経済的背景をなした。4.すなわち、「国家市民」、「国家の柱石」としての使命をバーデンの自由主義者により付与された中間層のなかで、経済的独立の基盤をもたず、小土地と結びつくことで再生産可能となる小営業者が多数を占めるようになると、自由主義者の間で「中間層保全」論が台頭する。バーデンの自由主義者は、政治的には封建的身分制社会の解体を強烈に指向する一方で、その後に来る市民社会の実質的担い手を小農民、小営業者等からなる中間層に求め、彼らの経済的基盤を崩壊させると考えられた営業自由のバーデンへの機械的導入に反対する。そしてツンフト制度の近代的再編により「国家市民」たる手工業者エリートの育成を目指すのである。5.以上のような社会経済的思想的背景のもとで生成・発展したバーデンの営業教育は、小営業の自助と近代化を推進するものであり、バーデン経済を資本主義的に発展させることで、農村小営業の拡大・窮乏化という前三月革命期バーデンの「社会問題」に対処しようとしたものと評価することができる。

3.中間層保全論の思想的基盤をなしたのは、この地の経済に支配的な小農・小営業を社会的基盤とする「西南ドイツ自由主義」であった。それは、封建的身分制社会の解体を強烈に指向したが、その後に来る市民社会の実質的担い手を小農民・小営業者等からなる中間層に求め、彼らの経済的基盤を掘り崩すと考えちれた営業自由の全面導入に反対した。しかしその政策提案は、従前のツンフト制度への復帰を指向する保守主義者のそれではなく、むしろ中間層の近代的経済発展過程への適応を促すという意図に基づくものであった。4.西南ドイツ自由主義を思想的基盤とする中間層保全論が1840年代に直面したのは、18世紀後半から続く全ヨーロッパ的人口増加を背景とする、農村を舞台とした小営業の拡大とその窮乏化という事態であり、その解決こそがバーデン小営業政策には求められていた。
公共財供給メカニズムの性能と均衡戦略の学習可能性:理論的・実験的研究

本研究では,ピボタル・メカニズムの性能とGroves-Ledyardメカニズムの下での均衡戦略の学習可能性について実験経済学手法を用いて研究し,次の2点を明らかにした。(1)厳密に凹の評価関数の下で連続的に変化する公共プロジェクトの規模決定問題に適用されるピボタル・メカニズムは,支配戦略である真実表明以外には最良反応が存在しない利得構造を実現でき,支配戦略の適合的学習を促す上で優れた性能を発揮する。(2)Groves-Ledyardメカニズムにおいて,個人の戦略選択行動のNash均衡への収束を図るために罰則パラメータの値はsupermoduralityの充足を要求するほど高い水準に設定される必要はなく,Nash行動下での収束条件の下限を超える値で十分収束が可能である。ピボタル・メカニズムは理論的には真実表明が高い割合で観察されると期待されているが,固定規模の公共プロジェクト実施の可否決定問題に適用されるピボタル・メカニズム(離散型P脳)に関する実験研究では低い真実表明率しか得られていないことが過去の研究によってわかっている。本研究の目的は,連続的に変化しうる公共プロジェクトの規模決定問題に適用したピボタル・メカニズム(連続型PVM)に関する需要表明実験を実施し,意思決定主体が戦略の選択とその結果得られる利得とのフィードバックに基づく学習過程を経ることによって、真の需要表明が支配戦略であることを見出し,ピボタル・メカニズムの真実表明が高い割合で観察されるとする理論的期待が実証的に裏付けられるか否かを検証することである。離散型PVMでは,支配戦略を選択しても他の戦略を選択しても利得が同一となるフラットな利得構造部分が存在する。そのため,自己と他の主体の様々な戦略の組合せの下での利得を試行錯誤的に探索し,支配戦略を見いだそうとする意志決定主体にとって,支配戦略を見出すことは困難であると考える。本研究では,フラットな部分のない利得構造を実現するため,戦略の範囲を真のパラメータ値を含む比較的少数の値に限定し,ピボタル・メカニズムの利得関数がsuperm。dularityを満たすよう実験モデルを設計し,試行実験を行った。離散型P四実験では,探索により真実表明が支配戦略であることを認識できたと判断できる被験者は全体の4割弱にとどまるのに対し,連続型P脳実験では,探索により真実表明が支配戦略であることを認識できたと判断できる被験者は全体の7割強に達することがわかった。このような実験結果は,フラットな部分を持たない連続型PVMの利得構造が意志決定主体の探索行動による支配戦略の認識を容易にするというわれわれの見解の妥当性を実証している。固定規模の公共プロジェクトの実施の可否決定問題に適用されるピボタル・メカニズム(離散型PVM)と連続的に変化しうる公共プロジェクトの規模決定問題に適用されるピボタル・メカニズム(連続型PVM)の性能を比較するための実験を行い,次のことを明らかにした。離散型PVMは真実表明は支配戦略であるが,一意的な最良反応ではなく,他の意思決定主体の戦略が一定であっても,支配戦略を選択した場合と他の戦略を選択した場合とで利得が同一となるフラットな利得構造部分が存在するのに対し,連続型PVMでは,公共プロジェクトの規模に関する個人の評価関数を厳密な凹関数に限定する限り,フラットな部分のない利得構造が実現できることを明らかにした。戦略の選択と自己の利得との対応関係から支配戦略を適合的に学習しようとする個人にとって,この利得構造の相違が,離散型PVMでは支配戦略を学習することは困難であるが,連続型PVMでは容易にさせていると考え,これを検証するために戦略選択の繰り返しを行う実験を行った。実験結果より,連続型PVMにおける支配戦略への収束の頻度や速度は,離散型PVMに比べて非常に高いということがわかった。さらに支配戦略の適合的学習過程を,Myopicな学習過程(前回の利得が前々回の利得以上であれば前回の戦略を変更せず,低ければ変更するという判断にもとづく行動)とHeuristicな学習過程(過去の最大利得を得た回数が多く,最小の利得を得た回数が少ない戦略を選択する行動)に特定化し,2つの学習過程を想定したコンピュータ・シミュレーションを実験と同様の意思決定環境の下で行い,実験結果と整合的な結果を得た。これらの結果は,離散型PVMに対して連続型PVMが支配戦略(真実表明)の適合的学習を促す上で優れた性能を発揮することを示していると結論づけた。本研究の連続型PVMの実験は,Milgrom and Robertsの示した定理(利得関数がsupermodularityを充たすゲームにおいては,プレーヤが適合的学習プロセスに従って戦略を修正して行くならば,そのゲームのNash均衡への安定的な収束が保証される)を特定のケースにおいて検証したと言える。公共財の効率的供給を達成する上でのNash遂行メカニズムの機能を保証するNash均衡戦略

学習プロセスの探求を本年度の研究目的とし,Nash遂行メカニズムの代表的なメカニズムであるGroves-Ledyardメカニズム(GLメカニズム)のもとで,Nash均衡へのメッセージの収束状況と罰則パラメータの値との関連性を調べるため実験を行い,次のことを明らかにした。2次の公共財評価関数を組み込んだ準線形の効用関数をもつ個人が,Nash行動(Cournot-Nash最良反応動学)に従ってメッセージの選択を行う場合,メッセージがNash均衡に収束し,Pareto効率的配分が達成されるための条件を罰則パラメータγの範囲として導出し,γの下限γcはGLメカニズムがsupermoduralityを満たすための条件としてY.Chenが示したγの閾値γsを下回ることを明らかにし,その上で,罰則パラメータγを3つのケース(0<γ<γc,γc<γ<γs,γs<γ)に設定した実験を行った。実験の結果,どの設定においても,意思決定ラウンドの後半にはNash行動が一般的となることを確認し,0<γ<γcと設定した場合にはNash均衡へのメッセージの収束は期待できないが,γs<γと設定した場合のみならず,γc<γ<γsと設定した場合においても,大部分の実験セッションでNash均衡へのメッセージの収束が観察されるという実験結果を得た。このような結果は,罰則パラメータγの設定に関して,Chenの示した閾値γsよりも下恨γcの方がより重要な意味を持つことを示唆している。また,個人の数(経済規模)が大きくなる場合や個人合理性の充足や応益性の観点からみた公平性の確保の問題を考慮した場合,γを高く設定することが,GLメカニズムの性能を低下させる可能性があると言える。
免疫不全ラットにおける移植および遺伝子治療モデル作製

ラットの多能性幹細胞を用いてIL2レセプターγ遺伝子を相同組み換えにより変異を加えX連鎖重症複合免疫不全症(X-SCID)のモデルラットを作成した。作成したX-SCIDラットは、血液中のT細胞、B細胞、NK細胞が著しく減少し、胸腺も著しく萎縮した重症免疫不全症であった。X-SCIDラットはヒトの造血幹細胞の移植生着は認められなかったが、ヒトの腫瘍細胞やマウスの造血幹細胞の細胞移植のモデル動物として有用であることが示唆された。平成23年度に作成したIL2rg KOラットの表現型と発現解析の結果から免疫不全であることが証明され、「X-SCIDマウス」とほぼ同様の表現型を示していたことが示された。平成24年度は、平成23年度に行ったIL2rg KOラットが免疫不全を呈していたことを基に昨年に引き続き、異種動物の細胞、腫瘍などのin vivo cultureを行った。その結果、皮下へのヒト腫瘍細胞、ヒトiPS細胞の生着を認めた。造血幹前駆細胞移植については、移植条件の検討中である。また、X-SCIDラットを用いた遺伝子治療モデルの確立のためのIL2rg遺伝子のcDNA作成、ベクター構築を行っている。平成23年度は、IL2rg KOラットを作成し、その表現型と発現解析の結果から免疫不全であることが確認された。このIL2rg KOラットは「X-SCIDマウス」とほぼ同様の表現型を示していることが確認された。平成24年度は、IL2rg KOラットが免疫不全を呈していたことから、引き続き異種動物の細胞、腫瘍細胞などのin vivo cultureを行った。皮下移植においてマウスおよびヒト由来腫瘍細胞の生着を認めた。平成25年度は、X-SCIDラットを用いた遺伝子治療モデルの確立のためのIL2rg遺伝子のcDNA作成およびウイルスベクターの構築を行った。また、同種であるラット造血幹・前駆細胞移植の条件を検討した。さらに、平成23年度より引き続き異種動物細胞移植のうち造血幹・前駆細胞の移植を行った。IL2rg KOラットは、放射線照射において野生型と同様の感受性を示した。異種であるマウスの骨髄造血幹・前駆細胞移植を行った結果、野生型ラットでは放射線照射の有無にかかわらず生着しなかったが、IL2rg KOラットにおいては放射線照射をしない群では全く生着しなかったが、放射線照射をした群ではマウス造血幹細胞が生着し4か月以上にわたり末梢血中の90%以上がマウス由来の血液細胞であることを確認した。このことから、IL2rg KOラットは放射線照射を行わないと移植した骨髄細胞が生着しないことが確認された。一方、ヒト臍帯血由来造血幹・前駆細胞移植では同様の放射線照射量では生着しなかった。また、新生仔ラットにおいて薬剤処理を行ったが同様にヒト臍帯血は生着しなかった。平成23年度は、X-SCIDラットの作成ならびに表現型および発現解析を行うことを目標とした。成果)1、X-SCIDラットの作成:ラットIL2レセプターγ遺伝子に変異(IL2rgKO)を加えたgermline transmission可能なES/iPS細胞をWild typeラットのBlastcystにinjectionし、作成したキメララットから得られたfounderのgenotypeをPCR,サザンブロット法により解析した。その結果、IL2rgKO /ES細胞由来ラットを得たので、このラットを繁殖し、今後の解析およびモデルラットとして実験に用いることとした。2、表現型および発現解析:末梢血および骨髄、脾臓、胸腺中の白血球分画比をフローサイトメトリー法により解析した結果、野生型に比べIL2rgKOラットではT細胞,B細胞,NK細胞の欠損あるいは著しい減少が認められた。この現象はX-SCIDマウスとほぼ同様の表現型を示していた(SugamuraらBlood, 1996,)。3、異種動物種の細胞移植(ヒト化ラットへの可能性):異種動物の細胞、腫瘍などのin Vivo cultureの可能性を検証するために、X-SCIDラットにヒトの腫瘍細胞セルラインを皮下に移植し、腫瘍の生着増殖を検討した。その結果、野生型では腫瘍形成は認められなかったが、IL2rgKOラットでは移植後3週間までに皮下に腫瘍の形成を認めた。また、異種の造血細胞等の移植を行うに当たり、adultのIL2rgKOラットの放射線照射量とマウス造血細胞移植の生着率について検討した結果、野生型では照射量に関係なく移植生着は認められなかったが、IL2rgKOラットでは放射線照射をした方がマウス造血細胞の生着率が高くなることが示された。ヒト細胞、同種移植についても現在行っている。昨年に引き続き、異種動物の細胞、腫瘍などのin vivo cultureを行った。X-SCIDラットを用いた遺伝子治療モデルの確立のためのIL2rg遺伝子のcDNA作成、ベクター構築を行っている。

X-SCIDラットの作成ならびに表現型および発現解析を行い、IL2rgKOラット作成の成功を示した。また、このラットにおける、異種動物の細胞移植が成立することを確認したことから、平成23年度の計画はおおむね順調に達成した。1、異種動物の細胞のin vivo cultureの可能性を検証するために、引き続き異種動物の細胞移植を行う。2、X-SCIDラットを用いた遺伝子治療モデルの確立のためのIL2rg遺伝子のcDNA作成、ベクター構築、並びに遺伝子導入を行う。1、異種動物の細胞、腫瘍などのin Vivo cultureの可能性を検証するために、引き続き異種動物の移植を行う。2、X-SCIDラットを用いた遺伝子治療モデルの確立のためにレトロウイルスベクターの構築を行う。培養、試薬、動物購入、飼育維持、外部発表を行う培養、試薬、動物購入、維持、外部発表等を行う
リン回収技術を様々な環境へ適用するための多様なポリリン酸蓄積細菌の集積培養条件

生物学的リン除去において重要な役割を担う微生物として,ポリリン酸蓄積細菌(PAOs)の存在が知られている.未だ分離株が得られていないミステリアスな微生物であるが,様々な特徴を有したグループが存在している事が知られている.ポリリン酸合成酵素(ppk 1)遺伝子に基づく分類で,PAOsは環境中において十数グループ近くの多様性を有し,脱窒能力の有無といった違いがある事も報告されている.このppk1遺伝子はリンがほとんど存在しない干潟や湖沼,河川からも回収されている.よって,そのような自然環境で存在するPAOsグループを集積培養する事ができれば,高塩分環境や湖沼等の低リン濃度環境からリン回収の夢が広がる.しかしながら,PAOsの集積培養は難しく,多くのPAOsグループの至適培養条件は全く明らかになっていない.本研究では,DHSバイオリアクターを用い脱窒性PAOs,高リン親和性PAOs,海洋性PAOsについて至適培養条件を明らかにする.平成25年度には,脱窒性PAOsの至適嫌気-好気(無酸素)時間の長さについて調査した.嫌気2-8、無酸素4-16時間で培養を行い,嫌気3,好気10時間でPAOs優占率が最大化する事を明らかにした(全細菌の48%).また,海洋性PAOsの特性や系統学的位置を明らかにするために,活性汚泥と干潟底泥をそれぞれ種植源とし、海水基質を用いて培養を行った.その結果,種植源が活性汚泥の場合は海水でリン除去できなかったのに対し,干潟底泥を用いた場合にはリン除去を達成する事ができた.高塩分廃水からのリン除去はこれまで達成できていなかったが,干潟底泥を種植する事でリン除去が達成出来るようになる可能性が示された.クローニングによる微生物解析を行った結果,この海洋性PAOsのppk1遺伝子はこれまでに報告されていない新規PAOsグループに属していた.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。