hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化器癌におけるｌｉｎｃＲＮＡの網羅的発現解析ならびに機能解析

これらのlncRNAの発現と、臨床病理学的因子との相関も比較したが、有意な相関はみられなかった。平成27年度はがん研有明病院で、直腸癌術前化学放射線療法の感受性予測マーカーとしての血清中lncRNAの有用性について検討した。術前化学放射線療法前に採取した血清サンプルからRNAを抽出し、まず、大腸癌患者血清に存在するとされるHOTAIRをreal-time PCRで解析しようと試みた。しかし、発現量が極めて少なく、定量解析は不可能であった。まとめると、平成25年度から27年度にわたって、消化器癌患者の組織中、血清中に存在するlncRNAを解析し、新たなバイオマーカーや治療感受性予測マーカー、治療標的となりうるかどうかを検討してきた。しかしながら、解析したlncRNAのなかでは有望な結果を導き出すことができなかった。消化器癌切除検体を用いて、正常組織、癌組織中のlncRNA(HOTAIR、Malat1、MEG3、GAS5)の発現をreal-time PCRで解析した。HOTAIRは食道癌、胃癌、大腸癌で正常粘膜よりも癌組織で発現が上昇していたが、Matat1、MEG3、GAS5は正常粘膜、癌組織で一定の発現変化はみられず、臨床病理学的因子、予後との相関もみられなかった。次に、血清中のlncRNAを解析するため、大腸癌患者血清を用いたが、発現量が極めて少なく、定量解析は不可能であった。本解析では、消化器癌におけるlncRNAを解析したが、新たなバイオマーカーを見つけることはできなかった。平成25年度の研究計画では1)消化器癌切除検体からのtotal RNA抽出、2)lncRNA発現の網羅的解析、3)lncRNAの発現と臨床病理学的因子、予後、治療効果との相関の検討を予定していた。また、その結果をもとにして平成26,27年度は、標的lincRNAの細胞生物学的機能解析、lincRNAの発現制御機構の解明、標的遺伝子の同定を予定していた。しかし、これまでのところ、消化器癌に特異的に発現し、新たなバイオマーカー、治療標的となりうるようなlincRNAの同定に至っていない。したがって、そこからのlincRNAの機能解析、標的遺伝子の同定もできていない現状である。平成25年度は九州大学で、平成26年度は熊本大学で研究を行った。九州大学でreal-time PCRによるlincRNAの測定を行い、手技的に安定した結果を得られるようになった。しかし、熊本大学でその結果の再現性を得るために同様の実験を行ったが、実験環境が変わり、手技の安定にやや時間を要したため、研究の進捗に遅れが生じてしまった。消化器癌の外科治療平成27年度はがん研有明病院で研究を推進する。これまでは消化器癌として食道癌、胃癌、大腸癌におけるlincRNAの解析を行ってきたが、平成27年度は大腸癌に絞って解析を進めていく予定である。がん研有明病院では、大腸癌手術症例数が多く、切除検体はすべて凍結保存されている。また、血清サンプルも利用可能である。そこで、多数例の大腸癌組織だけでなく、大腸癌患者血清中のlincRNA解析を行い、新規バイオマーカー検索を行いたいと考えている。特に、術前化学放射線療法を行った進行直腸癌症例の治療前後の血清サンプルが利用可能であり、化学放射線療法の感受性予測マーカーとなり得るlincRNAを同定したいと考えている。
沈降粒子フラックスと海洋環境変動

日本学術振興会の科学研究費基盤研究(B)による補助金を使用して、以下の研究を推進する事ができた。ベーリング海、北太平洋中部亜寒帯海域、北太平洋亜寒帯西部海域および西・中部赤道太平洋海域においてセディメント・トラップを使用して得られた時系列海洋生物源粒子フラックス試料を中心に解析を進めた。北太平洋亜寒帯海域での生物源粒子フラックスは、ベーリング海と西部亜寒帯で高く、中部亜寒帯海域では比較的低い値を示した。これらのデータにより過去に計測された東部亜寒帯のアラスカ湾でのフラックスは、もっとも低いグルーブに位置する事も分かり、亜寒帯海域全体の生物生産レベルの掌握に寄与した。また、生物ポンブの稼働状況の2海域での比較は、ベーリング海が著しく高く、中部亜寒帯海域がそれに続くレベルで稼働している様子が分かり、CO_2の大気から表層水への移動を示唆する結果が得られた。ベーリング海及び北太平洋中部亜寒帯海域において、長期時系列セディメント・トラップ沈降粒子フラックス試料を継続収集してきた。これらの時系列試料のうち2002年7月-2005年7月分に関しては、解析が行われていなかった。このうち平成17年度には、基本情報である全乾燥重量、生物源オパール、炭酸カルシウム、有機物、岩石源物質の項目データの取得を終了した。また、今年度には試料保存用冷蔵装置を購入し、時系列沈降粒子試料の分割を促進し、今後の適切な分析・解析のために試料の保存整理を行った。また、中部亜寒帯海域との比較の為、1997-2000年に得られた北太平洋亜寒帯西部海域のStations KNOT,40°,50°,および2001-2003年に回収されたStations K1,K2,K3のセディメント・トラップ試料のうち珪藻、珪質鞭毛藻、レディオラリア(放散虫)フラックスについての研究を推進した(次ページの成果リスト参照)。更に、西・中部赤道太平洋沈降粒子フラックス試料(平成10-14年度に行われた文部科学省科学技術振興調整費総合研究炭素循環に関するグローバルマッピングとその高度化に関する国際共同研究)のうち未解析の試料に関しても解析を推進した。特に珪藻およびレディオラリア群集フラックスに関しての分析・解析に力を入れて来た。従来行った1999-2000年の時系列試料の解析では、海洋環境はラニーニャ状態であったのに対し、今回解析を行った2001-2003年の時系列試料はエルニーニョ状態で得られたものであった。これらの異なる環境で生産された生物群集およびその沈降フラックスには、著しい違いが認められた。さらに珪藻およびレディオラリア群集フラックスの中には、これらの海況の指標となる種が含まれていた。これらの有用な結果を公表すべく現在出版に向けての作業中である。平成18年度には、北太平洋中部亜寒帯におけるセディメントトラップの揚集ならびに、北太平洋中部亜寒帯およびべ一リング海の2定点でのトラップ係留を行った。採取したセディメントトラップ試料に関して以下の分析ならびに解析を行った:全重量、炭酸カルシウム、生物源オパール、有機物のフラックス分析、および珪藻の種構成の解析を行った(次ページ研究成果参照)。2005-2006年にかけての北太平洋中部亜寒帯でのフラックスは比較的低く、今までの平均値以下の数値が記録された。珪藻フラックスに関しては、1990-1998年の8年分のフラックス変動の解析を行い月刊海洋にその解析結果を発表した(次ページ研究成果参照)。珪藻の種構成やフラックス値で見る限り顕著なフラックス増加や減少は見えないものの、珪藻種の含有率(%)に関して、増加するものと減少するものが僅かに見い出された。これが、即地球温暖化現象に対比できるかどうかは、今後の年次を追っての試料解析によるところが大きく、継続して観測を行う予定である。また、中部亜寒帯海域との比較の為、JAMSETC本多牧生博士らの努力によって1997-2000年に得られた北太平洋亜寒帯西部海域のStations KNOT,40°,50°,および同博士により2001-2003年に回収されたStations K2のセディメント・トラップ試料のうち珪藻、珪質鞭毛藻、レディオラリア(放散虫)フラックスについての研究も推進した。Stations K2の研究は、主として学部4年生3名の卒業研究の一環として行ない、現在日本海洋学会誌の「海の研究」に論文投稿を目指して準備中である。

GCMAPS計画で赤道海域にて過去に取得した時系列トラップ試料について、2002および2003年に得られたエルニーニョ期時系列試料を中心に分析およびデータ解析を進めた。また、これらのデータを、それ以前のラニーニャ期(1999-2001)および移行期のフラックスと比較検討した。特に珪藻およびレディオラリア群集の環境変化によって変化するフラックス変動パターンの詳細を明らかにした。国際誌は、Deep-Sea Researchに原稿を1編投稿した。更に、ベーリング海および北太平洋中部亜寒帯においては、本年度も北海道大学練習船おしょろ丸夏期航海に参加者を派遣し、北海道大学研究チームと連携してセディメント・トラップの揚集ならびに再設置を行った。これで長期時系列フラックス変動の解析の基盤となる18年目の試料が回収が予定(来年度)された。平成20年度も北海道大学練習船おしょろ丸夏期航海に参加者派遣し、ベーリング海および北太平洋中部亜寒帯において北海道大学研究チームと連携してセディメント・トラップの揚集ならびに再設置を行った。ベーリング(Station AB)海ならびに北太平洋中部亜寒帯海域(Station SA)にて継続収集してきた長期時系列セディメント・トラップ沈降粒子フラックス試料を解析した。得られた膨大な量の試料のうち、未処理試料の分析・解析を推進した。全乾燥重量化学分析・群集分析を推進し、論文執筆活動も行なった。気候変動の立場から長期的な沈降粒子フラックス変動を考察し、更にPacific Decadal Oscillation(PDO), Arctic Oscillation(AO), El Nino Southern Oscillation(ENSO)などの長期的変動パラメータとの関連の理解を深めた。また、中部亜寒帯海域との比較の為、1997-2000年に得られた北太平洋亜寒帯西部海域のStations KNOT, 40°, 50°,および2001-2003年に回収されたStations K1, K2, K3のセディメント・トラップ試料のうち珪藻、珪質鞭毛藻、レディオラリア(放散虫)フラックスについての研究も推進した。更に、先に西・中部赤道太平洋で得られたセディメント・トラップ沈降粒子フラックス試料のうち未解析の試料を解析し、出版事業を展開した。この研究では、エルニーニョ・ラニーニャ現象の動向とフラックス変動の理解を深めることが出来た。特に珪藻およびレディオラリア群集の環境変化によって変化するフラックス変動パターンの詳細を明らかにし、エルニーニョ期・移行期・ラニーニャ期における水塊の東西方向の移動とそれに伴う沈降粒子フラックス群集の変化を解明した。
非定常性に関する統計的逐次検定と変化点探索について

この研究においては、オンラインで観測される確率系列を想定し、金融時系列のバブルなどの非定常性の存在を探索する逐次検定の方法と、金融時系列におけるパラメータの変化を探索する逐次変化点問題の方法を確立した。また、疫学や人口統計で重要な分枝過程に関して、ウイルスや人口の爆発的な増加が起きるのか、それとも根絶や人口減少が起きるのかの逐次的に探索する手法を考察した。それぞれに対して、数学的な最適性の性質と数値計算の方法を見出した。これらの問題を統一的に分析可能にする方法は、ターゲットパラメータに局所対立仮説を想定し連続時間の確率過程の問題に帰着させ、確率解析の理論を応用することである。それにより、過誤確率や期待停止時刻といった動作特性の解析的評価できることが示された。本研究では、オンライン観測される時系列の非定常性についての検定と変化点問題を考え、停止時刻を用いて推測をおこなう統計的逐次解析の手法を開発する。特に、自己回帰過程を考え、観測されたフィッシャー情報量により停止時刻を定義し、非定常性に関するパラメトリックおよびセミパラメトリックな統計的逐次検定と変化点探索の手法を開発する。それは、時系列の非定常性の検定についてもっとも広く使われているDickey=Fuller検定、Augmented Dickey=Fuller検定、Phillipsのセミパラメトリック単位根検定に相当するものを統計的逐次解析の分野に創出することに他ならない。本年度はPhillips, P.C.B. (1987), "Time Series Regression witha Unit Root", Econometrica,Vol. 55, No. 2, pp. 277-301.で提案されたセミパラメトリックARモデルの単位根検定にたいしその逐次検定の方法を確立した。"Semiparametric Sequential Unit Root Test"と題する論文を京都大学経済研究所の西山慶彦氏と京都工芸繊維大学の人見光太郎氏との共著で執筆し、弱従属的誤差項を持つAR(1)過程(それは独立的誤差項を持つAR(p)過程を含む)についての逐次的単位根検定の手法を解明した。論文の第一の成果は、局所対立仮説のもとでの検定統計量の漸近正規性だけでなく、自己回帰パラメータが局所パラメータ(爆発的な場合を含む)を持つ場合にも検定統計量の漸近正規性が得られた点にある。また第二の成果は停止時刻は漸近的的にドリフト付きのベッセル過程で表され、そのモーメントが特殊関数により計算可能となる点にある。本研究では、連続時間での確率過程のパラメータに関して、停止時刻を用いた逐次検定と逐次変化点探索を考え、動作特性と最適性の一般理論を確率解析の手法を用いて確立した。そしてその応用として、以下の3つの離散時間モデルの逐次的問題を考えた。(i)高階自己回帰モデルの単位根の統計的逐次検定(ii)定常から非定常へ変化する自己回帰モデルの統計的逐次探索(iii)多次元分枝過程の臨界性に関する統計的逐次検定内容を簡単に述べると、確率過程の観測値が刻一刻と与えられる状況を考え、もっとも十分な情報量を持ったFisher情報量と呼ばれる統計量がある閾値に達しときサンプリングを停止し、その時刻でt統計量を用いて検定を行うということを考えた。このとき、帰無仮説は定常と非定常の境目である、臨界点とする。対立仮説は、Fisher情報量の水準を決める閾値を大きくしたとき、帰無仮説に近づく局所対立仮説を考えた。ただし、対立仮説は、定常な状態から帰無に近づけてもよいし、爆発の状態から帰無に近づけてもよいとした。このとき、t統計量は、閾値を大きくしたとき、帰無でも、局所定常でも、局所爆発でも漸近正規性を持つことがわかった。このことにより、検定のパワーも簡単に計算できることが示された。また、局所漸近正規性(Local Asymptotic Normality;LAN)が成立することより、局所対立仮説の下での漸近正規性が導かれた。LANの性質によりこの検定方法が局所漸近的に最適な検定(すなわちオオカミ少年でない)ことが分かった。さらに、停止時刻の漸近的な期待値や分散はMathematicaなどの数式処理ソフトで計算可能となった。数値計算の結果を見るとシミュレーションと対比して良好であった。経済統計統計的逐次解析における期待停止時刻や過誤確率などの動作特性(OC;Operating Characteristics)を拡散近似を用いて連続時間の統計的逐次解析のフレームワークに帰着させることがこの研究の特徴である。そのさい、確率解析の標準的手法である時間変更によってマルチンゲールをブラウン運動で表現し、Bessel過程で動作特性を評価する。いくつかの場合は特殊関数の数値計算で動作特性が評価可能な場合があることがわかった。従来の非線形更新定理は独立な確率変数列の場合OCを求めるための強力な手法として威力を発揮するが、非独立な確率変数列の場合ほとんど適用不能である。

上記大学院生達が実行したシミュレーションを通じて特殊関数による数値計算は十分に満足いく結果であることを確認している。しかしながら、いくつかの場合で動作特性の評価方法が分からない場合がある。それはブラウン運動とそれが作るBessel過程の同時密度関数が分からないことに起因する。たとえばSPRTの期待値はそれらの同時密度関数が分かってはじめて評価が可能になる。また対立仮説が正しい場合に現れるドリフト付きBessel過程の数値計算の方法もまだ困難がいくつかある。現在までの達成度はこの困難を克服していいない点と得られた結果を審査制ジャーナルに投稿をしていない点でやや遅れているといえる。Phillipsのセミパラメトリック単位根検定に相当するものを統計的逐次解析の分野に創出することができた。逐次解析による統計量は、パラメータを局所化した離散時間マルコフ過程にたいし連続時間モデルで近似できることがあり、そのとき統計量はブラウン運動や拡散過程の汎関数として表現される。そのとき、帰無仮説に対する局所対立仮説の尤度比検定が、フィッシャー情報量で停止時刻を定めたとき、LAN(局所漸近正規)になる場合がある。離散時間過程は仮説ごとに異なる拡散過程に収束するわけであるが、それらの分布は互いに絶対連続で、Girsanov変換を行う指数マルチンゲールがそのRadon=Nikodymの微分となる。それはまた離散時間における尤度比の極限にもなっている。スコアに対する極限をスコア過程、フィッシャー情報量に対する極限をフィッシャー情報量過程と呼ぶと、スコア過程の二次変分がフィッシャー情報量過程となる。そこでフィッシャー情報量から作られる停止時刻で時間変更を行うと、問題はDDSブラウン運動で表現され連続時間のLANがでてくる。もとのフィッシャー情報量やSPRTはともに時間変更後の新たなブラウン運動のもとで定義される別の拡散過程によって表現される。今のところわかっているのは、一般的にそのような双対的な拡散過程があるわけではなく、いくつかの特殊な場合に存在するようである。たとえば、今年度まとめた論文は一階の自己回帰過程の極限であるOrnstein=Uhlenbeck過程にたいし、Bessel過程がそのような双対的な拡散過程である。今後の研究の推進方策の最大のテーマは本研究をHajek-Inagaki-Le Camの理論と統合させることである。課題としては統計的逐次解析としての最適性と局所漸近最適性の両立する理論を構築することである。逐次解析による統計量は、離散時間モデルを連続時間モデルで近似したとき、ブラウン運動や拡散過程の汎関数として表現される。その理論の概要は以下のようなものである。離散時間マルコフ連鎖がある拡散過程で近似されるものとする。また帰無仮説に対する局所対立仮説の尤度比検定が、フィッシャー情報量で停止時刻を定めたとき、局所漸近正規(Local Asymptotic Normality; LAN)になっている場合がある。
ヒト白血病AMLに関連する新しい転写因子ファミリーPEBP2の構造機能解析

転写因子PEBP2はDNA結合を担うαサブユニットおよびそれと会合してDNA結合を強めるβサブユニットからなるヘテロダイマーである.さらに,両サブユニットはいずれもその機能異常により類似の急性骨髄性白血病AMLをひきおこすことが明らかにされている.そこで本因子による発癌の機序を明らかにするために,その基礎として,αの機能的中核であるRuntドメインおよびその対となる分子機能特性について詳細なin vitro解析を進めた.その結果,αサブユニットのDNA結合活性はSH基の酸化還元を介する調節,即ちRedox制御を受けること,またその活性化状態はPEBP2α単独では非常に不安定であり数分以内に急速に失活することが分かった.βサブユニットはこの失活を防ぐとともに,DTTに対する濃度依存性を著しく軽減する効果を示した.βによるこの促進効果は,既知のDNA結合親和性上昇効果とは別個にかつそれと相乗して現れる.この発見により,βサブユニットの担う機能的意義に新しい側面が加えられた。,次いで,PEBP2αのRuntドメイン内に存在する2箇所のシステイン残基(Cys115,Cys124)のうち,どちらがRedox制御の標的となるかを決定するために,系統的な変異解析を行なったところ,両システイン残基は共に協調してRedox応答性を高めることが明らかとなった.これは従来Jun/FosやNF-kBなどで知られていた単一システイン残基によるRedox制御とは様相が異なることから,PEBP2αのRedox制御は新しいカテゴリーに属するものと考えられる.転写因子PEBP2はDNA結合を担うαサブユニットおよびそれと会合してDNA結合を強めるβサブユニットからなるヘテロダイマーである.さらに,両サブユニットはいずれもその機能異常により類似の急性骨髄性白血病AMLをひきおこすことが明らかにされている.そこで本因子による発癌の機序を明らかにするために,その基礎として,αの機能的中核であるRuntドメインおよびその対となる分子機能特性について詳細なin vitro解析を進めた.その結果,αサブユニットのDNA結合活性はSH基の酸化還元を介する調節,即ちRedox制御を受けること,またその活性化状態はPEBP2α単独では非常に不安定であり数分以内に急速に失活することが分かった.βサブユニットはこの失活を防ぐとともに,DTTに対する濃度依存性を著しく軽減する効果を示した.βによるこの促進効果は,既知のDNA結合親和性上昇効果とは別個にかつそれと相乗して現れる.この発見により,βサブユニットの担う機能的意義に新しい側面が加えられた。,次いで,PEBP2αのRuntドメイン内に存在する2箇所のシステイン残基(Cys115,Cys124)のうち,どちらがRedox制御の標的となるかを決定するために,系統的な変異解析を行なったところ,両システイン残基は共に協調してRedox応答性を高めることが明らかとなった.これは従来Jun/FosやNF-kBなどで知られていた単一システイン残基によるRedox制御とは様相が異なることから,PEBP2αのRedox制御は新しいカテゴリーに属するものと考えられる.
非分解性と信じられているプラスチックの分解酵素遺伝子のクローニング

1.ポリ乳酸分解菌の単離と分解酵素の精製平均分子量5000のポリ乳酸をカルボジイミド法によってFluorescein aminoacetamideで標識し、GPCで精製することによって蛍光標識ポリ乳酸(F-PLA)を得た。ポリ乳酸粉末を埋設し、数ヶ月放置した土壌に含まれるポリ乳酸分解酵素活性をF-PLA溶液の蛍光偏光度の減少によって測定したところ、有意に高い活性が確認された。ポリ乳酸微粉末を含む寒天培地に形成されるハローを指標にこの土壌からポリ乳酸分解菌を3種類単離した。16SrDNAの配列解析の結果、これらはStreptomyces属、Burkholderia属、もしくはProteobacterium属の微生物であると考えられた。この分解菌このうち、酸性pHでもポリ乳酸分解活性を示したStreptomyces属の微生物を培養し、その培養上清からPLA分解酵素の精製を試みた。この分解酵素は分解されやすいためまだ完全に精製するには至っていないが、分子量45k程度のプロテアーゼであると考えられる。2.蛍光標識ポリスチレンの合成スチレンおよびスチレンスルホン酸をエチレングリコール/メタノール溶液(1:1)に溶解し、azobisisobutyronitriteとアミノエタンチオールを加え、減圧下、60度で24時間反応させて重合させた。スチレンとスチレンスルホン酸の比率を変えることによってポリマーの親水性を、アミノエタンチオールの比率を変化させることによってポリマーの分子量を操作した。この反応によって、末端に導入されたアミノ基を、カルボジイミド法によってFluorescein aminoacetamideで標識し、蛍光標識ポリスチレンを得た。現在、これを用いてポリスチレン分解菌の単離と分解酵素の精製を行っている。ポリスチレン分解酵素活性を測定するためには、10^<-9>M程度に水に溶解できる蛍光標識されたポリスチレンが必要であるが、ポリスチレンは極性が非常に低く、事実上水には溶解しない。そこで、スチレンモノマーにスチレンスルホン酸を加えて付加解裂型連鎖移動反応で重合させることによって、ポリマーに極性を付与して溶解度を上げると共に、その末端に蛍光修飾が可能な官能基を導入した。即ち、メタノールとエチレングリコールを等量混合した溶媒において、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル重合開始剤、アミノエタンチオールを連鎖移動剤として、60度で30時間重合反応を行った。まず、スチレンモノマー濃度を0.50M、スチレンスルホン酸濃度を0.35Mとし、アミノエタンチオール濃度を0.085,0.17,0.34Mとした時、平均分子量がそれぞれ78k,58k,33kのポリマーを得ることができた。得られたポリマーは水に対して十分な溶解度を持っていた。現在、スチレンモノマーに対するスチレンスルホン酸の比率を下げ、末端のアミノ基をフルオロセインスクシンイミジルエステルで蛍光標識し、水に溶解した際の蛍光強度を指標に、水に対して10^<-8>M程度溶解できるスチレンスルホン酸の比率を検討している。
非線形偏微分方程式と粘性解の研究

非線形退化楕円型および放物型偏微分方程式に対する粘性解の存在,一意性,その応用について研究した.これまでに得られている結果の検討,各地の専門研究者との研究打ち合わせを行い,さらに関連ある研究集会等に出席しながら,研究を進めた.具体的な研究経過としては,まずHamilton-Jacobi方程式に対する境界値問題を扱い,状態拘束条件を持つ最適制御における値関数の満たすような境界条件の定式化を取り扱った.Sonerによる定式化をより精密にし,より適切な境界条件を求めることができた.つぎに,係数に特異性のあるHamilton-Jacobi方程式を研究した.この場合にはDirichlet問題やCauchy問題の粘性解は一般に一意性をもたない.粘性解の定義を工夫することによって,最大解を特徴づけることに成功した.この結果はSiconolfiの最近の結果を大幅に改良するものとなった.界面の時間発展に対するレベル集合アプローチにおいて,特異点をもつ退化放物型方程式が現れる.この特異性が原点以外に現れる場合について,試験関数を工夫することにより,初期値問題あるいは初期値境界値問題の解に対する比較定理が成立することを証明した.このことは,界面の運動が等方性をもたないようなかなり広いクラスの問題に対してもレベル集合アプローチが有効であることを示している.最も典型的な場合である平均曲率流について,ある種の近似解法の収束問題を研究した.Bence,Merriman,Osherによって研究された近似法について,その一般化として熱核を一般のコンボリューション核に置き換えるという発想により新しい近似法を提案し,得られる近似解の平均曲率流への収束を証明した.さらに,関連した研究集会“非線形偏微分方程式研究会"を平成7年1月20,21日の両日に開催した.非線形退化楕円型および放物型偏微分方程式に対する粘性解の存在,一意性,その応用について研究した.これまでに得られている結果の検討,各地の専門研究者との研究打ち合わせを行い,さらに関連ある研究集会等に出席しながら,研究を進めた.具体的な研究経過としては,まずHamilton-Jacobi方程式に対する境界値問題を扱い,状態拘束条件を持つ最適制御における値関数の満たすような境界条件の定式化を取り扱った.Sonerによる定式化をより精密にし,より適切な境界条件を求めることができた.つぎに,係数に特異性のあるHamilton-Jacobi方程式を研究した.この場合にはDirichlet問題やCauchy問題の粘性解は一般に一意性をもたない.粘性解の定義を工夫することによって,最大解を特徴づけることに成功した.この結果はSiconolfiの最近の結果を大幅に改良するものとなった.界面の時間発展に対するレベル集合アプローチにおいて,特異点をもつ退化放物型方程式が現れる.この特異性が原点以外に現れる場合について,試験関数を工夫することにより,初期値問題あるいは初期値境界値問題の解に対する比較定理が成立することを証明した.このことは,界面の運動が等方性をもたないようなかなり広いクラスの問題に対してもレベル集合アプローチが有効であることを示している.最も典型的な場合である平均曲率流について,ある種の近似解法の収束問題を研究した.Bence,Merriman,Osherによって研究された近似法について,その一般化として熱核を一般のコンボリューション核に置き換えるという発想により新しい近似法を提案し,得られる近似解の平均曲率流への収束を証明した.さらに,関連した研究集会“非線形偏微分方程式研究会"を平成7年1月20,21日の両日に開催した.
脳卒中患者における栄養療法とアウトカムとの関係の検討－必要累積エネルギー量の設定

死亡原因の約10%は脳卒中であり,脳卒中の予防および治療は重要と思われる。日本,アメリカ,ヨーロッパの脳卒中ガイドラインにおいて,栄養に関しては,脱水,経管栄養,嚥下障害,血糖コントロールの記載が見られる。しかしアウトカムを改善する適切な栄養摂取量に関する記載はない。そこで栄養摂取量が脳卒中患者のアウトカムへ与える影響を検討することを目的として研究を行った。脳卒中急性期の栄養摂取量を評価するために必要な日数の検討を行った。生存群と死亡群のエネルギー摂取量を比較したところ,7日目に初めて有意な差が認められた。したがってエネルギー摂取量の評価に必要な期間は,7日間である可能性が示唆された。脳梗塞(CI)および脳内出血(CH)患者を対象とした検討においては,エネルギー必要量に対する充足率により対象を群分けし,アウトカムの比較を行った。なおエネルギー必要量は25kcal/kg/dayと定義した。その結果,充足率が3366%(8.2516.5kcal/kg/day)の群が,最も低い死亡率であった。次にくも膜下出血(SAH)患者を対象に検討を行った。SAH患者の年齢はCIおよびCH患者よりも若いため,エネルギー必要量を30kcal/kg/dayと定義した。CIおよびCH患者と同様の検討を行ったが,今回の検討ではエネルギー摂取量とアウトカムの関連を見つけることはできなかった。栄養摂取ルートは,経腸ルートもしくは静脈ルートのどちらが適しているか検討を行った。死亡率とエネルギー摂取量の間に関連が認められた,CIおよびCH患者で検討を行った。エネルギー摂取量で分類した群間において,静脈ルートからのエネルギー摂取量に差は認められなかった。一方,経腸ルートからのエネルギー摂取量は有意に異なっていた。そのため経腸ルートからのエネルギー摂取量が,死亡率と関連している可能性が示唆された。本研究は栄養サポートとアウトカムの関連を明らかにする目的で,脳卒中急性期の必要エネルギー量および栄養補給ルートの選択がアウトカムに与える影響について検討を行なっている。アウトカム指標は,脳神経外科集中治療室(NCU)入室後90日間の累積生存率とした。まずNCU入室後90日目の生死の状況により対象を2群に分類し,背景およびエネルギー摂取量の比較検討を行なった。その結果,死亡群に比し生存群で,有意にエネルギー摂取量が多い結果を得た。したがってエネルギー摂取量が生死に関係していると考えられた。次に脳卒中急性期の必要エネルギー量の検討のため,対象を0-8.25kcal/kg/day,8.25-16.5kcal/kg/day,16.5-25kcal/kg/day,25kcal/kg/day以上の4群に分け,アウトカムの比較を行なった。健康な成人のエネルギー必要量として25kcal/kg/dayが推奨されていることから,この25kcal/kg/dayを基準とし群分けを行なった。しかし25kcal/kg/day以上の対象は,その症例数が2例と少なかったため,今回の検討からは除外した。その結果,8.25-16.5kcal/kg/dayの摂取量の群で,累積生存率が有意に高値であった。したがって脳卒中急性期の適切なエネルギー摂取量は,8.25-16.5kcal/kg/dayの範囲にある可能性が示された。本研究は『脳卒中患者のアウトカムを改善させる栄養療法の確立』を目的としている。本研究期間内には栄養療法の中でも特に,脳卒中急性期のエネルギー摂取量に着目し,(1)脳卒中急性期の必要エネルギー量,および(2)脳卒中急性期の栄養補給ルート(経腸or静脈)がアウトカムに与える影響を検討する予定である。前年度は特に脳卒中急性期の必要エネルギー量に注目し,検討を行なった。

その結果,8.25-16.5kcal/kg/dayの摂取量の群で,累積生存率が有意に高値であった。したがって脳卒中急性期の適切なエネルギー摂取量は,8.25-16.5kcal/kg/dayの範囲にある可能性が考えられた。したがっておおむね順調に進展していると考えられる。前年度の検討は脳卒中の中でも,脳梗塞および脳内出血患者に焦点をあて実施した。したがってくも膜下出血患者は除外している。その理由としてくも膜下出血患者は,脳梗塞および脳内出血患者と比較し,若年の傾向があり,くも膜下出血患者の栄養サポートは異なると考えたためである。そのため今後の研究では,くも膜下出血患者のみを対象に,エネルギー摂取量の検討を行なう予定にしている。さらに栄養補給ルート(経腸ルートor静脈ルート)がアウトカムに与える影響についての検討も行ない,脳卒中急性期の患者に適している栄養補給ルートについて検討する予定にしている。前年度に開催されましたヨーロッパ静脈経腸栄養学会(ESPEN)およびアメリカ静脈経腸栄養学会(ASPEN)への参加に伴う費用が,予定していたよりも少ない金額であったため,未使用金が発生した。したがって未使用金を含めた,次年度の研究費の使用計画としては,以下のことを計画している。研究に有用な情報を得るため,また研究結果を発表するため関連学会へ参加するための旅費として使用論文投稿費に使用臨床栄養,脳卒中,重症病態など,研究に関連する書籍の購入に使用コピー用紙やインク,ファイルなど研究に使用する消耗品の購入に使用
有限振幅集束音場における回折現象とその超音波映像への応用に関する研究

球面状の集束音源によって単一周波数の正弦波音波を発生させると,音波が焦点に向かって伝搬するにしたがい,媒質の弾性的な非線形特性(非線形パラメータによって記述される)等を反映してその音圧波形が歪む.この集束音場の焦点後領域で観測される第2高調波成分の大半が,焦点通過時に焦点領域で発生したものであり,それより以前,以後に発生した第2高調波は互いに相殺し合うこと,この原因は焦点通過時に起こる音波の位相シフトにあることを理論的,実験的に明らかにした.このような集束音場の焦点領域に,周囲の媒質(水)とは非線形パラメータの異なる試料を挿入すると,焦点後領域で観測される第2高調波のうち位相パラメータがθ=π/2となる成分が大きく変化する.この原理を用いると,集束音場の焦点近傍に試料を挿入すると,その非線形パラメータが水のそれとどれだけ異なるかを検出し,これを映像化する可能性があることを,理論と実験により示した.一方,円筒状の集束音場では,音波の焦点通過時の位相シフト量が異なり,第2高調波の位相パラメータの性状が球面集束音場とは全く異なるものになるので,焦点領域で発生した第2高調波が焦点後領域で卓越せず,球面集束音場だけが本研究の課題の実現に適していることを理論的,実験的に示した.さらに一般的な場合を想定し,挿入試料の非線形パラメータだけでなく,線形的な音響特性(密度,音速および吸収係数)も周囲媒質と異なるときの,焦点後領域で観測される音波への挿入試料の定数の影響を理論的,実験的に検討した.その結果,焦点後で観測される第2高調波は線形のパラメータによっても大きく変わることが明らかになったが,密度,音速が既知であれば非線形パラメータを推定できる方法を示した.今後,本理論の前提になっているガウス分布集束音源を実現することによって,非線形パラメータを映像化できるものと考える.球面状の集束音源によって単一周波数の正弦波音波を発生させると,音波が焦点に向かって伝搬するにしたがい,媒質の弾性的な非線形特性(非線形パラメータによって記述される)等を反映してその音圧波形が歪む.この集束音場の焦点後領域で観測される第2高調波成分の大半が,焦点通過時に焦点領域で発生したものであり,それより以前,以後に発生した第2高調波は互いに相殺し合うこと,この原因は焦点通過時に起こる音波の位相シフトにあることを理論的,実験的に明らかにした.このような集束音場の焦点領域に,周囲の媒質(水)とは非線形パラメータの異なる試料を挿入すると,焦点後領域で観測される第2高調波のうち位相パラメータがθ=π/2となる成分が大きく変化する.この原理を用いると,集束音場の焦点近傍に試料を挿入すると,その非線形パラメータが水のそれとどれだけ異なるかを検出し,これを映像化する可能性があることを,理論と実験により示した.一方,円筒状の集束音場では,音波の焦点通過時の位相シフト量が異なり,第2高調波の位相パラメータの性状が球面集束音場とは全く異なるものになるので,焦点領域で発生した第2高調波が焦点後領域で卓越せず,球面集束音場だけが本研究の課題の実現に適していることを理論的,実験的に示した.さらに一般的な場合を想定し,挿入試料の非線形パラメータだけでなく,線形的な音響特性(密度,音速および吸収係数)も周囲媒質と異なるときの,焦点後領域で観測される音波への挿入試料の定数の影響を理論的,実験的に検討した.その結果,焦点後で観測される第2高調波は線形のパラメータによっても大きく変わることが明らかになったが,密度,音速が既知であれば非線形パラメータを推定できる方法を示した.今後,本理論の前提になっているガウス分布集束音源を実現することによって,非線形パラメータを映像化できるものと考える.球面状の集束音源によって単一周波数の正弦波音波を発生させると、音波が焦点に向かって伝搬するにしたがい、媒質の弾性的な非線形特性(非線形パラメータによって記述される)等を反映してその音圧波形が歪む。この集束音場の焦点後領域で観測される第2高調波成分の大半が、焦点通過時に焦点領域で発生したものであり、それより以前、以後に発生した第2高調波は互いに相殺し合うこと、この原因は焦点通過時に起こる音波の位相シフトにあることを理論的,実験的に明らかにした。次に、このような焦束音場の焦点領域に、周囲の媒質(水)とは非線形パラメータの異なる試料を挿入すると、焦点後領域で観測される第2高調波のうち位相パラメータがo=π12となる成分が大きく変化する。この原理を用いると、透過型超音波顕微鏡と同様の構成で挿入試料中で生ずる第2高調波成分、したがって挿入試料の非線形パラメータが水のそれとどれだけ異なるかを検出できることを、理論と実験により示した。またより一般的な場合を想定し、挿入試料の非線形パラメータだけでなく、線形的な音響特性(密度および音速)も周囲媒質と異なるとき、焦点後領域で観測される音波への挿入試料の特性の影響を理論的、実験的に検討し、矢張り、焦点領域の挿入試料中で発生する第2高調波が焦点後で検出され得ることを明らかにした。

一方、円筒状の集束音場では、音波の焦点通過時の位相シフト量が異なり、第2高調波の位相パラメータの性状が球面集束音場とは全く異なるものになるので、焦点領域で発生した第2高調波が必ずしも焦点後領域で卓越せず、球面集束音場だけが本研究の課題の実現に適していることを理論的、実験的に示した。また、挿入試料中での不均一な特性分布に起因する試料中の第2高調波の音源分布を実時間的に映像化するための装置も考案し、その一部を試作した。
輸送ハブの国際競争と経済厚生

本研究では、輸送ハブ間の国際的競争を分析する基本モデルを構築した。モデルにおいて、各国にある港湾が自国の貨物需要とともに第3国の積み替え貨物を取り扱うと想定する。このモデルに基づいて、競合する輸送ハブを持つ2国が、自国の港湾を民営化するか公営にするかという選択を分析した。その結果、均衡において民営化が選ばれるかどうか、そして民営化が均衡として実現する場合の両国および周辺国の経済厚生を評価した。次に基本モデルを拡張し、輸送規模の経済が存在する場合のハブ港湾運営者間の戦略的投資競争の分析を行った。規模の経済効果が強く働く場合、均衡における各港湾の容量は、最適な水準に比べて過大になることが示された。2国と周辺地域から成る経済における輸送需要の構造とハブ間の競争を記述する基本モデルを定式化し、このモデルの理論的性質を分析した。この基本モデルに基づいて、輸送ハブの国際的競争と民営化の影響を評価した。モデルは次のような要因を考慮している:(i)ハブ港湾を持つ2国とハブを持たない周辺地域(複数の国が含まれる)から成る経済; (ii)ハブ港湾は自国の輸出入貨物と、周辺地域からの積み替え貨物のために利用される; (iii)外国の利用者は2国のいずれかのハブ港湾を選択; (iv)港湾運営者(政府または企業)は、料金と施設の容量(サービス水準)を選択する。上記の基本モデルを用いて、自国の港湾を公営とすべきか民営化すべきか、という政府の選択を定式化した。次のような二段階ゲームを考える。第1段階:各国政府は公営か民営かを選択、第2段階:それぞれの運営方式のもとで料金水準を選択する。第1段階において、政府は自国の厚生が大きくなる方の運営方式を選ぶ。自国の厚生は、(自国の利用者便益)+(港湾の利潤)から成るものとする。第2段階において、公営の場合は厚生最大化、民営の場合は港湾の利潤を最大化するよう料金を設定する。さまざまなパラメータ(各国の市場規模、周辺国からの積み替え輸送市場の規模、費用構造)が結果に及ぼす影響を分析した。主たる結果は次の通り:(1)両国政府が民営化を選ぶような均衡が存在する;(2)民営化はハブ港湾を持つ国の厚生を増加させる。前年度に開発した基本モデルを拡張し、輸送における規模の経済を分析に導入した。具体的には、港湾利用者が多くなると、自国利用者の便益増大(基幹航路の寄港数増加による利便性向上)および港湾サービスの純収入増加(積み替え需要をより多く誘致することによる)を通じて、自国の経済厚生が増加する状況を定式化した。このとき、空間経済学における集積の理論モデルと同様、一方の港湾への利用者の集中が均衡として生ずることが明らかとなった。このことを考慮する各国の港湾運営者は、自国の港湾に集中を導くために料金設定と投資政策を戦略的に決定する。モデル分析の結果、現在、いくつかの国で見られるように、競って港湾への大規模な投資が行われる現象を説明することができた。またこのようなモデルにおいてよく見られるように、複数均衡が生じることも示された。昨年度に引き続き、輸送における規模の経済を導入した港湾競争の分析をさらに発展させた。二国のそれぞれにハブ港湾があり、第3地域からの積み替え需要をめぐって競争する状況を想定する。第3地域における利用者が積み替えのためのハブ港湾選択行動をロジットモデルにより定式化し、いくつかの理論的性質を解析的に導いた。主な結果は次の通り。(1)各港湾事業者が利潤を最大化するように港湾容量を選択する場合、規模の経済効果が大きくなるほど、均衡における港湾容量が大きくなる;(2)規模の経済がない場合には均衡における港湾容量は最適に比べて過小であるが、規模の経済が強くなると過大になる。東南アジアのシンガポールとマレーシアのデータに基づいてパラメータを設定し、数値シミュレーションを行った。その結果、均衡と最適の間には、量的なかい離が生じるだけでなく、容量の配分パターンにおいてもかい離が生じることが明らかになった。すなわち最適ににおいては2港湾の内1か所に投資を集中させるようなパターンであるのに対し、均衡では両港湾が積極的に投資を行うので集中化は生じない。今後は、料金政策の内生化、ローカルな需要を考慮すること、そして政府による介入政策の評価などの研究課題が残されている。交通経済学研究成果を国内外の学会で報告し、議論をもとに論文を改善する。27年度の計画にしたがって、輸送ハブ間に補完性が存在する場合の分析を進める。初年度の成果をまとめた論文がほぼ完成した。少額を無理に使う必要はないと考えた。研究成果を、国内外の学会で報告し、議論をもとに論文を改善する。
クリックケミストリ－による癌細胞の革新的可視化技術の開発

申請研究は光の持つ高い空間的ならびに時間的分解能を活用して、癌細胞を可視化する蛍光プローブを有機化学に基づいて開発することを目的としている。小さなプローブ分子が癌細胞上で効率的かつ特異的クリック反応することにより癌細胞を光らせ、リアルタイムに微小癌を検出する。トレーサーとしてのアルキンを有する糖や核酸誘導体の有機合成、またクリック反応によって蛍光を発するアジド基を持つクマリン分子の創製に成功した。これらを用いてリック化学による染色体DNAのカラーイメージングに成功した。さらにクリック反応により、細胞内でシグナル伝達分子誘導体の検出に成功した。小さな有機プローブ分子が癌細胞上で極めて効率的かつ特異的クリック反応することにより癌細胞を光らせ、リアルタイムに微小癌を検出する。本年度は、トレーサとしてのアルキンを有する糖や核酸誘導体の有機合成、またクリック反応によって蛍光を発するアジド基を持つクマリン分子の創製を進めた。その結果、クリック化学による染色体DNAのマルチカラーイメージングに成功した。またクリック反応により、細胞内でシグナル伝達分子誘導体の検出に成功した(Molecules, 18 (10), pp. 12909-12915.2013)。その結果、クリック化学による染色体DNAのマルチカラーイメージングに成功した(日本化学会第93回春季年会)本研究は、トレーサとしてのアルキンを有する糖や核酸誘導体の有機合成、またクリック反応によって蛍光を発するアジド基を持つクマリン分子の創製が第一段階である。そしてこれを基盤にした第二段階として、蛍光プローブ、光反応性およびクリックケミストリーを利用して細胞内でのイメージングに展開していく。さらに、物動試験、安全性試験(毒性試験)、臨床試験へと展開し、最終的に革新的可視化技術としての蛍光分子イメージングプローブの承認申請を目指す。研究経費の主たる部分を占める設備費について、細胞内にプローブ分子を導入する自動マイクロインジェクターには、これからの研究計画を進める上で必要な設備である。さらに、細胞を用いて実験するため、細胞培養は1年を通し常に行うことが予想され、そのための費用として、培地、血清、添加剤代を試算した。分子生物学試薬が必要である。その他試薬や消耗品類は、チューブなどで、サンプル調整のために必須のものである。
マイクロCT画像による組織学的診断技術の確立

本研究の目的は、肺癌における組織学的診断のための「マイクロCT画像による組織学的診断技術の確立」とその臨床的評価および応用の実現である。これを遂行するために2つの研究フェーズを設定し、平成27年度は従来の方法で作成された組織標本とマイクロCTで得られる画像データと比較することを主なフェーズとした。切除肺をマイクロCTでの撮像に適した固定方法を発見した。マイクロCTの至適撮像条件を発見した。撮像されたマイクロCT画像による組織学的診断を施行し、肺結節内部や肺胞間質内部の描出は未到達だが、肺胞間質が厚く描出され、癌に特徴的な画像所見を得ることができた。平成28年度では切除肺を伸展固定させた標本をマイクロCTで撮像した画像について、肺癌手術前に撮像した従来の臨床CT画像と解剖学的位置を対応させ記録した。また、撮像した検体を病理組織診断用標本にもどして一検体につき100枚程度のHEプレパラートにし、3D化してマイクロCTーHRCT-病理組織画像といった同一症例の同一検体による異なる装置による画像データの位置一致を試み、これを3例に施行できた。また、マイクロCT画像上、lepidic growthしている部分を自動で認識させて3D画像的に腫瘍範囲を描出可能となった。これにより肺癌の正確な存在診断がマイクロCT画像上で可能となり、将来的にマイクロCTが生体応用される際の準備研究として成果ができたと考えている。当初の目標だったマイクロCT画像による肺胞間質内部の描出や肺結節内部の描出は施行しえなかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。これを遂行するために2つの研究フェーズを設定し、平成27年度は従来の方法で作成された組織標本とマイクロCTで得られる画像データとの差を比較することを主なフェーズとした。1)肺癌に対し切除術を施行した症例の切除肺の一部を採取し、マイクロCTでの撮像に適した固定方法を検索した。その結果、ハインツマン法に準じ薬剤配合を改良した方法が最も固定に適していることを発見した。2)マイクロCTにより撮像するにあたり、試適撮像条件を検索し現行の撮像条件を編み出した。3)撮像されたマイクロCT画像による組織学的診断を施行したところ、肺結節内部や肺胞間質内部の描出は未到達だが、肺胞間質が厚く描出され、胸膜変化や癌に特徴的な画像所見を得ることができ、従来のHRCT画像と比較して統計学的にも優位に詳細な画像を得ることができた。4)従来の方法で作成された組織標本による組織学的診断とマイクロCT画像による組織学的診断を比較するために、共同研究者である森健策教授とともに画像診断を駆使して従来のHRCT画像・マイクロCT画像・組織標本の位置を一致させるデータベースの作成をすすめている。これにより目標の比較を次年度に比較し結果を得られると考えている。5)従来の方法で作成された組織標本とマイクロCT画像の解剖学的位置が一致していることを確認できた。これら計画した課題をほぼすべて完遂することができ、次年度の目標であるこれまでに得られたデータと手術前に撮像された従来のCT画像を比較し、手術前画像診断に応用する作業に移ることができる。これらを計画どおり遂行することにより、多元計算解剖モデルの構築に貢献したい。研究計画書に示した平成27年度の計画とほぼ一致して進捗できている。肺の伸展固定方法の工夫や開発が当初予期していない作業だったが、福井大学放射線科伊藤春海教授に直接指導いただき新たな固定方法を開発できた。また、以下の如く付随研究を行っている。現状のマイクロCT画像では肺胞間質内部を描出することはできず、これを克服するために造影剤の動注を行う必要がある。手術により得られた検体にこれを行うことは物理的に不可能で、ラットの切除肺で行う必要があり施行中である。このように進捗はほぼ計画どおりで、かつ付随研究も行っている。

これにより肺癌の正確な存在診断がマイクロCT画像上で可能となり、将来的にマイクロCTが生体応用される際の準備研究として成果ができたと考えている。当初の目標だったマイクロCT画像による肺胞間質内部の描出や肺結節内部の描出は施行しえなかった。平成27年度の実績から得られたデータをもとに、手術前に撮像された従来のCT画像を比較し、手術前画像診断に応用する。1)切除術により得られた伸展固定肺をマイクロCTで撮像した画像について、肺癌手術前に撮像した従来のCT画像と解剖学的位置を対応させ記録する。2) 1)で得られた解剖学的位置において、従来のCT画像やPET画像上のCT値やSUVmax値を記録する。3)得られた解剖学的位置と数値をデータベース化する。4)手術前に撮像される従来のCT画像からこれまで以上に正確な組織学的診断を推定できるシステムを実現するという計画どおりに進める。また現状のマイクロCT画像では肺胞間質内部を描出することはできず、これを克服するために造影剤の動注を行う必要がある。手術により得られた検体にこれを行うことは物理的に不可能で、ラットの切除肺で行う必要があり施行中である。同時にラットの肺移植を行い、肺移植後の時間経過に伴いどの程度肺胞破壊が生じるかマイクロCTで数的評価を行うことを計画している。28年度が最終年度であるため、記入しない。
微生物抗原を担持したエクソソームによる抗腫瘍免疫治療および感染予防の新戦略

腫瘍関連抗原(TAAs)は抗腫瘍免疫のターゲットとして期待される。しかし、腫瘍細胞は元々患者本人の細胞が悪性化してできたものであり、非変異型のTAAsは一般に免疫原性が低い。一方、腫瘍特異的な変異型の腫瘍抗原、ネオアンティジェンは、効率よく抗腫瘍免疫を惹起する可能性がある。しかし、腫瘍細胞がネオアンティジェンを持つ患者の割合は低い(2030%)。我々は、抗原性の高い結核菌抗原、ESAT-6の遺伝子を腫瘍細胞に導入して「人工ネオアンティジェン」として発現させ、免疫を活性化する戦略を開拓した。遺伝子導入した腫瘍細胞はESAT-6エピトープを「人工ネオエピトープ」として表面に提示しており、その細胞が分泌したエクソソームも同様にESAT-6エピトープを提示していることを確認した。ESAT-6エピトープ提示エクソソームは、担癌マウスに投与すると、高い抗腫瘍効果を示した。このような人工ネオエピトープ提示エクソソームが抗腫瘍効果を発現する機序として、樹状細胞がこれらのエクソソームを取り込み、微生物抗原エピトープを「外来危険信号」として認識し、腫瘍抗原とともにCTLに提示して抗腫瘍免疫を惹起するメカニズムを考えた。そこで、この機構を確認するために、培養腫瘍細胞を用いてESAT-6エピトープ提示エクソソームを調製し、培養DCに加えてDCの活性化が誘導されるかを検討した。これまでに、マウスの単球から誘導した培養樹状細胞に「人工ネオアンティジェン」提示エクソソームを取り込ませると、CD80、CD86などの共刺激因子、ならびにIL-12などのサイトカインの発現が向上し樹状細胞が効率的に活性化することを確認した。また、同エクソソームで活性化した樹状細胞を担癌マウスに投与すると、顕著な腫瘍増殖抑制効果が見られた。抗原性の高い結核菌抗原、ESAT-6遺伝子を培養腫瘍細胞に導入してESAT-6タンパクを「人工ネオアンティジェン」として発現させ、その培養上澄からESAT-6エピトープを「人工ネオエピトープ」として表面に提示したエクソソーム、ESAT-Exを得る方法を検討した。遺伝子導入に際して、プラスミドDNA/PEI/コンドロイチン硫酸三元複合体システムを用いることで、エピトープ提示量の高いESAT-Exが効率よく大量に得られることを見いだした。ESAT-Exは担癌マウスに投与すると著しい腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ESAT-Exを正常マウスに投与後、所属リンパ節から採取したリンパ球は高い抗腫瘍活性を示した。さらにESAT-Exが抗腫瘍免疫を誘起する機序を検討していく中で、昨年度は、ESAT-6遺伝子の導入が、獲得免疫の誘導だけでなく、投与直後にはマクロファージを活性化し、自然免疫を活性化していることを見いだした。抗腫瘍獲得免疫を誘起する機序を確認するために、ESAT-Exを培養DCに加え、DC活性化を誘導する効果を検討した。マウスの単球から誘導した培養樹状細胞にESAT-Exを取り込ませると、CD80、CD86などの共刺激因子、ならびにIL-12などのサイトカインの発現が向上し樹状細胞が効率的に活性化することが確認された。また、同エクソソームで活性化した樹状細胞を担癌マウスに投与すると、顕著な腫瘍増殖抑制効果が得られた。これらの効果は「人工ネオエピトープ」を持たないエクソソームには見られなかった。以上の結果から、「人工ネオエピトープ」提示エクソソームは、これを取り込んだ樹状細胞を成熟させ、T細胞をESAT-6とTAAsに対してクロスプライムさせることで抗腫瘍獲得免疫を誘導したと考えられる。培養DC、培養マクロファージを用いた「人工ネオ・エピトープ提示エクソソーム」の免疫活性化機能の再現性を検討し、作用機序を明確にするとともに、より活性の高いエクソソームの調製条件を検討する。また、これまでは患者本人の腫瘍細胞由来のエクソソームを用いた治療を念頭に置き、培養腫瘍細胞を用いてエクソソームを調製し、その効果を検討してきた。しかし、患者から採取した腫瘍細胞を培養することは容易ではない。そこでより実用的な展開を考え、正常筋組織などから採取して培養した線維芽細胞を用いた「人工ネオ・エピトープ提示エクソソーム」の調製法の検討を行う。効率よくESAT-6エピトープ提示エクソソームが正常細胞から得られたら、それらの樹状細胞、マクロファージに対する活性化機能を検討し、また、担癌マウスを用いてその抗腫瘍効果を評価する。同時により広く臨床に展開するためには他家のエクソソームによる治療が望まれる。そこで、アロジェネイックなモデルでの樹状細胞活性化効果、異種のガンに対する抗腫瘍免疫誘導効果についても検討を進める。腫瘍細胞由来のエクソソームは腫瘍関連抗原(TAAs)を持ち、抗腫瘍ワクチンとして期待された。しかし、TAAsは一般に免疫原性が低く、腫瘍細胞由来エクソソーム単独では効果がなかった。初めにESAT-6遺伝子を直接腫瘍細胞に導入し、発現させたところ、モデルマウスばかりでなく、イヌを対象とした動物臨床研究においても著しい抗腫瘍効果が認められ、「人工Neoantigen」導入療法が原発性腫瘍に対しても有効であることが確認された。