hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体外受精が胎児の性決定に及ぼす影響

近年、体外受精などの生殖補助医療の実施件数は増加傾向にある。一方、生殖補助医療で誕生した子供において、エピゲノム修飾異常を起因とした疾患の発症率が高くなることが報告されている。ほ乳類の性はY染色体の有無という先天的ゲノム情報によって決まる。一方、エピゲノムが性決定に果たす役割は不明であった。本研究室では、ヒストン脱メチル化酵素Jmjd1aが性決定遺伝子Sry遺伝子座の抑制的エピゲノム修飾であるH3K9メチル化を消去することで、その発現を正に調節し、性決定の制御に関わることを明らかにした。この結果は、ほ乳類の性は厳密なエピゲノム制御によって決定することを示した。上記の解析において、自然交配により生まれたXY型Jmjd1a欠損マウスの全ての個体が性転換を引き起こすわけではなく、精巣と卵巣の両方を有する性転換が不完全な“半陰陽"や性転換を起こさない個体も観察された。しかし、体外受精によりXY型Jmjd1a欠損マウスを作製したところ、すべての個体が性転換を引き起こしており、体外受精が胎児の性決定に影響を及ぼす可能性が示唆された。そこで、本研究では雌雄へのバランスが脆弱なXY型Jmjd1a欠損マウスの遺伝子背景を利用し、体外受精がエピゲノム制御を介して胎児の性決定にいつ、どのような影響を及ぼすのか解明を行ってきた。まず、体外受精による胎児の性転換の促進は初期胚のどの発生時期が影響しているのか解析を行った。マウスの体外受精の流れは体外受精用培養液内で精子と卵子を受精させた後、受精卵を胚培養液内で2細胞期胚まで発生させ、仮親に移植する。この流れのうち、2細胞期胚までの発生をin vivoで行い、仮親に移植したところ、体外受精による性転換の促進がレスキューされた。この結果は、受精から2細胞期胚まで間を体外培養することでXY型Jmjd1a欠損マウスの性転換が促進したことを示していた。当初、初期胚のどの発生時期が体外受精による胎児の性転換の促進に影響するのか明らかにする予定であった。早期に受精から2細胞期胚までの期間を体外で発生することが性転換の促進に影響することが明らかになった。そこで続いて体外受精がどのようなエピゲノム修飾に影響あるのか解析を行ったところ、Sry遺伝子座のDNAメチル化が体外受精を行うことで上昇していることも明らかとなった。さらに、この高メチル化は体外培養期間中に起こり、性転換期まで維持されていることも明らかになり、予定以上の成果を得ることができた。体外受精において、受精後に胚を体外培養することでSry遺伝子座のDNAメチル化が上昇し、このメチル化の上昇が性決定期まで維持され性決定に影響を与えることが明らかとなった。そこで、今後はより先進的な実験を行う予定である。具体的には、体外培養期間中にDNA脱メチル化を人工的に誘導することで体外受精の影響をレスキューできるのか試みる予定である。方法としては1体外受精用培地にDNA脱メチル化酵素の阻害剤を添加すること、2CRISPR/dCas9-Tet1CDシステムを用い、Sry遺伝子座の特異的な脱メチル化を誘導する。以上により体外培養期間中のDNA脱メチル化の促進を行う。

そこで続いて体外受精がどのようなエピゲノム修飾に影響あるのか解析を行ったところ、Sry遺伝子座のDNAメチル化が体外受精を行うことで上昇していることも明らかとなった。さらに、この高メチル化は体外培養期間中に起こり、性転換期まで維持されていることも明らかになり、予定以上の成果を得ることができた。体外受精において、受精後に胚を体外培養することでSry遺伝子座のDNAメチル化が上昇し、このメチル化の上昇が性決定期まで維持され性決定に影響を与えることが明らかとなった。そこで、今後はより先進的な実験を行う予定である。具体的には、体外培養期間中にDNA脱メチル化を人工的に誘導することで体外受精の影響をレスキューできるのか試みる予定である。方法としては1体外受精用培地にDNA脱メチル化酵素の阻害剤を添加すること、2CRISPR/dCas9-Tet1CDシステムを用い、Sry遺伝子座の特異的な脱メチル化を誘導する。以上により体外培養期間中のDNA脱メチル化の促進を行う。想定していたより早い段階で成果を得ることができ、それが試薬等の節約につながった。体外受精による性転換の促進の原因が体外培養期間に起こるDNAメチル化の上昇であることが明らかになったので、より先進的な実験を行いたい。具体的にはDNAメチル化酵素の阻害剤やCRISPR/dCas9-Tet1CDシステムを用いて、人工的に脱メチル化を誘導して、体外受精の影響がレスキューできるのか試みたい。次年度使用額は次年度請求額と合わせて約276,000円のため、次年度に実施予定であった前世代の体外受精の影響が次世代の性決定に対する影響を調べるために必要な消耗品及びマウス維持・購入費に加え人工的に脱メチル化を誘導するための阻害剤及びCRISPR/dCas9-Tet1CDシステム関連試薬の購入費に使用する予定である。
視覚野学習機構(自己組織化)のin vitro研究

神経細胞の遺伝子がもつ情報量は脳の神経回路の構造がもつ情報量に比べて圧倒的に少ない。この情報のギャップを埋めるのが学習であると考えられる。つまり、知能を生み出す脳の神経回路は遺伝子と学習の協調によって作られるもので、脳の神経回路形成における遺伝子と学習の役割を明らかにすることが、大脳皮質の神経発達学の中心課題である。我々の研究室は脳切片標本、脳移植標本、共培養標本に神経活動の光学的記録法、共焦点顕微鏡による軸索伸長の生体観察などを適用して、大脳皮質神経回路の遺伝子と学習に対する依存を調べ、大脳皮質の層状構造が遺伝子に依存することを明らかにした。大脳皮質は6層の層状構造をもち、神経細胞は層に特異的な神経結合をもつ。本研究は大脳皮質の層構造が神経活動が弱い共培養標本下でも完全に再現され、層構造が遺伝子に依存した構造であることを示した。また、層特異的な神経細胞の結合を誘導するさまざまな分子シグナルの存在を明らかにした。本研究のもう一つの成果は、発達期の可塑性を長期増強としてとらえたことである。本研究は発達期のラットの視覚野の脳切片標本には時間経過の早いfLTPと時間経過が遅いsLTPが生じること示した。sLTPは感受性期があり、膜電位依存性のCaチャンネルを通るCaの細胞内流入が引き金となり、遺伝子転写、蛋白合成を経て外側膝状体系シナプスに発現する。fLTPは明確な感受性期が無く、NMDAチャンネルを通るCaの細胞内流入が引き金となり、視覚野の出力細胞の軸索側枝系に発現する。これらのことは、sLTPが柱状構造の学習に関与する発達期の可塑性の担い手であり、fLTPは全ての年齢に発言する情報処理型の可塑性であることを示している。大脳皮質のほとんど全ての機能は後天的に獲得されるが、その学習のメカニズムは神経回路が神経活動に依存して変化する(自己組織化)ことであると考えられている。この学習のおいては、シナプスの前後の神経活動の相関に基づいてシナプス伝達が機能的に変化し(コバリアンス学習)、その後でこの変化がシナプスの形態的変化(シナプス出芽など)として神経回路に刻印されていると想定されている。この学習機構の理解のためには大脳の神経回路に入力を与え、それにより引き起こされるシナプス伝達の変化あるいは神経結合の変化を長期的に観察する必要がある。平成5年度の研究においては、外側膝状体(LGN)-視覚野(VC)共培養標本を用い、求心性神経結合の形成過程の研究を行った。LGN-VC共培養標本ではLGN軸索はVCの4層に特異的に終止する。この機構を明らかにするために、LGNに蛍光色素(DiI)を注入し、LGN軸索がVCに伸張し、分枝する様子を共焦点顕微鏡を用い長期的(10-30時間)に観察した。LGN軸索は6、5層を比較的早い速度で伸展するが、4層に進入すると突然停止する。その後しばらくして先端の成長円錐より数十ミクロン下の部分で分枝を出し、その後比較的遅い速度で各々の分枝が成長を続けた。このことはVCの4層にはLGN軸索の伸展を止め、軸索分枝を促す“stop and branch"信号が書かれており、一方、LGN軸索にはその信号を読みとる機構があることを示している。このような成長分枝パターンが13例の約2/3で見られた。しかしながら、若干例においては外側膝状体軸索の伸展停止と分枝が単独で生じることが観察された。このことは“stop"と“branch"がそれぞれ独立因子により制御されていることを示唆している。

大脳皮質のほとんど全ての機能は後天的に獲得されるが、その学習のメカニズムは神経回路が神経活動に依存して変化する(自己組織化)ことであると考えられている。この学習においては、シナプスの前後の神経活動の相関に基づいてシナプス伝達が機能的に変化し(コバリアンス学習)、その後でこの変化がシナプスの形態的変化(シナプス出芽など)として神経回路に刻印されていると想定されている。この学習機構の理解のためには大脳の神経回路に入力を与え、それにより引き起こされるシナプス伝達の変化あるいは神経結合の変化を長期的に観察する必要がある。平成6年度においてはIC電極アレイ(8x8;電極間距離、300μ)上で分離培養した胎児(E15-17)ラットの視覚野神経細胞の集団における神経回路の形成過程と可塑性をIC電極による電気刺激と電場電位の記録、自発発火活動の相関解析などの手法を用いて研究した。この実験により視覚野大脳皮質の発生初期においては、まず単シナプス性神経回路が形成され、これに続いて多シナプス性回路が形成され、これと共に、自発発火が生じ始めること、さらに中期において、多シナプス性回路の形成が始まると、自発発火がバースト的になり、バーストの頻度は多シナプス性回路の発達と共に高まること、このとき形成される神経結合には可塑性があり、条件刺激により、結合が強化され、あるいは条件刺激の周期(時間パターン)を記憶する能力をもつなどの結論がえられた。大脳皮質視覚野の神経回路の基本的構造は遺伝子により制御され、細部は学習的に形成されと考えられているが、その神経機構についてはほとんど明らかにされていない。本研究の目的は、これらの機構を共培養標本(Yamamoto et al.,1989)や脳切片標本などの手法(Toyama et al.,1995)を用いて明らかにすることである。平成7年度においては、1)腹側共培養標本(外側膝状体を視覚野の白質側に置く)、2)背側共培養標本(外側膝状体を視覚野の蜘蛛膜側に置く)、3)傍共培養(外側膝状体を視覚野の側面に4層に接して置く)などの3種類の外側膝状体-視覚野共培養標本を用いて、通常型顕微鏡による外側膝状体軸索の投射パターンの観察と共焦点顕微鏡による生きた外側膝状体軸索の成長の観察を行い、次の結果を得た。腹側標本においては、外側膝状体軸索は白質より6,5層を一定の速度で成長したが、4層に到着すると一旦成長を停止した後、分枝を開始した。このとき多くの軸索において、成長円錐が縮小し、後退するのが観察された。背側標本でも外側膝状体軸索は蜘蛛膜を通過して、4層に至り、腹側標本と同様の軸索分枝を形成した。背側標本においても外側膝状体軸索は腹側標本の場合とほぼ同じ速度で蜘蛛膜、視覚野表層を通過し、4層で減速あるいは一旦停止したが、観察の時間内では分枝は生じなかった。傍標本では、4層に侵入した軸索は水平に成長した後分枝を形成した。また表層より侵入した軸索は成長方向を変えて4層にいたり分枝を形成した。以上の所見は腹側標本の外側膝状体軸索の成長パターンの観察は視覚野4層に軸索の成長を一旦停止させる信号(stop signal)と分枝を促す信号(branch signal)の存在を示唆するようにも思われる。しかしながら、外側膝状体軸索が4層を水平に成長する傍標本では一旦停止なしに分枝が生じること、背側標本では一旦停止はするが必ずしも分枝が生じないことを考えあわせると4層にはbranch signalがあり、その他の層には外側膝状体の軸索成長を促す信号(nonstop signal)が存在することも考えられる。
熱ショック蛋白のHERGチャネル成熟化機構を用いたLQT2の新しい診断と治療

熱ショック蛋白70(Hsp70及びHsc70)はコシャペロンならびにCHIPと相互作用して蛋白質の成熟を助けるのみならず、未熟フォームを分解へと導く。我々は電位依存性K+チャネル(Kv1.5)の成熟過程にHsp70が重要であることを発見した(BBRC2008)。LQT2は電位依存性KチャネルHERGチャネル遺伝子変異が原因で心電図でのQT延長を特徴とし心室細動による失神や心臓突然死を起こす疾患である。変異HERG蛋白の多くはその不安定性のためユビキチンープロテアゾームシステムにより分解される。HERGの分解調節機構の解明はLQT2の病態解明と新しい診断・治療法の開発に重要であるが、Hsp70の関与が示唆されている。そこで本研究では平成21年度に野生型ならびに変異型HERGの分解調節におけるHsp70とHsc70の役割を検討した。Hsp70は野生型HERGの未熟HERGに結合し、ユビキチン化HERGを減少させることでHERGチャネルを安定化し、小胞体・ゴルジ体のHERGを増加させ、成熟HERGを増加させ、チャネル活性を増加した。一方で、Hsc70はHsp70のHERG安定化作用に拮抗した。このHsc70の拮抗作用は未熟型HERGのHsp70結合部位に競合的に結合することで、Hsp70のHERGへの結合を減弱させ、HERGの安定性を減少させる。このHERGへのHsp70とHsc70の競合的作用は生理的には熱ショックに対しての活動電位の変化を説明できる。Hsc70はbasalでERGに優位に結合しているが、熱ショックが加わるとHsp70が優位にHERGに結合することでHERGが安定化することで、Ikrが活性化し活動電位持続時間が短縮する。Hsc70のノックダウンにより熱ショックの活動電位持続時間短縮に拮抗したことからも上記の仮説を確認できた。
人工社会を組込んだ水文流出モデルによる水田減少に伴う栄養塩流出変動リスク評価

本研究では、耕作放棄に伴う水田面積減少による流域スケールでの栄養塩流出量変動のリスク評価を目的とした。水田の耕作放棄により最大流量、土砂流出量、懸濁態窒素およびリン流出量は増加する傾向を示した。放棄前の水田が湿田であった方が乾田よりも水、物質流出量が多く、また、傾斜地上の放棄水田の方がより多い結果であった。土地利用変化の傾向から近い将来の耕作放棄地の増加は必至であり、中山間地域の耕作放棄を防ぐことが重要である。将来的に、農業従事者高齢化による労働力減少により、条件不利地(中山間地)での水田をはじめとする農地の荒地化が加速し、それに伴って下流への窒素やリンの栄養塩流出量の変化が予想される。しかしながら、耕作放棄によって荒地となった放棄田での水・栄養塩動態や、流域スケールでのその影響の評価は不十分である。このため、本研究は、人間の意思決定に基づく土地利用変化を一定条件下で予測可能な人工社会モデルによって将来予測すると共に、河川流域の水・物質収支を推定できる水文流出モデルを組み合わせることで、主に放棄田の増加を考慮した農地の土地利用変化に伴う流域からの栄養塩流出量のリスク評価を行うことを目的とする。初年度は、水田の荒地化伴う栄養塩動態・収支観測を行うため、所属機関内試験圃場にある、長期間使用されていない水田区画において観測機器設置を行い、表面流出および地下水水質の測定を開始した。ここでは、放棄田の地形(急斜面、緩斜面、低地)を考慮して、地下水位(低、中、高)および土壌(全層多腐植質多湿黒ボク土、細粒黄色土、灰色低地土)の異なる区画(3種類2反復)において観測を実施した。また、MASモデルの構築と解析に向けて、農家の意思決定ルールの構築を行った。水文流出モデルを用いた最終的な流域からの栄養塩流出量評価に向けて、簡易シナリオによる水田放棄の影響評価も解析した。水田の耕作放棄に伴う水文プロセスの変化について、前年度に引き続き、異なる種類の水田土壌が充填されたライシメーターを用いた観測および既往文献を参考に検証を行った。その結果、放棄後経過時間に応じて水・栄養塩流出量は変化し、特に放棄前の水田が乾田か湿田かの違いにより大きく異なること、さらに水田の耕作放棄の進行による土壌の物理性の変化や木本類の侵入により、最終的に流域末端への流出に影響を及ぼす可能性が示された。流域スケールでの耕作放棄の影響を評価するため、小流域スケール(数平方km程度)および大流域スケール(1,000平方km程度)を対象に水文流出モデルSoil and Water Assessment Toolを用いた水田土地利用変化のシナリオ解析を行った。小流域スケールの解析では、放棄後数年数十年が経過した水田のパラメーターを導出するため、広島県東部の中山間流域を対象に詳細な調査を行い、現在(放棄後)および過去(放棄前)の土地利用を用いた推定結果からパラメーターを決定した。大流域スケールの解析では中国地方の一級河川のうち4流域を対象に、中山間地域に位置する傾斜地農地が農業従事者の高齢化等に起因する耕作放棄により荒地化した場合、および市街地(平地)の農地が宅地化した場合のシナリオについて、水・栄養塩流出量の変化を同水文流出モデルにより推定した。その結果、水田が耕作放棄により荒地化した場合、土砂および懸濁態窒素・リン流出量が増加する結果が示された。将来の水田土地利用変化を現実的な範囲で予測するモデル(ソフトウェアSwarmを用いたマルチエージェントシミュレーションモデル)は、初年度に構築した農家の意思決定ルールを基に構築し、検証および改良を続けている。水田の耕作放棄が水・栄養塩流出に及ぼす影響について、ライシメーターを用いた試験結果および既往文献の整理によって、概ね明らかとなった。また、流域スケールでの水田減少に伴う栄養塩流出変動リスク評価を行う基盤となる、水文流出モデルの各種パラメーターが観測結果等より決定され、土地利用データを入力することで栄養塩流出変動リスクを評価できる状態となった。将来の土地利用を予測するマルチエージェントモデルは、検証と改良を続けているところであるが、全体的に概ね計画通りに進展していると判断できる。最終年である本年は、MASシナリオ解析による毎年の土地利用データを連続出力し、対象流域からの栄養塩流出量を見積り、リスク評価を行った。広島県東部を流れる一級河川芦田川水系の山田川流域(5.3km2)および谷尻川流域(2.6km2)を対象とした。両流域とも中山間地に位置し、山林と谷筋に広がる水田が主な土地利用となっている。流域内の農地が全て耕作放棄された場合、最大流量は増加した。耕作水田では湛水している灌漑期の流出量が耕作放棄水田よりも多いことがあった。土砂・栄養塩流出量も増加し、特に傾斜地に位置する水田が耕作放棄される方が畑地の場合と比べて多かった。また、耕作が維持されている水田と比べて、耕作放棄された水田では20mm程度以下の降雨時には、地表からの浸透が増え、直接流出は抑えられたが、それ以上の降雨時には地表流が卓越し、それに伴って土壌侵食が生じた。水田が耕作放棄された場合、作物が植えられることによる土壌侵食抵抗係数は若干増加したが、侵食対策管理に関する係数は低下した。畦塗りや締固めなどの畦畔管理が放棄されることによって、畦畔のり面強度が低下することや、土壌が湿潤状態の時に豪雨が到来した場合、畦畔が低く貯留能力が少ない放棄田ではピーク流量が多くなることが既往研究で明らかになっており、これらはモデル解析結果の傾向と合致する。

このため、耕作放棄により地表面は草本類または木本類に覆われる一方で田面には亀裂が生じ、畦畔は損耗し、棚田等の石垣が崩壊することで物質流出量が増加したと考えられた。これらの効果を直接的にパラメータ化できていないが、これは、木本植物の侵入・定着が顕著にみられない放棄直後の数年間において生じ得る現象であり、将来的な耕作放棄に基づく栄養塩流出量の変化の可能性が示された。本研究では、耕作放棄に伴う水田面積減少による流域スケールでの栄養塩流出量変動のリスク評価を目的とした。水田の耕作放棄により最大流量、土砂流出量、懸濁態窒素およびリン流出量は増加する傾向を示した。放棄前の水田が湿田であった方が乾田よりも水、物質流出量が多く、また、傾斜地上の放棄水田の方がより多い結果であった。土地利用変化の傾向から近い将来の耕作放棄地の増加は必至であり、中山間地域の耕作放棄を防ぐことが重要である。水田の荒地化伴う栄養塩動態・収支観測を行うための水田の耕作放棄を模した試験圃場が所属機関内にあることもあり、計画通り観測を始めることができた。また、試験圃場での観測に加え、実際の放棄田についても調査を行い、知見を蓄積しつつある。MASモデルのための農家の意思決定ルールは、次年度以降の検証が必要であるが、予定通り構築できた。また、水文流出モデルによるMASモデルを用いない簡易シナリオ解析も行い、流域からの栄養塩流出に対する水田の耕作放棄の影響について試算が可能になった。土地利用変動を予測するマルチエージェントモデルSwarmを水文流出モデルSWATに連結させ、複数の社会情勢・農業政策シナリオ下の水田の土地利用変動を1年毎に推定し、その変化に伴う窒素・リン流出量の変動を解析する。水文学2年目も計画通り、試験圃場における栄養塩動態・収支の観測と共に、試験圃場以外での現地観測も行い、水・栄養塩動態の解明に向けた調査を継続する。また、初年度に構築した農家の意思決定ルールを基に、SwarmによるMASモデルの構築を行い、意思決定ルールおよびMASモデルの両方に対する検証を行う。効率的に予算を使用した結果、若干の金額が残った。研究を進める上で効率的に予算を使用したため、未使用金として若干残ってしまった。次年度の旅費もしくは消耗品購入に使用する。消耗品購入または旅費として使用する。
発癌プロモーターとプロテインキナーゼCとの結合様式の有機化学的解析

プロテインキナーゼC(PKC)は、細胞内情報伝達におけるキ-エンザイムであると同時に、強力な発癌プロモーター・ホルボールエステルの主要なターゲットとしても注目されている。ホルボールエステルはリン脂質存在下、PKCの調節領域に結合することが知られている。また最近、リン脂質非存在下におけるPKC調節領域の一部と水溶性ホルボールエステルとの複合体の結晶構造も報告された。しかしながら、リン脂質存在下におけるホルボールエステルとPKC複合体の三次元構造は依然として不明な点が多い。本研究はこの点を明らかにするため、新しいタイプの光反応性ホルボールエステルを複数合成し、PKCモデルペプチドに対する光アフィニティーラベリングを行った。昨年、両親媒体ホルボールエステルの疎水性領域である12位、13位とともに、親水性領域である3位にジアゾアセチル基を有する新しい光反応性プローブ3種(1-3)およびラット脳PKCγの101から151番目のアミノ酸からなるモデルペプチド(γ-Cys2)を合成した。今年度はまずγ-Cys2に対するプローブの結合能を測定したところ、3はphorbol 12,13-dibutyrateの約1/100、1および2はともに約1/10という比較的高い結合能を示した。そこで、プローブをトリチウム標識し、γ-Cys2に対する光アフィニティーラベリングを行った。その結果、12位あるいは13位にジアゾアセチル基を導入した1および2が、γ-Cys2を特異的に光標識できることが明らかになった。それに対して、3位に光反応性基を有する3を用いた実験では、γ-Cys2よりもホスファチジルセリンに対する標識がはるかに優先した。プローブ1および2によって標識されたγ-Cys2のアミノ酸残基の同定が今後の課題である。
羊膜類における顔面構造の形態形成とその進化

動物の形態を比較する際に基本となる原則のひとつが、相同な構造は生物体において常に同じ立体的位置関係(topographical relationship)を占めるという、結合一致の法則である。この原則が厳密に成立するなら、哺乳類と、哺乳類以外の四足動物との上あご前端は、神経支配のまるで異なるといった点において相同でない可能性がある。本研究はこの上あごの問題に挑むものである。これまでDlx1-CreERT2マウスを用いた上顎突起(顔面形態を構成する発生原基のひとつ)の系譜追跡や、Cyclopamineを用いた発生原基の結合阻害実験をマウスやニワトリで確立、また比較形態学の手法を使って各動物の発生を比較することで、上あご前端を構成する発生原基は、たしかに哺乳類に至る系統で大幅にずれており、神経支配のような解剖学的構造はそれに倣うという着地点が見えた。本研究が明らかになってきた事実はすなわち、これまで暗黙の裡に前提とされてきた上あご前端の相同性が、実際には哺乳類や鳥で大幅に異なる発生原基から生じるという意味で、教科書的な事実に意を唱えるものである。基礎研究はもちろんのこと、疾患モデルとして複数の動物を用いた際の比較においても必須となる知識なのはまちがいない。またこうした意外性の反面、解剖学的構造の分布と発生原基の細胞系譜とが、原基が視覚的に認識できなくなってのちも頑健に対応するということを、哺乳類モデルを用いて実験的に示した点でも意義がある。当初は初年度においてDlx1-CreERT2マウスの実験系を確立し、次年度に現生種の発生比較、最終年度に化石記録をも含めた進化史の復元を行うことを想定していた。しかし、Dlx1-CreERT2マウスを用いた実験は意外にも数か月で有効なデータが得られるようになり、また当初の計画になかった追加実験であるCyclopamineを用いた顔面突起の結合阻害実験も、特別研究員SPDに採用されたことによる特別研究員奨励費の増額により、初年度に主だったデータをそろえてしまうことができた。化石記録や非モデル動物との比較を次年度で終え、最終年度中には価値のある論文としてまとめられる見込みであることから、当初の計画以上の進行は明らかと言ってよいだろう。Dlx1-CreERT2マウスの系やCyclopamine実験の比較から、顔面を構成する発生原基が哺乳類とそれ以外の動物との間で大きくズレていることが分かった。では、このズレは進化史においていつ、どのように生じたのか。また、発生原基がズレているということは、上あご前端の骨要素(前上顎骨)に関し、哺乳類とそれ以外の動物とで相同性がとれないということになる。これは今までの比較解剖学のクライテリアと大きく異なるが、ではその進化過程を化石記録に見出すことができるか?今後は以上のテーマに主眼を置き、非モデル動物胚や、哺乳類にいたる単弓類系統の化石記録の比較を行い、現生動物間のズレが生じてきた過程とその要因に関して復元してゆく。以上の結果を論文としてとりまとめて発表する。また、研究の過程で多くの記載データや、変異マウスを用いた系譜追跡などからも派生的なデータが数多く得られた。前述の論文を完成させつつ、これらのデータもとりまとめ、本研究の主題を支持するような派生的な論文をいくつか完成させるよう模索する。

Dlx1-CreERT2マウスの系やCyclopamine実験の比較から、顔面を構成する発生原基が哺乳類とそれ以外の動物との間で大きくズレていることが分かった。では、このズレは進化史においていつ、どのように生じたのか。また、発生原基がズレているということは、上あご前端の骨要素(前上顎骨)に関し、哺乳類とそれ以外の動物とで相同性がとれないということになる。これは今までの比較解剖学のクライテリアと大きく異なるが、ではその進化過程を化石記録に見出すことができるか?今後は以上のテーマに主眼を置き、非モデル動物胚や、哺乳類にいたる単弓類系統の化石記録の比較を行い、現生動物間のズレが生じてきた過程とその要因に関して復元してゆく。以上の結果を論文としてとりまとめて発表する。また、研究の過程で多くの記載データや、変異マウスを用いた系譜追跡などからも派生的なデータが数多く得られた。前述の論文を完成させつつ、これらのデータもとりまとめ、本研究の主題を支持するような派生的な論文をいくつか完成させるよう模索する。
肥満や絶食によって発現量の変化する脳内の遺伝子群のクローニングとその役割

我々は、KKAy肥満マウス、60%高脂肪食負荷マウス、および4日間絶食にしたマウスを作製した。これらと、コントロールマウスから、脳を摘出しmRNAを抽出した。これらのmRNAを用いて、サブトラクションプローブを用いたcDNAライブラリーのスクリーニングと、DNAマイクロアレイを用いたcDNAスクリーニングの2種類の方法によって、発現量に変化の生じている遺伝子群の同定を行った。その結果、KKAy肥満マウスにおいて発現量の増加している遺伝子63個、減少している遺伝子39個を同定した。同様に、60%高脂肪食負荷マウスでは、それぞれ104個、67個の遺伝子が同定された。4日間絶食にしたマウスにも発現量の変化している多数の遺伝子が認められた。これらには、成長ホルモンなどの生理活性物質の他、キナーゼ活性を有する細胞内シグナル伝達への関与が示唆されるものも含まれていたが、未知の遺伝子が約60%を占めていた。現在、これらの生理的役割についての研究をすすめている段階である。
部位特異的GAD抗体の自己免疫性1型糖尿病の発症・進展への関与に関する研究

GAD65抗体は病態の異なる1型糖尿病の亜型ごとに特有なエピトープを有している。本研究はGAD65抗体の糖尿病病態への関与を明らかとするため、GAD65/GAD67キメラ蛋白遺伝子を用いて動物モデルにエピトープ特異的GAD65抗体を発現させて糖尿病病態の検討を行うものである。最近樹立されたGAD65ノックアウトNODマウスに、我々が作成したN端GAD65/C端GAD67、N端GAD67/C端GAD65のキメラ蛋白遺伝子を導入して、β細胞特異的に発現するトランスジェニックマウスを現在作成中である。しかしノックアウトNODマウスが妊娠前に糖尿病を発症してしまうため、受精卵の回収が困難な状態である。現在、糖尿病発症率の低いNODマウスとのバッククロスにより糖尿病発症率を漸減しながらの検討を行っている。さらにGAD65ノックアウトNODマウスに対する発生工学的遺伝子導入の不成功を想定して、GAD65遺伝子のN端およびC端の蛋白を作成しGAD65ノックアウトNODマウスへの投与の検討も施行中である。すなわちGAD65の各断端遺伝子をpTrcHisに結合し、これらのGAD65蛋白フラグメントとヒスチジンTagの融合蛋白を大腸菌(BL21)中で産生させ、Hisカラムで精製した。その結果、GAD65C端の蛋白は回収されたが、GAD65N端蛋白は回収されなかった。回収されたGAD65C端の蛋白をGAD65ノックアウトNODマウスに投与して、部位特異的GAD65抗体の発現および糖尿病発症率の変化について検討中である。また、大腸菌を用いて回収されなかったGAD65N端蛋白については昆虫細胞株Sf9を用いた遺伝子発現・蛋白精製を試みている。GAD抗体は、1型糖尿病の予知・診断の指標として広く用いられているが、その意義に関しては、膵β細胞破壊により血中に漏出した抗原に対して抗体が産生され単なる指標であるとする説、この自己抗体自体が膵β細胞破壊をもたらす発症要因であるとする説などがあり、見解が定まっていない。さらに最近、GAD抗体は1型糖尿病の進展を阻止しているとの報告もある。GAD抗体には複数のエピトープがあることが知られており、この抗体の意義に関する相反する報告の存在は、エピトープの異なる抗体が各々異なる作用を有するためとも想定されるが、これらは未解決のまま経過してきた。本研究では、GAD抗体の意義を実証するため、種々の合成GADペプチドを糖尿病動物モデルに投与することでの、GAD抗体の認識部位、糖尿病の発症率・発症時期や膵組織所見に対する影響を検討すべく、様々なGADの部分ペプチドを発現するプラスミドを作成し、大腸菌による蛋白合成、蛋白抽出を試みた。パイロット試験でGAD蛋白のN端、中央部、C端に相当するペプチドの合成・抽出が得られ、今後大量精製の予定である。また、これらGADペプチドを免疫する動物モデルとして、1型糖尿病動物モデルのNODマウスに遺伝子操作を行い、マウス内因性GAD65蛋白の発現が欠損したGAD65ノックアウト・NODマウスを作成し、系を樹立中である。今後はこのノックアウトマウスに上記GADペプチドの投与を行い、糖尿病病態に与える影響の検討を予定している。1型糖尿病の診断マーカーとして広く使用されているGAD65抗体は病態の異なる1型糖尿病の亜型ごとに特有な抗原認識部位を有しており、部位特異的GAD65抗体は各々糖尿病病態へ異なる影響を与えている可能性がある。本研究は動物モデルに部位特異的GAD65抗体を発現させて糖尿病病態への影響を検討するものである。

最近樹立されたGAD65をノックアウトしたNODマウスに、我々が作成したN端GAD65/C端GAD67、N端GAD67/C端GAD65などのキメラ蛋白遺伝子を導入して、β細胞特異的に発現するトランスジェニックマウスの作成を試みた。しかしNODマウスの糖尿病自然発症の影響で受精卵の回収が困難であった。このためGAD65遺伝子のN端、中央部およびC端の蛋白を作成し、GAD65ノックアウトNODマウスへの投与を試みた。すなわちGAD65の各断端遺伝子をpTrcHisAもしくはpTrcHis2Cに結合し、これらのGAD65t蛋白フラグメントとヒスチジンTagの融合蛋白を大腸菌(BL21)中で産生させ、Hisカラムで精製した結果、GAD65の中央部およびC端の蛋白は回収されたが、GAD65N端蛋白は回収されなかった。GAD65N端蛋白は大腸菌内で分解されている可能性が考えられた。回収されたGAD65の中央部およびC端の蛋白をGAD65ノックアウトNODマウスに投与して、部位特異的GAD65抗体の発現および糖尿病発症率の変化について現在検討中である。また、大腸菌を用いて回収されなかったGAD65N端蛋白については昆虫細胞株Sf9を用いた遺伝子発現・蛋白精製を試みている。現在GAD65N端蛋白遺伝子をトランスファーベクターであるpBlueBac4.5/V5-Hisに結合して、相同組み換えによりAcMNPVにGAD65N端蛋白遺伝子の導入を行っている。
ケトン体はうつ病、PTSDの新たな治療となりうるか

うつ病、PTSDの治療に用いる抗うつ薬は、一部の患者には十分な治療効果が得られず、新たな治療法の開発が望まれている。申請者は、ケトン体の一つであるβヒドロキシ酪酸(BHB)の投与により、うつ病モデル動物において抗うつ様の作用があること、ストレス時の炎症性サイトカインの上昇抑制作用があることを報告した。本研究では、他の精神疾患への応用に向けて、PTSDモデル動物に対してBHBを投与し、その抗うつ効果と抗不安効果を検証する。さらに、臨床応用に向けて、うつ病モデル動物、PTSDモデル動物に対して、体内BHBレベルを上昇させる中鎖脂肪酸油を投与し、抗うつ効果、抗不安効果を検証する。
ドイツにおける環境賦課金の生成および初期の展開に関する理論研究

本研究は、ドイツの環境保護法制に着目し、環境賦課金という「環境保全の新たな手法」を研究対象として、その実施に伴って生じる諸問題、特に法理論的課題について研究しようとするものである。本研究では、ドイツの排水賦課金制度について、(1)その導入の背景に「原因者負担原則」の実践および水管理法上の規制的手法の実効性の向上という意図があったことを明らかにし、その上で、(2)排水賦課金と水管理法との関係に焦点を当てることにより、(3)環境賦課金という手法の今後の方向性について展望した。本年度の研究においては、ドイツの排水賦課金という手法が、水質保全政策において必要になった背景にはいかなる事情が存したかを明らかにすることを、主な課題としてきた。そこから明らかになった主要な事項としては、ドイツでは、排水賦課金制度の法制化に至るまでの議論、および、排水賦課金制度の実践を通じて、「規制的手法と経済的手法の混合戦略」という環境政策上の新たなコンセプト形成されてきた、ということが挙げられる。それによると、環境賦課金という手法は、全体としての環境政策の中でそれ自体独立して存在するのではなく、伝統的な規制的手法に内在される限界や欠陥、すなわち、とりわけ「執行の欠缺」という直接型規制の機能不全を補うための補完的手法としての位置づけを与えられようとしてきた、というものである。このような環境賦課金という環境保全手法の方向性は、環境行政の今後のあり方をうらない、したがってまた、この分野における規制行政の新たな可能性を探るうえで、環境法にとってはもちろんのこと、行政法および行政法学への示唆に富むものといいうる。本年度の研究では、ドイツおよびわが国の環境法・行政法関係文献を対象とした調査・研究を実施することができたが、他方で、研究成果の公表にはまだ至っていない。そこで、次年度も研究を継続し、排水賦課金という手法と水管理法上の規制的手法という2つの手法の位置づけ・機能を明らかにすることにより、環境保全の法的手法のあるべき方向性を模索し、そこでの成果を論文等の執筆を通じて公表することとしたい。本年度の研究では、ドイツの排水賦課金という手法が、その法案審議過程を通して、当初構想された原案からいかなる修正が施されたのか、そして、その修正には、法的にみてどのような意義が存するかを明らかにすることを、主な課題としてきた。そこから明らかになった主要な事項は、ドイツの排水賦課金は、構想段階ではいわゆるボーモル=オーツ税として実施されることが望ましいと提言されてきたのに対して、現実の排水賦課金制度は、それとは異なるシステムとして導入されたという点である。すなわち、排水賦課金は、ドイツ環境政策上の原則の一つである原因者負担原則を実行するための手法として用いるという方針がとられてきたが、現実には、水質管理のための法的手法としては既に水管理法上の規制的手法が存在していたため、排水賦課金制度も水管理法との密接な関係の下に実施されることとなる。このため、排水賦課金制度には、この水管理法上の規制的目標およびその実現を補完するという機能を与えられることとなり、その後の数次にわたる法改正においてもこの機能をより明確なものとするための制度改定が重ねられてきた結果、当初構想されたシステムとは大きくその性格・内容を異とする法制度となった。そこで、重要なのは、現実のシステムとしての排水賦課金の性格・内容をいかに評価するかであるが、管見では、排水賦課金制度のこうした変遷の過程から、「規制法の執行支援」という、経済的手法としての環境賦課金の新たな機能を発見するに至ったことを、積極的に評価すべきであると考えている。
言語の韻律特性に基づく日本語音声の単語分節方略と発達過程に関する方言間比較研究

日本語における連続音声中からの単語分節の方略と手がかりを明らかとすることを目的として,アクセント,言語リズムなどの韻律的特徴が,語境界にどのように関与してあらわれるかについて調べ,方言間を比較して研究を行った.「乾湿器」と「監視付き」のように音列が同一で語境界が異なる語を調査したところ,アクセントにより語を弁別する方言話者(共通語話者)と弁別しない方言の話者(無アクセント話者)とでは,語境界における音の伸長の様相が異なることがわかった.これらの結果に基づき,連続音声中の単語同定の手がかりについて検討した.日本語における連続音声中からの単語分節の方略と手がかりを明らかとすることを目的として,アクセント,言語リズムなどの韻律的特徴が,語境界にどのように関与してあらわれるかについて調べ,方言間を比較して研究を行った.「乾湿器」と「監視付き」のように音列が同一で語境界が異なる語を調査したところ,アクセントにより語を弁別する方言話者(共通語話者)と弁別しない方言の話者(無アクセント話者)とでは,語境界における音の伸長の様相が異なることがわかった.これらの結果に基づき,連続音声中の単語同定の手がかりについて検討した.ことばの韻律的特徴に焦点を当て,日本語連続音声の発話生成および知覚において,アクセント,言語リズムが語境界にどのように関与してあらわれるかについて,言語面接調査および言語心理学的手法により,成人,乳児を対象に単語,文の発話・聴取実験およびコンピュータシミュレーションを行なって,日本語における連続音声中からの単語分節の方略と手がかり,それらの発達過程を明らかとすることを目的として研究を行なう.検討にあたっては,韻律特性の異なる2地域,共通語の東京地域といわゆる「無アクセント」方言のひとつ,栃木地域で同様の実験を行ない,結果を方言間で比較する.2010年度は以下の研究を実施し,成果を得た.東京地域で,成人話者を対象に発話生成実験を行なった.実験参加者は30名となった.検査語は,音系列が同一で語境界の異なるペア(例:「ふたえにしてくびにまくじゅず」;「二重にして,首に巻く数珠」と「二重にし,手首に巻く数珠」)を複数個,用意し,ノート型PCを用いて誘導音声および検査語を呈示し,参加者の発話生成を求め,音声収録器に記録した.収集した発話資料のピッチ,音節継続長を計測し,境界と対応して,これらの音響パラメータがどのようにあらわれるかについて調べ,アクセントおよび言語リズムと単語分節の関係性について検討した.発話実験参加者と同一の者を対象に,「のたかまも」のような疑似単語を用い,ピッチ,音節継続長を変化させた合成音声刺激を作成し,参加者に知覚させて語境界を判断させ,アクセントおよび言語リズムと単語分節の関係性も検討した.大規模言語音声コーパスのピッチ,音節継続長を計測して,アクセント,言語リズムと単語分節の関係性を調べ,語境界と対応する音響パラメータを抽出することも試みた.音声言語は,即時的,直接的に話者の意図を伝達する,強力なコミュニケーションの手段である.音声言語はほぼ切れ目なく音がつながることにより成される連続体でありながら,われわれはその聴取において,音声連続から単語を切り出し,話し手の意図を理解することができる.従来,音声言語の発話から単語を分節する手続きおよびその発達過程については,ヨーロッパ諸語ではかなり明らかとなっている.これに対し,日本語ではほとんど研究成果の蓄積がない.そこで,本研究では,韻律的特徴に焦点を当て,日本語連続音声の発話生成および知覚において,アクセント,言語リズムが語境界にどのように関与してあらわれるかについて,成人,乳児を対象に音声言語の発話生成および聴取の実験を行なって,日本語における単語分節の方略を明らかとする.平成23年度は,以下の成果を得た.(1)発話生成実験:東京地域を中心に,発話生成資料を収集した,検査語は,音系列が同一で,語境界の異なるペア(例:「ふたえにしてくびにまくじゅず」;「二重にして,首に巻く数珠」と「二重にし,手首に巻く数珠」)である.収集した発話資料のピッチ,音節継続長を計測し,境界と対応して音響パラメータがどのようにあらわれるかについて調べたところ,音節継続長については明瞭な結果が得られなかった.聴取実験の結果とあわせ,総合的に検討する必要がある-(2)聴取実験:発話生成実験と同一の対象者に,聴取実験を行なった.発話実験と同様の検査語および疑似単語を用い,合成音声刺激を作成し,参加者に知覚させて語境界を判断させた-結果については,現在解析中である.ことばの韻律的特徴に焦点を当て,日本語連続音声の発話生成および知覚において,アクセント,言語リズムが語境界にどのように関与してあらわれるかについて,言語面接調査および言語心理学的手法により,成人,乳児を対象に単語,文の発話・聴取実験およびコンピュータシミュレーションを行なって,日本語における連続音声中からの単語分節の方略と手がかり,それらの発達過程を明らかとすることを目的として研究を行なった.検討にあたっては,韻律特性の異なる2地域,共通語の東京地域といわゆる「無アクセント」方言地域で同様の実験を行ない,結果を方言間で比較した.検査語は,音系列が同一で語境界の異なるペア(例:「ふたえにしてくびにまくじゅず」;「二重にして,首に巻く数珠」と「二重にし,手首に巻く数珠」,「おしょくじけん」;「汚職事件」と「お食事券」など)である.本年度は最終年度にあたり,研究の総括として議論を進めた.

検査語のような音系列が同一で語境界の異なるペアは,東京方言地域ではアクセント等の韻律情報により識別でき場合もあるが,無アクセント地域ではアクセントを手がかりとして識別することは不可能である.種々の実験により収集されたデータを分析した結果,総じて,無アクセント地域においては,語境界にあたる音節の継続長が伸長する傾向が強く観察された.また,東京方言でも,アクセント情報に依存して識別できる場合とできない場合とで,音節の伸長が異なる様相が見られた.これらの結果は,音節継続長が語境界の検出に役割を果たしていることを示すものと考えられ,興味深い.従来明瞭とされていない,日本語音声における,連続音声からの単語分節方略に新たな知見を提供する結果である.さらに,発話生成の言語普遍的なモデルに対しても有益な提言となりうると捉えられる.調査地域・対象者に,東日本大震災の影響を受けたものがあり,調査の進展に遅れが見られた.25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は最終年度にあたり,とりまとめを中心に進める予定である・これに加え,前年度の影響を考慮し,データ収集も併せて行なうこととする.25年度が最終年度であるため、記入しない。
臨床検体の遺伝子発現情報を用いた仮想ダイセクション手法の開発とデータベース構築

本課題では、ヒト臨床検体(正常・炎症・癌組織)の遺伝子発現情報から、組織内に含まれる細胞群の混合率を推定するアルゴリズムを開発する。例えば、抗PD-1/PD-L1抗体などの免疫チェックポイント阻害剤では、癌組織に浸潤している免疫細胞(マクロファージ、NK細胞、T細胞、B細胞など)の違いも重要になると考えられる。治療法の選択においては癌細胞だけでなく間質細胞も細分化して解析し、各細胞の割合を定量的に算出することが必要となる。そこで、細胞種が混在した正常・炎症・癌などの組織の発現パターンを公共データベースから入手し、機械学習の一つである「教師なし学習」を用いて、各細胞群のリファレンスとなる発現パターン(リファレンス発現パターン)とそれらの混合比を検体ごとに推定する。さらにリファレンス発現パターンを用いて、新規に得られた検体の発現プロファイルに対して細胞群の混合比を算出し、研究者に提示するようなウェブシステムを構築する。2018年度では、まずアルゴリズムの方向性や前処理のパラメーターの評価・検討を行うため、既知の割合で混合したラット組織の公開発現データによる予備解析を実施した。その際、当初想定していた非負値行列因子分解(NMF)のみならず、非負値主成分分析(nsprcomp)や非負値スパース累積主成分分析(nscumcomp)などの類似手法による追加検討を行った。また、TCGA (The Cancer Genome Atlas)にて公開されている肝細胞癌、乳癌、肺癌のRNA-seqの発現情報を用いて、それぞれのがん種における細胞種の混合率の推定を行うとともに、それぞれのリファレンス発現パターンの生物学的意義の解釈を進めた。2018年度では、おもに細胞種の混合率を推定するアルゴリズムの検討を行った。本研究では公開されたRNA発現データを使用するが、公開データのヒト臨床検体では細胞種の混合率の情報を得ることが困難である。そのため、あらかじめ混合率が分かっているデータをもとに、予備解析と評価を進めることとした。そこで、ラットの脳・肝・肺からそれぞれ抽出したRNAを指定した割合で混合した公開マイクロアレイデータ(NCBI GEOデータベースアクセション番号GSE19830、0100%まで13種類の割合で混合したもの)を用いて評価を行った。その結果、当初検討していた非負値行列因子分解(NMF)よりも非負値主成分分析(nsprcomp)の方が既知濃度との当てはまりがよいことが分かったため、本研究ではnsprcompを主とし、NMFを比較用のアルゴリズムとして並行して開発を進めることとした。また、遺伝子発現解析では一般にlog2などの対数変換を行ったデータがよく用いられているが、元スケールの発現量を用いた場合の方がnsprcompやNMFによる混合比の推定結果が近いことが分かった。次に、TCGA (The Cancer Genome Atlas)に収載されている肝細胞癌、乳癌、肺癌のデータを用いて、それぞれのがん種における細胞種の混合率の推定を行った。上述のように、nsprcompとNMFの2つの手法を用いて、(1)各細胞種のリファレンス発現パターン、(2)各細胞種の存在比率、の推定を実施した。その結果、ある程度事前の予測された通り、がん種を問わず(A)腫瘍細胞由来と考えられる細胞周期関連遺伝子が亢進したリファレンス発現パターンと、(B)免疫細胞由来と考えられる炎症系の遺伝子が亢進したリファレンス発現パターン、の2つの主要な特徴を得ることができた。前述の通り、主要な2つのリファレンス発現パターンは直感的な解釈が可能であったものの、3つ目以降のリファレンス発現パターンはnsprcompやNMFのパラメーター(用いる遺伝子の選択基準、事前に定めるリファレンス発現パターン数、乱数シードの初期値、期待値最大化法の収束条件など)によって大きな揺らぎが見られたため、一義的な解釈が困難であった。そのため、2019年度では特徴抽出を複数条件で行い、条件間で類似したリファレンス発現パターンの出現頻度やその生物学的意義を検討することで、揺らぎの中でも安定的に見いだされる各細胞に固有の発現パターンであるリファレンス発現パターンを収集する予定である。また、既知の組織特異的マーカーを用いるとともに、遺伝子の重みづけ成分の内容を吟味しながら分担研究者および協力研究者とディスカッションし、慎重に決定する。さらに2020年度を目途に、最終的なリファレンス発現パターンから、解析対象とした全ての癌検体に対して細胞種の割合を計算し、公開データとして準備する。また公開用サーバーをクラウド環境で構築するとともにウェブ・アプリケーションを開発し、2020年度内の公開を目指す。

2018年度では、まずアルゴリズムの方向性や前処理のパラメーターの評価・検討を行うため、既知の割合で混合したラット組織の公開発現データによる予備解析を実施した。その際、当初想定していた非負値行列因子分解(NMF)のみならず、非負値主成分分析(nsprcomp)や非負値スパース累積主成分分析(nscumcomp)などの類似手法による追加検討を行った。また、TCGA (The Cancer Genome Atlas)にて公開されている肝細胞癌、乳癌、肺癌のRNA-seqの発現情報を用いて、それぞれのがん種における細胞種の混合率の推定を行うとともに、それぞれのリファレンス発現パターンの生物学的意義の解釈を進めた。2018年度では、おもに細胞種の混合率を推定するアルゴリズムの検討を行った。本研究では公開されたRNA発現データを使用するが、公開データのヒト臨床検体では細胞種の混合率の情報を得ることが困難である。そのため、あらかじめ混合率が分かっているデータをもとに、予備解析と評価を進めることとした。そこで、ラットの脳・肝・肺からそれぞれ抽出したRNAを指定した割合で混合した公開マイクロアレイデータ(NCBI GEOデータベースアクセション番号GSE19830、0100%まで13種類の割合で混合したもの)を用いて評価を行った。その結果、当初検討していた非負値行列因子分解(NMF)よりも非負値主成分分析(nsprcomp)の方が既知濃度との当てはまりがよいことが分かったため、本研究ではnsprcompを主とし、NMFを比較用のアルゴリズムとして並行して開発を進めることとした。また、遺伝子発現解析では一般にlog2などの対数変換を行ったデータがよく用いられているが、元スケールの発現量を用いた場合の方がnsprcompやNMFによる混合比の推定結果が近いことが分かった。次に、TCGA (The Cancer Genome Atlas)に収載されている肝細胞癌、乳癌、肺癌のデータを用いて、それぞれのがん種における細胞種の混合率の推定を行った。上述のように、nsprcompとNMFの2つの手法を用いて、(1)各細胞種のリファレンス発現パターン、(2)各細胞種の存在比率、の推定を実施した。その結果、ある程度事前の予測された通り、がん種を問わず(A)腫瘍細胞由来と考えられる細胞周期関連遺伝子が亢進したリファレンス発現パターンと、(B)免疫細胞由来と考えられる炎症系の遺伝子が亢進したリファレンス発現パターン、の2つの主要な特徴を得ることができた。前述の通り、主要な2つのリファレンス発現パターンは直感的な解釈が可能であったものの、3つ目以降のリファレンス発現パターンはnsprcompやNMFのパラメーター(用いる遺伝子の選択基準、事前に定めるリファレンス発現パターン数、乱数シードの初期値、期待値最大化法の収束条件など)によって大きな揺らぎが見られたため、一義的な解釈が困難であった。
尿路悪性腫瘍と可移植腫瘍における臨床的、実験的研究(プラスマフィブロネクチンを中心として)

1.ヒトにおけるPlasma Fibronectin(pFN)の測定。正常人24名、尿路悪性腫瘍患者61名において免疫比濁法によるpFN値の測定を行った。1)治療前におけるpFN値。正常人のpFN値は、平均379μg/ml、患者群では、356μg/mlであり、有意差を認めなかった。転移の有無によってもpFN値に有意差を認めなかった。予後良好群と不良群では、各々410μg/ml、300μg/mlであり、有意差を認めた。2)保存的治療中の患者群におけるpFN値。腫瘍の進行が遅い群と速い群におけるpFN値は、各々372μg/ml、287μg/mlであり、有意差を認めた。よって、pFN値と腫瘍の進行、予後との関連性が示唆された。3)各種治療に於けるpFN値の変動。化学療法中は7例中3例でpFN値の低下(50180μg/ml)を認めた。少数例ではあるが、温熱療法、放射線療法、IFN療法では変動はみられなかった。2.担癌マウスにおけるpFN値。移行上皮癌、腎細胞癌、乳癌細胞株をヌ-ドマウスに皮下移植し、pFN値を測定した。1)各細胞株による差はなかった。2)controlのpFN値は712μg/ml、移植後2、4、9、14週では各々652、844、902、730μg/mlであり多少の変動はみられるものの有意差はなかった。転移の有無、悪液質状態の有無によっても差はなかった。マウスの場合測定値のばらつきが大きく、その原因として、FN測定キットがロットによりFN活性に差があり、マウスでは検体量が限られ複数回の測定ができない場合があった事、血清に近い検体があった事などがあげられる。これが、臨床例との相違の一つの要因であろう。今後は測定法の改良、他のパラメ-タ-を加えての総合的な検討が必要である。3.温熱療法について。継代した膀胱癌細胞において、至適温度における生存細胞数は加温前の10^<ー1>前後で熱感受性はあると思われた。ヌ-ドマウス移植腫瘍に対するTHERMOTRON・RF・I.Vを用いたRF加温実験では、マウスの死亡等により複数回の加温が困難であり、今後の課題と思われた。正常人24名、尿路系悪性腫瘍患者61名において免疫比濁法によるpFN値の測定を行った。正常人のpFN値は、平均379μg/ml、患者群では。356μg/mlであり、有意差を認めかなった。転移の有無によっても、pFN値に有意差を認めなかった。予後良好群と不良好群では、各々、410μg/ml、300μg/mlであり、有意差を認めた。