hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
硬組織誘導能を有するムコ多糖含有リン酸カルシウム根管充填材の開発

実験動物としてラットを用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法として報告されている手法にしたがってラットの大腿骨骨髄幹細胞を採取して骨髄幹細胞を培養する。そして、硬組織形成細胞に分化する間葉系幹細胞の単離を試み、培養器内の石灰化物の存在によって骨芽細胞への分化を確認するとともに、培養における担体にリン酸カルシウム硬化体を用いることによって、リン酸カルシウムセメントがin vivoで根管内に硬組織を誘導する可能性を探ることが今年度の目標であった。また、ラット切歯歯髄内にリン酸カルシウムセメントを填入し、歯髄反応を検索して、リン酸カルシウムセメントを応用した根管内に硬組織が誘導される現象が未分化な歯髄細胞が硬組織形成細胞に分化して生じるとした仮説をin vitroで明らかにすることも目標としていた。ラットの大腿骨骨髄幹細胞を採取して骨髄幹細胞を培養し、硬組織形成細胞に分化する間葉系幹細胞を単離して培養器内の石灰化物の存在によって骨芽細胞への分化を確認することに関して、その手法を確立した。そして、コンドロイチン硫酸を添加因子としての培養を行った。その結果、in vitroすなわち細胞培養系で顕著な硬組織形成は生じず、コンドロイチン硫酸は硬組織形成促進因子ではないことが示唆された。現時点では、コンドロイチン硫酸添加リン酸カルシウムセメントにのみ観察された動物皮下組織での小血管や結合組織のセメント内部への浸潤に見られるようにセメントの高い組織親和性に寄与する可能性と、ラット下顎臼歯根管に同セメントを填入して根尖部歯槽骨に骨芽細胞様細胞の存在と速やかな歯槽骨再生を観察している。今年度の実験結果から、コンドロイチン硫酸添加リン酸カルシウムセメントは歯槽骨の吸収を伴う根尖部の修復を促進するように作用するが骨芽細胞に直接的に作用するものではなく二次的である可能性が強く示唆された。リン酸カルシウムセメントのなかで、リン酸四カルシウムとリン酸水素カルシウム-二水和物との当モル混合物を選択し、この液相をコンドロイチン硫酸ナトリウムを含む緩衝液で練和する考えはきわめて独創的な試みであると考えている。リン酸四カルシウムとリン酸水素カルシウム-二水和物との当モル混合物は固相の緩衝作用を有するので、このリン酸四カルシウムとリン酸水素カルシウム-二水和物との当モル混合物を緩衝液で練和することによって、硬化過程でそのpHを中性に近い値を維持できる。このことはこのセメントが、生体内で組織に刺激性を示すことなく硬化する極めて生体親和性に優れた性状を呈すると期待された。実験の結果、生体に炎症を引き起こすことなく、さらに、コンドロイチン硫酸を添加したリン酸カルシウムセメントでは硬組織形成を促進する傾向が認められた。根管内では応用した歯髄切断面直下の根管壁に硬組織が添加され、根管は閉鎖された。根尖孔外の歯槽骨欠損部はセメントの吸収に伴う歯槽骨の速やかな再生が認められた。この研究で評価したリン酸カルシウムセメントには低濃度のクエン酸を含む緩衝液を硬化液として用いていることから、リン酸カルシウム結晶粒子が相互に凝集して結合し、硬化したセメントはアパタイトを形成するがその結晶性が低いという特徴がある。すなわち、硬化過程でのセメント周囲に微細な結晶粒子が残存するために埋入した組織内では初期にマクロファージや多核巨細胞が観察されており、セメント硬化体表面性状を改良する必要があるかもしれない。その一方で、低結晶性のこのセメントは生体吸収性の材料であると言えることは事実であり、骨の再構成にとってこのセメントは有効であると考えられる。
亜鉛・ビタミンE,Cの複合摂取による血圧上昇及び血管肥厚抑制効果

腎血管性高血圧モデルラットにビタミンE,Cを混合した飼料を摂取させ、血圧とアンジオテンシン(Ang)IIの産生を観察した結果、単独では血圧上昇するが、3種類を複合投与すると血圧の上昇抑制、血漿AngII量の低下、血管機能改善、血管肥厚の抑制が観察され、血管組織に対する数種の染色方法によって検討し、管腔側からの影響は好中球の内皮細胞への影響をフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いて現在検討中である。哺乳類の体内で、本年度は、抗酸化剤の効果を形態学的並びに定量的に評価するための正確で比較的簡便な方法を考案した。末梢血より好中球を分離し、プロテインキナーゼCの賦活剤であるPMAで刺激すると、好中球細胞質中のp40phox, p47phox,およびp67phoxがリン酸化され、好中球細胞質中の分泌顆粒の限界膜に内在するp22phoxおよびgp91phoxと結合し、NADPH oxidaseが形成され、顆粒腔内に活性酸素を産生する。これを酸化されると蛍光を発するH_2DCFDAで標識することにより、蛍光顕微鏡で、観察することが可能で、また、Flow cytometryで定量的に測定することが可能である。このように産生された活性酸素は、好中球が細菌等を貧食していない場合は、形質膜の方に移動し、好中球外へ分泌放出される。本年度は植物の細胞壁に普遍的に存在するリグニンの構成要素であるProto-catechuic acid(PA), Ferulic acid(FA),およびCaffeic acid(CA)の抗酸化効果を検索した。今回用い用量はそれぞれ100mMとした。蛍光顕微鏡による形態学的観察では、PMAで刺激したコントロールに比べ、これら3種のポリフェノールで処理をした場合には、活性酸素を有する顆粒の数は明らかに減少していた。Flow cytometryによる測定では、好中球の細胞質中の蛍光強度は、これらの抗酸化剤を加えた場合、それぞれ62.9%,71.4%,および86.1%で、CAが最も抗酸化効果が強かった。好中球から分泌放出された活性酸素、すなわち、細胞外の活性酸素の抑制効果は、PAで81.4%、FAで46.7%、CAで77.0%で、細胞外では、PAとCAに強い抗酸化効果が見られた。また、これら3種の抗酸化剤がNADPH oxidase酵素に如何なる効果を見たところ、この酵素の特異的阻害剤であるdiphenylene iodoniumでは、活性酸素産生能が92.1%阻害された。これに比べ、PA, FA, CAでは、それぞれ36.5%,54.6%,27.4%の酵素阻害効果が見られた。本法は抗酸化効果の観察、測定に有効で今後の研究に応用する所存である。抗酸化物質である亜鉛(Zn)とビタミンE、Cの相互作用が血管へのストレス軽減にどう関与するか、高血圧モデルラットの飼料にこれらの抗酸化物質を添加し、血圧、血管、angiotensin II(Ang II)などに及ぼす影響を検討した。「方法」6週齢のSD系雄ラットを用い、麻酔下にて左腎動脈に内径0.245mmのシルバークリップを装着し、腎血管性高血圧ラット(2KIC)を作成しました。対照群には手術のみを行い、SHAM群を作成した。血圧が上昇した10週齢より、AIN-93M飼料をコントロール食(C)として、これに亜鉛2mg/kgを混合したZn単独群(Zn)、亜鉛とビタミンE100mg/kg(VE)、ビタミンC200mg/kg(VC)を混合した3種混合食群(ZV)群を作成し、6週間自由摂取させ、対照群にはコントロール食を与えた。投与期間中、血圧測定を行い、投与終了の16週齢時に血液採取後、腹部大動脈を用いてmagnus法にてacetyl-choline(ach)及びsodium nitroprussid(SNP)による血管弛緩反応の観察を行った。胸部大動脈を摘出しHE、EvG、アルシアンブルー染色にて組織観察を行った。また血漿中のAng II、NO、IL-6の測定を行った。「結果」血圧は、対照群に比べ、高血圧群、Zn単独群、3種混合群では低下した。血管弛緩反応では、3種混合群において血管拡張性の改善がみられたのは、NO濃度の上昇と関連しているものと考える。中膜の肥厚は、AngIIの上昇と関係があり、3種混合投与により両者の低下がみられた。H_2O_2、SODに差はみられなかった。亜鉛、ビタミンE、Cの3種複合投与により腎血管性高血圧ラットの血圧上昇が抑制された。これにはAng IIによる血管壁の肥厚の抑制と、NOによる血管拡張性の回復が関与していることがわかった。

抗酸化物質である亜鉛(Zn)とビタミンE、Cの相互作用が血管へのストレス軽減に関与するかを高血圧モデルラットの飼料にこれらの抗酸化物質を添加し、血圧、血管、angiotensin II (Ang II)などに及ぼす影響を検討するため6週齢のSD系雄ラットに内径0.245mmのシルバークリップを装着し腎血管性高血圧ラット(2K1C)を作成したうえで、AIN-93M飼料をコントロール食(C)とし、これに亜鉛20mg/kgとビタミンE 100mg/kg、ビタミンC 200mg/kgを混合した3種混合食群を混合し6週間自由摂取させたところ、亜鉛とビタミンE・Cの3種混合食群では、対照群に比べ血圧の上昇がみられず、血管弛緩反応試験において血管内皮を介した血管拡張性の改善がみられた。また、血管組織を染色観察したところ、3種混合食群には中膜の肥厚の低下がみられた。これらの結果に基づいて、本年度は亜鉛、ビタミンE,Cによる効果が血管内皮細胞に与えた影響を検討するために、前年度に考案した抗酸化剤の効果を形態学的並びに定量的に評価するための正確で比較的簡便な方法を用いて、好中球の代わりに血管内皮細胞を用いてNADPHオキシターゼサブユニットによる経路による経路について活性酸素をH2DCFDAで標識することによって蛍光顕微鏡を用いて観察し、Flow cytometryにより定量的に測定することが可能になることを確認したうえで、血管内皮細胞にAngIIを作用させNADPHオキシターゼサブユニットによる経路、eNOSによる経路、Cu-Zn SODなどの細胞内抗酸化系に対する観察を行ったところである。亜鉛、ビタミンE,Cの効果については、現在も検討中であり、今のところ明確な結論を得るまでには至らなかった。腎性高血圧症ラットを用いて亜鉛・ビタミンE、Cの複合投与により、血圧の変化、動脈血管壁の肥厚にどのような影響を与えるかを検索した所、血圧上昇は有意に抑えられ、また血管壁の肥厚は、上記の3種混合投与により、抑制されていた。また今年度の研究の結果、血管拡張性の改善はNO濃度の上昇と関連しており、血管中膜の肥厚はアンギオテンシンIIの上昇と関連していることが明らかとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の実験により、1.亜鉛・ビタミンE,Cの3種投与で低下し、血管弛緩拡張したのは、NO濃度の上昇であることが分かった。2.血管中膜の肥厚はアンジオテンシンIIの上昇と関連していると考えられ、アセチルコリンは血管内皮細胞の弛緩に関連し、今回の実験で3種投与では低下し、血管弛緩の低下が改善していた。このメカニズムとNO,アンジオテンシンおよびIL-6との関連を解明して行きたい。
うつ病へのインターロイキン18の作用解明と新規治療戦略の模索

IL-18欠損マウスを使用した実験を継続して行った。2018年度は2017年度に行った解析よりIL-18欠損マウスは記銘力障害や意欲低下なうつ病様行動変化を呈した。病態・メカニズムとしてIL-18が欠損する事で海馬のミトコンドリアが変性し機能が失われ海馬機能不全から起こった可能性が1つ目に挙げられた。2つ目に海馬における神経再生を観察したところ、未分化神経細胞が減少しているだけでなく、成熟した神経細胞もIL-18欠損下では減少している事が新しい知見として発見された。3つ目にミトコンドリア機能不全が起こる事で本来であればエネルギー供給が正常に起こらず細胞死(アポトーシス)が誘導されるはずであるが、正常なアポトーシスは誘導されていなかった。アポトーシスを誘導する遺伝子変化を追跡したところ、アポトーシス抑制遺伝子の発現は低下しており、アポトーシスを誘導する方向へ動いている事が明らかとなったが、アポトーシスを誘導する酵素のカスパーゼ3が活性化を受けておらず、この部分に障害が発生している可能性が明らかとなった。これらについて2018年度は組み換えIL-18を脳室内へ投与し、これらの変化が治療可能かどうかを観察した。動物実験委員会と協議の結果、組み換えIL-18は1週間に2回、2週間投与し解析を行う事となった。その結果、ミトコンドリアの変性、成熟ニューロンについては組み換えIL-18を投与しても改善が見られなかったが、未分化神経細胞は一定の改善が見られた。これらから部分的には改善が見られ、今後治療応用が可能である可能性が示唆された。その成果について原著論文をまとめ、現在投稿中である。なお当研究の成果をまとめた内容を2017年度に発表した第113回日本精神神経学会学術総会、2018年度に発表した第114回日本精神神経学会学術総会において、2年続けて優秀発表賞を受賞した。昨年度の報告にも挙げたとおり、当初の予定では2017年度は行動学的解析と病態の構成概念妥当性を中心に解析を行う予定であったが、計画通り実験が進行したため、2018年度の実験計画であった病態の構成概念妥当性についての分子生物学的解析についても実験、解析が終了している。残りの計画通り、2018年度は当初の実験計画の予後妥当性を中心に組み換えIL-18の脳室内投与による治療効果判定を実験する予定であったが、トラブルなく計画通り進行し2019年度に行う予定であった得られた成果をまとめた原著論文作成も完了し、既に欧米の学術誌に投稿中である。2019年度の計画としては、欧米の学術誌への掲載、及び得られた知見の国内、国際学会での発表をそれぞれ1回、2回予定している。加えて、研究支援者や学会発表で頂いたコメントを参考にさらに深い解析を行う予定である。上記記載のように当初の実験計画以上に研究は進んでおり、2019年度の計画としては、少なくとも欧米の学術誌への掲載、及び得られた知見の国内、国際学会での発表をそれぞれ1回、2回予定している。加えて当初の計画以上に研究が進んでいるため、さらに下記の実験を可能な範囲内で行う予定である。2019年度としては今回得られた知見を元に、海馬以外の遺伝子発現の解析、中枢神経におけるIL-18の受容体発現、IL-18の中枢神経細胞への直接的な影響について、行う予定である。行動学的解析により、IL-18欠損マウスは野生型と比較し、記銘力障害や意欲低下などの抑うつ様行動変化を呈した。形態学的解析によるとIL-18欠損マウスの海馬は光学顕微鏡下では変化を認めなかった。しかし、電子顕微鏡では海馬の歯状回の神経終末のミトコンドリアに変性を認めた。神経再生(neurogenesis)に関しては神経再生が抑制されているという結果となった。分子生物学的解析を行った。まず、マイクロアレイの機能解析によれば、うつ病や認知症と関連している遺伝子変化を捕らえた。また、アポトーシスに関する遺伝子が多数変化していた。形態的な変化で観察されたミトコンドリアに関するタンパクの発現に差が見られなかった。さらに、Authophagyに関連する遺伝子のタンパクの発現にも差が認められなかった。アポトーシスに関連する遺伝子では、アポトーシス誘導のタンパクより、アポトーシス抑制因子のタンパクの発現がIL-18欠損マウスにて抑制されており、アポトーシスを誘導する方向へ動いていることが判明した。しかしながら、IL-18欠損マウス、野生型マウスの海馬におけるアポトーシスをTUNEL法を用いて観察したところ、いずれもアポトーシス陽性細胞は認めなかった。これらから、IL-18はアポトーシスのいずれかのシグナル、もしくは実行に必要不可欠であるという可能性が示唆された。組み換えIL-18の脳室内投与について現在実験を進行している。当初の予定では平成29年度は行動学的解析と病態の構成概念妥当性を中心に解析を行う予定であったが、計画通り実験が進行したため、平成30年度の実験計画であった病態の構成概念妥当性についての分子生物学的解析についても実験、解析が終了した。現在、平成30年度の実験計画の予後妥当性を中心に組み換えIL-18の脳室内投与による治療効果判定を実験中である。

病態・メカニズムとしてIL-18が欠損する事で海馬のミトコンドリアが変性し機能が失われ海馬機能不全から起こった可能性が1つ目に挙げられた。2つ目に海馬における神経再生を観察したところ、未分化神経細胞が減少しているだけでなく、成熟した神経細胞もIL-18欠損下では減少している事が新しい知見として発見された。3つ目にミトコンドリア機能不全が起こる事で本来であればエネルギー供給が正常に起こらず細胞死(アポトーシス)が誘導されるはずであるが、正常なアポトーシスは誘導されていなかった。アポトーシスを誘導する遺伝子変化を追跡したところ、アポトーシス抑制遺伝子の発現は低下しており、アポトーシスを誘導する方向へ動いている事が明らかとなったが、アポトーシスを誘導する酵素のカスパーゼ3が活性化を受けておらず、この部分に障害が発生している可能性が明らかとなった。これらについて2018年度は組み換えIL-18を脳室内へ投与し、これらの変化が治療可能かどうかを観察した。動物実験委員会と協議の結果、組み換えIL-18は1週間に2回、2週間投与し解析を行う事となった。その結果、ミトコンドリアの変性、成熟ニューロンについては組み換えIL-18を投与しても改善が見られなかったが、未分化神経細胞は一定の改善が見られた。これらから部分的には改善が見られ、今後治療応用が可能である可能性が示唆された。その成果について原著論文をまとめ、現在投稿中である。なお当研究の成果をまとめた内容を2017年度に発表した第113回日本精神神経学会学術総会、2018年度に発表した第114回日本精神神経学会学術総会において、2年続けて優秀発表賞を受賞した。昨年度の報告にも挙げたとおり、当初の予定では2017年度は行動学的解析と病態の構成概念妥当性を中心に解析を行う予定であったが、計画通り実験が進行したため、2018年度の実験計画であった病態の構成概念妥当性についての分子生物学的解析についても実験、解析が終了している。残りの計画通り、2018年度は当初の実験計画の予後妥当性を中心に組み換えIL-18の脳室内投与による治療効果判定を実験する予定であったが、トラブルなく計画通り進行し2019年度に行う予定であった得られた成果をまとめた原著論文作成も完了し、既に欧米の学術誌に投稿中である。2019年度の計画としては、欧米の学術誌への掲載、及び得られた知見の国内、国際学会での発表をそれぞれ1回、2回予定している。加えて、研究支援者や学会発表で頂いたコメントを参考にさらに深い解析を行う予定である。上記にも記載のように当初の実験計画以上に進展している。実験計画に記載のとおり、主に引き続き病態の構成概念妥当性と予後妥当性を中心に解析を行う。なお、解析にあたり、必要な点として再現性の確認であるが、これは上記実験と並行して再現実験を行い、再現性の確認も行う。実験が終了すれば、引き続き学会発表だけでなく、論文での発表を執り行う。上記記載のように当初の実験計画以上に研究は進んでおり、2019年度の計画としては、少なくとも欧米の学術誌への掲載、及び得られた知見の国内、国際学会での発表をそれぞれ1回、2回予定している。加えて当初の計画以上に研究が進んでいるため、さらに下記の実験を可能な範囲内で行う予定である。
レーザー光による眼底病変の生体組織学的検索

走査レーザー検眼鏡(SLD)は観察光の波長を変えることで、眼底の表層と深層の構造を強調して描出できる。光学的干渉断層計(OCT)は眼底の断面を1020^<um>の精度で画像化できる。OCT単独もしくはSLOとの併用により、眼底病変を「生体組織学」的に観察した。1)黄斑円孔をSLOでヘリウムネオン光で観察すると、網膜深層のヘンレ線維層が隆起しているのがわかる。OCTでその断面を観察すると、円孔の初期段階は、網膜の層間分離による嚢胞であることがわかった。円孔がさらに進行すると、非薄化した網膜が色素上皮から剥離し、さらにそれが蓋となり、全層円孔が完成した。2)黄斑前膜は網膜表面の疾患と目されていた。SLOでは前膜とそれの収縮により生じた網膜しわが鮮明に描出された。OCTで断面を観察すると、網膜の外層に浮腫が顕著にあるのが明らかになった。これは視力と多局所網膜電図での応答密度の低下としてあらわれた。3)糖尿病網膜症の黄斑をOCTで観察し、黄斑浮腫にはスポンジ状の網膜膨化と嚢胞様浮腫、そして漿液性網膜剥離があることを示した。網膜の厚さと視力低下はよく相関した。硝子体手術による浮腫の吸収に伴う組織所見をOCTは鋭敏に示した。4)加齢黄斑変性をOCTで観察すると、漿液性色素上皮剥離とそれに脈絡膜新生血管の合併、さらに円板状病変の形成の過程が、色素上皮下の空間の反射の増加としてとらえることができた。5)後部ぶどう腫のある強度近視眼では、眼軸長の延長とともに、網膜の組織密度が低下し、さらに黄斑では網膜分離症を合併することが、OCTで明らかになった。6)網膜剥離は復位しても、視力の回復に時間がかかることがある。OCTでは剥離した網膜に膨化があることが観察された。同様の所見は中心性網膜症でも得られた。走査レーザー検眼鏡と光学的網膜断面撮影装置を用いて、さまざまな眼底疾患で、病巣が網膜のどの層にあるか、網膜および視神経乳頭がどのように隆起または陥凹するかを評価した。1)黄斑円孔では初期の段階の中心窩の生理的陥凹が消失し、むしろ中心窩は隆起してくる。これは従来、網膜剥離によるものと解釈されていたが、長波長のヘリウムネオン光で観察すると、ヘンレ線維層が隆起して放射状のひだをつくることがわかった。中心窩ではこのため網膜の層状分離がおこり、嚢胞へと発展した。嚢胞の前壁が蓋としてはずれることで黄斑円孔が完成すると考えられた。円孔の底をアルゴン光で観察すると、顆粒状の組織が残存しており、嚢胞の外層に相当する視細胞層の一部と解釈された。硝子体手術が円孔が閉鎖すると、中心窩の生理的な陥凹は復活し、ヘンレ線維の放射状のひだも消失した。2)特発性黄斑前膜をアルゴン光で観察すると、網膜前面の膜が強調された。ヘリウムネオン光で観察すると、前膜の下の網膜のしわが明瞭に観察できた。断面撮影装置を用いると、網膜の肥厚とひだ形勢が観察された。以上により、網膜前膜の形態と、その収縮の結果である網膜の変化を、分離して評価ができるようになった。

3)緑内障では神経線維層の欠損が分節的に生じる。検眼鏡では見落としやすいこの神経線維層の菲薄化は、アルゴン光で眼底を走査することで鋭敏に観察できた。光学的網膜断面観察装置により、神経線維層欠損に対応する視神経乳頭の陥凹を定量的に評価した。緑内障の進行とともに拡大する陥凹部分の体積を計算した。さまざまな眼底疾患を、走査レーザー検眼鏡と光学的網膜断面撮影装置で、病巣が網膜のどの層にあるか、厚みがどのように変化しているかを観察し、その形態学的変化が多局所網膜電図で電気生理的にどのように対応するか検索した。1)黄斑円孔では、円孔の周囲の網膜が薄く剥離しているようにみえる。しかしヘリウムネオン光で観察すると、放射状のひだが観察される。これは全層の網膜剥離ではおこらない。円孔周囲のひだはヘンレ線維層の隆起によるものと解釈すべきである。多局所網膜電図では応答密度が円孔のある中心領域のみならず、視神経乳頭の1.6倍もの範囲で低下していた。これはヘンレ線維の隆起した範囲と一致した。黄斑円孔は中心窩網膜の欠損だけではなく、1.6乳頭径もの広い範囲の網膜機能の低下を伴う疾患であることが客観的にわかった。手術で円孔が閉鎖すると、ヘンレ線維の隆起は復位し、中心窩の生理的陥凹が復活した。多局所網膜電図の応答密度も、中心1.6乳頭径で、術後1か月には正常値の2040%に回復した。術後1年以上たつと、応答密度は正常の4060%にさらに向上した。黄斑円孔では解剖学的閉鎖の後も、網膜内での神経伝達回路の修復が長期にわたって続くことが示唆された。2)緑内障で視神経乳頭の陥凹が進行すると、乳頭の縁に切れ込みが生じ、そのこから網膜へ分布する神経線維の欠損ができる。この神経線維層の菲薄化は、アルゴン光で眼底を走査することで鋭敏に観察できた。走査レーザー検眼鏡(SLO)は観察光の波長を変えることで、眼底の表層と深層の構造を強調して描出できる。光学的干渉断層計(OCT)は眼底の断面を1020^<um>の精度で画像化できる。OCT単独もしくはSLOとの併用により、眼底病変を「生体組織学」的に観察した。1)黄斑円孔をSLOでヘリウムネオン光で観察すると、網膜深層のヘンレ繊維層が隆起しているのがわかる。OCTでその断面を観察すると、円孔の初期段階は、網膜の層間分離による嚢胞であることがわかった。円孔がさらに進行すると、菲薄化した網膜が色素上皮から剥離し、さらにそれが蓋となり、全層円孔が完成した。2)黄斑前膜は網膜表面の疾患と目されていた。SLOでは前膜とそれの収縮により生じた網膜しわが鮮明に描出された。OCTで断面を観察すると、網膜の外層に浮腫が顕著にあるのが明らかになった。これは視力と多局所網膜電図での応答密度の低下としてあらわれた。3)糖尿病網膜症の黄斑をOCTで観察し、黄斑浮腫にはスポンジ状の網膜膨化と嚢胞様浮腫、そして漿液性網膜剥離があることを示した。網膜の厚さと視力低下はよく相関した。硝子体手術による浮腫の吸収に伴う組織所見をOCTは鋭敏に示した。4)加齢黄斑変性をOCTで観察すると、漿液性色素上皮剥離とそれに脈絡膜新生血管の合併、さらに円板状病変の形成の過程が、色素上皮下の空間の反射の増加としてとらえることができた。5)後部ぶどう腫のある強度近視眼では、眼軸長の延長とともに、網膜の組織密度が低下し、さらに黄斑では網膜分離症を合併することが、OCTで明らかになった。
ターナー症候群との関連が疑われるzinc finger遺伝子ファミリーの機能解析

ヒトターナー症候群責任遺伝子の可能性が示唆されているZFX/Y(zinc finger protein X/Y)遺伝子のおよびそのマウスホモグロは、zincfinger構造を持ち、転写因子と想定されているが、未だその機能は明らかではなく、標的遺伝子もわかっていない。我々は、このzink finger遺伝子ファミリーの機能解析の第一歩としてマウスZfxが認識するgenomicDNA塩基配列の同定を目的とし、以下の研究を行った。大腸菌発現系を用いてリコンビナントZfxタンパクを調整し、genomic binding-siteクローニング法により、最終的にはZfxの標的遺伝子をクローニングすることを目的として、マウスZfx塩基配列に基づき、PCRプライマーを設計、合成した。このプライマーによりPCRをおこない、マウスZfx,DNA結合領域を増幅した。このPCR産物を大腸菌発現ベクターにサブクローニングし、現在大腸菌におけるZfx蛋白の発現系を構築中である。将来的には、この蛋白を用い、genomic binding-siteクローニング法によりマウスZfxの標的遺伝子を明らかにすることによって、Zfxが制御する一連の生命現象を解明する手がかりが得られるとともに、ヒトとマウスにおけるこれらの遺伝子の挙動の差異を明らかにでき、ターナー症候群の発症機序を理解する上で、重要な知見を得ることができる。
制御性T細胞の恒常性維持機構におけるCD48ーCD2相互作用の役割の解明

CD4^+CD25^+制御性T細胞は様々な免疫反応を抑制的に調節する機能に特化した特異なリンパ球である。近年制御性T細胞に関する研究は活発に行われているが、胸腺で分化し、末梢に移った後にどのような機構でその恒常性を維持しているのかは未解明である。本研究では我々が二次リンパ組織から単離、細胞株化したストローマ細胞とその表面に発現するCD48分子に注目をして研究を進めた。これまでの研究によりBALB/cマウスの脾臓とリンパ節から単離したCD4^+T細胞をストローマ細胞との間で一週間共培養すると、CD4^+T細胞単独で培養するよりもより多くの制御性T細胞が確認されることがわかっている。そこでストローマ細胞表面に発現するCD48と、その受容体であり、T細胞表面に発現するCD2の相互作用に注目し、この共培養の系に抗CD2、もしくは抗CD48ブロッキング抗体を入れた所、CD4^+CD25^+制御性T細胞分画の減少が観察された。この制御性T細胞の減少はアポトーシスの亢進によるものだというとことがわかった。またブロッキング抗体によってCD48/CD2相互作用を阻害された制御性T細胞は、それ自身のFoxp3発現や免疫抑制能は変化しないことがフローサイトメトリーと混合リンパ球培養による結果から明らかになった。さらにストローマ細胞上のCD48発現をsiRNAによってノックダウンすると、ブロッキング抗体を作用させたときと同様の結果が得られた。BALA/cマウスに抗CD2ブロッキング抗体を腹腔内投与し一週間後に、リンパ組織および胸腺中の制御性T細胞をフローサイトメトリーによって解析したところ、鼠蹊部リンパ節、腸間膜リンパ節および脾臓中の制御性T細胞の割合が減少することがわかった。以上のことから二次リンパ組織においてストローマ細胞はCD48/CD2相互作用を介して制御性T細胞を維持していることが示唆された。
河川と水辺環境保全のための地下生物指標による生態系健全度・回復力評価

河川および水辺の生態系の健全性評価のために地下指標生物を用いた手法開発を行った。第一に、河床内30ー50cm深度から採取したカワゲラ目水生昆虫幼虫および河畔で採取された羽化成虫集団に対して、ミトコンドリアDNAによる遺伝子解析を行い、種の対応関係を確認した。これにより、河床間隙域を幼虫時の主な生息場として利用し、指標種に適した水生昆虫種として、イシカリミドリカワゲラを特定した。第二に、イシカリミドリカワゲラを含む間隙に生息する無脊椎動物および餌資源となる基盤有機物(河床表面由来の付着藻類やリター由来デトリタス)を対象に、炭素・窒素安定同位体比分析を実施し、食物網構造を把握した。これにより、イシカリミドリカワゲラはユスリカ類やミミズ類を中心に一部基盤有機物も捕食する二次消費者として位置づけられた。さらに、表面水に確認された硝酸態窒素濃度の上下流方向への環境傾度に応じて、河床間隙域の食物網を支える基盤有機物における付着藻の寄与率は上昇した。第三に、イシカリミドリカワゲラの羽化による成虫個体の河川横断および縦断方向への移動距離の推定を、マレーゼトラップによる飛翔個体数定量化および窒素安定同位体比をマーカーとして用いて行った。これにより、横断方向には100m、縦断方向には10kmの移動を確認した。計画通りの進展が見られ、順調である。河床間隙域の環境評価には直接的な採掘などの物理的に困難で労力を要する作業が通常伴う。本研究は、間隙域に生息する昆虫類が羽化を通して陸上に出現する現象に着目して、水生昆虫を地下指標生物として用いる技術開発に取り組んでいる。本年度の研究により、イシカリミドリカワゲラがその幼虫時に主に河床間隙域に生息すること、さらに、その羽化成虫の種同定を完了することができた。本種の羽化成虫はその種同定を外部形態により容易に行うことが可能である。したがって、本種を地下指標生物として用いる妥当性が確認され、今後の研究をさらに推進できる。食物網の解析により、本種が河床間隙域の食物網に果たす機能的役割が一部明らかになった。間隙域の食物網構造については、実証的なデータが定量的に採取された事例が世界的に稀有であるため、極めて先進的な知見が得られている。食物網における間隙種の生態学的な機能を理解したことで、間隙域の環境評価にイシカリミドリカワゲラを用いることで得られる各種情報を正確かつ論理的に解釈することが可能になった。これまで、間隙域由来の羽化水生昆虫の移動距離についての実証研究はなく、移動分散の動態に関して得られた情報は科学的に新規性が高い。移動距離を推定できたことで、間隙域由来羽化成虫の幼虫時からの時空間的な生活史の一部が解明され、今後河畔消費者の応答を対象に行う研究活動に資する有用な基盤情報が得られた。今後、河畔域の消費者への波及効果および得られた知見の一般性の確認が必要である。また、遺伝子解析による種の対応関係は、一部の種に限定的に得られており、多種へも応用し、その他の種に対して、間隙域指標種としての有用性を検証する。消費者への波及効果については、間隙由来水生羽化昆虫が河畔消費者のエサ資源として貢献する度合いを定量的に評価する。このために、羽化昆虫の時空間的な移動動態をより詳細に把握し、さらに、炭素や窒素などの物質量としての定量評価を行う。また、河畔域に生息するクモ類やオサムシ科昆虫などを対象に、安定同位体比分析と群集構造の把握とその時空間変異を定量化して、間隙域から供給される資源量との関係性を明らかにする。遺伝子解析については、イシカリミドリカワゲラ以外にも種対応が未解明な水生昆虫幼虫が間隙域から採取されており、これらに対して作業を進め、間隙域と河畔域の関係性を群集レベルで明らかにする。知見の一般性の確認については、現在対象にしている道東に位置する十勝川水系札内川以外に調査対象地を空間的に広く設け、暫定的に間隙域指標種としてイシカリミドリカワゲラに焦点を当て、その羽化量や炭素・窒素安定同位体比を簡易的に定量化する計画である。調査地点は、他地域の複数河川の扇状地景観を有する区間(現調査対象地の状況に該当)および札内川の上流域(扇状地とは異なり、河床間隙域が少ないと予想される)とする。さらに、表面水に確認された硝酸態窒素濃度の上下流方向への環境

傾度に応じて、河床間隙域の食物網を支える基盤有機物における付着藻の寄与率は上昇した。第三に、イシカリミドリカワゲラの羽化による成虫個体の河川横断および縦断方向への移動距離の推定を、マレーゼトラップによる飛翔個体数定量化および窒素安定同位体比をマーカーとして用いて行った。これにより、横断方向には100m、縦断方向には10kmの移動を確認した。計画通りの進展が見られ、順調である。河床間隙域の環境評価には直接的な採掘などの物理的に困難で労力を要する作業が通常伴う。本研究は、間隙域に生息する昆虫類が羽化を通して陸上に出現する現象に着目して、水生昆虫を地下指標生物として用いる技術開発に取り組んでいる。本年度の研究により、イシカリミドリカワゲラがその幼虫時に主に河床間隙域に生息すること、さらに、その羽化成虫の種同定を完了することができた。本種の羽化成虫はその種同定を外部形態により容易に行うことが可能である。したがって、本種を地下指標生物として用いる妥当性が確認され、今後の研究をさらに推進できる。食物網の解析により、本種が河床間隙域の食物網に果たす機能的役割が一部明らかになった。間隙域の食物網構造については、実証的なデータが定量的に採取された事例が世界的に稀有であるため、極めて先進的な知見が得られている。食物網における間隙種の生態学的な機能を理解したことで、間隙域の環境評価にイシカリミドリカワゲラを用いることで得られる各種情報を正確かつ論理的に解釈することが可能になった。これまで、間隙域由来の羽化水生昆虫の移動距離についての実証研究はなく、移動分散の動態に関して得られた情報は科学的に新規性が高い。移動距離を推定できたことで、間隙域由来羽化成虫の幼虫時からの時空間的な生活史の一部が解明され、今後河畔消費者の応答を対象に行う研究活動に資する有用な基盤情報が得られた。今後、河畔域の消費者への波及効果および得られた知見の一般性の確認が必要である。また、遺伝子解析による種の対応関係は、一部の種に限定的に得られており、多種へも応用し、その他の種に対して、間隙域指標種としての有用性を検証する。消費者への波及効果については、間隙由来水生羽化昆虫が河畔消費者のエサ資源として貢献する度合いを定量的に評価する。このために、羽化昆虫の時空間的な移動動態をより詳細に把握し、さらに、炭素や窒素などの物質量としての定量評価を行う。また、河畔域に生息するクモ類やオサムシ科昆虫などを対象に、安定同位体比分析と群集構造の把握とその時空間変異を定量化して、間隙域から供給される資源量との関係性を明らかにする。遺伝子解析については、イシカリミドリカワゲラ以外にも種対応が未解明な水生昆虫幼虫が間隙域から採取されており、これらに対して作業を進め、間隙域と河畔域の関係性を群集レベルで明らかにする。知見の一般性の確認については、現在対象にしている道東に位置する十勝川水系札内川以外に調査対象地を空間的に広く設け、暫定的に間隙域指標種としてイシカリミドリカワゲラに焦点を当て、その羽化量や炭素・窒素安定同位体比を簡易的に定量化する計画である。調査地点は、他地域の複数河川の扇状地景観を有する区間(現調査対象地の状況に該当)および札内川の上流域(扇状地とは異なり、河床間隙域が少ないと予想される)とする。
グルタチオン非依存的な細胞生存機構の解明

細胞内の主要な抗酸化物質であるグルタチオン(GSH)の合成においてシステイン(Cys)は制御因子であり、Cysの供給不足はGSHを枯渇させ細胞死(フェロトーシス)を誘発する。多くの培養細胞ではシスチントランスポーターであるxCTに依存してCysが供給されGSHが維持されている。申請者はxCT欠損(KO)マウス由来のマクロファージがCysとGSH含有量が極めて低いにも関わらず、数日間生存したことから、マクロファージではGSHに依存しない新規の細胞生存機構の存在を見出した。本研究ではプロテオミクス解析とメタボロミクス解析を併用し、マクロファージのGSH非依存的な細胞生存の分子機構を解明することを目的とする。野生型(WT)とKOマクロファージから抽出したタンパク質をペプチドに分解し、ペプチドのアミノ基と反応する安定同位体標識試薬を用いたプロテオミクス解析を行なった結果、KOマクロファージではCytosolic non-specific dipeptidase 2(CNDP2)由来のペプチドが多く検出された。KOマクロファージではCNDP2タンパク質量が増加していることを免疫ブロット法により確認した。CNDP2はGSH分解により生じるシステイニルグリシンの分解活性を有することが報告されているため、酵素学的解析を実施し、WTよりもKOマクロファージのシステイニルグリシンの分解活性が高いことを明らかにした。以上の結果に加えて、LC-MSを用いたメタボロミクス解析により、マクロファージでは細胞外でのGSH分解と連動して、細胞内でCNDP2がシステイニルグリシンを分解することで効率的にCysを再利用する経路が活性化されていると考えられた。CNDP2が肝臓や腎臓、脳などの組織に分布することからも、このGSH分解系を介したCysの獲得系はマクロファージに限らず普遍的に存在する可能性がある。KOマクロファージでは高く発現する遺伝子としてCNDP2を見出した。CNDP2はGSH分解によって生じるシステイニルグリシンを特異的に分解することが報告されているが、その生理機能は十分に解明されていない。そのため、現在、CNDP2生理機能解明に向けてゲノム編集技術を用いてCNDP2欠損培養細胞やマウスの樹立に着手した。GSH分解を介したCNDP2によるCys獲得系の生理機能を解明するため、ゲノム編集技術によってCNDP2を欠損する細胞株およびCNDP2を過剰発現する細胞株を樹立し、シスチン欠乏下でのGSHやシステイニルグリシンの添加が細胞生存に影響を及ぼすかについて検討する。さらに、CNDP2の遺伝子変異は糖尿病性腎症との関わりあることが報告されていることから、腎臓中のCNDP2がフェロトーシス抑制因子として機能する可能性が考えられる。ゲノム編集技術を用いて、CNDP2欠損マウスを樹立し、マクロファージでのCNDP2の機能解析と共にCNDP2欠損マウスの表現型の解析を行なう。xCT-GSH系に依存せず抗癌剤耐性を持つ癌細胞での生存機構を調べるために、xCT阻害剤/抗癌剤耐性細胞を選抜し、その細胞生存を検討する。メラノーマやグリオブラストーマなどの悪性度の高い癌細胞に段階的にxCT阻害剤を投与して、xCT阻害剤耐性癌細胞に対して、さらにシスプラチンやドキソルビシンなど既存の抗癌剤に抵抗性を示す癌細胞を選抜する。選抜された細胞に対してCNDP2の発現を調べ、CNDP2の阻害剤やゲノム編集技術を用いた欠損が細胞生存に影響を与えるかについて調べる。

そのため、現在、CNDP2生理機能解明に向けてゲノム編集技術を用いてCNDP2欠損培養細胞やマウスの樹立に着手した。GSH分解を介したCNDP2によるCys獲得系の生理機能を解明するため、ゲノム編集技術によってCNDP2を欠損する細胞株およびCNDP2を過剰発現する細胞株を樹立し、シスチン欠乏下でのGSHやシステイニルグリシンの添加が細胞生存に影響を及ぼすかについて検討する。さらに、CNDP2の遺伝子変異は糖尿病性腎症との関わりあることが報告されていることから、腎臓中のCNDP2がフェロトーシス抑制因子として機能する可能性が考えられる。ゲノム編集技術を用いて、CNDP2欠損マウスを樹立し、マクロファージでのCNDP2の機能解析と共にCNDP2欠損マウスの表現型の解析を行なう。xCT-GSH系に依存せず抗癌剤耐性を持つ癌細胞での生存機構を調べるために、xCT阻害剤/抗癌剤耐性細胞を選抜し、その細胞生存を検討する。メラノーマやグリオブラストーマなどの悪性度の高い癌細胞に段階的にxCT阻害剤を投与して、xCT阻害剤耐性癌細胞に対して、さらにシスプラチンやドキソルビシンなど既存の抗癌剤に抵抗性を示す癌細胞を選抜する。選抜された細胞に対してCNDP2の発現を調べ、CNDP2の阻害剤やゲノム編集技術を用いた欠損が細胞生存に影響を与えるかについて調べる。
アモルファス金属コアを用いた超高電圧電子ビ-ム源の開発

“誘導電圧重畳"は,複数のパルスを強磁性体コアを用いて重畳することによって高電圧を得る新しい方式のパルス電力技術である。本研究は,高輝度電子ビ-ム発生を目的とした誘導電圧重畳装置“VIVAーI"(定格出力4MV)の開発を通じて誘導電圧重畳技術の確立を目的とする。“VIVAーI"は,マルクス発生器,ブル-ムライン方式パルス整形線路(PFL),誘導電圧重畳部から構成され,PFLで発生された2MV,60nsのパルスを4分割したうえで,2段の誘導重畳部でこれらを2並列・2直列に重畳する方式を採用している。本装置は,平均電位傾度応び1段当たりの印加電圧を高く(2.5MV/m,及び2MV/段,いづれも世界最高値)設定している点に特徴を持つ。初期動作確認は,各重畳段に各2個(定格の2/3)のコアを挿入し,定格の40%の範囲で全システムの動作特性を評価した。その結果,1斜動負荷試験では2MV(1MV/段)の出力電圧が確認された。2模擬負荷試験と,負荷のインダクタンスに起因する電圧降下を評価し,出力部のインダクタンスが設計値(450nH)と一致することを確認した。3電子ビ-ム発生及び伝送実験を行い,加速電圧1MVにおいて18kAの電子電流と,ガイド磁場による良好な伝送特性が得られた。次に,定格動作条件の実現のため,セル内の電界分布を評価し,これに基づいて1コアに電界緩和リングを設置,2コアのフランジの材質の改善を行い,絶縁破壊に対する安全係数を改造前の3倍に引き上げた。また,PFLの計算機シミュレ-ションによる動作パラメ-タの評価及びその最適化を実施し,定格動作のための条件を整えた。また,電圧変動率低減のため,充電に可飽和インダクタ-を用いた新しい方式のPFLを開発し,波形整形性の大幅な改善を実験的に確認した。現在,発生電圧の向上とビ-ム品質の評価実験を実施中である。本年度は、1)誘導システム駆動用パルス電源の製作及び動作試験、2)誘導高電圧発生部の設計及び製作、の2つのテ-マを重点的に行った。これらの概要を、以下に述べる。1)については、その駆動用電源として、従来用いて来たパルスパワ-発生装置“ETIGO-I"を改造し、新しくパルス整形線路-伝送線路-誘導セル等を設計・製作した。即ち、“ETIGO-I"については、マルクス発生器(出力出圧2.55MV、蓄積エネルギ-43kJ)だけを用いることとし、これに反転型ブル-ムラインのパルス整形線路(インピ-ダンス12.7Ω、パルス幅60ns)を製作し、これに4本のJ型伝送線路(50Ω)を接続して、2つの誘導セルの1次側に供給した。セルの2次側では、誘導された電圧を重畳し、入力の2倍の電圧を発生させ、模擬負荷を用いてその動作試験を行い、設計値を上回るデ-タを得た。模擬負荷による電圧重畳実験では、77%の重畳効率を得た。2)については、アモルファス金属磁性体コアを6ケ製作し(1ケ当りの寸法:外径700mm、内径300mm、幅96mm)、更に誘導コアの設計・製作を行った。

誘導セルは、セル当たりの印加電圧が2MVと高いので、内部の電界等の設計には十分な配慮が要求され、コンピュ-タ-を用いたシミュレ-ションを行った。その結果、2次回路開放時において、パルス整形線路電圧1.1MVの時、各セルの印加電圧860kV、パルス幅75ns、電流22kA更に上記の2つの実験をまとめて、総合システム(Versatile Inductive Voltage Adderの頭文字から“VIVA-I"と命名した)の運転を行い、負荷として電子ビ-ムダイオ-ドを設計製作した。そして、まだ予備実験の階段ではあるが、1.1MV、18kA、80nsの電子ビ-ムを発生させることに成功した。“誘導電圧重畳"は,複数のパルスを強磁性体コアを用いて重畳することによって高電圧を得る新しい方式のパルス電力技術である。本研究で開発した誘導電圧重畳装置“VIVAーI"は、定格出力4MV,パルス幅60nsであり,高電圧化に重要な平均電位傾度において2.5MV/mという世界最高値の達成を目指している。平成元年度には,本装置の設計・製作を行い,定格の40%の条件で各部の基本動作特性が評価された。平成2年度は,平成元年度の結果をもとに,a)装置の定格動作及びb)電子ビ-ムの品質(エネルギ-広がりの低減)の向上のためのPFLの波形整形性向上,を目的とした装置の改良を実施した。装置の定格動作を実現するためには,定格動作時(各セルに3個のコアを挿入して2MV/セルの電圧を印加)の誘導セルの内部電界を絶縁破壊電界以下にする必要がある。そこで,セル内の電界分布を評価した結果、定格動作においてコアの上端部で破壊電界を越える電界が発生することがわかり、コアの形状の改善((1)電界緩和リングを設置,(2)フランジの材質をベ-クライトからポリプロピレンに変更)を実施した。その結果,絶縁破壊に対する安全係数は1以下から3に引き上げられた。また,計算機シミュレ-ション及び実験に基づくPFLの動作パラメ-タの評価及びその最適化を実施した。以上の研究により,本装置の定格動作による運転において2.5MV/mの電位傾度実現の為の環境が整えられた。波形整形性の改善に関しては,PFLの充電に可飽和インダクタ-を用いた新しい方式を考案し,定格の40%の条件で動作確認を行った結果,波形整形性の大幅な改善が確認された。現在,定格動作に向けての充電電圧の向上とビ-ム品質の評価実験を実施中である。
FDG-PETによる炎症病変診断法の開発:膜輸送遺伝子、病理組織学的検討

1)実験的腫瘍におけるFDGの集積機序を検討するため、腫瘍の中心部(CT)、辺縁部(PT)、そして壊死アポトーシス部(NA)の3箇所に分けて検討を進めたところ、CT,PT,NAの順番でFDGの集積は高く、かつブドウ糖輸送遺伝子のGLUT1,GLUT3や解糖系の酵素であるHexokinase II(HKII)の活性と高い相関関係にあることが示された。以上より腫瘍へのFDGの不均一集積はGLUTやHKIIの発現程度の不均一性と関連があり、特に腫瘍の中央で高いことが示された。2)実験的腫瘍モデルにおいてcyclophosphamideやgemcitabineを用いた化学療法後の集積の変化について検討したところ、FDGの有意な集積低下が認められ、その集積低下は腫瘍内に生じるアポトーシスと関連が深いことが示された。3)臨床上で診断評価の重要である、心臓サルコイドーシスの検出能についてFDG-PETを用いて検討した結果、絶食時のFDGの局所的集積を認める場合には高率で心臓サルコイドーシスが存在することが確認できた。このようにFDGの強く集積する非腫瘍性病変として、肉芽腫を呈するサルコイドーシスが挙げられる。1)悪性腫瘍の診断、評価に広く利用されているFDGは炎症にも集積するため、鑑別上の問題点が指摘されている。本研究では主に実験的腫瘍や炎症モデル動物を用いて、PET検査におけるFDGの腫瘍や炎症への集積機序をブドウ糖代謝および膜輸送遺伝子の発現などの観点から明らかにすること、種々の薬剤負荷を加えることで病変の鑑別診断に役立てることができるか否かを検討することに主眼をおいて検討した。2)これまで実験モデルとして、肝細胞がんを移植した腫瘍モデルとブドウ球菌移植の感染およびテレビン油塗布の感染・炎症モデルを作成したが、本年度には肉芽腫をもつ炎症モデルの作成に成功した。各々の病変にFDGを投与して集積性を見たところ、これまでの肉芽腫では感染・炎症モデルと異なり、腫瘍モデルと同等の高いFDG集積があることが示された。3)これらの病変モデルに抗炎症剤のひとつステロイドを投与したところ、炎症モデルではFDGの集積が有意に低下したが、腫瘍モデルへのFDG集積はほとんど変化なく、ステロイド負荷法が病変の良悪の鑑別に有効である可能性が示唆された。4)臨床で頻繁に利用されているステロイド治療は、血糖を上昇させて病変へのFDG集積を低下させる可能性はあるものの、全般的にFDGを用いた腫瘍診断に大きな妨げにならないことも確認できた。
低酸素応答システムを標的とした超音波遺伝子導入による病的心筋リモデリングの制御

本研究の目的は、心不全発症メカニズムにおいて重要とされる低酸素応答システムを標的とし、遺伝子工学的に作成した癌抑制遺伝子p53-Ig遺伝子およびHypoxia inducible factor-1(HIF-1)遺伝子を超音波遺伝子導入法を用いて心筋細胞へ導入することで病的心筋リモデリングを制御することである。in vitroにおける導入遺伝子の発現を確認し、in vivo実験にて既存のGFP遺伝子をマウス心へ導入し、その遺伝子発現を蛍光顕微鏡下で確認した。本研究の目的は、心不全の発症メカニズムにおいて重要とされる低酸素応答システムに関する最新の知見を応用し、その代償期から非代償期に至る期間に、徐放性のあるゼラチンハイドロゲル封入遺伝子を超音波遺伝子導入法を用いて心筋細胞へ効率的に導入し、心不全へ至る病的心筋リモデリングを制御することである。具体的には、心不全発症メカニズムにおいて重要とされる低酸素応答システムを標的とし、遺伝子工学的に作成した癌抑制遺伝子p53-Ig遺伝子およびHypoxia inducible factor-1(HIF-1)遺伝子をゼラチンハイドロゲル心膜シートへ封入し、超音波マイクロバブル法を用いて心筋細胞へ効率的に導入することである。つまり心筋細胞と血管内皮細胞の細胞間ネットワークに着目し、p53とHIF-1との結合を阻害し、同時にHIF-1遺伝子を導入し高発現させることによりVascular endothelial growthfactor (VEGF)を誘導・活性化することで血管新生を促進し、病的心筋リモデリングを制御することである。本研究は従来の治療法が奏功しない重症慢性心不全に対し、より合理的・効率的かつ安全性の高い治療プロトコールが確立可能であり、現在研究・臨床試験段階にある心不全治療法を加速度的に進行するものと期待される。本年度は、in vitroにおける遺伝子導入および導入遺伝子発現の確認を行った。既存のGFP遺伝子をin vitroにて超音波遺伝子導入法によりCOS細胞へ導入し、その遺伝子発現をELISA法、蛍光顕微鏡下で確認した。初めにin vivoにおける遺伝子導入および導入遺伝子発現の確認を行い、続いてin vitro実験にて確認した既存のGFP遺伝子をマウス心へ超音波遺伝子導入法を用いて導入し、その遺伝子発現を蛍光顕微鏡下で確認した。現在、機能性遺伝子の作成およびその遺伝子発現効果につき検討中である。また今後、遺伝子導入効率を上げるために遺伝子封入心膜シートの作成を試み、実験的検討を行う必要がある。心臓血管外科学全般本年度は、in vitroにおける遺伝子導入および導入遺伝子発現の確認を行った。最終的な研究計画の達成まで、おおむね順調に進展しているものと考える。機能性遺伝子の作成およびその遺伝子発現効果につき検討する必要がある。そのためには、本研究計画に基づき着実に研究を推進していくことが重要であると考える。研究は当初の予定通りおおむね順調に進展しており、次年度使用額も少額である。次年度使用額に関しては、本研究推進に向けて必要な経費として適切に使用する予定である。