hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会性ハダニにおける攻撃性の異なる2型の分化・維持機構の解明

1.ススキスゴモリハダニの分子系統樹の作成とこれまでの研究成果の総合考察昨年度に引き続き、ススキスゴモリハダニにおける個体群間の分子系統解析に取り組んだ。初年度に採集したススキスゴモリハダニ個体群に加え、中国の研究者の協力により入手した中国福建省の個体群を用いて、核にコードされた遺伝子配列を用いた本種個体群の系統解析を行った。本系統解析から推定された系統関係と、初年度に明らかにした「オスの第1脚の相対長」と「オス同士の攻撃性」の結果から、本種におけるオス同士の殺し合い行動の進化過程が推測できるに至った。また、2年目に明らかにした、本種個体群間の生殖的関係と照らし合わせた結果、2型間には生殖的隔離の強化がおこっている可能性が高いことが示唆された。2.オランダ王国・アムステルダム大学における、ナミハダニのオス同士の攻撃性とその意義に関する行動学的・遺伝学的研究本研究課題を発展させるべく、オランダ王国アムステルダム大学にて、ハダニ類の中で最も生態的、生理的、遺伝的解析が進んでいるナミハダニを対象に、オス同士の攻撃行動の行動学的・遺伝学的研究に取り組んだ。滞在期間が半年であったこともあり、遺伝学的な研究結果を得るまでにはいたらなかったものの、行動学的な研究結果としては、個体群内におけるオス同士の攻撃性の変異や、それに関連して交尾可能なメスを得るための戦略の変異を発見し、その至近要因と究極要因に関して、ある程度明らかにすることができた。1.ススキスゴモリハダニの寄主植物であるススキの株分けによるクローン栽培は確立することができた。2.韓国-九州-琉球諸島(北・中・南)-台湾にかけて採集を行った。他研究者の協力もあり、研究遂行上十分なサンプルをえることができた。3.マイクロサテライトマーカーの開発に関しては、計6個のマーカーを開発することができた。しかしそのほとんどは、2型の判別や、個体群内の移動分散の推定に利用可能だと思われるものであり、当初計画していた「本種2型の南方起源説の検証」に有用だと思われるものは見つけることができなかった。引き続きマーカーの開発に取り組みながらも、「本種2型の南方起源説の検証」には、他の配列も検討する予定である。なお、今回開発されたマーカーは、最終年度に計画している「2型間の遺伝子流動状況の調査」に利用する予定である。4.「オスの形態計測」と「個体群間の生殖的隔離実験」は、初年度と次年度にかけて行う予定であった。後者は予定通りの進行状況であり、次年度も引き続き行う予定である。しかし、前者と最終年度に計画していた「オス同士の攻撃性の測定」に関しては、本年度中に結果をだすことができ、また、本研究の遂行上重要な情報をえることができた。それは、南琉球や台湾に分布する本種は、形態的にも行動的にもどちらの型とも区別のつかない中間的形質を有し、2型の祖先的な集団である可能性が高いというものである。この南方に分布する集団の存在は、本研究の要ともなる「本種2型の南方起源説」を強く支持するものであり、今後研究を進めるにあたって、鍵となると考えられた。1.前年度に採集したススキスゴモリハダニ個体群の系統関係を解析すべく取り組んでいたマイクロサテライトマーカーの開発に関しては、進展がえられなかった。しかし、受入研究者の協力の下、核にコードされた遺伝子の部分配列を用いて、系統関係をある程度解明することができた。昨年度のオスの形態(第1脚の相対長)と行動(オス同士の攻撃性)の解析結果からは、ススキスゴモリハダニにはこれまで知られていたHG型とLW型の他に第3の型が存在すること、そしてこの第3の型は形態的にも行動的にもHG型とLW型の中間的形質をもち、南方(琉球諸島や台湾)に分布することから、計画当初に想定していたHG型とLW型の祖先的集団であると推測されていた。しかし、今回えられた分子系統樹からはこの第3の型は一つのまとまった集団ではなく、HG型と近縁な集団とLW型と近縁な集団からなることがわかった。現在、1.2kbp程度解読し系統解析を行っているが、解読領域を広げることにより、もっとはっきりした進化の歴史推定を行うことができると考えている。2.HG型とLW型には不完全ながらも比較的強い不和合性が検出されている。今回、交配実験によりこれら2型と第3の型の生殖的関係を調査したところ、第3の型はHG型・LW型ともある程度交配可能であることが明らかとなった。この和合性は一方向であったため、細胞内共生菌が生殖的関係に影響している可能性が考えられるが、これまでハダニ類で感染が報告されているWolbachia、Cardinium、Spiroplasmaの感染の有無をPCR法にて調査したところ、感染は確認されなかった。そのため、この生殖的関係は遺伝的なものであり、本種の分化・維持機構を推察する上で重要な情報だと考えられた。

本系統解析から推定された系統関係と、初年度に明らかにした「オスの第1脚の相対長」と「オス同士の攻撃性」の結果から、本種におけるオス同士の殺し合い行動の進化過程が推測できるに至った。また、2年目に明らかにした、本種個体群間の生殖的関係と照らし合わせた結果、2型間には生殖的隔離の強化がおこっている可能性が高いことが示唆された。2.オランダ王国・アムステルダム大学における、ナミハダニのオス同士の攻撃性とその意義に関する行動学的・遺伝学的研究本研究課題を発展させるべく、オランダ王国アムステルダム大学にて、ハダニ類の中で最も生態的、生理的、遺伝的解析が進んでいるナミハダニを対象に、オス同士の攻撃行動の行動学的・遺伝学的研究に取り組んだ。滞在期間が半年であったこともあり、遺伝学的な研究結果を得るまでにはいたらなかったものの、行動学的な研究結果としては、個体群内におけるオス同士の攻撃性の変異や、それに関連して交尾可能なメスを得るための戦略の変異を発見し、その至近要因と究極要因に関して、ある程度明らかにすることができた。
NMDA受容体グリシン結合部位を標的とした新規アルツハイマー病治療薬の創薬研究

申請者はこれまでアルツハイマー病治療薬として承認を受けているdonepezil、galantamineにアセチルコリン賦活作用だけでなく、NMDA受容体賦活作用を有することを見出した。さらに、アルツハイマー病治療薬の候補化合物であるピロリドン誘導体であるnefiracetamも同様に、ニコチン性アセチルコリン受容体賦活作用だけでなく、NMDA受容体賦活作用を有することを見出した。本研究では、nefiracetamの細胞内機序ならびにシナプス間隙におけnefiracetamの作用部位について電気生理学的解析、ならびに生化学的解析を行った。その結果、nefiracetamは細胞内においてprotein kinase C (PKC)の活性化を介してNMDA受容体を活性化していること(Moriguchi et al., Mol. Pharmacol. 2007)、nefiracetamはシナプス前終末においてニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を介してグルタミン酸の遊離を促進していること(Moriguchi etal., JPET under submission)、さらに後シナプスにおいて細胞内のCa2+/calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII)およびPKCの活性化を引き起こすこと(Moriguchi et al., J. Neurochem. Under revision)を見出した。本研究より、新しいアルツハイマー病治療薬の作用機序として、NMDA受容体賦活作用ならびに細胞内CaMKIIおよびPKCの活性化が重要であることが明らかとなり、今後、より詳細な検討を行う予定である。本研究はピロリドン誘導体およびアダマンタン誘導体による新規アルツハイマー病治療薬の創製を目標に研究を行なった。本研究では、はじめにアルツハイマー病の神経変性疾患に非常に類似した症状を示す動物モデルの作成を行なうため、嗅球摘出モデルの作成を行ない、嗅球摘出によりマウスの海馬CA1領域においてアセチルコリン神経系脱落並びにNMDA受容体機能の有意な低下が引き起こされていることを明らかとした。また、記憶学習機能に重要な役割を果たしているCaM kinase II活性が有意に低下していることも明らかとした。(Moriguchi et al.,J.Neurochem.(2006))一方、ピロリドン誘導体の一つであるnefiracetamが記憶学習機能を有意に亢進することを行動薬理学的解析により明らかとした。nefiracetamは海馬CA1領域におけるLTPを有意に増強すること、さらに、海馬CA1領域においてCaM kinase II活性を有意に亢進することを明らかとした(投稿論文準備中)。一方、nefiracetamはNMDA受容体機能を亢進することを電気生理学的手法により明らかとした。このNMDA受容体機能の亢進には、protein kinase Cの活性化が重要であることも同時に明らかとした。(Moriguchi etal.,Mol.Pharmacol.(2007))今後の予定として、ピロリドン誘導体ならびにアダマンタン誘導体の記憶学習機構に及ぼす影響についてより詳細に検討する予定である。
水素選択性金属透過膜を用いた水素センシングデバイス

本研究では,金属中のプロチウムが他の成分に比較して高い拡散係数を有していることを利用し,高圧熱水中などの過酷な環境下で作動する水素センサーの開発を目的としている.センサーは約170°C以上で溶融塩電解質として作動する共晶組成のKOH-NaOH混合溶融塩を用い,Pdの薄膜を試料側電極とする電池を構成した.参照極には一端閉管のPdチューブ内に一定の水素分圧を有するAr+H_2混合ガスを流した可逆ガス電極を,測定極にはPd板を電極とする水素濃淡電池を構成し,水素濃淡電池型センサーならびに限界電流型センサーとしての基本的な作動特性について検討した.濃淡電池型センサーは200500°Cの温度範囲で理論起電力を表すNernstの式に従うことが明らかになり,基本的には原理どおりに作動していることが確認された.ただし標準極側水素分圧を高く保つと,電解質に浸漬されていないPd電極チューブを介して水素の透過が生じ,理論起電力より負に偏倚することが明らかになった.より実用性の高いセンサーとするために固体標準極の利用を検討し,固体標準極としてPd/PdOを用い,一定水蒸気圧を有する雰囲気下におけるPdO+H_2=Pd+H_2Oの平衡を利用して標準極の水素分圧を一定に保つ参照極を用いたセンサ特性の測定を行った.限界電流型センサーについては,試料極側のPd板厚を1mmとしたセルにおいて水素を試料極側から取り去る方向に直流分極すると,広範囲の印加電圧にわたって限界電流が観察された.限界電流は試料極側の水素分圧の1/2乗に比例し,文献値の透過率から計算した理論限界電流とも良く一致した.ただし,電解電流にはステンレス筺体からのCrの腐食電流が含まれている可能性が明らかになったため,筐体内部にAuのスリーブを用いることにより,その影響を排除して精度の高い測定が可能であることがわかった.本研究では,金属中のプロチウムが他の成分に比較して高い拡散係数を有していることを利用し,高圧熱水中などの過酷な環境下で作動する水素センサーの開発を目的としている.センサーは約170°C以上で溶融塩電解質として作動する共晶組成のKOH-NaOH混合溶融塩を用い,Pdの薄膜を試料側電極とする電池を構成した.参照極には一端閉管のPdチューブ内に一定の水素分圧を有するAr+H_2混合ガスを流した可逆ガス電極を,測定極にはPd板を電極とする水素濃淡電池を構成し,水素濃淡電池型センサーならびに限界電流型センサーとしての基本的な作動特性について検討した.濃淡電池型センサーは200500°Cの温度範囲で理論起電力を表すNernstの式に従うことが明らかになり,基本的には原理どおりに作動していることが確認された.ただし標準極側水素分圧を高く保つと,電解質に浸漬されていないPd電極チューブを介して水素の透過が生じ,理論起電力より負に偏倚することが明らかになった.より実用性の高いセンサーとするために固体標準極の利用を検討し,固体標準極としてPd/PdOを用い,一定水蒸気圧を有する雰囲気下におけるPdO+H_2=Pd+H_2Oの平衡を利用して標準極の水素分圧を一定に保つ参照極を用いたセンサ特性の測定を行った.限界電流型センサーについては,試料極側のPd板厚を1mmとしたセルにおいて水素を試料極側から取り去る方向に直流分極すると,広範囲の印加電圧にわたって限界電流が観察された.限界電流は試料極側の水素分圧の1/2乗に比例し,文献値の透過率から計算した理論限界電流とも良く一致した.ただし,電解電流にはステンレス筺体からのCrの腐食電流が含まれている可能性が明らかになったため,筐体内部にAuのスリーブを用いることにより,その影響を排除して精度の高い測定が可能であることがわかった.
GeTeベース強磁性半導体を用いたp-n-p構造を有するスピンデバイスの研究

本課題では、分子線エピタキシー(MBE)法によるGeTeベース強磁性半導体の成長および強磁性トンネル接合素子(MTJ)の作製を行ない以下の成果を得た。1.MBE法によるGeTeベース希薄磁性半導体の合成GeTeベース強磁性半導体の結晶性や磁気特性は磁性イオンとTeの供給比に強く依存することを明らかにした。また、基板としてBaF_2とSrF_2を比較したところ、SrF_2の方が良好な結晶性を示した。得られたキュリー温度はGe_<1-x>Mn_xTeではx=0.08のとき200K、Ge_<1-x>Cr_xTeではx=0.07のとき190Kとスパッタ法やクラスタイオンビーム(ICB)法に比べ大きく向上した。ICB法によりCdS障壁層を有するMTJを作製したところ、障壁幅3.4nmの素子においてトンネル電流を確認した。Simmonsの式より得られた障壁高さは0.28eVであり、設計値(2.1eV)に比べかなり低い値であった。トンネル磁気抵抗効果は得られなかった。そこで、MBE法による成長を行い、GeTe/GeMnTe/CdS/GeMnTeエピタキシャル膜の成長に成功した。3.p型半導体や絶縁体を障壁層としたMTJの作製と評価p型半導体ZnTeやスピンフィルタとして働く強磁性絶縁体EuS、およびSrF_2を障壁層に用いたMTJの作製を行なった。ZnTeおよびEuSについてはMBE法による成長を行ない、両積層膜ともにエピタキシャル成長を確認した。磁気輸送特性を測定した結果、GeTe/GeMnTe/EuS(2 nm)/GeTe構造において、10Kで約4.2%の磁気抵抗比を得た。Simmonsの式より得られた障壁幅は設計値とほぼ一致しており、障壁の高さは0.88-1.07eVであった。本年度は超高真空蒸着法を用いたGeTeべース強磁性半導体の合成、および、これを強磁性層としたトンネル磁気接合素子の作製について検討を行なった。1.MBE法によるGeTeべ一ス希薄磁性半導体の合成Ge_<1-x>Mn_xTeについてはトンネル接合において重要な平坦性の向上の観点から条件の最適化を行い、基板温度200250°C、Te/Mn供給比812において良好な薄膜を得た。またMn濃度0.8までの試料の合成を行なうことができた。Ge_<1-x>Cr_xTeについては、SrF_2基板について検討した結果、平坦性の向上がみられた。2.トンネル磁気接合素子の作製と評価クラスタイオンビーム法によるCdS障壁層を有するトンネル磁気接合素子についてさらに検討を行なった。しかしながらトンネル磁気効果は得られなかった。そこで、SrF_2障壁層を有するトンネル磁気接合素子の作製をクラスタイオンビームおよび超高真空蒸着法により行なった。その結果、非線形のI-V特性は得られたもののトンネル磁気効果は得られなかった。TEM観察を行なったところ、SrF_2障壁層へのMnの拡散がみられた。3.ZnTe障壁層の成長n型半導体障壁層としてZnTeについて超高真空蒸着法による成長を行い、成長条件について検討した。その結果、RHEED像においてストリークパターンが得られ、良好な単結晶膜の成長が可能となった。

また、Ge_<1-x>Mn_xTeを強磁性層としたトンネル磁気接合の成長を行い、積層膜成長後のRHEED像もストリークであることを確認した。本年度は超高真空蒸着法を用いたGeTeベース強磁性半導体を強磁性層とした磁気トンネル接合膜の成長とデバイス化の検討を主に行なった。1.MBE法によるCdS障壁層の成長界面向上の観点から、CdS障壁層のMBE法による成長条件の検討を行なった。成長温度200°Cにおいて、RHEEDはストリークであり、エピタキシャル成長に成功した。現在、GeMnTeを機能層とした磁気トンネル接合膜の作製を行なっている。2.強磁性トンネル接合素子の作製と評価p-n-pとの比較からGeTeと格子定数の近いp型半導体ZnTeを障壁層とした磁気トンネル接合膜(p-p-p)の成長を行なった。すべての層の成長後のRHEED像において、ストリークパターンを観察しており、積層膜の磁化測定の結果、成長温度を変えることでわずかに2段ヒステリシスを確認した。磁気抵抗測定(10K)において極めて小さなMR比ではあるがトンネル型の磁気抵抗を得た。しかしながら抵抗値の障壁厚依存性はみられておらず、抵抗値も極めて低いことから、成長方向を変えて検討中である。MgOを障壁層とし、一方の強磁性層を磁性金属(Co、NiFe)とした磁気トンネル接合膜を作製し、トンネル電流を確認した。しかしながら、磁気トンネル効果は得られなかった。また、EuSを中間層としたスピンフィルタ素子を作製したところ、10Kにおいて約5%のスピンフィルタ効果を得た。Simmonsの式から得られたトンネル障壁の高さと幅は設計値と一致していた。
特異な構造と活性をもつ新奇乳酸菌バクテリオシン群の生合成・作用機構の解明と利用

乳酸菌が生産する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、安全性の高い抗菌物質が求められる様々な用途への利用が期待される。我々は、リーダーレスバクテリオシンや環状バクテリオシンなどの構造に特徴をもつものをはじめ、菌種選択的な抗菌活性をもつものや他のバクテリオシンを伴って生産されるものなど、多種多様な新奇乳酸菌バクテリオシンを見出してきた。本研究では、新奇バクテリオシン群の食品保存や関連用途への実用と、その新たな構造と生合成機構を利用した新奇抗菌ペプチドの設計・創出に向けた分子基盤の確立を目指し、種々の新奇乳酸菌バクテリオシン群の生合成機構と抗菌作用の特異な分子機構を解明することを目的としている。新しい乳酸菌分離株より、特異な活性を示す新奇バクテリオシンを見出し、その精製・構造解析および特性の解析を行い、分子量の大きいタイプのバクテリオシン(バクテリオリシン)などを見出すことができた。新奇性の高いものについては、さらにドラフトゲノム解析等を行い、構造の決定とともに生合成遺伝子群の取得を進めている。一方、環状バクテリオシンであるラクトサイクリシンQやラクトサイクリシンQについては、生合成に必須な遺伝子群の特定に至った。また、同じく環状バクテリオシンであるエンテロシンNKR-5-3Bについては、これまでに構築した異種発現系を用い、環状化に必須な遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質中の重要なアミノ酸残基を特定することができた。同様にして、多成分バクテリオシントランスポーターについても、その活性に必須のアミノ酸残基が特定された。さらには、異種発現系を用いて、リーダーレスバクテリオシン・ラクティシンQや環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの種々の改変体を構築し、その構造と抗菌活性の関係の評価を進めている。新奇性の高い構造や特性を有する新奇乳酸菌バクテリオシンが得られ、ドラフトゲノム解析などにより、その生合成遺伝子群の解析も進んでいる。また、ラクトサイクリシンQやラクトサイクリシンQなどの新奇環状バクテリオシンの生合成必須遺伝子群が特定され、付随する生合成遺伝子群の解析も、それらの異種発現系の構築によって順調に進展している。多成分バクテリオシントランスポーターについての解析も、異種発現系を用いた変異体の構築と解析によって大きく進展した。さらに、環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの環状化に関わるタンパク質の同定と、その活性に必須なアミノ酸残基を特定することができた。異種発現系を用いて構築した、リーダーレスバクテリオシン・ラクティシンQと環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの改変バクテリオシンについても解析が進展し、抗菌活性に大きな影響を与える構造部位の推定に至った。今後、この知見を応用し、他のバクテリオシンにも同様の手法を適用することで、種々のバクテリオシンの改変や強化の可能と考えられる。研究は順調に進展しており、とくに構造や活性に特徴を持つバクテリオシンについて、優先的に研究を進め、進展を図る。構造未決定のバクテリオシンや新たに発見されたバクテリオシンについても、構造や活性に特徴を持つものについて優先的に精製・構造解析および生合成遺伝子群の解析を進め、ドラフトゲノム解析なども活用しながら、新たな構造・遺伝子情報の充実を図る。環状バクテリオシンの生合成機構については、構築した異種発現系を用いて引き続き解析を進めるとともに、環状化への関与が明らかとなったタンパク質およびそれに相同性を有するタンパク質群の機能解析に重点的に取り組み、環状化機構の解明を目指す。また、リーダーレスバクテリオシンと環状バクテリオシンの共通点には引き続き着目し、環状化機構、分泌機構、自己耐性機構、作用機構などの解明を図る。多くの新奇バクテリオシンとその生合成遺伝子群を利用でき、比較できる優位性を十分に活用しながら、乳酸菌バクテリオシンとその生合成機構を基盤とした、新奇抗菌ペプチドの設計と創出の分子基盤の確立を図る。

同様にして、多成分バクテリオシントランスポーターについても、その活性に必須のアミノ酸残基が特定された。さらには、異種発現系を用いて、リーダーレスバクテリオシン・ラクティシンQや環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの種々の改変体を構築し、その構造と抗菌活性の関係の評価を進めている。新奇性の高い構造や特性を有する新奇乳酸菌バクテリオシンが得られ、ドラフトゲノム解析などにより、その生合成遺伝子群の解析も進んでいる。また、ラクトサイクリシンQやラクトサイクリシンQなどの新奇環状バクテリオシンの生合成必須遺伝子群が特定され、付随する生合成遺伝子群の解析も、それらの異種発現系の構築によって順調に進展している。多成分バクテリオシントランスポーターについての解析も、異種発現系を用いた変異体の構築と解析によって大きく進展した。さらに、環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの環状化に関わるタンパク質の同定と、その活性に必須なアミノ酸残基を特定することができた。異種発現系を用いて構築した、リーダーレスバクテリオシン・ラクティシンQと環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの改変バクテリオシンについても解析が進展し、抗菌活性に大きな影響を与える構造部位の推定に至った。今後、この知見を応用し、他のバクテリオシンにも同様の手法を適用することで、種々のバクテリオシンの改変や強化の可能と考えられる。乳酸菌が生産する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、安全性の高い抗菌物質として様々な用途への利用が期待される。我々は、リーダーレスバクテリオシンや環状バクテリオシンなどの構造に特徴をもつものをはじめ、菌種選択的な抗菌活性をもつものや他のバクテリオシンを伴って生産されるものなどの抗菌作用に特徴を有するものなど、多種多様な乳酸菌バクテリオシンを見出してきた。本研究では、新奇乳酸菌バクテリオシン群の食品保存や関連用途への実用と、その新たな構造と生合成機構を利用した新奇抗菌ペプチドの設計・創出に向けた分子基盤の確立を目指し、種々の新奇乳酸菌バクテリオシンの生合成機構と抗菌作用の特異な分子機構を解明することを目的とした。新しい乳酸菌分離株より、特異な活性を示す新奇バクテリオシンを見出し、その精製・構造解析および特性の解析、さらに種々のPCRやドラフトゲノム解析によるバクテリオシン遺伝子の配列決定を行い、構造決定を進めている。一方、特異的な抗菌活性を有する新奇バクテリオシンであるラクトコッシンZの生合成遺伝子群を同定し、その生合成機構を明らかにするとともに、自己耐性機構および作用機構の一端を明らかにした。また、ラクトサイクリシンQやラクトサイクリシンQなどの新奇環状バクテリオシンの生合成に必須な遺伝子群、および環状化に必須な遺伝子群について、異種発現系の構築によって特定を進めている。多成分バクテリオシントランスポーターについては、構築した種々の異種発現株を用いてその基質特異性や分泌機構の一端を明らかにした。さらには、リーダーレスバクテリオシン・ラクティシンQや環状バクテリオシン・エンテロシンNKR-5-3Bの異種発現系を用い、バクテリオシン遺伝子に種々の変異を導入した改変バクテリオシンの生産とその抗菌活性の評価を進めている。新しい乳酸菌分離株より、さらに新奇性の高い構造や特性を有すると予想されるバクテリオシンが得られ、その構造解析や生合成遺伝子群の解析が順調に進んでいる。
バルジ天体のX線観測による中心核大質量ブラックホールの進化の解明

昨年に引続き、銀河系バルジにあるX線源の光度分布、空間分布に関する研究を進め、X線源の観点から楕円銀河と銀河系バルジの同質性を初めて明らかにした。まず、既知のバルジ天体を用いて、銀河系ディスクによるX線吸収量を調べ、その銀緯依存性をモデル化した。次にROSAT All-Sky Surveyで検出された、比較的明るいX線源の色から、吸収量とスペクトルのベキを推定した。その上で吸収量の小さなX線源は、手前に位置するものとして取り除いた。この手法により、3σ以上の有意性で、銀河系中心周りのX線源の集中を発見した。これらのX線天体までの距離を、銀河系バルジの大きさ(約1.7kpc)に基づいて推定することで、10^<34>-10^<38>erg/sに渡る銀河系バルジの光度関数を導くことに初めて成功した。バルジのX線源の殆どは、その光度から低質量X線連星系(LMXBs)と考えられる。そこでバルジ天体の光度関数を、Chandra/XMM衛星で検出された、M31のバルジや楕円銀河に付随するLMXBsのそれと比較した。LMXBsの数を、バルジまたは楕円銀河の大きさに対応するBバンドでの光度で規格化すると、10^<34>-10^<40>erg/sという極めて広い光度範囲に渡って、互いの光度関数が一致することを明らかにした。一方で、バルジ天体の銀河系中心周りの集中を表すスケール角度は4.1度であった。質量の軽い、星のスケール角度と比較すると、X線天体の方が2.4倍拡がっており、この性質も銀河系バルジに限らず、楕円銀河でも同様に見られることを突き止めた。以上の結果について、2005年9月にスペインで開かれた国際会議でポスター発表を行い、現在は投稿論文の準備を進めている。また本研究の今後の展開に必要となる、「すざく」衛星に搭載されたX線望遠鏡の応答関数構築に向けて、シミュレータの開発とその調整も平行して進めている。XMM-Newton衛星で観測された、電波パルサーG359.23-0.82(The Mouse)及び、近傍の2つの低質量X線連星系(以後LMXBs)SLX 1744-299,300に関して解析を行った。The MouseのX線スペクトルは指数1.9のベキ型関数で表され、視線方向の吸収も2.60×10^<22>cm^<-2>と精度良く決定できた。一方、銀河系中心領域に位置するSLX天体のスペクトルは、ベキ型関数または中性子星表面と降着円盤からの黒体輻射で再現でき、その吸収量は4×10^<22>cm^<-2>であった。この結果は、The Mouseが銀河系中心領域にあるというこれまでの考えと矛盾し、むしろ比較的手前に位置することを示唆している。次にROSAT All-Sky Surveyで検出された、比較的明るいX線源の吸収量をそのスペクトルの色から推定し、銀河系ディスクによるX線吸収量のモデルと比較した。The Mouseの解析と同様に、吸収量の小さいX線源は、手前に位置するものとして取り除いた。残りのX線源の個数密度を、銀河系中心からの離角の関数として表したところ、銀河系中心周りのX線源の集中を発見した。このスケール角度は4.1°であり、赤外線などで観測される銀河系バルジの大きさと対応していた。これら銀河系バルジにあると考えられるX線源を用いて、個数密度とX線フラックスの関係(log N-log S関係)を構築した。さらに、銀河系バルジの大きさ(約1.7kpc)による、各天体までの距離の不定性を考慮して、10^<34>から10^<38>erg/sに渡る銀河系バルジの光度関数を導くことに初めて成功した。また本研究の今後の展開のために必要なAstro-E2衛星に搭載される、X線望遠鏡の低バックグラウンド化を目指して、迷光防止用プリコリメータの開発・製作を行ってきたので、その成果を論文にまとめた。LMXBsの数を、バルジまたは楕円銀河の大きさに対応する

Bバンドでの光度で規格化すると、10^<34>-10^<40>erg/sという極めて広い光度範囲に渡って、互いの光度関数が一致することを明らかにした。一方で、バルジ天体の銀河系中心周りの集中を表すスケール角度は4.1度であった。質量の軽い、星のスケール角度と比較すると、X線天体の方が2.4倍拡がっており、この性質も銀河系バルジに限らず、楕円銀河でも同様に見られることを突き止めた。以上の結果について、2005年9月にスペインで開かれた国際会議でポスター発表を行い、現在は投稿論文の準備を進めている。また本研究の今後の展開に必要となる、「すざく」衛星に搭載されたX線望遠鏡の応答関数構築に向けて、シミュレータの開発とその調整も平行して進めている。
キノン補酵素形成機構の解明およびペプチド修飾酵素による機能性環状ペプチドの創出

キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素(QHNDH)の活性中心を形成する9 kDaのサブユニットQhpCには、キノン補酵素システイントリプトフィルキノン(CTQ)を含む2種類のユニークな翻訳後修飾構造が存在し、3つの修飾酵素が関与する多段階ステップによって生合成される。これまでの解析の結果、まず、細胞質内でラジカルSAM酵素QhpDがAsp/Glu残基とCys残基との間に3ヶ所の分子内チオエーテル架橋を形成し、次にFAD依存性水酸化酵素QhpGが前駆体Trp残基のインドール環を水酸化し、CTQ形成の初発反応を行うと考えている。その後、QhpDとの相互作用に必要であったQhpCのN末端28残基のリーダーペプチドは、サブチリシン様セリンペプチダーゼQhpEによって除去される。QhpEについては、Ps. putida QhpEの発現系を構築して、QhpCに対する反応性を解析した。まず、QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと混合し、反応生成物をMALDI-TOF-MS解析したところ、架橋形成QhpCではリーダーペプチドが切断されたのに対して、未架橋QhpCでは、リーダーペプチドが切断されていないものも観測された。QhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。次に、QhpEとQhpCを混合し、終夜反応物をMALDI-TOF-MS解析したところ、複合体を形成していない単独の場合では、QhpEはQhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。さらにQhpEの詳細な反応速度を調べるため、リーダーペプチドの解離の時間経過を観測したところ、架橋QhpCでは未架橋QhpCに比べて、QhpEに対する反応速度が大幅に上昇していることがわかった。また、基質フリーのQhpEの結晶化にも成功した。QHNDHの活性中心を形成するQhpCの翻訳後修飾には、3つの修飾酵素が関与する多段階ステップによって生合成される。これまでに、翻訳されたQhpCは、QhpDおよびQhpGと三者複合体を形成し、QhpDによって3ヶ所のチオエーテル架橋が形成される。その後、同一複合体上で、QhpGによってCTQ前駆体Trp残基側鎖インドール環が二重水酸化されることを明らかにしてきた。本年度では、リーダーペプチドを切断すると予想されるQhpEの機能解析を行った。QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと反応させた結果、複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。また、QhpD/QhpC複合体あるいはQhpCを基質としてQhpEと反応させた結果、QhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。QhpEとQhpCの複合体形成能を調べるため、Native PAGEを行ったところ、活性中心Ser残基を破壊したQhpE変異体(S180A)では、未架橋QhpCよりも架橋形成QhpCとの間に強い相互作用が観測された。すなわち、QhpEはQhpCの架橋形成構造を認識し、その活性が制御されていることが判明した。これらの結果からQhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では未架橋QhpCの場合、複合体の内部に埋もれており、QhpEがQhpCを認識できずリーダーペプチドを切断できないのに対して、架橋QhpCは複合体の外に露出することでQhpEとのアクセスが可能となり、リーダーペプチドが切断されるのではないかと示唆される。QhpCの架橋形成とCTQ形成初発反応にはリーダーペプチドを必要とするため、このようなQhpEの反応性は、翻訳されたばかりの未架橋QhpCのリーダーペプチドが素早く切断されるのを防ぐことに役立っていると考えられた。本研究では、QHNDHのチオエーテル架橋形成に関与するQhpD、およびCTQ形成に関与するQhpGなど、QhpCの翻訳後修飾に関与する酵素の反応メカニズムを詳細に理解した上で、そのユニークな修飾酵素を用いた機能性ペプチドの創出が実現できれば、新たな医薬品を創り出すツールにもなり得る。本研究の成果を新規性の高い医薬品や抗菌剤の開発につなげることが最終目標である。本年度は、QhpEやQhpE/QhpC複合体、QhpG/QhpC複合体の結晶構造解析を行い、詳細な基質認識機構を調べる。また、QhpDの結晶構造解析を行い、詳細なチオエーテル架橋形成機構の解析を行う。さらに、QhpDを用いて機能性環状ペプチドの創出を試みる。方法としては、araBADプロモーター支配下で厳密な発現制御が可能なベクターに、QhpDのみをクローニングしておく。QhpDをアラビノース添加によって発現誘導したときのみ、大腸菌が死滅することを指標に、環状化抗菌ペプチドの取得を目指す。なお、リーダーペプチドの除去が必要と考えられる場合には、それに関与するプロテアーゼQhpEも共発現させる。これまでの解析の結果、まず、細胞質内でラジカルSAM酵素QhpDがAsp/Glu残基とCys残基との間に3ヶ所の分子内チオエーテル架橋を形成し、次にFAD依存性

水酸化酵素QhpGが前駆体Trp残基のインドール環を水酸化し、CTQ形成の初発反応を行うと考えている。その後、QhpDとの相互作用に必要であったQhpCのN末端28残基のリーダーペプチドは、サブチリシン様セリンペプチダーゼQhpEによって除去される。QhpEについては、Ps. putida QhpEの発現系を構築して、QhpCに対する反応性を解析した。まず、QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと混合し、反応生成物をMALDI-TOF-MS解析したところ、架橋形成QhpCではリーダーペプチドが切断されたのに対して、未架橋QhpCでは、リーダーペプチドが切断されていないものも観測された。QhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。次に、QhpEとQhpCを混合し、終夜反応物をMALDI-TOF-MS解析したところ、複合体を形成していない単独の場合では、QhpEはQhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。さらにQhpEの詳細な反応速度を調べるため、リーダーペプチドの解離の時間経過を観測したところ、架橋QhpCでは未架橋QhpCに比べて、QhpEに対する反応速度が大幅に上昇していることがわかった。また、基質フリーのQhpEの結晶化にも成功した。QHNDHの活性中心を形成するQhpCの翻訳後修飾には、3つの修飾酵素が関与する多段階ステップによって生合成される。これまでに、翻訳されたQhpCは、QhpDおよびQhpGと三者複合体を形成し、QhpDによって3ヶ所のチオエーテル架橋が形成される。その後、同一複合体上で、QhpGによってCTQ前駆体Trp残基側鎖インドール環が二重水酸化されることを明らかにしてきた。本年度では、リーダーペプチドを切断すると予想されるQhpEの機能解析を行った。QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと反応させた結果、複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。また、QhpD/QhpC複合体あるいはQhpCを基質としてQhpEと反応させた結果、QhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。QhpEとQhpCの複合体形成能を調べるため、Native PAGEを行ったところ、活性中心Ser残基を破壊したQhpE変異体(S180A)では、未架橋QhpCよりも架橋形成QhpCとの間に強い相互作用が観測された。すなわち、QhpEはQhpCの架橋形成構造を認識し、その活性が制御されていることが判明した。これらの結果からQhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では未架橋QhpCの場合、複合体の内部に埋もれており、QhpEがQhpCを認識できずリーダーペプチドを切断できないのに対して、架橋QhpCは複合体の外に露出することでQhpEとのアクセスが可能となり、リーダーペプチドが切断されるのではないかと示唆される。QhpCの架橋形成とCTQ形成初発反応にはリーダーペプチドを必要とするため、このようなQhpEの反応性は、翻訳されたばかりの未架橋QhpCのリーダーペプチドが素早く切断されるのを防ぐことに役立っていると考えられた。
数理物理に関係した無限次元空間の研究

無限次元空間の重要なclassである写像空間の接bundleの構造群は写像群である。この種の無限次元群を構造群とするbundleの研究には通常の接続以外に無限次元性を反映する研究手段が必要である。その度非可換接続及びDirac作用素に関する接続という概念を導入しそれ等について次の結果を得た。1.写像群を含む重要な無限次元群GLPを構造群とするbundleを非可換接続を用いて調べ、非可換Poincae′補題、消滅定理、還元定理等を導いた、又これ等の証明において作用素の攝動論が非可換接続の研究に有効な事が示された。これ等の結果において'94年7月、Hungary,Debrecenでの微分幾何学国際会議で講演し近く刊行される。2.写像群bundleについてDirac作用素に関する接続を用いて、特にそのη-不変量からbundleの不変量を導いた.又Dirac作用素の族に対しそのparameter空間上のloop群とを構成し、これと上記Dirac作用素に関する接続との関係を明らかにした。この結果は新しいmoorodnomy論と見る事が出来'94年12月、Graece,Tessalonikiでの大域解析学、微分幾何及びLie群に関するwork shopで発表し近く刊行される。尚、これ等の場の理論等への応用は今後の課題である。これ等の研究には具体的な関数空間や力学等、及び物理的modelの研究が重要でありこれ等については真次、神谷、本田が研究を行なった。
重粒子線治療における照射領域可視化画像を用いた生理機能定量測定に関する研究

粒子線治療の照射野可視化手法ではPositron emission tomographyが先行している。陽電子放出核は生理学的効果による洗い出しのため画質が悪化する。本研究ではこの補正に必要な洗い出し速度の定量とそのメカニズムの解明を試みた。ラットの脳の照射実験から2成分を仮定した洗い出し速度は0.54, 0.011 min-1で、早い方は脳血流の速度に近い。また脳血流を増加させるアセタゾラミドを投与した場合、投与群の速度が下がり、アセタゾラミドが炭酸脱水酵素の阻害剤であるため陽電子放出核のC11は生体中でCO2になったと推測できる。本研究は、洗い出しの基礎データの提供と機序の理解に貢献した。当該研究グループで開発された開放空間においても撮像可能なOpenPETを用いて、ラットの脳へのC-11ビーム照射直後からの時間放射能曲線の解析を行った。2成分の生理的影響による洗い出し速度(中間成分k2m、遅い成分k2s)を仮定して、核医学で用いられるコンパートモデルを応用して算出した結果、平均の洗い出し速度は、ラット(N=4)では、k2m=0.54 min-1、k2s=0.011 min-1であった。このk2mはO-15標識水による脳血流測定で得られた洗い出し速度(k2)に近い値であることから、C-11の洗い出しも血流に依存するものではないかと考えた。そこで、血管反応性等の臨床検査でも使用される脳血流を増加させるアセタゾラミドを投与し(stress)、投与していない場合(rest)とで、それぞれC-11を脳に照射し、洗い出し速度を比較した。ラットの脳(N=6)に照射した結果、両者の時間放射能曲線はほぼ同じであり、またstress、restのk2mはそれぞれ0.31±0.07、0.28±0.08であり、有意な差は見られなかった。このことから、C-11の洗い出しは脳血流に依存しないものか、11CO2に変化したのではないかと示唆された。アセタゾラミドは炭酸脱水酵素の阻害剤であるため脳内にCO2濃度が増加し、血流は増加したが、洗い出しが抑えられたと考えられるためである。C-11の化学形を決める実験として、生体ではないが照射水に濃硫酸を添加し、アスカライトでCO2とトラップさせそこの放射能を測る実験を行ったが、バックグランドに対して、有意な検出はできなかった。しかしこれは常温溶解度に対して生成量が低いため、酸を入れたとしても残留した可能性もある。また、ラットに照射した後に、呼気の放射能を測定したが、こちらも有意な検出は認められなかった。さらに照射後20分後に採血し、血球と血漿に分離後それぞれ放射能を測定した結果、ほとんど血球に集まっていることが分かった。当研究グループで開発された開放空間においても撮像可能なOpenPETを用いて、ラットへのC-11ビーム照射直後からの時間放射能曲線の解析を行った。小型試作機である2リングによるSmall OpenPETで撮像したラット2匹、また次世代のOpenPETととして1リングでも開放空間の撮像可能なsingle-ring OpenPET小型試作機を用いてウサギ(1匹)およびラット(2匹)の脳への照射の解析を行った。C-11を照射してから生理的影響により洗い出しされる速度を核医学の動態解析で用いられるコンパートメントモデルを用いて算出した。ここではC-11は直接組織に入射したとし、通常動脈と組織の移行係数であるK1はゼロとし、瞬時のボーラス投与と仮定した。過去の文献にあるウサギにC-11を照射した実験から何か二種類以上の化学形をとり、異なる速度で洗い出しされたとして解析されていることから、本研究でも中間速度の洗い出しとしてk2m、遅い速度の洗い出しとしてk2sがあるとして、コンパートメントモデル解析を行った。その結果、平均の洗い出し速度は、ラット(N=4)では、k2m=0.54 min-1、k2s=0.011 min-1、ウサギ(N=1)ではk2m=0.74 min-1、k2s=0.012 min-1であった。このk2mはH2-15Oによる脳血流測定で得られた洗い出し速度(k2)に近い値であることから、C-11の洗い出しも血流に依存するものではないかと考えられる。一方でC-11がCO2になったと仮定し、過去のCO2を用いた犬の脳のpHマッピングで用いられた2コンパートメントモデルを採用して解析を行った結果、k2およびk3(コンパート間の移行係数)とも過去の文献の値と同程度の値が得られた。

このことより11CO2になったことが示唆されたが、今後はC-11の化学形を調べることが重要である。当該研究グループで開発された開放空間においても撮像可能なOpenPETを用いて、ラットの脳へのC-11ビーム照射直後からの時間放射能曲線の解析を行った。2成分の生理的影響による洗い出し速度(中間成分k2m、遅い成分k2s)を仮定して、核医学で用いられるコンパートモデルを応用した結果、平均の洗い出し速度は、ラット(N=4)では、k2m=0.54 min-1、k2s=0.011 min-1であった。このk2mはO-15標識水による脳血流測定で得られた洗い出し速度に近い。そこで脳血流を増加させるアセタゾラミド(ACZ)を投与し、投与していない場合(Rest)と比較した。ラットの脳(N=6)に照射した結果を時間放射能曲線のスタートをより正確に決めて(最後のスピルの始まりから2秒後)再解析したところ、昨年度の報告とは異なりRest、ACZそれぞれ0.41±0.06、0.28±0.06になり有意な差が得られた。つまり血流が増加したACZの方が洗い出し速度が遅くなった。これは入射したC-11の多くが最終的にCO2なった仮定すると説明できるかもしれない。アセタゾラミドの投与により炭酸脱水酵素が阻害され組織中のCO2濃度が高くなり、C-11起源の11CO2が拡散しづらくなった、あるいは11CO2がイオンに分解されることなく組織に残っていると考えることができる。これらの結果を論文にまとめて投稿中である。入射したC-11の化学形を決めるいくつかの実験を試みたが、感度の問題等で決定することができなかったが、この結果は11CO2になったことを示唆している。粒子線治療において照射野可視化の試みとしてPETが先行しているが、洗い出しの影響が問題となっている。より正確な補正には洗い出し速度の測定やその機序の解明が必要で、本研究の結果は、その基礎データの提供とメカニズムの理解に貢献できたと考えられる医学物理計画していた実験はすべて遂行することはできたが、C-11が生体に入った後の化学形を特定できるまでには至っていない。ガスクロマトグラフィのような化学分析で同定できることは期待できるが、検出効率等検討した結果、ビーム照射強度の106程度では、すべてが同じ分子になったとしても、同定が困難であると判断した。そこでシミュレーションによるアプローチで化学形の同定を試みることを考えた。しかし申請者は計算化学に不慣れなため、現在も計算プログラムの作成と高精度なモデルの導入等を行っている。モデル解析についてはシミュレーションも行い、解析の精度等についても十分検討した。さらに時間放射能曲線を得るにはOpenPETの再構成画像からROIをとって作成するが、そのROIの値の精度についても十分検討を行った。このことから本研究で用いたコンパートメントモデルの特性については十分把握できてたといえる。モデル解析が本研究のメインテーマであり、モデル解析の確立は、研究が順調に進んでいるといえる。アセタゾラミドによる洗い出しの変化は観測できなかったが、時間放射能曲線の後半部分をよく観察すると、有意な差ではないがstressの傾きが大きい傾向にある。これまでの解析では全脳に関心領域をとっていたが、部位ごとあるいはボクセルごとに解析することで、アセタゾラミドの効果を再解析し、血流との関係を再検討する。照射直後からの撮像が可能なIn-beamPETでのボクセル・バイ・ボクセルの解析は初めての試みである。
オワンクラゲの発光機構を再現する核酸分子

本研究は蛍光性人工ヌクレオシドを含有する核酸アプタマーを開発し、オワンクラゲと等価の発光機構を核酸一分子で実現しようというものである。オワンクラゲは緑色蛍光タンパク質とイクオリンからなる蛍光タンパク質複合体を利用して発光する。本課題では天然の核酸塩基シトシンを2工程で緑色蛍光タンパク質の発光本体であるパラヒドロキシベンジリデンイミダゾリノンに変換し、イクオリンのようにセレンテラジンを認識する核酸アプタマーに組み込んでオワンクラゲの発光機構を核酸分子で再現することを目指した。発光体は完成したが、高い認識能を有する核酸アプタマーは完成せず、発光機構の再現には研究継続が必要である。オワンクラゲの発光機構を人工核酸1分子で実現するために、GFPの発光色素本体を核酸塩基とするヌクレオシドおよび蛍光物質セレンテラジンを内包するRNAアプタマーを開発し、同一分子内に組み込むことを計画した。27年度はシチジン由来蛍光性ヌクレオシド合成法を、アデノシン、グアノシンに適用し、pーヒドロキシ桂皮酸活性エステルと各ヌクレオシドをピリジン中で作用させ、ヨウ素および水を加えて目的の発光ヌクレオシドを調製した。蛍光分光光度計により、励起波長、発光波長、強度、半減期等を指標に発光特性を精査した。発光ヌクレオシドを基質として、ピリジン中TBDMSClあるいは塩化トリチルを用いて5'水酸基を選択的に保護した後、2'水酸基選択的をp-メトキシベンジルオキシ基に変換し、イミダゾール存在下で三塩化リンを作用させて3'水酸基をH-ホスホネート化した。目的のRNA合成用モノマーを通算収率20%以上で3種のモノマーを1g以上合成することに成功した。一方で、セレンテラジンを内包するRNAアプタマーの探索についても着手した。当初の計画通り、蛍光性ヌクレオシドのモノマーの合成に成功し、RNAアプタマーの探索に着手したが、その論文化、特許化が遅れている。2種の蛍光タンパク質が関与するオワンクラゲの発光機構を人工核酸一分子で実現することを目的に研究をおこなっている。イクオリンと等価な機能を有する抗セレンテラジン-RNAアプタマーを開発し、そこに報告者の開発した緑色蛍光タンパク質(GFP)の発光体と等価な構造を有する人工ヌクレオシドを同一分子内に配置することでオワンクラゲの発光機構を再現することを計画した。28年度はカルシウムイオン濃度の上昇に伴いセレンテラジンと強く結合するRNAアプタマーの探索をおこなったが、結合定数の高いアプタマーは見つからなかった。一方で、緑色蛍光タンパク質の発光色素と等価な構造を有するアデノシン由来、シチジン由来蛍光ヌクレオシドの合成法はブラッシュアップされ、論文化に近づいている。29年度は外注も視野に入れ、自動探索装置を利用した抗セレンテラジンアプタマーの探索と、蛍光性ヌクレオシドが導入されたアプタマーによるオワンクラゲの発光機構を実現したい。セレンテラジンと強く結合するRNAアプタマーの探索をおこなったが、結合定数の高いアプタマーは見つからず、研究が遅延している。一方で、緑色蛍光タンパク質の発光色素と等価な構造を有する蛍光ヌクレオシドの合成法はブラッシュアップされた。本研究は蛍光性人工ヌクレオシドの合成と、セレンテラジンを認識する核酸アプタマーの探索、核酸アプタマーに蛍光性人工ヌクレオシドを導入し、オワンクラゲと等価の発光機構を核酸一分子で実現しようというものである。蛍光性ヌクレオシドの合成に関しては、蛍光性エテノヌクレオシド及び、それを含む核酸の合成には成功した。さらに天然ヌクレオシドであるアデノシン及びシチジンを、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発光本体であるイミダゾリノン骨格に変換することにも成功した。水酸基をTBDMS保護されたアデノシンあるいはシチジンに対して、塩基性条件下、クロロ酢酸エチルで処理し、イミダゾリノン骨格を形成したのち、続けてアニスアルデヒドを作用させることにより、GFPのコア色素と等価な構造に変換した。その後TBDMS基の除去、DMTr基の導入、亜リン酸機の導入を経て、オリゴヌクレオチド自動合成装置用の原料構造に変換した。一方で、セレンテラジンを内包する核酸アプタマーの探索に関してはた困難を極めた。安価な30量体長のDNAを用いて探索をおこなったものの、高い結合定数が得られる配列が見つからず、さらに修飾ヌクレオシド、人工ヌクレオシドなどを部分的に利用したが、芳しい結果は得られなかった。最終年度に30量体長のRNAを合成して探索を行うことで、数十種のアプタマー候補分子を見つけることに成功した。課題終了後にこれをさらに絞り込み、蛍光性ヌクレオシドと結合して本課題の対象分子を完成させたい。

28年度はセレンテラジン内包RNAアプタマーの探索をおこない、候補RNAに対して蛍光性ヌクレオシドの導入を試みる。29年度は自動探索装置を利用した抗セレンテラジンアプタマーの探索と、蛍光性ヌクレオシドをアプタマー内に配置することによるオワンクラゲの発光機構を実現したい。核酸化学論文投稿の遅れより、投稿費用、英文校閲に当てていた予算を繰り越すことになった。RNAアプタマーの探索が遅れるているため、28年度に予定していたRNA合成が29年度に繰り越されたため。投稿費用、英文校閲に当てていた予算を28年度で執行する。29年度にRNA合成を実施する。
歯周病関連細菌の主要外膜蛋白質の解析とそれらの臨床症状との関連性

1.種々のP.gingivalis菌株における主要外膜蛋白質の発現主要外膜蛋白質のうち、RagAおよびPgm6/7は同様の分子量のものがいずれの菌株にも存在した。ところが、RagBは菌株によって移動度が異なるだけでなく、特異抗体の反応性も著しく異なっていた。種々の環境因子が主要外膜蛋白質の発現に及ぼす影響を通常のバッチ培養によって調べたところ、温度が最も影響を与える因子であった。温度を上昇させると、主要外膜蛋白質のうち、RagA, RagBおよびジンジパインの発現が低下し、ほかに線毛や短線毛も発現が低下した。次に、培養環境の制御が可能な連続培養法を用いて、環境因子の影響を検討した。増殖速度が速くなると、線毛および短線毛の発現が著明に増加したが、ジンジパインの産生量と活性は低下した.栄養の乏しい条件では、線毛および短線毛の発現が減少した。気相を嫌気条件から通気条件へ変化させると、ジンジパインの活性が著明に低下した。酸素ストレスにより著明に増量する蛋白質スポットを二次元電気泳動法にて確認後、同定した。3.欠失変異株を用いたP.gingivalisの主要外膜蛋白質の性質の解析大腸菌のOmpAと相同性をもつP.gingivalisの主要外膜蛋白質Pgm6/7は、ヘテロ3量体を形成して外膜に存在していた。欠失変異株では親株と比較して多数のvesicle様構造物が菌体外に観察された。Pgm6/7が外膜の安定性および構造維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、主要外膜蛋白質RagAおよびRagBの欠失変異株の作製も終了したので、現在、変異株の性質の検討を進めている。4.歯周病患者血清とP.gingivalisの主要外膜蛋白質との反応性本学の臨床講座と協力して採取した歯周病患者の血清を用いて、P.gingivalisの主要外膜蛋白質に対する抗体産生の状態をウェスタンブロットによって調べた。根尖性歯周炎に罹患した患者の血清は、P.gingivalisに対する免疫反応を高い頻度で示し、なかでも主要外膜蛋白質であるRagBやジンジパインとの強い免疫反応を示した。臨床所見のうち、打診痛や根尖部透過像の有無が、P.gingivalisに対する免疫反応と相関していた。P.gingivalisの標準株であるATCC33277株を嫌気培養し,菌体から外膜画分を得た.主要外膜蛋白質には7種類の蛋白質が含まれているが,このうち,RagA,RagB,Putative porinを精製した後,抗原としてウサギに免疫を行い,特異抗体の作製を行った.2.種々のP.gingivalis菌株における主要外膜蛋白質の発現P.gingivalisの種々の菌株を培養し,電気泳動法によって外膜蛋白質パターンの比較を行うとともに,作製した特異抗体を用いて,各菌株で各主要外膜蛋白質が普遍的に発現しているか,また,菌株間で変異があるのかを調べた.RagA,Putative porinは同様の分子量のものがいずれの菌株にも存在した.