hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加速度を利用し軟骨細胞と骨髄幹細胞を用いた培養軟骨・骨複合体の開発

(U-,HA-)群と(U+,HA+)群のコンドロイチン4硫酸異性体量はそれぞれ培養後7日で27.8と32.5μg/ml、14日では64.9と90.2μg/mlであり有意に(U+,HA+)群が高かった(<0.01)。また、コンドロイチン6硫酸異性体量も同様で、それぞれ培養後7日で30.5と42.7μg/ml、14日では86.2と123.2μg/mlであり有意に(U+,HA+)群が高かった(p<0.01)。また(U+,HA-)群と(U-,HA+)群とには有意差はなかった。すなわちヒアルロン酸と超音波刺激が培養軟骨細胞を活性化させることが示唆された。ブタの脛骨骨髄より骨髄細胞を採取し、3日間15%FBSを含むDMEM培地にて培養し、その後底面に接着した細胞を単離し、2週間かけてDexamethasone、β-Glycerophosphate、L-ascorbic acid phosphateを含む培養液にて培養し骨芽細胞への分化を行った。この骨芽細胞浮遊液を1.0×10^6cellsづつ円盤状ハイドロキシアパタイトブロック内にろ過させることでブロック内に細胞を停留させ、24 well plateの底に置き1×10^<-4>Gの加速度を与えた条件下で2週間培養した。4週間経過した時点で、ブタ足関節より採取した軟骨より軟骨細胞を単離し、コラーゲンゲル内に包埋、2.0×10^6cellsづつ前述した骨芽細胞培養アパタイトブロック表面に撒き、さらに2週間、1×10^<-4>Gの加速度下に培養を継続した。結果は、アパタイトブロック内にて骨芽細胞はある程度とどまってはいたが、骨器質を形成まではいたらなかった。しかし、表面の軟骨層は層状に形成し、一部アパタイトブロックの孔内にも浸潤し、軟骨層がアパタイト層と比較的強固に固着し、いわゆるアパタイト・軟骨複合体を形成した。
ラーニングアナリティクスを活用したソフトウェア技術者教育支援システム

平成30年度前期の実験講義「システム開発実験」では、前年度開発したソフトウェア設計支援ツールからの学習データの自動収集のためのEclipseを拡張して作業ログを記録する機能を導入し、データ収集をおこなった。同実験講義では、ソフトウェア技術者教育支援システムALECCSの機能を学生に提供し、各種学習活動データ収集に加えてシステムの使用感アンケートなどをおこなった。この結果については、令和元年5月の国際学会(CSEdu2019,ギリシャ)にて報告する予定である。UML図(クラス図)の自動採点機能および作成履歴データの自動収集機能については、UML図のテキスト形式での記述法PlantUMLおよびそのWebUIについての調査が完了して基本部分の実装をおこなった。教育成果の質と量に関するWebアンケートシステムについての報告は情報処理学会の論文誌に採録された。また、本研究の知見を活かした小学校プログラミング教材の提案は、情報処理学会情報教育シンポジウムSSS2018にて学生奨励賞を受け、pgtracerの実践報告も同シンポジウムにて優秀発表賞を受けた。同シンポジウムでは他にpgtracerのデータ分析結果も報告した。遅れの出ていたサーバ構築も終わり、現在はデータ収集と分析を進めている。2019年度は最終年度のため、これまでに得られたデータを分析し、論文としてまとめ発表をおこなう。研究計画調書で予定していたプログラミング教育支援ツールpgtracerのJava言語拡張については、その基礎部分となる文法解析部について、JavaCCの文法ファイルを用いた実装の検討をおこなった。ソフトウェア設計支援ツールからの学習データの自動収集については、Eclipseを拡張して作業ログを記録する機能を実装した。収集については現行では手動である。Astah*Professionalを用いたUML図(クラス図)の自動採点機能および作成履歴データの自動収集機能の実装についてであるが、基礎調査時点でいくつか問題があることが判明したため、テキストのマークアップ記法であるPlainUMLとそのWebUIを利用する方向で再検討をおこなっている。これらに加えて、ALECSSへのテストケースチェック機能やGit作業実行チェック機能の追加、REMESTへのトレーサビリティ編集・チェック機能の追加、Perseusへのルーチン呼び出しおよびデータアクセス関係の自動抽出をおこなった。これらのツール群の実装と並行して、熊本高専にてpgtracerを使った授業実践をおこない、pgtracerを用いてプログラミング問題におけるマスクおよびコメントの非表示の影響などについて収集したデータを用いて定量分析し、その結果を国際学会LTLE 2017で発表するとともに、International Journal of Learning Technologies and Learning Environmentsに掲載した。基盤システム構築のための佐賀大学へのサーバ機導入については、これからである。UML図の自動採点機能および作成履歴データの自動収集機能の実装についての基礎調査段階で、当初採用予定であったAstah*Professionalでの実装でいくつか困難な点が見つかったためこれを取りやめ、テキストによるマークアップ記法であるPlainUMLとそのWebUIを採用する方向で再検討をおこなった。このためこれら機能の実装が遅れている。その影響で、実験環境の基盤システム構築が遅延している。なお、ツールの開発は概ね予定通り進行している。UML図の自動採点機能および作成履歴データの自動収集機能の実装については、PlainUMLとそのWebUIに変更して対応する。実験環境の基盤システム構築の遅延については、30年度前期での授業での実験は既存環境を流用して実施し、後期での実現を目指す。予定していたツールのいくつか(UML図関係)の実装の遅れで、基盤システム構築に遅延が出ており、予定していたサーバ導入ができなかった。今期は、遅れを取り戻して基盤システム構築をおこなう。採択されたが掲載が次年度になる論文や、国際学会CSEdu2019での発表予定など、論文掲載・発表スケジュールにより次年度に執行が回されたものがあるため次年度使用額が生じた。これらは既に使途が決まっているため、逐次執行していく。
海洋生物由来の新しい医薬素材の開発

海洋という特異な環境に生息し、適応するため、海洋生物はその進化の過程において、陸上生物とは異なる代謝系あるいは生態防御系を発展させてきたと考えられ、海洋生物が産生する二次代謝産物から、陸上生物由来の天然物質には見られない様な新しい骨格を有し、特異でかつ強力な生物活性を示すこれまでにない画期的な医薬あるいはそのリ-ド化合物が開発される可能性がきわめて大きい。豊富な未利用資源である海洋生物から、先導的医薬素材を探索し、新しい医薬開発への方途を探って、人類の健康と福祉に貢献するのが本研究の目的である。このような目的を遂行するため、現在、薬学、医学、理学、農学水産の各分野において独自に第一線で活躍している研究者20名を集約し、総合研究B「海洋生物由来の新しい医薬素材の開発」研究班を組織した。本研究班は、1)生物活性海洋天然物質の探索、2)海洋トキシコロジ-とファ-マコロジ-、3)海洋リ-ド化合物の化学合成、4)有用海洋細菌、微細藻類のバイオテクノロジ-、の4つの小グル-プに分類されている。そして、小グル-ブ内での会合、文書連絡および1989年9月と1990年1月に開催した全体会議において、活発な討論が行われ、班員間の有機的連携を深めた。その過程で、海洋医薬素材の化学的研究の発展を計ることの重要性がさらに強調された。また、1990年1月には公開シンポジウムを開催シ、班員による研究成果の公表と幅広い意見交換が行なわれた。その結果、先導的医薬素材の探索と開発を基盤とした海洋医薬素材の化学的研究を強く推進せねばならないとの結論に達し、本研究領域をさらに発展させて重点領域研究として申請するに至った。
膜輸送体ABCトランスポーターによる概日リズム制御機構の行動分子遺伝学的解析

昨年度までの研究により、E23の輸送物質を得ることができていた。その物質とはが昆虫ホルモンであり、脱皮変態を誘導することで良く知られているエクダイソンである。本年度では我々が確立した培養細胞でのアッセイ系により、エクダイソンは時計遺伝子vrilleとE23自身の発現を制御していることが明らかにできた。次にE23の発現領域を調べるために抗体作製を行った。得られた抗体による染色結果は思わしくなかったため、E23のプロモーターgal4系統の作製を行った。この系統ではE23の発現組織でgal4が発現するため、例えばUAS-GFP系統と交配することでショウジョウバエの脳内でのE23の発現部位を確認できる。その結果、E23は第3イントロン領域で制御されており、発現領域は脳内の時計細胞、特にその中でも最も上流に位置すると考えられているペースメーカーニューロンで発現していることが明らかとなった。つまりこれらの結果から、E23の制御因子はエクダイソンおよびCLK/CYCである可能性を示唆することができた。これまで得られた全ての結果全てを以下にまとめる。時計遺伝子のvrilleはCLK/CYCだけではなく、昆虫ホルモンであるエクダイソンによっても発現の制御を受けていることが分かった。また、E23も同様の制御を時計細胞内で受けている。一方で、発現したE23はエクダイソンを細胞外へ排出する機能を備えているため、自分自身およびvrilleの転写を負に制御している。これにより、今までの報告されていた概日リズムの制御がCLK/CYCによる転写・翻訳によるフィードバックだけではなく、それがホルモンによっても制御を受けるうえ、膜タンパク質E23がそのホルモンの細胞内量を変化させることでより安定なフィードバックループを形成している可能性を示唆することができた。本研究はショウジョウバエを用いて、膜タンパク質ABCトランスポーターによる概日リズム制御機構の解明を目指している。ABCトランスポーターをコードする遺伝子はショウジョウバエのゲノム上に56個あると予測されている。GAL4/UASシステムを用いた時計細胞特異的なRNAiスクリーニングにより、ABCトランスポーターの一つであるE23が概日リズムに関与していることを突き止めた。E23はその構造上から、他のABCトランスポーターと複合体を形成して機能する可能性があるため、まずE23以外のABCトランスポーターに対して網羅的なRNAiスクリーニングを行った。その結果、遺伝子発現のノックダウンが概日周期に強い効果を及ぼす3遺伝子座を同定した。これらとE23の関係性については現在解析中である。さらに、E23が既知の時計遺伝子発現に対しどのように影響を与えているかを検討するために、E23ノックダウン系統を用いて既知の時計遺伝子に対する定量PCRを行った。その結果、E23はある特定の時計遺伝子の発現協影響を与えている可能性が示唆されだ。培養細胞を用いたアッセイによっても同様の示唆が得られた。また、E23はショウジョウバエでの発現組織が報告されていない。そのため発現組織の同定をめざし、E23のプロモーターga14系統を確立した。この系統では、E23の発現組織でga14が発現されるため、例えばUAS-GFPと交配することで、E23の発現組織をin vivoで同定することができる。さらにこれと同時に、E23のドミナントネガティブ系統も確立することもできた。これによりE23がどのように概日リズムに関与するのかの分子メカニズムを検討できる準備が整った。来年度以降で、より具体的なメカニズムの解明を目指す。本研究はショウジョウバエを用いて、膜タンパク質ABCトランスポーター、特にその一つであるE23による概日リズム制御機構の解明を目指している。まずE23はその構造上から他のABCトランスポーターと複合体を形成して機能する可能性があり、21年度までに遺伝子発現のノックダウンが概日周期に強い効果を及ぼす3つの遺伝子を同定していた。22年度はこれらとE23の関係性について膜タンパクのtwo-hybrid法であるsplit-ubiquitin法をショウジョウバエの培養細胞系で実施できる実験系の開発を行った。確立した方法を用いて、候補分子に関してE23との結合および相互での結合を検定した。その結果、どの因子もE23と直接に結合していることを示唆する結果は得られなかった。一方で、E23どうしの結合は検出されたため、E23はホモダイマーで機能している可能性が最も高いと判断した。3つの候補因子については、E23と間接的に相互作用する可能性、および、E23とは全く別の経路で概日時計に影響する可能性の両面から今後も解析を続ける予定である。次に、概日時計機構にどのようにしてE23が影響するかを調べることを目的とし、E23による輸送物質の同定を目指した。21年度の段階で候補物質と時計遺伝子への関しては、培養細胞でのアッセイ系により大まかには把握できていたため、22年度はまずこの物質の代謝経路に関与する遺伝子群をRNAiでノックダウンしリズムを測定した。その結果いくつかの系統で周期の長周期化、無周期化が確認できた。次に培養細胞でのアッセイ系を用いてE23が候補物質量を調節しているかを検討した。結果、E23はその物質を細胞から排出している可能性が得られた。つまりE23はその物質量をコントロールすることで、特定の時計遺伝子の発現を負に制御する可能性が示唆された。最後にE23の発現組織の同定を目指し、現在組織染色を行っている。これに関しては23年度以降の課題として残っている。

昨年度までの研究により、E23の輸送物質を得ることができていた。その物質とはが昆虫ホルモンであり、脱皮変態を誘導することで良く知られているエクダイソンである。本年度では我々が確立した培養細胞でのアッセイ系により、エクダイソンは時計遺伝子vrilleとE23自身の発現を制御していることが明らかにできた。次にE23の発現領域を調べるために抗体作製を行った。得られた抗体による染色結果は思わしくなかったため、E23のプロモーターgal4系統の作製を行った。この系統ではE23の発現組織でgal4が発現するため、例えばUAS-GFP系統と交配することでショウジョウバエの脳内でのE23の発現部位を確認できる。その結果、E23は第3イントロン領域で制御されており、発現領域は脳内の時計細胞、特にその中でも最も上流に位置すると考えられているペースメーカーニューロンで発現していることが明らかとなった。つまりこれらの結果から、E23の制御因子はエクダイソンおよびCLK/CYCである可能性を示唆することができた。これまで得られた全ての結果全てを以下にまとめる。時計遺伝子のvrilleはCLK/CYCだけではなく、昆虫ホルモンであるエクダイソンによっても発現の制御を受けていることが分かった。また、E23も同様の制御を時計細胞内で受けている。一方で、発現したE23はエクダイソンを細胞外へ排出する機能を備えているため、自分自身およびvrilleの転写を負に制御している。これにより、今までの報告されていた概日リズムの制御がCLK/CYCによる転写・翻訳によるフィードバックだけではなく、それがホルモンによっても制御を受けるうえ、膜タンパク質E23がそのホルモンの細胞内量を変化させることでより安定なフィードバックループを形成している可能性を示唆することができた。
反応活性種としての有機スズ化合物試薬の開発

我々は炭素-スズ結合の潜在的なカルボアニオン性に着目し、今までに幾つかの新反応を開発してきた。本年度はその一環として新らたに光学活性な3員環化合物および4級炭素化合物の構築に応用したので報告する。1光学活性3員環化合物の合成シクロプロパン誘導体は3炭素のbuilding blockとして、また多くの天然物中の基本骨格として重要であり、そのため種々の合成法が知られている。我々は有機スズ化合物を用いて新たに合成法を確立した。α,β-エノンにMe_3SnLiを作用させ、次いでアルデヒドを反応させると、β-スタンニル-β-ヒドロキシケトンが得られる。このものに塩化メタンスルホン酸(MsCl)を作用させると、水酸基が活性化されシクロプロパン体を生成する。すなわち本反応は[2+1]型付加反応による3員環形成で、アルデヒド炭素を3員環の構成要素として用いる点が特徴的である。そこでα-位に不斉中心をもつアルデヒドを用いて光学活性な3員環化合物の合成を検討した。メチルビニルケトンにMe_3SnLiを作用させた後、バリンから合成した(S)-α-ヒドロキシアルデヒド誘導体を反応させるとアルドール体が得られる。このアルドールは3個の不斉炭素を有するため、4種のジアステレオマ-生成が考えられるが、実際には2種類しか得られない。これらをそれぞれ3員環化合物に誘導した後、塩基で処理すると一方のみの立体異性体になる。これを既知物質へ誘導し、その旋光度を比較することにより立体化学を決定した。これによりアルデヒドの不斉源を完全に3員環に誘導することが出来ることが示された。2光学活性4級炭素の構築我々は以前、γ-位に脱離基(塩素)を有するアリルスタンナンはルイス酸存在下アルデヒドと反応させることにより、形式的にアルデヒドのC-C結合にアリルユニットが挿入した生成物が得られることを報告した。今回これを不斉4級炭素構築に応用する目的で画不斉化合物を利用することを計画した。種々の条件下での反応を検討した結果、Yb(OTf)_3を用いたときに最高の収率とジアステレオ選択性が得られた。現在予備的な実験でこのクロム錯体を光学分割し、それぞれから得られる不斉生成物の立体化学との関連性を検討中である。
ミクロポーラス及びメソポーラス材料の環境調和型触媒への応用

2003年11月5日から2005年11月4日まで外国人特別研究員として当研究室に在籍し、ミクロポーラス材料の合成及び触媒反応への応用に関する研究を従事してきた。以下今年度に行った研究概要を記す。1)新規ゼオライトITQ-21の合成条件の検討とその酸化触媒能の発見シリカとゲルマニウム酸化物を骨格構成要素とするITQ-21の合成に取り組み、その形成条件を明らかにした。この過程で、テンプレートの除去に際し、360°C付近で大きな発熱が生じ、骨格が破壊される現象を発見した。このことは、ゲルマニウムによる有機物の酸化反応と考えられたので、各種酸化反応の検討を行った。その結果、300°Cから400°Cにおいてメタンの酸化反応が起こることを見いだした。この様にゲルマニウムが酸化能を有することはこれまで、知られていない現象である。なお、シリカのみのベータゼオライト及びITQ-21と同様に、シリカとゲルマニウム酸化物を骨格構成要素とするITQ-17ではそのような活性が認められなかった。これらのゼオライトではゲルマニウム原子のコンフィギュレーションが異なることが知られており、ITQ-21のように空孔内がゲルマニウムであることが、原因の一つであると考えられるが、現在さらに詳しい検討を行っている。結果がまとまった段階でNatureへの投稿を考えている。2)ZSM-12ゼオライト触媒によるビフェニルの形状選択的エチル化これまで検討してきたビフェニルのエチル化における経時変化の検討を行った。外表面酸点の多いZSM-12Sは高い活性を有するが4,4'-ジエチルビフエニル(4,4'-DEBP)の選択率が低く、また、急速な活性劣化が起こった。一方、脱アルミニウムにより表面酸点を除去したZSM-12Eは、活性は低かったが、4,4'-DEBPの選択率は40-60%に達し、また、活性劣化が少なかった。このことより、ZSM-12細孔はビフェニルのエチル化に形状選択能を有するが、選択性を高くするのは外表面酸点の関与を防止する必要のあることが判明した。
血清アルドステロン高値は高血圧や心肥大の危険因子であるか?

アルドステロンは、Na再吸収と水分貯留を来たすことより血圧を上昇させる。また、その作用は腎臓だけでなく、血管系や心筋組織に直接作用してリモデリングを惹起し、種々の臓器障害にも関与していることが明らかにされている。我々は、世界7力国共同研究の一環として昭和33年より福岡県田主丸町において経年的に一般住民検診を行ってきた。更に平成14年より長崎県宇久町で一般住民検診を毎年行っており、平成18年度も住民検診を行った。40歳以上の男女を対象として、身体変量および血圧測定、空腹時採血、心電図、心・頚動脈エコー等を施行した。327名分(男性122名、女性205名)のデータを入力し、。血清アルドステロン値と臓器障害の指標とする変数との関連を、単、多変量解析を用いて検討した。血清アルドステロンの平均値は男性が7.8±3.3mg/dl、女性が7.2±3.6mg/dlで、年齢と強い負の関連を示し、年齢が若いほど高値を示した。単相関で、収縮期および拡張期血圧、左室肥大、左室重量係数、頚動脈内膜中膜厚、クレアチニンクリアランスにおいて血清アルドステロン値と相関を認めなかった。年齢および性で補正後の多変量解析においては、ウエスト径(pく0.05)、総コレステロ・一ル値(p<0.05)および尿酸値(p<0.05)と正の関連が認められた。健常者の一般住民を対象とした疫学的研究では、アルドステロン値と心・腎・血管などの臓器障害との関連は認められなかった。ただ、ウエスト径、総コレステロール値および尿酸値との正の関連より、何らかの冠危険因子の意義を持つ可能性が示唆された。今後も検診を行い症例数を増やし、予後調査を含めた解析も行い、血清アルドステロン値と心血管病を始めとする臓器障害との関係を解明する。更に心・血管病患者の血清を500例目標として保存し、疾患別にアルドステロンと臓器障害との関係を解明する予定である。私どもは、世界7カ国共同研究の一環として昭和33年(1958年)より40年以上にわたり福岡県田主丸町において経年的に一般住民検診を行ってきた。また、平成14年より長崎県宇久町で一般住民検診を毎年行っており、平成16年度にアルドステロンを約200名に測定した。アルドステロンは、左室および血管リモデリングと密接な関連があると言われており、血管・心筋繊維症などとの関連が示唆されている。しかしながら、本邦では、血清アルドステロンに関する疫学的データがないため、その分布、男女差などの基本的特性もわかっていない。従って本研究では、まず多人数のデータを用いてこの点を明らかにすることから始めなければならない。もし、アルドステロンが血管内皮機能障害の指標となるのなら、健常者のデータを基に、ある値以上の異常値を示すものに対して、高血圧、心肥大などの予防策を講じることが可能になる。さらに、早めにアルドステロン拮抗薬を用いた治療を開始する閾値を知ることができれば、今後の診断、治療に大いに貢献することができ、研究はさらに発展していくと考えられる。アルドステロンにおける基礎的な疫学的検討から治療、創薬に至るまで総合的に探求することが本研究の目的である。平成17年度も7月下旬に長崎県宇久町で年一回の住民検診を行った。40歳以上の男女を対象として約200名の住民が受診し、検診内容は身体測定、栄養調査、血圧測定、血液検査(血計・一般生化学検査のほか糖・脂質代謝・高感度CRP、fibrinogen、Plasminogen activator inhibitor-1 [PAI-1]、アルドステロンなど)、心電図、心・頚動脈エコーなどの検査を施行した。全てのデータを入力し、肥満度・総皮脂厚といった身体変量、糖・脂質代謝、fibrinogen・PAI-1といった血栓マーカー、心エコー図における左室壁厚とアルドステロン値との関連を解析する予定である。また、急性心筋梗塞や心不全、高血圧といった疾患と血清アルドステロン値との関連に関しても、現在血清を収集、保存中であり、次年度に測定、解析を行う予定である。

単相関で、収縮期および拡張期血圧、左室肥大、左室重量係数、頚動脈内膜中膜厚、クレアチニンクリアランスにおいて血清アルドステロン値と相関を認めなかった。年齢および性で補正後の多変量解析においては、ウエスト径(pく0.05)、総コレステロ・一ル値(p<0.05)および尿酸値(p<0.05)と正の関連が認められた。健常者の一般住民を対象とした疫学的研究では、アルドステロン値と心・腎・血管などの臓器障害との関連は認められなかった。ただ、ウエスト径、総コレステロール値および尿酸値との正の関連より、何らかの冠危険因子の意義を持つ可能性が示唆された。今後も検診を行い症例数を増やし、予後調査を含めた解析も行い、血清アルドステロン値と心血管病を始めとする臓器障害との関係を解明する。更に心・血管病患者の血清を500例目標として保存し、疾患別にアルドステロンと臓器障害との関係を解明する予定である。
西太平洋-インド洋熱帯海域における季節内変動シグナルの解明

本研究における第1の成果として、太平洋赤道海域(8°N-8°S)に展開する定点観測ブイデータを用いた同海域上層海洋における季節内変動シグナルの記述があげられる。表層海流および水温の可能な限りの時系列データに対する解析によって、季節内変動の卓越深度・海域および卓越時期・持続期間などに注目し、シグナルの時空間特性を明らかにした。その結果、20世紀最大規模であった1997-98年エルニーニョ現象の発生期において発達した季節内変動のシグナルは、日付変更線付近を境に対照的な鉛直構造をもつこと、シグナルの発達がインド洋-西部太平洋海域上の海上風に卓越した季節内変動スケールの変動が重要な役割を果たすことが明らかとなった。これらの結果は、国内外での学会発表のほか、論文として米国学術雑誌に掲載された。第二の成果として、上述の上層海洋における季節内変動の発生要因と考えられるインド洋-西部太平洋海域上における海上風変動の特性があげられる。解析に用いた資料は、近年その実用化が急速に進んだ人工衛星散乱計データである。散乱計データを用いて対象海域における格子化データセットを作成後、季節内スケールに対応する周期帯における変動が抽出された時系列データに対して詳細な解析を行った。その結果、熱帯海域上における海上風の季節内変動は西太平洋およびインド洋上で変動の振幅が大きいこと、東西方向へ伝搬する傾向をもつといった空間特性が明らかになった。特に、1997-98年エルニーニョ現象の発生期に東方伝搬するシグナルが発達するという従来の研究で指摘された特性に加えて、エルニーニョ現象終息期には西方伝搬するシグナルが卓越するという注目すべき特性も明らかになった。以上の結果を学会等で発表したほか、本学の紀要へ論文として投稿し受理された。今年度行った作業の第一として、熱帯太平洋海域に展開する定点観測ブイデータから得られる表層海流・水温データの収集・編集処理を進めると共に、時系列解析を行い、季節内変動が卓越する深度・海域といった空間特性に加えて、卓越時期・持続期間といった時間特性を調べた。20世紀で最大規模と称された1997-98年エルニーニョ現象の発生・発達期に注目して解析を行った結果、上層海洋における季節内変動は、1996年末から97年前半のエルニーニョ発生期において顕著な卓越が見られると共に、西部から東部へ約2.6m/sの速度で東進するシグナルが明瞭に認められた。また、シグナルの鉛直構造を詳細に調べた結果、日付変更線付近を境に西部と東部で明らかな相違が認められ、西部においては季節内変動のシグナルが鉛直方向に急激に位相シフトする特性をもつことが明らかとなった。これは、同海域においてシグナルが海面を通して励起されることを意味しており、海上風変動による駆動の重要性が示唆された。上記の結果は、学会等で口頭発表を行うと共に、論文として学術誌に投稿済みである。第二の作業として、西部海域における海上風変動の解析を開始している。資料として、近年有効な資料の供給が可能になった人工衛星散乱計データを用いている。以前より実施してきた格子データの作成を継続し、まず赤道付近において係留ブイ観測による現場観測データとの比較による精度検証を行った。次に、対象海域における季節内変動シグナルの抽出を行い、変動の時間・空間特性の解析を行った。その結果、注目する期間において西部太平洋における季節内変動の発達が明らかとなったが、インド洋上における卓越も顕著であることが見出された。次年度は、太平洋-インド洋における同シグナルの発達過程について解析を進める予定である。

前年度からの継続作業として、太平洋赤道海域(8°N-8°S)に展開する定点観測ブイデータから得られる表層海流・水温データの収集・編集処理を行った後、季節内変動の卓越深度・海域および卓越時期・持続期間に注目した時系列解析によって、シグナルの時空間的な特性を調べた。その結果、20世紀最大規模であった1997-98年エルニーニョ現象の発生期において発達した季節内変動のシグナルは、日付変更線付近を境に対照的な鉛直構造をもつこと、シグナルの発達がインド洋-西部太平洋海域上の海上風に卓越した季節内変動スケールの変動が重要な役割を果たすことが明らかとなった。これらの結果は、国内外での学会発表のほか、論文として米国学術雑誌に掲載された。第二の作業として、上述の上層海洋における季節内変動の発生要因と考えられるインド洋-西部太平洋海域上における海上風変動の解析を進めた。用いた資料は、近年その実用化が急速に進んだ人工衛星散乱計データである。散乱計データを用いて対象海域における格子化データセットを作成後、季節内スケールに対応する周期帯における変動が抽出された時系列データに対して詳細な解析を行った。その結果、熱帯海域上における海上風の季節内変動は西太平洋およびインド洋上で変動の振幅が大きいこと、東西方向へ伝搬する傾向をもつといった空間特性が明らかになった。特に、1997-98年エルニーニョ現象の発生期に東方伝搬するシグナルが発達するという従来の研究で指摘された特性に加えて、エルニーニョ現象終息期には西方伝搬するシグナルが卓越するという注目すべき特性も明らかになった。以上の結果を学会等で発表したほか、本学の紀要へ論文として投稿し受理された段階である。
母体の甲状腺ホルモン阻害と次世代脳神経発達障害-fMRIによる脳機能診断への展開

甲状腺ホルモンを阻害されたラットは、行動を抑制できず、衝動的な傾向が観察された。新たなターゲットに、すばやく注意を切り替えることもできない。音刺激に対する閾値が上昇している可能性がある一方で、音に対する驚愕反射が増大しパニック傾向が見られた。空間的な位置関係に関する作業記憶の形成に、障害が見られた。海馬、脳の体積が縮小したが、海馬/脳の体積比には影響がなかった。PCBやダイオキシンは甲状腺ホルモンを撹乱し,脳の分化・発達を阻害する.このことから,ADHDなどの発達障害の一因ではないかと考えられている.そこで妊娠ラットに甲状腺ホルモン阻害剤メチマゾールを投与し,生まれた仔ラットの衝動性をオペラント条件付けのDRL20秒強化スケジュールで,注意能力をプレパルス・インヒビション(PPI)テストで検討した.さらにMRIを用いて脳と海馬の容量を測定した。実験の結果,甲状腺ホルモン阻害ラットは,(1)20秒間待って反応することを学習しなかった。このことから,行動を抑制する能力が低下していたと考えられる。これはADHDに見られる衝動性(行動を抑えられない、我慢できない)と類似した行動障害といえる。(2)プレパルスが75dBではPPIは生じなかった。しかしプレパルスが85dBと95dBの時はPPIが生じた。したがって,甲状腺ホルモン阻害によって注意障害は起こらないといえる。感覚入力系の障害(例えば,聴覚ニューロンの興奮閾値が上昇した)のため,75dBではPPIが起こらなかったと考えられる。(3)甲状腺ホルモン阻害ラットは驚愕刺激に対して過剰な反応を示した.これはパニック障害を起こしやすくなっていることを示している。(4)脳と海馬の容量が減少した。体重も減少したことから,甲状腺ホルモン阻害によって成長遅滞が起こったと考えられる。しかし脳や海馬に気質的な損傷は認められなかった。周産期に甲状腺ホルモン(TH)を阻害されると、次世代にどのような脳神経発達障害が生じるのか検討した。TH阻害剤メチマゾール(MMI)を飲料水に混入、妊娠ラットに投与した。濃度は、0(C), 0.002(L), 0.01(M), 0.02(H)%、投与期間はGD15PD21。指標として、(1)20秒間反応を抑制するとエサが与えられるDRL20、(2)ターゲットが提示された直後に反応するとエサが与えられるTD、(3)聴性驚愕刺激(P)の直前に小さな音(PP)を提示すると、驚愕反射が抑制される. PPI、(4)水迷路による空間記憶の訓練、を行った。TH阻害に対して脆弱な海馬、および脳全体の体積をMRIで測定した。1, DRL20 : TH阻害群は、20秒間反応を抑制できる。しかしエサを獲得できなかった後にバースト反応(短時間に反応を連発)が増加。オスに顕著。衝動性の高まりを示唆。2, TD :試行間間隔が短く、新しい試行がすぐに始まる場合にH群の正反応率が低下。すばやく注意を切り替えることができない。試行間間隔が長い場合には、正反応率に差なく、持続的注意には影響しない。H群は固執反応(反応連発)が多く、行動抑制に障害。3, PPI : Pによる驚愕反射は、MMI量に依存して増大。パニック傾向がある。この過剰反応は、PD1年日でも消失せず。PPが75dBのとき、H群はPPIが低下。しかしPPが85と95dBで億影響なし。聴覚障害の可能性がある。4,水迷路:参照記憶のテストでは、H群も空間記憶を形成。しかし逃避台にたどり着くまでの反応時間が長い。多動性のため、不必要に泳ぎまわった可能性がある。作業記憶のテストでは、H群の正答率が低い。作業記憶の障害を示唆。5, H群は海馬、脳の体積がC群より縮小。しかし海馬/脳の体積比には差なし
微小電流刺激と骨形成因子を応用したインプラント周囲骨増生法の開発

本研究では、微小電流刺激による骨形成能の活性化と、その骨形成能をさらに上昇させる目的で、骨形成因子などの生理活性物質の応用を試みた。ビーグル犬を用いたin vivoの実験を平成25年度より開始したが、実験動物施設の改修工事が始まったため、実験系をin vitroへ移行した。平成26年度では本研究課題でもう1つの開発の柱としていた骨形成能を有し骨膜下に挿入する骨増生シートの調製を行った。基材としてポリロタキサンという高分子に着目し、これに硫酸基を付与して骨形成性cell lineであるMC3T3E1細胞に投与したところ、その細胞の骨形成活性を有意に上昇させることが判明した。咬合や咀嚼機能回復のためのデンタルインプラントは近年その需要が高まりつつあるが、歯槽骨の条件が悪い場合には骨移植を前処置として行うなど、現状では二次的な手術が必要となり、患者にもその手術侵襲が負担になっている。そこで本研究では、微小電流刺激による骨形成能の活性化に着目し、インプラントを電極とする微小電流刺激実験を計画した。また、微小電流刺激による骨形成能をさらに活性化する目的で、骨形成因子等の生理活性物質を応用することも視野に入れ、最終的には人体応用への実用化を目指している。本法が実用化されれば、インプラント植立のために他部位から移植骨を採取する必要性は排除され、かつ1回の手術のみでインプラント周囲に骨増生がなされることから、患者の身体的負担をより軽減し、しかも確実なインプラント埋入が可能となる。平成24年度は実験実施のための手続きに時間を取られたため、実質的な実験の進捗が得られなかった。倫理審査や動物実験施設講習を経て、ようやく平成25年度に入ってからビーグル犬を2頭購入し、実際に大臼歯部を抜歯し、抜歯窩が治癒した後の歯槽骨にマイオモニターの電極を応用した微小電流刺激を加える動物実験を実施した。しかし、平成25年度7月末より動物実験施設の改修工事が始まってしまったため、年度内に実施できた動物実験はこの2頭のビーグル犬のみで、微小電流刺激の骨形成に与える影響を確認する前の段階で実験を中断せざるを得なかった。よって、今年度も実験の進捗が遅れたことは否めない。その代りに、本研究計画のもう一つの柱である、骨増生シート開発のための準備実験に着手した。したがって、平成25年度の後半では、実験系を動物実験ではなく主にin vitroの細胞培養実験に移し、これに新規高分子生体材料と骨形成因子をコンバインさせた材料を応用した実験の成果が少しずつ挙がってきている状況である。咬合や咀嚼機能回復のためのデンタルインプラントは近年その需要が高まりつつあるが、歯槽骨の条件が悪い場合には骨移植を前処置として行うなど、現状では二期的な手術が必要となり、患者にも負担になっている。本法が実用化されれば、インプラント植立のために他部位から移植骨を採取する必要性は排除され、かつ一回の手術のみでインプラント周囲に骨増生がなされることから、患者の身体的負担をより軽減したインプラント埋入が可能となる。平成24年度の前半ではイヌの下顎骨に対するインプラント埋入実験系を確立し、年度内にイヌにおける至適微小電流刺激の条件を検討、確立する予定であった。しかし、研究代表者の異動により本研究の申請書を提出した時と研究施設が変わったため、実験動物施設利用講習や実験に関する倫理審査を改めて受け、かつ、実験実施のための学内各種手続きや許可を経なければ実験が行えなかったため、実験の開始が平成25年に入ってからになってしまった。現在、イヌの実験系を確立している途中で、全身麻酔下に臼歯を抜歯し、同抜歯窩の治癒を待って、微小電流刺激のための電極として使用するスクリュウをまさにその顎堤に埋入しようとしているところである。咬合や咀嚼機能回復のためのデンタルインプラントは近年その需要が高まりつつあるが、歯槽骨の条件が悪い場合には骨移植を前処置として行う必要があるなど、現状では二次的な手術となり、患者にもその手術侵襲が負担となっている。そこで、本研究では、微小電流刺激による骨形成能の活性化に着目し、インプラントを電極とする微小電流刺激実験を計画した。また、微小電流刺激による骨形成能をさらに活性化する目的で、骨形成因子などの生理活性物質を応用することも視野に入れ、最終的には人体応用への実用化を目指している。

本法が実用化されれば、インプラント植立のために他部位から移植骨を採取する必要性が排除され、かつ1回の手術のみでインプラント周囲に骨増生がなされることから、患者の身体的負担をより軽減し、しかも確実なインプラント埋入が達成可能となる。本研究では、ビーグル犬を用いたin vivoの実験を平成25年度よりようやく開始したが、平成25年度に入ってまもなく実験動物施設の改修工事が始まり、実験系をin vivoではなく、in vitroへ移行せざるを得なくなった。そこで、平成26年度では本研究課題でもう1つの開発の柱としていた骨形成能を有し骨膜下に挿入する骨増生シートの作成実験を行った。基材としては、骨形成因子の担体として適切で、かつ骨形成因子の放出時期を調節可能な、つまり骨形成因子の徐放の程度を調節可能なポリロタキサンという高分子に着目した。さらに、これに硫酸基を付与して骨形成性cell lineであるMC3T3E1細胞に投与すると、その細胞の骨形成活性を有意に上昇させることが可能となることが判明した。本研究成果はすでに第65回日本歯科理工学会で発表し、2015年のMacromolecular Bioscienceという学術雑誌に論文掲載が予定されているほか、平成27年中に国際学会での発表も2回予定されている。外科系歯学、口腔外科動物実験施設の改修工事の影響で、本来本研究の研究計画に記載したビーグル犬を用いた動物実験は大幅に遅れてしまっている。しかし、本研究計画のもう一つの柱である骨増生シート開発のための準備実験に着手した。つまり、高分子生体材料に骨形成因子をコンバインさせ、骨増生に応用するための骨増生シート調製のためのin vitro細胞培養実験を行った。現在、シートの基材となる高分子生体材料の、骨形成性細胞に対する毒性の有無を検証中で、昨今、本材料がむしろ骨形成性細胞の骨形成能を低下させないどころか、むしろ増加させ得る可能性がある成果が得られている。本研究では骨膜下に挿入するための骨増生シートをちょうせい調製することも研究の目的としているため、動物実験は遅れてしまっているが、骨増生シート作製の準備状況に入ることができたという観点から、総合的に見た場合の本研究計画の進捗は「遅れている」ではなく、「やや遅れている」と自己評価した。研究代表者の施設異動に伴い、実験実施のための講習会受講や倫理審査の申請許可など、実験実施のための手続きを改めて多数受けなければ実験が行えなかったため、実際にイヌを使用しての動物実験の開始は平成25年の1月、つまり平成24年度の終盤になってしまった。現在イヌの臼歯の抜歯処置までは終了しているので、抜歯窩の治癒を待って微小電流刺激の電極用のスクリューを抜歯後の顎堤に植立しようとしているところである。さらに、本学の動物実験施設は平成25年8月より8か月間は改修工事が入るため、動物実験が実施できなくなる。そのために平成25年度も動物実験に関しては実施が予定よりもさらに大幅に遅れることは必定である。平成26年度に入って、動物実験施設使用の準備状況は整ってきてはいるが、当初は新施設使用のための再講習や利用手続きをもう一度踏む必要がある。したがって、研究という観点から本研究計画をより成果あるものに結び付けるためには、動物実験施設が改修のために閉鎖していた期間に進めてきたin vitroの実験を継続することが肝要と考える。
エリスロポエチン遺伝子発現調節機構:遺伝子治療への応用

ヒトErythropoietin (Epo)遺伝子のプロモーター領域に存在するGATA配列に、GATAが結合してEpo遺伝子発現を負に制御している。また、エンハンサー領域にHIF-1が結合してEpo遺伝子発現を促進している。この事実のもとに以下の研究結果を得た。2)この系にL-arginineを前処理することでL-NMMAによるNO・cGMP産生の抑制は解除される。これによりGATA結合活性・mRNA発現レベルは低下して、L-NMMAによるEpo産生抑制が解除され、腎性貧血の新規治療法となることを報告した(Kidney International.61:396-404,2002)4)カドミウムによるEpo産生抑制の機序は、HIF-1結合活性の低下によるためであり、GATAの関与は認めなかった(分子細胞治療12vol1(6)2-8,2000)5)マウスEpo遺伝子のプロモーターは解明されていなかったが、ヒトEpo同様にプロモーター領域のGATA配列にGATAが結合してマウスEpo遺伝子発現を抑制していることを認め報告した(医学のあゆみ198:731-732,2001)6)睡眠時無呼吸症候群の重症例を用い、一過性の低酸素刺激による生体のEPO・VEGF反応を解析した結果、重症化するにつれHbが増加するとともにVEGFは約5倍増加したが、Epoは1.6倍と低く一過性の低酸素刺激による反応様式の相違を認め報告した(Blood.98:1255-1257,2001,Blood.99:393-394,2002)Epo遺伝子の発現に関わるkidney inducible element(KIE)を解明する目的で、YACを用いたトランスジェニックマウスでの解析により、Epo発現細胞は腎臓のinterstitial cellであり、KIEは-22Kbpから-8Kbp上流域に存在することを確認した(In preparation)。ヒトErythropoietin(Epo)遺伝子のプロモーター領域に存在するGATA配列にGATAが結合してEpo遺伝子発現を負に制御している。これによりGATA結合活性・mRNA発現レベルは低下して、L-NMMAによるEpo産生抑制が解除され、腎性貧血の新規治療法となることを報告した(Kidney International. 61 : 396-404,2002)4)カドミウムによるEpo産生抑制の機序は、HIF-1結合活性の低下によるためであり、GATAの関与は認めなかった(分子細胞治療12 vol1(6)2-8,2000)5)マウスEpo遺伝子のプロモーターは解明されていなかったが、ヒトEpo同様にプロモーター領域のGATA配列にGATAが結合してマウスEpo遺伝子発現を抑制していることを認め報告した(医学のあゆみ198 : 731-732,2001)6)睡眠時無呼吸症候群の重症例を用い、一過性の低酸素刺激による生体のEPO・VEGF反応を解析した結果、重症化するにつれHbが増加するとともにVEGFは約5倍増加したが、Epoは1.6倍と低く一過性の低酸素刺激による反応様式の相違を認め報告した(Blood.98 : 1255-1257,2001,Blood.99 : 393-394,2002)Epo遺伝子の発現に関わるkidney inducible elementを解明する目的で、現在トランスジェニックマウス作成のため準備中であるが、constructは完成しinjection中である。これによりGATA結合活性・mRNA発現レベルは低下して、L-NMMAによるEpo産生抑制が解除され、腎性貧血の新規治療法となることを報告した(Kidney International.61:396-404,2002)4)カドミウムによるEpo産生抑制の機序は、HIF-1結合活性の低下によるためであり、GATAの関与は認めなかった(分子細胞治療12vol1(6)2-8,2000)5)マウスEpo遺伝子のプロモーターは解明されていなかったが、ヒトEpo同様にプロモーター領域のGATA配列にGATAが結合してマウスEpo遺伝子発現を抑制していることを認め報告した(医学のあゆみ198:731-732,2001)6)睡眠時無呼吸症候群の重症例を用い、一過性の低酸素刺激による生体のEPO・VEGF反応を解析した結果、重症化するにつれHbが増加するとともにVEGFは約5倍増加したが、Epoは1.6倍と低く一過性の低酸素刺激による反応様式の相違を認め報告した(Blood.98:1255-1257,2001,Blood.99:393-394,2002)

Epo遺伝子の発現に関わるkidney inducible element(KIE)を解明する目的で、YACを用いたトランスジェニックマウスでの解析により、Epo発現細胞は腎臓のinterstitial cellであり、KIEは-22Kbpから-8Kbp上流域に存在することを確認した(In preparation)。
環境の変化に適応する柔軟なナビゲーション行動の神経機構

本研究の目的は,ルート知識の更新プロセスに関わる神経メカニズムを明らかにすることである.ラットを対象として,目的地点まで移動するナビゲーション行動を,環境の変化に応じて更新することを要求する状況を設定する.学習初期には環境内を探索する行動が出現するが,探索を通して目的地へ到達することを何度も繰り返すという学習の進行に伴って,しだいにラットが取るルートは最短ルートに最適化されていく.また,ルートが学習された後に,環境の構成を変更することで,環境の変化に対してルート選択を適応させていくプロセスについて検討する.本年度は,新たに開発した格子状迷路を用いた実験を実施した.この迷路では,エリア内に打たれた杭に壁となるプレートを差し込む形で走路を構成するようになっており,任意のルートを設定することができる.迷路の四隅に設置したボックスの一つをスタート地点,別の一つのボックスをゴール地点とし,ラットには,ゴールまでのナビゲーション課題を課した.ゴールボックス内には報酬となるペレットエサを置いた.実験の結果,ラットが速やかにゴールまでのナビゲーションを学習することが確認できた.これまでに用いていた迷路では,5×5の碁盤の目状の走路に壁を刺し入れることでルートを設定する形になっていたが,今回導入した新たな装置では10×10の走路が設定できるようになっており,より物理的には複雑になっていたが,設定したルートによっては,ラットはかなり早くルートの学習ができることが分かった.実験室自体の改修があったため,研究進捗としてはやや遅れている状況である.改修の完了後,速やかに実験を開始する予定である.実験室の改修後,速やかに実験を再開する.ラットに格子状迷路内の設定したルートを走らせるナビゲーション課題を学習させ,課題実施時のニューロン活動を記録・解析する.迷路の四隅に設置したボックスの一つをスタート地点とし,ラットには,それ以外の三つのボックスをゴールとして,そこまで行くことを要求する.迷路内の構成は日ごとに変更し,新たな空間構造の学習とナビゲーションの最適化に関わる神経メカニズムについて検討する予定である.本研究の目的は,ルート知識の更新プロセスに関わる神経メカニズムを明らかにすることである.ラットを対象として,目的地点まで移動するナビゲーション行動を,環境の変化に応じて更新することを要求する状況を設定する.学習初期には環境内を探索する行動が出現するが,探索を通して目的地へ到達することを何度も繰り返すという学習の進行に伴って,しだいにラットが取るルートは最短ルートに最適化されていく.また,ルートが学習された後に,環境の構成を変更することで,環境の変化に対してルート選択を適応させていくプロセスについて検討する.本年度は,新たに開発した格子状迷路を用いた実験を実施した.この迷路では,エリア内に打たれた杭に壁となるプレートを差し込む形で走路を構成するようになっており,任意のルートを設定することができる.迷路の四隅に設置したボックスの一つをスタート地点,別の一つのボックスをゴール地点とし,ラットには,ゴールまでのナビゲーション課題を課した.ゴールボックス内には報酬となるペレットエサを置いた.実験の結果,ラットが速やかにゴールまでのナビゲーションを学習することが確認できた.これまでに用いていた迷路では,5×5の碁盤の目状の走路に壁を刺し入れることでルートを設定する形になっていたが,今回導入した新たな装置では10×10の走路が設定できるようになっており,より物理的には複雑になっていたが,設定したルートによっては,ラットはかなり早くルートの学習ができることが分かった.実験室自体の改修があったため,研究進捗としてはやや遅れている状況である.改修の完了後,速やかに実験を開始する予定である.実験室の改修後,速やかに実験を再開する.ラットに格子状迷路内の設定したルートを走らせるナビゲーション課題を学習させ,課題実施時のニューロン活動を記録・解析する.迷路の四隅に設置したボックスの一つをスタート地点とし,ラットには,それ以外の三つのボックスをゴールとして,そこまで行くことを要求する.迷路内の構成は日ごとに変更し,新たな空間構造の学習とナビゲーションの最適化に関わる神経メカニズムについて検討する予定である.次年度使用額はほぼないといえる状況である.翌年度に消耗品費として使用する予定である.
シナプス小胞動態の多様性を基盤とした記憶メカニズムの解明

脳の興奮性伝達物質であるグルタミン酸の開口放出量と開口放出状態にあるシナプス小胞数は培養期間に応じて増大した。そして、1回の活動電位発火で伝達されるグルタミン酸の放出効率は培養初期では高かったが中期になると低下し、以後は一定値を示した。また、単位シナプス小胞当たりのグルタミン酸含量もしくは受け手側のAMPA受容体の感受性は培養初期から中期には変化を認めず、培養後期に増大した。加えて、シナプス数は培養初期から中期にかけて急増し、中期から後期は微増する傾向が掴めた。中枢神経ネットワークにおけるシナプス伝達の動作原理を解明することは記憶のメカニズムを知るための基盤研究として位置づけられる。平成19年度は以下の2項目について重点的に実験を行い、本研究課題の基盤を築いた。1、シナプス小胞の開口放出の活動依存性の解明自己にシナプスを形成する「オータプス培養細胞」を作製し、発達に伴うシナプス小胞動態の可塑的変化を6-7day in vitro(DIV)、13-14DIV、21-23DIVにおいてパッチクランプ法にて解析した。結果、活動電位発生に同期してシナプス小胞から開口放出されるグルタミン酸(Synchronous release)は発達と供に増加し、Readily releasable pool(RRP)サイズも増大することが明らかとなった。加えて、幼若期の6-7DIVではシナプス小胞からのグルタミン酸放出確率(Pvr)は非常に高く、発達とともにPvrは減少し13-14DIV以降は一定値を示した。上記培養標本にパッチクランプ法を適用し、6-7DIV、13-14DIV、21-23DIVにおいて活動電位の高頻度刺激(20Hz)によるグルタミン酸放出のキネティクスを電気生理学的および生物物理学的に解析した。高頻度刺激中のシナプス小胞からのグルタミン酸開口放出において放出確率の高いシナプス小胞(High Pvr pool)と低いシナプス小胞(Low Pvr pool)の割合を解析したところ、シナプスの発達とともにHigh Pvr poolとLow Pvr poo1のサイズは増大したものの、両者の割合に有意な発達変化は認められなかった。以上の結果より、シナプス小胞動態の多様性に発達要因は含まれないことが判明した。このことは20年度にシナプス伝達長期増強(LTP)モデルを作製する上で、発達要因を除外できる有用な結果である。自己にシナプスを形成する「オータプス培養細胞」を作製し、発達に伴うシナプス小胞動態の可塑的変化を6-7day in vitro(DIV)、13-14DIV、21-23DIVにおいてパッチクランプ法にて解析した。1、前年度は活動電位発生に同期してシナプス小胞から開口放出されたグルタミン酸(Synchronous release)によるEPSCは培養期間に応じて増加することを報告した。本年度は、より生理的な環境下で評価するために、自発的グルタミン酸放出によって惹起されるminiature EPSCを観察し解析を行った。結果、培養初期から培養中期にかけては有意な変化を認めず、培養後期に増大した。2、シナプスの発達はEPSCの大きさで定義できることが報告されている(Gekel & Neher, 2008)。これを基に、本研究で得られたEPSCamplitude(nA)とPvr(%)の相関関係をプロットした。興味深いことに、培養初期と培養後期では正の相関がみられたが、培養初期では負の相関が得られた。このことから、培養初期は従来の相関関係が得られないことが判明した。この原因については更なる実験が必要である。3、シナプス開口放出は細胞外Ca^<2+>感受性があり、Pvrも細胞外Ca^<2+>によって変化する。シナプスの発達によるPvrの低下にはPvr多様性分布は関係しなかったことから、発達により細胞外Ca^<2+>感受性が変化する可能性を考えた。実験は、細胞外Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]。)を0.5、1、2、4、8、10mMに設定し、各濃度におけるEPSC amplitude(nA)を計測した。結果、発達とともに細胞外Ca^<2+>に対する協同性(Cooperativity)は低下し、Hill係数は増加したことから、発達によるPvr低下はCa^<2+>感受性低下が原因ではなかった。本研究により、シナプスの発達に伴ってPvrが低下することは明確となったが、その原因となるメカニズムを明らかにすることはできなかった。