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有機汚濁が進む閉鎖性水域の水環境保全に向けたＬＥＤ水環境修復技術の実用化と高度化

ダム貯水池のような水深の深い閉鎖性水域では,寡少な水中光環境を要因とする長期的な無酸素化とこれに起因する水環境劣化が大きな問題となる.そこで,このような有機汚濁水域の水環境修復対策として,水中LEDを光源とする藻類の光合成の活性化を利用した水質改善技術の可能性について室内実験より検討した.本研究の成果は,長期的な無酸素期間が水質改善効果に及ぼす影響,ならびに植物プランクトンに加えて付着性藻や糸状藻の大型藻類が良好なDO環境の維持に与える影響について,照射光の光質・光強度と関連付けて定量的に評価したことに集約される.本研究の第一の目的である「無酸素化に伴う水環境劣化の原因メカニズムの究明」に関わる内容として室内実験,現地観測および数値計算を行った.まず,閉鎖性水域の有機汚濁問題の要因である嫌気的有機物分解に関する基礎的知見を得るための室内実験を行った.その結果,嫌気的条件下の酸化還元電位の低下や鉄還元に伴うリン酸イオンの増加は高濃度の溶存態有機物や底質の酸化状態の影響を顕著に受けることを明らかにした.また,有機汚濁化現象が顕在した貯水池の現地観測を通じて,嫌気的条件下での水質動態特性を定量的に評価し,この知見を踏まえて,嫌気的な微生物代謝を組み込んだ生態系モデルベースの鉛直一次元水質予測モデルを構築した.本モデルをLDE照射による水底近傍でのDO環境の改善効果に関するシナリオ分析を行い,底泥による酸素消費量,底質からの栄養塩溶出,栄養塩の拡散フラックスなどの観点から底質が改善効果に及ぼす影響に関する有益な知見を得た.つぎに,第二の研究目的である「水中LEDによる水環境修復技術の実用化」では,長期的な嫌気的状態がLED照射によるDO環境の改善効果に及ぼす影響を検討するために,無酸素期間が約1週間と約3か月間の2ケースに対してLED照射実験を行った.その結果,無酸素期間が長期化することで,植物プランクトンの光応答性の鈍化によってDO生産に要する期間が長くなること,さらに還元物質の濃度増大によってLED照射後の酸素消費が増える結果となり,無酸素化・貧酸素化解消にも時間を要することが明らかになった.また.無酸素化に伴う栄養塩の溶出によって,植物プランクトンの発生量が増え,貧酸素化解消後のDOの増加速度は大きくなるものの,その大量発生によって栄養塩の現存量が減少することで付着藻類の繁殖が抑制される結果,DOはピーク以降に減少する傾向が顕著であった.本研究で提案するLED照射による水環境改善システムの現地適用に向けた有益な知見を得るとともに,その改善効果の評価に欠かせない水質予測モデルを構築できた点で,計画以上の成果が得られた.まず,LED照射までの無酸素化継続時間の長期化によって,無酸素化の解消に至るまでの期間,無酸素化解消後のDOの増加過程,およびDOピーク後の改善効果の持続性,以上三つの観点で,水環境改善効果に与える影響が大きいことが明らかになった.この知見は,LEDによる水環境改善技術の現地適用をする上で極めて重要な研究成果である.本年度では,上記の研究成果に加え,光合成に関する最適光量子量を基準として,LED照射光の強度がDO改善効果に与える影響についても検討しており,この知見も本技術の実用化に向けて貴重な成果となる.さらに,無酸素化が長期化するような有機汚濁水域を対象に水質環境動態を良好に予測可能なモデルを構築できたことによって,無酸素化水域に本技術を適用した場合の改善効果を精度良く評価することが可能となった.以上から,今年度で得られた成果をもとに「有機汚濁が進む閉鎖性水域の水環境保全に向けたLED水環境修復技術の実用化と高度化」という本研究の目的が着実に達成されていることが判断される.28年度では,水中LEDによる水環境修復技術の実用化に向けた知見を得ることを目的として実験水槽を用いたLED照射実験を行い,下記の研究成果をえた.まず,無光・無酸素期間,照射光強度,大型藻類の三つの視点から,DOの生産・消費量に影響を及ぼす要因の定量的評価を目的とした円筒水槽内でのLED照射実験を行った.その結果,長期間の無光状態は藻類の光応答性を低下させることで無酸素化解消までの期間が長期化すること,長期にわたる無酸素化は,還元性物質の増大によるDO環境改善に要する時間の長期化,溶出による栄養塩の増大に伴う光合成速度の加速,強い還元的状態による大型藻類の増殖の制限とDO改善効果の低下に繋がることを見出した.また,室内実験で得た知見を基に,長期的な無光状態による藻類の光合成制限,嫌気的条件下で増加した還元性物質によるDO消費量の増大,植物プランクトンと大型藻類によるDO生産の視点から水質予測モデルを構築し,水中LED照射による水環境改善効果の定量的な評価手法を確立した.つぎに,コンテナボックスを利用したLED照射実験を通じて,DO生産者として,植物プランクトンに加えて付着性藻や糸状藻の大型藻類に着目し,これらの植物相がDOも含めた水質改善効果に与える影響を,照射光の光質・光強度と関連付けて検討した.

その結果,LED照射光の光質・光強度がDO改善効果に与える影響は,糸状藻の光合成速度に対する光制限因子として現れることが示された.最適光強度の条件では,糸状藻の発生が持続的なDO改善効果に繋がり,この光合成速度は赤・青波長域の光量子量に強く依存することを見出した.弱光強度条件では,糸状藻は発生せず無酸素化の解消には至らないものの,植物プランクトン・付着性藻のDO生産により,栄養塩の溶出や硫化物の発生に代表される水質悪化の現象は抑制されるという点でLED照射の効果が確認された.水中LEDによる水環境修復技術の実用化に向けて,無光・無酸素期間,照射光強度,大型藻類の視点からDOの生産・消費量に影響を及ぼす要因を定量的に評価できた点で有益な知見が得られた評価できる.とくに,長期間にわたる無光状態と無酸素状態によって生じうる,藻類の光応答性の鈍化,栄養塩の溶出,還元性物質の増大がDOの生産量と消費量に与える影響を定量的に評価できた点で,非常に大きな達成度を得た.さらに,長期的な無光状態による藻類の光合成制限,嫌気的条件下で増加した還元性物質によるDO消費量の増大,植物プランクトンならびに付着藻や糸状藻などの大型藻類によるDO生産の視点から生態系モデルを改良できたことは,水質予測モデルを通じて有機汚濁水域での水中LED照射による水環境の改善メカニズムの究明を可能にするものであり,これはLEDによる水環境改善技術の現地適用をする上で極めて重要な研究成果である.さらに,上記とは異なる視点から本研究の達成に向けた顕著な知見を二つ得た.一つ目は,植物プランクトンに加えて付着性藻や糸状藻の大型藻類がDOも含めた水質改善効果に与える影響について,照射光の光質・光強度と関連付けて検討することができたことであり,とくに糸状藻がDO環境の改善効果に与える影響を定量的に評価できたことは極めて重要な知見である.二つ目は,光合成有効光量子量の10分の一程度の弱光条件の場合,無酸素化解消には至らないものの,嫌気的条件に伴う栄養塩の溶出や硫化水素の発生が抑制されたという点で水環境の改善効果を見出して点は,本研究で提案するLED照射による水環境改善システムの現地適用に向けた有益な知見ともいえる.以上から,今年度で得られた成果をもとに「有機汚濁が進む閉鎖性水域の水環境保全に向けたLED水環境修復技術の実用化と高度化」という本研究の目的が着実に達成されていることが判断される.本年度では,長期的な無酸素化によって栄養塩溶や硫化物が増大するような劣悪な水環境に対する本技術の有効性を検討するためにLEDの光条件に着目した.まず光スペクトル条件として,赤色・青色波長域の光を含むRB条件とこれに緑色波長域を加えたRGB条件の2条件を設定した.また,光強度条件として,植物プランクトンの光合成に十分な有効光量子量で設定した最適光条件と,これの1/10程度の弱好条件を設定した.本年度では,DO改善効果に対して植物プランクトンの他に沈水植物の貢献が大きいことを考慮して,この発生量の測定が可能なために,ビーカースケールでのLED照射実験を行った.まず,最適光条件のもとでは,光スペクトル条件関わらず,LED照射開始と無酸素化解消にタイムラグが生じ,増加開始後のDOは点灯と消灯に応じた時間周期の定常状態で推移した.
中山間地域・離島における居住の継続を支える社会関係資本の実態把握調査

本研究では、新潟県の中山間地域を中心に、条件不利地域での居住の継続に必要な要素のうちソーシャル・キャピタルに焦点を当ててフィールドワークを行なった。対象は十日町地域、村上市三面地域であり、他に前回の基盤研究費Cから継続して観察を続けている村上市高根地区、上越市桑取地区についても蓄積を行なった。十日町地域では2000年来3年ごとに開催されいている「越後妻有大地の芸術祭」のソーシャル・キャピタルへの影響を質問紙調査によって捉えた。その結果は2014年6月に刊行予定の『アートは地域を変えたか』で公表する(慶應義塾大学出版会)。本年度は、新潟県十日町圏域でアートトリエンナーレ「第5回越後妻有大地の芸術祭」が行なわれるのに併せ、地域住民に対して質問紙調査を行なった。6年前にも行なっており、その時間的変化を見ることが目的である。2,000票を送付し、484部回収、回収率24.2%であった。単純集計は終えており、今後、6年前との変化や、検定等を行なって詳細な分析を行なう。次年度には、これらの結果を踏まえ、書籍出版する予定で、既に出版社に企画書を渡してある。また、前回の科研から継続して参与観察している、旧朝日村高根集落と上越市桑取地区については、本年度も訪問調査を続けた。高根集落については、高根中学校の卒業生名簿を借り受け、卒業後も住み続けた人、地区外へ転出した人、Uターンした人に、どのような傾向があるかを分析した。結果、性差・年代差が見られるのではないかという仮説を得た。今後、それが一般的なのか、高根特有なのかを他地区等のデータを使って分析する予定である。桑取地区については、桑取で活動するNPOについて、これまで当事者からのヒアリングを主に行なってきたが、本年度は、NPO以外の住民や関係者に対して、ヒアリングを行なった。今後、中と外でどのように評価が異なるか、あるいは同じであるかを分析していく。なお、佐渡については初年度に引き続き、島内の協力者の都合で手つかずであり、最終年度にどうするかを検討中である。研究代表者の所属する大学内の佐渡ブランチ等との連携も模索する。本研究では、新潟県の中山間地域を中心に、条件不利地域での居住の継続に必要な要素のうち、ソーシャルキャピタルに焦点を当ててフィールドワークを行なった。主たる成果は、十日町地域、村上市三面地区の2地域・地区である。また前回の基盤研究費Cから継続して観察を続けた村上市高根地区、上越市桑取地区についても蓄積を行なった。十日町地域については、2000年以来3年ごとに開催されるアート・トリエンナーレ、「越後妻有大地の芸術祭」が地域住民にどのような影響を与えたかを、大規模な質問紙調査によって、2006年開催時と2012年開催時の時系列比較を行なった。その成果の一端は、鷲見(2013)で発表したほか、2014年6月に刊行予定の『アートは地域を変えたか越後妻有大地の芸術祭の12年』(慶應義塾大学出版会)で公表する。概略としては以下の知見を得た。「大地の芸術祭に積極的に協力したほど、橋渡型ソーシャル・キャピタルの蓄積につながる変化を享受しており、大地の芸術祭が、中山間地域が抱える課題の解決に必要不可欠な素地をつくった意義は大きい。ただし、ソーシャル・キャピタルの増加は見られるが、そのことが地域の課題解決にはつながっていない。すなわち高齢過疎化の歯止めになっているとはいえないのである。」。村上市三面地区は、合併以前は、新潟県岩船郡朝日村奥三面集落であり、マタギの里と呼ばれ、宮本常一も言及するなど民俗学では知られる集落であった。本調査では、語り尽くされた感のある「山の暮らし」を再度取り上げようというのではなく、それらでは明らかにされていない事実と、31戸の集団移転から約30年を経て、住民意識や付き合いの変化などをインタビューにより調べた(澤村2014)。本年度は、ダム建設に伴い集団離村から30年を経た集落の、ソーシャル・キャピタルの変化についてのインタビュー調査と、大規模な地域芸術祭実施地域の意識調査のプレテストを行った。前者は、新潟県旧岩船郡朝日村三面集落である。新潟県と山形県の接する山地に位置し、「マタギの村」として知られ、ダム建設に伴い1980年に41戸中31戸が集団で村上市内に移転した。これまでは狩猟の風習民俗などは調べられてきたが、本研究では、山中の隔絶した集落におけるソーシャル・キャピタルが、平地に降りてきた場合にどのように変化するか、あるいは維持されるかを中心に調べた。後者は、新潟県十日町地域で3年に一度行なわれる「大地の芸術祭」を対象としている。

2012年に実施される予定であるので、2011年秋にプリテストを行ない、2012年の芸術祭期間中の本調査に備えた。共に結果は現在取りまとめ中であり、2012年度前半には公表する予定であるが、前者については、以下のような結果が得られている。1)たとえばこれまでの通念であった「マタギの村」であっても狩猟が主たる生業とはいえず、昭和40年頃からは山林業などの賃仕事が大きな比重を占めていた。2)隣の集落まで約20kmという山中の隔絶した集落であるが他集落との通婚が行なわれていた。3)他集落との通交も山形側が主である家と新潟側が主である家があった。4)移転時に成人であった世代は移転後も密接なソーシャル・キャピタルを維持しているが、高校生以下であった世代は薄くなっていることがうかがわれる。最大の課題であった、「第5回越後妻有大地の芸術祭」開催に合わせての大規模質問紙調査が、ほぼ分析に耐える回収状況であったし、単純集計の段階でも、中山間地域のソーシャル・キャピタルと大規模アート展との関係が浮かび上がることが予想できる。当初の予定では、佐渡についての調査に着手することにしていた。そのために現地の研究協力者を依頼していたが、事故のために今年度には実施できなかった。十日町地域のプリテストについては、今年度中に結果を出す予定であったが、まだ解析が終わっていない。上述のように「第5回越後妻有大地の芸術祭」については書籍出版で社会に対して本科研費の成果を還元する予定である。高根の地域構造分析については、所属する旧朝日村の他集落の傾向ないし、集落出身者のその後の移動状況が判明する県内中山間地域集落のデータと比較検討する。三面の調査結果については取りまとめ中であり、まとまりしだい公刊する。十日町地域のプリテスト結果については春のうちに終わらせ、夏から開催される「大地の芸術祭」期間中の本調査に備える。佐渡については、研究協力者の都合を確認し、場合によっては代替協力者を捜す。前回からの継続である、旧朝日村高根地区と上越市桑取地区については、引き続きコンタクトを続ける。概ね、所期の研究計画に沿って、旅費、人件費・謝金の執行が見込まれる。前回の研究と合わせ、都合6年間の調査研究となったので、最終的には報告書をまとめて刊行する方向で支出を計画している。今年度に調査する予定であった佐渡について、研究協力者の都合で着手できなかった。そのため調査費の一部が次年度に繰り越すこととなった。十日町地域で大規模なアンケート調査を行なうため、その送付回収、データ入力等への支出が大きなウェイトを占める予定である。また佐渡の調査に着手できた場合、その旅費の支出が大きくなると見込まれる。
ヒト大腸癌幹細胞の同定と標的治療の確立

我々は,ヒト大腸上皮細胞よりオルガノイドを樹立し,ゲノム編集技術による遺伝子操作法を確立した.本法により,人工的な遺伝子変異導入による大腸発がんメカニズムの解明に迫った.さらに,ヒト大腸癌幹細胞の同定のため,LGR5遺伝子領域への細胞系譜解析レポーターの遺伝子ノックインに成功した.遺伝子改変オルガノイドは免疫不全マウスへの異種移植により,患者病理組織を反映した大腸癌組織の形成を示した.ゲノム編集技術による自在なヒト大腸上皮細胞の遺伝子操作は大腸発がんメカニズムの解明,遺伝子変異に着目した創薬や患者大腸癌の個別治療応用などの臨床応用が期待できる.我々は,ヒト大腸上皮細胞よりオルガノイドを樹立し,ゲノム編集技術による遺伝子操作法を確立した.本法により,人工的な遺伝子変異導入による大腸発がんメカニズムの解明に迫った.さらに,ヒト大腸癌幹細胞の同定のため,LGR5遺伝子領域への細胞系譜解析レポーターの遺伝子ノックインに成功した.遺伝子改変オルガノイドは免疫不全マウスへの異種移植により,患者病理組織を反映した大腸癌組織の形成を示した.ゲノム編集技術による自在なヒト大腸上皮細胞の遺伝子操作は大腸発がんメカニズムの解明,遺伝子変異に着目した創薬や患者大腸癌の個別治療応用などの臨床応用が期待できる.がん幹細胞はがんの治療抵抗性や再発など,がんの生命予後を規定する重要な概念であるが,その存在は未だ論争中である.我々は,細胞株を用いた研究や単一細胞の異種移植に依存した従来の研究から脱却し,患者由来の大腸がんの分子遺伝学的な細胞系譜解析を行い,より臨床に則したがん幹細胞の同定を行う研究を考案した.細胞系譜解析のため,「平成24年度研究実施計画」では,ヒト大腸癌幹細胞培養を利用し,遺伝子相同組換による遺伝子操作システムを確立すると記載した.我々は,安定的な患者由来大腸がん培養を可能にするオルガノイド培養を確立した.また,LGR5の遺伝子座を標的としたゲノム編集のため,配列特異的なTALE nuclease(TALEN)を作製し,細胞株に対してTALENはLGR5遺伝子座の標的配列を切断できることを確認した.ドナーレポーターの遺伝子座へのノックイン遺伝子相同組換えを確認した.さらに,患者由来オルガノイドによっても,TALENによるゲノム編集技術が確立できた.今後,本技術を用いてノックインレポーターによる遺伝子の可視化,並びにがん関連遺伝子の遺伝子破壊,さらにはゲノム編集されたオルガノイドの幹細胞機能解析を行い,新しい治療標的の創出に結び付けたい.がん幹細胞はがんの治療抵抗性や再発など,がんの生命予後を規定する重要な概念であるが,その存在は未だ論争中である.佐藤は,細胞株を用いた研究や単一細胞の異種移植に依存した従来の研究から脱却し,患者由来の大腸がんの分子遺伝学的な細胞系譜解析を行い,より臨床に則したがん幹細胞の同定を行う研究を考案した.細胞系譜解析のため,「平成25年度研究実施計画」では,ヒト大腸癌幹細胞培養を利用し,遺伝子相同組換による遺伝子操作システムを確立すると記載した.佐藤は,安定的な患者由来大腸がん培養を可能にするオルガノイド培養を確立した.また,ゲノム編集技術であるTALE nuclease (TALEN)を用い標的遺伝子の切断を確認した.申請時には確立されていなかった新しいゲノム編集技術,CRISPRが開発され,より効率の良い遺伝子改変が可能になった.本技術を利用して,人工的な遺伝子変異導入に成功した.また,ヒト大腸がんの遺伝子ノックインレポーター技術の開発に成功した.LGR5に代表される幹細胞マーカーはヒトではサイレンシングにより発現が消失することがわかった.このことは,他の研究者によっても報告されており,サイレンシングを回避できる幹細胞マーカーの探索を行っている.本技術による遺伝子発現の可視化を利用しは幹細胞や機能分子マーカーを標的とした治療開発や基礎研究技術基盤としてさらに研究を進めていきたい.ヒト培養腸管上皮細胞から作製したオルガノイドのゲノム編集技術の確立は,ヒト腸管上皮細胞や大腸がん細胞の遺伝子機能解析を施行する上で,極めて重要な技術となる.本技術の確立は海外でも多くの研究者が挑戦しているが,成功していない.今回,1年以内に本技術が確立できたことは,研究計画を進める上で,大きなアドバンテージとなる.25年度が最終年度であるため、記入しない。オルガノイドにおけるゲノム編集技術をさらに応用し,標的とする遺伝子の数細胞の種類を増やしていく.オルガノイドゲノム編集技術は,国際的にみても達成されていない重要な技術であり,集中的な資金投資により,飛躍的な成果が期待できる.25年度が最終年度であるため、記入しない。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり,消耗品購入に充てる予定である.平成25年度では当初の研究計画に沿って,研究を遂行していく.本研究はヒト臨床検体を用いているため,倫理審査書類の作製,協力患者の情報管理,ゲノム倫理指針など,事務的処理が多いため,専属の事務員の雇用が必要である.25年度が最終年度であるため、記入しない。
都市域の業務活動パターンに着目した交通圏モデルによる道路網計画の評価

本研究の目的は、大都市圏(たとえば京阪神)における道路網のあり方を検討するために、圏域内に形成される交通圏とネットワークとの関係を明らかにし、さらにそれにもとづく道路網計画への評価プロセスを開発することである。具体的には、【◯!1】大都市圏パーソントリップ調査データを用いて、トリップテチェインアプローチにより業務活動パターンとネットワーク形成の関係について実証的分析を行なう。【◯!2】都市域の業務活動に着目した交通圏モデルを構築し、京阪神都市圏全体を対象とした今後の広域道路網のあり方について、交通圏モデるの適用による評価プロセスを開発する。59・60年度に得られた主な研究成果を以下にまとめて示す。【◯!1】昭和55年度京阪神都市圏P.T.調査データを用いたトリップ単位の交通流動分析およびトリップチェインアプローチによる業務活動パターンの実証的分析を行ない、交通流動パターンとネットワーク形成の関係のとらえ方を明らかにした。【◯!2】事業所と訪問先との結びつきの強さが交通圏形成の規定要因であるとの仮定の下に都市域の業務活動に着目した交通圏モデルを構築した。さらに、このモデルを改良し、交通圏モデルを用いた将来道路網の評価プロセスの構成について多面的な検討を加えた。【◯!3】京阪神都市圏全体を対象として、将来道路網の整備計画案をいくつか設定し、それらが京阪神都市圏内に形成されている複数の核都市交通圏へどのような影響を及ぼすかについて、比較・評価した。同時に京阪神都市圏全体の一体性からみた道路網の評価方法について考察した。
遺伝子改変マウスを用いた生体内骨形成におけるＳＵＭＯ化修飾の機能解析

本研究課題は様々な分化段階における骨芽細胞培養細胞に対して、SUMO化修飾の阻害がBMP添加による分化誘導に与える影響を検討した。その結果、骨芽細胞への分化段階が進んだ細胞株は、前駆細胞から未熟な骨芽細胞への分化過程を示す細胞株とは異なり、SUMO化修飾阻害がBMP添加による骨芽細胞分化を抑制することを明らかにした。すなわち、骨芽細胞の分化成熟度によってSUMO化修飾阻害が抑制にも促進にも働き得ることが示唆され、SUMO化修飾を介した骨芽細胞分化制御には、細胞内のSUMO化修飾を全体的に抑制するよりも特定の標的タンパク質のSUMO化修飾を時期特異的に制御することが有効ではないかと考えられた。マウス筋芽細胞由来培養細胞株C2C12細胞およびマウス骨髄間葉系幹細胞由来培養細胞株ST2細胞を用いた研究から、これらの細胞株においてSUMO化修飾の阻害がBMP誘導性の骨芽細胞分化を促進させることが明らかになっている。この原因の少なくとも一部はBMPシグナル伝達において転写因子として機能するSmad4のSUMO化修飾にあると考えられるが、SUMO化修飾の標的となるタンパク質は多岐にわたり、SUMO化修飾が骨芽細胞分化に与える影響は未解明な点が多く残されている。本研究課題ではSUMO化修飾に必須の酵素であるUbc9を骨芽細胞特異的に欠失した遺伝子改変マウスを作成し、骨形成について野生型と比較することによって生体内の骨形成におけるSUMO化修飾の役割を明らかにすることを目的としている。これまでUbc9 folxマウスを作出しコンディショナルノックアウトマウスを作出することを予定していたが、遺伝子改変マウスの作製に必要なターゲティングベクターの構築が難航している状況である。その一方で、C2C12細胞やST2細胞よりも骨芽細胞への分化が進んだ骨芽細胞前駆細胞由来MC3T3-E1細胞を用いた研究から、Ubc9の機能阻害は骨芽細胞の石灰化を阻害するという結果が得られている。この結果は骨芽細胞分化の段階によってSUMO化修飾の影響が異なる可能性を示しており、現在、SUMO化修飾阻害剤としてアナカルジン酸を用いてSUMO化修飾を阻害することを計画している。さらに、骨芽細胞分化に必須の転写因子であるOsterixがSUMO化修飾を受けることを新たに見出し、Osterixの機能がSUMO化修飾によりどのような影響を受けるのかを検討している。その結果、OsterixはN末端領域から中央部にかけてSUMO化修飾を受け得る領域が存在すること、BMP刺激による骨芽細胞分化促進はOsterixのSUMO化修飾を抑制することが示唆されるデータを得られた。マウス筋芽細胞由来の培養細胞株C2C12細胞を用いた我々の研究から、SUMO化修飾阻害はBMP誘導性の骨芽細胞分化を促進させ、その原因の少なくとも一部はBMPシグナル伝達において転写因子として機能するSmad4のSUMO化修飾にあることが明らかになった。本研究課題ではSUMO化修飾に必須の酵素であるUbc9を骨芽細胞特異的に欠失した遺伝子改変マウスを作成し骨形成について野生型と比較することにより、生体内の骨形成におけるSUMO化修飾の役割を明らかにすることを目的としている。特定の細胞でのみUbc9を欠損したマウスを作製することを目的とし、本年度はUbc9 folxマウスを作出することを予定していたが、遺伝子改変マウスの作製に必要なターゲティングベクターの構築が難航している状況である。その一方で、C2C12細胞よりも骨芽細胞への分化度が進んだ骨芽細胞前駆細胞由来MC3T3-E1細胞ではUbc9の機能阻害は骨芽細胞の石灰化を阻害するという結果が得られた。これは、骨芽細胞の分化段階によりSUMO化修飾が異なる役割を担っていることを示唆しており、Smad4のみならず骨芽細胞への分化に重要な他のタンパク質がSUMO化修飾によりその機能が制御されていると考えられた。現在までに、転写因子OsterixがSUMO化修飾を受けることを見出しており、今後Osterixの機能がSUMO化修飾によってどのように制御されているかを明らかにしていきたいと考えている。以上より、予定している遺伝子改変マウスを用いたin vivo実験と並行して、培養細胞株およびマウス骨芽細胞の初代培養細胞を用いたin vitro実験によって、骨芽細胞分化段階におけるSUMO化修飾の役割およびその標的タンパク質の解明も行う必要があると考えられた。本研究課題は、SUMO化修飾が生体内の骨組織に与える影響を明らかにすることを目的としてSUMO化修飾に必須の酵素であるUbc9を骨芽細胞特異的に欠損した遺伝子改変マウスを作製し、野生型と骨形成能を比較することを計画していた。

しかし、遺伝子改変マウスを作出するために必要なコンストラクトの作製が予定外に難航したため、生体内における影響を検討する代替手段として、様々な分化段階における骨芽細胞培養細胞に対して、SUMO化修飾の阻害がBMP添加による骨芽細胞分化に与える影響を詳細に検討した。その結果、骨芽細胞前駆細胞由来であるMC3T3-E1細胞は、筋芽細胞由来C2C12細胞および骨髄ストローマ細胞由来ST2細胞の場合と異なり、SUMO化修飾阻害がBMP添加による骨芽細胞分化を抑制することを明らかにした。すなわち、骨芽細胞の分化成熟度によってSUMO化修飾阻害が抑制的にも促進的にも働き得ることが示唆され、SUMO化修飾を介した骨芽細胞分化制御には、細胞内のSUMO化修飾を全体的に抑制するよりも特定の標的タンパク質のSUMO化修飾をコントロールすることが有効ではないかと考えられた。Osterixは骨芽細胞分化に必須の転写因子である。本研究ではOsterixがSUMO化修飾を受けることを新たに明らかにした。C2C12細胞において、OsterixのSUMO化修飾はBMP添加により阻害されることを明らかにし、骨芽細胞への分化が進むにつれて、OsterixのSUMO化レベルが減少することが示唆された。さらに、OsterixのN末端側および中央領域にSUMO化修飾を受け得るアミノ酸配列が存在することも明らかにした。今後OsterixのSUMO化修飾が骨芽細胞分化に与える影響をさらに詳細に検討することにより、SUMO化修飾の制御を介した骨芽細胞分化の効率化につながると期待される。組織学当初の研究課題の目標の1つであった遺伝子改変マウスの作出については、未だコンストラクトの作製に成功しておらず、目標を達成できていない。その一方で、SUMO化修飾が骨芽細胞分化に与える影響を解明する、という点については、大きく進展したと考えている。1つは骨芽細胞分化に必須の転写因子であるOsterixがSUMO化修飾の標的となることを見出し、OsterixのN末端側から中央領域を含む変異体はSUMO化修飾を受ける一方で、C末端側のみからなる変異体ではSUMO化修飾が見られないことを示唆するデータを得られた点である。今後、どのアミノ酸残基がSUMOタンパク質と結合するのかを明確にすることによりSUMO化修飾を受けない変異型Osterixを作成し、その機能を解明する。2つめは、SUMO化修飾阻害剤としてアナカルジン酸を用いて骨芽細胞分化への影響を時期特異的に検討する実験系を立ち上げたことである。現在、C2C12細胞、ST2細胞ではアナカルジン酸の添加によりBMP刺激による骨芽細胞分化が促進される一方で、MC3T3-E1細胞では分化促進は見られず、Ubc9の阻害と同様の傾向を示すことが判明した。以上の結果はSUMO化修飾がSmad4のみならず骨芽細胞分化に重要な複数の転写因子の機能を制御する可能性を明らかにし、骨芽細胞分化においてSUMO化修飾が時期特異的に様々な影響を与えることを示唆するものであり、順調に研究が進展していると考えている。以上の事から、研究全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
両親媒性高分子の分子設計による自己組織化の制御

疎水性モノマーと電解質モノマーのランダム共重合体について、以下の分子設計と合成をおこなった。(1)自己組織化における疎水基の「個性」を明らかにするため、飽和および不飽和炭化水素やパーフルオロアルキル基を疎水基として置換したメタクリルアミド型モノマーを合成し、2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸ナトリウムと種々な組成で共重合することにより両親媒性共重合体を合成した。(2)疎水基と主鎖を結ぶスペーサー結合の効果を調べるために、アミド結合またはエステル結合を介して疎水基を直接主鎖に結合した両親媒性ランダム共重合体および、長さの異なるポリオキシエチレン鎖を介して結合した両親媒性ランダム共重合体を合成した。上記の両親媒性高分子の自己組織化過程並びにそれによって生成したナノ組織体の構造と性質のキャラクタリゼーションをおこなった。(1)蛍光物質を側鎖結合した蛍光標識モノマーを用い、三元共重合をおこなうことによって合成した蛍光活性な両親媒性高分子を合成し、蛍光標識基から過渡的蛍光情報に基づいて自己組織化現象並びにナノ構造の微視的ダイナミックスを調べた。過渡的蛍光情報として蛍光寿命、過渡的蛍光スペクトル、および時間依存蛍光偏光解消法を用いた。(3)ナノ組織体の慣性半径の測定を静的光散乱法によりおこない、流体力学的な大きさの評価を、動的光散乱法、体積排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動によりおこなった。(4)ナノ組織の巨視的なダイナミックス評価を、動的光散乱法、力学緩和法を併用しておこなった。(5)透過型電子顕微鏡によるモルホロジーの観察をおこなった。その結果、両親媒性高分子の自己組織化は、疎水性モノマーと電解質モノマーの割合、疎水基の性質、疎水基とポリマー主鎖をつなぐスペーサー結合などによって制御できることが明らかとなった。電解質モノマーと疎水性モノマーのランダム共重合体ついて、以下の合成を行った。(1)自己組織化における疎水基の寄与を調べるために、同一炭素数(C4からC16)の直鎖状、分岐状,環状(>C6)の飽和および不飽和炭化水素を疎水基として置換したメタクリルアミド型モノマーを合成し、2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸ナトリウム(AMPS)と様々な組成で共重合して完全にランダムな共重合体を合成した。(2)疎水基と主鎖を結ぶスペーサー結合の効果を調べるために、アミド結合またはエステル結合を介して疎水基を直接主鎖に結合したランダム共重合体及び、長さの異なるポリエチレン鎖やポリオキシエチレン鎖を介して結合したランダム共重合体を合成した。(3)電解質モノマー単位と疎水性モノマー単位の連鎖配列(連鎖分布)及び重合度の異なる両親媒性ランダム共重合を合成した。上記の両親媒性ランダム共重合体の自己組織化によって生成したナノ構造体のキャラクタリゼーションを行った。まず、静的光散乱法によりナノ構造体の慣性半径の測定を行った。また、動的光散乱法、体積排除クロマトグラフィー(GPC)、キャピラリー電気泳動法により動的な広がりの評価を行った。さらに、ナノ組織体の巨視的なダイナミックスの評価をレオメータを用いた力学緩和法によて行った。その結果、炭素数12の直鎖状飽和炭化水素を含むメタクリルアミド型モノマーとAMPSとからなる両親媒性高分子電解質では疎水基のモル組成が10%以下と50%以上で分子間の会合が生じるが、10%以下の場合は会合体が二様の粒径分布を有するのに対し、50%以上の場合は一様の粒径分布を持つことなどが明らかになった。

(1)自己組織化における疎水基の「個性」を明らかにするため、飽和および不飽和炭化水素やパーフルオロアルキル基を疎水基として置換したメタクリルアミド型モノマーを合成し、2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸ナトリウムと種々な組成で共重合することにより両親媒性共重合体を合成した。(2)疎水基と主鎖を結ぶスペーサー結合の効果を調べるために、アミド結合またはエステル結合を介して疎水基を直接主鎖に結合した両親媒性ランダム共重合体および、長さの異なるポリオキシエチレン鎖を介して結合した両親媒性ランダム共重合体を合成した。上記の両親媒性高分子の自己組織化過程並びにそれによって生成したナノ組織体の構造と性質のキャラクタリゼーションをおこなった。(1)蛍光物質を側鎖結合した蛍光標識モノマーを用い、三元共重合をおこなうことによって合成した蛍光活性な両親媒性高分子を合成し、蛍光標識基からの過渡的蛍光情報に基づいて自己組織化現象並びにナノ構造の微視的ダイナミックスを調べた。過渡的蛍光情報として蛍光寿命、過渡的蛍光スペクトル、および時間依存蛍光偏光解消法を用いた。(3)ナノ組織体の慣性半径の測定を静的光散乱法によりおこない、流体力学的な大きさの評価を、動的光散乱法、体積排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動によりおこなった。(4)ナノ組織の巨視的なダイナミックス評価を、動的光散乱法、力学緩和法を併用しておこなった。(5)透過型電子顕微鏡によるモルホロジーの観察をおこなった。その結果、両親媒性高分子の自己組織化は、疎水性モノマーと電解質モノマーの割合、疎水基の性質、疎水基とポリマー主鎖をつなぐスペーサー結合なとによって制御できることが明らかとなった。
骨格筋の再生メカニズムにおけるMCTの役割解明

超高齢化社会の中で、腰痛による運動器障害が歩行困難となる要介護者の増加と関連している。腰痛の原因として報告される筋肉脂肪変性について、我々は腰痛患者のMRIにより筋肉脂肪変性の評価を行ってきた。筋再生過程において初期には肥満細胞の集中が報告されており、関与が示唆される。過去に報告されるように我々も肥満細胞由来トリプターゼ(MCT)の刺激によりマウス筋芽細胞が増殖することを確認した。本研究の目的は、1)筋肉の脂肪変性における肥満細胞の脱顆粒によって放出されるトリプターゼの関与を解明し、2)マウス筋損傷モデルを使用し、同トリプターゼによる筋再生への影響を検討し、効果的に筋再生を促す新規分子標的薬の開発研究を行い、臨床に還元し発展させることである。2018年度は、1MCTが筋芽細胞の骨格筋への分化に与える影響、2MCTが筋芽細胞の脂肪化に与える影響を検討した。細胞はマウス筋芽細胞モデルであるC2C12および、G8細胞を休眠化した筋衛星細胞のモデルとして使用した。1MCT刺激により、筋分化が促進された。また、MCT受容体であるPAR2の阻害薬によりMCT刺激下の筋分化が抑制された。2筋芽細胞を低酸素状態で脂肪分化させ、MCTで刺激するも、脂肪分化過程を経て至った細胞は脱落数が多く、MCT刺激による差に有意な結果を得ることは出来なかった。次年度に酸素濃度、細胞密度とともに調整していく予定である。また、マウス筋損傷モデルを用いてMCTが筋再生を優位に促進しうるかも検討していく。肥満細胞由来トリプターゼ(MCT)の刺激によりマウス筋芽細胞(C2C12)が筋分化することを確認できた。また、このことにはMCT受容体であるPAR2を介したものであった。次年度は、予定通りにマウス筋損傷モデルを用いてMCTが筋再生を優位に促進しうるかを確認する計画である。2019年度は得られた結果よりin vivoモデルとしてマウス筋損傷モデルを用いて骨格筋再生時におけるMCTの筋分化への影響をさらに検討していく予定である。具体的には、マウスの背部を切開し背筋を直視下にCTXを注入し作成する筋損傷モデルを使用する。1単独損傷群(Sham群)と、損傷作成部位にMCTを注入する2CTX損傷+MCT群を作成する。損傷した背筋を経時的に採取し、組織学的・分子生物学的に骨格筋の再生と脂肪化を定量評価し、肥満細胞の発現について解析し、MCTの影響についてvitroでの結果と一致するかどうかを検証する。
酸化ストレスの視点から見た胎盤機能不全における絨毛細胞機能障害機構の解明

本研究では、炎症や虚血再潅流障害によって生成される活性酸素種がPIHの病態形成過程への関与を明らかにするために、XOとその基質であるXanthine(X)の同時添加、H2O2、スカベンジャーおよびTCDDが培養絨毛細胞に与える影響、合併症のない妊婦の分娩までの血圧と周産期予後、絨毛細胞の浸潤障害が少ない前置胎盤のPIHの発症頻度を検討し、X/XOによって生成されるH2O2がEVTにアポトーシスを誘導しうること、TCDDは絨毛細胞のアポトーシスを誘導しないこと、PIHを発症しなくても妊娠32週以降血圧の血圧は胎児発育に影響を与えること、前置胎盤妊婦ではPIH発症頻度が低いこと、がわかった。妊娠高血圧症候群(PIH)の病態形成には活性酸素種(ROS)を介した血管内皮機能障害が関わることが知られるとともに、PIH患者胎盤では、虚血性心疾患等における低酸素再潅流障害において重要な役割を担うとされるXanthine Oxidase(XO)の発現上昇が報告されている。初年度に、TCL1の培養上清中XOとその基質であるXanthine(X)の同時添加がEVTにアポトーシスを誘導しうること、妊娠全期間を通じて血圧が正常範囲内で推移した母児においても、拡張期血圧が1mmHg高値であるとSGAのリスクが上昇し、これにともない母体尿酸値も高値であること(Fukushimaら、Hypretens Res2012)、TCDDは絨毛細胞のアポトーシスを誘導しないこと(Fukushima, HET,2011)を明らかにした、本年度は虚血再潅流障害等によって胎盤で誘導されるXOはH2O2を介して、血管内皮だけではなくEVTのCell Fate決定に関与している可能性を示したものと考えられ、本年度は、絨毛細胞の活性酸素種によるアポトーシスの誘導機序および伴って起こる細胞生物学的変化について絨毛細胞由来細胞株を用いてより詳細に検討しEVT機能分化の指標は細胞運動能、絨毛細胞分化マーカーのタンパク発現、HIF1A発現、転写活性、マトリゲル上でのtube formation、接着能、浸潤能(Boyden Chamber法)について解析を進め、英文論文掲載された(Murata, Fukushimaら、JRD, 2013)。初年度に、TCL1の培養上清中XOとその基質であるXanthine(X)の同時添加がEVTにアポトーシスを誘導しうること、妊娠全期間を通じて血圧が正常範囲内で推移した母児においても、拡張期血圧が1mmHg高値であるとSGAのリスクが上昇し、これにともない母体尿酸値も高値であること(Fukushimaら、Hypretens Res2012)、TCDDは絨毛細胞のアポトーシスを誘導しないこと(Fukushima, HET,2011)を明らかにした、本年度は虚血再潅流障害等によって胎盤で誘導されるXOはH2O2を介して、血管内皮だけではなくEVTのCell Fate決定に関与している可能性を示したものと考えられ、これまでに絨毛細胞の活性酸素種によるアポトーシスの誘導機序および伴って起こる細胞生物学的変化について絨毛細胞由来細胞株を用いてより詳細に検討しEVT機能分化の指標は細胞運動能、絨毛細胞分化マーカーのタンパク発現、HIF1A発現、転写活性、マトリゲル上でのtube formation、接着能、浸潤能(Boyden Chamber法)について解析を進め、英文論文掲載された(Murata, Fukushimaら、JRD, 2013)。本年は胎盤における活性酸素種のの産生源について注目し、TCL1細胞に諸種のサイトカイン、負荷を加えたところ、XOタンパクが誘導されることを明らかにした(Fukusima,投稿準備中)。つまり胎盤における活性酸素種産生の少なくとも一部にはTNFその調節に関与するものと考えられた。本年度は、TCL1の培養上清中XOとその基質であるXanthine(X)の同時添加やH2O2添加が、TCL1細胞に与える影響を解析し、X/XOによって生成されるH2O2はEVTにアポトーシスを誘導しうることがわかった。

また、活性酸素種の供給源となり得るTCDDの影響についても検討したが、TCDDは絨毛細胞のアポトーシスを誘導しないことがわかった(Fukushima, HET,2011)。虚血再潅流障害等によって胎盤で誘導されるXOはH2O2を介して、血管内皮だけではなくEVTのCell Fate決定に関与している可能性を示したものと考えられ、今後その機構をさらに解析していく。妊娠全期間を通じて血圧が正常範囲内で推移した母児ともに合併症のない妊婦について、妊娠32週以降分娩までの妊婦健診で測定した血圧がpre-HT(収縮期血圧130以上140未満ないし拡張期血圧80以上90未満)に相当する71例と、対照403例について周産期予後を比較した。前者は妊娠前半における妊婦健診(中央値16週)の収縮期、拡張期血圧が有意に高く、出生体重およびその標準からの偏差が有意に小さく、SGA児の割合が高く、分娩前に術前検査等で測定した母体血中尿酸値が有意に高値であった。多変量解析では妊娠32週以降の1mmHgの拡張期血圧が上昇すると、SGA児のオッズ比は1.09と有意に上昇していることがわかった(Fukushimaら、Hypretens Res 2012)。in vitroの知見を裏付ける臨床的知見であると考えられる。本年度は、初年度に行うことができなかった、絨毛細胞の活性酸素種によるアポトーシスの誘導機序および伴って起こる細胞生物学的変化について絨毛細胞由来細胞株を用いてより詳細に検討を行い、英文論文掲載された。胎盤の酸化ストレスにおける初年度のに生じた遅延は解消し当該年度の研究スケジュールを進めることができ、順調に成果を得ることができている。平成23年度は予定していた実験のうち、絨毛細胞由来細胞株を用いて、活性酸素種添加ならびにサイトカイン等の諸種の刺激・阻害因子を負荷しその細胞生物学的効果について検討する。刺激・阻害因子としては、細胞外基質、酸素濃度、活性酸素供与体(xhantine oxidase, xhantine)、フリーラジカルスカベンジャー(superoxide dismutase(SOD)、catalase、L-NAME、液性因子(TNF)を用いて、EVT機能分化の指標は細胞運動能、絨毛細胞分化マーカーのタンパク発現、HIF1A発現、転写活性、マトリゲル上でのtube formation、接着能、浸潤能(Boyden Chamber法)については、おおむねの解析を終了することができた。受理されるにはいたっていないものの現在までに英文論文誌に投稿は果たし、リビジョンの実験中である。また、臨床的解析として、母体血中の活性酸素種の上昇や高尿酸血症がみられることがよく知られていることから、474例の妊娠全期間を通じて血圧が正常範囲内で推移した母児ともに合併症を有さない妊婦について検討し、拡張期血圧が上昇した妊婦では、たとえ正常範囲内の変化で、妊娠高血圧症候群の合併がない場合でも、PIHと同様の病態を示している化膿性を示唆することができ、成果を英文論文として発表することができた(Fukushimaら、Hypretens Res 2012)。今後その機序について免疫組織化学、細胞生物学的に検証する必要がある。研究費の使用は遅れているものの総じておおむね順調に成果を得ることができている。胎盤における活性酸素種障害の発生について、臨床検体において、8OHdG、superoxide dismutase等の免疫組織化学染色、を行い、これらの酸化ストレス
イオン透過性・細胞内局在において多様なチャネルロドプシンの創出

(1)ChR1とChR2のキメラ体であるChRWRとChRFRのステップ関数型変異体(SFO)を作製し、光電流キネティクスを波長、光強度、および照射時間の関数として解析した。また作製した改変体のうちの1つであるChRFR-C167Aをラット大脳皮質神経初代培養細胞に発現させ、膜電位を光強度と照射時間の関数として定量的に解析した。(2)Na+選択性において優れたMvChR1を改変し、大きな光電流を得ることに成功した。また、そのイオン透過様式を解明した。(3)ランタニドナノ粒子(LNP)をドナーとして近赤外光エネルギーを可視光に変換し、ChRをアクセプターとして神経細胞を光制御することに成功した。チャネルロドプシン(ChR)は微生物型ロドプシンの一種であり、クラミドモナスやボルボックスといった緑藻類が持つ光駆動型の非選択的陽イオンチャネルである。他の微生物型ロドプシンと同様にChRもまた7つの膜貫通へリックス(TM1-7)からなる構造を有する膜タンパク質である。特に第2へリックス(TM2)近辺に存在する5つのグルタミン酸残基(E)はChRファミリーにおいて保存されており、先行研究からこの極性アミノ酸残基がイオン透過性に関係すると考えられている。例えば、ChR2のE97をアラニン(A)に置換することで光電流の強い抑制が認められている。また同部位をアルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、グルタミン(Q)に置換した改変体を用いてGd3+をブロッカーとした実験においてはGd3+の抑制効果が減少する。これらのことからE97が陽イオン透過において重要な部位であり、Gd3+の高親和性結合部位であると共に陽イオンの脱水和に必須の部位であることが示唆されている。単細胞緑藻類の一種Mesostigma viride由来のChRのひとつ、MChR1は、クラミドモナスやボルボックス由来の既知のChRと異なり、上記5つのEのうち、ChR2のE97に相当する部位のアミノ酸残基がAに置き換わっている。そこで、本研究ではMChR1においてはGd3+の高親和性結合部位が欠損しているという仮説を検証した。さらに、MChR1におけるChR2のE97に相当する部位であるAをEに置換した改変体を作製し、MChR1及びChRと比較することで、ChR2のE97に相同するアミノ酸残基がGd3+の高親和性結合に必須であるとする仮説を検証した。その結果、MChR1においては、Gd3+の高親和性結合部位が欠損していることが確認された。この部位がCa2+透過性に関与している可能性について、平成26年度の研究において解明する計画である。チャネルロドプシン(ChR)の第2へリックス(TM2)近辺に存在する5つのグルタミン酸残基(E)がイオン透過性に関係すると考えられている。単細胞緑藻類の一種Mesostigma viride由来のChRのひとつ、MvChR1は、クラミドモナスやボルボックス由来の既知のChRと異なり、上記5つのEのうち、ChR2のE97に相当する部位のアミノ酸残基がAに置き換わっている。そこで、本研究ではMvChR1においてはイオン透過性のメカニズムが異なるという仮説を検証した。その結果、MvChR1およびその増強変異体のC2M1おいては、Gd3+の高親和性結合部位が欠損していることが確認された。さらに、C2M1におけるChR2のE97に相当する部位であるAをEやDなどの付加電アミノ酸残基に置換したところ、Gd3+高親和性になるとともに、陽イオン透過性が強く減少した。しかし、非電荷のQに置換しても影響を受けなかった。すなわち、MvChR1やC2M1においては、ポアサイズが比較的大きいため、透過陽イオンが脱水和されることなく、バルクで透過することが示唆された。本研究の成果は投稿中である(Ishizuka et al.)。ChR1と2を融合した改変型のChRGR遺伝子導入で、青緑色光に感受性を持つ筋細胞を作り、継続的に照射した。その結果、青緑色光の照射を受けた細胞は、収縮の最小構成単位である筋細胞内のサルコメア構造の発達が促進された。また、このように成熟した筋細胞が、光刺激に応答して収縮することも確かめた。筋小胞体などのオルガネラに発現したChRGRを介した周期的な細胞内カルシウム振動が効率的に成熟した筋細胞への分化を進めることが示唆された。本研究の成果は、論文として報告した(Asano et al., 2015)。

光遺伝学MChR1の構造機能解析の成果について、論文準備中にある。また、本研究において同定されたGd3+高親和性結合部位が、Ca2+透過性に関与している構造であるという新たな仮説を立てることができた。本仮説を平成26年度において検証することにより、「Ca2+を透過しないチャネルロドプシンの開発」という、当初の目的を達成できる見込みが高い。平成26年度の研究においては、Gd3+高親和性結合部位が、Ca2+透過性に関与している構造であるという新たな仮説を検証する研究を実施する。この結果に基づいて、「Ca2+を透過しないチャネルロドプシンの開発」や「Ca2+透過型チャネルロドプシンの開発」を推進する。
Hコイル法を用いた単板磁気特性試験法の国際規格化に向けた実用研究

変圧器やモータなどの電気機器鉄芯を構成する主な磁性材料である電磁鋼板の磁気特性評価に使用される単板磁気特性試験法において,磁界の強さの測定にHコイル法を適用する試験法が我国で提案されている.本研究では,その試験法の国際規格化を念頭に,測定精度に影響を与える諸因子を検討した.その結果,測定精度の確保のためには,ヨーク端面の平坦度を向上させることが重要であることを明らかにした.特に,国際規格で推奨されている500 mm幅試料用の試験法では,ヨーク端面の平坦度が測定精度の与える影響は顕著である.本研究では,電気機器内の磁気回路部に使用される代表的な鉄芯材料である電磁鋼板の磁気特性の高精度測定法を確立し,得られた技術を国際規格化することが狙いである.規格化に際しては,クリアすべきハードルが高いため,長年にわたる研究実績がなければ,達成は難しいと考えられる.諸外国では,磁性材料の磁気特性の標準測定法を専門に扱う国立の機関(例えば,ドイツではPTB(物理工学研究所),英国ではNPL(物理学研究所))が現在でも維持されており,技術が効率的に伝承されている.それに対して我国では,活発な研究活動を行っていた旧電子総合研究所の該当部門が廃止され,現在それに代わる組織はない.磁性材料がますます多用される時代になっており,また経済産業省の製造産業局に鉄鋼課があることからわかるように,我国における鉄鋼関連産業は重要視されているにもかかわらず,電気機器に使用される主な磁性材料である電磁鋼板の評価にかかわる研究を支える拠点が存在せず,諸外国に対する競争力が低下していることは明らかである.したがって,本研究を推進し,当該分野のレベルアップを図るとともに,我国の発展を担う鉄鋼関連産業の国際競争力を強化することは重要である.そこで本研究では,電磁鋼板の磁気特性測定法に関して,国際規格改訂の提案を念頭に置き,Hコイル法を用いた単板磁気特性試験法の国際規格化に向けた実用研究を目的としている.検討内容は,以下に示すとおりである.(1)回送試験に参加する予定の機関が保有する測定システムの基本的特徴を把握する.(2)回送試験で使用する単板磁気特性試験器(SST)を作製する.(3)Hコイル法の測定精度に影響を与える諸因子を検討する.(4)単板磁気特性試験法における磁界の強さ測定法の国際規格としてHコイル法を提案する.変圧器やモータなどの電気機器鉄芯を構成する主な磁性材料である電磁鋼板の磁気特性評価に使用される単板磁気特性試験法において,磁界の強さの測定にHコイル法を適用する試験法が我国で提案されている.本研究では,その試験法の国際規格化を念頭に,測定精度に影響を与える諸因子を検討した.その結果,測定精度の確保のためには,ヨーク端面の平坦度を向上させることが重要であることを明らかにした.特に,国際規格で推奨されている500 mm幅試料用の試験法では,ヨーク端面の平坦度が測定精度の与える影響は顕著である.本年度は,回送試験に参加する予定の機関が保有する測定システムの基本的特徴を把握するとともに,次年度の本格的回送試験で使用する単板磁気特性試験器(SST)を作製した.1.環状試料を用いた測定システムの基本的特徴の把握励磁巻線および磁束密度測定用のサーチコイル(Bコイル)を施した環状試料を用意し,8機関において,回送試験を実施した.本回送試験前に実施した予備的な試験によって,測定誤差が予想外に大きかったので,本回送試験時には,励磁電流および磁束密度に対応した電圧を測定するために,試料に加えてディジタルマルチメータも同梱して試験を実施した.その結果,予備試験において誤差が大きかった2機関が,本試験においても同様な傾向を示した.この点については,次年度以降,波形制御スキームに着目して,誤差原因を明らかにする予定である.2.100mm幅用小形SSTを用いたHコイルサイズの検討磁界強度の検出にHコイル法を適用する場合,試料サイズに対するHコイルの長さおよび幅が,測定精度に大きく影響を与える.そこで,小形のHコイルを作製して,局部的な磁界強度分布を測定した結果,Hコイルの長さおよび幅が,試料の2/3および85%程度であれば,代表的な電磁鋼板の商用周波数帯の磁気特性測定において,良好な精度を得られることが明らかになった.3.国際(IEC)規格で規定されている500mm幅試料用の大形SSTの作製最終的な回送試験に使用する500mm幅試料用SSTを作製した.本年度は,IEC提案の500mm幅試料用の大形単板磁気特性試験器(SST)の試作器の特性を,その特性が十分に把握されているJIS提案の100mm幅試料用の小形SSTと比較することにより検討し,以下の知見を得た.1.500mm幅試料用SSTと100mm幅試料用SSTで得られる磁気特性の比較両SSTで測定可能な100mm(幅)×500mm(長さ)を用い,使用するHコイルおよびBコイルも共通にして,磁気特性(磁化特性および鉄損特性)の比較検討を行った.その結果,全磁束密度領域において,両者の差異が510%であった.一般的には,同一の試料を同一の試験器で評価した際には,試料を設置したままで励磁を繰り返す場合は1%程度の再現性を確保する必要があると言われている.