hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子導入カイコガを用いた神経活動制御とネットワーク機構の解析

光感受性イオンチャネルを遺伝的に導入したカイコガを作出し,嗅覚一次中枢神経ネットワークである触角葉において,GABA作動性の介在神経は,弱い刺激が入ってきた場合では作動せず,出力神経のスパイク出力の非線形的応答は,嗅受容細胞と出力神経との間のシナプス結合の特性によってのみ決定している可能性が示唆した.強い刺激が入ってきた場合は,介在神経はGABA作動性抑制を示し出力神経のスパイク出力抑制に関与することで,出力神経の時間積分スケールに寄与している可能性を示唆した.さらに,触角葉の機能的シナプス接続性を調査することを目的とし介在神経及び出力神経からのホールセルパッチクランプ法による膜電位の同時計測を実施し,投射神経とスパイキングタイプの介在神経は一方向性の興奮性入力でのみ接続されており,スパイキングタイプの介在神経からの発生していることが予想された抑制性のシナプス入力は,投射神経において明確に認められないことが分かった.いっぽうで,ノンスパイキングタイプの介在神経と投射神経との間の機能的シナプス接続性を調査した場合,投射神経からノンスパイキングタイプの介在神経へ向けた興奮性のシナプス入力は,スパイキングタイプと同様に存在していることが示唆された.逆に,ノンスパイキングタイプの介在神経から投射神経へ向けたシナプス入力は,スパイキングタイプの場合とは異なり,非常に明確な抑制シナプス入力を観測することができた.さらには嗅覚高次中枢神経ネットワークであるキノコ体の主要構成細胞であるにおいてケニオン細胞に対してホールセルパッチクランプ法による膜電流計測を行い,ケニオン細胞の持つ電位依存性膜電流の解析に成功した.この膜電流は活性化の早い内向き電流と,その後に続く外向き電流として記録された.内向き電流の成分としてNa+電流とCa2+電流が,外向き電流の成分としては4-AP感受性で一過的なK+電流とTEA感受性で持続時間の長いK+電流,Ca2+依存性K+電流をそれぞれ薬理学的に単離することに成功した.また,電気的に記録した細胞を染色することで,その形態学的な特徴と対応させることに成功した.光遺伝学的手法を用いた研究成果を米国科学アカデミー紀要に投稿し,査読者の要求に応えた再投稿が,完了していないため,(3)の評価とした.上記の光遺伝学的手法を用いた研究成果を米国科学アカデミー紀要に再投稿する.また,機能的シナプス接続性に関する研究成果をJournal of Neurophysiologyに投稿する.雄のカイコガは同種の雌から放出される性フェロモンに対して,きわめて高感度に反応し,雌探索行動を発現する.カイコガにおける嗅受容細胞からの一次投射中枢である触角葉の出力神経の時間積分スケールがどのような神経機構によって生成されているのかを解明することを主たる目的とした.光刺激の持続時間として3ミリ秒間と10ミリ秒間の2種類を設定し,行動実験の結果に基づき3ミリ秒間の光刺激を「弱い刺激(30%程度の確率で行動発現が誘発され得る刺激)」及び10ミリ秒間の光刺激を「強い刺激(確実に行動発現を起こすことのできる刺激)」とみなし,出力神経のスパイク出力の時間積分スケールを調べた.弱い刺激に対して出力神経のスパイク出力は,おおよそ80ミリ秒の時間スケールに基づく非線形的応答を示したが,興味深いことに,強い刺激に対しては出力神経のスパイク出力は非線形的応答がキャンセルされ,線形的な応答を示すことが分かった.このような結果を受け,介在神経から送られているであろうGABA作動性の抑制性シナプス入力が出力神経のスパイク出力の非線形応答キャンセルに重要な役割を果たしているのではないかという作業仮説に基づき,介在神経のシナプス入力阻害を目的にGABA受容体の阻害剤であるピクロトキシンとCGP54626を投与し,前述した「弱い刺激」と「強い刺激」を同じ実験デザインで試行し,出力神経のスパイク出力にどのような変化が起きるかを調べたところ,阻害剤を投与しているにもかかわらず,弱い刺激に対しては,出力神経のスパイク出力に顕著な変化は観察されず,おおよそ80ミリ秒の時間積分スケールに基づき非線形的応答を示し,強い刺激に対しては,出力神経のスパイク出力が,弱い刺激時において観察されたような,およそ80ミリ秒の時間スケールに基づく非線形的応答に変化したという結果を得た.光感受性イオンチャネルを遺伝的に導入したカイコガを作出し,嗅覚一次中枢神経ネットワークである触角葉において,GABA作動性の介在神経は,弱い刺激が入ってきた場合では作動せず,出力神経のスパイク出力の非線形的応答は,嗅受容細胞と出力神経との間のシナプス結合の特性によってのみ決定している可能性が示唆した.強い刺激が入ってきた場合は,介在神経はGABA作動性抑制を示し出力神経のスパイク出力抑制に関与することで,出力神経の時間積分スケールに寄与している可能性を示唆した.さらに,触角葉の機能的シナプス接続性を調査することを目的とし介在神経及び出力神経からのホールセルパッチクランプ法による膜電位の同時計測を実施し,結果として,スパイキングタイプの介在神経と投射神経との間の機能的シナプス接続性を調査した場合,投射神経からスパイキングタイプの介在神経へ向けた興奮性のシナプス入力が存在していることが示唆された一方で,スパイキングタイプの介在神経から投射神経へ向けたシナプス入力は明確には観測されなかった.このような結果から,投射神経とスパイキングタイプの介在神経は一方向性の興奮性入力でのみ接続されており,スパイキングタイプの介在神経からの発生していることが予想される抑制性のシナプス入力は,投射神経において明確に認められないことが分かった.

いっぽうで,ノンスパイキングタイプの介在神経と投射神経との間の機能的シナプス接続性を調査した場合,投射神経からノンスパイキングタイプの介在神経へ向けた興奮性のシナプス入力は,スパイキングタイプと同様に存在していることが示唆された.逆に,ノンスパイキングタイプの介在神経から投射神経へ向けたシナプス入力は,スパイキングタイプの場合とは異なり,非常に明確な抑制シナプス入力を観測することができた.光感受性イオンチャネルを遺伝的に導入したカイコガを作出し,嗅覚一次中枢神経ネットワークである触角葉において,GABA作動性の介在神経は,弱い刺激が入ってきた場合では作動せず,出力神経のスパイク出力の非線形的応答は,嗅受容細胞と出力神経との間のシナプス結合の特性によってのみ決定している可能性が示唆した.強い刺激が入ってきた場合は,介在神経はGABA作動性抑制を示し出力神経のスパイク出力抑制に関与することで,出力神経の時間積分スケールに寄与している可能性を示唆した.さらに,触角葉の機能的シナプス接続性を調査することを目的とし介在神経及び出力神経からのホールセルパッチクランプ法による膜電位の同時計測を実施し,投射神経とスパイキングタイプの介在神経は一方向性の興奮性入力でのみ接続されており,スパイキングタイプの介在神経からの発生していることが予想された抑制性のシナプス入力は,投射神経において明確に認められないことが分かった.いっぽうで,ノンスパイキングタイプの介在神経と投射神経との間の機能的シナプス接続性を調査した場合,投射神経からノンスパイキングタイプの介在神経へ向けた興奮性のシナプス入力は,スパイキングタイプと同様に存在していることが示唆された.逆に,ノンスパイキングタイプの介在神経から投射神経へ向けたシナプス入力は,スパイキングタイプの場合とは異なり,非常に明確な抑制シナプス入力を観測することができた.さらには嗅覚高次中枢神経ネットワークであるキノコ体の主要構成細胞であるにおいてケニオン細胞に対してホールセルパッチクランプ法による膜電流計測を行い,ケニオン細胞の持つ電位依存性膜電流の解析に成功した.この膜電流は活性化の早い内向き電流と,その後に続く外向き電流として記録された.内向き電流の成分としてNa+電流とCa2+電流が,外向き電流の成分としては4-AP感受性で一過的なK+電流とTEA感受性で持続時間の長いK+電流,Ca2+依存性K+電流をそれぞれ薬理学的に単離することに成功した.また,電気的に記録した細胞を染色することで,その形態学的な特徴と対応させることに成功した.光遺伝学的手法を用いてカイコガ嗅覚神経回路の情報処理において特に時間積分特性について行動を規定する重要なデータを取得することが出来たこと,および多点同時パッチクランプ法を用いてカイコガ嗅覚神経回路の機能的シナプス接続性を定量的に評価できたことなどから(2)の評価とした.光遺伝学的手法を用いた研究成果を米国科学アカデミー紀要に投稿し,査読者の要求に応えた再投稿が,完了していないため,(3)の評価とした.
民家の板倉構法の変遷と成立構造

日本で板倉構法が比較的良く残る三地域、すなわち茨城県大子町、長野県八ヶ岳山麓,長崎県対馬の板倉の実地調査の結果、以下の点が明らかとなった。1。大子町角材を井桁に組んだせいろう倉,四隅に柱をたてて厚板を落とし込んだ落とし板倉,柱を密にたて、貫で固めて薄板をはめ込んだ貫倉の三類型がある。せいろう倉,落とし板倉,貫倉の順に古い構法であり,数も少い。使用木材量もその順に少くなる。落とし板倉と貫倉は外側を土で塗り込めたものも、数は少いが存在することが明かとなった。2。八ヶ岳山麓せいろう倉と落とし板倉の2類型がある。せいろう倉は古い構法で数も少い。せいろう倉.落とし板倉ともに土で塗り込めることを前提として、あらかじめ屋根には土をのせている。荒壁が塗られた状態のものが大半を占める。しっくいを塗られて土蔵として完成されたものは少く、板倉から土蔵へと変遷した時期は明治以降と推定される。3。対馬板倉は集落のはずわに群倉としてまとまって建てられている。建設年代は明治以降のもの。構法は平角の柱を密に立て、貫で固めて厚い一枚板を柱間ははめ込んだもの一種類で,その変遷は認められない。調査錬究の対象となっている茨城県大子町,長野県八ケ岳山麓,長崎県対馬について,板倉構法の実地調査を行った結果以下の点が明らかとなった。1。茨城県大子町この地域では、板倉構法はせいろう組,落とし板倉,はめ板倉の順に変遷した。せいろう組は,雨仕舞を考慮して台形状に加工され、また貫通ダボの採用など、板倉として極めて洗練された構法として完成されている。落とし板倉とはめ板倉は、その簡略形で,木材節約を目的として採用されたと考えられる。2。長野県八ケ岳山麓この地域では、板倉構法はせいろう組,柱を併用したせいろう組、落し板倉の順に変遷した。せいろう組はさらに、その組みかたから、互組から平組へと移行した。その要因は、製材技術の発達による部材断面の整理されたことと考えられる。また、落とし板への変遷は、板の製材技術の発達と木材資源の節約と考えられる。この地域で特徴的な点は、板倉から土蔵への変遷が観察されることであり、これは明治期以降、防火を目的として土蔵化された。その結果板倉は、土蔵の下地にとどまり、板倉として洗練されるには至らなかった。3。長崎県この地域では偏平な柱を繁く建て,その間に板を落とし込んだはめ板倉が普及している。構法の詳細は明らかにされたが,その成立過程は次年度の課題として残された。1。2。3。
３次元ＬＳＩ配線に向けた金属／ポリマー導電体におけるナノ粒子の役割

本研究課題は次世代3次元LSIにおける縦型・微細な導電配線に関連する。これまでに、光アシスト効果を用いて溶液中から新奇な金属/導電性ポリマー複合体を創出し、先行技術の10倍以上の速さで導電配線を形成できることを見出した。課題はさらなる低抵抗化のための材料原理の確立であり、本研究においては、金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)と導電率との関係を解明した。この成果は、金属ナノ粒子を利用することで、金属/ポリマー複合体の導電性に関する新たな複合則を提案したという学術的特色をもち、現状数時間かかる導電配線の形成が数分まで短縮され、次世代3次元LSIの生産効率が大きく向上することに寄与する。研究の全体構想は次世代3次元LSIにおける縦型・微細な導電配線を実現することである。申請者は光アシスト効果を用いて溶液中から新奇な金属/導電性ポリマー複合体を創出し、先行技術の10倍以上の速さで導電配線を形成できることを見出した。課題はさらなる低抵抗化のための材料原理の確立である。研究の目的は、金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)と導電率との関係を解明することである。学術的特色は、金属ナノ粒子を利用することで、金属/ポリマー複合体の導電性に関する新たな複合則を提案することである。期待される結果として、現状の数時間かかる導電配線の形成が数分まで短縮され、次世代3次元LSIの生産効率が大きく向上する。当該年度では、主として金属/導電性ポリマーの導電率の算出を行った。具体的には、以下の通りに行った。金属/導電性ポリマーについては前年度に作製した金属銀/ポリピロール(ドーパント:硝酸およびテトラフルオロホウ酸)を用いた。金属/導電性ポリマーを塗布法によりガラス等の基板上に形成した。導電率は、測定した抵抗値と形状寸法より算出した。抵抗値の測定では、4探針法および微小プローブ法を用いた。形状寸法については、基板上に形成した金属/導電性ポリマーの厚さ(高さ)がサンプルによって異なるため、顕微鏡による断面観察または表面粗さ計を用いた段差計測により金属/導電性ポリマーの厚さを決定した。サンプルの厚さを決定するために必要な加工が断面観察よりも簡便な段差計測を導入することで、導電率の算出に要する時間を短縮することができた。当該年度では、主として金属/導電性ポリマーの作製を以下の通り行った。有機ポリマーを化学重合により得るための反応前駆体(有機モノマー)としてピロール、有機ポリマーに導電性を付与するためのドーピングアニオン(BF4-およびNO3-)、金属として析出させるカチオンとして銀イオン(Ag+)を使用し、溶媒であるアセトニトリル等に溶解させた。基板にはガラスを用い、溶液に浸漬させた。反応系に対し、高圧水銀ランプを用いて紫外光の照射を行った。所定の時間、反応を行った後、基板とともに生成物を溶液より取り出し、乾燥させた。なお、溶液中の有機モノマーと金属カチオンとの比を変えることで、形成する金属/導電性ポリマーにおける金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)を変えた。申請者は光アシスト効果を用いて溶液中から新奇な金属/導電性ポリマー複合体を創出し、先行技術の10倍以上の早さで導電配線を形成できることを見出した。

当該年度では、主として、金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)の評価を行った。具体的には、以下の通りに行った。金属/導電性ポリマーについては、前年度までに作製した金属銀/ポリピロール(ドーパント:硝酸およびテトラフルオロ酸、ヘキサフルオロリン酸)を用いた。金属/導電性ポリマーを塗布法によりガラス等の基板上に形成した。SEMによる観察およびEDSによる元素分析を行い、含有率、サイズ、形状を評価した。結果として、銀イオンに対する配位エネルギーが小さいドーパントを用いることで、同じ銀含有率においても、析出する銀粒子のサイズが小さく、球状になることが明らかとなった。これにより、金属/導電性ポリマーの導電率が向上した。以上より、当該年度の研究計画を達成するとともに、本研究の目的を達成することができた。電気化学研究の目的は、金属/導電性ポリマーにおける金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)と導電率との関係を解明することである。この研究目的を達成するため、当該年度は主として金属/導電性ポリマーの導電率の算出を行った。なお、簡便なサンプル加工手法を導入することで、金属/導電性ポリマーの導電率の算出に要する時間を当初の想定よりも短縮することができた。以上より、研究の目的の達成度について、当初の計画以上に進展していると評価できる。研究の目的は、金属/導電性ポリマーにおける金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)と導電率との関係を解明することである。この研究目的を達成するため、当該年度は有機モノマー、ドーピングアニオン、金属カチオンを含む溶液に基板を浸漬させ、光照射を行うことで金属/導電性ポリマーを作製した。なお、金属/導電性ポリマーを作製する際、反応系に照射する光だけでなく、印加する熱を独立に可変制御するシステムを作ることができた。これにより、生成する金属/導電性ポリマーにおける金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)をより精密に制御することが可能となった。本研究課題の今後の推進方策について、金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)の評価を行う。具体的には、SEMによる観察やEDSによる元素分析を行う予定である。本研究課題の今後の推進方策について、導電率の算出および金属の存在状態(含有率、サイズ、形状)の評価を行う。前者については、4探針法による抵抗測定および膜厚測定を行い、後者については、SEMによる観察やEDSによる元素分析を行う予定である。消耗品(550千円):抵抗測定交換用プローブ、抵抗測定用ジグ、試薬、ガラス器具等旅費(500千円):研究成果発表に伴う外国出張人件費・謝金(350千円):実験補助その他(100千円):論文投稿、通信費等
エバネッセント音場を用いた近接センサの研究

本研究では、屈曲振動子周辺に生ずるエバネッセント音場が振動子の振動に非常に大きな影響を与える性質を利用した近接センサについて、その実用システムについて検討を行ってきた。本年度の研究により以下のことが明らかとなった。1.エバネッセント音場が形成される屈曲共振モードについて、屈曲次数を変えたときの検知性能の調査を行った。その結果、屈曲振動子の端部におけるエバネッセント音場を利用した場合には、低い屈曲次数(低周波数)において感度が良くなることが示された。また、屈曲振動面全体を用いた場合には、その差異はみられなかった。2.共振回路の閉ループに屈曲振動子を組み込み、その発振出力電圧から近接度を読み取る近接センサの実用システムを提案・制作した。この結果、ウィーンブリッジ回路を発振回路とした場合には、良好な発振電圧変化が現れることが明らかになった。これにより、莫大なコストが必要なインピーダンスアナライザによる近接検知を行わず、非常に安価な共振回路を用い、その共振出力電圧等を計測するシステムが構築された。本方式により近接センサが実用化される可能性が大きくなったと考えられる。3.本近接センサは気体の粘性減衰を用いていることから、気圧・気種センサとしての利用の可能性を探った。この結果、気圧が減少するにしたがって、電気端のインピーダンスが下がっていくことが明らかとなった。また、共振周波数は気圧が減少するにしたがい、低下することが明らかになった。この現象については、今後の研究も期待される。本研究では、屈曲振動子周辺に生ずるエバネッセント音場が振動子の振動に大きな影響を与える性質を利用して、近接センサを実現することを目的としており、本年度の研究により以下の成果が得られた。1.エバネッセント音場形成のための屈曲振動子の形状、及びその動作周波数の条件を理論的な解析より求めた結果、0.1mm厚のLINbO_3振動子を50kHz以下で駆動することにより、エバネッセント音場が形成されることが明らかとなった,また、LINBO_3分極反転板を屈曲振動子を用いることにより、電気信号で駆動可能な高いQ値を持つ振動子が実現できることがわかった。LiNbO_3分極反転屈曲振動子の作製方法を調査し、再現良いセンサの製作を開発した。2.検知対象物一屈曲振動子間距離による振動子の電気端インピーダンスの変化を測定した。その結果、検知対象物が屈曲振動子に近づくにつれて屈曲振動子の電気端インピーダンスが増大することが明らかとなり、近接センサとして利用できることが示された。3.様々な検知対象物を用いたときにどのように屈曲振動子の電気端インピーダンスが影響されるか調べた。その結果、本センサは殆ど検知対象物の依存性がないことが明らかとなった。また、屈曲振動子端部方向に生ずる音場において、検知対象物を近づけていった場合にも振動子の電気端インピーダンスが変化し、近接センサとして用いることができることが明らかとなった。この方法により近接を検知した場合には、約200μm程度以下の距離に検知対象物を近づけると再びインピーダンスが増加する現象が明らかとなった。
感温性機能ゲル粒子の創製と高機能マイクロリアクターへの応用

3種の有機、無機材料(感温性ゲル、酸化チタン・四酸化三鉄ナノ粒子)を複合化させ、その機能を協奏的に組み合わせる事で、高度に機能集積した材料の創製に成功し、更に高機能マイクロリアクターとしての応用可能性を示すことができた。光触媒ナノ粒子(酸化チタン)の水処理への応用において問題となるハンドリング性は、ゲル粒子に包括すること、また、同時に包括する四酸化三鉄の磁性を利用することで向上した。また、その結果生じる基質や生成物の拡散速度の低下は、四酸化三鉄のもう一つの特性である誘導加温を利用した感温性ゲルの膨潤収縮(温度応答性ポンピング)によって改善可能であった。本研究では、感温性ゲル粒子に機能性粒子として、光触媒能を持つ酸化チタン(TiO2)および磁性を持つ四酸化三鉄(Fe3O4)のナノ粒子を複合化し、それらの機能を協調的、協奏的に用いる事で高度に機能集積した有機-無機複合材料を創製する事を目的としている。今年度の研究では、1.感温性ゲル粒子にTiO2やFe3O4粒子を入れる事で、ゲル粒子の温度応答性(膨潤・収縮率)がどの程度変化するか、2.得られた感温性機能ゲル粒子に交流磁場を印加し、ゲル粒子のみの局所加熱が可能かどうか、またこれによりゲル粒子の温度応答を引き起こす事が可能かどうかを検討した。まず、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー(PNIPAM)とアルギン酸からなる感温性ゲル粒子を、単ノズル微粒化法で調製した。また1-4wt%の濃度でそれぞれTiO2やFe3O4粒子を複合化した感温性ゲル粒子を調製し、温度変化に伴う各ゲル粒子の体積変化を測定したところ、無機粒子を複合化することでゲル粒子の温度応答性は若干であるが鈍化すること、その鈍化の割合は無機粒子濃度の増加と共に増加する事が分かった。またその効果はTiO2の方が顕著である事が分かった。次に、交流磁場発生磁場装置を購入し、上記の実験で調製したFe3O4粒子を複合化した感温性ゲル粒子への交流磁場印加実験(誘導加熱)を行った。その結果、これによりゲル粒子の局所加熱が可能な事、またそれに付随してゲル粒子の体積変化(収縮)が起きる事が確認された。また粒径の異なる2種類のFe3O4粒子(約15nm、約200nm)を用いて同様の実験を行った所、小粒径のFe3O4粒子の方が局所加熱に適している事が分かった。更に、交流磁場を断続的に印可した所、ゲル粒子の膨潤収縮が連続的に起こり、本研究で目指していた温度応答ポンピングが確認された。これにより本プロジェクトの目的の約50%は達成された。今年度の研究では、感温性ゲルにTiO2ナノ粒子を導入し、まず温度応答性ポンピングによる基質や生成物の強制拡散のない状態で光触媒活性を検討した。またゲル粒子の粒径制御のため、粒子作成時に使用する滴下ノズルのサイズが得られるゲル粒子の粒径に与える影響を検討した。光触媒能評価実験は、基質としてメチルオレンジ(MO)を用い、感温性ゲルの下限臨界溶液温度である32°Cより低温である25°Cと、高温である40°Cの条件下において、それぞれTiO2導入量を変化させたゲル粒子を用いて行った。結果より、TiO2導入量の影響については、予想通り、TiO2量が増加するにつれて、見かけの光触媒活性が上がる事が分かった。一方、温度の影響については、低温の方が見かけの触媒活性が高い事が分かった。これは低温ではゲルが膨潤状態にあるため、基質や生成物の拡散が早く、この効果が温度上昇による反応速度増加の効果を上回ったためと考えられた。また、ゲル粒子作成時に使用する滴下ノズルのサイズを変更する事で、ゲル粒子の粒径制御は可能であるが、ゲル粒子の粒径が小さくなるほど重合時のNIPAMモノマーのゲル粒子外への漏出割合が増えるため、この点を考慮する必要が有る事が分かった。これにより、最終年度に行なう総合的な実験及びシミュレーションに必要な検討はぼぼ終える事が出来た。本研究では、感温性ゲル粒子に機能性粒子として、光触媒能を持つ酸化チタン(TiO2)および磁性を持つ四酸化三鉄(Fe3O4)のナノ粒子を複合化し、それらの機能を協調的、協奏的に用いる事で高度に機能集積した有機-無機複合材料を創製する事を目的として研究を行った。まず昨年、一昨年の研究で、単ノズル微粒化法を用いて、無機ナノ粒子を複合した感温性機能ゲル粒子の調製法を確立し、得られたゲル粒子が通常の感温性ゲル粒子とほぼ同程度の温度応答性を示すこと、交流磁場印可によりゲル粒子のみを局所的に加熱可能なことを示した。また光触媒能の評価も終了している。そこで、最終年度である今年度の研究では、これまでに得られた感温性ゲル粒子の温度応答性実験や、TiO2の光触媒実験の結果をもとにシミュレーションを行い、温度応答ポンピング有り、無しの両条件下で感温性機能ゲル粒子の光触媒能を比較検討した。その結果、一定の条件下では温度応答ポンピング有りの方が高い光触媒能を示した。

次に、この温度応答ポンピングの効果を向上させるため、ゲル粒子調製時に凍結乾燥を行なうことでゲル内に多孔質構造を形成することを試みた。この結果、単位時間当たりの基質交換量を2倍程度にまで向上させることができ、簡便な方法で温度応答ポンピングの効果を改善させることができた。これにより、予定した実験はほぼ終える事ができた。上記の結果より、本研究では3種の有機、無機材料を複合化させ、その機能を協調的、そして協奏的に組み合わせる事で、より高度に機能集積した材料の創製に成功し、更に高機能マイクロリアクターとしての応用可能性を示すことができ、研究目的を達成できたといえる。本研究によって得られた成果は、他の高活性だがハンドリングの困難なナノ粒子の応用へ道を拓き、かつ、より高度な複合材料の発展に寄与をするものと考えられる。3種の有機、無機材料(感温性ゲル、酸化チタン・四酸化三鉄ナノ粒子)を複合化させ、その機能を協奏的に組み合わせる事で、高度に機能集積した材料の創製に成功し、更に高機能マイクロリアクターとしての応用可能性を示すことができた。光触媒ナノ粒子(酸化チタン)の水処理への応用において問題となるハンドリング性は、ゲル粒子に包括すること、また、同時に包括する四酸化三鉄の磁性を利用することで向上した。また、その結果生じる基質や生成物の拡散速度の低下は、四酸化三鉄のもう一つの特性である誘導加温を利用した感温性ゲルの膨潤収縮(温度応答性ポンピング)によって改善可能であった。科研費申請時に設定した以下の研究計画・方法の4項目のうち、今年度までで3項目を順調に終える事が出来、最終年度に最後の項目を残すのみとなった。研究計画: 1.感温性機能ゲル粒子の調製と温度応答性評価、2.局所加熱特性評価、3.光触媒能評価、4.温度応答ポンピングによる光触媒能向上実験また最終年度に行なう予定のシミュレーションについても既に着手しており、全体としておおむね順調に進展していると判断した。今年度までのデータは投稿論文として査読付きのジャーナルに掲載されている。材料科学26年度の光触媒能評価実験では、温度一定のスタティックな条件で光触媒能評価実験を行ったが、27年度の実験では、交流磁場を間欠的に印加し、温度応答ポンピングを行いながら実施する。これにより、温度応答ポンピングによって実際に光触媒能の向上が可能かどうか、また向上した場合、どの程度向上するのかを評価する。また、温度応答しない時の光触媒反応の反応速度と、温度応答による体積変化の実験結果から、温度応答ポンピング時の反応速度をシミュレーションし、実験結果と比較検討する。科研費申請時に目標とした、「研究期間内にどこまで明らかにしようとするのか」の3つの項目のうち、初年度で2項目をほぼ終える事ができた。高周波交流磁場を用いた局所加熱実験は2年目に行う予定であったが、この実験の成否が本プロジェクトの成否の鍵となっていたので、初年度に前倒しで行った。その結果、期待通りの結果を得ることができ、本プロジェクトの実現可能性に大きく近づけることができた。しかしこの実験のために、初年度に予定していた、細かなパラメーターを振る実験が行えなかったが、全体的には計画以上に進展している。高周波磁場装置の購入を初年度に150万円で予定していたが、予備実験の結果、当初予定していたスペックでは足りず、より高性能で高価な物を購入する必要に迫られた。そのため、装置に付随して必要な冷却器の購入を初年度はあきらめ、今年度にする必要が生じた。更に、購入を予定していた放射型温度計と恒温振盪水槽の購入を断念せざるを得なくなり、結果として若干使用額に差が生じる事となった。
アジア太平洋地域における連携工学設計教育ネットワーク構築の調査研究

本研究では、我が国発の工学設計の実践教育を外国の大学と共同して実施し、その評価法を検討する。金沢工業大学が推進してきた工学設計教育に外国人学生が参画し、チーム活動を実施し、工学設計プロセスを体験する教育システムを構築する。平成16年度は以下の通り実施した。(1)提携校への工学設計教育の導入昨年度に引き続き、本学で実施されている工学設計教育のシンガポール理工学院での展開性を検討した。また、実際に金沢工業大学とシンガポール理工学院とで同一テーマの工学設計活動を実施し、学生の成果物を交換した。(2)提携校における授業運営方式の検討昨年度に引き続き、シンガポール理工学院を訪問し、工学設計教育に関する授業運営方式を検討した。(3)提携校における学習計画方式の検討昨年度に引き続き、シンガポール理工学院を訪問し、工学設計教育に関する学習計画方式を検討した。(4)シンガポールと日本の学生間でのプロジェクト推進のためのコンセンサスの検討工学設計過程推進における文化の違いからくる考え方の相違をシミュレーションし、その方策を検討した。特に住居環境の違いを具的的に示す環境計測データの必要性から、本学が位置する地域の環境計測を実施しシンガポール理工学院の学生に提供できるようにした。(5)同期型授業運営システムの導入昨年度導入した同期型共同授業システムを用いて導入し、実際の工学設計の授業において適用可能であるかを調査した。具体的な設計案に関する情報交換に対しては、ビデオチャットシステムの活用に加えて途中経過を文書・画像データにして交換し合うことが必要であることが分かった。平成15年度は以下の通り実施した。(1)提携校への工学設計教育の導入シンガポール理工学院の工学教育を精査し、本学で実施されている工学設計教育のシンガポール理工学院での展開性を検討した。また、導入における指針を立て、実際に金沢工業大学とシンガポール理工学院との同一テーマで工学設計教育を推進し、学生の成果物を交換した。(2)提携校における授業運営方式の検討シンガポール理工学院を訪問し、工学設計教育に関する授業運営方式を検討した。(3)提携校における学習計画方式の検討シンガポール理工学院を訪問し、工学設計教育に関する学習計画方式を検討した。(4)シンガポールと日本の学生プロジェクト推進のためのコンセンサスの検討申請者らの企業での海外プロジェクトの経験を生かし、工学設計過程推進における文化の違いからくる考え方の相違をシミュレーションし、その方策を検討した。(5)同期型授業運営システムの導入学生のプロジェクト活動を推進するための同期型共同授業システムを導入し、実際の工学設計の授業において適用可能であるかを調査した。ビデオチャットシステムを試行した。
肺癌におけるATP citrate lyase(ACL)の役割

癌などの悪性腫瘍に共通してみられる特徴として、代謝異常があげられる。我々は、脂質代謝に関わる酵素の一つ、ATPクエン酸リアーゼ(ATP citrate lyase ; ACLY)に注目し、肺腺癌における役割と治療標的としての可能性を検討した。ACLYは細胞質内においてクエン酸を脂肪酸前駆体であるアセチルCoAに変換することによりde novo脂肪酸合成を促進する酵素であるが、解糖系と脂質代謝を連結するため代謝全体のバランスにも関与する。昨年度は、肺腺癌組織と正常組織を用いて、ACLYについてreal time PCR、ウエスタンブロット、免疫組織化学、酵素活性など測定し、ACLYは正常組織に比ベて、癌において有意に発現が高く、また高度にリン酸化されていることがわかった。162例の肺癌患者の組織標本を調べた結果、ACLYのリン酸化は臨床病期、組織学的分化度と相関し、予後不良因子であった。A549細胞株をヌードマウスに移植し、腫瘍に直接ACLYに対するRNAiを投与すると、有意に腫瘍体積の減少を認め、ACLYは肺癌の進行に深く関与しており、新しい治療標的としての可能性が示唆された。21年度はACLYの阻割による抗癌効果のメカニズムについて調べ、癌細胞株のなかでもACLYの阻害に感受性を示し、細胞死が誘導される細胞群と非感受性で増殖抑制効果を示さない細胞群があることがわかった。現在これらの感受性を制御している分子を探索中である。我々は、脂質代謝に関わる酵素の一つ、ATPクエン酸リアーゼ(ATP citratelyase ; ACLY)に注目し、肺腺癌における役割と治療標的としての可能性を検討した。今回、肺腺癌組織と正常組織を用いて、ACLYの発現をreal time PCR、ウエスタンプロット、免疫組織化学的に解析し、同時に酵素活性も測定した。ACLYは正常組織に比べて、癌において有意に発現が高く、また高度にリン酸化されていることがわかった。次に、肺腺癌の細胞株を用いて、プロトオンコジーンであるAktを強制発現させるとACLYのリン酸化が亢進し、AktのDominantnegativeやphosphatidyl-inositol-3 kinase(PI3K)阻害剤処理によってリン酸化が有意に減少することを認め、ACLYの活性化は、PI3K-Aktシグナル伝達系により制御されていることがわかった。肺腺癌細胞株A549を用いたRNAiによるACLYの特異的抑制では、細胞周期がG1期で止まり、増殖能も有意に減少したが、インスリンを投与すると部分的に増殖能の改善を認めた。また、ACLYの抑制により脂肪酸合成が有意に減少したが、驚いた事に、細胞内にはリン脂質や中性脂肪が逆に蓄積していた。最後に、A549細胞株をヌードマウスに移植し、腫瘍に直接ACLYに対するRNAiを投与すると、有意に腫瘍体積の減少を認めた。以上より、ACLYは肺癌の進行に深く関与しており、新しい治療標的としての可能性が示唆された。
地域開発・福祉行政における第3セクターの機能と統制

1今年度は昨年度の研究成果をふまえ、理論的研究を中心に遂行し、あわせてそれを補強するために全国550余の自治体首長にアンケート調査を行った。第3セクターの運営やそれに対する統制、行政的評価の実態については、設立の理由は第3セクターの事業目的によって様々であること、経済社会状況の変化を反映して第3セクター形態による事業展開の分野がハードを中心とするものからソフト面を中心とするものへと変化しつつあること、第3セクターの事業活動に対する評価は当該事業分野の性格によって様々であり一様には語れないこと、第3セクターに対する様々な統制一議会や首長部局による監視・監督等ははなはだ不十分な状態にあること、その他多くの新しい知見を得ることができた。第3セクターに対する法学的行政学的研究を通じて、従来の「行政主体論」的理論枠組にかわる新しい認識枠組を設定する必要性が確認され、また、従来の行政処分や行政指導を念頭に置いた「権利救済」を中心とする伝統的な行政統制手法は、第3セクターに対する統制論としては極めて不十分であり、立法論を視野にいれた枠組形成の努力が必要であること、また、現実的な統制としては、現行制度においては議会を通した統制が有効であり、それを活性化するために必要な方策が研究された。経済学的研究を通じて、第3セクターの政策効果を経済学的に解明する場合は、官民の出資比率が重要であること、その他の多くの新しい知見が得られた。1.今年度は基礎的データの収集・整理とフレームワークを中心に研究を行った。2.基礎的データの収集は、年鑑や各種行政機関の報告書等の刊行資料及び雑誌・文献を中心とし、同時に自治体に出向いて関係職員から実態の説明を受けた。また他大学に所蔵の資料等も調査収集した。その結果、長野県、東京都、神奈川県北海道、愛知県等の諸県及び松本市等県内市町村及び若干の県外市についてデータを収集することができ、電算処理しうる体勢が整った。それらの詳細な整理・分析は来年度の課題である。3.基礎的データの収集、整理と同時に、現行の地方自治及び公務員法制の下で、住民自治の観点からする第3セクターの統制の可能性を検討するために、それに関する粉争事例を過去に遡って調査研究すると共に、現に進行中の訴訟(例えば福井地裁平成4年行(ウ)第4号職員派遣差止等請求事件等)についても当事者からのヒアリングや裁判の傍聴等を通じて粉争の実質と問題点の把握に努めた。訴訟以外の行政相談等による苦情処理の実態を松本市他若干の市町村について行った。来年度はこれらの粉争事例とフレームワークを結びつける研究を行う予定である。4.フレームワークに関しては、研究分担者各自の領域において研究を続けた他、学内外の研究者との意見交流や福祉行政の分野における研究会を実施した。これらの理論研究の成果を政策課題の発見と提示に結びつける作業は来年度の課題である。
分子進化工学的手法を用いたNav1.7阻害薬の開発

今回、我々が遺伝子解析を行った無痛症患者では電位依存性ナトリウムチャネル(Nav1.7)の変異により触覚・痛覚・嗅覚は保たれ、痛み刺激に対する感受性のみが欠失していた。この無痛症患者と同様にNav1.7阻害薬の投与により無痛状態にすることが出来れば急性痛・慢性痛を抱える患者にとって非常に有益であると考え、Nav1.7阻害薬の開発を目的とし研究を行うこととした。我々が解析を行った無痛症患者でもNav1.7の遺伝子に変異があることが明らかとなった。この遺伝子が関与するNav1.7の部位はポア周囲であり、この遺伝子変異をもとに同様の変異を持つNav1.7を培養細胞に発現させてホールセルパッチクランプを行ったところ、ナトリウム電流の減弱を認めるもののチャネル機能としては保たれており、ランプ電流のみが著名に低下していることが明らかとなった。このようなわずかな構造変化によるイオンチャネル機能低下でも無痛状態になっていることが明らかとなり、完全なNav1.7阻害を行わずとも無痛状態にすることができることが示唆された。そこでin vivoでも変異Nav1.7のチャネル機能の評価が行えるように変異Nav1.7をもつ遺伝子組み換えマウスを作成し、このマウスでも痛みの受容性の低下を認めることが明らかとなった。今後、この遺伝子組み換えマウスを用いて生体内でのNav1.7の機能変化を明らかとしたうえで、Nav1.7阻害薬として機能する蛋白のスクリーニングを行いNav1.7阻害薬の開発を進めて行く方針である。Nav1.7の変異が痛みの受容や感覚にどのような影響を与えるのかを調べており、Nav1.7のポア周囲に結合するペプチドスクリーニングに関しては現時点ではまだ行えていない。一方、無痛症患者と同様のNav1.7変異を持つマウスの作成を行っており遺伝子組み換えマウスを作成できれば、Nav1.7変異の痛み受容への影響が更に明らかになり、ペプチドスクリーニングも効率良く行えると考えられる。無痛症患者と同様のNav1.7変異を持つマウスを用いて生体内での変異Nav.17の機能変化を明らかにし、ペプチドスクリーニングのターゲットを絞り込んでいきより効率よくNav1.7阻害薬の開発を目指す。遺伝子組換えマウスの作成を行っており、ペプチドスクリーニングが次年度への持ち越しとなったため次年度使用学が生じた。次年度は遺伝子組み換えマウスの作成および、ペプチドスクリーニングに使用する予定である。
アルツハイマー病と糖尿病の接点の解明（多価不飽和脂肪酸による予防法の開発）

アルツハイマー病は脳内でインスリンシグナルに異常があることから、3型糖尿病ともいわれている。しかし、脳の病気であるアルツハイマー病と肥満や糖尿病が合併した場合、アルツハイマー病病態が重篤化するかは不明である。本研究は1アルツハイマー病モデルマウスに高脂肪食を与え肥満を誘導した際、アルツハイマー病病態が重篤化するか、2食品成分により肥満を改善することでアルツハイマー病病態を予防可能か検討を行った。まず、多価不飽和脂肪酸を多く含む魚油含有高脂肪食給餌による食餌誘導性肥満改善メカニズムの解明を行った。魚油含有高脂肪食給餌はラード含有高脂肪食と比べて顕著な体重増加の抑制、ミトコンドリアの増加に伴う鼠径部白色脂肪組織の褐色化、体熱産生に関与する脱共役タンパク質1(Ucp1)の発現上昇を引き起こした。しかし、マウスの深部体温を測定したところ、魚油高脂肪食給餌マウスではラード含有高脂肪食と比べて明期の体温が低下したことから、魚油含有高脂肪食給餌による肥満改善メカニズムには、Ucp1の発現上昇による体熱産生亢進を介したものではないことが明らかとなった。さらに、アルツハイマー病モデルマウスを用いて肥満がアルツハイマー病病態に及ぼす影響を新規物体認識試験により評価した。ラード含有高脂肪食を給餌して肥満を誘導したアルツハイマー病モデルマウスでは、標準体型のアルツハイマー病モデルマウスと比べて認知機能の低下が認められた。魚油含有高脂肪食を給餌したアルツハイマー病モデルマウスでは、ラード含有高脂肪食給餌のアルツハイマー病モデルマウスよりも体重増加が抑制され、新規物体に対するアプローチ時間の増加が認められた。以上の結果から、肥満はアルツハイマー病病態を悪化させること、肥満を改善する食品成分はアルツハイマー病病態を改善することが明らかとなった。しかし、脳内の病気であるアルツハイマー病と末梢組織において肥満・糖尿病が同時に発症した場合、アルツハイマー病病態が悪化するかは不明である。本研究ではアルツハイマー病モデルマウスと肥満による肥満・糖尿病モデルを併用し、食品成分による疾病予防を目指して研究を行っている。本年度は1.アルツハイマー病モデルマウスの動物実験施設への導入と2.多価不飽和脂肪酸を多く含む魚油高脂肪食が食事誘導性肥満を改善するか検討した。1.について、アルツハイマー病モデルマウスの動物実験施設への導入は完了し、現在、実験に必要なマウスの繁殖を行っている。2.について、野生型マウスにラードを含む高脂肪食と、多価不飽和脂肪酸を含む高脂肪食として魚油を含有する高脂肪食を摂餌させ、その体重増加率を比較したところ、魚油高脂肪食摂餌マウスがラード高脂肪食摂餌マウスと比べて体重増加が抑制された。また、ラード高脂肪食摂餌によって誘導される耐糖能異常やインスリン抵抗性の改善が魚油高脂肪食摂餌マウスで認められた。これまでに魚油高脂肪食による抗肥満作用について多くの研究が行われている。しかしながら本研究の結果において、既存の報告とは異なる表現型を確認した。これらの結果をふまえ、魚油高脂肪食に多く含まれる多価不飽和脂肪酸の摂取がどのようなメカニズムで抗肥満作用を示すかについて検討を行っている。アルツハイマー病モデルマウスの動物実験施設への導入は終了し、実験に必要な動物の繁殖に着手している。さらに、野生型マウスにラードを含む高脂肪食と、多価不飽和脂肪酸を含む高脂肪食として魚油を含有する高脂肪食を摂餌させ、その体重増加率を比較したところ、魚油高脂肪食摂餌マウスがラード高脂肪食摂餌マウスと比べて体重増加が抑制された、多価不飽和脂肪酸を多く含む魚油高脂肪食が食事誘導性肥満を顕著に抑制することを確認している。以上の点から、当初の計画に対しておおむね順調に進展している。しかし、脳内の病気であるアルツハイマー病と末梢組織において肥満・糖尿病が合併した場合、アルツハイマー病病態が重篤化するかは不明である。本研究はアルツハイマー病モデルマウスが肥満により肥満・糖尿病を発症することでアルツハイマー病病態が重篤化するか、食品成分により肥満・糖尿病を改善することでアルツハイマー病病態を予防可能か検討を行っている。本年度は1.多価不飽和脂肪酸を多く含む魚油高脂肪食による食餌誘導性肥満の改善メカニズムの解明と、2.アルツハイマー病モデルマウスの認知機能障害を魚油含有食給餌により改善できるか検討した。1.について、魚油含有高脂肪食はラード含有高脂肪食と比べて顕著な体重増加の抑制が認められた。この際、長期飼育によりミトコンドリアの増加に伴う鼠径部白色脂肪組織の褐色化や体熱産生に関与する脱共役タンパク質1(Ucp1)の発現上昇が認められた。しかしながら、短期間の実験では鼠径部脂肪組織の褐色化やUcp1発現上昇は認められなかった。また、深部体温を測定したところ、魚油高脂肪食給餌マウスではラード含有高脂肪食と比べて明期の体温低下が認められた。これらのことから魚油高脂肪食による肥満改善メカニズムには、Ucp1の発現上昇による体熱産生亢進を介したものではないことが示唆された。

2.について、ラード含有高脂肪食と魚油含有高脂肪食を給餌したアルツハイマー病モデルマウスの認知機能を評価するためY字迷路試験を実施した。魚油含有高脂肪食給餌マウスはラード含有高脂肪食給餌マウスよりも、短期記憶の指標である交替行動数を顕著に増加させ、認知機能の改善が認められた。現在、魚油による認知機能の改善メカニズムについて検討中である。本年度は、魚油含有高脂肪食の肥満抑制メカニズムの解明を行った。深部体温測定系を確立し、魚油含有高脂肪食とラード含有高脂肪食での体温を比較し、魚油が体温上昇を介さずに抗肥満作用を示すことを見出した。また、アルツハイマー病モデルマウスを用いて魚油含有高脂肪食とラード含有高脂肪食での認知機能の解析を行い、一定の成果が得られた。以上の点から、当初の計画に対しておおむね順調に進展している。アルツハイマー病は脳内でインスリンシグナルに異常があることから、3型糖尿病ともいわれている。しかし、脳の病気であるアルツハイマー病と肥満や糖尿病が合併した場合、アルツハイマー病病態が重篤化するかは不明である。本研究は1アルツハイマー病モデルマウスに高脂肪食を与え肥満を誘導した際、アルツハイマー病病態が重篤化するか、2食品成分により肥満を改善することでアルツハイマー病病態を予防可能か検討を行った。まず、多価不飽和脂肪酸を多く含む魚油含有高脂肪食給餌による食餌誘導性肥満改善メカニズムの解明を行った。魚油含有高脂肪食給餌はラード含有高脂肪食と比べて顕著な体重増加の抑制、ミトコンドリアの増加に伴う鼠径部白色脂肪組織の褐色化、体熱産生に関与する脱共役タンパク質1(Ucp1)の発現上昇を引き起こした。しかし、マウスの深部体温を測定したところ、魚油高脂肪食給餌マウスではラード含有高脂肪食と比べて明期の体温が低下したことから、魚油含有高脂肪食給餌による肥満改善メカニズムには、Ucp1の発現上昇による体熱産生亢進を介したものではないことが明らかとなった。さらに、アルツハイマー病モデルマウスを用いて肥満がアルツハイマー病病態に及ぼす影響を新規物体認識試験により評価した。ラード含有高脂肪食を給餌して肥満を誘導したアルツハイマー病モデルマウスでは、標準体型のアルツハイマー病モデルマウスと比べて認知機能の低下が認められた。魚油含有高脂肪食を給餌したアルツハイマー病モデルマウスでは、ラード含有高脂肪食給餌のアルツハイマー病モデルマウスよりも体重増加が抑制され、新規物体に対するアプローチ時間の増加が認められた。以上の結果から、肥満はアルツハイマー病病態を悪化させること、肥満を改善する食品成分はアルツハイマー病病態を改善することが明らかとなった。今後は以下のような検討を進めていく。1.アルツハイマー病モデルマウスの繁殖を行い、実験に必要な数が揃った段階で、高脂肪食の摂取がアルツハイマー病病態に及ぼす影響について検討する。2.ラード含有高脂肪食と魚油含有高脂肪食をアルツハイマー病モデルマウスに与え、魚油の摂取がアルツハイマー病病態に及ぼす影響について検討する。3.魚油高脂肪食がどのようなメカニズムで食事誘導性肥満を抑制するかについて検討する。1.魚油高脂肪食がどのようなメカニズムで食事誘導性肥満を抑制するかについてさらに検討を続ける。
核染色による絶対寄生性土壌病害菌の発芽検定法の確立と発芽誘引シグナルの探索

絶対寄生性の土壌病害菌であるアブラナ科根こぶ病菌のレース識別は、従来、検定植物への接種試験により行われていた。これを根こぶ病菌のレース識別を分子マーカーを用いて簡便に行う方法を確立するために、大、小サブユニットリボソームRNA遺伝子の塩基配列、IGS領域および本遺伝子中に発見されたイントロンの解析を行った。1.IGS領域の解析:名古屋大学より分離されたNGY03株のIGS領域には14bpのパリンドローム配列の中心に反復配列が挿入されたものが、987-1248nt領域に5反復存在した。これら反復配列は、本菌のグループ分けの指標となる可能性が示唆された。2.イントロンの解析:大、小サブユニットで発見された4つのイントロンの二次構造予測を行ったところ、Group-Iイントロンに特徴的であるstem-loop構造が見つかった。また、系統解析から、S516_NGYイントロンはGroup-Iイントロンのうちのsubgroup IEに、Pbr.S943_NGY、Pbr.S1506_NGYおよびPbr.1094_HagiはsubgroupIC1に属することが示された。NGY03株を含む世界各地で分離された7種類の根こぶ病菌のPbr.S1506イントロンの塩基配列の比較により、米国産のArkansas(U19881)のものは、P5ドメインの配列の一部が欠損していることがわかった。さらに、NGY03とArkansas株のその領域の二次構造は異なっていることが推定された。萩市(Hagi)および広島市(Hiroshima)から分離された株で見つかったPbr.L1094イントロンは、HagiとHiroshima間でその長さおよび塩基配列が異なっていた。NGY03株のエクソンおよび各イントロンの塩基配列は、クローン間で相同性が高かったのに対し、HagiおよびHiroshima株で見つかったPbr.S1904イントロンではクローン間で相同性が低く、この領域は地理的隔離株の識別に利用できる可能性が示唆された。一方で、Group-Iイントロンに特徴的なモチーフ配列(P,Q,R,S)は、すべての分離株の間で保存性が高かった。絶対寄生性の土壌病害菌であるアブラナ科根こぶ病菌の感染機構と有機物連用による発病抑制メカニズムを明らかにする目的で、土壌中での休眠胞子の発芽検定法の確立とレース分化の分子解析を行っている。1.核染色による発芽検定法の確立これまで核(DNA)染色によく用いられてきたDAPIは、根こぶ病菌の休眠胞子細胞壁を(生死にかかわらず)染色するFluorescent Brightner 28(FB28)と蛍光波長域が重なるため、この2つの色素を同時に使って、根圏土壌から回収した全胞子数と核を喪失した(発芽した)胞子の数を測定することはできない。そこで、FB28とは蛍光波長域を異にする核染色色素であるSYT082 Orange Fluorescent Nucleic Acid Stainsを用いて、核及び細胞壁の二重染色を行い、根こぶ病菌胞子の全数と発芽率,(核喪失胞子の割合)を同時に測定できる実験系を確立した。本方法により(1)根圏での休眠胞子の核喪失(発芽)率と寄主への根毛感染数との間には有意な相関があること、(2)土壌酸性を中和すると、寄主根圏における胞子の発芽率が有意に低下し、それに続く根毛感染が減少すること、(3)非寄主の根圏においても休眠胞子は発芽する場合があることなどを明らかにした。2.分子生態解析および発芽誘因物質の同定従来、検定植物への接種試験により行われていた根こぶ病菌のレース識別を分子マーカーを用いて簡便に行う方法を確立するために、名古屋大学研究圃場より分離されたNGY03株のリボソームRNA遺伝子(rDNA)IGS領域の塩基配列を決定した。さらに他の菌株のIGS領域をPCR増幅するための万能プライマーを設計するために、NGY03のrDNA転写ユニット9.5kbpの全配列を決定し、この株のIGS領域を特異的に増幅するプライマーの組み合わせを選抜することに成功した。絶対寄生性の土壌病害菌であるアブラナ科根こぶ病菌の感染機構と有機物連用による発病抑制メカニズムを明らかにする目的で、土壌中での休眠胞子の動態解析と分子生態解析のためのマーカー探索を行っている。1.二重染色法による休眠胞子の根圏での動態解析細胞壁を特異的に染色するFluorescent Brightner 28と核染色色素であるSYT082 Orange Fluorescent Nucleic Acid Stainsを用いて、核及び細胞壁の二重染色を行い、根こぶ病菌胞子の全数と発芽率(核喪失胞子の割合)を同時に測定できる実験系を確立した。本方法により(1)根圏での休眠胞子の核喪失(発芽)率と寄主への根毛感染数との間には有意な相関があること、(2)土壌酸性をCaCO_3で中和する、あるいはCa含量の高い堆肥を土壌に混和すると、寄主根圏における胞子の発芽率が有意に低下し、それに続く根毛感染が有意に減少することを明らかにした。これらの結果から、有機物連用による根こぶ病の抑止の主要な要因は、土壌pHの上昇による根圏での休眠胞子の発芽抑制であると結論された。2.分子生態解析従来、検定植物への接種試験により行われていた根こぶ

病菌のレース識別を分子マーカーを用いて簡便に行う方法を確立するために、名古屋大学より分離されたNGY03株のリボソームRNA遺伝子(rDNA)転写ユニットの全塩基配列9.5kbpを決定すると共に、RT-PCRによりrRNAの配列を決定することにより、イントロンの挿入位置を特定した。この情報を基にHiroshimaおよびHagi00株の28SrDNAの配列を決定したところ、これらの株にはNGY03株に存在しないイントロンが挿入されており、そのイントロンの塩基配列をマーカーとしてレース識別ができる可能性が考えられた。絶対寄生性の土壌病害菌であるアブラナ科根こぶ病菌のレース識別は、従来、検定植物への接種試験により行われていた。これを根こぶ病菌のレース識別を分子マーカーを用いて簡便に行う方法を確立するために、大、小サブユニットリボソームRNA遺伝子の塩基配列、IGS領域および本遺伝子中に発見されたイントロンの解析を行った。1.IGS領域の解析:名古屋大学より分離されたNGY03株のIGS領域には14bpのパリンドローム配列の中心に反復配列が挿入されたものが、987-1248nt領域に5反復存在した。これら反復配列は、本菌のグループ分けの指標となる可能性が示唆された。2.イントロンの解析:大、小サブユニットで発見された4つのイントロンの二次構造予測を行ったところ、Group-Iイントロンに特徴的であるstem-loop構造が見つかった。また、系統解析から、S516_NGYイントロンはGroup-Iイントロンのうちのsubgroup IEに、Pbr.S943_NGY、Pbr.S1506_NGYおよびPbr.1094_HagiはsubgroupIC1に属することが示された。NGY03株を含む世界各地で分離された7種類の根こぶ病菌のPbr.S1506イントロンの塩基配列の比較により、米国産のArkansas(U19881)のものは、P5ドメインの配列の一部が欠損していることがわかった。さらに、NGY03とArkansas株のその領域の二次構造は異なっていることが推定された。萩市(Hagi)および広島市(Hiroshima)から分離された株で見つかったPbr.L1094イントロンは、HagiとHiroshima間でその長さおよび塩基配列が異なっていた。NGY03株のエクソンおよび各イントロンの塩基配列は、クローン間で相同性が高かったのに対し、HagiおよびHiroshima株で見つかったPbr.S1904イントロンではクローン間で相同性が低く、この領域は地理的隔離株の識別に利用できる可能性が示唆された。一方で、Group-Iイントロンに特徴的なモチーフ配列(P,Q,R,S)は、すべての分離株の間で保存性が高かった。