hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インドネシアにおける地方分権化：自然実験を利用した影響評価

アジア通貨危機後、インドネシアでは民主化が進み、その一環として地方分権制度の導入も急遽決定された。本研究では、まず、この制度の導入が住民の厚生水準に与えた影響を探った。これまでの分析からは、制度導入前に民族が多様であった地域ほど、導入後のインフラ整備状況の水準(アスファルト舗装率)および都市人口割合が相対的に低くなっていることが確認された。次に、行政村単位のパネルデータを援用してオリジナルの都市圏データを構築し、ジャワ島で発生した地震によって生じた都市圏の人口成長率の違いを自然実験とみなして分析した結果からは、都市圏の成長が周辺農村部の(特に貧困層の)消費水準を高めていたことが確認された。本研究では、インドネシアを事例に、(1)地方分権化が住民の厚生水準に与えた影響と、(2)地方分権化に伴う厚生水準の変化が住民の投票行動に与えた影響、について定量的に厳密な手法で分析する。インドネシアでは、中央政府から権限が委譲されることになった地方自治体(県・市)の数が増え続けており、地方分権化の導入直後に354あった県・市が、分裂を繰り返した結果、500近くにまで膨れ上がっている。この地方分立の過程で生じた自然実験的状況に着目し、地理的に小さな行政単位への権限委譲がもたらした影響を厳密なかたちで定量分析することを目指している。初年度にあたる平成25年度は、まず、地方分権化に関する先行研究サーベイを通じて理論的枠組みを整理し、検証すべき仮説の精緻化を図った。次に、地方自治体の分立に伴い制定された法令などの資料を活用して、自然実験的状況が生じた地域の選出を進めた。第三に、政府が実施している家計調査結果や村落悉皆調査結果について、それぞれ個票データの最新版を入手し、後者については村レベルのパネルデータの構築を進めた。このパネルデータの構築は自然実験的状況が生じた地域を中心に進めている。また、地方自治体の財政状況についてもデータを入手し、入力作業を進めている。最後に、投票行動を確認するために、2009年に実施された総選挙結果資料(県・市単位の集計値)の入手・整理を行った。さらに、2014年の総選挙を直前に控えて、住民の投票行動についての一次情報を得るべく、いくつかの村・地区を訪問してヒアリングを行った。本研究では、インドネシアを事例に、(1)地方分権化が住民の厚生水準に与えた影響と、(2)地方分権化に伴う厚生水準の変化が住民の投票行動に与えた影響、について定量的分析を行う。インドネシアでは、地方分権化の導入後、地方自治体(県・市)の数が増え続けており、地方分権化の導入直後に354あった県・市が、分立を繰り返した結果、500近くにまで増えている。この過程で生じた自然実験的状況に着目し、地理的に小さな行政単位への権限移譲がもたらした影響を厳密な手法で分析することを目的としている。二年目にあたる平成26年度は、まず、インドネシアで実施された2014年総選挙の結果について情報を県・市ごとに収集し、1999年以降5年ごとに実施されてきた選挙結果とつなぎあわせてパネルデータセットを構築し、暫定的ながら国会議員選挙時に観察された投票行動分析を行った。この分析結果についてはInstitute of Southeast Asian Studies(ISEAS)でのセミナーにて報告し、Discussion Paperにまとめて公開した。次に、スマトラ島に位置するランプン州内のいくつかの村・地区を選び、個人の投票行動についてアンケート調査を通じて収集した。また、地方分権化後の県・市ごとの地方財政(決算)データについても入力作業をほぼ終わらせた。最後に、村落情報のパネルデータセット構築作業についても、2002年版と2011年版との接合作業をほぼ終わらせた。3年目にあたる平成27年度は、まず、村落情報の2002年および2011年の二年分のパネルデータを地理情報ならびに2010年人口センサス情報とマッチングさせたデータセットをもとに、行政村単位での人口密度や非農業人口割合などの変化を報告書としてまとめた(「インドネシアの都市化:2002年と2011年の比較」(共著))。次に、5カ年分(1999年から2011年まで3年おきに集められた個票データを用いている)の行政村レベルでのパネルデータの構築が終了していた北スラウェシ州については、2010年人口センサスとマッチングしたデータセットを用いて、同州におけるインフラ整備状況などの変化や人口移動について整理し、報告書にまとめた(「インドネシアの都市化:北スラウェシ州のケース」)。最後に、北スラウェシ州以外の地域についても1999年から2011年にかけての5カ年分のデータを用いた行政村レベルのパネルデータセットの構築を進め、年度末までに大部分の州についてその作業を終了させた。村レベルのパネルデータ構築作業に時間を要したため。

古いデータほど、想定していた以上に手作業での確認が必要となった。また、マッチング作業に用いた資料の一部に誤記が確認され、その修正作業にも時間を要した。本研究では、インドネシアを事例に、(1)地方分権化が住民の厚生水準に与えた影響と、(2)地方分権化に伴う厚生水準の変化が住民の投票行動に与えた影響、について定量的分析を行う。インドネシアでは、地方分権化の導入後、地方自治体(県・市)の数が増え続けており、地方分権化の導入直後に354あった県・市が、分立を繰り返した結果、500近くにまで増えている。この過程で生じた自然実験的状況に着目し、地理的に小さな行政単位への権限移譲がもたらした影響を厳密な手法で分析することを目的としている。平成28年度は、まず、世界銀行が収集・公開している地方財政情報を整理し、統計庁が公開している情報との整合性を確認した上で、地方自治体レベルでのパネルデータの構築を進めた。次に、2000年人口センサスの個票データを入手し、クリーニングを施したうえで、2010年の人口センサス情報とコミュニティー(行政村)・レベルでマッチングする作業を行った。ある1つの州についてのみまだ不完全な状態ではあるが、2010年時点の行政村の数でみれば約97%のマッチングに成功した。なお、この情報を援用して、Discussion Paper原稿を共著で二本執筆した(「The Causal Effect of Urbanization on Rural Poverty Reduction:Quasi-Experimental Evidence using Indonesian Urban Area Data」および「Human Capital Externalities in Indonesian Cities」)。最後に、2015年12月ならびに2017年2月に実施された統一地方首長選挙の選挙結果についての情報収集を進めた。特に後者については村レベルでの情報収集を行った。行政村レベルのパネルデータ構築作業に時間を要したため。村落センサスの人口情報に不備があることが分かったことから、人口センサスの個票データを用いた分析が不可欠となったが、2000年の人口センサスの個票データのクリーニング作業ならびに2010年人口センサスとの村レベルでのマッチング作業に膨大な時間を要した。本研究では、インドネシアを事例に地方分権化が住民の厚生水準に与えた影響を探っている。インドネシアでは、2001年の地方分権導入後、地方自治体(県・市)の数が増え続けており、地方分権化の導入直後に354あった県・市が、分立を繰り返した結果、500近くにまで増えている。最終年度にあたる平成29年度は、地方分権導入以前から存在した地域間の民族多様性の違いに注目し、その多様性の違いが地方分権導入後、各地域のインフラ整備水準に及ぼした影響を探り、成果を「インドネシアの都市化:地方分権制度の影響」としてまとめた。
新しい酵素添加酵素モデル銅錯体の開発とオレフィンの不斉エポキシ化触媒反応への応用

2活性種・反応機構の検討.(1)速度論研究から、反応は基質に一次、銅錯体に二次である。(2)反応系の分光学的研究から、酸素化剤iodosylbenzeneの添加により吸収極大の変化は小さいが、吸収強度が大きく変化し、更に基質の添加により、吸収強度はわずかながら変化する。この事は、銅(III)錯体あるいは銅(IV)錯体は生成していない事を示す。(3)ESR測定から、出発銅錯体は、g=2.2付近に異方性の小さい吸収を与えるが、iodosylbenzeneの添加によりESRシグナルは消失する。以上の結果から、活性種は、銅(III)錯体でなくiodosylbenzeneが架橋した二核銅(II)錯体であり、基質の配位により6配位錯体を経て反応が進行してゆくと考えられる。3オレフィンの不斉エポキシ化反応.4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridineにキラルな-methylbenzylamine,1-mehtholを各々ペプチド、エステル結合で導入した新しいキラル配位子を合成し、それらの銅錯体によるtrans-stilbeneのエポキシ化反応を行なったところ、e,e4.4%、11%の基質立体選択性が得られた。これは銅錯体では最初の例であり、今後の展開が期待される。
核異型関連遺伝子のGFP融合蛋白質を利用した探索

病理学における大きな診断要素とされている核異型事象を、分子細胞生物学的に遺伝子レベルで解明することを目指して本実験は計画された。すなわち強制発現プロモーター下流に全長のcDNAライブラリーをdirectionalに組み込み、さらにその下流にバイシストロニックな共発現が可能になるIRES部位を介しで導入マーカー兼核形態観察マーカーである核局在性のGFP遺伝子を配したベクター系をスクリーニングに用いることで、遺伝子導入された細胞のみで核の形態が蛍光顕微鏡下で観察可能になるという、独創的実験系を利用した遺伝子探索計画である。ホスト細胞やベクターの改変などを詳細に行うことで昨年度有効性を確認したこの実験系を利用して、今年度は順調に核の形態変動を指標としたスクリーニングを行った。当初の予定通り半自動化した機械による陽性クローン選択と同時に、肉眼観察によるより詳細な判別を並行利用したため、当初の予想より一次選択で時間がかかってしまったものの、数的に目安となる目標であった約20000クローンのスクリーニングは終了した。より確実な原因遺伝子を選択する目的で数回にわたり選択プロセスを繰返し、更にスクリーング過程で混入した混在クローンから原因遺伝子を取捨して選び出した結果、24個の核形態変化を惹起する遺伝子を選び出した。これらの遺伝子としては核内移行・核外移行関連遺伝子やアポトーシス関連遺伝子など、核の形態変動を引き起こす可能性が高い遺伝子が過半を占める一方、現時点で全く機能不明な遺伝子や、従来から解析されているものの核形態に関連する機能などは全く想定されていない遺伝子などがあり、その内訳は多岐に亘っていた。現在核形態に関して新規の機能が想起されるような遺伝子や特徴的な形態変化を引き起こす9個の遺伝子について更なる解析を行っている。今年度で目標としていた実験系の確立は様々な改変を加えた結果、ほぼ完成した。当初予定ではGFP融合蛋白質を利用して異型核内での局在性の変化を指標にスクリーニングを行う予定でいたが、この方法では予想以上に核内に移行する遺伝子産物が多く、陽性クローンの選択が困難であった。そこでより直接的に核異型を誘起できる能力を持った遺伝子を選択するために、以下のような実験系を考案した。すなわち真核細胞強制発現プロモーター下流に全長のcDNAライブラリーをdirectionalに組み込み、さらに蛋白質のバイシストロニックな共発現が可能になるIRES(Internal Ribosome Entry Site)部位を介して核全体に局在するよう核移行シグナルを融合させたGFP遺伝子をタンデムな形で繋げたプラスミドの遺伝子導入実験系である。これにより蛍光顕微鏡観察下では遺伝子導入された細胞でのみで核全体が緑色に確認されることになり、遺伝子導入による核形態変化を容易に観察可能な理想的な実験系が作成できた。この実験系では当初想定されたフレームの問題なども無いため、選択効率が3倍以上になることが予期され、この点でも大きな向上が期待される。さらに以前開発した多検体のプラスミド調整法にも様々な改良を新たに施すことで、遺伝子導入に必要なサンプル回収における質的・量的側面での進展をはかれた。今年度予定では30000クローン程度をスクリーニングする予定であったが、計画の変更や手法の改善などに時間を振り向けた為、スクリーニング終了クローンは約5000クローンになってしまった。しかし安定した実験系が確立され、さらに陽性クローン選択にも自動化の可能性が見うけられることから計画終了時には想定していた50000クローンのスクリーニングは十分可能と考えている。
単結晶超合金異相界面近傍のマイクロ・メゾ構造と強化機構の解明および高機能化

本研究では,微視構造を有する材料の高機能化,高強度化を行うべく,微視レベルの詳細な変形機構を捉え,その結果生ずる巨視的な変形挙動を明らかにするために,微視的観点に立脚したいくつかの力学手法の高精度化及び種々の変形応答を記述可能な形式への一般化を行った.ついで,これらを用いた数値シミュレーションによって微視構造を有する材料に特有の変形挙動を解明した.以下に得られた成果を示す.(1)固有ひずみ場を用いたSubdivisions Methodの高精度化をはかり,一方向繊維強化型複合材及び短繊維強化型複合材に対して適用し,適切な繊維の配置により,必要な剛性を得ることができることを示した.(2)ひずみ勾配依存型構成式を導入した均質化法によるシミュレーション結果から,複合材内部の強化粒子間隔が減少し,マトリクス相に大きなひずみ勾配が発生する場合,複合材の変形抵抗が増加することを確認した.これより,強化材の粒子寸法を小さく,使用環境下の力学状態に応じてマトリクス相に発生するひずみ勾配項を大きくするような粒子配置を選択することで,複合材の変形抵抗を改善可能であることを示唆している.(3)結晶塑性理論を導入した3次元均質化モデルを構築し,有限要素シミュレーションにより,γ'相の体積含有率及びγ'/γ両相の結晶方位の違いが,巨視的な変形特性に及ぼす影響について検討を行った.その結果,γ'/γ両相の異方性弾性係数の差が小さく,γ'相体積含有率の違いが巨視的な弾性特性に与える影響は小さいこと,γ'/γ両相の空間配置に対応した結晶方位を(101)面内で変化させた場合に比して,(001)面内で変化させた場合に,粘塑性特性に大きな差異を発生させることを明らかにしている.これは,γ'相の存在に起因する不均一変形場に誘起される各すべり系でのせん断ひずみ速度が結晶方位の違いにより大きく異なるためである.本研究では,微視構造を有する材料の高機能化,高強度化を行うべく,微視レベルの詳細な変形機構を捉え,その結果生ずる巨視的な変形挙動を明らかにするために,微視的観点に立脚したいくつかの力学手法の高精度化及び種々の変形応答を記述可能な形式への一般化を行った.ついで,これらを用いた数値シミュレーションによって微視構造を有する材料に特有の変形挙動を解明した.以下に得られた成果を示す.(1)固有ひずみ場を用いたSubdivisions Methodの高精度化をはかり,一方向繊維強化型複合材及び短繊維強化型複合材に対して適用し,適切な繊維の配置により,必要な剛性を得ることができることを示した.(2)ひずみ勾配依存型構成式を導入した均質化法によるシミュレーション結果から,複合材内部の強化粒子間隔が減少し,マトリクス相に大きなひずみ勾配が発生する場合,複合材の変形抵抗が増加することを確認した.これより,強化材の粒子寸法を小さく,使用環境下の力学状態に応じてマトリクス相に発生するひずみ勾配項を大きくするような粒子配置を選択することで,複合材の変形抵抗を改善可能であることを示唆している.(3)結晶塑性理論を導入した3次元均質化モデルを構築し,有限要素シミュレーションにより,γ'相の体積含有率及びγ'/γ両相の結晶方位の違いが,巨視的な変形特性に及ぼす影響について検討を行った.その結果,γ'/γ両相の異方性弾性係数の差が小さく,γ'相体積含有率の違いが巨視的な弾性特性に与える影響は小さいこと,γ'/γ両相の空間配置に対応した結晶方位を(101)面内で変化させた場合に比して,(001)面内で変化させた場合に,粘塑性特性に大きな差異を発生させることを明らかにしている.これは,γ'相の存在に起因する不均一変形場に誘起される各すべり系でのせん断ひずみ速度が結晶方位の違いにより大きく異なるためである.本研究では、単結晶超合金を対象とし、異相界面近傍のマイクロ・メゾ構造と強化機構を解明し材料の高機能化を図るための基礎研究を行い、以下の成果を挙げた。(1)既設の電子顕微鏡・原子間力顕微鏡を用いて、単結晶材料に変形を加え、結晶内における不均一変形と負荷方位の関連、析出材料の異相界面近傍のマイクロ・メゾスケールの構造変化を詳細に観察した。(2)異相界面近傍の,分子動力学によるマイクロスケールの変形挙動のシミュレーションモデルを構築し、、格子構造安定性から界面の安定性を検討した。同時に、異相界面近傍は通常の金属材料とは異なるために、シミュレーション領域の設定あるいは周期境界の妥当性,ポテンシャルの選定等を慎重に検討し適切なモデルを構築した。ついで,ミスフィット量ならびにエネルギを評価した.(3)析出相の単位構造を決定し、それに均質化手法と高次連続体理論を援用することにより、マクロな3次元応答を表すマクロメカニカルモデルを構築し、その応答をシミュレートするプログラムを作成した。同モデルによって、析出材料の強化機構を説明することができ、任意の方向に負荷した場合の材料の応答特性を初めて評価した。本研究では,微視構造を有する材料の高機能化,高強度化を行うべく,微視レベルの詳細な変形機構を捉え,その結果生ずる巨視的な変形挙動を明らかにするために,微視的観点に立脚したいくつかの力学手法の高精度化及び種々の変形応答を記述可能な形式への一般化を行った.ついで,これらを用いた数値シミュレーションによって微視構造を有する材料に特有の変形挙動を解明した.以下に得られた成果を示す.

(1)固有ひずみ場を用いたSubdivisions Methodの高精度化をはかり,一方向繊維強化型複合材及び短繊維強化型複合材に対して適用し,適切な繊維の配置により,必要な剛性を得ることができることを示した.(2)ひずみ勾配依存型構成式を導入した均質化法によるシミュレーション結果から,複合材内部の強化粒子間隔が減少し,マトリクス相に大きなひずみ勾配が発生する場合,複合材の変形抵抗が増加することを確認した.これより,強化材の粒子寸法を小さく,使用環境下の力学状態に応じてマトリクス相に発生するひずみ勾配項を大きくするような粒子配置を選択することで,複合材の変形抵抗を改善可能であることを示唆している.(3)結晶塑性理論を導入した3次元均質化モデルを構築し,有限要素シミュレーションにより,γ′相の体積含有率及びγ′/γ両相の結晶方位の違いが,巨視的な変形特性に及ぼす影響について検討を行った.その結果,γ′/γ両相の異方性弾性係数の差が小さく,γ′相体積含有率の違いが巨視的な弾性特性に与える影響は小さいこと,γ′/γ両相の空間配置に対応した結晶方位を(101)面内で変化させた場合に比して,(001)面内で変化させた場合に,粘塑性特性に大きな差異を発生させることを明らかにしている.これは,γ′相の存在に起因する不均一変形場に誘起される各すべり系でのせん断ひずみ速度が結晶方位の違いにより大きく異なるためである.
トランスジェニックラット感染モデルを用いたエイズワクチン・治療法開発

研究目的近交系が確立され、遺伝子操作が可能なラットにHIVが感染できるならば、治療法と予防法の開発に大いに役立つ.既に、我々はヒトCRM1を発現させたラット上皮細胞株にHIV plasmidを導入すると、ヒト細胞に準じるHIV粒子が生産されること、Tgラット体内でhCRM1が機能することを示した。そこで今年度は受容体とhCRM1を共発現するTgラットを作成すると共に、ラットT細胞株におけるヒト因子の要求性と抑制因子をさらに検討し、同定された因子を発現するTgラットを作成することを目的とした。研究成果ラットT細胞でのHIV-1の増殖はhCRM1とhCyclinT1の単独発現では数倍の増強にすぎないが、共発現によって数十倍の相乗的な増強が見られた。ヒトCD4/CCR5/CRM1/CyclinT1の4種を発現するラットT細胞ではヒトmolt4CCR5の1/31/10のp24が生産された。又、ラットには2種類の阻害因子があることが示唆された。hCCR5/hCXCR4を発現するTgラットを作成した。考察今年度、ラットT細胞株を用いてHIV-1の増殖に必用なヒト因子としてCRM1以外にCyclinT1を同定した。さらに、阻害因子の存在を示唆した。従って、HIV-1感受性のラットを作成するためには、hCRM1とhCyclinT1を発現し、阻害因子をノックダウンしたTgラットを作成する必用がある。エイズウイルス(HIV)がラットで増殖できない原因の分子機構を追求するために、ウイルスRNAの核外輸送過程を検討した.まず、ウイルス輸送因子Revがラット細胞で機能するかどうかを2種類のレポーターを用いて調べた.1つはHIVゲノムのenv領域にCAT遺伝子を挿入したもの(pDM128)、2つ目はHIVのほぼ全長を持つものである.PDM128を用いてCATの生産量で測定するとRevは十分効率よく働くが、後者のレポーターからはGag/Envがヒト細胞の1/100程度しか生産されなかった.ウイルスRNAの核から細胞質への輸送を半定量PCR,定量PCRで測定したところ、両細胞間で差がなかった.また、Gagタンパク質は両細胞中で安定であった.この結果はウイルスRNAがヒト細胞中で効率よく翻訳されるとこを示唆している.次に細胞輸送因子であるCRM1が原因であるかどうか調べた.ラット細胞にヒトCRM1を導入すると、Gagタンパク質が約10倍効率よく生産された.ウイルスRNAの輸送効率は変わらなかった.これらの結果は、ヒトCRM1は核から細胞質へのRNA輸送を司るだけではなく効率の良い翻訳にも関与していることを示唆している.他方ラットCRM1は効率的にウイルスRNAを翻訳できないことを示唆している.次に、ヒトCRM1を発現するトランスジェニック(Tg)ラット細胞を作製した。ヒトcrm1ゲノムを含むBACをクローニングし、ラット受精卵にマイクロインジェクションした.ヒトCRM1を発現するTgラットを1系統得た.トランスジーンは胸腺で高発現しており、脾臓ではあまり発現していなかった.これは内在性のラットCRM1と同様の発現パターンである.次いでTgラット由来のT細胞にヒト白血病ウイルス(HTLV-1)を感染させたところ、ヒトT細胞と同等の増殖を示した.研究目的近交系が確立され、遺伝子操作が可能なラットにHIVが感染できるならば、治療法と予防法の開発に大いに役立つ.既に、我々はヒトCRM1を発現させたラット上皮細胞株にHIV plasmidを導入すると、ヒト細胞に準じるHIV粒子が生産されること、Tgラット体内でhCRM1が機能することを示した。
EBウイルス感染モデルマウスにおける自然免疫応答の解析と免疫療法の基礎実験

免疫不全マウス体内にヒト免疫系を再構築したヒト化マウスにEBウイルス(EBV)を感染させると、脾臓NK細胞からインターフェロンγが産生されることが示唆された。また、ヒト化マウスに一定量以上のEBVを感染させると大多数がリンパ増殖性疾患により死亡するが、自己臍帯血由来活性化T細胞を投与するとマウス体内のEBV DNA量が低下し生存期間が延長することが分かった。以上より、EBV感染ヒト化マウスはこのウイルスに対する自然免疫応答を解析するための実験系として、またEBV関連疾患に対する免疫細胞治療を評価する場として有用であることが示唆された。本年度は、EBウイルス(EBV)感染マウスにおけるNK細胞の動態とインターフェロン産生を解析した。EBV感染後1,2,5日目においてマウス末梢血中のCD16或いはCD56陽性でCD3陰性のNK細胞数を計測したが、EBV感染マウスと対照マウスの間で明確な差は認められなかった。また、感染後2日目にヒトIFN-αおよびIFN-βの末梢血中濃度を測定したが、やはり明確な差は認められなかった。そこで、感染後2日目のマウス脾臓から回収した単核細胞を短期間培養し、培養上清中のIFN-γ濃度を測定した。EBV感染マウス5頭の結果は平均24.1pg/ml、範囲16.034.5pg/ml、標準偏差6.7、対照マウス5頭では、平均17.1pg/ml、範囲7.527.0pg/ml、標準偏差8.6であった。P>0.5で有意性は認められなかったが、EBV感染マウスで高い傾向が認められたので、今後実験を繰り返し更に検証を進めたい。次に、脾臓単核細胞のうちどの細胞が主にIFN-γを産生しているかを調べた。脾臓単核細胞から磁気ビーズ結合抗体によりCD56陽性細胞を除去した場合、ほぼ全てのマウスにおいてIFN-γ産生は検出感度以下に低下した。一方同じ方法によりCD8陽性細胞を除去した場合には、IFN-γ産生の低下は認められなかった。従って少なくとも一部分はNK細胞により産生されると考えられた。CD4陽性細胞除去の実験は現在進行中である。ヒトのEBV感染は主に不顕性感染であるため、自然免疫応答が主役を演じる感染直後の1週間は見逃されてしまう。また優れた感染モデル動物も存在しなかったため、EBVに対する自然免疫応答はほとんど調べられてこなかった。従って、今回の感染モデルマウスにおける解析結果は画期的である。EBウイルス(EBV)感染ヒト化マウスモデルを用いて、EBVに対する自然免疫応答の解析と免疫細胞治療法の基礎実験を行った。1.EBV感染後のインターフェロン産生の解析EBV感染後12及び36時間後のマウス血漿を用いてヒトIFN-α及びIFN-βの濃度を測定したところ、感染前及びmock感染コントロールと比較して有意な差は認められなかった。NOGマウスはNK細胞を完全に欠損しており、ヒト化した後のヒトNK細胞の分化は通常低レベルである。EBV感染直後のNK細胞の動態を解析するには十分なレベルのNK甑細胞の存在が必要であると考え、Di Santoらの方法によりNK細胞分化の誘導を試みた。臍帯血由来造血幹細胞を移植して血液免疫系を再構築したNOGマウスに、ヒトIL-15(2.5μg)及びヒトIL-15Rα-Fc(7.5μg)を腹腔内投与した。対照マウスにはPBSを投与した。実験群の3頭のマウス末梢血におけるCD16+CD56+NK細胞の頻度は投与前が0.5%,0.8%,0.75%であり、投与後は10.0%,16.6%,18.0%であった。対照群マウス2頭の投与後は0.0%,0.8%であった。これより、IL-15及びIL-15R投与により明らかにNK細胞の分化が促進された。現在、このようにしてNK細胞分化を促進したヒト化マウスにおいて、EBV感染後のNK細胞の動態及びIFN-γ産生を解析中である。3.EBV関連疾患に対する免疫細胞治療の基礎実験当初は、EBV遺伝子を導入した樹状細胞を用いてヒト化マウスに免疫応答を誘導する実験を行う計画であったが、これを変更して、EBVによるリンパ増殖性疾患を発症したヒト化マウスに対する自己活性化T細胞輸注の治療実験を行うこととした。今年度は、臍帯血からの活性化T細胞の調製法について検討したのち、3頭に対するパイロット実験を行った。その結果、活性化T細胞輸注を受けたマウスでは主要臓器におけるEBV DNA量が減少することが示唆された。現在、マウスの個体数を増やし生存期間に対する効果と併せて検証中である。本年度は、EBウイルス(EBV)

関連疾患に対する免疫細胞治療の基礎実験として、臍帯血から調製した細胞を用いる活性化T細胞輸注療法の効果検証と作用メカニズムの解析を、EBV感染ヒト化マウスを用いて行った。NOGマウスに臍帯血由来ヒト造血幹細胞(約1×10E5個/頭)を移植し、末梢血中にヒトBおよびTリンパ球が出現するのを確かめたのち、B95-8株EBV(約10E3 TD50)を投与した。臍帯血由来活性化T細胞は、臍帯血より分離した単核細胞を培養フラスコに付着させた抗CD3抗体と培養液中に添加したヒトIL-2(700 U/ml)の存在下で14日間培養して調製した。一部の実験ではこの活性化T細胞からCD4+細胞のみを磁気ビーズ付着抗体により分離して治療実験に用いた。計35頭のEBV感染ヒト化マウスを作成し、14頭には活性化T細胞を分画せずそのまま3回投与した(5.0×10E6 cells)(全T細胞投与群)。8頭には活性化T細胞から分離したCD4+細胞のみを投与した(CD4+細胞投与群)。残りの13頭には対照としてPBSを投与した(PBS投与群)。PBS投与群は感染後約4ヶ月の間に62%のマウスがEBV陽性リンパ増殖性疾患で死亡したのに対し、全T細胞投与群では20%が死亡したのみであった。生存曲線を比較したところ、全T細胞投与群とPBS投与群の間にはLogrank法により有意の差(P<0.05)が認められた。しかし、CD4+細胞投与群とPBS投与群の間には有意差が認められなかった。これらの結果から、臍帯血由来活性化T細胞はEBV関連リンパ増殖性疾患モデルマウスに対して有効であることが示された。CD4+細胞のみを分離して投与した場合の有効性は認められなかった。一部のマウスでは活性化T細胞投与後にHLA-DR+の活性化CD8+ T細胞が増加していた。EBV感染ヒト化マウスにおける自然免疫応答解析についてはほぼ計画通りに進展しているが、免疫療法の基礎実験については遅れている。最近、ヒトMHCクラスI遺伝子を導入した免疫不全マウスが開発され、免疫療法の基礎実験にはこのマウスをヒト化して用いる必要があると考えられた。この新しい免疫不全マウスを入手することを試みているが、現時点では困難であり、そのために遅れが生じた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトMHCクラスI遺伝子を導入した免疫不全マウスの入手は現時点では困難と判断し、研究計画を変更した。臍帯血或いは末梢血から調製した活性化T細胞を輸注する細胞治療は、造血幹細胞移植後の再発や感染症に対する治療法として期待されているが、作用メカニズムについては不明である。そこで、この活性化T細胞輸注療法の基礎実験をヒト化マウスを用いて行い、効果の検証と作用メカニズムの解析を行うこととした。この研究は従来の免疫不全マウスにより作成したヒト化マウスでも実施可能と考えられる。
脂肪細胞由来の未知の液性昇圧因子を標的とした肥満高血圧の新規診断・治療法の開発

メタボリック症候群・肥満患者における高血圧の制御は、国民の健康寿命延伸・医療費削減の両面から喫緊の課題である。近年、脂肪細胞由来の未知の液性昇圧因子が直接副腎に作用することによりアンジオテンシンIIとは独立してCYP11B2発現・アルドステロン分泌を亢進させ、肥満高血圧症の原因となっている可能性が示唆されている。本研究の目的は、同因子を単離・同定して機能解析を行った後、同因子を標的とした肥満高血圧症の新規創薬を進めることである。まず、ヒト副腎腫瘍由来H295R細胞に脂肪細胞より取得した培養上清を添加し、CYP11B2の発現誘導を指標に分子量による分画を行った。その結果、CYP11B2発現誘導能を有する画分を見出した。次に、同画分を質量分析装置にて解析することにより、液性因子の同定を行った。その結果、52種類の候補因子が同定された。さらに、それらの中からシグナルペプチドの存在が想定された12種類の因子を同定した。これらの因子中にはタンパク分解酵素AならびにAの作用により活性化する因子Bが含まれていた。そこで、タンパク分解酵素阻害剤の投与実験ならびに活性化されたBの受容体に対する阻害剤の投与実験を行ったところ、いずれにおいても培養上清が有するCYP11B2発現誘導活性の低下が認められた。以上の結果から、タンパク分解酵素AとAの作用により活性化する因子Bは脂肪細胞培養上清におけるCYP11B2発現誘導因子の有望な候補因子であることが示唆された。今後の本プロジェクトの遂行により、肥満高血圧症の新規創薬・治療法の開発が進むものと期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。肥満・メタボリック症候群患者では高血圧が高頻度に合併することが知られている。その一因として、脂肪細胞から分泌されているアンジオテンシン(A)IIとは異なるアルドステロン分泌刺激因子の関与が示唆されているが、その本態は未だ不明である。本研究で我々は、肥満高血圧の病態解明を目的として、脂肪細胞から分泌される未知のアルドステロン合成酵素(CYP11B2)発現誘導因子の同定を目指す。マウス線維芽細胞由来3T3-L1細胞を脂肪細胞に分化させ、分化脂肪細胞の培養上清を取得した。取得した上清を、ヒト副腎癌由来H295R細胞を用いたスクリーニング系に添加した後にCYP11B2転写活性・mRNA発現量を測定したところ、分化脂肪細胞培養上清中にCYP11B2発現誘導因子の存在が確認された。このCYP11B2発現誘導活性は、同培養上清の熱処理にて失活した。LC-MS/MS法を用いた検討にて、同培養上清中にはAIIは認められなかった。同培養上清の分子量による分画・H295R細胞を用いたスクリーニングにより、分子量50100kDa画分にCYP11B2発現誘導能を見出した。さらに、100kDa以下の画分を用いてLC-MS/MS法を施行したところ、12種の候補因子が確認された。現在、12種の候補因子それぞれに関してcDNAを単離し、HEK293T細胞を用いての過剰発現を施行してCYP11B2発現誘導活性を検討中である。本検討から、分化脂肪細胞培養上清中にはAIIとは異なる未知のCYP11B2発現誘導因子が存在していることが確認されたが、本因子がアルドステロン分泌を介して肥満患者における高血圧・動脈硬化を招来している可能性も考えられることから、将来的には本因子を標的とした肥満・メタボリック症候群の新規創薬を目指す。得られた12候補因子の中の1因子がCYP11B2発現誘導因子であることがほぼ確定的となっており、おおむね順調に進展していると考えられる。昨年までの段階で、マウス脂肪細胞3T3-L1の培養上清を用いた質量分析の結果、12種類の候補因子が同定された。それらの因子のcDNAを単離し、HEK293T細胞を用いて過剰発現を行い、その中の一個(X因子)がヒト副腎H295R細胞においてCYP11B2 mRNA発現を亢進させることを見出した。現在我々は、得られたX因子をCYP11B2転写活性を鋭敏にモニター可能な安定発現株であるCYP11B2-H295R細胞に添加してそのルシフェラーゼ活性の上昇を確認中である。今後は、同株を用いたハイスループットスクリーニング(HTS)系を確立するとともに、その系を用いて東北大学化合物ライブラリーのHTSを行い、化合物XのCYP11B2転写活性を抑制するヒット化合物を得る。さらに、得られたヒット化合物の合成展開・構造最適化を進めることにより、より活性が高く毒性の低いリード化合物の獲得を目指す。本プロジェクトの遂行により、肥満高血圧症の新規創薬・治療法の開発が進むものと期待される。

質量分析の結果同定された12種類の候補因子のcDNAの単離ならびにHEK293T細胞を用いての過剰発現が予想以上に時間がかかったため、若干当初の計画より遅れている。メタボリック症候群・肥満患者における高血圧の制御は、国民の健康寿命延伸・医療費削減の両面から喫緊の課題である。近年、脂肪細胞由来の未知の液性昇圧因子が直接副腎に作用することによりアンジオテンシンIIとは独立してCYP11B2発現・アルドステロン分泌を亢進させ、肥満高血圧症の原因となっている可能性が示唆されている。本研究の目的は、同因子を単離・同定して機能解析を行った後、同因子を標的とした肥満高血圧症の新規創薬を進めることである。まず、ヒト副腎腫瘍由来H295R細胞に脂肪細胞より取得した培養上清を添加し、CYP11B2の発現誘導を指標に分子量による分画を行った。その結果、CYP11B2発現誘導能を有する画分を見出した。次に、同画分を質量分析装置にて解析することにより、液性因子の同定を行った。その結果、52種類の候補因子が同定された。さらに、それらの中からシグナルペプチドの存在が想定された12種類の因子を同定した。これらの因子中にはタンパク分解酵素AならびにAの作用により活性化する因子Bが含まれていた。そこで、タンパク分解酵素阻害剤の投与実験ならびに活性化されたBの受容体に対する阻害剤の投与実験を行ったところ、いずれにおいても培養上清が有するCYP11B2発現誘導活性の低下が認められた。以上の結果から、タンパク分解酵素AとAの作用により活性化する因子Bは脂肪細胞培養上清におけるCYP11B2発現誘導因子の有望な候補因子であることが示唆された。今後の本プロジェクトの遂行により、肥満高血圧症の新規創薬・治療法の開発が進むものと期待される。早急にCYP11B2発現誘導因子を同定した後、動物実験ならびに抗体作成・ELISA系の確立を進める。現在X因子の機能解析を行っているが、今後は同因子の活性を抑制する化合物をHTSにてスクリーニングする予定である。当分野では他プロジェクトにてHTSの施行経験があることから、スムーズに新規創薬を進められると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
癌細胞にみられる染色体異常へのテロメアの関与

染色体異常の見られる癌は予後が悪く、悪性度が高い傾向にあることから、この染色体変異は癌化・癌の悪性化の一因を成すものと考えられる。本研究は癌細胞の進展・悪性化の過程での染色体変異とテロメア変異との関連性を、一つの染色体に注目して追求した。C6細胞株にPhIP(10μM)を投与すると、高頻度にX染色体の構成比の異常を起こすことが明らかとなった。PhIP投与後、2日目に再び細胞をクローン化し、細胞が10^6まで増殖した後、そこからDNAを抽出した。X染色体の5か所のマイクロサテライトをプローブとしPCR反応を行い、PCR産物の示す多型バンドの濃度変化をゲル電気泳動で調べた。X染色体マーカー(DXMit5)のB6特異的バンドがMSMバンドに比べ著しく薄くなっていたことが分かった。この結果はB6由来の不活化したX染色体が脱落し易いことを示している。さて、この脱落の機構として、X染色体のテロメアからmo-2領域にかけての反復配列に組換え変異が起こり、テロメア機能が損傷されたのが1つの原因であると仮定し、この作業仮説が正しいかどうかを知るためにテロメアの長さを測定した。B6由来のX染色体の組成が低くなったクローンを17株単離し、この細胞小塊を、アガロース・ブロックに埋め込んだ。そのゲル中でDNAを精製し、制限酵素・EcoRI、BstEII、HaeIII、およびAluIで切断した。DNA断片を長さによりPFGE電気泳動法で分画し、そのゲルを乾燥させたものに対し、合成したmo-2プローブおよびTTAGGG配列からなるテロメアプローブをハイブリダイズさせた。テロメアのサイズの変化は検出されるバンドの変化として検出される。現在、実験が終了していない段階だが、テロメアの変異は検出されるが、X染色体のテロメアが特異的に変異を起こすという結論は得られていない。
網膜細胞分化を制御するサイトカイン(特にTGF-Pスーパーファミリー)について

網膜を含む眼組織から細胞においてその細胞分化の調節を検討し、更にその調整を行う因子について検討した。有意な結果のみを以下に記す。1)網膜由来細胞のTGF-βスーパーファミリー受容体の発現について。RT-PCR法を用いて検討した。細胞としては網膜芽細胞腫細胞株Y79とWERIを用いた。これらは極めて未熟な細胞で各種の分化促進因子により視細胞、グリア細胞などに分化する。RT-PCR法によるとTGF-β受容体としてはI型受容体のmRNA発現しているが、II型受容体の発現は見られなかった。細胞のTGF-βに対する反応性の有無を増殖制御能において検討したところ、やはりTGF-β対する反応は見られず、網膜芽細胞腫細胞株では受容体の発現にも異常があることが考えられた。2)眼球全体のTGF-β受容体の分布についての組織化学的検討。網膜を含めて眼球の組織が分化を完了した状態でのTGF-βリガンドと受容体の分布について検討した。TGF-βリガンドは角膜上皮、水晶体上皮、網膜神経組織に主に分布していた。一方TGF-β受容体は網膜神経組織には発現は極めて弱く、網膜色素上皮層など周囲組織に分布していた。完成した網膜組織ではTGF-βは網膜そのものではなくその周囲環境に働きかけて網膜恒常維持に関与していると考察した。3)病的状態における網膜由来細胞のTGF-β受容体の発現。網膜由来の細胞が一度分化してから脱分化-再分化の過程を経て形成されると考えられる病態である増殖性硝子体網膜症、増殖糖尿病網膜症の網膜前増殖膜組織の構成細胞においてTGF-β受容体の発現について検討した。TGF-βが上記の病体に関連して脱分化-再分化に関連している可能性について検討した。増殖膜組織の形成過程初期においてはその発現が多く、細胞が少なくなる後期において受容体発現が減少した。TGF-βが脱分化-再分化に関連している可能性を考えた。4)神経提由来の細胞である角膜内皮細胞における形質の変化のメカニズムについても検討した。マーカーとしたのはGlucose transporter-1(GLUT1)遺伝子である。上皮増殖因子の投与によると角膜内皮細胞はGLUT1遺伝子発現が上昇し、この作用は蛋白質キナーゼCを介していることを確認した。
ダイヤモンド工具のイオンビーム加工に関する研究

ダイヤモンド工具は、アルミニウムや銅などの軟質金属切削用のダイヤモンドバイト、生物試料などの薄片を作るためのミクロトームの刃や超高圧発生用のダイヤモンド圧子などに用いられている。これらのダイヤモンド工具は、ダイヤモンド微粉末と軟質ラップ板を用いた機械研磨により加工されているが、この加工のみではダイヤモンド工具の先端を鋭利に仕上げるには不十分な場合がある。そこで、本研究ではイオンビーム加工法をこれらの最終仕上げに適用すること、および仕上がったダイヤモンド工具の先端半径評価法が未だ確立されていないので100【A!゚】前後の先端半径評価法を確立することについて検討し以下の結果を得た。(1)(株)エリオニクスの開発した形状測定用SEM(2個の二次電子検出器をもつ)を用いると切れ刃稜の丸み半径が100【A!゚】程度のダイヤモンド工具の先端形状を評価できることが分かった。(2)先端の頂角が45゚前後のダイヤモンドナイフは、機械研磨と20keVのArイオンを用いたイオンビーム加工を併用して、表面性状がよく、切れ刃の直線性も良く仕上げられることが分かった。しかし、これで仕上げたダイヤモンドナイフの表面の加工変質層・実際の切れ味や摩耗などについての検討が不十分なので、これらについては今後の検討が必要である。(3)ダイヤモンドバイトは、機械研磨で仕上げたものを更にイオンビーム加工することにより、切れ刃稜の丸み半径が2030mmのものが容易に得られることが分かった。
宇宙空間における筋萎縮（Sarcopenia）の分子機序解明と新たな治療への展開

加齢や各種病態による骨格筋萎縮(サルコペニア)は、肝疾患の予後因子であり、肝筋相関の重要性が注目されている。筋肉におけるPGC1α過剰発現マウス(サルコペニアモデルマウス)を用い、70%肝切除を行い、肝再生率を検討することを目的とした。PGC1α過剰発現マウスの交配を行い、サルコペニアモデルマウスの繁殖を試みた。38匹中、サルコペニアモデルは3匹で得られた。25週時点で肝切除を行い、サルコペニア状態における肝再生を検討する。臨床例による検討では、生体肝移植102例で、サルコペニア患者では肝機能が有意に低下しており、術中出血量が多く、術後経過で敗血症発症率が有意に高く在院日数が長期であった。宇宙空間においては骨格筋の著明な萎縮(Sarcopenia)が起こるが、その詳細な機序は未だ不明である。グルタミンは骨格筋で唯一産生され、血中に最も多く含まれている遊離アミノ酸であり、準必須アミノ酸である。リンパ球や腸管粘膜のエネルギー源であり、リンパ球の機能亢進、腸管免疫能改善などの働きを持つ。一方、臨床データからSarcopeniaは、肝疾患の予後因子となり、肝筋相関の重要性が注目されている。Sarcopeniaでは様々なアミノ酸の低下が言われており、アミノ酸の供給不足よって肝臓や免疫能の与える影響を検討することは、肝筋相関を解明の鍵となることが示唆される。また、肝組織における蛋白質分解や生合成、エネルギー産生に関わるオートファジーにも着目し、Sarcopenia、肝筋相関を解明していく目的で研究を行っている。方法は、筋肉におけるPCG1α過剰発現マウス(Sarcopeniaモデルマウス)、Wildtypeマウスにそれぞれ70%肝切除を施行し、比較検討を行う。医薬基盤研究所よりPGC1α/E過剰発現マウスの凍結精子を搬入し、交配を進めている。現在、交配によって得られた個体化したマウスをWild type、Homo型、Hetero型の識別を行うためGenotypingの手技を取得中である。オートファジーノックアウトマウスも、同様に交配をすすめており、Sarcopeniaとオートファジーの関連も今後解析予定である。加齢や各種病態による骨格筋萎縮(Sarcopenia)は、肝疾患の予後因子となるとされ、肝筋相関の重要性が注目されている。Sarcopeniaでは様々なアミノ酸の低下が言われており、アミノ酸の供給不足によって肝臓や免疫能の与える影響を検討することは、肝筋相関を解明の鍵となる。肝組織における蛋白質分解や生合成、エネルギー産生に関わるオートファジーにも着目し、Sarcopenia、肝筋相関を解明していく。方法は、筋肉におけるPGC1α過剰発現マウス(Sarcopeniaモデルマウス、筋肉特異的peroxisome proliferator activated receptor-1α過剰発現により筋肉のATP産生の異常あり、加齢とともに骨格筋の萎縮を起こす)、Wild typeマウスにそれぞれ70%肝切除を施行し、両群間で比較検討を行う。肝再生率の比較、血清アミノ酸(特に骨格筋由来のグルタミンやBCAAなど)、L-カルニチン(肝再生を促進、脂質代謝)の比較、再生肝におけるオートファジーの評価、腸管粘膜萎縮の検討、リンパ球サブセットと機能解を行って行く。昨年度は、PGC1α/E過剰発現マウスの凍結精子を搬入した。交配によって得られた個体化を進め、サルコペニアモデルマウス(PGC1-α過剰発現マウス)を繁殖させている。現在21匹のマウスを飼育し、適宜genotypingを行い、その中で10匹(雄8匹、雌2匹)がサルコペニアモデルマウスと考えている。マウスは十分な筋萎縮状態になる25週齢まで飼育後に実験を行う。PGC1α過剰発現マウスの繁殖と飼育に時間を要しているが、概ね順調に進展している。加齢や各種病態による骨格筋萎縮(サルコペニア)は、肝疾患の予後因子となるとされ、肝筋相関の重要性が注目されている。サルコペニアでは様々なアミノ酸の低下が言われており、アミノ酸の供給不足によって肝臓や免疫能の与える影響を検討することは、肝筋相関を解明の鍵となる。また、肝組織における蛋白質分解や生合成、エネルギー産生に関わるオートファジーにも着目し、サルコペニア、肝筋相関の解明を試みた。筋肉におけるPGC1α過剰発現マウス(サルコペニアモデルマウス)を用い、Wild typeマウスにそれぞれ70%肝切除を施行、比較検討を行う。PGC1α過剰発現マウスとは、筋肉特異的PGC1α過剰発現により筋肉のATP産生の異常あり、加齢とともに骨格筋の萎縮を起こすことから、サルコペニアのモデルとされている。PGC1α/E過剰発現マウスの凍結精子を搬入後に、交配によって得られた個体化を進め、サルコペニアモデルマウス(PGC1α過剰発現マウス)を繁殖させた。現在38匹中、サルコペニアモデルは3匹。25週時点で肝切除を施行し、検討を行う。臨床症例を用いた検討も行った。2014年4月2016年12月筋力と筋肉面積が測定可能であった生体肝移植レシピエント102名を用いた。臨床因子の比較により、サルコペニア患者では、肝移植前の肝機能が有意に低下していること、術中出血量が多く、術後経過として、グラフト肝機能が悪く、術後在院日数が長期であり、敗血症発症率が有意に高ことが明らかとなった。

多変量解析すると、サルコペニアは肝移植後6ヶ月死亡の独立危険因子であった。一方、これまで報告されていた筋肉面積のみでは、生存率に差を認めなかった。今後、筋力低下のメカニズム解明に向けた基礎的研究を継続していく加齢や各種病態による骨格筋萎縮(サルコペニア)は、肝疾患の予後因子であり、肝筋相関の重要性が注目されている。筋肉におけるPGC1α過剰発現マウス(サルコペニアモデルマウス)を用い、70%肝切除を行い、肝再生率を検討することを目的とした。PGC1α過剰発現マウスの交配を行い、サルコペニアモデルマウスの繁殖を試みた。38匹中、サルコペニアモデルは3匹で得られた。25週時点で肝切除を行い、サルコペニア状態における肝再生を検討する。臨床例による検討では、生体肝移植102例で、サルコペニア患者では肝機能が有意に低下しており、術中出血量が多く、術後経過で敗血症発症率が有意に高く在院日数が長期であった。PGC1α/E過剰発現マウスは、筋肉特異的peroxisome proliferator activated receptor-1α過剰発現により筋肉のATP産生の異常あり、加齢とともに骨格筋の萎縮を起こす。出生後24週経過し、サルコペニアがすすんだ状態での肝切除を予定しており、現在はマウスの交配をすすめている。肝切除の手技は習得済みであり、マウスの成育を待ち、検体を採取予定である。仮説として、以下を考えている。1.骨格筋由来のBCAAやグルタミン、アルギニンはPGC1α過剰発現マウスで低下。2. PGC1α過剰発現マウスでは哺乳類における最大の免疫機関である小腸粘膜において必須な栄養素であるグルタミンの低下により、腸管粘膜萎縮や免疫系(リンパ球やマクロファージ)の低下が起きる。3.グルタミン、アルギニン、Lーカルニチンは肝再生を促進させることが以前より報告されており、これらの低下が、肝再生低下を招く(肝筋相関)。これらの仮説を検証すべく、実験を進めて行く。消化器外科学これまでに我々が得ている臨床データから、骨格筋萎縮のため、BCAAやグルタミン、アルギニンは低下することが予想される。哺乳類における最大の免疫機関である小腸粘膜において必須な栄養素が、グルタミンでありSarcopeniaにおいては、腸管粘膜萎縮や免疫系(リンパ球やマクロファージ)の低下が起きると予想される。グルタミン、アルギニン、Lーカルニチンは肝再生を促進させることが以前より報告されており、これらの低下が、肝再生の低下を招くと考えられる。これらの仮説を確認予定である。
ミヤコグサを基準としたダイズのゲノム特性の解明

ダイズの完全長cDNAライブラリーの19,436クローンについて末端領域塩基配列を決定した。品質の低い配列を削除して、19,103(両端15,019、片端4,084)が解析の対象になった。スプライスバリアントを独立と見なすと独立クローンの数は10,261となり、重複率は46.3%であった。独立クローンについてアノテーションを行なった。ライブラリーの品質が高いことが判明したので、クローンの充実には既存のライブラリーからさらにクローンをピックアップすることで十分に達成できると判断し、新たに2万クローンを単離して末端領域塩基配列を決定した。完全長cDNAクローンの両端塩基配列から設計したプライマーによるPCR産物を制限酵素の組み合わせApaI/RsaI、AluI/HaeIIIで処理後SSCP法で多型解析を行なうため、処理条件、泳動条件を検討した。その結果PCR産物は変性溶液に溶解後、95°C、5分加熱後直ちに氷上に保存すること、多型解析は非変性不連続電気泳動法により、4°Cで、200V、7時間行なうことによりよい結果が得られることがわかった。この手法をCAS-SSCP(cleaved amplified sequence-single strand conformation polymorphism)法と名づけた。完全長cDNAの塩基配列から設計したプライマーで増幅産物が得られたもののうち、CAS-SSCP法で約40%が両親間で多型を示した。現在までにマッピング可能な48のマーカーが得られた。ダイズの組換え近交系を用いて、23クローンのマッピングが終了した。またミヤコグサの根粒で強く発現しているcDNAクローン19をRFLP法により同じ組換え近交系を用いてマッピングした。ミヤコグサのオルソログを同定して、今までのマーカーを含めて全体で261の共通マーカーの位置を決定することが出来た。これらのマーカーに基づきミヤコグサを中心にダイズとの比較地図を作製した。今までのシンテニーブロックが伸びたり、新たなブロックが加わった領域があり、比較地図を充実することが出来た。
TLRsは、どの様な機序でNASH発症・進展を修飾するのか?

非アルコール性脂肪性肝炎発症・進展におけるTLR-2とTLR-4の役割を解明した。wild type、TLR-2(-/-)、TLR-4(-/-)のマウスを用い、脂肪性肝炎を惹起させた。TLR-2(-/-)群は脂肪性肝炎の増悪、TLR-4(-/-)群は脂肪性肝炎発症の抑制を示した。TLR-2(-/-)マウスでは、肝におけるIGFBP-2の発現が低下し、pro-inflammatory cytokinesの発現が増加した。TLR-4(-/-)マウスでは、逆の結果であった。肝におけるサイトカイン産生の差異により、TLR-2は脂肪性肝炎発症・進展を抑制し、TLR-4は促進した。非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の発症・進展において、Toll like receptors(TLRs)の関与を明らかにするため研究した。【方法】野生型(WT)マウスにおけるTLR-2とTLR-4のmRNAの発現をin situ hybridizationにて調べた。WT、TLR-2(-/-)、TLR-4(-/-)マウスを用い、メチオニン・コリン欠乏食(MCD食)を与え、実験的NAFLDを作製した。サイトカイン・関連因子抗体アレイ解析を中心に実験した。【意義と重要性】MCD食によるNAFLDにおいて、TLR-2はNAFLD発症抑制的に、TLR-4はNAFLD発症促進的に働くことが明らかになった。TLR-2とTLR-4は、様々なサイトカイン・関連因子産生の差異を介しNAFLD発症・進展に関与することが示された。【研究の目的】非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の発症・進展において、Toll like receptors(TLRs)の関与を明らかにし、ヒトNAFLDのバイオマーカーの確立を目的として、研究を行った。【方法】野生型(WT)マウスにおけるTLR-2とTLR-4の蛋白発現を免疫組織学的にて調べた。WTマウスにメチオニン・コリン欠乏食(MCD食)を与え、実験的に非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を惹起し、TLR-2とTLR-4の蛋白レベルでの発現を免疫組織学的検査にて経時的に調べた。さらに、ヒトNAFLDにおいて、血清中1GF-binding protein-2(IGFBP-2)が脂肪肝の病態に関連したバイオマーカーになり得るか調べた。【結果】MCD食投与前のWTマウス肝の免疫組織学的検査では、TLR-2とTLR-4はKupffer細胞に発現されており、in situ hybridizationの結果と同様であった。しかし、MCD食投与後NAFLD発症に伴いTLRs(特にTLR-2)は、脂肪蓄積した肝細胞での発現が亢進した。この発現亢進は、MCD食投与後2、4、6、8週目に一定して認められた。腹部超音波にて診断したヒトNAFLD群(n=20)では、血清中IGFBP-2値315±241(ng/ml)であるのに対し、対照群(n=15)では574±295(ng/ml)とヒトNAFLD群では対照群に比べ有意に(P<0.01)低値であった。【研究成果の意義】肝細胞でのTLR-2の発現が増大し、NAFLD発症を抑制すると考えられた。IGFBP-2はNAFLD発症・進展抑制因子であることが推測された。ヒトNAFLD者では、対照者に比べIGFBP-2が有意に低値を示し、IGFBP-2がNAFLD抑制に働く臨床的にも有用なバイオマーカーになり得ることが示唆された。の