hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中性子散乱による融体・金属ガラスの構造ゆらぎとダイナミックス

金属ガラスの安定性は金属ガラスを構成する短範囲構造ユニットや中距離構造と深い関係があると考える。さらに、非平衡状態では安定になるための原子の動きがあることから、原子の運動とも深く関わっていると考えられる。熱的に安定なCu-Zr金属ガラスは20面体的な構造ユニットが多く存在するが、Ni-Zr金属ガラスはNi-Zr系の安定結晶を構成している三角プリズム構造が多く存在することが明らかになった。そのNi-Zr系金属ガラスにA1などの第三元素を添加することにより熱的安定性が増すが、そのときの構造変化を調べた結果、A1添加により三角プリズム構造が減少し、20面体的な構造ユニットの増加が観察された。このことは金属ガラスの熱的安定性は構造学的に20面体的な構造ユニットが強く関わっていることを示唆している。Cu-Zr系金属ガラスに第三元素としてA1を添加したときの構造変化を調べると、20面体的な構造ユニットの構造の急激な増加は見られないが、正20面体的なユニットの増加が観察された。この変化を、中性子非弾性散乱を用いたダイナミックス観点から検討を行った結果、5meV付近に観察される低エネルギー励起(ボゾンピーク)の強度がA1を添加することによって低下することが明らかになった。この現象は金属ガラスにおける自由体積(free volume)の減少と解釈することが出来ることから、第三元素の添加による金属ガラスの熱的安定性は系の自由体積の減少による原子の動きの低下によるものと解釈することができる。すなわち、金属ガラスの熱的安定性をよくするためには、系の構成構造ユニットである正20面体を増加させ、かつ自由体積を減少させることであることが明らかになった。昨今の金属ガラスの材料研究は驚くべき進歩を遂げ、その形態は薄膜からバルク状のものとなり、ガラスとしての安定性も飛躍的に改良されている。しかし、金属バルクガラスの安定性と原子配列の関係は全く明らかになっていないのが現状である。本研究では中性子散乱の特徴を最大限に利用して構造データを得るとともに、X線回折や電子線回折から得られたデータと互いに補足的に活用し、新しい構造の側面を見出すことを目的とする。アモルファスと結晶の違いを観察するために、TbFe_2ラーベス結晶が水素を吸蔵するとアモルファス化することに着目し、結晶状態とアモルファス状態の構造を観察することによって、アモルファス合金の構造の特徴を明らかにする研究を行った。中性子回折の特徴を用いれば水素を見ることが容易となる。それに対して、X線回折では水素原子を吸蔵することによって変化する金属原子の配列を観察することが出来る。これは中性子とX線が持っている構成元素に対する散乱能の違いによるものである。この特質を利用して、X線回折でアモルファスTbFe_2D_<3.0>の構造を観察し、水素吸蔵することによるTbとFe原子の配列変化を観察した。さらに中性子回折によって、水素原子(重水素:D)の位置する多面体やそれを構成する原子の種類をあきらかにした。すなわち、水素原子は4面体ユニット内に位置し、かつTb原子が多く構成する4面体ユニットに入りやすいことを明らかにすることができた。さらに、中性子回折ならびにX線回折実験から得られた構造因子S(Q)を基にしてリバースモンテカルロ法によって三次元構造モデルを構築した。このモデルからも水素原子の存在位置がより明確になるとともに、金属(Tb, Fe)原子配列に組成揺らぎが生じていることが分かった。この結果は、さらに小角散乱実験による揺らぎの観察の必要性、そして動的構造との関係など、金属ガラスの構造研究の重要性とその展開の必要性を示唆している。水素を吸蔵したTbFe_2金属ガラスとTbNi_2金属ガラスの構造モデルを中性子回折実験ならびにX線回折実験によって得られた構造因子S(Q)を基にして、リバースモンテカルロ(RMC)法によってモデル構造を構築した。TbFe_2金属ガラスの構造は水素を吸蔵することによって組成揺らぎが生じていることが明らかとなった。ところが、TbNi_2金属ガラスの構造はその揺らぎが存在していないことが分かった。これは水素原子が安定して存在する4面体の構成原子が異なることから生じていることが、多面体解析を行うなど構造学的観点から明らかになった。さらに、ガラス化温度を持たないNi_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスとガラス化温度を示すCu_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスの構造因子S(Q)を中性子回折実験から求めた。ガラス化温度が観測されるかどうかは金属ガラスの熱的安定性と重要な関係かあると考えられるため、その構造解明は重要である。今回、中性子回折によるS(Q)を基にしてリバースモンテカルロ(RMC)法によりモデルを構築した結果、世界で初めてNi_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスの特徴あるプレピークを再現することに成功した。Ni_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスのNi-Ni相関の部分S(Q)にはQ=18nm^<-1>に明瞭なプレピークが観測される。

Ni_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスとCu_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスの2体分布関数g(r)におけるNi-Ni(Cu-Cu),Ni-Zr(Cu-Zr)そしてZr-Zr相関の実空間上の分布の比較ではNi-Zr相関の分布が顕著にシャープであることが明らかとなった。これはNi_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスとCu_<33.3>Zr_<66.7>金属ガラスの短範囲構造の形態が大きく異なっていることを示唆している。中性子回折ならびにX線回折を用いて得られたNi33.3Zr66.7とCu33.3Zr66.7金属ガラスの構造因子S(Q)を基にして,リバースモンテカルロ(RMC)法により3次元構造モデルの構築し,得られたそれぞれの金属ガラスの構造学的特徴を明らかにした.リバースモンテカルロ(RMC)計算により得られたNi33.3Zr66.7とCu33.3Zr66。7金属ガラスの構造モデルの部分構造因子Si-j(Q)は,過去に報告されている実験結果をよく再現している.この3次元構造モデルにおける多面体解析を行い,それぞれの金属ガラスを構成する多面体の分布を明らかにした.Zr原子周りの多面体はNi33.3Zr66.7ならびにCu33.3Zr66.7金属ガラスで良く似ており,二十面体もしくはそれに類似な多面体が多く存在する.それに対して,NiとCu原子周りの環境はNi33.3Zr66.7金属ガラスとCu33.3Zr66.7金属ガラスで大きく異なっている.すなわち,Ni33.3Zr66.7金属ガラスのNi原子周りはプリズム関連の多面体で構成されていることが分かった.特に,(028000)で示されるアルキメデス反プリズムはNiZr2結晶のNi原子周りに存在する多面体である.一方,Cu33.3Zr66.7金属ガラスのCu原子周りの環境は,CuZr2結晶のそれとは大きく異なり,二十面体もしくはそれに類似な多面体が多く存在することが分かった.このようなNiならびにCu原子周りの多面体の違いが,この2種類の金属ガラスの形成能や安定性に影響を及ぼしていると考えられる.中性子回折ならびにX繰回折を用いて得られたNi33.3Zr66.7とNi25Zr60Al15金属ガラスの構造因子S(Q)を基にして,リバースモンテカルロ(RMC)法により3次元構造モデルの構築し,得られたそれぞれの金属ガラスの構造学的特徴を明らかにし,第3添加元素による構造安定性を議論した.リバースモンテカルロ(RMC)計算により得られたNi33.3Zr66.7とNi25Zr60Al15金属ガラスの構造モデルの部分構造因子Si-j(Q)を比較しその違いを明らかにすると共に,この3次元構造モデルにおける多面体解析を行い,それぞれの金属ガラスを構成する多面体の分布を明らかにした.Zr原子周りの多面体はNi33.3Zr66.7ならびにNi25Zr60Al15金属ガラスで良く似ており,二十面体もしくはそれに類似な多面体が多く存在し,Al添加により二十面体的多面体の増加が見られた.それに対して,Ni原子周りにおいて,Ni33.3Zr66.7金属ガラスではプリズム関連の多面体で構成されていることが分かった.特に,(028000)で示されるアルキメデス反プリズムはNiZr2結晶のNi原子周りに存在する多面体である.しかし,Alを添加したNi25Zr60Al15金属ガラスのNi原子周りの環境は,大きく変化し,プリズム的多面体の割合が減少し,二十面体もしくはそれに類似な多面体が増加することが分かった.さらに,Al原子周りの多面体では,二十面体もしくはそれに類似な多面体が多く存在することが分かった.
第二言語学習者の文法的誤りから見る人間言語の生得性

理論言語学では、人間言語の生得性(人間は生まれながらに言語に関する知識を有していること)を実証することが重要な研究課題である。これまで第一言語獲得研究での実証が進められてきたが、より多角的に生得性を実証するためには、新たなアプローチが必要である。本研究は、第二言語学習者が犯す文法的誤りに着目し、言語の生得性に対して、第二言語習得研究からの新たなアプローチを提示する。第二言語学習者の文法的誤りが、母語でも、学習しようとする言語でもなく、インプットを一切受けたことがない言語で文法的に許される構造であるか分析し、第二言語学習者も言語に関する生得的知識にアクセス可能であることを明らかにする。
肝類洞内皮細胞による類洞微小循環調節機序

ウイスター系雄性ラットより、コラゲナーゼ消化法及びelutriation rotorを用いて、肝類洞内皮細胞の分離を行った。分離細胞はマトリゲル上で培養した。培養3時間後より、ビデオで経時的に観察した。マトリゲル上の培養内皮細胞は、6時間後より遊走を始め、12時間後には管腔を形成した。管腔形成した後に、血管作動性物質を培養液中に加え、管腔の収縮、弛緩をビデオで観察した。アセチルコリン、サブスタンスP、エンドセリン、プロスタグランディンを加えて経時的に観察したが、ビデオでの観察では、管腔の収縮、弛緩は観察されなかった。今後は電顕的な観察によって、管腔の収縮、弛緩を定量化する必要がある。
ヒト卵子特異的ヒストンH1の同定および受精過程における機能解析

卵子特異的ピストンH1(H1foo)は原始卵胞から2-4細胞期胚までにしか存在しないため、卵子の全能性や遺伝子のリプログラミングへの関与が推測されている。我々は2003年にヒト卵子特異的ピストン遺伝子を決定した。平成17年度は、卵巣内、および受精過程に於けるタンパク動態を検討した。推定アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原として作成した家兎血清を用いた免疫組織化学染色では、卵巣内でH1fooは原始卵胞からグラーフ卵胞までの卵子のみに局在し、顆粒膜細胞や間質には局在は認められなかった。また、体外受精で受精しなかった卵子34個の精子核におけるH1fooの存在と、精子核膨化の関係を検討したところ、34個中15個が膨化もH1fooの反応とも見られず、精子核膨化をみた16個すべてにH1fooの反応がみられた。残り3個では膨化が見られなかったにもかかわらずH1fooの反応が見られ、本タンパクが受精のごく初期から精子核内に取り込まれることが明らかになった。さらに平成18年度は、胚発生に伴うmRNA量の推移、体細胞ピストンへの移行、および完全長cDNAクローンの作成と、これを用いた完全長タンパク発現を試みた。結果として、ヒトに於けるH1fooはnested-PCRによる半定量法で、4細胞で胚あたり3000-6000コピー程度存在するが、桑実胚期にいたると1000-2000コピーと減少していた。一方卵子・胚には体細胞ピストンH1aが発現することが明らかになった。また、市販ヒト卵巣組織cDNAライブラリから完全長cDNAクローンを作成し、タンパク発現を大腸菌、およびコムギ胚芽無細胞系で試みた。大腸菌では発現が見られなかったが、コムギ無細胞系ではタンパク発現がみられた。現在、精製タンパクからモノクロナール抗体を作成するとともに、組み替えタンパクを作成し、リン酸化部位を解析中である。減数分裂、受精、分化における、ヒト卵子特異的リンカーヒストンH1(osH1)の発現、機能を解析し、またその臨床診療への応用を試みた。(1)抗osH1ウサギポリクローナル抗体を用いたGV期および受精後桑実胚までの受精卵の免疫染色では、GVから2細胞期までは核クロマチン又は精子頭部に免疫染色で反応が見られたが,4細胞期以降見られなくなった。また同じ抗体を用いてICSI非受精卵(48時間以内に前核が確認できず、分割もなかった卵子)を染色したところ、精子頭部膨化が起こっている卵では全てosH1が精子のクロマチンへ取り込まれていたが、少数であるが非膨化精子核においてもosH1の反応が見られ、本蛋白は精子の卵子侵入後ごく初期から精子核に取り込まれることが確認された。(2)GV期、非受精卵のosH1 mRNA発現をRT-nested PCR法にて検討するとともに、osH1cDNAをクローニングして陽性コントロールを作成することにより、M-II期と4細胞期でosH1 mRNA量を比較した。受精後、4細胞以降には蛋白レベルでは、核クロマチンにosH1は存在しないが、mRNAは存在していた。さらに4細胞期はMII期にくらべmRNAは減少していなかったことから、この乖離は翻訳レベルでの調節,又はクロマチンへの結合性の変化によると考えられた。(3)非受精卵子においても体細胞ヒストンサブタイプ(H1a,b,c,d,e)がmRNAレベルで存在するが、そのsubtype構成は通常の体細胞と異なると考えられた。

核タンパクのなかで、リンカーヒストンH1はヌクレオソーム同士を接合させ、高次の染色体構造形成に重要な役割を果たしているともに、遺伝子発現調節機構としての役割も推測されている。H1ファミリーにはサブタイプが多く、卵子特異的ヒストンH1(H1foo)は原始卵胞から2-4細胞期胚までにしか存在しないため、卵子の全能性や遺伝子のリプログラミングへの関与が推測されている。我々はヒトに於ける卵子特異的ヒストンの遺伝子を決定し、その蛋白局在や受精時の精子核への取り込みの経時的変化を報告してきた。今年度は、胚発生に伴うmRNA量の推移、体細胞ヒストンへの移行、および完全長cDNAクローンの作成と、これを用いた完全長タンパク発現を試みた。結果として、ヒトに於けるH1fooはnested-PCRによる半定量法で、4細胞で胚あたり3000-6000コピー程度存在するが、桑実胚期にいたると1000-2000コピーと減少していた。一方卵子・胚には体細胞ピストンH1aが発現することが明らかになった。また、市販ヒト卵巣組織cDNAライブラリから完全長cDNAクローンを作成し、タンパク発現を大腸菌、およびコムギ胚芽無細胞系で試みた。大腸菌では発現が見られなかったが、コムギ無細胞系ではタンパク発現がみられた。現在、精製タンパクからモノクロナール抗体を作成するとともに、組み替えタンパクを作成し、リン酸化部位を解析中である。
オリゴデンドロサイトを介した神経軸索間情報伝達機構の解明

オリゴデンドロサイト(以下OL)は、ミエリン形成後もニューロンの活動電位の伝導速度を調節することが明らかになっている。また、一つのOLは複数の軸索に対してミエリンを形成することから、OLがニューロン間の情報伝達を仲介、調節している可能性が考えられているが、未だ不明な点が多い。当該研究課題では、(1)OL-ニューロン間の相互作用を生体マウスの中枢神経系で可視化する技術、(2)OL特異的に光感受性チャネルを発現させたマウス、(3)OL-ニューロン間に形成されるパラノードが崩壊するノックアウトマウスをそれぞれ確立、解析し、OL-ニューロン相互作用が脳の高次機能に与える影響を研究した。1)GFP標識した弱毒化狂犬病ウイルスを脳梁に注入することにより個々のオリゴデンドロサイト(OL)の形態を標識することに成功した。この狂犬病ウイルスと、DsRed2及びBFP標識したアデノ随伴ウイルスを用いた3重標識法によりOL-神経軸索間の相互作用を詳細に解析できる新規の手法を開発した。この手法により生体マウスの脳梁OLは左右どちらの脳半球から投射する神経軸索に対してもミエリン形成することを明らかにした。2)OL特異的に光感受性チャネルを発現させたマウスを用い、海馬白板にて複合活動電位を記録し、光刺激によってOLを脱分極させたときの軸索伝導変化を検討した。複合活動電位の振幅は、光刺激によるOLの脱分極の大きさに依存して、光刺激直後の増加とさらなる漸増の両方を示す場合と、漸増のみを示す場合とが観察された。複合活動電位の幅は、前者では、光刺激によって約10分間持続する一過性の減少を示したのに対し、後者では、複合活動電位の幅に変化はみられなかった。また、逆行性に伝導してくる活動電位の潜時を測定したところ、OLが大きく脱分極する場合では、一過性の潜時の減少が観察された。以上の結果は、OLの脱分極によって、軸索伝導に促進性の可塑的変化が生じたことを示唆する。これらの修飾効果は、複数の軸索を伝導する活動電位を同調させ、脳白質における情報処理に影響を与えるものと考えられる。3)ランビエ絞輪に隣接するパラノードでは、髄鞘-軸索間でjunctionを形成し、伝導速度の維持に機能している。NF155遺伝子欠損マウスにおいてパラノードの崩壊を誘導し、ニューロン側で発現変化する遺伝子をマイクロアレイ法により網羅的に解析した。その結果、発現が増減したニューロン遺伝子を多数同定した。(1)我々は、GFP標識した弱毒化狂犬病ウイルスを脳梁に注入することにより個々のOLの形態を詳細に標識することに成功した。DsRed2及びBFP標識したアデノ随伴ウイルス(AAV)によるサブタイプ依存的な神経軸索の標識と、前述の狂犬病ウイルスを合わせた3重標識法により、OL-神経軸索間の相互作用を詳細に解析できる新規の手法を確立した。この手法を生体マウスの異なった領域へ適応し、OLが局在する領域や、神経軸索のサブタイプに依存してミエリン形成様式が変化するかどうかを検証した。(2)オリゴデンドロサイト(OL)特異的に光感受性チャネルを発現させたマウスを用い、光刺激によってOLを脱分極させたときの、海馬白板における活動電位の軸索伝導変化を検討した。複合活動電位の振幅を増大させる効果がみられたが、それには、早期に発現して短時間持続する効果と、遅延して発現し長時間持続する効果の、2つの性質の異なる位相がみられた。後者は3時間以上持続したが、新たなタンパク質合成は必要ではなかった。また、光感受性チャネルに加え、Na+-K+-Cl-共輸送体をOLに過剰発現させたマウスを作製し、同様の実験を行ったところ、短時間・長時間両方における促進効果が有意に増大していた。これらのことから、OL脱分極による軸索伝導促進効果には、細胞内容量調節機能の変化が関与していることが示唆された。(3)神経軸索のランビエ絞輪に隣接するparanodal Junction(PJ)では、ミエリン-軸索間でjunctionを形成し、神経情報の伝達に機能している。PJの構成因子の一つであるNF155遺伝子の欠損によりマウスのPJを崩壊させた際、ニューロン側で発現変化する遺伝子をマイクロアレイ法により網羅的に解析した。その結果、発現が増減した遺伝子を多数同定し、それら遺伝子の発現がニューロンマーカーと非常に高い割合で共局在することを検出した。同定した遺伝子の機能解析を行うとともに、PJ崩壊によって引き起こされるマウス生体内での表現型の解析を行っている。1.申請者らはこれまでに、オリゴデンドロサイト(OL)-ニューロン間の相互作用を生体マウスの中枢神経系で可視化する技術を確立している。オリゴデンドロサイトがどのような機構で神経軸索を判別しているのかを明らかにするため、神経活動依存性に着目している。マウスの口髯除去による大脳皮質感覚野の活動低下、および眼瞼縫合による視神経の活動低下を誘起する系を確立し、髄鞘形成が神経活動に依存するかどうかを調べた。2.本年度より、OL脱分極による軸索伝導変化の生理的意義の検討を行っている。昨年度までと同様にOL特異的に光感受性チャネルを発現させたマウスを用い、OL操作により活動電位が同期したときの出力先(海馬台ニューロン)シナプスにおけるシナプス伝達の変化について検討した。

海馬台ニューロンから興奮性シナプス反応を記録し光刺激後のシナプス反応の変化を調べたところ、海馬台ニューロンの発火パターンによって増大の程度が異なっていた。また、同じ海馬台内でも、近位(CA1に隣接)と遠位(前海馬台傍海馬台に隣接)とで、光刺激によるシナプス反応の変化が異なっていた。これらの結果から、OL脱分極による出力先シナプスでの変化には場所優位性があり、さらに海馬台ニューロンの発火様式と密接に関連していることがわかった。すなわち、海馬出力を場所および細胞特異的に修飾している可能性が示唆された。3.神経軸索のランビエ絞輪に隣接するParanodal Junction(PJ)では、ミエリン-軸索間でJunctionを形成し、神経情報の伝達に機能している。まずPJの構成因子の一つであるNF155に対するsiRNAを発現するアデノ随伴ウイルスをマウス脳内に注入し、マウス内包のPJを破壊することに成功した。また、それに伴ったマウス筋電図の変化を電気生理学的に検出することに成功した。1.新規に開発したOL-神経軸索間の相互作用解析法を生体マウス脳に適用し、大脳皮質の異なる領野から投射する神経軸索に対して、OLが選択的に髄鞘形成を行うことを明らかにしてきた。引き続いて、髄鞘形成が神経活動に依存するかどうかに着目し、マウスの口髯除去による大脳皮質感覚野の活動低下、および眼瞼縫合による視神経の活動低下の誘起では、髄鞘形成が変化しないことも明らかになってきている。これらの結果から、研究進捗状況としては、順調に進んでいると判断した。2.主な研究事項は、1.OL脱分極による活動電位の伝導速度変化・活動電位同調作用の検討、2.OLによる軸索伝導変化の機序の検討、3.OL操作により軸索伝導が変化したときの出力先シナプスにおける可塑性誘導の変化、4.OL操作による軸索伝導変化の生理的意義のin vivoにおける検討である。1については、すでにその成果を論文発表した。2については、NKCC1をOLで過剰発現させたマウスを用いた実験から、軸索伝導促進効果の機序に容量調節が関与することを示した。3では、海馬CA1ー海馬台シナプスにおいて、今年度までに細胞特異的にシナプス伝達を修飾するという結果を得ている。長期増強誘導についてもOL活性化により、誘導閾値が低下することをとらえつつある。4では、海馬および皮質に記録電極を刺入し、神経細胞のスパイク測定が可能になっている。これらのことから、研究進捗状況としては、順調に進んでいると考える。3. PJの崩壊によって発現変化するニューロン遺伝子を複数同定しており、初代培養神経細胞と生体マウスを用いて、その遺伝子の機能解析を行っている。また、NF155ノックダウンを誘導するアデノ随伴ウイルスを生体マウスの内包領域に注入し、実際にPJの崩壊を誘導できることと、その崩壊によりマウス筋電図に変化が起こることを確認できている。これらの結果、サルを使った実験を遂行するための予備実験が完了した。(1)マウスの口髯除去による大脳皮質感覚野の活動低下、および眼瞼縫合による視神経の活動低下を誘起する系を確立し、神経活動依存性に着目した。我々の技術の利点を生かして、一つ一つのOLに近接している個々の軸索の活動に依存して髄鞘形成が変化することを明らかにした。(2)これまでに、OL脱分極による軸索伝導変化が、軸索の長さ方向の部位によって異なること(場所優位性)を新たに発見してきた。
腎細胞癌に対するtemsirolimusおよびcustirsen併用療法の検討

腎癌細胞株Caki-1にtemsirolimus(Tem)を投与すると,clusterin発現は上昇したが,custirsen(Cus)を併用投与することにより,発現上昇は抑制された。また、Tem,Cusの併用投与により,Caki-1のTemに対する感受性は亢進した.Sublethal doseのTemにCusを併用投与すると,Caki-1にアポトーシスが誘導され,Mcl-1の発現は低下した.さらに、in vivoでもTem,Cusの併用療法は,腫瘍の増殖を有意に抑制した.以上より,Tem,Cusの併用療法は,腎癌に対する新規治療となる可能性が示唆された.我々は交付申請書における研究計画に記した通り、現在までにTemsirolimusによるRCC細胞株におけるclusterinの誘導様式の評価、CustirsenによるRCC細胞株におけるclusterin発現抑制効果の解析、Temsirolimusおよびcustirsen併用療法がRCC細胞株の形質変化に及ぼす影響の解析、Temsirolimusおよびcustirsen併用療法がRCC細胞株の遺伝子発現レベルに及ぼす影響の解析を施行し、以下の知見を得た。1)Temsirolimus投与により2種類のヒトRCC細胞株(ACHN、Caki-1)にclusterinの発現が亢進した。2)Temsirolimusにより亢進したACHN、Caki-1におけるclusterinの発現を、custirsenが濃度依存性に阻害した。3)Temsirolimus+ custirsen併用投与により、custirsen単独、temsirolimus+control ODN併用投与に比し、ACHN、Caki-1の細胞増殖は顕著に抑制されたが、遊走および浸潤能に有意な差を認めなかった。4)Temsirolimus+ custirsen併用投与により、ACHN、Caki-1におけるアポトーシス、シグナル伝達およびオートファジー関連した複数の分子の発現が顕著に変化した。研究実績の概要に記した通り、本研究課題は交付申請書における研究計画に従って、ほぼ順調に推移していると考えられる。我々は交付申請書における研究計画に記した通りに研究を遂行し、今年度新たに以下の知見を得た。研究実績の概要に記載した通り,本研究課題は交付申請書における研究計画に従って,ほぼ順調に推移していると考えられる.本研究は、研究計画書に従い平成2728年度にかけて順調に推移していた。既に2年間の成果は論文として発表済である(Nishikawa M, Miyake H, Gleave M, FujisawaM : Effect of Targeting Clusterin Using OGX-011 on Antitumor Activity of Temsirolimus ina Human Renal Cell Carcinoma Model. Target Oncol. 2017;12:69-79.)が、この成果に加えて平成29年度においては、以下の検討を行った。In vitroにおいてヒト腎癌細胞株をtemusirolimusおよびcustirsenにて処理した後に発現が亢進する複数の分子シャペロンを同定し、これらを標的としたアンチセンスオリゴを精製した。このうち、temusirolimusおよびcustirsenに追加投与することにより、抗腫瘍効果の増強を認めるアンチセンスオリゴ(アンチセンスオリゴX)を用いて、temusirolimus + custirsen +アンチセンスオリゴXとtemusirolimus + custirsen +コントロールオリゴXの腫瘍増殖抑制効果をin vivoで検証したところ、前者の抗腫瘍効果が後者に比し有意に顕著であるとの所見を得た。今後、アンチセンスオリゴX単剤、アンチセンスオリゴXとtemusirolimusあるいはcustirsenの2剤併用療法の抗腫瘍効果およびアンチセンスオリゴXを軸とした新規治療の効果発現メカニズムを引き続き解析していく予定である。また、Tem,Cusの併用投与により,Caki-1のTemに対する感受性は亢進した.Sublethal doseのTemにCusを併用投与すると,Caki-1にアポトーシスが誘導され,Mcl-1の発現は低下した.さらに、in vivoでもTem,Cusの併用療法は,腫瘍の増殖を有意に抑制した.以上より,Tem,Cusの併用療法は,腎癌に対する新規治療となる可能性が示唆された.本研究は今後以下の順序で推進して行く予定である。1)In vivo RCCモデルにおけるtemsirolimusおよびcustirsen併用療法の評価(1In vivoにおけるtemsirolimusおよびcustirsen併用療法のclusterin発現レベルの制御の評価、2In vivoにおけるtemsirolimusおよびcustirsen併用療法の抗腫瘍効果の検討、3In vivoにおけるtemsirolimusおよびcustirsen併用療法の至適投与スケジュールの解析)、2)Temsirolimusおよびcustirsen併用療法における抗腫瘍効果発現に関与する分子を対象としたRCCに対する新規治療標的の開発、3)RCCのtemsirolimusに対する治療抵抗性獲得の早期診断に有用な分子マーカーの同定(1根治的腎摘除術標本を用いた免疫組織化学染色、2Temsirolimus投与中および投与後の血清を用いた分子マーカー検索)本研究は今後,RCCのtemsirolimusに対する治療抵抗性獲得の早期診断に有用な分子マーカーの同定に焦点を合わせて推進していく予定である.泌尿器科悪性腫瘍
胃がんにおけるPI3K活性化機構の解明とキナーゼ阻害薬の個別化治療への応用

新規多標的キナーゼ阻害薬であるforetinibはMET遺伝子に増幅のある胃がん細胞のみならずFGFR2に遺伝子増幅のある細胞にも有効であることが新たに分かった。少なくとも一部の胃がん細胞ではMETやFGFR2を核としたシグナルネットワークが存在し、効率的なPI3K経路活性化に関わっていることが示唆された。Foretinibはこのネットワークを破壊することで効果を発揮することが示唆された。我々は、新規多標的キナーゼ阻害薬(MET, RON, AXL, VEGFRsを標的)であるforetinib (GSK1363089)の作用機序を胃癌の細胞株パネル(n=12)を用いて解析した。胃癌細胞株の内、高い感受性を示したのはKATO-III(FGFR2増幅)とMKN-45(MET増幅)の2種類のみであった。予想された如く、MKN-45ではforetinib (1μM)と選択的MET阻害薬であるPHA665752(1μM)のいずれもが強い細胞増殖抑制とPI3K経路の抑制を導いた。一方、KATO-IIIではPHA665752はMETのリン酸化抑制は導くものの下流のシグナルおよび細胞増殖は抑制しなかった。一方、KATO-IIIにおいては、foretinib(1μM)と選択的FGFR阻害薬であるPHA665752(1μM)がFGFR2のリン酸化と下流シグナルおよび細胞増殖を強く抑制することが分かった。ForetinibのFGFR2に対する作用はこれまで報告がなかったが、我々は別のFGFR2遺伝子増幅胃癌細胞株であるOCUM-2Mでそれを確かめた。phospho-receptor tyrosine kinase arrayでは、MKN45において、foretinibがMETを介してEGFR、HER3、FGFR3のリン酸化を、KATO-IIIにおいてはFGFR2を介して、EGFR、HER3、METのリン酸化を抑制することが示唆された。MKN-45におけるHER3とFGFR3の細胞内シグナルおよび細胞増殖における役割を探索するため、これらをsiRNAを用いてknockdownしたところ、PI3K経路および細胞増殖が抑制された。結論として、foretinibはMETのみならずFGFR2の遺伝子増幅をもつ細胞に高い抗腫瘍効果を示すことが分かった。また少なくとも一部の胃癌細胞では、遺伝子増幅受容体を核とした受容体間ネットワークが存在し、効率的なPI3Kシグナルおよび細胞増殖に関わっていることが示唆された。
リスクアセスメントとオーラルリテラシーを向上する誤嚥性肺炎の危険予知システム開発

地域包括ケアシステムの確立が推進される中で、在宅高齢者の身体状態の変化を察知するリスクアセスメントが重要となっている。本研究の目的は、医療の中心を担う看護師が、高齢者の協力度に関係なく、誤嚥性肺炎のリスクの進行を予知できる科学的評価システムを開発することである。これまでは経験の中でリスクを見抜いてきたため、熟練度により身体変化の気づきに差が生じていた。もし、看護師のリスクアセスメントを裏付ける科学的評価が実現されれば、病気の早期発見の確信が得やすくなる。開発する科学的評価法は、誤嚥性肺炎の原因である口腔細菌の質と量の評価と、簡易嚥下機能評価を柱とした"健康状態の見える化"である。
植物香気物質フェニルプロペン生合成経路の解明と代謝工学

本研究では、芳香族香気成分であるフェニルプロペン類を高生産する植物種を探索し、フェニルプロペン類の多様性に関わるメチレンジオキシ環化酵素およびプレニル化酵素の単離、機能解析を行った。その結果、セリ科のディル、チャービル、パセリ、シキミ科のシキミ、ウマノスズクサ科のカンアオイにおいてミリスチシンやディルアピオール、ジメチルアリルオイゲノールなどフェニルプロペン類が高生産されることを明らかにした。さらに、メチレンジオキシ環化酵素およびプレニル化酵素をコードすると推定される酵素遺伝子をディルおよびシキミから単離することに成功した。植物香気成分として知られるフェニルプロペン類は、ベンゼン環(C6)に直鎖状プロペン(C3)が結合したC6-C3を基本骨格とする化合物群であり、1プロペン側鎖の立体構造、2ベンゼン環の置換基、の2点において構造多様性が見られる。申請者を含めた最近の研究によりフェニルプロペン化学構造の違いが抗菌作用や植食性動物に対する忌避作用など生物活性や香気特性に与える影響が明らかになっていく一方で、化学構造の多様性を規定する生合成酵素ならびにその反応機構についての報告は未だ数少ない。そこで本研究では、フェニル基(C6)部分をプレニル化およびメチレンジオキシ環化する従前未解明の酵素の単離、機能解析を行う。H27年度においては、プレニル基やメチレンジオキシ環を有するフェニルプロペン類を生成するシキミ(Illicium anisatum)やディル(Anethum graveolens)の代謝物変動解析を行った。さらに、フェニルプロペン量が多かった組織、生育段階からRNAを単離し、次世代シーケンス解析による候補遺伝子の探索を行った。研究計画通り、フェニルプロペン量の代謝物変動解析、および候補遺伝子の絞り込みが順調に進んでいる。植物香気成分として知られるフェニルプロペン類は、ベンゼン環(C6)に直鎖状プロペン(C3)が結合したC6-C3を基本骨格とする化合物群であり、プロペン側鎖の立体構造とベンゼン環の置換基の2点において構造多様性が見られる。申請者を含めた最近の知見(Koeduka et al., Plant Biol. (2011))から、フェニルプロペン化学構造のわずかな違いが、抗菌作用や植食性動物に対する忌避作用など生物活性や香気成分の匂い特性に影響を与えることが明らかとなっている。その一方で、化学構造の多様性を規定する生合成酵素の単離ならびにその反応機構についての報告は未だ数少ない。そこで本研究では、ベンゼン環(C6)部分をプレニル化およびメチレンジオキシ環化する従前未解明の酵素の単離、機能解析を行うこととした。現在までに、非揮発性の芳香族化合物であるリグナンやアルカロイドを基質とするメチレンジオキシ環化酵素やフラボノイドなどのポリフェノールをプレニル化する酵素については、徐々に報告例が増えてきている。本研究で単離を目指す候補遺伝子は、これら既報の酵素遺伝子と相同性が高いことが予想されることから、芳香族香気成分であるフェニルプロペン類を多く生成する組織に着目し、候補遺伝子のスクリーンニングおよび絞り込みを行った。H28年度においては、プレニル基やメチレンジオキシ環を有するフェニルプロペン類を生成するシキミ(Illicium anisatum)やディル(Anethum graveolens)からRNAを単離し、次世代シーケンス解析による候補遺伝子の探索を行った。さらに、候補遺伝子の酵素機能を解析するため、タバコでの一過的発現解析ならびに代謝物変換解析を行った。プレニル化オイゲノールを高蓄積するシキミから、トマト由来のプレニル化酵素遺伝子と78%のアミノ酸相同性をもつ全長遺伝子(1197 bp)を単離した。次に、この遺伝子を植物発現用のバイナリーベクターに挿入し、タバコ葉での一過的発現解析を行った。しかしながら、オイゲノールを基質とした場合、代謝物変換によるプレニル化合物の検出は見られなかった。そこで更なる候補遺伝子の探索として、アネトールのプレニル化体であるフェニキュリンを蓄積するアニス(Pimpinella anisatum)から、縮重プライマーを用いたプレニル化酵素遺伝子のクローニングを行った。その結果、パセリから単離されたクマリン特異的プレニル化酵素遺伝子と47-57%のアミノ酸相同性を有する2つの異なる遺伝子断片(約300 bp)を獲得することに成功した。現在、RACE-PCR法を用いた全長遺伝子のクローニングを進めている。一方で、ミリスチシンやディルアピオールを生成するディルからメチレンジオキシ環化酵素遺伝子をコードすると考えられる3つの全長候補遺伝子を単離することに成功した。これら候補遺伝子の発現パターンは、香気成分の組織別蓄積プロファイルと相関があり、リグナンのメチレンジオキシ環化酵素と32-55%のアミノ酸相同性を示した。現在、タバコ葉での一過的発現系を用いて環化活性を調べている。植物香気成分として知られるフェニルプロペン類は、ベンゼン環(C6)に直鎖状プロペン(C3)が結合したC6-C3を基本骨格とする化合物群である。これらフェニルプロペン類は、プロペン側鎖の立体構造とベンゼン環の置換基の2点の組合せにより化学構造の多様性が見られる。そして、これら化学構造のわずかな違いにより生理活性や香気特性が異なることが知られている。例えば、バジル主要香気成分の一つであるオイゲノールはフェノール性水酸基がプレニル化されると、修飾される前の母核構造には見られない抗虫活性を示すことが明らかになっている。

その一方で、化学構造の多様性を規定する生合成酵素の単離ならびにその反応機構についての報告は未だ数少ない。そこで本研究では、ベンゼン環(C6)部分をプレニル化およびメチレンジオキシ環化する従前未解明の酵素の単離、機能解析を行うこととした。現在までに、非揮発性の芳香族化合物であるリグナンやアルカロイドを基質とするメチレンジオキシ環化酵素やフラボノイドなどのポリフェノールをプレニル化する酵素は、いくつか報告されている。本研究では、これら報告のある酵素遺伝子と相同性が高く、芳香族香気成分であるフェニルプロペン類を多く生成する組織に高発現している候補遺伝子の絞り込みを行った。H29年度においては、プレニル基やメチレンジオキシ環を有するフェニルプロペン類を生成するシキミ(Illicium anisatum)やディル(Anethum graveolens)からRNAを単離し、次世代シーケンス解析による候補遺伝子の探索、RACE-PCRによる全長候補遺伝子の取得を行った。さらに、候補遺伝子の酵素機能を解析するため、酵母発現系を用いた組換え酵素の発現ならびに代謝物変換解析を行った。本研究では、芳香族香気成分であるフェニルプロペン類を高生産する植物種を探索し、フェニルプロペン類の多様性に関わるメチレンジオキシ環化酵素およびプレニル化酵素の単離、機能解析を行った。その結果、セリ科のディル、チャービル、パセリ、シキミ科のシキミ、ウマノスズクサ科のカンアオイにおいてミリスチシンやディルアピオール、ジメチルアリルオイゲノールなどフェニルプロペン類が高生産されることを明らかにした。さらに、メチレンジオキシ環化酵素およびプレニル化酵素をコードすると推定される酵素遺伝子をディルおよびシキミから単離することに成功した。今後は候補遺伝子の発現解析から代謝物の蓄積パターンと相関がある遺伝子について、組換え酵素遺伝子を作成する。さらに、組換え酵素遺伝子を用いたプレニル化およびメチレンジオキシ環化反応の酵素活性測定を確立する。今後は、アニスを含めた他の植物種からも更なる候補遺伝子の探索、全長遺伝子の単離を継続する。また、当該酵素活性の検出を行うため、タバコ一過的発現系に加え、酵母や昆虫細胞などを発現宿主として組換え酵素の最適な発現系を構築する。植物生化学効率良く代謝物分析が進められたため、当初予定していた予算(消耗品費:分析試薬類)よりも使用額が少なくなったため。他の研究費との兼ね合いから、物品費など予定よりも少額で済んだため、次年度予算へと繰越すこととなった。平成28年度は遺伝子のクローニングおよび組換えタンパク質の発現系確立に重点をおくため、繰越した予算はそちらの実験に使用する予定をしている。次年度に予定している組換え酵素を用いた当該酵素の機能解析に使っていきたい。
ホームレス者の健康支援を通じた社会的包摂の推進に関する研究

1.聞き取り実施26支援団体の活動内容:健康支援、居場所づくり・相談、炊き出し、居住・生活支援、まちづくり、夜回り、労働者の子どもへの支援2.うち7団体が紹介した15名(男性生活保護受給者)は、心動かす支援者からの働きかけ(3名)、居場所やいきがいづくり(8名)、居住・生活支援(4名)にむすびつき、支援団体・支援者とのかかわりの中で『人として生きるパワー』をとりもどしていた。釜ヶ崎を中心に西成区では生活保護受給者が急増している。生活保護受給により金銭的保障を受けても閉じこもり、鬱状態、アルコール依存など深刻な問題を抱える者も多く、必要な対応ができないまま、孤独死、自殺に追い込まれる者もいる。このような事態に対して、公的サービスだけでは必要な対応ができていない場合が多く、地域の民間支援団体、ボランティアなどが極めて多様な支援活動を展開している。平成22年度に実施した研究は、次のとおりである。(1)第1次調査:このような支援活動を続けている団体(17団体)から下記項目を中心に聞き取り調査を実施し、冊子『はーとふる』(ホームレス者の健康支援を通じた社会的包摂の推進に関する研究平成22年度報告書)としてまとめた。さらに数団体の協力を得て聞き取り調査を継続する予定である。*活動の理念*活動の対象*活動の内容*活動従事者*健康づくり、命や健康を守ることにつながっているか*仲間づくりにつながっているか*うまくいった事例*うまくいかなかった事例(2)第2次調査:聞き取り調査を実施した支援団体から支援した事例のうち、支援を通じて社会的包摂につながったケースを紹介してもらい、『支援する人々の関わり』の中で『人として生きるパワー』『社会とのつながり』を取り戻し、『釜ヶ崎で生きてきてよかったなあ』と思いながら暮らしている生活保護受給者からの聞き取り調査の一部を実施した。大阪市西成区の釜ケ崎では、日雇労働者の高齢化と不況があいまって、野宿生活を余儀なくされるものが増え、身体的・精神的疾患を持つものが多い。高齢・罹患などを契機に生活保護を受給し、アパート(多くは3畳1間の簡易宿泊所転用)で一人暮らしをするものが急増している。水内らによる西成区の生活保護受給者(野宿経験者多数含む)の調査によると、外出頻度の少ない引きこもり型の、社会との接点を持ちにくい人が約2割おり、傷病や入退院、障害その他、アルコールやギャンブルなど日常生活維持が困難なものが約3割程度いることが明らかになっている。深刻な問題を抱えながら必要な対応ができずに孤独死・自殺に追い込まれるものも少なくない。日雇労働者のさらなる高齢化と経済不況の長期化により、釜ケ崎における高齢単身(男性)生活保護受給者の増加傾向が続くことが予想され、効果的かつ効率的な支援が急がれる。このような状況に対して釜ケ崎地域では、健康支援をはじめ様々な民間の支援が行なわれているが、支援者するひととのかかわりを通じて、「人として生きるパワー」「社会とのつながり」をとりもどし、「釜ケ崎で生きてきてよかったなあ」と思いながら暮らすことができている人もいる。23年度はこのような事例の聞き取り調査を、支援者・支援者から紹介をうけた被支援者から、実施した。本研究により健康支援をはじめとする支援者とのかかわりを契機とするエンパワーメント方策・社会的包摂推進の可能性が実証されれば、ホームレス者や生活保護受給者にとってのみならず、社会全体にとってもその影響は極めて大きいと考える。釜ケ崎では、日雇い労働者の高齢化・不況があいまって、野宿生活を余儀なくされるものが増え、身体的・精神的疾患を持つものが目立つ。高齢・罹患などを契機に生活保護を受給し、アパート(多くは3畳1間)で一人暮らしをするものが急増、閉じこもり、うつ状態、アルコール依存をはじめ深刻な問題を抱えながら必要な対応ができずに孤独死・自殺に追い込まれるものも少なくない。このように多様で深刻な問題を抱えるものが多く居住する釜ケ崎においては、公的支援だけでは対応しきれず、多くの民間団体が支援を続けている。一次調査として釜ケ崎で活動をする民間支援団体から活動内容などについて聞き取り調査をおこなった。民間支援団体がさまざまな支援を行う中で、『人として生きるパワー』『社会とのつながり』を取り戻したものもいる。二次調査として、このような事例について民間支援団体から紹介を受け、本人にインタビュー面接をして聞き取り調査をおこない、支援内容と『人として生きるパワー』『社会とのつながり』を取り戻した経過・成育歴・生活歴などについて量的・質的分析を加えた。さらに以上のような調査の分析結果を踏まえて、長年にわたり社会から疎外されつづけた元日雇い・野宿経験を有する単身高齢男性の社会的包摂を推進するための仕組みづくりの試みとして、釜ケ崎地域内において、健康づくり・見守り支援、入院支援・退院支援、単身高齢者相互のふれあいの場所づくりを試行した。

東北の震災の影響による研究費一時凍結により、研究協力者(他機関教員など)の協力が得やすい期間である8月・9月にフィールド調査が実施できなかったため24年度が最終年度であるため、記入しない。1.これまでに実施した調査の加えて次の聞き取り調査をさらに加える(1)地域の医療機関に入院中・通院中の患者(2)結核治療終了者・DOTS終了者(3)健康支援NPOの支援を受けた生活保護受給者(4)サポーティブハウス居住者の聞き取り調査2.これまでに実施した調査に加えて24年度実施の調査とあわせて質的・量的分析をおこなう3.分析結果をもとに大阪市西成区通称釜ケ崎地域に社会的包摂を促進するための仕組みづくりを検討・試行する4.以上の実践的調査研究結果に関して学際的分析を加え、報告書を作成する24年度が最終年度であるため、記入しない。
機関内で研究に用いられるヒト細胞株の誤認証の実態把握と品質管理システムの確立

機関内で研究に用いられるヒト細胞株の認証に関する品質管理システムを確立するために、部門で共通機器として保有するキャピラリーシーケンサー(Applied Biosystems 3130ジェネティックアナライザ)を活用し、標準的16ローカスを標的とするShort Tandem Repeat(STR)解析システムを構築した。機関内で用いられSTRパターンが公開されているヒト細胞株を収集し、ゲノムDNAを抽出して、Multiplex PCR後にシーケンサーで泳動することでSTR解析を実施し、STRパターンの比較により細胞株種の識別が可能であることを確認した。期待するパターンと異なる結果を示す細胞を検出しなかったことから、A549肺癌細胞株の親株から表現型に違いのある複数の子株(独立するクローン)ならびにA549に遺伝子導入後にクローン化した中から表現型に差があるクローンをモデルとして提供を受け、クローン間での表現型の違いがクロスコンタミネーションによるものでないことを検証する実験系に計画を変更した。その結果、異なる子株(クローン)間では、マーカーの1つで繰り返し数が異なるパターンを示すものが検出されたが、informativeなマーカーのほとんどは一致していた。これは、A549の親株の細胞中に遺伝的な不均一性を持つクローン(clonalvariation)があり、これが表現型の違いに関与している可能性があるものの、亜株の範囲に留まり他の細胞株のクロスコンタミによるものではないことを示しており、研究における細胞認証の重要性が示された。以上から、現在まで機関内での誤認証は確認されていないものの、本研究を基に研究者への啓蒙と定期的なサーベイランスによる誤認証の防止システム確立に役立つ「機関内でのヒト細胞株認証サービスを柱とする誤認証監視システム構築」につながる成果が得られた。
放射性セシウム汚染土壌による内部被ばくに対するリスク評価の精緻化

福島第一原子力発電所事故時に放出された放射性セシウム(Cs)は土壌中の粘土鉱物のフレイドエッジサイトに強固に保持され、雨水等にほとんど溶出しないことが知られている。一方、現行の内部被ばく線量評価体系では、全てのCs化合物に対して体内吸収率は一律に100%と仮定されている。したがって、懸念される汚染土壌粒子の周辺住民および除染作業員に対する吸入・経口ばく露評価の更なる精緻化には、土壌粒子吸着態Csの体液への溶出特性の解明が必要である。その前段階として、Csの土壌粒子への吸着特性(時間・濃度依存性)の把握を試みた。具体的には、福島県を含む国内の代表的な土壌である黒ボク土、沖積土および黄色土を対象として, Cs-137をトレーサーに用いた振とう試験により吸着量を評価した。また、フレイドエッジサイト量の指標である放射性セシウム捕捉ポテンシャル(RIP)を測定した。経時的な振とう試験(固液比1:5、25°C、120rpm、1.548時間: 6時間区、Cs濃度10mM)の結果、1.5時間後には大部分のCsが固定され、24時間後には吸着平衡に達していた。濃度別の振とう試験(固液比1:5、25°C、120rpm、24時間、Cs濃度0.01400mM : 15濃度区)の結果、低濃度における吸着量は、黄色土≒沖積土>黒ボク土であり、RIPとの相関が認められた。他方、高濃度における吸着量は、土壌の種類による差を示さず、また、飽和状態には達しなかった。体液溶出試験に使用する土壌粒子吸着態Csを調製するための知見が獲得できた。なお、実環境下の発電所サイト外におけるCs-137汚染土壌の濃度レベルは本試験の濃度範囲よりも6桁以上低いため、事故により放出されたCsは短時間で、ほぼ全量が沈着先の土壌中に強く固定されたと考えられる。
心臓型アデニル酸シクラーゼを標的にする高齢化社会にむけた新しい心不全治療

本研究は心臓型アデニル酸シクラーゼ抑制薬を心不全ならびに不整脈治療薬として開発する。マウス心不全ならびに不整脈モデルを作成し、ビダラビンが心不全ならびに不整脈治療薬として有用である基礎薬理データを得た。また水溶性であり、ビダラビンと同等の作用を有する新規薬剤を開発した(H22-23)。平成24年度には横浜市立大学附属病院心臓血管外科で術後心房細動症例を対象にして、ビダラビンの抗不整脈薬としての有用性を確認した(H24)。[目的]アデニル酸シクラーゼ(AC)の9つのサブタイプのうち心臓特異的に発現するサブタイプ(AC5)欠損マウスの解析から、同酵素を選択的に阻害することで、心機能や呼吸機能抑制を起こさずにベータ遮断薬と同等の心不全治療ができる基礎データを報告した。本申請の目的はAC5特異的抑制剤を高齢者にも安心して使える心不全治療薬として開発することである。[方法と結果]1)抗ヘルペス剤の心不全治療薬への臨床開発5型サブタイプ阻害効果を持つ抗ヘルペス剤(Vidarabine)の適応症には心不全は含まれていないため、心不全治療における有効性を心不全マウスモデルを用いて実証する。(1)慢性カテコラミン刺激心不全マウスモデル(2)心筋梗塞心不全マウスモデル我々は以上2つの心不全マウスモデルを用いて、Vidarabineの心不治療薬としての有用性を検討したところ生理学実験(心エコー)、病理学実験(TUNEL染色、Masson-trichrome実験)、分子生物学・生化学実験(アポトーシスシグナルの評価)をおこない心不全治療薬としての有用性を検討。2)新規化合物の開発Vidarabineは水溶性が低く脂溶性であるため中枢神経系への副作用が懸念される。したがって水溶性が高くかつVidarabineと同等の5型サブタイプ選択的抑制作用をもつ薬剤は心臓に対する治療効果が高いと予測される。現在Vidarabineの側鎖を変えることで水溶性を高くなる候補化合物の構造式をデザインした。[研究目的]本申請の目的はAC5特異的抑制剤を高齢者にも安心して使える心不全治療薬として開発することである。[方法ならびに結果]平成22年度中に合成した新規AC5選択的抑制剤の候補化合物の心臓型アデニル酸シクラーゼに対する抑制効果ならびに心不全治療薬としての有用性について下記手法を用いて検討した。a)膜ACアッセイ心筋組織膜タンパク内のAC活性に対する抑制効果を,野生型マウスならびに心臓型アデニル酸シクラーゼノックアウトマウス(AC5KO)の心臓から抽出した膜分画を用いて検討した。新規AC5特異的抑制剤のAC活性抑制作用はWTから抽出した膜分画のAC活性抑制効果に比較して、AC5KOから抽出した膜分画のAC活性抑制効果は有意に少なかった。以上の結果から新規AC5特異的抑制剤はAC5に対する選択的な抑制薬であることが示唆された。b)サイクリックAMP accumulation assayラット胎児培養心筋細胞をフォルスコリン刺激して細胞内に蓄積したcAMPレベルに対する低下効果について検討したところ新規AC5特異的抑制剤はフォルスコリン刺激して細胞内に蓄積したcAMPを有意に低下させた。c)心不全マウスモデルを用いて検討イソプロテレノールを用いた慢性カテコラミン刺激心不全マウスモデルを用いて検討した。コントロール群に比較してイソプロテレノールと新規AC5特異的抑制剤を併用して投与したマウスでは心機能低下が有意に抑制された。以上の結果は新規AC5特異的抑制薬が心不全治療薬として有用であることを示唆している。[目的]ベータ遮断薬は心不全ならびに不整脈治療の代表薬であるが、導入初期の心機能と呼吸機能抑制という副作用は高齢者では大きな問題である。本申請では心臓型アデニル酸シクラーゼサブタイプ(AC5)欠損マウスの解析結果から、「AC5の選択的阻害薬は心機能や呼吸機能抑制を起こさず、高齢者にも安全に投与可能な心不全ならびに不整脈の治療効果が期待できる」という仮説をたて臨床応用を目指している。[方法と結果]1)AC5特異的抑制作用を有する抗ヘルペス薬(ビダラビン)の臨床治験:平成23年度には横浜市立大学付属病院倫理委員会にて臨床治験が承認(B110512007)され、平成24年度は横浜市大病院心臓血管外科で術後心房細動症例に対して、ビダラビンの抗不整脈効果について医師主導型臨床治験が開始された。12症例中8例で有効性が確認された。本研究成果はPCT国際出願を行った(「ビダラビンによる心房細動治療」PCT/JP2012/069540)。2)水溶性ビダラビン誘導体の毒性試験と中枢移行性の検討:マウス心不全モデルで抗心不全作用が確認できるのに十分な投与量では肝機能や腎機能への障害は確認されなかった。またストレキニーネ抑制試験の結果からビダラビンに比較して新規化合物は有意に中枢への移行性が低いことを確認した。