hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトDNA鎖切断修復の逆遺伝学的解析と医療への応用

DNA鎖切断修復経路の異常や欠損はさまざまな遺伝病やがんと密接に関連する.我々は最近,ヒトpre-B由来リンパ球細胞株Nalm-6を用いて,遺伝子ノックアウトを郊率良く行えるシステムの開発に成功した.そこで本研究では,DNA鎖切断修復に関わる遺伝子について系統的に遺伝子ノックアウトを行い,得られた変異細胞株の表現型解析を行った.特に,二重変異株の作製と解析により,遺伝子間あるいは経路間の相互作用の解析を進めた.主な成果の概要は以下の通りである.・二本鎖切断修復に関わる遺伝子の機能解析を行い,特にBLM(ブルーム症候群原因遺伝子)やp53,DNA ligase IV,Mus81エンドヌクレアーゼ,FANCB(ファンコニー貧血原因遺伝子の一つ)の変異株の詳細な表現型解析から,ヒト細胞におけるこれら遺伝子群の相互作用を明らかにした.・DNA二本鎖切断の修復には,相同組換えとエンドジョイニングの双方が重要な働きをしているが,傷の種類や量によって各経路の働きが大きく異なることを明らかにした.・TDP1(脊髄小脳失調症SCAN1原因遺伝子)欠損細胞は,カンプトテシンやブレオマイシンなどの抗がん剤に対して高感受性を示すが,APTX(脊髄小脳失調症AOA1/EAOH原因遺伝子)欠損細胞ではこうした表現型が観察されないことを明らかにした.・DNA ligase IVとArtemis(ともに重症複合免疫不全症の原因遺伝子)はともにエンドジョイニング経路において機能しているが,Artemisはこれとは別の機能,すなわち修復経路選択のステップにも関わっていることを明らかにした。DNA鎖切断修復経路は,ゲノム安定性の維持に不可欠であり,その異常や欠損はさまざまな遺伝病やがんと密接に関連する.我々は最近,ヒトpre-B由来リンパ球細胞株Nalm-6を用いて,遺伝子ノックアウトを効率良く行えるシステムの開発に成功した.そこで本研究では,このシステムをさらに充実させるとともに,DNA鎖切断修復機構の全体像を捉えることを目的として,この修復に関わる遺伝子のノックアウト細胞を系統的に作製し,得られた変異細胞株の表現型解析を行った.特に,二重変異株の作製と解析により,遺伝子間あるいは経路間の相互作用について検討を行った.その結果,BLM(ブルーム症候群原因遺伝子)欠損細胞の増殖遅延や複製阻害剤感受性がDNA ligase IV(エンドジョイニングに必須なDNAリガーゼ)の欠損により部分的に回復することや,BLM欠損細胞の複製阻害剤感受性がp53欠損によりレスキューされるにもかかわらずエトポシド感受性はレスキューされないことなどを明らかにした.また,Mus81エンドヌクレアーゼとFANCB(ファンコニー貧血の原因遺伝子の一つ)がDNA修復において部分的にオーバーラップした役割をもっていることや,電離放射線やネオカルチノスタチンで生じたDNA二本鎖切断の修復に相同組換えとエンドジョイニングの双方が重要な働きをしていることを明らかにした.さらに,脊髄小脳失調症SCAN1の原因遺伝子であるTDP1のノックアウト細胞を作製するとともに,DNA ligase IVとの二重破壊株を作製し解析を進めた.DNA鎖切断修復経路の異常や欠損はさまざまな遺伝病やがんと密接に関連する.我々は最近,ヒトpre-B由来リンパ球細胞株Nalm-6を用いて,遺伝子ノックアウトを郊率良く行えるシステムの開発に成功した.そこで本研究では,DNA鎖切断修復に関わる遺伝子について系統的に遺伝子ノックアウトを行い,得られた変異細胞株の表現型解析を行った.特に,二重変異株の作製と解析により,遺伝子間あるいは経路間の相互作用の解析を進めた.主な成果の概要は以下の通りである.・二本鎖切断修復に関わる遺伝子の機能解析を行い,特にBLM(ブルーム症候群原因遺伝子)やp53,DNA ligase IV,Mus81エンドヌクレアーゼ,FANCB(ファンコニー貧血原因遺伝子の一つ)の変異株の詳細な表現型解析から,ヒト細胞におけるこれら遺伝子群の相互作用を明らかにした.・DNA二本鎖切断の修復には,相同組換えとエンドジョイニングの双方が重要な働きをしているが,傷の種類や量によって各経路の働きが大きく異なることを明らかにした.・TDP1(脊髄小脳失調症SCAN1原因遺伝子)欠損細胞は,カンプトテシンやブレオマイシンなどの抗がん剤に対して高感受性を示すが,APTX(脊髄小脳失調症AOA1/EAOH原因遺伝子)欠損細胞ではこうした表現型が観察されないことを明らかにした.・DNA ligase IVとArtemis(ともに重症複合免疫不全症の原因遺伝子)はともにエンドジョイニング経路において機能しているが,Artemisはこれとは別の機能,すなわち修復経路選択のステップにも関わっていることを明らかにした。
力覚フィードバックを用いた遠隔ロボット制御の安定化と高品質化

本研究では、一人の利用者が触覚インタフェース装置を用いて、ネットワークを介して産業用ロボットを遠隔操作し、ビデオを見ながら、安定で高品質な遠隔ロボット制御を実現することを目的とした。利用者は、産業用ロボットのハンドに取り付けた力覚センサーからのフィードバックによって、ロボットハンドが物体に当たったときの反力を感じながら、操作することができる。この目的を達成するため、ロボット・制御工学の分野で研究されてきている安定性を確保する制御、通信・ネットワーク工学の分野における高いサービス品質(QoS: Quality of Service)を維持するQoS制御を融合し、更に発展させた。自由視点ビデオを見ながら触覚インタフェース装置を用いて遠隔の産業用ロボットを操作できるように実験システムを構築した。実験システムでは、簡単のためカメラの数を1とし、ネットワークの代わりにネットワークエミュレータを用いた。そして、今年度は、金属棒を穴に入れる作業、鉛筆・ボールペン・毛筆で文字を書く作業を対象とし、以下の検討を行った。(1)産業用ロボットに取り付けられた力覚センサーからの力情報を触覚インタフェース装置にどのように出力するか(最大反力の違いの吸収方法)、また両者の作業空間の大きさの違いをどのように吸収するかについて検討した。その結果、最大反力と作業空間の大きさのマッピング比率は作業内容に依存することが判明した。(2)ネットワークエミュレータによって、ネットワーク遅延を擬似的に発生させて実験を行い、ネットワーク遅延がシステムの安定性や操作性に与える影響を調査した。その結果、産業用ロボットの操作をある一定以上の速度で行うと、安定性が失われることが判明した。また、ネットワーク遅延の増加に伴い、操作性が大きく劣化することが判明した。操作性の劣化を抑えるためのサービス品質(QoS: Quality of Service)制御として、研究代表者らが以前に提案した反力の適応制御を適用し、その効果が大きいことをユーザ体感品質(QoE: Quality of Experience)評価によって定量的に示した。(3)自由視点ビデオの伝送方式として、研究代表らがこれまでに提案した合成画像伝送方式と画像・奥行画像伝送方式に対して、ネットワーク遅延に応じて伝送方式を切り替える制御を提案した。そして、QoE評価によって、その有効性を明らかにした。ビデオを見ながら触覚インタフェース装置を用いて遠隔の産業用ロボットを操作する実験システム(昨年度に構築)において、ネットワーク遅延揺らぎとパケット欠落の影響を調査した。作業として、予定通り、金属棒を穴に入れる作業、ボールペンで20ポイント程度の大きさの文字を書く作業を対象とした。主な検討内容を以下に示す。(1)力覚の制御方式として、Position-Position・Force制御方式(以下、P-PF方式)とPosition-Force制御方式(P-F方式)の比較を行った。ネットワークエミュレータによって固定のネットワーク遅延を擬似的に発生させて、作業時間や操作性に与える影響を調査した。その結果、P-F方式はネットワーク遅延の影響を受けにくいが、P-PF方式は受け易いことが判明した。しかし、ロボットアームの力センサーが付与されていない箇所が他の物に当たった場合などには、P-F方式では対応できないので、作業によってはP-PF方式が必要になることも分かった。(2)ネットワークエミュレータによって擬似的にネットワーク遅延揺らぎとパケット欠落を発生させて実験を行い、それらが作業時間や文字の形にどのような影響を与えるかを調査した。その結果、それらの値の増加に伴い、作業時間が長くなり、文字の形も劣化することを確認した。(3)ネットワーク遅延揺らぎとパケット欠落の影響を軽減するためのQoS制御の一つとして、位置の予測を行う予測制御を実装して、その影響を調査した。その結果、その効果は小さく、バッファリング制御と併用する必要があることが分かった。(4)産業用ロボット側の制御であるスティフネス制御の影響を調べ、金属棒を入れる作業では、その制御を行わないほうが優れていることが判明した。一方、文字を書く作業では、ネットワーク遅延が小さいときには制御を行うほうが良いが、大きくなると制御を行わないほうがよいことが分かった。産業用ロボットの安定化制御と、自由視点ビデオ伝送の高品質化の研究が遅れている。前者については、スキャッタリングマトリックスに対してウェーブフィルタと位相補償器を用いる手法を実験システムに実装するのにかなりの時間を要することが判明したからである。これは当初予期していなかったことであり、今後の研究の推進方策等で述べるように別の方法を検討する必要が生じた。後者に関しては、複数台のカメラを用いたときに選ばれた視点のビデオを合成するのに時間がかかり、ビデオ出力までの遅延が大きくなり、リアルタイム性が大きく失われることが明らかとなったからである。一人の利用者がビデオを見ながら触覚インタフェース装置を用いて遠隔の産業用ロボットを操作する遠隔ロボットシステムを対象とし、QoS制御と安定化制御の融合を図った。作業として、金属棒を穴に入れる作業、ボールペンで20ポイント程度の大きさの文字を書く作業だけでなく、針の穴に糸を通す作業を扱った。(1)遠隔ロボットシステムにおけるバイラテラル制御の安定化のために、研究分担者の三好が提案してきた、ウェーブフィルタに位相制御フィルタを組み合わせて用いる手法を適用し、実験によりその効果を確認した。(3)安定化制御のために、ネットワーク遅延やその揺らぎに応じて最適な粘性係数が存在することを明らかにし、粘性の適応制御を新たに提案した。(4)針の穴に糸を通す作業に対して、カメラ角度、作業空拳のマッピング比率、ネットワーク遅延が作業効率に及ぼす影響を調査した。

(5)触覚インタフェース装置を用いた重さや形状の知覚を調査するため、三次元仮想空間内にある重りを二人の利用者が一緒に持ち上げる、重さ知覚バランスシステムと、仮想オブジェクト識別ゲームを作成し、ネットワーク遅延の影響などを明らかにした。また、QoS制御としてローカルラグ制御を用いれば、ネットワーク遅延にほぼ関わらず、バランスさせながら作業が可能であることが判明した。重さ知覚バランスシステムでは、オブジェクトとして、サウンドや香りを有するものを扱い、触力覚、聴覚、嗅覚の効果を比較した。本研究では、一人の利用者が触覚インタフェース装置を用いて、ネットワークを介して産業用ロボットを遠隔操作し、ビデオを見ながら、安定で高品質な遠隔ロボット制御を実現することを目的とした。利用者は、産業用ロボットのハンドに取り付けた力覚センサーからのフィードバックによって、ロボットハンドが物体に当たったときの反力を感じながら、操作することができる。この目的を達成するため、ロボット・制御工学の分野で研究されてきている安定性を確保する制御、通信・ネットワーク工学の分野における高いサービス品質(QoS: Quality of Service)を維持するQoS制御を融合し、更に発展させた。金属棒を穴に入れる作業と文字を書く作業は、当初の計画では平成26年度、27年度に行う予定であったが、平成26年度中に、誰が作業しても簡単に金属棒を穴に入れられるようになったこと、当初の目標値であった20ポイント程度の大きさの文字を書くことができるようになったことから、この点に関しては大きく研究が進展した。これは、主に反力の適応制御と、反力と作業空間のマッピングが予想以上に効果的であったからである。しかし、文字を書く作業の場合には、触覚インタフェース装置の操作性にまだ改善の余地があることが判明した。また、産業用ロボットの納入に時間を要したことにより、安定化制御として、スキャッタリングマトリックスに対してウェーブフィルタと位相補償器を用いる手法の実装を行う時間がなかったため、ロボットを操作する速度などをある一定値以下になるようにして安定な状況の下で研究を進めた。また、自由視点ビデオで視点を移動したときの画像品質の劣化が大きく、カメラを複数にして、さらに高画質化が必要であることが分かった。以上より、進んでいるところもいくつかあるが、大きく遅れているところもあるので、全体としては、やや遅れている。産業用ロボットの安定化制御については、学外の連携研究者(豊橋技術科学大学の三好孝典准教授)と相談し、スキャッタリングマトリックスに対してウェーブフィルタと位相補償器を用いる手法が実装されたノートPCを接続することによって解決可能であることが判明したので、この遅れは取り戻すことが可能である。
活性型ARFの定量法および細胞内局在決定法の開発

低分子量GTP結合蛋白質ARFは,オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは,グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に,形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され,ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し,蛋白質輸送が完了する。つまり,細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。最近,ARFと結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し,GGA分子の中央にあるGATドメインがGTP結合型ARFとの特異的な結合に関与することを示した。そこで本研究では,このGATドメインとARFの結合機構について調べた。1.GGA1のGATドメインとGTP結合型のARFとの相互作用について,GATドメインの種々の変異体を作製し,相互作用の詳細を明らかにした。また,GATドメインのX線結晶構造解析を行い,その立体構造を明らかにした。2.この研究の過程で、GATドメインがユビキチンと結合することを発見した。さらに、ARFはGATのN末端側のサブドメインに、ユビキチンはC末端側のサブドメインに結合することを明らかにした。
様々な生物活性を有するアルカロイド類の系統的な合成と生物有機化学的研究

アルカロイド類は顕著な生理活性を示す化合物が数多く知られており,大変魅力的な化合物群である。本研究では様々な生理活性発現のメカニズムの解明や活性酸素抑制のメカニズム解明のために2,6-2置換ピペリジンアルカロイド類の効率的な合成法の確立を目的とした。1.2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成:Spectamine Aのような2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成は2,6-cis体よりも困難である。Pdによる選択性はtrans:cis=5:2と改善の余地がある。この課題を克服するために立体障害の大きな配位子であるtri-tert-butyl phosphineなどを用いて反応を行ったが反応性が低かった。従って方針を変更し,嵩高いアリルエステルを調製し環化反応を行ったが収率が悪いため保護基をCbmとして検討した結果Pd_2(dba)_3を用いて収率88%選択性79:21という結果を得た。2.立体選択的なテトラヒドロピランの構築とバンレイシ科アセトゲニンのpyranicinの合成:PyranicinはTHP型アセトゲニンの一種である。本研究では2価のPdを用いた選択的なピペリジン環構築の知見を活かしTHP環の立体選択的な構築に応用した。(-)-Muricatacinより数工程で得られるビフェニルエステルに対しCl_2Pd(CH_3CN)_2を用いて環化反応を行い93:7の比で望む2,6-cis体のTHP環を得た。これより数工程でpyranicinの全合成を達成した。また類縁体の10-deoxypyranicin,4,10-dideoxypyranicinの合成も行った。合成物をミトコンドリアcomplex I阻害活性試験を行い対応するTHFアセトゲニンよりも活性がやや低下した。また,関連化合物のtonkinelinの合成も行い絶対構造を決定した。含窒素天然有機化合物(アルカロイド類)は顕著な生理活性を示す化合物が数多く知られており,大変魅力的な化合物群である。これらのアルカロイドは自然界からの供給が限られているため,生物活性発現のメカニズムの解明や医薬品への応用といった研究が遅れている。このような観点から本研究では様々な生理活性発現のメカニズムの解明や活性酸素抑制のメカニズム解明のための分子プローブの創製を目的に2,6-2置換ピペリジンアルカロイド類の効率的な成法を確立することを目的とした。具体的な合成方法はPdなどの有機金属を駆使して触媒的に立体化学を制御して合成するという将来工業化をにらんだ合成経路を開発することにした。1.2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成Spectamine A(1)のような2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成は2,6-cis体よりは困難とされている。申請者らはspectamine Aの形式的全合成を達成してはいるが2価のPdによる2,6-trans-ピペリジン環形成反応においてその選択性はtrans:cis=5:2とまだまだ改善の余地がある。この課題を克服するために触媒のデザインが必須であり立体障害の大きな配位子であるtri-tert-butyl phosphinetri-tert-butyl phosphineやなどを用いて反応を行ったが反応性が低かった。従って方針を変更し,嵩高いアリルエステルを調製し種々の環化反応に供したところ収率は改善の余地があるものの選択性は良好であった。今後反応の最適化を行いspectamine A(1)の全合成を行う予定である。

2.立体選択的なテトラヒドロピランの構築とバンレイシ科アセトゲニンのpyranicinの合成Pyranicinは400を超えるアセトゲニン類の中でもわずか8種しかないTHP型アセトゲニンの一種である。本研究では2価のPdを用いた選択的なピペリジン環構築の知見を活かしてこの反応をテトラヒドロピランの立体選択的な構築に応用した。(-)-Mudcatacinより数工程で得られるビフェニルエステルに対しCl_2Pd(CH_3CN)_2を用いて環化反応を行ったところ93:7の選択比で望む2,6-cis体のテトラヒドロピラン環を得た。これより数工程でpyranicinの全合成を達成した。アルカロイド類は顕著な生理活性を示す化合物が数多く知られ,大変魅力的な化合物群である。本研究では様々な生理活性発現のメカニズム解明のために分子プローブの創製するために2,6-2置換ピペリジンアルカロイド類の効率的な合成法を確立することを目的とした。1.2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成:Spectamine Aのような2,6-trans-ピペリジンアルカロイドの合成は2,6-cis体よりは困難である。Pdによる2,6-trans-ピペリジン環形成反応の選択性はtrans:cis=5:2とまだまだ改善の余地がある。この課題を克服するために触媒のデザインが必須で立体障害の大きな配位子であるtri-tert-butyl phosphineなどを用いて反応を行ったが反応性が低かった。従って方針を変更し,嵩高いアリルエステルを調製し環化反応に供したところ収率が低いため保護基をCbmとして種々検討した結果Pd_2(dba)_3を用いて収率88%選択性79:21という結果を得た。2.立体選択的なテトラヒドロピランの構築とバンレイシ科アセトゲニンのpyranicinの合成:Pyranicinは400を超えるアセトゲニン類の中でもわずか8種しかないTHP型アセトゲニンの一種である。(-)-Muricatacinより数工程で得られるビフェニルエステルに対しCl_2Pd(CH_3CN)_2を用いて環化反応を行ったところ93:7の選択比で望む2,6-cis体のテトラヒドロピラン環を得た。また類縁体である10-deoxypyranicin,4,10-dideoxypyranicinの合成も行った。合成物に関してミトコンドリアcomplex I阻害活性試験を行ったところ対応するTHFアセトゲニンよりも活性がやや低下することが分かった。
金融リテラシー水準を考慮したファイナンシャル・マーケティング理論の構築

本年度は、次世代金融サービスの顧客化階層分析を実施し、金融サービスの「試用率」「常用率」へ顧客化階層推移率がどの程度影響を与えているのか分析を行い、ワーキングペーパーにまとめた。次世代金融サービスの顧客化階層分析を実施し、金融サービスの「試用率」「常用率」へ顧客化階層推移率がどの程度影響を与えているのか、各々を被説明変数とし各顧客化階層推移率を説明変数候補とする線形回帰モデルを構築し推定を行った。次世代金融サービスについては不認知⇒認知⇒理解の推移だけでは顧客化ができず、理解⇒試用の推移率がボトルネックであることが示された。顧客化階層は自動的にはつながらず、理解⇒試用⇒常用の関連が問題になる。重要なのは、顧客化階層において新たな金融サービスをどのような顧客接点から「試用」し「常用」化するのかという点である。試用者にいかに反復的に利用してもらえるのかは、その金融サービスの「経験価値」に依存する。金融サービスの品質は経験価値からは切り離すことができず、使用価値から得られる満足度は常用化につながる。経験価値の構成は、サービスへの加入の容易さ、利用のしやすさ、常用することの便益など様々な要素からなる。今後の研究課題としては、金融リテラシー別の顧客化戦略など消費者インサイトに切り込み、さらに詳細な分析を実施し、次世代金融マーケティング戦略の検討を続けたい。次世代金融サービスの進展が早く、先行研究も次々に発表される中でレビューを行いつつ、日経NEEDS金融調査のデータ分出来を引き続き行う。一昨年度は1本のペーパーを査読付き雑誌に掲載ができたが、昨年度はワーキングペーパーはまとめたものの公刊にいたる論文はなく、引き続き、掲載を目指して研究を進めていく。引き続き金融リテラシーと金融資産選択行動について、研究計画に従い実施する。金融庁や日経NEEDS調査の個票データをもとに、個々の消費者セグメントに合致した金融マーケティングの施策や金融リテラシー教育のありかたについて、米国・英国などの投資先進国の事例をもとに検討を行う。成果については、2019年度中に1本は査読付き論文で公開を目指す。
複眼式コリメータとイメージングプレートを用いた3次元ガンマカメラの開発

従来のガンマカメラの弱点を根本的に改善するものとして、イメージングプレートと複眼式ピンホールコリメーターを組み合わせたガンマカメラを考案した。前年度に、モンテカルロシミュレーションにより本方式の原理実証及び最適なコリメーター形状の検討を行うとともに、作製した試作機により実証試験を行い、その結果、計算・実験の両者よりコリメーターに水平方向、垂直方向で2.5mm、10.8mmという空間分解能が得られている。水平方向に比べ垂直方向の空間分解能が著しく劣っているのは、垂直方向の情報量が不足していることが原因であり、本年度は、これを改善するため、複眼式ピンホールコリメーターを複数用い、それぞれ角度をつけて設置する角度可変マルチピンホールコリメーター方式を考案し、モンテカルロシミュレーションによる原理実証及び最適形状の検討を行うとともに、試作機による実証試験を行った。この結果、水平方向、垂直方向で2.0mm、2.5mmの空間分解能が得られ、今回試みた新方式によりコリメーターに垂直方向の空間分解能が著しく改善されたといえる。今後残された検討課題としては、画像再構成法の高度化およびフラットパネルディテクターを使用したリアルタイム測定の検討などが挙げられる。これらの課題を解決することで、本手法が既存の放射線診断手法に取って代わり、放射線診断における患者の被曝線量の大幅な軽減につながることが期待される。本年度は、表題のガンマカメラ開発のための基礎研究として以下の研究を行った。1)最適なコリメータ構造の決定コリメータの構造、サイズなどは、ガンマ線のエネルギーや、要求される空間分解能、検出効率に依存する。そこで、汎用のモンテカルロコードを用いて、対象とするγ線のエネルギー等の種々の条件を考慮して、最適なコリメータ形状の検討を行った。2)コリメータの作製本年度の研究では特に低エネルギー(^<57>Co,^<99m>Tc)以下のガンマ線を対象として、上記の検討に基づき、鉛製のコリメーターをで作製した。3)シミュレーションプログラムおよび画像再構成プログラムの開発次に、試作したコリメータを使用したガンマカメラの性能を評価するために、専用のモンテカルロ法を用いたシミュレーションプログラムを作成した。さらに、シミュレーションにより得られた情報から、放射線源像を得るための画像の再構成プロフラムを作成した。画像の再構成はバックプロパゲーション法によった。^<57>Coの点線源に対する空間分解能として、約6mmの値を得た。4)最後に、^<57>Co線源を用いて実際に線源像の撮影を行った。コリメーターより垂直方向100mmの距離においた点線源に対して、空間分解能約10mmで線源像を得ることが可能であった。シミュレーション結果に比べて、実験で得た空間分解能が劣る理由の一つには、コリメーター作製時の工作精度があげられる。精度の高いコリメーターの作製は、次年度以降の大きな課題の一つである。
代謝因子(低カリウム血症、高尿酸血症等)による腎障害機構と血管保護によるその抑制

1.カリウム欠乏による腎尿細管間質障害□カリウム欠乏性腎症ラットにおいて腎皮質と髄質でエンドセリン(ET)-1産生が亢進すること、腎髄質でエンドセリンA受容体(ETA)とエンドセリンB受容体(ETB)の発現が亢進することを明らかにした。ETA阻害により尿細管間質障害と腎機能は改善し、尿蛋白の減少も認められたが、腎でのET-1産生は抑制されなかった。一方、ETB阻害により腎におけるET-1産生とETA発現が抑制され、ETA阻害時とほぼ同等の腎機能、尿細管間質障害改善が認められた。カリウム欠乏性腎症ではET-1はETAを介して腎障害を促進するのみならずETBを介した腎局所でのET-1産生刺激により腎障害形成に関与する可能性を明らかにした。□カリウム欠乏性腎症ラットにおいてアンジオテンシンII受容体拮抗薬により尿細管間質障害と腎機能が改善することを証明し、腎局所で生成されるアンジオテンシンIIが尿細管間質障害形成に関与することを明らかにした。2.血管保護因子による腎障害抑制血管弛緩、血管保護作用を有するアドレノメデュリンが、ラットの虚血再灌流腎傷害においてTNF-α、interleukin-6の発現亢進を抑制し、尿細管壊死・アポトーシスを軽減する可能性を明らかにした。3.DNAマイクロアレイ法による腎障害関連遺伝子の検索2型糖尿病モデルであるdb/dbマウスでは、糖尿病性腎症早期から糖代謝、脂質代謝、酸化ストレスに関与する遺伝子群に加え、血管新生、糸球体形成に関与する遺伝子群の発現が変化することを明らかにした。1.低カリウム血症による腎尿細管間質障害(1)尿細管間質障害を伴うカリウム欠乏性腎症ラットにおいて、腎皮質と髄質でのエンドセリン(ET)-1産生亢進と腎髄質でのエンドセリンA受容体(ETA)及びエンドセリンB受容体(ETB)の発現亢進を明らかにした。腎のアドレノメジュリン含量に明らかな変化は認められなかったが、vascular endothelial growthfactor(VEGF)発現は髄質で低下した。(2)アンジオテンシンII受容体拮抗薬(losartan)投与により尿細管間質障害(尿細管傷害、間質線維化、炎症細胞浸潤)の改善とクレアチニンクリアランス(Ccr)の上昇が認められることを証明し、腎局所で生成されるアンジオテンシンIIが尿細管間質障害形成に関与することを明らかにした。losartanにより腎でのET-1産生亢進は一部抑制されたが、髄質でのVEGF発現低下や尿細管周囲毛細血管の密度減少に明らかな改善は認められなかった。(3)特異的ETA阻害薬(ABT-627)投与により尿細管傷害、間質線維化、炎症細胞浸潤、尿細管上皮過形成は改善しCcrの上昇と尿蛋白の減少も認められたが、腎でのET-1産生は抑制されなかった。一方、特異的ETB阻害薬(A-192621)投与により腎におけるET-1産生とETA発現が抑制され、ETA阻害薬投与時とほぼ同等の腎障害改善が認められた。ET-1はETAを介して腎障害を促進する一方、ETBを介したNa利尿や内皮からのNO放出刺激により腎保護に作用すると考えられてきたが、カリウム欠乏性腎症ではET-1はETAを介するのみならずETBを介した腎局所でのET-1産生刺激により腎障害形成に関与することを証明し、ETB阻害がin vivoで腎保護作用を有する病態が存在する可能性を示した。

2.高尿酸血症による腎尿細管間質障害uricase阻害薬であるoxonic acid投与により作成した腎臓への尿酸結晶沈着を伴わない軽度の高尿酸血症モデルでは、腎におけるET-1産生亢進は明らかでなかった。1尿細管間質障害における腎内hypoxiaの意義尿細管間質障害のモデルであるカリウム欠乏性腎症ラットで、hypoxiaのマーカーであるpimonidazoleの腎への取り込みが2週間のカリウム欠乏で有意に増加することを明らかにした。しかしhypoxiaにより誘導されるVEGF、eNOSの腎での発現には明らかな上昇が認められなかった。またカリウム欠乏性腎症をエンドセリンA受容体阻害剤により軽快させても、pimonidazoleの腎への取り込みは減少しなかった。カリウム欠乏性腎症へのhypoxiaの関与は示唆されたが、その証明は今後の課題である。2血管保護因子による腎障害抑制血管弛緩、血管保護作用を有するアドレノメジュリンの持続投与により、ラットの虚血再灌流腎障害において腎機能改善と尿細管の壊死・アポトーシスの減少が認められた。アドレノメジュリン投与により尿細管へのpimonidazole取り込み低下は認められなかったが、虚血再灌流により惹起される腎髄質でのTNF-α、interleukin-6の発現亢進が抑制された。アドレノメジュリンが腎局所におけるproinflammatory cytokineの発現を抑制することにより、尿細管障害を軽減する可能性を明らかにした。3カリウム欠乏による腎障害機序のin vitroにおける検討糸球体内皮細胞、尿細管上皮細胞を低カリウム状態で培養したが、明らかな細胞障害(LDH放出上昇、アポトーシス)は認められなかった。カリウム欠乏性腎症のmediatorであるエンドセリンの糸球体内皮細胞、尿細管上皮細胞からの分泌は、低カリウムにより全く刺激されなかった。4 DNAマイクロアレイ法による腎障害関連遺伝子の検索2型糖尿病モデルであるdb/dbマウスで、糖尿病性腎症早期に糸球体の遺伝子発現を対照マウスと比較した。糖代謝、脂質代謝、酸化ストレスに関与する遺伝子群に加え、血管新生、糸球体形成に関与する遺伝子群の発現変化を認めた。また軽度高尿酸血症モデルラットの腎皮質と髄質を用いて血管収縮、内皮障害に関連する遺伝子群の発現を検討したが、有意な変化は認められなかった。
接着性修復材料における辺縁封鎖性の非破壊的手法による検討

本研究における接着性修復材料における辺縁封鎖性の非破壊的検討方法として、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いた手法を用いて検討を行った。実験方法としては、まず各種レジン接着システムを用いて実験的窩洞修復を施した試料を作製し、その試料に対して繰り返し荷重、サーマルサイクリングの負荷、または両条件の同時負荷を与えた後に、蛍光色素であるRhodamine B溶液中に試料を浸漬した。その後、波長568nmのAr/Krレーザーを励起光として用いることにより微少辺縁漏洩状態の観察が可能であることが既に確認できており、それに基づいて検討を行った。従来より、接着性修復物の辺縁封鎖性検討には、多くの研究者が色素浸透とその後の試料の切断により顕微鏡観察するという色素浸透試験の手法を用いてきたが、本研究においてはCLSMと蛍光色素の利用により、非破壊状態で検討を行うことが可能となった。さらに、窩洞のどの部位から辺縁漏洩が進行していくかについても検討を行い、窩洞内における歯質接着の欠陥を調べることにより、非破壊的辺縁漏洩評価の一法としてのCLSMと蛍光色素の利用の正当性を明らかにした。本研究における接着性修復材料における辺縁封鎖性の非破壊的手法として、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いた手法を現在検討中である。各種レジン接着システムを用いて修復操作を行った試料を作製し、繰り返し荷重およぴサーマルサイクリングの同時負荷を与えた後に蛍光色素であるRhodamine B溶液中に試料を浸漬し、波長568nmのAr/Krレーザーを励起光として用いることにより微少辺縁漏洩状態の観察が可能であることが確認できている。従来より、接着性修復物の辺縁封鎖性検討には多くの研究者が色素浸透試験と試料の切断が行われてきたが、本研究においてはCLSMと蛍光色素の利用により、非破壊状態で検討を行うことが可能となった。また、従来辺縁漏洩評価の使用されていたメチレンブルーなどに代表される色素とRhodamine Bなどに代表される蛍光色素の浸透性の差異についても検討中である。これらにより、非破壊的辺縁漏洩評価の一法としてのCLSMと蛍光色素の利用の正当性を確立する予定である。本研究における接着性修復材料における辺縁封鎖性の非破壊的検討方法として、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いた手法を用いて検討続行中である。実験方法としては、まず各種レジン接着システムを用いて実験的窩洞修復を施した試料を作製する。その試料に対して繰り返し荷重、サーマルサイクリングの負荷、または両条件の同時負荷を与えた後に、蛍光色素であるRhodamine B溶液中に試料を浸漬し、波長568nmのAr/Krレーザーを励起光として用いることにより微少辺縁漏洩状態の観察が可能であることが既に確認できており、引き続き検討中である。また、窩洞のどの部位から辺縁漏洩が進行していくかについても検討を始めている。これは窩洞内における歯質接着の欠陥をこれらにより、非破壊的辺縁漏洩評価の一法としてのCLSMと蛍光色素の利用の正当性を確立する予定である。

さらに、窩洞のどの部位から辺縁漏洩が進行していくかについても検討を行い、窩洞内における歯質接着の欠陥を調べることにより、非破壊的辺縁漏洩評価の一法としてのCLSMと蛍光色素の利用の正当性を明らかにした。
可視赤外和周波発生分光装置の可視光波長可変化と電子共鳴表面和周波発生への応用

平成13年度は、昨年度作製した可視光波長固定のマルチプレックス方式可視赤外表面和周波発生(SFG)分光システムを発展させ、可視光波長可変化した。可視光の波長可変化は、光パラメトリック発生/増幅器(OPG/OPA)によって行った。OPG/OPAの励起用光源として、昨年度にSFGの可視プローブとして作製したナローバンド可視光(400nm)を用いた。我々のレーザーシステムの400nmのエネルギー(500microJ)は、OPG/OPAの励起可能なぎりぎりの大きさである。このため、非線形結晶の結晶長や内部光学系の調整などによって、既製OPG/OPAを低出力の励起が可能なように改造した。その結果、波長可変範囲が470-700nmで、波数幅約15cm-1、パルスエネルギー30microJ程度の出力が得られた。SFG分光の標準試料である金属膜上のアルカンチオール自己組織化膜を対象に測定をおこない、作製した分光システムの性能を評価した。試験測定に使用した可視プローブ波長は、633、535、477、400nmである。いずれの波長を使用した場合も、測定時間1分で良好なSN比のスペクトルが得られた。得られたSFGスペクトルのスペクトル形は、可視光波長によって顕著に変化した。この変化は、使用した可視プローブ光の波長範囲内に存在する金のバンド間遷移との共鳴効果の度合が変化するために、SFG信号を与える二次の非線形感受率のうち金基板からの寄与の強度と位相が変化したためであると解釈した。本研究の目的は、可視光波長可変性を備えた高感度なマルチチャンネル化したSFG(マルチプレックスSFG)分光装置を開発することである。平成12年度は、フェムト秒の再生増幅器の基本波(800nm、時間幅約120フェムト秒)からピコ秒のナローバンドの倍波(400nm)を発生する部分および分光光度計部分を作製し、波長固定(400nm)ではあるがマルチチャンネル化したSFG分光システムを作製した。ブロードバンド赤外レーザーは、フェムト秒の基本波によって光パラメトリック発生/増幅を行い、発生したシグナル光とアイドラー光の差周波を更に発生させることによって得た。得られた赤外光の波数幅は、波数3000cm^1において半値全幅で250cm^<-1>以上であった。フェムト秒レーザーよりナローバンド可視レーザーを得る方法として、フェムト秒のレーザー光を二つにわけ逆方向にチャープさせたのちに倍波発生を行うことにより波数幅の狭いピコ秒の倍波出力を高効率で得る手法を、採用した。この方法により、120フェムト秒、1.8mJ、800nm、波数幅240cm^<-1>の基本波から、5.3ピコ秒、0.5mJ、400nm、波数幅11cm^<-1>の倍波を得た。このようにして得た倍波は高出力であるため、非線形光学的手法によって波長可変化が可能だと予想している。その結果、従来のシングルチャンネル法による既報のスペクトルと同等なSNのスペクトルを、マルチチャンネル法ではl/6の測定時間1分で得ることができた。このことは、マルチチャンネル法の優位性を示している。
ニューロン新生と脳の左右差および記憶形成との関連性の検討

空間記憶は、脳で見られる左右非対称の高次機能である。その記憶において中心的な役割を担うと考えられている海馬の歯状回には、生涯を通じて新生される顆粒ニューロンが存在する。本研究では、新生ニューロンの発達過程においても左右差が存在するかを調べるために、神経回路網を形成しているシナプスの中でも反対側の歯状回から新生ニューロンへ投射しているシナプス入力に焦点をあてた。一方で若齢での新生ニューロンも追跡可能にした。本研究を基にすることで、新生ニューロンによる神経回路網再構築と脳の左右差に新しい知見が得られ、記憶形成のメカニズムの理解が深まることが期待される。昨年度に引き続き、本研究では、反対側の歯状回由来の交連線維が新生ニューロンの発達および成熟過程に及ぼす影響を、電気生理学的手法を用いて調べている。その為に、まず成体マウス脳の片半球の門にdyeを注入し、注入した側とは反対側の海馬のスライス標本の作成を、水平断面、傍矢状断面、冠状断面、さらに様々な角度をつけて行った。その結果、海馬采経由のdye標識された交連線維の全体像を観察することは難しかったが、従来の解剖学的知見と同じように、顆粒細胞層に近い分子層の幅狭い部位への入力を確認することができた。さらにその部位を電気刺激するために、タングステン電極ではなくガラス電極を用いることで、既存のニューロンからシナプス応答を誘導することができた。一方で、本研究を遂行するにあたって、最も重要な、GFPを発現するレトロウイルスを用いて、既存の顆粒ニューロンと新生ニューロンとを区別することを試みた。他の研究室よりレトロウイルスのベクターを入手し、所属研究室でレトロウイルスを作製した。11週齢の麻酔したマウスの脳を脳固定装置で固定し、マイクロインジェクターにより片半球の門にレトロウイルスを注入したところ、GFPを発現した新生ニューロンを3週間以降でも急性スライス標本において確認することができた。しかし、GFPを発現した新生ニューロンは予想以上に少なく、急性スライス標本において電気生理学的実験を行うためには、より効率を上げる必要があることが分かった。この問題を早急に克服し、引き続きニューロン新生と脳の左右差、さらには記憶形成が密接に関連する可能性を明らかにする。本研究では、成体マウス海馬歯状回における新生ニューロンの発達、成熟に、反対側の歯状回由来の交連線維とのシナプス伝達がどのように関与するのか検討した。新生ニューロンと既存ニューロンとを区別するため、11週齢の麻酔したマウスの脳を脳固定装置で固定し、マイクロインジェクターにより両半球の門にGFPを発現するレトロウイルスを注入した。GFPを発現した新生ニューロンを2週間以降でも急性スライス標本において確認することができたが、その新生ニューロンからホールセル記録を行うことには困難を窮めた。蛍光顕微鏡下でのGFPからのシグナルが著しく暗かったことが原因として考えられたため、所属先の研究室で作製したレトロウイルスよりもウイルスの力価が高い市販のものに変更したが、残念ながら劇的に改善するに至らなかった。次に、個体で新生されるニューロンの数を増やすことで、急性スライス標本作製時に電気生理学アプローチ可能な新生ニューロンの数を増やすことにした。そのため、本研究で計画していた若令マウス(生後15日目)において新生するニューロンに焦点を移行した。この頃はマウス脳の大きさが発達する段階途中であるため、海馬歯状回の門にレトロウイルスを注入する際のブレグマからの座標を決めることから行った。その結果、急性スライス標本において生後15日目のGFPを発現した新生ニューロンの数が、11週令のマウスにレトロウイルスを注入した時よりも多く確認することができた。生後15日目の新生ニューロンの発達時期に、左右の海馬をつなぐ脳梁も発達すると考えられていることから、今回の結果は、新生ニューロンの発達と脳の左右差の関連性を調べる大きな手がかりになると思われる。脳の大半のニューロンは生後まもなく作り終えられるが、二か所の部位で生涯を通じニューロンが作られることが知られている。その一つが、記憶において中心的な役割を担うと考えられている海馬の一領域、歯状回に存在する顆粒細胞である。歯状回の顆粒細胞層と門(hilus)の境に位置する神経幹細胞から作りだされた新生ニューロンは、新生後3日目に顆粒細胞層において神経突起を伸ばし始める。新生後1週間頃から新生ニューロンの樹状突起は顆粒細胞層を越え、分子層を海馬裂の方向に伸展し始める。分子層を3等分した時、マウスにおいては、顆粒細胞層に近い1/3は反対側の歯状回、中間1/3は同側の内側(medial)内嗅皮質、海馬裂に近い側の1/3は外側(lateral)内嗅

皮質由来の入力があるが、新生後1週間では、新生ニューロンからグルタミン酸作動性興奮性シナプス応答は観察されず、反対側の歯状回由来の交連線維がいつ新生ニューロンとシナプスを形成し、シグナル伝達が行われるのかについてはわかっていない。本研究では、電気生理学的手法を用いて反対側の歯状回由来の交連線維が新生ニューロンの発達および成熟過程に及ぼす影響を検討している。その為に、まず成体マウス脳の片半球の門にdyeを注入し、注入した側とは反対側の海馬歯状回において、dye標識された交連線維の入力を観察することができるスライス標本の作成を行っている。引き続き、様々な手法を組み合わせることで、ニューロン新生と脳の左右差、さらには記憶形成が密接に関連する可能性を明らかにする。これまでに海馬采経由の交連線維の入力を確認し、この入力を電気刺激する準備を整えた。また、レトロウイルスを用いたGFP発現による新生ニューロンの標識化を可能にした。一方で、新生ニューロンから効率良く電気生理学的な記録を取るには、まだ至っておらず、現在、この問題を解決すべくさまざまな方法を模索中である。910週齢の麻酔したマウスの脳を脳固定装置で固定し、マイクロインジェクターにより片半球の門にDiAを注入した。1週間以上後DiAを注入した側とは反対側の海馬について、長軸方向に垂直なスライス標本を作成した。従来の解剖学的知見から、歯状回における分子層のうち顆粒細胞層に近い部位において標識された軸策が観察することが期待されたが、今のところ、明確には見ることができていない。そのため、反対側歯状回由来の交連線維の入力と既存の顆粒細胞との間のシナプス応答を調べるために様々な方法を模索中である。海馬歯状回での新生ニューロンの数は、年齢とともに減少することが知られている。本研究では、レトロウイルスを様々な週齢のマウスに注入することも計画していたため、現在行っている11週齢のマウスよりも早い週齢のマウスにレトロウイルスを注入する。この方法によりGFPを発現する新生ニューロンの数を増やし、スライス標本において、反対側の歯状回由来の入力と新生ニューロンとで形成されているシナプスの電気生理学的特性および可塑性について効率よく調べていく。本研究を遂行するにあたって、最も重要なのは、GFPを発現するレトロウイルスを用いて、既存の顆粒細胞と新生ニューロンとを区別することである。研究代表者が所属する研究室にはGFPを発現するレトロウイルスが存在しなかったため、他の研究室から譲受されなければならなかった。しかし無事手配することができ、現在レトロウイルス作製の準備に入っている。上記のdyeを用いた実験と並行することで、スライス標本において、反対側の歯状回由来の入力と、既存および新生ニューロンとで形成されているシナプスの電気生理学的特性および可塑性について調べていく。新生ニューロンからの記録を効率よく行うため、光学系システムをさらによりよく整備する予定である。他は、試薬等の消耗品に使用する予定である。新生ニューロンからの記録を効率よく行うため、現存の設備よりも性能のよい光学系システム一式(約150万円)をとりいれる予定である。
組織工学的手法によるマラッセ上皮遺残細胞と歯髄細胞による歯の再生技術の確立

今回提案した研究課題を通じて、マラッセ上皮遺残細胞の長期間の培養に成功した。次に培養マラッセ上皮細胞は歯髄細胞と共培養することで、エナメル芽細胞に分化した。さらに、組織工学的手法に用いて、培養マラッセ上皮細胞と歯髄細胞を移植すると、移植体の中にエナメル質が形成した。これらの結果から、マラッセ上皮遺残細胞がエナメル質形成能力を持っていることが確認でき、予定した研究課題を成就できたと考えられる。本年度は3T3細胞をフィーダーレイヤーとしたマラッセの上皮遺残細胞の培養方法を確立した。われわれは,今までに3T3-J2細胞と鐘状期歯胚上皮細胞を混合培養することで,歯胚上皮細胞の初期の形質を維持しながら継代培養に成功している。そこで,同じ手法を用いることで,マラッセの上皮遺残細胞の形質を維持したまま継代培養できることが確認できた。マラッセの上皮遺残細胞の形質の維持の確認には,二つの方法で検討した。第1に,マラッセの上皮遺残細胞からmRNAを採取し,現在までにマラッセの上皮遺残に発現することが知られている細胞特異的な上皮細胞のマーカー遺伝子およびエナメルタンパクのマーカー遺伝子群の発現をRT-PCRによって比較,解析を行った。RT-PCRの結果では,初代マラッセの培養細胞と10継代した培養マラッセの上皮細胞においてその遺伝子発現パターンは類似していた(歯周病学会にて発表)。さらに,継代した培養マラッセ上皮遺残細胞のタンパクの発現を解析した。継代培養した細胞を,マラッセの上皮遺残細胞から上皮細胞のマーカーとなるサイトケラチンとエナメル関連タンパクのアメロゲニンの発現を抗体をもちいて,免疫細胞化学的に検討したところ,継代培養したマラッセの上皮細胞はサイトケラチン14陽性で有り,アメロゲニン陰性であり,この発現パターンも初代培養を類似していた(歯科基礎学会にて発表)。これらの結果からわれわれの手法で培養増殖させたマラッセの上皮遺残細胞は,表現系を維持したまま,培養増殖されていることが示唆され,本年度計画していた実験は予定通り終了し,次年度に移行する。本年度は、今回申請した研究課題の最終目的となるマラッセの残存上皮細胞が歯の形成能を所有しうることを検討した。検討方法はin vitroにおいて、マラッセの残存上皮細胞がエナメル芽細胞に分化することを確認すること、in vivoにて組織工学的手法を用いてマラッセの残存上皮細胞と歯髄細胞との上皮-間葉相互作用によってエナメル芽細胞に分化し、エナメル質を形成することを確認することである。昨年度において、ブタ乳歯歯根膜からマラッセの残存上皮細胞の単離と培養に成功している。そこで、その培養マラッセ残存上皮細胞とブタ第三臼歯歯髄組織から単離した歯髄細胞と共培養することで、マラッセの残存上皮細胞がアメロゲニンを発現することを免疫細胞化学染色とRT-PCRによって確認した。マラッセの残存上皮細胞を単独で培養した場合およびフィーダー細胞と共培養した時はアメロゲニンを発現しなかった。したがって、マラッセの残存上皮細胞は歯髄細胞と共培養するとエナメル芽細胞に分化することが示唆できる。次に歯の組織形成能を検討するために、培養マラッセ残存上皮細胞と歯髄細胞をコラーゲンスポンジの担体に播種してヌードラットの腹部大網に移植した。移植4週後と8週後に試料を取り出して、組織学的及び免疫組織化学的に解析した。移植4週後では、すでに象牙質は再生し、その再生した象牙質上にアメロゲニンに陽性となるエナメル芽細胞が配列していた。さらに、移植8週後においては、象牙質-エナメル質の複合体が再生し、エナメル質はアメロゲニン抗体に陽性であった。これらの結果から、マラッセの残存上皮細胞は歯髄細胞との上皮-間葉相互作用によって、生体内においてもエナメル芽細胞に分化し、エナメル質を形成できることが確認した。
脳血管攣縮に於けるリゾフォスフォリピッド受容体を介したシグナル伝達機構の検討

Rho-Kinase抑制剤で抑制されない、強力な経路の存在が示唆された。SPC, S1Pのスフィンゴ脂質による血管の収縮機転には違いがみられた。S1P収縮においては収縮早期に微弱な細胞内カルシウム濃度の上昇がみられるが、SPCではそれが全くみられない。Y-27632の効果はSPCでより強く、しかしミオシンのリン酸化程度の解除に関しては大きな差はないと考えられた。これらの結果から、SPCによる血管収縮機転はRho/Rho-kinase系への依存性が高く、S1P収縮ではカルシウム依存性経路が一部関与していることが示唆された。我々は血小板からその凝固過程で放出されるsphingosine-1-phosphate(以下S1P)が、平滑筋収縮に於いてカルシウム感受性に深く関わりのあるRho/Rho kinase pathwayの上流となり、脳血管攣縮の候補原因物質であることを報告した。今回、まず我々はS1Pによって生じる脳血管の収縮について、カルシウム感受性亢進機転を含むその特徴について検討を行った。細胞内カルシウム-血管収縮、同時測定法、ミオシンリン酸化測定法を行った。犬脳血管短冊状標本を用いた張力-細胞内カルシウム同時測定法によるin vitroの収縮実験に於いて、10micro MのS1Pは脳血管を収縮させた。この時、細胞内カルシウムレベルは収縮に先行して上昇したもののその後、ほぼ定常状態となり収縮はそれに比して上昇した。遅れて生じた収縮はカルシウム感受性が関与した収縮であることが疑われた。10micro MのS1Pで収縮させた血管を収縮開始15分後、瞬時に凍結しミオシンのリン酸化程度をウエスタンブロットを用いて観察すると、ミオシンのリン酸化レベルは上昇していた。また選択的Rho-kinase inhibitorであるY-27632(10μmol/L)を15分前に前投薬した後、S1Pを同様に投与したところ、S1Pによる収縮はほぼ完全に抑制され、この時のミオシンのリン酸化程度も減少した。従ってS1Pによる脳血管の収縮はミオシンのリン酸化を介したもので、このリン酸化はRho-kinaseを介したものであることが考えられた。S1Pによる平滑筋でのカルシウム感受性亢進機転が脳血管攣縮の発生と病態に関与していることが疑われた。
体液中のクレアチニンの測定に有用な酵素系及び高感度定量法の開発

土壌より分離したクレアチニン資化性細菌Pseudomonasputida77は下記の如くにクレアチニンを分解代謝し、サルコシンを生成することを認めた。クレアチニン→Nーメチルヒダントイン→Nーカルバモイルサルコシン→サルコシン。また、それぞれの反応に関与する酵素を精製・単離し、クレアチニンデイミナ-ゼ、Nーメチルヒダントインアミドヒドロラ-ゼ、Nーカルバモイルサルコシンアミドヒドロラ-ゼであることを証明した。これらのうち後者の2つの酵素は従来その存在が知られていない新規な酵素であった。上記の反応系はサルコシンオキシダ-ゼを共役させると過酸化水素を最終シグナルとするクレアチニンの新しい測定系として利用できる(下式参照)サルコシン→グリシン+過酸化水素→赤色色素この測定原理は、副生物としてのアンモニアやクレアチンを測定する従来の方法に比較して、クレアチニンに由来する骨格分子たるNーメチルヒダントイン→Nーカルバモイルサルコシン→サルコシンを測定することに基づいており、従来法が解決し得なかったアンモニア・クレアチンによる誤差の問題から解放されており、極めて優れたものといえる。実際に反応条件を設定し、クレアチニンの分析を行ったところ、上記の原理に基づく方法の有利性が確認された。土壌より分離したクレアチニン資化性細菌Pseudomonasputida77はクレアチニン→N-メチルヒダントイン→Nカルバモイルサルコシン→サルコシン→グリシンへと順次代謝する新しい分解経路によりクレアチニンを分解代謝することを明らかにした。またそれぞれの分解反応に関与する酵素を精製単離し、それらがクレアチニンデイミナ-ゼ,N-メチルヒダントインアミドヒドロラ-ゼ、N-カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ-ゼ、サルコシンデヒドロゲナ-ゼであることを明らかにした。また、N-メチルヒダントインアミドヒトロラ-ゼ及びN-カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ-ゼはこれまでに報告のなかった新規酵素であることも判明した。特に前者はアミド結合の解裂にATPを要求した。この経路の最初の3酵素とサルコシンオキシダ-ゼを共役させると過酸化水素を最終シグナルとする新しいクレアチニンの測定系が構築できる。この系はクレアチニン分解の副産物としてのアンモニアやクレアチンを測定する従来の方法に比して、クレアチニンに由来する骨格分子であるN-メチルヒダントインを測定するため、従来法がクリア-しえなかった検体ブランクの差引操作の省略が可能なことを認めた。酵素の生産性を上昇させるために、培養条件の検討を行ない、P.putidaをクレアチニンを0.51.5%含むグリセロ-ル・ペプトン培地で培養すると、上記の酵素が効率よく誘導生成し、特に本測定経路のキ-酵素であるN-メチルヒダントインアミドヒトロラ-ゼNおよび-カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ-ゼ総可溶性タンパク質中に占める割合は14%に達した。土壌より分離したクレアチニン資化性細菌<Pseudomonas>___ー<putida>___ー77は下記の如くにクレアチニンを分解代謝し,サルコシンを生成することを認めた。また,それぞれの反応に関与する酵素を精製・単離し,クレアチニンデイミナ-ゼ,Nーメチルヒダントインアミドヒドロラ-ゼ,Nーカルバモイルサルコシンアミドヒドロラ-ゼであることを証明した。上記の反応系はサルコシンオキシダ-ゼを共役させると過酸化水素を最終シグナルとするクレアチニンの新しい測定系として利用できる(下式参照)サルコシン→グリシン+過酸化水素→赤色色素この測定原理は,副生物としてのアンモニアやクレアチンを測定する従来の方法に比較して,クレアチニンに由来する骨格分子たるNーメチルヒダントイン→Nーカルバモイルサルコシン→サルコシンを測定することに基づいており,従来法が解決し得なかったアンモニア・クレアチンによる誤差の問題から解放されており,極めて優れたものといえる。