hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RNA合成酵素複合体の分子構造進化基盤

本研究ではtRNA末端を合成するCC-、A-、CCA-付加酵素、翻訳因子と複合体を形成するRNA合成酵素の反応分子機構を明らかにした。CC付加酵素では、tRNAがCC合成過程で酵素上を回転し、転移することによって1つの活性部位で2つのCが付加される機構を明らかにした。また、A付加酵素はtRNA上腕部の長さを測ることによって、末端のAが欠けたtRNAのみにAを付加する機構を明らかにした。また、CCA付加酵素には成熟tRNAと未成熟tRNAを識別する機構があることを明らかにした。さらに、S1蛋白質と複合体を形成するRNA合成酵素では、S1がRNA合成開始に必要である分子基盤を明らかにした。本年度は、QβウイルスRNA複製酵素と宿主由来の翻訳伸長因子EF-Tu、EF-Tsおよびリボソーム蛋白質S1のN末端領域(OBフォールドを3つ含む)の4者複合体の結晶化、構造決定に成功した。この4者複合体は、QβウイルスのゲノムRNA複製(プラス鎖RNAからマイナス鎖RNA)を行うことができるとともに、ウイルスRNA(プラス鎖)の3'末端からおよそ1000ヌクレオチド上流に位置する特定の領域(M-サイト)配列に依存して忠実にRNA複製を開始できることも,申請者が構築した試験管内ゲノムRNA複製システムを用いて確認した。一連の構造解析、生化学的な解析から、リボソーム蛋白質S1はN末端に位置する2つのOBフォールドを介して複合体中のβサブユニットへのみ結合し、3番目のOBフォールドは複合体とは相互作用せず、複合体表面から溶媒中につきでていることが明らかになった。さらに、この3番目のOBフォールドのM-サイトRNAへの結合能力とQβウイルスのゲノム複製に相関があることも明らかになった。これらのことからリボソーム蛋白質S1の可動性をもつN末端から3番目に位置するOBフォールドがQβウイルスゲノムRNAを特異的に認識することによって、ゲノムRNAをQβウイルスRNA複製酵素複合体へリクルートし、その結果、Qβウイルスのゲノム複製開始が効率よく進行することが示唆された。このことは、蛋白合成開始に関わるリボゾーム蛋白質が、RNA合成開始因子として機能することを示唆する。本年度は、研究計画に記した真正細菌Aquifexaeolicus由来のA付加酵素と3'末端様式あるいはアクセプターヘリックスの長さが異なったtRNA各種(3'末端がC74C75A76のもの、A76、C75A76が欠けたもの、さらにアクセプターヘリックが6bpあるいは8bpで3'末端のA76が欠けたもの)との二者複合体、さらにその二者複合体にCTPあるいはATPを加えた三者複合体などの結晶を作成し、構造解析を行った。最終的に十二種類の結晶構造を決定した。これらの構造解析から、A付加酵素にはtRNAの結合部位が一か所のみ存在し、L字型三次元構造をとるtRNAのTPsiCループおよびDループの両方がA付加酵素のC末端側に形成されるテールドメインとボディードメイン間のくぼみに結合し、tRNAの三次元構造が酵素によって認識されていることが明らかになった。さらに、このC末端の酵素のくぼみを起点として酵素がtRNAの上部のアクセプターTPsiCへリックスの長さを測り、3'末端のAが欠けたtRNAの3'末端のみが、活性触媒ポッケトに到達できることが明らかになった。これらの一連の構造解析、および構造を基にした生化学解析から、A付加酵素がC74C75をtRNAへ付加することができず、末端のA76のみを付加することができる詳細な分子基盤が明らかになった。今年度の研究計画に記載した研究実施計画の真正細菌由来の鋳型非依存的RNA合成酵素のうちA付加酵素の特異性の分子メカニズムの詳細を明らかにできたため。本年度はクラスIIに属するCCA付加酵素とtRNAの複合体の構造解析を通して、特異性切り替えの分子基盤を明らかにすることを目指した。申請者がすでに単体の構造を決定しているThermotoga maritima CCA付加酵素とtRNAの末端様式の異なるtRNA(CCA、CA、あるいはAが欠けたもの、あるいは末端がCCAのもの)との複合体結晶のスクリーングを行った。結果、末端がCCA配列をもつtRNAとの結晶が得られ、その構造を分子置換法を用いて決定した。決定した構造は、CCA付加酵素が末端のAを付加する過程、あるいはAを付加した直後の構造とは異なっていた。CCA末端配列は活性触媒ポケット内でA付加反応直後とは異なったコンフォメーションをとっており、さらにtRNAの酵素に対する結合の仕方もAを付加する過程の構造とは異なっていた。CCA配列が合成された後、CCA配列が触媒ポケット内でリフォールドしていた。この構造は合成されたCCA配列を酵素が認識して、CCA配列合成が完了したtRNAを酵素から解離させる状態を表しているものであると示唆された。また、クラスIIに属するCCA付加酵素には、末端がCCAである成熟tRNAとCCA配列が欠けた未成熟tRNAとを識別する仕組みが存在することが示唆された。さらに、これまで、クラスIIのCCA付加酵素にはtRNAの結合部位は1箇所のみであり、tRNAは酵素上を回転、移動しないと考えられてきたが、今回の解析から、クラスIICCA付加酵素には、成熟tRNAと未成熟tRNAを認識、識別する2つのtRNA結合箇所が存在すること、またCCA付加反応終結に際してtRNAが酵素に対して回転、移動することも明らかになった。

本研究ではtRNA末端を合成するCC-、A-、CCA-付加酵素、翻訳因子と複合体を形成するRNA合成酵素の反応分子機構を明らかにした。CC付加酵素では、tRNAがCC合成過程で酵素上を回転し、転移することによって1つの活性部位で2つのCが付加される機構を明らかにした。また、A付加酵素はtRNA上腕部の長さを測ることによって、末端のAが欠けたtRNAのみにAを付加する機構を明らかにした。また、CCA付加酵素には成熟tRNAと未成熟tRNAを識別する機構があることを明らかにした。さらに、S1蛋白質と複合体を形成するRNA合成酵素では、S1がRNA合成開始に必要である分子基盤を明らかにした。研究計画のうち、QβウイルスRNA複製酵素の3番目の宿主因子リボゾーム蛋白質S1の機能を構造、生化学的解析を通して明らかにできた。今後は、真正細菌由来のCCA付加酵素についてtRNA複合体のX線結晶構造解析、機能解析を進め、クラスIIに属するCCA-、A-、CC-付加酵素の特異性の差異の詳細な分子基盤を明らかにしていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学、構造生物学今後は、本申請で対象としている鋳型非依存的RNA合成酵素と各種RNAとの複合体の構造解析、機能解析を進める。これまで、いくつかの結晶が得られており、またそのうちのいくつかに関しては構造を決定できている。
ハイブリッド型電解法による難生分解性複合廃水処理システムの開発

ハイブリッド型電解法は、溶解性電極(たとえばアルミニウム)を用いた電解浮上分離と不溶性電極を用いた電気化学的分解を併用する処理法である。本課題では、有害化学物質にフェロシアン化合物を用い、ハイブリッド型電解プロセスの装置設計および操作の最適化に資することを目的とした。溶解性電極を用いた回分電解浮上分離実験から、分離過程は電流密度[A/m^2]毎に処理液単位体積当りの通電量[C/m^3]でまとめることができ、分離初期から中期までは一次速度式で表された。電流密度の低下と共に電解効率が増すため、速度定数は低電流密度ほど増大した。また速度定数はpHが低いほど増大するが、分離終期には初期pHによらず約89で一定となった。連続実験では、主に電極構造、すなわち通常のタイプと複極式の違いが分離効率に与える影響について検討した。その結果、分離効率は複極式で高くなることが分かった。分解実験では、被覆材料にIrO_2、Pt、PbO_2を用いた。シアン化合物は、電解質にNaClを用いた場合に分解された。このことは、分解に塩素ラジカルが関与していることが示唆された。分解速度は電流値の増大と共に大きくなるが、通電量基準でまとめることができた。電解酸化によりフェリシアンはフェロシアンに変化後、急速に分解された、後者の過程において、鉄イオンが生成するが、酸化され、水酸化鉄の沈殿物が形成した。分解速度は、酸素過電圧の高いPbO_2が最大で、以下Pt、IrO2の順となった。ハイブリッド電解法では、後段に耐久性に優れ、安価なIrO_2を用いても、十分な除去率を得ることができた。廃水中の難生分解性物質の電気化学的な分離あるいは分解を目的に,ハイブリッド型電解法を提案した.一般に,処理対象物質濃度が高い場合,単一プロセスで規定の濃度まで減少させることは困難かつ不経済である.そこで本手法では,プロセスの前段に溶解性アルミニウム(Al)電極を用いた電解浮上分離装置を,また後段に不溶性電極(DSE)を用いた電気分解装置を採用することにより,高効率で高速分離可能な処理システムを構築することとした.電解浮上分離では,溶解性アルミニウム電極を用いることで,通電に伴い生成したAl水和物に有害物質を吸着させ、同時に発生した微細気泡とともに浮上分離させることができる.分離対象物質にフッ素を選び,回分実験を行ったところ,本法によりフツ素をほぼ完全に分離できた.分離速度は電極面積、電流値によらず単位液容積当たりの通電量[C/dm^3]に依存し,分離過程は一次速度式で表された。速度定数[dm^3/C]は,pH68で最大となり,この領域はAl(OH)_3の生成範囲と一致した.電気分解装置では,導電性ダイヤモンド電極(B, Nドープ)を用いて,フェノールを対象に半回分実験を行った。ダイヤモンド電極は,PbO_2電極などに比べて陽極過電圧が大きく,高い分解能を有する。フェノールの分解は通電量とともに進行するが,その速度は電解質の種類で変わり,Na_2SO_4に比べてNaClの方が大きい。中間生成物の分析から、分解機構を調べたところ,Na_2SO_4の場合,OHラジカルによりフェノールの開環から無機物までの酸化反応が進むが,NaClでは,より強い酸化作用を持つ過塩素酸(OCL^-)が同じ役割を担っていることが分かった.以上の基礎実験を踏まえて,新規なハイブリッド型プロセスを開発する.ハイブリッド型電解法は、溶解性アルミニウム電極を用いた電解浮上分離と、不溶性電極を用いた電気分解を併用した手法である。本課題では、難生分解性化合物としてフェロシアン化合物を対象に、装置設計および操作の最適化に資することを目的とした。

溶解性電極を用いた回分実験から、分解過程は液温、pHなどが同じであれば、電流密度ごとに通電量[C/dm^3]で整理できた。また電解効率が増すため電流密度が低いほど、分離速度は増大した。初期pHが低いほど分離速度は増大するが、分離終期のpHは約89に上昇した。連続実験では、分離効率に及ぼす電極構造の影響を検討した。その結果、複数の電極板を用いる場合、両端のみを電源に接続する複極式とそれぞれの板に電源を接続するタイプでは、同じ消費電力の場合、複極式の方が高い分離効率を示した。回分分解実験では、酸素過電圧の異なるIrO_2、Pt、PbO_2の金属被膜電極(基板はTi)を用いた。シアン化合物は電解質にNaClを用いた場合にのみ分解された。したがってCl・が分解に寄与していると思われる。分解速度は、電流値が大きくなるほど増大するが、通電量基準でまとめることができた。分解過程として、フェリシアンは電解酸化によりフェロシアンに変化後急速に分解されるのに併せて、鉄イオン(塩化物と思われる)が生成し、鉄イオンは水酸化物の生成とともに漸減した。また分解速度は、PbO_2で最大となり、以下Pt、IrO_2の順となった。ハイブリッド型の連続実験は、後段に優れた安定性を示すIrO_2電極を用いて行ったところ、最適操作条件下で、出口シアン化合物濃度は、ほぼゼロとできた。
表情・行動トレーニングによるサービスマインドコンピューティングの研究

本研究は,日本独自のきめ細かい接客のノウハウの輸出・ビジネス化を目的として,システムを通じて教育トレーニングを行うことで,サービスのノウハウの蓄積・伝承・普及をすることができるサービスマインドコンピューティングの研究を行う.バーチャルエージェントを利用したサービスマインドの伝承システムを開発する.これまでの説得技術の実験の研究成果,および専門家の具体的なノウハウをシステムに蓄積しシナリオを作成し,ユーザの表情およびジェスチャ・行動をセンシングすることでユーザのサービスマインドを評価・教育するサービスマインドトレーニングシステムを通してサービスマインドコンピューティングの技術を開発した.本研究では,日本伝承文化とも言える日本独自のきめ細かい接客のノウハウの輸出・ビジネス化を目的として,システムを通じて教育トレーニングを行うことで,日本の若い世代や外国の人々に対しても,サービスのノウハウの蓄積・伝承・普及をすることができるサービスマインドコンピューティングの研究を行う.海外諸国と比較して,日本のきめ細やかな接客の応対には目を見張るものがあり,世界に誇れるサービスと言える.それは,顧客一人一人を思いやった気持ちが態度となり,顧客に対する行動・表情・言葉に結びついており,長年に渡って日本に引き継がれてきた伝承文化である.本研究は,日本伝承文化とも言える日本独自のきめ細かい接客のノウハウの輸出・ビジネス化を目的として,システムを通じて教育トレーニングを行うことで,日本の若い世代や外国の人々に対しても,サービスのノウハウの蓄積・伝承・普及をすることができるサービスマインドコンピューティングの研究を行う.バーチャルエージェントを利用したサービスマインドの伝承システムを開発する.これまでの説得技術の実験の研究成果,および専門家の具体的なノウハウをシステムに蓄積しシナリオを作成し,ユーザの表情およびジェスチャ・行動をセンシングすることでユーザのサービスマインドを評価・教育するサービスマインドトレーニングシステムを通してサービスマインドコンピューティングの技術を開発した.初年度はEEGを用いることによりトレーニングを受けるユーザの表情を認識,音声認識を用いることにより発した言葉の認識しサービスマインドトレーニングのシステムを開発し検証した.次年度はKinectを用いることによりジェスチャを認識するシステムを追加したシステムを開発し検証した.本研究は,日本独自のきめ細かい接客のノウハウの輸出・ビジネス化を目的として,システムを通じて教育トレーニングを行うことで,サービスのノウハウの蓄積・伝承・普及をすることができるサービスマインドコンピューティングの研究を行う.バーチャルエージェントを利用したサービスマインドの伝承システムを開発する.これまでの説得技術の実験の研究成果,および専門家の具体的なノウハウをシステムに蓄積しシナリオを作成し,ユーザの表情およびジェスチャ・行動をセンシングすることでユーザのサービスマインドを評価・教育するサービスマインドトレーニングシステムを通してサービスマインドコンピューティングの技術を開発した.世界でもトップクラスと言われる日本の接客サービスの個々の顧客にきめ細かく配慮する心としてのサービスマインドに着目し,キャラクタエージェントとの対話により接客方法についての教育トレーニングを提供するシステムを開発した.日本の航空会社は接客サービスにおいては常に世界のトップクラスに位置づけられている.サービスマインドとは,顧客を幸せにするための技術,または心持ちのことであり,顧客サービスに笑顔は大切であると言われている.本システムは,3Dモデルのキャラクタエージェントを表示し,脳波計測器を用いた表情認識を行い,音声認識・音声合成システム,対話システムにより対話による教育トレーニングをユーザに提供する.被験者を用いた実験により本システムの効果測定を行い,その結果をもとに考察した.プロトタイプ開発を終え,25年度に行う予定であったその検証も行うことができたため.今後は本システムのさらなる改良を加えその検証も行っていく.具体的には,インタフェースの問題点を解消していく予定である.システム評価についても目的に沿ったより詳細な評価を行っていきたいと考える.前年度行った研究を国際会議で発表を行い学会誌への投稿を行っていく.インタフェースの改良のための機器やデジタルデータ,開発費なども使用する予定である.
カーボンナノチューブを応用した粒子検出の研究

カーボンナノチューブは炭素原子からなる直径数nm・長さ数10μmの物質である。この物質は金属より高い熱伝導度と融点を持つ。その微細な構造により、これを電極として用いた場合、近傍で高い電場を発生することが可能になる。これらの性質より、粒子検出器に応用できれば、長寿命、高い検出効率のものが開発できる可能性がある。2cm*2cmの平面電極構造をもつチェンバーを用いて、評価を行う。実験に用いたカーボンナノチューブは放電法で作った直径7-12nm、長さ10μmのもので、純度は90%のものである。実際の製品を見ると、長さ0.5mm程度の非常に細かく、密度の低いスス状の構造をしている。これを電極として用いるために、接着剤中に混入し電極に塗布した。ところがこの場合、ナノチューブは接着剤中に懸濁する形になり、電極として用いることは不可能だった。第二の方法として電極に導電性接着剤を塗り、ナノチューブを均一に散布する、という方法も試みた。この方法を用いることで、ある程度表面に濡れのないナノチューブ層を得ることが可能になった。この電極を用いて、検出器のとしての性質を確認する試験を行った。アルゴン・エタンの混合ガスをこの電極間に充填した後に、高電圧を掛け電極からの信号をチャージアンプで増幅し、オシロスコープを用いて測定を行った。2000Vまでの電圧を印加して試験したが、優位な信号は見られなかった。将来の改善策としては、CVD法を用いて基板に直接ナノチューブを形成することが考えられる。その場合、電気的な性質を改善できるだけでなく、長さ・方向の均一性を向上させることができる。
レンチウイルスベクターを用いたランダム遺伝子破壊による性染色体機能の解析

レンチウイルスベクターを受精卵に感染させれば、非常に効率良く多数の遺伝子座にGFP発現遺伝子を組み込むことができる。そのことを利用して、GFP遺伝子を性染色体に組み込むと同時に内在性遺伝子を破壊することにより、性染色体の遺伝子機能を解析することを目的として研究を進めてきた。これまでに、酸性処理による透明帯除去ではなく、ガラスキャピラリーを用いて透明帯と卵の隙間にウイルスを注入するマイクロインジェクション法であれば、必要ウイルス量を減らせるだけでなく、卵へのダメージも少ないことを確認した。また破壊された遺伝子、つまりウイルスベクターが組み込まれた場所を、ランダムプライマーを用いたPCR法により決定する系を確立した。これまでに作製したトランスジェニックマウス系統について、150系統あまりの遺伝子導入部位を決定した。さらにX性染色体にGFP発現カセットが組み込まれたトランスジェニックマウスを用いることで、雌雄の胚を着床前に選別し(X/X雌xX^<GFP>/Y雄の交配で得られる雌胚はすべてX/X^<GFP>、雄胚はすべてX/Yとなり、雌胚のみが緑色蛍光を発する)、雌雄における初期遺伝子発現の比較を行った。その結果、胚盤胞期ではY染色体からDbyおよびEif2s3yが、X染色体からはXistおよびRhox5が特異的に発現していることを明らかにした。さらに解析を進めRhox5がインプリント遺伝子であることを明らかにした。以上のことから、性染色体は着床前の早い時期から性分化の鍵を握っていることが推測された。そのことを利用して、GFP遺伝子を性染色体に組み込むと同時に内在性遺伝子を破壊することにより、性染色体の遺伝子機能を解析することを目的として研究を進めている。今年度は、レンチウイルスベクターを受精卵に感染させることにより効率良くトランスジェニックマウスが作製できること、ならびにその方法を利用すればプロモーター領域の解析などにも有効利用できることを明らかにし、論文報告した。さらに共同研究としてレンチウイルスベクターを用いたトランスジェニックマウスの作製を行い、ノックアウトマウスのレスキュー実験のように高効率が要求される実験において成功を収めている。現在は、さらに遺伝子改変動物の作製効率を上げるための検討を行っている。具体的には、卵の透明帯があるとウイルスが感染できないので現在は酸性タイロード処理しているが、卵へのダメージが大きいために発生能が低下してしまう。そこでガラスキャピラリーを用いたマイクロインジェクション法を試している。それに並行して、遺伝子破壊を目的としたトラップベクターの構築や、組み込まれた遺伝子座の同定方法についての確立を目指して研究を進めている。破壊された遺伝子の同定は5'-RACE法を、組み込まれた場所の同定はプラスミドレスキュー法を予定しており、それぞれ条件検討を始めている。今年度は、遺伝子改変動物の作製効率をさらに上げるための検討を行った。そこでガラスキャピラリーを用いたマイクロインジェクション法を試した。特に顕著な効率化は認められなかったが、胚への侵障性が低く、必要なウイルス量を減らすことが可能であった。これまでに作製したトランスジェニックマウス系統について、順次、遺伝子導入部位の決定を進めている。さらにsiRNAを発現するレンチウイルスベクターを作製し、in vitroでRNAiにより目的遺伝子の発現を抑制する手法を確立した。またインテグレース活性を破壊したレンチウイルスベクターを用いれば、効率良く相同組換えによるジーンターゲティングが行えることを見出した。今後は新規手法の個体レベルへの応用を含め、様々な面から性染色体の遺伝子破壊や発現抑制による機能解析を行っていく。

さらに解析を進めRhox5がインプリント遺伝子であることを明らかにした。以上のことから、性染色体は着床前の早い時期から性分化の鍵を握っていることが推測された。
脳内電位発生源を推定する双極子追跡の臨床応用

脳内に発生した電位を一つの電流双極子と仮定し、頭皮上から記録される電位分布から脳内に電源の位置とベクトル・モ-メントを求める双極子追跡法(DT法)を完成し、頭部形状計測装置も併せて完成した。そこでこれら二つの装置をスウェ-デンのウプサラ大学病院・臨床神経生理学教室に空輸し、3名の患者につき延べ5回の研究を行った。同教室はスウェ-デンにおける難治性テンカンのセンタ-で、テンカン発作を抑えるため観血的な治療を行なっており、術前に硬膜下電極を頭蓋内に挿入しテンカンの責任病巣を決定している。我々が開発した双極子追跡法は非観血的に、非侵襲的に電源の位置を決定できるのでテンカン発作の責任病巣決定についてその有効性の検討が急がれた。事前に硬膜下電極でテンカン波の記録がしてあった患者2名、硬膜下電極挿入前後にわたって脳波の記録できた患者1名について研究を行ない以下の結果を得た。症例1:38歳女性。難産。1歳のときからテンカン発作有り。入院時週に2回程の発作があり、薬物でコントロ-ルできず。CT、MRI上所見無し。通常のEEGで右側の側頭葉領域から棘波の出現。硬膜下電極にて右側の側頭葉下内側にある電極からのみテンカン波が記録された。右側の海馬に病巣があると診断された。DT法により棘波の電源を推定し、MRI像に重ねると右側の海馬で、硬膜下電極のうち、棘波を記録した電極に一致して求った。また、電源の時間的軌跡は海馬のニュ-ロン配列と極めて類似し頭皮上から記録された棘波は海馬ニュ-ロンに発生した細胞体ー樹状突起に流れた電流の総和によると推定された。これらの結果はNeuroscience Lettersに投稿し、現在印刷中である。その後、脳外科的に右側の海馬の一部が切除され、発作は消失した。切除組織から神経膠症が確認された。症例2:29歳女性。出産のときの異常なく、頭部外傷の既往もない。6歳のとき発作が始まる。通常のEEG検査で右側の側頭葉中央に徐波を認めた。CT像では右側のシルビ-溝の拡大を認めたが、MRI像では所見無し。薬剤無効で週に2ー3回の発作を認める。硬膜下電極挿入の手術前にDT法で電源を推定した。推定された電源は海馬付近で、症例1より中央よりに、あるときは左側または右側の海馬に存在した。術後の硬膜下電極から両側の海馬付近に病巣が決定された。現在二双極子追跡法で解析を終わり、論文を準備中である。また、術後に硬膜下電極より矩形波電流を微量流し人工的に電流双極子を作り、この双極子による頭皮上の電位分布から電源を推定し、X線像による硬膜下電極の三次元座標と比較し、DT法の補正因子を算出した。これらの結果は、IEEE Transaction of Biomedical Engineeringに投稿中である。両側に病巣があることから脳外的手術は不可能とされた。症例3:43歳男性。20歳のとき高所より転落し、頭部外傷。3週間意識不明。26歳のとき発作発現。通常のEEG検査で左側の前頭葉領域にテンカン波を認める。硬膜下分極では左側の前頭葉外側部から始まる発作波を確認。CT像で左側の前頭葉とその低部に低密度陰影を認める。週3ー4回発作出現。睡眠時に全身発作に移行すること多し。DT法での発作波の電源は脳実質に軟化巣があり、このため推定誤差が大きく、現在補正プログラムを開発し、検討中である。これらの研究から非観血的、非侵襲的検査法である我々の開発したDT法は脳実質に大きな電導率の変化がなければ観血的方法である硬膜下電極法と同様に充分臨床応用できる装置であるが、電源推定の精度を高めるため、さらに補正因子の検討が必要であることが明らかになった。また、この種の研究は国外にはなく、わが国が最先端を行っていることを付け加えたい。症例1:38歳女性。難産。

硬膜下電極にて右側の側頭葉下内側にある電極からのみテンカン波が記録された。右側の海馬に病巣があると診断された。DT法により棘波の電源を推定し、MRI像に重ねると右側の海馬で、硬膜下電極のうち、棘波を記録した電極に一致して求った。また、電源の時間的軌跡は海馬のニュ-ロン配列と極めて類似し頭皮上から記録された棘波は海馬ニュ-ロンに発生した細胞体ー樹状突起に流れた電流の総和によると推定された。これらの結果はNeuroscience Lettersに投稿し、現在印刷中である。その後、脳外科的に右側の海馬の一部が切除され、発作は消失した。切除組織から神経膠症が確認された。症例2:29歳女性。出産のときの異常なく、頭部外傷の既往もない。6歳のとき発作が始まる。通常のEEG検査で右側の側頭葉中央に徐波を認めた。CT像では右側のシルビ-溝の拡大を認めたが、MRI像では所見無し。薬剤無効で週に2ー3回の発作を認める。硬膜下電極挿入の手術前にDT法で電源を推定した。推定された電源は海馬付近で、症例1より中央よりに、あるときは左側または右側の海馬に存在した。術後の硬膜下電極から両側の海馬付近に病巣が決定された。現在二双極子追跡法で解析を終わり、論文を準備中である。また、術後に硬膜下電極より矩形波電流を微量流し人工的に電流双極子を作り、この双極子による頭皮上の電位分布から電源を推定し、X線像による硬膜下電極の三次元座標と比較し、DT法の補正因子を算出した。これらの結果は、IEEE Transaction of Biomedical Engineeringに投稿中である。両側に病巣があることから脳外的手術は不可能とされた。症例3:43歳男性。20歳のとき高所より転落し、頭部外傷。3週間意識不明。26歳のとき発作発現。通常のEEG検査で左側の前頭葉領域にテンカン波を認める。硬膜下分極では左側の前頭葉外側部から始まる発作波を確認。CT像で左側の前頭葉とその低部に低密度陰影を認める。週3ー4回発作出現。睡眠時に全身発作に移行すること多し。DT法での発作波の電源は脳実質に軟化巣があり、このため推定誤差が大きく、現在補正プログラムを開発し、検討中である。これらの研究から非観血的、非侵襲的検査法である我々の開発したDT法は脳実質に大きな電導率の変化がなければ観血的方法である硬膜下電極法と同様に充分臨床応用できる装置であるが、電源推定の精度を高めるため、さらに補正因子の検討が必要であることが明らかになった。また、この種の研究は国外にはなく、わが国が最先端を行っていることを付け加えたい。
生涯学習施設の経営診断・評価技法の標準モデルの開発　―公民館経営診断を中心に―

本研究は、主としてわが国固有の生涯学習施設である公民館の経営診断技法の標準モデルの開発を行なった。ここでは、東北地方の公民館を対象に行なった経営改善事例の調査に基づいて分析を行なった。収集した160の経営改善事例を経営診断の枠組みである公民館の経営上の問題である「診断名」、「改善・整備」「改善・整備による成果」の分類項目によってコード化し、その組み合わせ(リンケージ)のパターンを分析した。その中から、利用者の固定化や減少等に関して、類似したパターンを示す7つのリンケージを抽出することができた。これらのリンケージが経営診断技法の標準モデルになると考えられる。生涯学習施設の経営診断・評価技法のモデル開発に向けて、本年度は主に次の三点の研究作業を行った。第一は、日本の生涯学習施設(図書館、博物館、公民館等)の診断・評価にかかわる文献資料の収集、施設の事業評価と事務事業評価等の行政資料等の収集を行った(実地調査、web等による)。生涯学習施設の診断の実践に関する資料はほとんどないが、図書館、博物館、公民館等の各施設の評価の方法的特徴と課題の抽出を行った。第二は、外国の生涯学習施設の診断・評価の概念、方法論、実践に関する資料収集、実地踏査と動向の分析等を行った。国内やwebを通じて、ドイツにおける成人教育施設の認証評価(LQW等)の関係資料を収集するとともに、その評価を実践しているベルリンのフォルクホッホシューレであるBerlinMitteを訪問し、教育施設側からみた評価の現状について聞き取りを行った。また、教育施設の評価を行っている組織であるKOSを訪問し、LQWとは異なる教育施設評価手法についてに聞き取り調査を行った。さらに、デンマークの成人教育施設フォルケホイスコーレ(リュ・ホイスコーレ、ロンデ・ホイスコーレ)を訪問した。フォルケホイスコーレでは、学校の目標(価値)をウェブで公開し、また、2年に1度、その評価をすることが義務となっている。その目標をどのよう設定しているか、また、それをどのように評価しているか等についての聞き取り調査を行った。これらをもとに、外国における成人教育施設の評価の方法的枠組について分析した。第三は、公民館に焦点を当てて、公民館経営の実践の中から経営診断に必要な「診断名」「改善・整備」「改善・整備による成果」のリンケージを抽出する目的で、新潟県十日町市、山形県新庄市、同真室川町、愛媛県松山市、岩手県釜石市、静岡県焼津市の公民館、鳥取県倉吉市の公民館(全11館)において聞き取り調査を実施した。公民館の経営評価・診断技法の開発に向けた質問紙調査(本調査)と事例に関する調査を行った。質問紙調査では、東北各県の約1200の公民館を対象に、「公民館運営の充実・改善に関する調査」を実施した。回答数は190程度であったが、公民館経営診断のリンケージ作成に必要な、課題・改善を要する事項、改善・整備の手だて、課題が解決された状態の3項目についての具体的事例を収集することができた。例えば、その1つに「職員が出張所との兼務のため、事業が滞る」(課題・改善を要する事項)に対して、「出張所繁忙期には本庁より応援を求める体制を整える」「公金運送業務を業者に委託する」「図書室に指導員を置き、図書業務を分担させる」(改善・整備の手だて)ことにより、「公民館事業の滞りが少なくなった」(課題が解決された状態)という課題解決・改善の事例があった。また、訪問調査では、岩手県釜石市、同一関市、同山田町、神奈川県相模原市の公民館(計6館)を訪問し、公民館経営の改善に関わる事例の聞き取り調査を行った。ここでは、公民館で行われる地域の会合への参加者の減少や遅刻等が目立ったことから、会議改善への取組とその経緯、それによる効率的な会議運営の実現の経緯等の事例を収集できた。外国の生涯学習施設の評価・診断の概念、方法論、実践に関する資料収集では、デンマークのフォルケホイスコーレ2校(リュホイスコーレ、ブランディホイスコーレ)、及びフォルケホイスコーレ研究所(FFD)を訪問し、フォルケホイスコーレの全国的な動向と学校評価の取組みについて聞き取りを行った。両学校の評価においても、学校が目指す価値(veardi)の設定が重要であることが理解できた。公民館経営診断・評価技法のモデル開発に向けた質問紙では、平成26年度末に実施した東北地方6県の公民館を対象とした公民館経営の改善事例の調査(悉皆調査)により、160の改善・改善事例を収集した。これらの個々の事例について「課題・改善を要する事項」「課題が改善・解決された状態」「課題の改善・解決のための手立て」の内容を小分類で抽出し、その内容を中分類に集約し、公民館経営診断の「診断名」(53項目)、「改善・整備による成果名」(36項目)、「改善・整備名」(41項目)の分類項目名(候補名)を作成した。事例に基づいて、これらの分類項目名の連関を分析し、経営診断のためのリンケージを開発した。リンケージとは概念と概念の結びつき(組合わせ)を示すもので、経営診断では、診断名に対して期待する改善・整備の成果の組合わせ、さらにその成果を生み出すのに有効な改善・整備の組合わせということができる。複数の改善事例にみられた連関から開発されたリンケージとして、「(診断名)講座参加者数の減少、利用者の減少」ー「(改善・整備による成果名)受講者、参加者の増加」ー「(改善・整備名)広報の充実・強化」

「(同)講座等の内容、方法の改善、充実」「(同)講座等の開催方法等変更」「(同)講座等の周知内容、方法等変更」などがある。生涯学習施設の経営改善に関する聞き取り調査では、広島県大竹市、福岡県糸島市、愛媛県松山市、同西予市、秋田県由利本荘市、同にかほ市、大潟村の公民館、生涯学習推進センター等の実地調査を行い、リンケージ開発の事例を収集した。なお、上記の研究成果の一部は、関連の学会において口頭発表を行った。公民館調査により収集した改善事例数が多かったことに加え、小分類による細かな分類を行ったことによりその集約、分析に時間を要したが、調査はほぼ予定のとおり進行した。なお、研究成果の口頭発表後にさらなる分析、考察を加えたことから、研究成果の公表のみを残すことになった。本年度中に行なった研究内容を加えつつ、研究期間の最終年度として、これまでの調査、分析の内容を総括し、学術論文の投稿・掲載と研究報告書の作成を通じて、研究成果の発表を行った。学術論文「公民館経営診断における「診断名」「改善・整備による成果」「改善・整備」の連関ー分類項目間のリンケージの構築を意図してー」(日本生涯教育学会論集、37号、2016年9月)は、前年度に行なった学会発表の内容(「公民館経営診断技法の検討ー経営診断におけるリンケージを中心にー」、日本生涯教育学会第36回大会、2015年11月)にさらなる検討を加えて、公民館経営診断のリンケージ構築のための方法とリンケージの例示を行なった。また、研究報告書として『公民館経営診断技法のリンケージ開発に関する研究報告ー公民館の経営改善事例の調査を通じてー』(2017年3月)を作成した。上記の学術論文が研究成果の結論部分を中心にしているのに対して、研究報告書では公民館経営診断のリンケージとして8事例を示すとともに、公民館の経営改善に関する調査で得られた経営改善の事例(事例数160)をすべて掲載し、これから公民館経営診断のリンケージを構築していく具体的なプロセスも提示している。公民館経営診断のリンケージ(8事例)は本研究の重要な成果と考えられる。また、160の経営改善の事例だけを見ても、同種の課題を抱えている公民館にとって、どのような手立てを取ることが経営改善に有効であるかを検討する際に有効な資料となると考えられる。本研究は、主としてわが国固有の生涯学習施設である公民館の経営診断技法の標準モデルの開発を行なった。ここでは、東北地方の公民館を対象に行なった経営改善事例の調査に基づいて分析を行なった。収集した160の経営改善事例を経営診断の枠組みである公民館の経営上の問題である「診断名」、「改善・整備」「改善・整備による成果」の分類項目によってコード化し、その組み合わせ(リンケージ)のパターンを分析した。その中から、利用者の固定化や減少等に関して、類似したパターンを示す7つのリンケージを抽出することができた。これらのリンケージが経営診断技法の標準モデルになると考えられる。東北6県のすべての公民館(各県教育委員会が把握している公民館)を対象に、公民館の運営改善に関する調査が実施できた。調査内容が各公民館の運営状況と改善事例で自由記述による回答形式であったため、回答率は高くなかったが、多くの具体的な改善事例を収集することができた。これは、今後の経営診断のモデル構築の有効なデータとして活用できると考えている。
精密測量によるガンダーラ佛寺構成の再検討

昨年につづき、本年度はガンダーラのタフテバヒ寺院跡の建物造立の編年的調査とタキシラの諸寺院跡の編年的調査を目的としたが、諸般の事情からタフテバヒ寺院跡の調査は斷念し、野外調査としてはタキシラの諸寺院跡の調査を集中して行うことになった。したがってタキシラではとくにダルマラージカ-寺跡を徹底的に分析することになった。主塔と小塔とで構成されるこの寺跡は、近隣の都市遺跡シルカップの第2層にある佛塔の特徴ある石組みと層位的な位置關係とから、1世紀から建設されたことが確實となった。主塔は初期に建設された圓形の基壇の上に半球の伏鉢をのせているが、初期の圓形基壇を圍んでつくったのちの基壇は、發掘者のマーシャルによって後期の石積みとされていたが、そうではなく一時期前の、いわゆるdiaper式石積であることが判明した。しかしこの基壇にとりつけられた東西南北四面の階段は、主塔の東面に貼り付けられた祀堂の石積の形式からみて最末期における作り替えである。一方、この基壇を取り圍んでいる小塔群や祀堂群にももちろん造立の前後關係がある。マーシャルはこれをおおきく3時期のものとみている。初期がrubble,ついでdiaper,そして最後にsemi-ashlarというかれが分類した石積樣式である。マーシャルの設定した石積樣式の大筋はみとめることができるが、それぞれの樣式にはきわめておおくの型式があり、とくにrubbleとdiaper、diaperとsemi-ashlarなど各樣式の間の漸移的な型式をどちらの樣式とみるかによって、その石積をつかって建設された佛塔や寺院建築の年代が左右される。そこで本年度の調査のおおきな部分として、小塔群や祀堂群がどのような石積によって建設されているかを逐一記述し、スティル寫眞に撮影し、これを研究室内で圖面と對照しつつ、詳細に檢討するための基礎資料とした。このような實地の觀察のなかから既に、廣大なダルマラージカ-寺跡の建設の順序がすこしづつあきらかになっている。ダルマラージカ-寺跡の北側に位置する僧坊地區には、G、H、Jの三つの僧坊とふたつの佛塔がある。マーシャルが認めていた編年はここではまったく通用しない。われわれの觀察と石積の研究からすると、これら僧坊はマーシャルがあたえたタキシラ佛教史再末期の年代(5世紀末)よりはるかに後の時代(8-10世紀)にまで亘って建築がおこななわれていたことが證明される。一方ふたつの佛塔のうち、ひとつは古い時代に削平されてしまうが、あとのひとつはここに述べた僧坊とともに延命することが確認される。これら佛塔の石積はみかけはきわめて古層に屬するが、ひとつははやくに消滅し、ひとつは補修をうけながら生き延びてタキシラ再末期に至る。タキシラにはインド政廳時代の舊インド考古局が今世紀のはじめに發掘した、ダルマラージカ-寺跡を含む17の佛寺跡がある。さらにある程度の發掘をへたみっつの都市遺跡があり、そのうちシルカップ市街には佛塔がいくつか殘る。こういった遺跡にのこる佛塔のうち、一ヶ寺を殘してすべての佛寺の佛塔に關し、佛塔の特徴をよくあらわしている基部繰り形(base mouldings)の斷面圖を實測によって集成した。この基部繰り形は、タキシラ佛教の初期である石積rubbleの時代に2形式があらわれ、兩形式は同じ佛塔に併用されることなく、石積diaperの時代まで存續するが、石積semi-ashlarの時代になると、ひとつの形式は姿を消し、もうひとつの形式が低平な型式へと變化しつつ、さかんに利用され、さらに再末期には壯大な二重繰り形(double mouldings)となる。石積形式と基部繰り形形式とは相互に密接な關係があり、繰り形の變化を逐うことにより、從來石積の變化ばかりから逐っていた佛寺建築の編年におおきな役割を今後期待できる。このようなタキシラ諸寺院跡を實地檢證によって再檢討するには自ずから限界がある。パキスタン考古局の努力にもかかわらず、遺構はすでに發掘から半世紀以上をへていること。さらに遺跡の現状と發掘者マーシャルの報告書の記述と相異である。このギャップを埋めるのは發掘當時に撮影された寫眞である。寫眞資料の多くは失われたが、一部はThe BritishLibraryが所藏しているので、これを調査した。さらにThe British Museumをはじめとするイギリス、あるいはインドの博物館においては、ガンダーラ彫刻にあらわれた佛塔資料を蒐集し、またタキシラやガンダーラの初期佛塔の形式研究の比較資料として西インドの石窟寺院内の佛塔資料を實地に蒐集した。

したがってタキシラではとくにダルマラージカ-寺跡を徹底的に分析することになった。主塔と小塔とで構成されるこの寺跡は、近隣の都市遺跡シルカップの第2層にある佛塔の特徴ある石組みと層位的な位置關係とから、1世紀から建設されたことが確實となった。主塔は初期に建設された圓形の基壇の上に半球の伏鉢をのせているが、初期の圓形基壇を圍んでつくったのちの基壇は、發掘者のマーシャルによって後期の石積みとされていたが、そうではなく一時期前の、いわゆるdiaper式石積であることが判明した。しかしこの基壇にとりつけられた東西南北四面の階段は、主塔の東面に貼り付けられた祀堂の石積の形式からみて最末期における作り替えである。一方、この基壇を取り圍んでいる小塔群や祀堂群にももちろん造立の前後關係がある。マーシャルはこれをおおきく3時期のものとみている。初期がrubble,ついでdiaper,そして最後にsemi-ashlarというかれが分類した石積樣式である。マーシャルの設定した石積樣式の大筋はみとめることができるが、それぞれの樣式にはきわめておおくの型式があり、とくにrubbleとdiaper、diaperとsemi-ashlarなど各樣式の間の漸移的な型式をどちらの樣式とみるかによって、その石積をつかって建設された佛塔や寺院建築の年代が左右される。そこで本年度の調査のおおきな部分として、小塔群や祀堂群がどのような石積によって建設されているかを逐一記述し、スティル寫眞に撮影し、これを研究室内で圖面と對照しつつ、詳細に檢討するための基礎資料とした。このような實地の觀察のなかから既に、廣大なダルマラージカ-寺跡の建設の順序がすこしづつあきらかになっている。ダルマラージカ-寺跡の北側に位置する僧坊地區には、G、H、Jの三つの僧坊とふたつの佛塔がある。マーシャルが認めていた編年はここではまったく通用しない。われわれの觀察と石積の研究からすると、これら僧坊はマーシャルがあたえたタキシラ佛教史再末期の年代(5世紀末)よりはるかに後の時代(8-10世紀)にまで亘って建築がおこななわれていたことが證明される。一方ふたつの佛塔のうち、ひとつは古い時代に削平されてしまうが、あとのひとつはここに述べた僧坊とともに延命することが確認される。これら佛塔の石積はみかけはきわめて古層に屬するが、ひとつははやくに消滅し、ひとつは補修をうけながら生き延びてタキシラ再末期に至る。タキシラにはインド政廳時代の舊インド考古局が今世紀のはじめに發掘した、ダルマラージカ-寺跡を含む17の佛寺跡がある。さらにある程度の發掘をへたみっつの都市遺跡があり、そのうちシルカップ市街には佛塔がいくつか殘る。こういった遺跡にのこる佛塔のうち、一ヶ寺を殘してすべての佛寺の佛塔に關し、佛塔の特徴をよくあらわしている基部繰り形(base mouldings)の斷面圖を實測によって集成した。この基部繰り形は、タキシラ佛教の初期である石積rubbleの時代に2形式があらわれ、兩形式は同じ佛塔に併用されることなく、石積diaperの時代まで存續するが、石積semi-ashlarの時代になると、ひとつの形式は姿を消し、もうひとつの形式が低平な型式へと變化しつつ、さかんに利用され、さらに再末期には壯大な二重繰り形(double mouldings)となる。石積形式と基部繰り形形式とは相互に密接な關係があり、繰り形の變化を逐うことにより、從來石積の變化ばかりから逐っていた佛寺建築の編年におおきな役割を今後期待できる。このようなタキシラ諸寺院跡を實地檢證によって再檢討するには自ずから限界がある。パキスタン考古局の努力にもかかわらず、遺構はすでに發掘から半世紀以上をへていること。さらに遺跡の現状と發掘者マーシャルの報告書の記述と相異である。このギャップを埋めるのは發掘當時に撮影された寫眞である。寫眞資料の多くは失われたが、一部はThe BritishLibraryが所藏しているので、これを調査した。
発達期の性ステロイドホルモンによって規定される脳機能の性差に関する研究

本研究では、「痛覚」と「情動」の性差に着目し、これらの性差形成に発達期の性ステロイドが関与しているか否かを明らかにする。げっ歯類の雌は、雄より回避行動を起こす痛覚刺激閾値が低く、情動においては、雌は雄より不安様行動が強い。そこで本研究では、発達期に性ステロイドの処置をすることで、脳を本来の遺伝的性ではない性に分化させ(雌を雄性化、雄を雌性化)、痛覚や情動に及ぼす変化を、行動学的及び電気生理学的解析を用いて検証する。
日常生活における5W1H体験の長期記録とその分析手法の確立

本研究では,体験を長期間記録可能なウェアラブル機器を開発し,実際に体験を記録した長期記録データを基に,体験に含まれる情報の生起パターンや,そのパターンがユーザ認知に与える影響を分析することが目的であった.ウェアラブル機器は映像記録を中心としたものと音声録音を中心としたものの2種類を開発した.本年度は次の2つのテーマに基づいてシステム機能の開発を行い,構築システムの検証を行った.国内外において計4件の研究成果の発表を行った.(a)映像に含まれる行為と場所情報の認知への影響の分析ユーザ視点の映像を取得可能なウェアラブル装置を開発した.ユーザ視点映像の記録を用いた物探し支援システム実現のために,ユーザが物を扱った時の映像を記録・収集した.実験・分析結果により,映像に映るユーザ行動と場所の情報に関するユーザの認知がカメラ視野角の影響を強く受けることを明らかにした.(b)一人称発話の長期記録と記録発話パターンの分析骨伝導マイクとICレコーダにより,ユーザ自身だけの発話(一人称発話)を常時録音可能なウェアラブル記憶補助装置を構築した.実際に日常生活で利用し,常時利用可能であることを確かめた.また,録音した発話データを分析し,一人称発話を参照することで,他者との会話を想起できる可能性があることを確認した.本研究の目的は,ウェアラブル機器によって5W1H体験を長期間記録し,長期記録データを基に5W1H体験の各情報の基本的な生起パターンや5W1H体験の情報間の基本的な相互関係の分析技術を実現することである.また平成17年度の研究計画は,5W1H体験の長期記録実験用のウェアラブル機器を設計・開発し,また記録された5W1H体験の編集用ソフトの設計を行うことであった.平成17年度では,ウェアラブル機器の設計・開発を行った.本研究では,5W1H体験を長期間記録するため,市販のカメラやバッテリを利用可能とする設計・開発方針を採用した.直径7mmの小型CCDカメラ2台を頭部の両こめかみ付近に設置可能であり,カメラの視点方向の微調整・固定が可能なカメラ設置機構を開発した.対角150度の広視野角レンズを設置したカメラが2台存在することで,両腕を撮影中心として日常生活を超広視野角で記録可能である.また,5W1H体験を記録する媒体としてHDDビデオレコーダを採用した.HDDビデオレコーダは映像・音声の記録に特化した軽量のモバイル機器で,映像を連続72時間まで記録可能である.また,市販のモバイル用大容量バッテリを並列駆動可能な並列化機構を開発した.並列駆動が可能なため,体験の長期記録時に記録状態を維持したまま,バッテリの交換が可能である.また,バッテリ数に限定されない並列化機構とすることで,1時間以上,1時間毎のバッテリ無交換による連続記録時間の調整が可能となった.これにより,記録・分析したい体験の長さによって,接続するバッテリ数を変更することが可能となり,体験記録実験の目的に合わせて装置の重量を最小化させることが可能である.また,並列化機構はバッテリを2箇所に分散させることが可能であり,装置の身体装着時の重量バランスの調整が可能である.本研究では,体験を長期間記録可能なウェアラブル機器を開発し,実際に体験を記録した長期記録データを基に,体験に含まれる情報の生起パターンや,そのパターンがユーザ認知に与える影響を分析することが目的であった.ウェアラブル機器は映像記録を中心としたものと音声録音を中心としたものの2種類を開発した.本年度は次の2つのテーマに基づいてシステム機能の開発を行い,構築システムの検証を行った.国内外において計4件の研究成果の発表を行った.(a)映像に含まれる行為と場所情報の認知への影響の分析ユーザ視点の映像を取得可能なウェアラブル装置を開発した.ユーザ視点映像の記録を用いた物探し支援システム実現のために,ユーザが物を扱った時の映像を記録・収集した.実験・分析結果により,映像に映るユーザ行動と場所の情報に関するユーザの認知がカメラ視野角の影響を強く受けることを明らかにした.(b)一人称発話の長期記録と記録発話パターンの分析骨伝導マイクとICレコーダにより,ユーザ自身だけの発話(一人称発話)を常時録音可能なウェアラブル記憶補助装置を構築した.実際に日常生活で利用し,常時利用可能であることを確かめた.また,録音した発話データを分析し,一人称発話を参照することで,他者との会話を想起できる可能性があることを確認した.
7回膜貫通型受容体の蛋白間相互作用の解析とその生理的意義

受容体の細胞内局在、およびその制御機構の解明のため、α1アドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきている。現在までに、受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にし、新規の相互作用分子の同定を行った。新たな手法としてのpH感受性を持つGFP変異型プローブを融合した受容体コンストラクトを用いることで、受容体近傍の微小環境を可視化し、受容体刺激に伴う、pH変化と受容体分子の細胞内への移行現象を同時測定することにも成功し、発表した(Awaji et al. BBRC 2001)。この手法を更に発展させ、受容体に対する相互作用分子による局在変化現象を解析中である。受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、アドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。本年度は、アドレナリン受容体間、および他の7回膜貫通型受容体として、バソプレッシンVlA受容体との間の相互作用について解析を行った。エピトープタグと、GFPを付けた受容体コンストラクトを用い、相互作用を解析したところ、受容体サブタイプによって相互作用を起こす組み合わせに差のあることを見いだした。検出された、受容体ヘテロ二量体もしくは、多量体を詳細に解析したところ、この相互作用は、アゴニスト刺激、アンタゴニスト刺激により変化は認められなかった。また、GFPに替えてpH感受性を持つGFP変異型プローブを融合した受容体コンストラクトを用いることで、受容体近傍の微小環境を可視化することにも成功した。
心筋のG蛋白共役オーファン・レセプターのリガンドの同定と心機能調節療法の開発

1.(1)心筋において豊富に発現していることがすでに報告されているorphan G protein-coupled receptor(GPCR)のうちそのcDNAを入手可能であった7種および新たに心筋での発現を確認した6種について主として実験を行なった。ウシの心筋抽出液からC18カラムでペプチド成分を抽出し、逆相クロマトグラフィーにて分画したサンプルをそれぞれのGPCRを発現させたHEK293T細胞と反応させFLIPRassayにて活性を測定した(第1回スクリーニング)。その結果、1つのGPCRにおいて特定の分画に有意の反応が認められ、その有意の反応は合計5回再現性が確認されたことから、特異的なリガンドがその分画に含まれていると判断した。第1回スクリーニングで反応の見られた分画をさらに逆相クロマトグラフィーにて分画して第2回スクリーニングを行なったところ、一部の分画で反応が認められた。現在さらに再現性を検証中である。(2)FLIPRassayより高感度と考えられるメラノフォアーを用いた活性測定法にて逆相クロマトグラフィーにて分画したサンプルとこれらのGPCRとの反応を同様に検討したところ、FLIPR assayにて再現性が確認された1種類でのみ有意と思われる反応が見られたが再現性は確認できなかった。以上より、先に特異的な反応が認められたGPCRにしぼってFLIPRassayにてさらに精製を進めている。2.脳室上衣細胞無血清長期培養上清中に心筋細胞と下垂体細胞に特異的に作用して細胞内Ca濃度を上昇させる生理活性物質があることが分かったため、1.と同様の系で精製を開始した。脳室上衣細胞培養上清中のペプチド成分を逆相クロマトグラフィーにて分画したサンプルをラット培養心筋細胞、ウズラ心筋cell lineに負荷したところ、有意の活性を持つ分画が認められた。(A)心筋において豊富に発現していることがすでに報告されているオーファンGPCRのうちそのcDNAを入手可能であった7種について主として実験をおこなった。(B)ウシの心筋抽出液を逆相クロマトグラフィーにて分画したサンプル(第1回分画)をそれぞれのGPCRを発現させたHEK293T細胞と反応させFLIPRにて活性を測定したところ(第1回スクリーニング)、複数のGPCRにおいて13分画に反応が認められた。そこで、新たに作成した(異なるロットの)ウシの心筋抽出液を用いて活性を測定したところ、1種類のGPCRにおいてのみ再現性が確認された。さらに、メラノフォアーを用いた活性測定法にて第1回分画とこれらのGPCRとの反応を同様に検討したところ、FLIPRにて再現性が確認された1種類を含むすべてのGPCRで反応の再現性は確認されなかった。第1回分画の中で、1種類のGPCRとの反応が確認された分画をさらに陽イオン交換クロマトグラフィーにて分画したサンプル(第2回分画[陽イオン交換])を用いて、そのGPCRとの反応性をFLIPRにて測定したところ、すべての分画で活性が見られなかった。そこで、活性のあった第1回分画を逆相クロマトグラフィーにて分画したサンプル(第2回分画[逆相])を用いて、そのGPCRとの反応性をFLIPRにて測定したところ(第2回スクリーニング)、弱いながら特定の分画で反応が認められた。今後、心筋抽出液を大量に作成して(第2回スクリーニング)での活性の再現性を確認した上で、逆相またはイオン交換による分画の適否を検討しつつ(第3回以降のスクリーニング)を進めていくこととした。