hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Poly(I:C)投与動物モデルを利用したLINE-1転移機構の解析

poly(I:C)マウスモデルを用い、仔マウス神経前駆細胞の解析を行った。RNA-seq解析では、免疫応答や炎症関連遺伝子群などで発現上昇を、神経発達に関連する遺伝子群で発現低下を認めた。iTRAQ法による蛋白質解析からはウイルス活動に対し抑制的に働く因子の発現上昇を認めた。また、マウスで転移活性を有する3種類のLINE-1サブファミリーについて個別にシトシン修飾状態を解析したところ、1種において、メチル化状態の低下とハイドロキシメチル化状態の上昇を同定した。ハイドロキシメチルシトシンは転写活性化に伴う修飾であると考えられ、転移活性化が選択的に生じている可能性が示唆された。本年度は、マウス妊娠個体へのpoly(I:C)投与条件について複数の投与条件の検討を行い、仔マウス(生後一日目)前頭葉部位でのLINE-1ゲノムコピー数が最も増大する条件の検討を行った。その結果、妊娠マウスのステージとして、当初想定していたe9.5の時期より、より後期のステージでの化合物投与の方が安定したLINE-1ゲノムコピー数の増大が認められること、また、LINE-1ゲノムコピー数の増大はpoly(I:C)化合物の投与量に依存して上昇することを確認した。LINE-1ゲノムコピー数の確認実験は、生後一日目マウス前頭葉からゲノムDNAを抽出し、マウス完全長LINE-1配列の5'末端から3'末端まで多様な領域に設定したPCRプライマーを用い、qPCR法にて定量を行った。解析の結果、全てのプライマーセットで、コントロール群と比較し有意にLINE-1ゲノムコピー数の上昇が認められた条件を見出している。次に、仔マウス胎生期の神経前駆細胞でのLINE-1ゲノムコピー数上昇の分子メカニズムを明らかにするため、poly(I:C)化合物投与後の仔マウス脳部位から、神経前駆細胞マーカーを指標とし、神経前駆細胞の単離条件の確立を行った。神経前駆細胞マーカーを用いた磁気ビーズを用いて単離後、セルソーターおよび免疫染色法により、単離神経前駆細胞の品質を確認し、高純度の細胞が回収できる単離条件を確立した。当初計画通り、動物モデル作成の最適な条件の確立ができた。昨年度確立した、レトロトランスポゾンLINE-1の胎仔脳でのコピー数増大が安定して生じる妊娠マウスへのpoly(I:C)化合物投与条件下(e12.5から5日間の低容量のpoly(I:C)連続投与)において、最終投与を行ったe16.5から1日後のe17.5ステージの胎仔から前脳領域を採取し、神経前駆細胞をProminin-1をマーカーとした磁気ビーズ法により単離を行った。単離したProminin-1陽性神経前駆細胞からtotal RNAを抽出し、RNA-Seq解析を行った。解析はpoly(I:C)投与群(N=5)と対照群(N=5)の比較解析で行った。またタンパク質を抽出し、iTRAQ法によるタンパク質発現解析を行った。その結果、RNA-seq解析からは、免疫応答関連遺伝子群や炎症関連遺伝子群、host defense関連遺伝子群などにおいて有意な発現上昇を認めた。一方で、神経発達関連遺伝子群や神経機能に関連する遺伝子群では有意な発現低下を認めた。また、poly(I:C)投与によりスプライシングパターンが変動する神経伝達物質受容体遺伝子を見出した。iTRAQ法によるタンパク質発現解析からはレトロトランスポジションやウイルス活動に対し抑制的に働くエピジェネティック制御に関わる因子の発現上昇と、神経発達に関連する蛋白質の発現減少を認めた。合わせてPoly(I:C)投与により胎仔脳で上昇したレトロトランスポジション活性を抑制する分子機構が働いていると考えられた。神経前駆細胞の単離とオミックス解析が順調に進展している。本年度は、妊娠マウスにpoly(I:C)化合物投与時の、胎仔神経前駆細胞におけるLINE-1転移活性に関連するエピジェネティックな修飾状態の解析を行った。確立した条件下でpoly(I:C)を妊娠マウスに投与後、e18.5のステージにおいて胎仔前頭葉を採取した。前頭葉からprominin-1陽性神経前駆細胞を磁気ビーズ法により単離した。単離した神経前駆細胞群から核ゲノムDNAの抽出を行いエピジェネティクス解析に使用した。ヒトでは転移活性を保有するLINE-1のサブファミリーはLINE-1Hsの1種のみであるが、マウスではMdA, MdGf, MdTfの3種類のサブファミリーが転移活性を保有する。この3種のLINE-1の5'UTRに存在するプロモーター領域について、パイロシークエンサーを用いたシトシン修飾状態を個別に定量する実験系の確立を行った。確立したパイロシークエンシングによるシトシン修飾状態解析法を用い、神経前駆細胞におけるLINE-1プロモーター領域のメチル化状態とハイドロキシメチル化状態の解析を同時に行ったところ、サブファミリー依存的な状態変化が認められた。興味深いことに、3種のうち、特に1種において、シトシンメチル化状態の低下とハイドロキシメチル化状態の上昇を同定した。一般的にハイドロキシメチルシトシンは転写活性化に伴う修飾であると考えられることから、この1種の転移活性の活性化がエピゲノム変化を介して選択的に生じている可能性が示唆された。

iTRAQ法による蛋白質解析からはウイルス活動に対し抑制的に働く因子の発現上昇を認めた。また、マウスで転移活性を有する3種類のLINE-1サブファミリーについて個別にシトシン修飾状態を解析したところ、1種において、メチル化状態の低下とハイドロキシメチル化状態の上昇を同定した。ハイドロキシメチルシトシンは転写活性化に伴う修飾であると考えられ、転移活性化が選択的に生じている可能性が示唆された。次年度以降で、本条件下で作成・調整した神経前駆細胞での分子生物学的・細胞生物学的解析を行っていく。最終年度は、神経前駆細胞のLINE-1のエピジェネティックな修飾状態に焦点をあてた解析を行っていく方針である。29年度が最終年度であるため、記入しない。精神医学29年度が最終年度であるため、記入しない。
正常・病的骨格筋細胞膜と細胞外基質の各種抗体標識による三次元超微形態研究

骨格筋細胞膜と細胞外基質の抗体標識による三次元超微形態研究を開始するにあたり、抗体をα、βジストログリカン、及びラミニンは種々のサブユニットがあるが骨格筋に特異的なサブユニットMであるメロシンに絞って研究を実施した。α、βジストログリカンはNature 355: 696-702,1992にアミノ酸の全シークエンスが発表されているので、ここからαジストログリカンはアミノ酸No.30-44,102-115,300-316の3つ、βジストログリカンはC端アミノ酸15残基のペプチドを合成し、羊とウサギに免役して抗体を得た。いずれも抗体価は充分に上昇したが、イムノブロットによる検討ではβジストログリカンは良好な結果を得たもののαジストログリカンでは複数のバンドがみられ、アフィニティー精製等をしないと使用困難と判明した。従って本研究ではβジストログリカンの免疫透過電顕の研究をし、骨格筋細胞膜の内側にそれに随伴して局在が認められた。次にラミニンのサブユニットMすなわちメロシンは単クローン抗体が市販されているが、これはヒト骨格筋に特異的でマウス骨格筋のメロシンは認識しない。このメロシンを使用した金粒子標識免疫電顕では骨格筋線維の基底膜の最内層で筋細胞膜より約3050nmの距離の部位に金粒子の局在があることが判明した。骨格筋のフリーズエッチレプリカの電顕観察では筋細胞膜の表面に柱状に突出した太さ約510nmの細胞骨格、これと連なる網状構造物とその網状物に混在し太さ約30nmのコラーゲンと考えられる構造物などが認められた。メロシン抗体標識によるフリーズエッチレプリカの観察ではメロシンを標識する金粒子が、筋細胞膜表面に細胞膜から突出した柱状細胞骨格と連続する網状構造物とに局在しているのが認められた。本研究ではαジストログリカンの局在を知ることを最優先したため、抗体の作製とその性状の評価に意外な時間を要した。幸いメロシンはαジストログリカンのレセプターであることが判明したので(Sunada Y, et al. J Biol Chem 269: 13729-13732,1994)、このメロシンの細胞膜側はαジストログリカンである可能性が大きく、有意義な結果が得られている。Ibraghimov-Beskrovnayaらにより発表された156kDa及び43kDaのdystrophin associated glycoproteinないしジストログリカンのcDNAより筋細胞内外に位置すると考えられるそれぞれペプチド12(Pro-Lys-Asn-Met-Thr-Pro-Tyr-Arg-Ser-Pro-Pro-Pro-Tyr-Val-Pro)及び11(His-Trp-Pro-Ser-Glu-Pro-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-Asp-Trp-Glu-Asn)を合成し、ウサギと羊にて抗体を作製した。

しかしイムノブロットによる検討ではウサギ抗体はペプチド11とペプチド12に対するものはともに使用困難であり、羊のペプチド12に対する抗体は正常筋の43kDaの蛋白を認識したが、羊のペプチド11に対する抗体はやはり156kDaの蛋白を認識せず使用不能であることがわかった。従って現在156kDaのジストログリカンの抗原としてのペプチド2個を別の部位から選定し合成を終了した段階である。このペプチド抗体をニュージーランドにて羊にて間もなく作製開始しようとしている所である。尚、ペプチド12の羊抗体でヒトやマウスの正常筋細胞を染色すると筋細胞の周辺にその反応がみられた。また、ラミニンに関しての筋組織での検討は光顕レベルで開始している。現在研究の進行状況は上記の通りであるが、良い抗体を得るのに時間がかかり、思う様に研究が進行しない悩みがある。良好な抗体を得次第、次の段階へ進みたい。骨格筋細胞膜と細胞外基質の抗体標識による三次元超微形態研究を開始するにあたり、抗体をα、βジストログリカン、及びラミニンは種々のサブユニットがあるが骨格筋に特異的なサブユニットMであるメロシンに絞って研究を実施した。α、βジストログリカンはNature 355:696-702,1992にアミノ酸の全シークエンスが発表されているので、ここからαジストログリカンはアミノ酸No.30-44,102-115,300-316の3つ、βジストログリカンはC端アミノ酸15残基のペプチドを合成し、羊とウサギに免疫して抗体を得た。いずれも抗体価は充分に上昇したが、イムノブロットによる検討ではβジストログリカンは良好な結果を得たもののαジストログリカンでは複数のバンドがみられ、アフィニティー精製等をしないと使用困難と判明した。従って本研究ではβジストログリカンの免疫透過電顕の研究をし、骨格筋細胞膜の内側にそれに随伴して局在が認められた。次にラミニンのサブユニットMすなわちメロシンは単クローン抗体が市販されているが、これはヒト骨格筋に特異的でマウス骨格筋のメロシンは認識しない。このメロシンを使用した金粒子標識免疫電顕では骨格筋線維の基底膜の最内層で筋細胞膜より約3050nmの距離の部位に金粒子の局在があることが判明した。骨格筋のフリーズエッチレプリカの電顕観察では筋細胞膜の表面に柱状に突出した太さ約510nmの細胞骨格、これと連なる網状構造物とその網状物に混在した太さ約30nmのコラーゲンと考えられる構造物などが認められた。メロシン抗体標識によるフリーズエッチレプリカの観察ではメロシンを標識する金粒子が、筋細胞膜表面に細胞膜から突出した柱状細胞骨格と連続する網状構造物とに局在しているのが認められた。本研究ではαジストログリカンの局在を知ることを最優先したため、抗体の作製とその性状の評価に意外な時間を要した。幸いメロシンはαジストログリカンのレセプターであることが判明したので(Sunada Y,et al.J Biol Chem 269:13729-13732,1994)、このメロシンの細胞膜側はαジストログリカンである可能性が大きく、有意義な結果が得られている。
明治以降昭和20年までの台湾語会話書および台湾における日本語教科書の研究

本研究のテーマは、「明治以降昭和20年までの台湾語会話書および台湾における日本語教科書の研究」である。平成30年度は、交付申請書に記載したとおり、資料収集、資料分析に必要な環境を整えた。特に携帯可能な撮影機器は、図書館の許可を得て資料を撮影したり、コンピュータの検索手順を撮影したりした際に不可欠であった。初年度であるため、さまざまな可能性を探るため、台湾の古書店へも足を運んだ。このような中で、「国家図書館」「国立台湾図書館」「国立台湾大学図書館」といった図書館に赴くことがまず必要であることが分かってきた。特に「国立台湾図書館」に赴き、図書館の許可を得て収集・複写した資料の中に極めて貴重なものが存在していたため、調査を終え帰国した後、日本で資料を詳細に確認した。これらの資料についてまとめたのが【園田博文(2019)「昭和初期台湾における日本語教育月刊誌『薫風』『黎明』『国光』についてー青年劇と地震の記事を中心にー」『近代語研究』21、近代語学会編(武蔵野書院刊)、9月刊行(掲載確定、印刷中)】である。昭和初期(昭和7年15年)の台湾における日本語教育(あるいは国語教育)を扱った先行研究として、『国光』については、1編論文が見られるが、『薫風』、『黎明』については、管見の限り皆無である。園田博文(2019)では、貴重な『薫風』『黎明』『国光』という3種の資料を紹介するとともに、青年劇と地震の記事を取り上げ、月刊誌による日本語教育のあり方に迫った。以上が平成30年度に行った研究とその成果の概要である。「研究実績の概要」において、【園田博文(2019)「昭和初期台湾における日本語教育月刊誌『薫風』『黎明』『国光』についてー青年劇と地震の記事を中心にー」『近代語研究』21、近代語学会編(武蔵野書院刊)、9月刊行(掲載確定、印刷中)】を執筆したことを述べた。現在は、これに続く論文を執筆中で、5月末投稿締切の『日本近代語論叢』(査読付き)に投稿する予定で、執筆の最終段階を迎えたところである。「国家図書館」「国立台湾図書館」「国立台湾大学図書館」に加え、台中にある図書館へも赴く計画を立て、近々出張する。以上、予定通り調査を行い、掲載が確定した論文1編と投稿間近の論文1編を執筆しているので、「おおむね順調に進展している。」と判断した。令和元年度(2019年度)も、引き続き台湾の資料調査を続ける。特に「国家図書館」「国立台湾図書館」「国立台湾大学図書館」、台中の図書館等に赴き、資料の収集と分析に努める。並行して、台湾語会話書リストの作成、台湾における日本語教科書リストの作成を行う。可能であれば、本研究の目的の一部にもなっている「研究成果の公開」を急ぎたい。具体的には、台湾語会話書や台湾における日本語教科書のリスト、および、資料を分析した結果について、日本語教育や日本語学の研究者、隣接分野の研究者、さらには、一般市民に向けて「図書」(印税なし)の形で公開することを模索したい。

以上、予定通り調査を行い、掲載が確定した論文1編と投稿間近の論文1編を執筆しているので、「おおむね順調に進展している。」と判断した。令和元年度(2019年度)も、引き続き台湾の資料調査を続ける。特に「国家図書館」「国立台湾図書館」「国立台湾大学図書館」、台中の図書館等に赴き、資料の収集と分析に努める。並行して、台湾語会話書リストの作成、台湾における日本語教科書リストの作成を行う。可能であれば、本研究の目的の一部にもなっている「研究成果の公開」を急ぎたい。具体的には、台湾語会話書や台湾における日本語教科書のリスト、および、資料を分析した結果について、日本語教育や日本語学の研究者、隣接分野の研究者、さらには、一般市民に向けて「図書」(印税なし)の形で公開することを模索したい。調査の日程等を圧縮して行ったため、当初の計画よりも旅費が少なくなっている。また、人件費・謝金の部分も自身で行うことが多くなったため発生していない。翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画については、以下の通りである。まず、調査に必要な旅費はなるべく使うようにして、予定通りの調査を実施する。その上で、使用可能額がある場合は、「その他」として、図書の出版(印税等はなし)等を通して、研究成果の公開を模索する。
知の交流により思考の発達と知識獲得を促す協調学習環境システムの開発と授業実践

最近接発達領域論に基づき子どもの学習活動について考察して思考の発達と知識獲得を促す知の交流のあり方を明らかにした。また,正統的周辺参加論に基づき学習と発達のダイナミズムを考察し,認識の基礎や追求を扱う教科学習および認識の総合を扱う総合的学習の単元レベルの授業設計について検討した。さらに,知の交流を行うためのコミュニケーション用サーバ機と学習情報蓄積のための学習情報用DBサーバ機から構成される協調学習環境システムの開発を行った。学習者がタグを付加、削除する活動と、クライアントマシンが学習情報を結合するなどの処理を行うメカニズムはHTMLとJavaScriptを用いた。DBサーバ機側にはFileMakerとWebCompanionを用いた。また,比較的柔軟な枠組をもつXMLを採用し、学習情報や学習履歴情報を表現する枠組や、SVGを利用した相互作用の可視化ツールについて検討と試作を行なった。相互作用の中での言語運用について振り返りを支援するように、話し合いで利用したメタ情報を抽出し、構造化表示にするようなツールについても考察を行なった。これらの成果に基づいて授業計画を行った。具体的には,小学校の総合的な学習の時間,国語と算数,中学校の技術・家庭科と社会科地理について単元開発,協調学習環境システム開発を行った。それぞれの授業については,教科内容を子どもの認知に基づいたスキーマ構造によって教材化してワークシートと学習環境システムのインタフェースの開発などを行い,相互作用機能としてつなぎ言葉とメタ情報を組み込んでシステムを実装して授業実践を行った。また,2年間の本研究期間中に行った授業実践について,授業実践記録およびこれに基づく授業分析などをデータベース化した。最近接発達領域論に基づき子どもの学習活動について考察し,思考の発達と知識獲得を促す知の交流のありかたを明らかにした。また,正統的周辺参加論に基づき学習と発達のダイナミズムを考察し,認識の基礎や追及を扱う教科学習および認識の総合を扱う総合的学習の単元レベルの授業設計について検討した。これに基づき総合的な学習の時間と技術・家庭科の授業を設計した。子どもの学習活動によって得られたさまざまな学習情報(子どもが学習活動によって集めた観察記録を収めたワークシート,実験実習や活動記録ノート,メモなど)を最近接発達領域の場における交流に活用して,子どもが知の共有と新しい意味づけを行う支援をするために,学習情報の中の意味,考え方,解釈などを明示するタグを設計し,授業実践を行った。これにより,タグの有効性が確かめられた。またタグを分析することで学習者の学習状況が把握できることが明らかになった。総合的な学習の時間や教科学習の授業において,知の交流を行うためのコミュニケーション用サーバ機と学習情報蓄積のための学習情報用DBサーバ機から構成される協調学習環境システムの構築を行った。学習者がタグを付加,削除する活動と,クライアントマシンが学習情報を結合などの処理を行うメカニズムはHTMLとJavaScriptを用いた。また,DBサーバ機側にはFileMakerとWebCompanionを用いた。前年度にひき続き,思考の発達と知識獲得を促す協調学習環境システムの構築と学習環境システムの実働試験および改善を行った。すなわち,子どもの相互作用について,学習情報(教材)を用いた相互作用と他者の発信情報に基づく相互作用の2面から捉えた。子どもが扱いやすい学習情報の構造を開発するために,連接関係に基づくつなぎ言葉の開発を行った。また,比較的柔軟な枠組をもつXMLを採用し,学習情報や学習履歴情報を表現する枠組や,SVGを利用した相互作用の可視化ツールについて検討と試作を行なった。さらに,相互作用の中での言語運用について振り返りを支援するように,話し合いで利用したメタ情報を抽出し,構造化表示にするようなツールについても考察を行なった。これらの成果と昨年の成果に基づいて授業計画を行った。具体的には,小学校の国語と算数,中学校の社会科地理について単元開発,協調学習環境システム開発を行い,授業案を作成した。小学校国語は静岡県の小学校で,算数は福岡県の小学校,社会科地理については和歌山県の中学校で実践を行った。

それぞれの授業については,教科内容を子どもの認知に基づいたスキーマ構造によって教材化してワークシートの開発と学習環境システムのインタフェースの開発を行い,相互作用機能としてはつなぎ言葉とメタ情報等を組み込んでシステムを実装して授業実践を行った。学校の教室には教室用サーバ機を持ち込み,大学のサーバ機と連携して協調学習環境システムとして稼働させた。また,2年間の本研究期間中に行った授業実践について,授業実践記録およびこれに基づく授業分析などを学校現場の教師に役立つよう資料として整理した。
漢字圏の描線動作にみられる共通特性の解明：日中台の児童・大学生の比較による検討

本研究では日本、中国、台湾という漢字圏にある地域の児童・大学生を対象とし、円や三角形などの幾何学図形の一筆描き課題を実施して描き始めの位置や描く方向にみられる特徴を検討することを目的とした。2018年度では台湾の児童を対象に図形の一筆描き課題を実施し、データの収集をおこなった。調査に協力してくれたのは、台湾の小学1年生14名、小学2年生26名であった。このうち、分析の対象としたのは右利きの児童36名(小学1年生10名、小学2年生26名)であった。円の描画課題では、描き始めの位置を時計の文字盤をもとにして12の点に分類した、描く方向は時計回りと反時計回りに分類した。三角形の描画課題では、描き始めの位置を三角形の各頂点に分類し、描く方向を時計回りと反時計回りに分類した。これらの反応の頻度を学年ごとに集計し、その発達的変化を検討した。その結果、小学1年生では円の描き始めの位置には偏りはみられず、また描く方向にも特定の傾向はみられなかった。他方、小学2年生では円の描き始めの位置を1112時にとる反応が多く(17名)、さらにその位置(1112時)から描き始めると、半数は円を時計回りに描き、残りの半数は円を反時計回り描くことが明らかになった。この結果は、台湾の大学生を対象とした調査結果と一致していた。台湾の小学2年生の円の描線動作には、成人と同様の特徴がみられることが示された。つぎに、三角形の描画課題では小学1・2年生とも、上の頂点から反時計回りに描く傾向がみられた。こうした描線動作の特徴は、台湾の大学生の三角形の描画でも多くみられるものであった。以上の結果をふまえ、今後、日本、中国、台湾での調査で収集したデータを分析し、漢字圏に特有の描線動作の特徴について研究成果をまとめていく予定である。2016年度では中国、台湾の大学生を対象に調査をおこない、日本人大学生のデータと比較する計画であった。これまでのところ、中国人大学生については2016年9月に調査を実施し、32名のデータを得ている。また、台湾人大学生については2017年3月に調査を実施し、34名のデータを得ている。調査に協力してくれた中国人大学生32名は、全て右利きであった。これら32名のデータをもとに、円および三角形の描線動作について分析をおこなった。まず、円描画課題では描き始めの位置を時計の文字盤をもとに112に分類し、描く方向は時計回りと反時計回りに2分類した。その結果、中国人大学生では、円を左下(時計の文字盤の8ー9)から時計回りで描く反応が多く、また、左上(時計の文字盤の10ー12)から反時計回りに描く反応も多かった。つぎに、三角形描画課題では描き始めの位置を三角形の各頂点に分類し、描く方向は円描画と同じように、時計回りと反時計回りに2分類した。その結果、中国人大学生の8割が三角形の上の頂点から反時計回りに描くことが明らかになった。これらの特徴はTaguchi(2010)において示された日本人大学生の描画特徴と非常に類似していた。以上のように、中国人大学生のデータについては一定の分析結果を得ている。いっぽう、台湾人大学生のデータについては、未だ分析が終了していないため、今後、中国人大学生のデータと同じように分析していく必要がある。、2016年度では中国および台湾の大学生のデータを収集し、日本の大学生のデータと比較することを目的としていた。上述したように、これまでの研究で中国人大学生32名、台湾人大学生34名からデータを得ており、当初計画していた被験者数を満たしている。これらのデータのうち中国人大学生のデータの一部については分析を終えており、日本人大学生のデータと比較検討をおこなった。その結果については、2017年3月におこなわれた日本発達心理学会第28回大会にて報告している。台湾人大学生のデータについては分析途中であるため、日本人大学生との比較はまだ実施できていない。今後、台湾人大学生のデータの分析を進めていき、日本人大学生の描線動作との共通点、相違点を明らかにしていく必要がある。以上のように、データの分析に若干の遅れはあるが、おおむね当初の研究計画通りに研究は実施できているとおもわれる。本研究では漢字圏(とくに日本、中国、台湾)の児童・大学生を対象として円や三角形などの幾何学図形の一筆描き課題を実施し、描き始めの位置や描く方向にみられる特徴を検討することを目的とした。2017年度における当初の計画では、台湾の大学生の実験データを分析すること、つぎに各国の児童を対象として図形の一筆描き課題を実施し、データ収集をおこなうことを予定した。台湾の大学生のデータ(右利き32名のデータ)については、日本および中国の大学生のデータと合わせて分析をおこなった。円描画課題では、描き始めの位置を時計の文字盤をもとにして12の点に分類し、描く方向は時計回りと反時計回りに分類した。その結果、台湾の大学生では円の左下(67時)から時計回りに描く反応がやや多いこと、また描き始めの位置を1112時にとる反応が多く、さらにその位置(1112時)から描き始めると時計回りに描く反応と反時計回り描く反応とに二分されることが示された。このように、台湾の大学生の円の描き方は、日本や中国の大学生の円の描き方に類似していた。

つぎに、三角形描画課題では、描き始めの位置を三角形の各頂点に分類し、描く方向を時計回りと反時計回りに分類した。その結果、台湾の大学生では大半が三角形の上の頂点から反時計回りに描いており、こうした描線動作の特徴は、日本や中国の大学生にも多くみられるものであった。以上の結果から日本および中国語圏の大学生では、図形の一筆描きにおける描線動作に共通の特徴がみられることが示された。つぎに児童のデータについては、台湾での調査により小学2年生10名からデータを収集している。また、日本の児童についてはこれまでに一定数のデータを収集している。ただし、これらのデータの分析はまだ終了していない。今後、中国語圏の児童のデータをさらに収集し、分析を進める必要がある。台湾の大学生のデータ(右利きの被験者32名を対象)については、当初の計画どおりに、分析をおこない、日本および中国の大学生と比較して結果をまとめることができた。その結果は、2017年9月の日本心理学会81回大会および同年10月の日本教育心理学会59回大会にて報告された。大学生のデータ収集、分析、結果のまとめなどは計画どおりに進んだといえる。いっぽう、児童を対象とした描画データの収集は、日本および台湾において実施してきた。これまでのところ、日本の児童の描画データは一定数を収集しており、また、2017年9月には台北市近郊で台湾の児童を対象とした調査をおこない、10名のデータを得ることができた。しかし、2018年3月に実施予定であった台湾での2回目の調査が、台湾で発生した地震などにより延期となってしまった。そのため、台湾の児童を対象とした描画データの収集が遅れることとなった。今後、中国語圏の児童を対象としたデータの収集に関し、計画の見直しが必要である。本研究では日本、中国、台湾という漢字圏にある地域の児童・大学生を対象とし、円や三角形などの幾何学図形の一筆描き課題を実施して描き始めの位置や描く方向にみられる特徴を検討することを目的とした。2018年度では台湾の児童を対象に図形の一筆描き課題を実施し、データの収集をおこなった。調査に協力してくれたのは、台湾の小学1年生14名、小学2年生26名であった。このうち、分析の対象としたのは右利きの児童36名(小学1年生10名、小学2年生26名)であった。円の描画課題では、描き始めの位置を時計の文字盤をもとにして12の点に分類した、描く方向は時計回りと反時計回りに分類した。三角形の描画課題では、描き始めの位置を三角形の各頂点に分類し、描く方向を時計回りと反時計回りに分類した。これらの反応の頻度を学年ごとに集計し、その発達的変化を検討した。その結果、小学1年生では円の描き始めの位置には偏りはみられず、また描く方向にも特定の傾向はみられなかった。他方、小学2年生では円の描き始めの位置を1112時にとる反応が多く(17名)、さらにその位置(1112時)から描き始めると、半数は円を時計回りに描き、残りの半数は円を反時計回り描くことが明らかになった。この結果は、台湾の大学生を対象とした調査結果と一致していた。台湾の小学2年生の円の描線動作には、成人と同様の特徴がみられることが示された。つぎに、三角形の描画課題では小学1・2年生とも、上の頂点から反時計回りに描く傾向がみられた。こうした描線動作の特徴は、台湾の大学生の三角形の描画でも多くみられるものであった。
歯周病原性バイオフィルム形成因子の分子生物学的解析と機能性タンパク質による抑制

歯周病は口腔の主要な感染症であり、その原因となっているのは口腔内バイオフィルムであるデンタル・プラーク中に存在する細菌である。本研究は、歯周病原性バイオフィルムの形成に関わる因子について解析するとともに、その形成を抑制あるいはバイオフィルム細菌に対して抗菌性を発揮するような機能性タンパク質について検索した。培養細胞やマウスを用いて、シスタチンやガレクチンなどの機能性タンパク質のバイオフィルム形成抑制作用や内毒素活性抑制作用などを解明した。歯周病は、口腔内バイオフィルムであるデンタル・プラーク中に存在する細菌が原因となる感染症である。本研究では、バイオフィルム形成に関わる因子について解析し、さらには歯周病原性因子との関わりについて解析を行っていく。本年度は、バイオフィルムモデル、培養細胞やマウスを用いて、機能性タンパク質のバイオフィルム形成抑制作用や抗菌性および宿主免疫応答における役割を検討した。日本産ウナギ上皮から精製したガレクチンを用いて、歯周病原細菌バイオフィルム形成および内毒素活性に対する阻害効果を検討した,Aggregatibacter actinomycetemcomitans全供試菌株において、ウナギガレクチンAJL-1は、濃度依存的に有意にバイオフィノレム形成を抑制した(ρ<0.05)。しかし、その他の供試菌に対しては有意な抑制はみられなかった。バイオフィルム形成抑制効果のみられたA.actinomycetmcomitansのLPSに対する阻害効果を調べた結果、AJL-1はLPS刺激によるヒト正常臍帯静脈血管内皮細胞からのIL-6(ρ<0.01)およびIL-8(ρ<0.05)産生誘導を有意に抑制することがわかった。ガレクチンがA.actinomycetemcomitansLPSの炎症性サイトカイン誘導活性を阻害するか否かマウス脾細胞およびヒト培養細胞を用いて検討した.ガレクチン-3は、1ヶ月齢のマウス脾細胞では、LPSのサイトカイン誘導活性を抑制したが、7ヶ月齢マウスの場合は、抑制効果がみられず、加齢に伴いその応答が変化した。またヒト正常臍帯静脈血管内皮細胞を用いた実験から、ガレクチン-3はA.actinomycetemcomitansLPSのサイトカイン誘導活性を抑制するが、ガレクチン-4は、その誘導活性を助長し、炎症の増悪因子となることが示唆された。ガレクチンは、多彩な機能をもつレクチンであり、生体防御にもかかわっている。本年度は、バイオフィルムを形成する歯周病原細菌AggregatibacteractinomycetemcomitansLPSのヒト培養細胞からの炎症性サイトカイン誘導能に対するガレクチン-3の抑制効果について検討した。また生活習慣病の病因としてのアルコールおよびニコチンのガレクチン-3産生への影響も検討した。ヒト正常臍帯静脈血管内皮細胞あるいはヒト正常大動脈内皮細胞の培養液にA.actinomycetemcomitansY4株から精製したLPS(10ng/ml)単独あるいはLPSとヒトガレクチン-3(10μg/ml)を同時に加え細胞を培養し、17時間後の培養上清中のIL-6およびIL-8量をELISAキットで測定した。また培養液にエタノール(0.01-0.1%)あるいはニコチン(1.25-125μg/well)を加え、産生されるガレクチン-3量をELISAキットで測定した。さらにエタノール添加細胞におけるLPS刺激によるIL-6産生について検討した。A.actinomycetemcomitansLPS刺激によるサイトカイン産生誘導はガレクチン-3によって抑制された。エタノールは濃度依存的にガレクチン-3産生量を増加させるとともに、LPSによるサイトカイン産生誘導を抑制した。エタノールによるサイトカイン産生の抑制は、抗-ヒトガレクチン-3抗体を加えることによってみられなくなった。ニコチンは、用いた細胞からのガレクチン-3産生には影響しなかった。ガレクチン-3は、A.actinomycetemcomitans LPSに結合し、その炎症性サイトカイン誘導活性を抑制するものと思われる。またエタノールは、内皮細胞からのガレクチン-3産生を促進し、そのためLPSの炎症性サイトカイン誘導が抑制されることが示唆された。シスタチンは、動物の体液などに存在するシステインプロテアーゼインヒビターであり、骨吸収や組織の炎症などを調節したり、癌細胞の浸潤と転移を抑制したりすることが知られている。本研究では、唾液に含まれるシスタチンSAの歯周病原細菌Porphyromonas gingivalisおよびAggregatibacter actinomycetemcomitans増殖に対する抑制効果について検討した。P.gingivalis5株およびA.actinomycetemcomitans5株を、それぞれヘミンおよびメナジオンあるいはyeast extractを含むTrypticase soybrothを用いて24時間嫌気条件下で前培養した。発育菌体を5等分し、それぞれに新しい培地を加えた。そのうちの4本にシスタチンSA1あるいはシスタチンSA2を1.0μg/ml、10μg/mlずつ加え、1本はコントロールとした。

その後嫌気培養を続け、増殖の状態をATP活性によって確認し、24時間後の増殖菌量を660nmの吸光度測定により調べた。同様の実験を5回くり返し、その平均で評価した。シスタチンSA1およびSA2とも、1.0μg/mlでは供試菌の増殖に対して顕著な影響を与えなかった。しかし10μg/mlでは、供試したA.actinomycetemcomitans全菌株に対して、またP.gingivalis3株に対して増殖抑制効果を示した。本抑制効果は、シスタチンSA1の方がSA2よりも強かった。供試した両シスタチンともP.gingivalisおよびA.actinomycetemcomitans増殖に対して抑制効果を示した。以上の結果から、唾液中に存在する機能性タンパク質シスタチンは歯周病原細菌に対して増殖直制を示し防御的にはたらくことが明らかになった。
循環器病における蛋白質S-グルタチオン化の動態及び役割の解明

循環器における障害細胞から分泌されるエクソソームやマイクロベシクルといった細胞外小胞は細胞質を内包するため血清そのものよりも鋭敏に細胞質内でのS-グルタチオン化の変化を検出できる可能性がある。本研究では患者の血清から分離した細胞外小胞を解析し、循環器病におけるS-グルタチオン化蛋白の動態および役割を解明する。具体的には循環器病患者血清から分離した細胞外小胞を用いて1S-グルタチオン化蛋白の定量、2S-グルタチオン化蛋白の同定、3S-グルタチオン化蛋白の機能解析および循環器病の病態との関連性の検討、の3項目につき研究を遂行した。前年度の研究にて急性心筋梗塞および拡張型心筋症患者ではエクソソーム中の蛋白質S-グルタチオン化のレベルが増加していることが確認できた。今年度はこのサンプルから新規のS-グルタチオン化蛋白を検出するべく研究を推進した。まずS-グルタチオン化蛋白を検出するためHis Myc taggedGST融合蛋白を合成した。融合蛋白はS-グルタチオン化蛋白に結合し、Western blottingではS-グルタチオン化蛋白の同定が出来ることを確認した。またサンプル中のグルタチオンが融合蛋白のS-グルタチオン化蛋白への結合を阻害することを確認した。しかしながらエクソソームからS-グルタチオン化蛋白を質量解析に必要な分量を免疫沈降することはできなかった。抽出したエクソソームをライセートし電気泳動し銀染色を施行すると心筋梗塞患者でコントロールでは観察できないバンドが観察できたためこれらに対し質量解析を施行した。既知のS-グルタチオン化蛋白は認めれられなかった。現在これらの蛋白質がS-グルタチオン化される蛋白であるか培養細胞を用いて検討中である。障害細胞から分泌されるエクソソームやマイクロベシクルといった細胞外小胞は細胞質を内包するため血清そのものよりも鋭敏に細胞質内でのS-グルタチオン化の変化を検出できる可能性がある。具体的には循環器病患者血清から分離した細胞外小胞を用いて1S-グルタチオン化蛋白の定量、2S-グルタチオン化蛋白の同定、3S-グルタチオン化蛋白の機能解析および循環器病の病態との関連性の検討、の3項目につき研究を遂行する予定である。平成29年度は1循環器病患者血清中の細胞外小胞に含有されるS-グルタチオン化蛋白の定量および2循環器病患者血清中の細胞外小胞に含有されるS-グルタチオン化蛋白の同定を施行する予定であった。現段階にておおよそ100例の急性心筋梗塞および心不全の患者血清からエクソソームを抽出しており、これらについて解析を進めている。研究成果として、急性心筋梗塞の患者からえられたエクソソームでは蛋白質のS-グルタチオン化が亢進していることが判明した。心不全患者では有意差はないものの、拡張型心筋症患者の心不全の増悪においてはエクソソーム中のS-グルタチオン化が亢進している傾向があることを確認している。エクソソーム中のS-グルタチオン化蛋白の同定はエクソソーム中のS-グルタチオン化蛋白が微量であること、蛋白質のプルダウンの効率が悪いことより難航している。現在新規のプルダウン法を確立すべく実験を遂行している。研究計画書に記載したGSH抗体でのプルダウンは効率が悪く、GSTを用いた新規のプルダウン法についてはプルダウンが出来ないことが判明した。現在サンプル中のGSHを除去するとGSH抗体を用いた方法でプルダウン効率が改善することを確認できたため、実験系を確立すべく研究を進めている。

現在これらの蛋白質がS-グルタチオン化される蛋白であるか培養細胞を用いて検討中である。心筋梗塞患者ではエクソソーム中の蛋白質S-グルタチオン化が増加することが確認できている。また拡張型心筋症の心不全でもエクソソーム中の蛋白質S-グルタチオン化は増加することが判明した。どの蛋白質がS-グルタチオン化されているかは不明であり、今後はこれを同定すべく研究を遂行する。同定できた場合は研究計画通りに同定した蛋白質の機能を解析する。
生体内における細胞ストレス応答の分子生物学的理解からストレス順応モデルの作製へ

採択から今日に至るまで細胞ストレスの生体イメージング技術開発やIRE1を始めとする小胞体ストレス応答分子の機能解析に重点を置いて研究を進めてきた。前者の研究から私たちは酸化ストレスを生体レベルで解析できるトランスジェニックマウスを作出し、酸化ストレスと脳虚血およびマラリア感染との関連性を明らかにした。後者の研究から私たちはIRE1およびXBP1が樹状細胞機能、B細胞分化、脂質代謝、アセトアミノフェン代謝、胎盤血管新生、腸腫瘍増殖抑制、腸管杯細胞機能、および腸管パネート細胞機能に関与することを見出した。本研究の目的は生体内における細胞ストレス応答を分子生物学的側面から理解し、ストレス順応性モデルを作り出すことである。ここで対象とする細胞ストレスの主たるものは「小胞体ストレス」であり、平成24年度はIRE1とATF4に関する研究を中心に遂行した。このIRE1やATF4に関して次のことが以前から分かっていた。IRE1は小胞体局在型I型膜タンパク質として存在し、小胞体内腔で生じるタンパク質に構造異常を監視している。もし小胞体内で異常構造化したタンパク質が増加すると、IRE1は自身が有するRNase活性を発揮してXBP1mRNAのスプライシングを誘導する。スプライシングされたXBP1mRNAからは転写因子として機能的なXBP1タンパク質が作り出され、小胞体分子シャペロン遺伝子群の発現を上昇させる。一方、ATF4はXBP1とは異なるメカニズムで小胞体ストレス時に活性化される転写因子であり、ストレスに対し保護的に働く遺伝子の活性化を促す。本年度新たに得られた知見は以下の通りである。IRE1は自身のRNase活性を利用して脂質合成遺伝子(mRNA)の分解反応に関わり、血中および肝臓での中性脂肪やコレステロール量をコントロールすることが分かった。また大腸においては同じくRNase活性を利用してムチン産生制御に関わることが分かった。小胞体ストレス感知機構の観点からはIRE1αとは異なるIRE1βの分子メカニズムの一端を明らかにした。さらにIRE1αの阻害剤を発見し、それに抗腫瘍活性があることを見出した。ATF4に関しては遺伝子発現調節を介したエリスロポエチン産生制御能があることを突き止めた。さらには、それによって生み出されたモデルを利用し、関連する疾患の診断や予防、治療をも見据えた応用研究への研究展開を将来的に進める。ここで対象とする細胞ストレスの主たるものは「小胞体ストレス」であり、平成25年度はIRE1に関する研究を中心に遂行した。このIRE1に関して次のことが以前から分かっていた。本年度、新たに得られた知見は以下の通りである。その研究から私たちはIRE1やXBP1が脂質代謝、アセトアミノフェン代謝、胎盤血管新生、腸腫瘍増殖抑制、腸管パネート細胞機能、プラズマ細胞における抗体産生制御、および樹状細胞の抗原提示機能に関与することを見出した。またストレス源の違い(変性タンパク質や飽和脂肪酸)によりIRE1α活性化様式に差があることを明らかにした。さらに私たちは幾つかのHIVプロテアーゼ阻害剤が小胞体ストレスを誘導することを示した。本年度は昨年以前とは異なり生体イメージングおよびタンパク質ジスルフィド結合に重点を置いて研究を進めてきた。その研究から私たちは酸化ストレスをGFP蛍光により可視化できるマウスの開発に成功した。これまでにはルシフェラーゼ発光を利用した酸化ストレス可視化マウスの開発に成功していたが、GFP蛍光によるレポーターマウスの作出により、さらに微細な生体組織領域の酸化ストレスを解析できるようになった。このマウスを用いて脳虚血時に生じる酸化ストレスを詳細に解析し、酸化ストレス応答分子であるNrf2の役割について新たな知見を得ることができた。また脳マラリア時に生じる酸化ストレスの検出に成功した。マラリア感染と酸化ストレスとの関連性は以前から指摘されていたが、生体イメージング技術の導入により感染から酸化ストレス発症、体内での原虫増殖、および症状悪化までの時間経過がパラレルに評価できた。また小胞体ストレスを可視化できるマウス(2004年および2009年発表済み)を利用してアセトアミノフェン(解熱鎮痛薬として広く利用されている)で生じる肝傷害の検出にも成功した。解析の結果から小胞体ストレス時に活性化されるCHOP(アポトーシス誘導性分子)がアセトアミノフェンでも活性化されて肝傷害を引き起こしているようであることを突き止めた。

さらに私たちはERdj5(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの1種)がロドプシンに作用し、その正常なタンパク質フォールディングに関わることを示した。加えて水銀毒性とタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの関係性も明らかにした。どうやらタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対するメチル水銀化が小胞体ストレスを誘導し、細胞内のタンパク質品質管理機構にダメージを与えることでも水銀は毒性を発揮することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度予定していた主な研究には3種類の遺伝子組換えマウスの作製、実験手法の条件検討、および培養細胞実験からの基礎データ収集があるが、いずれも計画通りに遂行できた,特に培養細胞実験から得られたデータからは細胞ストレス感知に関わる新たな知見が得られたため論文発表に至っている。本年度予定していた遺伝子組換えマウスの解析は国内外の共同研究を緊密に行うことによって計画通りに遂行できた。特に疾患に関連した研究から成果が見え始めており、かなりインパクトの高い雑誌への論文発表ができるようになってきた。これまでの研究がおおむね順調に進展しているので、計画通りに研究を遂行するつもりである。特に計画変更や新たな課題は今のところ見当たらない。これまでの研究において経費の使用状況は計画通りであり、繰り越し経費などもない。今後も同様に使用される予定である。
腎移植におけるプロテオーム解析による急性・慢性拒絶反応の低侵襲診断技術の確立

腎移植にとって拒絶反応は最大の障壁であるが、その診断を的確に診断する臨床的マーカーはない。本研究では、まず始めに尿検体取り扱い方法ならびに尿のプロテオーム解析法を確立した。次に、腎移植後に安定した経過をたどる腎移植後患者と腎移植後拒絶反応を示す患者尿を経時的に採取し、腎移植後拒絶反応を起こした患者尿において腎移植後1週間から3カ月経時的の尿を二次元電気泳動法で分析した。その結果、経時的に変動する8種類の蛋白スポットを検出した。さらに、これらの蛋白質スポットを切り出して、ゲル内消化後、LC-MSIMS分析にて同定に成功した。本研究はプロテオミクス解析技術を用いて腎移植後の急性拒絶反応、慢性拒絶反応の早期診断治療効果判定を可能とする尿中マーカー蛋白質候補を探索することを目的とする。平成19年度に北里大学泌尿器科で行われた生体腎移植移植患者に対しインフォームド・コンセントを行い、了承の得られた尿と血液検体を採取し、凍結保存している。検体は全例、術前と術後1週間分採取し、外来通院中に拒絶反応を起こした時点の検体も採取している。ここで採取された尿は、本年度検討し、確立した尿の取り扱いのプロトコールをもとに取り扱い、保存した。本年度はこれらの尿検体(腎不全患者尿)を試料とし、アガロース二次元電気泳動法とペプチド成分の抽出法(K法)への応用と条件検討を行った。この条件をもとに平成20年度は腎移植後拒絶反応を起こした患者血清と尿を対象とした診断マーカー候補タンパク質ならびにペプチドの探索を本格的に開始する。タンパク成分に関しては抗体カラムにより血清中の約80%を締めるアルブミンと免疫グロブリンを除去した血清中の微量タンパク成分を再現性の良い逆相HPLCで25分画し、この分画物中のタンパク質をSDS-PAGEならびに二次元電気泳動で定量分析を行う。また、ペプチド成分に関しては北里大学理学部で開発したペプチド抽出法を用いて高効率に再現性良くペプチド成分を濃縮し、その成分をペプチド用の逆相HPLCカラムで60分画したものを質量分析計(MALDI-TOF MS)で分析する予定である。平成19年度に検討した実験条件をもとに平成20年度は腎移植後拒絶反応を起こした患者血清と尿を対象とした診断マーカー候補タンパク質ならびにペプチドの探索を本格的に開始する。(1)血清タンパク成分に関しては抗体カラムにより血清中の約80%を締めるアルブミンと免疫グロブリンを除去した血清中の微量タンパク成分を再現性の良い逆相HPLCで25分画し、この分画物中のタンパク質をSDS-PAGEならびに二次元電気泳動で定量分析を行う。上記により低分子量のペプチドレベルからタンパク質レベルまでの網羅的解析が可能となる。(2)尿腎移植後安定している時に採取した尿、拒絶反応を起こしている時に採取した尿、治療後に採取した尿の3検体を用いて、アガロースニ次元電気泳動法で尿中タンパク質の定量的変化の比較検討を行う。上記により急性拒絶反応の際、上昇が認められたタンパク質、ペプチドについては抗体をもちいて今後検討をおこなう予定である。腎移植にとって拒絶反応は最大の障壁であるが、その診断を的確に診断する臨床的マーカーはないため、血清クレアチニン値などの血液検査で腎機能の悪化、尿中蛋白量の上昇、発熱、尿量減少、浮腫などの臨床症状やなどを目安としている。この研究はプロテオミクス解析技術を用いて腎移植後の急性拒絶反応、慢性拒絶反応の早期診断治療効果判定を可能とする尿中マーカー蛋白質候補を探索することを目的とする.平成21年度は(1)尿検体の取り扱いと尿プロテオーム解析法の確立。(2)腎移植後に拒絶反応を示した患者尿の経時的なプロテオーム解析。(3)尿中のペプチド分析法の確立を行った。概略を以下に示す。(1)従来法では10mLの尿の処理に約5時間、1検体約5000円のコストがかかっていたが、高価なゲル濾過カラムを使用せず限外濾過法だけで濃縮・脱塩する方法を確立した。これにより1検体約3時間で、コストも2000円程度となった。(2)腎移植後に安定した経過をたどる腎移植後患者と腎移植後拒絶反応を示す患者尿を経時的に採取し、(1)で確立した前処理法を用いて脱塩・濃縮後にSDS-PAGEで比較解析した。その結果、両者において腎移植に伴い尿中の蛋白量ならびに蛋白組成が一時的に大きく変動するが、腎移植後約1週間で移植前の尿とほぼ同じ状態になることがわかった。

そこで、腎移植後拒絶反応を起こした患者尿において腎移植後1週間から3カ月経時的の尿を二次元電気泳動法で分析した。その結果、経時的に変動する約10種類の蛋白質スポットを検出した。さらに、これらの蛋白質スポットを切り出して、ゲル内消化後、LC-MS/MS分析にて同定した。現在、この中の3種類の蛋白質に関しては抗体を入手しウエスターンプロッティング法による確認・評価の準備を行っているが、いずれも思った以上にバックグラウンド信号が強いため様々な条件検討を行っているところである。(3)使い捨ての逆相カラムを用いて効率よくペプチドだけを濃縮する方法の確立に成功した。
卵巣癌幹細胞は卵巣癌細胞の「iPS化」により生じるか

多分化能を発揮させる遺伝子の発現が、卵巣癌の発生や幹細胞の同定、化学療法抵抗性に関連している可能性があると考え、山中4因子の卵巣癌での発現、および卵巣癌細胞株に山中4因子を発現させることによる変化を検討した結果、卵巣未熟奇形腫の未分化な部分に山中4因子のひとつであるOCT4が発現することを見出した。また、この研究の過程において、卵巣癌の転移に関してはTGF-b経路が重要な役割を果たしている可能性を見出した。卵巣癌は、早期より腹腔内転移という形で進行癌となる、婦人科癌のうち最も予後不良で治療法のさらなる開発を必要とする癌である。また、発生母地も、上皮性、胚細胞性など多様で生物学的特性も異なり、自ずから治療法も異なるはずである。特に、上皮性卵巣癌では、一時的には化学療法が著効し肉眼的病変が消失しても、一定の時間経過とともに再発し化学療法抵抗性となることが比較的多い。また、腹腔内転移の制御も大きなテーマである。これらの問題を根本的に解決するためには、卵巣癌の発生・転移のメカニズムについてのさらなる基礎的研究、また卵巣癌幹細胞の探索が不可欠であると考えられる。このような視点から、われわれは既に、良く知られている上皮性卵巣癌に有効なプラチナ製剤に耐性を持つ卵巣明細胞腺癌に対し、sorafenibが有効であることを見出した。今回、われわれは癌の多分化能に着目して研究を行い、卵巣未熟奇形腫の未分化な部分にiPS細胞作製に必要な山中4因子のひとつであるOCT4が発現することを見出した。このように多分化能を発揮させる遺伝子の発現が卵巣癌の発生や幹細胞の同定、化学療法抵抗性の獲得に関連している可能性があると考えられるため、この仮説をさらに発展させ、卵巣癌細胞株に山中4因子を発現させることによる変化を検討し、卵巣癌の発生、幹細胞の同定、化学療法抵抗性獲得のメカニズムを解き明かす鍵を見出すべく研究を継続中である。また、卵巣癌の転移に関しては、TGF-b経路が重要な役割を果たしている可能性を示した。