hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経伝達物質放出カルシウムセンサーの膜融合タンパク質複合体からの解離

神経伝達物質放出にはカルシウムセンサーであるシナプトタグミンと膜融合能を持つスネア複合体が必須であるが、両者の相互作用は不明である。本研究では、伝達物質放出の分子機構を解明するため両者の相互作用を解析した。ラット脳から可溶化した天然のタンパク質、哺乳動物細胞で発現させた組換えタンパク質、脂質膜に組み込んだ大腸菌で発現させた組換えタンパク質を用いたいずれの結合実験において、スネアに結合したシナプトタグミンは、カルシウムが結合するとスネアから解離した。これらの結果は、カルシウムによるシナプトタグミンのスネア複合体からの解離が伝達物質放出を引き起こすことを示唆する。神経伝達物質放出の分子機構を理解するため、カルシウムセンサーシナプトタグミンとスネア膜融合複合体の相互作用を解明することが本研究の目的である。前年度、私達はシナプトタグミンとスネア複合体の結合が、生理的温度においてカルシウム依存性に解離することを見いだした。以前私達は、シナプトタグミンとスネア複合体の結合が、スネアの構成因子のうち、シンタキシンを介していることを示した。これらを踏まえ今年度は、スネア複合体からの解離はシナプトタグミンのシンタキシンへの結合阻害によること、解離にはシナプトタグミンへのカルシウム結合が必須であること、シナプトタグミンの2つのカルシウム結合ドメイン(C2A、C2B)の解離における役割を明らかにするため、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞に強制発現させた組換えタンパク質を用いて解析した。組換えシナプトタグミンは、脳から精製したスネア複合体とカルシウム非存在下で結合し、カルシウム濃度依存性に解離した(IC50 = 0.9 mM)。組換えシナプトタグミンとシンタキシンの結合も、カルシウム濃度依存性に阻害された(IC50 = 0.6 mM)。シナプトタグミンの二つのカルシウム結合ドメイン、C2AとC2Bのカルシウム結合部位は5つのアスパラギン酸(D)から構成され、二番目のアスパラギン酸(D2)が重要であることが明らかにされている。これらのD2残基に変異を導入し、スネアからのカルシウム依存性解離に対する影響を調べたところ、シナプトタグミンのC2AではなくC2Bドメインへのカルシウム結合が必須であることが明らかとなった。神経細胞からの伝達物質放出にはC2AよりもC2Bドメインへのカルシウム結合が必須であること明らかにされている。したがって、本研究の成果は、カルシウムによるシナプトタグミンのスネア複合体からの解離が伝達物質放出を引き起こすことを示唆する。前年度までに私達は、シナプトタグミンとスネア複合体の結合が、生理的温度においてカルシウム依存性に解離すること、組換えシナプトタグミンは脳から精製したスネア複合体とカルシウム非存在下で結合しカルシウム濃度依存性に解離すること、両者の解離にはシナプトタグミンの二つのカルシウム結合ドメインのうち、C2AではなくC2Bへのカルシウム結合が重要であることを見いだした。Tスネアはシナプス前膜にVスネアはシナプス小胞膜に存在する。そのため小胞ドッキング後、スネアは膜近傍領域が離れたトランス型複合体を形成し、膜融合後シス型へと移行する。溶液中ではシス型が再現できるのみである。そこで、今年度はリポソームに再構成したスネアを用いてシナプトタグミンが膜融合前のトランス型に結合するか解析した。大腸菌で発現させた組換えVスネアとTスネアを精製後、透析法により別々に再構成したリポソームを融合が生じないよう4°Cで混和しトランス型複合体を形成させシナプトタグミンと反応させた。密度勾配遠心後、上層に回収されたリポソームをイムノブロッティングにより調べたところ、シナプトタグミンはトランス型スネアに結合し、Ca2+により解離することが分かった。以上の結果から、ドッキングした小胞とシナプス前膜間に形成されたスネア複合体にシナプトタグミンが結合することが示唆される。シナプトタグミンの結合がスネアの働きを抑制するならば、Ca2+による解離により抑制が解除され、伝達物質が放出されると考えられる。神経伝達物質放出の分子機構を理解するため、Ca2+センサーシナプトタグミンとSNARE膜融合複合体の相互作用を解明することが本研究の目的である。私達を含めいくつかの研究グループが、両者がCa2+非存在下で結合することを示している。これを踏まえ初年度は、両者の結合に及ぼすCa2+の影響について調べた。ラット脳可溶化画分をCaCl2存在下において37°Cで反応させた後、抗シナプトタグミン抗体で免疫沈降しイムノブロッティングにより解析した。

シナプトタグミンと共沈するSNAREはCa2+濃度依存性(IC50 = 0.65 mM)に減少したことから、両者はCa2+により解離することが明らかとなった。Ca2+を添加後、種々の温度で脳可溶化物を反応させたところ、4°Cでは解離は生じず、10°Cで解離し始め、37°Cまで温度を上げるに従い解離が増加した。両者の解離は本研究で用いている結合実験法の解析時間の限界である5分以内にプラトーに達した。シナプトタグミンとSNAREの解離は、in vitroにおいて伝達物質を放出させるBa2+でも生じたが、正常な放出を阻害するSr2+では生じなかった。以上の結果から、天然のシナプトタグミンとSNARE複合体はCa2+依存性に解離することが明らかとなった。このことは、これまで報告されている大腸菌で発現させた組換えタンパク質を用いた結合実験の結果とは全く異なり、それらを基にした従来のモデルに替わる新しい仮説の提唱につながる。これらの成果に加え、次年度以降の研究計画の予備的な実験を行い、予想された結果を得た。上述したように平成24年度の研究計画は当初の計画通りに進み、予想された結果が得られたため。上述したように平成23年度の研究計画は当初の計画通りに進み、予想された結果が得られたため、達成度を上のように判断した。脂質膜に再構成したスネアからのシナプトタグミンのカルシウム依存性解離について調べる。得られた成果をまとめ、査読つき科学雑誌に論文を発表する。シナプトタグミンのCa2+結合部位に導入した点突然変異の解離に及ぼす影響を調べるに先立ち、組換えシナプトタグミンが天然のものと同様にSNARE複合体へ結合・解離するか調べる。ラット脳から精製したSNAREと、HEK293細胞に発現させた野生型シナプトタグミンを反応させ結合させる。Ca2+添加後反応を続け、解離のCa2+濃度依存性を調べ、前年度に得られた結果と比較する。次に、Ca2+結合に重要なアミノ酸を置換した変異シナプトタグミンをSNAREと反応させ、変異のCa2+依存性解離に対する影響を調べる。私達は、シナプトタグミンがSNARE複合体の構成タンパク質のうちシンタキシンとのみ結合することを明らかにしている。そこで、シナプトタグミンのSNARE複合体からの解離がシンタキシンからの解離であることを示すために、シンタキシンからのシナプトタグミンのCa2+依存性解離がSNARE複合体と同様に起こることを組換えタンパク質同士の結合実験で示す。SNARE複合体はシナプス前膜に存在するt-SNAREと、シナプス小胞膜に局在するv-SNAREから構成される。シナプス前膜に小胞がドッキングした後、t-SNAREとv-SNAREは細胞質領域の一部が結合したトランス型複合体を形成する。膜同士が融合した後、v-SNAREはシナプス前膜に移行し3種類のSNAREが同一の膜上に存在するシス型複合体へと移行する。膜から可溶化した溶液中ではシス型と同様な完全に結合した複合体が再現できるのみである。また、シナプトタグミンのCa2+結合親和性は細胞膜の成分であるホスファチジルセリン(PS)により著しく増大する。
膜結合性脂溶性成分の抽出・再構成による光化学系I反応中心の機能の解析

1光化学系1クロロフィルタンパク質からアンテナ機能を持つChl aを抽出し、その後、自然界ではこのタンパク質には結合していないChlb(Chl aの側鎖が酸化されたもの)、Chlaエピマー(Chl aの立体異性体)およびPhe a(Mgを持たないChl a)を再添加した。(1)Chl bは、Chl aと同程度の親和性を持ってChl a結合部位に結合し、Chl aと同等の集光性機能も持つことが示された。Chl aとともに加えることにより、Chl bからの光エネルギー伝達効率は更に向上した。Chl bの側鎖の違いはChla結合部位への結合にほとんど影響しないと解釈された。(2)ChlaエピマーはChl aの約半分の親和性でChl a結合部位に結合し、集光性機能も示した。クロロフィル分子の立体配置の違いはChl a結合部位への結合に障害になっているが、結合したものはChl aと同等の集光性機能を持つことがわかった。(3)Pheaは、Chlaエピマーと同じく、約1/2の親和性で結合したが、集光性機能は殆ど示さなかった。Phe aはChla結合部位ではなくタンパク質の表面に乱雑に結合しており、Phe a分子どうしが重合体となって結合する傾向が示された。中心金属であるMgはChla結合部位への結合に必須であることが確かめられた。2クロレラを高濃度亜鉛培地・暗所で生育させると、MgがZnに置換されたZn-Chlが形成され、全Chlの約30%に達することが明らかになった。このZn-Chlは光化学系1および2に組み込まれており、吸収した光エネルギーを効率よく光合成反応中心に伝達することがわかった。3光化学系Iの電子受容体として働くフィロキノンを欠損したシロイズナズナ変異体ではP700が形成されておらず、光化学系I活性はないが、光化学系Iの長波長アンテナChlは存在していることが明らかになり、反応中心部のみが欠損した光化学系1を持つことが明らかになった。1.光化学系I反応中心タンパク質のエーテル処理によりChlを徐々に抽出すると、Chla/P700比に比べてChl a/Chl a'比は常に小さいことが明らかになった。このことから、P700の失活は、P700を構成するChl a dimer構造が壊れ、次いでP700を構成するクロロフィルが抽出される、という二段階で起こることが明らかとなった。全Chlの98%を抽出した標品を用いて、脂質と共にChl aを添加するとP700が再構成され、その量が約2倍に増えることがわかった。2.Chl a/P700=10の標品を陰イオン性界面活性剤で処理すると、P700は失活するがChl a'の量は変化しなかった。P700の酸化条件下で同様な処理を行うと、P700の失活に伴って、P700を構成する2個のChl分子(Chl aとChl a')のうち、Chl aのみが酸化変性することが明らかになった。

この結果から、(1)P700が酸化されるとChl aに+電荷が局在すること、(2)このChl a^+は酸化変性され易いこと、(3)この処理によりP700のdimer構造が壊れることがその失活の原因になっていることが明らかになった。3.クロレラを高濃度亜鉛培地・暗所で生育させると、MgがZnに置換されたChlが形成され、全クロロフィルの約20%に達することが明らかになった。このZn-Chlは光合成膜に組み込まれており、吸収した光エネルギーを効率よく光合成反応中心に伝達することがわかった。4.光化学系Iの電子受容体として働くフィロキノンを欠損したシロイズナズナ変異体ではP700が形成されておらず、光化学系I活性はないが、光化学系Iの長波長アンテナChlは存在していることが明らかになり、反応中心部のみが欠損した標品が得られることがわかった。1.光化学系Iの反応中心(PsaA/B)には多数のChl a分子が結合し、アンテナ色素として働いている。ここから大多数のChl aを抽出したのち、本来反応中心に存在しないChl bを再添加すると、Chl a結合部位に再結合し、Chl aと同じく効率の良いアンテナとして働き得ることが明らかになっている。Chla結合部位への結合親和性を調べるため、Chl bとともにChl aを様々な割合で加え、結合したChl a/b比を測定した。その結果、Chl bはChl aとほぼ同じ親和性を持ってChl a結合部位へ結合することがわかった。したがって、生体内で光化学系Iの反応中心(PsaA/B)にChl aしか結合していないのは、このアポタンパク質がクロロフィルを結合する際、Chl aしか存在しない場でこの反応が進行すると推定された。2.Chla生合成にかかわる酵素の遺伝子操作により、Chl aがほとんどdivinyl Chl aに置き換わったシロイヌナズナが得られている。この葉緑体膜片からアンテナ色素のほとんどを抽出し、P700が色素的にかなり濃縮された標品を得た。この標品のP700光酸化活性や色素分析からP700もdivinyl Chl aから構成されていると推定される結果を得た。現在、この反応中心の活性が通常とどう違うかの解析を進めている。3.クロレラを高濃度亜鉛培地で育てることにより、Zn-Chl aが形成され、これがアンテナとして働くことがわかってきた。このZn-Chlaが葉緑体膜中のどこに局在するかを調べた。その結果、光化学系IおよびIIの反応中心タンパク質により特異的に結合していることが明らかになった。特に光化学系Iでは、P700の直前で光エネルギーのsinkとして働く長波長クロロフィルの立体構造の構築がZn-Chl aによって妨害されることから、Zn-Chl aはP700のごく近傍に結合しているものと推定された。光化学系1反応中心ロロフィルタンパク質に結合しているアンテナ機能を持つクロロフィルaを抽出し、その後、自然界ではこのタンパク質には結合していないクロロフィルaエピマー(クロロフィルaの立体異性体)およびフェオフィチンa(Mgを持たないクロロフィルa)を再添加したとき、これらのクロロフィルが再結合するか、また、結合したクロロフィルが集光性機能を持つかを検討した。1クロロフィルaエピマーはクロロフィルa結合部位に結合するが、結合の親和性はクロロフィルaの約半分であった。しかし、結合したものはクロロフィルaと同程度の集光性機能を持つことが確かめられた。
10代前半の摂食障害者における社会的認知の検討：顔認知課題を中心に

摂食障害者において自己の顔画像と他者の顔画像を観察している際の脳活動を、NIRSを用いて検討した。具体的には自己顔を観察している際の脳活動を、摂食障害者とコントロール群との間で、比較検討した。その結果、定型発達群では、自己顔にのみ特異的な脳活動がみられたが、摂食障害群では、自己顔および他者顔の双方に対して、側頭部の脳活動が見られた。この結果は、摂食障害者の特殊な自己認知を意味している。また、ADHD児を対象に表情認知を、これもNIRSを用いて検討し、ADHD児では、笑顔に対してのみ、脳活動が観察された。さらに定型発達乳児においても、質感知覚やカテゴリカル色知覚について検討した。本研究では、10代前半の摂食障害者の知覚・認知的特徴を、実験的に解明することを試みることを計画していた。一般的には、摂食障害とは16歳から24歳の女性を中心に、ダイエット文化などの社会的影響によって発症する心の病であると考えられている。しかし近年、むしろ認知の偏りやそれを生み出す脳科学的な要因の関与が報告されるようになってきており(Chowdhury et al., 2003;Jáuregui-Lobera, 2011)、10代前半での発症も急増している現状がある。本研究では摂食障害を、認知的要因の偏りをスタートポイントとして社会的要因をきっかけに生じる「発達的な障害」と捉え、この認知の偏りとその脳科学的な根拠を、顔認知課題を中心とする様々な実験心理学的な手法を駆使して明らかにしていくことを計画した。上記の目的を達するため、本研究では、摂食障害を含めた発達障害児全般の脳活動をNIRSを用いて検討することを進めてきた。具体的には、本研究室において乳児を対象に実施してきた顔認知課題を用いて、これと同じ課題を摂食障害者に適用することを行っている。具体的には、自己顔を他者顔との比較で用い、摂食障害者の側頭葉の活動を計測することに成功した。また、表情認知課題を用いて、摂食障害直後の表情カテゴリーの乱れを明らかにしてきた。これらの成果は、学会発表や研究会などの検討へて、現在論文化への作業が進行中である。本研究では、10代前半の摂食障害者の知覚・認知的特徴を、実験的に解明することを試みた。しかし近年、むしろ認知の偏りやそれを生み出す脳科学的な要因の関与が報告されるようになってきており、10代前半での発症も急増している現状がある。本研究では摂食障害を、認知的要因の偏りをスタートポイントとして社会的要因をきっかけに生じる「発達的な障害」と捉え、この認知の偏りとその脳科学的な根拠を、顔認知課題を中心とする実験心理学的な手法を駆使して明らかにした。具体的にはNIRSによる脳活動を指標に自己顔と他者顔認知の実験を、摂食障害者と定型発達者のコントロール群の2者で比較した。実験の結果、通常特別な活動が見られる自己顔に対して、定型コントロール群においては他者顔よりも強い活動が観察された。この結果は、摂食障害者の自己認識が定型発達者と異なっていることを示唆している。この結果は、国際誌PlosONEに掲載された。また、一般メディアにプレスリリースを行い新聞各紙に掲載された。これに加え、Jornal of Vision2本、i-Perception、PlosOne、などの専門誌、ならびにCurrent BiologyやPNASなどのインパクトファクターが高い一般科学誌での成果発表も行った。平成26年度繰り越し分においては、摂食障害者の認知実験及びNIRSによる脳活動の計測を準備し調整を行った。本計画では、顔画像として自己顔と他者顔を用い、脳活動計測の方法としては、発達障害児/者でも負担なく計測が可能なNIRS(近赤外分光法)を用いた。摂食障害者は、自己の身体の認知について極端に現実とは異なるイメージを保持しており、自己イメージの歪みが指摘されてきた。本研究計画でもこの仮説にのっとり、自己顔の認知が、摂食障害者において、なんらかの観点で歪んだものとなっているのではないか、と考えた。顔認知については一般に右側頭が強く反応することが知られている。NIRSは、fMRIに比べれば、脳の表面しか測定できないという欠点をもつが、実験参加者への負担が少ないという有利な点をもつ。そのため、発達障害児/者という拘束を比較的嫌う人たちを対象としても、NIRSは有効である。本計画では、安静時と顔観察時の脳活動の差分を、自己顔と他者顔との間で比較した。その結果、摂食障害群では、自己顔、他者顔の双方で、顔認知で活動がみられる右側頭での有意な活動の増加がみられたが、コントロール群では自己顔に対してのみ、右側頭での反応がみられた。この結果は、摂食障害者にとって、自己の顔も、他者の顔と同様に処理しているという点で、自己顔認知がゆがんだものとなっていることを示唆している。

これに加え、Jornal of Vision2本、i-Perception、PlosOne、などの専門誌、ならびにCurrent BiologyやPNASなどのインパクトファクターが高い一般科学誌での成果発表も行った。平成27年度基金分においては、摂食障害者の認知実験及びNIRSによる脳活動の計測を実際に行った。本計画では、顔画像として自己顔と他者顔を用い、脳活動計測の方法としては、発達障害児/者でも負担なく計測が可能なNIRS(近赤外分光法)を用いた。摂食障害者は、自己の身体の認知について極端に現実とは異なるイメージを保持しており、自己イメージの歪みが指摘されてきた。本研究計画でもこの仮説にのっとり、自己顔の認知が、摂食障害者において、なんらかの観点で歪んだものとなっているのではないか、と考えた。具体的には自己顔を観察している際の脳活動を、摂食障害者とコントロール群との間で、比較検討した。顔認知については一般に右側頭が強く反応することが知られている。NIRSは、fMRIに比べれば、脳の表面しか測定できないという欠点をもつが、実験参加者への負担が少ないという有利な点をもつ。そのため、発達障害児/者という拘束を比較的嫌う人たちを対象としても、NIRSは有効である。本計画では、安静時と顔観察時の脳活動の差分を、自己顔と他者顔との間で比較した。その結果、摂食障害群では、自己顔、他者顔の双方で、顔認知で活動がみられる右側頭での有意な活動の増加がみられたが、コントロール群では自己顔に対してのみ、右側頭での反応がみられた。この結果は、摂食障害者にとって、自己の顔も、他者の顔と同様に処理しているという点で、自己顔認知がゆがんだものとなっていることを示唆している。この結果は、国際誌PlosONEに掲載された。また、一般メディアにプレスリリースを行い新聞各紙に掲載された。摂食障害者において自己の顔画像と他者の顔画像を観察している際の脳活動を、NIRSを用いて検討した。その結果、定型発達群では、自己顔にのみ特異的な脳活動がみられたが、摂食障害群では、自己顔および他者顔の双方に対して、側頭部の脳活動が見られた。この結果は、摂食障害者の特殊な自己認知を意味している。また、ADHD児を対象に表情認知を、これもNIRSを用いて検討し、ADHD児では、笑顔に対してのみ、脳活動が観察された。さらに定型発達乳児においても、質感知覚やカテゴリカル色知覚について検討した。本研究計画は完成年度を迎えたため、いったんここで終了する。今後は本研究計画で得られた基礎的な研究成果をベースに、臨床現場との連携を考えていきたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験心理学現在、摂食障害者を対象に、表情認知、注意の切り替え課題などを用いて、定型発達群に比べ、有意な違いが明らかになりつつある。本研究プロジェクトの最終目標が、10代前半の摂食障害者が、通常の20歳前後の摂食障害と異なっていることを明らかにすることである。特に、前者と自閉症との関連を検討し、最終的には両者の脳活動による識別可能となるような指標を明らかにすることが目標である。
初期語彙発達における母語音声・音韻体系獲得過程の実証的検討

従来の乳児音声言語獲得研究の多くは、音声弁別の可否に注目し、音声知覚が母語に特化する過程を明らかにしてきた。しかし、母語の音声・音韻体系は、母語特有の音声特徴や音韻が実際の語彙構築に反映されることで初めて、獲得されたといえる。促音を例にとると、日本語獲得においては単に促音を弁別するだけでなく、促音の有無のみで同定される音形(「トキ」「トッキ」)をそれぞれ、異なる指示対象(「時」「突起」)に結びつけ、語彙として獲得する必要がある。本研究ではこのような語彙獲得の枠組みから、母語の音声・音韻体系の獲得を検証することを目的とし、約300名の乳児を対象に馴化脱馴化法を用いた実験を行った。その結果、対象とした三種の日本語音声要素(アクセント型、促音、長母音)の知覚、及びこれらの要素を用いた語彙獲得について、以下の知見を得た。(1)アクセント型の違いを完全に知覚できるようになるのは18ケ月齢であった。また、14ケ月齢ではアクセント型を用いた語彙獲得は困難であり、18ケ月齢で語彙獲得が可能になった。(2)促音と非促音の弁別は12ケ月齢で可能であるが、促音を用いた語彙獲得は14、18、22ケ月齢全ての月齢で困難であった。(3)長短母音は10ケ月齢の時点で弁別可能であるが、母音長を用いた語彙獲得は14ケ月及び18ケ月齢ともに困難であった。したがって、促音と長母音については、その知覚が可能になる時期に比べ、語彙獲得が可能になる時期はかなり遅れることが示された。あわせて、アクセント型、促音、長母音を用いた語彙獲得は、自立拍に比べて困難であることも示された。本研究は、語彙獲得という新しい枠組みを導入して母語音声・音韻体系の獲得過程を検討した点、さらにこれまで未解明であった日本語特有の音声要素の詳細な知覚発達・語彙獲得過程を明らかにした点に、大きな意義がある。
フグ毒テトロドトキシンの体内動態解析とテトロドトキシントランスポーターの解明

フグの毒化機構解明のため、薬物動態解析法によりトラフグにおけるテトロドトキシン(TTX)の体内動態を調べた。TTXはトラフグ消化管から速やかに吸収され、血漿中では一部血漿タンパク質と非特異的に結合し、ほとんどが遊離型として存在すること、TTXは毒化の初期段階として肝臓に取込まれるが、肝臓におけるTTXの初回通過効果は極めて小さいことが明らかになった。cDNAサブトラクション法で、TTX投与したトラフグの肝臓で発現増大したcDNA1136クローンからトランスポーター関連遺伝子11クローンを得た。フグがフグ毒テトロドトキシン(TTX)をもち、その毒は食物連鎖を介した生物濃縮により毒化すると考えられているが、経口的に取り込まれたTTXがフグの体内でどのようにして、どのようなメカニズムで肝臓や卵巣などの特定部位に蓄積するのかは依然不明である。そこで本研究では、トラフグを試料魚にしてTTXの体内動態を薬物動態学的手法により解析し、さらに、肝臓におけるTTX取込みを担う輸送担体トランスポーターの特定を試みた。1)トラフグにおけるTTXの体内動態: TTX溶液(0.25mgTTX/kg体重)をトラフグ(体重約1kg)の静脈、肝門脈、消化管からそれぞれ急速単回投与して血中TTX濃度変化を調べた。その結果、静脈および肝門脈投与の場合、血中TTX濃度推移は分布相と消失相を示した。投与5時間後には投与したTTXの70%以上が肝臓から回収された。しかし、肝臓への取込み効率を表す肝抽出率は9%と低かった。一方、消化管投与(0.25mgTTX/kg体重)の場合、血中TTX濃度推移は一次吸収過程を示し、バイオアベイラビリティーは62%であった。しかし、0.5mgTTX/kg体重以上の投与では消化管吸収は飽和することが示唆された。これらの結果から、トラフグに経口的に摂取されたTTXは消化管から効率よく吸収され、血液で運搬され、肝臓に蓄積される様子が初めて薬物動態学的に解析された。2)トラフグ肝臓TTXトランスポーターの特定: TTXを筋肉投与したトラフグと非投与トラフグの肝臓からそれぞれmRNAを精製してcDNAサブトラクションライブラリーを作成し、TAクローニング法を用いてTTX投与によって発現誘導された遺伝子群をスクリーニングした。cDNAライブラリーから142クローンを得て、BLASTならびにフグゲノムデータベース検索したところ、多くはペプシジン前駆体、フィブリノーゲンや生体防御関連遺伝子と同定され、1クローンが芳香族アミノ酸トランスポーターと同定された。この結果を受けて、アミノ酸トランスポーターを候補と考えTTXトランスポーターの特定を行っている。今年度はおもに以下の2点について研究を行った。1)トラフグ血漿タンパク質とTTXの結合親和性:昨年度行ったTTXの体内動態解析の結果、消化管に投与されたTTXは効率よく吸収され、血液により運搬され、おもに肝臓に蓄積されることが明らかになった。そこで今年度は、循環血液によるTTX運搬がフグと他魚種で相違があるか調べることを目的に、トラフグおよびアイナメの血漿、ウシ血清アルブミン(BSA)およびウシα-1-酸性糖タンパク質(AGP)との結合親和性を評価した。その結果、TTXはトラフグおよびアイナメの血漿タンパク質と非飽和的に結合し、結合型TTX量はトラフグがアイナメに比べ約2倍多かったが、TTXは魚類血漿中においてほとんどが遊離型で存在することがわかった。また、TTXはBSAとAGPにも結合し、これらの結合型TTX量はトラフグの値を上回った。以上の結果から、TTXはフグ科魚類の血漿タンパク質以外にも非特異的に結合し、血液運搬においてはフグの特異性はないものと考えられた。2)トラフグ肝臓TTXトランスポーターの探索:昨年、TTXを筋肉注射したトラフグと非投与トラフグの肝臓からそれぞれmRNAを精製してcDNAサブトラクションライブラリーを作成し、TAクローニング法を用いてTTX投与によって発現誘導された遺伝子群をスクリーニングしたところ、そのほとんどが生体防御関連遺伝子であった。そこで今年度は、トラフグにTTX投与群とTTXを含まない緩衝液投与群を用いて、両群の肝臓におけるmRNAの発現量を比較することとした。

現在、TTX投与で優位に発現した遺伝子を反映するcDANライブラリーから1000クローン以上を取得し、それらの遺伝子を解析中である。フグはフグ毒テトロドトキシン(TTX)をもち、食物連鎖を介した生物濃縮により毒化すると考えられているが、経口的に取り込まれたTTXがフグの体内でどのようにして肝臓や卵巣などの特定部位に蓄積するのかは不明である。そこで本研究では、トラフグを試料魚にしてTTXの体内動態を薬物動態学的手法により解析し、さらに、肝臓におけるTTX取込みを担う輸送担体トランスポーターについて検討した。今年度はおもに以下の2点について研究を行った。1)トラフグ肝臓TTXトランスポーターの探索:TTXを筋肉注射したトラフグとTTXを含まない緩衝液を投与したトラフグの肝臓からそれぞれmRNAを精製し、TTX投与群で有意に発現または特異的に発現増加したmRNAを反映するトラフグ肝臓subtracted cDNAライブラリーを構築した。ライブラリーからプラスミドDNA 1136クローンを得て、1048クローンの塩基配列を同定した。最も多く得られたクローンはhepcidin前駆体(92クローン)で、次いで補体成分(63クローン)、serotransferin(30クローン)が多く、トランスポーター関連遺伝子は11クローンが得られた。2)トラフグ消化管におけるTTXの吸収:トラフグ消化管におけるTTXの吸収を評価する方法として反転腸管法を検討した。トラフグから摘出し、反転させた消化管嚢に緩衝液を充填し、これをTTX含有緩衝液に浸漬したところ、反転消化管嚢中のTTX濃度は経時的に増加した。また、外液のTTX濃度を増加すると反転消化管嚢中のTTX濃度は増加する傾向を示したことから、トラフグ消化管がTTXを通過することがin vitro実験ではじめて実証され、反転腸管法はTTXの消化管吸収の測定に有望であることがわかった。
メタルナノ粒子を吸着した薬剤溶出性ビーズによる新規放射線増感療法の基礎的検討

過酸化チタンナノ粒子は新規の放射線増感剤として注目され、我々の先行研究で国際特許を取得している。過酸化チタンナノ粒子の臨床応用への大きな課題はドラッグデリバリーである。過酸化チタンナノ粒子が癌細胞に到達すれば強力な放射線増感作用を発揮するが、現況では到達が困難であり、臨床応用がなされていない。この問題を解決するため薬剤溶出性ビーズ(ヘパスフィア)に吸着した過酸化チタンナノ粒子をIVRの手法を用いて経動脈的に投与する新たな放射線増感療法を提案し、基礎から臨床応用に向けた橋渡し研究を行う。本研究では薬剤溶出性ビーズ(ヘパスフィア)をメタルナノ粒子製剤のデリバリーシステムとした新しい放射線増感療法の開発を行う。メタルナノ粒子に関しては我々のグループが国際特許を取得している(特許2010-032055、PTC/JP2011/53348)過酸化チタンナノ粒子を主に用いる。過酸化チタンナノ粒子はX線照射によって大量のヒドロキシラジカルを発生し、有望な放射線増感剤と考えられるが、ドラッグデリバリーに問題を抱えている。研究予定は以下のとおりである:1過酸化チタンナトリウム粒子とヘパスフィアの吸着確認、2Cell-free系でのROS産生の評価、3In vitroでの過酸化チタンナノ粒子の細胞内取り込みと放射線増感の評価、4In vivoでの過酸化チタンナノ粒子含浸ヘパスフィア動注による過酸化チタンナノ粒子の体内分布確認と放射線増感の評価。2018年度の研究実績としては3In vitroでの過酸化チタンナノ粒子の細胞内取り込みに関しての治験を得た。MIAPaCa-2細胞と蛍光標識したチタンナノ粒子を共培し、両者が混在することでがん細胞内にチタンナノ粒子が取り込まれることが明らかとなった。なお、チタンナノ粒子の取り込みをより増強する方法も同時に検討したが、現時点では取り込み増強について有望な方法に関する知見は得られていない。その他、1に関しては現在その実験プロトコールの改善を図っている。4に関してはIVR手技を担当する研究分担者と動注方法や動物モデルに関しての選定について検討している段階である。3In vitroでの過酸化チタンナノ粒子の細胞内取り込みに関しては一定の実験結果を得られている。しかし、過酸化チタンナトリウム粒子とヘパスフィアの吸着徐放に関する最適な測定方法に関して文献調査等を行っており、実験プロトコールを作成段階である。ヘパスフィアは高額な医療材料であるため、まずは実験プロトコールの最適化や各種予備実験を優先して行っている。文献調査はおおむね完了しており、実験プロトコールを作成後には直ちに実験を開始できる。チタンナノ粒子の吸着に関して良好な結果が得られない場合は、他のメタルナノ粒子を検討する予定である。具体的に、有望なメタルナノ粒子としては金ナノ粒子を検討している。In vivo実験に関して動注方法や動物モデル、チタンナノ粒子の体内分布測定方法についての更なる検討を同時並行で行うよう、次年度の計画に組み入れた。研究推進のため各分野に精通した神戸大学工学部や医学部IVR科の研究者にも協力、助言を依頼する。

チタンナノ粒子の吸着に関して良好な結果が得られない場合は、他のメタルナノ粒子を検討する予定である。具体的に、有望なメタルナノ粒子としては金ナノ粒子を検討している。In vivo実験に関して動注方法や動物モデル、チタンナノ粒子の体内分布測定方法についての更なる検討を同時並行で行うよう、次年度の計画に組み入れた。研究推進のため各分野に精通した神戸大学工学部や医学部IVR科の研究者にも協力、助言を依頼する。
前近代ペルシア語文化圏における世界認識：世界史書文献の研究

1研究成果の公表。世界史書文献に関する新見解、および世界史書に叙述された世界認識に関して、国内外6つの学会・シンポジウムで報告の機会を行った。その中でも、ケンブリッジ大学で開催された第9回イスラーム写本会議の研究発表に応募し、報告者の研究報告"AForgotten nkhanid Historical Work : Abu al-Qasim Kashani's Zubdatat-Tawarikh"が採用されたことは特筆に価する。本報告は、ペルシア語世界史書の中で最も有名な史料の一つ『集史』第2巻の成立について、先行研究の説を覆す新しい説を提示したものであったが、この説は国際学会に集った写本研究者たちの賛同を得るに至った。また、本年度には、英語論文1本、日本語論文1本を刊行した。その中でも、英語論文"A Study on the Geographicat Understanding of Hamd-Allah Mustawfi"は初年度にアジア世界史学会(AAWH)第2回国際大会で報告した内容の一部を、論文として公表したものである。これは、報告者がこれまで最も力を注いで研究しているハムド・アッラー・ムスタウフィー(1344年頃没)という知識人による『心魂の歓喜』という作品が、先行研究で指摘されてきたように単なる地理書ではなく、歴史を含むその他の事象に関する情報も含んだ博物誌であることを明らかにした最新の研究で、報告者の初めての英語論文である。2史資料収集。アラビア語、ペルシア語、トルコ語で書かれた世界史書・地理書文献の写本・石版本調査をイギリス、アイルランド、トルコ、イランの4カ国14図書館で行い、本研究に必要な文献の画像データの購入に成功した:12013年8月21日9月11日:ケンブリッジ大学付属図書館、ボードリアン図書館、英国図書館、チェスター・ビーティー図書館、スレイマニエ図書館、バヤズィト国立図書館、22014年2月14日3月14日:テヘラン大学付属中央図書館、イラン国立図書館、議会図書館、マレク国立図書館、ゴレスターン宮殿付属図書館、ミーノヴィー図書館、人文科学・文化研究所付属中央図書館、タブリーズ中央図書館、スレイマニエ図書館。(抄録なし)研究計画に従い、研究成果の公表と史資料の収集を進めた。1.研究成果の公表。国際学会で報告者のこれまでの研究成果を口頭発表した。2012年12月7日、ナポリで開催された「写本とテクスト」という国際会議において、「ハムド・アッラー・ムスタウフィーの系図:いかに普遍史を数葉の紙に描くのか」と題する報告を行い、報告者が発見した新出史料とその史料的価値を紹介した。また、世界史書の中でも研究代表者が特に力を入れて研究しているハムド・アッラー・ムスタウフィー著『選史』に関する写本研究の成果を、「『選史』続編の研究:新出史料『ジャラーイル朝史(選史続編)』を中心に」『アジア・アフリカ言語文化研究』85号、2013年という形で出版した。2.史資料収集。アラビア語、ペルシア語、トルコ語で書かれた世界史書・地理書文献の写本・石版本調査を、10都市19図書館で行った:(1)2012年9月18日10月10日:オーストリア国立図書館、イラン学研究所、バイエルン州立図書館、ベルリン州立図書館、スレイマニエ図書館、(2)2012年12月4日12月28日:ナポリ国立図書館、テヘラン大学、イラン国立図書館、議会図書館、マレク図書館、マルアシー図書館、イスラーム宝物センター、ゴルパーエガーニー図書館、レザー廟付属図書館、マシュハド大学、(3)2013年3月5日3月16日:ビールーニー東洋学研究所、ウズベキスタン国立大学、(4)2013年3月21日3月22日:京都大学、京都外国語大学。その他、パリの国立図書館から本研究に必要なペルシア語写本のマイクロフィルム3点を購入した。1研究成果の公表。2史資料収集。アラビア語、ペルシア語、トルコ語で書かれた世界史書・地理書文献の写本・石版本調査をイギリス、アイルランド、トルコ、イランの4カ国14図書館で行い、本研究に必要な文献の画像データの購入に成功した:12013年8月21日

9月11日:ケンブリッジ大学付属図書館、ボードリアン図書館、英国図書館、チェスター・ビーティー図書館、スレイマニエ図書館、バヤズィト国立図書館、22014年2月14日3月14日:テヘラン大学付属中央図書館、イラン国立図書館、議会図書館、マレク国立図書館、ゴレスターン宮殿付属図書館、ミーノヴィー図書館、人文科学・文化研究所付属中央図書館、タブリーズ中央図書館、スレイマニエ図書館。写本調査を当初の予定よりも多い10都市19図書館で行い、未刊行の世界史書文献を収集できた。また、2度の国際会議での報告に加え、研究代表者が特に注目している世界史書文献『選史』の写本研究には大きな進展が見られ、史料論文を刊行できたことは評価できる。しかし、2012年度の写本調査で収集した文献の中にはまだ分析が終わっていないものもあり、2013年度は『選史』以外の文献の研究を進める必要がある。昨年度に収集した文献の読解・分析を進め、その成果を学会報告、論文の刊行という形で公表する。世界史書文献の調査も引き続き行う予定である(今年度はイギリス、イランを予定)。研究計画の変更。史資料収集の成果の一環として、1340年にハムド・アッラー・ムスタウフィーが著した博物誌『心魂の歓喜』の校訂・翻訳を始めた。『心魂の歓喜』は前近代ペルシア語文化圏で好評を博し、当時の世界認識・地理認識の形成に重要な役割を果たした作品であるにもかかわらず、作品の後半部分しか出版されておらず、未だにその全容は明らかにされていない。前半部分を分析するために、昨年度の史資料収集では、二つの古写本(1449年書写のパリ写本、148011年書写のイスタンプル写本)と1894年にボンベイで出版された石版本の複写を購入した。これらに依拠し、順次校訂と日本語訳の作成を進めているところである。(抄録なし)
培養網膜血管内皮細胞に対する硝子体内物質の役割

糖尿病網膜症に対する硝子体手術時に得られた硝子体液を用いてTGF betaの存在をウエスタンブロット法にて確認した。得られた検体を酸性で処理し活性化させた後、リンパ球を用いた培養実験を行いその免疫抑制効果を調べたところ、免疫抑制作用が確認された。免疫抑制物質として眼内には少なくとも2種類存在している。以前に行った実験から、その1つは分子量3000以下の比較的小さい物質でもう1つはTGF betaに相当するものと考えられる。今回の結果より免疫抑制物質として硝子体内にTGF betaが存在していることが推察された。しかし、病期とTGF betaの間の相関は不明で、検体数が少なく今後さらに検討する必要がある。子牛網膜より網膜血管を酵素処理及びナイロンメッシュを用いてふるい分けをし、単離し培養した。この培養により網膜血管内皮細胞と網膜血管ペリサイトが培養された。内皮細胞の指標としてファクターVIIIを用い、ペリサイトと区別した。さらに、内皮細胞増殖因子を用いることにより、内皮細胞の選択的増殖が可能となった。現在、さらに基礎実験を重ねているが、今後この培養細胞に対する、手術時に得られた硝子体液の影響を検討する必要がある。
EELS分光と量子化学計算によるプロトン伝導体の状態分析とその材料設計への応用

本研究では,透過型電子顕微鏡(TEM)に付随した電子線エネルギー損失分光(EELS)と理論計算を駆使し,材料中の水素周囲の局所構造解析を行うことを目的とした.特に,特定の回折条件下での分光により得られる,特定の原子面からのエネルギー損失スペクトルの活用を試みた.このサイト選択的分光は,現時点では,定量的分析に向けた理論解析の整備段階であり,Mn_3O_4やNiAl_2O_4といったモデル的な結晶において,定性的に非経験的量子化学計算から得られたサイトごとのスペクトルと対応する成果を得ている.これは,2005年オーストリアで開かれたEELS国際ワークショップで発表し,関連する論文誌Ultramicroscopyに投稿中である.一方,通常のEELSの使用法で,鉄炭化物中の水素の分析を行った.ホワイトラインと呼ばれる鉄のL_<2,3>端EELSスペクトルは水素により大きくL_3/L_2の相対強度比が低下することを実験的に確証した.この変化を利用して,水素の間接的な高空間分解能分布をTEM-EELSより得ることを試みた.分析した鉄炭化物中に水素は濃度がほぼ均一に存在するため,鉄炭化物の厚みに比例したコントラストを得る結果となったが,濃度分布のある厚みの均一な試料で同様の分析を準備している.水素により鉄の化学結合状態がどのように変化したか調べるため,X線吸収スペクトルを測定し,非経験的量子化学計算から理論解析を行った.この結果,水素は結合欠損のある鉄原子近傍に吸着し,鉄-水素結合により鉄のd電子p電子の状態が大きく変化することが示された.以上の結果は,2006年オーストリアで開かれるTEMと密度汎関数法計算のワークショップで発表予定であり,関連論文誌に投稿中である.本研究では,特定の回折条件で生じる電子のチャネリング現象を生かし,サイト選択性のある電子線分光を行い,プロトン伝導体材料における個々のサイトを分析することを最終的な目的としている.このために,まず,モデル的な系において,チャネリング条件下でのEELS測定を行った.測定は,NiAl_2O_4及びMn_3O_4スピネル型化合物について行った.これらは,それぞれAlとMnが異なる2種のサイトに存在する.Al-K殻,Mn-L_<2,3>殻励起端構造をそれぞれのサイトからのシグナルを増強させるチャネリング条件で測定した.スペクトル形状はチャネリング条件で明らかに変化し,それぞれ個々のサイトからのスペクトルが異なることを示唆した.更に,スペクトルを装置分解能関数でデコンボリューションすることで,ピーク構造の違いが明確になった.Al-K端等,通常の励起端近傍構造は第一原理バンド計算等の手法でスペクトルの微細構造までよく再現できることが知られている.本研究においてもそれぞれのサイトに内殻空孔を導入した第一原理計算で,実験結果とよく符合する結果を得た.一方,Mn-L_<2,3>端等の遷移金属のホワイトラインと呼ばれるスペクトルは,3dあるいは4fの電子の多体効果が本質的に重要となり,通常の一電子近似のバンド計算では計算が困難である.これらのスペクトルについては,計算面では,3dあるいは4f軌道のコンフィギュレーションインタラクションを計算する手法が近年報告されている.最近なされたMn_3O_4についての計算結果と本研究で得た実験スペクトルはよく傾向が対応するものであった.以上より,今後はプロトン伝導体材料に適用し,プロトン伝導体材料にドープされた遷移金属のサイトごとのスペクトルから,それぞれのサイトの価数を分析できるものと考えている.これ以外の副次的な成果以下のものが挙げられる:(1)EELSスペクトルと同様の微細構造をもつX線吸収スペクトルの吸収端を用いてセラミックス固溶体サイアロン中の溶質原子の局所環境を実験と理論計算から詳細に明らかにした.(2)水素雰囲気メカニカルミリングで生成したナノ構造黒鉛中の水素が及ぼす化学結合変化をC-K端EELSスペクトルから調べ,グラファイトシート層間に存在する水素がスペクトル構造に変化を与えることを第一原理分子軌道計算とともに明らかにした.本研究では,透過型電子顕微鏡(TEM)に付随した電子線エネルギー損失分光(EELS)と理論計算を駆使し,材料中の水素周囲の局所構造解析を行うことを目的とした.特に,特定の回折条件下での分光により得られる,特定の原子面からのエネルギー損失スペクトルの活用を試みた.このサイト選択的分光は,現時点では,定量的分析に向けた理論解析の整備段階であり,Mn_3O_4やNiAl_2O_4といったモデル的な結晶において,定性的に非経験的量子化学計算から得られたサイトごとのスペクトルと対応する成果を得ている.これは,2005年オーストリアで開かれたEELS国際ワークショップで発表し,関連する論文誌Ultramicroscopyに投稿中である.一方,通常のEELSの使用法で,鉄炭化物中の水素の分析を行った.ホワイトラインと呼ばれる鉄のL_<2,3>端EELSスペクトルは水素により大きくL_3/L_2の相対強度比が低下することを実験的に確証した.この変化を利用して,水素の間接的な高空間分解能分布をTEM-EELSより得ることを試みた.分析した鉄炭化物中に水素は濃度がほぼ均一に存在するため,鉄炭化物の厚みに比例したコントラストを得る結果となったが,濃度分布のある厚みの均一な試料で同様の分析を準備している.水素により鉄の化学結合状態がどのように変化したか調べるため,X線吸収スペクトルを測定し,非経験的量子化学計算から理論解析を行った.

この結果,水素は結合欠損のある鉄原子近傍に吸着し,鉄-水素結合により鉄のd電子p電子の状態が大きく変化することが示された.以上の結果は,2006年オーストリアで開かれるTEMと密度汎関数法計算のワークショップで発表予定であり,関連論文誌に投稿中である.
ピロリ菌CagAによる胃上皮細胞のDNA損傷誘発機構と発がんにおける役割の解明

ピロリ菌はcagA遺伝子を持つ株と持たない株に分類されるが、胃がん発症に関与するのはcagA陽性株である。日本では毎年約5万人が胃がんで死亡しているが、日本人の胃がん患者の大半はcagA陽性ピロリ菌感染者である。ピロリ菌は菌体内で産生したCagAタンパク質を胃上皮細胞内に直接注入する。申請者は、CagAが注入された細胞でDNA二本鎖切断が引き起こされることを見出している。DNA二本鎖切断は重篤なDNA損傷であり、修復されない場合には遺伝子変異や染色体転座の原因となることが知られている。本研究では、CagAがDNA二本鎖切断を誘発する分子機構を解明し、細胞がん化への関与を検討する。
疾患特異的な質的変化を示す腫瘍マーカーペプチドの探索

健常者と癌患者を区別することが出来るヒト血清中のCEAペプチドの探索を目的とした。CEA濃度が高い大腸癌患者血清を用いてIP-MRM法の条件検討を行った。その結果、ヒト血清において定量測定可能な8種類ペプチドを選定し,MRMトランジションを作成した。CEA濃度が10-20ng/ml程度のわずかに高値の検体をIP-MRMの測定対象とした(大腸癌3例、肺癌2例、健常者男性2例、健常者女性3例)。測定した全てのCEAペプチドにおいて癌患者、健常者間での定量差は見られなかったが、AIA-600IIとIP-MRMによるCEA濃度の値は同程度であった。平成27年度はCEAのIP-MRM法の条件検討を行った。まず、定量解析のためのCEA標準品の発現プラスミドを構築した。本プラスミドは目的遺伝子の挿入部位の上流に分泌シグナルをコードしていることから、目的タンパク質を培地中に発現させることができ、N末端およびC末端にそれぞれFLAGタグとBNCタグ、さらにMRM定量用のペプチドを付加した融合タンパク質を発現するように設計した。SILAC培地で培養した293T細胞にリポフェクション法を用いてCEA発現プラスミドをトランスフェクションし、48時間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清に対し、FLAGおよびBNC抗体を用いたIPを行った。トリプシン消化後、MRM定量用の標準ペプチドを加え、QTRAP 5500(AB SCIEX)を用いてMRM測定を行い、CEAの標準品の濃度を算出した。次に、CEAのIP(免疫沈降法)の条件検討を行った。回収した培養上清に対し、CEA抗体を用いたIPを行った後、CEA濃度を全自動酵素免疫測定装置AIA-600II(東ソー)で測定しIP効率を算出した。95%以上のIP効率を示す最適なIP条件の検討を行った。次にCEAのMRM法の条件検討を行った。精製したCEAトリプシン消化ペプチドを重酸素水中でPNGaseによるグリコアミダーゼ消化を行いLTQ Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific)を用いて、LC-MS/MS解析を行った。同定されたCEA由来の多数のペプチド情報を基にMRMチャネルを作成し、QTRAP 5500を用いてMRM解析の条件検討を行った。次にCEAが非常に高値の大腸癌患者血清に対して、IP-MRM法を用いたCEAの測定が可能なことを確認した。また、IP-MRM法で測定したCEAの絶対量とAIAで測定したCEAの絶対量は近い値を示した。本年度の目標はCEAに対するIP-MRM解析の条件検討を行うことであった。CEAペプチドのチャネルの作成を行い、イオン強度が非常に高いチャネルを見つけ出すことに成功し、測定可能なN型糖鎖ペプチドのチャネルも同時に設定することが出来た。また、CEA高値の大腸癌患者血清からもIP-MRM法を、用いたCEAの定量測定が可能なことを確認した。初年度として次につながる十分な結果を得ることができたので、おおむね順調と判断した。ヒト血清中のCEAの分子形態に着目し、健常者と癌患者を区別することが出来るCEAペプチドの探索を目的とした。大腸癌患者血清のCEA濃度をAIA-600II(東ソー)で測定し、最もCEA濃度が高かった血清を用いてIP-MRM測定の条件検討を行った。その結果、IP-MRM法にてヒト血清から定量測定可能な8種類ペプチドを選定した。8種類ペプチドのうち5種類のペプチドは糖鎖修飾を受けているペプチドであった。その多くは報告がこれまでされていない新規の糖ペプチドであった。また、本研究ではSILAC標識されたCEAを含む培養上清をIP-MRM測定の内部標準とした。健常者血清も同様にCEA濃度をAIA-600II(東ソー)で測定した。CEA濃度が10-20ng/ml程度のわずかに高値の検体を測定対象とし、大腸癌患者血清も同様に10-20ng/mlのCEA濃度を示した検体を測定対象とした。大腸癌患者血清および健常者血清において、IP-MRM法による安定した定量結果が得られたCEAペプチドは8種類中3種類のみであった。それら全てのCEAペプチドにおいて癌患者、健常者間での有意な定量差は見られなかった。本研究では、IP-MRM法を用いることで極微量の腫瘍マーカータンパク質の定量解析に成功した。さらに研究を継続することで、測定対象の分子形態の変化(質的変化)を明らかにする可能性がある。今後、更なる高分解能を持つ質量分析計や新規タンパク質前処理法を用いることで診断精度を向上させるマーカーペプチドの発見は可能だと考えられる。

平成28年度は各種疾患患者血清に対してCEAのIP-MRM測定を行う。患者血清は、癌患者血清(大腸癌、膵癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌)、良性疾患患者血清(糖尿病、慢性肝炎)と健常者血清を用いる。本解析を行うことで疾患を判別できるマーカーペプチドおよび高い臓器特異性を示すマーカーペプチドを同定とする。見つかったマーカー候補ペプチドに対して、さらに多くの患者血清に対して同様の実験を行い、再現性を確認することで、診断精度を向上させる疾患特異的なCEAマーカーペプチドの有用性を評価する。また、他の腫瘍マーカー(CA125、PSA)に本解析法が応用可能か検討する。プロテオミクス本研究は質量分析装置を用いた実験を行う。そのためLCカラムなどの消耗品を購入する必要があったが、予想していた以上に測定が順調に行えたため消耗品の購入を見送った。本研究は平成28年度に各種疾患患者血清を大量に購入する予定である。当初予定していたよりも多くの血清を購入する必要があると思われたため、その購入資金に当てる予定である。
ポリロタキサン構造に基づく刺激増幅機構を利用した高感度酸素活性種センサの創生

本研究では超高感度酸素活性種センサの開発を目的として、新規ロタキサン型酸素活性種センサの合成を行う。高感度なセンシングを実現する手法として、ロタキサンの、ストッパーの開裂を経る分解機構に着目した。分解機構のトリガーに酸素活性種を適用することができれば、ロタキサンを酸素活性種一分子から多分子に分解できる。それに加え、ロタキサンの構成要素が蛍光性環状分子とクエンチャーとなる軸分子であれば、酸素活性種一分子が複数の環状分子の蛍光をONとする刺激増幅を利用したセンシングを実現できると期待した。本研究では、刺激増幅機構を利用した新規ロタキサン型酸素活性種センサの開発を行う。