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エピジェネティクスからみた生殖補助技術の配偶子・受精卵ゲノムへの影響解析

近年、組織特異的な分子発現における転写調節にはゲノムDNAのエピジェネティクな変化が重要な役割を果たすことが明らかになってきた。また遺伝子のエピジェネティクな変化は、環境因子を含めた後天的な諸要因で容易に影響され得ることから、臨床医学的にもこの遺伝子の変化と生活習慣病や難治性疾患との関連が注目され始めている。本研究では、受精・初期発生における雌性生殖管内の機能分子の生体内の働きを追求する事を最終目的とし、その前段階として、現時点で行われている配偶子・受精卵体外培養技術がそれらの細胞に与えるエピジェネティクな影響を、特にCpGアイランドのメチル化を指標にして生体内(卵管内)の環境との比較し得るか検討した。RLGS法によるCpGアイランドのメチル化、特に組織依存的にメチル化される領域(T-DMR)のデータベースよりプライマー設定し、PCR法を用いて生殖細胞のゲノムの増幅条件設定を試みた。一匹のマウスより得られる卵は自然排卵では排卵処理を行わないと10-20個しか回収されない為、アガロースビーズ法によるsingle cell PCR法の確立を目指した。この結果、微小細胞サンプルからのゲノムDNAの調整及びPCR検出については、100個/2μlの試料を用いてのPCR法を確立した。100個/2μl以下の微小サンプルにおいては、nested PCRを行う必要があり、プライマー選択の重要性が示唆された。これらの結果はCpGアイランドのメチル化を検出するためにはマウス一群を5-10匹に設定することでデータを得られると思われ、in vivoとin vitroにおける生殖細胞、特に卵を評価する方法として有用と思われる。さらにこれらの予備データを応用する候補遺伝子として、生殖細胞待異マーカー分子であるTEX101遺伝子のモーター領域の構造をCpGアイランドの有無を含め詳細に検討した。哺乳類の細胞において、組織特異的な分子発現は転写調節機構に依るが、最近、その調節にはゲノムDNAの化学修飾、すなわちエピジェネティクな変化が重要な役割を果たすことが明らかになってきている。また遺伝子のエピジェネティクな変化は、後天的な要因(環境)で容易に影響され得ることから考え、臨床医学的にもこの変化と生活習慣病や難治性疾患との関連などが近年大きく注目され始めている。本研究では、受精・初期発生における雌性生殖管内の機能分子の生体内の働きを追求する事を最終目的とするために、その前段階として、現時点で行われている配偶子・受精卵体外培養技術が、それらの細胞に与えるエピジェネティクな影響を特にCpGアイランドのメチル化を指標にして、卵管内の環境との比較検討を試みている。RLGS法によるCpGアイランドのメチル化、特に組織依存的にメチル化される領域(T-DMR)のマッピングは、C57B1/6マウスで詳細な検討がなされているため、本年度はまず、初期胚発生に関与するT-DMRのデータベースよりプライマー設定し、PCR法を用いて生殖細胞のゲノムの増幅をまず試みた。一匹のマウスより得られる卵・受精卵は過剰排卵処理を行わないと10-20個ほどしか取れないため、これら実験の確実な遂行のためにはアガロースビーズ法によるsingle cell PCR法の確立が必須になるが、今年度はこのsingle cell PCRの条件を検討した。この結果現時点では細胞約50個からのゲノムDNAで遺伝子を増幅する条件を確立した。現在約10個の細胞からのゲノムDNAを用いたDNA増幅が確実に行える条件を検討中である。次年度はこの条件を用いて各環境変化による配偶子・受精卵ゲノムメチル化に与える影響を引き続き検討する予定である。

近年、組織特異的な分子発現における転写調節にはゲノムDNAの化学修飾、即ちエピジェネティクな変化が重要な役割を果たすことが明らかになってきている。また遺伝子のエピジェネティクな変化は、環境因子を含めた後天的な諸要因で容易に影響され得ることから、臨床医学的にもこの遺伝子の変化と生活習慣病や難治性疾患との関連が注目され始めている。本研究では、受精・初期発生における雌性生殖管内の機能分子の生体内の働きを追求する事を最終目的とし、その前段階として、現時点で行われている配偶子・受精卵体外培養技術がそれらの細胞に与えるエピジェネティクな影響を、特にCpGアイランドのメチル化を指標にして生体内(卵管内)の環境との比較し得るか検討した。RLGS法によるCpGアイランドのメチル化、特に組織依存的にメチル化される領域(T-DMR)のマッピングは、C57B1/6マウスで詳細な検討がなされている為、初期胚発生に関与するT-DMRのデータベースよりプライマー設定し、PCR法を用いて生殖細胞のゲノムの増幅条件設定を試みた。一匹のマウスより得られる卵は自然排卵では排卵処理を行わないと10-20個しか回収されない為、これら実験の確実な遂行のためのアガロースビーズ法によるsingle cell PCR法の確立を目指した。この結果、微小細胞サンプルからのゲノムDNAの調整及びPCR検出については、100個/2μlの試料を用いてのPCR法を確立した。100個/2μl以下の微小サンプルにおいては、nested PCRを行う必要があり、プライマー選択の重要性が示唆された。これらの結果はCpGアイランドのメチル化を検出するためにはマウス一群を5-10匹に設定することでデータを得られると思われ、in vivoとin vitroにおける生殖細胞、特に卵を評価する方法として有用と思われる。
行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読

線虫温度走性を司る神経回路をモデル回路とし、行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読を目指した。AFD感覚ニューロンは、飼育温度を受容し、温度を記憶すること、そして、その記憶はCaMKIとrafの活性によって制御されることがわかった。AFDから温度情報が伝達されるAIY介在ニューロンと、AIYの下流に存在し、頭部運動ニューロン群RMDとSMDを制御するRIA介在ニューロンの神経活動をカルシウムイメージングによって測定した結果を総合し、頭部の舵取り運動と、身体全体の蛇行運動に関する外部刺激依存的な神経回路制御の全容を説明できる神経回路モデルを提唱した。本研究では、線虫の温度に対する記憶・学習行動である温度走性の主要神経回路における神経活動制御の分子メカニズムを解明し、行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読を目指した。温度受容ニューロンAFDが温度刺激を受けると、小胞性グルタミン酸トランスポーターVGLUTに依存したグルタミン酸がAFDのシナプス後ニューロンであるAIYに発現する抑制性グルタミン酸受容体GLC-3によって受容され、AIYの活動性が抑制されることが明らかになった(Ohnishi et al.,in press)。また、AFDからAIYへ、第二の温度受容ニューロンであるAWCからAIYへ、興奮性のシグナルの関与が示唆された。そこで、VGLUTに依存しない興奮性シナプス伝達に関与する分子の同定を試みた。その結果、代謝型グルタミン酸受容体(MGL)の変異体であるmgl-1;mgl-3二重変異体とmgl-1;mgl-2;mgl-3三重変異体が、高温で飼育した場合に温度走性異常を示すことがわかった。mgl-1;mgl;mgl-3三重変異体の示す温度走性異常は、ngl-3cDNAを感覚ニューロンで発現させることにより、回復することがわかった。また、ニューロペプチドの変異体であるnlp-1変異体は、好冷性温度走性異常を示すことがわかった(Ohnishi et al.,unpublished)。温度走性に関与することが示されたイネキシン遺伝子(inx-4)をinx-4変異体のAFDニューロンで発現すると、温度走性異常が回復することが明らかになった。AFDニューロンにおけるINX-4の局在を調べたところ、シナプスに局在していることが示唆された(Emmei et al.,unpublished)。本研究は、線虫の記憶・学習行動である温度走性の主要神経回路における神経活動制御の分子メカニズムを解明し、行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読を目的とする。温度感知・記憶細胞AFDが温度刺激を受けると、小胞性グルタミン酸トランスポーターVGLUTに依存したグルタミン酸がAFDのシナプス後介在細胞AIYに発現する抑制性グルタミン酸受容体GLC-3によって受容され、AIYの活動性が抑制されることがわかった。また、VGLUTに依存したグルタミン酸が第二の温度感知・記憶細胞であるAWCから放出されてAWCのシナプス後介在細胞AIYに働くと、AIYの活動性が上昇することが示唆された。従って、同じVGLUT依存的なグルタミン酸放出は、異なる感覚細胞(AFDとAWC)から、同一の介在細胞AIYに対して相反する神経シグナルを伝達していることが明らかになった(Ohnishi et al.,EMBOJ,2011)。nj24変異体は、温度勾配上において、過去に飼育されていた温度より約1°C高い温度へ移動する異常を示す。原因遺伝子は、無脊椎動物において、ギャップ結合を形成するイネキシン(INX-4)をコードすることがわかった。この変異体の異常は、INX-4をAFDに発現させることにより回復した。また、INX-4は、AFDのシナプス周辺に局在することもわかった。inx-4変異体のカルシウムイメージングを行ったところ、温度に対する応答性は、AFDでは野生型と差が見られなかったが、AIYでは野生型よりも高い傾向が見られた(Emmei et al., unpublished)。AIYの応答性が高いと高温への移動を駆動する(Kuhara et al., Nat.Commun., 2011)。これらの結果に基づき、INX-4が構成するギャップ結合の役割を追求する予定である。本研究は、記憶・学習行動である線虫温度走性の主要神経回路における神経活動制御の分子メカニズムを解明し、行動を制御する神経コードの分子レべルでの解読を目指した。これまでに、AFD感覚ニューロンは、飼育温度を受容するだけでなく、飼育温度を細胞自律的、シナプス非依存的に記憶していることが明らかになり、温度記憶情報をAIY介在ニューロンに伝達していることが示唆された。AIY介在ニューロンの下流に存在し、蛇行運動の舵取りとなる頭部運動

ニューロン群RMDとSMDを制御していると考えられるRIA介在ニューロンのカルシウムイメージングを詳細に行ったところ、温度一定の条件でも、RIAの軸索は局所的に確率的なカルシウム濃度情報を示すことがわかった。興味深いことに、温度上昇刺激を与えると、RIAの確率的活動が、飼育温度付近で抑圧されることがわかった。温度走性回路を構成する神経細胞の機能不全を起こしている突然変異体を用いたイメージング解析の結果、この飼育温度依存的神経活動の抑圧は、AFDによる温度受容および温度記憶に依存しており、AFDの下流に存在するAIY介在ニューロンからの情報伝達に依存することもわかった。また、RIAの機能を欠損する変異体では、RIAの軸索内の局所的活動の頻度が低下し、局所間の活動が同期することが見出された。これら一連のカルシウムイメージングの結果と、先行研究によって見出されている線虫の背腹運動を制御するコマンド介在ニューロンに支配されている運動回路における知見を総合して、線虫の首ふり運動と、身体全体の蛇行運動に関する外部刺激依存的な神経回路制御の全容を説明できる神経回路モデルを提唱した(Kobayashi et al., in preparation)。最終年度であるH26年度も引き続き、環境条件に依存して可塑的な変化を示す線虫温度走性行動を司る主要神経回路をモデル回路とし、行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読を目指した。AFD感覚ニューロンは、飼育温度を受容するだけでなく、飼育温度を細胞自律的に記憶し、その記憶はCaMKIとrafキナーゼの活性によって制御されていることがわかった(Kobayashi et al.,投稿中)。また、AFD感覚ニューロンの温度記憶情報は、AIY介在ニューロンに伝達されると考えられるが、補助的な温度受容を担うAWC感覚ニューロンからも、AIYに温度情報が伝達されると考えられる。突然変異体を用いて、AFDのみ、あるいは、AFDとAWCの両方からの温度情報がAIYに伝達されない状態での、AIYの神経活動をカルシウムイメージングによって測定した結果、AFDからは決定論的な温度記憶情報を、AWCからは確率的な情報を受けることが示唆された。また、AIYの下流に存在し、背側-腹側への蛇行運動の舵取りとなる頭部運動ニューロン群RMDとSMDを制御するRIA介在ニューロンの軸索は、温度一定の条件でも、局所的かつ確率的なカルシウム濃度変動を示すことがわかった。興味深いことに、温度上昇刺激を与えると、AIY介在ニューロンを介したAFDの温度記憶情報に依存して、RIAの確率的活動が飼育温度付近で抑圧されることがわかった。これら一連のカルシウムイメージングの結果と、先行研究によって見出されている線虫の背腹運動を制御するコマンド介在ニューロンに支配されている運動回路における知見を総合して、線虫の頭部の舵取り運動と、身体全体の蛇行運動に関する外部刺激依存的な神経回路制御の全容を説明できる神経回路モデルを提唱した(Kobayashi et al.,投稿中)。本研究では、線虫の温度に対する記憶・学習行動である温度走性の主要神経回路における神経活動制御の分子メカニズムを解明し、行動を制御する神経コードの分子レベルでの解読を目指した。
アンドロゲン受容体イメージング薬剤の簡便合成法の確立ならびに薬物動態の解明

フッ素-18標識フルオロジヒドロテストステロン(16β-[^<18> F] fluoro-5α-dihydrotestosterone、FDHT)は、PET用アンドロゲン受容体イメージング薬剤として前立腺ガン等の診断に有用性が期待されている。しかし、既報の合成法では難易度が高いため、海外においても高度な専門技能を有する施設でしか利用することができない。本研究では、臨床使用されている市販カセット型PET薬剤自動合成装置を用いて、この装置に適用可能な温和な条件下でのFDHT合成法の最適化を行なった。合成は、院内サイクロトロンで製造したフッ素18を用い、標識、還元、加水分解反応の順に実施した。標識前駆体の16α-[[(Trifluoromethyl) sulfonyl] oxy]-3,3-(ethylenedioxy)anhydrostan-17-oneを4mg、2mg、1mgと変動させ、それぞれ無水アセトニトリル2mLに溶解後、相関移動触媒下でフッ素18と125°C10分間標識反応を行った。次いで、水素化ホウ素ナトリウム1. 5mg/エタノール溶液を加え室温で5分間17位のケトン基を特異的に還元させた。加水分解反応では、0. 1mol/ml溶液で85°C15分間反応させて目的物を得た。次いで、HPLCによる分離精製を行い、生理食塩水に溶媒置換後0. 22μmメンブランフィルターで滅菌ろ過し注射製剤として製することに成功した。標識前駆体量を変動させた検討では、4mgで最も安定した収率が得られた。得られた製剤について、マウスによる急性毒性試験を行ない異常は認められなかった。本研究により、特定のPET施設でしか利用できなかったFDHTの製造がカセット型PET薬剤自動合成装置で可能となり、アンドロゲンレセプターに関係する病態の診断・解明に大いに貢献できると考えられる。フッ素-18標識フルオロジヒドロテストステロン(16β-[^<18>F]fluoro-5α-dihydrotestosterone、FDHT)は、ポジトロン断層撮影(PET)用アンドロゲン受容体イメージング薬剤として前立腺ガンの診断等に有用性が期待されている。しかし、既報の合成法では難易度が高いため、高度な専門技能を有する施設でしか利用することができない。本研究では、臨床使用されている市販カセット型PET薬剤自動合成装置を用いて、この装置に適用可能な温和な条件下でのFDHT合成を試みた。合成は、フッ素18を用いた標識反応および還元反応、加水分解反応の順で行った。出発原料である16α-[[(Trifluoromethyl) sulfonyl]oxy]-3,3-(ethylenedioxy)anhydrostan-17-oneを無水アセトニトリルに溶解し、これを相関移動触媒のKryptofix2.2.2存在下、サイクロトロンで製造した^<18>Fイオンと125°C10分間、標識反応を行った。次いで、反応容器に水素化ホウ素ナトリウム/エタノール溶液を加え室温で5分間17位のケトン基を特異的に還元させた。塩酸による加水分解反応では、0.1mol/ml溶液で85°C15分間反応させて目的物を得ることに成功した。その後の高速液体クロマトグラフ法(HPLC)による分離精製では、16β体のみを分離する条件を決定し、より高品質な薬剤として製することに成功した。合成収率は134%(減衰補正後)で、目標値であった収率10%を上回ることができた。製造時間は^<18>Fの1半減期以内である100分であった。

本研究により、特定のPET施設でしか利用できなかったFDHT製造がカセット型PET薬剤自動合成装置で可能となり、アンドロゲン受容体を介した病態の診断・解明に大いに貢献できると考えられる。フッ素-18標識フルオロジヒドロテストステロン(16β-[^<18>F]fluoro-5α-dihydrotestosterone、FDHT)は、PET用アンドロゲン受容体イメージング薬剤として前立腺ガン等の診断に有用性が期待されている。しかし、既報の合成法では難易度が高いため、海外においても高度な専門技能を有する施設でしか利用することができない。本研究では、臨床使用されている市販カセット型PET薬剤自動合成装置を用いて、この装置に適用可能な温和な条件下でのFDHT合成法の最適化を行なった。合成は、院内サイクロトロンで製造したフッ素18を用い、標識、還元、加水分解反応の順に実施した。標識前駆体の16α-[[(Trifluoromethyl)sulfonyl]oxy]-3,3-(ethylenedioxy)anhydrostan-17-oneを4mg、2mg、1mgと変動させ、それぞれ無水アセトニトリル2mLに溶解後、相関移動触媒下でフッ素18と125°C10分間標識反応を行った。次いで、水素化ホウ素ナトリウム1.5mg/エタノール溶液を加え室温で5分間17位のケトン基を特異的に還元させた。加水分解反応では、0.1mol/ml溶液で85°C15分間反応させて目的物を得た。次いで、HPLCによる分離精製を行い、生理食塩水に溶媒置換後0.22μmメンブランフィルターで滅菌ろ過し注射製剤として製することに成功した。標識前駆体量を変動させた検討では、4mgで最も安定した収率が得られた。得られた製剤について、マウスによる急性毒性試験を行ない異常は認められなかった。
モット転移近傍におけるフォノン、軌道、乱れの効果

1.軌道自由度のあるハバード模型のモット転移を動的平均場理論により調べた。フント則結合Jの効果により、モット転移の臨界相互作用U_cが急速に小さくなる。また、J=0では2次転移としておこるモット転移がJ≠0では1次転移へと変化する。2.軌道自由度のある1次元ハバード模型を数値的厳密対角化法により調べた。フント則結合Jとクーロン相互作用Uの共に大きな強相関領域で実現する完全強磁性は、結晶場分裂Δの効果により不完全強磁性へと変化する。さらに、不完全強磁性近傍の金属状態では超伝導が実現する。3.オンサイトのクーロン相互作用Uに加えて、最近接サイト間のクーロン相互作用Vをもつ1次元拡張ハバード模型の金属絶縁体転移を、数値的厳密対角化法により調べた。有限系に対する厳密対角化の結果を初期値として繰り込み群の方程式に代入することにより、電荷ギャップや臨界指数をU-V平面上で精度良く求めた。4.ハバード相互作用Uと電子フォノン相互作用gの全領域で、ハバード・ホルスタイン模型の金属絶縁体転移を動的平均場理論により調べた。Uが大きな領域ではモット絶縁体へ、gが大きな領域ではバイポーラロン絶縁体へと転移する。前者は常に2次転移であるが、後者はUが大きい場合には1次転移となる。5.周期的アンダーソン・ホルスタイン模型を動的平均場理論により調べた。電子フォノン相互作用の増大と共に準粒子の有効質量が増大し、強結合領域では有効質量が100倍以上になる重い電子状態が実現する。それに伴って、フォノンのソフト化や大きな格子の揺らぎが見られる。また、強結合領域ではイオンの有効ポテンシャルが、単純な調和型ポテンシャルからdouble-well型ポテンシャルへと変形する。モット転移近傍の電子状態では、特徴的なエネルギースケールが電子相関効果によって繰り込まれて小さくなるため、軌道やフォノンなどの効果が電子状態に対して大きな影響を与え、同時にこの電子状態の大きな変化が、軌道やフォノン状態に対して大きな反作用を与える。本研究では、動的平均場理論を用いて、第零近似として運動エネルギーとクーロン相互作用に加えてさらにフント則結合、電子フォノン相互作用を同等に且つコンシステントに取り扱うことにより、多種類の相互作用の効果が拮抗する系のモット転移を正確かつ統一的に調べた。ここで用いた動的平均場理論は、摂動展開理論とは異なり模型のすべてのパラメータを同等にコンシステントに取り扱うことのできる手法であり、これまで様々な模型の研究に用いられてきたが、多種類の相互作用の効果が拮抗する複雑なモット転移の問題に適用されたのは本研究が最初である。具体的な成果を以下に示す。(1)軌道自由度のあるハバード模型のモット転移軌道縮退したハバード模型のモット転移を線形動的平均場理論により調べ、モット転移点を軌道縮重度と電子数の関数として解析的に求めた。さらに、フント則結合の効果によりモット転移が1次転移として起こることを明らかにした。(2)電子間相互作用と電子フォノン相互作用のある系のモット転移ハバード相互作用Uと電子フォノン相互作用gの全領域で、モット転移の相図を求めた。Uが大きな領域ではスピン揺らぎが臨界的に増大するモット転移、gが大きな領域では電荷と格子の揺らぎが臨界的に増大するモット転移が起こる。さらに、両者がともに大きな場合に、この2つのモット転移に挟まれた領域で興味ある金属状態が実現することを明らかにした。PrOs_4Sb_<12>やCeFe_4Sb_<12>などの充填スクッテルダイト

化合物では、小さな振動数をもつ希土類イオンの局所振動(ratllingと呼ばれる)が観測されており、その重い電子や近藤半導体的振る舞い、超伝導などとの関わりが注目されている。そこで、このような系を記述する最も簡単化した模型として希土類イオンのf電子と局所フォノンとの電子格子相互作用を考慮に入れた周期的アンダーソン模型(周期的アンダーソン-ホルスタイン模型)を考えた。この模型に対して、電子間のクーロン相互作用と電子格子相互作用を同等に且つコンシステントに取り扱える動的平均場理論を適用してその電子状態を調べた。この理論において必要となる有効媒質中の不純物アンダーソン-ホルスタイン模型の解法には、これまで研究代表者がホルスタイン-ハバード模型に適用してその有効性を確認した厳密対角化法を用いた。電子格子相互作用gの増大と共に準粒子の有効質量と格子の揺らぎが共に増大し、現実的なgの値に対して有効質量が10100倍程度の重い電子状態が実現する。また、電子数がユニットセル当たり2個のハーフフィルドで化学ポテンシャルが混成ギャップの中にある場合には、混成ギャップが繰り込まれて10100分の1程度に小さくなる近藤半導体が実現する。この時、f電子の状態密度には繰り込みによる幅の狭い準粒子バンドや小さな混成ギャップに加えて、多重フォノン散乱によるブロードなピークが新たに現れる。一方、フォノンのスペクトル強度の計算から、重い電子や近藤半導体が実現する場合には、フォノンの振動数が繰り込まれて10100分の1程度に小さくなる顕著なソフト化がおこることが判った。PrOs_4Pb_<12>などの充填スクッテルダイト化合物やCe_3Pd_<20>Ge_6などのクラスレート化合物では、カゴに内包された希土類イオンがオフセンターに複数の極小値を持つポテンシャルの中で局所振動(ラットリング)を示し、その重い電子状態や超伝導との関わりが注目されている。希土類イオンの局所振動と伝導電子との結合の効果を明らかにするため、f電子間のクーロン相互作用に加えてf電子と局所フォノンとの相互作用を考慮に入れた周期的アンダーソン・ホルスタイン模型を動的平均場理論により調べた。電子フォノン相互作用の増大と共に準粒子の有効質量が増大し、強結合領域では有効質量が100倍以上になる重い電子状態が実現する。それに伴って、強結合領域ではフォノンのソフト化や大きな格子の揺らぎが見られる。また、イオンの有効ポテンシャルを変分波動関数を用いて調べ、強結合領域では単純な調和ポテンシャルからdouble-well型ポテンシャルへと変形することがわかった。さらに、伝導電子間に働く有効相互作用を調べ、重い電子の形成され始めるところで超伝導を導く引力相互作用が最大となることがわかった。以上の結果は、PrOs_4Pb_<12>において電子フォノンの強結合効果による重い電子状態が実現している可能性を示唆すると共に、以前A15化合物に対してYuとAndersonによって提案された局所電子フォノン模型に対して電子フォノン相互作用を正確に取り扱い定量的な議論を初めて行った意義がある。
分節パターンを決定する反応拡散波-数理モデルを用いたアプローチ-

分節パターンを決定するメカニズムを解明する目的で、以下の2つの研究を行った1)ニワトリ胚の分節現象が反応拡散波の性質を有することを示す実験反応拡散系の特徴として、外科的なかく乱に対して修正作用を持つことがあげられる。体節形成に反応拡散の原理が働いているのであれば、胚を変形させても同じ大きさの体節を作れるはずであり、そのような現象が起きれば、他のモデル(clock and wavefront model)と区別をつけることができる。体節形成期のニワトリ胚をピンセットで物理的に伸張させ、細長い中はいようにしたところ、伸張度合いにかかわらず同じ大きさの体節ができることを確認した。これは、体節形成に反応拡散の原理が働いていることの傍証である。2)ゼブラフィッシュの模様形成遺伝子の探索ゼブラフィッシュの皮膚模様も自発的に成立する等間隔パターンである。同じ分子メカニズムが働いている可能性があると考え、模様形成遺伝子のクローニングを行った。これまでに、模様形成に関係する2つの遺伝子のポジショナルクローニングに成功している。Obelix変異は、縞の幅が広くなる変異を示す。原因遺伝子はKir7.1というKチャンネル分子であった。この遺伝子は色素細胞でのみ発現しており、また、変異体の遺伝子はKの透過性を失っていることがわかった。縞が斑点に変わる変異遺伝子レオパードのクローニングも行ったが、これはGAP JUNCTION関連の遺伝子をコードしていた。現在これら2つの遺伝子の変異がどのような機構で模様を替えているのか計算機によるモデル化を行っている。1ゼブラフィッシュの模様形成遺伝子の同定皮膚の模様に関与する突然変異が幾つか知られている。それらの幾つかはc-kitfamilyに属しており、このタイプのシグナル伝達系が模様形成に働いている可能性がある。そこでfamilyのうち、まだ変異体や遺伝子が取られていないVEGF,PDGFの遺伝子をクローニングし、それを卵に導入、発現させる実験を行っている。現在まで、クローニングと鰭部分への遺伝子導入発現を行った結果、VEGFに関してはメラノサイトのアポトーシスを誘導し模様が消えることが観察されたが、パターン自体の変化は観察されていない。2ゼブラフィッシュの皮膚構造・構成細胞の同定皮膚パターンを生じさせる「場」としての皮膚の微細構造について詳しく把握するため、皮膚切片の電子顕微鏡による解析を行い、皮膚の層状の構造、各層に存在する細胞の種類が同定された。また多層からなる皮膚のどこに位置情報場の存在する色素細胞が存在するのかを知るためメラノサイト移植を行い、位置情報場が皮膚の非常に限られた部分にのみ存在することを発見した。3ニワトリ体節形成に反応拡散系が働いていることの証明ニワトリの体節形成時にhairyなどの遺伝子の発現パターンが波状に移動するが、このダイナミクスはチューリングモデルで良く説明できる。今回、体節形成直前の中胚葉細胞に対して外科的な処置を行い、パターンの再性現象を観察した結果、計算機シミュレーションとの比較よりチューリングモデルが良く成り立っていることがわかった。脊椎動物の体節の長さがどのようにして決定されるかについては、2つの異なる理論が提唱されている。そのどちらがより妥当かを調べるため、胚に人為的な変異を加えた状態で発生させ、その結果をシミュレーションによって解析した。ニワトリ胚を物理的に伸張させて発生させた場合、伸びた体節ができるのでなく、正常な長さの体節が数多くできることが解った。体節の部位特異的に発現する遺伝子や、Hox遺伝子等の発現状態を解析した結果、位置情報が反応拡散でできると仮定したときのシミュレーションの結果と一致し、体節形成の位置情報が反応拡散の波でできていることを示唆した。また、ゼブラフィッシュの胚を用いて、低温化での体節形成時に分節遺伝子がどのようなパターンで発現するかを解析したその結果、通常の温度ではPSMの尾部で発現が振動しているher1等の分節遺伝子が、低温化では振動しなくなることが解った。この結果はもう一つのモデルであるCWモデルとは決定的に相容れないが、RDモデルでは説明できるため、この結果も反応拡散による体節の分節位置の調節を示唆した。脊椎動物の分節パターンを決定する位置情報が反応拡散波であるという仮設の下に実験および数値計算による解析を行っている。また同一の原理(反応拡散波)が働いていると推定される「魚の模様」を作る分子原理の解析を行っている。1)マウスの体節形成にかかわる遺伝子のKO実験(相賀研究室)により、各遺伝子を失った時に起きる変異が報告されている。体節形成ではDelta1,Delta3の2種類のリガンドの働きが重要とされており、どちらの遺伝子をKOしてもパターンはできない。またDelta1のにあるpresenelinをKOしてもパターンはできない。しかしpresenelinKOマウスでさらにDelta3の遺伝子をヘテロにすると、不完全ながらも等間隔パターンが復活する。この現象は現在有力と考えられているcw説では説明できないが、我々の計算によると反応拡散原理でD1をactivatgr, D3をinhibitorとすると簡単に説明されることがわかった。2)魚の皮膚に反応拡散機構が働いていると仮定すると、拡散に影響を与える障害物として鱗の存在がある。鱗は方向性を持って皮膚に挿入されているため、拡散に異方性を与える可能性が高い。反応拡散系において拡散異方性が縞模様の向きに与える影響を計算したところ、約5%の異方性で縞模様の向きが決定できることがわかった。

この結果近縁の魚でも縞の模様の向きが極端に違う現象をうまく説明できる。3)ゼブラフィッシュの皮膚に存在する各細胞種の同定、皮膚内での存在様態、組織培養状態での動態についての解析を進めている。特に鰭の細胞は、種類が少ないにもかかわらず完全な模様を作れるため、将来in vitroで縞模様を作らせるための基本的な情報を得るのに適していることがわかった。体節形成に関して前年度までに、ニワトリの予定体節中胚葉を物理的に引き伸ばしても同じ間隔で体節が出来ることを実験的に示したが、これだけではチューリング波が体節の形態形成を決めているという決定的な証拠にはならない。チューリング波の存在を直接的に示すには、どうしても遺伝子振動のリアルタイム可視化が必要という結論に達した。現在、理研BSIの宮脇研と共同して、細胞内リン酸化のFRETによるリアルタイム観測を行えるraichuのシステムをニワトリ胚に導入することを試みている。(ニワトリ培養細胞では、何とか観測できるようになったが、胚ではまだ成功していない。)ゼブラフィシュ皮膚模様に関してポジショナルクローニングを行っていた2種の模様変異(leopard, Jagure)のうち幅広模様を作るjagure遺伝子のゲノム状の位置を特定し、もっとも近くにある遺伝子にアミノ酸変異を起こす点突然変異があることを確認した。今後、この領域を含むBacクローンによるレスキューを行い、これが原因遺伝子であることを確認する。また、レーザーによって任意の色素細胞を破壊し、その後のパターン再生を観測する実験系を確立した。再生バターンを解析した結果、色素細胞間には、近距離・遠距離の2種類の相互作用が存在することが明らかとなった。レーザー再生実験からわかった色素細胞間の相互作用を計算機に入力し、シミュレートすることにより、ストライプ・スポット等の模様が形成されることを確認した。現在それぞれの色素細胞特有に発現しているシグナル分子をクローニングしていくことで、相互作用の基になっている分子を特定したい。分節パターンを決定するメカニズムを解明する目的で、以下の2つの研究を行った1)ニワトリ胚の分節現象が反応拡散波の性質を有することを示す実験反応拡散系の特徴として、外科的なかく乱に対して修正作用を持つことがあげられる。体節形成に反応拡散の原理が働いているのであれば、胚を変形させても同じ大きさの体節を作れるはずであり、そのような現象が起きれば、他のモデル(clock and wavefront model)と区別をつけることができる。体節形成期のニワトリ胚をピンセットで物理的に伸張させ、細長い中はいようにしたところ、伸張度合いにかかわらず同じ大きさの体節ができることを確認した。これは、体節形成に反応拡散の原理が働いていることの傍証である。2)ゼブラフィッシュの模様形成遺伝子の探索ゼブラフィッシュの皮膚模様も自発的に成立する等間隔パターンである。同じ分子メカニズムが働いている可能性があると考え、模様形成遺伝子のクローニングを行った。
糖尿病性腎症の増悪因子であるアポE2遺伝子・高レムナント血症と薬剤介入

目的はわれわれの見出したアポE2遺伝子、高中性脂肪血症/高レムナント血症が糖尿病性腎症を増悪させる機序を、また薬物の効果を検討することである。アポE2遺伝型を有する糖尿病患者由来レムナントリポ蛋白が培養ヒト腎メサンギウム細胞に対してTGF-βおよび細胞外基質のmRNAを増加させることを明らかにした。さらにPPARαのリガンドであるフィブラート薬がレムナントリポ蛋白によるTGF-βおよび細胞外基質のmRNAの増加を抑制することが判明した。フィブラート薬は糖尿病患者において血中レムナントを低下させ、また腎メサンギウム細胞に直接作用して糖尿病性腎症を防御する。以前、われわれはアポE2遺伝子が糖尿病性腎症を増悪させる遺伝子であることをはじめて見出した。アポE2遺伝子は高脂血症関連遺伝子であり、血中レムナントリポ蛋白や中性脂肪(TG)を増加させる遺伝子である。レムナントリポ蛋白はTG-rich、コレステロールrich、アポE-richで動脈硬化惹起性リボ蛋白として知られていた。したがってアポE2遺伝子が糖尿病性腎症を増悪させる機序として、レムナントリポ蛋白が増加し、これが腎障害を起こしている可能性が最も考えられる。日本人糖尿病患者数を740万人とすると、その約7%すなわち数十万人がアポE2遺伝子を有し、高TG血症、高レムナント血症を呈しやすい腎症ハイリスク群ということになる。本研究の目的はアポE2遺伝子、高レムナント血症が糖尿病性腎症を増悪させる機序を明らかにすること、そしてアポE2遺伝子と関連した高TG血症、高レムナント血症を薬物によって抑制することにより、糖尿病性腎症の進展を抑えることができるかどうかを検討することである。培養した正常ヒト腎メサンギウム細胞とアポE2を有する糖尿病性腎症患者より得たレムナントリポ蛋白をincubationし、腎メサンギウム細胞へのリポ蛋白の取り込み能を検討した結果、取り込み能の増加が確認された。この系におけるスカベンジャ-受容体、LDL受容体、VLDL受容体の関与についてRNA interference法により検討した結果、VLDL受容体が関与することが明らかになった。さらに、正常ヒト腎メサンギウム細胞と糠尿病患者由来アポE2-レムナントリポ蛋白とのincubation実験において、アポE2-レムナントリポ蛋白が培養ヒト腎メサンギウム細胞に対してTGF-βおよび細胞外基質のmRNAを増加させることをRT-PCR法により明らかにした。これらの検討によりアポE2-レムナントリポ蛋白が腎糸球体硬化、糖尿病性腎症増悪をさせる機序を明らかになった。現在、フィブラート薬やスタチン薬がこの系において防御的に作用するか検討中である。レムナントリポ蛋白はTG-rich、コレステロールrich、アポE-richで動脈硬化惹起性リポ蛋白として知られていた。培養した正常ヒト腎メサンギウム細胞とアポE2を有する糖尿病性腎症患者より得たレムナントリポ蛋白をincubationし、腎メサンギウム細胞へのリボ蛋白の取り込み能を検討した結果、取り込み能の増加が確認された。さらに、正常ヒト腎メサンギウム細胞と糖尿病患者由来アポE2-レムナントリポ蛋白とのincubation実験において、アポE2-レムナントリポ蛋白が培養ヒト腎メサンギウム細胞に対してTGF-βおよび細胞外基質のmRNAを増加させることをRT-PCR法により明らかにした。

今回、フィブラート薬(ベザフィブラート)をこの系に添加する実験を行った結果、PPARαのリガンドであるフィブラートがアポE2-レムナントリポ蛋白によるTGF-βおよび細胞外基質のmRNAの増加を抑制することが判明した。フィブラート薬は糖尿病患者において血中レムナントを低下させ、また、腎メサンギウム細胞に直接作用して、糖尿病性腎症を防御するであろう。
高齢ドライバーの交通適合性に関する研究

高齢ドライバー(65歳以上)7名、若年ドライバー31名について走行実験を行なった。被験者は公道にて先行車(測定車)を種々の課題の元に追従走行するよう求められた。課題としては走行速度50,60,80km/hの3条件において「走りよい距離」「最小安全距離」などの造成を求めた。走行実験後には安全運転態度検査、危険感受性テストなどが同被験者に行なわれ、追従走行行動特性とその背景にある心理的特性との関連を検討するための資料とした。主な結果は次の通りである。:(1)危険を感じ始める距離は若年者は高齢者の1/2である。(2)心理的ゼロ点(近すぎも遠すぎもしない距離)は年代間で差がない。(3)被験者によって走行速度を造成距離との関係において次の3つタイプが認められた。(1)走行速度の増減に伴い車間距離も増減。(2)速度の変化にかかわらず一定距離で走行。(3)速度と距離の関係は必ずしも直線的でなく道路環境の相違によって調整。若年者・高齢者共に第1のタイプが最も多く認められたが、若年者にあっては高齢者に見られなかった第2のタイプが観察された。このタイプは車間距離も狭く、安全運転態度検査においても不安全な傾向を示す運転者であった。第3のタイプはそれに対して安全運転者としての心理的特性を示す運転者が多かった。高齢者は安全運転態度においても追従行動特性においても安全運転者としての特性を多く示すことが認められたが若年運転者が安全と感じる距離を高齢者は危険な距離と感じるなど、危険知覚特性が異なることによる行動のズレは大きい。このような年代間の非等質性は交通コンフリクト現象の原因として問題となり、互いの行動特性、心理特性の理解を含んだ安全運転教育等の対策に折りこまれることが有効と思われる。
ゲノム研究基軸放線菌における抗生物質生合成遺伝子機能の網羅的解析

(研究目標)ゲノム研究基軸放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)の生産する抗生物質に注目し,その生合成を司る構造遺伝子群の機能・制御を解析し,二次代謝制御を通じた遺伝子ネットワーク解明に資する。(今年度の研究成果)抗生物質の構造多様性の源となる立体化学制御を司るケト還元酵素遺伝子の機能同定に成功している。その基質認識機構を探るべく、還元酵素の3次元構造をホモロジーモデリング法により予測し、有意なモデルを得ることができた。その結果、酵素活性発現に必須と予想されるアミノ酸残基が見出されたので、反応機構の詳細を探るべく化学的に不安定な基質に代わるアナログ基質類を合成し、これらを用いて各酵素の大腸菌での発現・精製・性状等の生化学的解析を進め、組換えタンパクによる還元活性の検出に成功した。活性を与える基質について種々検討したところ、酵素結合型アナログに比較して、酵素非結合型アナログ(フリーアシッド型)が基質として遥かに優れていることが判明した。このことは、タイプII型ポリケタイド合成酵素が関与する生合成酵素間の基質チャネリングを解明する上で重要な知見であると考えられる。また、モデリングの結果から示唆された活性発現に必須と予想される残基(ヒスチジン、グルタミン酸)に関して点変異導入を行ったところ、組換えタンパクによる還元活性が消失または大幅に低下することを見出し、モデリングの結果が妥当であることが示された。また、比較ゲノム研究の一環として同種の立体化学制御に関与すると推定される遺伝子を異種放線菌よりクローニングすることにも成功した。
セメント系改良地盤上の盛土構造物の安定性に関する研究

最初に、普通ポルトランドセメント、高炉セメントにより土質改良された有明粘土の強度・変形特性について実験的に検討し、次の様な結果をえた。(1)両改良土の圧縮応力と圧縮ひずみ、側方ひずみと圧縮ひずみの関係は、圧縮応力が圧縮強度の8090%に至までは線形である。(2)材令28日以下の改良土の変形係数E_<50>は圧縮強度alpha_Cに比例する。普通ポルトランドによる改良土でE_<50>=132alpha_C、高炉セメントによる改良土でE_<50>=153alpha_Cとなる。(3)改良土のポアソン比は、普通ポルトランドによる改良土で0.00.10、高炉セメントによる改良土で0.050.15の範囲にある。次に、セメント系固化材により土質改良された有明粘土改良土地盤上に築造されている盛土の安定性について検討した。具体的には、有限要素法(FEM)により地盤の応力・変形(圧密)解析を行い、地盤の変形(沈下)および地盤内応力について、現場観測データと比較検討し、以下のような結果をえた。(1)改良地盤は不等沈下を生じ、沈下量は最大約1.2mになると予測された。沈下速度については、圧密試験から求まる透水係数の5倍の値を使用した解析結果と現場観測結果がほぼ一致した。この結果、改良地盤の沈下は今後約2年間は継続する。(2)盛土中に発生した改良地盤の断面急変部におけるクラックが、曲げに起因する大きな引張応力の発生よることがFEM解析から明らかとなった。
商品デザインの保護に関する知的財産法横断的考察――競争政策を手掛かりに

1概要...本研究は4年計画で実施するものであり、今年度はその3年目に当たる。交付申請書の「実施計画・方法」に従い研究を実施した。具体的には、規制の根拠を「混同」に求めるのか「不正使用」に求めるのかの問題(具体的テーマ2)、および、2機能等の特性から他者の使用が容認される商品デザインに関する問題(同3)である。なお、実施の順序を一部変更し、具体的テーマ4の機能等の特性から他者の使用が容認されるデザインに関する問題に取り組んだ。2具体的成果...今年度、研究成果として公表した論文とその内容・意義は次のとおりである。(1)「商品展示会に出展された試験管様の加湿器に関して、1「他人の商品」(不正競争防止法2条1項3号)該当性および保護期間(同法19条1項5号イ)の始期について、2応用美術の著作物性について、それぞれ判断がなされた事例」判例評論713号(判例時報2368号)177頁:本稿はスティック加湿器事件控訴審(知財高判平成28年11月30日)の判例研究である。商品デザインの保護について、不競法と著作権法の両面から保護の可能性が争われたものであり、本研究の具体的テーマ1と関連が深い。(2)「書体の著作物」著作権判例百選〔第6版〕(別冊ジュリスト242号)20頁:本稿は最判平成12年9月7日(ゴナU事件)の判例研究である。書体は応用著作物としての性格もあり、意匠法との関係についても触れた。デザインの保護について不競法と著作権法の両面から保護の可能性が争われた事例であり、本研究の具体的テーマ1と関連が深い。(3)「組立て式棚の形態の商品等表示該当性」速報判例解説(法学セミナー増刊)24号259頁:本稿はユニットシェルフ事件(知財高判平成30年3月29日)の判例解説である。本稿では「競争上似ざるを得ない形態」について検討をおこなっており、本研究の具体的テーマ4と関連が深い。本年度、研究代表者は所属機関を変更した。それに従い、新たに研究環境を整備する必要が生じたため、若干の研究の遅れが生じた。本研究の最終年度に当たる次年度では当初の研究計画に従い、具体的テーマ14の考察結果を総合して分析・検討を行った上で、具体的成果を論文等の形で公表する。また、その前提として、やや分析・検討が遅れている具体的テーマ2および3についても、別途、成果を公表したいと考えている。1概要...商品デザインを保護する代表的な知的財産法には、意匠法、不正競争防止法、著作権法、商標法がある。本研究は、そうした個々の法律を独立して取り上げるのではなく、商品デザインの保護について知的財産法を横断的に考察するものである。本研究は4年計画で実施するものであり、今年度はその1年目に当たる。交付申請書の「実施計画・方法」に従い、今年度は4つの具体的テーマのうち、1著作権法と意匠法の棲み分けの問題、2商品デザインを商標法で保護することの問題、に取り組んだ。そのため、必要な資料の収集・整理、企業実務家や弁護士、研究者に対するヒアリング、研究会への出席等を行い、その後、それらをまとめて論文等を執筆・公表した。(1)「周知商標をパロディ的に使用した登録の可能性」速報判例解説(別冊法学セミナー)20号277頁:本稿はフランク三浦事件(知財高判平成28年4月12日)の判例研究である。本件ではいわゆるパロディ商標の登録可能性が、商標法4条1項10号、11号、15号、19号との関係で問題となったが、知財高裁がそのいずれにも該当しないとして登録が認められたものである。本件は、商品デザインの1つの構成要素となり得るパロディ商標の登録の是非および権利の範囲といった重要な問題と関連している。(2)「展示会への出展品の形態模倣と不正競争防止法2条1項3号」L&T75号73頁:本稿はスティック形状加湿器事件(知財高判平成28年11月30日)の判例研究である。本稿では本件で争点となった不正競争防止法における「3号の保護期間の開始時期」および「保護期間の終期の起算点」の問題を中心に論じたが、商品デザインの著作権法による保護、その際に生じる意匠法との棲み分けの問題を分析・検討する際の有益な素材となるものである。本年度は本研究課題の4つの具体的テーマのうち、1著作権法と意匠法の棲み分けの問題、2商品デザインを商標法で保護することの問題を取り上げることとしていた。そして、具体的作業として両テーマについて、必要な資料の収集・整理、企業実務家や弁護士、研究者に対するヒアリング、研究会への出席等〔Step1〕、テーマ1については、それら資料や知見の分析・検討〔Step2〕を計画していた。実際の作業として、関連する資料(国内外の図書、雑誌、審判決例、政府・公共機関・シンクタンク等が作成した報告書等)の収集(適宜、他大学の附属図書館や国会図書館に出張した)、研究会への出席・発表(主なものとして知的財産判例研究会(比較法研究センター主催)、同志社大学知的財産法研究会)、他の研究者や実務家(弁護士、弁理士、企業の実務家)との意見交換などを行った。

テーマ1およびテーマ2のいずれについても、部分的ではあるにせよ、上記「研究実績の概要」に挙げたとおり、具体的成果を公表すること(この作業はStep3に当たり、テーマ1・2とも、次年度に計画していたものである)ができたことは、本研究が概ね順調に進展していることの証左である。他方で、テーマ1のうち、トリップ・トラップ(TRIPP TRAPP)事件控訴審判決(知財高判平成27年4月14日)以降も相次いで出されている応用美術や実用品を巡る著作権法分野の判例の動向を分析・検討する成果、また、テーマ2については、パロディ商品以外の商品デザインについて分析・検討した成果を公表するには至らなかった。1概要...本研究は4年計画で実施するものであり、今年度はその2年目に当たる。交付申請書の「実施計画・方法」に従い、研究を実施した。具体的には、1著作権法と意匠法の棲み分けの問題について成果の発表、2商品デザインを商標法で保護することの問題について成果の発表、および3規制の根拠を「混同」に求めるのか「不正使用に求めるのか」の問題について資料の収集・整理等である。そのため、必要な資料の収集・整理、企業実務家や弁護士、研究者に対するヒアリング、研究会への出席等を行った。2具体的成果...今年度、研究成果として公表した論文とその内容・意義は次のとおりである。(1)「リサイクル品トナーカートリッジの製造販売と品質誤認(不競法2条1項14号)および商標権侵害」速報判例解説(法学セミナー増刊)22号255頁:本稿はリサイクル品インクカートリッジ事件(大阪地判平成29年1月31日)の判例研究である。本件は商品の表示に関するものでありデザインに関する事案ではないが、不競法と商標に跨るものであり、本研究の具体的テーマ3と関連が深い。(2)「商品展示会に出展された試験管様の加湿器に関して、1「他人の商品」(不正競争防止法2条1項3号)該当性および保護期間(同法19条1項5号イ)の始期について、2応用美術の著作物性について、それぞれ判断がなされた事例」判例評釈(校正中):本稿は知財高判平成28年11月30日(スティック加湿器事件)の判例評釈である。商品デザインの保護について、不競法と著作権法の両面から保護の可能性が争われた事例であり、本研究の具体的テーマ1と関連が深い。本年度の研究について計画と実績とを比較すると、1著作権法と意匠法の棲み分けの問題について成果を発表するという点では、現在校正中ではあるものの、前掲「研究実績の概要」2(2)を執筆した。また、3規制の根拠を「混同」に求めるのか「不正使用に求めるのか」の問題について資料の収集・整理等するという点でも、同上・2(1)を公表した。しかしながら、いずれも、判例研究であり、総合的な研究というには不十分である。また、2商品デザインを商標法で保護することの問題について成果の発表を行うという点では、昨年度の積み残しである「立体商標以外の問題について」は全く着手することができなかった。このことの主たる理由は2つある。1つは、研究科長に就任したため、2つ目は所属機関を平成30年度から変更予定であったたため、研究時間の物理的な不足である。
ぶどう膜炎に対する眼内への遺伝子導入による治療法の開発

今回の研究期間において、まず眼内への遺伝子導入法の基礎研究を行った。その結果、LacZを示標としたアデノウイルスベクターをラット前房内に入れた場合、主に角膜内皮細胞に、また硝子体腔内に入れた場合は網膜神経節細胞に遺伝子が導入されたが、毛様体、脈絡膜への取り込みはみられなかった。硝子体内へ注入した場合でも、ぶどう膜、網膜への遺伝子導入は見られなかった。ラットに実験的自己免疫性ぶどう膜炎を惹起して同様の実験をおこなった。炎症眼では角膜内皮細胞、前房隅角組織への遺伝子取り込みはむしろ抑制されることが明らかになった。毛様体、脈絡膜への取り込みはやはりみられなかった。しかし、網膜下に注入した場合は、網膜色素上皮細胞や炎症眼では炎症細胞に遺伝子が導入された。臨床の場では網膜下投与は困難であり、さらなる投与経路とベクターの検討が必要と考えられた。また眼周囲組織でも導入遺伝子の効果の発現を見るため、VEGFレセプターの一つであるflt-1を分泌するアデノウイルスベクター(AdfltFc)をin vivoに投与し、マウス眼瞼腫瘍の発育を調べると発育抑制効果が見られた。眼周囲組織へ効果が及ぶことがこの系では明らかになった。次にぶどう膜炎の炎症における遺伝子治療の標的を決める目的でノックアウトマウスを用いた実験をおこなった。CD8分子を欠損したマウスではEAUの発症がより早期になり増強する傾向があった。またMCP-1の受容体であるCCR2分子の欠損マウスではリンパ球に代わって好中球が眼内に浸潤した。これらの機能分子がぶどう膜炎の病態を変化させることが示された。これらの結果は眼内での炎症反応を制御する遺伝子治療のターゲットとして、今後の治療モデルの開発につながる可能性が示された。In vivoでの遺伝子導入法が本研究のポイントとなるため、本年度は眼組織細胞内への遺伝子導入の効率を検討した。ルイスラットにIRBP(interphotoreceptor retinoid binding protein)抗原ペプチドで実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を生じさせ、lacZ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターの注入を行った。対照眼では前房内に入れた場合、主に角膜内皮細胞、前房隅角組織に遺伝子が導入されたが毛様体、脈絡膜への取り込みはみられなかった。一方、炎症眼では角膜内皮細胞、前房隅角組織への遺伝子取り込みはむしろ抑制され、毛様体、脈絡膜への取り込みはやはりみられなかった。網膜下に注入した場合は、網膜色素上皮細胞や炎症眼では炎症細胞に遺伝子が導入された。網膜下投与臨床応用が困難であるため硝子体腔や毛様体へのベクターの直接注入、リポゾームによる注入を行って検討を重ねた。硝子体内へ注入した場合、ぶどう膜、網膜への遺伝子導入は見られなかった。硝子体切除眼では一部遺伝子導入が見られたが導入効率は不安定であった。毛様体など前眼部ぶどう膜組織への遺伝子導入にベクターの投与経路に更なる工夫を要すると考えられ、現在毛様体、脈絡膜へ効率よく導入させる目的でベクターを眼内へ注射後、直接毛様体、あるいは上脈絡膜腔へ電極を刺入して電撃を加えるelectroporation法を組み合わせて試行中である。In vivoでの遺伝子導入法が本研究のポイントとなるため、本年度も引き続き眼組織細胞内への遺伝子導入の効率を検討した。ラット眼を用いて前房内や硝子体内へ注入した場合、毛様体、脈絡膜への遺伝子導入効率は良くない。