hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
らせん構造による微量不斉源のキラル増幅現象を活用した不斉多成分連結反応への挑戦

本年度は、反応基質として用いる側鎖にカルボン酸を有する一方向巻きらせん構造のポリ(ジフェニルアセチレン)を溶液中で安定に扱う手法を確立した。その結果、アキラルなアンモニウム塩とのイオン対形成を利用することによって、反応に必要な溶解性の改善と同時にらせん構造の安定性が飛躍的に向上することを明らかにした。さらに、同ポリマーのキラル増幅現象を明らかにするために、モデルとして光学純度の異なるキラル置換基を側鎖に有するポリ(ジフェニルアセチレン)を合成し、加熱操作によりらせん構造を誘起した際の誘起円二色性(ICD)を評価した。その結果、前例のないらせん反転を伴う異常なキラル増幅現象が発現することを見出した。さらに、同現象は温度や溶媒などのらせん誘起の際の条件を変えることにより、その非線形特性を制御可能であることも見出した。このように用いるらせん高分子の特性を明らかにした上で、多成分連結反応によるらせん高分子側鎖の化学修飾を行った。カルボン酸を有するポリ(フェニルアセチレン)に対して、キラルリン酸を触媒としてPasserini反応を行ったところ、良好な置換度で多成分連結反応が進行することが確認された。しかし、生成ポリマーがCD活性を殆ど示さないことから、本反応の不斉選択性は高くない可能性が示唆された。また、反応中にポリマー主鎖の異性化反応が起こり、主鎖の立体規則性が低下している可能性が確認された。そこで、化学的安定性の高いポリ(ジフェニルアセチレン)を用いて、多成分連結反応を行ったところ、立体的にかなり混み合っているにも関わらず、比較的良好な置換度で反応が進行していることが確認された。今後、同ポリマーに対して高置換度かつ高い不斉選択性を示す触媒系を見出すことによって、本研究で見出した新規キラル増幅現象を利用したキラルマテリアルの開発が可能になることが期待される。近年、コンビナトリアル化学の成熟に伴い、三成分以上の基質が単一の生成物へと収束する反応(多成分反応)の重要性が認識されている。医薬品や機能性材料の創成において不斉合成反応が求められており、多成分連結反応においても同様に有効な不斉合成手段の構築が求められている。一方で、反応に関与する基質の多さから、多成分連結反応の反応機構は不明瞭であることが多い。この問題を解決するため、本研究ではらせん高分子が特異的に示す不斉増幅現象に着目した。らせん高分子は強力な不斉場を形成し、かつ高分子効果によりその不斉特性を増幅可能であり、不斉らせん高分子上で多成分連結反応を行うことで、少ない不斉源からの効率的な多成分連結反応が可能であると仮定した。上記の研究計画を遂行するため、本年度は反応性基を有するらせんポリマーの設計・合成を行った。達成すべき不斉多成分連結反応としてPasserini反応をモデル反応として選択した。これは、Passerini反応が高分子合成に有用であることが既に知られており、さらに必要な反応基質としてらせん高分子に導入が容易なカルボン酸を用いるためである。以上を考慮し、カルボン酸を側鎖に有するらせんポリマーの合成を行った。具体的には、側鎖にカルボン酸を有するポリ(フェニルアセチレン)およびポリ(ジフェニルアセチレン)誘導体を合成した。その結果、反応性基を有する一方向巻きのらせん高分子の合成に成功し、らせん高分子上での不斉多成分連結反応を検証可能な状況となっている。本年度はらせんポリマー上での多成分連結反応を可能にする、らせん高分子の設計および合成に注力した。はじめに、多成分連結反応の足がかりとなる反応性基の選定を行った。当初の計画通り、らせん高分子に芳香族アミノ基の導入を目指したが、アミノ基含有モノマーの重合が進行しなかった。このため、Passerini三成分連結反応の足がかりとなり得るカルボン酸に着目した。さらに、不斉多成分連結反応への応用展開を考慮し、らせん構造の性質が異なる二種類のらせん高分子に着目した。つまり、溶液中で動的ならせん構造を取り得るポリ(フェニルアセチレン)誘導体および溶液中で動的かつ静的ならせん構造を取り得るポリ(ジフェニルアセチレン)誘導体の二種類のポリマーを基本骨格とした。ポリ(フェニルアセチレン)誘導体の場合には、らせん構造の動的な性質から、少量のキラルコモノマーとの共重合を行った。具体的には、4-エチニル安息香酸とL-アラニン含有モノマーとの共重合により、カルボン酸を有する一方向巻きらせんポリマーを合成することができた。一方、ポリ(ジフェニルアセチレン)誘導体の場合には、らせん誘起と記憶の手法により光学活性アミンとの相互作用を利用してカルボン酸を有する一方向巻きのらせんポリマーを合成した。以上を総括し、本年度は本研究目的の達成に必要な側鎖にカルボン酸を有する一方向巻きらせん構造のポリ(フェニルアセチレン)およびポリ(ジフェニルアセチレン)誘導体の合成に成功し、不斉多成分連結反応への応用を指向した上で最も重要な基盤を構築出来たと判断している。

さらに、同ポリマーのキラル増幅現象を明らかにするために、モデルとして光学純度の異なるキラル置換基を側鎖に有するポリ(ジフェニルアセチレン)を合成し、加熱操作によりらせん構造を誘起した際の誘起円二色性(ICD)を評価した。その結果、前例のないらせん反転を伴う異常なキラル増幅現象が発現することを見出した。さらに、同現象は温度や溶媒などのらせん誘起の際の条件を変えることにより、その非線形特性を制御可能であることも見出した。このように用いるらせん高分子の特性を明らかにした上で、多成分連結反応によるらせん高分子側鎖の化学修飾を行った。カルボン酸を有するポリ(フェニルアセチレン)に対して、キラルリン酸を触媒としてPasserini反応を行ったところ、良好な置換度で多成分連結反応が進行することが確認された。しかし、生成ポリマーがCD活性を殆ど示さないことから、本反応の不斉選択性は高くない可能性が示唆された。また、反応中にポリマー主鎖の異性化反応が起こり、主鎖の立体規則性が低下している可能性が確認された。そこで、化学的安定性の高いポリ(ジフェニルアセチレン)を用いて、多成分連結反応を行ったところ、立体的にかなり混み合っているにも関わらず、比較的良好な置換度で反応が進行していることが確認された。今後、同ポリマーに対して高置換度かつ高い不斉選択性を示す触媒系を見出すことによって、本研究で見出した新規キラル増幅現象を利用したキラルマテリアルの開発が可能になることが期待される。次年度は本年度の成果を活用し、らせん高分子に対する多成分連結反応に軸足を移す。多成分連結反応として、カルボン酸を反応基質とするPasserini三成分連結反応およびUgi四成分連結反応の活用を想定している。らせん高分子に対する多成分連結反応の反応効率をNMRやIRなどの各種測定によって詳細に調べ、反応条件と反応効率との相関を明らかにする。次に、多成分連結反応により化学修飾されたらせん高分子の分解反応を行い、側鎖構造から対応する目的化合物を単離する。そのエナンチオマー過剰率をキラルHPLCにより調べ、ポリマー主鎖のらせんキラリティーが効率的に不斉多成分連結反応へと転写されているのかを評価する。反応条件とエナンチオマー過剰率との相関を明らかにし、その結果を反応条件にフィードバックすることで、より高効率な不斉多成分連結反応の実現を目指す。また、多成分連結反応を利用した新しいらせん高分子の機能性材料としての応用を目指し、得られたらせんポリマーをHPLC用のキラル固定相として応用し、そのキラル識別能を調べる。さらに、得られる新規らせんポリマー誘導体の熱特性などの諸物性を、示差走査熱量測定や熱重量測定などにより詳細に調べ、新しい高分子材料としての評価を行う。上記を総括し、来年度以降はキラルらせん高分子を反応場とした高効率な不斉多成分連結反応の達成および、それに基づく新しいらせん高分子材料の創成を目指す。(理由)経費は当初計画に沿って使用されたが、使用品目の組み合わせ上、残額が0円とはならなかった。(使用計画)執行見込額と実支出額に僅かな差異が生じたが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、予定通り計画を進める。少額であるため、その他の費目として使用する。
頭部超音波による新生児中枢神経発達の評価(脳幹面積の発達変化)

中脳部面積を35例で経時的に測定した。うち、早期産AFD児を対象にした検討では、中脳部面積の生後の変化はHashimotoらの報告している胎児発育とほぼ同等の変化をすることが明らかとなった。染色体異常例で、MBAの低値が認められた。脳室周囲白質軟化症発症例には一定の傾向を認めず、周産期虚血性病変の評価には有用でないと考えられた。同時に測定した脳梁の前後径は測定値に脳梁形態に起因する個人差が大きく、絶対値での評価は不適であった。しかし、容易に安定した測定値が得られることにより、経時的な変化の評価には適していた。脳梁の変化率とその後の脳容積、発達との関連は今後の課題である。現在まで頭部MRIを新生児期と修正1歳時に14例で撮影したが、MRIによる脳容量計測とMBAの相関の検討(ピアソン検定を用いた)では、中脳部面積は受胎後週数35週で、平均2.12±0.16cm^2、受胎後週数40週で平均2.54±0.16cm^2、新生児期の脳容積は、大脳平均336.6±32.1cm^3、小脳平均24.4±5.0cm^3、修正1歳時、大脳730.1±81.5cm^3、小脳93.0±10.0cm^3であった。中脳部面積は35週時、40週時ともに1歳時の大脳容積と有意な相関を認めた(ともにp<0.05)。新生児期の脳容積および1歳時の小脳容積とは相関を認めなかった。中枢神経発育には有用な指標となる可能性があると考えられた。発達指数と中脳部面積、MRIによる脳容積との関連については今後検討をすすめる予定である。今年度25例の早産児において生後の中脳部面積の経時的変化を測定した。頭部超音波を用いた早産児の中脳部面積の測定は、侵襲が少なく繰り返し行えることがわかった。測定には7.5MHzのプローベを用いることで明瞭に中脳部を描出することが可能であった。合併症のない早産児における生後の中脳部面積の変化は、生後の低栄養や生理的な体重減少の影響を受けず、胎児発育と同等の変化をすることが明らかとなった。頭囲も同様の発育変化であったが、頭囲は頭蓋の形態や産瘤、骨重積などの影響で対象毎に測定値のばらつきが大きいため、絶対値での評価は困難と思われた。対象数は少ないが、子宮内発育遅延例や染色体異常例は中脳部面積が生下時より小さい傾向が、周産期虚血性脳障害受傷例は受傷後の中脳部面積の発育抑制が認められた。この所見は今後対象を増やして再現性があるか確認する必要がある。中脳部面積の変化を経時的に評価することは、児の中枢神経発育が順調であることを示すパラメーターとして有用である可能性が示唆された。対象のフォローアップは、乳児期の運動発達、予定日および1歳時の頭部MRI検査、1歳6カ月時の発達指数を評価している。新生児期の中脳部面積の絶対値や発達変化のパターンが、その後の中枢神経系の発達と関連するか、MRI所見を基に中脳部のみならず、大脳、基底核、脳幹、脳室などの形態計測を行い比較検討する予定である。また乳児期の発達や神経学的所見と、新生児期の中脳部面積の発達、MRI所見との関連を検討し、中脳部面積の測定が、機能的な面からも中枢神経発達の予測因子となりうるか検討したい。
歯冠形成に必須な細胞外マトリックスの産生と再構築に働く上皮-間葉相互作用の解明

自発的に不死化された間葉系細胞系を用いた歯胚の再生機構について、in vitro三次元歯胚器官培養法およびでin vivo細胞移植法を用いて行った。E14.5マウス歯胚から解剖学的に分離し、dispase IIとDNase Iを用いて酵素処理を行い、胚葉性上皮組織を得た。次に分離した胚葉性上皮組織と我々が樹立した象牙芽前駆細胞odontoblast-lineage cells(OLC)とをコラーゲンドロップ内で三次元的に再配置した。in vitro再構成培養系の開始後3日目でも、播種したOLCは円柱状の構造を保っていたが、2週間後になると、OLC細胞塊は外見的に上皮組織周囲で収縮した。次に、このような三次元的に再配置したOLC-上皮組織をマウスの腎皮膜下に移植し、2週間観察した。in vivoにおけるグループVI(胎生14.5日目の上皮組織とOLC)の組織切片は、コラーゲンを含んだ青色のデンチン層と脱石灰化した赤茶色のエナメル層とが明らかに区別された。GFP陽性の細胞は免疫組織染色法により移植部で観察でき、OLCがバイオ再生医学で形成した歯胚に存在していることが明らかになった。グループIVの組み合わせの内3分の2で、しかしながら、不規則な組織形成を観察した。OLCの球形の再構成体内には、GFP陽性領域に出現しており、in vitroで最もよく観察された。in vivo実験では、円形をした骨芽細胞様の細胞からなる骨様形成領域に囲まれたケラチン層が観察された。これらの結果から、移植した3分の1が歯組織に分化した。OLC由来GFP陽性の細胞は免疫組織染色法にて石灰化した歯胚に存在していることを証明できた。OLCは上皮-間葉系相互作用により機能を持った象牙芽細胞に分化したことが分かった。以上のことから、我々は歯再生実験において、OLCは歯間葉系組織に充分代替できる細胞であることが判明した。従って、我々が樹立したOLCは歯の分化・再生過程において有用な研究材料になると思われる。昨年度、エナメル芽前駆細胞を樹立した同様な方法でマウス胎児の歯牙の象牙芽細胞の形質を有しているpapilla細胞から継代培養して、不死化細胞を樹立した。この細胞を象牙芽前駆細胞(odontoblast-lineage cell (OLC))と命名した。象牙芽前駆細胞は、DSPやDMP1のような、象牙質の細胞外マトリックスタンパク質を産生していた。本年度の目的はin vivoで歯再生を達成するための最適な効率のよい細胞外マトリックス(足場)を開発することであった。そこで、これまでに我々の研究室で樹立したエナメル芽前駆細胞と象牙芽前駆細胞についてその機能発現に関する研究を行った。Matrigelはよく利用されているマトリックスである。ヌードマウスの皮膚にMatrigelに包埋したエナメル芽前駆細胞を移植したところ100%の細胞に石灰化が起こった。一方、Matrigelに包埋した象牙芽前駆細胞を同様にヌードマウスに移植しても組織学的に何も観察されなかった。そこで、PuraMatrix(水溶性の人工合成低分子ペプチドの水溶性ゲル)を用いたところ、6週間後に移植した象牙芽前駆細胞の約25%に有意な石灰化したコラーゲン塊が出現した。我々は2種類の前駆細胞の2次元共培養系を開発した。基底膜は歯根形成に必須であるので、ポリマー性膜の表面に基底膜をコートしたインサート上にPuraMatrix内に封入した細胞をサンドイッチ様に封入した培養法を考案した。予備実験では細胞外マトリックスの中に石灰化が観察された。このようにin vivoにおける実験は生理的な環境に即しているので有益な結果をもたらした。一方、in vitroでの上皮-間葉系細胞の混合実験は器官形成過程における相互作用(組織-細胞、細胞-細胞間の相互作用)を検討するために有力な手段となることが分かった。

in vivo実験では、円形をした骨芽細胞様の細胞からなる骨様形成領域に囲まれたケラチン層が観察された。これらの結果から、移植した3分の1が歯組織に分化した。OLC由来GFP陽性の細胞は免疫組織染色法にて石灰化した歯胚に存在していることを証明できた。OLCは上皮-間葉系相互作用により機能を持った象牙芽細胞に分化したことが分かった。以上のことから、我々は歯再生実験において、OLCは歯間葉系組織に充分代替できる細胞であることが判明した。従って、我々が樹立したOLCは歯の分化・再生過程において有用な研究材料になると思われる。
レーザー衝撃法による高密度格子欠陥導入・高密度結晶構造残存の機構解明とその応用

結晶構造の異なる5種類の材料に対してフェムト秒レーザを照射し照射後の金属組織変化および力学的特性変化を調べた結果、鉄、チタン、シリコンに関しては準安定構造が存在すること、また全ての材料に関して高密度の格子欠陥が形成されていることと硬度が上昇することが明らかとなった。純鉄に対してフェムト秒レーザの条件を変化させて照射し照射後の金属組織変化および力学的特性変化を調べた結果、フェムト秒レーザパルスのショット数が硬化深さおよび硬化率に影響を及ぼすことがわかった。応用研究項目であるプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザピーニング手法の開発に取り組み、材料の疲労特性を向上させられることがわかった。申請者らはこれまでに、新しい塑性加工プロセスとして“レーザー衝撃法"を提唱し、この手法を用いて固体内部に高密度の格子欠陥を導入し、また高密度結晶構造を残存させることに成功している。ところがこれらの機構は解明されておらず、またマクロな材料特性向上には至っていない。そこで本研究では、レーザーパラメーターと物性値の観点からこれらの現象を定量的に理解し、機構解明することによって、高密度格子欠陥導入過程と高密度結晶構造残存過程を同時に記述するモデルを構築することを目的とする。さらにこのモデルを用いて、これらの現象によるマクロな材料特性向上として高硬度化および圧縮残留応力付与の最適条件を見出し、本手法をプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザーピーニング手法として確立させる。本年度は、高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存現象を定量的に理解することとその機構解明を目的として、鉄(体心立方格子)、チタン(細密六方格子)、シリコン(ダイヤモンド構造)、アルミニウム(面心立法格子)、ニッケル(面心立法格子)の5種類の材料に対してフェムト秒レーザーを照射し、照射後の金属組織変化および力学的特性変化を調べた。その結果、鉄、チタン、シリコンに関しては準安定構造が存在すること、また全ての材料に関して高密度の格子欠陥が形成されていることと硬度が上昇すること、が明らかとなった。さらに、鉄、チタン、アルミニウムに関しては、フェムト秒レーザーを重ね合わせて照射することによって、圧縮残留応力が付与されることがわかった。申請者らは、これまでに新しい塑性加工プロセスとして“レーザー衝撃法"を提唱し、この手法を用いて固体内部に高密度の格子欠陥を導入し、また高密度結晶構造を残存させることに成功している。本年度は、高密度格子欠陥導入現象を定量的に理解することとその機構解明を目的として、純鉄に対してフェムト秒レーザーの条件(パルスエネルギー、ショット数)を変化させて照射し、照射後の金属組織変化および力学的特性変化を調べた。その結果、フェムト秒レーザーパルスのショット数が硬化深さおよび硬化率に影響を及ぼすことがわかった。また、表層約3um以内の領域には高密度転位を有するマイクロバンドが存在し、その領域は硬化領域に一致することがわかった。これらのことから、表層硬化の要因は、フェムト秒レーザー駆動衝撃波の繰り返し負荷に起因する高密度な転位進展構造の形成であると考えられる。さらに、衝撃波の繰り返し負荷に伴い局所的に転位堆積部が形成され転位の易動度に差異が生じ、これが転位堆積を助長することによってマイクロバンドが形成されると考えられる。本年度は、既に実施した高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存現象の定量的理解とその機構解明と、高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存過程のモデル構築に関する研究のさらなる深掘りを進めた。さらに、本研究計画実施後に計画していたフェムト秒レーザー駆動衝撃圧縮過程のその場計測による材料強度発現機構の解明に関する研究を前倒しで進めた。具体的には、フェムト秒レーザー駆動衝撃波による材料の圧縮過程における格子面間隔の挙動を高輝度超短パルスX線プローブで計測した。その結果、フェムト秒レーザー駆動衝撃圧縮後に形成される高密度の転位は、従来言われている増殖機構では無く、衝撃波頭背後での生成機構に基づくことがわかった。応用研究項目であるプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザーピーニング手法の開発に取り組み、材料の疲労特性を向上させられることがわかった。

純鉄に対してフェムト秒レーザの条件を変化させて照射し照射後の金属組織変化および力学的特性変化を調べた結果、フェムト秒レーザパルスのショット数が硬化深さおよび硬化率に影響を及ぼすことがわかった。応用研究項目であるプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザピーニング手法の開発に取り組み、材料の疲労特性を向上させられることがわかった。当初計画では、本年度は高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存過程のモデル構築に関する研究項目を実施する予定であった。本実施内容は当初の予定通り遂行することが出来た。さらに、次年度着手する予定だったプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザーピーニング手法確立に関する研究項目を開始することが出来た。その結果、これらの相乗効果によって研究計画全体が予定以上に進み、多くの成果を得ることが出来た。具体的には、今年度だけで英文論文誌に3本、和文論文誌に1本の論文が掲載された。このように、本研究は当初の計画以上に進展している。レーザー加工既に実施した高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存現象の定量的理解とその機構解明と、高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存過程のモデル構築に関する研究のさらなる深掘りを進めながら、応用研究項目であるプラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザーピーニング手法の早期確立を目指す。さらに、本研究計画実施後に計画していた新しい研究計画を前倒しで進める。すなわち、フェムト秒レーザー駆動衝撃圧縮過程のその場計測による材料強度発現機構の解明に関する研究である。具体的には、フェムト秒レーザー駆動衝撃波による材料の圧縮過程における格子面間隔と格子欠陥の挙動をそれぞれ高輝度超短パルスX線プローブおよび電子線プローブで計測することによって材料の塑性変形の起源を明らかにし、理想強度に関する統一的見解を得る。これらのプローブはそれぞれ別のプロジェクトで開発中であり、開発されたものを応用的に用いる。当初計画では本年度は高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存現象を定量的に理解することとその機構解明に関する研究項目を実施する予定だったが、次年度以降着手する予定だった高密度格子欠陥導入および高密度結晶構造残存過程のモデル構築と、プラズマ閉じ込め媒質を用いない新しいレーザーピーニング手法確立に関する研究項目を開始することが出来た。現在それらの成果を論文に纏めているところであり、具体的にはScience誌に1本、Applied Physics Letters誌に2本、Scripta Materialia誌に1本の論文を執筆中である。このように、当初の計画以上に進展している。平成26年度内に購入する予定であった材料の納品が遅れ、平成27年度に納品されることになったため。
成長ゾーンを有する肋骨・助軟骨移植片の自立的成長能に関する実験的研究

平成13年度は、成長ゾーンを有するcostochondral graftにおいて、遊離移植をいくつかの異なった移植床について行い、骨成長および骨代謝機構に違いがあるかどうか、形態学的、組織学的、生化学的および分子生物学的に解析した。幼若家兎の肋骨-肋軟骨部を用いて移植を行った。移植床としては、骨あるいは軟骨との接豫を有する点から頭蓋骨骨膜下、耳介軟骨軟骨膜下に移植し、血行による差を明らかにする点から背部皮下、大腿直筋筋肉内、肝臓内への移植を行った。(2)各遊離モデルと血管柄付移植モデルとの骨形成に関する形態学的および組織学的比較検討各移植床に遊離移植されたcostochondral graftを術後4,8,12,18,24週において長さを測定し成長曲線を比較検討した。X線上で形態学的に検討し、また脱灰および非脱灰研磨標本を作成し組織学的検討を加えた。(3)採取した検体から肋骨・肋軟骨接合部を取りだし、肋骨・肋軟骨接合部における生化学的および分子生物学的解析を行った。1)骨新生状態を各種タンパクの定量、Ca、Pの定量により行った。2)コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチンなどの細胞外マトリクスの発現を免疫組織学的手法にて、そのmRNAの発現をin situ hybridazationにより検討した。3)アルカリフォスファターゼ活性など骨形成に密接に関連する物質の活性の変化を抗体染色法、組織化学法により検討した。
3D内視鏡を用いた消化管機能の計測

消化管機能性疾患はよく遭遇する疾患で、消化管の運動や拡張の異常などが病態とされる。世界標準の検査は特殊で、日本では普及していない。我々は複眼内視鏡の3次元計測技術が消化管機能を計測できる可能性について基礎的技術検証を行い主に以下の結果を得た。1)消化管運動の検出:複眼内視鏡は2mm/sで移動する収縮波を1.74mm/s(誤差13%)と観測した。2)消化管拡張の検出:複眼内視鏡は直径20mmの円柱の直径を19.6mm(誤差3%)、直径20mmの半球の容積を1.9mm3(理論値2.09、誤差9%)と観測した。以上より、本技術は消化管機能を高精度に測定する可能性が示唆された。消化管の基本パラメータと蠕動を計測した。その過程で派生したアイデアから、消化管の3次元構造を広範囲に把握するパノラマ技術の開発に着手した。1)消化管の基本パラメータの計測:消化管の基本形状は円柱と半球である。円柱の直径および半球の容積を3次元内視鏡で算出した。i)円柱の直径メスシリンダーを測定対象として管腔径を計測した。3次元内視鏡で得られたデプスマップデータを円でフィッティングさせ、その円の直径を算出した。たとえば、直径実測値14mmに対し、計算値12mmの結果が得られた。ii)半球の容積3Dプリンターで各種大きさの半球を作成して容積を計測した。3次元内視鏡で得られたデプスマップデータをフィッティングせずに直接容積を算出した。たとえば、理論値0.88mlに対して計算値0.93mlの結果が得られた。2)消化管の蠕動の計測:消化管の蠕動を模倣するドライモデルとして、布地を下から電動ステージで圧迫する系を構築した。電動ステージを複数の速度で移動させて3次元内視鏡で観測、現在データを解析中である。3)3次元内視鏡のパノラマ:1)で円柱を3D内視鏡で撮影するとき、遠くのデプスマップは必然的に精度が落ちることが問題となった。内視鏡を移動させながら撮影してデプスマップを合成すればパノラマ写真と同じように、消化管の3次元構造を広範囲に把握出来る可能性に気付いた。円柱を対象にして合成技術の開発に取り組んでいる。1)研究遂行において当初の予想よりもコンピュータのプログラミングに多くの時間を要したため、期待した程の進捗が得られなかった。2)研究の途中で予想しなかった新しい課題(派生技術、スピンオフ)が発生し、それの対応に時間を要したため。3)当初予定していなかった特許申請を検討したため。4)研究環境が複数の施設に分散していたところを一カ所に集中させたが、その調整に時間を要したため。そのスピンオフとして消化管の3次元構造を広範囲に把握するパノラマ技術の開発に着手した。i)円柱の直径:3次元プリンターで任意の大きさの円柱を作成し、3次元内視鏡で得られたデプスマップデータから円の直径を1割以内の誤差で算出出来ることを確認した。今年度はさらに実際の生体の消化管を対象とした測定を行った。現在解析中であるが、たとえば直径50mmの円柱の内側に生体の消化管を張り付けて内腔を観測すると、直径40mm程度の結果が得られた。なお、胃壁はおよそ5mmの厚みである。ii)半球の容積:3次元プリンターで任意の大きさの半球を作成し、3次元内視鏡で得られたデプスマップデータから半球の容積を1割以内の誤差で算出出来ることを確認した。今年度はさらに実際の生体の消化管を対象とした測定を行い、現在解析中である。2)消化管の蠕動の計測:3次元プリンターで作成した蠕動波の波形を電動ステージで移動させ、3次元内視鏡で観測した。得られたデプスマップデータより蠕動波の頂点座標を算出すると1割以内の誤差で蠕動波の移動速度を算出出来ることを確認した。次に、この蠕動波の上に生体の消化管を留置し、電動ステージで動かし、3次元内視鏡で観測した。デプスマップデータから生体消化管の頂点は識別可能で、現在移動速度を解析中である。3)3次元内視鏡のパノラマ観測対象は円柱とした。円柱の内側の一点から三次元内視鏡で内腔を観察しても遠方の情報は得られないが、内視鏡を円柱に沿って移動させれば遠方の情報も得られる。そこで、内視鏡の位置情報を自ら判断しながら内視鏡近くの情報を継ぎ接ぎして円柱全体の内腔を再構築する技術を開発した。1)生体材料を用いたウエットな実験は、動物実験計画を立て、施設の承認のもと、動物実験施設で行っている。シミュレーションやファントムを用いたドライな実験に比べて実験の手続きが煩雑となり、実験が迅速には進まない。2)プログラミングに必要な時間が想定よりも多かったため。3)派生技術であるパノラマ観測の研究が予想よりも進捗が良好なため。消化管機能性疾患は日常的によく遭遇する疾患である。病態として消化管の運動異常や拡張異常などが想定されている。

我々は、複眼内視鏡による3次元計測技術を開発した。本研究の目的はこの技術が消化管の運動および拡張を検出する十分な能力を有するか基礎的な技術検証を行うことである。1)消化管運動の検出:我々は先行研究にて収縮波の高さをmm単位の精度で検出出来ることを示した。本研究では3次元プリンターおよび電動ステージを用いて、収縮波の消化管内伝達を模倣するドライモデルを作成した。蠕動波を2 mm/sで移動させ複眼内視鏡で観察、移動速度は1.74±0.02 mm/s(誤差13%)と算出された。次に収縮波の上に動物の摘出臓器を乗せて2 mm/sで移動させ複眼内視鏡で観察、移動速度を同様に算出した。ウシ小腸2.01±0.03mm/s(誤差0.3%)、ブタ食道1.44±0.08 mm/s(誤差28%)、ブタ胃前庭部0.80±0.05mm/s(誤差60%)であった。測定誤差は測定対象物によって大きく変化したが、測定結果の標準偏差は少ない。今後この原因を検討する。2)消化管拡張の検出:腸管を円柱と見なしたときの直径、半球と見なしたときの容積を算出した。最初に3次元プリンターで円柱と半球を作成し、複眼内視鏡で観察、直径あるいは容積を算出した。直径20 mmの円柱の直径は19.6 mm(誤差3%)、直径20 mmの半球の容積は1.9 mm3(理論値2.09、誤差9%)と算出された。次に直径7 cmの半球の上にブタ胃底部を乗せ、複眼内視鏡で観察、容積は48.3 mm3(真の値46.8、誤差3%)と算出された。以上の結果より、複眼内視鏡による3次元計測技術は消化管機能を高精度に測定する可能性が示唆された。消化管機能性疾患はよく遭遇する疾患で、消化管の運動や拡張の異常などが病態とされる。世界標準の検査は特殊で、日本では普及していない。我々は複眼内視鏡の3次元計測技術が消化管機能を計測できる可能性について基礎的技術検証を行い主に以下の結果を得た。1)消化管運動の検出:複眼内視鏡は2mm/sで移動する収縮波を1.74mm/s(誤差13%)と観測した。2)消化管拡張の検出:複眼内視鏡は直径20mmの円柱の直径を19.6mm(誤差3%)、直径20mmの半球の容積を1.9mm3(理論値2.09、誤差9%)と観測した。以上より、本技術は消化管機能を高精度に測定する可能性が示唆された。研究内容は当初予定していたものに新しい派生技術も加え、特許申請の可能性を常に考慮しながら研究を推進する。研究の律速段階はコンピュータのプログラミングであることから、より多くの人材をその部分に投入する。今後の研究で新しい派生技術が他にも発生することが考えられ、それも大事に育てる。今後の研究で新しい派生技術が他にも発生することが考えられ、それらも大事に育て、特許申請の可能性を常に考慮しながら研究を推進する。消化器内科学1)研究の進捗が当初の予定よりも遅延したため。2)研究目的で購入する予定であった器材の一部を他施設から借りることが出来たため。動物実験は当初高額な生体で行う予定だったが、安価な摘出された臓器で代替出来たため。研究費は当初の研究内容の他にそこから派生した新しい研究内容にも投資する。
極短パルス繰り返し低温プラズマによる燃焼速度向上メカニズムの解明

低温プラズマ点火装置は,熱的に非平衡な放電を主体とし,雰囲気予混合気の温度はあまり高温にならず,電子温度のみが高温状態となっている.そして,この高温電子は,予混合気中の分子と衝突し,反応性の高い化学種を生成し,自着火を促進させる.これにより,低温プラズマ点火装置は,点火を実現している.しかしながら,低温プラズマによりどのような化学種が発生しているのかは,プラズマの発生時間が極めて短いことなどから実験による観察は難しい.そこで,化学種発生状態や雰囲気場が化学種生成に与える影響について,シミュレーションにより調査した.低温プラズマ点火シミュレーションソフトウェアとしてVizGlow (ver. 2.2)を用いた.VizGlowは米国EsgeeTechnology社が開発したソフトウェアであり,低温プラズマを対象とした多次元シミュレーションモデルである.多次元モデルであるため,低温プラズマやそれに伴い発生した化学種の分布を定性的に確認することが出来る.また,本ソフトは空気-メタンを対象とした低温プラズマ反応メカニズムが組み込まれており,天然ガス雰囲気に近い状態での反応状況を確認することが出来る.計算の結果,以下の知見が得られた.(1)本計算では,雰囲気温度や圧力が電子数密度の発達過程に影響を与えていないことが確認された.この一因として,運動量計算にドリフト拡散近似式を用いており,この式中に温度,圧力の影響を示す項が含まれていないためと推測した.(2)空気過剰率の違いが,電子数密度の発達過程に影響を与えることが予測された.また,化学種も空気過剰率の違いにより発達過程に違いが出た.全般的に,空気過剰率が小さいほうが,化学種を多く生成する傾向となった.実験で観測された燃焼速度の向上に対し,数値解析で化学反応に着目し調査を行った.非常に高速な現象であるので,放電初期の解析しか出来なかった.空気過剰率が電子数密度に与える影響を見ると,圧力,温度とは異なり,電子数密度分布に明確な違いを示した.このことから,空気過剰率は放電の発達プロセスに影響を与えていると判断できる.熱発生が生じるまでの数値解析は膨大な時間がかかるため,プラズマ形成過程の計算は今年度までとする.来年度以降は,電圧の立ち上がり勾配が燃焼に与える影響について,実験と簡易反応計算から解析を進める.低温プラズマ点火装置は,熱的に非平衡な放電を主体とし,雰囲気予混合気の温度はあまり高温にならず,電子温度のみが高温状態となっている.そして,この高温電子は,予混合気中の分子と衝突し,反応性の高い化学種を生成し,自着火を促進させる.これにより,低温プラズマ点火装置は,点火を実現している.しかしながら,低温プラズマによりどのような化学種が発生しているのかは,プラズマの発生時間が極めて短いことなどから実験による観察は難しい.そこで,化学種発生状態や雰囲気場が化学種生成に与える影響について,シミュレーションにより調査した.低温プラズマ点火シミュレーションソフトウェアとしてVizGlow (ver. 2.2)を用いた.VizGlowは米国EsgeeTechnology社が開発したソフトウェアであり,低温プラズマを対象とした多次元シミュレーションモデルである.多次元モデルであるため,低温プラズマやそれに伴い発生した化学種の分布を定性的に確認することが出来る.また,本ソフトは空気-メタンを対象とした低温プラズマ反応メカニズムが組み込まれており,天然ガス雰囲気に近い状態での反応状況を確認することが出来る.計算の結果,以下の知見が得られた.(1)本計算では,雰囲気温度や圧力が電子数密度の発達過程に影響を与えていないことが確認された.この一因として,運動量計算にドリフト拡散近似式を用いており,この式中に温度,圧力の影響を示す項が含まれていないためと推測した.(2)空気過剰率の違いが,電子数密度の発達過程に影響を与えることが予測された.また,化学種も空気過剰率の違いにより発達過程に違いが出た.全般的に,空気過剰率が小さいほうが,化学種を多く生成する傾向となった.実験で観測された燃焼速度の向上に対し,数値解析で化学反応に着目し調査を行った.非常に高速な現象であるので,放電初期の解析しか出来なかった.空気過剰率が電子数密度に与える影響を見ると,圧力,温度とは異なり,電子数密度分布に明確な違いを示した.このことから,空気過剰率は放電の発達プロセスに影響を与えていると判断できる.熱発生が生じるまでの数値解析は膨大な時間がかかるため,プラズマ形成過程の計算は今年度までとする.来年度以降は,電圧の立ち上がり勾配が燃焼に与える影響について,実験と簡易反応計算から解析を進める.
組織内微小リンパ管の免疫学的機能に関する研究

申請者は平成10年度において以下の事実を明らかにした。1.ヒト健常組織のリンパ管は、白血球接着因子の中で、PECAM-1のみを発現する。2.ヒトリンパ節皮質辺縁には5'-nucleotidase活性とPECAM-1の発現がともに強い活性化リンパ球が観察される。以上1.2.の結果は、ヒトリンパ管内皮細胞がPECAM-1を介してリンパ球と接着する可能性を示すものである。3. CD4+およびCD8+αβ+T細胞が種々のヒト組織内リンパ管に存在する。4.多数の血管がMHCclassIIを発現しているヒト炎症組織において、ICAM-1,ICAM-3,PECAM-1およびVCAM-1を発現しているリンパ管が存在する。5.マウスリンパ管は通常ICAM-1を発現しないが、TNF-αおよびIFN-yを腹腔に投与したマウスの腸管膜では、ICAM-1を発現しているリンパ管が存在する。以上3.4.5.の結果は、リンパ管は通常PECAM-1のみを発現するが、炎症組織内のリンパ管内皮細胞は種々の白血球接着因子を発現すること、その発現は炎症性サイトカイン依存性に増大することを示唆している。本研究は、組織内リンパ球の組織からリンパ管内への移動にリンパ管内皮細胞が発現する接着因子が寄与する可能性を示すものである。このことは以後、免疫担当細胞のリンパ循環系のならびに腫瘍のリンパ節転移機構の研究に大きく貢献すると考えられる。1.ヒト組織内リンパ管における接着因子発現の検索2.ヒトリンパ管内皮細胞とリンパ球との接着についての検討ヒト組織内リンパ管におけるリンパ球の存在とその両者におけるPECAM-1の発現を免疫組織化学的に明らかにした(投稿準備中).現在抗PECAM-1抗体を用いたリンパ球のリンパ管に対する接着阻止試験を検討中である.申請者は平成10年度において以下の事実を明らかにした。
北海道地域社会における生活文化の形成と変容-網走管内の開拓村落を事例に-

北海道の開拓村落社会は、道外の伝統的社会からの移住者によって、人為的に形成された社会である。伝統的社会から人々が移住・定着して以来、現在に至るまでの歴史が短いだけに、その形成と変容過程を、道外の伝統的社会に比ベて、より具体的に把握することができる点に特徴がある。北海道地域社会の生活文化を総合的・体系的研究に把握するには、伝統的社会からの人々の北海道への移住の時間的経緯のなかで、その新旧の歴史を縦軸とし、その空間的広がりを横軸として、生活文化の態様を基準に、次のAEに地域社会を類型化して把握できる。即ち、A型同一母村同時型、B形同一母村継時型、C型二異母村同時型、D型二異母村継時型、E型多異母村混合型である。網走管内への屯田兵およびその家族の移住は、明治30年と31年の両年にまたがっている。端野(現端野町)へは屯田歩兵第四大隊第一中隊、野付牛(北見市)へは第二中隊、相ノ内(北見市に合併)へは第三中隊、上湧別(上湧別町)へは第四中隊であった。例えば、野付牛へ移住した家族のうち、記録焼失不明者を除く移住者を、府県ごとに多い順に並ベるとなんと、石川県、山形県、岐阜県、富山県、福井県、佐賀県、福岡県、愛知県、福島県、高知県、和歌山県、宮城県、鳥取県、三重県、新潟県、広島県、熊本県、愛媛県、徳島県、香川県、島根県、奈良県、青森県、兵庫県、山口県、栃木県、大分県、秋田県、埼玉県、滋賀県、京都府と、31府県197戸に及び、北海道開拓村落の中でも、網走管内の屯田兵村は、背景を異にする生活文化を担うわが国のさまざまな伝統的社会からの移住者である屯田兵をベースに形成されている。移住形態からみるその村落社会の生活文化の特徴は多異母村混合型であるといえよう。移住したその年は収穫物なく、本部から扶助米と塩菜料が3年間給与された。5人家族が単位で、主食は雑穀と馬鈴薯で、芋味噌や芋餅、はては芋粥にして、糊口をしのいだという。移住4年目にして豆、麦、黍がとれるようになった。その後、この地域はハッカ栽培の主産地と知られるようになり、幾たびかの苦難の時代をくぐり抜け、今や、小麦、ビート、馬鈴薯、玉葱、豆類などの畑作を基幹産業として、新たな地域づくりをめざして未来へ向けて大きく羽ばたいている。
ショウジョウバエの内胚葉形成初期過程に発現する遺伝子の機能解析

研究代表者はショウジョウバエで内胚葉形成の分子機構の解明を目指して、内胚葉で形成の初期段階から発現する遺伝子A7-123をエンハンサートラップ法で同定し、クローニングした。本研究はA7-123エンハンサートラップ系統に挿入されたトランスポゾンを利用してA7-123遺伝子の突然変異体を分離し、その表現型から遺伝子の機能を明らかにすると共に内胚葉形成の遺伝子カスケードにおけるA7-123遺伝子の位置づけをすることを目的とした。ショウジョウバエの内胚葉を形成する胚末端部の領域はtorso受容体チロシン・キナーゼ、Ras、Raf、MAPKK、MAPKを介したシグナル伝達系によって決定されることが知られている。torso突然変異胚におけるA7-123遺伝子の発現をwhole mount in situ法で調べてところ、発現は見られず、多くの内胚葉形成遺伝子と同様、torso受容体チロシン・キナーゼに始まるシグナル伝達系の下位にあることが判明した。突然変異体の分離にはA7-123エンハンサートラップ系統へのP因子転移酵素の導入により、A7-123遺伝子に挿入されたトランスポゾンの再転移を誘導し、その結果A7-123遺伝子が位置する第2染色体右腕、52F染色体領域が欠損する胚性致死の系統Df(2R)JP-7を相補しなくなった系統を検索した。約300系統を検索し、そのような系統が1つ得られた。この系統(89a)ではA7-123遺伝子の発現は検出されず、遺伝子の機能が失われていると思われる。その表現型は頭部形成に異常を示す胚性致死であったが、A7-123遺伝子が、内胚葉形成の早い段階から発現しているのにも関わらず、89a系統では内胚葉の形成異常は胚発生の後期になって始めて観察された。今後は分子マーカーなどを用いて表現型をより詳細に調べると共に、89a系統がA7-123遺伝子の単一突然変異であるか否かを解析している。
bFGF誘導性の瘢痕抑制性microRNAの探索と標的核酸治療法開発の基盤研究

Mesenchymal stem cell (MSC)に対するmiR146b-5pの影響を検討した。創傷部でのPDGFRα+/Sca-1+細胞の発現性を検討した結果、bFGF投与創部ではPDGFRα+/Sca-1+細胞が有意に減少し、逆にmiR146b-5p+/Sca-1+細胞は増加していた。これらの相反する増減から、miR146b-5pはPDGFRα+/Sca-1+細胞に発現するPDGFRαを標的とし、その標的化による発現抑制からMSCの増殖を制御し、線維芽細胞抑制から線維化抑制に寄与することが示唆された。以上からmiR146b-5pはPDGFRα+/Sca-1+細胞のPDGFRαを標的にし、その発現抑制からMSCsの増殖を抑制し線維芽細胞を抑制することで、線維化抑制に働いていることが示唆された。miR146b-5pKOラットを作成し、以下について検討を行う。1.皮膚創傷部位における瘢痕化形成への影響評価現在までに検討を行ってきた成果を臓器レベルで実証するため、miR146b-5pKOラットを作成しmiR146b-5p欠失による逆の効果としての瘢痕促進効果を皮膚潰瘍瘢痕形成実験で検証する。方法としてはラット背部に皮膚全層性創傷を作成する。創傷後、瘢痕量の形態計測や瘢痕の質的変化の評価としてPDGFRα、collagen I、IIIおよびMMPなどについて発現量を比較検討することでmiR146b-5pの創傷治癒及び瘢痕形成への影響を評価する。2.生体の臓器レベルでの影響評価Mesenchymal stem cell (MSC)に対するmiR146b-5pの影響を検討した。2. miR146b-5pの標的分子PDGFRαの発現細胞を解析する。特にPDGFRα発現細胞には間葉系幹細胞が含まれるので、miR146b-5pの標的分子PDGFRαの発現細胞に間葉系幹細胞が含まれるかどうかを、PDGFRαとSca-1の共発現する間葉系幹細胞の発現性から検討する。さらにFGFR1 siRNA投与した皮膚潰瘍部におけるbFGF依存性miRNA146b-5pの発現変化とそれに伴う標的分子PDGFRαの発現変化、さらには標的分子PDGFRαとSca-1の共発現する間葉系幹細胞の発現変化を検討し、miR146b-5pによる間葉系幹細胞の発現制御も検討する。2.生体の臓器レベルでの影響評価Sprague-Dawleyラットの皮膚から樹立した培養線維芽細胞をbFGFで刺激した際のcollagenについて検討を行った。今回同様に、MMP-2, -3, -9についてのmRNA検出を行う予定であったが検討途中のため必要なプライマーなどの経費を次年度への使用額とした。miRNAの発現量をReal time PCRとNorthern blotting法にて確認する予定であったがReal Time PCRを行った結果、違いが確認されたためNorthern Blotting法をではなくReal time PCRで定量化をすることで比較検討を行った。Northern Blotting法で使用する予定であった分に関しては次年度更にN数を増やしてReal time PCRを行う際のプライマー及び検出試薬を購入する予定である。Sprague-Dawleyラットとin vitroで実験を行う予定であったが、miR146b-5pKOラットを作成したことにより新しく個体・臓器レベルでの解析検討に必要なプライマー、抗体などの経費を次年度への使用額とした。
ＰＤの腹膜機能不全、慢性腎臓病に対するリンパ管新生を標的とした新規治療戦略

適切な体液量管理は、腹膜透析患者の良好な成績を得るために重要である。我々は、ヒト腹膜透析の排液、培養ヒト腹膜中皮細胞、ヒト腹膜組織、さらに腹膜線維化モデルを用いて腹膜透析におけるリンパ管の役割を検討した。今回の研究により、横隔膜を中心として線維化に伴いリンパ管新生が認められ、腹膜傷害時のリンパ管新生が普遍的現象であることを示した。そして、リンパ管新生にはTGF-bーVEGF-C pathwayを介する経路があり、リンパ管抑制によって除水量の改善が期待できることが明らかとした。さら横隔膜リンパ管新生において、VEGF-Dも重要な役割を果たしていることを明らかにした。1.腹膜機能障害におけるリンパ管新生についてクロルヘキシジン(CG)モデル腹膜において検討し、リンパ管の発現はTGF-b typeI受容体阻害剤による線維化抑制治療により軽減し、線維化に伴いリンパ管新生が進行することを明らかにした。腹腔内投与したFITC-dextranの吸収、体循環へのドレナージはリンパ管新生によって増加し、COX2阻害剤投与によるリンパ管新生抑制により減少した。線維化にともなったリンパ管新生が、PDにおける透析液吸収を介しUFFに深く関与することが明らかとなり、新たな治療ターゲットとなりうることを示し、J Am Soc Nephrolに発表した。リンパ管新生が普遍的におきるかを、別のメチルグリオキサールモデルを用いて検討、アデノウィルスベクターs-VEGFR3-Ig(ヘルシンキ大学K Alitaro教授より供与)投与によるリンパ管新生の抑制を行い、その意義を検討。さらに人に応用可能な腹膜透析リンパ管機能をみる検査法を検討した。VEGF-CとともにVEGF-Dも腹膜リンパ管新生に重要な働きをしていることを明らかにし、その成果を本年の日本腎臓学会で発表予定、論文作成中である。collagen Iプロモーターにhuman VEGF-Cをつないだベクターの構築し、Hec293細胞にトランスフェクションし、VEGF-C蛋白の過剰分泌を確認。分泌されたVEGF-C蛋白がリンパ管内皮細胞を増殖・管腔形成を誘導することをin vitroの系で検討し、生理学的活性をもつことを確認した。このベクターを受精卵に注入し、tgマウスを作成。現在、germ-line伝達を確立中である。本tg miceを用いて、腹膜擦過モデルと尿管閉塞(UUO)モデル等でリンパ管新生の意義を検討する。腎疾患におけるリンパ管新生の意義に関して新たな知見を得、論文化した(Kidney Int. 2012;81(9):865-79)。ラット尿管結さつ(UUO)モデルを用い、腎線維化とともにVEGF-C分泌が進み、リンパ管新生が進行することを証明。近位尿細管細胞、集合管細胞においてTGF-bがVEGF-Cを誘導することを確認。UUOモデルにおいて、TGF-b受容体抑制剤を腎動脈から投与し、VEGF-Cの発現が抑制され、これによってリンパ管新生を抑えるメカニズムをin vitro, in vivo実験で証明し、論文とした。現在、transgenic miceを作成し、リンパ管新生が腎疾患進行に与える影響につき検討を進めている。また、TGF-bとVEGF-Cを結ぶシグナル伝達を検討・解明中である。腹膜におけるリンパ管新生の意義に関する研究では、ヒト腹膜機能不全(除水不全)においてリンパ管新生が進んでいることを組織における免疫組織染色、real-time PCRで確認した。また、ヒト腹膜透析排液においてもVEGF-Cを検出し腹膜透過性と良好な相関も確認した。ヒト腹膜透析排液由来腹膜中皮細胞においてTGF-b1刺激によるVEGF-C増加はD/P Crと相関を認めた。腹膜炎からの腹膜線維化動物モデル(において、リンパ管新生が進むことを見出した。この新生リンパ管は実際機能しており、腹腔内へ注入した液がリンパ管から吸収・ドレナージされることを示し、リンパ管新生が腹膜透析患者の除水不全に深く関与することを証明した。さらにin vitro, in vivoにおいて線維化の中心的な成長因子であるTGF-bとリンパ管新生との関連を示し、腹膜線維化のプロセスとともにリンパ管新生が進むことも証明した。現在論文投稿中。(1)腹膜機能障害におけるリンパ管新生についてCollagen Iをプロモーターとした、線維化に伴いVEGF-Cが過剰発現するTgマウスを作製した。低コピーgene発現マウス、高コピーgene発現マウスででき、腹膜擦過モデルでリンパ管新生の亢進が確認できた。今後さらなる検討が必要であると考えられる。医歯薬学

(1)腹膜機能障害におけるリンパ管新生についてクロルヘキシジン(CG)モデル腹膜において検討し、線維化にともなったリンパ管新生が、PDにおける透析液吸収を介し除水不全(濾過不全)に深く関与することが明らかとなり、新たな治療ターゲットとなりうることを示し、J Am Soc Nephrol 2013に発表した。リンパ管新生が普遍的におきるかを、別のメチルグリオキサールモデルを用いて検討、その意義を検討した。さらにアデノウィルスベクターs-VEGFR3-Ig(ヘルシンキ大学K Alitaro教授より供与)投与によるリンパ管新生の抑制を行い、VEGFR3が新たな腹膜透析除水不全の治療ターゲットになる点を明らかにし、その成果を本年7月の日本腎臓学会で発表予定、近日中に論文投稿となる。collagen Iプロモーターにhuman VEGF-Cをつないだベクターの構築し、Hec293細胞にトランスフェクションし、VEGF-C蛋白の過剰分泌確認を完了。分泌されたVEGF-C蛋白がリンパ管内皮細胞を増殖・管腔形成を誘導することをin vitroの系で検討し、生理学的活性をもつことを確認した。このベクターを受精卵に注入し、tgマウスを作成。現在、germ-line伝達を確立中である。その中で、すでに2ラインでgerm-line伝達を確立。予定通りtgマウス作成に成功しており、本マウスを用いて、腹膜擦過モデルと尿管閉塞(UUO)モデル等でリンパ管新生の意義検討を5月より開始する。平成24年度の計画は、下記(1)-(3)であったので、各項目について報告する。(1)腹膜機能障害におけるリンパ管新生について:腹膜線維化とともにTGF-b-VEGF-C pathwayを介しリンパ管新生が進行することが明らかとなった。線維化にともなったリンパ管新生が、PDにおける透析液吸収を介しUFFに深く関与することが明らかとなり、新たな治療ターゲットとなりうることを示し、現在、投稿中である。(2) VEGF-C transgenic miceについて:当初、Fibroblast Specific Protein 1 (FSP1)をプロモーターとした、線維化に伴いVEGF-Cが過剰発現するTgマウスを作製する計画で、実施したが、VEGF-C mRNAは上昇したが、VEGF-C蛋白の分泌が見られないことが判明し、collagen IプロモーターにVEGF-Cをつないだベクターの構築が完了し、Hec293細胞にトランスフェクションし、VEGF-C蛋白の過剰分泌確認を完了した。現在、リンパ管内皮細胞を用い、Hec293細胞にトランスフェクションし産生されたVEGF-C蛋白が、生理学的活性をもっていることを検討中である。この終了後に、マウス作成にとりかかる。予定としては、今年秋までにtransgenic miceができる予定である。(3)慢性腎臓病における意義について:近位尿細管細胞において、TGF-bがVEGF-Cを誘導することを報告してきた。このシグナル伝達を解明中である。この中でinhibitor、蛋白DNAアレイを実施し、transcription factorを同定する作業にはいっている。現在計画した3つの柱となる研究を進めている。