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グラフのタフネス,平面性と次数を制限した全域木の関係

論文2では当研究課題の目的の一つである,「トーラス上の任意の4-連結グラフはハミルトン閉路を持つ」というGrunbaum, Nash-Williams予想に関して,重要な部分的解決を与えている.Tutteの平面グラフの結果以降,閉曲面上のグラフのハミルトン性に関してさまざまな結果が示されてきたが,Grunbaum, Nash-Williamsの予想は40年以上前に予想された重要な未解決問題である.この予想の難しさの一因は,平面や射影平面上では現れなかった,トーラス上の4-連結グラフで「タフネスがちょうど1」であるものが存在する,という事実である.通常,ハミルトン閉路に関する問題は,帰納法を適用する都合上,「ハミルトン閉路を持つ」よりも強い性質を示す方が良い場合が多く,実際に平面・射影平面の結果は全てそのような手法で証明されている.しかし,そのようなより強い性質は「タフネスがちょうど1」であるグラフでは,少数の例外を除き,成り立たないことが示されているため,平面や射影平面では考慮する必要のない,「タフネスがちょうど1となるグラフ」が,既存の手法を適用するための障害となっていた.この点を考慮し,われわれは既存の研究とは根本的に異なる手法を提案することで,「トーラス上の任意の4・連結グラフは,タフネスがちょうど1ならば,ハミルトン閉路を持つ」という結果を示している.したがって,Grunbaum, Nash-Williams予想の解決のためには,タフネスが1でないグラフのみを考慮すれば良く,そこで平面や射影平面の場合に成功した既存の手法を用いることができる可能性がある.上記した以外にも,Grunbaum, Nash-Williams予想に関連して,本年度はいくつかの結果も得ている当初,prism-hamiltonianと2-歩道らのグラフ構造との関連を見出すとの目的で始めた研究であったが,予想以上にその解析が進み,Grunbaum,Nash-Williams予想というより大きな未解決予想への重要な部分的解決が得られたため.本研究課題(特別研究員奨励費)は本年度で終了するが,この研究は今後も継続する予定である.特に,上記したGrunbaum,Nash-Williams予想については,本研究課題における結果の改良・組合せによって完全解決ができる可能性があり,重点的に研究を行う.それ以外にも,予想とタフネスとの関連等についても研究を行う予定である.グラフのタフネス,平面性と次数を制限した全域木の関係,について主に研究を行っている.本年度は,グラフの平面性と次数を制限した全域木の存在との関係について主に研究を行い,以下の結果を得ている.平面より種数の高い閉曲面上に埋め込まれたグラフと,次数に関しての制約のある全域部分グラフとの関連を研究した.全域木は,"連結な"全域部分グラフであるが,この連結という条件をはずし,代わりに次数制約を強くした構造についての研究を行ったのである.実際に,種数の大きな閉曲面上に埋め込まれたグラフはある種の平面性が高ければ,4-連結または,5-連結を仮定すると,すべての頂点の次数が2である全域部分グラフと,3である全域部分グラフをそれぞれ持つことを証明している.特に,ハミルトン閉路は"連結"ですべての頂点の次数が2である全域部分グラフとみなすことができるので,これはハミルトン閉路の次数に関しての条件にのみ注目した結果である.(11.研究発表5本目の論文)また,閉曲面をトーラスに限定した「任意の4-連結なトーラス上のグラフがハミルトン閉路を持つ」という命題は,Nash-WilliamsとGrunbaumの予想である.これは40年近く未解決であり,グラフ理論では非常に重要な予想である.本年度はこの予想の解決を目指し,予想はグラフをトーラスの三角形分割に限定すると正しいことを証明した.この結果は予想の完全解決に向けて大きな一歩となることが期待されている.本年度は,上記したほかに,種数の高い閉曲面に埋め込まれたグラフの持つ,次数の制限された全域木の存在など様々な結果を残している.グラフのタフネス,平面性と次数を制限した全域木の関係,について主に研究を行っている.本年度は,次数を制限した全域木に関連し,長さの短い全域閉歩道に関して研究を行い,以下の結果を得た.「任意の3-連結平面グラフは3-木を持つ」ということは,Barnetteにより示された当分野における重要な結果である.これをGaoとRichterは「任意の3-連結平面グラフは2-歩道を持つ」という形へと拡張している.その一方で,Nakamoto,Oda,Otaは「任意の3-連結平面グラフGは次数3の頂点が高々(|G|-7)/3個以下の3-木を持つ」という別の形へと拡張した.3-木における次数3の頂点は,2-歩道ではちょうど2回通られる頂点に対応するため,「任意の3連結平面グラフGは2回通る頂点が高々(|G|-const)/3個以下の2-歩道を持つか?」という疑問は自然に起こるものである.実際何本かの論文ではこの問題に言及されており,本研究の一つの研究動機もこの問題である.ここで,2-歩道で,2回通る頂点の回数を制限する,という問題は,その全域閉歩道の長さを制限する,ということと同値である.したがって,「任意の3-連結平面グラフは長さが短い全域閉歩道を持つか」という問題は,上の問題を考える前段階として重要なものとなっている.また,この問題はGoemans氏が組合せ最適化の分野からのモチベーションで提起しており,その点でも重要なものとなっている.

この2点を研究動機とし,私は本年度「任意の3-連結平面グラフGは長さが4|G|/3以下の全域閉歩道を持つ」ということを証明した.本年度はこの他にもいくつかの結果を得ている.論文2では当研究課題の目的の一つである,「トーラス上の任意の4-連結グラフはハミルトン閉路を持つ」というGrunbaum, Nash-Williams予想に関して,重要な部分的解決を与えている.Tutteの平面グラフの結果以降,閉曲面上のグラフのハミルトン性に関してさまざまな結果が示されてきたが,Grunbaum, Nash-Williamsの予想は40年以上前に予想された重要な未解決問題である.この予想の難しさの一因は,平面や射影平面上では現れなかった,トーラス上の4-連結グラフで「タフネスがちょうど1」であるものが存在する,という事実である.通常,ハミルトン閉路に関する問題は,帰納法を適用する都合上,「ハミルトン閉路を持つ」よりも強い性質を示す方が良い場合が多く,実際に平面・射影平面の結果は全てそのような手法で証明されている.しかし,そのようなより強い性質は「タフネスがちょうど1」であるグラフでは,少数の例外を除き,成り立たないことが示されているため,平面や射影平面では考慮する必要のない,「タフネスがちょうど1となるグラフ」が,既存の手法を適用するための障害となっていた.この点を考慮し,われわれは既存の研究とは根本的に異なる手法を提案することで,「トーラス上の任意の4・連結グラフは,タフネスがちょうど1ならば,ハミルトン閉路を持つ」という結果を示している.したがって,Grunbaum, Nash-Williams予想の解決のためには,タフネスが1でないグラフのみを考慮すれば良く,そこで平面や射影平面の場合に成功した既存の手法を用いることができる可能性がある.上記した以外にも,Grunbaum, Nash-Williams予想に関連して,本年度はいくつかの結果も得ている本年度の目的は,グラフのタフネスや平面性とk-木・k-歩道の関係について、特にk-歩道に関してのものだった.上記した結果他により,平面グラフと2-歩道の関係についての関連が見出せ,順調に研究が進展したといえる.当初,prism-hamiltonianと2-歩道らのグラフ構造との関連を見出すとの目的で始めた研究であったが,予想以上にその解析が進み,Grunbaum,Nash-Williams予想というより大きな未解決予想への重要な部分的解決が得られたため.引き続き、グラフのタフネスや平面性とk-木・k-歩道の関係について研究を行う.特に,現在まで平面性との関連についてmで述べた結果などいくつかの進展得ているため,今後はそれらの結果を参考に,タフネスとの関連を考察する予定である.具体的には,「ある定数tが存在し,タフネスがt以上のグラフはハミルトン閉路を持つ」というChvatalの予想は,対象をプリズムーハミルトニアンにしても未解決である.Chvatalの予想の部分的解決として,まずこの予想の肯定的解決を目指す.本研究課題(特別研究員奨励費)は本年度で終了するが,この研究は今後も継続する予定である.特に,上記したGrunbaum,Nash-Williams予想については,本研究課題における結果の改良・組合せによって完全解決ができる可能性があり,重点的に研究を行う.それ以外にも,予想とタフネスとの関連等についても研究を行う予定である.
アクアポリンの発現に対する麻酔薬の影響

a)高浸透圧ストレスによるAQP3,AQP5 mRNA発現における吸入麻酔薬の影響ヒト肺胞上皮由来の細胞株(A549)に,吸入麻酔薬であるイソフルランの存在下,非存在下で,200mMのSorbitolを12時間暴露し,total RNAを抽出した。AQP3,および,AQP5のmRNAの発現量をリアルタイムRT-PCRにより測定し,イソフルランの効果を検討した。イソフルランの培地中の溶存濃度は,気化器による設定と比例した。リアルタイムRT-PCRにおける内部コントロールとして,GAPDH mRNAを用いたが,再現性に乏しく,βアクチンを内部コントロールとして,mRNA発現の半定量に用いた。結果はAQP3のmRNA発現に関して,イソフルランは有意な影響をもたらさなかった。b)高浸透圧ストレスによるAQP3,AQP5蛋白質発現における吸入麻酔薬の影響高浸透圧ストレスに関わるとされるMAPKの経路に関して,MAPKの活性を計測し,AQP3,AQP5蛋白質発現量との相関性の有無の検討を試みた。ラット大動脈を試料としてウェスタンブロッティング法により,MAPKの活性を計測し,イソフルラン,あるいはセボフルラン存在下でのMAPKの活性測定の条件検討を行なった。イソフルランはsodium orthovanadateによるp42 MAPKのリン酸化を抑制し,セボフルランはangiotensin IIによるp44/42MAPKのリン酸化を抑制した。a)高浸透圧ストレスによるAQP3、AQP5mRNAの誘導のリアルタイムRT-PCRによる定量。今後、麻酔薬のAQP3、AQP5のmRNAの発現に対する効果を検討するために、吸入麻酔薬、静脈麻酔薬を暴露し、AQP3、AQP5のmRNAの発現定量を行う予定である。b)高浸透圧ストレスによるAQP3、AQP5蛋白質のウェスタンブロット法による定量。AQP3、AQP5蛋白質の定量を行う際、高浸透圧ストレスのシグナル伝達にかかわると報告されている、MAPKの活性について(1)も、ウェスタンブロット法により検討するために、ラット大動脈を用いてウェスタンブロット法の条件検討を行い、安定してMAPKの活性を計測できるようになった。今後、ヒト肺胞上皮由来の細胞株(A549)に、200mOSMのSorbitolを暴露し、AQP3、AQP5蛋白質の定量、およびMAPK活性の計測を行う予定である。続いて吸入、静脈麻酔薬のAQP3、AQP5蛋白質発現に対する影響を検討する予定である。
血小板活性化受容体CLEC-2を標的とした癌手術後リンパ浮腫の予防法

癌手術時に広範なリンパ節郭清を加えた場合、四肢にリンパ浮腫が生じることがある。リンパ浮腫が慢性化すると、線維化、象皮化へと進み、QOLを著しく阻害するばかりでなく、蜂窩織炎や管肉腫を発症することもある。我国には12万人の患者がいるが、有効な根治療法も予防法もない。私達は血小板活性化受容体CLEC-2と、その生体内リガンドがポドプラニン(PDPN)という膜蛋白であることを同定した。CLEC-2は胎生期にリンパ管内皮が血管内皮から分離して生じる際、リンパ管内皮のPDPNと結合してリンパ管と血管の分離を促進する。CLEC-2/PDPNの結合で活性化された血小板からTGFbetaが放出され、リンパ管内皮の遊走や増殖を抑制するためと考えられる。私たちは、「術後リンパ節郭清後にリンパ管が伸長する際、血小板CLEC-2とリンパ管内皮のPDPNの結合で活性化された血小板から放出されたTGFbetaにより、伸長が阻害されて浮腫となる」との仮説を立てた。昨年までに、マウスリンパ浮腫モデルとして尾部環状切開法を検討したが、再現性のあるデータが得られなかった。今年度は、後肢放射線照射およびリンパ節除去による放射線照射後肢リンパ浮腫モデルを検討したが、放射線照射による皮膚の炎症が強く、不適当であった。そこで後肢皮膚を環状切開後、鼠経・膝窩リンパ節除去し、創部にゴムバンドを縫合する後肢リンパ浮腫モデルを作製した。野生型骨髄キメラマウスと血小板特異的CLEC-2欠損骨髄キメラマウスを10匹ずつ作製し、本術式を行い、day0-14まで後肢の周径を測定した。術後3日目までの急性期の周径に差はなかったが、day 5-10でCLEC-2欠損キメラで有意に周径が減少していた。この結果は仮説に矛盾しない結果であるが、さらなる検討が必要である。リンパ浮腫モデルマウスがおおむね確立できた。今後、リンパ管造影を行い、リンパ管の走行の程度を野生型マウスとCLEC-2キメラマウスで比較するとともに、組織切片でリンパ管再生の程度も確認する。また、抗CLEC-2抗体やCLEC-2結合低分子化合物Co-HPなど、別の方法でCLEC-2を抑制した際にも同様の現象が生じるかを検討する。マウスリンパ浮腫モデル(尾部環状切開法)でCLEC-2を欠損させた際の浮腫の程度を対照と比較した。抗CLEC-2抗体あるいはコントロールIgG抗体を投与して4日後のマウス(各6-7匹)に、上記環状切開を加えて、7日後、10日後の浮腫の程度を、焼灼部位より2 mm下部の最大径としてノギスにて測定した。対照として、上記の手術を加えないマウス(3匹)の尾部同部位の厚みも計測した(3.042-5.051 mm)。仮説通りCLEC-2欠損マウスで浮腫の有意な軽減(P<0.05)が認められた。しかし、別の術者では差が認められず、手技の熟達が必要と考えられた。まだリンパ浮腫モデルの確立できていない。30 Gyの放射線を左鼠蹊部に照射後1週間で、皮膚を切開してリンパ管を結紮してリンパ浮腫を惹起するOashiらの方法を検討する予定であったが、細いリンパ管を特定して結紮する方法が困難と思われ、尾部環状切開法を選択したが、こちらも手技の安定には、かなりの熟練が必要であった。

CLEC-2/PDPNの結合で活性化された血小板からTGFbetaが放出され、リンパ管内皮の遊走や増殖を抑制するためと考えられる。私たちは、「術後リンパ節郭清後にリンパ管が伸長する際、血小板CLEC-2とリンパ管内皮のPDPNの結合で活性化された血小板から放出されたTGFbetaにより、伸長が阻害されて浮腫となる」との仮説を立てた。昨年までに、マウスリンパ浮腫モデルとして尾部環状切開法を検討したが、再現性のあるデータが得られなかった。今年度は、後肢放射線照射およびリンパ節除去による放射線照射後肢リンパ浮腫モデルを検討したが、放射線照射による皮膚の炎症が強く、不適当であった。そこで後肢皮膚を環状切開後、鼠経・膝窩リンパ節除去し、創部にゴムバンドを縫合する後肢リンパ浮腫モデルを作製した。野生型骨髄キメラマウスと血小板特異的CLEC-2欠損骨髄キメラマウスを10匹ずつ作製し、本術式を行い、day0-14まで後肢の周径を測定した。術後3日目までの急性期の周径に差はなかったが、day 5-10でCLEC-2欠損キメラで有意に周径が減少していた。この結果は仮説に矛盾しない結果であるが、さらなる検討が必要である。リンパ浮腫モデルマウスがおおむね確立できた。今後、尾部環状切開法を行っている施設を見学の上、反復して尾部環状切開法を繰り返し、熟達したうえで、CLEC-2抗体の効果を検討する。別のリンパ浮腫モデルについては、日常的に行っている施設との共同研究を検討する。今後、リンパ管造影を行い、リンパ管の走行の程度を野生型マウスとCLEC-2キメラマウスで比較するとともに、組織切片でリンパ管再生の程度も確認する。また、抗CLEC-2抗体やCLEC-2結合低分子化合物Co-HPなど、別の方法でCLEC-2を抑制した際にも同様の現象が生じるかを検討する。2名分の旅費を申請したが、1名分を支出する必要がなくなったため。予定よりも使用マウス数が少なく、ラットモデルも検討しなかったため、実験動物の飼育委託費が少なかった。次年度は、マウス尾部リンパ浮腫モデルを用いた実験を加速するため、マウス、抗体など免疫染色用用品、抗CLEC-2抗体ハイブリドーマ培養精製用品、マウス飼育費など、消耗品を中心に使用する予定である。
ランダム性とファジィ性を含む大規模多目的多重レベルシステムに対する対話型意思決定

本研究課題では,複雑に依存しあう現実の様々な意思決定状況におけるランダム性とファジィ性を考慮した大規模多目的計画問題や多重レベル計画問題の定式化を進めるとともに,上位レベルと下位レベルの意思決定者の間の対話をも考慮した不確実性や曖昧性の下での多重レベル計画問題や多目的計画問題に対する対話型意思決定手法の開発に焦点が当てられ,(1)ランダム性とファジィ性を含む多重レベル計画問題に対する対話型ファジィ計画法に関する研究と(2)ランダム性とファジィ性を含む多目的計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究の2種類のテーマに分類される.研究テーマ(1)では,多重レベル非線形整数計画問題やファジィランダム変数係数を含む2レベル線形計画問題を定式化して,上位の意思決定者と下位の意思決定者間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するという対話型ファジィ計画法を提案している.研究テーマ(2)に関しては,ランダム性とファジィ性を考慮したファジィランダム変数係数を含むファジィランダム多目的最適化問題を定式化するとともに,可能性測度や必然性測度に基づいて,下位レベルの意思決定者の満足度とのバランスを考慮しつつ対話的に上位レベルの意思決定者の満足解を導出するという対話型意思決定を提案した.さらに,二次確率優越の概念に基づくパレート最適解の概念の導入により多目的確率計画問題を変換した多目的期待値リスク最適化問題に対するパレート最適解集合の中から意思決定者の選好に基づく解を導出するために,各目的関数に対する意思決定者の人間としての判断のあいまい性を考慮するためのファジィ目標を導入し,期待効用最大化原則と整合的な満足解を対話的に導出するための対話型ファジィ満足化手法を提案している.本研究課題で得られたこれらの研究成果は内外の著名な学術雑誌に数多く掲載され,高く評価されている.本研究課題では,複雑に依存しあう現実の様々な意思決定状況におけるランダム性とファジィ性を考慮した大規模多目的計画問題や多重レベル計画問題の定式化を進めるとともに,上位レベルと下位レベルの意思決定者の間の対話をも考慮した不確実性や曖昧性の下での多重レベル計画問題や多目的計画問題に対する対話型意思決定手法の開発に焦点が当てられ,(1)ランダム性とファジィ性を含む多重レベル計画問題に対する対話型ファジィ計画法に関する研究と(2)ランダム性とファジィ性を含む多目的計画問題に対する対話型ファジィ意思決定に関する研究の2種類のテーマに分類される.研究テーマ(1)では,多重レベル非線形整数計画問題やファジィランダム変数係数を含む2レベル線形計画問題を定式化して,上位の意思決定者と下位の意思決定者間の満足度をバランスよく達成させるような満足解を対話的に導出するという対話型ファジィ計画法を提案している.研究テーマ(2)に関しては,ランダム性とファジィ性を考慮したファジィランダム変数係数を含むファジィランダム多目的最適化問題を定式化するとともに,可能性測度や必然性測度に基づいて,下位レベルの意思決定者の満足度とのバランスを考慮しつつ対話的に上位レベルの意思決定者の満足解を導出するという対話型意思決定を提案した.さらに,二次確率優越の概念に基づくパレート最適解の概念の導入により多目的確率計画問題を変換した多目的期待値リスク最適化問題に対するパレート最適解集合の中から意思決定者の選好に基づく解を導出するために,各目的関数に対する意思決定者の人間としての判断のあいまい性を考慮するためのファジィ目標を導入し,期待効用最大化原則と整合的な満足解を対話的に導出するための対話型ファジィ満足化手法を提案している.本研究課題で得られたこれらの研究成果は内外の著名な学術雑誌に数多く掲載され,高く評価されている.複雑に依存しあう社会システムにおける様々な意思決定は,確率論的不確実性とファジィ論的曖昧性を同時に取り入れた広い意味での不確実性の下で,大規模多変数でしかも複数個の相競合する目的を有する複数人の意思決定者の意向を考慮して行わなければならないことに着目して,不確実性の下での多目的性や多重レベル性を考慮した最適化問題の定式化を進め,定式化した問題に対処し得るいくつかの対話型ファジィ満足化手法の提案を試みた.より具体的には,現実の意思決定状況の確率論的不確実性とファジィ論的曖昧性を同時に考慮して今後定式化される大規模多目的ファジィ多重レベル最適化問題に対して,多目的最適化問題に対する申請者の開発済みの対話型ファジィ意思決定手法に,確率計画法やファジィ計画法などの意思決定手法の望ましい特徴を取り入れることにより,多目的確率線形計画問題に対する期待値最小化モデル,分散最小化モデル,確率最大化モデルおよび満足基準最適化モデルに基づく対話型ファジィ満足化手法を提案するとともに,これらの4種類のモデルに基づく確率変数係数を含む多目的線形計画問題に対する対話形ファジィ満足化手法を提案し数値例によりその有効性を示した.また,連続変数のみならず離散変数のファジィ多目的離散最適化問題にも対処し得るような対話型ファジィ多目的最適化手法を開発するために,これまで申請者が提案してきた遺伝的アルゴリズムを,線形のみならずより一般の非線形の整数計画問題に対しても適用が可能となるような拡張を試みた.さらに,これまで個別に考察されてきた確率的不確実性とファジィ論的曖昧性を同時に考慮したファジィランダム変数を含む新たな多目的0-

1計画問題や多目的整数計画問題の定式化を進め,期待値最小化,分散最小化,確率最大化および満足基準最適化の観点からの意思決定者のファジィ目標を考慮した対話型意思決定手法を提案して,小規模から中規模までのいくつかの数値例によりその有効性を示した.本年度は,ランダム性とファジィ性を含む様々な大規模多目的多重レベル最適化問題の定式化と人間中心の対話型意思決定手法の開発をさらに進める目的で以下のとおり実施した。(1)確率的ランダム性とファジィ論的曖昧性を同時に考慮したファジィランダム変数係数を含むファジィランダム大規模多目的多重レベル最適化問題の定式化に関しては,ファジィランダム変数係数を目的関数のみに含む連続変数で線形の大規模多目的多重レベル最適化問題の非線形問題への拡張を行った後,ファジィランダム変数係数を目的関数のみならず制約条件式にも含む場合への一般的な拡張を試みた.さらに,連続変数のみならず離散変数をも含む線形および非線形の大規模多目的多重レベル最適化問題の定式化も遂行した.(2)多目的ファジィ最適化問題に対する申請者の開発済みの対話型意思決定手法に,確率計画法やファジィ計画法の対話型意思決定の望ましい特徴を取り入れるともに、パラメータに含まれるファジィ性やランダム性のみならず,意思決定者の判断の曖昧性をも同時に考慮して,上位レベルの意思決定者と下位レベルの意思決定者がお互いの立場をわきまえて,可能な限りレベル間の満足度をバランスよく達成させるという人間中心の新しい対話型意思決定手法の開発を行った.(3)提案した対話型意思決定手法に基づいて対話型ソフトウェアを作成するとともに,小規模から中規模までの数多くの数値例によりその有効性を検証した.このような研究成果をふまえて最終年度となる来年度は,これまで個別に考察されてきた期待値最小化,分散最小化,確率最大化および満足基準最適化の観点からの確率的不確実性とファジィ論的曖昧性を同時に考慮した新たな対話型意思決定手法の開発についてさらに検討を進めたい。本年度は,ランダム性とファジィ性を含む大規模多目的多重レベルシステムにおける対話型意思決定手法の開発に関する研究を以下のとおり実施した.(1)二次確率優越の概念た基づくパレート最適解の概念の導入により多目的確率計画問題を変換した多目的期待値リスク最適化問題に対するパレート最適解集合の中から意思決定者の選好に基づく解を導出するために,各目的関数に対する意思決定者の人間としての判断のあいまい性を考慮するためのファジィ目標を導入し,期待効用最大化原則と整合的な満足解を対話的に導出するための対話型ファジィ満足化手法を提案した.さらに,他のリスク指標を用いたモデルや高次の確率優越の概念に基づく考察および多重レベル計画問題への拡張を考察した.(2)確率的ランダム性とファジィ論的曖昧性を同時に考慮したファジィランダム変数係数を含むファジィランダム大規模多目的多重レベル最適化問題を定式化するとともに,レベル集合と確率最大化モデルに基づいて,上位レベルと下位レベルの意思決定者間の協力関係の下で,下位レベルの意思決定者の満足度とのバランスを考慮しつつ対話的に上位レベルの意思決定者の満足解を導出するという対話型意思決定を提案した.さらに,期待値最適化モデルや満足基準最適化モデルを含む他の確率計画モデルに対する考察も試みた.(3)提案した対話型意思決定手法に基づいて対話型ソフトウェアを作成するとともに,数多くの数値例によりその有効性を検証した.
視神経脊髄型多発性硬化症の自己抗原同定

1.2次元電気泳動を用いた抗原検索ラットおよび正常ヒト脳のタンパク質を各々の可溶性で分画し、プロテインAビーズと共有結合させた多発性硬化症患者血清IgGと反応させ、血清IgGと特異的に反応した蛋白を2次元電気泳動法にて泳動し、銀染色を行った。染色スポットを患者と健常者との間で比較を行ったが、患者に特異的な共通した蛋白質は同定されなかった。2.HEQ293培養細胞を用いた血清抗アクアポリン4(AQP4)抗体の同定ヒトAQP4の全長cDNAを作成しプラスミドベクターに組み入れた後、HEQ293細胞に導入し培養増殖させた。8倍希釈した患者血清をAQP4発現HEQ293細胞に反応させ、間接蛍光抗体法にて血清中の抗AQP4抗体の有無を確認した。疑い例を含む多発性硬化症患者148例の血清において抗AQP4抗体の測定を行い、33例で抗AQP4抗体が陽性であった。33例はいずれも視神経脊髄型多発性硬化症あるいはそのハイリスク群であった。抗体価の経時的変化の検討において、治療後の抗AQP4抗体価の低下が一部の患者で認められ、再発時に抗体価が上昇することが確認された。3.視神経脊髄型多発性硬化症における髄液ニューロフィラメントH鎖(NfH-SMI35)の定量視神経脊髄型多発性硬化症24例、通常型多発性硬化症24例、再発性脊髄炎4例、および筋萎縮性側索硬化症9例の髄液中のリン酸化ニューロフィラメントH鎖(NfH-SMI35)レベルをELISA法にて測定した。髄液NfH-SMI35レベルは視神経脊髄型の25%(24例中6例)で異常高値であったのに対し、通常型および再発性脊髄炎の髄液NfH-SMI35レベルはすべて正常であった。視神経脊髄型における髄液NfH-SMI35レベルの異常頻度は通常型と比較して有意に高く、その平均値も著しく上昇していた。髄液NfH-SMI35レベルが異常高値の6例のEDSSの中央値は6.5で比較的障害の程度は重かったが視神経脊髄型全体において髄液NfH-SMI35レベルと重症度、罹病期間、再発頻度、髄液所見、MRI所見、などとの間には有意な相関は認められなかった。通常型との比較において、視神経脊髄型では軸索障害あるいは神経細胞死や軸索変性がより強く病態に関与していることが示唆される。1.血清NMO-IgG陽性の視神経脊髄型多発性硬化症の臨床的、画像的特徴の解析視神経脊髄型多発性硬化症の63%で血清NMO-IgGが陽性であり、有用なマーカーとなりうると考えられた。NMO-IgG陽性患者では高度な障害を示す傾向にあり、特に失明を来した症例は全例NMO-IgGが陽性であった。NMO-IgG陽性症例の中には脳病変を来す症例も認められるが、古典的多発性硬化症に見られるような典型的な楕円形の病変は稀であった。視神経脊髄型多発性硬化症においても脳病変が生じうることを示唆していると考えられる。2.2次元電気泳動を用いた抗原検索ラットおよび正常ヒト脳のタンパク質を各々の可溶性で分画し、プロテインAビーズと共有結合させた患者血清IgGと反応させ、血清IgGと特異的に反応した蛋白を2次元電気泳動法にて泳動し、銀染色を行った。3.SEREX法による抗原検索1.2次元電気泳動を用いた抗原検索ラットおよび正常ヒト脳のタンパク質を各々の可溶性で分画し、プロテインAビーズと共有結合させた多発性硬化症患者血清IgGと反応させ、血清IgGと特異的に反応した蛋白を2次元電気泳動法にて泳動し、銀染色を行った。

髄液NfH-SMI35レベルは視神経脊髄型の25%(24例中6例)で異常高値であったのに対し、通常型および再発性脊髄炎の髄液NfH-SMI35レベルはすべて正常であった。視神経脊髄型における髄液NfH-SMI35レベルの異常頻度は通常型と比較して有意に高く、その平均値も著しく上昇していた。髄液NfH-SMI35レベルが異常高値の6例のEDSSの中央値は6.5で比較的障害の程度は重かったが視神経脊髄型全体において髄液NfH-SMI35レベルと重症度、罹病期間、再発頻度、髄液所見、MRI所見、などとの間には有意な相関は認められなかった。通常型との比較において、視神経脊髄型では軸索障害あるいは神経細胞死や軸索変性がより強く病態に関与していることが示唆される。
国際取引における適用法規-国際的信託に対する抵触法的規整を中心として-

1.わが国の実務の実態と問題点実務家との会合により、(1)わが国においても近年国際的要素を有する信託の利用が増加しつつあること、(2)しかしながら、実務界においては、必ずしも国際的信託に対する適用法規の問題に関して十分に対応できているわけではないことが判った。特に、わが国の信託会社が受託者となる国際信託については、信託会社としては日本法が準拠法になるとの根拠のない希望的観測の下に、受託を行っている。国際信託の準拠法について明確な指針を示すことが、学界に要請されているといえよう。2.諸外国における国際信託の規整信託が頻繁に利用されている米国では、信託の準拠法に関する法状態として、抵触法第二リステイトメントの規則がほぼ一般に承認されているといえる。そこでは、原則として当事者自治の原則が認められているが、他方で信託事務処理地法や不動産所在地法も十分に考慮されている。3.わが国際私法における信託の準拠法わが国際私法において国際信託をいかに規整すべきかという問題の検討は、今後の課題である。この課題についての検討を含む、本研究の最終的成果は、「信託の準拠法」とのテーマで、今春(平成6年5月)の第90回国際私法学会にて報告する予定である。
レアメタルの持続可能な利用を目的としたモリブデンの生物学的濃縮・回収技術の開発

レアメタルの生物学的濃縮・回収技術の確立のため、まず金属応答遺伝子の探索を始めた。水銀耐性細菌Bacillusmegaterium MB1株は有機水銀を効率よく分解できることを確認し、さらにMB1株の有機水銀分解酵素MerB3は猛毒のフェニル水銀に強い親和性をもつことがわかり、MerB3は生物学的水銀解毒剤とするポテンシャルがあることを示唆し、また基質親和性を金属応答性の指標とすることは有効であることを証明した。これらの成果を英文論文にしてJournal of Environmental Biotechnologyに投稿し、掲載が決定した。モリブデン吸着遺伝子について、モリブデンを特異的結合する大腸菌由来のModEタンパク質のC末端配列と、細胞表面に局在・固定する配列、レポーター遺伝子の蛍光遺伝子などを融合遺伝子に作製した。その融合遺伝子を酵母に付加させた。作製した酵母の細胞表面における融合遺伝子の発現は蛍光顕微鏡により確認した。組換え酵母を用いたモリブデン吸着実験では、モリブデン溶液から有効にモリブデンを回収することが確認できた。組換え酵母の生育ステージ、吸着時間、振とう条件などの吸着条件を検討し、24時間培養した酵母を1時間振とうの条件において最大75%の吸着率を示したことがわかった。また、低濃度のモリブデン溶液への適用を図り、融合遺伝子の上流にあるプロモーターを変えた。その結果、0.1 ppmまで有効に溶液からモリブデンを吸着できるように成功した。上記の研究成果を、2019年3月に東京農業大学にて開催された日本農芸化学会において、演題「Bioengineering of a stable molybdate bindingsystem using Saccharomyces cerevisiae」として発表した。また、現在英文論文を準備中である。金属応答性遺伝子の探索について、水銀化合物に対する応答性を指標として、水銀分解酵素MerB3の特徴をして英文論文として掲載が決まった。また、モリブデンを効率的かつ選択的に濃縮・回収するシステムの開発について、本研究が計画した三つの項目のうち、研究項目1モリブデン吸着遺伝子の探索については、大腸菌からモリブデンを効率的に結合するタンパク質の遺伝子を選定することができた。研究項目2レアメタルの濃縮システムの構築については、酵母を吸着・回収担体とし、反応速度の速い細胞表層吸着法を選定して行った。研究項目1で取得したモリブデン吸着遺伝子と、足場となる細胞表層に局在・固定する配列を酵母に組み込み、モリブデンを細胞表層に吸着する酵母を作製した。作製したモリブデン吸着酵母を用いた吸着性能試験により、最大吸着速度および吸着能、そのための細胞培養・処理の諸条件を計画通り決定できた。さらに、プロモーターを変えることにより、低濃度でモリブデン回収を可能にした。また、研究項目3繰り返して利用可能なレアメタルの濃縮・回収システムの技術基盤の確立について、濃縮したモリブデンの回収と酵母の再利用方法について現在検討しており、上記の研究成果により、当初の計画通り研究遂行されていると言える。次年度は、まずは現在作製したモリブデン吸着酵母を用いた回収実験より、各濃度のモリブデン溶液からの回収効率を明らかにする。また、吸着効率をさらに向上させるために、現在は細胞表層に提示する工法で構築しているが、細胞表層に複数のタンパク質を構築する加工の工法を試みる。次に、研究計画のうちの項目3繰り返して利用可能なレアメタルの濃縮・回収システムの技術基盤の確立:酵母に濃縮されたモリブデンを容易に回収することを図り、モリブデン誘導プロモーターを細胞凝集遺伝子の上流に構築し、現在作製したモリブデン吸着酵母に導入する。形質転換酵母によるモリブデン吸着時の細胞凝集を実験で実証するとともに、回収したモリブデンを酵母から脱着させ、脱着した酵母の再利用を図る。脱着には再利用できる金属キレート剤または化学的な手法を検討し、モリブデンの濃縮・回収システムの繰り返し利用可能性を技術的に証明する。その次には、モリブデン吸着酵母を固定することによって、より高密度の酵母細胞を吸着反応に用いることができること、また固定することにより吸着酵母の取り扱い上の利便性の向上を図る。

上記の研究成果を、2019年3月に東京農業大学にて開催された日本農芸化学会において、演題「Bioengineering of a stable molybdate bindingsystem using Saccharomyces cerevisiae」として発表した。また、現在英文論文を準備中である。金属応答性遺伝子の探索について、水銀化合物に対する応答性を指標として、水銀分解酵素MerB3の特徴をして英文論文として掲載が決まった。また、モリブデンを効率的かつ選択的に濃縮・回収するシステムの開発について、本研究が計画した三つの項目のうち、研究項目1モリブデン吸着遺伝子の探索については、大腸菌からモリブデンを効率的に結合するタンパク質の遺伝子を選定することができた。研究項目2レアメタルの濃縮システムの構築については、酵母を吸着・回収担体とし、反応速度の速い細胞表層吸着法を選定して行った。研究項目1で取得したモリブデン吸着遺伝子と、足場となる細胞表層に局在・固定する配列を酵母に組み込み、モリブデンを細胞表層に吸着する酵母を作製した。作製したモリブデン吸着酵母を用いた吸着性能試験により、最大吸着速度および吸着能、そのための細胞培養・処理の諸条件を計画通り決定できた。さらに、プロモーターを変えることにより、低濃度でモリブデン回収を可能にした。また、研究項目3繰り返して利用可能なレアメタルの濃縮・回収システムの技術基盤の確立について、濃縮したモリブデンの回収と酵母の再利用方法について現在検討しており、上記の研究成果により、当初の計画通り研究遂行されていると言える。次年度は、まずは現在作製したモリブデン吸着酵母を用いた回収実験より、各濃度のモリブデン溶液からの回収効率を明らかにする。また、吸着効率をさらに向上させるために、現在は細胞表層に提示する工法で構築しているが、細胞表層に複数のタンパク質を構築する加工の工法を試みる。次に、研究計画のうちの項目3繰り返して利用可能なレアメタルの濃縮・回収システムの技術基盤の確立:酵母に濃縮されたモリブデンを容易に回収することを図り、モリブデン誘導プロモーターを細胞凝集遺伝子の上流に構築し、現在作製したモリブデン吸着酵母に導入する。形質転換酵母によるモリブデン吸着時の細胞凝集を実験で実証するとともに、回収したモリブデンを酵母から脱着させ、脱着した酵母の再利用を図る。脱着には再利用できる金属キレート剤または化学的な手法を検討し、モリブデンの濃縮・回収システムの繰り返し利用可能性を技術的に証明する。その次には、モリブデン吸着酵母を固定することによって、より高密度の酵母細胞を吸着反応に用いることができること、また固定することにより吸着酵母の取り扱い上の利便性の向上を図る。今年度が計画した研究内容を行い、2019年3月の会計が締めるまでは、1209円の残金があったため、2019年度の物品費に合わせて使用する計画で対応した。
地域生活の変容と子どもの社会化に関する研究

1.調査対象地区の設定岡山県倉敷市全域を調査対象とすると共に、さらにインテンシブに問題点を整理するため、2つの特徴的性格をもつ地区を選定した。(1)水島亀島地区・臨海工業地帯にもっとも隣接する地区で、コンビナートに関連する職場につとめる人たちが多い地区。住民の性格も多様で、いわゆる福祉的課題も多い。保育ニーズの多様化が顕著である。(2)児島天城地区・旧児島地区の地場産業への従事者も多い。住民には地付層が多く、地域的には安定している。保育(子どもの教育)への関心は強く、とりわけ協力的姿勢がみられる。2.文書記録資料の収集(1)倉敷市役所児童福祉課その他関係諸機関・諸団体の資料を収集した。(2)2つの地区の保育所並びに市全域にわたる保育所の所蔵する参考資料を収集した。3.面接聴取調査(1)倉敷市役所児童福祉の関係職員から聴取(2)2つの地区の保育所はじめ市域全体にわたる保育所の保母・主任保母・園長などから聴取(3)2つの地区の保育所園児の親から個別的に面接・聴取4.参考的観察・資料収集(1)2つの地区の保育所はじめいくつかの保育所の保育実践に参加(あるいは見学)することにより当該研究テーマの資料を収集(2)園長・主任あるいは保母、保育関係者の研究会・研修会に参加し、当該研究テーマの資料を収集5.調査研究のまとめ・問題点の整理上記の調査を実施することにより、つぎのような問題点が整理された。(1)保育ニーズの多様化地域生活の多様化にともない保育ニーズ(保育所への役割期待)も多様化しており、これへの対応が求められる(2)家族の教育的機能の抵下と保育所への過大期待(3)コミュニティ・センターとしての保育所乳幼児だけでなく児児童、おとな、老人へのサービスセンターとしての役割1.調査対象地区の設定岡山県倉敷市全域を調査対象とすると共に、さらにインテンシブに問題点を整理するため、2つの特徴的性格をもつ地区を選定した。(1)保育ニーズの多様化地域生活の多様化にともない保育ニーズ(保育所への役割期待)も多様化しており、これへの対応が求められる(2)家族の教育的機能の抵下と保育所への過大期待(3)コミュニティ・センターとしての保育所乳幼児だけでなく児児童、おとな、老人へのサービスセンターとしての役割
地域医療に従事する医師・看護師の適正配置と負担軽減に関する総合的研究

地理情報システム(GIS)を用いた研究において、市町村から拠点病院への自動車アクセス時間が90分以上の群に心血管疾患SMRの上昇の傾向(OR=3.60、P=0.065)を認めた。周産期アウトカムではアクセス時間に関連を認めず、小児科医数の影響を認めた。脳外科の拠点病院にもアクセスの格差を認め、ベイズ法でアクセス時間上昇によりSMR上昇の傾向を認めた。また、GISを用いて施設配置の改善の度合いを定量化することができた。看護師等病院離職の意思・うつ症状については、職業要因として上司のサポートや仕事のコントロールが有意な関連を認め、上司のサポートや仕事のコントロール対策が必要な可能性が示唆された。1.地理情報システムを用いた中核病院分布・医師数の医療アウトカムへの影響: 175市町村からの周産期拠点病院へのアクセス時間、市町村の所得指標、二次医療圏毎の小児科医数を説明変数。アウトカムは乳児死亡と新生児死亡は第3三分位、周産期死亡は第4四分位。粗解析では二次医療圏毎の小児科医数について、各指標に対して保護的なオッズ比となる傾向を認めた。アクセス時間では、周産期死亡率に対し120分以上がオッズ比を有意に上昇したが(OR=5.00、p=0.037)、30分60分未満では逆に有意にオッズ比を低下した。多変量解析では乳児死亡率、新生児死亡率に対し小児科医数の保護的オッズ比は有意となり、新生児死亡に対し90分以上が有意にオッズ比を低下した。周産期死亡に対し、3060分未満は有意にオッズ比を低下していたが、120分以上にはオッズ比上昇の傾向も消失した。アクセス時間の周産期アウトカムへの影響ははっきりしなかったが、医師数が関連していた。2.地域医療における看護師等パラメディカルの労働負荷・ストレスと離職に影響する要因:4地域医療の病院の900名が解析対象。病院離職の意思ありに対し有意な関連は、高要求度OR 1.62、低コントロールOR 2.14、低上司サポートOR 2.59であった。うつ症状ありでは、労働時間50-59h/週OR 1.68、労働時間≧60h/週OR 1.88、高要求度OR 1.69、低コントロールOR 2.38、低上司サポートOR 1.41、低同僚サポートOR 1.48、低家族/友人サポートOR 1.84。病院離職の意思・うつ症状については、職業要因として上司のサポートや仕事のコントロールが有意な関連を認め、上司のサポートや仕事のコントロール対策が必要な可能性が示唆された。また、うつ症状では加えて長時間労働と、要求度も有意な関連みとめ、過重労働対策や仕事の負担を減らす対策も必要な可能性がある。(1)「地理情報システムを用いた中核病院分布・医師数の医療アウトカムへの影響」:単変量解析では、虚血性心疾患SMRについて、アクセス時間が90分以上の群が30分未満の群に比べて有意に上昇していた(オッズ比(OR)=3.72、P=0.048)。また、所得指数のORも有意に上昇していた。医療施設従事者数は有意の関連を認めなかった。脳血管疾患SMRについて、アクセス時間が90分以上の群が30分未満の群に比べて上昇する傾向を認めた(OR=3.09、p=0.060)。医療施設所属医師数や所得指数は有意差を認めなかった。多変量解析(アクセス時間、医療従事者数、所得指数を同時投入)では、虚血性心疾患SMRについて、アクセス時間が90分以上の群に上昇の傾向を認め(OR=3.60、P=0.065)。また、所得指数のオッズ比も有意に上昇していた。医療施設従事者数に有意の関連を認めなかった。脳血管疾患SMRについて、多変量解析では、アクセス時間、所得指数、医療施設所属医師数とも有意差を認めなかった。経済要因の影響も考えられるが、90分以上のアクセス時間は予後に影響を与える可能性が考えられることは、医療の救急アクセスを考える上で重要で、医療機関のアクセス時間の格差を縮小していくことを考慮すべきと考えられる。(2)「地域医療における看護師等パラメディカルの労働負荷・ストレスと離職に影響する要因」では、4つの地域医療の病院の看護師にアンケート調査を行い、1062名から回答を得た。病院を移りたいと考えているのが16.4%、看護師の仕事を辞めたいと考えているのが9.4%、職業性ストレス

簡易調査票で全国平均より、量的負担が高くコントロールが低いこと、CES-Dで16点以上が46.7%と高いことなど、道北の地域医療のための病院の看護婦について多くの人数ではじめてメンタルヘルスの問題が明らかにできた。本年度は、220救急医療機関にアンケートを送付し101医療機関より回答を得た。経年変化では救急車台数は増えていたが、年時間外・休日外来受診者数は減少傾向にあり、不要不急の受診は減少傾向にある可能性が考えられた。コンビニ受診対策としては、ポスターが最も多く、37医療機関、ついでパンフレットとホームページが7医療機関であった。医師の当直については、日当直が多く行われていることや、当直翌日の休みの取得が難しいなど、負担があることが考えられ、その負担軽減のために多くの施設で外部からの日当直医に頼っていた。看護師の時間外・休日救急外来対応については、小規医療機関の場合、病棟看護師が担当を兼ねていることが多いと考えられた。看護師が時間外・休日救急外来専属となる場合は、日直と当直を兼ねることは少ない。救急外来の混雑や救急搬送に備えた待機看護師の有無について43施設で待機看護師ありと回答があり、一定の負担が生じている可能性があると考えられた。研究全体の成果としては、地理情報システム(GIS)を用いた研究において、市町村から拠点病院への自動車アクセス時間が90分以上の群に心血管疾患SMRの上昇の傾向を認めた。周産期アウトカムではアクセス時間に関連を認めず、小児科医数の影響を認めた。脳外科の拠点病院にもアクセスの格差を認め、ベイズ法でアクセス時間上昇によりSMR上昇の傾向を認めた。GISを用いて施設配置の改善の度合いを定量化することができた。看護師の病院離職の意思ありに対し有意な関連は、要求度OR 1.53、コントロールOR 0.73、上司サポートOR 0.59であった。うつ症状ありでは、要求度OR 1.39、コントロールOR 0.63、上司サポートOR 0.81、家族/友人サポートOR 0.67であった。公衆衛生学1)「地理情報システム(GIS)を用いた中核病院分布・医師数の医療アウトカムへの影響」については、当初の計画通り北海道の市町村・2次医療圏毎に人口動態統計データによる心疾患、脳血管疾患への影響について、医師数や経済要因を調整しても90分以上のアクセス影響について初年度明らかになり、周産期アウトカムへのアクセス時間の影響については、医師数や経済要因を調整した解析の結果、小児科医師数が関連し、アクセス時間の影響については、はっきりしないことが明らかにできた。(2)「地域医療における看護師等パラメディカルの労働負荷・ストレスと離職に影響する要因」についても、当初の計画通りに、地域の4医療機関の質問票調査から初年度に労働負荷、ストレスと離職の状況を明らかにでき、離職の医師やうつ症状をアウトカムとしたで多変量解析によって、上司のサポートや仕事のコントロール対策が必要なことを明らかにし、各医療機関へのフィードバックもできた。1)「地理情報システム(GIS)を用いた中核病院分布・医師数の医療アウトカムへの影響」については、当初の計画通り北海道の市町村・2次医療圏毎に人口動態統計データをによる心疾患、脳血管疾患の標準化死亡比(SMR)への影響しついて、GISソフトを用いて、アクセス時間を計算し、医師数、所得指数などの要因も考慮した解析を行い、90分以上の影響について明らかにできた。
新規非コードＲＮＡによるＲＮＡ干渉制御メカニズムの解明

平成27年度は主にmiRNAの遺伝子抑制機能において重要な役割を果たすGW182因子の解析について注力したので、その実施状況を報告する。前年度、作出に成功したgw182欠損変異体の解析を行った。gw182欠損変異体は、2齢幼虫で成長が止まり、致死となる。miRNA標的遺伝子の発現変動の確認と致死の原因となる遺伝子の探索のため、RNAシークエンス解析を行った。その結果、コントロールと比較してgw182変異体で2倍以上の発現上昇を示したmRNA群に、特定のmiRNAの標的配列を有するmRNAが濃縮されていることが判明した。したがって、ショウジョウバエ個体内において、GW182は真にmiRNAの機能を担っていることが示唆された。一方、コントロールと比較しgw182変異体で発現が優位に減少している遺伝子群には幼虫の表皮を形成する遺伝子群の多くが含まれていた。このことから、表皮の形成不全がgw182欠損変異体の致死性の一端であると推測された。今後、gw182遺伝子変異体で発現上昇が認められたmiRNAの標的遺伝子と表皮形成に必須の遺伝子群との関係を調べ、GW182の分子機能と表皮形成との関係を解明していく。また、現在、生体内でmiRNAの遺伝子抑制活性を評価する系を構築することを計画しており、その準備段階として、miRNAのレポーター遺伝子系統作出の準備やgw182遺伝子の一部欠損変異体などの作出を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。RNAi経路ではsiRNAが標的mRNAを切断、分解する。ショウジョウバエにおいて、siRNAはDicer-2によって産生された後、Argonaute2(Ago2)を核とするRISCと呼ばれる複合体を形成し、標的mRNAを切断する。これまでに申請者は、環境ストレス応答の一例として熱ショック応答を取り上げ、その応答機構のうち、hsp70 mRNA分解機構に着目し、研究を行ってきた。その過程で、インシュレーターscs'由来long ncRNA(non-coding RNA)がDicer-2のdicing活性を阻害することを示唆し、熱ショック時にRNAi経路が抑制される可能性を見出した。外的刺激によるDicer-2機能の制御やncRNAによるDicer-2機能の阻害については、これまでに全く知見がなく、その詳細なメカニズムは未知である。そこで、熱ショックによるscs'ncRNAのDicer-2機能阻害メカニズム解明を本研究の目的とした。具体的にはscs'ncRNAによるDicer-2dicing活性及びRISC形成への阻害様式解明とin vivoにおけるscs'ncRNAのsiRNA標的mRNAの安定性に対する影響を検討する。特に平成24年度は、in vivoにおけるscs'ncRNA機能的重要性を評価するため、scs'ncRNA欠損変異体ショウジョウバエの作出に注力した。しかしながら、ショウジョウバエ遺伝子欠損変異体作出の一般的方法であるP因子欠損方法では遺伝子変異体が取得できず、現在、新規方法であるTALEN法を用いた遺伝子欠損変異体作成に取り組んでいる。TALEN法でのショウジョウバエ遺伝子欠損作成は、世界的に報告例が少なく、いまだに発展途上である。TALEN法による効率的なショウジョウバエ遺伝子欠損作出系の確立は、ショウジョウバエ遺伝学において、.有効な手段となりうると考える。その過程で、インシュレーター由来long ncRNA(lncRNA)がDicer-2のdicing活性を阻害することを示唆し、熱ショック時にRNAi経路が抑制される可能性を見出した。本研究では熱ショックによるlncRNAのDicer-2機能阻害メカニズム解明を試みていた。昨年度まで研究結果から、当初予想されていたlncRNAによるDicer-2の活性阻害効果を再現することができなかった。そこで、lncRNAとDicer-2との関係性見直すため、in vivoにおけるlncRNAの生物学的重要性を検討することとした。平成26年度は新たなゲノム編集技術であるCRIPR/Cas9システムを用いlncRNAの欠損変異体ショウジョウバエの作出を試みた。lncRNAの変異体の取得には至っていないが、変異体が取得された後は、表現型の解析をとおしてその機能を探ることを計画している。申請課題とともに、平成26年度はmiRNAに関する研究について2つのテーマを設定し、研究を行った。我々はこれまでの知見が少ないmiRNAの遺伝子発現抑制機構に関してその生物学的意義を解明する研究と新たな機構の存在が予想されるmiRNAの標的認識機構についての研究に取り組んだ。

したがって、ショウジョウバエ個体内において、GW182は真にmiRNAの機能を担っていることが示唆された。一方、コントロールと比較しgw182変異体で発現が優位に減少している遺伝子群には幼虫の表皮を形成する遺伝子群の多くが含まれていた。このことから、表皮の形成不全がgw182欠損変異体の致死性の一端であると推測された。今後、gw182遺伝子変異体で発現上昇が認められたmiRNAの標的遺伝子と表皮形成に必須の遺伝子群との関係を調べ、GW182の分子機能と表皮形成との関係を解明していく。また、現在、生体内でmiRNAの遺伝子抑制活性を評価する系を構築することを計画しており、その準備段階として、miRNAのレポーター遺伝子系統作出の準備やgw182遺伝子の一部欠損変異体などの作出を行った。当初の研究計画で定めた課題については、in vitroの解析を諦め、in vivo解析が可能となるようにlncRNA変異体の作出を試み、準備を進めている。一方、miRNAの遺伝子抑制機構に関する研究では、lncRNA変異体と同じ手技を用いることでGW182の欠損変異体の作出に成功しており、生体内機能解析に着手している。また、miRNAの標的認識機構についての研究では、in vitroでの条件が大方終了し、大規模な実験に着手可能となった。平成26年度は、これまで進捗が滞っていた解析系の構築がおおかた終了したため、今後の研究の進捗が予想されるため、おおむね順調であると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。lncRNAの研究については、引き続き変異体の作出に取り組み、その生物学的意義を問うことを目指す。一方、miRNAの遺伝子発現抑制機構の研究では、作出されたGW182変異体の表現型解析をとおして、RISCのmRNA分解経路の生体内での重要性を明らかにする。また、miRNAの標的認識機構についての研究は、網羅的解析をとおして、dAgo1-RISCと標的mRNAとの結合強度と標的配列との関係性を明らかにすることを目指す。当初の計画では、in vitroでのSCS'ncRNAによるDicer-2機能阻害メカニズムの解明を第一に考えていた。しかし、SCS'ncRNAの生体内での重要性を主張するには、in vivoでの解析が必須と考え、取得に時間のかかるSCS'ncRNA欠損変異体の作出を最優先にした。その結果、従来の手法では、遺伝子欠損変異体が取得できず、まったく新規の手法(TALEN法)を試みることとなった。そのため、系の構築に時間がかかっており、当初の計画よりも遅れている状態である。今後もSCS'ncRNA欠損変異体の作出のため、TALEN法の構築を進める。