hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発光モード変化で微細環境を識別する新規蛍光核酸の開発と遺伝子検出プローブへの応用

誰にでも簡単に使える一塩基多型(SNPs)識別プローブを開発し、様々な現場で用いることが出来る遺伝子診断ツールを開発することは、病気の診断、治療、予防やオーダーメイド医療の実現のために、極めて重要であると考えられる。本研究では、一塩基多型識別プローブを実現するために、極性環境をはじめ、粘性、pHなどの周辺のミクロ環境変化に応じて蛍光強度や蛍光発光波長を鋭敏に変化させる環境感応型蛍光核酸塩基を開発し、標的核酸(DNAやRNA)とハイブリダイズした際のマッチーミスマッチの違いによるミクロ環境変化を蛍光発光色(発光波長)の変化で検出するという全く新しい概念を用いた蛍光プローブの開発を行った。新規環境感応型蛍光核酸塩基として、これまでに分子内にドナー・アクセプター構造を有する様々な蛍光核酸塩基(モノマー分子)をデザインしており、実際に数種類の蛍光ヌクレオシドを合成し、評価を行ってきたが、得られた蛍光核酸の発光波長が当初考えていたよりも短く、オリゴヌクレオチドに導入した際にも十分な塩基識別能が得られていなかった。しかしながら平成28年度の後半から29年度にかけて、これらの問題点を克服できそうな、興味深い光学特性を有する数種類の蛍光核酸塩基が得られた。そこで、得られた最適化された分子の光学特性の評価を再度行った結果、蛍光DNAプローブとして応用できそうなモノマー分子が得られたことがわかった。そこで最終年度となる平成30年度に、環境感応型蛍光核酸塩基の候補分子としてえられた2種類の発光モードを示す環境感応型蛍光核酸塩基のDNA鎖への導入と一塩基識別能の評価、さらにプローブの作成を行った。実際にプローブの塩基識別能を評価したところ、標的DNA中の一塩基の違いを、大きな発光波長変化でとらえることに成功した。実用に耐えうる、誰もが簡単に行なえる遺伝子診断法を確立するためには、誰にでも簡単に使える一塩基多型(SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms)識別プローブの開発が重要となる。本研究では、極性、粘性、pHなどの周辺のミクロ環境変化に応じて蛍光強度や蛍光発光波長を鋭敏に変化させる環境感応型蛍光核酸塩基を開発し、標的DNAやRNAとハイブリダイズした際のマッチーミスマッチの違いによるミクロ環境変化を蛍光波長(色)の変化で検出するという全く新しい概念を用いた新規蛍光プローブの開発を行っている。本年度は、環境感応型蛍光核酸塩基として新たにデザインした2種類の発光モードを示す環境感応型蛍光核酸塩基の開発を行っている。まず初めに、分子内にドナー・アクセプター構造を有する蛍光核酸塩基(モノマー分子)をデザインし、それらを実際に合成、評価する必要があるが、本年度は、これらの分子のデザインと、実際の合成を中心に研究を推進してきた。数種類の蛍光ヌクレオシドを実際に合成し、光学特性等を評価したところ、いくつかの化合物で、当初目指した性質に近い分子を得ることができた。しかしながら、蛍光波長などが当初考えていたよりも若干短く、オリゴヌクレオチドに導入した際にも十分な塩基識別能が得られなかったため、未だ改良する余地が残っている。さらに、実際にいく種類かの蛍光核酸塩基を合成していく過程で、優れた光学特性を有する分子を得るための改良点なども浮き彫りになってきた。実際、興味深い光学特性を有する分子も得られた。そのため、年度の後半では、年度の前半で得られた結果を基に、新たに分子デザインを行い、新分子の合成を精力的に行っているところである。本年度の前半には、環境感応型蛍光核酸塩基の候補となる新しい分子のデザインを行い、それを基に実際の分子の合成を進めてきた。早いものでは、平成28年度の前半の段階で合成を完了できたものもあり、それらに関しては、光学特性の評価を行い改良点を見出すための知見を得ることができた。実際にそこで得られた知見、結果をフィードバックし、次の分子設計および合成に役立てることができており、これらを繰り返すことで、合目的の分子を得るために必要な分子の特徴などががわかり始めてきているところである。また、いくつかの分子に関しては、実際にオリゴヌクレオチド鎖に導入することにも成功しており、オリゴヌクレオチドレベルでの評価も行うことができた。(ただし、現在までのところ合目的なプローブは得られていない。)オリゴヌクレオチド鎖での塩基識別能を評価することで、モノマーレベルでの光学特性の評価では分からなかった問題点も知ることができ、それらの結果を組み込んだ上での新たなモノマー分子のデザインに取り組むこともできている。いく種類かの蛍光核酸塩基を合成していく過程で、興味深い光学特性を有する分子も得られており、現在も新たな分子の合成を精力的に進めている。そのため、研究は申請書の計画と同様に進展していると考えている。実用に耐え得る遺伝子診断法を確立するためには、誰にでも簡単に使える一塩基多型(SNPs, Single Nucle otide Polymorphisms)識別プローブの開発が重要であるとかんがえられる。本研究では、極性環境をはじめ、粘性、pHなどの周辺のミクロ環境変化に応じて蛍光強度や蛍光発光波長を鋭敏に変化させる環境感応型蛍光核酸塩基を開発し、標的核酸(DNAやRNA)とハイブリダイズした際のマッチーミスマッチの違いによるミクロ環境変化を蛍光発光色(発光波長)の変化で検出するという全く新しい概念を用いた蛍光プローブの開発を行っている。平成28年度は、環境感応型蛍光核酸塩基として新たにデザインした2種類の発光モードを示す環境感応型蛍光核酸塩基の開発をおこなった。

分子内にドナー・アクセプター構造を有する蛍光核酸塩基(モノマー分子)をデザインし、それらを実際に合成し評価した。数種類の蛍光ヌクレオシドを実際に合成し、光学特性等を評価したところ、いくつかの化合物で、当初目指した性質に近い分子を得ることができた。しかしながら、蛍光波長などが当初考えていたよりも若干短く、オリゴヌクレオチドに導入した際にも十分な塩基識別能が得られなかったため、未だ改良する余地が残っていた。そこで28年度の後半から29年度にかけて、これらの問題点を克服すべくさらに数種類かの蛍光核酸塩基を合成した。その結果。実際に興味深い光学特性を有する分子がいくつか得られた。そのため、再度最適化された分子の光学特性の評価を行った結果、蛍光DNAプローブとして応用できそうなモノマー分子が得られたため、モノマー分子のDNA導入の検討を行っている。平成28年度の前半には、環境感応型蛍光核酸塩基の候補となる新しい分子のデザインを行い、それを基に実際の分子の合成を進めてきた。平成28年度の前半の段階で合成を完了できたものもあり、それらに関しては、光学特性の評価を行い改良点を見出すための知見を得ることができた。実際にそこで得られた知見、結果をフィードバックし、平成29年度分子設計および合成に役立てることができており、これらを実際に繰り返し、合目的の分子を得るために必要な分子の特徴がわかってきた。特に平成29年度には、実際に蛍光DNAプローブとして利用できそうな分子が得られオリゴヌクレオチド鎖への導入を検討している。この他にもいくつかの分子についてオリゴヌクレオチドレベルでの評価を行うことができている。オリゴヌクレオチド鎖での塩基識別能を評価することで、モノマーレベルでの光学特性の評価では分からなかった問題点も知ることができ、それらの結果を組み込んだ上での新たなモノマー分子のデザインに取り組むこともできている。そのため、研究は申請書の計画と同様に進展していると考えている。誰にでも簡単に使える一塩基多型(SNPs)識別プローブを開発し、様々な現場で用いることが出来る遺伝子診断ツールを開発することは、病気の診断、治療、予防やオーダーメイド医療の実現のために、極めて重要であると考えられる。本研究では、一塩基多型識別プローブを実現するために、極性環境をはじめ、粘性、pHなどの周辺のミクロ環境変化に応じて蛍光強度や蛍光発光波長を鋭敏に変化させる環境感応型蛍光核酸塩基を開発し、標的核酸(DNAやRNA)とハイブリダイズした際のマッチーミスマッチの違いによるミクロ環境変化を蛍光発光色(発光波長)の変化で検出するという全く新しい概念を用いた蛍光プローブの開発を行った。新規環境感応型蛍光核酸塩基として、これまでに分子内にドナー・アクセプター構造を有する様々な蛍光核酸塩基(モノマー分子)をデザインしており、実際に数種類の蛍光ヌクレオシドを合成し、評価を行ってきたが、得られた蛍光核酸の発光波長が当初考えていたよりも短く、オリゴヌクレオチドに導入した際にも十分な塩基識別能が得られていなかった。しかしながら平成28年度の後半から29年度にかけて、これらの問題点を克服できそうな、興味深い光学特性を有する数種類の蛍光核酸塩基が得られた。
終末糖化物質抑制剤としてのアセトアルデヒドの脳内作用の研究

生体に悪影響を及ぼすAGEの形成を、その前駆物質であるアマドリ化合物の段階でアセトアルデヒドが阻害する可能性が近年示唆されている。適度な飲酒が健康によいとする報告も踏まえて、今回アセトアルデヒドとアマドリ化合物により生成されるアセトアルデヒド-アマドリ化合物(AAP)に着目してその作用について検討した。様々な条件設定を行った上で作成したウサギアルブミン(RA)-AAPをニホンシロウサギに免疫し、抗体の作成を計った。6羽に対し2週毎に免疫し8週目に採取した血清をELISA法にて検討したが、特異性のある抗体価の上昇はいずれも認めなかった。この理由として、元来アマドリ化合物と同様に生体に存在する構造体でありエピトープとして認識されない、もしくは反応によって構造の変化する部位があまりに微細なため認識されづらい、といった可能性が考えられた。ラット胎児大脳皮質神経細胞の初代培養系においてAAPとAGEの細胞障害性の検討を行った。培養神経ディッシュ内にそれぞれを添加し、2472時間後にMTT法により吸光度の減少を細胞障害の指標として測定した。その結果AGEで明らかに細胞障害性が認められる濃度においてもAAPは細胞障害性を認めなかった。抗体の作成は達成されなかったが、今回の検討を通してAAPの神経毒性はAGEに比して低く、アセトアルデヒドが生体内にて細胞保護的に作用しているという仮説を支持する結果が得られた。今後生体内でのアセトアルデヒドの代謝、反応経路に関して更なる検討が行われることが期待される。Rabbit albuminまたはBSAをD-glucoseと種々の条件下で68週間反応させた。この反応からアマドリ・プロダクトを生成するための条件として、(1)D-glucose濃度は0.5M(0.01M,0.1Mとの比較)以上は必要であること。(2)bufferはPBSでは反応が進まず、0.2M sodium phosphate bufferが適切であること。(3)フィルターにより除菌を行えば、長期にわたるincubationを行ってもコンタミネーションは起こさないこと。以上の三点が明らかにされた。2.AAPの作成以上の予備的検討をふまえて、下記の反応条件を設定した。上記1),2)をクリーンベンチ内でフィルターをかけ、無菌処理をした後、37°Cで48時間インキュベートした。その後、透析を48時間行い、再度フィルターを使用して除菌した後、アセトアルデヒド400μlを加える。さらに37°Cで10日間インキュベートし、RA-AAP,BSA-AAP候補物質を作成した。候補物質をコーティングし、抗AGE抗体を一次抗体としてELISAを行ったところ、AGEの反応はほとんど認められなかった。すなわち、AGEの前駆物質であるアマドリ・プロダクトが含まれている可能性が高いと考えられた。

抗体の作成は達成されなかったが、今回の検討を通してAAPの神経毒性はAGEに比して低く、アセトアルデヒドが生体内にて細胞保護的に作用しているという仮説を支持する結果が得られた。今後生体内でのアセトアルデヒドの代謝、反応経路に関して更なる検討が行われることが期待される。
再生組織(結合織・癌組織・リンパ節・血管)統合による高次免疫システム構築

本研究は、腫瘍免疫学と医用工学とが統合した「腫瘍工学」という新たな領域の構築により、動物実験の一部を回避しうるような高次の機能を有する複数の人工組織を作成すること、およびこれら人工組織を組み合わせた免疫システムを作り上げることを目的とした。本研究期間中に得られた研究実績は、次のようにまとめられる。(1)人工結合織の作成:TGF-b1を含むタイプIコラーゲンゲル内に線維芽細胞さらには臍帯静脈由来の血管内皮細胞を混合培養する事で、血管網の形成が盛んな人工結合織を作成した。(2)人工癌組織の作成:上記人工結合織に種々のヒト癌細胞を共存させ、増殖因子の添加により、非浸潤性癌組織および浸潤性癌組織を作成した。(3)人工リンパ節の作成:タイプIコラーゲン網をOKT-3、フィブリノーゲンなどでコートし、これにヒト線維芽細胞とリンパ節およびIL-2を含むコラーゲン液を注入し、10日間以上にわたりIFN-gなどのサイトカインを産生する人工組織を作成した。(4)高次免疫系システムの作成:コラーゲンゲル内に、末梢単球由来の樹状細胞が存在する樹状細胞層、人工結合組織内に各種癌細胞を共存させた人工癌組織層、およびコラーゲンゲル内に末梢血単核球を高密度に含むリンパ球層からなる第一世代の免疫系システムを作成した。(5)免疫システムの応用:癌組織における樹状細胞の遊走、傷害癌細胞の貪食、サイトカイン産生およびリンパ球の産生といった一連の免疫反応のリアルタイムでの観察の可能性が示された。さらに、TGF-b1依存性浸潤胃癌に対するIFN-g療法、進行胃癌に対するIFN-g/cyclosporin-A併用療法といった新たな治療法開発の可能性が生まれた。以上、開発した人工組織を用いて当初計画した全ての実験が完了したわけではないが、不完全な免疫システムを応用して、新たな腫瘍免疫反応のの解析法、癌に対するワクチン療法を初めとする種々の新たな治療法開発の可能性が生まれた。本研究は、平成13年度および14年度の一年間において、医用工学と共同で創設した「腫瘍工学」領域において両分野の知識を統合して高次の免疫組織を構築することを目標とする。本年度(平成13年度)の計画案に沿って研究結果を概説する。(1)第二世代および第三世代の人工結合織の作成:手術時摘出組織より採取した線維芽細胞をtransforming growthfactor β1(TGF-β1)を添加したタイプIコラーゲン内で培養することで、線維芽細胞増殖の盛んな、第二世代の結合織、さらには臍帯静脈由来の血管内皮細胞が効率よく血管網を構築する第二世代の結合織を作成した。現在、低重力培養装置を応用することで末梢単核球および末梢単核球より誘導・増殖させた未熟樹状細胞が共存する第三世代の結合組織作成が進行中である。(2)(2)人工癌組織の構築:上記、第二および第三世代の人工結合織を利用して高度な浸潤能を有するスキルス胃癌類似の人工胃癌組織を作成した。(3)人工リンパ節の作成:多数の子室からなるコラーゲン網をOKT-3抗体等でコートし、これにヒト繊維芽細胞とリンパ球を含むコラーゲン液を注入し、低重力培養装置の中で培養し、数週間にわたり生存し、IFN-gなどのサイトカインを産生・放出するサ人工組織を作成した。

(4)小口径人工血管の作成:共同研究者の松田が開発した、エキシマレーザーによって管状薄膜セグメント化ポリウレタンに孔を開け、光反応性ゼラチン分子と増殖因子を内外面にコーティングした径1mmの人工血管を臍帯静脈由来の血管内皮細胞で覆うことには成功しているが、人工結合織に埋め込んだ人工血管内への内皮細胞の誘導法の確立には未だ成功せず、現在進行中である。本研究は、平成13年度および14年度の二年間において、医用工学と共同で創設した「腫瘍工学」領域において両分野の知識を統合して高次の免疫組織を構築することを目標とする。本年度(平成14年度)の計画案に沿って研究結果を概説する。(1)高次免疫系システムの作成:タイプIコラーゲンゲル内にGM-CSF/IL-4で誘導した末梢単球由来の樹状細胞を存在させ(樹状細胞層)、この上に、Transforming growth factor beta-1(TGF-b1)を含むタイプIコラーゲン内で線維芽細胞および臍帯静脈由来の血管内皮細胞からなる人工結合組織内に各種癌細胞(胃癌細胞および膵癌細胞)を共存させた癌組織類似の浸潤能の高い人工癌組織層(癌組織層)を乗せ、さらにこの上にIL-2を含むコラーゲンゲル内に末梢血単核球を高密度に含む層(リンパ球層)を乗せた、樹状細胞層、癌組織層、リンパ球層からなる第一世代の免疫系システムを作成した。このシステムにおいては、各種細胞を異なる蛍光色素で標識することにより、位相差顕微鏡あるいは蛍光顕微鏡下に個々の細胞の移動や複雑なサイトカインの産生をリアルタイムで観察しうる可能性が示された。しかし、前年度も問題として残った、癌組織層からの他の層への血管網の進展が不十分であり、この問題を乗り越えるために、VEGFなどの血管新生因子の導入などを検討している。(2)高次免疫系システムの応用:上記のシステムにより、最下層の樹状細胞が癌組織内へ侵入し、壊死あるいはアポトーシスに陥った癌細胞を貧食し、IL-12およびIFN-9を産生する過程、さらには、一部の樹状細胞が最上層のリンパ球層へ移動し、リンパ球のIFN-g産生を誘導することがリアルタイムで観察され、本システムのさらなる改良により、癌に対する複雑な生体免疫反応の解析が可能となる事が示唆された。現在、このシステムを応用して、癌組織層にOK-432やPSKといったBRMを投与した場合の樹状細胞やリンパ球の動き、あるいは、培養液中に抗癌剤を添加した場合の免疫細胞や癌細胞の変化を観察中である。ただし、上述したように当初計画していたこれら三つの人工組織を血管網で連結する方法は研究期間中に遂行できなかった。
人工骨被覆ポリマーシートメンブレンの生医学的評価

本研究は、PETシートを基材の上にゼラチンとリン酸カルシウムをコートした材料を、骨誘導再生用のメンブレンとして応用することを念頭に置き、本材料の組織再生機能を細胞培養実験と動物埋入試験を通じて評価した。その結果、本材料はヒト歯根膜細胞の増殖や伸展に対して好適な環境を供するだけでなく、イヌの抜歯窩の再生を有意に促すことが明らかとなった。よって、本材料は骨誘導再生用メンブレンとして極めて有望であることが明らかとなった。本研究は、PETシートを基材の上にゼラチンとリン酸カルシウムをコートした材料を、骨誘導再生用のメンブレンとして応用することを念頭に置き、本材料の組織再生機能を細胞培養実験と動物埋入試験を通じて評価することを目的としている。細胞培養試験に用いた細胞は、ヒト歯根膜細胞である。試験の結果、本研究の材料はヒト歯根膜細胞の接着・増殖および伸展に関して好適な環境を提供しうるものであることが明らかになった。このことから、本材料は骨誘導再生のみならず、組織誘導再生にも応用しうるものであることが示唆された。動物実験は、6歳齢の雌ビーグル犬を用いて実施した。4匹の実験動物について下顎の左右第1第4前臼歯を抜去し、左側の歯槽骨には本研究の材料をメンブレンとして用い、右側は何も埋植せずに縫合してコントロールとした。14日および30日後に実験部を摘出して組織観察を行ったところ、本研究の材料をメンブレンに用いた側では、平均約6倍の骨形成が見られた。このことから、本研究の材料は骨誘導再生用メンブレンとして非常に有望と思われた。研究を通じて得られた知見を踏まえ、本材料の改善点も明らかになった。本材料が組織再生を促す理由は、最外層のリン酸カルシウム(リン酸八カルシウムと低結晶性水酸アパタイト)の溶解性が高いためと思われるが、血液などで濡れると、リン酸カルシウム層が剥がれやすくなった。この点を改善すべく、新たな作製法の確立を試みた。現時点では作製条件の最適化には至っていないが、リン酸カルシウム層の剥離の程度を大幅に低減できることがわかった。また、ヒト歯根膜細胞は、平滑な表面ほど伸展することから、新しい製法は有利に働くと思われた。本研究は、PETシートを基材としてそれにゼラチンとリン酸カルシウムをコートして生体の組織再生を促進する機能を付与した材料(以下PETメンブレンと表記)について、これを骨誘導再生用のメンブレンとして応用することを念頭に置き、その細胞応答性の調査および動物実験による有効性の調査を行うことを目的としている。今年度は、細胞培養試験を通して、組織再生促進効果を説明する基礎データの取得を目的として、骨芽細胞以外の細胞(破骨細胞、間葉系幹細胞など)の培養を行う予定であった。細胞培養については、計画をやや変更して、繊維芽細胞系細胞であるヒト歯根膜細胞の培養を行った。これは培養に供するサンプルの調製に不具合が発覚したためと、細胞株の入手がうまくいかなかった事情による。しかし、歯根膜細胞の培養試験を通じて、さらなる治癒機序を支持する知見が得られた。本PETメンブレンにおいては、骨芽細胞はリン酸カルシウム層側で非常に早期に増殖と分化をし、PET側ではほとんど接着しないことがわかった。それに対して歯根膜細胞の場合には、PET側では急速に増殖する反面、リン酸カルシウム側では約7日の休眠期間を示すことが明らかになった。このことは、リン酸カルシウム層が、骨形成に必要な骨芽細胞の活動を促すとともに繊維芽細胞系の過増殖を抑えること、同時にPET側では繊維芽細胞の迅速な接着によって、雑菌の侵入をシールし、感染症の発生の防止に寄与していることが考えられた。また、ミニブタを用いた動物実験も一部開始した。しかし、PETメンブレンの治癒促進効果が想定よりも大きかったため、実験部摘出時にはほぼ治癒が完了していたこともあり、次年度の計画を実行する際の予備的知見を得ることができた。当初は、23年度に細胞培養、24年度に動物実験を行う計画であった。細胞培養は、上記のような理由で進行がやや遅れている。しかし、予備的な動物実験を前倒しで行うことができたので、24年度終了時までには当初の計画通りの研究が進展すると考えられる。細胞培養はさらに継続して実施する。特に歯根膜細胞と血管内皮細胞を用いて研究を進める。動物実験については、昨年度の予備実験の結果を踏まえ、飼育期間をより短縮するなどして継続して研究する。動物実験のデータ整理等に係る人件費、試料作製に要する消耗品費、成果発表に必要な学会発表旅費等に使用する。
乱流領域における筋肉収縮蛋白質溶液の流体力学的研究

本研究は筋肉収縮の主役と考えられている蛋白質であるF-アクチンの動的な物性を、トムズ効果(乱流抑制効果)という現象を手懸りとして、全く新しい視点から捉え直すことを目指している。そのために、先ずATPを含むF-アクチン溶液の円管内流動に際し、レイノルズ数とATPの加水分解反応速度の関係を調べることにした。ウサギ骨格筋より抽出、精製したG-アクチンを水溶液中、Kclを加えることによって重合させて、F-アクチンを作り、そのATPを含んだ溶液を種々の流速で、パイプの中に流す。実験の前後で溶液中の無機リン酸の濃度を定量する。円管内流動測定装置はシリンジとストレーンゲージ型圧力センサーを用いた装置を製作したが、貴重な試料蛋白質を有効に使うために、今回従来よりもより少量(約1/4,1ml位)の溶液で測定できるように改良を行っている。内径約0.5mmのパイプを用いることにしたので、圧力差も約4倍と大きくなり、より正確な測定ができる。これには本補助金で購入したレコーダも大きな寄与をしている。流動曲線測定装置もスコット・ブレアーのアイデアを参考にして、少量の試料で測定できるものに改良を行っている。また、より少量の溶液を用いるので、それに伴って無機リン酸のより鋭敏な定量法が必要になるが、最近発表された「高感度リン酸定量法」は、迅速性もあり、本研究にも応用する予定である。東北大学流体科学研究所において、流体力学関係の文献等の調査も行った。
固形がん免疫療法の効果増強に関する研究

ヒト大腸癌100例以上にOK-432 5KE/fibrinogen 80mgの混合液を局注して切除標本を解析した結果,この療法によって癌間質に誘導された遅延型アレルギー反応が癌の退縮に寄与していることが判明した.その過程で働いている細胞性免疫の主体はCD4+Tリンパ球で,これをin vitroで増殖させて解析した結果,このリンパ球は細胞表面にICAM-1を強く発現し標的細胞に強く接着して,lymphotoxinをeffector moleculeとして放出していることが分かった.また,所属リンパ節のBリンパ球を用いたハイブリドーマ作成法による解析で,液性免疫としては癌に特異性の高いイムノグロブリンが関与している可能性が示された.こうした反応は大腸癌ばかりでなく乳癌や甲状腺癌についても誘導され,それぞれの癌でcytotoxic T細胞や癌反応性のヒト型イムノグロブリンを産生するハイブリドーマが作成できた.OK-432/fibrinogenによる免疫療法は,癌の転移巣についても有効で,大腸癌肝転移巣に対する経皮的局注をおこなった7例では,血中腫瘍マーカー値の低下や画像上の腫瘍縮小が経験された.さらに,この療法をmodifyして,肝動脈内に留置したカテーテルを通して腫瘍の栄養血管に塞栓療法を施行したところ,肝癌でも有効例のあることが明らかになりつつある.この場合は,まず動脈内でOK-432を含有するfibrin clotが形成され腫瘍の一部が阻血壊死に陥る一方,時間経過とともに再開した血流によってOK-432の緩徐な放出がおこり,それを貧食したマクロファージから放出されるサイトカインが直接癌巣に作用して特有の変化がおこるものと推定され,肝癌治療のneckであるdaughter結節にも強い融解壊死が誘導されていることから,予後の向上に期待がよせられている.このようにfibrinogenはBRMの効果を著しく高める効果を有することが本研究から明らかになった.ヒト大腸癌100例以上にOK-432 5KE/fibrinogen 80mgの混合液を局注して切除標本を解析した結果,この療法によって癌間質に誘導された遅延型アレルギー反応が癌の退縮に寄与していることが判明した.その過程で働いている細胞性免疫の主体はCD4+Tリンパ球で,これをin vitroで増殖させて解析した結果,このリンパ球は細胞表面にICAM-1を強く発現し標的細胞に強く接着して,lymphotoxinをeffector moleculeとして放出していることが分かった.また,所属リンパ節のBリンパ球を用いたハイブリドーマ作成法による解析で,液性免疫としては癌に特異性の高いイムノグロブリンが関与している可能性が示された.こうした反応は大腸癌ばかりでなく乳癌や甲状腺癌についても誘導され,それぞれの癌でcytotoxic T細胞や癌反応性のヒト型イムノグロブリンを産生するハイブリドーマが作成できた.OK-432/fibrinogenによる免疫療法は,癌の転移巣についても有効で,大腸癌肝転移巣に対する経皮的局注をおこなった7例では,血中腫瘍マーカー値の低下や画像上の腫瘍縮小が経験された.さらに,この療法をmodifyして,肝動脈内に留置したカテーテルを通して腫瘍の栄養血管に塞栓療法を施行したところ,肝癌でも有効例のあることが明らかになりつつある.この場合は,まず動脈内でOK-432を含有するfibrin clotが形成され腫瘍の一部が阻血壊死に陥る一方,時間経過とともに再開した血流によってOK-432の緩徐な放出がおこり,それを貧食したマクロファージから放出されるサイトカインが直接癌巣に作用して特有の変化がおこるものと推定され,肝癌治療のneckであるdaughter結節にも強い融解壊死が誘導されていることから,予後の向上に期待がよせられている.このようにfibrinogenはBRMの効果を著しく高める効果を有することが本研究から明らかになった.ヒト末梢血単核球にin vitroでOKー432 0.1KEを貪食させ、上清中のcytokineをEIA法で測定したところ、TNF、ILー1α、ILー1βは12ー24時間後に最大値となることが確認された。MethA腫瘍皮下移植BALB/cマウスを用い、fibrinogen 16mg(XIII因子含有)とOKー432 0.2KEをaprotinin 0.2mlで溶解した液を腫瘍内注入して、腫瘍径の変化とその生存期間を観察するとともに注入部組織像の経時的変化を観察した。その結果、OK単独投与群に比しfibrinogen混合投与群で有意の腫瘍増殖抑制効果(p<0.05)がみられ、生存期間も著明に延長した(p<0.05)。今年度に購入したpersonal computerはこの統計処理に使用している。組織学的検討では、局注部に形成されたfibrin meshwork内にOKー432粒子が長期にわたり残留し、OKー432を貪食した細胞(Mφ)やリンパ球・形質細胞・好酸球が多数集積するとともに、広範な腫瘍壊死が観察された。OKー432 5KE/fibrinogen80mgの混合液をヒト大腸がん50例に対して経内視鏡的投与した.この投与には当該研究費で購入したファイバ-スコ-プが有用であった.局注後数日でがん巣部の出血と周堤隆起の崩壊がおこり、7日目には腫瘍の平坦化や潰瘍の縮小瘢痕化がみられた。

病理組織学的な検討では、注入されたfibrinogenは局所に繊細なfibrin網を形成しており、その中に多数の好中球・Mφ・多核巨細胞・形質細胞・リンパ球が集積するとともに著しい血管新生がみられ、その周囲を囲繞するようにおびただしい数の好酸球が集合する像が見られた。経時的に変化を追うと、局注後1週間もするとがん間質は著しいリンパ球浸潤をともなう肉芽組織と化し、3週間後には強い線維化をきたして瘢痕化することが分かった。これらの一連の反応は、免疫学的には肉芽腫形成をともなう遅延型アレルギ-反応と解釈され、がんはその間質の変性にともなって退縮していた。ヒト大腸がんへのOK-432/Fibrinogen局注は、100例に達した。局注例の新鮮切除材料をマイクロウエーブ照射によって迅速固定し、digoxigeninで標識したIL-1αのcDNAを用いてin situ hybridizationを施行したところ、がん間質に浸潤する単核球(Mphi)の細胞質に当該cytokineのmRNAが検出された。また、組織切片上でcytokineそのものを検出すべく、種々のcytokineに対する抗体を用いた免疫染色を施行したが、産生細胞の確認にまでは至っていない。局注例の所属リンパ節から回収したリンパ球は、局注後2週間目まではCD4(+)のT細胞が主体を占めていることが分かった。これらをin vitroの培養に移し、OK-432で間けつ的に刺激しながらIL-2存在下に増殖させると、CD4(+)T細胞の選択的な増殖が得られ、このCD4(+)T細胞はほぼ100%CD25を発現していることが分かった。このCD4(+)T細胞を限界希釈法でクローニングし、4名の患者から4つのクローンを樹立することができた。このCD4(+)T細胞クローンは、自己の腫瘍細胞ばかりでなく、Allogeneicな大腸がん細胞およびK562、Daudiなどの広範囲の腫瘍細胞を傷害する活性を有していた。接着能の高い細胞障害性T細胞が得られることも分かった。一方、乳がん患者へのOK-432/Fibrinogen局注も開始し、術中に所属リンパ節を回収してヒト型イムノグロブリンを産生するハイブリドーマ作成に着手した。さらに、手術不能の肝転移巣に対するOK-432/Fibrinogenの局注を5例以上について施行し、その効果をCT画像およびEcho観察で追跡する作業をも開始した。ヒト大腸癌100例以上にOK-432 5KE/fibrinogen 80mgの混合液を局注して切除標本を解析した結果,この療法によって癌間質に誘導された遅延型アレルギー反応が癌の退縮に寄与していることが判明した.その過程で働いている細胞性免疫の主体はCD4+Tリンパ球で,これをin vitroで増殖させて解析した結果,このリンパ球は細胞表面にICAM-1を強く発現し標的細胞に強く接着して,lymphotoxinをeffector moleculeとして放出していることが分かった.また,所属リンパ節のBリンパ球を用いたハイブリドーマ作成法による解析で,液性免疫としては癌に特異性の高いイムノグロブリンが関与している可能性が示された.こうした反応は大腸癌ばかりでなく乳癌や甲状腺癌についても誘導され,それぞれの癌でcytotoxic T
皮膚線維症におけるI型コラーゲンおよび関連分子遺伝子転写調節機構の解析

ケロイドや強皮症などの皮膚線維症に見られる線維化は膠原線維の増生を特徴とし、コラーゲンの真皮における過剰な沈着をその病変の特徴としている.コラーゲンの過剰な沈着は主に線維芽細胞の転写レベルでの過剰産生による。これまでに私共はマウスα2(I)コラーゲン・プロモーター遺伝子に結合し、転写を制御する因子すなわち,CCAAT結合因子,Nuclear Factor I, ColF1についての同定,精製,特徴づけ等を行ってきた。ColF1はCOL 1A2の転写開始点より約400bp上流に結合しin vitroでその転写を活性化する因子で,DNAシークエンス特異的アフィニテイーカラムにより精製した因子は42kDaおよび40.5kDaの2本のポリペプチドより構成されていた。42kDaのペプチド断片のアミノ酸配列はすべてc-myc上流遺伝子結合蛋白質Pur αに一致していた。40.5kDaのポリペプチドの一部の断片はPur αのファミリーで部分的にのみ配列の知られているPur βと一致していた。その後、Pur βのcDNAの全長をクローニングした。その結果、42kDaのポリペプチドはPur αで、40.5kDaのポリペプチドはPur βに一致していることが明らかとなった。私共はコラーゲンに異常をきたす強皮症やEhlers-Danlos症候群などの真皮線維芽細胞を初代培養しそのコラーゲン遺伝子発現量の異常な細胞株を今後のモデルシステムとするために検索している。最近私共はEhlers-Danlos症候群の4例でIII型コラーゲン遺伝子発現の欠如する細胞株を証明した。老化のモデルとされ、コラーゲンの異常が主な病態と考えられるacrogeriaでI型およびIII型コラーゲン遺伝子発現量が低下していることを証明した。またマクロライド誘導体EM703が正常および強皮症線維芽細胞のコラーゲン遺伝子発現を著しく低下させることを明らかにし、それがI型コラーゲン遺伝子の転写の低下と、CCAAT結合因子の結合低下によることを解明出来た。線維化は膠原線維の増生を特徴とし、皮膚線維症、すなわち強皮症、ケロイド、肥厚性癖痕、Shulman症候群などにおいても真皮の膠原線維の主成分であるI型コラーゲンの真皮における過剰な沈着をその病変の特徴としている。コラーゲンの過剰な沈着をきたすメカニズムとして最も重要なことはI型コラーゲンの過剰な産生であり、既に強皮症やケロイドでそれが真皮線維芽細胞におけるI型コラーゲン遺伝子の転写レベルでの過剰産生によることが明らかにされている。我々もこれらの患者の真皮より初代培養し得た線維芽細胞における発現調節の解析を行い、遺伝子発現調節因子およびcis-DNA-エレメントとコラーゲン産生に影響するサイトカインや疾患との関係を調べてきた。一方では私共はマウスα2(I)コラーゲン・プロモーター遺伝子に結合し、転写を制御する因子すなわち,CCAAT結合因子,Nuclear Factor Iおよび近年私共がクローニングし、c-myc上流遺伝子結合因子Purα/Purβであることを明らかにしたColF1についての同定、精製、特徴づけ等をマウスNIH3T3細胞を用い行い、その転写制御機構を解析してきた。またI型コラーゲンの関連分子である真皮膠原線維に多く含まれるIII型コラーゲンおよびそれらの分解酵素のコラゲナーゼ(MMP-1)の発現の関連性についても解析してきた.

Ehlers-Danlos症候群はこれらの分子の異常により皮膚の脆弱性、過進展などを主症状とする疾患であるが、今回、その真皮線維芽細胞を初代培養しI型およびIII型コラーゲンの産生能を調べたところ、IV型Ehlers-Danlos症候群の少なくとも5症例由来線維芽細胞でIII型コラーゲン発現の著明に低下していることを明らかにした。今後はこれらの線維芽細胞株を用いて発現調節のメカニズムを検討していく予定である。線維化を主な病変とする強皮症、ケロイドなど皮膚線維症では真皮の主成分であるI型およびIII型コラーゲンの過剰な沈着をその病変の特徴としている。コラーゲシの過剰な沈着は主に線維芽細胞の転写レベルでの過剰産生による。これまでに私共はマウスα2(I)コラーゲン・プロモーター遺伝子に結合し、転写を制御する因子すなわち,CCAAT結合因子,Nuclear Factor I, ColF1についての同定,精製,特徴づけ等を行ってきた。ColF1はCOL 1A2の転写開始点より約400bp上流に結合しin vitroでその転写を活性化する因子で,DNAシークエンス特異的アフィニティーカラムにより精製した因子は42kDaおよび40.5kDaの2本のポリペプチドより構成されていた。42kDaのペプチド断片のアミノ酸配列はすべてc-myc上流遺伝子結合蛋白質Purαに一致していた。40.5kDaのポリペプチドの一部の断片はPurαのファミリーで部分的にのみ配列の知られているPurβと一致していた。その後、PurβのcDNAの全長をクローニングした。その結果、42kDaのポリペプチドばPurαで、40.5kDaのポリペプチドはPurβに一致していることが明らかとなった。私共はコラーゲンに異常をきたす強皮症やEhlers-Danlos症候群などの真皮線維芽細胞を初代培養しそのコラーゲン遺伝子発現量の異常な細胞株を今後のモデルシステムとするために検索している。最近私共はEhlers-Danlos症候群の4例でIII型コラーゲン遺伝子発現の欠如する細胞株を証明した。老化のモデルとされるacrogeriaでI型およびIII型コラーゲン遺伝子発現量が低下していることを証明した。またある種のマクロライド系薬剤がコラーゲン遺伝子発現を著しく低下させることを明らかにし、そのメカニズムを検討中である。強皮症などの皮膚線維症では、真皮の主成分であるI型およびIII型コラーゲンの過剰な沈着をその病変の特徴としている。コラーゲンの過剰な沈着は主に線維芽細胞の転写レベルでの過剰産生による。ColF1はCOL 1A2の転写開始点より約400bp上流に結合しin vitroでその転写を活性化する因子で,DNAシークエンス特異的アフィニテイーカラムにより精製した因子は42kDaおよび40.5kDaの2本のポリペプチドより構成されていた。40.5kDaのポリペプチドの一部の断片はPurαのファミリーで部分的にのみ配列の知られているPur βと一致していた。
レスキュー活動における情報収集の迅速化のためのインターフェイスの開発

人間にとって危険であると考えられる災害現場等で人間に代わりに,作業の効率化を図るロボットをレスキューロボットと呼び,災害後の危険な環境内での「情報収集」を行うレスキューロボットの開発が進められている.しかし,これらのロボットの多くは遠隔操作によって操縦されるため,その操縦インターフェイスが悪ければ,ロボット本来の走破性を生かすことができない.本研究では,レスキューロボットによる情報収集の迅速化を妨げている技術的要因を解決する情報収集インターフェイスを作成することを目的とする.本年度は昨年度の研究実績を踏まえ、迅速な情報収集の実現を目的とする上で、3次元環境をPC上で再現することよりも急務な課題であると考えられる、複数台ロボットの操作を直感的に操作可能なインターフェイスについて研究を行った。まずは、通信負荷の軽減と複数台ロボットの同時操作を可能とする,複数台のレスキューロボットの操作インターフェイスについて提案した.通信負荷軽減のためにカメラ画像の伝送方法を修正し,通信状況の可視化も行っている.また,各ロボットに3次元CGとして用意し,状況把握を容易にしている.さらに各ロボットに操作モードを指定でき,複数台のロボットを様々なモードで並列的同時に操作することを実現した.さらに、操作負荷を軽減化するために,タッチペンによる操作指令入力と編隊制御を用いた,複数台のレスキューロボットの直感的な操作インターフェイスについても研究を行った.開発したインターフェイスでは,モデル予測制御に基づく編隊制御との連携により,ロボット同士の衝突を回避しながら,移動対象のロボットが目標地点に移動できるようにした.操作者は,「このロボットたちはここに行け」という単純な入力を表示された地図上でタッチペンを用いて描くだけで,簡単に複数台のロボットの操作を行うことができる.人間にとって危険であると考えられる災害現場等で人間に代わりに,作業の効率化を図るロボットをレスキューロボットと呼び,災害後の危険な環境内での「情報収集」を行うレスキューロボットの開発が進められている.しかし,これらのロボットの多くは遠隔操作によって操縦されるため,その操縦インターフェイスが悪ければ,ロボット本来の走破性を生かすことができない.ロボットが探査した環境の情報を提示する手法として,探査環境の形状に基づく地図を作成することが一般的であるが,環境形状の取得や地図の作成に時間がかかり,迅速な活動が求められるレスキュー活動の現場での使用に耐えられるものはこれまでほとんどなかった.本研究では,レスキューロボットによる情報収集の迅速化を妨げている技術的要因を解決する情報収集インターフェイスを作成することを目的とする.平成19年度は、「1.複数の地点からの環境形状のスキャンを行い,それらをつなぎ合わせる」について研究を行った.当初予想していた通り、スキャン点群を重ね合わせるICP(Iterative Closest Point)という手法では、うまく重ね合わせることが困難であるという点について改良を行った。具体的には、ロボットの操作者がスキャンした地形上の特徴的な場所と地図上で対応すると思われる特長的な2点をクリックするだけで自動的に地図を修正することができるというものである。地図上で対応すると思われる2点をクリックするだけなので操作者への負荷も少なく、従来では一度ずれてしまうと修正が困難であったICPをより利用しやすい形でシステムに取り組めるようになった。また、上記に加えて、複数台のロボットでのレスキュー活動の方がより迅速に情報収集が行えるだろうとの考察に基づき,複数台のロボットの操作を直感的に行えるインターフェイスの開発も行った。まずは、通信負荷の軽減と複数台ロボットの同時操作を可能とする,複数台のレスキューロボットの操作インターフェイスについて提案した.通信負荷軽減のためにカメラ画像の伝送方法を修正し,通信状況の可視化も行っている.また,各ロボットに3次元CGとして用意し,状況把握を容易にしている.さらに各ロボットに操作モードを指定でき,複数台のロボットを様々なモードで並列的同時に操作することを実現した.さらに、操作負荷を軽減化するために,タッチペンによる操作指令入力と編隊制御を用いた,複数台のレスキューロボットの直感的な操作インターフェイスについても研究を行った.開発したインターフェイスでは,モデル予測制御に基づく編隊制御との連携により,ロボット同士の衝突を回避しながら,移動対象のロボットが目標地点に移動できるようにした.操作者は,「このロボットたちはここに行け」という単純な入力を表示された地図上でタッチペンを用いて描くだけで,簡単に複数台のロボットの操作を行うことができる.
ＦｃγＲⅡＢ欠損とＳｌｅ１６領域多型の相補作用による関節リウマチ発症機序の解明

抑制性IgG Fc受容体(FcγRII)はB細胞および種々の免疫細胞上に発現し、その機能を負に制御する重要な免疫調節分子である。本研究では、FcγRII発現欠損による免疫系の異常亢進が自己免疫疾患を誘発するかを解析した。その結果、FcγRII発現欠損のみでは自己免疫疾患は発症せず、FcγRIIコード遺伝子Fcgr2bに近接して存在するSle16領域にコードされる自己免疫型SLAMfamily遺伝子の多型との相補作用でヒト関節リウマチ(RA)に近似した全身の多発関節炎を自然発症する可能性を見出した。本研究成果は、ヒトRAの疾患感受性遺伝子解析に重要な情報を提供するものである。我々は、抑制性IgG Fc受容体FcγRIIBをコードする遺伝子を欠損させたB6マウス(KO1と命名)に、ヒト関節リウマチ(RA)に近似した全身の多発関節炎を自然発症することを見出している。前年度、KO1に自己免疫促進遺伝子Yaaを導入すると、RAは抑制され、代わりに高度のループス腎炎が発症することを見出した。本年度は、以下の解析を行なった。1)細胞特異的FcγRIIB発現欠損マウス系の樹立:B細胞、樹状細胞、マクロファージ系細胞特異的にFcγRIIB発現を欠損するマウス系にYaa遺伝子を導入し、ループス腎炎発症に係る細胞群の同定を進めている。2)RAおよびループス腎炎発症に係る素因遺伝子のゲノムワイド解析:KO1マウスとNZWマウスを交配したF1マウスでは、RA発症は見られず高度のループス腎炎が発症した。そこで、RAおよびループス腎炎発症に関与する疾患共通遺伝子および疾患特異的遺伝子をゲノムワイドに解析する目的で(KO1 x NZW) x KO1退交配マウスを約200匹作製して病態を解析した。その結果、無症状マウスが54%、RA発症マウスが32%、ループス腎炎発症マウスが11%、両疾患発症マウスが3%の比率で認められた。現在、疾患素因遺伝子のマッピングを行なっている。3)KO1マウスの関節炎発症機序の解析: KO1マウスにTNFαあるいはIL-17の遺伝子欠損を導入し、関節炎への影響を解析した。その結果、TNFα欠損KO1マウスでは関節炎は完全に抑制されたが、IL-17欠損KO1マウスでは予想に反して抑制効果は全く認められなかった。TNFα欠損KO1マウスの関節炎の抑制には、破骨前駆細胞が含まれる末梢血単球の比率の低下、関節局所におけるMCP-1発現抑制と炎症局所への末梢血単球の移行頻度の減少、破骨に係るRANKL/OPG比率亢進の抑制が関与していた。FcγRIIBは代表的B細胞活性化抑制分子で、その発現低下はB細胞を活性化し、自己抗体産生を招いて自己免疫疾患を誘発する可能性がある。我々は、129マウスES細胞を用いてFcγRIIB遺伝子を欠損させ、B6マウスに戻し交配してFcγRIIB欠損B6マウス系(KO1)を樹立した。このKO1マウスの病態観察の結果、全身の関節変形を伴う高度の関節リウマチ(RA)が自然発症した。本年度は、RA発症KO1マウスに、自己免疫病態を増悪させることで知られるYaa(Y chromosome-linked autoimmune acceleration)変異遺伝子を導入して病態の解析を行った。KO1.Yaaマウスでは、驚いたことにRAの発症は抑制され、代わりに生後早期から高度のループス腎炎を伴う全身性エリテマトーデス(SLE)が発症した。そこでRAからSLEへの病態の転換に関わる要因を細胞・分子レベルで解析した結果、IL-21およびIL-10産生CD4陽性T細胞の活性化が関与する可能性を得た。近年、IL-21はSLE発症に関わることが示されている。一方で、IL-10はB細胞を活性化するという免疫反応に対する正の効果とともに、炎症局所のマクロファージによる炎症性サイトカインの産生を抑制するという負の効果を有しており、この負の効果がRAを抑制した可能性がある。本解析から、KO1マウスはRAおよびSLEの両病態の素因をもち、その病態はサイトカインの環境により左右される可能性が示唆された。RAとSLEは、臨床的に異なる病態を呈する疾患であるが、いずれもB細胞の免疫寛容破綻による自己抗体産生という共通の素因が存在しており、疾患特異性を決定する要因が注目されている。KO1マウス系は、RAとSLEに共通の病因、および疾患特異的病因を明らかにするために、極めて有用なモデル系である。

我々は、抑制性IgG Fc受容体(FcγRII)発現欠損と、FcγRIIコード遺伝子Fcgr2bの下流のSle16領域に存在するSLAMfamilyコード遺伝子が129マウスに由来するマウス系(KO1と命名)に、ヒト関節リウマチ(RA)に近似した全身の多発関節炎を自然発症すること、さらにFcγRII発現欠損とB6マウスに由来するSLAMfamily遺伝子多型を持つマウス系(KO2と命名)には自己免疫病態は発症しないことを見出した。さらに、KO1マウスに自己免疫促進遺伝子Yaaを導入すると、RAは抑制され、代わりに高度のループス腎炎が発症すること、KO2マウスにYaa遺伝子を導入するとループス腎炎が発症することを見出した。この一連の解析結果から、FcγRIIB発現欠損、SLAM family遺伝子多型、およびYaa遺伝子の相補作用が、疾患感受性および疾患特異性を左右することが明らかとなった。本研究では、これらの3つの遺伝要因の作用を、個別に解析する研究を進め、次の3つの研究結果を得た。1)細胞特異的FcγRIIB発現欠損マウス系の樹立:細胞特異的にFcγRIIB発現を欠損するマウス系にYaa遺伝子を導入し、ループス腎炎発症に係る細胞群の同定を進めた結果、B細胞および単核球上のFcγRIIB発現欠損が、各々異なる機序で自己抗体産生を誘導することを見出した。2)RAおよびループス腎炎発症に係る素因遺伝子のゲノムワイド解析:KO1マウスとNZWマウスを交配したマウス系を用いて、RAおよびループス腎炎発症に関与する疾患共通遺伝子および疾患特異的遺伝子をゲノムワイドに解析を進行中である。3)KO1マウスの関節炎発症機序の解析: KO1マウスの関節炎発症に関与するサイトカイン解析で、TNFαおよびIL-6の病因としての重要性は、破骨に係るRANKL/OPG比率亢進であることを明らかにした。一方、IL-17は、KO1マウスの関節炎発症の要因でないことも明らかにした。免疫病理学ループス腎炎を特徴とする全身性エリテマトーデス(SLE)は、RAと同様に自己抗体産生とその結果生じる免疫複合体の組織沈着によって惹起される炎症性自己免疫疾患であるが、病変部位が異なり、臨床症状も異なっている。疾患特異性が生じる原因の詳細は未だ明らかではない。我々のFcγRIIB欠損KO1マウスはRAを自然発症し、Yaa遺伝子導入あるいはNZWマウスと交配することで、RAがSLEに変換することから、KO1マウスは両疾患に共通する遺伝要因に加えて、疾患特異的な遺伝要因を持つと考えられ、疾患特異性の決定要因を解明する最適なモデル系であると考えられる。正常B6マウスにYaa遺伝子を導入してもSLEは発症しないが、FcγRIIB欠損マウスにYaa変異遺伝子を導入すると高度のSLEが発症するので、FcγRIIB発現欠損はRAとSLEに共通の遺伝要因の1つである。細胞特異的にFcγRIIB発現を欠損するマウス系の樹立により、B細胞におけるFcγRIIB発現欠損のみではYaa遺伝子を導入しても高度のSLEは発症しないという可能性を得ている。従って、B細胞以外の細胞でのFcγRIIB発現欠損が重要であり、その細胞の同定が期待される。IL-17シグナル抑制はSLEを抑制すると報告されているが、KO1マウスのRAは抑制されない。関与する炎症性サイトカインの差異の解析は、両疾患の発症機序の違いを探る手がかりとなる。RAとSLEはいずれも自己抗体産生とその結果生じる
実験的歯周炎による歯の病的移動の歯周組織の変化

本研究の目的は、イヌの歯に実験的歯周炎を惹起させ、その歯の歯周組織の変化を検討することである。本研究は、4頭のビーグル犬を用いて、ナイロン製のデンタルフロスを歯肉溝内に4週間結紫し、その後、4、5週目に局所麻酔下にてルートプレーニング(RP)を行った。同時にTooth cleaningを週3回、4から12週目まで行った。垂直的変位量の測定は、イヌのP3の根面板の上面と測定用ステントの下面との間にトレーを用いて、頬側からシリコンラバー系印象材を填入し、印象採得を行い、この印象面を根面板の中心部で近遠心的に切断し、ステントの下端から根面板の端の近心、中央、遠心の3点付近へそれぞれ下ろした垂線の長さを読み取り顕微鏡で測定し、その3点の平均値を算出した。組織学的観察は、P3を中心とした歯周組織を一塊として切り出し、上昇アルコール系列で脱水を行い、リゴラック樹脂に包埋し、近遠心側方向に100μmにて組織切片を作製し、methlenblue-fuchsin重染色を行った。骨の動態を捉えるための実験開始8および12週目にCalceinを2日間にわたり筋肉内注射を行い、骨のラベリングを行った。測定は、根尖の近心、遠心の2点付近から新生骨へそれぞれ下ろした垂線の長さを蛍光顕微鏡で測定した。本研究の結果、実験的歯周炎を惹起すると、0.8mmの垂直挺出、PRを行うと、1周目で01.16mm、2週目で0.14mmの垂直挺出、歯周組織が安定すると垂直挺出の減少を認めた。組織学的評価は、実験群では、根尖の骨の増加は近心側では0.3±0.05mm、遠心側では、0.3±0.07mm、健康群(12週間Tooth cleaningのみ)は、近心側では0.0±0.01m、遠心側では、0.3±0.01mmであった。各々について、Welch's t testを用いて統計処理を行うと、それぞれp=0.02で有意に新生骨の増加を認めた。本研究の結果は、炎症の状態とRPは、歯の挺出に関係することが解った。このように、歯周疾患罹患歯におけるRPの歯の移動と根尖の骨の増加の関係を明らかにし、炎症状態に影響することが示唆された。本研究の目的は、動物の歯に実験的歯周炎を惹起させ、その歯の歯周組織の変化を検討することである。本実験の遂行にあたり、慢性歯周炎広範囲型に罹患した患者を被験者とし、プラークコントロール・縁上スケーリング・ポケット内洗浄を行ったのをSP群(被験者数10名)、ルートプレーニグを行ったのをRP群(被験者数6名)とし、被験者に歯周基本治療を行い、治療前後で全顎および動揺歯の咬合がどのように変化したかを感圧測定シートデンタルプレスケールにより咬合接触関係を検討した。臨床パラメータ、PPD、PAL、TM、咬合接触関係の解析は、咬合力、咬合面積、最大圧力、平均圧力である。その結果、SP群では、前歯部の動揺歯は、ポケット内洗浄を行うと有意な値を認めないが、咬合力は、初診時37.5(N)からSP後40.1(N)などと咬合接触関係が改善した。また、前歯部の動揺歯で、PPDの改善とPALの改善と咬合力の増大は有意な相関を認めた。RP群では、咬合面積、最大圧力、平均圧力で、RPにより初診時と比較して有意な増加を認めた。咬合力も有意差を認めないが、初診時54.8(N)からRP後59(N)と増加していた。臨床パラメータは、歯周基本治療によって有意に歯周組織の改善を認めた。本結果は、歯周基本治療によって咬合接触関係は改善される可能性があることが示唆された。このことは、歯周基本治療により歯周組織の改善を認めるがそれに伴う咬合機能の改善は微小であることが推測される。このため消炎を行うことが歯周病罹患歯の歯根膜の病態生理に大きな影響を及ぼしていることは容易に推測できるため、今後、今回の報告に基づく炎症が歯周病罹患歯の歯周組織がどのような影響を及ぼすかを検索する必要がある。