hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィブリン重合および内因性線溶機構に関する基礎的研究

そこでFbg値の解離を示した症例で,血清および血漿のシアル酸を測定したが,血清・血漿間に解離は認められなかった。現在,肝細胞癌症例の血漿よりFbgを精製中であり,精製Fbgにて上記と同様の検討を行なう予定である。トロンビンによって切断され,フィブリノペプチドB放出後に露呈される重合反応基の相補的結合部位はBβ鎖に存在すると推定されている。この相補的結合部位にシアル酸を含む糖鎖が関係するために、トロンビン時間法でのFbg低値の原因である可能性が高い。一方,Fbg,プラスミン分解産物であるD分画,およびE分画の分離・精製は順調に行なわれ,結晶解析・作成に着手可能となった。フィブリノペプチドB(FPB)放出後に露呈されるフィブリン重合反応基に関する検討ではグリミン-ヒスチジン-アルギニン-プロリン(Gly-His-Arg-Pro)ペプチド断端とプラスミン分解産物Dl分画を用いたDlセファローズカラムとの結合実験を行なった。主にpHおよびカルシウムイオンの効果を中心に検討した。その結果,カルシウムイオン存在下では生理的pHより低くなると両者の結合能は上昇したが,カルシウムイオン非存在下では逆に低下することが明らかになった。このことより,FPB放出後に露呈されるフィブリン重合反応基に対する相補的結合部位はカルシウムイオン結合部位に近接し,さらに両者の結合にHisのイミダゾール基(pka:6.0)も影響を及ぼすことが示唆される。また,Dl分画をシアリダーゼ処理し,シアル酸を除去した後にDlセファローズ・カラムを作り,Gly-His-Arg-Proペプチドを用い,両者の結合を検討した。その結果,両者の結合は50μMのカルシウムイオン濃度で最大効果を示した。シアリダーゼ未処理のDlセファローズカラムにおける検討では,0.1mM以上のカルシウムイオン濃度において両者の結合は着干抑制されたが,強い抑制効果は認められなかった。以上のことよりβ鎖364位アスパラギンに付加している糖鎖(シアル酸)が両者の結合に影響を及ぼしていることが示唆される。一方,後天性フィブリノゲン異常分子の精製,結晶解析を始めているが,それらに関しては新たな知見は得られていない。今後も引き続き,検討する予定である。
高エネルギー重イオン衝突における前方ミュー粒子対測定で紐解くハドロン質量の起源

高温媒質内における低質量ベクトル中間子の質量測定は、「カイラル対称性の自発的破れによるハドロン質量の生成」の直接的検証になると期待される。しかし、信号対雑音比(S/N比)が小さいため、この検証は未だに成功していない。本研究は、新型シリコン飛跡検出器(Muon Forward Tracker:MFT)をALICE検出器群に組み込むことで、μ粒子対質量分解能を向上させ、高温媒質内ベクトル中間子質量の高精度測定を実現する。質量分布の系統的測定から、理論的解釈の不定性を取り除き、カイラル対称性とハドロン質量の関係を明らかにする。
精神疾患におけるクロモグラニンの機能解析

本研究は、機能性精神疾患に関与するクロモグラニンB(CHGB)の機能の解明を目的とする。(1)CHGB調節領域に位置する多型と統合失調症との関連解析:CHGB上流領域を中心にTag-SNPを選出、大規模な統合失調症サンプルを用いて検討を行った。その結果、CHGB上流領域に位置する2つのSNPにおいて有意な関連がみられた。これら2つのSNPは先に報告したExon 4内に位置する有意なSNPとも連鎖不平衡の関係にあり、発現調節に関与する可能性が示唆された。(2)CHGB多型とヒトの認知機能との関連解析:ヒトの認知機能(記憶・知能)とCHGB多型との関連を検討した。CHGB上流域に存在する2 SNPについて、神経心理学的検査結果のスコアとの共分散分析を行ったところ、言語性記憶および人格特性のうち新規性追求との関連傾向がみられた。(3)統合失調症患者末梢Bリンパ芽球における発現解析:統合失調症患者末梢Bリンパ球をEBウイルスにより株化させ、網羅的遺伝子発現解析を行った。統合失調症患者15名と、年齢性別をマッチさせた健常対照者15名の実験および解析を行い、さらに2nd setとして統合失調症患者15名と健常対照者15名の実験および解析を行った。統合失調症患者と健常対照者間にCHGBの有意な発現の差は認められなかったが、統合失調症患者特有の発現プロファイルの同定と再現を行っている。(4)CHGB遺伝子コンストラクトの作成:機能解析に用いるCHGB遺伝子コンストラクトを作成するため、Neuroblastoma細胞から抽出したtotal RNAよりCHGBのクローニングを行った。今後、これを用いて培養神経細胞における機能解析、遺伝子改変動物における機能解析を行う予定である。本研究は、所属機関の倫理委員会の審査および承認のもと行い、全ての対象者については自発的意志のもと研究への参加を表明され、書面で同意が得られている。検体はいずれも匿名化されており、実験をする上で試料提供者の個人情報に触れることはなかった。本研究は,機能性精神疾患に関与するクロモグラニンB(CHGB)の機能の解明を目的とする。本年度は以下の項目についての検討を行った。(1)CHGB調節領域に位置する多型と統合失調症との関連解析:CHGB領域の連鎖不平衡ブロックを検討し,Haploviewプログラムを用いて遺伝子調節領域を中心にTag-SNPを選出,大規模な統合失調症サンプルを用いて検討を行った。その結果,CHGB上流領域に位置する2つのSNPにおいて有意な関連がみられた(p<0.05)。これら2つのSNPは先に報告したExon4内に位置する有意な3SNPとも連鎖不平衡の関係にあり,これら2つのSNPがCHGBの発現という機能調節に関係する可能性も考えられる。(2)CHGB多型とヒトの認知機能との関連解析:ヒトの高度な脳機能であり,精神疾患のエンドフェノタイプとして注目されている認知機能(記憶・知能)と,CHGB多型との関連を検討した。認知機能を評価するため用いた神経心理学的検査は,WMS-R,WAIS-RおよびWCSTである。さらに人格特性の評価としてTCIおよびSPQを用いた。CHGB上流域に存在する2SNPについて,各種検査結果のスコアとの共分散分析を行ったところ,言語性記憶および人格特性のうち新規性追求との関連傾向がみられた(P<0.1)。(3)統合失調症患者末梢Bリンパ芽球におけるCHGBの発現解析:統合失調症患者末梢Bリンパ芽球における網羅的遺伝子発現の結果から,CHGBの発現状態を解析した。アレイ上にスポットされているCHGBプローブのシグナルデータから,統合失調症患者と健常対照者間にCHGBの発現の差があるか検討を行ったが,有意な差は認められなかった。本研究は,国立精神・神経センターにおける倫理委員会の審査および承認のもと行い,全ての対象者は自発的意志のもと研究に参加し,書面で同意が得られている。

統合失調症患者と健常対照者間にCHGBの有意な発現の差は認められなかったが、統合失調症患者特有の発現プロファイルの同定と再現を行っている。(4)CHGB遺伝子コンストラクトの作成:機能解析に用いるCHGB遺伝子コンストラクトを作成するため、Neuroblastoma細胞から抽出したtotal RNAよりCHGBのクローニングを行った。今後、これを用いて培養神経細胞における機能解析、遺伝子改変動物における機能解析を行う予定である。本研究は、所属機関の倫理委員会の審査および承認のもと行い、全ての対象者については自発的意志のもと研究への参加を表明され、書面で同意が得られている。検体はいずれも匿名化されており、実験をする上で試料提供者の個人情報に触れることはなかった。
前駆体蛋白質の分子進化における品質管理機構の解明と分子設計への応用

平成30年度は、引き続き、分子内シャペロン機能を有する前駆体プロウログアニリンの分子進化における品質管理機構の存在について焦点を絞り、研究を行った。本目的のため、ヒトだけでなく、アリゲーター(爬虫類)、ウナギ(魚類)およびツメバケイ(鳥類)由来プロウログアニリンを遺伝子組換え体として作成し、その立体構造形成反応を行い、反応機構について調べた。研究はおおむね順調に進んでおり、研究過程において新たな知見を得ることができ、さらなる検討の必要性が生じている。1)異種由来プロウログアニリンの立体構造形成:各種由来の前駆体タンパク質を遺伝子組換え体として調製し、それらの立体構造形成を評価した。昨年度の検討により、それぞれの種の前駆体を、直接、組換え体として得ることができるようになったため、それらの立体構造形成を調べた。その結果、鳥類以外のものでは正しい立体構造形成が起こることが分かった。これらの結果と、短鎖ペプチドの立体構造形成および解析結果から、分子進化機構について仮説をたてつつある。特に、立体構造形成の最終段階であるアルファヘリックス構造への構造転移を伴った進化の理由が説明されつつある。2)de novoデザインした新規生理活性物質のデザインにおいては、部位特異的変異体を用いた立体構造形成実験から、分子内シャペロン機能の最終段階での重要な役割が明らかになりつつあり、想定以上の成果が得られた。そこで、成熟体領域とプロ領域をつなぐヒンジ部位の水素結合の重要性をしらべるため、水素結合を有さない種々の変異体を作成し、それらの立体構造形成反応を調べた。その結果、ヒンジ部位での水素結合が、予想通り、立体構造形成の最終段階での構造選択性を制御していることが明らかになった。また、現在、この知見に基づき、さらなる新規生理活性ペプチドの創作および立体構造形成反応を検討中である。1)ヒト型プロウログアニリンについてその変異体を用いた立体構造形成機構の解析および昨年度来続けてきたNMRによるそれら中間体類似体の立体構造形成解析により、これまで予想していた立体構造形成途中での品質管理機構は、さらにもう一段階の管理機構の存在を明らかにすることができた。すなわち、分子内シャペロンによる立体構造形成は大きく2段階の品質管理機構で行われ、こまかくは3段階の品質管理が行われていることを意味している。また、その最終段階の立体構造の選択がプロセッシング部位における水素結合により制御されていることが分かってきた。本プロジェクトの核心部分がほぼ完結しつつあり、確証を得るための実験を残すのみとなったため、順調であると判断した。2)魚類、鳥類および爬虫類における前駆体プロウログアニリンの立体構造形成の実験から、魚類では、ヒト型とは異なる中間体を経由している可能性が高まり、反応中間体を変更することで分子進化を遂げた可能性が高まった。そこで、本知見を基に、ヒトと魚類のカセット変異体を作成し、分子進化を加速させたものの立体構造形成を評価することができた。分子進化と立体構造形成反応の関連との観点から、本成果は画期的な内容を含んでおり、今後、精査したのち、高レベルでの論文投稿を予定しているため。3)人工設計した混成前駆体タンパク質の立体構造形成反応を調べたところ、ジスルフィド結合の架橋様式が同じであるにもかかわらず、立体構造が異なるトポロジカル異性体を選択的に形成することが分かった。この結果から、ヒンジ領域の水素結合性が最終段階の立体構造の選択性に関与していることが分かったため、その立体構造解析を行うにいたった。現在、NMR法による立体構造解析を進行中であり、今後、十分に目的を達成することができると判断している。1)平成30年度に、魚類から、両生類、爬虫類、哺乳類(ヒトなど)について、インフォマティックによる解析から、分子進化過程を予想し、おおむね目的を達成することができた。しかし、前述のように、鳥類においては、唯一、天然型の形成効率が低いものであった。そこで、鳥類の他の遺伝子について発現実験を行い、本結果が鳥類独自のものであるのかを確認する。2)分子進化を加速した前駆体タンパク質の立体構造解析:分子進化上かけ離れたヒトと魚類(メダカ)のヒンジ領域におけるハイブリッド体を形成し、その立体構造形成を調べたところ、正しい立体構造形成が行われることが分かった。そこで、本タンパク質の立体構造をNMR法で決定する。3)混成タンパク質の立体構造形成と分子内シャペロンの最終制御機構の解明:最終段階での選択性に関与すると予想されるヒンジ領域のAsp残基との水素結合形成を制御するため、成熟体領域の電子ドナーを特定する。それら変異体の立体構造形成および成熟体領域のみの立体構造形成とを比較し、分子内シャペロンが分子進化の過程で現在まで生き残った理由について明らかにする。4)既に作成した、新たなde novoデザイン蛋白質について、その前駆体での立体構造を解析し、成熟体領域が、前駆体中でどのように安定化されているのかを調べる。本研究成果は、本プロジェクトとの発展性を促すものであり、分子進化と生理活性構造形成の中核をなすものと位置づけられる。以上、おおむね、予定通りに進んでおり、今後、本プロジェクトで得られた成果を発表することに尽力する。平成28年度は、化学合成ペプチドを用いた立体構造形成スイッチング機構(品質管理機構)の解明に重きを置き、種々の化学合成ペプチドの立体構図形成反応の評価およびNMR法によるそれらペプチドの立体構造解析を行った。

1)2次構造の構造変化スイッチによる立体構造レベルでの品質管理機構の解明:3種類の長さの異なるヒト型プロウログアニリンのC末端ペプチドを化学合成し、その立体構造形成を種々の条件下で評価した。その結果、立体構造形成初期においてはN末端側に伸長したペプチドほど、ヘリックスの安定化により2型中間体が選択的に得られることを証明することができた。すなわち、前駆体の立体構造形成において、人型の場合は、重要な2型中間体を反応初期に形成することで、その後の正しい天然型への立体構造形成を制御、管理することを明らかにした。現在、そのNMR構造について最終の精密化を行っている。2)分子進化への品質管理に対するスイッチング機構を調べるため、魚類ウログアニリンの短鎖ペプチドをヒト型と同様に調製し、それらの立体構造形成を調べた。その結果、やはり、反応初期に2型の中間体の形成が観察されたが、ヒト型のものほど顕著ではなかった。このことは分子進化において、ヒト型になるほど厳密な品質管理ができていることを示唆している。また、これまで、困難であったウナギプロウログアニリンを融合蛋白質として発現させ、その後、融合体部分を除去して最終的にウナギ型プロウログアニリンを得ることに成功した。3)これまでにすでに得られているハイブリッド型の人工生理活性ペプチドの品質管理機構についても、化学合成ペプチドを用いて同様に検討した。その結果、上記の野生型のプロウログアニリンとハイブリッド体の立体構造形成は異なっていることが分かってきた。今後、その形成反応を詳細に調べ、上記との比較により立体構造制御をさらに解明したい。1)ヒト型プロウログアニリンの立体構造形成機構における品質管理スイッチング機構の役割についてほぼ明らかにすることができ、また、それらの立体構造についてもNMRによりほぼ決定することができた。また、この研究過程において、ある種の変異体ではベータシート構造のわずかな位置のずれが観察された。これはさらなる品質管理機構の存在を示唆しており、この点においては予想以上の成果であった。2)魚類についてもほぼその品質管理の本質を見極めつつある。また、前駆体についてもすでに入手しており、平成29年度の研究への基盤を形成することができた。3)ハイブリッド体については、当初の予想した結果と少し異なることが明らかになりつつある。即ち、デノボ設計したものは本来のプロウログアニリンとは異なった反応経路により立体構造が制御されており、さらなる研究の発展につなげることができた。平成29年度は、分子内シャペロン機能を有する前駆体プロウログアニリンの分子進化における品質管理機構の存在について焦点を絞り、研究を行った。本目的のため、ヒトだけでなく、ウナギ(魚類)およびツメバケイ(鳥類)由来プロウログアニリンを遺伝子組換え体として作成し、その立体構造形成反応を行い、反応機構について調べた。研究はおおむね順調に進んでおり、研究過程において新たな知見を得ることができ、さらなる検討の必要性が生じている。1)ウナギおよびツメバケイ由来プロウログアニリンの立体構造形成:各前駆体タンパク質を遺伝子組換え体として調製し、それらの立体構造形成を評価した。
神経突起伸展因子の作用機作に関する研究

神経突起伸展因子(NOF)を認識し,これと結合する分子(受容体)は,筋肉側にも,神経側にも存在するものと考えられる.そこで今回は,筋肉側の膜分画に存在し, NOFと結合し,かつNOFの生物活性(突起伸展活性)を阻害する分子について追求したので報告する.ニワトリ砂嚢平滑筋の膜分画を0.5%Nonidet p-40で抽出し,その20万g, 60分の上滑をNP-40抽出液とした.各種濃度のNOFを培養皿に塗布し, 300μgのNP-40抽出液を加えていくと, NOFの突起伸展活性が抑えられた.また一定量のNOFを培養皿に塗布して, NP-40抽出液を漸次増加していくと, NOFの突起伸展活性は30μg/wellで完全に抑えられた.一方,ラミニンによる突起伸展作用はNP-40抽出液では抑えられなかった. NP-40抽出液は毛様体ニューロンの生存や,基壁への細胞の結合に対しては影響を与えなかった.トリプシン処理や熱処理で, HP-40抽出液の活性は消失した.DTT処理では活性の低下が見られS-S結合の関与が示唆された.骨格筋は筋胃とほぼ同程度の活性が存在したが,大脳の活性は,筋肉の約1/6であった. NP-40抽出液の阻害活性をもつ成分がNOFと結合するかどうかを調べるために,リカンドフロッティングを行ったところ, 82KDaの蛋白バンドにNOFと結合することが分った.この蛋白質を各種カラムを用いて部分精製した.この部分精製したサンプルをSDSゲル電気泳動にかけ,ゲルをスライスして活性を調べた所, 82KDaの主バンドにNOFの作用を阻害する活性が存在した.lamininに結合する物質(CSAT antigen)やlaminin受容体が知られているが,これらはlaminin細胞結合ドメインと親和性がある.我々の82KDaの蛋白質はNOFの細胞結合ドメインではなく,突起伸展ドメインを認識するようである.今後, 82KDaの蛋白質の精製を進めると共に, 82KDaの蛋白質に対する抗体を作製し, NOF受容体について検討を進めていく予定である.神経突起伸展因子(NOF)を認識し,これと結合する分子(受容体)は,筋肉側にも,神経側にも存在するものと考えられる.そこで今回は,筋肉側の膜分画に存在し, NOFと結合し,かつNOFの生物活性(突起伸展活性)を阻害する分子について追求したので報告する.ニワトリ砂嚢平滑筋の膜分画を0.5%Nonidet p-40で抽出し,その20万g, 60分の上滑をNP-40抽出液とした.各種濃度のNOFを培養皿に塗布し, 300μgのNP-40抽出液を加えていくと, NOFの突起伸展活性が抑えられた.また一定量のNOFを培養皿に塗布して, NP-40抽出液を漸次増加していくと, NOFの突起伸展活性は30μg/wellで完全に抑えられた.一方,ラミニンによる突起伸展作用はNP-40抽出液では抑えられなかった. NP-40抽出液は毛様体ニューロンの生存や,基壁への細胞の結合に対しては影響を与えなかった.トリプシン処理や熱処理で, HP-40抽出液の活性は消失した.DTT処理では活性の低下が見られS-S結合の関与が示唆された.骨格筋は筋胃とほぼ同程度の活性が存在したが,大脳の活性は,筋肉の約1/6であった. NP-40抽出液の阻害活性をもつ成分がNOFと結合するかどうかを調べるために,リカンドフロッティングを行ったところ, 82KDaの蛋白バンドにNOFと結合することが分った.この蛋白質を各種カラムを用いて部分精製した.この部分精製したサンプルをSDSゲル電気泳動にかけ,ゲルをスライスして活性を調べた所, 82KDaの主バンドにNOFの作用を阻害する活性が存在した.lamininに結合する物質(CSAT antigen)やlaminin受容体が知られているが,これらはlaminin細胞結合ドメインと親和性がある.我々の82KDaの蛋白質はNOFの細胞結合ドメインではなく,突起伸展ドメインを認識するようである.今後, 82KDaの蛋白質の精製を進めると共に, 82KDaの蛋白質に対する抗体を作製し, NOF受容体について検討を進めていく予定である.
遺伝情報の維持と突然変異制御の機構

生物の遺伝情報はDNA分子の中に塩基配列の形で保持されており、細胞世代、個体世代を通じてそれを安定に維持することは生物にとって最も重要な機能の一つである。それを担うものは多様な損傷に対するDNA修復機構と高精度のDNA複製機構であるが、我々はその分子的機構を主として大腸菌を用いて明らかにし、その上にたってヒトを含む哺乳動物の細胞内で働いている機構についても部分的に明らかにした。1.アルキル化剤に対する大腸菌の適応応答の分子的機構:適応応答において中心的役割を果たしているAdaタンパクの遺伝子に改変を加え、アミノ酸置換したAdaタンパク、ドメイン構造の一部のみをもつタンパクを作製して解析した。その結果39KDaAdaタンパクのN末端側の20KDaドメインにプロモ-タ-への結合活性があり、特にN末端から69番目のシステイン残基のメチル化によりDNA結合活性と転写促進活性がともに上昇することがわかった。2.自然突然変異の制御におけるDNA複製酵素の役割:大腸菌の複製酵素であるDNAポリメラ-ゼIIIの触媒サブユニット(epsilon)にアミノ酸置換をいれることによって高い自然突然変異率を示すようになることを明らかにし、変異型ポリメラ-ゼの酵素的性質を明らかにした。またAT→CGトランスバ-ジョンの生起を抑えているMut Tタンパクの機能を、そのタンパクがもつdGTPase活性との関連において明らかにした。3.DNAや突然変異の制御に関わる哺乳動物の遺伝子:アルキル化剤によるDNAの傷を修復するメチルトランスフェラ-ゼのcDNAを各種哺乳動物の細胞からクロ-ニングし、ヒトとマウスについてはその遺伝子の構造をほぼ明らかにした。ヒトのある種の癌細胞ではその遺伝子の発現が抑えられていることを明らかにした。1.アルキル化剤に対する大腸菌の適応応答の分子的機構を明らかにするため、その過程で中心的な役割を果しているAda蛋白の機能を中心に研究した。クローニングしたada遺伝子を用いてAda蛋白を大量につくらせ、それからAda蛋白を均一に精製し、それがメチル化されたDNAからメチル基をAda蛋白を転移するメチルトランスフェラーゼ活性をもつこと、Ada蛋白がada遺伝子およびalkA遺伝子の転写促進を行うこと、メチル化されたAda蛋白は非メチル化蛋白に比べてada遺伝子を転写する活性がはるかに高いことを明らかにした。ついでAda蛋白のメチル受容部位と思われるアミノ酸残基を人工変異導入法によって他のアミノ酸に置換し、Cys-69およびCys-321がそれぞれメチルホスホトリエステルおよび【O^6】-メチルグアニンからのメチル受容部位であること、前者のメチル転移が転写促進に、後者のメチル転移が突然変異誘起と致死作用の抑制に効いていることを示した。さらにada遺伝子の転写調節領域のヌクレオチドを変化させたミュータントDNAライブラリーを作製し、どの塩基配列が転写調節にかかわっているかを明らかにした。2.自然突然変異の制御におけるDNA複製酵素の役割を明確にするため、大腸菌のDNAポリメラーゼのεサブユニットの構造遺伝子dnaQと強いミューテーター活性を示すその変異型の遺伝子(mutD5,dnaQ49)の塩基配列を決定し、複製の精度維持に必要な部位を明らかにした。3.アルキル化剤に感受性のヒト培養細胞にクローン化したada遺伝子を移入してその発現をみた。移入した遺伝子の量に応じてメチルトランスフェラーゼ活性が上昇し、またアルキル化剤に対する低抗性も増加した。この結果はヒトの細胞でも同様な酵素が遺伝情報の維持において重要な役割を果していることを示している。アルキル化剤は強い突然変異誘起作用,発がん作用をもっているが,これはアルキル化剤によってDNAにできたアルキル化塩基によっておこると考えられる.生物はそのそのようなアルキル化塩基をDNAからとり除く機構をもっているが,特に大腸菌などの細菌ではそのような修復酵素が微量のアルキル化剤の前処理によって誘導されることが明らかにされている.

その誘導にはada遺伝子の産物であるAdaタンパクが中心的な役割を演じていることを前年度の研究で明らかにしたが,本年度はさらにその分子機構について詳しく解析した. Adaタンパクは2つのメチル受容部位をもつがN端側のCys^<69>はメチルホスホトリエステルから, C端のCys^<321>は0^6メチルグアニンおよび0^4メチルチミンからそれぞれメチル基をうけとり,そのうちCys^<69>のメチル化がAdaタンパクの転写調節因子としての活性化に直接かかわっていることが明らかになった.メチル化されたAdaタンパクはada遺伝子のプロモーター領域に結合して転写を活性化するが,種々の欠失および塩基置換を導入して解析した結果,転写開始点より約50塩上流に位置する8塩基より成る配列AAAGCGCがada遺伝子の発現に必須なことがわかった.この領域に結合したAdaタンパクとそれより下流の-35領或に結合するRNAポリメラーゼの間に物理的なコンタクトがあることを示唆するデータも得られた.Adaタンパクと類似のメチルトランスフェラーゼの活性は他の細菌や哺乳動物の細胞にも存在する.ヒトのがん細胞にはこの活性を欠くものが存在するが,そのような細胞にクローン化した大腸菌のada遺伝子を移入することによりアルキル化剤に対する抵抗性が上昇することを示した.このとき0^6メチルグアニンを修復するC端側の半分だけで回復がおこったので,この塩基の修復が致死および突然変異の誘起と関係すると結論した.DNAの遺伝情報がいかにして安定に維持され、それが次代の細胞へ伝えられるか、その機構を分子レベルで明らかにするため、その機構に異常を持つミュータントを分離し、その遺伝子の産物を同定して研究を進めた。まず自然突然異変の制御機構を明かにするため、正常よりも著しく自然突然変異率の上昇したミューテーターを用いて研究をおこなった。大腸菌のミューテーターのうちmutT変異はAT→GCトランジション変異を特異的にひきおこすことが知られている。この遺伝子をクローニングし、その産物である分子量15.000のタンパク質を分離し、それがdGTPase活性をもつことを明らかにした。DNAポリメラーゼコア酵素は正確な塩基対合に基づいてD.NA合成をすることが知られているが、それでも一定の低い率でい型鎖のAのところにGを誤って取り込むが、このような誤りは反応系にMutTタンパクを加えることによってほぼ完全に抑えられた。このタンパクはdGTPの特殊な異性体(たとえばsyn型)を選択的に分解することによってこのような効果を示すのではないかと考えられる。誘導突然変異に関しては昨年度にひき続いてAdaタンパクを中心に研究を進めた。ada遺伝子の発現は微量のアルキル化剤処理によって誘導されるが、ada遺伝子のプロモーターに変異を導入することによって、この転写促進に必要な配列を同定した。
抗癌遺伝子リボザイムとp53同時発現アデノウイルスベクターの抗腫瘍効果の検討

本研究では、癌遺伝子に対するリボザイムと、癌抑制遺伝子p53とを同時に発現する単一のアデノウイルスベクターの、泌尿器科癌に対する抗腫瘍効果を検討することを目的とした.抗癌遺伝子リボザイムはpol IIIプロモーター、wild-type p53はCMVプロモーターにより、それぞれ単独あるいは同時に発現するアデノウイルスベクターの作製、精製、力価測定を行った後、各種継代ヒト癌細胞への感染効率を検討した.各種細胞間での感染効率の相異をもとに至適投与量を決定した後、治療的遺伝子(各種リボザイム、p53)の細胞内での発現情況を検討し、良好な発現が確認された.抗腫瘍効果の検討は、Hras, erbB-2,p53のstatusのそれぞれ異なる4種の膀胱癌細胞(T-24,EJ, UMUC-3,HT-1376)により行なった.アデノウイルスベクターは、抗癌遺伝子(Hras, erbB-2)リボザイムを単独で発現するAd-HrasRz, Ad-erbB2Rz, p53を単独で発現するAd-p53それぞれの単独投与・併用投与、およびリボザイム・p53を同時発現するAd-HrasRz/p53,Ad-erbB2Rz/p53を投与し、抗腫瘍効果を比較検討した.検討したすべての細胞において、リボザイム単独発現アデノウイルスとAd-p53の併用投与により、抗腫瘍効果の増強が確認された.さらにリボザイムおよびp53同時発現ベクターにおいては、とくにAd-erbB2/p53において、より低容量で併用投与と同等あるいはより優れた抗腫瘍効果が確認された.本研究より、複数の治療的遺伝子同時発現ベクターでは、より低容量の投与で有効性が得られるため、ベクター自体の副作用の発現を軽減させることが可能と考えられた.本研究では、癌遺伝子に対するリボザイムと、癌抑制遺伝子p53とを同時に発現する単一のアデノウイルスベクターの、泌尿器科癌に対する抗腫瘍効果を検討することを目的とした.抗癌遺伝子リボザイムはpol IIIプロモーター、wild-type p53はCMVプロモーターにより、それぞれ単独あるいは同時に発現するアデノウイルスベクターの作製、精製、力価測定を行った後、各種継代ヒト癌細胞への感染効率を検討した.各種細胞間での感染効率の相異をもとに至適投与量を決定した後、治療的遺伝子(各種リボザイム、p53)の細胞内での発現情況を検討し、良好な発現が確認された.抗腫瘍効果の検討は、Hras, erbB-2,p53のstatusのそれぞれ異なる4種の膀胱癌細胞(T-24,EJ, UMUC-3,HT-1376)により行なった.アデノウイルスベクターは、抗癌遺伝子(Hras, erbB-2)リボザイムを単独で発現するAd-HrasRz, Ad-erbB2Rz, p53を単独で発現するAd-p53それぞれの単独投与・併用投与、およびリボザイム・p53を同時発現するAd-HrasRz/p53,Ad-erbB2Rz/p53を投与し、抗腫瘍効果を比較検討した.検討したすべての細胞において、リボザイム単独発現アデノウイルスとAd-p53の併用投与により、抗腫瘍効果の増強が確認された.さらにリボザイムおよびp53同時発現ベクターにおいては、とくにAd-erbB2/p53において、より低容量で併用投与と同等あるいはより優れた抗腫瘍効果が確認された.本研究より、複数の治療的遺伝子同時発現ベクターでは、より低容量の投与で有効性が得られるため、ベクター自体の副作用の発現を軽減させることが可能と考えられた.数種の治療的遺伝子発現アデノウイルスベクターの,高力価精製バイアルの作製および力価測定は終了した.すなわち,抗癌遺伝子リボザイム(抗Hras,および抗erbB2リボザイム)発現ベクター,p53発現ベクター,およびこれらを同時(抗Hrasリボザイム+p53,抗erbB2リボザイム+p53).に発現するベクターを作成後,増殖-精製を行い,力価測定により高い感染性を有するウイルスベクターが得られた.作製したウイルスベクターの,各種腫瘍細胞への感染効率を確認する目的で,2種のヒト膀胱腫瘍細胞株(EJ,T24)および4種のヒト前立腺癌細胞株(LNCap,PC-3,TSU,DU-145)に対して,beta-galactosidaseを発現するウイルスベクターを培養細胞に感染させて検討した.これらより得られた,作製した各ウイルスベクターの力価の相違,および各腫瘍細胞への感染効率の相違をもとに,各腫瘍細胞に対するウイルスベクターの力価を標準化し,腫瘍細胞の増殖抑制効果の検討を開始している.それぞれの治療的遺伝子を単独で使用したときに,腫瘍増殖抑制効果が容量依存的に認められることが確認できた.また,複数のウイルスベクターの併用効果,あるいは同時発現ベクターの腫瘍抑制効果につき検討している.現在,標的遺伝子およびその生成蛋白の治療前後における発現性の変化につき,分子生物学的解析を行っている.今後は,標的遺伝子だけでなく,腫瘍増殖関連遺伝子(アポトーシス因子,血管新生因子など)の変化についても,免疫染色および分子生物学的手法により解析していく予定である.抗癌遺伝子リボザイム(抗Hras,および抗erbB2リボザイム)発現ベクター,p53発現ベクター,およびこれらを同時(抗Hrasリボザイム+p53,抗erbB2リボザイム+p53)に発現するベクターを作成,精製した.今年度は,作製したウイルスベクターの4種のヒト膀胱腫瘍細胞株(EJ,T24,HT-1376,UMC-3)および乳癌細胞MCF

-7に対する感染効率および抗腫瘍効果を検討した.感染効率を検討する際,これら腫瘍細胞のアデノウイルスに対する受容体CAR(Coxsackie-Adenouvirus Receptor)の発現に関してもRT-PCRにより検討した.その結果,いずれの膀胱癌細胞もCARを発現していることが確認された.また,beta-galactosidaseを発現するアデノウイルスベクターを培養細胞に感染させて,in vitroでの感染効率を検府した.これらより得られた結果をもとに,各腫瘍細胞に対するウイルスベクターの力価を標準化し,腫瘍細胞の増殖抑制効果を検討した.それぞれの治療的遺伝子を単独で使用したときに,腫瘍増殖抑制効果が容量依存的に認められることが確認できた.また,複数のウイルスベクターの併用あるいは同時発現ベクターの投与により,腫瘍抑制効果が増強することが確認できた.またp53発現アデノウイルスによる,アポトーシスの誘導についても検討が終了した.今後は,複数の遺伝子の同時発現ウイルス投与による,標的遺伝子および腫瘍増殖関連遺伝子(アポトーシス因子,血管新生因子など)の解析を進め,in vivoでの検討に移行していく予定である.本研究では、癌遺伝子に対するリボザイムと、癌抑制遺伝子p53とを同時に発現する単一のアデノウイルスベクターの、泌尿器科癌に対する抗腫瘍効果を検討することを目的とした.抗癌遺伝子リボザイムはpol IIIプロモーター、wild-type p53はCMWプロモーターにより、それぞれ単独あるいは同時に発現するアデノウイルスベクターの作製、精製、力価測定を行った後、各種継代ヒト癌細胞への感染効率を検討した.各種細胞間での感染効率の相違をもとに至適投与量を決定した後、治療的遺伝子(各種リボザイム、p53)の細胞内での発現情況を検討し、良好な発現が確認された.抗腫瘍効果の検討は、Hras, erbB-2, p53のstatusのそれぞれの異なる4種の膀胱癌細胞(T-24, EJ, UMUC-3, HT-1376)により行った.アデノウイルスベクターは、抗癌遺伝子(Hras, erbB-2)リボザイムを単独で発現するAd-HrasRz, Ad-erbB2Rz, p53を単独で発現するAd-p53それぞれの単独投与・併用投与、およびリボザイム・p53を同時発言するAd-HrasRz/p53, Ad-erbB2Rz/p53を投与し、抗腫瘍効果を比較検討した。検討したすべての細胞において、リボザイム単独発現アデノウイルスとAd-p53の併用投与により、抗腫瘍効果の増強が確認された。さらにリボザイムおよびp53同時発現ベクターにおいては、とくにAd-erbB2/p53において、より低容量で併用投与と同等あるいはより優れた抗腫瘍効果が確認された.本研究より、複数の治療的遺伝子同時発言ベクターでは、より低容量の投与で有効性が得られるため、ベクター自体の副作用の発現軽減させることが可能と考えられた.
足裏への温度提示による無意識の立位調節機序の解明とリハビリテーションへの応用

申請者はこれまでの研究で,無意識的な運動調節に温痛覚が寄与することを示唆した.本研究はこれを立位姿勢の制御へ応用し,簡便で負担の少ないリハビリテーションが実施されることを目的とする.重心制御を行うにあたり,温度刺激を足裏に提示する手法を採用している.これまで使用してきた装置は,バランスWiiボード(任天堂)上部にペルチェ素子を用いた自作の温度刺激装置を取り付け,足裏への温度刺激と重心の計測を同時に行なってきた.装置の最上部,足裏が接触する温度提示面にはペルチェ素子を敷き詰め,その下部には冷却用の放熱板とファンを配置する.ペルチェ素子は印加する電流量の制御により加熱・冷却が可能な電子素子であり,温度を提示する素子としては一般的なものである.ペルチェ素子の提示温度はマイコン制御され,高速に変化することが可能である.配置された各ペルチェ素子はそれぞれ異なる温度を提示することが可能である.初年度までこの試作装置を用いた予備実験を続け,刺激提示と重心計測の両者について限界が見えてきた.試作段階での実験結果を生かし,より精密な刺激提示・計測が可能な装置を設計しており,次年度でこれを作成し実験に用いる.また温痛覚と運動調節の関係についてこれまで行ってきた研究のうち,指先に提示される温度と把持力の関係について行った研究につき論文化を執筆中であり,これは今後Current Biology誌への投稿を予定している.広範囲への温度刺激提示手法に密接に関わる錯覚現象Thermal Referralについての実験結果もまとめており,感性工学会論文誌へ投稿の予定である.本申請は温痛覚と運動制御の関係性を解明し,これを応用した立位リハビリテーション手法の礎を築くものである.申請者はこれまでの研究で無意識に出力された運動が,温痛覚の生起を知る手がかりとなるのみならず,一方で温痛覚・運動制御間の関係は,提示する温度パタンによって誘発される人間の運動を制御できることも示している.温度刺激の提示場所として,人間の立位姿勢制御に大きく関わり,全体重を支える足裏を選択した.足裏に温度を提示する装置を試作・予備実験を行い,その結果をもとにより正確な提示・計測が可能な装置を設計した.本研究の基幹となる温度ー運動調節についての研究,関連する温度錯覚現象についての研究結果も論文化を進めている.次年度では初年度の設計をもとに実験を行う.初年度に行った設計に基づき,実験装置を作成する.初年度に購入した重心動揺計と電子部品を用いて自作の温度提示装置を増設する.その構造はこれまでのものと基本的に同じであり,ペルチェ素子と放熱板を用い,マイコン制御によって提示温度を調整するものである.足裏に提示する温度パタンを変化した際の姿勢変化を検証するとともに,被験者の脚部に装着した筋電位計から,姿勢変化時の筋活動を検証する.温度提示による姿勢調節のメカニズム解明にあたり,姿勢変化に伴い身体のどの筋肉が使用されるのかは重要な手掛かりとなる..温度ー筋活動間の関係が明らかとなれば,効率的な機能回復のために特定の筋を重点的に活動させるということも可能となる.これらの実験は,まず姿勢調節機能に問題のない被験者に行い,その後機能に問題をもつ被験者へ適用し,リハビリテーションの効果を検証する.申請者はこれまでの研究で,無意識的な運動調節に温痛覚が寄与することを示唆した.本研究はこれを立位姿勢の制御へ応用し,簡便で負担の少ないリハビリテーションが実施されることを目的とする.重心制御を行うにあたり,温度刺激を足裏に提示する手法を採用している.これまで使用してきた装置は,バランスWiiボード(任天堂)上部にペルチェ素子を用いた自作の温度刺激装置を取り付け,足裏への温度刺激と重心の計測を同時に行なってきた.装置の最上部,足裏が接触する温度提示面にはペルチェ素子を敷き詰め,その下部には冷却用の放熱板とファンを配置する.ペルチェ素子は印加する電流量の制御により加熱・冷却が可能な電子素子であり,温度を提示する素子としては一般的なものである.ペルチェ素子の提示温度はマイコン制御され,高速に変化することが可能である.配置された各ペルチェ素子はそれぞれ異なる温度を提示することが可能である.初年度までこの試作装置を用いた予備実験を続け,刺激提示と重心計測の両者について限界が見えてきた.試作段階での実験結果を生かし,より精密な刺激提示・計測が可能な装置を設計しており,次年度でこれを作成し実験に用いる.また温痛覚と運動調節の関係についてこれまで行ってきた研究のうち,指先に提示される温度と把持力の関係について行った研究につき論文化を執筆中であり,これは今後Current Biology誌への投稿を予定している.広範囲への温度刺激提示手法に密接に関わる錯覚現象Thermal Referralについての実験結果もまとめており,感性工学会論文誌へ投稿の予定である.本申請は温痛覚と運動制御の関係性を解明し,これを応用した立位リハビリテーション手法の礎を築くものである.申請者はこれまでの研究で無意識に出力された運動が,温痛覚の生起を知る手がかりとなるのみならず,一方で温痛覚・運動制御間の関係は,提示する温度パタンによって誘発される人間の運動を制御できることも示している.温度刺激の提示場所として,人間の立位姿勢制御に大きく関わり,全体重を支える足裏を選択した.足裏に温度を提示する装置を試作・予備実験を行い,その結果をもとにより正確な提示・計測が可能な装置を設計した.本研究の基幹となる温度ー

運動調節についての研究,関連する温度錯覚現象についての研究結果も論文化を進めている.次年度では初年度の設計をもとに実験を行う.初年度に行った設計に基づき,実験装置を作成する.初年度に購入した重心動揺計と電子部品を用いて自作の温度提示装置を増設する.その構造はこれまでのものと基本的に同じであり,ペルチェ素子と放熱板を用い,マイコン制御によって提示温度を調整するものである.足裏に提示する温度パタンを変化した際の姿勢変化を検証するとともに,被験者の脚部に装着した筋電位計から,姿勢変化時の筋活動を検証する.温度提示による姿勢調節のメカニズム解明にあたり,姿勢変化に伴い身体のどの筋肉が使用されるのかは重要な手掛かりとなる..温度ー筋活動間の関係が明らかとなれば,効率的な機能回復のために特定の筋を重点的に活動させるということも可能となる.これらの実験は,まず姿勢調節機能に問題のない被験者に行い,その後機能に問題をもつ被験者へ適用し,リハビリテーションの効果を検証する.
オブジェクトベ-スシステムに適した並行処理制御方式の性能評価に関する研究

研究計画調書に基づいて,平成3年度の研究では以下に記した二つの課題を主要な目的として研究を行なった。最初に,相互に複雑な関連をもつと考えられる動画像,アニメ-ション,テキスト,音声などの情報メディア各々をオブジェクトとしてとらえ,オブジェクト間の構造あるいは相互の関係を可能な限り直接的に表現したオブジェクト指向に基づいたマルチメディアモデルを確立し,ワ-クステ-ションに構築し,本研究で提案する並行処理制御方式の対象とする基本的なオブジェクトベ-スモデルとした。つぎに,本研究の中心的なテ-マである高性能を有する並行処理制御方式の考察・提案を行なった。まず,従来から重点的に行ってきたオブジェクト指向デ-タベ-スシステムにおける並行処理制御方式の調査研究を総括し研究動向をまとめた。そのうえで,オブジェクトベ-スシステムで特に重要と考えられる協調作業環境の支援を充分に考慮した制御方式の提案を行なった。さらに,構築した基本的なオブジェクト指向のデ-タモデルを対象として,上記で提案した並行処理制御方式を適用し,実装を行なう準備を行なった。特に,本年度の研究で開発した高度リフトウエアとしては,マルチメディアプレゼンテ-ションシステムHarmonyがある。以上,本年度で計画していた研究およびソフトウエア開発に関する目標を滞りなく完了した。
可換環論とその表現の研究

上記の研究課題の下に研究代表者、分担者により可換環論、多変数関数論、偏微分方程式論、ディオファンタス近似論、4次元多様体論などにまたがった以下のような研究成果が得られ、そのある部分はすでに学会発表、論文発表などのかたちで公表されている。複素領域における偏微分方程式の初期境界値問題、いわゆるグルサ-問題において、ある種の方程式の解の存在領域、解析接続に関しての成果を得た。(武内)1次元Schrodinger作用素の正値性に関するSawyerの結果を用いて楠岡-Strook-保城型作用素が準楕円型になるための必要十分条件が得られた。さらに極大関数を用いて、多次元Schrodinger作用素の正値性に関する十分条件を与え、それを用いて、無限次退化の2階楕円型作用素の準楕円性を論じた。(森本)ディオファンタス近似と超越数について、Beukers積分を用いて、対数値の非2次無理数度が改良された。(畑)また、代数拡大の一般環への拡大、P-pairsの統一理論に関する成果。(秋葉)複素算術幾何平均は複素平面上の集合としてある種の自己相似性があることが解明された。(西和田)上記の研究課題の下に研究代表者、分担者により可換環論、多変数関数論、偏微分方程式論、ディオファンタス近似論、4次元多様体論などにまたがった以下のような研究成果が得られ、そのある部分はすでに学会発表、論文発表などのかたちで公表されている。(西和田)
活性酸素種生成酵素の網羅的解析に基づく植物ROSダイナミクス・ネットワークの解明

シグナル物質として機能すると考えられている活性酸素種(ROS:Reactive Oxygen Species)の生成を担うのは,NADPH oxidaseのRboh(respiratory burst oxidase homolog)である.このRbohに着目し,ROSの生成制御機構および,その生理学的意義の解明を目的に研究をおこない,下記の点について明らかにした.シロイヌナズナにある10個のAtRboh遺伝子について,RT-PCRやpromoter::GUSによる発現解析をおこなった.興味深いことに、8遺伝子が根で発現していることを明らかにした.このことは,AtRbohにより積極的に生成されたROSは,根において多彩な役割を担っていることを示唆するものである.【AtRboh活性制御因子の同定】【イネOsRbohBの活性化制御】イネの感染防御応答に関与すると考えられているOsRbohBについて,HEK239T細胞を用いた異種発現解析をおこなった.OsRbohBも,AtRbohと同様に蛋白質リン酸化およびCa^<2+>により活性化されることを明らかにした.さらに,OsRbohBのN末端欠失変異体シリーズの解析をおこない,EF-handよりN末端側の領域もCa^<2+>による活性化に必須であることも明らかにした(Takahahi et al.,The Journal of Biochemistry,in press,2012).活性酸素種(ROS)は,非常に細胞毒性が強いため,生物にとって不要なものである,と思われがちである.しかし,ROSは,生きる上で必要不可欠な物質でもある.では,植物はどのように,ROSを利用しているのであろうか.シロイヌナズナには,ROSを生成する酵素が10種もある.本研究により,これらはCa^<2+>あるいはリン酸化により活性化しROSを生成すること,相互作用因子により活性が調節されることを示唆した.これらのことから,植物は,適当な組織・タイミングでROSを生成し,毒性の強いROSを巧みに活用していることを明らかにした.光合成や呼吸の際,副次的に活性酸素種(ROS)が生成される.ROSは,きわめて反応性が高い物質で,細胞に甚大な影響を及ぼすため,植物にとっていわば毒となる物質である.ところが,生体防御応答・形態形成・環境ストレス応答など多様な生命現象の局面においてROSは積極的に生成され,シグナル物質として機能する必須の物質でもある.本研究では,積極的に生成されるROSの発生機構および生理学的意義の解明を目的として研究を進めている.これまでに,下記の点について明らかにした.【植物rbohの網羅的機能解析】シロイヌナズナから単離した10種のROS生成酵素AtrbohA-JとイネOsrbohBについて,ヒト培養細胞HEK293Tを用いた異種発現解析をおこなった.その結果,ほぼ全てのrbohはROS生成能を持つこと,Ca^<2+>イオノフォアであるイオノマイシン,脱リン酸化阻害剤カリクリンAにより活性化されること,さらに両者により相乗的に活性化されることを明らかにした(投稿準備中).【Atrboh活性制御因子の単離と機能解析】イネCa^<2+>チャネル候補因子OsMCA1は細胞膜に局在すること.OsMCA1過剰発現株,機能破壊株の解析より,低浸透圧下でのCa^<2+>上昇ならびに低浸透圧誘導性のROS生成に関与することが示唆された(投稿準備中).毒性の強い活性酸素種(Reactive Oxygen Species : ROS)は,形態形成・生体防御応答・環境ストレス応答など多様な生命現象の局面において,酵素により積極的に生成され,シグナル物質として利用されている.この積極的ROS生成を担う酵素が,Rbohである.本研究では,このRbohに着目し,ROSの生成制御機構および,積極的に生成されたROSの生理学的意義の解明を目的として研究を進めている.本年度,下記の点について明らかにした.【AtRboh活性制御因子の同定】酵母two-hybridscreeningによりAtRbohD, AtRbohFの相互作用因子を探索し,19種の候補因子を単離した.得られた候補因子をHEK293T細胞内で異種共発現させ,AtRbohD, AtRbohFの活性化制御への関与を調べた.結果,活性を昂進させる因子と,抑制させる因子を同定した.これらの結果は,複数の制御因子により,AtRbohD, AtRbohFの活性化が,厳密に制御されていることを示唆している.【分子内相互作用による活性化制御】AtRbohFのN末端領域とC末端領域が,酵母内において相互作用することを明らかにした.この結果は,両端領域の相互作用が,AtRboh活性化のきっかけになるという可能性を示唆するものである.今後,Ca^<2+>オシレーション下における,AtRboh活性化制御機構の解明につながると考えている.AtRbohD, AtRbohFのCa^<2+>依存的な活性化は,蛋白質リン酸化酵素阻害剤K252aにより阻害されることを明らかにした.このことは,Ca^<2+>-ROSによるポジティブフィードバック制御において,Rbohのリン酸化により誘導されたROSがこのフィードバックの初発であるという,新規な概念を提唱するものである.シグナル物質として機能すると考えられている活性酸素種(ROS:Reactive Oxygen Species)の生成を担うのは,NADPH oxidaseのRboh(respiratory burst oxidase homolog)である.

このRbohに着目し,ROSの生成制御機構および,その生理学的意義の解明を目的に研究をおこない,下記の点について明らかにした.シロイヌナズナにある10個のAtRboh遺伝子について,RT-PCRやpromoter::GUSによる発現解析をおこなった.興味深いことに、8遺伝子が根で発現していることを明らかにした.このことは,AtRbohにより積極的に生成されたROSは,根において多彩な役割を担っていることを示唆するものである.【AtRboh活性制御因子の同定】【イネOsRbohBの活性化制御】イネの感染防御応答に関与すると考えられているOsRbohBについて,HEK239T細胞を用いた異種発現解析をおこなった.OsRbohBも,AtRbohと同様に蛋白質リン酸化およびCa^<2+>により活性化されることを明らかにした.さらに,OsRbohBのN末端欠失変異体シリーズの解析をおこない,EF-handよりN末端側の領域もCa^<2+>による活性化に必須であることも明らかにした(Takahahi et al.,The Journal of Biochemistry,in press,2012).
明清の散文における亡妻哀悼文学の展開

本研究は、明清の士大夫が自ら筆を執って亡妻(亡妾)を哀悼した散文、すなわち亡妻行状・亡妻墓誌銘・祭亡妻文を中心に、明清の哀悼文学の特徴を考察することを目的としている。平成30年度は、明清の亡妻墓誌銘および亡妻行状、祭亡妻文についてその全体量を把握するための調査を行った。明代については研究開始前に『四庫全書』所収の明人別集と京都大学人文学研究所所蔵の明代文集を中心に初歩的な調査を終えていたが、30年度はこれまで調査の及んでいなかった中国国家図書館(北京図書館)などに赴き、調査を進めた。また、国内では国会図書館(関西館)にて、『四庫全書存目叢書』および『続修四庫全書』のうちの明人文集から亡妻墓誌銘および亡妻行状、祭亡妻文を索出する作業を行った。これらの調査の結果、現在のところ、明代では、亡妻墓誌銘151篇亡妻行状57篇、祭亡妻文151篇を収集している。しかし、一方、清代の文集は量も多いことから、まだ調査が及んでいないものが多い。また、女性墓誌銘/行状の文体に対する金石学者や儒学者の見解の整理を行った。たとえば汪鈍翁が「女子に伝無く謚(おくりな)無きに亦た奚(なん)ぞ行状を用って為すや」(「与人論墓誌銘篆蓋書」)というように、女性の行状について否定的立場を採る清人は多い。黄宗羲、閻潜丘、顧炎武など清の金石学儒学者の見解を調べつつ、清の学者が文体としての亡妻行状をどのようにとらえていたかを整理した。このほか、本研究の背景となる明清士大夫の文化史について論じた李孝悌氏の論文集の翻訳と監訳を行い、10月には李孝悌氏を招聘して奈良女子大学にてシンポジウム「明清文化研究の現在」を開催し、研究交流を行った。明清の亡妻墓誌銘および亡妻行状、祭亡妻文を収集する作業は、電子データの検索によって索出できるものではない。亡妻墓誌銘/行状/祭文は、その標題に「亡妻」「亡室」とあれば、士大夫が亡妻のために書したものであることは明らかだが、「〇〇夫人」または「〇氏」とのみ題されている場合も多いからである。そのため、調査に手間と時間がかかる。また、清代の文集は量も多く、所蔵機関が各所に分散しており、国内出張の必要があるが、平成30年度は勤務先の大学の業務が多忙で、思うように出張の時間がとれなかったという事情がある。清代の文集は量も多いことと、所蔵機関が各所に分散していることから、叢書を閲覧するのが最も効率がよいと判断している。現在、清代の文集の叢書としては、『清代詩文集彙編』(4058種、全800冊、上海古籍出版社)、『清代詩文集珍本叢刊』(全600冊、国家図書館出版社)、『清文海』(全106冊、国家図書館出版社)が公刊されている。しかしながら、これらの大型図書は大変高価であり、日本には所蔵している機関が存在しない。そのため、次年度以降は、これらの大型叢書をすべて所蔵している台湾中央研究院の文哲所図書室と傅斯年図書館に赴き、調査を行うことを計画している。これによって、清代の亡妻行状、亡妻墓誌銘の索出作業が進むことが期待される。