hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小口径人工血管(2mm)吻合部狭窄に対するピオグリタゾンの抑制効果

口径2mm程度の人工血管は未だ実用化されていない。その理由の一つに吻合部の狭窄があり有効な予防法はない。使用したピオグリタゾンは糖尿病治療薬でありながら細胞増殖を抑える効果が期待できる。まず静脈グラフトを腹部大動脈に移植するモデルを使用した。その結果、経口投与したピオグリタゾンは吻合部狭窄予防効果を有することが確認できた。現在2mmの人工血管周囲にピオグリタゾン徐放性シートを巻きその効果を確認中である。平成20年度は小口径人工血管の使用を予定していたが、小口径人工血管を入手できるまでの間に自己静脈を用いて以下の実験を施行した。ピオグリタゾンは経口投与した。(平成21年度第109回日本外科学会定期学術集会にて口演予定)【方法】ラット自家大腿静脈を用いた腹部大動脈置換モデルを作成し、これらをピオグリタゾン(3mg/kg/day)経口投与群(group A、n=6)と非投与群(group B、n=6)に分類した。術後8週目に、グラフトの血流速度と外径の拡張率を測定し、摘出静脈グラフトをHE染色、Elastica van Gieson染色およびα-SMA免疫組織化学染色にて病理組織学的に評価した。【結果】術後8週目において、ラット自家静脈グラフトはすべて開存していたが、ピオグリタゾン投与群では相対的グラフト血流速度(グラフト血流速度/腹部大動脈血流速度)が非投与群と比較して有意に速く(A, 0.77±0.05; B, 0.59±0.06; P<0.0001)、外径の拡張率は有意に抑制されていた(A, 23.1±4.8%; B, 41.3±5.7%; P=0.0001)。非投与群ではグラフト内膜および中膜が破綻し、不均一な新生内膜が形成していたのに対して、ピオグリタゾン投与群ではそれらが保持されて新生内膜の形成が抑制されていた(A, 14.7±3.3%; B, 29.9±7.2%; P=0.0008)。また免疫組織化学染色では、ピオグリタゾン投与群においてα-SMA陽性細胞が減少し、平滑筋細胞の増殖抑制が示唆された。【結論】ピオグリタゾンは、動脈再建に用いたラット自家静脈グラフトにおいて、グラフト拡張および内膜過形成を抑制し、グラフト血流速度を改善させた。平成21年度は昨年度報告したように、人工血管の代わりに自己静脈を用いて以下の実験を施行し論文投稿し受理され現在印刷中である。【方法】ラット自家大腿静脈を用いた腹部大動脈置換モデルを作成し、ピオグリタゾン(3mg/kg/day)経口投与群(group A、n=6)と非投与群(group B、n=6)の2群に分類した。術後8週目に、グラフトの血流速度と外径の拡張率を測定し、摘出静脈グラフトをHE染色、Elastica van Gieson染色およびa-SMA免疫組織化学染色にて病理組織学的に評価した。【結果】術後8週目において、ラット自家静脈グラフトはすべて開存していたが、ピオグリタゾン投与群では相対的グラフト血流速度(グラフト血流速度/腹部大動脈血流速度)が非投与群と比較して有意に速く(A,0.87±0.02;B,0.66±0.05;P<0.0001)、外径の拡張率は有意に抑制されていた(A,36.3±2.2%;B,61.4±3.9%;P=0.0002)。非投与群ではグラフト内膜および中膜が破綻し、不均一な新生内膜が形成していたのに対して、ピオグリタゾン投与群ではそれらが保持されて新生内膜の形成が抑制されていた(A,14.6±1.3%;B,29.9±2.9%;P=0.0008)。また免疫組織化学染色では、ピオグリタゾン投与群においてa-SMA陽性細胞が減少し、平滑筋細胞の増殖抑制され吻合部狭窄も抑制された。また静脈グラフトの吻合部狭窄も抑制した。平成22年度は昨年度報告したように、人工血管の代わりに自己静脈を用いて以下の実験を施行し論文が掲載された。【結果】

術後8週目において、ラット自家静脈グラフトはすべて開存していたが、ピオグリタゾン投与群では相対的グラフト血流速度(グラフト血流速度/腹部大動脈血流速度)が非投与群と比較して有意に速く(A,0.87±0.02;B,0.66±0.05;P<0.0001)、外径の拡張率は有意に抑制されていた(A,36.3±2.2%;B,61.4±3.9%;P=0.0002)。非投与群ではグラフト内膜および中膜が破綻し、不均一な新生内膜が形成していたのに対して、ピオグリタゾン投与群ではそれらが保持されて新生内膜の形成が抑制されていた(A,14.6±1.3%;B,29,9±2,9%;P=0.0008)。また免疫組織化学染色では、ピオグリタゾン投与群においてα-SMA陽性細胞が減少し、平滑筋細胞の増殖抑制され吻合部狭窄も抑制された。【結論】ピオグリタゾンは、動脈再建に用いたラット自家静脈グラフトにおいて、グラフト拡張および内膜過形成を抑制し、グラフト血流速度を改善させた。また静脈グラフトの吻合部狭窄も抑制した。平成22年度はピオグリタゾンの静脈吻合部狭窄抑制効果を確認し、ピオグリタゾン浸漬徐放性ジェルを作製した。今後継続し小口径人工血管吻合部にピオグリタゾン浸漬徐放性ジェルを使用し狭窄抑制効果を検討してゆく予定である。
部分酸化と水素化分解の２段階処理による未利用炭素資源からの単環芳香族合成法の開発

リグニンを部分酸化処理と水素化分解処理により単環フェノール類を合成するプロセスの開発を目指し,リグニン部分酸化の反応挙動の検討および外部からの水素供給なしで低分子化リグニンの水素化分解反応を可能にする反応系の開発を行った.リグニン部分酸化反応は定速昇温法により,酸化過程での重量増加とその反応速度を定式化することに成功した.また,外部から水素供給を行わない新規水素化分解反応系として,メタノール溶媒中,白金触媒共存下で低分子化リグニンモデル物質の水素化反応を実施した。本反応系ではメタノール分解による水素生成と反応器内で生成した水素による水素化反応が同時に進行することを明らかにした。本研究の目的は,部分酸化前処理とメタノール溶媒存在下での水素化分解処理の2段階処理によるリグニンからの単環フェノール類合成プロセスの開発を行うことである.初年度は,(1)リグニンの部分酸化反応速度の定式化と(2)ベンゾフランのメタノール溶媒中,アルミナ担持白金触媒共存下でのin-situ水素化分解反応の検証を実施した.(1)リグニンの部分酸化反応速度解析:熱天秤を用いリグニン試薬を空気流通下において40 °Cから2, 5, 10 °C/minの一定昇温速度で昇温した際の重量変化より実施した.いずれの昇温速度においても80160 °Cの範囲で酸素取り込みによる重量増加を確認した.反応速度解析により,リグニンの重量増加を伴う酸化反応の活性化エネルギーは5668 kJ/molであることを明らかにし,部分酸化反応条件を決定するための有用な知見が得られた.(2) in-situ水素化分解反応の検証:リグニン熱分解で生成が予想されるベンゾフランをモデル物質とし,メタノール溶媒,アルミナ担持白金触媒共存下で実施した.バッチ式反応器にベンゾフランとメタノール,アルミナ担持白金触媒を充填し,220 °Cで24時間反応を行ったところ,気相水素と2,3-ジヒドロベンゾフラン,o-エチルフェノール,少量のフェノールが生成し,ベンゾフランの転化率は11.5 mol-%に達し,水素利用効率(正味の水素生成量に対する水素化反応による水素消費量)は0.53となった.本反応条件ではフラン環の水素化および水素化分解のみが進行し,ベンゼン環の水素化は見られなかった.反応温度,反応時間を大きくするほどベンゾフラン転化率および水素利用効率は増加したが,気相水素量は10時間以降で大きな変化は見られなかった.触媒上で生成した原子状水素の一部は脱着し,気相へ放出された後再溶解し反応に関与した可能性が示唆された.部分酸化前処理においては,リグニン酸化時の挙動を反応速度解析により定式化し,前処理条件決定に有用な知見を得られた.また,in-situ水素化分解処理では,フラン環のin-situ水素化分解反応を実施し,メタノールからの水素生成と含酸素官能基の水素化および水素化分解が可能であることを明らかにした.当初の目標であった触媒担体の影響の検討には至らなかったが,概ね順調であると判断される.本研究は部分酸化前処理とメタノール溶媒存在下での水素化処理の2段階処理によるリグニンからの単環フェノール類を合成するプロセス開発を目的とする。本年度は、後段の処理について1生成物収率の経時変化、2触媒担体の影響、3反応基質の影響を検討した。1生成物収率の経時変化:白金担持アルミナ触媒、メタノール溶媒共存下、反応温度220度、反応時間148時間、モデル物質としてベンゾフランのin-situ水素化分解を実施した.本反応系では,メタノール分解で生成した水素によりベンゾフランのフラン環部分のみが選択的に水素化され、2,3-ジヒドロベンゾフラン、エチルフェノールとフェノールが生成することを見出している。反応時間の増加に伴い,液相生成物の収率は加速的に増加した。一方、気相の水素生成量は24時間までは増加したが、その後48時間まではあまり変化しなかった。したがって、反応系内の水素分圧増加により水素化反応は促進されるが、メタノール分解反応は平衡に達することが示唆された。2触媒担体の影響:アルミナ、チタニア、ジルコニアの3種類の担体について検討した。アルミナ担体は他の担体に比べ担持した白金の粒子径が半分となり、高いin-situ水素化分解活性を示した。3反応基質の影響:脂肪族エーテルのモデル物質としてジベンジルエーテルのin-situ水素化分解をメタノール溶媒、白金担持アルミナ触媒存在下220度24時間実施した。エーテル基の水素化分解により、ベンジルアルコールが5 mol%、トルエンは3mol%の収率でそれぞれ得られた。一方、メチルベンジルエーテルも得られたことから水素化分解だけでなくジベンジルエーテルとメタノールとの反応が進行する事が示唆された。

リグニンから単環フェノール類を合成するプロセス構築を目標に(1)リグニン部分酸化時の反応部位の特定と(2)反応基質と触媒担体がin-situ水素化分解反応に及ぼす影響の解明を行う.(1)リグニン部分酸化時の反応部位の特定:温度一定条件でリグニン酸化実験を実施し,含酸素官能基量の経時変化をFT-IRにより測定,重量変化と元素組成と併せて定量を行う.(2)反応基質と触媒担体がin-situ水素化分解反応に及ぼす影響:リグニンからのフェノール類合成においてはフラン環の他にエーテル基やアルキル基の切断が不可欠である.モデル物質としてジフェニルエーテル,ジベンジルエーテル,ジフェニルプロパンを用い,それぞれin-situ水素化分解を実施する.また,現在までの反応系では気相水素が多く生成しており,反応器質の触媒担体上での吸着量が小さいと考えられる.そこで,異なる酸性質を有する触媒担体を用いin-situ水素化分解を実施し,担体の酸性質と水素化分解反応性の相関を明らかにする.最終的にはリグニン試薬からの2段階処理による単環フェノール類合成プロセスを実証する.28年度が最終年度であるため、記入しない。反応工学28年度が最終年度であるため、記入しない。
遅発性神経細胞死におけるCa^<2+>代謝異常の細胞生理学的研究

1)IP_3 3キナーゼノックアウトマウスにおける機能的変化IP_33kinaseノックアウトマウスすなわちIP_4欠損マウスを使用し、同マウスにおける学習・記憶障害とCa^<2+>動態の変化を組織学的・生理学的に観察した。1)IP_33kinase抗体を用いた免疫組織学的検索ではIP_33kinaseは正常海馬CA1領域に強く発現していた。2)10分間の両側前脳虚血では、虚血7日後海馬の組織学的ダメージに差異は認められなかった。3)電気ショックを用いたpassive avoidancetestで、ノックアウトマウスは野生種に比し、学習・記憶能力に劣っていた。4)Rhod2-AMを用いた海馬スライスのCa^<2+>イメージングで、ノックアウトマウスはGlucose-Oxygen除去後、CA1における細胞内のCa^<2+>の増加開始までの時間が長く、Ca^<2+>増加率も少なかった。以上より、IP_4は細胞内Ca^<2+>の増加経路の1つとなっており、学習・記憶の獲得に関与していることが推測された。2)幼若砂ネズミの虚血抵抗性一般的に言われるように幼若動物が本当に虚血抵抗性があるならば、そのメカニズム解明は脳虚血治療に結びつく可能性がある。生後2週間以内の砂ネズミを使い、1)実際に前脳虚血に対し抵抗性があるか、2)抵抗性があるとすれば、そのメカニズムは何かにつき、主としてCa^<2+>代謝の面から検討した。1)5分間の両側総頚動脈遮断による前脳虚血に対し、成砂ねずみが全例(10例)海馬CA1領域に遅発性神経細胞死を来たしたのに対し、幼弱砂ねずみでは同数中、遅発性神経細胞死を来たした例はなかった。2)海馬スライスを用いたRhod2-AM負荷による[Ca^<2+>]_iイメージング実験において、成砂ネズミでは酸素グルコース除去後にCA1領域において約2.5倍の[Ca^<2+>]_i上昇を認めたが、幼弱動物では[Ca^<2+>]_i上昇をほとんど認めなかった。3)生直後からの海馬のAMPA型グルタミン受容体のGluR1-4の蛋白発現を経時的に調べると、GluR2のみ成個体に比し生後13,20,27日において有意に発現が増加していた。以上3つの結果より、AMPA型グルタミン酸受容体のGluR2が幼弱期における神経細胞死の制御を、細胞内Ca^<2+>の調節を介して行なっている可能性が示唆された。1)IP_3 3キナーゼノックアウト

マウスにおける機能的変化IP_33kinaseノックアウトマウスすなわちIP_4欠損マウスを使用し、同マウスの虚血脆弱性、野生種マウスと比べた記憶能力に関して実験を行なった。ノックアウトマウスのbackground strainはマウスの中では最も虚血感受性の強いC56BL/6であり、本strainで通常、細胞死が得られる20分間の両側総頚動脈閉塞法にて前脳虚血を作成、虚血7日後に経心的潅流固定を行い、海馬における細胞死の程度をノックアウトマウスと野生種で組織学的に比較検討したところ、虚血脆弱性に有意な差は得られなかった。2)幼若砂ネズミの虚血抵抗性一般的に言われるように幼若動物が本当に虚血抵抗性があるならば、そのメカニズム解明は脳虚血治療に結びつく可能性がある。生後2週間以内の砂ネズミを使い、1)実際に前脳虚血に対し抵抗性があるか、2)抵抗性があるとすれば、そのメカニズムは何かにつき、主としてCa^<2+>代謝の面から検討した。1)5分間の両側総頚動脈遮断による前脳虚血に対し、成砂ねずみが全例(10例)海馬CA1領域に遅発性神経細胞死を来たしたのに対し、幼弱砂ねずみでは同数中、遅発性神経細胞死を来たした例はなかった。2)海馬スライスを用いたRhod2-AM負荷による[Ca^<2+>]_iイメージング実験において、成砂ネズミでは酸素グルコース除去後にCA1領域において約2.5倍の[Ca^<2+>]_i上昇を認めたが、幼弱動物では[Ca^<2+>]_i上昇をほとんど認めなかった。3)生直後からの海馬のAMPA型グルタミン受容体のGluR1-4の蛋白発現を経時的に調べると、GluR2のみ成個体に比し生後13,20,27日において有意に発現が増加していた。以上3つの結果より、AMPA型グルタミン酸受容体のGluR2が幼弱期における神経細胞死の制御を、細胞内Ca^<2+>の調節を介して行なっている可能性が示唆された。1)IP_33キナーゼノックアウトマウスにおける機能的変化IP_33kinaseノックアウトマウスすなわちIP_4欠損マウスを使用し、同マウスにおける学習・記憶障害とCa^<2+>動態の変化を組織学的・生理学的に観察した。1)IP_33kinase抗体を用いた免疫組織学的検索ではIP_33kinaseは正常海馬CA1領域に強く発現していた。2)10分間の両側前脳虚血では、虚血7日後海馬の組織学的ダメージに差異は認められなかった。3)電気ショックを用いたpassive avoidancetestで、ノックアウトマウスは野生種に比し、学習・記憶能力に劣っていた。4)Rhod2-AMを用いた海馬スライスのCa^<2+>イメージングで、ノックアウトマウスはGlucose-Oxygen除去後、CA1における細胞内のCa^<2+>の増加開始までの時間が長く、Ca^<2+>増加率も少なかった。以上より、IP_4は細胞内Ca^<2+>の増加経路の1つとなっており、学習・記憶の獲得に関与していることが推測された。1)5分間の両側総頚動脈遮断による前脳虚血に対し、成砂ねずみが全例(10例)
光反応基を有する側鎖間架橋ヘリカルペプチドのバイオツールとしての応用

DNA結合性タンパクの結合ドメインをモチーフとしたジアリールエテン架橋ヘリカルペプチドを開発した。架橋ヘリカルペプチドとDNAを相互作用させた際、水晶発振子マイクロバランス(QCM)を用いて解析したところ、相互作用が光制御されることをリアルタイムで観測することに成功した。また、ジアリールエテンを骨格とする非天然アミノ酸を合成し、短鎖ペプチドの主骨格に光反応部位を導入することにも成功した。α-ヘリックス構造は、タンパクの機能発現部位に最も多くみられる高次構造の一つである。そこで安定なヘリックス構造をとるペプチドを合成、すればタンパクと生体分子との相互作用を、ペプチドとの相互作用へ還元することが可能である。当該研究者は、クロスリンク剤を用いて安定な短鎖ヘリカルペプチドを構築する手法を確立している。本研究において安定なヘリックス構造を有する短鎖ペプチドに光反応部位を導入し、バイオツールとしての応用を目指すことにした。以前、DNA結合性タンパクの結合ドメインをモチーフとした架橋ヘリカルペプチドを作製した。このヘリカルペプチドは、オリジナルのタンパクに匹敵する結合能と基質特異性を示す。そこで、架橋部位として代表的なフォトクロミック色素であるジアリールエテンを用いて、光応答性架橋ヘリカルペプチドとDNAとの相互作用を光制御することにした。2012年度において、ジアリールエテン骨格が閉環構造を取る場合、安定なヘリックス構造が維持され、光照射によって開環構造へと異性化するとヘリックス構造が不安定化されることがわかった。光応答性架橋ヘリカルペプチドとDNAを相互作用させた際、水晶発振子マイクロバランス(QCM)を用いて解析したところ、相互作用が光制御されることをリアルタイムで観測することに成功した。現在、光ラベル化部位であるジアジリンを導入した架橋ヘリカルペプチドを開発中である。当該研究者は、短鎖ペプチドのα-ヘリックス構造を安定化させるための手法として種々のクロスリンク剤を用いた側鎖間架橋による安定化手法を確立させている。本実施課題において、この手法で合成した側鎖間架橋ヘリカルペプチドに光反応基を導入したバイオツールを開発し、実例をもってその有用性を示すことを目標とし、研究を行っている。平成23年度において、実際に光反応基を導入する前に種々の蛍光基を架橋ヘリカルペプチドのアミノ末端に導入し、短鎖架橋ヘリカルペプチドの化学修飾に対する一般性を確認することにした。蛍光ラベル化後、ラベル化による光物性、ならびにヘリックス構造に与える影響を検証するためにラベル化ペプチドの蛍光スペクトル、ならびにCDスペクトルを測定した。蛍光基として、ピレン・アルキニルピレン・ペリレン・クマリンを用いた。アルキニルピレンで蛍光ラベル化されたぺプチドにおいては、自己会合している可能性を示唆する結果が見られたが、アルキニルピレン以外の蛍光基に関しては自己会合を誘起することもなく、ヘリックス構造に対して影響をほとんど与えることがなかった。また、蛍光特性に大きな影響が見られなかったことから、架橋ヘリカルペプチドのアミノ末端に導入された蛍光基の光物性が保持されることがわかった。得られた結果より、架橋ヘリカルペプチドのアミノ末端に光反応基を導入しても大きな影響がないと予想される。上記研究に加えて、架橋部位にジアリールエテン骨格を持つ架橋ヘリカルペプチドを合成し、これとDNAとの相互作用を光照射によって制御することに成功した。研究実績の概要において述べたように、架橋ヘリカルペプチド構造のアミノ末端、ならびに架橋部位において光機能化できることがわかった。これら結果をもとに平成24年度研究を展開していけば、目的とする光反応基を有する側鎖間架橋ヘリカルペプチドを開発できると考えらえる。上記の理由から、本実施課題はおおむね順調に進展していると判断した。平成23年度において、架橋ヘリカルペプチドのアミノ末端、ならびに架橋部位における光機能化の目処がついたので、平成24年度においては光反応基を有する架橋ヘリカルペプチドを合成する。具体的には、DNAに結合可能な架橋ヘリカルペプチドのアミノ末端にジアジリンを導入し、これとDNAを相互作用させ、光照射した際に両者間で共有結合が形成されるかを確認する。研究の進捗次第で、標的をDNAからタンパクとして研究を展開していく。その際、必要に応じて共同研究を行っていく。共同研究先は、富山大薬、ならびに東北大薬を予定している。平成23年度、約11万円の繰越金が生じた。その理由として、研究室に所属している学生数の関係から、当初の予定に比べて消耗薬品が生じなかったことがあげられる。平成24年度においては、学生数が増えたことからペプチド合成するための試薬が大量に必要となることが予想される。そこで、繰越金を合算した研究費は主にペプチド合成用の試薬代として使用する予定である。
ヒト肺癌培養細胞株NOGマウス肺葉内移植モデルの確立

ヒト癌細胞のマウス体内移植モデルにおいて病変の進展を非侵襲的に評価する手法は確立されていない。ヒト肺癌株をNOGマウス尾静脈に投与し形成させた肺腫瘍のMRI画像を撮影し、肺固定標本と画像との対比を行った。MRIにおいて時間経過とともに肺病変の形成・伸展を反映する浸潤陰影の出現と増悪が確認され、病理所見と一致していた。本実験でマウス体内移植モデルにおける病変の変化の非侵襲的評価法の可能性が示された。従来のマウスを用いたヒト肺癌正所性モデルは、皮下移植モデルと異なり、腫瘍を体表から確認できず、犠牲死させることによってしか腫瘍の生着・進展を評価ができない。そのため、同一個体における腫瘍の進展の経時的な観察が不可能で、情報量が限られるため、治療効果や進展の確認をしにくく、結果の再現性の検証も難しい。また、これまでに存在したいずれのマウスにもnatural killer活性をはじめ多くのinnate immunityが残存しており、これが移植癌細胞の生着や増殖・転移能に影響を及ぼしている可能性は否定できない。この点を修正した、あらたな非小細胞肺癌のin vivoモデルの開発を目指し、以下の実験を進行中である。動物として、T、B、NK細胞機能、樹状細胞、補体活性が従来に比べ極めて低いマウスである、NOGマウス(NOD/SCID/γC null mouse)を用いる。このNOGマウスの肺内への、ヒトNSCLC細胞株の移植、生着率や至適移植条件について現在、検討中である。今後は腫瘍移植後のマウスの肺の瘍進展の観察し、その一部についてCTで画像所見を評価し、実際の腫瘍組織所見との対比を観察、一部は腫瘍死までの進展の様子をCTで観察することにより、CTによるin vivoでの腫瘍進展の評価の有用性を検討し、腫瘍の肉眼的・組織学的所見を観察する予定である。その際に遠隔転移の形成の検索もあわせて行う。本年度は、マウス肺内の腫瘍病変の画像評価とその有用性について評価するため、腫瘍細胞浮遊液をNOGマウスの尾静脈に接種することで肺内へ生着させ、MRI画像を用いて評価する実験を行った。NOGマウス(♂、1112週令)15匹を5群に分け、作成した細胞浮遊液内の細胞数をそれぞれ、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6個に調整し尾静脈に注射した。それぞれ3、4、5週後に各群1匹ずつ犠牲死させ、肺固定標本を作製し、病巣の生着を評価したところ、すべての条件で複数の癌細胞colony生着を確認した。Colonyの数は注入細胞数条件間で安定していることも確認した。この結果を検討した結果、画像撮影実験における注入細胞数を10^5、10^6とすることとした。MRI画像撮影実験を以下の通り行った。NOGマウス10匹を2群に分け、10^5、10^6個に調整したAS49細胞浮遊液をそれぞれ尾静脈に注射した。2、3、4、5週後に各群1匹ずつ犠牲死させ、直後にMRIを用いて画像撮影を行った。撮影後に肺固定標本を作製し、画像との対比を行った。肺固定標本では10^5、10^6個の両条件とも2週目より肺内の腫瘍病変を顕微鏡的に確認した。腫瘍病変数は注入細胞数に応じて増減していた。しかし同じ注入細胞数の群では各個体間では犠牲死の時期に応じて病変の増大・融合所見はあるものの、形成される病変数に明らかなばらつきはなかった。MRI画像では10^5注入群では4週目、10^6注入群では3週目より肺野全体の濃度上昇所見が確認され、時間経過とともに病変の融合を反映すると思われる濃度上昇と浸潤陰影の出現が確認された。本実験でNOGマウス体内病変の解剖学的な変化の非侵襲的な検査が可能である可能性が示唆され、今後施設の体制をさらに整え、in vivoにおける画像撮影やマウス肺内への直接移植した腫瘍病変の経時的変化の評価や抗癌剤治療の効果判定等へと進めていく予定である。
児童の継続的な自主的学習選択による個別的学習コースのもたらす学習効果と学力の変化

小学校5年生から6年生にかけての算数の授業において,児童が自主的に学習を選択して個別的な学習コースを形成する授業を実施し,その効果を検討した。実験群には,複数の学習の中に「メタ認知的学習」を用意し,それを選択して学習することだけでなく,複数の学習から自主的に選択する教育環境自体が,メタ認知的学習ストラテジーを育成することを意図した。主な結果は次のとおりである。1.適正として,学力,メタ認知および学習スタイルを組み込んで,重回帰分析を行ったところ,適性の主効果としては,多くの場合で学力の主効果が得られ,学習指導法の主効果としては,全体としては期待していた「学習コース形成」の学習指導の効果は得られず,従属変数が「知識・理解」課題の場合は,むしろ「指導書準拠」の方が,確実に児童に学力をつけるものであった。メタ認知的課題でも期待したほどの効果は得られなかったが,「知識・理解」の場合のようなネガテイヴな結果ではなかった。適性処遇交互作用としては,一部で学力と処遇,あるいは学習スタイルと処遇との交互作用が得られ,「学習コース形成」が学力を利用するものであり,また熟慮的な学習スタイルの児童ほど通常の学習指導法が効果をもたらしていた。2.「学習コース形成」群における児童の学習選択の実態から,学習選択の環境の効果を検討した。自由な選択が保障される教育環境の重要性の一端が示されたが,「メタ認知的学習」の選択回数と適性との間には明確な関連は見られず,児童はメタ認知的学習を選択しても,その動機づけを高める支えがないと,いわゆる「算数らしさ」をもつ学習選択に戻ってしまう傾向がある。3.学習選択の可能な環境では,児童が自分に適合する学習を選択できる力を高めることの重要性が明らかになった。「メタ認知的ストラテジー」を,学習ストラテジー全体の中に位置づけ,それらの体系的な指導を行っていくことが,真の学力を育成することにつながることが示唆される。教授心理学研究の立場から、小学校5年生を対象に,算数の「単位量あたり」と「割合」の単元について,複数の指導方法を取り入れた授業を実施し,児童が自主的に学習コースを形成する効果を検討した。授業実施が,受け入れ校の関係で「自主的に学習コースを形成する」群(実験群)と「通常の授業を展開する」群(統計群)の2群(各23名)による比較とせざるを得なかった。実験群は,1人の教員で複数の教授法を実施できるように,プリントで選択していく方法を取ったが,それぞれのやり方で学んだことを出し合えるセッションをとり,まとめの段階で再び複数の方法に分かれるようにした。また,学習ストラテジーを考慮した教授法としては,課題を既習の課題と比較したり,自分で問題作りをするなどのメタ認知的なスキルにつながるようなストラテジーを使用することを促す教授法を試みた。(1)2つの群の比較:実験群の方が統制群よりも学習効果が高いことが予想されたが,むしろ基礎的な事項の理解については統制群の方が成績がよかった。統計的に有意ではなかったが,特に問題作りなどの項目で,実験群の方に,知的能力を利用するような形での効果がもたらされた。(2)「自主的に学習コースを形成する」群について:指導書に準拠した教え方とまとめ方のみを選択した子どもは,延べ46名中6名にとどまり,自由な選択が保障される教育環境の重要性の一端が示されたと言えよう。

しかし,児童自身が教科書のまとめをし応用問題を解くといういわゆる「算数らしさ」に拘泥する傾向も強かった。今後の研究では,さらに継続的して長期的な効果をとらえる方向とともに,低学年の段階から柔軟な教育環境で自主的選択の効果をとらえる方向をとることも必要であると考えられる。教授心理学研究の立場から,平成8年度に引き続き,教科算数において児童が自主的に学習コースを形成することの学習効果を検討した。平成8年度には,小学校5年生を対象に「自主的に学習コースを形成する」群(実験群)と「通常の授業を展開する」群(統制群)の2群(各23名)をクラス別とし,2クラス間での比較を行なってきたが,5年次から6年次にかけてクラス替えがあったため,長期的な効果をみるという点では,被験者数および群間の適性次元の分布の均一性の問題を抱えながらの比較検討となった。平成9年度は,平成8年度の実験群の教師が1クラスに対し児童各自が自分なりのやり方や考え方を自由に発言し合えることに重点をおいて継続的に授業を行ない,その授業後のテストの分析をした。また,平成8年度中のデータの分析も続行し,あらたな視点からの検討も試みた。主な結果は次の通りである。1.事前に測定した学力だけでなく,質問紙によって測定したメタ認知,算数に対する好嫌,学習ストラテジー等を適性として取り上げ,重回帰分析を行ない,授業との適性処遇交互作用を検討したが,事前に測定した学力の主効果が大きく,児童が自主的に学習コースを形成することによる効果という点では,期待したほどの効果は得られなかった。2.「自主的に学習コースを形成する」群に期待した効果が得られなかった要因の1つには,児童の学習選択に対する態度がある。児童の学習選択理由と自由記述から,選択の力を高めることができなかったことがわかった。低学年の段階から,柔軟な教育環境で,自主的選択を効果的に行なえるだけの適性の育成をはかっていくことが重要であると考えられる。今後は低学年での研究を行なう予定である。
ポリオーマウイルスの新たな遺伝子発現制御機構の解明

ヒトポリオーマウイルスであるJCウイルス(JCV)の後期遺伝子からは、pre-mRNAとして機能する長鎖のRNAが転写されており、新たに判明したスプライシング様式により転写後調節されて後期タンパク質を発現する成熟mRNAが産生されることが明らかとなった。後期遺伝子pre-mRNAの特殊なスプライシングは、後期タンパク質の発現やウイルス増殖に必要であることも判明した。本研究で判明した後期遺伝子の転写後調節機構は、JCVの細胞内増殖機構の解明につながる新たな知見となった。本研究は、ヒトポリオーマウイルスであるJCウイルス(JCV)が発現する長鎖RNAの機能を明らかにし、それらが宿主細胞内にてウイルス増殖を制御するメカニズムを解明することを目的としている。JCVゲノムから転写されていることが判明した10kb前後の後期遺伝子方向の長鎖RNAの機能を解析するため、長鎖RNAをin vitroで合成しウイルスゲノムと共に細胞内に導入した結果、ウイルスmRNAの発現に顕著な変化は認められなかった。また、長鎖RNAのノンコーディング領域に対するsiRNAを作成し発現抑制を試みたが、十分な抑制効果が確認できなかった。後期遺伝子方向のRNAを詳細に解析した結果、Agnoproteinのコーディング領域内約120bpの繰り返し配列が様々な数で生じていることが判明した。このことから約5kbのRNAスプライシングが数回にわたり起こっていると考えられた。このスプライシングがウイルス遺伝子発現に与える影響について今後検討を行う。こうしたウイルス遺伝子の転写、翻訳に関わる細胞内因子を探索するため、siRNAライブラリーを用いた網羅的解析を行う予定である。この解析に用いるレポーターウイルスを作製するため、後期遺伝子のVP2、VP3、VP1領域をそれぞれGFPに置換したウイルスゲノムを作成し、蛍光タンパク質発現、ゲノム複製、他のウイルスタンパク質発現の効率を比較検討した。IMR-32細胞では3種類のレポーターウイルスはGFPを発現し、ゲノム複製も確認できた。これらのレポーターゲノムの早期タンパク質TAgの開始コドンを停止コドンに置換したものでは、GFP発現が顕著に低下したことから、これらのレポーターウイルスはゲノム複製および早期、後期タンパク質発現を反映するものと考えられた。本研究は、ヒトポリオーマウイルスであるJCウイルス(JCV)遺伝子の新たな転写後調節機構を明らかにし、宿主細胞内におけるウイルス増殖の制御機構を解明することを目的としている。本研究では特にウイルス後期遺伝子の転写産物について詳細に解析を行った結果、JCV感染細胞において、JCV後期遺伝子方向の転写産物は約5kbのDNAゲノムから一周以上の長さで転写されていることが判明した。この長鎖RNAはpre-mRNAとして機能すると考えられ、新たに判明したスプライシングパターンにより後期タンパク質を発現する成熟mRNAが産生されることが明らかとなった。後期遺伝子mRNAは、Agnoproteinコーディング領域内のスプライシングによりタンデムリピート配列が生じていた。この後期遺伝子pre-mRNAの特殊なスプライシングが、ウイルスタンパク質の発現、ウイルス増殖に与える影響を検討するため、JCV Mad1株のAgnoproteinコーディング領域内の2か所のアクセプター配列に変異を導入したウイルスゲノムを作製し、感染許容細胞であるIMR-32細胞に導入し、ウイルスmRNA、タンパク質発現量を継時的に解析した。その結果、Agnoprotein領域内でのスプライシングは後期mRNAの産生に必要であり、2か所のアクセプター配列の内どちらか一方のみを利用することでより効率的なスプライシングが起こり後期mRNA量が増加することが判明した。さらにIMR-32細胞で継代されたJCV株では、Agnoprotein領域内に15塩基の欠失があり、2か所の内一方のアクセプター配列が機能しないことで効率的に後期遺伝子を発現していることが明らかとなった。本研究で得られた後期遺伝子の新たな転写後調節機構は、JCVの細胞内増殖を規定する新たな因子であり、今後JCV増殖抑制法を開発する上で有用な知見と考えられる。本研究では、ヒトポリオーマウイルスであるJCウイルス(JCV)の遺伝子発現制御機構の一つとして、JCV感染細胞においてウイルス由来の長鎖non-coding RNAが発現される可能性を検討し、発現が確認出来た場合、それらが宿主細胞内にてウイルス増殖を制御するメカニズムを解明することを目的としている。平成23年度は、ウイルス由来の長鎖RNAの発現を確認するため、感染細胞より回収したRNAを用いてノーザンブロッティング法により長鎖RNAを含むウイルス由来RNAの検出を試みた。JCVゲノムは約5kbの二本鎖環状DNAであり、一方の鎖に早期遺伝子、その相補鎖に後期遺伝子がコードされている。それぞれの鎖に対するRNAプローブを作成し、ウイルス由来RNAに対するノーザンブロット法を行った結果、ウイルスタンパク質のmRNA以外に、10kb前後の長さの後期方向のRNAを数本検出した。このことから、JCVゲノムからはウイルス各タンパク質のmRNA以外に、後期方向にゲノム全長である一巻以上の長鎖RNAが転写されていることが判明した。また、この長鎖RNAをクローニングするために、5'-または3'-RACE法により長鎖RNAの末端配列を増幅しシークエンスにより解析を試みた。

その結果、3'端は後期遺伝子mRNAと同様のpolyA siteであると考えられた。5'端に関しては、数か所の遺伝子部位が検出され、一様ではない可能性が示唆された。これらの結果から、JCV感染細胞では後期遺伝子方向のpolyA配列を超えて転写される長鎖のRNAが存在することが明らかとなった。次年度はこの長鎖RNAの機能について解析を進める。平成24年度の研究推進方策に沿った研究を計画通り実施した。平成23年度の実施計画に示した研究を計画通り実施した。平成24年度の研究結果より、後期遺伝子のmRNAにおいてAgnoproteinのORF内にタンデムリピートが生じるRNAが存在することが判明した。このRNAがウイルス遺伝子発現に与える影響を解析するため、スプライシングサイトの変異ウイルスゲノムを作成し解析を行う。この後期遺伝子スプライシングのパターンが、感染許容細胞に特異的なものであるかについても検討を行う。平成24年度に作製したレポーターウイルスゲノムをIMR-32細胞に導入し、siRNAライブラリーによるスクリーニングを行う。ウイルス増殖に関与する細胞内遺伝子が判明した場合、特に転写、翻訳に関わる因子を中心にそのメカニズムについて詳細な検討を行う。ウイルスゲノムより転写される長鎖RNAが、早期、後期ウイルス遺伝子発現にどのような影響を及ぼすのかを検討するため、長鎖RNAの培養細胞内発現系もしくはin vitro合成で作成したRNAを用いて、長鎖RNA発現下での早期、後期ウイルスmRNA発現ならびにタンパク質発現量を検討する。また、ウイルス感染時に発現する長鎖RNAの発現を抑制するため、ウイルスmRNAの発現に影響しない領域で長鎖ncRNAに対するsiRNAを作成し、感染細胞に導入して、長鎖RNA発現抑制によるウイルスタンパク質発現への影響を検討する。長鎖RNAがウイルスタンパク質発現に関与していることが判明した場合、作用機序の解明を試みる。長鎖RNAがウイルス遺伝子のプロモーター領域に作用し、転写調節している可能性や、ウイルス遺伝子の転写後調節に関与している可能性を検討するため、ウイルスmRNAのスプライシング効率や翻訳効率の検討を行う。長鎖RNAのウイルス増殖への影響が確認できなかった場合、ウイルス増殖を反映するレポーターウイルスを作成しウイルス遺伝子の転写、翻訳に関与する細胞内機構をsiRNAライブラリを用いて網羅的に解析する。平成24年度の経費の節減の結果生じた使用残については、次年度研究費と合わせ、上記研究遂行に必要な試薬、消耗品費として使用する。また、上記研究の結果、研究成果を報告できる場合、国内学会参加の旅費として使用する。
自己修復能を有するデンドリマー型超分子の合成と機能化

Y字型枝分かれ分子を成長単位として、水素結合などの比較的弱い分子間力によってデンドリマー型に集積する系の構築を目指して研究を行った。成長単位となるY字型分子として、分子内にヒドロキシル基やカルポキシル基を2個有するアミンやピリジン類を分子設計・合成して、その集合状態を濃度変化として調べたが、デンドリマー型への分子集合状態を明確に確認するには至らなかった。そこで、本研究の着想の原点である、ボロン酸(-B(OH)_2)を用い、これにニトロキシド(NO)、ニトロ(NO_2)等の水素結合受容部位を導入した化合物を設計・合成した。溶解度の低いものが多く、結晶として析出するものが大部分で、このような分子でも周期的結晶配列を取りやすいことが示された。これにより、この研究目的を達成するには、溶解性と分子集合化との兼ね合いという重要な問題を解決しなければならないことが示唆された。水素結合性分子間化合物を得る目的で、フェニルボロン酸と4-ヒドロキシTEMPOとの水素結合錯体の作成を試みたさい、予想に反してエステル化が起こり、ボロン酸エステルが得られた。この結晶についてSQUIDによる磁気測定をで行った結果、反強磁性相互作用の存在が認められた。また、このX-線結晶解析の結果、フェニルボロン酸のOH基とNOラジカルの酸素原子の間が水素結合で結ばれた一次元的鎖状配列をしており鎖間の相互作用として、メチル基の水素がNOの酸素原子にかなり接近している構造が明らかになった。磁気的相互作用は、メチル基の水素原子を介して起こるものと推定した。本研究は、Y字型に枝分かれした分子骨格の三つの末端部位に分子間引力の作用点を導入し、この分子を集合化・集積化させることによりデンドリマ-型の超分子集合体を構築することを目標にしている。まず、フェニルホウ酸のHO-B-OH構造をY字型の枝分かれ部位とし、ニトロキシド基NOを水素結合の受容部とするニトロキシドを置換したフェニルホウ酸類を二種類合成した、そのX線結晶構造にはY字部分を利用したNO...HO-B-OH...ON型の水素結合の存在が見られたが、溶液での疑集状態を知るため、NMR、IR、UVの濃度依存性、濃度による濁度の変化等を検討した限りでは、溶液中での集積状態について明確な情報は得られなかった。しかし、この化合物者の結晶では、NOラジカル中心間に強磁性的相互作用があることが見出された。次に、NO...HOの分子間水素結合による集積化が可能なピリミジン環(六員環内にNが2個)とフェノール部位をアセチレン結合で結んだY字型化合物の合成を試みた。また、フェノール環の代わりにヨードベンゼン環を組み込んだ化合物を合成し、N...Iのヘテロ原子間相互作用による集積も試みた。後者の場合、化合物の合成に成功した。この分子は結晶化せず、規則的周期構造に集積しにくいことから、Y字型集積の可能性が示唆された。溶液での挙動についても、濃度変化に凝集状態の特異性を示唆する徴候が観測された。今後、さらに、この化合物の構造修飾体を設計・合成して、集積化の特異性を検討する。
HERGK^+チャネルの活性化ゲートの同定

本研究はHERG K^+チャネルの活性化ゲートを同定する目的で行った。1.野生型HERG K^+チャネルの活性化ゲートは脱分極によって開き、過分極では開かない。しかしS6に存在するI655の変異によって、野生型とは全く異なり過分極で活性化ゲートが開く(閉じない)チャネルが得られた。各種点変異体を作製して検討したところ、655番目に電荷あるいは極性を有するアミノ酸が存在すると過分極で活性化ゲートが開くものと考えられた。また野生型のような外向き電流が流れるためには同部位に疎水性アミノ酸が存在する必要があるものと思われた。2.G657の点変異体でもI655の場合と似た結果が得られ、657番目のアミノ酸が電荷あるいは極性を有する場合に過分極で活性化ゲートが開くという可能性が示唆された。また657番目の場合、脱分極によって外向き電流が流れるためには、A、Sのような小さなアミノ酸が同部位に存在する必要がある可能性が考えられた。3.過分極によって活性化ゲートが開く点変異体においてイオン選択性の変化も認められ、内向き電流が流れる際にはイオン選択性フィルター部位の動きも伴っているものと思われた。4.野生型HERG K^+チャネルにおいてS4-S5領域に存在する荷電アミノ酸D、E、Rを全てAに置換したところ、野生型チャネル同様脱分極によって外向き電流が流れたが、それに加え過分極による内向き電流も観察された。また過分極で内向き電流が流れるI655およびG657の点変異体において同様の置換を行ったが、大きな変化は認められなかった。5.K^+チャネルが開口する際にその部位で曲がると考えられているグリシン残基(HERGの場合G648)に関する検討によって、脱分極による開口にはG648が関与しているが、点変異体で見られる過分極による開口にはG648は関与していないものと考えられた。活性化ゲートの構造は未だ不明であるが、電位センサーと活性化ゲートのカップリングに大きな影響を与える領域が明らかになった。HERGは致死的不整脈を引き起こす家族性QT延長症候群の原因遺伝子のひとつである。またHERGがコードする電位依存性K^+チャネルは薬物などによる二次性QT延長症候群の原因分子でもある。本研究はこの病態生理学的に重要なHERG K^+チャネルの活性化ゲートを同定する目的で行った。1.野生型のHERG K^+チャネルにおいては脱分極パルスによって外向き電流が流れる。しかし、野生型とは異なり過分極で内向き電流が流れる第6膜貫通領域のプロリン点変異体が得られた。この点変異体においては活性化ゲート(や電位センサーとのカップリング)に変化が起きているものと考えられた。そのため同アミノ酸を他のアミノ酸に置換した点変異体を作製して流れる電流を検討したところ、野生型と同様に脱分極パルスで外向き電流を流すものと、逆に過分極パルスで内向き電流を流すものとが認められた。同部位がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリンなどの場合に脱分極パルスによって外向き電流が観察され、また同部位がグルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、さらにはセリン、スレオニンなどの場合に過分極パルスによる内向き電流が観察された。

同部位が疎水性アミノ酸である場合に外向き電流が流れるような結果であったが、個々のアミノ酸のどのような性質が電流の向きを決定するのか、また同部位がゲートそのものであるのか等については今後の検討が必要である。2.外液K^+イオン濃度を変えて逆転電位を検討したところ、過分極パルスによって内向き電流を流すような点変異体においては、ネルンストの式に従う関係が得られなかった。即ち、そのような変異体においては活性化ゲートに関係する変化ばかりではなく、チャネルを流れるイオンの選択性も変化していた。このことは重要な知見だと思われる。現在、イオン選択性フィルターに関与する領域の変異体を作製して検討中である。HERGがコードする電位依存性K^+チャネルは心筋活動電位の再分極に重要な役割を演じており,その遺伝的な異常は家族性QT延長症候群の原因となる.また,HERG K^+チャネルは二次性QT延長症候群の原因分子でもある.本研究はHERG K^+チャネルの活性化ゲートを同定する目的で行った.1.野生型HERG K^+チャネルでは脱分極に伴う電位センサーの動きによって活性化ゲートが開き,過分極ではゲートは開かない.しかし,第6膜貫通領域のプロリン点変異体で野生型とは全く異なり過分極で活性化ゲートが開くチャネルが得られた.同部位の点変異体を作製して検討したところ,疎水性アミノ酸への置換では野生型と同様に脱分極で活性化ゲートが開くが,荷電を有するアミノ酸への置換によって過分極で活性化ゲートが開くという結果を得た.2.第6膜貫通領域の別のアミノ酸(1.のアミノ酸の近傍)のプロリン点変異体においても過分極で活性化ゲートが開くことが明らかになった.この部位ではアラニンおよびセリンへの置換でのみ脱分極で活性化ゲートが開いた.また,1.と同様に荷電を有するアミノ酸への置換によって過分極で活性化ゲートが開くという結果が得られた.3.過分極よって活性化ゲートが開く点変異体において,チャネルを流れるイオンの選択性の変化も認められた.このことは重要であり,過分極によって活性化ゲートが開く際にはイオン選択性フィルター部位の構造変化も伴っていることを意味している.4.K^+チャネルが開孔する際にその部位で曲がると考えられているグリシン残基(2ヶ所)に関する検討から,点変異体で見られる過分極による開孔に2番目のグリシンは関与していないと考えられた.活性化ゲートの構造は未だ不明であるが,電位センサーと活性化ゲートのカップリングはごく少数のアミノ酸によって決定されている可能性が示された.本研究はHERG K^+チャネルの活性化ゲートを同定する目的で行った.1.野生型HERG K^+チャネルでは脱分極に伴う電位センサーの動きによって活性化ゲートが開き,過分極ではゲートは開かない.しかし,第6膜貫通領域の2カ所において各々のアミノ酸残基の点変異によって,野生型とは全く異なり過分極で活性ゲートが開く(閉じない)チャネルが得られた.両部位の点変異体を作製して検討したところ,電荷を有するアミノ酸への置換によって過分極で活性化ゲートが開くという結果が得られた.2.ホモロジーモデルによる検討によって,上述した部位は第4第5リンカー(電荷を有するアミノ酸が存在する)と非常に近い位置関係にあることが推測された.この部位はShaker K^+チャネルにおいて活性化ゲートを形成していると考えられている領域に相当する.
分子ナノマシンの光スイッチングを目指した人工DNAデバイスの構築

本申請研究では、1)分子ナノマシンの光スイッチングに適した光応答性DNA(=人工DNAデバイス)を開発し、2)光を燃料とする新規な分子ピンセットを構築した。分子マシンの"エンジン"部分に相当する光応答性DNAは、精緻な分子設計により、従来型の無置換アゾベンゼンと比較して3倍効率が高い新規なアゾベンゼンの合成に成功した。これによってtrans-体でより二重鎖を安定化し、cis-体で大きく不安定化する新規な光応答性DNAが得られた。また更に精密な分子設計によって、これまでとは逆のスイッチング-trans-体で二重鎖が解離しcis-体で二重鎖を形成する-にも成功した。上記で開発した一部の光応答性DNAを活用することで、光駆動型の分子マシン-分子ピンセット-を開発した。従来の天然のDNAを使用した分子ピンセットでは、ピンセット開閉の駆動力としてDNA自身を使用するのに対し、本申請研究の光駆動型分子ピンセットは、光応答性DNAを"エンジン"として搭載している。いわばソーラー型分子ピンセットであり、設計どおり可視光照射でピンセットを閉じUV光照射で開くことが出来た。DNA自身を燃料としている従来型の分子ピンセットは、開閉操作の繰り返しでDNA二重鎖が老廃物として不可避的に系内に蓄積した。そのためにピンセットの開閉を繰り返すと効率が顕著に低下してしまった。一方本申請研究で開発した光駆動型分子ピンセットは、"環境に優しく"系内を汚染しない"光"を駆動力に使用しているので、開閉操作を繰り返しても効率の低下は観察されなかった。すなわち本申請研究の分子マシンは、DNAが光分解しない限り半永久的に開閉操作を繰り返すことが可能な分子マシンと言える。本申請研究では、1)分子ナノマシンの光スイッチングに適した光応答性DNA(=人工DNAデバイス)を開発し、2)これまで提案されてきた分子ナノマシンに光スイッチング機能を付与させる。これによって分子ナノマシンやDNAコンピューターの機能を、特定波長の光照射のみでON-OFFスイッチングすることを目指す。17年度は、よりclear-cutな光制御を実現するためアゾベンゼンの化学修飾を検討した。DNAの主鎖から遠い位置に存在するベンゼン環のパラ位をメチル基で修飾したアゾベンゼンを合成しDNAに導入ところ、未修飾のアゾベンゼンと比較してtrans-体でDNA二重鎖を不安定化しcis-体では安定化してしまい、光制御能は大きく低下した。一方メタ位に導入した場合では未修飾のアゾベンゼンとほとんど同じ挙動を示した。しかしオルト位(2位)にメチル基を導入したところ、trans-体は安定化しcis-体では不安定化したため、trans-cis異性化に伴うTmの変化(ΔTm)は未修飾のアゾベンゼンより2倍向上した。更にもう一方のオルト位(6-位)にメチル基をもう一つ導入したところ、ΔTmは3倍に向上した。この2,6-位それぞれをメチル基で修飾したアゾベンゼンを12merのDNAに1分子導入しただけで、trans-cis異性化によって最大50%光制御可能なことが判った。このようにオルト位をメチル基で修飾することで、光制御能を大きく向上させることに成功した。これによって分子ナノマシンやDNAコンピューターの機能を、特定波長の光照射のみでON・OFFスイッチングすることを目指す。18年度は17年度の成果を踏まえ、アゾベンゼンのオルト位(2',6'・位)へのメチル基導入による光制御効率向上のメカニズムを解析した。NMRによる構造解析から、Trans-2',6'-

ジメチルアゾベンゼンでは導入したメチル基と上下の塩基対とのスタッキング相互作用で二重鎖が安定化されることが判明した。一方cis-体ではメチル基の立体障害で隣接する塩基対形成が大きく阻害されるため融解温度が大きく低下することが、コンピューターを用いた分子モデリングから示唆された。これらの解析結果は、DNAの主鎖に近い側のベンゼン環のオルト位(2,6-位)でも同様の効果が期待できることを示唆している。そこで主鎖に近い側のベンゼン環の2-位をメチル化したアゾベンゼンをDNAに導入したところ、無置換のアゾベンゼンと比較して期待通り光制御効率が向上した。さらに興味深いことに、17年度合成した2',6'-ジメチルアゾベンゼンは高効率光制御のみならず、cis-体の熱安定性も従来の無置換型と比較して約10倍改善されることも見出した。以上のように、オルト位をメチル基で修飾したアゾベンゼンをDNAに導入することで、光制御効率と(融体の熱安定性の両方が大きく向上することを明らかにした。本申請研究では、1)分子ナノマシンの光スイッチングに適した光応答性DNA(=人工DNAデバイス)を開発し、2)これまで提案されてきた分子ナノマシンに光スイッチング機能を付与させる。これによって分子ナノマシンやDNAコンピューターの機能を、特定波長の光照射のみでON-OFFスイッチングすることを目指す。19年度は18年度の成果を踏まえ、これまでに開発した光応答性DNAを活用して、本申請研究の最終目的である光応答性分子マシンの構築と、駆動を目指した。ここではYurkeらが以前に構築したDNAを燃料とする分子ピンセットをベースにした、光駆動型分子ピンセットを設計・構築した。Yurkeらが構築した分子ピンセットの動作原理(分子ピンセットが開いた状態から閉じた状態への動き)は、燃料としてDNA(=Fuel DNA)を添加して分子ピンセットのオーバーハング部位とハイブリダイズさせることに基づいている。Close→Openの動作は、Fuel DNAと相補的なDNA(anti-Fuel DNA)を新たに"燃料"として添加し、分子ピンセットを閉じる際に添加したFuel DNAをオーバーハング部位から引き剥がすことで行う。つまりこの設計では、Fuel DNAとanti-Fuel DNAを交互に添加しないと作動しないため、Fuel/anti-Fuelが系内に蓄積されてしまい、ピンセットの開閉操作を繰り返し行うと、劣化した。それに対し我々は、18年度に開発した光応答性DNAをFuel-DNAとして使用し、可視光-UV光照射でピンセットを開閉できるように設計した。その結果、設計どおりに可視光を照射することで分子ピンセットは閉じ、UV光照射で開いた。この分子ピンセットの開閉操作は、anti-fuel DNAを必要とせず、可視光-UV光照射のみで劣化を伴わずにピンセットの開閉操作を繰り返すことができた。以上のように、当初目標に掲げた光駆動型分子マシンの構築に成功した。