hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
延性二相合金における重層的な強化機構と高温変形律速機構の解明

この結果はFEシミュレーションによっても確認された.従って,延性二相合金の実験結果を単相合金のクリープ理論で解釈する場合は,十分な注意が必要である(変形速度が極端に速いか遅いときにだけ正しい).例えば,微細粒α-Mg相(応力指数2)とラメラ状LPSO相(応力指数5)からなる延性二相合金では,実験から得られる応力指数nは変形速度によってn=25の中間値をとり,低速変形の場合はn →5となって荷重を多く分担している強化相(LPSO相)が全体の変形を主に支配し,逆に高速変形の場合はn →2となってマトリックス(α-Mg相)が全体の変形を支配することが判明した.今後は,母相と強化相の結合性を評価する強化係数を理論式に導入し,強化相の配置がクリープ挙動に及ぼす影響について調べる所存である.延性二相合金と各単相合金の高温変形が,押込み試験法と計算モデルを使って調べられている.実験結果は,単相合金に関するクリープ速度と押込み圧力の両対数プロットは直線上に乗ることを示す.その勾配はクリープの応力指数に対応し,各々n1とn2である.一方,二相合金の全てのデータは単相合金のデータの中間にあり,それらは直線上に存在しない.二相合金の応力指数nは,クリープ速度の増大と共にn1からn2に変化する.計算結果は,そのn値が各相の値だけでなく負荷条件にも依存することを示す.クリープ速度がkかなり遅いとき,硬い相が荷重の大部分を担うため,硬い相のクリープ機構が二相合金のクリープ挙動に強い影響を与える.初年度は,理論式の導出,FEモデルの作成,実験条件の確認を行ったが,二年目となる本年度は,計画通り,二相合金と各構成単相のクリープ試験を実施した.また,FE解析により,理論式の導出で前提とした三件が変形中に成り立っているか,二相合金のクリープ特性値が変形速度によって変化する理由,それに及ぼす強化相の不連続性の影響などを検討した.ここまでは,概ね順調に進展している.ただし,研究代表者と海外協同研究者の日程上の都合により,α-Mg相とLPSO相の間で生じているはずの異相界面すべりの効果を考慮したモデル作成までには至らなかった.材料強度物性学試料をある方向に圧延することにより,二相合金中のLPSO相に又はLPSO単相にキンクバンドを導入し,それがクリープ変形を抑制する効果を有するか否かを調査する.また,FE解析では予定より遅れた部分を海外協同研究者の支援を得ながら進展させる.さらに,透過型電子顕微鏡による転位下部組織の観察なども行って活動すべり系を特定すると共に,これまでの研究成果を総括し,ミクロ/マクロのマルチスケールの視点に立ってこの種の延性二相合金における重層的な強化機構と高温変形律速機構を解明する.二相等ひずみ速度変形モデルに基づく理論構築とマイクロインデンターを用いた二相合金及び各単相合金の押込みクリープ実験は順調に進展しているが,計算機シミュレーションの一部が未完成である.今年度設備備品費で購入したWorkstationに汎用有限要素プログラムをセットアップすることに予定より時間を費やしたためである.この夏に海外共同研究者(Dr. Ming Dao, MIT)の支援を得て副プログラムを作成し,モデリングを一気に進めるように努力する所存である.当初,海外協同研究者(M.Dao, MIT)から延性二相合金のクリープ挙動を再現するFEモデル作成について助言を得るため渡米する予定であったが,何回かのメールのやり取りの結果,日程調整がうまく行かなかったことと,当面は当方だけで対応できることが判明したため,海外出張を中止したことが主たる理由である.
頸動脈超音波検査を用いたサイトカイン・アディポカインの動脈硬化に及ぼす影響の分析

E県A市において過去に頸動脈超音波検査及び循環器検診を実施した追跡集団(男女計4,340人:4079歳)を対象として平均4.5年間追跡した結果、WHO/MONICAの診断基準に即して94例の循環器疾患発症を把握した。これらのcase群に対して、性・年齢をマッチさせたcontrol群を同一追跡集団内から1:2の割合で計188名抽出し、コホート内nested case-control studyの手法を用いてhs-CRP及びIL-6について解析を行った。尚、解析に際しては各炎症指標及びサイトカインを3分位に区分し、logistic regression analysisを用いて最下位を基準とする循環器疾患発症に対する相対危険度を算出した(調整因子:性・年齢、BMI、喫煙、収縮期血圧、中性脂肪、血糖値、食後時間)。その結果、hs-CRPでは最下位に比べ、最高位ではオッズ比が1.6倍と増加傾向を示した。一方で、IL-6についてはオッズ比が0.61倍と減少傾向を示した。一方でこれまでの本研究では、血管内皮で産生されるIL-6に対する血球側受容体の1つであるCD4/CD25(+)T cellが動脈硬化、特にプラーク等の隆起病変と正の関連を認め、IL-6受容体増加が動脈壁肥厚から粥状硬化等に至る経路の指標となる可能性を示唆する結果を得ていたが、今回、IL-6自体については環器疾患発症と負の関連が示唆されたことから、動脈硬化の終末像としての発症直前の段階では、他のcytokineによるIL-6産生を抑制させる機序の存在が示唆された。本研究計画に基づき、研究初年度である本年度2月までに、研究対象である満65歳の地域住民男女計499名のうち計画通りに262名(52.5%)の者からベースラインデータとして生活習慣調査、生活体力測定、循環器検診、頸動脈超音波検査及び血液学的計測及び血清の凍結保存を終了した。その結果、これまでに調査を開始していた者を合わせると854名となり、当初解析予定とした対象者数900名の目標をほぼ達成できた。尚、さらに詳細な解析が可能となる様、同一の方法を用いて平成15年度は300名の追加募集を行う予定である。また併せて、調査を完了した者について地区保健センターを通じてその動向を追跡中である。さらにサイトカイン・アディポカイン(IL-2・IL-4・IL-5・IL-6・IL-10・IFN-γ・TNF-α)測定に際しての基礎的検討を行い、新鮮血清だけでなく凍結血清からの測定も安定して計測できること、また測定の精度も同一検体かつ同一条件での変動係数(CV)がいずれの指標とも47%以内に管理できることを確認できた。そのため、これまでに資料収集が完了していた対象者を本研究に加えることが可能となると同時に、今後これらの指標の有用性が明らかとなった場合、検診等への導入に対する手技上の問題が解決された。現在はサイトカインの個体内の1年間の季節変動についてボランティア集団(10名)を対象に採血条件のturn overも含めて計測を繰り返しており季節較差に関する検討を実施中である。平成15年度は凍結血清についても新たに測定を開始する予定である。尚、疫学研究倫理指針(平成14年7月通達)に基づき、本研究について新たに倫理審査を受け承諾された。本研究計画に基づき、研究2年目となる平成15年12月までに、研究対象である満65歳の地域住民男女計1500名(年500人×3年間)のうち、1063名の者からベースラインデータとして生活習慣調査を完了し、また、727名の者について生活体力測定、循環器検診及び頸動脈超音波検査、血液学的計測のための血清の凍結保存を予定通り完了した。また既に研究初年度にサイトカイン・アディポカイン計測系(IL-2・IL-4・IL-5・IL-6・IL-10・IFN-γ・TNF-α)の基礎的検討を完了(変動係数(CV)がいずれの指標とも4-7%以内)していたが、一部の測定項目については健常者における分布範囲が狭いことから、更に高感度の試薬を用いることが望ましいと判断し、改めて測定を開始することとした。本年度は、生活習慣及び循環器疾患既往歴情報・生活体力測定・頸動脈超音波検査所見の揃っている者の凍結血清のうち、まず男性の検体の測定を開始し、頸動脈超音波検査による動脈硬化が強い群ほど血清IL-6値の増加を認めた。尚、その他の測定項目については、傾向性を認めるに止まった。最終年度である平成16年度は、解析対象者の補充を行うと共に予定通り残りの凍結検体を測定し、(1)頸動脈超音波所見のうちIMT等の定量的な動脈壁肥厚度とサイトカイン・アディポカイン・炎症反応の関連の検討(2)動脈硬化の性状分類(不安定なプラーク)とサイトカイン・アディポカイン・炎症反応との関連についての検討(3)動脈硬化の程度が比較的強いカテゴリーにおいてサイトカイン等のマーカーが高値(低値)を示す群とそうでない群での食生活習慣や運動能力のスコアの差、及び肥満・インスリン抵抗性・LDLを介したサイトカインへの影響に関する検討を実施する。

これらのcase群に対して、性・年齢をマッチさせたcontrol群を同一追跡集団内から1:2の割合で計188名抽出し、コホート内nested case-control studyの手法を用いてhs-CRP及びIL-6について解析を行った。尚、解析に際しては各炎症指標及びサイトカインを3分位に区分し、logistic regression analysisを用いて最下位を基準とする循環器疾患発症に対する相対危険度を算出した(調整因子:性・年齢、BMI、喫煙、収縮期血圧、中性脂肪、血糖値、食後時間)。その結果、hs-CRPでは最下位に比べ、最高位ではオッズ比が1.6倍と増加傾向を示した。一方で、IL-6についてはオッズ比が0.61倍と減少傾向を示した。一方でこれまでの本研究では、血管内皮で産生されるIL-6に対する血球側受容体の1つであるCD4/CD25(+)T cellが動脈硬化、特にプラーク等の隆起病変と正の関連を認め、IL-6受容体増加が動脈壁肥厚から粥状硬化等に至る経路の指標となる可能性を示唆する結果を得ていたが、今回、IL-6自体については環器疾患発症と負の関連が示唆されたことから、動脈硬化の終末像としての発症直前の段階では、他のcytokineによるIL-6産生を抑制させる機序の存在が示唆された。
熱輸送を伴う固体・流体ニ相乱流のDNSと確率的数理モデル構築

本研究では、固体・流体二相乱流の直接シミュレーション(DNS)を実施し、分散性二相乱流とその熱輸送の確率モデルに繋がる知見を収集した。DNSの数値解析手法として、固体と流体の体積平均速度を変数としたスペクトル法を開発した。また二相流・熱輸送の確率モデルとして、ランダムウォークによる拡散の模擬および二体衝突による混合の模擬をベースとした手法を考案した。固体球が分散した一様乱流を取り上げ、フーリエスペクトル法により直接シミュレーション(DNS)を行った。二相流を取り扱うため、体積平均速度を変数としたナビエストークス式を基礎方程式として用いた。予備計算として、固体球を含まない単相一様乱流、および、一様流中に置いた球後流を計算し、既存の計算値ならびに実験値との比較から、数値解析コードが妥当性を示した。二相乱流に対する計算では、動粘度を1/300に設定し、球の緩和係数を6.4572.6の範囲で変化させ、各条件に対して厳密な二相流計算を行い、さらに、質点モデルによる簡易的DNS、ならびに、乱流変動をポワソン過程で表わした確率モデル解析も行った。厳密解析により、本計算の範囲では、固体球が乱流全体に与える影響は小さいものであったが、球直径程度のスケールにおいて乱れが増幅する現象が観察された。また時間が経過するに伴い、固体球の変動は大きくなるが、ある時刻を過ぎると小さくなり、緩和係数が小さい程より大きな変動が現れた。厳密解析の結果を、質点モデル解析、確率モデル解析と比較したところ、緩和係数が30以上の場合は、三つの解析結果はよく一致したが、緩和係数がそれよりも小さくなると、質点モデル解析および確率解析の結果は厳密解析よりも25パーセント程度大きくなり、顕著な誤差があった。以上のように、分散性二相乱流の厳密解析コードによって高精度な数値データを採取し、現象のモデリングに必要な知見を収集できた。平成22年度に実施した分散性一様乱流のDNS(直接シミュレーション)では、連続の式を満たす初期条件を作成することが困難であった。この問題を回避するため、DNSコードを改変し、固体球を分散した二次元噴流のコードを作成した。最初に、単相二次元噴流の時間発展三次元計算を行い、乱流場の発展挙動を観察し、計算プログラムの正当性を吟味した。速度分布は、境界層を三次関数で近似した分布形状として、境界層厚さに様々なかく乱を与えて、噴流の時間発展挙動を検討した。次に、固体球の衝突計算を厳密化するため、ある時刻の二つの球の位置と速度から、球が衝突する位置と時刻、ならびに、衝突後の速度と経路を計算し、時間ステップ経過した後の球の状態を与えるサブルーチンを開発し、DNSコードに導入した。このようなDNSコードを用いて、格子解像度と計算体積を変化させた計算を行い、これらの影響が小さく、計算コードが健全に作動していることを確認した。本計算においては、一辺2πの立方体状の計算領域における二次元噴流の時間発展を取り扱った。噴流のレイノルズ数を1500とし、噴流中に30個の固体球を分散した。固体球と流体の密度比を210の間で変化させ、5ケースの計算値を得た。格子点数は144の三乗を基本としたが、より高解像度の計算も行った。比較のため、固体球を含まない二次元噴流も計算した。計算結果から、固体球の存在によって、平均速度の平坦化が促進されており、噴流の発達が早くなることが確認された。固体球が存在すると、噴流周辺部の乱れが強くなることや、低圧化する渦中心に球が引き込まれるため、固体球の拡散が加速されること等が判明した。以上のように基礎的な新現象の確認ができたことから、流動層等の応用的研究にへの基盤的な研究環境が整備できた。平成24年度は、前年度までに開発した固体流体二相乱流DNSプログラムを利用して固体球の回転を考慮しない場合の計算例を増やし、さらに、固体球の回転を考慮した数値解析法を取り入れて数値解析を行った。固体球の回転を考慮しない数値解析では、前年度までに行った体積平均速度からの流体と固体の速度への分離に問題があることが判明したため、これを修正してデータ処理を行った。前年度と同様、一辺2πの立方体内部の減衰二次元噴流に固体球を分散させて、レイノルズ数1500、密度比510とした数値解析結果を用いて、流れと固体球の速度を正しく分離して分析を行った。その結果、流体のエネルギーは、固体球を分散させることで、最初は速く減衰するが、その後、緩やかに減衰すること、固体球のエネルギーは、流体よりも速く減衰することが判明した。その一方で、平均速度分布や乱流エネルギーの分布に関する傾向は、前年度と同様であり、前年度の検討結果が正当であったことが裏付けられた。さらに新たな分析として、固体球の軌跡を検討した。それによると、計算の進行に伴って、噴流内部の粒子密度よりも、噴流外側の粒子密度が大きくなる現象が確認できた。

従って、前年度に見出した渦による固体粒子の巻きこみ効果による粒子軌跡への影響を確認できた。固体球の回転を考慮した数値解析を、回転を考慮しない場合と同じ計算条件で実施した。今回の計算条件では、固体球の回転は、それほど強い影響は無いことが分かった。しかしながら、粒子の移動と同様に、最初に流体から与えられた回転が維持される傾向が観察され、回転においても慣性が存在することが明らかになった。以上のように、平成24年度は、より完成度の高いデータ分析法を確立し、さらに、回転まで考慮した固体球ー乱流解析プログラムを開発できた。分散性二相流の解析において問題となる初期条件の問題が回避でき、固体球の衝突の厳密な計算法を確立した上で、固体・流体二相噴流DNSコードを完成できた。また、このコードの格子依存性が小さいこと等の正当性を立証でき、さらに球が渦の低圧中心に引き込まれる等の新現象も見出した。以上のように、研究は順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。次のステップとして、分散性二相乱流中の熱移動の計算を行う計画である。このためには、計算手法を書き下し、そのコーディングを行い、計算コードに導入した上で、テスト計算によって妥当性を吟味する必要がある。一方、確率的数理モデルの開発に関しては、モデルの方向性を立案、検討した上で、DNSによる計算値の導入による検討方法を考える必要がある。
パンルヴェ方程式の大域解析

本研究における研究実績は多様であるが、研究課題と直接関係するものを3項目にまとめる。1.パンルヴェ方程式の対称性:本研究課題のもとでこの期間にもっとも進展した分野である。岡本和夫が80年代前半に見付けたパンルヴェ方程式のBacklund変換群(アフィンWeyl群の実現)に関する見通しの良い理論が構築された。この理論は単に岡本の結果を整理しただけのものではなく、パンルヴェ方程式の特殊関数論に有効な手段をも与えた。例えば、このBacklund変換がτ関数にまで自然に持ち上がるので、パンルヴェ方程式に付随して登場する種々の特殊多項式の生成が容易に行えるようになり、また変換自体は複雑な有理変換であるが必要な変換を求めることは極めて容易となった。この理論はいわゆる離散パンルヴェ方程式にも有効で、その方面の研究が現在進行中である。2.初期値空間:パンルヴェ方程式、高階パンルヴェ方程式あるいは多変数パンルヴェ系(ガルニエ系)の解全体を幾何的に捉える初期値空間の研究に進展があった。もともとのパンルヴェ方程式(第1パンルヴェ方程式を除く)の初期値空間がBacklund変換群を用いて記述されることが分かった。これより直ちにBacklund変換でうつるパンルヴェ方程式の初期値空間はすべて同型という事実が得られた。高階パンルヴェ方程式、2変数退化ガルニエ系の初期値空間(と確信されるもの)の構成も進んだ。これがどのような意義をもつものかの検討は今後の課題である。3.パンルヴェ方程式の解析:完全WKB解析によるパンルヴェ方程式の研究が進展した。もともとは線形方程式に対して適用されてきたWKB解析を、外から大きなパラメータを導入されたパンルヴェ方程式に適用したものである。接続関係式における主要項が見事に求められた。この解析では第1パンルヴェ方程式が最もgenericなものであり、第2以上の解析にはバーコフの標準形への変換定理を用いる。1.パンルヴェ方程式の定義多様体の幾何的研究:パンルヴェ方程式方程式のパンルヴェ性の証明が定義多様体を用いると簡明になることを示した.パンルヴェ型微分方程式の定義多様体を決定する問題は次の2項とも関連して様々な実験を行っている状況である.2.パンルヴェ方程式のアフィン・ワイル群対称性の研究:パンルヴエ・ガルニエ系のアフィンルート系による拡張に関して,(1)アフィン・ワイル群の表現に基づいてパンルヴェ型差分系の系統的な構成法を与えたこと,(2)A型アフィン・ワイル群がベックルント変換群として作用するような,高階パンルヴェ型微分方程式を構成したことの2点の成果を得た.またアフイン・リー環(ループ群)に付随する無限可積分系の有限次元への還元として一般のパンルヴエ・ガルニエ階層を構成できることが分かったので,無限次元旗多様体とパンルヴェ・ガルニエ方程式の定義多様体との関連など,種々の興味深い問題が今後の研究を待つことになった.3.パンルヴェ関数の特殊関数としての研究:大きなパラメータを含んだパンルヴェ・ハミルトン系の2-パラメータ解の挙動を調べるためにバーコフの標準形への特異摂動的な簡約化の結果を得た.4.その他:多変数第4型パンルヴェ方程式のハミルトン構造に付随して現れるある種の組合わせ的公式を証明した.その応用として、ゲーゲンバウアー多項式の新しい2次関係式を見付けた.1.パンルヴェ方程式の定義多様体の研究:パンルヴェ方程式がもつ対称性すなわちベックルント変換と定義多様体の記述との間の直接的関係が明らかになった.

ベックルント変換を方程式の定義域を拡張するものと見て、これをあらゆる変換について行って定義域を拡げたものが定義多様体と一致するという結果である.変換は無限個あるが適当な有限個について考えればよいこともわかる.この事実はパンルヴェ方程式が定義する定義多様体の葉層構造が一様であるといういわゆるパンルヴェ性によって保証される.この他、野海・山田理論に現れるA^<(1)>_4型方程式の定義多様体と思われるものの記述も得られた。2.パンルヴェ方程式の対称性の研究:一般のアフィン・リー環に付随するドリンフェルト・ソコロフ階層をしかるべく特殊化することにより、アフィン・ワイル群対称性をもつパンルヴェ型微分方程式のクラスが得られることが分かった.このクラスでは、ワイル群対称性が無限次元旗多様体の幾何的言葉で理解できる.3.研究集会の実施:平成11年10月26日から10月29日まで神戸大学において、"パンルヴェ方程式の大域解析"という研究集会を開催した.参加者は大学院生を含め60数名.講演は2時間講演が3、1時間講演が11で、この内大学院生の講演は外国人を含め6、外国人研究者の講演は2であった.パンルヴェ方程式の最近の研究動向をとくに若い研究者および大学院生に知らせるために、神戸大学のRokko Lectures in Mathematicsの一つとして、この研究集会の報告集を出版することにした.主なものは以下の通りである。1.パンルヴェ方程式のアフィンWeyl群対称性:アフインWeyl群の実現としてのBacklund変換群が一般的にどのようにして得られるかという点が明確になった。現在この方面の研究は離散パンルヴェ方程式に対して行われている。2.初期値空間:パンルヴェ方程式については、Backlund変換を座標変換とみて多様体を構成するとそれが岡本の初期値空間である。この記述は非常に便利であるので、すべての事実をこのBacklund変換による記述にもとづいて構成し直すことが求められるが、もっとも基本的な葉層構造の一様性は岡本の初期値空間についての証明と同様に示された。また高階パンルヴェ系、2変数退化ガルニエ系の初期値空間(と確信されるもの)についての知見を蓄積しつつある。3.パンルヴェ方程式の完全WKB解析:完全WKB解析の立場から、パンルヴェ超越関数に関する大域的な接続問題の研究を行った。特に、II型のパンルヴェ関数の接続問題が、I型のパンルヴェ関数に対する接続公式を組み合わせることで解けることを示した。また、パンルヴェ方程式の雛型とも考えられる3階線型方程式に対する完全WKB解析についても考察し、その中から、解の積分表示に対する従来の最急降下法の一般化が見い出された。4.超幾何関数:ガウスの微分方程式のパラメータがすべて純虚数のときに、シュバルツ写像の像領域がどのように構成されるかを明らかにし、その基本領域の境界が円からどれくらい歪むかを実験的に計算した。5.逆分岐問題と特異Wiener-Hopf方程式:人口の反応拡散モデルの逆分岐問題の研究のために、特異Wiener-Hopf方程式の可解性を確立した。
植物ホルモン動態解明に基づくカンキツ単為結果性発現の分子機構

ウンシュウミカン、清見、ヒュウガナツ、クレメンチンのカンキツ類4品種について調査を行い、各4品種の単為結果性の程度を確認した。特にウンシュウミカンにおいては、高い単為結果性(種なし性)を有するのみならず、子房の初期成長速度が他の品種よりも著しく大きかった。子房のRNAを抽出し、マイクロアレイにより品種間の発現差異を調査したところ、ジベレリン(GA)生合成遺伝子について発現差異のあることが認められた。そこで、ウンシュウミカンのGA生合成遺伝子(GA20酸化酵素遺伝子、GA2酸化酵素遺伝子、GA3酸化酵素遺伝子)の単離と機能解析を行い、成長促進あるいは抑制活性のある酵素遺伝子を同定した。今年度(H25年度)は、まず昨年度作出したCuGA20ox1およびCuGA20ox2の過剰発現系統における内生ジベレリンの変動を明らかにするため、早期非水酸化経路上の産物であるGA24, GA9, GA34, GA51および早期13位水酸化経路上の産物であるGA19, GA20, GA8, GA29についてLC-MS/MSによる一斉分析を行った。その結果、野生型と比較しCuGA20ox1およびCuGA20ox2の過剰発現系統はいづれもGA24が減少し、GA34とGA51が増加した。GA9については野生型および形質転換体どちらも蓄積量が少なく、有意差はみられなかった。また、早期13位水酸化経路では、野生型に比較し、CuGA20ox1およびCuGA20ox2の過剰発現系統ではGA19が減少し、GA20, GA8,およびGA29が増加する傾向が見られた。活性型のGA1およびGA4は濃度が非常に低く検出限界以下であった。-これは、ジベレリン定量に使用したシロイヌナズナが開花後の植物体で、伸長ステージを過ぎていたからだと考えられる。一方、これら活性型の代謝物であるGA34およびGA8が有意に過剰蓄積していた。これらの結果から、CuGA20ox1およびCuGA20ox2は、それぞれのGA生合成経路を活発化させることにより活性型GA濃度を上昇させ、CuGA20ox1およびCuGA20ox2過剰発現系統の茎の伸長を促進させたことが示唆された。シロイヌナズナ形質転換体におけるジベレリンの一斉定量が軌道に乗ったことから、ウンシュウミカン、クレメンチン、ヒュウガナツ、清見の子房における内生ジベレリンの定量を行った。定量結果については現在解析中である。また、H25年度に計画していたサイトカイニン、オーキシン等の塩基性植物ホルモン定量についても条件検討実験を行い、各カンキツ類の子房における内生濃度を一斉分析するための前処理条件を確立した。GA20ox樣遺伝子のcDNAを`シルバーヒル'から2種類単離し、CuGA20ox1およびCuGA20ox2とした。これらの配列は既に報告のあるCcGA20ox1およびCcGA20ox1とほぼ一致した。サザンブロット解析により、CuGA20ox1は1コピー、CuGA20ox2は1もしくは2コピーがゲノム上に存在していることが示された。また、ウンシュウミカン以外のカンキツ品種11種類においても上記2種類のGA20ox樣遺伝子の存在が示された。特にCuGA20ox1は品種横断的にほぼ同様のバンドパターンを示し、進化的に強く保存されていることが示唆された。CuGA20ox1は栄養組織全般に発現が見られたのに対し、CuGA20ox2は花蕾に発現が限定されていた。このことからこの2つの遺伝子は機能的に分化したか、あるいは元々異なる機能を有していた可能性もある。次に、これらの2種類の遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナを作出したところ、コントロールに対していずれも抽台時期の早期化および花序の徒長が観察された。GA2ox樣遺伝子のゲノム領域およびcDNAを`シルバーヒル'から4種類単離し、対応するシロイヌナズナ遺伝子の配列に基づき暫定的にCuGA2ox/GA3ox-like、CuGA2ox4-like、CuGA2ox2/ox3-like、およびCuGA2ox8-likeとした。CuGA2ox/GA3ox-likeは種子特異的に、CuGA2ox4-likeは果実に、CuGA2ox2/ox3-likeは幼若性組織に、CuGA2ox8-likeは多様な組織に発現が見られた。これら4種類の遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナを作出したところ、コントロールに対していずれも抽台時期の遅延化および植物体の生長抑制が観察された。4品種(ウンシュウミカン、清見、ヒュウガナツ、クレメンチン)の子房におけるマイクロアレイの結果、特にウンシュウミカンの子房においてGA2酸化酵素遺伝子の変動が見られた。

そのため、GA2酸化酵素遺伝子(GA2ox)を中心に各種GA生合成遺伝子について各品種の子房における時期別の定量PCRを行った。GA20酵素遺伝子はカンキツでは2種類存在することが分かっている。本研究においてもウンシュウミカンから2つの遺伝子を単離し発現解析を行った結果、GA20ox1遺伝子は栄養成長組織に主として発現していることが示されたと同時に、子房にも発現が見られた。GA20ox1は興味深いことに、ウンシュウミカン、清見において開花期前に発現が高いことが示され、ヒュウガナツ、クレメンチンでは発現が低いことが示された。一方、GA20ox2遺伝子はウンシュウミカンの開花期直前に発現が高かった。GA2oxに関しては4つの遺伝子を単離し機能解析を行った結果、強弱はあるがすべての遺伝子がGA2酸化酵素遺伝子様の活性のあることが確認できた。GA2oxの子房における発現を解析した結果、マイクロアレイで示されたほど、品種間の変動が見られなかった。これについては、再度確認の実験を行う必要がある。開花前にウンシュウミカンの子房においてGAの濃度が上昇することが知られているが、この現象は、GA20ox1とGA20ox2の共同作用の結果であることが示唆された。今後、GA3酸化酵素遺伝子の挙動の把握、マイクロアレイの再解析を行う必要がある。研究期間中に研究代表者が所属組織を異動したこともあり、研究計画に遅れを生じた。ウンシュウミカンのGA生合成遺伝子についての特徴付けについてはほぼ完了したため、今後随時学会発表、論文発表を行っていく予定である。園芸科学各種植物ホルモンの定量については前処理条件等が確定し、カンキツ子房および組換シロイヌナズナの内生ホルモン量を測定することができた。また、カンキツ子房におけるジベレリン生合成遺伝子の発現を定量PCRで測定することができた。しかしながら、昨年7月に職場の異動(農研機構から佐賀大学)があり、実験機器の不足や研究室の立上に時間がかったこともあり、想定していた実験スケジュールに遅れが生じた。高および低単為結果性カンキツにおける子房・胚形成過程の形態学的比較をおこなうためのサンプリングと包埋、植物ホルモン分析系の改良、および各カンキツ子房の植物ホルモン定量を行った。また、GA生合成経路遺伝子のゲノム領域および発現遺伝子を取得した。マイクロアレイによる解析も開始しており、当初の計画通り進捗している。H26年度は植物ホルモンの定量解析に重点を置きつつ、オーキシンのシグナル伝達に関与している遺伝子と果実形成との関連性や、子房の発達とGA遺伝子の発現との関係を明らかにしたい。特に、カンキツ子房におけるジベレリン、サイトカイニン、オーキシンの動態について、4品種の時期別サンプルの分析により明らかにする。また、アレイの結果から抽出した候補遺伝子について、各品種の時期別子房における発現を確認する。平成25年度は、各カンキツ品種における胚形成過程の形態学的観察、植物ホルモン(ジベレリンおよびサイトカイニン)の分析を引き続き行う。また、カンキツ各品種の子房におけるジベレリン関連遺伝子の発現を経時的に解析する。マイクロアレイについては、これまでの解析に加え、新たにデータ取得を行う。ARF8やSIARF7、DELLA等の相同遺伝子については遺伝子の単離及び基本的な特徴付けを進める。
セルロースナノファイバー高度利用のための高分子付加による配向性の向上

地球環境における主要な炭素資源である木質系バイオマスの主成分であるセルロースの有効利用を目的として、セルロースの末端に直鎖状の疎水性および親水性高分子の付加を試みた。これにより水にも油にも溶解しがたいセルロースの溶解性の向上と、カプセルなどの調製に有利な配向性を獲得し、セルロースの利用拡大が想定される。本研究では、末端へのポリ乳酸の重合が期待される還元末端の水酸基以外を保護したグルコースの調製条件と、還元末端にメトキシポリエチレングリコールを付加したグルコースの調製条件を確立した。地球全体の炭素資源のサイクルを考えたとき,木質系バイオマスの有効利用法を開発することは科学の使命である。木質系バイオマスの有効利用法として,エネルギー化や有価材料化が検討されているが,より付加価値の高い材料開発が求められている。本研究では,セルロース由来の付加価値の高い材料開発として,セルロースナノファイバーに疎水性および親水性高分子を付加し,配向性が向上した直鎖状分子の調製を目指した。その調製戦略として,グルコースの1位の炭素に,疎水性の高分子とてポリ乳酸を,あるいは親水性の高分子としてメトキシポリエチレングリコール(PEG)を付加した化合物を調製し,イオン液体中においてβーグリコシダーゼの転移反応を利用してセルロースの還元末端に化合物を付加させることを計画した。まず,疎水性のポリ乳酸をグルコースの1位に直鎖状に付加するために,種々の検討を行ったが,アルカリ感受性のあるポリ乳酸を維持するためには,弱酸で解離できる保護基で1位以外のOH基を保護する必要があることが明らかとなった。そこで,δーグルコノラクトンにメトキシメチル基(MOM基)を付加し,1位以外のOH基を保護した。1位を還元し,1位のみがOH基となったMOMグルコースを調製できた。各ステップの生成物はNMRで確認した。次に,親水性のPEGを付加した直鎖状化合物調製のために,出発物質として2,3,4,6-テトラベンゾイルα-グルコシルブロマイドを用いてPEGを1位に付加した。次に弱アルカリ条件下でベンゾイル基を脱離させ,グルコースの1位に直鎖状のPEGが付加した化合物を得た。各ステップの生成物はNMRおよびゲルクロマトグラフィーで確認した。本挑戦課題の最終産物である高分子を付加したセルロースを合成するには至らなかったが,最終目的にいたる中間体の合成法を確立した。地球全体の炭素資源のサイクルを考えたとき,木質系バイオマスの有効利用法を開発することは,科学の使命である。木質バイオマスの利用には,前処理・分離・精製などの各プロセスでの克服すべき課題に加え,付加価値の高い出口が少ないことも問題となっている。本研究では,セルロースに着目した付加価値の高い材料開発に挑戦している。すなわち,セルロースナノファイバーに,配向性を付与するための高分子付加技術開発を目的としている。水にも疎水性溶媒にも溶解し難いセルロースナノファイバーに疎水性あるいは親水性の高分子を重合させることによって,ファイバーに配向性を持たせ液晶やミセルなどのように自己組織化できるようになると考えられる。さらには,カプセル形成,微小空間に繊維状物質を敷き詰めるなど,ナノデバイスへの用途が爆発的に発生し,セルロース資源の有効利用法を加速させることになる。当該年度では,まず疎水性のポリマーとなるポリ乳酸をセルロースに重合させる検討から試みた。イオン液体中にセルロースを溶解させ,D-ラクチドを加える重合反応では,ポリ乳酸がセルロースに付加する可能性が示された。しかし,研究当初に意図したような,末端のみだけでなく,セルロースの有する水酸基に結合したグラフト型である可能性が示された。グラフト型は,配向性を示しにくいが,カプセルとしては用いる可能性がある。また,L-ラクチドを用いて同様の検討を行い,ステレオコンプレックスを形成させれば,より強固なカプセルが形成できる可能性がある。本課題が採択された時期が5月であったので,本課題を行うための人員を充分にあてることができなかった。そのため,予定の計画よりやや遅れている。特に親水性の高分子の付加については計画を練ることしかできなかった。しかし,次年度(H24年度)は当初より予定より多い人員を配し,本課題を遂行することが可能になった。疎水性の高分子および親水性の高分子の付加について,それぞれの課題を集中的に行う。セルロースファイバーへの疎水性および親水性高分子の付加について当初の予定通り研究を行っていく。疎水性高分子については,ポリ乳酸を用いた重合体について,グラフト構造の確認と重合度の確認を行う。また,D型およびL型を用いて付加させた物質について,ステレオコンプレックスの形成についても,構造および重合度の確認を行い,融解温度等の変化も確認する。

また,当初の目的の通り,セルロース末端にポリ乳酸を付加するためにグルコーステトラベンゾエートにポリ乳酸をまず付加させて,それをセルロースファイバーに導入するストラテジーで検討を行う。一方,ポリエチレングリセロール(PEG)の付加については,当初の予定通り,グルコースブロマイドテトラベンゾエートとPEGからPEGグルコースを合成する。この物質を基質とし,イオン液体中でβーグルコシダーゼによってセルロースナノファイバーの末端のグルコース残基と転移反応を生起させ,位置特異的にPEGを付加させる方法を試みる。合成された分子を親水性膜に供与し,その乾燥物の構造を走査電子顕微鏡で観察し,分子の配向性を検証する。次年度の研究費は,その大部分を研究計画で示した実験の試薬代および分析器具および試薬代として使用する。また,得られた成果を発表するためと,ファイバー調製に関する打ち合わせとしての旅費を使用する。
反応性有機単成分結晶及び多成分結晶の設計と固相光反応性の研究

1.オレフィン類の固相光二量化反応の方向性をアンカー分子(又は原子)との結晶性コンプレックス生成により他の方向へ変化させる方法を見だすこと、及び、同じ方法により、反応性の無いオレフィンを反応性にするための研究を行った。即ち、桂皮酸はジアミンとの複塩結晶中で光二量化するとα-トルキシル酸を与えずにβ-トルキシン酸を主として生成するが、このときに、′n=3ルール′(α,ω-ジアミンのポリメチレン鎖の長さがn=3の時に桂皮酸の二量化収率は最大になる)や′ゴ-シュルール′(1,2-ジアミンがゴ-シュ型立体配座を取ると反応性結晶構造になる)の存在することが見だされた。これらの結果により、トリメチレンジアミンやトランス-及びシス-のシクロヘキサン-1,2-ジアミンが桂皮酸の二重結合を近ずけるためのアンカー分子としての役割を果たしていることが明らかにされた。基質分子間のπ一π相互作用やC1...C1,C-H...C1相互作用によりアンカーのコンホメーションが制御されることも示された。アンカーと光反応性分子との結晶性コンプレックス形成相互作用としては、分子間相互作用の中でも特に重要なイオン結合、水素結合、メタル-リガンド相互作用を利用している。そのために、アンカーとして、ジアミン、ジカルボン酸、メタルを用い、更に他の基質の反応へ展開させる予定である。2.2,4,6-トリイソプロピルベンゾフェノン-4′-カルボン酸メチルエステルの固相光環化反応性が異常に低い原因を探るために、単結晶X線構造解析や核酸反射スペクトルの測定、温度効果の実験を行った。その結果、異常な低反応性は結晶のパッキングが密なことに起因していることが解った。
咬合接触状態の変化は中枢制御機能に影響を与えるか

顎口腔系の状態が姿勢制御に与える影響について考察を行う目的で、下腿の腓腹筋部に電気による外乱刺激を与えた場合の重心動揺が咬合、非咬合時で変化するか否かを検討した。被験者は咬合状態に自他覚的異常を認めない男性10名である。刺激負荷時では殆どの症例で咬合により重心動揺面積が減少したが、非刺激条件において減少したのは半数に過ぎなかった。このことより咬合は外乱刺激に対し、重心動揺の安定、すなわち姿勢制御の安定に寄与する可能性があると考えられた。今回我々は科学研究費のご援助を頂き、3年の期間で顎位の変化が中枢制御に与える影響について検討したいと考えている。本年度は研究費で購入したデンタルプレスケールおよびオクルーザーを用いて咬合接触状態に関する検討を行っている。プレスケールは顕色剤を塗布したポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの上にマイクロカプセル化した発色剤を塗布し、さらに極薄層のPETフィルムで両面を覆った厚さ97μmの馬蹄型フィルムである。咬合することでフィルム中に分散された発色剤がその外力に応じて破壊され、その中の染料が顕色剤と化学反応を起こして赤色の濃淡を生じる。このフィルムの発色を専用の解析装置であるオクルーザーで分析すると、咬合力、咬合面積、平均圧力およびそれぞれの左右バランスが明らかになる。このプレスケールとオクルーザーを用いて、咬合状態に自他覚的な異常を認めない個性正常咬合と思われる被験者に対し平均的な咬合接触状態の診査を行った。その結果、咬合接触面積の平均は20mm^2(男性群21mm^2、女性群17mm^2)、咬合力の平均は812N(男性群851N、女性群736N)で、いずれも男性群の方が女性群よりも数値が大きかった。咬合力の左右差については全体の70%の被験者が16%以下、80%の被験者が18%以下であった。上記被験者から咬合接触状態の良好な被験者を選抜し、CO2レーザーを用い、疼痛刺激を手首に与えた場合の咬合、非咬合時の脳の反応を全頭型neuromagnetometerで解析を行う予定であるが、これまでのところ、明らかな差異が認められず、現在、刺激付与法など、実験条件の再検討を行っているところである。来年度は本年度の遅れを取り戻すべくペースを速めてゆきたいと考えている。本年度も昨年度同様、CO2レーザーを用い、疼痛刺激を手首に与えた場合の咬合、非咬合時の脳の反応を全頭型neuromagnetometerで解析を行っている。しかしながらパイロッドスタディの結果に反し、これまでのところ明らかな差異が認められず、現在、引き続き刺激付与法など、実験条件の検討を行っているところである。よって本年度は重心動揺と咬合の関係についての検討を中心に行った。重心動揺の検討に用いたのは四分割バランサーという機器である。これは体重バランスに関する足底圧を左前、左後。右前、右後の4つのセンサーで測定し、各部の体重や割合を検出することのできる装置である.これまで平衡機能障害が認められず、また、顎関節に自他覚的な異常を認めない個性正常咬合の男性5名について下顎安静位、咬頭嵌合位および各種スプリント介在位にて各部の体重バランスの変化を計測し、検討した。スプリントは前歯部で約2mmの挙上量となるよう調整し、上顎前歯部、上顎左右小臼歯、上顎左右大臼歯の3種類を作製した。下顎安静位に比較して動揺が減少した者は3例、変わらなかった者は2例であったことから個性正常咬合者においては咬合は重心動揺を安定させる可能性が示唆された。前歯部のみ接触するスプリントを介在させた場合は4例で下顎安静位に比較し、重心動揺が大きくなった。大臼歯部のみ接触するスプリントを介在させた場合は3例で下顎安静位に比較し、重心動揺が大きくなった。一方、小臼歯部のみ接触するスプリントを介在させた場合、下顎安静位に比較し、重心動揺が大きくなったのは2例に過ぎなかった。このことから前歯部の咬合接触は重心動揺の制御に影響を与えやすい可能性が示唆された。今後は疼痛刺激を与えた際の重心動揺が咬合接触状態の変化によりどのように変化するのかも検討してゆきたいと考えている。我々は痛み刺激に対する脳磁場の反応、そしてその反応に対する咬合状態の影響を明らかにし、さらに顎位の変化が中枢制御に与える影響について検討したいと考え、研究を進めてきた。これまで咬合状態に自他覚的な異常を認めない個性正常咬合の被験者を対象とし、CO2レーザーによる疼痛刺激を手首に与えた場合の咬合、非咬合時の脳の反応の解析を試みてきたが、予備的に行ってきた実験結果と異なり、明らかな差異が検出されていない。

よって本年度は腓腹筋部に電気刺激を与えた場合の重心動揺が咬合、非咬合時で変化するか否かを検討し、顎口腔系の状態が姿勢制御に与える影響について考察することとした。被験者は年齢24-44歳の問診により平衡感覚に異常を認めず、咬合状態に自他覚的な異常を認めない個性正常咬合の男性10名である。被験者に対し、閉眼、閉足位における重心動揺を下顎安静位、咬頭嵌合位、電気刺激負荷時の下顎安静位、電気刺激負荷時の咬頭嵌合位の4条件で計測を行い、比較検討した。重心動揺の測定にあたっては60秒間における軌跡の外形面積と軌跡長を検討した。外乱刺激としての電気刺激には日本光電社製電気刺激装置を用い、表面刺激電極を右側腓腹筋部に設置し、疼痛を発生させない最大刺激量を負荷した。外形面積の平均は下顎安静位856±422mm2、咬頭嵌合位876±397mm2、刺激負荷時の下顎安静位1163±626mm2、刺激負荷時の咬頭嵌合位963±447mm2であった。軌跡長の平均は下顎安静位2256±429mm、咬頭嵌合位2318±369mm、刺激負荷時の下顎安静位2445±418mm、刺激負荷時の咬頭嵌合位2374±451mmであった。このことから、咬合は姿勢の安定に影響を与えている可能性が示唆された。
中大脳動脈閉塞実験モデルに見られる局所虚血性神経細胞死の機構とその回避

ラット(SHRSP)の中大脳動脈枝の完全閉塞実験による局所虚血性神経細胞死モデル実験系において、大脳皮質の虚血負荷後の経時的な形態変化を、主に組織学的に解析した。虚血後2時間で既に大脳皮質の虚血中心領域には梗塞巣が見られ、神経細胞は“necrosis"による細胞死の様相を呈する。同時期の梗塞巣周囲領域(penumbra)は一見正常であるが、電顕微細形態では膨化傾向にある神経細胞と、萎縮傾向にある神経細胞が共に観察された。虚血後6時間のpenumbraでは両者の形態がより明瞭になり、電子密度が低く細胞全体が大きく膨化して明らかに,“necrosis"に陥った細胞と、電子密度が高く細胞内小器官は正常であるがリソゾームシステインプロテアーゼ免疫反応性の増加を伴い細胞質の萎縮を示す“apoptosis"に陥った細胞が混在して観察された。これらの皮質神経細胞は虚血後1日から3日の間にTUNEL陽性の遅延性核変性を示す。Penumbraでは星状膠細胞と希突起膠細胞も死に至るが、中でも星状膠細胞は虚血後2時間で既に細胞質内の構造変化が著しく、従来虚血障害には最も強いとされていた星状膠細胞が最も早く細胞死に向かう可能性が示唆された。星状膠細胞の死は神経細胞に見られた“apoptosis"と“necrosis"の二つの異なった細胞死機構の始動に深く関連するものと思われた。スナネズミ短時間虚血後の海馬CA1錐体神経細胞において、Caspase familyの一つであるCPP32の免疫反応性がTUNEL陽性反応を示す直前に増強された。これらの結果は神経細胞が死に至る機構、特に“apoptosis"において、細胞を死に導く情報伝達機構の下流領域にCaspaseを含むシステインプロテアーゼが重要な因子の一つとして機能する事を示し、その活性化の抑制が細胞死を回避する要素の一つと成りうるものと考えられた。本年度は、大脳皮質に限局した局所虚血性神経細胞死モデルの動物実験系の確立を目指し、ラット(SHRSP)の片側中大脳動脈(MCA)枝の完全閉塞実験を行ない、ほぼ安定した梗塞範囲を持つ実験系を得ることの成功した。虚血負荷後6、12及び24時間、3及び7日に動物を固定し、中枢神経系、特に大脳皮質、視床、及び海馬領域の神経細胞への影響について、主に組織学的及び免疫組織化学的に解析した。虚血後6時間では既に大脳皮質の虚血中心領域が陥没梗塞巣を形成しており、梗塞巣の神経細胞はTUNEL陽性の核DNAの障害を伴う急激な細胞死の様相を呈していた。大脳皮質の梗塞巣周囲領域(penumbra)は一見正常であるが、この領域のほとんどの皮質神経細胞は虚血後24時間から3日の間にTUNEL陽性反応を示し、遅延型細胞死を起こすことが分かった。視床や海馬の神経細胞に特別な変化は見られなかった。penumbraの皮質神経細胞の遅延型細胞死過程において、代表的リソゾームシステインプロテアーゼであるカテプシンB, H, Lの神経細胞内の免疫反応性が虚血後6時間から増大し、萎縮した細胞質内に多数の粗大果粒状陽性反応が認められるようになる。特に、正常な神経細胞内での分布が報告されていないカテプシンHの免疫反応が虚血後3日の神経細胞に特異的に見られるようになるという結果は興味深い。

この様に、虚血中心梗塞巣とpenumbraでは神経細胞死の経過が異なり、梗塞巣では主に“necrosis"による急激な細胞死が起こり、penumbraでは主に“apoptosis"による遅延型細胞死が起きている可能性が示唆された。そこで、両領域で見られた細胞死の機構が“necrosis"であるか“apoptosis"であるかを評価する上で重要な要素となる電顕による微細形態のデータを現在検索中である。当初予定していたin situ hybridization法による細胞死関連遺伝子の発現に関しては、RNAプローブの作製を含め、現在も継続して準備を進めている段階である。本年度は、ラット(SHRSP)の片側中大脳動脈(MCA)枝の完全閉塞実験による局所虚血性神経細胞死モデル実験系において、主に電顕形態学的解析を行なった。虚血負荷後2、6、12及び24時間、3及び7日に動物を固定し、中枢神経系、特に大脳皮質、視床、及び海馬領域の神経細胞や神経膠細胞への影響について検索した。虚血後2時間では既に大脳皮質の虚血中心領域の梗塞巣に分布する神経細胞が膨化し、細胞膜や核膜さらにミトコンドリア等の細胞内小器官の膜系が崩壊した典型的な"necrosis"の様相を呈しており、TUNEL陽性の核DNAの障害を伴う急激な細胞死であることが分かった。同時期の大脳皮質の梗塞巣周囲領域(penumbra)は光顕観察上は一見正常であるが、電顕微細形態では細胞質の電子密度が低く膨化傾向にある神経細胞と、電子密度が高く萎縮傾向にある神経細胞が共に観察された。虚血後6時間のpenumbra領域ではこれら両者の形態がより明瞭になり、電子密度が低く細胞全体が大きく膨化して明らかに"necrosis"に陥った細胞と、電子密度が高く細胞内小器官は正常であるがリソゾームシステインプロテアーゼ免疫反応性の増加を伴い細胞質の萎縮を示す"apoptosis"に陥った細胞が混在して観察された。penumbra領域の神経膠細胞の中で星状膠細胞と希突起膠細胞は細胞死に至るが、中でも星状膠細胞は虚血後2時間で既に細胞質内の構造変化が著しく、従来虚血障害には最も強いとされていた星状膠細胞が最も早く細胞死に向かう可能性が示唆された。星状膠細胞の死は神経細胞に見られた"apoptosis"と"necrosis"の二つの異なった細胞死機構の始動に深く関連するものと思われた。以上の結果をふまえ、現在in situ hybridization法による細胞死関連遺伝子の発現解析を進めている段階である。本年度は、ラット(SHRSP)の片側中大脳動脈(MCA)枝の完全閉塞実験による局所虚血性神経細胞死モデル実験系、およびスナネズミの総頚動脈の短時間閉塞実験による一過性前脳虚血神経細胞死モデル実験系において、主に免疫組織学的解析を行なった。局所虚血性神経細胞死モデルでは虚血負荷後2、6、12及び24時間、3及び7日に動物を固定、また一過性前脳虚血神経細胞死モデルでは虚血負荷再還流後2、6、12及び24時間、3、4、5及び7日に動物を固定し、細胞死関連蛋白の一つと考えられるCaspase familyのなかでICEおよびCPP32に対する抗体を用いて免疫染色を行ない、中枢神経系、特に大脳皮質、視床、及び海馬領域の神経細胞や神経膠細胞における免疫染色反応性の変化の有無あるいは時間経過について検索した。結果としては残念ながら呈示しうるような明確な反応性の変化得られなかった。これはおそらく、購入した抗体の抗体力価等の問題であると考えられるが、しかし虚血負荷後比較的早期の両モデル動物の細胞死に向かう神経細胞群において微弱ではあるが免疫反応性の増強があるようなので、さらに新しい抗体等を用いて現在検索中である。
癌化学療法における多剤耐性の克服を目指した機能性リポソームの研究開発

平成15年度に行った検討から、以下に示す知見を得た。1)癌細胞標的化のためのリガンド付与リポソームの設計鉄の運搬体であり、癌細胞に高発現しているトランスフェリン受容体のリガンドであるトランスフェリンをリポソーム表面に化学結合させる事により、癌細胞に高親和性のある標的化リポソームの調製に成功した。このリポソームは抗癌剤のドキソルビシンを安定に保持することが可能であり、ドキソルビシンに耐性を示す細胞(SBC-3/ADM)に対して高い殺細胞効果を示すことが分かった。一般に受容体を介したリポソームの細胞内取り込みは、受容体依存的なエンドサイトーシスであることが知られているが、種々の阻害剤を用いた検討の結果、受容体を利用した細胞膜とリポソーム膜の融合、あるいは脂溶性の高いドキソルビシンの細胞膜へのトランスファーによる可能性が高いことが明らかとなった。2)酵素感受性高分子脂質によるリポソームの修飾受容体依存的エンドサイトーシスにより内在化された後の最大の課題は、いかに速やかにリポソームから薬物を放出させ、bioavailableにさせるかという点である。この課題を克服するため、昨年度pH感受性リポソームの利用を行った。しかしながら、pH感受性リポソームの安定性を向上させる目的で修飾剤として用いたポリエチレングリコールは、残念ながらpH感受性を抑制することが分かった。そこで、細胞内ライソゾーム酵素によって選択的に切断されるペプチドをPEG化リン脂質のスペーサーとして用い、酵素-pH感受性リポソームの開発を試みた。In vitroでの検討の結果、特異酵素と低いpH環境(4.5-6.0)でのみ内封薬物を放出することが示唆された。現在上記技術を融合させた標的化酵素-pH感受性ドキシルビシン封入リポソームを用いて、耐性癌への殺細胞作用について検討しているところである。平成14年度に行った検討から,以下に示す知見を得た.1)トランスフェリン修飾リポソームの調製リポソーム表面にトランスフェリンを共有結合させることで安定なトランスフェリン修飾リポソームを得ることができた.2)酵素感受性リポソームの調製既存のpH感受性リポソームの安定性を向上させる目的でPEG化脂質をその基剤に添加すると,pH感受性リポソームが本来有しているpH感受性が阻害されることが知られている.そこで,目的部位まではPEGの鎧をまとい,目的部位に到達すると速やかにPEGが表面から解離し,本来有しているpH感受性が快復するような機能性(酵素感受性)をリポソームに付加(ジスルフィド結合の付加)した.その結果,ジスルフィド結合の解劣に呼応してPEG鎖がなくなるとpH感受性が復活することが分かった.この結果を受けて,現在生体適応可能なペブチド配列の導入により酵素感受性リポソームの開発を試みている.3)内封薬物の核内移行速度の検討オルガネラ分画法により回収した核内の封入薬物移行速度を定量的に検討した.その結果,作用部位である核内への薬物の移行速度と効果の間には非常に良好な相関関係が見られ,作用部位へ薬物を速やかに送達しうるデバイスの開発が,封入薬物の高い薬理効果(効果と副作用の間の差)を得る上で需要であることが明らかとなった.平成15年度に行った検討から、以下に示す知見を得た。