hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生誘導因子を用いた神経前駆細胞賦活によるALS治療法の開発

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis以下ALS)は神経疾患のなかで最も過酷な疾患とされており、早期に病因の解明と有効な治療法の確立が求められている。本研究ではALS病態下では再生誘導因子は強力な運動ニューロン保護因子として働くだけでなくアストロサイト機能修飾作用とミクログリア活性化抑制作用も合わせもつ細胞外微小環境調整因子として働くことを見出した。Cu/Zn superoxide dismutase(Cu/Zn SOD)遺伝子が一部の家族性ALSの原因遺伝子であることが発見されたが、Cu/Zn SODの異常がなぜ運動ニューロンに選択的な細胞死をもたらすかは依然として不明である。本研究ではこの変異Cu/Zn SODがもたらす神経変性の過程における内在性の神経幹(前駆)細胞の動態に注目し、本研究申請者の青木らが開発したトランスジェニックラットによるALSモデルを用いてALS病態下における脊髄神経前駆細胞の増殖と分化、特に「損傷誘導性ニューロン新生(insult induced neurogenesis)」の有無を検討した。発症後のトランスジェニックラットにEGFおよびFGF-2の同時に一週間髄腔内へ持続投与して、人工髄液のみを投与する対照群と比較した。その結果、対照群に比してEGF+FGF2投与群ではBrdU陽性の新生細胞が腰髄実質広汎にわたって有意に増加しており、未分化神経前駆細胞やグリア前駆細胞などの増殖促進が明らかとなった。FGF受容体はニューロンのみならず中心管周囲上衣層やグリア前駆細胞、アストロサイトに発現が確認され、前角細胞数に両群間の有意差がなかったことから、EGF+FGF2の前駆細胞への直接効果が示唆された。Cu/Zn superoxidedismutase(SOD1)遺伝子が一部の家族性ALSの原因遺伝子であることが発見されたが、SOD1の異常がなぜ運動ニューロンに選択的な細胞死をもたらすかは依然として不明である。本研究ではこの変異SOD1がもたらす神経変性の過程における内在性の神経幹(前駆)細胞の動態に注目し、本研究代表者の青木らが開発したトランスジェニックラットによるALSモデルを用いてALS病態下における脊髄神経前駆細胞の増殖と分化、特に「損傷誘導性ニューロン新生(insult induced neurogenesis)」の有無を検討した。発症後のALSラットに対するEGFおよびFGF-2の同時に髄腔内持続投与にて、EGF+FGF2の前駆細胞への直接効果が示唆された。さらには肝細胞増殖因子(HGF)をはじめとする再生誘導因子は強力な運動ニューロン保護因子であるだけでなくアストロサイト機能修飾作用とミクログリア活性化抑制作用も合わせもつ細胞外微小環境調整因子として働くことを見出し、実際にALSラットで内因性HGFを阻害するとグリア増生と再生阻害因子発現が亢進してしまう知見を得た。
デザインとの協同による共創哲学の理論と実践

理論的な面では、Inclusive DesignやUniversal Designに関する研究を進めた。とりわけあらゆるものをデザインの観点からとらえ直し、そこにどのような排除が潜んでいるか、その原理を考察した。業績としては、8月にゲッティンゲン大学でThe Ethos and Nomos of Inclusionをテーマに講義を行い、3月には台湾の国立交通大学で、Design as Theory and Practice for Social Inclusionと題して講演を行った。実践的な面では、5つの哲学対話についての講習、5つの〈哲学×デザイン〉プロジェクトのワークショップを行ったー1「働く人の哲学対話だぁ!」では、社会人を対象に日常の問いから哲学対話を行った。2「ルワンダへの恋、ルワンダからの問い」では、ルワンダ在住の加藤雅子氏を迎え、現地の生活の中で抱いた問いから自分たちを見つめ直すワークショップを行った。3「音楽と想起のコミュニティ」では、ミュージシャンのアサダワタル氏を迎え、音楽によって喚起される記憶を通して人々を結び付ける彼の活動を紹介していただき、会場でも懐メロを使ったワークショップを行った。4「『ぐるぐる回る光の中で』映画をめぐる試行錯誤×対話ワークショップ」では、映画監督の中里龍造氏を迎え、彼が独特の手法を使って制作している映画を上映し、そのテーマをめぐって哲学対話を行った。5「「木」を書く字を書くことから見えてくる“わたし"」では、書家の華雪氏の一字書のワークショップにおいて、書を通して参加者が一体となってそれぞれが自らに向き合うという体験をした。哲学教育との関連では、都立高校で探求学習のための教員研修や授業運営のサポートを行った。また、宮崎の高千穂高校では、世界農業遺産を地域おこしに生かすために、哲学対話と文章の書き方の講習を行った。理論面では、デザインに関する文献を集め、読み込むことで排除の構造およびその発生、その対処の方法について原理的な理解を得ることができた。とりわけデザインの理論では、より実践的な意味でのヒントを多く得ることができた。実践面でも、様々な現場ー外国、音楽、映画、教育、芸術などーの人たちとコラボレーションすることで、排除と包摂が具体的にどのような形をとりうるのか、そのデザイン上の工夫や原理を実感と共に理解することができ、自分でも様々な形で試す機会に恵まれた。文部科学省により探求学習が導入される時期に重なったことが幸いし、教育の現場で排除の仕組みを実地に見て、その改善を試みるのに現場の教員たちと生産的に協働できた。とくに都立高校では、文科省の方針がもつ教育観や学校という制度が持つ排他性など、様々な問題点が浮かび上がり、またその中で「探求」をどのように実現するか、そのデザインについて多くの示唆が得られた。どの点に関しても、その方面の協力者ー水内智英、鞍田崇、社団法人子どもの成長と環境を考える会、NPO法人グローカルアカデミー、総合地球環境学研究所などーと緊密な連携が取れたことで、これだけの成果を上げることができた。理論面では、Inclusive DesignやUniversal Designの理論を学ぶことにより得たものは多かったが、他方で哲学的な掘り下げ、とくに「対話的なもの」の本質を追求するのは、デザインの理論だけでは十分にはできそうにないことも明らかになってきた。それを考えるためには、身体論、空間論、言語論等の側面から哲学的な考察を深めていかなければならない。実践面では、さらにいろいろなデザイン関係の人たちと共同していく。教育との関連では、本年度から探求学習が本格化することもあり、学校とのより緊密な連携が可能になる。そこから授業のデザインとして、よりインクルーシブな場の創出のために体制が整うと思われる。社団法人子どもの成長と環境を考える会と協働し、さらに具体的な形にできるよう活動を広げていく。5年前から関わってきた宮崎県の五ヶ瀬中等教育学校のスーパーグローバルハイスクールが終了し、哲学対話が学校教育にも高校生の寮生活にも、地域との交流にも根づいて文化のようになってきており、そうした成果の上に本研究を接続できるのも、大変なメリットであった。そして今年度からは、グローカル型のプログラムに採択され、高千穂高校とも協働して地域再生に取り組むことになった。今後はNPO法人グローカルアカデミーの協力を得て、より広い範囲で地域おこしと教育の変革のためのデザインに関われることになった。地域おこしについては、その他にも、総合地球環境学研究所で以前プロジェクトを持っていた時に関わっていた滋賀県の朽木での活動がその後さらに進展しており、あらためて現地のメンバーと連携できそうであり、この方面でもコミュニティのデザインという観点から研究を進めていく。

4「『ぐるぐる回る光の中で』映画をめぐる試行錯誤×対話ワークショップ」では、映画監督の中里龍造氏を迎え、彼が独特の手法を使って制作している映画を上映し、そのテーマをめぐって哲学対話を行った。5「「木」を書く字を書くことから見えてくる“わたし"」では、書家の華雪氏の一字書のワークショップにおいて、書を通して参加者が一体となってそれぞれが自らに向き合うという体験をした。哲学教育との関連では、都立高校で探求学習のための教員研修や授業運営のサポートを行った。また、宮崎の高千穂高校では、世界農業遺産を地域おこしに生かすために、哲学対話と文章の書き方の講習を行った。理論面では、デザインに関する文献を集め、読み込むことで排除の構造およびその発生、その対処の方法について原理的な理解を得ることができた。とりわけデザインの理論では、より実践的な意味でのヒントを多く得ることができた。実践面でも、様々な現場ー外国、音楽、映画、教育、芸術などーの人たちとコラボレーションすることで、排除と包摂が具体的にどのような形をとりうるのか、そのデザイン上の工夫や原理を実感と共に理解することができ、自分でも様々な形で試す機会に恵まれた。文部科学省により探求学習が導入される時期に重なったことが幸いし、教育の現場で排除の仕組みを実地に見て、その改善を試みるのに現場の教員たちと生産的に協働できた。とくに都立高校では、文科省の方針がもつ教育観や学校という制度が持つ排他性など、様々な問題点が浮かび上がり、またその中で「探求」をどのように実現するか、そのデザインについて多くの示唆が得られた。どの点に関しても、その方面の協力者ー水内智英、鞍田崇、社団法人子どもの成長と環境を考える会、NPO法人グローカルアカデミー、総合地球環境学研究所などーと緊密な連携が取れたことで、これだけの成果を上げることができた。理論面では、Inclusive DesignやUniversal Designの理論を学ぶことにより得たものは多かったが、他方で哲学的な掘り下げ、とくに「対話的なもの」の本質を追求するのは、デザインの理論だけでは十分にはできそうにないことも明らかになってきた。それを考えるためには、身体論、空間論、言語論等の側面から哲学的な考察を深めていかなければならない。実践面では、さらにいろいろなデザイン関係の人たちと共同していく。教育との関連では、本年度から探求学習が本格化することもあり、学校とのより緊密な連携が可能になる。そこから授業のデザインとして、よりインクルーシブな場の創出のために体制が整うと思われる。社団法人子どもの成長と環境を考える会と協働し、さらに具体的な形にできるよう活動を広げていく。5年前から関わってきた宮崎県の五ヶ瀬
第Ⅷ因子活性化・不活化機構の解明と新規凝固・抗凝固薬への応用に関する基礎的研究

血液凝固第VIII因子(FVIII)は、欠乏では重篤出血(血友病A)を呈し、逆に増加では血栓形成を惹起する。従来凝固研究は、内因系/外因系/凝固抑制系/線溶系に分け各々研究されてきたが、実際の凝固過程は複数系が互いに絡み合い進行していくと支持されている。本研究は、この新概念を基に、凝固止血反応で出血・止血に重要に関与するFVIIIが、内因系因子(トロンビン、FIXa)のみならず、線溶系因子(プラスミン)、凝固抑制因子(プロテインS)、外因系因子(FVIIa/組織因子)、炎症性因子(好中球プロテアーゼ3)と相互作用することにより凝固血栓が巧みに制御されていることを明らかにした。凝固第VIII因子(FVIII)は、欠乏では重篤出血(血友病A)を、増加では易血栓を惹起するため、FVIIIを中心とする凝固血栓形成や抑制機序の解明は、血友病Aの治療戦略や血栓形成病態に応じた抗血栓凝固療法の発展に寄与する。凝固形成過程は内因系/外因系/凝固抑制系/線溶系が同時に互いに絡み合い進行する。今回FVIII活性化/不活化機構におけるこれら複数系の役割の新知見を得た。1内因系(FVIII-トロンビン(FIIa)制御軸:血液凝固にはFIIaのFVIII活性化は必須である。この反応に極めて重要なFVIIIArg372開裂を制御するFIIa結合領域は酸性領域内アミノ酸残基340-350内であり、さらに硫酸化Tyr346が重要に貢献していることが明らかになった。2外因系(FVIII-FVIIa/組織因子(TF)制御軸):FVIIaは凝固極初期相にFVIIIを活性化する。この反応に組織因子(TF)が必須であるが、FVIIa同様にTFもFVIIIに直接結合しVWFと競合阻害することによりFVIIaが極めて作用しやすくすること、またこのTFがFVIIIの軽鎖A3酸性領域が関与していることも明らかになった。3FVIIIa-FIXa制御軸:FIXa結合領域にあるPro1809→Leuの新規変異FVIIIを有する軽症型血友病AがFVIIIインヒビターを出現する機序を同定した。この変異FVIIIはC2エピトープ2248-2285残基認識抗体を出現させること、この変異のためVWFやリン脂質結合部位をdisturbすることも明らかになった。4炎症性因子(好中球プロテアーゼ3)はFVIIIをリン脂質非依存性に不活化するが、VWF存在下ではこの反応は抑制される生理的意義および、他の好中球プロテアーゼの働きと少し異なることもを示した。5FVIIIインヒビター治療薬のFVIIa/FX複合体(MC710)はFVIIIを活性化することを初めて示した。そしてFVIII同種または自己抗体(インヒビター)存在下でもFVIII活性化が阻害されないこと、特に抗C2タイプ1では活性化効果がより持続しやすいことも示した。このことは新たな治療方針の展開をも示唆し得るものであった。この反応に極めて重要なFVIIIArg372開裂を制御するFIIa結合領域は不明であったが、酸性領域内アミノ酸残基340-350内に存在する可能性が示唆された。この反応に組織因子(TF)が必須であるが、TFがFVIIIに直接結合しVWFと競合阻害することによりFVIIaが極めて作用しやすくする可能性を示唆した。3FVIIIa-FIXa制御軸:FIXa結合領域にあるPro1809→Leuの新規変異FVIIIを有する軽症型血友病Aを同定した。この変異FVIIIはC2エピトープ同種抗体を出現させ、Pro1809はC2ドメインの抗原性を制御するとともに、C2内のFIXa結合領域との密接な関連性を示唆した。

4炎症性因子(カセプシンGとプロテアーゼ3)はFVIIIをリン脂質非依存性に不活化するが、VWF存在下ではこの反応は抑制される生理的意義の一部を示した。5FVIIIインヒビター治療薬の活性型プロトロンビン複合体製剤(aPCC)はFVIIIを活性化することを初めて示した。そしてFVIII同種または自己抗体(インヒビター)存在下でもFVIII活性化が阻害されないこと、特に抗C2タイプ1では活性化効果がより持続しやすいことも示した。このことは新たな治療方針の展開をも示唆し得るものであった。血液凝固第VIII因子(FVIII)は、欠乏では重篤出血(血友病A)を、増加では易血栓を惹起する。ゆえに、FVIIIを中心とする凝固血栓形成や抑制機序の解明は、血友病Aの止血治療戦略や血栓形成病態に応じた抗血栓凝固療法の発展に寄与する。凝固形成過程は内因系/外因系/凝固抑制系/線溶系が同時に互いに複雑に絡み合い進行する。今年度はFVIII活性化/不活化機構におけるこれら複数系の役割の新知見を得た。1内因系(FVIII-トロンビン)制御軸:血液凝固反応増幅にはトロンビンのFVIII活性化は必須である。特に重要なFVIII-Arg372開裂を制御するトロンビン結合領域はA1ドメイン内の酸性領域内での硫酸化Tyr346が重要に関与していることが明らかになった。またTyr346を中心に数個の残基が結合に貢献している可能性が考えられた(現在研究中)。2外因系(FVIII-FVIIa/組織因子(TF)制御軸):FVIIaは凝固極初期相にFVIIIを活性化し、その活性化の促進にTFが重要な役割を果たす。このTF機序としてFVIIIに直接結合してvon Willebrand因子と競合阻害することによりFVIIaがより作用しやすくなること、またこの結合にはFVIII軽鎖が、TFでは膜貫通領域外領域が相互作用している可能性が考えられた。3FVIIIa-FIXa制御軸: FIXa結合領域にあるP1809L新規変異FVIIIを有する軽症型血友病AがFVIIIインヒビターを出現する機序を最終的に決定した。Pro1809はC2ドメインの抗原性を制御するとともに、この変異FVIIIはC2エピトープ2248-2285残基認識抗体出現させること、この変異のためC2ドメイン両末端の領域の構造を変化させることによりVWFやリン脂質結合部位をdisturbすることが明らかになった。医歯薬,内科系臨床医学,小児科学,血液止血血栓学当初は3つの課題、1FIIaやFVIIaによる生理的なFVIII活性化機序、2FVIIaやTFのFVIII結合部位の同定、3炎症系因子とFVIII活性化機序、を想定し、1と3は当初の目標は順調に達成できており、2はアッセイ系の確立等に時間がかかっており、十分でなく達成することができていない。しかし、軽症型血友病の変異FVIIIからFVIII-FIXa制御軸の一面も示すことができた。そして、MC710製剤(FVIIa, FX含有)によるFVIII活性化機序も初めて報告できた。このことは、内因系+外因系(複合因子)とFVIIIとの凝固制御機序をより明確にする事ができたと思われる。当初は3つの課題、1FVIIaによる生理的なFVIII活性化機序、2FVIIaのFVIII結合部位の同定、3炎症系因子とFVIII活性化機序、を想定し、1と3は当初の目標は最低は達成できたが、1と3に時間がかかり、2は研究時間が十分でなく達成することができていない。しかし、TFとFVIIIの関連性やこの反応の生理的意義の一部を明らかにできた。また、軽症型血友病の変異FVIIIからFVIII-FIXa制御軸の一面も示すことができた。
リアルタイム画像支援による仮想気管支鏡システムの開発

仮想気管支鏡を気管支鏡画像と並べ、リアルタイム表示を行うことで、高精度なナビゲーションシステムを開発することを目的としている。深部情報可視化3次元画像構築ソフト(SYNAPSE VINCENT、Fuji film社製)を用いて、予め匿名化された症例における胸部造影CTのDICOMデータを用いて、3D-CT及び気管支ナビゲーション画像を作成した。仮想気管支鏡画像の最適化により滑らかな動画表示を行うことが可能となった。気管支鏡動画と胸部CT画像からイメージを連携させ、仮想気管支内視鏡の動きや位置を推定するアルゴリズムを改良した。仮想内視鏡画像と気管支鏡画像の同時シンクロ表示が可能となった。本研究はリアルタイム画像支援による仮想気管支鏡の開発にある。仮想気管支鏡をリアルタイム表示で行うことにより、気管支の分岐方向の指示や、リルート機能など、高精度マッチングを目指し、臨床応用することを目的としている。本年度は1予め同意の得られた患者の胸部造影CTより、匿名化されたDICOMデータを使用して、仮想気管支の構築を行った。2仮想気管支鏡と、臨床の現場で行う気管支鏡から得られた画像をリアルタイムでマッチングさせるべく、画像の抽出を行った。3気管支分岐パターン認識をアルゴリズム化し、実際に各気管支の分岐部の画像を用い、仮想気管支鏡の分岐パターンとマッチングさせることで、精度の改善を図った。4カメラ挿入時の動作画像より、カメラの動きを予測することで、連続する気管支分岐の分岐パターンの予測を行った。また、サブ解析用にはsony VAIO Z13A1を用いて、検証用PCとした。両者を用いて気管支鏡画像から画像抽出を行った。静止画から動画までを対象として抽出し、マッチングを検証した。概ね進捗状況は順調である。本研究はリアルタイム画像支援による仮想内視鏡の開発である。本年度は予め匿名化されたDICOMデータを用いて3D-CT及び、気管支ナビゲーション画像を製作した。さらに匿名化された気管支鏡動画を用いて動画からフレーム抽出を行った。さらに気管支鏡動画と、CTから得られた3Dイメージと連携させ、仮想内視鏡の動きや位置を推定するアルゴリズムの開発を行った。アルゴリズムは内視鏡の位置変化や回転変化などに対応するものとした。現時点でハードウェアは主にLAPTOP型のPCにSYNAPSE VINCENTをインストールし、内視鏡動画との連携を行った。画像処理能力については特に問題点を認めなかった。主に気管分岐部からのマッチングを行い、内視鏡動画における各フレーム間の差異から内視鏡の前後位置、回転度の推定を行った。また気管支について区域支、亜区域支の穴をそれぞれ認識させ、3D-CTイメージから取得した仮想気管支における穴とのマッチングを行った。深部情報可視化3次元画像構築ソフト(SYNAPSE VINCENT、Fuji film社製)を用いて開発を行った。予め匿名化された症例における胸部造影CTのDICOMデータを用いて、3D-CT及び気管支ナビゲーション画像を作成した。同症例における気管支鏡動画像から静止画抽出を行った。主に気管支分岐部の静止画像を用いて、個々の気管支分岐を同定する設定とした。再構築された仮想気管支鏡動画は、フレームレートを最適化することで、画像処理スピードの向上が得られ、より滑らかな動画表示を行うことが可能となった。さらに気管支鏡動画と胸部CT画像から得られた3Dイメージを連携させ、仮想気管支内視鏡の動きや位置を推定するアルゴリズムの開発を行った。アルゴリズムは気管支鏡の挿入深度の位置変化や、術者による回転変化などに対応するものとした。仮想内視鏡画像と気管支鏡画像は同一モニター上に2画面表示され、常時リアルタイム表示とした。仮想内視鏡画像において、PCのCPU及びグラフィックボード演算能力を改善したところ、実際の内視鏡画像に対するタイムラグの解消が図られた。画像と気管支鏡所見のマッチング精度を高めるべくシステムに改良を加えることとしている。また、気管支鏡画像から得られた情報を実際に臨床の現場で使用するべく、システムの仕様変更を行っていく。システムの有効性が確かめられたならば、前向き臨床試験を検討する。臨床試験は前向きFeasibility試験であり、経気管支肺生検(TBLB)における内視鏡支援システムの有効性を検証する予定である。継続して内視鏡動画像と仮想気管支鏡画像のリアルタイムマッチングを行い、精度向上を目指す。グラフィックボードなどの見直しを行い計算処理能力の改善を図り、できる限り仮想画像との「時間的ずれ」を少なくなるよう随時変更を行っていく。システムの有効性が確立した時点で、前向き臨床試験を実施する。

臨床試験は前向きFeasibility試験とし、経気管支肺生検(TBLB)における内視鏡支援システムの有効性を検証することとする。呼吸器外科学内視鏡システムとの接続における、デジタル画像転送のシステム構築が遅延しており、コンピューターを含めた機器の購入を次年度に見送る方針としたため使用額に変更が生じた。内視鏡システムとPCの接続にはデジタル画像転送装置を介して行っているが、次年度の購入予定のため今回は使用額に計上していない。次年度、デジタル画像転送装置機器の購入、内視鏡ユニットへの接続装置の購入、及び仮想内視鏡をインストールするコンピューターを購入する予定としている。デジタル画像転送装置とグラフィック性能がより高性能であるコンピューターの購入と、仮想気管支鏡動画像を出力する高精細モニターおよびipadの購入を予定している。
ポジティブな側面からの健康度評価尺度の開発

本研究では、健康度を重篤な疾病状態から極めて健康で意欲に満ちている状態までのスペクトルとして表現することをねらっている。このうち、疾病状態などのネガティブな側面についてはすでに様々な調査票が開発されているが、健康のポジティブな側面については健康度を評価するための指標がほとんど見あたらないため、健康度を両側面から把握できる新たな健康指標の開発を試みた。具体的には、健康度の尺度として、ライフスタイルの状態、疾病の状態、様々な自覚症状の状態、健康づくりの実践状況、体力レベル、および余暇の充実度などの要素を抽出し、また精神的健康の状況についても十分配慮した上で、総合指標を算出するための尺度を開発した。そして、それぞれの要素について重回帰分析の手法を用いてデータ解析を行い、できるだけ少ない説明変数で各要素得点を算出するよう配慮し、各要素得点を総合して健康指標の得点とした。これらの要素のうち、特に健康度のポジティブな側面については、体力レベル、ライフスタイルの状況、余暇活動の充実などの要素で把握された。このようにして開発された健康指標をもとに評価した健康度は、健康度の自己評価の結果ともかなり一致することが確認され、ある程度の信頼性が認められた。また、この健康指標は性別や年齢などの人口統計学的変数とも有意な関連を示した。性別については、男性が女性よりも健康度が高い結果が示された。また、年齢については、20歳代で健康度が最も低く、年齢が高齢になるにつれて健康度がしだいに高くなる傾向がみられた。
イヌの系統分化、モンゴル韓国と日本の関係

1.モンゴル在来犬は、大型長毛のモンゴルと、これと比べて体型がやや小さく短毛のタイガの2つに分れる。毛色はブラックアンドタン(黒褐)と黒である。この両系統の合計101頭について、血液タンパク質の多型を調べたところ、系統間に大きな差は認められなかった。モンゴル犬は、血球ヘモグロビンA(Hb^A)の頻度が0.995と著しく高かった。血球ガングリオシドモノオキシゲナーゼg(Gmo^g)の頻度は0.109であった。また血球エステラーゼ2^F(Es-2^F)の頻度は0.934と著しく高かった。主成分分析の結果は、この犬種が北サハリン在来犬や韓国在来犬(珍島犬、済州島犬)など東北アジア在来犬などど近い関係にあることを示している。2.サプサリは古くから韓国にいた在来種であるが、1992年に韓国政府により天然記念物に指定された。中型長毛で、長い毛が顔面を覆っている。青色と黄色(赤色)の2つの毛色がある。この40頭について血液タンパク質の多型を調べたところ、血球血球ヘモグロビンA(Hb^A)の頻度が0.538、血球ガングリオシドモノオキシゲナーゼg(Gmo^g)の頻度は0.452、血漿プントランスフェリンA(Ptf^A)の頻度は0.842、血球エステラーゼ2^F(Es-2^F)の頻度は0.430と著しく高く、東北アジアの犬の特色を持っていた。主成分分析の結果、サプサリは珍島犬、済州島犬と近いことが分った。3.モンゴルに生息するオオカミ11頭の血液を採取してその型を調べたところ、血球ヘモグロビンA(Hb^A)の頻度が0.818、血球ガングリオシドモノオキシゲナーゼg(Gmo^g)の頻度は0.262、血球エステラーゼ2^F(Es-2^F)の頻度は0.853といずれもかなり高かった。すでに調べたヨッロッパオオカミやインドオオカミでは、血球ヘモグロビンA(Hb^A)と血球ガングリオシドモノオキシゲナーゼg(Gmo^g)の遺伝子は全く見いだされておらず、Hb^FとGmo^gに固定されている。これらのことから、東北アジアのイヌに見いだされるHb^AおよびGmo^g遺伝子は中国など周辺の地域のオオカミに由来するものであり、東北アジアのイヌの成立過程でこのオオカミから遺伝子の流入があったと推定された。
嗅覚の神経回路形成の分子機構

大気中の匂い分子は嗅細胞の発現する匂い受容体により認識される。マウスでは約1000種の匂い受容体の遺伝子が存在するが、個々の嗅細胞はこのなかから1種類をのみを選んで発現する事が知られている。同じ匂い受容体を発現する嗅細胞は嗅上皮上では散在しているが、その軸索は収束して同一の糸球体へと投射する。結果として、嗅球表面には匂い受容体の種類によって特徴づけられる糸球体の地図ができあがる。嗅神経の投射において、匂い受容体自身が非常に重要な働きをすることがわかっている。たとえば、ある匂い受容体遺伝子座に別の受容体を組み替えてやると、その遺伝子を発現した軸索は、元々の受容体とも新しく獲得した受容体とも異なる第3の糸球体に収束すると報告されている。嗅神経投射において、嗅細胞の神経活動が関与するか否かについては大きな論争がある。そこで、Hebb型学習則に基づく活動依存的神経回路モデルを用いて嗅神経投射のシミュレーションを行い、現在までに示されている実験データをどこまで説明できるか検討した。一般的に軸索投射は大まかには活動非依存的にガイドされ、活動依存的に最終的な調整が行われると考えられている。本研究ではその考えを基に、活動依存的な嗅神経相互作用が働く範囲を48 x 48の格子内に限定し、その中で16種類の匂い受容体を発現する嗅細胞の軸索が相互作用する様子を、Tanakaの自己組織化モデルを用いてシミュレートした。その結果、仮想匂い分子の刺激により、同じ受容体を発現する嗅細胞が糸球体様構造に収束することが示された。さらに、匂い受容体欠損マウスにおける嗅神経投射のパターンや、トランスジェニックマウス等で遺伝子改変した匂い受容体遺伝子アレルを発現する軸索の分離など、多くの実験結果をこのモデルによりうまく再現することができた。マウス嗅球からの軸索は、終脳外側の狭い領域を尾側に伸長し、嗅索と呼ばれる軸索の束を形成する。我々の作製したモノクローナル抗体lot1が認識する神経細胞(lot細胞)は、嗅球から軸索が伸長し始めるより前から、将来この軸索が伸長することになる経路にわたって細胞の帯を作って配列し、嗅球軸索をこの経路へとガイドする。したがってlot細胞が終脳における嗅索の位置を決定していると考えられるが、なぜこの細胞が予定嗅索領域に配列するのかについては謎であった。そこで本年度は、様々な培養法を用いてlot細胞が終脳のどこで発生し、どのようにして嗅索領域に局在するようになるのかを解析した。lot細胞が最終分裂を行っているE10.5の終脳を様々な領域に分割して分散細胞培養し、lot細胞が終脳のどの領域から分化してくるのかを検討した。この時期の終脳は、遺伝子発現の様式の違いから、背側の新皮質と腹側の神経節隆起との2つの区画に分けることができる。lot細胞はそのうち新皮質の細胞を培養したときにのみ分化し、神経節隆起を培養しても分化してこなかった。また終脳新皮質の中では、どこの部位からもまんべんなく分化してきた。実際の生体内でlot細胞が新皮質全体で発生してくるとすれば、これらの細胞はかなりの距離にわたって終脳半球を腹側方向に移動しなければならない。しかしこれまでにこのような細胞移動の報告はない。そこで、マウス全胚培養法を用いて、この時期の終脳における細胞移動を解析した。その結果、実際に終脳新皮質全体で生まれた細胞が腹側方向に移動し、予定嗅索領域に配列する事が確かめられた。以上の結果を総合すると、生体内でlot細胞は終脳新皮質全体で発生し予定嗅索領域まで移動するという興味深い発生過程をたどると考えられる。発生時、神経の軸索は、その先端にある成長円錐で周囲の環境を探りながら、適切な方向へと伸長する。軸索伸長の分子機構を探る目的で、マウス嗅球軸索の培養下での伸長に影響を与えるモノクローナル抗体の作成を試みた。その結果、この軸索伸長を強力に阻害するモノクローナル抗体H1-1B4を単離した。この抗体は、成長円錐の先端の膜蛋白質に結合する。伸長中の軸索にH1-1B4抗体を添加すると、すみやかに成長円錐の前進が停止した。この時興味深いことに、成長円錐の形態は保たれ、成長円錐上にある糸状突起の運動性も維持されていた。この点はこれまでに解析が行われた軸索反発因子の活性とは明らかに異なる。H1-1B4抗体の認識する抗原遺伝子をクローニングしたところ、35kダルトンの4回膜貫通蛋白質M6aをコードしていた。M6aたんぱく質を培養株細胞に強制発現すると、細長い突起が多数形成され、この突起上にM6aたんぱく質が濃縮するのが観察された。この突起には、actin線維や微少管などの細胞骨格はほとんど検出できなかった。M6aを強制発現した株細胞を経時的に観察すると、生じる突起は、細胞が移動した後に足跡のようにのこる退縮線維であることが明らかとなった。現在のところ、この退縮線維形成の生理的意義については明らかではないが、H1-1B4抗体添加により退縮線維形成も阻害されることから、M6aたんぱく質の何らかの機能を反映した現象であると考えられる。これまで軸索伸長機構については、細胞骨格を中心として研究が進められており、細胞外と細胞骨格との接点である膜たんぱく質の役割についてはほとんどわかっていない。M6aはこのような位置で軸索伸長を制御する分子として期待できる。

嗅球の軸索は、終脳の外側を伸長して嗅索を形成する。この嗅索の軸索のうち一部のみを染色することから、モノクローナル抗体H1-2c7が当研究室で単離された。発生ステージにより染色パターンには若干の違いはあるが、常に嗅索中の腹側表層に位置する一群の軸索に染色が認められる。この染色パターンの意味を知るために、H1-2c7抗体の認識する抗原分子を検索した。その結果、この抗体は膜型チロシンキナーゼレセプターc-kitを認識していることがわかった。嗅球内でのc-kitの発現をしらべたところ、脳室帯と僧帽細胞層の間の中間帯に分布する細胞体に強い発現が認められた。この位置に存在する細胞としては二種類の可能性が考えられる。一つは分裂を終えたばかりの僧帽・房飾細胞で、もう一つは発生途中の顆粒細胞である。ブロモデオキシウリジンを用いた細胞トレース実験から、c-kitを発現するのは分化直後の僧帽・房飾細胞であることがわかった。これらの細胞は、脳室帯から表層に向かって放射状に移動する際に、一過的にc-kit蛋白質を発現していると考えられた。これらの結果を総合すると以下のシナリオが考えられる。1)嗅球の僧帽・房飾細胞は、最終分裂直後に一過的にc-kitという共通の蛋白質を発現する。2)これらの同時期に分化した投射神経細胞の軸索は、嗅索の中の特定の位置を束になって伸長する。3)発生が進むと、先程の投射神経におけるc-kitの発現は停止し、また新たに分化した僧帽・房飾細胞でc-kitの発現が起こり、その軸索が嗅索内の特定の領域を伸長する。これまでの研究で、嗅球における僧帽・房飾細胞体の位置と嗅索内の軸索配置との間にはトポグラフィックな対応関係はないとされてきた。本研究は、その結果を追証すると共に、嗅索内の軸索には発生ステージの違いに応じた組織化が存在することを示した。近年の研究で、嗅覚一次中枢である嗅球の表面には、高度に選別された匂い情報が定型的な地図として表現されていることがわかってきた。この地図が、その後どのような形で中枢へと受け渡されていくのかが次の興味深い問題であるが、これ以降の軸索投射の規則性については全くわかっていない。嗅球の投射神経細胞は複数の嗅皮質領域に投射するが、軸索標識等の実験からは、これらの間の結合に秩序を見いだすことはできない。それどころか、嗅球の軸索の伸張経路である嗅索内において、すでに軸索は不規則に入り混じり、トポグラフィックな位置関係は失われると考えられている。我々は、嗅索を走行する軸索の一部を染色するモノクローナル抗体H2C7を単離した。発生ステージにより染色パターンに若干の違いはあるが、常に嗅索中の腹側表層に位置する一群の軸索に染色が認められる。この染色パターンの意味を知るために、H2C7抗体の認識する抗原分子を探索したころ、膜型チロシンキナーゼレセプターc-kitが抗原であることが明らかとなった。c-kitは、嗅球内では中間帯に分布する細胞で強く発現されていた。ブロモデオキシウリジンを用いた細胞トレース実験から、分裂を終えた僧帽・房飾細胞が、中間帯を放射状に移動する際に一過的にc-kitを発現し、その後その発現を停止することが示された。すなわち、同時期に誕生した嗅球の僧帽・房飾細胞は、その細胞体の空間的配置にかかわらず、軸索を嗅索の中で収束させて伸長すると考えられた。
プロテオーム解析と原子間力測定に基づいたMBRにおける膜ファウリングの制御

本研究では、実都市下水を処理するMBRにおいて膜ファウリングに関与しているタンパク質の詳細な構造解析を試みた。閉塞膜より抽出した試料の前処理方法を検討し、二次元電気泳動によるファウリングタンパク質の分離に成功した。分子量と等電点に基づき分離したファウリングタンパク質のアミノ酸配列解析により、Pseudomonas属に属する細菌の外膜タンパク質がMBRにおける膜ファウリングに深く関与していることが示された。次世代の下水処理技術として膜分離活性汚泥法(Membrane Rioreactor, MBR)がこれまでも注目を集めてきたが、膜ファウリングに伴う高コストが阻害要因となってMBRは普及していない。MBRにおける膜ファウリングはタンパク質等の細胞外代謝産物により引き起こされるというのが通説となっているが、既往の研究のほとんど全てが代謝産物の量を包括的に把握することにより膜ファウリングの発生を考察するものにとどまっている。この結果として、「どのような」有機物がMBRにおける膜ファウリングを引き起こしているのか、という点に関して現時点における情報および知見が決定的に乏しく、効果的な膜ファウリングの抑制を実行するのにはほど遠い状況となっている。本研究では生化学分野において確立された技術であるプロテオーム解析およびナノテクノロジー分野において注目を集めている原子間力測定を導入して、膜ファウリングの原因となる物質に関する情報を飛躍的に充実させることを目的とするものである。21年度において、パイロットスケールMBR槽内より採取した有機物および閉塞膜からアルカリ抽出しだ有機物を対象としてプロテオーム解析の第一段階として必要となるSDS-PAGEの適用を検討した。SDS-PAGE分析にあたり、生化学分野で一般的に用いられている手法の適用ではスメアなバンドが出ることを確認し、限外ろ過による精製とエタノールを用いた分別沈殿がSDS-PAGEの適用にあたり有効であることを見いだした。また、膜ファウリングを引き起こす糖および糖タンパク質に関する情報を得るため、レクチンアフィニティークロマトグラフィーの適用可能性を検討した。MBR槽内中に存在する糖類を分画し、ファウリングポテンシャルの高い糖類画分があることを確認した。これらの結果は、MBRにおいて膜ファウリングを引き起こす特定の有機成分を決定するために有用な知見を含むものである。MBRをより広範に普及させるためには膜ファウリングの抑制が重要である。膜ファウリングを抑制するためには、膜ファウリング発生機構を正確に理解することが不可欠であるが、そのためには膜ファウリングを引き起こしている物質(膜ファウリング物質)の特性を把握することが重要である。既往の研究において、タンパク質がMBRにおける主要な膜ファウリング物質であることが報告されている。しかし、現段階においては具体的にどのようなタンパク質がMBRにおける膜ファウリングの発生に大きく寄与しているのかは明らかになっていない。2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(2D-PAGE)はタンパク質の分離・分析に非常に有用な手法である。2D-PAGEにおいては、試料に含まれるタンパク質は各々のタンパク質の分子量と等電点に基づいて分離される。本手法を用いて活性汚泥懸濁液中に含まれるタンパク質及び膜ファウリングの発生に寄与しているタンパク質を解析することによってどのようなタンパク質が膜ファウリングの発生に大きく寄与していたのかを検討することが可能である。本年度は、実都市下水を処理するパイロットスケールMBRの連続運転を行い、運転期間中に採取した汚泥中有機物と運転終了時に閉塞膜より抽出した膜ファウリング物質の2D-PAGE分析を実施し、膜ファウリングに大きく寄与しているタンパク質の性質について検討を行った。SRTの異なる2種類のMBRについてファウリングに関与するタンパク質性質の検討を行った結果、膜ファウリング物質中において存在割合が大きいタンパク質の性質は異なることが明らかになった。また、本年度の結果により、2D-PAGEを用いて膜ファウリングに関与するタンパク質の分離が可能になった。膜の閉塞(膜ファウリング)は膜分離活性汚泥法(MBR)における最大の問題であり、膜ファウリングの原因物質(膜ファウリング物質)の特性を含めた膜ファウリング発生機構の解明が待望されている。タンパク質はMBRにおける主要な膜ファウリング物質であるため、膜ファウリングを引き起こしているタンパク質の性質や機能を明らかにすることができれば膜ファウリング発生機構に対する理解を大幅に深めることが可能となる。本年度は、実都市下水を処理するパイロットスケールMBRにおける膜ファウリング物質に対し、2D-PAGEとN末端アミノ酸配列解析から構成されるメタプロテオーム解析を適用し、MBRにおいて膜ファウリングを引き起こしているタンパク質の性質/機能解析を行うことを試みた。本年度行った検討では、運転条件の異なる2系列のMBRから、合計32種類のタンパク質を分析したが、そのうち3種類のタンパク質を同定することに成功した。タンパク質の分離に2D-PAGEを適用したことによって、タンパク質の分離能が飛躍的に向上し、より多くのタンパク質についてN末端アミノ酸配列解析が実施できるようになった。膜ファウリングを引き起こすタンパク質の構造決定を行ったのは、おそらく本研究が世界で初めての例である。今回同定に成功したタンパク質は、OprFとOprDであった。

いずれもPseudomonas属の外膜タンパク質であり、非常に分解されにくいことが知られている。これらのタンパク質はMBR汚泥懸濁液中に分解を受けないままに比較的サイズの大きい粒子として残存し、膜細孔の閉塞を引き起こしていたと考えられる。
多谷エネルギー地形モデルによるタンパク質の構造変化機構のシミュレーション研究

自ら開発した、タンパク質の構造変化を記述するMultiple-basin modelとリガンドの効果を取り入れるImplicit ligand modelをF_1-ATPaseに適用をした。F_1-ATPaseは、リングサブユニットにある3つの触媒部位でATPを加水分解して、それによって得られた自由エネルギーから回転子γ-サブユニットの回転運動を生み出している。どのようなメカニズムで、化学エネルギーから力学エネルギーに変換されているのか、最近の実験またはシミュレーションにより明らかになりつつある。特にγ-サブユニットの働きに注目をすると、γ-dictator mechanismという考え方がある。これは、γの回転角度によって、各触媒部位のヌクレオチド状態が制御されているという考え方である。この考えを検証するために、まず、γの回転角とADP解離の間のallosteryについてシミュレーションを行った結果、γを正方向に回してやることでADPサイトがopen構造へ構造変化する速度が速くなることを示し、γとADP siteのβの間の相互作用が重要であることを示した。また、80回転を生み出すATP結合、ADP解離の間のallosteryについても解析をして、2つのプロセスのタイトなカップリングにγ-サブユニットの存在が必要不可欠であることを示し、また、γサブユニットの軸を削っていったときの回転への影響に関する実験結果(Furuike et al.Science 319:955(2008))を定性的に再現することができた。これらの結果はともに、γ-dictator mechanismを示唆している。自ら開発したタンパク質の構造変化を記述するMultiple-basin modelを拡張し、リガンドの効果を取り入れたモデルを開発して、タンパク質の構造変化とリガンド結合の共役の仕方を解析した。その結果、相互作用の強さと相互作用距離のパラメーターに応じて共役の仕方が変わることが分かった。つまり、相互作用が強くなるにつれpopulation-shiftからinduced-fitに共役の仕方が変わり、相互作用距離も長くなるにつれbopulation-shiftからinduced-fitに共役の仕方が変わる。この結果から、実際に実験的にpopulation-shiftと示されているタンパク質・リガンド相互作用が接触面が小さく主に疎水性相互作用などの短距離力が主体であるのに対して、induced-fitと示されているものが接触面が大きく主に静電相互作用などの長距離力が主体であるということを見出した。このようなタンパク質の構造変化とリガンド結合をうまく記述する粗視化モデルは、他に例のない独自性の高いものであり、特に大規模な系のシミュレーションを行う場合に有効である。さらにこのモデルを回転分子モーターF1-ATPaseに適用をした。この揚合、回転子であるγサブユニットの回転によってリングサブユニットの3つのヌクレオチド結合サイトの構造変化が起こりヌクレオチド状態が変化することで、うまく回転運動が起こると言われている。このようなγサブユニットの回転が引き起こすアロステリック効果に注目をした。具体的には、γサブユニットを任意の角度に拘束してADP結合サブユニットの構造変化を観察した。その結果、ADP阻害構造からγサブユニットを回転させるほどADP結合サブユニットがopen構造に構造変化してADPが外れやすくなることが分かった。
共振を利用したナノ・マイクロ機構の操作及び微小エネルギーの収集機構の開発

本研究課題は,電界,磁界を用いてこれまでに確立されてきた電気機器の動作原理を非電磁的作用力を用いたナノ・マイクロ領域のアクチュエータに適用することを試みたものである.マイクロ機構の操作とエネルギー収集だけでなく,エネルギーを振動モードの切り替えにより一方向に伝搬する機構,すなわちラチェット機構の開発に繋げられることを明らかにし,演算機能を有する機械共振メモリの開発の可能性を明らかにした.本研究課題は,電界,磁界を用いてこれまでに確立されてきた電気機器の動作原理を非電磁的作用力を用いたナノ・マイクロ領域のアクチュエータに適用することを試みたものである.マイクロ機構の操作とエネルギー収集だけでなく,エネルギーを振動モードの切り替えにより一方向に伝搬する機構,すなわちラチェット機構の開発に繋げられることを明らかにし,演算機能を有する機械共振メモリの開発の可能性を明らかにした.近年,ナノ,マイクロスケールの物理化学に関連する基礎研究が進み,ナノファブリケーションが工学の基本的な,横断的技術として重要になりつつある.このようなナノ,マイクロスケールの微粒子・構造の操作技術は,原子・分子配列を操作するメモリーに関する基本操作としても重要視されている.上述したナノ・マイクロ環境において,主たる力は分子,原子間の作用力である.これらの力を介したナノ,マイクロ微粒子・構造の操作および搬送機構を開発する本申請の目的に従い,平成21年度は,理論的にカンチレバーによる原子・分子の機械的パラメトリック共振による操作の可能性を検討し,国際共同研究を実施した.その成果は時宜を得た研究と評価され,Physical ReviewLettersに採択された.この理論的検討に基づき,原子間力顕微鏡のプローブ系により,原子・分子との機械的共振を実現するための構造等を検討したが,機械振動だけでは任意の周波数で実現することが難しいとの知見を得た.一方で,電場や磁場励振を利用したプローブ系を検討し,プローブの制御系の検討をすすめ,理論的にはArnoldの舌状の共振領域が存在することをエネルギーの閾値から確認し,実験的に原子・分子操作の作用を実現できる可能性を検討した.逆に,共振によりエネルギーを収集する系の構造をマクロな実験系を組み,平成22年度以降に実験を行う準備を行った.近年,ナノ,マイクロスケールの物理化学に関連する基礎研究が進み,ナノファブリケーションが工学の基本的な,横断的技術として重要になりつつある.本申請の目的に従い,平成22年度は,平成21年度に実施したカンチレバーによる微小粒子の機械的パラメトリック共振による操作の可能性の結果を踏まえ,MEMS共振器の振動モードの検証とその共振切り替え制御の検討,及びマクロなパラメトリック振子をもしいた振動からエネルギーを回収する機構のメカニズムについて実験的検討を行った.その結果,非線形MEMS共振器において特異なヒステリシス特性存在し,広い解の共存領域を持つデバイスの製作が可能である事を示した.これを受けて,共存する共振解が制御入力により切り替え可能である事を数値的に示し,メモリー等への機械共振機構の利用が可能であることを示すと共に,構造に適した制御法の検討を行った.一方エネルギー回収機構に関しては,マクロな系において,上記切り替えと同じ時間遅れフィードバックによりパラメトリック振動子の共振モードの切り替えを実現し,より大きなエネルギーの回収が可能なモードを励振することが可能である事を示した.これらにより,非線形振動子に共存する解の切り替えによりエネルギー回収を実現する機構の開発への手がかりを得た近年,ナノ・マイクロスケールの物理化学に関連する基礎研究が進み,ナノファブリケーションが,工学の基本的な横断的技術として重要になりつつある.本申請の目的に従い,平成23年度は,平成2122年度に実施した,カンチレバーによる微小粒子の,機械的パラメトリック共振による操作の可能性の結果,MEMS共振器の振動モードの検証と,その共振切り替え制御の検討,及びマクロなパラメトリック振子を用いた,振動からエネルギーを回収する機構のメカニズムに基づき,MEMSにおけるラチェット機構の開発が,これらの研究成果を適用した新しい機構の開発につながるとの結論に至った.そのため,ラチェット機構を結合MEMS共振器で実現すると同時に,局在モードの切り替えを実現する制御法,およびその実現に関して数値的および実験的に検討を進めた.その結果,平成22年度に製作した,ヒステリシス特性を有する非線形MEMS共振器を用いて,MEMS共振メモリの開発に着手した.MEMS共振メモリは,その振動モードを保存状態とするメモリである.本研究では,特にその読み出し,書き込みの実現が,本研究課題がこれまでに達成してきた成果の適用により可能となることを明らかにし,その可能性を数値的および実験的に示した.MEMSメモリの状態測定系は,従来工学測定が主として用いられ来たが,メモリ状態への作用が生じるなどの問題があることから,MEMS共振器の対称構造を考慮した駆動系による差動,セルフセンシングが適することを示した.また,平成22年度に提案した制御手法に,変位測定の結果を適用し,メモリの状態書き換えが可能であることを初めて示した.こられの結果により,本申請課題が目指すマイクロ機構の操作とエネルギー収集だけでなく,エネルギーを振動モードの切り替えにより一方向に伝搬する機構,すなわちラチェット機構の開発に繋げられることが明らかとなった.さらにその振動を利用することにより,ナノ・マイクロ機構のアクチュエータ開発にもつながる成果を得ることができた.
IL-1受容体アンタゴニスト欠損マウスを使用した血管炎の発病メカニズムの解析

IL-1には、IL-1α、IL-1β及びIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1RN)の3つのリガンドが存在し、このうち、IL-1RNはIL-1受容体に結合しても生理活性を誘導せず、IL-1αとIL-1βの生理作用を阻害する分子と考えられている。したがって、IL-1RN遺伝子欠損マウスでは、IL-1αとIL-1βの生理作用が阻害できないため、自己免疫性大動脈炎を自然発症する。このIL-1RN遺伝子欠損マウスの自己免疫性大動脈炎の発症はIL-17やTNFといった3型免疫応答に依存していることが知られている。大動脈炎を発症したIL-1RN遺伝子欠損マウスの大動脈において、IL-17ファミリーサイトカインであるIL-25の発現が亢進していることが明らかになった。IL-25は2型免疫応答を促進するサイトカインで、その2型免疫応答の活性化を介して3型免疫応答を抑制する作用も持つ。したがって、3型免疫応答依存的なIL-1RN遺伝子欠損マウスの大動脈の発症において、IL-25は抑制的な作用を持つことが期待された。そこで、3型免疫応答依存的なIL-1RN遺伝子欠損マウスの大動脈の発症におけるIL-25の関与と役割を明確にするために、IL-1RN遺伝子欠損マウスにIL-25欠損マウスを交配し、IL-25・IL-1RN遺伝子欠損マウスを作成した。IL-25・IL-1RN遺伝子欠損マウスでは、IL-1RN遺伝子欠損マウスと比較して、大動脈炎の発症率が低下し、症状も軽減していることが明らかになった。IL-25はマウスの多発性硬化症モデルのような3型免疫応答依存的な自己免疫疾患を抑制することが知られているが、3型免疫応答依存的なIL-1RN遺伝子欠損マウスの大動脈の発症においては抑制的な作用を持つことが明らかになった。指定難病である血管炎症候群は重篤な難治性自己免疫疾患であり、病態機序の解明は未だ十分でない。血管炎へのIL-25とIL-33の関与を究明するため、自然発症血管炎モデルマウスであるIL-1Ra遺伝子欠損マウスを用いて、IL-25遺伝子欠損マウスとIL-33遺伝子欠損マウスの各々と交配し、二重欠損マウスを作成した。それぞれのマウスの大動脈基部の組織標本を作成し、H&E染色とEVG染色を行い、血管炎の発症率を評価した。12週齢のIL-1Ra遺伝子欠損マウスでは28.5% (8/28)であるのに対して、IL-1Ra IL-25遺伝子欠損マウスでは0% (0/18, p=0.01)と減少を認めた。一方、IL-1Ra IL-33遺伝子欠損マウスでは37.5% (6/16, p=0.54)と有意差を認めなかったが、うっ血性心不全や突然死の頻度が2群に比較して高かった。心不全発症マウスの病理組織像は、弁への炎症細胞浸潤による狭窄と両心肥大を認めた。これらの結果から、IL-25欠損は血管炎の発症に抑制的に作用し、IL-33欠損は血管炎の発症には影響しないが、弁組織の炎症増悪に関わっていることが示唆された。次に、本疾患モデルにおける、IL-25とIL-33の産生細胞を同定するため、免疫組織染色でIL-25およびIL-33発現細胞を同定した。IL-25は、大動脈血管内皮細胞とリンパ球で発現し、IL-33は炎症部位で著明に増殖した線維芽細胞核内で発現を認めた。また、GFP-IL-1Ra遺伝子欠損マウスを用いて、蛍光免疫染色でIL-1Ra発現部位が大動脈血管内皮細胞であることが分かった。IL-25発現細胞において、血管内皮細胞と炎症細胞のどちらが関わっているかを確認するため、IL-1Ra遺伝子欠損マウスとIL-1Ra IL-25遺伝子欠損マウスの間で、骨髄移植実験を行った。遺伝子欠損マウスの作成と交配・繁殖に時間を要したが、実験必要数確保することができた。また、血管炎発症率の評価のため、大動脈病理組織作成と特殊染色・免疫染色・蛍光免疫染色結果が安定して得られた。血管炎へのIL-25とIL-33の関与を究明するため、自然発症血管炎モデルマウスであるIL-1Ra遺伝子欠損マウス(Il1rn-/-)を用いて、IL-25遺伝子欠損マウス(Il25-/-)とIL-33遺伝子欠損マウス(Il33-/-)の各々と交配し、二重欠損マウスを作成した。12週齢のIl1rn-/-マウスでは40.6% (26/64)であるのに対して、Il1rn-/-Il25--マウスでは6.9% (2/29, p=0.001)と減少を認めた。一方、Il1rn-/-Il33-/-マウスでは47.1% (16/34, p=0.57)と有意差を認めなかった。尚、16週齢では両群とも有意差を認めなかった。