hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光イメージングと光操作を駆使したがん転移におけるＥＭＴとＭＥＴの時空間解析

27年度が最終年度であるため、記入しない。近年、EMTおよびMETががん転移に重要な現象であることが明らかにされてきたが、そのほとんどがin vitroでの解析であり、in vivoで実際にEMT・METが起きていることは未だに証明されていない。本研究では、in vivoでがん転移におけるEMT・METをイメージングによってリアルタイムで可視化することで原発巣からがん細胞が転移していく様子や、全身循環に乗って移動するがん細胞、また遠隔臓器で転移巣を形成する瞬間を捉え、がん転移におけるEMT・METの分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。EMT・METに対するプローブには光を用いたオプトジェネティクス技術を利用し、光照射によってEMTを誘導し、さらには上皮細胞と間葉系細胞を可視化するためのコンストラクトを考案した。まず初めにMelanopsinとNFATプロモーターを利用した遺伝子発現誘導システム(Ye et al,. 2011,. Science)の利用を試みたが、光照射によって遺伝子発現誘導がほとんど起こらなかった。そこでGAVPOおよびUASGを利用した他の遺伝子発現誘導システム(Wang et al,. 2013,. Nature Methods)を利用したところ非常に高いSignal/Noise ratioで遺伝子発現誘導を確認することができた。また上皮細胞に対する蛍光プローブとしてE-cadherinプロモーター制御下で蛍光タンパク質を発現するコンストラクト、光照射によってEMTを誘導するプローブの作製を終えている。光照射による遺伝子発現誘導システムを確立したこと、また上皮マーカーであるE-cadherinプロモーター制御下で蛍光タンパク質を発現するコンストラクト、光照射によってEMT誘導因子を発現するコンストラクトの作製を終えているため。本研究計画は最終的にin vivoでの実験を想定しているため、プローブの確認にはEMTの誘導に汎用されている非転移性のNMuMG細胞を使用するだけではなく、EMT誘導因子の発現によって転移能を獲得するがん細胞株で確認を行い、使用する細胞株のスクリーニングを行う。
プラズマCVDダイヤモンドのp型表面伝導層の発現機構の解明

現有の超小型高分解能RBS装置に付設して、高分解能反跳粒子検出法が可能な磁場型のエネルギー分析器を設計・製作した。その際に、いわゆるkinematic broadeningにより深さ分解能が低下することを避けるため、静電型の4重極レンズを分析器と試料の間に設置した。また、水素を測定する1次元位置検出器用に、パーソナルコンピューターと高速のADCボードを組み合わせた、新たな2次元データ収集システムを開発した。これを用いることにより、ノイズの低減と水素検出感度の向上に成功した。500keVの炭素イオンをプローブイオンに使用して、この高分解能反跳粒子検出装置の性能を評価したところ、4重極レンズを働かせることにより深さ分解能0.2nmで水素分布の測定が可能であった。また、静電型の偏向器によって散乱炭素イオンを除去することにより、0.5at%以下の水素を検出することができることを示せた。さらに、CVDダイヤモンドの表面伝導層に対する熱処理の影響を検討して表面伝導層の発現機構を探るため、高分解能ERD装置内で熱処理と、電気伝導の測定が可能になるように装置の改良も行った。開発した装置を用いて、CVDダイヤモンドの水素分布を測定したところ、ほとんどの水素は表面に存在するものの、一部の水素は表面下0.51nmの領域にも存在することが分かった。この水素分布が、ホウ素のドーピングの有無や400°Cの熱処理、酸化後の水素プラズマによる再水素化、などによりどのように変化するかを調べた。その結果、ホウ素のドーピングによる影響はほとんどなく、400°Cのアニールによっても水素分布はほとんど変化しなかった。また、酸化による水素除去後の水素プラズマによる再水素化で、水素の分布はほとんど元通りに回復することが分かった。さらに、散乱したプローブイオンを反跳水素イオンから分離するために、分析器と検出器の間に静電型の偏向器を設置した。500keVの炭素イオンをプローブイオンに使用して、この高分解能反跳粒子検出装置の性能を詳価したところ、4重極レンズを働かせることにより深さ分解能0.2nmで水素分布の測定が可能であった。昨年度完成させた、高分解能反跳粒子検出装置(高分解能ERD装置)では、マイクロチャンネルプレートと抵抗電極を組み合わせた1次元位置検出器を使用している。この1次元位置検出器は、検出位置によって増幅率やノイズレベルに違いがある事が知られている。通常使用される、PSDアナライザーとマルチチャンネルアナライザーを用いた1次元データ収集システムでは、ノイズをカットするために設定する信号レベルを検出位置ごとに設定できないため、ノイズの低減を効率よく行うことができず、水素の検出感度を向上させることが困難であった。

この困難を避けるためには、検出位置ごとにノイズレベルの設定を変えることが可能なデータ収集システムの構築が必要である。この目的のため、パーソナルコンピューターと高速のADCボードを組み合わせた、新たな2次元データ収集システムを開発した。これを用いることにより、ノイズの低減と水素検出感度の向上に成功した。これと平行してCVDダイヤモンドの表面伝導層に対する熱処理の影響を検討して表面伝導層の発現機構を探るため、高分解能ERD装置内で熱処理と、電気伝導の測定が可能になるように装置の改良を行った。また、入手できるダイヤモンド基盤結晶の大きさが3mm×3mmと小さいため、その場測定のためには、高分解能ERD法と干渉しないようにCVDダイヤモンドの表面に電極を形成することが必要である。このような電極をダイヤモンド表面の技術の開発を行い、ERDと電気伝導計測のその場測定が可能であることを示した。
高次元複素力学系と非アルキメデス的力学系の無理的中立周期系の解析的研究

複素力学系の退化と分岐およびリヤプノフ指数関数の連続拡張性問題に関する研究を通じて無理的中立周期系の定量的理解が順調に進展しているため。平成30年度に得られた結果を基にして、引き続き複素力学系の研究者のみならず、国内およびフランス、英国、アメリカ、イタリア、フィンランド等国外の代数的整数論、数論幾何、ネヴァンリンナ理論、多重複素ポテンシャル論、非アルキメデス的解析関数論等の研究者と交流しながら、複素力学系の無理的中立周期系の解析的線型化問題を最良の形で解決することを最大の目的として研究を推進する。複素および非アルキメデス的力学系の無理的中立周期系の等分布現象の定量化を通じた理解が順調に進展しているため。非アルキメデス的力学系の重み付きMahler和の評価を通じて無理的中立周期系の定量的理解が順調に進展しているため。算術力学系および複素力学系における二三の等分布現象の確立を通じて無理的中立周期系の定量的理解が順調に進展しているため。平成27年度に得られた結果を基にして、引き続き複素力学系の研究者のみならず、国内外のネヴァンリンナ理論、数論幾何、非線型ポテンシャル論、リーマン幾何、複素多様体論、多変数函数論などの研究者と交流しながら、複素力学系の無理的中立周期系の解析的線型化問題を最良の形で解決することを最大の目的として研究を推進する。平成28年度に得られた結果を基にして、引き続き複素力学系の研究者のみならず、国内外の代数的整数論、解析数論、数論幾何、ネヴァンリンナ理論、非線型ポテンシャル論、複素多様体論、多変数函数論などの研究者と交流しながら、複素力学系の無理的中立周期系の解析的線型化問題を最良の形で解決することを最大の目的として研究を推進する。平成29年度に得られた結果を基にして、引き続き複素力学系の研究者のみならず、国内およびフランス、英国、アメリカ等国外の代数的整数論、数論幾何、ネヴァンリンナ理論、非線型ポテンシャル論、多重複素ポテンシャル論等の研究者と交流しながら、複素力学系の無理的中立周期系の解析的線型化問題を最良の形で解決することを最大の目的として研究を推進する。平成28年度前期にAmiens大学において複素および非アルキメデス的力学系のパラメーター空間の定量的研究に関する研究打ち合わせを行う必要が生じた為。平成29年度にRennes大学において代数力学系の族およびモヂュライ空間の定量的研究に関する研究打合わせを行う必要が生じた為。複素力学系の有理型退化族に付随するLyapunov指数関数の漸近挙動と非アルキメデス的力学系に関するLaura DeMarco教授との共同研究を継続しており研究打ち合わせのため2019年度にNorthwestern Universityに海外渡航するために使用する。平成28年度前期にAmiens大学において複素および非アルキメデス的力学系のパラメーター空間の定量的研究に関する研究打ち合わせを行うために使用する。平成29年度にRennes大学において代数力学系の族およびモヂュライ空間の定量的研究に関する研究打合わせを行うために使用する。
多電子機能触媒を目指した精密金属集積超分子の創製

我々は、幾何学的に密度勾配を持つ樹状構造体には分子内電子密度勾配が存在すると予想し、金属集積部位としてアゾメチン(イミン)を有する樹状のπ共役高分子に着目、世界で初めて、金属の位置と個数を精密にしかも自在に制御した有機/金属ハイブリッド化に成功した。本研究では、この精密金属集積機能をもつ新物質の特異的な段階的放射状錯形成を確定するため、TEMによる直接観察、化学的還元の2種の手法により明らかにした。さらに電子勾配を利用し部位特異的に機能分子を導入することに成功した。電子勾配の存在を確定するため、コア構造をフェニル基から機能分子へ拡張した球状高分子、および、球状分子の枝の部分のデンドロンの錯形成挙動を観測した。具体的には、ホール輸送能を持つトリチエニルフェニルアミンおよび生体機能触媒分子として知られるポルフィリンをコアにもつ新規第4世代フェニルアゾメチンデンドリマーを合成した。さらに、アニリンでキャップしたデンドロンを合成した。いずれの物質においても、塩化スズを加えると4段階の等吸収点のシフトが観測された。1bでは3→6→12→2.4当量、1cでは4→8→16→32当量、1dでは1→2→4→8当量、それぞれ金属イオンを添加したときに等吸収点のシフトが生起した。いずれの物質においても、内側の世代より段階的に金属が精密に集積されていることを明らかに出来た。金属と有機物の機能を相乗的に増幅できる有機/金属ハイブリッド分子は、次世代のエレクトロニクス分野を担う新しいナノ材料として期待されている。近年のナノサイエンス・テクノロジーの進歩に伴って、有機材料中での金属の位置と個数を精密かつ自在に制御することが強く望まれているがいまだ実現されていない。初年度確立した精密金属集積挙動の観測方法(分光法、透過型電子顕微鏡観察、化学的還元法、^<13>C-NMR)を駆使して、新規樹状構造の精密金属集積を評価した。1bでは3→6→12→24当量、1cでは4→8→16→32当量、1dでは1→2→4→8当量、それぞれ金属イオンを添加したときに等吸収点のシフトが生起した。
2光子励起ケイジドグルタミン酸を用いたシナプス結合形態・機能の動態と可塑性の研究

これまで、ケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。本研究では、神経回路の調節という観点から、単一のシナプス形態を詳細に実時間観察し、2光子励起ケイジドグルタミン酸を用いて単一シナプスで可塑性を誘発し,シナプス形態がどのように長期的に安定するのか、その形態依存性を見出すことを目的とした。シナプス後部のスパイン形態について詳細に検討するため、培養海馬スライス標本にGFP遺伝子を導入して長期間にわたって形態観察を行うことを可能にした。その結果、通常の培養状態において、大きなスパインの多くは3日間以上、安定して存在し、加えて、殆ど形態の変化を起こさないものが多かった。一方、小さなスパインは数倍に及んで大きくなるものが半数近くあるが、より小さくなったり、消滅するものが多くあることがわかった。そして減った数にほぼ対応すように、新しく小さなスパインが生成していた。このことはグルタミン酸をスパインに頻回投与した場合のスパイン形態変化の形式とよく一致しており、スパイン形態変化の様式は、神経回路として機能している状態でも、その初期のスパイン形態に依存することがわかった。さらにこの様式は、神経活動を高める、または弱める作用をもつ薬理効果によって、変化することがわかってきた。しかし、回路の活動性に関わらず、大きなスパインは安定であり、その構造自体が安定である可能性が示唆された。我々は、ケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。本研究では、神経回路の調節という観点から、スパインとともに軸索終末の形態も詳細に実時間観察し、2光子励起ケイジドグルタミン酸を用いて単一シナプスで可塑性を誘発し,シナプス形態がどのように長期的に安定するのか、その形態依存性の法則を見出すこと、また可塑性として、長期増強のみならず、長期抑圧の現象においても、スパイン形態と機能の連関性を明らかにすることを目的とする。まずシナプス後部のスパイン形態について詳細に検討するため、培養海馬スライス標本にGFP遺伝子を導入して長期間にわたって形態観察を行うことを可能にした。さらに、GFP発現した錐体細胞のスパインに2光子励起法によるケイジドグルタミン酸の頻回刺激を行い、同時に形態変化を追跡した。その結果、反復刺激直後に、刺激したスパインおよび周辺スパインの頭部の肥大化が見られた。半数の例では、形態変化は可逆的で30分ほどで元に戻るが、残りの場合には刺激したスパインにほぼ限局した頭部の肥大が2時間以上持続することが見出された。この形態可塑性は、スパインの初期形態に依存し、スパイン頭部のやや小さいものに強い。スパイン頭部の肥大化はNMDA受容体阻害剤、カルモジュリン阻害剤、およびアクチン重合阻害剤によってほぼ完全に阻害された。シナプス前線維のデタヌス電気刺激によっても、一部のスパイン頭部に同様な形態変化が起こることから、この現象はシナプス可塑性に重要な役割を担っていることが示唆された。さらに穿孔パッチした錐体細胞において脱分極と2光子励起ケイジドグルタミン酸法を組み合わせることで、刺激スパインのみでAMPA受容体反応を増強させることに成功した。AMPA受容体反応が増強される場合、形態の増大も伴い、また頭部肥大が起こらない場合、AMPA受容体反応も増強されないことがわかった。この結果は、AMPA受容体の機能発現とスパイン形態が、可塑性の過程においても強く連関することを示している。さらに、このスパイン頭部の肥大は数日に及んで持続するものもあるが、現在解析をすすめている。また、刺激頻度を変化させたり、細胞外カルシウム濃度を変化させることで、スパインの矮小化、またはスパインの消失が見られている。より生理的条件に近づけるため、現在、ケイジドグルタミン酸によるスパインの刺激と、そのスパインを持つ細胞を電気刺激し細胞の脱分極を誘発することを、同時に行うことを試みている。
相模原地区における家族性パーキンソニズムの原因遺伝子の探索

相模原地区の常染色体優性遺伝様式をとる家族性パーキンソニズムの原因遺伝子同定を目指して研究を進めてきている.現在までにα-Synuclein,Parkin,Tau,UCH-L1について相模原家系では報告されている変異がないこと,およびこれら4遺伝子との連鎖の可能性について検討し,自験パーキンソニズム家系はこれらとは連鎖しないと推測された.現在,全常染色体について各染色体を約10cM間隔でカバーする382種のマイクロサテライトマーカーによりポジショナルクローニングを開始した.相模原家系患者12人,非/未発症者11人および配偶者3人の計26人の家系メンバーについて,microsatellite markerをそれぞれPCR増幅し,allele typingを行った.また,各marker alleleの健常群遺伝子頻度を非血縁健常者48人をtypingすることで求め,これらのmarker alleleをもとに2点連鎖解析programのMLINKによってLod scoreの計算を行った.その結果,3カ所で高いLod scoreを示す領域が検出された.さらに候補領域を絞り込むため,この3カ所の遺伝子領域を約1cM間隔でカバーするmicrosatellite markerを選出し同様の解析を行った.その結果,1領域でより高いLod scoreを得た.さらに,この3カ所の遺伝子領域において患者共通のhaplotypeが存在するか否かを調べるために,3カ所の候補遺伝子領域においてhaplotypeの構築をおこなうとともに,多点連鎖解析programのLINKMAPによって3カ所の候補領域を解析中である.相模原地区の常染色体優性遺伝様式をとる家族性パーキンソニズムの原因遺伝子同定を目指して研究を進めてきている.現在までにα-Synuclein,Parkin,Tau,UCH-L1について相模原家系では報告されている変異がないこと,およびこれら4遺伝子との連鎖の可能性について検討し,自験パーキンソニズム家系はこれらとは連鎖しないと推測された.現在,全常染色体について各染色体を約10cM間隔でカバーする382種のマイクロサテライトマーカーによりポジショナルクローニングを開始した.相模原家系患者12人,非/未発症者11人および配偶者3人の計26人の家系メンバーについて,microsatellite markerをそれぞれPCR増幅し,allele typingを行った.また,各marker alleleの健常群遺伝子頻度を非血縁健常者48人をtypingすることで求め,これらのmarker alleleをもとに2点連鎖解析programのMLINKによってLod scoreの計算を行った.その結果,3カ所で高いLod scoreを示す領域が検出された.さらに候補領域を絞り込むため,この3カ所の遺伝子領域を約1cM間隔でカバーするmicrosatellite markerを選出し同様の解析を行った.その結果,1領域でより高いLod scoreを得た.さらに,この3カ所の遺伝子領域において患者共通のhaplotypeが存在するか否かを調べるために,3カ所の候補遺伝子領域においてhaplotypeの構築をおこなうとともに,多点連鎖解析programのLINKMAPによって3カ所の候補領域を解析中である.
リソゾ-ム形成における膜識別と融合に関する研究

ラット肝リソソ-ム膜に存在する分子量107Kの糖タンパク質(LGP107)の細胞内動態を検討した。LGP107の特異的抗体とperoxidase(HRP)との複合体を作成した。肝細胞を固定した後に、細胞内におけるLGP107の局在を免疫電顕で検討すると、FabーHRP複合体はcoated pit, endosome,lysosomeに検出された。この複合体を細胞内に取り込ませて経時的に追跡すると、取り込み直後ではCoated pitとearly endosomeのみが染色され,時間の経過と共にlate endosomeとlysosomeが染色された。これらの結果から、LGP107はplasma membraneとlysosome間をendosomeを介してrecycleしており、LGP107の主なる存在場所はlysosomeであることが明らかになった。リソソ-ム膜糖タンパク質である酸性フォスファタ-ゼ(APase)が可溶性リソソ-ム加水分解酵素と異なり、Mー6ーPの受容体に依存しない異なった機構でリソソ-ムへ移行することを明らかにした。そこでリソソ-ム膜糖タンパク質が選別輸送されるためのsorting sigーnalはタンパク質部分にあると考えて、APase,LGP107,LGP96およびLGP87のcDNAをクロ-ニングした。それぞれは423,407,411,478個のアミノ酸から構成されていた。LGP87のみは膜にアンカ-されていると考えられる部分がNおよびびC末端の二ケ所に有り、膜アンカ-部分の他の三者のそれとの相同性は観察されなかった。しかし、これら三者間の膜にアンカ-されていると考えられる疎水性の高い部分は何れもC末端側にあり、それぞれ27,24,24個のアミノ酸よりなり、これらの一次構造には75%以上の相同性が認められた。この事はLGP87は現在までクロ-ニングされたリソソ-ム膜糖タンパク質とは著しく性質を異にするリソソ-ム膜糖タンパク質で有ることが明らかになった。エンドソ-ムとリソソ-ムの試験管内融合実験では、現在まで明らかにされているエンドソ-ム間の融合とは性質を異にする融合が起こることを明らかにした。LGP107の特異的抗体よりFabを調製し、peroxidase(HRP)と共有結合した複合体を作成した。肝細胞を固定した後に、細胞内におけるLGP107の局在を免疫電顕で検討すると、Fab-HRP複合体はcoated pit、endosome、lysosomeに検出された。この複合体を細胞内に取り込ませて経時的に免疫電顕で観察すると、散り込み直後ではcoated pitとearly endosomeのみが染色され、時間の経過と共にlate endosomeとlysosomeが染色ざれた。これらの結果から、LGP107はplasma membraneとlysosome間をendosomeを介してrecycleしており、LGP107の主なる存在場所はlysosomeで有ることが明らかになった。

リソソ-ム膜糖タンパク質である酸性フォスファタ-ゼが可溶性リソソ-ム加水分解酵素と異なり、M-6-Pの受容体に依らない全く異なった機構でリソソ-ムへ移行することを明らかにした。そこでリソソ-ム膜タンパク質が選別輸送されるためのsorting signalはタンパク質部分にあると考えて、酸性フォスファタ-ゼ、LGP107およびLGP96のcDNAをクロ-ニングした。それぞれは423、407、411個のアミノ酸から構成されていた。膜にanchorされていると考えられる疎水性の高い部分は何れもC末端側にあり、それぞれ27、24、24個のアミノ酸よりなり、これらの一次構造には75%以上の相同性が認められた。また、リソソ-ム膜を突き抜けて細胞質側に存在すると考えられるcytosolic domainにおいても三者の間には50%以上の相同性が見られたので、これらリソソ-ム膜糖タンパク質のC末端側がリソソ-ムへのtargetingに必要なsignal sequenceである可能性が高いことが推察された。リソソ-ム膜糖タンパク質である酸性フォスファタ-ゼが可溶性リソソ-ム加水分解酵素と異なり、Mー6ーPの受容体に依存しない異なった機構でリソソ-ムへ移行することを明らかにした。そこでリソソ-ム膜糖タンパク質が選別輸送されるためのsorting signalはタンパク質部分にあると考えて、本年度は、リソソ-ム膜に局在する、分子量85Kのシアロ糖タンパク質(LGP85)のcDNAのクロ-ニングを行った。単離したLGP85のcDNAは2065個のヌクレオチドから成り、478個のアミノ酸(Mr54,090)をコ-ドする翻訳領域と11ケ所の糖鎖結合部位を有していた。N末端のアミノ酸シ-クエンスは読み始めのメチオニンのみを消失しているだけでシグナルシ-クエンスは切断されずに保持されていた。また、二ケ所に高い疎水性部位が観察され、N末端(アミノ酸残基4ー26)側とC末端(アミノ酸残基433ー458)に存在していた。二ケ所の膜アンカ-部位を有するリソソ-ム膜糖タンパク質についての報告は現在までなく、NおよびC末端側の膜アンカ-部分は何れも前述のリソソ-ム膜糖タンパク質のそれとの相同性は観察されなかった。LGP85は非常にユニ-クなリソソ-ム膜糖タンパク質である事が明らかになった。リソソ-ムの形成には、エンドソ-ム、autophagic vacuole,およびゴルジ複合体に由来する輸送小胞が関与している。リソソ-ムが機能するためには、二次リソソ-ムと上記オルガネラとの融合が必須である。そこで、Ehrenreichらの方法でゴルジ-エンドソ-ム画分を調整し、精製エンドソ-ム間の融合を検討した。精製エンドソ-ム間の融合に要求されるファクタ-と粗エンドソ-ム間の融合に必要とされるファクタ-の相違は観察されなかった。しかし、オ-トリソソ-ムと精製エンドソ-ムとの融合に於いては、ATP存在下と非存在下での融合率はほぼ同じであった事はエンドソ-ム間の融合条件とは著しく異なっていた。
新規プレニル基転移酵素の機能解析と有用化合物創製への応用

本年度は前年度同定したシクロラバンデュリルジリン酸合成酵素(CLDS)の組換えタンパク質をDMAPPと反応し、その反応産物の構造解析を行った。フォスファターゼによって反応産物からジリン酸を除去した化合物の構造をN厭によって解析したところ、シクロラバンデュロールであることが確かめられた。そのことより、CLDSがDMAPPの縮合と環化によってシクロラバンデュリルジリン酸を合成する新規のプレニルジリン酸合成酵素であることが明らかになった。このCLDSによって合成したシクロラバンデュリルジリン酸を、前年度までに同定したプレニル基転移酵素とフラビン依存型酸化酵素の反応系に供給して、フェナジン-1-カルボン酸のプレニル化反応を行った。この反応によるラバンドシアニンの生成が確認できたことから、シクロラバンデュリルジリン酸がプレニル基供与体として働くことも明らかにすることができた。また、ラバンドシアニンの生産菌においてclds遺伝子を欠失させたところ、ラバンドシアニンの生産が失われたため、CLDSがラバンドシアニンの生合成において確かにシクロラバンデュリ'ル基の形成に関与することが確かめられた。さらに、本来ラバンドシアニンを生産しない放線菌Streptomyces lividansTK23を用いたラバンドジアニン異種生産系を構築し、本研究で同定した遺伝子がラバンドシアニンの生合成に必要十分であることを確かめた。CLDSの詳細な反応機構を明らかにするために結晶構造解析も試みた。最終的な構造の決定には至らなかったが、Nativeタンパク質、およびセレノメチオニン置換体タンパク質の結晶を作製し、高い分解能の回折データを取得することができた。今後、構造を明らかにすることで新規のテルペノイド生合成機構が明らかになると期待される。以上のラバンドシアニンの生合成研究に加えて、放線菌の生産するプレニル化インドールの生合成についても研究を行った。フェナジンの窒素原子のプレニル化機構の解明を目的として、抗腫瘍化合物ラバンドシアニン(LAV)の生合成研究を行った。LAV生産菌Streptomyces sp.CL190(以下CL190株)のゲノム配列に対し、既知のプレニル基転移酵素(PTase)の配列を用いてBLAST検索を行い、候補遺伝子を見出した。この遺伝子をCL190株のゲノム上で破壊すると、LAV生産能を失い、プレニル基を持たないフェナジン-1-カルボン酸(PCA)が蓄積するようになった。さらに、破壊株培養液にPTaseの組換え酵素とジメチルアリルニリン酸を添加すると、LAVの生産が回復したため、このPTaseがLAVの生合成に関与することが明らかになった。組換え酵素を添加した際にはLAVに加えて、フェナジンのジメチルアリル化体も蓄積したことから、このPTaseはPCAのジメチルアリル化を触媒すると予想された。In vitroの実験から、CL190株の持つフラビン依存型酸化酵素PhzSとPTaseを同時に作用させると、PCAのプレニル化、脱炭酸、カルボニル形成が進行することが判明した。類似の反応はフェナジンの窒素原子にメチル基を持つPyocyaninの生合成に見出され、メチル基転移酵素(MTase)とPhzSが、協調して作用してPCAのメチル化、脱炭酸、カルボニル形成を触媒する。本研究によって、相同性のないPTaseとMTaseがともにPhzSと協調して作用し、フェナジンの窒素原子の修飾反応を触媒することが明らかになった。これを応用することで、フェナジンの窒素原子に様々な置換基を持つ誘導体の合成が可能になると期待される。また、放線菌の生産するプレニル化インドールの生合成研究も行い、結果としてトリプトファンをインドール-3-アセタルドキシムに変換するフラビン依存型酸化酵素SCO7468を同定することができた。平成22年度の研究によって、ラバンドシアニン(LAV)生合成におけるフェナジンの窒素原子をプレニル化する酵素(PTase)遺伝子を同定し、その機能解析を行った。平成23年度は一昨年度までに明らかにできなかったテルペノイドの分岐や環化を触媒する酵素遺伝子の同定を目指して研究を行った。PTaseの反応で生成した5-N-ジメチルアリル-1-フェナジノン(NDP)が生合成中間体であると考えられたので、この化合物をPTase遺伝子破壊株に添加し、最終産物であるLAVの生産が回復するか試験した。しかし、LAVの生産は回復しなかったため、プレニル化、テルペノイドの分岐、環化が順次進行するという仮説は誤りであると結論した。それに代わり、環状テルペノイドであるシクロラバンドリル二リン酸が生成したのち、フェナジン骨格に転移すると仮説を立て、LAV生産菌のドラフトシーケンスから目的遺伝子を探索した。LAVと同様にシクロラバンドリル基を持つラバンドキノシン生産菌のドラフトシーケンスとの比較から、両菌株に特異的に存在するテルペノイド生合成遺伝子を見出した。この遺伝子をクローニングし、組換えタンパク質を調製した。組換えタンパク質をマグネシウムイオンの存在下、ジメチルアリル二リン酸と反応させたところ、新たな化合物の生成が確認された。また、この反応溶液を基質として用い、フェナジンのプレニル化反応を行ったところ、LAVの生成が確認された。このことから、本年度同定したテルペノイド生合成遺伝子がシクロラバンドリル二リン酸を合成していることが示唆された。現在、反応産物を精製し、その構造解析を行っている。

シクロラバンドリル基は様々な生物活性物質に見出される部分構造であり、本研究はそれらの化合物の生合成にも重要な知見を与えると期待される。本年度は前年度同定したシクロラバンデュリルジリン酸合成酵素(CLDS)の組換えタンパク質をDMAPPと反応し、その反応産物の構造解析を行った。フォスファターゼによって反応産物からジリン酸を除去した化合物の構造をN厭によって解析したところ、シクロラバンデュロールであることが確かめられた。そのことより、CLDSがDMAPPの縮合と環化によってシクロラバンデュリルジリン酸を合成する新規のプレニルジリン酸合成酵素であることが明らかになった。このCLDSによって合成したシクロラバンデュリルジリン酸を、前年度までに同定したプレニル基転移酵素とフラビン依存型酸化酵素の反応系に供給して、フェナジン-1-カルボン酸のプレニル化反応を行った。この反応によるラバンドシアニンの生成が確認できたことから、シクロラバンデュリルジリン酸がプレニル基供与体として働くことも明らかにすることができた。また、ラバンドシアニンの生産菌においてclds遺伝子を欠失させたところ、ラバンドシアニンの生産が失われたため、CLDSがラバンドシアニンの生合成において確かにシクロラバンデュリ'ル基の形成に関与することが確かめられた。さらに、本来ラバンドシアニンを生産しない放線菌Streptomyces lividansTK23を用いたラバンドジアニン異種生産系を構築し、本研究で同定した遺伝子がラバンドシアニンの生合成に必要十分であることを確かめた。CLDSの詳細な反応機構を明らかにするために結晶構造解析も試みた。最終的な構造の決定には至らなかったが、Nativeタンパク質、およびセレノメチオニン置換体タンパク質の結晶を作製し、高い分解能の回折データを取得することができた。今後、構造を明らかにすることで新規のテルペノイド生合成機構が明らかになると期待される。以上のラバンドシアニンの生合成研究に加えて、放線菌の生産するプレニル化インドールの生合成についても研究を行った。平成23年度の研究計画に記載したシクロランドリル基を形成する酵素遺伝子を同定し、その活性の検出に成功したため。反応産物の構造決定や、酵素学的な解析等解析すべき点はいくつか残っているが、平成24年度に行うことが十分可能であると判断したため、おおむね順調に進展していると判断した。これまでに同定したラバンドシアニン生合成遺伝子を一つのベクターにクローニングし、異種放線菌に導入することでラバンドシアニンの異種生産を目指す。それによって、ラバンドシアニン生合成の最小遺伝子単位を決定する。また、各生合成遺伝子について、各組換えタンパク質の詳細な酵素学的な解析を行う。また、X線結晶構造解析も行い、各酵素の基質認識や触媒機構について考察を加える。
若年雇用者に対する企業の採用・人材育成・技能伝承からみる人事変革の方向性

研究期間内において若年層の雇用状況が改善されたため、若年層の雇用課題でも中小製造業を対象に「採用・確保・定着」についてのアンケート調査を実施するとともに、中国の若年層の雇用についての訪問調査を実施した。回答結果を地域別・優良/一般企業別・規模別に分類して結果を分析した。その結果、明らかになった代表的な点は以下のとおりである。(1)優良企業においては理系大卒の従業員数の割合が高い。(2)中小製造業においては年齢構成のワイングラス状況は存在せず、30・40代の年齢層の割合が高い。(3)全般的には、採用の際に重視する項目としては職務関連項目ではなく「人柄」「まじめさ」等の個入特性項目が重視されているが、生産系社員や地方においては「出身学部」等の職務関連項目も重視される傾向がある。(4)定着に関しては、優良企業においては「賃金」「休暇」等の労働条件を重視する傾向がある。(5)優良企業では採用後に長期に人材育成しようとする傾向がある。調査結果から考察される点は、現在は従業員の採用が困難だという状況ではないが、時間をかけて技能を育成していく余裕が低下していることから、教育機関と企業との問における必要な人材についての情報交換が不可欠であり、企業における人材育成期間を短縮して製造業における必要な人材供給のミスマッチが発生しない方策が必要である。中国上海での訪問調査にからは、中小製造業の後継ぎ問題がすでに発生していることが明らかになった。日本においても、製造業とくにBtoB企業の若年層の認識が希薄である。イノベーティブな製造業の次世代を担う入材の育成は、日本・中国において共通する課題である。最後に、ニート・フリーター問題は数字的には解消する傾向はみられるものの、若年層の職業意識の醸成についてはまだ残された課題である。キャリア教育が充実する傾向にあるが、若者の観察から、仕事そのものから回避する若者が減少しているわけではない。1.中小製造業における人材確保についての研究関西では、中小製造業において優良な企業が多数存在するが、今後の存続を考えた場合、どのように若年層の人材を確保・定着させる必要があるかについて、資料を収集し、アンケート調査を実施した。大阪府下400社、近畿300社、全国300社に送付して、165社から回答があった。この結果の集計・分析は、平成19年度に実施する。2.専門高校の戦後の変遷についての研究全国15都道府県(北海道、宮城県、東京都、新潟県、愛知県、大阪府、兵庫県、京都府、奈良県、滋賀県、和歌山県、広島県、愛媛県、福岡県)の専門高校(主として、工業高校と商業高校)の戦後の変遷、とくに、地場産業や地元企業に対して、どのように人材供給を果たしてきたかについて分析するための資料収集を行なった。工業高校においては、デュアルシステムなどの新たな取り組みがでてきており、スーパー専門高校等の新たな取り組みがみられる。しかしながら、専門高校においても、大学進学希望者も多く、今後、製造業の技能を担う人材の確保をどのようにするかが課題となることが明らかになった。3.伝統産業における技能伝承についての研究この点に関しては、3月に沖縄・宮古島の現地調査を実施した。琉球絣・紅型・宮古上布などでは、後継者育成事業によって、後継者が育ち、伝統産業を継続させつつある実態を確認できた。都会からの人たちも、こうした事業に応募してきている実態もあり、若年層に対して、こうした伝統産業の伝授が後継者発掘には不可欠である。

また、こうした希少価値をもつ製品については、すでに、流通経路が固定化していて、一般消費者のニーズに対応した商品開発ができていないことも明らかとなった。伝統的だけでは、現代人のニーズにマッチできないわけで、伝統産業に新しい感覚、デザイン力を付加する必要がある。これに、若年層のひとびとが活躍する余地がある。とくに、沖縄では、芸術大学があり、そこから排出される人材が、沖縄に新しい息吹をもたらしている。4.女性の就業継続に関する研究在宅勤務、SOHOが女性の就業継続にかかわっているかについて、研修・インタビュー等を実施した。今年度はH18度に実施した「中小企業の人材育成に関するアンケート調査」の結果分析を主として実施した。若年者の採用・育成については、当初大企業調査を実施する予定であったが、経済状況の改善とともに、若年層全般の問題も重要ではあるが、中小製造業で若年層が採用されない場合、これまで培われてきた技術や技能の伝承が困難となることから、今後も成長が見込まれる優良な中小製造業に対象を絞って人材の採用・確保・育成について、アンケートを実施してその結果分析をおこなった。この調査結果の特徴的な点は以下のとおりである。(1)優良企業では大卒理系技術者を確保できている。(2)採用に当たってはハローワーク中心ではあるが、学校との連携関係を有していたり、役員や従業員の知り合いなどから広く人材を探している。(3)また、従業員の定着に関しては男女とも年齢に関わらず、賃金で工夫するという企業が多い。しかし、女性に対しては休暇や就業時間の柔軟性ということで定着を図ろうとしている割合も高く、ワークライフバランスに対する配慮と定着との関係がみられる。(4)今回の調査では、関西に重点を置いた研究を実施したことから、大阪市においてはとくに優良企業数の割合が少なく人材等に関しても文系中心であったりと、他のグループと比較して多くの相違点がみられた。ただし、配布先において問題があり、今後別途調査表を配布して、これらの結果の有効性を確認する必要がある。また、今年度は、中小企業の人材育成に関する国際比較調査(中国上海市・中国石家荘市・タイバンコク)を実施し、今後その分析をする予定である。何故ならば中小製造業での人材確保に関しては、同様の問題が中国においても生起しているからである。
咬合機能による交感神経系への反射性調節機構の解明

本研究は,交感神経線維から活動電位を記録する慢性実験系により,咬合機能ならびに咬合障害が交感神経活動に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.覚醒動物においては,交感神経-副腎髄質系は生体のストレス状態を反映し,交感神経活動状態を理解するうえで重要な指標の一つになる.このような観点から本実験では副腎交感神経の活動電位を解析対象とした.実験にはウイスター系ラットを用いた.実験動物に副腎交感神経活動記録用電極,咬筋筋電図電極を留置した.外科処置からの回復後,水と固形試料を自由に摂取できるよう無拘束で飼育し,安静時および摂食時の副腎交感神経活動を記録した(対象群).対象群と同じ外科処置を行った動物で,実験的咬合干渉を大臼歯部に付与した影響について,同様に安静時およぴ摂食時の副腎交感神経活動を解析した(実験群).対象群では,副腎交感神経は摂食開始の約2秒前から活動が増加した.この現象は,ネコ腎神経の慢性神経活動記録による報告とは明らかに異なった.また,この神経活動の増加は摂食を続けている間持続したが,咀嚼リズムや筋活動量とは明らかな関連性は認められなかった.咬合干渉を付与した実験群においては,安静時・咀嚼時とも副腎神経活動レベルは対象群に比べてやや大きかったが,有意な違いは見られなかった.本研究の結果からは,咬合障害と交感神経活動の直接の因果関係を見出すことはできなかった.しかしながら,付与した干渉が,実験動物にとってストレッサーとしての目的を果たすことが出来ない規模のものであった可能性が考えられ,今後の要検討課題となった.[目的]咬合機能時に生じる口腔領域の固有感覚である歯根膜,咀嚼筋筋紡錘,および顎関節からの感覚情報が副腎カテコールアミンの分泌調節を行っている交感神経線維の活動に及ぼす影響を調べた.[方法]実験にはラットを用い,麻酔下で左側副腎を支配する交感神経線維束の遠心性放電活動を導出した.口腔領域への刺激は以下のように行った,1)上顆切歯舌面に対して強さ300gfの持続圧刺激,および2Hzの反復圧刺激を与えた.2)大脳皮質誘発性の咀嚼運動様の周期性顎運動中に,上下切歯間で木片を咬合させた.3)歯根膜からの感覚情報を遮断する目的で,上顎神経および下歯槽神経を両側切断した動物で2)の実験と同様に皮質誘発性の顎運動中に木片を咬合させた.4)皮質誘発性の顎運動中に,筋紡錘からの感覚情報を増加させるために下顎を牽引した.[結果]1)上顎切歯に圧刺激を行うと副腎交感神経活動は増加した.持続圧刺激による神経活動は有意な増加ではなかったが,反復圧刺激では神経活動は最大で135%となり有意に増加した(P<0.05).2)大脳皮質誘発性の周期性顎運動中に木片を咬合させると,神経活動は圧刺激を行ったときよりも増加し,最大156%の増加率を示した(P<0.05).3)上顎神経および下歯槽神経を切断した動物では,木片を咬合させても交感神経活動に明らかな変化は認められなかった.4)下顎を牽引して筋紡錘からの感覚情報を増加させても,交感神経活動に明らかな変化は認められなかった.[考察]以上より,歯への機械的刺激は副腎交感神経活動を増加させることが明らかとなった.この副腎交感神経活動の増加は,歯根膜からの感覚情報の増加によるものであり,筋紡錘や顎関節からの感覚情報は関与していなかった.本研究は,交感神経線維から活動電位を記録する慢性実験系により,咬合機能ならびに咬合障害が交感神経活動に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.覚醒動物においては,交感神経-副腎髄質系は生体のストレス状態を反映し,交感神経活動状態を理解するうえで重要な指標の一つになる.このような観点から本実験では副腎交感神経の活動電位を解析対象とした.実験にはウイスター系ラットを用いた.実験動物に副腎交感神経活動記録用電極,咬筋筋電図電極を留置した.外科処置からの回復後,水と固形試料を自由に摂取できるよう無拘束で飼育し,安静時および摂食時の副腎交感神経活動を記録した(対象群).対象群と同じ外科処置を行った動物で,実験的咬合干渉を大臼歯部に付与した影響について,同様に安静時およぴ摂食時の副腎交感神経活動を解析した(実験群).対象群では,副腎交感神経は摂食開始の約2秒前から活動が増加した.この現象は,ネコ腎神経の慢性神経活動記録による報告とは明らかに異なった.また,この神経活動の増加は摂食を続けている間持続したが,咀嚼リズムや筋活動量とは明らかな関連性は認められなかった.咬合干渉を付与した実験群においては,安静時・咀嚼時とも副腎神経活動レベルは対象群に比べてやや大きかったが,有意な違いは見られなかった.本研究の結果からは,咬合障害と交感神経活動の直接の因果関係を見出すことはできなかった.しかしながら,付与した干渉が,実験動物にとってストレッサーとしての目的を果たすことが出来ない規模のものであった可能性が考えられ,今後の要検討課題となった.
意図的な電磁妨害による故障利用攻撃に対抗する環境電磁工学的対策技術の開発

本研究は、暗号機器の故障を引き起こす妨害電磁波伝搬を周波数および時間領域で計測し、妨害波の伝達効率を決定する物理的なパラメタ及び妨害を受けているコンポーネントを特定すると同時に、意図的な電磁波妨害によって生ずる情報漏えいのリスク評価を行った。さらに、妨害波の伝達効率を決定する物理パラメタに基づき、汎用的な機器の設計時に妨害電磁波に対する耐性を評価可能なシミュレーションモデルを構築すると共に、シミュレーションによる妨害電磁波伝搬の高精度な解析に基づき機器に故障が引き起こされるメカニズムを明らかにした。メカニズムとリスク評価の結果に基づき対策技術を提案した。平成25年度は,交付申請書の各項目に対応して以下の2項目について研究を行った。1.故障を引き起こす妨害周波数を決定するパラメタ抽出と電磁妨害先コンポーネントの特定:故障を引き起こしやすい周波数で妨害波を機器外部から印加し、機器上に妨害波が伝搬する様子を周波数及び時間領域で観測し、妨害電磁波の周波数特性を決定するパラメタを抽出した。また、機器上の妨害周波数の伝搬強度分布から、妨害を受けているコンポーネントを特定した。2.IEMIによる意図的な電磁妨害によって機器から出力される情報を用いたリスク評価:リスク評価として、IEMIによる故障注入時に出力される任意のビットに誤りが生じた暗号文へ、既存の解析手法の適用可能性や解読時間を計測した。また、注入するレベル、及び周波数を変化させ、出力される暗号文の誤りビット数に変化が生ずることを基礎実験より明らかにし、Differential Fault Analysis (DFA)により鍵の取得が可能であることを示した。さらに,電磁妨害の影響を受けないカードを用いた暗号プロトコルの開発も進めた。この研究を実施するために,実験環境として供試デバイスなどと電磁界数値解析システムを整備し,また,研究成果の公表として国内外の研究会合に参加した。上述の研究成果は高く評価され、環境電磁工学分野においては、国内学会(2013電子情報通信学会ソサイエティ大会)で招待講演を行うと共に、情報セキュリティ分野の国際会議(IWSEC (International Workshop on Security)2013)においても招待され講演を行っている。平成26年度は,交付申請書の研究実施計画各項目に対応して以下の2項目について研究を行って成果を得た。(a)汎用的な暗号機器設計時に妨害電磁波への耐性を評価可能なシミュレーションモデルの構築について,故障を引き起こし易い妨害周波数を決定するパラメタを基に,基板上の電磁界分布などの実測結果を確認しながら暗号機器設計時に耐性を評価可能とする基礎的なシミュレーションモデルを構築した。また,故障を引き起こしやすい妨害電磁波の周波数を決定するパラメタを抽出して,基板上の電磁界分布と各点におけるSパラメタ及び伝達関数などの実測を行いつつ,汎用的なシミュレーションモデルの基礎を得た。(b)電磁妨害メカニズム解明と対策技術の開発について,故障注入に必要な妨害電磁波は正弦波の場合にインパルスより200倍小さいという基礎検討から,機器内部で共振が生じるモデルを用いて,妨害波が伝搬し共振する時間領域現象を可視化することでメカニズムを解明した。また,意図的な電磁妨害に対して耐性の高い暗号プロトコルの開発を進めて,電磁妨害の影響を受けないカード組を用いた暗号プロトコルの開発を進め、その成果のひとつはIEICE Trans. Fundamentals誌に掲載されることが決定している。さらに,計測,リスク評価及び耐性評価モデルの結果を取りまとめ、成果の発表を行った。(1)汎用的な暗号機器設計時に妨害電磁波への耐性を評価可能なモデルの構築前年度に抽出した故障を引き起こし易い妨害電磁波の周波数を決定するパラメタを基に、電磁界シミュレーションモデルを構築すると共に、シミュレーションのみでは評価が困難な複雑な電子機器にも適用可能な妨害電磁波評価回路を設計した。そして、シミュレーション及び評価回路をベースに暗号機器設計時に妨害電磁波への耐性を評価可能とする汎用的なモデルを構築した。モデルの構築は、基板上の電磁界分布、各点におけるSパラメタ及び伝達関数などの実測により得られた各種結果と比較し、妥当性を確認した。(2)電磁妨害メカニズム解明と対策技術の開発妨害波の機器上伝搬を時間領域で可視化すると共に、故障時に暗号機器から出力される誤りを計測することで、妨害波は暗号モジュール内部で分配されるクロック信号に重畳し、セットアップタイム違反を引き起こすことで故障が引き起こされていることを明らかにした。また、本メカニズムに基づき、電源線を利用した故障注入手法に対しては、暗号機器への妨害波の伝搬を抑制するためフェライトコアなどの安価で機器に容易に適用可能なEMC対策手法が有効であることを示唆した。(3)意図的な電磁妨害に高い耐性のある暗号プロトコルの開発意図的な電磁妨害に耐性のある物理的暗号システムの一つとして、前年度に引き続きカードを用いた暗号プロトコルの開発を進め、情報漏えいを防止する物理的ケースを導入することにより効率的なプロトコルを構築した。交付申請に掲げた26年度の研究実施計画の項目について,そのすべてを達成するとともに,計画を大きく超える成果を得た。

暗号機器設計時に妨害波への耐性を評価可能とするシミュレーションモデルの構築について,故障を引き起こしやすい妨害電磁波の周波数を決定するパラメタを抽出して,基板上の電磁界分布と各点におけるSパラメタ及び伝達関数などの実測まで進めることができた。また,IEMIによる暗号機器への故障注入メカニズムについて,機器内部で共振が発生して注入した妨害波の振幅が一定のレベルを超えることにより故障を引き起こすという示唆が得られて,次年度の発展への足掛かりを得た。さらに,意図的な電磁妨害に対して耐性の高い暗号プロトコルの開発を進めて,カード組を用いた暗号プロトコルの開発も進めた。これらの研究成果は,学会論文誌や国際会議に投稿し,以下に示すように当初計画を大幅に超える件数の発表を行って研究成果の報告および国内外の研究者との議論と情報交換を行うことができ,また,IEICE Trans. Fundamentalsへの採録が決定している。27年度が最終年度であるため、記入しない。情報通信工学今後は,(1)シミュレーションモデルの高精度化を図るとともに,シミュレーションモデルを用いて妨害電磁波の伝搬を高時間分解能で計算し,時系列で可視化することによりIEMIによる機密性・完全性低下のメカニズムを解明し,(2)得られたメカニズムとリスク評価の結果を基に電気的な対策技術の開発を行うとともに,(3)意図的な電磁妨害に対して耐性のある暗号プロトコルの開発を行う。交付申請に掲げた25年度の研究計画の項目について、その全てを達成すると共に、計画を大幅に越える成果を得た。さらに、IEMIによる意図的な電磁妨害によって機器から出力される情報を用いたリスク評価を行う過程で、暗号機器から生ずる漏えい電磁波を利用することで機器の外部からタイミングをコントロールし、故障を注入することが可能であることを発見した。計画を大きく超える成果を得ることができたことにより当初計画以上の研究会合発表を行う必要が生じたことに対応するため,また,研究費を効率的に使用するために,今年度の物品費予算を節約することにして,シミュレーションモデルの検討に用いるソフトウェアのライセンスの期間を調整し,実験機材については現有のものを活用するよう工夫した。その節約の効果として,研究成果発表の旅費や学会参加費などが増大したものを補っても未使用額が生じた。これを次年度の研究成果発表のために研究会合出席する旅費に充てることとした。今後は、前年度のパラメタ抽出とリスク評価を継続すると共に、計測結果に基づく暗号機器設計時に妨害電磁波への耐性を評価可能な、汎用的シミュレーションモデルの構築を行う。
酸性ストレスに応答する植物の分子機構に関する研究

DNAマイクロアレイ解析の条件検討とその解析Synechocystis sp. PCC6803をpH3-8で酸処理し、pH3、30分、1時間、2時間および4時間培養した細胞と、通常条件であるpH8で同時間培養したものとをDNAチップを用いて解析した。その結果、酸性環境下に発現増加する32遺伝子、抑制される29遺伝子を同定できた。酸性ストレス特異的応答遺伝子欠損株の作出上記研究で見出された、酸性ストレス特異的に誘導される32遺伝子のうち、より酸性ストレス特異的で、機能未知な遺伝子の欠損株を13株作成した。その中で、明らかに酸性ストレスに感受性が高くなり成長の阻害が認められた株が、4株見出された(下図参照)。4時間まで増加し続ける2つの機能未知遺伝子(sll0939,slr0967)は、浸透圧ストレス、塩ストレスによっても発現誘導されることが報告されており、直接酸性などのストレスに関係していることが強く示唆される。そこで、大腸菌のtrcプロモーターを用いた強発現系を構築中であり、さらに酵母two-hybridsystemによる解析およびhis-tagを導入した遺伝子の発現させることによる、相互作用する遺伝子群の探索、大腸菌による大量発現による抗体の作成、抗体による細胞内局在などの解析を進めている。また、これら酸性特異的遺伝子間の相互関係について各遺伝子欠損株を用いたリアルタイムPCRによる遺伝子解析をしたところ、slr096欠損株においてsll0939の発現が大きく低下していることが明らかとなり、sll0939はslr0967の支配を受けていることが明らかとなった。植物は常に強光、低温、酸性雨などの環境ストレスにさらされ、その生存のために細胞応答をしている。すでに強光あるいは低温などの環境ストレスに対する応答のメカニズムについては数多くの報告があるが、酸性ストレスについてはほとんどない。そこで我々は酸性pH条件をいろいろと検討した上でラン色細菌Synechocystis sp.PCC 6803をpH3.0の培地で30分4時間培養した細胞と通常pH条件で30分4時間培養した細胞からRNAを精製し、DNAマイクロアレイを用いて両者の遺伝子発現の違いを網羅的に比較した。その結果、酸性特異的に発現が誘導される遺伝子をおよそ30個見出した。そのうちslr0967とsll0939は、Wild typeに比べその発現が少なくとも4時間まで、それぞれ、12倍と20倍に増加し続けることが確認され、これらの遺伝子産物が酸性ストレスに対し直接的な関与をしていることが示唆され、非常に興味深い。そこで、両遺伝子の破壊株を作成し、酸性ストレスに対する応答を検討した。その結果、得られた欠損株と野生株をpH4.5の酸性BG-11プレート上にまき生存限界を調べたところ、両欠損株とも、酸性ストレスに対する感受性が高まっていて、Wild typeに比べ、長く生存できないことがわかった。両遺伝子に加え、その他、酸性ストレス応答遺伝子欠損株についても解析中である。また、両遺伝子の強発現系を構築中であり、その変異株について酸性ストレス耐性を評価予定である。DNAマイクロアレイ解析の条件検討とその解析Synechocystis sp.PCC6803をpH 3-8で酸処理し、pH 3、30分、1時間、2時間および4時間培養した細胞と、通常条件であるpH 8で同時間培養したものとをDNAチップを用いて解析した。

その中で、明らかに酸性ストレスに感受性が高くなり成長の阻害が認められた株が、4株見出された(下図参照)。4時間まで増加し続ける2つの機能未知遺伝子(sll0939,slr0967)は、浸透圧ストレス、塩ストレスによっても発現誘導されることが報告されており、直接酸性などのストレスに関係していることが強く示唆される。そこで、大腸菌のtrcプロモーターを用いた強発現系を構築中であり、さらに酵母two-hybridsystemによる解析およびhis-tagを導入した遺伝子の発現させることによる、相互作用する遺伝子群の探索、大腸菌による大量発現による抗体の作成、抗体による細胞内局在などの解析を進めている。また、これら酸性特異的遺伝子間の相互関係について各遺伝子欠損株を用いたリアルタイムPCRによる遺伝子解析をしたところ、slr0967欠損株においてsll0935の発現が大きく低下していることが明らかとなり、sll0939はslr0967の支配を受けていることが明らかとなった。