hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルケン・アルキンスキャニングによる迅速構造活性相関ストラテジー

本年度は、まずムライマイシンのアルケンスキャニング誘導体を合成し、そのMraY阻害活性評価を行った。その結果、ロイシン、エピカプレオミシジン、バリン残基のいずれをアリル基で置換した誘導体も酵素阻害活性を保持し、これらのアミノ酸残基は活性発現に重要ではないことが示唆された。次にアリル基に対する置換基導入に関して、どのような反応が適用できるかを検討し、クロスカップリング・メタセシス反応が適用可能であることがわかった。また、ムレイドマイシン誘導体の合成についても検討した。ジアステレオ選択的C-Hアミノを利用したジアミノブタン酸の立体選択的・効率的な合成を確立し、さらに銅触媒を用いるカルボキサミドとヨードオレフィンのクロスカップリングと続くペプチドカップリングを用いる事で、ムレイドマイシン誘導体の母骨格の一般的合成法を確立した。本法を用いて、アルケンスキャニング誘導体の合成検討を行った。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ウリジルペプチド系天然物の全合成経路の確立を目指した。ウリジンのZ-ヨウ化アルケン誘導体とテトラペプチドカルボキサミド体との銅を触媒としたクロスカップリングによるオキシエナミド形成反応を鍵反応とする、パシダマイシンDの初の全合成を達成しており(Org. Lett. 2011)、本経路を用いて3'-ヒドロキシパシダマイシンDの合成も行った。標的酵素であるMraYの阻害活性と抗緑膿菌活性を評価したところ、3'-ヒドロキシパシダマイシンDは天然物と同等の活性を有する事がわかり、3'位への水酸基の導入は許容であることがわかった。3'-ヒドロキシ体は天然物よりも合成が簡便である。各種アルケン・アルキン置換誘導体を効率的に合成すべく、本全合成経路の改良を行った。多成分反応は、一工程で複雑な骨格を構築できるのみならず、用いる成分を交換することで容易に多様な誘導体合成を可能にする。3'-ヒドロキシパシダマイシンDの合成にUgi4成分反応を適用することとし、誘導体を合成終盤で一挙に構築することとした。まず、Z-ビニルヨードウリジン誘導体とホルムアミドのクロスカップリングによりN-ホルミルエナミド体を調製した後、脱水反応によりイソニトリル体を得た。その後、Ugi 4成分反応によりウレアジペプチド、アルデヒド、置換ベンジルアミンと連結し、残る一つのアミノ酸をN-末端に導入し、脱保護する事で3'-ヒドロキシパシダマイシンDの合成を達成することができた。当初研究計画では、研究初年度はウリジルペプチド系天然物の誘導体合成に適した全合成経路の確立を目指していた。実際に当該年度では、銅を触媒としたクロスカップリングによるオキシエナミド形成反応を鍵反応として、パシダマイシンDと、合成がより容易な3'-ヒドロキシパシダマイシンDの合成を達成する事ができた。また3'位への水酸基の導入は許容であることを明らかにし、誘導体合成の効率化の目処がたった。さらに各種置換誘導体を効率的に合成すべく、Ugi 4成分反応を利用して誘導体を合成終盤で一挙に構築することも計画していた。これについても、ウレアジペプチド、アルデヒド、置換ベンジルアミンを用いた結果、所望のUgi成績体を得る事が出来、残る一つのアミノ酸をN-末端に導入し、脱保護する事で3'-ヒドロキシパシダマイシンDの合成を達成することができた。これにより効率的な誘導体合成法を確立する事ができたと言える。今後は、各種アリル・プロパルギル基置換フラグメントの調製と、これらのフラグメントを用いて各種スキャニング用誘導体を合成する。第2段階目である、スキャニング誘導体に対する置換基導入に関して、どのような反応が適用できるかを予備的に検討することとし、クロスカップリング・メタセシス・クリックケミストリー等をベースとして反応を検討する。合成した緑膿菌に対する抗菌活性を指標として、取り込みに与える各置換基の影響についてスキャニングを行う。スキャニング用誘導体のうち、活性を保持した化合物は、様々な置換基を導入することで構造活性相関研究を行い、高活性誘導体を見いだす。具体的な研究推進方法は、以下のとおりである。抗菌活性発現のもととなる標的酵素MraYは、細菌細胞膜貫通型のタンパク質であり、その活性部位は細胞質側に存在する。そのため、本酵素を標的とする分子は、細胞膜を透過するだけの脂溶性が必要である。ムレイドマイシンは、その化学構造から十分に脂溶性に富んでいるとは言えない。そこで、脂溶性残基を中心とした各種官能基の導入を行う。

この際、申請者らが手掛けてきた天然物の膜透過性の向上を指向した創薬化学のノウハウを利用して効率的に、構造活性相関を検討する。ムレイドマイシンの緑膿菌体への取り込み様式や細胞内局在を直接観察する事は、取りさらに、取り込みの標的分子を同定するためのケミカルプローブの合成を行い、取り込み標的分子の同定を行う。例えば、ビオチンを結合した光反応性クロスリンカーを活性保持型スキャニング誘導体に導入し、緑膿菌細胞破砕物と混合・クロスリンク反応を行う。アビジンビーズによるクロスリンク成績体のつりあげの後、結合タンパク質のフラグメント化、質量分析結果の解析によるタンパク質の同定を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
エマルション望遠鏡、高速飛跡読取技術を駆使したγ線天体精密観測と宇宙線加速の研究

最新の原子核乾板および解析技術をガンマ線観測器へ応用することで、現存するGeVガンマ線観測機器よりも1桁高い解像度でガンマ線源を撮像することが可能となる。本研究は、高角度分解能「エマルションガンマ線望遠鏡」を開発し、大面積検出器を気球に搭載して長時間フライトを実施し、現在「未同定」とされている謎のガンマ線天体や、宇宙線加速が示唆される超新星残骸等の精密観測の実現を目指している。2015年5月、中口径(0.4平米)のエマルション望遠鏡を用いたガンマ線天体Vela pulsarの検出、および100MeV帯域において最高精度でのイメージング実証を目的とした気球実験(JAXA国際大気球実験)をオーストラリアアリススプリングスにて実施した。フライト時間は14.3 h(36 km以上の浮遊時間11.5 h)、その後、東約1000km離れたロングリーチ近郊にて検出器を回収し、フライト乾板を手にする事に成功した。現像後の乾板を日本に持ち帰り、名大で開発中の超高速自動飛跡読取装置HTSを使用して記録された飛跡データの取得を実施し、約3ヶ月の運用で乾板42平米のデジタル化を完了した。取得した飛跡データを解析し、ガンマ線起因の反応(γ→e+e-)を自動選出するソフトウェアの開発を行った。原子核乾板100層を積層したガンマ線コンバーター内に蓄積した反応の系統的な選び出しが現在進行中である。サブサンプルデータを用い、天体検出において主な背景事象となる大気ガンマ線の流束8.76±2.35E-3 [/cm^2/s/sr](>150MeV)を導出し、過去の測定と無矛盾な結果が得られた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、高分解能「エマルションガンマ線望遠鏡」を開発し、大面積検出器を気球に搭載して長時間フライトを実施し、現在「未同定」とされている謎のガンマ線天体や、宇宙線加速が示唆される超新星残骸等の精密観測を実現することを目的としている。本年度は、2014年11月に予定しているJAXA国際大気球実験に向け、準備研究を行った。本実験は、GRAINE計画の2回目のフライトであり、我々の開発するエマルションガンマ線望遠鏡によってガンマ線天体Velapulsarを検出し、100MeV領域において最高精度でのイメージング性能を実証することを目指す。名古屋大学で独自製造している高感度型原子核乳剤を用いてプロトタイプ検出器を製作し、東大宇宙線研付属乗鞍観測所(標高2770m)へ運び、100MeV領域のガンマ線観測テストを行った。乳剤自体を改良する事で飛跡検出効率の大幅な改善がみられ、ガンマ線検出に有効であることを確認した。さらにこの乳剤の連続製造体制を整え、本番実験に向けて量産を開始した。今夏までに必要な乳剤が製造完了となるペースで準備が順調に進んでいる。2015年度に予定している大気球実験は、中口径のエマルションガンマ線望遠鏡をオーストラリアアリススプリングスより放球し、ガンマ線天体Vela pulsarを検出し、100MeV領域において最高精度でのイメージング性能を実証することを目指している。2014年度は、以下の準備研究を行った。(1)実験に使用する約50平米の原子核乾板の製造、(2)気球搭載風船型圧力容器の開発、(3)J-PARCニュートリノビームラインミューオンピットでのビーム照射試験による検出器空間校正手法開発。全ての搭載機器は2015年2-3月にオーストラリアへ発送した。

取得した飛跡データを解析し、ガンマ線起因の反応(γ→e+e-)を自動選出するソフトウェアの開発を行った。原子核乾板100層を積層したガンマ線コンバーター内に蓄積した反応の系統的な選び出しが現在進行中である。サブサンプルデータを用い、天体検出において主な背景事象となる大気ガンマ線の流束8.76±2.35E-3 [/cm^2/s/sr](>150MeV)を導出し、過去の測定と無矛盾な結果が得られた。気球打ち上げの時期が半年延期した。27年度が最終年度であるため、記入しない。2015年4月よりオーストラリア入りし、気球の打ち上げに備える。放球は5月を予定している。回収した原子核乾板をシドニー大学で現像処理し、日本へ送り返し、データ解析を開始する。当初の計画よりもフライトが半年延期となったが、検出器製作、原子核乳剤の量産ペースは順調に進んでいる。2014年11月のフライトに向けて全力で準備を進める。
内皮由来一酸化窒素およびPGI_2産生遊離の老化による異常と分子生理学的機序解明

老化ラットにおける内皮依存性血管拡張反応と老化血管でのnitric oxide(NO)およびプロスタサイクリン(PdI2)産生遊離能力の関係を分子生理学的に検討した.Langendorff灌流心臓において,エンドセリンやアンジオテンシンIIによる冠血管収縮作用は,加齢とともに増強され,その結果強い心筋抑制作用が現れる.その原因としては,内皮由来血管拡張性因子,なかでもNO産生放出の低下が大きく関与することが明らかになった.NOは冠灌流液中に遊離されたNO2-/NO3-を蛍光法で測定したものであり,冠血管内皮細胞の機能変化を反映している.もうひとつの重要な血管弛緩因子であるPGI2の産生遊離は,NOとは反対に,老化冠血管で若齢ラットより著明に増加していることが明らかとなった.老化冠動脈におけるNO産生低下およびPGI2産生の増加がどのようにして起こるのか,NO合成酵素,PGI2合成に関わる酵素であるcyclooxygenase(COX),PGI合成酵素,およびPGI受容体の発現変化をもとに考察した.ウエスタンブロットの結果,COX-1蛋白質およびPGI合成酵素蛋白質はともに老化ラットで増加していた.遺伝子発現の相違について,リアルタイム定量PCRを用いて検討した結果,COX-1,PGI合成酵素のmRNAは老化ラットにおいて増加していた.PGI受容体の発現には有意な差異は認められなかった.摘出した大動脈のNO合成酵素には発現量の変化が認められなかった.以上の結果から,老化個体においては,COX-1,PGI合成酵素mRNAの転写亢進によりそれらの発現が増加し,PGI2産生遊離の促進がおこるものと考えられた.NOの遊離量低下は,NO合成酵素の変化によるものとは認められなかったため,NOの分解系が老化によって変化している可能性があると考えられた.老化ラットにおける内皮依存性血管拡張反応と老化血管でのnitric oxide(NO)およびプロスタサイクリン(PdI2)産生遊離能力の関係を分子生理学的に検討した.Langendorff灌流心臓において,エンドセリンやアンジオテンシンIIによる冠血管収縮作用は,加齢とともに増強され,その結果強い心筋抑制作用が現れる.その原因としては,内皮由来血管拡張性因子,なかでもNO産生放出の低下が大きく関与することが明らかになった.NOは冠灌流液中に遊離されたNO2-/NO3-を蛍光法で測定したものであり,冠血管内皮細胞の機能変化を反映している.もうひとつの重要な血管弛緩因子であるPGI2の産生遊離は,NOとは反対に,老化冠血管で若齢ラットより著明に増加していることが明らかとなった.老化冠動脈におけるNO産生低下およびPGI2産生の増加がどのようにして起こるのか,NO合成酵素,PGI2合成に関わる酵素であるcyclooxygenase(COX),PGI合成酵素,およびPGI受容体の発現変化をもとに考察した.ウエスタンブロットの結果,COX-1蛋白質およびPGI合成酵素蛋白質はともに老化ラットで増加していた.遺伝子発現の相違について,リアルタイム定量PCRを用いて検討した結果,COX-1,PGI合成酵素のmRNAは老化ラットにおいて増加していた.PGI受容体の発現には有意な差異は認められなかった.摘出した大動脈のNO合成酵素には発現量の変化が認められなかった.以上の結果から,老化個体においては,COX-1,PGI合成酵素mRNAの転写亢進によりそれらの発現が増加し,PGI2産生遊離の促進がおこるものと考えられた.NOの遊離量低下は,NO合成酵素の変化によるものとは認められなかったため,NOの分解系が老化によって変化している可能性があると考えられた.この研究の第1の目的は老化ラットにおいて内皮依存性の血管拡張反応と老化血管でのNOおよびPGI2産生遊離能力の関係を決定することである.これまでの研究で我々は,ETやAngIIによる冠血管収縮作用が加齢とともに増強され,その結果強い心筋抑制作用が現れることを見出しており,原因として内皮由来血管拡張性因子,なかでもNO産生放出の低下が大きく関与することが明らかになった.さらに意外なことには,ETやAngIIによって刺激すると,もうひとつの血管内皮由来弛緩因子であるプロスタサイクリン(PGI2)の産生遊離が,NOとは反対に,老化冠血管で若齢ラットより増加していることを見いだした.このことから,プロスタサイクリンがNO産生放出の低下を補完して,冠動脈の収縮弛緩反応の極度の異常を抑制するのではないかと仮定し,実験をおこなった.その結果,老化動物の摘出ランゲンドルフ灌流心臓を用いた冠血流量測定では,サイクロオキシゲナーゼ抑制薬投与によっても,冠動脈収縮はさらなる増悪を見せなかった.このことから,プロスタサイクリンの心筋保護作用については否定的な結果が得られた.しかしながら,このことが老化組織におけるプロスタサイクリン受容体の減少に伴うものである可能性も高い.このような観点から,老化ラットの冠血管および大動脈におけるeNOSとiNOSそれぞれの発現の相互関係,および老化心臓でのCyclooxygenaseとPGI synthaseの発現の変化を現在検討中である.老化ラットにおける内皮依存性血管拡張反応と老化血管でのnitric oxide(NO)およびプロスタサイクリン(PGI2)産生遊離能力の関係を分子生理学的に検討した.Langendorff

灌流心臓において,エンドセリンやアンジオテンシンIIによる冠血管収縮作用は,加齢とともに増強され,その結果強い心筋抑制作用が現れる.その原因としては,内皮由来血管拡張性因子,なかでもNO産生放出の低下が大きく関与することが明らかになった.NOは冠灌流液中に遊離されたNO2-/NO3-を蛍光法で測定したものであり,冠血管内皮細胞の機能変化を反映している.もうひとつの重要な血管弛緩因子であるPGI2の産生遊離は,NOとは反対に,老化冠血管で若齢ラットより著明に増加していることが明らかとなった.老化冠動脈におけるNO産生低下およびPGI2産生の増加がどのようにして起こるのか,NO合成酵素,PGI2合成に関わる酵素であるcyclooxygenase (COX),PGI合成酵素,およびPGI受容体の発現変化をもとに考察した.ウエスタンブロットの結果,COX-1蛋白質およびPGI合成酵素蛋白質はともに老化ラットで増加していた.遺伝子発現の相違について,リアルタイム定量PCRを用いて検討した結果,COX-1,PGI合成酵素のmRNAは老化ラットにおいて増加していた.PGI受容体の発現には有意な差異は認められなかった.摘出した大動脈のNO合成酵素には発現量の変化が認められなかった.以上の結果から,老化個体においては,COX-1,PGI合成酵素mRNAの転写亢進によりそれらの発現が増加し,PGI2産生遊離の促進がおこるものと考えられた.NOの遊離量低下は,NO合成酵素の変化によるものとは認められなかったため,NOの分解系が老化によって変化している可能性があると考えられた.
慢性呼吸器疾患におけるサルコペニアの意義と新規バイオマーカーの探索

本研究の目的は慢性呼吸器疾患、とくに脳死肺移植待機中の慢性呼吸不全、間質性肺疾患および睡眠時無呼吸症候群におけるサルコペニアの意義と病態を、画像解析ならびに患者検体の蛋白および遺伝子の網羅的な発現解析によって明らかにすることである。平成30年度は、1)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者において、plueroparenchymal fibroelastosis(PPFE)といわれる特徴的な画像所見が予後に与える影響、2)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと長期予後の関連、3)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者における骨格筋量と予後の関連、4)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと骨格筋量の関連、5)抗ARS抗体陽性間質性肺炎におけるBAL検体のマイクロアレイ解析に基づく新規バイオマーカー(血清CXCL-13の意義)を検討した。1)、2)はpeer reviewのある英文誌に受理され、発刊された。3)、4)、5)は学会発表、論文化を目標に解析を進めている。3)、4)では骨格筋量がそれぞれ生命予後、健康関連QOLの予測因子となることを仮説としており、5)ではCXCL-13が抗ARS抗体陽性間質性肺炎におけるバイオマーカーとなることを示そうとしている。加えて、平成29年度に引き続き、6)特発性肺線維症をはじめとする難治性間質性肺疾患において、オミックス解析によるバイオマーカーの包括的探索を行うために、血液検体及び肺組織検体を前向きに集積している。この前向き研究では、画像や健康関連QOL、運動耐容能も併せて評価しており、症例の蓄積および長期の経過観察とともに、難治性慢性呼吸器疾患におけるサルコペニアの臨床的意義、新規バイオマーカーと治療標的の同定が期待される。本研究の目的は慢性呼吸器疾患、とくに脳死肺移植待機中の慢性呼吸不全、間質性肺疾患および睡眠時無呼吸症候群におけるサルペニアの意義と病態を、画像解析ならびに患者検体の蛋白および遺伝子の網羅的な発現解析によって明らかにすることである。平成28年度は、1)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者において、plueroparenchymal fibroelastosis(PPFE)といわれる特徴的な画像所見が予後に与える影響、2)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと長期予後の関連、3)睡眠時無呼吸症候群における骨格筋量と重症度の関連を検討した。1)PPFEは体重減少やサルコペニアとの関連が示唆されてきたが、肺移植待機中の慢性呼吸不全患者の予後とは直接関連せず、原疾患によって異なる意義を有することが示唆された。2)サルコイドーシスでは質問票で得られた健康関連QOLと長期予後が有意に関連することが示された。3)睡眠時無呼吸症候群では、CTで計測された骨格筋量の増加がむしろ重症化と関連した。また骨格筋の濃度低下も重症化と関連したことから、骨格筋内への脂肪沈着に伴う見た目の筋量増加が、睡眠時無呼吸症候群の病態と関連すると推測された。1)、2)、3)は学会発表済、もしくは論文投稿中である。また、4)特発性肺線維症をはじめとする難治性間質性肺疾患において、オミックス解析によるバイオマーカーの包括的探索を行うために、血液検体及び肺組織検体を前向きに集積している。4)この前向き研究では、画像や健康関連QOL、運動耐容能も併せて評価しており、症例の蓄積および長期の経過観察とともに、難治性慢性呼吸器疾患におけるサルコペアの臨床的意義、新規バイオマーカーと治療標的の同定が期待される。既存の臨床データを用いた解析はおおむね順調に進展しており、1)慢性呼吸不全患者におけるPPFE所見の意義、2)サルコイドーシスにおける健康関連QOLの予後予測能、3)睡眠時無呼吸症候群における骨格筋量、骨格筋濃度の意義については、英文論文を執筆中、もしくは投稿中である。いずれの研究も、慢性呼吸器疾患において、サルコペニアやそれに関連しうる胸部の画像所見、健康関連QOLが臨床的な意義を持つことを示しており、サルコペニアおよびその関連因子の研究が妥当性を有することを示唆している。また、1)慢性呼吸不全患者における骨格筋量の意義、2)サルコイドーシスにおける骨格筋量の意義を検討するかたちで、すでに研究の発展が試みられており、継続的な臨床研究が可能である。難治性間質性肺炎におけるオミックス解析は症例および検体の集積を進めている段階であり、特定のバイオマーカーやサルコペニア関連因子の同定には至っていない。症例の登録、縦断的なデータおよび検体の集積は順調に行われているが、経過観察期間が短いこともあって、オミックス解析そのものには着手できていない。ただし、検体の保存を含めてオミックス解析を行うための体制は十分に確保されている。平成29年度は、1)睡眠時無呼吸症候群における骨格筋量と重症度の関連、2)睡眠呼吸障害における遺伝的要素の寄与、3)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者において骨格筋量と予後の関連を検討した。3)は学会発表、論文化を目標に解析を進めている。

平成28年度に引き続き、4)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者において、plueroparenchymal fibroelastosis(PPFE)といわれる特徴的な画像所見が予後に与える影響、5)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと長期予後の関連を論文化し、投稿中である。PPFEは胸郭変形や体重減少との関連が報告されており、続報としてサルコペニアとの関連を検討する予定である。サルコイドーシスの健康関連QOLと長期予後が有意に関連することが明らかになっており、引き続き健康関連QOLとサルコペニアの関連を検討する。また、5)特発性肺線維症をはじめとする難治性間質性肺疾患において、オミックス解析によるバイオマーカーの包括的探索を行うために、血液検体及び肺組織検体を前向きに集積している。5)この前向き研究では、画像や健康関連QOL、運動耐容能も併せて評価しており、症例の蓄積および長期の経過観察とともに、難治性慢性呼吸器疾患におけるサルコペニアの臨床的意義、新規バイオマーカーと治療標的の同定が期待される。既存の臨床データを用いた解析はおおむね順調に進展しており、1)睡眠時無呼吸症候群における骨格筋量、骨格筋濃度の意義、2)睡眠呼吸障害における遺伝的要素の関与については、peer reviewのある英文誌で論文化された。一方、1)慢性呼吸不全患者におけるPPFE所見の意義、2)サルコイドーシスにおける健康関連QOLの予後予測能は、いずれも論文投稿中であるが発刊には至っていない。これらの研究は、慢性呼吸器疾患において、サルコペニアやそれに関連しうる胸部の画像所見、健康関連QOLが臨床的な意義を持つことを示しており、サルコペニアおよびその関連因子の研究が妥当性を有することを示唆している。また、1)慢性呼吸不全患者における骨格筋量の意義、2)サルコイドーシスにおける骨格筋量の意義を検討するかたちで、継続的な臨床研究が行われている。難治性間質性肺炎におけるオミックス解析は、引き続き症例および検体の集積を進めている。特定のバイオマーカーやサルコペニア関連因子の同定には至っていないが、症例の登録、縦断的なデータおよび検体の集積は順調である。検体の保存を含めてオミックス解析を行うための体制は十分に確保されているが、オミックス解析そのものには着手できていない。本研究の目的は慢性呼吸器疾患、とくに脳死肺移植待機中の慢性呼吸不全、間質性肺疾患および睡眠時無呼吸症候群におけるサルコペニアの意義と病態を、画像解析ならびに患者検体の蛋白および遺伝子の網羅的な発現解析によって明らかにすることである。平成30年度は、1)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者において、plueroparenchymal fibroelastosis(PPFE)といわれる特徴的な画像所見が予後に与える影響、2)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと長期予後の関連、3)肺移植待機中の慢性呼吸不全患者における骨格筋量と予後の関連、4)サルコイドーシスにおける健康関連QOLと骨格筋量の関連、5)抗ARS抗体陽性間質性肺炎におけるBAL検体のマイクロアレイ解析に基づく新規バイオマーカー(血清CXCL-13の意義)を検討した。1)、2)はpeer reviewのある英文誌に受理され、発刊された。3)、4)、5)は学会発表、論文化を目標に解析を進めている。3)、4)では骨格筋量がそれぞれ生命予後、健康関連QOLの予測因子となることを仮説としており、5)ではCXCL-13が抗ARS抗体陽性間質性肺炎におけるバイオマーカーとなることを示そうとしている。
大規模水域における流体運動と物質輸送現象に関する水理学的研究

本研究は、湖沼、貯水池、沿岸海域および河川などの大規模水域における流れと物質輸送を、ス-パ-・コンピュ-タを用いて精度良く予測するための数値解析モデルを開発するとともに、観測および実験結果と比較することにより検証することを目的としている。平成3年度に得られた成果を要約すれば次のようになる。1.汽水域におよび沿岸海域の流れと物質輸送:河口感潮域や汽水湖および沿岸海域の流れは、淡水と海水の混合による密度の非一様性だけでなく、潮位変動および河川流量んどの影響をうけ、複雑な挙動を示す。本研究では、従来解析が因難であった潮位変動が大きく設算格子間隔を越えるような場合について、自由表面変動の新たな解析法を開発することにより解析可能にした。さらに、この解析法を実水域に適用することにより、3次元的な塩水遡上および河口からの洪水流出過程を解析し、モデルの実用性を検証した。2.3次元解析による貯水池の富栄養化現象の解明:貯水池の富栄養化現象を解明するために、直交曲線座標系を用いて貯水池の複雑な平面形状を表現し、流れの滞留と水質指標の3次元的な分布特性を精度良く再現できる解析法を開発した。さらに、山間部の貯水池に適用し富栄養化の予測を行うことにより、水の華の発生などの水質現象と水理・水文条件の関係について新たな知見を得た。3.湖沼における密度流現象:成層化した湖沼の鉛直混合について、小スケ-ルの界面波が混合に及ぼす役割の着目し、水温計格子による多点同時観測結果から得られた水温鉛直分布形の時間変化過程を解析することにより、乱流拡散係数をモデル化した。4.一般曲線座標系を用いた高精度数値解析法の開発:複雑な路床形状を有する水域における密度流現象を解析するために、路床形状の正確な表現に有利な一般曲線座標系による鉛直2次元モデルを開発した。5.混相流および密度流のモデリングと諸係数の設定:本研究で対象とする流れのほとんどは空間的に密度が非一様であり、かつ土砂などの固体を含む複雑な流れである。平成3年度では、土砂と流れの相互作用を考慮した混相乱流の諸係数の設定法を考察した。本研究は、湖沼、貯水池、沿岸海域および河川などの大規模水域における流れと水質パラメ-タを、ス-パ-・コンピュ-タを用いて精度よく予測するためのシミュレ-ション・モデルの開発と、その検証を目的としている。平成元年度に得られた成果は次のようである。(1)湖沼における流れと物質輸送;細・粗格子を併用した三次元モデルを開発し、局所的に卓越する流れ(河川流入部の流れや琵琶湖南北湖間に生ずる交流など)を詳細かつ短時間に再現可能とした。(2)貯水池における流れと物質輸送;貯水池の複雑な境界形状を考慮できるように、直交曲線座標系を用いた三次元モデルを開発し、従来の鉛直二元モデルでは表わしえなかった局所的な流れおよび水質パラメ-タの挙動を再現可能にした。(3)沿岸海域における流れと物質輸送;洪水、高潮に及ぼす埋立の影響、潮汐と流入河川水の関連について、上記(1)の三次元モデルを用いて解析し、観測値との比較により検証した。さらに、水理模型実験を併用して流れの再現を行うときに問題となる模型縮尺の合理的選定について縮尺の異なる模型を用いた考察を行った。(4)河川感潮部の流れ;水位変動が格子間隔より大きいばあいにも計算可能なモデルを開発するとともに、格子間隔を十分小さくすれば塩分濃度、流速分布の観測結果が良好に再現されることを示した。(5)河川合流部での水質混合;一般曲線座標系を用いた平面二次元流れと水質混合のモデルを開発し、現地河川に適用することにより観測結果と計算結果を比較し、モデルの妥当性を検証した。(6)モデル係数の合理的設定;予測精度の向上には、乱流拡散係数、渦動粘性係数の合理的設定が必要であり、これらの係数と乱れ特性量の関係を理論的に考察し、拡散実験結果との比較により検証した。本研究は、湖沼、貯水池、沿岸海域および河川などの大規模水域における流れと水質指標を、ス-パ-・コンピュ-タを用いて精度よく予測するための数値解析モデルを開発するとともに、観測および実験結果と比較することにより検証することを目的としている。平成2年度に得られた成果を要約すれば次のようになる。1.湖沼における流れと物質輸送:湖沼の水温分布の時間変化過程を水温計格子を用いて観測し、水温分布形の変化に伴う拡散係数分布の変化過程を明らかにした。得られた結果をこれまでに開発された数値解析モデルに組み込むことにより、モデルの高精度化に努めた。2.貯水池における流れと物質輸送:平成元年度までに開発された、直交曲線座標系を用いた3次元解析モデルを実貯水池に適用し、計算結果と観測結果を比較することによりモデルを検証した。さらに、貯水池の複雑な地形形状が水質指標に及ぼす影響について考察し、流れの滞留時間と植物プランクトン濃度の関係を見いだした。3.河口感潮域および汽水域における塩水遡上:これまでに開発された3次元解析モデルを実際の汽水域に適用することにより、塩水遡上現象の再現を試みた。さらに、観測結果と比較することにより、基礎式および境界条件に関する問題点を明確にし、モデルを改善するための指針を得た。

4.河川における水質の横拡散:これまでに開発された一般曲線座標系を用いた平面二次元解析モデルを実河川に適用し、観測結果との比較よりモデルを検証するとともに、流況と水質の拡散過程の関係を明らかにした。5.混相流・密度流における諸係数の設定:混相流・密度流の基本的な流れを再現するための拡散係数および粘性係数の設定法をまとめ、数値解析モデルの高精度化のための有益な知見を得た。本研究は、湖沼、貯水池、沿岸海域および河川などの大規模水域における流れと物質輸送を、ス-パ-・コンピュ-タを用いて精度良く予測するための数値解析モデルを開発するとともに、観測および実験結果と比較することにより検証することを目的としている。平成3年度に得られた成果を要約すれば次のようになる。1.汽水域におよび沿岸海域の流れと物質輸送:河口感潮域や汽水湖および沿岸海域の流れは、淡水と海水の混合による密度の非一様性だけでなく、潮位変動および河川流量んどの影響をうけ、複雑な挙動を示す。本研究では、従来解析が因難であった潮位変動が大きく設算格子間隔を越えるような場合について、自由表面変動の新たな解析法を開発することにより解析可能にした。さらに、この解析法を実水域に適用することにより、3次元的な塩水遡上および河口からの洪水流出過程を解析し、モデルの実用性を検証した。2.3次元解析による貯水池の富栄養化現象の解明:貯水池の富栄養化現象を解明するために、直交曲線座標系を用いて貯水池の複雑な平面形状を表現し、流れの滞留と水質指標の3次元的な分布特性を精度良く再現できる解析法を開発した。さらに、山間部の貯水池に適用し富栄養化の予測を行うことにより、水の華の発生などの水質現象と水理・水文条件の関係について新たな知見を得た。3.湖沼における密度流現象:成層化した湖沼の鉛直混合について、小スケ-ルの界面波が混合に及ぼす役割の着目し、水温計格子による多点同時観測結果から得られた水温鉛直分布形の時間変化過程を解析することにより、乱流拡散係数をモデル化した。4.一般曲線座標系を用いた高精度数値解析法の開発:複雑な路床形状を有する水域における密度流現象を解析するために、路床形状の正確な表現に有利な一般曲線座標系による鉛直2次元モデルを開発した。5.混相流および密度流のモデリングと諸係数の設定:本研究で対象とする流れのほとんどは空間的に密度が非一様であり、かつ土砂などの固体を含む複雑な流れである。平成3年度では、土砂と流れの相互作用を考慮した混相乱流の諸係数の設定法を考察した。
ニワトリES細胞株の基礎と応用に関する研究

本研究では,ニワトリからいろいろな細胞に分化可能な胚性幹細胞(ES)細胞の樹立を行い,培養時や生体内でのES細胞の特徴を解析するといった基礎研究から遺伝子組換えニワトリの作出への応用研究を行った。その結果,本研究で樹立したニワトリES細胞は試験管内で多分化能と生殖細胞分化能を維持し,また生体内でもいろいろな細胞に分化できること,また緑色蛍光タンパク質の全身発現や眼が赤く光る遺伝子改変キメラニワトリ(GO)の作出に成功した。平成19年度には、ニワトリES細胞のストックの拡大と評価方法の確立、遺伝子改変ベクターの構築を行い以下の成果を得た。1.新規ES細胞は40種樹立した。3.ES細胞を免疫染色により簡便に評価するために、chNanog,CVHおよびchiwiに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製した。4.作出した抗体を用いて、ES細胞を評価したところ樹立したES細胞はすべてchNanog陽性であり、その中にCVH及びchiwiの二重陽性の細胞が存在することがわかった。5.2-4までの評価により、優秀なES細胞を4種選抜し、レシピエント胚への移植実験によりES細胞のキメラ形成能を評価した。その結果、選抜・評価したES細胞は極めて高頻度にキメラ形成能を有していることがわかった。6.遺伝子改変ベクターの構築では、一種(1)については既に同じコンセプトのペクターが存在することが判明し、理化学研究所・丹羽仁博士より分与を受けた。もう一種のベクター(2)については計画通りベクターの構築を完了した。7.(2)のベクターに関しては、平成20年度以降の実験で相同遺伝子組換えに利用していくことを考慮し、高頻度に組換え細胞を得るために、インサーション型のベクターも同時に構築した。8.作出したベクターはDT-40細胞株を用いた機能試験を行い、いずれも目的どおり機能することを確認した。以上のように、平成19年度に計画した研究はすべて年度内に完了した。来年度はこれらの成果をもとに実際に遺伝子改変ニワトリの作出研究を進める。平成20年度は,樹立したニワトリES細胞に対して2種の遺伝子改変ベクター(ランダムインテグレーションによりGFP遺伝子を導入するベクターと相同遺伝子組換えによりδクリスタリン遺伝子下流にDsRed遺伝子を導入するベクター)を導入し,薬剤による選抜・クローニングを行いGO世代の遺伝子改変ニワトリの作出研究を行い,以下の成果を得た。1)GFP遺伝子を導入したES細胞は,薬剤選抜によりin vitroの全ての細胞で緑色蛍光タンパク質を発現し,また多能性維持マーカーであるNanogと生殖細胞分化マーカーであるCvhの発現が維持されていた。2)GFP発現ES細胞をレシピエント胚へ移植することにより,ES細胞の多分化能を観察したところ,胚のほぼ全身と移動期の始原生殖細胞で緑色蛍光が観察された。3)GFP発現ES細胞を移植したレシピエント胚はそのまま発生させ,多数の孵化個体(GO)を作出した。4)3種のES細胞に対してエレクトロポレーション法により相同遺伝子組換えベクターを導入したところ,その内の一種で相同遺伝子組換え細胞が得られた。5)相同遺伝子組換えES細胞は,限界希釈法により細胞クローニングを行い,最終的にδクリスタリン遺伝子下流にDsRed遺伝子が挿入されたES細胞株の取得に成功した。6)このES細胞株を移植したレシピエント胚はそのまま発生させたところ,クリスタリンタンパク質が発現する眼球においてDsRed(赤色蛍光)が水晶体線維細胞で特異的に発現することが確認された。以上の成果は,ニワトリにおいて世界で初めてジーンターゲティングが可能であることを示した知見であり,マウスと同様ノックイン・アウトニワトリの作出を可能とし,基礎研究分野から応用研究分野まで幅広く利用可能な技術となりえる成果である。平成21年度は,ランダムインテグレーションによりGFP遺伝子を導入したES細胞と相同遺伝子組換えによりδクリスタリン遺伝子下流にDsRed遺伝子をノックインしたES細胞から,G0世代とG1世代の遺伝子改変ニワトリの作出研究を行った。また,各種阻害剤の添加によるES細胞培養系の改変を行い,以下の成果を得た。1) GFP遺伝子を導入したES細胞とDsRed遺伝子をノックインしたES細胞からG0世代のキメラニワトリをそれぞれ10羽および5羽作出し,性成熟後,人工授精によりG1世代の作出実験を行ったが,G1世代の作出はできなかった。2)遺伝子改変ES細胞を移植するレシピエント胚をガンマ線照射処理したキメラ胚では,効率良くGFP発現ES細胞が始原生殖細胞に分化し,生殖巣へ移動していることが観察された。3)人工授精に使用したキメラニワトリの精子並びに飼育途中に死亡したメスのキメラニワトリの卵巣から抽出したゲノムDNAを用いて,改変遺伝子の検出を行ったところ,精子および卵巣でGFP遺伝子が検出されたことから,遺伝子改変ES細胞が雌雄の両生殖細胞までは分化できていることがわかった。

即ち1)でG1世代が得られなかった理由として,効率の低さが考えられ,現在性成熟を迎えようとしているレシピエント胚をガンマ線照射処理したキメラニワトリでのG1世代の誕生が期待された。4)各種阻害剤の添加によるES細胞培養系の改変では,MEKのリン酸化阻害剤並びにROCK阻害剤がES細胞の培養系に効果的に機能することがわかった。MEKのリン酸化阻害剤は,ES細胞の多能性維持と増殖に機能し,ROCK阻害剤は低細胞密度からの増殖に有効であることも判明した。以上のように平成21年度中にG1世代の遺伝子改変ニワトリの誕生はできなかったが,実施したレシピエント胚をガンマ線照射処理やES細胞の培養系の改変により,今後その可能性が十分に期待できる成果を得た。
法面被覆植物として活用可能な雑草の探索とその土壌侵食防止機能の解明

法面被覆植物の土壌侵食抑制機能はその生活型の相違によるとの観点から,被覆植物の生活型が土壌侵食抑制に及ぼす効果を検討した。実験は,傾斜10度のマサ土法面において,2m(W)×5m(L)の試験枠を設置し,下端に設置した導入板と貯水槽により,降雨毎の表面流去水並びに土壌侵食量を実測した。法面被覆植物としては,厳しい環境への適応力が高いと考えられ,かつ生活型の異なるギョウギシバ,ダイコンドラおよびヨモギの3草種を供試し,対照区としての裸地区と比較した。得られた結果は以下の通りである。(1)危険降雨期は5月11月であり,年降雨量が少ない場合でも,3mm/10min以上の降雨の頻度が高ければ,土壌侵食量は多くなる。(2)対照区としての裸地区の土壌侵食量はわが国の許容量の限界値であったが,ヨモギ区とギョウギシバ区においては,許容量以下の侵食量であり,法面被覆植物の土壌侵食軽減効果が確認・定量化できた。草種間では,直立型のヨモギが優れていた。この傾向は,以下の現象も同様であった。(3)この効果は,植物体の根系による土壌間隙の増大や植物体から供給される有機物分解(腐植)による土壌団粒の形成等による粗間隙の増大のために,降雨の降下浸透量の増大,地表面流去水の減少が生じることを明らかにした。(4)また,腐植の増大は土壌のCECを増大させ,土壌構造のさらなる発達と,土壌環境を法面被覆植物の生育に適するものに改善する効果がある。(5)法面被覆植物による酸性雨のpH軽減効果が認められ,土壌侵食抑制効果のみならず,大気環境悪化の生態系への影響を軽減する効果も確認できた。法面被覆植物の土壌侵食抑制機能はその生活型の相違によるとの観点から、被覆植物の生活型が土壌侵食抑制に及ぼす効果を検討した。実験は、傾斜10度のマサ土法面において、2m(W)×5m(L)の試験枠を設置し、下端に設置した導入板と貯水槽により、降雨毎の土壌侵食量を実測した。法面被覆植物としては,厳しい環境への適応力が高いと考えられ,かつ生活型の異なるギョウギシバ,ダイコンドラおよびヨモギの3草種を供試し、対象区としての裸地区と比較した。開設1年目における各試験区の特性は以下の通りである。1.裸地区の流出高1とすると、ヨモギ区0.62、ダイコンドラ区0.67、ギョウギシバ99区0.65、ギョウギシバ96区0.63であり、被覆植物の表面流抑制効果は無植生に比べて約3540%と顕著であった。2.裸地区の土壌侵食量を1(土壌侵食量10.5kg10m^<-2>)とすると、ヨモギ区0.09、ダイコンドラ区0.42、ギョウギシバ99区0.14、ギョウギシバ96区0.16であり、被覆植物の土壌流亡抑制力は無植生に比べて約1016%と顕著であった。ダイコンドラ区の値が大きいのは植被率が小さく裸地に近いためである。3.現時点では、表面流抑制効果や土壌流亡抑制力に対する草種間差は有意ではないが、総葉面積、草高、根張り、群落形成等の要因から見ると、ヨモギが早期緑化にすぐれ、かつ侵食防止能に優れている傾向が認められた。4.法面被覆植物による酸性雨のpH軽減効果が認められ、土壌侵食抑制効果のみならず大気環境悪化の生態系へ影響軽減効果も確認できた。

法面被覆植物の土壌侵食抑制機能はその生活型の相違によるとの観点から,被覆植物の生活型が土壌侵食抑制に及ぼす効果を検討した。実験は,傾斜10度のマサ土法面において,2m(W)×5m(L)の試験枠を設置し,下端に設置した導入板と貯水槽により,降雨毎の土壌侵食量を実測した。法面被覆植物としては,厳しい環境への適応力が高いと考えられ,かつ生活型の異なるギョウギシバ,ダイコンドラおよびヨモギの3草種を供試し,対象区としての裸地区と比較した。現在までに得られた結果は以下の通りである。(1)危険降雨期は5月11月であり,年降雨量が少ない場合でも,3mm/10min以上の降雨の頻度が高ければ,土壌侵食量は多くなる。(2)対象区としての裸地区の土壌侵食量はわが国の許容量の限界値であったが,ヨモギ区とギョウギシバ区においては,許容量以下の侵食量であり,法面被覆植物の土壌侵食軽減効果が確認・定量化できた。(3)この効果は,植物体の根系による土壌間隙の増大や植物体から供給される有機物分解(腐植)による土壌団粒の形成等による粗間隙の増大のために,降雨の降下浸透量の増大,地表面流去水の減少が生じることを明らかにした。(4)また,腐植の増大は土壌のCECを増大させ,土壌構造のさらなる発達と,土壌環境を法面被覆植物の生育に適するものに改善する効果がある。(5)法面被覆植物による酸性雨のpH軽減効果が認められ,土壌侵食抑制効果のみならず,大気環境悪化の生態系への影響を軽減する効果も確認できた。実験は,傾斜10度のマサ土法面において,2m(W)×5m(L)の試験枠を設置し,下端に設置した導入板と貯水槽により,降雨毎の表面流去水並びに土壌侵食量を実測した。現在までに得られた結果は以下の通りであり,経年の傾向に変化はない。得られた結果は以下の通りである。
ユビキチン・プロテアソーム系の破綻に起因する神経変性疾患のNMR構造生物学

神経変性疾患にかかわるタンパク質の三次元構造、相互作用、凝集機構を原子レベルの分解能で解明することにより、神経変性疾患の発症メカニズムの分子構造論的基盤を与えることを目指してきた。今年度は、特に、ユビキチン-プロテアソームシステムの破綻に着目し、マシャド・ジョセフ病原因遺伝子産物であるataxin-3および家族性パーキンソン病原因遺伝子産物であるalpha-synuclein、parkinを対象に超高磁場NMR装置を用いた解析を行った。alpha-synucleinは、"natively unfolded protein"とよばれ、特定の高次構造を形成しておらずNMRシグナルの重なりが激しく解析が困難であるが、超高磁場NMR装置の世界最高分解能を積極的に活用して解析を行い、抗alpha-synuclein抗体や14-3-3etaのalpha-synuclein上の結合部位を同定することに成功した。また、ataxin-3のジョセフィンドメインについてNMRを用いた三次元構造決定を行い、鎖長の定まったポリユビキチン鎖を用いて、ポリユビキチン鎖とataxin-3の相互作用様式をNMRにより明らかとした。さらに、Abeta(1-40)をユビキチンとの融合型として大腸菌による大量発現に成功し、Abetaの構造解析を行う基盤を整えた。安定同位体標識を施したAbeta(1-40)を調製し、さまざまな分子との相互作用やその凝集による構造変化を捉えることが可能となった。
多種イオンプラズマにおける大振幅磁気音波

本研究計画で得られた結果を以下に列挙する。主成分としての水素以外にヘリウム、鉄などの重イオンを含むプラズマ中では、磁気音波衝撃波は全ての重イオン粒子をほぼ同じスピードに加速する事を理論と粒子シミュレーションで示した。2種類のイオンを含むプラズマ中の小振幅磁気音波の伝播を、理論および3流体モデルに基づくシミュレーションで調べた。まず無衝突プラズマにおける、直角伝播の高周波モードパルスの減衰率を理論的に導き、それがシミュレーション結果とよく一致することを確かめた。更に、低周波モードについても減衰が存在する事を示した。非熱的な高エネルギーイオンを含むプラズマ中を磁気音波が伝播する時、高エネルギーイオンの一部は衝撃波によってさらに高いエネルギーに加速されることを見出した。この現象は直角伝播衝撃波でも斜め伝播の場合でも起こる。斜め伝播の場合に特筆すべきは、波と共に動き、従って、一つの衝撃波により何度もこの加速を受ける粒子が存在する事である。衝撃波によって超相対論的電子が生成される事を、粒子シミュレーションで示した。この現象は比較的強磁場中の、大振幅斜め衝撃波において起こる。シミュレーションで観測された電子のロレンツ因子は100を超える。強磁場中大振幅衝撃波(従って伝播速度は光速に近い)における電磁場の強度を理論的に求め、それを基にイオンの運動を解析した。これらの結果は粒子シミュレーションによって確認された。本年度は、プラズマに多種類のイオンが存在することの効果に注目して、不安定性、非線形波動、および粒子加速の研究を理論とシミュレーションを用いて行なった。2種類のイオンを含むプラズマ中の磁気音波(高周波モード)の伝播を、理論および3流体モデルに基づくシミュレーションで調べた。無衝突プラズマにおける直角伝播の小振幅パルスの減衰率を理論的に導き、それがシミュレーション結果とよく一致することを確かめた。非熱的な高エネルギーイオンを含むプラズマ中を磁気音波が伝播する時の、粒子と波の相互作用を調べた。非熱的な高エネルギーイオンの一部は衝撃波によってさらに高いエネルギーに加速されることが、シミュレーションによって見出された。この加速は、水素イオンにも、少数粒子である重イオンについても同じように起こる。簡単な物理的描像に基づいてエネルギーの増分を理論的に導いた。この結果は、多数の磁気音波パルスが存在する時、高エネルギーイオンが次々に更に高いエネルギーに変化することが可能であることを示唆する。更に、強磁場中の衝撃波について調べた。磁場が強くなるにつれ、アルヴェン速度は光速と同じオーダーとなり、衝撃波の速度は光速に近づく。このような場合の衝撃波における電磁場の強さを伝播速度の関数として理論的に求めた。伝播速度が光速に近づくと、電磁場は急激に強くなり、それとともに、縦成分に対して横成分が卓越してくる。これらの結果は相対論的な粒子シミュレーションの結果とよく一致した。更に、これらの結果を基に、イオン運動を詳細に解析した。本年度は2年計画の最終年度に当たり、昨年度に引き続き、多種イオンプラズマ中の輸送、非線形波動、および粒子加速の研究を理論とシミュレーションを用いて行なった。2種類のイオンを含むプラズマ中の磁気音波の伝播を、理論および3流体モデルに基づくシミュレーションで調べた。まず、高周波モードの無衝突プラズマにおける直角伝播の小振幅パルスの減衰率を理論的に導き、それがシミュレーション結果とよく一致することを確かめた。高エネルギーイオンの一部は衝撃波にようてさらに高いエネルギーに加速されることが、電磁的粒子シミュレーションによって見出された。この現象は最初、直角伝播衝撃波で見つけられたが、斜め伝播の場合にも同じような加速機構が存在する事が確認された。斜め伝播の場合に特筆すべきは、波と共に動き、従って、一つの衝撃波により何度もとの加速を受ける粒子が存在する事である。
アミノ酸過剰生産誘導性ストレスに対する応答遺伝子の機能解析と応用に向けた基盤構築

コリネ型細菌のグルタミン酸過剰生産を誘導するストレスに応答して転写量が増大する遺伝子計6種類について、各遺伝子の破壊株および増幅株を用いて機能解析を行った。増幅株では対照株との顕著な違いが観察されなかった。一方、2種類の遺伝子破壊株では、それぞれビオチン制限条件下あるいはTween40添加条件下で対照株に比べ生育ならびにグルタミン酸生産性の上昇傾向が認められ、別の1種類の遺伝子破壊株ではペニシリン添加条件下で低下傾向が認められた。また、GFPおよびRFPをレポーターとするプロモータアッセイ系を構築し、機能未知遺伝子の上流領域にストレス応答性プロモータが存在するかどうか、解析を進めている。コリネ型細菌Corynebacterium glutamicumにグルタミン酸を過剰に生産させることができる3種類のストレス条件下(ビオチン制限培養、脂肪酸系界面活性剤Tween40添加培養、ペニシリン添加培養)では、3条件のいずれかにおいて大きく転写量が増大する遺伝子、及びこれら3条件いずれにおいても転写量が増大する遺伝子が計7種類存在する。ストレスに応答するこれら7種類の遺伝子の共通点は、1)5090アミノ酸残基程度の小さいタンパク質をコードすること、2)コリネバクテリウム属細菌にのみ相同性の高い遺伝子が見出される新奇な遺伝子であること、3)相同遺伝子の機能が明らかに示された例がなく機能未知であること、である。本年度は、7種類の機能未知遺伝子のうち6種類について、それらの機能を調べるために増幅株と欠損株をそれぞれ構築してグルタミン酸過剰生産誘導性ストレスに対する応答性を調べた。増幅株については、いずれの増幅株も対照株との差異は認められなかった。一方、ビオチン制限培養条件下において、3種類の遺伝子破壊株については、対照株に比べ生育が上昇する傾向が認められたが、グルタミン生産性には差異が認められなかった。1種類の遺伝子破壊株については対照株に比べ生育ならびにグルタミン酸生産性の低下傾向が認められた。残り2種類の遺伝子破壊株については、対照株に比べ生育ならびにグルタミン酸生産性の上昇傾向が認められた。また、機能未知遺伝子の非ストレス条件下とストレス条件下における発現状態を比較する目的で、コリネ型細菌におけるプロモーターアッセイ系を構築した。今年度は、解析対象としている遺伝子の機能を明らかにする目的で、これまでに構築した7種類の機能未知遺伝子のうち6種類の遺伝子の増幅株と破壊株を用いて、グルタミン酸過剰生産誘導性ストレスに対する応答性を昨年度に引き調べた。しかし、増幅株、破壊株どちらについても十分な再現性を認められる実験結果が現時点では得られておらず、明確な結論を下すのが難しい。増幅株および欠損株の再構築を含めて実験材料を見直し、実験条件を再検討中である。昨年度完了していなかった残り1種類の遺伝子の破壊株構築についてもプロセスを見直しながら継続している。また、機能未知遺伝子上流領域に存在すると想定されるストレス応答性プロモータを同定する目的で、昨年度構築したGFPをレポーターとする系を用いてプロモータアッセイを試みた。まだ培養条件や測定条件を含め検討を重ねている予備的な段階にあるが、ある程度の定性的な評価は可能なことが分かった。しかし、現在の実験系ではGFPの存在量を再現良くかつ定量的に評価して、どの領域がストレス応答性プロモータを含むのかどうかの判断は難しい。自家蛍光の影響をどのように排除するか、どのように測定値を標準化するかが現時点における主な課題である。RFPをレポーターとする系も構築し、どちらの系がコリネ型細菌におけるプロモータアッセイとして優れているかを検討中である。今後は、これまでに構築した研究基盤を発展させ、ストレス応答性遺伝子の機能を明らかにするとともに、ストレス応答性遺伝子産物ないしストレス応答性プロモータを利用した有用物質生産系の開発を続けたい。当初目標としていた7種類の機能未知遺伝子のうち6種類については、増幅株ならびに破壊株を構築した。アミノ酸過剰生産誘導性ストレスに対する応答性を調べ、増幅株では対照株との差異が認められなかったものの、ビオチン制限培養条件下においては、3種類の遺伝子破壊株では対照株に比べ生育が上昇する傾向があるもののグルタミン酸生産性には差異が認められないこと、1種類の遺伝子破壊株では対照株に比べ生育ならびにグルタミン酸生産性が低下する傾向があること、残り2種類の遺伝子破壊株では生育ならびにグルタミン酸生産性が対照株に比べ上昇する傾向があること、を見出した。また、当初目標どおり、非ストレス条件下とストレス条件下における機能未知遺伝子の発現状態を比較する目的でコリネ型細菌におけるプロモータアッセイ系を構築した。研究活動スタート年度としては、おおむね順調に進展していると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初目標としていた7種類の機能未知遺伝子について調べるために、未完成になっている1種類の遺伝子についてその増幅株および破壊株を構築し、アミノ酸過剰生産誘導ストレス条件下でのグルタミン酸生産性について調べる。

すでに構築した6種類の破壊株について、ビオチン制限培養条件下以外のアミノ酸過剰生産誘導性ストレス条件(Tween40添加培養、ペニシリン添加培養)でのグルタミン酸生産性について調べる。また、当初計画通り、構築したプロモータアッセイ系を用いて、非ストレス条件下とストレス条件下における7種類の機能未知遺伝子の発現状態を比較する。25年度が最終年度であるため、記入しない。