hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓型アデニル酸シクラーゼを標的にする高齢化社会にむけた新しい心不全治療

本研究成果はPCT国際出願を平成23年10月20日に行ったが、平成25年3月12日の知的財産審査委員会でJSTの支援が決定した(整理番号S2011-0050)。3)これまでの動物実験データの再現性の確認:平成23年度より開始した心不全ならびに不整脈マウスモデルのN数を増やし再現性を確認した。心不全モデルに関しては論文発表を行った(Am J Physiol Heart Circ Physiol 302, H2622-2628, 2012)。新規AC5特異的抑制薬が、平成22年度に確認した既存のAC5特異的抑制剤である抗ヘルペス薬(ビダラビン:商品名:アラセナA)と同程度に心不全ならびに不整脈抑制作用を有することが確認された。また平成22年度中に得られた研究成果をもとに2件の特許申請を行うことができた。すなわちビダラビンが、心機能や呼吸抑制を起こさずにベータ遮断薬と同等の心不全ならびに不整脈治療が可能であるという特許申請である(特願2010-240301,特願2011-222421,PCT/JP2011/74098)。平成23年度には横浜市立大学付属病院倫理委員会にて臨床治験が承認(B110512007)され、平成24年1月から循環器内科、心臓血管外科、皮膚科にてビダラビンの不整脈効果について医師主導型臨床治験が開始された。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22年度より大手製薬メーカーとの共同研究を開始したが、同製薬会社の開発研究部門との協議をおこない臨床試験に時間のかかる心不全で最初の適応を申請するのではなく、短期間で効果判定が可能な不整脈での適応取得を目指して臨床試験を進めていくことにした。[研究スケジュール](1)平成24年前半:現在進行中の術後心房細動症例(心臓血管外科)、心室性期外収縮ならびに一過性心房細動症例(循環器内科)、不整脈合併帯状疱疹症例(皮膚科)をターゲットにして同薬剤のヒトでの治療効果に関するデータのさらなる蓄積を行い、医師主導型臨床試験を継続してビダラビンの不整脈治療薬としての新規適応を取得する。(2)平成23年度のAC5に対する特異的抑制作用が確認された新規化合物の毒性試験を行う。動物実験で心不全ならびに不整脈抑制効果が確認できた投与量(15mg/kg/day 7日間)を投与した群と非投与群の肝機能(GPT,GOT)、腎機能(BUN,クレアチニン)、行動解析を行う。またビダラビンは中枢移行性があるが、新規化合物は水溶性のため中枢移行性がないことが期待される。抗ヘルペス剤としてビダラビンを使用する場合は投与期間が10-14日であるが、心不全あるいは不整脈が治療の対象疾患である場合は投与期間が長期になる。したがって中枢移行性は無いことが望ましい。新規化合物の中枢移行性についてアイソトープ標識法あるいはストレキニーネ投与実験(投与開始-痙攣-死亡までの時間を測定)で評価する。
胎盤形成異常における酸化ストレスの与える影響の解析

癒着胎盤、前置胎盤、妊娠高血圧症候群(PIH)、正常胎盤および胎盤床を用いて、NK細胞やマクロファージのマーカーであるCD56やCD68、およびTLR3、TLR4、TRXの免疫染色法を行った。胎盤のトロホブラストにおけるTRX陽性率は絨毛膜、絨毛、脱落膜ともにPIH胎盤で増加、前置胎盤・癒着胎盤で減少した。また胎盤におけるCD56発現はPIHで発現増加を認めた。TLR、CD68、VEGFには差を認めなかった。TRXは前置胎盤・癒着胎盤で発現減少を認めた。今後、診断マーカーや治療の標的としての可能性に期待が持てた。正常な胎盤形成には、トロポブラストの脱落膜やらせん動脈への侵入、そして動脈壁のリモデリングを必要とする。妊娠高血圧症候群(PIH)胎盤において炎症細胞の活性化やToll-like Receptorの亢進が報告され、トロホブラストの侵入にも関与すると言われている。また、PIH胎盤において酸化ストレスマーカーであるThioredoxin(TRX)の発現が増加することも報告されている。一方、前置胎盤患者ではPIHの発症が胎盤位置正常の妊婦に比べて1/2以下と報告されている。今回、これらの分子に関して前置胎盤、特に癒着胎盤での発現解析を行った。妊娠30週以降で帝王切開分娩となった胎盤(対照群7例、PIH8例、前置胎盤7例、癒着胎盤6例)と胎盤床(対照群5例、癒着胎盤5例)を用いた。PIH群の血圧が高い以外は患者間の年齢や妊娠週数などに有意差はなかった。免疫染色法にてTRX、TLR4、TLR3、NK細胞のマーカーであるCD56、マクロファージのマーカーであるCD68、およびVEGFに関して発現程度の差を絨毛膜、絨毛、脱落膜、胎盤床ごとに比較した。TRXに関しては、PIH群でやや発現増加を認め、逆に前置胎盤・癒着胎盤では胎盤のどの部位にもほとんど発現が見られなかった。胎盤床においてはほとんど違いがなかった。TLR4や3に関してもPIHで発現が強く、前置胎盤や癒着胎盤で発現が見られない傾向があったが、全体的に発現が弱かった。CD56に関してはPIHの脱落膜で発現増加傾向を認め、癒着胎盤の胎盤床で発現減弱傾向を認めた。CD68やVEGFに関してほとんど違いは見られなかった。今回、前置胎盤・癒着胎盤でTRX発現減少を認めた。これは前置胎盤では酸化ストレスが減少しており、PIHが少なくなる病態を反映している可能性が考えられた。今回、in vitroにおける検討では、胎盤形成およびそれに基づく病態発生に大きな役割を果たす抗酸化システムに注目し、低酸素・酸化ストレス環境下におけるトロホブラストに与える影響を解析した。さらに臨床検体における検討では、前置胎盤・癒着胎盤/妊娠高血圧症候群/正常患者の胎盤において胎盤形成異常に影響する因子を分析した。我々はこの研究が、前置胎盤・癒着胎盤やPIHなどの胎盤形成異常の発症メカニズム、および低酸素・酸化ストレス環境下胎盤が母児の予後に与える影響などの解明に貢献できることを期待した。我々の予備実験において、前置胎盤・癒着胎盤の臨床検体では、対象群に比較しチオレドキシンの発現が減少していることを認めた。また、ヒト絨毛癌のcell lineであるBeWo細胞でトロホブラストの侵入実験を行ったところ、低酸素環境において侵入は増加し、チオレドキシン発現が減弱することを認めた。また、チオレドキシンを投与したところトロホブラストの侵入は減少した。胎盤のトロホブラストにおけるTRX陽性率は絨毛膜、絨毛、脱落膜別に正常(2/7、4/7、2/5)、PIH(3/8、4/8、5/8)、前置胎盤(0/7、1/7、1/6)、癒着胎盤(1/6、0/6、0/6)。胎盤床では正常(4/5)、癒着胎盤(2/5)であった。また胎盤におけるCD56発現はPIHで発現増加を認め、胎盤床においては癒着胎盤で減少傾向であった。TLR、CD68、VEGFの発現程度には差を認めなかった。トロホブラスト侵入規定因子の検討に関しては症例数を増やす必要がある。酸化ストレスマーカーであるTRXに関しては前置胎盤・癒着胎盤で発現減少を認めた。前置胎盤では酸化ストレスが減少しており、PIHが少なくなる病態を反映している可能性が考えられた。前置胎盤・癒着胎盤の患者検体はこれまで集積したものも含め今後の解析準備が十分可能な段階である。

また、in vitroにおける実験では、ヒト絨毛癌のcell lineであるBeWo細胞およびマウス胎盤のトロポプラストを用いた培養系がすでに確立されており、in vivoにおけるチオレドキシン過剰発現のトランスジェニックマウスもすでに実験準備段階にあり、preliminaryなデータを出している段階である。24年度が最終年度であるため、記入しない。in vitroにおける検討では、これまでの知見に基づいてBeWo細胞およびマウス胎盤のトロホブラストにおける低酸素・酸化ストレス環境下でのチオレドキシンの発現、およびトロホブラストの遊走/侵入(invasion/migration)および動脈への置換(replacement)に与える影響を検討するとともに、in vivoにおいて、チオレドキシンのトランスジェニックマウスを用いて、低酸素・酸化ストレス環境下における胎盤形成に与える影響を病理学的に解析する。さらに患者検体における検討では、DNAマイクロアレイ法によって胎盤形成異常に影響する遺伝子発現の差異を網羅的に解析するために前置胎盤・癒着胎盤/妊娠高血圧症候群/正常群の胎盤検体の集積を継続していく。
葉緑体CemA2の機能と栄養環境変化における役割

葉緑体は光合成反応や脂質合成などの代謝経路において重要な役割を持っており、膜を通して様々な物質のやりとりをしているがその全容解明には至っていない。AtCemA2は葉緑体に局在し、AtCemA2機能欠損ホモ系統およびコントロール野性個体から単離した無傷葉緑体緩衝液懸濁液を用いた解析から、AtCemA2は光照射後のプロトン放出活性に関与していることが示唆された。これらのことから未解明であった葉緑体包膜プロトン輸送に関与する分子実体の1つはAtCemA2であると結論づけた。葉緑体は光合成、脂質合成など重要な諸反応が行われる場であり、膜を通して様々な物質のやりとりをしているが全容解明には至っていない。本研究は未解明であった葉緑体包膜プロトン輸送に関与する分子実体の1つはCemA2であり、そうであったならば植物の代謝等に関与する役割を担っているのかどうかを検証することを目的としている。ラン色細菌のpHホメオスタシスに関与するPxcA同定や植物の機能未知CemAパラログであるCemA2には推定アミノ酸配列のアミノ末端側に推定シグナルペプチド様配列が存在していたため、レポータータンパク質GFPを用いて、パーティクルガン法により一過的発現解析をしたところ葉緑体にターゲットされたため、このCemA2は葉緑体で機能しうるタンパク質であることが明らかとなった。またAtCemA2遺伝子発現に光応答性や日周性は見られず光に対する応答性は確認出来なかったが、一方で硝酸応答性を解析した結果、硝酸応答性遺伝子であるNIR1およびnitr1の発現誘導が見られ、AtCemA2の発現も同様に発現が誘導されていた。AtCemA1発現様式も同様に調べたが、同様の応答性は確認出来なかった。このことは生理条件の変化に伴い互いに役割分担をしている可能性を示唆している。さらに、CemA2遺伝子発現様式を組織・細胞レベルで明らかにするために、GUSをレポーター遺伝子とする形質転換植物を作成し、発現特異性を解析した結果、葉で強く発現し、非光合成器官である根でも相対的に弱いながら発現していることが確認されたが,その他の器官ではほとんど発現を確認出来なかった。本研究は未解明であった葉緑体包膜プロトン輸送に関与する分子実体の1つはCemA2であるかどうかを検証することを目的としている。昨年度の成果からCemA2が葉緑体にターゲットされる事が確かめられたが、葉緑体で機能しているのかどうか不明であった。そこで、葉緑体におけるプロトン吸収放出反応に関与しているのかどうかを確かめるために、選抜から得られたAtCemA2機能欠損ホモ系統およびコントロール野性個体から無傷葉緑体をそれぞれ単離し、マイクロpH電極を用いて光照射による葉緑体プロトン吸収放出反応測定を行った。無傷葉緑体緩衝液懸濁液を用いたコントロールの単離葉緑体において、光照射後のプロトン放出活性がみられ、一方でAtCemA2機能欠損形質転換体の単離葉緑体においても、放出活性は確認されたが半分程度の活性しか示さなかった。無機炭素添加条件下においても機能欠損形質転換体単離葉緑体のプロトン放出活性能の低下が確認された。光合成電子伝達反応の寄与を確認するために、阻害剤であるDCMU存在下で同様に調べた結果、コントロール葉緑体および機能欠失形質転換体の葉緑体のいずれにおいても、光照射後のプロトン放出活性がみられなくなった。これらのことから、AtCemA2は光照射後の葉緑体プロトン放出能に関与していることが示され、これらの反応は光合成電子伝達反応と連動して起こっていることが示された。昨年度までの成果からCemA2が葉緑体にターゲットされる事、また、AtCemA2機能欠損ホモ系統およびコントロール野性個体から単離した無傷葉緑体緩衝液懸濁液を用いた光照射後のプロトン吸収放出反応の解析から、AtCemA2は光照射後のプロトン放出活性に関与していることが示唆されたが、その寄与率は約半分程度であることが示された。阻害剤を用いた解析からは、これらの放出活性は光合成電子伝達反応と連動して起こっていることが示された。遺伝子発現解析から、窒素同化時における寄与の可能性が示唆されていたため、これらの機能の結果と合わせ、生育にどの程度寄与しているのかを確かめた。硝酸濃度の異なる培地条件で比較検討した結果、植物個体の成長に有意な差は無く、生育には影響を及ぼしていなかった。また、高温ストレス時において発現誘導される事が示唆されているため、温度変化による生育への影響についてなどを検討したが、有意な差は確認出来なかった。以上の結果から、AtCemA2は光照射時の葉緑体内のpHホメオスタシスに寄与しているが、植物個体の生育差が生じるほどまでには影響を及ぼさないと結論づけた。このことは、シアノバクテリアホモログ欠損株では確認出来なかった残存活性による影響によるものと考えている。

葉緑体は光合成反応や脂質合成などの代謝経路において重要な役割を持っており、膜を通して様々な物質のやりとりをしているがその全容解明には至っていない。AtCemA2は葉緑体に局在し、AtCemA2機能欠損ホモ系統およびコントロール野性個体から単離した無傷葉緑体緩衝液懸濁液を用いた解析から、AtCemA2は光照射後のプロトン放出活性に関与していることが示唆された。これらのことから未解明であった葉緑体包膜プロトン輸送に関与する分子実体の1つはAtCemA2であると結論づけた。選抜によるAtCemA2機能欠損ホモ系統を得ることができたこと、得られたホモ系統を含めた無傷葉緑体の単離精製および単離された無傷葉緑体での光照射後のプロトン吸収放出活性の検証により、AtCemA2が葉緑体で機能しているタンパク質であり、光照射後の葉緑体プロトン放出能に寄与していることが明らかにすることができたなど重要な知見が得られ、計画通りに進捗している。また、AtCemA2特異的抗体を作成し抗原ペプチドと反応することは確認することはできたが、単離葉緑体タンパク質を用いたウェスタンブロッティングでバンドの検出はできなかったため今後の検討が必要である。また、窒素同化時における寄与の可能性が発現解析から示唆されたが、植物個体の成長には影響を及ぼしておらず、別の環境要因の可能性について検討する必要がある。これらはポジティブな結果を得られていないが、おおむね計画通り進捗している。植物分子生理学本年度の成果からCemA2が光照射後のプロトン吸収放出活性の検証により、AtCemA2が、光照射後の葉緑体プロトン放出能に寄与していることが明らかにすることができたため、次年度はこの葉緑体での反応が植物個体の成長や環境変化にそのような役割があるのか、またどの程度寄与しているのかを検証する。予備的ではあるが、高温時において発現誘導される事が示唆されているため、温度変化による生育への影響についてなどを検討する必要性が出たため、検討する予定である。また、AtCemA2は一過的発現解析から葉緑体に局在することが示唆されたが、現時点では葉緑体のどこで機能しているのか詳細を証明できた訳ではない。そこで、現在作成選抜を進めているGFPをレポーター遺伝子として発現させた形質転換体を得ることによって、その局在場所が葉緑体外包膜か内包膜もしくはチラコイド膜であるのかを蛍光顕微鏡もしくはGFP抗体を用いた手法で推進していく予定である。推定シグナルペプチド様配列とレポータータンパク質GFPを用いた一過的発現解析により葉緑体にターゲットの確認やAtCemA2遺伝子発現に光に対する応答性が無いこと、一方で硝酸応答性遺伝子であるNIR1等の発現誘導性と同様にAtCemA2発現誘導性が確認されたこと、AtCemA1は同様の応答性はないことを明らかにする事ができるなど、おおむね計画通りに進捗している。また、次年度以降に予定の形質転換体作成にも着手しているが、やや遅れているものもあるものの、GUSをレポーター遺伝子とする形質転換植物を作成し、発現特異性の解析まで進めることができたものもあり、これは当初の計画以上に進展している。当該年度は計画よりやや進捗した項目と概ね計画通りであるものの、それらの結果により予定していた実験計画の細部の変更等もあった。それらに適切に対応した結果、次年度使用額がややプラスとなった。
非線形微分方程式の特異解の研究

第一の結果はRiemann多様体の間の調和写像についてのものである。はじめに、定義域が3次元以上のRiemann多様体からの調和写像全体のなす空間について研究を行ない、定義域の次元をnとするとき、一階微分のL^nノルムが一様に有界であるような調和写像の集合は写像のC^∞位相に関してコンパクトであることを示した。この結果は定義域が境界をもつ場合も含んでおり、境界で連続になる調和写像だけではなく、境界の近傍で特異な挙動をとるような調和写像についても成り立つ結果である。この結果は論文として学術雑誌Differential and Integral Equationに発表した。次に、定義域の内部に特異点をもつ調和写像全体の空間の構造について研究を行ない。特異な調和写像についても、上と同様のコンパクト性定理を証明した。このことから、特異点をもつ調和写像の列が一様有界なL^nノルムをもつならば、その極限写像の特異点集合は元のものより大きくはならないという結果が得られた。この結果については、現在、補助金より備品として購入したパーソナルコンピューターで数式処理ソフト、グラフィックソフトを用いて、いくつかの例について特異点の付近の写像の挙動について、計算を行なっており、その論文は現在準備中である。第二の結果はゲージ理論に現れるの方程式についてである。まず、平成九年度分の補助金を用いて、静岡大学の芥川和男助教授を招聘してゲージ理論についての専門的知識の提供を受けた。これらを基にして、5次元以上の多様体を底空間とするバンドル上のYang-Mills接続全体のつくるモジュライ空間に対してのコンパクト性定理を得た。この結果の論文は投稿中であり、現在ではYang-Mills接続の特異解についてこの結果の拡張の研究を続行中である。幾何学の非線形問題の解と特異解について偏微分方程式論の立場から研究を行った。はじめに、弱収束する調和写像の列について、その極限として表される写像は、一般には特異点をもつ調和写像となることが知られていたが、本研究では、写像の一階微分から定まる共形不変量を考え、その不変量が一様有界という、条件の下では極限写像は、特異点をもたず微分可能な写像となり、その収束も部分列をえらぶことにより、任意の階数の微分が広義一様収束するというコンパクト性定理を示した。証明において重要や役割を担うのが、ユークリッド空間全体で定義された調和写像で前述の不変量が有限なものは、定値写像に限るというリュービルの定理を調和写像への一般化した結果である。この結果を論文として発表した。次に、特異点をもつ調和写像にについて、一階微分の特異点の近くでの挙動についての結果として、一階微分の一様評価を導き、それを用いて、特異点をもつ調和写像に対して、前述のコンパクト性定理を拡張した。この研究については、仮定する条件についてまだ改善の余地があると考えられるために現在も継続中である。次にゲージ理論に現れるヤング-ミルズ接続について、5次元以上の多様体について調和写像の場合と同様のコンパクト性定理が成立することを証明した。この結果を論文に作成し、現在投稿中である。現在、ゲージ理論におけるモノポール方程式やディラック作用素についての研究も行っており、これについては来年度に継続することになっている。

この結果は論文として学術雑誌Differential and Integral Equationに発表した。次に、定義域の内部に特異点をもつ調和写像全体の空間の構造について研究を行ない。特異な調和写像についても、上と同様のコンパクト性定理を証明した。このことから、特異点をもつ調和写像の列が一様有界なL^nノルムをもつならば、その極限写像の特異点集合は元のものより大きくはならないという結果が得られた。この結果については、現在、補助金より備品として購入したパーソナルコンピューターで数式処理ソフト、グラフィックソフトを用いて、いくつかの例について特異点の付近の写像の挙動について、計算を行なっており、その論文は現在準備中である。第二の結果はゲージ理論に現れるの方程式についてである。まず、平成九年度分の補助金を用いて、静岡大学の芥川和男助教授を招聘してゲージ理論についての専門的知識の提供を受けた。これらを基にして、5次元以上の多様体を底空間とするバンドル上のYang-Mills接続体のつくるモジュライ空間に対してのコンパクト性定理を得た。この結果の論文は投稿中であり、現在ではYang-Mills接続の特異解についてこの結果の拡張の研究を続行中である。
南インドにおける乳癌の発生要因についての疫学的研究

南インド(マドラス)には、宗教上の理由から肉を食しない菜食主義者が多い。癌登録資料からみたこの地域における乳癌の年齢調整罹患率は人口10万対20.8と、日本と同程度(大阪19.7)である。これは、乳癌の発生要因のひとつとして肉食が考えられているが、肉食以外の乳がんの発生要因を追究するには格好の地といえる。また、研究対象地域のマドラスでの癌研究は、WHOの技術援助を得て完成した癌登録を有するCancer Instituteが中心に行っており、疫学的な研究を行う基盤が整っていた。以上の理由により、1992年7月から、南インド・マドラスにおいて、菜食主義者での乳癌の患者対照研究を行った。患者は、1992年7月以降Cancer Instituteで新たに診断された乳癌患者である。対照は健康対照として病院に入院している患者の家族の中からから性、年齢を一致させた者1人、病院対照としてCancer Instituteを受診した他の部位のがん患者から性、年齢を一致させた者1人を選び、患者対照200セット(600人)を集め、検討した。検討した項目は、問診項目(社会経済状態、生殖歴、栄養素摂取量、心理要因など)、体格(身長、体重)、血清情報(ホルモンレベル、脂質類、ビタミン類など)などの項目である。1993年12月24日現在までに、面接によっての情報収集、体格情報の収集が終了したのは、乳癌患者200人、病院対照200人(乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌以外の癌)、健康対照200人についてである。個人についての栄養素摂取量の算出、全ての情報の計算機への入力を行った。現在までに心理面の解析から、健康対照に比べ、乳癌患者と病院対照(癌患者)は、ストレスの多いLifeevent、抑欝的な状態におかれていることなどが伺われた。さらに、病院対照に比べ、乳癌患者はよりこれらの傾向が強いことが示唆された。本研究では、ホルモンレベルの測定のために黄体期に採血を行っているが、上記の対象者の内採血が終了した者は、乳癌患者200人、病院対照200人、健康対照75人であった。初期の予想に反し、健康対照についての採血が困難を極めたので、今回は血液成分のうち、健康対照のホルモンレベルについての検討を断念することとした。血清についての解析からは、健康対照75人についての検討では、マドラスでのβカロテンのレベルは日本よりは低い傾向があること、レチノールのレベルはやや低いがほぼ同程度であることが示唆されている。また、乳癌患者と病院対照のホルモンレベルを比較すると、前者ではエストロゲンE1 75.7pg/ml、エストロゲンE2 42.3pg/ml、エストロゲンE3 2.1pg/ml、後者ではエストロゲンE1 59.4pg/ml、エストロゲンE2 13.3pg/ml、エストロゲンE3 1.2pg/mlであった。また、乳癌患者(197人)についてEIAキット(Trion Diagnostics Inc.)を用いてc-erbB-2蛋白陽性率を測定したが、20U/ml以上を陽性とすると、陽性率は約28%であった。現在、上記の成果をもとに、各研究担当者が業績のまとめを行っている。

初期の予想に反し、健康対照についての採血が困難を極めたので、今回は血液成分のうち、健康対照のホルモンレベルについての検討を断念することとした。血清についての解析からは、健康対照75人についての検討では、マドラスでのβカロテンのレベルは日本よりは低い傾向があること、レチノールのレベルはやや低いがほぼ同程度であることが示唆されている。また、乳癌患者と病院対照のホルモンレベルを比較すると、前者ではエストロゲンE1 75.7pg/ml、エストロゲンE2 42.3pg/ml、エストロゲンE3 2.1pg/ml、後者ではエストロゲンE1 59.4pg/ml、エストロゲンE2 13.3pg/ml、エストロゲンE3 1.2pg/mlであった。また、乳癌患者(197人)についてEIAキット(Trion Diagnostics Inc.)を用いてc-erbB-2蛋白陽性率を測定したが、20U/ml以上を陽性とすると、陽性率は約28%であった。現在、上記の成果をもとに、各研究担当者が業績のまとめを行っている。1992年7月から、南インド・マドラスにおいて、乳がんの患者対照研究を開始した。患者は、1992年7月以降Cancer Instituteで新たに診断された乳がん患者である。対照は住民対照、病院対照とも性、年齢を一致させた者各1人を選んだ。最終的に、これらの患者対照200セット(600人)を集め、検討する。検討する項目は、問診項目(社会経済状態、生殖歴、栄養素摂取量、心理要因など)、体格(身長、体重)、血清情報(ホルモンレベル、脂質類、ビタミン類など)及び病理細胞情報(エストロジェン受容体)などの項目である。1993年1月10日現在までに、面接によっての情報収集が終了したのは、乳がん患者126人、病院対照63人、住民対照58人についてである。本研究では、ホルモンレベルを測定するために黄体期に採血を行っているが、上記の内採血が終了した者は、それぞれ107人、51人、9人である。採血、分離した血清は、現在インド、日本両国で分割して保管している。これは、インド、日本両国で、ビタミン類などの測定が同時に行えるような体制を作ることを目的にしているからである。インド国内でのビタミン類の測定は著についたところであり、研究期間中に測定を終了することは難しいことが予想された。ホルモン類、ビタミン類の測定は、日本側が一括して行うこととした。乳がん細胞のエストロジェン受容体の測定体制はインド側で整えられたので、本受容体の測定はインド国内で行うこととした。現在までのところ、研究実施に当たって、(1)インド側のディープフリーザーが故障し急遽保存場所を液体窒素内に変更したこと、(2)黄体期に限定した採血を行っているため、住民対照の血清収集が人手を要しかなり因難を極めていること、以外は順調に進んでいる。本年7月末を目標に資料の収集を終え、問診項目からの栄養素摂取量の算出、血清成分の測定を行い、最終解析に入る予定である。
自閉症者歯髄からのｉＰＳ細胞樹立と解析

自閉症での神経細胞異常を解析するための研究材料を確立する目的で、自閉症者由来の歯髄細胞からiPS細胞を樹立した。歯髄細胞は10名の自閉症者から14系統作製し、これから3名の自閉症者由来6系統の初期化クローンを得た。うち2系統で多分化能を有することを確認した。こららのクローンは神経前駆細胞マーカーの発現と神経細胞突起様の細胞突起を伸ばす細胞への分化誘導が可能であったが、通常発達者由来のiPS細胞から同様に分化誘導した細胞との明らかな差異を期間内に見いだすには至らなかった。しかし、これら自閉症者由来のiPS細胞はより詳細な解析によって神経細胞異常を解明する目的に資するものである。本年度は引き続き自閉症者と定型発達者からの歯髄細胞採取と歯髄幹細胞の樹立を進め、前年度分と併せ自閉症者7例から11系統、定型発達者17例から20系統の歯髄幹細胞株を樹立し、凍結保存ストックが作製された。さらに今後の実験結果の比較評価のために、原因が判っている単一遺伝子異常による脳発達障害の症例としてCornelia de Lange症候群の1患児からも歯髄幹細胞の4系統を樹立した。樹立した歯髄幹細胞からのiPS細胞作製ではレンチウイルスを用いた遺伝子導入により塊状増殖コロニーの出現が見られ、iPS細胞のマーカーであるSSEA4発現までが確認された。これらの細胞はパッセージを繰り返すと大型化し接着性が増して幹細胞としての特徴を失うものが出現してくるため、現在は未分化状態と増殖能を維持した均質なクローンを得るために樹立済みの歯髄幹細胞由来iPS細胞を岐阜大学より供与を受け比較検討しながらの試行を開始した。一方、歯髄幹細胞からの神経細胞分化誘導では、細胞突起を伸ばした神経細胞様形態への変化と、これに伴うβIIIチュブリン等の細胞骨格系蛋白の発現を上昇させることが出来た。しかし分化神経細胞の機能を再現するためにneuroliginfamily等シナプス関連分子の発現誘導を検討したところqPCRれべるでの転写増加が確認できるものの、十分量の蛋白発現には至っていなかった。自閉症者歯髄からのiPS細胞作製のために、本年度は自閉症者3名、非自閉症者12名の抜歯歯髄から歯髄幹細胞を分離し、細胞株として樹立した。これらの細胞は増殖良好でiPS細胞作製のソースとして凍結保存ストックを大量に準備することが出来た。本研究課題はiPS細胞から神経細胞への分化誘導を行い自閉症者由来神経細胞の異常を見いだすことにあるが、歯髄幹細胞(多くは神経堤由来)自体に神経細胞への分化能があるという報告もあり、iPS細胞作製を介さずに歯髄幹細胞から神経細胞へ直接分化させる条件を検討した。その結果各種栄養因子投与により既報のように種々の神経細胞マーカーの発現と初代培養神経細胞様の形態を示す状態に分化させることが可能となった。しかし自閉症病態解析に必須と想定しているシナプス形成までには至っておらず、さらに分化した神経細胞に誘導するためにneurogeninやdominant negative REST等の転写因子の遺伝子導入実験を進めている。平成24年度中はiPS細胞作製は実施しなかったが、山中4因子を導入するためのレンチウイルスベクターの入手、レンチウイルスベクター導入のための培養機器と施設の整備を進めた。また岐阜大学で樹立された健常発育者歯髄由来のiPS細胞株を複数譲与いただき、培養を開始した。iPS細胞を多能性を維持した状態で培養を継続するための経済的な条件の検討と、iPS細胞から神経細胞への分化誘導を上記の歯髄幹細胞と同様に進めたが、歯髄幹細胞に比して増殖能が低く、現在までは神経細胞マーカー発現の検討までには至っていない。平成26年度末の時点で系統樹立した歯髄細胞は、健常発達者19名から23系統、自閉症者10名から14系統に達した。今年度はこれらからのiPS細胞作製を進め、自閉症者3名から6系統の初期化細胞コロニーを得るに至った。これらの初期化コロニーにおいてOct4、Sox2、Nanog、SSEA-4、TRA1-81といった初期化細胞マーカーの発現を確認した。さらに多能性確認のために免疫不全マウスへの接種実験を行ったが、テラトーマ形成の確認は次年度への持ち越しとなった。なお健常発達者由来歯髄細胞クローンは同様に初期化を施しコントロールとして使用する予定であったが、代わりに京都大学CiRAから購入した解析済みのiPS細胞をコントロールとして使用したため、初期化コロニーの樹立には至っていない。平行して自閉症者由来初期化細胞から神経細胞への分化誘導実験を進め、栄養因子添加と長期培養により長い細胞突起を有する神経細胞様の形態を獲得することを確認した。機能的な解析に関してはこれも次年度への持ち越しとなっている。さらに自閉症は遺伝学的多様性もあり、歯髄細胞や作製したiPS細胞の全ゲノムまたは全エクソーム解析が必要になることが想定されるため、対象を広げて遺伝学的複雑性が低く初期化によるゲノム変化の除外をより簡便に済ませられることが期待できる単一遺伝子疾患からの歯髄細胞採取も進めた。その結果平成26年度はCornelia de Lange症候群患児2名から5系統の歯髄細胞を樹した。平成27年度は歯髄細胞の新たな集積はなく、作製した初期化細胞の解析を主に行った。26年度までに樹立した自閉症者3名由来の6系統の初期化クローンのうち2系統のテラトーマアッセイを実施し、免疫不全マウス精巣でのテラトーマ形成を確認した。これにより初期化クローンはiPS細胞である確証を得た。

iPS細胞からのex vivoでの神経細胞分化誘導実験ではニューロフィラメントを発現する神経前駆細胞までの安定的な誘導が可能となった。しかし、ドーパミンニューロンや抑制性ニューロン等、特定の神経細胞への分化には着手できなかった。代わって多能性幹細胞から神経幹細胞や神経前駆細胞への分化誘導系を神経系分化過程モデルとして利用し、自閉症原因遺伝子ニューロリギン4Xの発現制御変化を解析した。その結果、我々がこれまでに同定して来た2つのプロモーターが神経系細胞にコミットして行く段階で使い分けられている事実を明らかになった。自閉症での神経細胞異常を解析するための研究材料を確立する目的で、自閉症者由来の歯髄細胞からiPS細胞を樹立した。歯髄細胞は10名の自閉症者から14系統作製し、これから3名の自閉症者由来6系統の初期化クローンを得た。うち2系統で多分化能を有することを確認した。こららのクローンは神経前駆細胞マーカーの発現と神経細胞突起様の細胞突起を伸ばす細胞への分化誘導が可能であったが、通常発達者由来のiPS細胞から同様に分化誘導した細胞との明らかな差異を期間内に見いだすには至らなかった。しかし、これら自閉症者由来のiPS細胞はより詳細な解析によって神経細胞異常を解明する目的に資するものである。iPS細胞作製技術の確立が当初の計画より遅れたため、これに伴って樹立されたiPS細胞の解析に遅れをきたした。また初期化によるゲノム変異が起きていないことを確認するための全ゲノム解析は当初の研究計画で予算計上しておらず、これを実施していない。しかし厳密にiPS細胞樹立を言うためには必須と考えられ、「iPS細胞作製完了」が遅れる要因となっている。病理学引き続き自閉症者の歯髄細胞収集を進めると共に、研究実績の概要に記載したように対象疾患の範囲を拡大して神経系の発達障害を引き起こす単一遺伝子疾患の患児からも歯髄細胞収集を進め、iPS細胞を作製することとした。既にこの変更は施設の倫理審査承認を得ている。元々本研究課題は自閉症の病態解析に主眼を置いているが、自閉症の遺伝学的複雑性から短期的には成果を得難い可能性も想定し、当面は研究リソース整備としての自閉症者由来歯髄細胞とこれに由来するiPS細胞の収集、蓄積自体も重視して来た。一方で、患者iPS細胞由来の神経細胞がこれまで困難だった神経系疾患の、特に細胞レベルでの病態解明に広く有用であることを検証するため、分化誘導神経細胞の変化と遺伝学的異常の関連解明がより容易と考えられる疾患を研究対象に加え、成果をあげることを目指す。iPS細胞作製のための歯髄幹細胞は概ね順調に樹立が進んでいる。これは共同研究として当初計画より多くの施設から歯髄の提供を受ける体制が構築出来たためである。歯髄幹細胞の樹立も実験手技が熟練してきたため、効率よく樹立出来るようになっている。一方iPS細胞の作製に関しては、リプログラミング遺伝子の導入を他施設のプロトコールに従って行うと細胞死に陥る割合が高く、これがiPS細胞を未分化状態で安定的に維持することが出来ない原因と考えている。このため遺伝子導入の条件検討に時間を費やしており計画が停滞している。
錯体触媒の配列制御による新規物質変換反応場の開拓

本年度は、錯体触媒として知られる置換不活性なRh(II)パドルホイール型錯体の軸位にカルベン前駆体を配位させて、多孔性フレームワークを構築することを目的とした。そこで、他のカルベン前駆体として[1,2,3]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン誘導体に着目した。このトリアゾールはジアゾ体との平衡にあり、熱によりその平衡をジアゾ側に偏らせることができるだけではなく、Nドナー配位子として優先的に軸位に配位させることができる。まず、既報のRh錯体に反応性を示す、3位にメチルエステル基を有するトリアゾールのアダクトの結晶化を試みた。しかし、アダクトの結晶パッキング中ではトリアゾールと配位子とのπ-πスタッキングの介入により、配位子間のアレーン-パーフルオロアレーン相互作用が阻害されていることが判明した。そこで、この打開策として3位にかさ高いtert-ブチルエステルを導入したトリアゾールを新規に設計、合成した。前述したメチルエステル基を有するトリアゾールと同様な条件でアダクトの結晶化を試みたところ、興味深い結果が得られた。まず、得られた結晶構造はセルパラメータで分類すると3種類であり、結晶化溶媒によらず配位子間のアレーン-パーフルオロアレーン相互作用によって2-Dシート構造が構築され、さらにその2-Dシートの積層により、一次元のチャネル構造が形成されていた。すなわち、かさ高いtert-ブチル基によって、戦略通りにトリアゾールと配位子のπ-πスタッキングを阻害することに成功したといえる。この結果に加え、3種類の結晶構造中ではトリアゾールの配位様式は1種類ではなく、1位と2位の窒素で配位したものが混在しており、溶媒の極性や形状に応じて配位様式を柔軟に変化させることでチャネル構造の形成を可能にしていると考えられる。今後の展望としては、結晶パッキングの違いによる反応選択性の制御等が期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、錯体触媒の配列制御による新規反応場の構築を目的としている。具体的には触媒能を有する置換不活性錯体の集積化によりこれまでにない多孔性材料の創成を目指す。置換不活性錯体の導入により期待できることとして、置換活性錯体よりも安定な構造体の形成および高活性な機能の付与といったものが挙げられる。本年度は、錯体触媒として知られる置換不活性なRh(II)パドルホイール型錯体の配列制御とその集積体の物性評価に取り組んだ。戦略としては、錯形成に高温を要する置換不活性な錯体を配位結合を駆動力として集積化させるのは困難であるため、分子間相互作用による温和な条件下での集積化を試みた。分子間相互作用部位を有する配位子としてアレーン-パーフルオロアレーン相互作用部位を複数導入した配位子4-[(perfluorophenyl)-ethnylbenzoic acidを用い、Rh(II)パドルホイール型錯体を合成・集積化させることで、室温下で多孔性のフレームワークを得ることに成功した。また、単結晶X線構造解析により、Rh錯体のアキシャル位は構造の構築に関与しておらず、活性点を保持して集積化できていることが判明した。さらに、得られた構造は基質がアクセス可能なチャネル構造を有しているのに加え、アキシャル位はチャネル方向を向いているという理想的な反応場を有していた。実際、フレームワークの反応性について粉末X線構造解析を用いて検討を行ったところ、フレームワークのチャネルは保たれたまま、軸位の交換反応が結晶性状態で進行することが判明した。置換不活性なセカンダリービルディングユニットのみで構成された多孔性のフレームワークはこれまでに単結晶まで構造決定できている金属有機構造体や配位高分子の報告例はなく、本研究はこの分野において大変興味深い結果であると言える。本年度は、錯体触媒として知られる置換不活性なRh(II)パドルホイール型錯体の集積体の反応性評価と、新たな集積体の構築に取り組んだ。初年度に得られたフレームワークは多孔性構造を有しており、孔内での特異的な反応が期待できる。そこで、このフレームワークを物質変換反応場として用い、孔のサイズや形状によって何らかの選択性が得られるかどうかについて調査を行った。その結果、前年度得られた錯体は、少なくともカルベン挿入反応に対して触媒活性を有していることが判明したが、フレームワークを不均一触媒として用いるのは溶解性の問題から困難であることがわかった。そこで、超分子構造の耐久性を向上させるために、ユニット同士を分子間相互作用ではなく配位結合によって連結させることが必要であると考えた。その一つの戦略として、分子間相互作用によって集積化させた後、配位子同士を光二量化反応によって連結させる手法を考え、アレーン-パーフルオロアレーン相互作用部位と光二量化反応部位を併せ持つ配位子を設計・合成した。配位子の結晶性粉末は紫外光を24時間光照射することで、光二量化反応が完全に進行した。続いて、その配位子を用いRh(II)パドルホイール型錯体を合成・集積化させることで、初年度に得られたものと同様な多孔性のフレームワークを得ることに成功した。

しかし、配位子間距離自体は0.42nm以下という反応進行に必要な条件を十分満たしていたにもかかわらず紫外光照射による光二量化は進行せず、励起状態がRh中心によって失活してしまうことが示唆された。初年度得られた錯体は、少なくともカルベン挿入反応に対して触媒活性を有していることが判明したが、フレームワークを不均一触媒として用いるのは溶解性の問題から困難であることがわかった。また、フレームワークの耐久性を向上させるべく、分子間相互作用部位と光二量化反応部位を併せ持つ配位子及びその配位子を用いた錯体の合成に成功したまではよかったが、配位子で完全に進行した光二量化反応が錯体ではほぼ進行しなかった。以上の状況より、やや遅れていると判断した。本年度は、錯体触媒として知られる置換不活性なRh(II)パドルホイール型錯体の軸位にカルベン前駆体を配位させて、多孔性フレームワークを構築することを目的とした。そこで、他のカルベン前駆体として[1,2,3]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン誘導体に着目した。このトリアゾールはジアゾ体との平衡にあり、熱によりその平衡をジアゾ側に偏らせることができるだけではなく、Nドナー配位子として優先的に軸位に配位させることができる。まず、既報のRh錯体に反応性を示す、3位にメチルエステル基を有するトリアゾールのアダクトの結晶化を試みた。しかし、アダクトの結晶パッキング中ではトリアゾールと配位子とのπ-πスタッキングの介入により、配位子間のアレーン-パーフルオロアレーン相互作用が阻害されていることが判明した。そこで、この打開策として3位にかさ高いtert-ブチルエステルを導入したトリアゾールを新規に設計、合成した。前述したメチルエステル基を有するトリアゾールと同様な条件でアダクトの結晶化を試みたところ、興味深い結果が得られた。まず、得られた結晶構造はセルパラメータで分類すると3種類であり、結晶化溶媒によらず配位子間のアレーン-パーフルオロアレーン相互作用によって2-Dシート構造が構築され、さらにその2-Dシートの積層により、一次元のチャネル構造が形成されていた。すなわち、かさ高いtert-ブチル基によって、戦略通りにトリアゾールと配位子のπ-πスタッキングを阻害することに成功したといえる。この結果に加え、3種類の結晶構造中ではトリアゾールの配位様式は1種類ではなく、1位と2位の窒素で配位したものが混在しており、溶媒の極性や形状に応じて配位様式を柔軟に変化させることでチャネル構造の形成を可能にしていると考えられる。今後の展望としては、結晶パッキングの違いによる反応選択性の制御等が期待される。結晶構造だけでなく、粉末X線回折やガス吸着測定により、分子間相互作用で構築された多孔性フレームワークの反応場としての有用性を実証できた。具体的には軸配位子の嵩高さや配位能の集積化様式への影響、および集積体中のチャネルを保持した触媒反応の進行可能性を示せたため、計画以上の進展があったと判断した。次年度は、初年度に得られたフレームワークを用い、予めフレームワークに基質を取り込ませたものを結晶化し、固体状態で反応させ、そのスナップショット観測を試みる。
新しい独占的競争市場モデルによるマルクス分業論の数理経済学的展開の試み-製品差別化、規模にかんする収穫逓増,および資本-賃労働関係を中心として

本研究では,生産の専門化の尺度が内生化されたワイツマンの独占的競争市場一般均衡モデルのフレームワークに修正を加えた1市場・静学モデルの構築を行った.修正は,モデルを個別企業の生産関数から組み立てることと,マルクスが資本主義的生産の出発点を与えると指摘したタイプの生産技術を,生産の内生的専門化と規模にかんする収穫逓増の生産関数によって表現することによって行われた.これによって,従来散文的に論じられてきた協業や分業にかんするマルクスの指摘をベースにした数理経済学的モデルを記述することが可能となった.このモデルでは,一方でより大規模な生産が有利であることによって小規模な生産が駆逐され,独占化の傾向が生まれると同時に,他方で生産の専門化がもたらす効果によってその傾向が打ち消されることも示された.また,特殊ケースにおいて新古典派の規模にかんする収穫一定のときの結論が導かれることも示し得た.さらに,規模にかんする収穫逓増と新古典派の収穫一定という技術の違いによって,失業の存在(独占的競争モデル)と非存在(完全競争モデル)というシステムの性格を区分したワイツマンの考察を,より正確に行うことによって,前者で失業が存在するためには階級関係がなければならないことを明らかにした.これに基づいて,新古典派の規模にかんする収穫一定の仮定が階級社会を想定することと相容れない仮定であることも明らかにされた.マルクスの資本主義的市場経済の諸前提との比較により,本研究やワイツマンのモデルは,生産手段の私的所有を仮定すれば,マルクスの商品生産社会の前提をすべて含むことも明らかにされ,独占的競争理論の「内在的深化」を通じて,マルクスの経済理論の基本問題に踏み込んだ点も本研究の特徴である.本研究では,生産の専門化の尺度が内生化されたワイツマンの独占的競争市場一般均衡モデルのフレームワークに修正を加えた1市場・静学モデルの構築を行った.修正は,モデルを個別企業の生産関数から組み立てることと,マルクスが資本主義的生産の出発点を与えると指摘したタイプの生産技術を,生産の内生的専門化と規模にかんする収穫逓増の生産関数によって表現することによって行われた.これによって,従来散文的に論じられてきた協業や分業にかんするマルクスの指摘をベースにした数理経済学的モデルを記述することが可能となった.このモデルでは,一方でより大規模な生産が有利であることによって小規模な生産が駆逐され,独占化の傾向が生まれると同時に,他方で生産の専門化がもたらす効果によってその傾向が打ち消されることも示された.また,特殊ケースにおいて新古典派の規模にかんする収穫一定のときの結論が導かれることも示し得た.さらに,規模にかんする収穫逓増と新古典派の収穫一定という技術の違いによって,失業の存在(独占的競争モデル)と非存在(完全競争モデル)というシステムの性格を区分したワイツマンの考察を,より正確に行うことによって,前者で失業が存在するためには階級関係がなければならないことを明らかにした.これに基づいて,新古典派の規模にかんする収穫一定の仮定が階級社会を想定することと相容れない仮定であることも明らかにされた.マルクスの資本主義的市場経済の諸前提との比較により,本研究やワイツマンのモデルは,生産手段の私的所有を仮定すれば,マルクスの商品生産社会の前提をすべて含むことも明らかにされ,独占的競争理論の「内在的深化」を通じて,マルクスの経済理論の基本問題に踏み込んだ点も本研究の特徴である.
近赤外光照射による哺乳動物初期胚発生制御機構の解明

体外で作出された受精卵の品質は低いことから,受精卵の品質を改善するための技術開発が求められている。我々は,近赤外光照射が哺乳動物受精卵の品質におよぼす影響について調査した。その結果,近赤外光を受精卵に照射することで,受精卵の発生能力を改善することが明らかとなった。その効果は発生ステージで異なっており,特に,発生が進んだ受精卵(胚盤胞)で顕著であった。さらに,近赤外光を照射した胚盤胞を移植し,受胎成績が改善されること,得られた産子が正常であることを明らかとした。これらの研究成果は,我々の技術が哺乳動物受精卵の品質改善技術として有用であることを示唆するものである。今日,体外で受精卵を生産して産子を得る受精卵移植技術は,畜産分野では優良家畜の増産や家畜改良に,医療分野(産婦人科領域)では不妊治療に欠かせない重要な技術である。しかしながら,体外における受精卵の人為的操作は,受精卵の品質の低下をまねき,さらには治療成績の低下にもつながることから,体外受精卵の品質を改善させる技術開発が強く求められている。これまでの研究で,受精卵の品質とミトコンドリア活性に正の相関が認められること,近赤外領域の光に細胞のミトコンドリア活性を向上させる働きがあることが報告されている。そこで本研究では,近赤外領域の光が哺乳動物の初期胚発生に及ぼす影響およびその制御機構を明らかにすることを目的としている。平成26年度は,主にマウス受精卵を用いて,近赤外光照射が受精卵の発生能力におよぼす影響について解析した。胚盤胞に対して近赤外光を照射した結果,ふ化胚盤胞への発生率,総細胞数は,近赤外光を照射せずに培養した胚盤胞と比較して有意な差は認められなかったものの,発生速度(ふ化胚盤胞への到達時間)が有意に速まることが認められた。また,その効果は桑実胚,8細胞期胚に照射した際には認められなかった。以上の結果から,近赤外光は受精卵の発育を促進する効果を有しており,その効果は発生が進んだ受精卵で高いことが示唆された。今日,体外で受精欄を生産して産子を得る受精卵移植技術は畜産分野では優良家畜の増産や家畜改良に,医療分野(産婦人科領域)では不妊治療に欠かすことのできない重要な技術である。しかしながら,体外における受精卵の人為的操作は,受精卵の品質の低下を招き,さらには治療成績の低下にもつながることから,体外受精卵の品質を改善させる技術開発が強く求められている。そこで本研究では,近赤外領域の光が哺乳動物の初期胚発生におよぼす影響およびその制御機構を明らかにすることを目的としている。平成27年度は,ウシ体外受精卵に対する近赤外光照射の影響を解析した。その結果,桑実胚期(発生培養5日目)および胚盤胞期(発生培養7日目)のいずれの照射タイミングでも,非照射区と比較して有意に発生率が向上した。さらに,近赤外光を照射した胚盤胞は,非照射区と比較して,構成細胞数が有意に増加し,孵化胚盤胞へ至る時間も有意に短くなることが明らかとなった。これらは,平成26年にマウス受精卵で得られた研究成果と同様の傾向であった。また,マウス受精卵を用いて,受精卵移植試験を実施した。近赤外光を照射した胚盤胞を,偽妊娠雌マウスの子宮へ移植した結果,受胎率,産子率のいずれも,近赤外光照射区で向上する傾向が観察された。今後は,移植例数を増やすとともに,産子の正常性についても検討する予定である。平成26年度では実験材料が入手できず一部の実験が遅れていたが,今年度はその実験も含めて順調に成果をあげることができている。今日,体外で受精卵を生産して産子を得る受精卵移植技術は畜産分野では優良家畜の増殖は家畜改良に,医療分野(産婦人科領域)では不妊治療に欠かすことの出来ない重要な技術である。しかしながら,体外における受精卵の人為的操作は,受精卵の品質の低下を招き,さらには受胎成績(治療成績)の低下にもつながることから,体外受精卵の品質を改善する技術開発が強く求められている。これまでの研究で,受精卵の品質とミトコンドリア活性に正の相関が認められること,近赤外領域の光に細胞のミトコンドリア活性を向上させる働きがあることを報告している。そこで本研究は,近赤外領域の光が哺乳動物の初期胚発生におよぼす影響を明らかにすることを目的としている。平成28年度では,近赤外光を照射したマウス胚盤胞の移植試験を実施して,本技術の有効性,安全性について評価した。移植試験の結果,近赤外光を照射した胚盤胞を移植した試験区では,照射せずに移植した対照区と比較して,受胎率が高い傾向があり(P=0.06),産子率が有意に高いことが示された(P<0.05)。また,得られた産子の発育を調査したところ,試験区と対照区に差は求められなかった。さらに,試験区のすべての産子で繁殖能力を有していることも確認した。以上,本研究課題の研究結果から,近赤外光を応用した本技術は,哺乳動物胚の品質改善技術として有用かつ安全な方法であることが示唆された。

今後,作用機序の解明や照射条件の最適化などの研究は必要であるが,本技術が,畜産分野や医療分野における生殖技術の発展に貢献できることが期待される。体外で作出された受精卵の品質は低いことから,受精卵の品質を改善するための技術開発が求められている。我々は,近赤外光照射が哺乳動物受精卵の品質におよぼす影響について調査した。その結果,近赤外光を受精卵に照射することで,受精卵の発生能力を改善することが明らかとなった。その効果は発生ステージで異なっており,特に,発生が進んだ受精卵(胚盤胞)で顕著であった。さらに,近赤外光を照射した胚盤胞を移植し,受胎成績が改善されること,得られた産子が正常であることを明らかとした。これらの研究成果は,我々の技術が哺乳動物受精卵の品質改善技術として有用であることを示唆するものである。マウス受精卵を用いた試験は,概ね計画どおり実施できた。一方,ウシ受精卵を用いた試験も実施する計画であったが,本研究を実施するための屠場由来卵巣が十分に確保できなかったため,当初の計画よりもやや遅れている。本研究から,近赤外光による受精卵発育促進効果がマウスおよびウシにおいて認められた。効果が発揮される照射タイミングも同様であることから,近赤外光の効果は哺乳動物受精卵において普遍的であると推測される。今後は,受精卵に対する近赤外光照射の安全性について詳細に評価することを計画している。動物生殖科学本研究から,近赤外領域の光には,受精卵の発育を促進する効果があることが示唆された。申請者は,受精卵のミトコンドリア機能と関連していることを推測しているが,その制御機構の詳細は未解明のままである。また,近赤外光を照射した受精卵の正常性についても,検討が必要であると考えている。今後は,近赤外光による哺乳動物胚の制御機構の解明,および受精卵に対する近赤外光照射の安全性について解析を進める計画である。平成26年度では,ウシ受精卵に対する影響を調査する計画であったが,雌牛の屠殺頭数が例年よりも少なく,本研究に必要なウシ卵巣が十分に確保できない状況であった。そのため,この研究で使用する計画であった消耗品費,人件費,交通費を残す結果となった。平成26年度に実施できなかったウシ受精卵に対する影響に関する研究を次年度に実施する計画とし,平成27年度分として請求した助成金と合わせて使用する計画である。