hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリアの動的特性が生み出すRNA顆粒-ncRNAの機能変化の解析

スクリーニングの結果から興味深い因子をいくつか同定することができた。申請者らのこれまでの研究成果からミトコンドリアの膜とmtDNAは一部で協調的に働いていることが分かっていたが、本申請研究において、ミトコンドリアの膜だけを変化させる遺伝子、またはmtDNAだけに変化を及ぼす遺伝子のように、どちらか一方を制御する候補遺伝子も選出することができた。さらなる詳細な解析も必要とするが、本研究からミトコンドリアの膜とmtDNAの動的特性の変化と細胞機能の変化に重要な因子が明らかになりつつある。研究計画に従い、個体レベルの解析と細胞レベルの解析を両面から進め、得られた結果を互いにフィードバックすることでより研究を推進する。これまでに得られた結果を含めて本研究期間の成果として取りまとめ、国内外の学会、学術誌への投稿という形で発表する。ミトコンドリア今後は研究計画に従い、細胞レベルの解析結果を個体レベルの解析につなげられるように研究を推進する。そして、これまでに得られた結果を取りまとめ、国内外の学会での発表と学術誌の投稿準備を進める。またスクリーニングより得られた関連遺伝子が関わる分子経路を標的とした抗がん剤の開発が進められている。本申請研究で開発に直接貢献することは難しいが、この研究課題でミトコンドリアダイナミクスとの関連を明らかにできればがんの病態解明に寄与することは十分に期待できる。このように本申請研究で進行中のスクリーニングシステムを用いたミトコンドリアダイナミクスの関連遺伝子の探索が、領域をまたいで貢献することが見込まれる。本申請研究では個体と細胞レベルでの研究を計画しており、それに準じた経費を計上している。今年度では、細胞レベルの解析に大きな進捗が見られたため、動物実験に関わる経費の使用がやや少なかった。また、細胞レベルの解析には申請者が所属する施設が所有する機器をもちいた解析が中心であり、支出が当初の計画より少なかったことが理由である。新規遺伝子の探索から本申請研究の基盤となるデータを習得できたのだが、候補遺伝子の解析に想定していなかったいくつかの実験をする必要があり、その条件検討などに時間を要してしまった。また育児等で計画していた実験を一時中断せざるを得ない状況があったため研究に遅延が生じてしまった。実験動物を用いた解析も並行して進めていることから、次年度に本年度の研究計画分の実験を進めることを計画しており、研究費はこれに沿った形で支出する。また、成果について積極的にとりまとめ、さらに多くの国内外の学会や学術誌への投稿が見込まれるのでその経費として使用する予定である。新規関連遺伝子の探索は順調に進んでおり、候補遺伝子の解析から本事業の大きな進展が見込まれている。次年度は候補遺伝子の詳細な解析を中心に、成果発表に向けた準備に助成金の使用を計画している。
末梢型肺癌に対する光線力学的治療法

[目的]末梢型肺癌に対する低侵襲治療としての光線力学的治療法(photodynamic therapy ; PDT)の可能性を検討するために、実験動物の正常肺実質に対し組織内照射法によるPDTを施行して、その組織学的影響およびPDT効果の増強法について研究することを目的とした。[実験材料および方法]ブタに光感受性物質photofrin又はATX-S10Na(II)を投与した後、肺実質に誘導針を介して円柱ファイバーを挿入し、ダイオードレーザー(630nm又は670nm)で照射を行った。照射後3日で標本を作製した。[実験結果]実験を通して呼吸不全を来したブタはなかった。光感受性物質を投与しないコントロール群においては、レーザーの温熱効果による壊死は生じなかった。標本のマクロ所見では、胸膜直下に暗褐色の境界明瞭・内部均一な壊死巣を認めた。臓側胸膜には構造の破壊はなかった。組織像では、壊死巣の周囲を肉芽組織層が囲んでおり、分界線を形成していた。壊死巣の中心部と辺縁部では壊死に質的・時間的差異はなかった。PhotofrinによるPDTでは、100mW/cm・100-400J/cmの照射条件で10mmの壊死を形成した。10mW/cmでは、同じ照射量で100mW/cmと比べ大きな壊死を形成したが(p<0.01)、照射量の前半を10mW/cm・後半を100mW/cmとする照射条件でも同等の効果であった。ATX-S10Na(II)によるPDTでは、同じ照射条件でPhotofrinより大きな11.5mmの壊死を形成した(p<0.03)。回転移動照射式ファイバーを用いた照射では、15mmまでの壊死を形成した。[結語]組織内照射法によるPDTで正常肺実質に生じる壊死は、ファイバー周囲に均一に形成され被包化されているため、PDT後も周囲組織の機能は比較的保持されると考えられるPDT効果の増強は照射方法の工夫や第二世代の光感受性物質により可能であった。末梢型肺癌の低侵襲治療としてのPDTの可能性が示唆された。[初年度の目的]末梢型肺癌に対するPDTの安全性を検討するために、実験動物の正常肺実質に対し組織内照射法によるPDTを施行して、その組織学的影響を研究した。[実験材料および方法]当初は実験動物としてウサギを予定していたが、基礎実験で本実験侵襲には耐えられないことが判明したため、生後3ヶ月の正常ブタ(30-35kg)を使用した(n=5)。光感受性物質はフォトフィリン^<TM>を使用し、5mg/kgのdoseでPDTの24時間前に静注した。全身麻酔下に小開胸を行ってから、右下葉または中葉に19Gのエラスター針を刺入し、これを介してファイバーを肺実質内に導入した。励起光源はダイオードレーザー(630nm)を使用した。長さ2cmのdiffuser fiberを使用して、出力200mW/fiberで100-400J/fiberの照射を行った。各ブタにつき順に3点で実験を行った。

照射後3日で犠牲死させ、肺を摘出してホルマリン固定を行い、標本を作製した。[実験結果]実験後に呼吸不全を来したブタはなかった。光感受性物質を投与しないコントロール群においては、レーザーの温熱効果こよる壊死は生じなかった。標本のマクロ所見では、胸膜直下に暗褐色の壊死巣を認め、内部は均一で周囲との境界は明瞭で、やや大きい気管支や血管への影響は少なかった。穿刺部周辺の臓側胸膜は若干肥厚していたが、構造の破壊は認めなかった。壊死巣中心部のEVG染色では、細気管支の弾性線維や平滑筋層、細血管の内膜・中膜・外膜の基本構造が比較的良く保たれていた。壊死巣辺縁部と正常部分とを含めた組織像(HE染色)では、壊死巣の周囲を肉芽組織層が囲んでおり、分界線を形成していた。壊死巣の中心部と辺縁部とを比較すると、壊死に質的・時間的な差異はなかった。壊死部の大きさは100Jでは5mmであったが、200Jと400Jでは10mmであった。[考察]PDTによる正常肺実質に生じる壊死はdiffuser fiberの周囲約1cm限局し、壊死部は被包化されているため、その修復過程において、収縮・瘢痕化は起こり難く、PDT後に周囲組織の機能が比較的保持される可能性が示唆された。[目的]末梢型肺癌に対する低侵襲治療としての光線力学的治療法(photodynamic therapy;PDT)の可能性を検討するために、実験動物の正常肺実質に対し組織内照射法によるPDTを施行して、その組織学的影響および照射方法の工夫によるPDT増強効果について検討した。[実験材料および方法]ブタに対して光感受性物質Photofrin又はATX-S10(Na)を投与した後、肺実質に誘導針を介して円柱ファイバーを挿入し、ダイオードレーザー(630nm又は670nm)で照射を行った。照射後3日で標本を作製した。[実験結果]実験を通して呼吸不全を来したブタはなかった。光感受性物質を投与しないコントロール群においては、レーザーの温熱効果による壊死は生じなかった。標本のマクロ所見では、胸膜直下に暗褐色の境界明瞭・内部均一な壊死巣を認めた。臓側胸膜には構造の破壊はなかった。組織像では、壊死巣の周囲を肉芽組織層が囲んでおり、分界線を形成していた。壊死巣の中心部と辺緑部では壊死に質的・時間的差異はなかった。PhotofrinによるPDTでは、100mW/cm・100-400J/cmの照射条件で10mmの壊死を形成した。10mW/cmでは、同じ照射量(J)で100mW/cmと比べ大きな壊死を形成したが(p<0.01)、照射量の前半を10mW/cm、後半を100mW/cmとする照射条件でも同等の効果であった。ATX-S10(Na)によるPDTでは、同じ照射条件でPhotofrinより大きな11.5mmの壊死を形成した(p<0.03)。回転移動照射式ファイバーを用いた照射では、15mmまでの壊死を形成することが可能であった。[結語]組織内照射法によるPDTで正常肺実質に生じる壊死は、ファイバー周囲に均一に形成され被包化されているため、PDT後も周囲組織の機能は比較的保持されると考えられる。PDT効果の増強は照射方法の工夫や第二世代の光感受性物質により可能であった。末梢型肺癌の局所治療法としてのPDTの可能性が示唆された。
若年男性の冠動脈石灰化と頸動脈肥厚による動脈硬化度と循環器疾患危険因子との関連

当該研究期間中に以下の各点が明らかになった。1)血圧・脂質・喫煙など古典的危険因子は米国人の方が良好だが、冠動脈石灰化の程度は米国人で大きいこと、2)ハワイの日系米人の動脈硬化進展度が日本人より大きく、遺伝子以外の因子が関与すること、3)歩数計を用いた運動量のパイロットスタディの結果、運動量の季節変動は認められたが、運動量の大小や季節変動が動脈硬化と関連するかどうかは不明で、更に参加者数を増やしての検討が必要であること検体検査の厳密な標準化のため、検体を米国に送付し、古典的な危険因子に加えて、核磁気共鳴による脂質分画の比較、アディポサイトカインをはじめとする新たな危険因子および、動脈硬化に関連する遺伝子の解析を引き続き行う予定である。現段階で日本人の潜在的冠動脈硬化は進んでいなかったが、将来も虚血性心疾患が増加しないと結論することはできない。特に最近増加している肥満と糖尿病による動脈硬化の進展には注意が必要である。今後は、1)インスリン抵抗性をはじめとした新しい危険因子の調査すること、2)韓国など他のアジア人の集団を加えること、3)日本でも新たに年齢層を拡げて調査を継続することを検討している。国民の食生活と生活習慣全般にわたる欧米化は、脂肪摂取量の増加を来たすとともに、血清総コレステロール値の上昇を来たした。特に、戦後生まれの中年期男性の血清総コレステロール値は、2000年現在、200mg/dlを超え日米間の相違が殆どない。わが国の循環器疾患の特徴は、脳卒中が多く逆に虚血性心疾患が少ないことであった。わが国は、心筋梗塞罹患率、死亡率は先進工業国の中では最も低い国である。しかし、血清総コレステロール値が若いときから上昇している40歳代男性については、将来、彼らが心筋梗塞発症危険年齢、すなわち60歳以降の年齢に達したときに、現在と同じように低いか否かは定かでない。そこで、40歳代男性の動脈硬化度を冠動脈、頚動脈、胸部大動脈から腹部大動脈、内臓脂肪、等において日米で比較することにより、将来の心筋梗塞・動脈硬化予防対策に役立てることとした。本年度は、日米の研究者が相互に訪問し、標準化のための会議を3回実施した。また、エコーの標準化とその手技の統一のため、日本から担当の医師をビッツバーグ大学に派遣した。本年度は、予定通り2月に予備試験を実施し、10名の調査を研究計画通り終了した。草津市からの40歳男性のランダムサンプルの応答率は、予備試験より20-30%確保できることが明らかとなり、来年度からの本試験に向けての準備が完了した。予備試験データの米国への送付も、本年度中に実施する予定である。以上、来年度より予定通り300名の本試験を実施できる体勢が整った。【方法】この調査の対象者は、滋賀県草津市に在住の40歳代の男性から抽出されたランダムサンプルおよび米国ペンシルバニア州ピッツバーグのある健康保険会社の被保険者のうち研究参加希望者である。滋賀医科大学附属病院において、質問票および面接による問診・医師診察・身体計測・血液検査・血圧測定・Electron-beam CT scanning(EBCT)による心臓冠動脈の石灰化の検討・頚動脈超音波検査による内膜中膜肥厚の検討、上下肢血圧比および脈波速度の測定を行っている。また、同様の調査をピッツバーグ大学にても実施している。【現在の進捗状況および結果】本年度は日本で153名の調査を終了し、現在、アメリカとの標準化を行っているところである。既に結果が得られた対象者(日米各々約50名ずつ)について、総コレステロール平均値及び冠動脈石灰化有病率は、日本で199.8+31.8mg/dl、11%、米国では196.8+30.7mg/dl、45%であった。脂質については日米で差が無いにもかかわらず、冠動脈石灰化の割合は大きく違っていた。将来の冠動脈心疾患の発症率は、米国並にはならない事を示唆している。今後の研究では、更に現状を明らかにすると共に、その要因の解明が重要と考える。尚、この知見については本年度の日本疫学会で報告した。1.研究の目的および概要

日本の3040歳代男性は、血圧、喫煙率、コレステロールなどの冠動脈危険因子の程度が米国と比較して予防的な状態ではなく、従来のように心筋梗塞発症率が米国よりも低い状態を保てるかどうかについては議論のあるところである。そこで、滋賀県草津市在住の40歳代の男性から無作為に選んだ対象者について、動脈硬化の進展度を詳細に調査し、米国の集団と比較することを目的とした。尚、本研究は米国ピッツバーグ大学との共同研究であり、米国側でもAmerican Heart Associationの研究補助金の助成を受けて同様の研究を行っているものである。2.本年度の進捗状況昨年度からの2年計画で300名の対象者の調査を完了した。そのうちの100名については、血液検体の解析および心臓冠動脈の石灰化スコアの解析を終了した。3.研究によって得られた知見(1)背景となる危険因子日米で、ボディマスインデックスは23.3、27.0(kg/m^2)、収縮期血圧は122.6、113.7(mmHg)、総コレステロールは220.9、192.8(mg/dl)、HDLコレステロールは54.7、45.9(mg/dl)、喫煙率は48.0、15.0(%)であり(各々、日本、米国の順)、いずれも統計学的有意差が認められた。(2)心臓冠動脈の石灰化カルシウムスコアが正であったものの割合は、日米で13.3、47.0(%)であり、カルシウムスコアが10以上であったものの割合を比較すると、5.1、26.0(%)であった。(3)まとめ日本人40歳代男性の危険因子は米国と比較して決して好ましい状態ではなかったにもかかわらず、心臓冠動脈石灰化率は米国の方がはるかに高いことが明らかになった。なぜ日本人に冠動脈硬化が少ないのかについては、インスリン抵抗性や代謝症候群の観点から今後更なる分析が必要である。本課題はピッツバーグ大学とハワイのアジア太平洋ヘルスリサーチ機構との共同研究であるERA JUMP (EBT and Risk Factor Assessment among Japanese and U.S. Men in the Post World-War II Birth Cohort)の調査の実施および解析である。本研究の目的は、前病段階の動脈硬化および危険因子を40歳代男性の無作為抽出集団で国際比較し、動脈硬化の決定因子を明らかにすることであった。今年度末までに、日本300例、ピッツバーグ300例、ハワイ100例、新たに加わった韓国100例が終了する予定である。日米の比較で、1)血圧・脂質・喫煙など古典的危険因子は米国人の方が良好だが、動脈硬化進展度は米国人で大きいこと、2)ハワイの日系米人の動脈硬化進展度が日本人より大きく、遺伝子以外の因子が関与することが明らかになった。今年度はさらに、1)運動量のパイロットスタディ、2)収集されたデータ整備、3)ハワイ、韓国を交えた共同研究の推進を行った。運動量調査は、精度が保証されている同一機種の歩数計を用いてパイロットスタディを半年毎に2回行った。2004年10月21,22日に韓国において、Shin医師の研究室で合同研究会議を開催し、今後の共同研究推進の詳細を取り決めた。既に、ハワイ、韓国での調査も順調に進行している。本課題自身は今年度で終了となるが、今後、収集された調査成績の分析を引き続き実施してゆく。現在、核磁気共鳴によるリポプロテイン分析結果の論文作成、メタボリックシンドローム、内臓脂肪の分析と潜在性動脈硬化の関連分析を行っている。
チベット高原と中高緯度大気循環場の相互作用の研究

本研究で、チベット高原の存在が中高緯度の大気循環場の季節進行にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的として実施した.本年度は、昨年度に引き続き、研究上必要なデータセットの整備を実施した.1)インドの静止衛星によって取得された可視画像および赤外画像データを再処理し,データベース化した.2)大気循環場のデータ(NCAR/NCEP再解析データ)を用いて,循環場の統計を求め、データベース化した.3)中国気象局発行の「中国地面気象記録」に掲載されている地上気象データのデジタルデータセット化を継続した.昨年度に引き続きチベット嵩原およびその周辺域の大気の季節進行と積雪,チベット高原上の積雲対流活動の関係を調査した.15年分の人工衛星による赤外放射データおよび循環場のデータより,北半球夏期にみられるチベット高気圧がチベット高原上空に成立・維持するためにはチベット高原上の積雲対流活動およびチベット高原表面付近の大気下層の気温の日変化が重要であることが明らかとなった.また,春の積雪の消失と初夏のチベット高気圧の確立の関係に時間的に正の相関をもつことが明らかとなった.昨年度実施した予備解析は,気象庁長期予報グループ発行の「グロースベッター」誌に掲載された.また、本年度の解析結果は適当な学術雑誌へ投稿準備中である.本研究では,チベット高原の存在が中高緯度の大気循環場の季節進行にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的としている。当年度は,1992年から1993年にかけての冬季から春季にかけての季節進行の予備解析(1),1993年の夏季の季節進行の予備解析(2),および本解析に必要なデータの収集およびデータセットの作成を行なった。予備解析(1)では,SSM/Iデータから作成された積雪データのチベット高原上での精度の評価をおこなった。その結果,1)地形が複雑な地域,2)永久凍土の存在する地域では,積雪が過大評価される傾向があることが明らかになった。このような点に注意しつつ大気下層の成層状況との関連を調べ,春の融雪と植生の活動が活発になる時期に大気下層が湿潤不安定になりやすいことが明らかになった。予備解析(2)では,1993年の夏季の季節進行を調査した。チベット高原の積雲対流活動が,チベット高原圧を高原上に存在させるために重要であることを指摘し,また積雲対流活動が中緯度偏西風帯のトラフの活動によって規制されることを明らかにした。予備解析(2)の結果は,日本気象学会や気象庁での研究会にて発表し,気象庁長期予報グループ発行の「グロースベッター」誌に掲載される予定である。データセットの作成に関しては,1)米国NCARよりインドの静止衛星によって得られた可視画像および赤外画像データを取得した。取得したデータに幾何補正および必要な時間解像度への変換を施した。2)大気循環場のデータとして,NCEP/NCARの再解析データを取得し,必要なデータの抽出を行なった。3)また,地上気象要素のデータが必要なため,中国気象局発行の「中国地面気象記録」に掲載されているデータのデジタルデータセット化をすすめた。本研究で、チベット高原の存在が中高緯度の大気循環場の季節進行にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的として実施した.本年度は、昨年度に引き続き、研究上必要なデータセットの整備を実施した.1)インドの静止衛星によって取得された可視画像および赤外画像データを再処理し,データベース化した.2)大気循環場のデータ(NCAR/NCEP再解析データ)を用いて,循環場の統計を求め、データベース化した.3)中国気象局発行の「中国地面気象記録」に掲載されている地上気象データのデジタルデータセット化を継続した.昨年度に引き続きチベット嵩原およびその周辺域の大気の季節進行と積雪,チベット高原上の積雲対流活動の関係を調査した.15年分の人工衛星による赤外放射データおよび循環場のデータより,北半球夏期にみられるチベット高気圧がチベット高原上空に成立・維持するためにはチベット高原上の積雲対流活動およびチベット高原表面付近の大気下層の気温の日変化が重要であることが明らかとなった.また,春の積雪の消失と初夏のチベット高気圧の確立の関係に時間的に正の相関をもつことが明らかとなった.昨年度実施した予備解析は,気象庁長期予報グループ発行の「グロースベッター」誌に掲載された.また、本年度の解析結果は適当な学術雑誌へ投稿準備中である.
シグマ受容体の基礎的研究

初めにハロペリド-ル(HAL)に対するモノクロ-ナル抗体(AntiーHAL)を作成し、種々の薬物との反応性を検討したところ、得られたAntiーHALはHALのピペリジニ-ル基を認識していることが判った。次のAntiーHALを抗原としてBALB/Cマウスに免疫し,抗イディオタイプ抗体(AntiーIdーmAb)を得た。ラット脳あるいは牛脳線条体の膜標品で、シグマ受容体を標識するリガンドとして[ ^3H]ーハロペリド-ルを,D_2ドパミン受容体を標識するリガンドとして[ ^3H]ースピペロンを用いてantiーIdーmAbによる結合阻害実験を行った。その結果、AntiーIdーmAbはシグマ受容体と[ ^3H]ーハロペリド-ルとの結合だけを阻害し、D_2ドパミン受容体と[ ^3H]ースピペロンとの結合を阻害しなかった。またAntiーIdーmAbは、ジギトニンとコ-ル酸で可溶化したシグマ受容体を75%免疫沈降させたが、D_2ドパミン受容体を免疫沈降させることはなかった。これらの実験結果から、抗イディオタイプ抗体はD_2ドパミン受容体ではなく、シグマ受容体を特異的に認識することが判った。抗イディオタイプ抗体をセファロ-ス4Bゲルに結合させ、アフィニティ-クロニトグラフィ-を行いシグマ受容体の精製を試みた。pH3.0の酸性容液で溶出すると300倍に精製され、SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動上では、30kDaに主要バンドが認められた。その他45kDaと65kDa近辺にも数本づつのバンドが認められるので、今後さらに精製度を上げる必要がある。1.シグマ受容体の可容化シグマ受容体を1%ジギトニンと0.1%コ-ル酸で可溶化した。ラット脳膜分画では、Bmax=2pmol/mg prot,kd=2.4nMであるのに対し、可溶化分画では、Bmax=3pmol/mg prot,kd=8.4nMであった。可溶化分画を用いてシグマ受容体に関連する薬剤の結合阻害実験を行うと、ハロペリド-ル>DTG>(+)ー3PPP>(ー)ブタクラモ-ル>(ー)ー3PPP>(+)ブタクラモ-ルの順に阻害がみられ、膜分画と同じ力価順位であった。BーPPPとブタクラモ-ルに対するシグマ受容体に特徴的な立体特異性は、可溶化しても保持されていた。2.シグマ受容体を認識する抗体の作成ハロペリド-ルに対するモノクロ-ナル抗体(AntiーHAL)を巻き貝ヘモシアニンに結合したものを抗原として用いた。BALB/Cマウスに免疫すると、抗血清中に〔^3H〕ーハロペリド-ルとAntiーHALの結合を抑制する抗イディオタイプ抗体(IdーAb)が産生されているのが確認出来た。次に免疫したマウスの脾細胞とミエロ-マ細胞を細胞融合し、IdーAbを産生するハイブリド-マをアッセ-した。その結果、5種類のモノクロ-ナル抗イディオタイプ抗体(AntiーIdーmAb)を得ることが出来た。このAntiーIdーmAbはラット脳膜分画のシグマ受容体結合を抑制しなかったが、この抗体をセファロ-ス4Bゲルに結合させ、可溶化したシグマ受容体と反応させると、75%のシグマ受容体を免疫沈降させた。このことから、得られたAntiーIdーmAbはシグマ受容体を認識する抗体であると考えられた。またイムノ・ブロッティングでは、6万8千の主要バンドが認められた。

初めにハロペリド-ル(HAL)に対するモノクロ-ナル抗体(AntiーHAL)を作成し、種々の薬物との反応性を検討したところ、得られたAntiーHALはHALのピペリジニ-ル基を認識していることが判った。次にAntiーHALを抗原としてBALB/Cマウスに免疫し、抗イディオタイプ抗体(AntiーIdーmAb)得た。ラット脳あるいは牛脳線条体の膜標品で、シグマ受容体を標識するリガンドとして[ ^3H]ーハロペリド-ルを、D_2パミン受容体を標識するリガンドとして[ ^3H]ースピペロンを用いてAntiーIdーmAbによる結合阻害実験を行った。その結果、AntiーIdーmAbはシグマ受容体と[ ^3H]ーハロペリド-ルとの結合だけを阻害し、D_2ドパミン受容体と[ ^3H]ースピペロンとの結合を阻害しなかった。またAntiーIdーmAbは、ジギトニンとコ-ル酸で可溶化したシグマ受容体を75%免疫沈降させたが、D_2ドパミン受容体を免疫沈降させることはなかった。これらの実験結果から、抗イディオタイプ抗体はD_2ドパミン受容体ではなく、シグマ受容体を特異的に認識することが判った。抗イディオタイプ抗体をセファロ-ス4Bゲルに結合させ、イムノアフィニティ-クロマトグラフィ-を行いシグマ受容体の製製を試みた。pH3.0の酸性溶液で溶出すると300倍に精製され、SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動上では、30KDaに主要バンドが認められた。その他45KDa,65KDaの近辺にも数本づつのバンドが認められるので、今後さらに精製度を上げる必要がある。
高封圧・高温下における岩石の変形破壊の実験的研究

1.温度300°C,封圧3GPaまでのカコウ岩の変形破壊実験から,温度が上昇しても圧縮強度と摩擦強度が等しくなると破壊機構が変化することが確かめられた。すなわち,圧縮強度が摩擦強度より大きい場合は低圧型と呼ばれる従来から知られている脆性破壊が起こるが,両者が等しくなるときには高圧型破壊と呼ばれる前者とは異なる型の破壊が起こる。これにより,間隙水圧が非常に高い場合を除いては,高圧型の破壊が地殻でのものであると考えられる。これらの実験結果と岩石の強度の寸法効果の推定から,浅部の摩擦強度で表される脆性領域と深部の羃乗則クリープで表される延性領域の中間に高圧型破壊領域が存在する新しいリソスフェア強度のモデルが提唱された。2.精度のよい測定が可能な封圧500MPaまでの実験で低圧型および高圧型とみなされる破壊が起こる片麻岩のAE計測の解析から,AEの規模別頻度分布指数が低圧型では破壊直前に減少するのに対して,高圧型では破壊のかなり前から単調な減少を示すことが明らかになった。3.低圧型破壊が起こる領域の広いエクロジァイトを用いた実験が温度250°Cまで行われ,高圧再脆性化現象は,カタクラスティック延性に固有のものであり,構成粒子の硬さに依存する,という新しい知見が得られた。4.封圧500MPaまでの条件で高精度の多チャンネル弾性波速度測定から,弾性波トモグラフィーの手法を用いて,岩石の破壊形成の核の存在が明らかにされた。高温での封圧下の破壊直前の高精度の弾性波速度の測定を行うために開発された,低摩擦ピストンを用いた実験により,最終破壊直前には段階的に応力降下が起こっていることが見いだされた。温度300°C,封圧3GPaまでのカコウ岩についての実験はほぼ完了した。実験は,100°C,250°C,300°Cで行われた。その結果は,今後解決すべき問題点は残っているが,室温の実験で求められたように,圧縮強度と摩擦強度が等しくなると破壊機構が変化することが確かめられた。圧縮強度が摩擦強度より大きい場合の破壊を低圧型,両者が等しくなるときのものを高圧型と呼んでいるが,この実験結果により,間隙水圧が回りより高い場合を除いては,この高圧型の破壊が地殻でのものであるという考えが一歩進められた。また,この実験中,低圧型と高圧型の境界で強度が非常に高くなることが見いだされた。そこでは両方の型の破壊が同時に起こっており,それぞれの型の破壊形成の成長が互いに妨げ合い,岩石試料は予期されるよりも高い応力状態を保持したものと考えられる。このことは,地下での地震発生域との関連で興味深いものであるが,詳しい研究によって解明される必要がある。精度のよい測定が可能な封圧500MPaまでの片麻岩についての実験で,圧縮強度と摩擦強度が等しくなると破壊挙動の変化が起こることが明かになった。このことは,低圧型及び高圧型破壊の存在が精度のよい実験で実証されたという意味を持っている。さらに,高圧型破壊に対するAE活動度が始めて精度良く測定され,破壊に先行する前兆的AE活動の実態が明らかにされた。封圧500MPaまでの条件で高精度の多チャンネル弾性波速度測定から,弾性波トモグラフィ-の手法を用いて,岩石の破壊形成の核の存在が明らかにされた。温度300°C,封圧3GPaまでのカコウ岩についての実験から,室温の実験で求められたように,圧縮強度と摩擦強度が等しくなると破壊機構が変化することが確かめられた。

すなわち,圧縮強度が摩擦強度より大きい場合の低圧型破壊では開口型(モ-ドI)クラックの合体と崩壊が主な役割を演じているが,両者が等しくなるときの高圧型破壊では面内剪断型(モ-ドII)クラックの進展が支配的であることが明かになった。これにより,間隙水圧が非常に高い場合を除いては,高圧型の破壊が地殻でのものであるという考えが一歩進められた。これらの実験結果と岩石の強度の寸法効果の推定から,浅部の摩擦強度で表される脆性領域と深部の羃乗則クリ-プで表される延性領域の中間に高圧型破壊領域が存在するというリソスフェア強度の新しいモデルが提唱された。しかし,この実験中の低圧型破壊強度に問題が残っており,低圧型破壊が起こる領域の広いエクロジァイトを用いた実験で確認することが進められている。精度のよい測定が可能な封圧500MPaまでの実験で低圧型および高圧型とみなされる破壊が起こる片麻岩のAE計測の解析から,AEの規模別頻度分布指数が低圧型では破壊直前に減少するのに対して,高圧型では破壊のかなり前から単調な減少を示すことが明らかになった。これは地震予知にとって重要な知見であるが,すでに得られている他の岩石についてのデ-タを解析して確かめる必要がある。封圧500MPaまでの条件で高精度の多チャンネル弾性波速度測定から,弾性波トモグラフィ-の手法を用いて,岩石の破壊形成の核の存在が明らかにされた。さらに最終破壊直前には段階的に応力降下が起こっていることが見いだされ,それらはSV波,SH波の観測から形成核内でのクラックの合体などの核の内部構造の変化に対応すると解釈された。1.温度300°C,封圧3GPaまでのカコウ岩の破壊実験後の回収試料の顕微鏡観察から、温度が上昇しても圧縮強度と摩擦強度が等しくなると破壊機構が変化することが確かめられた。すなわち,圧縮強度が摩擦強度より大きい場合の低圧型破壊では開口型(モードI)クラックの合体と崩壊が主な役割を演じているが,両者が等しくなるときの高圧型破壊では面内剪断型(モードII)クラックの進展が支配的であることが明かになった。これらの実験結果と岩石の強度の寸法効果の推定から,浅部の摩擦強度で表される脆性領域と深部の羃乗則クリープで表される延性領域の中間に高圧型破壊領域が存在する新しいリソスフェア強度のモデルが提唱された。2.カコウ岩の実験中に問題が残っていた低圧型破壊の強度にを解決するため,低圧型破壊が起こる領域の広いエクロジァイトを用いた実験が行われた。予想に反して,この問題を解決することにはならなかった。用いたエクロジァイトは,温度250°C,封圧500MPaで延性化したが,それより高い封圧下では再び脆性化することが見いだされた。これにより,この実験の初期の目的は達成できず別の研究が必要になったが,高圧再脆性化は,カタクラスティック延性に固有の現象であり,構成粒子の硬さに依存する,という新しい知見が得られた。3.高温での封圧下の破壊直前の高精度の弾性波速度の測定を行うために開発された,低摩擦ピストンを用いた実験により,最終破壊直前には段階的に応力降下が起こっていることが見いだされた。弾性波トモグラフィーによる解析から,これは破壊核内でのクラックの合体などの核の内部構造の変化に対応すると解釈された。これにより,新しい地震の震源核形成過程が考えられようとしている。
微生物が生産するNADH-フマル酸還元酵素阻害剤の探索研究

バラエティーに富んだ微生物培養液約8,200サンプルの中からNADH-フマル酸還元酵素阻害物質をスクリーニングしたところ、約2%の培養液が阻害活性を示した。ほとんどの培養液の活性物質は水溶性であり、酵素の基質となるフマル酸、または低分子有機化合物あるいは無機塩が活性を示すことが示唆された。一方、脂溶性の性質を示す活性物質を精製したところ、放線菌Streptomyces sp.培養液から初めてNADH-フマル酸還元酵素選択的な阻害活性を示す(4E)-5-(2-methylphenyl)-4-pentenoic acidを単離した。糸状菌Penicillium sp.FKI-5329株培養液からは強力な阻害活性を示すペンタエン化合物prugosene A1とその新規類縁体2化合物を単離した。寄生虫は嫌気的環境で生育するためにほ乳類とは異なるエネルギー代謝系を用いている。本研究はその一つであるミトコンドリア電子伝達系NADH-フマル酸還元酵素(以後NFRDと略)を選択的に阻害する化合物を微生物二次代謝産物から取得することを目的としている。今年度は微生物培養液のスクリーニングを重点的に行った。ブタ回虫体壁筋から調製したNFRDを用いて、海洋由来放線菌・糸状菌培養液を約2,000サンプル、土壌由来糸状菌培養液を約2,200サンプル、外部共同研究機関より提供された糸状菌.放線菌培養液約1,000サンプルをスクリーニングした。その結果、約1%のサンプルが選択的にNFRDを阻害することがわかった。特に強く酵素を阻害するものから順次、小スケール分画を行い活性物質の極性を調べたところ、微生物の種を問わず多くのサンプルで高極性(水溶性)画分に活性が見出された。現在、この原因について調査中である。低極性画分に活性を確認できた糸状菌4株および放線菌1株の培養液については培養条件の最適化とスケールアップを行い、活性化合物の精製を進めた。このうち放線菌の培養液からpiericidinA_1と(4E)-5-(2-methylphenyl)-4-pentenoic acidを単離し、後者はNFRDに対しより選択的な阻害活性があることを確認した。この結果より糸状菌だけでなく、放線菌もNFRD選択的な阻害活性物質を生産していることが明らかとなった。来年度は本結果を受けて、放線菌および細菌培養液サンプルのスクリーニングと、水溶性活性物質の単離を主軸として研究を進める。本研究はその一つであるミトコンドリア電子伝達系NADH-フマル酸還元酵素(NFRD)を選択的に阻害する化合物を微生物二次代謝産物から見出すことを目的としている。今年度は土壌由来の放線菌・糸状菌培養液約3,000サンプルを新たにスクリーニングし、約1%のサンプルにNFRD選択的な阻害活性を見出した。昨年度および今年度のスクリーニングでNFRD選択的な阻害活性を示した微生物培養液のうち、海洋由来バクテリア2株、土壌由来糸状菌2株の培養液から活性物質の精製を行った。海洋由来バクテリア2株の培養液中の活性物質はいずれも水溶性であったため、イオン交換樹脂などを用いて精製を試みたが、脱塩操作によりNFRD阻害活性が失われてしまった。そのため、バクテリア2株の活性物質は低分子量の化合物と推定された。土壌由来糸状菌2株のうち一株の活性物質も水溶性であり、各種イオン交換樹脂、活性炭等により精製を進めた結果、偽活性を示すフマル酸が検出された。そこでフマル酸を早期に検出する方法を確立し、現在スクリーニングに反映させている。残る土壌由来糸状菌培養液は脂溶性画分に活性が見出され、各種カラムクロマトグラフィーにより精製を進めた結果、prugosene A1およびその新規類縁体2種をNFRD選択的な阻害活性物質として見出すことができた。Prugosene A1は過去にNFRD阻害化合物として見出されたukulactone類に非常に近い構造を持っていた。本糸状菌はさらに複数のprugosene類縁体を生産していることがわかったため、現在精製を進めている。
高次脳機能障害者が自助グループにおいて自己を再形成するプロセスに関する発達的研究

平成18年度末にかけて実施したピアサポータートレニングプログラムを受けたメンバーを中心とする2030代の当事者7名を対象に、ピアサポータートレーニングプログラム作成委員会を結成して月に1回のペース計11回集まり、研究協力者と(中塚圭子)ともにフィシリテーターを努めて将来のピアサポートに向けての都トレーニングプログラム練成を図った。また当事者家族の要請を受けて、家族向けピアサポータートレニングプログラムを平成19年9月から20年3月まで計8回実施した。これらの活動を経て当事者らがどのように障害を持つ自分自身の意識を変容させたかを検討できるようにビデオに録画した。こうした活動の合間に、これまで調査したカナダや、京都、福知山、大阪、奈良、神戸の当事者団体と可能な限り連絡を取り合い、当事者のあり方めぐって意見を交わしながら連携を図り、平成20年2月から3月にかけてカナダの当事者団体スタッフを招いて福知山、神戸、奈良で相談を開くとともに、当事者団体やピアサポーターらの協力を得て、花園大学においてフォーラムを開催した。以上の活動経過は当事者団体会報や「福祉と人間科学」に記し、発達心理学会で発表した。研究3年目の終わりに到達した課題は、以下の3点である。まず高次脳機能障害がリハビリ求められる会社適応に専心するのみならず、自己適応をも要すること。また「会社に向けて発信するピア」というモデルを得ることが、自己変容を推進すること。家族もまた適応およびピアというモデルを要していること。これら3つの観点は、当事者とその家族が会社との接点を得ていく上で、不可欠のものと思われる。本研究は、高次脳機能障害者がピアサポートシステムへの参加を通じていかなる自己変容を遂げるかについて、その発達過程の体系的な解明を目的としている。この目的遂行のため平成17年度は、9月と2月にそれぞれ半月間ずつカナダ・ブリティッシュコロンビア州ビクトリア市を拠点としてフィールド調査を行なった。これまでにピアサポーター養成プログラムの内容と実践についての調査も行なうとともに、20代から60代のカナダの当事者11名、日本の当事者4名、カナダの関連9機関のスタッフ11名に対してインタビューを行なった。また、当事者の変容を支えるネットワークの様相を調べるために、関連機関の担当者から話を聞き、資料の提供を受けた。その結果、ピアサポートプログラムやネットワークの考え方のポイントは、「当事者の主体性を取り戻すこと」「一人のスタッフで抱え込もうとしないこと」の2点であることが明らかとなった。これらの調査結果をまとめて、3月末の日本発達心理学会においてポスター発表を行なった。その発表にも記したように、カナダの多くの当事者は他者と出会い、果敢に新たな自己に新たな自己の再構築に挑んでいることが見出された。つまり当事者主義の徹底がネットワークの形成につながっていると言うことができる。今後は回復途上にある当事者を注意深く調べること、日本の当事者の自己認識や再適応を阻んでいる要因を探り、日本版ピアサポーター養成プログラムにつなげることが課題となる。本研究は、高次脳機能障害者がピアサポートシステムへの参加を通じていかなる自己変容を遂げるかについての体系的な解明を目的としている。平成17年度のうちにカナダの当事者団体を2回訪れてピアサポーター養成プログラムの内容と実践についての調査も行なうとともに、カナダや日本の当事者、関連機関のスタッフに対してインタビューを行なっている。こうした調査活動を土台として平成18年度は、9月に約3週間カナダ・ブリティッシュコロンビア州ビクトリア市を拠点として高次脳機能障害者の当事者団体のほかに、病院や個人ネットワークの支援体制の状況、犯罪更生施設にまで手を広げてフィールド調査を行なった。また11月には仙台にある高次脳機能障害者の社会復帰施設を調査したり、カナダから来日した包括的支援担当者のワークショップに参加したりして、情報収集に努めた。これらの調査を経て団体間の直接の連携も準備した上で、12月からは毎週日曜日に日本の高次脳機能障害者6名を対象に、ピアサポータートレーニングセッションの実践活動を行なって記録に残し本研究の最大の目的でもある日本版ピアサポーター養成プログラムの作成にめどが立ちつつある。今後は回復途上にある当事者の社会適応に向けての実践的活動を継続しながら、日本の当事者とカナダの当事者の連携をさらに発展させていくために、カナダの当事者団体関係者を日本に招いてワークショップを行なう準備を進めているところである。

まず高次脳機能障害がリハビリ求められる会社適応に専心するのみならず、自己適応をも要すること。また「会社に向けて発信するピア」というモデルを得ることが、自己変容を推進すること。家族もまた適応およびピアというモデルを要していること。これら3つの観点は、当事者とその家族が会社との接点を得ていく上で、不可欠のものと思われる。
日本脳炎ウイルス感染におけるスフィンゴミエリン/脂質ラフトの役割

スフィンゴミエリンは細胞脂質二重膜の主要構成成分であり、増殖、遊走、ウイルス感染などの細胞機能に関与する。日本脳炎ウイルスはフラビウイルス科に属し、蚊を媒介として感染して日本脳炎を引き起こす。日本脳炎ウイルスの標的細胞への感染にはウイルスのE蛋白が必要であるが、標的因子は分かっていなかった。本研究では、細胞膜上のスフィンゴミエリンを合成する酵素を欠失させることで日本脳炎ウイルス感染が低下することを細胞およびマウスで明らかとした。本研究成果は日本脳炎ウイルスの感染防御法の開発へと繋がると期待できる。スフィンゴミエリン(SM)は細胞脂質二重膜の脂質ラフトを構成する主要スフィンゴ脂質であり、増殖や遊走、ウイルス感染などの細胞機能に関与している。SMはSM合成酵素(SMS)によりゴルジ体で合成され細胞膜に運ばれる。他方、フラビウイルスに属する日本脳炎ウイルス(JEV)は神経細胞へ感染し、日本脳炎を引き起こすが、その接着-感染における細胞側のターゲット因子は分かっていない。本年度は、SMがJEVの接着-感染に関与するかを細胞レベルで検証した。SMSにはSMS1とSMS2の二種類があり、その両方を欠損したマウス胎児繊維芽細胞では正常マウス胎児繊維芽細胞に比べSM量が著しく減少している。このSMS欠損細胞では、JEV感染48時間後の細胞内および培養上清中のウイルス量が顕著に減少していた。また、正常細胞へ細胞膜SMを分解するバクテリアスフィンゴミエリナーゼを処理することで、JEV感染が抑えられたことから、細胞膜SMがJEVの感染に重要であることが明らかとなった。また、JEVの接着に関しても、SMS欠損細胞においてJEV感染15分後と非常に短時間での細胞内ウイルス量が正常細胞に比べ低下し、またDilラベルしたJEVでも接着が減少していたことから、JEV接着がSMを起点としていることを示している。さらに、SMS1またはSMS2をSMS欠損細胞に戻したところ、SM量自体はどちらの導入でも回復したにもかかわらず、細胞膜SMをライセニンにより染色したところ、SMS1細胞においてのみ細胞膜SM量が増加しており、それに一致して、15分後のJEV接着および48時間後のJEV感染量も増加した。これらの結果から、SMS1により合成された細胞膜SMがJEVの接着-感染に重要であることを示した。次年度は、これらの現象が、SMS1欠損マウスにおける個体レベルでも起こっているかを検証したい。スフィンゴミエリン(SM)は細胞脂質二重膜の脂質ラフトを構成する主要スフィンゴ脂質であり,増殖や遊走,ウイルス感染などの細胞機能に関与している。細胞膜SMはゴルジ体でSM合成酵素(SMS)により合成され,その後細胞膜へと運ばれる。他方,フラビウイルス属である日本脳炎ウイルス(JEV)は神経細胞へ接着・感染し,日本脳炎を引き起こすが,その標的細胞への接着・感染のターゲット因子は分かっていない。前年度までにSMS1が合成するSMが,JEVの接着・感染に重要であることをSMS欠損マウス胎児繊維芽細胞を用いて示したが,本年度は,SMS1欠損マウスにおける個体レベルでのJEV感染を検証した。まずはじめにマウスの脳内のSM量をLC-MSにより測定したところ,SMS1欠損マウスでは,野生型マウスにくらべて脳内のSM量が顕著に減少していた。野生型マウスおよびSMS1欠損マウスへ腹腔内投与によりJEV感染を行ったところ,投与後13日までで,野生型マウスでは明らかな体重減少が見られたが,SMS1欠損マウスでは見られなかった。この感染13日後の脳内のJEVを調べたところ,野生型マウスでは脳においてJEVエンベロープ蛋白が確認されたが,SMS1欠損マウスでは検出されなかった。また,野生型マウスの脳では髄膜炎や白血球の浸潤などの炎症症状が見られ,炎症性サイトカインIL-6の上昇も見られたが,SMS1欠損マウスではこれらの所見は得られなかった。以上の結果から,SMS1欠損マウスにおいてはJEV感染およびその後の炎症が抑制されており,個体のレベルにおいてもSMS1が合成するSMがJEVの標的細胞への接着・感染に関与していることが示唆された。スフィンゴミエリン(SM)は細胞脂質二重膜上の脂質ラフトを構成する主要スフィンゴ脂質であり,細胞の増殖,遊走,ウイルス感染などへの関与が示唆されている。前年度までにSM合成酵素ノックアウト(SMS-KO)マウスより樹立した胎仔線維芽細胞において,細胞膜上のSMが減少しており,日本脳炎ウイルス(JEV)の細胞膜への接着が抑制され,その後のJEV感染(ウイルス複製放出)も抑えられることが明らかとなった。また,このJEVの接着・感染の抑制は,SMSの2種類のアイソフォームのうち,SMS1の導入により回復することから,JEVの接着・感染にはSMS1により合成された細胞膜SMが重要であることが示唆された。平成27年度は,前年度から引き続きSMS1-KOマウスでの感染の検討を行った。野生型およびSMS1-KOマウスへのJEV腹腔内注射により,野生型マウスは注射後13日後に脳へのJEV感染および白血球浸潤や髄膜炎などの炎症所見が見られたにも関わらず,SMS1-KOマウスでは感染および炎症は確認されなかった。また,炎症性サイトカインであるIL-

6も野生型マウスの脳では増加していたが,SMS1-KOマウスの脳では増加が見られないことから,SMS1によるSM合成はマウスにおいてもJEVの接着・感染に重要であることが明らかとなった。以上の結果から,SMS1がJEV感染の予防における標的となることが示唆された。スフィンゴミエリンは細胞脂質二重膜の主要構成成分であり、増殖、遊走、ウイルス感染などの細胞機能に関与する。日本脳炎ウイルスはフラビウイルス科に属し、蚊を媒介として感染して日本脳炎を引き起こす。日本脳炎ウイルスの標的細胞への感染にはウイルスのE蛋白が必要であるが、標的因子は分かっていなかった。本研究では、細胞膜上のスフィンゴミエリンを合成する酵素を欠失させることで日本脳炎ウイルス感染が低下することを細胞およびマウスで明らかとした。本研究成果は日本脳炎ウイルスの感染防御法の開発へと繋がると期待できる。今年度は,SMS1欠損マウスをもちいた個体レベルにおいても,JEVの感染にはSMS1およびSMが重要であることを示した。これらの成果は2nd International Workshop on Melecular Medicine of Sphingolipidsや日本ウイルス学会等で発表した。また,マウス個体におけるJEV感染実験も行えたので,3年目が期待できる。脂質生化学本研究課題では,細胞膜SMのJEV接着・感染への機能に着目し,JEV接着・感染の分子メカニズム解明を目指す。本年度はマウスを用いた個体レベルでの実験を行った。これらの結果をさらに発展させるために,次年度は,実際に日本脳炎に重要である神経細胞においてもSMおよびSMSのJEV接着・感染への役割を明らかにしたい。今年度は、細胞レベルにおいて、SMがJEV接着-感染の場として重要であることを示した。これらの成果はウイルス学会等で発表した。また、ウイルス接着の可視化においても、当初の目的である蛍光遺伝子導入によるラベルではなく、蛍光物質での直接ラベルでも十分ウイルスの可視化が可能であることが見出せたので、2年目が期待できる。本研究課題では、細胞膜SMのJEV接着-感染への機能に着目し、JEV接着-感染の分子メカニズム解明を目指す。本年度は、SMS欠損細胞を用いた細胞レベルでの実験を行った。これらの結果をもとに、次年度はSMS1ノックアウトマウスを用いた個体レベルでの実験を行いSMのJEV接着-感染への役割の解明を目指したい。
新生児仮死に伴う行動障害の発生機序と薬物治療に関する研究

1.新生児仮死モデルにおける行動評価生後7日目のSDラットを用いて新生児仮死モデル(n:15)を作成した。Morris水迷路試験を用いて、水面下のプラットホームに達するまでの遊泳時間、遊泳距離を日齢35日目から4日間連続で測定し学習能力を評価し、さらにロタロッドを用いて運動能力を評価した。sham手術を受けた対照群(n:15)と比較検討したところ、仮死群では遊泳時間、遊泳距離の明らかな延長が見られた。一方、運動能力には両群間に差がなく、遊泳時間の延長が空間学習能の低下によると推測された。2.組織学的解析及び生化学的解析1)組織学的解析:行動評価終了後に大脳組織を摘出して、大脳皮質梗塞面積、海馬CA1領域の神経細胞密度を測定し行動評価法の結果との関係を検討したが,有意な相関を認めなかった。行動障害は,特定領域ではなく複数領域を結ぶネットワークの障害が原因と推測された。2)生化学的解析:負荷後24時間Caspase3活性を測定したところ、対照群では左右の大脳半球で差を認めなかったが、仮死群では障害側半球で有意に活性が上昇していた。3.薬物治療の効果に関する解析Casepase阻害物質(BAF)100mMを、低酸素負荷前(BAF-1群:n=15)、低酸素負荷前及び負荷後12時間後(8AF-2群:n=5)にラット脳内へ投与した。生後28日目に行動評価を行ったが,未治療群との間に差を認めなかった。4.本研究のまとめと今後の課題一側大脳半球への低酸素性虚血負荷により、行動障害ラットを作成した。本モデルはに運動能力障害を持たず、空間学習能力の障害を認めた。Casepase阻害物質による治療効果は見られず,今後、投与時期や他の薬剤について研究を進める必要があると考えられた。また、生後5日目のラット脳に6-OHDAを投与して、ADHDモデルを作成し、本仮死モデルとの差異を検討していきたい。1.新生児仮死に伴う行動障害に関する検討日齢7日目のSDラットを用いて新生児仮死モデル(RiceのHIモデル)を作成した。水迷路試験法により、水面下プラットフォームに達するまでの遊泳距離、遊泳時間を日齢28日目から5日間連続的に測定することによって空間学習能力を評価し、同日齢の対照群と比較検討した。仮死群では遊泳時間、遊泳距離に明らかな延長が認められ、新生児期の低酸素性脳虚血が空間学習能力の低下をきたすことが明らかとなった。2.組織学的解析及び生化学的解析1)行動評価終了後に大脳組織を摘出して、大脳皮質梗塞面積、海馬CA1領域の神経細胞密度を測定し行動評価法の結果との関係を検討したが、有意な相関は認められなかった。行動障害の出現には海馬以外の特定の領域の障害が関与している可能性が示唆された。2)低酸素性虚血負荷後に経時的に脳を摘出し、免疫組織化学的手法によってCaspase 3陽性細胞の出現時期を検討したところ、負荷後16時間から24時間後に急速に陽性細胞が出現した。また、ウエスタンブロッティング法によっても、Caspase 3陽性細胞の出現時期と一致してピークが確認された。この結果、薬物治療の開始時期は仮死発生後遅くとも16時間以内に設定する必要性が明らかとなった。3.薬物治療の投与量、投与経路に関する検討

アポトーシス発生に対するCaspase阻害物質(BAF)の効果を、頭蓋内投与に加えて、より臨床応用が簡便な腹腔内投与法を用いて検討を行った。しかし、BAFを大量に腹腔内へ投与した場合には他の臓器への悪影響が見られ、適切な投与時期とともに投与方法の設定が重要であることが判明した。4.ADHD障害ラットの作成生後5日目のラットに6-OHDAを脳槽内に投与し、ADHD障害モデルの作成を試行中である。平成16年度には、これらの研究成果をもとに、BAFなどの薬物投与が低酸素性虚血性脳障害に伴って生じる空間学習障害にどのような治療効果を持つかを検討していく予定である。1.新生児仮死モデルにおける行動評価生後7日目のSDラットを用いて新生児仮死モデル(n:15)を作成した。Morris水迷路試験を用いて、水面下のプラットホームに達するまでの遊泳時間、遊泳距離を日齢28日目から5日間連続で測定し学習能力を評価し、さらにラット用踏み車を用いて運動能力を評価した。同日齢の対照群(n:15)と比較検討したところ、仮死群では遊泳時間、遊泳距離の明らかな延長が見られた。一方、運動能力には両群問に差がなく、遊泳時間の延長が空間学習能力の低下によることが明らかとなった。2.組織学的解析及び生化学的解析(1)組織学的解析:行動評価終了後に大脳組織を摘出して、大脳皮質梗塞面積、海馬CA1領域の神経細胞密度を測定し行動評価法の結果との関係を検討したが,有意な相関を認めなかった。行動障害は,特定領域ではなく複数領域を結ぶネットワークの障害が原因と推測された。(2)生化学的解析:免疫組織学的手法、ウエスタンブロッティング法によりCaspase3陽性細胞が、負荷後16時間から24時間にピークとなって出現することを確認した。3.薬物治療の効果に関する解析Caspase阻害物質(BAF)100mMを、低酸素負荷前(BAF-1群:n=15)、低酸素負荷前及び負荷後12時間後(BAF-2群:n=5)にラット腹腔内へ投与した。生後28日目に行動評価を行ったが,未治療群との間に学習能力に差を認めなかった。4.本研究のまとめと今後の課題一側大脳半球への低酸素性虚血負荷により、学習障害ラットを作成した。本モデルはヒト新生児の片側大脳半球梗塞例と同様に運動能力障害を持たず、空間学習能力の障害を認めた。Caspase阻害物質による治療効果は見られず,今後、投与経路や他の薬剤による効果について研究を進める必要があると考えられた。