hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TRH欠損症における人proTRH cDNA塩基配列異常の研究

TRH欠損症患者のproTRH cDNAの検討TRH欠損症患者のproTRH cDNAの検討ラットproTRHcDNAのamplificationラットproTRHcDNAの5端+117のsense並びにproTRHをencodeしているexon5の3'端antisense(T_7promtorを付加し、かつEcoRI〔G GAATTCC〕並びにHindIII認識塩基linker〔CAAGCTTG〕を付加している)を用い、Mg^<++>0.2mM,annealing温度56°Cのlow stringencyでTaq polymeraseを使用するPCRを30cycles行い、ラットproTRHcDNAをamplifyした。その後EcoRI並びにHindIIIのrestriction enzymeを使用し、上記のamplifsedCDNAを切断後、SP65vectorへinsertした。その後、T_7RNA polymeraseを用いて^<32>P-proTRHcRNAを作製した。ラットを甲状腺摘出し2週間後にT_47.5μg/100g体重を腹腔内投与後、経時的に断頭屠殺し、前視床下部をguanidium-thiocyanate,lithium chloride,phenol,ethanol沈澱法を用い、全RNAを抽出した。1%agarose gel電気泳動を行い、ナイロンフィルタ-にblottingした後、上記にて得られた^<32>P-proTRHcRNAを用いてNorthern blot解折を行った。ラットproTRHmRNAは1.2Kbpの位置に検出された。このNorthern blotをデンシトメ-タ-により測定すると、正常全視床下部TRHmRNAは23.3±3.4AU(N=7)であり、甲状腺摘出2週間後には43.8±5.3AU(N=13)へと著明に増加し、T_4投与3時間後には、27.3±2.9AU(N=7)へと減少し、投与24時間後には12.0±2.3AU(N=7)へと正常よりむしろ減少した。これらの成績はproTRHcDNAはPCR法により確実にamplifyされた事を示しており、かつラット前視床下部でのproTRH gene expression研究にも応用可能である事を示している。2.人及びマウスproTRHcDNAの決定:ラットproTRHcDNAseguenceの5′側並びに3′側(antiーsense)oligonucteotidesをDNAシンセサイザ-で合成し(各々に2025mer)、人及びマウス視床下部RNAよりrererse transcriptidaseで合成したcDNAをtemplateとし、polymerase chain reaction法によりamplificationを行った。5′cDNA amplificationはuntranslatea regionと、coding regionをprimerとしてamplificationを行った。また3′end amplificationは最初oligo(dT)primerでamplificationを行い、(Sal I酵素認識部位を含む)、次いで25merのprimerとoligo(dT)primerとの間でamplificationを行い、更にinside primerとSal I認識部位との間でamplificationを行った。これらのfragmentsをpGEM3Z vectorにsubcloningし、dideoxynucleotideーtermination法によりseguenaを行った。Northern blot解析、translated proteinの抗proTRH抗体沈障法により、これらが、人及びマウスproTRHcDNAである事が決定された。TRH欠損症患者のproTRHcDNAの検討
加齢黄斑変性サルの網膜色素上皮細胞における分子細胞生物学的解析及び新規治療法の探索

黄斑部にドルーゼンをともなう加齢性黄斑変性カニクイザルの網膜色素上皮細胞を初代培養し、健常な細胞との比較を行った。電子顕微鏡による細胞接着構造、貪食作用、オートファジー、遺伝子発現が比較され、疾患細胞において様々な異常が観察された。1.黄斑変性症カニクイザルの網膜色素上皮(RPE)細胞の病態生理学的解析疾患ザルの初代培養RPE細胞を播種し、培養6日後の細胞数を測定した結果、正常個体のRPE細胞に比べ著しく増殖能が低下、或いは遅くなることが分かった。タイトジャンクションタンパク質であるZO-1の免疫染色とウェスタンブロッティングでは、発現が顕著に減少した。RPE細胞は、老化し脱落する視細胞の外節を貪食作用により、細胞の中に取り込み分解することで微環境を守る。この貪食作用をタイムラップス顕微鏡で撮影した結果、その機能が明らかに低下していることが判明された。以上の表現型解析から、このカニクイザル疾患モデルはヒトの加齢性黄斑変性症フェノタイプと非常に類似していることが示唆された。2.網膜色素上皮細胞の遺伝子発現解析初代培養カニクイザルRPE細胞からトータルRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイ解析を行った。解析にはRhesus Macaque(V2)Gene Expression Microarray(4×44K、アジレント社)とFilgen Array for Macaca fascicularis(フィルジェン社)の二種類のチップを使用した。その結果、多くのケモカインや補体因子の著しい発現増加が認められた。また、これらタンパク質の発現変化を免疫染色とフローサイトメーターで確認した。さらに、今まで報告のなかったある遺伝子の発現変化を初めて見つけた。その発現変化をRT-PCRやウェスタンブロッティングにより確認した。生物学的分類では免疫関連や炎症性関連遺伝子の発現変化が最も激しかった。現在、更なる機能解析を行っている。黄斑部は主に霊長類で発達しており、一般的な実験動物であるげっ歯類のマウスやラットには存在しない。本研究では、(1)疾患と健常カニクイザルの網膜色素上皮細胞の細胞生物学的解析を行い、疾患モデルの病理学的変化などの情報を得る。(2)遺伝子発現解析を行い、発現分子の差から、細胞内の代謝経路の違いを探る。発現量の差は疾患に直接あるいは二次的に関与するものが含まれており、これらを整理し、追試することによって、発症に直接関与する分子機構を解明する。本研究で得られる情報はヒト加齢黄斑変性症の病態解明、予防・治療法の開発にも有用と考えられる。DNAマイクロアレーを用いた遺伝子発現解析の実験によって、ヒト加齢黄斑変性に関与する補体やケモカインなどの免疫関連遺伝子の発現が大きく変動しており、同種の遺伝子についても上昇あるいは低下しているものが観察された。これらの遺伝子は個別に遺伝子改変マウスが作製されており、黄斑変性に特徴的な網膜の表現型が観察されている。本実験においてこれらの遺伝子の発現変動幅が最も大きかったことは、疾患サルの網膜色素上皮細胞において、同様な代謝変化が起こっていると考えられる。今回疾患3頭、健常3頭から網膜色素上皮細胞を培養し、疾患個体から重篤なものと軽傷なものを選別したが、遺伝子発現もこれに連動して変化することが明らかとなった。変動の大きかった補体やケモカインに対する阻害薬を硝子体投与した後にレザー照射誘導型の網膜新生血管モデルを作製し、その影響を検証したが、顕著な結果は得られなかった。
ＭＡＰＫシグナル亢進による炎症性歯周病モデルの作製

歯周病は細菌感染による慢性炎症疾患である。歯周病の治療を進歩させるために生体側の病態の解明が重要である。我々は,病態を反映した歯周病モデルの確立を目指して,炎症性の細胞内伝達因子であるMAPKが恒常的に活性化しているMAPK phosphatase-1 (MAPK不活性化因子, MKP-1)遺伝子欠損マウスと骨吸収が亢進したOPG遺伝子欠損マウスを交配して新規の炎症性歯周病モデルの作製を試みた。(結果)MKP-1・OPG遺伝子へテロ二重遺伝子改変マウスを得た。マイクロCTの解析より、MKP-1・OPG遺伝子へテロ二重遺伝子改変マウスでは歯槽骨の進行を認めた。しかし,病態は複雑であり解明は十分でない。その理由は,細菌や宿主に関わる多様な因子が関与するためである。宿主の慢性的な炎症反応により歯周組織破壊および歯槽骨吸収が起こる。しかし,炎症反応が歯槽骨吸収にどの程度関与するかは明確でない。本研究の目的は,(1)病態を反映した歯周病モデルの確立を目指して,炎症性の細胞内伝達因子であるMAPKが恒常的に活性化しているMAPK phosphatase-1 (MAPK不活性化因子, MKP-1)遺伝子欠損マウスと骨吸収が亢進したOPG遺伝子欠損マウスを交配して新規の炎症性歯周病モデルの作製を試みる。(2)(1)を用いて,歯周病に対する炎症性遺伝子の役割を生体レベルで解明する。(3)炎症性歯周病モデルに抗炎症薬または骨吸収抑制薬を投与して評価することである。(実験内容)新規炎症性歯周病モデルの作製:MAPKを恒常的に発現するMKP-1遺伝子欠損とOPG遺伝子の二重欠損マウスを作製する。A)MKP-1及びOPG遺伝子欠損マウスを交配する。B)これら,MKP-1・OPG遺伝子二重欠損マウス及びMKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスの歯槽骨をマイクロCTで撮影する。評価項目は,ヒトと同様にセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を歯槽骨吸収量として測定する。このマウスの歯槽骨を解析中である。歯槽骨吸収のみならず全身性の骨吸収に及ぼす影響を調べるために大腿骨の海綿骨量も解析中である。MKP-1・OPGヘテロ欠損二重遺伝子改変マウスに歯周病細菌の接種を行い,その歯槽骨吸収量を解析中である。この解析により,歯槽骨吸収におけるMKPKの影響が明らかにできる。今後,MKP-1・OPGヘテロ欠損二重遺伝子改変マウスに歯周病細菌の接種を行い,その歯槽骨吸収量などを検討する予定である。

しかし,病態は複雑であり解明は十分でない。その理由は,細菌や宿主に関わる多様な因子が関与するためである。宿主の慢性的な炎症反応により歯周組織破壊および歯槽骨吸収が起こる。しかし,炎症反応が歯槽骨吸収にどの程度関与するかは明確でない。歯周病の治療を進歩させるために生体側の病態の解明が重要である。本研究の目的は,(1)病態を反映した歯周病モデルの確立を目指して,炎症性の細胞内伝達因子であるMAPKが恒常的に活性化しているMAPK phosphatase-1 (MAPK不活性化因子, MKP-1)遺伝子欠損マウスと骨吸収が亢進したOPG遺伝子欠損マウスを交配して新規の炎症性歯周病モデルの作製を試みる。(2)(1)を用いて,歯周病に対する炎症性遺伝子の役割を生体レベルで解明する。(実験内容)新規炎症性歯周病モデルの作製:MAPKを恒常的に発現するMKP-1遺伝子欠損とOPG遺伝子の二重欠損マウスを作製する。A)MKP-1及びOPG遺伝子欠損マウスを交配する。B)これら,MKP-1・OPG遺伝子二重欠損マウス及びMKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスの歯槽骨をマイクロCTで撮影する。評価項目は,ヒトと同様にセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を歯槽骨吸収量として測定する。(結果)MKP-1・OPG遺伝子二重遺伝子改変マウスを得た。マイクロCTの解析より、MKP-1・OPG遺伝子二重遺伝子改変マウスでは歯槽骨の進行を認めた。MKP-1欠損による影響は著明ではなかった。MKP-1・OPGヘテロ欠損二重遺伝子改変マウスに歯周病細菌の接種を行ったところ、その歯槽骨吸収量は増加した。MKP-1欠損による炎症の亢進により歯槽骨吸収の増加傾向が観察された。細菌感染による他の因子も歯槽骨吸収の進行に重要であることが示唆された。医歯薬学研究の目的に記載したとおりの実験を行うことが出来た。研究の目的に記載したとおりの実験を行うことが出来た。本実験より得られたMKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスへの歯周病細菌接種による高感度な細菌感染性歯周病モデルの作製A)MKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスの口腔に歯周病細菌であるP. gingivalisを接種した。B)細菌感染後のMKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスの歯槽骨量をマイクロCTで評価する。歯周組織を組織学的に検討する。c)全身性の骨吸収に及ぼす影響を調べるために大腿骨の海綿骨量も解析中である。これらの評価より,歯周炎の発症における細菌感染や炎症性因子の意義を考察する。今年度の実験により得られたMKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスへの歯周病細菌接種による高感度な細菌感染性歯周病モデルの作製A)MKP-1・OPG遺伝子へテロ二重欠損マウスの口腔に歯周病細菌であるP. gingivalisを接種する。学会発表が予定より少なく出張費に未使用額が生じた。本研究成果をまとめて学会発表を次年度行う予定である。学会の出張費として使用する予定である。該当なし
表面・吸着分子の光電子スペクトルの線形に関する理論及びそのスペクトル解析への応用

1.16ビットマイクロコンピュータを用い、スペクトルデータのディジタル化、及びデコンボリューション処理を行うためのシステムを作製した。特にチャート紙に記録されたデータをイメージスキャナによりディジタル化して取り込めるシステムを新しく開発した。この方法によれば、チャート紙に書かれたどんな種類のスペクトルでもコンピュータ処理が可能である。きわめて簡便な方法にもかかわらず、精度も良く、今度この方法によるスペクトル処理に広く応用できるものと期待される。2.スペクトルデータのデコンボリューションのためのプログラムを新しく開発した。マイクロコンピュータで高速処理を行うため、すでに我々が提唱したFIRO(ファイナイト.インパルス.レスポンス.オペレータ)法を応用した。今回新しく理論的考察により、高速フーリェ変換(FFT)法をFIRO法に導入し処理速度を格段に向上させるソフトを開発した。この新しい方法では、特に線形が、ガウス,ガウス-ロレンツ-コンボリュートであるものについて、従来より100倍も高速処理が可能となった。新しいFT-FIRO法では高速ハードディスクの利用により一般のスペクトル解析に広く応用することができる。3.吸着分子のスペクトルは一般に広巾で分解能は良くない。特に光電子スペクトルでは吸着分子と表面との相互作用の結果、高分解能スペクトルを得ることが難かしい。本研究では銅表面上に吸着したメタノールの光電子スペクトル(UPS)について、上記システムを用いFT-FIRO法による分解能の向上を試み、実測スペクトルの分解能を向上させることができた。今後、光電子スペクトルの解析手段としてきわめ有効である。特にFT-FIRO法では処理スペクトルのη次微分形が容易に求められ、ピーク位置の決定の精度を上げることができ、より一層の発展が期待できる。
抗酸化物質を用いた肩腱板変性断裂に対する予防的治療の開発

まずin vitro実験としてヒト腱板組織より肩腱板由来細胞を分離後、各種抗酸化薬の投与下で48時間培養し、酸化・炎症関連遺伝子の発現やROS・アポトーシスの発現、細胞活性など評価する。次にin vivo実験ではAGEs/ROS発現増強動物モデルとして1年齢もしくは2年齢の高齢のラットまたは糖尿病ラットを用い、各種抗酸化薬を投与した上で、腱板組織におけるAGEs/ROS発現量および酸化・炎症関連遺伝子の発現、ROS・アポトーシスの発現量の評価、引っ張り試験による腱板強度評価を、抗酸化薬非投与群のラット腱板組織と比較検討する。
骨シンチグラフィーを利用した咬合変化に伴う顎関節部骨リモデリングの解明

【目的】骨シンチグラフィーで使用する99mTc-metylenediphosphonateは、骨のturn-overが盛んな部位に強く集積する特性を持ち、骨のリモデリングの状態を動的に把握することが出来る。本研究では、咬合支持の喪失により顎関節で生じる骨リモデリングの様相を骨シンチグラフィーを用いて経時的に観察した。【対象と方法】全身麻酔下にてWistarラットの上顎右側臼歯3本を抜歯し、咬合支持喪失モデルとした。99mTc-MDPを静注(74mBq/body)し、核医学画像処理装置(ZLC7500、Siemens社製)に自作の高解像度用ピンホールコリメーターを装着し、ラット顎関節部の骨シンチグラフィーを頭頂方向から撮像した。撮像は抜歯4日後、1,2,3,4週間後までの期間とした。得られた骨シンチ画像ファイルは、データ処理装置(scintipac700、島津社製)からパーソナルコンピューターへ転送した後、画像解析ソフト(osiris、Geneva University Hosipital)で解析処理を行った。X線画像による顎関節の位置を参考にして、骨シンチ画像上で左右の顎関節の部位に関心領域(ROI)を設定し、左右の顎関節での99mTc-MDPの取り込み量を比較した。【結果】抜歯4日後より、抜歯側顎関節での99mTc-MDPの集積値は、健側顎関節の値に比較して有意に増加し、3週後まで有意差が認められた。このことから咬合の変化に伴う顎関節のリモデリングは、抜歯直後から持続的に生じることが示唆された。抜歯側では咬合支持喪失により顎関節にかかる負荷が増大することが予想され、その力的負荷に対する生体反応として骨代謝活性の亢進、すなわちリモデリングが速やかに生じたものと考えられる。申請者らが用いたラットは、4週目と週齢が若いことから成長期にあると考えられ、健側においても骨形成が認められた。今後は成長期を過ぎたラットにおいても同様の実験を行い、骨形成に変化が認められるかを検証する必要があると考えられる。【目的】骨シンチグラフィーで使用する^<99m>Tc-metylenediphosphonateは、骨芽細胞の活性が高い部位に強く集積する特性を持ち骨のリモデリングの状態を動的に把握することが出来る。^<99m>Tc-MDPを静注(74mBq/body)し、核医学画像処理装置(ZLC7500、Siemens社製)に高解像度用ピンホールコリメーターを装着し、ラット頭部の骨シンチグラフィーを頭頂方向から撮像した。X線画像による顎関節の位置を参考にして、骨シンチ画像上で左右の顎関節の部位に関心領域(ROI)を設定し、左右の顎関節での^<99m>Tc-MDPの取り込み量を比較した。【結果】抜歯4日後より、抜歯側顎関節での^<99m>Tc-MDPの集積値は、健側顎関節の値に比較して有意に増加した(p<0.05:Mann-Whitney U test)。

【結果】抜歯4日後より、抜歯側顎関節での99mTc-MDPの集積値は、健側顎関節の値に比較して有意に増加し、3週後まで有意差が認められた。このことから咬合の変化に伴う顎関節のリモデリングは、抜歯直後から持続的に生じることが示唆された。抜歯側では咬合支持喪失により顎関節にかかる負荷が増大することが予想され、その力的負荷に対する生体反応として骨代謝活性の亢進、すなわちリモデリングが速やかに生じたものと考えられる。申請者らが用いたラットは、4週目と週齢が若いことから成長期にあると考えられ、健側においても骨形成が認められた。今後は成長期を過ぎたラットにおいても同様の実験を行い、骨形成に変化が認められるかを検証する必要があると考えられる。
消化器固形癌特異的発現トランスポーターLST-2を用いた癌指向性抗癌剤の開発

申請者は最近単離した新規有機アニオントランスポーターLST-1に引き続きLST-2を世界に先駆けて単離した。LST-2は正常ヒト肝臓のみに弱く発現していたが胃癌、大腸癌、膵臓癌において多量に発現していた。各種発現系の結果からLST-2はMTXを飽和的にかつ濃度依存的に輸送し培養細胞へのLST-2遺伝子の導入は細胞のMTXに対する感受性を高めることが明らかとなった。本研究ではアデノウイルスを用いたLST-2強制発現細胞を作製し、その発現細胞に取り込まれる蛍光標識物質の蛍光強度に対する各種薬物の阻害効率を指標に消化器固形癌指向性薬物の探索を目的とする。我々はアデノウイルスを用いたトランスポーターの強制発現系を樹立し、蛍光マイクロタイタープレートを用いてLST-2で輸送される蛍光基質の取り込みの抑制を指標とした消化器固形癌指向性薬物のスクリーニング系の開発を行った。動物細胞で働くCAGプロモーターを含むcosmid vector, pAxCAwtにLST-1,LST-2c DNAの翻訳領域を挿入、アデノウイルスゲノムDNAと共にリン酸カルシウム法でHEK293細胞にcotransfectionし、LST-1,LST-2組み換えアデノウイルス(AdLST-1,AdLST-2)を得た。AdLST-1,AdLST-2を各種細胞株に感染させ、放射線標識体の取り込み実験を行った。AdLST-1,AdLST-2を感染させたHepG2,PLC/PRF/5,HT17で[3H]-タウロコール酸(TCA)の取り込みを検討したところ、コントロールに対して最大36.7倍の有意な取り込みが認められた。AdLST-1,AdLST-2の感染により発現したLST-1及びLST-2は共に濃度依存的、飽和的にTCAを取り込んだ。また、ケノデオキシコール酸(CDCA)はLST-2によって濃度依存的飽和的に取り込まれ、そのKm値は0.66+0.11μMであり非常に親和性の高い基質であることがわかり、機能的にも効果的に細胞にLST-2を導入することが可能になった。
非相同末端再結合修復機礎のhaploid insufficiencyと大腸発がん

実験に使用するマウスを得るためのDNA-PKcs変異のタイピングを簡便に行う為に、新たにプライマーを設計して蛍光標識オリゴマーを作成し、シークエンサーを用いたAFLP解析によるDNA-PKcs変異の簡便な検出系を開発した。2.自然発生及びAOM誘発突然変異の変異体頻度(MF)と変異スペクトラムに対するDNA-PKcs失活の影響欠失型変異検出系(Spi-assay)により解析した。DNA-PKcs変異のホモ接合体(scid/scid)及び野生型(+/+)マウスの大腸粘膜における自然発生突然変異のMFに有意差は認められなかったが、azoxymethane(AOM)誘発突然変異のMFはscid/scidの方が+/+より高い傾向が認められた(P=0.053)。変異スペクトラムの解析より、5cfd/5cfdから得られた変異体には、1kbp以上の大きさ(大欠失型)の欠失変異の多い傾向が認められ、特にAOM誘発突然変異では、有意に高かった(P=0.048)。3.AOM誘発突然変異及び発がんに対するDNA-PKcsのhaploid insufficiencyの影響自然発生突然変異の場合、ヘテロ接合体(scid/+)のMFは、特に100bp以下の欠失(小欠失型)で+/+よりも高い傾向が認められた。AOM誘発突然変異の場合は、MFは、5cfd/5cfd,5cfd1+,+/+の各遺伝子型で、106個のプラーク当たり7.3±1.6,25.9±12.5,5.7±2.9であった。また、scid/+は+/+よりも、小欠失のみならず、有意に大欠失型のMFが高かった。小欠失型のみならず、大欠失型のDNA修復機構においてもhaploid insufficiencyが存在している可能性が示唆された。大腸発がん性に関しては、組織学的に詳細に検討中である。1.DNA-PKcs変異を導入したgpt deltaマウスの作成DNA-PKcs変異のホモ接合体であるScidマウスとgpt deltaマウスを交配して選別を行い、DNA-PKcs変異はヘテロ接合体であり、gpt deltaはホモ接合体であるマウスを得た。これらのマウスを継代・繁殖させて実験に使用するマウスを得ている。また、新たにプライマーを設計して蛍光標識オリゴマーを作成し、シークエンサーを用いたAFLP解析により、DNA-PKcs変異の有無によるタイピングを簡便に行う系を開発した。2.DNA-PKcs変異を導入したgpt deltaマウスを用いたin vivoでの自然発生及びAOM誘発突然変異の変異頻度の検討gpt deltaマウスを用いたin vivoでの突然変異検出系の特に欠失変異を検出するSpi^- assayにより検討した。DNA-PKcs変異のホモ接合体及び野生型マウスの大腸粘膜における自然発生突然変異の変異頻度に有意差は認められなかったが、azoxymethane(AOM)誘発突然変異の変異頻度はホモ接合体の方が野生型より高い傾向が認められた(P=0.12)。ヘテロ接合体については、現在検討中である。3.変異スペクトラムの解析DNA-PKcs変異のホモ接合体及び野生型マウスから自然発生及びAOM誘発突然変異で得られた変異体の変異スペクトラムを解析した。ホモ接合体から得られた変異体には、1kb以上の大きさの欠失変異が多い傾向が認められ、特にAOM誘発突然変異では、ホモ接合体の変異頻度が野生型よりも有意に高かった(P=0.048)。

4.AOMで誘発される発がん性に対するDNA-PKcsのhaploid insufficiencyの影響についての検討DNA-PKcs変異のホモ接合体、ヘテロ接合体、野生型の雌雄を用いて、AOMで誘発される大腸の発がん性を検討中である。1.DNA-PKcs変異を導入したgpt deltaマウスを用いたin vivoにおける自然発生及びAOM誘発突然変異体頻度及び変異スペクトラムに対するhaploid insufficiencyの影響欠失型変異検出系(Spi^- assay)を用いて、ヘテロ接合体(scid/+)の大腸粘膜DNAについて解析した。自然発生突然変異では、scid/+の突然変異体頻度は10^6個のプラーク当たり各々7.8,2.7,2.2,3.7,37.4,70.8,1.5,1.4,1.2だった。他の個体に比較して1020倍高かった2個体の変異プラークの大部分は同一変異であり、1種類の変異体が細胞増殖により増幅したと仮定すると、scid/+は平均10^6個のプラーク当たり3.1±2.1だった。ホモ接合体(scid/scid)及び野生型(+/+)の10^6個のプラーク当たり2.3±1.5,2.4±1.3とscid/+に有意な差は認められなかった。AOM誘発突然変異において、scid/+は平均10^6個のプラーク当たり25.9±12.5であり、scid/scid及び+/+の7.3±1.6,5.7±2.9に比較して有意に高かった。scid/+は+/+よりAOM誘発突然変異体頻度が高いことから、AOMによるDNA損傷のDNA修復にはDNA-PKcsが関与し、haploid insufficiencyが存在することが示唆された。scid/+がscid/scidと比較して突然変異体頻度が高いのは、scid/scidは、突然変異が多く誘発されるためapoptosisが誘導され、結果として突然変異細胞が少なくなった可能性が考えられる。AOMにより誘発される大腸のapoptosisに関して各遺伝子型マウスを用いて解析する予定である。scid/+由来の変異プラークの変異スペクトラムは現在解析中である。2.AOMで誘発される発がん性に対するDNA-PKcsのhaploid insufficiencyの影響AOMを用いた投与実験は終了し、現在、組織学的解析を行っている。DNA-PKcs変異を導入したgpt deltaマウスを用いたin vivoでの自然発生及びazoxymethane(AOM)誘発突然変異における変異スペクトラムに対するhaploid insufficiencyの影響を調べた。まず、欠失型変異検出系(Spi^- assay)において大腸粘膜DNAから得られた突然変異体の変異部位における欠失サイズを解析した。自然発生突然変異の場合、突然変異体頻度は、scid/scid,scid/+,+/+の各遺伝子型で10^6個のプラーク当たり2.3±1.5,3.1±2.1,2.4±1.3であったが、大欠失型(1kbp以上の欠失サイズ)の突然変異体頻度は、0.6±0.4,0.3±0.5,0.3±0.4であり、小欠失型は、1.5±1.7,2.1±1.7,1.1±1.1であった。
手指による物体操作の伝達を可能とするロボットの半自律遠隔操作技術の開発

平成30年度は,遠隔操作におけるロボットの自律機能の一環として,剛体および非剛体の認識技術の開発を行った.剛体の認識技術については,ロボットの頭部と左右のハンドに搭載された3台のRGB-Dカメラの画像から,画像情報とカメラ間の相対姿勢情報を同時に利用して,多層ニューラルネットにより物体認識を行う手法を開発した.評価実験の結果,カメラ間の相対姿勢情報を使うことによって,物体の部分隠蔽に対して頑健な認識を実現できることが確認できた.非剛体の認識技術については,ロボットによる衣類や布の操りを想定して,平面上に無作為に置かれた長方形布の形状を1枚の画像から推定する手法を開発した.提案手法では,格子状に配置した離散特徴点で布をモデル化し,特徴点近傍のテクスチャ情報と隣接特徴点間の位置制約を同時に利用して,多層ニューラルネットにより画像中の各特徴点の位置を推定する.評価実験の結果,隣接特徴点間の位置制約によって,折れ曲がり箇所が複数存在する布に対して形状の推定精度が向上することが確認できた.また,平成28年度に開発した持ち替えに基づく未知小物体の全周3次元形状計測法では,ロボットハンドによる把持の可否を考慮せずに持ち替えを計画していた.平成30年度は,物体の部分3次元形状データを球・円筒・対向面のプリミティブ形状に分解し,ロボットハンドで把持可能な箇所を多様体として求め,RRT法に基づき現在位置といずれかの把持候補多様体を結ぶロボットハンドの経路を計画することによって,実機で持ち替えを実現できるようにした.実験の結果,シミュレータ環境では物体の全周3次元形状を精度よく計測できることが確認できたが,実環境ではセンサのマルチパスやロボットハンドと物体の滑りなどに起因する計測誤差が発生することが確認できた.国内学会にて研究発表を5件行った.平成28年度は,ロボットを遠隔操作する操作者の動作認識の一環として,遠隔操作者が手指で物体を操る動作を撮影した映像を元に,手と物体の相互隠ぺいが発生している状況で手の形状を頑健に認識する手法の開発を行った.具体的には,深層学習の一種であるConvolutional Neural Networks (CNN)を2系統並列に配置し終端を全結合層で統合した2stream CNNを構築し,RGB-Dカメラの深度情報と肌色情報を元に映像を手領域と物体領域と背景領域に分割し,手領域と物体領域を各CNNに入力することによって,相互隠ぺいが発生している状況で精度よく手形状を識別することが可能な識別器を学習させた.実画像を使用した実験で,従来の1stream CNNと比較して識別性能が有意に向上したことを確認した.遠隔操作におけるロボットの自律機能の一環として,ロボットに搭載したRGB-Dカメラと2台のロボットアーム・ハンドを用いて,未知小物体の全周3次元形状を自動計測する方法を開発した.具体的には,これまでに開発したRGB-Dカメラと1台のロボットアーム・ハンドを用いる方法を拡張し,途中で物体を持ち替えることによって,欠損が生じる把持位置の画像やアームの可動範囲外の視点からの画像を補い,欠損のない全周3次元データを取得する方法を開発した.ロボット実機を模したシミュレーション環境で開発した方法の効果を確認した.国内学会にて研究発表を2件行った.平成28年度に実施予定だった研究は概ね順調に進展した.平成29年度は,ロボットの自律運動機能と遠隔操作者による操作指令を融合した遠隔物体操作を実現するためのロボットの自律機能の開発を行った.特に狭隘空間で,多指ハンドとロボットアームを搭載したロボットを用いて遠隔物体操作を行うために,次の2つの自律運動機能を開発した.(1)RRTに基づく経路計画法を拡張し,障害物近傍でのみ多指の自由度を探索に利用することによって,把持の崩れを最小限に抑え,なおかつロボットアームと多指ハンドの双方の自由度を利用して狭隘空間で物体を目的の場所に移動することが可能な経路計画法を開発した.(2)一種の幅優先探索であるRRTに基づく経路計画法と,勾配降下法を利用した深さ優先探索を組み合わせることによって,狭隘空間における物体の把握動作を効率よく計画する方法を開発した.動力学シミュレータを用いたシミュレーション実験および多指ハンドとロボットアームを搭載した実ロボットを用いた実機実験によって,提案手法の有効性を確認した.また,狭隘空間での遠隔物体操作において,ロボット頭部のカメラとロボットアームに搭載したカメラの映像を3次元的に合成し,頭部と対象物体の間の障害物を透過表示することによって,隠蔽されていない操作対象物体の見えを遠隔操作者に提示して遠隔操作を容易にする映像提示手法を開発した.また,提案手法を実ロボットとHMDから構成されるロボットシステムに実装して,その有効性を検証した.国内学会にて研究発表を7件行った.平成29年度に実施予定だった研究は概ね順調に進展した.平成30年度は,遠隔操作におけるロボットの自律機能の一環として,剛体および非剛体の認識技術の開発を行った.剛体の認識技術については,ロボットの頭部と左右のハンドに搭載された3台のRGB-Dカメラの画像から,画像情報とカメラ間の相対姿勢情報を同時に利用して,多層ニューラルネットにより物体認識を行う手法を開発した.評価実験の結果,カメラ間の相対姿勢情報を使うことによって,物体の部分隠蔽に対して頑健な認識を実現できることが確認できた.

非剛体の認識技術については,ロボットによる衣類や布の操りを想定して,平面上に無作為に置かれた長方形布の形状を1枚の画像から推定する手法を開発した.提案手法では,格子状に配置した離散特徴点で布をモデル化し,特徴点近傍のテクスチャ情報と隣接特徴点間の位置制約を同時に利用して,多層ニューラルネットにより画像中の各特徴点の位置を推定する.評価実験の結果,隣接特徴点間の位置制約によって,折れ曲がり箇所が複数存在する布に対して形状の推定精度が向上することが確認できた.また,平成28年度に開発した持ち替えに基づく未知小物体の全周3次元形状計測法では,ロボットハンドによる把持の可否を考慮せずに持ち替えを計画していた.平成30年度は,物体の部分3次元形状データを球・円筒・対向面のプリミティブ形状に分解し,ロボットハンドで把持可能な箇所を多様体として求め,RRT法に基づき現在位置といずれかの把持候補多様体を結ぶロボットハンドの経路を計画することによって,実機で持ち替えを実現できるようにした.実験の結果,シミュレータ環境では物体の全周3次元形状を精度よく計測できることが確認できたが,実環境ではセンサのマルチパスやロボットハンドと物体の滑りなどに起因する計測誤差が発生することが確認できた.国内学会にて研究発表を5件行った.当初の研究計画どおり,共起性を利用した把持形態と物体の同時認識技術および把持形態と物体の認識結果に基づいた自律動作と遠隔操作の自然な融合技術の開発を進めていく.当初の研究計画どおり,共起性を利用した把持形態と物体の同時認識技術およびと把持形態と物体の認識結果に基づいた自律動作と遠隔操作の自然な融合技術の開発を進めていく.一部の購入予定物品の仕様を再検討する必要が生じたため.理由:一部の物品の購入時期を次年度に変更したため.使用計画:開発中の多指ハンドの製作費に使用する.物品の仕様を再検討して購入する計画である.
中国嶺南地域の摩崖石刻の資料化とそれに拠る中国山水文学の実証的研究

石刻は一次史料であり、中でも摩崖石刻は山水文学との関係が深い。中国の嶺南地域には摩崖石刻が多く、かつ唐代の山水文学の形成に最も影響の大であった桂林およびその周辺に集中している。本研究では桂林の摩崖石刻について、現地調査を行い、原文を復元することで、従来の研究を補足し、また訂正を迫った。調査地点は約二十個所、調査文物は百余に達し、その中で唐・五代に関する石刻六十六件について、存在地点、現存状態を詳細に記録し、あるいは画像処理した上で、録文を示し、また方志・総集・拓本など今日に伝わる歴代の史料によって対校・校勘を加えて原文の復元を試み、さらに刻年・作者・書者・事跡・真偽等について考察を加えた。その中で最も大きな成果は、1:現状の記録と復元によって文学・史学から宗教・美術に及ぶ多分野に大量の文献資料を提供した。2:『全唐文』・『全唐詩』および最近出版の『全唐文新編』・『全唐詩補編』に収める詩・文を数百字に亙って訂正すると同時にそれらに収められていないものも発見・復元した。それらは千字を越える。3:復元と考察を通して、李渤・呉武陵や元晦が桂林における景勝の開発と山水文学の発展に貢献する所が大であることを明らかにした。3:李陽冰・顔真卿・韓方明など著名な書家の作品を発見し、その真偽を考察すると同時に事跡等に関する史書の記載と従来の研究を補足・訂正した。本研究は摩崖石刻を中心としたものであるが、今回の現地調査によって洞内の深部にも貴重な石刻・墨書が現存していることを知った。この発見も大きな成果の一つである。今回の研究を基礎として洞外から洞内を対象とした調査と研究に進みたい。本年度の研究は、嶺南地域で摩崖石刻が最も集中しており、かつ唐代の山水文学の形成に最も影響の大であったと思われる桂林およびその周辺について、1「文献研究」、2「実地調査」、3「石刻史料等の研究」の過程によって進めた。1、文献研究:方志および当地発行の文献資料等に拠って、本研究に関係する摩崖石刻の存在の有無およびその場所を可能な限り特定し、実地調査に備えた。また、『全唐文』・『全唐詩』及び石刻史料集・方志等に拠って録文を収集・整理し、校勘に備えた。2、実地調査:中国桂林に渡り、すでに特定した地域(鉄封山・虞山・疊彩山・宝積山・西山・隠山・象鼻山・伏波山・独秀峰・七星山・芦笛岩・乳洞岩等)に入って摩崖石刻の位置・現状等を約二週間に亘って調査し、カメラ等の機材によって記録した。また、現地の桂林博物館・桂海碑林・桂林図書館で関係の文献資料を調査すると同時に桂林博物館・広西師範大学・桂林旅游高等専門学校・桂林人民政府等の研究者と交流し、情報・資料の提供を得た。3、石刻史料等の研究:現地調査で得た画像資料をパソコン等によって処理すると同時に、『全唐文』・『全唐詩』・石刻史料集・方志等との対校および校勘・解読を開始した。現段階ですでに百個所を越える異文を発見しており、その中には当地の学者の間でも未発見あるいは未研究の摩崖石刻・岩壁墨書があると思われる。成果の発表:

今回の調査と研究をふまえて、2002年1月6日に桂林旅游高等専門学校にて「桂林旅游資源開発」と題する学術報告(発表1時間30分、質疑30分)を行い、当地のテレビ・新聞『桂林日報』(1月9日第一面)でも紹介された。また、2002年2月18日に京都大学人文科学研究所にて「顔真卿書"逍遥樓"について」と題して研究発表を行い、顔真卿の書とされる桂林石刻の疑問等を指摘した。本年度は、昨年度に現地で行った摩崖石刻の基礎的な調査と資料収集によって得た画像の解析等に基づいて『全唐詩』・『全唐文』・『全唐詩補編』・『全唐文新編』や明・清の録文、さらに桂林文物管理委員会『桂林石刻』と対校し、原文を可能な限り復元した。その結果、中国山水文学の研究に限らず、史学・哲学・宗教・美術等に及ぶ幅広い分野に対して貴重な資料を提供すると同時に、従来の録文及び学説に対して大幅な訂正を迫ることができた。今回の復元による訂正は、『全唐文』・『全唐詩』に所収の作品に限っても、未収録の作品を含めば、数百字から千字に達する。中でも李渤「南溪詩序」・李渉「南溪玄巖銘并序」は、ほぼ完全な状態で現存しており、中国山水文学発展の研究にとって重要な史料であるだけでなく、著名な書家・韓方明の書である可能性が高い、貴重な文化財でもあることが分かった。また、現存する韓雲卿「平蠻頌」も、その存在はほとんど知られていないが、高い史料性を有する。本研究の成果の一部は、中国・永州柳宗元国際学術研討会(2002.8)で、石刻を使った山水文学の必要を説いて「簡州石刻柳宗元《永州八記》略考」と題して口頭発表し、また桂林の石刻と山水について論文「桂林名山"象鼻山"与"漓山"」・「成句"桂林山水甲天下"の出自と典拠について」を執筆した。その他、島大国文年会(2002.12.7)で「桂林の石刻」と題して王正功詩の石刻について講演し、また鳥取県技術士会第2回研修会(2003.3.1)では「桂林の歴史と文物」と題して李渤・李渉の石刻を中心にした講演を行うなど、地域社会への還元と交流をはかった。但し今回の調査で満足のいく結果を得ることができなかったものもある。機材・道具をそろえた上で再度調査に臨む必要がある。
重みつきグラフにおける新しい重み付け条件に関する研究

本年度は、昨年度に行った「禁止部分グラフと2-因子との関係」に関する研究を発展させ、「禁止部分グラフと因子との関係」について中心的に研究を進めた。以下、得られた結果について具体的に述べる。あるグラフHに対して「頂点数が十分大きい偶数のグラフGがH-フリーであるならば1-因子を持つ」という命題を考えた際、この命題を成り立たせるHはスターのみであることが知られており、またGに連結度の条件を加えた場合でもそれぞれの連結度に応じて適当なHのサイズが決定されている。この研究を動機として、二つのグラフを禁止した場合の適当な禁止部分グラフのペアについて研究がなされていた。しかしながら、禁止部分グラフのペアの完全な決定は連結度が低い場合のみなされており、連結度の高いグラフにおいては全容が解明されていなかった。本研究ではこの全容を解明し、連結度に応じた適当な禁止部分グラフのペアを完全に決定した。また、得られた結果は既存の結果のアナロジーとはなっておらず、これまでに予測できなかったペアが出現することが示されている。これはこの分野の今後の研究における一つの転換点となることが予想され、興味深い結果であると言える。また、2-因子についても同様に、二つの禁止部分グラフを用いた際の適当な禁止部分グラフのペアについて調べた。この問題については先行研究がなかったものの、1-因子の場合と似た性質が得られるとともに2-因子特有の性質についても明らかになり、今後の研究への広がりを期待させる結果となっている。本研究の目的は、重みつきグラフの持つ性質に関して「より多くの問題について」「より広いクラスの重みつきグラフに対して」一般のグラフと同様の性質を見い出し、一般のグラフにおける既存の定理を重みつきグラフに拡張することであった。本年度は3年計画の1年目にあたり、2年目以降における研究への準備として一般のグラフについての研究を進めた。その中で、特に多くの知見が得られた「2-因子」に関しての研究成果を以下に述べる。グラフが2-因子を持つかどうかを考える際、「最小次数が大きいグラフは必ず2-因子を持つ」という命題は成り立たない。しかしながら、太田・徳田の結果により、「スターと呼ばれるグラフを誘導部分グラフとして持たないグラフ(スターフリーグラフ)」に限定すれば、最小次数の大きいグラフは2-因子を持つということが示されている。本研究では、連結度の高いスターフリーグラフにおいては2-因子を持つための大田・徳田の最小次数条件が改善されるのではと予想し、任意の頂点連結度・辺連結度を持つグラフに対して2-因子を持つための最善な最小次数条件を解明した。さらに、スターに加えて、windmillやP4と呼ばれるグラフを誘導部分グラフとして持たないという条件を加え、それぞれの条件を満たすグラフに対して2-因子を持つための最善な最小次数条件を解明した。上に挙げたいずれの研究も得られた最小次数条件はグラフの連結度に応じてそれぞれに対する最善なものであり、この研究によって多くの知見が得られたと言える。また、本年度の研究における「誘導部分グラフとして持たないグラフ」を用いた条件と最小次数条件を組み合わせた形の研究は、容易に重みつきグラフへの拡張が考えられるにも関わらずこれまでに重みつきグラフについては行われていない。そのため、本年度に得られた成果が来年度以降の研究へとつながることが大いに期待される。
構造縮約と入力縮約の両機能を兼備した変位と加速度の高精度予測縮約モデルの提案

従来の自由度縮約モデルには、多自由度系を1質点に縮約する方法や、モーダル解析の概念に基づく低次の少数モードの重ね合せなどがある。従来の方法では変位の予測精度は保証されるものの、加速度では高次モードの影響が大きいため、その高精度予測モデルは存在しない。本研究では、構造縮約に加えて入力縮約の概念を新たに導入し、それらの両機能を兼備した変位と加速度の高精度予測縮約モデルを提案した。2011.3.11の東北地方太平洋沖地震における高層建物内での家具・機器類の挙動および居住者の安心感醸成のための加速度評価の必要性が急激に高まっており、本縮約モデルの開発により大幅な応答評価労力の軽減が可能となる。[1]少数節点縮約モデルに対して振動数領域での定式化を導入し、変位・速度・加速度の等価性条件に基づき入力モデルの変換や縮約を振動数領域で行う方法を展開した。構造モデルの縮約と入力の縮約を同時に行う点が新しい点である。振動数領域での定式化のため、(1)多くの変動パラメターに対する計算負荷の問題、(2)非線形モデルへの適用の問題等が存在するが、それぞれ、(1)変動パラメターに対するテイラー展開による入力変換での大幅な計算効率化と、(2)線形モデルを用いた入力モデルの変換と時間領域での非線形解析を結合した斬新な解析法の構築によりこれらの困難点を克服した。[2]非線形モデル(リリーフ機構付ダンパー)に対しても本手法が高精度の性能を有する理論的根拠を解明した。さらに、非線形要素を含む原モデルに対する時刻歴応答解析結果との比較により、本提案手法が計算効率化と精度保持の両者の要求をバランスよく満足することを明らかにした。具体的には、リリーフ機構付き非線形オイルダンパーを有する建物について提案手法を適用し、その精度を明らかにした。[3]骨組モデルをせん断型モデルに縮約する方法や、多自由度せん断型モデルを少自由度せん断型モデルに縮約する方法など、種々の構造縮約に対して提案手法の精度を明らかにした。多自由度原モデルの時刻歴応答解析における計算負荷の低減のために少自由度の縮約モデルを用い,さらに精度向上のために縮約モデルに作用させる時刻歴外力を調整する手法を提案した.(1)地震動入力時の運動方程式右辺の地動加速度による慣性力を各自由度に作用する外力と見なし,「地動慣性力」と呼ぶ.原モデルと縮約モデルの応答の等価性条件を満足するように,縮約モデルに作用させる地動慣性力を変換し,得られた「変換地動慣性力」を時刻歴外力として縮約モデルに作用させ時刻歴応答解析を行う方法を展開した.(2)提案手法は振動数領域における変位応答の等価性条件に基づき振動数領域の変換地動慣性力を生成し,その逆フーリエ変換により時間領域の変換地動慣性力を生成する.この操作は原モデルと縮約モデルの伝達特性の差を地動慣性力に反映させることに相当する.振動数領域の定式化により,変換地動慣性力を用いれば,原モデルにおいて縮約モデルと対応する自由度の変位,速度,加速度の等価性が理論的に保証されることを示した.(3)本手法をダンパー最適配置法における感度計算の繰り返しや,免制振装置の物理特性の変動を考慮したばらつき解析に利用する場合を想定し,構造モデルの剛性や減衰の変動による変換地動慣性力の変動を,テイラー展開を用いて少ない計算負荷で求める手法を提案した.(4)本提案手法は振動数領域の応答の等価性を用いるため,理論的に応答の等価性が保証されるのは線形モデルに対してのみである.しかしながら,本提案手法は時刻歴荷重を生成するため,非線形問題にも近似的に利用することができる.非線形のリリーフ機構付きオイルダンパーを設置したモデルに対して本手法を適用し,縮約モデルを用いて原モデルの対応自由度の時刻歴応答を精度良く評価できることを明らかにした.さらに、非線形応答を示す構造物モデルを振動台上に設置し、提案手法の精度検証を行った。工学・建築構造学構造縮約と入力縮約を同時に行う新しい概念を展開し、加速度まで精度よく追跡可能となることを明らかにした点はほぼ計画通りである。構造パラメターのばらつきを考慮した場合のテイラー展開定式化もほぼ計画通りである。非線形モデルについては、リリーフ機構付オイルダンパーだけでなく、その他のモデルについても定式化を適用したいと考えている。また、大規模骨組についても適用を考えている。当初、提案手法の精度検証の実験などを行う予定であったが、定式化と数値例題作成などに予想以上の時間が必要となったため、精度検証の実験などは翌年に行うこととしたため。
腰痛の診断治療における神経栄養因子の応用

腰椎変性疾患患者55例より摘出した60椎間板の変性髄核組織中のNGF、BDNF発現量をELISA法にて測定した結果、NGF、BDNF平均発現量はヘルニア群(n=29)においては、その他群(腰椎変性すべり症など:n=31)と比べ、いずれも有意に高かった。各群で椎間板変性度と各因子の発現を比較すると、ヘルニア群では変性度による発現量の有意差を認めなかった。その他群ではBDNFが高度椎間板変性例で若干高い傾向が見られた。両群ともに、腰痛の有無による各因子の発現量の違いは認めなかった。本年度内に、手術時に摘出した椎間板および、脊髄造影検査時に採取した脳脊髄液を保存継続し、一部の検体を用いて目的とする物質の発現について進めました。神経栄養因子であるNGF、GDNF、BDNF、CNTF、炎症性メディエーターであるIL17をELISAにて調べましたが、残念ながら椎間板内のNGF、BDNF以外の物質以外は発現を認めることができませんでした。脳脊髄液に関しては神経障害を反映する物質であるpNFH、ストレスホルモンのCRFなども試しましたが、pNFHのみ発現を認めました。椎間板内のNGF、BDNF発現に関しましては、椎間板ヘルニアの有無、椎間板変性の程度、痛みの程度などとの関連性を調べました。結果として椎間板ヘルニアの有無によりNGF、BDNFの発現が多いことが判明しました。残念ながら椎間板変性の程度は弱い相関、痛みとは相関がないと思われる結果でありました。これにより、椎間板はヘルニアを起こした後にNGFやBDNFなどの神経栄養因子が増加する可能性を示すことができました。今後、検体数を増やし引き続き椎間板変性や痛みとの関連を調査継続すること、神経栄養因子を発現する細胞の種類などを調査して研究を進めたいと考えます。脳脊髄液の研究は、各物質のELISAによる検出が非常に難しく、なかなか進行しておりませんが、今回pNFHが検出可能であったことから、腰痛、下肢神経症状などとpNFHの発現などについて調査を継続する予定であります。椎間板性腰痛発症メカニズムに神経栄養因子が関与している可能性があると考えられている。腰椎変性疾患患者において手術時に摘出した椎間板における神経栄養因子の発現を調査して、臨床症状との関連を調査している。腰椎変性疾患患者の脊髄造影時に得られる脳脊髄液においては神経栄養因子の発現は認められなかったが、軸索の障害を反映するpNFHの発現を認めたため、研究を行ったが、頚髄症、胸髄症患者と比べ発現量が有意に少なく、腰痛の程度との相関は認められなかった。腰椎椎間板検体は腰椎変性疾患患者55例より摘出した60椎間板を摘出し、研究を行った。変性髄核組織中のNGF、BDNF発現量をELISA法にて測定し、椎間板ヘルニア患者(ヘルニア群)とそれ以外の腰椎変性疾患患者(その他群:腰椎すべり症、脊柱管狭窄など)、椎間板変性の程度、腰痛の有無で発現量に違いがあるか調査したところ、NGF、BDNF平均発現量はヘルニア群(n=29)で各83.4pg/mg(以下単位略)、36.5、その他群(n=31)で各64.8、16.2であり、いずれもヘルニア群で有意に高かった。ヘルニア群とその他群の2群を異なる病態と考え各群で椎間板変性度と各因子の発現を比較すると、ヘルニア群では変性度による発現量の有意差を認めなかった。その他群ではPfirmann grade3-4(n=22)では各59.7、13.5に対し、Grade5(n=9)では各76.7、23.1であり、BDNFは高度椎間板変性例で若干高い傾向が見られた(NGF:p=0.101、BDNF:p=0.099)。椎間板ヘルニアを症候性椎間板断裂と考えると、NGF、BDNFは椎間板断裂後に発現増加する可能性が示唆された。平成23年度より、腰椎変性疾患患者からの脳脊髄液および椎間板組織の収集を開始しておりますが、同意を取得の上、脊髄造影検査時に3cc程度の脳脊髄液を、腰椎手術時に1ー2g程度の椎間板組織を採取し、冷凍保存しております。ELISAを行うために、各種神経栄養因子(NGF、BDNF、GDNF)のELISA Kitを購入しました。脳脊髄液中の神経栄養因子濃度を求めるため、まずは5倍希釈で各種ELISA Kitにて検出を試みましたが、すべて検出限界以下の吸光度を示しました。次に脳脊髄液を希釈せずに用いて、NGFのELISAを行いましたが、いくつかの検体を除き検出限界以下でありました。

脳脊髄液中の神経栄養因子含有量は非常に少量である可能性があり、今後脳脊髄液の検体を増やし、一定量の検体を収集した時点で各種神経栄養因子の発現量をELISAにて求めることを予定しております。椎間板検体はELISAおよびRT-PCRを行うため、2つに分けて保存しております。ELISAにてNGFはやはり検出限界を超えないため、ELISAに使用する検体量を少しずつ増やして検出限界を超える量の設定をするよう調整を続けております。いくつかの検体で少量ではありますが検出が可能でありましたので、今後は検体量を増やしながら、適切な実験系を設定できるよう努力を継続いたします。RT-PCRを行うべく、RNAを抽出しておりますが、1g程度の椎間板組織からもほとんどRNAを抽出することが出来ず、椎間板手術検体からのRNA抽出がうまく進んでおりません。椎間板採取量を増やすこと、検体をRNAlaterへ保存するまでの時間を短縮することなどで研究に耐えうる量のRNAを抽出できるような実験系を組み立てる努力をしております。椎間板断裂時に誘導されるnerve growthfactor(NGF)等の神経栄養因子が椎間板性腰痛の発症に関与している可能性が示唆されている。腰椎変性疾患患者55例より摘出した60椎間板の変性髄核組織中のNGF、BDNF発現量をELISA法にて測定し、椎間板ヘルニア患者とそれ以外の腰椎変性疾患患者(腰椎すべり症、脊柱管狭窄など)、椎間板変性の程度、腰痛の有無で発現量に違いがあるか調査したところ、NGF、BDNF平均発現量はヘルニア群(n=29)で各83.4pg/mg(以下単位略)、36.5、その他群(n=31)で各64.8、16.2であり、いずれもヘルニア群で有意に高かった(NGF: p=0.031、BDNF:p=0.013)。各群で椎間板変性度と各因子の発現を比較すると、ヘルニア群では変性度による発現量の有意差を認めなかった。その他群ではPfirmann grade3-4(n=22)では各59.7、13.5に対し、Grade5(n=9)では各76.7、23.1であり、BDNFは高度椎間板変性例で若干高い傾向が見られた(NGF:p=0.101、BDNF:p=0.099)。両群ともに、腰痛の有無による各因子の発現量の違いは認めなかった。患者椎間板免疫染色を行ったところ、HE染色標本においてはヘルニア群で炎症性細胞の浸潤がみられる傾向があったが、BDNFは椎間板細胞(軟骨細胞)に発現していた。今回の結果より椎間板断裂がNGF、BDNF発現誘導を介して、椎間板性腰痛発症のトリガーとなる可能性が示唆された。整形外科椎間板、脳脊髄液の研究を行っておりますと、様々な物質の発現を検出することが非常に難しく、その点では非常に苦労しております。幸い、主要な目的であったNGF、BDNFの発現が微量ながら認めることができたことで、今年度になりやっと研究が軌道に乗り始めました。検体の収集は順調に進んでおり、組織学的な研究も十分に進めることができそうな方向になっております。可能であれば、ある時期からは椎間板検体を細胞培養の系に使用開始することも視野に入れることができてまいりました。また、脳脊髄液の研究においてもpNFHという物質が検出可能になりましたので、神経障害、疼痛などとの関連を調査することが可能になりました。そのような点から考えますと、当初の研究目的はおおむね順調に進展していると考えております。手術摘出標本における神経栄養因子の測定は、これまではRT-PCR法、Western Blotting法、免疫染色による組織評価による報告のみであったが、本研究において初めてELISA法を用いて数値化して評価することができた。