hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｐ２１発現制御による変形性関節症における関節軟骨再生への挑戦

p21 knockoutマウスを用いて変形性関節症モデルマウスを作成したところ、p21が細胞外基質であるアグリカンと、メタロプロテアーゼであるMMP13の発現を調整することがわかった。軟骨のhomeostasisを維持する働きがあることがわかった。これに関して整形外科関連での国内学会1回、国際学会で5回発表。現在英語論文を投稿中である。概ね初期の目標は達成されたと考えている。研究計画では、p21という分子に着目して変形性関節症の治療ターゲットとなりうるかを検討する、ということが本研究のテーマであった。昨年度までにin vitroでの研究を遂行していた。結果としてp21を軟骨細胞でsiRNAを用い発現を抑制すると、メカニカルストレス存在下に軟骨基質産生分子であるアグリカンの発現が抑制され、軟骨基質分解酵素であるMMP13の発現が増強する結果が得られた。totalの基質合成能はグリコサミノグリカン定量で評価しているが、減少した。分子メカニズムを調査するためにSTAT3 inhibitorを用いて同様の実験を行うと、これまでの反応はcancelされた。これをin vivoで確認するためにまずwild typeのマウスにDMM modelを作成しp21の発現、STAT3に関連するシグナルを調べるとin vitroで得られた結果とparallelな結果が得られた。具体的にSTAT3の上流シグナルであるSDF-1, CXCR4がDMM modelにおいてコントロールと比較して発現が上昇する結果が得られた。STAT3のリン酸化が上昇していることが推察される。さらにこれらの結果を直接的に証明するためにp21 knockout mouseを用いてDMM modelを作成してin vitroで得られた結果を検証中である。wild typeの研究までの内容は本年度、2回国際学会で口演発表しており、さらに現在英文雑誌に投稿中である。メカニカルストレス存在下でP21はMMP-13, aggrecanの発現を調節していることがin vivo, in vitroで解明された。このことは生体内においてP21が軟骨組織恒常性維持に関与していることが示唆された。我々の研究目標はP21の発現制御により変形性関節症において軟骨組織の修復が行われるかを検討することであった。今年度の研究計画として、軟骨細胞においてP21の発現を制御することにより軟骨細胞の増殖、さらに軟骨組織の再生が可能であるか検討することであった。よって研究計画に従い、今年度は、軟骨細胞でp21の発現をsiRNAを用いknock downしメカニカルストレスを与えたところ、当初予想していた結果とは逆のけっかになった。軟骨基質であるアグリカンの発現が減少し、軟骨分解酵素であるMMP-13の発現が亢進した。さらに軟骨基質産生量を定量すると減少した。つまりp21の発現を抑制すると、軟骨組織にはcatabolicな働きをすることがin vitroで証明された。分子生物学的な機序として、p21をknock downするとSTAT3のリン酸化が上昇する。STAT3の阻害剤で培養すると、先程の系で上昇したMMP-13の発現は低下した。すなわちp21をknock downするとSTAT3がリン酸化し、MMP-13の発現が上昇することがわかった。現在これまでのin vitroでの研究結果を論文に投稿中である。さらに同内容の研究成果は本年度の日本軟骨代謝学会(2012). Osteoarthritis Research International annual meeting (2012)で学会発表している。最終的な実験目標がp21ノックアウトマウスを使用して変形性関節症モデルを作成しp21のfunctionを見ることである。最終年度に入る前にすでに開始しており順調であると考えられる。本年度の目標は、in vitroで軟骨細胞において、p21の発現を制御することでの細胞外基質産生、それに関連する遺伝子の発現変化、さらにその分子生物学的な機序の検討であった。これらに関して概ねすべて研究結果が出ており、in vitroでの研究結果もすでに学術論文に投稿中であるので、予定通り研究が遂行されていると考える。p21ノックアウトマウスを用いて組織学的な評価を行い、p21の変形性関節症に関する機能を解明する予定である。in vitroでのp21の機能がわかったため、今度は予定通りin vivoでのp21の機能解析を行う。変形性関節症を再現するマウスのモデルとしてDMM (内側半月板切除)モデルを作成する(Glasson, Osteoarthritis Cartilage, 2007)。これは手術により内側半月板を切除することで関節の不安定性が増大し他のモデルに比し緩徐に関節症が進行する(6Wで関節症性変化進行)というモデルで、他の関節症発症モデル(ヨード酢酸関節内投与、前十字靭帯切除モデル)に比べ緩徐に進行する変形性関節症を再現するのに適しているモデルであると近年提唱されてきているので、これを作成する。週令8週のP21cip1-/-ノックアウトマウスとP21cip1-/+, P21cip1+/+の3群に各右膝にDMMモデルを作成、左膝はsham手術を行う。

週令14週ですべてsacrificeし、まずX線撮影行い関節裂隙の評価を行う。次にマイクロCTでも関節症性変化を評価する。画像評価ののち膝関節を固定、脱灰ののち切片を作成する。そのH-E染色、Safranin O染色、トルイジンブルー染色で形態学的評価(軟骨細胞数、細胞外基質量の評価)を行う。次にP21cip1, Type II collagen, Aggrecanの免疫組織化学染色で正常な軟骨組織構造が再生されているのかを評価行う。最後にTUNEL染色で軟骨細胞のアポトーシスが誘導されているか、すなわちCell cycle progressionが促進されているのかも含めて検討する主にマウスの管理費用、組織学的な解析のためにかかる試薬等の費用に使用する予定である。主にp21ノックアウトマウスを購入、並びにマウスの飼育費、さらにDMM modelを作成するにあたっての手術器具、顕微鏡購入資金に充当する予定である。一方現在in vitroでの仕事を学術論文投稿中であり、査読後に必要な追加実験が生じるようであれば、それに伴う抗体などの試薬購入資金としても研究費が必要となってくる。
小胞体ストレス誘導脂肪組織恒常性破綻を抑制するメタボリック症候群改善薬の探索

本研究では、小胞体ストレス誘導性脂肪組織恒常性破綻の分子機構を抗酸化酵素であるSODアイソザイムに着目し検討した結果、SODアイソザイムの内で細胞外局在型のSODアイソザイムであるSODのみその発現量が減少することを明らかにした。また、EC-SOD発現調節機構に小胞体ストレス応答因子であるeIF2αの関与が示唆された。以上の結果から、EC-SOD発現量を制御することはメタボリック症候群の予防・改善に繋がると考えられた。本研究では、新規メタボリック症候群改善薬の提示を最終目的とする。そのためには、小胞体ストレス下における脂肪細胞機能制御因子の発現の変動とその機序の解明が必要であると考えられた。そこで、平成21年度ではin vitro実験系を用いて、小胞体ストレス下の3T3-L1細胞における酸化ストレス防御酵素(EC-SOD、他のSOD)並びにアディポカイン類(アディポネクチン、TNF-α)のmRNA発現変動をRT-PCR法を用いて網羅的に解析した。小胞体ストレス誘導方法(タプシガルギン添加法)にて3T3-L1細胞を処理した場合、タプシガルギンの濃度・処理時間依存的にEC-SOD発現量が減少することを見出した。しかし、他のSODアイソザイムの発現量に変化は認められなかった。この結果は、虚血状態誘導下の3T3-L1細胞及びCOS7細胞を用いた時の実験結果と同様であった。また、アディポネクチン発現量が減少すること並びに炎症性アディポカイン(TNF-α及びMCP-1)発現量が一過性に増大することも見出した。一方、これまでにPERK、eIF2α並びにCHOP等の小胞体ストレス制御因子によって、アディポネクチン発現量が調節されていることが報告されている。しかし、上記制御因子によるEC-SODの発現制御の詳細は解明されていない。そこで、EC-SOD発現に及ぼす小胞体ストレス制御因子の影響を検証したところ、eIF2αの脱リン酸化阻害剤であるsalubrinalを前処理することにより、タプシガルギンによるEC-SOD発現量の減少が有意に増強することを見出した。また、蛋白質合成阻害剤cycloheximideの前処理により、タプシガルギンによるEC-SOD発現量の減少は有意に抑制された。この成果から、小胞体ストレス下の脂肪細胞では、eIF2α由来シグナルによってEC-SOD発現量が調節されている可能性が示唆された。以上、平成21年度の研究成果により、in vitro実験系の実験方法・実験条件の確立と共に、本研究のターゲット遺伝子であるEC-SODの発現調節機構を解明する上で重要な知見を得ることが出来たと考えられる。前年度までに小胞体ストレス誘導方法(タプシガルギン添加法)にて3T3-L1細胞を処理することにより、酸化ストレス防御酵素(EC-SOD)並びにアディポネクチン発現量が減少することを見出している。そこで、平成22年度では他の小胞体ストレス誘導方法(ツニカマイシン添加法)を用いることにより、小胞体ストレス下の3T3-L1細胞におけるEC-SODのmRNA発現変動を詳細に解析した。ツニカマイシンにて3T3-L1細胞を処理したところ、EC-SOD及び他のSODアイソザイムの発現量に変化は認められなかった。この結果は、小胞体ストレス下のCOS7細胞を用いた時の実験結果と同様であった。また、アディポネクチン発現変動においても、タプシガルギン処理した細胞と比較しその発現量の減少は軽度であった。次に、小胞体ストレス誘導方法によるシグナル伝達経路の差異を比較検討したところ、小胞体ストレス制御因子であるATF6の活性化はいずれの処理方法においても認められたが、eIF2α及びXBP-1の活性化はタプシガルギン添加法でのみ活性化が認められた。前年度までに、タプシガルギンによるEC-SOD発現減少機構に及ぼすeIF2αの関与の可能性を見出しているが、eIF2α脱リン酸化阻害剤(salubrinal)を前処理することにより、ツニカマイシン処理細胞においてもeIF2αの活性化並びにEC-SOD発現量の減少が認められた。この成果から、3T3-L1細胞におけるEC-SOD発現は、小胞体ストレス下において普遍的に制御を受けるのではなく、eIF2αに由来するシグナルが重要であると推察された。以上、平成22年度の研究成果により、in vitro小胞体ストレス下においてEC-SOD発現量は、小胞体ストレス制御因子の中でも特にeIF2α由来のシグナルにより制御されることが見出された。このことから、eIF2α由来のシグナル経路を制御することにより、小胞体ストレス下におけるレドックス恒常性の維持しいてはメタボリック症候群の予防が可能であると考えられる。
シグナル抑制因子ＣＢＬの分子複合体構造と病因変異の解析

CBLはE3酵素として受容体型、非受容体型チロシンキナーゼの分解に関与する.CBLの機能不全はガン化や重篤な免疫不全を示す.CBLのE3活性はY371のリン酸化により制御されているがその機構は不明である.今回、非リン酸化体、およびリン酸化体CBLについてNMR法を用いて構造を明らかにした.非リン酸化体ではE2酵素との結合部位はマスクされているが、リン酸化にともないマスクが外れ、E2酵素と効率的に結合しユビキチン化を促進する事がわかった.CBLのY371のリン酸化を行うFGFRは秩序だった自己リン酸化過程を経て活性化される.今回活性化ループの自己リン酸化に関与する二量体構造を明らかにした.CBLはE3酵素として受容体型、非受容体型チロシンキナーゼの分解に関与する.CBLの機能不全はガン化や重篤な免疫不全を示す.CBLのE3活性はY371のリン酸化により制御されているがその機構は不明である.今回、非リン酸化体、およびリン酸化体CBLについてNMR法を用いて構造を明らかにした.非リン酸化体ではE2酵素との結合部位はマスクされているが、リン酸化にともないマスクが外れ、E2酵素と効率的に結合しユビキチン化を促進する事がわかった.CBLのY371のリン酸化を行うFGFRは秩序だった自己リン酸化過程を経て活性化される.今回活性化ループの自己リン酸化に関与する二量体構造を明らかにした.細胞内タンパク質のトラフィッキングや細胞内シグナル伝達にはphosphoinositide(PI)とエフェクタータンパク質との相互作用が重要な役割を果たしている。しかし、PIは膜に埋もれているため、エフェクターとの相互作用を定量的に解析する方法がなかった。我々は水溶性の膜モデルとしてナノディスクに注目し、ナノディスクに埋め込んだPIとエフェクタータンパク質との相互作用を明らかにする系を作った。脂質二重膜の側端を両親媒性ヘリックスよりなるmembrane scaffolding protein(MPS)で覆うことにより、サイズのそろった水溶性のナノディスクを構築した。ナノディスク内部に1分子のPIを埋め込み、FYVE,PH,PXドメイン等のエフェクターとの相互作用を解析する系を作った。まず、定性的な結合を評価するため、ナノディスクに埋め込まれたPIとGST融合エフェクタータンパク質との複合体をGST-pulldownによりおとすとともに、MPSに付けたHis-tagに対するウエスタンブロットによりエフェクターとPIとの結合を検出した。従来の方法に比較して再現性高く結合を検出できることを示した。さらに、エフェクターに蛍光ラベルを付け、ナノディスクとの結合を蛍光偏光解消法により測定した。このようにして、PIとの結合を定量的に評価できることを示した。次いで、PI結合によるエフェクタータンパク質の化学シフト変化よりPIとの結合面を同定した。以上、ナノディスクを用いることにより、定性的、定量的、更にPIとの結合様式を解明できることを示した。Cbl-bはRINGタイプのE3リガーゼである。細胞表面のT-セルレセプターや細胞成長因子レセプターを認識し分解することにより、過度の免疫応答や細胞増殖を抑制している。Cbl-bのE3活性の欠損は自己免疫疾患やがん化に関連していることが報告されている。Cbl-bはTKB領域(ヘリックスバンドル、EFハンド領域、SH2より構成される),ヘリックスリンカー、RINGフィンガー、プロリンに富む領域及びユビキチン結合ドメインより構成される。SH2はチロシンリン酸化された標的タンパク質の認識にかかわり、ヘリックスリンカー部位に存在するチロシンのリン酸化によりE3活性が顕著に亢進されることが報告されているが、その機構に関しては不明であった。今回、我々はE3活性を持つTKB+ヘリックスリンカー+RINGドメインについてNMRおよびX線小角散乱を用い、リン酸化により誘起される構造変化を明らかにした。非リン酸化状態ではヘリックスリンカー+RINGはTKB領域とタイトに相互作用し、RINGとE2との相互作用は阻害されていた。しかし、Y363のリン酸化により、ヘリックスリンカーはTKBよりリリースされるとともに、リン酸化チロシンを介してRING領域の塩基性残基と相互作用を行いコンパクトな構造をとり、新たなE2結合面を提示することが分かった。リン酸化を介したCbl-bのE3活性の制御モデルに従い、TKBとヘリックスリンカーの相互作用を弱める変異体を作製し、Cbl-Bの自己ユビキチン化を指標としてE3活性を測定した。その結果、E3活性は顕著に増大していることより、今回我々が提出した活性化機構が妥当であることを明らかにした。リン酸化による活性制御の新しい機構を提出した点で、注目を集め、PNASに掲載された。平成24年度に確立したFGFR1の発現方法を平成25年度においてさらに発展させ、cMet, Mer受容体型チロシンキナーゼ、Src, Abl等の非受容体型チロシンキナーゼに適用し、大腸菌による大量発現調製法を確立した。これまではチロシンキナーゼ活性を保持した標品はバキュロウィルスによる発現系のみで可能であったが、今回の調製方法により大腸菌を用いても活性の高いチロシンキナーゼを大量に調製できることを確認した。今回得られた発現方法はチロシンキナーゼ研究のブレークスルーと考えられる。チロシンキナーゼは二量体を形成するが、それぞれのチロシンキナーゼが基質、酵素の関係で互いにリン酸化を行なう。

興味深いことに、複数の部位に存在するチロシンが逐次リン酸化されることによりチロシンリン酸化活性は1,000倍以上に昂進することが知られている。本研究では最初のリン酸化過程である活性化ループのチロシンリン酸化の機構を明らかにすることを目的とした。まず、FGFR1の15N均一ラベル体を作成しNMRスペクトルを解析した結果、活性化ループをたがいに活性中心に提示した二量体構造が形成される可能性が示された。そこで、架橋が可能と思われるCys変異体を10種類作成し架橋実験を行った結果、A488C, K523C, E707C変異体がホモで二量体形成を行うこと、さらにA488C-K523C、R675C-E707Cの二量体を形成することがわかった。これらの結果を考慮してドッキング計算を行った結果、パラレルな配向をとった二量体構造をとることが確認できた。この二量体構造に基づき、界面に存在する塩基性残基にたいし、変異実験を行った結果、顕著にキナーゼ活性を失う変異体を見いだした。以上の結果を考慮に入れることにより、FGDR1の二量体構造の精密化を行うとともに、キナーゼ活性との関連を明らかにできた。平成25年度までに明らかにしてきたように、Cblのようなシグナル伝達分子は大きな構造変化を誘起することによりシグナル伝達を制御する。しかし従来のNOEをベースとした近距離情報に基づくNMRの手法では大きな構造変化を検知するのは困難である。そこで、平成26年度は大きな構造変化を検知するのに有効な常磁性ランタニドプローブ法をペプチドグりカン合成酵素群のひとつであるMurD(ATP+Mg存在下でUMAlaよりUMAla-Gluの合成を行う。)に適用し、基質結合に伴うドメイン構造の大きな変化を検知する方法を検討した。常磁性ランタニドイオンをタグを介してタンパク質に結合することにより金属タンパク質でなくても常磁性ランタニドプローブ法の対象とすることができる。MurDは基質結合に伴いドメイン1-2に対しドメイン3が大きく相対配置を変える。相対配置の変化に鋭敏なドメイン2に常磁性ランタニドタグを二つのS-S結合を介して固定し、偽コンタクトシフトに基づくドメイン3のシグナルの変化を測定した。偽コンタクトシフトはランタニドイオンと測定核との間の距離と角度情報を与えるため定量的な構造情報を与える。ドメイン3由来のシグナル10個を帰属し、基質結合に伴う構造変化を解析した。基質が存在しないときはドメイン3は開構造をとるがATP+Mg, ADP+Mgではセミ閉構造、ADP+Mg+UMAおよび阻害剤存在下では閉構造をとることが明らかとなった。セミ閉構造は結晶構造では同定されておらず、今回NMR解析により初めて見出された状態である。このように常磁性ランタニドプローブ法は定量的な構造情報を与える点でユニークな手法である。今後シグナル伝達分子のように大きな構造変化を誘起する分子の解析や過渡的複合体形成の解析に有効な手法となることが期待される。平成24年度は、CblBのチロシンリン酸化に関与するチロシンキナーゼに研究の重点を移した。
立体配座制御活性型ビタミンDアナログの合成、受容体結合性、および遺伝子発現調節

活性型ビタミンDおよびその20-エピアナログの側鎖の可能コンフォメーションを分子力学法を用いて解析した。その結果ビタミンD側鎖の可動領域が、A、G、EA、EGの4つに分類できることを明らかにした。次に、側鎖の動きがこれら4つの領域のいずれか1つに制御されるアナログ、(2OR,22R)・22・methyl・1,25・(OH)2D3(1),(2OR,22S)・22・methyl・1,25・(OH)2D3(2),(2OS,22R)・22・methyl・1,25・(OH)2D3(3),(2OS,22S)・22・methyl・1,25・(OH)2D3(4)を論理設計し、ステロイド側鎖エノン体へのアルキル銅試薬の面選択的共役付加反応を鍵段階として立体選択的に合成した。これら4種のアナログ(1・4)のビタミンD受容体(VDR)親和性は天然活性型Dの活性を1とすると、各々、1/(60)、1/3、20、1/(100)であった。以上の結果から、ビタミンDおよびその20-エピ体がが受容体に結合する際、側鎖が空間的にしめる領域がAおよびEA領域であることが示唆された。そして、これらの結果からビタミンDの活性は側鎖領域で示すとEA>A>G>EGの順であることを提案した。A環アナログとしては受容体の結合立体構造をNMRを用いて解析するためのプローブとなる、4-及び19-フッ素化ビタミンDアナログ3種の合成に成功した。これらのNMR解析によりA環のコンフォメーションを19FNMRで容易にモニターできることが明らかになった。受容体-リガンド結合構造を解析するために不可欠なビタミンD受容体リガンド結合領域はアメリカグループの協力で遺伝子組み替え法により数10mgレベルでの合成に成功した。活性型ビタミンDおよびその20-エピアナログを用いて、ビタミンDの側鎖を分子力学法を用いてコンフォメーション解析した。その結果ビタミンDの側鎖の到達可能領域が、A、G、EA、EGの4つに分類できることを明らかにした。次に、側鎖の動きがこれら4つの領域のいずれか1つに制御されるアナログを同様に分子力学解析に基づいて設計した。22-メチル-1,25-ジヒドロキシビタミンD3の20および22位の4種のジアステレオマ-、(20R,22R)-22-methyl-1,25-(OH)2D3(1),(20R,22S)-22-methyl-1,25-(OH)2D3(2),(20S,22R)-22-methyl-1,25-(OH)2D3(3),(20S,22S)-22-methyl-1,25-(OH)2D3(4),である。我々はこれら4種の立体配座制御アナログを、ステロイド側鎖エノン体へのアルキル銅試薬の面選択的共役付加反応を鍵段階として立体選択的に合成することに成功した。これら4種のアナログのビタミンD受容体(VDR)親和性がアメリカのDeLucaのグループによって検討された。

化合物1、2、3および4のブタ小腸受容体への結合性は活性型d3の活性を1とすると、各々、1/60、1/3、20、1/100であった。以上の結果から、ビタミンDが受容体に結合する際、側鎖が空間的にしめる領域が示された。すなわちAおよびEA領域が重要であることが明らかになった。特筆すべきは、20S、22R体(3)が天然の1,25-ジヒドロキシビタミンD3の約20倍の受容体結合活性を示したことである。その他の生理活性も検討した。その結果、受容体結合性が天然活性型D2の20倍高い、20S、22R体(3)は、前骨髄性白血病細胞分化誘導能も200倍と高かく、in vivoのカルシウム代謝調節作用も倍近かった。メチル基の他、エチル、ブチル置換アナログについても同様に合成と生理活性を検討した。前年度の研究で活性型ビタミンDおよびその20-エピアナログの側鎖の可能コンフォメーションを分子力学法を用いて解析し、ビタミンD側鎖の可動領域が、A、G、EA、EGの4つに分類できることを明らかにした。そして、配座制御アナログの合成と活性の検討結果から、ビタミンDアナログの受容体結合活性は側鎖領域で示すとEA>A>G>EGの順であることを明らかにした。今年度は、この活性空間領域のコンセプトを既知の高活性アナログに適応し、細胞分化誘導活性との関係を検討した。その結果、分化誘導活性の高くカルシウム作用の弱く、乾癬症の治療剤として開発されたアナログや、抗癌剤として開発中のアナログの側鎖が占める領域を見出し、F領域と命名した。この仮説を基に分化誘導活性の高くカルシウム作用の弱いアナログを設計合成した。A環アナログとしては受容体との結合立体構造をNMRを用いて解析するためのプローブとなる、4-及び19-フッ素化ビタミンDアナログ(4F2-1,25(OH)2D3及び10(19)E-&Z-19F-1,25(OH)2D3)の合成に成功した。これらのNMR解析によりA環のコンフォメーションを19FNMRで容易にモニターできることが明らかになった。受容体-リガンド結合構造を解析するために不可欠なビタミンD受容体リガンド結合領域はアメリカグループの協力で遺伝子組み替え法により数10mgレベルでの合成に成功した。
敗血症病態における骨髄由来上皮分子化細胞を用いた組織再生理論の確立

リポポリサッカライド(LPS)の静脈内投与を施した812週齢の雄性BALB-Cマウスにおいて,敗血症類似病態の時系列に沿って,サイトケラチン陽性多能性上皮分化細胞(epidermal progenitor cell)が肺に動員されることを組織科学的方法で確認した。これらは,podoplanin(1型肺胞上皮細胞マーカー)ではなく,SP-C(2型肺胞上皮細胞マーカー)やcaveolin-1(血管内皮細胞)と共存する傾向があり,Gr-1あるいはvon Willebrand因子と共発現していることが免疫組織科学的手法で明らかとなった。また,抗サイトケラチン抗体IgGビーズや抗caveolin-1抗体IgGビーズを用いて,epidermal progenitor cellを分離した結果,共にGr-1を強く発現することが確認された。一方,骨髄抑制を特徴とするop/opマウスにLPSを静脈内投与し敗血症類似病態とすると,epidermal progenitor cellの肺への動員が消失した。さらに野生型BALB-Cマウスとop/opマウスにおいて,LPS10mg/kgおよび20mg/kgの腹腔内投与による生存曲線を比較すると,op/opマウスで死亡率が高いことが確認された。Epidermal progenitor cellが骨髄由来であることをさらに評価するために,GFP-BMTマウスを用いて,LPS10mg/kgおよび20mg/kgをGFP-BMTマウスの腹腔内に投与し,GFPとサイトケラチンの共陽性細胞が肺に出現するかを確認した結果,LPS投与の約13時間よりこれらの細胞が肺に集積しすることが確認された。本研究は敗血症病態におけるepidermal progenitor cellの肺への動員を評価したものである。従来,幼弱球として分類されてきた敗血症病態の白血球は,骨髄より動員され,肺胞2型上皮細胞や血管内皮細胞に分化できる可能性を持つことが確認された。本研究の研究動物には,雄性BALB-Cマウス(8-12週,体重20-30g)に10mg/kgのlipopolysaccharide (LPS: E. coli 055:B5; List Biological Laboratories, Campbell, CA)を腹腔内投与したものが,敗血症モデル動物として用いられた。敗血症病態で誘導された上皮分化機能細胞は,骨髄に由来する上皮性分化を特徴とする抗サイトケラチン抗体陽性細胞(Bone Marrow Derived Epithelial Cells: BMDECs)として特徴付けられた。そのBMDECsは,抗サイトケラチン抗体や,CD45, CD11b, CO146で染色可能な細胞であり,こららの抗体を用いた抗体ビーズ法で敗血症病態24時間以降の心臓血より回収することができた。しかし,骨髄抑制病態を特徴とするop/opマウスを敗血症にした際には,cytokeratin陽性BDMDECsの回収率が10%以下の量に減少することが確認された。BALB-Cマウスの敗血症24時間と48時間で回収されたcytokeratin19(上皮マーカー)陽性のBMDECsにおいて,SP-C(2型肺胞上皮細胞マーカー),podoplanin(1型肺胞上皮細胞マーカー),caveolin-1 (血管内皮細胞)のイムノブロット解析とreal time RT-PCR解析を行った結果,BMDECsにはアンチトロンビンIII(活性値100%以上)とG-CSFの外来投与に依存して,SP-Cとcaveolin-1の発現が高まるが,podoplaninの発現を高めないことが確認された。このように,20年度の研究では,敗血症病態で肺に誘導される上皮分化機能細胞は骨髄由来である可能性が強く示唆されたとともに,このBMDECsはアンチトロンビンIIIとG-CSFに依存して,2型肺胞上皮細胞と血管内皮細胞に分化する可能性が確認された。

従来,幼弱球として分類されてきた敗血症病態の白血球は,骨髄より動員され,肺胞2型上皮細胞や血管内皮細胞に分化できる可能性を持つことが確認された。
磁気熱量効果を利用した低環境負荷型冷却システムの構築とその最適化

1.磁性材料充填層内における熱移動特性および圧力損失挙動に関する実験平成16年度に制作した実験装置を用い,磁性体と周囲熱媒体との間の熱移動特性および磁性体粒子充填層内における圧力損失挙動を検討した.実験パラメーターとして,励磁・消磁の周期,周囲流体の流量変化,磁性体充填セルの長さ,およびセルの直径を変化させた.2.数値解析的検討繰り返し内部吸発熱を伴う物体からの高速熱交換に関する数値解析モデルを構築し,磁性体粒子充填層内における熱移動特性に関する数値解析を行った.また,実験結果との比較検討を行いモデルの妥当性の評価を行った.これらの解析結果をふまえ,磁気冷却システムの構築に関する設計指針の把握およびシステムの最適運転条件に関する検討を行った.3.成績係数の評価に関する検討各実験条件から定まる磁石の駆動に要する仕事を理論的に計算し,その結果と実験で得られた冷熱量からCOPを算出し,最適な運転モードとCOPに関する考察を行った.4.研究成果および特筆すべき点(1)作業物質の粒子径が大きい条件では,1サイクルにおいて温度変化が緩慢である.(2)磁性体粒子充填層内における圧力損失分布は,Ergunの式によく一致するが,磁場内においては粒子の充填構造が変化するため,圧力損失は低下する.(3)作業物質の充填率および充填長さに関しては,冷却能力が極大値を示す条件が存在するため,適切な充填率および充填長さの条件を選択することによって,より大きな冷却能力を得ることが可能となる.(4)磁石の移動時間および熱交換時間の条件により,冷凍システムのCOPは大きく変化する.(5)COPは磁石移動速度が低いほど大きく,得られる冷熱量は磁石の移動速度が大きいほど大きくなる.したがって,COPと冷熱量の関係には最適条件が存在する.1.熱移動特性を検討するための実験装置の製作繰り返し吸発熱を繰り返す磁性材料の熱移動特性を検討するための実験装置を制作した.本実験装置は主に,永久磁石を用いた磁気回路,磁性体を封入し熱媒体(流体)と熱交換を行わせるための熱交換部,磁性体の温度変化を高温側と低温側に振り分けるための熱スイッチ,熱媒体循環系,および各測定系から構成されている.磁気回路は,ネオジウム系永久磁石を一定の間隔をあけて閉回路とした構造となっており,その間には磁性材料が封入された試験セルを10列に配置した試験部が設置されている.また,磁気回路は電動スライダー上に設置されており,あらかじめ設定された周期および振幅の往復運動をすることにより磁性体に付与する磁場を変化させることが可能となっている.2.磁性材料の選定本研究では,磁気熱量効果が常温付近で最大となる性質を持ったガドリニウムおよび,組成によりキュリー点を任意に設定することが出来るLa-Fe-Si系の合金を供試磁性体として用いた.3.熱移動特性の実験製作した実験装置を用いて,磁性体と周囲熱媒体との間の熱移動特性に関する実験,およびシステムの冷凍能力の評価を行った.実験パラメーターとして,励磁・消磁の周期,熱交換流体の流量,および初期磁性体温度を変化させた.4.研究成果および特筆すべき点(1)磁性体のキュリー点を消磁過程の開始温度とした場合,冷凍能力は最大値を示す.(2)冷凍能力は,熱輸送流体流量の増加に伴い飽和する傾向を示す.(3)大きな冷凍能力を得るためには,熱容量および熱伝導率の大きな流体を選択することが重要である.1.磁性材料充填層内における熱移動特性および圧力損失挙動に関する実験平成16年度に制作した実験装置を用い,磁性体と周囲熱媒体との間の熱移動特性および磁性体粒子充填層内における圧力損失挙動を検討した.実験パラメーターとして,励磁・消磁の周期,周囲流体の流量変化,磁性体充填セルの長さ,およびセルの直径を変化させた.2.数値解析的検討繰り返し内部吸発熱を伴う物体からの高速熱交換に関する数値解析モデルを構築し,磁性体粒子充填層内における熱移動特性に関する数値解析を行った.また,実験結果との比較検討を行いモデルの妥当性の評価を行った.これらの解析結果をふまえ,磁気冷却システムの構築に関する設計指針の把握およびシステムの最適運転条件に関する検討を行った.3.成績係数の評価に関する検討各実験条件から定まる磁石の駆動に要する仕事を理論的に計算し,その結果と実験で得られた冷熱量からCOPを算出し,最適な運転モードとCOPに関する考察を行った.4.研究成果および特筆すべき点(1)作業物質の粒子径が大きい条件では,1サイクルにおいて温度変化が緩慢である.(2)磁性体粒子充填層内における圧力損失分布は,Ergunの式によく一致するが,磁場内においては粒子の充填構造が変化するため,圧力損失は低下する.(3)作業物質の充填率および充填長さに関しては,冷却能力が極大値を示す条件が存在するため,適切な充填率および充填長さの条件を選択することによって,より大きな冷却能力を得ることが可能となる.(4)磁石の移動時間および熱交換時間の条件により,冷凍システムのCOPは大きく変化する.(5)COPは磁石移動速度が低いほど大きく,得られる冷熱量は磁石の移動速度が大きいほど大きくなる.したがって,COPと冷熱量の関係には最適条件が存在する.
露水の化学組成とその酸性化機構

1.露水の生成・消滅速度...台ばかり上に露水採取器(厚さ10cmの発泡スチロール板(90cm×90cm)上に厚さ0.1mmのテフロンシートを両面テープで張り付けて作製)を固定して当大学研究棟屋上に夜間設置し、その重量変化を翌朝まで1分毎にコンピューターに記録した。単位時間当たりの重量増加量および減少量を採取面積で割り、それぞれ露水の生成および消滅速度を求めた。1995年には計16回の測定を行ったが、露水生成速度の平均値は5.2g/m^2/h(2.19.0g/m^2/h)、消滅速度の平均値は15g/m^2/h(6.444g/m^2/h)であり、消滅速度は生成速度の約3倍大きいことが明らかとなった。2.露水の化学組成...露液滴はテフロンハケで掻き取ってテフロンビーカー内に回収した。この試料を孔径0.45μmのMFで吸引ろ過した後に、pH、伝導度、主要無機イオンに加え、亜硫酸、亜硝酸、ギ酸、酢酸、無機炭素、有機炭素および各アルデヒドの測定を行った。1995年の露水の平均はpHは5.09(3.507.58)、総イオン濃度は0.275meq/Lであり、同時期に採取した雨水の平均pH(4.63)よりも高く、総イオン濃度は約6倍高かった。このうち、陽イオンではNH_4^+(全体の25%)、陰イオンではSO_4^<2->(全体の11%)の占める割合が高く、S(IV)を高濃度(全体の9%)に含んでいた。露水中にS(IV)が高濃度に含まれている原因として、S(IV)の一部がH_2O_2などの酸化剤による液相酸化をほとんど受けないヒドロキシメタンスルホン酸(HMSA)を形成しているためであることが明らかとなった(HMSAの平均濃度:65μM、濃度範囲:0.9580μM)。3.露水酸性度の支配要因...1995年には計3回の露水の経時採取を行った。いずれの場合も主要無機イオン濃度は露水の成長時には希釈効果により低下、消滅時には濃縮効果により増加するが、pHおよびS(IV)濃度の変化は必ずしも露水量の変化と対応していなかった。抵抗モデルにより、露水中のS(V)濃度は主に大気中のHCHO、SO_2濃度に支配されていることが分かった。また、このS(IV)の液相酸化はMnの触媒効果により進行することが示唆された。
染色体構造異常を有しないヒト運動精子の選択的分離とその先体反応誘起

これまでカフェインはそのPDE阻害活性により精子内cAMP濃度を上昇させ、先体反応の誘起を促進すると考えられてきたが、PDE阻害による精子内cAMP増加は精子運動を賦活するが先体反応誘起には関与せず、さらにCa^<2+>チャネルブロッカーを用いた検討によりキサンチン誘導体による先体反応誘起促進はCa^<2+>チャネルを介した細胞外Ca^<2+>の先体への流入促進であることを示唆する結果を得た。キサンチン誘導体であっても細胞膜非透過な8-SPTが運動に影響しなかったことは、カフェインによる精子運動賦活は細胞内、先体反応誘起促進は細胞表面と、両者は精子の異なる部位で異なった機序で起こっていることが示された。本研究ではさらに精漿中にアデノシンが存在することを初めて見出し、アデノシン受容体アゴニストであるPIAが先体反応誘起を抑制し、アンタゴニストである8-SPTが促進し、両者は拮抗することを明らかにした。精子は精漿から離脱することにより自発的に先体反応を誘起するが、精漿を除去してもアデノシン存在下では誘起せず、再洗浄によりこれを除去すると誘起を開始することを認めた。これらの結果はアデノシン受容体が精液中における先体反応の抑制に関与し、精漿の除去、すなわち洗浄によるアデノシンの除去が先体反応誘起の引き金となっている可能性を示唆している。ヒト精子染色体構造異常を裸化ハムスター卵への侵入させ、染色体を膨化させた後、観察した結果、妊孕性確認(有子)男子を被験者としたにもかかわらず14-25%の精子に構造異常、特に欠失を認めた。精子を4層Percoll密度勾配に層積し、250xg、3-4分間遠心分離すると約1%の精子が沈澱中に回収され、この分画中の精子染色体異常率は平均3%に低下した。また洗浄精子をKS-II精子保存液を用いて凍結保存し、融解後に蘇生した運動精子を同様にして染色体異常率を観察した結果、平均5%程度に低下していた。検討した両法を比較すると、精子回収率の点で後者が有用であり、今後染色体構造異常を有しない精子に選択性のある凍結保存液の開発を行う。1.染色体構造異常を有しない精子の選択的分離液化精液を多層Percoll法で遠心分離し、染色体構造異常精子の除去を試みた。等張化した80、70、60、50%Percoll各1.0mlを順次ニトロセルロースチューブに層積し、精液を載せて遠心分離し、チューブの底に穴を開け、管底に沈殿した精子を回収した。これを透明帯除去ハムスター卵と培養し、侵入した精子の染色体標本を作製し、欠失、断裂等の染色体構造異常を観察した。

その結果、低速(400xg)で短時間(10分間)遠心分離した場合、管底への精子回収率はわずかである(3.6(].SY+-。[)1.1%,n=7)であるが、染色体構造異常率は18.4(].SY+-。[)7.6%(対照:未分離精液)から1.8(].SY+-。[)0.6%に低下することを認めた。本成果により顕微受精等の精子数を必要としない受精法では実用可能でであるが、さらに汎用化を図るには染色体構造異常精子分離能を保持したまま、以下に回収率を高くするかが問題であり、Percoll段数の増加とそれに伴う遠心条件の至適化をさらに進める必要がある。2.精子の先体反応人工的誘起法の開発1.において分離した精子の先体反応の人工的誘起を図るのが本研究の目的であるが、本年度は予備実験として未分離の標品(撹拌密度勾配法により濃縮した運動精子)を用いて先体反応誘起促進活性を有する薬物の検索を行った。従来、この目的にはカフェインが汎用されてきたが、本研究においてその類縁体である8-Sulfophenyl theophyline(8-SPT)は精子運動に影響せず先体反応を特異的に誘起促進し、逆にN6-L-phenylisopropyladenosine(PIA)は用量依存的に誘起を阻害し、両者は拮抗することが明らかとなった。またアセチルコリンは強い先体反応誘起活性を有していた。通常、卵の培養は10%程度の血清を含む培養液が用いられるが、アセチルコリンは精子に作用させた後、その懸濁液を直接卵培養液に添加しても、血清中のコリンエステラーゼにより瞬時に分解されるため、将来の臨床応用に有望と考えられ、さらに作用機序等を詳細に検討する予定である。これまでカフェインはそのPDE阻害活性により精子内cAMP濃度を上昇させ、先体反応の誘起を促進すると考えられてきたが、PDE阻害による精子内cAMP増加は精子運動を賦活するが先体反応誘起には関与せず、さらにCa^<2+>チャネルブロッカーを用いた検討によりキサンチン誘導体による先体反応誘起促進はCa^<2+>チャネルを介した細胞外Ca^<2+>の先体への流入促進であること示唆する結果を得た。キサンチン誘導体であっても細胞膜非透過な8-SPTが運動に影響しなかったことは、カフェインによる精子運動賦活は細胞内、先体反応誘起促進は細胞表面と、両者は精子の異なる部位で異なった機序で起こっていることが示された。本研究ではさらに精漿中にアデノシンが存在することを初めて見出し、アデノシン受容体アゴニストであるPIAが先体反応誘起を抑制し、アンタゴニストである8-SPTが促進し、両者は拮抗することを明らかにした。精子は精漿から離脱することにより自発的に先体反応を誘起するが、精漿を除去してもアデノシン存在下では誘起せず、再洗浄によりこれを除去すると誘起を開始することを認めた。これらの結果はアデノシン受容体が精液中における先体反応の抑制に関与し、精漿の除去、すなわち洗浄によるアデノシンの除去が先体反応誘起の引き金となっている可能性を示唆している。ヒト精子染色体構造異常を裸化ハムスター卵への侵入させ、染色体を膨化させた後、観察した結果、妊孕性確認(有子)男子を被験者としたにもかかわらず14-25%の精子に構造異常、特に欠失を認めた。精子を4層Percoll密度勾配に層積し、250xg、3-4分間遠心分離すると約1%の精子が沈澱中に回収され、この分画中の精子染色体異常率は平均3%に低下した。また洗浄精子をKS-II精子保存液を用いて凍結保存し、融解後に蘇生した運動精子を同様にして染色体異常率を観察した結果、平均5%程度に低下していた。検討した両法を比較すると、精子回収率の点で後者が有用であり、今後染色体構造異常を有しない精子に選択性のある凍結保存液の開発を行う。
炎症性骨疾患における破骨細胞およびマクロファージ巨細胞の役割の解明

1)細胞融合遺伝子の転写機構の解明DC-STAMPがRANKLの刺激により発現誘導がかかることから、下転写因子、NFATc1とc-Fosに注目し、プロモーター解析を行い、これらの転写因子が破骨細胞分化において、強くDC-STAMPの発現誘導を行うことを確認した。また、c-Fos欠損マウスでは破骨細胞分化に伴いDC-STAMPが発現しないこと、NFATc1の核内移行を遮断するFK506により破骨細胞分化時にDC-STAMPが発現しなくなり、細胞融合が起こらないことを見出した。一方、同条件でも異物巨細胞分化誘導時にはDC-STAMPは強く発現し、細胞融合が起こることを見出した。以上から破骨細胞分化と炎症におけるマクロファージの融合では異なった転写制御機構があることを見出した。慢性炎症時においてはPU. 1とNFκBの結合領域に点変異を加えたプロモーターで発現解析を行い、これらの転写因子により、DC-STAMPは強く発現が誘導され、マクロファージは融合することを見出した。また、破骨細胞分化においてはNFATc1とc-Fosが、慢性炎症時においてはPU. 1とNFκBがそれぞれ、直接DC-STAMPのプロモーター領域に結合することをクロマチン免疫沈降で確認した。同時に、破骨細胞融合がまったく起こらない、c-Fos欠損マウスでも、in vitroでDC-STAMPは強く発現が誘導され、異物巨細胞が形成されること、c-Fos欠損マウスの皮下に異物を留置した場合に、異物巨細胞を形成することから、生体における慢性炎症時の生理的なマクロファージの融合でも、同様に、破骨細胞とは異なった転写制御機構により、PU. 1とNFκBによりDC-STAMPの発現は制御され、細胞融合が起こることを明らかにした。1)細胞融合遺伝子の転写機構の解明われわれは、DC-STAMPがRANKLの刺激により強く発現誘導がかかることから、下流の転写因子、NFATc1とc-Fosに注目し、プロモーター領域でのそれぞれの結合領域に点変異を加えプロモーター解析を行い、これらの転写因子が破骨細胞分化において、強くDC-STAMPの発現誘導を行うことを確認した。慢性炎症時においてはPU.1とNFκBの結合領域に点変異を加えたプロモーターで発現解析を行い、これらの転写因子により、DC-STAMPは強く発現が誘導され、マクロファージは融合することを見出した。また、破骨細胞分化においてはNFATc1とc-Fosが、性炎症時においてはPU.1とNFκBがそれぞれ、直接DC-STAMPのプロモーター領域に結合することをクロマチン免疫沈降で確認した。同時に、破骨細胞融合がまったく起こらない、c-Fos欠損マウスでも、in vitroでDC-STAMPは強く発現が誘導され、異物巨細胞が形成されること、c-Fos欠損マウスの皮下に異物を留置した場合に、異物巨細胞を形成することから、生体における慢性炎症時の生理的なマクロファージの融合でも、同様に、破骨細胞とはまったく異なった転写制御機構により、PU.1とNFκBによりDC-STAMPの発現は制御され、細胞融合が起こることを明らかにした(Yagi et al. J Bone Miner Res. ahead of print)。2)細胞融合機構の解明3)マクロファージ巨細胞特異的機能の解明In vitroにおける様々な発現分子の調査から、異物巨細胞は破骨細胞とは異なった表面分子を発現しており、破骨細胞に見られるような強い骨吸収能は持たない一方、異物の取り込み能は強いことをみいだした。
吸入麻酔薬の体性-副交感神経反射に対する効果

口腔顔面領域の血管は交感神経により血管収縮、副交感神経により血管拡張反応を起こす。特に副交感神経血管拡張神経は味覚、痛覚らの体性感覚神経の刺激により反射性に興奮がおこり、口唇、口蓋、舌らの血管を拡張させる。本研究では種々吸入麻酔薬の体性-副交感神経血管拡張反応に対する効果を検討した。ネコをケタミン(30mg/kg。im)により入眠後、α-クロラロース(30mg/kg,iv)とウレタン(100mg/kg,iv)で麻酔し、筋弛緩薬(パンクロニウム、0.4mg/kg、後0.2mg/kg/h)投与後,人工呼吸下(50%酵素、50%空気)で実験を行った。副交感神経の興奮は体性神経を求心性に刺激して反射性に起こした。即ち舌神経を露出後切断し、中枢性に電気刺激(30V、10Hz、2ms、20秒)をして反射性に副交感神経血管拡張繊維を興奮させ下顎口唇、口蓋に血管拡張反応を起こし、その反応をレーザードプラー血流計で測定した。この血管反応に対する吸入麻酔薬(イソフルラン、セボフルラン、ハロセンら)や笑気等の麻酔薬がどのような効果をもたらすかを検討した。イソフルラン、セボフルラン、ハロセンの吸入麻酔薬は1MAC(minimum alveolar cocentration)の濃度で反射性副交感神経血管拡張反応をそれぞれ86.2、69,2、66.6%抑制した。各吸入麻酔薬とも吸入直後に抑制がみられ、30分近くで最大抑制を示した。また吸入を解除するとその抑制は20-30分で完全に消失する。イソフルランによる抑制は中脳部位での除脳では殆ど影響を受けない。γ-アミノ酪酸(GABA)受容体拮抗薬のプクロトキシンによりイソフルランの抑制は殆ど回復した。これらの結果は吸入麻酔薬の体性-副交感神経血管拡張反応に対する抑制はGABAが重要な働きをし、その作用部位は脳幹レベルであることが推定された。im)により入眠後、α-クロラロース(30mg/kg,iv)とウレタン(100mg/kg,iv)で麻酔し、筋弛緩薬(パンクロニウム、0.4mg/kg、後0.2mg/kg/h)投与後,人工呼吸下(50%酸素、50%空気)で実験を行った。

イソフルラン、セボフルラン、ハロセンの吸入麻酔薬は1MAC(minimum alveolar cocentration)の濃度で反射性副交感神経血管拡張反応をそれぞれ86.2、69.2、66.6%抑制した。各吸入麻酔薬とも吸入直後に抑制がみられ、30分近くで最大抑制を示した。また吸入を解除するとその抑制は20-30分で完全に消失する。イソフルランによる抑制は中脳部位での除脳では殆ど影響を受けない。γ-アミノ酪酸(GABA)受容体拮抗薬のプクロトキシンによりイソフルランの抑制は殆ど回復した。これらの結果は吸入麻酔薬の体性-副交感神経血管拡張反応に対する抑制はGABAが重要な働きをし、その作用部位は脳幹レベルであることが推定された。口腔顔面領域の血管は交感神経により血管収縮、副交感神経により血管拡張反応を起こす。特に副交感神経血管拡張神経は味覚、痛覚らの体性感覚神経の刺激により反射性に興奮がおこり、口唇、口蓋、舌らの血管を拡張させる。本研究では種々吸入麻酔薬の体性-副交感神経血管拡張反応に対する効果を検討した。ネコをケタミン(30 mg/kg。im)により入眠後、α-クロラロース(30mg/kg,iv)とウレタン(100mg/kg,iv)で麻酔し、筋弛緩薬(パンクロニウム、0.4mg/kg、後0.2mg/kg/h)投与後,人工呼吸下(50%酵素、50%空気)で実験を行った。副交感神経の興奮は体性神経を求心性に刺激して反射性に起こした。即ち舌神経を露出後切断し、中枢性に電気刺激(30V、10Hz、2ms、20秒)をして反射性に副交感神経血管拡張繊維を興奮させ下顎口唇、口蓋に血管拡張反応を起こし、その反応をレーザードプラー血流計で測定した。この血管反応に対する吸入麻酔薬(イソフルラン、セボフルラン、ハロセンら)や笑気等の麻酔薬がどのような効果をもたらすかを検討した。これらの結果は吸入麻酔薬の体性-副交感神経血管拡張反応に対する抑制はGABAが重要な働きをし,その作用部位は脳幹レベルであることが推定された。
偏微分方程式の散乱理論とその応用

この科学研究費補助金により、我々は、中規模と、小規模の研究集会を開催し積極的な討論を行い、現在の研究の進展状況に関する情報交換と、これからの研究の動向を探った。本科学研究費補助金による研究課題は偏微分方程式論の研究の内でも、日常的問題に関わる分野を中心に総合的な研究を行った。その具体的方法としては、それぞれの課題を各分担者が中心となって中規模の、あるいは小規模の研究集会を開催し討論を繰り返して理論の発展を図った。特に、若手の研究者のエネルギーを有効に用いるために、若手を中心とした研究集会に力を入れて、運用した。また、散乱理論とその応用に関しても力を注ぎ日本の数学者で散乱論とその応用を研究している人を集めて、情報交換と共にこれから、どのような問題をどのように研究していくかを熱心に討論した。それと同時に、日本において問題の重要性に比して研究者の数が圧倒的に少ない現状を鑑み、偏微分方程式論研究者の中から、また大学院生の中からこの問題に取り組む人を生み出すべく、これらの研究集会に参加してもらった。この研究課題は2年間に亘って行われたが、その一年目の終わり近くに神戸大地震が起こった。我々は、この地震波の逆問題も重要な課題として考えてきた。勿論数学理論としての研究が中心課題ではあるが、この数学的理論の研究の発展が自ずと、地学や地震学との交わりを深めることにより、実用的意味を持つまでに発展する事が望まれる。今後、数学研究者の枠を越えて、工学、地学などの研究者と理論と実際とをつきあわせつつ研究を進めることができるようその機会を求めている。このような、課題がもう少し大規模に、分野を越えて共同研究ができるようになることを願っている。本年度は,それぞれの研究課題を各分担者を中心として,研究集会を開催し,発表,討議などを行った。2年間に瓦る研究の第一段階として、準備としての性格を持ちつつ研究活動を行った。本研究課題は偏微分方程式論の散乱論を中心課題としているが,そのためには偏微分方程式の全般的研究が不可欠であり、よって、多くのかつ巾広い偏微分方程式の研究者との研究集会や討論を行った。特に、(i)シュレ-ディンガー作用素にたいしては、磁場のある場合のスペクトル、あるいは多体問題の散乱理論の研究を中心として、これからの研究の動向を探った。(ii)双曲型方程式としては、波動方程式や弾性方程式の散乱理論を中心として、散乱核の特異性と散乱体の幾何学的性質の関連を考察した。次年度の研究を展望しつつ、全体として幅広く、周辺分野との関連性を重視しつつ研究した。偏微分方程式論の研究の内でも、日常的問題に関わる分野を中心に総合的な研究を行った。

勿論数学理論としての研究が中心課題ではあるが、この数学的理論の研究の発展が自ずと、地学や地震学との交わりを深めることにより、実用的意味を持つまでに発展する事が望まれる。今後、数学研究者の枠を越えて、工学、地学などの研究者と理論と実際とをつきあわせつつ研究を進めることができるようその機会を求めている。このような、課題がもう少し大規模に、分野を越えて共同研究ができるようになることを願っている。
多世代による市民文化活動が地域社会変容要因としてもつ人間形成機能に関する研究

本研究では、多世代による市民文化活動がもつ地域社会変容要因特にその人間形成機能の解明を目的として、研究計画にしたがい以下の調査研究を実施した。1地域社会における市民文化活動に関する文献を探索し、特に演劇活動に関する各種資料を収集し多面的に検討した。また成人期を中心とした生涯学習機会に関する文献を収集し、多世代を含む学習機会の構造と機能的特性を理論的に検討した。2調査対象地域である大阪府豊中市において、行政施策としての地域文化活動の成立要件の把握ため、当該活動に関する資料を追加収集し行政職員からの聞き取り等をおこなった。3当市に特徴的な市民文化活動である「市民演劇」活動における参加者と運営者との相互交渉過程と人間関係の変容・創出過程の検討のため、活動運営者からの文書等の情報の収集、活動参加者からの面接・電子通信等による資料収集及び市民演劇活動の継続的な経過観察と一部参与による資料収集を実施した。以上の収集資料の検討・分析により、この市民文化活動が世代とともに性・居住地域・障害の有無等多様な社会的属性をもつ参加者に相互交流・理解の機会を提供し、同時に演劇という活動形態が自己表現とその受容による相互理解を経て集団次元での人間関係の変革と再形成の機能を果していることを指摘できる。また個人次元でもより深層へと至る自己理解と自己変革への自己教育的契機としての意味をもつことも重要な知見である。さらに一般市民の活動運営への主体的関与が行政施策面での地域社会の変容へと架橋する可能性もみられる一方、活動の継続実施に伴い参加者の参加経験の差異が新たな属性として集団内分化を発生させている点を新たな課題として指摘できる。この市民文化活動の特に人間関係変革と自己教育的契機としての機能に着目して、活動当初の目的である人権教育実践へと架橋するための諸条件を検証することが今後の課題である。