hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RNA interference(RNAi)を利用した膵臓癌遺伝子治療法の確立

RNA interference(RNAi)を利用した膵臓癌遺伝子治療の開発にあたり、まず、膵臓癌で高頻度に変異が認められるK-ras遺伝子を治療標的遺伝子の候補とした。当教室で樹立したヒト膵臓癌細胞株YAPCと腹膜高転移株であるYAPC-PDは、K-ras遺伝子のコドン12に変異を認めた。ついでK-ras遺伝子中の翻訳領域を標的とする2種類のsiRNAを設計した。K-ras遺伝子変異を持つヒト膵臓癌細胞株YAPC-PD、AsPC-1、MIAPaCa-2にRNAiFect Reagentを用いてsiRNAを導入した。遺伝子発現抑制効果をRT-PCR法で比較したが、対照として用いたsiRNAが遺伝子発現抑制効果を示したのに対し、K-ras遺伝子を標的とするsiRNAは抑制効果を示さなかった。今回設計したsiRNAは標的とした配列が適切でなかったため、抑制効果を示さなかったと考えられる。これらの実験に並行して、新規治療標的遺伝子の探索のため、教室で樹立したヒト膵臓癌細胞株YAPCと、高腹膜転移株YAPCの遺伝子発現をcDNAマイクロアレイ法で比較した。その結果、33種類の遺伝子が2.5倍以上の発現変動を示した。この中から治療標的遺伝子を選択するため、real-time RT-PCR法、免疫染色法などを用いた膵臓癌臨床検体での遺伝子発現の解析が必要と考えられた。まず当教室で樹立したヒト膵臓癌細胞株YAPCと腹膜高転移株であるYAPC-PDのK-ras遺伝子の変異の有無についてdirect sequence法で解析したところ,いずれも膵臓癌で高頻度に認められるコドン12の変異を認めた.次に7種の膵臓癌細胞株(YAPC,YAPC-PD,AsPC-1,MIAPaCa-2,Panc-1,BxPC-3,Hs766)のK-ras遺伝子の発現をRT-PCR法で確認したところ,全ての細胞株で同レベルの発現を認めた。このとことから,今回設計したK-ras遺伝子を標的とする2種類のsiRNAは細胞に導入されているにも関わらず,標的とした配列が適切でなかったため,K-ras遺伝子の発現の抑制を示さなかったと考えられる.現在,K-ras遺伝子中の翻訳領域の他の部位を標的とする新たなsiRNAオリゴヌクレオチドの設計,選定を行っている.RNA interference(RNAi)を利用した膵臓癌遺伝子治療の開発にあたり、まず、膵臓癌で高頻度に変異が認められるK-ras遺伝子を治療標的遺伝子の候補とした。
細胞内侵入抗体を用いた重症心不全に対する革新的治療薬の開発

本研究ではHB-EGF抗体用いた不全心特異的にsiRNAを送達可能なベクターの開発を行っており、本年度は下記の研究を行った。蛍光標識HB-EGF抗体結合ベクターを不全心モデルマウスに投与し、標的細胞の同定を行った。その結果、HB-EGF抗体結合ベクターは線維芽細胞およびマクロファージを標的とすることが示唆された。しかし、マクロファージではFcレセプターを介した非特異的な結合が起きている可能性が示唆された。そこで、Fcブロックを用いてFcレセプターとの結合を阻害した実験を行った。その結果、線維芽細胞での蛍光強度に変化は見られなかったが、マクロファージで蛍光強度の低下がみられた。また、HB-EGF抗体結合ベクターはIsotype control抗体で作成したベクターに比べてマクロファージで蛍光を示すことから、マクロファージでは一部Fcレセプターと結合していることが明らかになった。これまでHB-EGFは心筋細胞で発現していることが報告されてきた。しかし、本研究ではHB-EGF抗体結合ベクターが線維芽細胞及びマクロファージに結合することから、これらの細胞でのHB-EGFの発現を確認するため、HB-EGF抗体での免疫染色を行った。しかし、所有しているHB-EGF抗体の免疫染色では再現性のある結果は得られなかった。そこで、心筋組織中の細胞を分離して各細胞でのHB-EGF mRNA発現量の比較検討を行うため、flow cytometryでの非心筋細胞の単離法の確立を行った。マーカーとなる遺伝子の発現量を比較した所、flow cytometryで血管内皮細胞と線維芽細胞の分離可能であることが明らかになった。しかし、マクロファージでは高い純度が得られなかったため、マーカーの選別が必要である。flow cytometryで単離した内皮細胞、線維芽細胞及び心筋細胞のHB-EGF mRNAの発現量を比較した所、線維芽細胞でHB-EGFの高発現している事が明らかになった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ロープレスエレベータへの応用を目指した高温超伝導リニアモータの実験的特性評価

上下だけでなく左右にも移動できる次世代のロープレスエレベータへの応用に向けて,高い推力密度を持ち低損失で高効率に加え,構造が簡単で低コストな高温超伝導リニアモータの実現を目指す。本研究では,二次側に永久磁石や巻線が不要で一次側に集中巻の簡単な巻線を持つリニアスイッチトリラクタンスモータを対象に,巻線に高温超伝導線材を用いた実験機を作製し,実証実験,損失の定量的評価および駆動システム,制御方法の確立を行うことを目的とする。また,これまでに研究開発が行われたロープレスエレベータ用リニアモータと特性を比較し,本研究で開発する高温超伝導リニアスイッチトリラクタンスモータの利点や課題を解明していく。
免疫老化、自己免疫疾患発症における胸腺髄質上皮細胞の変容とその意義

昨年度までに、自己寛容を保証する胸腺髄質上皮幹細胞の存在を証明し、かつその活性が生後直後に急速に低下することが明らかとなり、それらの点について論文としてまとめることができた。本年度は、中枢性自己寛容を担う髄質上皮細胞の何らかの異常と、自己免疫疾患発症との関連を様々な自己免疫モデルマウスを用いて検討した。その結果、全身性自己免疫疾患であるSLEのマウスモデルが、髄質上皮細胞の発生異常を呈することが明らかとなった。そこで、胸腺髄質上皮幹細胞の同定とその活性の評価に大きな役割を果たした培養系を用いて、本マウスの胸腺上皮コロニー形成能について検討したところ、B6マウスと比較して新生児の時点て明らかにコロニー形成能が低いことが分かった。以上の結果は、SLEモデルマウスで認められるT細胞の機能異常が、胸腺髄質上皮細胞の発生異常に起因する可能性があること、またこの発生異常が幹細胞レベルで起こっている可能性を示唆するものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。胸腺はT細胞の産生と自己寛容の確立を司る中枢免疫器官であり、生後早期に退縮するというユニークな性質を有する。特に末梢組織特異的自己抗原に対する中枢性自己寛容の成立に必須の髄質上皮細胞はより早期にその数が減少することから、加齢に伴う炎症性素因の増大や自己免疫疾患発症率の増加に関わる可能性が示唆されている。また髄質上皮細胞の異常は全身性自己免疫疾患モデルにおいても認められることから、その発症や病態にも関与する可能性も指摘されている。本研究では申請者が携わってきた髄質上皮を生涯維持可能な前駆細胞分画に着目し、この分画に含まれると想定される幹細胞の存在を証明するとともに、加齢や胸腺退縮の過程で幹細胞の活性がどのように変化するのか、自己免疫疾患モデルマウスにおいて髄質上皮細胞および幹細胞に認められる異常の詳細を検討することによって、胸腺髄質の機能異常と免疫老化、および自己免疫疾患発症との関連を包括的に理解することを目指す。本年度は、1)髄質上皮細胞の産生を長期間維持可能な胎生期クローディン(Cldn)陽性胸腺上皮前駆細胞分画のうちSSEA1陽性の細胞群に、長期再構成能が濃縮すること、2)このCldn+SSEA1+の細胞はin vitroにおいて高いコロニー形成能を持ち、かつ継代可能である、即ち自己複製能を有すること、3)コロニー形成能は生後すぐ顕著に低下すること、を明らかにした。これらの結果から、胎生期Cldn+SSEA1+に胸腺髄質上皮幹細胞が存在すること、幹細胞の活性は加齢に伴い低下することが明らかになった。以上の結果を、論文として報告した(Immunity 2014 Sekai et al.)。本研究は、中枢性自己寛容の成立を担う髄質上皮細胞の加齢に伴う早期減少や、自己免疫疾患モデルで認められる髄質上皮細胞の多様な異常が、免疫老化や自己免疫疾患の発症や病態にどの程度、またどのように関与しるかを明らかにすることを目指すものである。今年度は、本目的の根幹となる、髄質上皮幹細胞の同定を行うことが出来た。また、幹細胞の活性や異常を評価するin vitroコロニーアッセイシステムの確立、SLEモデルマウスに認められる胸腺髄質異常の原因について遺伝学的解析を行うことができ、おおむね順調に進んでいると考えている。これまでの成果を受けて、今後主に以下の3点に研究の焦点をおいて推進する予定である。1.加齢に伴い胸腺髄質上皮幹細胞の活性が低下するメカニズムの解明:生後直後にコロニー形成能が低下する原因について、Cldn+SSEA1+分画に認められる遺伝子変化を検討するなどして明らかにする。2.SLEモデルで認められる髄質上皮細胞の異常を遺伝子レベルで同定する:現在HE染色にて観察されているSLEモデルマウスの胸腺髄質上皮細胞の分化異常をより詳細に解析するために、髄質上皮細胞をFACSにて純化し、その遺伝子発現を正常マウスと比較する。これにより、異常の原因とその意義を明らかにする。3.髄質上皮細胞の異常を制御する方法論の開発:1,2の結果を基に、胸腺髄質

上皮細胞の加齢による減少や、自己免疫疾患に先行する分化異常を制御する方法の開発に取り組む。これにより、免疫老化に関連する現象の一端や自己免疫疾患の発症や病態がコントロール可能であるかを検証する。これらは、T細胞の中枢性自己寛容と末梢の免疫システムの恒常性維持との関連を理解し、それを制御するために必須の課題であり、期間内での解明をめざして研究を推進する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
NETCAGEによる婦人科癌のエンハンサーに特化した転写制御領域地図の作成

現在までに多くの大規模統合的ゲノム解析により様々なゲノム変異と腫瘍特性の関連性が示唆されてきた。後天的なゲノム変異は腫瘍特異的エンハンサーを形成し腫瘍を促進するが、従来解析ではエンハンサー解析には特化しておらずその解明もまだ発展途上にある。エンハンサーはそれ自体から合成されるRNA産物(eRNA)を検出し同定されるがその検出は難しい。そこでエンハンサー解析技術であるNET-CAGE法に着目し、婦人科癌におけるエンハンサーの解析を試みる。エンハンサーの統合的な解析は発生・進展の根源的な分子メカニズムを解明する可能性を有し、エンハンサーに特化した婦人科癌の転写制御領域地図の作成を目指す。
造血幹細胞ニッチを構成する骨髄間葉系前駆細胞の老化とその分子機構の解明

生涯にわたり血液細胞を供給する造血幹細胞は、骨髄のニッチ(niche)と呼ばれる限局した微小環境に接着し維持されている。CAR細胞は、骨髄で造血幹細胞の維持に必須のニッチを構成する中心的な細胞で老化に伴い骨髄を占有する脂肪細胞を産生する脂肪・骨芽細胞前駆細胞である。私たちは、転写因子Ebf3がCAR細胞特異的に発現し、発現が老齢マウスで低下することを見出した。そこで薬剤投与でEbf3発現細胞をラベルできるマウスを作製し、CAR細胞は1年以上自己複製能を持ち骨芽細胞と脂肪細胞を供給する幹細胞であること、老齢マウスで増加する脂肪細胞は、CAR細胞由来であることを明らかにした。次にCAR細胞特異的にEbf3を欠損するマウスを作製し、野生型マウスと比較したところ、26週令での骨髄は、組織学的に著差なく、造血幹細胞・前駆細胞の数が約半分に低下していた。しかし、老齢の遺伝子欠損マウス(90週令)の骨髄では、CAR細胞の骨芽細胞への分化が進み、骨棘が著増して骨髄腔が著しく減少し(重症大理石病様)、骨髄腔あたりの造血幹細胞・前駆細胞の細胞数が著減していた。一方、Ebf3と相同性が高いEbf1とEbf3の両方をCAR細胞で欠損させると若齢より骨棘が著増し骨髄腔が著しく減少した。以上より、老齢個体における骨髄腔の維持、CAR細胞の骨芽細胞への分化の抑制による未分化性維持にEbf3が必須であること、Ebf1は若年ではEbf3の機能を代替できるが老齢ではできず、機能が低下することが示された。本研究によって、CAR細胞が間葉系幹細胞であることが証明され、間葉系幹細胞(CAR細胞)の未分化性維持における老化特異的分子機構が初めて明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。私たちは、骨髄で造血幹細胞の維持に必須のニッチを構成する中心的な細胞(CAR細胞)と、その機能や発生の分子基盤を世界に先駆けて明らかにし、CAR細胞が老化に伴い骨髄を占有する脂肪細胞を産生する脂肪・骨芽細胞前駆細胞であることを明らかにした。そこで、CAR細胞の老齢による機能の変化を検討した。若年マウスと老齢マウスのCAR細胞を分離して、遺伝子発現量を比較したところ、CAR細胞特異的に発現することを見出していた転写因子Ebf3の発現が老齢マウスで低下していた。Ebf3発現細胞の性状を解析するため、薬剤投与でEbf3発現細胞をラベルできるマウスを作製したところ、Ebf3発現細胞はCAR細胞と同一であること、CAR細胞は1年以上自己複製能を持ち骨芽細胞と脂肪細胞を供給する幹細胞であることが明らかとなり、老齢マウスで増加する脂肪細胞は、CAR細胞由来であることが確認された。次にCAR細胞で特異的にEbf3を欠損するLepR-Cre;Ebf3 flox/floxマウスを作製し、野生型マウスと比較したところ、26週令で欠損マウスの骨髄は、組織学的に著差なく、造血幹細胞・前駆細胞の細胞数が約半分に低下していた。しかし、老齢マウス(90週令)の骨髄では、骨棘が著増することで骨髄腔が著しく減少し(重症大理石病様)、残存するCAR細胞では、骨芽細胞で高発現する転写因子OsterixやOsteocalcin、アルカリフォスファターゼの発現が増加していた。更に、骨髄腔あたりの造血幹細胞・前駆細胞の細胞数は著減していた。すなわち、老齢マウスのCAR細胞で、Ebf3の欠損により骨芽細胞への分化が進み、造血幹細胞・前駆細胞支持能が低下した。以上より、老齢個体における、CAR細胞の骨芽細胞への分化の抑制による未分化性維持にEbf3が必須であることが明らかになった。骨髄のCAR細胞が間葉系幹細胞であることが、はじめて証明され、老齢マウスで増加する脂肪細胞は、CAR細胞由来であることが確認された。また、老齢期で、骨髄の造血を支持する間葉系幹細胞(CAR細胞)の、骨芽細胞への分化の抑制による未分化性維持に必須の転写因子(Ebf3)が世界ではじめて同定された。これらは、老化によりCAR細胞の未分化性維持機構が低下する可能性を分子レベルで示す等、間葉系幹細胞とその老化の理解を大きく進める重要な成果である。

次にCAR細胞特異的にEbf3を欠損するマウスを作製し、野生型マウスと比較したところ、26週令での骨髄は、組織学的に著差なく、造血幹細胞・前駆細胞の数が約半分に低下していた。しかし、老齢の遺伝子欠損マウス(90週令)の骨髄では、CAR細胞の骨芽細胞への分化が進み、骨棘が著増して骨髄腔が著しく減少し(重症大理石病様)、骨髄腔あたりの造血幹細胞・前駆細胞の細胞数が著減していた。一方、Ebf3と相同性が高いEbf1とEbf3の両方をCAR細胞で欠損させると若齢より骨棘が著増し骨髄腔が著しく減少した。以上より、老齢個体における骨髄腔の維持、CAR細胞の骨芽細胞への分化の抑制による未分化性維持にEbf3が必須であること、Ebf1は若年ではEbf3の機能を代替できるが老齢ではできず、機能が低下することが示された。本研究によって、CAR細胞が間葉系幹細胞であることが証明され、間葉系幹細胞(CAR細胞)の未分化性維持における老化特異的分子機構が初めて明らかになった。若年マウスと老齢マウスのCAR細胞におけるFoxc1とEbf3の遺伝子発現について、発現細胞の細胞数と細胞一個あたりの発現量を解析する。また、引き続き、薬剤投与によりCAR細胞特異的にFoxc1遺伝子の欠損または強制発現を誘導できるマウスの作製を進める他、骨髄のCAR細胞由来の脂肪細胞の役割を明らかにするために、CAR細胞特異的にPPARγまたはC/EBPα遺伝子を欠損するマウスを作製する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
魚油代謝物のアレルギー症状緩和効果の検証と、その作用メカニズムの解明

魚油の摂取は、アレルギー発症の抑制やアレルギー症状の緩和に関連すると報告されており、その作用機構についての仮説がいくつか提示されている。予備検討の結果、魚油に含まれる多価不飽和脂肪酸の一つであるドコサヘキサエン酸(DHA)の代謝物の一つである、ドコサヘキサエノイルエタノールアミド(DHEA)がマスト細胞や好塩基球の脱顆粒反応を抑制する知見を得た。そこで本研究では、DHEAによる脱顆粒抑制効果の作用機構を解明するとともに、DHAとDHEAの生体内での関係について検討する。2018年度は、マスト細胞/好塩基球のモデル細胞株であるRBL-2H3細胞を用いて、DHEAの脱顆粒抑制効果の作用メカニズムについて検討した。まず、カルシウム蛍光プローブであるFluo-4AMを用いて、抗原刺激時に発生する細胞内カルシウムイオン濃度の変化にDHEAが及ぼす影響を評価した。その結果、DHEAは抗原刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を有意に抑制した。そのためDHEAは、細胞内カルシウムイオン濃度の変化に至る細胞内シグナル伝達を阻害することが示唆された。そこで、ウエスタンブロット解析により、生体内シグナル伝達分子のリン酸化に及ぼすDHEAの影響を検討した。その結果、Syk、PLC gamma 2、Aktのリン酸化亢進が有意に減弱した。これらの結果から、DHEAはFc epsilon RI経路の上流に位置するシグナル因子に作用して細胞内シグナル伝達を阻害し、その結果、脱顆粒が抑制されることが示唆された。また、2017年度に合成したDHEA誘導体について、RBL-2H3細胞を用いた脱顆粒反応に及ぼす影響を評価した。その結果、RBL-2H3細胞の脱顆粒反応をDHEAよりも強く阻害する誘導体が複数見出された。得られた結果をもとに構造活性相関解析を行い、脱顆粒をより強力に阻害する誘導体の創出を試みる。2018年度は、RBL-2H3細胞を用いてDHEAの脱顆粒反応抑制効果の作用メカニズムについて検討した結果、DHEAが脱顆粒反応を抑制する作用部位を推測できる結果を得ることができた。また、種々合成したDHEA誘導体の脱顆粒抑制効果を測定した。この結果から構造活性相関を解析し、脱顆粒をより強力に阻害する誘導体の創出を推進する。以上のとおり、実施計画に記載した内容を概ね達成することができた。2019年度は、花粉症モデルマウスを作製し、DHEAが花粉症の症状に及ぼす効果を検討する。その際、血中IgEレベルやサイトカイン産生に及ぼす影響についても評価する。また、LC-MSを用いた血中DHEAレベルの分析方法を確立する。その後、DHAやDHEAをマウスに経口投与し、血中の濃度変化を追跡して、DHEAの体内動態やDHAから変換されるDHEA量の測定を行う。魚油にアレルギー症状を緩和する効果があることが示唆されているが、詳細については未だ明らかになっていない。申請者は、魚油に含まれる多価不飽和脂肪酸の一つであるドコサヘキサエン酸(DHA)に着目し、下記の検討を行った。ラット好塩基球細胞株RBL-2H3細胞を好塩基球/マスト細胞のモデルとして培養細胞系の実験に用い、DHAが当該細胞の脱顆粒反応に及ぼす影響を検討した。その結果、DHAの脱顆粒反応抑制効果は極めて弱いことが明らかになった。そこで、ヒト体内で生成するDHA代謝物を有機化学的手法で合成して、上記と同様の実験を行った。その結果、脱顆粒反応抑制効果がDHA代謝物の一つに認められた。この結果から、魚油の抗アレルギー効果は、DHAを摂取後、DHAが体内で代謝されて別の化合物に変換され、それが効果を発揮すると推察された。次に、このDHA代謝物が培養細胞レベルだけでなく、生体レベルでも抗アレルギー効果を発揮するのか検証するために、マウスにDHA、またはDHA代謝物を5日間経口投与した後、受動皮膚アナフィラキシー反応を誘導した。その結果、DHA代謝物投与群マウスのアレルギー反応は、対照群(水を経口投与)マウスのそれと比べて有意に緩和されることを確認した。また、DHA投与群マウスのアレルギー反応は、対照群マウスのそれと比べて有意ではないものの緩和傾向にあることを確認した。さらに、このDHA代謝物の構造を改変したDHA代謝物誘導体を種々合成した。また、DHAを他の脂肪酸に置き換えた脂肪酸代謝物も種々合成した。今後、これら化合物の脱顆粒反応への影響、および受動皮膚アナフィラキシー反応への影響を検討する予定である。当初計画で2017年度に実施する内容について概ね検討したが、血中のDHA代謝物の精製方法の確立と機器分析の条件設定については、年度内に完了しなかった。2017年度の研究の実施によって、1)DHAを摂取後、ヒト体内で生じるDHA代謝物の一つがラット好塩基球細胞株RBL-2H3細胞の脱顆粒反応を抑制すること、2)当該DHA代謝物を経口投与したマウスは、経口投与しなかったマウスと比べて、受動皮膚アナフィラキシー反応が有意に軽減されること、3)DHAを経口投与したマウスは、経口投与しなかったマウスと比べて、受動皮膚アナフィラキシー反応が軽減される傾向にあること、の3点を明らかにすることができた。また、構造を改変したDHA代謝物誘導体、および、DHAを他の脂肪酸に置き換えた脂肪酸代謝物を種々合成することができた。

魚油の摂取は、アレルギー発症の抑制やアレルギー症状の緩和に関連すると報告されており、その作用機構についての仮説がいくつか提示されている。予備検討の結果、魚油に含まれる多価不飽和脂肪酸の一つであるドコサヘキサエン酸(DHA)の代謝物の一つである、ドコサヘキサエノイルエタノールアミド(DHEA)がマスト細胞や好塩基球の脱顆粒反応を抑制する知見を得た。そこで本研究では、DHEAによる脱顆粒抑制効果の作用機構を解明するとともに、DHAとDHEAの生体内での関係について検討する。2018年度は、マスト細胞/好塩基球のモデル細胞株であるRBL-2H3細胞を用いて、DHEAの脱顆粒抑制効果の作用メカニズムについて検討した。まず、カルシウム蛍光プローブであるFluo-4AMを用いて、抗原刺激時に発生する細胞内カルシウムイオン濃度の変化にDHEAが及ぼす影響を評価した。その結果、DHEAは抗原刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を有意に抑制した。そのためDHEAは、細胞内カルシウムイオン濃度の変化に至る細胞内シグナル伝達を阻害することが示唆された。そこで、ウエスタンブロット解析により、生体内シグナル伝達分子のリン酸化に及ぼすDHEAの影響を検討した。その結果、Syk、PLC gamma 2、Aktのリン酸化亢進が有意に減弱した。これらの結果から、DHEAはFc epsilon RI経路の上流に位置するシグナル因子に作用して細胞内シグナル伝達を阻害し、その結果、脱顆粒が抑制されることが示唆された。また、2017年度に合成したDHEA誘導体について、RBL-2H3細胞を用いた脱顆粒反応に及ぼす影響を評価した。その結果、RBL-2H3細胞の脱顆粒反応をDHEAよりも強く阻害する誘導体が複数見出された。得られた結果をもとに構造活性相関解析を行い、脱顆粒をより強力に阻害する誘導体の創出を試みる。2018年度は、RBL-2H3細胞を用いてDHEAの脱顆粒反応抑制効果の作用メカニズムについて検討した結果、DHEAが脱顆粒反応を抑制する作用部位を推測できる結果を得ることができた。また、種々合成したDHEA誘導体の脱顆粒抑制効果を測定した。この結果から構造活性相関を解析し、脱顆粒をより強力に阻害する誘導体の創出を推進する。以上のとおり、実施計画に記載した内容を概ね達成することができた。前年度に完了しなかった研究計画に加えて、今年度の研究計画を予定どおり実施する。受動皮膚アナフィラキシー反応とは異なるアレルギーモデルとして、花粉症モデルマウスを作製し、DHAおよびDHA代謝物が症状に及ぼす影響について評価する。また、生化学的・薬理学的手法を用いて、DHA代謝物の脱顆粒反応抑制効果のメカニズムの解明を試みる。2019年度は、花粉症モデルマウスを作製し、DHEAが花粉症の症状に及ぼす効果を検討する。その際、血中IgEレベルやサイトカイン産生に及ぼす影響についても評価する。また、LC-MSを用いた血中DHEAレベルの分析方法を確立する。その後、DHAやDHEAをマウスに経口投与し、血中の濃度変化を追跡して、DHEAの体内動態やDHAから変換されるDHEA量の測定を行う。当初の想定よりも研究の進捗が遅れたため、本来購入するべき試薬等の購入に至っておらず、当該助成金が生じた。翌年度分と合わせて、実験動物、試薬、投稿論文投稿費用などに使用する計画である。
ナトリウム利尿ペプチドの作用機構

この心機能への差が生じる原因を探る目的で、全身麻酔下の犬を開胸し、冠動脈の左前下行枝に電磁流量計のプロブを装着し、その上流部からhuman BNP,dog BNPおよびeel VNPを持続注入した。また、冠動脈にカテーテルを留置して血液中のcGMP濃度を測定した。human and BNPを冠動脈へ注入すると心拍出量はdose-dependentに減少し、強いnegative inotropic actionを認めるのに対して、VNP投与では心拍出量は有意な変化を認めなかった。冠血流量の変化はいずれのペプチドでも有意でなかったが、BNP投与群で減少が強い傾向を示した。冠静脈中のcGMPの増加率は、VNP投与時に比較してBNP投与時が有意に大きかった。ナトリウム利尿ペプチド(NP)の腎への作用特性を解析する目的で、犬の腎動脈へNPを直接注入した成績では、心房性NP(ANP),B-type NP(BNP)ともに同程度の利尿作用を示すが、ともに腎循環へは有意な作用を認めなかった。すなわち、両者の利尿作用は尿細管への直接作用が主体と考えられる。一方、心に対しては従来の報告と異なり、ANP,BNPともに心拍出量を減少させ、negative inotropic actionの強いことが確認された。冠動脈へNPを注入した成績では、冠血流量増加作用は認められず、negative inotropic actionはさらに顕著となった。ウサギおよびサケ心室から抽出されたventricular natriuretic peptide(VNP)も、犬においてANPやBNPと同程度の利尿作用を示すことが確認された。一方、VNPは心機能に対してはANPおよびBNPとは異なる生理活性を持つ可能性が示唆された。VNPは大量を静脈内に注入すると、初期には強い陽性変力作用を持つが、持続注入すると一過性の陽性変力作用の後に、陰性変力作用に変わる、2相性の作用が認められた。この作用特性は、全末梢血管抵抗、冠循環などにはほとんど影響のない状態で発現することから、心筋への直接作用である可能性が高い。以上の研究成果を基に、現在second messenger(cGMP)との関連並びに高張液輸液における作用特性を検討している。この心機能への差が生じる原因を探る目的で、全身麻酔下の犬を開胸し、冠動脈の左前下行枝に電磁流量計のプロブを装着し、その上流部からhumanBNP, dogBNPおよびeel VNPを持続注入した。また、冠静脈にカテーテルを留置して血液中のcGMP濃度を測定した。冠静脈中のcGMPの増加率は、VMP投与時に比較してBNP投与時が有意に大きかった。
MRIを用いた白質病変の自動評価と認知症発症予測システムの開発

アルツハイマー群と健常群を提案手法を用いてSupport vector machineを用いて自動識別を行ったところ、感度87.9%、特異度80.0%にて識別可能であることを示した。MRIの縦断画像データを用いたアルツハイマー病の自動識別法の検討を行った。本手法は、従来のアルツハイマー病における灰白質の萎縮のみならず、T1強調画像における白質の低信号領域、すなわち白質病変の変化にも着目した手法である。具体的にはT1強調画像よりStatistical Parametric Mapping:SPMで用いられるベイズ推定に基づく組織分割によって得られた条件付き事後確率マップ(灰白質・白質・脳脊髄液)よりこれら脳組織の縦断的な変化を表す指標を提案した。提案手法をアルツハイマー病の観察臨床研究であるJapaneseAlzheimer's Disease Neuroimaging Initiativeのデータを用いて検討した。前処理として、申請者がこれまで開発したファントムを用いた歪み補正法と、米国ADNIで採用されているMRIの信号不均一補正を施した。各被験者の0時点および6か月時点のT1強調像からSigle SubjectTemplate:SSTを作成し、対称性Affine変換によりSSTへ位置合わせした脳組織画像から最小二乗法を用いて、組織の変化率行列coefficients with probability change:CPCを求めた。アルツハイマー群と健常群をCPC行列の各成分を用いてROC解析を比較した。結果として、AUCで最大0.885の精度で健常群とアルツハイマー群の識別が可能であった。本研究の提案時には、白質病変としてFLIAR画像上の白質病変を抽出して、白質病変の重症度の指標を自動的に算出する手法の開発を目指した。しかしながらFLIAR画像は通常の臨床ルーチンで必ずしも実施される画像検査ではないため、より汎用性の高い手法としてT1強調画像を用いる手法の検討を行った。白質病変はT1強調画像では白質領域の低信号域として表せられるため、FLIAR画像程ではないが描出可能である。この成分を含むCPC行列を用いたアルツハイマー群と健常群とのROC解析で妥当な識別結果を示したためこの評価とした。具体的にはT1強調画像よりStatistical Parametric Mapping:SPMで用いられるベイズ推定に基づく組織分割によって得られた条件付き事後確率マップ(灰白質・白質・脳脊髄液)を取得し、これら脳組織の縦断的な変化を表す指標を提案した。先行研究により報告されている縦断解析バイアスの発生しない変形を採用した。具体的には各被験者のベースライン時点と6か月時点のT1強調像からSigle SubjectTemplate:SSTを作成し、対称性Affine変換により位置合わせを実施した。変形後のベースライン時点と6か月後の白質・灰白質・脳せき髄液の確立マップより、、提案する組織の変化率行列coefficients withprobability change:CPCをボクセル毎に求めた。各被験者のSSTからラベルフュージョン法を用いて解剖学的関心領域の自動分割を行い、領域内のCPCの各成分の平均を求めた。アルツハイマー群と健常群をCPC行列の各成分を用いてSupport vector machineを用いて健常群とアルツハイマー群の自働識別を行ったところ、感度87.9%、特異度80.0%にて識別可能であることを示した。本年度の研究成果では、ROC解析によりアルツハイマー群と健常群の識別の初期検討を行い良好な結果を得た。今後は、CPCを用いた機械学習の適応による精度向上や、バイオマーカーとしての有効性の検証を行っていきたいと考える。具体的には、CPC行列の各成分からアルツハイマー群と健常群の識別に有効な要素を判定・抽出し、その要素を用いてSupport Vector Machine等を用いた判別器の精度を検証して行きたい。医用画像解析初期検討の結果より高次元の画像処理の必要性が判明した。この画像処理を実現するため、多数のコンピュータを組み合わせたグリットコンピューティングが有効である。よって次年度にグリットコンピューター群の購入費用が発生したためである。計32コア程度となるよう、1台あたり4コアのコンピュータ8台程度の購入を計画する。
滑膜炎症性マクロファージに多量に発現する分子のcDNAクローニング

I C45抗原のcDNAクローニングmammalian発現ベクターpcDLSRαを使い、RA滑膜ライブラリーを作成した。B.Seedの方法にて、RA滑膜細胞を免疫して得られた5種の抗体を用いて、認識する抗原のcDNAクローニングをおこなった。C45抗原のcDNAクローニングにはまだ成功していないが、1種の抗体の認識する抗原は塩基配列の結果CD14であった。2 I8抗原のcDNAクローニングλgt11を用いてRA滑膜ライブラリーを作成し、I8抗体と反応する18個のクローンを得た。5種のクローンの部分的な塩基配列を検討したところ、1)カゼインキナーゼIIβ2)チロシンフォスファターゼイプシロン3)リボゾ-マルL234)遺伝子バンクに登録されているが機能が不明なもの5)まだ遺伝子バンクに未登録のもの、であった。これらをプローベに他の13個のクローンとハイブリダイズさせたところ、1)とハイブリするものが他に1個みつかったが、他はハイブリしなかった。現在得られたクローンに共通なアミノ酸配列・構造はなく、I8抗体がどの構造を認識しているのか決定できていない。今後、他の発現系での抗体の反応性を検討する予定である。mammalian発現ベクターpcDLSRαを使い、RA滑膜ライブラリーを作成した。
インタビュー調査に基づく製造企業のスケジューラの思考パターンの解明

本研究では,最初に製造企業の生産スケジューリングの担当者を訪問し,実務で使用されている生産計画システム,計画手順やスケジュールの評価尺度,計画と実際の一致の度合いやスケジューリングの難しさなどについて聞き取り調査を実施した.10社からの回答内容にその他の調査で得られた内容も含めて検討したところ,スケジューラを中心とした協働的な生産計画が多くの企業で採用されていることが明らかとなった.具体的には,スケジューラが生産計画システムを使って計画を決定する際に,営業部門の担当者や現場作業者と密に情報を交換していること,また,詳細な計画決定は現場の職長に適宜委ねつつ,工場全体としての高い生産性実現に向けて腐心していることが明らかとなった.このことは,スケジューラが,現状の正確な把握→計画作成→評価,という手順を何度か繰り返すことで,必須要件を満たしつつ,運用時に問題が生じにくい計画を見つけ出そうとしていることを示していると考えられる.この思考・行動のフローに必要とされる代表的情報を列挙し,これらを整理してスケジューラの基本的な思考パターンとした.最後に,スケジューラの役割の重要性が必ずしも正しく評価されていないとの問題意識に基づき,システムダイナミックスによるスケジューラの振る舞いのモデル化を行った.仮想的な設定のもとでのシミュレーション実験より,スケジューラが現場との情報交換を密にしていることの重要性が数値的に明らかとなった.本研究では,最初に製造企業の生産スケジューリングの担当者を訪問し,実務で使用されている生産計画システム,計画手順やスケジュールの評価尺度,計画と実際の一致の度合いやスケジューリングの難しさなどについて聞き取り調査を実施した.10社からの回答内容にその他の調査で得られた内容も含めて検討したところ,スケジューラを中心とした協働的な生産計画が多くの企業で採用されていることが明らかとなった.具体的には,スケジューラが生産計画システムを使って計画を決定する際に,営業部門の担当者や現場作業者と密に情報を交換していること,また,詳細な計画決定は現場の職長に適宜委ねつつ,工場全体としての高い生産性実現に向けて腐心していることが明らかとなった.このことは,スケジューラが,現状の正確な把握→計画作成→評価,という手順を何度か繰り返すことで,必須要件を満たしつつ,運用時に問題が生じにくい計画を見つけ出そうとしていることを示していると考えられる.この思考・行動のフローに必要とされる代表的情報を列挙し,これらを整理してスケジューラの基本的な思考パターンとした.最後に,スケジューラの役割の重要性が必ずしも正しく評価されていないとの問題意識に基づき,システムダイナミックスによるスケジューラの振る舞いのモデル化を行った.仮想的な設定のもとでのシミュレーション実験より,スケジューラが現場との情報交換を密にしていることの重要性が数値的に明らかとなった.中国地方に製造拠点をもつ企業10社余りを訪問し,生産計画やスケジューリングの方法の現状や課題などについて生産管理担当者にインタビュー調査を行った。企業の業種や規模は異なるものの,多くの企業では製品が一般の消費者向けであるという点に共通点がある。インタビューによって明らかとなった現場の現状や課題としては,需要変動が大きいこと,消費者の嗜好の多様化に伴い受注生産や小ロット生産へシフトしていること,このような状況下で,納期遵守と製品品質の保証を最優先しつつ,仕掛在庫の削減,負荷の平滑化などが重要な課題とされていることなどが分かった。多くの企業では自社の生産環境に応じた生産計画システムが年月をかけて独自に構築されており,それらの中心となるロジックにはMRPの採用例が多く見受けられた。生産管理部門の担当者の主要業務は概算の負荷計画を立てることにあり,詳細なスケジューリングは現場の職長などに任せている場合の多いことも明らかとなった。生産現場の状況は変化しやすいことに加え,作業者の習熟度や機械の調子などの数量化しにくい情報も多く含まれることより,コンピュータによる自動スケジューリングはしばしば困難であり,現場の諸条件を熟知した職長がスケジューラとして重要な役割を演じている。しかしながら,職長自身も判断の妥当性に必ずしも確信がないことや,局所的視点に偏りがちであることより,生産計画担当者と現場の職長との意思決定の整合性を保つと同時に,現場の多様な状況を踏まえたスケジューリング支援システムの必要性が明確となった。前年度に実施した中国地域の製造企業10社へのインタビュー調査の結果を中心として,製造企業のスケジューラの計画業務について検討した.その結果,スケジューラを中心とした協働的な生産計画が多くの企業で採用されていることが明らかとなった.具体的には,スケジューラが生産計画システムを使って計画を決定する際に,営業部門の担当者や現場作業者と密に情報を交換していること,また,詳細な計画決定は現場の職長に適宜委ねつつ,工場全体としての高い生産性実現に向けて腐心していることが明らかとなった.このことは,スケジューラが,「現状の正確な把握」→「計画作成」→「評価」という手順を何度か繰り返すことで,必須要件を満たしつつ,運用時に問題が生じにくい計画を見つけ出そうとしていることを示している.この思考・行動のフローに必要とされる代表的情報として,納期,負荷,生産能力,仕掛在庫など9項目を列挙し,これらを整理してスケジューラの基本的な思考パターンとして提案した.さらに,スケジューラの役割の重要性が必ずしも正しく評価されていないとの問題意識に基づき,システムダイナミックスによるスケジューラの振る舞いのモデル化を行った.

スケジューラを中心とした協働的生産計画では,スケジューラが現場の実態をより正確に把握できるとともに,生産計画を現場と検討することで生産性の向上につながる計画が得られると仮定した.シミュレーション実験より,このようなスケジューラの活動が残業生産時間の削減という形で評価できることを確認した.
肺deltaグルタミルトランスペプチダーゼの生後誘導における酵素刺激の役割に関する研究

胎児の肺は子宮内の低酸素環境下にあるが、新生児の肺上皮は呼吸の開始によって酸素分圧の急上昇にさらされる。このような酸化ストレスの急上昇に対する適応機構を明らかにするため、抗酸化剤であるグルタチオンの細胞内濃度を制御しているGGT(gamma-glutamyl transpeptidase)の発現を、In vivoおよびIn vitroの実験系を用いて検討した。1)、妊娠18日齢から生後8週齢のラットの肺におけるGGT遺伝子の発現をノーザンブロッテイング方を用いて検討した。GGT遺伝子の発現は、妊娠18日齢から認められ生後4週齢には最大値に達し、GGT酵素活性の誘導パターンとほぼ一致した。RNAの分子量は発達にともなって2.1Kbから2.4Kbにシフトし、胎仔期と生後発達期では異なった遺伝子が発現している可能性が示唆された。2)、これまで報告されている3種類のGGT遺伝子の特異的配列をプライマーとしたRT-PCR法を用いて、各発達期に発現しているGGT遺伝子の分子種を検討した。その結果、胎仔期には腎臓型の分子量2.1KbのmRNAが、生後発達期には肝臓型の分子量2.4KbのmRNAが発現することが明らかになった。3)、腎臓型から肝臓型への遺伝子発現の切り替えの機構を探るため、妊娠18日齢のラット胎仔の肺から上皮細胞を分離精製し、3%および21%の酸素濃度環境下に培養した。3%酸素濃度下では腎臓型のGGTmRNAが、21%酸素濃度下では肝臓型のmRNAが検出された。4)、以上の結果から、肺のGGT遺伝子は発達段階に対応した発現制御を受けており、酸素刺激に関連した因子が遺伝子発現の制御に関わっていることが強く示唆された。
漁業権行使に関する将来的な展望についての研究

本研究では特に東日本大震災以降に顕著化し始めた漁業権行使に関わる居住要件について、現状の把握と今後の在り方について探求することを目指している。被災地では住居を失い、それまでとは異なる場所での生活を余儀なくされた漁業者が多かった。そのような居住者の中には漁業権行使に関わる実質的な居住制約との関係から、漁業から撤退せざるを得なくなったものもいることが本研究での調査の中で明らかになっている。このような状況が、制度面を考慮した際に必然的に発生することについては、既に確認済みである。一方、この間の2回の漁業権の一斉更新の際には、水産庁から「特別な配慮」に対する要請を行っている。昨年度は2回目の一斉更新の時期に該当したが、この要請に対する宮城県内における対応について、県漁協および各支所においてヒヤリング調査を実施した。県漁協は、1回目の際には「漁村」単位の自主判断に委ねるという判断をしていた。それに対して2回目の際には、水産庁の配慮要請に積極的に応じるという決断を行った。すなわち、東日本大震災前の居住地について漁業権行使に関わる居住制約を満たす場合には、特例措置を講じるというものである。1回目の際にもそのような対応がなされた地区も多かったが、県全体の方針として示されたものではなく、異なる判断を行った地区もあったようだ。2回目においては行使規則に特別措置を明記が明記されたことが確認されており、この点において大きな決断を行ったと言える。県漁協としては「指導」という形で上記の方針を進めたが、各地区はその指導に準拠する形で対応しており、結果として同一方針が実現する結果となっている。もちろん、あくまでも特別措置であり、新規就業者に適応されるものではない。そのため、新しい沿岸漁業の方向性が見えてきたとまで言える状況に達したとは言えない。今年度は進捗が遅れていた漁業地区調査を完了させることができたが、当初の予定では研究が完成する年度となるはずであった。このような進捗状況に鑑み、研究期間を1年延長した。先方との予約の不調が続いたこと、共同研究者が抜けたことなどを理由として漁業地区調査が大幅に遅れたとが、おもな理由である。現地調査が概ね終了したことから、研究の完成を目指すことになる。更新された漁業権の免許についての情報が入手可能となったため、現地調査から得られた事実とを比較しながら客観的な事実の把握をしていく。沿岸漁業においては資源管理や漁業集落における協調体制の確立などに寄与してきたと評価されている制度ではあるが、特異な状況と考えられる現在の東北太平洋沿岸地区において、本来的な意味とは異なる形で機能している可能性が見えてきたことが、本研究の背景にはある。以上の研究課題に取り組むために、本年度は、漁業地区調査と既存研究の整理を行った。漁業地区調査では宮城県石巻市の3地区と宮城県の広域を管轄とする漁協1か所におけるヒヤリングを実施した。先行して前年度に別の地区で実施したヒヤリングの結果も含め、明らかになってきたのは以下の点である。第一に、相異なる二つの意見が明確に対立する状況が存在しているということである。具体的には、本来の居住要件通り、いかなる理由があっても対象地域に居住していないものには漁業権の行使を認めないという意見に対して、特例的な状況であることから居住要件をある程度緩めるべきだという意見が存在している。第二に、意見の分布が地区によって異なっているということである。居住要件を厳しくするべきという意見が多数を占める地区から、その逆の地区まで分布の態様は様々であることが確認された。以上のような状況の中で県を統括する漁協に対して統一的な方針を示すべきであるという意見も存在している。ただし、漁業権行使については伝統的な漁村単位の自治に委ねられてきたことから、そのような対応は現状としては難しいようである。既存研究の整理においても、現地調査で確認された2つの異なる立場と同様のものが存在していることが確認されているが、本研究課題について直接取り組んでいる研究の存在は確認されていない。2016年度には、漁業地区調査として、漁協および支所を合わせて20地区でヒヤリングを実施する計画であったが、実施できたのは10地区であった。先方の都合もあり、こちらの予定通りのスケジュールで必ずしも進められないことが計画通りに進んでいない一つの要因となっている。ただし、調査を実施する中で派生的に得られた情報もあるため、必ずしも当初の20地区すべてで調査を実施する必要性はなくなったと判断している。特に、宮城県の広い範囲を管轄とする漁協において適切な情報を収集できたことは本研究の進展にとって非常に意義があったと判断している。調査研究を行う前には、漁協が統一的な方針を示し、その方針で示された状況に向かって収束していくという結末もありうると考えていたが、現時点では、そのような可能性は低いと判断している。もう一つ予定した調査研究事項である、既存研究の整理については予想していたよりも対象領域についての先行研究が少ないことが分かったため、周辺領域も含めて再度調査することが必要となっており、次年度に残された課題となっている。以上の点を考慮した上での研究の実質的な進捗状況は7割程度と評価しており、やや遅れ気味という判断となる。次年度以降、適切な調整を行いながら、対応していきたいと考えている。

本研究では特に東日本大震災以降に顕著化し始めた漁業権行使に関わる居住要件について、現状の把握と今後の在り方について探求することを目指している。漁業権行使に関わる居住要件について考える場合、それが制度上の明確な制約であるのか、慣例や漁村独自のルールによるものなのかを識別しなければならない。制度上については、組合管理型漁業権との関わりで、1水産業協同組合法第18条の「組合の地区」2漁業法第11条の「地元地区」およびそれと同様の考え方で定められる「関係地区」からの制約について考える必要がある。これらの法的な地区概念は、いずれについても伝統的な漁村による漁業権管理を下支えするものにはなっているが、法的に完全な制約になっているわけではない。例えば、「地元地区」に居住していないと組合管理型漁業権を営むことはできないという明確な法的制約はない。ただし、「下支え」となっている部分が地区単位の自治的な運営の中で事実上の居住制限を後押ししている側面は否定できない。別の言い方をすれば、漁村単位の厳しい居住要件を生み出す土壌を法的側面が後押ししているということである。その側面が顕著に表れているのが、「漁業権行使規則の制定における地元地区住民2/3以上の書面同意」である。この制約によって、「行使権利者を地元地区居住者に限定する」という自主ルールが生まれやすくなっている。各漁村の伝統的な管理を重視するという側面からは望ましい法体系であると考えられるが、非常時とも言える現状にあっては、問題を生み出す源泉となっているとも言える。もちろん、その点については水産庁も認識しており、2012年、2017年に都道府県知事を通じて配慮要請を行っている。その効果は一定程度あると評価できるが、長期的な判断への影響までは不明である。この点も含め今後の調査研究の中で明らかにしていきたい。今年度は昨年からの継続中の漁業地区調査を実施し、宮城県内については概ね完了させることが目標であったが、先方との予約の不調が続いたこと、共同研究者との日程調整が困難だったことの2点を理由として、予定していた調査の多くについて実施が困難であった。そのため、漁業地区調査頼みのデータが得られず、研究の核心部分に踏み込めずにいる状況となっている。被災地では住居を失い、それまでとは異なる場所での生活を余儀なくされた漁業者が多かった。そのような居住者の中には漁業権行使に関わる実質的な居住制約との関係から、漁業から撤退せざるを得なくなったものもいることが本研究での調査の中で明らかになっている。このような状況が、制度面を考慮した際に必然的に発生することについては、既に確認済みである。一方、この間の2回の漁業権の一斉更新の際には、水産庁から「特別な配慮」に対する要請を行っている。昨年度は2回目の一斉更新の時期に該当したが、この要請に対する宮城県内における対応について、県漁協および各支所においてヒヤリング調査を実施した。県漁協は、1回目の際には「漁村」単位の自主判断に委ねるという判断をしていた。
滑動性眼球運動と前庭動眼反射の干渉系における視線信号の軽視機構―補足眼野の活動―

ゆっくり動く物体からの視覚情報を適切に取り込むために滑動性追跡眼球運動が必要であるが、実際の運動中は頭部が頻繁に動く状態で視標追跡運動が行われるため滑動性眼球運動は必然的に前庭動眼反射系と干渉を起こして視線信号を形成する。今回は、この両運動の干渉系における視線信号の形成に、小脳虫部と補足視野がどのように関わるかを調べるため、これらの領域に再現される信号の性質を、訓練した日本サル3頭を用いて調べた。小脳虫部で滑動性眼球運動に応答した42個のプルキンエ細胞活動を、滑動性眼球運動、前庭動眼反射抑制課題、前庭動眼反射(×1)課題を用いて調べた。その結果、虫部の滑動性眼球運動に応答したプルキンエ細胞は殆どすべて、前庭動眼反射抑制課題にも応答し、両課題における最適応答方向はあらゆる方向を向いていた。個々の細胞について応答特性を詳細に調べると、約半数の細胞は、滑動性眼球運動と前庭動眼反射抑制課題における最適応答方向がほぼ一致し、両課題における個々の細胞の応答の大きさは有意に相関したが、前庭動眼反射(×1)課題と有意の相関を示さなかった。また、滑動性眼球運動中に短時間(200ms)指標を消して追跡運動をさせた場合でもニューロン応答はほぼ維持された。これらの結果は、虫部の応答が、前回調べた前頭眼野の応答と類似することを示す。補足視野からの記録は現在進行中であるが、滑動性眼球運動と前庭動眼反射抑制課題に応答し、前庭動眼反射(×1)課題には応答せず、視線速度に有意の相関を示す細胞が記録されている。以上の結果は、滑動性眼球運動と前庭動眼反射の干渉系における視線信号の形成には、複数の脳領域が関わり、すでに前頭葉眼球運動関連領域で視線信号が形成されていることを示唆する。
感染症発生動向データの疫学的解析・評価システムの開発

感染症サーベイランスのデータを適切に解釈し、有効な対策へとつなげることは公衆衛生上重要な意義がある。データ解釈と対策につなげるまでの過程を、より迅速で適切かつ継続的に行っていくためには、IT技術を活用したシステムの利用が不可欠である。研究代表者はこれまで、感染症サーベイランスデータの可視化システムの構築に継続的に取り組み、患者報告の状況を容易に確認できるウェブシステム「NESID Dashboard」の開発を行ってきた。本研究では、既存のシステムに改良を加え、サーベイランスデータのより適切な疫学的解釈と系統的なリスク評価を可能にするシステムへと進化させる。
不死化させた歯胚細胞を用いた歯再生に関する基礎的研究

歯はエナメル芽細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞などが相互作用を及ぼして形成されていくものと考えられる。したがって、歯の再生を考える上ではまず始めに、歯胚からこれらの性質を備えた細胞を分離し、その細胞間相互作用を明らかにすることが重要である。そこで、私たちは細胞の不死化に着目し、それらの性質を有する細胞間の相互作用について分子生物学的に解析した。歯は上皮由来のエナメル芽細胞、間葉系由来の象牙芽細胞や歯髄細胞、歯根膜細胞などが相互作用を及ぼして形成されていくものと考えられる。したがって、歯の再生を考える上ではまず始めに、歯胚からこれらの性質を備えた細胞を分離し、その細胞間相互作用を明らかにすることが重要なことである。しかし、これら細胞間相互関係を解明するには再現性のある細胞が必要となる。また、歯胚細胞は癌細胞とは異なり正常細胞であるため、増殖能力に限界があり継代していくうちに死滅してしまう。したがって、これらの性質を持った細胞を歯胚組織から分離しても、半永久的に使用することは不可能である。そこで、私たちは細胞の不死化に着目した。矯正治療のため便宜抜歯が必要と診断された患者から歯胚を取り出し、single cellとして分離し、DNA腫瘍ウイルス(SV40)を導入し不死化ヒト歯胚細胞を樹立した。次に、不死化歯胚細胞をsingle cellにして培養し、single cell coloney形成後、それぞれの細胞集団のmRNAの発現変化について解析し、エナメル芽細胞様、象牙芽細胞様、歯髄細胞様細胞に篩い分ける。上記のように篩い分けた細胞群にサイトカインによる細胞分化増殖への影響を検討するためにFGF-2、BMP-2、BMP-4、ectodinを投与し、アメロゲニン(エナメルタンパク)、ホスホホリン(象牙質リンタンパク質)、プロテオグリカン、I型コラーゲン、アルカリフォスファターゼの発現変化および細胞増殖について検討した。その結果、ホスホホリンの発現が増強している細胞群およびI型コラーゲン、アルカリフォスファターゼの発現が増強している細胞群が確認できたが、歯牙構造物のどの組織を形成しているのかは断定できていないため今後のさらなる研究が必要である歯牙・歯周組織は上皮由来のエナメル芽細胞、間葉系由来の象牙芽細胞や歯髄細胞、歯根膜細胞などが相互作用を及ぼして形成されていくものと考えられる。前年度樹立した不死化ヒト歯胚細胞からエナメル芽細胞様、象牙芽細胞様、歯髄細胞様細胞にそれぞれ篩い分けした。single cell coloneyを用いて、それぞれの細胞群をコラーゲン膜を介して共存培養を行い、その相互作用を解析することである。また、BMP-2、BMP-4、ectodin、FGF-2、をそれぞれ添加して、共存培養を行いそれらの細胞群の遺伝子発現変化およびタンパク質発現変化も解析する。エナメル芽細胞様、象牙芽細胞様、歯髄細胞様細胞に篩い分けをされたそれぞれのsingle cell coloneyを細胞は透過することが出来ないコラーゲン膜上に播種し、培養液中で培養する。1)培養後、3, 5, 7, 14, 21日目でそれぞれのsingle cell coloneyを回収してmRNAを抽出し、アメロゲニン、ホスホホリン、プロテオグリカン、I型コラーゲン、アルカリフォスファターゼの遺伝子発現変化についてRT-PCR法にて検討する。2)同じ条件下でsingle cell coloneyよりタンパク質を抽出し、アメロゲニン、ホスホホリン、プロテオグリカン、I型コラーゲン、アルカリフォスファターゼのタンパク発現変化をウエスタンブロット法にて解析する。3)それぞれのsingle cell coloneyを回収し、発現タンパク質の局在を確認するためにアメロゲニン、ホスホホリン、プロテグリカン、I型コラーゲン、アルカリフォスファターゼの免疫染色を行