hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織工学的手法による椎間板再生法の確立

多血小板血漿(platelet rich plasma : PRP)とゼラチンハイドロゲル粒子(粒子)を用いた椎間板再生法を臨床応用する前段階として、家兎変性椎間板モデルを用いて、椎問板変性抑制効果のメカニズム解析および治療対象となる椎間板の変性度を評価した。PRPと粒子を組み合わせて椎問板内に注入することにより、髄核細胞への明らかな細胞増殖効果を認めなかったが、アポトーシスが抑制され、髄核細胞の細胞外基質産生が元進することにより椎間板内の水分含有量が保持された。対象となる椎間板変性度はPfirrmann分類でGrade Iおよび工であった。本研究の目的では、DDS技術を基盤として、組織再生学的手法と組み合わせることにより椎間板の変性程度に応じた再生方法を確立することを最終目標としている。平成19年度では、椎間板の変性程度に応じた再生方法を確立するための第一段階として、当研究チームで確立した方法に基づき、家兎椎間板変性モデルおよび多血小板血漿(PRP)を作成し、椎間板変性抑制のメカニズムについて解析を行っている。PRPを予め調整した、ゼラチンハイドロゲル粒子に含浸させて変性椎間板内に投与した(PRP-粒子群)。対照群として、phosphate-buffered saline(PBS)含浸粒子を投与する群、および穿刺のみを行う群(Sham群)を作成し、それぞれ処置を行った。投与後、経時的に椎間板組織を摘出し、以下の評価を行った。摘出した椎間板の髄核における細胞外基質(プロテオグリカンコアプロテイン、II型コラーゲン)の遺伝子発現量をreal time PCR法で、椎間板変性度と水分含有量をMRT2強調画像で評価した。この結果から、PRP含浸ゼラチンハイドロゲル粒子の椎間板内投与は、髄核細胞外基質(プロテオグリカンコアプロテイン、II型コラーゲン)の遺伝子発現量を促進し、椎間板変性が抑制され、水分含有量が維持されていた。本研究の結果は、第36回日本脊椎脊髄病学会(平成19年4月27日、金沢)、第28回日本炎症再生医学研究会(平成19年8月3日、東京)、第22回日本整形外科学会基礎学術集会(平成19年10月26日、浜松)、WORLD FORUM FOR SPINE RESEARCH(January 25, 2007, Kyoto)にて学術発表を行い、椎間板変性に対する新しい治療法として注目を集めた。本研究の目的はdrug delivery system技術を基盤とし、組織再生学的手法と組み合わせることで椎間板の変性程度に応じた再生方法を確立することを最終目標としている。平成20年度では多血小板血漿(PRP)とゼラチンハイドロゲル粒子(粒子)による椎間板変性抑制のメカニズムの解析や適応となる変性椎間板のMR画像の評価を行った。日本白色家兎の髄核を部分吸引し、2週間飼育することにより家兎変性椎間板モデルを作製した。PRP含浸粒子を変性椎間板内に注入したPRP含浸粒子群、phosphate-buffered saline(PBS)含浸粒子を注入したPBS含浸粒子群、PRP単独注入群、および穿刺のみを行うSham群を作製した。注入後、経時的に椎間板組織を摘出し、以下の評価を行った。PRP含浸粒子の髄核細胞に対する増殖効果を評価するためProliferatingcell nuclear antigen(PCNA)免疫染色を、PRP含浸粒子の髄核細胞へのアポトーシス抑制効果を評価する目的でTUNEL染色を実施した。適応となる注入時の変性椎間板はPfirrmann分類でGrade IおよびGrade IIであった。全群で髄核および内層線維輪にPCNA陽性細胞を認めなかった。全群で髄核にTUNEL陽性細胞を認め、全髄核細胞におけるTUNEL陽性細胞の比率は、PRP含浸粒子群は他の群と比べ有意に低値であった。以上から、本法による椎間板再生効果を望める変性椎間板のMR画像のGradeはIおよびIIであり、PRP含浸粒子による髄核細胞への明らかな細胞増殖効果を認めなかったが、アポトーシスを抑制する可能性があると考えた。本結果は、第37回日本脊椎脊髄病学会、第29回日本炎症再生医学研究会、第24回日本整形外科学会基礎学術集会、55th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Societyで学術発表を行い、椎間板変性に対する新しい治療法として注目を集めた。以上の結果をまとめ、Tissue Engineeringに論文を投稿中である。
エフェ・ピグミーにおける夢の解釈と世界観

エフェ・ピグミーの夢とその解釈についてこれまでに得られた資料および、文献を検討して、現在までに以下の知見を得ることができた。1.夢に見られるさまざまな事象について、その象徴的な解釈の体系が存在する。それらは主に人の死の予兆とされており、エフェ・ピグミーの深層心理において人の死がしめる意義の大きさを示唆している。2.上記以外に、狩猟の結果の予兆とされる夢が多く、現実に狩猟などをおこなう際の意志決定の判断材料とされている。これはエフェ・ピグミーにおける夢と現実の密接な関係を示している。3.夢には亡くなった故人が登場することが多く、これがエフェ・ピグミーの死生観を裏付ける結果となっている。エフェ・ピグミーは死後もなお、熱帯雨林の奥深く生前と同じ生活様式で暮らし続けるのであるとの考えを持っているのである。つまり、彼らが先祖の生活を今なお墨守する根拠を、夢が与えているのである。4.また夢に現れる故人は、エフェ・ピグミーの文化的な中核である歌を教えてくれるほか、狩猟のための毒矢の製法など、現実の生活を送るためのさまざまな智恵を与えてくれるとされる。3.で述べたこととあわせると、彼らの夢は現実生活の送り方と、さらにその改良の方策までをも指示するのである。5.以上のように、エフェ・ピグミーにおいて夢は、世界観的、宗教的な意義を持つとともに、生者の生活の多くの側面に決定的な影響を与えており、夢は、エフェ・ピグミーの心性を理解するための重要な鍵であることがわかる。これらの知見のいくつかは、世界の狩猟採集民研究においても従来指摘されなかった点であり、その世界観の研究に寄与するであろう。現在上記のテーマについて、論文を執筆中であり、近いうちに発表する予定である。
第一原理計算および陽電子消滅法を利用した金属間化合物における空孔形成サイトの決定

金属間化合物における原子空孔の形成挙動は,純金属とは異なり複数の空孔形成サイトが存在するため,純金属に比べると非常に複雑である.本研究の目的は,第一原理計算および陽電子消滅法を利用し,金属間化合物における空孔形成サイトの決定を行うことである.本年度の研究実績の概要は以下の通りである.1.CoAlおよびCoTiの各種空孔の陽電子寿命計算を行い実験結果との比較により導入される空孔サイトの決定を行った.その結果,CoAlについてはCo空孔とAl空孔がともに存在しその割合が組成により変化することを実験と計算により確認した.CoTiでは単空孔の理論計算値では説明できない測定値が得られており,単空孔以外の複空孔やTriple Defectが陽電子をトラップしている可能性があることが分かった.2.CoAlおよびCoTiに関してサイズの異なるスーパーセルの計算を行うことにより,形成エネルギーの組成依存性を調べた.その結果,CoTi中のCo不正原子などでは化学量論組成付近で形成エネルギーが低くなる欠陥種があることが明らかになった.得られた電子状態を解析した結果,CoTiではTiからCoへの電子の移動がCoAlに比べて大きいこと,不正原子周辺のCo-Co結合がCo-Ti結合よりも強いことなどに起因していることが分かった.本結果は熱活性化過程で導入される空孔の形態が化学量論組成付近で変化している事を示唆している.3.代表的な水素吸蔵合金であるLaNi_5の各種サイトの単空孔,複空孔および空孔クラスターの陽電子寿命計算を行い,陽電子寿命測定の実験値と比較することにより水素吸蔵過程で導入される空孔の同定を行った.その結果,水素化過程では主にNiの23重空孔が形成されており,脱水素化後の回復焼鈍ではLaサイトも含んだ空孔集合体になることが明らかとなった.金属間化合物における原子空孔の形成挙動は,純金属とは異なり複数の空孔形成サイトが存在するため,純金属に比べると非常に複雑である.本研究の目的は,第一原理計算および陽電子消滅法を利用し,金属間化合物における空孔形成サイトの決定を行うことである.本年度の研究実績の概要は以下の通りである.1.経験的なデータを用いない第一原理的な電子状態計算に基づいた陽電子寿命計算のプログラム開発を行った.電子状態の計算には第一原理計算の一つであるDV-Xα分子軌道計算を利用することにより,原子空孔周辺の局在的な量子構造を反映した陽電子寿命値の計算が可能である.2.Cu, Alなどの純金属の完全結晶および単空孔に関する陽電子寿命値の計算を行い,既存データとの比較により開発したプログラムの検証を行い,実験で得られる陽電子寿命値を再現することを確認した.また,CoAl, CoTiなどの金属間化合物における完全結晶の陽電子寿命値を再現できることも確認した.3.金属間化合物における格子欠陥の寿命値を解釈する上で重要となる空孔周辺部の格子ひずみの影響について第一原理分子動力学計算により調査した.その結果,CoAlやCoTiでは構成原子の原子半径差では説明することのできない格子緩和が起こることが明らかになった.これは金属間化合物の化学結合がイオン結合性と共有結合性を合わせ持つことに由来するものであると考えられる.次年度は格子緩和に関して系統的な研究を行い,格子緩和を考慮に入れた陽電子寿命値の計算を行うことにより,単空孔の陽電子寿命計算の高精度化を図り,B2型や水素吸蔵合金などの空孔形成サイトの決定を行う予定である.金属間化合物における原子空孔の形成挙動は,純金属とは異なり複数の空孔形成サイトが存在するため,純金属に比べると非常に複雑である.本研究の目的は,第一原理計算および陽電子消滅法を利用し,金属間化合物における空孔形成サイトの決定を行うことである.本年度の研究実績の概要は以下の通りである.1.CoAlおよびCoTiの各種空孔の陽電子寿命計算を行い実験結果との比較により導入される空孔サイトの決定を行った.その結果,CoAlについてはCo空孔とAl空孔がともに存在しその割合が組成により変化することを実験と計算により確認した.CoTiでは単空孔の理論計算値では説明できない測定値が得られており,単空孔以外の複空孔やTriple Defectが陽電子をトラップしている可能性があることが分かった.2.CoAlおよびCoTiに関してサイズの異なるスーパーセルの計算を行うことにより,形成エネルギーの組成依存性を調べた.その結果,CoTi中のCo不正原子などでは化学量論組成付近で形成エネルギーが低くなる欠陥種があることが明らかになった.得られた電子状態を解析した結果,CoTiではTiからCoへの電子の移動がCoAlに比べて大きいこと,不正原子周辺のCo-Co結合がCo-Ti結合よりも強いことなどに起因していることが分かった.本結果は熱活性化過程で導入される空孔の形態が化学量論組成付近で変化している事を示唆している.3.代表的な水素吸蔵合金であるLaNi_5の各種サイトの単空孔,複空孔および空孔クラスターの陽電子寿命計算を行い,陽電子寿命測定の実験値と比較することにより水素吸蔵過程で導入される空孔の同定を行った.その結果,水素化過程では主にNiの23重空孔が形成されており,脱水素化後の回復焼鈍ではLaサイトも含んだ空孔集合体になることが明らかとなった.
機能性材料ゼオライトの自在設計・合成法の確立

ゼオライトを出発原料に用いたゼオライト合成、ゼオライト転換により、FAU、*BEAおよびLEV型ゼオライトから*BEA、CHA、LEV、RUTおよびMFI等の様々なゼオライト合成に成功した。アモルファスゲルを原料に用いる通常のゼオライト合成と比べ、ゼオライトを出発原料に用いた場合には結晶化速度が増大した。この結晶化速度の増大は、出発ゼオライトの分解により生成した局所的秩序構造を有するアルミノシリケート種である構造ユニットが他のゼオライトへ再構築されていることを強く示唆している。出発ゼオライトと最終生成物であるゼオライト間の構造類似性がゼオライト転換を決める極めて重要な因子である。本年度はまず有機構造規定剤の種類や合成温度、アルカリ濃度等を変えてゼオライト転換を行い、その転換過程を詳細に解析し、出発ゼオライトの分解挙動と生成するナノパーツの構造の関係を検討した。合成時間(水熱処理時間)を様々に変化させて得られた生成物(固体部分)中に存在するアルミノシリケート種の化学構造を様々な測定法を用いてキャラクタリゼーションすることにより、出発ゼオライトの分解挙動とともにゼオライト転換過程を明らかにした。具体的には、ゼオライト転換過程の結晶構造の変化をXRD測定により、構成元素であるSiやA1原子の配位状態を固体NMR測定により、siやAl原子の結合状態の変化をFT-IRを用いて調べた。また、ゼオライトの転換過程においては、原料であるゼオライトはまずアルカリ源でもある有機構造規定剤によって分解され、その一部は液相に溶解する。その後目的のゼオライトへ結晶化する。そのため、水熱処理後の溶液中には比較的質量の小さなナノパーツが存在すると考えられる。そこでゼオライト転換過程において、目的のゼオライトが生成する前の段階(アモルファス状態)で水熱処理を終え、遠心分離によって液相と固相とに分離し、溶液中のナノパーツの構造解析を本年度設置したエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)で行った。遠心分離処理において、毎分数千回転(約5000rpm)の回転では生成物中の微粒子が完全に分離されず、さらに、回転により発生する熱で生成物中の組成が変化し、測定に一部支障をきたした。そのため、遠心分離処理は毎分数万回転(約20000rpm)の冷却機能のある超遠心分離機で行い、予備的な検討を開始した。本年度は、ゼオライト転換過程の解明を目指し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)測定による転換過程に存在するナノパーツの質量分析を行うとともに、FAUおよび*BEA型ゼオライト転換とアモルファス原料を用いた通常のゼオライト合成を比較・検討した。その結果、出発ゼオライトと目的のゼオライトの構造に類似性があるほど、効率的に目的のゼオライトが得られることを見出した。すなわち、ゼオライト転換過程に生成するナノパーツの構造は出発ゼオライト、有機構造規定剤(OSDA)および水熱合成条件に強く依存し、出発ゼオライトの構造ユニットを保持したまま分解することができれば構造類似性の高いゼオライトへの転換が可能である。この結果を踏まえ、構造類似性を利用した種結晶およびOSDAフリーの*BEA-MFIおよびLEV-CHAゼオライト転換にも成功した。そこでゼオライト転換過程において、目的のゼオライトが生成する前の段階(アモルファス状態)で水熱処理を終え、遠心分離によって液相と固相とに分離し、溶液中のナノパーツの構造解析を前年度に引き続きESI-MSで行った。以上の結果は、ゼオライト転換過程に生成するナノパーツ構造の解明が進めば、ゼオライト転換法もゼオライト合成における重要な合成方法の一つになることを示唆している。前年度までに、既存のゼオライトを出発原料に用いたゼオライト合成、ゼオライト転換によりFAU,*BEAおよびLEV型ゼオライトから*BEA,CHA,LEV,RUTおよびMFI型等の様々なゼオライトの合成に成功するとともに、本手法ではアモルファス原料を用いる通常のゼオライト合成に比べ、結晶化速度が速いことを明らかにした。ところで、ゼオライトの水熱合成には無機および有機カチオンが構造規定剤として用いられている。有機カチオンではアンモニウムカチオンが一般的であるが、近年ホスホニウムカチオンを用いたゼオライト合成も報告されてきている。そこで本年度は、種々の分子構造を有するホスホニウムカチオンを有機構造規定剤に用いてFAUゼオライト転換について検討した。

その結果、AEI, CHA, LEV, MEI型などの様々なリン含有ゼオライトが得られた。中でもリン含有AEI型ゼオライトの耐熱性が著しく向上することを見出した。また、Cu担持触媒を調製し、アンモニアによる窒素酸化物の選択還元用触媒の活性評価も行った。ディーゼルエンジンからの排ガスを模倣した10%水蒸気雰囲気下での耐水熱性の評価も行った。900°Cで4時間処理後においてもその触媒活性の低下はなく、高い水熱安定性を有していることを見出した。固体NMR測定によるゼオライト中のリンの化学状態の観察から、この高い水熱安定性は、骨格構造中の四配位アルミニウムにホスホニウムカチオンからのリンが結合していることに起因していることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。触媒化学26年度が最終年度であるため、記入しない。出発ゼオライトの分解過程が、有機構造規定剤の種類や合成温度、アルカリ濃度等に大きく依存することを明らかにした。また、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によるゼオライト転換過程での構造ユニット(ナノパーツ)の測定条件に関する知見が得られた。FAUおよび*BEA型ゼオライト転換とアモルファス原料を用いた通常のゼオライト合成を比較することにより、ゼオライト転換過程に生成するナノパーツの構造は出発ゼオライト、有機構造規定剤および水熱合成条件に強く依存し、出発ゼオライトの構造ユニットを保持したまま分解することができれば構造類似性の高いゼオライトへの転換が可能であることを明らかにした。出発ゼオライトの分解によって生成した構造ユニット(ナノパーツ)の構造解析を行うとともに、それらナノパーツの自由な組み合わせによる機能性材料ゼオライトの自在設計・合成法(レゴ合成法)の確立を目指す。出発ゼオライトの分解によって生成した構造ユニット(ナノパーツ)の構造解析を行う。また、リンを含む有機構造規定剤を用いたゼオライト転換の可能性についても検討する。最終的には、ナノパーツの自由な組み合わせによる機能性材料ゼオライトの自在設計・合成法(レゴ合成法)の確立を目指す。出発ゼオライトの転換過程を引き続き解析する。また、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-によるナノパーツの解析を進める。出発ゼオライトの分解により生成すると考えている局所的秩序構造を有するアルミノシリケート種(構造ユニットナノパーツ)の解析を質量分析法により検討を進めたが、分析に最適な試料調製ができていないため、その化学構造について十分な検討が行えなかった。質量分析法以外の手法により構造ユニットナノパーツの解析を行う。
出芽・分裂を起こす人工細胞創成のためのｄｅ　ｎｏｖｏデザイン

本研究では、細胞の分裂現象の重要性に着目し、生体系とは異なる原理を用いて出芽と分裂を自在に制御できる人工細胞のde novoデザインについて研究を行った。その結果、蛍光性の親水性有機分子や非二分子膜構造を形成できる人工脂質を化学シグナルに用いると、脂質二分子膜ベシクルの分裂を誘起できることを見出した。また、両親媒性分子を界面に配置したマイクロ液滴からなる人工細胞は、加水分解反応により両親媒性分子へ変換される脂質分子を共存させることで、等分裂あるいは不等分裂を選択的に誘導できることを明らかにした。本研究では、細胞の分裂現象の重要性に着目し、生体系とは異なる原理をもちいて、出芽と分裂を自在に制御できる人工細胞のde novoデザインについて研究を行っている。平成24年度は、以下の成果が得られた。1.モデル細胞膜系で出芽・分裂を起こすための物理化学的因子の探索:前年度にモデル細胞系で観測された出芽・分裂挙動に関して、その機構を物理化学的視点から詳細に検討した。その結果、膜分裂は、シグナル分子のモデル細胞膜への結合、それに誘起される膜の相分離、さらにそれに起因する膜の出芽という3段階のプロセスから構成されていることを明らかにした。第一段階のシグナル結合過程に影響を与える温度、pH、イオン強度などの物理化学的因子については、分光学的測定から定量的に評価を行った。また、第二段階の相分離過程については、示差走査熱量分析結果を定量化することで得られる相転移パラメータと、蛍光顕微鏡観察結果との相関を明らかにした。2.出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザイン:上記の結果と、分子モデル計算による検討から、膜を形成する脂質の臨界充填パラメータを制御するための分子間相互作用を精密に考慮した分子設計を行うことで、人工細胞膜に出芽・分裂を起こさせることができるという設計指針を提示した。3.人工メンブレントラフィックシステムへの展開:合成ペプチド脂質あるいはセラソーム形成脂質から構成されるモデル細胞膜を用いて、生細胞への遺伝子デリバリーが可能な系を見出した。この人工メンブレントラフィックシステムにおいて、モデル細胞膜と生細胞の生体膜との相互作用に出芽・分裂過程がどのように関わっているかについて評価を行った。本研究では、細胞の分裂現象の重要性に着目し、生体系とは異なる原理を用いて、出芽と分裂を自在に制御できる人工細胞のde novoデザインについて研究を行った。最終年度にあたる平成25年度は、以下の成果を得た。1.化学シグナルが誘起する人工細胞膜の出芽・分裂:蛍光性の有機低分子を化学シグナルに用いることで、人工細胞膜の出芽と分裂が誘導されることを前年度までに明らかにした。今年度は、この動的挙動を支配する物理化学的因子を詳細かつ定量的に解析し、温度やイオン強度によって出芽・分裂現象を制御できることを示した。また、タンパク質であるシトクロムcオリゴマーを化学シグナルに用いると、人工細胞膜の動的形態変化を制御できることを新たに見出した。さらに、細胞融合過程での関与の重要性が指摘されている非二分子膜構造を形成できる人工脂質を化学シグナルとして組み込んだ人工細胞膜では、温度制御により膜の相状態を変化させて、出芽・分裂現象を選択的に誘導できることも明らかにした。2.人工細胞の等分裂・不等分裂の制御:モデル人工細胞として、両親媒性分子を界面に配置したw/o型のマイクロ液滴を作製した。これに、加水分解反応により両親媒性分子へ変換される脂質分子を共存させることで、モデル人工細胞が分裂することを見出した。この分裂は、液滴の体積に対する表面積の比率が増加することで引き起こされるが、液滴細胞の外部にある溶媒の温度や粘性を適度に調節することで、等分裂と不等分裂を選択的に誘導することに初めて成功した。3.出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザイン:以上のように、本研究では人工細胞の出芽と分裂を自在に制御できる様々な超分子システムを構築した。また、これらの動的挙動を制御する物理化学的因子を明らかにし、分子認識にもとづく新たな人工細胞分裂システム創出のための設計指針を提示した。本研究では、細胞の分裂現象の重要性に着目し、生体系とは異なる原理をもちいて、出芽と分裂を自在に制御できる人工細胞のde novoデザインについて研究を行う。具体的には、まず、(1)モデル細胞膜系において、出芽・分裂を起こすための物理化学的因子を探索し、それにもとづいて、(2)出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザインの指針を提示するとともに、その検証を行う。さらに、(3)モデル細胞膜の出芽・分裂にともなう機能を活用して、高次の物質輸送や情報伝達が可能な人工メンブレントラフィックシステムの開発を目指した。平成23年度は、(1)及び(2)について検討を加え、以下の成果が得られた。1.脂質膜による化学シグナルの分子認識に関する検討を行うために、イオン性頭部をもつ人工脂質を設計し、その合成を行った。

人工脂質には、その後の膜ドメイン形成に影響を与えると考えられる水素結合による脂質間認識部位を導入した。この人工脂質とリン脂質の二成分混合系で形成されるジャイアントベシクルについて、種々の蛍光性シグナル分子との相互作用を評価したところ、シグナル認識には、静電的多点相互作用が有効であることがわかった。2.化学シグナルの認識によって誘起される膜ドメイン形成挙動を評価したところ、本研究で用いた混合脂質系では、シグナル認識に引き続き、膜ドメイン形成が進行することを明らかにした。3.この系では、膜ドメイン形成に引き続き、膜の出芽・分裂挙動も観測されたが、このような膜の動的挙動は温度、pH、イオン強度などの物理化学的因子によって支配されることがわかった。4.以上の検討結果をもとに、出芽を伴う膜分裂を進行させるための化学シグナルや膜形成脂質の構造因子、ならびに外部制御因子の最適な組み合わせや許容範囲が明らかになり、出芽・分裂を起こす人工細胞膜の設計指針を提示することができた。平成24年度に計画していた(1)モデル細胞膜系で出芽・分裂を起こすための物理化学的因子の探索と、それにもとづく(2)出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザインの指針提示が、いずれも達成された。また、(3)人工メンブレントラフィックシステムへの展開についても、モデル細胞膜による生細胞への遺伝子導入が可能になったという知見を得た。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。平成23年度に計画していた(1)モデル細胞膜系において、出芽・分裂を起こすための物理化学的因子の探索と、それにもとづく(2)出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザインの指針の提示が、いずれも達成されたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。平成25年度は、基本的には当初計画に従い、以下の3つの観点から研究を推進する。1.モデル細胞膜系で出芽・分裂を起こすための物理化学的因子の探索については、シグナル分子の膜への結合、それに誘起される膜相分離と膜の出芽という3段階のプロセスの個々について、影響を与える各物理化学的因子のさらなる定量化を図る。2.出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザインについては、前年度に提示した設計指針にもとづいて、シグナル分子や脂質分子の構造を変化させて膜の動的挙動を評価し、その検証を行う。3.人工メンブレントラフィックシステムへの展開については、前年度に見出した遺伝子デリバリー系の機構解明を目指すとともに、新たな人工メンブレントラフィックシステム系の開拓を行う。出芽・分裂を起こす人工細胞膜のde novoデザインの指針をより明確にするために、前年度の研究をさらに積極的に推し進めるが、それに加えて、膜の出芽・分裂現象を組み込んだ人工メンブレントラフィックシステムの開発へと展開する。すなわち、生体系には、細胞膜表面からエンドソームへの物質輸送や、小胞体からゴルジ体へのタンパク質の輸送等、重要な生体分子を膜小胞に包んで輸送するメンブレントラフィックシステムが多数存在する。
多価不飽和脂肪酸貯蔵量の減少が及す生体への影響　ー新たな視点からのアプローチー

本課題では、生理活性脂質の前駆物質であるPUFAの生体への影響に着目し、これまでのPUFAを外因的に摂取させることにより生じる生体への影響に加えて、体内のPUFAの貯蔵量を減少させることで生じる内因的な影響を解析することで、新たな視点から“生命現象におけるPUFAの役割"の全体像を把握できると考えた。本研究課題では、PUFAの貯蔵の場であるグリセロリン脂質中のPUFA含量が低下するACSL4欠損マウスを用い、各種炎症性疾患、がん及び生殖等に対する影響について解析し、PUFAの生理的・病理的な役割の全容を明らかとすることを目指す。
パラダイム転換期における訪問看護師の看護実践に対する自己効力尺度の開発

本研究の目的は,訪問看護師の看護実践上の課題である医療モデルから生活モデルへのシフトに着目した自己効力尺度を開発することであった.平成16・17年度の研究成果に基づいて109の質問項目を選定し,訪問看護師57名を対象とした予備調査を実施した.予備調査結果に基づく項目分析により「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」原案87項目が選定された.次に本調査において,訪問看護師263名を対象とし,信頼性を,Cronbach' αの信頼性係数と折半法で求め,妥当性は,構成概念妥当性,並存的妥当性,内容妥当性,で求めた.すべての分析にはSPSS13.OJ for Windowsを用いた.なお,今回実施した調査は,聖隷クリストファー大学の倫理委員会の承認を得て実施している.(以下に詳細を述べる)1)信頼性:2)妥当性:(1)最尤法プロマックス回転による因子分析の結果,「利用者・家族とのパートナーシップ形成能力」,「在宅ケアチームアプローチ能力」,「自己の気づきを高める能力」,「セルフケアにつながる成果設定能力」,「シームレスケア提供能力」の5因子から構成する「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」(43項目)が示された.(2)並存的妥当性は,「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」と特性的自己効力感尺度との相関(r=0.59)によって確認した.(3)内容妥当性は,共同研究者4名と心理学専門家1名によって確認した.今後の課題には,病院から在宅へ移行した訪問看護師を対象とした継続教育プログラムに活用できる簡易尺度として,有用性を高めるために,尺度の信頼性と妥当性をさらに検討することが挙げられる.研究目的:訪問看護師の看護実践上の課題である医療モデルから生活モデルへのシフトに着目した自己効力尺度を作成し、その妥当性と信頼性を検討する。平成16年度研究目標:病院から在宅へと働く場を移した訪問看護師が認知する看護実践上の課題について明らかにする。研究方法:1.データ収集1)研究協力者研究機関関連施設である訪問看護ステーション所属訪問看護師19名である。平均年齢37.7歳,訪問看護師としての経験は6ヶ月9年,平均4.5年,病院での看護師としての経験は3年22年9ヶ月,平均10.5年であり、すべて女性であった。病院における経験としては、内科もしくは外科病棟での経験者16名,ICU病棟での経験者2名,NICU病棟での経験者1名であった。2)調査方法2004年9月11月にかけて、訪問看護の経験年数3年未満と3年以上のグループにわけ、フォーカスグループインタビューを3グループに対し各1回約90分実施した。3)分析方法テープは逐語録とし、その逐語録から共同研究者4名が訪問看護実践上の課題に関する部分を抜き出し、それを解釈し概念化していった。結果分析について内容妥当性を高めるため、質的研究・指導に携さわっている専門家にスーパーバイズを受けた。4)倫理的配慮研究協力者に文書を用いて研究の趣旨を伝え、研究への同意を得た。尚、本調査は聖隷クリストファー大学倫理委員会の承認を得て実施に至った。結果および考察:経験年数3年未満の者は、【在宅療養者とパートナー関係をむすぶ】こと、医療者として【ひとりで訪問する】ことを主な課題として捉えていた。経験年数3年以上の者は、生活者の視点をもった【医療から生活へ看護の軸を移す】こと、【在宅ケアチームの一員となる】ことを主な課題として捉えていた。今回の調査から、訪問看護経験年数によって看護実践上の課題に違いがあることが明らかになった。【研究目的】訪問看護師の看護実践上の課題である医療モデルから生活モデルへのシフトに着目した自己効力尺度を作成し、その妥当性と信頼性を検討する。【平成17年度目標】訪問看護師が認知する訪問看護実践の構造についてデルファイ法を参考としたアンケート調査によって考察を補完する。【調査方法】1.調査対象者:研究機関関連施設である訪問看護ステーション所属訪問看護師および訪問看護経験者である。2.データ収集方法1)第1次調査:平成16年度フォーカスグループインタビュー分析結果から得られた15領域49項目の在宅療養者とその家族のQOLにつながる訪問看護実践に基づいて質問紙を作成した。質問紙はこの全項目に関して、全く同意できる(4点)全く同意できない(0点)の5段階リッカートスケールとした。調査の合意を得られた27名に質問紙を配布、23名より回答を得て(回収率85.0%)、結果を集計した。2)第2次調査:第1次調査の結果として各項目の同意の割合を記載した調査用紙を作成した。調査対象者23名がその結果を参照できるようにし、調査質問紙の回答を求め、対象者全員より回答を得た。3.データ分析方法49項目について同意の割合を算出し、統計ソフトにはSPSS(Ver.13)を用いた。コンセンサスの程度は同意率75%を目安とした。4.倫理的配慮調査協力者に文書を用いて研究の趣旨を伝え、研究への合意を得た。【結果および考察】第2次調査対象者23名の背景としては、平均年齢39.0歳であり、訪問看護経験年数は4ヶ月10年,平均経験年数5.3年であり、すべて女性であった。

訪問看護経験年数について3年以上の者は15名,3年未満の者は8名であった。在宅療養者とその家族のQOLにつながる訪問看護実践に関する49項目のうち同意率が75%以下であった8項目について内容の再検討が示唆された。また、訪問看護経験年数の違い(3年以上,3年未満)による同意率の差は認められなかった。本研究の目的は,訪問看護師の看護実践上の課題である医療モデルから生活モデルへのシフトに着目した自己効力尺度を開発することであった.平成16・17年度の研究成果に基づいて109の質問項目を選定し,訪問看護師57名を対象とした予備調査を実施した.予備調査結果に基づく項目分析により「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」原案87項目が選定された.次に本調査において,訪問看護師263名を対象とし,信頼性を,Cronbach' αの信頼性係数と折半法で求め,妥当性は,構成概念妥当性,並存的妥当性,内容妥当性,で求めた.すべての分析にはSPSS13.OJ for Windowsを用いた.なお,今回実施した調査は,聖隷クリストファー大学の倫理委員会の承認を得て実施している.(以下に詳細を述べる)1)信頼性:2)妥当性:(1)最尤法プロマックス回転による因子分析の結果,「利用者・家族とのパートナーシップ形成能力」,「在宅ケアチームアプローチ能力」,「自己の気づきを高める能力」,「セルフケアにつながる成果設定能力」,「シームレスケア提供能力」の5因子から構成する「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」(43項目)が示された.(2)並存的妥当性は,「QOLにつながる訪問看護実践効力尺度」と特性的自己効力感尺度との相関(r=0.59)によって確認した.(3)内容妥当性は,共同研究者4名と心理学専門家1名によって確認した.今後の課題には,病院から在宅へ移行した訪問看護師を対象とした継続教育プログラムに活用できる簡易尺度として,有用性を高めるために,尺度の信頼性と妥当性をさらに検討することが挙げられる.
非侵襲的言語マッピング法の開発：刺激介入から脳情報解読へのパラダイムシフト

非侵襲的言語マッピング法の開発を目指して、研究を推進した。言語優位半球に頭蓋内電極を留置した難治部分てんかん患者のうち研究に同意を得た者を対象に以下を行った。中核言語ネットワークの参照データ作成において、ネットワーク地図のための皮質皮質間誘発電位(CCEP)の波形パターンの分類と解剖学的分布について明らかにした(国内学会発表)。中核言語野の言語課題の障害程度と結合様式については定性的な相関を少数例で予備的にまとめた(国内学会発表)。背側・腹側言語ネットワークに関連する前頭-頭頂葉・側頭葉間の皮質間結合の左右差につきCCEP記録から明らかにした(論文発表)。皮質電気刺激に替わる低侵襲的脳機能マッピング法に、運動関連の皮質脳波の脳律動解析の手法を考案し(論文発表2報)、言語機能マッピングの基盤の手法を確立した。臨床マッピングで用いる高頻度皮質電気刺激の刺激伝播の影響につき、刺激中の遠隔放電を解析し、刺激の大部分は刺激直下の皮質由来であることを示した(国内学会発表)。非刺激介入の言語課題下の誘発皮質脳波律動計測を行った。意味判断課題の皮質脳波の高周波律動から前部側頭葉における視覚性・聴覚性意味処理のハブ機能を明らかにした(国内学会発表)。今後、意味・音韻処理について言語課題脳波律動のデコーディングから各電極の誘発神経活動の重み付けを評価するための課題の追加、症例蓄積を行う。言語ネットワークの動態解析として、呼称課題下の皮質脳波の重回帰解析の重み付け情報を用いたコヒーレンス解析により言語領域間のネットワークの結合動態を予備的データとして明らかにした(国際学会発表)。今後は症例の蓄積と刺激介入のデータと照合し非刺激介入言語ネットワークマッピング法の開発を目指す。これまでの解析データ・手法をもとに、次年度から、非侵襲的な脳磁図にも応用し、新規言語マッピング法の開発と有用性の評価を行う。研究計画の下記項目それぞれにつき成果が挙げている。A.中核言語ネットワークの参照データ作成:基本となる研究として1脳内ネットワークの青写真となるCCEP波形分類、2低侵襲の脳機能マッピング法について学会発表、論文2本発表した。中核言語野の言語課題の障害程度と結合様式については定性的な相関を少数例でまとめ学会発表した。現在、追加症例含めて11例の症例について解析に着手しており、言語ネットワーク内のハブとノードの同定を行う。B.デコーディングによるネットワーク内の重み付け評価:非刺激介入の言語関連課題として意味判断課題の皮質脳波の高周波律動から前部側頭葉における視覚性・聴覚性意味処理の機能について国内学会発表を行った。現在、同課題の皮質脳波記録の症例蓄積と他の言語課題である類義語判断課題の皮質脳波記録症例の蓄積を行っている。今後、言語課題脳波律動のデコーディングから各電極の誘発神経活動の重み付けを評価するために、引き続き症例蓄積とあわせて脳波データ解析を行っていく。C.数理モデルによるネットワーク動態解析:言語ネットワークの動態解析として、呼称課題下の皮質脳波の重回帰解析の重み付け情報を用いたコヒーレンス解析により言語領域間のネットワークの結合動態を1例において予備的データとして明らかにし国際学会発表した。現在、追加症例11例の解析に着手、症例蓄積を引き続き行っていく。D.侵襲的頭蓋内研究から非侵襲脳磁図研究への橋渡し:言語関連課題について継続して作成、選定を行っており、準備が整えば課題下の脳磁図計測に着手する。以上、研究計画のACそれぞれで、研究実績に具体的に示したように、研究計画にそって、症例蓄積およびデータ解析、学会発表、論文公開を順次行っている。DについてはACの結果を踏まえて着手していく予定である。下記ADの項目に沿って研究を進める。A.中核言語ネットワークの参照データ作成:高頻度・低頻度電気刺激から、言語機能の皮質機能地図と皮質間結合地図を探索する。言語課題の障害程度(障害される課題数)と結合様式(言語関連領域との結合強度および数)からネットワーク内のハブとノードを同定するため症例蓄積を行う。B.デコーディングによるネットワーク内の重み付け評価:物品呼称、復唱、意味判断課題を課し、誘発皮質脳律動を計測する。各物品・単語の意味・音韻属性を用いた機械学習や相関(重回帰)解析から言語表出(音韻処理)と理解(意味表象)の脳内活動のデコーディングを行う。全電極の皮質脳律動パターンから、各電極の誘発神経活動の重み付けを判定する。C.数理モデルによるネットワーク動態解析:課題下の重回帰解析の重み付け情報を用いたコヒーレンス解析や多次元因果性解析といったネットワーク解析から、言語課題遂行中の言語領域間のネットワークの結合動態を明らかにする。症例を追加して引き続き解析を行う。刺激介入の中核データ(A)と照合し、デコーディング・ネットワーク解析のパラメーター調整と至適化(B,C)から、非介入(非侵襲)言語ネットワークマッピング法の開発を目指す。D.侵襲的頭蓋内研究から非侵襲脳磁図研究への橋渡し:ACで最適化された言語関連課題と解析手法を非侵襲検査である脳磁図に応用し、脳外科手術前後の言語神経心理データとの照合から、新規言語マッピング法の有用性を評価し、言語機能の生理的バイオマーカーの探索を目指す。言語関連課題が選定された時点で計測に着手する。

言語優位半球に頭蓋内電極を留置した難治部分てんかん患者のうち研究に同意を得た者を対象に以下を行った。中核言語ネットワークの参照データ作成において、ネットワーク地図のための皮質皮質間誘発電位(CCEP)の波形パターンの分類と解剖学的分布について明らかにした(国内学会発表)。中核言語野の言語課題の障害程度と結合様式については定性的な相関を少数例で予備的にまとめた(国内学会発表)。背側・腹側言語ネットワークに関連する前頭-頭頂葉・側頭葉間の皮質間結合の左右差につきCCEP記録から明らかにした(論文発表)。皮質電気刺激に替わる低侵襲的脳機能マッピング法に、運動関連の皮質脳波の脳律動解析の手法を考案し(論文発表2報)、言語機能マッピングの基盤の手法を確立した。臨床マッピングで用いる高頻度皮質電気刺激の刺激伝播の影響につき、刺激中の遠隔放電を解析し、刺激の大部分は刺激直下の皮質由来であることを示した(国内学会発表)。非刺激介入の言語課題下の誘発皮質脳波律動計測を行った。意味判断課題の皮質脳波の高周波律動から前部側頭葉における視覚性・聴覚性意味処理のハブ機能を明らかにした(国内学会発表)。今後、意味・音韻処理について言語課題脳波律動のデコーディングから各電極の誘発神経活動の重み付けを評価するための課題の追加、症例蓄積を行う。言語ネットワークの動態解析として、呼称課題下の皮質脳波の重回帰解析の重み付け情報を用いたコヒーレンス解析により言語領域間のネットワークの結合動態を予備的データとして明らかにした(国際学会発表)。今後は症例の蓄積と刺激介入のデータと照合し非刺激介入言語ネットワークマッピング法の開発を目指す。これまでの解析データ・手法をもとに、次年度から、非侵襲的な脳磁図にも応用し、新規言語マッピング法の開発と有用性の評価を行う。研究計画の下記項目それぞれにつき成果が挙げている。A.中核言語ネットワークの参照データ作成:基本となる研究として1脳内ネットワークの青写真となるCCEP波形分類、2低侵襲の脳機能マッピング法について学会発表、論文2本発表した。中核言語野の言語課題の障害程度と結合様式については定性的な相関を少数例でまとめ学会発表した。現在、追加症例含めて11例の症例について解析に着手しており、言語ネットワーク内のハブとノードの同定を行う。B.デコーディングによるネットワーク内の重み付け評価:非刺激介入の言語関連課題として意味判断課題の皮質脳波の高周波律動から前部側頭葉における視覚性・聴覚性意味処理の機能について国内学会発表を行った。現在、同課題の皮質脳波記録の症例蓄積と他の言語課題である類義語判断課題の皮質脳波記録症例の蓄積を行っている。今後、言語課題脳波律動のデコーディングから各電極の誘発神経活動の重み付けを評価するために、引き続き症例蓄積とあわせて脳波データ解析を行っていく。C.数理モデルによるネットワーク動態解析:言語ネットワークの動態解析として、呼称課題下の皮質脳波の重回帰解析の重み付け情報を用いたコヒーレンス解析により言語領域間のネットワークの結合動態を1例において予備的データとして明らかにし国際学会発表した。
窒化珪素基新規固溶体の作製と評価

共有結合性が強い窒化物,炭化物,ホウ化物等の非酸化物セラミックスは,その強固な化学結合に由来して,高温でも高強度を示すことが知られており,21世紀を支える高温・構造材料として期待されている.しかしこの強固な化学結合は,材料の難焼結性や難加工性と密接に関係し,これらの材料の工学的有用性を低下させているのが現状である.本研究では非酸化物セラミックス中のイオンの一部を,他のイオンで置換(固溶)することにより,原子間結合の共有性/イオン性を人工的に制御して,非酸化物セラミックスの諸特性(とくに力学物性)を改良することを目的とした.まず,共有結合性の強い窒化ケイ素にアルミナを固溶させて調製されているサイアロンセラミックス中の粒界ガラス相を,固溶反応を利用して消失させた後,高温域までの弾性率と内部摩擦を測定した.その結果,粒界ガラス相を消失させる操作は,この種の材料の高温・構造特性を飛躍的に向上させ得ることを明らかにできた.次に,同じく共有結合性の強い炭化ケイ素の単結晶を,窒化アルミニウム粉末中に埋め,これを高温・高圧処理することによって,SiとAlの相互固溶が生じること,および,この固溶反応は炭化ケイ素の相変態の温度変化に影響を与えることを明らかにした.この研究では,炭化ケイ素単結晶の表面に発生するエッチピットの形態と密度を統計的に調査し,高温・高応力条件下における炭化ケイ素セラミックスの耐久性の向上に関する基礎科学的なデータを蓄積できた.共有結合性が強い窒化物,炭化物,ホウ化物等の非酸化物セラミックスは,その強固な化学結合に由来して,高温でも高強度を示すことが知られており,21世紀を支える高温・構造材料として期待されている.しかしこの強固な化学結合は,材料の難焼結性や難加工性と密接に関係し,これらの材料の工学的有用性を低下させているのが現状である.本研究では非酸化物セラミックス中のイオンの一部を,他のイオンで置換(固溶)することにより,原子間結合の共有性/イオン性を人工的に制御して,非酸化物セラミックスの諸特性(とくに力学物性)を改良することを目的とした.まず,共有結合性の強い窒化ケイ素にアルミナを固溶させて調製されているサイアロンセラミックス中の粒界ガラス相を,固溶反応を利用して消失させた後,高温域までの弾性率と内部摩擦を測定した.その結果,粒界ガラス相を消失させる操作は,この種の材料の高温・構造特性を飛躍的に向上させ得ることを明らかにできた.次に,同じく共有結合性の強い炭化ケイ素の単結晶を,窒化アルミニウム粉末中に埋め,これを高温・高圧処理することによって,SiとAlの相互固溶が生じること,および,この固溶反応は炭化ケイ素の相変態の温度変化に影響を与えることを明らかにした.この研究では,炭化ケイ素単結晶の表面に発生するエッチピットの形態と密度を統計的に調査し,高温・高応力条件下における炭化ケイ素セラミックスの耐久性の向上に関する基礎科学的なデータを蓄積できた.
道管形成過程での液胞崩壊の研究

また我々は、これまでにヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素への分化転換系において、道管形成の分子機構について詳細な解析を行い、液胞が細胞の自己分解過程で崩壊することによりプログラム細胞死の中心的役割を担うことを明らかにしてきた。特に、細胞死特異的発現を示すS1ヌクレアーゼ遺伝子(ZEN1)の産物が液胞に特異的に蓄積されること、液胞崩壊後の核分解に直接関与していることなどを示してきた。本年度は、これ以外にCa/Mg依存ヌクレアーゼが細胞死の時に一過的に発現することを明らかにした。また、ZEN1以外の細胞死特異的システインプロテアーゼZCP4,細胞死特異的ヌクレアーゼZeRNase1が、分化中の管状要素でのみ、小胞体、ゴルジ体を経由して液胞に蓄積することを明らかにした。本年度は、ヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素への分化転換系を用いて、液胞の崩壊機構、液胞内への分解酵素のターゲッティング機構、さらには液胞崩壊後の分解酵素の働きを明らかにすることを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.液胞崩壊機構の解析:液胞崩壊前に分化細胞で特異的に、液胞膜の陰イオン輸送活性が低下することが明らかになっている。そこで、陰イオン輸送活性を阻害することにより液胞の崩壊が促進されるかどうかを、プロベネシドを用いて解析した。その結果、プロベネシドは分化途中の液胞の崩壊を促進するのみならず、非分化細胞でもゆっくりではあるが液胞の崩壊を引き起こすことが明らかになり、陰イオン輸送活性が液胞の崩壊に関与する可能性が示唆された。2.液胞内への分解酵素のターゲッティング機構の解析:ヒャクニチソウ管状要素分化の細胞死過程で特異的に現れるS1タイプDNアーゼの解析を行った。まず、DNアーゼcDNAをもとに大腸菌に作らせたタンパク質を抗原として、抗体を作成した。次に、DNアーゼが液胞内に蓄積されるか、また蓄積されるとすれば液胞内で活性をもつかどうかを明らかにするために、DNアーゼのゲノムDNAをグルココルチコイド系につなぎ、アグロバクテリアを用いてタバコBY2細胞に導入した。得られた形質転換培養細胞にDEXを与え、DNアーゼを発現させたところ、この活性は液胞特異的に現れることが明らかになった。また、抗体を用いた解析から、タンパク質自体も液胞に特異的に存在することが明らかになり、このDNアーゼは液胞にターゲットされ、液胞中で活性をもつことが明らかとなった。1.液胞崩壊機構の解析:液胞崩壊機構を探るために、様々な阻害剤を用いた解析を行った。その結果、プロテアソームの阻害剤が特異的に液胞崩壊を遅らすことが明らかになり、液胞崩壊に対するプロテアソームの関与が示唆された。2.液胞内分解酵素の働きの解析:ヒャクニチソウ管状要素分化の細胞死過程で特異的に現れるS1タイプDNアーゼの活性とタンパク質発現のタイムコースを調べた。その結果、活性、タンパク質とも自己分解の直前に出現することが明らかになった。次に、管状要素の液胞崩壊が核分解にエッセンシャルかどうかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた。その結果、液胞崩壊以前には核DNAの分解はほとんど起こらないが、液胞崩壊後10分以内に核内DNAはほぼ完全に分解されることが明らかになり、液胞崩壊が核DNAの速やかな分解を引き起こすことが示された。それに対して、管状要素以外の細胞の液胞が崩壊しても、核DNAの分解は起こらなかった。したがって、管状要素特異的なDNアーゼが液胞内に蓄積し、液胞崩壊後速やかに働くことが明らかになった。さらに、システインプロテアーゼ遺伝子の発現をZCP4プロモーターにβグルクロニダーゼをつないだ遺伝子をシロイヌナズナに導入することで調べた。その結果、この遺伝子は管状要素にのみ特異的に発現することが明らかとなり、他の細胞死には関与していないことが示された。本年度は、ヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素への分化転換系を用いて、プログラム細胞死過程での液胞の崩壊機構、液胞内への分解酵素のターゲッティング機構、さらには液胞崩壊後の分解酵素の働きを明らかにすることを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.液胞崩壊機構の解析:核と細胞質を染色し、連続観察した結果、管状要素成熟過程で液胞が核を押しつぶすように膨張すること、すなわち液胞が膨圧を持っている可能性があること、さらに液胞の物理的崩壊に12分先だって液胞膜の選択的透過性が失われることが明らかになった。これらの結果は、液胞の性質が崩壊に先立って大きく変わっていることを示した。2.液胞への分解酵素のターゲッティング機構とその機能の解析:これまで、液胞崩壊時に分化特異的に作用する加水分解酵素として、ZEN1ヌクレアーゼ、ZCP4システインプロテアーゼ、ZRNase1ヌクレアーゼが知られていたが、マイクロアレイにより新たにある種のリパーゼ遺伝子が管状要素分化に伴って分化特異的に発現することが分かり、リパーゼが液胞崩壊時あるいはその後の細胞内容物の分解に関与していることが示唆された。

分解酵素の細胞内局在をZEN1抗体を用いた免疫電顕法により解析した。その結果、ZEN1酵素はゴルジ体、小胞、液胞中の繊維状構造に局在していることが示された。また、E64dを用いてオートリソゾーム様の構造を誘導して観察したが、そこにはZEN1酵素は含まれず、ZEN1酵素はゴルジ体から通常の輸送系に乗って液胞に運ばれると考えられた。我々は高等植物細胞の形態形成における液胞の寄与について研究を進めている。高等植物細胞の液胞はさまざまな機能を持ち、形態についても多様であることが知られている。近年、一個の細胞内において液胞の機能が分化に伴って変化することや機能の異なる複数の液胞が共存することが分かってきた。一方、細胞の形態形成や細胞分裂のような現象に液胞がどのように関与しているかについてはまだ不明な点も多い。今年度は生細胞における液胞の動態を可視化すべく、脂溶性の蛍光色素であるFM4-64によるパルスラベルを行い、タバコ培養細胞BY-2の細胞周期各期における液胞の動態の観察に成功した。また、GFP-α-チューブリン融合タンパク質を恒常的に発現するタバコ培養細胞の形質転換細胞BY-GT16を用いて、液胞の動態を微小管構造と合わせて検討した。これらの観察の結果、G2期の終わりよりフラグモソーム中にチューブ状の液胞構造が連なったネットワークが微小管の分裂装置を取り巻くように生じること、後期以降ではチューブ状構造はフラグモプラスト近傍にも出現すること、G1期初めに細胞板と娘核の間にある液胞構造のいくつかは核が細胞板から離れて行くにつれて体積を増加して大きな間期の液胞に成長することなどが明らかになった。また、我々はこれまでにヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素への分化転換系を開発し、道管形成の分子機構について詳細な解析を行い、液胞が細胞の自己分解過程で崩壊することによりプログラムされた細胞死の中心的役割を担うことを明らかにしてきた。その過程で、細胞死特異的発現を示すS1ヌクレアーゼ遺伝子(ZEN1)の産物が液胞に特異的に蓄積されることも明らかになった。今年度は、このS1ヌクレアーゼが液胞崩壊後の核分解に直接関与していることを、1)in vitroの単離核分解活性のZEN1抗体による阻害、2)アンチセンスZEN1によるin vivoでの核分解阻害から明らかにした。また我々は、これまでにヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素への分化転換系において、道管形成の分子機構について詳細な解析を行い、液胞が細胞の自己分解過程で崩壊することによりプログラム細胞死の中心的役割を担うことを明らかにしてきた。特に、細胞死特異的発現を示すS1ヌクレアーゼ遺伝子(ZEN1)の産物が液胞に特異的に蓄積されること、液胞崩壊後の核分解に直接関与していることなどを示してきた。本年度は、これ以外にCa/Mg依存ヌクレアーゼが細胞死の時に一過的に発現することを明らかにした。また、ZEN1以外の細胞死特異的システインプロテアーゼZCP4,細胞死特異的ヌクレアーゼZeRNase1が、分化中の管状要素でのみ、小胞体、ゴルジ体を経由して液胞に蓄積することを明らかにした。