hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
資産運用手法と信用リスク計量手法の研究:数理計画法によるアプローチ

産運用研究に関しては、2006年以来取り組んできた、「決定係数最大化ポートフォリオ」構築問題に、動的ファクター選択方法を適用すると、従来の静的ファクター選択方法より遥かに良いパフォーマンスが実現されることを示した。また決定係数の定義の中の「分散」を、「絶対偏差」に置き換えることによって、従来より大型のモデルが解けること、そして事後パフォーマンスが大幅に改善されることを示した。信用リスクの研究に関しては、大型の半正定値計画法に利用した倒産確率推計法を開発し、その有効性を実証した。また超楕円曲面によって企業を分類する手法を開発し、この方法を用いると、企業の財務データのみを用いて、極めて短時間で有力な格付け機関が行った格付けと類似の格付けを行うことができることを示した。本年度のもう1つの大きな収穫は、決定係数最大化ポートフォリオ構築や、企業の格付けに必要となる「ファクター選択問題」に関して、"一定数のファクターの中で、データとの当てはまりが最も良いものを求める問題"を、ほぼ完璧な形で解決したことがあげられる。古くから統計学上の難問と考えられてきたこの問題を、残差絶対偏差差和最小化問題として定式化した上で、0-1整数計画法を用いて解くことによって、最良のファクター集合を短時間で選択出来ることが示された。またその後に開発した、「多段階選択法」を用いることによって、より大規模な問題が解けることを実証した。1.資産運用の研究に関しては、次の2つの研究が得られた。(1)インデックス・プラスアルファ・ポートフォリオ構築問題(インデックスを上廻るパフォーマンスを実現するポートフォリオを求める問題)に対しては、トラッキング・ポートフォリオとインデックス・ウェイトとの相関関数に一定値以上とする制約条件を追加した数理計画問題を解くことにより、安定的にインデックスを上廻るパフォーマンスを実現するポートフォリオを構築することに成功した。(2)トランスファー係数と呼ばれる指標に関する制約を追加した平均・絶対偏差ポートフォリオ最適化モデルを解くことにより、アクティブ運用の際の事後パフォーマンスを改良することに成功した。2.信用リスク計量手法の研究に関しては、わが国の有力な格付け機関による格付けをシミュレートとするテータ・マイニング手法を開発した.具体的には、まず整数計画法を用いて説明力が最も大きくなる財務指標を柚出し、これらの指標が構成するユークリッド空間における6個ないし9個の超楕円面を生成して、企業の信用力を6段階ないし9段階に分類する方法を提案し、格付け機関の格付けを95%以上の精度で再現できることを示した。従来の方法の精度が85%程度であったことに比べると、画期的な改善と呼ぶに相応しい結果である。なおこれらの成果をもとに書かれた3編の論文は、現在専門誌で審査中である。以上われわれは、当初の計画を大きく上廻る成果を出すことに成功した。
薬膳食材の加熱・非加熱調理操作による機能性成分の発現と消長に関する研究

薬膳食材としてタマネギ、ゴーヤの実・わた、ショウガ、ミョウガ、白菜等について、食品機能性成分として血糖上昇抑制活性をα-グルコシダーゼの阻害活性を指標として、加熱・非加熱調理方法の影響について検討を行った。タマネギ、ゴーヤの実、白菜では非加熱調理条件でα-グルコシダーゼの阻害活性が認められたが、加熱により消失した。ゴーヤのわたにおけるこの阻害活性成分は非常に分子量の小さい物質で、熱に安定であることが示唆された。各種食材に関して、今年度ミョウガ、ショウガ、カボチャ、ゴーヤ水抽出試料を中心にラット腸管粘膜より調製した粗酵素(α-グルコシダーゼ)によりその活性阻害について測定した。これら試料では、冷蔵保存(4°C、1ヶ月前後)で活性の低下がみられ、精製が進むうちに失活を認めた。一方、ゴーヤ水抽出試料では冷蔵保存でもかなりの酵素阻害活性が保持されていた。このことを反映して、加熱・非加熱による抽出条件、セファデックスG-25のカラムクロマトの結果より、加熱に伴い生じる阻害活性画分もあり、現在までに得られているの活性・非活性画分と加熱条件の有無について検討を行っている。同じくカボチャ試料のカラムクロマトでは水抽出物より加温抽出で阻害活性画分が増加し、再加熱試料で阻害活性の減少が認められていたが、今回の抽出調製においては阻害活性が十分に認められず、試料差異の影響と考えられた。また、ニンニク試料について検討を行った結果、対象試料の内因性酵素活性の影響を受け、緑化を伴う酵素活性反応が生じる試料と、変色が見られない試料との間で糖質分解酵素阻害活性に差が認められた。現在の条件では、一方の試料のみが特に阻害活性が強いとったことはなく、阻害活性物質の変化に由来するのか、生成物による阻害活性への影響であるかは不明瞭であった。この試料についてもセファデックスG-25のカラムクロマトを実施し各画分について検討中である。これまでの糖質分解酵素活性阻害のスクリーニングでは、試料の購入時期の影響も認められた。前年度に得られたタマネギ、ゴーヤの実、ゴーヤのわたの水抽出画分の糖質分解酵素(α-グルコシダーゼ:ラット腸管粘膜由来)に対する阻害活性物質について、セファデックスG-25、presep-CC18(ODS)による分画で精製を行った。ゴーヤの実、わたの試料ではODSに非吸着画分に強い阻害活性が認められた。この画分をToyopealHW-40Sのゲルクロマトグラフィーで阻害活性を検索した結果、低分子領域に阻害活性が検出された。リクロマトを繰り返しマルターゼ阻害活性、スクラーゼ阻害活性について検討した結果、両者は同一の画分に存在した。この阻害様式は、Lineweaver-Burkプロットによる解析から不拮抗阻害であることが示唆された。現在までのところ得られた精製試料はシロップ状で、阻害活性は熱に安定であることを認めている。そのため糖類関連物質として、さらにその構造決定を行う予定である。タマネギより調製した水抽出試料ではODSカラムによる精製で30%アセトニトリル溶出画分に強い阻害活性が認められた。さらにToyopealHW-40Sによるゲルクロマトグラフィーでの精製で、大きく2画分に阻害活性を有していた。これら2者の試料の加熱条件による阻害活性の増減は、一定した結果でなく、処理試料の生育条件などの影響も考慮した検討を行っている。今後、調理条件による阻害活性の消長変動についても検討し効率的調理条件のモデルを明らかにする。今年度、前年度にゴーヤの抽出試料からの粗単離できた糖質分解酵素阻害活性成分の精製をさらにHPLCにより進めたが、精製途中において十分な精製純度、精製量が得られず、構造決定には至らなかった。しかし、Toyopeal HW-40Sによる精製結果より阻害活性成分は低分子画分に存在し、これまでに報告されているトレハロース以外の成分の存在が示唆された。また、ゴーヤの実の水抽出物からの糖質分解酵素阻害活性成分の酵素阻害の形式は、不拮抗阻害であることが示唆された。保存に伴う血糖阻害活性の消長が認められたニンニクについては、調理方法(加熱方法、保存方法等より)から再検討を実施したが、試料の個体差により、阻害活性が認められず、活性の消長原因が明らかにできなかった。試料中の有機酸量を反映すると考えられる試料調製時のpHによる抽出の検討において、糖質分解酵素阻害活性成分の効果的な活性上昇は認められなかった。タマネギに含まれる糖質分解酵素阻害活性成分はODSに対して、30%アセトニトリル溶出画分に強い活性が認められ、フェノール硫酸法による発色より糖類を含むと考えられた。ゴーヤ試料においては、ODS非吸着画分に強い阻害活性が認められフェノール硫酸法による発色は認められなかった。これらの結果より、ゴーヤ、ニンニク等における糖質分解酵素阻害活性成分は、食事など生鮮食料品の調理品としの摂取では穏やかな調理操作での摂取がその効果を保持できるものと推定される。
都市排水系での難分解、極性有機物質(P3)の汚染実態と制御方法に関する研究

新たな汚染物質として、生活で広く使われている医薬品や化粧品などの日常用品(Pharmaceutical & Personal Care Product,PPCP)が潜在的な環境問題となり始めている。これらの多くは、難分解で、やや極性があるPersistent Polar Pollutant(P3)で、排水処理では取りにくいことが予想される。PPCPが水環境へ流出する状況を把握するため、広範囲な生活排水などを収集する下水道をターゲットに汚染実態と下水道での削減状況を捉えるとともに、バイオアッセイによる毒性データから初期リスク評価を行った。また回分実験によって活性汚泥での分解除去性を検討した。SPE-LC/MS/MS法を用いて47のPPCPを分析した。下水処理場での調査を行った結果、流入水中から多くの医薬品類が検出され、検出濃度のオーダーは10ng/L10μg/Lのオーダーであった。カフェイン(10μg/L)、アセトアミノフェン(8.4μg/L)、ベザフィブラート(2.7μg/L)、テオフィリン(2.0μg/L)、クラリスロマイシン(1.4μg/L)、スルピリド(1.1μg/L)などが流入水から高濃度で検出された。生物処理による除去率は-30100%であり、物質によって除去率が大きく異なった。オゾン処理により二次処理水中に残留した医薬品の約80%が除去されたが、ジソピラミドやケトプロフェンはオゾン処理によっても約60%程度しか除去されず、オゾン処理後も100ng/L以上の濃度で残留していた。また、生物処理によるリスク削減効果としては二次処理により流入水中で1以上あったハザード比が1以下に削減され,オゾン処理によって0.1以下まで削減された。通常の活性汚泥と不活化処理した活性汚泥による除去速度定数との差を見かけ上の生分解速度定数と定義し、生分解性を評価した。特に抗菌剤以外の医薬品は活性汚泥による除去に生分解が寄与していることが示唆され、抗菌剤以外の医薬品は実際の処理揚での除去率と見かけ上の生分解速度定数に正の相関がみられた。1.医薬品(PPCP)のプライオリティー付けと調査対象物質の検討内外の文献情報を整理し、検討した結果、最も重要な医薬品として抗生物質を取り上げ、国内での売上実績、薬価、体内排泄率を考慮して、水環境への総排出量を推定した。この結果、クラリスロマイシン(CAM)、レボフロキサシン(LVFX)が国内での環境への排出量が多いという視点から重要であることが明らかとなった。2.対象物質の分析方法の開発固相カラムとLC/MS/MSを用いて、CAMおよびLVFXの水試料からの抽出法、定量方法を検討し、下水、下水処理水での検出下限、定量下限性、回収率を検討した。3.対象物質の下水濃度の推定と実態の把握CAMおよびLVFXの下水の存在濃度を推定し、下水および下水処理水(活性汚泥法)の存在濃度を3箇所の下水処理場で調査を行って、実態を明らかにした。流入濃度は推定値と測定値に比較的良い一致が見られた。4.対象物質の下水道での除去特性の検討対象物質の流入、処理過程での水質、下水処理水質から、下水処理場での処理過程での除去特性を把握した。この結果、CAM, LVFXとも最初沈殿池でやや除去されるが、生物処理での除去率は大きくなく、また塩素やUVでの消毒過程ではほとんど変化はなかった。

また処理過程の中では、一旦濃度の増加が見られる場合があった。下水処理場の活性汚泥を用いて、人工下水とCAM, LVFXを添加した回分式で分解実験をおこなった。この結果、初期吸着が見られた後、濃度が低下したが、その速度はきわめて遅かった。5.対象物質の生物への影響評価方法の検討対象物質を、緑藻類(Pseudokirchneriella subcapitata)の増殖阻害試験(96hr)を用いて生物影響の濃度依存性を検討した。この結果、CAMのEC50は、LVFXのEC50よりも2桁程度毒性が高かった。また、実測された下水処理水濃度と、CAM, LVFXの毒性を比べると、影響が認められない結果となったが、CAMではその比率は小さく、他の生物の感受性の相違を考慮すると、さらに詳細な生態リスクの検討が必要であると考えられた。広く使われている医療品のうち、生態毒性が大きいと考えられた人用抗生物質、レボフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシンを対象として(1)対象物質の分析方法の開発、とくに粒子に収着している濃度の分析開発を行った。この結果、高速溶媒抽出法とLC/MS/HSを組み合わせる方法による方法で活性汚泥に収着している対象物質の測定が可能となった。(2)対象物質の下水処理場内での濃度変化の実態把握を行った。特に、生物学的窒素・リン除去を行っている処理プロセスとオゾン処理をさらに加えている処理プロセスでの除去実態を調査した。この結果、生物学的窒素・リン除去を用いている処理過程は、二次処理過程よりも水中の対象物質に対してやや高い除去率となる傾向が見られ、さらにオゾン処理により低減する傾向にあった。しかし、これらの高度処理によっても処理水に残留し、とくにレボフロキサシンの除去率は、比較的低いことが明らかとなった。(3)対象物質の下水道での除去特性の検討するため、回分実験を行い、アルミ系凝集剤添加活性汚泥法で、凝集剤添加後、汚泥に収着している対象物質の水相への脱ち着が生じることが示唆された。これらの収脱着は、これまで活性汚泥と有機化学物質の挙動は、主にオクタノール水分配係数で代表できる疎水性だけでは説明できず、電気化学的な力の関与も考えられた。(5)対象物質の生物への影響評価方法の検討するため、藻類生長阻害試験を継続して行うとともに、淀川水系での下水処理場からの対象物質の排出実態と、下流水域への流達状況を把握した。この結果、淀川水系では下水処理場から排出される対象物質の占める割合が高いこと、特にレボフロキサシンは下流への流達が比較的大きいことが明らかとなった。新たな汚染物質として、生活で広く使われている医薬品や化粧品などの日常用品(Pharmaceutical & Personal Care Product, PPCP)が潜在的な環境問題となり始めている。これらの多くは、難分解で、やや極性があるPersistent Polar Pollutant (P3)で、排水処理では取りにくいことが予想される。PPCPが水環境へ流出する状況を把握するため、広範囲な生活排水などを収集する下水道をターゲットに汚染実態と下水道での削減状況を捉えるとともに、バイオアッセイによる毒性データから初期リスク評価を行った。また回分実験によって活性汚泥での分解除去性を検討した。SPE-LC/MS/MS法を用いて47のPPCPを分析した。
３次元多様体のシャドウ複雑度と幾何構造に関する研究

可微分4次元多様体のシャドウとは,大雑把に述べるとその多様体の局所平坦な2-骨格のことをさす.シャドウの閉近傍の境界は3次元多様体となるため,シャドウにより可微分3次元多様体,4次元多様体双方を組合せ的に表示することができる.シャドウにより記述される多様体の構造は,とりわけ3次元双曲幾何学と相性が良いことが特徴的である.各3次元多様体,4次元多様体が許容するシャドウの最小頂点数をその多様体のシャドウ複雑度とよぶ.本研究では,シャドウ複雑度が小さい3次元多様体,4次元多様体の分類とその性質の考察を行うことを目標にしている.本年度は,直江央寛氏との共同研究において,シャドウ複雑度が2以下である非輪状4次元多様体で境界が3次元球面であるものは標準的な4次元球体と微分同相であることを証明した.非輪状4次元多様体で境界が3次元球面である4次元2ハンドル体で標準的な4次元球体と微分同相でないものが存在すれば,直ちに4次元可微分ポアンカレ予想の反例を与えることから,この問題は非常にナイーブで重要な問題であるが,この問題に対するシャドウ複雑度に応じた検証という研究の方向性を確立できたことになる.この他,Sangbum Cho氏, Arim Seo氏と共同でトーラス組み紐と(1,1)-結び目に関する論文, Sangbum Cho氏, Junghoon Lee氏と共同で3次元球面のHeegaard分解に付随する原始円盤複体に関する論文を執筆しarXivで公開し,定期刊行専門誌に投稿中である.また,石井一平氏,石川昌治氏,直江央寛氏と共同で正フロースパインと接触構造に関する研究を進めた.シャドウ複雑度が2以下の非輪状4次元多様体について,期待通りの結果を得ることが出来た.シャドウ複雑度が0の場合,シャドウ自身が1点に崩壊可能であったのに対し,シャドウ複雑度が1或いは2であるシャドウの中には可縮だが1点に崩壊可能ではないものが多く存在するため,状況は格段に複雑であった.しかし,この状況においても多面体のトポロジーに関する考察および絡み目のデーン手術に関する既知の深い事実(Property R)を駆使することにより難点を克服することができた.シャドウ複雑度がより高い多様体に対する同様の問いについては今後の課題としたい.「現在までの進捗状況」で述べたように,研究はおおむね順調に進んでいる.これからの研究の方向として,上記研究から明らかに想定できる拡張の方向の他に,これまでにあまり多くの時間を割くことができていなかった3次元多様体のシャドウと安定写像の関連について研究を進めていきたい.シャドウ複雑度が1のS^3内の双曲絡み目,および分岐シャドウ複雑度が2であるが安定写像の特異ファイバーの数が1本である双曲結び目(いわば分岐シャドウ複雑度が1+1/2のクラス)の特徴付けについて考察してく予定である.可微分4次元多様体のシャドウとは,大雑把に述べるとその多様体の局所平坦な2-骨格のことをさす.シャドウの閉近傍の境界は3次元多様体となるため,シャドウにより可微分3次元多様体,4次元多様体双方を組合せ的に表示することができる.シャドウにより記述される多様体の構造は,とりわけ3次元双曲幾何学と相性が良いことが特徴的である.各3次元多様体,4次元多様体が許容するシャドウの最小頂点数をその多様体のシャドウ複雑度とよぶ.シャドウ複雑度は絡み目や空間グラフに対しても定義される.本研究では,シャドウ複雑度が小さい3次元多様体,4次元多様体の分類とその性質の考察を行うことを目標にしている.本年度は,Bruno Martelli氏,直江央寛氏との共同研究において,シャドウ複雑度が1以下である可微分閉4次元多様体の完全な特徴づけを行った.特に,このクラスの多様体は,シャドウの特異集合の近傍の構造から自然に構成される19個のコンパクト4次元多様体,および3次元実射影空間と円周との直積という「例外的」な4次元多様体によって「生成」されるグラフ多様体(と有限個の複素射影平面を連結和したもの)であることが分かった.証明には,シャドウの局所変形に関する非常に技術的で精密な考察に加え,シャドウの構造から自然に得られる双曲多様体に対する例外的Dehn充填の分類という「3次元トポロジーの問題」が自然に表れ,これらを解決することで上記結果を得ることに成功した.この他,Sangbum Cho氏と共同でGoeritz群の結び目理論への応用に関する研究,船吉健太氏と共同で3次元球面に拡張可能閉曲面の自己同相写像の研究を行った.得られた結果は全てarXivで公開し,定期刊行専門誌に投稿中である.シャドウ複雑度が1以下の閉4次元多様体のクラスについて,ほぼ満足のいく形で全貌が解明できた.特に,シャドウ複雑度が0のクラスと同様,このクラスもコンパクト4次元多様体のダブル(の複素射影平面との連結和)によって占められていることが判明した.ただし,シャドウ複雑度が0のクラスにおいては,ダブルをとる4次元多様体は2ハンドル体に限られていたのに対し,シャドウ複雑度が1のクラスはより多くのダブルを含んでいることも分かった.帰結として,このクラスには,まだasphericalな多様体や,非自明なE8因子を含む偶の交叉形式を持つ多様体は含まれていないことが分った.また,単連結な多様体も自明な例(4次元球面,複素射影平面,2つの複素射影直線の直積など)を除いてみつかっていない.

これらの多様体がシャドウ複雑度を上げていく過程でいつ現れるのかという問いは今後の課題としたい.可微分4次元多様体のシャドウとは,大雑把に述べるとその多様体の局所平坦な2-骨格のことをさす.シャドウの閉近傍の境界は3次元多様体となるため,シャドウにより可微分3次元多様体,4次元多様体双方を組合せ的に表示することができる.シャドウにより記述される多様体の構造は,とりわけ3次元双曲幾何学と相性が良いことが特徴的である.各3次元多様体,4次元多様体が許容するシャドウの最小頂点数をその多様体のシャドウ複雑度とよぶ.本研究では,シャドウ複雑度が小さい3次元多様体,4次元多様体の分類とその性質の考察を行うことを目標にしている.本年度は,直江央寛氏との共同研究において,シャドウ複雑度が2以下である非輪状4次元多様体で境界が3次元球面であるものは標準的な4次元球体と微分同相であることを証明した.非輪状4次元多様体で境界が3次元球面である4次元2ハンドル体で標準的な4次元球体と微分同相でないものが存在すれば,直ちに4次元可微分ポアンカレ予想の反例を与えることから,この問題は非常にナイーブで重要な問題であるが,この問題に対するシャドウ複雑度に応じた検証という研究の方向性を確立できたことになる.この他,Sangbum Cho氏, Arim Seo氏と共同でトーラス組み紐と(1,1)-結び目に関する論文, Sangbum Cho氏, Junghoon Lee氏と共同で3次元球面のHeegaard分解に付随する原始円盤複体に関する論文を執筆しarXivで公開し,定期刊行専門誌に投稿中である.また,石井一平氏,石川昌治氏,直江央寛氏と共同で正フロースパインと接触構造に関する研究を進めた.シャドウ複雑度が2以下の非輪状4次元多様体について,期待通りの結果を得ることが出来た.シャドウ複雑度が0の場合,シャドウ自身が1点に崩壊可能であったのに対し,シャドウ複雑度が1或いは2であるシャドウの中には可縮だが1点に崩壊可能ではないものが多く存在するため,状況は格段に複雑であった.しかし,この状況においても多面体のトポロジーに関する考察および絡み目のデーン手術に関する既知の深い事実(Property R)を駆使することにより難点を克服することができた.シャドウ複雑度がより高い多様体に対する同様の問いについては今後の課題としたい.「現在までの進捗状況」で述べたように,研究はおおむね順調に進んでいる.今後,閉4次元多様体に関する研究でははまずasphericalな多様体,非自明なE8の因子を含む偶の交叉形式を持つ多様体の持つシャドウ複雑度について,考察を進めていきたい.とりわけ,K3曲面のシャドウ複雑度は14以下であることが知られているが,この多様体のシャドウについては,ほとんど何も知られていない.例を深く観察することから研究を進めていきたい.また,シャドウ複雑度が1のS^3内の双曲絡み目,および分岐シャドウ複雑度が2であるが安定写像の特異ファイバーの数が1本であるS^3内の双曲結び目(いわば分岐シャドウ複雑度が1+1/2のクラス)の特徴付けについても,上記研究の手法とシャドウ絡み目のS^3への埋め込みの考察を行うことで実行してく予定である.「現在までの進捗状況」で述べたように,研究はおおむね順調に進んでいる.これからの研究の方向として,上記研究から明らかに想定できる拡張の方向の他に,これまでにあまり多くの時間を割くことができていなかった
カルシウム, 不飽和脂肪酸依存性膜結合グアニレートシクラーゼの精製と内在性調節蛋白

受容体-cyclic GMP連関の機構は不明である.受容体刺激-情報伝達過程で生成される膜内の物質がmediatorとなり,受容体と膜局在グアニレートシクラーゼ活性が連関していると考える.私共は,生理的低濃度のCa^<2+>と不飽和脂肪酸により著明に活性化されるguanylate cyclase(略してCF-G.Cycl-ase)をシナプス膜に発見し, Ca^<2+>と不飽和脂肪酸が活性化のmediatorであると考えるに至った.また,上記酵素の活性化調節に関与すると考えられる高分子性調節因子(GCM)を酵素標品より分離した.1.酵素の可溶化,精製;ラット脳シナプス膜よりCa^<2+>と不飽和脂肪酸への依存性を有したままCF-G.Cyclaseを可溶化,部分精製した.2.本酵素の種々臓器別分布及び細胞分画別分布を測定した.3.本酵素の活性化における脂肪酸の構造特異性を検討した.また,過酸化反応等の検討により,不飽和脂肪酸そのもの自身が,本酵素の活性化に有効であった.4.本酵素の活性化にはCa^<2+>が必須である.50%max activationを示す遊離Ca^<2+>濃度は,シナプス膜の本酵素では2.7μMであり,精製酵素では2.3μMであった.カリモジュリンの関与は否定的であった.5.本酵素の活性化にGTPが必須である.GTP誘導体の効果を測定した.活性化におけるGTPのKa値は77.5μM, GTPγSのKa値は22.1μMであった.6.Ca^<2+>とGTP共存による本酵素の活性化は温度依存性,および,反応時間依存性であった.7.高分子性調節因子(GCM)については,かなり高度に精製する方法を確立した.分子量は37Kと考える.臓器別含量,細胞内分布などを検討した.本因子はCF-G.Cyclaseの活性,特に不飽和脂肪酸過剰域において,著しい活性促進効果を示した.8.百日咳菌毒素並びにコレラ毒素によるADPリボシル化は本酵素の活性にほとんど影響しなかった.従って, GTPの作用点に未知の新しいGTPタンパクの関与が考えられる.受容体-cyclic GMP連関の機構は不明である.受容体刺激-情報伝達過程で生成される膜内の物質がmediatorとなり,受容体と膜局在グアニレートシクラーゼ活性が連関していると考える.私共は,生理的低濃度のCa^<2+>と不飽和脂肪酸により著明に活性化されるguanylate cyclase(略してCF-G.Cycl-ase)をシナプス膜に発見し, Ca^<2+>と不飽和脂肪酸が活性化のmediatorであると考えるに至った.また,上記酵素の活性化調節に関与すると考えられる高分子性調節因子(GCM)を酵素標品より分離した.1.酵素の可溶化,精製;ラット脳シナプス膜よりCa^<2+>と不飽和脂肪酸への依存性を有したままCF-G.Cyclaseを可溶化,部分精製した.2.本酵素の種々臓器別分布及び細胞分画別分布を測定した.3.本酵素の活性化における脂肪酸の構造特異性を検討した.また,過酸化反応等の検討により,不飽和脂肪酸そのもの自身が,本酵素の活性化に有効であった.4.本酵素の活性化にはCa^<2+>が必須である.50%max activationを示す遊離Ca^<2+>濃度は,シナプス膜の本酵素では2.7μMであり,精製酵素では2.3μMであった.カリモジュリンの関与は否定的であった.5.本酵素の活性化にGTPが必須である.GTP誘導体の効果を測定した.活性化におけるGTPのKa値は77.5μM, GTPγSのKa値は22.1μMであった.6.Ca^<2+>とGTP共存による本酵素の活性化は温度依存性,および,反応時間依存性であった.7.高分子性調節因子(GCM)については,かなり高度に精製する方法を確立した.分子量は37Kと考える.臓器別含量,細胞内分布などを検討した.本因子はCF-G.Cyclaseの活性,特に不飽和脂肪酸過剰域において,著しい活性促進効果を示した.8.百日咳菌毒素並びにコレラ毒素によるADPリボシル化は本酵素の活性にほとんど影響しなかった.従って, GTPの作用点に未知の新しいGTPタンパクの関与が考えられる.受容体-cyclic GMP連関の機構は不明である。受容体刺激-情報伝達過程で生成される膜内の物質がmediatorとなり、受容体と膜局在グアニレートシクラーゼ活性が連関していると考える。私共は、生理的低濃度の【Ca^(2+)】と不飽和脂肪酸により著明に活性化される【Ca^(2+)】,fatty acid activated guanylate cyclase(略してCF-G.Cyclase)をシナプス膜に発見し、【Ca^(2+)】と不飽和脂肪酸が活性化のmediatorであると考えるに至った。また、上記酵素の活性化調節に関与すると考えられる高分子性調節因子(Guanylate Cyclase Modulator:GCM)を酵素標品より分離した。1.酵素の可溶化,精製;ラット脳シナプス膜より【Ca^(2+)】と不飽和脂肪酸への依存性を有したままCF-G.Cyclaseを可溶化、精製した。しかし、活性化の性質が不安定のため高度の精製は困難であった。

2.本酵素の種々臓器別分布及び細胞分画別分布を測定した。3.部分精製した本酵素の活性化における脂肪酸の構造特異性を検討した。その結果、本酵素の活性化には、天然に存在するC16-C20の不飽和脂肪酸のみが有効であり、また不飽和脂肪酸そのもの自身が有効であった。4.本酵素は可溶化、部分精製により、【Ca^(2+)】による活性化は増加する傾向にある。カルモジュリンの関与は否定的である。5.本酵素の活性化にはGTPが必須である。部分精製酵素について、GTP及び種々の非水解性のGTP誘導体の効果を測定した。GTP誘導体の効力の強さは本酵素に特異的であり、構造と活性化効力の相関を推測するのは現在困難である。6.高分子性調節因子(GCM)については、かなり高度に精製する方法を確立した。分子量は37Kと考える。臓器別含量,細胞内分布などを検討した。CF-G.Cyclaseの分布とは一致せず、GCMの機能的役割を考える上で興味がもたれる。またGCMは、酵素の活性化におけるGTPの作用に直接関与する結果は得られなかった。
遺伝子手法を用いた食品中の菌叢解析法に関する研究

食品企業において微生物管理は常に重要課題であり、企業は商品の設計・試作時および原料や製造工程、最終製品に至るまで各所で微生物検査を行っている。近年、食品業界において菌叢の重要性について、微生物の質的管理という観点から重要性が周知されつつある。しかし、菌叢を把握するためには多大な時間と労力とを要するため、菌叢情報の有用性は認識しつつも実施が困難である、という問題が存在する。そこで本研究課題では、食品製造の現場において適用可能な迅速性・省力性を持った菌叢解析手法を開発することを目的とした。本年度上期には、一般に利用される食用魚類の(内臓を除く)菌数および菌叢を調査し、対象とすべき菌群を把握した。既報の情報もあわせて考察したうえで52属84種、計90株を用いてT-RFLP法(制限断片長多型)のデータベースを作成した。上期には並行して、魚類加工品(剥き身や魚卵など)へ純菌株を接種した系にてDNA抽出、検出感度の向上などT-RFLP法の実施条件について検討を行った。両検討結果を合わせ、T-RFLP実施条件とT-RFデータベースをセットとした鮮魚類の菌叢推定用T-RFLPシステムを構築した。本年度下期には、本T-RFLPシステムの実用性を評価すべく、市販鮮魚類の菌叢解析を本システムと従来法(培養、菌株同定を主とする方法)で並行して行い、評価した。本T-RFLPシステムは市販鮮魚類25サンプル中22サンプルについて従来法と同等の結果を得た。また、本システムは試験的な保存条件下における菌叢変化を迅速にモニタリングしていくことができた。このように、本システムは一般的な菌叢解析用途において従来法と同等の結果を得ることが確認された。結果を得るまでに掛かる時間は、従来法は5日7日であったのに対し、本T-RFLPシステムでは12日と、大幅な迅速化とともに実験担当者の作業も省力化することができた。以上、本研究課題において限られた労力と時間の制約のある食品製造現場においても有用な菌叢推定システムを開発することができ、所期の目的を達成することができたと考えている。
クロ-ズドコロニ-系統の遺伝的モニタリングに関する基礎的研究

我が国でよく使われているマウスおよびラットのクロ-ズドコロニ-系統について表現型頻度や遺伝子頻度などのデ-タを得た。マウス,ラットを通して全系統で比較的遺伝的多型性が保たれていることが明らかになった。また,起源あるいは由来が異なるにも係わらずスイスマウスとドイツマウスが類似する一方で,ノンスイスとドイツマウス,ノンスイスとスイスマウスが予想どおり遺伝的な違いを示した。ラットではWistar系統が3施設で多型遺伝子座の率が異なるだけではなく対立遺伝子の種類に違いを示し,1940年代に我が国に入ってきたコロニ-の直系が他の2系統と遺伝的に異なること,そして,Donryu系統が他の2系統と比べて特異な地位を示すことが明らかになった。本研究期間を通して,マウス2系統およびラット1系統を対象に定期的な調査を行った結果,3系統とも3回にわたりほぼ同じ結果を示した。この結果を受けて,クロ-ズドコロニ-を対象にして行う遺伝検査およびモニタリングの実施案を次のように提案する。(1)特性検査ではできるだけ多くの遺伝子を調べる。(2)定期的検査(モニタリング)では近交系で使われている19遺伝子を検査項目として使う。(3)特にクロ-ズドコロニ-については19項目の結果から多型を示す数種類の遺伝子座を選んで遺伝子頻度の検査に主眼を置いた検査を行う。(4)検査頻度と検査個体数は一コロニ-から60頭選び,一年に一度実施する。本研究で得られた結果は,今後,マウス,ラットのクロ-ズドコロニ-系統の遺伝学的研究および遺伝的モニタリングを実施する場合に,基礎的デ-タとして重要になるものと期持される。マウスおよびラットのクローズドコロニー系統の遺伝的モニタリングに関する基礎的研究を行い、今年度は以下の研究成果を挙げた。1.マウスおよびラットで調査した標識遺伝子マウスでは19遺伝子座(生化学的遺伝子15種類および免疫遺伝学的遺伝子4種類を、またラットでは13遺伝子座(生化学的遺伝子11種類および免疫遺伝子学的遺伝子2種類)を調査対象標識遺伝子とした。今年度はラットの標識遺伝子をマウスのそれと同数にするために6遺伝子座の検出系の確立を目的に検討を行った。2.クローズドコロニー系統の遺伝学的調査研究2-(1)クローズドコロニーマウス系統の標識遺伝子の調査ICR、ddYおよびCF1系統について上記の標識遺伝子を調べた結果、3系統で遺伝的多型性が認められた。生化学的標識遺伝子では系統に特徴的な遺伝子は認められなかったが、H-2遺伝子で顕著な系統差みられた。すなわち、CF1系統では約70%の個体にH-2^kタイプが、ICRではH-2k^dが約40%の個体で見られ、そしてddY系統では、H-2k^sが約60%で認められた。2-(2)クローズドコロニーラット系統の標識遺伝子の調査SD、WistarおよびDonryu系統の中、SDとWistar系統について調べた。その結果両系統共Hbbで顕著な違いが見られた。まず、SD系統については2社のうちの一方がbタイプに固定しており、他方はa、b、a/bに分離していた。Wistar系統についても同様で、一方はa型に固定していたが、他方では分離型を示した。3.今後の研究計画ラットの調査遺伝子数を増やす。ヘテロ型を示した遺伝子座について表現型頻度あるいは遺伝子頻度を毎年調べ、経時的変化を追う。本研究は、クロ-ズドコロニ-系統における種々の標識遺伝子の多型性を調べ、クロ-ズドコロニ-の遺伝的モニタリング法を確立することにあり、本年度は以下の研究成果を得た。

1.ラットの標識遺伝子の検査法の確立:ラットの新しい標識遺伝子として次の7遺伝子座、Akpー1,Alpー1、Esー6、Esー7、Esー8、Esー9およびEsー10を腎蔵、および睾丸を試料として用い、等電点電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検査できるようにその方法を確立した。この結果、従来からの検査項目、Amyー1、Esー1、Esー2、Esー3、Esー4、Esー14、Gc、Hbb、Mupー1、RT1、RT2およびSvpー1と合わせて19遺伝子の検査法を確立することができるようになった。2.ミトコンドリアDNA多型検査法の確立:マウスのミトコンドリアDNA多型を検出する方法としてマウスのミトコンドリアDNAを非アイソト-プで標識してプロ-ブに用いるサザンブロット法を確立した。3.マウス・ラットクロ-ズドコロニ-系統の標識遺伝子の調査:WistarおよびSD系統の標識遺伝子を調べ、コロニ-間で遺伝子の種類と頻度を比較した。Wistar系統を3業者から導入して調べた結果、コロニ-の由来が異なることによりRT1やMupー1のような遺伝子座で遺伝子の種類や頻度に顕著な違いが見られた。マウスクロ-ズドコロニ-集団について母性遺伝することが判っているミトコンドリアDNAの検査を行ったところ、domesticusタイプがICR、ddYおよびCF1系統で共通してみられた。一方、ddYではmolossinusタイプが、また、CF1ではbrevirostrisタイプが特徴的に見られた。以上の結果は、系統間を区別し、さらにはそれぞれの由来を明らかにするために極めて有用である。本研究は,クロ-ズドコロニ-系統における種々の標識遺伝子の多型性を調べ,クロ-ズドコロニ-の遺伝的モニタリング法を確立することにあり,本年度は以下の研究成果を得た。1.マウスおよびラットの標識遺伝子の検査法の確立ラットの新しい標識遺伝子として次の3遺伝子座,Aconー1,Ahdー2およびFhー1を腎臓および肝臓を試料として用い,等電点電気泳動によって検査できるようにその方法を確立した。一方,マウスについては3遺伝子座を加えた。Hbaは赤血球を試料として用い,等電点電気泳動で,また,Lyー1およびLyー2は,リンパ球を試料として用い,細胞障害性試験で検出できるようにした。以上の結果,マウスおよびラットで,22遺伝子座が検査できるようになった。2.マウス・ラットのクロ-ズドコロニ-系統の標識遺伝子の調査Wistar,SDおよびDonryu系統を導入して標識遺伝子を調べ,系統間の比較を行った。その結果,SD系統については,2社間で大きな差は見られなかった。しかし,本系統において,Esー1遺伝子のcタイプが高い頻度で見られた。Wistar系統ではほとんど認めなかったので,両系統を区別できる標識遺伝子になると期待される。次に,Donryu系統については,Esー4においてcタイプが見られ,SDおよびWistar系統と明確に区別できることが分かった。また,RT1遺伝子についてはkタイプが見られた。このタイプは,Wistar:Imamichiで認められるが,他のWistarおよびSD系統には見られなかった。ミトコンドリアDNAの検査を行ったところ,Wistar系統で3種類のタイプ,A,BおよびCが見られ,SD系統ではAおよびBタイプが見られた。また,Donryu系統では,AとGタイプがみられた。
顆粒球・単球系細胞特異的遺伝子および産物の構造と機能について

MS2について:1.マウスMS2(mMS2)およびヒトMS2(hMS2)のメタロプロテイナーゼ(MTP)およびジスインテグリン(DI)ドメイン蛋白を合成分離した。DIの抗血小板凝集作用を証明した。この活性が抗MS2抗体で阻止されることを確認した。mMS2およびhMS2のMTPおよびDI蛋白に対する単クロン(mAb)を作成した。MS2が単球系細胞および好中球に特異的に発現することを確認した。2.hMS2 cDNAの全塩基配列を解読した。分泌型hMS2 cDNAを分離した。3.mMS2のMφ細胞株における特異的発現およびLPSによる発現増強のシス領域をCATアッセイで検討し各々複数の領域の存在を確認した。CD14について:1.ウサギCD14 cDNAを分離し、全塩基配列を決定した。2.リコンビナントCD14(rCD14)および抗マウスCD14ポリクロン抗体およびmAbを作成した。PAP法やFACSでCD14が顆粒球・単球系細胞にのみ発現することを証明した。mAbがin vitroでLPSによるMφ細胞株からのTNF遊離を阻止することを観察した。3.mCD14REと結合する三種のDNA結合蛋白を観察した。4.Kupffer細胞(KC)とMφのCD14,CD18,サイトカインのmRNA発現を検討し、KCにおけるCD14はLPSの清掃細胞としても機能することを明らかにした。5.リピドIV_AとRhodobacter spheroides lipid A (RSLA)のLPSとCD14移入細胞を用いてCD14がLPSとCD14関連性のLPSシグナル伝達因子との結合を助長することによりLPSへの感受性を促進させることを示唆する成績を得た。6.mCD14のN末端から109個のペプチドを発現させHPLCで精製した。7.マウス腹腔MφはLPS刺激によるTNFα産生は抗mCD14抗体で阻止されないことを観察した。8.メタロチオネイン遺伝子5領域をプロモーターとする膜型と非膜型CD14を発現するトランスジェニックマウス(TM)を作成した。TMの肝と小腸にmCD14の発現を観察した。非膜型TMでは末梢血遊離mCD14値が正常および膜型TMのそれに比べ有意に高く、また、LPS投与時のTNFα値は有意に低いことを観察した。MS2について:1.ヒトMS2(hMS2)cDNAの分離:hMS2 cDNAの全塩基配列を解読した。また、膜貫通部を欠如するcDNAを分離した。2.マウスMS2(mMS2)およびhMS2のリコンビナント蛋白(RP)の分離:メタロプロテイナーゼ(MTP)ドメインと血小板凝集阻止因子(PA1)ドメインの両者あるいは各々のドメインなど種々の領域のRPを大腸菌、哺乳動物、昆虫細胞系ベクターに発現させた。現在のところ大腸菌のもの以外は発現量が少なくその増加を試みている。

また、大腸菌のRPは封入体に含まれ変形剤を用いて溶解するため、refoldingの問題が起こった。(A).MTP蛋白の酵素活性検索:タイプIVコラーゲン、ゼラチン、合成螢光基質(Max-Planck研究所Gram博士より供与)などを用いコラゲナーゼ活性を検索しているが、なお、活性を証明するに至っていない。これには活性化が必要であることやrefoldingをよく行わせることなどが考えられ現在種々検討を行っている。哺乳動物および昆虫細胞系のRPは量的に少ないことと、内在性のコラゲナーゼ活性が高く、対照と有意差が得られていない。(B).単クローン抗体(mAb)作成:mMS2およびhMS2のRPを用いてmAbを作成した。これらのmAbを用いてマウスでは常在Mphiや腹腔炎症細胞、種々の細胞株の、ヒトでは末梢血白血球および細胞株におけるMS2発現をPAPで検討した。これによりMphi、好中球およびMphi細胞株で発現が認められた。CD14について:1.ウサギCD14cDNAの分離解析:ウサギのCD14cDNAを分離し、全塩基配列を解読した。2.CD14および抗マウスCD14.mAb作成と利用:マウスCD14 cDNAを用いて大腸菌に発現させ、rCD14を分離した。CD14をラツトに免疫し抗マウスCD14mAbを動物では国内外ではじめて作成することに成功した。このmAbとcDNAを用いてLPS刺激に伴うCD14の発現様式をKupffer細胞(KC)と腹腔Mphiで比較検討した。KCのCD14はLPS刺激により著明に発現増強し、常時強くCD14を発現し、LPS刺激では発現増強が軽度な腹腔Mphiとは著しく性質が異なることを明らかにした。KCではmRNAの発現増加が蛋白の発現に先行して見られることから、貯蔵されたCD14の発現ではなく、積極的な生産が考えられた。現在さらにmAbを用いてフローサイトメトリーによるKCと腹腔Mphiの解析を行っており、KCは特有な小集団のMphiに由来する可能性がある結果を得た。MS2について:1.マウスMS2(mMS2)遺伝子発現機序の解析:mMS2のMφ細胞株における特異的発現およびリポポリサッカライド(LPS)による発現増強のシス領域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイで検討し各々複数の領域の存在を確認した。1.mMS2およびヒトMS2(hMS2)の機能解析:(A).MS2リコンビナント蛋白(RP)の分離:大腸菌、昆虫細胞系ベクターを用いて各ドメイン蛋白のRPを合成分離した。(B).PA1蛋白の機能検索:RPの抗血小板凝集作用を凝集計で検索し、PA1活性の存在を証明した。この活性が抗MS2抗体で阻止されることを観察した。(C).単クローン抗体(mAb)作成:mMS2およびhMS2のRPに対するmAbを作成した。マウスおよびヒトの種々の血液細胞における発現を検討し、単球系細胞および好中球に特異的に発現することを確認した。CD14について:1.CT14遺伝子発現機序の解析:TPA responsiveelement様配列(TRE)のオリゴヌクレオチドを合成しこれをDNA結合ラテックスに結合させHINS-B3細胞の核蛋白をこのカラムでaffinity精製した。このカラムによりTREと結合する三種のDNA結合蛋白を観察した。
外国判決の執行許可手続の簡素化と債務者利益との調整のあり方

平成30年度は、ブリュッセルIa規則における執行許可手続(Exequaturverfahren)の廃止とそれに代わる新たな規律方法を分析することで、ブリュッセルIa規則における外国判決の執行にかかる債権者利益と債務者利益の調整メカニズムの特徴を明らかにすることを課題としていた。検討に際しては、先行して執行許可手続を廃止した欧州債務名義規則と比較・検討する手法を用いた。当初分析を予定していた重要文献の一つの公刊が2019年に延期されたため、今後、同文献による検証作業がなお必要であるが、これまでの検討から以下の点が明らかとなった。(1)執行許可手続が廃止されたことにより、原裁判国の裁判が同国で認証されれば、EU域内において有効な債務名義となり、これを直接の根拠として他の構成国での執行が可能となる。この点で、債権者の迅速な権利実現が期待される。(2)他方で、従来の承認拒絶事由に相当するものが、執行国において債務者が強制執行を阻止ための事由として残置されている。したがって、欧州債務名義規則の規律とは異なり、執行国における原裁判国の裁判内容に対するコントロールは残る。(3)このコントロールは、債権者のイニシアチブによる執行許可手続ではなく、債務者の申立てにもとづく執行からの救済手続において行われるため、起訴責任の転換がなされている。救済手続の具体的な規律は各国国内法に委ねられるが、ドイツ法は請求異議の訴え(ZPO767条)によるものとしている。以上のようなブリュッセルIa規則の新たな規律は、原裁判国の裁判の執行力を執行国への拡張することを肯定したうえで、執行手続の段階での債務者主導による裁判内容のコントロールを認めることで、債権者の迅速な権利実現の利益と債務者利益の調整を図ろうとする点に特徴がある。当初、分析予定であったブリュッセルIa規則に関する重要文献の出版が、2019年に延期されたため、同書の検討は次年度に委ねざるを得ず、その点での若干の進捗の遅れは否定できない。しかし、当初予定していたブリュッセルIa規則における外国判決の執行にかかる債権者利益と債務者利益の調整メカニズムの大枠の分析はおおむね達成できており、これにもとづき次年度の研究は当初の計画通り遂行できると考えられる。次年度は、平成30年度に入手できなかった図書を用いて、これまでの分析結果を検証、補充したうえで、当初の計画通り、ブリュッセルIa規則の規律メカニズムに対するドイツ法の評価を分析するとともに、2020年3月にドイツ・ライプツイッヒで開催予定のドイツ法系民事訴訟法担当者会議に出席し、ドイツ人研究者との意見・情報交換を行う予定である。また、2019年11月に神戸で開催される世界訴訟法会議においても、本研究テーマに関連するセッションが開催されるとの情報を得たので、当初の計画に加えて同会議にも出席し、情報収集並びに意見交換を行う予定である。

また、2019年11月に神戸で開催される世界訴訟法会議においても、本研究テーマに関連するセッションが開催されるとの情報を得たので、当初の計画に加えて同会議にも出席し、情報収集並びに意見交換を行う予定である。購入を予定していた図書の刊行が2019年に延期されたため、その購入のための残置していた金額が結果として、次年度使用額となった。したがって、次年度使用額は、この図書の購入に充てられる。
原発開放隅角緑内障の原因遺伝子(WDR36)の機能解析

1.組換えWDR36タンパク質の発現および精製WDR36タンパク質の特性等を解析するために、このタンパク質の発現・精製を試みた。これまでに、大腸菌で発現させたヒトWDR36タンパク質は低温条件(15°C)で発現誘導させると可溶化能が向上することを明らかにした。より改善するために、これに発現段階で分子シャペロン(groESおよびgroEL等)を共発現させた。その結果、可溶化能が更に向上し精製タンパク質を調製することが出来る可能性が高まった。2.遺伝子解析欧米人の緑内障患者において検出されているD658Gが、日本人においても認められるか否かを調べた。同意を得た患者70人の血液よりゲノムDNAを精製し、変異が報告されている領域をPCRにより増幅し、配列の決定を行った。その結果、変異を確認することが出来なかった。このことは日本人においてはD658G変異が、緑内障発症に関与しない可能性を示唆するが、より信頼性を高めるために更に多くの症例を解析する必要があると考えられる。3.細胞内局在の調査WDR36タンパク質の細胞内局在および機能を調査するために、野生型および緑内障発症に関与すると考えられているD658G型変異をコードするWDR36遺伝子、各々を発現ベクターに組み込み、これらを標準的な条件で培養したCOS-1、NIH3T3およびRGC-5細胞に導入し、発現させたタンパク質の局在および細胞への影響を調査した。その結果、WDR36タンパク質は変異の有無に関係なく細胞質に分布し、細胞の形態変化あるいは細胞死等の違いは認められなかった。これらのことから、D658G型タンパク質は、緑内障発症に関与することが知られている酸化ストレス等を与えた条件下でのみ、野生型タンパク質の機能との違いが検出されることが考えられる。また、WDR36タンパク質はある特定の細胞内オルガネラではなくサイトゾルで働くことが予想される。1)組み換えWDR36タンパク質の発現および精製WDR36タンパク質の特性等を明らかにするためにこのタンパク質を精製する。これまでに、大腸菌で発現させたヒトWDR36タンパク質は、25°C以上の培養条件下では不溶化し、15°Cで発現を誘導されると可溶化能が向上することが分かった。今後は、分子シャペロンを共発現させる等の工夫を行い可溶化したタンパク質の生産量を増加させ、より高純度のタンパク質を精製する。2)WDR36タンパク質の発現様式および局在の調査発生段階が異なるマウスおよびラットの各組織・器官におけるWDR36タンパク質の発現様式を調べるために、これらを認識する抗WDR36抗体の作成を行った。また、眼構成組織においては局在を詳細に調べるために、切片作成および免疫染色の最適化を行っている。3)WDR36遺伝子導入による機能解析主に神経系の細胞における働きを調べる目的のために、神経節細胞、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトにおいて、WDR36遺伝子を強制発現させる、あるいはRNAiにより機能抑制・阻害する各種ベクター等の構築・設計は終了した。現在、各種細胞の培養系の構築、および遺伝子導入条件等の検討を行っている。4)WDR36タンパク質の構造解析タンパク質の一次構造に基づいて立体構造を予測するソフトウエア(Mol Soft,ICM社)、を用いて解析を行ったところ、WDリピートドメインは既知のものと構造が類似していることが明らかになった。現在、各種変異を持つWDR36タンパク質の構造のシュミレーションを行っている。1.組換えWDR36タンパク質の発現およ

ひ精製WDR36タンパク質の特性等を角析するために、このタンパク質の発現・精製を試みた。これまでに、大腸菌で発現させたヒトトWDR36タンパク質は低温条件(15°C)で発現誘導させると可溶化能が向上することを明らかにした。より改善するために、これに発現段階で分子シャペロン(groESおよびgroEL等)を共発現させた。その結果、可溶化能が更に向上精製タンパク質を調製することが出来る可能性が高まった。2.遺伝子解析欧来人の緑内障患者において検出されているD658Gが、日本人においても認められるか否かを調べた。同意を得た患者70人の血液よりゲノムDNAを精製し、変異が報告きれている領域を戸CRにより増幅し、配列の決定を行った。その結果、変異を確認することが出来なかった。このことは日本人においてはD658G変異が、緑内障発症に関与しない可能性を示唆するが、より信頼性を高めるために更に多くの症例を解析する必要があると考えられる。3.細胞内局在の調査WDR36タンパク質の細胞内局在および機能を調査するために、野生型および緑内障発症に関与すると考えられているD658G型変異をコードするWDR36遺伝子、各々を発現べクターに組み込み、これらを標準的な条件で培養したCOS-1、NIH3T3およびRGC-5細胞に遺入し、発現させたタンパク質の局在および細胞への影響を調査した。その結果、WDR36ダシワくグ質ほ変異の看無に関係なく細胞質に分布し、細胞の形態変ヒあるいは細胞死等の違いは認められなかった。これらのことから、D658G型タンパク質は、緑内障発症に関与することが知られている酸化ストレス等を与えた条件下でのみ、野生型タンパク質の機能との違いが検出されることが考えられる。また、WDR36タンパク質はある特定の細胞内オルガネラではなくサイトゾルで働くごとが予想される。