hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノム情報や視細胞の形態・生理に基づく加齢黄斑変性の僚眼発症予測モデルの確立

患者本人の著しいQOL低下や社会への経済的コスト増大に繋がる加齢黄斑変性の両眼発症に対し、可能な限りの備えに繋げ得るだけでなく、効率的な受診タイミングの決定にも役立ち、逼迫する医療提供者な供給体制の整備も副次的効果としても期待できる成果が得られた。眼科加齢黄斑変性や類似した病態とも考えられている近視性脈絡膜新生血管、毛細血管拡張症、網膜色素線条に伴う脈絡膜新生血管などに関する詳細の検討を行い、さらに病態観察を新開発の補償光学適応レーザー走査型顕微鏡や光干渉断層計、眼球追尾型網膜電図も用い丹念に行い検討を加えた。一方で、眼科治療のもたらすQOL改善効果と経済効率性の評価を行うことができた。具体的には、最新のSS-OCTを用いてReticular Pseudodrusenを伴う加齢黄斑変性症例の脈絡膜厚の評価(Ueda-Arakawa N, AJO. 2014)や網膜感度の評価(Ooto S, AJO. 2013)などについて報告した。また、網膜色素線条症例での胎盤組織標本に関する考察(Tanioka M, JD. 2013)や脈絡膜厚の経時変化(Nakagawa S, Retina. 2013)などについて報告した上で、日本における弾性線維性仮性黄色腫の診断基準作成(厚生労働省宇谷班、日眼会誌及び日皮会誌. 2013)に深く関与した。加齢黄斑変性や類似した病態とも考えられている近視性脈絡膜新生血管、毛細血管拡張症、網膜色素線条に伴う脈絡膜新生血管などに関する詳細の検討を行い、さらに病態観察を新開発の補償光学適応レーザー走査型顕微鏡や光干渉断層計、眼球追尾型網膜電図も用い丹念に行い検討を加えた。具体的には、網膜下出血を伴う加齢黄斑変性の視力予後(Ueda-Arakawa N, JJO. 2012)やラニビスマブ硝子体注射治療への反応を左右する因子(Yamashiro K, AJO. 2012)、網膜の形態変化と視機能との関連性(Akagi-Kurashige Y, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2012)などについて報告した。毛細血管拡張症の詳細で総合的な病態変化(Takayama K, Retina 2012)や近視性脈絡膜新生血管への抗VEGF剤治療の長期成績を報告し、網膜色素線条では脈絡膜新生血管の時間経過に伴う変化(Nakagawa S, Retina. 2013)を報告した上で、日本における弾性線維性仮性黄色腫の診断基準作成(厚生労働省宇谷班、日眼会誌及び日皮会誌. 2013)に深く関与した。さらに、日本での白内障手術のQOL改善効果と経済効率性の評価(ECCERT, JJO. 2013)を報告し、本研究を単純化した日本人の加齢黄斑変性における僚眼発症とARMS2遺伝子多型の関連性(Tamura H, AJO.2012)を報告した各症例への治療及び収集したデータの解析を進める。前年度から引き続き各症例への治療と各種診療データを集積する。心筋梗塞の発症予測モデル作成などの疾患予後予測モデル作成の経験が豊富なハーバード大学公衆衛生大学院クック教授の助言を得ながら収集したデータの解析を行う。2眼目発症予測モデル作成を行う。上記で行った解析を踏まえ、最終的な予測モデルに用いる予測因子の選定を行い、各係数を決定した上で予測モデルを決定する。
リゾチームのフォールディングにおける各SS結合の役割

1.ニワトリリゾチームの1SS体の4種を用い、各SS結合に関わるCys残基の実効濃度を決定した。ネイティブ溶液条件下での実効濃度はSS3が一番高く、SS1が一番低い。蛋白質の立体構造形成とSS結合形成との共役度合を反映する、ネイテゥヴならびに変性溶液条件下での実効濃度の比は、SS1が最高で、SS4は最低であった。SS1形成蛋白の立体構造は、2次構造を持つが3次構造はない。ヒトαラクトアルブミンで報告されたようなSS2の実効濃度比の異常に高い値は、ニワトリリゾチームでは見られない。2.SS結合形成のキネティクス解析の基礎となる、1SS体4種についてのグルタチオンとの混合ジスルフォド体、各3種、の分離・同定を、逆相液体クトマトグラフィにて実現した。SS3の結合形成は遅く、それは混合ジスルフィド体の片方が形成されにくいためである。3.2SS体6種の酸化的再生反応において、ネイティヴSS結合2本の形成には、グリセロールの添加が有効であった。一方、ヘリックス構造を安定化するトリフルオロエタノールの添加は、却って、ネイティブSS結合の形成を阻害した。すなわち、2次構造の安定化機構と3次構造のそれは明白に異なる。4.2SS体のうちSS1とSS2を持つものは、オ-センティックなリゾチームと同程度の2次構造・3次構造・溶菌酵素活性を有する一方、SS3とSS4を持つものは少し2次構造と、ごくわずかの3次構造・溶菌酵素活性を有するにすぎなかった。これは、どちらに相当する変異体もモルトン・グロビュールであると報告されているヒトαラクトアルブミンの場合と大きく異なり、最終構造が酷似していても、蛋白質内部での局所あるいは非局所相互作用は異なることを示す。
グローバル化の中の国家なき「マイノリティ」-西欧地域主義の変容-

問題:本研究はフランスのブルターニュを事例として、グローバル化社会における西欧の歴史的地域が現在どのようにマイノリティ意識を変容させてきているかを考えることを目的とする。ケルトの遺産やフランス支配文化への抵抗で知られるブルターニュでは、1960-70年代には知識人・学生などを主体とする地域主義が発展したが、それは「エスニック・リバイバル」「民族主義的nationalitaire」と形容された。1990年代以降に見られる新しい地域主義においては、シヴィックなアイデンティティ、グローバル化の中のマイノリティ連帯を探る傾向への変化が見られるのではないか、という仮説を検証した。研究方法:制度的な変化と行為者側の分析、という2側面から検討した。ブルターニュ(ブレスト市)でアソシエーションの活動に実際に参加するなどしながら参与観察を行い、半構造化インタビューを行った。またブルターニュの例と(特に制度的差異の地域主義への影響について)比較するため、スペインのカタルーニャ(バルセロナ)で聞き取り調査を行った。研究結果:ブルターニュで1990年代後半以降に顕著となるソフトな地域主義においては、従来からの少数民族との連帯に加え、多文化主義を外側と内側に模索する様子が見られたことが指摘できる。従来の地域主義がケルト系民族やフランスの他地域に向かった「横並び」の連帯だったとすれば、現在の動きには移民文化、少数民族文化、アボリジニ文化など、様々な意味で「マイノリティ化された」他者との連帯を強調する言説が顕著となる。現在のブルターニュにおける「領域・共同体への所属」はエスノナショナリズム的志向性を持つものではなく、「反-文化平準主義」「反-単一国民文化主義」という形をとる。以上の点を特に「音楽の革新」と「移民地区の中で見るブルターニュ文化と地域アイデンティティの役割」という2側面に確認することができた。1本年度研究の主眼点:18年度はブルターニュ地域文化団体の選定をし、次に開始する質的調査の足固めをすると共に、同地域が主張する「連帯」の「対象とされる」他国地域での調査を行うことが研究の主眼であった。2海外調査:当初の計画から数点変更を行った。(1)調査地:ブルターニュ・レンヌ市の代わりにブレスト市を選択(同県内の二都市-ブレスト・カンペールー比較により対照性がより明確化するため)。同じく調査予定地だったスペインのバスク地方とアルジェリアではテロが再開し現地入りは困難となったため、カタルーニャで調査を行った。そのため、ブルターニュからの「連帯の対象」としての調査ではなく、ブルターニュと同様に地域文化を通したマイノリティ文化との連帯を探る地域との比較が課題となった。(2)調査団体:音楽・ダンス系団体を調査する予定だったが、むしろ具体的に移民文化と交流を持つ団体に対象を変更、インタビューを30余り終了。カタルーニャでは自治政府関係者への聞き取り4件終了。3分析の中心:現時点で、特に両地域の共通点・相違点に注目した場合、次の点が指摘できる。(1)ブルターニュがボトム・アップのイニシアチブで市民社会の中からマイノリティ連帯を探る傾向があるのに対して、カタルーニャでは政府主導の中、地域文化に移民などのマイノリティ文化を統合しようとする6(2)ただし、各地域の支配文化との関係(カタルーニャではスペイン文化に対抗的・ブルターニュでは仏文化と補完性を強調)が地域・移民文化関係に影響。(3)「マイノリティ同士の連帯」という主張はブルターニュに独自のもの。4来年度の課題:比較精緻化のため、ブルターニュでは制度側、カタルーニャではアソシエーション側に重点的な聞き取り作業を行う予定。5講演会実施:昨年12月にブルターニュの研究者ドゥ・フランス氏と報告者の講演会を行い、現在の地域主義変容について意見交換を行った。1研究の目的

グローバル化の中でのマイノリティ地域の連帯志向性を探ることを目的とした本研究の最終年にあたる平成19年度は、特にブルターニュでの質的調査続行、カタルーニャでの移民アソシエーションでの聞き取りを通じて、国別比較を含んだ現在の地域主義についての理論的な展望を提示することを目標とした。2現地調査カタルーニャでの調査期間を十分確保できなかったため調査依頼先との予定がかみ合わず、スペインでの調査は不可能となった。代わりにブルターニュでの調査に力を入れ、特にブレスト市での市議会議員などと非公式な会合を持った。さらに移民地区ポンタネゼンで参与観察を深め、各種アソシエーションの活動に実際参加しながら分析を行うと共に、統計資料の補充につとめた。アソシエーションに動員される層・動員されない層についての比較分析も行った。3調査結果と成果今回の調査では移民地区でのアソシエーション活動に現れる地域主義の(1)個人ネットワークと(2)組織ネットワークを分類、地域主義が必ずしも政党支持・政治活動に現れるのではなく日常的なアソシエーション活動にも複雑に作用するという側面を明らかにした。さらに、移民地区住民の中でブルターニュ地域文化に動員される層、されない層がほぼ明確に区別されることが分かった。すなわち前者はむしろ移民第1世代・40-60歳・文化資本をすでに有する層であり、後者はフランスで生まれ育った(したがって理論的にはむしろブルターニュ文化に触れる機会がより大きいと考えられる)第2世代・若者・文化資本の希薄な層である。以上の点をブルターニュ地域主義の文化志向性・統合力の問題として、理論的展望と共に総括するため、現在論文を執筆中。(研究の一部はすでに口頭発表・論文を執筆した。現在は移民地区の中でのアソシエーション活動に焦点を絞った論文を執筆、2008年6-7月脱稿予定。)
企業年金の国際課税に関する研究

本研究において、前年度に引き続き、平成16年度も人の移動と各国の企業年金税制のバラツキが引き起こす国際課税問題についてEUと日米それぞれの視点から検討を行い、さらに企業年金の投資媒体である年金ファンドの運用に関する内外差別課税についても考察した。EU域内の国境を越える企業年金課税の問題は、EC条約の枠組みのなかでの議論であり、EU域内の調整が中心である。Skandia判決が一連の判決に引き続きECJで下されたことにより、欧州委員会の各国の年金差別課税の撤廃の勧告、IORP指令制定の動きがあった。その結果、問題となる国内税法の歪みが調整され、EFRPが提唱してきた汎欧州年金基金の構想が現実化しつつあることがわかった。一方、我が国は国税不服審判所裁決以降、調整の取り組みが行われていない。米国は財務省モデル条約に国境を越える年金課税の調整規定を制定し、各国との租税条約にそれをベースにした規定を漸次導入してきた。米国の取組みはEUのそれとはアプローチが異なり、多国籍企業の国境を超える課税上の不利益をどうするかが問題であり、租税条約による調整が中心である。しかしながら、日米社会保障協定による年金二重払いの問題は調整されたものの、新日米租税条約には課税調整規定が導入されていない。我が国の国内税法は、年金ファンドの運用先が国内か外国かで差別的に扱っており、若干の諸国も類似の税法をもつ。このことは、従来の二重課税排除の考え方では調整できない重複課税をひきおこす。そのため、新日米租税条約をはじめ若干の租税条約は調整規定を導入することにより問題解決を図っている。以上の研究成果は、平成16年度に開催された学会及び国際シンポジウムにおいて研究発表を行った。さらに、欧州委員会の企業年金課税担当者との研究会における討論者として最先端の論点について議論の機会をもつことができた。本研究において、平成15年度は、人の移動と各国の企業年金税制のバラツキが引き起こす国際課税上の問題について、EUを中心に考察を行うことを目標とした。具体的には、まず第一に、我が国における現行企業年金税制が、拠出時、運用時、給付時のうちいずれのタイミングでどのように課税されるかということと、国際的視点からみた問題点を明らかにした。第二に、国境を越える企業年金課税の問題は、EUでEC条約との関係で提起されてきたので、EUの報告書、シンポジウム、ECJの判決等の議論を中心に検討した。そこでは、加盟国の企業年金税制を類型化すること、人の移動と各国企業年金税制の違いにより、「二重課税」、「二重免除」が生じる原因とメカニズムを整理すること、さらに、それを調整する場合に「二重課税」は従来の国際課税上の二重課税の概念とは異なるため、その限界をおさえること、また、国内法や租税条約による調整方法と課題は何かが分析の視点であった。第三に、この問題は多国籍企業にとって重要視されているので、その解決の一助となる汎欧州年金基金の構想を瞥見した。EUでは、ECJの判決、欧州委員会、専門家によって、問題となる国内税法の歪みが取り除かれることで、問題解決にむけての議論が前進しつつある。さらに、これらの研究は、EUを中心に行ってきたが、EUのみの議論にとどまるのではなく、我が国でもこの問題に対する考え方は十分汎用性があることが確認できた。以上の研究成果は、平成15年度に論文として公表した。
イオン選択性電極による高分子電解質とイオン性界面活性剤とのイオン会合性の評価

申請者らが開発したフロースルー型可塑化PVC膜高分子アニオンセンサーを用いて,感応物質としての両親媒性カチオンの効果といくつかの高分子アニオンや無機アニオンに対する電位応答特性を検討した.数種の両親媒性カチオンを検討した結果,感応物質としての溶媒抽出されやすさと分子構造の差異によりポリスチレンスルホン酸(PSS)に対する応答特性に特徴があることがわかった.溶媒抽出されやすい両親媒性カチオンは,PSSに対してより大きな電位変化を示した.また,アルキル直鎖の両親媒性カチオンを用いたセンサー(ACセンサー)は,比較的短い時間で一定の観測電位に達した.ACセンサーは,PSSの低濃度に対して比較的大きな電位差変化を示したが,高濃度での電位勾配は小さかった.一方,平面型や球形型の両親媒性カチオンを用いたセンサー(PSセンサー)は,ACセンサーよりも一定の観測電位に達するのが遅かったが,PSSの高濃度に対しても一定の大きな電位勾配を示した.これらのセンサーは,どの分子型の両親媒性カチオンを用いても親水性の強いポリビニル硫酸やヘパリン硫酸に対してはPSSほど大きな電位変化を示さないことがわかった.ポリビニル硫酸に対しては,PSセンサーよりACセンサーの方が大きな電位勾配を示した.また,これらのセンサーは,過塩素酸イオン,チオシアン酸イオン,ヨウ化物イオン,硝酸イオン,ドデシル硫酸イオン,ドデシルベンゼンスルホン酸イオンに対して,高濃度でいずれもネルンスト応答を示したが,溶媒抽出のされやすいアニオンに対しては,高濃度でスーパーネルンスト応答になることがわかった.多様な電位応答特性は,両親媒性カチオンの膜外への分配により膜界面で生成されるイオン会合体や高分子電解質集合体が膜電位を左右するためであると考えられた.申請者らが開発したフロースルー型可塑化PVC膜高分子アニオンセンサーを用いて,感応物質としての両親媒性カチオンの効果といくつかの高分子アニオンや無機アニオンに対する電位応答特性を検討した.数種の両親媒性カチオンを検討した結果,感応物質としての溶媒抽出されやすさと分子構造の差異によりポリスチレンスルホン酸(PSS)に対する応答特性に特徴があることがわかった.溶媒抽出されやすい両親媒性カチオンは,PSSに対してより大きな電位変化を示した.また,アルキル直鎖の両親媒性カチオンを用いたセンサー(ACセンサー)は,比較的短い時間で一定の観測電位に達した.ACセンサーは,PSSの低濃度に対して比較的大きな電位差変化を示したが,高濃度での電位勾配は小さかった.一方,平面型や球形型の両親媒性カチオンを用いたセンサー(PSセンサー)は,ACセンサーよりも一定の観測電位に達するのが遅かったが,PSSの高濃度に対しても一定の大きな電位勾配を示した.これらのセンサーは,どの分子型の両親媒性カチオンを用いても親水性の強いポリビニル硫酸やヘパリン硫酸に対してはPSSほど大きな電位変化を示さないことがわかった.ポリビニル硫酸に対しては,PSセンサーよりACセンサーの方が大きな電位勾配を示した.また,これらのセンサーは,過塩素酸イオン,チオシアン酸イオン,ヨウ化物イオン,硝酸イオン,ドデシル硫酸イオン,ドデシルベンゼンスルホン酸イオンに対して,高濃度でいずれもネルンスト応答を示したが,溶媒抽出のされやすいアニオンに対しては,高濃度でスーパーネルンスト応答になることがわかった.多様な電位応答特性は,両親媒性カチオンの膜外への分配により膜界面で生成されるイオン会合体や高分子電解質集合体が膜電位を左右するためであると考えられた.
造園樹木の樹形の計量・類型化に関する研究

本研究は、樹種に固有である樹形の特徴を量的に把握解析して法則性を見出し、究極的には樹形の類型分類あるいは樹木管理等への応用に繋げることをねらいとする。樹形の、特に量的な特徴の解明は、樹体を大きく、幹軸部、樹冠最外縁部の若い枝とシュートの層、これらを中間で結ぶ様々な次元の枝(嘗てのシュート層の数年後の姿)、という三つの段階に分けて進めるのが適当である。そこで初・二年度は、80の樹種について樹形表現に関与する大・中・小ランクの項目15個を選んでカテゴリー分けによる計測と数量化理論III類による分析を行なった。その結果、これらの樹種は、樹形の特徴によって四つのグループにまとめられ、かつそれらの樹形の印象を決める最大の因子は、樹冠全体を支える樹幹の形と量、並びに樹冠の粗密と輪郭線の凹凸の程度であることが判明した。これらの結果を承けて、第二・三年度は、代表的な落葉広葉樹の樹冠外縁部の13年生枝がどのような伸長・分枝習性を示すかを調べた。特にケヤキとカツラのシュートの伸長量(y)と節数(x)との間に、y=K-a・b^x(ケヤキ);y=x/(a+bx)(カツラ)という関係式の成立つこと、また、伸長量と分枝角度は逆相関を示すことを見出した。最終年度は樹齢の異なるケヤキ供試木の樹冠外縁部5年生までの各年齢の枝の上にできる小枝又は芽の数(y)と枝の齢(x)との関係を調べて、25年生成木の場合でいうと、関係式:log_<10>y=-0.648+0.7_xが得られた。これより若い段階の個体では、急速又はやや緩慢に立上る二次式曲線が描かれている。従って、樹齢が進むにつれて樹冠最外部の枝の分枝習性は成木の形に収斂してゆくものと推定される。本研究の目的は、一つ一つの樹種が持つ様々な樹形の特徴を量的に把握して、それらの類型化と分類を試みることである。樹形は通常、幹軸部、樹冠外縁部の若いシュート層、そしと中間で両者を結んでいる様々なオーダーの枝、という三者の配列、形状あるいは組合せによって左右される。初年度は、特に前二者の解析を計画したが、意図したシュート層の計測が思うに任せず、幹軸部の特徴の解析が中心となった。まず49種の造園樹木について樹形全体を捉える大観察項目として樹冠形、樹高と枝張りの割合及び樹幹長、中項目として樹形の骨組みとなる枝の伸長方向、小項目として樹木個々を識別する要因となる幹、枝、葉のテクスチャー等に関する20項目の量的計測を進め、類型化3類による分析を行った。各項目の区分は、樹形を定性的に識別する根拠となっている区分を最大公約数的にまとめて行った。分析の結果、研究対象となった49樹種は次の四つのグループにまとめられた。(1)樹冠は縦長、端正・緻密、樹幹は伸びて梢端に達する。(2)樹幹は梢端または樹冠の2/3まで伸び、樹冠はやや不整形。(3)樹幹は樹冠下端部で終り、樹冠は横広がりで枝先に特徴あり。

(4)明白な樹幹がなく、樹高も低く、樹冠は不整形。各グループの属性は、X軸の葉の形とその着き方、枝の太さと分枝様式等と、Y軸の樹冠形とその場合、樹幹長等によって類型化された。次年度以降は、シュートの分枝性の量的把握に努め、それが上述の各樹種の幹軸部形成とどのように結びついているかの解明に進む予定である。樹木の樹形は通常、幹軸部、樹冠外縁部の若いシュート層、そしてこれら両者を中間で結ぶ様々な次元の枝、という三者の性状や量的構成の変遷によって成立する。本研究のねらいは、一つ一つの樹種が固有に有する樹形の特徴を量的に把握し、それらの類型分類と法則性の解明を試みることにある。研究の初年度は、多数の造園樹種についてそれらの樹形あるいは樹冠形が樹幹の形状とどのような関係にあるのかを調べて若干の知見を得た。本年度は、葉序(互生:対生)や葉形(単葉:複葉)を異にする代表的な落葉広葉樹4種[ケヤキ(互、単)、ムクノキ(互、単)、カツラ(対、単)、エンジュ(互、複)]について、樹幹外縁部のシュート層、特に13年生枝部分がどのような伸長、分枝習性を示すかと、それらの習性が枝の年齢や樹冠部位によってどのように変化するかを調べた。特にケヤキとカツラでは、シュートの伸長量と節数、伸長量と分枝角度の関係を調べたところ、次の関係式が得られた。つまり、ケヤキではシュートがある程度以上長くなるとその上の葉数(節数)は一定数を超えない(節間長が長くなる)が、カツラでは節間長はシュートの長さに関係なくほぼ一定である。一方、両種とも分枝角度が大きいシュートでは逆に伸長量が小さい。また、上記両式の定数は樹冠の部位や個体の樹齢によってその値が変化する。同じ分析方法を他の多くの樹種にも適用することによって樹種間の樹体構築特性の差異を明らかにすることができると思われる。樹木の樹形は通常、幹軸部、樹冠外縁部のシュート層、これらを中間で結ぶ様々な次元の枝、という三者の形状や量的配分などを変えることによって形成される。本研究の目的は、個々の樹種に固有である樹形の特徴を量的に把握し、それらの類型分類と法則性の解明を試みることにある。本年度は、前年度にシュートの伸長量とその上の節数との間に顕著な関係を示すことが明らかになったケヤキを用いて、この樹種が、個体の樹齢の増加に伴ってどのような分枝習性の変化を示すかを調べた。その結果、樹冠外縁部5年生までの枝の各部分の齢(幹に最も近い方を0として:x)と各年齢の枝の上にできた次年度以降の枝(最若齢枝では芽)の数の合計(y)との間に次の関係式が得られた。3年生個体y=45.6-69.8x+25.2x^2いずれも二次又は対数式で、枝のある部分の齢が増えると、その上に形成された分枝の数が冪級数的に増えることを示すが、特に3年生個体に比べて5年生個体の曲線の立上りが著しく急である。また、成木は両者の中間に位置する。つまり、若齢個体のうちは、分枝の数も齢や樹冠内部位によって様々で、それに応じて緩急様々な曲線の立上りを示す。しかし、樹齢の増加とともに、樹種特有の成木の安定した曲線に収斂し、それが安定した樹冠輪郭線の表現に結びついてゆくと考えられる。
産業医学領域への遺伝子診断の応用-より積極的、正確な個人健康管理をめざして-

2)遺伝子多型と発癌性に関しては、Benzo(a)pyreneの代謝に関与する、GSTM1、P1、ハロゲン化メタンを代謝するGSTT1、アリルアミン代謝に関与するNAT2の4つの薬物代謝酵素の遺伝子多型と尿路上皮癌、胃癌、大腸癌、口腔癌感授性、喫煙との関連性を分子疫学的に解析した。その結果、GSTM1、NAT1とNAT2遺伝子多型が尿路上皮癌発症の遺伝要因であること、GSTM1、P1遺伝子多型と口腔癌との有意な関連性を見出した。また、GSTM1の遺伝子型で分け、喫煙量と発癌危険度との関連性を解析したところ、遺伝子型によってその危険度パターンが異なることが示された。同様の結果がNAT2の遺伝子型にも観察されており、化学物質の曝露に対して感受性が異なる集団の存在が示唆された。3)トリクロロエチレンを使用している作業現場を選定し、遺伝子多型と尿中総塩化物と関連性について検討した。しかし、トリクロロエチレンの曝露濃度が低く代謝酵素GSTとのあいだに関連性は認められなかった。平成10年度3. Benzo(a)pyreneの代謝に関与する、Glutathione S-transferase(GST)M1、P1、ハロゲン化メタンを代謝するGSTT1、アリルアミン代謝に関与するNAT2の4つの薬物代謝酵素の遺伝子多型と尿路上皮癌感授性、喫煙との関連性を分子疫学的に解析した。その結果、GSTM1とNAT2遺伝子多型が尿路上皮癌発症の遺伝要因であること、そして、これらの遺伝子と喫煙との相互作用が、尿路上皮癌発症に重要であることが示された。4.検診機関より情報収集を行い、トリクロロエチレン作業現場を選定した。1.アリルアミン代謝に関与する抱合体酵素N-acetyltransferase(以下NAT)1遺伝子多型と胃癌、大腸癌発症に関する症例・対照研究を行った。その結果、NAT1 PolyA siteの遺伝子多型が高分化型胃癌の遺伝的危険因子であることを明らかにした。3.Benzo(a)pyreneの代謝に関与する、Glutathione S-transferase(GST)P1の日本人における遺伝子頻度を初めて分析し、口腔癌・肺癌・胃癌・大腸癌・尿路上皮癌発症との関連性について報告した。4.アリルアミン代謝に関与する抱合体酵素N-acetyltransferase(以下NAT)1/2と尿路上皮癌との関連性を分子疫学的に解析した。その結果、NAT1とNAT2遺伝子多型が尿路上皮癌発症に関し相乗的に影響を与えていることを明らかにした。5.トリクロロエチレン作業現場の環境濃度、労働者の尿中総塩化物を測定した。1.薬物代謝酵素の遺伝子多型と発癌感受性に関する分子疫学的解析アリルアミン代謝に関与する抱合体酵素N-acetyltransferase(以下NAT)1遺伝子多型と胃癌、大腸癌発症に関する症例・対照研究を行った。その結果、NAT1 PolyA siteの遺伝子多型(MAT1^*10)が高分化型胃癌の遺伝的危険因子であることを明らかにした。2.薬物代謝酵素遺伝子多型と環境曝露との関連性に関する発癌リスクに関するモデル化これまでの疫学研究によって尿路上皮癌の環境要因として産業職場からのベンジジン、β-ナフチルアミンといった芳香族アミンの曝露や喫煙といった生活習慣が報告されている。Benzo(a)pyreneの代謝に関与する、Glutathione S-transferase(GST)M1、P1、ハロゲン化メタンを代謝するGSTT1、アリルアミン代謝に関与するNAT2の4つの薬物代謝酵素の遺伝子多型と尿路上皮癌感授性、喫煙との関連性を分子疫学的に解析した。その結果GSTM1とNAT2遺伝子多型が尿路上皮癌発症の遺伝要因であることが示された。3.いくつかの検診機関より情報収集を行い、トリクロロエチレンを使用している作業現場を選定し、遺伝子多型と尿中総塩化物との関連性について検討した。しかし、曝露環境の改善により、トリクロロエチレンの曝露濃度が低く代謝酵素GSTとのあいだに関連性は認められなかった。
水素・酸素同位体比を用いた大気中の水循環システムの解析

紀伊半島全域における渓流水を全163箇所で採水し,同位体比の空間分布特性を調査した.また,和歌山市において,渓流水を継続的に採水し,同位体比の時間変動・季節変動を調査した.同位体比の空間分布特性から緯度効果,内陸効果,高度効果,雨陰効果,雨量効果の影響について考察した.その結果,緯度,標高,海岸からの距離と同位体比との関係はみられたが,降水量との関係はみられなかった.つぎに,同位体比分布に与える地形効果を定量的に明らかにするために重回帰分析を行った.その結果,和歌山県の地表水の同位体分布に影響を与える効果として,緯度効果の影響が最も強いことが明らかとなった.しかし,線形回帰式だけでは同位体分布を説明できないことが明らかとなった.そこで,降水過程などの気象データを考慮した解析を実施した.その結果,降雨特性に関して,降水同時発生率を用いて紀伊半島の降雨特性の分類(zone分け)を行い,各zoneにおいて同位体比の特性を考察し,同位体比の空間分布が降雨特性と関連があることを明らかにした.さらに,領域内で最も早く降水が観測される場所を決定する解析方法(early-dropped rainwater analysis)を新たに提案し,レイリー過程に基づく同位体分別過程により,同位体比の空間分布特性の説明を行った.その結果,総観規模の擾乱により,紀伊半島南西部地域では同位体分布が重くなり,降雨時間間隔の短い集中的な降雨特性により,半島東部において同位体比が重くなることが明らかとなった.紀伊半島全域における渓流水を全163箇所で採水し,同位体比の空間分布特性を調査した.また,和歌山市において,渓流水を継続的に採水し,同位体比の時間変動・季節変動を調査した.同位体比の空間分布特性から緯度効果,内陸効果,高度効果,雨陰効果,雨量効果の影響について考察した.その結果,緯度,標高,海岸からの距離と同位体比との関係はみられたが,降水量との関係はみられなかった.つぎに,同位体比分布に与える地形効果を定量的に明らかにするために重回帰分析を行った.その結果,和歌山県の地表水の同位体分布に影響を与える効果として,緯度効果の影響が最も強いことが明らかとなった.しかし,線形回帰式だけでは同位体分布を説明できないことが明らかとなった.そこで,降水過程などの気象データを考慮した解析を実施した.その結果,降雨特性に関して,降水同時発生率を用いて紀伊半島の降雨特性の分類(zone分け)を行い,各zoneにおいて同位体比の特性を考察し,同位体比の空間分布が降雨特性と関連があることを明らかにした.さらに,領域内で最も早く降水が観測される場所を決定する解析方法(early-dropped rainwater analysis)を新たに提案し,レイリー過程に基づく同位体分別過程により,同位体比の空間分布特性の説明を行った.その結果,総観規模の擾乱により,紀伊半島南西部地域では同位体分布が重くなり,降雨時間間隔の短い集中的な降雨特性により,半島東部において同位体比が重くなることが明らかとなった.1.調査概要和歌山市,大阪市,富田林市において,長期間継続して降雨を採水し,雨水の微量元素および水素・酸素同位体比の分析を行った.2.同位体比に関する考察(1)海域から水蒸気が蒸発する際の蒸発速度により決定される同位体比のd値に関して,夏季と冬季に分かれた明瞭な季節変動がみられた.従来の知見によると,d値の変化は蒸発起源海域の相違によると考えられていたが,衛星画像の解析から,和歌山県に降雨をもたらす水蒸気は夏季・冬季ともに東シナ海もしくは太平洋上で生成すると考えられた.これらの結果より,蒸発速度は相対湿度の低下する冬季において太平洋上でも早くなると考えられ,和歌山県においても雨水のd値の季節変化がみられることが明らかとなった.(2)降雨の同位体比は一降雨内において大きく変動するが,降雨中に新たな水蒸気が上空に供給された場合は同位体比の変動が抑制される傾向が観測された.さらに,和歌山市,大阪市,富田林市における降水の同位体比の変動パターンは類似しており,数十kmスケールではほぼ同時に同位体比が変動することが明らかとなった.3.化学組成に関する考察(1)和歌山市,大阪市,富田林市における降水のCl^-,Na^+,Mg^<2+>は海水粒子であり,NO_3^-,SO_4^<2->,NH_4^+,K^+, Ca^<2+>は土壌粒子や人間活動による放出物であることが明らかとなった.陰イオン中にCl^-が占める割合は内陸に進むにしたがって減少し,NO_3^-,SO_4^<2->の占める割合は内陸に進むにしたがって増加した.(2)和歌山市でのpH値はpH6.1であり,大阪市(pH5.2)と富田林市(pH5.1)と比較して非常に高い値を示した.この原因として,和歌山市では雨水に陽イオン成分が他の地域より多く含まれているためである結果が示された.1.調査概要

和歌山県における渓流水の採水を全57箇所において実施し,渓流水の水素・酸素安定同位体比の空間分布特性を調査した.また,和歌山市において,降雨を継続的に採水し,水素・酸素安定同位体比の時間変動・季節変動を調査した.2.研究業績の要約本研究では,渓流水の水素・酸素同位体比を分析し,その空間分布特性から緯度効果,内陸効果,高度効果,雨陰効果,雨量効果の影響について考察した.その結果,緯度,標高,海岸からの距離と同位体比との関係がみられたのに対して,降水量との関係はみられなかった.つぎに,同位体比分布に与える地形効果を定量的に明らかにするために重回帰分析を行った.その結果,和歌山県の地表水の同位体分布に影響を与える効果として,緯度効果の影響が最も強いことが明らかとなった.また得られた重回帰式を用いて,同位体比の空間分布を予測した.実測値との誤差がみられた地域については,地形効果以外の他の要因を考慮する必要があり,降水過程などの気象データと合わせた,より詳細な解析を行う必要があると考えられる.また,調査範囲を和歌山県に限って解析を実施したが,和歌山県内で最も重い水は三重県との県境の新宮で観測され,また,最も軽い水は奈良県との県境付近の高野山において観測された.したがって,調査対象域のゾーニングの影響もあることから,広域の水循環を考えるためには,調査範囲を拡大する必要があるといえる.今後は,定点における時間変化と広域での空間変化から,大気中における水循環システムのより詳細な解析を行う予定である.1.調査概要紀伊半島全域における渓流水の採水を全163箇所において実施し,渓流水の水素・酸素安定同位体比の空間分布特性を調査した.また,和歌山市においで渓流水を継続的に採水し,水素・酸素安定同位体比の時間変動・季節変動を調査した.2.研究業績の要約本研究では,渓流水の水素・酸素同位体比を分析し,その空間分布特性から緯度効果,内陸効果,高度効果,雨陰効果,雨量効果の影響について考察した.その結果,緯度,標高,海岸からの距離と同位体比との関係がみられたのに対して,降水量との関係はみられなかった.つぎに,同位体比分布に与える地形効果を定量的に明らかにするために重回帰分析を行った.その結果、和歌山県の地表水の同位体分布に影響を与える効果として,緯度効果の影響が最も強いことが明らかとなった.しかし,線形回帰式だけでは同位体分布を説明できないことが明らかとなった.そこで,降水過程などの気象データを考慮した解析を実施した。その結果,降雨特性に関して,降水同時発生率を用いて紀伊半島の降雨特性の分類(zone分け)を行い,各zoneにおいて同位体比の特性を考察し,同位体比の空間分布が降雨特性と関連があることを明らかにした.さらに,領域内で最も早く降水が観測される場所を決定する解析方法(early-dropped rainwater analysis)を新たに提案し,レイリー過程に基づく同位体分別過程により,同位体比の空間分布特性の説明を行った.その結果,総観規模の擾乱により,紀伊半島南西部地域では同位体分布が重くなり,降雨時間間隔の短い集中的な降雨特性により,半島東部において同位体比が重くなることが明らかとなった.
ヘテロマーＧＰＣＲ受容体を指向したアロステリックリガンドによる機能変化の応用研究

医薬品全体の30%以上が標的とするGタンパク質共役型受容体ファミリーは、二量体または多量体で機能する。ヘテロマー受容体複合体は、ホモ受容体を形成した際には見られない、全く新たな受容体機能を獲得する例が明らかになりつつある。本研究では、受容体複合体を機能単位として捕らえ、この働きを制御する手法を開発することを目的とした。具体的な応用例として、オピオイド受容体と複合体を形成するGタンパク質共役型受容体について、各種のスクリーニング系を開発して検索し、オピオイドの鎮痛効果を増強する或は副作用を軽減する新たな方法について、基礎的知見を得ることに成功した。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は創薬の対象分子ファミリーとして重要な位置を占め、上市されている医薬品の30%以上がGPCRファミリーに属する受容体を標的としている。最近では、これまで困難であった構造解析研究の成果により、特定のGPCRが特異的薬物やGタンパク質と分子間相互作用する機序の詳細について知見が得られている。GPCR分子単体での構造は解明されつつあるが、未だ課題も残されている。具体的には、近年このGPCRファミリーは二量体または多量体で機能することが報告されており、同種受容体同士が二量体を形成するホモマー複合体受容体に加え、互いに異なる受容体モノマー同士が一つのヘテロマー複合体受容体を形成し、構成要素となる受容体モノマーがそれぞれホモ受容体を形成した際には見られない、全く新たな受容体機能を獲得する例が明らかになりつつある。しかし、受容体複合体を機能単位として捕らえ、この働きを制御することを目的とした創薬手法は未だ開発されておらず、この点が本研究の果たす役割と考えられる。具体的な応用例として本研究では、オピオイド受容体と複合体を形成し得るGタンパク質共役型受容体について、各種のスクリーニング系を開発しながら検索し、オピオイドの鎮痛効果を増強する或は副作用を軽減する化合物を見出すことを目的としている。これまでの成果を踏まえ、本年度は、オピオイド受容体による鎮痛、耐性獲得機能に影響を与える化合物のスクリーニング系を培養細胞系において確立し、実際にスクリーニングと見出した化合物の効果の評価を行なった。その結果、オピオイド受容体刺激薬のモルヒネと相互作用する非オピオイド受容体リガンドで、モルヒネと共存する場合には、アデニレートサイクラーゼ(AC)のフォルスコリン感受性亢進を有意に抑制する複数の化合物を見出すことに成功した。申請者らは本研究課題、ならびにこれまでの研究において、オピオイド受容体と複合体を形成し得るGタンパク質共役型受容体を各種のスクリーニングを開発しつつ検索している。特に、オピオイドの鎮痛効果を増強する或は副作用を軽減する化合物について、最も強力な鎮痛効果を持つモルヒネが、mu-オピオイド受容体を介して起こす薬物耐性や依存性を軽減させるためのリガンドや複合体形成を起こし得る非ピオイド受容体の同定を目指している。本年度は、発現細胞株を用いた実験においてMOR1受容体と非オピオイド受容体との相互作用を確認し、確認できた非オピオイド受容体に関し、生体内でも同一細胞に共発現し、直接相互作用する可能性があるかについてデータベース検索と、実際の脳内組織分布解析によって受容体共存の有無について検討した。非オピオイド受容体の脳内における発現分布について、まず公共データーベース(Allen brain atlas、Expression omnibus、GEO)より収集し、実際に免疫組織染色により実験的に確認した。特にMOR1受容体が発現する下行性痛覚抑制性経路や中脳、視床下部、側坐核などオピオイド耐性、依存性形成に関わる部分について詳しく解析を行った。さらに、MOR1受容体に対する抗体と非オピオイド抗体との2重染色を行なったところ、MOR1受容体と中脳において共発現するためヘテロマー受容体を形成し得る受容体を見出すことに成功した。また、オピオイドリガンドの受容体に対する親和性を解析するために、放射線標識オピオイドリガンドと未標識オピオイド化合物、受容体発現細胞からの膜分画試料の3種類を用いた受容体結合実験を行なった。受容体を共発現させヘテロマー受容体の存在が考えられる場合、さらに非オピオイド受容体に対する未標識非オピオイド化合物を加えて起こるアロステリック効果を検出することに成功した。これまでの薬の約30%以上が標的としているGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、医薬品が作用する分子群として重要な位置を占める。GPCRを標的とする医薬品を開発する際、多くは特定の受容体に選択的に作用する化合物を得ることを目指す。また、GPCRの内在性リガンドについても、多くは限られた受容体サブタイプにのみ結合する。近年の構造解析研究の成果により、特定のGPCRが特異的薬物やホルモンと分子間相互作用する分子機序が明らかになりつつあり、in silicoでの薬物スクリーニングにも応用が期待されている。

今年度の研究において我々は、GPCRのアロステリックリガンドを検索する過程で、特異な受容体選択性を示すペプチドリガンドを発見した。すなわち、既に知られるリガンドと受容体の対応関係を越え、複数の受容体ファミリーを含む、広範囲な受容体に結合が可能な合成ペプチドの同定に成功した。この合成ペプチドは元来サブスタンスP受容体の拮抗薬として開発され、ボンベシン受容体にも阻害効果を持つことが注目されていた。我々は、さらにこの合成サブスタンスP受容体拮抗薬が、バゾプレッシン受容体サブタイプV1b、V2、さらにオキシトシン受容体にも結合することを見出した。さらに、GPCRファミリー受容体のアミノ酸配列とリガンドの結合親和性を合わせて解析することにより、ある受容体とリガンドの親和性を予測することを可能とする薬理学的リネージ解析法を確立した。この解析法により、GnRH受容体の合成サブスタンスP受容体拮抗薬への親和性を予測することに成功した。以上より、アロステリックリガンドとともに、広域な親和性を持つペプチドは、ヘテロマーを形成した受容体の機能調節に有効な手段であると示唆され、今後のリガンド探索に有効なツールであると考えられられた。薬理学臨床的には強力な鎮痛効果示すモルヒネであるが、繰り返し使用するにより、鎮痛効果の減弱である鎮痛耐性や、身体的薬物依存を起こす場合が知られる。本研究では、ヘテロマー複合体受容体をモデルに、副作用の発現機序を解明し、予防に役立てる手段を探索することが主要な目的の一つとなっている。昨年度からの研究により、研究の第一段階として、MOR1オピオイド受容体と相互作用する非オピオイド受容体をスクリーニングし、相互作用が確認できた受容体の生体内における共発現解析を進めてきた。mu-オピオイド受容体と直接相互作用する可能性がある受容体については、オープンソースのデータベースにある発現分布情報と、実際の脳内組織分布解析を合わせて受容体の共存情報をより確実な形で得ることに成功した。さらに本年度も、cAMPの産生を抑制するオピオイド受容体の機能が、ヘテロマー発現細胞で変化するかについて、オピオイド単独、あるいは非オピオイドリガンドとの共存下で検討を行った。さらにMOR1受容体単独発現細胞では非オピオイドリガンドの効果は見られないことをネガティブコントロールとして確認しながら確実に研究を進めている。以上より、オピオイド受容体を介して起こす薬物耐性や依存性を軽減させるためのリガンドの候補が発見されつつあり、研究は本年度まで予定通りおおむね順調に進行していると考えられた。本課題全体では、ヘテロマー受容体が形成されることが知られるオピオイド受容体について新しい薬物を探索し、新規オピオイド受容体ヘテロマーを対象に麻薬鎮痛薬の効果増強、有害作用抑制に関わる化合物を同定することを目的とする。そこで本年度は、計画したごとく、ヘテロマーを形成し得る非オピオイド受容体について、オピオイド受容体と発現分布が重なり生体内でヘテロマー受容体が存在し得る可能性について検討し、両受容体が共発現することを細胞レベルで明らかにすることに成功した。また競合的受容体結合実験を実施し、モルヒネを含むオピオイドの受容体膜分画への親和性を変化させる非オピオイド化合物について探索を行なった。
ANGPTLによる免疫グロブリン様受容体を介した免疫制御機構の解析

これまで私共はAngptl2が造血幹細胞の分化を阻害し体外増幅を促進する事を明らかにし、免疫グロブリン様受容体が関与する事を明らかにしてきた。近年Angptl2は慢性炎症の発生に重要な役割を果たしていることが報告されているが、どのような機構で炎症病態に関与しているか、ほとんど明らかになっていなかった。本研究によりAngptl2がマウス腹腔マクロファージ、単球を活性化し、NO合成酵素やプロスタグランジン合成酵素、IL-1β、IL-6、TNFα、CSF2などの様々な炎症性遺伝子の転写を劇的に増大させる事が明らかになり、炎症におけるAngptl2の新しい機能が示された。本研究ではAngptl2が抑制性免疫グロブリン様受容体を介して、免疫担当細胞にどのような作用を与えるか解析し、その分子メカニズムを明らかにする事を目的とした。まず、活性を持ったAngptl2蛋白質を実験に用いる為、末端にFlagタグ配列を付加したAngptl2遺伝子をコードするレトロウイルスを作成し、293T培養細胞に感染させ、Angptl2を安定して産生する培養細胞株を樹立した。培養液中に分泌される修飾型のAngptl2-Flag蛋白質を抗Flag抗体を用いて精製することで、Angptl2-Flag蛋白質を安定して供給する系を確立した。次に、LILRB2のマウスホモログPirBを発現している免疫担当細胞であるマクロファージを対照にAngptl2の作用を解析した。マウス骨髄細胞をGM-CSFによりM1型マクロファージ様細胞に分化させ、Angptl2-Flagを加えたところ、形態的な変化は見られず、TNFa、IL-6、IL-10などのサイトカインの産生も見られなかった。また、LPS刺激による形態変化、TNFaなどのサイトカインの産生誘導にも、ほとんど影響を与えず、マイクロアレイによる遺伝子発現解析でも注目すべき差は認められなかった。M-CSFで分化させたM2型マクロファージ様細胞に対しては、形態的にも、TNFα、IL-6、IL-10などのサイトカインの産生に対し、なんら影響を与える事はなかったが、NFκBが核移行することが明らかとなった。以上より、Angptl2は、M2型のマクロファージに対して、何らかの未知の作用があると考えられ、現在、M2型のマクロファージを対象とし、Angptl2の作用の解析を進めている。本研究ではAngptl2が抑制性免疫グロブリン様受容体を介して、免疫担当細胞にどのような作用を与えるか解析し、その分子メカニズムを明らかにする事を目的としている。初年度には、活性を持ったAngptl2を安定して産生する培養細胞株を樹立し、培養液中に分泌される修飾型のAngptl2-Flag蛋白質を安定して供給する系を確立した。次いで、免疫学的実験に良く用いられる骨髄由来マクロファージやRAWマクロファージ様細胞、B細胞、T細胞由来の細胞などPirBを発現している細胞を中心にAngptl2に対する反応を解析したが、明らかな反応を見出す事はできなかった。しかし、今年度、マウス生体由来の免疫細胞を用いてAngptl2の作用を検討する過程で、特定の免疫担当細胞群が生理的な濃度のAngptl2で活性化され、形態的に変化する事を見出した。この免疫担当細胞群は培地中にIL-6、IL-1、TNFαといった炎症性サイトカインをLPSで刺激した場合と同じレベルで産生しており、炎症性サイトカインの遺伝子発現のレベルはAngptl2処理3時間で顕著に増加していることから、Angptl2直接の作用であると考えられた。これまでAngptl2の刺激により免疫担当細胞に蛋白質レベルでIL-6、TNFαといったサイトカインの産生が起こる事を示した報告はなく、Angptl2の新たな生理的な作用の一つである。更に、Angptl2がどのような細胞内シグナルを介してサイトカインの産生を誘導するか検討したところ、LPS刺激と同様に、3つの主要なMAPキナーゼ( ERK、JNK、p38 )の活性化とNFκBの核移行が認められ、それらの免疫反応応答経路を介していることが示唆された。まず、活性を持ったAngptl2を産生する培養ヒト細胞株を樹立し、Angptl2-Flag蛋白質を安定して供給できる系を確立した。次いで、免疫学的実験に良く用いられる骨髄由来マクロファージやRAWマクロファージ様細胞、B細胞、T細胞由来の細胞などAngptl2受容体であるPirBを発現している細胞を中心にAngptl2に対する反応を解析したが、明らかな反応を見出す事はできなかった。しかし、マウス生体由来の免疫細胞を用いてAngptl2の作用を検討した結果、腹腔マクロファージがAngptl2で活性化され、培地中にLPS刺激と同じレベルのIL-6、IL-1、TNFαといった炎症性サイトカインを分泌することが明らかになった。これまでAngptl2の刺激により免疫担当細胞に蛋白質レベルでIL-6、TNFαといったサイトカインの産生が起こる事を示した報告はなく、Angptl2の新たな生理的作用の1つと考えられる。更に、Angptl2がどのような細胞内シグナルを介してサイトカインの産生を誘導するか検討したところ、Angptl2はLPS刺激と同様にd3つのMAPキナーゼとNFκBを活性化することが明らかになった。

しかし、Angptl2によるマクロファージの活性化とLPSによる活性化の遺伝子発現変化を比較したところ、変動パターンに差異が認められ、LPS刺激とは異なる反応を引き起こしていることが明らかになった。また、大腸菌に産生させたAngptl2や、in vitro翻訳システムにより産生したAngptl2による腹腔マクロファージの活性化は認められなかったことから、Angptl2の造血幹細胞の増殖促進作用とは異なる分子機構を介している事が示唆された。以上のように本研究で、Angptl2が未知の受容体を介して腹腔マクロファージを特異的に活性化する事が明らかになった。これまで私共はAngptl2が造血幹細胞の分化を阻害し体外増幅を促進する事を明らかにし、免疫グロブリン様受容体が関与する事を明らかにしてきた。近年Angptl2は慢性炎症の発生に重要な役割を果たしていることが報告されているが、どのような機構で炎症病態に関与しているか、ほとんど明らかになっていなかった。本研究によりAngptl2がマウス腹腔マクロファージ、単球を活性化し、NO合成酵素やプロスタグランジン合成酵素、IL-1β、IL-6、TNFα、CSF2などの様々な炎症性遺伝子の転写を劇的に増大させる事が明らかになり、炎症におけるAngptl2の新しい機能が示された。今年度は、大量調製したAngptl2蛋白質を用いて、予定通り様々な細胞の反応について検証を行った。その過程で、マウスの免疫担当細胞で、修飾型のAngptl2に特異的に反応を示す特殊な細胞群の存在が明らかになり、それら細胞群の性質を詳しく検証する事ができたことから、当該研究はおおむね順調に進展していると考えている。生化学、免疫学Angptl2刺激により、炎症性遺伝子の発現が誘導されることから、Angptl2がどのような経路で、この転写因子を活性化するか、また、その下流でどのような遺伝子の発現が調節されているか明らかにする。Angptl2処理したAngptl2反応性細胞の細胞内蛋白質を経時的に回収しAngptl2刺激後に細胞のリン酸化蛋白質を分離し、ディファレンシャル2次元電気泳動によって細胞内の蛋白質のリン酸化状態に変化の見られるシグナル蛋白質を同定する。また、Angptl2処理した細胞のmRNAを回収し、マイクロアレイ法により、Angptl2処理により発現変化の見られる遺伝子を探索する。LPS刺激により変化の見られる遺伝子群との比較からAngptl2の関与するシグナル系の同定を試みる。また、Angptl2反応性免疫担当細胞と、NFκBの核移行が確認できたM-CSF刺激により分化させた骨髄由来マクロファージ様細胞、NFκBの核移行が見られなかったGM-CSF刺激により分化させた骨髄由来マクロファージ様細胞の発現遺伝子の差異を解析する事で、Angptl2の受容体候補分子を選択する。選択した受容体候補蛋白質の発現を分子遺伝学的手法を用いて増減させ、Angptl2の反応性が変化するかを指標に受容体の同定を行う。次いで、受容体候補の免疫沈降実験を行い、Angptl2処理により、会合する蛋白質の増減や受容体自身のリン酸化状態を解析し、Angptl2シグナルに関与しているか明らかにする。以上の解析を行う事で、受容体から遺伝子発現制御に至る一連のAngptl2シグナル系を明らかにして行く予定である。
グルタミン酸伝達調節による難治性抑うつ状態の治療法開発に関する研究

NMDA型グルタミン酸受容体遮断薬のケタミンが、難治性抑鬱状態を速効的に改善することに着目し、新規抗うつ薬の手がかりを得るため、NMDA受容体の内在性コアゴニストであるD-セリンのシグナル調節の分子細胞機構を解析した。D-セリン合成酵素のセリンラセマーゼ、細胞内外のD-セリン濃度に影響するDsm-1、亜鉛イオン等が、本受容体に直接作用する細胞外D-セリン又はグルタミン酸の濃度調節に関与することがわかり、NMDA受容体機能抑制性抗うつ薬の開発標的の可能性が示唆された。また、本受容体GRIN2Bサブユニットの遮断薬で既認可薬のイフェンプロディールの難治性抑鬱状態に対する、臨床投与試験を開始した。標準的な薬物療法に抵抗する難治性の抑うつ状態は、気分障害、脳器質性障害その他の精神疾患でしばしば認められ、患者の日常活動を著しく障害するだけでなく、自殺行動に結びつくことも多いことから、新しい治療法の開発が医学的・社会的急務となっている。本研究では、NMDA型グルタミン酸受容体遮断薬が、難治性抑うつ状態に対して即効的で持続する効果を発揮することや、抑うつ状態の動物モデルを改善することが報告されている点に注目し、NMDA受容体機能を、本受容体の様々な調節部位やそれ以外の分子細胞システムを介して抑制することによって、難治性抑うつ状態を改善する、新規治療法を開発するための基礎的・臨床的研究を行う。今年度は、新規治療法の手がかりを得る目的で、NMDA受容体機能促進作用をもつ内在性物質のD-セリンが結合する本受容体グリシン調節部位の選択的拮抗薬5,7-dichrolokynurenate(DCK)を、ラットの脳室内に注入し、脳内各部位で、抑うつ状態と関係の深いdopamine(DA)およびserotonin(5-HT)の代謝や、行動量への影響を観察した。DCK投与により、内側前頭葉皮質のDA代謝回転の指標(主要代謝産物3,4-dihydroxyphenylacetic acidのDAに対する比)が有意に軽度な上昇を示し、自動測定装置のケージ内での行動量が増加することがわかった。内側前頭葉皮質の5-HT代謝、線条体と、中脳辺縁系DAニューロンの投射領域(側坐核・嗅結節・中隔を含む)におけるDAおよび5-HT代謝の指標には有意な変化は認められなかった。これらの影響は、グリシン調節部位の選択的拮抗薬が抗うつ効果をもつ可能性が示唆された。また、D-セリンの取り込みや放出を修飾する分子の気分障害患者死後脳における発現を検討した(特許に関連する可能性があり具体的情報は公表しない)。今年度は、新規治療法の標的となるNMDA受容体の調節の分子細胞機構を明らかにする目的で、本受容体活性化に必須のコアゴニストのD-セリンについて、その合成酵素・セリンラセマーゼ(SR)と細胞内外のD-セリン濃度の関係を調べた。共同研究者のハーバード大学コイル教授から供与された、SR遺伝子を胎生期から欠損マウスの内側前頭葉皮質において、野生型littermate controlと比べて、組織中および細胞外液中Dの-セリンが著明に低下し、従来の報告と一致したが、NMDA受容体機能を反映すると考えられる、NMDA局所注入後の細胞外タウリン濃度の上昇は、変化が見られなかった。我々の他の実験系ではSRのコンディショナルノックアウト後、比較的短期間では、同様の操作で細胞外タウリン濃度の上昇の抑制が見られたことから、胎生期からのD-セリン濃度低下が、もう一つの内在性NMDA受容体コアゴニストであるグリシンによって代償されたと推測された。これらの結果は、NMDA受容体機能を治療目的で抑制するためには、D-セリンとグリシンの相互作用を考慮する必要があることを示唆している(特許に関連する可能性があり具体的情報は公表しない)。