hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音刺激フィードバックによりスポーツ動作中の筋活動を高めるリハビリテーションの確立

本研究の目的は,スポーツ外傷により筋機能が低下した症例に対して,音刺激(聴覚情報)によるフィードバックを用いて筋活動の賦活を促し,動作習得の促進を試みる新たなリハビリテーション手法を確立することである.平成30年度は,前年度までに計測したパイロット実験の手法を元に本データの収集に取り組み,本研究課題の根幹となるデータの一部を収集することを到達目標に設定した.足関節捻挫群を対象に実験を実施し,ホップ動作中の足関節キネマティクスに関するデータを収集することができた。しかし,動作課題が音刺激のフィードバックに十分に適さない課題も明らかとなり,一部動作課題に修正を加える必要が発生したが,研究グループで予備実験を繰り返すことにより解決に至った。これらの課題解決により,本研究の目標である「足関節捻挫受傷者に対して音刺激フィードバックを用いて筋活動を賦活すること」のデータ収集が可能となった.本研究課題は,得られた研究データを着実に論文としてアウトプット可能な段階に入っており,平成30年度の到達目標は当初見込を上回る成果を上げることができたと考える.本研究の研究予定期間(4年)の内,前半の2年間で目標とした測定システムの構築し、3年目となる平成30年度は本データの計測に着手することができた。前年度の課題となっていた、足関節捻挫群の被検者選定についても、適切な質問紙調査や評価にて選別することが可能となった。また、音刺激フィードバックを行う筋活動レベル(%MVCの設定)についても、実験データから適性値を導くことができ、本データ収集を進めることに繋がった。これまでに計測したデータは、本データの一部であり、測定上一部修正が必要な部分があるものの、概ね順調に進展していると考える。また、研究成果のアウトプットについては、国際誌1編、国内誌3編のアクセプトがあり、当初予定よりも前倒しで進めることが可能であった。一方、本務のスケジュールの都合等により、当初予定していた国際学会における発表は見送ることとなり、国内学会での発表に止まった(第1回足の構造と機能研究会学術集会,2018年5月)。令和元年度は、本データのアウトプットにより注力しながら、学術的情報のインプットでも不足が無いよう、国際学会へ積極的に参加し、情報収集する必要がある。以上より,現在までの進捗状況は概ね順調に進展していると判断できる。今後は、課題を解決した上で,本研究課題の完了に向け、本実験および研究成果のアウトプットを進める予定である.令和元年度は,足関節捻挫群に対して音刺激フィードバックを行い,スポーツ動作中における筋活動を賦活させるリハビリテーションを確立する予定である.これらの実現にあたり,本実験のデータをさらに蓄積する必要がある。これまでは、ホップ動作におけるフィードバックに限定してデータ収集を進めていたが、本研究課題が推し進める新たなリハビリテーション手法をより一般化するためには、その他の動作課題についても検証することが求められる。当初予定のホップ動作に加え、一般的な筋力トレーニング、バランストレーニングにおいても筋活動を賦活することを確立できれば、本研究課題を汎用性の高いリハビリテーションとして提案できる可能性がある。具体的には、複数の群(種目別トレーニンググループ)を設定し、音刺激フィードバックの介入プログラムを展開する.介入プログラムでは,運動中の下肢筋活動をモニタリングし,一定の筋活動量(%MVC)に達した時点で音刺激によりフィードバックを行う。介入期間は約8週間とし,介入後に再度スポーツ動作中の筋活動量を計測し,介入効果を検証する。これらのデータを分析した上で、本研究で開発したプログラムの普及に向けた内容を展開予定である。一般化に向けては、再現性や簡便性を十分に検討する必要があるが、これらについては実験を積み重ねることで得られる工夫更と、根拠となるデータの蓄積が必須である。研究を進める段階で生じる問題点については,北翔大学研究センター研究員および札幌医科大学の医師および理学療法士で本研究領域に高い専門性を有する研究者に助言を得ることにより,適切な解決策を講じて研究を遂行する予定である。本研究の目的は,スポーツ外傷により筋機能が低下した症例に対して,音刺激(聴覚情報)によるフィードバックを用いて筋活動の賦活を促し,動作習得の促進を試みる新たなリハビリテーション手法を確立することである.平成28年度は,実験環境における計測システムを構築し,データ測定から解析までの流れを完成させること目標に設定した.本研究では,下肢の筋活動状態を簡易式筋電計を用いてモニタリングし,さらに,筋活動レベルに応じて電子音によりフィードックするシステムが必要である.実験で使用する簡易式筋活動モニタ(MuscleAlive,身のこなしラボラトリー社)は,一定の筋活動レベルに到達すると電子音が鳴る機器であるが,機器はモニタリング用に開発されたものであり,測定データを記録および解析する機能は有していない.そこで,機器開発社と研究代表者間で直接打ち合わせを行い,測定データを記録し,分析できるよう測定機器のカスタマイズを進めた.システムの改良を重ねた結果,電子音が発生したデータを特定(ラベリング)することが可能となり,予定していた実験が実現可能なシステム環境が構築された.また,パイロット実験を実施する過程で,本研究で測定予定である足関節筋力の測定再現性が乏しいことが明らかとなった.この問題を解決することを目的に,足関節筋力測定用の機器を新たに制作した(足関節外返し/内返し筋力測定器,竹井機器工業株式会社).

これにより,筋力測定の高い再現性が担保され,精度の高い測定が実施できる環境を整備することに繋がった.以上により,平成28年度の目標とした簡易式筋活動モニタを用いて,動作中の筋活動のモニタリングおよび音刺激によるフィードバックの効果を判定するための測定方法を確立させることが概ね達成できた.本研究の研究期間は4年間であるが、平成28年度は初年度にあたり、実験環境の整備、測定システムの構築が到達目標であった。本研究で使用予定の機器には、大幅なカスタマイズが必要であり、カスタマイズにあたっては技術者と協働して進めることが求められた。測定機器の開発者と試行錯誤を重ね、本研究で必要なデータを収集できる測定環境を整えることができたことは、次年度以降のデータ収集に向けた大きな進展であった。また、パイロット実験を重ねる中で発生した問題点についても、新たな測定機器を考案し、従来の測定機器では難しかった精度の高い測定を可能とすることで解決することができた。研究を進める過程で起こる新たな課題に対しても、研究協力者らと協議を重ねることで柔軟に対応することができ、研究進捗に大きな影響を及ぼさなかった。以上より、現在までの進捗状況は概ね順調に進展していると判断できる。研究が順調に進む中、現段階で不足している点は、最新の学術的情報のインプットである。同領域の学術論文は収集しているが、海外の研究者らとディスカッションをしながら情報を得る機会は十分に得られていない。平成29年度以降は、これらの課題を解決するため、積極的な学術集会参加が必要である。本研究の目的は,スポーツ外傷により筋機能が低下した症例に対して,音刺激(聴覚情報)によるフィードバックを用いて筋活動の賦活を促し,動作習得の促進を試みる新たなリハビリテーション手法を確立することである.平成29年度は,前年度までに構築した計測システムを元に,パイロット実験を進め,基礎データを収集することを到達目標に設定した.健常者を対象に実施した実験では,本研究が測定するフィールドテストに含まれるホップ動作中の足関節運動を,3次元動作解析装置を使用して詳細に計測することができた.また,筋活動および床反力のデータを同期するシステムも構築した.これらの実現により,本研究の目標である「足関節捻挫受傷者に対して音刺激フィードバックを用いて筋活動を賦活すること」の効果検証を確認することが可能となった.研究成果のアウトプットとしては,平成28年度に制作した「足関節外返し/内返し筋力測定器(竹井機器工業株式会社)」を用いた足関節筋力評価の精度をデータ化し,国内学会で発表する機会を得た(第1回足の構造と機能研究会学術集会,2018年5月発表予定).また,測定中の運動疲労を数値化する手法についても確立し,これらの基礎データを国内学会で発表した(第28回日本臨床スポーツ医学会学術集会,2017年11月).さらに,本研究の基礎データとなる実験データは国内学術誌に投稿し,アクセプトされた(日本アスレティックトレーニング学会誌,3巻, 1号,p39-44).本論文作成を通じて、本研究の根幹となる測定手法や分析方法について十分に検証し,確立することができた.
ユーラシアステップ植生の体系化と種分布モデルによる群落の将来分布予測

中国北東部からハンガリーにかけて広大に広がるユーラシアステップ(以下ステップ)では,近年放牧や耕作といった人為圧の増大による草原退行・砂漠化が急速に進行している.このような現状においてステップにおける持続的な草原利用に寄与するために,種組成に基づく植生の体系化と,植生の体系化により区分された群落の将来分布予測を行った.モンゴルを中心に多点で植生資料の収集を行い,既存研究の植生資料とともに植物社会学的方法による群落区分を行った.さらに区分された群落の分布を規定する環境要因を明らかにするために,降水量や気温の因子を説明変数とする多変量決定木モデルを構築し,その結果を用いて将来分布予測を行った.多変量決定木モデルの構築を行った結果,各群落の分布を規定する気候要因として降水量に関係する因子と気温に関係する因子の両方が選択され,乾湿傾度で各群落の分布が規定されていることが示された.その結果を用いて現在気候下における分布を予測した結果,各群落の分布は高精度で予測された.そこで将来分布予測を行った結果,モンゴル中東部においてステップの分布は南に分布ポテンシャルを拡大する可能性が示された.一方でモンゴル南西部ではステップの分布は縮小する可能性が示された.今後本体系を用いることで各地域の本来分布しうる群落の種組成やその特徴を容易に把握することが可能となる.また将来分布予測結果を用いることで将来的な植生変化を考慮した草原利用方法の構築が可能になると考えられる.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。中国北東部からハンガリーにかけて広大に広がるユーラシアステップ(以下ステップ)では,近年,過放牧や耕作,地下資源開発などの人為圧の増大により,急速に草原退行が進行している.このステップの持続的管理を目指し,自然性の高い植生の種組成データを用いて,群落ベースでの植生の体系化を行うこと,各群落の将来分布予測を行うことを目的として研究を開始した.モンゴル中部とステップ中央部に位置するロシア・ハカス共和国で現地植生調査を行った.これまで取得してきた植生調査資料と本年度新たに取得した植生調査資料,さらには既存研究の植生調査資料を用いて,植物社会学的方法による群落区分を行った.区分された群落の分布を規定する降水量や気温といった環境要因を明らかにするために,多変量回帰木と一般化加法モデルを用いて解析を行った.解析結果を用いて,各群落の将来分布予測を行った.ステップ各地の自然性の高い植生が種組成に基づいて体系的にまとめられ,地域ごとの種組成の特徴が明らかになった.今後,本体系が,現地の草原管理者や他研究者による草原状態の判断等に利用されることが期待される.また,区分された群落の分布規定要因の解明とその結果を用いた各群落の将来分布予測を行ったことにより,各群落の現在および将来の分布を空間的に把握できるようになった.今後,脆弱な生態系になりうる地域はどこか等の,将来的なリスクを考慮しての持続的管理方法の構築に利用されることが期待される.中国北東部からハンガリーにかけて広大に広がるユーラシアステップ(以下ステップ)では,近年放牧や耕作といった人為圧の増大による草原退行・砂漠化が急速に進行している.このような現状においてステップにおける持続的な草原利用に寄与するために,種組成に基づく植生の体系化と,植生の体系化により区分された群落の将来分布予測を行った.モンゴルを中心に多点で植生資料の収集を行い,既存研究の植生資料とともに植物社会学的方法による群落区分を行った.さらに区分された群落の分布を規定する環境要因を明らかにするために,降水量や気温の因子を説明変数とする多変量決定木モデルを構築し,その結果を用いて将来分布予測を行った.多変量決定木モデルの構築を行った結果,各群落の分布を規定する気候要因として降水量に関係する因子と気温に関係する因子の両方が選択され,乾湿傾度で各群落の分布が規定されていることが示された.その結果を用いて現在気候下における分布を予測した結果,各群落の分布は高精度で予測された.そこで将来分布予測を行った結果,モンゴル中東部においてステップの分布は南に分布ポテンシャルを拡大する可能性が示された.一方でモンゴル南西部ではステップの分布は縮小する可能性が示された.今後本体系を用いることで各地域の本来分布しうる群落の種組成やその特徴を容易に把握することが可能となる.また将来分布予測結果を用いることで将来的な植生変化を考慮した草原利用方法の構築が可能になると考えられる.26年度が最終年度であるため、記入しない。植生調査資料が不足しているモンゴル中部と,ステップ中央部に位置するロシア・ハカス共和国において,現地植生調査を行い,植生調査資料の取得ができたため.また,本年度とこれまで取得してきた植生調査資料,既存研究を統合し,ステップにおける植生の体系化と将来分布予測が行えたため.植生調査資料をさらに蓄積し,これまでの結果と統合することにより,群落区分および区分された群落の将来分布予測の精度を高める.また,種ごとの将来分布予測を進めることにより,各群落の将来的な種組成変化の可能性を検証する.
期待効用理論による電力事業価値評価

電力自由化に伴い、電気事業には将来のリスクを評価した投資計画が必要である。事業価値の評価手法として純現在価値法がよく用いられるが、投資家のリスクに対する考え方を考慮できないなどの欠点がある。そこで、投資家の満足度を表す効用関数を用いることでリスクを考慮した事業価値評価ができることを、火力発電事業を対象に示した。さらに、事業の実行非実行のみに着目し、プロビットモデルによる事業価値評価法を開発した。電力市場価格の時系列解析について、従来からの、24時間前の電力市場価格と電力需要を説明変数とする回帰式で相当の部分まで説明できることを再確認するとともに、さらに別の視点からの解析手法としてカオス時系列解析も試みて、電力市場価格の価格構造を明らかにしつつある。一方、2008年に生じた原油価格の暴騰、続く金融危機に伴う急落は、これら燃料価格の価格構造の解析を困難なものとし、燃料価格に関する検討は未だ途中である。効用無差別価格を用いた事業価値評価手法については、今年度も石油火力発電事業を対象に、電力価格の長期価格水準を二項モデルで表現することで不確定要因を増加させる場合について検討を行った。その結果、長期価格水準の変動が大きくなるほど、従来手法であるNPV法では事業価値が高く評価されるのに対し、我々が提案するUNPV法ではリスクを考慮するために事業価値を低く評価することが示された。また、将来の柔軟な経営判断に対応するリアルオプションを考え、今年度は、電力価格の長期価格水準が低下する際には事業から撤退する「撤退オプション」を適用した場合について検討した。その結果、長期価格水準の変動が小さい場合は「撤退オプション」を適用しない方が望ましく、ある程度大きい場合には最適な撤退条件があることを示した。さらに、提案する効用無差別価格を用いた事業価値評価は、実用化の際に効用関数の評価が難しいため、その欠点を克服する簡約化法に関する検討、および、効用無差別価格理論に基づく気温オプションの価値評価に関する研究も進めている。電力市場価格の時系列解析に関しては、日本の卸電力取引所(JEPX)や米国東部の電力市場等の市場価格は、24時間前の市場価格と需要(JEPXの場合は買い入札量)を説明変数とする自己回帰式で概ね説明できることを明らかにした。さらに別の視点から非線形解析手法であるカオス時系列解析も試みたものの、そのカオス性を明らかにすることはできなかった一方、カオス性の存在を否定することもできない結果となり、カオス性の有無については今後さらに検討が必要である。効用無差別価格を用いた事業価値評価手法(UNPV法)に関し、今年度は天然ガス火力発電事業を対象に事業価値評価を行い、前年度の石油火力発電事業における事業価値評価の場合と同様、リスクを回避しようとする事業者の選好度がUNPV法によって正当に考慮され、事業価値を正しく評価できることを確認した。さらに、新たにパラメータの同定に困難さが残る効用関数を前面に出すことなく、事業者のリスクに対する考え方を含んだ事業価値の評価手法として、事業の実行・非実行という二値関数を被説明変数に、また、さまざまなシナリオによって得られる正味現在価値(NPV)の平均と分散を説明変数とする回帰式(プロビットモデル)を考案した。数少ないデータでプロビットモデルを構築したために、現時点のモデルでは回帰係数に対する検定値(t値)が低く、説明変数の有意性が低いと評価されるなどの問題が生じている。しかし今後、UNPV法による解析を進めプロビットモデルを構築するためのデータ数を増やすことで、この問題は解決できるものと考えている。電力市場価格の時系列解析により、これまで本研究で用いてきた平均回帰モデルで電力市場価格を表すことが妥当なことは既に検証している。また、米国内の天然ガスのスポット取引価格を元に天然ガス価格の平均回帰モデルを作成し、提案している効用無差別価格を用いた事業価値評価手法(UNPV法)を用いて、ガス火力発電事業の事業価値評価を行った。電力市場価格モデルと天然ガス価格モデルのパラメータを変動させてさまざまなシナリオを作り、UNPV法によるガス火力発電事業の事業価値評価を行い、UNPV法によってリスクを回避しようとする事業者の選好度が正しく評価されていることから、本手法による事業価値評価の妥当性を示している。また、UNPV法で用いる効用関数はパラメータ同定が難しいことから、事業者のリスクに対する考え方を含んだ事業価値の評価手法として、昨年度新たにプロビットモデルを提案した。これは、事業の実行・非実行を表す二値関数を被説明変数に、また、さまざまなシナリオによって得られる正味現在価値(NPV)の平均と分散を説明変数とする回帰式である。本年度は、さまざまなシナリオ下のガス火力発電事業に対するUNPV法による評価結果を用いて、プロビットモデルの妥当性を検証した。その結果、事業の実行・非実行はほぼUNPV法とプロビットモデルの両者で一致し、各説明変数も有意であることを確認した。さらに、市場価格が価格スパイクなどで大きく変動し、さまざまなシナリオを通して得られるNPVの分布が正規分布とは大きく異なるような場合に対して、プロビットモデルの説明変数としてNPVの平均と分散に加えて3次・4次の項を用いる、高次のプロビットモデルを提案している。
樹木の根圏における土壌微生物と根の相互作用

【樹木根圏の微生物活性】根圏では、根と土壌の間で水や養分、有機物の移動があり、根圏土壌の微生物活性が非根圏土壌と異なることがある。森林の樹木根圏の物質移動の特性を明らかにするため、微生物活性を根圏土壌と非根圏土壌で比較した。東京大学北海道演習林内のエゾマツ人工林2林分及びトドマツ人工林3林分において深さ05cmの表層土壌を壊さずに採取した。実験室に持ち帰り、土壌試料を根ごと取り出した際に、根を含む土塊からすでに崩れ落ちていた土壌を非根圏土壌とし、根の表面から約5mm以内に付着している土壌を根圏土壌とした。全炭素量及び全窒素量、無機態窒素量が根圏土壌で多かった。セルラーゼ活性、窒素無機化活性、プロテアーゼ活性が根圏土壌で高かった。これらの微生物活性が根圏で高いのは、根からの有機物供給による基質の増加によるものだろう。酸性フォスファターゼ活性も、根圏土壌で高かったが、植物根から放出されるものも多いことが知られており、微生物由来でない可能性がある。樹木根圏での物質移動の特異性があることがわかったが、さらに定量的な検討を行う必要がある。マツノザイセンチュウを接種して弱ったアカマツの根圏と無接種のアカマツの根圏の土壌を採取し、上記と同様の項目を調べ、樹体の状態の違いが根圏の土壌微生物の働きに与える影響を調べた。根圏土壌の採取が困難で、有意な微生物活性の違いは見いだせなかった。【樹木根からの有機酸分泌】P欠乏に対する熱帯産マメ科早生樹3種(Acacia mangium、Paraserianthes falcataria、Leucaena leucocephala)の有機酸分泌を無菌栽培系で調べたところ、P欠乏による有機酸分泌の増加は見られなかった。砂耕栽培系では、P欠乏によってAcacia mangiumの根にクエン酸が蓄積した。Acacia mangiumの2つの実験結果の違いが、分泌によるものか栽培系によるものかはわからない。さらに検討を要する。さらに検討を要する。
英米文学における<知識の枠組み>としての<ジオグラフィ>

本年度は、前年度に続いて、<ジオグラフィ>を研究テーマとして活動を行った。ここで<ジオグラフィ>と呼ぶものは、単に地理あるいは地理学のことではなく、<地政学><地域性><見取図>などの多面的な意味概念を含んでいる。ことに、本年度は、<ジオグラフィ>のなかでも<マップ>をとりあげ、それが単なる<地図>だけではなく、人間が地球上で宇宙の中で占める位置を<知覚化>し、他者との位置関係で<系統化>し、全体の中で<概観化>するものであることを論じた。I研究例会1. 4月1日(土):(1)山口敬雄「南北戦争前夜における自己境界-H・D・ソローの『ウォーキング』を読む」、(2)杉本裕代「教育と家庭小説-『広い、広い世界』とアメリカン・ライシーアム運動」2.9月9日(土):(1)福井崇史「『色』と『血』を超えて-ウィリアム・ディーン・ハウエルズの『至上の義務』と遺伝言説」、(2)三添篤郎「オーディオは来たけれど1950年代合衆国ハイファイ文化論」、(3)中田崇「ラグタイムの20年-メディアとしての楽器と楽譜」3. 3月31日(土):(1)梅潭嘉偉「なぜ結末は不測なものとなるのか-"An Occurrence at Owl Creek Bridge"の語り」、(2)三添篤郎「男らしい聴き方トランジスタ補聴器と『静かな世代』」、(3)宮本陽一郎「ハエ男の館一冷戦の設計図」II国際コラボレーション1.ウォルター・リム(シンガポール国立大学):エイミー・タンの中国2.イーハブ・ハッサン(アメリカ合衆国ウィスコンシン大学):地図をめぐる考察3.吉田恭子(在ブラウン大学):マシュー・フォンテン・モーリーの海図III刊行物1.『知識の枠組み』12人分担著2.『アメリカ文学評論』(特集:マップ)8人共著平成17年度は、本研究課題の最初の年なので、主に基本文献の収集と基本概念の徹底に努めた。以下は、その活動方針に沿った成果のいくつかである。I研究例会1.4月2日(土)に筑波大学大塚校舎で開催された例会では、若手研究者の山口善成・大学院生の山口敬雄が口頭発表を行った。2.9月23日(祝)に筑波大学大塚校舎で開催されたシンポジウムでは、大学院生の佐藤憲一が「アメリカ哲学協会の設立と<アメリカ的>知の枠組み」、鷲津浩子が「クジラ漁の始まったころ-『白鯨』と船舶位置確定」、宮本陽一郎が「アメリカを輸出する国アメリカ-冷戦とアメリカ研究の誕生」の口頭発表の後、公開討論会が行われた。3.10月15日に北海学園大学(札幌)で開催された日本アメリカ文学会全国大会で、佐藤憲一・山口善成が口頭発表を行い、司会の大井浩二氏から当研究グループに「筑波学派」の呼称を与えられた。II小研究会研究課題の初年度にあたるので、<マップ>についての基本概念を確認した。ここでの<マップ>は、単なる一地方の<地図>にとどまらず、人間が地球上で、宇宙の中でしめている位置を<視覚化>し、他者との間で<相関化>し、全体像のなかで<概観化>するものを示す。したがって、<マップ>は<知識の生成場所>としての実験室や野外観察、<知識の体系化装置>としての百科事典・辞書、<知識の保管庫>である図書館・博物館、<知識の受容の場.としての見世物・公開実験、<知識の発信所>としての出版文化などと切り離して考えることはできない。III刊行物来年度刊行予定の雑誌特集<マップ>に向けての基本方針を示した。I研究例会1. 4月1日(土):(1)山口敬雄「南北戦争前夜における自己境界-H・D・ソローの『ウォーキング』を読む」、(2)杉本裕代「教育と家庭小説-『広い、広い世界』とアメリカン・ライシーアム運動」2.9月9日(土):(1)福井崇史「『色』と『血』を超えて-ウィリアム・ディーン・ハウエルズの『至上の義務』と遺伝言説」、(2)三添篤郎「オーディオは来たけれど1950年代合衆国ハイファイ文化論」、(3)中田崇「ラグタイムの20年-メディアとしての楽器と楽譜」3. 3月31日(土):(1)梅潭嘉偉「なぜ結末は不測なものとなるのか-"An Occurrence at Owl Creek Bridge"の語り」、(2)三添篤郎「男らしい聴き方トランジスタ補聴器と『静かな世代』」、(3)宮本陽一郎「ハエ男の館一冷戦の設計図」II国際コラボレーション

1.ウォルター・リム(シンガポール国立大学):エイミー・タンの中国2.イーハブ・ハッサン(アメリカ合衆国ウィスコンシン大学):地図をめぐる考察3.吉田恭子(在ブラウン大学):マシュー・フォンテン・モーリーの海図III刊行物1.『知識の枠組み』12人分担著2.『アメリカ文学評論』(特集:マップ)8人共著
正常眼圧緑内障モデルマウスにおける熱ショック蛋白質を介した網膜神経保護

緑内障とは眼圧の上昇や網膜循環障害などを背景に視神経障害が進行していく慢性疾患である。初期には自覚症状なく進行し、やがて視野が次第に欠損してきて、ついには失明に至る。特に近年は高齢化社会が進むにつれて、患者数も増加の一途をたどっている。しかし現在のところ、薬剤等を使用して眼圧を下降させて、間接的に視神経を保護する治療には限界もあり、直接的に視神経を保護あるいは再生させるような治療の開発が、世界中で望まれている。緑内障の網膜神経節細胞保護による治療の可能性を検討するため、熱ショック蛋白の系を活性化させる薬物を用いて細胞死の抑制効果を調べている。マウスに植物であるヤバツイ由来のEupalinolide B、アスパラガス抽出物であるETASをあらかじめ腹腔内投与した。これらの薬剤は全身的に熱ショック蛋白の発現を上昇させることが分かっている。実験は以下に示す網膜虚血再灌流モデルを用いて検討している。マウスの眼より135.5cm(100mmHg)の高さになるようにつり上げておき, 33Gの注射針を前房内に刺入し固定する。45分後に注射針を抜き、眼圧を低下させることにより網膜を再灌流させ、24時間後に眼球を摘出した。眼球をパラフィン固定し、網膜切片を作成。網膜神経節細胞を鋸状縁から対側の鋸状縁までカウントして神経細胞死を評価した。また、マウス上丘より、4%Fluoro-Goldを注入し、7日後に、眼を摘出し網膜フラットマウントを作製し、逆行性に染色された網膜神経節細胞の密度を調べたところ、Eupalinolide B、ETAS、ともに網膜組織に熱ショック蛋白の発現していることが免疫染色で示され、さらにこれら二種類の薬物は容量依存的に網膜神経節細胞保護を示すことが分かった。実験手技に不慣れなため、当初は網膜虚血再灌流がうまくいかなかった。しかし、周囲のサポートもあり、今では安定したモデルを作製できるようになり、問題はおおむね解決している。HSP70についてウエスタンブロッティングを行い、リアルタイムPCRでmRNAを測定し、定量的評価を行う。またcaspase-3、caspase-9についてactivity assayを行いアポトーシスの抑制効果について検討する。さらに正常眼圧緑内障モデル動物のグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の機能異常をもつ遺伝子欠損マウスを用いて、網膜神経節細胞保護効果を調べていく。緑内障はわが国では第1位、世界でも第2位の中途失明原因であり、最近の調査では40歳以上の約5%に発症し、70歳以上ではその有病率が10%を超えることが分かった。現在、日本の潜在患者数は500万人とも推定され、今後さらなる高齢化社会の到来と共に、患者数の増加が予想される。本症には眼圧が高値を示すものと、眼圧が正常範囲内にある正常眼圧緑内障があるが、わが国では約70%が正常眼圧緑内障で占められている(Iwase A et al. Ophthalmology. 2004)。緑内障の病態としては、網膜神経節細胞がアポトーシスを起こすことで、徐々に視野が欠損してやがては失明へ至ると考えられているが、その詳しいメカニズムは不明である。現在の臨床治療は、眼圧を低下させることで緑内障の進行を抑制することを目的としているが、正常眼圧緑内障の中には、眼圧が充分低いにもかかわらず、症状が進行していくものが含まれる。そのため今後は直接的に網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制する治療が期待されている。熱ショック蛋白質(HSP)は熱などのストレスによって発現が誘導される分子シャペロンであり、構造変化を来した異常蛋白の形状を元に戻し、その凝集を阻害するのみならず、プロテアソームにおける変異蛋白の分解を促進することで、抗アポトーシス効果を示すと考えられている。神経細胞にβアミロイドを過剰発現すると神経細胞死が引き起こされるが、HSP70を神経細胞に強制発現させると、神経毒性を軽減することができる(Magrane J et al.J Neurosci. 2004.)。そこでHSPをターゲットにした新しい緑内障治療を検討する。一時的に、動物実験室でマウスに感染症が発生して実験の中断を余儀なくされた時期もあったが、現在は感染症の終息が確認されつつある。そのため、実験スケジュールの進行に遅れが生じてしまった。現在までに、網膜虚血再灌流実験をスクリーニングとして行い、1Riluzole投与と2Eupalinolide B投与について、その網膜神経節細胞保護効果を確認している。また12の投与によって熱ショック蛋白も発現していることも確認済みである。スケジュールの遅れはあるが、実験そのものは当初の計画通り進行していると考えている。

緑内障の網膜神経節細胞保護による治療の可能性を検討するため、熱ショック蛋白の系を活性化させる薬物を用いて細胞死の抑制効果を調べている。マウスに植物であるヤバツイ由来のEupalinolide B、アスパラガス抽出物であるETASをあらかじめ腹腔内投与した。これらの薬剤は全身的に熱ショック蛋白の発現を上昇させることが分かっている。実験は以下に示す網膜虚血再灌流モデルを用いて検討している。マウスの眼より135.5cm(100mmHg)の高さになるようにつり上げておき, 33Gの注射針を前房内に刺入し固定する。45分後に注射針を抜き、眼圧を低下させることにより網膜を再灌流させ、24時間後に眼球を摘出した。眼球をパラフィン固定し、網膜切片を作成。網膜神経節細胞を鋸状縁から対側の鋸状縁までカウントして神経細胞死を評価した。また、マウス上丘より、4%Fluoro-Goldを注入し、7日後に、眼を摘出し網膜フラットマウントを作製し、逆行性に染色された網膜神経節細胞の密度を調べたところ、Eupalinolide B、ETAS、ともに網膜組織に熱ショック蛋白の発現していることが免疫染色で示され、さらにこれら二種類の薬物は容量依存的に網膜神経節細胞保護を示すことが分かった。実験手技に不慣れなため、当初は網膜虚血再灌流がうまくいかなかった。しかし、周囲のサポートもあり、今では安定したモデルを作製できるようになり、問題はおおむね解決している。3アスパラガスからの抽出物であるETAS投与による網膜神経節細胞死抑制についても網膜虚血再灌流モデルで検討したのち、今後、動物飼育室の安全性が確保された時点で、ノックアウトマウスを受け入れて、次の亜急性実験へと移行する予定である。HSP70についてウエスタンブロッティングを行い、リアルタイムPCRでmRNAを測定し、定量的評価を行う。またcaspase-3、caspase-9についてactivity assayを行いアポトーシスの抑制効果について検討する。さらに正常眼圧緑内障モデル動物のグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の機能異常をもつ遺伝子欠損マウスを用いて、網膜神経節細胞保護効果を調べていく。(理由)一時的に動物実験室でマウスに感染症が発生し、実験の中断を余儀なくされたため予定より研究費が残存した。(使用計画)29年度に施行予定であった実験計画や30年度に行う予定の実験費用(細胞賠償試薬、抗体、遺伝子発現解析試薬、プラスチック消耗品など)に使用する。実験が思うように進まず、今年度の経費が思ったよりも少なかった。今後の研究の進行につれて、試薬や動物購入費用がかかるものと思われる。
発光現象を利用したマイクロ波可視化の研究

○研究目的マイクロ波は通信やプラズマ計測など多様に応用されている。しかし目に見えないものであるから、身近な存在であるにも関わらずその特性は周知されていない。そこでマイクロ波を目に見える形で検出し、教育に役立てるのがこの研究の目的である。○研究方法マイクロ波源として9GHz帯のクライストロンとガンダイオード、25GHz帯のガンダイオードを用意した。それぞれ電圧を印加することでマイクロ波を発生する。マイクロ波を検出する方法としてショットキーバリアダイオードによる整流・平滑化を考えた。これはマイクロ波により電子回路中に生じる交流電圧を直流電圧に変換する手法である。直流電圧に変換することで、マイクロ波の周波数に対応していない電圧計でもマイクロ波の検出に使えるようになる。平滑化にはダイオードが持つ微小な抵抗成分とコンデンサ成分を利用する。マイクロ波の検出に用いるダイオードとして、ショットキーバリアダイオード1ss154(東芝製)を選んだ。そのカソード側をオシロスコープのプラス端子、アノード側をGND端子につなぎ、マイクロ波源に接続した導波管の導波管口から約1mm離した位置にダイオード1ss154を設置した。マイクロ波源に電圧を印加して導波管口から放出されるマイクロ波をダイオードに当てると、周波数が9GHzの時に約2.5V、25GHzの時に約170mVの電圧が生じたことをオシロスコープから確かめられた。次に赤色LED(順方向電圧2.0-2.2V)をダイオードに接続した。これにより9GHzマイクロ波に反応してLEDが発光する。また25GHzに対しダイオードが生じる電圧はLEDを点灯させるのに不十分なため、トランジスタ2SC3964(東芝製)を用いてエミッタ接地増幅回路を製作し、LEDを点灯できる電圧へ増幅した。○研究成果ショットキーバリアダイオードとLEDを用いることで周波数帯域がX-bandとK-bandのマイクロ波を目に見えるかたちで検出する方法を考案した。
珪藻の特異な光捕集系の構造および機能の解明

ツノケイソウの光捕集色素結合タンパク質を単一の粒子として精製することができた。この複合体は、細胞内の全クロロフィルの60%を結合しており、解析の結果、製した標品は過剰光から光化学系を保護するというよりは、主に光捕集を担うと複合体であると考えられた。この複合体の構成タンパク質がFCP3とFCP4であり、未同定のタンパク質がごく少量含まれていた。この精製標品を用い、構造解析のために結晶化を進めた。海洋の珪藻類が地球上の全光合成的炭酸固定に寄与する割合は、全体の約25%にも及ぶ。珪藻が海の中で光の強い表層付近だけでなく、暗い有光層下部でも高い生産性を持つのは、他の光合成生物とは異なる波長の光を捕集する、より効率良い光捕集システム(fucoxanthin chlorophyll binding protein; FCP)のためである。一方、明るい光環境下では、過剰に集めた光が光化学系を破壊しないようにFCPに結合したdiadinoxanthinがdiatoxanthinに変換され(DDサイクル)、過剰な光エネルギーが熱として放散される。本研究では、これまでの所属研究室での研究を元にして次の3つのことを達成することを最終目標とした。1珪藻のFCPの結晶化による構造解析。2光合成色素の空間配置の詳細な決定による、効率的光捕集の仕組み解明。3DDサイクル色素と他の光合成色素との空間的位置関係の決定により、DDサイクルによる過剰な光エネルギーの熱への変換の仕組みの解明。25年度は、珪藻からのFCPの精製条件を予備実験よりもさらに詳細に検討した。予備実験時には、精製標品には2つの重合度の異なる複合体が含まれていたが、精製法の改良により、Blue-native PAGE解析でほぼ一つの複合体として精製されていることが確認できるまでに改善した。構成サブユニットのN末端アミノ酸はブロックされていたため、リシルエンドペプチダーゼにより限定分解を行い、内部アミノ酸配列を解析し、2種のタンパク質にまで絞り込むことができた。また、精製標品の動的光散乱を測定し、多分散性が40%にまで改善された。これまでに結晶化スクリーニングを行い、形を持った茶色の微小な沈殿物が得られた。海洋性珪藻Chaetoceros gracilisを材料にし、クロロフィルc系の色素結合タンパク質複合体を安定に精製する条件を検討した。前年度の研究により、使用している界面活性剤と目的のタンパク質複合体との相互作用がたいへん強いことが明らかになった。そこで、界面活性剤の種類や濃度を変えて目的のタンパク質複合体を精製する方法を検討した。その結果、今まで見られた重合度の異なる複合体の混在が低減し、さらに純度が上がって溶解度も向上し、粘度も下がった。この高純度かつ高濃度の精製標品を用いて、結晶化ロボット・モスキートによる結晶化作業を取り入れ、結晶化条件スクリーニングの迅速化および絞り込みを図った。当初の精製標品は、動的光散乱の測定によりモノモーダルであることが確認できたので、結晶化スクリーニングを進め、有形の茶色の微小な(100 μm程度)沈殿物が多数、再現性よく得られた。偏光下の検鏡により、偏光性があるように見られ、タンパク質の結晶であることが期待された。H26年度には新しい界面活性剤でより高純度に精製されたので、良質の結晶が得られる可能性が高まった。その精製標品の色素分析により、光捕集に関与する色素がチラコイド膜より高い割合で含まれ、過剰光放散に関わる色素もチラコイド膜と同程度に保持されていたことから、精製した標品は光捕集を担うと同時に過剰光から光化学系を保護する複合体であることが示された。高分離能電気泳動により、分子量の近似した3種類のタンパク質により構成されていることが確認されたが、いずれのタンパク質もN末端がブロックされていた。そのため、内部配列解析を試み、3つの内の多量に存在する二つは、FCP3とFCP4であることが同定された。これは、結晶構造解析の迅速化に資するものである。光合成光捕集色素タンパク質複合体の精製が、Blue-native PAGE解析でほぼ一つの複合体として確認できるまでに改善した。この複合体は、Nagaoら(Nagao et al. (2013) J. Physiol. Chem. B)により報告された高エネルギー消散機能を有するタンパク質複合体に対応すると見られる複合体である。構成サブユニットの内部アミノ酸配列の解析により、2種のタンパク質にまで絞り込むことができた。また、精製標品の動的光散乱測定では、半値半幅の小さな単一のピークとなり、多分散性の値は40%にまで改善された。このように、結晶化以外の項目は順調に進捗しているが、構造解析ができるほど明瞭な結晶が得られているとは言えないため、「やや遅れている」とした。

精製度が改善されが、さらに多分散性の値を上げるように、精製法の改善を行う。現在までに、精製溶液中のMgイオンの効果やスクロースの効果を検討しており、他の溶質の効果等も含めて精製純度や結晶化に対する効果の検討を続ける。また、ゲル濾過の有効性の検討、ゲル濾過の前後の濃縮法も含め、結晶化に適した精製法の検討を行う。精製を進めたところ、PEGにより沈澱が得られるようになったため、精製や結晶化の際にPEGを用いる条件の検討も加える。このようにして、良質の結晶を得るために、さらに精製法の改善や結晶化条件の検討を進める。これまでの結晶化条件スクリーニングで茶色の形を持った沈殿物が得られることがあるので、その条件の周辺条件や、その他各種条件を詳細に詰め、回折実験・構造解析まで進める。また、膜タンパク質複合体の存在は、脂質と密接に関与していると考えられる。そこで、光捕集色素結合タンパク質複合体の脂質組成の分析を進め、脂質の種類や量が複合体の存在形態にどのように関わっているかを解明する。結晶化の際の共存物質としての脂質の検討も行う。
酸素添加酵素を用いた有用化合物の不斉合成

1.ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)による不斉合成DBHは、生体内においてdopamineのベンジル位を不斉に酸化しnorepinephrineを生成する。本酵素および化学修飾により安定化したPEG-DBHの新たな電子伝達系を構築し、活性発現について検討した結果、本酵素とferrocene誘導体からなるハイブリッドタンパク質が電極と電子の授受を行い効率的に酵素活性を発現することを見いだした。DBHおよびPEG-DBHの有用化合物合成への適用範囲を探るため、基質特異性について検討した。本酵素はphenylalkylamine化合物やphenylalcohol化合物を不斉に酸化しR体の光学活性アルコールを生成した。また、基質のヘテロ原子上に種々の置換基を導入した結果、phenylalkyl誘導体については、alkyl末端に水素結合において水素供与体なり得るようなヘテロ原子をもつ化合物が本酵素の基質となることが明らかとなった。さらに、indanなどの2環化合物について検討した結果、芳香環のβ位にアミノ基や水酸基をもつ化合物が基質となり、酵素により導入された水酸基の立体選択性はphenylalkyl化合物と異なりS体であった。このことから、本酵素の活性中心の構造が推定された。2.シトクロームP450camの新たな活性発現系の再構成天然では活性発現に複雑な電子伝達系を必要し、そのため合成化学への利用が困難であったシトクロームP450cam(P450)の電子伝達系の再構成について検討した。P450と電極との直接の電子授受は観測されなかったが、putidaredoxinを電極上に化学的に固定化したタンパク質修飾電極を用いることで、電極とP450の間で電子の授受が起こった。また、本系に基質を加えると、触媒電流が観測されることから、本系が新たなP450活性発現系であることは明らかである。今後は、より効率的な電子伝達系を再構成し、本酵素による合成化学的な応用を図る。
細胞間接着を制御するc-Srcキナーゼ依存シグナル伝達系の解析

本研究の主眼点は、シグナル伝達系によるカドヘリン依存症細胞間接着の可逆的な制御機構を生化学的に解明する事にある。我々は、Srcキナーゼのシグナル伝達系を解析し、この細胞間接着系がリン酸化を介するシグナル伝達系によって可逆的な制御を受けることを初めて明らかにした。これらの成果にもとづき本研究は、細胞周期依存の接着制御や、NO依存シグナル伝達系を主題として、細胞間接着系のSrcキナーゼ依存シグナル伝達系による制御機構を解析することを立案した。本年の成果は、(1)Srcキナーゼと結合し、その活性化を促進するアダプター型シグナル伝達因子Crkが、Ras-Mek系を介してカドヘリン依存症細胞間接着を著明に抑制する事を明らかにした。(2)我々は、重金属やNOなどの刺激がc-Srcキナーゼを活性化させる事を初めて明らかにした、そこで、Src導入細胞にeNOS遺伝子を導入し、相互反応を調べたところ、活性型SrcキナーゼとeNosが結合する事を見い出した。以上の成果は、Srcシグナル伝達系による可逆的な細胞接着制御機構を系統的・包括的理解する上で重要な知見となると確信している。本研究の主眼点は、シグナル伝達系によるカドヘリン依存性細胞間接着の可逆的な制御機構を生化学的に解明する事にある。これらの成果にもとづき本研究は、細胞間接着系のSrcキナーゼ依存シグナル伝達系による制御機構を解析する事を目的として立案された。そこで、Srcキナーゼ下流シグナル伝達因子であるG蛋白質・MEK/MAPキナーゼ・PI3キナーゼの種々の変異遺伝子を導入し、細胞間接着を調べた結果、Rasシグナルが重要な役割をになうことを発見した。これらの成果にもとづき本研究は、細胞周期依存の接着制御や、NO依存シグナル伝達系を主題として、細胞間接着系のSrcキナーゼ依存シグナル伝達系による制御機構を解析する事を立案した。本年の成果は、(1)Srcキナーゼと結合し、その活性化を促進するアダプター型シグナル伝達因子Crkが、Ras-Mek系を介してカドヘリン依存性細胞間接着を著明に制御する事を明らかにした。(2)我々は、重金属やNOなどの刺激がc-Srcキナーゼを活性化させることを初めて明かにした。そこで、Src導入細胞にeNOS遺伝子を導入し、相互反応を調べたところ、活性型SrcキナーゼとeNosが結合する事を見い出した。
電力貯蔵用電池の電極材料LiAlの高温電気伝導機構

LiAl中のLiイオンの拡散に関する研究から以下のような成果が得られた。一定温度に保った時のLiAlの電気抵抗率の時間的変化をアルゴンガス雰囲気中で測定した結果、電気抵抗率の急激な減少が観測され3050分で一定の値になった。この結果は、Al格子点中のLi原子(【Li_(Al)】)がLi原子空孔(【V_(Li)】)を媒介としながら外部拡散することにより、LiAl中のLi濃度が減少し、組成が48at%Li付近に達したためと推定される。また、以上の結果を用いて、電気抵抗率の勾配変化法から求めたLiイオンの拡散の活性化エネルギーは、Ea=1.2 eVである。この値は、LiAl中のLiイオンの自己拡散の活性化エネルギーEa=0.110.15 eVよりも一桁大きい値である。本研究で求めたEa=1.2 eVは【Li_(Al)】から【V_(Li)】,【AL_(Li)】から【V_(AL)】へのどちらかの原子移動に起因しているものと考えられる。以上の結果から、次に述べる実用化の見通しが開けた。(1)電力取り出し用固体電解場LiAl中のLiイオンの自己拡散のエネルギーが極めて小さいので、LiAlを温度差発電用材料として利用できる可能性がある。(2)電力貯蔵用電池の長寿命化と高効率化LiAlを電力貯蔵用電池の電極材料として使用すれば、アルカリ溶融塩中のアルカリ金属による電極の腐食防止が可能であり、電池の長寿命化の達成と600K以上での高効率化が期待できる。
選択的ミトコンドリア分解の分子基盤と制御機構

オートファジーに依存したミトコンドリアの選択的分解は「マイトファジー」と呼ばれ、酵母からヒトまで保存された基本的な機構であり、ミトコンドリアの質や量を管理する仕組みとして寄与している。本研究では、酵母の変異体を用いた解析により、リン脂質メチル化酵素・タンパク質N末端アセチル化酵素・新生ポリペプチド鎖結合因子が、効率よくマイトファジーを起こすのに重要であることを明らかにした。ミトコンドリアの選択的分解はオートファジーの仕組みを利用していることから「マイトファジー」と呼ばれ、ミトコンドリアの品質や量を管理する仕組みである。これまでの研究で、出芽酵母のリン脂質メチル基転移酵素Opi3を欠失した細胞でマイトファジーが強く抑制されることを見出している。細胞の主要なリン脂質フォスファチジルコリン(PC)は、フォスファチジルエタノールアミン(PE)のメチル化によっても生成される。酵母においては、PEにメチル基を1つ付加してフォスファチジルモノメチルエタノールアミン(PME)を生成する酵素Cho2と、PMEにメチル基を2つ付加してPCを生成するOpi3が存在する。本研究では、Opi3欠失が引き起こすマイトファジー不全の機序の解明と、選択的ミトコンドリア分解におけるリン脂質メチル基転移反応の役割の理解を目的として、解析を進めた。その結果、opi3欠失細胞に蓄積したPMEがオートファジーに必須なユビキチン様タンパク質Atg8に共有結合することがわかった。野生型細胞で生成されるAtg8-PEとは異なり、Atg8-PMEはマイトファジーを効率よく起こすことができない。加えて、Opi3欠失によってCho2の発現が異常に亢進していた。リン脂質のメチル化は、抗酸化物質グルタチオンの生成と共役している。グルタチオン量が上昇すると、マイトファジーに必須なタンパク質Atg32の発現は抑制されるが、実際にopi3欠失細胞ではグルタチオン量が増加し、Atg32のレベルも顕著に低下していることがわかった。これらの知見は、Cho2およびOpi3によるリン脂質メチル化反応の適切な制御が、マイトファジーに重要であることを示唆している。ミトコンドリアの選択的分解は「マイトファジー」と呼ばれ、オートファジーの仕組みを利用してミトコンドリアの質や量を管理する仕組みである。これまでの研究で、出芽酵母のタンパク質N末端アセチル化酵素NatAを欠失した細胞でマイトファジーが強く抑制されることを見出している。Natは酵母からヒトまで保存されており、リボソームと結合しながら新生鎖のN末端のアセチル化を触媒する。酵母には5種類のNatがあり、1つの触媒サブユニットと1または2つのアダプターサブユニットからなる複合体を形成して、アセチルCoA(Ac-CoA)のアセチル基を新生鎖のN末端に転移する。NatAは触媒活性をもつArd1と、リボソーム結合部位を有するNat1から構成される。Natはそれぞれ異なる基質特異性を持っている。NatAの場合、メチオニンアミノペプチダーゼによる開始Metの除去後、Ala, Ser, Thr, Val, Glyにアセチル基を付加することが知られている。本研究では、NatA欠失が引き起こすマイトファジー不全の機序の解明と、選択的ミトコンドリア分解におけるタンパク質N末端アセチル化反応の役割の理解を目的として解析を進めた。その結果、アセチル化反応を触媒するNatAの活性がマイトファジーに必要であることがわかった。加えて、リボソームへのNatAの結合もマイトファジーに重要であることが示唆された。これらの知見は、NatAによってアセチル化される基質タンパク質の中に、マイトファジーを促進する因子が存在し、その因子の機能がアセチル化によって制御されている可能性を提起している。ミトコンドリアは「細胞の発電所」とも呼ばれるATP産生の要であり、細胞はそのエネルギー需要によって、ミトコンドリアの量をダイナミックに増減させる。一方ミトコンドリアは、そのエネルギー変換の過程で生じる活性酸素種に直接曝されている。過去の知見から、余剰なミトコンドリアや酸化ストレスによるダメージを蓄積したミトコンドリアは丸ごと隔離され、分解コンパートメントであるリソソーム(酵母では液胞)に運ばれて除去されると考えられている。この機構はオートファジーの系を利用していることから「マイトファジー」と呼ばれる。本年度の研究では、選択的ミトコンドリア分解に重要な新規因子としてOm14を見出した。Om14欠損細胞では、マイトファジー誘導時に起こるミトコンドリアの断片化が強く抑制されていることがわかった。ミトコンドリアが小さく断片化することは、マイトファジーが効率よく起こるために重要であると考えられている。既知のミトコンドリア分裂制御因子Dnm1を欠損してもマイトファジーは8割程度の効率で起こるが、Om14欠損細胞では5割近くまで顕著に低下することがわかった。Om14はミトコンドリア外膜に局在する膜タンパク質であり、オートファジーやタンパク質を積み荷とした選択的オートファジーには必要ない。通常の培養条件において、Om14欠損細胞のミトコンドリア形態は野生株同様チューブ状である。一方、マイトファジー誘導条件下の野生株では、ミトコンドリアは断片化するが、Om14欠損細胞ではチューブ状のままであることが明らかとなった。以上の知見から、マイトファジーにリンクして駆動するミトコンドリア分裂機構があり、Om14はその経路で重要な役割を果たしていると想定できる。

マイトファジー関連因子の中には、タンパク質の生合成に関与する新生ポリペプチド結合複合体NAC(nascent polypeptide-associated complex)の構成因子Egd1が含まれている。最近、NACがミトコンドリア外膜タンパク質Om14と結合し、合成と共役したタンパク質輸送に機能していることが報告された。なお、NACのミトコンドリアタンパク質輸送の機能は、Egd1だけでなくEgd2(Egd1とヘテロダイマーを形成するNAC構成因子)も必要とするが、Egd2欠損細胞でマイトファジーは大きな影響を受けていないことを確認している。一方、Om14欠損細胞でマイトファジーを調べたところ、顕著に低下していることがわかった。さらに、野生株やEgd1およびEgd2欠損細胞で見られるミトコンドリアの断片化が、Om14欠損細胞では強く抑制されている。上記の結果から、Om14欠損細胞のマイトファジーおよびミトコンドリア分裂の不全は、Egd1の機能やミトコンドリアタンパク質輸送への影響によるものでないことが示唆された。これらの知見は、Om14欠損細胞において、ミトコンドリアの断片化が正常に起こらないことが直接の原因となり、マイトファジーが抑制されている可能性を提起している。Om14は、マイトファジーが誘導されていない細胞のミトコンドリア形態制御には必要ないが、マイトファジーが駆動されると、ミトコンドリアの断片化に重要な役割を果たす。このような特徴を持つタンパク質は、Om14以外には知られていない。今後の解析により、マイトファジーに特異的なミトコンドリア分裂についての知見を世界で初めてもたらすことが期待される。ミトコンドリアは「細胞の発電所」とも呼ばれるATP産生の要であり、細胞はそのエネルギー需要によって、ミトコンドリアの量をダイナミックに増減させる。一方ミトコンドリアは、そのエネルギー変換の過程で生じる活性酸素種に直接曝されている。過去の知見から、余剰なミトコンドリアや酸化ストレスによるダメージを蓄積したミトコンドリアは丸ごと隔離され、分解コンパートメントであるリソソーム(酵母では液胞)に運ばれて除去されると考えられている。この機構はオートファジーの系を利用していることから「マイトファジー」と呼ばれる。本年度の研究では、マイトファジー誘導時のミトコンドリアの断片化に働くタンパク質Om14と、ミトコンドリア分裂に機能する可能性のあるダイナミン様GTPaseの関与について解析した。出芽酵母においてマイトファジーが起こる際、分解基質を隔離するオートファゴソームの大きさ以下にミトコンドリアを小さくする必要がある。Om14欠損細胞では、野生型細胞で起こるミトコンドリアの断片化が顕著に抑制され、チューブラーネットワークを保つことがわかった。そこで、ミトコンドリア分裂に必須なダイナミン様GTPase Dnm1がミトコンドリアに局在しているかどうかを調べるため、Dnm1-GFPをOm14欠損細胞で発現させ蛍光顕微鏡で解析した。その結果、野生株同様、Dnm1-GFPはミトコンドリアへ正常に局在していることが明らかとなった。次に、他のダイナミン様GTPaseの欠損細胞におけるミトコンドリア断片化を調べた。