hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
競争環境下における流通チャネル管理のための数理モデルの研究

本研究課題では国際的に研究成果を発信することを当初より予定していたため、この客観的な研究成果から、「(2)おおむね順調に進展している」と判断される。本研究課題の最終年度である平成29年度は、交付申請書に基づき、流通チャネル管理の意思決定支援に有用な含意を提供する数理モデルを構築する研究をさらに進め、その研究成果を発表することに重点を置いた。具体的には、研究代表者は次のような3つの研究を進め、成果としてまとめた。第1に、製造業者・小売業者から構成される2段階の間接流通システムを想定し、需要の不確実性下において、直販チャネルと小売チャネルの2つの流通チャネルを販路として用いる製造業者は、いつ直販チャネルにおける直販価格と小売チャネルにおける卸価格を決定することが最適かを求める、不完備情報のモデルを構築した。そして、製造業者の需要予測精度が小売業者のそれよりも低い場合には、製造業者は直販価格をできるだけ遅くに設定することで、その利潤を増加させられることなどを示した。この結果をまとめた研究論文は、研究代表者の所属研究機関のディスカッションペーパーとして収録し、国際学術誌へ投稿した。第2に、確実性下において、製造業者が複数の小売業者へ財を卸す間接流通の状況を考え、製造業者は卸価格をいつ設定すれば良いか、さらに小売業者はいつ小売価格を設定すれば良いかを内生的に決定するモデルを構築した。この研究論文は国際学会にて報告した後に、国際学術誌に受理・掲載された。第3に、製品差別化がなされている場合に、競争環境下では、一部の製造業者は直接流通と間接流通の2つの販路を両方用いて財を販売するのに対し、他の製造業者は直販の販路のみを用いて財を販売するという、製造業者間で非対称的な流通チャネルが生成するモデルを構築した。この他にも「研究発表」の項目に記しているとおり、研究代表者および分担者は流通チャネルの数理モデルに関連する理論・実証研究を行い、国際学術誌への論文公表や国際学会における報告などを行い、最終年度においても複数の研究実績を得た。本研究課題では、数理的表現を用いて流通システムを描写することにより、競争環境に直面する企業が流通チャネル管理のための意思決定を行う際に、多面的に役立てられる数理モデルを構築することが目的であった。研究成果として、第1に製造業者・流通業者にとって望ましい流通チャネルはどのような形態になるか、第2に製造業者・流通業者にとって最適な意思決定のタイミングはいつになるか、第3に需要の不確実性が存在するときに製造業者・流通業者間における望ましい情報共有のあり方はどのようなものになるか、をそれぞれ明らかにした。これらの成果は主に国際学術雑誌、国際学会において公表した。
復帰変異モザイク表皮水疱症モデルマウスの作製と新規遺伝子治療法の開発

17型コラーゲン遺伝子特異的CRISPR/Cas9システムの構築:遺伝子編集技術の中でも特に有効性の高いCRISPR/Cas9システムを用いて,ターゲット遺伝子であるマウス17型コラーゲン遺伝子の切断を試みている。in silico softwareを用いて、マウス17型コラーゲン遺伝子のexon2、exon3、intron2領域を特異的に切断可能なガイドRNAを設計した。さらにpEGxxFPシステムを用いてCRISPR/Cas9の効率を確認し、それぞれのターゲットに対する高効率なCRISPR/Cas9システムを構築した。復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスの作製:17型コラーゲンタンパクを欠損する表皮水疱症患者では、ほぼ全例で復帰変異モザイクを有することが知られている。我々は復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスを作製している。マウス17型コラーゲン遺伝子のexon 2およびexon 3のある部位を特異的に切断することが可能なCRISPR/Cas9システムをマウス受精卵にinjectionし、マウス17型コラーゲン遺伝子のexon 2およびexon 3にフレームシフト変異を誘導させたヘテロ17型コラーゲン遺伝子欠損マウスを作製した。現在、これらのマウスを交配し、17型コラーゲンのそれぞれのアリルのexon2およびexon3にフレームシフト変異を有する複合ヘテロ接合型17型コラーゲン欠損マウスの作製を行っている。表皮角化細胞に対し高効率に遺伝子編集可能なCRISPR/Cas9システムの構築:マウス17型コラーゲン遺伝子のintron2領域においてDNA2本鎖切断を誘導するCRISPR/Cas9システムの作製に成功した。これまでAAV-2セロタイプを用いた遺伝子導入法を試みていたが、AAV-Proを用いることで高効率に遺伝子編集を誘導することが可能になった。上述のように、117型コラーゲン遺伝子特異的CRISPR/Cas9システムの構築、2復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスの作製、3表皮角化細胞に対し高効率に遺伝子編集可能なCRISPR/Cas9システムの構築に成功したため、現在、モデルマウスに対し、直接CRISPR/Cas9の遺伝子導入を行っている。ただ、この表皮水疱症モデルマウスは長期間生存することが困難であり、遺伝子導入後早期に死亡するため、現在、生体内において体細胞組換えを確認できていない。表皮水疱症モデルマウスが長期間生存しないことが、現在の問題点である。今後は免疫不全マウスにモデルマウスの皮膚を移植し、長期間観察することが可能な状況下で、研究を進めていく。17型コラーゲン遺伝子特異的CRISPR/Cas9システムの構築本研究では、マウス17型コラーゲン遺伝子のexon2、exon3、intron2領域を特異的に切断する遺伝子編集技術を応用する必要がある。今回我々は、遺伝子編集技術の中でも特に有効性の高いCRISPR/Cas9システムを用いてターゲット遺伝子の切断を試みている。実際にはin silico softwareを用いて、マウス17型コラーゲン遺伝子のexon2、exon3、intron2領域を特異的に切断可能なガイドRNAを4個ずつ設計した。さらにpEGxxFPシステムを用いてCRISPR/Cas9システムの効率を確認し、それぞれのターゲットに対する高効率なCRISPR/Cas9システムを構築した。復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスの作製17型コラーゲンタンパクを欠損する表皮水疱症患者では、ほぼ全例で復帰変異モザイクを有することが知られている。前述で述べたマウス17型コラーゲン遺伝子のexon 2およびexon 3のある部位を特異的に切断することが可能なCRISPR/Cas9システムをマウス受精卵にinjectionし、マウス17型コラーゲン遺伝子のexon 2およびexon 3にフレームシフト変異を誘導させたヘテロ17型コラーゲン遺伝子欠損マウスを作製した。F0マウス(初代マウス)と野生型マウスの交配で目的としたF1マウスの誕生に時間がかかり、複合ヘテロ接合型17型コラーゲン欠損マウスの作製に時間を要している。

現在、これらのマウスを交配し、17型コラーゲンのそれぞれのアリルのexon2およびexon3にフレームシフト変異を有する複合ヘテロ接合型17型コラーゲン欠損マウスの作製を行っている。表皮角化細胞に対し高効率に遺伝子編集可能なCRISPR/Cas9システムの構築:マウス17型コラーゲン遺伝子のintron2領域においてDNA2本鎖切断を誘導するCRISPR/Cas9システムの作製に成功した。これまでAAV-2セロタイプを用いた遺伝子導入法を試みていたが、AAV-Proを用いることで高効率に遺伝子編集を誘導することが可能になった。上述のように、117型コラーゲン遺伝子特異的CRISPR/Cas9システムの構築、2復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスの作製、3表皮角化細胞に対し高効率に遺伝子編集可能なCRISPR/Cas9システムの構築に成功したため、現在、モデルマウスに対し、直接CRISPR/Cas9の遺伝子導入を行っている。ただ、この表皮水疱症モデルマウスは長期間生存することが困難であり、遺伝子導入後早期に死亡するため、現在、生体内において体細胞組換えを確認できていない。マウスの交配数を増やし、研究時間の短縮を予定している。表皮水疱症モデルマウスが長期間生存しないことが、現在の問題点である。今後は免疫不全マウスにモデルマウスの皮膚を移植し、長期間観察することが可能な状況下で、研究を進めていく。
超微小粒子の壁面への沈着

超LSI製造工程などにおける製品不良率をできるだけ低く抑えるために、高度な清浄空間を作り出すことが重要であると同時に、空気中の微粒子の物体表面への沈着をできるだけ少なくする工夫が必要である。そのためにはまず、粒子の表面への沈着機構を明らかにし沈着量を推定する方法が確立されていなければならない。本研究では、現在量産体制にりつつある1MビットLSIの制御対象粒径である0.1μm前後の超微小粒子に着目し、0.020.8μmの範囲の単分散エアロゾル粒子を発生させ、粒子帯電や壁の材質の違いの粒子沈着量に及ぼす影響を実験的に検討した。昭和62年度では、まず銅管、ガラス管、アクリル管など6種類の材質の異なる円管に単分散粒子を流し、粒径、速度、粒子帯電量を変化させて壁への粒子沈着速度を粒子透過率の実測値より求めた。その結果、銅管(導体)では粒子の帯電の有無に拘らずブラウン拡散のみで沈着するが、アクリルなどの誘電体管では粒子が帯電すると沈着量が著しく増加し、帯電粒子の沈着速度はクーロンカパラメータでまとめられることがわかった。次いで昭和63年度では、半導体であるシリコンウエハ上への粒子沈着量と空気清浄度(エアロゾル濃度)との関係を明らかにするために、垂直層流型クリーンブース内にウエハ面を水平または鉛直に設置し、蛍光物質であるロダミンB単分散粒子をウエハ中心軸上方のノズルから周囲の清浄気流と共に流すという従来にない方法でウエハ面上を流し、蛍光分光光度計により沈着量を測定した。結果はAhn-Liuが提出した拡散沈着速度推定式に、重力およびクーロンカ沈着速度を加算した式に極めてよく一致した。これにより、従来、0.5μm以上の粒子のみに対してしかなかった沈着量データが0.03μmまでの超微小粒子に対して得られたことになり、4Mビット時代での粒子沈着量の推定、ひいては製品歩留りの予測に役立つものと思われる。超LSI製造工程などにおける製品不良率をできるだけ低く抑えるために硬度な正常空間を造り出すことが重要であると同時に,空気中の微粒子の製品表面への沈着をできるだけ少なくする工夫が必要である.そのためには,まず粒子の表面への沈着機構を明らかにしなければならない.本研究では,現在量産体制に入りつつある, 1MbitLSIの制御対象粒径である0.1um前後の超微粒子に着目し, 0.020.3umの範囲の単分散NaCl粒子を発生させ各種材質壁への粒子沈着量を実測した.すなわち,本年度は壁として円管壁を取り上げ,銅,アクリル,塩ビ,ポリエチレン,ポリプロピレン,ガラス管に粒子の帯電状態を,帯電数0, 1, 2の三種類に調整したエアロゾルを流し,管入口および出口粒子濃度から粒子透過率を求め,壁への粒子沈着速度に換算した.その結果,粒子沈着速度は粒子が帯電しているか否かにより著しく異なり,無帯電粒子の場合,管材質によらず,円管内のブラウン拡散沈着に関するGarmley&Kennedyの式で沈着量がほぼ推定でき,また帯電粒子では,導体である銅管を用いた場合は,静電気効果はなく,上記ブラウン拡散沈着の式に従うが,アクリル管など材質が合成樹脂の場合は,沈着量が極端に多くなり,すべての帯電粒子の壁沈着速度は,壁表面が帯電していると仮定して得られたクーロンカパラメータでまとめられることがわかった.

次に,シリコンウエハ表面での粒子沈着量と表面附近でのエアロゾル濃度との関係を明らかにするため,水平に置かれたウエハに垂直下方にロダミンBエアロゾル粒子(粒径0.050.3um)を長時間(数時間数日)流し,濃度とウエハ表面上の沈着量を蛍光分光光度計で推定した.実験は,粒子帯電数,ウエハ表面電位,粒径を変化させた.その結果,粒径0.1um附近に沈着量の最小値が存在し,理論の予測と合致することがわかった.これについては,来年度も研究を継続して行う.超LSI製造工程において、シリコンウエハ上の粒子が沈着すると製品の歩留りが低下する。歩留りを改善するためには高度な清浄空間が必要であるが、どの程度空気を清浄にすれば目的とする歩留りを達成できるか明らかでない。そこで本年度は、空気清浄度(エアロゾル濃度)とウエハ上への粒子沈着量との関係を明らかにするために垂直層流型クリーンブース内にウエハを水平または鉛直に置き、蛍光物質であるロダミンBの単分散粒子(粒径0.030.8μm)をウエハ中心軸上方のノズルから周囲の清浄気流と等速度で長時間(数時間数日)流し、ウエハ表面上の沈着粒子量を、0.1ppbまで微量分析が可能な蛍光分光光度計で測定した。測定値より、ウエハ表面への粒子沈着速度を計算し粒径に対してプロットするとウエハ面を鉛直にした場合、沈着速度は粒径に対し単調に減少するが、ウエハ面を水平にした場合は、粒径0.10.2μm付近で最小値をもつ。これは前者の場合、沈着機構としてブラウン拡散のみが、後者の場合、粒径の小さいところでブラウン拡散が、粒径の大きいところで重力がそれぞれ作用するからである。さらに、ウエハに電圧を印加し帯電粒子を流すと、沈着速度は粒径が0.1μm以下でクーロン引力のために一桁以上大きくなる。以上の実験結果を、Ahn-Linが提案した拡散沈着速度推定式に重力沈降速度式およびクーロン力沈着速度式を加算したものと比較すると、両者はウエハヘの空気の接近速度、粒径、印加電圧、粒子帯電量の広い範囲で極めてよく一致した。さらに、ウエハ上での粒子沈着量分布を測定したところ、中心部と端で沈着量が多くなり、理論の予測と合致した。ウエハ上への粒子沈着速度に関しては、これまで0.3μm以上の粒子に対してしかデータがなかったが、以上の結果にり0.03μm以上の粒子に対して沈着速度の的確な予測が可能となり、歩留りの予測にも役立つ。
並列処理を担う作業記憶に関する生理心理学的研究

「作業記憶」は、ある活動に必要な情報を外界または内的な貯蔵機構(長期記憶)から取り込み、必要な期間それを能動的に保持するメカニズムとされる。複雑な課題解決においては、同時にいくつもの情報を並行して脳内に作業記憶として保持しておく必要がある。本研究では、複数の情報が保持され得るような課題状況でサルの前頭連合野からニューロン活動を記録し、その保持の過程を調べた。得られた結果は次のようにまとめられる。(1)サルに右か左の餌箱のどちらかランダムにりんごとかレ-ズンなどの餌、あるいはそれと結びついた中性刺激を提示し、一定の遅延期間後にその刺激の提示された側にサルが反応すればその餌を報酬として与えるという「遅延反応課題」を訓練した。(2)遅延反応の遅延期間中に左右の試行で異なった活動を示すニューロンが見出された。(3)異なった報酬が期待される場合、遅延期間中にその違いを反映した活動を示すニューロンが見出された。(4)報酬を実際にサルに見せた場合(直接法)と、特定の報酬を意味する中性刺激を出した場合(間接法)では、遅延期間中のその違いを反映した活動を示すニューロンも見いだされた。(5)最も重要な発見として、前頭連合野ニューロンの中にはこうした「遅延反応における左右の試行の違い」、「報酬の違い」、「直接法と間接法の違い」といった情報の内の2つまたはそれ以上の情報を並列的に作業記憶として保持する働きをするものが見出された。前頭連合野は行動のプログラミングと行動の適切な順序による遂行をモニターする働きをしているが、前頭連合野のこうした高次機能は、複数の情報を並列的に保持する働きをもつ作業記憶を担う前頭連合野ニューロンにより支えられているのではないかと考えられる。複雑な課題解決においては、同時にいくつもの情報を平行して脳内に作業記憶として保持しておく必要がある。本研究は、複数の情報が保持され得るような課題状況でサルの前頭連合野からニューロン活動を記録し、その保持の過程を調べた。(1)サルにある餌、あるいはその餌と結びついた中性刺激(又は空の餌箱あるいは餌と結び付かない中性刺激)を見せた後、遅延期間をおいてサルがパネル押し反応をすると、(餌のある場合には)その餌を与えるという「連合課題」の訓練をする。次にサルに右か左の餌箱のどちらかランダムにりんごとかレ-ズンなどの餌、あるいはそれと結びついた中性刺激を提示し、一定の遅延期間後にその刺激の提示された側にサルが反応すればその餌を報酬として与えるという「遅延反応課題」を訓練した。(2)異なった報酬が期待される場合、遅延期間中にその違いを反映した活動を示すニューロンが見出された。(3)報酬を実際にサルに見せた場合(直接法)と、特定の報酬を意味する中性刺激を出した場合(間接法)では、その違いを反映した活動を示すニューロンも見いだされた。(4)遅延反応の遅延期間中に左右の試行で異なった活動を示すニューロンが見出された。(5)前頭連合野ニューロンの中にはこうした「報酬の違い」、「直接法と間接法の違い」、「遅延反応における左右の試行の違い」といった情報の内の2つまたはそれ以上の情報を並列的に作業記憶として保持することに関係するニューロンが見出された。これらは作業記憶の並列処理に重要な役割を果たしていると考えられる。複雑な課題解決において、同時にいくつもの情報を並行して脳内に作業記憶として保持しておく必要がある。

本研究では、複数の情報が保持され得るような課題状況でサルの前頭連合野からニューロン活動を記録し、その保持の過程を調べた。得られた結果は次のようにまとめられる。(1)サルの右か左の餌箱のどちらかランダムにりんごとかレ-ズンなどの餌、あるいはそれと結びついた中性刺激を提示し、一定の遅延期間後にその刺激の提示された側にサルが反応すればその餌を報酬として与えるという「遅延反応課題」を訓練した。(2)遅延反応の遅延期間中に左右の試行で異なった活動を示すニューロンが見い出された。(3)異なった報酬が期待される場合、遅延期間中にその違いを反映した活動を示すニューロンが見出された。(4)報酬を実際にサルに見せた場合(直接法)と、特定の報酬を意味する中性刺激を出した場合(間接法)では遅延期間中にその違いを反映した活動を示すニューロン見いだされた。(5)最も重要な発見として、前頭連合野ニューロンの中にはこうした「遅延反応における左右の試行の違い」、「報酬の違い」、「直接法と間接法の違い」といった情報の内2つまたはそれ以上の情報を並行的に作業記憶として保持する働きをするものが見出された。前頭連合野は行動のプログラミングと行動の適切な順序による遂行をモニターする働きをしているが、前頭連合野のこうした高次機能は、複数の情報を並列的の保持する働きをもつ作業記憶を担う前頭連合野ニューロンにより支えられているのではないかと考えられる。
角膜における骨髄由来幹細胞の機能解析

GFPトランスジェニックマウスより骨髄を採取し、Lin(-),Sca-1(+),c-kit(+)等の細胞表面マーカーで造血幹細胞群を分離抽出した。あらかじめ放射線照射した同系新生児マウス(C57BL/6)に分離した造血幹細胞を顔面静脈より移植し、2週後に末梢血中のGFP陽性白血球を確認後、造血幹細胞移植モデルとして使用した。同時に、コントロールとして、全骨髄のみを抽出・移植して骨髄移植モデルを作成した。移植後のマウス角膜、強膜に分布する造血幹細胞・骨髄細胞由来GFP陽性細胞の経時的変化を蛍光前眼部撮影装置を用いて経過観察し、定量解析を行った。その結果、角膜に分布するGFP陽性細胞は移植後2ヶ月まで漸増し、その後6ヶ月までは平衡状態を保った(100cells/mm^2)。次に移植したマウス角膜組織における造血幹細胞・骨髄細胞由来GFP陽性細胞の分布の詳細な特徴を組織学的側面から考察を加えた。GFP陽性細胞の角膜上皮、実質、内皮での分布傾向を経時的に観察し統計学的処理を行った。その結果、両移植もモデルともに、陽性細胞の出現頻度は周辺部角膜実質が約25%と最も多く、中央部角膜実質は約8%であった。強膜に分布するGFP陽性細胞は全細胞の約18-28%であった。さらに、GFP陽性細胞の細胞生物学的特徴を免疫組織化学染色法を用いて行った。具体的には、抗原提示細胞マーカー(CD11c,CD11b)で免疫染色を行いGFPと二重染色される細胞の部位、分布および比率等を比較検討した。その結果、両移植モデルともにCD11cと比較してCD11bと二重染色されたGFP陽性細胞が約50%前後と多かった。また、強膜においても、前述の二重染色された陽性細胞が同様に観察された。以上の結果より、骨髄由来幹細胞は、マウス角膜、強膜組織に広く分布し、その細胞の多くはマクロファージ系の細胞群であることがわかった。GFPトランスジェニックマウスより骨髄を採取し、Lin(-), Sca-1(+),c-kit(+)等の細胞表面マーカーで造血幹細胞群を分離抽出した(分離効率95%)。移植後のマウス角膜に分布する造血幹細胞・骨髄細胞由来GFP陽性細胞の経時的変化を蛍光前眼部撮影装置を用いて追跡調査し、定量解析を行った(2D,1W,2W,1M,3M,6M)。その結果、両移植モデルともに、移植後2週間で角膜周辺部にGFP陽性細胞が出現した。その頻度は経過時間とともに移植後2ヶ月まで漸増し、その後6ヶ月までは平衡状態を保った。まず、GFP陽性細胞の角膜組織(上皮、実質、内皮)での分布傾向を経時的に観察し統計学的処理を行った。角膜上皮への分布は、今回の組織学的検討では出現頻度は少なく約1%前後であった。具体的には、その細胞生物学的特徴を種々の抗原提示細胞マーカー(CD11c, CD11b)で免疫染色を行い、GFPと二重染色される細胞の部位、分布および比率等を比較検討した。以上の結果より、骨髄由来幹細胞は、マウス角膜組織に分布し、その細胞の多くはマクロファージ系の細胞群であることがわかった。

強膜に分布するGFP陽性細胞は全細胞の約18-28%であった。さらに、GFP陽性細胞の細胞生物学的特徴を免疫組織化学染色法を用いて行った。具体的には、抗原提示細胞マーカー(CD11c,CD11b)で免疫染色を行いGFPと二重染色される細胞の部位、分布および比率等を比較検討した。その結果、両移植モデルともにCD11cと比較してCD11bと二重染色されたGFP陽性細胞が約50%前後と多かった。また、強膜においても、前述の二重染色された陽性細胞が同様に観察された。以上の結果より、骨髄由来幹細胞は、マウス角膜、強膜組織に広く分布し、その細胞の多くはマクロファージ系の細胞群であることがわかった。
乳腺の脂肪前駆細胞が分泌する乳腺増殖因子の分離・精製

ラット乳腺より樹立した乳腺間充織細胞の生物学的特性を決定することは、乳腺細胞との相互作用を解析する上でも重要である。そこで先ず、樹立細胞の生物学的特性を解析した。樹立細胞は1-メチル-3-イソブチルキサンチン処理により脂肪滴の蓄積が認められることから、脂肪前駆細胞であることが確認された。乳腺でのestrogenの乳腺細胞に対する増殖活性は、estrogenが間充織細胞に作用し、この細胞から増殖因子の分泌を誘導することによると推定されている。樹立細胞をestrogen処理し、培養上清中の乳腺細胞に対する増殖活性を検討したが、estrogen処理による変化は認められなかった。estrogenの作用機構については今後の検討が必要である。次に、この増殖活性の細胞に対する特異性を検討する目的で、間葉系細胞である3Y1、rat1、NIH/3T3およびBalb/3T3と、ラット乳腺上皮細胞を用いて、これら細胞に対する増殖活性を検討した。その結果、3Y1、rat1およびNIH/3T3に対する増殖活性はほとんど認められず、Balb/3T3の細胞数を対照群の約2倍に増加させる活性を認めるに止まった。これに対し、乳腺上皮細胞では対照群の約15倍の細胞増加を認め、樹立脂肪前駆細胞より分泌される増殖因子は、乳腺上皮細胞に特異的な増殖活性を有することが明かとなった。増殖因子の分離は、現在2つの方法で進行中である。培養上清から増殖因子を精製する方法では、精製をより容易にする目的で培養系の無血清化を試みた。しかし、現在までのところ成功していない。分子生物学的手法により、増殖因子のcDNAを直接分離する方法では、clone化した脂肪前駆細胞より増殖因子を分泌していない細胞株の分離を行っている。同一の細胞株より増殖因子分泌細胞と非分泌細胞が得られれば、両者のcDNAライブラリーのsubtraction法により目的のcDNAが得られるものと考えられる。
重度精神薄弱者の職場適応のための教育訓練

1.研究の目的各企業(事業所)において、重度精神薄弱者の職場適応を促進するための教育訓練(指導)のあり方を実態に即して明らかにすることを目的とした。2.ヒアリング調査・文献調査の結果(1)重度精神薄弱者に対する管理監督者の教育訓練(指導)...個性の重視入職直後の13ヶ月間程度は、ある仕事にはりつけて、その間に本人の個性(能力・適性など)を見抜き、他の部署に移すなどの指導が必要である。たとえば、性格的に素直か、持続性があるか、反抗的かなどについてはよく把握し、指導することが肝要である。また、少しの進歩も見逃さず「ほめる」ことによって、根気強く、長期間の見通しをもった指導を行うことが何よりも大切である。しかし、場合によっては、甘やかしすぎることなく、働くことの厳しさも自覚してもらえるように指導することも必要である。さらに、不正確な仕事を覚えないように、段階的な指導を行うことも大切である。(2)精神薄弱者のワークパーソナリティの形成と教育訓練(指導)...興味・意欲の喚起ワークパーソナリティの重要な一側面である職業遂行能力は、障害の程度とはあまり関係がなく、むしろ、他の側面、すなわち作業に対する興味や作業意欲の程度が影響しているようである。つまり、その能力を高め、潜在能力を引き出すためには、本人の興味・関心や意欲を高める指導が必要である。たとえば、通常されているように、長年にわたって同じ作業ばかりをさせるのではなく、一つの仕事ができたら、別の仕事にもチャレンジさせるなどの指導が大切である。また、そのことが他の障害者の励みにもなる。3.今後の課題:諸般の事情で質問紙調査が実施できなかったので、今後の課題としたい。
分子シャペロン機能を有する熱安定性オボアルブミンの構造と生理機能

鳥類の発生においては卵白の特異的な存在があり、それを構成する卵白タンパク質はアミノ酸源、栄養素輸送、生体防御因子としてその機能が論じられてきたが、オボアルブミンは胚の形態形成に関係する因子であることが明らかにした。オボアルブミンはタンパク構造がセルピン(セリンプロテアーゼインヒビター)ファミリーであるが、その機能は不明であった。オボアルブミンは発生中、その一部は消化されることなく、胚組織に移行することを明らかにした。また、オボアルブミンは発生過程でそのタンパク構造を変化し、熱安定型に転換することから、この構造変化が機能発現に重要であると考えた。オボアルブミンの生理機能の解明の過程で、ニワトリ胚を寒天培地で発生させるin vitro培養系を確立し、この系を使って胚からオボアルブミンを除去する方法を作成した。オボアルブミンをノックアウトした場合、原始線条期胚では致死に、神経形成期胚では神経管の閉鎖の阻害、体節形成や心臓形成にも多くの異常が見られた。異常な胚はオボアルブミンを再び添加すると回復され、正常な発生をするからオボアルブミンは形態形成・分化に重要に関与すると結論した。オボアルブミンは酵素などのタンパク質に共存させると、酵素の活性を安定化させる分子シャペロン様効果を示した。オボアルブミンの機能型は熱安定型オボアルブミンであると結論した。以上にように、オボアルブミンは新しいタイプの母性由来の形態形成因子であり、タンパクの構造の変化が機能発現に重要に関係することが本研究で明らかになった。今後、オボアルブミンがどのような機能を持ち、形態形成などの発生に関与するかに興味が持たれ、本研究は発生生物学の分野で大いに貢献できた。胚発生中にオボアルブミンが熱安定性型になることから、これをHS-オボアルブミンと命名し、その構造解析を行った。HS-オボアルブミンはS-オボアルブミンとは異なる構造であることを明らかにしたこととプロテアーゼインヒビター機能および分子シャペロン効果を持うものであることを見出した。N-オボアルブミンの結晶構造解析はすでに報告されているが、S-オボアルプミンとHS-オボアルプミンは今、X線解析の準備に入っており、これら3者の明確な構造の違いを明らかにすることが出来るであろう。本年度のHS-オボアルブミンの構造解析はCDスペクトルによる2次構造の解析、表面疎水性の測定、タンパク凝集性について行った。HS-オボアルブミンは他のオボアルブミンよりα-ヘリックスの減少とβ-構造の増加、加熱による凝集性・表面疎水性の変化に明らかに差が見られそしてプロテアーゼに対し感受性も異なっていることから2次、立体構造が変化したオボアルブミンと考えられた。N-オボアルブミンからHS-オボアルブミンが生じるにはシーズとなるHS-オボアルブミンが必要で、N-オボアルプミンをプリオンの場合とよく似たメカニズムで熱安定型に変換させる結果を得た。この自己複製にはPH、温度およびコファクター存在の存在により促進効果に影響することが分かった。自己触媒作用において卵白の成分、金属イオン、ATPなどの影響について調べ、これらはいずれも促進効果があることが確認された。現在、卵白のコファクター成分の単離を進めている。また、オボアルブミンにはジスルフィド結合による単量体、2量体および多量体が存在し、自己複製との関連について検討した。HS-オボアルブミンの分子シャペロン効果としてリゾチームを使った実験では、リゾチームの長期高温処理での活性低下を防ぎ、尿素処理後における巻き戻し効果を上げた。その他、アルドラーゼやリンゴ酸脱水素酵素の耐熱や酸処理に効果を上げた。

この現象はin vitroでも再現でき、また、発生中の多くの胚組織にインタクトなオボアルブミンが検出され、それらは熱安定型であることも明らかにした。オボアルブミンは機能の不明なタンパク質であるが、胚発生中に構造変化を生じ、ネイティブオボアルブミンは熱安定型(HS-オボアルブミン)となる。このHS-オボアルブミンはタンパクの二次構造の変化によって起こると考えられてきたが、DSC解析の結果、熱安定型には2つのタイプが存在しており、1つは二次構造の変化が見られなかった。他の解析とも併せ、熱安定型への転換はタンパク構造の微妙な変化によっても生じることが明らかになった。オボアルブミンの機能解析では、プロテアーゼインヒビター活性はないものの、MDHやアルドラーゼなどの酵素活性を安定化させる機能があり、HS-オボアルブミンは最も効果的な作用を示し、他にも部分変性させたタンパク質を巻き戻す効果が見られた。よってオボアルブミンは分子シャペロン様機能を有することが明らかになった。オボアルブミンをin vitroの鶏胚培養系でノックアウトする方法を開発した。オボアルブミンをノックアウトした初期胚は中枢神経系の形成に異常をきたし、ステージ4胚では致死となった。ステージ7胚では神経管の形成が阻害され、体節にも異常が見られた。これらの異常はオボアルブミンをノックアウト胚に添加するとレスキューされ、正常な胚となり、神経管や体節もコントロールと変わりなく形成された。このことからオボアルブミンはアミノ酸栄養源だけでなく、タンパク質として胚組織ではたらいていることが明らかになった。オボアルブミンの機能についてはまだ不明であるが、胚発生を通じて多くのはたらきをもつものとされ、今後、形態形成との関係について追究していく。卵白タンパク質のオボアルブミンはセルピンファミリーでありながらプロテアーゼインヒビター活性を有さない。そのため、生体内での機能は不明であった。しかし、発生過程でその一部は分解を受けず、胚組織に取り込まれることからその機能が注目された。また、この過程でオボアルブミンはタンパクの構造を変化させ、熱安定型へと転換することから、構造変化が機能に関係すると推定した。ニワトリ胚でオボアルブミンをノックアウトする系を作製し、胚に対する影響を調べた。初期胚では中枢神経の形成、体節や多くの組織で異常が見られた。初期胚ではオボアルブミンは脳に多く分布していることから脳の形成への関与が示唆された。特に、神経管形成期のオボアルブミンノックアウト胚では神経管閉鎖が阻害され、脳胞が生じないものとなり、神経細胞の増殖に影響が見られた。この異常はオボアルブミンを添加することでレスキューされたことから、オボアルブミンは形態形成に重要に関係するタンパク質であることを明らかにした。オボアルブミンの熱安定型には2つのタイプがあり、1つは卵を貯蔵したときにできるS-オボアルブミンであり、もう1つは胚発生に生じるHS-オボアルブミンである。今回、この両者を見極めるモノクロナール抗体を見つけ、胚組織で局在するオボアルブミンはHS-オボアルブミンであることを確認した。HS-オボアルブミンは胚発生の初期からN-オボアルブミンから自然発生的に生じ、S-オボアルブミンがアルカリpHで生じるのとは異なるメカニズムを持っものと結論した。
罹災都市借地借家臨時処理法の立法史的研究

1 GHQ文書の捜索罹災都市借地借家臨時処理法は、GHQによる占領下の立法である。それ故、立法課程においてGHQの関与があることが予想された。実際、膨大なGHQ文書の複写、引き延ばしを行い、いくつかの罹災法関連文書を発見することができた。しかし、その資料は、いずれかと言えば限定的なものであり、むしろ日本政府のイニシアチブによる立法であることが明らかになった。2議会資料の捜索帝国議会における罹災法審議は、委員会審議が主な意見が出された場である。しかし、第90回帝国議会の委員会速記録は、国会図書館においてもマイクロフィルムにおいてのみ閲覧が可能であった。そこで、マイクロ複写を行った後、この文書のテキストファイル化を行った。このためにワープロ検定技能者を採用し、テキストファイルによりフロッピ-ベースに移し込んだ。これにより、今後、資料利用が容易になった。3戦時罹災土地物件令との比較罹災法は、戦時罹災土地物件令(昭和20年)の後処理のための法であることが明らかになった。戦時物件令は、罹災建物の居住者に土地の暫定的な使用権を与えた。これに基づき、戦後バラックが多数建設されたが、物件令の廃止により、バラックの週挙が行われるべき運命にあった。しかし、当時の資材不足ではバラックを撤去させるのが適切ではなく、このため、罹災法は、バラックの建設者に優先借地権、借地権優先譲受権を与えて、バラックの存置をはかった。これが罹災法の最大の立法理由である。4現在の状況との対比神戸弁護士会において、複数の弁護士に対し、罹災法に関して聞き取りを行ったところ、更地を誰が利用できるかということが最大の問題であることが明らかになった。資材不足の存在しない現在では、多くの場合罹災法の各種優先権は地主からの代償の支払いにより放棄させていた。戦後の状況下に制定された罹災法が、現在では異なる役割を果たしていた。
注意ネットワーク理論に基づく注意の意図的制御メカニズムとその神経基盤

本課題は,認知エフォートの意図的制御が注意を構成する3つの機能(警戒,定位,実行制御)及びその下位成分に及ぼす影響を検証することを目的とする。その認知エフォートの意図的制御に関して,課題遂行時における二つの認知方略に着目した。一つが,従来の研究で暗黙の前提としていた最大限のエフォートを投じ,課題成績を最大限に引き上げる戦略である。もう一つが,エフォートの投資を最小限に(節約)する戦略である(Irons & Leber, 2016)。段階的に研究を進めており,H30年度は以下の二つのプロジェクトを実施した。一つは,前年度の行動実験を継続し,二つの認知方略が注意機能(特に,定位)の下位成分に及ぼす影響を検証した。もう一つは,fMRIの測定結果に関して,関心領域(Region of Interest; ROI)等を用いた解析を行い,ノイズとなった要因を追及する新たなプロジェクトを派生させた。前者の研究において,定位機能(特に,解放成分)の効率が向上する傾向が示されたが,注意において被験者の意図が及ぶ範囲を明確に特定するに至らなかった。後者の研究において,Fan et al. (2007)を基にROIを設定し,様々な視点・手法を用いて解析を進めたが,想定していた領域において賦活を確認することができなかった。以上のように,実験手続きや解析手法の修正を余儀なくされ,現在対策を講じている。一つの改善案として,これまで実施してきた各注意成分を同時に測定する実験パラダイム(Attention Network Test, ANT; Fan et al., 2002, ANT-R; Fan et al., 2009)ではなく,各注意成分を独立して測定することが可能なパラダイム(例えば,Theeuwes et al., 2004)を用いて測定することを現在検討している。H30年度は,以下の二点を目標としていた。第一の目標が,行動指標を基に視覚的注意に意図が及ぶ範囲を注意機能の下位成分にまで限局して明らかにする行動実験を継続することであった。第二の目標が,前年度までに実施していたfMRIの測定結果に関して,Region of Interest (ROI)等を用いた解析を行い,ノイズとなった要因を追及する新たなプロジェクトを進行することであった。しかし,それらの目標に関して,期待した通りには進捗しなかった。すなわち,想定した実験結果が得られず,実験手続きや分析手法等を改良する必要が生じた。ただし,本研究課題の派生プロジェクトは,大きく進捗した。具体的には,原著論文が国際ジャーナル及び国内ジャーナルに1本ずつ採択され,国内外の学会にて5回の主発表を行っている。また前年度内定していた3つの論文賞・学会賞を受賞し,本年度も新たに学会賞の内定を受けた。以上のことから,進捗状況としてやや遅れているが,研究成果が対外的に認められたといえる。行動実験又はfMRI測定を基に,注意の意図的制御を可能にする範囲を特定する。そして,学習や発達の基礎となる注意機構の新たな測定法の開発に資する。そのために,H30年度までに実施してきたパラダイムとは異なる課題を用いて,認知方略が視覚的注意に及ぼす影響を検証する。本研究の目的は,認知的エフォートの意図的制御が注意を構成する3つの機能(警戒,定位,実行制御)及びその下位成分に及ぼす影響を検証することである。認知エフォートの意図的制御に関して,課題遂行時における二つの方略に着目した。一つが,従来の研究で暗黙の前提としていた最大限のエフォートを投じ,成績を最大限に引き上げる方略である。もう一つが,エフォートの投資を最小限にする方略である。段階的に研究を進めており,本年度は二つのプロジェクトを実施した。一つが,行動指標を用いて視覚的注意に意図が及ぶ範囲を特定した。もう一つが,fMRIを用いて認知エフォートの制御に関する基礎的な枠組みを構築した。実験では,注意ネットワーク課題(ANT)及びその改良版(ANT-R)を用いた。この課題は,フランカー課題と視覚的手がかりを単一の課題に組み込み,注意の覚醒(反応への準備状態の生成),定位(特定の刺激に対する情報処理),実行制御(行動目標に関する反応選択)成分を行動指標で測定する。被験者は教示に従ってその課題に要するエフォートを調整するように求められた。行動実験の結果,視覚的注意において被験者の意図が及ぶのは定位機能のみで,覚醒・実行制御機能に影響しない可能性を示唆した。また定位機能の下位成分である解放及び定位時間の効率が,積極的にエフォートを投じたときに比べて,その投資を抑制したときに向上する傾向が見られた。重要なことに,fMRIを用いた実験において,投資を抑制したときに左右頭頂側頭接合部及び内側前頭前野で有意な賦活が見られ,この賦活はDefault-modeの活動に類似していた。これらの結果は,エフォートの最小限の投資が注意の無意識成分を増大させ,定位機能及びその下位成分の効率を促進させたことを示唆している。本研究は,単に課題に要するエフォートを制御することが視覚的注意に影響することを明らかにした。平成29年度は,(1)行動指標を基に視覚的注意に意図が及ぶ範囲を注意機能の下位成分にまで限局して明らかにすること,(2) fMRIを用いて認知エフォートの制御に関する基礎的な枠組みを構築することを目的とし,2つのプロジェクトを進めていく予定であった。計画に変更はなく,2つの研究を予定通り実施することができた。

(1)のプロジェクトに関して,視覚的注意に意図が及ぶ範囲が定位機能及びその下位成分である解放や定位時間に渡る可能性を見出した。ただし,(2)のプロジェクトに関して,解析を進めていくうえで,想定していた領域における賦活を確認できなかった部分があり,サンプル数が十分ではなかった可能性が確認された。しかし,(1)の行動指標の測定だけでは実証することができないDefault-modeの活動に関する知見は,今後研究を進めていく上で非常に重要な発見であると考えられる。そのため,進捗状況としておおむね順調に進展しているといえる。本課題は,認知エフォートの意図的制御が注意を構成する3つの機能(警戒,定位,実行制御)及びその下位成分に及ぼす影響を検証することを目的とする。その認知エフォートの意図的制御に関して,課題遂行時における二つの認知方略に着目した。一つが,従来の研究で暗黙の前提としていた最大限のエフォートを投じ,課題成績を最大限に引き上げる戦略である。もう一つが,エフォートの投資を最小限に(節約)する戦略である(Irons & Leber, 2016)。段階的に研究を進めており,H30年度は以下の二つのプロジェクトを実施した。一つは,前年度の行動実験を継続し,二つの認知方略が注意機能(特に,定位)の下位成分に及ぼす影響を検証した。もう一つは,fMRIの測定結果に関して,関心領域(Region of Interest; ROI)等を用いた解析を行い,ノイズとなった要因を追及する新たなプロジェクトを派生させた。前者の研究において,定位機能(特に,解放成分)の効率が向上する傾向が示されたが,注意において被験者の意図が及ぶ範囲を明確に特定するに至らなかった。後者の研究において,Fan et al. (2007)を基にROIを設定し,様々な視点・手法を用いて解析を進めたが,想定していた領域において賦活を確認することができなかった。以上のように,実験手続きや解析手法の修正を余儀なくされ,現在対策を講じている。一つの改善案として,これまで実施してきた各注意成分を同時に測定する実験パラダイム(Attention Network Test, ANT; Fan et al., 2002, ANT-R; Fan et al., 2009)ではなく,各注意成分を独立して測定することが可能なパラダイム(例えば,Theeuwes et al., 2004)を用いて測定することを現在検討している。H30年度は,以下の二点を目標としていた。第一の目標が,行動指標を基に視覚的注意に意図が及ぶ範囲を注意機能の下位成分にまで限局して明らかにする行動実験を継続することであった。第二の目標が,前年度までに実施していたfMRIの測定結果に関して,Region of Interest (ROI)等を用いた解析を行い,ノイズとなった要因を追及する新たなプロジェクトを進行することであった。しかし,それらの目標に関して,期待した通りには進捗しなかった。すなわち,想定した実験結果が得られず,実験手続きや分析手法等を改良する必要が生じた。ただし,本研究課題の派生プロジェクトは,大きく進捗した。
ヒト樹状細胞の生理的役割を解明する変異型IgE受容体設計と遺伝子改変マウス作出

アレルギーに関わるIgE受容体FcεRIの発現はマスト細胞と好塩基球に特異的と考えられてきたが、近年、ヒト末梢血中にFcεRIを恒常的に発現している樹状細胞(DCs)が発見された。一方、マウスDCsにはFcεRIが発現しないため、DCsがFcεRIを介して果たす役割について個体レベルでの十分な解析がなされていない。そこで、DC上にFcεRIを発現する遺伝子改変マウスを作出するため、マウスDCに発現し且つマウスIgEと十分な親和性で結合するFcεRIα変異体を設計することを目指した。ヒトαの立体構造情報を基に変異体を複数種類作製し、最終的に4アミノ酸置換により目的の変異体を得ることに成功した。IgEは花粉症などのアレルギー反応を引き起こす抗体であり、高親和性IgE受容体(FcεRI)を介してエフェクター細胞を活性化する。FcεRIは、ヒト、マウス共にマスト細胞と好塩基球の表面に発現するが、加えて、ヒトの場合には樹状細胞にも恒常的に高レベルに発現している。FcεRIはα、β、γの3種類のサブユニットより構成されており、これら分子の発現特異性とタンパク質構造特性により、マウスの樹状細胞はFcεRIを発現しない。そこで、IgE抗体が樹状細胞を介して及ぼす生体内の免疫応答を解析するために、ヒトαのようにγとの相互作用のみで樹状細胞上に発現し、かつ野生型マウスαと同程度に強くマウスIgEと結合できる変異型αの構築を目指した。まず、αの一次アミノ酸配列をヒトとマウス間で比較し、ヒトαの立体構造情報を基に、IgE抗体のFc領域と直接結合するアミノ酸残基のうち、ヒトとマウスで異なる4アミノ酸残基を選定した。続いて、ヒトαのcDNAをクローニングし、4つのアミノ酸残基を単独、あるいは複数組み合わせてマウス型アミノ酸残基へ置換するため変異導入を施した変異体の発現ベクターを構築した。これらをマウスγ発現ベクターと共に、非血球系細胞株Plat-Eに一過性導入し解析した結果、いずれの変異体も細胞表面に発現することが確認された。IgE抗体の結合強度は、4アミノ酸残基全てをマウス型に置換した変異体で最も強く、マウス野生型αとほぼ同等であった。さらに、マウス骨髄細胞より分化誘導して調製した樹状細胞にウィルスベクターを用いてα変異体を発現させたところ、いずれの変異体も他の分子の共発現なしに細胞表面に発現していた。これらのことから、目的であったマウス樹状細胞表面に発現し、かつマウスIgE抗体と自然な強度で結合するα変異体が得られたと示唆された。ほぼ目指す特性を持ったα変異体を得ることができた。また、α変異体を発現させるウィルスベクター系が構築できており、恒常的にα変異体を発現するプライマリー樹状細胞を調製する体制ができている。これを用いることによって、in vitroでの樹状細胞機能解析を随時行うことができると同時に、α変異体発現樹状細胞をマウスに移植する実験によって遺伝子改変マウスの作出と同時進行でin vivo解析を進めることができる。遺伝子改変マウスの作製については、α変異体のcDNAをノックインマウスやトランスジェニックマウス作製のためのベクターへ挿入して用いることができるため、速やかに着手できる。マスト細胞と好塩基球は高親和性IgE受容体FcεRIを特異的に発現し、アレルギー反応の主たるエフェクター細胞として機能する。研究代表者は、FcεRIを構成する3種類のサブユニットのうち、他Fc受容体の共通分子であるγを除いたαとβについて発現調節機構を解析し、血球系細胞特異的転写調節因子や共役因子により細胞特異的発現が巧妙に制御されている仕組みを見出してきた。また、α、β遺伝子の転写調節領域に多型が存在し転写因子の結合に影響を及ぼす結果、受容体発現レベルやアレルギー発症リスクと相関することを報告した。この過程で、ヒト末梢血中の樹状細胞がFcεRIを恒常的に発現していることを見出した。ヒト樹状細胞では、βが発現しないためFcεRIはαγ2型の3量体として発現する。一方、マウスFcεRIの構成にはβが必須であり、且つマウス樹状細胞にはαとβが共に発現しないため、IgEを介した樹状細胞機能についてマウスを用いた解析を行うことができない。これを解決する手段としてヒトα遺伝子Tgマウスが利用されているが、ヒトαとマウスIgEとの親和性が弱いなどの問題点がある。そこで、ヒトαの立体構造情報を基に、IgE抗体のFc領域と直接結合するアミノ酸残基のうち、ヒトとマウスで異なる残基を選定し、マウス型へ置換した変異体の発現ベクターを構築した。その結果、IgE抗体との結合が強いα変異体を得ることができ、これを樹状細胞に発現させたところ、他の分子の共発現なしに細胞表面にFcεRIαが検出された。樹状細胞の活性化に伴い、細胞表面のFcεRI発現量や結合IgEとして検出される量が減少することから、受容体介在型エンドサイトーシスが引き起こされていると示唆される。以上、マウス樹状細胞表面に発現し、かつマウスIgE抗体と十分な強度で結合するα変異体が得られ、IgEによる樹状細胞機能調節の解析準備が整備された。

一方、マウスDCsにはFcεRIが発現しないため、DCsがFcεRIを介して果たす役割について個体レベルでの十分な解析がなされていない。そこで、DC上にFcεRIを発現する遺伝子改変マウスを作出するため、マウスDCに発現し且つマウスIgEと十分な親和性で結合するFcεRIα変異体を設計することを目指した。ヒトαの立体構造情報を基に変異体を複数種類作製し、最終的に4アミノ酸置換により目的の変異体を得ることに成功した。IgE抗体の結合活性がマウス野生型αとほぼ同等の変異体が得られているが、異なるマウスIgEクローンについての検討や濃度依存性の解析など、さまざまな条件下で確認し、構造-機能相関を考察できる定量データを蓄積する。解析の結果、より強い活性が必要と判断された場合には他の候補アミノ酸残基を選定し変異導入を加えていく。十分に高活性なαであると判断され次第、レトロウィルスベクター系を用いてマウス骨髄由来樹状細胞へα変異体を強制発現させ、抗原とIgE抗体に応答した細胞機能を解析する。具体的には、受容体を介した抗原取り込み能やT細胞活性化能、樹状細胞自身のサイトカイン産生や共刺激分子発現を評価する。同時に、α変異体cDNAをRosaローカスに挿入するためのベクター構築を行い、プラスミドが得られ次第ノックインマウスを作製する。このマウスをCD11cプロモーター制御下にCre酵素を発現するマウスと交配することによって、CD11c陽性細胞(樹状細胞)特異的にα変異体を発現するマウスを得る。IgE抗体依存的な生体応答が関わるアレルギーモデルを用いて、本マウスの生体内で樹状細胞が及ぼす作用を明らかにする。ノックインマウスの作製に時間を要する可能性が考えられるが、対応策として、野生型の骨髄由来培養樹状細胞にレトロウィルスベクターを用いてα変異体を恒常的に発現する樹状細胞を調製し、これをマウスに移植して生体内免疫応答を解析する。本学GSC発展コース受講生がジュニア農芸化学会2018年度(平成30年度)大会において金賞を受賞農芸化学
連鎖解析を用いた熱帯熱マラリア原虫の新たな赤血球侵入関連分子の同定

申請者は、熱帯熱マラリア原虫HB3株とDd2株の遺伝子高配子孫株を用いたポジショナル・クローニングにより、赤血球への侵入能力と関連を示す約100kbの領域を第四染色体サブテロメアに同定した。この領域に存在する25の読み枠には、既知の赤血球結合蛋白の相同体が2つ認められたが、これらは2株間において塩基配列、転写レベル、蛋白の局在などにほとんど差がなかった。そこで、これら以外の、全く未知の読み枠のいずれかが赤血球侵入に関連する分子である可能性がでてきた。昨年度は、この新規赤血球侵入関連分子を同定するために、あきらかに関係がないと考えられる遺伝子を除いた遺伝子群について、転写解析、アミノ酸多型解析、および抗体による局在解析を行った。その結果、今年度は2つの遺伝子を候補遺伝子と考え、検討を加えた。そのひとつの候補(SURFINと呼ぶ)は、赤血球侵入型原虫の先端部に局在があるものの、赤血球表面にも局在し、赤血球侵入に関するよりも、むしろ感染赤血球の血管内皮細胞への接着現象に関与している可能性が高いと考えられた。COS細胞表面へ組換え蛋白質として発現したが、現在のところ、赤血球結合能はみとめられていない。赤血球侵入能力が劣るDd2株に、HB3株型の遺伝子を導入するため、もうひとつの候補(RBPpsと呼ぶ)とあわせて、HB3株から遺伝子を増幅しGatewayシステムを利用して、発現コンストラクトを構築した。申請者は、熱帯熱マラリア原虫HB3株とDd2株の遺伝子交配子孫株を用いたポジショナル・クローニングにより、赤血球への侵入能力と関連を示す約100kbの領域を第四染色体サブテロメアに同定した。今年度は、この新規赤血球侵入関連分子を同定するために、あきらかに関係がないと考えられる遺伝子を除いた遺伝子群について、まず、転写レベルでの差の解析および塩基配列レベルでの多型解析を行った。転写レベルについては2株間で有意に差があるものは認めなかったが、塩基配列レベルでは、複数の遺伝子に関して多型が認められた。熱帯熱マラリア原虫の赤血球侵入関連蛋白の多くで多型現象が見られ、株間における侵入能力を決定する場合があるため、これらの遺伝子産物は強い候補と考えられる。また、DNA免疫により抗血清を作成し、マラリア原虫における細胞内局在を検討したところ、複数の遺伝子産物について赤血球侵入型原虫に発現していることが判明した。二つの結果を総合的に判定した結果、現在のところ2つの遺伝子を候補遺伝子として検討を加えている。来年度はこれらの遺伝子について、ジーンターゲティングの手法を用いて、どちらかの遺伝子がポジショナル・クローニングに用いた赤血球侵入形質に関連しているのかどうかの検討を加える。