hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血中膵癌由来ペプチドの網羅的解析による新規バイオマーカーの探索

今回、我々は、新たに開発したペプチド解析プラットフォームを用いて、早期発見が困難とされる膵癌患者の血清中に特異的にみられるペプチドを網羅的に解析した。その結果、膵癌患者に特異的に増加したり、減少したりするペプチドを多数同定した。同定されたペプチドは、病態疾患ペプチドームを形成していると考えられる。今後、プロテオミクス解析を用いて、さらなる診断マーカーの開発や病態解明が発展することが期待される。現在まで当科に保存されている、膵癌や慢性膵炎の患者血清からタンパクを抽出した。我々は、2D-μHPLC-MALDI-TOF-MS(質量分析計)を用いたハイスループットの検出系をすでに確立しており、この系を用いて解析する。病期が進展するのに伴い、特に低分子のペプチドの発現をプロファイリングした。特に癌化との関連ペプチドに注目した。コントロールとして肝癌患者や他の消化器癌患者関しても検討する。具体的には以下の方法を用いた。血清サンプルを前処置後SCXおよびC18カラムを用いた2D-μHPLCにより6x190=1140の分画に自動装置によってわける(AccuSpot)。それぞれの分画を質量分析計(AXIMA CFR plus: reflectron mode)にかけ、結果をディファレンシャル解析ツールにより解析した。その後に再調整することなくMS^n測定により、タンパク・ペプチドの構造決定をした。これらの一連の過程はすべて自動化で施行している。(自動多次元タンパク質MSプロファイリングシステムを共同で開発した)。本法によって、包括的かっ網羅的なプロテオーム解析が可能になるが、検体処理速度は1週間に2検体が可能である。本研究では特に質量5000以下のペプチドを中心に網羅的に解析する。この結果多数の疾患特異性ペプチドを同定することが可能であった。現在、同定されたペプチドを解析しその修飾についても検討中である。質量分析計によるタンパクの同定は、ペプチドマスクフィンガープリント法(PMF)とアミノ酸内部配列解析を施行する。具体的には、PMFはタンパク質を特異的切断酵素で処理し、データベースから予想されるペプチドの質量と実測値を比較し、既存のデータベースより同定する。また、アミノ酸内部配列解析は、ペプチド断片をさらにペプチド結合の位置で分解し、アミノ酸内部配列解析を施行する。これにより未知のタンパク質も構造を明らかにすべき研究をすすめている。本年度も昨年に引き続き、膵癌や慢性膵炎の患者血清からタンパクを抽出した。膵臓癌患者41例(転移なし26例、転移あり26例)の血清と対照群として健常人11例、単純性脂肪肝18例の血清を用いた。血清から低分子量タンパク質(ペプチド)を抽出し、強陽イオンカラム交換(SCX)カラムと弱陰イオン交換(WCX)カラムでステップワイズ分画したのち、逆相クロマトグラフィーで分画した384分画を、MALDI-TOF MS/MS解析を行い、各群の低分子量タンパク質(ペプチド)の定量比較とROC解析をin-houseのソフトウェアParnassum行った。成績:健常人との比較において膵臓癌で上昇するバイオマーカーペプチド候補が25種類(ROC解析でAUC>0.75)、単純性脂肪肝18例との比較において膵臓癌で上昇するバイオマーカーペプチド候補が86種類(ROC解析でAU(>0.8)見出された。このうち多くは血清に大量に含まれるタンパク質の断片であったが、癌関連タンパク質やがんシグナル伝達におけるリン酸化酵素の断片が膵臓癌でのみ見出された。これらの新規に同定された膵臓癌ペプチド腫瘍マーカー候補についてLC-MS法による定量アッセイを確立し、これらのバイオマーカーによる膵臓癌血液診断における臨床有効性を明らかにしたい。結論:膵癌患者血清中において多数の特異的ペプチドを同定した。これらは、膵癌の早期診断マーカーになり得ると考えられた。さらに、こらえらのペプチドの同定や修飾の解析をすすめ、臨床意義を含めその臨床意義、有用性についても検討中である。肝疾患患者血清ペプチドの疾患プロテオミクス。前年度までの方法を用い、膵癌における新規バイオマーカーの同定を試みた。一例を示すと、健常者ではほとんど発現がみられないが、ほとんどの膵癌患者で上昇しているペプチドまた、その逆に膵癌で発現が低下しているペプチドを多数みとめた。膵癌患者と健常者との比較。AUC値のカットオフを0.8以上と設定すると以下に示すペプチドがクラスターとして認められた。膵癌で増加したペプチド25ペプチド、膵癌で減少したペプチド93ペプチドを確認した。膵癌患者と脂肪性肝疾患患者との比較。AUC値のカットオフを0.75以上と設定すると以下に示すペプチドがクラスターとして認められた。膵癌で増加したペプチド88ペプチド、膵癌で減少したペプチド243ペプチドを確認した。また両解析に共通するペプチドも多数、同定できている。またAUC値ており、現在さらなる解析風である。

これらの分子においては、膵癌患者において健常人、脂肪肝患者と比較して優位に増加または減少している。また、同定されたペプチドの分類は、膵癌患者で増加しているものComplement-related, Inflammatory reaction, Electron transport chain, ECM-related, Cholesterol Metabolism-related, Neurotransmitter, Tyrosine-protein kinase, Angiogenesis-related, Serine protease familyなど。膵癌患者で減少しているものFinrinogen-related, Cytoskelton-related, Heme-related, Ferritin-related, Energy-enzyme, Phosphoryrate-enzyme, Neuron-relatede, Metabolism-related, Immunoglobulin-related, Thyroid hormone-related, Tumor-suppresor protein,, transporterPhosphoryrate-enzymeなどであった。同定されたペプチドは癌遺伝子、細胞内シグナル関連、血管新生関連や代謝関連あんど非常に多岐に渡っていた。すでに膵癌関連分子と報告されているものもあり、本方法による解析の妥当性が示唆され、疾患関連バイオマーカーの探索に有用であることが示唆された。
占領と日本「復帰」－米軍占領政策の実践からみた１９５１年東京と沖縄の「復帰」支持

一つ目の成果は、サ講和期の沖縄帰属問題に関する在ハワイと在東京の沖縄人の連携と温度差を明らかにしたことである。「復帰」支持を表明していたハワイ沖縄移民の意見を分析し、両地域間の連絡が密であった様子とともに「復帰」で東京と意見を一にしていた彼らの支持理由が抽象論に留まる事実に光を当てた。二つ目は、在日沖縄人の「復帰」支持の背景にGHQ占領下の朝鮮人の抑圧を見出し、実証を試みた点にある。東京をしのぐ沖縄人集住地・関西を中心に、朝鮮人と沖縄人の法的地位や自己認識における類似性と差異を調査し、「非日本人」として弾圧対象化された朝鮮人の存在が沖縄人の「日本国籍」希求を方向付けた可能性を検討した。関西の沖縄人と朝鮮人に関する調査:本年度は、「復帰」支持と米軍占領統治・実践という当初の計画を修正して、関西地区の沖縄人と朝鮮人の関係について調査をはじめた。関西に着目した理由は、在東京沖縄人の「復帰」支持背景を調査する過程で、関西沖縄人コミュニティの規模が東京を大きく上回っている事実(1947年時点の「沖縄人連盟」会員数は東京・神奈川合計13,231人に対し大阪・兵庫32,790人)と、関西の沖縄人が「沖縄人」呼称に対して潜在的に反発していた可能性に気づいたためである。同時に、終戦直後の朝鮮人最大の集住地域も関西地方である点に着目し、1在東京沖縄人の帰属意識に対する関西地方の影響、2GHQ下朝鮮人の政治社会的状況が沖縄人の日本「復帰」論理を形成した可能性、の2点を明らかにすべく、関西における朝鮮人と沖縄人の社会生活上の接点を調査しはじめた。7月の報告で朝鮮人との関連という仮説を発表し、10月初旬に関西方面へ出張を行う。関西沖縄人の研究者らと交流を持ちつつ、大阪・兵庫の沖縄人集住地区(大正区・戸ノ内)のフィールドワークを行った。また1960年代より兵庫県に在住し、大阪・兵庫の沖縄関係活動の重要人物である方の自宅にて蔵書整理を手伝い、本研究に関連すると思われる書籍を多数譲り受けた。こうしたフィールドワークと並行して、1990年代に大阪・兵庫で行われた聞き取り記録や1946年3月に行われた朝鮮人・中国人・台湾人・琉球人帰還希望調査に関する資料、GHQ統治下の在日朝鮮・韓国人史、大阪社会労働運動史、沖縄系機関紙のなかの朝鮮人表象など多方面から一次・二次資料を調査している。しかし両者の関係について直接的に記された文献資料の多くないことがこれまでの調査で明らかになっている。1)比嘉春潮文庫:5月と8月9月に沖縄県立図書館所蔵・比嘉春潮文庫の1940年1953年頃までを対象に1在東京沖縄人の政治運動、2海外沖縄人との交流、を示す資料を調査した。1に関しては東京の沖縄人組織「沖縄人連盟」関連書類の複写、熊本発行の「内報」、沖縄から送付された「沖縄の現状報告」等の資料を複写した。また在東京沖縄人の動向を推測するための補助資料として「沖縄文化」、「文化沖縄」「沖縄タイムズ」の複写も行った。2については北アメリカから送付の「救援ニュース」「会報」、ブラジルから送付の「会報」、ペルーから送付の「救援ニュース」をそれぞれ閲覧、複写した。これらの資料の意義は在東京沖縄人と国内、海外の沖縄人コミュニティとのネットワークを実証する点であり、これらの内容分析により当時の沖縄人の政治的活動の実態が沖縄サイドから明らかにできる点に資料の重要性があるといえよう。2)ハワイと東京の関係:9月から11月まではハワイの日系紙「ハワイタイムス」に沖縄日本復帰支持を投書した与世盛智郎と玉代勢法雲の在東京沖縄人とのつながりについて、二次資料と東京発行の雑誌「おきなわ」をもとに研究をすすめた。また当時のハワイ日系/沖縄系社会をとりまく政治状況について先行研究の読み込みを行った。これらの意義は、沖縄の帰属問題が在海外沖縄人の関心をも惹いていた事実を明らかにすることであり、東京とハワイという異なる統治状況を並置して考察する点に重要性が存在する。3)情報流通経路:11月から2月まではこれまで調査してきた一次資料と先行研究をもとに、当時の沖縄、東京、海外(ハワイ)の情報共有の実態を、郵便制度、進駐軍、引揚という3つの視座から解明を試みた。3つの地域の沖縄人コミュニティを繋ぐ制度的側面とともに、GHQや沖縄統治に携わった日系二世兵士の動態に着目した点に意義と重要性がある。本年度はH25年に引き続きGHQ占領下の沖縄人と朝鮮人の政治的な連携の可能性について調査と考察を行った。

具体的には、在日朝鮮人研究の先行研究をもとにGHQおよび日本政府の対朝鮮人政策を調べ、「第三国人」「非日本人」といったラベリングが当該時期の在日朝鮮人、沖縄人コミュニティの「生存権」の模索に与えた影響を検討した。関連して、当該時期の朝日新聞大阪版の紙面を調査し、1948年から1950年にかけて北朝鮮国旗掲揚問題、阪神教育闘争、ドブロク作成集落の急襲といったトピックを通じて朝鮮人が「騒乱」の原因として日本社会で表象されていた実態を確認した。また、1970年代後半に阪神地域にて沖縄出身者を対象に行われた聞き取り調査の結果を再分析し、敗戦直後の生活状況(職業・集住状況)を明らかにするとともに、闇市場における朝鮮人や台湾人との協働・競合の側面を調査した。これらの研究より以下の点が明らかとなった。1関西地域では戦前から沖縄人と朝鮮人を類似視する風潮があり、戦後も日本社会の一部に同様の傾向がみられた。2在日沖縄人が沖縄の日本「復帰」を意識する時、「外国人」/「日本人」という二重の身分から生存権を主張する朝鮮人の状況と、それに対するGHQ・日本政府の弾圧という同時代的な要因を考察する必要がある。3故郷から切り離された在日沖縄人、朝鮮人は闇市場や闇商売を主な生業の場とするなど共通点も多く協働する側面も存在したが、限られた社会資本をめぐる競合関係、沖縄人側の一部に存在した対朝鮮人の蔑視意識など、GHQ下の「非日本人」というカテゴリーでは捉えきれない側面が存在する。東アジア戦後政治史/サンフランシスコ講和研究/沖縄近現代政治史今年度より関西方面の沖縄人および朝鮮人に対する調査へ新たに着手したため、当初予定していた「在東京沖縄人の政治活動に関する日本政府・GHQ側の資料調査」や、昨年度に提出した今後の推進方策の「沖縄・東京・ハワイ3か所における統治状況の違いを日本、沖縄の占領政策の観点から調査」計画と比較すると、かなりの逸脱/遅れとも受取れる。そのうえで「やや遅れている」とした理由は以下のとおりである。まずこの変更は、在東京沖縄人のみをもって日本全体の沖縄人とその「復帰」背景を代表させることの危険性を克服する上で重要な変更であり、朝鮮人という存在を補助線として、当該時期の政治社会状況(「共産主義者」「第三国人」というレッテルと生活権の危機が直結する状況)を推察する上でも不可避な変更である。この点において研究課題の「占領下の「復帰」支持」というテーマ自体から大きく逸脱しているとは考えていない。また今年度は、当時の朝鮮人に対するGHQ/日本政府の政策(の転換)の調査を進めるうえで占領統治下の対「非日本人」/「非外国人」政策の整理に着手し、朝鮮人と沖縄人の接点を探る過程で国会の議事録調査も開始した。どちらも継続中であるが、日本政府・GHQ側の政策への着目は、アプローチと使用資料が異なるとはいえ、当初の研究に沿ったものといえる。研究外の理由としては非常勤としての教育活動が挙げられる。今年度より週1回非常勤講師として演習を担当することになったが、とりわけ前期は本研究と直接関係のないテーマでの授業運営であったため、授業準備に想定以上の時間が割かれた。第一の理由として、本研究が当初対象に含めていなかった在ハワイ沖縄人と、ハワイ・東京・沖縄の情報流通経路に関する調査に時間と資源を割いた点が挙げられる。報告者は本研究費申請以前から在ハワイ沖縄人の調査を行ってきたが、今回、比嘉春潮文庫を調査した結果、在東京沖縄人と海外とりわけ在ハワイ沖縄人との人的・情報面の繋がりの重要性を再認識した。
新規合成レチノイドの分子病理学的作用メカニズムの解明

新規合成レチノイド(acyclic retinoid, ACR)は副作用を惹起することなくヒト肝癌治療後の再発を有意に抑制する。本研究の目的はACRの抗腫瘍作用メカニズムを分子レベルにおいて詳細に解析することである。私達はヒト癌細胞においてACRの細胞周期関連分子の発現に対する影響と核内レセプター転写活性に及ぼす効果を検討した。ACRはヒト肝癌細胞株(HepG2)・食道扁平上皮癌細胞株(HCE7)・大腸癌細胞株(HCT116)の増殖を濃度依存的に抑制した。ACRはHepG2細胞株において短時間(3h)にp21^<CIP1>のmRNAとタンパク発現を誘導した。また、ACRはRARβのmRNAとタンパクの発現及びRARβの転写活性を誘導した。以上の結果よりACRによる癌細胞増殖抑制メカニズムにはRARβとp21^<CIP1>が非常に重要な役割を果たしていることが明らかになった。ACRはヒト頭頚部(YCU-N861,YCU-H891)・食道癌細胞株HCE7おいても肝癌細胞に対する作用と同様にcyclinD1を抑制しp21^<CIP1>を誘導した。ACRはこれらの細胞においてG1 arrestを引き起こしapoptosisを誘導した。またACRはc-Fos及びAP-1プロモーター活性を濃度依存的に抑制し、リン酸化型EGFR(pEGFR),pStat3及びpErk1/2のタンパク発現を抑制した。ACRはHepG2細胞株においてOSI461(sulindac誘導体)との併用により癌細胞増殖抑制に関して相乗効果を示し、そのメカニズムとしてp21^<CIP1>とRARβの誘導が重要であることが明らかになった。以上の結果はACRがヒトの様々なタイプの癌に対する治療薬あるいは予防薬として有効であることを示唆する。ACRとOSI461との併用は肝癌や他の癌の予防や治療の有効なレジメンとなる可能性がある。新規合成レチノイド(acyclic retinoid, ACR)は副作用を惹起することなくヒト肝癌治療後の再発を有為に抑制する。ACRはヒト肝癌細胞(HepG2)・頭頚部扁平上皮癌細胞(HCE7)・大腸癌細胞(HCT116)の増殖を濃度依存的に抑制した。ACRはHepG2細胞において暴露3時間後に細胞周期抑制タンパクであるp21^<CIP1>のmRNAとタンパク発現を誘導した。この誘導はp53非依存的に起きていた。ACRは暴露3時間以内にRARβのmRNAとタンパクの発現を有為に誘導した。RARE-CATリポーター遺伝子をHepG2細胞にRARα,RARβ,RARγ,RXRα発現ベクターと共に導入し、ACRを暴露させACRのこれらの遺伝子の転写活性に対する影響を解析した。ACRの存在下でRARβを導入した時CAT活性は4倍に上昇したが他の発現ベクターを導入した時は2倍以下であった。さらにACRはHCE7細胞においても肝癌細胞に対する作用と同様にcyclinD1を抑制しp21^<CIP1>を誘導した。

またACRはc-Fos及びAP-1プロモータ活性を濃度依存的に抑制し、リン酸化型EGFR(pEGFR),pStat3及びpErk1/2のタンパク発現を抑制した。以上の所見はACRがヒトの様々なタイプの癌に対する治療薬あるいは予防薬として有効であることを示唆する。本研究の目的は新規合成レチノイド(acyclic retinoid : ACR)の抗腫瘍作用メカニズムを分子レベルで詳細に解析することである。私達はヒト肝癌細胞株(HepG2)を用い、細胞周期の調節に関連するp21^<CIP1>及びp53のmRNA発現に対するACRの作用を解析し、レチノイドの核内受容体であるRARα/β/γ及びRXRα/β/γのmRNA、タンパク及び転写活性に与えるACRの効果を解析した。さらに、頭頚部・食道癌細胞株(YCUN, YCUH, HCE7)を使いACRの細胞周期とシグナル伝達に及ぼす影響を解析し、HepG2細胞におけるACRとOSI461(sulindac誘導体)との相乗効果の有無を検討した。研究成果として以下の新しい発見があった。ACRはRARβを活性化しp21^<CIP1>の転写活性化を引き起こす。p21^<CIP1>の活性化にはp53非依存的なメカニズムが関与している。ACRはAP-1とc-Fosのプロモーター活性を抑制する。ACRはHCE7細胞においてTGFαタンパクの細胞内レベルを下げ、EGFR,Stat3,ERKタンパクのリン酸化を減少させる。ACRはヒト頭頚部・食道癌細胞株に対してもcyclinD1を抑制しp21^<CIP1>を誘導することにより増殖を著しく抑制する。さらにACRはこれらの細胞においてG1 arrestを引き起こしapoptosisを誘導した。これらの研究によりACRの細胞周期に関する可能な標的分子が明らかになった。これらの情報は今後の効果的な癌の予防や治療のための新薬開発の一助となろう。また、ACRはヒト肝癌細胞株においてOSI461との併用により癌細胞増殖抑制に関して相乗効果を示し、そのメカニズムとしてp21^<CIP1>とRARβの誘導が重要であることが明らかになった。従って、ACRとOSI461との併用は肝癌や他の癌の予防や治療の有効なレジメンとなる可能性がある。
エネルギー識別能力をもつ医療用大面積X線画像検出器の開発

有機金属気相成長法によるSi基板上の単結晶CdTe厚膜層を用いて、入射X線に対するエネルギー識別機能を持つ、アレイ型大面積X線画像検出器を実現することを目的として、p-CdTe高抵抗厚膜層/n-CdTe低抵抗バッファ層/n^+-Si構造の検出器の高性能化を検討した。ヨウ素を不純物としたp-CdTe高抵抗層とn-CdTe低抵抗層の成長条件を確立した。さらに大面積の高品質CdTe層の成長に不可欠なSi基板の成長前処理技術を確立した。有機金属気相成長法によりSi基板上に直接成長したCdTe層を用いた,p-CdTe厚膜層/n-CdTeバッファ層/n^+-Si構造のヘテロ接合型ダイオードX線検出器について,検出性能およびエネルギー分解能の向上を目的として検討を行った。検出感度向上にはp-CdTe層を100μm以上に厚膜化しX線吸収効率を増加すると共に,動作時にはこの層全体に電界を印加し,X線により発生したキャリアの取り出し効率を向上する必要がある。実用的バイアス電圧のもとでその条件を満足するためには,p-CdTe層中のイオン化不純物密度(N_A-N_D)を極力低減する必要がある。ここではp-CdTe層成長時にn型不純物であるヨウ素の添加を行い,その際に生じる自己補償効果を利用したN_A-N_Dの低減について詳細に検討を行った。その結果,N_A-N_Dを10^<13>cm^<-3>以下に低減できるヨウ素添加条件を見いだし,目的検出器の実現につながる大きな成果を得た。また本検討によりこれまで未解明であったCdTeの自己補償による高抵抗化メカニズムの詳細が明らかになりつつある。また,検出器暗電流を低減しS/Nを向上するためには,n型CdTeバッファ層の電子密度を高くする必要がある。これまでSi基板上のCdTe層の電子密度制御に関する詳細な検討は未実施であったが,Si基板上でも再現性よく10^<16>cm^<-3>以上の電子密度を有するn型CdTe層が得られる条件を見いだした。さらに上記の検討をふまえて試作した検出器では,まだ常温における検出特性には改善の余地があるものの,-30°C程度に冷却した場合には既に実用化されているCdeバルク結晶による検出器と比較して遜色のない良好なエネルギー分解能が得られることが確認できた。有機金属気相成長法によりSi基板上に直接成長したCdTe層を用いた、p-CdTe厚膜層/n-CdTeバッファ層/n^+-Si構造のヘテロ接合型ダイオードX線検出器について、検出感度およびエネルギー分解能の向上を目的として検討を行った。検出感度向上にはp-CdTe層の厚膜化(100μm以上)と共に、p-CdTe層の高抵抗化が必要である。p型層高抵抗化は成長温度510°C以上でTe過剰の成長条件(VI/II比3.0)で、エチルヨウ素添加量を10^<-6>mol/min以上とすることにより自己補償を活用して達成できることを見いだした。また、CdTe層電気特性のヨウ素添加量依存性からCdTeにおける自己補償機構について検証を行った。一方、エネルギー分解能の向上には、動作時の暗電流の低減が必要である。暗電流の低減には格子不整合による高密度の転位が存在する、n-CdTe層中への空乏層の広がり防止が必要である。ここではn-CdTe層の高電子密度化による空乏層の広がりの低減を検討した。その結果n-CdTeは成長温度325°C、VI/II比を0.15以下に低減することにより、Si基板上でも電子密度10^<17>cm^<-3>以上の高電子密度のn-CdTe層が成長できることを確認できた。この結果をふまえ今後n-CdTe層厚さ等の最適化を実施しさらに暗電流の低減を図る。またこれまで、成長面内における成長層結晶性や電気特性の不均一が、検出器の特性や再現性変動を引き起こし、目的とする検出器アレイ実現の障害となっていた。この最大の原因は成長前処理として実施する、GaAs処理時における基板温度変動やその分布の不均一と考えられる。これらの問題の解決を目的として前処理装置の根本的な改良を実施した。今後はその装置を用いて、検出器特性の向上と共に、目的素子の実現を図る。有機金属気相成長法によりSi基板上に成長したCd(Zn)Te単結晶厚膜を用いて、画素ごとに入射X線フォトンエネルギーを識別できる能力をもつ、高性能大面積の2次元アレイ型X線画像検出器を開発することを目的として研究を行った。

本年度は1.検出器暗電流のさらなる低減による検出特性向上と、2.大面積アレイ実現を目指した、成長層の高品質化と大面積化について検討を実施した。1暗電流低減にはヘテロ接合界面の格子不整合に起因する転位による影響の低減が必要である。このためn-CdTeバッファ層中の転位密度の低減を目的として検討を行った。バッファ層成長時に成長を中断し、この間に成長温度から常温まで数回昇降温を繰り返し実施した場合、暗電流が低減できることが確認できた。これは上紀の処理により転位の発生とアニールによる消滅が生じるためと考えている。今後アニール温度の最適化によってさらに低暗電流化が見込める。2成長層高品質化と大面積化については以下の検討を実施した。これまでSi基板上の成長層では基板からの成長層の部分的剥離や、成長面内での結晶性の不均一の発生防止が課題であった。これは主としてCdTe成長に先だって実施するSi基板の成長前処理における、基板面内での処理条件の変動や不均一が発生によって生じる。本年度はこの問題の改善を目的として新規の前処理装置を開発し、成長前処理の精密制御化を実現すると共に、基板面内における前処理の均一性と再現性の向上を図った。その結果、基板と成長層の部分的な剥離を防止すると共に、良好かつ均一な結晶性をもつCdTe層を実現した。さらにこの成長層によって検出器アレイを製作し、その特性の評価からも、均一かつ良好な特性が得られていることを確認した。以上の結果は本研究で提案した方法により、最終目的とする高性能大面積X線画像検出器が実現できることを強く示唆している。
フェレドキシン依存性酵素とフェレドキシンとの複合体結晶構造の解析

フェレドキシン(Fd)してトウモロコシ、スギナ、マラリア原虫由来のもの、Fd依存性酵素としてトウモロコシFd : NADP+還元酵素(FNR)と亜硫酸還元酵素(SiR)を用いて、以下の研究を遂行した。1)トウモロコシSiRとFdとの電子伝達複合体の結晶構造解析を前年度に引き続いて行ったが、分解能の改善は得られておらず構造解明に至っていない。2)スギナにはFdIとFdIIの2種のFdイソフォームが存在する。FdIには植物Fdに特徴的なArg39とGlu28の分子内塩橋構造が存在する。この塩橋構造はFd分子の安定性に重要であり、またFNRとの相互作用の際に、FdとFNRとの間の分子間塩橋に掛け変わるものである。FdIIではこの塩橋形成に対応する2残基は別の非解離性のアミノ酸に置換しており、分子の安定性やFNRとの相互作用の仕組みが異なるものと推定される。本年度は、このFdIIのx線結晶構造を決定した。その結果、Arg22とGlu58の間に新たな塩橋が形成されていることが判明した。この分子のFNRとの相互作用はFdIより強く、逆に、従来型の塩橋構造が形成できるように部位特異的改変を加えるとFdIと類似した特性に変化することも判明した。3)マラリア・アピコプラストのFdのx線結晶構造を決定した。主鎖構造は植物由来の根型Fdと極めて類似したものであったが、分子表面の静電ポテンシャルはマラリアFd特有であった。これを反映して、FNRとの相互作用は、植物FNRに比べマラリアFNRとの方が強いことが判明した。この結果はマラリア特異的なFd : FNRの相互作用様式があることを示唆するものである。高等植物のフェレドキシン(Fd)は、主に葉緑体中に存在し、活性中心に[2FE-2S]クラスターを持つ分子量約11Kの電子伝達蛋白質である。これは光化学系Iから受け取った電子を複数の同化還元酵素へと伝達する役割を担っている。一般的にFdとFdに依存する酵素間での電子の受け渡しは、電子伝達複合体を形成した後に起こることが判っている。電子伝達複合体形成の際に注目したいのは、同じFdが生理活性の全く異なる複数の還元酵素と複合体を形成することである。研究代表者はトウモロコシ葉緑体中にあるFdとFd-NADP+還元酵素(FNR)との複合体結晶構造を明らかにしているが、この複合体構造中ではFd側の電荷を持ったアミノ酸による静電的な相互作用がFNRとの複合体形成に重要であることが見出された。さらに複合体を形成することによりFdとFNRの双方に構造変化が誘発されることも明らかにしている。しかしながら、FNR以外にFdとの複合体構造は報告されておらず、他の還元酵素の場合はどうであるかは不明のままであった。平成13年度は、生理的に葉緑体型と逆の反応を触媒する根プラスチド型のFNRとFdを用いて電子伝達複合体を結晶化し、その立体構造を明らかにした。根型FNR : Fd複合体の分子間には、葉緑体型では見られなかった多くの水素結合が確認された。また、酸化還元中心であるFADと鉄・硫黄クラスターの相対配置が異なっており、鉄・硫黄クラスターの表面を使い分ける電子伝達の可能性が考えられる。さらに根型複合体中の分子間相互作用領域は葉型に比べると狭く、他のFd依存性酵素が複合体の酸化還元中心に接近する余地を残している。今回得られた複合体構造中のFNRと葉型複合体中のFNR、ホウレン草のFNR : NADP(H)複合体の3構造を比較したところ、根型複合体ではFdの結合だけでなくピリジンヌクレオチドの結合も根特異的であることが判り、このような器官特異的な相互作用がFNRの酵素作用の調節要因となる可能性を示していると言える。

3)マラリア・アピコプラストのFdのx線結晶構造を決定した。主鎖構造は植物由来の根型Fdと極めて類似したものであったが、分子表面の静電ポテンシャルはマラリアFd特有であった。これを反映して、FNRとの相互作用は、植物FNRに比べマラリアFNRとの方が強いことが判明した。この結果はマラリア特異的なFd : FNRの相互作用様式があることを示唆するものである。
癌組織中の2つの間質細胞の機能解析と新規治療法開発

癌研究においては、今まで癌細胞に注目する研究が主だった。しかし、最近になって癌組織内に存在する間質細胞の役割が注目されるようになってきている。我々は、特に間質細胞の多様性に注目している。癌細胞の増殖を正・負に調整する役割を考えた場合、少なくとも2つの細胞群に分けることができるはずで、我々はあるマーカーによって2つの群の存在を証明した。また、ヒトの癌サンプルから間質細胞を収集し、ヒトにおける役割を解析する基礎を作った。I.臨床サンプルにおける間質細胞の検討1)胃癌、大腸癌、食道癌患者サンプルからの間質細胞の分離・培養(1)サンプルをHomogenizeした後、Collagenase処理によって、細胞を分離し培養した。この培養には、癌細胞と間質細胞が混在する。間質細胞がトリプシンによってdishから容易に剥離できることを利用して、癌細胞と間質細胞を個々に培養した。それぞれ、Numberingして患者を代表するサンプルとして保存している。(2)間質細胞の形態を観察し、podoplaninによる免疫染色を施行し、陽性率を算出した。2)臨床データとの相関を評価II.間質細胞の基礎実験(1)podoplanin+細胞とpodoplanir細胞それぞれと癌細胞株(HCT116大腸癌株、KYSE食道癌株など)を共培養し、癌細胞株の変化を評価するために、上記のように、分離培養中。III.マウスを用いた検討(4)以上の実験をヒト由来podoplanin+間質細胞とpodoplanin-間質細胞で検討するために、現在セルライン化を試行中。現在までに、ヒト大腸および胃癌のサンプルから、5つの間質細胞を分離・培養した。いずれも、セルラインとして確立し、保存されている。免疫組織染色によって、desimi, alpha-SMA陽性であることを確認し、CD31, CKに陰性であることも確認した。以上の染色性に関しては、1つのセルライン中の多様性もあり、興味深い結果も得られている。詳細は、今後検討していく予定である。次に、癌細胞に対する影響を、in vivoで調べだ。現在まで報告きれた情報では、癌間質細胞は、癌細胞と同時にヌードマウス皮下に移植した場合、癌増殖を促進する効果が知られている。今回の同様の実験では、4つの間質細胞は、大腸癌細胞株HCT116に対して、同様に増殖促進効果を示した。しかし、1つの間質細胞は、HCT116増殖を有意に抑制することがわかった。これは、今までにない効果をで、今回我々が提唱している仮説を裏付ける結果である。このメカニズムを明らかにするために、in vitroの系を用いて実験を行った。結果、in vivoでの癌抑制効果を示した間質細胞のCMは、HCT16をむしろ増殖促進させることがわかった。よって、この間質細胞の癌抑制効果の原因は、in vivoの血管新生抑制の可能性が考えられる。今後、この因子を同定していく方法を検討中である。一方で、ケモカインとサイトカインは、in vivoとin vitroで異なる効果があることが考えられ、現在5つの間質細胞における、ケモカイン・サイトカインの相違を調べている。
COX-2特異的阻害剤の免疫担当細胞への作用およびその抗腫瘍効果

COX-2選択的阻害剤NS-398を用い、ヒト舌癌由来扁平上皮癌細胞株NAおよびHSC-4の免疫担当細胞に対する作用、その抗腫瘍免疫作用に関して検討し、以下のような結果を得た。1 COX-2選択的阻害剤NS-398がマウス腹腔浸出マクロファージの増殖に及ぼす効果を調べたところ、NS-398はマクロファージ増殖を促進したが、マクロファージの一酸化窒素産生能には影響を及ぼさなかった。3 COX-2選択的阻害剤NS-398で処理した扁平上皮癌細胞NAはICAM-1,ICAM-2のレベルに変化は見られなかったが、ICAM-3発現レベルが増強された。またこの効果は、PGE_2を同時添加することにより抑制された。以上よりCOX-2特異的阻害剤が、COX-2を高発現している癌細胞の産生能を抑制することによりその増殖を阻害することが示された。一方NS-398がマクロファージの機能を抑制することなく、その増殖を促進することが明らかとなり、COX-2特異的阻害剤を用いた新たな癌治療法確立の可能性が示唆された。主としてCOX-2選択的阻害剤NS-398を用い、ヒト舌癌由来扁平上皮癌細胞株NAおよびHSC-4の免疫担当細胞に対する作用、その抗腫瘍免疫作用に関して検討し、以下のような結果を得た。1扁平上皮癌細胞と白血球を共存培養させたものに対し、1L-1βを作用させるとCOX-2の発現が誘導される。これによりIL-1βで処理した腫瘍細胞の培養上清は白血球のIL-10の産生を亢進させ、IL-12の産生を抑制した。またPGE2の産生も亢進した。(ELISA法にて測定)2扁平上皮癌細胞と白血球を共存培養させたものに対し、つぎにCOX-2阻害剤であるNS-398を作用させたところ、IL-1β処理後の扁平上皮癌細胞の培養上清では、白血球からのIL-10の産生は抑制され、またIL-12の産生は増加傾向が見られた。(ELISA法にて測定)3扁平上皮癌細胞と白血球を共存培養させたものに対し、アンチセンスDNAを用い、NS-398と同様に腫瘍細胞のCOX-2を阻害すると、やはり白血球からのIL-10の産生は抑制され、またIL-12の産生は増加傾向が見られた。(ELISA法にて測定)4またNOの産生は、IL-1β処理後の腫瘍細胞の培養上清で測定したところ抑制傾向がみられた。(Griess法にて測定)以上、COX-2を強制発現させることにより、腫瘍細胞の培養上清は白血球のIL-10の産生を亢進させ、IL-12の産生を抑制がみられ、またCOX-2特異的阻害剤を用いることによってそれらの変化に回復が認められた。これらより免疫担当細胞は抗腫瘍効果において、重要な役割をはたしていると考えられる。
認知症高齢者のBPSDの経時的変化とそれに対する対応

BPSDの緩和の過程を日内変動及び長期的変動とそれに対する看護師・介護士の対応方法を前向きに調査・分析することにより、BPSDの再発症防止及び迅速緩和に有効なケア方法を明らかにすることを目的とする。3か月以内に緩和した群を緩和群、緩和しなかった群を非緩和群とし長期的変動を調査する。日内変動は、BPSDの誘発因子・発症時間・症状などについて調査し、発症している時間を「発症期」、発症していない時間を「非発症期」、発症後介護士・看護師の対応により一時的にBPSDの対応をせずとも過ごせる・対応の必要がない状態を「一時的緩和」とする。緩和要因・非緩和要因を記録及びインタビューより調査・分析する。
フィリピン共和国における広域テフラ・ネットワークの構築に関する日比共同研究

フィリピン諸島には,日本と同様にプレートの沈み込みに伴う火山が多く分布している.この研究では,同国の火山地震研究所(PHIVOLCS)との共同研究により,ルソン島のPinatuno, Taal, Irosinの各火山,さらに南方のミンダナオ島にあるParkerとMatutumの両火山の噴火史,およびそこから噴出された広域テフラの年代学的フレームワークの構築を試みた.特にPinatubo火山については,約60 km北東にあるPaitan湖でボーリング・コア試料を採取して,噴火年代の高精度化とこれまで未検出であった噴火を発見することができた.本年度は,ピナツボ火山,タール火山およびサンパブロ火山群において,フィリピン火山地震研究所(PHIVOLCS)と共同で現地調査を実施した.まず,ピナツボ火山については,平成24年9月に山体周辺の調査を実施し,水分析や熱ルミネッセンス年代測定用の試料も採取した.現在,分析およびその結果解析を進めているところである.また,同時にピナツボ火山の山体だけでなく北北東約80kmに位置するパイタン湖で本格的な掘削をするための予備調査を実施した.ハンドオーガーによって深度3mまでのコア試料を採取し,花粉分析や炭素14年代測定を行い,予察的な報告を論文として公表している(Fujiki et al., 2013).この結果をふまえて,平成25年度に本格的な機械ボーリングを実施することにしている.また,ピナツボ火山についても山麓を中心に調査を継続させる予定である.さらに,平成24年12月および平成25年2月には,タール火山の東約30kmに位置するサンパブロ火山群でも機械ボーリングを実施する予定であり,タール火山から噴出したテフラもこの地点で多く捉えることができ,サンパブロ火山群のみならず,タール火山の噴火史をより詳細に解明できると期待している.平成24年11月には,PHIVOLCSからDaag氏とBariso氏を招聘し,福岡大で田口氏との水分析に関する討論,鹿児島大で小林氏とイロシンカルデラに関する地質学的な議論を行い,国分平野で実施されているボーリング掘削現場も視察した.この視察は,日本でのボーリング技術をフィリピンの研究者に直接みせて,我々の意図するところ理解してもらうことを目的とした.以上のように,平成24年度は,次年度以降の機械ボーリングを掘削することを念頭に,ロジスティックスも含めた基本的な情報収集を進め,その一部については予察的な論文を公表した.この研究では,フィリピン,ルソン島における最近5万年間のテフラ層序(特にイロシンカルデラ,タール火山,ピナツボ火山)を明らかにすべく,ボーリング掘削を行うことにしている.その候補地選定のため,ピナツボ火山に近いパイタン湖(タフリング),タール火山に隣接するサン・パブロのセブン・レーク(マール),イリガ火山のブヒ湖(岩屑なだれによるせき止め湖)などで音波調査を実施し,湖底の形状を明らかにした.次年度では,これらの湖底堆積物のピストンコアによる採取,湖畔などで機械ボーリングにより良質な試料を得てテフラの検出を進めることにしている.ピナツボ火山では,山頂地域の地質調査を実施し,古カルデラ湖の存在を示す湖成層を確認した.放射性炭素年代測定用の試料(木片)も採取し,年代測定を進めている.今後,山頂域を構成する溶岩の熱ルミネッセンス年代と合わせて,同火山の噴火史の詳細を明らかにする予定である.小特集「フィリピン・ルソン島のイロシンカルデラとブルサン火山の地質と最近の噴火活動(その1)」を「地学雑誌」に出版した.そのなかで,イロシンカルデラを形成した大規模火砕流の噴火推移を報告している(Kobayashi et al., 2014).また,檀原ほか(2014)は,その一部にカミングトトン閃石が含まれるなど岩石記載的特徴を詳しく報告しており,これらの知見が今後の広域対比に役立つものと期待している.この研究は,フィリピン・ルソン島を中心に広域テフラのネットワークを構築することを目的としている.特にこのようなテフラを生産する噴火の可能性があるピナツボ,タール,イロシンの各火山を対象として地質調査を行うと共に,周辺の湖沼堆積物をコア試料として採取している.これらを詳しく観察・分析することから,熱帯地域で風化が進むためにテフラの保存状態が悪いこの地域全体のテフラ層序を確立することを目指している.これまでにイロシンカルデラの約4万年前の火砕流噴火について明らかにし(「地学雑誌」小特集1と2),ピナツボ火山でも山頂地域の地質調査や熱ルミネッセンス年代および放射性炭素年代から山体形成に関する情報を明らかにしつつある.また,近接するパイタン湖(火口湖)で深度28mまでボーリング・コア試料を採取し,7枚のテフラ層を検出した.現在,それらの年代や湖沼堆積物中に潜在しているテフラについても初磁化率測定などから検討しているところである.さらに,タール火山近くのサンパブロ単成火山群の湖沼についても音波探査を実施して,水深および良好な湖底堆積物が存在することを確認している.今後,マッケラス式採泥装置で最大コア長4mの試料を採取することにしている.これらを取りまとめ,フィリピンにおける広域テフラネットワークを構築するための基礎を築くことができつつある.この研究は,フィリピン共和国における広域テフラ・ネットワークを確立するために,同国立火山地震研究所との共同で実施されたものである.

ルソン島中央部のパイタン湖の湖畔でボーリング・コア試料を採取して,挟在するテフラを見いだした他,放射性炭素年代測定や珪藻群集分析によりテフラの年代や堆積環境の変遷を復元した.今回,深度28mまでのコアが得られ,約2万年前以上遡ることがわかった.テフラは,いずれも斑晶鉱物組成からピナツボ火山起源である可能性が高いが,この地点での層序がピナツボ火山だけでなく,ルソン島における基準になることが期待できる.同様にサンパブロ火山群の湖沼(セブンレイク)でマッケラス式コアラーを用いて湖底堆積物を採取した.残念ながら,これらの湖では養殖に伴うヘドロが厚く堆積し,タール火山などのテフラのためか,分析に耐えうる十分な試料を得ることができなかった.さらに,ミンダナオ島のパーカー火山とマツツン火山でも調査を実施した.パーカー火山は,ピナツボ火山と地形的特徴が酷似しており,同様の噴火史により形成されたことが想定される.山麓の火砕流堆積物中の炭化木片から放射性炭素年代を得た.パーカー火山東麓では,火砕流に伴う降下火山灰も発見された.今後,広域テフラとして追跡できる可能性がある.今後,得られたデータをさらに整理して広域テフラネットワークを提示することにしている.フィリピン諸島には,日本と同様にプレートの沈み込みに伴う火山が多く分布している.この研究では,同国の火山地震研究所(PHIVOLCS)との共同研究により,ルソン島のPinatuno, Taal, Irosinの各火山,さらに南方のミンダナオ島にあるParkerとMatutumの両火山の噴火史,およびそこから噴出された広域テフラの年代学的フレームワークの構築を試みた.特にPinatubo火山については,約60 km北東にあるPaitan湖でボーリング・コア試料を採取して,噴火年代の高精度化とこれまで未検出であった噴火を発見することができた.平成25年度にマッケラス式採泥装置一式をフィリピンに持ち込む際に通関に時間がかかり,研究協力者との日程調整のため,サンパブロ火山群における湖底堆積物の採取が遅れている.また,パイタン湖でのボーリングコア試料の採取についても,現地の実施業者との調整に時間がかかったため,ボーリングの実施が平成26年度末にすることになった.27年度が最終年度であるため、記入しない。火山地質学平成27年度にサンパブロ火山群における湖底堆積物の採取・分析,パイタン湖で採取したコア試料の分析を進め,ピナツボ火山での調査結果も含めてそれらをとりまとめる.この研究では,ピナツボ,タール,イロシンの3火山から噴出したテフラをキーとして,ルソン島のテフロクロノロジーを確立することを目指しており,ボーリング掘削により得たコア試料が基礎となる,初年度において,ピナツボとタールに近接した地点での候補地を選定し,ロジスティックスの準備も整えた.当初の計画では1年に1ヶ所ずつであったが,平成25年度にまとめて掘削することとした.年度内に湖底堆積物をコア試料として採取する予定であったが,送付した機材がマニラ港での通関に時間がかかったために,試料採取が実施できなかった.既に通関は完了しており,次年度にコア採取を実施することにしている.また,良好な試料を採取するためのボーリング業者の選定も難航しているが,次年度は実施できるようにしたい.27年度が最終年度であるため、記入しない。
ドコサヘキサエン酸の酸化に伴うアミロイドβ蛋白質の修飾は痴呆症の病因に関与するか

老化により亢進する脳内の酸化ストレスが認知症の発症に関与するかどうかを調べるために,神経細胞の細胞膜に豊富に含まれる不飽和脂肪酸docosahexaenoic acid(DHA)の脂質過酸化物に対する特異的抗体を用いて認知症患者の組織免疫染色を行った。その結果,正常老人,アルツハイマー病,パーキンソン病患者脳の脳組織において,酸化DHA修飾タンパク質が神経細胞の膜で増加し,特に認知症患者の脳組織で顕著であった。さらに,神経変性疾患に共通の特徴である異常タンパク質凝集体(老人斑・レビー小体)に酸化DHA修飾タンパク質が存在することを明らかにした。老人斑の主要構成成分であるamyloid-β(Aβ)に対してDHAはin vitroで凝集を促進したが,Aβと同様にレビー小体の主要構成成分であるα-synucleinに対しても凝集促進効果が認められた。この凝集反応は脂質内の二重結合の数に依存していた。また,特異的抗体を用いたウェスタンブロティング法により,DHA存在下で重合したタンパク質にDHA由来の脂質過酸化物が付加していることを明らかにした。これらの結果から,DHAは脂質過酸化反応依存性のタンパク質の異常凝集を誘導することが明らかとなった。現在,この酸化DHA修飾タンパク質の詳細な構造解析をTOF-MS,LC-MS/MSで行っている。次に,培養神経細胞に対するDHAの毒性の有無を検討した。その結果,キャリアータンパク質と結合したDHAには神経細胞毒性が認められた。この細胞毒性は抗脂質過酸化剤α-tocopherolにより完全に抑制されたため,DHAの脂質過酸化反応による細胞毒性であることが証明された。従って,DHAは強い抗酸化作用を有するが,DHAの酸化された生成物にはが細胞毒性も示す二面性の性質が示唆され,DHA投与時には抗酸化剤の同時投与が有効である事が明らかとなった。以上の結果から,認知症を伴う神経変性疾患の共通の特徴である異常タンパク質凝集体形成にはDHAの脂質過酸化反応が関与しており,DHAの脂質過酸化反応が神経細胞毒性を誘導することを明らかにした。正常老人、アルツハイマー病、パーキンソン病患者脳の組織免疫染色を行い、酸化docosahexaenoic acid(DHA)修飾蛋白質が変性神経細胞の膜、および老人斑に存在することを認めた。酸化DHA修飾蛋白質の構造および神経細胞への毒性の有無を明らかとするために本研究を行った。老人斑の主成分であるAβ蛋白質をin vitroで各種脂質とともにインキュベートし酸化させた。Aβ標品を37°C、24、96時間反応させ、電気泳動法およびウェスタンブロッティング法を用いてAβの多量体化と凝集を検討した。その結果24時間以上の反応時間で、脂質から生じる反応性の高いアルデヒド(アクロレインまたはヒドロキシノネナール)とAβが共存した場合、Aβの多量化と凝集と考えられるバンドが認められた。細胞膜を構成する多価不飽和脂肪酸であるDHAまたはarachidonic acid(AA)とともに反応させた場合にもアルデヒドと同様な結果が得られた。ウェスタンブロッティングの結果、アルデヒドあるいは多価不飽和脂肪酸と反応後、重合化したAβの抗原性(構造)が変化していることが示唆された。これらの結果は不飽和脂肪酸Aβの構造変化を引き起こすことにより、蛋白質の凝集の原因となっていることを示しており、さらに、抗酸化物によりこれらの反応が抑制されたことより脂質過酸化の関与が示唆された。今後はin vitroから得られたAβ酸化修飾物をLC-MSにより分析し、どのような構造になっているのか明らかにし、さらにこのような物質が神経細胞に神経毒性を持つのかどうか検討する必要がある。さらに食品由来化合物の中でも、大豆由来のイソフラボン類、ゴマ由来のゴマリグナン類、ウコン由来のクルクミン類等、ポリフェノール類を中心としてDHAの酸化、酸化DHAによるAβの修飾、Aβ凝集のいずれかの段階を抑制する作用を定量的に検討する予定である老化により亢進する脳内の酸化ストレスが認知症の発症に関与するかどうかを調べるために,神経細胞の細胞膜に豊富に含まれる不飽和脂肪酸docosahexaenoic acid(DHA)の脂質過酸化物に対する特異的抗体を用いて認知症患者の組織免疫染色を行った。

この細胞毒性は抗脂質過酸化剤α-tocopherolにより完全に抑制されたため,DHAの脂質過酸化反応による細胞毒性であることが証明された。従って,DHAは強い抗酸化作用を有するが,DHAの酸化された生成物にはが細胞毒性も示す二面性の性質が示唆され,DHA投与時には抗酸化剤の同時投与が有効である事が明らかとなった。以上の結果から,認知症を伴う神経変性疾患の共通の特徴である異常タンパク質凝集体形成にはDHAの脂質過酸化反応が関与しており,DHAの脂質過酸化反応が神経細胞毒性を誘導することを明らかにした。
ロリクリンの変異が角化細胞のアポトーシスに及ぼす影響

ロリクリン角皮症の概念の確立辺縁帯の主成分ロリクリンの遺伝子異常による角化異常症は我々が発見した疾患であるが、本研究の期間中にも新しい家系を発見し、これらを「ロリクリン角皮症」という概念で包括した(J Dermatol Sci, 1999, Br J Dermatol 2001)。ロリクリン角皮症における細胞死過程の解析ロリクリン角皮症患者では顆粒層、角層の細胞の核は断片化DNAとプロフィラグリンアミノ末端ドメインを有していたため本症では細胞死の頓挫の状態にあることが示唆された。また、ロリクリン角皮症患者の発現する変異蛋白に対する抗体を作成し、その局在を検討したこところ、変異蛋白は辺縁帯には移行せず、これらの断片化DNAを含む核に蓄積されていることを明らかにした(J Invest Dermatol, 2000)。インボルクリンとシスタチンAの遺伝子発現調節機構辺縁帯の成分であるインボルクリンとシスタチンAの遺伝子発現調節機構を明らかにした(Biochem J, 1999, BBRC, 2000)。辺縁帯形成におけるエピトープマスキング角化細胞のアポトーシスの機序紫外線による角化細胞のアポトーシスはFasリガンドの結合なしにFas抗原の多量体形成によることで起きること(J Invest Dermatol Symp Proc 2001), Bcl-2はこれを抑制することを示した(Photochem Photobiol 2001)。本研究において我々はロリクリンの変異が角化細胞のアポトーシスに及ぼす影響を細胞生物学的アプローチにより明らかにする。平成11年度において我々はロリクリンの遺伝子変異によっておきる魚鱗癬を伴うVohwinkel症候群を日本人患者で初めて同定した(J Dermatol Sci 19:44-47,1999)。角化細胞の終末分化はアポトーシスに特徴的な核DNAの断片化を伴うことを電顕レベルのTUNEL法を開発することにより証明した(J Histochem Cytochem47:711-717,1999)。また角化過程においてロリクリンの抗原エピトーブはデスモゾームのアタッチメントプラーク部分においてマスクキングを受けることを発見し、これが蛋白分解酵素処理により賦活化されることを見いだした(Exp Dermatol 8:402-406,1999)。さらに、ロリクリン変異によって生じる角化異常症(ロリクリン角皮症)に特有の変異ロリクリンを認識する抗体を作成しその蛋白局在を検討したところ、核小体に集積し、その後核内に拡散することを見いだした(J Invest Dermatol 112:551,1999)。これは変異ロリクリンのもつアルギニンにとむアミノ酸配列が核、及び核小体移行シグナルとして働いていることを示唆するものであり、変異ロリクリンが核機能を傷害することにより表皮角化細胞の分化に伴う細胞死の過程を障害、ロリクリン角皮症が生じると考えられた。ロリクリン角皮症の概念の確立ロリクリン角皮症における角化過程の解析プロフィラグリンのアミノ末端ドメインは辺縁帯前駆体と考えられていたが、我々は同ドメインが核内移行しこの核はapoptosisに特徴的な断片化DNAを含むことを発見した(Lab Invest 1998)。ロリクリン角皮症患者では顆粒層、角層の細胞の核は断片化DNAとプロフィラグリンアミノ末端ドメインを有していたため本症では角化という細胞死の頓挫の状態にあると考えられる。ついで、この遺伝子変異から予想される変異蛋白を検出する特異抗体を作成し、その局在を検討したことろ、変異蛋白は辺縁帯には移行せず、顆粒細胞、角質細胞のapoptoticな核に集積していることが明らかになった(J Invest Dermatol,2000)。