hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線虫C.elegansの胚発生各期に特異的に発現される遺伝子群の解析

細胞間でのdefferentialスクリーニングの試みのひとつとして、初期胚の割球間で遺伝子発現量の比較をおこなった。まず、24細胞期の割球の分離法を確立した。親虫をアルカリブリーチ処理して初期胚を得、卵殻が非常に固いのでキチナーゼ処理した後、浸透圧を調節した緩衝液中でマイクロマニピュレーターを用いて、ガラス針で物理的に分離した。まず、AB、P1の各前後単一割球およびコントロールとして後期胚から核酸を抽出し、PCR法を応用した全cDNA種の増幅をおこなった。増幅cDNAの質を検討するために、卵から初期胚でのみmRNAが検出される母性遺伝子glp-1、fem-3、後期胚から発現が見られる咽頭筋遺伝子myo-2の存在を調べたところ、AB、P1割球由来増幅cDNAともglp-1、fem-3が存在したが、myo-2はバックグランドレベルであった。一方、後期胚由来cDNAは逆の結果となり、増幅したcDNAが元の組成を反映していることが裏付けられた。そこで、各割球由来増幅cDNAをプローブとして、線虫初期胚集団から通常の方法で作成したcDNAライブラリーのスクリーニングをおこなった。約5x10^5クローンをスクリーニングした結果、比較的強いシグナルを与えるものとして、前割球(AB)特異的なものを3種類7クローン、後割球(P1)特異的なものを1クローン、分離した。各クローンの解析は現在進行中である。mRNAの極在を確かめるために、胚でのin situハイブリダイゼーション法を検討した。卵殻の除去、ヴィテリン膜の除去、形態維持のための浸透圧調整、などをおこない、中期胚以降については成功したが、初期胚については、大量の卵黄タンパクの存在によるバックグランドの高さなどのためさらに検討を重ねている。(1)本研究計画のために新たに開発した、単一胚からcDNAを増幅調整する方法を用いて、胚発生(受精からふ化まで13時間)の各期(2時間おき)のcDNAプロ-ブを作成した。(2)各期のcDNAプロ-ブを標識し、別に各期の混合集団から作成されたcDNAライブラリ-をスクリ-ニングした。このようにして(differential hybridization)、予備実験で、第一卵割後、1.5時間(原腸陥入期)と9時間(形態形成期)にそれぞれ強く発現が見られるクロ-ンを得た。ほぼ全ゲノムをカバ-するYAC(酵母人工染色体整列クロ-ンをブロットしたメンブレンフィルタ-を用いて遺伝地図上の位置を決定した。(3)一方、増幅したcDNAを逆にメンブレンフィルタ-にドットブロットし、cDNAクロ-ンの方を標識してハイブリダイズさせる方式を設定した。(2)で得たクロ-ンは明瞭に時期特異的発現を示した。Hoskins博士(米国)との共同研究で、運動神経回路形成異常をおこすuncー30遺伝子のcDNAクロ-ンについて調べた所、うすいシグナルであるが第一卵割後7時間後から発現が始まることがわかった。この時期は、uncー30遺伝子に支配される運動神経が伸長を始める時期と完全に一致した。このことから、増幅cDNAのフィルタ-を用いることにより、任意のcDNA(遺伝子)の発現パタ-ンを知ることができるので、均一化したcDNAライブラリ-から、cDNAクロ-ンをランダムに多数選び出し、順々に発現時期を調べ、最終的に全cDNAの発現パタ-ンを記述することをめざした方法の設定を行っている。(4)cDNAの発現を細胞レベルで決定するためにin situハイブリダイゼ-ションを試みた。In situハイブリダイゼ-ションの条件設定のために、ジゴキシゲニン標識プロ-ブを用いる方法を試みた。cDNAクロ-ンの系統的な解析のために、線虫himー8株(雌雄同体と雄がほぼ同数出現する)の混合期集団(発生の全ての時期を含む)からpolyーA^+mRNAを精製し、まず2Kb以上の分画についてλZAPIIを用いてcDNAライブラリ-(平均挿入長、23Kb)を作成した。ここから独立の10,000プラ-クを拾い、すでに同定したabundant cDNAクロ-ンをプロ-ブにハイブリダイゼ-ションを行った。その結果、約5,000の比較的rareなcDNAクロ-ンのセットを得た。これらについて、(1)新たに開発した挿入cDNAの4塩基認識制限酵素地図作成法を用い、地図パタ-ンをフィンガ-プリントとしてクロ-ンの分類を進めた、(2)ほぼ全ゲノムをおおうYAC製列クロ-ンを利用して各cDNAのマッピングを進めた、(3)各期の単一胚から増幅したcDNAをドットブロットしたメンブレンを用いて各cDNAの発現パタ-ンを調べた。大部分はハウスキ-ピング様であったが、発生時期特異的な発現を示すクロ-ンを多数得た。(4)挿入cDNAの両端から数百塩基を、そのシングルプラ-クから簡単に決定できる条件を設定した。一方、細胞特異的に発現する遺伝子を分離することを目指して、各割球から全cDNA種の増幅を試みた。割球の分離には成功し、各割球間のcDNAのサブトラクションの条件設定を行った。

まず、AB、P1の各前後単一割球およびコントロールとして後期胚から核酸を抽出し、PCR法を応用した全cDNA種の増幅をおこなった。増幅cDNAの質を検討するために、卵から初期胚でのみmRNAが検出される母性遺伝子glp-1、fem-3、後期胚から発現が見られる咽頭筋遺伝子myo-2の存在を調べたところ、AB、P1割球由来増幅cDNAともglp-1、fem-3が存在したが、myo-2はバックグランドレベルであった。一方、後期胚由来cDNAは逆の結果となり、増幅したcDNAが元の組成を反映していることが裏付けられた。そこで、各割球由来増幅cDNAをプローブとして、線虫初期胚集団から通常の方法で作成したcDNAライブラリーのスクリーニングをおこなった。約5x10^5クローンをスクリーニングした結果、比較的強いシグナルを与えるものとして、前割球(AB)特異的なものを3種類7クローン、後割球(P1)特異的なものを1クローン、分離した。各クローンの解析は現在進行中である。mRNAの極在を確かめるために、胚でのin situハイブリダイゼーション法を検討した。卵殻の除去、ヴィテリン膜の除去、形態維持のための浸透圧調整、などをおこない、中期胚以降については成功したが、初期胚については、大量の卵黄タンパクの存在によるバックグランドの高さなどのためさらに検討を重ねている。
小中学校に設置された病弱・虚弱学級の実態に関する研究

本研究では、小中学校に設置された「病弱・虚弱特別支援学級」について、その設置形態、在籍児童・生徒の病類、教育課程、共同・交流教育の実施形態、他機関との連携、担当教員が考える課題・問題点、児童・生徒やその保護者の満足度と不満点について明らかにすることを目的とする。調査は、各都道府県教育委員会に質問紙、あるいは電話調査を行い、各都道府県の小中学校に設置された「病弱・虚弱特別支援学級」の存在、所在地を知ることからはじめ、次に小中学校に設置された「病弱・虚弱特別支援学級」の担任教員、児童・生徒やその保護者を対象に調査を行う.リファレンスとなる学級に関しては事例調査を行う。
ブドウ果粒の発育に関連するジベレリンの同定とそれらを利用した無核化技術の開発

GA_3処理により全てのブドウ品種を無核化できない原因を内生ジベレリン類(GAs)との関係から調査し、次のような結果を得た。(1)'キャンベル・アーリー'、'デラウェア'および'甲州'の未熟種子からGAsを抽出・精製後、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離した結果、いずれの品種においても3画分群(I、II、III)でGAs活性が認められたが、活性の強さは品種によって異なっていた。また、'キャンベル・アーリー'のIII画分群中からGA_4、3-epi-GA_4、GA_7およびGA_<34>がガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)で同定され、生物活性からこの品種の主要GAsはGA_4およびGA_7と推定された。なお、ブドウ未熟種子中のGA_3は微量であることが判明した。(2)GA_3、GA_4、GA_7の花(果)房処理は、'キャンベル・アーリー'や'デラウェア'の花粉発芽を抑制したが、'甲州'では抑制効果が著しく弱かった。また、これらのGAs処理による無核化率は、'キャンベル・アーリー'ではGA_7(96%)>GA_3(71%)>GA_4(66%),'デラウェア'ではGA_7(99%)>GA_4(97%)>GA_3(94%),'甲州'ではGA_3(28%)>GA_7(16%)>GA_4(13%)の順に高かった。(3)'キャンベル・アーリー'と'甲州'から得られた内生GAsを用いて両品種の無核化を試みたところ、各画分群(I、II、III)処理により両品種の着果率に対する反応が著しく異なっていた。以上の結果から、今後は内生のGAsと花粉の発芽率との関係、無核化し易い'デラウェア'と無種子化が困難な'甲州'の内生GAsの違いを明らかにする必要がある。GA_3処理によりすべてのブドウ品種を無核化できない原因を内生GAsとの関係から明らかにしようとした。GA_3処理により無核化し易い'キャンベル・アーリー'、中間の'デラウェア'および困難な'甲州'の3品種の種子中のGAsの量的・質的違いについて、HPLCで分離後得られたヒストグラムで比較したところ、いずれの品種においても画分番号1317(I)、2225(II)、2627(III)に強いGAs活性が認められた。しかし、'キャンベル・アーリー'ではIII画分が、'デラウェア'ではIIとIII画分が、'甲州'ではIとIII画分の活性が強かった。また、各画分の活性を合計して比較すると、明らかに'キャンベル・アーリー'、'デラウェア'、'甲州'の順に活性が強かった。この結果、3品種間でGAsの質的違いはないかもしれないが、それぞれのGAs量が異なっている可能性が考えられた。次に、開花23日前の'キャンベル・アーリー'の小花を除雄した子房に、'キャンベル・アーリー'の種子から抽出・精製したI、IIおよびIII画分(2ng・eq GA_3)を処理したところ、いずれの画分も単為結果を誘起した。特に、III画分の活性が強く、2ng GA_3処理よりも果粒の肥大を著しく促進した。この結果、'キャンベル・アーリー'の主要GAsはIII画分に存在するGAsであると推察された。

そこで、III画分についてGC-MSで同定した結果、GA_4、3-epi-GA_4、GA_7、GA_<34>が存在していた。特に、GA_4とGA_7が量的に多く認められた。この結果、'キャンベル・アーリー'の主要GAsはGA_4あるいはGA_7であることが判明した。GA_3処理により全てのブドウ品種を無核化できない原因を内生GAsとの関係から明らかにするため、昨年度はGA_3処理により無核化し易い'キャンベル・アーリー'、中間の'デラウェア'および困難な'甲州'の3品種の種子中のGAsの量的・質的違いについて調査した。その結果、いずれの品種においてもHPLC画分番号1317(I)、2225(II)、2627(III)に強いGAs活性が認められた。しかし、品種によって各画分の活性の強さが異なり、総活性では'キャンベル・アーリー'、'デラウェア'、'甲州'の順に強かった。また、'キャンベル・アーリー'のIII画分中の主要GAsはGA_4とGA_7であることを明らかにした。そこで、本年度はGA_3、GA_4およびGA_7を開花前後の2回処理(100ppm)し、無核化に及ぼす影響を3品種間で比較した。その結果、'キャンベル・アーリー'では、GA_7(無核化率96%)>GA_3(71%)>GA_4(66%)、'デラウェア'ではGA_7(99%)>GA_4(97%)>GA_3(94%)、'甲州'ではGA_3(28%)>GA_7(16%)>GA_4(13%)の順に無核化率が高かった。しかし、無核化率から判断して、実際栽培で使用可能なGAsは'キャンベル・アーリー'ではGA_7、'デラウェア'ではGA_3、GA_4、GA_7であったが、'甲州'ではいずれのGAsでも無核化率が著しく低かった。この原因を各GAsで処理した小果の開花期の花粉の発芽率から調べてみると、'キャンベル・アーリー'や'デラウェア'ではいずれのGAsでも0.20.8%と著しく抑制されたが、'甲州'では、GA_3で5.4%、GA_4で7.7%、GA_7で13.3%と抑制割合が低かった。このことから、'甲州'がGA_3、GA_4やGA_7で無核化できない一つの原因は、これらのGAsが花粉の発芽率を抑制する効果が低いためであると推察された。したがって、他のGAsすなわち昨年度の調査で明らかになったIおよびII画分のGAsの種類と無核化に対する効果を調査する必要があると考えられた。GA_3処理により全てのブドウ品種を無種子化できない原因を内生GAsとの関係において明らかにしようとしてきた。これまでの2年間の研究により、いずれの品種においても内生GAsは3画分群(I、IIおよびIII)で活性が認められた。しかし、各画分の活性の強さは品種によって異なっていた。また、'キャンベル・アーリー'の主要内生GAs(III)である、GA_4およびGA_7が花粉発芽に及ぼす影響をGA_3と比較調査した結果、'キャンベル・アーリー'や'デラウェア'ではいずれのGAsでも発芽を抑制したが、'甲州'ではいずれのGAsでも抑制効果が著しく弱かった。そこで本年度は、内生GAsと単為結果誘起能力との関係を明らかにするため、'キャンベル・アーリーおよび'甲州'から抽出したGAsを両品種の開花期と開花2週間後の2回除雄した子房(果実)に処理し、単為結果の誘起を試みた。'キャンベル・アーリー'のIII画分群処理は、両品種ともに高い着果率を示した。また、II画分群処理では'キャンベル・アーリー'および'甲州'ともに着果率は低く、I画分群処理では'甲州'のみ着果がみられた。これに対して、'甲州'のIII画分群処理は'キャンベル・アーリーで約40%の着果率が得られたが、'甲州'では全て落果した。
知能分子ロボット実現に向けた化学反応回路の設計と構築

本研究課題では,知能を備えた分子ロボットのためのDNAを用いた化学反応回路の設計論を提示すると同時に,新学術領域「分子ロボティクス」の他班との共同研究により,分子ロボットプロトタイプの創製に貢献した.主要な結果としては,光応答性の人工塩基を用いた高速な計算デバイスの開発,環境の変化に適応できる化学反応系の例の実装,さらに,デバイス間の濃度ギャップ問題を解決し得る高性能な1000倍の濃度増幅器の開発が挙げられる.この増幅器は,分子ロボットプロトタイプの創製に大きな役割を果たした.また,分子ロボット開発に有効な,リアクティブな化学反応系の設計論と分子ロボット群のための分散計算理論を構築した.分子ロボットで利用可能な反応回路を構築するためには,高速かつ高機能な演算素子を開発することが必要である.そこで,本計画班が持つ素子の中で最も有望な,光応答性塩基をさらに高性能化することを試みた.その成果の1つとして,シトシンとメチルシトシンを見極める光架橋反応の開発に成功した.2本鎖DNA中のメチルシトシンに対して秒単位で可逆的に光架橋でき,シトシン上の5位のメチル基の有無というわずかな違いを光架橋反応によって読み取る基本原理を構築することに成功した.また,光応答性塩基を利用した回路の高速化・再利用性に関する新規な発案と,数値計算による検討を行った.また,本計画班が有するDNAポリメラーゼを利用した1分子状態遷移機械の技術を,センサーからのシグナルに応答して高速に増幅する回路の開発に応用するための基礎実験を進めた.さらに,スライム型ロボットの運動を実現するためのインターフェースとして,DNA架橋ゲルの開発を行った.核酸等の分子シグナルへの応答動作に成功するとともに,シグナル感度を向上させるための条件検討を行い,これまでの報告よりも1桁以上高感度化させる見込みが得られた.またこれと並行して,DNAコンピュータによって制御可能なゲルアクチュエータの最適な分子デザインについて検討した.そのようなアクチュエータの分子デザインとして,回路の出力によって弾性率が変化するゲルアクチュエータと,pH振動反応を駆動源として自励駆動するゲルアクチュエータを接着させて作製するバイゲル型アクチュエータを発案した.さらに,DNAによって架橋密度をコントロール可能なゲルアクチュエータとして,新規デンドリマーゲルの合成検討を行った.また,分散計算理論の立場から反応回路の理論解析を進めるため,分子間の相互作用などを考慮した計算モデルである個体群プロトコルに対する検討を進めた.化学反応回路に関する研究課題として,演算速度の高速化に関する課題と演算素子の再利用性に関する課題に取り組んだ.演算速度を高速化する課題に関しては,核酸類を超高速で操作可能なシアノビニルカルバゾールを含むDNA光クロスリンク反応について機構解析を行った.さらに光クロスリンク反応を組み込ませることで核酸類の鎖置換反応を大きく加速できることを見出した.また,演算素子の再利用性に関する課題に関しては,新しいタイプの化学反応回路として,アナログ計算を行う化学反応素子を提案した.これらの素子は,入力の変化に応じて出力を変化することができ,更に,長時間利用できるという,従来の化学反応素子にない長所を持つ.反応回路とアクチュエータとのインタフェースを構築する課題にも取り組んだ.まず,架橋部分をDNAで構成したハイドロゲルを利用したり,DNAと共存可能な新規ゲルとしてデンドリマーゲルの開発を目指した.デンドリマーゲルについては,その物性は,ゲル合成時のデンドリマーと直鎖状高分子の比率および濃度に大きく影響を受けることが明らかになった.また,細胞サイズの分子ロボット実機の創製を目指してマイクロスケールでゲルを構築し、環境情報としての分子刺激を受容してゾル化等の応答をさせ、リアルタイムに観察することに成功した.ゾル/ゲルの相転移を繰り返すことで,ゲルが移動する新しい分子ロボットの計算モデルに関する研究も進めた.移動を局所的に制御することを狙い,この分子ロボットをmetamorphic systemによってモデル化し,移動が分散アルゴリズムによって局所的に制御できることを示し、移動速度の上下限を検討した.また,化学反応回路では核酸配列がさまざまな形で干渉するため分子種の個数が組み合わせ爆発する.このような複雑な化学反応系の平衡状態を計算するための一般的な計算手法を開発した.分子ロボットの知的情報処理機能の中枢を担う化学反応回路の構築に向けて,知能班では,回路の高性能化,センサーやアクチュエータとのインタフェースの開発,新しい計算モデルの構築に取り組み成果を収めた.回路の高性能化については,DNA鎖置換反応の高速化に関連して超高速光クロスリンカー(cnvK)より,さらに8倍程度の高速光架橋能を有する新規光クロスリンカー(cnvD)の開発に成功した.これら光クロスリンカーを用いたDNA鎖置換反応の反応解析を行い,照射エネルギー依存的に高速化が可能であることを見出した.光架橋能の優れた分子ほど,DNA鎖置換反応を高速化できることも見出した.これらの成果により,DNA鎖置換反応の高速化に関する機構が概ね明らかとなった.また,時間応答性のある回路の開発に関しては,昨年度提案したDNA鎖置換反応に基づくアナログ回路に対し,その設計手法を検討し,時間応答性のある閾値素子や比較素子を構成できることを数値シミュレーションにより確認した.インタフェースの開発については,化学反応回路と分子モータの間のnMとμMという濃度ギャップを解決するため,DNAシグナル増幅回路の性能向上に取り組み,多様な条件下において30分程度の反応時間でDNAシグナルを1,000倍以上に増幅することに成功した.また,DNAコンピュータを内包するゲルロボットの作製を目指して,DNAコンピュータを内包するゲルカプセル作成のため,様々な化学構造を有するゲル微粒子の合成検討を行った.計算モデルについては,分子ロボットを分散システムと捉えて制御するための基礎となる分散計算理論に関する成果を収めた.

具体的には,3次元モレキュラーロボットの走性発現に必要な局所能力の解析,3次元自律分散ロボット群による平面合意問題の解析,ポピュレーションプロトコルモデルによる自励振動の解析を行った.回路素子の高性能化と新しい計算モデルに関する研究の進展と同時に,開発した素子を他班と連携しながら統合化・システム化することを試みた.DNA鎖置換反応の高速化に関しては,異なる加速効果を有する3種類の光応答性塩基の作成に成功した.またこれらの人工塩基とそれに結合する相補鎖の水素結合様式に応じて異なる加速効果が得られることを見出した.例えばシトシンへの光操作において通常相補塩基はグアニンであるが、イノシンやアミノプリンに変換することでDNA鎖置換反応を3倍から5倍程度高速化させることに成功した.Time-responsiveなアナログ回路の設計方法については,一般の化学反応系に一般化して議論し,加算・乗算・除算のみからなる回路の「標準形」を導入することにより,その設計が容易になるという見通しを得た.スライム班との連携により,反応回路のハイブリッド性も重要であるとの知見も得た.また,感覚班との連携により,感覚と知能の機能要素を統合した分子ロボットのプロトタイプを設計した.具体的には,センサーとしてのDNAナノ構造体をロボット躯体であるベシクル表面に提示し,外部環境の刺激をセンサーが受け取ると,ベシクル内部に情報を伝達して化学反応回路が駆動し,ロボットプロトタイプが動作する設計である.新しい計算モデルを探求するために,反応中間体を介した分子反応系の安定性を数理的に示し,この性質を有する自己維持的な反応系を作成した.またノイズ条件下の環境に適応し分子を選択して反応を続けることが可能な系の予備実験を行った.また,自律分散システム論の立場から,分子ロボット群の理論解析も行った.自己組織化を実現するためには,匿名性,無記憶性,ランダム性が重要であることを示した.また,感覚班の瀧ノ上のビーズの抽象モデルとみなせる個体群プロトコルを用いて,自励振動の発現について興味深い理論的成果を得た.回路の高性能化に関しては,3種類の新しい光応答性塩基を開発することに成功しているだけでなく,相補鎖の塩基との水素結合様式により,様々な加速効果が得られることを見出している.これは,加速効果の多様性を利用した計算モデルの可能性も示唆しており,重要な研究の進展である.また,Time-responsiveなアナログ回路の設計に関しても,従来の化学反応ネットワークの設計で必要となる難しい反応パラメータの調整の問題に関して,回路の標準形を考えることにより設計が容易になるという見通しを得ており,十分な研究の進展が得られている.
細胞外へのアスコルビン酸排出を担う輸送体の同定

ビタミンC (アスコルビン酸)は、抗老化作用を持つ必須の栄養素である。マウスなど殆どの哺乳類は肝臓でアスコルビン酸を合成するが、ヒトは合成能を欠損している。ヒトにおけるアスコルビン酸の体内動態は未だ不明な点が多く、特にアスコルビン酸を細胞外に排出する輸送体は同定されていない。本研究では、アスコルビン酸の排出輸送体を探索するため、ヒト大腸がん由来CACO-2細胞およびヒト肝がん由来HepG2細胞を用いて、細胞内アスコルビン酸濃度を最大限高める培養条件を決定した。これらの培養細胞および培養条件を用いることで、細胞内アスコルビン酸の排出を評価し、アスコルビン酸排出輸送体の同定が可能となる。アスコルビン酸は生体に必須の栄養素であり、欠乏により酸化ストレスが増加し、長期の不足で寿命短縮や老化関連疾患を発症する。ヒトで血清中アスコルビン酸は加齢で減少することからも、老化とアスコルビン酸は密接な関係が窺える。しかしながら、アスコルビン酸の体内動態は未だ不明な点が多い。その一因として、排出輸送体が未同定な点が挙げられる。本研究では、未同定のアスコルビン酸を細胞外に排出する輸送体を、アスコルビン酸を体内で合成する・しない種の特性という観点から、マウス肝臓由来細胞およびヒト腸由来細胞を用いて探索することを目的とした。アスコルビン酸は高い抗酸化能を有するため、輸送体解析の進展によって体内アスコルビン酸濃度の制御が可能となれば、栄養学や医学分野への貢献も期待できる。平成26年度はまず、アスコルビン酸の排出が阻害される現象を捉えるため、アスコルビン酸が生合成できないSMP30/GNL KOマウス由来の不死化肝実質細胞株、およびヒト腸管モデル細胞株CACO-2を用いて、培地へ排出されるアスコルビン酸が高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で検出できる濃度まで、最大限アスコルビン酸を細胞に取込ませる培養条件の検討を行った。その結果、SMP30/GNL KOマウス由来不死化肝実質細胞株およびCACO-2それぞれにおいて、細胞内へアスコルビン酸を最大限取込ませる培地濃度および培養時間を決定することができた。抗酸化能を有するビタミンC(アスコルビン酸)は、長期的な不足によりマウスでは寿命が短縮し、老化関連疾患を発症する。人の血清中アスコルビン酸も加齢で減少することから、アスコルビン酸と老化の関連が示唆される。アスコルビン酸の体内動態は、排出輸送体が未同定なことなどから、未だ不明な点が多い。本課題では、アスコルビン酸を細胞外に排出する未知の輸送体を、アスコルビン酸を体内で合成する・しない種の特性に着目して、マウス肝臓由来細胞およびヒト腸由来細胞を用いて探索することを目的とした。アスコルビン酸合成不全SMP30/GNL KOマウス由来不死化肝実質細胞株およびヒト腸管モデル細胞株CACO-2を用いて、細胞内へアスコルビン酸を最大限取込ませる培地濃度および培養時間を得た。得られた条件の際に、アスコルビン酸を細胞内へ取り込むトランスポーターであるsodium dependent vitamin C transporter (SVCT)の遺伝子発現変化の有無を先ず検討した。アスコルビン酸非添加培地で培養したCACO-2の培養培地へ、アスコルビン酸の添加・非添加して培養を継続した際の、SVCTの遺伝子発現を測定した。アスコルビン酸添加培地で培養した細胞では、培養時間の経過に伴って、培養当初のSVCT遺伝子の発現に比べて低下する傾向が認められた。マウス小腸において、アスコルビン酸欠乏によりSVCTの遺伝子発現は増加する。ヒト腸管モデル細胞おいても、アスコルビン酸の欠乏によりSVCTの発現は増加し、アスコルビン酸の存在を何らかの機構により感知すると遺伝子発現は定常状態へ戻る可能性が示唆された。アスコルビン酸の排出が阻害される現象を捉えるため、SMP30/GNL KOマウス由来不死化肝実質細胞株およびCACO-2を用いて、培地へ排出されるアスコルビン酸がHPLCで検出できる濃度まで、最大限アスコルビン酸を細胞に取込ませる培養条件の検討を行った。結果、それぞれの細胞株において、細胞内へアスコルビン酸を最大限取込ませる培地濃度および培養時間を決定した。更に、アスコルビン酸を添加した培地および培養上清では、培養1時間後にはアスコルビン酸濃度が調製時の半分以下になることがわかったことから、一定時間ごとに培地交換を行ったところ、より高い細胞内アスコルビン酸濃度が得られることを明らかにした。以上により研究はおおむね順調に進展していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。

生化学、基礎老化学今後は、CACO2の極性化を行い、細胞外へのアスコルビン酸の排出を阻害または促進する阻害剤を調べる。また、細胞株をプレートで培養し、各種薬剤を培地に添加した際に、細胞内外のアスコルビン酸濃度や様々な遺伝子発現が検出し得る培養条件の検討、およびアスコルビン酸の排出を阻害する物質の探索を行う予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
血管機能・血管代謝の研究における空気嚢型炎症モデルの活用

炎症の病態モデルとして我々が開発した各種のラットの空気嚢型炎症モデルは、炎症反応誘発後、数日で増殖性の袋状の新生肉芽嚢組織が形成され、組織液に対応する嚢内液が多量に採取できるため、血管の増殖や増殖抑制、血流調節に関与する生理活性物質の検索が可能である。1.増殖型炎症組織中の血管新生の組織学的観察方法の検討カラゲニンを起炎剤とした空気嚢炎症惹起7日後に、ラットにX線造影剤を注入し新生肉芽嚢組織の軟X線写真を撮影すると、この組織は微細血管の新生が極めて旺盛であることが認められた。このような微細血管の新生を抗ヒト第【VIII】因子抗体を用いた第二抗体法による蛍光抗体法で、組織学的に観察する方法を検討した結果、用いた抗体はラット第【VIII】因子に交叉反応し、また、ヒト臍帯を用いて凍結切片法によらなくてもパラフィン包埋法で第【VIII】因子の抗原性を失わずに組織標本の作成が可能で、内皮細胞を同定できる方法を確立した。以上の結果から、新生肉芽嚢組織を抗ヒト第【VIII】因子抗体を用いた蛍光抗体法で観察すると、比較的大きな血管では十分に内皮細胞が同定できることが明らかとなった。現在、ラット正常組織を用いた毛細血管の同定と、肉芽嚢組織中の新生毛細血管の同定を検討中である。2.局所での血流調節因子に関する検討51Cr標識ラット赤血球をトレーサーとしてカラゲニン空気嚢炎症誘発8日後のラットに静注し、肉芽嚢組織内の血流量を測定したところ、プロスタグランジン(PG)E1は局所血流量を用量依存的に増加させるが、PGE2については有意な増加は認められなかった。また、蛍光標識したBSAをトレーサーとして血管透過性亢進を測定しても同様の結果が得られ、このような結果は、増殖期の組織は局所での血流調節因子と考えられているPGE2に対しては反応性が低いことを示すものと思われる。
視覚系における神経コーディングの研究

カエル網膜のオフ持続型神経節細胞(ディミング検出器)群は、減弱光刺激や拡大する黒スポット光刺激に対して位相の揃った周期的(30-50Hz)なスパイクを発生する。網膜におけるこのような周期的スパイク発火を薬理学的に抑制したり増強したりすると、拡大する黒スポット光刺激に対するカエルの逃避行動は阻止されたり促進されることが明らかになった。ディミング検出器は、網膜内層の神経回路で発生した律動性シナプス入力を受け取ることで周期的スパイクを発生する。本年度は周期的スパイク発火の周波数に影響を与える要因を調べ、逃避行動との関連を検討した。KチャネルのサブタイプであるKv3は、聴覚系や大脳皮質の神経細胞における周期的スパイクの生成に関与していることが知られている。そこで網膜のKv3を低濃度のTEAで阻害したところ、ディミング検出器への律動性シナプス入力の周波数が低下すると共に、ディミング検出器における周期的スパイク発火の周波数が低下した。一方、TEAは他のKチャネル(Kv1.1、BK、KCNQ2/3)にも作用する可能性があるので、これらのKチャネルに対する特異的な阻害剤を網膜に投与したが、ディミング検出器における周期的スパイク発火の周波数は低下しなかった。カエル網膜におけるKv3の局在を免疫組織化学的に検索した結果、各種サブタイプのうちKv3.3が内網状層の2本の亜層に分布することが明らかになった。カエルの眼球内にTEAを投与すると、拡大する黒スポット光刺激に対する逃避行動が抑制された。律動性シナプス入力が形成される網膜内神経機構、及び、位相の揃った周期的スパイク発火がデコードされる中枢神経機構については引きつづき検討中である。
感情・態度を表す日本語音声の表出診断・訓練プログラムの構築に関する研究

本研究では、発話の表現意図や感情、態度などに焦点をあわせ、日本語非母国語話者のための「表出診断モデル」と「CAIによる表出訓練モデル」を構築し、日本語音声教育の改善と効率化を目指し、以下の主要結果に基づき、指導上の指針を示した。1.合成音を用い、「はい」の4感情の発話音声の音響的特徴は、強度は喜びと悲しみに、また、F_0と強度が怒りと恐れに、それぞれ重要であることがわかった。2.一語文の音調の音響的特徴として、「反問」は「問い返し」や「中立」と比べ、発話時間は長く、基本周波数の変動値は大きく、強度は強いことがわかった。3. F_0など視覚的な情報を利用して、一語文の3種類の音調の指導を日本語学習者に試行し、指導・実践上の留意点などを考察した。4.日本語韻律の訓練プログラムをインターネットのWWW上に公開し、また、Windows環境での実現も行った。5.風南語母語話者では、感情の込められた音声よりも中立音声の判断と表出に困難が、また、中国語母語話者には、依頼・勧誘に対して「断る応答」と「平板型アクセント」の表出に困難があることがわかった。6.広島方言の「後上がり調」を音響分析し、全国共通語との聞こえの差の要因であることを確認した。7.感情・態度を持つ音声の知覚表出訓練のため、促音の含まれる発話のCAI用テキストの作成をした。8.拗音・促音・長音・アクセントを含む8文字のファジイ測度・積分モデルを利用することで、日本語のことばの響きを診断する人工知能コンピュータシステムを構築した。(1)陳述表示型、行為指導型、行為拘束型、態度表明型の発話文を選定し、非母語話者の発話意図にかかわる問題点を発掘するための対象文Aとした。(2)対象文Aについて、喜び、恐れ、驚き、悲しみ、嫌悪、怒りの情緒を伴う発話音声を、非母語話者・母語話者から採集し、SD評定尺度により定量化し、非母語話者の不自然な発話音声の特徴抽出を行った。(3)単文を単文節、単語、単拍レベルに区切った発話音声を、心理言語学的並びに音響学的に比較分析し、非母語話者(中国語母語話者)の場合、拍レベルの音声にはおおむね問題はないが、文レベルへと音声連鎖が拡大するにつれ、問題が生じることを実証した。(4)中立音声を合成することにより、喜び、恐れ、悲しみ、怒りの情緒の表出に必要な音響的特徴の抽出を行った。(5)感性工学的手法による単音レベルの調音メカニズムの分析結果に基づき、78語のイメージの診断システムを開発した。(6)広島地域における生活日本語の語アクセント・イントネーションの型を把握するための調査および資料の収集を行い、広島地域語と全国共通語との相違点を明らかにした。広島地域語の特色をもつ「ふるさといはらの方言集」を基に、約2500語の語アクセントの収集をした。(7)日本語初級教科書によく使われる語について、全国共通語と広島地域語の語アクセント対応表を作成した。(8)広島在住の教師・学習者のための生活語教育に関する理論研究を行った。1.前年度研究の追加として、発話意図にかかわる非母語話者の問題点を発掘するための発話文(陳述表示型、行為指導型、行為拘束型、態度表明型)について、感情(喜び、恐れ、驚き、悲しみ、嫌悪、怒り)の強度を変化させた発話音声を収集し、SD評定尺度で定量化することにより、「表出診断モデル」の主要資料が構成できる見通しを得た。[心理言語学的研究班で担当]

2.上記1.の音声資料に関して、調音メカニズムの側面から単音レベルで分析し、非母語話者の不自然な発話音声の特徴抽出をおこなった結果、非母語話者に対する実用的な訓練としては、文レベルの訓練が優先されるべきであるという結論に達し、「表出訓練モデル」構築の方向性と焦点化を促進した。[感性工学的研究班で担当]「日本語アクセント練習プログラム」を用い、一語文の文末イントネーションを習得する場合の問題点を発掘し、「表出訓練モデル」構築の基礎資料を得た。[言語教育工学的研究班で担当]4.広島地域生活日本語の語アクセント・イントネーションの型に関する収集資料にもとづき、語アクセントの音響的特徴の類型的把握をおこない、広島地域在住日本語学習者の指導指針の基礎資料とすることができた。これにより広島地域生活日本語の「表出診断・表出訓練モデル」構築の可能性に希望をもつことができた。[言語教育学的言語位相論的研究班で担当]5.平成7年度では、さらに調査・実験を重ねて構築されるモデルの信頼性と妥当性を確立した上で、日本語音声教育の改善と効率化を目指すプログラムとして、最終報告書を公表し、実用に供する予定である。本研究では、発話の表現意図や感情、態度などに焦点をあわせ、日本語非母語話者のための「表出診断モデル」と「CAIによる表出訓練モデル」を構築し、日本語音声教育の改善と効率化を目指し、以下の主要結果に基づき、指導上の指針を示した。1.合成音を用い、「はい」の4感情の発話音声の音響的特徴は、強度は喜びと悲しみに、また、F_0と強度が怒りと恐れに、それぞれ重要であることがわかった。2.一語文の音調の音響的特徴として、「反問」は「問い返し」や「中立」と比べ、発話時間は長く、基本周波数の変動値は大きく、強度は強いことがわかった。3.F_0など視角的な情報を利用して、一語文の3種類の音調の指導を日本語学習者に試行し、指導・実践上の留意点などを考察した。4.日本語韻律の訓練プログラムをインターネットのWWW上に公開し、また、Windows環境での実現も行った。5.〓南語母語話者では、感情の込められた音声よりも中立音声の判断と表出に困難が、また、中国語母語話者には、依頼・勧誘に対して「断る応答」と「平板型アクセント」の表出に困難があることがわかった。6.広島方言の「後上がり調」を音響分析し、全国共通語との聞こえの差の要因であることを確認した。7.感情・態度を持つ音声の知覚表出訓練のため、促音の含まれる発話のCAI用テキストの作成をした。8.拗音・促音・長音・アクセントを含む8文字までのファジイ測度・積分モデルを利用することで、日本語のことばの響きを診断する人工知能コンピュータシステムを構築した。
正常筋および骨への晩期的影響をもたらすBNCTとX線との基礎的比較解析

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)はがんを高選択的に攻撃する放射線治療であるが、照射野内に含まれる正常組織に対する影響についても考慮しなければならない。本研究では、正常な筋および骨に対するX線およびBNCTによる耐容線量をそれぞれ求め、結果を比較する。研究項目は以下の通りである:1.マウス後肢へのX線照射もしくはBNCTによる、筋および骨の晩期障害発生頻度の比較。2.ホウ素薬剤投与後の組織中ホウ素分布の解析。3.腫瘍移植マウスに対するX線照射もしくはBNCTによる、抗腫瘍効果の比較。この基礎実験により、科学的根拠に基づいた適正なBNCT線量による臨床応用が可能となる。
アサガオゲノムの解析

アサガオは、江戸時代後期に多くの自然突然変異体が単離され、さらに大正から昭和初期にかけて、わが国で古典遺伝学的研究が盛んに行われた。本研究の目的は今後の分子生物学的研究の基礎となるようなアサガオのゲノム解析を行うことである。我々のグループは既に、アサガオの変異の大部分は、En/Spm系のTpn1類縁のトランスポゾン(Tpn1ファミリー)の挿入によるという事を見出している。具体的には以下の項目について研究を行った。1)突然変異系統の解析・整理:500系統以上、約3000個体の系統更新・写真記録を行い、この際に各系統の突然変異形質の記録を行った。2)統合的連鎖地図の作製:約400のAFLPマーカー、表現型マーカー、クローン化された遺伝子の分子マーカーを用いて15連鎖群からなる最初のバージョンの連鎖地図を作製した。今後、AFLPマーカーを、より精度の高い、クローン化された遺伝子やESTによる共優性マーカーに切り替えていきたい。3)Tpn1ファミリーの解析:Tpn1ファミリーを含む約200クローンを制限酵素地図で分類し、現在までに24グループについて塩基配列を決定した。その結果、内部配列はアサガオの遺伝子を取り込んだ特殊な構造をしていることが明らかになった。塩基配列決定したTpnの中でtransposaseをコードしている自律型因子を同定する。4)Tpn1ファミリーを指標にした突然変異体の原因遺伝子の単離・解析:Tpnによりタグされた未知有用遺伝子を簡単に同定できる簡易トランスポゾンディスプレイ(Simplified Transposon Display;STD)法を開発し、紫地に青色の絞り花を咲かせる易変性「紫」変異purple-mutableの同定に成功した。このSTD法は非常に有効であり、今後、他の易変性を示す突然変異体に応用し原因遺伝子を単離する。4)均一化cDNAライブラリーの作製・塩基配列決定等については現在準備を行っている。
アルキル化剤によるがん原性DNA変異の生起とその抑制機構

1.アルキル化剤によってできたDNAの傷を修復する酵素系は大腸菌から哺乳動物の細胞にわたって普遍的に存在するが、それらの酵素のうちあるものは細胞を低濃度のアルキル化剤で処理することによって誘導されることが知られている。この機構を明らかにするため、それに関する遺伝子adaとalKAを大腸菌からクローニングして解析した。その結果adaは0-6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼの構造遺伝子であるとともに、ada遺伝子自体およびalKA遺伝子の調節遺伝子であることが明らかになった。アルキル化剤で処理した時と正常時の細胞内でつくられるRNAを解析した結果、両遺伝子の発現は転写レベルで調節されていることがわかった。2.正常のヒトの細胞は上記メチルトランスフェラーゼ活性をもっているが、がん細胞の中にはその活性が著しく減少しているものが存在する。そのような細胞はアルキル化剤に対しても高い感受性を示す。そこで大腸菌からクローニングしたada遺伝子を哺乳動物細胞の発現ベクターpSV2neoに挿入し、それをMe【r^-】細胞(メチルトランスフェラーゼ欠損株)に導入したところ、その細胞の中に多量の大腸菌のメチルトランスフェラーゼがつくられ、細胞はMe【r^+】の表現型を示すことがわかった。3.ヒトの高発がん性遺伝病である色素性乾皮症の患者由来の細胞XP20S株にマウスのDNAを移入し、紫外線感受性が正常株に近づいた形質転換株を分離した。それからとったDNAをXP20S株に移入し、さらに二次形質転換株を分離することができた。この細胞内には特定のマウスDNAが存在するので、それを利用して遺伝子のクローニングをする途がひらけた。
上肢機能障害に対するボツリヌス治療後の上肢ロボット訓練と修正版CI療法の効果

慢性期脳卒中患者の上肢痙縮を合併する重度の上肢機能障害に対し、ボツリヌス治療後に上肢ロボット訓練と従来から兵庫医科大学リハビリテーション科で実施しているConstraint-induced movement therapy(CI療法)を併用し、上肢機能を日常生活動作へ転移するための戦略(Transfer Package)により改善した上肢機能を日常生活へ汎化することで、上肢機能障害の改善を図り、上肢痙縮を合併する重度の上肢機能障害に対する新たな治療法の確立を目指す.慢性期脳卒中患者の上肢痙縮を合併する重度の上肢機能障害に対し、ボツリヌス治療後に上肢ロボット訓練と従来から兵庫医科大学リハビリテーション科で実施しているConstraint-induced movement therapy(CI療法)を併用し、上肢機能を日常生活動作へ転移するための戦略(Transfer Package)により改善した上肢機能を日常生活へ汎化することで、上肢機能障害の改善を図り、上肢痙縮を合併する重度の上肢機能障害に対する新たな治療法の確立を目指す.
甘味・旨味・苦味・酸味受容細胞以外の味蕾細胞の機能解析

甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞に特異的に発現する新規遺伝子の取得を目指し、味蕾と味蕾を含まない有郭乳頭上皮組織のDNAマイクロアレイデータを基に、遺伝子の探索と発現解析を行った結果、甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞に特異的に発現する3つの遺伝子を取得した。食物を摂取した際に生じる味覚は、食品中に含まれる呈味物質が口腔内に存在する味蕾と呼ばれる組織中の味細胞により受容されることにより生じる。味は、一般に甘味、旨味、苦味、酸味、塩味の5基本味に分類され、このうち、甘味、旨味、苦味、酸味の4つの味の受容機構については、分子レベルでの解析が進み、それぞれ異なる味細胞で受容されることが明らかになった。味蕾を構成する細胞のうち、約半数が甘味、旨味、苦味、酸味細胞であるが、残る半数を占める細胞の生理機能については不明であった。本研究では、舌上皮層から味蕾、味蕾を除いた乳頭上皮、および非乳頭上皮の3組織の遺伝子発現データをもとに、味蕾にのみ発現量の多い遺伝子を抽出し、in situハイブリダイゼーションによる発現解析を行い、甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞に発現する遺伝子を探索した。DNAマイクロアレイデータから味蕾に高発現している50遺伝子を抽出した。この中には、既に味蕾特異的な発現を示すことが知られている19遺伝子が含まれており、残りの31遺伝子のうち26遺伝子について、マウス有郭乳頭における発現分布をin situハイブリダイゼーションにより解析した結果、17遺伝子が味蕾特異的に発現していた。このうち、既知味細胞マーカー分子との二重in situハイブリダイゼーションによる発現解析を行ったところ、甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞特異的に発現している2つの遺伝子を見出した。本研究では、それらの味蕾細胞の機能を解明するために、味蕾におけるin situハイブリダイゼーションによる発現解析を行い、甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞に発現するイオンチャネル遺伝子を探索した。味蕾を対象としたDNAマイクロアレイデータを用い、味蕾に高発現しているイオンチャネル遺伝子を抽出した。これらの遺伝子について、マウス有郭乳頭における発現分布をin situハイブリダイゼーションにより解析した結果、いくつかの遺伝子のシグナルが味蕾細胞特異的に観察された。このうち、既知味細胞マーカー分子との二重in situハイブリダイゼーションによる発現相関解析を行ったところ、甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞特異的に発現している遺伝子を見出した。このことから、これらの甘味、旨味、苦味、酸味細胞以外の味蕾細胞にも膜電位の変化が生じうることを見出した。
新規遺伝子多型解析プローブとしての環状フェロセン化インターカレータ

ヒトゲノムプロジェクトの終結を迎え,個人レベルでのSNP(single nucleotide polymorphism一塩基多型)解析が重要となってきている.これはSNPが遺伝病などの致命的な病気を引き起こさないまでも高ストレスにより生ずる病気に関連していることが示されてきていることや,薬の投与量による副作用の有無にも関連していることが証明されてきているからである.当該年度では,ナフタレンジミドとフェロセンとからなる環状インターカレータCyNDIFcをSNP分析のための分子プローブとして発展させること目的として研究を行った.正常遺伝子と変異遺伝子とのヘテロ二本鎖はSNP領域にミスマッチ核酸(一本鎖核酸)を含むことになるので,CyNDIFcがその部位に好んで結合すればこの部位を電気化学的に検出できる可能性がある.X線構造解析によりCyNDIFcが予想どおり環状構造を取っていることが証明された。核酸のTmを用いてCyNDIFcのミスマッチ部位に対する影響を評価した。その結果ミスマッチ部位が存在することにより、大きくTmが上昇することが明らかとなった。CyNDIFcによるミスマッチの電気化学的検出のために,DNA修飾電極を用いてCyNDIFc存在下の電気学的測定を行った。電極上に固定化されたDNAの1本鎖領域の増加に伴ってCyNDIFcに由来する電流値の増大が見られた。これらの結果によりSNP解析のための分子プローブの可能性を開くことができた。今後,CyNDIFcの構造をさらに最適化すれば,選択性・感度ともに高い分子プローブが構築できるものと考えられる.ヒトゲノムプロジェクトの終結を迎え,個人レベルでのSNP(single nucleotide polymorphism一塩基多型)解析が重要となってきている.これはSNPが遺伝病などの致命的な病気を引き起こさないまでも高ストレスにより生ずる病気に関連していることが示されてきていることや,薬の投与量による副作用の有無にも関連していることが証明されてきているからである.当該年度では,ナフタレンジミドとフェロセンとからなる環状インターカレータCyNDIFcをSNP分析のための分子プローブとして発展させること目的として研究を行った.正常遺伝子と変異遺伝子とのヘテロ二本鎖はSNP領域にミスマッチ核酸(一本鎖核酸)を含むことになるので,CyNDIFcがその部位に好んで結合すればこの部位を電気化学的に検出できる可能性がある.X線構造解析によりCyNDIFcが予想どおり環状構造を取っていることが証明された。今後,CyNDIFcの構造をさらに最適化すれば,選択性・感度ともに高い分子プローブが構築できるものと考えられる.申請者は、すでにフェロセンとナフタレンジイミドを環状に連結した環状インターカレータの合成に成功している。また、本インターカレータが、DNAに二重らせんよりも二重らせん上の塩基の飛び出した部分に結合する可能性を示していた。当該研究では、この予備的結果を踏まえ遺伝子多型の解析プローブとして本インターカレータを発展させることを目的としている。先に合成した大環状インターカレータは、2本鎖上に塩基が飛び出した部分に結合できると期待されるので、この結合をモニターすることにより遺伝子多型を検出できる。当該年度では、まずフェロセンとナフタレンジイミドの連結部分の長さを変えることによるミスマッチ塩基の識別能を調べた。これによって最適リンカー長があることがわかった。次に、種々の異なったミスマッチを有するオリゴヌクレオチド二重らせんを用いて、この2本鎖オリゴヌクレオチドの温度に伴う崩壊過程(融解挙動)を基に大環状インターカレータの効果を調べた。その結果、リンカーにビスアミノプロピルピペラジンを有するものがミスマッチオリゴヌクレオチド2本鎖に結合し、そのヘテロ二重らせんを安定化することが明らかとなった。そこで、オリゴヌクレオチド修飾電極を用いた遺伝子多型解析への応用を試みた。これは、大環状インターカレータが電気化学活性なフェロセンを有するので電極上に形成された使用遺伝子と合成オリゴヌクレオチドとのミスマッチを含むヘテロ二重らせんに濃縮され、それに伴う電流増加が期待されるからである。結果は、ミスマッチが存在するとフェロセンに由来する電流値の増加が見られた。更に、大環状インターカレータのミスマッチ塩基識別機構を調べる目的でX線構造解析を行なった。その結果、フェロセンとナフタレンジイミドが折りたたまれた分子構造が得られ、この間へのミスマッチ核酸塩基の取り込みが示唆された。遺伝子多型は遺伝子上の微小な塩基の違いである.従って,異なった多型を示す2種の遺伝子間で2本鎖形成(ハイブリダイゼーション)を行なうと,2本鎖上に塩基が突出した部分(ミスマッチ)が生じる.ここに特異的に結合する化合物を利用すれば,遺伝子多型が検出できるものと思われる.申請者がすでに開発した環状インターカレータは,この目的に適した化合物である.

この物質はフェロセンとナフタレンジイミドを環状に連結したものであり,DNA二重らせん上の塩基突出部位に結合する可能性がこれまでに示されていた.当該研究では,この予備的結果を踏まえ,遺伝子多型の解析プローブとして本インターカレータを発展させることを目的としている.当該年度は,まずフェロセンとインターカレータ部位とのリンカー部分の長さを変えることによる,ミスマッチ塩基の識別能変化を調べ,最適リンカー長を決定した.続いて,種々の異なったミスマッチを有する二重らせんオリゴヌクレオチドの,温度上昇に伴う崩壊過程(融解挙動)に対する大環状インターカレータの効果を調べた.その結果リンカーにビスアミノプロピルピペラジンを有するものがミスマッチオリゴヌクレオチド2本鎖に結合し,ミスマッチ二重らせんを安定化することがわかった.そこで,オリゴヌクレオチド修飾電極を用いた遺伝子多型解析に大環状インターカレータを応用することを試みた,これは,大環状インターカレータが電気化学活性なフェロセンを有するために,電極上に形成された遺伝子と合成オリゴヌクレオチドとのミスマッチを含むヘテロ二重らせんに濃縮され,それに伴う電流増加が期待されるからである.その結果,ミスマッチが存在する場合にフェロセン由来の電流値増加が見られた.これらの結果は,新しいSNP検出試薬の開発につながる重要な知見を示している.
簡易な潜在的走能力・適性の評価法および走能力開発プログラム作成に関する研究

実験室的研究では、Monodのクリティカルパワー(CP)分析をランニングに応用し、重量負荷の走パフォーマンスへの影響を調べた。測定は無負荷、重量負荷でそれぞれ(90,100,110%Vo2max強度)3スピードで計6回トレッドミル走を疲労困憊に至るまで行った。その結果、y軸に仕事量(体重×移動距離)、x軸に継続時間をおくと両負荷回帰直線は同一であり、無負荷と重量負荷に関わらず継続時間は1本の回帰直線で表現されることが明らかになった。無負荷と重力負荷で走って同じエネルギーを消費するなら、無負荷の方が継続時間が長いということが分かった。重量負荷は走パフォーマンスに大きく影響しており、走距離の継続時間は距離と体重に規定されていることから、体重の減少により記録の向上が得られると考えられる。そして、距離×体重と移動距離の回帰式を求めることで、記録の推定が可能であることが示唆された。フィールド的研究では、現場で簡易に利用できる個人の潜在的走能力や適正の評価と有酸素的能力を効率良く向上させるトレーニング処方を開発することをねらいとして、高校生を対象にした追加実験を行った。1000mと1500mの走記録から求められるクリティカル速度(Critical Velocity以下CV)とOBLA,乳酸性作業閾値(Lactate threshold以下LT)との関連性について調べた。その結果、CVとOBLAの間には、r=0.836,CVとLTの間には、r=0.748と高い相関関係が認められた。Monodたちのクリティカルパワー分析法を利用して個人の潜在的走能力と走能力特性を評価できる方法を開発する目的で本年度は次のような研究を行った。1.トレッドミルにおいて3種の異なるスピードでの持続時間からクリティカルパワー分析を行い、傾きであるクリティカル速度(Critical velocity,CV)が最大酸素摂取量、乳酸闘値、OBLA、乳酸の定常状態が成立する最大スピード(Maximal lactate steady state;MaxLass)との関連性を検討した。その結果CVはいずれの測度とも高い正の相関関係が認められた。しかもCVとMaxLassの相関係数はOBLAとMaxLass間の相関係数よりも高かった。またCVはほぼMaxLassに近似していた。2.世界、日本、日本ジュニア混成競技100傑の400mと1500mの記録からCVと切片を求め、他の種目の記録との相関分析を行った。全ての集団で共通してみられた関係は、CVが高いほど1500が速く、切片または切片を理論上無酸素的エネルギー供給に要するとされる40秒で除した測度(以下AnV)とCVの比(AnV/CV)が高いほど100mが速い、または、1500mが遅いということであった。この他に、比較的技術要素が高いと考えられるパワー系の種目で、切片や、AnV/CVと正の相関または、CVと負の相関がみられた。3.発育期の中学生陸上競技選手男子155名について400,800,1500mのタイムトライアルを行い、その記録からCVと切片の関連から種目別の特性を調べた。AnV/CVは中長距離、短距離、投擲の順に高くなり、種目特性を反映していると推察された。以上の結果から走記録のクリティカルパワー分析によって得られるパラメーターから走能力特性が予測できる可能性が示唆された。またその方法としてAnV/CVを提唱した。昨年までの研究でランニングについてもクリティカルパワー説が有効であることが明らかになった。クリティカルパワー分析法のY軸は仕事量である。先行研究では、仕事量がランニング時の走行距離×体重で予測可能であることが示されている。そこで本研究では、トレッドミル負荷法を用い無負荷と重量負荷(+10kg)の2つの条件でそれぞれ3種の異なるスピードでのexhaustion timeを測定した。その結果、走行距離×(休重+重量負荷)をY軸にexhaustion timeをX軸にすると、2条件の回帰直線の傾き、切片に有意差はなく一本の回帰直線で表わせることが明確となった。したがってランニングにクリティカルパワー分析法を応用することにより、個人の特性と同時に個人の潜在的パフォマンスを推測できると考えられた。さらに高校生を対象に、1000mと1500mのタイムトライアルから求めたCVからOBLAが予測できる可能性が示唆された。