hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
甲状腺細胞の増殖調節機構に関する研究

ド代謝を抑制する作用のあることを証明した。これらは従来のインビボの作用を説明するものと思われる。甲状腺細胞の増殖と機能に対する各種ホルモン、成長因子、ビタミン等の作用を検討した。培養ブタ甲状腺においてレチノ-ルがTSHによるヨ-ド取込み、その有機化と放出を阻害することは既に報告したが、本年度はその機序について更に検討し、レチノ-ルはTSHによる甲状腺サイロイドペリオキシダ-ゼ(TPO)のmRNA発現を抑制することが明らかになった。更にレチノ-ルは8ブロモサイクリックAMPによるTPO mRNA発現をも同様に抑制した。したがってレチノ-ルの作用はサイクリックAMP以降の機構に作用することによりTPO遺伝子発現を抑制するものと結論された。またレチノ-ルのヨ-ド有機化抑制作用の一部はTPOの合成抑制によるものであることが示唆された。これらレチノ-ルの作用は甲状腺細胞におけるレチノ-ル受容体を介するものと思われる。核受容体についてはいまだ検討していないが、細胞質中には明らかにレチノ-ル結合蛋白が存在することが明らかとなった。次に血管内皮細胞その他の細胞が産生する局所ホルモンであるエンドセリン(ET)の作用について検討した。その結果、ETー1は単独では甲状腺細胞の増殖には関与しないがEGFやIGFー1によるDNA合成を増強すること、濃度依存性にTSHによるヨ-ド取込みや有機化を抑制することが判明した。更にETー1は8ーブロモサイクリックAMPによるヨ-ド代謝をも抑制し、その作用はサイクリックAMP産生以降に働くものと考えられた。ETー2にも同様な作用が認められた。また標識ETを用い検討でブタ甲状腺細胞にET受容体を証明した。なおブタ甲状腺細胞にはFGF mRNAが発現していること、FGFはブタやラット甲状腺細胞の増殖を促進するとともにヨ-ド代謝を抑制することを明らかにした。培養ブタ甲状腺細胞、ラット甲状腺細胞株FRTL5及びヒト甲状腺組織を用いて細胞増殖及び細胞機能を調節する因子について検討した。先ずブタ甲状組織中にFGFが存在することを見出し、更にFGFのmRNAの発現も確認した。ヒトの甲状腺組織においてもFGFのmRNAの発現があり甲状腺乳頭癌では発現量が増加していた。癌の発育に関与することが示唆された。ブタ甲状腺細胞やFRTL5細胞の増殖に対してFGFは促進的に作用するがヨ-ド代謝に対しては抑制的に作用し、TSHによるヨ-ドの取りこみ、有機化、甲状腺ホルモンの分泌はいずれもFGFにより抑制された。またFGFは甲状腺ペルオキシダ-ゼのmRNA発現に対しても抑制作用を示した。これらの作用に対応して甲状腺細胞には高及び低親和性の受容体の存在が証明された。以上FGFはパラクリンあるいはオ-トクリン機構により甲状腺細胞の増殖と機能を調節する因子であることを証明した。次に血管作動性物質であるエンドセリン(ET)の作用について検討した。10^<ー10>10^<ー7>MのETはブタ甲状腺のヨ-ド取りこみを濃度依存性に抑制することを見出した。この作用はTSHによるサイクリックAMP産生の抑制を介するものではなかった。
受精阻害遺伝子を利用したほ乳動物の産み分けに関する研究

本年度は精子形成時にmRNAが細胞間架橋通過を通過できないことが報告されているSmok1遺伝子の5'および3'領域を組み込んだ遺伝子を構築し、遺伝子組換えマウスを作出した。作出した雄マウスの1系統を解析した結果、子孫に遺伝子組み換えマウスが得られたことから報告されているSmok1遺伝子の5'および3'領域には細胞間架橋の通過阻止機能はない可能性が示唆された。また、後代に組換え遺伝子を伝達しない雄マウスに組み込まれた遺伝子のコピー数を解析した結果、非常に多くのコピーが染色体に導入されていることが明らかとなったことから、受精阻害が導入遺伝子のコピー数に依存する可能性が示唆された。本研究は受精阻害に関わる遺伝子を利用した、ほ乳動物の産み分け技術の開発を目的とした。昨年度作製した遺伝子組換え個体のうち、受精阻害遺伝子Aが機能したことで雄が不妊になった系統が3系統得られた。また、別の1系統では生まれてくる産子がすべて組換え遺伝子を持っていないという系統が得られた。前者の3系統のマウスでは、受精阻害遺伝子産物が精子形成の過程で隣接するすべての精子細胞に伝達されたため、雄個体が不妊になったことが考えられる。そこで、遺伝子産物が隣接した細胞に移行しない機能を持つことが報告されているSmok1遺伝子の上下流領域を受精阻害遺伝子Aに接続した遺伝子を構築し、組換えマウスを作出し、3系統の雄マウス、2系統の雌マウスを得た。得られた雄系統のうち1系統においては雄個体からの産子が得られたが、後代に遺伝子組み換え産子が得られていることから、報告されているSmok1遺伝子の5'および3'領域には細胞間架橋の通過阻止機能はない可能性が示唆された。他の系統においては現在交配実験を継続中である。また、上述した3系統が不妊になった別の可能性として、組換え遺伝子が複数の染色体に導入されたことも考えられるが、後代が得られていないため、解析はできない。次に、前年度作出した遺伝子組み換え産子を産まない別の1系統のマウスの後代を作出するために、この組換えマウスから採取した精子を用いて、体外受精によって遺伝子組換えマウスを作出したが、生まれた遺伝子組換え個体は雌のみであったため、現在交配を継続して雄個体の作製を試みている。また、この系統の雌においてサザンブロッティングで導入された遺伝子のコピー数を検定した結果、正確なコピー数は得られなかったが、非常に多くのコピーが染色体へ導入されたことを示す結果が得られており、コピー数に依存した受精阻害効果の可能性も示唆された。申請者はこれまでの研究で、受精阻害を目的として6系統の遺伝子組換え雄マウスの作出を行い、交配実験を行った結果、3系統が不妊であった。このことから、これら3系統のマウスでは受精阻害遺伝子A(これまでの研究で探索された遺伝子)が機能したことで不妊になったことが予測される。このことは、導入された受精阻害遺伝子産物が細胞間架橋を通ってすべての精子細胞に伝達されたため、すべての精子が受精できなくなったと考えられる。このことから、本研究で構築した受精阻害遺伝子が受精阻害機構の構築に有効に利用できることが明らかとなった。また作出した1系統のマウスでは生まれてくる産子がすべて組換え遺伝子を持っていないという結果が得られている。このことはこの組換え遺伝子Aを持った精子は受精できなく、この遺伝子を持っていない精子のみが受精したと解釈できる。これは、組換え遺伝子Aの産物が遺伝子Aを持っていない隣接細胞には伝わらなかったことを意味し、この組換えマウスにおいては組換え遺伝子産物が細胞間架橋を通過しない仕組みを備えていることになる。このことが実証されれば、細胞間架橋通過阻害の機構も解決されたことになる。以上の成果は本課題を最終的に解決する上で極めて重要なシーズである。この遺伝子Aを持つ組換え個体は遺伝子組み換え産子を次世代に残すことができないので、これらの個体の精子を用いて、顕微受精あるいは体外受精を行って、産子を得ることを試み、1系統において後継産子を得ることができたが、出生直後に喰殺によって死亡したため、現在さらに顕微受精による産子の作出を試みている。受精阻害遺伝子が機能することが明らかになったが、受精阻害によって自然交配では産子が得られないことから、さらなる解析のためには顕微受精によって産子を得た。しかしながら、喰殺により産子の解析が行えなかったことから、実験がやや滞った。また、細胞間架橋通過阻止の仕組みの開発のために、Smok1遺伝子の5'UTRおよび3'UTRを組み込んだ遺伝子組み換えマウスの作製については5'UTRの特殊な配列のためか、組換えベクターへの組込みにかなり時間を要しており、組換えベクターの構築

もう少し時間がかかりそうである。受精阻害の機構がほぼ確定しているので、細胞間架橋通過阻止の機構の確立のため、Smok1遺伝子の5'UTRおよび3'UTRを組み込んだ遺伝子をもつ遺伝子組み換えマウスを作出する。この組換えマウスの精巣において転写産物が精子細胞間を通過しないかどうかについて、GFPマーカー遺伝子の発現あるいはin situ hybridization法によって確認する。また、同時に性染色体への組込み位置を決定するため、X染色体およびY染色体の遺伝子発現領域を解析し、その領域を含むBACクローンを探索する。BACクローンへのマーカー遺伝子の導入部位を確定し、組換え遺伝子の設計を行う。本年度の計画において、組換えベクターの構築に時間がかかったため、遺伝子組み換えマウスの作製ができなかった。そのためこの経費は次年度の組換えマウス作製のために使用する。また、上述した課題を解決するためには受精阻害と細胞間架橋の通過阻止の特性を持ち合わせる組換え遺伝子を性染色体に組み込む必要がある。性染色体ではヘテロクロマチン領域が広く存在するために、組み込んだ遺伝子が発現しないことが想定される。そのために、あらかじめ遺伝子発現量域を確認して、ノックインマウスを作出する必要がある。この目的を達成するためにBACクローンの情報収集を行う。BACライブラリーは約150-200kbの長さを持つクローンからなっており、長い全長を持つことから遺伝子が組み込まれた周囲のゲノムの影響を受けることなく、BACの配列に含まれる染色体情報を正確に反映することがその特徴となっている。XおよびY染色体の遺伝子発現情報を解析し、特定の遺伝子の発現部位のやや下流域のBACクローンを選択し、性染色体上のノックイン領域を特定する。
造血幹細胞からマクロファ-ジへのlineageを規定する核内因子の検索

幹細胞→骨髄球→単球→マクロファ-ジ系列の最終ステップである、単球からマクロファ-ジへの分化を規定するDNA結合蛋白の検索を進めた。Genomic cloningしたILー1_β,Fcr_<II>R.TNFα遺伝子のうち、まず、TNFαを用い、マクロファ-ジ分化に伴って発現してくる遺伝子の転写調節要素を解析した。得られた結果は以下の通りである。1.TNFα遺伝子の5'上流ー3300bpより3'下流1000bpを含む全領域を10個に分断し、CAT遺伝子と連結後、マクロファ-ジ分化に伴う、転写杉性化をみた。マクロファ-ジ分化を誘導する2種類の全く異なる刺激(TPA,vー<mos>___ー)の両者に反応して転写活性化を引きおこすcisーelementがー1300900とExonIVの2領域に存在した。2.この領域中のcisーelementを特定するため、ゲルシフト分析、フットプリント分析を行なった。ー1300ー900中のelementは、分化、未分化種々の刺激下の核抽出物との結合活性から、分化と連動して活性化されるとは限らないことが示唆された。ExonIVの中のelementは分化と呼応した活性化を示し、フットプリントの結果、11bpに亘るhair loop構造をとるDNA配列に核蛋白の結合が示された。3.このDNA配列を人工合成しゲルシフト分析を行なうと、ExonIV中のelementと同一の核蛋白結合能を示した。4.さらに、このDNA配列は、TNFα遺伝子のみならず、ILー1_β遺伝子のー1000付近とExonIV中の2か所、Fcr_<II>R遺伝子のー400近傍の存在することがわかり、マクロファ-ジ分化に伴う遺伝子活性化に共通の要因である可能性が高くなった。5.合成DNAをプロ-グとして、分化時cDNAライブラリ-から、このDNA配列に結合する核蛋白の遺伝子を単離する予定である。
粒界介在物の形状測定による粒界エネルギ-の評価

本研究は、内部酸化法にて導入した、Cu粒界上のSiO_2粒子の形状を測り、Cuの粒界エネルギ-(相対値)を決定することを第1の目的とした。次いで、粒界析出、粒界すべり等、粒界で起こる現象と粒界エネルギ-との相関を調べることを第2の目的とした。以下に得られた成果をまとめる。1.〈110〉対称傾角粒界、〈100〉及び〈110〉ねじれ粒界のエネルギ-を粒界の回転角に対して求めた。〈110〉対称傾角粒界は、{111}Σ3、{113}Σ11、{221}Σ9に、〈100〉ねじれ粒界は、Σ5、Σ13、Σ17、Σ29、Σ41に、そして〈110〉ねじれ粒界は、Σ3、Σ11にエネルギ-カスプを持つことがわかった。また、〈110〉を回転軸とするΣ3、Σ11の非対称傾角粒界のエネルギ-も調べ、同一のΣ値を持つ粒界も、対称性が変るとエネルギ-を大きく変えることを明らかにした。さらに、粒界エネルギ-は、粒界上への酸素の偏析に強く依存することや、粒界上での酸素の拡散は粒内のそれより桁ちがいに大きいこともわかった。2.Cu-Fe-Co合金でのFe-Co粒子の粒界析出は、粒界エネルギ-と強い相関を持つことがわかった(〈110〉対称傾角粒界、〈100〉ねじれ粒界)。すなわち、エネルギ-の大きい粒界上では、析出が起こりやすく、粒子の密度とサイズが増し、無析出帯の幅も広くなった。3.〈110〉対称傾角粒界近くでの、電子線照射によってできる2次欠陥の生成状況を調べた。エネルギ-の大きい粒界は、点欠陥のsinkとなる能力が大きいことがわかった。4.〈110〉対称傾角粒界と、〈100〉ねじれ粒界のすべりやすさを調べた。nm(ナノ・メ-トル)程度のすべり範囲では、エネルギ-の大きな粒界ほど、より低温ですべりが生じることがわかった。昭和63年度の研究実績を以下に個条書で記す。1.双結晶作製装置の制作は終了した。2.結晶の方位解析を自動的に行うシステム(ディジタイザー、パーソナルコンピューター、プロッター、ソフトウェア)は順調に作動しており、試料作りの迅速化を図ることができた。3.<110>対称傾角粒界のエネルギーを、粒界で接する2つの結晶の方位差を変えて測った。そして、{111}Σ3、{113}Σ11に大きなカスプが{221}Σ9に小さいカスプがあることがわかった。4.<110>ねじれ粒界は、Σ3、Σ11にエネルギーカスプを持つことが、わかった。5.<100>ねじれ粒界も、Σ5、Σ13、Σ17、Σ29、Σ41にエネルギーカスプを持つことを示した。6.<110>

対称傾角粒界にでるFe粒子(Cu-Fe合金)の析出パラメーターと粒界エネルギーは、密接な相関を持つことを知った。7.<110>を回転軸とする非対称Σ3傾角粒界を、粒界面の対称位置{111}{111}からの偏奇(△)の関数として求めた。そして、△=83.3°及び△=5°の非対称粒界は、その前後の△、粒界よりエネルギーが小さいことを明らかにした。前者は、{5513}{7711}からなる粒界である。後者は、有理数のミラー指数をもつ面からは構成されていない。8.粒界エネルギーは微量の酸素の偏析で大きく変わることを知った。9.粒界上の酸素の拡散は、格子中のそれより桁ちがいに大きいことがわかった。以下に、箇条書で記す。1.CuのΣ3傾角粒界エネルギ-(γ)を対称方位{111}{111}からの偏奇角(Δ)を変えて測ることを試みた。たいていの粒界は、ファセット化した。ファセット面より、Δ=5°、83.3°のところに、γ-Δ曲線のカスプがあることがわかった。Δ=83.3°の粒界は、{5513}{7711}から成りそのエネルギ-は、{112}{112}対称傾角粒界のそれより小さかった。2.CuのΣ11傾角粒界エネルギ-を、対称方位{113}{113}からの偏奇角を変えて測った。そして、Δ=10°、72.3°のところに、γ-Δ曲線のカスプがあることがわかった。これらの粒界のエネルギ-も決定できた。3.〈110〉対称傾角粒界を含むCu試料で、電子線照射によって生じる2次欠陥の生成状況を調べた。このため、超高圧電顕を用いた。その結果、エネルギ-の大きい粒界程、巾の広いDenuded ZOneができることがわかった。また、高エネルギ-粒界は、それ自身点欠陥のSinkというより、速い拡散経路と考えるべきであることもわかった。一方、低エネルギ-粒界では、粒界上にも2次欠陥ができることもわかった。4.Cuの〈110〉対称傾角粒界のすべりの難易を調べた。nm程度きすべりでは、エネルギ-の高い粒界程すべり易いことがわかった。10μm程度のすべりでは、エネルギ-との相関が強くなかった。むしろ、巨視的尺度で存在する粒界のステップに強く依存することが想像された。5.Cuの〈100〉ねじり粒界のすべり易さを、内耗法(微小すべり)で調べた。そして、すべりの難易は、粒界エネルギ-の大小と強く相関することがわかった。
銀行業における女性役職者のキャリア形成過程と促進諸要因に関する研究

調査を開始するまえに、国立国会図書館、早稲田大学図書館、銀行協会図書館等が所蔵する文献・資料の中で、特に銀行業の人事労務政策、女性のキャリア、労働組合の男女平等化への取組に関するものの収集、整理を行った。その後、首都圏および新潟県の都市銀行と地方銀行の人事労務担当者、首都圏の都市銀行と地方銀行で働く女性役職者、労組役員等に聞き取り調査を実施した。これらの文献・資料の研究、聞き取り調査の結果から以下の傾向が明らかになった。なお、銀行業の保守性・閉鎖性、女性役職者の絶対数の少なさ、都市銀行の従業員組合の保守性・閉鎖性などのため、今回の被調査者数は銀行側、女性役職者、労働組合側の各々において一桁台に留まっている。今後は、いまだ根強い銀行の横並び意識を逆に利用し、今回の調査で解明された点をさらに発展させた調査票を作成して、質問紙法による調査を実施したいと考えている。1.現在、役職についている女性たちは、日本企業の同質化管理によって、男性とは異なる人事労務管理の下に置かれているが、銀行業の場合も同様であり、他業種と比較してよりその傾向が強く見られる。したがって、女性役職者のキャリア形成は、個人の能力と努力に依存しているのと同様、運にも大きく左右されている。2.現在進められているコ-ス別人事管理制度によって、同質化管理がある程度改善されることが望まれるが、女子「総合職」の人事管理のあり方は、各銀行によって異なり、したがって問題点も違っている。また、トップの号令だけで職場の受け入れ・活用態勢は整わず、顧客である企業の偏見も根強い。3.コンピュ-タ化による影響の一つとして、定型業務に携わる一般職女子の削減と、パ-トや派遣労働者への転換が進行しているが、今後、これらの労働者をいかに組織化していくかが労組の重要な課題となっている。
低酸素プレコンディショニングにより骨髄細胞の血管再生機能が 増強するか?

これまでに、申請者らは健常動物由来の骨髄細胞に対するex vivoでの低酸素プレコンディショニングが細胞移植治療の効果を向上させる簡便かつ有用な方法であることを報告してきた。しかし、加齢や様々な病態により細胞障害が生じることが知られており、そのような細胞に対しての低酸素プレコンディショニングがどのような効果をもたらすかは不明であった。本研究では加齢動物の骨髄細胞に対しても低酸素プレコンディショニングが有用であることを証明した。申請者は、健常動物の骨髄細胞に対する低酸素プレコンディショニング(Hypoxic preconditioning: HPC)が細胞移植による血管再生治療を向上させる簡便かつ有用な方法であることを報告してきた。しかし、加齢や様々な病態では細胞障害が生じており、そのような細胞に対するHPCの効果は不明である。そこで、本研究では加齢動物由来の細胞に対するHPC効果を検証することを目的とした。平成24年度は、低酸素プレコンディショニングが細胞移植による血管再生治療に及ぼす効果をin vivoで評価した。加齢マウス(Aged; 20-22ヵ月齢)と対照マウス(Young; 3ヵ月齢)から骨髄細胞を単離した。次に、単離後の骨髄細胞を低酸素(Hypoxia、2%O2;HPC)または正常酸素(Normoxia、20%O2)条件下で24時間培養後、Agedマウスの虚血下肢筋肉内に骨髄細胞を直接移植することで、血管再生治療の効果を評価した。虚血下肢における毛細血管密度と血流量の変化を、各々、アルカリフォスファターゼ法およびレーザードップラー法にて検証した。Agedマウスにおいて、HPC後の細胞を移植した虚血下肢では有意な毛細血管密度の増加(P<0.05)がみられた。また、虚血下肢の血流量についても有意な改善効果(P<0.001)が認められた。さらに、Agedマウスの骨髄細胞に対するHPCによって得られた治療効果の増強は、Youngマウスの骨髄細胞の場合と同程度であった。以上の結果から、加齢動物の骨髄細胞に対するHPCによって、細胞移植による血管再生治療の効果を向上できることが分かった。今後、ヒトの骨髄由来細胞をSCIDマウスの虚血下肢筋肉に移植する実験、ならびに、ウサギ等の大動物を用いた実験を行って有用性と安全性を証明した後、臨床試験への移行が期待される。細胞移植による血管再生治療の効果は限定的であり、治療効果を向上させる有用な方法の開発が急務である。申請者は、健常動物由来の骨髄細胞に対する低酸素プレコンディショニング(Hypoxic preconditioning: HPC)が治療効果を向上させる簡便かつ有用な方法であることを報告してきた。平成23年度は、加齢による骨髄細胞の質や機能へ及ぼす影響を調べると共に、HPCの効果をin vitroで検証した。Youngマウスと比較して、Agedマウスの骨髄細胞では幹細胞マーカーCD34やc-kit陽性細胞率が有意に減少していた。また、細胞老化マーカーp53の発現上昇やテロメラーゼの活性低下も認められた。以上から、加齢により、骨髄細胞において幹細胞数の減少と機能低下が生じることが確認された。次に、単離後の骨髄細胞を低酸素(Hypoxia、2%O2;HPC)または正常酸素(Normoxia、20%O2)条件下で24時間培養後、以下の検討を行った。Youngマウスと比較して、Agedマウスの骨髄細胞の接着・生存は有意に低下したが、HPCによって有意な改善効果が得られた。また、機能低下が認められたVEGF産生能や内皮分化能といった血管再生能についても、HPCによる有意な増強効果が認められた。さらに、HPCによる細胞機能の増強効果にYoungマウスとAgedマウスの間で反応性の違いは認められなかった。以上の結果から、機能低下が認められた加齢動物の骨髄細胞に対するHPCによっても細胞機能が増強することが示された。当初の計画通り、加齢動物由来の細胞に対する低酸素プレコンディショニングの効果についてin vitroでの検証が順調に進捗したため。平成23年度に引き続いて、加齢動物由来の細胞に対する低酸素プレコンディショニングの効果についてin vivoでの検証を行う。下肢虚血モデルを作製後、虚血筋肉組織内に直接、骨髄細胞を移植して、虚血下肢の血流量の変化と毛細血管の形成を検討することで、血管再生の治療効果を評価する。上記の研究の推進方策に基づいてin vivoでの生化学・組織学的解析等を行うために、関連試薬、一般試薬・器具、および実験動物等を購入する。

これらの試薬等は平成23年度の購入を予定していたが、研究代表者が平成24年度から所属研究機関を異動するために、次年度に購入・使用することとなった。また、情報収集・成果発表のための旅費としても研究費を使用する。
遺伝子改変酵素群APOBECはHPV感染における発癌因子か？

本研究は遺伝子改編酵素群APOBECのヒトパピローマウイルス(HPV)感染病態における病的役割を明らかにする事を目的とした。その結果、1APOBECはHPVやインターフェロンにより発現が誘導される事、2APOBECはHPVゲノムや宿主ゲノムに変異を導入し、またHPVゲノムの宿主へのインテグレーションと相関する事、3その一方でHPVビリオン産生細胞で発現すると、感染性を低下させる事を発見した。以上の知見は抗ウイルス因子と発癌因子という、HPV感染病態におけるAPOBECの二面的役割を反映していると考えられた。我々はHPV16陽性細胞株を用いて、APOBECがインターフェロンβによって誘導され、HPV16 E2遺伝子にC-to-T/G-to-A hypermutationを導入する事を以前報告した。そのような現象がin vivoでも起きているのか検討するため、HPV16陽性子宮頸部異形成検体を用いてHPVゲノムの変異解析を行った。その結果、細胞株で得られた知見と同様、HPV16 E2遺伝子にもhypermutationが検出される事を発見し報告した。すなわちAPOBECによるE2のhypermutationIがin vivoでも起きている事が示唆された。さらに、これまでの変異解析は3D-PCRというPCRの変法を用いて行ってきたが、新たに次世代シーケンスを用いた変異解析方法を立ち上げた。この方法でHPV16陽性異形成検体を解析した結果、E2以外の広い遺伝子領域にhypermutationが入っている事を示した(投稿準備中)。一方で、HPVウイルス粒子の形成におけるAPOBECの役割についても検討を始めた。Pseudovirion(PsV)を用いた実験系で、PsV産生細胞でAPOBECを強制発現させる事でPsVの感染性が低下する事を発見した。さらにHPV16キャプシド蛋白であるL1にAPOBECはin vitoで結合する事をあわせて報告した。以上の知見はAPOBECがカプシド蛋白への結合を介してPsVの感染性を低下させている可能性を示唆した。またHPV16(+)子宮異形成組織由来細胞株W12を用いて、double strand break及びインテグレーションが高カルシウム培地にて誘導されるという予備的知見を得ており、さらに検討を進めている。APOBECによりHPVゲノムにhypermutationがin vivoで導入される事を示せた事は順調な成果と言える。またインテグレーションやDNA損傷について評価する系についてもW12を用いて立ち上がる目処が立っており、引き続き取り組んで行く。AID/APOBECファミリーは、脱アミノ反応によりシトシン(C)をウラシル(U)に変換する遺伝子改変酵素群である。本研究は、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染病態におけるAPOBECの発癌への関与を明らかにする事を目標にした。1子宮頸部異形成細胞株W12を用いた検討にて、インターフェロンβによりAPOBECが誘導されHPV16ゲノムに連続するC-to-U変異(hypermutation)が導入される事を明らかにした。2同じくW12を用いて、上皮細胞の分化がAPOBECの発現を誘導し、ミトコンドリアゲノムにhypermutationを導入する事を明らかにした。3293細胞を用いた検討により、APOBECは染色体ゲノムにもhypermutationを導入する事を明らかにした。4HPV16(+)子宮頸部異形成検体を用いた検討の結果、W12と同様hypermutationがHPV16ゲノムから検出される事を明らかにした。5中咽頭癌検体を用いた検討により、APOBECの発現量とHPV16ゲノムの宿主へのインテグレーションは相関する事を明らかにした。以上の知見から、APOBECはウイルス感染により放出されるサイトカインや宿主細胞の分化によって誘導され、染色体、ミトコンドリア、HPVゲノムに変異を導入する事で発癌に寄与する可能性が示唆された。また変異導入がHPVゲノムのインテグレーションに寄与している可能性が示唆された。現在APOBECにより導入された変異が細胞の形質にどう影響を与えるのかなど、さらに検討を進めている。臨床検体を用いたウイルスゲノムの変異解析の結果、hypermutationが広範囲に見つかった事は順調な成果といえる。ゲノム不安定性やウイルスゲノムのインテグレーションを評価するin vitroの系は立ち上げに時間がかかっているが引き続き取り組んでゆく。立ち上がり次第マウスへの移植の実験系も立ち上げたい。W12の系を用いて、引き続きAPOBECの発現と、ゲノム不安定性やインテグレーションの惹起の相関及びメカニズムについて検討を進める。また不死化表皮細胞などよりprimaryに近い系でも実験系の立ち上げを試みる。臨床検体についてもAPOBECの発現量とインテグレーションの相関についてデータを引き続き蓄積する。引き続きAPOBECによるゲノム不安定性惹起やHPV16ゲノムのインテグレーションを評価するin vitroの系を立ち上げる。

初代表皮細胞へのHPV16ゲノムの遺伝子導入以外に、不死化表皮細胞へのHPV16ゲノムの導入、さらにエピソーム型HPV16を持つ細胞株W12を代わりに使う事も視野にいれ進めて行く。臨床検体についてもAPOBECの発現と変異蓄積やインテグレーションの相関について引き続きデータを蓄積する。46197円の未使用額が生じたが、翌年度に使用する事が効率的と考えたため、平成28年度に持ち越しにした。41533円の未使用額が生じたが、翌年度に使用する事が効率的と考えた為H27年に持ち越しをした。46197円の未使用額は消耗費購入等にあてる。41533円の未使用額は消耗品購入等にあてる。
強力な微生物起源新オ-キシンの合成とその難増殖・難再分化針葉樹カルスへの応用研究

新規なオ-キシン物質の開発は、資源植物とその培養細胞の増殖・分化・成長を制御する上で、重要な課題の一つと考えられる。本研究では、筆者らが見いだした微生物起源新オ-キシン物質、アクレモオ-キシンA(AAーA、1ー0ー[(2S)ー2ー(3ーindolyl)propionyl]ーDーarabitol)とその関連物質の合成を行うと共に、得られたアクレモオ-キシン類について増殖・分化等の難しいスギ等のカルスの誘導と増殖に対する効果、およびハクサイ、イネ等の芽生えに対する作用性を調べ、次のような新知見と研究成果を得た。1.AAーAは、ラセミ体の2ー(インド-ル)プロピオン酸(IPA)をAAーA生産菌で処理して得られた高純度(+)ーIPAとDーマンニト-ルから調製したアラビト-ルー2,3:4,5ージアセトニドとを、触媒の存在下DCC縮合物を得、次いでその脱保護により初めて合成し、構造解析により得たAAーAの構造を確認した。また、関連化合物(AAーB)も、IPAの代わりにIAAを用いて同様の反応手順により合成し、その構造を明らかにした。2.AAーAを含む種々のオ-キシン類について、スギとマツの頂芽由来のカルスの増殖等に対する作用を調べた結果、カルス増殖の大きさは,3倍体のスギ>2倍体のスギ>アカマツ、オ-キシン作用の強さでは、NAA、2,4ーD>IBA>IPA,AAーA,IAAの順であった。3.ハクサイ,ダイコン、イネ、ムギ等の芽生えに対する成長阻害作用では、AAーAよりもIPAの阻害作用がさらに強く,IPAの光学異性体間では多くの植物で(+)ー体の作用が強く現れたが,ダイコン、イネでは逆に(ー)ー体の成長阻害作用が高いという興味深い結果を得た。新規な植物ホルモン物質の開発は,資源植物とその培養細胞の生長・分化・増殖を制御する上で、重要な課題の一つと考えられる。本研究では、筆者らが見いだした微生物起源新オ-キシン物質、acremoauxin A(AAーA)[1ー0(2S)ー2ー(3ーindolyl)propionyl]ーDーarabitol、を効率的な方法で合成し、AAーAとその関連物質について、増殖や分化が困難な針葉樹カルスに対する施用効果を検討する事を目的に研究を行い、次のような成果ならびに新知見を得ることができた。1.AAーAの合成研究では、光学活性インド-ルプロピオン酸(IPA)の調製法が重要な問題と考えられたが、これはAAーA生産糸状菌(Acremonium roseum)がラセミ体のIPAを(+)ーIPAと(-)ー2ー(3ーindolyl)propaー1ーolに微生物変換することを見いだしことにより、高い光学純度を有する(+)ーIPAを効率よく調製する事ができた。さらに、得られた(+)ーIPAとDーマンニト-ルから調製したarabitol2,3:4,5ーdiacetonideを触媒の存在下でDDCにより縮合させ、次いで脱保護することにより、極めて高い光学純度を有するAAーAを合成する事に成功した。その各種スペクトルデ-タは、天然物と完全に一致した。

2.クロ-ンスギ(東南置賜4号、岩船7号)カルスの増殖に対するAAーAとその関連物質の効果の検討においては、それぞれの茎頂から誘導した無色カルスの増殖速度が、IAA,AAーA<(±)ーIPA,IBAの順であり、いずれも短時間(57日)に効果を失いカルスが褐変化すること事が明らかとなった。しかし、インド-ル核を有しない合成オ-キシンは、20日以上活性が持続し、カルスの色も変わらず生育は良好であった。新規なオ-キシン物質の開発は、資源植物とその培養細胞の増殖・分化・成長を制御する上で、重要な課題の一つと考えられる。本研究では、昨年度に引き続き、筆者らが見いだした微生物起源新オ-キシン物質アクレモオ-キシンA(AAーA)の関連物質である1ー0ー[(3ーindolyl)acetyl]ーDーarabitolの合成を行い、関連物質の構造を明らかにすると共に、アクレモオ-キシン類についてスギカルスの誘導と増殖に対する効果およびハクサイ、イネ等の芽生えに対する成長阻害効果を調べ、次のような新知見と研究成果を得た。1.AAーAの関連化合物は、Dーマンニト-ルから調製したアラビト-ルー2,3:4,5ージアセトニドとインド-ル酢酸を、触媒の存在下DCCで縮合させ、次いで脱保護することによって合成し、融点150151°Cの結晶として得た。得られた化合物のHPLC、MS(テトラアセテ-ト)および^1HーNMRは、AAーAと共に得られた関連天然物(AAーB)とよく一致した。本物質はトリプトファンを添加した培養法により、多く生産された。2.スギ針葉切片からのカルスの誘導と増殖について調べた結果、アクレモオ-キシン類ではインド-ル酢酸同様カルス誘導は認められたが、その増殖効果は弱いものであった。一方、合成オ-キシンの2,4ーDやNAAではスギカルスの著しい増殖が観察され、その増殖は2倍体よりも3倍体品種において良好であった。3.AAーAおよび2ー(インド-ル)プロピオン酸(IPA)の光学異性体について、ハクサイ、ダイコン、イネ、ムギ等の芽生えに対する作用を調べた結果、成長阻害作用はAAーAよりIPAが強く、後者の光学異性体間では多くで(+)ー体の作用が強かったが、ダイコン、イネでは逆に(-)ー体が強いという面白い結果を得た。
感情の色彩化とユーザの閲覧行動に基づく感情センシング

閲覧情報から人の感情を推定する手法の確立するために,人の感情を色彩情報へ変換する手法の提案と,変換した色彩情報を直観的に閲覧できる探索システムを構築した.研究対象は書籍とし,形容詞と色彩の関連性を表現した色彩データベースを構築した.書籍本文とレビューから感情を表す形容詞を抽出し,色彩へ変換後,出版書籍表紙へ適用することによって,読書後の印象を反映させた書籍表紙画像を生成した.色彩情報を多面的に扱えるリング状検索インタフェースを応用し,書籍探索システムを構築した.本システムは,新たな書籍に出会う機会を与え,ユーザは自身の感情を提案画像にすり合わせながら所望の書籍を選択できることを確認した.感情を色彩情報へ変換する手法の確立に向けて,本年度は,読者の印象を反映させた表紙画像を生成するための色抽出手法を検討した.具体的には,人間の内面的な性質や状態を表す形容詞と色の関係性に着目した色彩データベースを構築し,書籍本文とレビューから表紙色を抽出する手法を提案した.本データベースでは,3184語の形容詞と,色が持つ意味の違いを的確に捉えることができる代表色130色を対応付けた.各色に対し,最大25語の形容詞が定義されている.また,各色に対する各形容詞には,イメージを配色で表現する際に,代表色が使われる頻度を5段階で指数化した値である使用頻度が定義されている.本手法では,入力された書籍本文とレビューに対し,形態素解析を行い,形容詞を抽出する.抽出された形容詞に対し,各形容詞の出現頻度と,書籍本文と感想文の文章量の比率を考慮し,形容詞のスコアを算出する.その後,形容詞と色の関係性を示す色彩データベースを用いて,形容詞を色に変換する.色のスコアを算出するにあたり,形容詞のスコアだけでなく,色彩データベースに登録されている使用頻度を考慮し,色のスコアを算出する.このスコアが高い色を,読者の印象を反映させた色として定義し,書籍表紙画像色として抽出した.本手法の評価として,被験者20人による表紙画像の描画による実験,被験者15名による書籍表紙色の選択による実験,被験者20名による販売書籍への適用による実験を行った.その結果,販売書籍表紙よりも本手法による抽出色を適用した書籍表紙の方が読者の印象に合っていること,書籍本文の文章量には依存せず読者の印象に適合した色抽出が行えること,解説より小説の方がより読者の印象に適合した色抽出が行えること,本手法による抽出色は読後感が充実している読者の心情をより表現できることが分かった.感情を色彩情報へ変換する手法の確立に向けて,本年度は,(1)読者の印象を反映させた表紙画像を生成する手法の提案と,(2)ユーザの感情を直観的に検索条件として入力できる検索インタフェースの検討を行った.(1)では,人間の内面的な性質や状態を表す形容詞と色の関係性に着目した色彩データベースを用いて,レビューを色彩に変換し,変換した色を販売書籍画像へ適用した.色彩データベースには,色彩心理学に基づき,3184語の形容詞と130色が対応付けられている.各色には最大25語の形容詞と,各形容詞をイメージする際にその色が使用される頻度が定義されている.本手法では,書籍販売サイトにおけるレビューを収集し,形態素解析で形容詞を抽出した後,色彩データベースにおける形容詞,色,頻度を用いて色スコアを算出し,テキストを色に変換する.販売書籍画像へ色スコア上位の色を適用させるにあたり,色差25以上となるような色を選択し,隣接する色との視認性を考慮した.(2)では,感情を表現する色彩を検索条件として柔軟に入力できるよう,連続量を詳細に調整できる検索インタフェースを開発した.本インタフェースは,検索の切り口として用意された属性を選択すると,その属性に対する属性値を整列させたリングが表示される.リング上の特定の位置にある属性値を検索条件として利用することで,リング内部に検索結果を表示する仕組みである.複数の属性を組み合わせることによりAND検索を,同一属性から複数のリングを表示させることによりOR検索を提供する.ユーザの閲覧行動から,そのユーザの感情をセンシングする手法を確立するために,本年度は,色彩情報を直観的に閲覧できる書籍探索システムの構築に取り組んだ.昨年度までに検討した,ユーザの感情を直観的に検索条件として入力できる検索インタフェースを搭載し,読者の印象を反映させた表紙画像を生成する手法により作成した画像を検索結果として表示する仕組みである.本インタフェースでは,検索の切り口として用意された各属性を,その属性に対する属性値を整列させたリングで表現する.リング上の特定の位置にある属性値を検索条件として利用するため,ユーザはリングを追加・削除・回転させることにより,リング内部に表示された検索結果を閲覧しながら探索を進めることが可能である.今後は,本システムをユーザが利用することによって,閲覧行動に基づくユーザの関心度を考慮した検索アルゴリズムの検討と,表紙画像の提示によるユーザの感情センシングの効果を検証する.平成27年度の課題は,色彩情報を直観的に閲覧できる探索システムの構築と感情センシングの効果検証であった.前者はおおむね順調に進んでいるが,後者は出産に伴う研究中断により取り組むことができなかった.

構築した探索システムは,連続量や離散量を問わず,多次元属性情報を柔軟に探索できる検索インタフェースを搭載し,読者の印象を反映させた表紙画像を提示する.販売書籍画像を提示するシステムと比較した際,提案システムは読後感の近い書籍が検索結果として集まっていることが確認できたため,順調に進展していると考えられる.ユーザの閲覧行動から,そのユーザの感情をセンシングする手法の確立を目指し,本年度は,読者の印象を反映させた書籍表紙画像を表示する書籍探索システムの構築,および,書籍探索システムを用いたシステムとユーザの感情の相互作用について検証した.検索結果として表示される書籍表紙画像は,出版表紙画像に,視認性を考慮して,書籍レビューから抽出された感情を表現する色彩を適用した画像である.生成した表紙画像の評価では,書籍販売サイトにおける4種類のジャンルから,売上上位にランクインしている計8冊に対し,10代から50代の計400名によるアンケート調査を実施した.すべてのジャンルに対し,レビュー作成者が多いと考えられる年齢層において,出版表紙画像より,本手法により生成された書籍表紙画像の方が,読後感に近いことが確認された.書籍探索システムの構築にあたり,色味や雰囲気など色彩を直観的に操作できる属性を用意し,多次元属性情報を柔軟に扱うことが可能なリング状検索インタフェースを応用した.リング上の特定の位置にある属性値を検索条件として利用し,リングを組み合わせることによってAND検索を提供する.ユーザはリングを追加・削除・回転させることにより,リング内部に表示された検索結果を閲覧しながら探索を進めることが可能である.システムとユーザの感情の相互作用を検証するにあたり,ユーザは表紙画像から読書後の印象を汲み取りつつ,自身の感情を色彩にすり合わせ,最終的に自身の気分に合った書籍を発見できるか調査した.実験協力者のうち,書籍内容のイメージなど曖昧な情報要求を持つユーザは,希望通りの探索を進め,満足度の高い書籍を選択することができた.一方,特定の著者やジャンルを希望する明確な情報要求を持つユーザは,探索過程において情報要求を自然に変更させるとともに,新たな書籍に出会う機会を与えられたことを確認した.閲覧情報から人の感情を推定する手法の確立するために,人の感情を色彩情報へ変換する手法の提案と,変換した色彩情報を直観的に閲覧できる探索システムを構築した.研究対象は書籍とし,形容詞と色彩の関連性を表現した色彩データベースを構築した.書籍本文とレビューから感情を表す形容詞を抽出し,色彩へ変換後,出版書籍表紙へ適用することによって,読書後の印象を反映させた書籍表紙画像を生成した.色彩情報を多面的に扱えるリング状検索インタフェースを応用し,書籍探索システムを構築した.本システムは,新たな書籍に出会う機会を与え,ユーザは自身の感情を提案画像にすり合わせながら所望の書籍を選択できることを確認した.平成26年度の課題である読者の印象を反映させた表紙画像を生成する手法の確立,および,ユーザの感情を直観的に検索条件として入力できる検索インタフェースの検討は,おおむね順調に進んでいる.前者の表紙画像生成手法の確立では,平成25年度に提案した感情を表現するための色抽出アルゴリズムを改良し,視認性を考慮した書籍表紙画像を生成する手法を提案した.被験者実験においても,既存の書籍表紙画像より,本手法により生成された書籍表紙画像の方が,読者の印象をより表現していることを確認したため,順調に進展していると考えられる.一方,検索インタフェースの検討では,連続量である感情を表現する色彩を柔軟に検索条件として入力できるインタフェースを開発した.
産業廃棄物最終処分場排水の水質と農業に与える影響

本研究は平成7,8の2年間にわたって行ったものであるが、この間の調査で明らかになった点を以下に挙げる。1.産業廃棄物最終処分場のうち、管理型と安定型の排水について調査を行った結果、管理型では排水を処理しているにもかかわらず、T-Nなど高い濃度の排水が見られた。一方水質を汚染しないはずの安定型最終処分場の場合大半の処理場ではT-N, CODなど低い排水濃度であったが。一部の安定型処分場では高濃度のT-NやCODを含む浸出水が検出された。(寺泊夏戸処分場)2.高濃度の排水があった寺泊の処分場を対象に詳細な調査を行った。その結果、ここでは浸出水があまり希釈を受けないで水田に灌漑水として取水されているため、水稲の倒伏やいもち病の発生が多く見られたが、それは窒素過多によって起こっていることが分かった。3.この処分場は埋め立てが完了しているが、経年的に水質濃度は減少しており、その逓減傾向は年を追って穏やかになっている。そのため、指数関数式で逓減傾向を表すことができることがわかった。4.上記の関数式を用いて水稲に対して影響度の大きいと考えられるT-N, CODそれにEC(電気伝導度)がどの程度年数を経たら農業用水基準を満足する濃度にまで低下するのか試算を行った。その結果T-Nで20年、COD、ECで約10年かかることがわかり、水稲に影響度が最も大きいと考えられるT-Nが水質を回復するのに最も長時間を要することがわかった。5.浸出水の濃度は長期的には、逓減傾向を示しているが、短期的には降雨などの影響を受けて変動している。そのため、渇水年か多雨年かのよって水質濃度が異なってくる。そこで、浸出水の水量、水質が合うようなタンクモデルを考案し、適用を試み、自然渓流水との比較を行った。その結果産業廃棄物最終処分場からの浸出水は渓流水に比較して水量の変化が緩やかで渇水流量も多かったが、モデルでもそのような特徴を再現でき、水質についても良い適合度を得ることができた。本年度は産業廃棄物最終処分場の安定型7箇所、管理型2カ所を対象に処分場からの排水や浸出水の水質調査を行った。全体的に管理型の排水は処理が行われているものの、T-NやCODといった水質濃度は安定型より高かった。ただ安定型の中にも極めて濃度が高い処分場が存在した。また安定型のうち2カ所はすでに埋め立てが完了した処分場であり、完了後の水質の推移を見るため、他地区より頻繁に調査を行った。今年度だけの結果だけでなく、これまでの結果を合わせて完了後の濃度の推移をみた結果、COD、T-Nの水質濃度は次式で表されることが分かった。ここでCt:埋め立て完了t年後の排水の水質濃度Co:埋め立て完了直後の濃度e:自然対数、k:定数、t:埋め立て完了後の経過年数この結果、A処分場ではT-N濃度、COD濃度が農業用水基準に達するのにそれぞれ13.7年、6.7年かかることがわかり、水質への影響が長期化することが分かった。またこのA処分場では埋め立て完了後5年を経過した1995年にも処分場排水を灌漑した水田に被害が表れた。

それらの水田の水稲について調査分析を行ったが、主に窒素過剰による倒伏、いもち病の発生、不稔籾の増加という現象が見られた。本年度は、これまで調査を行ってきた産業廃棄物最終処分場のうち、水質を汚染しないはずの安定型最終処分場でありながら、高濃度のT-NやCODを含む浸出水が検出された寺泊夏戸処分場を対象に詳細な調査を行った。その結果次の事が明らかになった。1.浸出水があまり希釈を受けないで水田に灌漑水として取水されているため、水稲の倒伏やいもち病の発生が多く見られたが、それは窒素過多によって起こっていることが分かった。2.この処分場は埋め立てが完了しているが、経年的に水質濃度は減少しており、その逓減傾向は年を追って緩やかになっている。そのため、指数関数式で逓減傾向を表すことができることがわかった。3.上記の関数式を用いて水稲に対して影響度の大きいと考えられるT-N,CODそれにEC(電気伝導度)がどの程度年数を経たら農業用水基準を満足する濃度にまで低下するのか試算を行った。その結果T-Nで20年、COD、ECで約10年かかることがわかり、水稲に影響度が最も大きいと考えられるT-Nが水質を回復するのに最も長時間を要することがわかった。4.浸出水の濃度は長期的には、逓減傾向を示しているが、短期的には降雨などの影響を受けて変動している。そのため、渇水年か多雨年かによって水質濃度が異なってくる。そこで、浸出水の水量、水質が合うようなタンクモデルを考案し、適用を試み、自然渓流水との比較を行った。その結果産業廃棄物最終処分場からの浸出水は渓流水に比較して水量の変化が緩やかで渇水流量も多かったが、モデルでもそのような特徴を再現でき、水質についても良い適合度を得ることができた。
振動刺激装置による顎骨の再生医療を目指した基礎的・臨床的研究

本年申請者らは、平成15年度・16年度のin vitroで得られた結果をふまえ、振動刺激を用いたメカニカルストレス負荷法を臨床応用すべくラットを用いたin vivoの検討を行った。先に開発した骨芽細胞培養用振動刺激装置を応用して動物実験用振動刺激装置を設計・作製した。10週齢のラット用い、in vitroで決定された至適振動刺激条件で1日15分の振動刺激を7日間実施後、ネンブタール過剰投与により安楽死させ、頭蓋骨を摘出した。摘出した骨を用いてH-E染色、免疫染色(アルカリフォスファターゼ活性、RANKL、OPG)を施行した。ラットを用いた検討では振動刺激群と非刺激群において明らかな差を認めなかった。切断面においてOPGの強産生が認められたが、これは、骨折治癒過程の反応性のものと考えられた。今後in vivoの実験系において、振動条件の再検討ならびに骨形成因子の投与を併用するなどの検討が課題と思われた。本研究で行った検討結果をまとめると、振動刺激によるメカニカルストレス負荷法は、安価かつ簡便で、臨床応用に適した方法であったが、他のメカニカルストレス負荷法と比較して細胞に及ぼす効果が小さいものと考えられた。現段階での臨床応用の可能性を考慮すると、超音波と性質が近いことから、骨髄炎の治療などが可能性としてあげられる。また、cDNA microarray施行によって明らかとなった機能不明め遺伝子の中から、メカニカルストレスの骨形成作用の鍵となる遺伝子を特定することによって、メカニカルストレス受容構造の解明を行うことが今後の検討課題としてあげられた。メカニカルストレスを細胞に付与する方法として、ひずみ応力、ずり応力、超音波等の様々な手法が報告されているが、振動刺激を用いた報告は少ない。さらに、振動刺激を用いた骨芽細胞へのメカニカルストレスの付与は全く新たな試みであり、細胞培養用振動刺激装置は現時点では発売されていない。そこで、申請者らは(株)MEシステムの協力を得て骨芽細胞培養用振動刺激装置を新たに開発した。しかしながら、超音波とは異なり共振等を生じやすく、振動刺激の制御は困難をきわめた。安定した振動刺激を効率良く細胞に付与するためには、今後さらなる振動装置の改良が必要である。本年度、申請者らは、培養ヒト骨芽細胞に上記装置を用いて振動刺激を加えた後、培養上清を回収しGriess法を用いて培養上清中のNO産生量を測定した。また、total RNAを回収・精製しcDNAmicroarrayを用いて骨のリモデリングに関与する骨細胞分化・増殖遺伝子の発現を包括的にスクリーニングした。その結果、培養上清中のNO産生量の変化は認められなかったが、cDNA microarrayの結果よりCOX-2、OPG、Cbfa-1、BMP-4のmRNA発現誘導が示唆された。しかし、それらの発現量の差は微弱であり、また各々の遺伝子が発現する時期も様々であるため、今後定量的RT-PCR法ならびにウエスタンブロッティング法を用いて骨芽細胞増殖に最も効果的な振動条件について検討予定である。本年度申請者らは、昨年度の結果をふまえ培養ヒト骨芽細胞に骨芽細胞培養用振動刺激装置を用いて振動刺激を付与した後、total RNAを回収・精製しcDNA microarrayを用いて約3万遺伝子の発現を検討した。その結果、骨のリモデリングに関与する骨細胞分化・増殖遺伝子の発現においては明らかな差違を認めなかった。この結果より、骨芽細胞においては振動刺激を認識する機構が存在しないことが示唆された。同時にヒト歯肉由来線維芽細胞に同装置を用いて15分間振動刺激を付与したところ、刺激後6時間後にCOX-2 mRNAの発現量が増加していることが認められた。しかしながら蛋白産生のレベルではCOX-2産生に差違は認められなかった。このことより、振動刺激を感知するのは骨芽細胞ではなく周囲の組織であり、そこから骨芽細胞にメッセージが送られるのではないかと推測された。

これらの結果より、現在申請者らはヒト歯肉由来線維芽細胞に振動刺激を付与し、cDNA microarrayを用いて遺伝子の発現を包括的な検討を行っている。さらにラットの頭蓋骨欠損モデルを作製し、vivoにおいての振動刺激の影響を検索中である。本研究期間中に、申請者らは、培養線維芽細胞における炎症性サイトカイン産生の検索過程で、内圧というメカニカルストレスが加わる嚢胞壁由来の線維芽細胞は、歯肉由来・歯根膜由来の線維芽細胞と比較して有意にIL-6産生量が高いことを報告した。また、近年ウィルス感染における生体防御機構に関連するとの報告が有るが、その機能はよく知られていない遺伝子であるRIG-Iについて検討したところ、炎症性サイトカインIL-1β刺激により、RIG-I産生を誘導することを報告した。本年申請者らは、平成15年度・16年度のin vitroで得られた結果をふまえ、振動刺激を用いたメカニカルストレス負荷法を臨床応用すべくラットを用いたin vivoの検討を行った。先に開発した骨芽細胞培養用振動刺激装置を応用して動物実験用振動刺激装置を設計・作製した。10週齢のラット用い、in vitroで決定された至適振動刺激条件で1日15分の振動刺激を7日間実施後、ネンブタール過剰投与により安楽死させ、頭蓋骨を摘出した。摘出した骨を用いてH-E染色、免疫染色(アルカリフォスファターゼ活性、RANKL、OPG)を施行した。ラットを用いた検討では振動刺激群と非刺激群において明らかな差を認めなかった。切断面においてOPGの強産生が認められたが、これは、骨折治癒過程の反応性のものと考えられた。今後in vivoの実験系において、振動条件の再検討ならびに骨形成因子の投与を併用するなどの検討が課題と思われた。本研究で行った検討結果をまとめると、振動刺激によるメカニカルストレス負荷法は、安価かつ簡便で、臨床応用に適した方法であったが、他のメカニカルストレス負荷法と比較して細胞に及ぼす効果が小さいものと考えられた。現段階での臨床応用の可能性を考慮すると、超音波と性質が近いことから、骨髄炎の治療などが可能性としてあげられる。また、cDNA microarray施行によって明らかとなった機能不明の遺伝子の中から、メカニカルストレスの骨形成作用の鍵となる遺伝子を特定することによって、メカニカルストレス受容構造の解明を行うことが今後の検討課題としてあげられた。