hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
波動方程式族の係数同定問題に対する安定かつ高精度な数値解法開発のための総合的研究

当該年度は,研究計画における「(i)合成梁欠陥同定問題を例とする1次元波動型方程式の係数同定問題に対するH2勾配法の確立」,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」を実施し,さらに「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」の研究にも着手した.(i)については,方法確立において必要なパラメータ選択について,同定精度との関係を数値実験により明らかにした.具体的には,数値の大きさは本質的に重要ではなく,パラメータ同士の比率が重要であることを示した.この成果により,選択を検討すべきパラメータ数を当初の3ではなく2へ減らすことに成功,すなわち開発手法を簡易化することができた.この成果については,学会で発表するとともに学術論文誌へ投稿し,採択・掲載された.(ii)については,GPBiCGSafe法を拡張した「テンソル積構造GPBiCGSafe法」を開発し,連立一次方程式に対する反復解法としての収束性の向上に成功した.(iii)については,(i)の成果を拡張することで2次元スカラー波動方程式に対するH2勾配法を開発した.具体的には,2次元問題に対する密度型問題の導出,汎関数の定義と導汎関数導出し,アルゴリズム構築した.また,数値実験により,その有効性と安定性を示した.この成果については,逆問題関係の国際研究集会で発表した.当初の研究計画では,研究初年度中に「(i)合成梁欠陥同定問題を例とする1次元波動型方程式の係数同定問題に対するH2勾配法の確立」,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」を実施・完了する予定であった.(i)については,当初計画通りに実施・完了させることができ,さらに研究2年目に実施する予定であった「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」に着手することもできた.(ii)については,多倍長計算による検証は実施しなかったものの,収束性を向上した手法を開発することができた.以上の理由により,現在までの進捗状況として「(1)当初の計画以上に進展している。」とした.「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」については,機械学習を援用してパラメータ値選択の基準を検討し,その数値実験結果を元に解析的な手法を検討・開発する.さらに「(iv)多次元弾性波動方程式に対する開発手法の応用」を当初計画より1年早く開始する.また,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」については,多倍長計算環境による検証を実施するとともに,テンソル積構造係数行列に対する,構造を保持し,かつ効果的な前処理方法の開発を実施する.当該年度は,研究計画における「(i)合成梁欠陥同定問題を例とする1次元波動型方程式の係数同定問題に対するH2勾配法の確立」,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」を実施し,さらに「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」の研究にも着手した.(i)については,方法確立において必要なパラメータ選択について,同定精度との関係を数値実験により明らかにした.具体的には,数値の大きさは本質的に重要ではなく,パラメータ同士の比率が重要であることを示した.この成果により,選択を検討すべきパラメータ数を当初の3ではなく2へ減らすことに成功,すなわち開発手法を簡易化することができた.この成果については,学会で発表するとともに学術論文誌へ投稿し,採択・掲載された.(ii)については,GPBiCGSafe法を拡張した「テンソル積構造GPBiCGSafe法」を開発し,連立一次方程式に対する反復解法としての収束性の向上に成功した.(iii)については,(i)の成果を拡張することで2次元スカラー波動方程式に対するH2勾配法を開発した.具体的には,2次元問題に対する密度型問題の導出,汎関数の定義と導汎関数導出し,アルゴリズム構築した.また,数値実験により,その有効性と安定性を示した.この成果については,逆問題関係の国際研究集会で発表した.当初の研究計画では,研究初年度中に「(i)合成梁欠陥同定問題を例とする1次元波動型方程式の係数同定問題に対するH2勾配法の確立」,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」を実施・完了する予定であった.(i)については,当初計画通りに実施・完了させることができ,さらに研究2年目に実施する予定であった「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」に着手することもできた.(ii)については,多倍長計算による検証は実施しなかったものの,収束性を向上した手法を開発することができた.以上の理由により,現在までの進捗状況として「(1)当初の計画以上に進展している。」とした.「(iii)多次元スカラー波動方程式の係数同定問題に対するH1およびH2勾配法の開発」については,機械学習を援用してパラメータ値選択の基準を検討し,その数値実験結果を元に解析的な手法を検討・開発する.さらに「(iv)多次元弾性波動方程式に対する開発手法の応用」を当初計画より1年早く開始する.また,「(ii)多次元スカラー波動方程式の境界値問題に対する直接的解法の開発」については,多倍長計算環境による検証を実施するとともに,テンソル積構造係数行列に対する,構造を保持し,かつ効果的な前処理方法の開発を実施する.購入ワークステーションが,当初計画した額より安価であったため,次年度使用額が生じた.
新生血管内皮に発現するインテグリンをターゲットとした腫瘍血管増殖制御の試み

はじめに:癌周囲では正常組織とは異なる局所環境が形成され、腫瘍増殖に必要不可欠な腫瘍血管新生が亢進している。細胞浸潤に必要なmatrix metalloproteinase(MMP)の産生、腫瘍、免疫応答を司るIL-12の抑制,血管内皮に発現する接着分子E-selection(CD62E)のsoluble formの増加、血管内皮の増殖因子であるVEGFの産生など、様々な現象が報告されてきた。本研究では、背部に透明窓を装着したマウスモデルを用い、これら各因子の腫瘍血管新生に及ぼす影響を検討した。方法と結果:ヒト膵癌細胞株に対してはSCIDマウスを、マウス大腸癌C26にはBALB/cマウス、メラノーマB16にはSCIDマウスを用いた。マウス背部にチタニウム製の透明窓を装着し、皮下の血管網を生体顕微鏡システムで観察できるモデルを作製した。透明窓内に腫瘍を移植し経時的に血管新生過程を評価した。[MMP]MMPinhibitor投与群では血管密度、血管径とも有意に低値でC26の腫瘍増殖も抑制された。また新生血管の形成不全が見られ腫瘍に壊死部が出現し、その作用はTNP470に比較し強力であった。[IL-12]ヒト膵癌細胞株PKにアデノウイルスベクターを用いIL-12遺伝子を導入してIL-12/PKを作製した。IL-12/PKでは有意に血管新生が抑制され腫瘍増殖も見られなかった。この現象は抗IL-12抗体または抗IFN抗体の投与により消失した。[E-selectin]B16にE-Selectinsoluble・fromのcDNAを導入し、B16/Sを作製した。B16/SではB16に比較し有意に腫瘍増殖が促進したが、selectinアンタゴニストの投与によりB16/Sの増殖は抑制された。[VBGF]VEGFレセプターのsoluble formのcDNAを組み込んだアデノウイルスベクターを作製した。ウイルスベクターを投与したマウスでは腫瘍血管新生が有意に抑制された。考察:腫瘍血管新生には癌微小環境を形成する様々な因子が影響を及ぼしている。癌の個性に見合った抗腫瘍癌血管新生療法を確立するとともに、各因子の血管新生形成過程における役割を明らかにしていくことが必要である。1)腫瘍血管新生観察システムの確立マウス背部にチタニウムで作製した透明窓を装着し、同部に腫瘍を移植した後に血管新生形成過程を観察できるモデルを作製した。この過程を生体顕微鏡システムで観察し、ビデオシステムで画像を録画した。また腫瘍細胞の接種方法を改良することにより、腫瘍内の細胞の毛細血管網まで観察可能となった。2)血管新生定量法の確立録画された画像をNIHシステムで処理し、血管径、腫瘍血管密度、血管長を求めてangiogenic activityの定量化を行った。さらにフラクタル解析を導入して、腫瘍血管新生網の特徴を明らかにした。腫瘍血管のフラクタル定数は正常血管網に比較して低かった。3)TNP-470の腫瘍血管新生抑制効果ヒト膵癌細胞株を用いて、フマジリン誘導体であるTNP-470の腫瘍血管新生抑制効果を検討した。血管新生は顕著に抑制され、腫瘍の増殖も見られなかった。

この効果の評価に上記で確立したパラメーターは有用であった。4)インテグリンαvβ3抗体の新生血管抑制作用マウス由来の大腸癌細胞株C26を用い、上記の観察モデルを作製した。この腫瘍血管新生過程に及ぼす抗インテグリンαvβ3抗体の作用を検討した。この抗体はhybridoma細胞株RMV-7から作製した。腫瘍血管新生過程をこの抗体は抑制しなっかた。腫瘍血管新生をターゲットとした戦略が新たな癌治療法として注目を集めている。フマジリン誘導体やマトリックス・メタロプロテネース阻害剤が既に臨床治験に入り、その結果に関心が高まっている。本研究は、新生血管に特異的に発現し血管新生過程に重要な役割を担っていると報告されている、インテグリンαvβ3に関する基礎研究である。すなわち、マウスに作製した腫瘍血管のαvβ3発現を評価し、これをターゲットとして腫瘍血管新生をコントロールし、腫瘍の増殖を抑制する治療法を開発することを目的としている。まず、in vivoの系で腫瘍血管新生を評価するために、マウスの背部に透明窓を作製し、経時的に新生血管の発育を観察可能な生体顕微鏡観察システムを確立した。さらに、ビデオに録画した画像をコンピュータシステムに取り込み、新生血管形成過程を数量化する解析方法を考案した。同時に、マウスのインテグリンαvβ3に対する抗体を入手し、マウス腫瘍を免疫染色したが、残念ながら良好な染色結果が得られなかった。また、中和抗体を用いて腫瘍増殖に対する抑制効果を検討したが腫瘍の増殖には変化が認められなかった。残念ながら、これまでSan DiegoのScrippsから報告された実験結果は再現できていない。そこで、αvβ3抗体の使用を断念し、マトリックス・メタロプロテネース阻害剤、IL-12、合成糖鎖の血管新生抑制効果を検討したが、いずれもが血管新生抑制効果を有することが判明した。これらの研究成果は本報告書に記されているが、特に以下の点を強調しておきたい。1)マトリックス・メタロプロテネースは従来癌細胞の浸潤に関与し、転移巣の形成を促すとされていたが、血管内皮のmigrationとmaturationに重要な役割を担う、2)細胞性免疫応答を介して抗腫瘍作用を発揮するIL-12には、強力な血管新生抑制作用が存在し、この作用はIFN-γを介している、3)E-selectinには血管新生促進作用が存在する、ことである。本研究の成果により、今後多彩なプロジェクトの展開が期待でき、既にVEGFやBAIIなどを用いた血管新生をターゲットとした癌に対する遺伝子治療の開発に向けて研究が進んでいる。
品種・環境要因に基づく水稲穂数予測モデルの開発

水稲穂数予測モデルの開発のため、群落基部補光装置を用いた光質処理や窒素施用処理により、水稲の茎数動態に及ぼす光量・質、窒素供給速度の影響およびそれぞれの関係性を検討した。群落基部に対する赤色光の補光は最高分げつ期以降の分げつの減少に影響を及ぼさないことを明らかにした。最高分げつ期の出現時期は土壌溶液中のアンモニア態窒素の消長に依存する一方、それ以降の窒素吸収速度が茎数に及ぼす影響は小さく、受光量の多寡による光合成産物量の差が有効茎数の維持により重要であることが示唆された。(1)イネにおいて群落上/下部の光環境が分げつ発生・伸長に及ぼす影響を明らかにする実験解析のため、群落基部補光装置を作成し、その効果を検証することが昨年度の目的であった。本課題で作成した補光装置により群落基部の赤色光(波長:640680nm)の光量は最大でおよそ60μmol/m^2/s増加させることができ、これは日中の自然条件で測定した赤色光のおよそ半量程度に相当した。また最高分げつ期以降では、群落基部の赤色光と近赤色光の比(R/FR値)を標準区の0.270.57から280581へと補光により大きく改変できることを確認した。作成した補光装置を用いて群落基部の光量やR/FR値を大きく変えた条件でも、分げつ数の増減は標準区と比べ明らかな差異はなかったことから、群落基部における光(赤色光)環境が分げつの発生動態へ及ぼす影響は小さいことが示唆された。ただし前年の試験では慣行に比べ最高分げつ期の茎数が少なく、群落サイズや分げつ数の減少が小さい栽培条件であったため評価環境を再検討することが不可欠と考えられる。(2)遺伝子型の異なる北陸193号(indica)、日本晴(japonica)、モミロマン(mixed)の3品種について栽培試験を行い、分げつ発生動態とN施肥量との関係性の基礎知見を得た。いずれの品種も多N施肥条件で茎数は高く推移したが、既報と異なりN施肥量間で最高分げつ期の差異はみとめられなかった。またjaponicaで穂数型品種である日本晴は分げつ発生時期が早く、その後の分げつ数も大きく推移したが、いずれの施肥区でも最高分げつ期の品種間差はみとめられなかった。(1)、(2)の実験から得られた知見は、茎数予測モデルの構築において重要な基礎データとなる。(1)光環境が水稲の分げつ発生・伸長に与える影響を明らかにすることを目的に、前年度に作成した群落基部補光装置を用いて赤色光のみを補光しR/FR値を大きく増加させる処理区や群落上部に寒冷紗をかけた遮光区を設け、その分げつ動態を評価した。結果として、前年度と同様にいずれの処理区でも有意な分げつ数の増減はみとめられず、分げつの発生・枯死には光環境以外に強く分げつ数の決定に関わる要因があると考えられた。一方、群落上部の遮光は地上部乾物重を低下させ、上位葉のSPAD値、比葉面積、葉/茎重比を大きく増加させたが、群落基部の補光によってこれらの変化が抑制されることが示唆された。群落基部の光環境は分げつ動態以外の生育特性には大きな影響をもっていると推察された。群落上/下部の光環境が水稲の生育に与える影響を、分離して評価できた意義は大きいと考えられる。(2)前年度と施肥条件を変え生育初期に肥効の強く表れない慣行性窒素肥料を用いて栽培試験を行ったところ、いずれの品種でも前年度より最高分げつ期が大きく遅れ、最高分げつ期決定への施肥条件の重要性が確認された。また最高分げつ期前後に土壌溶液を採取しアンモニア態窒素濃度を評価したところ、既報の通り最高分げつ期において窒素濃度がかなり低下していることが観察された。以上より、水稲の分げつ動態には光環境よりも土壌中の窒素動態が強く関わる可能性が示唆され、この効果をより詳細に解析する必要があると考えられた。(3)アジアの多様な環境条件下で生育した水稲9品種の分げつ発生動態についてモデル解析を行い、窒素吸収量あたりの分げつ数の品種間差異は、葉面積あたりの葉身窒素量を支配する品種パラメータと関連があることが明らかになった。穂数予測モデルの構築に向けて重要な知見を得た。1光環境が水稲の分げつ発生・伸長に与える影響を明らかにすることを目的に、昨年に引き続き、自作の群落基部補光装置を用いた圃場試験を行った。

これらデータの解析から、最高分げつ期以降の分げつ減少期において、1.遮光により日射量が減少すると分げつの減少量が増加すること、2.赤色光のみの補光(R/FR比の増加)は分げつの減少に影響を及ぼさないこと、3.一方で赤+青色補光により若干の分げつ数の減少が抑えられたことがわかった。イネの最高分げつ期以降の茎数の減少には、同化産物量が支配的に関わっている一方、光質の影響は小さいことが示唆された。2窒素(N)供給量が分げつに与える影響について、追肥量の処理区を設けて栽培試験を行ったところ、最高分げつ期の多窒素追肥は、茎数減少の抑制効果が小さいことがわかった。また、作期移動試験によって、異なる気象条件における分げつ発生動態を明らかにするとともに、当該期間の水田土壌溶液のアンモニア態N濃度を継続的に測定し、各作期の最高分げつ期と土壌アンモニア態N濃度の消失時期の関係を明らかにした。3水稲発育モデルを用いた解析の結果、作期移動試験で観察された各作期の最高分げつ期は、稲体の異なる発育ステージ(幼穂分化期穎花分化期ごろ)に現れており、積算気温に対する初発分げつの発生が遅れた作期では、最高分げつ期も遅れたことがわかった。4水稲穂数決定過程のモデル化には、当初仮定した分げつの発生・伸長に対する群落基部の光質の影響よりも、稲体要因と日射量によって変動する同化産物供給速度の影響が重要であることが示唆された。今後、これまでに得た試験結果のデータベースを用いて、同化産物供給速度についての水稲モデルのキャリブレーションを進め、水稲モデルの出力変数を用いた茎数動態予測モデルの構築を行う。水稲穂数予測モデルの構築に向けた基礎データの取得は順調に進んでおり、本研究で新たに構築した水稲群落基部補光装置を用いた実験により、分げつ発生動態に関する重要な知見を得た。さらに本研究で遂行中の圃場試験結果のみならず、既報の生育データを用いることによって、水稲穂数の品種間差についての解析も進めているところである。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度までの研究成果から、群落基部光環境が分げつ発生動態に与える影響については一定の知見を得た一方、生育初期の気温と土壌溶存アンモニア態窒素濃度の相互作用の重要性が指摘された。そこで穂数モデルの構造決定に関わる重要な基礎データを拡充する目的で、茨城県つくば市と新潟県上越市において、作期移動試験と土壌アンモニア態窒素濃度のモニタリングを並行して行う。今年度の連絡試験では供試品種は1ないし2品種に絞り、穂数の品種間差の解析は既報の水稲生育データを用いて進めることとする。
身体化認知の機能的メカニズムの解明

本年度は主に研究の総括として,空間ー感情メタファに関するこれまでの知見をまとめ,さらにそれらのデータを基にメタ分析を行った。以下に詳しい内容を説明する。・上下空間ー感情メタファと左右空間ー感情メタファの顕著性の違い我々の心の中で,上下左右空間と感情の快不快が連合している(空間ー感情メタファ: e.g., Casasanto, 2009)。具体的には,上と利き手側は快感情,下と非利き手側は不快感情と結びついている。これらのメタファが我々の行動に影響を与えると言われている(メタファ一致効果)。近年,上下空間ー感情メタファの方が,左右空間ー感情メタファよりも,メタファ一致効果が顕著に現れるということが報告されている(e.g., Marmolejo-Ramos et al., 2013)。本研究では,この顕著性の違いには各研究間で使用されている課題の種類が関与しているのではないかと考え,反応時間を指標にしている課題を用いた研究とそれ以外の課題を用いた研究に分けてメタ分析を行った。その結果,上下空間ー感情メタファはいずれの課題であっても有意なメタファ一致効果が認められ,左右空間ー感情メタファでは反応時間課題でのみ有意なメタファ一致効果が見られた。このことは,上下空間ー感情メタファの影響は広範囲の認知処理で見られる一方で,左右空間ー感情メタファは処理の流暢性や効率性に特化して影響を与えることを示唆している。これらの成果について,国内学会で発表を行い,現在論文を執筆中である。他にも,関連する成果を専門誌ならびに国内外の学会にて発表を行った。具体的には,1本の査読付き論文,3本の査読無し論文,1件の国際学会,さらに14件の国内学会・シンポジウムにて発表を行った。また,2件の国内学会発表について発表賞を受賞した。現在も6本の論文を査読付き雑誌に投稿中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は身体で体験される運動や感覚が,感情などの概念とどのように関わっているかについて明らかにするものである。本年度は,(1)身体化認知と意識の関係性および(2)身体動作による画像の感情価の遡及的変容について検討を行った。(1)の研究では,画面上に感情を喚起する画像を呈示し,その後に呈示される黒点を垂直面に固定されたジョイスティックにより,画面上の任意の場所に移動させるという実験を行った。実験の結果,快画像を観察した後では,不快画像を観察した後に比べて,黒点を画面上部に移動されることが明らかになった。この効果は,画像が両眼間抑制により,意識に上らない場合は生起しなかった。したがって,上下方向の感覚運動表象は,意識的にアクセス可能な感情情報によって活性化されると考えられる。本成果については,現在査読付き国際誌に投稿し,原稿修正中である(Sasaki, Yamada, & Miura, in revision)。(2)の研究では,タッチパネルディスプレイ上に呈示された画像の感情価が直後の身体動作によって変容するかについて検討した。実験の結果,画像が消えた直後に画面を上部にスワイプした場合は画像が快く,下部にスワイプしたら画像が不快に評価された。この結果は,感情は現在の出来事だけでなく,その出来事と時間的に近接する関連情報を統合することで,後付け的に形成されていることを示唆している。本成果については,査読付き国際誌に掲載された(Sasaki, Yamada, & Miura, 2015)。他にも,身体化認知に関与するような感情処理(閾下嗅覚手がかりによる好意度の上昇)や素朴理論(知覚的な摩擦手がかりによる運動予測の変容),概念処理(数字と水平空間の連合と時間処理)に関する研究も行い,共著を含め査読付き雑誌に三本掲載された。本研究は感情と身体が相互にどのように関わり合っているかを明らかにすることが目的である。特に平成27年度は主に視覚意識との関係について検討を行った。(1)自発的運動行為に与える感情の影響と意識の関係感情が自発的な身体動作に与える影響を検討した。実験の結果,快感情の場合は,不快画像の時に比べて,上方向への身体動作を誘導することが明らかになった。さらに,連続フラッシュ抑制(CFS)により,画像が不可視な状態ではこのような影響は見られないことを示した。これらの結果は,感情による上下空間の感覚運動表象の活性化には,感情情報への意識的なアクセスが必要なことを示唆している。(2)身体動作による感情判断への影響上下の身体動作が感情情報への意識的なアクセスに影響を与えるかについて検討を行った。実験では,参加者は腕を上げた状態(上動作条件),腕を下げた状態(下動作条件),腕を動かさない状態(動作なし条件)で感情を喚起する画像を観察した。なお,画像はCFSにより見えない状態であった。参加者の課題は画像が見えたら報告することであった。その結果,画像の検出において動作の影響は見られなかった。しかしながら,画像が快か不快であったかを判断する課題では,上動作条件では,快感情画像に比べて,不快感情画像が呈示された場合の方が判断までに時間がかかることが明らかになった。これらの結果は身体動作が感情情報に対する意識的な判断に影響を与えていることを示唆する。これらに関連する成果は専門誌ならびに国内外の学会にて発表された。

具体的には,4本の査読付き論文,1件の国際学会,さらに4件の国内学会・シンポジウムにて発表を行った。また,1件の国内学会発表について発表賞を受賞した。これらの業績および本研究をまとめた学位論文が認められ,平成28年3月25日に九州大学より博士(心理学)の学位が与えられた。上記の通り,順調に学術誌に論文が掲載され,国内外の学会で発表を行っている。本年度は主に研究の総括として,空間ー感情メタファに関するこれまでの知見をまとめ,さらにそれらのデータを基にメタ分析を行った。以下に詳しい内容を説明する。・上下空間ー感情メタファと左右空間ー感情メタファの顕著性の違い我々の心の中で,上下左右空間と感情の快不快が連合している(空間ー感情メタファ: e.g., Casasanto, 2009)。具体的には,上と利き手側は快感情,下と非利き手側は不快感情と結びついている。これらのメタファが我々の行動に影響を与えると言われている(メタファ一致効果)。近年,上下空間ー感情メタファの方が,左右空間ー感情メタファよりも,メタファ一致効果が顕著に現れるということが報告されている(e.g., Marmolejo-Ramos et al., 2013)。本研究では,この顕著性の違いには各研究間で使用されている課題の種類が関与しているのではないかと考え,反応時間を指標にしている課題を用いた研究とそれ以外の課題を用いた研究に分けてメタ分析を行った。その結果,上下空間ー感情メタファはいずれの課題であっても有意なメタファ一致効果が認められ,左右空間ー感情メタファでは反応時間課題でのみ有意なメタファ一致効果が見られた。このことは,上下空間ー感情メタファの影響は広範囲の認知処理で見られる一方で,左右空間ー感情メタファは処理の流暢性や効率性に特化して影響を与えることを示唆している。これらの成果について,国内学会で発表を行い,現在論文を執筆中である。他にも,関連する成果を専門誌ならびに国内外の学会にて発表を行った。具体的には,1本の査読付き論文,3本の査読無し論文,1件の国際学会,さらに14件の国内学会・シンポジウムにて発表を行った。また,2件の国内学会発表について発表賞を受賞した。現在も6本の論文を査読付き雑誌に投稿中である。計画通り,意識と身体化の関係性に関する研究を行い,年度末に査読付き国際誌に投稿することができた。その上,身体動作が遡及的に感情処理に影響を与えることも明らかにした。この問題の検討は,当初予定してなかったが,身体化認知のメカニズムを解明する上で重要であると考え,実施した。この成果については,研究実績の概要に挙げているように,査読付き国際誌にて公表した。また,身体化認知に関与するような感情処理や概念処理,素朴知識に関する論文も査読付き雑誌に三本掲載された。以上のことより,当初の計画以上に進展しているといえる。計画書に記載した感情馴化との関係を検討した実験を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。以下を予定している。(1)身体動作が感情を喚起する画像への意識的なアクセスを促進/抑制するかについての検討,(2)他者の身体動作の観察でも感情処理に影響を与えるかについての検討を行う予定である。
Stokes抵抗の微視的な理論

【目的】流体中で分子を一定速度で動かすと流体から力を受ける(Stokes抵抗)。この抵抗力は、液体中の分子に外場を加えて束縛すると分子が自由に運動する場合に比べ6割も大きくなることが、分子動力学シミュレーションで示されている。Stokes抵抗は拡散係数とEinsteinの式で関係付くので、分子を外場で束縛すると拡散係数が4割減少することになる。ここでは、拡散係数の減少あるいは抵抗力の増大を理解するために、緩和の空間スケールに注目し、Stokes抵抗に最も重要な液体の緩和の長さを明らかにする。【理論】Stokes抵抗を受ける分子を溶質とし、外場をかけて束縛しそれを溶媒に沈めた系において、抵抗係数を計算する理論を定式化する。抵抗係数はGree-Kubo公式を使って、溶質にかかる力の時間相関関数で表せる。相関関数は、溶質と溶媒の両方含んだ密度場で与えられ、ここでは溶媒と溶質の相関関数の積で近似する。さらに、空間についてフーリエ変換を行った。ここで、溶媒の密度場の時間相関関数がある緩和時間を持った一つの指数関数で表されるという仮定を行う。その仮定から抵抗係数γはボルツマン定数、温度、溶質の緩和を表す時間相関関数、仮定により1つの指数関数で表されている溶媒の時間相関関数で表されることが分かった。溶質の緩和を表す時間相関関数は外場のもとでのオーバーダンプのランジュバン方程式から求めた。この時、溶質の緩和を表す時間相関関数はγを含んでいるので、得られた式は自己無矛盾な式である。ここでは、この自己無矛盾な式を、溶質に全く外場をかけずに束縛しない場合と、無限に強い外場で束縛する2つの極限を考えて解いた。この結果を分子動力学simulationと比較した所、4%以内で一致した。当初の計画では、2018年度までに物体が内部自由度を持つ場合の応用の計算になっていたが、現在、それはすでに終り、さらに、無限大の極限の検討はほとんどの場合に終っている。さらに、接線方向の力が働かない場合ではあるが、摂動の次のオーダーまで計算できて、その次の段階の外場の影響の研究に入った。溶質の大きさを変えたものについて、MDとの比較を行い、理論の妥当性を検討する。速度を持った液体中に巨視的な物体(溶質)を沈めると、流体から溶質は力を受ける。この力はStokes則により計算されるが、溶質の表面における流体の境界条件に依存する。マクロな立場では境界条件は仮定だが、ミクロな立場からは、力は溶質と流体粒子の相互作用により決まるので、境界条件も一意的に導けると考えられる。本年度の実績は、Stokes則の境界条件を、原子分子をあらわに考えるミクロな力学から基礎付ける方法を開発し、ミクロな表現を導いたことにある。これまで、溶質と流体粒子のミクロな相互作用について、溶質の表面に沿った方向の力を考える場合と考えない場合にミクロな表式を導いたが、新たに溶質が複数の粒子からなる場合の表式を明らかにした。溶質は互いに相互作用するn個の粒子からなり、流体粒子とも相互作用をしている。それらの粒子は外場によって原点付近に束縛されているが、外場のポテンシャルは球対称なので、流れを考えると系全体は軸対称になる。溶質全体の大きさをRとし、Rと液体粒子の大きさの比の極限を取る。ただし、接線方向に働く力は、この比の1/2乗に比例させて小さくなると仮定する。ミクロな力学として、粒子間の相互作用をあらわに考える正準方程式を考える。その方程式系を密度場と運動量場の時間変化を表す式に書き換え、佐々の方法に従い、非平衡分布で平均を取る。さらに、定常状態を考え、速度についての線型化を行った方程式系について、特異摂動法を使い、溶質の直ぐ近傍と充分離れた遠方とに全空間を2つに分けて極限を取った。その結果、slipとstickを含む境界条件が得られ、そのパラメータ(slip長)が溶質に働く接線方向の力の時間相関関数で表されることが分かった。また、コロイド分散系にプローブ粒子を入れ、コロイドを流した系で溶媒を考慮した理論的な手法を開発した。当初の計画では、溶質が球対称の場合を考えることになっていたが、実際、内部自由度のある場合まで進むことが出来た。[目的]細胞中の生体物質のようなまわりの粒子よりも大きな粒子の、拡散係数をミクロな粒子間の相互作用から計算することを目的とし、Stokes-Einstein則を使い、それに必要な拡散する粒子の表面の境界条件を粒子間の相互作用で表す理論を定式化する。特に、拡散する粒子の表面に平行な力が働かない場合、マクロな極限ではslip境界条件となるが、極限が成り立たない時それからずれる。このずれのミクロな表式を得る。[設定と方法]速度を持った液体中に、液体粒子よりも大きな溶質を沈める。液体粒子と溶質、液体粒子同士もすべて相互作用をしている。ただし、液体粒子と溶質の相互作用は球対称で、溶質の表面に平行な力は働かない。この系に対し、相互作用をあらわに考えるミクロな運動方程式を考え、溶質の大きさRと液体粒子の大きさaの比a/Rで摂動展開をする。

この摂動は特異的なので、空間を二つの領域に分けて展開すると、溶質から十分離れた領域では流体力学が得られ、溶質の近傍から境界条件が導かれる。境界条件はa/R=0の極限でslipになるが、さらにa/Rが0でない場合のslip境界条件からのずれをa/Rの1次まで求めた。[結果]液体の速度に対する溶質の表面の境界条件を得た。そこに含まれるslip長と言われるバラメータを微視的な相互作用で計算できる式を導いた。その式は、溶質と液体粒子の間の相関関数やミクロな運動量流、液体粒子の密度、溶質-液体粒子間に働く力の時間相関関数などで表される。この式は、拡散係数そのものよりずっと容易に、計算機シミュレーションなどで計算できる。また、slip長が得られれば、流体力学を解くことにより、拡散係数が計算できる。当初の計画では、2017年度までに溶質の大きさが無限大の極限で接線方向の力の効果を考えることになっていたが、現在、無限大の極限の検討は終り、接線方向の力が働かない場合ではあるが、摂動の次のオーダーまで計算できた。【目的】流体中で分子を一定速度で動かすと流体から力を受ける(Stokes抵抗)。この抵抗力は、液体中の分子に外場を加えて束縛すると分子が自由に運動する場合に比べ6割も大きくなることが、分子動力学シミュレーションで示されている。Stokes抵抗は拡散係数とEinsteinの式で関係付くので、分子を外場で束縛すると拡散係数が4割減少することになる。ここでは、拡散係数の減少あるいは抵抗力の増大を理解するために、緩和の空間スケールに注目し、Stokes抵抗に最も重要な液体の緩和の長さを明らかにする。【理論】Stokes抵抗を受ける分子を溶質とし、外場をかけて束縛しそれを溶媒に沈めた系において、抵抗係数を計算する理論を定式化する。抵抗係数はGree-Kubo公式を使って、溶質にかかる力の時間相関関数で表せる。相関関数は、溶質と溶媒の両方含んだ密度場で与えられ、ここでは溶媒と溶質の相関関数の積で近似する。さらに、空間についてフーリエ変換を行った。ここで、溶媒の密度場の時間相関関数がある緩和時間を持った一つの指数関数で表されるという仮定を行う。その仮定から抵抗係数γはボルツマン定数、温度、溶質の緩和を表す時間相関関数、仮定により1つの指数関数で表されている溶媒の時間相関関数で表されることが分かった。溶質の緩和を表す時間相関関数は外場のもとでのオーバーダンプのランジュバン方程式から求めた。この時、溶質の緩和を表す時間相関関数はγを含んでいるので、得られた式は自己無矛盾な式である。ここでは、この自己無矛盾な式を、溶質に全く外場をかけずに束縛しない場合と、無限に強い外場で束縛する2つの極限を考えて解いた。この結果を分子動力学simulationと比較した所、4%以内で一致した。当初の計画では、2018年度までに物体が内部自由度を持つ場合の応用の計算になっていたが、現在、それはすでに終り、さらに、無限大の極限の検討はほとんどの場合に終っている。さらに、接線方向の力が働かない場合ではあるが、摂動の次のオーダーまで計算できて、その次の段階の外場の影響の研究に入った。研究をより精密化するために、発表を精力的に行い、様々な人と議論を重ね、不足している部分、問題点を把握する。その中で、今仮定している人為的な部分を取り除く方法を考える。コロイド分散系についても、議論を重ね、問題点を把握する。プローブ粒子と溶媒の相互作用を一部取り入れる方法を考える。今年度得た結果を接線方向に力がある場合に拡張する。
X線結晶構造解析による阻害剤探索を自動化するためのゲルコーティング技術の開発

X線結晶学は,リガンド結合の詳細を観察できることから,構造に基づく薬剤探索にとって非常に重要な技術となっている.しかしながら,X線によるリガンドスクリーニングでは,通常,ソーキング実験をマニュアルで行うので,非常に多くのリガンドをスクリーニングする程のスループット性はない.本研究では,ゲルとインクジェット技術を使ってタンパク質結晶をマウントループに固定する技術を開発し,ループにマウントした結晶をそのままリガンドの含まれる溶液に浸けることを可能にした.この新しい技術は薬剤探索の自動化に使うことができる.X線結晶学は,リガンド結合の詳細を観察できることから,構造に基づく薬剤探索にとって非常に重要な技術となっている.しかしながら,X線によるリガンドスクリーニングでは,通常,ソーキング実験をマニュアルで行うので,非常に多くのリガンドをスクリーニングする程のスループット性はない.本研究では,ゲルとインクジェット技術を使ってタンパク質結晶をマウントループに固定する技術を開発し,ループにマウントした結晶をそのままリガンドの含まれる溶液に浸けることを可能にした.この新しい技術は薬剤探索の自動化に使うことができる.Tetra-PEGゲルの骨格長,官能基,ゲル溶液濃度の最適な組み合わせを検討し,官能基については,「マレイミドとチオール」の組み合わせ,骨格長は,粘度とゲル強度から判断して,繰り返し数にして100が最適であると決定した.インクジェットによるゲルの吐出機構と,画像認識プログラム,XYZステージ,回転機構を連動させ,一つのシステムとして組み立てた.この装置は,結晶を自動観察しながらXYZステージで最適な位置に動かして,インクジェット技術を用いて結晶周りにゲル溶液を吹き付ける機能を持っている.結晶とマウント冶具の正確な位置にゲルを吐出するためには画像認識技術を用い,画像処理速度を高速化するためには,グラフィックボードを用いた並列性の高い演算処理を行った.平成25年度に作製した結晶固定化装置を実際の結晶に適用して,結晶の安定性確認とリガンドソーキング実験を行った.汎用性を高めるためには,できるだけ多くの蛋白質結晶を使って検討する必要があるが,標準試料として結晶化条件が確立しているニワトリ卵白リゾチーム,ウシ膵臓トリプシンを利用し,さらに本研究室において過去に構造解析したCesZ, GatCABを使用した.すべての結晶について,SPring-8あるいはPhoton Factoryで回折データを収集して構造解析を行い,ゲル固定によるダメージが無い事を確認した.さらにニワトリ卵白リゾチーム,ウシ膵臓トリプシンについては,既知阻害剤がソーキングできることを確認した.その実験結果をまとめて論文として発表し,またSPring-8に技術提供した.X線結晶学,構造生物学ゲル化を促進する触媒を使うことによってゲル化速度を上げてゲル化前の溶液による結晶のダメージを抑え,グラフィクスボードを使った高速演算処理によって結晶の形を認識するソフトをつくり,ゲルを吹き付けるために結晶を空気中にさらす時間を10秒以内に抑るなど,さまざまな困難に対処して,予定通りの装置を組み立てることができた.構築した結晶固定化装置を利用して実際にリガンドソーキング実験を実施する.汎用性を高めるためには,できるだけ多くの蛋白質結晶を使って検討する必要があるが,標準試料としては,結晶化条件が確立しているニワトリ卵白リゾチーム,ウシ膵臓トリプシンなどの利用を予定している.また,本研究室において過去に構造解析した蛋白質の中から適当なものを選んで利用する.リガンドソーキングを行った結晶については,SPring-8やPhoton Factoryなどの大型放射光施設で回折データを収集して構造解析を行い,実際にリガンドソーキングが可能であることを確認する.確認作業は可能な限り多くの蛋白質結晶において実施し,幅広い条件下で利用可能なシステムとなるよう調整を行う.それらの実験結果をまとめて論文として発表する.本システムの中心となるインクジェット装置は研究室既存のものを使い,また必要とされる電子回路は自作することによって,費用を抑えながら装置を作製することができた.また,テストとして使った結晶は,他の研究で使ったものが残っていたため,それらを使うことによってさらに費用を節約した.作製した結晶固定化装置の汎用性を高めるためには,できるだけ多くの蛋白質結晶に適用してみる必要がある.したがって,平成26年度は,可能な限り多くの蛋白質結晶を使ってリガンドソーキング実験を実施する.予算の多くは,蛋白質精製のための試薬代として使用する.また,回折データの収集は,SPring-8やPhoton Factoryなどの大型放射光施設で行うので,そのための旅費が必要である.また,実験結果を学会発表するための旅費としても使用する.
修復象牙質形成過程におけるオステオポンチンの役割の解明

修復象牙質形成過程におけるオステオポンチン(OPN)の役割について、in vivo窩洞形成実験モデルと象牙質・歯髄複合体のin vitro器官培養実験モデルを用いて解析を行った。野生型マウスでは、窩洞形成後14日で修復象牙質が形成されたのに対し、Opn遺伝子欠損マウスでは修復象牙質形成が阻害されており、I型コラーゲン形成が認められなかった。また、器官培養系にて、OPNはI型コラーゲンの形成に関与することが示された。本年度では、オステオポンチン(OPN)の修復象牙質形成過程における役割を検索した。生後5週齢野生型およびOpn遺伝子欠損(KO)マウスの上顎第一臼歯近心部に窩洞を形成した。抗nestin、抗OPN、抗DSP、抗I型コラーゲン、抗integrin αvβ3免疫組織化学、Opn、col1a1、Dsppのin situハイブリダイゼーションを行った。また、リコンビナントOPN(rOPN)を用いて象牙質・歯髄複合体のin vitro器官培養を行った。術後1日では、野生型およびOpn KOマウスにおいて、窩洞直下の象牙芽細胞に変性像が認められ、nestin陽性反応が消失していた。術後3日には象牙芽細胞様細胞が歯髄・象牙質界面に配列し、nestin陽性反応を示していた。野生型マウスでは、窩洞直下の歯髄細胞にOpnを強く発現する細胞が認められ、石灰化前線にOPN陽性反応が認められた。術後14日では、窩洞直下に修復象牙質形成が、髄床底側に反応象牙質形成が認められ、象牙芽細胞様細胞にDspp, col1a1の発現、DSP、I型コラーゲン、integrin αvβ3陽性反応が認められた。一方、KOマウスでは、術後14日において、髄角部で修復象牙質形成が阻害されており、象牙芽細胞様細胞に、Dspp/DSP, integrin αvβ3の発現が認められたものの、I型コラーゲン、col1a1の発現が認められなかった。象牙質・歯髄複合体の器官培養7日では、KOマウスにおいて、象牙芽細胞様細胞にcol1a1の発現が認められなかったが、rOPN投与群ではcol1a1の発現がレスキューされていた。以上より、歯の窩洞形成後の歯髄治癒過程において、石灰化前線へのOPNの沈着が、新たに分化した象牙芽細胞様細胞のI型コラーゲン形成、すなわち修復象牙質形成に必須の因子であることが明らかになった。本年度では、修復象牙質形成過程におけるオステオポンチン(OPN)の役割について、in vivo窩洞形成実験モデルと象牙質・歯髄複合体のin vitro器官培養実験モデルを用いて解析を行った。興味深いことに、Opn遺伝子欠損マウスでは窩洞形成後に修復象牙質形成が阻害されており、また、器官培養系にて、OPNはI型コラーゲンの形成に関与することが示された。これらの知見は歯の損傷後の歯髄治癒機構の解明へ向けて大きく前進させることが期待できる。抗nestin、抗OPN、抗DSP、抗DMP1免疫組織化学、Opn、col1a1、Dsppのin situハイブリダイゼーションを行った。さらに、術後3日の歯髄を取り出し、マイクロアレイにて遺伝子発現を解析した。術後1日では、野生型およびKOマウスにおいて、窩洞直下の象牙芽細胞のnestin陽性反応が消失していた。術後14日では、窩洞直下に修復象牙質形成が、髄床底側に反応象牙質形成が認められ、象牙芽細胞様細胞にDspp, col1a1の発現、DSP陽性反応が認められた。一方、KOマウスでは、術後3日で歯髄のDmp1遺伝子発現の上昇が認められ、窩洞直下の石灰化前線にDMP1陽性反応が認められた。術後14日において、髄角部で修復象牙質形成が阻害されており、象牙芽細胞様細胞に、Dspp/DSPの発現が認められたものの、col1a1の発現が認められなかった。以上より、歯の窩洞形成後の歯髄治癒過程において、石灰化前線へのOPNの沈着が、新たに分化した象牙芽細胞様細胞のI型コラーゲン形成、すなわち修復象牙質形成に必須の因子であることが明らかになり、Opn KOマウスではDMP1がOPNの機能を代償している可能性が示された。

野生型マウスでは、窩洞形成後14日で修復象牙質が形成されたのに対し、Opn遺伝子欠損マウスでは修復象牙質形成が阻害されており、I型コラーゲン形成が認められなかった。また、器官培養系にて、OPNはI型コラーゲンの形成に関与することが示された。Opn遺伝子欠損マウスにおいても、窩洞形成後に象牙芽細胞様細胞の分化が認められ、他の接着タンパク質がOPNの機能を代償している可能性が考えられた。そこで、SIBLINGファミリーに属するdentinmatrix protein1(DMP1)などのタンパク質の役割の解析に着手し、歯の損傷後の象牙芽細胞様細胞の分化メカニズムの解明をめざす。口腔解剖学年度末の学会の旅費の支払が4月になり、次年度となったためすでに執行済みであり、4月に支払が完了している
ヒトREV3タンパク質の大腸菌における発現誘導系の構築と精製法の確立

ヒトREV3タンパク質はヒトでの損傷乗り越え(translesion)DNA合成経路の生化学的解析に必要不可欠なタンパク質因子の一つである。本研究では、組み換えREV3タンパク質を大腸菌で効率よく発現誘導させる系を構築し、組み換えREV3タンパク質の精製法を確立することを目的とする。これまでは、REV3遺伝子が350kDaという巨大タンパク質をコードすることから、組み換えタンパク質の発現誘導が難しく研究の防げとなっていた。実際に、ヒトREV3遺伝子を大腸菌で発現させたところ、REV3タンパク質に相当する産物を確認することができなかった。ヒトREV3遺伝子のコドン組成は大腸菌での使用頻度の低いコドンが多く、REV3タンパク質をコードするコドン3133個のうち、大腸菌での使用頻度の低いコドンは763個見出され、これが発現の阻害要因であると考えられた。そこで、PCRによる塩基置換導入法を使って、REV3遺伝子の大腸菌での使用頻度の低いコドン763個のうち、299個のコドンを大腸菌での使用頻度の高いコドンに置換した。改変REV3遺伝子を大腸菌において発現させた結果、コドン改変前には全く発現が観察することができなかった組み換えREV3タンパグ質が、コドン改変後には銀染色で観察することができるレベルまで増加することが分かった。このタンパク質の見かけ上の分子サイズは350KDaにほぼ一致し、またREV3タンパク質の特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、組み換えREV3タンパク質の発現が誘導されたことが明らかになった。また、精製をより容易にするために、N-末端にHisタグ、C-末端にFLAGタグを付けた。発現誘導処理した菌体を溶菌し、可溶性画分として回収された大腸菌粗抽出液をFLAG抗体カラムにかけ、FLAGペプチドにより溶出した後、キレーティングセファロース(chelating sepharose)にニッケル(Ni)を結合させたカラムにかけ、イミダゾール(imidazole)の濃度を上げてカラムから溶出した。これにより、組み換えREV3タンパク質の部分精製に成功した。また、大腸菌のシャペロン(trigger factor)遺伝子を導入共発現し精製を試みた。今後は、菌体破砕法の条件を検討し、精製度の高い可溶性組み換えREV3タンパク質を得ることを目指す。そこで、PCRによる塩基置換導入法を使って、REV3遺伝子内の大腸菌での使用頻度の低いコドン763個のうち、299個のコドンを大腸菌での使用頻度の高いコドンに置換した。改変REV3遺伝子を大腸菌において発現させた結果、コドン改変前には全く発現が観察することができなかった組み換えREV3タンパク質が、コドン改変後には銀染色で観察することができるレベルまで増加することが分かった。また、精製をより容易にするために、N_末端にHisタグ、C_末端側にFLAGタグを付けた。発現誘導処理した菌体をHeat Lysis方法で溶菌し、遠心操作で可溶性画分として回収された大腸菌粗抽出液をFLAG抗体カラムにかけ、FLAGペプチドにより溶出した後、キレーテイングセファロース(chelating sepharose)にニッケル(Ni)を結合させたカラムにかけ、イミダゾール(imidazole)の濃度を上げてカラムから溶出した。改変REV

3遺伝子を大腸菌において発現させた結果、コドン改変前には全く発現が観察することができなかった組み換えREV3タンパグ質が、コドン改変後には銀染色で観察することができるレベルまで増加することが分かった。このタンパク質の見かけ上の分子サイズは350KDaにほぼ一致し、またREV3タンパク質の特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、組み換えREV3タンパク質の発現が誘導されたことが明らかになった。また、精製をより容易にするために、N-末端にHisタグ、C-末端にFLAGタグを付けた。発現誘導処理した菌体を溶菌し、可溶性画分として回収された大腸菌粗抽出液をFLAG抗体カラムにかけ、FLAGペプチドにより溶出した後、キレーティングセファロース(chelating sepharose)にニッケル(Ni)を結合させたカラムにかけ、イミダゾール(imidazole)の濃度を上げてカラムから溶出した。これにより、組み換えREV3タンパク質の部分精製に成功した。また、大腸菌のシャペロン(trigger factor)遺伝子を導入共発現し精製を試みた。今後は、菌体破砕法の条件を検討し、精製度の高い可溶性組み換えREV3タンパク質を得ることを目指す。
スーパーオキサイドと一酸化窒素(NO)の相互作用と組織障害

新しく開発したONOO^-測定法を加えて好中球でのO_2^-とNO、さらにONOO^<2->の測定ヒトの好中球を分離し、PMA(PKC活性化剤)による刺激下でのO_2^-、NO、ONOO^-の生成量とその時間経過を検討した。O_2^-の測定はMCLAケミルネッセンス法とチトクロームC還元法によった。NOはNO_2^-/NO_3^-をGriss法で測定した。ONOO^-はヒドロキシフェニルによるニトロ化反応で生成するNO_2^-HPAをHPLCでC18逆相カラムをを用いて分離し、360nmの吸光度を測定することにより行った。これらによりヒトの好中球はNO_2^-を50±15nmoles/-10^6cells/h、ONOO^-をHPA-NO_2として4.5±1.2pmoles/cells/hを生成することがわかった。ラットとギネアピックの摘出心臓をoxymyoglobinを含む液で灌流し、種々のメカノストレスを与えた状態でのNO_2^-/NO_3^-測定を行った。その結果、ギネアピックはBradykinninに反応して、NOを放出し、冠血管抵抗を下げるがラットではNO放出がなく、他のメカニズム(EDHF)により血管拡張が起こることが明らかになった。これらと心筋障害因子との関係に関する実験はまだ施行するにいたらなかった。3)Nitrotyrosineの抗体による組織染色法の確立ONOO^-が蛋白中のTyrosine残基を攻撃しNitrotyrosineを生成することを根拠に肝、胃、腸などの組織におけるONOO^-の障害を証明するためNitrotyrosineの染色を行った。Semmelweis大学で得られた肝、胃、腸バイオプシー組織片と切除標本の一部をヘマトキシリンエオジン染色とともに、ニトロタイオシンの抗体を用いた免疫組織染色を行った。肝臓では全体がニトロチロシン陽性を示した。胃、腸は組織全体が弱いが陽性に染色された。したがって、正常部、潰瘍部、腫瘍部、腫瘍周辺部の鑑別は出来なかった。この結果を得た後、より特異性があり精度の高い検出法としてこれらの組織のニトロタイロシン自身を測定する方法を検討した。測定原理は組織をフェノールの存在下に6N HCLで加水分解した後上清をC18カラムを用いた逆層HPLCを通して溶出後270nmのUV吸収で測定するものである。本法を確立する過程で酸加水分解中にニトロタイロシンが一部分解されることが判明した。ニトロタイロシンの分解を防ぎ、ニトロタイロシンを安定して測定するために種々、試行錯誤をしながら、最終的には0.1%フェノールを添加することにより標準サンプルでは加えたニトロチロシンのほぼ100%回収できるところまで安定性と精度を上げることが出来た。以上、科学研究費補助金(国際学術)によって、Semmelweis大学と当研究室の活性酸素、一酸化窒素、ONOO^-に関する研究は大幅に進歩した。又、Feher博士、Pronai博士との研究相談、実験結果の討論によって測定法などの改善が可能であった。さらに本研究はハンガリーで多く認められるアルコール性肝硬変症における活性酸素、一酸化窒素ONOO^-の関連に対しての今後の研究方法を示すものとなった。この方法により現在胃潰瘍部のみにニトロタイロシンが40±12umoles/mg protein存在し、さらにその値は、潰瘍の重症度と相関することが判明した所である。4)Semmelweis大学での研究Semmelweis大学プロナイ博士が、本研究室に来日し上記2と3の方法を習得した後、実際に自身が持参した組織、血清を測定した。また、帰国後は同大学のアルコール性肝硬変患者、急性肝炎、慢性肝炎患者の好中球におけるO_2^-、NO、さらにONOO^-生成機構の変化を検討していく。又、本研究室でも東海大学における種々の疾患のバイオプシー組織と血清中のニトロタイロシン測定を続行する。3)Nitrotyrosineの抗体による組織染色法の確立