hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アメリカにおける愛国心を形成する学校行事・儀式の普及とダイバーシティ教育の起源

20世紀初頭から半ば頃にアメリカの学校で行われた学校行事・儀式を対象として、その理念と実際を分析し、その教育的な機能や意義を実証的に解明する。それにより、アメリカにおける愛国心教育の実態に迫り、自国第一主義が台頭している現状の背景を探る。同時に、現在脚光を浴びているダイバーシティ教育の先駆がそのなかで開かれ、今求められている民主主義の教育の基礎となりうることを示す。
並列計算環境を対象とした効率的オブジェクトレイアウト法とその自動化

本研究は、各種計算環境上の不規則データを扱う並列プログラムに対して、そのチューニングの自動化を目指したものである。今年度は、特にPCクラスタなどの分散計算環境を対象として研究を行った。分散環境では共有データアクセスに伴う通信オーバヘッドが問題となる。このため、分散共有メモリなどによる自動化アプローチは速度面で問題があり、MPIなどの通信ライブラリを用いた明示的データ移動が現在は主流である。ただし、データ一貫性をプログラマ自身が保障する必要があり、不規則データの場合、意図しないバグに悩まされることも多い。発表1の研究では、データ配置やキャッシュ方針をプログラマが指示することのできる共有メモリ型計算環境を提案した。計算局面毎に変数キャッシュ方針を指定するだけで、データ移動などはシステムが自動的に行う。PCクラスタ上での試験的評価の結果、本システムはMPIで記述した場合と同等の実行性能を達成しており、またアクセス傾向に偏りのあるB&H型N体問題などでは、MPIで記述した場合に比して、高速化も期待できる結果となっている。本研究は、昨年度からおこなっていた適応的オブジェクトの研究に基づくものであり、現在、本システムの本格実装をおこなっている最中である。Java上のポータブル実装技術としては、バイトコード変換ツールCusapiの提案、実装も平行して進めている(発表3)。本ツールは、並列計算上の各種実装技術をプログラム変換モジュールとして簡単に作成し、ライブラリのように配布・適用できる環境の実現を目指したものである。現在、上述の分散計算環境の実装をCusapiベースで実現すべく、研究を進めている。また、分散計算の対象が高性能計算のみにとどまらず、XMLを介したビジネス用途などに広がりをみせているのをうけて、現在、XML処理Nanafusiの研究も進めている。遠隔データを効率的に処理するため、ネットワーク遅延隠蔽技術などを盛り込んだ研究であり、研究発表2、4を行い、処理系も公開中である。本研究では、今後増加するであろう並列・分散アプリケーションに対し、台数効果達成のためのプログラムチューニング自動化を目指しており、(a)共有メモリ向けオブジェクトレイアウトの自動最適化と、(b)適応的オブジェクトによる効率的分散オブジェクト実装の二つのアプローチから研究を行っている。(a)に関しては、フィールドアクセス情報をもとにクラスを分類・分割し、これらの分類情報をもとに自動メモリ管理機構がキャッシュを意識した並列向けレイアウトをおこなうことで実現を目指している。本年度は、SUN HotSpot Server VMの自動メモリ管理機構に対し、深さ優先コピー方式やアクセス傾向別領域を導入し、その有効性を評価しており、クラス分割レイアウトでは最大30%の速度向上をメモリオーバヘッドの削減のみによって達成した。この研究成果については現在論文を投稿中である。また、システムの完成を目指して,現在、bytecode変換技術によるプロファイラやレイアウト変換ツールを実装中である。(b)の適応的オブジェクトとは、局面情報を用いることでプログラムの実行状況の変化を捉えるための枠組みであり、本年度は局面解析手法とそのアルゴリズムを提案した(論文1)。加えて、適応的オブジェクトを用いた最適化技法として、一定期間定数化する変数を解析することで一貫性を保証しつつ排他制御緩和を行う方法を提案、プロトタイプシステムを用いて実証した(論文2)。この結果、共有メモリ並列環境における共有オブジェクトに対し、自動的な排他制御緩和の効果を示すことができた。現在、効率的な分散オブジェクトへの応用にむけて、精度の向上のための解析手法の見直しと、システム実装を行っている。加えて,実際のサーバサイドアプリケーション例として、商用分野で注目を集めるXMLWEBサービスに対し、効率実装の研究をはじめている(投稿中)。本研究では、今後増加するであろう並列アプリケーションに対する、台数効果達成のためのプログラムチューニング自動化を目指しており、(a)共有メモリ向けオブジェクトレイアウトの自動最適化と、(b)適応的オブジェクトによる効率的分散オブジェクト実装の二つのアプローチから研究を行っている。まず、(a)に関しては、最先端のJava処理系のメモリ管理機構との統合を行い、最大30%もの件能向上を果たすことができた[論文1,2]。本機構を本格実装するに当たりportabilityの向上のためbytecode変換技術を用いた実装手法を採用した。また、bytecode変換に関する知見を発展させる形で、現在、bytecode変換ツールCusapiの提案ならびに実行を進めており、現在論文として投稿中である。(b)に関しては、PCクラスタなどの分散環境で集合などの共有データを扱うための枠組みとして分散コレクションを提案し、分散コレクションシステム上でデータ再配置ならびにキャッシュ機構の自動化を目指している(現在投稿中)。集合要素データへのアクセスについては、プログラマは共有メモリの時と同様に、排他制御区間を設定してアクセスを行い、プログラマ自身がキャッシュ操作を明示的に行う必要がない。代わりに、重要な変数やオブジェクトの性質の変化についてのヒントを、我々の提案してきた局面変数の形で記述してもらう。システムでは、プログラマからのヒント情報を基に、局面毎のオブジジェクトの性質を解析し、キャッシュに適した変数と遠隔アクセスすべき変数を分離、効率的なキャッシュ機構の自動化を行う。本解析では、昨年度から提案している局面解析系が利用することで、オブジェクトの性質の変化を捉えた最適化の実現が目指している。これらのシステムは、現在試験評価中であり、購入したPC群や大学の演習室を利用した実験を行っている。また、研究(b)の延長として、分散環境における効率的XML処理Nanafusiの研究を行っており、その成果は論文3ならびに投稿中論文としてまとめおり、処理系も公開中である。

今年度は、特にPCクラスタなどの分散計算環境を対象として研究を行った。分散環境では共有データアクセスに伴う通信オーバヘッドが問題となる。このため、分散共有メモリなどによる自動化アプローチは速度面で問題があり、MPIなどの通信ライブラリを用いた明示的データ移動が現在は主流である。ただし、データ一貫性をプログラマ自身が保障する必要があり、不規則データの場合、意図しないバグに悩まされることも多い。発表1の研究では、データ配置やキャッシュ方針をプログラマが指示することのできる共有メモリ型計算環境を提案した。計算局面毎に変数キャッシュ方針を指定するだけで、データ移動などはシステムが自動的に行う。PCクラスタ上での試験的評価の結果、本システムはMPIで記述した場合と同等の実行性能を達成しており、またアクセス傾向に偏りのあるB&H型N体問題などでは、MPIで記述した場合に比して、高速化も期待できる結果となっている。本研究は、昨年度からおこなっていた適応的オブジェクトの研究に基づくものであり、現在、本システムの本格実装をおこなっている最中である。Java上のポータブル実装技術としては、バイトコード変換ツールCusapiの提案、実装も平行して進めている(発表3)。本ツールは、並列計算上の各種実装技術をプログラム変換モジュールとして簡単に作成し、ライブラリのように配布・適用できる環境の実現を目指したものである。現在、上述の分散計算環境の実装をCusapiベースで実現すべく、研究を進めている。また、分散計算の対象が高性能計算のみにとどまらず、XMLを介したビジネス用途などに広がりをみせているのをうけて、現在、XML処理Nanafusiの研究も進めている。遠隔データを効率的に処理するため、ネットワーク遅延隠蔽技術などを盛り込んだ研究であり、研究発表2、4を行い、処理系も公開中である。
筋線維芽細胞・CollagenⅢを増加させる口蓋形成術の開発

実験動物を用いて軟口蓋の骨格筋損傷に対しての新たな治療法を確立するために、SVペプチドが損傷骨格筋の再生治癒に及ぼす影響を生理学的機能評価および形態学的評価を用いて検討を行った。SVペプチドの投与は骨格筋の自己再生能力を賦活化し、筋損傷後の機能回復に有意に働くことが示され、有効な筋機能再生治療の1つとなる可能性が示唆された。SVペプチドが再生修復過程に如何なる影響を及ぼすか組織学的検討を行った。SVペプチドは筋芽細胞の増殖能,遊走能,移動能を賦活化させ、筋管細胞分化誘導因子であるMyogeninの発現を上昇させることで、骨格筋再生が促進させることが示唆された。口腔外科学
抗菌ペプチドの発現抑制は黄色ブドウ球菌による好酸球性副鼻腔炎の誘因である

好酸球性副鼻腔炎患者より得た鼻ポリープ組織におけるβ-デフェンシンとカテリシジンの発現の程度を実証し、上皮組織から分泌される抗菌ペプチドの黄色ブドウ球菌の上皮細胞接着の抑制作用が実証された。1好酸球性副鼻腔炎とβ-デフェンシンとカテリシジン遺伝子と蛋白発現の関連、2好酸球炎症を惹起するサイトカイン、ケモカインによる粘膜上皮の抗菌ペプチドの応答性、3抗菌ペプチドによる黄色ブドウ球菌への上皮接着への影響が実証された。好酸球性副鼻腔炎における抗菌ペプチドの防御因子としての重要であることが判明された。好酸球性副鼻腔炎の病因として、黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原の関与の証拠が挙げられている。本来の生体には外的因子に対する防御因子によって細菌の排除機構が備わっており、黄色ブドウ球菌の定着が阻害されるが、好酸球性副鼻腔炎では黄色ブドウ球菌に対する排除機構が抑制・破綻されている可能性がある。そこで、好酸球性副鼻腔炎の増悪機序として、抗菌ペプチドによる防御因子の抑制に注目して鼻ポリープにおけるβ-デフェンシンとカテリシジンの機能解析を行った。鼻茸内の浸潤好酸球数100以上のものを好酸球性副鼻腔炎、100未満のものを非好酸球性副鼻腔炎と診断(臨床症状も考慮)する。コントロールとして正常の蝶形骨洞粘膜を使用して3タイプで比較検討を行った。また好酸球性副鼻腔炎患者より得た鼻ポリープ組織におけるβ-デフェンシンとカテリシジンの発現の程度を計測した。上皮組織から分泌される抗菌ペプチドの黄色ブドウ球菌の上皮細胞接着の抑制作用を実証し、好酸球性副鼻腔炎における抗菌ペプチドの防御因子としての役割を明らかにする。具体的には、1好酸球性副鼻腔炎とβ-デフェンシンとカテリシジン遺伝子と蛋白発現の関連、2好酸球炎症を惹起するサイトカイン、ケモカインによる粘膜上皮の抗菌ペプチドの応答性、3抗菌ペプチドによる黄色ブドウ球菌への上皮接着への影響を行う。外界からの黄色ブドウ球菌は鼻副鼻腔粘膜の表面上皮に接着し、内毒素に含まれるスーパー抗原の作用によって血中から好酸球を粘膜組織に動員させる。好酸球ならびに関連の各種サイトカインや活性化蛋白によって、上皮細胞や粘膜へ浸潤した炎症性細胞を刺激・活性化させ、抗菌ペプチドを分泌させる。抗菌ペプチドは表面上皮へ作用して黄色ブドウ球菌の上皮接着を抑制し、病態の悪化を抑えることが判明した。鼻副鼻腔は気道系の門戸である。つまり外界の吸気性異物(ウイルス、細菌、真菌など)が最初に暴露する臓器であり、異物除去のための種々の防御機構が構築されている。

近年、難治性の鼻副鼻腔炎として、I型アレルギーが関与しない好酸球浸潤を伴う鼻ポリープ(好酸球性副鼻腔炎)が注目されている。今回の結果から、好酸球性副鼻腔炎の病因として、黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原の関与の証拠が挙げられている。黄色ブドウ球菌由来の内毒素はスーパー抗原としての構造を有しており、Tリンパ球のクラスII受容体と結合して、Tリンパ球を刺激し、Th2型の各種サイトカインを誘導して好酸球を動員するという機序が推察されあた。本来の生体には外的因子に対する防御因子によって細菌の排除機構が備わっており、黄色ブドウ球菌の定着が阻害される。従って、好酸球性副鼻腔炎では黄色ブドウ球菌に対する排除機構が抑制・破綻されている可能性が示された。気道系の外的因子への抗菌ペプチドはβ-デフェンシンとカテリシジンが抗菌及び免疫調節作用を果たしている。上述した好酸球性副鼻腔炎における抗菌ペプチドの役割に関して、以下の結果を得た。1Th2サイトカインは鼻ポリープ由来の培養上皮細胞からの抗菌ペプチドの分泌を抑制した、2カテリシジンを誘導する活性型ビタミンDは慢性副鼻腔炎で低下している、3好酸球性副鼻腔炎の好酸球動員にeotaxinとIL-17Aが関与している、4好酸球性副鼻腔炎で認めるマスト細胞の細胞内Caの増加と生物作用の活性化がβ-デフェンシンによって生じた。耳鼻咽喉科学慢性副鼻腔炎・鼻茸は耳鼻咽喉科の日常診療において頻繁に遭遇する疾患で,鼻閉,鼻漏,嗅覚障害などの原因となり患者の生活の質(quality of life,QOL)を低下させる。従来の慢性副鼻腔炎の大部分は,細菌感染による急性炎症の反復と持続を契機として発症する化膿性副鼻腔炎であった。しかしながら、近年の慢性副鼻腔炎は好酸球性炎症による難治性の病態が注目されており、常在菌である黄色ブドウ球菌が好酸球動員の本体であるいう仮説を証明する。さらに、好酸球性副鼻腔炎における抗菌ペプチドの役割を以下の観点から研究する。1鼻ポリープにおける好酸球浸潤と抗菌ペプチド発現の関係、2鼻ポリープの好酸球動員に関連するeotaxinとIL-17Aによる抗菌ペプチド分泌、3抗菌ペプチドの鼻ポリープ上皮細胞における黄色ブドウ球菌の接着能への影響である。生命体の自然治癒を促す抗菌ペプチドの低下が好酸球性副鼻腔炎の病因の一端を荷うことが判明すると、生体にとって安全な治療薬の開発に繋がる可能性を模索する。今回の研究が新しい創薬に結びつくことによって、難治性の好酸球性副鼻腔炎による鼻汁、鼻閉、後鼻漏、嗅覚障害などの鼻症状、頭痛、頬部痛などに悩み、苦しむ数百万人の患者への大きな福音となり、国民生活の質的向上をもたらす研究成果を目指す。将来的には従来の薬物治療、手術治療とは異なる抗菌ペプチド製剤の治療法開発も念頭に置く。研究の進捗状況に応じ、当初購入を予定していた機器の購入を一部先送りした。また、予定していた学会への出席の予定が合わず出席を断念した学会があった為。研究を進めるにあたり、今後の高額消耗品の必要性や購入予定であった消耗品の先送りなど、一部予想困難な変動も生じ得る為、適時年度計画を見直しつつ、支出計画の確認を行い成果を上げる予定である。
高性能燃料電池を目指した炭化水素系膜電極接合体に関する研究

固体高分子形燃料電池の高性能化を目指した新規高分子電解質材料とそれを用いた膜電極接合体(MEA)の創製が本研究の目的である。芳香族系高分子電解質において、安定性や気体透過性を損なうことなくプロトン導電性を大幅に向上させる分子構造を明らかにした。酸性基を高密度に集積した親水部を有するブロック型のポリアリーレンエーテルが、従来の高分子電解質膜に比べて著しく高いプロトン導電率を示すことを見出した。この電解質材料を用いて、100°C、30%RH(相対湿度)という厳しい条件においても高い燃料電池特性を達成した。プロトン輸送を促進できる炭化水素系高分子電解質の分子構造について検討を行った。具体的には、スルホン酸化ポリイミド電解質においてトリアゾール基などの易動性水素を含む分子骨格の導入を試みた。トリアゾール基を含まない従来ポリイミド膜との比較から、トリアゾール基の導入は酸化分解・加水分解耐性を維持したまま耐熱性、機械強度の向上をもたらすことが明らかになった。この新型ポリイミド電解質膜はトリアゾール基の存在により親水性が増大しており、従来ポリイミド膜よりも低い湿度でも高いプロトン導電率を示した。新型ポリイミド電解質膜は、乾燥及び加湿のいずれの条件下においてもフッ素系電解質膜Nafionと比較して極めて低い水素・酸素透過性を示した。さらにガス透過性の温度依存性も小さく、高温運転に適しているがわかった。低湿度におけるプロトン導電率を改善するため、スルホン酸基を有するケイ素酸化物の添加効果についても検討している。電極触媒層用のバインダーとして高い触媒利用率とガス拡散性を両立できる新規な高分子電解質を設計した。本年度は、分子サイズを制御したポリイミド電解質について焦点を絞り、分子末端にスルホン酸基が局在化して存在する多分岐状オリゴマーを合成した。核磁気共鳴スペクトルや滴定により、目的とする分岐状オリゴマーの構造を確認した。既にMw=433kDa程度のいくつかの分岐状ポリイミド電解質の合成に成功しており、更に詳細な構造解析を進めている。分子サイズを厳密に制御した分岐型のスルホン酸化ポリイミド電解質を設計、合成した。具体的には、2つの異なる方法(反応性末端基が異なる2種類の分岐型オリゴマー前駆体を使用)によって分子末端にスルホン酸基を有する分岐型のポリイミド電解質の合成に成功した。IECは計算値に比べ若干低い値であったが、ほぼ設計通りの分子量を持つ電解質が得られた。分岐型のポリイミド電解質は水やアルコールへ良く分散し、直鎖の炭化水素系電解質溶液に比べて低粘性の溶液とすることができた。また、分子量を制御した5量体、50量体、285量体のSPIオリゴマーを新たに合成した。得られたオリゴマーの導電性および含水率は、分子量低下とともにいずれも若干低下することが明らかとなった。これらのSPIオリゴマー電解質を電極触媒への被覆を検討した。分子量の異なる各SPIを電極触媒層用バインダーとし、スクリーン印刷機を用いて電極触媒層を作製、Nafion NRE212膜と組み合わせ膜電極接合体(MEA)を作製した。窒素吸着法による触媒層の細孔分布測定の結果、目的通り分子量の低下に伴い、細孔内部までバインダーを導入することが可能となった。次に、各MEAを単セルに組み込み、サイクリックボルタンメトリーよりその電気化学活性表面積(ECA)を算出した。バインダー量の増加に伴いECAは増加したが、分子量とECAの間には明らかな相関は観察されず、低分子量化に伴う触媒利用率の向上は観測されなかった。バインダーの被覆厚減少によるプロトン導電パスの減少が原因と考えられる。現在、SPIオリゴマー電解質の特徴を活かしたMEAの調製法と運転条件についての詳細な検討を進めている。フルオレニル基を有するスルホン酸化ポリエーテル(SPE)電解質膜が高い安定性とプロトン導電特性を示すことを明らかにしてきたが、SPE電解質膜の性能をさらに向上させることを目的として、ブロック共重合化の効果を検討した。高密度にスルホン酸化した親水部を有することが特徴である。疎水部としてビスフェノールA(B-SPE-1)あるいはベンゾフェノン(B-SPE-2)骨格を含む2種類のブロック共重合体を重合した。得られたB-SPEの数平均分子量は50kDa、重量平均分子量は200kDa以上であり、溶液キャスト法により柔軟で強靭な膜として得られた。B-SPE電解質膜はランダム型SPE電解質膜と同程度の含水率を示すにもかかわらず、導電率が大きく向上していることが明らかとなった。プロトン導電率はIECの増大とともにさらに向上し、IEC=1.86meq/gのB-SPE-2膜は40%RH以上でナフィオンNRE膜に匹敵する値を示した。

B-SPE-1に比べてB-SPE-2のほうが高いプロトン導電率を示した。B-SPE-2膜を用いて単セル運転試験を行い、Nafion膜と比較した。80°Cで水素/酸素を用いて運転を行ったところ、相対湿度30-80%RH、電流密度0-0.7A/cm^2の運転条件においてNafion膜とB-SPE-2膜はほぼ同程度の性能を示した。セル抵抗値はプロトン導電率から計算される値とほぼ同じであり、B-SPE-2膜が有効に機能していることが確認できた。80°Cで水素/空気を用いた運転では>53%RHではNafion膜とB-SPE-2膜は同程度の性能を示したが、30%RHでは膜の乾燥のためB-SPE-2膜の性能は若干低下した。さらに厳しい条件として100°Cにおいて水素/酸素、水素/空気それぞれの条件で運転を行った。電極との接合性や水保持性(水の拡散性)など解決しなければならない課題があるが、100°C、30%RHでも優れたセル性能を達成することができた。
網膜性色素変性症RP9の原因遺伝子PAP-1とその関連遺伝子群の機能解析

PAP-1は癌遺伝子産物Pim-1の結合タンパク質として本研究室で単離・同定した新規タンパク質である。また、そのアミノ酸変異は網膜性色素変性症RP9の原因であると報告されている。PAP-1の機能解析のためにPAP-1結合タンパク質をスクリーニングしたところ、splicing因子SC35,U2AF35が同定され、これらは核内でドット状に共局在することが判明した。In vivo,in vitrosplicing assayを行なったところPAP-1はそのリン酸化状態に依存してAd2 Ela geneのスプライシングパターシを変更させることからsplicing因子であることが明かとなった。この結果はin vitro再構成系で更に確認された。RP9患者に見られる2種類のPAP-1変異の内、D170G変異PAP-1は野生型に比較してリン酸化の程度が低く、かつsplicing因子としての機能を失っていた。以上より,PAP-1は網膜で発現する遺伝子のsplicing調節因子として機能し、RP9患者では正常なsplicingが起きないために異常なタンパク質が産生されることが病因と考えられた。PAP-1結合タンパク質として単離・同定された新規タンパク質PAPA-1は核小体に存在し、Pim-1-PAP-1機能を調節し、細胞周期を負に制御することが明らかとなった。更に,PAPA-1結合因子としてc-Myc結合タンパク質であるMiz-1を同定した。更に、PAPA-1も直接c-Mycに結合することが判明し、3者は拮抗的にc-MyCに結合してc-Myc機能調節を行っていることが判明した。事実、PAPA-1はc-Mycを正に、Miz-1はc-Mycの転写能を負に制御していた。3.PAP-1ノックアウトマウスの作成PAP-1の固体レベルでの機能解析を目的としてPAP-1ノックアウトマウスの作成を行なっている。現在までにマウスPAP-1ゲノム遺伝子単離,ターゲットベクターを作成,組替ES細胞のスクリーニングが完了した。にも結合した。以上より、AMY-1のBIG2/BIG1複合体形成によるゴルジ体での機能が示唆された。にも結合した。PAP-1は癌遺伝子産物Pim-1の結合タンパク質として本研究室で単離・同定した新規タンパク質である.また,そのアミノ酸変異は網膜性色素変性症RP9の原因であると報告されている.PAP-1の機能解析のためにPAP-1結合タンパク質をスクリーニングしたところ,splicing因子SC35,U2AF35が同定され,これらは核内でドット状に共局在することが判明した.In vivo, in vitrosplicing assayを行なったところ,PAP-1はそのリン酸化状態に依存してAd2 Ela geneのスプライシングパターンを変更させることからsplicing因子であることが明かとなった.RP9患者に見られる2種類のPAP-1変異の内,D170G変異PAP-1は野生型に比較してリン酸化の程度が低く,かつsplicing因子としての機能を失っていた.以上より,PAP-1は網膜で発現する遺伝子のsplicing調節因子として機能し,RP9患者では正常なsplicingが起きないために異常なタンパク質が産生されることが病因と考えられた.PAP-

1結合タンパク質として単離・同定された新規タンパク質PAPA-1は核小体に存在し,Pim-1-PAP-1機能を調節し,細胞周期を負に制御することが明らかとなった.更に,PAPA-1結合因子としてc-Myc結合タンパク質であるMiz-1を同定し,Pim-1→cMyc経路がつながった.3.PAP-1ノックアウトマウスの作成PAP-1の固体レベルでの機能解析を自的としてPAP-1ノックアウトマウスの作成を行なっている.現在までにマウスPAP-1ゲノム遺伝子単離,ターゲツトベクターを作成,組替ES細胞のスクリーニングが完了した.PAP-1は癌遣伝子産物Pim-1の結合タンパク質として本研究室で単離・同定した新規タンパク質である。また、そのアミノ酸変異は網膜性色素変性症RP9の原因であると報告されている。PAP-1の機能解析のためにPAP-1結合タンパク質をスクリーニングしたところ、splicing因子SC35,U2AF35が同定され、これらは核内でドット状に共局在することが判明した。In vivo, in vitrosplicing assayを行なったところ、PAP-1はそのリン酸化状態に依存してAd2 E1a geneのスプライシングパターンを変更させることからsplicing因子であることが明かとなった。この結果はin vitro再構成系で更に確認された。RP9患者に見られる2種類のPAP-1変異の内、D170G変異PAP-1は野生型に比較してリン酸化の程度が低く、かつsplicing因子としての機能を失っていた。以上より,PAP-1は網膜で発現する遺伝子のsplicing調節因子として機能し、RP9患者では正常なsplicingが起きないために異常なタンパク質が産生されることが病因と考えられた。PAP-1結合タンパク質として単離・同定された新規タンパク質PAPA-1は核小体に存在し、Pim-1-PAP-1機能を調節し、細胞周期を負に制御することが明らかとなった。更に,PAPA-1結合因子としてc-Myc結合タンパク質であるMiz-1を同定した。更に、PAPA-1も直接c-Mycに結合することが判明し、3者は拮抗的にc-Mycに結合してc-Myc機能調節を行っていることが判明した。事実、PAPA-1はc-Mycを正に、Miz-1はc-Mycの転写能を負に制御していた。3.PAP-1ノックアウトマウスの作成PAP-1の固体レベルでの機能解析を目的としてPAP-1ノックアウトマウスの作成を行なっている。現在までにマウスPAP-1ゲノム遺伝子単離,ターゲットベクターを作成,組替ES細胞のスクリーニングが完了した。
音楽治癒効果の定量的評価手法の確立 (バーチャルセラピストの実用化に向けて)

本プロジェクトでは、音楽および音が人間にどのように影響するかを検討し、それらの関係を計算機上にモデル化した。Wavelet変換によって獲得したスイッチを押す時に発生する音の物理的特性に注目し,それらに対応する3つの感性評価値(迫力因子,金属因子,美的因子)の評価得点を出力するモデルを,ニューラルネットワークを用いて構築した.学習後のネットワークモデルを解析した結果、スイッチ音の音響特性に対する人間の感性に関する重要な知見を獲得した。本研究課題では、音声をはじめとする外部刺激が人間の心理・生体にどのように影響するかを調べ、それらを解析することにより、人間の感じる心地よさを定量化する.ここでは、脳波、心拍変動、呼吸、皮膚電位、眼球運動、脈波伝播速度などの生体情報と人間の感性との関係を明確にする.獲得した生体情報と被験者の心理状態を、ニューラルネットワークを用いてコンピュータ上にモデル化することにより、様々な外部刺激が、どのような精神状態に誘導するのかを解明し、バーチャルセラピストとしてシステムを構築する.現段階では、被験者に聞かせる音刺激、またそれらから引き起こされる感性情報「澄んだ-濁った」、「迫力のある-物足りない」、「金属的な-柔らかな」などを選定している.また、50名ほどのデータを収集する予定であったが、脳波アンプの導入が遅れ10名程度のデータしか獲得できていない.来年度バーチャルセラピストのシステムを完成させるために、H20年度6月までに早急にデータを採取する予定である.また、10名の獲得した生体情報と感性評価の関係は、部分的には解明しているものの、引き続き解析が必要である.これまでの成果としては、ニューラルネットワークを用いて人間の感じ方をモデル化することに関して「動的ニューラルネットワークを用いた人間の明順応モデル」(文献1)を発表している.また、「ニューラルネットワークを用いたボタン音印象評価モデル」(文献2)においては、ボタンを押す音とその印象との関係をモデル化可能であることを示し、ウェーブレット変換による音声情報のパラメータを修正することにより、様々な印象のボタン音を構築できることを確認した.これらのことから、平成20年度において、生体情報と心地よさの関係もニューラルネットワークを用いて実現できると考えられる.本研究課題では、音声をはじめとする外部刺激が人間の心理・生体にどのように影響するかを調べ、それらを解析することにより、人間の感じる心地よさを定量化する.ここでは、脳波、心拍変動、呼吸、皮膚電位、眼球運動、脈波伝播速度などの生体情報と人間の感性との関係を明確にする.獲得した生体情報と被験者の心理状態を、ニューラルネットワークを用いてコンピュータ上にモデル化することにより、様々な外部刺激が、どのような精神状態に誘導するのかを解明し、バーチャルセラピストとしてシステムを構築する.これまでの成果として、ニューラルネットワークを用いて人間の感じ方をモデル化することに関して「動的ニューラルネットワークを用いた人間の明順応モデル」日本感性工学会論文集vol.7, No.2, (2007)を発表している.また、「ニューラルネットワークによるボタン押し音評価モデルの構築」(文献1)においては、ボタンを押す音とその印象との関係をモデル化可能であることを示し、ウェーブレット変換による音声情報のパラメータを修正することにより、様々な印象のボタン音を構築できることを確認した.さらに、「Impression Evaluation Model for Button Sounds Using a Neural Network」(文献2)において、これらの研究成果を国際会議にて報告した。生体情報と心地よさの関係については、今後さらなる解析・検討が必要であるが、本研究課題において、ニューラルネットワークを用いて人間の感性を抽出・理解し応用してくための基礎を確立し、多くの有益な新しい感性処理に関する知見を獲得することができた。
水疱症病変部の化学伝遺物質の同定ならびにその好中球機能への作用

1.Boyden chamberを使っての化学発光の測定から、好中球定化性因子は酸素代謝をおこしながら遊走するもの(FMLP、C5aなど)とこれとは無関係に遊走させるもの(モノサイト由来の因子、IL-3など)の2種類に分けられることを明らかにした。2.膿疱性疾患の1つである乾癬の皮疹部鱗屑抽出液中に好中球の活性酸素産生する因子のあることを明らかにした。3.天疱瘡、類天疱瘡、熱傷の水疱内容をフラクションに分けて検討したところ、乾癬鱗屑同様cytochrome C markerに一致するchemotactic peptideに高い化学発光が認められた。しかしこれらの発光量と水疱内C5aレベルは相関しなかった。このことから、このフラクションにはC5a以外の因子の存在が示唆された。3.1例の角層下膿疱症の膿疱内容においては今迄見つかったchemotacticpeptideないしはLTB_4とは異なる別の因子が存在することを明らかにした。4.水疱症の解析症剤がいまだに少なくて、結論は出せないものの、水疱症においても乾癬と同様分子量12,00018,000のchemotactic peptideが病態に重要な因子として作用する可能性が示唆された。このフラクションにはC5aが含まれることは間違いないことであり、病変形成のみでC5aが重要な役を演じているものと思われるが、さらにこれ以外の因子の関与も考えられる。1L-6などをはじめとするいくつかのサイトカインは分子量的にはこのフラクションに入るものであり、これらのサイトカインの役割が今後のポイントになるものと思われる。結果:尿中【TxB_2】排泄量は移植後早期および移植心拒絶時期に上昇し、尿中【6keto-PGF_(1α)】排泄量は移植後早期にのみ上昇した。またTx産生阻害剤を用いた群では移植心生着期間が有意に延長し、全経過にわたり尿中【TxB_2】排泄量は著明に低値であった。無処置群が拒絶される時期(移植後6日目)にあわせて各群の一部から摘出された移植心の組織所見では、血管周囲単核球浸潤,間質浮腫等の急性拒絶反応所見は各群ともにみられたが、心筋内出血,筋層内動脈の閉塞は無処置群のみに認められた。考察ならびに結論:移植後早期にみられたTx排泄量の増加は、対照とした同種同系移植群(LEW-LEW)にも認められたため、おそらくsurgical traumaによるものと考えられた。しかしこの時期には、同時に拮抗する【6keto-PGF_(1α)】排泄量も増加しており、Txによる組織障害を防止しているものと思われた。これに対して無処置群の拒絶反応に伴うTxの上昇に対しては【6keto-PGF_(1α)】は上昇せず、Txの組織障害作用をより強化している可能性があると考えられた。またTx産生阻害剤を用いた群でもTx排泄量の増加を伴わない遷延性拒絶反応が全例にみられたことから、Txはおそらく早期拒絶反応に強く関与しているものと推定され、移植心の組織所見から血管病変の成立に深くかかわっていると思われた。本研究者らは今後、酵素抗体法等の手技を用いてTxの組織内分布の解析を試み、Txの拒絶反応における役割についてさらに検討を進める予定である。
ジアリールエテンをスイッチングユニットとして用いた電子スピン系論理回路の構築

ニトロニルニトロキシドを2個、ジベンゾチエニルエテンにp-フェニレンカップラーを用いて連結させたビラジカル1aを合成した。π共役系の長さを調節することにより、スイッチングをESRを用いて検出することに成功した。開環体1aは313nmの紫外光により閉環体1bに、1bは578nmの可視光で1aにそれぞれ変換され、可逆なフォトクロミズムを示した。分取した閉環体との比較により、光定常状態での変換率は99%であることが分かった。フォトクロミズムに伴うESRスペクトル変化を追跡した。開環体1aは、複雑な15本線を示し、交換相互作用が超微細結合定数と同程度であることを支持している。366nmの紫外光を照射すると直ちに9本線のスペクトルが現れ、光定常状態のスペクトルは9本線となった。閉環体1bにおいて、交換相互作用の値は超微細結合定数よりも十分大きいことを示している。開環体由来のシグナルは光定常状態では観測されず変換率が非常に高いことを反映している。光定常状態に達した試料に対して、520nm以上の可視光を照射すると元の開環体のスペクトルに戻った。スペクトルのシミュレーションの検討により、開環体と閉環体で2桁程度の交換相互作用の変化があることが分かった。
ネットワーク性能の多様性と動的な変化を考慮した分散アルゴリズムに関する研究

本研究では、ネットワーク性能の多様性と動的な変化を考慮して、ネットワーク環境で効率よく問題を解決するための分散アルゴリズムに関する研究を行い、本年度は以下の結果を得た。1.モーバイル・コンピューティング環境での分散アルゴリズムに関する研究:モーバイル・コンピューティング環境は、ネットワーク性能が動的に変化するネットワークの典型的な例と考えられる。本研究では、モーバイル・コンピューティング環境において、前後関係保存放送を実現する分散アルゴリズム、および、大域チェックポイントを求める分散アルゴリズムの設計を行った。2.適応型分散アルゴリズムに関する研究:ネットワークの性能の変化に自動的に対応できる分散アルゴリズムとして、自己安定分散アルゴリズムが有用である。本研究では、時計合わせ問題、k-相互排除問題に対し、自己安定分散アルゴリズムの設計を行った。また、ネットワーク性能が動的に変化する環境では、各計算機が低速な計算機の処理を待つことなく、各計算機の処理速度に応じた時間で問題を解くことが望ましい。これを実現する分散アルゴリズムとして、無待機アルゴリズムがある。本研究では、時計合わせ問題、および、共有オブジェクトを実現する問題に対し、無待機アルゴリズムの設計を行った。本研究では、ネットワーク性能の多様性と動的な変化を考慮して、ネットワーク環境で効率よく問題を解決するための分散アルゴリズムに関する研究を行い、これまでに以下の結果を得た。1.ネットワーク性能の多様性を考慮した分散アルゴリズムに関する研究:処理速度の著しく異なる計算機が混在するネットワークにおいては、各計算機が低速な計算機の処理を待つことなく、各計算機の処理速度に応じた時間で問題を解くことが望ましい。本研究では、時計合わせ問題に対して、同期時間最適な無待機アルゴリズムの設計を行った。2.ネットワーク性能の動的な変化を考慮した分散アルゴリズムに関する研究:(a)モ-バイル・コンピューティング環境での分散アルゴリズムに関する研究:モ-バイル・コンピューティング環境は、ネットワーク性能が動的に変化するネットワークの典型的な例と考えられる。本研究では、モ-バイル・コンピューティング環境において、前後関係保存放送を実現する分散アルゴリズムの設計を行った。(b)適応型分散アルゴリズムに関する研究:ネ-ットワークの性能の変化に自動的に対応できる分散アルゴリズムとして、自己安定アルゴリズムが有用であると考えている。しかし、ネットワークの性能の変化は、ネットワーク全体の性能が同時に変化することは少なく、ネットワークの一部での局所的な変化であることが多いと考えられるが、従来の自己安定アルゴリズムでは、ネットワーク性能の局所的な変化に対しても、その影響がネットワーク全体に及んでしまう。本研究では、いくつかの問題について、小規模で局所的な性能変化に対して、その影響を局所的にとどめ、効率よく解を再計算する自己安定アルゴリズムの設計を行った。
放線菌由来ポリケタイド・ペプチド合成酵素のリプログラミング

NRPS / PKSモジュール酵素のリプログラミングは、新規生物活性分子創出のための魅力的な方法である。本研究では、環縮小、環拡大、および、アルキル鎖の多様化の3つの操作に成功し、非天然の新規な誘導体ライブラリー構築を実用的収率で達成した。本研究は、NRPS-PKSモジュール酵素を設計するための有用な戦略を提示した。放線菌由来デプシペプチドantimycin化合物群は、類似した構成アミノ酸が異なる回数の縮合を経た大きさの異なるlactone構造を持つ。28年度は、JBIR-06生合成酵素のPKSモジュールのAT、ACPドメインをantimycinのものに置き換え、antimycinの多様なアルキル基を持つ新規trilactone化合物を合成に着手した。また、JBIR-06型の開始基質、antimycin型の伸長基質を受け入れるKSドメインを創出、化合物合成系に用いることで、人工生合成遺伝子クラスターの構築に着手した。Neoantimycinのラクトン環縮小のため、環構成アミノ酸の導入を担う最終モジュールの欠損を試みた。JBIR-06生合成遺伝子クラスターの配列と比較することで、酵素活性を失わず、目的の化合物を合成する変異酵素遺伝子を設計し、大腸菌in vivoでの組換え反応を用いて遺伝子組換えを行い、変異酵素遺伝子発現ベクターを作製した。それを放線菌発現宿主へ導入し、遺伝子発現することで物質生産系の構築を行った。異種発現系にて蓄積した化合物を単離し、NMR、MS分析によって構造決定を行った。その結果、テトララクトンがトリラクトンへと変化した新規neoantimycin類縁体が得られたことが判明した。また、種々の副生成物が得られ、現在それらの構造決定を行っている。本研究成果より、一般に改変が困難なモジュール酵素をエンジニアリングし、非天然型化合物合成に繋げるために有益な知見が与えられたと考えられる。計画通り、Neoantimycinのラクトン環縮小類縁体の生産にも成功し、順調に進捗している。生合成酵素を用いた化合物合成は、立体構造形成制御が容易である点、有機溶媒を用いず環境に優しい点など化学合成にはない利点を含み、今後医薬品生産へと大きく寄与する可能性を秘める。しかし、本手法は現在発展途上であり、自由自在に化合物合成ができる状態とは程遠い。そこで、本手法に関する知見を深めることを目的に、医薬品資源として著名なデプシペプチドであるantimycin化合物群の生合成酵素改変による新規類縁体合成に着手した。antimycinは電子伝達系を阻害することで抗菌活性を示すため、医薬品シードとしての可能性を秘める。本化合物群はジラクトンantimycin、トリラクトンJBIR-06、テトララクトンneoantimycinなど環サイズの異なる多様な構造が存在する。本研究では、それぞれの生合成酵素群の比較に基づく機能改変によって、新規antimycin化合物の合成を試みた。それぞれの化合物の生合成遺伝子はBACベクターにて放線菌発現宿主に導入し、必要に応じて改変を行い、モジュール構造を作り変えることで物質生産を行った。即ち、(1) neoantimycinモジュールの欠損によるラクトン環縮小、(2) JBIRモジュールの追加によるラクトン環拡大、また、(3) JBIR-06のATドメインに部位特異的変異導入を行うことで、ラクトン環への多様なアルキル側鎖の導入、に成功した。本研究成果より、改変が困難なモジュール酵素をエンジニアリングし、非天然型化合物合成に繋げるために有益な知見が得られた。現在、研究成果を論文投稿し、原稿修正中である。Antimycin、JBIR-06合成酵素のKS-ATドメインの結晶構造解析に着手する。触媒ドメインをモジュールから分割する必要があるが、deoxyerythronolide B合成酵素のKS-ATドメインのモジュールからの分割を例にして行う。コドンを最適化した遺伝子をpET、pQEベクターを用いて大腸菌生体内で発現し、タンパク質の大量発現を行う。His-tagを用いたアフィニティー精製の他に、AKTA explorerシステムによるイオン交換、ゲル濾過クロマトグラフィー精製を行うことで高純度タンパク質を取得、結晶化に供する。SmlC-AntD融合型PKSモジュールの創出および物質生産への利用。立体構造より見出したAntDの伸長基質認識に関わる部分をSmlCに導入し、変異型KSドメインを作製する。得られた変異型KSドメインをantimycinのAT、ACPドメイン、SmlCのTEドメインと連結した複合型モジュール遺伝子をin-fusion PCR法(Takara)を用いて連結し、SmlABD三遺伝子発現放線菌に導入して発現する。得られた発現放線菌宿主を培養し、LC-MS分析することによって非天然型化合物ができるか試験する。得られた化合物は大量調製の後NMR、MS分析にて構造決定する。さらに我々が過去にantimycinの化合物ライブラリー作成に用いた同様の手法により、様々な伸長基質の原料を培養液に投与することで多様な側鎖を持つtrilactone型化合物ライブラリーを構築する。得られた化合物ライブラリーを抗菌活性試験、Bcl-xL活性試験に供してその阻害活性を調べる。生物分子科学有機化学、生化学試薬など消耗品のストックがあり、消費が予想外に少なかった。
ヨーロッパ私法の動向と日本債務法の現代化

本研究の目的は、ヨーロッパ私法およびEU私法の展開とわが国の契約法および不法行為法の展開をフォローし、これまでの関連研究の成果を踏まえて、わが国の債権法改正作業並びに私法の現代化にとって具体的な提言に向けた成果を得ることにある。本研究では、EU法レベルでの私法の動向、また、それに対応した各国私法の現代化現象に関する具体的な分析を行い、日本法との対比の中で、検討を行い、論文の形で成果を公表した。とくに国内外の研究者との学術交流を通して、さまざまな角度から、最新の動向、議論に触れることができ、それによって問題がより明らかとなり、研究内容を深めることができた点は意義深い。本研究の結果、ヨーロッパ私法の平準化・統一の動きが、契約法領域に止まらず、私法全体の領域へと拡大していることが明らかとなった。またこれらの議論の考察を通して、日本法の債権法改正作業において、いくつかの重要な示唆を得ることができた。本研究の目的は、EUレベルで進行する私法の統一化の方向性および特質を解明し、こうした動きを基礎づける近代ヨーロッパ私法の原理や統一法典の構想等を分析し、その射程と、わが国私法への影響を考察することにあった。そのために計画していた、ヨーロッパの比較法研究者と連携しての研究セミナーや、資料的な価値をもつ文献等の翻訳などの活動を2008年度も行った。具体的には、スイスのI.シュヴェンツァー教授を迎えてのセミナー開催などにより、海外の重要な議論状況を学ぶことができた。特に、比較法の世界的な大家であるR.ツィンマーマン教授を迎えることができたのは大きな成果であった。また、本共同研究の前身ともいえる「ヨーロッパ統一私法の展開と日本法への影響(平成1719年度基盤研究C)」の成果として出版したヨーロッパ契約法原則I・IIの日本語訳(2006年12月出版)に続く形で、『ヨーロッパ契約法原則III』(0.ランドー=E.クライフ=A.プリュム=R.ツィンマーマン編、潮見佳男=中田邦博=松岡久和監訳、法律文化社、2008年10月)の出版に至った。これにより、今日すでに日本の契約法研究にも参照を欠かすことのできない重要文献の全体を日本語で総覧できるようになったものであって、民法学界に少なからず貢献する出版物と言えよう。なお、以上の活動と並行して、R.ツィンマーマン『ドイツ新債務法とヨーロッパ私法・契約法』の翻訳作業も進行中である。また、その他継続的に行っている研究活動の成果は、『ヨーロッパ私法の展開と課題』(「11.研究発表」欄に記載)にも反映されている。2009年度も、ヨーロッパ私法およびEU私法の展開について、法従来の関連研究の成果を踏まえて、さらに検討を行い、研究計画に従い、継続して作業を進行した。とりわけ、本年度においても定期的に研究会および基礎的な資料の分析・検討会を重ねた。とりわけ、第1回研究会にて、アクセル・メツガー教授(ドイツ・ハノーファー大学)ヨーロッパ私法における一般的法原則--ヨーロッパの多層システムにおける統一的方法論のための試論--」、第2回研究会にて、オリバー・レミーン教授(ドイツ・ヴュルツブルク大学)「強行法規、および基本的自由、ヨーロッパ契約法」、第4回研究会にて、マルティン・シュミットーケッセル教授(ドイツ・オスナブリュック大学)「ヨーロッパでの法平準化の流れにおける水平化指令提案」を迎え、研究の最前線にふれた。こうした公開研究会を開催し、最新情報を提供し、多数の参加者のもとで、EU法レベルでの私法の動向、またそれに対応した各国私法の現代化現象の分析を行うとともに、これらの展開に対して日本法が今後どのようなスタンスをとりうるのか検討を重ねた。現在、これらの講演原稿、また質疑の内容は公表のための作業を行っている。とくに、ドイツ法との関係で、ワーキンググループを作り、ドイツ不法行為法の基礎資料の翻訳作業も行い、近く公表する予定となっている。さらに、共通参照枠(DCFR)にかかわり、情報および資料を集めた。さらに、ツィンマーマン『ドイツ新債務法とヨーロッパ私法・契約法』の翻訳作業も随時、進めており、その出版を計画・準備している。他にも、本研究の観点から、近時の民法改正作業にかかわり、研究会のメンバーが論稿を発表している。本年度も、研究計画に従い、継続して作業を進行した。ヨーロッパ私法およびEU私法の展開とわが国の契約法および不法行為法の展開をフォローしながら、従来の関連研究の成果を踏まえて、具体的な提言を行うべく研究を進行させた。

今年度は本研究の最後の年度であり、とりまとめの作業も行った。研究作業のプロセスにおいては、これまでと同様に、本年度においても定期的に研究会および基礎的な資料の分析・検討会を重ね、海外の研究者との連携のもと国際的な学術交流を行った。いずれの研究会においても、講演原稿を本研究会のメンバーを中心として、事前に翻訳するとともに、研究会当日においても、研究会メンバーによる通訳をつけることで、参加者の便宜を図り、研究会メンバーは、参加者とともに、活発な議論を行った。これらの講演内容については、隣時、今後公表の予定である。このうち、ウルリッヒ・マグヌス教授(ドイツ・ハンブルク大学名誉教授)により、「ヨーロッパレベルで見るドイツ不法行為法」と題された研究会(龍谷大学ともいき荘)は公開研究会の形をとり、同テーマについて関心をもつ研究者らに自由に参加していただき、活発な議論を行った。また、当該研究会に参加するメンバーが中心となって進めてきた潮見佳男・中田邦博・松岡久和編『概説国際物品売買条約』(法律文化社・2010年6月)が刊行された。加えて、研究会の各メンバーが、海外で開催されるシンポジウムなどにも積極的に参加することにより、より一層の国際学術交流を深めた。こうした公開研究会の開催や、学術交流により、最新情報をもとにして、多数の参加者のもとで、EU法レベルでの私法の動向、また、それに対応した各国私法の現代化現象の分析を行った。また、これらの展開に対して日本法が今後どのようなスタンスをとりうるのかについてもさらに検討を重ねた。現在、これらの講演原稿、また質疑の内容は公表のための作業を行っている。とくに、ドイツ法との関係で、ドイツ不法行為法の基礎資料の翻訳作業は完成しており、近く公表する。さらに、共通参照枠(DCFR)にかかわり、情報および資料を集めた。他にも、本研究の観点から近時の民法改正作業にかかわった論稿を発表した。
蛍光タンパク質ノックインによる上皮メカノセンサーの分子数計測

上皮細胞の機械刺激への応答性(メカノセンシング)の分子メカニズムを解明するためには、そこで働く分子の量的動態を知ることが一つの有力な方法となる。しかし、内在性のタンパク質の「量」を知る手段は現在のところ確立されていない。本研究ではゲノム編集技術を用いて内在性のタンパク質に蛍光タンパク質タグを付加し、その蛍光強度を比較することで種々のタンパク質の相対量を決定することを当面の目標とした。さらにその技術を用いて量的側面から上皮メカノセンシングの新たな動作原理を解明することを目指している。2018年度の計画はメカノセンシングに関わる種々の遺伝子のC末端側に緑色蛍光タンパク質(GFP)、あるいは赤色蛍光タンパク質(RFP)をホモ接合でノックインした上皮細胞株を樹立することであった。本年度の成果としては、細胞間接着を構成し、メカノセンシングの分子基盤となるカドヘリン複合体の遺伝子であるCdh1とCtnna1(タンパク質名はそれぞれE-cadherin, alpha-Catenin)、それらの遺伝子とアクチン細胞骨格を繋ぐVclやActn1/4(Vinculin, alpha-Actinin-1/4)、またタイトジャンクションを構成するTjp1/2(ZO-1/2)についてGFPノックイン細胞株の樹立に成功した。いくつかの遺伝子についてはRFPノックイン株も既に樹立している。成功した遺伝子の数は多くはないものの、現段階で得られた七種類の遺伝子に対するノックイン株を用いてタンパク質量を比較することができる。そこから得られる量の情報は全く新規の知見であり、上皮メカノセンシングの分子メカニズムの解明に資する重要な成果であると期待している。次年度以降の目標であったタンパク質存在量の決定についても既に着手している。まず細胞間接着の形成初期段階で形態的にも観察しやすいPunctate Adherens Junction (pAJ)に着目した。pAJでは細胞間接着複合体にアクチン細胞骨格を介した牽引力がかかっていると考えらておりメカノセンシングが働く代表的な細胞器官である。ノックインに成功した遺伝子群に対する解析ではpAJに存在するタンパク質の相対量比を決定することができた。この量比については後述の誤差を含み、値の正確性について詳細に検討を加える必要がある。しかし例えばZO-2はVinculinと同等の存在量があることが示唆されるなど、従来では全く知られていなかった量の情報が本研究によって明らかになりつつあることは大変意義深いと考えている。現段階ではGFPのみを用いて定量を行なっているが、RFPでも同様の解析を行うことで定量の正確性を担保することができると期待され、これについては進行中である。また、上述の解析は現在のところホルムアルデヒドによる固定を行なった細胞について行っている。固定に伴う誤差を生じる要素として、例えばタンパク質が正しい局在で保持されているか、や、固定によるGFPの蛍光効率の変化などが挙げられる。それらを含むいくつかの誤差要素については定量に与える影響を見積もることが課題として残っており、一つずつ解決していく必要がある。今回ノックインを試みたものの成功しなかった遺伝子としてはCtnnb1, Zyx, Lima1(beta-Catenin, Zyxin, EPLIN)があった。原因はいくつか考えられるが個々の遺伝子座によってノックイン効率が大きく変わること、C末端にタグを付加することでタンパク質が不安定化する場合があること、タンパク発現量が低く細胞クローニングの際に見落としていることなどが挙げられる。三つめの理由の場合は高感度・ハイスループットの顕微鏡を使うなど、技術的に改善可能であるため次年度も継続してノックイン株の種類を増やしていく予定である。メカノセンシングに関与するタンパク質の定量解析については、次年度以降は生細胞を用いてタンパク量の時間変化を追跡することを予定している。そのためにはライブイメージング中に生じるシステム的、あるいは人為的な蛍光誤差をできるだけ小さくするよう測定条件を最適化し、さらに誤差自体を見積もる必要もあるだろう。ライブイメージングでは免疫染色法が使用できないため観察領域の設定に工夫をする必要がある。固定細胞ではE-カドヘリンの免疫染色像によりpAJを検出し測定領域としたが、生細胞ではE-カドヘリンやbeta-Cateninなどに蛍光タグを付けて生きたまま接着領域を可視化することを考えている。そのための遺伝子導入法や測定条件の設定など検討すべきことはあるが、なるべく早急に生細胞での定量ができるよう注力する。