hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歩行を促す都市環境とその評価に関する研究

その結果,歩数の人口密度弾力性は約0.045程度あること,また人口密度が11000人/km2においてピークがみられることなどを明らかにした.人口密度が高くなると,目的地までの距離が短くなると同時に公共交通の利便性が高まり歩数が減少する可能性を指摘した.今後,パネル分析を行って介入効果の検討を行う必要がある.データ分析については目的を達成した.今後,政策評価につなげるための検討(海外文献等のレビュー)が必要である.文献レビューや日本各地での歩行に関する取組について調査するとともに,これまでの研究成果のとりまとめを,報告書として印刷物としてとりまとめたいと考えている.都市工学今後,自動車と比較した歩行や自転車などのActivie Transportの評価手法について海外の文献等の整理を行いたいと考えている.○外出歩行時間と物的環境についての関係についての分析により,人口密度と外出歩行時間の間には,2次関数で表現される関係があり,外出歩行時間が最大となる人口密度が存在する可能性が示唆されたこと.半年間,在外研究の機会を得て,オランダに滞在したため,別の調査データを入手する可能性があったため,その予算をとっておいたが,そのデータは入手できないことがわかり,使用せず,翌年に回すこととした.文献レビューおよび歩行を促す取り組みを行っている地域の調査またこれまでの成果をとりまとめる報告書の費用として支出する予定である.○歩数データの収集および整理.厚生労働省の「国民健康・栄養調査」の個票データを,人口密度等,物的環境を表す指標と組み合わせて,たとえば人口密度とは2次関数で表現できる関係があるかかどうかについて分析する.○先行研究レビューの継続.国内の歩行者・自転車などの計画に関する調査や文献調査を行いたいと考えている.東京都の個票データの入手可能性を検討し,もしその確保ができた場合は,分析をしたいと考えていたため(実際には入手できませんでした).厚生労働省のデータの分析をより丁寧に行うこと.また先行研究レビューについても,充実させることを考えている.
心筋Na/Ca交換機転の分子機構の研究

(背景)心筋細胞の形質膜に存在するNa/Ca交換機転は、細胞内のCaイオンを細胞外に駈出することで細胞内Caイオン濃度を低いレベルに保つための機構であるとされている。しかし、Na/Ca交換機転は正転・逆転の両方が可能であり、脱分極側の膜電位では細胞内Caイオン濃度を上昇させることができる。したがって、生理的条件下ではNa/Ca交換機転が活動電位にともなう細胞内Ca濃度変化に影響していることが予想される。そこで、膜電位の変化がNa/Ca交換機転の作用に及ぼす影響について調べた。(結果)膜電位固定したモルモットの心室筋細胞からNa/Ca交換電流を記録した。細胞内Ca濃度が生理的条件下と同様に変化するよう、細胞内には0.2mMのBAPTAをもちいた。実験より、次の結果が得られた。1)コマンドパルスで誘発されたNa/Ca交換電流は活性化の後すみやかに減弱するが、それはNa/Ca交換電流の逆転電位が移動するのを反映した現象であった。2)この逆転電位の移動は、細胞内のCa濃度変化を直接反映したものであった。3)Na/Ca交換電流の逆転電位は、最終的にそのときの膜電位に等しい値となった。4)一定の膜電位の下でもcaged-Caをもちいて細胞内Ca濃度をジャンプさせると(1)と同様な電流変化が見られた。(結論)心筋のNa/Ca交換機転は細胞内Ca濃度を膜電位によって定まる値に緩衝する。この働きにより、細胞内Caイオン濃度は拡張期には10-7 M付近に、収縮期には10-5 M付近に緩衝される。このことは、心筋細胞において活動電位の大きさと持続時間が収縮の強さや長さに影響する原因となると考えられた。
脱アセチル化酵素ＳＩＲＴ１を介した神経幹細胞の増殖における概日リズム形成機構解明

記憶等に重要な役割を果たしている脳の海馬では、ニューロンを生み出す神経幹細胞が存在し、絶えず分裂して、自身の数を絶やさないようにしています。この海馬・神経幹細胞の細胞分裂は1日の中で特定の時間帯に起こることが実験動物を用いた研究により明らかになっております。ところが、その詳しいメカニズムは不明のままです。本研究では、神経幹細胞の細胞分裂がいつ起こるのかを自動で解析する実験系を構築しました。また、このシステムを用いてSirt1という脱アセチル化酵素が細胞分裂の日内リズムを生みだしていることが分かりました。この成果は抗がん剤の副作用を軽減する時間薬物療法の開発に応用できる可能性を秘めています。海馬歯状回の神経幹細胞の増殖活性は概日リズムを示すことが知られており、そのメカニズムとして、時計遺伝子・転写ネットワークによる細胞自律的な内的制御が推定されるが、神経幹細胞の増殖リズム形成の仕組みは依然として不明である。本研究では海馬・神経幹細胞の増殖における概日リズム形成の分子基盤を明らかにすることを目的とし、時計遺伝子・転写ネットワークの下流シグナル分子として働く脱アセチル化酵素SIRT1が神経幹細胞の増殖における24時間変動に関与している可能性を、神経幹細胞のリアルタイム増殖イメージング技術等を駆使して解析する。前年度までの研究においては、神経幹細胞におけるNAD+サルベージ経路/NAD+量/SIRT1活性の概日リズムの解析を行い、胎生マウス海馬よりニューロスフェア法によって分離培養した神経幹細胞において増殖因子EGFの刺激によりNAD+サルベージ経路の律速酵素であるNAMPT mRNAの発現が概日変動を示すことを明らかにし、さらに単細胞レベルのリアルタイム増殖イメージング法を確立することに成功した。そこで本年度では、リアルタイム増殖イメージング技術を用い、G1→S期およびG2→M期の概日リズムを指標にして、NAD+サルベージ経路/SIRT1の制御機構の解析を行った。その結果、EGF刺激と同時にSIRT1阻害薬(sirtinol 5 μM、splitomicin 5 μM)あるいはNAMPT非競合的阻害薬(FK-866 10 nM)を処置した場合、神経幹細胞の増殖における概日リズムが乱れることが観察された。さらにこれらの薬物が神経幹細胞に対して顕著な毒性を示さないことをWST-8アッセイ、TUNNEL染色、LDH遊離アッセイなどで確認した。この目的を達成するために、平成24年度においては次の2つの項目について検討を行い、下記のような成果を得た。1)神経幹細胞におけるNAD+サルベージ経路/NAD+量/SIRT1活性の概日リズムの解析:すでに胎生マウス海馬よりニューロスフェア法によって分離培養した神経幹細胞において増殖因子EGFの刺激によりNAD+サルベージ経路の律速酵素であるNAMPT mRNAの発現が概日変動を示すという予備的知見を得ているため、これを再確認したところ、時計遺伝子Per2 mRNAと同位相でNAMPT mRNAが概日変動することを明らかにした。また、NAMPTタンパク質レベルやSIRT1活性もEGF刺激により概日変動することを見出した。2)単細胞レベルのリアルタイム増殖イメージング法の確立:増殖リズムを高精度で解析するためには、単細胞レベルの空間解像度を有する増殖イメージング技術が必要となるが、これらを1CCNB1-dGluc発現神経幹細胞を用いた生物発光リアルタイムイメージング解析および、2細胞周期特異的蛍光タンパク質Tgマウス由来神経幹細胞を用いた蛍光リアルタイムイメージング解析により確立した。最終年度の研究では、生体の海馬歯状回・神経幹細胞の増殖リズムにおけるSIRT1の役割の解明に挑戦した。

その結果、海馬歯状回の神経幹細胞におけるNAMPTタンパク質の発現リズムを免疫染色によって明らかにした。海馬歯状回の増殖リズムは特に歯状回上側のType2b細胞において明瞭に観察されるため、Type2b細胞マーカーのdoublecortinとの二重染色によって解析したところ、Type2b細胞においてNAMPTタンパク質レベルが日内リズムを示すことを確認できた。これらのリズムは視交叉上核破壊マウスでは消失することから中枢時計の制御下にあることが明らかになった。今後はレトロウィルスベクターを用いてマウス海馬歯状回の神経幹細胞にNAMPTまたはSIRT1の過剰発現体またはsiRNAを導入し、明暗環境下でマウス脳をサンプリングし、リン酸化ヒストンH3抗体およびBrdU抗体を用いた免疫染色法によって海馬歯状回の増殖リズムを解析し、生体内におけるSIRT1の役割を明らかにする必要がある。神経薬理学平成24年度に確立した単細胞レベルのリアルタイム増殖イメージング法を用いることによって、薬理学的阻害薬を用いた客観的評価方法を駆使することが「研究の目的」を達成できた主な理由であると思われる。すなわち、Fucciマウスは特定の細胞周期に特異的にユビキチン分解される細胞周期関連タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードした2種類のレポーター遺伝子のダブルTgマウスであり、細胞周期の進行を細胞核の緑色(G1期)・赤色蛍光(S・G2・M期)で観察できるが、このFucciマウス海馬歯状回から神経幹細胞を分離培養し、増殖因子EGFで刺激し、その蛍光をライブ撮像してG1→S期イベント(細胞核の赤から緑色への変化)を定量し、その増殖リズムに対するSIRT1阻害薬(sirtinol 5 μM、splitomicin 5 μM)あるいはNAMPT非競合的阻害薬(FK-866 10 nM)の効果を客観評価することでNAD+サルベージ経路/NAD+量/SIRT1活性が神経幹細胞の増殖リズムを制御することを明らかにすることができた。単細胞レベルのリアルタイム増殖イメージング法の確立については、2種類の細胞分裂可視化技術を用い、培養神経幹細胞の細胞分裂を1530分の時間分解能で解析する方法を確立でき、ほぼ当初の目的を達成することができた。すなわち、1CCNB1-dGlucは分裂(M)期特異的に発現するCyclinB1の遺伝子プロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を融合させた発光レポーターであるが、これを神経幹細胞に発現させる方法を確立し、研究分担者が作製した生物発光イメージングシステムで可視化できることを確認できた。また、2Fucciマウスは特定の細胞周期に特異的にユビキチン分解される細胞周期関連タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードした2種類のレポーター遺伝子のダブルTgマウスであり、細胞周期の進行を細胞核の緑色(G1期)・赤色蛍光(S・G2・M期)で観察できる。
代数的手法と解析的手法の相互補完に基づく制御理論の展開とその応用

安定解析に関して,周波数領域でみて定義されるサンプル値系の周波数応答作用素に基づき,正実性についての理論を完成させた.具体的には,作用素のスペクトル解析に基づき,正実性と固有値条件との対応を明らかにするほか,作用素の固有値に関する慣性に基づく正実性の代数的判定条件を確立し,これに基づく安定解析手法を完成させた.加えて,周期時変系のナイキスト安定判別法についても,周波数応答作用素に関する2次正則化行列式を用い,偏角の原理に基づいた新たな手法を導出した.これらの安定解析に関する成果は,サンプル値系のロバスト安定解析,ロバスト性能解析に対しても応用が可能なものであり,代数的手法と解析的手法をうまく結び付けることにより,サンプル値系のロバスト安定解析,ロバスト性能解析への道筋をつけたといえる.たとえば,これらの基礎的な結果に基づき,周期時変スケーリングなどの新規な手法を導いており,その基本的性質を明らかにするなどの研究も行った.また,連続時間制御装置の離散化と低次元化手法について,理論面での検討と数値例に基づく検証を行った.これらの研究を通して,今後さらに研究を通して明らかにすべき事項の明確化ができたといえる.この他,周期時変系の解析に関して,無限次元の方程式の解を求めることを必要としない近似計算法と,その誤差解析を通しての有効性を明らかにした.さらに,本研究における考え方の有効性を示す一端として,より広いクラスとして線形時不変系を対象として,正実性解析や有界実性の解析を統一的に行うことを可能とする見通しのよい方法を明らかにした.安定解析に関して,周波数領域でみて定義されるサンプル値系の周波数応答作用素に基づき,正実性についての理論を完成させた.具体的には,作用素のスペクトル解析に基づき,正実性と固有値条件との対応を明らかにするほか,作用素の固有値に関する慣性に基づく正実性の代数的判定条件を確立し,これに基づく安定解析手法を完成させた.加えて,周期時変系のナイキスト安定判別法についても,周波数応答作用素に関する2次正則化行列式を用い,偏角の原理に基づいた新たな手法を導出した.これらの安定解析に関する成果は,サンプル値系のロバスト安定解析,ロバスト性能解析に対しても応用が可能なものであり,代数的手法と解析的手法をうまく結び付けることにより,サンプル値系のロバスト安定解析,ロバスト性能解析への道筋をつけたといえる.たとえば,これらの基礎的な結果に基づき,周期時変スケーリングなどの新規な手法を導いており,その基本的性質を明らかにするなどの研究も行った.また,連続時間制御装置の離散化と低次元化手法について,理論面での検討と数値例に基づく検証を行った.これらの研究を通して,今後さらに研究を通して明らかにすべき事項の明確化ができたといえる.この他,周期時変系の解析に関して,無限次元の方程式の解を求めることを必要としない近似計算法と,その誤差解析を通しての有効性を明らかにした.さらに,本研究における考え方の有効性を示す一端として,より広いクラスとして線形時不変系を対象として,正実性解析や有界実性の解析を統一的に行うことを可能とする見通しのよい方法を明らかにした.平成15年度は,サンプル値系や周期時変系の安定解析ならびに性能解析に関する研究を進め,基礎的な成果を得た.まず,サンプル値系の安定解析に関しては,周波数領域でみて定義される周波数応答作用素に基づくサンプル値系の正実性について,従来の研究を細部に渡り詰め,完成させた.具体的には,作用素のスペクトル解析に基づき,正実性と固有値条件との対応を明らかにするほか,作用素の固有値に関する慣性に基づく正実性の代数的判定条件を確立し,これに基づく安定解析手法を完成させた.加えて,ナイキスト安定判別法についても,周波数応答作用素に関する2次正則化行列式を用い,偏角の原理と連続性の議論に基づき,制御対象の相対次数によらない新たな結果を導出した.これらの安定解析に関する成果は,サンプル値系の性能解析に対しても応用が可能なものであり,サンプル値系のロバスト安定解析,ロバスト性能解析への道筋をつけたといえる.周期時変系の解析に関しては,やはり周波数応答作用素に基づくH_2ノルム解析を行った.具体的には,無限次元調和リアプノフ方程式の解を必要とする厳密計算法の難点を回避するために,フーリエ解析に基づく近似システムの遷移行列の計算を介した無限次元方程式の有限次元打ち切りについて考察した.さちに,有限次元化された調和リアプノフ方程式に基づく打ち切り計算結果の誤差解析に基づき,打ち切りパラメータの増大とともに打ち切り計算結果がH_2ノルムの真値に収束することを明らかにした.一方,連続時間制御装置の離散化と低次元化手法については,理論面での検討と数値例に基づく検証を行い,今後さらに検討を加えるべき点についてその明確化を行った.平成16年度は,サンプル値系のロバスト安定解析,ならびに,連続時間制御装置のサンプル値周波数応答に基づく離散化手法について研究を進めた.前者に関しては,前年度に得られたナイキスト安定判別法より導かれる"Separator"型のロバスト安定条件において,それが周期時変なSeparatorを許容することに着目し,周期時変系をスケーリングに用いることについて考察を行った.すなわち,パラメトリックな不確かさに対して,周期時変系のなかでももっとも単純なものとして,周期時変ゲインをスケーリング要素として用いた場合について,とくにそのゲインを階段関数とした場合の最適化問題が,高速サンプル・ホールド近似のもとでLMI最適化の問題に帰着させられることを示した.さらに,そのようなスケーリングを用いた解析が,パラメトリックな不確かさのもとでのロバスト安定解析における保守性を低減するのに有効であることを明らかにした.

後者については,もとの連続時間制御装置と,それを離散化した制御装置とサンプラおよび0次ホールドからなるサンプル値制御装置との誤差系を何らかの意味で小さく抑える離散化手法について検討を進めた.具体的には,この誤差系に対して適当な周波数重みをかけた系の周波数応答作用素について,そのHilbert-Schmidtノルムを各角周波数ごとにすべて最小化するような離散化制御装置が,インパルス変調公式を用いて状態空間で計算可能であることを示すとともに,そのような理想的な制御装置は,実際には非プロパーとなり実現不可能であることも明らかにした.この問題を回避してよい離散化制御装置を得る方法として,サンプル値H_2最適制御装置を利用する方法などが有効と考えられることを明らかにした.平成17年度は,サンプル値系のナイキスト安定判別法に基づくロバスト安定解析の理論の精緻化に力点をおき,研究を進めた.まず,前年度研究を行った周期時変スケーリングに基づくロバスト安定解析について,スケーリング要素をゲインと限らない動的な周期時変要素の場合も含める形に拡張して理論的検討を行った.とくに,簡単な例を通して,周期時変スケーリングが厳密なロバスト安定解析を可能とする場合があることを明らかにした.さらに,従来のサンプル値系のスモールゲイン定理に基づく解析や,μタイプの解析では,静的で時不変な不確かさに関するロバスト安定解析が,サンプリング周期が長くなるにつれていくらでも保守的なものとなってしまう場合があることを明らかにし,これにより,周期時変スケーリングの有効性を理論的にさらに実証した.一方で,連続時間制御系はサンプル値系の特殊ケースとして見ることができることから,サンプル値系において有効性が確認された周期時変スケーリングが,連続時間制御系においても有効であるか否かについても検討を行った.その結果,単純に予想され得る結果に反して,連続時間制御系に対しては,周期時変スケーリングは,従来の通常の時不変スケーリングに比べて,何ら有効性を発揮しないことを明らかにした.すなわち,周期時変スケーリングが有効となるのが,サンプル値制御系に特有の事柄であること,そして,このことは逆に,サンプル値系におけるより本質的なスケーリングが周期時変スケーリングであることを示唆していると考えられることを明らかにした.この他,制御対象のもつパラメータ不確かさのもとでのサンプル値系のロバスト性能の解析や制御装置の離散化などに関しても着実な研究成果を得ており,3ヵ年の研究計画をバランスよく達成した.
投機的実行を用いるゲーム探索プログラムの実現と評価

近年、汎用計算機の低価格化により、非常に多数の汎用計算機をネットワークなどにより結合して分散計算機環境を構築することが容易に行えるようになってきている。同時に、このような計算機環境において、ある程度長い時間にわたりプロセッサ資源が余剰する状況が起こり得る。この余剰のプロセッサ資源において、近い将来に役立つであろう仕事を前もって実行しておく「投機的実行」が試みられつつある。本研究ではゲーム木探索の応用プログラムにおいて、投機的実行を適用させることを考えた。すなわち、ゲーム木探索において通常時間がかかる仕事(たとえば、局面の評価値の計算)を前もって実行しておき、実際に必要となった時にその結果を利用することにより、応答時間の大幅な短縮を試みるものである。その第1ステップとして、同一あるいは類似の局面の計算を何度も行わないようにするためのハッシュ表を複数の計算機間で共有するための機構を設計・実現した。この「共有ハッシュ表」を用いれば、余剰のプロセッサにおいて次々と新たな局面を生成・評価値を計算し、ハッシュ表に格納するという仕事を投機的に実行させることができる。ゲーム木探索のメイン・ルーチンが実行される際に、前もって投機的実行により作成されたハッシュ表にヒットした場合には、計算時間を大幅に短縮させることができるものと予測される。上記の共有ハッシュ表の基礎的な性能を評価したところ、その利用のコストは小さく、結果としてゲーム木探索の応用プログラムの性能向上が図れるという見積りがたてられた。
少数言語のドキュメンテーションと、エチオピア諸言語のダイナミズムに関する調査研究

エチオピアの少数言語の文法記述とドキュメンテーションを作成するため、アジスアベバ大学のエチオピア人研究者と共同で現地調査を行い、オモ系(バスケト語、ディメ語、ハマル語、カラ語)、セム系(マスカン語)、クシ系(アルボレ語、ハディーヤ語、アッレ語)、ナイルサハラ系(ニャンガトム語、コウェグ語、ベルタ語)の使用状況を記録した動画・音声データ(モノローグ、民話、なぞなぞ)を収集し、動画編集ソフトELANを使ってIPA転写、語釈、翻訳をつけた。言語ダイナミズムの分析をするため、エチオピア学研究所図書館で少数言語の文献資料を集めると共に、エチオピアの少数言語の母語教育について調査し、データベース化した。(1)アジスアベバ大学のエチオピア人研究者と共同で現地調査を実施し、エチオピアの少数言語のドキュメンテーションを作成するため、ビデオカメラを使って、オモ系(バスケト語、ハマル語、ディメ語)、セム系(ティグリニャ語、マスカン語)、クシ系(アルボレ語、アッレ語)、ナイルサハラ系(ニャンガトム語、コウェグ語)の語り(モノローグ・ダイアローグ)の動画データを収集して分析し、注釈をつけた。またウェブ公開に向けて動画保存用のサーバを試験的に立ち上げ、効率的な動画配信の方法、動画編集の方法、及び他の言語データや論文とリンクさせる方法について検討を行った。(2)エチオピア諸言語の文献データを収集し、少数言語がアムハラ語および地域有力言語とどう共存共生していくのか、言語ダイナミズムの分析をしている。(3)ウェブに公開するためにXHTML形式で記述されていた語彙データおよび言語情報データを、より汎用性の高いText Encoding Initiative (TEI)形式へ変換する作業を行い、様々なソフトウェア上でデータを利用することが可能となるデータベースの骨格を作る準備をしている。(4)社会的貢献活動として、既刊「アムハラ語入門」の改定増補に向け、ネイティブチェックを含めた確認を行い、あらためて必要な加除訂正を行うとともに、新版の構成を確定し、新記述に向けての必要なデータ整理を行った。またエチオピアの少数言語調査用の語彙集を作成し、ウェブ上で公開する準備を進めている。(5)メンバー内でドキュメンテーションについての理解を深めるための研究会を東京で実施した。また研究成果は日本ナイルエチオピア学会で学会発表をし、電子ジャーナルStudies in Ethiopian Languages(ISSN: 2187-1388)で発表した。1.アジスアベバ大学のエチオピア人研究者と共同で現地調査を実施し、エチオピアの少数言語のドキュメンテーションを作成するため、ビデオカメラを用いて、オモ系(バスケト語、ハマル語、ディメ語)、セム系(ティグリニャ語、マスカン語)、クシ系(アルボレ語、カロ語)、ナイルサハラ系(ニャンガトム語)の語り(モノローグ・ダイヤローグ)の動画データを収集してELANを使って文法分析し、注釈をつけた。またウェブ公開に向けて動画保存用のサーバの試験運用を行い、効率的な動画配信および動画編集の方法、他の言語データや論文とリンクさせる方法について検討を行った。2.エチオピア諸言語の文献データを収集し、少数言語がアムハラ語および地域有力言語とどう共存共生していくのか、言語ダイナミズムの分析をしている。3.ウェブに公開するためにXHTML形式で記述されていた語彙データおよび言語情報データを、より汎用性の高いText Encoding Initiative(TEI)形式へ変換する作業を行い、様々なソフトウェア上でデータを利用することが可能となるデータベースの骨格を作る準備をしている。4.社会的貢献活動として、既刊「アムハラ語入門」の改訂増補に向け、データの整理を行っている。またエチオピアの少数言語調査用の例文集のウェブ公開の準備を進めている。5.研究資料としての動画撮影の基礎技術と、実際の解析方法の習得のために、東京外国語大学で開催された言語ドキュメンテーションに関するセミナーおよびワークショップに参加した。その知見をもとに、動画の保存と公開の具体的な準備と議論を行った。また研究成果は第19回国際エチオピア学会学術大会で発表し、電子ジャーナルStudies in Ethiopian Languages(ISSN: 2187-1388)で発表した。現地調査による動画データ収集はかなり集まってきている。またELANを使ったドキュメンテーションのデータベース化はおおむね順調に進展している。ウェブによるデータベース構築のための準備もおおむね順調である。一方、文献による言語ダイナミズムの研究は、やや遅れており、アムハラ語入門の改訂増補版もまだ少し時間を要する。1.エチオピアの少数言語のドキュメンテーションを作成するため、アジスアベバ大学のエチオピア人研究者と共同で現地調査を重ね、オモ系(バスケト語、ディメ語)、セム系(チグリーニャ語、マスカン語)、クシ系(アルボレ語、ハディーヤ語)、ナイルサハラ系(ニャンガトム語)の使用状況を記録した動画・音声データ(モノローグ、民話、なぞなぞ)を収集し、ELANを使って転写、語釈、翻訳をつけた。またウェブ公開に向けて、字幕の形で付し、さらにデータの加工に適したELAN/XMLデータと、YouTubeなど動画サイトでの配信に適したデータの両方を作成した。2.少数言語がアムハラ語および地域有力言語とどう共存共生していくのか、言語ダイナミズムの分析をするため、少数言語の教科書を入手して母語教育について調査すると共に、セム系グラゲ諸語などの文献データの収集および1990年以降のエチオピア諸言語の文献リストの作成を行った。3.エチオピア諸言語に関する基本情報データベースと、それぞれの言語に関する研究文献データベースを統合した。

また、このデータベースとGISを連携させ、地図上から言語の基本情報・研究文献情報を参照可能にするための作業を継続している。なおGISに関しては、クラウド型のArcGISへの移行に伴い、地図属性の整理と効率化を行った。4.社会的貢献活動として、既刊「アムハラ語入門」の改訂増補に向けて、データの整理を行っている。5.言語ドキュメンテーション作成方法に関して、動画撮影の基礎技術および実際の解析方法を東京外国語大学で開催されたセミナーに参加したメンバーから研究会で報告を受け、情報共有をした。また、研究成果は電子ジャーナルStudies in Ethiopian Languages(ISSN: 2187-1388)などで発表した。現地調査による動画データは順調に集められている。またELANを使ったドキュメンテーションのデータベース化は、翻訳およびIPAによる転写に関しては順調であるが、記述が十分でない少数言語の語釈に関してはやや遅れている。一方、文献による言語ダイナミズムの研究は、セム系を中心にやや進展したが、他の系統に関しては遅れている。アムハラ語入門の改訂増補版は完成に向けて作業を進めているところである。データベースの基本部分の設計が終わり、各言語の文献データを付加する段階である。1.エチオピアの少数言語のドキュメンテーションを作成するため、アジスアベバ大学のエチオピア人研究者と共同で現地調査を重ね、オモ系(バスケト語、ディメ語)、セム系(チグリーニャ語、マスカン語、チャハ語)、クシ系(アルボレ語、ハディーヤ語)、ナイルサハラ系(ニャンガトム語、ベルタ語)の使用状況を記録した動画・音声データ(モノローグ、民話、なぞなぞ)を収集し、ELANを使って転写、語釈、翻訳をつけた。またウェブ公開に向けて、字幕の形で付し、さらにデータの加工に適したELAN/EMLデータと、YouTubeなど動画サイトでの配信に適したデータの両方を作成するとともに、各言語の基礎情報をまとめたデータベースを整備した。2.少数言語がアムハラ語およびアラビア語とどう共存共生していくのか、言語ダイナミズムの分析をするため、SIL(Summer Institute of Linguistics)エチオピア支部で、SILとエチオピア政府・教育省がこれまで行ってきた言語記述・母語教育開発についてエチオピア諸語研究者と意見交換すると共に、SIL附属図書館にてエチオピア諸語の文献調査を行った。3.オモ系バスケト語、クシ系ハーディヤ語、セム系チャハ語・マスカン語、ナイルサハラ系ベルタ語・ウドゥック語の文法を調べた。4.社会的貢献活動として、既刊「アムハラ語入門」の改訂版を完成させ、国内研究機関に送付した。5.エチオピア南西部ウォライタ大学で開催された第一回オモ研究国際会議に出席して研究発表すると共に、研究成果は電子ジャーナルStudies in Ethiopian Languages(ISSN: 2187-1388)などで発表した。
関節リウマチを対象としたヒト免疫学の確立

本研究では関節リウマチ(RA)患者のリンパ球について、主に(1)制御性T細胞(Treg)(2)遺伝子多型(3)自己抗原特異的CD4陽性T細胞に焦点を当てて解析した。(1)マウスにおいてTGF-beta3を産生し液性免疫応答を抑制するLAG3陽性Tregを同定し、さらにヒトLAG3陽性Tregが活動性RAで減少していることを示した。(2)健常人約100名のリンパ球サブセットで発現遺伝子と遺伝子多型を解析し、遺伝子多型から遺伝子発現量を推定する手法を開発した。(3) RAの自己抗原BiPからエフェクターと制御性のCD4陽性T細胞が認識するエピトープを別個に同定した。関節リウマチ(RA)の疾患感受性遺伝子として同定した蛋白のシトルリン化酵素であるPADI4については、コラーゲン誘発性関節炎がPADI4欠損マウスで有意に抑制されることが分かった。さらにPADI4欠損マウスでは血清の抗II型コラーゲン抗体価が減少しており、関節炎が抑制された機序のひとつと考えられた。PADI4欠損マウスではコラーゲン免疫後7日目の濾胞性B細胞の数が減少しており、PADI4は適応免疫におけるB細胞分化に重要な役割を果たしている可能性があることが示唆された。またPADI4欠損マウスでは炎症性サイトカイン産生も修飾されており、PADI4の自然免疫への関与も推測された。自己抗原BiP特異的T細胞のRA患者における解析では、BiPのepitope(BiP336-355)特異的T細胞はRA患者末梢血CD4陽性T細胞の0.1-0.5%,滑膜の2-5%であった。注目すべきことに、CD4陽性IL-17分泌細胞中のBiP336-355特異的細胞の割合は、末梢血では5%未満であるのに対し、滑膜中では15-60%と著明に濃縮されていた。IL-17はRAの炎症形成に重要なサイトカインであり、関節局所のIL-17産生CD4陽性T細胞のかなりの部分がBiP336-355に特異的であるという事実は、BiPのRA発症における自己抗原としての重要性を示唆している。またBiP336-355特異的T細胞のT細胞受容体の配列を単一細胞レベルで調べたところ、一部にクローナルな増殖が確認され、α鎖、β鎖の配列を同定できた。今後はT細胞受容体をクローニングし、抗原特異的T細胞の分化、関節炎における役割をヒト化マウスモデルで検討することで、Bip特異的T細胞の関節炎および自己免疫における役割を検討する予定である。以上のように、RAにおけるヒト免疫の異常の解明に関して重要な進展がみられた。関節リウマチ(RA)における主要自己抗原BiP蛋白から、リンパ球との共培養で抑制性サイトカインIL-10産生を誘導するペプチドを同定、このペプチドがマウス関節炎モデルで制御性T細胞(Treg)を誘導することを見出した。一方、RA末梢血CD4陽性メモリーT細胞に関して、シングルセル解析と次世代シークエンス(NGS)解析によるT細胞レセプター(TCR)レパトア解析を行い、健常人およびRA患者のメジャークローンを同定し、このクローンが関節にも存在し、Th1細胞型であることを見出した。またRA患者の末梢血のリンパ球をマルチカラーフローサイトメーターで解析した。リウマトイド因子の力価と形質芽球の割合、形質芽球の割合とTh17細胞様濾胞性ヘルパーT(TFH17)細胞の割合の相関があり、この形質芽球とTFH17細胞は未治療のRAでは増加していた。一方、疾患活動指標と相関するのは、CD4陽性CD45RO陽性のメモリーT細胞と、非Th1かつ非Th17細胞様のT細胞集団であった。これらから病期により病態形成に関与するT細胞集団が異なる可能性が示唆された。RAの疾患関連遺伝子多型については、多民族ゲノムワイドメタ解析をハーバード大学と共同で行い、新たに42のRA感受性遺伝子座を同定した(Okada Y et al. Nature 2014)。疾患関連遺伝子として報告している蛋白のシトルリン化酵素PADI4については、ノックアウトマウスではTh17細胞分化が抑制され、ミエロイド細胞のアポトーシスが亢進し、関節炎の発症が抑制されることを見出した。ヒトLAG3陽性TregはIL-10, EGR2などマウスLAG3陽性Tregと類似した遺伝子発現プロファイルを示し、B細胞とTFHとの共培養による抗体産生を抑制した。この抑制がB細胞アポトーシスを介しており、細胞接触依存性であることを示した。我々がマウスで同定した新規制御性T細胞CD4+CD25-LAG3+T細胞(LAG3+Treg)は抑制性サイトカインIL-10を高産生し、アナジー関連転写因子Egr-2を特異的に発現し、B細胞の抗体産生を抑制する。今回、ヒトLAG3+Tregを扁桃や末梢血中で同定した。ヒトLAG3+TregはIL-10, EGR2などマウスLAG3+Tregと類似した遺伝子発現プロファイルを示し、IL-10を高産生した。さらに本細胞群はB細胞・濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)との共培養による抗体産生を強力に抑制した。また、ヒトPBMC移入により惹起されるヒト化

マウスの移植片対宿主病が、本細胞群の共移入により抑制された。ヒト疾患においては、末梢血中のヒトLAG3+Tregの割合は、健常人に比較してRA患者で有意に減少していた。これらの知見により、ヒトLAG3+Tregが、自己抗体産生を抑制し自己免疫疾患を制御する、ヒトにおける新規制御性T細胞である可能性が考えられた。疾患関連遺伝子PADI4のKOマウスについても、GPI誘導性関節炎への感受性が著明に低下していることが判明した。以上の結果からRAにおけるヒト免疫について重要な進展がみられたと言える。関節リウマチ(RA)患者の末梢血のリンパ球をマルチカラーフローサイトメーターで解析し,血清サイトカインや臨床パラメータとの関連を検討した。通常のTh1, Th17, Tregの割合は疾患活動性との関連はほぼ示さず、血清サイトカインではIL-6が疾患活動性との弱い関連を示したものの、血清サイトカインの多くは疾患活動性との関連を示さず、リウマトイド因子との関連を示した。その一方で、免疫細胞の関節への遊走に重要とされるCXCR4を発現するメモリーT細胞の割合は、抗シトルリン化蛋白抗体の力価、疾患活動性や健康評価と相関を示した。またRAのCD4陽性T細胞の自己抗原BiPに対する反応性がRAの疾患活動性と関連することを明らかとした。RAの疾患活動性と関連のあるT細胞集団の同定に成功したことの意義は大きく、今後のRAの病態の解明に向けてさらに発現遺伝子や遺伝子多型との関連の検討を進める。既にゲノムの国際共同研究などでRAとの関連を明らかとしたPADI4についてはノックアウトマウスの解析を進め、PADI4がIL-6産生に重要であることを明らかとした。IL-6はRAにおいて非常に重要であり、その産生メカニズムとシトルリン化の関連がみられたことは重要な知見と言える。またヒトLAG3陽性Tregについては、これまでにマウスLAG3陽性Tregと類似した遺伝子発現プロファイルを示し、抗体産生を抑制することを明らかとしていたが、さらにヒトLAG3陽性TregがSLEや活動性RAで減少していることを示した(Okamura et al. Nat Commun 6:6329,2015)。LAG3TregはB細胞機能抑制にTGF-beta3を用いることを明らかとし、自己抗体産生機構の解明は有効な治療戦略の開発につながると期待される。関節リウマチ(RA)における主要自己抗原BiP蛋白から、リンパ球との共培養で抑制性サイトカインIL-10産生を誘導するペプチドを同定、このペプチドがマウス関節炎モデルで制御性T細胞(Treg)を誘導することを見出した。一方、RA末梢血CD4陽性メモリーT細胞に関して、シングルセル解析と次世代シークエンス(NGS)解析によるT細胞レセプター(TCR)レパトア解析を行い、健常人およびRA患者のメジャークローンを同定し、このクローンが関節にも存在し、Th1細胞型であることを見出した。またRA患者の末梢血のリンパ球をマルチカラーフローサイトメーターで解析した。リウマトイド因子の力価と形質芽球の割合、形質芽球の割合とTh17細胞様濾胞性ヘルパーT(TFH17)細胞の割合の相関があり、この形質芽球とTFH17細胞は未治療のRAでは増加していた。
新規機能配列選択法を用いたリボソームRNAの機能解析

SSER法は特定遺伝子の機能部位において、完全にランダムな配列から機能配列のみをin vivoで選択する方法で、研究代表者が考案した全く新しい機能配列解析法である。本研究ではSSER法を用い、リボソームRNA(rRNA)の機能解析を行うことを目的とした。特に23S rRNAのペプチド転移反応と16S rRNAのコドン解読能に焦点をあてる。リボソームRNAの機能部位を完全にランダマイズし、リボソームの機能に必須な配列のみを細胞内で選択することによりリボソームRNAの機能を解析する。また迅速な選択であるため、リボソームの本質的な機能には影響しないものの、活性が低いがために自然選択で排除されてきたような、変異体を選択できる点が特徴でもある。したがって進化的な保存性からは見逃されていた真の機能的な保存性を知ることができ、rRNAの本質的な役割を抽出することができる。また、本手法を用いてリボソームRNAに系統的な欠失・短縮変異、あるいは挿入変異を導入することが可能である。本年度の成果として以下のことが挙げられる。全146個のRNAヘリックスのうち40箇所で短縮あるいは欠失が可能であった。欠失変異を組み合わせることで、100塩基以上の短縮に成功した。また、トランスポゾンTn5を用いた系統的挿入変異導入を行い、23Sr RNAに36箇所、16S rRNAに16箇所の挿入変異体を得た。これら挿入可能部位は、真核rRNAで伸張している全18領域のうち13領域に一致したことから、真核生物のrRNAは進化の過程で挿入変異を繰り返すことで、新たな機能ドメインを獲得したことが強く示唆された。また、rRNAは短縮・挿入・分断化などの変異に対してフレキシブルであり、rRNAの変化が進化の過程においてリボソームアーキテクチャーを改変する原動力になっている可能性が示された。特に23SrRNAのペプチド転移反応と16SrRNAのコドン解読能に焦点をあてる。また迅速な選択であるため、リボソームの本質的な機能には影響しないものの、活性が低いがために自然選択で排除されてきたような変異体を選択できる点が特徴でもある。今年度は16SrRNA上の暗号解読中心(H18,H44)、翻訳精度スイッチ(H27)についてライブラリーを作成し、完全にランダムな配列からリボソームの各機能に必須な配列を選択することに成功した。天然型を含む様々な配列がコンセンサス配列として選択され、結晶構造や生化学的な実験から得られた知見と矛盾しない結果であった。進化的に高度に保存されている部位にバリアントが得られたことから、本手法による解析が機能配列のみを選択する目的に優れていることを再確認した。H18の高度に保存された内部ループの機能選択により、G530,C518,C519,A520,G529,A533の6残基が必須残基として同定された。これらはクラスターを形成しており、シウドノット構造はこの特徴的な構造を維持するために必要であると考えられる。H44ではA1492,A1493以外にG1494,T1495,G1497,C1404,G1405,C1407などが必須残基として同定された。H27の翻訳精度スイッチの機能選択では、885型から888型への構造変化はリボソームの機能に必須ではないことが明らかとなった。しかし、885型を不安定化する変異を導入すると888型が選択されることが明らかとなった。

また、トランスポゾンTn5を用いた系統的挿入変異導入を行い、23Sr RNAに36箇所、16S rRNAに16箇所の挿入変異体を得た。これら挿入可能部位は、真核rRNAで伸張している全18領域のうち13領域に一致したことから、真核生物のrRNAは進化の過程で挿入変異を繰り返すことで、新たな機能ドメインを獲得したことが強く示唆された。また、rRNAは短縮・挿入・分断化などの変異に対してフレキシブルであり、rRNAの変化が進化の過程においてリボソームアーキテクチャーを改変する原動力になっている可能性が示された。
細胞質におけるN型糖鎖の新規な機能解析

本研究は、小胞体における糖蛋白質の品質管理機構により細胞質に逆行輸送されたミスフォールド蛋白質やポリマー形成不全蛋白質のN型糖鎖、特に高マンノース型糖鎖の新規な機能解析を目的とする。東京都臨床医学総合研究所・腫瘍免疫研究部門において見出されたN型糖鎖を認識するユビキチンリガーゼ群(Fbx2やFbx6b)は、糖鎖が糖蛋白質の品質管理、特に小胞体関連分解(ERAD)に関与することを明確に示した。この成果は、解析が進展していない糖鎖の機能解明には糖鎖結合蛋白質からのアプローチが非常に有効であることを端的に示した。細胞質へ逆行輸送されたミスフォールド糖蛋白質の蛋白部分は、最終的にユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。一方、糖鎖部分はN-グリコシダーゼ(PNGase)やエンドH型酵素によって蛋白質より切り出され、その後細胞質のα-マンノシダーゼによってMan_5GlcNAcにまで分解されることが報告されている。従来、このN型オリゴ糖鎖は、最終的にリソソームに存在する特異的なトランスポーターによって取り込まれると想定されている。しかしながら、トランスポーターの存在を含めてこの機構は現在までに全く実証されていない。平成16年度より2年間、マウスやラット脳の細胞質画分を材料にして、糖蛋白質からPNGaseやエンドH型酵素によって切り出されたオリゴ糖の結合蛋白質の単離・精製を試みた。種々の高マンノース型糖鎖をプローブとして解析したが、単離・同定に至らなかった。この主な原因として、オリゴ糖鎖プローブを用いるアッセイ法に問題があったと考えられた。今後の展開として、上記アッセイ法の新規開発に加えて、リソソームなどの細胞内小器官における糖鎖結合蛋白質の単離・同定、その後の分子生物学、生化学、免疫学的手法等を用いた解析が必要と思われる。本研究は小胞体における糖蛋白質の品質管理の結果、細胞質に逆行輸送されたミスフォールド蛋白質やポリマー形成不全蛋白質のN型糖鎖、特に高マンノース型糖鎖の新規な機能解析を目的とする。私共によって発見されたN型糖鎖を認識するユビキチンリガーゼ群(Fbx2やFbx6b)は、糖鎖が糖蛋白質の品質管理、特に小胞体関連分解(ERAD)への関与を明確に示した。この成果は、糖鎖の機能解明には糖鎖結合蛋白質の解析が非常に有効であることを端的に示している。細胞質へ逆行輸送されたミスフォールド糖蛋白質は、最終的にユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。しかし、その前にN-グリコシダーゼ(PNGase)やエンドH型酵素によって蛋白質と遊離オリゴ糖に分離される。この糖鎖は、細胞質のα-マンノシダーゼによってMan_5GlcNAcにまで分解され、最終的にリソソームに取り込まれることが報告されている。従来、糖蛋白質より切り出されたN型オリゴ糖鎖は、最終的にリソソームに存在する特異的なトランスポーターによって取り込まれると想定されている。平成16年度は、マウスやラット脳の細胞質画分を材料にして、糖蛋白質からPNGaseやエンドH型酵素によって切り出されたオリゴ糖の結合蛋白質の単離・精製を試みた。種々の高マンノース型糖鎖をプローブとして解析しているが、現在まで単離・同定に至っていない。

平成17年度には、この蛋白質を単離・同定し、その後、分子生物学、生化学、免疫学的手法等を用いて、糖鎖結合蛋白質の特性を解析する予定である。さらに、この結合蛋白質の受容体をこの存在が想定されるリソソームなどの細胞内小器官より検出することを目指している。本研究は、小胞体における糖蛋白質の品質管理機構により細胞質に逆行輸送されたミスフォールド蛋白質やポリマー形成不全蛋白質のN型糖鎖、特に高マンノース型糖鎖の新規な機能解析を目的とする。東京都臨床医学総合研究所・腫瘍免疫研究部門において見出されたN型糖鎖を認識するユビキチンリガーゼ群(Fbx2やFbx6b)は、糖鎖が糖蛋白質の品質管理、特に小胞体関連分解(ERAD)に関与することを明確に示した。この成果は、解析が進展していない糖鎖の機能解明には糖鎖結合蛋白質からのアプローチが非常に有効であることを端的に示した。細胞質へ逆行輸送されたミスフォールド糖蛋白質の蛋白部分は、最終的にユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。一方、糖鎖部分はN-グリコシダーゼ(PNGase)やエンドH型酵素によって蛋白質より切り出され、その後細胞質のα-マンノシダーゼによってMan_5GlcNAcにまで分解されることが報告されている。従来、このN型オリゴ糖鎖は、最終的にリソソームに存在する特異的なトランスポーターによって取り込まれると想定されている。しかしながら、トランスポーターの存在を含めてこの機構は現在までに全く実証されていない。平成16年度より2年間、マウスやラット脳の細胞質画分を材料にして、糖蛋白質からPNGaseやエンドH型酵素によって切り出されたオリゴ糖の結合蛋白質の単離・精製を試みた。種々の高マンノース型糖鎖をプローブとして解析したが、単離・同定に至らなかった。この主な原因として、オリゴ糖鎖プローブを用いるアッセイ法に問題があったと考えられた。今後の展開として、上記アッセイ法の新規開発に加えて、リソソームなどの細胞内小器官における糖鎖結合蛋白質の単離・同定、その後の分子生物学、生化学、免疫学的手法等を用いた解析が必要と思われる。
癌宿主相互作用による肺癌の浸潤・転移におけるＮＥＣＬ５の役割の研究

我々が独自に開発したDouble-layeredcollagen gel hemisphere(DL-CGH)法を用い、Necl-5の癌間質相互作用における役割について検討を行った。DL-CGHの内層にGEPで蛍光標識したA549とWI-38を共培養したもの、RNAi法でNecl-5を抑制したGFP-A549とWI-38を共培養したものを各々作成し、比較検討を行った。外層に浸潤するGFP-A549を観察したところ、Necl-5の発現を抑制した群では、外層に浸潤したGFP-A549の細胞数が有意に減少しており、浸潤能が抑制されることが示された。(背景)Necl-5は、細胞間接着の制御の他、細胞運動や増殖にも関与し、癌細胞で発現が増加することが知られている。我々はこれまで、肺腺癌切除検体においてNecl-5の免疫染色を検討したところ、癌浸潤領域および術後生存率との相関を見いだした。今回我々は、肺腺癌浸潤におけるNecl-5の役割を明らかにするため、実験的検討を行った。(方法)A549(肺胞上皮癌細胞)、WI-38(肺線維芽細胞)のcell lineを用いた。我々が独自に開発した細胞の浸潤能を視覚化できるDouble-layeredcollagen gel hemisphere(DL-CGH)法を用いてこれらを共培養し、浸潤能を観察した。更に、RNAi法によってNecl-5の発現を抑制した際の浸潤能の変化を検討した。(結果)Western blottingによりNecl-5の発現をみたところ、A549で強発現しており、WI-38と共培養しても発現に変わりはなかった。DL-CGH法においてこれらを共培養したところ、まず外層に向かってWI-38が伸び、単独培養では外層に向かって浸潤できないA549が、WI-38に沿ってアメーバ状に姿をかえつつ外層に侵入する様子が観察された。RNAi法によってNecl-5を抑制したA549を用いたところ、外層への浸潤能が有意に低下した。更に、Necl-5を抑制したA549では、移動能、増殖能も有意に低下することを確認した。(結論)単独では浸潤能を持たないA549の浸潤にはWI38の足場が必要と考えられた(癌ー間質相互作用)。またその際のA549の形状の変化も注目された(上皮間葉移行)。さらに、この現象にはA549由来のNecl-5の発現が重要な働きを持つことが示唆された。本タンパク質は癌浸潤コントロールのための有力な標的になりうると考えられた。DL-CGH法を用いて、内層にGEPで蛍光標識したA549とWI-38を共培養したもの、RNAi法でNecl-5を抑制したGFP-A549とWI-38を共培養したものを各々作成し、比較検討を行った。WI-38に沿って外層に移動するGEP-A549を経時的に観察し、12時間後の移動距離について比較したところ、Necl-5を抑制したGFP-A549では、抑制していない群に比べ、有意に移動距離が減少していた。また、増殖能については、A549のcell lineにおいて、24時間、48時間、72時間後の細胞数をカウントすることとした。A549のNecl-5をRNAi法で抑制した群では、抑制していない群に比べ、48時間後、72時間後のA549の細胞数が有意に低下しており、増殖能が低下していることが示された。以上の結果より、Necl-5を抑制したA549では、細胞遊走能、増殖能がともに抑制された結果、浸潤能が抑制されることが明らかとなった。癌細胞におけるNecl-5は、細胞の移動、増殖に関わることが示唆された。更に、DL-CGH法において、癌細胞のNecl-5を抑制することで、癌の浸潤能が抑制された。癌間質相互作用においてNecl-5は重要な役割を担っていると考えられ、Necl-5は肺腺癌におけるmolecular targetになり得る。我々は、外科切除された肺腺癌63症例における主病変部におけるNecl-5の発現について、パラフィンブロックを用いた免疫組織化学染色で調べ、68%で強い発現を確認した。そして本蛋白質の発現はリンパ節転移の有無、病理病期、BAC率と有意に相関し(それぞれp=0.0398、p=0.0070、p=0.0423)、また、発現例では有意に予後不良であった。

これらの結果から、同蛋白質が原発性肺癌の臨床において重要な役割を持つことが明白となり、癌治療、とくに癌浸潤・転移コントロールにおける分子標的になり得ることが示された。一方、我々が開発した3D in vitroモデルは、細胞の動きをリアルタイムに観察でき、動画として連続的に変化を捉えられる。また画像処理により浸潤の定量的に評価を可能にした。そして本法により、単独では遊走能を持たない癌細胞が線維芽細胞周囲をアメーバ様に盛んに運動することを見出した。これらの研究成果により、我々は、癌細胞と線維芽細胞の相互作用におけるNecl-5の役割に関しての研究に着手した。本年度は、マウスおよびヒトの肺癌細胞におけるNecl-5の発現をコントロールするためのプラスミドベクターおよびsiRNAを作成した。Necl-5の遺伝子情報に基づきマウスおよびヒト遺伝子cDNAを合成の上、それぞれをプラスミドベクターに組換えし、発現ベクターとして用いた。3D in vitroモデルでの実験用に上記のcDNAを蛍光標識ベクター(pAcGFP1およびpDsRed;Clontech)に組換えし、肺癌細胞に導入して、3D in vitroモデル上で腫瘍浸潤が可視化できることを確認した。次に各遺伝子に対するsiRNAを設計・合成し、ヒトおよびマウス肺癌細胞でのNecl-5の発現をノックダウンできることを確認した。本研究では、癌・宿主由来細胞間相互作用におけるNecl-5の分子機構を明らかにして、新しい癌浸潤コントロールのための標的となり得るかを見出すことを目的とし、ノックアウトマウスを用いた浸潤モデルと我々が開発した3D in vitroモデルを用いることにより、癌細胞の線維芽細胞周囲での運動のメカニズムを、両細胞におけるNecl-5のダイナミクスに注目して、明らかにすることを目的としている。3年間の研究計画の中で、特にこの1年は、ヒト細気管支肺胞上皮癌(BAC)細胞A549と肺由来の線維芽細胞WI38を、我々が開発した3D in vitroモデルである2層化コラーゲンゲル半球(Double-layered Collagen Gel Hemisphere; DL-CGH)に封入することにより、「癌浸潤における癌細胞ー炎症細胞相互作用」をシミュレートし、蛋白質の発現と細胞運動・接着との関係を観察することに研究の重点をおいた。そして、研究実績の概要に記載した通りの結果を得て、その内容はすでに英文の学術雑誌(Exp Mol Pathol. 2013 Apr;94(2):330-5)に掲載され、国際的にも評価を得ている。当初の計画では、論文の出版は3年目以降になるとしていたため、計画以上の進展と考えている。平成23年度は、マウスおよびヒトの肺癌細胞におけるNecl-5の発現をコントロールするためのプラスミドベクターおよびsiRNAを作成が完了した。次に各遺伝子に対するsiRNAを設計・合成し、ヒトおよびマウス肺癌細胞でのNecl-5の発現をノックダウンできることを確認したため、次年度の本実験のためのマテリアルを揃えることができ、おおむね順調に進展していると考える。
マウスでの抗原反復投与によるTH1/TH2不均衡の成立機序:マウスのアトピー性皮膚炎モデル作成とその検討

1.剃毛したBALB/cマウスの背部に10^6個のカンジダ胞子をおいて24時間密閉固定することにより、皮膚感染をおこす。これを繰り返した群とそうでない群について比較検討を行った。(1)カンジダ抗原を耳介に10mlずつ皮下注したときの腫脹を経時的にみると、皮下注後6時間より後に、繰り返した群で耳介腫脹がより大きかった。ただし、3回以上繰り返した場合にさらに大きな腫脹が生じるということはなかった。(2)カンジダ抗原刺激による、所属リンパ節細胞の増殖反応/サイトカイン産生反応を調べると、繰り返した群で(繰り返した回数が大きい程)量的により大きい反応が認められた。質的差異は認められなかった。2.マウスの片側の耳介にカンジダを繰り返して塗布した場合についても、同様の検討を行った。(1)耳介に皮下注したカンジダ抗原による腫脹の反応は、概して小さく、また、左右差を認めなかった。これは、カンジダ塗布のかわりにカンジダ抗原皮下注を片側の耳介へ繰り返した予備実験の結果と異なるものだった。