hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス胃液及び胃粘膜上皮細胞におけるニトロソ化たん白質の網羅的解析

一酸化窒素(NO)は、L-アルギニンからNO合成酵素(NOS)によって内因的に産生されるが、もう一つの経路として、野菜などに多量に含まれる硝酸塩や亜硝酸塩の摂取によって、外因的に胃内での酸性、還元的環境下で化学的にNOに変換され胃もしくは全身に供給される。胃におけるNOは、感染防御や局所血流の維持だけでなく、胃酸分泌、粘液分泌、重炭酸イオン分泌の制御等、胃の多彩な生理作用に非常に重要な役割を果たすことが知られている。加えて、NOは全身循環血液中において血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、抗アテローム性動脈硬化など血液循環動態の本質的役割を果たしていることも知られている。近年、シグナリング分子としてのNOの役割に関心が注がれてきている。特にカスパーゼ系酵素やある種のイオンチャネル、リアノジンレセプターなどの機能性たん白質は、その構造中のスルフホドリル基(-SH基)がNO関連物質(N_2O_3やニトロソニウムイオン)によってS-ニトロソ化(-SNO)され、その機能が変化すること、更に、たん白質のS-ニトロソ化反応は、翻訳後修飾の代表であるリン酸化反応と連動・拮抗しながら生体の恒常性の維持を担うことも推察されてきている。そこで本研究では、上述した胃の様々な生理機能と上皮細胞におけるニトロソ化たん白質との関連性を評価するためのデータベースを構築するために(1)胃でのニトロソ化たん白質の検出(2)外因的NO供給源として亜硝酸塩をマウスに投与したときの胃粘膜ニトロソ化たん白質の質的、量的変化(3)胃粘膜ニトロソ化たん白質の分離並びにプロテオーム解析を行った。その結果、(1)瞬間凍結剥離法によってマウス胃粘膜と筋層を分離し、胃粘膜ニトロソ化たん白質の検出を、Jaffreyら(Nat Cell Biol.3:193-7,2001)の報告したビオチンスイッチアッセイ(若干変更)にて検出できた。(2)本法を用いて、マウスに亜硝酸塩を経口投与させた後の胃粘膜ニトロソ化たん白質をウエスタンブロッティング法にて定量的に評価すると、亜硝酸塩の投与量に依存して180,80,38,32,4kDaの分子量のニトロソ化たん白質が顕著に増加することを示した。加えて、これら分子量以外のたん白質も亜硝酸塩の摂取量に依存してニトロソ化されることも示した。(3)これらニトロソ化たん白質を網羅的に同定するために、胃粘膜ライセートにNOドナーであるニトロソグルタチオン(GSNO)を加え、可能な限りニトロソ化した後、ビオチンスイッチアッセイにてニトロソ化たん白質を標識し、ストレプトアビジンゲルカラムにて精製した後、二次元電気泳動にて、ニトロソ化たん白質を分離した。その結果、GSNOを加えていないサンプルよりもGSNOを加えたサンプル方が、顕著に30以上のニトロソ化たん白質が銀染色法によって検出された。ゲルスポットを切り出し、脱色後、トリプシンにて酵素消化し、脱塩したサンプルをMALDI-TOF MASSにてフィンガーマスプリンティングを行った結果、現在までのところ、比較的量の多いハウスキーピングたん白質のみが同定できた。今後は、検出された全てのニトロソ化たん白質の同定を行うことが残されている。野菜に高濃度含まれている硝酸塩や亜硝酸塩の摂取は、外因的な一酸化窒素(NO)、あるいはNO関連物質の供給源となり、胃粘膜局所での感染防御や胃血流の改善に重要な役割を果たしていることが示唆されている。本年度は、胃粘膜でのNO関連物質の一つであるニトロソ化たんぱく質を検出し、胃の生理機能との関連性を評価した。ICR雄性マウスに種々投与量の亜硝酸ナトリウム(0-0.2mmol/kg)を経口投与し、1時間後、胃をすばやく摘出し、瞬間冷却剥離法により筋層を除去し、マウス胃粘膜を調製した。調製した胃粘膜をSDS含有HEN bufferにて溶解させ、上清中のたんぱく質をBiotin switch assayにてニトロソ化たんぱく質の検出を行った。その結果、マウス胃粘膜のニトロソ化たんぱく質は、投与した亜硝酸ナトリウム量に依存して相対的に増加した。これらニトロソ化たんぱく質のうち、特に分子量180,80,38,32,4kDaのたんぱく質は、亜硝酸ナトリウムを投与しなかったマウスにおいても検出され、そのバンドの強度は亜硝酸ナトリウムの投与量依存的に増加した。今後は、これら分子量のニトロソ化たんぱく質の同定をプロテオーム解析にて行う予定である。これに加えて、本実験で使用した硝酸塩(0-0.2mmol/kg)や亜硝酸塩(0-0.2mmol/kg)のマウスやラットへの経口投与によって、水浸拘束ストレス(21°C,4時間拘束)による実験的潰瘍形成が顕著に抑制されることを見いだした。今後は、これらのストレス負荷時でのニトロソ化たんぱく質の量的、質的変化に関しても追跡していく予定である。

胃におけるNOは、感染防御や局所血流の維持だけでなく、胃酸分泌、粘液分泌、重炭酸イオン分泌の制御等、胃の多彩な生理作用に非常に重要な役割を果たすことが知られている。加えて、NOは全身循環血液中において血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、抗アテローム性動脈硬化など血液循環動態の本質的役割を果たしていることも知られている。近年、シグナリング分子としてのNOの役割に関心が注がれてきている。特にカスパーゼ系酵素やある種のイオンチャネル、リアノジンレセプターなどの機能性たん白質は、その構造中のスルフホドリル基(-SH基)がNO関連物質(N_2O_3やニトロソニウムイオン)によってS-ニトロソ化(-SNO)され、その機能が変化すること、更に、たん白質のS-ニトロソ化反応は、翻訳後修飾の代表であるリン酸化反応と連動・拮抗しながら生体の恒常性の維持を担うことも推察されてきている。そこで本研究では、上述した胃の様々な生理機能と上皮細胞におけるニトロソ化たん白質との関連性を評価するためのデータベースを構築するために(1)胃でのニトロソ化たん白質の検出(2)外因的NO供給源として亜硝酸塩をマウスに投与したときの胃粘膜ニトロソ化たん白質の質的、量的変化(3)胃粘膜ニトロソ化たん白質の分離並びにプロテオーム解析を行った。その結果、(1)瞬間凍結剥離法によってマウス胃粘膜と筋層を分離し、胃粘膜ニトロソ化たん白質の検出を、Jaffreyら(Nat Cell Biol.3:193-7,2001)の報告したビオチンスイッチアッセイ(若干変更)にて検出できた。(2)本法を用いて、マウスに亜硝酸塩を経口投与させた後の胃粘膜ニトロソ化たん白質をウエスタンブロッティング法にて定量的に評価すると、亜硝酸塩の投与量に依存して180,80,38,32,4kDaの分子量のニトロソ化たん白質が顕著に増加することを示した。加えて、これら分子量以外のたん白質も亜硝酸塩の摂取量に依存してニトロソ化されることも示した。(3)これらニトロソ化たん白質を網羅的に同定するために、胃粘膜ライセートにNOドナーであるニトロソグルタチオン(GSNO)を加え、可能な限りニトロソ化した後、ビオチンスイッチアッセイにてニトロソ化たん白質を標識し、ストレプトアビジンゲルカラムにて精製した後、二次元電気泳動にて、ニトロソ化たん白質を分離した。その結果、GSNOを加えていないサンプルよりもGSNOを加えたサンプル方が、顕著に30以上のニトロソ化たん白質が銀染色法によって検出された。ゲルスポットを切り出し、脱色後、トリプシンにて酵素消化し、脱塩したサンプルをMALDI-TOF MASSにてフィンガーマスプリンティングを行った結果、現在までのところ、比較的量の多いハウスキーピングたん白質のみが同定できた。今後は、検出された全てのニトロソ化たん白質の同定を行うことが残されている。
美術教師のライフコース研究ー「教師性」と「作家性」の融合に注目してー

本研究は、これまで教師研究の俎上に上がることのなかった美術教師のキャリアに着目したものである。美術大学出身の美術教師がどのような軌跡を辿って教職に就いたのか、また自身の専攻をどのように教職と繋げているのかを明らかにすることを目的としている。制作者を養成する美術大学で学んできた美術教師のキャリアモデルが具体的に示されることにより、教師を目指す非養成系大学の学生が自身の専攻の学びと教職の世界を結びつける際のモデルになることが期待できる。
ソーラー水中グライダーによる海洋環境モニタリングに関する研究

本研究では,長期間・広範囲に亘って海洋の環境や生態系をモニタリングすることのできる実海域用ソーラー水中グライダーTonai60(トーナイ・シックスティ)の研究開発を行った。機体には,画像解析によって造礁サンゴの被度分布などを調査するためのネットワークカメラや海中音響観測によって鯨類の生態を調査するためのシステム,海洋環境プロファイラー(計測項目:深度,水温,塩分濃度,電導度,濁度,クロロフィルa,溶存酸素)を装備している。水槽試験および実海域試験によって,機体の潜航性能を実証した。本研究の最終目標は,「グライダー型群知能海中ロボット」を開発し,千機を全地球規模の海洋に展開して,長期に亘る3次元多点同時観測を可能にすることである。本研究では,太陽光エネルギーを用いて長期間の運用が可能となる「ソーラー水中グライダー」を開発し,地球の短期的な気象変動に大きな影響を及ぼす浅海域の海洋環境データをモニタリングすることを目指している。本年度は,(1)浮力調整装置・推進機構の検討,(2)太陽光発電システムの検討,(3)水中グライダーの設計,(4)制御用ソフトウェアの検討,について検討を行った。太陽光は,海水による減衰を受けて,海中では青緑色の成分(約465nmの波長の帯域)のみが透過できる。しかも水深150200mでその99%が吸収されてしまうので,水中でも効率良く太陽光エネルギーを利用するためには,この波長域を吸収することのできるアモルファスシリコン太陽電池を採用することが望ましいと考えている。一方,海面に浮上して測位やデータ通信を行っているときにはより広帯域の太陽光エネルギーを吸収することが求められ,アモルファスシリコン太陽電池と通常の多結晶(または単結晶)シリコン太陽電池のハイブリッド型の太陽光電池パネルを用いたソーラーパネルマウントを設計・製作してスイミングプールおよび実海域での太陽光発電性能の計測を行った。消費電力などの推定を行い,搭載機器の検討を行った。その結果,スラスターを用いた潜航ではなく,浮力調整装置を用いる必要があることが明らかとなった。また,浅海域での運用を目指すソーラー水中グライダーの応用事例として,海洋生態系環境のモニタリング手法について検討を行った。海棲動物の音響観測および造礁サンゴの画像計測の実現可能性を見出すことができた。次年度は,実海域用ソーラー水中グライダーの詳細設計を行い,製作を進めていく予定である。本年度は,(1)実海域用ソーラー水中グライダーの開発,(2)海棲哺乳類の海中音響観測,(3)造礁サンゴの画像解析,を行った。前年度までに開発を行ってきたMPPT(Maximum Power Point Tracking)制御回路や過放電防止回路,バランス充電回路を搭載して,太陽光発電を効率的に持続できるようにしている。また,ソーラー水中グライダーの水槽試験および実海域試験を行い,設計通りの潜航ができることを確認している。さらに,ソーラー水中グライダーによる海洋生態系のモニタリングに向けて,アラスカのプリンスウィリアムス湾で海棲哺乳類(シャチ)の音響観測を行い,音源の方向推定が可能であることを明らかにした。さらに,新江ノ島水族館において造礁サンゴの画像計測・解析を行い,水中ロボットによる自動観測の可能性を明らかにすることができた。本年度は,(1)太陽光発電システムの開発,(2)ソーラー水中グライダーの設計,(3)海棲哺乳類の海中音響観測,(4)造礁サンゴの画像解析,を行った。太陽光発電を効率的に持続するためには,MPPT(Maximum Power Point Tracking)制御や過放電防止回路,バランス充電回路が必要になってくる。本年度は,これらの回路を開発して,実験によってその効果を検証することができた。また,ソーラー水中グライダーの詳細設計を行い,浮力調整装置や画像計測に必要な耐圧容器などの開発を行った。さらに,ソーラー水中グライダーの運用を目指して,海中音響観測システムを構築して,海棲哺乳類(シャチ,ザトウクジラ,ハシナガイルカ)の音響観測を行い,音源の方向推定が可能であることを明らかにした。さらに,造礁サンゴの画像計測・解析を行い,水中ロボットによる自動観測の可能性を明らかにすることができた。次年度は,実海域用ソーラー水中グライダーの詳細設計と製作を進め,耐圧試験,水槽試験および実海域試験を行い,ソーラー水中グライダーの実用化を目指していく予定である。

交付申請時の研究計画に沿って実施できているので。搭載機器の選定が終わっていないので,数値流体力学(CFD)的手法を用いた機体形状の設計は実施できなかったが,実海域用ソーラー水中グライダーの応用分野として,海洋生態系環境のモニタリング手法の検討を行うことができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請時の研究計画に沿って実施することができたので。また,実海域用ソーラー水中グライダーの応用分野として海洋生態系に注目し,海棲哺乳類の音響観測と造礁サンゴの画像解析を試み,実現可能性を明らかにすることができたので。当初の研究推進方策の通りに進めることができる。それに加えて実海域用ソーラー水中グライダーの応用として,海洋生態系環境のモニタリング手法についての検討を進めていく。当初の研究推進方策に沿って進めることができると考えている。ソーラー水中グライダーの水槽試験を9月に,実海域試験を12月に予定しているが,実験施設との調整や天候などにも影響を受けるので,若干前後する可能性はある。また,実海域用ソーラー水中グライダーの応用分野として,海棲哺乳類の海中音響観測と造礁サンゴの画像解析を進めていく予定である。
重力波観測における逆問題の定式化および修正重力理論の検証への応用

我が国のKAGRAを含めた4台の重力波検出器によって、偏波観測が可能となる場合が存在する事を初めて指摘した。これまで、偏波観測には5台以上が必要だと考えられていた。今回の成果は、偏波観測を用いた修正重力理論の実証を加速するものである。また、一般相対性理論が予言するベクトル型の重力の効果は、Gravity Probe B実験により存在が実証されたばかりで、検証の余地が大きく残されている。修正重力理論模型のなかでも、パリティ破れを示唆するチャーン・サイモンズ重力補正を実験的に検証する意義は大きい。チャーン・サイモンズ重力補正に起因する時空構造(計量)を遅い自転をする弱場の天体周りに対して調べた。弱場を解析した理由は、ブラックホールや中性子星のようなコンパクト天体に比べて、弱場天体の方が天体内部の物質分布に依存するチャーン・サイモンズ重力補正が大きくなる利点があり、そのために実証が容易になる可能性があるからである。実際、一様密度球の模型に対して、ポスト・ニュートン近似を用いて時空計量を求めた。得られた結果を用いて、チャーン・サイモンズ重力補正に対して従来法よりも僅かではあるが強い制限を与えることができた(Nakamura, et al. 2019)。さらに、ブラックホールとトポロジー的に異なる種類の強重力場の時空構造としてワームホールが理論的に知られている。特に、回転するワームホール周りの光線の振る舞いを解析的手法を用いて調べた。特に光源および観測者がワームホールから有限の距離にいる状況での光線の曲がり角を論じた。こうした有限距離での計算手法が申請者らにより近年、「ガウス・ボネ定理」を応用することで得られている。この新しい手法を用いて、回転するワームホールによる効果が、次世代の天文観測技術で実証可能かどうか検討した(Ono, Ishihara, Asada, 2018)。重力波の偏波実験に関する新たな知見が得られたため。得られた偏波実験に関する知見は、基礎理論の段階である。これを実用に向けて更に発展させたい。aLIGOおよびVIRGOによる重力波の本格的観測が始まり、日本のKAGRAによる本格観測も間もなく始動するいま、様々な重力理論の実験的検証が注目されている。修正重力理論もしくは新奇なエネルギーの形態を仮定して、ヌル測地線の基礎的性質を明らかにした。通常の重力レンズは必ず集光が起きるという意味で、凸型の光学レンズとの類似がある。本研究では、通常型でない光の伝播(凹型重力レンズ)のサーべイ的な研究を行なった(Asada, 2017)。この凹型重力レンズの出現は、ある種のエネルギー条件の破れを要するため、奇妙な形態のエネルギーの導入もしくは重力理論の修正と関連する事が容易に想像される。具体的には、マイクロレンズ、弱レンズのシアなどを、北村らと共に提案した逆ベキ模型(Kitamura, Nakajima and Asada, 2013)を用いて解析した。また、一般相対性理論には、ベクトル型の重力場も内包する。しかし、このベクトル型の重力の効果は、Gravity Probe B実験により、ようやく存在が実証されたばかりで、検証の余地が多く残されている。特に、ブラックホールのような強場周りでのベクトル型の重力場の検証を通じて、新しい重力理論の実験的証拠が見つかるかもしれない。微分幾何における「ガウス・ボネ定理」を応用することで、重力レンズに関して、おもに相対論的な重力場におけるべクトル型重力場由来の曲がり(gravitomagnetism)についての高精度な理論予測を可能にする計算手法を展開した(Ono, Ishihara, Asada, 2017)。太陽の自転角運動量による光の曲がり角への補正、および銀河中心ブラックホールのスピンによる余剰な曲がり角などを定量的に見積もり、その補正が次世代の天文観測の精度内であることを初めて指摘した。初年度に予定通りの研究成果が出たため。

この新しい手法を用いて、回転するワームホールによる効果が、次世代の天文観測技術で実証可能かどうか検討した(Ono, Ishihara, Asada, 2018)。重力波の偏波実験に関する新たな知見が得られたため。初年度は重力場中のヌル測地線の研究に重点を置いていた。今後は、その成果を発展させて、重力波の諸性質の研究を推進させたい。得られた偏波実験に関する知見は、基礎理論の段階である。これを実用に向けて更に発展させたい。スケジュールが合わなくなり、予定した海外出張を行なわなかったため。ただし、国内で開催された国際会議で研究打合せが行なえたので、初年度の研究遂行に支障は無かった。当初想定した国際会議への出席を見送ったため。今年度は、成果発表および研究打合せのため国際会議への参加旅費に充てる。
血管内皮細胞機能を調節する魚類由来機能性ペプチドの解析研究

魚類由来ACE阻害ペプチドtunaAIの血管内皮細胞機能への作用を牛大動脈内皮細胞(BAEC)培養系を用いて解析した。アンジオテンシン11産生-BAEC培養系におけるアンジオテンシンIからIIの産生を多形核白血球(PMN)の遊走法(Boyden法)で測定したところ、tuna AIはこの系におけるアンジオテンシンII産生を抑制した。遊走、増殖-血管損傷や血管新生時に最初に起こる現象の遊走、増殖について、テフロンフェンスで接触阻害したBAEC培養系を用いて調ベた。Tuna AIは内皮細胞の遊走、増殖を増強した。また、tuna AIはBAECにおけるインターロイキンI産生およびマイトーゲン(PDGF,c-myc)のmRNAの発現量を増加し、これらの作用は遊走、増殖の増強につながる変化と考えられた。しかし、tunaAI自身は増殖因子活性及びプロテアーゼ阻害活性を示さなかった。抗血栓性- ^3H-アラキドン酸を取り込ませたBAECからのアラキドン酸及び抗血栓性PGI_2の遊離に対して作用を示さなかった。血管トーヌス-内皮細胞が産生する最も強力な血管収縮物質エンドセリンの産生を有意に抑制した。一方、弛緩物質のNOの産生に対して作用を示さなかった。血管内皮細胞に備わっている様々な生理機能の傷害ならびにそれにともなってもたらされる細胞膜等の構造破壊は動脈硬化や心筋硬塞の初期病変として注目されている。また血管平滑筋やコラーゲン繊維等の基底膜を含めた血管壁における様々な液性因子による機能調節機構が次第に明らかとなってきている。今夜、食品ペプチドの血管内皮細胞に対する作用のメカニズムの解析とともに食品の第三次機能因子としての有用性についてさらに研究を進めて行きたいと考えている。
熱帯アフリカにおける畜産由来薬剤耐性菌発生の実態把握と対策の提案

平成30年度は、9月から10月にかけてウガンダに渡航し、調査地の一つであるワキソ県カキリおよびチテベ周辺の農家で、粗放な飼養形態におかれたアフリカ在来種のブタ3頭、同ニワトリ3羽から糞を採取し、28および29年度に引き続き選択培地で乳酸菌を分離培養した。その結果、それぞれの家畜種からLactobacillus mucosaeなど47株とL. fermentumなど15株の乳酸菌を分離した。これらについて、抗菌性など生理活性の検討作業を継続中である。大型スーパーマーケットおよび路傍の小規模食肉店など経営規模の異なる商店から精肉40検体を購入し、選択培地で大腸菌を分離した。PCRで種同定を行なったのち、1検体から最大2株分離し、合計68株の大腸菌を得た。DNAを抽出し、薬剤耐性遺伝子の検査を行った。その結果、テトラサイクリン耐性株(17.7%)、アンピシリン耐性株(7.4%)などが検出された。ESBL産生株やカルバペネム耐性株は検出されなかった。系統発生分類により、全体の68.4%が動物由来系統とされるB1グループであったことから精肉上の大腸菌は畜産動物に由来するものが主流であると考えられた。ウガンダでは食肉の冷蔵システムが未発達であり、精肉は屠殺された日に出荷・消費されるため、今回分離された精肉上の薬剤耐性大腸菌は農場から消費者へ直接伝達するおそれが強く、ヒトにおける耐性菌蔓延のリスクを高めるものと予想された。また、29年度にヨーネ病疑い事例から分離された抗酸菌の維持を行った。https://doi.org/10.1111/tbed.13024)。この一部は、ウガンダ国内に於ける初めてのメタゲノム研究となった。その中で、粗放な形態の伝統的畜産業では、薬剤耐性菌の侵襲が著しく少ないことを明らかにし、畜産物の品質管理の面で、ウガンダ農業が目指す方向性を明らかにできた。また生理活性を検定する乳酸菌も利用のしやすい菌種を中心に、無薬の伝統的畜産業から200株以上が分離されており、今後、生理活性検定を進める。最終年度に当たる31年度については、プロバイオティクス候補菌の選定を進めるほか、市販畜産物への薬剤耐性菌の侵襲状況についてさらに調査を進め、ウガンダ共和国の食品管理行政に役立てられるように、現地カウンターパートを通じて行政へ情報提供を行う。ウガンダ共和国の家畜および野生動物における薬剤耐性菌侵襲を評価すること、さらに薬剤を代替できるウガンダ産のプロバイオティクスを開発する目的で研究を実施している。平成28年度には、研究打ち合わせのための短期滞在1回のほか、1ヶ月間の調査を2回実施した。採材を行った地域は、首都カンパラに隣接するワキソ県とムピジ県で、大・中規模農場に加えて粗放な飼養形態の在来家畜からも採材を行った。薬剤耐性遺伝子の分布を網羅的に解析するために、家畜糞(ニワトリ糞9検体、ブタ糞9検体、ウシ糞9検体)からDNAを抽出し、品質による判定でそのうちの10試料について次世代シーケンサーの解析を行っている。また、現地で細菌を分離し,直接評価することを行った。対象とした細菌は、薬剤耐性を評価する大腸菌群とプロバイオティクス候補菌としてのLactobacillus属を中心とした乳酸菌である。前者は、ウシ27検体、ブタ11検体、ニワトリ10検体から大腸菌192株を分離した。後者はニワトリ10検体ブタ10検体、ウシ10検体、農場周辺の茎葉表面14検体から80株の乳酸菌を分離した。また、このほか予備的に抗酸菌についても分離を試みた。大腸菌192株中、137株がABP、CEZ、CPX、IPM、KM、GM、TC、CP、NA、CIP、STのいずれかに耐性を示した(大久保ほか、未発表)。畜種別では、ウシ由来株が68%、ニワトリ由来が78%、ブタ由来株が98%の耐性率を示した。ウシでは、ABPに対する単剤耐性を示した株が半数以上を占めているのに対し、ブタではABP/TC/STに対する3剤耐性かTC/STに対する2剤耐性を示す株のいずれかしか検出されなかった。ニワトリでもTC/STへの2剤耐性株が多く、中には4剤から6剤耐性を示す株が検出される農場もあった。今回の検査ではセフェム系薬への耐性菌は検出されなかった。計画通り首都近郊の集約的農場からの採材が順調に進み、薬剤耐性菌の侵襲状況が判断できた。同時にプロバイオティクス候補菌の探索も順調に進んでおり、特に、粗放な飼養形態の在来種ブタからも採材が可能となったことは特筆すべき事である。また、抗酸菌についても評価を開始し、現地における培養の成功で、次年度につながる結果を得ることができた。次世代シーケンサーを用いた網羅解析は、これまで配列の取得までは順調に推移しており、現在、MG-RASTでの解析を進行中である。野生動物からの採材は、大学構内のような国立公園外でも研究許可をUNCST以外にUWAからも必要であるとのことから、28年度は実施しなかった。29年度は、29年6月、9月および30年2月に渡航を実施した。6月渡航時には、マケレレ大学で開催されたInternational Scientific Cultural Boma and Conferenceに参加し、本研究の成果について代表者が講演した。

9月は、ムピジ県、ワキソ県およびムバララ県において家畜糞便35検体(ウシ9検体、ブタ11検体、ヤギ1検体、ニワトリ14検体)を採集し、大腸菌を分離した。分離株は単離後に大腸菌特異的PCRで種同定を行なった。1検体から最大4株分離し、合計127株の大腸菌を得た。同時に、粗放な飼育形態のアフリカ品種家畜(ニワトリ2検体、ブタ3検体、ウシ1検体)から乳酸菌約50株を分離するとともに、野生動物としてアフリカハゲコウ及びハダダトキの新鮮糞3検体を採取し、DNA検査を実施するため保存した。あわせて農場土壌の薬剤耐性菌汚染を評価するため、土壌試料のPCR検査を行ったところ、土壌中からは、使用薬剤との関連の強いtet系およびsul系の耐性遺伝子が高頻度で検出された。30年2月には、カンパラ市中の食肉店(30ヵ所)で購入した牛肉30検体から大腸菌を分離し、PCRで種同定を行なった。1検体から最大2株分離し、合計50株の大腸菌を得た。PCRによる薬剤耐性遺伝子の検出は、前年度と同様にβラクタム耐性遺伝子blaTEM、およびテトラサイクリン耐性遺伝子tetA, tetBのみが検出されている。これら大腸菌の各薬剤の最小発育阻止濃度測定の準備中である。このほか、28年度に引き続き抗酸菌の分離をヨーネ病疑い事例から行うとともに、28年の分離株のDNA検査をマケレレ大学講師が、30年1月に岐阜大学において実施した。28年度に得られたメタゲノムデータの解析が終了し、家畜糞便中で検出頻度の高い薬剤耐性遺伝子を決定することができた。現在、この解析データを含めてウガンダの家畜における薬剤耐性菌の論文を投稿中である。29年度は、当初計画通り、首都近郊ばかりでなく遠方のムバララ県での採材が実現され、首都近郊とは異なる生産形態における薬剤耐性菌の侵襲状況を把握することができた。プロバイオティクス候補菌の最終も順調に進んでいる。評価を開始した食肉や、家畜や農場環境由来の抗酸菌についても、現地協力者が順調に採材を進めており、次年度の評価につながる状況となっている。また、今年度には、農場の土壌の薬剤耐性遺伝子の検査を行うことができたほか、野生動物の糞便の解析を始めることができた。平成30年度は、9月から10月にかけてウガンダに渡航し、調査地の一つであるワキソ県カキリおよびチテベ周辺の農家で、粗放な飼養形態におかれたアフリカ在来種のブタ3頭、同ニワトリ3羽から糞を採取し、28および29年度に引き続き選択培地で乳酸菌を分離培養した。その結果、それぞれの家畜種からLactobacillus mucosaeなど47株とL. fermentumなど15株の乳酸菌を分離した。これらについて、抗菌性など生理活性の検討作業を継続中である。大型スーパーマーケットおよび路傍の小規模食肉店など経営規模の異なる商店から精肉40検体を購入し、選択培地で大腸菌を分離した。PCRで種同定を行なったのち、1検体から最大2株分離し、合計68株の大腸菌を得た。DNAを抽出し、薬剤耐性遺伝子の検査を行った。その結果、テトラサイクリン耐性株(17.7%)、アンピシリン耐性株(7.4%)などが検出された。ESBL産生株やカルバペネム耐性株は検出されなかった。系統発生分類により、全体の68.4%が動物由来系統とされるB1グループであったことから精肉上の大腸菌は畜産動物に由来するものが主流であると考えられた。
Quercetin誘導体による癌転移阻害の分子メカニズムの解明

人類は,400万年という長い歴史の中で,身のまわりの植物,動物,鉱物の全てを含む天然産物から病気と戦う武器として数多くの薬を見つけ,各地の文明の発展と共にその知識を大切に伝承している。樹木を含む薬用植物には多彩な成分が豊富に含まれるためにその生理機能や利用法も多様である。近年ではポリフェノールをはじめとした植物の二次代謝成分の生体に与える健康効果について数多くの報告がされ注目の的となっている。植物中の有用成分の単離,構造決定,あるいは作用機序の解明は食品,医薬,化粧品などの業界において強く望まれている。本研究で注目したのは,代表的なポリフェノールであるquercetinの抗癌活性である。Quercetinは樹木や薬用植物,食品に広く含まれている代表的なフラボノイドの一種であり,多くの生物活性が報告されている。その中でもquercetinは様々な癌細胞に対して転移の原因となる遊走と浸潤を阻害することが知られている。これまでに合成したquercetin誘導体を用いて,メラノーマ細胞の転移に与える影響を調査したところ,quercetinをメチル化体とすることでquercetinよりもはるかに強力な遊走阻害活性を示すことが明らかとなった。この活性の違いが,メラノーマ細胞内のタンパク質と本化合物との相互作用の変化によるものであると推測した。そこで本研究ではmethylquercetinと結合するタンパク質の単離同定と,生きた細胞内で「1分子イメージング」技術を用いてタンパク質と本化合物の相互作用を調査することで,分子レベルにおける作用メカニズムの解明を目指す。現在methylquercetinの7位選択的にビーズを結合させることに成功している。また,この合成したビーズを用いてプルダウンアッセイを行った結果,methylquercetinと結合するタンパク質のバンドを複数確認した。これらのタンパク質を酵素消化しMascot Searchによりタンパク質の同定を試みた結果,いくつかのタンパク質の候補が得られた。このタンパク質の同定はさらなる確認作業が必要であるが,推定されるタンパク質が得られたことは一つの進展であり,当初の計画と比較してもおおむね順調であると言える。得られたmethylquercetinと結合するタンパク質の同定をさらに進める。位置選択的ビーズの導入をmethylquercetinの他の部分でも同様に試み,得られるタンパクを確認することで,結合タンパクとmethylquercetinの構造との相関を調査する。同定したタンパク質及びquercetin誘導体を蛍光標識し,「1分子イメージング」技術により,生きた細胞内における両者の相互作用を観察することで,quercetin誘導体の癌遊走阻害メカニズムの解明を試みる。
古代刀の原料と製造技術に関する自然科学的研究

1)古代刀の調査日本の代表的な古代刀である蕨手刀の現状について調査した。主として宮城県,岩手県,福島県,北海道の代表的な蕨手刀を現地で発掘時期,同場所,形状,寸法,保存状態などを調べ,さらに可能な場合には以下の自然科学的研究を実施した。2)古代刀の自然科学的研究古代刀の自然科学的研究方法は確立されていなかったので、元素分析方法として化学分析方法とグロー放電質量分析方法を、観察方法としてX線マイクロアナライザー付き走査型電子顕微鏡法を研究し,さらに新たに鉄資料を対象とした鉛同位体質量分析法を研究した。この方法は青銅器の産地推定法に使用されている方法であるが,鉄資料中の鉛含有率は10ppm以下で少なく,分析技術上困難視されていた。研究者らは新たに乾式鉛同位体質量分析法を開発し,分析を可能にした。この鉄資料の鉛同位体分析法については、平成6年4月に,中国三門峡市で開催された国際冶金史会議(BUMA-3)で発表した。3)古代刀の製造技術の再現実験平成5年6月26,27日に,岩手県大東町大原において,刀匠菅原平氏の協力を得て、小型製鉄炉を使用し,蕨手刀の再現実験を実施した。餅鉄(円礫状磁鉄鉱)23kgとほぼ同量の木炭を交互に入れ,約1300°C,3時間で一次還元鉄を得,再溶解後,鍛造し,研磨し,刀を造った。この実験の解析結果と,原料である餅鉄,刀,蕨手刀そのものなどの自然科学的研究結果から,新たにつぎのことがわかった。通常のように砂鉄使用ではなく,塊状鉄鉱石使用であること,餅鉄の純度は高いことなどの結果を得た。また,餅鉄は比較的低い温度で還元されて鉄になり,生成した鉄の炭素含有率は砂鉄原料の場合に比較して低いことなどもわかった。1)古代刀の調査日本の代表的な古代刀の一つである蕨手刀については、これまで調査が本格的に行われていなかった。そこで、その所蔵場所,発掘時間,形状,寸法,保存状態などについての調査を開始した。本年度は宮城県,岩手県などの東北地方を中心として、25本の現地調査を行い、結果をまとめた。2)古代刀の自然科学的研究古代刀の研究方法がまず確立していなかったので、新たに、微量元素分析方法としてグロー放電・質量分析方法を、ミクロ非破壊観察分析方法としてX線マイクロアナライザー付き大資料室走査型電子顕微鏡を使用する方法を研究、確立して、適用した。以上の方法などで蕨手刀中の微量元素、金属組織、酸化系介在物などについて自然科学的に研究した結果、蕨手刀の原料は砂鉄ではなく、塊状の鉄鉱石が多く使用されたことを見いだした。この塊状鉄鉱石としては、この地方特産の餅鉄と呼ばれている円〓状磁鉄鉱(磁鉄鉱が川の流れなどによって角が取れて丸みを帯びたもの)を特に調査した。3)古代刀の製造技術の再現実験平成6年6月26、27日に、岩手県大東町大原において、刀匠菅原平氏のご協力を得て、鉄製製鉄炉を使用し、蕨手刀の再現実験を実施した。上記の餅鉄23kgとほぼ同量の木炭を交互に入れ、約1300°Cで約3時間かけて、第一次の還元鉄を得、再溶解後、鍛造し、研磨し、刀を造った。

この刀の肌は蕨手刀の肌に似ており、その中の酸化物系介在物も蕨手刀のそれに似ていた。製造した刀、製鉄原料、スラグなどについての、微量元素分析などの自然科学的研究は現在、実施中である。1)古代刀の調査日本の代表的な古代刀である蕨手刀について,前年度の宮城県と岩手県にひきつづき,東北地方全県の調査を実施した。さらに長野県,北海道などの調査も行った。現地で発掘時期,同場所,形状,寸法,保存状態などを調査し,さらに可能である場合には以下の自然科学的研究を実施した。2)古代刀の自然科学的研究古代刀の研究方法は確立されていなかったので,微量元素分析方法としてグロー放電質量分析方法と化学分析方法を,ミクロ観察方法としてX線マイクロアナライザー付き走査型電子顕微鏡法を研究し,さらに新たに鉄資料を対象とした鉛同位体質量分析法を開発し,適用した。この方法は青銅器の産地推定法に使用されている方法を,鉄資料に適用するものであるが,鉄資料中の鉛含有率は10ppm以下で少なく,これまでは分析技術上から困難とされてきた。本研究においては,乾式の新鉛同位体質量分析法を開発し,分析を可能にした。この鉄資料の鉛同位体分析法については,平成6年4月に,中国三門峡市で開催された国際治金史会議(BUMA-3)で発表した。3)古代刀の製造技術の再現実験前年度に実施した蕨手刀の再現実験の解析を実施するとともに,得た資料と原料とした餅鉄を分析した。X線マイクロアナライザー付き走査型電子顕微鏡法とグロー放電質量分析法によれば,一般的な古代刀のように砂鉄使用ではなく,通常の鉄鉱石使用であること,餅鉄の純度は高いことなどの結果を得た。また,餅鉄は比較的低い温度で還元されて鉄になり,生成した鉄の炭素含有率は砂鉄原料の場合に比較して低いことなどもわかった。
加齢にともなう動物臓器へのドリコールの蓄積に対する食餌タンパク質の影響に関する研究

ドリコールは種々の組織で加齢と共に増大する。コレステロール生合成経路と同じ経路で合成されるので、コレステロールと同様に種々の食餌因子によって影響を受ける事が考えられる。本研究ではドリコールの肝臓、腎臓、脳、脾臓、脂肪組織への蓄積に対して、大豆タンパク質やカゼインがどのような影響を与えるかを調べた。A.肝臓について:カゼインタンパク質食群では、加齢とともにコレステロールおよびドリコールが著しく増大したが、大豆タンパク質食群では肝臓へのコレステロールの蓄積が抑制されるのと同様にドリコールの蓄積をも抑制された。コレステロールエステルの割合が高い時は、ドリコールエステルの割合も高かった。このことからコレステロールおよびドリコールのエステル化は呼応しているものと推定された。B.肝臓について:加齢によるコレステロールの蓄積はなかったが、ドリコールの蓄積は観察された。やはり、大豆タンパク質食群ではカゼイン食群よりドリコール含量は低かった。C.脂肪組織について:加齢とともにコレステロール、ドリコール共に増加したが、タンパク質の種類によって変化はなかった。ただ、一般にはドリコールの前駆体ポリプレノールは肝臓、腎臓等の臓器では数パーセント以下であるのに脂肪組織では30-40%と高い割合で存在していた。ドリコール生合成系の研究に格好の材料となることを示している。以上の結果は平成5年8月のドリコールに関する国際学会(於:ポーランド)で発表する予定である。
昆虫における時間感覚の神経機構の解明

昨年度報告したコオロギの気流誘導性逃避行動に対する音刺激による修飾作用について,刺激のタイミングや持続時間の影響を検証し,昆虫の時間認知についてのメカニズムに迫った。200 msの音刺激の開始を気流刺激開始よりも0800 ms先行させた群(いずれも気流刺激と同時に終了)間と,音刺激の終了時間を気流刺激終了時より0600 ms先行させた群(いずれも気流刺激に800 ms先行させて開始)間で比較した。その結果,前者の群間では,音刺激を先行させた群では歩行方向は後方へ偏ったが,同時に開始した群(0 ms)は気流刺激のみを呈示した群と変わらなかった。一方,刺激終了時刻をシフトさせた群間では,終了時間にかかわらず歩行方向の後方への偏りがみられた。すなわち,音刺激による気流誘導性歩行方向の修飾は,気流刺激に対する音刺激の先行が必要であるが,それらの同時入力は必要としないことがわかった。以上の結果は,コオロギは気流感覚入力と聴覚入力の時間的関係を認識し,それに応じて気流逃避行動を変化させていることを示唆する。気流誘導性歩行における方向制御には脳からの下行性信号が必要であることから,音刺激のタイミングや持続時間の認知も脳内の神経回路によって生じている可能性が高い。そこで,食道下-前胸神経節間の腹側神経束から吸引電極による細胞外電位記録を行い,様々な時間パターンの組合せ刺激に対する下行性神経活動応答を比較した。その結果,気流刺激だけを呈示した場合や同時呈示した場合に比べて,音刺激を先行して呈示した場合には,それに続く気流刺激に対する応答の最大発火数が有意に減少することがわかった。すなわち,音刺激が気流刺激に対して先行するかどうかは脳内で認識され,歩行を制御する下行性神経活動が変化していることが示唆された。今後は脳内で複数種の感覚入力の時間関係を比較する神経機構についての解明を目指したい。27年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫が刺激に関する「時間認知」を行うかどうかを検証するため,コオロギを材料とした新しい学習タスクの確立を目指した。異なる持続時間を持つトーン音の弁別課題を実施するために,防音箱内にボール型トレッドミルと高速度ビデオカメラ,報酬用の水を与えるためのノズルを設置したトレーニングボックスを作成した。また罰刺激として電気ショックを与えるためにコオロギの腹部に銅ワイヤを埋め込んだ。トレッドミル上のコオロギに,5kHzのトーン音を1秒間提示し,その後口元の報酬用ノズルから水を与えた。また,4秒間のトーン音提示後に電気ショックを与えた。しかし,コオロギはノズルから押し出された水滴に気付かなかった。また,トーン音と電気ショックを組み合わせて繰り返し条件付けしても,音刺激に対してマウスなどでみられる「すくみ行動」のような明確な忌避的行動を示さず,時間弁別のためのタスクは年度内に確立できなかった。そこで,本研究室で新たに発見した,音刺激による気流誘導性逃避行動の修飾作用について,音刺激のタイミングや持続時間の影響を検証し,コオロギの音刺激の時間認知についてのメカニズムに迫った。これまで気流刺激に0.8秒間先行して10kHzの音刺激を提示した場合,側方からの気流に対する歩行の方向が後方に偏り,さらに反応閾値が上昇することを報告した。先行する音刺激を気流刺激前に終了しても同様の効果が見られたのに対し,トーン音を気流刺激と同時に提示したときはこの効果がみられなかった。以上の結果から,コオロギは音刺激を先に知覚した場合に逃避行動を変化させ,必ずしも両者が同時に提示される必要はないことが分かった。さらに先行する時間を0.4秒に短縮したところ,上記の効果に加えて身体をターンさせる角度が増大することが分かった。すなわち,コオロギは複数種の感覚刺激の同時性や時間のずれを知覚できることが示唆された。

その結果,気流刺激だけを呈示した場合や同時呈示した場合に比べて,音刺激を先行して呈示した場合には,それに続く気流刺激に対する応答の最大発火数が有意に減少することがわかった。すなわち,音刺激が気流刺激に対して先行するかどうかは脳内で認識され,歩行を制御する下行性神経活動が変化していることが示唆された。今後は脳内で複数種の感覚入力の時間関係を比較する神経機構についての解明を目指したい。動物が報酬をなかなか認知せず,条件付けが成立しなかったこと,また電気ショックに対する生得的な忌避行動がトレッドミルやビデオ撮影で観察できなかったため,時間弁別の効果的な学習タスクを確立できなかった。しかし,音刺激による気流誘導性歩行行動への影響について,音刺激の時間パラメータの効果を調べることによって,コオロギが複数種の感覚刺激の同時性や時間差を検出できるという新しい知見を得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は時間弁別のための新しい学習タスクとして,オペラント条件付けを用いた新しい課題を試す。手掛かりとなるトーン音を1秒間提示した後,コオロギが歩行するまで電気ショックを与え続ける。すなわちコオロギの歩行行動をトレッドミルで検出し,その運動によって罰刺激を止められることを学習させる。このオペラント条件付けが成功すれば,コオロギはトーン音によって歩行を開始するようになることが予想される。しかし,学習成立後もトーン音が終了した後に歩行がみられなければ電気ショックが与えられるように設定することで,コオロギはトーン音終了に向けて歩行頻度を増していくはずである。学習が十分に成立した後,1秒間より長いトーン音を提示し,そのときの歩行頻度の変化を調べることにより,コオロギが音の長さを知覚しているかを調べることができる。さらに,学習が成立したコオロギの下行性神経活動を細胞外記録し,1秒より十分長いトーン音を提示したときに,1秒後から発火が現れる,もしくは発火頻度が変化するユニットを探索する。また,音刺激により気流誘導性歩行行動を変化させる脳領域を明らかにするため,脳神経節の膜電位イメージングを行う。脳神経節を膜電位感受性色素によって染色し,気流刺激に先行して音刺激を与えた場合の応答パターンと,音刺激と気流刺激をそれぞれ単独で与えたときの応答パターンを比較する。これらの応答パターンの差分から,特に音刺激が先行した場合にのみ気流刺激に対する応答が変化した脳領域を抽出する。
メラノーマの発症・進展を劇的に抑制できる革新的分子標的療法の開発

代表者らが樹立したRET-トランスジェニックマウス(RET-マウス)は、皮膚メラノサイト系良性腫瘍を100%発症し、高率(約65%)にBRAF変異の無いメラノーマを発症する。本研究では、RET-マウスに発症した良性腫瘍とメラノーマを用いてマイクロアレイ解析を施行し、良性腫瘍の悪性転化の際に発現が変化する分子を選別した。次に、上記分子を対象とした機能解析により、これらの分子が足場非依存性増殖や浸潤・転移に関与していることを示した。以上のように、メラノーマのバイオマーカーとして有効な分子を提案しただけでなく、メラノーマの増殖・浸潤・転移を抑制する分子標的療法を開発するための基礎データを提供した。【背景・目的】メラノーマは皮膚科疾患において最も予後不良な疾患の1つである。近年、BRAF変異を持つ転移性メラノーマに対する分子標的療法の劇的効果が示され、治療後の再発はあるが、メラノーマ治療に光明が見出されつつある。一方、日本人の75%はBRAF変異認めないメラノーマを発症する。ゆえに、日本では、BRAF変異の無いメラノーマの浸潤・転移を制御することが、有効な治療法を開発するために、必要不可欠である。本研究では、まず、代表者らが樹立した良性腫瘍からBRAF変異の無いメラノーマを自然発症するモデル動物(RET-マウス)を用い、良性腫瘍がメラノーマに悪性転化する際に発現が変化する分子を網羅的に調べる。次に、癌との関連を示す報告が限られている分子に着目し、メラノーマの発症・進展を制御する新しい分子を用いた分子標的療法や新規バイオマーカーを動物レベルで提案する。最後に、本研究で標的とする分子の発現レベルや機能をヒトメラノーマでも確認し、本分子標的療法やバイオマーカーを臨床応用するための基礎データを固める。【研究成果】1、Espin分子の発現レベルが、ヒトやRET-マウスに発症したメラノーマにおいて、母斑や良性メラノサイト系腫瘍より高いこと発見した。これらの知見は、ESPIN分子の発現レベルが、メラノーマのバイオマーカーの候補になりえる可能性を示している。2、発現レベルの修飾により、Espin分子がメラノーマ細胞の浸潤を制御している可能性を示した。さらに、Espin分子の発現が低下したメラノーマ細胞では、マウスの肺転移が有意に抑制された。これらの知見は、Espin分子はメラノーマの浸潤・転移を制御する可能性が示された。3、国際共同研究により、RET-マウスに発症したメラノーマに対する免疫療法の開発を推進した。【背景・目的】近年、BRAF変異を持つ転移性メラノーマに対する分子標的療法の効果がヒトで証明され、再発はあるものの、メラノーマ治療の分子標的療法に大きな期待が寄せられている。一方、日本人においてBRAF変異のあるメラノーマは25%にすぎないので、BRAF変異の無いメラノーマの浸潤・転移を制御することが、大変重要である。次に、メラノーマの発症・進展を制御する新しい分子を利用した新規バイオマーカーや分子標的療法を動物レベルで開発する。最後に、本研究で標的とする分子の発現および機能をヒトメラノーマ細胞や組織でも確認し、バオーマーカーや分子標的療法を臨床応用するための基礎データを固める。【研究成果】1. Deltex-3-like(DTX3L)分子の発現レベルが、ヒトやRET-マウスに発症したメラノーマにおいて、母斑や良性メラノサイト系腫瘍より高いこと発見し、DTX3L分子の発現レベルが、メラノーマのバイオマーカーの候補になりえる可能性を提案した。3. LateSV40 factor 3(LSF)がマウスおよびメラノーマにて発現が低下していることを示した。さらに、LSFがp21のプロモーターとして機能し、メラノーマ増殖に関与している可能性を示した。4.国際共同研究により、リンパ節切除が、メラノーマの進展に与える影響を免疫学的に検討した。昨年までのEspin・Plxnc1・Gng2に加えて、DTX3L・LSF分子が、メラノーマの新規バイオマーカーの候補となりうる可能性を提案できた。さらに、DTX3L・LSF分子がメラノーマの増殖または転移を予防・治療できる分子標的療法の候補になりうる可能性を世界で初めて報告した。また、最近、注目されているメラノーマ免疫療法に加えて、プラズマ照射を用いた新規メラノーマ治療法を提案した。以上より、本研究は、当初の計画以上に進展していると判断できる。【目的】日本人のメラノーマでは、BRAF変異の無いものが多いにもかかわらず、メラノーマに対する有効な治療法は限られている。ゆえに、BRAF変異の無いメラノーマに対して有効なバイオマーカーや予防・治療法を開発することは極めて重要である。本研究では、動物モデル(RET-マウス)におけるメラノーマを対象とし、BRAF変異の有無に関係なく、メラノーマの発症・進展を抑制することができる分子標的療法およびバイオマーカーの開発に挑戦した。さらに、動物で得られた成果の一部をヒトのメラノーマで確認し、臨床応用のための基礎データの提供をめざした。【成果の概要】代表者等は、先行研究において、皮膚メラノサイト系良性腫瘍を100%発症し、高率(約65%)にBRAF

変異の無いメラノーマを発症するRET-トランスジェニックマウス(RET-マウス)の樹立に成功している。本研究では、まず、1個体のRET-マウスに同時に発症した良性腫瘍とメラノーマを用いてマイクロアレイ解析を施行し、良性腫瘍の悪性転化の際に発現が変化する分子群をピックアップした。次に、過去に癌との関連性の報告が少ない分子に着目して分子機能を調べ、メラノーマの発症・進展を抑制する効果のある分子を選別した。さらに、国際共同研究により、IL-4やT細胞を介した免疫療法を動物レベルで提案した。最後に、ヒトのメラノーマ組織を用いて、動物での成果を一部検証するとともに、バイオマーカとしての有効性を検証した。【成果の意義・重要性】本研究期間中に、メラノーマのバイオマーカーおよび分子標的療法の候補となりうる複数の分子を提案できた。代表者らが樹立したRET-トランスジェニックマウス(RET-マウス)は、皮膚メラノサイト系良性腫瘍を100%発症し、高率(約65%)にBRAF変異の無いメラノーマを発症する。本研究では、RET-マウスに発症した良性腫瘍とメラノーマを用いてマイクロアレイ解析を施行し、良性腫瘍の悪性転化の際に発現が変化する分子を選別した。次に、上記分子を対象とした機能解析により、これらの分子が足場非依存性増殖や浸潤・転移に関与していることを示した。以上のように、メラノーマのバイオマーカーとして有効な分子を提案しただけでなく、メラノーマの増殖・浸潤・転移を抑制する分子標的療法を開発するための基礎データを提供した。過去に、癌との関連がほとんど報告されていなかったEspin等の分子が、メラノーマの新規バイオマーカーの候補となりうる可能性を見つけただけでなく、メラノーマの増殖または転移を予防・治療できる分子標的療法の候補になりうる可能性を世界で初めて発見した。上記に加え、免疫療法によるメラノーマ予防・治療法を開発することに成功できた。ゆえに、本研究は、当初の計画以上に進展していると判断した。現在、新規に数種類の新規メラノーマ制御分子の分子機能進め、代表者オリジナルのメラノーマ自然発症マウス(RET-マウス)を用いた新規分子標的療法の開発を進める。さらに、最近、メラノーマ治療の主役になりつつある免疫療法にも着目し、RET-マウスを用いた国際共同研究をさらに積極的に推進する。また、医工連携研究により、メラノーマに対する新療法の開発を進める。最後に、複数の治療法を組み合わせることにより、より効果的なメラノーマ予防・治療法の開発をめざす。皮膚科学現在、新規メラノーマ制御分子の分子機能を解明した論文をまとめられる段階に至っているので、平成27年度中に国際科学誌に公表できるように研究を推進する。さらに、RET-マウスに発症したメラノーマを用いて新しい免疫療法を開発する国際共同研究を積極的に推進する。以上により、分子・細胞・マウスレベルで、メラノーマに対する革新的分子標的療法の開発を進めながら、標的分子のヒトメラノーマでの発現を調べ、分子標的療法やバイオマーカーを臨床応用するための基礎データを蓄積する。メラノーマの予防・治療だけでなくバイオマーカーとして有効である可能性のある新規分子を発見した。