hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属ガラス合金の軽元素周辺の局所構造と結合状態

金属ガラスでは主構成元素の原子半径が12%以上異なっていることが知られている。小さな原子は骨格となる大きな原子のランダム配列の間隙を埋めることによって、充填率と結合強度を上げる繋ぎの役割を果たすと考えられる。従って、高いガラス形成能の起源を探るうえで軽元素の役割を理解することは重要である。X線吸収微細構造(XAFS)測定で軽元素の吸収端を測定すれば軽元素周辺の局所構造が観測できるが、軽元素の吸収端は大気でも短距離で吸収される軟X線領域になるため、金属ガラスについては軽元素のXAFS測定がこれまで行われていなかった。そこで、He雰囲気でPd78Cu6Si16金属ガラスの軽元素SiのK吸収端XAFS測定を広島大HiSORのBL3で行った。計算と比較した結果、Si周辺の局所構造について第一近似としてはPd9Si2結晶と類似していることが分かった。Si周辺のPd配位数は8から10程度で、Si-Pd距離はPd9Si2結晶の場合より0.1Åほど小さい。このことからガラス状態では静的にランダムに揺らいだ配置をとるPdによってSiが圧迫されて押しつぶされていると見られる。アルゴンに酸素を含む雰囲でアニールされたPd78Cu6Si16では表面3μm程度の深さまでSiは酸化されており、Si周辺は4配位の酸素で囲まれている。軟X線領域にあるPdのL3吸収端XAFS測定によると、Pdは酸化されておらずPd周辺の局所構造はもともとPd同士の結合が主であるため、Siが酸化されても大きな変化は見られなかった。さらに、Cu周辺のK吸収端XAFS測定を高エネ研PFのBL9Aで行った結果、Cuも酸化の影響は受けず、組成から予想される通りCuの周辺構造はPdが主に配位しているモデルで合う。このことから、Siだけが選択的に酸化され金属ガラス表面にシリカガラスが析出していると考えられる。前半はZr60 Al15 Ni25のNi周辺局所構造をX線吸収微細構造(XAFS)により評価した。ガラスと結晶のNi-K吸収端測定は高エネ研PFのBL13にて行われた。解析の結果、ガラス試料ではメインのNi-Zr距離が2.62Å、結晶試料ではNi-Zr距離2.67Åであった。結晶ではNi-Ni距離2.49ÅのNiによる散乱の寄与が認められた。軽元素Alは原子数が少ない、散乱因子が小さい、原子間ポテンシャルの谷が重元素に比べ浅いため、他の元素に押しのけられるように原子間距離の分布が広がり易い、の理由でNi吸収端XAFSへの明らかな寄与を認めにくい。従って、軽元素そのものの吸収端測定が必要である。後半はPd78 Cu6 Si16金属ガラスの軽元素Si周辺局所構造を直接的に評価するため、Si-K吸収端のXAFS測定を広島大HiSORのBL3にて行った。AlはSiよりK吸収端エネルギーが低く測定可能領域から外れている。当初は超高真空での測定を考えていたが、Si-K吸収端で、Pd78 Cu6 Si16に対するX線進入長が0.55μmであることから表面には敏感ではないこと、X線の大気圧Heガスによる吸収は200mmの行程でも5%以下、厚さ20μmのBe窓による吸収が30%程度であることから、He置換雰囲気での測定で十分であった。測定の結果、約360eVの範囲(最大光電子波数9.7Å-1)まで振動構造が観測された。またSi-K吸収端の位置は酸化されたSiの場合より約7eV低く、第一ピークの形状からもSiの化学結合状態はSi単体のものと類似しており、Pd、Cu配位原子との間の電荷移動はほとんど無いことが分かった。次年度は解析を進めガラス状態のSi周辺局所構造を明らかにし、さらに結晶化した試料のSi-K吸収端測定を行いガラスと結晶でのSiの組み込まれ方の変化を調べる。

さらに、Cu周辺のK吸収端XAFS測定を高エネ研PFのBL9Aで行った結果、Cuも酸化の影響は受けず、組成から予想される通りCuの周辺構造はPdが主に配位しているモデルで合う。このことから、Siだけが選択的に酸化され金属ガラス表面にシリカガラスが析出していると考えられる。
進行性ミオクローヌスてんかん発症機構の解明

ラフォーラ病は、全身性痙攣を初発症状として6歳から18歳で発症し、刺激誘起性ミオクローヌス、欠神発作、大発作、痴呆、小脳失調症などの症状を特徴とするてんかんで、神経細胞内や心筋、肝細胞、皮膚の汗腺上皮細胞、骨格筋に検出されるポリグルコサンを主体とするラフォーラ小体が本疾患の特異的所見として知られる。症状は進行性であり、発症後10年以内に死亡する。今のところ有効な治療法は無い。脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓など広い範囲の組織に発現が認められる遺伝子EPM2Aにミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト、欠失変異など複数の疾患変異が報告され、EPM2Aがコードする蛋白はラフォーリンと名付けられている。我々は以前、ラフォーリン蛋白がdual-specificity phosphatase活性を持つこと、細胞内でポリリボゾーム画分に存在すること、疾患変異を有する蛋白が異常な胞状構造を形成しそこに蓄積することなどを明らかにしている。本課題において我々は、EPM2Aのalternativeスプライシングがラフォーリンの細胞内局在を左右すること、ラフォーラ病患者が早期発症痴呆を伴う型と伴わない型に分けられ、さらにEPM2A遺伝子エキソン1の変異と早期発症痴呆併発型とが関連すること、ラフォーリンがNifU-likeドメインを有するHIRIP5蛋白と結合することなどを明らかにし、論文として報告した。また、我々はEPM2Aノックアウトマウスを作成し、このマウスがラフォーラ病患者と同様に、神経細胞変性、脳波異常に加え、ラフォーラ小体を蓄積することを見いだし報告した。これらの知見は、ラフォーラ病発症メカニズムの理解、治療法の開発に大きく役立つものである。ラフォーラ病は、刺激誘起性ミオクローヌス、間代硬直発作などを特徴とし、運動失調、精神機能の退行を伴う進行性で重篤なてんかんであり、10歳から18歳で発症し多くの患者は発症後10年以内に死亡する。ポリグルコサンを主体とするラフォーラ小体と呼ばれる凝集体が、脳、肝臓、皮膚など広い組織で認められる。原因遺伝子としてEPM2Aが報告されており、以前我々はEPM2Aがデュアルフォスファターゼであるラフォーリンをコードすることを明らかにしている。本課題において我々はフォスファターゼ領域をコードするエクソンをターゲットとしたノックアウトマウスの作成に成功し、このマウスが、1.生後2ヶ月で広い範囲の神経組織において細胞変性を示すがラフォーラ小体の形成はこの時点ではさほど認められないことこと、2.4-12ヶ月でラフォーラ小体の蓄積が顕著に認められるようになること、3.ラフォーラ小体がユビキチンおよび、AGEP陽性であること、4.変性した細胞はアポトーシスの特徴(DNAフラグメンテーション、TUNEL陽性)を示さないこと5.9ヶ月頃より、ミオクローヌス発作とそれに伴う脳波異常を示すようになること、等を明らかにし、報告した。これらの知見は、発症メカニズムの解明に大きく役立つものである。又、我々はイーストツーハイブリッド法・substrate trap法を用いてラフォーリンに結合する蛋白・基質の候補を複数同定し、現在、その確認と結合の機能的意味を探っており、immunoliposome法を用いた遺伝子治療についても検討を重ねている。

今のところ有効な治療法は無い。脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓など広い範囲の組織に発現が認められる遺伝子EPM2Aにミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト、欠失変異など複数の疾患変異が報告され、EPM2Aがコードする蛋白はラフォーリンと名付けられている。我々は以前、ラフォーリン蛋白がdual-specificity phosphatase活性を持つこと、細胞内でポリリボゾーム画分に存在すること、疾患変異を有する蛋白が異常な胞状構造を形成しそこに蓄積することなどを明らかにしている。本課題において我々は、EPM2Aのalternativeスプライシングがラフォーリンの細胞内局在を左右すること、ラフォーラ病患者が早期発症痴呆を伴う型と伴わない型に分けられ、さらにEPM2A遺伝子エキソン1の変異と早期発症痴呆併発型とが関連すること、ラフォーリンがNifU-likeドメインを有するHIRIP5蛋白と結合することなどを明らかにし、論文として報告した。また、我々はEPM2Aノックアウトマウスを作成し、このマウスがラフォーラ病患者と同様に、神経細胞変性、脳波異常に加え、ラフォーラ小体を蓄積することを見いだし報告した。これらの知見は、ラフォーラ病発症メカニズムの理解、治療法の開発に大きく役立つものである。
空き空間の再生による郊外の複合化と継承に関する研究

本研究では,郊外における多様な主体による空き空間再生に着目し,それが地域空間とコミュニティの複合化へとつながるポテンシャルについて検討を行った。国内外でのフィールドワーク及びアクションリサーチより,1)空き空間を再生することで,多様な世代が気軽に会話を交わすサードプレイスを生み出すことができる,2)サードプレイスでの会話の中から,新しい担い手を発掘・支援するインキュベーター的な役割を果たし次の場づくりへとつながっていく,3)こうして新たな担い手による場によって地域が複合化を果たすことで,地域の魅力が高まる。今後はこのような新たな魅力を中古住宅の流通促進につなげるエリアマネジメントが必要となる。本研究は,今後に空き家・空き地の増加が見込まれる郊外エリアの住宅地を対象に,1)住宅のリノベーションやシェアハウス・カフェ・コミュニティ拠点へのコンバージョン,空き地の菜園化などの方策により,空き空間の再生行うこと,2)そのような空き空間の再生を通して,ほぼ均質な住宅のみによって構成されていた郊外住宅地において,サードプレイスとなる居場所,新たなワーキングスペースなど,従来は見られなかった場が生まれることによる用途の複合化が実現すること,3)そして,複合化の結果として新たな魅力が新規転入者を惹きつけ,地域の持続・継承へとつながること,の3段階について,それぞれフィールドワーク等を行うことによりそのポテンシャルを検討することを目的としている。平成27年度には,下記のフィールドワーク調査を実施した。1)空き地が増加しつつある住宅地(福岡市城内住宅)における空き地マネジメントの実態:将来の公園化構想のため,行政が住宅を買い取り空き地化・芝張りを進めている城内住宅を対象に,空き地の公共とコミュニティの協働での維持管理,およびコミュニティによる利活用の状況等について調査を行った。2)佐賀市における空き地を活用した居場所づくり「わいわいコンテナ」の実態分析:佐賀市内で空き地を活用して居場所づくりを行っているNPO等に取材するとともに,居場所の運営スタッフとして参与観察を行うことにより,新たな居場所が地域再生に及ぼす影響等について考察を行った。3)シアトルにおける住宅地内のサードプレイスの意義:シアトル郊外の住宅地においてカフェ等の観察調査を行い,時間帯ごとの訪れる客層とその過ごし方,他者とのコミュニケーションの取り方等から,サードプレイスとしての意義を考察した。平成27年度について,当初の計画では基礎的な情報収集を主な活動としていたが,フィールドワークの対象地がいち早く選定できた上に,対象地のコミュニティとも良好な関係を構築できたため,福岡市城内住宅と佐賀市において,NPO・自治会等の活動のリーダー等への取材,居住者や利用者へのインタビュー,各種図面の採取等のフィールドワークを行った。その結果,当初の研究目的に対する有効な知見を得ることができた。また,海外フィールドワークについては,当初は空き家・空き地化が極度に進行しているデトロイト市での実施を検討し対象コミュニティも選定していたが,治安上の問題等から変更し,シアトルでのサードプレイス調査を実施した。その結果,日常生活における地域の機能複合化の意義,魅力の維持と地域の持続可能性等に関する知見を得ることができた。また,同時に行ったニューヨークブルックリン・ハーレムでの視察では,特にジェントリフィケーションの状況について現地を見て回った。空き家だらけの荒廃したエリアにおいて,アートやNPOの活動等により地域のイメージが更新され,新たなミドルクラスが流入してくることで地域の価値が大きく向上している。一方で,家賃高騰で従来からのコミュニティが転出を強要されるなど,負の側面も有している。この視察により,新たな居住者獲得等の地域再生を常に望ましこととせず,多面的に考察するための視座を得ることができた。本研究は,開発から時間が経過し高齢化,更には空き家・空き地の増加が進行している郊外ニュータウンを対象に,従来の住宅のリフォームや建て替えのみでなく,中古住宅の創造的なリノベーション,シェアハウスやカフェ等へのコンバージョン,地域内の空き店舗やアパートの活用等を通して,地域空間の機能,さらにはコミュニティの複合化を果たすことにより,その持続性を高める方策を考察することを目的としている。研究開始当初は,アメリカのシアトル市およびカリフォルニア州の郊外エリアにて,サードプレイスとしてのカフェの実態,郊外エリアにおけるタウンマネジメントの方策と効果,住宅地のブランド価値の維持等に関するフィールドワークを行った。また,国内においても,福岡・佐賀や全国の調査対象地にて,戸建て住宅の創造的なリノベーションやカフェ等へのコンバージョン事例を取材し,その担い手の特徴や空間ストック流通の新しい仕組み等に関する知見を得た。平成28年度には,福岡県宗像市の日の里ニュータウンを研究の主要な対象と定め,エリア内での中古住宅のリノベーションと若い入居者のライフスタイルに関する調査を行った。その結果,開発から時間が経過した,いわゆるオールドタウンであるが,近年は単に安価な中古住宅ではなく,眺望,趣味を楽しむことのできる広い敷地,ニュータウンの縁で林と隣接する自然豊かな環境等のその場所固有の魅力を読み取り,中古住宅をリノベーションしながらその住宅と地域の空間ストックの魅力を上手く継承している住み手が現れ始めていることが,注目に値する傾向として見出すことができた。さらに日の里ニュータウンで,空き店舗のコミュニティ拠点へのリノベーションプロジェクトに継続して関わることで,高齢化している第一世代と現在の子どもたちやその親世代との交流の場が有効に機能していることを見出した。本研究では,当初は複数の住宅地を対象とし,そこでの空間実測や居住者・担い手へのインタビューを通して現在の状況を把握する実態調査を実施し,住宅地の今後のポテンシャルを考察する予定であった。しかし,そのようなフィールドワークのなかで出会った日の里ニュータウンの担い手と強い協力関係を築くこととなったため,協働で活動を行いながら研究を行うアクションリサーチへとスムーズに移行することができた。

その結果,より深く実態を理解することができた上,協働のアクションを行うことにより,地元コミュニティや不動産マーケットのニーズについても試行しながら把握する機会に恵まれた。さらに,ニュータウンの第一世代を中心とした地元コミュニティ団体,親となった第2世代を中心とした小学校オヤジの会,空き店舗再生の拠点づくり活動を行っているクリエイティブな担い手などの多様な地域の主体と共に新たなアクションを起こしていく機運を高めることができた。また,自治体やニュータウン内に団地を持つUR,市内の工務店や不動産会社,市外の大手ハウスメーカーやリノベーションデザイナーとも関心を共有し,共同のプロジェクト実施に向けて現在は検討を進めている。こうした多様な主体と協働で行う日の里ニュータウンでの空間ストック再生のアクションリサーチを実施することにより,実際のマーケットを狙ったビジネスモデルとなりうる再生のあり方を検討していくことができる。本研究は,開発から時間が経過し高齢化,更には空き家・空き地の増加が進行している郊外ニュータウンを対象に,従来の住宅のリフォームや建て替えのみでなく,中古住宅の創造的なリノベーション,シェアハウスやカフェ等へのコンバージョン,地域内の空き店舗やアパートの活用等を通して,地域空間の機能,さらにはコミュニティの複合化を果たすことにより,その持続性を高める方策を考察することを目的としている。最終年度である平成29年度には,対象フィールドを福岡県宗像市の日の里ニュータウンに定め,コミュニティの複合化を目指すための様々な活動を行った。特に,研究代表者らのチームで実際に空き店舗を賃借し,地域の活動拠点「日の里サードベース」の運営を行った。その結果,1)仲間を募りながらDIYリノベーションを実施することによりリノベーションに関心を持つ居住者のネットワーク形成を図った。実際に,参加者の中から自宅で住み開きリノベーションを行うものが現れるなど,地域での効果が生まれている。2)サードベースでのまちづくりワークショップやイベント等を連続して実施をする中で,地域居住者,地域内外の意欲的な担い手,関心を持つ企業,行政等と頻繁な議論を行う場が形成された。さらに,次年度以降に地域のエリアマネジメント団体を設立する母体となっている。3)地域で新たな仕事を始めるためのスタートアップの場として,無料での場所の提供を行った。その結果,サードベースでの活動を通して,実際に近隣の空き店舗を単独で借りて営業する担い手も現れた。特に,住宅地において,子育て中の女性のスタートアップの場が求められていることが明らかとなった。以上の拠点を活用したアクションリサーチを元に,次年度以降は民間の資金等を活用したエリアマネジメント活動に取り組むことを計画している。
Aurora-Aの安定性を制御するリン酸化調節機構と口腔癌におけるその異常

本研究は、リン酸化/脱リン酸化を介した、ユビキチン・プロテアソーム系によるAurora-Aキナーゼの分解メカニズムの詳細について明らかにし、口腔癌でみられたリン酸化異常に起因する過剰発現の原因を解明することを目的とした。そのために、タンパク結合や、Aurora-AのフォスファターゼであるPP2A活性について詳細な検討を行うと同時に、Bサブユニットを介したPP2Aの機能調節機序とその生物学的意義について検討し、明らかにした。本年度は主に、Aurora-Aのセリン51のリン酸化・脱リン酸化動態の詳細と、その調節機構を明らかにするための検討を進めた。まず、リン酸化と脱リン酸化のタイミングを明らかにするために、HeLa細胞を用い、細胞周期同調法を応用して間期(G2期)から分裂期(M期)、そして間期(G1期)までのリン酸化状態をリン酸化特異的抗体を用いて調べたところ、G2期からM期にかけて、タンパク量の増加と共にリン酸化量が増加し、M期中期前後にそのピークを迎えた後、M期後期G1期に向かってリン酸化量が減少した。このタイミングは、Aurora-Aのキナーゼとしての活性のピークと一致したことから、その整合性を認めると共に、Aurora-Aによるセリン51の自己リン酸化を示唆しうるものであると考えられた。次に、セリン51をリン酸化ずるキナーゼの同定として、まず自己リン酸化について検討するために、GFPタグを付与したAurora-A発現ベクターを構築し、そのHeLa細胞内での発現を確認した。今後、今回作製したGFP-Aurora-Aに加え、FLAGタグのAurora-AやリコンビナントAurora-Aなどを用いて、自己リン酸化について検討を進めていく。次にフォスファターゼの同定として、PP2Aの関与について重点的に検討を進めた。PP2Aの足場サブユニットであるAサブユニットには、AαおよびAβがあるが、この両者のshRNAベクターを入手し、HeLa細胞に導入した後、薬剤選択を行なって、発現抑制効果の高いクローン(それぞれ、sh-Aαおよsh-Aβ)を得た。これらの細胞をnocodazoleによる同調をかけ、M期におけるセリン51のリン酸化状態を検討したところ、対照HeLa細胞と比べ、sh-Aαによって劇的にリン酸化量が増えていることがわかった。このことは、PP2Aがセリン51を脱リン酸化することを証明する有力なデータとなりうる。現在、さらなる確証を得るために、AαおよびAβの発現ベクターを構築しており、sh-AαによるAurora-Aのセリン51リン酸化量上昇を、Aαの強制発現によって抑えられるかどうかを検討する準備をしている。本年度は主に、Aurora-Aを脱リン酸化するPP2Aに重点を置いた検討を行った。そこで、PP2Aの活性を制御するメカニズムについて考察するため、Bサブユニットの中でも比較的よく研究されている因子であるB56αについて、その動態制御を検討した。B56αは、細胞周期を通して常に発現量が維持されているが、分裂期ではトライトン不溶画分に移行していることがわかった。また、免疫蛍光染色によって、それが染色体の動原体上に局在していることが確かめられた。また、RNAiとプラスミドを用いた過剰発現系の検討により、B56α自身も細胞分裂期にリン酸化によって活性が制御されており、染色体分配に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。このことは、PP2Aの新しい活性制御機構を明らかにしたのみならず、PP2Aによるタンパクの脱リン酸化が細胞分裂の中で劇的に変化する様々なタンパクのリン酸化状態を制御する為に非常に重要な役割を担っており、リン酸化/脱リン酸化の絶妙なバランスの上に細胞分裂が営まれていることが考察された。次に、口腔癌細胞株におけるB56αのリン酸化状態を調べたところ、ある種の細胞株では、正常なリン酸化調節がなされていないこともあきらかとなった。この結果から、脱リン酸化酵素であるPP2Aは、Aurora-Aなどの癌遺伝子産物を脱リン酸化を介して制御しているのみならず、PP2A活性もまた、癌遺伝子産物を含む様々な因子によって制御されている可能性が考えられた。本研究結果は、細胞分裂や発癌の鍵因子であるAurora-Aの詳細な制御機構を明らかにしたのみならず、脱リン酸化酵素が細胞癌化の抑制に果たす役割を明らかにし、新たな分子治療薬のターゲットとなりうる可能性まで示唆するものである。
生物におけるホウ素の新機能の検証－ビタミンB6代謝に対するホウ酸の役割－

必須元素とは、生物のライフサイクルを完結させるために欠くことのできない元素を指す。ホウ素は植物の微量必須元素のひとつであり、実験的に示されている生理機能は植物細胞壁のペクチン質多糖の架橋のみである。近年、酵母、動物においてもホウ素の有用性が報告されてきている。これらの生物は細胞壁ペクチンを持たないため、細胞内の可溶性画分に存在するホウ素に未知の生理機能がある可能性を示唆するものであるが、植物細胞壁以外のホウ素の生理機能は明らかにされていない。先行研究において、高濃度のホウ酸が植物(シロイヌナズナ)においてビタミンB6欠乏障害を緩和する可能性を見出した。本研究では、高濃度のホウ酸が植物のビタミンB6欠乏障害を緩和する機構の解明を通じて、細胞壁とは異なる、可溶性画分に存在するホウ素の生理機能を示すことで、生物に普遍的なホウ素の役割の解明を目指した。シロイヌナズナにおいて高濃度ホウ酸がビタミンB6欠乏障害を緩和するという現象の確認とビタミンB6定量を行う栽培条件を確定させるため、ビタミンB6代謝に関わる複数の酵素遺伝子の変異株を対象として、様々なホウ酸濃度存在下での成長試験を行った。その結果、各変異株でホウ酸による成長抑制の回復が観察される光条件や培地ホウ酸濃度は異なることが明らかになり、各変異株の応答の違いを見出した。ホウ酸の効果が観察される条件の違いがあるものの、各変異株においてホウ酸依存的な成長抑制の回復が確認された。成長回復の原因がビタミンB6量の変化に起因するのか否かを明らかにするため、HPLCによるビタミンB6定量の測定系の新規立ち上げの準備を進めた。また、ホウ酸の効果の普遍性を明らかにするため、酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるビタミンB6合成酵素遺伝子の破壊株での成長試験のため、培地組成検討を含めて準備を実施した。本年度は植物および酵母の双方の実験において、解析の準備に時間を要した。特に、植物のビタミンB6定量実験では、ビタミンB6代謝に関わる複数の酵素遺伝子のシロイヌナズナ変異株において、ホウ酸による成長回復が顕著に認められる環境条件(光条件および培地中ホウ酸濃度)が異なることが見出されたため、定量を行う環境条件の設定に時間を要する結果となった。当初の計画に従い、以下の実験を進める。(1)ビタミンB6合成が低下したシロイヌナズナ変異株における高濃度ホウ酸による生育抑制の回復の分子機構を明らかにするため、ホウ酸がビタミンB6合成に与える影響に焦点をあて、異なるホウ酸条件で生育させた野生型株およびビタミンB6合成変異体植物を用いて、植物体内のビタミンB6量の蓄積量の変化をHPLCによる測定を行って明らかにする。並行して、(2)高濃度のホウ酸によるビタミンB6欠乏症の回復が、酵母においても観察されるかを検証する。ビタミンB6合成酵素遺伝子を欠損した酵母を用いて、ビタミンB6欠乏培地での成長抑制がホウ酸添加によって回復するかを明らかにする。加えて、野生型株酵母においては、ホウ酸を欠如させた環境で生育させ、成長抑制などのホウ酸欠乏症状が認められるかを明らかにする。研究推進のため、短時間の研究補助者の雇用を計画している。

当初の計画に従い、以下の実験を進める。(1)ビタミンB6合成が低下したシロイヌナズナ変異株における高濃度ホウ酸による生育抑制の回復の分子機構を明らかにするため、ホウ酸がビタミンB6合成に与える影響に焦点をあて、異なるホウ酸条件で生育させた野生型株およびビタミンB6合成変異体植物を用いて、植物体内のビタミンB6量の蓄積量の変化をHPLCによる測定を行って明らかにする。並行して、(2)高濃度のホウ酸によるビタミンB6欠乏症の回復が、酵母においても観察されるかを検証する。ビタミンB6合成酵素遺伝子を欠損した酵母を用いて、ビタミンB6欠乏培地での成長抑制がホウ酸添加によって回復するかを明らかにする。加えて、野生型株酵母においては、ホウ酸を欠如させた環境で生育させ、成長抑制などのホウ酸欠乏症状が認められるかを明らかにする。研究推進のため、短時間の研究補助者の雇用を計画している。シロイヌナズナにおける栽培条件の設定、HPLC測定の新規立ち上げに時間を要したため、当初予定していたビタミンB6代謝に関わる遺伝子変異株でのビタミンB6定量には至らなかった。また、情報収集のため学会参加を計画していたが、研究遂行を優先したため次年度使用額が生じた。次年度に酵母での様々な培地条件での成長観察実験およびビタミンB6定量の機器分析を進めるための物品費(消耗品)として使用する。また、研究推進のため、短時間の研究補助を雇用する。
モダリティと視点に関わる言語現象と統語構造の多層性

研究分担者のにし垣内は、「指定文」と「潜伏疑問」の統語構造と論理構造の分析を進め,その中で「自分」の解釈など「視点」に関わる要因が関与している現象についての分析を進めた。これらの構文に関わる省略現象の分析の中で,ロゴフォリックな要素の有無が関与することがあることを示した。「理由」と「原因」--「理由」を主要部とする連体修飾構造では「証拠性」(evidentiality)の文脈が生じ,「自分」のロゴフォリックな使用があること,それに対し「原因」を主要部とする連体修飾構造ではそのような文脈が生じないという現象について考察した。この内容は10月にStuttgartで行われたWorkshop “Logophoricity and Perspectivization in Wackershofen"で招待発表を行った。副詞節の基本的な構造とwh疑問文の部分については、研究成果の一部が国際誌に2つ受理された点で順調に研究計画が進んでいる。副詞節とモダリティの部分については、一部を金管の本に組み込む見通しがついた点で順調に研究計画が進んでいるが、まだ十分には洗練された状態にはなっていない。モダリティーについては、ヨーロッパから出版される本に収納する誘いを受け、審査の結果、論文が受理され掲載されることになった点で順調に研究が進んでいるが、最終原稿がまだ完成しておらず、まだ十分ではない。研究分担者とのモダリティと副詞節の関係を詰めることを目指す。最終的には、論文に形にすることを目指す。多様な構文に見られる「自分」や主観性を表す言語表現のふるまいに関して「視点」に関わる統語範疇(「視点」投射)が関与していることを示すことが本研究の一次的な目的であり,これまで「指定文」「潜伏疑問」「XをYに」構文などに関連して,それぞれまとまった業績をあげている。「阻止効果」について,Nishigauchi (2014)に対する反応が中国語,韓国語に関する研究の中で出ているので,今年度以降の研究の中で中国語,韓国語に力点を置いた「阻止効果」の研究を進める。本研究は、従来は語用論,談話分析の研究対象であったモダリティおよび視点に関わる意味的な言語現象を,統語構造を細分化し,動詞の屈折に関わる領域(IP)および補文構造に関わる領域(CP)をそれぞれ複数の「層」からなる構造と考え,モダリティ・視点の現象をそれぞれの統語的な「層」と関連づけることで人間の言語の意味と構造の関係を明らかにすることを目標にしている。この目標を実施計画に沿って、次のように達成した。(1)まず、研究代表者が、研究協力者との共同論文として、ベルリンとジュネーブで開催された国際会議において、副詞節について研究発表を行なった。そこでは、副詞節に生じるIP領域のモダリティの性質と話し手のモダリティが関与する擬似条件文の性質を取り上げて、世界に向けて研究成果を発信した。(2)次に、視点については、英語のhow come疑問文を用いて、上記の国際会議で発表した。そこでは、how come疑問文においてゼロ主語が生じることを明らかにした。(3)さらに別の構文として、言いさし文を取り上げ、研究代表者が研究協力者と共に、日本語と西フラーメン語(West Flemish)に見る言いさし文について議論を重ね、言いさし文が両言語で終助詞と共に用いることができる点に着目し、その性質を多層の統語構造で表現する方法を探った。(4)バリエーションについては、研究代表者と研究協力者が議論を重ねた結果、how come疑問文が3つのバリエーションに分類できることを突き止めた。そして、その3つのバリエーションのパタンを多層構造を用いて、CP領域にあるFinという機能語の名詞性と補文標識の発音可能性に還元する可能性を模索した。これらの成果は、忘備録にまとめ、次年度以降に論文として国際的なジャーナルに発表する準備をした。(1)副詞節については、研究計画の通りに、研究代表者は、研究協力者とともに国際会議で研究発表を行ない、日本語に見る副詞節に生じるIP領域のモダリティの性質と話し手のモダリティが関与する擬似条件文の性質を取り上げて、世界に向けて発信すると同時に問題点を探ることができた点で、当初の研究目標は達成された。(2)次に、視点については、英語のhow comeの構文を用いて、研究代表者は、研究協力者と議論を重ね、書き手の視点から書かれる日記英語にhow come疑問文がゼロ主語を伴って生じることを初めて明らかにすることができた。これは当初に計画していなかった以上の成果である。(3)言いさし文については、研究代表者は、研究協力者と共に、日本語と西フラーメン語に見る言いさし文について議論を重ね、言いさし文が両言語で終助詞を持てる点を明らかにした。そして、その性質を多層の統語構造で表現する方法を探ることができた。日本語と西フラーメン語の共通性は、当初に計画していた以上の成果である。この点のおおまかな論点は明らかにされ、論文にまとめる準備はできたので、当初の研究計目的は達成された。(4)バリエーションについては、研究代表者と研究協力者が議論を重ねた結果、how come疑問文が3つのバリエーションに分類できることを突き止めることができた。具体的には、CP領域にあるFinという機能語の名詞性と補文標識の発音可能性に還元する可能性を模索できた。

(1)と(3)と(4)については、忘備録にまとめることができ、将来国際的なジャーナルに掲載する準備ができたので、研究目標は達成することができた。研究代表者と研究分担者との共通の論点については、2017年度に日本英語学会でシンポジウムを開催し、発表することが決まり、その内容をつめることができたので、研究目標は達成することができた。本研究は、従来は語用論,談話分析の研究対象であったモダリティおよび視点に関わる意味的な言語現象を,統語構造を細分化し,動詞の屈折に関わる領域(IP)および補文構造に関わる領域(CP)をそれぞれ複数の「層」からなる構造と考え,モダリティ・視点の現象をそれぞれの統語的な「層」と関連づけることで人間の言語の意味と構造の関係を明らかにすることを目標にしている。この目標を実施計画に沿って、次のように達成した。(1)まず、文の「層については、研究代表者が、研究協力者との共同で副詞節の階層関係を取り扱った論文を海外の国際誌に投稿した。(2)次に、モダリティについては、話し手の主観性が関与する英語のhowcome疑問文について、韓国、中国、スイスの国際会議で発表した。(3)視点、モダリティ関係の表現については、日本英語学会で研究分担者が司会を務めるシンポジウムにおいて、研究分担者との話し合いを踏まえた研究成果の一部を発表した。(4)「主観表現」に関わる分析に関連し、「視点投射」(POV-projections)の下位投射との微細な対応関係を示し,主要部上昇によって視点領域が広がる統語的な分析を行った。(5)「理由」「原因」という従来「非飽和名詞」と呼ばれているものを含む構文の中で見られる「視点」現象を考察した。研究分担者と話し合いを持ち、副詞節内部に生じる視点、モダリティ表現の性質をある程度解明でき、学会で発表できたので、概ね順調に研究が進展していると思われる。また、その基盤となる、文の「層」について、研究協力者たちと、副詞節を用いて、論文が完成したので、この点についても、ある程度は順調に研究が進んでいると思われる。研究分担者のにし垣内は、「指定文」と「潜伏疑問」の統語構造と論理構造の分析を進め,その中で「自分」の解釈など「視点」に関わる要因が関与している現象についての分析を進めた。これらの構文に関わる省略現象の分析の中で,ロゴフォリックな要素の有無が関与することがあることを示した。「理由」と「原因」--「理由」を主要部とする連体修飾構造では「証拠性」(evidentiality)の文脈が生じ,「自分」のロゴフォリックな使用があること,それに対し「原因」を主要部とする連体修飾構造ではそのような文脈が生じないという現象について考察した。この内容は10月にStuttgartで行われたWorkshop “Logophoricity and Perspectivization in Wackershofen"で招待発表を行った。副詞節の基本的な構造とwh疑問文の部分については、研究成果の一部が国際誌に2つ受理された点で順調に研究計画が進んでいる。副詞節とモダリティの部分については、一部を金管の本に組み込む見通しがついた点で順調に研究計画が進んでいるが、まだ十分には洗練された状態にはなっていない。モダリティーについては、ヨーロッパから出版される本に収納する誘いを受け、審査の結果、論文が受理され掲載されることになった点で順調に研究が進んでいるが、最終原稿がまだ完成しておらず、まだ十分ではない。
反芻家畜におけるCa、P、Mgの消化管からの吸収像および吸収率に関する研究

反芻家畜におけるCa、P、Mgの消化管からの吸収像および吸収率を、めん羊を用いて検討した。Pは十二指腸以前で分泌を示したが、その量は、濃厚飼料:粗飼料比、飼料給与量、飼料の物理的形態によって異なり、この分泌が唾液経由であることが推察された。十二指腸を流れるP量は、摂取量の26倍で、飼料摂取量、飼料の物理的形態、さらには動物のP栄養状態によって大きく変化した。そのため十二指腸以降でのP吸収像は、摂取量と糞排泄量から得られるみかけの吸収像とは異なるものであった。十二指腸以降でのP吸収量は、唾液経由のP分泌量にほぼ見合う量であったが、吸収効率は6087%となった。これはPの摂取量など、動物のP栄養状態と関係が深いようであった。Pの吸収の主要な部位は小腸前半部で、大腸からの吸収は少なかった。また、小腸上部でのPの吸収には、内容物(液)の流速、P濃度、pHなどが大きく影響することが認められた。Caは濃厚飼料多給時には、十二指腸以前での吸収も認められたが、粗飼料多給時には摂取量の12倍の分泌を示し、これも唾液経由であると考えられた。唾液経由のCa分泌が多いと小腸での吸収量や吸収効率が高くても、内因性分泌Ca量に及ばず、Ca出納が負になる傾向が認められた。Mgは濃厚飼料多給時には、十二指腸以前での吸収が認められた。粗飼料多給時には唾液経由の分泌もあったが、十二指腸以前での吸収を示した。但し、十二指腸以前での吸収をのがれたMgは小腸で吸収された。反芻家畜の消化管からのCa、Mg吸収に及ぼす諸要因についての研究は現在遂行中あるが、まだ充分な結果を得ていない。モデル数式の作成は研究成果がそろった上で行う予定である。めん羊の消化管からのCa、P、Mgの吸収の様相、吸収率と飼料要因の関係について調べた。粗飼料多給(乾草8:穀類2)条件下で、飼料摂取量の違い、乾草の切断長の違いが消化管からのミネラル吸収に及ぼす影響を、第一胃フィストラ、十二指腸及び回腸カニューレを装着しためん羊を用いて検討した。Caは十二指腸以前で0.52.0g/dの分泌を示した。粗飼料多給で、乾草の切断長が長いと、Caのみかけの吸収は負となり、切断長を短くすると吸収は改善された。Pは唾液から多量の分泌があるので十二指腸通過P量は510g/dと摂取量の3倍以上の値であった。この十二指腸通過P量は、P摂取量(飼料摂取量)に比例し、又乾草切断長が長いと多くなる傾向があった。Pの主たる吸収部位は小腸で、十二指腸通過P量の7585%が小腸から吸収されていた。しかしバランス試験では、腸管からの吸収効率の低い区の方が出納は正を示す傾向があった。Mgのみかけの吸収率は粗飼料多給時には2030%で、十二指腸以前での吸収が主であったが大腸からも吸収が見られた。小腸はむしろMg分泌部位のようである。濃厚飼料多給時でPの摂取量が多い時は、みかけの唾液P分泌量は約2.5gと少く、第一胃壁からの吸収の存在が示唆された。

この時腸管からの吸収効率は低いにもかかわらず、みかけの吸収は正となった。以上の結果からPの吸収に関して次のことが推察された。即ち、唾液経由で多量のPが分泌され、第一胃での再吸収を十分受けずに十二指腸以降へPが流出すると、腸管での吸収効率が高くても、分泌しただけのPを回収することができず、Pの出納が負になる(この時、尿へのP排泄は無視し得る量である。)。第一胃および腸管からのPの再吸収に影響を与える要因については今後の研究課題である。飼料の物理的形態の違いが、唾液経由のリン(P)の動きに及ぼす影響を、めん羊で検討した。粗切飼料では粉砕飼料に較べて唾液分泌量、第一胃内容量、第一胃流出速度ともに増加する傾向があった。また第一胃内容液中のP濃度は粗切飼料の方が低かった。これは唾液P濃度を反映していると考えられた。飼料の物理的形態による飼料通過時間の変化とCa,P,Mgの吸収率の関係については現在分析中である。小腸の2ケ所にカニュ-レを装着しためん羊を用い、一時分離小腸による灌流試験で、Pおよび他のミネラルの吸収を検討した。510ml/min(7.214.4l/d)の灌流速度では、流速が遅いほど水分吸収率、P吸収とも高かった。灌流液のP濃度を1050mMの範囲で変えると、水分吸収率には違いはなかったが、P吸収率は濃度が高くなるほど減少する傾向にあった。しかしPの総吸収量は濃度が高い程増加し、本実験下では飽和状態はみられなかった。今回の試験では、灌流液中のCa,Mg濃度が低く設定されていたので、Ca,Mgの吸収については明らかな傾向は見られなかった。Ca,Mgの吸収については、カニュ-レの装着部位も含めて今後の検討が必要である。invivo状態での灌流試験は、動物を種々の条件下において(P充分、P欠乏など)行う予定である。なお、本年度の実験の過程で、P充分飼料からP不足飼料への切り換えや、唾液Pの除去が、唾液を中心とするPおよび水分代謝に影響を及ぼす傾向が見られたので、今後この点についても検討を進めていく予定である。飼料の物理的形態の違いが、めん羊の消化管内でのCa、P、Mgの分布に及ぼす影響を調べた。6cm切乾草給与区と、0.2cm粉砕ペレット乾草給与区の2区をもうけ、それぞれの飼料で3頭ずつのめん羊を2週間飼育した。給餌は3時間間隔で1日8回の等量分与とし、少なくとも屠殺1週間前より指標物質として一定量のポリエチレングリコ-ルを給与した。めん羊は飼料摂取後3時間目に、麻酔下で放血屠殺後、開腹し、消化管の11ケ所の部位から内容物を摂取し、ミネラルの分布を検討した。6cm区では水分流量が0.2cm区より多いこと、第一胃液中のP濃度が低いことから、唾液分泌量の増加が推察された。しかし、1日当たりの唾液P流量は両区間に差は認められなかった。飼料摂取量の56倍のPが唾液から分泌され、12指腸通過P量の約80%が小腸から吸収されていたが、飼料区間による差は認められなかった。Caは摂取量の0.51倍が唾液経由で分泌されているようであった。6cm区ではCaの内因性分泌量が多く、小腸での吸収量は0.2cm区より多いにもかかわらず、みかけの吸収率は-40%と負の値となった。Mgは唾液経由の分泌は1020%と、P、Caに較べると少なかった。0.2cm区では前胃部での吸収を、6cm区では分泌を示した。小腸上部の2ケ所にカニュ-レを装着しためん羊3頭を用いて一時分離小腸による潅流法でミネラルの吸収を検討した。潅流速度が早いとPの吸収率は低下したが、Ca、Mgの吸収率に影響はなかった。但し、吸収速度はいずれも増加する傾向があった。また潅流液pHを4.47.0と高くするとP、Naは吸収速度、吸収率ともに低下した。しかし潅流液からNaを除いてもPの吸収に影響はなかった。
サルモネラのTypeIII病原蛋白分泌システムの機能解析

(1)AAA+プロテアーゼによるサルモネラのTypeIII輸送装置の発現制御サルモネラのAAA+プロテアーゼ破壊株を作成しその病原性について検討した結果、1onとclpXP破壊株において病原性の低下を認めた。また、clpXP破壊株では鞭毛やSPI1病原因子などTypeIII輸送装置によって分泌される蛋白の分泌量が増加していることを確認した。そこで、この原因について検討した結果、鞭毛の過剰発現は、鞭毛レギュロン転写階層の最上位で正の転写因子として働くF1hD_2C_2複合体の蓄積のためであることを確認した。また、1on破壊株ではSPI1病原因子の分泌量の著しい増加と培養上皮細胞に対する細胞侵入性の亢進を確認した。Lon変異株では、マクロファージ感染の後にSPI1の発現が抑制されるのであるが、その抑制が行われず、SPI1病原因子が宿主細胞内に過剰に蓄積することを明らかにした。この細胞内に蓄積したSP1l病原因子はCaspase-1とCaspase-3を活性化し培養細胞に過剰なアポトーシスを誘導することを明らかにした。(2)分子シャペロンによるサルモネラの病原性とTypeIII輸送装置分子シャペロン遺伝子破壊株を作成し、その病原性を検討した。その結果、dnaK破壊株において病原性の著しい低下が起こることを確認した。またdnaK破壊株では、TypeIII輸送装置を用いて分泌される病原因子(SPI1,SPI2)や鞭毛の発現が強く抑制されている事を明らかにした。(3)経口生ワクチン開発clpXPや1on破壊株はマウスに対して弱毒化し持続感染性を示すことが確認した。そこで、マウスに経口接種でclpXPや1on破壊株を与えた。その結果、どちらの株においても一回の経口接種で強力な感染防御効果が得られることを明らかにした。このように、これら破壊株の生ワクチンとしての有効性を示した。病原細菌が宿主に感染するさいに、ストレス蛋白と総称されるAAA^+プロテアーゼ(lon,clpXP,clpAP,hslVU)や分子シャペロン(dnaK,groEL)などが、宿主の防御機構に起因するストレスで誘導される。そこで、我々はストレス蛋白と病原性に注目して研究を進め、サルモネラ属細菌のプロテアーゼ(lon,clpXP)や分子シャペロン(dnaK)破壊株においてSPI1病原因子や鞭毛などTypeIII輸送装置を用いて細胞外に分泌される蛋白群の分泌量の変化を確認した。dnaKシャペロン破壊株においては、SPI1病原因子や鞭毛の分泌量が著しく減少することを発見した。そこで、dnaK破壊株の病原性について検討した。なお、dnaK破壊株は温度感受性の表現型を示し、37°C以上では著しい増殖阻害が観察される。そこで、上記温度で増殖可能なサプレッサー変異株を分離してマウスや培養細胞を用いた研究をおこない、dnaK破壊株では著しい病原性の低下が起こる事を確認した。またlonプロテアーゼ破壊株では、SPI1病原因子が過剰に分泌されることを発見した。そこで、その原因を調べる目的でβ-ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子としながら、Lonのターゲット蛋白の同定を試みた。その結果、SPI1遺伝子群の転写活性化因子HiID, HiIC蛋白がターゲットである可能性が高いことを発見した。そこで抗HiID, HiICの抗体を作成し、細胞内存在量を定量した結果、lon破壊株において安定化が起こりHiID, HiICが蓄積していることを確認した。

またSPI1病原甲子は、感染初期にマクロファージにアポトーシスを引き起こす特性があることが知られているが、lon破壊株では野生株と比較してSPI1病原因子の過剰分泌によるアポトーシスの過剰誘導が起こっていることを確認した。病原細菌からの感染防御の為に宿主細胞は様々な防御機構を有する。病原細菌は、それら防御機構に対抗するために、ストレス蛋白と総称される蛋白群を合成する。ストレス蛋白には、AAA^+プロテアーゼと総称されるプロテアーゼ群(lon, clpXP, clpAP, hslVU)や分子シャペロン(dnaK, groEL)などが存在している。そこで、我々はこれらストレス蛋白と病原性に注目して研究を進め、サルモネラ属細菌のAAA^+プロテアーゼや分子シャペロン破壊株を組織的に作成することにより、その表現型を調べた。その結果、lon, clpXPプロテアーゼ破壊株においてTypeIII輸送装置を用いて細胞外に分泌される蛋白群の分泌量に変化が起こることを確認した。lonプロテアーゼ破壊株においてはサルモネラの小腸上皮細胞侵入に関わるSPI1病原因子の過剰分泌、clpXP破壊株ではSPI1病原因子と鞭毛の過剰分泌を確認した。また、dnaKシャペロン破壊株では、SPI1病原因子や鞭毛の分泌量が著しく減少していた。そこで、lon, clpXP, dnaK破壊株の病原性について検討した。その結果lon, clpXPでマウスでの病原性の低下と持続感染性を確認した。この結果は、これら破壊株が生ワクチンとして有望で有ることを示しており、マウスを用いた研究より実際に生ワクチンとして有効であった。SPI1病原因子は、感染初期にマクロファージにアポトーシスを引き起こす作用があることが知られているが、lon破壊株はcaspase-1とcaspase-3を活性化することによりアポトーシスを感染初期に強く誘導することを明らかにした。サルモネラは全身感染の過程でマクロファージ内での増殖が必要であり、lon破壊株の病原性低下は過剰なアポトーシスによるマクロファージ内での増殖抑制による可能性を考えた。
トランスクリプトーム・シストローム統合解析による肺小細胞癌転写ネットワークの解明

Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)から51細胞株の小細胞癌(SCLC)のトランスクリプトームのデータを入手しクラスタリング解析・主成分分析等を行ったところ、1. ASCL1 high、2. NeuroD1 high、3. YAP/TAZ highの3つのクラスターに分類された。E-MTAB-2706に登録されている30種類のSCLCのRNA-seqのデータを用いても同様の結果が得られた。YAP/TAZ, ASCL1. NeuroD1の高発現はそれぞれexclusiveである傾向が観察された。それぞれのクラスターにおける細胞の形態学的特徴を観察したところ、YAP/TAZ highのsubgroupでは接着系のphenotypeが多く、ASCL1 highのsubgroupでは浮遊系のphenotypeが多かった。In vitroでは、H209, Lu134A, Lu134B, Lu139, SBC3, SBC5の6つのSCLC細胞株を用いてYAP・TAZの発現を確認したところ、SBC3ではYAP/TAZの高発現、SBC5ではYAPの高発現が確認された。これらの細胞においてsiRNAを用いてYAPのノックダウンを行ったところ、細胞形態が小型・円形に変化した。YAPの下流の遺伝子をmicroarrayにより探索したところ、AJUBAやAMOTL2などの遺伝子が同定された。さらにsiRNAによりAJUBAのノックダウンを行ったところ、YAPのノックダウンと同様に細胞形態の小型・円形化が認められ、YAP-AJUBAのシグナルが細胞形態の維持に関与している可能性が示唆された。最後にYAP/TAZのdrug sensitivityへの影響を検討した。公開されているSCLC細胞株のIC50のデータを用いてYAP/TAZ highとlowのsubgroupにおける薬剤感受性の比較したところ、YAP/TAZ high群では、SCLCの治療でよく使われるEtoposideやTopotecanなどの薬剤へのIC50が有意に低くこれらの薬剤への治療反応性が高いと考えられた。またYAP/TAZ high群ではあらたにPLK inhibitorやmTOR inhibitorのIC50が明らかに低いことが判明し、これらの新規薬剤がYAP/TAZ high群で有効となる可能性が示唆された。
筋細胞におけるカベオラの機能と形成調節機構の解明

本研究は、筋細胞に特異的に発現するカベオリン3と、多くの細胞に発現するカベオリン1について、両者の性質の違いを解明することで、カベオラという細胞膜のくぼみの筋細胞における生理的機能を理解することを目標として行ってきた。今年度の目標であった、異なるカベオリンによって形成されるカベオラ中の分子組成の違いの検討、は残念ながら遂行できなかった。しかし、以下に示すように、少なくとも一部の平滑筋組織では、カベオリン1とカベオリン3が別個のカベオラを形成して存在する可能性を組織学的に示せたことは、今後平滑筋細胞を材料として、それぞれのカベオリンが形成するカベオラを免疫沈降法などにより別個に単離し、両者の分子組成を比較検討することで、それそれのカベオラに共通の性質や固有の性質を解明できるという方向性を示す重要な知見であると考えている。平滑筋組織におけるカベオリン1,3の発現の組織学的解析の結果マウスの種々の平滑筋組織におけるカベオリン1、3の発現を免疫組織化学とウエスタンブロットにより解析した結果、カベオリン1が瞳孔散大筋を除くほとんどすべての平滑筋細胞に発現するのに対し、カベオリン3は、瞳孔括約筋、消化管の輪走筋、膀胱、一部の血管平滑筋などに強く発現していた。さらに胃の輪走筋と膀胱の平滑筋について、カベオリン1とカベオリン3の染色を高倍率で観察した結果、両者の染色は完全には一致しないことが明らかになった。この結果は、平滑筋細胞の細胞膜上にはカベオリン1からなるカベオラが多く存在する部位と、カベオリン3からなるカベオラが多く存在する部位が存在することを示すと考えられ、これらのカベオラがそれぞれ異なる機能を果たす可能性を示唆すると考えている。本研究の目的は、筋細胞に特異的に発現するカベオリン3からなるカベオラと、多くの細胞に発現するカベオリン1,2からなるカベオラについて、その形成機構と分子組成の両面を比較、解析することによって、カベオラの生理的機能への理解を深めることである。1.平滑筋組織におけるカベオリン1,3の発現の組織学的解析マウスの種々の平滑筋組織におけるカベオリン1,3の発現を免疫組織化学法により解析した結果、カベオリン1はすべての平滑筋細胞で発現が見られたが、カベオリン3は、消化管の縦走筋、子宮平滑筋、血管平滑筋などで発現が見られなかった。文献によると、これらの平滑筋には自律神経支配の形態学的特徴に共通点が見られる。この結果は、カベオリン3の発現と自律神経支配の様式の関連を初めて示唆するものであり、平滑筋におけるカベオリン3の機能を解明する上で重要な手がかりになると考えている。今後さらに免疫電顕法により単一のカベオラ内にすべてのタイプのカベオリンが存在するのか、カベオリン3からなるカベオラとカベオリン1,2からなるカベオラは別個に存在するのかを明らかにする予定である。2.培養筋細胞を用いたカベオリンファミリー遺伝子の発現調節機構の解析培養筋芽細胞C2C12の筋細胞への分化に伴うカベオリンファミリー遺伝子の発現を解析し、カベオリン3の発現増加と同時に、カベオリン1の発現が抑制されることを明らかにした。さらにこの現象の分子基盤を明らかにするために、カベオリン1遺伝子の転写開始点の上流1.3kbとカベオリン3遺伝子の転写開始点の上流1.8kbを用いてプロモーターアッセイを行った。しかし現在のところ、転写調節に重要なシスエレメントの同定には至っていない。今後は両遺伝子についてさらに広範囲にわたって転写調節領域の解析を行い、筋細胞におけるカベオリンファミリー遺伝子の発現調節機構を明らかにしたい。

この結果は、平滑筋細胞の細胞膜上にはカベオリン1からなるカベオラが多く存在する部位と、カベオリン3からなるカベオラが多く存在する部位が存在することを示すと考えられ、これらのカベオラがそれぞれ異なる機能を果たす可能性を示唆すると考えている。