hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
国立科学博物館附属自然教育園における自然生態系特別調査

本研究の目的は、都市環境下にある自然教育園内の植物・動物などの生物群集、大気・土壌・水収支などの無機的環境を含めた自然生態系の調査をするとともに、これまで実施した調査の結果と比較し、この20年間にどのように変遷したかを明らかにすることである。調査の結果、泥土中の花粉分析により古代から現代までの森林の歴史的変遷、また過去120年の気候の資料から気温の上昇・湿度の低下現象が明らかになった。特に温暖化の影響で、シュロ・シダ植物・変形菌・鳥類・蝶類などで暖地性の種の侵入・定着が確認された。この他の無機的環境の調査の結果、水収支では不透水地の増加に伴い流出量が増加していること、土壌重金属ではニッケル・鉛には変化がなく、銅・亜鉛が高い傾向を示したこと、降下ばいじんでは変化がなかったことなどがわかった。植物群落調査では、遷移の進行に伴い園内の森林が常緑樹林化し、陽性の野草類・人里植物・低木などが減少傾向にあった。また、森林の低木層に群生していたアオキが胴枯病により激減、逆にイロハモミジが10倍に増加するなど興味深い現象も見られた。ファウナ・フローラ調査では、菌類とササラダニで新種、地衣類とクモ類・ササラダニ類では日本初記録種、シダ植物・変形菌類・クモ類・蝶類・蛾類で希産種が確認された。前回の調査と比較すると、シダ植物・変形菌類・鳥類・陸産貝類・カイガラムシ類などは漸増、コケ類・多足類・ミミズ類・蝶類・蛾類は減少、直翅類・トンボ類は激減傾向にあった。これらの原因は、調査の精度にも関連するが、森林の常緑林化に伴う環境の変化、都市化による当園の孤立化などが大きな要因と考えられた。調査の結果、前回の調査(1976年)の記録と比較すると、この20年間に大きく変貌していることがわかった。シダ植物・帰化植物・陸産貝類・多足類・クモ類・アリ類・アブラムシ類・カイガラムシ類・ハエ類などでは、確認できなかった種、新たに確認された種もかなりみられた。また・東京都内ではすでに姿が見られなくなってしまったチョウ類・トンボ類・鳥類などの希少種がいまだ健在であることもわかった。さらには、ササラダニ類などの微小生物では、日本初記録の種も数種確認されている。全体的には、都市環境下にある自然教育園の森林は、都市化の影響を受けるとともに、植物群落の遷移が進み、常緑樹林化している。このため、都市環境の悪化に伴い、スギ・モミ・アカマツなどの針葉樹の激減、ミズキ・イイギリ・キハダなどの落葉樹の世代交代、シイ・カシ・シロダモなどの常緑樹の増加などの現象が見られる。また、都市の温暖化により、亜熱帯性植物のシュロの繁栄、亜熱帯性シダ植物の侵入などの現象も見られている。また、土中の花粉の分析調査では、歴史時代に入ってから、関東地方の台地の植生がいかに人為的に改変され、現在に至ったかが明らかになった。本研究は、2年目に当たるが、今年度の調査の結果新たな知見が得られている。植物相・動物相の調査では、蘇苔類・地衣類・子のう菌類・変形菌類・陸産貝類・クモ類・ササラダニ類・多足類・ミミズ類・ガ類・ハバチ類・アリ類・アブラムシ類・ハエ類・鳥類などで新たに生育・生息が確認された種も多く見られた。また、東京都内では姿が見られなくなった生物が多い中で、クモ類・ガ類・バッタ類・ハエ類などでは希少種がいまだ健在であることもわかった。さらには、蘇苔類・地衣類・クモ類・ヤスデ類では日本初記録の種、ササラダニ類・ムカデ類などの微小生物では、新種と考えられる種も確認されている。また、植生の調査では、自然教育園の森林は、植物群落の遷移が進み、常緑樹林化している傾向が見られた。このため、落葉樹林下に常緑樹が侵入し林床植物の単純化を招き、路傍でも人里性の帰化植物が減少している。一方、やや耐陰性のあるイロハモミジがこの35年間に10倍に増加したり、都市気候の温暖化の影響で亜熱帯性植物のシュロが繁茂するなどの現象も見られている。無機環境の調査では、自然教育園内の土壌中には長年にわたって蓄積された銅・亜鉛などの重金属が多いことや、明治以来120年間の都市気候と水収支の関係なども明らかとなった。

植物群落調査では、遷移の進行に伴い園内の森林が常緑樹林化し、陽性の野草類・人里植物・低木などが減少傾向にあった。また、森林の低木層に群生していたアオキが胴枯病により激減、逆にイロハモミジが10倍に増加するなど興味深い現象も見られた。ファウナ・フローラ調査では、菌類とササラダニで新種、地衣類とクモ類・ササラダニ類では日本初記録種、シダ植物・変形菌類・クモ類・蝶類・蛾類で希産種が確認された。前回の調査と比較すると、シダ植物・変形菌類・鳥類・陸産貝類・カイガラムシ類などは漸増、コケ類・多足類・ミミズ類・蝶類・蛾類は減少、直翅類・トンボ類は激減傾向にあった。これらの原因は、調査の精度にも関連するが、森林の常緑林化に伴う環境の変化、都市化による当園の孤立化などが大きな要因と考えられた。本研究の目的は、都市環境下にある自然教育園内の植物・動物などの生物群集、大気・土壌・水収支などの無機的環境を含めた自然生態系の調査をするとともに、これまで実施した調査の結果と比較し、この20年間にどのように変遷したかを明らかにすることである。調査の結果、泥土中の花粉分析により古代から現代までの森林の歴史的変遷、また過去120年の気候の資料から気温の上昇・湿度の低下現象が明らかになった。特に温暖化の影響で、シュロ・シダ植物・変形菌・鳥類・蝶類などで暖地性の種の侵入・定着が確認された。この他の無機的環境の調査の結果、水収支では不透水地の増加に伴い流出量が増加していること、土壌重金属ではニッケル・鉛には変化がなく、銅・亜鉛が高い傾向を示したこと、降下ばいじんでは変化がなかったことなどがわかった。
新規抗癌ウイルス製剤を用いた末梢循環腫瘍細胞の検出の検討

本研究では、テロメア伸長酵素であるhTERT遺伝子と緑色蛍光蛋白質のGFP遺伝子を組み込んだアデノウイルスであるテロメスキャンを利用して末梢循環腫瘍細胞の検出について研究を行った。採血した末梢血中に口腔扁平上皮癌細胞を混ぜでテロメスキャンを感染させ、蛍光発光をさせることは可能であったが、SCCAやEGFRのmRNA遺伝子発現や蛋白発現との比較を行ったところ、蛍光発光との間に十分な相関はみられなかった。この原因として、培養条件や細胞の保存状態、ウイルスの感染効率等が考えられた。しかしこれらの結果から血液中で、口腔扁平上皮癌細胞が一定期間存在しうる可能性について示唆することができると考えられた。口腔癌において遠隔転移の制御は、所属リンパ節への転移の制御とともに極めて重要な予後因子である。癌細胞の脈管内浸潤を末梢循環腫瘍細胞のモニタリングで観察できるようになれば、治療方針の選択や予後の判定に非常に有用であると予測される。本研究では、癌細胞に特異的に感染して発色するウイルス製剤を用いて、末梢血液中に循環する腫瘍細胞のモニタリングによる口腔癌の新たな診断用技術の開発を目指している。In vitroでの選択的な腫瘍細胞の増殖と腫瘍細胞を蛍光発光させることによる可視化について実験を行っている。ヒトの口腔扁平上皮癌細胞を低分化型、中分化型さらに高分化型の3タイプに分け、さらにヒト口腔正常上皮細胞にテロメライシンを感染させ、テロメラーゼ依存性のウイルス増殖を、リアルタイムPCR法を用いてウイルスの力価について比較検討してきた。また、抗E1A抗体を用いた免疫組織学的染色やウエスタンブロット法によるウイルス感染効率も検討、解析を行っている。その結果、リアルタイムPCR法においてはウイルスの増殖や遺伝子の発現とその蛋白の発現量に相関がみられた。また、ウイルスを用いてテロメスキャンを感染させた口腔扁平上皮癌細胞を、蛍光顕微鏡にて観察することがまだ可能となっていない。ウイルス感染とテロメスキャンの増殖さらにGFP遺伝子の発現について検討中である。そのため、テロメスキャンの増殖とGFP遺伝子の発現の相関に関して、現在フローサイトメトリー解析による遺伝子の発現について実験を重ねているところである。まだ定量的な相関性を示す実験データーは得られていない。口腔癌の遠隔転移の制御には、所属リンパ節への転移を抑制することがまず重要な点となる。そのため、癌細胞の脈管内浸潤と末梢循環腫瘍細胞をモニタリングすることを計画した。In vitroで選択的に腫瘍細胞のなかでウイルスを増殖させることで腫瘍細胞を蛍光発光させることを利用して研究を行っていた。ヒトの口腔扁平上皮癌細胞を、低分化型、中分化型さらに高分化型の3タイプに分け、コントロールとしてヒト口腔正常扁平上皮細胞を用いて、これらの細胞にテロメライシンをウイルスの感染により導入し、テロメラーゼ依存性のため、正常細胞ではウイルスが増殖せず、腫瘍細胞でのみ特異的に増殖するウイルスについて、リアルタイムPCR法を用いてウイルスの発現を比較検討した。ウイルスの感染効率については、抗EIA抗体を用いた免疫組織学的染色とウエスタンブロット法を用いて検討した。さらにフローサイトメトリー解析による遺伝子発現解析の実験を行った。しかしテロメスキャンの増殖とGFP遺伝子の発現の相関に関しては十分な関連性が得られていない。最終年度では、末梢循環腫瘍細胞モデルの確立にむけて、採血した末梢血液中に口腔扁平上皮癌細胞を混和し、一定期間培養した後、赤血球溶解液を加え、遠心分離したペレットにウイルスを感染させ、高感度冷却3CCDカメラにて観察した。口腔扁平上皮へウイルスの感染が起こりうることは確認できたが、その再現性にかけることがみられた。しかし、血液中で、口腔扁平上皮が一定期間存在しうる可能性について、示唆する結果は得られた。末梢循環腫瘍細胞(CTC)を高感度で検出できるように、研究を進めている。まず、in vitroにおけるテロメスキャンの選択的増殖と蛍光発光の可視化について検討している。低分化、中分化型さらに高分化型のヒト口腔扁平上皮癌細胞、およびヒト上皮異形成細胞、さらにヒト口腔正常細胞にテロメライシンを感染させ、テロメラーゼ依存性のウイルス増殖能について、リアルタイムPCR法によりウイルスの力価を測定した。抗E1A抗体を用いた免疫組織染色やウエスタンブロット解析を行い、E1A遺伝子の発現とウイルスの増殖の相関を検討した。その結果、リアルタイムPCR法によるウイルスの増殖と遺伝子の発現、さらにその蛋白発現量にほぼ正の相関がみられた。口腔の扁平上皮癌細胞にテロメスキャンをウイルスを使用して感染させ、蛍光顕微鏡を用いて、GFPによる蛍光発現を観察することで、ウイルス感染とテロメスキャンの増殖、さらにGFP遺伝子の発現について観察した。その結果口腔の扁平上皮細胞にウイルスを感染させることが可能であった。

さらに感染した細胞ではGFP遺伝子が発現し、蛍光の発現を確認することができたことから、テロメスキャンの増殖が生じていることが示された。しかしながら、テロメスキャンの増殖とGFP遺伝子の発現の相関に関しては、十分な実験結果はこれまで得られていない。現在フローサイトメトリー解析によるGFP遺伝子の発現について検討しているところであるが、まだ定量的な相関性を示す実験データーは得られていない。ヒト口腔扁平上皮癌細胞と正常上皮細胞にテロメライシンを感染させ、テロメラーゼ依存性のウイルス増殖を、リアルタイムPCR法を用いてウイルスの力価については計測が可能となっている。また、抗E1A抗体を用いた免疫組織学的染色やウエスタンブロット法によるウイルス感染効率もほぼ安定的なデーターの取得が可能となっているまたリアルタイムPCR法による遺伝子の発現も信頼性のあるデーターが得られてきた。また、ウイルスを用いてテロメスキャンを感染させた口腔扁平上皮癌細胞を、蛍光顕微鏡にて観察することがまだ可能となっていない。ウイルス感染とテロメスキャンの増殖さらにGFP遺伝子の発現について検討中である。そのため、テロメスキャンの増殖とGFP遺伝子の発現の相関に関して、現在フローサイトメトリー解析による遺伝子の発現について、定量的な相関性を示す実験データーは得られていない。ウイルス感染をさせた細胞をフローサイトメトリーにかける際の処置について、うまくいかず時間がかかっていた。とくに感染効率について、ある程度一定の割合で行えるように研究している。蛍光の発現やリアルタイムPCR法についてはほぼ順調に実験を行うことができた。口腔扁平上皮癌細胞を、蛍光顕微鏡にて観察することがまだ可能となっていない。ウイルス感染とテロメスキャンの増殖さらにGFP遺伝子の発現について検討していく。そのため、テロメスキャンの増殖とGFP遺伝子の発現の相関に関して、フローサイトメトリーによる解析で遺伝子の発現を検索していく。腫瘍細胞のEGF receptorの発現やSCC antigenの発現と各種腫瘍マーカーとについて測定を行い、そのウイルス感染とテロメスキャンの増殖との関連性について検討する。トランスレーショナルリサーチとして、早期の臨床応用を目指す。当初の予定していた末梢循環腫瘍細胞(CTC)のモニタリングの可能性についての基礎実験については今年度概ね達成することができた。今後は血流に流れている口腔扁平上皮癌細胞に対し、ウイルス製剤を感染させ、可視化することができるかを検討する予定である。今後も口腔扁平上皮癌細胞へのウイルス感染を行い、その可視化についての研究費が一番多くかかると思われる。また、フローサイトメトリーに関する試薬や高感度蛍光検出システムの開発研究、蛍光顕微鏡下での観察に経費が多く必要となると思われる。腫瘍マーカーの計測や学会発表、論文発表の費用も予定している。CTCのモデルの確立およびウイルス製剤感染による選択的可視化についての検討を予定している。
女性の就労、平等な役割分担に立ちふさがる「構造的壁」:地域格差のマルチレベル分析

本研究は、地域における女性の就業・育児支援環境と女性の就業と家庭内での役割分担との関連を検討し、以下の分析結果を得た。(1)地域労働市場における女性の専門技術職率の高さと保育施設の充実は女性の就業と正の相関を持ち、個人的な要因による影響を統制した上でも、労働市場における女性の活躍度や保育施設の充実度が女性の就業を促進する。(2)その一方で、女性の管理職率の高さは女性の就労を抑制する。家事分担については、(3)労働市場における女性の活躍度が高い地域では夫の家事参加率が高いが、(4)地域の子育て支援度は、夫の家事参加に有意な効果を持たないことが明らかになった。(1)女性労働、家庭内役割分業に関する研究文献を幅広く収集し、女性労働史、労働社会学、家族社会学、ジェンダー論等の多様な分野からの文献の検討を行った。これまでの成果と残された課題を整理する中で、本研究の目的である社会構造的要因と個人要因の関連の分析が危急の課題であることが確認された。(2)2000年2003年JGSSの個票データを基に、本研究にて用いるデータファイル作成を行った。使用変数の記述的分析のほか、欠損情報の分析や欠損によるバイアス分析などの分析を実施した。統合、加工した個人レベルデータを都道府県ごとにファイリングし、分析・整理を行っている。(3)都道府県レベルデータの収集を行った。都道府県ごとの(a)有配偶女性就労率、男女賃金格差、女性の管理職・技術職率などの経済データ、(b)保育所数・定員、児童在所率など都道府県の育児支援策データ、さらに(c)県民の性別役割分業に関する社会通念など多岐にわたる指数の収集を行っている。具体的には、男女共同参画委員会による男女共同参画指数など、主に官庁・地方公共団体等よりデータの収集を行った。また、都道府県ごとに適当なサンプル数が必要となるため、不足する場合に備え、データの統合の可能性を検討した。さらに、都道府県レベルデータとの時期的適合性の確認を行った。現在、比較可能性を高めるため、データの標準化に留意し、一次データの再編成も必要に応じ行っている。収集したマクロデータは都道府県ごとにファイル化している。(4)次年度に予定しているマルチレベル分析のため、研究環境の物的な整備を行った。具体的には、マルチレベル分析を行うために専門的な統計ソフトウェア、高性能コンピュータを導入した。本研究は、地域における女性の就業・育児支援環境の地域格差と女性の就業と家庭内での役割分担との関連を検討した。データは、女性の就業については2000年から2003年の「日本版General Social Surveys」(大阪商業大学比較地域研究所・東京大学社会科学研究所)、家事分担に関しては2006年の「男女の働き方と仕事と生活の調和に関する調査」(内閣府男女共同参画局)を用いた。本研究の成果は以下の点にまとめられる。(1)地域労働市場における女性の専門技術職率の高さと保育施設の充実は女性の就業と正の相関を持ち、個人的な要因による影響を統制した上でも、労働市場における女性の活躍度や保育施設の充実度が女性の就業を促進することが示された。(2)その一方で、女性の管理職率の高さは女性の就労を抑制することが示唆された。これら結果から、保育施設の充実や魅力ある就業環境の整備が女性の就労を促す上で重要な条件であることが示された。しかし、長時間労働など管理職になるために職場への強いコミットメントが要求される場合、単に管理職に多くの女性を登用する手法では全般的な女性の就業拡大につながらないことも示唆された。家庭内における家事分担については、(3)労働市場における女性の活躍度が高い地域では夫の家事参加率が高いが、(4)地域の子育て支援度は、夫の家事参加に有意な効果を持たないことが明らかになった。女性が活躍できる地域では、女性の経済的自立の可能性も高まるため、女性の家庭内での交渉力が高まることなどが推測される。今後、夫の家事参加を促進するためには、保育施設の充実など女性の育児負担軽減を主とした就業支援策のみならず、父親育児休業など直接的に男性の家事育児参加を促す政策も必要になると考えられる。
骨髄異形成症候群の白血化過程におけるテロメア短縮様式とG2期制御機構

骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome;MDS)は約30%が白血化し、その過程が病型移行という形で観察されるため、固形癌における多段階発癌と同じ分子機序が想定されている。一方、染色体末端のテロメア反復配列は癌化や老化と共に短縮することが知られており細胞分裂寿命を反映すると言われている。そこで、MDSの白血化過程における分子機構を明かにする目的で白血化前後のテロメア反復配列の変化を既報のTRA(termenal repeat assay)法で経時的に解析した。その結果MDSはテロメア短縮様式より以下のI-III型に分類された。I.初診時よりテロメア短縮を認める群。II.白血化に伴ってテロメア短縮を認める群。III.経過を通じてテロメア短縮を認めない群。個のうちI群は複雑型染色体異常を有する例が大半で、6ヶ月以内に急激な経過で死亡する高リスク群が多いのに対してIII群は正常核型の例がほとんどであった。またII群では白血化と共にdouble minuteの出現を認める例があった。このようにMDSにおいてはテロメア短縮は染色体異常と深い関わりを持っていると考えられた。またMDSという前癌状態から白血病へと進行する過程においてこの様なテロメア反復配列の変化がみられたことよりMDSの一部の症例ではゲノム不安定性が病態に影響を及ぼしている可能性が示唆された。DNA修復機構と共に細胞周期関連遺伝子制御との関係を解明していくことが今後の課題と思われる。
米国公立学校教員人事・評価制度の法的原理と実際的態様に関する研究

本研究では、以下の諸点が知見として検出された。まず、米国教員評価制度中、先進的システムと目される「同僚教員評価制度」に関しては、全米50州中未だ特定州でしかその存在が確認できなかったものの、確認できる諸州においては、後述のとおり一定の成果を上げており、同僚による支援的な評価活動の有効性が明らかとなった。次に、関係判決例の分析では、その多くが評価の妥当性に関するものに集中する傾向があり、司法は「評価基準の具体性」と「明確な根拠性」を強く求めていること、加えて、評価に関する多様な評価手続の設定は、被評価者の評価に際しての諸権利を保護するにとどまらず、評価者自身の権利をも保障する機能を有していることが明らかとなった。本年度の研究活動としては、米国全州にわたる関連法令の渉猟と関係先行研究の検討を行った。そのため、研究課題に直結した顕著な研究成果を社会的に公表するには至らなかった。しかしながら、次ページに示すような概説的ではあるが、一定の著作を通して研究の一端を披瀝することはできた。その概要は、以下の通りである。アメリカの公立学校の教員人事は、各州・各学区(school district)によって極めて多様であり、このことが同国における教員人事の大きな特徴ともなっている。この公立学校教員人事の多様性は、アメリカ公教育制度の根幹をなす地方統制(10cal control)原理を背景にして、それら教員人事に関する諸権限が各地方の学区教育委員会に付与されていることによるものである。学区の教育委員会は、教員の採用・配置・研修・評価・給与・異動・昇任・解雇・退職といった人事管理全般にわたる諸権限を、所轄学校の校長との連携下、配下の事務局(教育長と関係専門職員)に執行させている。しかしながら、その運用の実態をみてみると、学区によって程度の差はあるものの、我が国の教員人事と比べ、各校長の影響力の強さが目を引く。とりわけ新任教員の採用人事においてはこの傾向が顕著であり、学区によっては校長の意見具申を学区事務局が拒否できないことを明示しているところすらある。一方、現職教員の異動(転任人事)に関しては、逆に教員の希望と年功(seniority)が最大配慮されて実施されており、その意味では校長の関与度は脆弱といえる。この背景には、学区との団体交渉を通して教員組合が獲得してきた「教員の勤務条件や地位をめぐる成果」が影響しているためであろう。また、各学区の教育経費の多くが当該学区住民への直接課税によって徴収されるため、地方統制原理に根ざした公立学校教員人事は、常に住民が掌握しているとの意識が伝統的に根強い。したがって、保護者や地域住民の不満や訴えを反映した教員解雇の事例も少なくなく、教員の人事をめぐる住民の影響力も無視できない。シカゴの学校改革で創設された学校委員会(親・住民代表が過半数以上のメンバーを占める学校単位のミニ教育委員会)が校長の任免権すら有しているのは、まさに住民による直接統制の典型であろう。このように、アメリカ公立学校の教員人事は、基本的に各学区レベルを単位とする教育委員会事務局による運営を基軸としながらも、所轄学校の校長、さらには教員団体や保護者・住民らの希望・意見を尊重した、分権的性質の強いものとなっている。本年度は、主に評価制度を中心に研究した。その結果、米国における教員評価制度に関する州法規定はおおよそ以下のような特徴を有していることが明らかとなった。1.州による権限付与の強弱という点からみて、その基本的構造が「州集権型」「州一定関与型」「地方分権型」の3つのタイプに類型化できる。2.現行各州法規定では、教員評価制度は不適格な教員の排除を目的とした管理的な制度というよりも、教員の資質能力の改善を目的とした支援的な制度である。3.米国における教員評価制度は、そのプロセスにおいて「教員の権利」を十分に保障し、評価に対する「納得性」や「透明性」を高めようとする姿勢が看取されるとともに、教員ヘ一定の権限を委譲することによって、教員の専門職性の向上を図ろうとしている。4.米国における教員評価制度の内包する課題として、(1)同制度における評価者の評価責任が十分に明確化されていない、(2)同制度の基本的構造形態や教員に対する意見尊重度を特徴づけるうえで重要な要素である「教員参加」に関する規定が十分でない、といった諸点がある。本年度は、当該課題研究最終年次にあたり、以下の諸点に関する研究に従事した。1.米国各州の教員人事・評価制度中、特に近年注目される「同僚教員評価制度」を中心にその先進的地域(オハイオ州、カリフォルニア州)の詳細な制度実態の把握。2.関係判決例の分析を通した基本的判決原理の整理。その結果、次のような知見を得ることができた。

まず、「同僚教員評価制度」に関しては全米50州中未だ特定州のみでしかその存在が確認できないものの、確認できる諸州においては、一定の成果を上げており、同僚による支援的評価活動の有効性が明らかとなった。特に、カリフォルニア州ポーウェイ統合学区の事例においては、制度全体を通して、同僚教員による評価と校長による評価がうまくバランスを取っており、注目される。とりわけ、終身教員調停プログラムにおいて顕著であるが、複数の人々(評価チーム)による評価を通して評価の客観性や公正さを確保しようとする姿勢は注目に値する。これらの諸点は、先発部隊のオハイオ州トレドやコロンバスと比べても、優れている点であり、高く評価されよう。次に、関係判決例の分析では、その多くが評価の妥当性に関するものに集中しており、司法は「評価基準の具体性」と「明確な根拠性」を強く求めていることが判明した。加えて、評価に関する多様な評価手続の設定は、被評価者の評価に際しての諸権利を保護するにとどまらず、評価者自身の権利をも保障する機能を有していることが明らかとなった。
薬剤耐性菌制圧に向けた天然物から創薬リードへの変換研究

薬剤耐性菌に対する新規薬剤の開発は世界的急務である。本申請研究は、グラム陽性菌・グラム陰性菌双方の新規多剤耐性抗菌薬のシード供給を実現すべく、複数の天然物を研究対象として包括的かつ多角的に研究を行う。具体的には、質の良い生理活性天然物の誘導体合成の効率的な供給と理論的薬物設計を通して、活性増強・毒性の低減・低分子化等をはかり、効率的にシードを獲得する。創薬ターゲットは従来の薬剤にはない新規作用機序を原則とし、ヌクレオシド系天然物とペプチド系天然物をベースとして、それぞれにグラム陽性菌・グラム陰性菌に対抗できる天然物を研究対象とする。抗薬剤耐性菌薬リードを開発する本研究の成果は、将来的に世界的な健康福祉の維持、QOLの向上に大きく貢献する事が予想される。平成30年度は、以下の研究を行った。1)ムライマイシンの廃材制御型誘導体の合成を行った。2)スファエリミシン誘導体の合成とMraY阻害活性評価を行い、高いMraY阻害活性を有する誘導体を見出した。3)ムレイドマイシンA誘導体を合成し、高いMraY阻害活性と抗緑膿菌活性を有する誘導体を見出した。さらにAquifex aeolicus由来MraYとの複合体のX線結晶構造解析を行った。4)プラスバシンA3誘導体の合成を行った。またプラスバシンA3の作用機構解析も行った。5)コリスチン耐性細菌に有効な誘導体を見出すべく、コリスチン誘導体30個を合成しその抗菌活性を評価した。薬剤耐性菌の蔓延を阻止することは全世界的要請である。本研究では、抗薬剤耐性菌薬リードを開発する事が出来たと言える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究は、グラム陽性菌・グラム陰性菌双方の新規多剤耐性抗菌薬のシード供給を実現すべく、複数の天然物を研究対象として包括的かつ多角的に研究を行うものである。本年度は、以下の項目に関して研究を行った。ムライマイシンとMraYの複合体のX線結晶構造解析に基づいて、分子内イオン対形成やヌクレオシド部の配座に着目した環化型、スピロ型誘導体を設計・合成した。本誘導体は、ムライマイシンD2よりも2倍程度高いMraY阻害活性を示す事がわかった。各種環サイズの変更や脂溶性側鎖を変換した誘導体も合成した。MraYを強力に阻害するスファエリミシンに関しては、シクロペンテノールとアミノリボースを不斉辻-Trost反応にて連結し、連続還元的アミノ化反応によりピペリジン含有大員環を構築することで、考えられうる8つのコア構造のうち2つのジアステレオマーの合成を達成した。ムレイドマイシン誘導体の合成に関しては、多検体調製を可能とすべく固相合成と液相合成を検討した。その結果、ワンポット連続脱水縮合による液相合成を開発する事ができた。本法を用いでムレイドマイシン誘導体2種を合成し、合成経路を確立する事が出来た。プラスバシンについては、a-位に不斉中心を有する環状イミンを用いたジアステレオ選択的なUgi多成分反応の再検討を行った。その結果、溶媒依存的なジアステレオ選択性の発現機構を明らかにする事ができた。更に本法を用いて、プラスバシンA3の全合成を達成する事が出来た。コリスチンの固相合成法を精査し、15個のコリスチン誘導体を合成した。緑膿菌に対する抗菌活性を評価することで、活性発現に必要なアミノ酸残基を同定する事ができたが、親化合物であるコリスチンの活性を超える誘導体を見出す事は出来なかった。各研究項目とも、天然物の全合成や設計した誘導体の合成を達成する事が出来ている事や、設定した誘導体数を順調に合成し、生物活性評価を行う事が出来ているため。以下の4つのクラス(AD)の天然物について、誘導体合成を進めるとともに、各種生物活性評価を順次行い、構造活性相関研究へとステージを移行した。A.ムライマイシンについては、スピロ型誘導体の合成を検討し、コア構造を得る事が出来た。スファエリミシンについては、不斉辻-Trost反応と分子内2連続還元的アミノ化反応により、高度に縮環したコア構造を構築する事ができ、8つのジアステレオマーのうち、2つのスファエリミシンコア構造の合成を達成した。さらに、生物活性に必須と考えられる脂溶性側鎖としてパルミトイル基を有する誘導体を合成し、そのMraY阻害活性を検討したところ、一方のジアステレオマーが強力なMraY阻害活性を有する事を明らかにした。B.固相合成によりパシダマイシンの誘導体5個を合成した。抗菌活性を評価したところ、N-、C-末端ともにm-L-チロシンを有する誘導体が、親化合物に比べて、約24倍強い抗緑膿菌活性を示す事を明らかにした。C.プラスバシンが有する2つのヒドロキシアスパラギン酸残基をアスパラギン酸に置換した誘導体を合成し、抗菌活性を評価したところ、活性が消失する事がわかった。各種構造解析や分子動力学計算による考察を行い、2つのヒドロキシアスパラギン酸のヒドロキシ基が、活性配座を保つのに重要な役割をはたす事が示唆された。D.15個のコリスチン誘導体を合成し、抗緑膿菌活性を評価した。その結果、ジアミノブタン酸残基は、抗菌活性に重要な影響を与える事がわかった。

ほとんどのアミノ酸残基の置換は、抗菌活性を低下させたが、ジアミノブタン酸の一部をジメチルアミノブタン酸に変換しても抗菌活性は減弱しない事がわかった。当初計画のとおり、4つのクラスのベース化合物の合成を達成し、誘導体合成を進めるとともに、各種生物活性評価を順次行い、構造活性相関研究へとステージを移行する事ができたため。薬剤耐性菌に対する新規薬剤の開発は世界的急務である。本申請研究は、グラム陽性菌・グラム陰性菌双方の新規多剤耐性抗菌薬のシード供給を実現すべく、複数の天然物を研究対象として包括的かつ多角的に研究を行う。具体的には、質の良い生理活性天然物の誘導体合成の効率的な供給と理論的薬物設計を通して、活性増強・毒性の低減・低分子化等をはかり、効率的にシードを獲得する。創薬ターゲットは従来の薬剤にはない新規作用機序を原則とし、ヌクレオシド系天然物とペプチド系天然物をベースとして、それぞれにグラム陽性菌・グラム陰性菌に対抗できる天然物を研究対象とする。抗薬剤耐性菌薬リードを開発する本研究の成果は、将来的に世界的な健康福祉の維持、QOLの向上に大きく貢献する事が予想される。平成30年度は、以下の研究を行った。1)ムライマイシンの廃材制御型誘導体の合成を行った。2)スファエリミシン誘導体の合成とMraY阻害活性評価を行い、高いMraY阻害活性を有する誘導体を見出した。3)ムレイドマイシンA誘導体を合成し、高いMraY阻害活性と抗緑膿菌活性を有する誘導体を見出した。さらにAquifex aeolicus由来MraYとの複合体のX線結晶構造解析を行った。4)プラスバシンA3誘導体の合成を行った。またプラスバシンA3の作用機構解析も行った。5)コリスチン耐性細菌に有効な誘導体を見出すべく、コリスチン誘導体30個を合成しその抗菌活性を評価した。薬剤耐性菌の蔓延を阻止することは全世界的要請である。本研究では、抗薬剤耐性菌薬リードを開発する事が出来たと言える。平成29年度以降は、各種生物活性評価を順次行い、構造活性相関研究へとステージを移行する。いずれの化合物も、抗菌活性・HepG2細胞(もしくはヒト腎臓由来細胞)を用いた細胞毒性評価・血中タンパク質の結合能・代謝安定性を含む薬物動態(PK)に関する評価をそれぞれ行う。またマウスin vivo試験の予備検討として、カイコ評価系を用いた治療効果の測定も行う。活性が保持した化合物に関しては、活性を向上すべくさらに誘導体を合成し、良好な活性プロファイルを有する化合物は、マウスを用いたin vivo活性試験を検討する。最終的には、4つのクラスいずれかからの新規抗菌剤シードの創出を目指す。また同時にプローブ分子を調製し、ターゲットの分子機構や天然物の作用機序の詳細解明を目指したケミカルバイオロジー的アプローチも行う。更に各種生物活性評価を順次行い、構造活性相関研究を移行する。活性が保持した化合物に関しては、活性を向上すべくさらに誘導体を合成し、良好な活性プロファイルを有する化合物が創出できた場合は、マウスを用いたin vivo活性試験を検討する。
画像処理装置を用いた塵肺X線フィルムの定量的評価-塵肺重症度判定客観化の試み-

今回塵肺の管理区分決定は、直接撮影による塵肺検診X線フィルムを塵肺標準フィルムと比較して重症度を判定する、という方法で行われている。しかしこれは、読影者の経験と勘に基づいた主観的な判定の要素が入ることは否定しがたい。事実、塵肺専門家の間でも、同じフィルムが1型から3型まで大きく意見が分かれるということが珍しくない。しかしこの判定に基づいて管理区分が決定され、その後の医療上、健康管理上の取扱が大きく異なり、社会的にも影響を与えてきた。そこで、塵肺X線フィルムの重症度判定の客観化を目指して、通常のビデオカメラとデジタイザーおよびパソコンに接続した画像処理装置NEXUSを用い、X線フィルム上の画像情報を簡便かつ定量的に読み込むシステムを開発した。次にこれを用いて、石綿肺の肺線維症の広がりに対応する簡便かつ定量的な画像情報表現法として、右肺野中央部の鉛直方向のX線吸収率を選択した。じん肺標準フィルムの内、石綿肺の測定を行ったところ、横隔膜直上と肺尖部との吸収率に差は3型が最も大きく、X線吸収率の鉛直方向の変化は型の進展に対しておおよそ一次式で回帰できることが示された(各型を等間隔とすると型数と吸収率の傾きとの相関係数は0.95)。なお、12番の標準フィルムの吸収率の傾きは2型でありながら1型の2枚にかなり近く、特異であることがわかったが、このことは今後標準フィルムの改訂等に際し参考になろう。現在、鎖骨と横隔膜を結ぶ線のずれにによるばらつきの影響を測定し、その合理的な決定法を検討している。今後、第一に実際の石綿作業者の長期の間隔をおいたフィルムを多数測定し、この指標の妥当性を確認すること、第二にこの指標の経年変化に喫煙が与える影響を調べるという二点の検討を予定している。
小胞体におけるタンパク質品質管理機構

小胞体における品質管理機構のなかで、小胞体関連分解の分子機構について解析を行った。ミスフォールドタンパク質をproductive foldingから分解経路へ引き抜く因子EDEM1の他に、小胞体における初めての還元酵素ERdj5が、ミスフォールド基質のジスルフィド結合を還元することによってERADを促進することを見出した。ERdj5の結晶構造解析にも成功し、糖タンパク質のERAD経路の全体像を明らかにした。本計画研究においては、主として小胞体およびサイトゾルにおけるタンパク質の品質管理機構を研究する。【1】小胞体関連分解におけるEDEMファミリータンパク質の役割小胞体においてミスフォールルドしたタンパク質は、小胞体内から逆輸送チャネルを介して、サイトゾルへ逆輸送され、小胞体関連分解(ERAD)と呼ばれる機構により分解される。申請者らは、この分解の鍵となる因子としてEDEMおよびEDEMファミリータンパク質を発見した。1)EDEMファミリータンパク質の性質の解析、2)EDEMに関連し、ERADを促進する他の因子の同定・探索と、それらがEDEM経路のどこに位置するのかの解析を行う。【2】小胞体レドックス関連因子によるミスフォールドタンパク質の分解制御小胞体においてはタンパク質はジスルフィド結合を介してフォールディング骨格を安定化するが、これには酸化酵素、イソメラーゼが関わっている。一方、ミスフォールドしたタンパク質がトランスロコンを通過するためには、ジスルフィド結合が還元され開裂していなければならない。ミスフォールドタンパク質の効率的なERAD促進のために、1)小胞体におけるレドックスネットワークの解明、2)とりわけ小胞体還元酵素の同定とクローニング、3)それら還元酵素による基質タンパク質の凝集阻害、ジスルフィド結合の還元を通じてレトロトランスロケーションの促進について研究する。本年度の成果は以下の通りである。[1]EDEMに関連した成果としては、EDEMと同様に分解シグナルとしての糖鎖を認識するレクチン様のタンパク質OS9に関して、OS9がどのような糖鎖を認識するかを明らかにした。特にマンノース鎖の内、C鎖がトリミングされた構造を特異的に認識することを明らかにし、現在投稿中である。また、ユビキチン化に関与するgp78が嚢胞性線維症の原因遺伝子CFTRの分解を促進すること、それが従来考えられていたようなE3酵素としてではなく、E4酵素として機能しているという事実を見出し、Mol. Biol. Cellに発表した。[2]小胞体レドックスがどのように小胞体関連分解ERADに関与するかという研究では、ERdj5という新しいタンパク質が、小胞体においてジスルフィド結合の還元酵素として働き、ERADを促進していることを発見し、Science誌に発表することができた。なんらかの原因で細胞内にミスフォールドしたタンパク質ができてしまった場合、それを分解処理する必要があるが、本研究においては、細胞の品質管理機構において、1)どのように分解すべき基質のみが認識され、分解処理にまわされているか、および、2)変性あるいは凝集したタンパク質を、どのように分解可能な状態に保持し、かつ効率的に分解装置にアクセスさせるか、という2点に注目して研究を行うことを目的とする。平成20年度においては、ERdj5の他に小胞体において酸化還元に関与する因子の探索を行い、新たな酸化還元酵素TMX4を発見、クローニングすることに成功した。TMX4は小胞体膜に局在する酸化酵素であり、タンパク質の構造形成に必須のジスルフィド結合形成に関与することを示すことができた。特に、TMX4の小胞体内腔側に存在するCXXCモチーフが酸化に関与することを変異体作成などによって明らかにし、またTMX4が小胞体分子シャペロンカルネキシンと相互作用することによって、新生ポリペブチド鎖にジスルフィド結合を導入することを示し、また同様に他の酸化還元酵素ERp57とも相互作用しつつ、その活牲を発揮している可能性を示した。平成21年度においては、小胞体においてタンパク質の構造形成(productive folding)および小胞体関連分解(ERAD)の両者に必須のプロセスとして関与している酸化還元酵素群のネットワークについて解析を行い、顕著な成果を得た。すなわち、小胞体に局在する21種類の酸化還元酵素にタグを付け、免疫沈降によって相互作用するタンパク質を同定するインターラクトーム解析を行った。その結果、主たる酸化還元酵素ERO1aに結合する数種類の酸化還元酵素群を見つけることができた。なかでもERO1aはPDIと強い結合を示し、機能的にも互いに制御し合うハブ複合体を形成していた。また酸化力はERO1aからPDIを経て、他の酸化還元酵素にも伝えられること、さらにこの複合体の活性を負に調節する薪たな因子

ERp72が存在することも示すことができた。小胞体においては多くの酸化還元酵素が複雑なネットワークを形成しながら酸化還元反応を遂行していることが明らかになった。なんらかの原因で細胞内にミスフォールドしたタンパク質ができてしまった場合、それを分解処理する必要があるが、本研究においては、細胞の品質管理機構において、1.どのように分解すべき基質のみが認識され、分解処理にまわされているか、および、2.変性あるいは凝集したタンパク質を、どのように分解可能な状態に保持し、かつ効率的に分解装置にアクセスさせるか、という2点に注目して研究を行うことを目的とする。平成22年度においては、小胞体でミスフォールドした非糖タンパク質の分解におけるジスルフィド還元酵素ERdj5の関わりを解析した。ERdj5はC末端に位置するチオレドキシン様ドメイン(Trx4ドメイン)を介して、ミスフォールドした糖タンパク質をレクチン様分子EDEMから受け取る一方、Jドメインを介して、ミスフォールドした非糖タンパク質を分子シャペロンBiPから受け取り、これら基質のジスルフィド結合を還元することで分解を促進することを明らかにした。ERdj5により還元された基質はJドメインを介してBiPへ受け渡され、BiPから小胞体膜上に形成される(ERAD)複合体へ受け渡され、サイトゾルへ逆行輸送されることを明らかにした。さらに、非糖タンパク質分解経路が小胞体ストレス時にオーバーフローした糖タンパク質分解経路のバックアップとして機能するという新しい機構を明らかにした。以上の成果は現在投稿中である。小胞体内にミスフォールドタンパク質が生じた場合、小胞体からサイトゾルへ逆輸送した後、それをユビキチン・プロテアソーム系によって分解する機構が、それぞれの細胞には備わっている。これを小胞体関連分解(ERAD)と呼ぶ。申請者たちは、ERADの分子機構を明らかにする上で、極めて重要な二つの因子を発見した。1つはミスフォールドしたタンパク質を糖鎖トリミング依存性に認識し、分解経路へまわす機能をもつEDEMであり、もう1つは分解タンパク質中のジスルフィド結合を還元し、ディスロコンを通りやすくする還元酵素ERdj5である。本年は、ERdj5の結晶解析に成功し、その分子構造を元として、ERAD経路の一連のプロセスを明らかにすることに成功した。その結果、ミスフォールドタンパク質は、その糖鎖トリミング依存的にEDEMによって認識され、さらにEDEMに結合した還元酵素ERdj5によってジスルフィド結合が開裂されたのち、分子シャペロンBipによって逆輸送チャネルまで輸送され、分解されることが明らかになった。EDEM・ERdj5・BiP経路は糖タンパク質の分解経路であるが、非糖タンパク質の分解経路がカルネキシン・EDEM経路を使わず、BiP/ERdj5/BiPからなる一連の因子間をリレーされることによって分解されることを示すことができた。このように細胞内には、糖タンパク質、非糖タンパク質の2つのEARD経路があることを明らかにした。
複雑骨格天然物の生合成に関わる酵素の構造機能解析

本研究では、ステロイドに匹敵する多様で重要な生物活性を有し、医薬品開発が期待される、メロテルペノイドの生合成マシナリーの精密機能解析と物質生産を主たる目的とした。本研究において、WANG博士は、本研究室で進行中の、バークレージオンなど、新奇で複雑な骨格を有する糸状菌由来生物活性メロテルペノイドの生合成研究に従事した。既に生産菌のドラフトゲノム配列の解析により、候補となる生合成遺伝子クラスターは判明しており、これを麹菌の異種発現系に再構成することにより、その生合成経路を確立し、物質生産系を構築することを目的とした。また、メロテルペノイドの構造多様性創出の鍵となる、特異な反応を触媒する多機能型酸化酵素について、その反応機構と構造機能相関の解明、酵素機能の改変などをめざした。糸状菌メロテルペノイドberkleydioneは、austinolと同一の生合成中間体preaustionoidA1から、異なるKOX反応によって骨格形成されると予想される。Wang博士はberkleydioneからparaherquoninへと至る後期骨格酸化過程の全容解明を目的として、その生合成反応の解明に取り組んだ。paraherquonin生産Penicilliumのゲノムシーケンスを行い、前駆体供給に関わる酵素遺伝子、KOX酵素遺伝子を含む遺伝子クラスターを探索した。その結果、前駆体であるDMOAを合成するポリケタイド合成酵素遺伝子を含む数多くの前駆体供給、骨格形成に関わる酵素遺伝子を発掘した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ステロイドに匹敵する多様で重要な生物活性を有し、医薬品開発が期待される、メロテルペノイドの生合成マシナリーの精密機能解析と物質生産を主たる目的とする。バークレージオンなど、新奇で複雑な骨格を有する糸状菌由来生物活性メロテルペノイドの生合成研究に従事する。既に生産菌のドラフトゲノム配列の解析により、候補となる生合成遺伝子クラスターは判明しており、これを麹菌の異種発現系に再構成することにより、その生合成経路を確立し、物質生産系を構築する。また、メロテルペノイドの構造多様性創出の鍵となる、特異な反応を触媒する多機能型酸化酵素について、その反応機構と構造機能相関の解明、酵素機能の改変などをめざす。メロテルペノイド生合成において分子骨格構築の鍵となるのはポリケタイド部分生合成を担うポリケタイド合成酵素、テルペノイド部分を縮合するプレニル基転移酵素、末端二重結合に対するエポキシ化を触媒するフラビン要求性の酸化酵素、そして閉環反応を担う環化酵素である。これら4種の酵素が構造多様性を産み出す基盤となる。初年度は、バークレージオンなど、新奇で複雑な骨格を有する糸状菌由来生物活性メロテルペノイドの生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子を、麹菌の異種発現系に再構成することにより、その生合成経路を確立し、物質生産系を構築をめざした。計画通り、バークレージオン生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子を、麹菌の異種発現系に再構成することにより、その生合成経路を確立し、物質生産系の構築に成功した。今年度も、引き続き、バークレージオン等、糸状菌由来生物活性メロテルペノイドの生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子を、麹菌の異種発現系に再構成することにより、その生合成経路を確立し、物質生産系を構築をめざす。また、生合成遺伝子クラスターを構成する各酵素について、他のホモログ酵素との配列比較、または、ホモロジーモデルなどに基づく、部位特異的変異の導入などにより酵素の構造機能相関を検討し、酵素反応機構の解明と分子多様性創出をめざす。さらに、各酵素の潜在的触媒能力を利用してコンビナトリアル生合成による非天然型新規メロテルペノイド生合成マシナリーの構築に着手する。
末梢血幹細胞による骨・軟骨再生

1、骨芽細胞への分化に関する研究(方法)ラットより末梢血及び骨髄液を採取し培養した。コンフルエントに達した後継代し、デキサメサゾン、BMP、bFGFを作用させた。これらの細胞に対しアルカリフォスファターゼ染色を行った。また、細胞よりtotal RNAを抽出し、骨基質蛋白(アルカリフォスファターゼ、タイプ1コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン)およびハウスキーピング遺伝子(GAPDH)の遺伝子発現をRT-PCR法にて解析した。(結果)骨髄間質細胞では、デキサメサゾンやBMPを加えることにより、アルカリフォスファターゼ染色陽性細胞が多数みられたが、末梢血由来細胞では、いずれの処理においても陽性細胞はみられなかった。さらに骨髄間質細胞では、これらの処理により骨基質蛋白遺伝子の発現が増加した。末梢血由来細胞における骨基質蛋白遺伝子の発現はわずかにみられるのみであった。2、軟骨細胞への分化に関する研究(方法)ラット由来の末梢血由来細胞、骨髄間質細胞、線維芽細胞およびES細胞を遠心管培養法、高密度培養法など三次元構造を維持する方法にて培養した。これらの培養法に対しデキサメサゾンや成長因子(BMP、TGF-b)を作用させ、3週まで培養した。これらの細胞を包埋切片とし、アリューシャンブルーにて染色し、軟骨基質の産生について組織学的に評価した。(結果)骨髄間質細胞、線維芽細胞およびES細胞では、これらの培養法により、アリューシャンブルーにて染色される基質を有する軟骨様の組織がみられたが、末梢血由来細胞では、いずれの処理においてもこれらの所見はみられなかった。末梢血由来細胞における骨基質蛋白遺伝子の発現は現在検討中である。今後成長因子を加えるタイミングなどを検討することにより骨芽細胞への分化がもっともよくみられる培養条件を決定したい。2、軟骨細胞への分化に関する研究(方法)ラット由来の末梢血由来細胞および骨髄間質細胞を遠心管培養法、高密度培養法など三次元構造を維持する方法にて培養したこれらの培養法に対しデキサメサゾンや成長因子(BMP、TGF-b)を作用させ、3週まで培養した。(結果)骨髄間質細胞では、これらの培養法により、アリューシャンブルーにて染色される基質を有する軟骨様の組織がみられたが、末梢血由来細胞では、いずれの処理においてもこれらの所見はみられなかった。今後アルギネート内培養法など他の三次元構造を維持する培養法や成長因子による処理法などを検討することにより軟骨細胞への分化を促進するような培養条件を決定したい。

また、細胞よりtotal RNAを抽出し、骨基質蛋白(アルカリフォスファターゼ、タイプ1コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン)およびハウスキーピング遺伝子(GAPDH)の遺伝子発現をRT-PCR法にて解析した。(結果)骨髄間質細胞では、デキサメサゾンやBMPを加えることにより、アルカリフォスファターゼ染色陽性細胞が多数みられたが、末梢血由来細胞では、いずれの処理においても陽性細胞はみられなかった。さらに骨髄間質細胞では、これらの処理により骨基質蛋白遺伝子の発現が増加した。末梢血由来細胞における骨基質蛋白遺伝子の発現はわずかにみられるのみであった。2、軟骨細胞への分化に関する研究(方法)ラット由来の末梢血由来細胞、骨髄間質細胞および線維芽細胞を遠心管培養法、高密度培養法など三次元構造を維持する方法にて培養した。これらの培養法に対しデキサメサゾンや成長因子(BMP、TGF-b)を作用させ、3週まで培養した。これらの細胞を包埋切片とし、アリューシャンブルーにて染色し、軟骨基質の産生について組織学的に評価した。(結果)骨髄間質細胞および線維芽細胞では、これらの培養法により、アリューシャンブルーにて染色される基質を有する軟骨様の組織がみられたが、末梢血由来細胞では、いずれの処理においてもこれらの所見はみられなかった。
大網を用いた広背筋被覆による循環補助能増大の可能性に関する実験的検討

実験の前段階として犬を用いて広背筋に大網をどのように被覆するかを検討した。最初に広背筋を胸腔内に挿入せずに行った。実験は広背筋を剥離しないものと剥離したもの両方で検討した。広背筋は神経血管茎を残して剥離しても多くは筋肉の遠位部の3分の1が虚血状態になった。また大網は腹部正中切開をおこない胸骨剣状突起下より皮下に出し左広背筋に被覆することができた。この実験で広背筋は剥離して最も虚血を生じる広背筋遠位部に大網を被覆することが最も効果的であり可能である事がわかった。さらに臨床応用を想定して広背筋を心臓に直接被覆するCardiomyoplasty(心臓骨格筋形成術)を行った後横隔膜経由で大網を広背筋の遠位端に被覆する実験を行った。この実験では左右の広背筋について行い検討した。実験の結果としては解剖学的にはCardiomyoplasty後に大網被覆は左右どちらの広背筋でも可能であった。現在大網を被覆せずに左広背筋に電極を挿入し電気的トレーニングを行う対照を作成中である。対照を修了した後大網被覆群を作成する予定である。これにより大網が広背筋を剥離することによる虚血に血流増大効果を生じるかどうかを検討する予定である。さらに大網被覆による広背筋の循環補助能の増大を見るために広背筋で骨格筋心室を作成し、大網被覆群と非被覆群で比較し検討するため現在非被覆群を3頭作成し電気的トレーニングを施している最中である。骨格筋心室も非被覆群を対照としこれを終えた後、被覆群を作成予定である。
各種血管作動薬の脊髄鎮痛機構に及ぼす影響に関する研究

1.カルシウムチャネル拮抗集ジルチアセムやα2アドレナリン作動薬クロニジンがネコの脊髄後角Rexed第V層型単一細胞に対する作用を研究した。約3kgの成ネコを用いて、両側中脳網様体の除脳を行い、脊髄を露出し、L1-L2で脊髄を横断した。Rexed第V層単一細胞活動を細胞外微少電極誘導法にて記録した。実験は自発発射及ピンチ法による誘発発射の発射数の対照値を測定した後、微少電極刺入付近の脊髄表面にジルチアゼム10mg/ml(D10mg群)20mg/ml(D20mg群)を1ml投与し、自発発射及誘発発射を測定した。クロニジンについても同様の実験を行った。5マイクロg(1ml)(C5群)50マイクロg(1ml)(C50群)を投与した。その結果、いずれの群も単一細胞の自発発射及ぴ携先見射が減少した。ジルチアゼム実験では用量依存的な反応が見られたが、クロニジン実験では見られなかった。この結果、カルシウムイオンチャネルとα2アドレナリン受容体が疼痛制御機構に関与しており、慢性難治性疼痛患者への疼痛治療に応用され得る可飽性を示した。2.クロニジン軟膏を帯状痘疹後神経痛の患者に適応して、痛みの程度への影響を検討した。クロニジン軟膏(60mlcrogrom,150microgram,300microgram/軟膏1gramの3種類)を作成し、疼痛部位に塗布を行い、検索した。その結果、有効率は90%であった。濃度的には、150microgramが最も多く使われた。いずれも副作用は、認められなかった。クロニジンの作用は脊髄レベルのみならず、神経終末レベルにおいても疼痛効果が期待された。これらの一連の研究からも血管作動薬が疼痛制御に大きく関わっていることが明確となった。またこれらの一連の薬物の臨床への応用が期待された。250300gの雄のSprague-Dawley系ラットを用い,GOI麻酔下にて,気管切開,総頚動静脈カニュレーションの後,頭蓋内容を吸引して除脳した.第1,2腰椎間で脊髄を横断し,腰部椎弓切除術を行い,人工呼吸にて一般状態を生理学的正常範囲内に維持した.微小電極を第7腰髄内に細胞活動のmodalityを確かめつつ,マイクロドライバーを用いて挿入し,脊髄後角第5層型単一細胞活動を細胞外微小電極誘導記録法において測定観察した.自発発射数,及び疼痛定量刺激装置による誘発発射数の対照値を測定した後,微小電極挿入付近の脊髄表面にカルシウム拮抗薬の滴下を行い,5分毎に自発発射及び誘発発射の変化を測定した.その結果、自発発射数及び誘発発射数共に,カルシウム拮抗薬の投与5分後より減少を示し、20分30分後に最大の抑制率を示した。しかし、その効果には限度があった.以上の結果より、カルシウム拮抗薬は脊髄後角第5層型単一細胞活動を軽度抑制するものと考えられる.今後はやクロニジンの滴下,一酸化窒素の曝露を行い,各種血管作動薬の脊髄後角第5層型単一細胞活動に及ぼす影響を検討する.更に,microdyalisisを用いて脊髄内濃度も測定する予定である.1.カルシウムチャネル拮抗集ジルチアセムやα2アドレナリン作動薬クロニジンがネコの脊髄後角Rexed第V層型単一細胞に対する作用を研究した。各種血管作動薬が脊髄疼痛制御機構に与える影響について研究の過程としてカルシウムチャネル拮抗薬ジルチアゼムとカルファ2アゴニストクロニジンについて検討した。