hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌胎児性抗原特異的キメラ抗原受容体導入Ｔ細胞による消化器癌治療法の開発

(1)マウス型CEA特異的CARレトロウイルスベクターコンストラクトの作成とマウスT細胞への導入(2)マウス型CAR導入マウスT細胞のin vitro機能評価。(3)リンパ球減少性の前処置との併用によりCEA特異的CAR導入T細胞輸注は、抗腫瘍効果を発揮した。(4)輸注したCAR-TはWTとCEAーTgマウスにおいて同程度の抗腫瘍効果を発揮したが、CEA-Tgマウスにのみ重篤な体重減少を誘導した。(5) CAR-T輸注によりWTとCEA-Tgマウスの肺に炎症が見られた。(6) CEAを標的としたCAR導入T細胞輸注療法は有効だが、安全性に十分な注意を払う必要性が示唆された。本研究では、大腸がん患者治療を目的として、癌胎児性抗原CEAを標的とした、GITRを含む様々な副刺激分子のシグナル伝達ドメインを付加したCAR導入T細胞を作製し、重度免疫不全マウスであるNOD/SCID/γc-/-(NOG)マウス及びCEAトランスジェニックマウスを用いたin vivo評価系を樹立することにより、安全で有効なCAR導入T細胞療法の開発を目指す。本年度は、様々な副刺激分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインを付加したCEA特異的CARレトロウイルスベクターコンストラクトを作製し、それを用いて調製したCAR導入ヒト末梢血T細胞のin vitroにおける機能評価を行なった。並行してNOGマウスを用いてin vivoにおける抗腫瘍効果を評価し、以下の結果を得た。複数種類の副刺激分子CD28、GITR、ICOS、4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むCEA特異的CARのヒト末梢血T細胞への導入効率を比較検討した。その結果、CD28ないしGITR副刺激シグナルを含むCARコンストラクトが、導入率・発現強度の点で優れていた。また、その際のレトロウイルスコピー数は最少で、安全性が高いことも示唆された。さらに、in vitroにおいて抗原特異的活性化によるサイトカイン産生能並びにCEA陽性・陰性腫瘍細胞株に対する腫瘍細胞傷害性が高いCAR導入T細胞を得ることができた。次にin vivoでの有効性を評価する目的で、ヒト癌細胞が生着可能なNOGマウスにCEA陽性胃癌細胞株MKN45を接種すると同時にCEA特異的CAR導入T細胞を輸注し、腫瘍縮小効果を評価した。その結果、CD28(28z)もしくはGITR(zG)を含むCARを導入したヒトT細胞の抗腫瘍作用を確認した。(1)マウス型CEA特異的CARレトロウイルスベクターコンストラクトの作成とマウスT細胞への導入。申請者の生理的かつ臨床的条件下におけるCAR導入T細胞のin vivo機能評価系を確立するためには、免疫系が保たれている個体での検証が必要である。そのために、CAR導入マウスT細胞を用いた移入治療モデルが必要である。そこで、移入T細胞のマウスによる拒絶を防止するために、CEA特異的CARのシグナル伝達ドメインの遺伝子を全てマウス相同遺伝子と変換したマウス型CARレトロウイルスベクターを作製し、マウスT細胞への導入を行なう。マウスT細胞への効率的なレトロウイルスによる遺伝子導入方法は既に申請者の研究室において確立済みである。(2)マウス型CAR導入マウスT細胞のin vitro機能評価調整したマウス型CAR導入マウスT細胞のin vitro機能評価を、CEA遺伝子を導入したマウス繊維肉腫細胞株を標的として行った。故に、CAR-T輸注による肺の炎症はCEA非特異的であるが、体重減少は宿主のCEA抗原との特異的相互作用に起因することが示唆される。CEAを標的としたCAR導入T細胞輸注療法は有効だが、安全性に十分な注意を払う必要性が示唆された。遺伝子免疫分子治療学応募内容に基づいて、平成25研究計画は全て完成している。応募内容に基づいて、平成24年研究計画は全て完成している。(1)癌胎児性抗原(CEA)トランスジェニックマウスを用いたCEA特異的キメラ抗原受容体導入T細胞輸注療法の有効性と安全性の検討(2)CEA

特異的CAR-T細胞にCD8+T細胞とCD4+T細胞のいずれか、あるいは両方がin vitro機能評価、in vivo抗腫瘍効果を検討する。(1)マウス型CEA特異的CARレトロウイルスベクターコンストラクトの作成とマウスT細胞への導入NOGマウスにヒトT細胞を移入すると、最終的には移植片対宿主病(GVHD)を発症してしまい、長期のわたるCAR導入T細胞の有効性や安全性を評価することはできない。したがって、CAR導入マウスT細胞を用いた移入治療モデルが必要である。そこで、CEA特異的CARのシグナル伝達ドメインの遺伝子を全てマウス相同遺伝子と変換したマウス型CARレトロウイルスベクターを作製し、マウスT細胞への導入を行う。導入条件の検討にはCAR陽性率と発現強度を指標にして行う。(2)マウス型CAR導入マウスT細胞のin vitro機能評価マウス型CAR導入マウスT細胞を用いて、in vitroにおけるCEA陽性マウス大腸癌細胞株に対する以下の総合的機能解析を行なう。a) in vitroにおける細胞増殖/腫瘍傷害性。b)抗原特異的サイトカイン産生性。c)活性化細胞誘導死(AICD)抵抗性(3)ヒトと同様のCEA発現様式を持つCEAトランスジェニックマウス(CEA-Tg)を導入し、移植腫瘍と大腸発がんモデルを用いたCAR導入T細胞の有効性と安全性評価CEA-Tgマウスに発がんイニシエーターであるアゾキシメタン(AOM)を腹腔内前投与、さらにデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)反復投与し、大腸炎症の再燃と寛解を繰り返す潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌を摸したマウスモデルを作成する。マウス型CARコンストラクトを導入したマウスT細胞をAOM投与14週後のマウスに移入した後、経時的に大腸/腸管膜リンパ節/粘膜固有層を採取し、大腸癌の増殖抑制効果を確認すると共に各臓器の組織切片をH&E染色や免疫染色法を用いて解析し、腫瘍縮小効果を確認すると共に移入されたCAR陽性T細胞の局在と合併症の有無を解析する。NOGマウスの購入と飼育、試薬と抗体の購入。
一般トイレ利用可能・車いすに常備できる折りたたみ移乗器の開発

現在開発されている移乗器は,車いすとともに持ち運びすることを想定していないため,外出頻度の高い活動的な車いす利用者にとって使いやすいものとは言えない.そこで本研究では,超小型・軽量な折りたたみ式の新しい移乗器を開発した.本機器を折りたたんで車いす後部に携帯しておけば,外出先でも利用できる.また,その横幅はわずか36cmなので,障がい者用トイレのみならず,一般トイレでも利用できる.移乗時に必要な力はとても小さく,小柄な女性でも簡単に移乗動作が可能である.また,移乗時に利用者の腹部は圧迫されず,目線を常に水平に保つことができる“介助する側・される側"の双方にとって優しい移乗器と言える.平成26年度は,力学モデルおよび実機を用いて試作1号機の評価を行った.以下にその具体的な内容を示す.●試作機の詳細な力学モデルを作成し,持ち上げ時に必要となる力を算出した.被験者の身体条件を,身長170 cm,体重73 kgと仮定し計算を行ったところ,動作初期における副フレームの押し込み動作時には,水平方向に約12.8 kgfの最大力が必要となり,その後,持ち上げる際には垂直方向に約13.1 kgfの力が必要であることが分かった.一方,小型のロードセルおよびフォースゲージを用いて実機における移乗動作時における力を計測した結果,フレーム押し込み動作時の水平方向力は約11.3 kgf,持ち上げ時の垂直方向力は約8.4 kgfとなった.垂直力には比較的大きな誤差が発生しているが,その原因は,実験時におけるスリングシートのたるみ具合と関わっているため,妥当な結果であると言える.また,走行時の安定性については,前方耐久加速度が約4.4 m/s2であり,後方耐久加速度が約1.5 m/s2と算出された.●3D-CADソフト:SolidWorksを用いて,有限要素法による機器の強度解析を行った.その結果,主フレームに大きな力がかかることが分かったため,試作1号機の中空棒を変更し,アルミ板を重ねることにより作製した中実棒と交換した.●2台のUSBカメラ,および3次元モーションキャプチャ:PV STUDIO 3Dを用いて,移乗動作を解析できる環境を整えた.平成27年度は,平成26年度に行った試作1号機の評価結果を反映させ,試作2号機の設計・製作を行った.以下に研究実績の概要を示す.●平成26年度に作成した力学モデルを見直し,よりシンプルで適切な新しい力学モデルを構築し,シミュレーションを行った.以前のモデルでは,実際に使用する際のスリングシートのたるみ具合をモデル化できていなかったが,本モデルでは,移乗器と椅子にかかる荷重負担率を考慮することにより,シミュレーション結果を実験値に近づけることができた.また,移乗時に,機器の傾きを抑えることが,移乗時に必要な力を大幅に減少させることが分かった.●試作1号機において,機器とスリングシートの間に「巻き上げ器」を挿入した試作2号機を製作した.「巻き上げ器」の導入により,移乗時と着座時に高さの違いがある場合にも対応できるようになった.本巻き上げ器は手動としたため軽量・安価であり,ウォームギアを使用しているため,巻き上げ途中に手を離しても,逆回転による利用者の落下の危険はない.その他,利用者が重度な身体障がい者である場合,座位姿勢が崩れ,頭部が移乗器にもたれかかる状態が考えられる.そこで安全性を確保するために,移乗器にクッション部を追加した.●愛媛県立医療技術大学の窪田先生,佐賀大学の松尾先生,および特定医療法人財団健和会補助器具センター作業療法士の太田さんと共に,特別養護老人ホーム葛飾やすらぎの郷を訪れ,本邦の介護職の腰痛予防に資する福祉用具開発における課題と方法について検討を行い,その一部として,本機器の評価・課題について検討を行った.本研究の申請書における計画に沿う形で,試作2号機の製作を行った.「巻き上げ器」が設計どおりに動作すること,および移乗器に付加したクッションの有効性を確かめることができた.また,実際の介護現場を訪れ,専門職の方々とのディスカッションを通して,本機器の有効性を客観的に知ることができた.本機器の問題点として,着座位置がやや浅めになる点があったが,その対策として,膝当て部の厚みを増すこと,専用のスリングシートの製作などの解決案が挙げられた.最終年度となる平成28年度では,試作器に対し,安全な移乗のための改良を加えた.●後方確認用センサの追加:本移乗器を用いて被介助者を移乗器から椅子等へ移乗する場合,被介助者の陰に椅子が隠れてしまい,介助者が椅子等の位置を目視しづらいという問題があった.そこで本研究では,移乗先の位置を把握するためのセンサ(赤外線測距センサ)を追加し,さらにセンサで取得した情報を視覚的に介助者へ伝えるために,モニタ用LED部を新たに追加した.モニタ用LEDは移乗器と椅子の接近距離に応じて,青(安全),黄(注意),赤(危険)を点灯する.●ブレーキ機構の改良:これまでの試作機では,ブレーキ機構の実現のために,ブレーキ付きキャスタを前輪2輪に用いていた.ブレーキバーを移乗器の前方に配置することにより,介助者はそれを片足で操作することが可能であったが,操作性はあまり良いものであるとは言えなかった.また,本移乗器の特徴となるスライディング機構において,介助者が副フレームを押し込む際に,斜めに力がうまく入らず,スライドがスムーズに行えない状況が見られた.

そこで,これらの問題を解決するために,片側にしかフリー回転できないワンウェイクラッチの原理を応用し,“フリー回転の方向を変更できる片側ブレーキ"および“両側ブレーキ"が電動で切り替えられる新機構を考案し,移乗器に実装した.その結果,介助者は足を使わずに手元でブレーキをかけることができ,またスライドがスムーズにいかない場合,仮に手を放しても副フレームが戻されることがなくなり,安全な移乗が可能となった.現在開発されている移乗器は,車いすとともに持ち運びすることを想定していないため,外出頻度の高い活動的な車いす利用者にとって使いやすいものとは言えない.そこで本研究では,超小型・軽量な折りたたみ式の新しい移乗器を開発した.本機器を折りたたんで車いす後部に携帯しておけば,外出先でも利用できる.また,その横幅はわずか36cmなので,障がい者用トイレのみならず,一般トイレでも利用できる.移乗時に必要な力はとても小さく,小柄な女性でも簡単に移乗動作が可能である.また,移乗時に利用者の腹部は圧迫されず,目線を常に水平に保つことができる“介助する側・される側"の双方にとって優しい移乗器と言える.1.試作機の詳細な力学モデルに基づく持ち上げ力の算出,2. 3D-CADソフトを用いた機器の強度解析,並びに3. 3次元モーションキャプチャによる動作計測など,研究計画に沿った研究を行い,おおむね期待した成果を得ることができたから.平成28年度は,試作機を実用レベルまで引き上げることがメインテーマとなる.使いやすさに加え,デザイン性等も考慮した製品化をめざすためには,可能であれば地元企業との協力が望ましい.地元企業の候補として,床走行移乗機の開発・販売を行っている「(株)アグメント」への交渉を検討している.また,本機器の発展課題として,機器へのセンサの埋め込むがある.例えば,傾斜計の値を常時モニタできるようにすれば,介助者はより適切な持ち上げ動作を行うことができる可能性が生まれる.また,椅子との距離をセンシングできれば,より安全に移乗を行うことができるようになる.介助福祉ロボティクス・メカトロニクス平成26年度の成果を反映させた試作2号機の設計・製作を行う.物品が予定より安価に購入できたため.物品が予定より安価に購入できたため.平成28年度の物品費として繰り越す.平成27年度の物品費として繰り越す.
超伝導ダイヤモンドのナノスケール電子分光:絶縁体転移近傍の超伝導 と乱れの効果

ボロンドープダイヤモンドにおいて,金属-絶縁体転移近傍における超伝導と乱れの効果を明らかにするために,走査トンネル顕微鏡を用いたナノスケール電子分光を行い超伝導電子状態の観測を行った.その結果,トンネルスペクトルのボロン濃度度依存性と局所状態密度の空間変化が明らかになり,ボロンはキャリア量を制御するドーパントだけではなく局所的な乱れの起源にもなっていることが分かった.ボロンドープダイヤモンドにおいて,金属-絶縁体転移近傍における超伝導と乱れの効果を明らかにするために,走査トンネル顕微鏡を用いたナノスケール電子分光を行い超伝導電子状態の観測を行った.その結果,トンネルスペクトルのボロン濃度度依存性と局所状態密度の空間変化が明らかになり,ボロンはキャリア量を制御するドーパントだけではなく局所的な乱れの起源にもなっていることが分かった.本研究の目的は,ボロンドープダイヤモンド薄膜において,極低温領域まで走査トンネル顕微/分光(STM/STS)測定を行い,金属-絶縁体転移近傍に現れる特異な超伝導,乱れの効果,局在電子状態をナノスケールの観点から明らかにすることである.そのために,本研究課題の初年度である平成22年度は以下の項目について研究を行った.1.試料作製,表面処理:ボロンドープダイヤモンドの(111)配向のエピタキシャル薄膜を気相成長法により作製した(連携研究者の協力による).実験に用いる試料は,STM装置の試料処理用真空チャンバー内で加熱することによって清浄な表面を準備した.金属-絶縁体転移に近いTcが比較的低めの薄膜を用いて,ゼロ磁場中,T=0.35KにおいてSTM/STS測定を行い,超伝導ギャップを観測するとともに局所状態密度(∝dI/dV)の実空間変化を観測した.その結果,50100nm程度のスケールで局所状態密度は空間変化することが分かった.この空間変化は試料表面における微細構造とは相関は無く,ボロンドープダイヤモンドにおけるミクロな乱れと関係があると考えられ,酸化物高温超伝導体のナノスケール電子状態との比較を行った(学会発表).3.強磁場中STM/STS測定の準備:来年度以降の強磁場におけるSTM/STS測定のために強磁場STM装置の開発を行った(学会発表).平成23年度は前年度に引き続きボロンドープダイヤモンド薄膜の局所電子状態を明らかにするために極低温・磁場中で走査トンネル顕微/分光(STM/STS)を行う予定であった.しかし,東日本大震災の影響で測定装置の一部に破損が生じたため,装置の復旧作業を行うとともに以下の研究を実施した.震災により超高真空部晶である試料搬送用のロッドに曲がりなどの破損が生じたため,部品の交換と調整を行った.その間,STMを用いない低温・磁場中電気抵抗測定(以下の2.に示す)を中心に実験を行い研究計画に遅れが生じないように実験を行った.2.磁場中電気抵抗率の測定平成22年度にSTM/STSを行ったボロンドープダイヤモンド(111)薄膜について,磁場中で電気抵抗率ρ(T,H)測定を行った.温度依存性や磁場依存性から上部臨界磁場H_<c2>(T)を求めるとともに,磁気抵抗の振る舞いを詳細に調べた.その結果,H_<c2>(T)以上の高磁場領域で負の磁気抵抗が観測され,電子局在の存在を示唆する結果が得られた.3.超伝導エネルギーギャップの観測平成22年度に行ったSTM/STS測定では局所状態密度の実空間分布が明らかになった,平成23年度はエネルギーギャップの空間変化についても詳細に調べた.その結果,局所状態密度の空間変化に対応してエネルギーギャップも同程度のスケール(100mm)で空間変化することが分かった.これらの結果は,電子状態は薄膜試料の表面微細構造ではなくバルクに存在する乱れ(ボロンの分布など)の影響を受けていることを示唆している.以上の他に,磁場中のSTM/STS測定結果について,その他の超伝導体との比較を行った(学会発表).本研究では,ボロンドープダイヤモンド薄膜において,極低温領域(T=0.35K)まで走査トンネル顕微/分光(STM/STS)測定を行い,金属-絶縁体転移近傍に現れる特異な超伝導,乱れの効果,局在電子状態をナノスケールの観点から明らかにすることを目的とした.東日本大震災によって破損したSTM装置の大部分は平成23年度中に復旧を終了しているが,平成24年度にいおても引き続き測定結果を検討しながら実験装置の修復と調整を行った.STM測定の準備としてボロンドープダイヤモンド薄膜を真空中で加熱して清浄表面を準備し,そのままSTMヘッドに試料を搬送することで安定度の高いSTM/STS測定を目指した.平成24年度はTcが5K程度のボロンドープダイヤモンド薄膜を中心にSTM/STS測定を行い,原子分解能を持ったナノスケール電子分光からスペクトルの空間変化,磁場・温度依存性を詳細に測定した.特に結晶粒などの構造や微細構造と局所状態密度の同時測定を行い,結晶粒界などの構造が局所的な超伝導特性に与える影響を調べた.その結果,局所状態密度やエネルギーギャップの値がナノスケールで空間変化することが分かった.しかし,その空間変化は結晶粒界や結晶粒表面の微細構造とは一致しておらず,薄膜内部に存在する乱れの影響を受けていることを示唆している.本研究で得られた結果とこれまでに得られたボロン濃度依存性を総合して検討した結果,試料内部に存在するキャリアドーパントととしてのボロンは局所的な乱れの起源にもなっていることが分かった.

東日本大震災によりSTM装置の破損などが生じたが,STMの復旧作業期間にSTMを使用しない電気抵抗測定などを重点的に行ったため,年度全体としては大きな遅れは生じなかった.24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度も継続して極低温STM/STS測定を行う.特に,磁場中STM/STS測定を重点的に行い,渦糸構造と渦糸内電子状態をについてナノスケールの観点から明らかにする.また,最終年度でもあるため研究期間全体の成果の取り纏めを行う.24年度が最終年度であるため、記入しない。
進行性腎障害に対する遺伝子治療

1.メサンジウム増殖性腎炎モデルである抗Thy-1腎炎モデルラットにおいて、TGF-β受容体-IgG Fcキメラ蛋白発現ベクターを筋肉に遺伝子導入することによる実験腎炎の遺伝子治療を試み、その糸球体硬化病変に及ぼす影響を検討した。抗Thy-1腎炎の糸球体のmRNAレベルはキメラ分子発現ベクター導入群でTGF一βならびにI型コラーゲンのmRNAが抑制されていることが確認された。また、病変惹起7日後の糸球体PAS染色像においても細胞外基質産生が強く抑制されていることが確認された。以上、このキメラ分子発現ベクターをラット抗Thy-1腎炎モデルに導入することにより、筋肉で過剰発現したキメラ分子は腎糸球体に作用しTGF-βによる細胞外基質産生作用を抑制することが確認された。2.TGF-βが過剰発現し間質細胞や形質転換、線維化に関与していることが報告されている一側尿管結紮モデルを用いて、腎間質線維化に対してTGF-βアンチモンスオリゴによる遺伝子治療法の有効性について検討した。はじめに、改良型HVJリポソーム法によりFITCラベルしたオリゴDNAをラット尿管より逆行性に腎臓へ導入したところ、10分後、すでにFITCラベルしたオリゴDNAが、腎髄質のみならず皮質の間質細胞の核にも集積していることが確認された。次にTGF-βに対するアンチセンスあるいはスクランブルオリゴをラット尿管より逆行性に腎臓へ導入した。TGF-βアンチセンスオリゴの腎間質細胞への導入により、TGF-β,I型コラーゲンmRNAの発現が抑制されるとともに、スクランブルオリゴを導入した群に比し、腎間質の線維化が抑制された。改良型HVJリポソーム法を用いた腎間質細胞へのTGF-βアンチセンスオリゴ導入は、間質線維化に対する遺伝子治療法として有効な方法となりうることが示唆された。糸球体硬化の進展を阻止する治療法の開発は腎臓病学における最も重要な課題である。最近、我々は増殖因子であるTGF-β糸球体での過剰発現が糸球体硬化病変の直接の因子であることを示し、さらにアンチセンスDNAを利用して腎での増殖因子の遺伝子発現を抑制する遺伝子治療に取り組んできたが、本年度は、TGF-β異的阻害物質として、TGF-βtypeIIセプターの細胞外ドメインのcDNAをヒトIgのFc部分のcDNAに融合し、発現ベクターpCAGGSのCMVエンハンサー/chickenβ-adinプロモーターの下流に接続し、キメラ分子発現ベクターを作製し、腎での増殖因子の作用発現をレセプターのレベルで阻害することによる進行性腎障害に対する遺伝子治療法の開発を目指し、以下の結果を得た。i)培養BNul-7細胞においてもTGF-βは濃度依存性に細胞増殖抑制効果を示しているが、TGF-βR-Fcキメラ分子を培養上清中に添加することによりTGF-ベータによる細胞増殖抑制効果は完全に抑制された。ii)TGF-β添加により培養NRK細胞においてEIIIA^+ファイブロネクチンは著増したが、キメラ分子はこの産土をほぼ完全に抑制した。iii)このキメラ分子発現ベクターをラット抗Thy-1腎炎モデルに導入することにより、筋肉で過剰発現したキメラ分子は腎糸球体に作用しTGF-βによる細胞外基質産生作用を抑制することが確認された。iX)糸球体のmRNAレベルは同群でTGF-β1・I型コラーゲン・ファイブロネクチンのmRNAが抑制されていることが確認された。

以上、TGF-βの特異的阻害物質として、TGF-βR-Fcキメラ分子を用いて、腎での増殖因子の作用発現をレセプターのレベルで阻害できることが可能となった。また、TGF-βR-Fc分子発現ベクター遺伝子の筋肉への遺伝子導入により、過剰発現したキメラ分子を血流を介して作用させることによりTGF-βの過剰発現による進行性腎障害に対して、遺伝子治療の可能性が示唆された。糖尿病性腎症モデルラットは糸球体硬化病変のモデルの一つであり、糖尿病性腎症の初期病変である腎肥大、糸球体肥大にTGF-β発現が関与していることが最近報告されている。本研究ではTGF-βの特異的阻害物質として、TGF-βレセプターの細胞外ドメインとヒトlgGのFc部分からなるキメラ分子(TGFβRFc)発現ベクター糖尿病ラット筋肉に導入し、糖尿病性腎症に対する遺伝子治療法の開発を目指した。血糖値は糖尿病ラットにおいて無治療群、キメラ遺伝子導入群で差を認めなかったが、腎重量/体重比はキメラ遺伝子導入群で無治療群に比し有意に小さく、糖尿病性腎症の初期病変である腎肥大がキメラ遺伝子導入群により抑制されいていた。単離糸球体のNorthern blot analysisにより、無治療の糖尿病モデルラットにおいては正常ラットに比し、糸球体のTGF-βmRNAレベルは著増していたが、キメラ遺伝子導入群では、糸球体のTGF-βmRNAの増加は抑制されていた。また、このTGF-βmRNAの抑制に相応して、糖尿病性腎症の初期変化であるglomerular hyper trophyの進展も抑制し得た。さらに、糖尿病性腎症の初期病変のひとつである糸球体基底膜肥厚への影響を検討したところ、糖尿病性腎症モデルラットにおいては正常ラットに比し、糸球体の係蹄壁の肥厚が認められたが、キメラ遺伝子導入群では、糸球体の係蹄壁の肥厚は抑制されていた。以上から、糖尿病性腎症モデルラットを用いたinvlvoの検討により、TGFβRFcキメラ分子の遺伝子導入は、糸球体でのTGF-β作用を抑制することにより、糖尿病性腎症の初期病変である、腎肥大・糸球体肥大・糸球体基底膜肥厚を抑制し、細胞外基質蛋白の発環をmRNAレベルで抑制することが確認された。1.メサンジウム増殖性腎炎モデルである抗Thy-1腎炎モデルラットにおいて、TGF-β受容体-IgG Fcキメラ蛋白発現ベクターを筋肉に遺伝子導入することによる実験腎炎の遺伝子治療を試み、その糸球体硬化病変に及ぼす影響を検討した。抗Thy-1腎炎の糸球体のmRNAレベルはキメラ分子発現ベクター導入群でTGF-βならびに1型コラーゲンのmRNAが抑制されていることが確認された。また、病変惹起7日後の糸球体PAS染色像においても細胞外基質産生が強く抑制されていることが確認された。以上、このキメラ分子発現ベクターをラット抗Thy-1腎炎モデルに導入することにより、筋肉で過剰発現したキメラ分子は腎糸球体に作用しTGF-βによる細胞外基質産生作用を抑制することが確認された。2.TGF-βが過剰発現し間質細胞の形質転換、線維化に関与していることが報告されている一側尿管結紮モデルを用いて、腎間質線維化に対してTGF-βアンチセンスオリゴによる遺伝子治療法の有効性について検討した。
チューイングの脳内ストレス抑制機構を担う神経回路の解明と生体ストレス抑制への応用

本申請者は、ストレス負荷と共に咀嚼器官を活性化させる(チューイング)と、中枢神経性ストレス反応およびその下流にある全身性ストレス性応答を減弱させることを明らかにしてきた。これまでに、精神的・肉体的ストレス負荷が速やかに視床下部室傍核でのp-ERK1/2陽性細胞を誘導するが、チューイングさせることにより減少し、情動の上位中枢である扁桃体のGABA作動性ニューロンの選択的神経細胞破壊薬であるAnti-GAT1-sapにより、その減少現象が抑制されることを見出した。すなわち、ストレス下でのチューイングによる咀嚼器官の活性化は、扁桃体GABA作動性ニューロンを介して直接もしくは間接的に視床下部室傍核のp-ERK1/2の発現を抑制することを明らかにしてきた。そこで本研究では、ストレス単独およびストレス+チューイング群のタスク負荷開始直後から解放後30分までの扁桃体内神経伝達物質を10分間隔でEicom HTEC500を用いてマイクロダイアリシス法により採取し、まずグルタメート・アセチルコリン・セロトニンならびにドーパミン等がストレス下でチューイング依存性に変化する神経伝達物質であるか否かをピーク値の変化を比較することで同定する。さらに、同様の手法により視床下部室傍核での神経伝達物質の挙動を検討することで、ストレス下のチューイングによる扁桃体を中心とした脳内ストレス抑制機構ネットワークを視床下部室傍核のp-ERK1/2の発現を指標に解明し、最終的にはこれまでに報告してきたOut put以外の島皮質と前帯状回についても検討し、その抑制機構の脳内ネットワークの全貌を解明することを目的とする。マイクロインジェクション法を用いた扁桃体を含む、各核へのアプローチが困難であるため、時間を要している。今後、研究推進の方向性に関しては特に変更することなく進める予定であり、技術的な問題を解決していく予定である。確実な実験手技の獲得に時間がかかっているため、本実験に移行できず助成金の行使ができなかったが、来年度にはテクニカルな問題を解決し試薬等も逐次購入していく予定である。
粘膜免疫系を応用した要介護高齢者の誤嚥性肺炎の新しい予防法の開発

高齢ウサギにおける誤嚥性肺炎の実験モデルを確立するため,ドーパミンレセプター阻害剤を高齢ウサギに投与し,嚥下反射と咳反射の維持に必須でドーパミンによる分泌調整を受けているサブスタンスPの分泌を抑制させて誤嚥性肺炎を惹起させた.このとき,ウサギに与える粘着性の軟食餌の稠度を前年度よりも増すことで,誤嚥性肺炎の発症頻度を高めることができた.なお,ウサギにおける嚥下反射および咳反射の評価はヒトの臨床検査に準じ,嚥下反射については潜時を,咳反射については咳を生じるクエン酸濃度の閾値を,肺炎の診断については呼吸音,胸部X線写真撮影,血液検査,および喀痰培養検査を,それぞれ評価することができた.一方,まず前年度に確立した方法で,Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus aureusなどの高齢者の誤嚥性肺炎からしばしば分離される口腔内常在細菌と日和見感染細菌に対する特異的唾液SIgAを高齢ウサギに誘導できた.このとき,誘導された特異的な唾液SIgAおよび血清IgGの量をELISA法で,菌体の排除に最も強く関係する凝集活性を直接凝集反応で,それぞれ測定してモニターしたところ,経日的な抗体量の上昇が認められた.次いで,上記の菌群の生菌を多量に播種した場合でも,口腔内常在細菌に対する唾液SIgAによって誤嚥性肺炎の発症が抑制されることを明らかになった.このとき,経日的にウサギ口腔内から細菌を採取して菌数測定することでも,上記の菌群の抑制効果が確認できた.これらの結果から,本研究は,粘膜免疫系を応用した要介護高齢者の誤嚥性肺炎の新しい予防法の確立に大きく貢献できることが分かった.誤嚥性肺炎では,複数の口腔内常在細菌による混合感染が多く認められているため,申請者がこれまでに行なってきた方法に準じ,高齢者の誤嚥性肺炎からしばしば分離される口腔内常在細菌と日和見感染細菌のホルマリン死菌全菌体を混合して高齢ウサギの口蓋扁桃に滴下し,誘導された特異的な唾液SIgAおよび血清IgGの量をELISA法で,菌体の排除に最も強く関係する凝集活性を直接凝集反応で,それぞれ測定した.その結果,扁桃投与法で複数種の口腔内常在細菌に対するSIgA応答を同時に高齢ウサギに誘導できることが明らかになった.また,特異的唾液SIgAが誘導されたウサギの口腔内に上記の菌群の生菌を播種し,経日的にウサギ口腔内から細菌を採取して菌数測定したところ,誘導された唾液SIgAによって同菌群が実際に口腔内から減少できることが確認された.これにより,それらの菌数を口腔内で効果的に抑制できることが明らかになった.一方,高齢ウサギにおける誤嚥性肺炎の実験モデルの確立についても検討を行なった.すなわち,嚥下反射と咳反射の抑制をもたらした高齢ウサギに,ウサギに与える餌を口腔内に残留しやすい粘着性の軟食に変更し,口腔内の自浄作用を低減させることで誤嚥が生じやすいようにしたところ,誤嚥性肺炎をウサギに生じさせることができた.ただし,その頻度はあまり高くなかったため,次年度の研究によって動物モデルの確立を行ないたい.さらに,口腔内常在細菌に対する唾液SIgAによる誤嚥性肺炎の抑制効果についても,次年度にその効果を判定したい.高齢ウサギにおける誤嚥性肺炎の実験モデルを確立するため,ドーパミンレセプター阻害剤を高齢ウサギに投与し,嚥下反射と咳反射の維持に必須でドーパミンによる分泌調整を受けているサブスタンスPの分泌を抑制させて誤嚥性肺炎を惹起させた.このとき,ウサギに与える粘着性の軟食餌の稠度を前年度よりも増すことで,誤嚥性肺炎の発症頻度を高めることができた.なお,ウサギにおける嚥下反射および咳反射の評価はヒトの臨床検査に準じ,嚥下反射については潜時を,咳反射については咳を生じるクエン酸濃度の閾値を,肺炎の診断については呼吸音,胸部X線写真撮影,血液検査,および喀痰培養検査を,それぞれ評価することができた.一方,まず前年度に確立した方法で,Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus aureusなどの高齢者の誤嚥性肺炎からしばしば分離される口腔内常在細菌と日和見感染細菌に対する特異的唾液SIgAを高齢ウサギに誘導できた.このとき,誘導された特異的な唾液SIgAおよび血清IgGの量をELISA法で,菌体の排除に最も強く関係する凝集活性を直接凝集反応で,それぞれ測定してモニターしたところ,経日的な抗体量の上昇が認められた.次いで,上記の菌群の生菌を多量に播種した場合でも,口腔内常在細菌に対する唾液SIgAによって誤嚥性肺炎の発症が抑制されることを明らかになった.このとき,経日的にウサギ口腔内から細菌を採取して菌数測定することでも,上記の菌群の抑制効果が確認できた.これらの結果から,本研究は,粘膜免疫系を応用した要介護高齢者の誤嚥性肺炎の新しい予防法の確立に大きく貢献できることが分かった.
強相関電子系の電子状態と磁性の理論的研究

1.原子内クーロン相互作用を含んだ多重軌道タイトバインデング模型に対して、局所的三体相関を取り入れて電子構造を計算する理論を発展させ、この理論を遷移金属酸化物MnO、FeO、CoO、NiOに適用した。ハートリーフォック近似に三体相関を取り入れた自己エネルギー補正を行い、励起スペクトルを計算した。三粒子状態の多重項は完全に考慮した。この自己エネルギー補正により、FeO、CoO、NiOの励起スペクトルは大幅に改良され、光電子放出実験とよく一致するバンドギャップおよびサテライト構造が得られ、準粒子分散関係も、CoO、NiOにたいする角度分解型光電子放出実験の結果と良く一致するものが得られた。MnOに対しては、自己エネルギー補正は小さいことが示された。又、上記理論をLa_<1x>Sr_xCoO_3に適用して、低スピン状態、中間スピン状態、高スピン状態での励起スペクトルを計算した。x=0での低スピン状態での計算結果は、実験とよい一致を示した。中間スピン状態、高スピン状態はxの増加に伴い安定化されることが示された。2.1次元ハイゼンベルグ反強磁性鎖に反強磁性的に結合した不純物スピンのふるまいを、量子モンテカルロ法を用いて調べた。不純物帯磁率およびスピン相関関数を計算した。絶対零度へ外挿した不純物帯磁率の逆数をエネルギースケールにとると、帯磁率はきれいなスケール則に従うことを見い出した。また、この問題を共鳴準位模型に写像することで、上記のエネルギースケールは共鳴準位幅と解釈できることを示した。
ＨＢＶ由来低分子ＲＮＡの機能解析と肝癌発癌メカニズムの解明

肝細胞がん培養細胞HepB3に同定したHBV genomeから転写されていると考える26ntの塩基を発現するプラズミドベクターを作成し、遺伝子導入した。しかし、目的とするsmall RNAの発現を認めなかった。しかし、上記プラズミドベクターを安定発現する細胞株を作成したところ、間葉変形を起こす細胞が作成された。詳細なメカニズムは以前不明であるが、このsmall RNAによりEMTが惹起されていることが考えられた。前回、miHBVの予想配列を組み込んだ発現ベクターを培養細胞へ導入し、細胞よりRNAを回収して発現しているRNAの解析を施行した。まず、100bp程度の位置に発現しているバンドが認められたため、これが、組み込んだベクターより発現したRNAと考えられた。しかし、本来であれば、さらに短い位置へ生体内の酵素により切断されたRNA(成熟miRNA)のバンドが確認されるはずであった。今回の導入実験ではこの位置でのバンドは確認されなかった。このため、われわれはさらに、別の発現ベクターを2種類作製し、同様の実験を行った。しかし、こちらでも予想されるバンドは確認されなかった。原因としては、生体内での、成熟化は行われているものの、Detectに問題がある可能性も否定出来ないため、各ベクターを導入し細胞内の生体現象(分裂・増殖能など)に変化が見られるかを確認することとした。まず細胞の外見を観察したところ、ベクターの導入により大きな違差は見られなかった。現在、増殖能に変化が来ているかをアッセイにて確認中である。HBV由来の特定の遺伝子の導入により、生体内へどのような影響が出るかを検討、確認することはこれまで実験にて証明されたことがなく、世界に先駆け、HBVの特定部位の遺伝子が何かしらの機能を有していることを証明できると考えられると考えられる。1)我々が同定した、23塩基のHBV由来の配列とその周辺の配列から予想されるPrecursor miRNAを発現し得る配列をコンピューター予測した。2)次に、この予測配列を発現し得る発現ベクターを3種類構築した。3)さらに、これらのベクターをヒト膵臓組織由来の培養細胞へ遺伝子導入を行った。4)遺伝子導入後の組織を回収し、mature miRNAの発現が行われているかどうかをPCR法を用いて確認した。確認したところ、3種類の内2種類ではPCR法によりバンドが出現しており、matureなmiRNAが発現している可能性が示唆された。PCR法は以下の方法を使用した。a)回収した組織よりsmall RNAのみ回収できるキットを用いてtotal small RNAを回収した。b)その後、3'側へ既知の配列によるリンカーを結合させた。c)次にsmall RNA+リンカーを逆転写させた。d)目的のmiRNAの配列とリンカーの配列をprimerとしてPCRを施行した。現在、sequence法を用いて、同定されたバンドがHBV由来のmiRNAの配列に相当するかどうかの確認実験を行っている。この結果は、実験計画の最初の部分に相当している。現在、HBV由来の遺伝子は4種類のみ同定され、かつmiRNAがコードされているという報告はない。この実験結果が正しければ、ウイルス学的に重要な発見であるとともに、HBVによる肝炎、肝硬変、肝癌の進展に対しての新たなる、病態生理の解明、治療法の開発が可能となる可能性がある。1肝細胞ガン培養細胞HepB3に前年度までに同定したHBV genomeから転写されていると思われる26塩基を発現するプラズミドベクターを作製し、遺伝子導入した。導入したHep3B細胞から、microRNAを精製、逆転写し、1)目的塩基を増幅し得るTaqman Probeを作製しrealtime PCRにて増幅出来るか確認した。2)PCRを施行し電気泳動にて目的の位置に増幅後のbandが出現するか確認した。その結果、bandが見られたため、さらにそのバンドを切り取り、精製・クローンング・シークエンス解析を行った。しかし、シークエンスでは意図する塩基配列は得られなかった。2肝細胞ガン培養細胞へ上記プラズミドベクターを遺伝子導入し、1)がん細胞の浸潤能や2)増殖速度、3)細胞形態が変化するかを検討した。1)浸潤能の検討にはマトリゲル細胞浸潤チャンバーを使用した。しかし、遺伝子導入により、有意な変化は認められなかった。2)増殖速度には、一定の細胞数を培養したのちに細胞数の変化を観察した。3)細胞形態は直接顕微鏡を用いて、観察した。幾つか作製したクローンの内1つのクローンにて上皮間葉変形用の形態変化を示したため、このクローンにおける細胞分子学的変化を検討したが、有意な変化は認められなかった。3以上より、HBV由来miRNAの存在は今回の検討では確認は得られなかった。消化器外科HBVmiRNA発現ベクターを導入したところ、予想されるmiRNA長さ(20bp前後)の発現が見られなかった。そのため、種々のベクターを構築、もしくはDetection法に問題がある可能性も否定できず、確認に時間を要した。

当研究施設で実験助手を採用し、臨床を行いながらでも、実験が進む体制が整えられた。上で述べたように、発現ベクターを導入し、まずIn vitroにて細胞に与える影響を分子生物学的に検討する。細胞増殖能、遊走能、apoptosisアッセイを検討する。また、細胞内でのmRNA, Proteinの発現がどのように変化しているかを検討する。変化のあったmRNA ProteinにおけるLuciferaseアッセイを行い。miHBVが発現変化に関係しているかを検討する。上記の通りに、PCR法により同定したバンドが目的のHBV miRNAの配列であることをsequence法を用いて確認する。その配列が正しければ、肝細胞へ導入し、細胞内でどのような変化が生じるかを分子生物学的に検討する。可能であれば、マウス、もしくはラットへ発現ベクターを用いて遺伝子導入を行うことで、生体内、特に肝臓内での変化を検討する。最終的には肝癌の発癌が起きるかどうかを検討する。研究の遅れにより、購入予定品を購入しなかった。次年度の適切な時期に予定品を購入する。Sequenceingでの消耗品代、培養細胞関連消耗品代、PCR、real-time PCR, western blot,免疫染色の各消耗品代。マウス代、ラット代。学会発表に伴う旅費などに使用する。
契約労働者の保護と法律関係--個人請負従事者の法的課題

本研究は、個人請負・業務委託型就業者(以下では、委託型就業者)およびそのなかで委託者との関係において経済的・組織的従属関係にある者(契約労働者)について、諸外国の法制度を参考にしながら、その法的保護と法的構成を検討したものである。その成果として、契約労働者の業務災害について、労災補償制度と同様の業務災害補償制度を創設する必要があること、および解約・更新拒否等の契約トラブルに対する契約ルールの立法化の必要があることを明らかにしている。この年度には、労働組合、フランチャイズ関連企業、学識経験者などにヒヤリング調査を行い、(1)請負、業務委託契約下で自分で業務に従事する就業者の労働組合法上の労働者性および(2)契約労働者の契約関係を研究した。上記(l)の研究成果としては、労働組合法上の労働者の概念および判断基準を明らかにしたことがあげられる。すなわち、労組法上の労働者とは、労基法上の労働者と区別された概念であり、(1)労働契約の一方当事者、または(2)請負、委託などの労働契約以外の契約に基づき(a)自分で役務を提供しこれに対して報酬を受け取り生活すること、かつ、(b)使用者の事業組織に組み入れられて、(c)契約締結時および契約締結後において契約内容の一・方的決定・変更を実質的に受け入れざるを得ない地位にある者をいうべきである(北海道労働判例研究会報告)。上記(2)の研究成果としては、民法上の典型契約である雇用と労働契約の違いを明らかにし、さらに、現在検討されている債権法改正に対して提案を行ったことがあげられる。すなわち、雇用と労働契約の違いとしては、(1)契約自由原則の下にある雇用に対して、判例法理として労働契約が労働者保護の観点から法形式強制のもとにおかれていること、(2)雇用とは自分で労務に従事していることを要件としているのに対して、労働契約は、使用者が労働力の利用につき指揮命令の権能を有する契約をいうと解する。そのうえで、現在法制審議会(債権関係)で検討している債権法改正審議について、雇用と労働契約を一体化する提案がなされているが、法律時報誌において、これに反対する旨を述べた(下記、法律時報1027号掲載)。本年度は、昨年度に引き続き、国内の関係諸団体にヒヤリング調査を行うとともに、平成23年12月に、ドイツ・ベルリンにおいて、連邦議会議員、連邦労働社会省、ドイツ連邦使用者団体、ドイツ労働総同盟、ドイツ・サービス統一労組、労働問題弁護士にヒヤリング調査を行った。また、平成24年1月から2月にかけて、イギリス・ロンドン・オックスフォードにおいて、政府機関、経営者団体、労働組合会議、個別労組、労働法研究者(大学教授)にヒヤリング調査を行った。これらの調査から、ドイツでは、労働者、事業者の間の第三のカテゴリである労働者類似の者とは別に、1990年代のハルツ改革以降、労働者を用いないで役務を提供する自営業者の数が増加し、それは一般に「一人自営業者」と呼ばれ、政府・労使は「一人自営業者」の保護について新たな立法措置を検討していることが判明した。イギリスでは、労働契約上の被用者(employee)と自営業者(self-employed)との間に就業者(worker)を法的に設けているが、これとは別に、労働者を用いない自営業者について、労働組合は、その労働者性および社会保障の面で新たな立法措置を求めている。また、こうした制定法上の措置の法的根拠については、Freedland/kontourisの著書は、ヨーロッパの動向をみすえながら、新たな視点を提供している。これにより、(1)「一人自営業者」にはなんらかの法的保護措置が必要とされ、その定義は法的保護の内容に応じて異なっていること、(2)その保護の法的根拠については、これまでの使用従属関係ではなく、「仕事における人格性」(personality of Work)に求めている説を検討すべきであろう。契約労働者を、1伝統的な労働者、諸外国における第三のカテゴリ(たとえば、ドイツの「労働者類似の者」)、さらには自営業者と対比させて定義し、2その保護の必要性を諸外国の法制度と比較しながら日本の実態をふまえて探り、3契約労働者に対して労働法上いかなる保護(労働条件)を付与すべきか、社会保障法上いかなる制度を構築すべきか、4個人役務提供者の契約関係をどのように法的に構成するかを検討する。その際、労働法にとどまらず、民法(債権法)、社会保障法(雇用保険制度、労災保険制度など)にも目配りしながら研究する。今年度は、委託型就業者、契約労働者に関するこれまでの国内調査、海外調査の結果をとりまとめ、この分野の研究者と宿泊合宿を行い、成果のとりまとめを行った。その内容は以下の通りである。委託企業により業務を受託して、個人で役務を提供する個人役務提供者のうち、「特定の企業(委託者)から業務を受託して、個人で役務を提供し、これに対する報酬によって生活する者」を「契約労働者」と定義する。

本研究は、憲法25条の生存権、27条1項の労働権に基づき、契約労働者を業務災害から補償するため、委託者の無過失責任に基礎とした、委託者の強制加入による災害補償保険制度の創設を提言する。委託型就業者がその法的地位を事前に確認できるようにするために、国は、関係者の申請に基づいて、その法的地位を確認する照会手続を創設すべきである。また、委託型就業者の契約について、その法的性質を基本的に民法上の「雇用」と捉え、民法の雇用規定に、契約内容の特定および変更に関するルール、報酬債権の発生と消滅に関するルール(とくに、不就業における報酬債権の存続)、解約規制ルールなどを設けることを提言する。交付申請書で予定したとおり、イギリスとドイツにおいて契約労働者の実態、法律関係について現地ヒヤリング調査を実施した。また、国内調査についても5か所でヒヤリング調査を実施した。また、日本労働法学会121回大会(沖縄大学)においてミニシンポ「個人請負・委託就業者の保護」を行い、学会員による討議を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、本研究の最終年度となることから、これまでの調査、シンポでの討議などを取りまとめて、契約労働者の保護の在り方について提言を行う予定である。そのうえで、研究成果については、別途、論部(研究雑誌に掲載)または著書の形で公表して、この問題について広く問題提起を行う予定である。
酵母を用いたイネ三量体Gタンパク質を介するシグナル伝達経路の解明

「酵母変異株を用いたイネGタンパク質関連因子の検索」本研究は、イネGタンパク質αサブユニット変異株に認められた倭性(植物体高の短縮)や短粒種子などの表現型が、酵母グルコースシグナル伝達経路を構成する三量体Gタンパク質αサブユニットならびにそれと共役した受容体の欠損株における細胞のサイズ減少と共通している点に着目し、酵母変異株に認められる劣性表現型を相補あるいは抑圧できるイネの遺伝子を単離しようとするものである。申請者は、分裂酵母ホモタリック株のgit3遺伝子破壊株にみられる富栄養条件下での胞子形成をイネGタンパク質αサブユニットの高発現が相補する事を発見した。このことは酵母においてイネGタンパク質が機能する事を示している。そこで、吸水初期のイネからtotal RNAの抽出を行い、イネcDNAの高発現ライブラリーを構築しgit3遺伝子破壊株に導入し、劣性の表現型を回復する遺伝子のスクリーニングを行った。胞子形成の有無は、ヨウ素染色により行った。その結果、αアミラーゼの他、ユビキチン付加酵素ホモログ、Gタンパク質ホモログなどが得られた。αアミラーゼ以外については、イネにおける機能解析を検討している。また、酵母Two-hybrid法によりイネGタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングを行い、複数の候補遺伝子が得られた。この中でも特にユビキチン化に関与する遺伝子が複数得られたことより、Gタンパク質とタンパク質分解の関与が考えられた。これらの知見は、イネのGタンパク質シグナル伝達系解明にさまざまな情報を提供するものと考える。三量体Gタンパク質は、酵母から高等動物にいたるまで広く保存されており細胞の増殖・分化など様々な生命現象に関与している。近年、植物においても三量体Gタンパク質ホモログが見出されその機能解析が始められた。1999年には、イネ三量体Gタンパク質αサブユニットの遺伝子に変異のある株が同定された。この変異株は、植物の背丈が短くなる矮性ならびに種子の短粒などの表現型を示したことから、三量体Gタンパク質が植物の生育に関与する可能性が考えられた。我々は、これまでに出芽酵母の三量体Gタンパク質αサブユニットであるGpa2を介するシグナル伝達経路の解析を行い、Gpa2と共役する受容体遺伝子GPR1をクローニングした。またGpr1,Gpa2がグルコース依存的に細胞内cAMPレベルを制御するグルコースシグナル伝達経路を構成することを明らかにした。本シグナル伝達経路の変異株では細胞のサイズ減少や菌糸様の増殖形態である偽菌糸形成不全などの劣性表現型が認められた。我々はイネ変異株に見られた矮性や短粒という表現型が酵母変異株における細胞のサイズ減少と近似していることに着目し、酵母変異株を用いた相補実験を行った。酵母変異株にイネGタンパク質αサブユニットを発現させたところ、変異株における上記の劣性表現型が回復することを見出した。そこで本年度研究においては、グルコースシグナル伝達経路に変異のある酵母株(GPR1遺伝子破壊株およびGPA2遺伝子破壊株)の表現型を相補するイネの遺伝子をクローニングすることを目的として、イネcDNAライブラリーを構築し酵母変異株に導入し表現型によるスクリーニングを試みている。

そこで、吸水初期のイネからtotal RNAの抽出を行い、イネcDNAの高発現ライブラリーを構築しgit3遺伝子破壊株に導入し、劣性の表現型を回復する遺伝子のスクリーニングを行った。胞子形成の有無は、ヨウ素染色により行った。その結果、αアミラーゼの他、ユビキチン付加酵素ホモログ、Gタンパク質ホモログなどが得られた。αアミラーゼ以外については、イネにおける機能解析を検討している。また、酵母Two-hybrid法によりイネGタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングを行い、複数の候補遺伝子が得られた。この中でも特にユビキチン化に関与する遺伝子が複数得られたことより、Gタンパク質とタンパク質分解の関与が考えられた。これらの知見は、イネのGタンパク質シグナル伝達系解明にさまざまな情報を提供するものと考える。
高対象性有機結晶の合成設計とその機能制御に関する研究

テトラメチルテトラセレナフルバレン(TMTSF)のラジカルカチオン塩は,有機物超電導体として,初めて発見されたもので,ドナー分子が一次元結晶構造を有する唯一の有機超電導体でもある。一般に,一次元積層構造を有する有機電導体は,極低温下で,パイエルンス転移を起こして,絶縁体化するのが宿命と言われているのに対して,この化合物のみが,超電導を発現するのは,非常に興味深いことである。今までに,特に低分子の対称性の高い様々な種類のドナー分子の合成法を検討してきたが,今回の研究では,電導性に主眼をおいたラジカルカチオン塩や電荷移動錯体の有機結晶の対称性に注目し,得られた塩や錯体のX線結晶解析による構造の評価および固体ESR測定による電子状態の考察を行い,物性制御に役立つ統一的知見を得ることを目的とし,以下の検討を行った。まず、ナフタレン系縮合多環化合物に、1,4-ジチイイン環や1,2-ジチオール環のようなカルコゲン原子を含む複素環化合物を縮環させた新規化合物を設計し、合成した。次に、これらの化合物に対して、種々の入手可能な無機イオンのアクセプター(ClO_4^-,BF_4^-,PF_6^-,I_3^-,IBr_2^-,ReO_4^-,Aul_2^-,NO_2^-など)とラジカルカチオン塩を合成し,アニオンの形によるラジカルカチオン塩の電導性について加圧成型試料を用いて比較検討した。また,様々な有機アクセプター(テトラシアノキノジメタン(TCNQ),テトラシアノエチレン(TCNE)など)とも電荷移動錯体を合成し,同様の検討を行なった。以上のように、設計・合成したカルコゲン原子修飾縮合多環化合物のラジカルカチオン塩及び電荷移動錯体について,電導度測定及び吸収スペクトルの測定結果から,固体構造の評価を行った。さらに,単結晶が得られたものについては,X線構造解析を行い,固体構造の解析を行った。また,ESR測定による電子状態の考察を行い,得られた塩や錯体の構造上の物性評価も併せて行った。テトラメチルテトラセレナフルバレン(TMTSF)のラジカルカチオン塩は、有機物超電導体として、初めて発見されたもので、ドナー分子が一次元結晶構造を有する唯一の有機超電導体でもある。一般に、一次元積層構造を有する有機電導体は、極低温下で、パイエルンス転移を起こして、絶縁体化するのが宿命と言われているのに対して、この化合物のみが、超電導を発現するのは、非常に興味深いことである。今までに、特に低分子の対称性の高い様々な種類のドナー分子の合成法を検討してきたが、今回の研究では、電導性に主眼をおいたラジカルカチオン塩や電荷移動錯体の有機結晶の対称性に注目し、得られた塩や錯体のX線結晶解析による構造の評価および固体ESR測定による電子状態の考察を行い,物性制御に役立つ統一的知見を得ることを目的とし、以下の検討を行った。1)カルコゲン原子修飾縮合多環化合物の合成ナフタレン系縮合多環化合物に、1,4-ジチイイン環や1,2-ジチオール環のようなカルコゲン原子を含む複素環化合物を縮環させた、新規化合物を設計し、合成した。2)カルコゲン原子修飾縮合多環化合物のラジカルカチオン塩及び電荷移動錯体の合成1)の方法により合成した,化合物に対して、種々の入手可能な無機イオンのアクセプター(CIO_4^-,BF_4^-,PF_6^-,I_3^-,IBr_2^-,ReO_4^-,Aul_2^-,NO_2^-など)とラジカルカチオン塩を合成し,アニオンの形によるラジカルカチオン塩の電導性について加圧成型試料を用いて比較検討した。