hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
住民主体の災害復興過程における実践的研究

本研究は、住民主体の復興を実現するための方途を理論的かつ実践的に検討することを目的とする。本年度では、2つの取り組みが行った。(1)東日本大震災の被災地である茨城県大洗町において、「クロスロード:大洗編」という名称の防災学習ツールを被災地住民が自ら制作することを研究代表者が支援することを中心としたアクションリサーチを通して、パターナリズム構造の悪循環を解消することを試み、浦河べてるの家が推進する「当事者研究」の視点から考察した。その結果、査読論文の李フシン・宮本匠・矢守克也(2019)当事者研究からみる住民主体の震災復興ー防災ゲーム「クロスロード:大洗編」の実践を通じてー実験社会心理学研究58(2) 81-94で掲載されている。(2)「被災地大洗町と未災地黒潮町」の交流勉強会の開催。大洗町では、震災から7年経った現在の課題は、大洗サンビーチの観光客数のさらなる回復および地域防災のソフト対策などが挙げられる。しかし、対策の実践に至っていない。その理由は、高齢化、防災人材の不足、防災意識の低下、行政と住民のコミュニケーション不足などが挙げられる。そのため、大洗町が抱える防災の課題に関しては、津波による「犠牲者ゼロ」を打ち出して数々のユニークな対策を実施に移してきた南海トラフ地震の「未災地」である高知県黒潮町の経験と知見が交流できた。研究代表者は2018年5月26日・27日に大洗町で第1回の交流勉強会を開催し、2019年1月27日・28日に黒潮町で第2回の交流勉強会を開催した。その結果、両地および研究者との交流によって、住民主体の震災復興および事前復興の課題に向けた解決策が得られた。また、両地が互いに影響しあうことで、黒潮町は、大洗町の経験を活かし、防災教育教材「クロスロード:黒潮編」を作成でき、大洗町は、サンビーチで津波避難実測訓練を実施した。本研究は昨年度の報告書の予定通りに進展している。また、本研究の当初の計画では、2015年関東・東北豪雨被災地常総市石下地区で大洗町と同様のインタビュー調査および参与観察を行う予定だった。平成30年度では、茨城県大洗町と高知県黒潮町を中心にフィールド活動を行ったため、常総市石下地区で活動することは困難であった。今後は常総市石下地区の事例を参考した上で、大洗町、黒潮町、台湾を中心に研究を実行する予定である。来年度は、本研究計画の最終年度である。そのため、これまでの研究成果を海外の英文雑誌、学会で発表する予定である。また、今年度に実施した大洗町と黒潮町の交流勉強会は、すでに具体的な成果として表れたが、たとえば大洗町における津波避難訓練の実施、「クロスロード:黒潮編」などの取り組みをいかに継続的に実践できるのか、本交流勉強会の実施が必要であると考えられる。そのため、来年度も開催する予定である。台湾では、台湾の震災復興の文化・歴史・政治状況そして地域住民と外部支援者の関係性を把握した上で、台湾政府行政院水土保持局の「土石流防災専員」プログラム(土石流防災の地域リーダー育成)と連携し、「クロスロード:台湾土石流編」を作成する。その中で、ゲームの作成およびプレーのプロセスを通じて、台湾における住民主体の地域復興と事前復興の特徴を把握し、日本と比較する。具体的には、地域住民自らがカードゲーム形式の防災教材「クロスロード」の作成と実施に参画するプロセスを通して考察する。本年度では、東日本大震災の被災地である茨城県大洗町において、「クロスロード:大洗編」という名称の防災学習ツールを被災地住民が自ら制作することを研究代表者が支援することを中心としたアクションリサーチを通して、パターナリズム構造の悪循環を解消することを試み、浦河べてるの家が推進する「当事者研究」の視点から考察した。その結果、第1に、「クロスロード」の制作は、被災地住民が自らが直面する課題を自身の言葉で表現したことを意味し、これは、当事者研究に言う「<問題>と人との、切り離し作業」に相当する。この作業を通じて、一方に、<問題>について主体的に考える被災地住民が生まれ、他方に、当事者とは切り離された客体的な対象としての<問題>が可視化されている。第2に、「クロスロード」として表現された<問題>は、多くの人が共有しうる、より公共的な<問題>として再定位される。また、大洗町以外のコミュニティで「クロスロード:大洗編」のような当事者自身が防災教材を作成することによる効果をはかるために、研究代表者の出身地である台湾で参加型防災ワークショップ「クロスロード:大洗編」を実施した。その結果、台湾の参加者は、積極的に「クロスロード」の設問を作成した。その理由は、地域の問題を可視化・共有化するだけではなく、行政やマスメディアなどの外部支援者にアピールし、外部者から関心や理解を得るためである。つまり、「クロスロード」は、地域外部とのコミュニケーションのツールとしてみられる。この点は、大洗町で「クロスロード:大洗編」を実施した効果と異なる特徴である。

本年度は、当初の計画通り、住民主体の復興の取り組みの実現に向けて、「当事者研究」を参照しながら、災害復興過程において住民にどのような不安、矛盾が生じたのか、どのように対処していくのか、また、「クロスロード」活動を通じて、どのように体現したのかを調査することを目的とした。茨城県大洗町住民の「クロスロード:大洗編」の作成プロセスについて、べてるの家の「当事者研究」の視点から考察した。これまで希少である震災復興と精神医療を結びつけた研究を行ったという意味で大きな成果があった。また、災害復興における課題を体系化し、パターナリズム構造の打開に向けて問題を明らかにした。ただし、当初の計画では、2015年関東・東北豪雨被災地常総市石下地区で大洗町と同様のインタビュー調査および参与観察を行う予定だった。平成29年度では、茨城県大洗町を中心にフィールド活動を行ったため、常総市石下地区で活動することは困難であった。他方で、研究代表者は出身地である台湾で、本研究を実施した。台湾は日本と同じく、地震、土砂災害、水害に苦しんでいる。台湾の地域における復興は、住民が積極的に外部支援者と関係性を構築することが特徴である。「クロスロード」を台湾で実施することで、日台の比較研究により、住民主体の復興の実現に向けて提案を行いたい。本研究は、住民主体の復興を実現するための方途を理論的かつ実践的に検討することを目的とする。本年度では、2つの取り組みが行った。(1)東日本大震災の被災地である茨城県大洗町において、「クロスロード:大洗編」という名称の防災学習ツールを被災地住民が自ら制作することを研究代表者が支援することを中心としたアクションリサーチを通して、パターナリズム構造の悪循環を解消することを試み、浦河べてるの家が推進する「当事者研究」の視点から考察した。その結果、査読論文の李フシン・宮本匠・矢守克也(2019)当事者研究からみる住民主体の震災復興ー防災ゲーム「クロスロード:大洗編」の実践を通じてー実験社会心理学研究58(2) 81-94で掲載されている。(2)「被災地大洗町と未災地黒潮町」の交流勉強会の開催。大洗町では、震災から7年経った現在の課題は、大洗サンビーチの観光客数のさらなる回復および地域防災のソフト対策などが挙げられる。しかし、対策の実践に至っていない。その理由は、高齢化、防災人材の不足、防災意識の低下、行政と住民のコミュニケーション不足などが挙げられる。そのため、大洗町が抱える防災の課題に関しては、津波による「犠牲者ゼロ」を打ち出して数々のユニークな対策を実施に移してきた南海トラフ地震の「未災地」である高知県黒潮町の経験と知見が交流できた。研究代表者は2018年5月26日・27日に大洗町で第1回の交流勉強会を開催し、2019年1月27日・28日に黒潮町で第2回の交流勉強会を開催した。その結果、両地および研究者との交流によって、住民主体の震災復興および事前復興の課題に向けた解決策が得られた。また、両地が互いに影響しあうことで、黒潮町は、大洗町の経験を活かし、防災教育教材「クロスロード:黒潮編」を作成でき、大洗町は、サンビーチで津波避難実測訓練を実施した。本研究は昨年度の報告書の予定通りに進展している。また、本研究の当初の計画では、2015年関東・東北豪雨被災地常総市石下地区で大洗町と同様のインタビュー調査および参与観察を行う予定だった。平成30年度では、茨城県大洗町と高知県黒潮町を中心にフィールド活動を行ったため、常総市石下地区で活動することは困難であった。今後は常総市石下地区の事例を参考した上で、大洗町、黒潮町、台湾を中心に研究を実行する予定である。
固相担持型光学活性メントール補助基の合成と不斉光反応への応用

環状エノンとオレフィン類との不斉[2+2]光付加環化反応について、シクロデキストリンを用いたエナンチオ選択的反応と光学活性メントール補助基を用いたジアステレオ選択的反応を検討した。シクロデキストリンを不斉反応場として利用したエナンチオ選択的光反応を行った。温水中でシクロヘキセノン、ペンテノンそれぞれをα,β,γ-シクロデキストリンに包接させた。得られた1:11:2包接錯体を水懸濁状態と固相状態でエチレンとの光反応を行ったところ、付加環化体が得られ不斉選択性が発現することが明らかとなった。本反応は、シクロデキストリンを用いた異種分子間不斉光反応としては初めての例であるが、反応収率、エナンチオ選択性は実用レベルまでには至っていない。本手法において高収率、高選択性を得るためには、高圧下で反応を行うなどの反応条件の検討が必要であると考えられる。両親媒性ポリエチレングリコールレジン(PEG-OMe)担持型メントール補助基を合成し、シクロヘキセノンとエチレンとのジアステレオ選択的光反応を行った。有機溶媒中では高収率、高選択性が得られたが、水中では副反応が進行し目的物がほとんど得られなかった。そこで界面活性剤と、さらに長鎖メチレン鎖を導入したナノサイズメントール補助基を用いたところ、水中でも付加環化体が得られた。シクロペンテンとの反応では有機溶媒中よりも水中の方が、高収率、高選択性が得られた。これは、界面活性剤とメントール補助基が共同でミセル、エマルションを形成することにより、反応物の配列が制御されることと、濃縮効果に起因すると考えられる。マイクロリアクターを用いて、ジアステレオ選択的光反応を行った。従来のバッチ反応(フラスコ内の反応)と比較したところ、反応速度、選択性が共に向上した。これはマイクロ空間で反応させることにより、高効率、高精度に光照射、温度制御が行えたことに起因する。フェニルメントール誘導体を芳香環のパラ位でポリマーに繋げた新規固相担持型メントール補助基を各種合成した。これにシクロヘキセノンを縮合させ、エチレンとのジアステレオ選択的[2+2]光付加環化反応を行った。一般に、コンビナトリアル合成用レジンを用いた固相反応の多くは、液相反応と比較し、不均一反応系に起因する収率の低下が見られる。しかし、トルエン、塩化メチレンなどの有機溶媒と水にも可溶な両親媒性ポリエチレングリコールレジン(PEG-OMe)担持型メントール補助基を用いた場合、塩化メチレン、トルエン中、-78°Cで、液相反応に匹敵する高い収率で光付加体が生成した。特に疎水性ドデカメチレン鎖を導入した場合、高いジアステレオ選択性が得られた。さらに、塩化メチレン溶液に、各種無機塩水溶液を加えたところ、選択性が大幅に向上する新たな添加物効果を見出した。反応液は懸濁していたことから、金属イオンをコアとしてPEGが集積することにより、逆ミセル状の反応場が形成されたと考えられる。この逆ミセル反応場において、加えた金属イオンの正電荷との相互作用により反応部位のstacked s-trans配座に安定化され、高選択性が発現したと考えられる。一方、Polymer部位に平均90Åの空孔を有するWangマクロポーラスポリスチレンレジン(Wang-MP)、Linker部位に疎水性のヘキサメチレン鎖を導入した固相担持型メントール補助基を用いて光反応を検討したところ、溶媒を用いずにエチレンガス雰囲気で固-気反応が進行した。これまで合成したシクロヘキセノン誘導体は同条件下では全く反応しない。これは、エノンがポリマー内に分散されているとともに、レジンの空孔を通じてエチレンガスがポリマー内部まで浸潤したためだと考えられる。これは有機溶媒を必要としないことから、グリーン・ケミストリーの見地からも興味深い。

これは、界面活性剤とメントール補助基が共同でミセル、エマルションを形成することにより、反応物の配列が制御されることと、濃縮効果に起因すると考えられる。マイクロリアクターを用いて、ジアステレオ選択的光反応を行った。従来のバッチ反応(フラスコ内の反応)と比較したところ、反応速度、選択性が共に向上した。これはマイクロ空間で反応させることにより、高効率、高精度に光照射、温度制御が行えたことに起因する。
核物質の状態方程式解明を目指した中性子星からのスペクトル構造の探索

重い星が一生の最後に超新星爆発を起こすと、そのあとに超高密度の星である中性子星が作られることがある。中性子星は、太陽と同程度の質量を持ちながら半径がわずか10km足らずしかなく、その中心部は地上では実現できない超高密度になっている。そのような超高密度の物質(核物質)がどのような振る舞いを示すのか、観測的に明らかにしようというのが本研究の目的である。それには、中性子星の質量と半径が核物質の性質に大きく依存することを利用し、逆に中性子星の質量と半径を観測から求めれば良い。本研究では、中性子星表面で核反応が爆発的に起きる現象、すなわちX線バーストの精密観測から、質量半径の計測を試みる。
アルツハイマー病におけるタウ病変、ミクログリア活性、アミロイド蓄積の病態関連研究

アルツハイマー病(AD)のタウ病変を、新たに開発された[11C]PBB3-PETで評価し、脳内炎症とアミロイド沈着との関連を検討した。AD初期ではタウ病変は側頭葉主体に認めたが、進行とともに前頭頭頂葉へと広がっており、Braakの提唱する進展様式と一致した。タウ病変と脳内炎症、アミロイド病変の広がりは相関を示し、アミロイド仮説を支持するとともに、脳内炎症はタウ病変が直接関与していると考えられた。アルツハイマー病は三大認知症の一つであり、高齢化社会の到来とともに増加の一途をたどっていおり、介護量の増加が社会に与える影響は大きい。アルツハイマー病の主要病理はβアミロイド沈着と神経原線維変化(タウ蛋白病変)と考えられているが、タウ病変の生体イメージングは最近開始されたところであり、タウ病変が脳内環境に与える影響などとの関連は未だ不明である。アルツハイマー病のタウ蛋白病変を[11C]PBB3を用いたポジトロン断層法(PET)で評価し、活性化ミクログリアのトレーサーである[11C]DPA713を用いて脳内炎症を評価するとともに、認知機能障害、βアミロイドの沈着との関連を検討を行っている。アルツハイマー病症例の臨床評価、PET撮像を完了し、健常対照群の撮像を継続している。また、新規トレーサーである[11C]PBB3のPET画像からBinding potential (BPND)画像の作成方法する方法を確立した。[11C]PBB3のBPNDはBraak分類にそった広がりを示し、[11C]PBB3がアルツハイマー病におけるタウ病変の評価に有用であり、病態評価に応用可能であることが確認できた。さらに、全般的認知機能と[11C]PBB3のBPNDの上昇とは相関関係を示したことから、タウ病変の広がりが認知機能の低下に関連することが示された。さらに、[11C]DPA713のBPNDの上昇はタウ病変と重なり合う傾向にあり、タウ病変と神経炎症との関連が示唆された。今後は、アミロイド病変を評価する[11C]PIBのBPNDとタウ沈着との関連を評価するとともに、脳内タウ蛋白の沈着過程が、βアミロイドの沈着や活性化ミクログリア、臨床症状に与える役割を明らかにしていく。アルツハイマー病症例の臨床評価、PET撮像は完了している。データ解析に関しては、[11C]PBB3、[11C]DPA713に関して、Simplified reference tissuemodel: SRTMを用いた、Binding potential (BPND)画像の作成方法の条件設定をおこなった。これに伴い、BPNDパラメトリック画像をもちいた統計画像解析ソフトstatisitical parametric mapping(SPM)による統計画像解析が可能となった。アルツハイマー病症例に関して、[11C]PBB3、[11C]DPA713のBPNDパラメトリック画像の作成は完了している。さらに、現在撮像を完了した健常対照群の[11C]PBB3、[11C]DPA713のBPNDパラメトリック画像との比較をSPMにておこなった。結果、AD症例においてタウ蛋白の沈着はBraak分類によるタウ病変の広がりと類似した広がりを見せた。また、アルツハイマー病では[11C]DPA713の集積が上昇しており、神経炎症の存在が明らかであった。また、[11C]PBB3のBPNDの上昇と[11C]DPA713のBPNDの上昇はオーバーラップしており、タウ沈着と神経炎症が同時に存在することが明らかになった。研究成果は、PBB3実証研究5thミーティングにて発表を行った。アルツハイマー病(AD)の主要病理はアミロイド沈着とタウ病変であるが、タウ病変と他のAD病態との関連は不明である。ADのタウ病変を、新たに開発された[11C]PBB3-PETで評価し、活性化ミクログリアを可視化する[11C]DPA-PETにて評価した脳内炎症と[11C]PIB-PETで評価したアミロイド沈着、各種認知機能との関連を検討した。対象は、NINCDS/ADRDAのAD診断基準に合致する孤発性AD患者20人(平均年齢69.4±8.3歳、男性7名、女性13名)。AD初期では、タウ病変は側頭葉主体に認めたが、進行とともに前頭頭頂葉へと広がっており、Braakの提唱する進展様式と一致した。[11C]PBB3-PETで、早期ADのタウ病変を把握できていると考えられる。全般的認知機能を評価するMMSEの低下と、側頭葉から前頭葉にかけてのタウ病変の広がりとに相関関係をしめしたことは、タウ病変の広がりが認知機能の低下に直接かかわっていることを示していると考えられた。外側側頭葉のタウ病変が上昇と、前頭葉から側頭葉にかけてのアミロイド病変の広がりとに相関関係を示したことは、アミロイド仮説を支持する結果と考えられた。[11C]DPA-PETによる検討では、側頭、後頭、前頭葉を中心に活性化ミクログリアの進展を示し、これらの結果は過去の報告に合致するとともに、ADでは、早期から脳内炎症が広範に広がっていることが示唆された。また、脳内炎症の進展様式は、タウ病変の広がりと重なり合う傾向にあり、右海馬にて、タウ病変と脳内炎症は直接の相関を示した。以上から、活性化ミクログリアの進展には、タウ病変が直接関与しているものと考えられた。

その関連が一部でしか示されなかったことは、活性化ミクログリアの進展が、早期のADにおいても、すでに広範に広がっており、一部はプラトーに達している事が要因と考えられる。アルツハイマー病(AD)のタウ病変を、新たに開発された[11C]PBB3-PETで評価し、脳内炎症とアミロイド沈着との関連を検討した。AD初期ではタウ病変は側頭葉主体に認めたが、進行とともに前頭頭頂葉へと広がっており、Braakの提唱する進展様式と一致した。タウ病変と脳内炎症、アミロイド病変の広がりは相関を示し、アミロイド仮説を支持するとともに、脳内炎症はタウ病変が直接関与していると考えられた。アルツハイマー病症例の臨床評価、PET撮像は完了している。前年度に引き続き、健常対象群のPET撮像を完了させる。これにともない、健常対照群のBPNDパラメトリック画像の作成を完了させ、アルツハイマー病群との比較検討をSPMを用いて検討する。また、アルツハイマー病群の[11C]PIBのBPNDパラメトリック画像を作成し、[11C]PBB3のBPNDの上昇との相関関係をregion of interest(ROI)法を用いて検討する。結果は、日本神経科学会にてポスター発表し、また、society for neuroscience 2016にて国際学会での発表を行う。さらに、研究成果は英文紙へ論文投稿し、広く研究成果を発信する予定である。神経内科学申請時の計画にのっとって、必要に応じて研究費を執行したが、当初の見込額と若干異なり、軽度ながら残額が生じた。申請時の研究計画からの変更はない。前年度の研究費を含め、予定どおり研究を進めていく。残額は2016年に開催される国際学会の参加費として計上する予定である。
炉心制御の基礎

本研究課題のもとに4計画研究がある。それらは1)超高温プラズマ診断、2)爆縮基礎技術、3)加熱技術の基礎、4)新方式閉じ込め、である。1)においては「高温プラズマ中不純物計測用ビームプローブ・レーザー分光法」の課題をとりあげ、2)においては、「慣性核融合用電子ビーム及び軽イオンビーム技術の基礎」、3)では、「高周波加熱におけるアンテナ周辺技術」、4)では、「トーラスプラズマの小型化・高ベーター化に関する研究」、をそれぞれの課題とした。これら計画、及び公募研究15課題よりなる「炉心制御の基礎」計画は、核融合研究における炉心としてのプラズマ研究を主題とするもので、研究の推進状況を把握し、計画の成果を検討し、それを運営に反映させ、計画全体の調整をとりつつ計画の有機的連繋の下での進展を促進することが強く望まれるところである。この線に沿って、全体計画の推進・調整、また今期は第2次3ヶ年計画の最終年次に当るが、続く第3次3ヶ年計画の内容の検討と課題の設定、などのため4回の総括班会議が開催された。また第1次3ヶ年計画のうち、その後の研究の育成と振興を目的として、研究成果検討会を「高効率エネルギー変換」について行った。計画研究のなかに直接含まれない課題のうち、研究会による成果の検討や情報交換の必要と考えられるものに関しては、小規模研究会を主催して、研究の一層の推進に当った。それら小研究会は「トカマク物理ワークショっプ」、「サーマルバリア形成機構の研究」、「プラズマ中の磁場直接測定及び新計測法開発研究会」である。昭和60年度における、第3班「炉心制御の基礎」計画の成果報告会は61年2月12-13日にわたり、約70名の研究代表者及び分担者、等を含め名古屋市の愛知厚生年金会館にて開催され、成果の報告、問題点の摘出、今後の計画への見通しなど検討され討論が行われた。
尿酸は肺高血圧症の病態形成において増悪因子なのか？

我々はオキソニン酸を経口投与することで高尿酸血症にすることに成功した。また肺高血圧モデルマウス(低酸素飼育マウス)を高尿酸血症にすることで、右室肥大・右室圧・肺動脈平滑筋の肥厚が増悪することを確認した。以上の結果より、尿酸が肺高血圧症の増悪因子である可能性が示唆された。今後は尿酸トランスポーターURAT1の肺組織における発現や阻害薬(ベンズブロマロン)の効果につき検討を重ねる予定である。(1)ラットの肺高血圧モデルを用いた血行動態・生存率の解析。低酸素曝露マウスでは高尿酸血症により右室圧・右室肥大・血管平滑筋の肥厚が増悪することを確認している。次の研究段階としてSprague-Dawleyラット(♂, 180-220g)へモノクロタリン(MCT)を60mg/kgで皮下注射を行うMCT投与ラットを通常食群とOA投与群(オキソニン酸を2%で通常飼料へ混合)に分けて3週間飼育し、心臓超音波装置を用いて右室圧を推定する三尖弁逆流量と左室駆出率を1週・2週・3週間の時点で経時的に測定、また3週間飼育した時点で右頚静脈よりカテーテル検査を行い右室圧の測定と摘出した肺組織の病理標本で肺動脈血管平滑筋の肥厚を評価する予定。同様の実験をVEGF阻害薬投与/低酸素曝露ラット(♂, 180-220g)の動物モデルでも行う。さらに生命予後におよぼす影響を確認するためにMCT投与ラット(♂,180-220g)を1Control群、2Control+高尿酸血症群、3MCT投与群、4MCT投与+高尿酸血症群の4群において比較検討する予定。(2)尿酸トランスポーターURAT-1の発現解析尿酸トランスポーターであるURAT-1の肺組織上の発現解析。MCT投与ラットとSu/Hypoxiaラットの肺標本を抗URAT-1抗体を用いて免疫染色を行う。免疫染色の際に血管平滑筋を認識する抗α-SMA抗体、血管内皮細胞を認識するvon Willebrand factor因子を用いた二重染色からURAT-1の局在を明らかにする。またURAT-1発現量の定量評価としてMCT投与ラットとSu/Hypoxiaラットから肺動脈血管平滑筋細胞と血管内皮細胞の初代培養を行い定量PCRを行う難治性疾患である特発性肺動脈性肺高血圧症は血中尿酸値と重症度が相関する事が以前より報告されていたが、その意義はわかっていなかった。そのため肺高血圧症に対する尿酸治療薬使用の是非については議論が分かれるところであった。我々は肺高血圧症の病態形成における尿酸代謝の役割が明らかとなれば、新規の治療ターゲットとなり得ると考え本研究を始めた。尿酸トランスポーターであるURAT-1を介して尿酸が肺動脈血管平滑筋細胞の炎症・増殖を促すという仮説をたてた。肺高血圧モデル動物として低酸素環境下マウスで右室圧が上昇していることを確認した。またモノクロタリン投与ラットで右室圧が上昇していることを確認した。高尿酸モデル動物としてオキソニン酸含有飼料を食べさせることで、血中尿酸値が上昇していることを確認した。病理組織では高尿酸血症にした低酸素飼育マウスでは、通常食の低酸素飼育マウスと比較して右室肥大と右室圧上昇を確認した。今後は肺組織における尿酸トランスポーターURAT-1の発現解析、肺動脈平滑筋培養細胞が尿酸刺激で増殖するのか、その増殖がベンズブロマロンによって抑制できるかの検討、さらにはベンズブロマロン投与によって肺高血圧モデル動物が改善するのか、ということを行っていきたいと考えている。また、慶應義塾大学病院で保管している肺高血圧患者の病理検体を用いて、URAT-1の発現が対照群と比較して上昇しているかを調べていきたいと考えている。・ラットの右室圧測定の手技が安定しなかった。・VEGF阻害薬投与/低酸素曝露ラットモデルが再現性を持って作製困難であった。・免疫染色に適した抗URAT1抗体がなかった。循環器内科学右室圧測定およびVEGF阻害薬投与/低酸素曝露ラットモデル作製、さらに抗URAT1抗体について専門家へアドバイスを伺っている。動物モデル作製の再現性が良くなかったため、購入予定試薬の量が予定より少なかったため。申請書の内容に準じて使用予定。
数値流体力学を用いた解析による温室の隙間換気の推定

隙間換気は温室のエネルギー効率を損ねるため、定量的な評価手法が必要である。本研究では、数値流体力学を用いた解析から算出した温室外表面における風圧力と、被覆材の隙間を通過する空気量を計算するモデルを用いて隙間換気回数を推定した。計算値と実測値の相関係数、ならびに計算値の2乗平均平方根誤差は、いずれも良好な結果であったことから、本手法は保温性に優れた温室設計の一助となることが期待できる。数値流体力学解析は,施設園芸分野では,温室内気流分布の推定に利用されて以来,多くの解析が積み重ねられ,内容もより現実の温室に即したものとなっている。しかしながら,従来手法が精度よく温室環境を再現し得るには,温室構造を解析空間上に正確に描画することが前提であり,流れの出入り口を特定できない隙間換気を直接的に予測することは困難である。そこで,本研究では,数値流体力学を用いた解析から隙間換気の駆動力を予測することで,温室の隙間換気回数を算出し,その妥当性を検証する。平成26年度は,トレーサガス法による隙間換気測定時のアーチ型プラスチックハウスを対象とした数値流体力学の解析に着手した。解の依存性を無視できるメッシュサイズ,乱流モデル,地面境界条件の組合せから,温室周辺の気流性状を精度よく再現する解析条件を検討した。最小メッシュサイズを0.175 mとし,乱流モデルにはRNG k-e,地面境界条件にはせん断応力を考慮した標準壁関数を適用したところ,相関係数,標準誤差において温室周辺の風速を良好に予測することができた。その後,隙間換気回数の実測値を得た6つのデータセットを境界条件に用いた数値流体力学解析から,温室各面に作用する平均風圧係数のデータセットを算出し,助走区間流れモデルを応用して温室の内圧係数と隙間換気回数を算出した。その結果,内圧係数の推定値は文献値と同水準となり,隙間換気回数の推定値は外風速と正の相関を持つ実測値の傾向を再現し,数値流体力学を用いた解析によって温室の隙間換気を推定できる可能性を見出した。本研究では,コストのかかる温室の隙間換気測定の代替方法として,数値流体力学を用いた解析から隙間換気の駆動力となる温室内外の圧力を計算し,隙間換気回数を予測することを目的とする。東西棟のアーチ型プラスチックハウスを対象とし,風上側の防風施設にネットが展張された場合とそうでない場合について,平成26年度より数を増やした計16のケースについて,温室周辺の気流性状を解析した。温室周辺における風速の計算値は,相関係数,標準誤差において実測値とよく一致した。その結果から,温室各面における平均風圧係数のデータセットを抽出し,助走区間流れモデルを応用して温室各面の隙間を通る空気の流入量と流出量を推定し,隙間換気回数を算出した。隙間換気回数の推定値のRMSEは,防風ネットの展張時は0.28,巻上げ時は0.40であり,実測値との相関係数は展張時0.97,巻上げ時0.85であった。推定結果は,巻上げ時,展帳時ともに,外風速が増加するにつれて隙間換気回数が増加する実測値の傾向を良好に再現した。さらに,提案手法の適用範囲を確認するため,既存の東西棟に隣接した位置に新設した同一形状の南北棟のプラスチックハウスにおいて,温室周辺の気流性状の計測とトレーサガス法による隙間換気測定を実施し,数値流体力学解析のためのデータセットを取得した。数値流体力学による解析事例を蓄積して,隙間換気回数の推定方法の検証を進め,実測値の傾向を良好に再現する段階に到達したことは,おおむね順調に進展している状況にあると考えている。コストのかかる温室の隙間換気測定の代替方法として,数値流体力学を用いた解析から隙間換気の駆動力の大きさを表す温室の外圧係数と内圧係数を計算し,隙間換気回数を予測するモデルを開発した。温室の外圧係数を計算するCFD解析では,有限体積法を元に質量,運動量,乱流エネルギーと散逸の保存式の解を数値的に得た。解析は定常状態とし,乱流モデルにはRNG k-εモデルを用いた。各温室の外圧係数は,温室表面を東西の妻面,南北の軒面,アーチ天面,の5つに分割し,各面の平均値として算出した。温室の隙間換気回数の推定には,建物の隙間流れを計算するVickery・Karakatsanis(1983)の式を用いた。外圧と内圧の差によって生じる隙間流れの単位時間流量の和が温室全体ではゼロになると仮定して,外圧係数より内圧係数を算出し,それらを用いて温室を出入りする空気流量を再度算出することで,隙間換気回数を推定した。検証実験には東西棟および南北棟のアーチ型プラスチックハウス(間口6.0 m,奥行き14.0 m,棟高3.5 m)を使用し、1層保温カーテンと温風加温機を用いた5ヶ月間のトマト栽培期間中に、SF6をトレーサガスに用いた濃度減衰法による隙間換気回数の測定を行った。測定期間中には,一時的にフィルムとスプリングを用いて側窓および妻面の扉の隙間を閉塞し、温室の隙間面積の変化がモデルの計算精度に及ぼす影響を検証した。温室の隙間換気回数の推定値は,隙間の閉塞如何に関係なく,南北棟および東西棟の実測値とよく一致した(R = 0.820.99,RMSE = 0.0140.052回/h)。また、隙間を閉塞しない時には東西棟の隙間換気回数が常に大きくなるという測定結果は,CFD解析に基づく推定においても正確に再現された。

隙間換気は温室のエネルギー効率を損ねるため、定量的な評価手法が必要である。本研究では、数値流体力学を用いた解析から算出した温室外表面における風圧力と、被覆材の隙間を通過する空気量を計算するモデルを用いて隙間換気回数を推定した。計算値と実測値の相関係数、ならびに計算値の2乗平均平方根誤差は、いずれも良好な結果であったことから、本手法は保温性に優れた温室設計の一助となることが期待できる。数値流体力学解析の計算条件を決定し,温室の内圧係数の推定を通じて隙間換気回数を試算し,実測値と比較したことは予定以上の進捗状況である。一方,データセットの数が十分でないこと等を考慮すると,総合的な達成度は概ね順調な状況にあると考えている。今後は,東西棟と南北棟のプラスチックハウスを対象とした数値流体力学解析を実施し,その計算結果を用いて,温室周辺の気流性状とトレーサガス法による隙間換気の計測結果との比較を進める。農業環境工学今後は,トレーサガス法による隙間換気測定と数値流体力学解析の追試を同時に進め,高性能の計算機を導入することで,データセット数の確保を加速する。また,風向による隙間換気回数の影響を検討するため,棟方向の異なる温室について隙間換気測定と数値流体力学解析を実施したい。発表申込みをした国際会議からの発表採択通知が年度を越えたため,参加費の支払いを次年度に繰り越すことになった。発表申込みをした国際会議からの採択通知が遅れたため,内部手続きが間に合わず,参加費の支払いを次年度に繰り越すことになった。繰り越した研究費は,国際会議の参加費として使用される予定である。
イオン性クラスレートハイドレートの工学利用に向けた熱力学性質とガス包蔵特性の解明

イオン性クラスレートハイドレートは常温近傍でも生成する結晶固体であり、メタンや二酸化炭素などのガスを包蔵するため、空調技術およびガス分離技術への応用が期待されている。本研究ではこれらの機能的性質を制御すべく、生成するために必要となるイオン性ゲスト物質をカルボキシ酸等の様々なアニオンによりデザインした。生成したハイドレートについて、融点や生成分解熱などの熱力学性質測定および結晶構造解析によるガス包蔵特性の解析を行った。以上により、工学利用に向けたイオン性クラスレートハイドレートのガス分離特性および熱力学性質の制御に関わる知見を得た。当初の研究計画に則り、メタンもしくは二酸化炭素をゲストガス、テトラ-n-アンモニウム(TBA)をゲストカチオン、1から3の炭素数を有する直鎖のカルボキシ酸をゲストアニオンとするイオン性クラスレートハイドレートの相平衡条件の測定を行った。炭素数1および2となるギ酸および酢酸をゲストアニオンとした場合、予想と異なりガスハイドレートの生成が確認されなかった。そこで炭素数3のアクリル酸アニオンを用いてガスハイドレートの生成を試みたところ、これに成功した。TBAアクリル酸+メタンハイドレートについて相平衡測定を行った他、ガスハイドレートとガスを包蔵していないハイドレートについて単結晶サンプルを作製しX線回折により結晶構造を解析した。以上より次の結果が得られている。(1)炭素数1から2のカルボキシ酸をゲストアニオンとすると、メタンもしくは二酸化炭素を含むガスハイドレートは生成しない。(2)炭素数が3であるアクリル酸をゲストアニオンとすると、ゲストガスをメタンとした場合292 Kにおいて2 MPa程度の条件でガスハイドレートが生成する。(3)メタンガスを包蔵する場合としない場合で結晶構造は変わらなかった。当初の予定を前倒しし、カルボキシ基にヒドロキシ基が付加したα-ヒドロキシ酸をゲスト物質とする新たなイオン性クラスレートハイドレートの生成を行った。ガスを包蔵しないハイドレートについて、相平衡測定とX線結晶構造解析を行った。課題(1)ガス分子のイオン性クラスレートハイドレート構造への適合性の解明:テトラブチルアンモニウムカチオンに対して酪酸や吉草酸などをアニオンとするイオン性ゲスト物質についてCH4またはCO2ガス加圧下における3相平衡測定を行った。これらの系では、CH4およびCO2ガスの相平衡条件は近い値となった。酪酸テトラブチルアンモニウムはTetragonal構造のハイドレートを生成すると考えられることから、本構造に対するCH4およびCO2の適合性はほぼ同等であると考えられる。これらの系において単結晶を生成しX線結晶構造解析を行った結果、Tetragonal構造を示唆するデータが得られた。課題(2)新たなイオン性ゲスト物質の探索:2-ヒドロキシ酪酸や3-ヒドロキシ酪酸などをイオン性ゲストアニオンとするイオン性クラスレートハイドレートの生成温度ー濃度条件の測定と融解熱の測定を行った。3-ヒドロキシ酪酸をイオン性ゲストアニオンとすることでハイドレートの融点はおよそ282 Kとなり、2-ヒドロキシ酪酸に比して3 K程度融点が低下した。これは、ヒドロキシル基の位置によりアニオンの包接構造が変化したことで適合性が低下したためと考えられる。課題(3)イオン性クラスレートハイドレートのガス選択性の解明:臭化テトラブチルアンモニウムをイオン性ゲスト物質としてCH4 + CO2混合ガス加圧下において単結晶を生成し、X線回折により分析した。結果から、Orthorhombic構造のハイドレートにはCO2が選択的に包蔵されていることが示唆された。アクリル酸テトラブチルアンモニウムをイオン性ゲスト物質とし、バッチ式の反応装置を用いてCH4 + CO2混合ガス加圧下で分離実験を行った。その結果、ハイドレート相へのCH4の濃縮を示す結果が得られている。平成27年度までの研究により、カルボキシ酸をアニオンとするテトラブチルアンモニウム塩のイオン性クラスレートハイドレートについて、CH4およびCO2ガスの包蔵特性が明らかとなってきた。当初の予想とは異なり、ギ酸や酢酸など比較的小さなカルボキシ酸アニオンを用いた場合のガスハイドレートの生成は確認できていない。そのため、カルボキシ酸を全体的な傾向の把握には至っていないものの、Tetragonal構造やOrthorhombic構造などのイオン性クラスレートハイドレートの結晶構造に対するCH4およびCO2ガスの適合性の全体像は捉えつつある。新たなイオン性ゲスト物質の探索に関してはヒドロキシカルボキシ酸の構造異性体について検討が進んできた。イオン性ゲストアニオン中のヒドロキシ基の位置によって熱力学的安定性が大きく変化することが明らかとなった。課題(1)ガス分子のイオン性クラスレートハイドレート構造への適合性の解明、および課題(3)イオン性クラスレートハイドレートのガス選択性の解明:メタンもしくは二酸化炭素をゲストガスとして生成したアクリル酸テトラブチルアンモニウム(TBA)もしくは酪酸TBAイオン性クラスレートハイドレートについて、詳細な相平衡測定を実施した。得られた相図により、アクリル酸TBAハイドレートおよび酪酸TBAハイドレートに対するメタンおよび二酸化炭素ガスの適合性はそれぞれ異なることが分かった。これらのハイドレートについて単結晶X線回折による結晶構造解析を進め、すべてTetragonal構造と同定した。各々の結晶格子は、二酸化炭素を含むハイドレートの方が長かった。非球状分子である二酸化炭素の包蔵により、格子が伸長した考えられる。単成分のガスにより生成したハイドレートにおいてガス包蔵量や原子位置等の精密な解析が困難であったため、混合ガスから生成したハイドレートについては結晶構造解析を実施しなかった。

しかしながら、結晶格子の明確な違いはこれらのハイドレートに対するメタンと二酸化炭素の適合性の差を示し、これを利用したガス分離技術への応用が期待される。本成果は熱力学の有力紙に掲載された。課題(2)新たなイオン性ゲスト物質の探索:最も単純なヒドロキシカルボキシ酸であるグリコール酸を有するイオン性クラスレートハイドレートを合成した。相平衡測定を実施したところ、当該ハイドレートの融点はこれまでに用いた乳酸や2-ヒドロキシ酪酸のハイドレートよりも低くなった。一方で、単結晶X線回折測定データからは同様の結晶構造を有することが示唆された。そのため、炭素鎖長が短くなったことにより、ハイドレート構造の安定性が低下したと考えられた。イオン性クラスレートハイドレートは常温近傍でも生成する結晶固体であり、メタンや二酸化炭素などのガスを包蔵するため、空調技術およびガス分離技術への応用が期待されている。本研究ではこれらの機能的性質を制御すべく、生成するために必要となるイオン性ゲスト物質をカルボキシ酸等の様々なアニオンによりデザインした。生成したハイドレートについて、融点や生成分解熱などの熱力学性質測定および結晶構造解析によるガス包蔵特性の解析を行った。以上により、工学利用に向けたイオン性クラスレートハイドレートのガス分離特性および熱力学性質の制御に関わる知見を得た。26年度の計画は、ゲストアニオンにカルボキシ酸を用いたイオン性クラスレートハイドレートに関して相平衡測定とX線結晶構造解析を実施し、アニオン中の炭素数と熱力学性質およびガス包蔵特性の相関を明らかにすることであった。当初の予想と異なり、いくつかのイオン性ゲスト物質についてガスハイドレートの生成が明確に確認できなかった。このため、直鎖カルボキシ酸アニオンにおける炭素数と、熱力学特性およびガス包蔵特性の相関の把握は早期に終了する見込みがで出てきた。次年度に計画していたα-ヒドロキシ酸をゲストアニオンとするイオン性クラスレートハイドレートについて、すでに研究を開始している。平成28年度は最終年度となるため、これまで展開してきた課題(1)ー(3)を集約し、カルボキシ酸等の有機酸を対アニオンとするテトラブチルアンモニウム塩のイオン性クラスレートハイドレートのガス包蔵について体系的な理解を試みる。課題(1)については引き続き信頼性の高い相平衡データの取得と単結晶X線回折測定によるイオン性クラスレートハイドレートの結晶構造の同定を行い、各イオン性クラスレートハイドレートの結晶構造に対するゲストガスの適合性を確認する。課題(2)において、他のヒドロキシカルボキシ酸等を対アニオンとして新規ゲスト物質の探索を行い、融点や生成熱等のデータを取得する。課題(3)混合ガスを用いて生成したイオン性クラスレートハイドレートについて、単結晶X線回折測定を実施する。
クライオパイリン関連周期熱症候群の発症機序の構造生物学的解明

本研究では、クライオパイリン関連周期熱症候群(CAPS)発症機序の分子生物学的な解明のため、ヒトNLRP3リコンビナント蛋白の発現・精製を本研究の目的とした。昆虫細胞を利用した蛋白発現系(カイコ及びSF9細胞)を使用し種々の発現コンストラクトを試み、リコンビナント蛋白の発現は確認されたが、いずれも不溶性で機能実験、構造解析に使用可能な可溶性蛋白としては回収が困難であった。結論として、現状ではヒトNLRP3をリコンビナント蛋白として大量精製するのは困難であることが判明した。本研究では、クライオパイリン関連周期熱症候群(CAPS)発症機序の分子生物学的な解明を一義的な目的とする。特にヒトCAPS患者で同定されるNLRP3の遺伝子変異は、その遺伝子型に応じてCAPSが発症した際の重症度をおおまかに規定しているとされる。これらの分子基盤の解明のため、NLRP3リコンビナントタンパク(野生型・変異型)の発現・精製を本研究の第一の目的とした。H26年度は、NLRP3分子のリコンビナントタンパクの発現系を、昆虫細胞発現系を利用して構築することを試みた。昆虫細胞用発現ベクターpFastBac1(Invitrogen社)に全長、LRRドメイン欠失型の遺伝子コンストラクトをそれぞれ組み込んだものを作成し、Bacmid DNAを作成。さらにこれらをSF9細胞に感染させたところ、NLRP3全長及びLRRドメイン欠失型はタンパクの発現が確認された。しかし非常に少量のタンパクしか発現せず、かつ不溶性であった。次いで、カイコを使用したタンパク発現系を利用して上記タンパク群の発現精製を試みたところ、カイコ脂肪組織中からNLRP3タンパクを抽出することができなかった。H27年度は発現コンストラクトの最適化、分泌型タンパクとしての発現系の再構築、他生物種由来発現系(主に大腸菌発現系)でのタンパク発現系の構築を試みる予定である。昆虫細胞用発現ベクターpFastBac1に全長、3種類のLRRドメイン欠失型(ΔLRR)の遺伝子コンストラクトをそれぞれ組み込んだものを作成し、Bacmid DNAを作成。NLRP3と相同性の高い分子であるNLRC4のタンパク立体構造が2014年に報告されているが、NLRC4タンパク発現はN末端のPyrinドメインを欠失させたコンストラクト(ΔPYD)で作成されていた。この情報を元にH27年度は発現コンストラクトの最適化を目的とし、NLRP3ΔPYDのコンストラクトを3種類設計し、SF9細胞に感染させ、タンパク発現を試みた。NLRP3ΔPYDはいずれもSF9細胞内に発現が確認されたが、やはり不溶性で機能実験、構造解析に使用可能な可溶性タンパクとしては回収が困難であった。H28年度は、可溶性ドメイン分子を融合した形のコンストラクトを作成し、タンパク発現系の構築を試みる予定である。Native配列のNLRP3では、リコンビナントタンパクとして精製する場合、タンパクの不溶性が課題である。これらの分子基盤の解明のため、NLRP3リコンビナント蛋白(野生型・変異型)の発現・精製を本研究の第一の目的とした。H26年度は、NLRP3分子のリコンビナント蛋白の発現系を、昆虫細胞発現系を利用して構築することを試みた。pFastBac1にNLRP3全長及び3種類のLRRドメイン欠失型の遺伝子コンストラクトを組み込んだものを作成し、それぞれSF9細胞で蛋白発現が確認された。しかし非常に少量の蛋白しか発現せず、かつ不溶性であった。次いで、カイコを使用した蛋白発現系を利用して上記蛋白群の発現精製を試みたが、カイコ脂肪組織中からNLRP3蛋白を抽出することができなかった。NLRP3と相同性の高い分子であるNLRC4の蛋白立体構造が2014年に報告されているが、NLRC4蛋白発現はN末端のPyrinドメインを欠失させたコンストラクト(ΔPYD)で作成されていた。この情報を元にH27年度は発現コンストラクトの最適化を目的とし、NLRP3ΔPYDのコンストラクトを3種類設計し、SF9細胞に感染させ、蛋白発現を試みた。NLRP

3ΔPYDはいずれもSF9細胞内に発現が確認されたが、やはり不溶性で機能実験、構造解析に使用可能な可溶性蛋白としては回収が困難であった。H28年度は、可溶性ドメイン分子(human SUMO3 tag)を融合した形のコンストラクトを作成し、蛋白発現系を再構築したが、NLRP3は分解してしまい蛋白発現を得ることはできなかった。NLRP3をリコンビナント蛋白として大量精製するのは困難である。本研究では、クライオパイリン関連周期熱症候群(CAPS)発症機序の分子生物学的な解明のため、ヒトNLRP3リコンビナント蛋白の発現・精製を本研究の目的とした。昆虫細胞を利用した蛋白発現系(カイコ及びSF9細胞)を使用し種々の発現コンストラクトを試み、リコンビナント蛋白の発現は確認されたが、いずれも不溶性で機能実験、構造解析に使用可能な可溶性蛋白としては回収が困難であった。結論として、現状ではヒトNLRP3をリコンビナント蛋白として大量精製するのは困難であることが判明した。リコンビナントタンパクの不溶性が課題である。NLRP3のNative配列に可溶性ドメイン分子を融合した形のコンストラクトを作成し、タンパク発現系の構築を試みる予定である。小児科学発現コンストラクトの最適化、分泌型タンパクとしての発現系の構築、大腸菌発現系でのタンパク発現系の構築を試みる予定である。
X・Y精子分離と性決定遺伝子の研究

伴性劣性遺伝病患者の配偶子の性分離および初期胚を用いた着床前診断法の確立は、発生初期に保因者に対する疾患の発現阻止をする為に極めて重要な課題である。疾患遺伝子を用いた診断が切望されるが、単一細胞から正確に診断することが要求されるため、性診断には疾患発現の可能性を診断することは極めて実践的である。第一に睾丸決定遺伝子(SRY)に対するプライマーを作製し、少量の細胞DNAより性の遺伝子診断法を検討した。羊水細胞、リンパ球、および精子を用いて、希釈法による細胞数に対する検出を検討した後に、マイクロマニピュレーターを用いて単一細胞を吸引サンプリングし、その検出について検討した。SRY遺伝子はsingle copyの遺伝子であるため、単一細胞での遺伝子増幅は安定性にはなお問題が残存した。single copy遺伝子に対して、X、Y染色体は特異的なα-サテライトまどの数千コピーからなる繰り返し配列を有しており、この部分についての増幅を行なうことで、PCRでの増幅効率および精度は極めて良好となる。X染色体のDXZ-1、Y染色体のDYZ-1などがXおよびY染色体の繰り返し配列部分にあたる。また、PCRの検出に必要な遺伝子増幅サイクル数を減少させ、なるべくシンプルな操作で安定した検出結果を得るために、アニーリング温度などのPCRの至適条件を検討し、精度の高い検出条件を確定した。さらに、多種のプライマーを用いて一度に複数の遺伝子増幅を行なうmultiplex PCR法を適用し、X、Yの診断精度を向上させることに成功した。単一プライマーによるPCRのバンド陰性例では、遺伝子の存在が否定的である場合の他に、amplification failure、sampling errorの可能性も否定できず、これに対しmultiplex PCRを開発したことにより、複数の遺伝子を同時に増幅し、1プライマーによるmisdiagnosisを回避することを可能とした。これらの結果、本研究により性の遺伝子診断はより高感度で安定した方法への変遷として、SRYによるsingle coy遺伝子の性判定から、nested PCRの応用、繰り返し配列に対する増幅の効率上昇、single PCRへの単純化、そして最後にmultiplex PCRによる2DNAの同時増幅法を確立し、精度の高い診断法を可能とするに至った。睾丸決定遺伝子(SRY gene)を用いて分離精子の性を遺伝子レベルで解析し、蛍光を用いた遺伝子プローブによるFluorescence In Situ Hybridization(FISH)法の手法を応用した解析と並行させて、確実な分離法の確立と、伴性遺伝病患者または保因者に対する疾患の発現阻止のためにこの分離精子を用いた生殖技術の確立することが本研究の最終的な目標である。これまでに血液細胞や羊水細胞を用いたSRY遺伝子のPCRによる遺伝子増幅と電気泳動による解析法を確立した。まず、精子分離法として密度1.09より1.04まで0.05刻みの多層Percollによる密度勾配を作製し、遠心分離を数段階に分けて行うことでX精子を多く含む層を分離した。この分画について、FISH法を用い、XおよびY精子の含有分布を評価した。性遺伝子の検出は、FISH法ではXおよびY染色体に特異的な遺伝子プローブとしてDXZ-1,DYZ-1を用いた。さらに、単一細胞のDNA診断を実施する目的で、PCRには高い検出効率を有する診断法の検討を開始した。第一にSRY遺伝子に対するプライマーを作製し、少量の細胞DNAより性の遺伝子診断法を検討した。

羊水細胞、リンパ球、および精子を用いて、稀釈法による細胞数に対する検出を検討した後に、マイクロマニピュレーターを用いて単一細胞を吸引サンプリングし、その検出について検討した。SRY遺伝子はsingle copyの遺伝子であるため、単一細胞での遺伝子増幅は安定性にはなお問題が残存した。Y染色体のヘテロクロマチン領域に残存する3000copyにもわたる繰り返し配列領域の塩基配列で新たなプライマーの設計による効率のよいPCR法を開発し、SRY遺伝子の増幅による検出率と比較した。その結果、単一細胞とくに単一精子でも95%以上の高い検出効率を獲得した。現在なお、単一の細胞遺伝子からでも安定した遺伝子解析を可能にするべく検討を行っている。伴性劣性遺伝病患者の配偶子の性分離および初期胚を用いた着床前診断法の確立は、発生初期に保因者に対する疾患の発現阻止をする為に極めて重要な課題である。疾患遺伝子を用いた診断が切望されるが、単一細胞から正確に診断することが要求されるため、性診断には疾患発現の可能性を診断することは極めて実践的である。これまでに染色体の単一コピー遺伝子である睾丸決定遺伝子(SRY)の診断から、さらに繰り返し配列に対する確実で効率の良いPCR遺伝子診断の開発へと発展してきた。さらに、single copy遺伝子に対して、X、Y染色体は特異的なα-サテライトなどの数千コピーからなる繰り返し配列を有しており、この部分についての増幅を行なうことで、PCRでの増幅効率および精度は極めて良好となる。X染色体のDXZ-1、Y染色体のDYZ-1などがXおよびY染色体上の繰り返し配列部分にあたる。また、PCRの検出に必要な遺伝子増幅サイクル数を減少させ、なるべくシンプルな操作で安定した検出結果を得るために、アニーリング温度などのPCRの至適条件を検討し、精度の高い検出条件を確定した。さらに、多種のプライマーを用いて一度に複数の遺伝子増幅を行なうmultiplex PCR法を適用し、X、Yの診断精度を向上させることに成功した。単一プライマーによるPCRのバンド陰性例では、遺伝子の存在が否定的である場合の他に、amplification failure、sampling errorの可能性も否定できず、これに対しmultiplex PCRを開発したことにより、複数の遺伝子を同時に増幅し、1プライマーによるmisdiagnosisを回避することを可能とした。これらの結果、本研究により性の遺伝子診断はより高感度で安定した方法への変遷として、SRYによるsingle copy遺伝子の性判定から、nested PCRの応用、繰り返し配列に対する増幅の効率上昇、single PCRへの単純化、そして最後にmultiplex PCRによる2DNAの同時増幅法を確立し、精度の高い診断法を可能とするに至った。