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ピレンを鍵骨格とする斬新なナノカーボンマテリアルの開拓

機能性の付与を目的にピレン骨格のC=C結合をB-N結合で置換した4-aza-5-phenyl-5-borapyreneを設計した。これまで物性値がほとんど得られていなかったBN核置換ピレンの問題点を明らかにし、合成ならびに単離精製、構造決定に成功した。単結晶X線構造解析にも成功し、BN結合が二重結合性を有していることを明らかにした。また、ハロゲン化物イオン認識についても調べ、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンの添加では見られない蛍光強度の減少がフッ化物イオンの添加により見られた。これらの結果から、フッ化物イオン認識能を明らかにした。また、これらBN置換化合物に関する研究内容はTubingen大学のBettinger教授との共同研究である。有機合成の手法を駆使した分子性ナノカーボンチューブの構築も引き続き研究を行った。ピレン誘導体の合成を行い、ワンポット合成、ステップワイズ合成によって単結合を含む環状体合成に取り組んだ。条件検討の結果、ピレン3量体を経由した合成ルートより、環状ピレン8量体と考えられる質量分析のピークを観測することができた。これら研究成果より、博士課程2年半で短縮学位を取得することができた。一連の研究で得られた知見は、分子ナノカーボンの設計や合成の簡便化だけでなく、新たな機能性の付与についても有効であり、多様な分子ナノカーボンを短工程かつ簡便に構築する足掛かりになる。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子性グラフェンでの検討を行う前に、まずより単純な構造である多環芳香族炭化水素の酸化状態における電子状態の解明に着手した。多環芳香族炭化水素は分子性グラフェンを構成するための重要な構成要素であり、得られた知見は、分子性グラフェンの電子状態・反応性を解明するうえで重要な情報になると考えられる。特に、多環芳香族炭化水素化合物の中でもペリレンに着目して研究を行った。結合位置が異なる2種類のペリレン誘導体をそれぞれ合成した。ペリレン誘導体と酸化剤を反応させ、紫外可視吸収スペクトルを測定した結果、それぞれ異なった吸収波形を示した。このことから、2種類のペリレン誘導体のラジカルカチオンおよびジカチオンは、異なる電子状態をとっていることが確認された。また、ペリレン誘導体1のジカチオン体の単結晶X線構造解析に成功した。中性状態とジカチオン状態の結合距離を基にHOMA値を算出した結果、中性状態では2つのナフタレン部位に芳香族性が寄与し、ジカチオン状態ではその芳香族性はアントラセン骨格に変化したことを実験事実として明らかにした。一方で、ペリレン誘導体2のDFT計算によって、ジカチオン状態はフェナントレンの電子状態をとっていることが示唆された。これらの結果から、酸化に伴う芳香族性のエリアのシフトは、他の多環芳香族炭化水素でも十分に起こりうると考えられる。これらの知見は、分子グラフェンの酸化種の安定性や化学修飾を行う際の反応メカニズム予測することができるだけでなく、新規機能性を有した多環芳香族炭化水素の合成や有機エレクトニクス材料を開発する上での設計指針としての十分な役割を果たすと考えられる。目標に掲げる多環芳香族炭化水素(PAH)にもとづく斬新なナノカーボンマテリアルの創製に向けて、当該年度は精力的にPAHの酸化種を制御する研究およびその知見を活かした高次構造体の構築に取りかかっていた。ピレンやペリレン誘導体の反応性を制御することで、安定な酸化種の生成が行えることを見出した。また、結合位置の違いによっても、その電子状態が大きく異なることを実験的に証明することができた。特に、単結晶構造解析による緻密な議論によって、PAHの2電子酸化種について新たなClar則の適用事例を実験事実として実証することに成功した。また、これらの研究成果は、第一著者として国際論文を2報報告し、うち1報は扉絵を獲得した。国際会議でもポスター発表を行うことができた。今後、これらの得られた知見をもとに、最大の目標であるナノカーボンチューブの完全有機合成に向けて、研究を展開していく予定である。

ピレンの置換位置と反応性について精査しながら、ワンポット合成、ステップワイズ合成と順に合成ルートを探索していく。反応を進めていく上で、置換基や触媒など条件を絞り込み最適なものを見つけ出していく作業がこの分子を構築する上で重要な工程であると考えている。効果的な環状化方法の確立のために、確実なプロセスを踏みながら、研究を行っていく予定である。また、ナノカーボンチューブの合成が成功したなら、ホスト分子としての性能や有機半導体特性についても調査を行っていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
フォトニック結晶ファイバを用いた医療診断イメージング用ファイバスコープの設計

近年,医療用システムとして断層画像診断技術(OCT)が注目されている.OCT技術においての横分解能は,顕微鏡の開口数に依存するため,高開口数が必要とされている.OCTで使われる波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯での高開口数用PCFの設計を,有限差分法(FDM)を用いた数値シミュレーションにより行った.本研究では,この数値解析モデルをOCTに応用することを提案している.OCTにおける画像明細度(分解能)は使われる光源とファイバスコープにより決められ,その光源がインコヒーレント,つまりスペクトルの広い光であればあるほど画像明細度(縦分解能)は上がり,そのファイバスコープが高開口数であればあるほど画像鮮明度(横分解能)は上がる.しかし,高開口数ファイバスコープをつくろうとしても,PCFは複雑な構造となり製造が難しいため大きな開口数を得られていないのが現状で,横分解能が不十分は状態であった.本研究では,眼科,消化器科,歯科に使われている波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯における,OCTのため製造が容易な構造をもった高開口数ゼロ分散シングルモードPCFを推奨する.シミュレーション結果は推奨するPCF構造がOCTシステムの横分解能を向上させることを示している.なお,数値解析手法として有限差分法を用いた.波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯における高開口数分散フラットPCFの数値シミュレーションを行った結果,高開口数を有するPCFであることが確認でき,このPCFをOCTに応用することによってOCTの横分解能を現在の20倍近く向上させることができた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。近年,医療用システムとして低コヒーレント光干渉を用いた断層画像診断技術,光コヒーレンストモグラフィ(OCT)が注目されている.OCTを用いることで,生体組織下数mmに渡って断層画像を容易に取得することができる. OCTの技術向上には幾つかの課題があり,その1つに高分解能化がある.この課題を解決するための手段として,フォトニック結晶ファイバ(PCF)を励起して得られるスーパーコンティニューム(SC)光がある. PCFを用いてSC光を発生させるための最適な条件は, PCFの高い非線形性とSC光帯域の中心波長でPCFがゼロ分散,またはゼロ近傍の正常分散を有していることである.さらに, OCTに用いるPCFはシングルモード動作をする必要がある.現在, OCTで検討されている主な波長帯は,眼科では0.83μm,皮膚科や消化器科では1.06μm,歯科では1.31μmである.本研究では,歯科での応用が検討されている波長1.31μm帯で,高効率にSC光を発生させるため, PCFのコア部にゲルマニウム(Ge)を添加した高非線形六角形PCF,高非線形四角形PCF及び高非線形八角形PCFの3種類を提案し,有限差分法(FDM)を用いて数値解析し,理論的に比較検討を行った.各モデルの数値シミュレーションした結果より,高非線形四角形PCFが最もよい特性を得ることができた.また,高非線形四角形フォトニック結晶ファイバが波長1.31μm帯において,高い非線形性とゼロ近傍の正常分散を得ることができ,コヒーレンス長がスーパールミネッセントダイオード(SLD)より短くなることが分かった.従って、歯科用の高分解能の光源として期待できることが確認できた.近年,医療用システムとして断層画像診断技術(OCT)が注目されている.OCT技術においての横分解能は,顕微鏡の開口数に依存するため,高開口数が必要とされている.OCTで使われる波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯での高開口数用PCFの設計を,有限差分法(FDM)を用いた数値シミュレーションにより行った.本研究では,この数値解析モデルをOCTに応用することを提案している.OCTにおける画像明細度(分解能)は使われる光源とファイバスコープにより決められ,その光源がインコヒーレント,つまりスペクトルの広い光であればあるほど画像明細度(縦分解能)は上がり,そのファイバスコープが高開口数であればあるほど画像鮮明度(横分解能)は上がる.しかし,高開口数ファイバスコープをつくろうとしても,PCFは複雑な構造となり製造が難しいため大きな開口数を得られていないのが現状で,横分解能が不十分は状態であった.本研究では,眼科,消化器科,歯科に使われている波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯における,OCTのため製造が容易な構造をもった高開口数ゼロ分散シングルモードPCFを推奨する.シミュレーション結果は推奨するPCF構造がOCTシステムの横分解能を向上させることを示している.なお,数値解析手法として有限差分法を用いた.波長830 nm,1060 nm,1310 nm帯における高開口数分散フラットPCFの数値シミュレーションを行った結果,高開口数を有するPCFであることが確認でき,このPCFをOCTに応用することによってOCTの横分解能を現在の20倍近く向上させることができた.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究成果が、査読付き学術論文に2編採択され、国際学会で2件発表されており、さらに、英語の著書を1冊発行しているため、計画された研究はおおむね順調に進展している。

本研究では,歯科での応用が検討されている波長1.31μm帯で,高効率にSC光を発生させるため, PCFのコア部にゲルマニウム(Ge)を添加した高非線形六角形PCF,高非線形四角形PCF及び高非線形八角形PCFの3種類を提案し,有限差分法(FDM)を用いて数値解析し,理論的に比較検討を行っているが、今後,皮膚科や消化器科では1.06μmや1.55μm帯についても検討する予定である。
格子QCDによるハドロン物理学の研究

原子核・ハドロンの系を支配する強い相互作用の第一原理計算である格子量子色力学(格子QCD)計算を用いて、ハドロンの諸性質やそれらのダイナミクスの研究を行った。その結果、物質の構造に直結するフレーバー8重項のメソン・バリオン結合定数の定量的評価に成功した。また、カラーSU(2)の系において、ハドロン間相互作用を詳細に研究し、数々の新しい知見を得ることに成功した。世の中の構成要素である、陽子・中性子・中間子など、強い相互作用にしたがう原子核・ハドロンの系は、'より基礎的な理論、量子色力学(QCD)によって支配されていることがわかっている。QCDは簡潔なラグランジアンで記述されるSU(3)非可換ゲージ理論であるが、そのダイナミクスはQCDの持つ強結合性により非常に複雑・多彩なものとなっている。現在においても、QCDのダイナミクスを解くことは容易ではなく、ハドロン物理のQCDからの理解はまだ発展途上といえる。申請者は強力な第一原理計算である、格子QCDモンテカルロ計算を用いて、ハドロン物理を直接QCDの観点から解明することを主眼に研究を行った。主な研究対象はストレンジクォークを含む、負パリティバリオンA粒子である。近年、核子とK中間子の間の非常に強い引力の存在が示唆されており、この引力は、これまで考えられていなかった、新しい物質形態(K中間子物質)を生み出す可能性がある。核子とK中間子の相互作用を知ることは現実には容易ではないが、核子とK中間子の束縛・共鳴状態と見なされているA粒子の性質を調べることにより、核子・K中間子相互作用に重要な示唆を与えることができる。申請者は、格子QCDを用いて、A粒子の内部フレーバー構造を評価した。その結果、基底状態は、フレーバー1重項が支配的であり、励起状態はフレーバー8重項成分が支配的であることをつきとめた。格子QCDによる、粒子のフレーバー構造の評価は、世界で初めての成果である。これちの結果は、国際会議で発表され、査読付き論文誌に掲載された。その他、物質の構造に直接関与する、ハドロン間ポテンシャルの研究を新たに開始し、その成果は日本物理学会で発表されている。世の中の構成要素である、陽子・中性子・中間子など、強い相互作用にしたがう原子核・ハドロンの系は、より基礎的な理論、量子色力学(QCD)によって支配されていることがわかっている。主眼としたのは、ハドロン間相互作用と(非可換ゲージ理論における)古典的ゲージ場の時間発展である。・古典的ゲージ場の時間発展:重イオン衝突において、クォーク・グルーオン・プラズマが生成された後、非常に短時間で熱化することが指摘されているが、このメカニズムを基礎理論であるQCDから理解すべく、研究を行った。古典ヤンミルズ理論の時間発展プロセスを追い、そのリアプノフ指数を調べた。その結果、ヤンミルズ理論の時間発展には異なった時間スケールが存在し、それらのスケールは、(時間平均的)リアプノフスペクトルの振る舞いによって、特徴付けられることを突き止めた。・SU(2)QCDにおけるハドロン間相互作用:陽子・中性子などのハドロン間相互作用は、遠・中距離は湯川秀樹により提唱された中間子論で記述されるが、近距離領域の相互作用は不明な点が多い。そこで、よりシンプルな理論であるSU(2)QCDを用いて、ハドロン間相互作用を検証した。その結果、中間子交換相互作用以外にも、遠距離領域でのユニバーサルなグルーオン的引力・近距離領域での斥力が存在することを突き止めた。特に、この斥力の振る舞いは、パウリ排他律とカラー磁気相互作用を起源とするシナリオと矛盾しないことを突き止めた。**研究の目的**申請者は、平成23年度において、強い相互作用の第一原理計算である格子QCD計算を用いて、「1.SU(2)カラーQCDにおけるハドロン間相互作用の研究」「2.チャームクォークを含むハドロンダイナミクスの研究」「3Λ(1405)粒子の研究」を行った。研究の目的は、これらの研究を通して、我々の世界の物質の構造に重要な寄与を果たすハドロン間相互作用を、基礎理論であるQCDから直接理解することである。実際の世界のダイナミクスはSU(3)カラーであるが、このダイナミクスは複雑である。その一方で、SU(2)カラーの世界は、非摂動効果は共通部分が多いが、ダイナミクスはよりシンプルであり、この系の解析により有用な示唆を得られることが期待される(研究1)。

また、チャームクォークやストレンジクォークを含むハドロンの相互作用は、星内部など極限状態にある物質の構造を支配する重要な物理量であるが、研究2・3の遂行により、これらのダイナミクスを解明することが期待される。**研究の成果**平成23年度における申請者の研究成果は以下のとおりである。1.SU(2)QCDを用いて、ハドロン間相互作用を研究し、近接したハドロン内に誘起されるカラー励起状態の大きさなどを見積もった2.チャームクォークを含むハドロンと中間子の相互作用を理解すべく、ハドロン3点関数の計算を行った3.Λ粒子の性質を理解するため、複数の演算子を用いて相関行列を対角化し、スペクトルの研究を行ったこれらの研究はまだ完成されていないものの、現時点でpreiiminaryな結果を得ている。これらの結果は、国際会議等で発表が予定されている。
ソフトマテリアルの電気泳動マイクロレオロジー

生体をはじめとするソフトマテリアル複合系は内部に様々な空間スケールを有する構造が階層的に存在するため、その巨視的力学物性は十分に解明されているとは言いがたい。しかし、ソフトマテリアルのミクロな構造やダイナミックスの制御を行う上で、各構造に対応したさまざまな時空間スケールで局所力学測定を行い、それらに関する知見を得ることは重要である。本年度は非イオン性界面活性剤(C_<12>E_5)からなる柔らかい2分子膜が数十nmの繰り返し周期で水中に分散した系(リオトロピックラメラ相)に膜間隔より小さな荷電コロイド粒子を分散させ、その複素誘電率スペクトル測定を行った。その結果、誘電率スペクトルに数百kHzおよび1kHzに2つの緩和過程が観測された。低周波緩和は粒子を添加した場合のみに現れたのに対して高周波緩和は粒子を添加しない場合にも現れる。解析の結果、低周波緩和は昨年度報告した電気泳動易動度の高周波緩和と同一の機構で起こっていること、高周波緩和は導電体である水相中に絶縁体である2分子膜が分散することで生じるMaxwell-Wagner緩和であることがわかった。さらに蛍光標識されたコロイド粒子の運動を蛍光顕微鏡下で直接観察することにより、昨年度観測された低周波における易動度の著しい低下の原因が、ラメラ構造の欠陥に捉えられながら拡散していく粒子のきわめて遅いブラウン運動によるものであることをつきとめた。本研究により得られた2分子膜からなる不均一構造を有した媒質中でのナノ粒子の局所的な物質輸送に関する知見は、生体中ならびにそれを模倣したソフトマテリアルを用いたナノ空間内での輸送現象とその制御のための基礎的情報を与える点で意義がある。生体をはじめとするソフトマテリアルからなる複合系の特徴はその内部にさまざまなスケールの構造が階層的に存在する点にあるが、その粘弾性をはじめとする力学物性は従来、巨視的なスケールでしか行われて来なかった。このため、測定により得られる情報は巨視的なスケールにわたる平均的なものでしかなく、個々の内部構造に対する情報を分離することは困難であった。しかし、ソフトマテリアルのミクロな構造やダイナミックスの制御を行う上で、各構造に対応したさまざまなスケールでの物性測定を行い、それらに関する知見を得ることは必要不可欠である。本年度は階層的構造を有する複雑流体中にプローブとして荷電コロイド粒子を分散させ、我々が独自に開発した光散乱を用いた複素電気泳動易動度スペクトル測定システムによりその易動度スペクトルを測定することで、複雑流体の局所的な輸送現象ならびに力学的性質に関する知見を得ることを目指した(電気泳動マイクロレオロジー)。具体的には、非イオン性界面活性剤(C_<12>E_5)からなる柔らかい2分子膜が数十nmの繰り返し周期で水中に分散した系(リオトロピックラメラ相)に膜間隔より直径の小さな荷電コロイド粒子を分散させ、その複素電気泳動易動度スペクトル測定を行った。その結果、スペクトルに2つの緩和過程が観測され、低周波ほど易動度が減少し、数Hz以下ではほとんどその易動度がゼロになることがわかった。さらに、この系の誘電緩和測定ならびに蛍光ラテックス粒子を用いた蛍光顕微鏡観察による1粒子追跡の結果、これらの緩和が膜間隔(数十nm)、ならびに膜の相関長(数百nm)程度の距離でコロイド粒子の自由な拡散を妨げる障壁が存在するために発生していることがわかった。本研究により内部に階層構造を有する複雑流体中でのナノ粒子のダイナミックスには階層的な構造に対応した動的階層構造が現れることが明らかとなった。
肝分化・肝再生におけるdickkopf 3の作用機序の解明

肝分化・肝再生に関わると予想される分泌蛋白質Dickkopf 3 (Dkk3)の作用機序を解明するためにDkk3高発現細胞における抗アポトーシス作用の分子機序の解析、受容体探索およびDkk3ノックアウトマウスにおける肝再生への影響を解析した。その結果、抗アポトーシス作用には活性酸素種の抑制が関連すること、また受容体としてはCKAP4など数種の候補分子を明らかにし、その結合と作用を確定しつつある。一方今回のノックアウトマウスを用いた解析では、肝再生に顕著な影響は見出せなかった。本研究はdickkopf3(Dkk3)が肝分化の分子機構解明のキィー分子の一つと仮定し、Dkk3の受容体の同定や作用シグナル分子の探索を行い、Dkk3の肝分化、再生における機能を明らかにすることを目的としている。平成21年度は計画の初年度として以下の研究を行った。1.Dkk3受容体の同定(1)Dkk3発現を調べ、受容体同定に使用する蛋白サンプルを採取する細胞株候補を選択した。(2)肝芽腫細胞株HuH6-Cl5と当研究室で樹立したヒト非腫瘍肝組織由来不死化肝細胞株tPH5CHを含む数種の細胞株はDkk3を高発現することが確認された。HuH6-Cl5、tPH5CHはRNAiによりDkk3発現を抑制すると増殖が低下し、Dkk3が機能していることが推測された。2.Dkk3ノックアウトマウスを用いた肝再生における機能解析(1)Dkk3ホモ、ヘテロ型ノックアウトマウスを理研バイオリソースセンターに提供依頼した。(2)ホモ型は現在繁殖中である。今後繁殖したノックアウトマウスの部分肝切除、四塩化炭素肝障害モデルを用い、肝再生におけるDkk3の機能を解析する予定である。dickkopf3(Dkk3)は本研究代表者らによって肝分化・肝再生に関わる分子として新規に見出された。本研究ではDkk3の機能を解明することを目的として、Dkk3の受容体やシグナル分子の探索、またDkk3ノックアウトマウスを用いた肝再生への影響の解析を行う。平成22年度の成果は以下のとおりである。1.Dkk3受容体の同定と下流シグナルの解析(1)Dkk3発現ヒト非腫瘍肝細胞株tPH5CHとリコミナントヒトDkk3蛋白を用いたCo-immunoprecipitation及びLC-MS/MSの解析により、数種の相互作用膜蛋白の候補を得た。再試験を行い確認する。(2)tPH5CH細胞などDkk3発現細胞においてDkk3が抗アポトーシス機能を持つことが示唆されている。この結果に着目し、生存に関連するシグナル経路の分子Erk1/2、Akt、STAT3について、Dkk3発現抑制に伴う活性化(リン酸化)の変化をウェスタンブロットにて検討した。その結果これらのリン酸化が抑制されることが明らかになった。今後(1)の結果との関連についてさらに詳細な検討を行う。以上の成果からDkk3の受容体と関連シグナル経路に関し具体的な分子を特定できる可能性が得られた。2.Dkk3ノックアウトマウスを用いた肝再生における解析(1)野生型(コントロール)、ホモ型を繁殖し、実験に用いる個体数の確保を行っている。(2)四塩化炭素投与肝障害モデルを作製するために、四塩化炭素投与量の検討と予備的試験を行っている。今後両群の肝再生における差異を機能的、組織学的に評価する。(3)70%部分肝切除モデルを作製するために、部分肝切除の手技の検討と習得を試みた。以上の活動により、ノックアウトマウスを用いた研究が実現できる見込みがついた。Dickkopf3(Dkk3)は本研究代表者らによって肝分化・肝再生に関わる分子として新規に見出された。本研究ではDkk3の機能を解明することを目的として、Dkk3の受容体やシグナル分子の、またDkk3ノックアウトマウスを用いた肝再生への影響の解析を行った。平成23年度の成果は以下のとおりである。1.Dkk3抗アポトーシス機序に関するシグナル分子の解析およびDkk3受容体の同定(1)Dkk3発現ヒト非腫瘍肝細胞株tPH5CH蛋白と分泌Dkk3含有馴化培地もしくはリコミナントヒトDkk3蛋白を用いたCo-IP及びLC-MS/MSの解析により、Dkk3受容体として有力候補を得た。この分子は今後腫瘍細胞特異的なDkk3の抗アポトーシス作用の解明を発展させるための標的分子とすることができると考えられる。(2)RNAiによるDkk3発現抑制系を用いた解析により、Dkk3発現腫瘍細胞におけるDkk3抑制はアポトーシスを誘導することが明らかになった。この機序として、Catalaseなど抗酸化酵素の発現低下が関与し活性酸素種濃度の増加によって酸化ストレスが上昇することが一因である可能性が示唆された。2.Dkk3ノックアウトマウスを用いた肝再生における機能解析

(1)四塩化炭素投与肝障害モデルと、先行実験として70%部分肝切除モデルを用いて解析を行なった結果、いずれのモデルでも野生型とホモ型で有意な差は認められなかった。(2)(1)の結果の原因について、Dkk3蛋白発現解析においてホモ型にも抗Dkk3抗体に反応する蛋白の発現が認められたため、詳細なDkk3蛋白発現を検討した。その結果、ホモ型の遺伝子組み換えは確認されているが、同時にDkk3に近似する蛋白が発現し機能している可能性が明らかになった。このことから本研究で用いたホモ型でDkk3の肝再生における機能を解析するのは困難である、という結論に至った。
「脳・神経細胞におけるインパルス・シグナリングの分子機構」の推進

本年度は、本領域研究の初年度ということで平成元年8月と平成2年2月の2回に亘り総括班会議を、また平成元年9月と12月には、幹事会を行い、向う3年間の研究推進の方法と、平成元年度に於ける短期的な研究推進方法について検討を行った。その結果以下のような事項を決定した。即ち平成元年度は「神経伝達へのアプロ-チ」と位置づけ(1)計画研究班員には代表の研究推進方針(共同研究チ-ムを作りブレ-クスル-を狙う)を徹底させ、来年度以降研究成果を挙げ易い体制にする。(2)そのために早大人間科学部をセンタ-、阪大基礎工学部、九州大学薬学部をサブセンタ-として共同研究の場作りを行う。(3)研究に専念するため、班員には会議その他の呼びかけを遠慮する。以上3項目に重点を置いた。先ず(1)の目的を達成するためにサ-キュラ-を発行し、研究代表者の考えを班員に徹底させることを図り、平成2年2月には計画研究班、一般公募班合同の班会議を開き、これを確認した。またこの方針の一環として、毎月一回定例研究会を東京で開催し、主として公募班員のメンバ-の方々にそれぞれの研究内容を紹介して貰い、徹底的な討論を行った。目的(2)を遂行するため、センタ-・サブセンタ-の機能の充実につとめた。この結果地域での情報流通の度合が格段に進展した。目的(3)を実現するため計画研究班員・公募班員とも前記定例研究会での発表以外に一切のデュ-ティ-を免除した。以上のようにこの一年間を経過したが、平成2年度には効率のよい共同研究を実施するために、計画研究班員に対しての研究費の配分方式を工夫する必要があることが分かった。
ADSCスフェロイドと単球・マクロファージ共培養による骨再生への検討

脂肪組織は、その中に含まれる幹細胞の数が骨髄に比較しておよそ1000倍であることから体性幹細胞のソースとして注目されている。単球/マクロファージ系は、移植後の局所において、骨リモデリング開始に寄与すると考えられている。本研究では、脂肪組織由来幹細胞(ASC)スフェロイドと単球との共培養を行った。その結果、共培養5日目にTRAP陽性多核細胞を認めた。多核細胞は融合し、細胞の巨大化が認められた。骨芽細胞分化誘導培地では、より細胞が凝集する傾向が見られた。共培養によりASCスフェロイドの石灰化促進が認められたことより、単球によってASCの骨芽細胞分化能が亢進した可能性が示唆された(現在論文投稿中)。骨や軟組織の欠損に対する低侵襲な再生療法として、自己の組織幹細胞を用いた移植材開発に期待が寄せられている。脂肪組織は皮下の浅層に豊富に存在するため、採取が非常に低侵襲である上に、その中に含まれる幹細胞の数が骨髄に比較しておよそ1000倍であることから、体性幹細胞のソースとして注目されている。この脂肪組織由来幹細胞(ASC)から生じた細胞シートを成形してスフェロイドを作製し、monocyteとの共培養を行った。その結果、共培養5日目にTRAP陽性細胞を認め、DAPI染色にて多核の細胞を多数認めた。骨芽細胞分化培地では、より細胞が凝集する傾向が見られた。共培養21日目では石灰化noduleの形成を認めた。Monocyteとの共培養によって,VitD3やPGE2などのosteoclast分化誘導試薬を用いなくとも多核細胞が多数出現してきたことから、ASCが骨芽細胞へ分化誘導されたことによるシグナリングで、monocyteからosteoclastが分化誘導された可能性が考えられた。さらに、分化培地でのASCの単独培養よりも増殖培地での共培養でALP活性が高かったことより、monocyteとASCの間に相互作用が起こった可能性も考えられた。共培養ではスフェロイドから延びて重層になった細胞シートの下層にTRAP陽性多核細胞が、上層にはALP陽性単核細胞が存在する形となっており、骨のリモデリングを模倣する形になっていると考えられた。ASCスフェロイドは内部細胞が細胞外マトリックスを産生することで三次元的に大きく成長し、直径が増えることで表層の未分化細胞数も増大する。monocyteとの相互作用で分化誘導が促進されれば、大きさと分化誘導のタイミングをコントロールできるスキャフォールドフリーの移植材としての利用の可能性が今後大きく期待できる。顎口腔領域の骨や軟組織の欠損に対する低侵襲な再生療法として、自己の組織幹細胞を用いた移植材開発に期待が寄せられている。脂肪組織は皮下の浅層に豊富に存在するため、自家骨や骨髄に比べ、採取が非常に低侵襲である上に、その中に含まれる幹細胞の数が骨髄に比較して約1000倍であることから、体性幹細胞のソースとして注目されている。この脂肪細胞由来幹細胞(ASC)から生じた細胞シートを成形してスフェロイドを作製し、観察した。まず、作製したスフェロイドを骨補填材であるβ-TCPのディスク上において培養を行い、スフェロイドにおける多分化能を検討する目的でin situ hybridizationを行い、多分化能のマーカー遺伝子でsるOct3/4、Nanog、Sox2 mRNAの発現を確認した。直径1mm以上の大きく成長したスフェロイド内部に壊死は認められなかった。スフェロイドは大きな核を有し、幹細胞の特徴を有する表層の細胞と、立体構造の維持に必要なコラーゲンなどの細胞外基質を分泌する内部細胞で構成されており、多分化能のマーカー遺伝子の発現は、表層細胞で強く確認された。さらに、スフェロイドとmonocyteの共培養を行った。その結果、共培養5日目でTRAP陽性細胞を認め、また、DAPI染色にて多核の巨細胞を多数認めた。また、石灰化noduleの形成も認めた。ASCが骨芽細胞へ分化誘導されたことによるシグナリングで、monocyteからosteoclastが分化誘導された可能性が考えられた。共培養ではスフェロイドから延びて重層になった細胞シート下層にTRAP陽性多核細胞が、上層にはALP陽性単核細胞が存在する形となり、骨リモデリングを模倣する形になっていると考えられた。今回の実験により、生体の構造に近い組織再生が実現する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。インプラント・口腔再生医学26年度が最終年度であるため、記入しない。

本年度の研究目標は骨のリモデリングをin vitroで模倣することである。脂肪細胞由来細胞が骨芽細胞へと分化し、脾臓から採取した単球とともに共培養させたとき、単球が胞へと分化するかを確認することを具体的な目標とした。実験により、安定したスフェロイドの作成に成功し、また、脂肪細胞由来幹細胞がALP陽性、石灰化noduleの形成することを確認できた。さらに、単球由来細胞からTRAP陽性多核細胞を確認することができ、ほぼ目標通りの成果を出すことができた。in vitroでは、共培養により形成されたALP陽性細胞とTRAP陽性多核細胞のスフェロイドのさらなる性質をPCRにより確認する。また、in vivoでは共培養により形成されたALP陽性細胞とTRAP陽性多核細胞のスフェロイドをマウス頭蓋骨欠損モデルに移植し、欠損部の骨再生について観察していく予定である。
アルツハイマー型認知症に伴う精神症状に関するドパミン・セロトニン神経の統合的検討

アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状は、ドパミン・セロトニン神経系との関連が注目されているが、両者を同時かつ統合的に検討した研究はない。我々は先行研究で、123I-FP-CIT SPECTを用いて両神経系を同時に評価する手法を確立してきた。本研究の目的は、我々の手法を用いた123I-FP-CIT SPECTにより、ドパミン・セロトニン神経系を統合的に評価し、MRIから得られる脳の構造的・機能的情報とあわせて検討することでアルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状のメカニズムや抗認知症薬の作用機序の解明を行うことである。それにより、これらの症状に関連した生物学的なバイオマーカーの同定や個々の患者の特性に応じた治療法の開発が期待できると考えられる。平成30年度には、アルツハイマー型認知症患者9名や健常被験者20名のリクルートを行い、背景情報の聴取、認知症評価、神経心理学的評価、神経精神症状評価などの神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行った。健常高齢者のデータを使用し、線条体のドパミントランスポーターと心理的ストレスや抑うつ症状との関連、中脳のセロトニントランスポーターと悲しみの表情認知の関連について見出したため、国内学会にて発表予定である。今後も目標組み入れ人数に向けてリクルートを継続する予定であり、最終的には、これらの検査結果の統計解析を行い、アルツハイマー型認知症患者における疾患特異的なドパミン・セロトニン神経系の機能異常についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状・精神病症状とドパミン・セロトニン神経機能の関連についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状に対するドパミン・セロトニン神経機能を介した抗認知症薬の作用機序の検討を行う予定である。健常者については目標組み入れ人数に向けて被験者のリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行うことができている。アルツハイマー型認知症患者については、リクルートが遅れているため、より集中的にリクルートを行う予定である。現在までに得られた健常高齢者のデータを使用し、線条体や中脳の123I-FP-CIT集積値と、心理的ストレス・抑うつ症状や表情認知との関連について検討を行った。その結果として、心理的ストレスや抑うつ症状とが関連し、さらにドパミントランスポーター密度を反映すると考えられる線条体における123I-FP-CIT集積値を介していることを見出した。さらに、悲しみの表情認知とセロトニントランスポーター密度を反映していると考えられる中脳の123I-FP-CIT集積値が相関していることを見出した。これらの結果について、それぞれを国内学会にて発表予定である。平成31年度以降も引き続き目標組み入れ人数に向けてリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行う予定である。最終的には、これらの検査結果の統計解析を行い、アルツハイマー型認知症患者における疾患特異的なドパミン・セロトニン神経系の機能異常についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状・精神病症状とドパミン・セロトニン神経機能の関連についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状に対するドパミン・セロトニン神経機能を介した抗認知症薬の作用機序の検討を行う予定である。平成29年度には、アルツハイマー型認知症患者や健常被験者のリクルートを行い、背景情報の聴取、認知症評価、神経心理学的評価、神経精神症状評価などの神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行った。今後も目標組み入れ人数に向けてリクルートを継続する予定である。目標組み入れ人数に向けて被験者のリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行うことができており、概ね順調に研究を遂行できていると思われる。

我々は先行研究で、123I-FP-CIT SPECTを用いて両神経系を同時に評価する手法を確立してきた。本研究の目的は、我々の手法を用いた123I-FP-CIT SPECTにより、ドパミン・セロトニン神経系を統合的に評価し、MRIから得られる脳の構造的・機能的情報とあわせて検討することでアルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状のメカニズムや抗認知症薬の作用機序の解明を行うことである。それにより、これらの症状に関連した生物学的なバイオマーカーの同定や個々の患者の特性に応じた治療法の開発が期待できると考えられる。平成30年度には、アルツハイマー型認知症患者9名や健常被験者20名のリクルートを行い、背景情報の聴取、認知症評価、神経心理学的評価、神経精神症状評価などの神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行った。健常高齢者のデータを使用し、線条体のドパミントランスポーターと心理的ストレスや抑うつ症状との関連、中脳のセロトニントランスポーターと悲しみの表情認知の関連について見出したため、国内学会にて発表予定である。今後も目標組み入れ人数に向けてリクルートを継続する予定であり、最終的には、これらの検査結果の統計解析を行い、アルツハイマー型認知症患者における疾患特異的なドパミン・セロトニン神経系の機能異常についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状・精神病症状とドパミン・セロトニン神経機能の関連についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状に対するドパミン・セロトニン神経機能を介した抗認知症薬の作用機序の検討を行う予定である。健常者については目標組み入れ人数に向けて被験者のリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行うことができている。アルツハイマー型認知症患者については、リクルートが遅れているため、より集中的にリクルートを行う予定である。現在までに得られた健常高齢者のデータを使用し、線条体や中脳の123I-FP-CIT集積値と、心理的ストレス・抑うつ症状や表情認知との関連について検討を行った。その結果として、心理的ストレスや抑うつ症状とが関連し、さらにドパミントランスポーター密度を反映すると考えられる線条体における123I-FP-CIT集積値を介していることを見出した。さらに、悲しみの表情認知とセロトニントランスポーター密度を反映していると考えられる中脳の123I-FP-CIT集積値が相関していることを見出した。これらの結果について、それぞれを国内学会にて発表予定である。平成30年度以降も引き続き目標組み入れ人数に向けてリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行う予定である。最終的には、これらの検査結果の統計解析を行い、アルツハイマー型認知症患者における疾患特異的なドパミン・セロトニン神経系の機能異常についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状・精神病症状とドパミン・セロトニン神経機能の関連についての解析、アルツハイマー型認知症に伴う抑うつ症状や精神病症状に対するドパミン・セロトニン神経機能を介した抗認知症薬の作用機序の検討を行う予定である。平成31年度以降も引き続き目標組み入れ人数に向けてリクルートや背景情報の聴取、神経心理検査、123I-FP-CIT SPECTやMRIの撮像を行う予定である。
高次元離散多変量解析の理論研究とその応用

二元分割表および多元分割表における対称性や非対称性のモデルは数多く提案されており、あるデータに対して複数のモデルの適合度が良い場合にどのモデルを選択するかという問題が生じる。そこで平成29年度に引き続き、分割表解析におけるモデル選択の方法として、L1型正則化法を用いた方法論の研究を行った。平成29年度にAdaptive LassoとAdaptive Elastic Netを実装することに成功したが、その理論的な性質の解明やシミュレーションによる方法論の妥当性の検証など多くの課題が残った。平成30年度の実績としては、(1)罰則付きの推定量の導出、(2)実装したプログラムの精査、(3)シミュレーションによる提案手法の妥当性の検証、が挙げられる。(1)については、先行研究を参考に本課題の場合に関する計算を行い、類似の推定量の導出に成功した。この結果を実装したことにより、数値計算の実行時間短縮につながった。また、別の罰則項を用いた場合についても同様に計算可能であることが予想され、研究の方向性がより明確になった。(2)については、プログラムの精査を行うことにより、数値計算の実行時間を大幅に改善することに成功した。プログラムに用いていた組み込み関数を変更することにより、計算精度および実行時間に大きな変化があることを確認した。(3)については、シミュレーションを行うことで、方法論の良い点・悪い点が浮き彫りになった。今後は、シミュレーションの結果をよく考察し、方法論の改良を考えたい。5.研究実績の概要に記したように、シミュレーションの結果が非常に興味深いものだった。そのような結果となった原因の解明が難しく、研究の進捗を遅らせている。スパース推定に用いるチューニングパラメータの選択問題、罰則項の選択問題、推定量の漸近性質など検討する必要のある項目が多く、整理しきれていない状況である。また、提案手法が罰則をパラメータの一部分だけに課すという方法のため、多くの先行研究と異なることも研究の進みが悪い一因となっている。今後は、この分野の専門家などからアドバイスをもらいながら、一歩一歩着実に研究を進めたい。国際会議において、スパース推定の分野の専門家からアドバイスをいただくことができた。具体的には、(1)すでに実装した方法とは別の方法でも実装が可能、(2)罰則項の選択に関しては、取り扱う問題に適したものを利用することが重要、(3)分割表のサイズ及びサンプルサイズのバランスが重要、とのことであった。すでにこれらのアドバイスに基づき、研究を進めいくらかの改善をみた。さらに、正方分割表解析の枠組みに囚われることなく、一般の分割表解析における問題への応用や、ゲノムデータに代表されるような小サンプル高次元データにおける推定問題への適用についても検討したい。二元分割表および多元分割表における対称性や非対称性のモデルは数多く提案されており、あるデータに対して複数のモデルの適合度が良い場合に、どのモデルを選択するかという問題が生じる。各モデル間に包含関係が存在する場合には、尤度比検定統計量の差を用いてモデル間の比較をすることが可能であることが知られている。一方で、各モデル間に包含関係が存在しない場合には、AICやBICに代表されるモデル選択基準を用いることが一般的である。本研究では、分割表解析におけるモデル選択の方法として、L1型正則化法を応用することを考えた。実際に、多元分割表解析において独立性および条件付き独立性などに関するモデルの選択問題にL1型正則化法を用いた研究(Nardi and Rinaldo, 2012)が存在し、その効果が実証されている。また機械学習の分野では、分割表解析においてベイズ論的アプローチとLassoを組み合わせた研究が行われている(Raman, Fuchs, Wild, Dahl and Roth, 2009)。これらの先行研究は、すべて分割表解析における独立性や条件付き独立性に関連するモデルの研究である。したがって、これらの先行研究を対称性のモデルへの適用が可能になるように拡張を行った。実際に、LassoとElastic Netを実装した。さらに、それらの拡張であるAdaptive LassoとAdaptive Elastic Netも実装した。それぞれの罰則項を用いて、実データ解析を行い良好な結果を得ることに成功し、これまでよりも詳細な分割表データの解析が可能になった。同時に、それらのスパース推定から得られる推定量の性質に関する数理面の研究も順調に解明されつつある。正方分割表解析において、対称性のモデルのクラスを定義し、そのクラスのなかにあるモデルの中から最適なモデルを選択する問題を考えた。この場合、包含関係にないモデルも含まれているため、従来のような尤度比カイ二乗統計量の差を用いることができない。また、AICやBICなどのモデル選択基準を用いる方法も考えられるけれども、その場合はカテゴリ数の増加に伴い候補となるモデルの数が指数的に増加するため得策ではない。したがって、スパース推定の方法を利用することにした。実際に、スパース推定のアルゴリズムを計算機に実装することに成功した。実データ解析を行い、概ね良好な結果を得ることにも成功した。また、得られる推定量の数理的な性質に関する研究も順調に進んでいる。今後、スパース推定に用いるチューニングパラメータの選択問題についても考えたい。また、推定量の漸近的な性質や罰則項の改良なども検討したい。

そこで平成29年度に引き続き、分割表解析におけるモデル選択の方法として、L1型正則化法を用いた方法論の研究を行った。平成29年度にAdaptive LassoとAdaptive Elastic Netを実装することに成功したが、その理論的な性質の解明やシミュレーションによる方法論の妥当性の検証など多くの課題が残った。平成30年度の実績としては、(1)罰則付きの推定量の導出、(2)実装したプログラムの精査、(3)シミュレーションによる提案手法の妥当性の検証、が挙げられる。(1)については、先行研究を参考に本課題の場合に関する計算を行い、類似の推定量の導出に成功した。この結果を実装したことにより、数値計算の実行時間短縮につながった。また、別の罰則項を用いた場合についても同様に計算可能であることが予想され、研究の方向性がより明確になった。(2)については、プログラムの精査を行うことにより、数値計算の実行時間を大幅に改善することに成功した。プログラムに用いていた組み込み関数を変更することにより、計算精度および実行時間に大きな変化があることを確認した。(3)については、シミュレーションを行うことで、方法論の良い点・悪い点が浮き彫りになった。今後は、シミュレーションの結果をよく考察し、方法論の改良を考えたい。5.研究実績の概要に記したように、シミュレーションの結果が非常に興味深いものだった。そのような結果となった原因の解明が難しく、研究の進捗を遅らせている。スパース推定に用いるチューニングパラメータの選択問題、罰則項の選択問題、推定量の漸近性質など検討する必要のある項目が多く、整理しきれていない状況である。また、提案手法が罰則をパラメータの一部分だけに課すという方法のため、多くの先行研究と異なることも研究の進みが悪い一因となっている。今後は、この分野の専門家などからアドバイスをもらいながら、一歩一歩着実に研究を進めたい。現在、罰則項としてLassoとElastic Netの実装に成功した。また、それらの改良として、Adaptive LassoとAdaptive Elastic Netの実装も完了している。今後は、SCADやその重み付きの方法などの研究を進めたい。また、それらの方法から得られる推定量の性質およびモデルの選択に関する性質など応用・理論の両面から研究を進めたい。さらに、正方分割表解析の枠組みに囚われることなく、一般の分割表解析における問題への応用や、ゲノムデータに代表されるような小サンプル高次元データにおける推定問題への適用についても検討したい。国際会議において、スパース推定の分野の専門家からアドバイスをいただくことができた。具体的には、(1)すでに実装した方法とは別の方法でも実装が可能、(2)罰則項の選択に関しては、取り扱う問題に適したものを利用することが重要、(3)分割表のサイズ及びサンプルサイズのバランスが重要、とのことであった。
青色光受容体PHOTの分子構造と光受容初期過程

植物は光環境情報を、赤色光領域に吸収を持つフィトクロムと青色光領域に吸収をもつ複数の青色光受容体で受容している。後者の一つフォトトロピン(phot)は、光屈性の光受容体として見つけられた色素タンパク質で、その後、葉肉細胞中の葉緑体の光定位運動および光による葉の気孔開口の光受容体としても働くことが解り、これら三機能が光合成活性の効率化に重要な働きをすることから注目されている。Phot分子はN-末端側に光受容ドメイン、C-末端側にシグナル伝達ドメインをもつ。前者には、二つのLOV(Light, Oxygen, Voltage)ドメインが存在し発色団として各々FMNを一つ結合している。後者はScr/Thrキナーゼを形成している。本研究課題は、発色団に入力した青色光シグナルが、どのような光反応過程を介してキナーゼ活性を調節し下流へとシグナル伝達するのかを解明することである。(1)LOVドメインの光反応機構の研究。大腸菌による、intactな光反応を示すシロイヌナズナphot1、phot2およびシダphy3のLOV1とLOV2各ドメイン試料調製系を確立し、これらの試料の光反応を低温紫外・可視吸収スペクトルよび振動分光ペクトルの測定により解析し、初期反応機構と中間体に関する新しい知見を得た。今年度は、FMNとアダクトを作るシステインが励起状態でプロトン化していること、光反応に水分子を介した水素結合の再編が関与することを見つけ、さらに発色団反応をタンパク質部分の二次構造変化に結びつける役割を果たすアミノ酸残基の一つを同定した。(2)LOVドメイン光反応にともなうタンパク質部分の構造変化の研究。SPring8共同利用研究を行い、X線小角散乱による構造解析を行い、光反応にともなう構造変化がLOV2ドメインとキナーゼドメインの間のリンカー部分で主に起きていることを明らかにした。これまでに、photキナーゼ活性に関しては自己リン酸化しか報告されていなかったが、初めてphot2キナーゼドメインが自己以外の基質をリン酸化することをも見つけ、LOV2がキナーゼ活性の光制御を担い、LOV1はその光感受性を下げる機能をもち、それぞれ役割分担をしていることを明らかにした。移動能力を持たない植物は、外界の環境変化に適切に応答して発芽・成長し、効率よく光合成を行い、開花・結実して子孫を残す。いずれの過程にも光による制御機構が働いており、これらの光形態形成反応の光センサーとして、赤色光領域に吸収を持つフィトクロムと、青色光領域に吸収を持つ一群の青色光受容体が知られてる。後者の一つフォトトロピン(PHOT)は、光屈性の光受容体として見つけられたが、最近、葉緑体の光定位運動、気孔開口といった光合成機能の効率化に重要な生理反応の光受容体として働くことが明らかになり注目されている。PHOTはN-末端にLOVドメインと呼ばれるフラビンモノヌクレオチド(FMN)を結合するサイトを2つもち、C-末端側にはSer/Thrキナーゼドメインをもつ。その分子構造や、発色団と考えられるFMNがどの様にしてキナーゼ活性を制御しているのかは未知である。ロドプシン、フィトクロム、PYPなど他の光受容体では、光受容初期過程に発色団の光異性化とプロトン移動という共通の素過程が存在し、これらがタンパク質部分の構造を変化させてシグナル伝達を制御すると考えられるが、PHOTではこれらと異なる反応を考えざるを得ず、現在一つの可能性としてシステイン-FMN付加物生成の関与が取りざたされている。本年度PHOTの全長および部分断片タンパク質の遺伝子発現系を用いた調製システムを確立し、それらの振動分光学測定結果より光受容初期過程に関して新たな知見を得た。フォトトロピンは植物の光屈性、葉緑体光定位運動、光による気孔開口など光合成効率の最適化に密接に関係した生理機能の制御に係わる青色光受容体である。C-末端にセリン/スレオニンキナーゼドメイン、N-末端には発現団であるFMNを1分子結合した.LOV(PASの1種)ドメインを2つもち、LOVで受容された青色光エネルギーが何らかの形でキナーゼ活性を制御し、下流へのシグナル伝達を調節すると考えられている。我々は光の入力側からフォトトロピン青色光受容機構を探るべく、その分子構造、発色団ドメインの光反応機構、発色団ドメインの光反応がどの様なメカニズムでセリン/スレオニンキナーゼ活性を調節するのかを主要な課題として研究を進めてきた。まず、発現系によるシロイヌナズナPHOTおよびシダPHY3の全長を除く各LOV、キナーゼドメイン等のホロタンパク質試料調製システムを確立した。それらを用いて以下の初歩的結果を得た。1)LOV2ドメインの光反応初期過程の解析:極低温振動および紫外可視分光スペクトル解析により、光受容初期過程の反応様式を確定した(JACS,2002)。また、従来の光異性化型光受容体と異なりフラボタンパク質型特異的と思われる反応を見つけ、その詳細を解析中である。2)LOV2ドメインの構造変化の解析:上記研究中に結晶構造解析に基づき提案されている光反応による分子構造変化の結果と矛盾するデータを得たので、溶液中の分子構造変化を調べるべく多次元NMR測定による解析を開始した。3)分子構造解析:SPring8を共同利用してX線小角散乱の測定を行い幾つかのドメインの分子モデルを構築する一方、機能の良く解っていないLOV1ドメインがPHOT分子の2量体の結合サィトを形成している事を示唆する結果を得た。

さらに各ドメィン試料の結晶化条件をスクリーニング中である。4)キナーゼ活性解析:キナーゼドメインおよびそれにLOVが付加した試料のin vitroのセリン/スレオニンキナーゼ活性assay系を作り解析を始めた。これまでにカゼインを基質とした系で、C-末端のみではキナーゼ活性が見られないのに対して、LOV2が結合すると光依存的にキナーゼ活性が発現するという興味有る結果を得、更に詳細な解析を行っている。フォトトロピンは植物の光屈性、葉緑体光定位運動、光による気孔開口など光合成効率の最適化に密接に関係した生理機能の制御に係わる青色光受容体である。C-末端にセリン/スレオニンキナーゼドメイン、N-末端には発現団であるFMNを1分子結合したLOV(PASの1種)ドメインを2つもち、LOVで受容された青色光エネルギーが何らかの形でキナーゼ活性を制御し、下流へのシグナル伝達を調節すると考えられてれる。我々は光の入力側からフォトトロピン青色光受容機構を探るべく、その分子構造、発色団ドメインの光反応機構、発色団ドメインの光反応がどの様なメカニズムでセリン/スレオニンキナーゼ活性を調節するのかを主要な課題として研究を進めてきた。本年度は昨年度に確立した発現系によるシロイヌナズナPHOTおよびシダPHY3の全長を除く各LOV、キナーゼドメイン等のホロタンパク質試料調製システムを以下の結果を得た1)発色団の光反応は一般にタンパク質部分にシグナル伝達に関与する構造変化を引き起こす。近年異なるソースのLOV1およびLOV2暗中およびシグナル伝達状態のX線結晶構造解析が報告された。これら、フォトトロピンが光反応してシグナル伝達状態に変化してもタンパク質部分の構造はほとんど変化しないと報告している。しかし最近、結晶中の光反応は発色団近傍に限られており、溶液中で見られるシグナル伝達に関与するような大きなタンパク質部分の構造変化は起こらないことが解ってきた。我々は溶液試料のX線小角散乱観測から、キナーゼ活性制御につながると考えられる構造変化を初めて検出した(J.Biol.Chem.投稿中)。2)またLOV2ドメインの光反応初期過程の解析:極低温振動および紫外可視分光スペクトル解析により従来の光異性化型光受容体と異なりフラボタンパク質型特異的と思われる反応を見つけた(Biochemistry 2003)3)キナーゼドメインおよびそれにLOVが付加した試料のカゼインを基質としたin vitroのセリン/スレオニンキナーゼ活性assay系を用いて解析を行い、キナーゼ活性の光制御機構に関する興味深い発見を行った(Proc.Natl.Acca.Sci.USA、投稿中)。植物は光環境情報を、赤色光領域に吸収を持つフィトクロムと青色光領域に吸収をもつ複数の青色光受容体で受容している。後者の一つフォトトロピン(phot)は、光屈性の光受容体として見つけられた色素タンパク質で、その後、葉肉細胞中の葉緑体の光定位運動および光による葉の気孔開口の光受容体としても働くことが解り、これら三機能が光合成活性の効率化に重要な働きをすることから注目されている。Phot分子はN-末端側に光受容ドメイン、C-末端側にシグナル伝達ドメインをもつ。