hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エディブルコーティング剤としてのキトサン利用による果実の鮮度保持に関する研究

緑熟バナナ′Cavendish′を入手し、分子量の異なるキトサン(低分子:10,000、中分子:600,000、高分子:1,000,000)でコーティングして、13°C下で保蔵中の果実品質の変化を調査した。その結果、追熟まで高分子キトサン塗布果実は25日を要したのに対し、中分子、低分子キトサンではそれぞれ20日、17日であった。キトサン処理果実は水分損失、でん粉分解、テクチャの低下等が抑えられ、明らかにバナナにおいても鮮度保持効果が認められた。典型的なクライマクテリック型果実であるバナナ果実の呼吸及びエチレン生成のピークは、キトサン処理によって遅延する傾向があった。このようにキトサンコーティングは最大一ヶ月の保蔵を可能とした。一方、高分子キトサンの腐敗抑制効果を明らかにする目的で、キトサンコーティングしたニホンナシ′豊水′及び′新興′果実の果皮に、純粋培養した灰色かび病菌(Botrytis cinerea)を接種し、キトサンのエリシター作用を検討した。すなわち、PRタンパクのキチナーゼ活性が高まるか、否かを調査したが、果皮タンパク中には明らかにキチナーゼ活性は認められるものの、高分子キトサン処理果実で特段に多い傾向があるとは認められなかった。これは高分子キトサンが組織内部に浸透せず、キチナーゼ活性を促すエリシター作用が示せなかったためと考えられ、高分子キトサンの抗菌作用は、キチナーゼ以外のPRタンパク、あるいはファイトアレキシンの誘導や、構造的な防御反応などがその機作と推定された。今回、検討できなかったより低分子キトサンを用いて、エリシター作用の更なる解明を試みる必要がある。まず分子量の異なるキトサン(便宜上、分子量10,000のものを低、600,000を中、1,000,000を高分子キトサンとする)を0.4%で溶解して、リンゴ`ジョナゴールド'果実にコーティング処理し、5°C条件で貯蔵した。その結果、高分子キトサンコーティング果実は果実硬度が高く保持され、呼吸量は低く抑えられていた。一方、低分子キトサンはリンゴの鮮度保持には効果が少ないことが分かった。高分子のキトサンはもとより水に不溶である。従って、溶解条件として酸液が考えられ、リンゴ酸、クエン酸、酢酸の各種濃度を用い、pHの変化並びにコーティング剤として重要な要素である粘性について計測した。粘度は酢酸を用いたもので高く、pHの低下も少ないことが判明し、0.5%前後の酢酸を溶媒とすることが望ましいことを明らかにした。さらにニホンナシ`豊水'果実を用い、水溶性の低分子キトサンと前述の高分子キトサンのコーティング処理効果を検討した。ニホンナシではいずれのキトサンコーティング果実も水分損失量が少なく水との親和性力吠きいことが認められ、高分子のみならず水溶性キトサン処理果実でも果実硬度が高く推移して、果実内へ取り込まれて物性改善効果をもたらしたものと推察した。しかし、果実着色の進みや果実内シュクロースの還元糖への分解(新規購入HPLC使用)、さらには呼吸、エチレン生成の抑制等から、高分子キトサンコーティングが有効であることを明らかにした。現在、イチゴ果実を用いて軟弱果実への適用について研究を進行中である。また、キトサンの抗菌特性についても検討中である。イチゴ'とちおとめ'の70%着色果実を均一に収穫し、不溶性キトサン及び可溶性(低分子)キトサンでコーティング処理後、1°C及び5°Cで保蔵した。その結果、可溶性キトサンの効果は明らかではなかったが、不溶性キトサンの鮮度保持効果をイチゴでも確認できた。すなわち、1°C保蔵ではその差が明確でないが、5°C保蔵では0.5%及び1.0%キトサン処理で水分損失、可溶性固形物増加割合の抑制、果実着色の抑制等に無処理果実、キトサン溶解のための酢酸のみ処理果実などと比べ、効果が明らかに認められた。さらにキトサン処理をした後、純粋培養した灰色かび病菌(Botrytis cinerea)を果実に接種した。電顕による観察から不溶性及び可溶性キトサン処理果実で、分生胞子の発芽、生長が抑制されていることが認められた。同様にニホンナシ'豊水'果実に1%キトサンを0.3%酢酸で溶解して処理を行い、1°Cで貯蔵した。この際、果皮全面コーティングばかりでなく、半面、1/4、1/8分割コーティング処理も併せて行った。その結果、前年同様キトサン処理は'豊水'果実の熟度の進みを抑制したが、半面、1/4、1/8分割コーティング処理果実も果皮着色、果実硬度、呼吸量などに影響を及ぼして、全面処理の効果には及ばないものの鮮度保持効果のあることが判明した。全面処理果実の果実内部ガス、特にCO2やエチレンが高濃度となり、off-flavorの発生要因となることが懸念された。一方、半面、1/4、1/8分割コーティング処理果実では無処理果実と比べるとガス濃度は高いものの、全面処理果実ほどではなかった。このように、MA効果を維持しつつ、内部ガスを過度に高めることのないキトサンコーティング処理の方法が開発できたと考えている。現在、これらの抗菌効果について、キトサンのエリシター機能に注目しキチナーゼ活性を調査中である。緑熟バナナ′

Cavendish′を入手し、分子量の異なるキトサン(低分子:10,000、中分子:600,000、高分子:1,000,000)でコーティングして、13°C下で保蔵中の果実品質の変化を調査した。その結果、追熟まで高分子キトサン塗布果実は25日を要したのに対し、中分子、低分子キトサンではそれぞれ20日、17日であった。キトサン処理果実は水分損失、でん粉分解、テクチャの低下等が抑えられ、明らかにバナナにおいても鮮度保持効果が認められた。典型的なクライマクテリック型果実であるバナナ果実の呼吸及びエチレン生成のピークは、キトサン処理によって遅延する傾向があった。このようにキトサンコーティングは最大一ヶ月の保蔵を可能とした。一方、高分子キトサンの腐敗抑制効果を明らかにする目的で、キトサンコーティングしたニホンナシ′豊水′及び′新興′果実の果皮に、純粋培養した灰色かび病菌(Botrytis cinerea)を接種し、キトサンのエリシター作用を検討した。すなわち、PRタンパクのキチナーゼ活性が高まるか、否かを調査したが、果皮タンパク中には明らかにキチナーゼ活性は認められるものの、高分子キトサン処理果実で特段に多い傾向があるとは認められなかった。これは高分子キトサンが組織内部に浸透せず、キチナーゼ活性を促すエリシター作用が示せなかったためと考えられ、高分子キトサンの抗菌作用は、キチナーゼ以外のPRタンパク、あるいはファイトアレキシンの誘導や、構造的な防御反応などがその機作と推定された。今回、検討できなかったより低分子キトサンを用いて、エリシター作用の更なる解明を試みる必要がある。
血管壁および血小板と血液凝固系・線溶系キニン系の開始因子との相互反応

本研究は,血液凝固線溶キニン系の開始因子と,血小板,白血球および血管壁構成成分との相互作用を解析することにより, invivoでの血栓形成機構,さらには,動脈硬化などの血管病変の機構を明らかにすることにある.そのために,実験動物を用いたinvivoの反応系と,精製した凝固因子を組み合せたinvtroでの反応系を比較しながら解析しつつある.昨年度においては,トロンビンの蛍光性やプチド基質と遠心方式自動分析計を組合せ,血液凝固キニン線溶系プロテアーゼの高感度自動分析法を開発した.本年度は,本法を用い,ラットおよびスンクスの血漿の開始反応系をヒトと比較した.スンスク血漿の内因系凝固反応は,エラジン酸やサルファチドによる反応は,ヒトと比べて著るしく遅いが,クオハンによる反応はヒトと変らなかった.スンクス血漿中のプレカリクレイン含量はヒトの13%しかなく,デキストラン硫酸を用いても,殆んど活性化は見られなかった.以上の結果から,スンクス血漿の内因系凝固反応は,カオリン以外の物質では極めて起こりにくく,またキニン生成系も低いので,内因系凝固反応の意義を解析する上で有用な実験動物であると考えられる.一方,ラット血漿の場合,凝固反応は極めて早いが,それは,血漿中のXa様活性によることが明らかになった.ラット血漿よりX因子を精製し,そのモノクローナル抗体を調整したが,ラット血漿中のXa活性は, x因子のモノクローナル抗体より阻害され,少なくとも,採取した血漿中には, Xa因子が有意に存在することが明かとなった.このXa因子が,どのような反応系により活性化されたものか,未だ明らかではないが,ラットの場合,血球成分あるいは血管壁成分との相互反応によるXa因子が極めて生成されやい状態にあるのではないかと考えられ,ラットを用いた反応系は,これらの相互反応を明らかにする上で,極めて有用なモデル反応系と考えられる.本研究は,血液凝固線溶キニン系の開始因子と,血小板,白血球および血管壁構成成分との相互作用を解析することにより, invivoでの血栓形成機構,さらには,動脈硬化などの血管病変の機構を明らかにすることにある.そのために,実験動物を用いたinvivoの反応系と,精製した凝固因子を組み合せたinvtroでの反応系を比較しながら解析しつつある.昨年度においては,トロンビンの蛍光性やプチド基質と遠心方式自動分析計を組合せ,血液凝固キニン線溶系プロテアーゼの高感度自動分析法を開発した.本年度は,本法を用い,ラットおよびスンクスの血漿の開始反応系をヒトと比較した.スンスク血漿の内因系凝固反応は,エラジン酸やサルファチドによる反応は,ヒトと比べて著るしく遅いが,クオハンによる反応はヒトと変らなかった.スンクス血漿中のプレカリクレイン含量はヒトの13%しかなく,デキストラン硫酸を用いても,殆んど活性化は見られなかった.以上の結果から,スンクス血漿の内因系凝固反応は,カオリン以外の物質では極めて起こりにくく,またキニン生成系も低いので,内因系凝固反応の意義を解析する上で有用な実験動物であると考えられる.一方,ラット血漿の場合,凝固反応は極めて早いが,それは,血漿中のXa様活性によることが明らかになった.ラット血漿よりX因子を精製し,そのモノクローナル抗体を調整したが,ラット血漿中のXa活性は, x因子のモノクローナル抗体より阻害され,少なくとも,採取した血漿中には, Xa因子が有意に存在することが明かとなった.このXa因子が,どのような反応系により活性化されたものか,未だ明らかではないが,ラットの場合,血球成分あるいは血管壁成分との相互反応によるXa因子が極めて生成されやい状態にあるのではないかと考えられ,ラットを用いた反応系は,これらの相互反応を明らかにする上で,極めて有用なモデル反応系と考えられる.
Caシグナリング蛋白質発現制御による心不全治療の基礎的研究

心筋の収縮性は心筋細胞内カルシウム濃度によって規定されている。このカルシウム調節は筋小胞体に存在するカルシウムシグナリング蛋白質によって担われている。本研究はこのカルシウムシグナリング蛋白質の遺伝子発現を調節することにより心不全治療を行う基礎的検討を行うことを目的とした。筋収縮にもっとも重要な働きをしているカルシウム遊離チャネル遺伝子の発現調節機構の解明に焦点を当てた。特に組織特異性を規定している分子メカニズムを検討した。その遺伝子の5'上流領域を単離し、それをレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を結合し、単離心筋細胞と骨格筋細胞にトランスフェクションし組織特異性を規定している領域を同定した。その結果プロモーター領域は組織特異性を規定していないことが明らかとなった。さらにその上の上流のE-boxが骨格筋においての負の調節をしていることがわかった。筋特異的E-box結合転写因子であるmyoD,Myf-5,myogenin,MRF-4はゲルシフトアッセイの結果結合しないことがE12には結合することが明らかとなった。したがって未知のbasic helix-loop-helix蛋白質が結合すると考えられる。これをin vivoで検討するためlacZと上流領域を結合したコンストラクトを用いてトランスゲニックマウスを作成した。現在解析中である。また心不全時に見られる心筋細胞内カルシウム濃度の上昇が心不全の病態形成に寄与しているかどうか検討するためカルシウム除去系であるCaATPaseのトランスゲニックマウスを作成した。現在検討中である。現在解析中である。現在検討中である。本研究は心筋の収縮性の規定因子であるCa調節に関連しているCaシグナリシグ蛋白質の遺伝子発現を介した心不全治療の基礎的検討を行うのを目的とする。さらに細胞内Ca濃度の変化が細胞構造に変化を与え心不全の原因になりうるかを検討する。今年度は筋小胞体Ca遊離チャネル遺伝子に焦点を当てた。5'上流領域3kb、心筋特異的発現を規定していると考えられる300BP、72bpのプロモ-タ-領域を各々CAT cDNAの上流に結合し、それらをマウス卵細胞に導入することによりトランスゲニックマウスを作製した。現在発現状態を詳細に検討中である。プロモ-タ-領域だけを含むコンストラクトにおいても種々の臓器に発現が見られるため発現に必要な最小機能は持っていることが推察された。さらにvitroでの検討と同様このプロモ-タ-では組織特異性が規定されないことが明らかとなった。またin vitroの検討により心筋小胞体Ca遊離チャネルを骨格筋に発現させない配列がE-boxであることを同定した。DNAアフィニティカラムでこの配列に結合する蛋白質を単離した。この蛋白質は分子量約3万kDaであった。Caによる心筋細胞細胞骨格破壊の検討を行うためCa依存性プロテア-ゼ(カルパイン)のノックアウトマウスの作製に着手した。まずカルパインのマウスcDNAの単離、塩基配列を行った。アミノ酸レベルでは報告されているヒト、ラットのものと同一であった。さらにその上流のE-boxが骨格筋において負の調節をしていることがわかった。筋特異的E-box結合転写因子であるmyoD,Myf-5,Myogenin,MRF-4はゲルシフトアッセイの結果結合しないがE12には結合することが明らかとなった。

したがって未知のbasic helix-loop-helix蛋白質が結合すると考えられる。これをin vivoで検討するためlacZと上流領域を結合したコンストラクトを用いてトランスゲニックマウスを作成した。現在解析中である。また心不全時に見られる心筋細胞内カルシウム濃度の上昇が心不全の病態形成に寄与しているかどうか検討するためカルシウム除去系であるCaATPaseのトランスゲニックマウスを作成した。現在検討中である。
虚血性脳血管障害における遺伝子多型の解析

【目的】内皮細胞間ギャップジャンクションの一蛋白であるコネキチン(connexin)のグループが動脈硬化の様々な形成過程に関与することが報告されている。最近になり頚動脈の動脈硬化病変の有無とconnexin37の遺伝子多型C1019Tとの関連を示唆する報告がなされた。しかし、この遺伝子多型と虚血性脳血管障害や虚血性心疾患症例との関連についての検索はされていない。今回、我々は虚血性脳血管障害との関係について検討した。【対象・方法】当院通院中の虚血性脳血管障害患者220名(年齢59.0±6.7)(アテローム血栓性脳梗塞;62名、ラクナ梗塞;137名、一過性脳虚血性発作;21名)及び健常者対照群として当院職員検診受信者316名(年齢58.6±4.3)を対象とした。全例より、紙面にてインフォームドコンセントを得た上で、PCR-RFLP法を用いてconnexin37の遺伝子多型C1019Tを解析した。【結果】Genotypeは虚血性脳血管障害患者ではそれぞれC/C 60.9%,C/T 29.5%,T/T 9.5%,健常対照群ではそれぞれC/C 67.4%,C/T 28.2%,T/T 4.4%であった。脳血管障害患者にてT alleleが有意に多かった(P=0.04)。また、高血圧群でT alleleが有意に多く、その他の危険因子とのロジスティック回帰解析の結果も合わせて、この遺伝子多型の脳血管障害の疾患感受性は高血圧の影響も考えられた。【結論】connexin37の遺伝子多型C1019TはT alleleにて虚血性脳血管障害の危険因子となることが示唆された。しかし、高血圧を介した機序も考えられ、今後のさらなる検討が必要と考えられた。【対象・方法】当院通院中の虚血性脳血管障害患者228名(年齢59.0±6.7)(アテローム血栓性脳梗塞;67名、ラクナ梗塞;139名、一過性脳虚血性発作;22名)及び健常者対照群として当院職員検診受診者316名(年齢58.6±4.3)を対象とした。【結果】Genotypeは虚血性脳血管障害患者ではそれぞれC/C61.0%,C/T29.4%,T/T9.6%,健常対照群ではそれぞれC/C67.4%,C/T28.2%,T/T4.4%であった。また、その他の危険因子とのロジスティック回帰解析で高血圧の影響が疑われた。
母体栄養障害による胎児脳の成人疾患へのプログラミングとその解除に関する実験的研究

母体低栄養の胎児への影響は出生後も続き成人疾患の大きな要因になると考えられているが、胎児脳における影響に関しては詳しく調べられていなかった。本研究では、低蛋白食を与えた妊娠マウスの胎仔脳が膣炎などの母体感染を受けやすくなることを見出した。また、この原因が胎児脳の遺伝子調節(エピジエネティクス)の異常に関与すること、総合ビタミン剤の妊娠中の投与で改善する可能性があることを見出した。制限摂食群ヒツジの準備および遺伝子検索に必要なヒツジ用primerの設定に時間を要したため,本年度の実験は遺伝子レベルを中心とした解析に限定し,先ず,マウス胎仔を用いた実験を行った.十分な栄養を給餌した「通常餌群」ならびにこれと同等の熱量を有するものの蛋白質のみ50%に制限された制限餌を交配開始前から給餌された「制限餌群」の二群を準備した.胎齢17日の胎仔から胎盤および肝臓を採取してRNAを抽出し,これらの臓器でエピジェネティックな調節を受けている遺伝子群を中心にRNAの発現をRT-PCRを用いて調査した.肝臓では制限餌群において脳内オリゴデンドロサイトの増殖を元進するIgf2の発現が低下していたが,オリゴデンドロサイトの分化を促進するIgf1の発現には両群間で差はなかった.Igf2は胎盤にも発現して胎仔の成長を促進させるが,胎盤での発現においても両群間に差はなかった.肝臓におけるIgf2発現の違いに基づいて,胎齢17日および生後7日における脳組織を免疫組織化学的に検討した.すなわち,胎齢17日の脳ではオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであるOlig2とPDGFRαの局在を通常餌群と制限餌群で比較し,また,生後7日の脳においては成熟オリゴデンドロサイトのマーカーであるMBPの局在および陽性細胞数を両群間で比較した.肝臓におけるIgf2の発現低下から制限餌群でのオリゴデンドロサイト関連マーカー陽性細胞数が減少していることを期待したが二群間に有意な差は認められなかった.その理由のひとつとして胎仔脳に多数存在する神経幹細胞がこれを補償したためと推察された.そこで母体に経膣的にリポ多糖類を投与して子宮内炎症を惹起し,胎仔脳に残存する補償能を検討した.制限餌群(+)かつ子宮内炎症(+)群のみでオリゴデンドロサイトが有意に減少し,本補償機構の破綻が強く示唆された.現在,本補償機構を詳細に解析するためにマイクロアレイ法を用いてRNA発現を網羅的に調査している.本年度は、母体栄養障害の胎児脳への影響、特に感染に対する低タンパク食の影響に関して研究を進めた。また、栄養障害の胎児脳に与える影響の機序を調べるためにRNAの網羅的検索を行った。妊娠マウスに通常エサに比ベカロリーは同じでタンパク質成分を半分にしたエサを与え飼育した(低栄養群)。(1)妊娠中の母体体重増加は両軍で有意差はなかった。(2)妊娠17日目、生後7日目で低栄養群の胎仔の体重減少が見られた。生後妊娠14日齢で0.01mg/ml×30μ1のLPSを経膣的に投与し妊娠17日目に胎仔脳のPDGF-RAlpha, 0lig2, ActCapase3の免疫染色を行った。これらは各群間で変化が見られなかった。生後7日目に行ったMBP,GFAP,nestinの染色では、MBPが低栄養LPS群で有意に低下、GFAPは変化なく、GFAPとnestinの2重陽性割合はLPS投与群で増加していた。日齢19日では各群で神経膠細胞前駆細胞の有意な変化は見られず、アポトーシスもこの時になかった事になる。また、生後7日目にLPS群で活性アストロサイトが活性化していること、低栄養LPS群のみで成熟オリゴデンドロサイト(OL)の有意な減少が示された。次に、妊娠17日目の胎仔の肝臓、心臓を用いRNAの網羅的解析を行った。低栄養群では、Igf2とそのBd蛋白の有意な低下が見られた。これに対し、Igf1の有意な変化はなかった。Epigeneticな変化を見るために、Igf2遺伝子のP1-promoter領域のHistoneメチル化を調べた。低栄養群ではH3,H4領域でメチルに有意な変化が見られた。Igf2はOLの発育を増進し、Igf1はその分化を調節している。OLの減少はIgf2の減少に関与すると考えられた。本研究では低タンパク質の食事がIgf2のepigenetic制御異常を生じ、これに感染が加わると新生児期の脳内でOLの減少がすることが分かった。母体の栄養障害が胎児の脳に影響し成人後の精神障害の原因になっているのではないかと考えられている。本研究の目的は、母体低栄養が胎児に与える影響の機序を動物実験で明らかにする事であった。前年度まではモデルマウスを用い低タンパク質制限を行った実験で発症の機序にepigeneticsが強く関与している事が想定された。

本年度は、これをより詳しく調べるためにepigeneticsの補酵素である葉酸に注目し、葉酸の欠乏でも同様の遺伝子発現変化が起こるかを調べた。十分な栄養を給餌した「通常餌群」ならびにこれと同等の熱量を有するものの蛋白質のみ50%に制限された制限餌を交配開始前から給餌された「制限餌群(1)」、また、妊娠0日目から葉酸のみを抜いた「制限餌群(2)」と妊娠8日目から葉酸のみを抜いた「制限餌群(3)」の4群を準備し、胎齢17日の胎仔から胎盤および脳を採取してRNAを抽出し,これらの臓器でepigeneticな調節を受けている遺伝子群を中心にRNAの発現をRT-PCRを用いて調査した.制限餌群(3)で有意に胎盤重量、胎仔重要の低下が見られた。脳では、制限餌群(1)、(2)、(3)において脳内オリゴデンドロサイトの増殖を亢進するIgf2の発現低下が見られた。制限食群(3)ではこの発現低下に雌雄差が見られた。また、制限餌群(3)で、メス・オス共通してepigeneticsに不可欠の酵素であるHadoc7aの著明な発現低下が見られた。これはヒストンのアセチル化が進行していることを示し、バイサルファイト法でもメチル化の減少を確認した。また、生活習慣病を誘発する遺伝子Cckbrや、脳内GAB受容体やセロトニン分泌に関与する遺伝子BMPの発現がメスで特異的に増加しており、母体低栄養が胎児脳に及ぼす影響に遺伝子調節レベルでの異常が大きく関係している事が分かった。
シクロブタン型ピリミジン二量体・光回復酵素の発現と活性の調節機構に関する研究

キュウリの第一葉の成長はUV-Bによって阻害される。この成長阻害の作用スペクトルがDNA損傷の作用スペクトルと似ていたことやDNA損傷を修復する光回復酵素活性が低いときに紫外線影響が強く出ることなどから、光回復酵素活性が植物の紫外線耐性に深く関わっていることが示唆された。そこで、光回復酵素(photolyase)の遺伝子発現制御、活性調節機構を解明することを目的として研究を行った。キュウリからCPD-photolyaseをコードするcDNAを単離し、さらに核DNA(CsPHR)を単離してプロモーター領域を調査したところ、CsPHRのプロモーター領域に光誘導に関与していると思われるシス配列が見いだされた。明暗日周期の中でのCsPHRのmRNA蓄積量を調べたところ、mRNA蓄積量は午前中に最大に達し、その後急速に減少する日周変化を示した。この午前中のピークは、UV-B付加により更に増大した。光によるCsPHR誘導の作用スペクトルの作成を行い、310nm付近に誘導のピークがあることが分かった。続いて、プロモーターにレポーターとしてβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をつないだキメラ遺伝子をシロイヌナズナに導入した。この組換え体にUV-Bを含む光を照射すると葉、茎および根の先端においてGUSが発現した。そこで、これを用いてGUS誘導に関する作用スペクトルを検討したところ、この場合も310nm付近に誘導のピークが認められた。次にプロモーターのシス領域を明らかにするために、プロモーターのdeletionシリーズをレポーター遺伝子LUCに繋いでシロイヌナズナに導入し、UVBによる誘導を調べた。翻訳開始点の上流202-296bpのプロモーター領域が誘導に必須なシス領域であることが分かった。しかし、gain-of-function実験により、この領域だけではLUC誘導ができないことがわかり、翻訳開始点の上流201bpまでの領域にこのシス因子と協同的に倒く因子があることが示唆された。太陽光に含まれるB領域紫外線(UV-B)は植物の成長を阻害するなどの害作用を有する。この成長阻害の作用スペクトルがDNA損傷の作用スペクトルとよく似ていたことやDNA損傷を修復する光回復酵素活性が低いときに紫外線影響が強く出ることなどから、光回復酵素活性が植物の紫外線耐性に深く関わっていることが示唆された。まず、キュウリからCPD-photolyaseをコードするcDNAを単離し、さらに核DNA(CsPHR)を単離した。このDNAのプロモーター領域を紫外線で誘導されることが知られているカルコン合成酵素のプロモーター領域と比較して、CsPHRのプロモーター領域にも光誘導に関与していると思われるシス配列が存在することが分かった。1日の明暗日周期の中でのCsPHRの遺伝子発現について明らかにするために、CsPHRのmRNAの蓄積量を調べた。mRNA蓄積量は午前中に最大に達し、その後急速に減少する日周変化を示した。この午前中のピークは、UV-Bを付加照射すると更に増大した。しかし、このUV-Bの促進効果は、午前中のピーク時のみに見られ、他の時間帯では見られなかった。つぎに、基礎生物学研究所の大型スペクトログラフを用いて、この光(特にUV-B)によるCsPHR誘導の作用スペクトルの作成を試みた。これまでのところ、300nmあるいは310nm付近に誘導のピークがあることを示唆する結果が得られている。

太陽光に含まれるB領域紫外線(UV-B)は植物の成長を阻害するなどの害作用を有する。キュウリの第一葉の成長はUV-Bによって阻害される。この成長阻害の作用スペクトルがDNA損傷の作用スペクトルとよく似ていたことやDNA損傷を修復する光回復酵素活性が低いときに紫外線影響が強く出ることなどから、光回復酵素活性が植物の紫外線耐性に深く関わっていることが示唆された。そこで、光回復酵素(photolyase)の遺伝子発現制御、活性調節機構を解明することを目的として研究を行った。まず、キュウリからCPD-photolyaseをコードするcDNAを単離し、さらに昨年度までに核DNA(CsPHR)を単離した。昨年度に引き続き、基礎生物学研究所の大型スペクトログラフを用いて、光(特にUV-B)によるCsPHR誘導の作用スペクトルの作成を試み、UV-B領域の310nm付近に誘導のピークがあることを示す作用スペクトルが得られた。続いて、CsPHRのプロモーター領域にあるCsPHR誘導に関与するシスエレメントを明らかにすることを目的に、プロモーターにレポーター遺伝子としてβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をつないだキメラ遺伝子をシロイヌナズナに導入して組換え体を作製した。この組換えシロイヌナズナにUV-Bを含む光を照射すると葉、茎および根の先端においてGUSが発現すること、UV-Bを含まない光照射ではGUS発現が極めて低いことが明らかになった。現在、プロモーター中のシスエレメントを明らかにするための検討を行っている。太陽光に含まれるB領域紫外線(UV-B)は植物の成長を阻害する。このようなUV-Bの害作用には、UV-BによるDNA損傷が関わっている可能性が示唆されている。DNA損傷は速やかに修復されるが、植物では特に光回復酵素(photolyase)が重要である。そこで、キュウリからCPD-photolyase遺伝子(CsPHR)およびそのcDNAを単離し、CsPHRの誘導を調べたところ、310nm付近のUV-Bによって発現が誘導されることが昨年までの研究によって明らかになった。そこで、光受容から遺伝子発現までのシグナル伝達系を明らかにすることを目的に、CsPHRのプロモーターにレポーター遺伝子としてGUS遺伝子を繋いだものをシロイヌナズナに導入して、GUSの発現について検討したところ、シロイヌナズナにおいてもUV-BによってGUS発現が誘導されることが分かり、光(UV-B)受容から遺伝子発現に至るシグナル伝達系はシロイヌナズナもキュウリと同様であること、キュウリのCsPHRがシロイヌナズナのシグナル伝達系を利用できることが分かったので、これを用いてCsPHR誘導に関する作用スペクトルについて検討したところ、この場合も310nm付近に誘導のピークが認められ、このプロモーター上に310nm付近のUV-B受容からのシグナルを受け取る部位が存在することが明らかになった。
学習者の振る舞いを模倣する模倣学習エージェントを用いた教育システムの開発

本研究の目的は,人間が機械知が協調して発展する未来の共生関係を実現するという見地に立ち,その関係に資する有効な教育エージェントとは何かを模索することである.本研究では機械学習により学習者の癖やスキルを含めた振る舞いを模倣する「模倣学習エージェント」を開発し,自分を振り返るための教育的な「鏡」として利用できるかを検証する.当面の学習対象としては,論理的ボードゲームにおける戦略的スキルを対象とする.最終的には,複数の学習者に模倣学習エージェントを適用し,ネットワーク化することで競争的かつ協調的な教育環境を構築し,教育的検証をおこなうことで教育システムの新たな可能性を探る.本研究の目的は,人間が機械知が協調して発展する未来の共生関係を実現するという見地に立ち,その関係に資する有効な教育エージェントとは何かを模索することである.本研究では機械学習により学習者の癖やスキルを含めた振る舞いを模倣する「模倣学習エージェント」を開発し,自分を振り返るための教育的な「鏡」として利用できるかを検証する.当面の学習対象としては,論理的ボードゲームにおける戦略的スキルを対象とする.最終的には,複数の学習者に模倣学習エージェントを適用し,ネットワーク化することで競争的かつ協調的な教育環境を構築し,教育的検証をおこなうことで教育システムの新たな可能性を探る.
脂質異常症治療薬エゼチミブによるコレステロール吸収トランスポーター阻害機構の解明

コレステロール吸収トランスポーターNPC1L1に関して、阻害剤エゼチミブが効果を示さないことが報告されているV55L変異体の解析を行い、その影響の検討を行った。また、コレステロール以外の基質の認識および細胞内への取り込みに関して検討を行った。α-トコフェロールはNPC1L1によって吸収されるという報告があるが、我々の検討により、α-トコフェロールがNPC1L1によって認識され、さらに、コレステロールと同様のメカニズムによって細胞内に取り込まれることを示すことができた。本研究では、コレステロールトランスポーターNPC1L1に関して、そのコレステロール吸収機構およびコレステロール吸収阻害剤エゼチミブの作用機構の解明を目的としている。これまでの研究では、N末端球状ドメインへのコレステロールの結合や第2細胞外ループ領域へのエゼチミブの結合は明らかになっているが、それらがどのようにしてコレステロールの吸収、または、コレステロール吸収阻害に至るかの機構解明には至っていない。本研究では、NPC1L1のドメイン間相互作用に着目して研究を進めている。エゼチミブが効果を示さない変異体(V55L)を持つ人がいることが知られているが、エゼチミブが結合するドメインとは別のドメインに存在する変異がどのようにしてエゼチミブの効果を打ち消すのかは不明である。本研究では、これまでにNPC1L1のV55L変異体を作製し、V55L変異体を安定に発現する細胞株の樹立を行った。また、NPC1L1においてコレステロールが結合するN末端球状ドメインをNPC1L1のホモログであるNPC1のN末端球状ドメインに置換した変異体の作製も行い、その安定発現株の樹立も行った。その他の実績としては、N末端球状ドメインへのコレステロールの結合活性をRIラベルしたコレステロールを用いて解析する手法を確立した。また、NPC1L1に緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合させたNPC1L1を用いて、コレステロール投与によるNPC1L1の細胞内局在変化およびエゼチミブによる吸収阻害効果を細胞を用いてアッセイする系の確立を行った。さらに、アッセイ系を確立する過程でNPC1L1がコレステロール以外の基質に対しても作用することを細胞レベルで明らかにすることができた。これまでに、1)N末端球状ドメインにコレステロールが結合すること、2)第2細胞外ループ領域にエゼチミブが結合すること、が明らかになっているが、詳しいことはわかっていない。本研究の特色として、NPC1L1のドメイン間相互作用に着目して研究を行っていることが挙げられる。エゼチミブが効果を示さない変異体(V55L)を持つ人がいることが明らかになっているが、エゼチミブが結合するドメインとは異なるドメインに存在する変異がどのようにしてエゼチミブの効果を打ち消すのかに関しては不明である。そこで、本研究では、V55Lを含め、エゼチミブ結合ドメインとは異なる部位に様々な変異体を作製し、その影響を確かめた。解析の結果、V55L変異体はエゼチミブによる阻害が起こらず、野生型と同様にコレステロール取り込みが起こることが明らかになった。NPC1L1はコレステロール以外にもα-トコフェロール(ビタミンE)の吸収にもかかわるという報告があるが、詳しい点に関しては明らかになっていない。NPC1L1の基質認識に重要なアミノ酸残基を含め、基質認識機構を明らかにすることができれば、基質結合後の基質取り込みに重要なドメイン間相互作用部位の解明へとつながる手掛かりを得ることができるため、NPC1L1によるα-トコフェロール取り込みに関しても詳細な解析を行った。解析の結果、NPC1L1はコレステロールと同様にα-トコフェロールの取り込みも行うことができることが明らかになった。さらに、コレステロールと同様、α-トコフェロールもN末端球状ドメインによって認識されており、その吸収はエゼチミブによって阻害されることが明らかとなった。タンパク質科学コレステロールトランスポーターNPC1L1は、これまでの研究から、1)N末端の球状ドメインにコレステロールが結合すること、2)コレステロール吸収阻害剤エゼチミブはN末端球状ドメインとは別の細胞外ドメインに結合し、阻害活性を示すことが明らかになっている。しかし、NPC1L1へのコレステロールの結合から細胞内に取り込まれる機構およびエゼチミブによってコレステロール吸収が阻害される機構に関しては不明である。そこで、本研究では、NPC1L1のコレステロール吸収機構、また、エゼチミブによる吸収阻害機構に関して、NPC1L1のドメイン間相互作用に着目して研究を行っている。現在までに、エゼチミブが効果を示さない変異体(V55L)の作製が完了している。また、N末端球状ドメインをNPC1L1のホモログであるNPC1のN末端球状ドメインに置換した変異体の作製も完了している。これまでに、コレステロール吸収阻害剤のエゼチミブが効果を示さない変異体(V55L)の作製が完了している。

また、コレステロール結合活性が確認されているN末端球状ドメインをNPC1L1のホモログであるNPC1のN末端球状ドメインと置換した変異体の作製も完了している。そこで、両変異体において、コレステロール吸収活性にどのような影響が現れるか細胞を用いた解析を行う。併せて、エゼチミブ投与時にコレステロール吸収阻害が起こるか否かの解析を行う。両変異体ともエゼチミブが結合するドメインとは別のN末端球状ドメインの変異体であるので、エゼチミブの作用に対する影響を確かめることができれば、コレステロール吸収機構およびエゼチミブの作用機構に関する新たな知見となる。
新規ドラッグデリバリー理論と新世代シスプラチンによる頭頸部癌治療法の開発

近年DDSを目的とした1Pt(カチオン型シスプラチン)および3Pt(アニオン型シスプラチン)という2つの新規薬剤が開発された。これらは従来のシスプラチンを電荷型にすることで、腎毒性をなくすことに成功したものである。さらに1Ptは芳香族環を有すことから高い抗癌活性をもち、従来のシスプラチンを上回る効果が期待される。また3Ptはリン酸基が骨成分に高吸着性を示す。我々はこれらの新規薬剤の臨床応用に向けた、トランスレーショナルリサーチとして、頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いたin vitroおよびin vivoの薬剤評価実験を行い、シスプラチンに比べて高い骨移行性を確認した。ダハプラチン(一般名:オキサリプラチン)は、切除不能進行大腸癌に対するFOLFOX法(オキサリプラチン、レボホリナート、5-FUの併用)として承認されている。抗癌剤を一定の大きさのミセルに内包することで、血中での安定性向上と癌組織に集積しやすくなる特徴を有することが知られている。本研究では、オキサリプラチンのミセル化薬剤であるダハプラチン誘導体ミセル(以降、NC-4016)を用いて、抗腫瘍効果増強と神経障害軽減の可能性を検討した。抗腫瘍効果を実験1-3にて検討した。実験1では、頭頸部癌cell lineでのオキサリプラチンとNC-4016の抗腫瘍活性をMTS assayにてIC50を検討した。実験2では、KB細胞をヌードマウスの背部皮下に播種し各薬剤(オキサリプラチン、NC-4016、5%ブドウ糖液)を投与し、腫瘍長径と短径を毎週測定した。神経障害は実験4にて検討した。オキサリプラチン、NC-4016、5%ブドウ糖液の3群にてラット足底に対するAcetontest、coldtest、heat test、von Frey testにて神経障害を評価した。Cell lineにおける抗腫瘍効果は従来のオキサリプラチンが、NC-4016より高い抗腫瘍効果を認めた。一方で、マウスにおける抗腫瘍効果は、NC-4016において有意に腫瘍の増大を抑制していた。血漿中のプラチナ濃度は、オキサリプラチンは薬剤投与直後から低下するのに対して、NC-4016は薬剤投与24時間以降も高かった。ミセル化薬剤の血中での安定性と腫瘍への集積効果が、高い抗腫瘍効果をもたらすと考えられた。寒冷刺激であるAcetontestとcoldtestでは、オキサリプラチン群においてのみスコアの上昇と通常より高い温度刺激での反応を認めた。ダッハプラチン誘導体ミセル(NC-4016)の高い腫瘍集積性と抗腫瘍効果、急性期神経障害の軽減の可能性が示された。今後は、薬剤の複数回投与を行い慢性期神経障害についても検討する必要がある。金沢大学薬学部にて新規開発された次世代プラチナ製剤である電荷型白金抗癌剤(カチオン型シスプラチンとアニオン型シスプラチン)による頭頸部癌新規治療戦略開発を目的とし、下記のごとく研究が進行中である。1in vitro:抗腫瘍効果:頭頸部癌細胞株OSCー19、OSCー20対して、新規2剤と従来のシスプラチンを添加し、MTT assayにてin vitroにおける抗腫瘍効果を比較した。IC50値は新規2剤が従来薬と比し高い結果となっており、従来薬よりもin vitroでの活性が高いことが示された。追加実験として、シスプラチン耐性OSCー19/OSC-20を作成した。耐性細胞株に対しても同様の実験を行う予定である。2in vivo:抗腫瘍効果:ヌードマウス背部皮下にOSCー19移植し担癌マウスを作成し、薬剤投与の予備実験を行った。現在マウス数を増やして本実験を進行中である。3骨浸潤モデルマウスの作成:ヌードマウス咬筋にOSCー19を筋肉内注射し、骨浸潤を伴うモデルマウスを作成した。マウスCTを用いてそれを撮影した。現在画像解析を用いて浸潤の量的評価方法を検討中である。4Patient-derived xenograftモデルマウスの作成:臨床検体を用いてそれをNOD/scidマウスに移植した(およそ20例)。その内、3例で生着を認めた。生着したマウス背部腫瘍を更に継代し、生着を確認した。以降、第3世代以降でマウス数を増やし、新規モデルとして抗腫瘍効果を測定する予定である。電荷型白金製剤においてin vitroにおいて想定どおりのデータが得られたから頭頸部癌におけるキードラッグはシスプラチンである。しかし、シスプラチンは骨浸潤した癌に対しては抗腫瘍効果が低く、またその腎毒性が高いことが臨床的には問題である。こうした点を克服するべく金沢大学薬学部にて新規開発された次世代プラチナ製剤である電荷型白金抗癌剤(カチオン型シスプラチンとアニオン型シスプラチン)による頭頸部癌新規治療戦略開発を目的とし、下記のごとく研究を施行した。1in vitro:抗腫瘍効果頭頸部癌細胞株OSCー19、OSCー20対して、新規2剤と従来のシスプラチンを添加し、MTT assayにてin vitroにおける抗腫瘍効果を比較した。2in vivo:抗腫瘍効果ヌードマウス背部皮下にOSCー19移植し担癌マウスを作成し、薬剤投与したところアニオン型シスプラチンはシスプラチンとほぼ同等の抗腫瘍効果をしめした。

さらに腎機能についてはアニオン型シスプラチンは腎機能障害の軽減作用が認められた。3骨浸潤モデルマウスの作成ヌードマウス咬筋にOSCー19を筋肉内注射し、骨浸潤を伴うモデルマウスを作成した。マウスCTを用いてそれを撮影した。コントロール群に比べて、シスプラチンは一定の抗腫瘍効果を示したが、アニオン型シスプラチンはシスプラチンよりも高い抗腫瘍効果を示した。以上から、アニオン型シスプラチンは従来のシスプラチンに比べて一般的な抗腫瘍効果は同定であるが、腎毒性は低く、また骨浸潤した癌には高い抗腫瘍効果を示すことがわかった。近年DDSを目的とした1Pt(カチオン型シスプラチン)および3Pt(アニオン型シスプラチン)という2つの新規薬剤が開発された。これらは従来のシスプラチンを電荷型にすることで、腎毒性をなくすことに成功したものである。さらに1Ptは芳香族環を有すことから高い抗癌活性をもち、従来のシスプラチンを上回る効果が期待される。また3Ptはリン酸基が骨成分に高吸着性を示す。我々はこれらの新規薬剤の臨床応用に向けた、トランスレーショナルリサーチとして、頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いたin vitroおよびin vivoの薬剤評価実験を行い、シスプラチンに比べて高い骨移行性を確認した。ミセル化薬剤の頭頸部癌での有用性についての基礎的実験から学会発表、論文投稿と一定の成果を示すことができた次世代プラチナ製剤である電荷型白金抗癌剤(カチオン型シスプラチンとアニオン型シスプラチン)も用いて引き続き頭頸部癌での抗腫瘍効果等の評価を予定している。腫瘍評価についてはPatient-derived xenograftも併用していく予定である。頭頸部腫瘍ミセル化薬剤(シスプラチン、ダッハプラチン)について投与経路、薬剤動態のさらなる検討が今後の予定である。薬品、抗体の購入費が想定以下であったため現在の実験継続のための薬品、物品、マウス購入等の予定である。
スーパーファインセラミックスの概念設計と要素技術の開発

本研究では、金属や半導体に比べて組成的にも構造的にも複雑なセラミックスの多様性を、原子レベルの構造設計とそれを実現するプロセスの開発という観点から捉えて問題を整理し、セラミックス研究の新分野を開拓することを目的として、研究を進めた。その結果、以下のような成果を得ることができた。1。超高真空下でのパルスレーザー蒸着プロセス(レーザーMBE法)を独自に開発し、多元系セラミックスにおける原子層制御と人工超構造の設計・構築に非常に有効な手段であることを実証した。本方法を用い、パルスレーザー蒸着法では世界で初めて、長時間持続するRHEED(反射高速電子線回折)強度振動を観測することができた。この振動はセラミックス単結晶の単位格子長を1層とした2次元層状エピタキシャル成長を示していた。すなわち、RHEED強度振動のモニターは原子層レベルでの膜厚制御を可能にしてくれる。2。RHEED強度振動を伴う2次元エピキシャル成長が膜表面の原子レベルでの平担性向山の効果であることを原子間力顕微鏡(AFM)観察により明らかにした。これにより、高温超伝導を用いたジョセフソントンネル接合形成のため基礎プロセスを確立することができた。3。レーザーアブレーション法による高品質YBCO超伝導薄膜作製のための最適条件を明らかにし、低温走査型トンネル顕微鏡(STM)観察により、高品質YBCO超伝導薄膜の表面は大気暴露にも非常に安定であることを明らかよした。STS測定において明瞭な超伝導ギャップ(Δ=20meV)を観測することができた。本研究は、金属や半導体に比べて組成的にも構造的にも複雑なセラミックスの多様性を、原子レベルでの構造設計とそれを実現するプロセスの開発という観点から捉えて問題を整理し、波動力学の支配する新しいセラミックス(ス-パ-ファインセラミックス)を開拓することを目的として研究を進めた。その結果、以下のことを明らかにした。(1)原子層レベルで制御したセラミックスヘテロエピタキシャル薄膜を作成する新しい方法として、レ-ザ-アブレ-ションを超高真空下に行うレ-ザ-MBE法を考え,独自に装置を設計・製作した。これを用い、種々のセラミックスのエピタキシャル成長過程を調べた。従来困難と考えられていた、セラミックスの2次元層状成長にもとづくRHEED強度振動を、CeO_2/Si(100),SrTiO_3/SrTiO_3(001),(Ca,Sr)CuO_2/SrTiO_3(001)のエピタキシャル成長において観察することに成功した。その振動周期の長さから、イオン結合性の強い酸化物においては、成長単位として電荷中性を保持できる最小構成ユニットが考えられた。(2)レ-ザ-MBE法により、成膜過程をRHEEDでその場観察しながら、SrCuO_2/SrTiO_3,SrVO_3/SrTiO_3,Nd_2O_3/CeO_2の各セラミックス人工超格子をほぼ設計通りに作製することができた。周期構造は,本研究備品である高分解能走査電子顕微鏡で確認することができた。またSrCuO_2/SrTiO_3超格子において、各層厚を電子のコヒ-レンス長程度にした時,電気的挙動が,金属的なものから半導体的なものに変化することを見い出した。(3)光MOCVD用原料の高純度化と光吸収特性評価を行い,セラミックスの低温合成(〈500°C)のための薄膜化要素技術の検討を行った。低圧水銀ランプ紫外光照射が、Bi系超伝導体に関連する酸化物薄膜の低温合成に有効であることを実証した。本研究では、多元系セラミックの原子層レベルでの人工的超構造構築と量子力学の支配する新しいセラミックス学(ス-パ-ファインセラミックス)の体系化を目的として研究を行った。その結果の主なものを以下に挙げる。1。セラミックスの原子層制御技術の確立:独自に設計・製作した超高真空パルスレ-ザ-蒸着(レ-ザ-MBE)装置を用いて、2次元エピタキシャル成長に伴う反射高速電子線回折(RHEED)の強度振動をいくつかのセラミックスについて明瞭に観察することに成功した。振動の1周期は、単位格子長に対応しており、振動数を数えることにより、原子層オ-ダ-で膜厚を制御してセラミックス超構造を構築できることが実証された。2。セラミックス超格子の作製:レ-ザ-MBE法により、原子層レベルで膜厚とヘテロ界面を制御して、以下のセラミックス超格子を作製することができた。(2)(SrTiO_3:80A/SrCuO_2:3080A):導電層であるSrCuO_2の膜厚の減少にともない、低抗温度特性が金属的から半導体的に変化した。3.セラミックスの2次元エピタキシャル成長機構の解明:高温超伝導体の母構造を有する無限層状銅酸化物(ACuO_2、A:アルカリ土類)の初期成長過程をin situ XPS(光電子分光)測定から調べ、基板および成長最表面の構造が成長様式に大きく影響することを明らかにした。また、膜と基板との格子定数の不整合による膜構造歪を、超伝導体超薄膜(<100A)を用いて調べ、歪緩和のための臨界膜厚と格子不整合との相関を明らかにした。

本研究では、金属や半導体に比べて組成的にも構造的にも複雑なセラミックスの多様性を、原子レベルの構造設計とそれを実現するプロセスの開発という観点から捉えて問題を整理し、セラミックス研究の新分野を開拓することを目的として、研究を進めた。その結果、以下のような成果を得ることができた。1。超高真空下でのパルスレーザー蒸着プロセス(レーザーMBE法)を独自に開発し、多元系セラミックスにおける原子層制御と人工超構造の設計・構築に非常に有効な手段であることを実証した。本方法を用い、パルスレーザー蒸着法では世界で初めて、長時間持続するRHEED(反射高速電子線回折)強度振動を観測することができた。この振動はセラミックス単結晶の単位格子長を1層とした2次元層状エピタキシャル成長を示していた。すなわち、RHEED強度振動のモニターは原子層レベルでの膜厚制御を可能にしてくれる。2。RHEED強度振動を伴う2次元エピキシャル成長が膜表面の原子レベルでの平担性向山の効果であることを原子間力顕微鏡(AFM)観察により明らかにした。これにより、高温超伝導を用いたジョセフソントンネル接合形成のため基礎プロセスを確立することができた。3。レーザーアブレーション法による高品質YBCO超伝導薄膜作製のための最適条件を明らかにし、低温走査型トンネル顕微鏡(STM)観察により、高品質YBCO超伝導薄膜の表面は大気暴露にも非常に安定であることを明らかよした。STS測定において明瞭な超伝導ギャップ(Δ=20meV)を観測することができた。
ストレス性精神疾患の可視化とナノメディシン

ストレス性精神疾患は現代病とも言える精神疾患である。その原因はストレスによるHPA(視床下部-下垂体-副腎)axisの変調がグルココルチコイドの産生を増加させ、これによって神経細胞死が誘導される事である。最近では、細胞死を伴わない神経回路網変調も疾患原因の一端を担っている事が示唆されている。そこで本研究ではストレス性精神疾患の新たな治療戦略を提示すべく、1)ストレス負荷時(デキサメタゾン投与:DEX)の精神機能に関与する神経回路網の可視化及び2)樹状突起の可動制御によるナノメディシンの基礎的研究を行った。WGAトランスジーン法を応用した神経回路網の可視化では、培養海馬神経細胞においてWGA-EGFP融合蛋白質発現ベクターの導入により、本蛋白質が経シナプス的に輸送される事が証明された。一方、マウス個体ではWGA発現adenovirusを海馬歯状回及び側坐核への導入後、5日目の脳切片をWGA免疫染色によって評価したところ、歯状回導入群では導入部位の他に導入側のCA3、CA1領域、大脳皮質、更に反対側の歯状回、CA3、CA1においてWGA蛋白質を検出した。同様に側坐核導入群では両側の線条体及び海馬歯状回領域でWGA蛋白質を検出し、正常時における神経回路網の可視化に成功した。これに対してDEX投与マウスでは顕著な投射先部位の減少が認められた。現在、より詳細な解析を行うため、Cre制御WGA発現トランスジェニックマウスの作成を行っている。一方、樹状突起の可動制御機構の解明では、神経系で産生される神経ステロイドの一群がMAP2に結合する事で、Tubulin重合を制御する事を試験管内再構成実験により見出した。プレグネノロン(PREG)はTubulin重合を促進する作用が認められ、培養海馬神経細胞への添加によって樹状突起を伸長させた。一方でプロゲステロン(PROG)はPREG同様MAP2結合するが、PREGによるtubulin重合促進に阻害的に働いた。PROGによる阻害効果は培養実験においても観察され、PREGによる樹状突起を伸長及びDEXによる樹状突起退縮を阻害した。