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子宮内胎児発育不全ラットにおける行動異常と分子生物学的異常の関連に関する検討

【背景】子宮内胎児発育不全(IUGR)の中枢神経障害の機序解明のため、胎仔新生仔期における中枢神経系の分子生物学的検討を行った。【方法】IUGRモデルラットはトロンボキサンA2(STA2)を母獣に持続投与する方法にて作成した。中枢神経系におけるアポトーシスについて、TUNEL法を用いて組織学的に、またアポトーシス関連蛋白(BCL-2、BAX、β-actin)の発現を定量的に評価した。併せてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の発現については、Neurocan、Phosphacan、Neuroglycan Cについて免疫組織染色とWestern blotによる蛋白定量にて評価をした。【結果】STA2を投与した母獣から出生した新生仔の出生体重は4.73±0.33gであり、対照群の5.95±0.35gに比して有為に少なかった。IUGR群では中枢神経系におけるTUNEL法にてアポトーシスが亢進している所見が認められたが、アポトーシス関連蛋白の発現に関しては、BAX、β-actinの発現に関しては、有意な差を認めるには至らなかった。BCL-2はすべての群で認められなかった。免疫染色によるCSPGの発現評価では、IUGR群において、日齢0および日齢10にけるNeurocan、Phosphacan、Neuroglycan Cの染色性が上昇していた。各CSPGの局在については、両群で差を認めなかった。Western blotによる蛋白定量評価では、IUGR群において、日齢0のNeurocanおよびPhosphacanの発現が亢進していた。【考察・結論】本研究の結果からIUGRの中枢神経障害にはCSPGが関与している可能性が示唆された。これらの知見は、IUGRの中枢神経障害の機序解明に重要な示唆を与える。【背景と目的】コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)は発達期の中枢神経系に多く存在することが知られている糖タンパクであり、神経の損傷、修復、再生に大きく関与するといわれている。一方、子宮内胎児発育不全(IUGR)は全妊娠の37%に認められると言われ、児は精神発達遅滞や学習障害など神経学的異常をきたすことがある。トロンボキサンA2(STA2)を投与することで作成した動物モデルでは妊娠高血圧(中毒症)に準じた状態を呈し、より病態に即したモデルとなり得る。本研究では、STA2を妊娠ラットに持続投与することによりIUGRモデルを作成し、中枢神経系の組織学的変化の有無、CSPG発現の変化の有無を検討した。【方法】1)IUGRモデルラット作成:妊娠13日目のSDラット下腹部に浸透圧ポンプを埋め込み、STA2を20ng/時で持続投与して作成した。2)検体採取:妊娠20日で帝切し、母体より胎盤および胎仔より脳を得る。生後0日、10日の新生仔から脳を採取する。【現在までの結果】免疫染色では、IUGR群でCSPの染まりがやや薄い傾向にあった。Western blottingにて確認をしたが、有為な違いはみとめなかった。今後は、検体でTUNEL染色も行う予定である。【背景】子宮内胎児発育不全(IUGR)の出生後の栄養状態の違いが中枢神経に及ぼす影響は未だ不明であり、中枢神経障害の改善につながるIUGRに対する出生後の理想的な栄養管理に関して検討した。【方法】SD系ラットの母獣の腹腔内に、合成トロンボキサンA2を20ng/時で持続投与をしてIUGRを作成した。通常栄養IUGR群、栄養障害IUGR群、栄養改善IUGR群の3群に分けてアポトーシス関連蛋白について検討を行った。

アポトーシス関連蛋白の発現については、日齢0にコントロール群とIUGR群、日齢7にコントロール群とIUGRの各3群がら脳を採取し、大脳、小脳、海馬におけるBCL-2、BAX、β-actinの発現を検討した。【結果】日齢7の平均体重はコントロール群が12.98g±0.89、通常栄養IUGR群が10.67g±1.18で通常栄養IUGR群がコントロール群に比べて有意に小さかった。日齢7で栄養障害IUGR群の平均体重は9.38g±1.16、栄養改善IUGR群は11.89g±1.09で、通常栄養IUGR群と栄養障害IUGR群、栄養改善IUGR群と通常栄養IUGR群を比べると、それぞれ後者の方が有意に小さかった。日齢7の栄養改善IUGR群の体重はコントロール群よりも有意に小さく、生後の栄養改善でも日齢7までは追いつくことがなかったアポトーシス関連蛋白の発現に関しては、BAX、β-actinの発現に関しては、3群間で有意な差を認めるには至らなかった。BCL-2はすべての群で認められなかった。【考察】生後の栄養の差異により、日齢7ではそれぞれの群で体重に有意な差を認めることができたが、アポトーシス関連蛋白の発現には各群で差を認めなく、中枢神経障害の機序解明には更なる詳細な検討が必要と考えられた。
高濃度イオン注入灰化シリコン非晶質層の再結晶化と不純物効果の解明

本研究によって高濃度イオン注入によって炭化シリコン中に形成された非晶質層の再結晶化過程への不純物効果について以下の知見を得た。1.非晶質層の再結晶化過程への不純物効果についてPおよびAlのようなSiC中で格子点を置換する不純物がイオン注入されることで形成される非晶質層がその後の熱処理によって再結晶化する場合、これらの不純物の導入によって、再結晶化速度の増加が起こる。再結晶化速度の増加は1x1020/cm3以上の場合に顕著であり、不純物がPまたはAlのどちらでも不純物濃度を1x1021/cm3まで大きくすることで、再結晶化速度は4倍まで増加する。これらの非晶質層の再結晶化速度の熱処理温度依存性においては、活性化エネルギーは、3.4eVである。ここで得られた活性化エネルギーは、SiC非晶質層が、3C,4H,および6Hに再結晶化する場合に等しい。再結晶化されるSiCの結晶構造と再結晶化速度を比較した場合、4Hが最も早く、6H,3Cとジンクブレンド結合の割合が大きくなるにつれて、低速となる興味深い知見が得られた。このことは、これらの結晶ヘイオン注入を行う場合に、熱処理条件の検討において重要である。2.イオン注入されたリン不純物の電気的活性化イオン注入されたP不純物は、非晶質層の再結晶化とともに格子点をすぐさまに置換し、電気的活性化すると考えられる。また、このメカニズムが再結晶化速度の増加する従来のモデルと矛盾なく説明できる。P不純物が注入されたSiCにおいて、高温での熱処理を行っても、P不純物から発生する電子の濃度に変化は観察されないことから、非晶質層の再結晶化の終了と同時にP不純物が格子点を置換することを確認できた。他の不純物として、N不純物をイオン注入により導入したSiCについても、結晶性の回復およびN不純物の電気特性評価を行った。今年度の研究は「種々の不純物イオンを注入し形成される欠陥層の再結晶化速度の導出」を行った。具体的な成果は以下の通りである。1.購入した4H-SiC(112-0)基板に、不純物濃度が1x10^<20>,5x10^<20>および1x10^<21>/cm^3であり、欠陥層の厚さが約200nmなるように、リンおよびアルミニウムを注入した。2.リン不純物濃度が5x10^<20>/cm^3であるイオン注入試料について欠陥層の再結晶化速度の熱処理度依存性を700から800度の温度範囲で求めた。ここで求めた再結晶化速度の活性化エネルギーは、以前に報告した6H-SiCの場合と同様に、3.4eVであった。しかし、再結晶化速度は4H-SiCにアルゴンをイオン注入した場合に比べて約4倍大きく、欠陥層にある不純物がリンであることに起因すると考えられる。また、再結晶化速度のリン不純物濃度依存性は、リン不純物濃度が1x10^<20>から1x10^<21>/cm^3の範囲では明確でない。3.アルミニムをイオン注入した4H-SiC(112-0)では、リンイオン注入試料と同様に、アルゴンイオン注入によって形成した欠陥層と比べて、再結晶化速度は高速であり、その活性化エネルギーも3.4eVであった。

1.高濃度イオン注入炭化シリコン層の再結晶化高濃度のリンおよびアルミニウムイオン注入によって炭化シリコン表面にイオン注入非晶質層を形成した。この形成された非晶質層の再結晶化過程は、活性化エネルギー3.4eVにしたがって再結晶化過程が進行することを明らかにした。この活性化エネルギーは不活性ガスであるアルゴンをイオン注入したイオン注入非晶質層と同等のエネルギーであり、不純物に依存しないことを明らかにした。リンおよびアルミニウム濃度が1x10^<20>から1x10^<21>cm^<-3>の範囲において、再結晶化速度が濃度とともに増速する現象を見出し、再結晶化速度は最大5倍程度まで増速することを明らかにした。さらに高濃度の窒素イオン注入をおこなった炭化シリコンイオン注入層の再結晶化過程を検討した。この場合、イオン注入層は非晶質化しない。欠陥の消滅は200度と低温でも進行し、450から600度の熱処理範囲において、欠陥の消滅が顕著に進行することを明らかにした。600度以上の熱処理ではほとんどの欠陥は速やかに消滅する。このことから、昇温イオン注入が500度程度で実施されている現状とよい一致を見た。2.イオン注入層の非晶質化と不純物の活性化過程イオン注入された炭化シリコン層が非晶質化している場合、イオン注入不純物は非晶質層の再結晶化過程においてすでに格子位置を置換し、1000度程度の熱処理において電気的に活性化することを明らかにした。また、前記と同様にリン不純物濃度の範囲において、熱処理を1700度において実施した。得られたキャリア濃度はイオン注入不純物量の約10%前後であり、イオン注入層が非晶質化している場合、イオン注入不純物は高い活性化率で電気的に活性化することを明らかにした。炭化シリコンへのイオン注入による不純物ドーピングにおいてイオン注入層の非晶質かはイオン注入不純物の効率的な電気的活性化に効果的であることを明らかにした。
イギリス歴史学派と方法論争

方法論争を歴史学派の立場から総括したのは,W.J.アシュレーであった。その総括の要点を記すと,次のようになる。第一に,アシュレーは,方法論争が起こった原因は,両陣営の研究者の適性と関心が相違していたことにあると考えた。自分が特定の方向に沿って考えるのは,主として自分自身の精神的適性がその方向に合っているからであり,自分自身が惹かれている研究が,すべての課題のなかで最も緊急かつ有益なものだと感じるのは,きわめて自然である。第二に,一方の方法を他方の方法で置き換えようとする試みは,実際に成功しなかった。かつての過激な歴史学派が抱いた望みというのは,経済学における抽象的・演繹的な方法を廃棄して,これを歴史的方法によって置き換えるということだった。すなわち,経済理論の前提を現実的なものにするために,事実の調査研究から一般的なものを導出する過程が,演繹的推論に先行しなければならない。演繹的推論を行うのは,その後でなければならない,というのであった。しかし,この主張は,理論派はもちろんのこと,理論の役割に理解を示す歴史学派の論者からも,批判を招くことになった。しかし,第三に,方法論争は正統派経済学者の考え方に影響を与えた。すなわち,「学説の相対性」「社会現象の統一性」「行為の多元性」といった歴史学派の観点が,正統派の経済学者にも共有されるようになった。第四に,方法論争の結果,それまで軽んじられていた研究分野が,その地位を高めるに至った。ドイツにおいては理論的研究が,イギリスにおいては歴史的研究が,経済学上の一分野としての権利を獲得した。第五に,方法論争を通して,歴史学派の進むべき方向が明らかになった。今や,ドイツにおいてもイギリスにおいても,歴史学派の経済学者は,精力的に経済史の研究に取り組んでいる。アシュレーが方法論争を総括するさいに最も強調したのは,この点であった。イギリス歴史学派の方法論とJ.S.ミルの方法論との関係について研究を深めた。歴史学派を特徴づけるものの一つは,歴史的方法(historical method)である。彼らは,古典派の演繹法あるいは理論的方法に対して,歴史的方法を対置して登場してきた。しかし,古典派の代表者の一人であるJ.S.ミルは,その『論理学体系』(初版1843年)において,すでに歴史的方法について語っていた。ミルによれば,当時,ヨーロッパ大陸の最も先進的な思想家たちが歴史の経験的法則を探究していた。しかし,歴史の経験的法則を探求するだけでは,歴史的方法を用いることにはならない。この法則がそれの依存する心理学的および性格学的法則と結びつくまでは,科学的法則と呼ぶことはできない。ミルのいう歴史的方法を用いていたのは,大陸の歴史学派の中でも,コントだけであった。イギリス歴史学派においても,歴史的方法は,歴史の経験的法則を探求するという意味で用いられる場合もあれば,コントーミル的な意味で用いられる場合もあった。さらに,これらの2つの用法を超えて,歴史的方法そのものが進化をとげていったということができる。したがって,厳密な意味でのコントーミル的な歴史的方法は,イギリス歴史学派の一部にのみ継承されたといわなければならない。しかし,古典派の理論的方法を定式化した「直接的演繹法」以外に,歴史的方法をも容認していたミルの方法論は,この点から見ても,包括的なものであったことが分かる。

イギリス歴史学派は,その初期には,理論的方法を歴史的方法によって置き換えようとする過激な主張を展開するのであるが,やがて,歴史的方法だけではなく理論的方法の意義も認めるようになる。つまり,再びミルの総合的な立場へと戻ってゆくことが明らかになった。この成果は,平成19年度に論文にまとめる予定である。方法論争を歴史学派の立場から総括したのは,W.J.アシュレーであった。その総括の要点を記すと次のようになる。第一に,アシュレーは,方法論争が起こった原因は,両陣営の研究者の適性と関心が相違していたことにあると考えた。自分が特定の方向に沿って考えるのは,主として自分自身の精神的適性がその方向に合っているからであり,自分自身が惹かれている研究が,すべての課題のなかで最も緊急かつ有益なものだと感じるのは,きわめて自然である。第二に,一方の方法を他方の方法で置き換えようとする試みは,実際に成功しなかった。かつての過激な歴史学派が抱いた望みというのは,経済学における抽象的・演繹的・理論的な方法を廃棄して,これを歴史的方法によって置き換えるということだった。すなわち,経済理論の前提を現実的なものにするために,事実の調査研究から一般的なものを導出する過程が,演繹的推論に先行しなければならない。演繹的推論を行うのは,その後でなければならない,というのであった。しかし,この主張は,理論派はもちろんのこと,理論の役割に理解を示す歴史学派の論者からも,批判を招くことになった。しかし,第三に,方法論争は正統派経済学者の考え方に影響を与えた。すなわち,「学説の相対性」「社会現象の統一性」「行為の多元性」といった歴史学派の観点が,正流派の経済学者にも共有されるようになった。第四に,方法論争の結果,それまで軽んじられていた研究分野が,その地位を高めるに至った。ドイツにおいては理論的研究が,イギリスにおいては歴史的研究が,経済学上の一分野としての権利を獲得した。第五に,方法論争を通して,歴史学派の進むべき方向が明らかになった。今や,ドイツにおいてもイギリスにおいても,歴史学派の経済学者は,精力的に経済史の研究に取り組んでいる。アシュレーが方法論争を総括するさいに最も強調したのは,この点であった。
分子設計による半導体ポリマーの機能制御と機能性電極への応用

今年度行った研究の成果は、導電性ポリマー薄膜を圧電結晶上に感応マトリックスとして用いる高選択性ガスセンサに関して得られた以下に示す新しい知見である。圧電結晶上に電気化学的に酸化重合させたポリマー薄膜の質量変化および電気抵抗変化を同時に測定できるようセンサチップの構造を設計、加工することにより、導電性ポリマー薄膜を感応マトリックスとして用いる高選択性有機ガスセンサを構築することができた。また、このセンサを用いて同時に得られる質量変化と抵抗変化の情報は有機ガス分子とポリマー膜との相互作用機構を解明するに大変有用であることが判明した。電気化学的にBF_4あるいはClO_4でドープしたポリプロール(PP)膜を感応膜に用いたセンサチップをアセトンや各種アルコールについて種々の濃度の蒸気に曝したとき、同時に測定される相対的な抵抗変化(ΔR/R_0)を相対質量変化(ΔM/M_0)に対してプロットすると、いずれの試料についても原点を通る良好な直線が得られた。ここで、R_0およびM_0は、それぞれPP膜の初期抵抗および初期質量である。得られた各直線の傾き(ΔR/R_0)/(ΔM/M_0)の値と吸着1分子に対する抵抗変化(ΔR/R_0)/(N_<ad>/M_0)、ここでN_<ad>はPP膜に吸着した分子数、の結果から、それぞれの分子は(ΔR/R_0)(ΔM/M_0)の値により認識できること、またガス分子は(ΔR/R_0)、あるいは(ΔM/M_0)より定量することが可能であることが判明した。さらに第一級アルコールの(ΔR/R_0)/(N_<ad>/M_0)は、それぞれほぼ等しい値であるが、(ΔR/R_0)/(ΔM/M_0)値の方は分子量が増加するにつれて減少することからアルコールの官能基(OH基)が電気伝導度に与える効果が、アルコールの種類に因らず、ほぼ同じであること、換言するとOH基の効果は、アルコール分子のアルキル基の種類にほとんど依存しないことがわかった。
白亜紀関門層群の比較堆積地質学的・古地磁気学的研究

1.層序学的研究関門層群下部の脇野亜層群分布地域である小倉南部山田緑地の地質学的層序学的研究を行い、模式地若宮地域の層序との対比により脇野亜層群の層序を確立することができた。2.岩相・古流系解析脇野亜層群を中心に詳細な岩相解析を実施し、古流系資料も収集することができた。脇野亜層群の代表的堆積相として、沖積河川堆積相、湖沼縁辺相、湖沼中心堆積相が識別された。とくに、湖沼中心相には典型的なリズマイト相が発達しており、その産状と起源を明らかにした。3.砂岩の岩石学的研究主として脇野亜層群の砂岩について岩石学的検討を行い、同時代の朝鮮半島の慶尚層群砂岩との比較を行った。その結果、脇野亜層群砂岩は片岩・安山岩などの岩片が多いのに対し、慶尚層群砂岩は片麻岩など高変成度岩石に由来しており、供給源が異なっていた。4.赤色岩の岩石学的研究関門層群を特徴づける赤色岩の岩石学的研究を行い、その形成過程について、地質学的要因を明らかにした。5.古地磁気学的研究関門層群脇野・下関両亜層群について古地磁気測定を行った。その結果、下関亜層群については良いデータを得ることができた。それによると、本堆積岩は現在よりも高緯度地域で形成されたことを示している。6.広域造構的考察関門層群堆積盆地の造構的特性について、近接する朝鮮半島の慶尚堆積盆地および東シナ海陸棚上の白亜紀堆積盆地と比較しながら、広域的意味づけを行うことができた。平成元年度は次の研究を行った。1.関門層群に関する研究資料の収集と文献目録の作成公表されている関門層群とそれに関連のある文献を収集整理し、目録を作成した。2.層序学的研究関門層群の下半部を代表する脇野亜層群について、鞍手郡宮田町、直方市、北九州市の要地で詳細な層序の検討を行った。3.岩相・古流系解析脇野亜層群上部の若宮層を中心に岩相解析を実施した。また、数地点において古流系資料を得た。若宮層の岩相について最も重要な知見は、全体として典型的なタ-ビダイトが発達することである。本層は湖成層であり,タ-ビダイトを主とする重力流堆積物の発達は、今後のアジア大陸東縁部の後期中生界堆積盆地の発達を考えるうえで極めて重要な新発見といえる。タ-ビダイト単層は厚さ数cmから120cmにわたり、Bouma ModelのTa-b,Tc-e構造がよく認められる。小規模なスランプ堆積物の狭在、チャネル構造も本層の重要な特徴である。泥層優勢部からはガス発泡孔が認められることもあり、今後の詳細な産状観察が必要である。堆積サイクルの認定を行ったが、多様な形式が認められそうである。4.堆積岩石学的研究主要な断面で岩石学的研究のための試料採取を行った。5.古地磁気学的研究古地磁気分析用試料採取のための地質断面の選定を行った。平成2年度は次の研究を行なった。1.層序学的研究関門層群下半部の脇野亜層群の模式地である若宮地域で脇野亜層群の層序を再検討し,新層序区分を確定した。また,小倉南部の山田緑地はこれまで地質研究の空白地帯であったが詳細な地質図を作成するとともに,層序を明らかにすることができた。本地域の層序は脇野亜層群の千石層に対比された。

2.岩相解析脇野亜層群の詳細な堆積相の解析を行ない,赤色シルト岩相,砂岩・泥岩相,リズマイトの3岩相を識別した。これらの各岩相の堆積環境についても資料を得ることができた。各岩相は詳しい柱状図にまとめた。3.古流系解析若宮地域と小倉地域の地質断面で古流系解析を行ない,若干の資料を得ることができた。古流向を示す露頭状況は一般によくなかった。4.堆積岩石学的研究脇野亜層群の代表的層準から採取された約40個の砂岩サンプルについて鉱物組成の検討を行なった。その結果,本亜層群砂岩は石英と堆積岩片に富む石質アレナイトで特徴づけられることが明らかになった。この事実は堆積当時の造構環境考察に重要である。5.古地磁気学的研究脇野亜層群と下関亜層群の代表的な露出地点で組織的な試料採取を行ない,現在,地磁気測定を行なっている。6.地質構造解析若宮地域と小倉地域で地質構造解析を行ない,褶曲と断層などの大構造を中心に資料を得た。平成3年度の研究実績の概要は次の通りである。1.層序学的研究関門層群下半部の脇野層群について,模式地である若宮地区で層序を確立した。さらに,小倉南部の山田緑地一帯の地質学的層序学的研究を完成させた。関門層群上半部の下関亜層群についても,下関市吉見付近で層序学的研究を行い,多くの資料が得られた。2.岩相解析脇野亜層群の堆積相解析資料のまとめを行った。また,下関亜層群については,彦島吉母海岸で詳細な岩相柱状図を作り,新知見を得た。3.古流系解析下関市彦島吉母一帯に分布する下関亜層群を中心に古流系解析を行い,若干の資料を得ることができた。4.堆積岩岩石学的研究関門層群脇野・下関両亜層群の赤色岩層を中心に岩石学的研究を行い赤色岩の形成過程を検討した。この結果,堆積時の後背地における火山活動と含鉄珪酸塩鉱物に富む基盤岩類の風化による鉄成分の供給,及び温緩多湿気候が赤色岩の形成に重要な役割を果したことが結論される。5.古地磁気学的研究関門層群脇野・下関両亜層群の露出地要地で得られた試料について古地磁気測定を行っており,資料が得られつつある。6.朝鮮半島慶尚層群との比較研究関門層群の層序学的・堆積学的資料を,同時代の慶尚層群のそれと比較研究を始めた。その結果,両層群は一つの連続した堆積盆地ではなく,別々の盆地に堆積したことが強く示唆された。平成4年度の研究実績を次のようにまとめることができる。1.層序学的研究北九州の関門層群分布地域内で、実体が不明であった小倉南部山田緑地一帯の地質調査結果をまとめ、詳細な地質図を示すとともに堆積相を明らかにした。この成果は坂井ほか(1992)で公表された。2.岩相解析関門層群下部の脇野亜層群について詳細な岩相解析を行い、その成果をまとめた(徐ほか、1992b)。それによると、主な堆積相として、沖積河川相、湖沼縁辺相、湖沼中心相が識別される。注意すべき現象として、湖沼中心相には微小な葉理のサイクルが発達したリズマイト相が確認された。さらにリズマイト相に3タイプがあることがわかった。それらの産状と起源について検討した。3.砂岩の堆積岩石学的研究脇野亜層群について砂岩の岩石学的検討を行い、新事実を得た。とくに、脇野砂岩の組成を朝鮮半島慶尚層群の同時代砂岩と比較し、相互の違いとその原因を明らかにした。本成果は徐ほか(1992a)に発表した。4.古地磁気学的研究関門層群の主要層準について古地磁気測定を行い、脇野亜層群よりも下関亜層群でよい結果を得た。それにより関門層群の原堆積位置について新資料を示すことができた。5.関門層群堆積盆地のテクトニクス湖成層の赤色岩で特徴づけられる関門層群を同時代のアジア大陸東縁域の堆積物と比較して、堆積盆地の起源と造構的な意義を検討した。
喘息における肝細胞増殖因子の新薬およびバイオマーカーとしての可能性

肝臓の再生因子である肝細胞増速因子(HGF)が、アレルギー性炎症において重要な因子である好酸球に対して、好酸球の遊走活性、活性酸素産生能、脱顆粒を抑制することを報告した。さらに、細胞活性に重要なMAPKやCa流入といった細胞内シグナルを抑制することで、好酸球の様々な機能を制御することも解明した。これらの結果は、HGFが喘息における新薬の一つとなり得る可能性がより高いものであることが実証されたものと考えられる。さらに、喘息発作時にヒト血清中のHGFが増加する傾向があることが観察され、HGFが喘息病状のモニタリングマーカーになりえることも考えられた。以前に我々が報告した、肝細胞増殖因子(HGDによるアレルギー気道炎症や気道過敏性、さらには気道リモデリングに対する抑制効果のメカニズムについて、アレルギー性炎症にて重要な因子である、ヒト好酸球を用いてin vitroで検討を行った。その結果、HGFにてヒト好酸球を前処理することにより、細胞内MAPKシグナルが抑制されることにより、好酸球の遊走能および活性酸素産生能、さらには脱顆粒が抑制されることを明らかにし報告した。in vitroにてHGFの喘息に対する作用機序が証明されたことにより、HGFが喘息における新薬の一つとなり得る可能性がより高いものであることが実証され、今後の喘息治療に一石を投じる重要な成果と考えられる。一方、喘息モデルマウスを用いて、気管支肺胞洗浄液中のHGF、さらには気道リモデリング形成に重要なTGF一βについて、抗原曝露後の時間経過と濃度変化についての検討を行った。その結果、抗原曝露後にHGFは一時的に上昇するが、TGF一βは曝露後に長時間にわたって、濃度が高く維持されることが観察された。この結果から、喘息の病状をモニタリングするには、HGFだけでなく、TGF一βも併用して計測することでバイオマーカーとして活用できる可能性が示唆された。これは喘息の病状を把握するための今後の新しいバイオマーカー開発につながる成果と考えられる。また、この動物実験から、HGFの特異的受容体であるc-Metは炎症が起こっている時のみ、気道上皮に出現していることが観察され、HGFは喘息には必要時にのみ作用し副作用が殆どない物質であることも示唆され、HGFが安全な新薬になり得ることが証明され意義のある成果と考えらた。さらに、TGF一β濃度が抗原暴露初期から、上昇することから、吸入ステロイドを含めた喘息治療の早期導入が証明された報告であり、社会的貢献度も高いと考えられる。以前に我々が報告した、肝細胞増殖因子(HGF)によるアレルギー気道炎症や気道過敏性、さらには気道リモデリングに対する抑制効果のメカニズムについて、アレルギー性炎症にて重要な因子である、ヒトの好酸球を用いて検討を行った。平成19年度は、HGFが好酸球の遊走能および活性酸素産生能、さらには脱顆粒が抑制されることを明らかにし報告した。本年度は好酸球の生存能と接着能、さらには好酸球表面上の接着分子の発現に対するHGFの影響について検討を行ったが、全て有意な結果は得られなかった。昨年度の結果と併せると、HGFの好酸球の重要な機能に対する作用機序が明らかになったことは、今後のHGFの抗アレルギー効果の作用機序の更なる解明研究に繋がる、そして、喘息に対するHGFを含めた新薬創薬に一石を投じる重要な成果と考えられる。動物モデルの実験にて、喘息発作時にマウスの気管支肺胞洗浄液中のもともと生体内にある内因性HGF濃度が有意に増加していることを観察している。また、ヒトにおいては、急性肝炎患者において、血清中の内因性HGF濃度が健常人より有意に上昇している、との報告もある。そこで、今回、ヒト喘息患者における非発作時と発作時において血清中の内因性HGF濃度がどのようになっているのか検討を行った。その結果、まだ検討症例は少ないが、発作時に血清HGFが増加する傾向があることが観察された。この結果は、HGFが喘息の病状を反映している可能性があり、喘息のモニタリングのための今後の新しいバイオマーカー開発につながる成果と考えられ、喘息管理の観点からも、社会的貢献度が高い研究結果と考えられる。
癌遺伝子産物を標的としたヒト型モノクローナル抗体による癌免疫療法

2.ヒト乳癌細胞株に対する増殖抑制効果の比較:c-erbB-2蛋白陽性ヒト乳癌細胞株SK-BR-3に対する増殖抑制効果をMTT assayを用いて検討した.mu4D5はrhu4D5に比して高い増殖抑制効果を示した.4.in vivoでの抗腫瘍活性:SCIDマウスに移植したヒト胃癌株4-1STおよびSt-15を用いて抗腫瘍活性を検討した.4-1STは,c-erbB-2蛋白陽性であり,St-15は,陰性である.移植後腫瘍体積が100300mm^3になった時点で,rhu4D5 36mg/kgを1回静脈内投与した.投与後4日目には,4-1STの%治療マウスの腫瘍重量/対照マウスの腫瘍重量(%T/C)は,有意に減少した.一方,c-erbB-2蛋白陰性のSt-15においては,%T/Cは,100%以上であった.5.SCIDマウスにおけるADCC活性の検討:4-1ST腫瘍を短期培養し,ADCCのtargetとした.マウス脾細胞の細胞障害活性は,mu4D5によりほとんど増強されないのに対して,ヒトPBMCの細胞障害活性は,rhu4D5により著しく増強された.2.ヒト乳癌細胞株に対する増殖抑制効果の比較:c-erbB-2蛋白陽性ヒト乳癌細胞株SK-BR-3に対する増殖抑制効果をMTT assayを用いて検討した.mu4D5はrhu4D5に比して高い増殖抑制効果を示した.4.in vivoでの抗腫瘍活性:SCIDマウスに移植したヒト胃癌株4-1STおよびSt-15を用いて抗腫瘍活性を検討した.4-1STは,c-erbB-2蛋白陽性であり,St-15は,陰性である.移植後腫瘍体積が100300mm^3になった時点で,rhu4D5 36mg/kgを1回静脈内投与した.投与後4日目には,4-1STの%治療マウスの腫瘍重量/対照マウスの腫瘍重量(%T/C)は,有意に減少した.一方,c-erbB-2蛋白陰性のSt-15においては,%T/Cは,100%以上であった.5.SCIDマウスにおけるADCC活性の検討:4-1ST腫瘍を短期培養し,ADCCのtargetとした.マウス脾細胞の細胞障害活性は,mu4D5によりほとんど増強されないのに対して,ヒトPBMCの細胞障害活性は,rhu4D5により著しく増強された.1.c-erbB-2癌遺伝子産物に対する結合能:各種のc-erbB-2癌遺伝子産物陽性ヒト癌細胞株に対する反応性をflow cytometryにより検討した.ヒト型mAbは,マウスmAbとほぼ同程度の反応性を有していた.2.抗体単独による癌細胞の増殖抑制作用:c-erbB-2陽性ヒト乳癌株SK-BR-3の培養液に抗体を添加し,MTT assayにより増殖抑制効果を測定した.抗体単独で有意に増殖を抑制した.3.ヒト末梢血リンパ球をeffectorとするADCC活性:c-erbB-2陽性ヒト癌細胞株を標的とするヒト末梢血リンパ球をeffectorとする細胞障害活性は抗体の添加により有意に増強された.以上の結果をふまえ,次年度では,SCIDマウス-ヒト腫瘍移植系を用いて,n vivoでの抗腫瘍効果を検討する.SCIDマウスに移植したヒト胃癌株4-1STおよびSt-15を用いて,rhu4D5のin vivoでの抗腫瘍活性を検討した。4-1STは,c-erbB-2蛋白陽性であり,St-15は,陰性である.4-1STあるいはSt-15移植後,腫瘍体積が100300mm^3になった時点で,rhu4D5 36mg/kgを1回静脈内投与した.投与後4日目には,4-1STの%治療マウスの腫瘍重量/対照マウスの腫瘍重量(%T/C)は,有意に減少した.一方,c-erbB-2蛋白陰性のSt-15においては,%T/Cは、100%以上であった.SCIDマウスにおけるADCC活性の検討rhu4D5投与SCIDマウスにおけるADCC活性の検討をするため,4-1ST腫瘍を短期培養し,ADCCのtargetとした.ヒト末梢血リンパ球の細胞障害活性は,rhu4D5により著しく増強された.以上より,ヒト型化抗c-erbB-2抗体は,ヒトにおいては,SCIDマウスを用いたpreclinical studyから予測される以上の効果が期待され,clinical studyを計画すべきものと考えている。
サイトカイン遺伝子の発現調節機構と細胞増殖、分化の制御

われわれが遺伝子クローニングに成功した転写制御因子IRF-1、IRF-2は、細胞増殖制御及び細胞分化において生理活性を示すインターフェロン(IFN)系の発現およびその作用を担う正および負の転写因子である。そこで本研究はこの2つの因子を通して細胞増殖制御の分子メカニズムの一端を明らかにすることを目的に行われた。その結果、(1)転写制御因子IRF-1、IRF-2はそれぞれ癌抑制遺伝子、癌遺伝子として機能しうる。(2)IRF-2プロモーターにIRF結合配列が存在し、IRF-1によって発現誘導されることからIRF間の発現調節機構の1つであると推測される。IRF-1遺伝子欠損線維芽細胞を用い、IRF-1が活性型ras遺伝子と協調して癌抑制遺伝子として機能すること、IRF-1がアポトーシスに関与することがわかり、細胞増殖と細胞死に重要な役割を果たすことが明らかとなった。さらにIRF-1遺伝子欠損細胞で抗ウイルス作用の低下がみられ、この低下はウイルスの種類によってその程度が異なることが明らかとなった。すなわちIRFが生体防御に重要な役割を果たすことを明らかにするとともにIFNによる抗ウイルス作用にはウイルスの種類によって異なった遺伝子が必要であることを示唆した。ヒトIRF-1遺伝子は染色体5q31.1にマップされた。そこで5qに異常のある白血病やMDS患者13例のDNAを用いて、IRF-1近傍の遺伝子の欠損を調べるとIRF-1遺伝子のみが一致して欠失していた。またヒトIRF-1にはalternative splicingによるDNA結合領域欠失変異体が存在し、この変異体には癌抑制能がなかった。そこでDNA解析とは異なったMDS患者のmRNAを調べると、約20%で正常mRNAがほとんど検出されず、癌抑制遺伝子の新たな不活性化の機構が推測された。インターフェロン遺伝子の発現を制御する転写因子IRF-1及びIRF-2の細胞増殖制御における役割について検討した。まずIRFの細胞周期における発現をNIH3T3細胞を用いて調べた。血清除去によるGl arrest時IRF-2:IRF-1比の減少がみられ、増殖刺激により増加することが明かとなり、IRFの細胞増殖に対する関与が示唆された。そこで、IRF-2発現ベクターを遺伝子導入しIRF-2高発現NIH3T3細胞株を樹立した。得られた細胞株は細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲル内でのコロニーの形成、ヌードマウスでの腫瘍の形成がみられ、IRF-2がoncogenic potentialを有することが明かになった。さらにこれらの細胞株はIRF-1ゲノム遺伝子導入によるIRF-1高発現によって野生型に復帰し、IRF-1のanti-oncogenic potentialを見いだした。これらの現象は、組み換え体レトロウイルスを用いた遺伝子導入によっても確認された。さらに、ヒトIRF-1遺伝子が白血病やMDS患者細胞で高率に欠損の見られる染色体5q31.1に位置することを明かとした。そこで染色体分析で5qに異常の見られた白血病及びMDS患者13例のサンプルでのIL-4,IL-5,IRF-1,CDC25C,GM-CSF遺伝子の欠損を検討した。その結果、IRF-1遺伝子のみがすべての症例に一致して欠損していた。更に、1alleleの欠損に加え、残りのalleleにプロモーター部位の欠損が起こり不活化されたIRF-1遺伝子を持つ白血病の一症例を検出した。また、in situ hybridization法によりIRF-1両allele欠損が急性白血病症例に主に観られること見い出した。以上より、IRF-1欠損と白血病、MDS発症の関連が示唆された。一方、ジーンターゲッティング法を用いIRF-1及びIRF-2ノックアウトマウスをそれぞれ作製することに成功した。

今後、個体レベルでの細胞増殖機構の解明に利用できるものと考えている。インターフェロン(IFN)系の転写制御因子IRF-1,IRF-2がそれぞれ癌抑制遺伝子、癌遺伝子として機能することをNIH3T3を用いて明らかにした。またヒトIRF-1、IRF-2遺伝子がそれぞれ5q31.1、4q35.1にマップされ、さらにIRF-2遺伝子の発現がIRF-1によって制御されることからIRFを中心とした遺伝子制御ネットワークが存在することを明らかにした。また、IRF-1ないしIRF-2遺伝子欠損マウスの作製に成功し、IRF-1欠損マウスの胎児線維芽細胞で二重鎖RNA刺激でのIFN-α,-βの発現が低下することを見いだした。しかし、ウイルス感染時では変化はなく、IFN-β処理によるIFN誘導遺伝子(PKR,1-8,2'-5'オリゴA合成酵素遺伝子)の発現にも変化が見られなかった。一方、IRF-1欠損マウスのマクロファージでのIFN-γによる一酸化窒素(NO)の産生、誘導型NO合成酵素(iNOS)遺伝子の発現誘導がみられず、iNOS遺伝子の発現は特にIRF-1に依存している事を見いだした。以上より、IFNシステムにおけるIRFの重要性と共にredundancyが存在することを明らかにした。インターフェロン(IFN)系における転写活性化因子IRF-1、転写抑制因子IRF-2はIFN系全体において重要な役割を果たすこと、さらにNIH3T3細胞を用い、IRF-1は癌抑制遺伝子、IRF-2は癌遺伝子として機能し、細胞増殖制御に深く関わることを明らかにしてきた。一方でヒトIRF-1遺伝子が染色体5q31.1に位置し、白血病/MDS患者で欠損していることを見い出した。本年度は(1)IRF-1、IRF-2欠損マウスをそれぞれ作製し、IRF-1欠損繊維芽細胞でIRF-1が癌抑制因子として機能すること、さらに細胞死(アポトーシス)に重要な転写因子であることを明らかにした。(2)IRF-1欠損マウスで抗細菌、抗ウイルス作用の低下がみられ、IRFが生体防御に重要な役割を果たすことを明らかにした。さらにIFN-α及びIFN-γ処理によるIFN誘導遺伝子の発現を調べた結果、IFN誘導遺伝子はその発現がIRF-1に依存した遺伝子(iNOS遺伝子など)とIRF-1に依存しない遺伝子(PKR遺伝子など)の2種類に分類されることを見い出した。(3)ヒトIRF-1にはalternative splicingによるDNA結合領域欠失変異体が存在し、MDS患者の約20%で正常mRNAがほとんど検出されないことから,この癌抑制遺伝子の新たな不活性化の機構が推測された。(4)転写抑制因子IRF-2はカルボキシル末端に塩基性アミノ酸が多く存在しその領域が転写抑制活性に重要であること、さらにその部分が欠損することによりIRF-2が転写活性化因子として機能しうることを明らかにした。
チェルノブイリ周辺小児甲状腺がんの分子疫学調査

チェルノブイリ事故後に急増した小児甲状腺がんの放射線障害の起因性を明らかにするために、チェルノブイリ周辺地域(ベラルーシ、ウクライナ、ロシア)における分子疫学調査を行った。特に、分子疫学を行うためにの基礎として甲状腺および末梢血液より核酸(DNAおよびRNA)抽出法について検討した。1)ベラルーシのミンスク医科大学と長崎大学は姉妹校を結び小児甲状腺がんの診断技術の研修を行っている。ベラルーシのゴメリを中心として、小児甲状腺がん患者についてのCase-Control Studyを行い、甲状腺がん症例220例、Control(年齢、性別)をあわせたもの1320例を抽出して現在調査を行っている。2)患者の核酸を永久保存するための基礎検討として、ベラルーシから持ちかえった抹消血液からのDNA抽出検討を行った。その結果、血清を除き生理食塩に血球を希釈して持ちかえることで、4°Cの場合と室温保存と差がなく3週間後でも高品質のゲノムDNAを抽出することが可能であった。さらにDNA資料の半永久保存のための試みとしてLone-Linker PCR法について検討している。3)甲状腺腫瘍組織からRT-PCR法によりcDNAを増幅して、放射線により誘導される遺伝子異常の一つと推測されているRet/PTC遺伝子の解析を行った。旧ソ連邦の核実験場であったセミパラチンスクで発症し手術を受けた甲状腺組織を用い、RNAを抽出しRet/PTC1,2,3の異常が認められるかどうかについて解析した。その結果、Ret/PTC3の異常が高頻度で見られ、被爆とこの遺伝子異常の関連性が示唆された。この結果はLancettに掲載された。
血管内皮細胞におけるu-PA/u-PAR系による分化制御機構の解析

ラットの背部皮下組織に移植したポリスチレン製カプセル内部には経時的(3,5,9および14日)に肉芽組織の浸出が見られた。フィブリン包埋カプセル内部には中空カプセル内部よりも有意に多くの組織が回収された。このことからフィブリンの存在が創傷治癒過程において促進的に作用することが示された。組織学的にはカプセル移植後5日目にはフィブリン包埋カプセル内部の組織中には顕著な血管の新生が認められ、中空カプセルでは9日目以降に新生血管が認められた。したがってフィブリンの存在によって血管内皮細胞の増殖および遊走が促進されたことが裏付けられた。ウロキナーゼ(u-PA)およびその受容体(u-PAR)の発現もフィブリンカプセル内組織において有意に高値を示した。マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)などの組織蛋白分解酵素の活性のパターンもフィブリン存在、非存在のカプセル内組織で異なっており、血管内皮細胞の増殖および遊走に及ぼす影響も異なっていることが示された。そのほかカプセル内部に貯留された組織滲出液および血漿中の蛋白分解活性なども両群で差異を認めた。結論としてラットの創傷治癒過程におけるプロテアーゼはu-PA/u-PARを中心としてMMPなどの活性発現が制御され、血管新生が誘導されること、およびこの調節の一部はフィブリンによって促進的に働くことが示された。
微量試料からの高効率RNAプルダウン法の確立

始原生殖細胞(PGCs)において重要な役割を果たす翻訳・スプライシング制御因子Tial1の解析目指し、本申請書の研究計画では、微量細胞からTial1結合RNA分子を同定する実験手法の開発および評価を目的とした。しかし実験手法の評価に必須なTial1 KOマウスが途絶えていた為、申請者はTial1 KOマウスを作製した。さらに、Tial1類似タンパク質Tia1の発現も解析し、Tial1の解析基盤を構築した。申請者は、(1)始原生殖細胞(PGCs)において重要な役割を果たす翻訳及びスプライシング制御因子Tial1の標的RNAを解析し、その分化過程におけるTial1を中心とした転写後遺伝子発現制御ネットワークを同定し、(2)移動期PGCsの恒常性を維持する分子メカニズムを解明することを長期的な目標として見据え、Tial1が結合するRNA分子をゲノムワイドに同定する事が可能なプルダウン法及び増幅法の開発を行う事を計画した。本研究はTag付きTial1タンパク質を用いた技術基盤の確立と、ノックアウトマウスを用いた研究結果の検証から成る。申請者らはまずノックアウトマウスを海外より入手し、内在性Tial1タンパク質の機能を正確に再現するTag付きTial1の作製に取りかかる予定であったが、Tial1ノックアウトマウスが現時点において途絶えていることが判明した。Tag付きTial1タンパク質が内在性Tial1タンパク質と同等の機能を持つか検証するためには、ノックアウトマウスは不可欠である。そこで予定を変更し、申請者らはTial1ノックアウトマウスの作出に着手した。Tial1は3つのRNA結合ドメインを有するRNA結合タンパク質であるが、申請者はこれらすべてのRNA結合ドメインを発現しないよう、Exon2のスプライシング受容部位を欠失し、さらにフレームシフトにより他のアミノ酸配列の合成もストップするようデザインしたターゲティングベクターを作製した。エレクトロポレーション法を用いてこのベクターをES細胞に導入し、Tial1ヘテロ変異ES細胞の候補株を19クローン得た。これらについて5'probe,3probe,neo probeを用いてサザンプロッティング解析を行い、最終的に9クローンのTial1ヘテロ変異ES細胞株を得た。現在、このうち3クローンを用いてキメラマウスを作成中である。今後、これらのマウスからTial1ノックアウトマウス、ノックアウトES細胞を樹立し、内在性Tial1と機能的に相同なtag付きTial1タンパク質の設計と機能的裏付けを取った後に、Tial1が結合するRNA分子をゲノムワイドに同定する事が可能なプルダウン法及び増幅法の開発に取りかかる予定である。本研究はTag付きTial1タンパク質を用いた技術基盤の確立と、ノックアウト(KO)マウスを用いた研究結果の検証から成る。申請者らはまずKOマウスを海外より入手し、内在性Tial1タンパク質の機能を正確に再現するTag付きTial1の作製に取りかかる予定であったが、Tial1 KOマウスが現時点において途絶えていることが判明した。そこで予定を変更してTial1 KOマウスの作製に着手した。3クローンのES細胞由来のTial1 KOマウスを得、それらが生殖細胞形成異常を示す事を確認した。先行研究よりTial1にはパラログとしてTia1が存在し、両者は機能的に等価である事が示されている。これはTia1の存在は、Tial1研究をより複雑なものにする可能性が考えられる。そこで、Tial1とTia1の生殖細胞系列における遺伝子発現動態を解析した。その結果、両者ともに、転写レベルでは生殖細胞系列において一貫して発現する事が示された。しかし興味深い事に、生殖細胞系列特異的に翻訳レベルでTia1の発現が抑制されていることを見出した。これは、Tial1の標的mRNAを評価する上で、Tia1の影響を無視出来る事を示す。今後、Tag付きTial1発現マウスを作製し、Tial1が結合するRNA分子をゲノムワイドに同定する事が可能なプルダウン法及び増幅法の開発に取りかかる予定である。
甲状腺疾患時における薬物トランスポータの発現変化と薬物体内動態変動

甲状腺疾患時に薬物体内動態の変動する例が報告されているが、その機構に関しては不明な点が多い。甲状腺ホルモンの血中濃度変化に伴って薬物トランスポータの発現量が変化した結果、薬物体内動態が変動する可能性に着目し、昨年度は甲状腺ホルモンがペプチドトランスポータPEPT1の発現量を抑制的に調節することを、細胞レベル・個体レベルで明らかにした。また、予備的な検討から、甲状腺機能亢進モデルラットにおいてP-糖蛋白質の発現がタンパク質レベルで亢進していることを示した。引き続き本年度はPEPT1ならびにP-糖蛋白質に関する解析を個体レベルで進めた。甲状腺機能亢進モデルラットにおけるPEPT1の発現が低下していたことから、PEPT1のモデル基質であるグリシルザルコシン小腸内投与後の門脈血中濃度推移について検討したところ、甲状腺機能亢進群において有意な低下が認められ、PEPT1の発現低下に伴う吸収能の低下が示された。一方、甲状腺機能亢進ラットにおけるP-糖蛋白質の発現について詳細に検討したところ、腎臓、肝臓においてP-糖蛋白質の発現が亢進していることが判明した。さらに、ラットにおいてP-糖蛋白質をコードする2種類の遺伝子mdr1a, mdr1bについてそのmRNAの発現量を定量的に解析した結果、腎臓においてmdr1a, mdr1b mRNAの発現がともに上昇しており、肝臓ではむしろ発現が低下していることが明らかになった。従って、甲状腺ホルモンによるP-糖蛋白質の発現調節機構が臓器によって異なることが示唆された。また、甲状腺機能亢進時に強心配糖体ジゴキシンの血中濃度が低下することが知られているが、ジゴキシンがP-糖蛋白質の基質となることからP-糖蛋白質の発現亢進によりジゴキシンの排泄が促進され、その結果血中濃度が低下する可能性が考えられた。本研究で得られた知見は、甲状腺機能亢進時における薬物体内動態変動を理解する上で有用な情報を与えるものと考える。甲状腺ホルモンは核内レセプターに作用して蛋白の発現量を変動させることから、疾患時の甲状腺ホルモン血中濃度変化に伴って薬物トランスポータの発現量が変化した結果、薬物体内動態が変動する可能性が考えられた。本研究では、甲状腺ホルモン濃度の変動に伴う薬物トランスポータ(ペプチドトランスポータPEPT1及びP-糖蛋白質)の発現量変化について培養細胞系並びにラットを用いた解析を行った。培養腸上皮細胞Caco-2を甲状腺ホルモン(T_3)で前処理したところ、PEPT1基質であるグリシルザルコシンの取り込みはT_3の処理濃度・処理日数依存的に低下した。さらにT_3処理によってCaco-2細胞におけるPEPT1の発現量は、mRNAレベル、蛋白質レベルともに低下が認められた。次に甲状腺機能亢進モデルラットを作成し、PEPT1の発現量について検討したところ、正常ラットに比べ小腸におけるPEPT1mRNA、蛋白質の発現が低下していた。また、反転腸管法によってグリシルザルコシンの取り込みについて評価したところ、甲状腺機能亢進ラットにおいて取り込みが減少しており、PEPT1発現量の低下と対応する結果が得られた。一方、甲状腺機能亢進ラットにおけるP-糖蛋白質の発現量について検討したところ、腎臓、肝臓、空腸においてP-糖蛋白質の発現が亢進していることが判明した。以上の結果より、甲状腺機能亢進時においてPEPT1やP-糖蛋白質の発現が変動することが明らかとなり,甲状腺ホルモンによってこれら薬物トランスポータが発現調節を受けていることが示唆された。今後薬物トランスポータの発現量変化と薬物体内動態の変動の相関について検討を進める予定である。また、甲状腺機能

亢進時に強心配糖体ジゴキシンの血中濃度が低下することが知られているが、ジゴキシンがP-糖蛋白質の基質となることからP-糖蛋白質の発現亢進によりジゴキシンの排泄が促進され、その結果血中濃度が低下する可能性が考えられた。本研究で得られた知見は、甲状腺機能亢進時における薬物体内動態変動を理解する上で有用な情報を与えるものと考える。
ホタルルシフェリン生合成経路の解明とキラルフリー発光システムへの応用

本研究では、ホタルD-ルシフェリンの生合成経路を利用したキラルフリー発光システムの構築を目的とした研究を行った。ホタル体内では、発光基質D-ルシフェリンがその鏡像異性体であるL-ルシフェリンのチオエステル化、立体反転、加水分解というデラセミ化プロセスによって調製されるという仮説のもと、まずモデル反応として、細菌由来チオエステラーゼとホタルルシフェラーゼを組み合わせた反応系を作成し、L-からD-体への立体反転を伴った発光反応が確かに進行することを確かめた。また、本プロセスに関与する遺伝子群を、成虫のトランスクリプトーム解析を行うことによって特定することも試みた。本研究では、ホタルD-ルシフェリンの生合成経路を解明すると共に、生合成経路を利用したキラルフリー発光システムの構築を目的とした研究を行う。ホタル体内では、発光基質D-ルシフェリンがその鏡像異性体であるL-ルシフェリンの立体反転によって調製されるという仮説のもと、本プロセスに関与する遺伝子群をトランスクリプトーム解析によって特定することを試みると共に、その遺伝子群を利用してD-, L-ルシフェリンのいずれからでも発光するキラルフリーシステムを構築し、細胞を用いたin vivoイメージングへと応用することを目指す。本年度は、ホタルD-ルシフェリンの生合成経路に関わる酵素遺伝子の特定を目指した検討を行った。申請者らは既に、モデル反応として細菌由来エピメラーゼ、チオエステラーゼ(加水分解酵素)と、ホタルルシフェラーゼ(上記経路中のチオエステル化酵素に対応)をin vitroにて組み合わせたデラセミ化反応系を作成し、L-からD-体への立体反転を伴った発光反応が予想通り進行することを確かめており、本経路がホタル体内でも作動している可能性は極めて高いと確信していた。そこでまず、ゲンジおよびヘイケボタル成虫に対するトランスクリプトーム解析(遺伝子発現解析)を行うことによって、上記仮説を裏付けるような酵素遺伝子が発現しているか確認した。本解析はゲノム支援(文部科学省科学研究費新学術領域研究「生命科学系3分野支援活動」)に採択されたため委託した。現在解析中であるが、予想通りチオエステラーゼ遺伝子の存在を確認することができた。また、細菌由来チオエステラーゼを用いたモデル反応系の最適化も行うと共に、ルシフェリンアナログに対する検討も行い、デラセミ化システムの有用性を確認することもできた。昨年度までに申請者らは、モデル反応として細菌由来チオエステラーゼ(加水分解酵素)と、ホタルルシフェラーゼ(上記経路中のチオエステル化酵素に対応)をin vitroにて組み合わせたデラセミ化反応系を作成し、L-からD-体への立体反転を伴った発光反応が進行することを確かめていた。またゲンジおよびヘイケボタル成虫に対するトランスクリプトーム解析(遺伝子発現解析)を行った(本解析はゲノム支援(文部科学省科学研究費新学術領域研究「生命科学系3分野支援活動」)に採択されたため委託した。)本年度は、得られた次世代シーケンスデータをアセンブルし、ホタル発光器内で発現しているタンパク質を予想した。その結果、目的と合致すると考えられる複数のチオエステラーゼ遺伝子の存在を確認することができた。そこで、これらのうち、遺伝子番号m38228を含む2種類を選択しcDNAを作成、クローニングし、大腸菌にてタンパク質発現を試みた。その結果、発現量は少ないながらタンパク質を得ることができた。ホタルは非常に有名な発光生物であるが、その基質、D-ルシフェリンの生合成経路は謎に包まれている。今回申請者らは、本発光基質が、ホタル体内にてその鏡像異性体であるL-ルシフェリンから立体反転を伴ったデラセミ化反応によって合成されているという仮説を立てている。つまり、まずチオエステル化酵素によってL-ルシフェリンとCoASHからチオエステル体を生成する。次に、本チオエステル体に対してエピメリ化酵素が作用、立体が反転し、最後に加水分解酵素によってD-ルシフェリンが得られるという経路である。申請時にはすでに最近由来のチオエステラーゼを利用したモデル反応系を構築し、反応の進行は確かめていたが、実際にホタル体内にチオエステラーゼが存在するかは不明であった。昨年度までの成虫を用いたトランスクリプトーム解析で、チオエステラーゼがホタル体内に存在しうることを確認できたため、今年度はそれらをクローニングし、大腸菌にてタンパク質を発現させた。これによってチオエステラーゼタンパク質を用いてL-ルシフェリンからの発光反応が進行することを確認し、申請者が提唱したデラセミ化経路がホタル体内で実際に存在していることを確かめるための準備が整った。よって本年度の研究は、当初の予定通り順調に進行していると判断した。本研究では、ホタルD-ルシフェリンの生合成経路を解明すると共に、生合成経路を利用したキラルフリー発光システムの構築を目的とした研究を行った。