hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植後の水痘帯状疱疹ウイルスに対する免疫再構築を基盤とした感染予防戦略の確立

次年度は、さらに症例数を増やして解析を継続する予定であり、また、VZVの各抗原特異的T細胞の細胞障害活性等の解析を行う計画であることから、繰越分は、当初の次年度予定予算と合わせて使用する計画である。
細胞外マトリックスの新しい蛋白の単離とその機能ー組織脆弱と関連して

仔牛皮膚約5Kgを出発材料として血清成分を除去した後、6M尿素、4Mグアニジンを含む緩衝液にて可溶化する成分を抽出した。共存するコラーゲンをイオン交換クロマトグラフィーにて除き、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約4.5万を示す領域をゲルから切り出した。このゲルを粉砕した後、家兎に完全アジュバントと共に免疫した。本抗体は既存の細胞外マトリックス成分と交叉を示さず、分子量約4.5万の蛋白とのみ反応した。免疫組織化学的検索ではコラーゲン周囲、血管内皮細胞に染色された。培養線維芽細胞に於てコラーゲン合成と比べて極めて微量合成されることが判明した。シアンブロマイドにより3本のペプチドが得られ、分子サイズは約1.5-1.2万を示した。これらのアミノ酸配列はそれぞれN末端より,DINGGAATLPQKLYQT,WLVNDTAVLPGKLYYVGVGFA,SPDFAASTLAGLDDATKV配列を示すことが判明した。本蛋白質のN末端はDINGGAATLPQKLを示すことから、大きなCBペプチドがN末端領域であることか知られた。本蛋白をコードする遺伝子を解析するため上記アミノ酸配列を基に合成オリゴヌクレオシドを作製した。培養線維芽細胞、血管内皮細胞由来cDNAからPCR法により、抗体を用いたクローニングを行ったが、用いたオリゴDNAと反応するcDNAを得ることが出来なかった。これは培養実験結果から本蛋白が通常の培養条件では極めて微量しか合成されていないため、遺伝子クロニングするためにはmRNA量が不十分であった為と思われた。このため現存各サイトカインを培養液に添加し、本蛋白の合成量を測定している。子牛皮膚より6M尿素、4Mグアニジンにて可溶化された蛋白を超遠心にて分離後、HW-55Fゲル(6×60cm)による中高速液体クロマトグラフィ-を行い、さらにCsCl密度勾配遠心によりコラ-ゲンを除き、6M尿素存在下にてステップワイズによるDEAEカラムクロマトグラフィ-にてデコリンを含む画分を得た。さらに直線濃度勾配により650Sゲルによるイオン交換クロマトグラフィ-により精製し、この画分に微量存在する分子量約45000の蛋白をSDSーPAGEにて分離した。家兎にこの分離した蛋白を免疫したが、微量蛋白のため抗体活性は上昇しなかった。ニトロセルロ-ズ膜に転写後アミノ酸配列を調べたところN-末端から14番まで配列が判明し、ホモロジ-検索では未だ報告のない蛋白であることを見出した。

培養線維芽細胞、血管内皮細胞由来cDNAからPCR法により、抗体を用いたクローニングを行ったが、用いたオリゴDNAと反応するcDNAを得ることが出来なかった。これは培養実験結果から本蛋白が通常の培養条件では極めて微量しか合成されていないため、遺伝子クロニングするためにはmRNA量が不十分であった為と思われた。このため現在各サイトカインを培養液に添加し、本蛋白の合成量を測定している。
海上輸送産業における市場構造と価格形成に関する研究

本研究は,海上輸送産業に関して3つの観点から検討を行った.第1に,定期船市場における市場構造の変化についてCAPMの時変的なβを推定し,それを政策と関連付けて検証した.第2に,不定期船市場のスポット運賃と先物・先渡し価格の形成について,海運サービスの性質を考慮したモデル分析を行った.第3に,海上輸送産業に関連して,港湾のガバナンスのあり方についてについてモデルとPFIの事例を用いて検討した.本研究は,海上輸送産業に関して3つの観点から検討を行った.第1に,定期船市場における市場構造の変化についてCAPMの時変的なβを推定し,それを政策と関連付けて検証した.第2に,不定期船市場のスポット運賃と先物・先渡し価格の形成について,海運サービスの性質を考慮したモデル分析を行った.第3に,海上輸送産業に関連して,港湾のガバナンスのあり方についてについてモデルとPFIの事例を用いて検討した.本研究は,海上輸送産業における「定期船市場」および「不定期船市場」の双方を対象として市場構造と価格形成の関係についての検討を行うものである.第一に,寡占的とされる「定期船市場」では海運同盟やグローバス・アライアンスなどのような競争抑制的な企業間の協調行動がある一方で,米国の改正海運法の施行などのような競争促進政策も導入されている.そこで,これらの点が価格形成にどのような影響をあたえたかという問題を取り上げる.第二に,完全競争的とされる「不定期船市場」において,船主や用船者の戦略的な行動が結果としてスポットおよび先物/先渡しの価格形成にどのような影響を与えうるかという問題に焦点を当てる.第一の問題については,資本資産評価モデル(CAPM)のβと市場の競争的な環境との関係をモデルの上で表現したうえで,わが国の定期船市場を対象に時変的βを推定しその観察を行った.その結果,定期船市場が競争的な環境になるほどβの値が高くなる可能性が示唆された.この成果は2008年3月に行われた国際学会にて報告され,あわせて,この内容の一部は関連する海外査読誌にて公表される(2009年に公刊予定).第二の問題については,手塚・石坂(2006)およびTezuka, Ishizaka and Ishii (2006)によるスポット運賃と先物価格の形成モデルを援用して先物カーブを作成した.当該分野の先行研究では,海運の先物価格がスポット運賃(価格)の期待値と等しくなるという経験的な仮説(アンバイアス仮説ないしは期待仮説と呼ばれる)を基にした実証分析が中心である.それに対して,本研究では先物カーブを描くことによって,各期においてプレミアムが存在することを示し,上記の仮説が必ずしも成立しえないことを示した.本研究は,海上輸送産業における「定期船市場」および「不定期船市場」の双方を対象として市場構造と価格形成の関係についての検討を行う.第一に,寡占的とされる「定期船市場」では海運同盟やアライアンスなどのような企業間の協調行動がある一方で,米国の改正海運法の施行などのような競争促進政策も導入されている.そこで,これらの点が価格形成にどのような影響をあたえたかという問題を取り上げる.第二に,完全競争的とされる「不定期船市場」において,船主や用船者の戦略的な行動が結果としてスポットおよび先物/先渡し(Fright Forward Agreement)の価格形成に与える影響に焦点を当てる.第一点に関して,本年度も昨年度から継続して,資本資産評価モデル(CAPM)のβと市場の競争的な環境との関係をモデルの上で表現したうえで,わが国の定期船市場を対象に時変的なβを推定しその観察を行った.この成果については, 2008年10月に日本海運経済学会にて報告し,その成果を論文として作成し,投稿した.また,上記の枠組みを我が国のガス事業にも同様の枠組みを適用して分析を行い,その成果を公表した.第二点に関しては,手塚・石坂(2006)およびTezuka, Ishizaka and Ishii(2006)によるスポット運賃と先物価格の形成モデルを援用して先物カーブを作成した.この成果は,昨年8月に海外の専門誌に投稿された.現時点では(2008年4月),査読者からの修正要求に基づき,論文の修正を行っているところである.また,あわせて,ゲーム論の枠組みを用いたスポット運賃の形成モデルを作成し,その成果を昨年度IAME(国際海運経済学会)コンファレンスにて報告を行った.現在,この成果を専門誌に投稿する予定である.本研究は,海上輸送産業における「定期船市場」および「不定期船市場」の双方を対象として,それらの市場構造と価格形成との関係について,いくつかの観点から分析を行った.その内容と成果は以下の通りである.第一に,寡占市場である「定期船市場」において,かつての海運同盟やグローバル・アライアンスの形成など企業間の協調行動が観察される一方で,米国における改正海運法の施行などの競争促進政策も導入・施行され,それらがともに市場成果に大きな影響を与えている.そこで,このような市場環境の変化が市場にどのような影響を与えたかという問題意識のもと,海運産業の資本資産評価モデル(CAPM)のβを推定し,それを用いて解釈を行った.この研究に関しては,本年度までに日本海運経済学会をはじめとしたいくつかの学会で報告し,それらの内容をもとに専門誌への投稿を行った.

第二に,完全競争市場に近いとされる「不定期船市場」において,船主や用船者の戦略的な行動が結果としてスポット運賃および先物/先渡し(Fright Forward Agreement)の価格形成に対していかなる影響を与えるかを検討した.とくに本年度は,Tezuka and Ishii (2008)を展開させ,非協力ゲーム理論の枠組みを用いたモデルを作成し,価格変動についてのいくつかの解釈を加えた上で,その内容を専門誌へ投稿した.第三に,本年度は海運産業の基礎をなす港湾間競争にも焦点をあて,上記の不定期船市場の分析で用いた非協力ゲームの枠組みを適用して,モデルを用いて検討を行った。そこから得られた均衡価格に対していくつかの解釈を行い,それを2009年のIAME(国際海運経済学会)の学会で報告を行った.
微細フォノニック結晶の設計のための周期領域マルチフィジックストポロジー最適化

(具体的内容)(1)種々のフォノニック結晶のトポロジー最適化及び(2)新しい最適設計法の構築に取り組んだ。(1)に関して、はじめに、周期領域における弾性波散乱解析の高速直接境界要素法を開発した。当初の予想通り、高速直接境界要素法に基づく解法は、従来の有限要素法に基づく解法と比較して高精度かつ高効率であることを確認した。つぎに、当手法をトポロジー最適化に組み込み、遠方場特性のトポロジー最適化法を構築した。具体的な応用例として、弾性波吸収体、負の屈折率を有するフォノニックメタマテリアルの最適設計が実行可能であることが明らかになった。また、遠方場特性のトポロジー最適化を利用することで、光学迷彩装置のトポロジー最適化法の高効率化が可能であることも分かった。(2)に関して、トポロジー導関数と形状導関数を併用することで目的関数の収束性を改善できること、パラメータ曲面の制御点を設計変数とすることで得られる設計解の幾何学的複雑さを制御できることが明らかとなった。(意義・重要性)本研究で構築した高速直接境界要素法に基づくフォノニック結晶のトポロジー最適化法は他に類を見ず、計算科学的な観点から意義深い。また、光学迷彩装置のような他の物理現象に支配される問題への応用も可能であるという点も重要である。同時に、トポロジー最適化自体の改良にも取り組んでいることは上述の通りであるが、本研究で開発した設計解の幾何学的複雑さを制御する機能は得られた設計案を実際に製作する際に必要不可欠なものである。製造要件を満たす設計案を自動的に導く手法に関する研究は多くないことから、設計工学的に重要な成果である。今後もその高度化に関する研究を継続する予定である。H29年度は弾性波を制御する目的のフォノニック結晶に対するトポロジー最適化の開発とその応用を主な目的としていた。概要に述べたとおり、高速直接境界要素法とこれに基づくトポロジー最適化法が完成したことから当初の目的は達成できたと考える。当初の予定通り、これまでに開発した手法を複数の物理が関係するトポロジー最適化問題へと応用する。具体的な応用としてはbifunctional cloakやphoxonic結晶などを対象とする予定である。また、トポロジー最適化法そのものの高度化についても研究を継続する。次年度は最終年度であることから、研究の総括、後続研究の基礎を築くことにも注力する予定である。(具体的内容)当初の研究計画に基づき、フォノニック結晶のバンド特性を制御するためのトポロジー最適化法の高速化に注力した。バンド特性は、波数ベクトルをパラメータとして得られる数十の固有値問題を解くことにより得られることから、高速トポロジー最適化の実現にあたっては固有値解析の高速化が鍵となる。本研究で用いる境界要素法とSS法に基づく固有値解析法の律速となるのは固有値解析アルゴリズム内で求められる代数方程式の求解である。本研究では、各々の固有値解析の際に現れる代数方程式の係数行列Aの一部分Bが波数ベクトルに依らないことを見出し、このことを利用した代数方程式(群)の高速解法を構築した。すなわち、BのLU分解等を予め計算した上でWoodburyの公式により代数方程式を解く方法を開発した。また、BのLU分解及びWoodburyの公式に現れる各種線形代数演算を階層行列法(Hマトリクス法)を用いてさらに高速化した。以上を二次元Helmholtz方程式のNeumann問題に支配される場に対するトポロジー最適化に組み込み、数値実験を行った。結果として、典型的な例において、トポロジー最適化全体にかかる計算時間を従来法と比較して30%程度の高速化が達成されることを確認した。さらには、開発した高速トポロジー最適化法を用いて、フルバンドギャップ幅の最大化問題のみならず局在モードの発生する周波数を制御する最適設計問題を解けることを確認した。また、当初はH30年度に実施する予定であった音響ダイオードの最適設計法の開発も行いダイオード特性が0.9を超える音響ダイオードの最適設計を行うことができた。(意義と重要性)境界要素法とSS法の組み合わせによる高精度なバンド解析法は新規であるのみならず、ここで用いた区分行列に基づくアプローチは様々な問題へ応用できる可能性があることから、計算科学的に意義深いといえる。当初の予定通り、SS法と境界要素法に基づく固有値解析法を区分行列を用いた方法により高速化することに成功した。開発した高速固有値解析法に基づき、フルバンドギャップ幅の最大化問題及び局在モードの位置を制御する最適設計問題を解き、その有効性を確認できた。さらには、当初H30年度に実施する予定であった音響ダイオードの最適設計法のプロトタイプ版はすでに完成し、高いダイオード特性を持つ音響ダイオードを設計することに成功した。以上より、研究は順調に進展していると判断できる。一方で、これらの成果の公表は未だ準備中であることから、最上位の評価とはしなかった。今後、結果をまとめ、国際誌へと投稿する予定である。

つぎに、当手法をトポロジー最適化に組み込み、遠方場特性のトポロジー最適化法を構築した。具体的な応用例として、弾性波吸収体、負の屈折率を有するフォノニックメタマテリアルの最適設計が実行可能であることが明らかになった。また、遠方場特性のトポロジー最適化を利用することで、光学迷彩装置のトポロジー最適化法の高効率化が可能であることも分かった。(2)に関して、トポロジー導関数と形状導関数を併用することで目的関数の収束性を改善できること、パラメータ曲面の制御点を設計変数とすることで得られる設計解の幾何学的複雑さを制御できることが明らかとなった。(意義・重要性)本研究で構築した高速直接境界要素法に基づくフォノニック結晶のトポロジー最適化法は他に類を見ず、計算科学的な観点から意義深い。また、光学迷彩装置のような他の物理現象に支配される問題への応用も可能であるという点も重要である。同時に、トポロジー最適化自体の改良にも取り組んでいることは上述の通りであるが、本研究で開発した設計解の幾何学的複雑さを制御する機能は得られた設計案を実際に製作する際に必要不可欠なものである。製造要件を満たす設計案を自動的に導く手法に関する研究は多くないことから、設計工学的に重要な成果である。今後もその高度化に関する研究を継続する予定である。H29年度は弾性波を制御する目的のフォノニック結晶に対するトポロジー最適化の開発とその応用を主な目的としていた。概要に述べたとおり、高速直接境界要素法とこれに基づくトポロジー最適化法が完成したことから当初の目的は達成できたと考える。H30年度は主に以下の二点に関する研究を実施する予定である。(1)バンド特性のトポロジー最適化法の高度化: H29年度は2次元Helmholtz方程式のNeumann境界値問題を例題として取り扱ったが、本研究の最終目標であるマルチフィジックス問題への応用のためには種々の境界値問題に対するバンド特性を制御することが必要である。H30年度は2次元動弾性問題や3次元問題に対する数値計算コードを開発する予定である。(2)音響ダイオードの性能向上:波動の持つの相反性のため、音響ダイオードが通常の材料(線形、均質、粘性のない弾性体など)からなる場合には透過波の伝播する方向は入射波のそれとは異なる。そこで、本年度は材料に関する制約を緩和し、非相反的な特性を示す波動デバイスの最適設計を試みる。さらには、トポロジー導関数のみならず形状導関数を併用した新しい最適設計法の試み、板曲げ波などのこれまでとは異なる場におけるトポロジー最適化への展開などの検討も行う予定である。当初の予定通り、これまでに開発した手法を複数の物理が関係するトポロジー最適化問題へと応用する。具体的な応用としてはbifunctional cloakやphoxonic結晶などを対象とする予定である。また、トポロジー最適化法そのものの高度化についても研究を継続する。次年度は最終年度であることから、研究の総括、後続研究の基礎を築くことにも注力する予定である。次年度への繰り越しが生じたのは、予定していた性能のワークステーションが想定よりも安価に購入できたことによる。次年度、3次元問題などのより大規模な計算を行うにあたり、メモリの増強に使用する予定である。
情報モラル教育の学習目標の種類に応じた学習プロセスと学習活動を示した指導法の開発

本研究の目的は、学習目標の種類に着目し、それに応じた学習プロセスと学習活動を示した情報モラル教育の指導法の開発と提案である。2018年度は以下の3つの研究を実施した。まず、これまで行ってきた論文分析による学習目標の種類に関する研究に、2018年3月までの新規の論文を加え、再度論文を分析した。その中で教材開発や授業実践を行っている181件を抽出した。それらを対象に、学習目標の種類と内容を基にボトムアップ的に分類し、資質・能力の3つの柱と対応付けてカリキュラム表の作成を試みた。また、対応する教材の分類も行った。これらの途中経過を研究会で発表した。今後は改善したカリキュラム表を用いて、教員研修などでの指導案作成に生かす予定である。次に、SNS上でのコミュニケーションスキルの向上を目的としアサーション・トレーニングを取り入れた指導法に関する研究の成果を紀要としてまとめた。具体的には、これまでの2回の実践から得られた改善点として、講義でSNSでのやり取りに対するポイントの説明を加えること、ロールプレイを振り返る際に話し方の印象評価とルーブリックによる文章評価を取り入れること、ロールプレイでの評価を授業の最後に自分の話し方を振り返ることに利用すること、を追加した実践とその評価についてである。最後に、著作物の利用における著作権侵害の判断力を育成するための枠組みを新しく開発し、普通科高等学校における授業実践を通して、その効果を検証した。その結果、著作物の利用における著作権侵害の判断をすることはできるが、枠組みにおけるパターンマッチングによる判断に終わってしまっており、著作権法の目的の深い理解に基づいた判断ができるようになるまでには至っていないことがわかった。今後は、この結果を基に、改善をしていく予定である。2018年度の目標は、情報モラル教育に関する論文と教材による学習目標の種類の分析と、それに対応した情報モラルの指導法の実践的なサイクルの実行である。まず、論文と教材による調査による分析については、前年度までの研究結果より、論文によって学習目標の設定や評価の方法の粒度に差があり、一律に扱うことが難しいという課題が明らかになった。そのため、本年度は次の改善を行った。一つ目に、前年度までの研究より以後に発表された新しい論文を加えた。次に、粒度を揃えるために文部科学省「情報モラル指導モデルカリキュラム」の中目標や小目標を参考にして、すべての学習目標について再度分類を行った。その結果、分類だけにとどまらず、新学習指導要領の3つの資質・能力に対応させたカリキュラム表の作成を試みることができた。これについては想定していたよりも発展させることができた。また、後者については、これまで行ってきた社会スキルの向上を目指したSNS上のコミュニケーションに関する指導法については、これまでの実践から得られた知見を取り入れた実践とその評価について紀要としてまとめることができた。さらに、判断力の育成を目指した著作権に関する指導法については、新たに枠組みを開発し、授業実践を行い、課題を明らかにした。本研究の方法として、指導法を設計し、実践し、検証し、改善するサイクルを繰り返す実践的な研究アプローチをとっており、それを着実に実行できている。以上より「おおむね順調に進展している」と判断した。2019年度は、次のことを重点的に行う予定である。論文調査による学習目標の種類の分析については、2018年度の研究から情報モラル教育のカリキュラム作成への目途がついた。そのため前年度の研究を整理し、精緻化する。具体的には、学習目標の種類や内容を、3つの資質・能力に対応付けたカリキュラム表を完成させ、それを教員研修で使い、評価を行いたい。これらの過程を学会で発表し、また2019年度中に論文・紀要への投稿等を行い、結果を公表していきたいと考えている。学習目標の種類に着目した情報モラルに関する指導法については、設計し、実践し、改善するというサイクルを着実に実行していく。今年度は次のことについて行いたいと考えている。まず、前年度から引き続き、著作権の判断力の育成に関する指導法の開発、実践、改善を行っていく予定である。ここでいう著作権の判断力とは、条文や単語とのマッチングによる判断ではなく、著作権法の理念(第1条)と著作物の定義(第2条)を理解した判断を目指している。前年度は判断をするための枠組みを開発し、それに沿って判断を行うことを試みたが、枠組みとのマッチングに陥ってしまう部分がみられた。そのため、方法の変更も含めてどのような方法が効果的かを検討していく予定である。また、この研究についての経過を学会や研究会等で発表していきたい。さらに、可能であれば、新しくこれまで取り組んだことのない分野、例えば、情報セキュリティに関する教材や指導法に関して検討したい。尚、この実践や研究、評価は、当初の予定通り、本学の初等・中等情報の教員養成の学生や大学院生と共に行う。また、さらに、全国大会や研究会、国際会議などで随時発表を行い、成果の発表と他の研究者からの情報収集を積極的に行う。2017年度は以下の研究を実施した。まず、CiNiiを使用して2016年4月1日までに発刊された939件の情報モラル教育に関連する論文を対象とした分析を行った。その中で教材開発や授業実践を行っている155件を抽出し、学習目標の種類を分析した。その結果、知識理解、意識や態度変容、判断力育成、ルール学習、社会スキル育成という分類分けができた。

しかし、対象論文の目的や評価などの粒度に差があり、再度、検討する必要があることがわかった。また、学習目標の種類が、社会スキル育成、ルール作成による態度変容、判断力育成の3種類の指導法に関する実践を行った。これまでの研究の続きとして、SNS上でのコミュニケーションスキルの向上を目的とし、アサーション・トレーニングを取り入れた指導法の実践と、SNSを使用する際の適切な行動基準の作成を目指し、内省活動を取り入れた指導法の実践を行った。現在、SNS上のやり取りによるトラブルは大きな社会問題となっており、これに対する指導法を検討することは意義が大きいと考える。今後は、実践で明らかになった成果を整理し、指導の流れを明確にし、指導法として提案することを目指す。さらに新たに、法的三段論法の考え方を理解し著作権の侵害が成立するかの判断力を育成する実践を行った。著作権法の理念と著作物の定義を理解し、具体的事実を当てはめて、法に違反しているかどうか等の結論を導くロールプレイを取り入れた。その結果、著作権法に基づき客観的な判断ができるようになることがわかった。著作権については知識理解や意識変容を学習目標とした先行研究が多く、判断力育成を対象とした研究はあまりみられない。今後さらに改善をしていく予定である。2017年度の目標は、情報モラル教育に関する論文調査による学習目標の種類の分析と、それに対応した情報モラルの指導法の実践的なサイクルの実行である。前者の論文調査による分析については、教材開発や授業実践を行っている155件を対象に、その論文で行われている教材や授業の学習目標の種類を分析した。その結果、知識理解、意識や態度変容、判断力育成、ルール学習、社会スキル育成、その他という分類分けができ、本研究の一定の目標を達成した。一方で、論文によって学習目標の設定や、評価の方法の粒度に差があり、一律に扱うことが難しいという課題が明らかになった。また、後者については、これまでの研究も含めて、社会スキル育成、ルール作成による態度変容、判断力育成という3つの学習目標の種類が異なる指導法に対して、全部で5回の実践を行い、検証を行った。本研究の方法として、指導法を設計し、実践し、検証し、改善するサイクルを繰り返す実践的な研究アプローチをとっており、それを着実に実行できている。うち以前より継続しているSNS上のコミュニケーションスキル向上の指導法については2018年度中に指導法をまとめたいと考えている。以上より「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究の目的は、学習目標の種類に着目し、それに応じた学習プロセスと学習活動を示した情報モラル教育の指導法の開発と提案である。2018年度は以下の3つの研究を実施した。まず、これまで行ってきた論文分析による学習目標の種類に関する研究に、2018年3月までの新規の論文を加え、再度論文を分析した。その中で教材開発や授業実践を行っている181件を抽出した。
合成二分子膜によるヘリックス超形態の形成とその構造に関する研究

水中の二分子膜会合体はゲルー液晶相転移温度(Tc)よりも低い温度での熟成によって、ヘリックス超構造体に形態変化することがある。本研究は、このヘリックス超構造体について(1)形成に影響する諸因子と(2)分子配向・パッキングなどを検討したもので、以下の成果を得た。1.キラル二分子膜について構成分子の疎水鎖長とヘリックス形成の関係を系統的に調べた結果、鎖長が長くなるとヘリックス超構造体は形成されにくくなることがわかった。2.ヘリックス超構造体は水素結合基を有する一鎖型キラル両親媒性化合物のみならず、アキラル両親媒性化合物からも形成され、不斉はヘリックス形成にとっての必要条件ではないことがわかった。しかし、ヘリックス超構造体は不斉な膜化合物から成長しやすいので、ヘリックス形成には、不斉,水素結合,そして適当な長さの疎水鎖という3つの要素が大きく影響することを明らかにした。3.ヘリックス超構造体の形成には、上の分子構造上の因子の他,熟成条件も大きく影響する。特にアニ-リングは一定温度での熟成よりもヘリックスの成長を促進する作用がある。4.可視・紫外スペクトルおよびFTーIRスペクトルはヘリックスの大きさとは無関係で、小さいヘリックスも巨大なヘリックスと同様のスペクトルとなった。つまり、これらのスペクトル挙動が同じであればヘリックスではない会合体であっても局所的にはヘリックスと同じ分子配列様式を有する可能性がある。5.上で述べたスペクトルは、成分分子の疎水鎖に含まれる炭素数の偶奇によって異なることがわかった。この偶奇鎖長効果はヘリックスが観察できない二分子膜についても見られ,偶数炭素鎖型と奇数炭素型の二分子膜は、全く異った分子配向・パッキング状態にあることがわかった。本研究は二分子膜が形成するヘリックス超構造体について、(1)ヘリックス形成を支配する要因と(2)ヘリックス中での分子配向を明らかにすることが目的であり、本年度までに次のような知見等の成果を得た。1.ヘリックス形成に影響する因子について:二鎖型のキラル両親媒性分子を用い水中でのヘリックス形成を光学顕微鏡で観察した。疎水鎖長とヘリックス形成の関係を調べた結果、鎖長が長くなるに従いヘリックス形成は抑制されるものの、すべての化合物からヘリックスが形成された。特に最長鎖長の化合物は従来ヘリックスを形成しないとされていたものであり、本研究によりはじめてヘリックス形成能を有することがわかった。熟成温度・時間とヘリックス形成を調べた結果、二分子膜水溶液をゲル-液晶相転移温度(Tc)以上で数日間熟成した後、Tcより約10°C低い温度で熟成を続ければ、疎水鎖長によらず同程度の長さをもったヘリックスが同程度の数で形成されることがわかった。2.分子配向の検討:上述の二分子膜水溶液の赤外スペクトルを経時的に記録した結果、ヘリックスの数や大きさは、吸収波数に影響しないことがわかった。しかし、疎水鎖中の炭素数が偶数であるか奇数であるかによって吸収波数が異なるという偶奇効果を新たに見い出した。この偶奇効果は、アゾベンゼン発色団を含む一鎖型の膜化合物を用い、紫外スペクトルからも観察できた。これらの二分子膜もヘリックスを形成したがその時点での吸収極大は疎水鎖中の炭素が偶数個の時350nmにあり、奇数個の時320nmにあった。以上の結果はヘリックスが分子構造よりも熟成など外的因子に支配されて形成されることを示唆している。また、ヘリックス中の分子配向は疎水鎖中の炭素数が偶数であるか奇数であるかによって異なっていることも明らかになった。

文研究は二分子膜が形成するヘリックス超構造体について、(1)ヘリックス形成を支配する諸因子と(2)ヘリックス中での分子配向・パッキングを明らかにすることが目的であり、本年度は以下の結果を得た。1.ヘリックス形成に影響する因子について分子構造上の因子として新たに不斉を検討したところ,アキラルな二分子膜からもヘリックス超構造体が形成されることを知った。このことから,不斉はヘリックス形成の必要条件にならないことを明らかにした。また,このアキラル二分子膜化合物が水素結合能を有することから水素結合はヘリックス超構造体の形成を促進する因子であることがわかった。しかしながら,アキラル二分子膜によるヘリックス形成は一般性に乏しく,この点から、ヘリックス形成は不斉と水素結合の協同効果による所が大きいと解釈できる。一方、熟成条件を検討することにより、一定温度で熟成するよりもアニ-リングを行った方がヘリックス超構造体は形成されやすいことがわかった。2.分子配向・パッキングの検討について可視・紫外スペクトルやFTーIRスペクトルをさらに詳細に検討した結果、各スペクトルはヘリックス超構造体の大きさには依存せず同じであることが明らかになった。このことは、ヘリックス超構造体が観察されない二分子膜であっても,スペクトルがヘリックス超構造体のそれと同じ時,局所的には同一の分子配列様式を有する可能性があることを示唆している。また,昨年度得られた偶奇鎖長効果に関しては,ヘリックス超構造体を形成しない二分子膜についても見られる一般性の高い現象であることが明らかになった。
急速凍結装置の改良とそれを基本とした高精度の免疫組織化学法の開発およびその応用

本研究は、種々の生理的状態の組織や細胞を液体ヘリウムによる急速凍結とそれに続く凍結置換法またはディープエッチレプリカ法を用いて処理し、それぞれ状態における色々な細胞内蛋白質成分の静的な局在部位やそれらの部位の移動を、免疫組織化学的手法を用いて調べる技術を開発することを目的として開始した。実際には、1)急速凍結技術自体の良好な凍結部位の深度を上げること、2)そして凍結置換後に樹脂包埋・薄切した試料中の抗原を蛍光標識しその局在を示す微弱なシグナルを高感度・高分解能の冷却CCDカメラによって捉えることなどに努力した。1)に関しては、フリージングヘッド部分を熱伝導率の低い材質に変えたときにやや結果が良いようであった。2)では、哺乳動物小脳のプルキンエ細胞におけるイノシトール3燐酸受容体(IP_3R)の分布を調べるべく、急速凍結後フォルマリン・アセトンにより凍結置換を行い樹脂包埋後の超薄切片を抗IP_3R抗体で標識した。この切片は、電子顕微鏡観察に使う厚さに近く、抗体染色は辛うじて肉眼的に認められる程度のごく弱いものであったが、冷却CCDにより撮影したプルキンエ細胞はその細胞体・樹状突起ともに多数の点状の像を明瞭に示し、多くの場合数個の点が直線状に並んで分布していた。同時に作製した切片の電子顕微鏡像からこれらの点状の構造物が滑面小胞体であることが判明したが、同じ材料のフリーズレプリカ像において、相当する部位に2次元結晶を形成する膜蛋白質が検出され、さまざまな証拠からこの成分がIP_3Rであることを確認した。次に、植物細胞において約70μm/secという高速の原形質運動を担うミオシン分子の局在部位を探索した。細胞を開いて筋肉ミオシンSlを潅流後急速凍結してそのレプリカを観察するとSlで修飾されたアクチン束の一部が小胞体からの突出物に結合していた。この分子は尾部に球状ドメインを有し、そこで膜に結合しているらしい。本研究は、種々の生理的状態にある組織あるいは細胞を液体ヘリウムを用いた急速凍結とそれに続く凍結置換法またはディープエッチレプリカ法を用いて処理し、それぞれの状態における色々な細胞内蛋白質成分の静的な局在部位や細胞内におけるそれらの局在部位の移動を、主として免疫組織化学的手法を用いて調べる技術を開発することを目的としている。本年度はまず、1)急速凍結技術自体の良好な凍結部位の深度を上げること、2)そして凍結置換後に樹脂包埋・薄切した試料中の抗原を蛍光標識しその局在を示す微弱なシグナルを高感度・高分解能の冷却CCDカメラによって捉えることに努力した。第1の目的を果たすために、急速凍結装置を改造して純銅ブロック直上に強力な永久磁石をとりつけ凍結直前の試料を強い磁場にさらすことを試みたが、残念ながら対照試料との大きな差異は見られなかった。さらに目的を追求するために、フリージジングヘッド部分を熱伝導率の低い材質に変え、凍結直前に一瞬強い圧力をかける装置を新たに設計するなどの別の方向からの試みを継続している。第2の目的に関しては、哺乳動物小脳のプルキンエ細胞におけるイノシトール3燐酸受容体の分布を調べるべく急速凍結後フォルマリン/アセトンにより凍結置換を行い樹脂包埋後の超薄切片を抗イノシトール3燐酸受容体抗体で標識した。抗体染色は辛うじて肉眼的に認められる程度の弱いものであったが、冷却CCDにより撮影したプルキンエ細胞はその細胞体・樹状突起ともに多数の点状の像を明瞭に示し、多くの場合数個の点が直線状に並んで分布していた。同時に作製した切片の電子顕微鏡像からこれらの点状の構造物が滑面小胞体であることが判明したが、同じ材料のフリーズレプリカ像において、相当する部位に2次元結晶を形成する膜蛋白質が検出された。さまざまな証拠からこの蛋白質はイノシトール3燐酸受容体であろうと考えられる。

次に、植物細胞において約70μm/secという高速の原形質運動を担うミオシン分子の局在部位を探索した。細胞を開いて筋肉ミオシンSlを潅流後急速凍結してそのレプリカを観察するとSlで修飾されたアクチン束の一部が小胞体からの突出物に結合していた。この分子は尾部に球状ドメインを有し、そこで膜に結合しているらしい。
可視光で駆動する表面固定化金属錯体を利用した触媒的分子変換デバイスの開発

クリーンで無尽蔵な光エネルギー(太陽光)を利用した選択的物質変換反応を可能とする光触媒の開発が重要な課題と言えるが極めてチャレンジングである。本研究では、可視光で駆動する表面固定化光応答性金属錯体の開発と選択的分子変換反応への応用を通して、全く新しい機能をもった次世代光触媒開発を行った。21世紀の化学は、環境を強く意識した発展が不可欠であり、物質変換においては、高選択的で超効率な触媒系の開発が望まれている。その達成には、クリーンで無尽蔵な光エネルギー(太陽光)を利用した選択的物質変換反応を可能とする光触媒の開発が重要な課題と言えるが極めてチャレンジングである。酸化チタンに代表される半導体光触媒は、酸化・還元力が強すぎるため選択性が低く、その応用は完全酸化分解反応などダウンストリームプロセスに留まっている。紫外光を利用した環化、異性化、転位反応なども古くから研究がなされているが、低収率・低選択性などの問題があり、実用化には適していない。そこで、本申請課題では、これまで不可能とされてきた高付加価値生成物を得る可視照射下での物質変換反応を、表面固定化光応答性金属錯体をモチーフにした新規具体的には、光触媒により達成することを目的とした。可視光で駆動する表面固定化光応答性金属錯体の開発と選択的分子変換反応への応用を通して、全く新しい機能をもった次世代光触媒開発の斬新で画期的な方法論を提供することを目的とすし、以下の3つのサブテーマを行った。1)強りん光発光性金属錯体を利用した高難度光酸素酸化の実現2)有機-無機ハイブリッド型光水素発生デバイスの構築3)表面プラズモン共鳴を利用した金属錯体の光触媒活性増強クリーンで無尽蔵な光エネルギー(太陽光)を利用した選択的物質変換反応を可能とする光触媒の開発が重要な課題と言えるが極めてチャレンジングである。そこで、本申請課題では、これまで不可能とされてきた高付加価値生成物を得る可視照射下での物質変換反応を、表面固定化光応答性金属錯体をモチーフにした新規光触媒により達成する。具体的には、以下の3つのサブテーマを行う。1)強りん光発光性金属錯体を利用した高難度光酸素酸化の実現2)有機-無機ハイブリッド型光水素発生デバイスの構築3)表面プラズモン共鳴を利用した金属錯体の光触媒活性増強本年度は、上記サブテーマに関して、各種光触媒の調製および、光触媒活性の評価を行った。各種ゼオライト、メソポーラスシリカの細孔内に様々な光応答性金属錯体(Pt, Ir, Ru etc.)の導入を行った。金属錯体の導入法としては、ship-in-a bottle法あるいは、有機リンカーへの固定化法を用いた。ゼオライトの細孔は、分子の配向と配列が制御された異方性を有するミクロ空間環境場であり、しかもイオン交換能を有することから、交換カチオン種を選択することで、細孔内の静電場や空間体積などの分子環境場を任意に制御できる。例えば、Li+やNa+などのイオン半径の小さい軽原子、Cu+やAg+などの中間原子、Rb+やCs+などの重原子では、細孔内の空間体積や静電場が異なる。一方、メソポーラスシリカでは、合成段階の構造規制剤の種類や、Si/Al比を変えることで、細孔サイズや表面の酸・塩基性をコントロールすることが可能である。本申請課題では、内包した光応答性金属錯体の電子状態、配位環境、光励起過程を、細孔環境により精密制御することが目的であり、調製した触媒のキャラクタリゼーションを次年度以降に行う。また、可視光照射下での光酸素酸化反応、水からの水素生成を行った。同時に反応最適条件(溶媒、触媒量等)も検討し、従来よりも高い活性が得られることを見出した。次年度は。以下の項目に焦点をしぼり研究を行う。1光触媒キャラクタリゼーション比表面積測定、XRD、SEMにより触媒のバルク構造を解析する。また、固体NMR、XPS、IR、XANES/EXAFS等を用いて行い、触媒活性種近傍の微細構造と光触媒機能の関連を明確にする。さらに、フォトルミネッセンス、UV-vis測定により、光吸収特性を詳細に検討する。これらの分析機器は、既設もしくは借用が可能である。また、高エネルギー加速器研究機構(KEK-PF)の研究課題が採択されており、XANES/EXAFS測定も可能である。さらに高輝度光科学研究センター(SPring-8)での研究課題も随時申請予定である。

種々の分光学的手法を駆使した触媒活性種近傍の微細構造に関する知見と触媒機能の関連性を解明することで、更なる高性能光触媒の設計指針にフィードバックする。2反応メカニズムの解明触媒キャラクタリゼーションと併せて、in-situでのUV-vis、フォトルミネッセンス、XANES/EXAFS測定に重点を置き反応メカニズム、光触媒活性発現の要因を明らかにする。また、活性酸素種の同定はESRにて行う。様々な反応ステージでの光吸収特性評価、活性点近傍構造の同定によって、反応基質・反応ガスの吸着・配位により生成する中間体の微細構造をも高精度で決定する。消耗品(触媒調製・反応用試薬、分析ガス等):700千円海外旅費(ICC2012(ドイツ)):350千円国内旅費(SPring-8、KEK-PF、触媒学会、石油学会):150千円謝金(実験補助アルバイト):200千円その他(学会参加費、論文投費):100千円未使用金の発生した経緯とその使用計画:研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
小分子RNAに誘導されるエピゲノム変化の生化学的解析

トランスポゾンとその残滓は、ヒトゲノムでは45%もの領域を占めている。トランスポゾンの持つ転移能は個体に有害であり、特に生殖細胞におけるトランスポゾンの発現抑制は次世代への正確な遺伝情報の伝達を考えた場合に、生物にとって喫緊の課題である。私は小分子RNAがトランスポゾンの発現を生殖細胞でいかに抑制しているかに関して研究をハエとマウスを用いて行ってきた。ハエにおいては、特定ゲノム領域に存在するタンパク質群を網羅的に同定する手法を開発してきた。また、マウスにおいては精巣中に含まれる少量の生殖細胞からクロマチン状態をプロファイルし、その様態を明らかにした。本年度は、特定ゲノム領域に存在するタンパク質やRNAを同定するための手法の開発を主眼に置いて研究を進めた。申請書においてはPIWI/piRNAによって発現抑制を受けるプラスミドを細胞から回収することを当初計画していた。計画通り、PIWI/piRNAによって発現抑制を受けるレポータープラスミドを構築することが出来たが、そのプラスミドを細胞から回収することに現段階で成功していない。よって、別の系の構築を開始した。CRISPR/Cas9は任意の遺伝子座に欠失・挿入を人為的に引き起こすことに広く使用されているツールである。Cas9はDNA切断活性を有しており、CRISPR RNAは任意の遺伝子座へとCas9を連れて行くガイド因子として働く。そこで申請者は、このCRISPR/Cas9をベースにして、特定ゲノム領域の濃縮を目指した。具体的には、ゲノムの切断活性を持つアミノ酸に変異を導入したCas9と、興味のある遺伝子座で設計したgRNAを細胞に導入し、その後Cas9を細胞から濃縮した。まずは、転写が活発に行われている遺伝子座を標的にこの手法を適用した。その結果、免疫沈降産物の中にヌクレオソームが銀染色で確認出来る程度にまで系を改善した。さらに転写やスプライシングに関与する核内タンパク質群の濃縮も見られた。次にこの手法をトランスポゾン領域で行った。申請者の使用した培養細胞ではトランスポゾンはヘテロクロマチン化を受けている。ヘテロクロマチン領域は高次構造をとり、タンパク質が近づきにくいゲノム領域である。そこでトランスポゾン領域がCas9によるゲノム切断を受けるかを確認したところ、興味深いことにCas9はこのゲノム領域を切断できることが明らかとなった。現在、トランスポゾン領域を上記のシステムで免疫沈降することで、この領域に存在するタンパク質群を網羅的に同定している。本年度は前年度に引き続き、特定ゲノム領域に存在するタンパク質やRNAを同定するための手法開発を主眼に置いて研究を進めた。前年度までにパイロット版の実験系を構築したため、結合タンパク質が既に知られているゲノム領域に対してゲノムIP法を適用した。インシュレーターは、例えばエンハンサーとプロモーターとの相互作用を阻害するなど、ゲノム上の隣接する二つの領域を隔絶する働きをもつことが知られたエレメントである。この領域にはCTCFなど複数のタンパク質が特異的に局在する。この領域でゲノムIP法を適用したところ、同定されたタンパク質にはクロマチン上に多く存在するものが含まれていた。また、既知のインシュレータータンパク質であるPARPやCP190なども同定された。これらの結果は、ゲノムIP法によって、プロテオーム的に純度の高いタンパク質群が濃縮されたことや、特定ゲノム領域に存在するタンパク質を同定することが可能であることを示唆している。上記のタンパク質群に加えて、Mediator複合体中の複数のタンパク質がインシュレーター領域でのゲノムIPで同定された。現在インシュレーター機能に対するMediator複合体の役割を検証中である。トランスポゾン上に存在するタンパク質を同定することは本研究の主眼の一つである。世界で広く使用されているCas9はStreptococcus pyogensから単離されたもの(SpCas9)だが、このCas9はヘテロクロマチンに効率良くアクセスすることが出来なかった。そこで、Staphylococcus aureusから単離されたCas9(SaCas9)を用いてChIPを行ったところ、このCas9はSpCas9に比べヘテロクロマチン領域に効率良くアクセスすることができることがわかった。現在SaCas9を用いたゲノムIPをトランスポゾン領域で行っている。本年度の研究実績の項目で述べたように、ヘテロクロマチン化されたトランスポゾン領域にSpCas9はうまくアクセスできないという問題が明らかになった。これは、ある特定のヘテロクロマチン領域のみで検証した結果ではなく、複数のヘテロクロマチンで共通して観察されたことであった。SpCas9は1368a.a.の非常に大きなタンパク質で、この巨大な構造のために、ヘテロクロマチンへアクセスしにくくなっているのではないかと考えた。SaCas9はSpCas9にくらべおよそ300a.a.短いタンパク質で、SpCas9に比べオフターゲット効果が少ないことが先行研究で示されている。そこで、この「小さな」Cas9タンパク質がヘテロクロマチン領域にいかに効率的にアクセスできるかを検証したところ、オープンなクロマチン領域へのアクセシビリティーと同程度の効率でヘテロクロマチン領域にアクセスできることが明らかになった。この発見は本研究課題を遂行する上で重要な知見であり、この点を克服できたことは大きいと考えている。上記の点と並行してゲノムIP法の改良を続けてきた。この改良版のゲノムIP法を用いて細胞からCas9タンパク質を免疫沈降したところ、細胞質由来のタンパク質のコンタミネーションがかなり減少した。これに対して、クロマチンに結合しているような既知のタンパク質群の濃縮が見られた。

このことから、ゲノムIP法によってプロテオーム的に純度の高いクロマチンを精製することに成功したと考えられる。以上の2点の発見内容を鑑みて、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。今年度は、マウス小分子RNAによるクロマチン状態変化の解析を行った。Miwi2はマウスの胎仔生殖巣に特異的に発現するアルゴノートファミリータンパク質でトランスポゾン上のエピゲノム状態を変化させることが知られている。Miwi2が発現している時期の生殖細胞はゴノサイトと呼ばれており、1個体あたりおよそ数万細胞程度存在する。Miwi2に依存したクロマチン状態変化を記述するためにゴノサイトを用いたATAC-seq解析を試みた。ATAC-seqはゲノム上のプロモーター領域や発現制御領域を同定し、さらにそれらが活性化しているかどうかも明らかにすることが可能である。精巣は生殖細胞と体細胞から構成されている。そこでまず初めに生殖細胞のみが光るマウスを取り寄せた。そのマウスから精巣を摘出し、生殖細胞のみをFACSで分取した。次に、分取した細胞からATAC-seq用のライブラリを調製した。得られたライブラリ中のDNAの配列決定を行いそれらを解析した結果、生殖細胞特異的に発現が知られる遺伝子近辺にシグナルがあること、逆に体細胞特異的遺伝子にはシグナルが無いことがわかり、雄性生殖細胞特異的なプロファイルを得ることが出来たと結論づけた。この解析を時系列に沿って行ったところ、ゲノム上の特定領域のアクセシビリティが一過的に上昇することがわかった。現在、クロマチン変化の解析のみならず、トランスクリプトームを各ステージで明らかにするためCAGE-seqを行っている。さらに、以上の解析をMiwi2の変異体でも行っている。今後これらの解析を通して、マウス小分子RNAによるクロマチン状態変化を体系的に明らかにしていく。トランスポゾンとその残滓は、ヒトゲノムでは45%もの領域を占めている。トランスポゾンの持つ転移能は個体に有害であり、特に生殖細胞におけるトランスポゾンの発現抑制は次世代への正確な遺伝情報の伝達を考えた場合に、生物にとって喫緊の課題である。私は小分子RNAがトランスポゾンの発現を生殖細胞でいかに抑制しているかに関して研究をハエとマウスを用いて行ってきた。ハエにおいては、特定ゲノム領域に存在するタンパク質群を網羅的に同定する手法を開発してきた。また、マウスにおいては精巣中に含まれる少量の生殖細胞からクロマチン状態をプロファイルし、その様態を明らかにした。「研究実績の概要」にもあるように、当初のプラスミドをベースにした系の構築は、現在までに達成できていない。そこで、当該年度ではCRISPR/Cas9をそれに換わる系として構築してきた。
脳型ADPリボシールシクラーゼの精製とcDNAクローニング

神経腫瘍細胞NG108-15細胞のADPリボシルシクラーゼは、ムスカリン受容体とカップルしていたが、脳のADPリボシルシクラーゼは、カップルする受容体が、数多くの試みの中からは検出できなかった。一方、心臓のADPリボシルシクラーゼは、イソプロテレノール、ノルアドレナリンやアンデオテンシンII刺激により、活性化された。私達の目的は受容体とカップルする膜型ADPリボシルシクラーゼの分子を決めることにあるので、さしあたり、ラット心室心筋を出発材料にすることにした。心筋を細分して低調液で、30分間浸け、テフロンガラスホモゲナイザーで均一化した後、1000g、10分の遠心により核を取り除いた。上澄みを105000g、15分の超遠心にかけ、膜分画を得た。それを2%のトライトンXで可溶化し、105000g、30分にて遠心し沈渣を除いた後、上澄みをDEAEカラムにとうした。ADPリボシルシクラーゼ活性は、DEAEカラムを1M NaClで溶出すると、タンパクのピークと一致して検出できた。この分画をさらにゲル濾過すると、アルブミンの溶出よりも少し分子量の低い分画にADPリボシルシクラーゼ活性が回収できた。ブルーセファロースカラスにより単一タンパクまでにさらに精製できた。一方、DNAシークエンスのデータベースの中より、ホモロジー検索によりCD38/ADPリボシールシクラーゼの類似DNAを検出することを試みた。よく保存された20マーをプライマーとし、心臓RNAをプレートとし、RT-PCRを試み期待される長さ、及びそうではないものを得た。これらのDNA断片の塩基配列を現在決めている。新規のADPリボシルシクラーゼを検索しているところである。細胞内のCaをセカンドメッセンジャーとするCaシグナリングは,数多くの受容体の下流に存在する重要な信号伝達機構の一つである。リアノジン感受性の細胞内Caプールを開く細胞内リガンドはサイクリックADPリボース(cADPR)であると考えられるようになってきた。しかし、cADPRがIP3のようなセカンドメッセンジャーであるとする仮説を正しいものとするためには,NADからcADPRが産生される代謝酵素が受容体によりコントロールされていることを示す必要がある。そのため、今年度は,NADからcADPRを産生する酵素であるADP-リボシールシクラーゼの活性を現在行われているHPLC法によらず薄層クロマトグラフィー(TLC)でより簡便に行える測定法を開発することにした。NG108-15細胞およびムスカリン性受容体m1m4を大量発現した細胞あるいはラット脳から膜分画を調整して,[^3H]NADを基質およびトレーサーとして用い、シリカゲルTLCに対し,種々の展開剤を試し,アイソトープ標識のNAD,ADPRやcADPRの分離が十分行える条件を見い出した。この方法で測定したADPRシクラーゼはアセチールコリンでその酵素活性を変化させた。細菌毒素により変化が消失したことからGたんぱく質が関与していることがあきらかになった。来年度の課題として、この測定法に精度をより高めることGたんぱく質の種類を同定すること、ADPRシクラーゼを精製してどのようなたんぱく質であるか決めることが必要であることが明らかになった。神経腫瘍細胞NG108-15細胞のADPリボシルシクラーゼは、ムスカリン受容体たカップルしていたが、脳のADPシボシルシクラーゼは、カップルする受容体が、数多くの試みの中からは検出できなかった。一方、心臓のADPリボシルシクラーゼは、イソプロテレノールやノルアドレナリン刺激により、活性化された。私達の目的は受容体とカップルする膜型ADP

シボシルシクラーゼの分子を決めることにあるので、さしあたり、ラット心室心筋を出発材料にすることにした。心筋を細分して低調液で、30分間浸け、テフロンガラスホモゲナイザーで均一化した後、1000g、10分の遠心により核を取り除いた。上澄みを105000g、15分の超遠心にかけ、膜分画を得た。それを2%のトライトンXで可溶化し、105000g、30分にて遠心し沈渣を除いた後、上澄みをDEAEカラムにとうした。ADPリボシルシクラーゼ活性は、DEAEカラムを1M NaClを溶出すると、タンパクのピークと一致して検出できた。この分画をさらにゲル濾過すると、アルブミンの溶出よりも少し分子量の低い分画にADPリボシルシクラーゼ活性が回収できた。単一タンパクまでさらに精製を続ける。神経腫瘍細胞NG108-15細胞のADPリボシルシクラーゼは、ムスカリン受容体とカップルしていたが、脳のADPリボシルシクラーゼは、カップルする受容体が、数多くの試みの中からは検出できなかった。一方、心臓のADPリボシルシクラーゼは、イソプロテレノール、ノルアドレナリンやアンデオテンシンII刺激により、活性化された。私達の目的は受容体とカップルする膜型ADPリボシルシクラーゼの分子を決めることにあるので、さしあたり、ラット心室心筋を出発材料にすることにした。ADPリボシルシクラーゼ活性は、DEAEカラムを1M NaClで溶出すると、タンパクのピークと一致して検出できた。ブルーセファロースカラムにより単一タンパクまでにさらに精製できた。一方、DNAシークエンスのデーターベースの中より、ホモロジー検索によりCD38/ADPリボシールシクラーゼと類似DNAを検出することを試みた。よく保存された20マーをプライマーとし、心臓RNAをテンプレートとし、RT-PCRを試み期待される長さ、及びそうではないものを得た。これらのDNA断片の塩基配列を現在決めている。新規のADPリボシルシクラーゼを検索しているところである。
とろみ食品の嚥下調整食への展開に向けた実証的研究

本研究は、摂食嚥下機能に応じた食事提供において、「とろみ液」を嚥下調整食に活用し介護保険施設における食形態のバリエーションを増やすことを目的としている。そこで、「とろみ液」を固形状の食品と組み合わせた新たな嚥下調整食を具体的な調整方法も含め考案する。「とろみ液」及び新たな嚥下調整食について、食品の物理的測定、口腔内感覚による官能評価、口腔過程の生理的測定を行い、各測定結果における相互関係を検証し、嚥下調整食として適切な調整方法を確立する。さらに、介護保険施設において、調理負担調査、官能評価的観点を含んだ介入調査を行い、摂食嚥下障害を有する被験者に活用しうる嚥下調整食を提案する本研究は、摂食嚥下機能に応じた食事提供において、「とろみ液」を嚥下調整食に活用し介護保険施設における食形態のバリエーションを増やすことを目的としている。さらに、介護保険施設において、調理負担調査、官能評価的観点を含んだ介入調査を行い、摂食嚥下障害を有する被験者に活用しうる嚥下調整食を提案する