hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
α-アゾヒドロ過酸化物からジアゾニウムイオンの無溶媒系での新発生法と反応性の研究-ジアゾニウムイオンの新発生試剤-

今回ジアゾニウムイオンの無溶媒固相系での新発生試剤として私共が新たに開発したα-アゾヒドロペルオキシド・溶媒の分子複合体立使用して次に示す三つの観点の研究成果を得た。これらは全て新発見である。(1)α-アゾヒドロペルオキシド・ベンゼン複合体と1-ナフトールの固有系での反応を行い、フェルアゾ1-ナフチルエーテルをはじめて合成した。この新化合物をモデルとして-O-N=N-結合の化学につき研究を行った結果上記O-N結合はイオン解離せずラジカル解裂によりラジカル対を生成し、各種特異反応がさらに進行することを見出した。(2)α-アゾヒドロペルオキシド・イソプロピルアルコールの分子複合体を室温で分解させるとジアゾニウムイオンとベンジル型カルバニオンが生成した。反応はさらに進行してP-アリールベンスアルデヒド又はP-アリールアセトアェノン(R=メチル)が生成する。このような反応は固相特有であり今後の発展が期待される。(3)上記の反応でα・アゾヒドロペルオキシドの分解に際し発生するジアゾニウムイオンはフェノール類によってトラップされアリールアゾフェノールを生成する。しかし同時に発生するベンジル型カルバニオンはトロピリウムイオンあるいはベンジルクロリド共存下においてチトラップできなかった。今回の成果はデトラヘドロン・レターズ等国際誌上に発表又は発表予定である。手塚の試薬、α-アゾヒドロペルオキシド・ベンゼンcomplex(【I】)の脱溶媒分解によって非水系固体状態で発生するジアゾニウムイオンとα-ナフドールを反応させることによって、世界ではじめて反応性ジアゾエーテル(【II】)を合成することができた。【II】のようなジアゾエーテルは100年以上も前に(1870年)Kehul【e! ́】によってジアゾカツプリングの中間体として予言された物質であるが、現在まで多くの試みにもかゝわらず、このものを合成単離することはできなかった。手塚の試薬によってこれがはじめて可能となった。この成果は61年東京で開かれた第8回IUPAC物理有機化学国際会議にて講演、FTHのprof.Dr.H.Zollingerによって評価された。続いてジアゾエーテル(【II】)からアゾナフトール(【III】)への転位反応の検討を行った。この結果はKehul【e! ́】の予言したような【II】から【III】への転位は塩基性条件,酸,熱による反応では効率が悪いことがわかった。それに代って光反応によって【II】から【III】が40%の収率で生成する。この新反応の反応機構の研究を行った。光転位は【II】の励起一重項から起り、溶媒の効果は受けない。一方、【I】とフェノール,p-ニトロフェノール,p-クロロフェノール等の反応を行い、ジアゾエーテルを得ようとしたが、現在のところ目的とする物質は得られていない。前年度からの研究で,αーアゾヒドロペルオキシドをジアゾニウムイオン源として使用することによって,反応性ジアゾエーテルの一つフィニルアゾノーナフチルエーテル(1)がはじめて合成單離された.このことについては昨年の実積概要で述べた.反応性ジアゾエーテル(1)は今から100年以上も前にKekuleによってジアゾカップリング反応の中間体として予見された化合物である.この重要かつ興味深く又未知のジアゾエーテル結合(ーOーN=Nー)を解明すべく,本年度はかなりの時間をこれに使った.その結果きわめて興味深い新知見を得た.以下それを列挙し述べる. (i)塩基や酸の作用でジアゾエーテル(1)から転位が起りアゾナクトール(アゾ色素)が一部生成する.しかしKekuleの予見のように定量的にこの反応は起らない. (一部前回の報告にあり). (ii)光反応によってジアゾエーテル(1)からアゾナクトール(アゾ色素)が生成すると考えられていた(前田報告)が,今回純粋に單離したジアゾエーテル(1)を使って光反応を再検討したところ,むしろ構造未知化合物(X)が主生成物であることが明らかになった.研究は続行中である. (iii)熱反応を研究した結果今回新しい知見が得られた.すなわち80°Cの加熱によってジアゾエーテル(1)はラジカル分解,アゾナフトールへの転位反応及びベンザインの生成を行うことがわかった.また室温ではアゾ色素への転位が有利となる.以上の研究によってようやくシアゾエーテル結合の化学の重要性がわかった.今回ジアゾニウムイオンの無溶媒固相系での新発生試剤として私共が新たに開発したα-アゾヒドロペルオキシド・溶媒の分子複合体立使用して次に示す三つの観点の研究成果を得た。

(3)上記の反応でα・アゾヒドロペルオキシドの分解に際し発生するジアゾニウムイオンはフェノール類によってトラップされアリールアゾフェノールを生成する。しかし同時に発生するベンジル型カルバニオンはトロピリウムイオンあるいはベンジルクロリド共存下においてチトラップできなかった。今回の成果はデトラヘドロン・レターズ等国際誌上に発表又は発表予定である。
多様な修飾ヒストンのライブラリー化に向けた基本技術の開発

DNA配列に直接依存しないで発現が制御されるシステムは、エピジェネティクスとよばれ、生活習慣病などの背景ともなるため、重要な制御である。それ故、エピジェネティクスを理解する、または理解する手法を確立することは重要なことである。核タンパク質であるヒストンH3の9番目のリシン(K9)をトリメチル化した場合に特異的に認識する蛋白質に、HP1(Heterochromatin Protein 1)がある。ヒトでは、HP1は3種類あり、生理的な機能は異なっている。しかし、トリメチル化K9を含む合成ペプチドを基質に用いた場合、3種はほぼ同じ性質をしており、アイソフォーム特異的機能がどのようにして引き起こされるかという分子機構は明らかでない。私は、2015年にK9をトリメチル化したヒストンH3を用いてヌクレオソームを再構成し、それを生化学的に結合基質にすることでアイソフォーム特異的な認識があると報告した。本年度は、K9をトリメチル化したヒストンH3を含むヌクレオソームが、HP1によりどのように認識されるかを計算によるシュミレーションで解析する共同研究を行った。シュミレーションでも以前に報告したHP1アイソフォーム特異的結合を見出すことができ、さらにその上、HP1分子に新たなDNA結合部位が示唆された。その新DNA結合能のついて、HP1の変異体を組換え体を作成し、生化学的解析を進めた。結果として、新DNA結合能の実在を確認し、修飾認識タンパク質研究の一つの型を提案することができた。細胞核内の基本構造であるクロマチン構造を形成するヒストン分子のN末端領域(テール)の修飾は、遺伝子発現調節において重要な役割を果たす。これまで、修飾を施した天然と同じ配列をもった全長ヒストンの合成が困難であるため、修飾を施したテール領域の合成ペプチドとの相互作用解析が主流であったが、この方法では、構造を基盤とした調節機構を明らかにできない。本計画では、有機化学と大腸菌を用いた生化学的手法を融合させ、生物系の研究者でも容易に目的の修飾を施したヒストンの調整法の確立を目指す。修飾には、様々な種類またや組み合わせが報告されているが、その中でも、最も修飾が多彩で機能的に重要なヒストンH3に焦点を絞り、化学合成と遺伝子工学を組み合わせ、天然と同じ配列を持った分子を調製した。ヒストンH3の9番目のリシン(K9)にメチル化を入れた分子の合成を始めた。リシンのメチル化には、3種、モノメチル化(me1)、ジメチル化(me2)、トリメチル化(me3)修飾がある。ヒストンH3K9のメチル化修飾はme2とme3がHP1など選択的に結合する因子によりクロマチン凝集状態が変化し、それにより遺伝情報発現の抑制に寄与していることが明らかにされているが、me1を始めその価数の違いが果たす機能については明確な生化学的検証はない。平成27年度は、K9me3を導入した入れたヒストンH3合成法の確立と大量調製の確立を試み、それに成功した。初年度に、K9をトリメチル化したヒストンH3の調製に成功し、それを論文かできたので(Kawamami et al., J. Biochem. 2015)、計画以上に研究が進行したと考えている。まず、H3のどの部分を化学合成し、連結に用いるかを決定する必要がある。連結部には、アラニン(Ala)を用いるので、H3N末端テールにあるA25、A29、A47について、Alaの一つ前のアミノ酸残基までにKme3をいれたペプチドを合成機で合成した。なかでも、最も効率良く合成されるペプチドとしてA25までのペプチドの合成効率が良いので、その部分を有機化学的に調製することに選定した。これに続くC末側断片のN末端AlaをCysに置換したコンストラクトを構築し、大腸菌で組換え体を発現・精製する。これには、いくつかベクターを試したが、pCold系のベクターが最もよかった。タグをつけて発現・精製させておいてから、タグをSENP2で切り離し、再度精製する方法が効率よく回収できた。H3のC末の組換えペプチドの配列内部には、Cys残基が存在するので、内部のCysのみを特異的に保護剤によりブロックする。その後、N末修飾ペプチドとC末組換えペプチドを化学的に連結する。連結後、分子内部のCysのブロックを除去する。これらのステップにより、K9がトリメチル化されたH3を調整することができた。遺伝子発現制御に、ヒストンの化学修飾が重要な役割を果たすことは、よく知られている。最近、ヒストン修飾の中に、DNAメチル化との関連性が示唆されているものとして、ユビキチン化修飾がある。これまで、試験管内でユビキチン化修飾の機能を調べるには、ユビキチン化修飾を導入したい位置のアミノ酸をシステインに変更し、ユビキチンと目的のたんぱく質とをS-S結合でつなぐ方法がよくとられてきた。しかしこれでは、一般に試験管内の反応で用いられる還元条件では、S-S結合が開裂していしまうため、機能解析が容易ではない。そこで、私は、共同研究者と、還元条件でも開裂しないよう、ユビキチン化修飾を共有結合で目的のペプチドの目的のアミノ酸に導入する法を開発した。この方法で、ユビキチン化したヒストンのN末端部分を合成し、それを大腸菌で作らせたヒストンC末端部分と連結することで、全長のユビキチン化ヒストンを調整した。

ユビキチン化ヒストンは、非修飾のヒストンと同様に、試験管内で、ヒストン8量体を形成することができ、それを用いてヌクレオソームまで再構成することができた。再構成ヌクレオソームを使い、ユビキチン化修飾が、ヌクレオソームの安定性に与える効果を温度を変えて調べたところ、ユビキチン化修飾がヌクレオソームの安定性を若干上昇することがわかった。次に、ヌクレオソーム凝集能に与える効果を調べるために、2価金属を添加して、高速遠心でヌクレオソームが沈殿に回収される量に対する効果も調べたが、これには優位な影響を与えることがなかった。つまり、ユビキチン化が生体何で機能するには、他因子との相互作用が必要であると示唆された。着実に学会発表を行うとともに、論文を発表しているため。エピジェネティクスは、DNAの塩基配列に依存しない遺伝子発現制御である。その制御機構には、代表的なものとして、ヒストンの化学修飾とDNAの塩基の修飾がある。ヒストンH3は、N末端付近にてユビキチン化されることが知られ、この修飾ヒストンは、DNAメチル化と関連があると報告がある。しかし、その分子機構は不明であったので、有機化学的にユビキチン化ヒストンを用意し(Kawakami et al., 2016)、DNAメチル化維持酵素(Dnmt1)活性に与える効果を調べた。その結果、非常に低い濃度(数十nM)のユビキチン化ヒストンH3が、Dnmt1活性を5倍以上促進することを見出した(Ishiyama et al., 2017)。また、共同研究で、両者は、活性促進に見られる濃度で結合すること、さらに両者が結合した複合体の立体構造を明らかにした。構造から、ユビキチン化ヒストンH3は、Dnmt1のN末端に存在するRFTSドメインをゆがめることが分かった。RFTSは、ユビキチン化ヒストンH3非存在下の時は、触媒部位にはまり込んで、触媒部位に基質DNAがアプローチできないようになっている。しかし、ユビキチン化ヒストンによりRFTSが構造変化し、触媒部位に基質DNAが入り込むことができるようになり、活性促進することが分かった。一方、高濃度の非修飾ヒストンH3が存在すると、Dnmt1のメチル化活性は阻害され、ヒストンH3がアセチル化されるとその阻害が解除されるということも、合成ヒストンH3を用いて明らかにできた(Mishima et al., 2017)。このように、目的の修飾を目的のアミノ酸に自由に導入する系を構築できたことにより、エピジェネティクス制御間の関連性を明らかにすることができた。一般的には、ユビキチン化蛋白は、ユビキチン化するアミノ酸をシステインに置換し、ユビキチンと目的の蛋白とを-S-S-結合でつなぐ。この連結方法では、還元剤を含む試験管内での反応は、両者が解離してしまい、効果を調べる事ができない。そこで、還元条件下でもユビキチンがはずなれないよう、特異的な合成法を開発した。還元条件下でも開裂しないユビキチン化ヒストンH3ペプチドを合成し(Kawakami et al., 2016)、これを用いることで、DNAメチル化との関連性を明らかにできた(Ishiyama et al., 2017)。合成は、ヒストンN末端領域のペプチドだけでなく、より生理的な機能解析をするため、ケミカルライゲーション法を使って、全長のユビキチン化ヒストンH3を用意することにも成功した(Kawakami et al, 2017)。
創発的活動を促進する教養法学の協調的学習教材の開発

教養科目を担当する法律の専門家ではない教員との半構造化インタビューで得られたデータのコーディングから、また、本報告者が実際に制作したウェブ教材の素材収集の過程で、当該学習教材の制作について、以下の視点が得られた:(1)法学学習の契機のユビキタス状況についてその理解を促進すること(2)参加型文化の視点から共同体における法の生成活動が重要であることを示唆すること(3)文学・芸術で歴史的に問われてきた法の理解を促進すること教養科目を担当する法律の専門家ではない教員との半構造化インタビューで得られたデータのコーディングから、また、本報告者が実際に制作したウェブ教材の素材収集の過程で、当該学習教材の制作について、以下の視点が得られた:(1)法学学習の契機のユビキタス状況についてその理解を促進すること(2)参加型文化の視点から共同体における法の生成活動が重要であることを示唆すること(3)文学・芸術で歴史的に問われてきた法の理解を促進すること研究目的(1.文学・芸術専攻学生の法的リテラシーの現状調査と教育体系の理論研究、2.法的リテラシー教材-ショートフィルム・ワークシート・ウェブサイト-の学生参加による協働制作、3.完成させた教材を活用した授業実施とその教育効果測定、及び、分析)及び、研究実施計画(1.教材作成前の資料収集、2.教材作成過程から教材完成、3.教材作成後の教育効果測定・分析の期間)に照らし以下4点を本研究実績として報告する1.文学・芸術専攻学生が学ぶべき「法的リテラシースタンダード」を定義づけする為の資料収集を行い、法的リテラシー判断基準として以下の3点を措定した:(1)文学・芸術分野における言表活動の自由についての知識獲得、(2)作品の知的財産としての価値を維持する権利についての知識獲得、(3)文学・芸術の表現活動を目指す学習期にある者の模倣活動、複製活動、公表行為、公衆送信活動、問題解決活動ついての知識獲得。2.量的調査実施のプレリサーチとしてインタビュー調査を開始した。3.法的リテラシースタンダードについての情報収集を行い、本研究で開発する教材を試験的に公表するためのウェブサイトを立ち上げた。文学・芸術を学ぶ大学生は、テキスト技法、作品制作技法等を修得する過程で、法的権利義務の発生、保護、衝突、などに少なからず直面する。所与の実践コミュニティとしての文学・芸術の教育ないし学習という状況に法教育の契機が埋め込まれている、という視座がここに生じうる。本年度の研究ではこうした視座から、1、文学・芸術分野における法と教育の理論研究を行い、2、文学や藝術の学習現場という実践コミュニティの具体に立ち入って法教育契機の経験的なデータを収集し、3、文学・芸術を学ぶ学生を調査対象として、法学習契機を日常の様々な制作実践に見いださせ、4、その典型的な場面をシナリオ化し教材(ウェブサイト、小冊子問題集)を学生と協働で作成する、そして、最終年度にあたる平成24年度には、5、その教育効果を測定、分析、発表し、本研究の一応の総括を行うことを予定していた。1、については当初、著作権、表現の自由、工業所有権といった実定法教育を文学藝術分野でどのようにとりあげるか、という問題意識をもって臨んでいたが、本年度は、文学藝術の学習現場の文脈そのものに焦点をあてて、そこに法教育の契機があるかどうかを探る、即ち、「はじめに文学藝術教育ありき」と考えて調査をすすめる必要があることが意識されるに至り、メディアスタディに埋め込まれた法教育契機の問題としてこれを雑誌『文学藝術』に発表した。同様の問題を扱う諸外国(特に英米法)の研究者(Austin Sarat,Paul Kahn,Franklin Strier,Oren Ben-Dor,Peter Goodrich)の業績について包括的にまとめて平成24年度法と教育学会に発表を行う予定である。2、については、メディアオーディエンス分析の観点から行った研究成果について、平成24年1月に開催されたTechnology Knowledge and Societyの第11回国際会議にて発表を行い、本研究者所属大学の教養教育課程開催の卒業生対象中学高校教員対象講演会にて講演を行った。3、4、の一部については本年度3月の調査をもとに、平成24年6月にホ文学・芸術を学ぶ大学生は、例えば、文学テキストの処理技法、最新のメディア技術を駆使したメディアアートを含む芸術作品の制作技法、二次創作、パロディやパスティーシュの技法、模写の実技と作品のインターネット上への公表など、を修得する過程で、法的権利義務関係の生成、保護、衝突、などに少なからず直面する。言い換えれば、所与の実践コミュニティとしての文学・芸術の教育ないし学習という状況は、法学習の契機をも同時に学生に提供しうる。そして、そのような学習の場には法教育の専門家でない者がかかわらざるを得ない。本研究者は、こうした「隠された法教育hidden legal education」の現場のワークに照準して研究を行った。具体的には、1、文学・芸術分野における法と教育の理論研究、2、文学や藝術の学習現場という実践コミュニティの具体に立ち入った法教育契機の経験的なデータ収集と分析((1)(3))、3、法学習契機を日常の様々な文学・芸術学習の実践に可視化させるような、教材制作にむけた協働作業、および、そうした営為についての教育効果を測定と分析(4)、を行った:(1)2012INTERNATIONALCONFERENCE on LAW and SOCIETY(米国)における論文発表(2)法と教育学会(日本)における学会発表(3)東アジア法と社会学会(中国)における論文発表(4)慶応義塾大学大学院システムデザインマネージメント研究科におけるワークショップ(招聘)

法学を専門としては学ばない文学・芸術系の学生も法の生成、維持、運用にかかわる市民感覚を高めるために、生ける法を学ぶための教材が必要であることを示唆したことに本研究の意義があり、教材制作という営為にかかわることによって彼らへの法教育がより効果的になされうることを、教育効果測定結果として平成25年にむけて発表予定である。本研究のフィールドは、高等教育機関の教育現場を想定しているが、震災の影響で、予定していた研究調査(研究倫理審査、参与観察する予定であった授業の担当教員とのすり合わせ、そして、学生参加希望者の募集)に大幅な遅れが生じてしまった。さらに、その派生問題として、文学・芸術における制作学習という実践のコミュニティではどのような法学習の文脈がたちあらわれるか、という課題点に多くの時間を割く事になったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。1、教材制作に遅れが出ているばかりか、当初予定していた学生の人数が減少し、その結果学生との協働制作過程で採取されるデータ収集に遅れが出ている。2、一口に教材制作といっても知識詰め込み型の教材を制作しても教育効果を期待できないのではという危惧がある。この2点の問題点を以下の方法で克服する。1、本研究者所属機関の夏期休暇をあててその挽回に務め、他大学の学生を広く公募する(その際、学生の個人情報、研究倫理に関して生じ得る問題への配慮を十分行う)。2、本研究の理論研究の成果をコンテンツ制作に取り入れ、シノプシスのみを与えてシナリオを創発する教材コンテンツを制作することとする。
逆行性脳潅流に関する実験的研究

1.逆行性脳潅流時の脳組織血流、酸素消費、二酸化炭素排出:逆行性脳潅流法では順行性体外循環時の1/2の脳組織血流および1/3の酸素消費、20%の二酸化炭素排出が観察され、逆行性潅流による脳への血液循環が確認できた。しかし、聴性脳幹反応は消失し、脳機能の維持は困難であった。2.逆行性脳潅流法と循環停止法との比較:逆行性脳潅流法は循環停止法に比して、脳組織PO2、脳組織内ATP値を高値を保つことができた。逆行性脳潅流により脳へ不十分ではあるが酸素供給が可能であり、施行中の酸素負債を軽減し、脳の虚血性変化を軽減することが可能であった。3.逆行性脳潅流法の至適潅流条件:逆行性脳潅流法では、静脈圧の上昇にともない脳脊髄液圧の上昇が観察された。脳圧亢進にしたがい脳循環は抑制されるため、静脈圧25mmHg以上の圧では酸素消費量は上昇するが、脳組織血流は有意の上昇を示さなかった。また、高い静脈圧では脳浮腫の発生も予想されるため、25mmHg以下の静脈圧が好ましいと考えられた。4.カラードマイクロスフェア法による逆行性脳潅流時の全身の組織血流:逆行性脳潅流法により順行性送血の約20%の脳組織血流が観察でき、その分布は脳全体への一様であった。上大静脈逆行性送血のみによっても上大静脈と下大静脈とのシャントにより腹部臓器への血液潅流が観察できた。5.逆行性脳潅流法の血液温による変化に関する検討:逆行性脳潅流においても順行性脳潅流と同様に血液温が低下するにしたがい動脈静脈間シャントが開き、毛細血管を流れる血流量は減少する傾向を示した。われわれは生理的循環に逆行する静脈系から動脈系への逆行性脳潅流の実験を行っている。平成3年度には1)逆行性脳潅流時の脳組織血流および組織血流分布の解明、2)潅流血液量、潅流圧による脳組織血流の変化の解明、3)逆行性脳潅流時の脳の組織代謝の解明、4)逆行性脳潅流時の脳機能の解明を目的に動物実験を行い、以下の知見を得た。1.20°C逆行性脳潅流モデル犬により脳組織血流を水素クリアランス法およびカラ-ドマイクロスフェア-法を用い測定した。外頸静脈圧25mmHgの条件下で、頭頂葉大脳皮質で順行性体外循環時の約1/2の脳組織血流が観察された。また、脳の組織血流は各脳葉、小脳、脳幹部において一様の分布を示し、大脳皮質は髄質に対し多くの組織血流を示した。2.脳組織血流は潅流血液量、潅流圧により変化を示した。潅流血液量の増加により外頸静脈圧は上昇し、脳組織血流も上昇した。しかし、脳脊髄液圧も上大静脈圧の上昇に伴い上昇し、脳圧亢進をきたした。

逆行性潅流法の至適潅流条件の設定は困難であるが、Starlingの仮説から考え、脳脊髄液圧(毛細血管圧)を25mmHg以下に保つことが、脳浮腫の予防のために肝要と考えられた。3.外頸静脈圧25mmHgの条件下の20°C逆行性脳潅流モデル犬で、順行性休外循環時の約1/3の酸素消費と約1/4の二酸化炭素の排出が観察され、逆行性脳潅流法により酸素供給が可能であることが証明できた。4.20°C1時間逆行性脳潅流モデルと20°C1時間循環停止モデルとの比較実験を行った。逆行性脳潅流モデルでは脳組織PO2、PH、ATPの温存が観察され、施行中の酸素負債も軽微であり、逆行性脳潅流法により、脳保護効果が認められた。5.常温逆行性脳潅流モデル犬において聴性脳幹反射を測定した。聴性脳幹反射は均行性脳潅流開始直ちに消失し、逆行性脳潅流により脳機能の保持は行えなかった。しかし、順行性体外循環再開後、直ちに正常に復したため逆行性脳潅流法による脳保護効果は認められた。現在、逆行性脳潅流時の微小循環の解明および逆行性脳潅流法の臨床応用における安全性の向上を目的に研究を行っている。1.逆行性脳潅流法の至適潅流条件の検討:逆行性脳潅流法では、静脈圧の上昇にともない脳脊髄液圧の上昇が観察された。脳圧亢進にしたがい脳循環は抑制されるため、静脈圧25mmHg以上の圧では酸素消費量は上昇するが、脳組織血流は有意の上昇を示さなかった。また、高い静脈圧では脳浮腫の発生も予想されるため、25mmHg以下の静脈圧が好ましいと考えられた。2.カラードマイクロスフェア法による逆行性脳潅流時の全身の組織血流に関する検討:逆行性脳潅流法により脳全体への一様な血流分布が観察された。上大静脈逆行性送血のみによっても上大静脈と下大静脈とのシャントにより腹部臓器への血液潅流が観察できた。下大静脈送血を付加することにより腎血流の増加が認められ、腹部臓器の保護効果が予想された。上大静脈送血に大腿動脈送血を付加することにより逆行性脳潅流は若干障害されるが、腎血流は有意に上昇し腹部臓器に対する良好な保護効果が認められた。3.逆行性脳潅流法の血液温による変化に関する検討:逆行性脳潅流においても順行性脳潅流と同様に血液温が低下するにしたがい動脈静脈間シャントが開き毛細血管を流れる血流量は減少した。4.逆行性脳潅流時のカテコラミンの変化に関する検討:常温逆行性脳潅流においては循環停止法と同様に施行直後から急激な内因性カテコラミンの上昇を認め、生体に対しては循環虚脱の病態と考えられた。1.逆行性脳潅流時の脳組織血流、酸素消費、二酸化炭素排出:逆行性脳潅流法では順行性体外循環時の1/2の脳組織血流および1/3の酸素消費、20%の二酸化炭素排出が観察され、逆行性潅流による脳への血液循環が確認できた。しかし、聴性脳幹反応は消失し、脳機能の維持は困難であった。2.逆行性脳潅流法と循環停止法との比較:逆行性脳潅流法は循環停止法に比して、脳組織PO2、脳組織内ATP値を高値を保つことができた。逆行性脳潅流により脳へ不十分ではあるが酸素供給が可能であり、施行中の酸素負債を軽減し、脳の虚血性変化を軽減することが可能であった。3.逆行性脳潅流法の至適潅流条件:逆行性脳潅流法では、静脈圧の上昇にともない脳脊髄液圧の上昇が観察された。4.カラードマイクロスフェア法による逆行性脳潅流時の全身の組織血流:逆行性脳潅流法により順行性送血の約20%の脳組織血流が観察でき、その分布は脳全体への一様であった。5.逆行性脳潅流法の血液温による変化に関する検討:逆行性脳潅流においても順行性脳潅流と同様に血液温が低下するにしたがい動脈静脈間シャントが開き、毛細血管を流れる血流量は減少する傾向を示した。
Charcot-Marie-Tooth病の分子遺伝学的アプローチによる病態解明

Charcot-Marie-Tooth病(CMT)は,遺伝性ニューロパチーの中で最も代表的な頻度が高い疾患であり,正中神経の運動神経伝導速度によって脱髄型と軸索型に分類されている.これまで約100の原因遺伝子が報告されており,その臨床的複雑性および遺伝的多様性のために臨床診断による原因遺伝子の推測は困難である.そこで今回、本邦のCMT疑いの1005症例を対象に次世代シークエンサーを用いてCMTの包括的遺伝子解析を実施し,これら症例の遺伝学的特徴について検討し、その結果を報告した.その結果1005例中,301例(30.0%)に病的変異を同定した.同定例における頻度はGJB1 (66例, 21.9%)とMFN2 (66例, 21.9%)が最も多く,次いでMPZ (51例, 16.9%)であった.脱髄型では45.7%の変異が同定され,同定例における頻度はGJB1(40.3%)が最も多くMPZ (27.1%), PMP22 (6.2%), NEFL(4.7%)と続いた.軸索型CMTでは同定率が22.9%と脱髄型と比較して低く、同定例における頻度はMFN2 (37.2%), MPZ (9.0%), HSPB1 (8.3%), GJB1 (7.7%), GDAP1 (5.1%), MME (5.1%)の上位6遺伝子で72.9%を占めた.発症年齢においては10歳が最も頻度が高く、さらに早期発症のCMTの診断率が高かった.北海道と四国を除く地域で,GJB1, MFN2, MPZの3遺伝子が上位を占めた.発症年齢分布については010歳発症が最も頻度が高く,さらに軸索(30.5%)および脱髄(54.8%)どちらも共に高い診断率を示した.本研究により,本邦における大規模な包括的遺伝子解析によりCMTの遺伝子頻度を示し,国際誌に報告した.これまでのところ順調で、一年間に250例のCMT患者の遺伝子解析を追加し、総数は2200例を超える。本年度は遺伝子検査のまとめをJNNP誌に報告することができた。継続してCMTの遺伝子検査は継続して行う。また、新規のCMTの原因遺伝子を発見しており、それらを踏まえて、遺伝子解析すすめていきたい。また、GJB1,MORC, MFN2など遺伝子別に臨床的な特徴と遺伝子検査の結果を明らかにしてきたが、今後もさらに、世界的にも最も進んだ遺伝子診断を行っているので、CMTの分子病対を包括的に明らかにしていく。
植物の形態構築と細胞骨格の遺伝制御機構に関する解析

葉の発生の制御機構を理解することは、植物の形の理解に必須である(Tsukaya,1995a,b)。しかし双子葉植物では葉の発生が複雑で、解剖学的解析が困難であった。本研究はそこで、アラビドプシスを材料に、葉の発生過程の研究に、細胞レベルでの発生遺伝学を導入することで解析を進めてきた(Tsukaya,1995a)。今年度の成果として、まずangustifolia(an)変異体とrotundifolia(rot)変異体との解析から、アラビドプシスの葉形が、細胞の極性伸長を通じて、縦と横との二方向独立に制御されていることを、初めて明らかにした(Tsuge et al.in press)。次に本解析から、細胞の極性伸長制御機構が示唆されたので、an変異をやや抑圧する劣性突然変異、macrophyllaの解析を行った。その結果、本変異により葉の横方向への伸長が促進されることが判明した(Tsukaya et al.,1995)。これは先の仮説を支持する結果である。さらに微小管の配向の解析から、AN遺伝子が葉の細胞表層微小管の配向制御に関与していることが、強く示唆される結果を得た(Tsuge,Ph.D.thesis)。このほか、細胞の伸長と分裂を共に制御するLAN1遺伝子、葉の全形を司るAS遺伝等の解析も進めた。一方アラビドプシスの子葉の特性(Tsukaya et al.1994)を活かすべく、子葉の変異体のスクリーニングを行ない、得られた変異体について、現在遺伝子学的解析を進めている。以上の成果は、双子葉植物の葉形態形成の発生遺伝学的解析として初のものである。本研究のさらなる進展のため、T-DNAタッギングラインからのスクリーニングを、なお続行中である。
マイクロマシニングによる超小型真空ポンプの開発

超小型真空ポンプの開発には、超微小領域の真空計測を含めた複合的な研究が必要である。本研究では以下の四点にしぼり基礎的な研究を行った。1.超小型真空計の開発真空ポンプを超小型化した場合、真空測定子も超小型化する必要がある。マイクロマシニングにより超小型の片持ち梁を製作し、これを用いた光学式振動形圧力センサーを開発した。理論的な検討を加え、よい一致をみた。気体以外にも液体の密度計に光熱効果を適用できるという新たな知見が得られた。2.駆動機構の開発非接触で駆動できるアクチュエータが開発できればマイクロメカトロニクスの分野に与える影響も大きいと考えられる。本研究では半導体レーザを用いた光学式アクチュエータを開発し、これをポンプの駆動に使用した。形状記憶合金の光熱変位を利用することによって、300mWのレーザ照射によって、3mmの変位、180gwの発生力が得られた。3.マイクロマシニングアクチュエータの駆動部分およびポンプ本体にマイクロフォトリソグラフィにより金属の薄板を加工しこれを積み上げる方法を適用し、Siの異方性エッチングを利用したマイクロマシニングは真空計用の超小型振動子の製作のみに用いた。4.ポンプの製作ダイアフラム式ポンプを試作し、本研究で開発した光学式アクチュエータを用いて駆動した。レーザ出力300mWで1.5mの吐出圧力と、1mの揚水能力で流量が140μl/minの特性が得られた。逆止弁が気体には適していないので真空ポンプとしては動作しなかったが、ポンプの片側に気体を入れた部屋をつくりこれを封止しておけば、この空間を1000mmH_2Oの圧力だけ140μl/min程度で気体を排気することができる。マイクロマシニングによる超小型モーターが実用的なものになれば、ターボ分子ポンプの翼の部分等もマイクロマシニングで作ることによって1mm以下のスケールでの真空ポンプが可能であると考えられる。この場合は非接触での回転が必要であるので、例えばレザーマイクロマニピュレーション等の手法を取り入れることが有効であると考えられる。半導体の超微細加工技術により、機械部品の製作・組み立てを行うマイクロマシニングは近年注目され、血液の微小流量制御などに使用され始めている。本研究の最終的な目的はマイクロマシニングで製作した部品を用い、超小型の全光学式の真空ポンプを開発することにある。今年度は初年度であり以下のような研究を行い新たな知見を得た。1.油回転ポンプの形態を有する真空ポンプを考えた場合、流体中において小形の板の振動がどの程度えられるかをまず確かめる必要があると考えられる。圧電素子の場合は液体中でも充分な振動がえられることはすでに確かめられているので、まず、光熱効果により液体中でも板が振動するかどうかを確認した。その結果、水中においても光熱中振動による共振現象が明確に生じるという新しい知見がえられた。光熱振動は空気中や真空中ではよく研究されているが液体中での実験は全くはじめてである。また、その共振周波数は液体の密度や粘性に依存するので、光学式の超小形の密度計あるいは粘性計などへの応用も考えられる。

2.液体中においても充分に光熱効果による振動が起きることが確かめられたので、光学式の水流ポンプの開発を実施し、弁の振動を確認している。超小型のポンプを製作するためには以下の4点から険討する必要があると考え、3年間の計画を立てた。即ち、1)ポンプの駆動源となる小型のアクチュエータの開発、2)ポンプの機構部品として最も重要な弁の製作、3)真空度の計測をするための超小型の真空計の開発、4)マイクロマシニングで製作した機構部品の装置への取り付け方法、である。本年度には1)から3)までについて険討し、以下のような研究成果が得られた。1.小型のアクチュエータとして従来の圧電素子にかわり、レーザ光によって動作する光学式アクチュエータを考案し、基礎的な実験を行った。形状記憶合金の光熟振動を利用することにより、10mWのレーザ出力で負荷1g・Wで振幅50um程度の振動が得られることがわかり、本研究で計画している超小型ポンプ用に使用できることが明らかになった。この研究成果については、Rev.Sci.Instrum.,64(1993)6月号にて公表予定である。2.小型の弁を製作し、圧電素子を用いた実験により十u1/min程度の水流ポンプとして動作することが明らかになった。上記で開発したアクタュエータを用いた光学式小型水流ポンプについては現在実験を行っている。3.マイクロマシニングにより製作した超小型のレーザ真空計については研究を殆ど終了した。本年度の研究成果はRev.Sci.Instrum.,63(1992)3781.にて公表した。また、圧力計測に及ぼす振動子の形状効果およびマイクロマシニングで製作した場合の片持ち梁近傍におかれたシリコン基板の影響についても実験を行い、理論解析とよい一致を示すことが明らかになった。これらの研究成果はJpn.J.Appl.Phys.,32(1993)2月号およびVacuum,44(1993).にて公表される予定である。超小型真空ポンプの開発には、超微小領域の真空計測を含めた複合的な研究が必要である。本研究では以下の四点にしぼり基礎的な研究を行った。1.超小型真空計の開発真空ポンプを超小型化した場合、真空測定子も超小型化する必要がある。マイクロマシニングにより超小型の片持ち梁を製作し、これを用いた光学式振動形圧力センサーを開発した。理論的な検討を加え、よい一致をみた。気体以外にも液体の密度計に光熱効果を適用できるという新たな知見が得られた。2.駆動機構の開発非接触で駆動できるアクチュエータが開発できればマイクロメカトロニクスの分野に与える影響も大きいと考えられる。本研究では半導体レーザを用いた光学式アクチュエータを開発し、これをポンプの駆動に使用した。形状記憶合金の光熱変位を利用することによって、300mWのレーザ照射によって、3mmの変位、180gwの発生力が得られた。3.マイクロマシニングアクチュエータの駆動部分およびポンプ本体にマイクロフォトリソグラフィにより金属の薄板を加工しこれを積み上げる方法を適用し、Siの異方性エッチングを利用したマイクロマシニングは真空計用の超小型振動子の製作のみに用いた。4.ポンプの製作ダイアフラム式ポンプを試作し、本研究で開発した光学式アクチュエータを用いて駆動した。レーザ出力300mWで1.5mの吐出圧力と、1mの揚水能力で流量が140mul/minの特性が得られた。
雌/非還元型、雄/還元型の配偶子形成をする四倍体フナの減数分裂機構解明

ギンブナ四倍体(4n)には雌雄両性が生じる。雌は4n卵を産み、雌性発生により繁殖するが、雄は減数分裂により2n精子を産する。本研究は4nギンブナを材料に、減数分裂を「する(雄)」、「しない(雌)」が何により決められるかを明らかにしようとした。その結果、(1)4nには2n精子を産する雄の外に、異数性精子を産する雄もいること、(2)キンギョ雄との人工交配では、3n雌個体により、3nのみ、4nのみ、あるいは3nと4n両方の子孫が生じる場合があること、(3)材料とした群馬県城沼由来集団には大陸系ギンブナを多く含むことが判明した。4nのゲノム構成により、多様な生殖が生じる可能性が示唆された。1.倍数性と頻度:城沼(群馬県館林市)に由来する群馬県水産試験場(前橋市)飼育♀ギンブナ集団の倍数性をフローサイトメトリー法で解析した結果、二倍体(2n)1尾、三倍体(3n)78尾、四倍体(4n)12尾、高2n異数体5尾、高3n異数体5尾の頻度であった。飼育♂集団13尾はすべて4nであった。4n♀10尾と同♂13尾について、RAPD-PCR法によるDNAフィンガープリント(DNA-FP)分析を行ったところ、16プライマーで多型が得られた。4n合計23尾はすべて個体毎に異なるDNA-FPを示し遺伝的に異なった。mtDNAには2つのハプロタイプが認められたが、3n、4n♀♂はいずれのハプロタイプにも出現した。2.非還元4n卵形成機構:4尾の3n♀より採卵し、キンギョ♂精子を媒精したところ、うち2尾は3n子孫のみを、1尾は3n、4n子孫両方を、1尾は4n子孫のみを作った。これらのDNA-FP解析は3nは遺伝的に同一クローンであるが、4nは精子核を受け入れ多型的であることを示した。4n♀より、卵巣を摘出し、卵母細胞培養と卵核胞単離を行ったが、良好な減数分裂染色体像の観察にはいたらなかった。3.還元2n精子形成機構:2014年に4n♀から得た卵にキンギョUV照射精子を授精して作出した雌性発生魚を1月間0.1μg/Lのメチルテストステロン入り飼育水に浸漬したところ、人為性転換に作成した。これらは予想と異なり還元2n精子は作らなかった。これら性転換4n♂は鞭毛に異常をもち、頭部直径の大きい(3.9-4.2μm:対照キンギョは3.0-3.2μm)異数性精子(1n-2n)を形成した。これら精子でキンギョ卵を授精したところ0.6-4.9n子孫が生じ、これらはすべて奇形で孵化しなかった。4.雌雄差の分子機構:性転換♂が予想に反し2n精子を形成しなかったため、検討は次年度にもちこされた。群馬水試♀親魚集団に2n、3n、4n、異数体が存在すること、4nには雌雄がいること、個々の4nは遺伝的に異なることが判明した。しかし、最適産卵期を逃したため、多くの3n及び4n♀由来の卵に、キンギョ精子、4n♂の2n精子を授精する実験ができなかった。また、十分な数の成熟♀が利用できなかったため、卵母細胞培養による卵核胞単離による減数分裂染色体像の観察が困難であった。自然の4n♂と同様に、4n♀からキンギョUV精子授精により得た雌性発生子孫を雄性ホルモン入りの飼育水に浸漬することにより作成した性転換4n雄は還元型2n精子を形成することを予想したが、これらは還元型の2n精子を作らず、異常形態を持つ異数性精子を形成した。このことが雌雄差の分子機構解明のための材料の不足をもたらしたが、同じ遺伝的組成を持ちながら自然の4n♂は還元型の2n精子を形成するのに対して、♀から性転換した4n♂は異常な精子形成をすることが判明した。以上の様に計画通りに行かなかった部分もあるが、4n親魚の遺伝的解析による非クローン性の解明、キンギョ精子との受精のみで4n子孫を作る♀親魚の観察などの成果が得られ、次年度計画につなげることができたので、おおむね順調に進展していると判断した。1.城沼由来飼育集団の組成:2016年4月に同集団ギンブナ214尾を入手した。フローサイトメトリー(FCM)の結果、半数体(1n)-二倍体(2n)モザイク2尾(雄2)、2n 37尾(雌26:雄11)、三倍体(3n)169尾(雌168:雄1)、2n-3nモザイク1尾(雌1)、四倍体(4n)4尾(雌3雄1)、不明1が検出された。系統特異的なマーカーと倍数体(3n, 4n)特異的な反復配列のPCR分析から、3nのうち108尾は在来系、61尾(雄1尾を含む)は大陸系と判定され、高い頻度で大陸系ギンブナを含むことが判明した。2.精子形成の二型:2014年に得た群馬水産試験場で飼育の4n雄13尾はいずれも還元的に2n精子を形成した。

これに対して2013年入手の4n雄の精子をFCMで調べたところ、1n以下から8n(モードは1nと2n間)のDNA量に相当する広いヒストグラム(CV値21%)を示し、昨年度報告の性転換4n雄と同様の異数性精子形成が認められた。顕微鏡観察の結果、精液中および精巣中の精子(あるいは精子様細胞)の頭部サイズが不均一であることも判明した。従って、ギンブナ4n中には還元型2n精子を作る雄と異数性精子を作る雄の2つのタイプがあることが初めて明らかになった。3.三倍体由来四倍体子孫の精子形成:昨年度、3n雌とキンギョ雄の交配の結果、(1)3n子孫のみ、(2)4n子孫のみ、(3)3nと4n子孫の両方を産する個体が存在することが判明した。(3)の子孫では3nは全雌であったが、4nには雌雄が生じた。これらの4n雄を飼育して、FCMを行ったところ、精巣と精液のいずれにおいても、広い範囲のDNA量に相当するヒストグラム(CV値24%)を示し、これらの精子の頭部サイズは不均一であった。従って、上記交配より生じる4n雄は異数性精子を形成するタイプであった。ギンブナ四倍体(4n)には雌雄両性が生じる。雌は4n卵を産み、雌性発生により繁殖するが、雄は減数分裂により2n精子を産する。本研究は4nギンブナを材料に、減数分裂を「する(雄)」、「しない(雌)」が何により決められるかを明らかにしようとした。その結果、(1)4nには2n精子を産する雄の外に、異数性精子を産する雄もいること、(2)キンギョ雄との人工交配では、3n雌個体により、3nのみ、4nのみ、あるいは3nと4n両方の子孫が生じる場合があること、(3)材料とした群馬県城沼由来集団には大陸系ギンブナを多く含むことが判明した。4nのゲノム構成により、多様な生殖が生じる可能性が示唆された。産卵期の早い時期に、人為採卵とキンギョ♂精子ならびに4n♂精子を用いた人工交配を試み、出来るだけ多数の3n♀、4n♀からの子孫を得て、その倍数性と遺伝特性を解明する。また、4n♀の卵母細胞より、卵核胞を多数得て、減数分裂時の染色体像を観察する。さらに、卵核胞崩壊以降に経時的に固定した卵の組織細胞学的な観察から、減数分裂時の染色体と分裂装置の挙動を観察する。性転換4n♂は使わず、自然に生じた4n♂を材料として、精巣のフローサイトメトリーにより精原細胞、精母細胞、精細胞を分離し、精母細胞からは減数分裂像を観察する。4n雌雄の生殖細胞を密度勾配遠心分離により分離し、これらの生殖細胞で発現するRNAを採取し、cDNAを合成し、雌雄で発現に差のある遺伝子候補を単離する。発現差のあるcDNAを同定し、その配列を決定するとともに、定量RT-PCR法を用いて発現動態を検討する。これにより減数分裂のオン/オフをコントロールする機構に迫る。水産遺伝育種学分担研究者の都合により、予定していた学会への出張ができなかったため。平成28年度春期のギンブナ類親魚の倍数性判別、DNA分析と産卵・交配実験、および成果物子孫の飼育実験の物品費に使用予定である。
「モノづくり」の実用化を指向した多機能性有機触媒による超臨界流体中ポリ乳酸合成

H24-25年度の公募研究において新たに見いだしたCO2可塑化重合法(CPP法:CO2 Plasticizing Polymerization)をさらに発展させ、「安全・安心・実用的なポリ乳酸合成」を達成するために、「有機分子触媒」と「超臨界二酸化炭素(scCO2)」の特長を活かしたポリ乳酸合成法を創製する。特に、以下の2つの課題について焦点を絞り、真に持続可能なモノづくり科学の実用化を目指した。1.実利用性に優れている高分子量ポリ乳酸合成を指向した多機能性有機分子触媒の開発2.乳酸からの有機分子触媒的フロー型ポリ乳酸合成ならびにリサイクル手法の開発平成27年度において、以下の項目について研究を実施した。(1)乳酸からの有機分子触媒的フロー型ポリ乳酸合成:ブレンステッド酸触媒と求核触媒の最適組合わせを検討し、安価に入手できる乳酸からラクチド化、続く重合のステップをscCO2中、フローシステムで確立することを試みたが、ラクチド化が高収率で進行しないことが明らかになった。(2)ポリ乳酸の有機分子触媒的分解によるリサイクルシステムの構築:高分子量のポリ乳酸の分解は容易ではないため、有機分子触媒の高反応性とscCO2の高溶解性によりポリ乳酸の加溶媒分解を達成したが、(1)におけるラクチド化が効率的ではないため、リサイクルシステムの構築には至らなかった。当初の予定にない研究計画として、鎖状ポリ乳酸とトポロジーの異なる環状ポリ乳酸を高収率、高光学純度でバッチならびにフロー系において合成できることが明らかになった。得られた高光学純度ポリ乳酸は熱的特性の優れたステレオコンプレックスを与えることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。H24-25年度の公募研究において新たに見いだしたCO2可塑化重合法をさらに発展させ、「安全・安心・実用的なポリ乳酸合成」を達成するために、「有機分子触媒」と「超臨界二酸化炭素(scCO2)」の特長を活かしたポリ乳酸合成手法を創製する。特に、以下の2つの課題について焦点を絞り、真に持続可能なモノづくり科学の実用化を目指す。1.実利用性に優れている高分子量ポリ乳酸合成を指向した多機能性有機分子触媒の開発2.乳酸からの有機分子触媒的フロー型ポリ乳酸合成ならびにリサイクル手法の開発平成26年度において以下の項目について研究を実施した。(a) scCO2中で有効に機能する多機能性有機分子触媒の開発:汎用性を向上するために高分子量化を検討したところ、分子量の低下が観察された。これはバックバイティングに起因する現象と推察される。課題解決の鍵は「求核性を向上しながら、scCO2中に溶解し、分子内反応を抑制する多機能性有機分子触媒の開発」であり、触媒部位、scCO2用界面活性部位、立体制御部位を同一分子内に有する有機分子触媒をデザイン・合成した結果、9-azajulolidine系触媒が反応性を向上しながら分子量7万を達成した。(b) scCO2中有機分子触媒的高分子量ポリ乳酸合成:Mw = 10万を目標値とし、高分子量化を検討した。PPY触媒を基本骨格として、3,5位に置換基を有する触媒を合成したが高分子量化を達成できなかった。その代わりとして、従来、ポリ乳酸合成において問題となっていたポリ乳酸のエピメリ化について種々の有機分子触媒を用いて検討した結果、scCO2中でエピメリ化が抑制されることが明らかになった。さらにブレンステッド酸を触媒としたとき、反応性が向上し、エピメリ化が進行しないことが明らかとなった。よって、本手法により光学純度の高いポリ乳酸を有機分子触媒条件下で合成できた。(a) scCO2中で有効に機能する多機能性有機分子触媒の開発(平成26年度達成)

(b) scCO2中有機分子触媒的高分子量ポリ乳酸合成(平成26年度検討済み)当初の計画にはないエピメリ化を伴わないscCO2中有機分子触媒的ポリ乳酸合成を達成した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後、以下の計画により、本研究課題を推進する。(c)乳酸からの有機分子触媒的フロー型ポリ乳酸合成(d)ポリ乳酸の有機分子触媒的分解によるリサイクルシステムの構築なお、26年度末にscCO2中有機分子触媒的環状ポリ乳酸合成を見いだしたので、これについても研究項目として加える。
量子井戸系における光電流分光法の研究

量子閉じ込め系における面内光電流スペルトル法の基礎的メカニズムを解明することを目的として、本研究ではGaAs/AlAs超格子の光電流信号強度を励起光波長(エネルギー)、格子温度、光励起強度の関数として測定を実施し、以下の結果および結論が得られた。1.量子井戸中での励起子共鳴光吸収による光電流スペルトル構造には、格子温度、光励起強度に依存して予測されていた正負のスペクトルピーク構造が現われ得ることが明らかになった。2.光電流スペルトルにおける正負のスペクトルピーク構造は、量子井戸層とその下(励起光の照射方向について)に在る基板GaAsバルク層の電気的に独立な二重伝導層モデルにより、説明できることが明らかになった。即ち、二重伝導層内の光励起キャリアーの(励起子発光再結合による)再結合長の大小関係が格子温度、光励起強度に依存して変化することにより説明できる。このことを、二重伝導層内の発光再結合時間の直接測定と、比較することにより示した。3.上記の項目2の結論は、光電流伝導メカニズムについての励起子効果、即ち、電気的に中性な励起子と云う形での光生成キャリアーの消滅が再結合長の変化を与えている点にはよく対応しているが、光電流信号強度の絶対量の減少については議論できなかった。この点については、多様な量子構造試料について実施すべく、別途新年度での研究続行を計画している。
PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造解析

PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造を明らかにする研究の一環として、以下の研究を行った。まず、PKC及びDGKの脂肪酸応答ドメインの同定を行ったところ、εPKCとDGKγにおいてはC1AではなくC1Bドメインが脂肪酸と相互作用すると予想された。一方、γPKCはC1AとC1Bのどちらかがあれば充分であった。ついで、NMR解析に供するため、DGKγC1A及びC1BドメインとGSTまたはMBPとの融合蛋白質を作製を試みた。最終的に、500mlの大腸菌培養液から約0.5mgのMBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bを得た。一方、GST融合蛋白質の収量は非常に少なかった。そこで、MBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bをプロテアーゼ処置によりタグを切断した後、Superose 6HRを用いたゲルろ過に供した。しかし、目的のペプチドが得られなかった。そこで、より微量なペプチドを検出するために、C末端にもFLAGタグを融合したMBP-DGKγC1A-FLAG及びMBP-DGKγC1B-FLAGを作製し、同様の実験を行った。その結果、DGKγC1A-FLAGとDGKγC1B-FLAGは、ともにボイドボリュームに溶出され、aggregationを起こしている可能性が強く示唆された。この傾向は、同様に作製したMBP-DGKγC1-FLAG, MBP-εPKCC1-FLAG及びMBP-εPKCC1A-FLAGでも認められた。また、作製した各融合蛋白質を再フォールディング後、PDBu結合能を測定したが、有意な結合は認められなかった。以上のことから、MBP融合PKC及びDGKのC1ドメインを大腸菌を用いて発現させた場合には、正常な高次構造を保持していない可能性が示唆された。今後、HAタグや、バキュロウイルス発現系など対応策を講じていく必要があると思われる。PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造を明らかにする研究の一環として、本年度は以下の研究を行った。1.これまでの研究より、DGKγにおいてはC1AではなくC1Bドメインが脂肪酸と相互作用すると予想された。そこで、1次構造上相同性の高い両ドメインの高次構造をNMR解析により比較することで、脂肪酸応答に必要な高次構造を明らかにしようと考えた。そのために、まずDGKγC1A及びC1BドメインとGSTまたはMBP(Maltose binding Protein)との融合蛋白質をコードするプラスミドを構築した。ついで、各プラスミドを大腸菌に形質転換し、グルタチオン及びアミロースカラムを用いて各融合蛋白質を精製した。その結果、500mlの培養液から約0.5mgのMBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bを得た。そこで、以降の実験にはMBP融合蛋白質を用いることとした。現在、MBP融合蛋白質をプロテアーゼ処置し、亜鉛イオン存在下でリフォールディングさせたのち、目的ドメインを精製するためのゲルろ過及びイオン交換を行っている。2.一方、DGKγ全体の高次構造を解析するため、GST融合DGKγをコードするバキュロウイルスを作製した。このウイルスを感染させた昆虫細胞培養液から、グルタチオンカラムを用いて全長DGKγを簡易精製することに成功した。