hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
樹木の生存に影響をおよぼす木部エンボリズム発生機構の解明

以上より,ダメージのシュートでは秋に受けるストレスが春のシュートの褐変に何らかの関連があることが示唆された。1.マツ木部のキャビテーションに対する感受性の解明クロマツのキャビテーション感受性に関する追加実験とアカマツのキャビテーション感受性の評価をおこなったところ,アカマツでも地上部の幹は地下部の根に比べて感受性の高いことがわかった。さらに,仮道管有縁壁孔の形態を走査型電子顕微鏡で観察したことろ,根のマルゴ網目の小孔の大きさが幹のそれに比べて大きいことがわかった。エアーシーディング理論によると,マルゴ網目の小孔が大きい程キャビテーション感受性が高くなる。本研究で観察したマルゴ網目の小孔の大きさの違いが,根と幹のキャビテーション感受性の違いの原因であると考えられる。次に,マツノザイセンチュウを接種したクロマツにおこるエンボリズムを調べたところ,生き残ったマツでも木部にはエンボリズムが生じていることがわかった。この研究成果は第8回国際植物病理学会議(ニュージーランド)で発表した。2.ハイマツの木部のキャビテーションに対する感受性の解明乗鞍岳の標高2750m付近に分布するハイマツ林で,春に針葉が褐変化したシュートと健全なシュートの蒸散速度(スーパーポロメーター使用)と水ポテンシャルの季節変化(7月から9月)を測定することで,それぞれのハイマツの水分生理状態を評価した。成長期間初期,褐変化したシュートは健全なシュートに比べて水不足がきびしいことがわかった。富士山の樹木限界付近に分布するヒメコマツでも葉の褐変化が見られたので,ハイマツの褐変化と対比するためにヒメコマツのキャビテーション感受性を評価したところ,ハイマツ同様に顕著なエンボリズムは認められなかった。これらのことから,ハイマツとヒメコマツにおこる針葉の褐変化は針葉の脱水が主要な原因である可能性が示唆されたが,来年度もさらに測定を重ねる多くのデータを得る必要がある。III.海外共同研究者であるユタ大学・ジョン・シュペリー教授を訪れ,平成13年度から14年度夏にかけて得られたデータの解析と実験機器改良のための情報を収集した。1.アカマツ木部のキャビテーションに対する感受性の解明マツの苗木にマツノザイセンチュウを接種した後、木部のキャビテーション感受性を空気注入法で作成したvulnerability curveを解析することで評価した。マツノザイセンチュウ接種後のvulnerability curveの変化から、低い注入圧でもキャビテーションが発生し、さらに低い注入圧で水分通導機能を失うことがわかった。さらに、vulnerability curveから水分通導度が半分に低下するmean cavitation pressureを計算したところ、樹体の部位には関係なく、地上部、地下部ともにキャビテーション感受性の高まりを確認した。このことから、マツノザイセンチュウが侵入したマツでは、健全なマツでは起こりえないような水不足の程度でもキャビテーションが発生するために、急激に木部の水分通導機能が失われることでマツが枯死すると考えられた。さらに、当初計画していなかった新しい実験をおこなった。
成虫休眠を調節する脳内神経回路とその生理機能

インスリン産生細胞(IPCs)は成虫休眠を調節する脳内神経回路の中枢である(Ojima, Hara et al., 2018)。初年度(H29年度)は、このIPCsにおける温度応答特性を電気生理学的手法により解析した。その結果、IPCsの温度応答は羽化後の飼育条件によって経験依存的に大きく変容する事が見出された。すなわち、羽化後、非休眠条件で育てられた雌のIPCsは低温に対する脱分極性の応答能を獲得し、低温刺激に対して大きな脱分極と持続的発火を示すが、休眠条件で育てられた場合にはそのような応答能は獲得されず、低温暴露時の発火は認められなくなる。この結果に基づき、本年度(H30年度)は非休眠条件のIPCsで見られる大きな脱分極応答の分子機構の解析を進めた。その結果、特定の味覚受容体がこの応答に関わることを新たに発見した。この味覚受容体がIPCsにおいて発現している事を実証するため、パッチ電極を用いた細胞質の回収による単一細胞RT-PCRを実施し、発現を確認した。さらに、IPCsで発現する4つのインスリン様ペプチド(Dilp1, 2, 3, 5)の発現についても単一細胞RT-PCRによる発現解析を行なった。その結果、それらペプチドの発現は温度応答特性と同様に、羽化後の飼育条件によって変化することが明らかとなった。したがって、環境依存的な膜特性の変化とインスリン様ペプチド発現の変化を組み合わせることにより、IPCsは卵巣発育を巧みに調節し、成虫休眠制御の中枢として機能するものと想定される。本研究ではIPCsにおける低温応答の分子機構の解明を目的の一つとして位置付けている。この点について、H29年度に既に同定したK2Pチャネルに続き、H30年度は味覚受容体の関与を新たに明らかにする事ができた。したがって、低温応答の分子実態の解明は着実に進展している。一方、当初のもう一つの目的としていたDorsal lateral peptidergic neurons (DLPs)に関する実験はやや遅れている。しかし、H30年度は当初の計画を超えた単一細胞での遺伝子発現解析に成功した。これにより、生理学実験で得られる単一細胞の膜特性の解析結果を、分子的アプローチから裏付ける強力な実験手法が確立された。以上を総合的に判断し、研究はおおむね順調と評価した。本研究では成虫休眠を制御する新規細胞としてDLPsを想定し、この細胞の卵巣発育における機能解析を計画している。この計画に基づき、H30年度に確立した単一細胞での遺伝子発現解析を新たなツールとして加え、以下の実験を実施する:1.予備実験より、DLPsで発現するある特定のホルモン受容体が休眠調節に関わる事が明らかとなっている。しかし、そのホルモンがDLPsの機能をどのように調節するのかは分かっていない。H31年度は、このホルモンを作用させた時にDLPsにどの様な膜電位応答が生ずるのかを調べ、DLPsの電気活動と休眠との関係を探る。2. DLPsがIPCsといかに協調して休眠を制御するのかを探るため、DLPsとIPCsの接続関係を調べる。具体的には、光遺伝学的手法によりIPCs/DLPsを活性化し、その時のもう一方のニューロンの膜電位応答を調べる。また、別のアプローチとして、IPCsとDLPsから同時に電気活動記録を行う。この二つの手法を用いた実験から両者の接続関係について結論を得る。ショウジョウバエの雌の成虫は短日・低温・饑餓条件に曝されると、高頻度で卵巣の発育を停止する。この卵巣発育の調節は、脳内に存在するインスリン産生細胞の活動によって支配されている。過去の多くの研究から、インスリン産生細胞は様々なしくみで栄養情報を受け取っている事が知られている。しかし、日長や温度といった環境情報がインスリン産生細胞にどのような影響を与えているのかは明らかでない。この疑問を明らかにするため、本年度は“温度"に的を絞り、温度変化がインスリン産生細胞の活動に与える影響を電気生理学的手法により調べた。その結果、(1)羽化直後のインスリン産生細胞は低温刺激に対して大きな膜電位変動を示さない、(2)羽化後一週間非休眠条件(長日・室温・摂食)に置かれた雌のインスリン産生細胞は、低温に応答して大きく脱分極し、低温曝露中持続的に発火する、(3)羽化後一週間休眠条件(短日・低温・饑餓)に置かれた雌のインスリン産生細胞は羽化直後と同様に低温に対して大きな膜電位変動を示さない、という三つのことが明らかとなった。これらの結果から、インスリン産生細胞は羽化後の飼育条件に依存して低温に対する応答性を変化させることが分かった。これは、環境に応じた卵巣発育の変化という生物の生理的応答を、脳内の一つの神経細胞の電気活動の変化から読み解いた発見である。更に、羽化後一週間非休眠条件に置かれた雌のインスリン産生細胞で見られる温度応答の分子機構の解析を行ったところ、K2Pチャネルをコードする一つの候補遺伝子が見つかった。これらの研究成果はThe 3rd International Insect Hormone Workshopで発表を行った。本研究計画は、インスリン産生細胞の温度応答に関わるチャネル遺伝子の同定を一つの目標として設定している。この遺伝子として、本年度は既に一つの候補遺伝子を見つけるに至った。また、インスリン産生細胞の低温応答能の獲得が羽化後の環境条件に依存するという知見は当初計画の想定外の成果であった。

以上の事から、研究の進捗状況は概ね順調に進展していると判断される。インスリン産生細胞(IPCs)は成虫休眠を調節する脳内神経回路の中枢である(Ojima, Hara et al., 2018)。初年度(H29年度)は、このIPCsにおける温度応答特性を電気生理学的手法により解析した。その結果、IPCsの温度応答は羽化後の飼育条件によって経験依存的に大きく変容する事が見出された。すなわち、羽化後、非休眠条件で育てられた雌のIPCsは低温に対する脱分極性の応答能を獲得し、低温刺激に対して大きな脱分極と持続的発火を示すが、休眠条件で育てられた場合にはそのような応答能は獲得されず、低温暴露時の発火は認められなくなる。この結果に基づき、本年度(H30年度)は非休眠条件のIPCsで見られる大きな脱分極応答の分子機構の解析を進めた。その結果、特定の味覚受容体がこの応答に関わることを新たに発見した。この味覚受容体がIPCsにおいて発現している事を実証するため、パッチ電極を用いた細胞質の回収による単一細胞RT-PCRを実施し、発現を確認した。さらに、IPCsで発現する4つのインスリン様ペプチド(Dilp1, 2, 3, 5)の発現についても単一細胞RT-PCRによる発現解析を行なった。その結果、それらペプチドの発現は温度応答特性と同様に、羽化後の飼育条件によって変化することが明らかとなった。したがって、環境依存的な膜特性の変化とインスリン様ペプチド発現の変化を組み合わせることにより、IPCsは卵巣発育を巧みに調節し、成虫休眠制御の中枢として機能するものと想定される。本研究ではIPCsにおける低温応答の分子機構の解明を目的の一つとして位置付けている。この点について、H29年度に既に同定したK2Pチャネルに続き、H30年度は味覚受容体の関与を新たに明らかにする事ができた。したがって、低温応答の分子実態の解明は着実に進展している。一方、当初のもう一つの目的としていたDorsal lateral peptidergic neurons (DLPs)に関する実験はやや遅れている。しかし、H30年度は当初の計画を超えた単一細胞での遺伝子発現解析に成功した。これにより、生理学実験で得られる単一細胞の膜特性の解析結果を、分子的アプローチから裏付ける強力な実験手法が確立された。以上を総合的に判断し、研究はおおむね順調と評価した。本研究では成虫休眠を制御する新規細胞としてDLPsを想定し、この細胞の卵巣発育における機能解析をH30年度以降の計画としている。この計画に基づき、H29年度に得られた研究成果を含めて、H30年度は具体的に以下の実験を行う:1. DLPsの卵巣発育における機能を探るため、DLPsとインスリン産生細胞との相互関係を光遺伝学的手法と電気生理学的手法を組み合わせて解析する。2.温度応答性チャネルの候補として同定されたK2Pチャネルを主なターゲットとしつつ、インスリン産生細胞の温度応答の分子機構の解析を進める。3. H29年度に新たに明らかとなった「インスリン産生細胞の環境依存的温度応答能の獲得」がどのようなしくみによるのかを探索する。
イタリアからフランスに向かった政治亡命者と移民の生活世界をめぐる歴史研究

近現代における人の移動をめぐって、従来しばしば別個のものとして理解され研究されてきた「移民」と「亡命」が生活世界において隣接した関係にあることに着目し、イタリアにおいて最も多くの亡命者を生み出したファシズム期を中心に両者の生活世界における具体的な諸関係を明らかにすることを目的とした。最初に、統計的な史料により、イタリアからフランスへの移民はピエモンテ、トスカーナの出身者が多いこと、ファシズム期の亡命者もほぼ同じ地域から多数生じていること、フランスでの居住地は移民、亡命者ともフランス南東部とパリに集中していることを明らかにした。ついで、フランスにおけるイタリア移民の政治的組織化に尽力した活動家=亡命者であるルイージ・カンポロンギ(トスカーナ地方マッサ・カッラーラ県出身)の生涯を概観し、活動内容を分析した。その結果、彼が最初に亡命した1898年の時点では生活に困窮して職人層の移民たちに援助を受けたこと、ファシズム期には移民が多数居住する地方を巡回してファシズムに反対する講演活動を頻繁に行ったことなど、移民と亡命者の日常生活における具体的な関わりの一端を明らかにした。さらに、ローマの国立中央文書館に所蔵されている「反政府活動者記録CPC(Casellario Politico Centrale)」を史料として、ファシズム期に最も多くの亡命者を生んだ地域の一つであるピサ県からカルチナイアというコムーネ(市町村)を選出し、プロソポグラフィックな分析を行った。その結果、亡命者はファシズム政権成立直後にその時点で二十代の年齢で亡命した者が多く、大半が既存の移民コミュニティがあるアルル市とその周辺で農業に従事したこと、1920年代後半から1930年代前半にかけては多くが政治活動から遠ざかるが、1935年のエチオピア戦争を契機としてその中から再び政治活動に立ち戻り、移民コミュニティの政治的動員を図る人たちが現れたこと、などを明らかにした。イタリアの移民統計(18761925)をもとにイタリアからフランスに向かった移民数を地域別に整理した結果、ピエモンテ、トスカーナ、ロンバルディアの順に多いことが明らかとなった。また、フランスの先行研究から、イタリア移民は20世紀前半のフランスにおいて、プロヴァンスなど南東部に多く在住していることが明らかとなった。他方、イタリアからフランスに向かった亡命者に関する先行研究から、ファシズム期にはトスカーナ出身者が数量的に最も多く、ピエモンテがそれに次ぐこと、亡命者の生活の拠点がフランス南東部とパリに集中していることが明らかになった。以上の予備的な考察から、トスカーナ出身者でフランス南東部に在住した移民と亡命者に対象を限定し、事例研究を行うことにした。その最初の試みとして、2003年9月にローマの国立中央文書館(ACS)において「反政府活動者記録保管所(CPC)」の目録から、トスカーナ出身でフランスに在住することが記録された活動家=亡命者を抜き出す作業を行った。その結果、1893年のエグモルト事件において多くの被害者を出したコムーネ(市町村)から多くの亡命者が生まれており、経済的な移民と政治的な亡命者が同一の地域的基盤から生まれていることが明らかになった。ついで、2004年3月のローマ国立中央文書館における調査では、フランスにおけるイタリア移民の政治的組織化に尽力した活動家=亡命者であるルイージ・カンポロンギ(トスカーナ州マッサ・カッラーラ県出身)に関するCPCの史料を閲覧した。その結果、彼が最初に亡命した1898年の時点では生活に困窮して職人層の移民たちに援助を受けたこと、ファシズム期には移民が多数居住する地方を巡回してファシズムに反対する講演活動を頻繁に行ったことなど、移民と亡命者の日常生活における具体的な関わりの一端を明らかにすることができた。

昨年度の研究成果を受けて、今年度はファシズム期を中心に、トスカーナ地方からフランス南東部に在住した移民と亡命者を対象とした事例研究を行うこととした。ローマの国立中央文書館に所蔵されている「反政府活動者記録(CPC)」のデータベースより、トスカーナ地方の中でピサ県が最多数の政治亡命者を生んだことと、CPCに登録されたピサ県出身者3771名のうち、フランス在住者(すなわちフランスへの亡命者)は1048名を数え、反政府活動を行ったと認定された者の四人に一人がフランスへの亡命を余儀なくされていたことが判明した。つづいて、ピサ県からカルチナイアCalcinaiaというコムーネ(市町村)を事例に選出し、CPCの史料に基づきプロソポグラフィックな分析を行うこととした。カルチナイアを選出した理由は、ここがピサ県の中でも最も多くのフランス在住者を生んだコムーネの一つであることに加え、1893年に起きたエグモルト事件においても最多数の被害者を生んだコムーネであり、19世紀後半からの移民現象との連続性の中で政治亡命の問題を考察することができる場所だからである。カルチナイアからフランスに亡命した61名(全員男性)を分析した結果、ファシズム政権成立直後にその時点で二十代の年齢で亡命した者が多く、職業としては農業に従事する者が大半を占め、亡命先はアルル市とその周辺に集中していることが明らかになった。また、1920年代後半から1930年代前半にかけては大半が政治活動から遠ざかるが、そのままイタリア公安の監視対象から除外される人と、1935年のエチオピア戦争後再び政治活動に立ち戻る人に二分されることが判明した。今年度の基礎的な作業を踏まえて、今後、カルチナイア一帯における政治文化の分析と、アルルにおけるカルチナイア出身者のコミュニティ分析をさらに進めていく必要性を確認できた。
福祉移送サービスにおけるリスク分析

2006年には,「道路運送法の一部改正」によって福祉有償運送の法的位置づけがされた.このことによりNPO等が有償で移動・送迎サービス(以下,移送サービス)を行うことが可能となった.またこれらによって,わが国の移送サービスは大幅に伸び,高齢者や障害者等の移動制約者の移動が確保されることになる.しかし,法的整備の促進や法的位置づけがされても様々な問題を抱えている.それら問題の中に事故等のリスク問題がある.移送サービスの事故には,乗降中の転落事故,車両が衝突した時に車椅子利用者が補助ベルトやアームレストに腹部を強打して内臓を損傷する事故等がある.そこで,本研究では移送サービスに関わるリスクの分析を行うことを目的とし,3つの調査を行った.(1)移送サービスを行う団体・法人,ドライバーにアンケート調査を行い,事故とヒヤリ・ハット内容を明らかにした.(2)知的・精神障害者の移送サービスを行うドライバーにアンケート調査を行い,知的・精神障害者の利用状況,ヒヤリ・ハット内容等を明らかにした.(3)ドライブレコーダーを移送サービスを行う車両に搭載し,運行中の危険挙動の詳細を明らかにした.この3つの調査よりヒヤリ・ハットの種類と対策,事故の種類と対応,危険挙動の種類と要因等より,リスク管理マニュアルの内容を細分化する必要があることが推測された.細分化する項目は,調査結果より[利用者属性],[利用者の有無],[運行ルートの違いによる危険挙動の有無],[ドライバー属性],[状況別]の5項目が得られた.2006年には,「道路運送法の一部改正」によって福祉有償運送の法的位置づけがされた.このことによりNPO等が有償で移動・送迎サービス(以下,移送サービス)を行うことが可能となった.またこれらによって,わが国の移送サービスは大幅に伸び,高齢者や障害者等の移動制約者の移動が確保されることになる.しかし,法的整備の促進や法的位置づけがされても様々な問題を抱えている.それら問題の中に事故等のリスク問題がある.移送サービスの事故には,乗降中の転落事故,車両が衝突した時に車椅子利用者が補助ベルトやアームレストに腹部を強打して内臓を損傷する事故等がある.そこで,本研究では移送サービスに関わるリスクの分析を行うことを目的とし,3つの調査を行った.(1)移送サービスを行う団体・法人,ドライバーにアンケート調査を行い,事故とヒヤリ・ハット内容を明らかにした.(2)知的・精神障害者の移送サービスを行うドライバーにアンケート調査を行い,知的・精神障害者の利用状況,ヒヤリ・ハット内容等を明らかにした.(3)ドライブレコーダーを移送サービスを行う車両に搭載し,運行中の危険挙動の詳細を明らかにした.この3つの調査よりヒヤリ・ハットの種類と対策,事故の種類と対応,危険挙動の種類と要因等より,リスク管理マニュアルの内容を細分化する必要があることが推測された.細分化する項目は,調査結果より[利用者属性],[利用者の有無],[運行ルートの違いによる危険挙動の有無],[ドライバー属性],[状況別]の5項目が得られた.福祉移送サービスは福祉有償運送として法的に整備された。これにより、わが国の移動・送迎サービスは大幅に伸び、高齢者・障害者等の移動困難者の地域での移動が確保されることになる。しかし、法的に移動・送迎サービスが整備されても様々な問題が生じている。その一つに「安全性」という問題が存在している。それらは2種免許の問題による運転の安全面、シートベルト等の安全装置に関する法的な基準がないこと、介護時に発生する介護事故等である。このような問題が存在しているものの移動・送迎サービスの事故等はほとんど把握できていない。今後、誰もが移動しやすい交通環境を整えるためには、NPO等の移動・送迎サービスの発展が不可欠であり、これらの問題を解決することが重要である。つまり、事故調査は急務の課題である。本調査では、NPO等の移動・送迎サービスを行っている団体にアンケートを配布し、事故の件数、種類、ヒヤリ・ハットを調査した。その結果を以下に示す。・研修については、ほとんどの団体がなんらかの研究を実施・受講している。その中でも他団体(地域ネットワーク団体)による研修の受講が半数以上である。・過去1年間の事故経験は、約2割の団体が有りと回答し、34件が報告された。その内容としては、「対物事故」、「運転中の事故」と車両に関する事故が多く、介助事故は報告されていない。・ドライバーは男性が約7割で、経験年数は約4年であった。資格の有無については、持っている人が6割以上存在し、そのうち7割の人がホームヘルパー2級を持っている。・ドライバーが経験したヒヤリ・ハットは286件報告され、半数以上のドライバーが経験している。・ヒヤリ・ハットの内容は、自動車事故の可能性に関するものが多く、急ブレーキなどによる利用者の転倒の危険性についても報告されている。・車両事故件数の推定において、移動・送迎サービスは年間の走行距離は短く事故にあうリスクは低い。福祉移送サービスは福祉有償運送として法的に整備された。今後、誰もが移動しやすい交通環境を整えるためには、NPO等の移動・送迎サービスの発展が不可欠であり、安全性を高める必要がある。本研究は、福祉移動サービスの安全・運行などのデータを取るため、ドライブレコーダーを使用する。

そして、これらのデータの運転挙動部分を取り上げ、データを整理することによって福祉移動サービスのこれからの課題と展望について考察することを目的とする。得られた結果を以下に示す。・利用者が乗車していない場合で危険挙動が多くみられた.・危険挙動の要因はブレーキによるものが多くみられ,その要因としては,交通量・速度・明暗の違いになどよるものである.・危険挙動箇所では,幹線道路での交差点付近走行時,幹線道路進入時に危険挙動が多くみられた.・ドライブレコーダー取り付け経過時間と危険挙動件数の関係では,取り付け経過時間が長くなるにつれ,件数も増えていく傾向がみられた.・利用者の有無に関係なく、ドライブレコーダー設置による安全意識が向上していることが分かった。・ドライビング・レコーダーを使用することで、今まであまり捉えられることのなかったヒヤリ・ハット場面の探索には有効に使用できることが分かった。とくに、運行管理者・ドライバーともに安全について考えるには良いツールであると考えられる。
生物活性ペプチドの分子内架橋による精密立体制御法に関する研究

ペプチド関連物質を活性発現に必要な立体構造も含め精密にデザインされた構造に変換できる新たな化学合成法の開発が必須である。本研究では新たなペプチド分子環化法および分子内架橋形成制御法を確立し、Conotoxin類をモデルとして、分子内の任意の位置で3組以上の架橋を有する精密に立体制御されたペプチドを高純度・高収率で得ることができる新たな化学合成法を確立することを目的とした。その結果、環形成反応を妨げている鎖状ペプチドの強固な構造(立体配座)を緩める新しい方法を開発し、ペプチドの剛直な立体配座に由来する分子内架橋形成の障壁を除くことにより、新たな立体構造の精密制御法の開発に成功した。分子内ジスルフィド結合の形成ならびに選択的な結合形成法に関する研究を行った。ペプチドの分子内に3組のジスルフィド結合を形成する場合、6つのシステイン残基がそれぞれ選択的にペアリングする必要がある。この場合、ランダムに結合するとその組合せは多数存在するため立体構造が制御された生成物を選択的に得ることは困難である。この問題を解決するためには、予め架橋を形成する相手のみと選択的に反応するよう設計し、各架橋の形成の順番をペプチド主鎖合成後に自由に選択できるようにした。すなわち、システイン残基のチオール基の保護基を選択し、反応条件を逐次厳しくすることによって実現可能であると考えた。一般に、複数の組合せが存在する場合、架橋形成の順番は温和な条件から順次進行するため、一旦主鎖を合成した後に架橋形成の順序を変更することができない。このためペプチド主鎖の構造によっては、自由度の低い立体配座による構造上の障害によって架橋形成反応が完結できないという決定的な問題にしばしば遭遇する。そこでそれぞれ相互に影響しない独立した条件で架橋形成を達成できる新しい反応法を開発が必須となる。これらの反応には、光化学反応法や電解酸化法、電解還元法など、一般化学反応法とは異なる特異性を有するものを含めて研究を行った。光化学反応法は光の透過性の問題から通常ペプチドの固相合成法などに導入することは困難であるが、本研究課題の中核技術である、逆ミセル反応法は、透明な溶液中に数十ナノメートルの微細粒子分散状態が形成され、UV照射反応も実現できるため、生体分子多段階合成に革新的な方法論をもたらすものと期待される。また、メディエーターを用いた電解法も逆ミセル反応法に応用できるため、生体分子の化学修飾を飛躍的に広げることができた。実際に生体内で活性を発現する立体構造の解明や医薬品原料としての応用には、これら基本となるペプチド関連物質を精密にデザインした立体構造に変換できる新たな化学合成法の開発が必須である。本研究では、天然物をモデルとして高度に制御された通常の方法では達成困難なペプチドの分子内架橋形成法を導入し、精密に立体構造を固定した有用ペプチド誘導体を高純度、高収率で大量に合成する革新的な方法を確立することを目的とした。これまでに申請者らが開発した逆ミセル連続反応法を用いた極めて効率の良い液相合成反応法を導入し、結合形成の順序を自在に制御する選択的分子内ジスルフィド架橋形成によるトポイソマーの完全選択合成、ペプチド主鎖の環化が困難なペプチド分子にも適用できる分子内環化反応等を新たに導入することによって、立体構造を制御した高度な修飾ペプチドの合成を実現する基本戦略に基づき研究を行い、その実現性の高さを立証することができた。本研究では、Conotoxinをモデルとして高度に制御された通常の方法では達成困難なペプチドの分子内架橋形成法を導入し、精密に立体構造を固定した有用ペプチド誘導体を高純度、高収率で大量に合成する革新的な方法を確立することを目的とする。申請者はこれまで、電解酸化によって活性化したカチオン種でチオールをトラップする方法を数多く開発してきた。今回、この方法を用いてターゲットとするジスルフィド結合を形成する方法と併せ、各組のチオール基がフリーになったものについて、活性カチオン中間体を用いて架橋を形成する。本法は中性の支持塩を溶解したニトロメタン中で進行するものでありこの溶液は疎水性タグが結合したペプチドが逆ミセルを形成するシクロヘキサンとは相互に分離するため、下層のニトロメタン溶液に溶解している架橋原料物質を直接電極酸化することによって、複雑なペプチドに架橋形成することができるものと期待される。また架橋剤の構造を変換することにより、架橋の長さを変えることも可能である。この新たな方法は、酸化還元剤等が不要であり、また、酸化処理される電極表面にペプチドが接触しないため、非常に温和な条件で修飾反応が実現できるという特徴を有する。本研究ではこの新たな方法を用いた架橋形成反応を実現する。計画通り、非天然型架橋形成法への応用、ならびにペプチド分子内の多数のジスルフィド結合を非天然型架橋で置換する新たな方法の開発に成功した。非天然型架橋を有するペプチドは医薬品としての利用価値が高と期待され、今後はナノスケールで製剤化することにより、これまで注射薬としての投与方法に限られていたペプチド医薬品活性原料を、経皮吸収、経肺吸収などによって投与することができればその応用法が著しく広がる。また、分子内に複数の非天然型架橋構造を持ち精密に立体制御されたペプチドを大量かつ高純度に合成する技術を確立することによって、血中や消化管内で分解を受けにくい医薬品原料としての価値が高まり、近年急速に伸びるペプチド医薬への応用が期待される。

今回、この方法を用いてターゲットとするジスルフィド結合を形成する方法と併せ、各組のチオール基がフリーになったものについて、活性カチオン中間体を用いて架橋を形成する。本法は中性の支持塩を溶解したニトロメタン中で進行するものであり、この溶液は疎水性タグが結合したペプチドが逆ミセルを形成するシクロヘキサンとは相互に分離するため、下層のニトロメタン溶液に溶解している架橋原料物質を直接電極酸化することによって、複雑なペプチドに架橋形成することができるものとの期待から研究を行った。その結果、架橋剤の構造を変換することにより、架橋の長さを変えるた新たな方法の開発に成功した。この新たな方法は、酸化還元剤等が不要であり、また、酸化処理される電極表面にペプチドが接触しないため、非常に温和な条件で修飾反応が実現できるという特徴を有し、ペプチド立体構造制御ならびに活性発現に重要手法を確立することができた。ペプチド関連物質を活性発現に必要な立体構造も含め精密にデザインされた構造に変換できる新たな化学合成法の開発が必須である。本研究では新たなペプチド分子環化法および分子内架橋形成制御法を確立し、Conotoxin類をモデルとして、分子内の任意の位置で3組以上の架橋を有する精密に立体制御されたペプチドを高純度・高収率で得ることができる新たな化学合成法を確立することを目的とした。その結果、環形成反応を妨げている鎖状ペプチドの強固な構造(立体配座)を緩める新しい方法を開発し、ペプチドの剛直な立体配座に由来する分子内架橋形成の障壁を除くことにより、新たな立体構造の精密制御法の開発に成功した。環形成反応を妨げている鎖状ペプチドの強固な構造(立体配座)を緩める新しい方法を開発する。すなわち、アミノ酸を逐次結合することによって得られる鎖状ペプチドは、アミド結合および分子内水素結合によって主たる立体配座は強固に固定されているものが多いが、この状態で分子内架橋形成や環化反応の実施を試みても、分子の剛直性によって達成できない場合が多い。この問題点を解決するためにペプチド分子の立体構造を分子内環化反応に適合する立体配座変換法を開発し、天然のイモ貝神経毒成分であり、鎮痛薬として期待される天然型、非天然型ペプチドの体系的合成に応用する。また、ペプチドの剛直な立体配座に由来する、分子内架橋形成の障壁を除くための研究を行う。電解あるいは光照射によって容易に脱保護できることに加え、疎水性タグとしての機能を持った新しいN-アルキルアミド形成法を開発し、多様なペプチド環化を達成する。さらに、非天然型架橋形成法に応用する、天然型、非天然型ペプチドの体系的合成法を確立する。非天然型架橋を有するペプチドは医薬品としての利用価値が高と期待され、今後はナノスケールで製剤化することにより、これまで注射薬としての投与方法に限られていたペプチド医薬品活性原料を、経皮吸収、経肺吸収などによって投与することができればその応用法が著しく広がることが期待される。さらにジスルフィド結合を形成する方法と併せ、各組のチオール基がフリーになったものについて、活性カチオン中間体を用いて架橋を形成する方法を新たに開拓する。本法は中性の支持塩を溶解したニトロメタン中で進行するものである。
円偏光照射によるクロム錯体の光不斉反転反応を用いた液晶系の光制御

円偏光照射によりラセミ体からR体またはS体を不斉選択する反応は、絶対不斉合成のひとつとして重要である。また、ネマチック液晶はキラル化合物の添加により、液晶分子がらせん状に配向し、コレステリック液晶になることが知られており、液晶系と組み合わせると個々のキラル分子の光誘起による構造変化増幅して、バルクな液晶の相変化として検出することが可能になると考えられる。本研究は、(1)配位子を工夫することにより、光不斉反転反応を行うクロム錯体をネマチック液晶中に溶解させた液晶ドープ系を作成し、(2)円偏光照射による可逆的な液晶相構造(ネマチック←→コレステリック)の光制御を実現し、(3)ねじれピッチ強度を決める液晶部位と錯体配位子の強相関相互作用の機構を明らかにする、ことを目的として研究を行った。昨年度から引き続いて円偏光照射によるクロム錯体の光不斉反転反応を用いた液晶系の光制御をおこなって、円偏光照射によるホメオトロピック-フィンガープリント組織転移に対する基板界面の効果を明らかにし、また、本年度は円偏光照射によるディスコチック液晶中でのフィラメント構造の変形を観察した。さらに本年度新たに、光反応誘起により高速で垂直に曲がるポリイミドゲルを実現した。また、ネマチック液晶はキラル化合物の添加により、液晶分子がらせん状に配向し、コレステリック液晶になることが知られており、液晶系と組み合わせると個々のキラル分子の光誘起による構造変化を増幅して、バルクな液晶の相変化として検出することが可能になると考えられる。本研究は、(1)配位子を工夫することにより、光不斉反転反応を行うクロム錯体をネマチック液晶中に溶解させた液晶ドープ系を作成し、(2)円偏光照射による可逆的な液晶相構造(ネマチック←→コレステリック)の光制御を実現し、(3)ねじれピッチ強度を決める液晶部位と錯体配位子の強相関相互作用の機構を明らかにする、ことを目的としている。円偏光照射による液晶相の制御は、これまでに3件報告されているのみ(いずれも外国)であるが、本研究では、すでにラセミ体のクロム錯体(Cr(Buacac)_3)/液晶系に少量のキラル助剤を添加した系で、可逆的なフィンガープリント組織の形成と消失を世界で初めて写真で示すことができた。本年度は、この系以外に、室温ネマチック液晶への溶解性を上げるためにクロム錯体の配位子の分子構造を工夫して、13種類のクロム錯体を合成し、それらの液晶への溶解性、溶液中での円偏光による光反転能、円偏光照射による液相組織の制御能を調べた。また、Cr(Buacac)_3よりもより室温ネマチック液晶への溶解度の高いオクチル側鎖をもつCr(Ocacac)_3では、少量のキラル助剤の存在下でのホメオトロピック-フィンガープリント間の円偏光照射による組織構造変化に対する液晶セル厚の効果を明らかにした。また、キラル助剤のない場合にも、Cr(Ocacac)_3/ベンジリデンアニル(9:100)系で円偏光照射によるコレステリック相形成を示唆する結果が得られている。
ＲＮＡｉ法を用いた網膜における神経ステロイド代謝酵素の機能解析

神経ステロイドは脳内において合成されるステロイドで、末梢内分泌器官と同様に生理活性を示す。近年網膜においても種々のステロイドが合成されることが報告され、神経ステロイドが網膜の神経細胞の発達と分化およびその機能調節に重要な役割を果たすことが示唆されている。本研究では、網膜で産生される神経ステロイドが、網膜の発生と視機能調節にどのように関与しているのかを明らかにするために、ステロイド代謝酵素のうち、アンドロゲンやプロゲステロンの代謝に関与する酵素である5α-リダクターゼおよび5β-リダクターゼの特異抗体を作製し、ラット網膜におけるこれら酵素の局在を免疫組織学的に検討した。神経ステロイドは、中枢神経組織で生合成・代謝されるステロイドホルモンであり、神経伝達物質、神経成長因子などの様々な作用を示して、神経機能を調節する。近年、脳内と同様に、網膜内でも神経ステロイドが合成されることが報告されている。本研究は、網膜において産生される神経ステロイドの一連の代謝経路を、ステロイド代謝酵素の局在と発現動態を統合的に解析することによって、網膜の発生と視機能調節に神経ステロイドがどのように関与しているのかを明らかにすることを目的としている。まず第一に、正常ラット網膜において、神経ステロイド代謝に関与する酵素が、網膜を構成する6種類の神経細胞とグリア細胞であるミュラー細胞のいずれかの細胞に存在するのかを特定し、さらに発生に伴う発現の変化を解析することを中心に研究を進めた。前年度において、アンドロゲンの合成・代謝に関与する酵素である5β-リダクターゼについて、特異抗体を作製し、網膜における発現を免疫組織学的に検討した結果、成熟ラットではミュラー細胞の突起と細胞体、および視細胞に認められ、また生後1日の未成熟な網膜の神経節細胞層にも陽性反応が認められた。アマクリン細胞にも、生後2週頃に陽性反応が認められ、これらの細胞の陽性反応には、いくつかの発現パターンが認められたことを報告した。本年度においては、活性型アンドロゲンの合成・代謝に関与する酵素である1型および2型5α-リダクターゼについて、特異抗体を作製し、その抗体の特異性を検討した後、網膜における発現を免疫組織学的に検討した。抗体の特異性については、GFP融合タンパクをCOS-1細胞に強制発現させて、ウエスタンブロットおよび、免疫染色により、2種の酵素抗体とも、それぞれに交差反応を示さないことを確認した。ステロイドホルモンは、内的および外的要因に反応して副腎や生殖器などの末梢内分泌器官で分泌され、全身の標的器官で生体内の恒常性維持などの生理作用を示す。脳内においても末梢内分泌器官と同様に、プログネノロンやプロゲステロンなど生理活性を示すステロイドが合成されることが報告され、神経ステロイドとして知られるようになった。近年、網膜においても種々のステロイドが合成されることが報告され、神経ステロイドが網膜の神経細胞の発達と分化およびその機能調節に重要な役割を果たすことが示唆されている。本研究は、網膜で産生される神経ステロイドの一連の代謝経路を、ステロイド代謝酵素の局在と発現動態を統合的に解析することによって、網膜の発生と視機能調節に神経ステロイドがどのように関与しているのかを明らかにすることを目的としている。これまでに、アンドロゲンの代謝に関与する酵素である5β-リダクターゼについて、特異抗体を作製し、成熟ラットの網膜において、ミュラー細胞の突起と細胞体、および視細胞に発現が認められることなどを示した。本年度において、活性型アンドロゲンやアロプレグナノロンなどの神経ステロイドの代謝に関与する酵素である1型および2型5α-リダクターゼについて、特異抗体を作製し、網膜における発現を免疫組織学的に検討した。成熟ラットの網膜において、1型は網膜すべての層で陽性反応が認められ、2型は視細胞の内節や内顆粒層、神経節細胞層などに強い反応が認められた。これらを明らかにするために、ステロイド代謝酵素特異抗体を用いた組織化学的手法、およびウエスタンブロットやreal time PCRといった分子生物学的手法を駆使して研究を行う。

本年度は、まず正常ラット網膜において、神経ステロイド代謝に関与する酵素が、網膜を構成する6種類の神経細胞とグリア細胞であるミュラー細胞のいずれかの細胞に存在するのかを特定し、さらに発生に伴う発現の変化を解析すること中心に研究を進めた。アンドロゲンの合成・代謝に関与する酵素である5βーリダクターゼについて、特異抗体を作製し、抗体の特異性をウエスタンブロット、および免疫組織染色により確認した後に、網膜における発現を免疫組織学的に検討した。成熟ラットではミュラー細胞の突起と細胞体、および視細胞に認められた。また生後1日の未成熟な網膜の神経節細胞層にも陽性反応が認められた。アマクリン細胞にも、生後2週頃に陽性反応が認められた。これらの細胞の陽性反応には、いくつかの発現パターンが認められた。これらの結果およびこれまでの研究結果から、網膜内の神経ステロイドは、脳内と同様に様々な神経機能の調節に関与していることが推察される。研究2年目に当たる本年度は、当初、前年度までに得られたデータを基に、RNAi法によるステロイド代謝酵素の遺伝子解析の手法を確立することを中心に進めることを計画していたが、正常網膜での神経ステロイドの発現動態の解析に研究の大半を費やしてしまったために、やや遅れているといえる。ただし、これまで蓄積されたデータ、および現在進行中の研究を合わせると、次年度での研究の達成は見込めると確信している。研究初年度にあたる本年は、正常網膜における神経ステロイド代謝酵素の局在、および発現の変化について、研究を行うことを計画した。これまでの研究結果、および本年の研究結果により、いくつかの神経ステロイド代謝酵素の局在について明らかになり、また、現在も進行中の研究もあわせるとおおむね順調に進展しているといえる。交付申請書に記載した研究実施計画に沿って、研究を進めていく。これまでに得られたデータを基に、RNAi法によるステロイド代謝酵素の遺伝子解析の研究手法を確立し、正常網膜で網膜形成に対するステロイド代謝酵素の役割、視機能調節にかかる役割について解析を行い、さらに、網膜変性疾患モデル動物を用いた神経ステロイドの発現とその変化についても研究を行い、正常網膜での局在解析で得られた所見と比較対比して、変性疾患モデルにおけるステロイド代謝酵素の生理作用について解析する。次年度においては、本年度の研究によって得られたデータをもとに、RNAi法によるステロイド代謝酵素の遺伝子解析の研究手法を確立することを中心に進め、さらに研究最終年度にかけて、網膜変性疾患モデル動物を用いた神経ステロイドの発現とその変化について研究を行い、さきに正常網膜での局在解析で得られた所見と比較対比して、変性疾患モデルにおけるステロイド代謝酵素の生理作用について解析する。これまでの研究結果から得られたデータを基にして、RNAi法による神経ステロイド代謝酵素の遺伝子解析を中心に研究を進める。胎生期から生後および成熟期、老齢期に至る発達過程において、網膜形成に対するステロイド代謝酵素の役割、視機能調節にかかる役割について順次解析を行う。本年度で得られた結果を基にして、RNAi法によるステロイド代謝酵素の遺伝子解析を中心に研究を進める。
早期自動運動を可能とする新しい腱縫合法の基礎的研究

前年度の実験より、4種類の主縫合法(double loop法、double Kessler法、modified Kessler法、single loop法)においてナイロン糸よりポリエステル糸を用いた際に引っ張り張力が有意に大きく、縫合法ではdouble loop法とdouble Kessler法が優れていることがわかり、私達は更なる工夫を加え縫合が容易な新しい縫合法開発した。この新縫合法は1本のループ糸だけを用いるため腱の滑動を阻害する結び目が1つと少なく、力学的には近年開発された他の縫合法と同等の引っ張り張力を示した(35N)。腱縫合後の早期自動運動療法に十分使用可能と思われた。腱縫合法の重要な構成要素である補助縫合法についても力学的検討を行った。5種類の補助縫合法(結節縫合、連続縫合、Lambert法、cross-stitch法、Halsted法)について主縫合と同様の実験を行った。縫合にはポリプロピレン糸を用いた。Halsted法が最も高い張力を示したが、縫合が複雑なため時間がかかり臨床で使用するのは困難であると思われた。連続縫合は簡便であること、cross-stitch法は張力が比較的高く主義も容易であることから両者とも推奨される補助縫合と思われた。研究結果の一部はH12第15回日本整形外科学会基礎学術集会およびH13年56th Annual meeting of American Society for Surgery of the Handにて発表した。屈筋腱縫合法における縫合糸および主縫合法の力学的特性について検討した。結果と考察1:離開張力は4-strandではMS,Cr,DL,DK法の順で高値となり、2-strandではMKがSL法より高値となった。またMS法はNylonを使用した方が高値となり、MS法以外はPolyronを使用した方が高値となった。これよりMS,MK法は腱把持力の強い縫合法と考えられ、一方ループ糸を用いたDL,DK,SL法は比較的腱把持力の弱い縫合法と考えられた。MS以外の縫合法で離開張力がPolyronを使用した方が高値となった原因として、伸びにくく滑りにくいい性質、また柔らかいため緩みにくい堅固な腱把持が可能なことが考えられた。NylonをPolyronに代えた場合の離開張力は特にループ糸を用いたDL,DK,SL法で22.6倍と大きく増加した。結果と考察2:MS法は縫合法が複雑なため所要時間が最も長く、Polyronの使用でさらに延長した。Polyronは滑りにくいため一回のロック毎に締め付ける必要があるためと考えられた。他の縫合法はPolyronを使用しても所要時間に大きな差はなかった。(研究結果の一部はH12年第15回日本整形外科学会基礎学術集会において発表した)前年度の実験より、4種類の主縫合法(double loop法、double Kessler法、modified Kessler法、single loop法)においてナイロン糸よりポリエステル糸を用いた際に引っ張り張力が有意に大きく、縫合法ではdouble loop法とdouble Kessler法が優れていることがわかり、私達は更なる工夫を加え縫合が容易な新しい縫合法開発した。
BCG-Cytokine fusion Proteinによる膀胱癌治療

本研究課題におけるin vivoの抗腫瘍効果判定系として、我々はFisher344ラットを用い、発癌物質であるN-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamineを飲水中に混ずることで、ほぼ100%のラットにおける膀胱腫瘍の発癌に成功した。一連の実験に用いるBCGとして、比較的入手の容易な東京株を用い(日本BCG製造)、実験に必要な量まで増菌を行った。次に本研究課題において購入した超音波ホモジナイザー(US-150T型)を用いて増菌したBCGをsonicationし、電気泳動にて検討を行った。この段階において、sonicationを行う際の使用するBCGの菌量、sonicationの条件(超音波処理の時間、超音波の強度等)について、基礎的データを収集した。電気泳動の結果より、sonicationにて得られるBCG fragmentの分子量を検討し、すでに報告されているパスツール株などをsonicationして得らたデータなどとの比較検討を行い、これらの株と東京株において大きな差異のないことを確認した。次に電気泳動により得られた各バンドを切り出し、各々に含まれるBCG由来の蛋白の濃度を定量、ロードしたBCGの量と比較し、高い回収率を得た。現在、これら各バンドより抽出した蛋白を抗原とし、ヒト末梢血リンパ球を用い、トリチウムチミジンの取り込みを指標としたproliferation assayを行い、電気泳動より得られた各分画の抗原性に関して検討を行い、最も抗原性が高いと思われる分画を同定中である。
動物個体を用いたPTEN遺伝子変異と発癌解析

我々はPTEN/PI3キナーゼ経路の役割を明らかにするために、PTEN組織特異的欠損マウスを作製し、このマウスには種々の癌の発症や種々の癌以外の疾患や病態を呈することを明らかにした。これらマウスはこれら疾患のモデルマウスとなり、さらなる癌発症機構の解析研究や、新規治療法の開発に強力なツールとなろう。多くの細胞成長因子はPI3キナーゼを活性化し、PI3キナーゼはホスホイノシチド-4,5-2リン酸(PIP2)をホスホイノシチド-3,4,5-3リン酸(PIP3)に変換し、細胞増殖亢進、細胞死抵抗性に働く。PTENは主にホスホイノシチド-3,4,5-3リン酸(PIP3)を主な基質とするホスファターゼで、PI3キナーゼの作用を負に制御する癌抑制遺伝子である。さらに、PTENの先天性のヘテロ変異はCowden病などの、過誤腫を呈し、悪性腫瘍を高頻度に合併する疾患群を呈することが報告されている。平成17年度には血管内皮細胞特異的においてPTENをヘテロ欠損させると、血管新生因子に対して感受性が高まるために、腫瘍血管新生が亢進して、腫瘍の進展速度が加速することから、ヒトCowden病などでは、腫瘍易形成性であることのみならず、一旦腫瘍が形成されると、腫瘍血管新生が高まるために、腫瘍の進展が加速する危険性を明らかにすることができた。またPTENをホモ欠損させると、種々の血管新生因子や、その受容体などの発現異常をひきおこし、血管内皮細胞に壁細胞や血管平滑筋細胞がうまく集積できず、マウスは血管のリモデリング異常のために、出血を起こし、全例胎生致死となった。このように血管内皮細胞の分化・発生にPTENは必須であることを見出した。さらに我々は、PI3Kα(p85α)やPI3Kγ(p110γ)欠損が、PTEN欠損による発現形を部分的に回復させることができることから、PI3Kアイソタイプ特異的な阻害剤が腫瘍血管を標的とする治療に奏功する可能性を示すことができた。さらに、骨格筋特異的なPTEN欠損は、インスリンの作用を増強させるために、II型糖尿病モデルマウスにおける高血糖を改善させることから、今後PTEN経路を標的とする治療方法がヒトII型糖尿病の治療に奏功する可能性を示すことができた。さらに、PTENの先天性のヘテロ変異はCowden病などの、過誤腫を呈して悪性腫瘍を高頻度に合併する疾患群を呈することが報告されている。平成18年度にはNKT細胞においてPTENを欠損させると、成熟NKT細胞が減少し、単位細胞あたりのNKT細胞の増殖能・IFNγ産生能などの機能が低下した。これらPTEN変異による生体への影響を明らかにするために、NKT欠損マウスに野生型またはPTENヘテロ欠損したNKT細胞を移植し、これらの個体において、メラノーマ細胞の肺への転移を検討したところ、野生型のNKT細胞を移植したときにはメラノーマの肺転移が減少したが、PTENのヘテロ変異したNKT細胞を移植しても肺転移の抑制効果はほとんどみられなかった。これらのことからPTENのヘテロ変異した個体(Cowden病)では、癌の発症頻度が加速されていることのみならず、これらの個体では一旦癌が発症した後も、腫瘍免疫監視機構が障害されているために、癌の進展が加速する危険性のあることを明らかにすることができた。また膀胱上皮でPTENを欠損させると乳頭状膀胱癌が自然発症すること、ヒト膀胱癌においても早期の表在性乳頭状膀胱癌や進行膀胱癌で、高頻度なPTENの発現減弱消失があることを見出した。多くのサイトカイン、インスリンなど、様々な刺激によって、PI3Kが活性化される。活性化されたPI3Kはイノシトールリン脂質のうちPIP2をリン酸化してPIP3を産生する。PIP3は、Aktをはじめとする様々な下流のシグナル伝達系を活性化して細胞増殖、生存などの多様な情報伝達の役割を果たす。PTENはその主な基質をPIP3とする脂質ホスファターゼで、PI3K経路を負に制御する。我々はPTENの生体における機能を解析するためにPTEN全身欠損マウスを作製したが、このマウスは胎生早期に致死となったことから、次にPTENfloxマウスを作製し、平成19年度は主に肺胞上皮細胞におけるPTENの機能を解析することにした。肺胞上皮細胞におけるPTENの機能解析することにした。肺胞上皮細胞におけるPTENの機能解析:がんの死因の1位は肺がんで、増加の一途をたどっている。

また肺がんのうち最多のものは肺腺がんであり、その約7割でPTEN蛋白質の発現の低下消失をみることが報告されている。そこで我々は肺におけるPTENの役割を明らかにするために、我々の作製したPTENfloxマウスと、(tetO)7-CreやSP-C-rtTAトランスジェニックマウスとを交配することによって、ドキシサイクリン投与によって肺胞細気管支上皮細胞特異的にPTENを欠損するマウスを作製した。肺胞細気管支上皮細胞特異的PTEN欠損マウスは、ほぼ全例自然肺腺がんを発症した。さらにこれらマウスでは発がん剤(ウレタン)投与による早期腫瘍形成が加速していた。さらにPTEN欠損マウスでは肺幹細胞(BASC)の増加を認めた。これまでに肺腺がんはBASC由来であることが示されていることを考えあわせると、PTEN欠損によるBASCの増加が肺腺がん発症の一因である可能性が示唆された。PTEN欠損マウスでは、細胞増殖や幹細胞維持に関わるAkt、c-Myc、Bcl-2、shhの活性化や発現亢進をみた。さらにPTEN欠損マウスでみられた肺腺がんでは高頻度にK-rasの変異が認められた。このようにPTEN欠損によるBASCの増加によって、肺幹細胞にK-rasなど他のがん関連遺伝子の変異がおこりやすくなり、これによって肺腺がんがおこる可能性が考えられた。我々は癌抑制遺伝子PTENの生体における機能を解析するためにPTEN欠損マウスを作製したが、このマウスは胎生早期に致死となったことから、次にPTENfloxマウスを作製し、平成20年度は主に色素細胞におけるPTENの機能を解析した。PTENfloxマウスとDCT-Creトランスジェニックマウスとを交配することにより、メラノサイト特異的PTEN欠損マウスを作成した。このマウスでは約70%のメラノサイトでPTENが欠損していた。そこで次に我々はこのマウスを用いて、毛髪色変化を検討したところ、野生型マウスでは頻回脱毛後、白髪になるのに対し、PTEN欠損マウスでは白髪形成に抵抗性であった。メラノサイト幹細胞は維持されないと白髪となることが知られている。そこで我々はc-kit抗体を投与して可視化したメラノサイト幹細胞が、頻回脱毛によってどのように変化するかを、野生型マウスとPTEN欠損マウスで検討したところ、野生型マウスでは頻回脱毛によって皮膚メラノサイト幹細胞数が枯渇してくるのに対して、PTEN欠損マウスでは頻回に脱毛しても、いつまでもメラノサイト幹細胞数が保たれることを見出した。また、メラノサイト特異的PTEN欠損マウスに自然発症メラノーマは認められなかったが、DMBA+TPA投与後野生型に比し有意に多くのメラノーマを認めた。PTEN欠損マウスでは、PTENの下流のAktやErkの活性化、またその下流のp27の発現低下、Bc1-2の発現亢進をひきおこすことによってメラノサイト幹細胞は枯渇抵抗性となり、白髪抵抗性になったものと考えられる。実際Bc1-2欠損マウスはメラノサイト幹細胞が維持されず、マウスは第二毛髪周期から白髪を呈し、PTEN欠損マウスとちょうど反対の発現形を示している。ヒトにおいて白髪は最も容易にわかる加齢現象であり、メラノーマもまた加齢に伴う紫外線や化学物質への暴露によっておこる腫瘍である。本研究は、PTEN経路分子は白髪や腫瘍を研究するコスメトロジーやオンコロジー研究者にとって魅力的な分子標的であることを示し、またメラノサイト特異的PTEN欠損マウスはヒトの白髪やメラノーマへの新規治療を考えるにあたって優れた動物モデルとなろう。