hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強磁場下での生体物質の新現象に関する研究

本研究は、生体中に存在する細胞やタンパク質に対して非侵襲的にテスラオーダーの強い磁気力を作用させることで、強磁場下における生体物質の新しい磁場現象の解明を目指すものである。強磁場よる生体物質の新規現象を検証するため、現在、医学・生物学領域において幅広く利用されている人工生体膜を生体モデルとして用いた。人工生体膜の一つであるリボソームに、膜の構造破壊・融合を誘発する鎖状化合物を脂質分子間に導入し、常磁性リボソームを調製し、これらのリポソームキャリアの膜崩壊・融合能について基礎的検討を行い、リボソームの磁場配向や膜安定度の違いについて検証した。さらに、強磁場下における生体膜構造の構造変化やその機能変化について調べ、生体物質が普遍的に持つ磁気的性質を利用した物質の分離・生成および構造解析、強磁場中における酸素反応測定や生体内の水やタンパク質の構造解析により生体磁気情報計測および制御に関する研究を推進した。そして、生体関連物質における磁場新規現象を見つけ出し、膜の磁化率、分子量、構造の違いなどから磁場における新規現象の発生メカニズムを解明した。本研究の目的は、強磁場を用いて、タンパク質や遺伝子などの生体物質に関する新しい磁場現象の解明であり、これまでに、磁場中における酸素反応測定や生体内の水、タンパク質の構造解析による生体磁気情報計測および制御などを行ってきた。生体系における水の構造や結合水の状態への強磁場効果とその機構を磁場中生体物質分光解析装置により、強磁場による生体物質の機能情報測定法を検討したところ、生体内で重要な役割を持つ溶存酸素は常磁性であることから、酸素濃度を富化した状態では最大14テスラの高勾配磁場中で濃度変化が見られた。そして、生体構造物質の最大14テスラ強磁場下での動態に関し、水分子集団の構造やタンパク質・糖類の水和構造物質への磁場効果を近赤外分光、さらには勾配磁場下における磁場物質の輸送過程をクロマトグラフィーなどにより調べることで、遺伝子や多糖類などの生体高分子の時期的特性における新しい知見が得られた。今年度は、それらの結果をコンピューターの画像処理システムを用い、新手法のシミュレーションを行った。今後はあらたなクロマトグラフィーおよび近赤外分光測定手法と強磁場を組み合わせることで、生体物質が普遍的に持つ磁気的性質を利用した物質の分離・生成および構造解析、強磁場中における酸素反応測定や生体内の水、タンパク質の構造解析による生体磁気情報計測および制御などに関する研究を推進する予定である。近年、MRIやリニアモーターカーのように積極的に静磁場を利用した機器が登場している。また、高分子や浮遊細胞がその磁気異方性により定磁場内で磁場配向するという興味ある現象が報告されている。今回我々は、強磁場における生体物質に関する新しい磁場現象の解明を目指し、磁場配向現象を示すコラーゲンを足場として短時間で細胞を制御可能かどうかについて検討した。付着細胞単独培養実験に使用した磁場曝露装置は、水平型超電導マグネットである。I型コラーゲン溶液と細胞を混合し、静磁場に曝露した。経時的にこれらの細胞形態の観察し、同時に細胞の配向方向と磁場方向との角度ならびに長軸方向の細胞の長さを計測した。曝露後2週後にコラーゲン線維に付着している細胞をコラゲナーゼ処理によって分離し、そのALP活性を測定した。細胞配向度計測において、コラーゲン線維に付着している全ての細胞が磁場方向に垂直から±20度以内に収まっていたが、非曝露群ではコラーゲン線維も付着細胞もランダムな方向に配列していた。細胞のサイズには両群とも差は認められなかった。曝露後2週後にコラーゲン線維に付着している細胞をコラゲナーゼ処理によって分離し、そのALP活性を測定したところ、曝露群は非曝露群に比べて有意に高い活性を示した。本研究により、コラーゲンと細胞との共存培養においてコラーゲン線維が磁場方向に垂直に配向し、これを足場としている骨芽細胞の分化が促進されることが明らかとなった。骨芽細胞自身は磁場方向に平行に配向することから、磁気異方性を持つ細胞とコラーゲン間の相互作用からのシグナルが細胞分化を促進することが予想される。分化誘導を受けた骨芽細胞はその後、独自に新たな基質を配向方向に形成していったと考えられる。静磁場刺激は、その形成方向を管理できる画期的な手法となりうる可能性をもつことが示唆された。本研究は、強磁場を用いて、タンパク質や遺伝子などの生体物質に関する新しい磁場現象の解明を目指すものである。本年度は、磁場中における酸素反応測定や生体内の水、タンパク質の構造解析による生体磁気情報計測および制御などに関する研究を行った。本研究では、生体構造物質の最大14テスラ強磁場下での動態に関し、水分子集団の構造やタンパク質・糖類の水和構造物質への磁場効果を近赤外分光、さらには勾配磁場下における磁場物質の輸送過程をクロマトグラフィーなどにより調べることで、遺伝子や多糖類などの生体高分子の時期的特性における新しい知見が得られた。

今後、あらたなクロマトグラフィーおよび近赤外分光測定手法と強磁場を組み合わせることで、生体物質が普遍的に持つ磁気的性質を利用した物質の分離・生成および構造解析、強磁場中における酸素反応測定や生体内の水、タンパク質の構造解析による生体磁気情報計測および制御などに関する研究を推進する予定である。本研究は、生体中に存在する細胞やタンパク質に対して非侵襲的にテスラオーダーの強い磁気力を作用させることで、強磁場下における生体物質の新しい磁場現象の解明を目指すものである。強磁場よる生体物質の新規現象を検証するため、現在、医学・生物学領域において幅広く利用されている人工生体膜を生体モデルとして用いた。人工生体膜の一つであるリボソームに、膜の構造破壊・融合を誘発する鎖状化合物を脂質分子間に導入し、常磁性リボソームを調製し、これらのリポソームキャリアの膜崩壊・融合能について基礎的検討を行い、リボソームの磁場配向や膜安定度の違いについて検証した。さらに、強磁場下における生体膜構造の構造変化やその機能変化について調べ、生体物質が普遍的に持つ磁気的性質を利用した物質の分離・生成および構造解析、強磁場中における酸素反応測定や生体内の水やタンパク質の構造解析により生体磁気情報計測および制御に関する研究を推進した。そして、生体関連物質における磁場新規現象を見つけ出し、膜の磁化率、分子量、構造の違いなどから磁場における新規現象の発生メカニズムを解明した。
軍記物語の生成と流動に関する総合的研究

本年度は、当初の研究計画に基づき、『平家物語』の諸本流動について明らかにするため、屋代本・覚一本・延慶本を主たる対象として相互の関係についての考察を重ねた。特に、語り本系(前二者)と読み本系(後者)の関係についての考察に力を注ぎ、かねてから研究の基軸としてきた「物語の終結様式」をめぐる論考、巻五・巻六を対象とする論考、および巻八前半部の諸本本文についての論考の、計三本の成果があったが、三本ともに博士の学位請求論文の一部としたため、審査期間中の公表には至っていない。いずれの論考も、上記三種の異本が、それぞれの方法のもとに流動・発展してきたことを明らかにするものであり、特に巻五・六と終局部の双方において、「王法の歴史語り」を基点にして諸本の関係を捉えうることを示したのは、大きな成果であったと考えている。「王法の歴史語り」という枠組みの有無こそが二大系統を分ける本質的な差異であり、これを極度に強固にしようとして様々な要素を取り込む延慶本に対して、語り本はそれを脱ぎ捨てて、「平家の物語」へと変貌しようとする。この違いが、頼朝挙兵譚の有無や終結様式という、系統ごと、諸本ごとの特徴に大きく反映されている。また、上記とは別に、屋代本の「大原御幸」をめぐる考察を進めている。屋代本を丁寧に読み解くことでその独自性を明らかにするとともに、その作業を通じて他諸本との関係にも論及しようとするもので、その成果として、屋代本的本文から覚一本へ、という従来の理解とは異なる新たな見取り図を提示することができると考えている。
水産植物スサビノリのゲノム編集による新育種基盤技術の研究開発

海藻類の養殖業ではノリ類が生産量の7割を占めている。ノリ類の代表的な品種はスサビノリであり、わが国の重要な水産物である。昨今、養殖海苔の白化問題や病害などが多発し、200億円(生産額の約20%に相当)もの損害が出ることもある。そのため、ノリの安定生産、かつ高品質・高収量そして耐病性などの品種改良に向けて、ノリ独自の新育種基盤技術の整備が急務である。本研究は、申請者らが開発したスサビノリの遺伝子導入技術を応用し、スサビノリのゲノム編集技術の確立に挑戦する。また、レポーター遺伝子をノックインしたスサビノリを用いて減数分裂時期の基礎的知見を得ることで、ノリ育種研究の発展に繋げることが目的である。具体的には、これまで開発した室内培養や遺伝子導入技術の応用とノウハウを駆使して、CRISPR/Cas9システムがスサビノリで機能することを実証する。また、ゲノム編集で作出したスサビノリ形質転換体(遺伝子ノックインスサビノリ)は、原理上1コピーの任意配列がゲノムDNA内に挿入されていると考えられる。そのため、このノックインスサビノリを利用して、これまで困難であった交配実験系による遺伝子レベルでのスサビノリ減数分裂時期の基礎的知見を得ることができる。当該年度は、スサビノリの糸状の胞子体(糸状体)を対象にハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ他殖の糸状体を選抜可能にするため、純系株および既存の方法で作出したハイグロマイシン耐性株の糸状体を対象にハイグロマイシン感受性試験を実施し、ハイグロマイシンが糸状体に影響を及ぼす致死濃度を調べた。これまで開発した遺伝子導入技術では形質転換体を得るため、ハイグロマイシン耐性遺伝子を導入したスサビノリの葉状の配偶体(葉状体)を対象に薬剤耐性株を選抜してきた。スサビノリを用いて減数分裂時期の基礎的知見を得るには、糸状体世代を介して形質転換体を選抜する必要があるため、糸状体のハイグロマイシン感受性試験を行った。その結果、糸状体に対するハイグロマイシン致死濃度を明らかにした。当該年度の目標である「ハイグロマイシンが糸状体に影響を及ぼす致死濃度の決定」が達成できたため、おおむね順調に進展していると判断した。レポーター遺伝子と選択マーカーを持つ遺伝子ノックインスサビノリを作出するため、ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9システム)がスサビノリでも機能することを検証する。当該年度研究計画の遂行にあたり、スサビノリの生細胞内でCas9タンパク質を発現させる一過的遺伝子発現系の候補にパーティクルガン以外の導入手法も有効と分かり実証する必要が生じた。そのため、当該年度は他の導入手法による実験系の適用可否を試験したところ、実用の可能性が見込まれる結果が得られた。したがって、研究期間を翌年度まで延長し、他の導入手法の実用性を実証することで当初の研究目的を達成することができると判断し、次年度使用を計画するものである。
生命システムの動的理解を可能にする分子性プローブの開発

細胞内では共通のシグナル伝達のストラテジーを用いているにもかかわらず,刺激が異なれば,それによって制御される細胞機能も異なる。これは,シグナリングに関与する分子の時空間動態の偏りに起因すると考えられるが,証明するのは容易ではない。ケージド化合物への光照射によって実現できる局所刺激は,生理的条件をできるだけ再現した刺激法だといえる。これを,実時間イメージングによるアプローチと併用すれば,従来の方法では得られない情報が得られる解析法になる。本年度は微小管の重合を安定化する分子,脂質性シグナル分子,セカンドメッセンジャー類のケージド化合物を合成した。このうち,ケージドジアシルグリセロールとケージドインヒビターペプチド用いると,哺乳動物培養細胞内のプロテインキナーゼの細胞内局在を光制御可能であることを明らかにした。次に,狙った一細胞内のキナーゼ活性を光制御可能か検討した。その結果,ケージドジアシルグリセロール(Bhcmoc-diC8)をバルクに加えた培養細胞のうち,405nmレーザー光を照射した近傍の細胞だけに,εPKCの細胞膜へのトランスロケーションが観察された。この化合物は,一細胞内の局所のみにジアシルグリセロールを生成させることも可能で,T-細胞の細胞極性形成にジアシルグリセロールの局所濃度の上昇が必要かつ十分であることを証明する実験に用いることができた。また,新規ケージドNO分子が2光子励起でNOを発生できることと,その時の2光子励起効率を明らかにした。ケージドDNAを調製するには2つの方法が考えられる。全長DNAを適切なケージング試薬でランダムに修飾する方法と,化学合成したケージドプライマーから酵素的に伸長して全長のケージドDNAにする方法である。このうち,ランダム修飾による方法は,操作が簡単で試薬が手に入れば誰でも利用できる点と,適用できるDNAの配列に制限がないと考えられる点で優れている。しかし,これまでに報告されているランダム修飾によるケージドDNAは,光照射の前後で数倍程度の発現誘導の上昇しか実現できていなかった。そこで, EGFPおよびルシフェラーゼ発現プラスミドをモデル化合物に選び, Bhc- diazoによるDNAのケージングと,光照射によるアンケージング条件の最適化をはかった。その結果, SV40 oriを持つルシフェラーゼ発現ベクターpRL- SV40をBhc- diazoでケージングし, COS-7細胞に導入後にUV光を照射すると,未照射細胞に比べて100倍以上の発現上昇が実現できた。また,発現の絶対量も未修飾のプラスミドによる発現量の数%程度まで増加できることを確認した。今回開発したSV40 oriを持つケージドプラスミドとSV40 largeT抗原発現細胞の組み合わせによる方法を用いると,光照射によって最高で300倍以上の発現効率の上昇が達成できることも明らかにした。これは,従来の方法が,ケージングによってプラスミドDNAから誤NAへの転写を光制御するのに対し, large T抗原発現細胞では, 1細胞内のコピー数が複製により飛躍的に上昇したことによる。すなわち,ランダム修飾によるケージングでDNAの複製を光制御可能なことを意味している。
初期埋没続成過程における有機物の分解・熟成と自生鉱物の生成に関する堆積学的研究

本研究課題で遂行されたテーマは2つにまとめられる。第1は、堆積物中の有機物(有機炭素)含有量の変動要因の解明と、その地質学的意義である。堆積時の初生的違いと、続成過程における有機物の分解による変化という2つの測面から検討を加えた。薄層理と生物擾乱層の分布や、堆積物粒度の変動等の堆積学的パラメーターと、堆積物の主成分及び微量成分含有量等の地球化学的パラメーターと、有機物含有量の変動パターンを比較する事により、有機物の濃度・分散の機構が、かなりはっきりしてきた。詳細については別冊報告書及び昨年度未報告書に述べた。第2のテーマは、ガス・ハイドレイトの生成・分解と炭酸塩続成の関係である。海水由来のSO_4^±の存在する埋没続成過程初期に分解した有機物は、一般に^<13>Cに乏しい炭酸塩を生成し、この結果δ^<18>Cが-15-30〓(PDB)の、Mgに富んだカルサイトやドロマイトが生成される。しかし、埋没が進行して還元的になると、有機物は主にメタンになるため、共存する炭酸塩は^<13>Cに富み、この結果δ^<13>Cが-5+25〓で、Feに富んだカルサイトや、アンケライト、シデライトが生成する。堆積物中で発生する生物源メタンが増大すると、間隙水はついにメタンに関して過飽和状態となり、一定の温度・圧力条件下(水深にもよるが、ふつう海底下数百メートル以浅)では、このメタンは固体、氷状のメタン・ハイドレイトを作る。メタンハイドレイトは^<18>Oを選択的に取り込む。この結果、ハイドレイトの生成に伴って間隙水のδ^<18>Oは徐々に軽くなる。逆に、ハイドレイトが数百メートルの深度で分解すると、水のδ^<18>Oは急に増大する。また大量のメタンが堆積物に供給される。この結果メタンによる鉄の還元が進むと同時に、間隙水のアルカリ度が急増して、重い酸素に特徴づけられれた、Feを含む炭酸塩鉱物、特にシデライトが生成する。このような特徴を持つシデライトはハイドレイトの"化石"と考えられる。北日本新第三系の珪質岩約100試料についてX線粉末回析による構成鉱物の同定と半定量,螢光X線分析による主要および少量元素, LECOーWRー12E装置による機炭素および炭酸塩炭素の定量,乾燥かさ比重の測定,そして切断面および鏡下での堆積構造の観察を行った.また,そのうち35試料について放射化分析により微量元素および希土類元素の定量を行った.その結果,現在迄に以下の事が明らかになった.(1)分析した珪質岩中の生物源シリカ量は化学分析値より783%と推定される.特に中期中新世の珪質岩では平均50%前後と高い.(2)珪質岩中の有機炭素量は0.33.6%で,生物源シリカ量と正の相関(γ=0.55)を示す.また,貧酸素状態で堆積したものほど有機炭素量が多い傾向が顕著である.

(3)炭酸塩炭素量は04.5%であるが, 0.1%を越す試料は全体の20%以下で,それらはほとんどの場合続成作用で形成されたものである.一般には生物起源の炭酸塩鉱物は非常に少ない.(4)有機炭素と正の相関を示すものとしてSi,Ba,Ni,Cu,Znがある.このうちSiおよびBaは生物源シリカに伴うと思われる.一方, Ni,Cu,Znは有機物に伴う可能性が高いが,その存在状態については有機物に吸着されているのか有機物の分解に伴って生成した褐鉄鉱などの自生鉱物中に取り込まれているのか現在の所明らかでない.これは今後解決すべき問題である.(5)希土類元素(La,Ce,Sm,Eu,Tb,Yb,Lu)の総量は18126ppmと平均的頁岩よりやや低く,生物源シリカ量と負の相関をもつ.これは生物源シリカには希土類元素が余り含まれない事による希釈効果も考えられる.また,砕屑物が細粒である程希土類元素の総量が大きい傾向がある.(6)希土類元素相互の相対比は,地域,時代,生物源シリカの量などによらず比較的一定している.そしてその相対比は平均的頁岩における相対比と類似する.前年度の行なった北日本新第三系珪質岩の化学、鉱物組成分析、堆積構造、生痕化石に基づく底層水の還元度の推定等の結果をもとに、珪質岩中の有機物量を規制する要因について検討を行なった。その結果、1.珪質岩中の有機物の大部分は珪藻起源と考えられる事2.(1)生物源シリカ含有量が高い程、(2)砕屑物粒度が細粒な程、(3)生痕がなく、平行葉理の保存が良い程有機物量が多くなる傾向がある事、が明らかにされた。生物源シリカ含有量が高い事は海水表層部における生物生産性の高さを、砕屑物が細粒である事は砕屑物堆積速度が遅い事あるいは沖合の環境を平行葉理の保存度が良い事は堆積時における還元的な底層水を各々反映していると考えられる。これらの要因は互いに独立ではなく、例えば表層水における高い生物生産性および沖合の深まりの様な環境は還元的な底層水を生む要因でもあったと考えられる。次に珪質岩中における諸元素の挙動と有機物の関係を調べるために因子分析を行なった。その結果、第1因子としてSi、Org-C、Cu、Ni、Znが、第2因子としてCO、CU、Ni、Zn、Rbなどが、第3因子としてAl、Ti、Ca、Na、Kが、第4因子としてCarb-C、Mg、Fe、Mn、K、Pが得られた。第1因子のCu、Ni、Znは海水中でbiological cycleにとり込まれる元素として知られ、初生的に有機物と共に挙動したものと考えられる。一方、第2因子は、Mo、U、葉理の保存度と正の相関を、砕屑物粒度と負の相関を示す事から堆積速度や底層水の環境と関係し、続成初期に海水から取り込まれた可能性が高い。第3因子は砕屑物に対応すると考えられる。第4因子は炭酸塩鉱物に対応すると考えられ、やはり初期続成過程での元素の挙動を示していると思われる。この様に、有機物量の制御要因、初期続成過程での元素の挙動がある程度明らかになった。更に詳細にせまるため、今年度、秋田県五城目において詳細なサンプリングを行い、現在分析中である。
涙腺慢性移植片対宿主病におけるドナー由来線維芽細胞の病態形成にかかわる役割

本研究では、マウスGVHDモデルを用いてドナー由来線維芽細胞の慢性GVHDの病態形成における役割を直接的に証明し、病態を解明することを目的とし本研究期間中に次の成果を得た。マウスGVHDの涙腺、結膜、唾液腺、肺、皮膚、小腸、肝臓等慢性GVHDの病的線維化の経時的形成過程の作成に成功した。マウス線維芽細胞のマーカーとしてコラーゲン特異的分子シャペロンであるHSP47が適切であることを見いだした。これによりマウスドナー由来線維芽細胞の検出のためにHSP47とFISH法の組み合わせによりGVHDマウスの涙腺、結膜慢性GVHDにおける病的線維化部位においてドナー由来の線維芽細胞の検出に成功した。さらに、GVHD線維化組織とコントロール組織から培養細胞にて涙腺および結膜の線維芽細胞株を樹立することに成功した。この培養線維芽細胞はGVHDとコントロールに形態および増殖能に差が認められており、GVHD涙腺結膜の線維芽細胞は増殖能が高く形態は小型でより扁平であった。今後この線維芽細胞株はGVHD線維化にかかわる線維芽細胞の病的な役割を検討し、治療効果の検討が解析可能となる点で重要である。ドナー由来線維芽細胞の由来を検討するために間葉系幹細胞、造血幹細胞等の細胞源の同定のため、各種移植細胞源の除去移植を行った。造血幹細胞除去移植ではLineage陰性、Sca-1陽性、c-kit陽性細胞を選択的に除去移植し移植し線維化抑制は明瞭ではなかった。間葉系幹細胞除去移植では、全骨髄細胞から間葉系細胞に特異的マーカーを用いて選択的に除去して移植し各臓器の線維化抑制が認められた。線維化にかかわるドナー由来維芽細胞は間葉系幹細胞も候補のひとつとして考えられた。本研究は、慢性GVHDの研究および診断,線維化抑制のための新規治療開発に道を開く司能性がある点で意義があり、今後の臨床応用の可能性を秘めており造血幹細胞移植の成功率の上昇に貢献する可能性があり重要性があると考える。本研究では同種造血幹細胞移植患者で証明されたドナー由来線維芽細胞についてGVHD病態形成への関与について動物モデルでの解析を次の3点に沿って行っている。平成18年度は病変部位のドナー由来線維芽細胞の存在を検討し、平成19年度はドナー由来線維芽細胞の細胞起源と病態形成への役割を追究する。1.マウスGVHDモデルの作成本年度は、申請時準備段階であったマウスGVHD線維化モデルについて造血幹細胞移植患者の涙腺と他臓器慢性GVHD線維化病理組織像に酷似する動物モデルの作成に各実験で成功した。このマウスでは、コントロールと比較して涙腺導管周囲上皮下組織、他臓器GVHD(皮膚、肺、肝臓、消化管、唾液腺)に高度な線維化病変とリンパ球浸潤をきたすことが判明した。例数をさらに増やして検討中である。高齢レシピエント(78週齢)への移植では組織解析によりさらに高度な線維化が認められている。2.ドナー由来の線維芽細胞の検出マウス線維芽細胞のマーカーとしてCD34、HSP47またはFSPから最適なものを選択し、最適な染色条件を決定し、免疫染色にて線維芽細胞を検出する検討を行なった結果、マウス組織パラフィン切片ではHSP47が涙腺線維芽

細胞において最適なマーカーになることを評価し確認した。この分子はヒトGVHD涙腺でも発現を詳細に検討し、本年度論文として発表した。(Ogawa Y.Invest Ophthalmol Vis Sci..2007;48(3):1079-1086)今後マウス涙腺線維細胞のHSP47の発現の検討に本論文の研究成果を発展させる。3.ドナー由来線維芽細胞の細胞起源の検討来年度は、結膜GVHDにおけるドナー由来線維芽細胞の役割を直接的に証明し、病態を解明することを目標とする。移植するドナーの骨髄細胞の分画の検討をすすめ準備段階に入っている。平成19年度はドナー由来の線維芽細胞の存在の起源および病態形成過程を検討する研究を進めた。1.線維芽細胞のマーカーHSP47とFISH法の組み合わせによりGVm)マウスにおいて涙腺、結膜、唾液腺、肺、皮膚、小腸、肝臓に経時的な線維化の進行を作成することに成功した。GVHDマウスにおいてドナー由来線維芽細胞を検出した。2.GVHD線維化組織とコントロール組織から培養細胞にて涙腺および結膜の線維芽細胞株を樹'立することに成功した。この培養線維芽細胞はGVHDとコントロールに形態および増殖能に差が認められており、GVHD涙腺結膜の線維芽細胞は増殖能が高く形態は小型でより扁平であった。今後この線維芽細胞株はGVHD線維化にかかわる線維芽細胞の病的な役割を検討し、治療効果の検討が解析可能となる点で重要である。3.ドナー由来線維芽細胞の由来を検討するために間葉系幹細胞、造血幹細胞等の細胞源の同定のため、各種移植細胞源の除去移植を行った。造血幹細胞除去移植ではLineage陰性、Sca-1陽性、c-kit陽性細胞を選択的に除去移植し移植し線維化抑制は明瞭ではなかった。間葉系幹細胞除去移植では、全骨髄細胞から間葉系細胞に特異的マーカーを用いて選択的に除去して移植し各臓器の線維化抑制が認められた。線維北にかかわるドナー由来線維芽細胞は間葉系幹細胞も候補のひとつとして考えられた。本研究は一慢性GVHDの研究および診断、線維化抑制のための新規治療開発に道を開く可能性がある点で意義がある
データベース化を目指したヒトメラノーマMitf-M特異的分子標的療法の開発

平成26年度では、CRISPR/Cas9システムを用いてMitfをノックアウトしたところ、ヒトメラノーマの細胞株によっては抗腫瘍効果の得られる可能性が示唆された。平成27年度では、CRISPR/Cas9-Mitfの導入効率と遺伝子発現抑制効果をさらに高めるため、レンチウイルスによりCas9およびguideRNAを発現させるCRISPR/Cas9システムを用いて、ヒトMitfのvariant4を標的としたplasmid(p)Lenti CRISPR/Cas9-Mitfを合成した。In vitroにおいて、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを電気穿孔法でヒトメラノーマ細胞株HMV-IIに導入したところ、コントロール群の8.2%までmRNAレベルでのMitfの発現が抑制された。pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを導入したHMV-II群とコントロールHMV-II群において、細胞数と細胞ヴァイアビリティを観察したところ、96時間後では共に有意差(P<0.05)が得られ、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfによる細胞増殖抑制効果が確認された。次に、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを導入したHMV-II群とコントロールHMV-II群からRNAを調整し、mRNAレベルでの遺伝子発現を比較検討したところ、Mitf、RIGI、IFN-beta、SOX2、SOX9、STAT1、STAT2、CXCR、c-Myc、CCR1、Hsp70、MDA5、GATA4、Rac1、TFAP2A、TP53、MTUS1、ID2、RUNX1において有意差が得られた。次いで、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを導入したHMV-IIとコントロールHMV-IIを免疫不全マウスに皮下移植して腫瘍の増殖程度を比較したが、両群に有意差はみられなかった。これらの結果から、ヒトメラノーマHMV-IIにおいてMitf遺伝子をノックアウトすると、in vitroでは癌関連遺伝子や種々の遺伝子の発現が抑制され、その結果として細胞増殖抑制効果が得られたと推察された。しかしin vivoでは腫瘍増殖抑制効果はみられなかった。その原因としては、腫瘍を取り巻く環境(血管、神経、膠原線維や弾性線維など)が、腫瘍の増殖を促進させる何らかの影響を与えている可能性があると推察された。研究代表者は、Mitf特異的siRNAをマウスのメラノーマに導入し、アポトーシスを誘導することで抗腫瘍効果を確認した(Gene Therapy 2007)。しかしメラノーマ細胞にMitfを過剰発現させると増殖が抑制されたという報告もある。そこで本研究では種々の色素性もしくは無色素性ヒトメラノーマ細胞株でMitfの発現レベルを調べるとともに、ヒトMitf-M特異的siRNAを細胞株に導入し、Mitf発現抑制による抗腫瘍効果を確認する。効果がみられない場合にはヒトMitf-M遺伝子を導入し過剰発現による抗腫瘍効果を確認する。細胞株のMitfレベルと治療効果の相関関係を明らかにし、治療適応となる患者の選択が可能な新規創薬の開発につなげることが研究の目的である。ヒトMitf-Mを標的にしたsiRNAの構築は不可能であったため、CRISPR/Cas9システムを用いてMitfをノックアウトすることにした。ヒトMitfのvariant4を標的としたCRISPR/Cas9-Mitfを6種類(No.1-6)合成した。HMV-II、G-361、SK-MEL-28のヒトメラノーマ細胞株にNo.1-6を電気穿孔法を用いin vitroでそれぞれ導入した。No.4のCRISPR/Cas9-MitfをHMV-IIに導入したところ、細胞ヴァイアビリティはコントロール群の約13%に抑えられた。メラノーマ細胞株の定常状態でのMitfの発現をヒトメラノサイトを基準として比較したところ、無色素性メラノーマであるSK-MEL-28では発現が低く、色素性メラノーマであるHMV-IIでは発現が高かった。しかし色素性メラノーマであるG-361では発現が低かった。また、CRISPR/Cas9-Mitf導入後に生き残ったHMV-IIのMitf発現レベルをリアルタイムPCRで調べたところ、コントロールCRISPR/Cas9導入群の1/3程度までMitfの発現が抑制されていた。ヒトメラノーマにおいてもMitfを抑制することで細胞株によっては抗腫瘍効果の得られる可能性はあると考えられたが、一方では生存し増殖を継続する細胞群が存在することも示唆された。

次に、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを導入したHMV-II群とコントロールHMV-II群からRNAを調整し、mRNAレベルでの遺伝子発現を比較検討したところ、Mitf、RIGI、IFN-beta、SOX2、SOX9、STAT1、STAT2、CXCR、c-Myc、CCR1、Hsp70、MDA5、GATA4、Rac1、TFAP2A、TP53、MTUS1、ID2、RUNX1において有意差が得られた。次いで、pLenti CRISPR/Cas9-Mitfを導入したHMV-IIとコントロールHMV-IIを免疫不全マウスに皮下移植して腫瘍の増殖程度を比較したが、両群に有意差はみられなかった。これらの結果から、ヒトメラノーマHMV-IIにおいてMitf遺伝子をノックアウトすると、in vitroでは癌関連遺伝子や種々の遺伝子の発現が抑制され、その結果として細胞増殖抑制効果が得られたと推察された。しかしin vivoでは腫瘍増殖抑制効果はみられなかった。その原因としては、腫瘍を取り巻く環境(血管、神経、膠原線維や弾性線維など)が、腫瘍の増殖を促進させる何らかの影響を与えている可能性があると推察された。ヒトMitf-Mを標的にしたsiRNAの構築は不可能であった。そのためsiRNAではなく、近年開発されたCRISPR/Cas9システムを用いてMitf遺伝子をノックアウトさせることにした。ヒトMitfのvariant4を標的としたsingle guide RNA(CRISPR/Cas9-Mitf)を6種類合成したが、カチオニック・リピッドを用いた導入方法では、導入効率が低く評価が難しかったため、電気穿孔法に導入方法を変えるなど評価に時間を要した。平成26年度に予定していたすべての実験ができなかったため、収支状況報告書の次年度使用額がゼロにならなかった。平成26年度の未施行の実験に加えて、予定していた平成27年度の実験も行う予定である。したがって、次年度使用額として、残額の1,902,028円に加えて、平成27年度の請求額である700,000円(直接経費)と210,000(間接経費)の計2,812,028円が必要である。すなわち、NOD/SCID/γcノックアウトマウス、CRISPR/Cas9-Mitf、プラスミドDNA、その他抗体や試薬など消耗品の購入を行う。特に、マウスを用いたin vivoにおけるCRISPR/Cas9やプラスミドの導入に関しては、1匹あたりに高容量が必要になると予想される。一群あたり8匹と仮定した場合に、少なくともターゲット群、コントロール群、無治療群が必要である。実験を数種類のメラノーマ細胞株で数回行い、前述の試薬などを購入すると満額が必要になる見込みである。
中世イスラームにおけるギリシア思想の流入と、その融合的発展

本年度は、当該研究の最終年度であるため、学会発表などを複数回行うことにより、これまでの研究成果を広く発表した。新プラトン主義協会での発表「キンディーにおける新プラトン主義哲学の影響」では、初期イスラーム哲学の翻訳期に活躍した哲学者キンディーal-Kindī(870以降歿)の『知性論』Risālah : fīal-'aqiに登場する「第二知性」と呼ばれるものに、どのようにしてギリシア思想、とりわけ新プラトン主義が影響を与えたか検討した。中世哲学会での発表「イスラーム哲学の文脈において哲学用語「wahm」が指すものの変遷」では、アリストテレスAristotelēs (BC384-322)の『魂について』Peri Psychēsで語られる「表象」Phantāsiaが、どのようにイスラーム世界に翻訳され、展開していったか。そしてその流れにおいてバグダード学派とキンディー学派によるtakhayyulとwahmという二つの用語選択が存在したことを明らかにした。またAvicenna Symposiumでの発表「Avicenna as an heir of Galen」では、中世イスラームの哲学者イブン・シーナーIbn Sīnā/Avicenna (980-1037)の内的感覚論における脳中心モデルの淵源が、古代ローマ時代のギリシア人医学者ガレノスGalēnos (200頃歿)にあり、中世イスラーム哲学の内的感覚論はファーラービーal-Fārābī(950歿)を除き、基本的にガレノスの脳中心モデルを採用していたことを明らかにした。以上の諸研究発表により、中世イスラーム哲学の思想的源泉の三つの要素(新プラトン主義、ペリパトス派哲学、そしてガレノス)をそれぞれ別個に検討し、明らかにすることが出来た。(抄録なし)本年度、研究代表者は東方キリスト教学会において研究発表「マイモニデス『迷える者たちの導き』預言者論における哲学者批判」を行い、年度末に発行された当学会の学会誌『エイコーン-東方キリスト教研究-』第42号に論文として発表した。一連の研究は中世イスラーム、とくにイブン・シーナーの哲学の影響を色濃く受けたマイモニデスによる哲学者批判を通じて、ギリシアからイスラームにおける預言者論の推移を明らかにしたものである。日本において当該分野の研究は遅れており、また預言者論の通時的概観は研究代表者の中心的題材にも大きく資するものである。また、11月に岩波書店から発行された『イスラーム哲学とキリスト教中世I理論哲学』では「イブン・シーナーの認識論」という章を担当し、執筆した。本叢書は日本においてほぼ単行本の研究書が刊行されていないと言っても過言ではないイスラーム哲学という分野を題材にしたものであり、本叢書において広く一般読者にイスラーム哲学の概説をおこなったということの意義は大きいと考えられる。また、イブン・シーナーを中心的な題材としている研究代表者にとっても認識論は重要な分野であり、本論考を執筆することにより、研究代表者自身の研究も大きく前進することになった。以上に加えて研究代表者はギリシアからイスラームへと移入したアリストテレス的伝統の哲学と、その新プラトン主義的発展についての調査を行い、とくにヘレニズム期から初期イスラームにおけるこれらの伝統の流れについての研究を行った。また研究遂行の助けとするため、年宋にはトルコに一週間ほどの研究調査に赴き、とくにスレイマニエ文書館にて、アラビア語写本の収集、調査を行った。平成24年度において研究代表者は、東方キリスト教学会にて、「ヤフヤー・イブン・アディー『徳の彫琢』における「完全な人間」」の口頭研究発表、新プラトン車義協会にて、以前からの研究助成企画(助成金は辞退済)「イブン・シーナーからスフラワルディーに至る「鳥物語」の系譜」の研究報告を行った。以上はイブン・シーナーを起点と考えたイスラーム哲学において、イブン・シーナー以前(ヤフヤー・イブン・アディー)とイブン・シーナー以降(スフラワルディー)の思想潮流を明らかにするという意味で、研究のイスラーム思想史中における立ち位置を明確にする一助になったと思われる。また同年9月には東京大学UTCPにおいて、「イスラームにおける障害の表現」と題する発表を行った。同年中には博士学位請求論文『イブン・シーナーにおける内的感覚の形成と発展』を提出し、これまでの研究の一区切りを付けた。同論文は平成25年5月現在、審査中である。同論文のテーマである内的感覚は、イスラーム哲学、とりわけイブン・シーナーにおいて著しく発展した分野であり、中世西洋の哲学における範型を作り上げたと言っても過言ではない。その意味で、内的感覚の発展史を明らかにするということは、イスラーム哲学史のみならず、中世哲学全体の発展に寄与することが可能である。さらに12月にはエジプト、カイロのドミニコ会東洋研究所に赴き、同地に10日ほど滞在し、研究資料の収集に努めた。これらは日本では入手の困難なものが多く、研究代表者の研究の推進に大いに資することと考えられる。中世哲学会での発表

「イスラーム哲学の文脈において哲学用語「wahm」が指すものの変遷」では、アリストテレスAristotelēs (BC384-322)の『魂について』Peri Psychēsで語られる「表象」Phantāsiaが、どのようにイスラーム世界に翻訳され、展開していったか。そしてその流れにおいてバグダード学派とキンディー学派によるtakhayyulとwahmという二つの用語選択が存在したことを明らかにした。またAvicenna Symposiumでの発表「Avicenna as an heir of Galen」では、中世イスラームの哲学者イブン・シーナーIbn Sīnā/Avicenna (980-1037)の内的感覚論における脳中心モデルの淵源が、古代ローマ時代のギリシア人医学者ガレノスGalēnos (200頃歿)にあり、中世イスラーム哲学の内的感覚論はファーラービーal-Fārābī(950歿)を除き、基本的にガレノスの脳中心モデルを採用していたことを明らかにした。以上の諸研究発表により、中世イスラーム哲学の思想的源泉の三つの要素(新プラトン主義、ペリパトス派哲学、そしてガレノス)をそれぞれ別個に検討し、明らかにすることが出来た。本年度における研究代表者の研究計画はおおむね順調に進展していると考えられる。ギリシアのアリストテレス的伝統における註釈家たちの著作の研究を行い、トルコにて写本の調査を行うなど、研究計画全体の遂行に必要な土台を本年度において築き上げた。また、同時に学会発表や啓蒙書の共著執筆など、研究成果の発表も順調に行っている。本年度における研究はおおむね順調に進展していると思われる。本年度は研究発表、研究報告、口頭発表、海外での資料収集、さらに博士学位請求論文の執筆も行い、前年度よりも幅広い分野での研究活動を遂行することが出来たと考えられる。本年度の研究成果をもとに、研究代表者は次年度以降、主に初期イスラームにおける魂論、とくに内的感覚論の研究を推し進めていこうと考えている。そのためには次年度以降もアラビア語文献を精密に分析していく必要がある。また、本年度において調査しきれなかったギリシアにおける註釈家の作品や思想などは、次年度以降も併せて調査していく必要があるので、これらも同時に推進していく予定である。今後の研究において、初期イスラームの翻訳期哲学、とくに「キンディー」の思想を分析し、それと共に、後期古代の註釈家たちの註釈の初期イスラーム哲学への影響を検討する必要がある。とりわけ、註釈家アンモニオスを祖とする、フィロポノス、シンプリキオス、ダマスキオスなどのアンモニオス学派の註釈と、それらのキンディー、そしてファーラービーなどに対する影響関係を詳細に研究しなければならない。そのためには、関連する資料を検討し、最終年度もまた外国に赴き、必要な写本などを収集する必要がある。(抄録なし)
地域特性に応じた小規模分散型排水処理システムの構築に関する研究

小規模排水処理方式には様々な異なる特徴を持つ方式があるため、地域の特性と意志決定者の意向とが合致する方式を合理的に選定することは因難なことである。そこで、小規模の集落からなる地域の特性に応じて排水処理方式を選択する際の意志決定支援システムとしてパソコン上で作動する階層分析(AHP)を組み込んだ対話型小規模排水処理方式選択システムを開発した。処理方式を選定する際に重要な評価基準(1次レベル)の要素として、処理性能、建設費用、維持管理、環境影響を取り上げた。さらに、2次レベルの評価基準として、処理性能についてはBOD除去率、N除去率、P除去率、SS除去率を項目要素とした((すなわち、処理性能は、これらの除去率によって評価される)。維持管理については、維持管理費用(発生汚泥の処理費用、電気代など)と維持管理技術の難易度をさらに、環境影響については、騒音、臭気、ハエ・カ等の発生を項目要素とした。システムの内容は、まず利用者は対象とする地域の人口、気象条件、地形地質に関する基本的なデータを入力する。ついで、地域に関する数値化が因難な情報(水質改善の必要性や経済的な基盤など)や地域住民や個人の考え方を総合して、小規模排水処理方式の選定に係わる各評価基準の重みづけを対話形式で一対比較により決定する。また、入力した基本データに基づいて処理性能や建設費用、維持管理費用などが計算され、データベース化される。利用者が各代替案の一対比較を行う際には、ディスプレイに表示されたこれらの各処理方式のデータや専門家の意見を参考にすることができる。そして、これらの重みづけ計算結果を総合して、各処理方式の総合重要度の順位付けを表示する。本システムによって、地域特性と排水処理特性の両者の特徴を十分に考慮した、適正な排水処理システムの構築が容易に可能となった。
表面状態制御によるSiGe混晶表面へのSiの単原子層吸着

本研究は原子層エピタキシー法(ALE)を用いて歪み制御Si/Ge原子層超格子をSiGe混晶上に作製し、その新物性発現を探索することを最終的な目的としている。本年度はSi/Ge原子層超格子を作製するとき必須となるALEによるSi表面へのGeのヘテロ成長(ヘテロALE)について研究を行った。GeのALEは(CH_3)_2GeH_2と原子状水素の交互供給によって実現できている。これはホモ成長(ホモALE)の場合であるので、表面の化学的性質の大きく異なるSi表面へのヘテロ成長にはこのままでは適応できない。しかし、1原子層のGeをSi表面に形成しておけば、上述のALEの手法によってヘテロALEは実現できると考えた。1原子層のGeをSi表面に形成する方法については、Si清浄表面上でGeCl_4と原子状水素の交互供給法を行えば1原子層のGeがSi表面上に自己制限的に成長できる。本年度はこの表面に(CH_3)_2GeH_2と原子状水素の交互供給を行いGeのホモALEを試み、その成長過程を調べた。まず、XPSによる評価から単原子層のGeが吸着したSi表面では下層Siの影響によってバルクGe表面とは水素の熱脱離速度などの化学的性質が変化して、ALEの発現条件がバルクGe表面とは大きく異なることがわかった。しかし、ALEの成長パラメータを調節することによって、Geが単原子層吸着したSi表面でもGeのヘテロALEが実現できることが確かめられた。また、STMによる表面超講造の評価およびCAICISSによる入射イオンの角度依存性から、このヘテロALEによるGeの成長層は臨界膜厚まで1サイクル当たり1原子層づつ層状に理想的な成長することがわかった。したがって、本研究課題の成果を用いれば、原子スケールで膜厚が制御され、かつ急峻な界面構造を有するSi/Ge原子層超格子が形成できると結論した。
非出来事文の構造と意味-中間構文を中心に-

1.英語の中間構文の持つ「動詞の内項やby句の表出を許さない」「文の表す困難度などが主語の指示対象の特質によるものであるという意味を持つ(Responsibility)」などの性質が,付加部を導きdue toのような意味を持つゼロ形前置詞の存在を想定することにより説明できることを明らかにした.2.中間構文の主語は,移動後の位置で「述語の表す特性の担い手」という意味役割を主述関係に基づいて与えられると考えるべき論拠を示した.このような意味役割は,動作主など出来事(event)の中での主題役割とは区別されるべきで,意味役割を与えられる位置(所謂θ位置)への移動は,移動後の位置で主述関係に基づき述語の表す特性の担い手」の意味役割が与えられる場合にのみ許されると考えられることを提案した.3.この2種類の意味役割の間に見られる移動に関する違いを,意味役割の認定と統語的素性照合との関係に関する一般的仮説から説明する分析を展開した.4.不定詞・動名詞句の空主語の名詞句(所謂PRO)および代名詞のoneが,定代名詞のように文脈上既出の対象に言及することができないという観察,また量化副詞や総称演算子に束縛されることはできても存在量化子に束縛されることはできないという観察に基づいて,極小主義の観点から定性・不定性と統語範疇との関係を再検討した.その結果,定性を欠く名詞句は自動的に不定名詞句として存在の解釈を許すのではなく,不定性は定性と同様に名詞句の持つ素性でなければならないことを示した.1.英語の中間構文の持つ「動詞の内項やby句の表出を許さない」「文の表す困難度などが主語の指示対象の特質によるものであるという意味を持つ(Responsibility)」などの性質が,付加部を導きdue toのような意味を持つゼロ形前置詞の存在を想定することにより説明できることを明らかにした.2.中間構文の主語は,移動後の位置で「述語の表す特性の担い手」という意味役割を主述関係に基づいて与えられると考えるべき論拠を示した.このような意味役割は,動作主など出来事(event)の中での主題役割とは区別されるべきで,意味役割を与えられる位置(所謂θ位置)への移動は,移動後の位置で主述関係に基づき述語の表す特性の担い手」の意味役割が与えられる場合にのみ許されると考えられることを提案した.3.この2種類の意味役割の間に見られる移動に関する違いを,意味役割の認定と統語的素性照合との関係に関する一般的仮説から説明する分析を展開した.4.不定詞・動名詞句の空主語の名詞句(所謂PRO)および代名詞のoneが,定代名詞のように文脈上既出の対象に言及することができないという観察,また量化副詞や総称演算子に束縛されることはできても存在量化子に束縛されることはできないという観察に基づいて,極小主義の観点から定性・不定性と統語範疇との関係を再検討した.その結果,定性を欠く名詞句は自動的に不定名詞句として存在の解釈を許すのではなく,不定性は定性と同様に名詞句の持つ素性でなければならないことを示した.今年度の研究によって,次のことが明らかになった.(1)英語の中間構文が,動詞の内項やby-句の表出を許さないという観察は,この構文の文にPesetsky(1995)で提案されたゼロ形前置詞を想定し,しかもそれが付加部を導くと考えることによって説明できる.(2)前述のゼロ形前置詞が,due toのような意味を持つとすると,中間構文について指摘されていたResponsibilityという性質(例えばThese shirts wash easily.は,状況による原因ではなく,シャツの特性による原因で洗うことが容易であるという意味を持つこと)が説明できる.avoid,hitなどの動詞が中間構文を許さないことは恐らくこの性質に帰因するものである.(3)中間構文の主語は,動詞・前述のゼロ形前置詞から与えられる意味役割とは独立に主語の位置でも(「その特性を担うもの」という)意味役割を主述関係に基づいて与えられる,即ち,中間構文の主語は,意味役割の与えられる位置(所謂θ位置)へ移動している.(4)中間構文とは異なり,John washed/shaved(before dinner),のような文では,目的語の位置から主語への移動,即ちθ立置からθ立置への移動は起きていないという証拠がある.こどもがこのような文を誤分析しないためには,θ立置への移動は自由に許されるべきではない.この結果を踏まえて,名詞句の受ける意味役割を,動作主のような「出来事(event)の中での役割」と,主述関係によって認定される「述語の表す特性の担い手」の2種類に分け,「θ(立置への移動は,そこで与えられる役割が『述語の表す特性の担い手』の役割である場合にのみ許される」ことを提案し,更に、「『出来事の中の役割』の認定にのみ名詞句と動詞との間の統語的素性照合が関わる」という仮説に基づいて,この2種類の意味役割の間に見られる移動に関する違いを説明する分析を発表した.今年度は,中間構文を扱った前年度の研究の成果の中から次の点を取り上げさらに発展させた.中間構文の主語は,移動後の位置で「述語の表す特性の担い手」という意味役割を主述関係に基づいて与えられる.

このような意味役割は,動作主など出来事(event)の中での主題役割とは区別されるべきで,意味役割を与えられる位置(所謂θ位置)への移動は,移動後の位置で前者の意味役割が与えられる場合にのみ許される.前年度の研究では「『出来事中の役割』の認定にのみ名詞句と動詞との間に統語的素性照合が関る」という仮説に基づいてこの点を説明する分析を展開したが,今年度の研究では,「意味役割の認定のための統語素性の照合は一切存在せず,意味役割の認定が移動を引き起こすことはない」という更に制限の強い仮説によってこれを説明する分析を試みた.この分析は,「individual-level predicateの外項(上記「述語の表す特性の担い手」を受ける項に相当)は動詞句の外で認定され(動作主を含む)stage-level predicateの主語は動詞句内で認定される」というDiesing(1988),Kratzer(1989)の提案に沿ったもので,その主旨は,「中間構文の主語は,格・人称などの照合のために時制辞の指定部に入り,そこで『述語の表す特性の担い手』という役割を認定されるが,動作主の認定される位置では格・人称などの照合が起きないためにこの位置への移動はあり得ない」というものである.今年度はまた,「不定詞・動名詞句の空主語の名詞句(所謂PRO)は定性・不定性を持たない」としたKawasaki(1996)の提案と,統語範疇などPROの内在的特性との関連について考察を進めた.
ラット顎骨の外形変化-機能力低下に伴う層板骨の骨動態-

当初の計画に従って、20週齢の雌性Wistarラットを用いて、上顎全臼歯の抜去を試みたが、セメント質の肥厚などの理由から完全な抜歯ができなかった。このため、10週齢のラットに変更して実験を行った。まず予備的実験としてラット10匹を用いて、5匹には抜歯を行い(Ext群)、残りの5匹には処置を行わなかった(Control群)。その後4週間飼育して、中性緩衝ホルマリンにて灌流固定し、屠殺した。摘出した下顎骨を左右2分割し、片顎を非脱灰でポリエステル樹脂に包埋した。Exact社製の研磨標本作製システム(BS3000、MG4000)により厚さ25μmの切片を作製し、塩基性フクシンとメチレンブルーで表面染色を行い、光学顕微鏡にて下顎骨の外層にある層板骨部を観察した。その結果、Ext群、Control群ともに、層板骨表面において吸収窩を形成している破骨細胞は観察されなかった。そこで、吸収活性を示していない破骨細胞系細胞についても観察するために、破骨細胞に特異的なtartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)を検出することを試みた。残りの組織を4°C下で10%EDTA溶液に約2週間浸漬して脱灰し、脱水の後、水溶性樹脂に包埋した。ミクロトームを用いて、厚さ4μmの脱灰切片を作製し、TRAP染色を行った。その結果、Ext群、Control群ともに、下顎骨の層板骨部においてはTRAP陽性細胞の発現が認められなかった。今回の実験で、骨吸収の発現が起こらなかった理由として、ラットでは切歯があるために、臼歯部の抜歯だけではメカニカルストレスの変化が生じなかったことが推察される。なお、顎骨骨髄部や歯根膜においてはTRAP陽性細胞が観察され、それらの発現量についてExt群とControl群において比較、検討中であり、TRAPをマーカーとした顎骨骨動態研究の展望が開けた。
脱ユビキチン化酵素による骨代謝調節の分子機構の解明

脱ユビキチン化酵素UCH-L3欠損マウスは、網膜など一部を除けば病理変化は乏しいと考えられてきたが、我々はUCH-L3欠損マウスと野生型マウスの骨形態計測を行い、UCH-L3欠損マウスは野生型マウスと比較して骨量の多いことを見出した。マウス骨芽細胞においてUCH-L3を過剰発現させると、骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性が低下した。マウス破骨細胞においては、UCH-L3の過剰発現による破骨細胞分化マーカーへの影響は見られなかった。これまでの研究結果から、UCH-L3は骨形成因子の制御に関わっている可能性のあることが示唆された。今後は、骨形成に関わる種々の因子と、それらのユビキチン化-脱ユビキチン化という観点から骨代謝機構の解明にアプローチする予定である。骨格系の制御機構の異常に基づく各種疾患の治療法を確立するためには、骨代謝に関わる細胞の分化・機能の調節因子およびその制御機構を解明する必要がある。細胞中の不要な蛋白質はユビキチン化され、ユビキチン-プロテアソームシステムを介して分解除去されている。細胞周期制御や転写因子に関わる重要な遺伝子の発現は、細胞内蛋白質のユビキチン化により調節されている。我々は、ユビキチン化された蛋白質からユビキチンを切り出す脱ユビキチン化酵素の欠損が、骨代謝に変化をもたらし骨量を増加させることを見出した。脱ユビキチン化酵素欠損マウスおよび対照群として野生型マウスの骨代謝動態を骨形態計測により組織学的に解析したところ、脱ユビキチン化酵素欠損マウスでは骨密度の上昇が確認された。また、野生型マウスより単離した骨芽細胞を培養し、ウイルスベクターを用いて脱ユビキチン化酵素UCH-L3を過剰発現させたところ、アルカリフォスファターゼ活性の低下が見られた。現在、骨代謝における脱ユビキチン化酵素の意義を解明すべく、野生型マウスの骨芽細胞および破骨細胞を単離し、脱ユビキチン化酵素を過剰発現させた場合および脱ユビキチン化酵素の活性を抑制した際の骨代謝関連因子への影響について、分子生物学的解析を進めている。細胞中の不要な蛋白質はユビキチン化され、ユビキチンープロテアソームシステムを介して分解除去されている。脱ユビキチン化酵素UCH-L3欠損マウスおよび対照群として野生型マウスの骨代謝動態を骨形態計測により組織学的に解析したところ、UCH-L3欠損マウスでは骨密度の上昇が確認された。また、野生型マウスより単離した骨芽細胞を培養し、ウイルスベクターを用いてUCH-L3を過剰発現させたところ、アルカリフォスファターゼ活性の低下が見られた。UCH-L3欠損マウスおよび野生型マウスの血清中の骨型酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TCUCP-5b)を測定したところ、UCH-L3欠損マウスでわずかに活性が高かった。また、UCH-L3欠損マウスおよび野生型マウスより骨髄由来の単球系細胞を単離し破骨細胞へ分化誘導したところ、UCH-L3欠損マウスで破骨細胞への分化の亢進が見られた。