hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経因性疼痛モデル脊髄前角と後角で異なるマイクログリアの反応：神経保護性と傷害性

末梢神経傷害後には脊髄でマイクログリア(MG)が活性化しているが、前角と後角におけるMGでは、その活性化の様式が異なると思われる。免疫組織化学による実験では、前角の活性化MGは神経を取り巻き、synaptic strippingと思われる現象が認められ、そのファゴゾーム内には神経シナプスのマーカーであるSynaptophysinが認められた。一方、後角における活性化MGは貪食マーカーであるCD68を発現しており、神経ではなくミエリンに接していた。そのファゴゾーム内にはミエリンのマーカーであるMyelin basic protein(MBP)が認められた。real time RT-PCRによる解析では、CD68の発現は前角よりも後角で有意に高かった。ミエリンマーカーは特に後角においては発現が減少する傾向にあったが、前角・後角ともに神経シナプスのマーカーには有意な変化を認めなかった。これらの結果から、前角における活性化MGよりも後角における活性化MGの方がより貪食性が高く、一方で、前角の活性化MGの働きには、神経保護的な要素が含まれる可能性があるのかもしれない。これらの研究内容は、日本神経麻酔集中治療学会およびNeuroscienceの国際学会で報告した。これまでに、末梢神経傷害時における脊髄後角でのマイクログリアの活性化が、神経因性疼痛に関与することが明らかになっている。我々の研究では、脊髄後角のみならず、脊髄前角においてもマイクログリアの活性化が認められることを見出した。脊髄前角におけるマイクログリアの活性化は、運動神経の周囲を取り囲みむような活性化をしており、Synaptic strippingと言われる現象が認められる。そこで、我々は脊髄前角と後角でのマイクログリアの性質の差異に注目し、本研究を行った。マクロファージ/マイクログリアの活性化マーカー、貪食に関するマーカー、マイクログリアのタイプを区別するマーカー(M1、M2マーカー神経保護因子や傷害因子)、神経やミエリンに関連するタンパクのmRNAなどを、脊髄の傷害側・健常側でそれぞれ前角・後角に分割し、4か所での発現の違いを解析した。その結果、M1マーカーの一つであるArginase1のmRNAが脊髄前角で有意に増加しており、Myelin basic protein(MBP)は脊髄後角で有意に減少していた。また、マイクログリアの活性化は傷害側前角よりも後角で強く、貪食能も後角の方が有意に高かった。Western Blotttingによる実験では、傷害側前角よりも後角でMBPの有意な減少を認めた。これらのことから、傷害側前角ではマイクログリアはより神経保護的な活性化をし、傷害側後角においてはより炎症の惹起および貪食に傾いている可能性が示唆された。おおむね予定通りのデータが得られており、順調に進んでいる。国際雑誌への投稿のため、論文にまとめ始めたところである。傷害側後角でのマイクログリアによるMBPの貪食をImmunohistochemistryなどの方法により捉える。また、前角でのマイクログリアの貪食のターゲットは何か、引き続き検索を行う。同時に前角で神経保護的な働きがある可能性を考え、前角での神経保護因子の産生状況などの検索を行っていく予定である。次年度に、試薬等の購入に使用する予定である。
薬物トランスポーターの発現制御機構の解明と抗癌剤耐性克服への応用

ABC輪送体ABCG2/BCRPはマイトザントロン、SN-38(イリノテカンの代謝活性化体)、トポテカンなどの抗癌剤を細胞外に排出するポンプとして働き、腫痛細胞に抗癌剤耐住を引き起こす。今までの研究によりエストロゲンレセプター陽性乳癌細胞株では、ABCG2の発現がエストロゲンにより転写以降の段階で劇的に抑制されることが分かっていたが、エストロゲン自体の生理作用のためABCG2の発現抑制のために使用することは困難であった。そこでエストロゲンに変わりABCG2の発現抑制を可能にする薬剤耐性克服剤を探索する目的で、内因性にABCG2を発現している乳癌細胞株MCF-7、胃癌細胞MKN1、NCI-N87にABCG2を安定的に高発現させたMCF7/ABCG2、MKN1/BCRP、N87/ABCG2細胞を樹立して様々な化合物によるABCG2の発現量の変化について検討した。MCF-7/ABCG2、MKN1/ABCG2、N87/ABCG2細胞の外因性ABCG2発現はp44/p42Mitogen-activated protein kinase(MAPK)阻害剤であるPD98059とU0126によって濃度依存性に著しく抑制された。これらの化合物はMCF-7/ABCG2、N87/ABCG2細胞のSN-38とマイトザントロンに対する耐性をほぼ完全に克服した。EACSによる解析で、この薬剤耐性の克服は細胞内への抗癌剤取り込みの亢進によるものであることが示された。半定量RT-PCRとreal-time RT-PCRによる解析ではPD98059とU0126によるABCG2 mRNAの転写量には変化が認められなかった。サイクロヘキサマイドにより蛋白質の新親合成を停止させABCG2蛋白質量を経時的にウエスタンブロットで解析したところPD98059存在下ではABCG2蛋白質の半減期短縮が認められた。PD98059によるABCG2蛋白質の分解亢進はユビキチン/プロテオソーム阻害剤であるMG132では抑制されず、エンドソーム阻害剤であるバフィロマイシンA1によって完全に抑制された。以上の結果によりP44/p42MAPK経路を抑制することによってABCG2のエンドソームでの分解が亢進し、薬剤耐性の克服が可能であることが明らかとなった。これらの結果はp44/P42mapk阻害剤が安全で有効な癌化学療法の確立に役立つかもしれないことを示している。ABC輸送体ABCG2/BCRPはマイトザントロン,SN-38(イリノテカンの代謝活性化体),トポテカンなどの抗癌剤を細胞外に排出するポンプとして働き,腫瘍細胞に抗癌剤耐性を引き起こす。今までの研究によりエストロゲンレセプター陽性

乳癌細胞株では,ABCG2の発現がエストロゲンにより転写以降の段階で劇的に抑制されることが分かっていたが,エストロゲン自体の生理作用のためABCG2の発現抑制のため使用することは困難であった。そこでエストロゲンに代わりABCG2の発現抑制を可能にする薬剤耐性克服剤を探索する目的でEGFレセプターを発現していることが知られている胃癌細胞株NCI-N87にABCG2を安定的に高発現させたN87/ABCG2細胞を樹立して様々な化合物による外因性ABCGの発現量の変化について検討した。N87/ABCG2細胞は親株であるN87細胞と比較してIC50においてSN-38で5倍,マイトザントロンで2.6倍の薬剤耐性を獲得した。また,MAPK阻害剤であるPD98059とU0126が外因性ABCG2の発現量を著しく抑制することを見い出した。これらの化合物はN87/ABCG2細胞のSN-38に対する耐性をほぼ完全に克服した。また,PPARgamma阻害剤であるトログリタゾンが外因性ABCG2発現を濃度依存性に亢進させることも同時に見い出した。MAPK経路の活性化により核でのPPARgammaの転写が亢進することが知られており,MAPK阻害剤による外因性ABCG2発現抑制の機序についてさらに検討を進めている。ABC輸送体ABCG2/BCRPはマイトザントロン、SN-38(イリノテカンの代謝活性化体)、トポテカンなどの抗癌剤を細胞外に排出するポンプとして働き、腫瘍細胞に抗癌剤耐性を引き起こす。今までの研究によりエストロゲンレセプター陽性乳癌細胞株では、ABCG2の発現がエストロゲンにより転写以降の段階で劇的に抑制されることが分かっていたが、エストロゲン自体の生理作用のためABCG2の発現抑制のために使用することは困難であった。そこでエストロゲンに変わりABCG2の発現抑制を可能にする薬剤耐性克服剤を探索する目的で、内因性にABCG2を発現している乳癌細胞株MCF-7、胃癌細胞株MKN1、NCI-N87にABCG2を安定的に高発現させたMCF-7/ABCG2、MKN1/BCRP、N87/ABCG2細胞を樹立して様々な化合物によるABCG2の発現量の変化について検討した。MCF-7/ABCG2、MKN1/ABCG2、N87/ABCG2細胞の外因性ABCG2発現はp44/p42Mitogen-activated protein kinase(MAPK)阻害剤であるPD98059とU0126によって濃度依存性に著しく抑制された。これらの化合物はMCF-7/ABCG2、N87/ABCG2細胞のSN-38とマイトザントロンに対する耐性をほぼ完全に克服した。FACSによる解析で、この薬剤耐性の克服は細胞内への抗癌剤取り込みの亢進によるものであることが示された。半定量RT-PCRとreal-time RT-PCRによる解析ではPD98059とU0126によるABCG2 mRNAの転写量には変化が認められなかった。サイクロヘキサマイドにより蛋白質の新規合成を停止させABCG2蛋白質量を経時的にウエスタンブロットで解析したところPD98059存在下ではABCG2蛋白質の半減期短縮が認められた。PD98059によるABCG2蛋白質の分解亢進はユビキチン/プロテオソーム阻害剤であるMG132では抑制されず、エンドソーム阻害剤であるパフィロマイシンA1によって完全に抑制された。
マクロファージ機能の選択的制御による新たな大動脈瘤退縮治療法の開発

大動脈瘤の主病態は、浸潤・集積したマクロファージによる炎症増幅と組織破壊である。マクロファージ抑制により瘤の炎症病態を是正することができれば、瘤壁組織の退縮治癒を促す可能性は高い。しかし、免疫抑制・感染症が一方で懸念される。研究代表者は、炎症増幅と組織破壊に関わるマクロファージの病的機能のみを選択的に制御することを着想し、そのための標的分子としてfocal adhesion kinase(FAK、接着斑キナーゼ)に着目した。本研究の目的は、FAKが瘤壁マクロファージの病的機能異常を選択的に制御する分子機構を解明し、FAKを標的とする有効かつ安全な大動脈瘤退縮治療法を新たに創出することである。そのため、平成30年度に以下の計画を実施した。【計画IV.FAK阻害が大動脈瘤に対する有用な予防・治療法であることの実証】野生型雄マウスを用いて塩化カルシウム局所刺激による腹部大動脈瘤モデルを作成し、小径瘤が形成される時期(カルシウム刺激後3週目)を待ってから、FAK阻害剤PF573228の治療的投与を開始した。対照として、Vehicle投与を行った。その結果、Vehicle投与ではカルシウム刺激後3週目から6週目の間に瘤径が増大したが、FAK阻害剤投与ではマウス大動脈瘤の進行・拡大がほぼ完全に防止できた。さらに、培養ヒト大動脈瘤組織の実験系において、FAK阻害剤を添加した。その結果、ヒト瘤組織においてもFAK阻害剤投与によって瘤病態に関連する炎症系分子が抑制されることが示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。そのため、平成28年度に、以下の計画を実施した。【計画I.大動脈瘤進展時におけるマクロファージ集積とFAK活性亢進の実証】手術症例から得られるヒト大動脈瘤組織を解析した結果、瘤壁のマクロファージ集積部においてFAK活性亢進を認めた。さらに塩化カルシウム刺激によるマウス大動脈瘤モデルを経時的に解析し、瘤形成に伴ってFAK活性が亢進することが明らかとなった。【計画II.瘤進展に関わるマクロファージの機能異常がFAK活性依存性であることの実証】マウス腹腔由来の培養マクロファージの機能を解析した結果、炎症性サイトカインTNF-alpha刺激によるFAK活性化、MCP-1とMMP-9分泌亢進がFAK阻害によって阻止された。さらにモデルマウスの大動脈瘤壁におけるマクロファージの集積が、FAK阻害剤投与によって抑制されることが明らかとなった。平成28年度に予定した【計画I】と【計画II】は、ともに予定どおりに実施でき、ほぼ期待通りの結果が得られた。そのため、平成29年度に以下の計画を実施した。【計画II.瘤進展に関わるマクロファージの機能異常がFAK活性依存性であることの実証】マウス腹腔由来の培養マクロファージにおいて、炎症性サイトカインTNF-alpha刺激によるFAK活性化、MCPとMMP-9の分泌亢進が、複数種の低分子FAK阻害剤あるいはFAK shRNAによるFAK阻害によって阻止された。【計画III.自然免疫に関わるマクロファージの正常機能がFAK活性に依存しないことの実証】マイクロビーズを用いた貪食能アッセイの結果、マウス腹腔由来の培養マクロファージの貪食能は、複数種の低分子FAK阻害剤のいずれによっても抑制されなかった。【計画IV. FAK阻害が大動脈瘤に対する有用な予防・治療法であることの実証】塩化カルシウム局所刺激によるマウス大動脈瘤モデルを作成し、FAK阻害剤PF573228の予防的投与を行った結果、マウス大動脈瘤の形成がFAK阻害剤によって防止できることが明らかとなった。平成29年度に予定した【計画II】、【計画III】と【計画IV】は、いずれも実施でき、ほぼ期待通りの結果が得られた。

マクロファージ抑制により瘤の炎症病態を是正することができれば、瘤壁組織の退縮治癒を促す可能性は高い。しかし、免疫抑制・感染症が一方で懸念される。研究代表者は、炎症増幅と組織破壊に関わるマクロファージの病的機能のみを選択的に制御することを着想し、そのための標的分子としてfocal adhesion kinase(FAK、接着斑キナーゼ)に着目した。本研究の目的は、FAKが瘤壁マクロファージの病的機能異常を選択的に制御する分子機構を解明し、FAKを標的とする有効かつ安全な大動脈瘤退縮治療法を新たに創出することである。そのため、平成30年度に以下の計画を実施した。【計画IV.FAK阻害が大動脈瘤に対する有用な予防・治療法であることの実証】野生型雄マウスを用いて塩化カルシウム局所刺激による腹部大動脈瘤モデルを作成し、小径瘤が形成される時期(カルシウム刺激後3週目)を待ってから、FAK阻害剤PF573228の治療的投与を開始した。対照として、Vehicle投与を行った。その結果、Vehicle投与ではカルシウム刺激後3週目から6週目の間に瘤径が増大したが、FAK阻害剤投与ではマウス大動脈瘤の進行・拡大がほぼ完全に防止できた。さらに、培養ヒト大動脈瘤組織の実験系において、FAK阻害剤を添加した。その結果、ヒト瘤組織においてもFAK阻害剤投与によって瘤病態に関連する炎症系分子が抑制されることが示された。今後は、まず平成29年度に予定した計画を実施する。現在のところ、計画の変更を要するような問題点はない。今後は、平成30年度に予定した【計画IV】(続き)を実施する。具体的には、FAK阻害薬物療法によって、マウス大動脈瘤モデルの退縮治癒が促進できることと、瘤組織における炎症系・基質分解系蛋白分泌の亢進およびマクロファージの滞留が是正できることを、実証する計画である。現在のところ、計画の変更を要するような問題点は見当たらない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
炎症反応における転写因子c-Fosの役割に関する研究

マクロファージ特異的c-Fos欠損マウスを作製し、野生型マウスと比較することにより、転写因子c-Fosが抗炎症作用を有することを個体レベルで証明するのが本研究の目的である。本年度はc-Fos蛋白質の構造機能相関評価、c-fostargeting vectorの作製、相同組み換えを起こしたES細胞の選択、胚盤胞へのインジェクション、キメラマウスの作製、キメラマウスとC57BL6マウスとの交配、その子F1マウスとマクロファージ特異的Creトランスジェニックマウスの交配、生まれて来たヘテロマウス(F2)同士の交配、その子供であるホモマウス(F3)の作製を行った。c-fosは4つのエクソンからなり、第3エクソン、第4エクソンにロイシンジッパー構造を有する。c-Fosが転写抑制能を発揮するためにはどの領域が必要であるかを見るためにc-Fosの種々の変異体をマクロファージ様細胞であるRAW264.7細胞に発現させ、IL-12プロモーター活性を比較した。その結果、c-Fosのロイシンジッパー構造が必要であることが明らかになった。よって、第2エクソンの5'側と第4エクソンの3'側にloxP siteをそれぞれ導入し、ロイシンジッパー構造を完全に欠失させるようにtargeting vectorを作製した。F3マウスは計画通り誕生したが、F3マウスは全て第4エクソン3'側のloxP siteが消失していた。そのためマクロファージにおいてc-fosの発現は低下していなかった。その後の検証の結果、F2マウス作製の過程において第4エクソンの3'側のloxP siteが消失したこと判明したので、現在そのloxP siteを維持すること注意しながらF2マウスを再作製している。
シクロヘプタ〔cd〕ベンゾフラン類の合成とその反応性に関する研究

4-ヒドロキシ-1-メトキシ-5H-ベンゾシクロヘプテン-5-オン【1!】にブロモ酢酸エチル,2-ブロモプロピオン酸エチルあるいは2-ブロモ酪酸エチルを作用させることにより(1-メトキシ-5-オキソ-5H-ベンゾシクロヘプテン-4-イルオキシ)酢酸【2!】,(1-メトキシ-5-オキソ-5H-ベンゾシクロヘプテン-4-イルオキシ)プロピオン酸【3!】及び(1-メトキシ-5-オキソ-5H-ベンゾシクロヘプテン-4-イルオキシ)酪酸【4!】がシクロヘプタ[cd]ベンゾフラン類の原料として合成された。化合物【2!】,【3!】,【4!】を無水酢酸中で酢酸ナトリウムと加熱するといずれの場合も90%以上の収率で相当するシクロヘプタ[cd]ベンゾフラン【5!】,2-メチルシクロヘプタ[cd]ベンゾフラン【6!】及び2-エチルシクロヘプタ[cd]ベンゾフラン【7!】が得られた。また【2!】,【3!】,【4!】に光を照射したところそれぞれ相当する生成物【5!】(13%),【6!】(50%),【7!】(67%)が得られた。このように化合物【2!】,【3!】,【4!】を原料とすることによりシクロヘプタ[cd]ベンゾフラン類を容易に合成できた。シクロヘプタ[cd]ベンゾフラン【5!】に対してヘプタフルベンならびにベンゾフランに特有な反応を行わせた。【5!】のクロロホルム溶液にトリフルオロ酢酸を加えると2-位にプロトン化が起こりトロピリウムイオンが生成した。パラジウム-炭素を用いて【5!】を接触環元すると7員環内の2つの二重結合が容易に還元されてテトラヒドロ体となったが、フラン環内の二重結合は安定であった。【5!】にテトラシアノエチレンを反応させると7員環内の2つの二重結合との間でDiels-Alder反応が起こり付加物を与えた。次に【5!】に対してオキシ塩化リンとジメチルホルムアミドによるホルミル化,塩化アセチルと塩化スズによるアセチル化を行うといずれも2-位で反応が起こった。また【6!】に光を照射すると7員環内で閉環反応が起こりインデノフランが得られた。これらの結果は【5!】がヘプタフルベンとベンゾフランの性質を合わせ持っていることを示している。
有機構造規定剤及びゲルマニウムフリー合成法による超大細孔ゼオライトの開発

化成品産業やエネルギー産業といった様々な分野における触媒や吸着剤として利用が期待される、超大細孔ゼオライトの従来合成には、ゼオライト骨格構造形成に寄与するゲルマニウムとテンプレートの添加が必要な場合が多く、ゼオライトの大量製造プロセスの煩雑化とコスト高が不可避である。本研究は、種結晶添加技術を利用し、超大細孔ゼオライトのゲルマニウム及びテンプレートフリー合成法の開発を目指して研究を実施した。研究期間中では実験と並行して文献調査と関連する国内・国際学会への参加を行い、国内外の研究者とのディスカッションを交えながらゼオライトをはじめ様々な多孔質材料に関連する最先端の技術動向を収集し、それらを踏まえながら研究を実施した。超大細孔ゼオライトのゲルマニウム及びテンプレートフリーで結晶化させるための前駆体形成と核生成・結晶成長の制御因子等を見出すために、モデルゼオライトの種結晶添加合成において、種結晶が最終生成物に及ぼす影響について検討し、多角的な分析手法よりゼオライト水熱合成環境における種結晶の状態について検討と結果の考察を実施した。得られた実験情報を活かして、有用なゼオライトの簡易合成技術の発展に貢献するため、研究を今後も進めていく予定である。超大細孔ゼオライトの一つであるUTL型ゼオライトを有機構造規定剤とゲルマニウムを用いない条件下で合成することを目標とする。本研究を達成するため、種結晶添加法を利用する。平成29年度は、種結晶添加法によるゼオライトの基盤合成技術を確立するため、まずは既存のモデルゼオライトを選択し、このゼオライト骨格において、アルミノシリケート反応混合物、水熱処理温度、水熱処理時間、種結晶のSi/Al比を変化させて、合成を実施した。種結晶や生成物はX線回折、電子顕微鏡観察、窒素級脱着測定などを用いて評価を実施し、多角的に解析することで、これらの条件が最終生成物の結晶性や不純物の成長度合いなどに及ぼす影響について検討した。本研究の研究計画で記載したように、来年度は、種結晶ゼオライトと様々な組成で調製したアルミノシリケート反応混合物から結晶化するゼオライトの構造類似性に着目した作業仮説に基づいて、合成を実施する予定である。並行して、UTL型ゼオライトに関する論文調査を実施し、そこから既往の合成手法や条件の探索を行い、来年度UTL型ゼオライト合成のための知見の拡充を行った。次年度は、これまでに得られた種結晶添加法の合成結果を基盤に、UTL型ゼオライトの有機構造規定剤及びゲルマニウムフリー合成を検討する。種結晶として既往の合成技術を基にUTL型の結晶化に成功した後、UTL型ゼオライトを再現性良く結晶化させるための合成条件(反応温度や時間等)の最適化を行う。得られたUTL型ゼオライトに対してはキャラクタリゼーションを行い、他のゼオライトのキャラクタリゼーションの結果と比較して、それぞれの特徴をまとめる。平成29年度は、種結晶添加法によるゼオライトの基盤合成技術を確立するため、既存のモデルゼオライトの合成および反応混合物組成条件が生成物に与える影響についてまとめる実験作業に大幅な研究時間を費やした。現状ではUTL型ゼオライトの種結晶添加法は実施できていないため(次年度に実施予定)、研究進捗状況に関しては、やや遅れていると判断した。今後は、昨年度得られた種結晶添加法の合成結果を基盤に、UTL型ゼオライトの有機構造規定剤及びゲルマニウムフリー合成を検討する。並行して、水熱処理結晶化過程における種結晶の役割を捉えるための手法の探索も実施し、種結晶の効果と合成条件が最終生成物に与える影響について検討する。今年度は国際学会等報告できる成果が得られず、予定していた全ての国内・国際会議への参加ができなかった。また、合成実験に関しては、基本すでに研究室に備えられている実験機器で実施したため、消耗品関係についての支出がなかった。今年度に繰り越した研究費は次年度のUTL型ゼオライト合成のための消耗品や実験設備などの拡充に充てる。

また次年度は本研究を遂行するために必要な知見を確保したいと考え、今年度繰り越した研究費を研究動向調査のための様々な国内・国際学会参加費に充てる予定である。
植物ホルモンアブシシン酸のリン酸化シグナルと選択的スプライシング制御機構の解明

アブシシン酸(ABA)は、植物のストレス応答を司る重要な植物ホルモンである。ABAシグナル伝達経路では、タンパク質のリン酸化が重要であり、申請者らはABAに応じてリン酸化される複数のmRNAの選択的スプライシングに関わる因子を発見した。そこで、選択的スプライシングを網羅的に解析するため、ABA処理を施したシロイヌナズナ野生型およびSnRK2欠損変異体から抽出したRNAを用いてシーケンス解析を行ったところ、170種以上のスプライスバリアントを発見した。現在、得られたバリアントの確認を進めるとともに、シロイヌナズナ種子由来のRNAについても同様の解析を進めている。植物細胞内のABAシグナル伝達経路は、受容体、タンパク質脱リン酸化酵素(PP2C)およびタンパク質リン酸化酵素(SnRK2)によるタンパク質のリン酸化シグナルが重要である。先行研究によって、SnRK2の標的タンパク質(基質)として複数のmRNAの選択的スプライシングに関わる因子が同定されたことから、これらの因子の機能解析を進め、ABAシグナルとmRNAの選択的スプライシング制御を明らかにすることを目的とした。27年度は、スプライシング因子のシロイヌナズナ遺伝子破壊株を単離し、それらの表現型解析を行った。ABAを含有した培地上において発芽試験を行ったところ、遺伝子破壊株の中にABA高感受性を示すものやABA非感受性を示すものを見出した。したがって、これらのスプライシング因子はABAに応答してリン酸化制御を受け、ABAシグナル伝達を直接的あるいは間接的に制御することが明らかとなった。また、ABAシグナルがシロイヌナズナにおけるmRNAの選択的スプライシングに及ぼす影響を網羅的に解析するために、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を計画した。本年度は、シロイヌナズナのABA応答に異常をきたすpoly(A)特異的RNA分解酵素の変異株ahg2-1の次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を試験的に行い、データを取得した。一方、ヒメツリガネゴケを用いた解析では、シロイヌナズナSnRK2が標的とする因子の明確なオルソログは同定されなかったが、SnRK2破壊株の作出に成功し、この破壊株はおよそ全てのABA応答を欠損することが明らかとなった。現在、この破壊株を用いたリン酸化プロテオーム解析を行い、新たなスプライシング因子の同定を目指している。当初計画した研究計画の一つであるスプライシング因子の遺伝子破壊株の単離が終了しており、さらに、遺伝子破壊株の表現型解析を進めて、一定の成果を得ている。特に、変異体の中にABA応答が変化する表現型を持つものがあったことは大きな進展であると言える。また、スプライシングの全容を解明するためのRNA-seq解析について、すでに第一段階の解析を終えたので、今後得られたデータのスプライシングパターンの解析を進めることによって、着実なデータの取得が見込まれる。ヒメツリガネゴケでは、当初期待されたシロイヌナズナのオルソログを解析することは断念したが、新たな因子を見つけるための取り組みを始めている。以上のことから、研究は順調に進んでいると判断した。植物細胞内のABAシグナル伝達経路は、受容体、タンパク質脱リン酸化酵素(PP2C)およびタンパク質リン酸化酵素(SnRK2)の3つが主要な因子として働いており、タンパク質のリン酸化が重要な役割を持つことがわかっている。申請者らは、近年リン酸化プロテオーム解析技術を用いて、SnRK2の標的タンパク質(基質)を大規模に解析した。その結果、複数のmRNAの選択的スプライシングに関わる因子が同定されたことから、これらの因子の機能解析を進めるとともに、ABAシグナル伝達におけるmRNAの選択的スプライシング制御を明らかにするための研究を計画した。28年度は、これまでに単離したスプライシング因子のシロイヌナズナ遺伝子破壊株についてさらに表現型解析を進めるとともに、野生型とシロイヌナズナSnRK2多重変異体を用いてRNA-seq解析を行った。予備的な解析の結果、シロイヌナズナ植物体中では多数の遺伝子がABA応答性の選択的スプライシング制御を受けていることが示唆された。また、種子におけるABAに応答したスプライシングパターン変動を解析するために、休眠打破操作、発芽誘導操作、ABA処理など発芽に関わる諸処理の最適化を行った。また、種子から高効率に高品質のRNAを抽出する方法を確立した。シロイヌナズナでSnRK2の標的タンパク質とされた選択的スプライシング因子のオルソログを基部陸上植物であるヒメツリガネゴケにおいて検索したところ、多くの因子がコケ植物にも保存されていることが明らかとなった。しかしながら、いずれも多重遺伝子族を形成しており解析が困難であった。そこで、ヒメツリガネゴケのSnRK2完全欠損体のリン酸化プロテオーム解析を行ない、ヒメツリガネゴケにおけるABA依存的なスプライシング因子を探索している。シロイヌナズナのスプライシングパターンをRNA-seq解析によって網羅する実験に時間がかかってしまい、当初計画した研究課題の一部にやや遅れがある。しかしながら、懸案のRNA-seq解析が終了し、現在は概ね順調に研究が進んでいる。

そこで、選択的スプライシングを網羅的に解析するため、ABA処理を施したシロイヌナズナ野生型およびSnRK2欠損変異体から抽出したRNAを用いてシーケンス解析を行った。今年度はデータ解析を進め、トランスクリプトームとスプライスバリアントの解析結果をまとめた。その結果、170種以上のスプライスバリアントが、ABAシグナルによって制御されることを発見した。また、それらはABAシグナル伝達の中枢因子の一つであるSnRK2プロテインキナーゼによる制御を受けることも明らかにした。現在、得られたバリアントの確認を進めるとともに、シロイヌナズナ種子由来のRNAについても同様の解析を進めている。さらに、シロイヌナズナの種子についても、休眠種子および休眠打破処理を施した種子についてスプライシングの解析を行った。また、本年度は代表者および分担者を併せて4件の原著論文を出版するとともに、17件の学会発表を行った。アブシシン酸(ABA)は、植物のストレス応答を司る重要な植物ホルモンである。ABAシグナル伝達経路では、タンパク質のリン酸化が重要であり、申請者らはABAに応じてリン酸化される複数のmRNAの選択的スプライシングに関わる因子を発見した。そこで、選択的スプライシングを網羅的に解析するため、ABA処理を施したシロイヌナズナ野生型およびSnRK2欠損変異体から抽出したRNAを用いてシーケンス解析を行ったところ、170種以上のスプライスバリアントを発見した。前年度に引き続き、スプライシング関連因子の遺伝子破壊株の詳細な表現型解析をすすめて、スプライシング因子によるABAシグナル制御の実態を明らかにしていく。また、RNA-seq解析については、SnRK2の三重変異体を用いた解析を新たに行う。これによって、ABAのリン酸化シグナルによるスプライシングパターンの制御の全容を明らかにすることを目的とする。さらに、ヒメツリガネゴケSnRK2遺伝子破壊株のリン酸化プロテオーム解析を行うことによって、新規なスプライシング関連因子の取得を目指す。引き続き、スプライシング因子の遺伝子破壊株等の表現型解析を行い、ABA応答における生理機能を明らかにする研究を進める。また、スプライシング解析については、すでに次世代シーケンサーを用いた解析を開始しており、近々データが取得できる予定である。このデータ解析を進めて、ABA応答性スプライシング制御の全貌を明らかにすることを目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
住宅計画における熱的快適性と意匠性・機能性の調和に関する研究

5年度に行った冬季調査結果のまとめと反省をもとに夏季調査の項目を決定して昨年冬季と同じ住戸を対象にして夏季のヒアリング調査と熱環境測定を行った。また,吹き抜けを持つ住戸を5戸(内1件はソーラーハウス)を選定し6年度夏期.冬期のヒアリング調査および熱環境測定を行った。また,昨年度ヒアリング調査の対象住戸と同一構造の住戸約50件の郵送調査を夏季・冬季に行った。室温の実測データから実生活における体感温度の推定を行うためにはより正確な熱収支量を知る必要があるため,正座位人体と周囲壁面との有効放射面積と形態係数を求める実験を行い,姿勢の違いに体感温度の差を推定をした。一般住戸の夏期の調査結果ではクーラー使用を控えて通風によって生活したいという要求が満たされない住戸が多い。また冬期調査では30m^2を上回る広いLDK空間でも直接的な寒さの不満は少ないが,こたつ・ホットカーペットで足元寒さに対処する住戸は多く,開放式器具による空気汚染の問題も予想されるが今回は空気質の測定は行っていない。吹き抜け住戸では夏の通風は有利であるが設計によってはあまり涼しく住めていない。また冬期は電気床暖房により採暖的に生活している2例,かなり寒い1例など十分に寒さを意識した計画はなされているとはいない。空気集熱式のソーラーハウスでは床暖房方式であり,足元の冷えがないために起居様式の季節差も少ない。今回の知見では初歩的な配慮によって熱環境を改善する手段が見いだされる例が多いので,そのような設計指針を設計者に啓蒙することによる改善が重要であると考えられる。既存研究のサーベイのうち、住宅の熱環境調査研究については主だった文献をほぼ収集し、知見をまとめた。当初の見通しのように,すまい方との関連性を中心にした文献はほとんどみられなかった。戦後の住様式、住み方研究に関しては現在文献のリスト作成を完了し,建築計画学分野からの熱環境の取り上げ方を明らかにする作業を進行中である。ヒアリング調査と熱環境測定に関しては軽量鉄骨のプレハブ住宅約70件の対象住戸の図面を採取し、平面,開口部等の分類作業を行った。平面形態はLDK,LD・K,L/DK,L/D・K等に分類し,各住戸についてLDKの面積・外壁に面する面積率等を計算した。LDK空間の面積はLD・K型では平均32.6m^2(22.744.0),LDK型では平均26.5m^2(16.134.4)であった。また、温熱環境測定・ヒアリング調査に関しては上記のプレハブ住宅8件,在来木造住宅1件,空気集熱式ソーラーハウス1件について平成6年1月に行った。プレハブ住宅の平面はLD・K型6件,L/D・K型2件であった。ソーラーハウスは現在も測定を継続中である。現在これらの測定・調査データの生理・分析中である。一つの知見として居住者の寒さの不満は起床時の温度が低いことによると考えられた。なお,以前調査したことのある断熱・気密性能が低い住戸のデータとの比較検討を行ってから,郵送調査項目を決定する方が有益であると考えられたので,冬期郵送調査は6年度に延期した。
学校教育における「日本的いのち教育」―カリキュラム編成と教材開発―

初年度である平成12年度は、教材開発とカリキュラム検討のための資料収集、それらの検討、実践活動を行った。国内外のDeath Education用の教科書、ワークブックを収集可能な限り集め、その内容を検討し、諸外国と日本人の死に対する感性との関連性・相違生をさぐり、教材作成の基礎資料とした。さらに、生涯教育の一環として「いのち教育」を実施する必要性が考えられ、「新潟大・上越教育大いのちの教育を考える会」を設立した。12年度は、次世代を担う自分の子どもを育ててると考えられる20(8160)1630代の男女を対象に「いのちの講座」を長岡市において計8回開催した。最終年度である平成13年度は、「日本的いのち教育」のための学校教育、特に家庭科教育を中心としたカリキュラムを作成し、その実践のために有用と考えられるCD-ROM教材2作品を開発した。教材は郷土理解を含む「昔ばなしからいのちを学ぼう(8160)16泉小太郎(8160)16」と悲嘆教育用の「悲しみってなあに?(8160)16悲しみをより理解するために(8160)16」の2作である。さらに、それらの教材を用い、小学校で授業を実践し教材の有効性を検討した。また、昨年度設立した会の活動として「いのち教育実践のための研修講座」を、上越教育大学を会場にして、7月23日(8160)1625日、8月25(8160)1627日の2回にわたって、異なる内容で開催した。講習会において、開発教材の紹介、その教材を用い、講座参加者を生徒に立てた模擬授業も行った。2年継続研究であり、初年度である平成12年度は、全員で作業、検討を行った。つまり、諸外国のDeath Education用の教科書、ワークブックを収集可能な限り集め、その内容を検討し、諸外国と日本人の死に対する感性との関連性・相違生をさぐった。「死」が日常生活から追い出されている現在において、多くの人が「生と死」の感性や、自然やいのちに関する畏敬の念に疎くなっており、そのことが一因として、若い世代の生命軽視の痛ましい事件が続発しているとも考えられる。その感性欠乏の原因の一つとして、「死」にまつわる慣習・行事の衰退も考えられる。故に、「死」に関する日本的な儀式や慣習が、かつてどのように一般市民の間で機能していたのかを知るため、上越市戸野目地区在住の高齢者を対象にフィールドワーク調査を行った。「死」に関する慣習・行事の機能の衰退の様子知るため、第2次世界大戦直後のそれらの取り組みと、現在の若い世代のそれらに対する認識や取り組みとの相違を知るためにアンケート調査は実施し、現在解析中である。また、「日本的いのち教育」に関する教育の歴史的な系譜の整理と確認、諸外国の義務教育レベルにおける情報収集を現在行っている。その実践の第一歩として、今年度は、次世代を担う自分の子どもを育てていると考えられる2030代の男女を対象に「いのちの講座」を長岡市において計8回開催した。
HSP70、及びアポトーシス誘導に着目した、NSAIDs潰瘍克服のための基礎研究

私は、胃粘膜での種々のHSPsの発現をmRNAレベルで検討した。その結果野生型マウスにおいて、インドメタシン投与依存にhsp70 mRNAが誘導され、この誘導がHSF1欠損マウスでは見られないことを見出した。一方、インドメタシンは他のhspのmRNA発現には影響を与えなかった。この結果から私は、HSP70に注目して以降の検討を行った。イムノブロット法および組織免疫染色法でHSP70の発現を検討した結果、インドメタシン投与依存にHSP70の誘導が見られ、この誘導はHSF1欠損マウスでは見られなかった。また、インドメタシン投与による胃粘膜でのアポトーシス誘導をTUNEL法で検討したところ、野生型マウスではインドメタシン投与後にTUNEL陽性細胞(アポトーシスを起こした)細胞の増加が見られたが、この増加はHSF1欠損マウスでは見られなかった。以上の結果から私は、HSF1依存的に誘導されるHSP70は、インドメタシン依存の胃粘膜細胞のアポトーシス誘導を抑制することにより、胃潰瘍の形成を抑制している可能性を考えた。この考えを検証するために、HSP70過剰発現マウス、及びその野生型マウスを用いて検討した。野生型マウスに比べ、HSP70過剰発現マウスではインドメタシン潰瘍の形成が有意に抑制されていた。また、HSP70過剰発現マウスでは野生型マウスに比べ、インドメタシン依存の胃粘膜細胞のアポトーシス誘導が顕著に抑制されていた。以上の結果から、HSP70はアポトーシス誘導を抑制することにより、NSAIDs潰瘍の形成を抑制していることが示唆された。我々は、NSAIDsによるATF4、CHOPの誘導がNSAIDsによるPUMAの誘導に関与していること、及び誘導されたPUMAがBaxの活性化を介してミトコンドリアを傷害し、アポトーシス誘導に関与していることを報告した。しかし、ATF4、CHOPが直接PUMAの誘導に関与していることは証明されていない。そこで、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行い、この問題に取り組んだ。PUMA遺伝子のプロモーター領域をクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。同時に、ATF4、及びCHOPの結合領域を欠損させた変異体を作成した。これらレポータープラスミドをヒト培養細胞に導入し、NSAIDsの添加によるルシフェラーゼ活性の変化を調べところ、NSAIDs依存のルシフェラーゼ活性上昇がATF4、及びCHOPへの変異導入により部分的に消失した。この結果は、これらの転写因子がNSAIDs依存のPUMA誘導に関与していることを示している。次に、野生型、及び上述の変異を導入したPUMA遺伝子のプロモーター領域を用いて、これらの転写因子がこの結合部位に直接結合することを、ゲルシフトアッセイを用いて確認した。最後にヒト細胞の核抽出液を用いてPUMA遺伝子の試験管内転写系を構築し、精製したATF4やCHOP、及びこれらの中和抗体の効果を調べるところ、精製したATF4やCHOP、が転写を促進すること、及びこれらのタンパク質に対する中和抗体により転写が抑制されることを見いだした。以上の結果は、ATF4とCHOPが直接PUMAの転写に関与していることを示している。私は、HSP70はNSAIDs依存のBaxの活性化を抑制することにより、NSAIDs依存のアポトーシスを抑制していることを示唆した。そこでこの分子機構を明らかにすることにより、HSP70によるアポトーシス抑制機構を解明できると考えた。HSPsは分子シャペロンであり、他の蛋白質(クライアント蛋白質と呼ばれる)と相互作用し、その蛋白質の成熟、輸送、分解を制御することにより、その蛋白質が正しい場所で、正しい構造で、正しい時間作用することを制御している。そこで私はHSP70がBaxと相互作用(結合)することにより、その活性化、及びミトコンドリアへの移行を抑制していると考えた。このことを検証するためにまず、免疫沈殿法により両者が結合するかを検証し、結合することを示唆した。次に、生化学的にHSP70がBaxの活性化を抑制するかを検討した。具体的には、HSP70、及びBaxを過剰発現細胞から精製し、HSP70がBaxの活性化を抑制するかを生化学的に検討したところ、抑制するという結果を得た。我々は、共同研究している企業から得た生薬ライブラリー(約600種)を所有している。私はこの中にHSP70誘導作用を持つものが存在すると予想した。そこでこれらの生薬の中から、HSP70誘導作用を持つものを選択した。その際、誘導に必要な絶対的な濃度だけでなく、細胞毒性を示す濃度に比べ、より低い濃度で効果を示すという観点からも生薬の選択を行った。尚、レポータープラスミドを用いたシステムで一次スクリーニングを、イムノブロット法で二次スクリーニングを行った。次に選択した生薬を経口投与し、胃粘膜でHSP70を誘導するか、NSAIDs潰瘍を抑制するか検討し、生薬の更なる絞り込みを行った。これらの研究から、ヤバツイを初めとする多くのHSP70誘導作用を持つ生薬を得た。

この結果から私は、HSP70に注目して以降の検討を行った。イムノブロット法および組織免疫染色法でHSP70の発現を検討した結果、インドメタシン投与依存にHSP70の誘導が見られ、この誘導はHSF1欠損マウスでは見られなかった。また、インドメタシン投与による胃粘膜でのアポトーシス誘導をTUNEL法で検討したところ、野生型マウスではインドメタシン投与後にTUNEL陽性細胞(アポトーシスを起こした)細胞の増加が見られたが、この増加はHSF1欠損マウスでは見られなかった。以上の結果から私は、HSF1依存的に誘導されるHSP70は、インドメタシン依存の胃粘膜細胞のアポトーシス誘導を抑制することにより、胃潰瘍の形成を抑制している可能性を考えた。この考えを検証するために、HSP70過剰発現マウス、及びその野生型マウスを用いて検討した。野生型マウスに比べ、HSP70過剰発現マウスではインドメタシン潰瘍の形成が有意に抑制されていた。また、HSP70過剰発現マウスでは野生型マウスに比べ、インドメタシン依存の胃粘膜細胞のアポトーシス誘導が顕著に抑制されていた。以上の結果から、HSP70はアポトーシス誘導を抑制することにより、NSAIDs潰瘍の形成を抑制していることが示唆された。上述のように、ほぼ計画通りに研究は進んでおり、またHSP70誘導生薬の発見など、世界的に新しい数多くの知見を得たため。計画通りに研究を進める。
喉頭全摘出者のQOL向上へつなげる看護体制の構築：RCTによる縦断的介入

咽喉頭がんによる喉頭全摘出者は,術前からがんによる辛さがあり,術後も失声障害や永久気管孔造設に伴う生活のしづらさが生じるため,QOLは退院1年後も術前と変わらず低いままである。特に,退院3か月後のQOLは,心身社会面の全てに下降傾向があり,社会復帰後の適応の困難さが窺えた。QOL向上においてフォーマルな情報的・心理的サポートが有効だが、その体制は十分に整えられていない。そこで本研究は,喉頭摘出者の暮らしを支える看護介入に関する訓練を受けた看護師を配置し,術前から退院1年後までの看護介入の効果をRCTにて検証し,退院後も安心して暮らせるようシームレスな看護体制の構築を目指す。
子宮内膜症由来の卵巣癌発癌進展過程におけるlipocalin2の発現と機能の解析

LCN2免疫染色では、LCN2は子宮内膜症や子宮内膜症との関連が知られている明細胞癌や類内膜癌において高発現していたが、封入嚢胞や漿液性癌ではほとんど発現を認めなかった。またLCN2高発現卵巣癌症例は優位に生存期間が短縮していることを見出した。そこで卵巣明細胞癌細胞株を用いてLCN2の機能解析を行った。LCN2は細胞内の鉄濃度を上昇させたが、活性酸素種ROSや酸化ストレスを上昇させずむしろ軽減し、LCN2は酸化ストレス耐性を増強し、アポトーシスを軽減させていた。その機序としてはCD44バリアントやxCT発現上昇を介してグルタチオン濃度を上昇させるためと考えられた。まず、免疫染色によるlipocalin2 (LCN2)発現の検討では、正常卵巣の封入嚢胞に比較して子宮内膜症腺上皮でlipocalin2 (LCN2)発現が有意に強く(P<0.01)、特に癌が併存する場合に発現が増強していた(P=0.02)。また上皮性卵巣癌においては、子宮内膜症に関連した明細胞腺癌、類内膜腺癌で発現が強い一方、漿液性腺癌では殆ど発現が認められなかった(P<0.01)。さらに非漿液性卵巣癌(明細胞、類内膜、粘液性)において、カプランマイヤー法(P=0.009)、コックス多変量解析(P=0.026)でLCN2高発現が予後不良因子となることを見出した。LCN2は子宮内膜症の癌化・進行に関与することが考えられた。次に子宮内膜症性嚢胞内では炎症と多量の遊離鉄により過剰な酸化ストレス状態にあると考えられることから、LCN2と酸化ストレスとの関係を培養細胞で検討した。LCN2低発現卵巣明細胞腺癌細胞株ES2にLCN2 cDNAを導入し、安定強発現させたES2-LCN2を樹立した。酸化ストレスとしてH2O2を培養液に添加し、DNA損傷マーカーである8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)発現、活性酸素種(ROS)産生をROS感受性蛍光プローブのジクロロフルオレシン(DCFH)、アポトーシスをアネキシンV染色、細胞生存能をWST-1アッセイを用いて検討すると、組み替えLCN2(rLCN2)添加やLCN2高発現は、ROS産生を抑制し、酸化ストレスを軽減すること、さらにアポトーシスを抑制し細胞生存能を高めることが示された。さらに、ES2-LCN2ではシスプラチンやパクリタキセルに対しても細胞の生存能を高めることが観察された。LCN2は酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性を増強し、卵巣癌細胞の生存を促進すると考えられた。昨年までの実験結果より、我々はlipocalin2 (LCN2)を発現させた卵巣明細胞腺癌細胞株において酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性が増強することを見出したため、その耐性獲得機序について検討した。まずSODやGPx等の抗酸化酵素のmRNA発現や蛋白発現をreal-time RT-PCR法やウェスタンブロッティング(WB)法を用いて解析したが、有意な差を認めなかった。そこで還元反応の基質として作用するグルタチオン濃度を測定したところ、卵巣明細胞腺癌細胞株ES2ではLCN2を高発現させたES2-LCN2において有意にグルタチオン濃度が上昇していた(P<0.001)。グルタチオン合成の律速段階はシスチンの細胞内への取り込みであることから、シスチンの輸送体であるxCTや、その発現を安定化するCD44 variant(CD44v)のmRNA発現や蛋白発現をRT-PCR法およびWB法で検討したところ、mRNA発現に差を認めなかったがES2-LCN2ではコントロール細胞ES2-mockに比べてxCT、CD44vの蛋白発現が増強していた。これらの結果よりLCN2はCD44vおよびxCT蛋白発現を転写後調節により増強させることで、シスチンの細胞内への取り込み増加から細胞内のグルタチオン濃度を上昇させ、酸化ストレス耐性・抗癌剤耐性に寄与すると考えられた。子宮内膜症は子宮外に子宮内膜が増殖する疾患で、卵巣の子宮内膜症では内部に血液が貯留した子宮内膜症性嚢胞(OEM)がしばしば形成される。OEMの約0.7%は癌化し明細胞癌(CCC)や類内膜癌(EC)が発生するが、特に日本人では、抗癌剤抵抗性で予後不良であるCCCの発生頻度が高いことが問題である。OEMの癌化では鉄イオンの関与が注目されている。すなわち、ヘモグロビンから遊離しOEM内に豊富に蓄積した鉄イオンは、フェントン反応から活性酸素種(ROS: reactive oxygen species)を発生させ、酸化ストレスを誘導することで発癌に寄与すると考えられている。Lipocalin 2(LCN2)は鉄輸送蛋白の1つで、炎症や種々の癌で高発現が報告されており、細胞内鉄濃度の調節から様々な機能を発現すると考えられている。我々はこれまでに、正常子宮内膜と比較して子宮内膜癌で発現が増強し、その悪性度増強に関与する因子としてLCN2を見出した。LCN2はその機能上とOEMとの関連が強く示唆されたため、OEMや卵巣癌におけるLCN2の関与を免疫組織染色にて検討したところ、LCN2はOEMやOEMから発生するCCCやECにおいて高発現し、LCN2高発現卵巣癌症例は有意に予後不良であった。そこで今回我々は、LCN2の機能解析を行うために、卵巣CCC細胞株を用いてLCN2と特に鉄イオン、ROSや酸化ストレスとの関係を検討した。

LCN2免疫染色では、LCN2は子宮内膜症や子宮内膜症との関連が知られている明細胞癌や類内膜癌において高発現していたが、封入嚢胞や漿液性癌ではほとんど発現を認めなかった。またLCN2高発現卵巣癌症例は優位に生存期間が短縮していることを見出した。そこで卵巣明細胞癌細胞株を用いてLCN2の機能解析を行った。LCN2は細胞内の鉄濃度を上昇させたが、活性酸素種ROSや酸化ストレスを上昇させずむしろ軽減し、LCN2は酸化ストレス耐性を増強し、アポトーシスを軽減させていた。その機序としてはCD44バリアントやxCT発現上昇を介してグルタチオン濃度を上昇させるためと考えられた。LCN2の酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性の機序として、CD44v発現やxCT発現上昇によるグルタチオン濃度上昇が関与していることを見出した。CD44vは癌幹細胞マーカーとしても注目されており、LCN2発現とこれらの分子の発現の関連の報告はなく、我々が新規に見出したものである。現在他の細胞株でも同様の結果が得られるか解析中である。外科系臨床医学・産婦人科学基本的には当初の計画通りにすすめる。LCN2高発現卵巣明細胞腺癌細胞株とコントロール細胞株をヌードマウスの皮下に移植し、造腫瘍能や抗癌剤耐性を比較する。またLCN2と相互作用する分子や下流分子の検索が必要であるが、これにはマイクロアレイ法で抽出された因子について検討を進める。また免役沈降法や質量分析法を用いて検索することを計画している。当初H26年度以降に計画していた卵巣癌細胞株を用いたLCN2機能解析を、すでに進めている。浸潤能や造腫瘍能に対する作用についても、結果を得られつつあり、また合計3種の細胞株を用いて、解析を進めている。基本的には当初の計画通りにすすめる。LCN2による酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性について更に検討を進める。そのためにLCN2と相互作用する分子や下流分子の検索が必要である。これにはマイクロアレイ法や免役沈降法とTOF-MAS法を用いて検索することを計画している。またLCN2による抗酸化酵素群の発現状況の変化も検討していく。我々の最近の予備実験でLCN2により癌幹細胞マーカー発現の変化が観察されており、これが酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性と関連している可能性が考えられ、さらに検討していく。