hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
硝酸塩摂取により伸張性収縮後の筋収縮力や筋小胞体機能の減退を抑制できるか？

10週齢の雄性ラット30匹を伸張性収縮前06日間、水溶化させた硝酸ナトリウムを経口摂取させ、伸張性収縮を300回負荷した。長指伸筋および前脛骨筋を、筋収縮終了直後に摘出し分析した。摘出した前脛骨筋はすぐに張力計につなぎ、生理食塩水(37°C)中で、筋収縮力を測定した。長指伸筋については、酵素活性測定用とタンパク質解析用に分割し測定までの間、-80°C冷凍庫にて保管した。硝酸塩摂取03日間の筋収縮力において伸張性収縮負荷脚(収縮群)は対照脚(対照群)と比較して明らかな減少がみられたが、6日間摂取において、その差は認められなかった。筋小胞体Ca2+放出速度では、硝酸塩を摂取しなかった0日間群において、収縮群は対照群と比較して顕著な減少がみられた。しかしながら摂取3日目以降では収縮群と対照群の間に差は認められなかった。細胞内Ca2+制御能力に関与するタンパク質の解析を行うために、SDSポリアクリルアミド法による電気泳動法にてタンパク質を分離した。引き続き免疫ブロッティングを行い、筋小胞体Ca2+放出に関与するリアノジン受容体とジヒドロピリジン受容体タンパク質の量的分析を行った。その結果、収縮群と対照群間に、硝酸塩摂取03日間のリアノジン受容体とジヒドロピリジン受容体の量に差異が認められなかった。しかしながら、36日間の硝酸塩摂取により、収縮群と対照群とともに、リアノジン受容体とヒドロピリジン受容体のタンパク質量の減少がみいだされた。硝酸塩摂取が伸張性収縮による筋収縮力、及び細胞内Ca2+制御能力の機能低下抑制に関与するか否かについて、ラットの速筋を用いて検討した。酸塩摂取3日目までみられた伸張性収縮による筋収縮力の減少が、6日間摂取においてはみられなくなり、硝酸塩無摂取群でみられた筋小胞体Ca2+放出速度の減少が、硝酸塩摂取3日目以降にみられなくなった。細胞内Ca2+放出に関与するタンパクであるリアノジン受容体とジヒドロピリジン受容体を免疫ブロッティング法により解析した。硝酸塩摂取と伸張性収縮は、収縮群と対照群間の両タンパク質の量に影響を及ぼさなかったが、収縮群と対照群ともに両受容体のタンパク質量の減少をもたらした。平成27年度に摘出し、冷凍保存している筋サンプルを用い、伸張性収縮後のSRのCa2+取込・放出機能に関連するタンパク質の量と機能的修飾(酸化的修飾など)に関する解析を行う。0、3、6日間の硝酸塩摂取後の伸張性収縮直後のCa2+の取込・放出(リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体)タンパク質の修飾的解析を行い、引き続き、伸張性収縮後の硝酸塩摂取が筋の機能低下の回復を促進するかに関する研究を開始する。運動生理学
日韓役割語の相互学習支援と参与観察研究-ネットを介した物語創作の協同活動-

本研究では、実際の言語教育現場で活用できる、もっとも効果的な役割語習得法として「ネットを介した、学習者主体の相互学習システム」を提案・実践し、その効果を検証した。協同活動の場としてSNSコミュニティーを利用し、「役割語」をテーマとした日韓・韓日翻訳活動を行った。この活動を参与観察した結果、日韓両言語学習者同士の「学習&支援」者としての相互学習の効果により、両言語の役割語意識が活性化したことが確認できた。本研究では、日本語教育現場と韓国語教育現場という2つの教育・研究拠点に加えて、日本と韓国の両地域を結ぶネットコミュニティーシステムを利用し、韓国人日本語学習者と日本人韓国語学習者の協同活動の場を提供することで、両言語役割語の相互学習を支援する活動を行う。なお、活動の中で交わされる議論を分析し、その結果を日韓対照役割語研究の発展にフィードバックする研究活動も並行して行う。したがって、今年度にもっとも力を入れて主に取り組んできた活動は、ネットコミュニティーを使った相互学習体制の構築と定着であった(より参加者の幅が広く自由度の高いコミュニティー空間としての常時開設ブログ)。具体的な流れは以下のとおりである。(1)日本と韓国あわせて4ヵ所の教育機関にて勤務中の研究協力者の協力を得て、各研究協力者が指導した両言語学習者を推薦してもらった。(研究協力者:北海道大学/研究代表者及び佐藤恵理講師、韓国江原大学校/恩塚千代招聘講師、京都外国語大学/坂口昌子准教授、長崎外国語大学/ヤン・ジョンソン講師)(2)推薦してもらった学習者を参加メンバーとするネットコミュニティーシステムを開通した。まず、無料公開型SNSのmixi、GREE、My Space、freeMLなどを検討して試行を行った後、freeMLに「日韓役割語相互学習倶楽部」という非公開コミュニティーを開設した。現在の参加学習者は、韓国人日本語学習者6名、日本人韓国語学習者5名である。今後、活動の成果を見守りながら、もっと参加者を増やしていく予定である。(3)コミュニティーの中では、まず両言語役割語についての共通理解や相互学習のための関係作りを行った。その後、研究代表者から提示される役割語を中心とした漫画作品の日韓翻訳など、いくつかの課題を参加者同士の協同活動形式で遂行中である。以上の活動の様子は、パネルディスカッションやシンポジウム発表の形で、報告を行っている。初年度から運営してきたSNSコミュニティ「日韓役割語相互学習倶楽部」の活動を現在も続けている。現在の活動メンバーは、韓国人日本語学習者6名、日本人韓国語学習者5名、現職日本語教師のサポーター4名で構成されている。具体的には、「役割語」をテーマとした、日本語漫画の韓国語訳という課題翻訳活動を行った。活動は,ペアによるレビューと、全体でのコメント合戦という2つの方式を織り交ぜて行われた。その中で,互いが学習者でありながら支援者であるというメリットが活動の質の向上に十分に生かされていたことが、参与観察の結果明らかになった。上記の活動から得られた情報をもとにした「日韓役割語対照研究」における研究成果を、学会発表やシンポジウムを通して報告している。いくつかの具体例をあげると、以下のとおりである。(1)「2010世界日本語教育大会(台湾国立政治大学):現代の日本語学習者の学習動機やネットコミュニティなどの発展に照らし合わせてみたときに、大衆文化作品に多く表れる「役割語」を日本語教育の指導現目として取りあげることへの意義を唱えた。(2)第35回日本語教育方法研究会(金城学院大学):SNSコミュニティ上でのCMC活動が言語学習に有効であることと、学習者&支援者というダブルロールを設定することで起こる相乗効果について、具体的な活動例をあげた上で明らかにした。(3)公開シンポジウム「役割語・発話キャラクタ研究の展開」(大阪大学):ペアレビュー、コメント合戦といったCHC活動の中で、学習者の役割語に対する意識がどう変化していったのか、学習がどう進んだのかに注目し、本活動が学習者の気づきとスキル向上に役立っていることを証明した。本研究の目的は、韓国人日本語学習者と日本人韓国語学習者の両言語役割語の相互学習を支援しながら、活動の中で交わされる議論を分析し、その結果を日韓対照役割語研究の発展にフィードバックすることである。協同活動の場としてネット上のSNSコミュニティを利用してきたが、活動3年目を迎えて初年度から利用してきた会員制の民間SNSサイトであるfreeMLから、よりカスタマイズしたSNSコミュニティを目指してopenPNEにサーバーを変更し、「役割語」をテーマとした日韓・韓日翻訳活動を引き続き行ってきた。今年度に活動の課題として注目したのは韓国ドラマの日本語訳であり、とりわけ注目して行った議論は、両言語による映像メディアの中での言語的特徴である。本活動から得られたアイディアをもとにした研究成果は、次の学会発表を通して報告している。(1)「日韓対照によるメディア言語研究へのアプローチ-映像メディアのジャンルによる言語的特徴を中心に」(第36回メディアとことば研究会)(2)「日韓対照の観点から見た映像メディアの言語的特徴」(2011世界日本語教育大会)

発表の内容を簡単にまとめると、日韓両言語による映像メディアを対照した結果、(1)日本語から韓国語への言語切り換えに、普通体から丁寧体への意図的な変形プロセスが見られる、(2)韓国語から日本語への言語切り換えに、意図的な「キャラクタの再創出」が観察される、という2点が明らかになったということである。ただし、この結果は断片的な例にもとつく一次的な結論に過ぎず、予備的研究として位置づけられる。今後は、これまでの「日韓対照役割語研究」の枠内で行ってきた対訳資料分析のノーハウを生かし、「日韓対照を通したメディア言語研究」に研究の枠を広げていきたいと考えている。
グラフィカル・データ・アナリシスによる格差研究と社会環境会計による解決方法の提案

2018年度の研究成果は、次の4つである。(1)データセット(DS-Osiris-2017)の前処理とデータ解析環境への読み込み(データラングリング)、そしてデータ解析の結果が再現可能となるかを検討した。具体的には、結果を得るための工程をUnix環境(主にmakeコマンドを利用)で自動実行することによって、データの前処理、データラングリング、データ解析、モデル選択、モデル評価、さらに文書作成までの全工程を再現可能なものとして生成できるかについて検証した。結果として、再現性が確保されることに成功した。(2)Bureau van Dijk社のデータベースOrbisから抽出したデータセットを、連結(Consolidated)主体のものと非連結(Un-consolidated)主体のものに区分し、データの前処理を実行した。さらにデータラングリングを行うことによって、データ解析ができる形式に変換した。これらの工程を再現可能とするために、makeコマンドを利用することによって、自動実行することも検証した。(3)企業活動の実態解明を行うために、(a)企業の富の偏在と国際・国内格差、(b)付加価値の分配、(c)企業の租税回避についての考察結果を、論文としてまとめ、会議発表した。(4)付加価値の分配に焦点を当て、企業が生み出した付加価値が、様々なステークホルダーにどのように配分されているかを確認するために、世界の全上場企業の付加価値分配の実態と動向を可視化した。その結果、過去25年間で、企業は従業員への分配を減少させ、利益を増加させていること、特にアメリカ企業ではそれが顕著であることが明らかとなった。一方で、ドイツやフランスでは、従業員への高い分配割合を維持していることもわかった。2018年度は、Orbisデータ等の前処理とラングリングから始め、実際にデータを可視化し、企業活動の実態解明を行った。研究の進捗状況を、時系列的に記載すると次のとおりとなる。2018年4月:データセット(DS-Osiris-2017)に対する探索的財務ビッグデータ解析を、データ(ファイル)操作、データ可視化、統計モデリング、モデル選択、モデル評価、再現可能研究の全行程の観点から実行することを検討した。2018年5月:上場企業のデータセット(DS-Osiris-C-2018(連結決算)、DS-Osiris-U-2018)を用いて検証した。2018年6月:データセット(DS-Orbis-C-2018)を用いて検証した。2018年7-8月:データセット(DS-Orbis-U-2018)を用いて検証した。2018年9月:データセット(DS-Orbis-C-2018)のFENNEL環境におけるクラスター化(Hadoop、Hive)を実施した。2018年10月:探索的財務ビッグデータ解析(データ可視化、統計モデリング、モデル選択、モデル評価、動的文書生成、再現可能研究)を実施した。2018年1112月:データ全体を再確認し、データ提供母体であるインフォメーションプロバイダの情報を追加したデータ再抽出を依頼した。データセット(DS-Orbis-C、U-2018)の前処理と、FENNEL環境下での並列化を検証した。2019年13月:再採取抽出されたデータセット(DS-Orbis-C、U-2018)の前処理を並列化し、FENNEL環境におけるクラスター化を検証した。データセット(DS-Orbis-C、U-2018)の可視化による検証を実施した。(1)時間的な推移を考慮したモデリングについては、経時的な観点から利用できるデータ量や、欠損情報などのデータの品質についての詳細な検討が必要であることがわかったため、引き続き2019年度に有効なモデリングを検討する予定である。(2)実際にデータを可視化し検証する過程で、精緻に分析するためにはデータの追加が必要であることがわかり、改めてデータセットを入手した。この新しいデータセットに対して、2018年11月から検討を始めた並列化処理を、GNU parallelを利用して実験的に試みた結果、約10分の1の時間で前処理が完了できるという結果を得た。これは、ビッグデータ分析で重要な速度(velocity)の観点から注目すべき成果が得られたことを意味し、2019年度はこの並列化処理についてさらに詳細な検討を行う。(3)前処理を行ったデータセットのファイルを、データ解析ソフトウェアRに読み込む段階、すなわちデータラングリングを行う工程を、R、Spark、Hadoop、Hive環境とGPGPU環境を連動させて高速化するというテーマについては、Sparkの最新のJava環境への対応の遅れから実現できていない。この課題に対して、2019年度は、データベースサーバPostgreSQLをGPGPU環境下で利用可能にするPG-Stromを用いることによって、高速化の実現を試みる。(4)2018年度は規模の大きなデータセットのデータ処理の再現性とスピードを改善させることに注力したため、時空間の観点からのダイナミックでインタラクティブなデータ可視化に本格的に取り組む段階に至らなかった。ただし、小規模データセットに対しては、データ解析環境RにおけるgoogleVis、Shinyパッケージを利用してダイナミックにデータの構造を可視化することに成功しており、2019年度にはこの手法を用いて可視化に取り組む。約30年間の世界140カ国の会計データについて、様々なビジュアライゼーション技法を用いて、グラフィカル・データ・アナリシスを実施し、企業の富とその偏在等に関する格差の証拠を提示した。

その上で、当該データのモデリングとフィッティングを行うために、会計データ分布の特殊性を考慮して修正した分析手法について検討を行った。また、プログラミング言語と文書整形システムを協調させることによって動的に文書を生成すること(動的文書:dynamic documentation)は、再生可能研究(reproducible research)を実現するための機能として、その重要性が認識されている。そこで、現在のデータ解析環境Rで利用される動的文書を生成するための環境であるSweaveとknitrについて、各種のオペレーティングシステムのもとでの環境設定法と利用法を検討し、財務データと経済指標データの解析への応用を行った。さらに、線形回帰モデルにおける説明変数間に多重共線性が存在するときには、最小自乗推定量を用いた回帰係数の推定に関して、精度の低下に伴って様々な問題が生ずることが以前より指摘されている。そこで、この問題に対して、縮小回帰推定量を用いた推定精度の改良の検討を行った。具体的には、縮小回帰推定量として通常リッジ回帰推定量、一般化リッジ回帰推定量、主成分回帰推定量、r-kクラス推定量を取り上げ、それらの総平均自乗誤差を求めることによって、これらの推定量の改良の程度を計算し、さらにそれらの実行可能性を検討した。結果として、(実行可能型)縮小回帰推定量が、多重共線性のもとで適切に利用されるならば、最小自乗推定量よりもより「有効」となる可能性を持つことが示された。本研究で扱うデータの特徴は、経時観測データ(パネルデータ)とよばれるもので、複数の個体(上場企業)に対する属性を決算年月日に観測したものであり、その構造から時間・空間の両面から調査する必要がある。このため、データの時間的な変化を見るための時系列解析や、財務ビッグデータの空間的な分析を見るためのクロスセクションデータの多変量解析を設計するにあたっては、時系列プロット・対散布図・モーションチャートなどを用いてデータの分布を可視化することにより、財務データの統計モデリングに必要な知見を得ることが必要であり、2016年度はこれらに取り組むことができた。今後は、2016年度に実施した可視化の成果を基にして、様々な観点からの可視化作業を発展させるとともに、モデリング研究を継続することができると考えている。経時観測データである企業財務ビッグデータについて、時系列解析や多変量解析に加え、データの空間的な分布をみるための時系列プロット・対散布図・モーションチャートなどを用いてデータの分布状態を可視化することによって、データ自身のもつ情報を探索的に引き出す、探索的データ解析(Exploratory Data Analysis: EDA)を行った。Bureau van Dijk(BvD)社のOsirisから、全上場企業の財務データを入手し(148カ国・約83,000社・30年分、85項目の財務データ、1.3GB超)、次の研究を行った。
虚血臓器障害モデルにおける抑制性細胞の関与と治療への応用

最近脳梗塞における炎症においてもT細胞が促進的な役割を果たすことが明らかにされつつある。我々は脳虚血モデルにおいて脳虚血早期にマクロファージが産生するIL-23が、脳虚血遅延期に浸潤するT細胞のIL-17産生を誘導していることを報告した(Nature Med.2009,15,946-950)。しかしIL-10やTGFβなどの抑制性サイトカインや抑制性細胞の寄与は十分解明されていない。TGFβは生体内で恒常的に産生されており、活性化マクロファージに対しては、炎症性サイトカイン及びNOの産生抑制作用を持つ。TGFβ下流の重要なシグナル伝達分子としてSmad2/3が知られており、本年度は、このSmad2/3のマクロファージにおける機能解析を通じて、マクロファージ抑制機構を分子レベルで解明することを目標とした。研究ではマクロファージ特異的Smad2欠損マウスおよびSmad3、Smad2/3両欠損マクロファージを用いてiNOS産生を解析した。その結果、Smad2欠損マウスでは腹腔マクロファージおよび腫瘍集積マクロファージにおいてiNOSの発現が上昇しており、Smad2のiNOS発現抑制作用が生理的に示された。その分子機構としてSmad2とSmad3が機能的に重複してiNOS発現を抑制すること、さらにSmad2/3はNF-kBのほかIRF3-インターフェロンβ(IFN-β)-STAT1経路を抑制するなど、複数の機構でiNOS mRNAの転写を抑制することを見いだした。腫瘍浸潤マクロファージの分化誘導や活性制御にも、Smad2/3が深く関与している可能性が腫瘍移植モデルを用いた解析からも示されており、虚血、感染のみならず、多くの疾患において、TGFβ、Smad2/3を介した制御が新たな治療ターゲットになりうることが本研究より示された。本研究成果は学位論文としてInt.Imlnuno1.誌に発表された。NO/lfNOSおよび活性化マクロファージの制御は虚血のみならず、多くの病態で重要であり、そのメカニズムを新しく発見したことは、期待以上の研究の進展があったと考えられる。TGFβ下流の重要なシグナル伝達分子としてSmad2/3が知られており、本年度は、このSmad2/3のマクロファージにおける機能解析を通じて、マクロファージ抑制機構を分子レベルで解明することを目指した。Smad2についてマクロファージ特異的な(LysM-Cre)Smad2cKOマウス、Smad3KOマウス、およびSmad2cKO/Smad3KOマウスを作成し、これらのマウスの腹腔マクロファージ(PEC)とin vitroの骨髄由来マクロファージ(BMDM)にLPSおよびTGFβ刺激を加えて、ELISA, real-time PCR, Western blotting等の解析を行った。これまでにSmad3がNFkB経路を抑制する可能性は指摘されていたが、我々はさらに、Smad2/3がIRF3→IFNβ経路の抑制作用、および、NO生産を抑制するArginaselの発現誘導促進作用を持つことを発見した。Smad2/3の抑制作用が多岐に渡るという発見は、サイトカイン毎にTGFβの抑制作用の影響が異なることと矛盾せず、今後詳細な分子機構の解明を進めていく予定である。また、Smad2/3はiNOS/NO生産を特に強く抑制する。これは、NO生産に至るまでの多段階でSmad2/3が抑制をかけることによるものと考えられる。

その分子機構としてSmad2とSmad3が機能的に重複してiNOS発現を抑制すること、さらにSmad2/3はNF-kBのほかIRF3-インターフェロンβ(IFN-β)-STAT1経路を抑制するなど、複数の機構でiNOS mRNAの転写を抑制することを見いだした。腫瘍浸潤マクロファージの分化誘導や活性制御にも、Smad2/3が深く関与している可能性が腫瘍移植モデルを用いた解析からも示されており、虚血、感染のみならず、多くの疾患において、TGFβ、Smad2/3を介した制御が新たな治療ターゲットになりうることが本研究より示された。本研究成果は学位論文としてInt.Imlnuno1.誌に発表された。NO/lfNOSおよび活性化マクロファージの制御は虚血のみならず、多くの病態で重要であり、そのメカニズムを新しく発見したことは、期待以上の研究の進展があったと考えられる。
噴流を用いたセラミックス材料の熱衝撃における伝熱

熱衝撃をうけるセラミックス材料の強度特性、および伝熱特性は一般に試験片全体を加熱し、急冷する方法により調べられている。しかし、実際には材料全体が一様に加熱されるのではなく、局所的に加熱され温度分布が一様ではない場合が多い。そこで、試験片を局所的に加熱するために赤外線放射加熱装置を、着実な急冷のために水の噴流を用いて、局所的熱衝撃を実現する実験装置を使用した。この装置では、試験片が円盤に装着され、その円周上に加熱部・冷却部が配置されてあり、両者間を移動し熱衝撃が与えられる。当年度は、当初の計画どおり、試験片を加熱部から急冷部へ移動させるステッピングモータを、パルスモータコントロールモジュールを介してコンピュータにより制御し、高速度での移動を可能とした。さらに、本研究の目的である、噴流による局所的な熱衝撃をうけるセラミックス材料の伝熱特性を調べるために、熱電対を挿入した試験片を作成する必要がある。しかし、熱衝撃をセラミックス材料に繰返し負荷するとしだいに強度が低下することが明らかになり、試験片表面にき裂が生じそれが進展していく、あるいは複数のき裂が生じると考えられる。このため、熱電対を挿入した試験片は作成せず、ビオ数を試験片板厚変えることにより変化させて、実験を行った。試験片寸法は、長さ60mm、幅10mm、厚さは0.5、1および2mmの三種類のアルミナセラミックを用いた。その結果、ビオ数が大きくなると、強度が急降下する臨界温度差はしだいに小さくなるが、その後一定になり変化しなくなることが分かった。つまり、局所的な熱衝撃では、板厚をある程度以上厚くしても熱衝撃特性は変化しないと考えられる。この原因を調べるために、局所的な熱衝撃での非定常熱伝導及び生じる熱応力を現在FEMで解析中である。今後、適切な実験方法により噴流による局所的熱衝撃の伝熱特性を調べる計画である。
低心拍出量状態に対するノルエビネフリン・血管拡張剤併用療法の研究

この研究では、雑種成犬を用いて心臓全体に及ぶ虚血性心筋障害(globalcardiac ischemia,GCI)に伴う低心拍出量状態(LOS)の実験モデルを独自の方法で作成し、このモデル犬に対しノルエピネフリン(NE)と各種血管拡張薬を、それぞれ単独に、あるいは両者同時に併用投与して、これらの薬剤の主として血行動態に及ぼす効果について検討した。1.LOSモデルの作成法:これまでに文献上も確立されたLOSモデル作成法の報告はなく、我々も2,3の方法を試行した後、最終的には下記の方法でLOSを作成した。すなわち、静脈麻酔、気管内挿管、室内空気による調節呼吸下に左第5肋間で開胸し、矩形波電気刺激(30volt,50Hz,5msec)により心室細動(VF)を誘発、1分後に直流除細動を行なって心拍再開させるという操作を57回反復して、VFに続発するGCIを発生させた。LOSモデルの条件としては、反復VF終了後30分のpeak dp/dt値がVF前の対照値の7080%、心拍出量および左室仕事量が対照値の70%以下になったものとした。2.薬剤投与の効果:上記の方法で作成したLOSモデル犬にNEの単独投与を行うと、動脈圧、peak dp/dt、心拍数、全末梢血管抵抗は著しく増加したが、心拍出量、一回心拍出量は改善せず、むしろ低下傾向を示したのに対し、NEにphenoxybenzamine(POB),trinitroglycerine(TNG)などの血管拡張薬を併用すると、血管抵抗の増大が効果的に抑制され、peakdp/dt、心拍出量の良好な回復を得ることができた。POBとTNGとの比較では、POBの方が左室仕事量の増大が少なく、心筋酸素消費量が少なくてすむことが示唆された。3.今後の研究の展開の計画:NEと併用する血管拡張薬として、目下phen-tolamine,カルシウム拮抗剤についても同様の検討を行いつつあり、臨床例のLOSに対する薬物療法において、何がNEと併用する血管拡張薬として最適かという明確な指標を得るようにしたいこの研究では、雑種成犬を用いて心臓全体に及ぶ虚血性心筋障害(globalcardiac ischemia,GCI)に伴う低心拍出量状態(LOS)の実験モデルを独自の方法で作成し、このモデル犬に対しノルエピネフリン(NE)と各種血管拡張薬を、それぞれ単独に、あるいは両者同時に併用投与して、これらの薬剤の主として血行動態に及ぼす効果について検討した。3.今後の研究の展開の計画:NEと併用する血管拡張薬として、目下phen-tolamine,カルシウム拮抗剤についても同様の検討を行いつつあり、臨床例のLOSに対する薬物療法において、何がNEと併用する血管拡張薬として最適かという明確な指標を得るようにしたい
マメ科植物の根粒菌共生と病原抵抗性に共通な機構の解明

マメ科のモデル植物であるミヤコグサについて、病原性細菌Pseudomonassyringaeの接種-解析系を確立した。この系を使って、根粒菌の共生の全身的な量的調節に関与するHAR1遺伝子がP.syringaeに対する抵抗性に関与していることを明らかにした。このHAR1依存的な抵抗性を解析したところ、多くの防御応答遺伝子の誘導や過敏感細胞死を伴わない抵抗性であることが明らかとなった。マメ科植物ミヤコグサにおいて、共生パートナーである根粒菌の感染を負に制御するHAR1遺伝子は病原菌であるPseudomonassyringaeの感染抑制にも関与している。HAR1依存的な抵抗性(以下HDR:HAR1 Dependent Resistance)の実体を明らかにするために、本年度はPseudomonassyringae感染時のミヤコグサの葉での組織学的観察を行った。トリパンブルー染色法により、P.s.pv.glycineaおよびpv.pisiを接種したミヤコグサでは約8時間後に細胞死の予兆が観察され、20時間後には部分的に細胞死が観察された。さらに20時間後に観察される実際の細胞死はhar1変異体では野生型植物に比べて観察される頻度が少なかった。このことから細胞死の予兆が観察される菌接種7時間後より前の段階でHAR1依存的な抵抗性による遺伝子発現が起こっていると推測される。これらの知見から現在は菌接種7時間前後の植物体を用いて病原応答遺伝子の発現を解析したところ、大部分の遺伝子はhar1変異体においても発現が観察された。野性型植物ではむしろこれらの遺伝子の発現誘導レベルが低い。以上の結果から、har1変異体では多くの病原応答機構は正常に保たれており、P.syringae抵抗性に必要な一部の防御応答が誘導できない可能性が推測される。また細胞死のパターンがP.syringaeを接種した領域全てではなく細胞レベルで部分的にしか生じないことから、HDRは研究の進んでいるavr-R遺伝子を介した抵抗性とは異なるメカニズムであることが考えられる。マメ科植物は根に根粒菌が感染することで根粒と呼ばれる器官を形成する。根粒内部では根粒菌が共生しており、大気中の窒素をアンモニアに変換して宿主植物に供給している。一方で植物は高度な防御機構を備えており、病原菌の侵入を感知すると過敏感細胞死や抗菌物質の蓄積などの手段により排除する。これまで根粒菌の感染-共生成立過程における防御応答機構の制御についての知見が少なかった。本研究では根に根粒菌が過剰に感染するミヤコグサのhar1変異体が、地上部において病原菌であるPseudomonas syringaeに対する抵抗性が弱まっていることが明らかとなっている。本年度はこのHAR1依存的な抵抗性の実体を明らかにするために、マイクロアレイを用いて解析を行ったところ、野性型植物と比較してhar1変異体では複数の防御応答遺伝子の発現が減少していることが明らかとなった。またマメ科植物の基礎的な防御応答の知見を得るために、一般に植物に防御応答を誘導することが知られているキチンおよびフラジェリンに対する応答遺伝子を、マイクロアレイを用いて網羅的に解析した。その結果、マメ科植物に特有の抗菌物質であるイソフラボノイド系ファイトアレキシンの合成に関与する既知の全ての遺伝子が誘導されることが明らかとなった。またこれらの遺伝子は根粒菌の分泌する共生開始シグナルであるNod Factorによっても一過的に誘導されることが明らかとなった。上記の結果からマメ科植物は根粒菌に対しても防御応答を一過的に作動させており、正常な相互認識が成立することで防御応答が解除されると推測される。
抗原分子の油状ナノ分散化技術を利用した低侵襲性経皮ワクチンの創製

ワクチンとは、ウイルスなどの抗原を体内に投与し、抗原特異的な免疫力を増強・記憶させ、以後その病気にかかりにくくする免疫療法である。一般的なワクチン投与は注射によって行われているため、本研究の最終目標である注射でしか投与できなかったワクチンを、塗り薬として投与できる経皮ワクチンの創製は、ワクチン注射における患者の苦痛軽減や感染症回避などが可能となり、我々の生活の質(Quality Of Life : QOL)向上に大きく寄与できると考えている。現在までに種々の抗原タンパク質に油状ナノ分散化技術(Solid-in-Oil(S/O)化技術)を利用することで、皮膚に存在する疎水性バリアを通過しやすくなり、注射と同程度の抗体産生が達成可能であることを明らかとしている。具体的には、経皮がんワクチン療法の開発を目的に、親水性ペプチドを修飾したTRP-2ペプチドを用い、界面活性剤の種類や比、免疫賦活剤の種類の観点からS/O製剤の最適化を行うことで、マウス皮膚に塗布してTRP-2抗原を体内に送達できるS/O製剤の調製に成功した。この製剤を用いてマウスに免疫化を行った後、メラノーマの皮下移植を行った結果、未処置群と比較して有意な腫瘍成長の抑制が認められた。注目すべきことに、S/O製剤による腫瘍抑制効果や延命効果は、注射により免疫化を行ったマウスよりも高いことが分かり、肺へのメラノーマの転移性も有意に抑制することを明らかにした。さらに経皮花粉症減感作療法の開発においても、スギ花粉のT細胞エピトープ配列を連結し免疫賦活剤を加えた場合、あるいは連結させずに免疫賦活剤を加えなかった場合、いずれにおいてもS/O製剤に封入しマウスに経皮ワクチンを行ったところ、注射投与と同等以上にアレルギー反応の指標であるIgE抗体の産生が抑制されることを明らかにしている。本プロジェクトでは、実利用可能な低侵襲性経皮免疫システムを構築するために、より実用化に近い抗原を用いて、(1)経皮がん免疫療法への応用、(2)経皮アレルギー減感作療法への応用の2つを大きな研究の目的として掲げた。(1)がん免疫療法への応用本年度は、実用化に近いがん抗原として、メラノーマ由来のTRP-2ペプチドを用いた。S/O製剤の最適化を行い、実際にこの製剤を用いてC57BL/6Nマウスに一週間おきに計2回の免疫化を行った後、メラノーマの皮下移植を行った。その結果、未処置群のマウスと比較して有意な腫瘍成長の抑制が認められた。注目すべきことに、S/O製剤による腫瘍抑制効果や延命効果は、皮下注射により免疫化を行ったマウスよりも高いことが分かり、半数程度のマウスにおいて、がんが生着しない「腫瘍拒絶」が見られた。さらに肺転移性も有意に抑制することが明らかとなった。(2)経皮アレルギー減感作療法のための経皮ペプチドワクチンスギ花粉症の治療に効果があると報告のあった7個のヒトT細胞エピトープ配列を、トリアルギニンリンカーを介して連結させた、7crpRをS/Oナノ粒子に封入し、免疫賦活剤として知られるR-848を油状基剤に溶解させて併用した。スギ花粉症モデルマウスを用いた実験では、R-848を含むS/O製剤を用いると抗原特異的IgE値が有意に減少し、その効果は皮下注射よりも高いことが明らかとなった。また、7個のヒトT細胞エピトープペプチドを連結させずにS/O製剤に封入し、同様の実験を行ったところ、皮膚浸透性が向上した結果、アジュバントのR-848なしでも注射と同等のIgE産生の抑制効果が得られ、各種サイトカイン産生量からも、アレルギー反応が緩和されたことが示唆された。これにより、スギ花粉症の簡便な治療法への見通しが開けた。これまでの研究で、モデル抗原ではなく、1がんや2アレルギーを対象とした実際の免疫治療に近い抗原を用いることで、油状ナノ分散化技術を用いた経皮ワクチンシステムによって、注射に匹敵する治療効果が得られることが明らかとなった。この中で、抗原ペプチドを用いた免疫療法の検討を行ったが、抗原ペプチドの性質によってS/O製剤の調製条件や免疫の活性に違いがみられることがわかった。この知見は、本システムにおける免疫産生メカニズムの解明にも繋がることから、さらに深く検討する。さらに、より実現性の高いターゲットに絞り込むことで、新しい形での油状製剤を用いた経皮ワクチンまたは経皮ドラッグデリバリーシステムを構築することを目指す。TRP2ペプチドを用いたがん免疫療法の検討により、疎水性の高いペプチドはS/O製剤化することが難しく、親水基アミノ酸を付与することで改善されることが分かった。そこで、今まで不安定なS/O製剤しか得られなかったペプチドに対して機能性ペプチドの導入を検討する。また、抗原提示細胞との相互作用が高いペプチド配列、糖鎖などを修飾した抗原の開発も行う。■臨床実績のある花粉症抗原の利用すでに、スギ花粉粗抗原を経口投与する事でヒトにおける花粉症の減感作療法の臨床試験が実施されている。そこで本研究では、既に臨床投与実績のある抗原をS/O製剤化する事で、本研究期間前半で確立された花粉症モデルマウスの評価系によって、スギ花粉粗抗原を経皮投与しても花粉症治療効果が得られるかを検証する。■ワクチン機能増強のためのアジュバント開発

今までの基礎検討ではアジュバントとして、マウスでの活性化が高いCpGやR848を中心に検討してきたが、本系ではより現実的なものとして、ヒトの経皮投与アジュバントとして実用化されているアジュバンドを利用することを計画している。経皮促進技術として開発されたsolid-in-oil (S/O)技術を実際のワクチン抗原に応用するために、S/O製剤の最適化を行った。本年度は、ワクチンのモデル抗原として、より実用的なメラノーマ抗原ペプチドTRP-2を用いた。S/O粒子をマウスの耳介部から経皮投与し、血清中の抗原特異的IgG抗体の生産量を評価した。その結果、抗体産生量はS/O製剤からの抗原ペプチドの徐放量と相関を持ち、TRP-2と界面活性剤の比率が1:50(w/w)のS/Oワクチン製剤を使用した場合に、注射とほぼ同等の抗体産生量が得られることが明らかとなった。がんの免疫療法は、悪性腫瘍への治療効果や転移・再発の抑制効果が期待されるがんの治療法である。本研究では、S/O製剤による抗腫瘍性免疫の誘導能を評価した。モデルがん抗原としてTRP-2ペプチド抗原を用い、マウスに一週間おきに三度、マウスの耳介部に200マイクログラムを経皮的に免疫化を行った。その結果、免疫化を行っていないマウスでは劇的な腫瘍体積の増加が見られたが、S/O製剤により免疫化を行ったマウスでは、腫瘍成長の顕著な抑制が認められた。さらに、転移の抑制も観察された。スギ花粉症治療のための経皮ペプチドワクチン開発本研究では、スギ花粉症を対象として、S/O技術を利用した花粉症免疫治療法の開発を試みた。マウスモデル実験においてスギ花粉症の治療に効果があると報告のあった7個のエピトープ配列を、S/O製剤に変換し使用した。スギ花粉症モデルマウスを作成し、エピトープ抗原の経皮投与による血清中の総IgE値および抗原特異的IgE値を調べた結果、ペプチド抗原を週一回で三度経皮投与したマウスでは、抗原特異的IgE値が大きく低下し、花粉症モデルマウスのくしゃみの回数も有意差を持って減少することが明らかとなった。これまでの研究成果によって、S/O化技術を用いることによって、抗原が角質層を通過でき、免疫付与が可能となることが示された。したがって本年度は、最適化したS/O製剤のワクチン利用を目的に、がんワクチンと花粉症ワクチンに焦点を当てた。具体的にがんワクチンにおいては、S/O製剤の免疫誘導能向上を期待し、免疫増強剤(アジュバント)としてR-848を添加したS/O製剤を調製した。各S/O製剤の経皮投与による抗腫瘍効果を調べるため、マウスを用いたin vivoでの経皮免疫を行い、腫瘍成長および転移抑制能評価を行った。がん細胞として高転移性マウスメラノーマ由来細胞株B16F10細胞を使用した。免疫化後の腫瘍体積変化を検証した結果、S/Oは注射と同等の腫瘍抑制効果を持つことが示された。これは抗原の経皮投与によって、皮膚中に豊富に存在するランゲルハンス細胞等の樹状細胞サブセットを効率的に利用できたためであると考えられる。さらに、アジュバントを投与したグループにおいてはこれらを上回る腫瘍抑制効果が確認された。花粉症の免疫治療においては、花粉症モデルマウスに経皮免疫を行い、その治療効果を評価した。花粉症において、治療効果の指標は血清中のIgE抗体価である。IgE抗体は花粉の暴露に応答して産生されるため、免疫が獲得されていれば、IgE抗体価は減少する。
撹乱環境下における植物の分集団動態-撹乱強度と絶滅確率の関係に関する数理的解析-

本研究で対象としている生活史の異なる木本種2種(トチノキ,サワグルミ)、林床植物3種(エンレイソウ、オオバナノエンレイソウ、オオウバユリ、スズラン)について、その生物集団の動態の解析を行った。生存率、成長率、繁殖率の撹乱などによる時間空間的変動が集団の増加率に与える影響を評価する従来の方法について検討が加えられ、近年発展した生命表反応実験(LTRE)という手法を用いる解析をおこなった。また、その結果をもとに絶滅確率を求める新たな手法を開発した。本研究で対象としている生活史の異なる木本種2種(トチノキ,サワグルミ)について、集団解析に使用する目的で、オニグルミ属で開発されたマイクロサテライトマーカーの適用可能性について検討した。また、林床植物3種(エンレイソウ、オオバナノエンレイソウ)に関して、これまで個体にマーキング処理を施してある永久調査区において、個体の成長、生存、死亡に関わる継続追跡調査を行った。また、生活史パラメーターの変動が個体群の増加率に与える影響を評価する個体群増加率の感度や弾力性を用いる方法について検討が加えられ、生命表反応実験(LTRE)という手法を用いる解析をおこなった。それらの研究の結果,オオバナノエンレイソウでは、自殖が集団内の生育段階構成や遺伝的構成に与える影響が明らかになった(裏面の「雑誌論文」の項参照)。また、サワグルミでは2遺伝子座について集団内の多型を検出可能なプライマーが得られた。そのプライマーを使った遺伝解析の結果を次年度にまとめる予定である.さらに、LTREという手法を用いることによって,トチノキ、サワグルミの集団の維持機構が明らかになった.(裏面の「雑誌論文」の項参照)。また、集団の絶滅確率を求めるシミュレーシヨンプログラムに用いるために、既存のセンサスデータの統計学的解析を行った。次年度には、上記のシミュレーションプログラムに手を加え、分散率が絶滅確率に与える影響の計算を行う予定である.現在これらの成果の一部が3本の論文、3回の学会発表において公表されている。本研究で対象としている生活史の異なる木本種2種(トチノキ,サワグルミ)、林床植物3種(エンレイソウ、オオバナノエンレイソウ、スズラン)について、集団解析に使用する目的で、これまで個体にマーキング処理を施してある永久調査区において、個体の成長、生存、死亡に関わる継続追跡調査を行った。それらの研究の結果,クローナル植物のスズランでは、栄養繁殖に偏る特徴的な繁殖様式と、それにともなう特徴的な遺伝的構成の空間配置が見いだされた。その成果は、英文論文として2008年に公表されている。また、トチノキでは生命表反応実験いう手法を用いることによって,台風という自然撹乱が生息場所依存的に異なる影響をトチノキ集団に与えることや,集団動態の時空間的変動を反映する集団の維持機構、すなわち集団動態のKey stage,Key processが同定された。この成果については、現在英文論文をJournal of Ecology誌に投稿準備中である。他にも植物群集の共存安定機構をもたらす要因に関する理論研究がなされ,英文論文として2009年に公表された。現在これらの成果の一部が3本の論文、3回の学会発表において公表されている。
翻訳後修飾アセチル化に着目した「新規関節リウマチ検査」の確立

関節リウマチ(RA)診断では、検査項目を補完するような新規検査項目が必要とされている。申請者は、RA患者の末梢血において特定の蛋白質のアセチル(Ac)化が亢進していることを突き止め、RAでAc化が亢進している蛋白質として、alpha-enolase (ENO1)などを同定した。次に、AcENO1の診断指標としての有用性を評価するのに必要なAcENO1抗体を作製するために、RA特異的に亢進しているENO1のAc化部位の特定を試みたが、特定まで至らず、今後の検討課題となった。また、ENO1のアセチル化による抗原性への影響を検証したところ、Ac化依存的に抗原性の変化は認められなかった。関節リウマチ診断のための臨床血液検査では、血清中の抗シトルリン化ペプチド抗体・リウマチ因子の検出などが採用されているが、十分とは言えない。従って、従来の検査項目を補完するような新規検査項目が必要とされている。申請者は、前年度の研究で、関節リウマチ患者の末梢血においてalpha-enolase (ENO1)とイソクエン酸デヒドロゲナーゼのアセチル化が亢進していることを突き止めた。そこで、平成25年度は、1)ENO1のアセチル化の測定法の確立を含め、2)診断的意義を明らかにすることを目的とした。上記1)の目的を達成するにあたり、アセチル化ENO1の診断指標としての有用性を評価する目的で、アセチル化ENO1の「アセチル化を受けているリジン残基とその周辺のアミノ酸配列」を認識する抗体を作製するために、関節リウマチ特異的に亢進しているENO1のアセチル化部位(リジン残基)の特定を試みた。被験試料であるENO1の調製法(ENO1量やプロテアーゼの種類など)や質量分析の条件等を複数検討し、関節リウマチ由来末梢血リンパ球由来ENO1のアセチル化部位の特定を試みたが、アセチル化ペプチドの検出は困難であった。次に、上記2)を遂行するにあたり、ENO1が、関節リウマチ特異的な自己抗体の抗原となりうるかについて調べるために、ENO1およびアセチル化ENO1を抗原とし(アセチル化ENO1は、リコンビナントで作製したENO1に、in vitroでアセチル化酵素およびアセチルCoAを作用させ、効率的にアセチル化させることで調製した。)、関節リウマチ患者血清を用いて、ウエスタンブロッティングを行ったところ、ENO1に反応する血清がいくつか認められが、アセチル化依存的な反応強度の変化は認められなかった。申請者グループは、関節リウマチ患者の末梢血において特定の蛋白質のアセチル化が亢進していることを突き止めており、本研究では、この蛋白質のアセチル化の測定法の確立を含め、診断的意義を明らかにし、臨床検査として確立したい。平成24年度の本研究では、まず、すでに検出している関節リウマチ患者末梢血リンパ球で、アセチル化が亢進している蛋白質を回収し、トリプシンで消化後、MALDI-TOF/TOF型質量分析器を用いて同定した。その結果、関節リウマチでアセチル化が亢進している蛋白質として、alpha-enolase (ENO1)とイソクエン酸デヒドロゲナーゼが同定された。次に、同定アセチル化蛋白質の診断指標としての有用性を評価する目的で、同定アセチル化蛋白質の「アセチル化を受けているリジン残基とその周辺のアミノ酸配列」を認識する抗体を作製するために、関節リウマチ特異的に亢進している同定蛋白質のアセチル化部位(リジン残基)の特定を試みた。まず、LC-MSを用いて、健常者末梢血リンパ球で試みた結果、120番目と126番目のリジン残基がアセチル化されたペプチドと256番目のリジン残基がアセチル化されたペプチドが検出され、健常においてENO1は、120、126、256番目のリジン残基でアセチル化されていることが明らかとなった。次に、関節リウマチ患者末梢血リンパ球を用いて、同様の検討を試みたが、現時点で、関節リウマチ特異的にアセチル化されたペプチドの検出には至っていない。現在、ENO1の調製法やLC-MSの条件等を変え、関節リウマチ特異的なアセチル化部位の同定を試みている。研究の目的を達成するにあたり、大きく3つの項目がある。そのうち、一つ目の項目は、申請者の以前の研究で検出している、関節リウマチ患者末梢血リンパ球でアセチル化が亢進している蛋白質を同定することであるが、アセチル化亢進蛋白質として2つの蛋白質を同定した。

現在、二つ目の項目の、同定アセチル化蛋白質の診断指標としての有用性を評価するために、関節リウマチ検体を集めるとともに、評価に用いる際の、特異的アセチル化抗体を作製するために、アセチル化亢進蛋白質のアセチル化部位を特定する点に注力している。また、一方で三つ目の項目の同定アセチル化蛋白質に対する自己抗体の診断指標としての有用性を評価するために、アセチル化亢進蛋白質をin vitroで調製できるよう、その条件設定に着手した。平成24年度では二つ目の項目までを終わらせる予定でいたが、二つ目の項目のアセチル化部位同定に時間を費やし、現在、解析中である。時間的には余力があったので、平成25年度の予定に記した三つ目の項目も前倒しで、並行して行い、実験条件の検討等などを終えた。そのため、おおむね順調に進展していると選択した。平成25年度は、1)同定アセチル化蛋白質の診断指標としての有用性の評価、2)同定アセチル化蛋白質に対する自己抗体の診断指標としての有用性の評価の2つのアプローチにより、同定アセチル化蛋白質ENO1の診断的意義を明らかにすることを目的とする。1)を遂行するにあたり、関節リウマチ特異的に亢進しているENO1のアセチル化部位(リジン残基)の特定をENO1の調製法(ENO1の量やプロテアーゼの種類など)やLC-MSの条件を変え、再度試みる。関節リウマチ特異的に亢進している「アセチル化を受けているリジン残基とその周辺のアミノ酸配列」を含むペプチドを合成し、アセチル化ペプチド抗体を作製する。また、2)を遂行するにあたり、ENO1が、関節リウマチ特異的な自己抗体の抗原となりうるかについて調べるために、ENO1をサンプルとし、関節リウマチ患者血清を用いて、ウエスタンブロッティングもしくはELISAを行う。その際に用いるアセチル化ENO1は、リコンビナントで作製したENO1に、in vitroでアセチル化酵素およびアセチルCoAを作用させ、効率的にアセチル化させることで調製する。また、上記に加えて、同定されたアセチル化亢進蛋白質が酵素であったので、アセチル化が亢進することにより、その酵素の機能がどのように変化するかについて調べる。これにより、関節リウマチのマーカーとしての意義だけでなく、関節リウマチの病態解明のヒントが得られるかもしれない。■試薬類、消耗品:平成24年度に引き続き、既存の機器を使い、大量に解析をするには、種々の試薬や消耗品に最もコストがかかるので、これらに重きをおく。具体的には、各翻訳後修飾を検出するのに必要な一次および二次抗体、各翻訳後修飾蛋白質を精製するのに不可欠な抗体カラム用抗体、プロテオミクス関連の消耗品及び試薬、一般的分子物学研究試薬などである。■学会参加費:プロテオミクス関連学会であるHUPO(平成25年横浜で開催予定)および日本生化学会(平成25年横浜で開催予定)へ出席し、成果発表および情報取得をするために計上している。■その他:平成25年度の解析用抗体作製費は、作製技術や作製に要する時間などを含め、コストパフォーマンスの面から専門に委託する方が、研究全体が効率的に進むと考え、計上している。
干潟土壌プロテアーゼに焦点化した干潟生態系の基盤形成に係わる研究

微生物は干潟土壌において酵素分泌を行い,物質浄化や一次生産者への栄養塩提供などの役割を担っている。分泌酵素の中でもとりわけプロテアーゼは,干潟生態に系における窒素循環サイクルの形成に重要な機能を果たしていることが知られている。本研究において賀茂川河口干潟22箇所の地点でプロテアーゼ活性の測定がなされた。コンターマップ表示により,活性の高い領域はハクセンシオマネキ棲息及びホンダワラの繁茂領域と一致していることが明らかになった。さらに統計的な解析により干潟内のプロテアーゼ活性は底質の有機炭素及び窒素量と相関があることが示された。実際にタンパク質気質として血清アルブミンを土壌に負荷した結果,ATPバイオマス増加なしにプロテアーゼ活性の著しい誘導が生じた。電気泳動的解析の結果,タンパク質負荷により明確なプロテアーゼバンドが生じることが明らかになった。以上の結果タンパク質負荷により,特定の微生物によるプロテアーゼ分泌が干潟土壌系内に引き起こされる事実が示唆された。干潟土壌に存在するプロテアーゼについて、広島県竹原市賀茂川河口干潟底質土壌を対象に電気泳動的手法を利用して分子量の異なる複数のプロテアーゼの季節変動を明らかにした。さらに試料となる多くの底質土壌の総プロテアーゼ活性を数値的に計測する手法について検討を行った。その結果、アゾカゼインを基質とし、TritonX-100を含む反応溶液を用いることにより、土壌プロテアーゼ活性を定量的に測定できることが明らかになった。この結果は、今後干潟の多様な環境条件の中で、各プロテアーゼがどのように分布しているかマッピングをする上での有用な手法になると思われる。また干潟底質土壌の環境を評価する上で間隙水の採水法について様々な検討を行った。その結果、珪酸ガラスフィルターを介しポンプによって土壌間隙から採水する方法が最も適していることがわかった。さらに、底質土壌間隙水の硝酸、アンモニア、リン酸、ATPバイオマスについて、従来の方法の問題点を検討し、より精度と信頼性の高い方法を確立したことも本年度の研究成果である。こうした成果により、次年度の干潟プロテアーゼの生態的特性について総合的に検討するという目標に対する技術的問題は、平成19年度においてほとんど解消できた。さらに、今年度の研究過程において、土壌微生物以外に、藻類及び珪藻プランクトンからもプロテアーゼが分泌されていることを見いだし、それらのプロテアーゼを電気泳動的に分離・分析することができた。この結果は赤潮等でのプランクトンブルーミングにおいて有意な有機物加水分解が海水、沈降した底質土壌において生じる可能性を示しており、赤潮が示す生態的インパクトについての考察にも本研究課題が波及することが明らかになった。平成20年度は,本研究課題において最も重要な,干潟成分分布調査と底質プロテアーゼの関係を検討することであった。入念に予備実験を行ったことにより,プロテアーゼ活性測定法の検討とGPSを用いた生物分布調査が順調にすすみ,対象とした賀茂川過去干潟においてプロテアーゼ活性のコンターマップとアマモ,コアマモなどの優占種の生息分布図を作成することができた。さらに底質の有機炭素,窒素量とプロテアーゼ活性値の相関を検討した結果,土壌中の負荷有機物量とプロテアーゼ活性の間に統計的に有意な相関を認めることができた。さらにこの結果を踏まえ,土壌にタンパク質,脂肪酸,デンプンを負荷した結果,タンパク質を負荷した場合においてのみ,プロテアーゼ活性が好気的環境下において約3倍も増加することが明らかになった。さらに本研究で開発した土壌プロテアーゼの電気泳動分離分析の結果,活性の増加に伴って特定のプロテアーゼが誘導されることを捉えることができた。以上の結果,土壌へのタンパク質の添加は,限定されたプロテアーゼ分泌を誘導する事実を証明することができた。また本研究と並行して海洋の植物プランクトンの加水分解酵素の検出も行った。すなわち21種の植物プランクトンを培養した結果,培養液中にプロテアーゼ活性を認めることができた。さらに電気泳動的に複数のプロテアーゼの存在を認めることができた。すなわち干潟には底質微生物のみならず,海洋水中の一次生産者にあたる植物プランクトンからもプロテアーゼが分泌され窒素代謝の始原となるタンパク質の加水分解がなされている実態を捉えることができた。したがって本年度の成果は,今まで論じられてきた窒素循環代謝活動に,植物プランクトンの関与という新たな側面を提起することになったと言える。なおこの結果は複数の論文としてまとめており,その一方は現在投稿する段階にある。

賀茂川河口干潟において明らかにした「有機物負荷によりプロテアーゼ活性が誘導される」という前年度の実験結果を受け,22年度は極度に汚染された環境下にある広島市内を貫流する猿侯川の河岸底質を対象に,土壌の特性とプロテアーゼ活性の関連,及び電気泳動法を用いたプロテアーゼの分離・分析を行った。その結果溶存態リン酸,アンモニア値及び硫化水素値から総合的に判断し最も汚染度の高いと判断された2地点において,プロテアーゼ活性は必ずしも有機物含有量とは比例しない事実を明らかにすることができた。すなわち,強熱減量の結果から汚染の進んでいる当該2地点では,土壌中の有機物含有量は他地点に比較し,有意に高いもののプロテアーゼ活性は他の地点と同程度の値を示した。この結果は,プロテアーゼ活性は土壌の嫌気的環境,あるいは共存物質の存在によってプロテアーゼ活性が阻害されている可能性を示している。したがって干潟生態系における窒素代謝循環の開始酵素に相当するプロテアーゼの活性を充分に発揮するためには土壌環境が極めて重要であることが明らかになった。この事実は,干潟生態系の環境保全において窒素循環機能活性を高めるためには好気的環境を保障すると同時に重金属等の阻害物質の除去が必須である事を示している。また汚染土壌のプロテアーゼの電気泳動法による分析結果から,複数のプロテアーゼが存在することが明らかになった。しかしながら同一地点内の底質問においては極めて類似したプロテアーゼ活性バンドが検出されたのに対し,距離的に異なる汚染2地点間のプロテアーゼ活性パターンは必ずしも同一ではないことから,異種の微生物分泌によりプロテアーゼが分泌されていることが推定された。