hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児生活習慣病モデルの酸化的ストレスと一酸化窒素代謝における脂肪組織の役割

3T3-L1脂肪細胞の培養液中にlipopolysaccharide(LPS)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)、interferon-γを同時添加するとiNOSが誘導され、NO産生が高まった。troglitazoneを予め添加すると抑制された。培養褐色脂肪細胞でも、LPSとTNF-α同時添加でNO産生が増加した。インスリン非依存型糖尿病モデルOLETF肥満ラットと対照であるLETOラットをtroglitazone含有および非含有飼料で飼育し、LPSを腹腔内注射すると、OLETFでLETOよりNO産生が高く、脂肪組織のiNOSが誘導された。troglitazone含有飼料で飼育すると抑制された。脂肪組織は酸化ストレスの原因となるiNOS産生能を有し、抗酸化剤で抑制される。肥満ラットでは腎の細胞内グルタチオン・ペルオキシダーゼ(C-GPX)および細胞外GPX(EC-GPX)産生が増加し、脂肪組織では両酵素は低下した。血清中protein carbonyl group(PCG)が増加し、TNF-αも増加していた。troglitazoneはこれを抑制した。単純性肥満児でも血中PCGは増加し、酸化LDLに対する血中抗体レベル(oxLDL-Ab)も非肥満児より有意に高値で、酸化ストレスが亢進していた。脂肪細胞のNO産生能に対して、3T3-L1ではc-AMPまたはforskolinは抑制的、褐色脂肪細胞では刺激的に作動し、脂肪細胞の種類で蛋白キナーゼA系の役割が異なっていた。KNRK培養細胞ではC-GPXがNOで不活化されるのに引き続いてmRNAが誘導された。EC-GPXもin vitroではC-GPXと同様にNOで不活化されるが、ラットの腹腔内にLPSを投与したin vivoモデルでは、むしろ酵素誘導されて血中濃度が増加している可能性が示唆された。分化させた3T3-L1脂肪細胞の培養液中にlipopolysaccharide(LPS)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)、interferon-γを組み合わせて添加するとiNOSが誘導されて、NOの産生が高まった。troglitazoneを予め添加すると、LPS-サイトカイン刺激によるiNOSの発現とNO産生を抑制した。インスリン非依存型糖尿病モデルOLETF肥満ラットと対照であるLETOラットをtroglitazoneと非含有飼料で10日間飼育し、LPSを腹腔内注射すると、OLETFでLETOよりNO産生が高く、脂肪組織のiNOSが誘導されていた。troglitazone含有飼料で飼育すると培養脂肪細胞におけると同様の抑制効果が認められた。以上の結果から、脂肪組織自体が酸化的ストレスの原因となるiNOS産生能を有し、抗酸化剤がその機能を抑制することが明らかになった。肥満ラットでは腎における細胞内グルタチオン・ペルオキシダーゼ(C-GPX)および細胞外GPX(EC-GPX)産生が増加していたが、脂肪組織では両酵素がの発現は低下していた。troglitazoneも両酵素の発現を抑制した。肥満ラットでは酸化的ストレスの指標である血清中protein carbonyl group(PCG)が増加しており、TNF-αも増加していた。単純性肥満児でも肥満ラットと同様に血中PCGは増加しており、酸化的ストレスが亢進していることが示された。EC-GPXは肥満における酸化的ストレスの軽減には作用していないと思われる成績であった。

培養白色脂肪細胞である3T3-L1ではlipopolysaccharide(LPS)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、interferon-γの同時添加でiNOSが誘導されて一酸化窒素(NO)産生増加が認められ、培養褐色脂肪細胞でも、LPSとTNF-αの同時添加によって、同様に有意なNO産生増加が認められた。脂肪細胞によるNO産生におけるc-AMP依存性kinaseの関与については、3T3-L1に3者同時添加した系では、c-AMPまたはforskolinはNO産生に抑制的に作動したのに対して、褐色脂肪細胞に2者同時添加した系では、対照的に、NO産生を刺激した。脂肪細胞の種類によって蛋白キナーゼA系の役割が異なることが明らかにされた。KNRK培養細胞(ラット腎尿細管由来)では細胞内(古典型)グルタチオン・ペルオキシダーゼ(C-GPX)がNOで不活化されるのに引き続いてmRNAが誘導されることが解明された。細胞外GPX(EC-GPX)もin vitroではC-GPXと同様にNOで不活化されるが、ラットの腹腔内にLPSを投与したin vivoモデルでは、むしろ酵素誘導されて血中濃度が増加している可能性が示唆された。HMG-CoA還元酵素阻害剤には、コレステロール合成阻害以外に、抗酸化作用など、他の薬理作用があることが判明しているが、生体内NO代謝への影響についても培養細胞で有意な変動が得られている。酸化LDLに対する自己抗体が動脈硬化の進展に関連することが報告されている。肥満児における酸化LDLに対する血中抗体レベル(oxLDL-Ab)について検討し、肥満男児同年齢非肥満児より有意に高値であり、肥満度、体脂肪率、腹囲臀囲比などと相関した。肥満によって酸化ストレスが増加するために、肥満児では酸化LDLが増加しており、酸化LDLが動脈硬化の進展を促している可能性がある。
レオ・オプティクスによる変形下・加熱過程での食品素材の構造力学的研究

複屈折を測定する意義は、分子の配向状態に関する情報を得て、力学側定からだけでは到達できない領域までの議論を可能にすることである。多糖類を対象とし、レオオプティックス手法を適用するための装置開発を行った。装置はレオメータ(TA instruments社ARES)及び複屈折測定装置である。まず、温度コントロール及び蒸発防止セルを新たに作成し、次いで、ARESから歪及び応力のシグナルを、複屈折と配向角とを同時に取り込んで処理可能なシステムの構築を行い、セル回転に由来するアーティファクトを数十分の一に抑えることに成功した。また、従来までの定常ずり変形時における流動複屈折だけでなく、周期的な微小変形時の動的な歪及び応力光学係数の測定が可能となった。このシステム構築の成功により、キサンタン、カラギーナン及びシゾフィランの、準希薄及び濃厚領域における基礎物性の評価ができた。いずれも、準希薄領域においては、ずり速度の増加と共に複屈折の増加が観側された。さらに、濃厚領域、特に液晶を形成する濃度及び分子量においては、定常ずり変形を加えている最中及びずり変形を加える回転を止めた後に、各試料に特徴的な複屈折及び配向角の振動が確認された。今後、この挙動を詳しく解析することにより、テクスチャーモディファイヤーの分子間相互作用の解明ができると期待される。一方、食品の三大成分(タンパク質、デンプン、脂質)混合系モデルとしてビスケットおよびシュー生地を取り上げた。加熱および時間経過に伴う物性変化とその相互作用を、シュー生地はマクロな形態変化と動的粘弾性測定から追跡し、ビスケットは電子顕微鏡観察による微細構造の変化と熱物性などから把握した。タンパク質、デンプンの二成分混合系モデルとして取り上げた米については、動的粘弾性と力学測定から基本物性を明らかにした。食品の加熱過程での変化はほとんど物理現象の現れである。この物理変化を明らかにするためには、明確に定義された物理的パラメーターを求めることより基本的な物性を把握し、分子論的解析つまり素材の構造力学という面からの解釈をわねばならない。しかし食品は「不均一・多成分の非平衡な濃厚分散系」と定義すべきものであり、しかも成分の間には一般に加成性が成り立たない複雑な系である。そこで本研究では、食品の三大成分(タンパク質、デンプン、脂質)各々基本物性を、レオロジー的手法(動的粘弾性測定)による力学物性、熱物性(DSC)あるいは電気物性(誘電緩和)により把握し、顕微鏡(電子、偏光)観察やX線解析などによる材料化学的な手法により、素材の構造との関係を明らかにし、素材の構造力学という面から食品の基本物性を把握、整理することを試みる。そして、力学測定では、レオ・オプティックスを用いての変形下でのミクロな微細構造の変化の追跡を試みる。本年度は、レオ・オプティックス装置に関し、最新知見の収集を行うと共に、現段階で作製に最も確実な技術力を持っているレオメトリック株式会社に調査に赴き、次年度開発に向けての打ち合わせを行った。一方、加熱過程でのマクロな形態変化の定量化のために市販オーブンを改良し、ビデオ撮影装置を組み合わせたTLPAシステムを構築し、試作オーブンを研究代表者勝田の研究室に、また試作型を元にしたTLPAシステム一式を分担者倉賀野の研究室に納入の手配を行い、タンパク質、デンプン、脂質の混合モデルとしてクッキーを取り上げ、画像解析による形態変化の定量化に成功した。そして、タンパク質デンプンの二成分混合モデルとして小麦粉を取り上げ、グルテンおよび小麦デンプン各々およびその混合系の力学物性および熱物性を明らかにした。本研究は、不均一・多成分系の非平衡な濃厚分散系と定義されるべき食品の三大成分(タンパク質、デンプン、脂質)について、各々の基本物性を素材の構造力学の面から把握、整理することを目標としている。

手法は動的粘弾性測定、熱物性、顕微鏡観察などのマクロな面とレオ・プティクスによるミクロな面から構造変化の追跡を試みる。本年度はレオ・オプティクス装置を研究代表者勝田の研究室に納入できたが、勝田の死亡に伴い、1月に研究者代表者および分担者が変更になった。そのため、レオ・オプティクス装置を新分担者西成の研究室へ移設できたのが3月であり、その後、装置の使用法について装置製造会社に説明を求めているが、回答が得られておらず、複屈折測定についてまだ検討の段階にある。また、定常流粘性を測定しながら、200倍程度の倍率での粒子観察についても、現在準備中である。一方、食品の三大成分が混合したモデル系として取り上げた低水分系小麦粉焼き菓子については、前年度に購入して、形態変化を定量化できることを確認していた写真撮影による形状の経時変化の解析システムを用いて、画像解析によりマクロな形態変化を把握した。同時に、大変形下の破断試験、ファリノグラフ・エクステンソグラフ測定および熱物性(DSC測定)による検討、電子顕微鏡による観察を行った。低水分系であっても小麦粉のタンパク質は加水、混捏によりグルテン網状構造の形成にいたり、小麦デンプンも加熱過程を経て膨潤糊化が起きる場合があることを明らかにした。焼き菓子では加水量が著しく少ないため、水に溶解する糖質の存在がタンパク質、デンプンの構造の変化に関わることが推察できた。平成14年度末に、大阪市立大学に移設したレオメータ(TA instruments社ARES)及び複屈折測定装置を用いて、食感コントロールとして用いられる多糖類を対象としレオオプティックス手法を適用するための装置開発を行った。移設後の装置を確認したところ、食品系に使われる多糖類には全く適用できない状態であった。まず、温度コントロール及び蒸発防止セルを新たに作成した。次に、ARESから歪及び応力のシグナルを、複屈折と配向角とを同時に取り込んで処理可能なシステムの構築を行い、セル回転に由来するアーティファクトを数十分の一に抑えることに成功した。また、従来までの定常ずり変形時における流動複屈折だけでなく、周期的な微小変形時の動的な歪及び応力光学係数の測定が可能となった。このシステム構築の成功により、キサンタン、カラギーナン及びシゾフィランの、準希薄及び濃厚領域における基礎物性の評価ができた。いずれも、準希薄領域においては、ずり速度の増加と共に複屈折の増加が観測された。さらに、濃厚領域、特に液晶を形成する濃度及び分子量においては、定常ずり変形を加えている最中及びずり変形を加える回転を止めた後に、各試料に特徴的な複屈折及び配向角の振動が確認された。今後、この挙動を詳しく解析することにより、テクスチャーモディファイヤーの分子間相互作用の解明ができると期待される。一方、タンパク質、デンプン、脂質の混合モデルとしてビスケットを取り上げ、混合系の熱物性および電子顕微鏡観察による微細構造を明らかにするとともに、糖の溶解が阻害されるとタンパク質の構造変化に基づく形態変化が起きることが推察できた。
ヒト腎臓細胞由来ｉＰＳ細胞による次世代人工腎臓作成の試み

申請者らは、文部科学省再生医療の実現科プロジェクト-iPS拠点事業において、ヒト腎臓由来iPS細胞には腎臓細胞としての細胞記憶が残されており、これにはDNAメチル化の異なる遺伝子群が関与していることを見いだした。本研究では腎臓由来iPS細胞の細胞記憶を担うターゲット遺伝子を同定し、ヒトiPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する方法の確立した。第二にヒトiPS細胞から分化誘導された腎臓構成細胞を用い、Lanzaらの報告したデバイスを用いてSCIDマウスに移植し、次世代人工腎臓作成の為の基礎データ収集を試みたが、Lanzaらの報告の再現は困難であった。本年度は、腎臓由来iPS細胞から腎臓構成細胞への分化誘導を試みた。Infinium解析で得られた遺伝子を特異的かつ強制的にOFFあるいはONとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する。さらに、分化誘導された細胞を既報のデバイスに播種し、SCIDマウスへ移植することにより、次世代人工腎臓として機能するか評価した。脱メチル化(活性化)すべき5遺伝子に関しては、iPS樹立時と同様にPlatE法を用い、レトロウイルスにより強制発現させる。メチル化が維持される(不活性化)5遺伝子については、siRNAを用いて遺伝子発現を抑制する。1の処置後、2ー4週間培養し、腎臓系統のマーカー発現をreal time PCRで評価し、siRNAおよびレトロウイルスの条件を最適化する。2で最適化された条件で、更に2ー8週間分化誘導を行い、組織染色により腎臓構成細胞への分化を検証する1ー3により、効率良く腎臓構成マーカー発現細胞が得られた。本研究では第一に、腎臓由来iPS細胞の細胞記憶を担うターゲット遺伝子を同定し、ヒトiPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する方法の確立を目的とする。一方、Lanzaらはクローン牛を用い、クローン腎臓の構成細胞を埋め込み型デバイスへ播種し、ウシにおける埋め込み型腎臓ユニットの作成に成功している(Nature Biotechnology, 2002)。本研究では、第二に、ヒトiPS細胞から分化誘導された腎臓構成細胞を用い、Lanzaらの報告したデバイスを用いてSCIDマウスに移植し、次世代人工腎臓作成の為の基礎データを得る事を目的とする。具体的な成果は以下のとうり。ヒト腎臓由来iPS細胞を新規に12クローン樹立し、iPSとしての初期化をマイクロアレイ解析により評価した。初期化が確認されたクローンに対して、腎臓系統への分化誘導条件を与え、未分化状態との包括的DNAメチル化の差異をInfiniumにより解析し、腎臓系統への分化において、メチル化が解除される遺伝子、メチル化が維持される遺伝子上位5遺伝子を同定した。24年度以後では、同定した遺伝子をsiRNAおよびレトロウイルスを用いることにより、特異的かつ強制的にONあるいはOFFとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導した。次に分化誘導した腎臓構成細胞を既報のデバイスへ播種し、SCIDマウスに移植することにより、次世代人工腎臓として機能するか評価した。平成23年度は以下の手順で研究を実施した。ヒト腎臓細胞由来iPS細胞の樹立1、ウイルス産生:山中4因子を導入する為にPlat-E細胞に4因子のベクターとpSVGL-1をtransfectionし、48時間御に得られたウイルスを回収する。2、遺伝子導入:Polybrene 4μg/mlの存在下で、24時間ウイルス液中でヒト腎臓細胞を培養し、4因子を導入する。遺伝子を導入したヒト腎臓細胞は6日間維持培養用の培地で培養し、6日目にMEF (mouse embryonic fibroblast)へ播種し、その後ES細胞用培地で培養する。3、コロニー選択:一日おきに培地を交換し、14ー21日コロニー形成を観察し、メサンギウム細胞、近位尿細管細胞それぞれから24コロニーを選択する。4、クローンの選択:得られたクローンのコロニーの未分化能を確認するため、ALP、Oct、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81の染色を行う。24コロニーのうち、染色が良好なクローンを12個ずつ選択する。5、未分化能の確認:選択したクローンの未分化能をPCR(Oct, Nanog, Rex-1)、FACS (Oct,SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81)で評価し、メサンギウム細胞、近位尿細管細胞それぞれから、12クローンのうち、上位6クローンを選択する。23年度では、6つのクローンが得られ、現在Affimetrix社Human Genome U133A Plus2.0によりマイクロアレイ解析中である。

申請者らは、文部科学省再生医療の実現科プロジェクト-iPS拠点事業において、ヒト腎臓由来iPS細胞には腎臓細胞としての細胞記憶が残されており、これにはDNAメチル化の異なる遺伝子群が関与していることを見いだした。本研究では第一に、腎臓由来iPS細胞の細胞記憶を担うターゲット遺伝子を同定し、ヒトiPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する方法の確立を目的とする。一方、Lanzaらはクローン牛を用い、クローン腎臓の構成細胞を埋め込み型デバイスへ播種し、ウシにおける埋め込み型腎臓ユニットの作成に成功している(Nature Biotechnology, 2002)。本研究では、第二に、ヒトiPS細胞から分化誘導された腎臓構成細胞を用い、Lanzaらの報告したデバイスを用いてSCIDマウスに移植し、次世代人工腎臓作成の為の基礎データを得る事を目的とする。平成26年度においては、平成25年度までで終えることのできなかった研究を行った。Infinium解析で得られた遺伝子を特異的かつ強制的にOFFあるいはONとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効良く腎臓構成細胞を分化誘導する。さらに、分化誘導された細胞を既報のデバイスに播種し、SCIDマウスへ移植することにより、次世代人工腎臓として機能するかを検討した。再生医学分化誘導条件の最適化にはまだ時間を要する状況である。移植により機能評価に難渋しており、最終年度内に研究を完成させることができなかった。東日本大震災の影響を東大でも受け、研究施設の一部の破損があり、研究開始が遅れた。しかし、その後は概ね順調に進んでおり、24年度には遅れを取り戻せると考えている。25年度以後では、同定した遺伝子をsiRNAおよびレトロウイルスを用いることにより、特異的かつ強制的にONあるいはOFFとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する。次に分化誘導した腎臓構成細胞を既報のデバイスへ播種し、SCIDマウスに移植することにより、次世代人工腎臓として機能するか評価する。移植に用いる腎臓構成細胞のqualityを見直すことにより、機能評価を行う。Infinium解析で得られた遺伝子を特異的かつ強制的にOFFあるいはONとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する。さらに、分化誘導された細胞を既報のデバイスに播種し、SCIDマウスへ移植することにより、次世代人工腎臓として機能するか評価する。1、脱メチル化(活性化)すべき5遺伝子に関しては、iPS樹立時と同様にPlatE法を用い、レトロウイルスにより強制発現させる。メチル化が維持される(不活性化)5遺伝子については、siRNAを用いて遺伝子発現を抑制する。2、1の処置後、2ー4週間培養し、腎臓系統のマーカー発現をreal time PCRで評価し、siRNAおよびレトロウイルスの条件を最適化する。3、2で最適化された条件で、更に2ー8週間分化誘導を行い、組織染色により腎臓構成細胞への分化を検証する。
曖昧な界面をもつナノ液晶ドロップレット分散高分子の高速光デバイス応用

液晶デバイスの課題は、応答速度、中でも電界除去時の戻り速度が遅いことである。電界除去後の液晶の再配列の速さは、液晶を閉じ込めた空間の大きさに依存する。本研究では、液晶を数十nmサイズの空間内に閉じ込めた高分子フィルムを開発し、従来に比べて3桁高速の電気光学効果を実現した。特に、高分子の重合に液晶性モノマーを使用し、重合条件を最適化することにより、応答速度と屈折率変化量の大きさを両立できることを示した。さらに、キラルな液晶性モノマーを用いてらせん構造を有する高分子/液晶ナノ複合フィルムを作製し、偏光回転素子、偏光無依存屈折率変調素子を実現した。液晶光デバイスの応答速度の高速化を目指して、液晶を微小空間内に閉じ込めたデバイスデザインが試みられているが、微小空間内での液晶分子の運動性の低下から、駆動電圧の増大や光学応答性の低下が問題となっていた。そこで、本研究では、明確な境界をもたない「曖昧な界面」を有するナノスケールの微小空間に液晶を閉じ込め、応答速度と液晶の運動性を両立可能な新しい概念のデバイスを提案し、その有効性の実証を試みた。従来の高分子・液晶複合膜が、光重合性モノマーと液晶との混合液に紫外線を照射して光重合相分離を誘起させて実現したのに対して、本提案では、液晶性を有する光重合性モノマーを採用した。複合膜中のモノマー濃度および光重合条件によって、高分子のモルフォロジーがネットワーク構造からスポンジ状の多孔性構造まで変化することが確認された。特に、液晶性モノマーの比率を30wt%以下の条件においても、ナノサイズの液晶・高分子相分離を有する高分子・液晶複合膜が作製でき、光重合温度が低く、照射紫外線強度が高く、モノマー組成比率が高いほど空隙の大きさが小さくなることを明らかにした。複合膜の電気光学特性を調べたところ、モノマー組成26wt%で、10マイクロ秒程度の立下り応答時間が得られ、従来のネマチック液晶の立下り時間に比べて3桁4桁の高速化が実現された。この場合のナノ空隙のサイズは約20数nmであり、高分子内にも液晶分子が含浸した構造が形成されているものと考えられる。応用例として、コレステリック液晶でナノサイズ複合膜を作製し、電界による選択反射の変化を観測した結果、選択反射バンドの形状は電界によって崩れることなく、長波長側のバンド端波長の可逆的なシフトが観測された。さらに、レーザー色素を添加してレーザー発振させた場合の電界印加効果を調べたところ、電界印加によってレーザー発振波長の可逆的な変調に成功した。液晶デバイスの高速化を目的として、微小空間に液晶を閉じ込めた構造のデバイス開発が盛んにおこなわれている。しかしながら、微小な空間に液晶を閉じ込めると、分子の運動性が悪くなり、駆動電圧の上昇や応答性の低下を招くという問題がある。そこで、本研究では、液晶と高分子の複合体において、明確な液晶/固体界面をもたない「曖昧な界面」で囲まれたナノ空隙を持つデバイスを提案し、液晶分子の運動性と高速応答性とを両立させることを目指している。本研究のポイントは、高分子を形成する基となるモノマーに、液晶性の分子を用いることであり、光重合性液晶と通常の液晶とを混合した系をあらかじめ分子配列させて、その後紫外線を照射することにより、ナノスケールの相分離状態が実現でき、しかも曖昧な界面が形成されるところにある。本年度は、本年度は、光重合時の温度の効果を調べ、低温で光重合をおこなうことにより、モノマー濃度が10w%以下の低場合であっても、電界印加によっても全体の分子配列は保たれることを明らかとした。その結果、光に反応しない通常の液晶の割合が高くでき、しかもナノ空隙を形成できるために高速応答(数十マイクロ秒)が実現できる。また、コレステリック液晶を採用し、キラルドーパントの濃度依存性を調べ、電界応答の閾値がキラル濃度、すなわち螺旋ピッチに依存しないことを明らかにした。一般に、コレステリック液晶では閾値電界は螺旋ピッチに反比例するが、今回の結果から、コレステリック高分子ナノ複合系では、螺旋が解ける運動ではなく、微小空隙内での分子再配列が、電界光学応答に寄与していることを明らかにした。電子工学ナノサイズの液晶・高分子相分離を発現させる条件を明らかにし、それにより電界印加によるマイクロ秒の高速応答と0.01以上の屈折率変化を実現することに成功した。さらに、低温において光重合行うことにより、モノマー比率が10wt%以下の条件においてもナノサイズ相分離が実現可能で、しかも高速応答が達成できることを見出しており、当初の計画を上回る成果が得られたと間がられる。液晶・高分子の曖昧な界面を有するナノ相分離の構造と作製条件との関係を明らかにすることに成功し、高速応答性が実現できることを明らかにした。

今後、ナノ相分離のモルフォロジーの詳細と液晶の分散状態の解明を行うとともに、駆動電圧の低減と屈折率変調度の増大を目指した材料探索を行う。今年度の当初計画では、光重合性液晶モノマーと液晶との混合条件や光重合条件の詳細を検討することによって、より高速、低閾値の電気光学応答を目指す目的で、種々の液晶材料、光重合性液晶材料を購入する予定であったが、幸いにも低温での重合により当初計画通りの低モノマー濃度複合フィルムが実現できた。そのため、まず今年度でその電気光学特性の測定を優先させたため、当初今年度予定していた液晶材料の購入を来年度に先送りしたため。平成26年度では、当初予定していた液晶材料等を購入し、材料物性や重合条件と複合フィルムの高次構造や電気光学特性との関係を明らかにする予定である。
超音波顕微鏡のメカニズムを応用した、歯科疾患の科学的診断方法の確立

健全歯と虫歯に罹患した歯質について超音波顕微鏡を用いて測定し音響特性を調べる。音響特性が健全歯と虫歯でどの程度違うかを解析する。X線など従来の歯科で行われている診断方法による測定を行い、超音波顕微鏡で得られたデータと比較し関連性を調べ、音響データ的に健全と虫歯の境目となる境界線を決定する。又、歯周病の進行に密接な関係がある歯石に注目し歯石を超音波顕微鏡から音響データや他の測定方法から得られたデータを照合させ、歯石を超音波顕微鏡で判別可能かを調べる。以上より得られたデータを用い、超音波顕微鏡のシステムを用いて虫歯と歯周病の診断が即時的かつ非侵襲的に行う事が出来るような診断機器の基盤作りを目指す。
歯科診療体位と治療操作が呼吸機能に及ぼす影響(鎮静法施行時と在宅治療を考慮して)

1)基礎的研究:安静時における呼吸状態の観察座位および水平位において、頭部前屈位から後屈位の頚部伸展度による呼吸状態に変動はみられなかった。水平位では、座位と比較し、1回換気量(VT)の増大と呼吸数の減少が認められた。各測定体位および頭部の伸展度により、経皮的動脈血酸素飽和度(SpO_2)および終末呼気炭酸ガス分圧(EtCO_2)に変動を認めなかった。2)臨床的研究(1):静脈内鎮静法施行時における呼吸状態の観察座位ではミダゾラム投与により、腹壁運動の減少、1回換気量の減少(532→397ml)、呼吸数の増加(11→17breath/min)を認めた。頭部後屈位により、舌根沈下と奇異呼吸が生じた症例もみられ、胸郭・腹壁運動に気道開通時と異なる特徴的なパターンを生じた。水平位では、ミダゾラム投与後、座位と同様、胸郭運動の減少と呼吸数の増大がみられ、頭部前屈により、舌根沈下を生じ、SpO_2の低下(94→87%)とEtCO_2の上昇(48→54mmHg)を示した症例もみられた。頭部後屈により胸・腹部運動およびSpO_2、EtCO_2測定値が回復した。3)臨床的研究(2):顎間固定による呼吸経路および換気量の測定健康成人を対象とした顎間固定操作によって、呼吸経路は鼻呼吸のみとなったが、VTおよび分時換気量に変動はみられなかった。顎間固定を伴う全身麻酔後では、顎間固定前に口呼吸が関与している症例において、顎間固定後にVTの減少(536→357ml)がみられた。
重症心身障害児のエネルギー消費量の分析と体力向上のための運動プログラムの開発

重症心身障害児は重度の肢体不自由と重度の精神薄弱とを併せもち,身体機能は健常者に比べて極めて低く,常に健康管理と体力向上を心掛けなければならない.本研究では,彼らの体力向上の可能性を探るために,日常生活における身体活動水準を心拍数時系列を手掛りとして検討してきた.そして,最重度の重症心身障害児は積極的,能動的な身体活動がなく,身体活動水準の極めて低いことを確認した.このため,彼らの心肺機能は低下する危険性があり,受動的であっても循環機能に刺戟を与えるようなトレーニングが必要であることを痛感した.そこで,昨年度より変動的トレーニング法として姿勢変換をとりあげ,姿勢変換(臥位より座位へ)に対する循環機能の反応を詳細に分析した.被検者は最重度の寝たきりの重症心身障害児20名,健常者10名であった.座位時の姿勢は介護者による寄りかかりかギャッジベットによって保持した.測定項目は心拍数,血圧,脈拍の3項目を中心にし,一部,酸素摂取量の測定も実施した.重症児の心拍数は座位時と仰臥位で約10拍の差がみられ,被検者間のばらつきも大きかった.健常者は約5拍の上昇であり,有意な違いであった.末梢の循環機能を示す指尖脈波は,スペクトル解析の結果からみると,重症児の場合約10%,健常者の場合65%まで座位時で減少を示した.血圧は重症児,健常者共に積極的な変化を示すに至らなかった.心拍数の上昇と脈波の減少との相関関係をみると,重症児は3つの群に分けられた. 1つは脈波の減少に対して非常に心拍数が上昇する群であり,末梢循環抵抗が極めて高いものと推察された.2つ目はほぼ健常者と同様な反応を示す群であり,彼らは以前,座位,立位のとれた者が多かった.3群目は,脈波の減少に対して心拍数の上昇がほとんどみられないものであり,循環中枢の不全が考えられた.重症心身障害児は重度の肢体不自由と重度の精神薄弱とを併せもち、身体機能は健常者に比べて単に劣っているのみならず、著しい特異性を示す。本研究では、彼らの身体活動水準、エネルギー消費量を明らかにするために、長時間の心拍数時系列を手掛りとして検討を加えてきた。この結果、最重度の重症心身障害児は積極的、能動的な身体活動がほとんどなく、身体活動水準の極めて低いことが確認された。このため、彼らの循環機能は低下する危険性をもち、受動的であっても循環機能に刺激を与えるようなトレーニングが必要であることが示唆された。そこで、本年度は、受動的な姿勢変換をとりあげ、これを詳細に分析し、循環機能に対するトレーニングの可能性を検討した。被検者は、最重度児6名,健常者6名の計12名とした。姿勢の変換は仰臥位安静の後、介護者による寄りかかりの座位を5-7分保持させた。測定項目は心拍数,酸素摂取量,脈波,血圧の4項目とした。重症児の心拍数は座位時と仰臥位で平均12.2拍の差がみられ、健常者の4.2拍に比べ有意な差を示した。酸素摂取量は両群とも姿勢間での有意な差は認められなかった。末梢の循環機能を示す指尖脈波は、スペクトル解析を手掛りに分析した結果、座位姿勢での値は仰臥位に比べ、重症者の場合11.6%、健常者の場合64.7%まで減少した。血圧は健常者の場合、最高血圧の変化はわずかであったが、これに比べて最低血圧の上昇が大きかった。重症者の血圧は測定可能な者の数が少なく、一定の傾向を確認するに至らなかった。以上のことから、重症者は末梢循環抵抗が極めて高いことが証明された。そこで、このような最重度の重症者に対しては、受動的であっても末梢循環に刺激を与えることは非常に重要なことであり、その手段の一つとして頻繁に姿勢変換を与えることも有効な方法であることが示唆された。重症心身障害児は重度の肢体不自由と重度の精神薄弱とを併せもち,身体機能は健常者に比べて極めて低く,常に健康管理と体力向上を心掛けなければならない.本研究では,彼らの体力向上の可能性を探るために,日常生活における身体活動水準を心拍数時系列を手掛りとして検討してきた.そして,最重度の重症心身障害児は積極的,能動的な身体活動がなく,身体活動水準の極めて低いことを確認した.このため,彼らの心肺機能は低下する危険性があり,受動的であっても循環機能に刺戟を与えるようなトレーニングが必要であることを痛感した.そこで,昨年度より変動的トレーニング法として姿勢変換をとりあげ,姿勢変換(臥位より座位へ)に対する循環機能の反応を詳細に分析した.被検者は最重度の寝たきりの重症心身障害児20名,健常者10名であった.座位時の姿勢は介護者による寄りかかりかギャッジベットによって保持した.測定項目は心拍数,血圧,脈拍の3項目を中心にし,一部,酸素摂取量の測定も実施した.重症児の心拍数は座位時と仰臥位で約10拍の差がみられ,被検者間のばらつきも大きかった.

健常者は約5拍の上昇であり,有意な違いであった.末梢の循環機能を示す指尖脈波は,スペクトル解析の結果からみると,重症児の場合約10%,健常者の場合65%まで座位時で減少を示した.血圧は重症児,健常者共に積極的な変化を示すに至らなかった.心拍数の上昇と脈波の減少との相関関係をみると,重症児は3つの群に分けられた. 1つは脈波の減少に対して非常に心拍数が上昇する群であり,末梢循環抵抗が極めて高いものと推察された.2つ目はほぼ健常者と同様な反応を示す群であり,彼らは以前,座位,立位のとれた者が多かった.3群目は,脈波の減少に対して心拍数の上昇がほとんどみられないものであり,循環中枢の不全が考えられた.
海棲哺乳類はその進化の過程において異なる時代,異なる場所において複数回の海洋進出を果たしてきた.これまで,各々の分類群がどのような変化を起こしてきたかについては明らかにされている部分もあるが,海棲哺乳類の海洋進出の全体像を同一の視点から比較検討する試みはなされてきていない.そこで,海棲哺乳類に起こった進化を,化石のCTスキャンから得られた断層画像を基に化石に残された感覚器の痕跡を三次元的に復元し,海棲哺乳類の多様化・生息海域拡大の要因を明らかにする.海棲哺乳類はその進化の過程において異なる時代,異なる場所において複数回の海洋進出を果たしてきた.これまで,各々の分類群がどのような変化を起こしてきたかについては明らかにされている部分もあるが,海棲哺乳類の海洋進出の全体像を同一の視点から比較検討する試みはなされてきていない.そこで,海棲哺乳類に起こった進化を,化石のCTスキャンから得られた断層画像を基に化石に残された感覚器の痕跡を三次元的に復元し,海棲哺乳類の多様化・生息海域拡大の要因を明らかにする.
腫瘍血管の成熟性を評価可能な光音響イメージングの腫瘍放射線医学への応用

本研究は、光音響イメージング法を用いて生体内臓器描出、腫瘍内微小構造の描出、血管機能(バリアー機能ならびに成熟性)を評価することである。平成29年度には、インドシアニングリーンを用いた光音響イメージングの腫瘍血管評価の為の研究として、論文発表を行った。平成30年度は、更にこの実験を進め、各種の腫瘍組織においてのICGの血行動態の把握を行った。Lewis lung carcinoma腫瘍株モデルでは腫瘍内のICGの血行動態把握が比較的容易に行えたが、B16メラノーマ細胞では、腫瘍内の光音響シグナルの検出が難しかった。これは腫瘍内のメラニン量が多くこれが光音響イメージングに影響を及ぼしたと考えられる。VEGF阻害剤による腫瘍血管からのICGの血管からのleakは論文の如く評価可能であり、その後の腫瘍細胞の縮小をいち早く検出する事ができた。その後、放射線治療やその他の抗腫瘍薬剤も考慮したが、今年度内には達成はできなかった。最終的に、本研究課題の研究において、インドシアニングリーンの血管内投与を用いた光音響イメージングは各臓器での血管透過性の評価に用いる事ができ、また腫瘍内においても濃度依存性を示し定量可能であり、腫瘍における抗腫瘍薬による血管透過性の低下を検知し、その後の腫瘍細胞の縮小をいち早く予測できると考えられた。平成28年度は、研究計画書に基づき、生体レベルでの定常状態における主要臓器の光音響シグナルの評価、および各種光音響プローブの投与による各主要臓器の光音響シグナル変化の評価をおこなった。具体的には、実験動物モデルとして、C57BL/6Jマウスを用い、既存の光音響イメージング装置として小動物超音波高解像度イメージングシステム(Vevo LAZR Imaging System)を使用し光音響イメージングの撮影、およびシグナル測定をおこなった。体表から観察可能なマウスの各臓器(肝臓、腎臓、皮膚、血管内)の光音響シグナルは、各々異なったシグナル強度を呈していた。光音響波を放出する薬剤(インドシアニングリーン、メチレンブルー、ゴールドナノロッド)をそれぞれ尾静脈より静脈注射し、マウスの各臓器における光音響シグナルの変化を経時的に観察した。ゴールドナノロッド、メチレンブルーでは、はっきりした信号上昇がみとめられず、メチレンブルーにおいては高濃度でマウスが死亡した。インドシアニングリーンを用いる事によって、各臓器において信号上昇が得られ、現状ではインドシアニングリーンが最適な造影剤として有用であると考えられる。現在、様々な濃度や各臓器ごとでの信号上昇の詳細な検討を行っている。また、薬剤投与後の各臓器のインドシアニングリーンの病理学的解析ができないかも検討中である。現状、研究計画書に基づいた実験が遂行できている。平成29年度は、平成28年度に引き続き研究計画書に基づて、生体レベルでの定常状態における主要臓器の光音響シグナルの評価をおこなった。体表から観察可能なマウスの各臓器(肝臓、腎臓、皮膚、血管内、腫瘍)の光音響シグナルを光音響波を放出する薬剤であるインドシアニングリーンに絞って、様々な濃度を尾静脈より静脈注射し、マウスの各臓器における光音響シグナルの変化を経時的に観察した。これにより至適濃度をどの程度に設定するべきかの知見を得た。またインドシアニングリーン投与では濃度勾配に従ってシグナル増強が観察された。またインドシアニングリーンの組織分布を摘出標本の免疫染色と合わせて検討した。腫瘍モデルを用いた研究では血管新生阻害剤を用いた状態での、光音響イメージングを行い、腫瘍縮小効果との比較検討を行った。メチレンブルー、ゴールドナノロッドでの検討を昨年度に引き続き行ったが、現在使用している光音響イメージング機器においては、マウス各臓器におけるシグナル上昇ははっきり認められなかった。濃度不足なども考えられるが、これ以上の濃度では非生理的な濃度となってしまうため、現行の装置でのこれらの血管内投与によるイメージングは困難と考えられた。光音響波を放出する薬剤としては、インドシアニングリーンが最適であると考えられる。今後はこれまでの検討とは異なった腫瘍細胞でのシグナルに変化が生じるかどうかを検討する予定である。

最終的に、本研究課題の研究において、インドシアニングリーンの血管内投与を用いた光音響イメージングは各臓器での血管透過性の評価に用いる事ができ、また腫瘍内においても濃度依存性を示し定量可能であり、腫瘍における抗腫瘍薬による血管透過性の低下を検知し、その後の腫瘍細胞の縮小をいち早く予測できると考えられた。現状、研究計画書に基づいた実験が遂行できている。光音響波を放出する薬剤としては、インドシアニングリーン、メチレンブルー、ゴールドナノロッドがあるが、後者2者に関しては、生体内でのシグナル上昇がはっきりしていない。この理由ははっきりしないが、現状で有用性の高いインドシアニングリーンに絞って研究を継続する予定である。今後はこれまでの検討とは異なった腫瘍細胞でのシグナルに変化が生じるかどうかを検討する予定である。ほぼ研究計画書に基づいた実験が遂行できているが、購入備品の状況により若干の誤差が生じた。来年度は、次年度使用額を含めて計画的に使用する予定である。
いかにしてヒトヘルペス8型は潜伏感染するのか

ヒトヘルペスウイルス8型(HHV-8)は、血管内皮細胞やB細胞に潜伏感染し、カポジ肉腫やprimary effusion lymphoma等を発症すると考えられている。HHV-8のウイルスタンパクlatency-associated nuclear antigen(LANA)は、潜伏感染時に発現しており、ウイルスゲノムの維持・複製に必須である。我々はウイルスゲノム維持のメカニズムを明らかにすることが、HHV-8関連疾患の解明及びその治療法につながると考え、LANAの機能解明を目指した。研究1:酵母ツー・ハイブリット・スクリーニングを行い、LANAと結合する複数の細胞因子を同定した。このうちヒトmyeloid cell nuclear differentiation antigen(MNDA)について検討を進め、以下の点を明らかにした(論文投稿中)。(1)MNDAは造血系細胞特異的に発現することが知られている。HHV-8感染細胞においては、インターフェロンα(IFNα)によって誘導されIFNα非存在下では発現していなかった。(2)HHV-8感染細胞において、LANAとMNDAは共局在した。(3)IFNαはHHV-8感染細胞の増殖を抑制するが、この作用にMNDAは関与していなかった。研究2:HHV-8非感染細胞を用いたHHV-8ゲノム複製モデルを新しく開発した(Shinohara et al. )。これよりHHV-8ゲノム複製維持にはLANAが必須であることが再現できた。またこの系にLANA変異タンパクを導入する実験により、LANAのN末端のクロマチン結合領域が重要あることも判った。分裂期細胞において野生型LANAは凝縮クロマチンに付着しているが、N末欠失LANAは凝縮クロマチンには結合せず細胞全体均一に広がっていた。この結果はLANAがクロマチンとウイルスゲノムをつなぎとめる働きをしていることを示唆している。MNDA機能はあまり判っていないが、インターフェロンαによってその発現が誘導されることが知られている。この為、細胞増殖抑制やアポトーシスなどインターフェロンαによる効果を担っている可能性を秘めている。(2)LANAとMNDAの局在を蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果、MNDAを強制発現させると、細胞形態がいびつになった。この原因としてはアポトーシスを含めてMNDAが細胞に何らかの影響を及ぼしていると考えてられる為、局在についての実験は一時保留にした。(3)LANAタンパクに対するモノクローナル抗体は現在作製中である。(4)HHV-8ゲノム複製モデルを新規開発した(投稿準備中)。このモデル系により、HHV-8ゲノム複製維持にはLANAが必須であることが判明した。さらにLANAタンパクのうちN末端側のクロマチン結合領域と呼ばれている部分が重要あることも判った。
３次元ナノ多孔質グラフェンのテラヘルツ応答と素子応用

本研究では、3次元のナノポーラスグラフェンによる高性能テラヘルツ素子の開発を目的とする。この材料は、3次元曲面を持ちながら、線形なバンド構造、高いキャリア移動度等、単層グラフェン特有の性質を保持している。さらに、光吸収率が単層グラフェンよりも格段に高く、多数のポーラスを有するため、電子・熱物性をポーラスの形状やドーピングにより制御することができる。以上から、本材料はテラヘルツ素子として有望である。本研究は、3次元ナノポーラスグラフェンの電子・光・熱物性とデバイス開発をお互い相関させながら進めた。今年度は、昨年度得られた知見を基に、実際にpn接合を有する3次元ナノポーラスグラフェンデバイスを作製し、性能を評価した。この材料は外部からのドーピングなしでは通常p型である。これに対して、ドーピング液を滴下する化学的な手法により、一部をn型に変換し、これによりpn接合を作製した。テラヘルツ応答の位置依存性を測定したところ、pn接合部で大きな応答信号を見出し、テラヘルツ素子としての動作を確認した。また、ポーラス(孔)がどのように効いているかを探求するため、磁気抵抗を測定・解析した。結果から、支配的な散乱機構が孔径によって変化することが分かった。この結果はディラック電子系の局在現象を幾何構造で制御できることを示しており、デバイスの更なる高性能化に向けて重要な知見を得ることができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、3次元グラフェンを用いることで、高性能なテラヘルツ素子の開発を目指す。この材料は、線形なバンド構造、高いキャリア移動度等、単層グラフェン特有の性質を保持したまま3次元化している。さらに、単層グラフェンの光吸収率よりも格段に高い値を示すため、テラヘルツ素子として有望である。また、多数のポーラスを有するため、電子伝導や熱伝導をポーラスの形状により制御することができる。以上から、3次元グラフェン膜の基礎的な電子・光物性を探求し、その知見をデバイス性能向上にフィードバックしながら研究を進める。今年度は、グラフェン膜が有するポーラス構造に着目した研究を行った。まず、この材料がテラヘルツ赤外領域において90%以上の高い吸収率を示すことを観測した。次に、この材料の光応答の空間分解測定から、ポーラスの径が小さいほど熱局在が顕著に生じることがわかった。この振る舞いは、ポーラス近傍のグラフェン膜が大きなひずみを受けるため、熱伝導が局所的に抑制されるためと解釈できる。また、この結果は熱伝導率や光反射率のポーラス径依存性の結果と一致する。以上から、テラヘルツ光に対する応答もポーラス径が小さいほど強く生じると予想される。実際に電気伝導測定用のソースならびにドレイン電極を有する素子を作製し、テラヘルツ応答を測定したところ、上記の予想と一致することがわかった。以上の結果は、ポーラス構造のデザインを最適化することにより、テラヘルツ応答の効果を増強できる可能性を示している。当該年度の目標は、3次元グラフェン膜の局所的な物性を探求することで、テラヘルツデバイスに向けた有用な情報を得ることであった。実際に、この膜材料の特徴の1つであるポーラス構造がテラヘルツ応答に対して顕著に効いていることを見い出し、デバイス性能とリンクしていることがわかった。これは、来年度のデバイス応用展開に向けて大きな前進であると考える。デバイスとしての性能を評価する。新規な材料であるため、物性を1つ1つ押さえていきながら、性能向上を行っていく。
極地に棲息する新規低温菌の探索と有用酵素の開発

1.産業上有用な好冷性酵素などの生産に適したタンパク質生産システムの開発を目的として、宿主となる低温菌の探索を行った。シベリア永久凍土、アラスカ永久凍土、フィンランド北極圏土壌などから、4°C付近での生育が速く、タンパク質の分泌生産能に優れた低温菌を選抜した。2.オーストリア国インスブルックの氷河地域を探索し、低温菌の分離源となる土壌を採取した。3.寒冷地での廃液処理などに有用と期待される低温活性カタラーゼを南極海水由来のShewanella livingstonensis Ac10から精製し、諸性質を明らかにした。4.フィンランド土壌由来Bacillus globisporus B9の培養上清に、著量のS-layer proteinホモログが蓄積することを見いだした。本タンパク質の分泌シグナル配列と遺伝子のプロモーター配列を用いることで、外来タンパク質を分泌高生産するシステムが構築できると考えられた。プロトプラスト法によって本菌を形質転換する方法を確立した。6.アラスカ永久凍土からヘモリシン共制御タンパク質ホモログを分泌高生産するPseudomonas sp.Ak26を単離した。本タンパク質の分泌システムを利用して異種タンパク質高生産系を開発することを目的として研究を行った。広宿主域ベクターであるpJRD215を有したEscherichia coliS17-1株と接合させることにより、形質転換が可能であることを見いだした。さらに、本菌が高生産するOprD遺伝子のプロモーター及びSD配列をpJRD215に組み込むことにより、本菌で機能する高発現用ベクターを構築した。7.南極海水から分離したShewanella livingstonensis Ac10の低温環境適応機構を解析するとともに、本菌を宿主とした外来タンパク質生産系を開発した。(1)シベリア永久凍土から分離したAcinetobacter sp.stain no.6を宿主とした異種タンパク質生産系を構築した。南極海水から分離したShewanella livingstonesis Ac10からグルコアミラーゼをコードする遺伝子を単離し、これをAcinetobacter sp.stain no.6を宿主とし、Glutamyl-tRNA reductase遺伝子のプロモーターを用いた系で分泌高生産した。Acinetobacter sp.stain no.6は外膜をもつグラム陰性細菌であるが、生産されたグルコアミラーゼの約1/3は菌体外画分に回収された。得られた酵素は40°C、1時間のインキュベーションで活性が40%に低下し、熱安定性の低い酵素であることが示された。(2)寒冷地での廃液処理などに有用と期待されるShewanella livingstonesis Ac10のカタラーゼを精製し、諸性質を明らかにした。C末端にHis-tagを付加したカタラーゼを、Escherichia coli BL21(DE3)pLysEを宿主とし、T7プロモーターを用いて発現させた。発現させた酵素はNiキレートカラム、疎水性カラムに供することで均一に精製した。本酵素は10°Cにおいて、ウシ肝臓由来のカタラーゼやMicrococcus luteus由来のカタラーゼが37°Cで示す活性と同程度の活性を示した。一方、これらの酵素に比べて著しく熱安定性が低いことが示された。本酵素の構造と活性・安定性の相関を解析することにより、産業上有用なカタラーゼの機能改変を行う上で重要な知見が得られることが期待される。(3)オーストリア国インスブルックの氷河地域を探索し、低温菌の分離源となる土壌を採取した。シベリア永久凍土、フィンランド北極圏土壌、アラスカ永久凍土などから、4°C付近での生育が速く、特定のタンパク質を分泌高生産する低温菌を選抜した。

フィンランド土壌由来Bacillus globisporus B9の培養上清には、Sporosarcina ureae由来S-layer proteinのホモログが著量認められた。本タンパク質の分泌シグナル配列、および遺伝子のプロモーター配列を利用することで、外来タンパク質を効率よく分泌生産するシステムを構築できると考えられた。形質転換法を検討した結果、プロトプラスト法により、pHY300PLKを本菌に導入できることが明らかとなった。2.南極海水から分離したShewanella livingstonensis Ac10が低温で誘導合成するタンパク質を同定し、本菌の低温環境適応への関与を解析した。プロモーター探索ベクターを用いて低温誘導性プロモーターを探索した。その結果、inositol monophosphatase遺伝子(suhB)のプロモーターが低温誘導性プロモーターとして同定された。suhB破壊株では低温での生育能が低下し、本遺伝子が低温での生育に重要であることが示された。3.ヘモリシン共制御タンパク質(Hcp)ホモログを分泌高生産するPseudomonas sp. Ak26(以下Ak26株)をアラスカ永久凍土より単離した。Hcpホモログの分泌システムを利用して異種タンパク質高生産系を開発することを目的として、本菌の形質転換法を検討した。その結果、広宿主域ベクターであるpJRD215を有したEscherichia coli S17-1株と接合させることにより、形質転換が可能であることが明らかとなった。さらに、Ak26株が高生産するポーリンタンパク質OprDの遺伝子のプロモーター及びSD配列をpJRD215に組み込むことで、Ak26株でタンパク質を高発現させるベクターを構築した。
超短パルス電子ビームを用いた高出力テラヘルツ時間領域分光システムの開発

本研究では、小型電子リニアック及び磁器パルス圧縮器によりパルス幅1ピコ秒以下の超短パルス電子ビーム(約40MeV)を生成し、コヒーレント・シンクロトロン放射により、高出力テラヘルツ(THz)領域の放射光生成に成功した。さらに、軸はずし放物面鏡を用いてTHzパルスを結晶上に集光させ、本研究におけるTHz-TDSシステム実現のための多くの知見が得られた。また、高出力のTHzパルスを利用した走査型のTHzイメージングに成功した。本研究は、小型電子リニアックにより生成したエネルギー約40MeV程度の超短パルス電子ビームを用いて、そのコヒーレント放射により高出力THzパルスを生成し、EOサンプリング法によるテラヘルツ時間領域分光(THz-TDS)システムの開発を目指すものである。それにより、レーザーベースの低出力テラヘルツ光源ではこれまで測りえなかった吸収の多い物質の分析や、分析時間の短縮等が期待される。本年度は、主に高出力コヒーレントTHzパルス生成、及びZnTe結晶等のEO結晶を用いたTHz検出のための予備実験を行った。まず、フォトカソードRF電子銃、及び2本の加速管を用いた小型電子リニアックによりエネルギー約40MeV、電荷量1nC以上の電子ビームを生成し、アクロマティックアーク(2個の偏向電磁石と4個の四極電磁石)により1ピコ秒以下のパルス幅(rms)を持つ超短パルス電子ビーム生成を行った。そして、生成した超短パルス電子ビームを、90度偏向磁石を用いて電子ビームの接線方向にテラヘルツ(THz)領域のコヒーレントシンクロトロン放射光パルスを生成した。生成したコヒーレントTHzパルスを、低損失の石英窓によって取り出し、軸はずし放物面鏡を用いて、0.1THz帯の放射光を約6mm程度に集光することができた。更にTHzパルスをEO結晶に集光すると同時に、フェムト秒レーザーをEO結晶にプローブ光として集光し、両者のタンミング測定までを行い、両者のタイミングが十分制御可能であることを検証した。次年度は、EOサンプリング法の実証と実サンプル測定を行う。本研究は、小型電子リニアックにより生成したエネルギー約40MeVの超短パルス電子ビームを用いて、そのコヒーレント放射により高出力THzパルスを生成し、EOサンプリング法によるテラヘルツ時間領域分光(THz-TDS)システムの開発を目指すものである。本年度はEO結晶(ZnTe結晶)によるTHz検出を柱としたシステムの実現を目指した。昨年度までの成果として、コヒーレント・テラヘルツ(THz)放射光生成、簡易的なTHzパルスの集光等を達成している。本年度では、まず、小型電子リニアックによって生成した超短パルス電子ビーム(約300500fs程度)を用いて、コヒーレント・テラヘルツ放射光生を成し、Niコーティング、及び金コーティングの軸はずし放物面鏡を用いて集光した。その際、集光サイズを回折限界(波長程度)まで絞るため、光源点から取出し窓までの距離を正確に計測し最適化研究を行った。さらに、EOサンプリング法によるTHzパルス検出を行うため、集光したTHzパルスの集光点にEO結晶を配置し、THzパルスを結晶上に集光させた。同時にフェムト秒レーザーをプローブ光として結晶に集光照射するため、アライメント用のファイバーレーザーにより精密な光路調整を行った。時間波形の取得には至らなかったが、結晶上でのプローブ光とTHzパルスとの空間的オーバーラップ制御の重要性が確認され、本研究におけるシステム実現のための多くの知見が得られた。また、本研究の派生研究として高出力のTHzパルスを利用した走査型のTHzイメージングに成功したことは大きな成果であると言える。