hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫性神経疾患の発病に関わる標的分子の遺伝子異常の研究

平成17年度は、慢性炎症性脱髄性神経炎(CIDP)と多発性硬化症(MS)を対象疾患とし、発病に関わる標的分子としてCIDPではPMP-22、P0 glycoprotein(P0)、P2、Connexin-32など末梢神経髄鞘蛋白を、MSではmyelin basic protein(MBP)、proteolipid protein(PLP)、myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)など中枢神経髄鞘蛋白に照準を当てた。血清中の抗体価をELISAにて測定したところ、CIDPは10例全てで陰性であったが、MSは90症例中、抗MOG抗体IgG2例、抗PLP抗体IgG4例、抗MBP抗体IgG5例で陽性であった。しかし、抗体価と臨床的重症度との相関関係は見出せなかった。平成18年度は、遺伝性ニューロパチー症例に注目し、詳細に調べたところ、CIDPに類似した特徴を有する症例が2症例存在した。いずれもP0遺伝子へテロmutationを認めた。P0へテロ欠損マウスは生後約半年で自己免疫性神経炎を自然発症することから、我々の症例でもP0遺伝子異常が自己免疫応答亢進の原因となりCIDP様の神経炎を発症した可能性を考えた。患者の末梢血リンパ球をP0-mutantpeptideと共培養し、2週間後、同抗原にて再刺激し細胞増殖反応を評価したところ、Thr124Metを有する症例では、P0-mutant peptideに対する増殖反応が有意に亢進していた。患者の有するmutationが免疫応答亢進の原因と考えられた。この結果は、遺伝子異常が自己免疫病発病の原因となる可能性を示唆するものである。「免疫性神経疾患の発病に関わる標的分子の遺伝子異常」の存在を明らかにする結果を得ることができた。症例を詳細に調べると、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎(CIDP)に類似した臨床像や病理所見を有する遺伝性ニューロパチーが2症例存在することが判明した。これらの症例はいずれもPO遺伝子に異常を認め、1例目はThr124Metで、2例目はThy68Cysのヘテロmutationであった。PO遺伝子はマウスの実験で遺伝子異常が自己免疫性神経炎の原因となることが知られており、ヘテロ欠損マウスは生後約半年でT細胞浸潤を伴った神経炎を自然発症する。またPOヘテロ欠損マウスに実験的自己免疫性神経炎を誘導すると、免疫応答が亢進し神経炎が重症化する。これらの知見から、我々の症例でもPO遺伝子異常が原因となって自己免疫応答が亢進し、CIDP様の神経炎を発症した可能性を考えた。免疫応答の解析方法として、患者の末梢血リンパ球をPO-wildpeptide、PO-mutant peptideそれぞれと共培養し、2週間後、同じ抗原にて再刺激し細胞増殖反応を評価した。その結果、健常コントロールでは、明らかな増殖反応は見られなかったが、Thr124Metを有する症例では、PO-mutant peptideに対するリンパ球の増殖反応が有意に亢進しており、患者の有するmutationが免疫応答亢進の原因と考えた。さらなる検討が必要であるが、PO遺伝子異常がPOに対する免疫応答亢進の原因となり、CIDP様の自己免疫性神経炎の発症につながったことが示唆される。
農林地生態系の地球化学的物質循環速度調整能とそのモデル化

土壌植物系は、その内部において物質循環を生じさせているとともに、大気圏との物質交換、水圏への物質流出を起こし、大気圏と水圏の質を決定している。人間活動は直接間接にその物質循環へ影響を及ぼしている。本研究ではその物質循環を測定し、モデル化するとともに、人間活動の結果生じる物質流出の変化を評価しようとした。得られた結果は以下の通りである。森林生態系では大気からの流入は極めて重要な役割をになっていた。すなわち、これまで土壌由来と考えていた塩基類は土壌から減少し、むしろ植物へ蓄積しており、その維持に大気からの流入が不可欠であることがうかがえた。しかし、降下アンモニウムのように植物の最重要必須要素の供給は、植物成長量を増大させ、塩基消費を早め土壌を酸性化し、結局、植物成長を制限する場合が考えられる。すなわち一概に栄養塩のインプットを良しとはし得ず、最小養分律の重要性が認識された。同様に、外部からの施肥は確かに土壌植物系を維持するが、硝酸溶脱、亜酸化窒素放出のように、水圏、大気圏の質を劣化させる場合も指摘された。このような物質のインプットにおける人間活動の影響ばかりでなく、生態系の改変や物質フローのコントロールもまた、土壌植物系へ影響を及ぼしていた。例えば、水資源の確保のために建設したダム湖はメタンの放出源となり、メタンを酸化分解する森林土壌が単に失われただけでないインパクトが生じることが示唆された。また、地域レベルの窒素循環を評価した結果、農地土壌は現在の農業技術では富栄養化しており、さらに食糧と飼料の輸入により屎尿や糞尿由来の窒素が多く廃棄され、河川負荷の点源となっていた。以上を総括すると、土壌植物系は地球の表面で大気圏と水圏の間の物質動態を植物吸収と有機物集積分解による生物地球化学的物質循環により規制しているが、その循環系は自然における大気からのインプットの影響を受けやすく、また人間活動で大幅な変化が生じるものであり、脆弱なものである可能性が高い。さらに循環過程における栄養元素の相互作用を考慮した研究を進める必要があるものと思われる。本研究は、エネルギーと物質の流れを規制する生態系の生物物理化学的調節機能を野外観測において明らかにし、その数値モデルを構築する目的で行っている。試験地は、北海道を南北に縦断する、気候、植生、地質、土壌、土地利用が異なる地点において選択した。本年度は、森林生態系における酸緩衝(天塩、苫小牧)、二酸化炭素放出(苫小牧)、メタン吸収(望来)の諸機能、および、農地生態系における二酸化炭素・亜酸化窒素放出、硝酸溶脱(三笠)について調査した。森林生態系に流入する酸は、植物土壌系を通過する間に完全に中和された。植生による中和機構は塩基交換放出と見受けられたが、針葉樹林では有機酸も分泌し、pH3に達する独自の酸性環境の作り出していた。針葉樹、広葉樹とも土壌から選択的に2価カチオンを吸収したが、針葉樹はCaが主体となるのに対して広葉樹は土壌によりCa、Mgの吸収比率は異なった。土壌中の余剰塩基の主体は降雨由来のNaと土壌由来のCa、Mgであるが、それらは土壌中で生成されるHCO_3と、降雨由来のClと共に土壌から溶脱した。ただし、森林地から流出する河川水は土壌浸透水より高濃度のMg、Ca、HCO_3を持ち、その水質形成は特異である。

そのHCO_3の生成について次年度集中的に調査する予定である。土壌中のHCO_3は、根の呼吸や微生物分解により生じるCO_2により供給される。森林土壌中のCO_2濃度は、夜間大きくなるが、その変動は微生物活動で説明できず、根呼吸と考えられた。CO_2は温暖化ガスでもあるが、植物群落内CO_2濃度は、昼間群落上大気より低下し、植生は土壌呼吸のシンクであった。さらにCH_4の酸化分解も認められた。しかし畑では、CO_2の290倍の温室効果を持つN_2Oの放出が無視できない。その放出の理由には硝酸化成と脱窒が上げられるが、低地土タマネギ畑での観測ではNO_3の溶脱に伴う土壌中での嫌気サイトでの脱窒がN_2O放出の主要因であることが伺われた。脱窒が伺われるにもかかわらず、暗渠排水から最大50ppmNにも達するNO_3が認められ、酸化的サイトをすばやく溶脱していることが認められた。このような現象は、粗孔隙と細孔隙からなる土壌の孔隙構造に基づいていると考えられる。次年度は、さらにデータを集積するとともに、さまざまな物質変換を生み出す土壌サイトを考慮した循環モデルの基本型を構築する。1)森林生態系に流入する酸は、植物系を通過する間に独自の酸環境に調整された。いづれの地域の広葉樹も、酸性雨をpH5.5以上に中和した。しかし針葉樹では、樹種により異なり、アカエゾマツではpH3まで低下する場合も見られ、独自の酸性環境を作り出していた。ただし、いづれの樹種も酸の中和のために主にKを交換放出していた。土壌浸透水のpHはいづれも降雨より高かった。ただしO層やA層のpHは針葉樹のみならず広葉樹でも5以下に低下する場合が多かった。土壌への主な酸供給要因として針葉樹では有機酸が、広葉樹では硝酸化成が上げられた。ただし、B層以下の層では土壌の母材独自の違いが強くなり、塩基性の蛇紋岩や未熟火山放出物由来の土壌ではpHは6前後に高まり、塩基の少ない第三紀泥岩ではpHは依然として5前後であった。河川水のpHは土壌のpHはり高かったが、地域により異なった。酸の中和のために土壌溶液に放出された塩基のうち、樹木は主にCaとKを吸収した。余剰塩基の主体は降雨由来のNaと、土壌由来のCa、Mgであり、それらは土壌植物由来の有機酸やHCO_3、降雨由来のClを伴なって溶脱していき、河川水質を形成した。2)森林生態系において大気、植物、土壌の各系への流入と流出フローを測定し、生態系内の炭素収支を見積もるモデルを構築した。火山放出物未熟土の落葉広葉樹林では、降雨と乾性沈着で年間47kgC/haの炭素が供給されていたが、樹木の純一次生産により固定された炭素はそれより圧倒的に大きく7605kgC/haに達していた。このうち、落葉落枝と根の枯死で1620kgC/haが土壌に供給される。さらに林内雨と樹乾流で59kgC/haが供給されていた。土壌呼吸量は5930kgC/haであったが、その70%は根呼吸によるものと認められ、土壌からの放出量は1779kgC/haであり、供給量とほぼバランスしていた。また植物が吸収するCO2は純一次生産分と根呼吸分を合わせた11756kgC/haであるが、土壌呼吸の69%は植物に再固定されており、大気からのCO2流入分は7664kgC/haであった。
神経移植による視覚機能回復はどこまで可能か?

本研究では、末梢神経移植によって再構築させた視覚経路の機能回復の程度を評価するための方法として、初年度はコントロールとして正常ラットを用い、α-クロラロース麻酔下での行動実験を実施した。その結果、光刺激を先行刺激とした聴覚性驚愕反射の抑制効果を認めた。今年度、同じく麻酔下に動き刺激を先行刺激した驚愕反射の抑制効果を得るべく努力したが、予想外の要因のため明確な抑制効果は得られなかった。そこで、新たにシャトル箱回避実験を実施したところ、正常ラットで、輝度変化を伴わない純粋な動き刺激に対する反応を得ることが出来た。さらに反応可能な動き刺激の下限の速度をおよそ推定することに成功した。シャトル箱回避実験では7-8週齢のWistar系ラットをシャトル箱に入れ、視覚刺激としてサイン波状の格子パターン(空間周波数0.5c/d)を常時提示した。条件刺激(CS)として格子パターンを10s間動かした。動きの速度は40,20,1.5,0.5deg/sの4種類とした。CS提示開始10s後に無条件刺激として、床グリッドから電気ショックを与えた。1日50試行の訓練を5日間実施したところ、回避率はいずれの群でも訓練に伴う増大を示し、5日目で55-70%の回避率を示した。9匹の移植動物を用い、白色LEDの点灯を聴覚性驚愕刺激(白色雑音113dB)に50-100ms先行させて提示し、自由行動下の状態で先行刺激抑制効果を検討したところ、驚愕反応の振幅が減弱する傾向を示したのはわずかに1匹だけであった。この動物は20deg/sの速さの動きを条件刺激とした回避実験で訓練に伴う回避率の増大が観察された。一方、40deg/sの動きに対する訓練では回避率の増大は認められなかった。以上の結果は、移植動物では正常動物とくらべ、検出可能な動き刺激の範囲は限られるものの、動き刺激の検出、認知が可能であることを示唆している。α-クロラロース麻酔下のラットを用い、視覚刺激に対する先行刺激抑制効果について調べた。自由行動下のラットでは、突然の強い音刺激に対する驚愕反応が、弱い光刺激を先行提示することにより抑制される(先行刺激抑制効果)。私達はこの現象を用いて、動物の視覚機能を行動学的に評価できることを報告してきた。しかしながら、自由行動下の動物に動き刺激を提示することには多くの困難を伴なう。一方、α-クロラロース麻酔下では、音刺激に対して著明な驚愕反応が引き起こされることが知られており、したがって、もし、麻酔下で動物の視野を固定した状態で、先行刺激抑制効果が得られるならば、動き刺激を先行刺激として用いることにより、動物が動き刺激を検出できるかどうかをテストできる。その前段階として、今回は、α-クロラロース麻酔下での先行刺激抑制効果ついて検討した。今回は、先行刺激として白色LED(2300lx,20ms)、驚愕刺激として白色雑音(104dB SPL,50ms)を用い、まず、自由行動下のラットで驚愕反応を加速度センサーによって記録した結果、刺激間間隔(ISI)が40-80msで、驚愕反応の抑制が認められ、最大の抑制(38.1%)はISIが60msの時に得られた。同じ動物のα-クロラロース麻酔下ではISIが50-200msで抑制が認められ、最大の抑制(72.2%)は70msで得られた。

以上の結果から、α-クロラロース麻酔下では、自由行動下に比べ抑制の程度は少ないものの、ほぼ同様の先行刺激抑制効果が得られることを示しており、今後、様々な視覚刺激を用いた視覚機能評価のために有用な実験系であることが示された。本研究では、末梢神経移植によって再構築させた視覚経路の機能回復の程度を評価する目的で、前年度はα-クロラロース麻酔下のラットを用い、光刺激を先行刺激とした聴覚性驚愕反射の抑制効果を認めた。今年度、同じく麻酔下に動き刺激を先行刺激した驚愕反射の抑制効果を得るべく努力したが、明確な抑制効果は得られなかった。この理由として、先行刺激抑制効果の実験デザインでは使用できる動き刺激の提示時問が短いのが最大の原因と考えられた。そこで、提示時間を長くとれるシャトル箱回避実験を実施したところ、正常ラットで、輝度変化を伴わない純粋な動き刺激に対する反応を得ることが出来た。さらに反応可能な動き刺激の下限の速度を決定することに成功した。7-8週齢のWistar系のラットを、中央に仕切り板のある透明なアクリル製のシャトル箱に入れ、視覚刺激としてサイン波状の格子パターン(空間周波数0.5c/d)を常時提示した。条件刺激(CS)として格子パターンを10s間動かした。動きの速度は40,20,1.5,0.5deg/sの4種類を用いた。CS提示開始10s後に無条件刺激として、ステンレス製の床グリッドから電気ショックを与えた。60sの試行間間隔で1日50試行の訓練を5日間実施したところ、回避率はいずれの群でも試練に伴う増大を示し、5日目では各群とも約60%の回避率を示した。一方、試行間の移動反応は0.5deg/s群のみ単調増加を示し、5日目で約6(回/試行)の値に到達した。他のすべての群では2日目以降、減少傾向を示した。このことから、正常ラットの反応可能な動き刺激の下限の速度は0.5-1.5deg/sの間にあることが示された。現在、移植動物を用いた実験を進行させている。
株主有限責任制度の根拠と限界

本研究は、ドイツ法と日本法を主たる素材として株主有限責任制度の根拠と限界について研究した。日本商法の原型は1884年起草のロエスレル草案に求められるが、本草案と日本側が提示した草案の研究から、株主有限責任が認められるための必要条件は、会社の資本が取引相手に対して開示され、会社資本が充実され維持されることであることが明らかとなった。しかし同時に、かかる二つの条件が、株主有限責任の原則を認めるための十分条件とはなりえないことが、現代の日独の法研究を通じて明らかになった。すなわち、ある会社(A)が別の会社(B)の株式を取得してこれを支配しているとき、株主有限責任の原則の存在にもかかわらず、B社が負う債務につきA社に責任を負わせるべきことが明らかになった。この分野はドイツではコンツェルン法として立法化されているが、日本では未だ未発達であり、法人格否認の法理が判例法としてこれをカバーしようと試みている状況にある。ドイツコンツェルン法との比較研究から、支配株主が支配力を濫用して従属会社に損害を負わせた場合には支配株主はかかる支配力濫用から生じた損害を賠償する責任を負うという法理が判例法上、日本において認められるべきことが明らかになった。なお、ロエスレル草案における株主有眼責任の原則につき、「ロエスレル氏商法草案意見書について」今中利昭編・民事法の諸問題第4巻(第一法規2000年5月出版予定)、ドイツコンツェルン法につき、「ドイツコンツェルン法と日本法への展望」加藤勝郎先生柿崎栄治先生古稀記念・社団と証券の法理(商事法務研究会1999年)、法人格否認の法理につき、「法人格の否認」家近正直編・現代裁判法大系(新日本法規出版1999年)、それぞれ研究業績がある。(1)ドイツにおける法人格否認の法理ドイツでは、法人格否認の法理は、コンツェルン法の議論に吸収されたと言われており、現在我が国で法人格否認の法理の問題として論じられている事例は、ほぼ、コンツェルン法上の問題とされている。そのドイツコンツェルン法において、近年、判例変更があり、新判例によると、親会社が子会社に直接債務を負うのは、親会社の子会社に対する強い支配だけではなく、それに加えて、支配関係から生ずる危険の実現、すなわち、コンツェルン指揮力を行使して子会社の固有の利益を侵害した事実が主張・立証されなければならない。(2)日本法への示唆日本では、コンツェルン法のような立法がなく、親会社に子会社債権者に対する直接の債務を負担させる成文法はない。最善の策は、我が国においてもコンツェルン立法を急ぐことであるが、解釈論としては、法人格否認の法理の適用要件を、親子会社に対する適用という観点から具体的に確立することである。その要件を検討するうえで、ドイツの新判例が示す上記の2要件は示唆に富むものである。さらに、債権者のタイプによって要件を変える必要があるのではないかという議論も行われており、十分な考察を要する。
アミロイドを標的とするSPECT用分子イメージングプローブの構築

我々は、これまでに、^<125> I,^<11> C,^<18> Fで標識したフラボノイド誘導体が、βアミロイド(Aβ)凝集体に対して高い親和性ならびに、脳への良好な移行性と脳からの迅速なクリアランスを示すことを報告した。本研究では、主に、核医学診断分野で最も繁用性に優れた^<99m> Tcを用いて標識したフラボノイド誘導体を合成し、評価した。安定で脂溶性の高い^<99m>Tc標識体を得るための配位部位として、ジアミンジチオール型のMAMAとBATを導入した。そのうち幾つかの標識体は、Aβ(1-42)凝集体に対し高い結合親和性を示し、さらに、動物実験においては、^<99m> Tc-BAT-chalconeが、アミロイドの画像化に適した迅速な脳への取り込みと消失性を示すことが明らかとなった我々は、これまでに、^<125> I,^<11> C,^<18> Fで標識したフラボノイド誘導体が、βアミロイド(Aβ)凝集体に対して高い親和性ならびに、脳への良好な移行性と脳からの迅速なクリアランスを示すことを報告した。そのうち幾つかの標識体は、Aβ(1-42)凝集体に対し高い結合親和性を示し、さらに、動物実験においては、^<99m> Tc-BAT-chalconeが、アミロイドの画像化に適した迅速な脳への取り込みと消失性を示すことが明らかとなった本年度の研究では、臨床診断上汎用性の高いアミロイドβ(Aβ)イメージングプローブの開発を目的として、フラボノイド化合物の中でもカルコン骨格を母核とした新たな^<99m>Tc標識化合物を設計・合成し、そのアミロイドイメージングプローブとしての有用性について基礎的検討を行った。まず、^<99m>Tcとの錯体形成部位であるmonoamine-monoamide dithiol(MAMA)及びbis-amino-bis-thiol(BAT)を導入したカルコン(CH)誘導体を4種類を作製し、その構造を推測するために同属元素であるReの錯体も合成した。^<9m>Tc-glucoheptonateとの配位子交換反応により^<99m>Tc標識体を得た。^<99m>Tc標識体および対応するRe錯体をHPLC分析により比較し、得られた^<99m>Tc標識体の構造を推測した。これら4種の^<99m>Tc標識カルコン誘導体は、Aβ(1-42)凝集体を用いたインビトロ結合実験から、Aβ(1-42)凝集体に対する結合親和性を有することが示された。その結合親和性には、導入するアルキル鎖の長さの違いによる差異が認められたが、錯体部位の違いによる差異はほとんど認められなかった。正常マウスを用いた体内放射能分布実験においては、4種の^<99m>Tcカルコン誘導体は投与後早期における脳への移行性と、その後のクリアランスを示した。その脳移行性には、分子量及び錯体部位の違いによる影響が認められた。特にBATを配位部位とするカルコン誘導体は良好な脳内放射能挙動を示した。以上の結果より、本年度開発した^<99m>Tc標識カルコン誘導体は、アルツハイマー病の診断を目的とするAβイメージングプローブとしての基本的性能を有することが示された。また、本検討結果は、今後の^<99m>Tc標識Aβイメージングプローブの開発に有益な情報を提供するものと考えられる。アルツハイマー病において、タンパク質アミロイドβ(Aβ)は、臨床症状が現れる以前の初期段階から沈着が起こるといわれており、脳内Aβに選択的に結合する分子イメージング用プローブの開発は、早期診断を実現できる可能性を持つものとなる。本研究は、我々が新たに開発した一連のフラボノイド化合物を、多くのアルツハイマー病患者に適用できる汎用性にすぐれたSPECT用製剤への展開を行うことを主目的とし、同時にアミロイドを病因とするプリオン病に対する分子イメージングへの展開の可能性についても検討を進めた。一連のフラボノイド化合物について、前年度に引き続きSPECT製剤として^<99m>Tc標識体の開発を中心に研究を進めた。カルコンおよびフラボン、オーロンを基本骨格に錯体形成部位を導入した数種の標識前駆体を合成し、良好な放射化学的収率(46-93%)で^<99m>Tc標識体を得ることに成功した。また、Aβ(1-42)凝集体を用いたin vitro結合実験から、^<99m>Tc標識フラボノイド化合物いずれにおいてもアミロイド凝集体に対する結合親和性を有することが示された。正常マウスを用いた体内放射能分布実験では、^<99m>Tc標識フラボノイド化合物は投与早期における脳への移行性と、その後の経時的なクリアランスを示した。一方、Tcと同族のレニウム(Re)の錯体を合成し、Tg2576マウス

脳切片を用いて蛍光染色実験を行った結果、脳切片上にRe錯体由来の蛍光像が観察され、^<99m>Tc標識フラボノイド化合物はマウス脳切片上のアミロイド斑に対する選択的結合性を有することが確認できた。これまでに開発した、一連の標識体を用いて、BSEプリオン感染モデルマウス脳切片との蛍光染色実験を行ったところ、フラボン、カルコンおよびオーロンでは脳切片上に顕著な蛍光像は観察されなかった。一方、フラボノイドの類縁体であるスチリルクロモンでは、脳切片上に化合物由来の蛍光像が確認された。この蛍光像は免疫染色による染色部位と一致したことから、これら化合物はPrPscへの結合性を有することが示された。すなわち、AβとPrPscの2種のアミロイドを区別できる化合物開発の可能性を期待させる結果と言える。アルツハイマー病において、脳内に病的に集積するタンパク質βアミロイド(Aβ)はアルツハイマー病の臨床症状が現れる以前の初期段階から沈着が起こるといわれており、脳内Aβに選択的に結合する分子イメージング用プローブの開発は、早期診断を実現できる可能性を持つものとなる。本研究では、我々が新たに開発した一連のフラボノイド化合物を、多くの患者に対応できる汎用性にすぐれたSPECT用製剤への展開を行うとともに、本年度は、同じくアミロイドを病因とするプリオン病に対する分子イメージング薬剤としての可能性の検討も行った。アミロイド結合性プローブの合成前年度に引き続きSPECT製剤としてフラボノイド及びスチリルクロモンの放射性ヨウ素標識体の合成を中心に、開発を進めた。また、フラボノイド以外の基本骨格としてアクリジン骨格に注目し、キナクリンを含む数種の化合物の合成とそのヨウ素標識を行った。その結果、Aβ凝集体への高い結合親和性と良好な脳移行性を示す数種のアクリジン誘導体を得ることができた。異常型プリオンモデルペプチドによるインビトロ結合実験昨年度、一連のフラボノイド及びスチリルクロモン誘導体を用いて行ったBSEプリオン感染モデルマウス脳切片の蛍光染色実験からは、AβとPrP^<Sc>の2種のアミロイドを区別できる化合物開発の可能性を期待させる結果が得られた。そこで、本年度は、自己凝集性を有するリコンビナントプリオンを用いて、アミロイドの特性を示す凝集体を作成し、インビトロ結合実験を進めた。その結果、フラボノイド及びスチリルクロモン誘導体間で結合親和性(Kd値)に差は認められなかったものの、スチリルクロモン誘導体はフラボノイド誘導体に比べて、Bmaxが大きいという結果が得られ、異常型プリオン凝集体の画像化を行う上で、有望な基本骨格となりうるものと判断した。
イソプレンを含むジアルケン炭化水素類の光酸化で生成する二次有機粒子組成

最近の研究から、イソプレンの酸化で生成する2-メチルテトロールが大気中の二次有機エアロゾル生成に寄与すると言われている。しかし、このポリオールの生成に関わる反応機構は十分には理解されていない。イソプレンや1,3-ブタジエン等のジアルケンの光酸化で生成する二次有機エアロゾルの組成の分析を通して、特にジアルケンからのポリオール類の生成に関わる酸化機構を調べることを本研究の目的とした。本研究では、NO_x存在下における6種類のジアルケン(1,3-ブタジエン、イソプレン、2,3-ジメチルブタジエン、2,4-ヘキサジエン、1,4-ペンタジエン、および1,5-ヘキサジエン)の・光酸化を室内チャンバー実験によって調べた。生成する二次有機エアロゾル(SOA)の水溶液に含まれるポリオール、有機酸、および硝酸を、イオン排除型液体クロマトグラフ-質量分析法によって分析した。イソプレンの実験でば、2-メチルテトロール(SOAの0.5-2wt%)、メチルニトロオキシブタントリオール(SOAの1-7wt%)、メチルジニトロオキシブタンジオール(SOAの0.3-8wt%)、および硝酸(SOAの4-9wt%)が、SOAの水溶液中に見つかった。抽出の3日後には、ニトロオキシポリオール(即ち、メチルニトロオキシブタントリオールおよがメチルジニトロオキシブタンジオール)の濃度は減少し、逆にポリオールと硝酸の濃度は増加した。同様の結果が、6つ全てのジアルケンの実験で得られた。実験結果は、NO_x存在下のジアルケンの気相光酸化ではニトロオキシポリオールが生成してSOAの生成に寄与し、ニトロキシポリオールは水溶液中で分解してポリオールと硝酸を生成することを示している。水溶液中に存在するポリオールと硝酸は加水分解の生成物であり、本当のエアロゾルの成分ではない。ジアルケンの酸化における気相の反応プロセスによるポリオール生成はNO_x存在下では抑制されると考えられる。本研究では、イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)を含む6種類のジアルケン類の光酸化実験で生成する二次有機粒子の組成分析から、イソプレンの光酸化で生じる二次粒子の生成機構を明らかにすることを目的としている。特に本年度については、イソプレン、1,3-ブタジエン、及び2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンを前駆炭化水素として用いることにより、二次粒子生成に対するジアルケン類のメチル側鎖の効果を明らかにすることを目的とした。すべての実験は、5ppmvの炭化水素および1ppmvの窒素酸化物を空気中に混合した試料に、キセノンランプの光を3時間照射して行われた。二次粒子の収率は生成した粒子の濃度に依存することが知られるが、本研究で測定されたイソプレンからの二次粒子の質量収率は、約400μg毎立米の質量濃度の粒子が生成したときに3%であり、以前に報告された結果を再現した。3時間の光照射で生成した二次粒子の収率は、ブタジエン(6%)で最も高く、ジメチルブタジエン(2%)で最も低かった。結果から、ジアルケン類のメチル側鎖は、光酸化で生成する二次粒子収率を抑制することが示唆された。液体クロマトグラフ-電子スプレーイオン化型質量分析計を用いて陰イオン化モードで試料の分析を行った。生成物として、分子量が1000以下のオリゴマー分子や、分子量が200以下のポリアルコール分子が検出された。ブタジエン、イソプレン、及びジメチルブタジエンの生成物の質量スペクトル中では、それぞれ105、119、及び119の質量電荷比を持つイオンの存在率が最も高かった。105及び119の質量電荷比を持つイオンはポリオール類からの擬分子イオンに仮同定された。次年度に行われる前駆体の炭素鎖の長さを変える実験から、本年度に得られた組成の仮同定を検証し、ジアルケン類から二次粒子生成の全体像を明らかにする予定である。

同様の結果が、6つ全てのジアルケンの実験で得られた。実験結果は、NO_x存在下のジアルケンの気相光酸化ではニトロオキシポリオールが生成してSOAの生成に寄与し、ニトロキシポリオールは水溶液中で分解してポリオールと硝酸を生成することを示している。水溶液中に存在するポリオールと硝酸は加水分解の生成物であり、本当のエアロゾルの成分ではない。ジアルケンの酸化における気相の反応プロセスによるポリオール生成はNO_x存在下では抑制されると考えられる。
大気圧プラズマによる細径ダイヤモンドコーテッドエンドミルの刃付け研磨技術の開発

本研究では、高精度・長寿命節密金型を実現するために、超硬合金を自由な形状に切削加工するための工具を開発する。具体的には微細加工用ダイヤモンドコーテッドエンドミルの刃先部分のダイヤモンド膜を軽負荷で研磨する技術を検討した。その結果、高密度大気圧プラズマを安定して連続照射できるプラズマトーチを開発した。さらに、プラズマによる気相エッチングとダイヤモンドのグラファイト化を促進するCoの触媒効果を併用した、メカノケミカル方式のダイヤモンド研磨技術を開発した。マイクロ波励起大気圧プラズマ発生装置に関して、ダイヤモンドのエッチングを可能にするためには高密度大気圧プラズマを安定して発生できるプラズマトーチが不可欠である。1.2kWの出力で30分以上安定してプラズマ発生が可能な水冷式トーチを開発した。ベースプラズマとしてアルゴンプラズマを形成し、酸素ならびに水素ガスを添加することで異なる発光スペクトルが得られ、それぞれ酸素、水素に起因する活性種を含む大気圧プラズマを形成できることを確認した。3種類のプラズマを用いて、超硬合金基板上に気相合成法で合成した多結晶ダイヤモンドのエッチングを行った。合わせて、プラズマ中に熱電対を装入することでプラズマ温度を直接測定するとともに、超硬合金基板の温度測定も行った。その結果、酸素プラズマが600700°C、水素プラズマは余剰水素が燃焼するために1000°C程度を示すことが明らかになった。超硬合金基板の温度は、400600°C程度を示した。ダイヤモンドのエッチングは温度の低い酸素プラズマの場合、15分程度のプラズマ照射で20μm程度のダイヤモンド膜が除去され下地の超硬合金基板が露出した。水素プラズマの場合は、多結晶ダイヤモンド特有の凹凸面(自形面と呼ばれる)の稜線が丸みをおびるといったマイルドなエッチング効果が認められた。なお、いずれのプラズマ照射においても結晶粒界や特定の結晶方位が選択的にエッチングされる現象は認められなかった。さらに、プラズマ照射の境界領域の観察によれば、ダイヤモンド膜は傾斜的にエッチングされるのではなく、極めて明瞭な境界を有していることが明らかになった。すなわち、目視でプラズマと接触している領域のダイヤモンド膜がエッチングされることが明らかとなった。前年度において、大気開放状態でのAr+O2プラズマにより多結晶ダイヤモンド膜が効率的にエッチングできることを確認した。本年度は、対象である細径ダイヤモンドコーテッドエンドミルと類似の形状の試料を用いて、プラズマ条件の最適化を行った。細径エンドミルの場合、基材となる超硬部材の質量が小さいために、大気圧プラズマ照射により基板温度が超硬合金の酸化開始温度を超えてしまうことが明らかとなった。すなわち、多結晶ダイヤモンド膜を効率良くエッチングできるものの、露出した超硬合金が酸化することで、薄緑色の粉末状の生成物(酸化粉末)が形成するという問題が生じた。このような温度変化によりダイヤモンド膜の密着力に悪影響を及ぼす事が明らかになった。すなわち、超硬合金の酸化の有無が処理温度の目安となっている。プラズマ投入電力を低減することで酸化を防止することは可能であるが、基板温度の低下に伴いエッチング効率が大きく低下するというトレードオフの関係を解決する必要が生じた。低い基板温度条件で効率的なダイヤモンド膜のエッチングを実現するために、触媒金属の活用を検討した。具体的には焼結ダイヤモンドのバインダーとして用いられるCo(コバルト)の利用である。Coに接触したダイヤモンド膜は、低い温度条件でも効率的にエッチングが進行することを明らかにした。この触媒効果を実用的な技術に発展させるための予備的な実験も行っている。ダイヤモンド膜上にCo粉末を散布して大気圧プラズマを照射する手法、および大気圧プラズマ中で高速回転させたCo丸棒をダイヤモンド膜に接触させてメカニカルな手段も併用する手法である。初年度において、大気圧プラズマトーチの改良によりAr+O2プラズマにより多結晶ダイヤモンド膜が効率的にエッチング出来ること、ならびに、通常のダイヤモンド工具にコーティングされる(111)面が主体の多結晶ダイヤモンドの場合、極端な結晶方位依存性や粒界の選択的なエッチングが生じない条件を確立した。2年目において、対象である細径ダイヤモンドコーテッドエンドミルと類似の試料を用いてプラズマ条件の最適化を行った。細径エンドミルの場合、基材となる超硬部材の質量が小さいために大気圧プラズマ照射により基板温度が超硬の酸化開始温度を超えてしまうことが明らかとなった。すなわち、多結晶ダイヤモンドを効率良くエッチングできるものの基板温度が上昇してダイヤモンド膜の密着性に悪影響を及ぼすという問題が明らかとなった。プラズマの投入電力量を下げて基板温度を低下させる、とエッチング速度が低下してしまう。このようなトレードオフの関係を解決する必要が生じた。具体的にはより低い基板温度で効率的なダイヤモンド膜のエッチングを実件するために触媒金属の活用を検討することにした。最終年度は、焼結ダイヤモンド合成における触媒金属であるCo, Ni, Feならびに炭素都反応して炭化物を形成しやすいTa, Tiに着目してこれら金属とダイヤモンド膜を接触させた領域にAr+O2プラズマの照射を行い,触媒効果を併用したエッチング効率を検証した。その結果Coをダイヤモンド膜と接触させることで超硬の酸化開始温度以下で効率的にダイヤモンド膜のエッチングが可能なことを実証した。さらに、具体的な研磨技術を確立する手段として、ダイヤモンド膜に対して超音波振動させたCoロッドを摺動させながらAr+O2プラズマを照射して、プラズマによる気相エッチングとCoの触媒効果を併用した機械研磨を併用した、新規なメカノケミカル研磨技術を開発した。なお、平成28年6月中の特許出願を予定している。

本研究では、高精度・長寿命節密金型を実現するために、超硬合金を自由な形状に切削加工するための工具を開発する。具体的には微細加工用ダイヤモンドコーテッドエンドミルの刃先部分のダイヤモンド膜を軽負荷で研磨する技術を検討した。その結果、高密度大気圧プラズマを安定して連続照射できるプラズマトーチを開発した。さらに、プラズマによる気相エッチングとダイヤモンドのグラファイト化を促進するCoの触媒効果を併用した、メカノケミカル方式のダイヤモンド研磨技術を開発した。当初の予測と異なり、超硬合金の酸化温度よりも高い領域でないとダイヤモンドが効率的にエッチングできないという問題に直面した。しかし、Coの触媒効果を利用することで、超硬合金が酸化しない温度域でダイヤモンド膜を効率的にエッチングできることを明らかにした。このような効果的なリカバリー対策を考案出来たことで、おおむね順調と判断した。生産工学今年度は、大気圧プラズマ雰囲気下においてCoの触媒効果によりダイヤモンド膜が効率的にエッチングできる基礎技術を開発した。次年度は、この基礎技術をエンドミルの刃先研磨に応用するための周辺技術の開発に注力する。具体的には、大気圧プラズマ内の活性種によるダイヤモンド膜の気相エッチング効果と、Coとの接触/摩擦を利用して化学反応と機械的な摺動を併用するメカノケミカル研磨により、超硬合金が酸化しない温度域で、ダイヤモンドコーテッドエンドミルの刃付け研磨を実現するための技術開発を行う。研究のベースとなる大気圧プラズマトーチについて、高密度プラズマを長時間にわたり安定して形成できるトーチの開発に成功したこと。また、アルゴンプラズマに酸素を添加することで、効率的にダイヤモンドのエッチングが可能であることを実証できたこと。結晶方位が異なり、多くの結晶粒界を含む多結晶ダイヤモンド膜のエッチングにおいて、結晶方位依存性や結晶粒界の選択的なエッチングが認められないことが実証でき、プラズマの素質としてエッチングに適していることが確認できた。当初予想しなかった問題が発生し、これを解決するための予備実験に時間を取られた。最終的に問題を解決する手段は明らかになったものの、消耗品の購入判断が遅れたために予算執行することが出来なかったためである。研究のベースとなる大気圧プラズマについては、トーチはほぼ完成し、ダイヤモンド膜を効率的にエッチングできる基本的なプラズマ条件を明らかにした。プラズマ条件については、さらに最適化を進めるとともに、メカニカルな研磨手段との併用について本格的な実験を進める。具体的には比較的低温で炭化物を形成しやすいタンタルとチタンについて、円錐状に加工したものを回転させることでダイヤモンド膜と摺動させ、その接触部に大気圧プラズマを照射する。
共通原因故障のリスク同定に基づく信頼性・保全性設計法の開発

原子炉等、事故による社会的影響が大きなシステムに対して、共通原因故障(CCF)による事故リスクを考慮したシステムの信頼性・保全性設計に関する研究に取り組んだ。研究細目1)確率論的安全評価のための新たなCCFモデリング・解析手法の開発、では、昨年に引き続き多変量ワイブル分布モデルを用いたシステム信頼度の定式化に取り組んだ。特に信頼度の算出において、ネットワークの信頼性評価で用いられるドミネーションの原理を用いることにより、効率的にシステムの信頼度が計算できることを示した。さらに、機器故障が集中して発生する現象を新たに考案した。これは故障する機器の組み合わせが限定されるモデルであり、同時故障を起こす機器は、機器が置かれた位置と、外的ショック源との距離により決定され、近い位置にある機器は同時故障となるリスクが高いという、従来のモデルに比べてより現実的なモデルである。そのモデルを用いたCCFのモデル化について検討した。研究細目2)CCFとその事故リスクを考慮したシステムの保全方式の確立、に関しては、最適保全方策の決定方法に関する研究を進めた。今年度は特に、設備の劣化に伴い機器の能力が低下する現象を状態空間モデルで記述し、CCFとその事故リスクを考慮した最適保全方策の性質を調べる研究。修理可能な小規模な故障と取り替えが必要な大規模な故障の2種類が発生するモデルにおいて、コストを最小にする最適保全方策に関する研究を進めた。共通原因故障により事故リスクを考慮したシステムの信頼性設計、および保全性設計を体系化するため、本年度は、(1)多変量ワイブル分布を用いた冗長システムの信頼度の定式化、(2)集中型故障をモデル化するための文献調査、(3)複数の保全方法が存在する際に、コストと稼働率の観点から最適な保全方策を得るためのアルゴリズムの検討、(4)機器の劣化に伴い能力が低下するモデルの最適保全方策の検討を実施した。(1)の検討から、多変量ワイブル分布を用いたCCFモデリングおよびシステム信頼度の定式化に一定の成果が得られた。特にシステム信頼度算出においてドミネーションの考えを取り入れることにより計算効率が向上した。また(2)では、集中型同時故障は現在まで検討が行われていないことが判明し、今後このモデルの解析を進めることとした。(3)に関しては、システムを連続時間マルコフ連鎖で記述し単位時間当たりのコストを最小化するアルゴリズムをを示した。(4)の検討により、設備の劣化を伴う場合の解析モデルの記述が可能となり、その最適制御方策の性質を調べることで、どのような場合に修理や取り替えを行うことが適切かの判断が可能となった。引き続き2つの研究細目それぞれについて、計画に基づいて研究を実施する。令和元年度は、研究細目1)に関しては、集中型同時故障のモデル化と、システム信頼度の定式化を進める。特にシステムの形態に関しては、従来のk-out-of-n型システム以外に、線状連続型システム、環状連続型システムなど、機器の位置関係に依存するシステムに対して、システム信頼度の定式化を目指す。研究細目2)に関しては、CCFが稼働率およびコストに与える影響を考慮した最適保全方策の検討を進める。特に、研究細目1)で得られているCCFモデル化手法を用いて、ライフサイクルコストの観点から最適な保全方策を決定するアルゴリズムを作成し、シミュレーションと文献調査により得られた結果を比較することにより提案したCCFモデル化手法の有用性を検討する。特に、最終年度であることから、2つの研究細目を統合し、安全関連装置全体のPSA実施要領をまとめる。原子炉等、事故による社会的影響が大きなシステムに対して、共通原因故障(CCF)による事故リスクを考慮したシステムの信頼性設計、および、保全性設計に関する研究に取り組んだ。研究課題を、1)確率論的安全評価のための新たなCCFモデリング・解析手法の開発、2) CCFとその事故リスクを考慮したシステムの保全方式の確立、の2つの細目に分けて研究を行った。細目1)では、多変量指数分布を用いたCCFモデリングについて、関連する文献調査、先行研究の確認を行った。その結果、多変量指数分布を用いたシステムの故障確率、信頼度の定式化に着目し研究を進めた。これは、CCFモデリングおよび、すべての機器が正常である確率の算出に比べ、システム構成を考慮する必要があるシステム解析は、2変量指数分布を用いた例があるのみで十分に行われていないことが理由である。そこで、一般的な冗長構造であるk-out-of-nシステムに着目し、あらゆる機器の組み合わせでCCFが発生する場合の、システムの故障確率を多変量指数分布を用いて定式化を行った。また、得られた結果と、従来の確率論的安全評価で一般に用いられるCCFモデリング手法であるαファクタ法との比較検討を行った。細目2)に関しては、保全データの収集、現在実施されている保全方策の調査を実施した。また、システムの稼働時間がランダムに与えられる状況で、緊急時に必要な安全関連系の隠れ故障を考慮した、稼働率、ライフサイクルコスト、点検間隔などに関する基礎的研究、不完全修理とシステムの状態監視保全を考慮し、マルコフ決定過程を用いた最適保全方策に関する基礎的研究を行った。共通原因故障(CCF)による事故リスクを考慮したシステムの信頼性設計、および、保全性設計を体系化するために、本年度は、(1)多変量指数分布に関する文献調査、先行研究の確認、(2)多変量指数分布を用いた、冗長システムの信頼度の定式化、

(3)原子力安全関連装置について、保全データの収集および現在実施されている保全方策を調査、(4)ランダム作業時間、隠れ故障を考慮した安全関連系の稼働率、コストの算出、保全方策に関する基礎的研究、(5)ランダムなショックによりシステムの状態が確率的に変化する劣化モデルの保全方策に関する基礎的研究を実施した。(1)の検討により、CCFモデリングに関して既に先行研究が存在するが、冗長システムの故障確率、信頼度の定式化が十分に行われていないことが判明し、今年度は、この(2)に関して予定を前倒して研究を進めた。その結果、定式化と従来法との比較に関して一定の成果が得られた。(4)(5)に関しては、複数の故障モードが存在するシステムの解析、システムの状態を部分的に観測可能な状態監視モデルの保全方策に関して一定の成果を得た。原子炉等、事故による社会的影響が大きなシステムに対して、共通原因故障(CCF)による事故リスクを考慮したシステムの信頼性・保全性設計に関する研究に取り組んだ。研究細目1)確率論的安全評価のための新たなCCFモデリング・解析手法の開発、では、昨年までに行った多変量指数分布モデルを拡張し、多変量ワイブル分布モデルを用いた解析手法の開発を行った。これは多変量指数型モデルではランダムに発生するショックによりCCFが発生するのに対し、多変量ワイブル型モデルを用いることにより、IFR型、DFR型など様々なタイプのショックの発生を解析に取り込むことが可能となるからである。多変量ワイブル分布に関する文献調査の後、CCFモデル化について検討し、多変量指数分布を拡張した形でモデル化できることを確認した。また、k-out-of-nシステムに着目し、システム故障確率の定式化を行った。研究細目2)CCFとその事故リスクを考慮したシステムの保全方式の確立、に関しては、最適保全方策の決定方法に関する研究を進めた。今年度は特に、システムの稼働時間がランダムに与えられる状況でシステムが故障した時刻により、複数種類の修理方法から1つを選択する方法についてコストを評価尺度とした解析方法の研究、ランダムに生起する外部ショックにより劣化する機器の最適保全方策に関する研究を進めた。共通原因故障により事故リスクを考慮したシステムの信頼性設計、および保全性設計を体系化するため、本年度は、(1)多変量ワイブル分布に関する文献調査、(2)多変量ワイブル分布を用いたCCFモデリング、(3)多変量ワイブル分布を用いた冗長システムの信頼度の定式化、(4)複数の保全方法が存在する際に、コストと稼働率の観点から最適な保全方策を決定する手法の研究、(5)ランダムショックモデルによる最適保全方策の研究を実施した。(1)(2)の検討から、多変量ワイブル分布を用いたCCFモデリングはすでに先行研究が存在するが、いずれも単一システムを対象としており、冗長システムに対する解析が十分に行われていないことが判明し、(3)の研究を予定を前倒しして進めた。その結果、定式化において一定の成果が得られた。(4)に関しては、修理器材・人員がシステム運用現場に存在しない場合の修理方法について、3つの修理選択肢からコストと稼働率を評価尺度として、最適な方法を選ぶ方法について一定の成果を得た。
アルツハイマー型痴呆におけるコリン作動性ニューロンの異常と老人斑との関連

自ら作成したヒト白血球ゲノムDNAコスミドライブラリーをスクリーニングして、Vesicular acetylcholine transporter(VAChT)翻訳領域全長を含むゲノムクローン(Cos25)を得た。VAChT翻訳領域をコードするゲノムにはイントロンがないので、翻訳領域の5′末端と3′末端のポリヌクレオチドをプライマーに用いCos25を鋳型としてpolymerase chain reaction(PCR)を行って、VAChT翻訳領域のみのDNAを得ることができた。このDNAを、インフレームで蛋白発現ベクターpGEX-5X-lに挿入し、スクリーニングした。ところが、得られた大腸菌クローンはすべてVAChT翻訳領域DNAが逆方向に挿入されたプラスミドのみを含んでおり、蛋白誘導可能な大腸菌はクローニングできなかった。そこで、VAChT翻訳領域のカルボキシル基末端側の一部を発現するベクターの作成を試みることに変更した。再度、Cos25を鋳型としてPCRを行い、VAChTカルボキシル基末端側の一部をコードする短いDNAを作成した。これをpGEX-5X-lに挿入して大腸菌をトランスフォームし、ようやくVAChT DNAが正方向にインフレームで組み込まれたクローンを1個(pGEX5Xl-VAChT-3)を得た。このクローンでトランスフォ一ムした大腸菌は、pGEX-5X-l由来の蛋白(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)とVAChTカルボキシル基末端側の58アミノ酸残基との融合蛋白(分子量約36kDa)を産生した。そこで、グルタチオン-S-トランスフェラーゼに対するアフィニティ力ラムを用いて、融合蛋白を発現誘導した大腸菌の細胞破砕液からVAChT蛋白を大量に抽出した。今後、ゲルろ過を行ってヒトVAChT蛋白をさらに精製し、最終的に不純物が混在しないヒトVAChT蛋白を十分量得た後に、ラットに免疫する予定である。自ら作成したヒト白血球ゲノムDNAコスミドライブラリーをスクリーニングして、Vesicular acetylcholine transporter (VAChT)翻訳領域全長を含むゲノムクローン(Cos 25)を得た。VAChT翻訳領域をコードするゲノムにはイントロンがないので、VAChT翻訳領域の5'末端のポリヌクレオチドと3'末端のポリヌクレオチドを合成し、これらをプライマーに用いCos 25を鋳型としてpolymerase chain reaction (PCR)を行って、VAChT翻訳領域のみのDNAを得ることができた。その際、両端に有用なクローニングサイト(Eco R I)を導入するため、5'末端のポリヌクレオチドには-塩基の変異を生じさせ、また3'末端のポリヌクレオチドの3'側にはリンカーとなるヌクレオチドを5塩基を付加した。このようにして得たVAChT翻訳領域DNAを制限酵素Eco R Iで消化し、インフレームで蛋白発現ベクターpGEX-5X-1に挿入し、スクリーニングした。ところが、得られた大腸菌クローンはすべてVAChT翻訳領域DNAが逆方向でpGEX-5X-1に挿入されたプラスミドのみを含んでおり、蛋白誘導可能な大腸菌はクローニングできなかった。構造上VAChT翻訳領域DNAは正方向に組み込まれにくいのか、あるいは、VAChT翻訳領域DNAが正方向でpGEX-5X-1に挿入された場合、これによって生ずる微量な機能性VAChT蛋白が大腸菌に致死的に働く可能性も否定できないと思われた。そこで、プライマーを変更し、PCRにて、VAChT翻訳領域のカルボキシル基末端側の一部(58アミノ酸残基あるいは48アミノ酸残基)をコードする短いDNAを生成した。これをpGEX-5X-1に挿入して、DNAが正方向にインフレームで組み込まれたクローンを得た。

現在、このクローンを用いてリコンビナントVAChT蛋白を発現しているところである。平成9年度に何度も試みたが、Vesicular acetylcholine transporter(VAChT)翻訳領域全長を発現するベクターは得られなかった。そこで、VAChT翻訳領域のカルボキシル基末端側の一部(58アミノ酸残基あるいは48アミノ酸残基)を発現するベクターの作成を試みることに変更した。すなわち、自ら単離したVAChT翻訳領域全長を含むゲノムクローンCos25を鋳型として、polymerase chain reactionによりカルボキシル基末端側の一部をコードする短いDNAを作成した。これをpGEX-5X-1に挿入して大腸菌をトランスフォームし、多数の組み換えDNAをスクリーニングして、ようやくVAChT DNAが正方向にインフレームで組み込まれたクローンを1個(pGEX5X1-VAChT-3)を得た。このクローンでトランスフォームした大腸菌は、pGEX-5X-1由来のグルタチオン-S-トランスフェラーゼとVAChTのカルボキシル基末端側の58アミノ酸残基との融合蛋白(分子量約36kDa)を産生した。この融合蛋白を発現誘導した大腸菌の細胞破砕液を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼに対するアフィニティカラム(グルタチオンセファロース4B)に通して、融合蛋白をカラムに吸着させた。その後、溶出液にてグルタチオン-S-トランスフェラーゼからVAChT蛋白を切り離し、ヒトVAChT蛋白を溶出することができた。そこで、大腸菌を大量に培養して、大容量のVAChT蛋白を精製した。しかし、グルタチオンセファロース4Bを用いたアフィニティカラムで精製しても、微量ではあるが、大腸菌由来の蛋白がVAChT蛋白溶出液に混入することは避けられなかった。そこで、大量に得たVAChT蛋白溶出液を濃縮した後、さらにゲルろ過を行ってヒトVAChT淡白を精製する必要がある。最終的に、不純物が混在しないヒトVAChT蛋白を十分量得た後に、ラットに免疫する予定である。