hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミジンコの浸透圧応答機構の分子生物学的解析

1.温度、浸透圧変化により誘導される遺伝子の検索と単離。Daphnia magnaの生存可能な限界塩濃度と限界温度を調べたところ、それぞれ70mM NaCl存在下と30°Cでの増殖が確認できた。そこで、70mM NaCl存在下及び30°Cで飼育したD.magnaと23°C、0mM NaCl条件下で飼育したD.magnaから全RNAを調製した。この全RNAを用いてdifferential display法により高温条件及び高塩濃度条件で発現の増加する遺伝子の検索と単離を行った。その結果、高温及び高塩濃度条件下で発現量の増加する3種類の遺伝子のcDNAの一部をクローン化した。クローン化したcDNAの塩基配列の決定し相同遺伝子の検索を行った結果、高温条件下で発現量の増加する遺伝子のcDNAの1つがribosomal protein S24遺伝子(rpS24)高い相同性を示した。更に遺伝子の発現が転写レベルで2倍の増加が認められた。現在、高温ストレスとrpS24の発現の増加について解析を行っている。その他のcDNAについても塩基配列の決定と解析を進行中である。2.ヘモグロビン遺伝子の酸素による発現制御機構の解析。D.magnaは溶存酸素量の低下に適応するために、ヘモグロビンの発現量が増加することが明かとなっている。そこで、転写の発現制御を解析するために、ヘモグロビン遺伝子のcDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。
骨欠損部への移植を目標とするサンゴを足場材料とした毛細血管の三次元培養

平成30年度は1培養毛細血管付きサンゴ外骨格を生体へ移植する際に、細胞培養用CO2インキュベーターから取り出し、診察室で培養液から一時的に別の液に保存する必要性を考慮して細胞活性を維持できる液体としてアミノ酸含有総合輸液に注目し、これを保存液として応用したが、溶液中にブドウ糖が含有されることが原因となり細菌が増殖するリスクを見出した。そのため、栄養素としてクエン酸を含有してなおかつ緩衝剤として重炭酸が添加された重炭酸リンゲル液に注目して、細胞の保存液としての性能を見出した。また、感染制御の観点から、重炭酸リンゲル液にセフェム系抗菌薬(セフトリアキソンナトリウム)と抗真菌薬(フルコナゾール)を添加してそれぞれ、ヒト正常皮膚線維芽細胞のミトコンドリア活性を測定し、生理食塩水に比べて高い数値を得た。さらに保存温度環境としては37-42°Cがミトコンドリア活性で高い数値を示した。2CAD/CAMによる加工成形を行い、サンゴ外骨格由来骨補填材の試作品(ネジ状構造)を作成した。これをイヌに移植し、12週の経過を7日毎にエックス線画像所見で観察した。12週後に犠牲にしたイヌの顎骨標本をマイクロCTで3次元データとして解析を行った。サンゴ外骨格の吸収の挙動をエックス線所見およびH-E染色病理組織所見から得た。3試作品とヒト正常皮膚線維芽細胞を培養し、細胞増殖能をホルマザンの発生をもって生化学的に、走査型電子顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いて形態学的に観察した。[多孔性材料が細胞増殖および毛細血管分化能に与える影響の検討]サンゴ、人工焼成骨および軽石といった多孔質材料を足場材料として、37°C、5%CO2条件下で正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)と正常皮膚線維芽細胞(NHDF)をVEGF-Aを含有する毛細血管分化培地で共培養し、毛細血管分化培地で培養する。培養24時間後に25mg / wellの各多孔質材料粒子を24穴マルチウェルプレートに添加した。細胞増殖能、毛細血管分化能を比較検討し、培養期間と形成される組織の関係、細胞増殖期、分化期を明らかにした。培養期間は1, 7, 14, 28日とした。細胞増殖能はMTTアッセイを行った。毛細血管分化能は抗ヒトCD31マウスIgGモノクロナール抗体をFITC標識抗マウスIgGヤギ抗体で免疫組織化学染色した毛細血管を観察した。[サンゴ周囲に形成される毛細血管の構造解析]多孔性材料周囲に形成されたHUVECとNHDFおよび毛細血管を蛍光免疫組織化学手法を用いて断層写真を撮影、これを画像処理して三次元的構造を解析した。各断層写真から得られる毛細血管の幅径を測定した。[多孔質材料表面および孔における細胞のSEMによる微細構造の観察]2.5% Glutaraldehyde-0.1M Phosphate Bufferで前固定、1%四酸化オスミウムで後固定した後、エタノールで脱水、t-ブチルアルコールで凍結真空乾燥、イオンスパッタリング装置を用いてpt-pdを蒸着し生物試料を作製した。細胞と多孔質材料の接着、多孔構造内部への細胞増殖を確認した。平成27年度はHUVECとNHDFを共培養し、サンゴを粉砕し直径350-500μmに調整した粒子を三次元培養の足場材料として添加し,無添加のものを対照群として培養した。三種類の粒子添加後14、21、および28日後にMTTアッセイをWST法で行い生細胞を計測した。毛細血管を抗ヒトCD31マウスIgGモノクロナール抗体を用いて免疫染色し、DAPIで核を染色した。毛細血管の形成は蛍光顕微鏡で観察した。サンゴ粒子表面をアリザリン染色し、培養環境下におけるサンゴ表層カルシウムの局在変化を蛍光顕微鏡で観察した。培養細胞はサンゴ粒子添加後21、28日おいて実験群で経時的に有意に増加した。サンゴ粒子表面のカルシウムはサンゴ粒子周囲の培養細胞内に移動した。毛細血管形成は対照群では二次元的であった。サンゴ添加群では血管形成が豊富かつ三次元的でネットワークが観察された。またSEMにおける観察ではサンゴ外骨格に細胞が突起を介して壁着していた。HUVECとNHDFを共培養した三次元培養におけるヒト毛細血管の新生は、サンゴ粒子が有用であることが示唆された。サンゴは骨補填材として知られ、生体吸収性材料であり、多孔質で細胞の増殖に有利な表面構造と化学的性状を有していると考えられる。平成28年度は1毛細血管がサンゴ骨格表面に付着する際に重要な役割を果たすと考えられる線維芽細胞とサンゴの関係性を培養ヒト線維芽細胞(正常皮膚線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞)を用いて、サンゴ顆粒表面に付着した線維芽細胞の形態、コラーゲン線維の形態を走査型電子顕微鏡で観察、細胞増殖とコラーゲン産生能をそれぞれMTTアッセイと比色定量法で計測した。また、サンゴ顆粒表面のカルシウムをアリザリン染色し、これが培養ヒト線維芽細胞の内部に吸収される現象とサンゴ顆粒周囲に存在する線維芽細胞表面のインテグリンα3βvの発現が亢進することを観察した。アリザリンで染色されたサンゴ顆粒表面カルシウムと蛍光免疫染色されたインテグリンα3βvを共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。

2毛細血管付きサンゴ顆粒を将来生体に移植するする際に、細胞培養用CO2インキュベーターから取り出し、診療室で培養液から一時的に毛細血管付きサンゴブロックを保存液に保存する必要性があることを考え、中心静脈輸液法で用いられる高カロリー輸液に注目し、浸透圧を生体と近似した約280mOsmに調整し、さらに抗菌薬を添加して細胞の保存液として実験的に応用した。調整された細胞の保存液を、37°Cに設定されたホットプレートの環境下でヒト線維芽細胞の保存を試み、細胞のミトコンドリア活性をMTTアッセイで評価した。その結果、大気中37°C環境下でヒト毛細血管の保存が可能であることが示唆された。当初計画した通り研究を実行することができた。サンゴ顆粒表面のカルシウムは線維芽細胞内に取り込まれ利用されている可能性が示唆された。またこの生体反応がサンゴ顆粒周囲で細胞増殖亢進の一因である可能性が示された。平成29年度に毛細血管付きサンゴ顆粒を生体に移植するため、培養室から実験室に移動、手術中に一時的に細胞を培養液以外のもので保存する必要が生じたため、当初予定していなかった細胞保存液の検討を行うことにした。平成29年度は1サンゴ外骨格とヒト毛細血管を共培養し、毛細血管の形成を形態学的に観察した。サンゴ外骨格が毛細血管形成に有用である結果を得た。2サンゴ外骨格の移植後の初期固定を考慮し、CAD/CAMによる加工成形を行い、試作品の作成した。これをイヌに移植し、12週の経過をエックス線画像所見で観察した。12週後に犠牲にしたイヌの顎骨標本をマイクロCTで3次元データとして解析を行った。サンゴ外骨格の吸収の1挙動を得た。3試作品とヒト正常皮膚線維芽細胞を培養し、細胞増殖能をホルマザンの発生をもって生化学的に、走査型電子顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いて形態学的に観察した。サンゴ外骨格がヒト正常皮膚線維芽細胞の細胞増殖とコラーゲン線維産生亢進に影響を与える結果を得た。4培養毛細血管付きサンゴ外骨格を生体へ移植する際に、細胞培養用CO2インキュベーターから取り出し、診察室で培養液から一時的に別の液に保存する必要性を考慮して細胞活性を維持できる液体としてアミノ酸含有総合輸液に注目し、これを保存液として応用した。また、感染制御の観点から、総合輸液にセフェム系抗菌薬と抗真菌薬を添加してそれぞれ、ヒト正常皮膚線維芽細胞のミトコンドリア活性を測定し、生理食塩水に比べて高い数値を得た。当初計画した通りの研究を実行することができた。サンゴ外骨格がヒト線維芽細胞の細胞増殖とコラーゲン線維産生能を亢進させる可能性が示唆された。毛細血管付きサンゴ外骨格を生体に移植する際、骨組織との適合(初期固定)を高める必要が生じたため、当初予定していなかったCAD/CAMを応用したカスタムメイド試作骨補填材を開発することになった。平成30年度は1培養毛細血管付きサンゴ外骨格を生体へ移植する際に、細胞培養用CO2インキュベーターから取り出し、診察室で培養液から一時的に別の液に保存する必要性を考慮して細胞活性を維持できる液体としてアミノ酸含有総合輸液に注目し、これを保存液として応用したが、溶液中にブドウ糖が含有されることが原因となり細菌が増殖するリスクを見出した。
次世代エレクトロニクス材料としての酸化物人工超格子の原子レベル設計と開発

酸化物は高温超伝導や巨大磁気抵抗などの発見に見られるように、半導体にはない様々な物性を発現し、次世代のエレクトロニクス材料として大きな期待が集まっている。これらの酸化物結晶の機能発現には、その構造制御が重要な鍵となる。特に超機能性を有する酸化物人工超格子を創製するには、厳密かつ正確な理論に基づく原子レベルでの構造設計が必須である。このような観点から本研究では、酸化物人工超格子の物性予測のみならず、酸化物人工超格子の機能発現に係わる2次元エピタキシャル成長機構を理論化学的に解明し、いかに原子レベルで平坦かつ均一なヘテロ接合を構築できるか、どのような積層パターンが安定なヘテロ接合となりうるか、理想的な界面構造を実現する最適なバッファー層は何かを明らかにすることを試みた。具体的には酸化物人工超格子の合成過程をシミュレーションするとこが可能な新しい分子動力学計算プログラムMOMODYを開発し、酸化物人工超格子の成長メカニズム、界面構造、格子ミスマッチの緩和、界面反応、表面欠陥などの解明や、最適なバッファー層の選択、最適合成条件の探索を通して、酸化物人工超格子の原子レベル設計を行った。その結果、YBCOなどの超伝導酸化物に対して格子マッチングの良好な基板を作成する手段として、TiO_2層を最表面とするSrTiO_3(001)基板上にSrO層を1層積んだ後に、BaO層を積む方法が適切であること、MgOの面方位による安定性の違いを利用してサファイア上に量子ドットの作製が可能であることなど多くの重要な知見を得ることに成功した。また、粗視化分子動力学法、高速化量子分子動力学法の開発も行い、より巨大な系や複雑に電子状態の変化を含む系への適用も可能となった。このように新規計算化学的手法を開発し、酸化物の結晶成長過程に適用することで、酸化物人工超格子の原子レベル設計と開発に繋がる実のりある成果をあげることができた。酸化物は、高温超伝導や巨大磁気抵抗などの発見にみられるように、半導体にはない様々な物性を発現し、次世代のエレクトロニクス材料として大きな期待が集まっている。特に最近、鯉沼らはα-Al_2O_3(0001)基板上に作成したZnO量子ドットがYAGレーザーで紫外レーザー発振することを発見し、高密度記録材料などへの応用が期待されている。そこで本研究では、多体相互作用を考慮できる新規な結晶成長過程分子動力学シミュレーションプログラムMOMODYを開発し、ZnOの結晶成長過程について検討を行った。平坦なZnO(0001)表面上にZnO分子を連続的に析出させたところ、析出させたZnO分子は全て再蒸発してしまい、平坦なZnO(0001)表面では結晶成長が非常に起こりにくいことが明らかとなった。次に、表面ステップを持つZnO(0001)面上での結晶成長過程についても検討した。その結果、平坦なZnO表面の場合とは異なり、ステップ基板では結晶成長が急激に進行することが明らかにされた。さらに詳細な成長過程の検討により下記のことが明らかにされた。平坦なZnO(0001)面上ではZnまたはOのみが表面上にでているため、析出したZnO分子は表面に対して1配位構造しかとれず、非常に不安定となりすぐに蒸発が起こる。それに対し、ステップを持つ表面では析出したZnO分子は表面に対して2配位構造をとり安定化することができる。その後、このZnOの2配位構造が結晶核となり結晶成長が進むことも明らかにされた。

さらに、上記結晶成長シミュレーションプログラムを活用することにより、MgO(001)面やSrTiO_3(001)面など様々な酸化物基板表面での結晶成長過程を明らかにするとともに、最適な合成条件を予測することに成功した。酸化物は、高温超伝導や巨大磁気抵抗などの発見にみられるように、半導体にはない様々な物性を発現し、次世代のエレクトロニクス材料として大きな期待が集まっている。特に最近、鯉沼らはα-Al_2O_3(0001)基板上に作成したZnO量子ドットがYAGレーザー下で紫外レーザー発振することを発見し、高密度記録材料などへの応用が期待されている。そこで本研究では、3次元周期境界条件密度汎関数計算を用いて、ZnOへの様々な金属のドーピングによるバンド構造変化について検討を行った。計算結果より、ZnOの格子構造を変化させずにバンドギャップを広げることができる候補としてMgが予測された。逆に格子構造を変化させずにバンドギャップを縮めることができる候補としてCoが予測された。また、Coをドーピングしたときに磁性の存在が予測された。さらに、鯉沼らにより実験的にも計算化学により得られたこれら予測が正しいことが証明された。ZnO(0001)面はZn終端面とO終端面の2種類が存在する。そこで、それら表面の極性と安定性についても3次元周期境界条件密度汎関数計算による検討を行った。その結果、Zn終端面はO終端面に比較し、金属ライクになっており安定性に劣ることが明らかにされた。また鯉沼らにより、Zn終端面の方が成長過程においてZnO分子などの脱離が顕著であることが実験的にも明らかにされ、本予測の妥当性が検証された。さらに、結晶成長シミュレーションプログラムの活用により、α-Al_2O_3(0001)上の′ZnO量子ドットが2段ステップを有する理由を解明することに成功した。さらに、α-Al_2O_3(0001)上ZmO量子ドットの配向性、極性についても検討した。酸化物は、高温超伝導や巨大磁気抵抗などの発見に見られるように、半導体にはない様々な物性を発現し、次世代のエレクトロニクス材料として大きな期待が集まっている。これらの酸化物結晶の機能発現には、その構造制御が重要な鍵となる。半導体の超格子構造ならび量子ドット構造は特異な電子状態をとることが理論的に予測され、高効率の発光素子として有望視され大きな注目を集めているが、その作製法は全く確立されていなかった。そこで本研究ではこの量子ドット構造の作製法および形成メカニズムに関して、我々の開発した結晶成長シミュレ-ションプログラムMOMODYを用いて酸化物であるMgO薄膜の成長過程の検討を行った。薄膜成長時の基板が成長様式に与える影響を評価するためα-Al_2O_3(0001)面上へのMgOの堆積過程を検討したところ、MgOはα-Al_2O_3(0001)面上に量子ドット構造を形成して、さらに高い結晶性を有していることが明らかとなった。さらにこの量子ドット構造を詳細に検討すると、MgO量子ドットは基板とのマッチングの関係上(111)配向をとっているが、MgOの(111)面は極性面であり不安定であるため、形成されたMgO量子ドットは(001)面や(011)面を露出させていることが解明された。従って、このような面方位による安定性の違いを利用することにより量子ドット構造の形成が可能であることが解明され、次世代エレクトロニクス材料としての酸化物の結晶成長における基板の重要性が明らかとなった。
炎症性腸疾患小家系におけるパーソナルゲノミクス解析

Genome-wide association study (GWAS)の隆盛により,炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease IBD)の疾患感受性遺伝子は163にも及ぶ.しかし,同定された遺伝子の多くは,オッズ比が小さく,クローン病の遺伝素因のおよそ20%を説明し得るに過ぎない.欧米人と日本人の疾患感受性遺伝子には驚くべき相違が認められるが,これまで日本人IBDに関するGWASは4試験のみであり,さらに,われわれが施行したメタ解析で再現性を認めた日本人に特有なSNPはごくわずかであった.このことから、個々のIBD患者発症に関連する遺伝子を同定するためには、家系内での遺伝子解析、あるいは細胞に機能変化を生じさせるエピゲノム変化をとらえる必要があると考えている。こうした現状を踏まえ,まず我々は、日本人IBDの小家系におけるパーソナルゲノミクスを解析にとりくんできた.これまでの研究手法を用いて,数家系のトリオおよび罹患同胞対のexome解析を行い,日本人に特有なIBD関連single nucleotide variant (SNV)を同定することを試みてきた。我々はすでに3家系(IBD患者)の解析を終了した。一家系については、Th2サイトカイン(IL-5, IL-13)発現に関連するプロモーター領域の遺伝子多型が認められた。他の家系ではIL-1 betaの発現に関連するプロモーター領域の遺伝子多型が認められた。しかしながら、これらの希少変異の再現性を検討するためには,多数の症例の集積が極めて重要である.したがって、共同研究施設でのさらなる症例集積が必要である。Genome-wide association study (GWAS)の隆盛により,炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease IBD)の疾患感受性遺伝子は163にも及ぶ.しかし,同定された遺伝子の多くは,オッズ比が小さく,クローン病の遺伝素因のおよそ20%を説明し得るに過ぎない.欧米人と日本人の疾患感受性遺伝子には驚くべき相違が認められるが,これまで日本人IBDに関するGWASは4試験のみであり,さらに,われわれが施行したメタ解析で再現性を認めた日本人に特有なSNPは,ごくわずかであった.こうした現状を踏まえ,本研究は,日本人IBDの小家系におけるパーソナルゲノミクスを解析する.これまでの予備的な戦略に則り,数家系のトリオおよび罹患同胞対のexome解析を行い,日本人に特有なIBD関連single nucleotide variant (SNV)を同定する.IBD感受性遺伝子の希少変異や低頻度多型は,罹患者のほうが非罹患者より多いはずである.しかし,これらの希少変異の再現性を検討するためには,ありふれた多型の関連解析にくらべより多数の症例の集積が重要である.引き続き共同研究施設での症例集積を継続する必要がある.解析対象は,数家系のIBD小家系であり,最大でも一家系4人構成として,5家系計20人までのexomeシークエンス解析を予定している.IBDはその発症に多因子が関わる非メンデル遺伝性複合性疾患であるため,優性および劣性遺伝形式に基づく解析対象の選定の両者を複合して解析対象選定する必要がある.すなわち家系内の健常者を含め全員を対象とするが,以上を満たす解析対象の選別や共同研究施設での症例集積に係る倫理委員会,IRBの手続きに当初の予想よりも時間を要した.Genome-wide association study (GWAS)の隆盛により,炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease IBD)の疾患感受性遺伝子は163にも及ぶ.しかし,同定された遺伝子の多くは,オッズ比が小さく,クローン病の遺伝素因のおよそ20%を説明し得るに過ぎない.欧米人と日本人の疾患感受性遺伝子には驚くべき相違が認められるが,これまで日本人IBDに関するGWASは4試験のみであり,さらに,われわれが施行したメタ解析で再現性を認めた日本人に特有なSNPはごくわずかであった.このことから、個々のIBD患者発症に関連する遺伝子を同定するためには、家系内での遺伝子解析、あるいは細胞に機能変化を生じさせるエピゲノム変化をとらえる必要があると考えている。解析対象は,数家系のIBD小家系であり,最大でも一家系4人構成として,5家系計20人までのexomeシークエンス解析を予定している家系内の健常者を含め全員を対象とする.今回、研究施設での症例集積に係る倫理委員会,ゲノム委員会の承認をえることができた。まず、潰瘍性大腸炎患者家系の遺伝子解析に取り組んだ。現在、3家系の解析が終了した。その結果、潰瘍性大腸炎患者家系において、IL-5, IL-13遺伝子プロモーター領域の一塩基多型が認められた。

また、他の家系では、IL-1 betaの発現に関連するプロモーター領域の遺伝子多型が認められたGenome-wide association study (GWAS)の隆盛により,炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease IBD)の疾患感受性遺伝子は163にも及ぶ.しかし,同定された遺伝子の多くは,オッズ比が小さく,クローン病の遺伝素因のおよそ20%を説明し得るに過ぎない.欧米人と日本人の疾患感受性遺伝子には驚くべき相違が認められるが,これまで日本人IBDに関するGWASは4試験のみであり,さらに,われわれが施行したメタ解析で再現性を認めた日本人に特有なSNPはごくわずかであった.このことから、個々のIBD患者発症に関連する遺伝子を同定するためには、家系内での遺伝子解析、あるいは細胞に機能変化を生じさせるエピゲノム変化をとらえる必要があると考えている。こうした現状を踏まえ,まず我々は、日本人IBDの小家系におけるパーソナルゲノミクスを解析にとりくんできた.これまでの研究手法を用いて,数家系のトリオおよび罹患同胞対のexome解析を行い,日本人に特有なIBD関連single nucleotide variant (SNV)を同定することを試みてきた。我々はすでに3家系(IBD患者)の解析を終了した。一家系については、Th2サイトカイン(IL-5, IL-13)発現に関連するプロモーター領域の遺伝子多型が認められた。他の家系ではIL-1 betaの発現に関連するプロモーター領域の遺伝子多型が認められた。しかしながら、これらの希少変異の再現性を検討するためには,多数の症例の集積が極めて重要である.したがって、共同研究施設でのさらなる症例集積が必要である。平成28年度内に,解析対象の選別や共同研究施設での倫理委員会,IRBの手続きがほぼ終了した.われわれは,すでに本研究内容と極めて類似した予備的検討を研究論文として報告(参考文献1. PLoS One 2015;10:e0137801)した実績があり,今後,即座に研究を開始することが可能である.平成29年度内に,解析対象の選別や共同研究施設での倫理委員会,IRBの手続きがほぼ終了した.われわれは,すでに本研究内容と極めて類似した予備的検討を研究論文として報告(参考文献1. PLoS One 2015;10:e0137801)した.本年度は、さらなる研究成果を積み重ねることにより、IBDの原因究明に関してPersonal genomicsの重要性を検討する。研究実施状況を報告したように,解析対象の選別および共同研究施設におけるIBD症例集積に係る書類上の手続きのため,実際のシークエンス解析に入ることができず,予算額より569,145円を次年度に繰り越した.次年度使用額が生じた理由については、受益者負担金にかかる費用がが予想よりも安価であったためである。翌年度分として、引き続き遺伝子解析費用ならびに受益者負担金として使用する予定である。平成29年度中には,実際のエクソンシークエンス解析を開始する見込みのため,繰越額は適正に使用される予定である.
心拍動調節の情報理論的理解と診断支援への適用

本研究では,心電図のR-R間隔から得られる心拍変動を,独立主成分分析(ICA)の手法を用いて,情報理論の観点から分析した.その結果,時間ー周波数の空間における,各符号語(フィルタ)の分布は疾病の有無で異なることが分かった(健康人は0から0.5Hzの間に均一に分布,睡眠時無呼吸症候者と心不全者では0.15Hzの低周波数に集中).このことは心臓疾患の計算機診断支援の可能性を意味する.また,コーディングの次元は,健康者から非健康者になるにつれて減少することが分かった.次元減少は心臓の情報処理能力の減少と考えることができる.このように心拍動調節の理解と診断について有用な知見を得た.心拍変動rはr =Asとモデル化できる.sは右心房の洞房結節(sinoatrial node,心拍を刺激つペースメーカとして機能)からの独立なスパースな信号,Aは基底関数からなる行列で,ポピュレーション符号(神経符号)と呼ぶ.独立成分分析により,独立成分sと分離行列W=A求め,Wの逆行列としてポピュレーション符号Aを得る.健康人(54名),睡眠時無呼吸症候者(35記録)および心不全者(29名)の3つグループについて,ポピュレーション符号(A)を,通常の独立成分分析と(パワーは相関を許す)トポグラフィック独立成分分析により求めた.得られたポピュレーション符号について,時間ー周波数の空間における,各符号語(フィルタ)の分布を観察・比較した.通常の独立成分分析による分布は,健康人では0から0.5Hzの間に均一に分布するが,睡眠時無呼吸症候者と心不全者では0.15Hzの低周波数に集中していた.一方,トポグラフィック独立成分分析の場合,3つのグループとも重なりがない均一な配置であった.すなわち,健康人と同じ均一な分布が,心臓に問題がある人にも観察された.つぎに,フィルタの中心周波数(CF)と帯域幅,CFと包絡線,CFと共振のQ,およびCFと減衰率,の相関を調べた.フィルタの中心周波数と帯域幅の分布を見ると,3つのグループでの視覚的な差は小さい.これは,異なる心拍変動の符号化が類似していることを示す.以上のことから次のことが推察できる.右心房の洞房結節の各細胞は独立なユニットとして振舞う.しかし,心臓の不調や疾患がある場合には,細胞群の集合体として,心拍動を維持できるように昨日している.すなわち,心臓に問題がある場合でも,その自律制御を維持できるように,ペースメーカ細胞の構造を適応させ得ることを示唆する.自律的な心臓調節は,心拍動維持の重要な機構で,その生物学的特性は良く理解されている.しかし,健康な心拍動と健康でないそれとの境界を説明できる理論的原理については少ししか分かっていない.心拍動の効率的符号化の考えに基づいて,3つの心拍動タイプ(健康,睡眠時無呼吸症候群,うっ血性心不全)について,次の仮説を検証した.その仮説は,ペースメーカー細胞(心拍動リズムを司る)は,心疾病があっても,自然な心拍動を維持するように,トポグラフィック組織化を試みる,である.2層の前向き神経回路網を用い,回路出力の依存性を最小にするよう,心拍動の独立成分分析を実施した.その結果,層間の係数は,健康な心拍動の主要な特徴を記述するフィルター(これをポピュレーションコードと呼ぶ)に似たものであった.しかしながら,睡眠時無呼吸症候群の心拍動を分析したところ,そのポピュレーションコードは心拍動の特徴を記述できるものではなかった.そこで,トポグラフィック独立成分分析(TICA)を適用した.その結果,睡眠時無呼吸症候群とうっ血性心不全の心拍動から得られたポピュレーションコードは,健康心拍動のICAで得られたコードに類似したものであった.TICAは,出力の統計的依存性を考慮して,解析対象のシステムを複雑型細胞として組織化し,さらにICAが単純型細胞を組織化することを考慮すると,上記の分析結果から次のことが言える.ペースメーカー細胞が,ある固有の周波数での自然な心拍動を維持するよう,クラスターとして発火しているので,我々の仮説が生物学的に妥当な説明で,このクラスターとしての発火は,心疾患をうまく回避して,自然な心拍動を維持するために発生していると考えうる.(2)おおむね順調に進展している研究計画に記載の項目を予定通り実施し,その成果を論文として投稿した.また,協力研究者のFausto Lucena博士およびAllan Kardec Barrosと,実験結果と研究手法について,ブラジルにて議論した.これにより,当該研究の進捗が良くなり,かつ今後の課題が明確化されたと考える.心臓の洞房結節以外の部位から起こる(異所性)拍動の発生の説明を試みた.異所性拍動は,心リズムの予期せぬ変化で,心拍動の過剰あるいは欠損をもたらす.この異所性拍動の原因は不明であるが,ペースメーカ細胞が脱分極できないことに帰着されることが多い.不思議なことに,異所性拍動は,心臓異常のある人に発生する傾向がある.ペースメーカ細胞で観察される一定しない振舞を説明するために,通信チャンネルとのアナロジーで心臓を考える.すなわち心臓は,情報処理能力の上限があり,それを越えた処理によるエラーが発生する.このエラーを異所性拍動と考える.心律動の制御における自律的心臓調節の重要な役割については,多くのことが知られている.

しかし,心拍動のコーディングの基礎となるメカニズムは完全には理解されていない.本年度は,心拍間隔データから得られたポピュレーションコードを使用して,心律動生成に関わるコーディングメカニズムを調べた.その結果,ポピュレーションコードが心拍間隔データを分解する空間の次元は,健康者から非健康者になるにつれて減少する,コーディング構造を有することを示す.空間次元の減少は,通信チャネル容量の低下,すなわち心臓の情報処理能力の減少と考えることができる.このことは,心臓の処理能力に応じて,ペースメーカ細胞が自己組織化できるだけでなく,正常な心律動を維持するためにその可変性を減少させうることを示唆する.この成果を,学術論文誌BioMed Research Internationalの論文および電子情報通信学会MEとバイオサイバネティックス(MBE)研究会での口頭発表として公表した.3年間での研究内容と成果および今後の課題を,報告書としてまとめた.本研究では,心電図のR-R間隔から得られる心拍変動を,独立主成分分析(ICA)の手法を用いて,情報理論の観点から分析した.その結果,時間ー周波数の空間における,各符号語(フィルタ)の分布は疾病の有無で異なることが分かった(健康人は0から0.5Hzの間に均一に分布,睡眠時無呼吸症候者と心不全者では0.15Hzの低周波数に集中).このことは心臓疾患の計算機診断支援の可能性を意味する.また,コーディングの次元は,健康者から非健康者になるにつれて減少することが分かった.次元減少は心臓の情報処理能力の減少と考えることができる.このように心拍動調節の理解と診断について有用な知見を得た.研究計画に記載の項目を予定通り実施し,その成果を神経回路学会の全国大会で発表した.また,協力研究者のFausto Lucena博士(ブラジル)を招聘し,研究を共同で実施したことにより,当該研究の進捗を良くし,かつ今後の課題が明確化されたと考える.なお,本年度の成果を,国際的な学術誌へ投稿する準備中である.本研究課題申請書に記載した通りに,H27年度に計画した研究課題を実施しでき,計画の変更が必要となる事態も発生しなかった.最終年度のH28年度には,申請書に記載した計画に基づいて,当該分野の専門家との議論・協力関係をより強化し,研究を実施する.生体信号処理本研究課題申請書に記載した通りに,H26年度に計画した研究を実施し,計画の変更が必要となる事態も発生しなかった.よって,申請書に記載した計画に基づいて,当該分野の専門家との共同研究を強力に進めながら,今後の研究を実施する.共同研究実施のために招聘した研究者(Fausto Lucena博士,ブラジル)が帰国する際,航空会社のストのため,飛行機をキャンセルし,あらたな航空券を購入することになった.これにより経費が不足することになったので,帰国旅費は運営経費(校費)から支出することになった.その結果,2万円強の次年度使用額が発生した.次年度使用額はH27年度経費に加算して,申請書に記載した研究の実施のために,有効かつ効率的に使用する.
量子分子動力学法に基づくアルカリ形燃料電池におけるアニオン伝導プロセスの解明

アルカリ形燃料電池の高性能化のため、金属触媒表面上のアニオン伝導プロセスを計算科学シミュレーションによって検討した。まず、大規模スケールの計算を可能にするため、我々が開発したTight-Binding量子分子動力学プログラムを分割統治法及び並列化処理によって高速化した結果、従来の計算コードの100倍の高速計算を実現した。ナノ粒子触媒におけるアニオンの伝導プロセスを評価するため、Pt及びAgナノ粒子上におけるアニオン拡散プロセスを第一原理計算によって検討した。アニオンはPtナノ粒子上ではほぼ障壁無しで拡散するのに対し、Agナノ粒子上では7.65 kcal/molの拡散障壁を示した。アルカリ形燃料電池の高性能化のためには、電極表面で起こるアニオン(水酸基)生成プロセス及び電解質への伝導プロセスにおける諸化学反応を詳細に解析し理解する必要がある。そこで、金属触媒表面近傍におけるアニオンの伝導プロセスを評価するため、Pt(111)表面とアニオン間のポテンシャルエネルギーを第一原理計算を用いて計算し、拡散プロセスについて検討を行った。具体的には、アニオンが表面上に吸着した状態を始状態、表面内部に局在した状態を終状態として、LST/QST法から活性化エネルギーを評価した。その結果、常温では起こりえない活性化エネルギーの値を示した。ここで、近年のアルカリ形燃料電池の空気極には炭素担体上にPt及びAgのナノ粒子が担持された触媒が用いられていることがわかっている。今後は、ナノ粒子上のアニオンの挙動を解明することがアルカリ形燃料電池の性能を向上させる上で重要だと考え、Ptナノ粒子上におけるアニオンの生成・拡散プロセスを検討することにした。また、Tight-Binding量子分子動力学法を活用して表面近傍におけるアニオンの拡散シミュレーションを行う。ここで、Tight-Binding量子分子動力学法は半経験的パラメータを用いた計算手法であるため、パラメータの調整を行った。今後、さらにパラメータの調整を行って、電解質材料における拡散シミュレーションを行っていく。アルカリ形燃料電池の高性能化のためには、アニオン(OH-)の空気極表面から電解質への伝導プロセスを詳細に解析し理解する必要がある。また、近年のアルカリ形燃料電池の空気極には炭素担体上にPt及びAgのナノ粒子が担持された触媒が用いられている。そこで、ナノ粒子触媒におけるアニオンの伝導プロセスを明らかにするため、55原子から成るPt及びAgナノ粒子上におけるアニオンの拡散プロセスを第一原理計算によって検討した。最初に、(001)と(111)面上のアニオンの吸着サイトと考えられる、原子上のon-topサイト、2つの原子間の中点上のbridgeサイト、3つ及び4つの原子に囲まれたhollowサイト上において、アニオンの吸着プロセスを検討した。その結果、Ptナノ粒子及びAgナノ粒子上においてアニオンは(111)面のon-topサイト及びbridgeサイト、また(001)面のbridgeサイトに吸着しやすいことを明らかにした。また、アニオンの拡散経路を調べた結果、両ナノ粒子上においてアニオンはon-top及びbridgeサイトを通ることを明らかにした。また、ナノ粒子上におけるon-topサイト及びbridgeサイトを通る経路に対するアニオンの拡散障壁を計算した結果、Ptナノ粒子上ではほぼ障壁無しで拡散するのに対し、Agナノ粒子上では律速段階において7.647 kcal/molの拡散障壁をとることを明らかにした。表面近傍におけるアニオンの伝導プロセスを高精度に解析するためには、アニオンの挙動に誘起される表面原子振動の効果も入れる必要があり大規模な計算モデルで行う必要がある。また、計算方法として分子動力学法が適当と考えられるが、第一原理計算に基づく分子動力学法は膨大な計算時間がかかるため、期間内にアニオン伝導プロセスの解析を行うことは困難である。そこで、高精度かつ大規模なアニオン伝導シミュレーションを行うために、東北大学久保研究室で開発済みのTight-Binding法に基づく量子分子動力学法プログラムに高速化及び大規模計算化処理を施し、計算時間の短縮化を行った。具体的には、量子分子動力学計算において計算負荷がかかるハミルトニアン行列の対角化を、従来用いていたQR法から分割統治法に変更して行った。ここで、Tight-Binding法におけるハミルトニアンの行列要素には零の部分が多く、零の行列要素を除いてより小さな固有値問題を解く分割統治法は有効である。その結果、従来のQR法による対角化の計算時間と比較すると、分割統治法を用いることによって約30分の1の計算時間の短縮に成功した。また、さらに計算時間を短縮するため、特に計算負荷がかかるハミルトニアン行列の対角化、Atomic bond population、原子間に働く力の計算部分について、12コアのマルチコアプロセスを用いた並列化によって高速化を行った。本手法の導入により、1000原子以上の大規模計算において1ステップあたり約3000秒かかっていたが、並列化によって30秒まで削減することに成功し、現状より100倍の高速計算を実現した。第一原理計算によって、空気極の金属触媒表面近傍におけるアニオンの拡散経路及び拡散障壁をアニオンの吸着及び拡散プロセスの解析する予定であった。

しかし、研究を進めるうちに、近年のアルカリ形燃料電池の空気極には炭素担体上にナノ粒子が担持された触媒が用いられており、空気極のサブ表面領域における現象は伝導プロセスに重要でないことがわかった。また、空気極におけるアニオン生成プロセス及び電解質におけるアニオンの拡散プロセスはアルカリ形燃料電池の性能に大きく影響することがわかっている。そこで、アルカリ形燃料電池における発電性能の向上に貢献するためには、迅速にアルカリ形燃料電池におけるアニオンの挙動を解明する必要がある。そのため、当初の研究計画を変更することにした。金属表面におけるアニオンの伝導プロセスの解析において、より高精度かつ大規模なシミュレーションを行うため、既存のTight-Binding量子分子動力学法プログラムに高速化処理を行った。従来の計算コードでは、最大300原子程度のモデルサイズしか扱えなかったが、本研究で実装した分割統治法及び並列化によって、100倍の高速計算を実現し、1000原子以上のモデルにおける大規模計算が可能になった。ただし、現在は1台の計算機内でマルチコアによる並列化を行っているが、今後は複数の計算機を使った大規模な並列化により、更なる計算速度の向上を目指す。アルカリ形燃料電池の性能は、空気極におけるアニオンの生成プロセス及び電解質におけるアニオンの伝導プロセスに大きく影響される。そこで、アルカリ形燃料電池におけるアニオンの生成・伝導プロセスを明らかにするため、第一原理計算手法を用いて、以下の研究を行う。(a)空気極材料として、炭素担体上にPt及びAgのナノ粒子が担持された触媒が用いられている。そこで、本研究課題では、第一原理計算を用いて、Pt及びAg表面上における酸素分子と水の化学反応プロセスを解析し、アニオンの生成における活性の起源を検討する。そして、得られた結果から、高活性の空気極触媒に関する知見を得る。(b)電解質材料として、ポリフェニレンオキシド類のアニオン交換膜が用いられている。そこで、本研究課題では、第一原理計算手法を用いて、ポリフェニレンオキシド類のアニオン交換膜上のアニオン伝導プロセスを解析する。そして、得られた結果から、高アニオン伝導の電解質に関する知見を得る。第一原理計算及び昨年度に開発したTight-Binding量子分子動力学法を活用して、表面上から表面数層のサブ表面領域におけるアニオンの吸着及び拡散シミュレーションを行い、金属触媒表面近傍におけるアニオンの伝導プロセスを明らかにする。そのために、以下の研究課題を行う。
原因不明の乳幼児突然死例における遺伝的背景の検討

乳幼児突然死症候群(sudden infant death syndrome ; SIDS)は、剖検と諸検査においても死因が不明のものとして除外診断されている。国内では1歳未満の死因の第三位を占め、病態の解明が重要な課題となっている。原因としては、うつ伏せ寝に伴う神経系の機能異常が推定されているが、12割程度の症例では呼吸器系・循環系・脳神経系等の先天性異常が原因と考えられている。先天性異常としては、睡眠中の無呼吸発作を主症状とする先天性中枢性肺胞低換気症候群(CCHS、Ondineの呪い)が病状の類似性から最も可能性のある候補となる。しかし、これを解剖から診断することは難しく、原因遺伝子についてDNA解析を行うことにより遺伝性疾患を判断できる可能性がある。実験計画について学内倫理委員会の承認を得た上で、実験目的での使用について遺族から承諾を得た48例につき、血液よりDNAを抽出し遺伝子解析を行った。現在までに、RET proto-oncogene、Phox2b(paired mesoderm homeobox 2b)、Phox2a、EDNRB(endothelin receptor type B)の解析を終了した。その結果、非同義置換をいくつか検出したが、それが直接的に発現や機能の異常に結びついているとは考えにくかった。特に、Phox2b遺伝子内のポリアラニン異常伸長はCCHSの10例中9例に検出されたのに対し、SIDS例では全く検出できなかった。すなわち、意外なことにSIDSにこのCCHSが遺伝的背景として関与している可能性は低いと推定された。現在は、心臓刺激伝導系の機能異常であるQT延長症やBurgata症候群の原因遺伝子であるSCN5A・KCAQ1・KCNE1・KCNH2等の遺伝子解析を進行中である。乳幼児突然死症候群(SIDS)は、剖検と諸検査において死因が不明のものとして除外診断されている。国内では1歳以下の死因の第三位を占め、病態の解明が重要な課題となっている。背景として推定されることは、うつ伏せ寝に伴う神経系の機能異常があげられるが、一部の症例では呼吸器系・循環系・脳神経系の先天性異常との関連も考えられる。先天性異常としては、無呼吸発作を主症状とする先天性中枢性肺胞低換気症候群(CCHS、Ondineの呪い)や不整脈を伴うQT延長症などが候補となるが、これらを解剖検査から診断することは難しい。しかし、原因となる遺伝子はかなり同定されているので、DNAを解析することにより遺伝性疾患を判断できる可能性がある。遺族から実験目的での使用について承諾を得た45例につき、血液よりDNAを抽出し遺伝子解析を行った。現在までに、CCHSの原因遺伝子とされているRET proto-oncogene、Phox2b (paired mesoderm homeobox 2b)、Phox2a、EDNRB (endothelin receptor type B)の解析を終了している。睡眠中の無呼吸発作を主症状とするCCHSがSIDS症例に含まれていると以前から推定されていたが、意外なことにSIDSにこのCCHSが遺伝的背景として関与している可能性は低いと推定された。今後は、他の遺伝子異常の検討も重ねてゆく予定である。
ヒロシマ原爆被爆時における看護体験の実相

1.広島原爆被爆時の医療・看護に関する調査,研究発表(1)広島原爆被爆当時の赤十字看護婦の教育的背景を明らかにする一貫として,救護員手牒にみる赤十字看護婦の思想について分析し,「救護員手牒にみる赤十字救護看護婦に求められた思想」と題して論文をまとめ,日本看護歴史学会誌に発表した。(2)平成14・15年度に実施した対象者12名の面接調査(原爆被爆時の看護体験)の分析・考察を実施中である。(3)面接調査のうち,1名の対象者の体験について,分析・考察した結果を,ICN主催で2005年5月に開催予定である23rd Quadrennial Congress 2005で発表予定である。2.広島原爆被爆時の医療・看護に関する研究成果の公表および啓発活動(1)日本赤十字広島看護大学の大学祭(平成16年10月30日)において,ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する展示会を企画した。内容は,看護活動を行った赤十字看護婦の「語り」を収録したビデオと原爆を題材にしたビデオ絵本の上映,救護活動に焦点を当てた「市民が描いた絵」の展示,広島赤十字病院の原爆被爆時の写真,原爆被爆の体験に関連した図書(絵本を含む)の展示を行った。(2)日本赤十字広島看護大学で特別講演会の実施のためにアメリカから招いた大学教員に,本研究活動について紹介を行った。(3)原爆被爆の体験に関連した文献収集を行った。1.ヒロシマ原爆被爆時の医療・看護に関する文献調査広島平和記念資料館,広島市立図書館所蔵原爆資料目録,国立国会図書館蔵書検索・雑誌索引を中心とした情報検索システムから文献を検索・収集した。広島陸軍病院赤十字病院の被害状況及び看護活動の状況を時系列的に整理するとともに,看護婦養成制度との関連について明らかにした。2.原爆被爆に関する情報収集広島平和記念資料館の常設展・企画展(当時の救護活動の様子を特集),放射線影響研究所オープンハウス,講演「放射線の人体影響」,放射線被曝者医療国際協力推進協議会(HICARE)主催のシンポジウムに参加し,また,当時の医療従事者(赤十字看護婦を含む)による被爆証言ビデオの鑑賞を行い,原爆被爆に関する概略を理解した。3.面接調査(1)集団面接当時,広島陸軍病院赤十字病院で看護活動に携わっていた看護婦生徒1年生6名及び2年生5名に,それぞれフォーカスグループインタビュー法による面接を実施し,当時の被災状況,看護活動の状況を調査した。(2)個人面接上記(1)の研究対象者の中から看護婦生徒9名と,加えて赤十字救護看護婦2名,看護婦生徒2名に,深層面接法による個人面接を実施し,当時,看護活動に携わったときの思い,体験を通して何を感じたのか,その後の人生にどういう影響を与えたのかを調査した。4.学会発表平成15年6月に開催される第4回日本赤十字看護学会学術集会において,研究成果の一部を,「ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する文献検討」として発表予定である。1.広島原爆被爆時の医療・看護に関する文献調査,研究発表(1)広島陸軍病院赤十字病院の被害状況及び看護活動の状況について分析し,平成15年6月に開催された第4回日本赤十字看護学会学術集会において「ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する文献検討」と題して,研究成果を発表した。さらに「ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する文献検討-広島陸軍病院赤十字病院における活動-」と題して論文をまとめ,日本赤十字看護学会誌に発表した。(2)広島原爆被爆当時の看護婦養成状況と赤十字看護婦の教育的背景について分析し,「ヒロシマ原爆被爆時の看護活動と赤十字看護教育」と題して論文をまとめ,日本赤十字看護学会誌に発表した。(3)広島原爆被爆当時の赤十字看護婦の教育的背景を明らかにする一貫として,救護員手牒にみる赤十字看護婦の思想について分析し,「救護員手牒にみる赤十字救護看護婦に求められた思想」と題して論文をまとめ,日本看護歴史学会誌に投稿し発表予定である。2.広島原爆被爆時の医療・看護に関する研究成果の公表及び啓発活動(1)日本赤十字広島看護大学の大学祭(平成15年11月2日)において,ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する展示会を企画した。内容は,看護活動を行った赤十字看護婦の「語り」を収録したビデオの上映,救護活動に焦点を当てた「市民の絵」の展示,原爆被爆の体験に関連した図書(絵本を含む)の展示,第4回日本赤十字看護学会学術集会発表のポスター展示を行った。(2)原爆被爆の体験に関連した文献収集を行った。3.面接調査個人面接の分析:平成14年度に実施した2名の対象者の面接内容を逐語録として作成し,分析を行った。2.広島原爆被爆時の医療・看護に関する研究成果の公表および啓発活動

(1)日本赤十字広島看護大学の大学祭(平成16年10月30日)において,ヒロシマ原爆被爆時の看護活動に関する展示会を企画した。内容は,看護活動を行った赤十字看護婦の「語り」を収録したビデオと原爆を題材にしたビデオ絵本の上映,救護活動に焦点を当てた「市民が描いた絵」の展示,広島赤十字病院の原爆被爆時の写真,原爆被爆の体験に関連した図書(絵本を含む)の展示を行った。(2)日本赤十字広島看護大学で特別講演会の実施のためにアメリカから招いた大学教員に,本研究活動について紹介を行った。(3)原爆被爆の体験に関連した文献収集を行った。
腫瘍形成にpH感知性受容体は機能しているか～受容体欠損マウスを用いた解析

腫瘍形成における宿主免疫の役割を、TDAG8受容体欠損マウスを用いて解析した。その結果、化学発がん物質3-メチルコラントレン(3-MCA)の投与による腫瘍形成は、野生型の9割に認めたが、TDAG8欠損型では半減した。しかし、免疫組織学的検討で腫瘍組織へのCD3+T細胞など免疫細胞の浸潤に違いを認めず、また、3-MCA誘発マウス繊維肉腫細胞株(MC57G)の接種による腫瘍形成や、MC57Gによって誘導される細胞障害活性に野生型とTDAG8欠損型で違いを認めなかった。以上から、TDAG8欠損型での腫瘍形成抑制は、直接的な細胞障害活性の違いではなく、宿主免疫の間接的な調節機構によるものと推定された。腫瘍形成における宿主免疫・炎症細胞の役割を明らかにするため、OGR1ファミリー受容体、特にTDAG8受容体欠損マウスを用いて、化学発がん物質である3'-メチルコラントレン(3-MCA)の投与、あるいは、マウス由来がん細胞(メチルコラントレン誘発マウス繊維肉腫細胞株:MC57G)の接種を行い、腫瘍形成、生存、免疫・炎症細胞の集積などを指標に解析した。その結果、(1)化学発がん物質3-MCAの投与後の腫瘍形成: 3-MCAをマウス背部に皮下投与すると、投与後10週前後から腫瘍形成(>500立方mm)を認めた。その発生率は野生型マウスでは9割以上であるのに対し、TDAG8欠損マウスでは発生率が半減した。腫瘍組織を採取し、腫瘍組織をホルマリンで固定した後に、免疫染色を用いて組織学的に検討したところ、腫瘍組織へのCD3+T細胞の浸潤が認められたが、その程度は野生型とTDAG8欠損マウスで明らかな違いを認めなかった。FOXP3+細胞(制御性Treg)でも同様の所見であった(2)マウス由来がん細胞(MC57G)の接種後の腫瘍形成:がん細胞をマウス皮下に接種し、毎週ごとに腫瘍を計測した。接種されたがん細胞は腫瘍を形成し、徐々に増大していくものの、その増大スピードは野生型とTDAG8欠損マウスで明らかな違いを認めなかった。(3)マウス由来がん細胞(MC57G)刺激により誘導される、がん細胞に対するマウス脾エフェクター細胞の細胞障害活性:マウスにMC57Gをインビボにて接種後、さらにマウス脾細胞を取り出し、さらにインビトロで刺激した。その結果、脾エフェクター細胞による細胞障害活性が野生型マウスに比べて、TDAG8欠損マウスにおいて増強している傾向を認めた。今後は、例数を増やし、また、低pH状態など条件を変えながら、TDAG8欠損マウスでの細胞障害活性の増強傾向を明らかにする。腫瘍形成における、OGR1ファミリー受容体、特にTDAG8受容体の関与を明らかにするため、化学発がん物質(3-メチルコラントレン:3-MCA)の投与、あるいは、マウス由来がん細胞(メチルコラントレン誘発マウス繊維肉腫細胞株:MC57G細胞)の接種を行い、腫瘍形成、生存、免疫・炎症細胞の集積などを指標に解析した。その結果、(1) 3-MCAの投与後の腫瘍形成: 3-MCAをマウス背部に投与すると、投与後10週前後から腫瘍形成を認めた。その発生率は、野生型では9割以上であるのに対し、TDAG8欠損型では半減した。腫瘍組織を採取し、免疫染色を用いて組織学的に検討したところ、腫瘍組織へのCD3+T細胞の浸潤が認められたが、その程度に野生型とTDAG8欠損型で明らかな違いを認めなかった。FOXP3+細胞(制御性Treg)でも同様の所見であった。(2) MC57G細胞接種後の腫瘍形成:MC57G細胞をマウスに接種し、毎週ごとに腫瘍を計測した。接種されたMC57G細胞は腫瘍を形成し、徐々に増大したが、その増大のスピードに野生型とTDAG8欠損型で明らかな違いを認めなかった。(3)MC57G細胞の刺激によって誘導される、マウス脾エフェクター細胞の細胞障害活性:マウスをMC57G細胞の接種によりインビボで刺激後、さらにマウス脾細胞を取り出して、インビトロで刺激した。その結果、脾エフェクター細胞は無刺激状態では細胞障害活性を示さないが、インビボ→インビトロで刺激後にはほぼ100%の細胞障害活性を示した。しかし、その細胞障害活性に、野生型に比べてTDAG8欠損型での増強傾向を認めなかった。従って、TDAG8欠損型での腫瘍形成の抑制は、宿主T細胞などの直接的な細胞障害活性の差異ではなく、その他の細胞性、液性などの宿主炎症・免疫の調節機構によって修飾されている可能性が推定された。

TDAG8受容体欠損マウスを用いることにより、TDAG8が化学発がん物質による腫瘍形成に対して促進的に機能しているという結果が得られた。さらに、マウス脾エフェクター細胞を用いた細胞レベルの実験により、その促進効果は腫瘍に対する細胞障害活性の抑制による可能性が示唆された。腫瘍免疫インビボの実験で重要な結果が得られたので、さらに細胞レベルでの機能解析を精力的に進める。特に細胞障害活性について、まず生理的pH状態におけるTDAG8欠損マウスによる促進効果を確認し、さらに低pH状態による影響も検討する。また、脾エフェクター細胞としてCD8+細胞障害性T細胞の関与や、TDAG8受容体の細胞障害活性への抑制機構ついても検討を行いたい。平成26年度にはマウスを用いたインビボ実験や細胞レベルの実験に多少手間取ったことから、実験の進捗が遅れ研究費の繰越が生じた。しかし、今後は順調に実験を行えるものと考えているので、特に大きな計画の変更は考えていない。TDAG8が化学発がん物質による腫瘍形成に対して促進的に機能しているという結果が得られた。その促進機能について、TDAG8受容体が脾エフェクター細胞の細胞障害活性を抑制している可能性が示唆された。そのため、細胞障害活性に対するTDAG8受容体の生理的pH状態での抑制効果を、今年度も例数を増やして明らかにする。一方、腫瘍形成部位では細胞外pHが6.0程度の酸性状態であることが知られ、さらにTDAG8受容体は細胞外プロトン(pH)を感知していることから、低pH状態による細胞障害活性への影響も解析する。さらに脾エフェクター細胞からCD8+T細胞などを単離して細胞障害活性を測定することや、抗CD4,CD8抗体を用いた細胞障害活性に対する阻害実験も行っていく。またTDAG8受容体は通常Gs/cAMP経路に連関しているため、可能であればAキナーゼ阻害剤なども用いて解析する。