hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓前駆細胞の機能解析

本研究では、Wntシグナルに関わる遺伝子の発現解析、並びにCre/ERT2Creマウスを用いた発現細胞の系譜解析によって、右心室以外の心臓に寄与する新たな心臓未分化細胞領域が同定された。またノックアウトマウスや培養系の解析から、心臓未分化細胞群に於いてWntシグナルは、心筋への分化の制御というよりはむしろ増殖の制御に関わっていることが示唆された。心臓未分化細胞の未分化性を維持した培養法の確立については、今後の課題として残った。本研究では、左心室を構成する新奇の心臓領域を同定し、この細胞群の性状を明らかにすることによって心臓構築の原理の理解を深めるとともに、この細胞群を細胞供給源とした心筋組織を人工的に構築し、心筋梗塞モデルの梗塞巣に移植することでこの細胞群の有用性を検討し、心筋組織再生という医療技術の発展につなげることを目的として研究を進めている。これまでに、Creマウスを用いた発現細胞の系譜解析を行い、Creを発現した細胞が心臓のどの領域に寄与し、どういった細胞に分化していくのかを検討した。左心室以外の心臓領域に寄与し、心筋、線維性細胞、刺激伝導系、冠動脈平滑筋、静脈洞を構成する細胞に分化することが明らかとなった。次に、この遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系の確立を試みた。E9.5日胚より、心臓に未だ寄与していないVenus陽性細胞を単離し培養すると、2日後には拍動を開始することを確認した。このことは、Venus陽性細胞が、心筋の前駆細胞であることを意味する。この因子を添加した場合に、分化抑制傾向が見られるが、まだ安定して抑制させるには至っていない。さらなる条件検討を行っている。さらに、未分化性維持に対する本因子としての機能について検討した。心筋細胞分化重要な役割を示すWntシグナルに対して、抑制作用を持つことが示された。本因子はWntシグナル抑制して未分化性を維持している可能性が考えられる。これまでに、Creマウスを用いた発現細胞の系譜解析を行ってきた。このマウスの解析に加え、新たに、ERT2 Creを導入したマウス作製し、どの時期に発現した細胞が心臓のどの領域に寄与し、どういった細胞に分化していくのかを現在検討している。予備的な実験で、初期に発現した細胞は左心室-心房-静脈洞の流入路側の心臓領域に寄与するが流入路側には寄与しないことが観察されていることから、流入路側の発現は後から発現する可能性を考えている。さらに、その詳細について検討する。次に、本遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系の確立を試み、E9.5日胚より、心臓に未だ寄与していないvenus陽性細胞を単離し培養すると、2日後には拍動を開始することを確認した。Wntシグナルを促進した場合に、分化ではなく増殖が促進され、Wntシグナル阻害効果を持つ本因子を用いると、増殖が抑制されることが明らかとなった。さらに、本遺伝子を含むファミリー遺伝子を全て欠損させたマウス胚で、流入路側が過形成となること、さらにカノニカル経路のβカテニンの発現が強く発現していることが明らかとなった。このことから、本因子が、カノニカル経路の阻害に働いていることが強く示唆された。本研究では、左心室に寄与する新奇の心臓未分化領域を同定し、この細胞群の性状を明らかにすることによって心臓構築の原理の理解を深めるとともに、この細胞群を細胞供給源とした心筋組織を人工的に構築し、心筋梗塞モデルの梗塞巣に移植することでこの細胞群の有用性を検討し、心筋組織再生という医療技術の発展につなげることを目的として研究を進めた。本年度は、作出されたErt2Creマウスを用いて系譜解析を行い、胎生7.59.5日目までに標識された細胞が心臓のどの領域に寄与するのか、時系列を追った細胞のlinage mapマップを作成した。その結果、胎生7.5日目にSfrp5遺伝子を発現した細胞が右心室を除く心臓の全ての領域に到達したが、その後時期を追うごとに、流出路や左心室に到達する細胞が減少するのに対し、心房に寄与もしくは静脈洞にとどまる細胞が多数を占めるようになることが明らかとなった。これらの観察から、時期を追うに従って発現細胞周辺の心臓領域へと細胞の寄与が限定的になること、発現を維持した細胞は静脈洞へと分化することが示唆された。以上のように、左心室に寄与する新規の心臓未分化細胞領域を標識することが可能になったと考えられる。また、YFP発現細胞を、未分化状態を維持しながら増殖させるための培養条件について検討した。Wntシグナルの抑制ではその効果が得られないことが明らかとなったため、他のシグナルの検討を進めている。培養条件の確立は、今後の検討課題となった。

またノックアウトマウスや培養系の解析から、心臓未分化細胞群に於いてWntシグナルは、心筋への分化の制御というよりはむしろ増殖の制御に関わっていることが示唆された。心臓未分化細胞の未分化性を維持した培養法の確立については、今後の課題として残った。Ert2Creマウスラインが完成し、時系列を追った細胞のlinage mapマップを作成に取り組んでおり、順調に進んでいる。また、本遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系について検討したが、Wntは分化を制御する効果は考えにくく、新たに分化を制御する効果を持つシグナル系の検討を行う必要が出てきた。この培養系の確立を持って、心筋梗塞巣へ移植するための組織の供給源としての有用性を検討するためには、さらなる条件検討を必要とする。発生遺伝学今後は、時系列を追った細胞のlinage mapマップの作成を行っていく。この解析で、いつに時期の発現細胞がどの心臓領域のどういった細胞へと分化するのかを明らかにできる。また、本遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系を早急に確立する。Wntシグナルが分化に対して効果を持たなかったため、Wntシグナル以外のシグナル因子のスクリーニングを進め、分化抑制を維持して増殖させる系を確立する。そして、この培養系の確立を待って、心筋梗塞巣へ移植するための組織の供給源としての有用性を検討する。まず、シート状にするなどして、心筋梗塞巣へ貼付し、その生着率を検討する。これまでの心筋梗塞巣へ移植実験は、移植片は正着せずに、その細胞群から分泌される生理活性物質によって、残存した細胞群の生存率の向上、活性化によって心機能の上昇が確認されることが多い。胚発生段階にある心筋へと分化する前駆細胞を移植片として用いることによって、この細胞移植片由来の細胞が多く正着することを目指して、研究を進めていきたいと考えている。Ert2Creを挿入したマウスが完成していないため、時系列を追った細胞のlinage mapマップを作成することはできていない。そのマウスの作製を急いでいる。また、この遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系については、まだ安定して抑制させるには至っていない。さらなる条件検討を必要とする。この培養系の確立を持って、心筋梗塞巣へ移植するための組織の供給源としての有用性を検討するため、急ぎたいと考えている。未分化性維持に対するWntシグナル阻害機能の解析は、おおむね順調にきている。Ert2Creが完成した後、時系列を追った細胞のlinage mapを作成する。いつの時期のこの遺伝子を発現した細胞がどの心臓領域のどういった細胞へと分化するのかを明らかにする。次に、本遺伝子を発現している細胞を選択・回収し、未分化状態を維持しながら増殖させる培養系を早急に確立する。さらなる条件検討によって、未分化細胞を回収することは可能となると考えている。この培養系の確立を待って、心筋梗塞巣へ移植するための組織の供給源としての有用性を検討する。まず、シート状にするなどして、心筋梗塞巣へ貼付し、その生着するかどうかを検討する。胚発生段階にある心筋へと分化する前駆細胞を移植片として用いることによって、この細胞移植片由来の細胞が生着することが期待される。
近世イングランドにおける議会の役割の再検討：数量的手法を中心として

本研究では、まず16世紀後半から17世紀前半におけるイングランド下院議員の伝記史料を統計的に解析して生涯選出区数、生涯当選回数、地元率などについてのデータベースを構築した。さらにこれを基盤としてコーンウォル地域において選出された下院議員、および強制借用金の支払いを拒否した下院議員の特徴を分析した。以上の手法により、議会が近世イングランドの政治社会において中央および地方で果たしていた役割の解明に努めた。本研究は、国家統治における議会の役割と地方との関係を実証的に分析し、その作業を通じて近世イングランド政治史を再検討することを目的としている。この目的を達成するために、本年度は1.17世紀前半における議員と選挙区との関係、および2.コーンウォル地域における議会と議員との役割の究明に努めた。1.については、17世紀初頭のイングランドで実施された選挙情報をデータベースとして集約し、既に申請者が構築していた16世紀後半のデータベースとの接合を行った。その結果、選挙区のタイプによって選出される議員の性質に差異があり、それゆえ折々の選挙に作用する要因の種類および強度も異なっていたということ、さらにパトロンや政府のエージェントといった外部からの働きかけと各選挙区の自律性の均衡が、ある時期まではその時々の中央の政治状況とかなり密接に結び付いていたことが、当該期の全体的動向として明らかになった。本研究成果については、英語論文として国際誌への投稿を準備中である。2.については、1.で構築したデータベースにもとづき、下院議員の選出という面においてコーンウォルが他地域より圧倒的に外部権力の影響を受けやすい状況にあったものの、初期ステュアート朝期に入ると地域社会と外部権力との軋轢は高まっていったという全体的構造を解明した。次に、この結果をミクロ政治史の手法によりリスカード市を中心として検討した結果、初期ステュアート朝期における選挙には都市内外の様々な要因がそれぞれ影響を与えていた状況を明らかにする一方で、選挙を主催する都市自治体内で実権を掌握していた者たちが戦略的に外部勢力を利用していたことも実証できた。本研究成果については、それぞれ国内の論集および学術雑誌に掲載予定である。平成27年度は、前年度までに構築した17世紀前半の下院議員データベースを踏まえ、強制借用金の支払いを拒否した下院議員たちに着目し、この運動全体の性格を明らかにするとともに、個別の事例研究を通じてこの運動の中で議員が中央と地方との関係において果たしていた役割を検討した。その結果、以下の2点が明らかになった。1.下院議員選挙における強制借用金への抵抗の意義強制借用金に対して特に強い抵抗を示した一部の州選挙区では、この政策に対する立候補者の姿勢が強い影響を与えていた。この事実は、有権者の多い州選挙区ではイングランド全域で共有される課題が選挙戦を大きく左右する可能性があったことを意味している。もっとも、都市自治体による寡頭支配ないし貴族や有力ジェントリなどパトロンによる支配が継続されていた都市選挙区においては、エリザベス治世期から議員の選出メカニズムが大きく変化した形跡は見出せなかった。したがって大半の都市選挙区においては、地域社会における特定の人物の地位の証明、ないしはパトロンとの紐帯を強化するための手段として下院の議席が依然認識されていた可能性が高い。2.強制借用金抵抗者の議会内における活動強制借用金への抵抗という姿勢が下院への選出に際しての大きな要因となった議員が、この問題と深く関連する活動を積極的に行う場合もみられるものの、彼らは決して多数派ではないという状況であった。すなわち、議会を地域利害が代弁される場として認識していた議員たちは少数に過ぎなかったのであり、権利の請願というその後の国制を大きく規定して行くことになる決議さえ、王国全土の政治国民の意見が実態的に反映されたものではなく、一部の議員たちの個人的な行動によって形成されたと考えるのが妥当である。本研究の当初の課題として挙げた3点のうち、2点までが具体的な研究成果として実を結んでいる。また、本研究の成果は、既に学術雑誌および論集に論文として掲載が決定している。それゆえ、研究成果の社会への還元は一定程度進捗していると考えられる。また本年度中に海外(イギリス)における史料調査を1度実施し、本研究における課題解決のための史料調査を実施することもできた。これにより、今後の研究の推進にあたっての準備も整っていると思われる。以上から、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。英国近世史次年度においては、1620年代後半の強制借用金支払い拒否運動に着目し、本年度に構築したデータベースにもとづいて同運動全体の性格を明らかにするとともに、個別の事例研究を通じてこの運動の中で議員が中央と地方との関係において果たしていた役割を検討する。具体的には、1.強制借用金支払い拒否を表明した議員についての全体的な動向を分析した上で、2.特定の議員についての事例研究を行う。1.強制借用金の支払い拒否を表明した議員はその全員が特定されている。しかし、彼らが自身の選挙区とどのような関係にあり、また各地域社会に説明責任を果たしていたのかを検証しようとした研究は、現在まで現れていない。

そこで本年度に構築したデータベースを利用し、これらの議員たちがどのような規模の選挙区から選出され、またどの程度選挙区を移動していたのかを包括的に検証する。これにより、支払い拒否運動の背景にあった各地域の利害と、議員の担っていた責務を解明する。2.強制借用金の支払いを拒否し収監された議員には、ジョン・ハムデンとジョン・エリオットが含まれている。両者については、これまで国王に反抗した急進的議員という位置づけがなされてきた。しかしその選出区であるバッキンガムシャやコーンウォルといった地域との関係から、彼らの活動を検討しようとした研究は少ない。そこで、本年度の成果も生かしつつ、強制借用金の支払い拒否という行為が中央と地方の関係においてどのような意味を有していたのかを、イギリスの地方文書館所蔵の史料などで収集する史料を利用して究明する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
肝膵同時切除および拡大肝切除術における肝虚血侵襲と酸素需給動態の解明

肝膵同時切除(hepatopancreatoduadenectomy、以下HPD)や拡大肝切除施行例の手術侵襲の把握と軽減を目的として検討を行い、以下の結果を得た。1)術中肝虚血浸襲をもたらす手術操作について2)肝での酸素需給動態と術後肝機能との関連について3)肝での酸素需給動態とサイトカインとの関連について4)全身の酸素代謝の指標と肝での酸素需給動態について術中15ml/kg/hr、0病日は5ml/kg/hrを目標とした積極的輸液管理を行い、術後全身循環は酸素運搬能600ml/min/m^2以上、酸素消費量135ml/min/m^2以上で推移し、Shvo_2の低下も認めなかった。【まとめ】術中Shvo_2値は肝虚血侵襲を表し、術中Shvo_2モニタリングを行い可及的に術中Shvo_2を低下させないことがHPDや拡大肝切除における肝不全回避に有用である可能性が示唆された。HPDにおいて組織酸素代謝の改善を目的とした積極的な輸液投与とintropicagentの併用が有用と考えられた。胆道癌の手術成績向上のため、手術侵襲軽減を目的とした術前ステロイド投与によるcytokine modulating therapyの有効性について今後検討したいと考えている。肝臓に対する手術侵襲が非常に大きく肝不全死の克服が問題にとなっている肝膵同時切除(hepatopancreatoduodenectomy,以下HPD)や拡大肝切除施行例の手術操作時の肝侵襲の軽減を目的として各々13例を対象とし検討を行い、以下の結果を得た。1)術中肝虚血侵襲をもたらす手術操作について肝での酸素需給動態と術後肝機能との関連について平均術中Shvo_260%以下低下時間は肝切除群では38.5±37.9分、HPD群では60.0±52.7分であった。Shvo_260%以下低下時間と術後T-Bil最高値の関係をみると、肝切除群ではp=0.0571であったが、HPD群ではp=0.0288、肝切除とHPDをあわせた全例でもp=0.007と有意の正の相関がみられた。術中Shvo_260%以下低下時間と肝切除終了時のarterial ketonebody ratioの関係では、肝切除群、HPD群、肝切除とHPDをあわせた全例いずれも相関関係がみられなかった。3)肝での酸素需給動態とサイトカインとの関連についてShvo_260%以下低下時間とIL-6およびPMNelastaseとの関係では各々p=0.0134、p=0.0132と有意の正の相関が見られた。【まとめ】術中Shvo_2値は肝虚血侵襲を表し、術中Shvo_2モニタリングを行い可及的に術中Shvo_2を低下させないことが、HPDや拡大肝切除における肝不全回避に有用である可能性が示唆された。Shvo_2値は、肝切除では肝虚血侵襲のみならず全身における侵襲も表していると考えられた。
高齢保育ボランティアにみる「世代性（generativity）」の形成過程

本研究は高齢者の発達課題である次世代の育成と文化継承の営みとしての「世代性(generativity:Erikson,1986,1998)」獲得の過程を明らかにすることを目的としている。1.【調査】(2018/12/12019/3/30)1「次世代への関与」に関するアンケート調査:放課後まなび教室に従事する高齢ボランティアを対象に,属性,社会活動,ボランティアを始めた契機,意義,継続要因,日本版世代性行動チェクリストGCB-R(丸島,2007)について実施した。(配布数61,回収数41,回収率67.2%)2「ボランティア活動とライフヒストリー」インタビュー調査:1より、応募のあった12名に実施した。3分析:1孫育児の有無によるGCB-Rの群間比較等統計的検定,2M-GTAに沿った内容分析を行い,プレ調査の結果と併せ学会発表準備を行った。20th Global IntergenerationalConference(2019/6/1216)にエントリーしアクセプトされた。1.調査に関して:1予定通り,研究協力者の理解を得ながら調査研究を実施することができた。2インタビュー逐語録の完成に時間を要し,分析期間が予定より遅れた。3予定していた学会での発表もアクセプトされた。2.会議,研修に関して:先進的な研究機関との交流や,研修を経て,研究を進めるにあたり,概念整理に応用可能な書物や情報を入手することができた。20th Global IntergenerationalConference(2019/6/1216)にて結果を発表する予定である。その他,国内関連学会や,誌上投稿に向けて,理論の精緻化を目指す。本研究の全体的枠組みは,高齢保育者の世代性尺度を開発する前段階の概念形成までを目標にしており,現段階で精緻化した理論概念をもとに,今後,高齢者を対象とした次世代育成プログラムの内容検討や,評価尺度の開発に活用することを予定している。物品費(パソコン)支出に関して:発注時の価格変動により予定より安価に納品された。
口腔の前癌病変を規定する遺伝子の検索と診断用抗体の作成：ラットからヒトへ

舌癌(口腔癌)の前癌病変および境界病変における遺伝子変異と組織型との相関を明らかにし、病理組織診断の診断基準や予後の指標となる新たなマーカーを見出して、上皮異形成や上皮内癌など、病理医が日常苦慮する症例(組織診や細胞診)の客観的な診断基準を確立した。(1)舌がんモデル動物による、前癌病変を規定する遺伝子の選抜や確立および機能解析をできた。選抜出来た遺伝子における、ヒト前癌病変の病理組織での評価や血清の腫瘍マーカーになる抗体を完成。(2)確立できた口腔の前癌病変マーカーを細胞診用の免疫染色に応用ができた。口腔癌の前癌病変および境界病変における遺伝子変異と組織型との相関を明らかにし、病理組織診断の診断基準や予後の指標となる新たなマーカーを見出して、上皮異形成や上皮内癌など、外科医や病理医が日常苦慮する症例の客観的な診断基準を確立を目指している。(1)舌がんモデル動物を用いて、前癌病変に関連する遺伝子の選抜と機能解析を行っている。(2)選抜された遺伝子(今回の研究は予備実験で見出した細胞増殖に関連するRNA結合タンパク質hnRNP K)による、前癌病変の病理組織や血清の腫瘍マーカーになる抗体の開発中である。我々が既に有力な前癌病変の候補遺伝子とした、細胞増殖に関連するRNA結合タンパク質hnRNP K遺伝子に絞った研究を優先し、前癌病変に対する腫瘍マーカー作成とした実験結果を目指している。口腔癌の前癌病変および境界病変における遺伝子変異と組織型との相関を明らかにし、病理組織診断の診断基準や予後の指標となる新たなマーカーを見出して、上皮異形成や上皮内癌など、外科医や病理医が日常苦慮する症例の客観的な診断基準を確立したい。(1)舌がんモデル動物を用いて、前癌病変に関連する遺伝子の選抜と機能解析を行う。(2)選抜された遺伝子(今回の研究は予備実験で見出した細胞増殖に関連するRNA結合タンパク質hnRNP K)による、前癌病変の病理組織や血清の腫瘍マーカーになる抗体の開発。本研究計画は様々な遺伝子プロファイル解析による、前癌病変に関連する遺伝子の検索し、舌癌モデル動物より作成した前癌状態の状態にあるラットや培養細胞を用いて遺伝子を直接導入して評価するスクリーニングを行い、ヒト培養細胞や病理組織に対する有用性を確認して、腫瘍マーカーの確立と抗体作成を実現化する。研究は3年間継続して、より優れた前癌病変に関連する遺伝子の検索を行う。また我々が既に有力な前癌病変の候補遺伝子とした、細胞増殖に関連するRNA結合タンパク質hnRNP Kを見出しているので、hnRNPK遺伝子に絞った研究を優先して、前癌病変に対する腫瘍マーカー作成を目指す。舌癌(口腔癌)の前癌病変および境界病変における遺伝子変異と組織型との相関を明らかにし、病理組織診断の診断基準や予後の指標となる新たなマーカーを見出して、上皮異形成や上皮内癌など、病理医が日常苦慮する症例(組織診や細胞診)の客観的な診断基準を確立したい。(1)舌がんモデル動物による、前癌病変を規定する遺伝子の選抜でき、および機能解析を行うことができた。(2)選抜出来た遺伝子(我々の研究で見出した細胞増殖に関連するRNA結合タンパクhnRNPKにおける、ヒト前癌病変の病理組織での評価や血清の腫瘍マーカーになる抗体の開発がほとんどできた。(3)確立できた口腔の前癌病変マーカーを細胞診用の免疫染色に応用させる(hnRNPKなど)ことができ、日常業務の病理診断に大いに役立っている。発がん有力な遺伝子として選抜された遺伝子hnRNPKを、ヒトの病理組織標本や細胞診を用いて、免疫染色やリアルタイムPCRの発現解析を行っている。現在までの結果では、細胞増殖マーカーki-67より、前癌病変では発現が極めてクリアな結果が見られる。同時にヒトの病理組織標本を用いた免疫染色(CK10,CK13,CK17,CK19,Ki-67)、レーザーマイクロダイセクションによる病変部組織の切除解析をして、腫瘍マーカーとなる抗体の開発へ移行する準備中である。したがってこのような本研究計画から、前癌病変の基礎研究から臨床応用までの一貫した研究基盤を確立でき、診断・治療に大きく寄与する情報を提供するに違いないと考える。遺伝子発現制御において、mRNAからタンパク質へと翻訳される過程はさまざまなRNA結合タンパク質によって制御されている。mRNAは核内で転写された後、hnRNPと呼ばれるRNA結合蛋白質の複合体を形成し、細胞質へ輸送される。hnRNPファミリーは10種類以上存在する。その中で我々が見出したhnRNPKは、核内においてはクロマチンの修飾やスプライシング、細胞質においては翻訳やmRNAの安定性の制御、特に細胞のストレス応答や増殖制御に機能する。1) hnRNPK関連のsiRNA(RNAi干渉)による発現解析:21塩基の

科学合成2本鎖siRNAlincRNA-p21とhnRNPKの複合体がターゲット遺伝子の上流に作用して、クロマチン修飾により細胞増殖の発現に関与が知られているので、hnRNPKに関与するRNAの未知なる機能を検索が必要である。2)選抜された遺伝子hnRNPkを、ヒトの病理組織標本や培養細胞を用いて、免疫染色やISHによるタンパク質の発現解析を行い、遺伝子の有用性の確認。モデル動物と同様にヒトの材料でも、病理組織像のhnRNPK発現やリアルタイムPCR解析を行う。細胞増殖マーカーki-67より、前癌病変では発現が極めてクリアな結果と予想される。ヒトの病理組織標本を用いた免疫染色(CK10, CK13, CK17, CK19, Ki-67)、レーザーマイクロダイセクションによる病変部組織の切除解析をして、腫瘍マーカーとなる抗体の開発へ移行する。予備実験から見出した遺伝子(hnRNP K)の1つで、前癌病変の病理組織像やリアルタイムPCRの結果から、ki-67より有用な結果を示した。現在の研究は、症例数を1000名ほどの大規模なものにして、我々が見いだした遺伝子hnRNPKの実用性を証明することを優先する予定である。また、hnRNPメチル化の免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬で、前癌病変を検出できる腫瘍マーカーの作成は、この分野の先駆者である海外研究協力者Dr.Dragani TAと開発する。前癌病変を規定する腫瘍マーカーの開発作成ヒト口腔前癌組織と正常組織とのタンパク質メチル化レベル(リジンメチル化、アルギニンメチル化)を比較すると、前癌部は特定の分子のリジンメチル化・全体的なアルギニンメチル化が亢進しており、癌化に伴いタンパク質のメチル化の亢進が特定のタンパク質で起こり、hnRNPKメチル化タンパク質の検出が腫瘍マーカーとなる。つまり抗hnRNPK抗体を用いてその複合体を免疫沈降し抗メチルリジン抗体(MeK)、又は抗メチルアルギニン抗体(MeR)でウェスタンブロッティングを行うことで、複数hnRNPKが細胞内で分子複合体として存在しており、MeR化されたタンパク質及びMeK化された複数のタンパク質がhRNPKであることを検出することが可能となる。なおこの分野の先駆者である海外研究協力者Dr.Dragani TAと開発する。以上より、hnRNPメチル化の免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬で、前癌病変を検出できる腫瘍マーカーの作成は実現化可能であることは、我々の研究室のメチル化の解析方法に関する業績は、過去の論文からも明らかである。該当なし
表面薄膜のナノインデンテーション評価

研究のねらいは,厚さ10nmオーダーの表面薄膜層の機械的性質を測定するため,ナノインデンテーション試験法及びその解析方法を確立することにあったが,初期の目的はほぼ達成した.恐らく,同種試験機としては世界最高の性能を持つ試験機の開発に成功した.得られるデータの信頼性は非常に高い.以下,具体的な成果を羅列する.1.ナノインデンテーション応力場の三次元有限要素法(FEM)解析を確立し,薄膜構造体の三角錐圧子による変形時の挙動を模擬することができた.これにより,実験データより膜の弾性常数推定が可能となった.2.ナノインデンテーション試験機の性能向上を果たした.とくに,交流光源を用いた光ファイバー変位計を開発し,0.7pm/√Hzの分解能と0.2nm/°Cのドリフトレベルを達成した.本試験機により圧痕深さ10nm,荷重1μN程度の試験が可能となる.また,本試験機は圧子と試料表面とのそう大変異を制御した試験を行なうことができ,その試料表面同定精度は0.2nmである.3.種々の材料の極表面層のナノインデンテーション評価を行った.深さ10nm以下の表面層評価においては,圧子先端形状が敏感に影響する.この影響を正確に考慮することにより,極表面層においては,せん断応力が理論強度に達するまで塑性変形を開始しないことが判明した.ナノインデンテーション試験の応用として,磁気記録媒体の評価を行ない,その結果と摩擦・摩耗などのトライポロジ性能との関連を明らかにした.研究のねらいは,厚さ10nmオーダーの表面薄膜層の機械的性質を測定するため,ナノインデンテーション試験法及びその解析方法を確立することにあったが,初期の目的はほぼ達成した.恐らく,同種試験機としては世界最高の性能を持つ試験機の開発に成功した.得られるデータの信頼性は非常に高い.以下,具体的な成果を羅列する.1.ナノインデンテーション応力場の三次元有限要素法(FEM)解析を確立し,薄膜構造体の三角錐圧子による変形時の挙動を模擬することができた.これにより,実験データより膜の弾性常数推定が可能となった.2.ナノインデンテーション試験機の性能向上を果たした.とくに,交流光源を用いた光ファイバー変位計を開発し,0.7pm/√Hzの分解能と0.2nm/°Cのドリフトレベルを達成した.本試験機により圧痕深さ10nm,荷重1μN程度の試験が可能となる.また,本試験機は圧子と試料表面とのそう大変異を制御した試験を行なうことができ,その試料表面同定精度は0.2nmである.3.種々の材料の極表面層のナノインデンテーション評価を行った.深さ10nm以下の表面層評価においては,圧子先端形状が敏感に影響する.この影響を正確に考慮することにより,極表面層においては,せん断応力が理論強度に達するまで塑性変形を開始しないことが判明した.ナノインデンテーション試験の応用として,磁気記録媒体の評価を行ない,その結果と摩擦・摩耗などのトライポロジ性能との関連を明らかにした.ナノインデンテーション(極超微小硬度)試験により、光学ガラス、カーボン薄膜、フェライト加工面の機械的評価を行なうとともにFEMを用いてその挙動解析を行なった。得られた主たる実績は以下の通りである。(1).三角錐圧子におけるインデンテーション挙動のFEM弾性解析;ナノインデンテーション試験においては鋭い圧子先端形状を得るため三角錐圧子を用いる。3次元FEM弾性解析により圧子押込み荷重変位関係を求め、光学ガラスを供試して計算結果を確認した。その関係を表わす形状係数は円錐圧子の場合より、約65%高くなった。(2).薄膜構造体のインデンテーション挙動のFEM弾性解析;薄膜構造体に円錐圧子を押し込んだ時の荷重変位関係を求めた。薄膜の弾性定数が基盤のそれより小さい時には、膜厚の1/10程度の深さにおいては薄膜の押し込み挙動を反映するがその後急激に基盤の押し込み関係式に漸近することが判明した。磁気記録媒体上のカーボン薄膜(厚さ30nm)を供試し、そのインデンテーション挙動とFEM解析結果を比較検討することにより、カーボン薄膜のヤング率を推定することができた。その結果、カーボン薄膜の接触弾性定数はそのスパッタリング生製条件に敏感に依存することが分った。(3).フェライト加工面のナノインデンテーション評価;磁気記録ヘッド用スライダに用いられるフェライト超精密加工面のインデンテーション評価を行った。その結果、加工方法の違いによって、表面のインデンテーション挙動は極端に異なり、加工変室層は10nm1μmと変化することが分かった。光学ガラス、シリコンウェハーなどの表面にも同様な加工層の存在が確認でき、ナノインデンテーションは超精密加工面の評価に極めて有効な方法である。ナノインデンテーション(極超微小硬度)試験により、光学ガラス、カーボン薄膜、フェライト加工面、銅コネクター表面メッキ層などの機械的評価を行い,また、FEMを用いてその挙動解析を行った。主たる実績は以下の通りである。1.三角錐圧子におけるインデンテーション挙動のFEM弾性解析;ナノインデンテーション試験においては鋭い圧子先端形状を得るため三角錐圧子を用いる。三次元FEM解析により圧子押し込み荷重変位関係を求め,光学ガラスを供試して計算結果を確認した。その関係を表す形状係数は円錐圧子の場合より約65%大きくなった。

2.薄膜構造体のナノインデンテーション挙動のFEM弾性解析;薄膜構造体に円錐圧子を押し込んだときの荷重変位関係を求めた。薄膜の弾性常数が基盤のそれよりも小さいときには,膜厚の1/10程度の深さにおいては薄膜の押し込み挙動を反映するがその後急激に基盤の押し込み関係式に漸近することが判明した。磁気記録媒体上のカーボン薄膜(厚さ30nm),およびスパッタリングカーボン膜を供試し,そのインデンテーション挙動とFEM解析結果を比較検討することにより,カーボン薄膜のヤング率を推定することができた。また,それらの機械的性質と記録媒体のトライボロジ的性能との関連を検討した。3.材料表面層のナノインデンテーション評価;磁気記録ヘッド用スライダに用いられるフェライト超精密加工面のインデンテーション評価を行った。その結果,加工方法の違いによって,表面のインデンテーション挙動は極端に異なり,加工変質層は10nm1μmと変化することが分かった。光学ガラス,シリコンウエハーなどの表面加工層,コネクタ-錫メッキ層の評価などを行い,ナノインデンテーション試験が,表面層の機械的評価に極めて有効であることを確認した。4.ナノインデンテーション試験機の性能向上;ナノインデンテーション試験機の性能を向上させるためには,変位計の分解能およびドリフト特性を向上させる必要がある。そこで、交流光源を用いた光ファイバー変位計を開発し、0.04nm/√<Hz>の分解能と0.2nm/°Cのドリフトレベルを達成した。
ＥＧＦレセプター二量体界面を標的としたプローブの創製と新規二量化阻害剤の探索

ヒト上皮成長因子(EGF)レセプターは多くの上皮系がん細胞で過剰に発現している細胞膜タンパク質であり、その無秩序な活性化が細胞の異常増殖に関連している。このEGFレセプターを分子標的とした抗がん薬候補化合物を効率的に選出するための新しい蛍光分子と化合物評価方法を見出すことに成功した。実際に本手法を使って、ペプチド性の抗がん薬候補化合物を新規に2種類創出した。また、共焦点顕微鏡観察により、生理条件下、ヒト上皮系がん細胞に取り込まれる環状ペプチドを見出した。これらペプチドは、新たな細胞内薬物送達分子に応用できることが期待される。EGFレセプターは、一般の細胞では増殖や分化など多くの重要な生命現象に関わっている一方で、多くのがん細胞で過剰発現しており、その無秩序な活性化が細胞の異常増殖に関係している。本研究では、EGFレセプターの活性化に必須のイベントである細胞外領域の二量化に着目した「二量化阻害」という新たな作用機序の抗EGFレセプター阻害薬リード創製を目的としている。本課題では、これまでの研究にて見出したEGFレセプター二量化阻害環状ぺプチド1の構造最適化を指向したツール開発として、EGFレセプターの二量体界面に結合する新規ケミカルプローブを創製することを目指している。本年度は、環状ぺプチド1の蛍光標識化を目指し、まずはアミノ酸を一つずつアラニンに置換したペプチドを合成し、EGFレセプター二量化阻害試験および自己リン酸化阻害試験を実施した。これらの結果をもとに、阻害活性に及ぼす影響の少ないアミノ酸を推定することに成功した。これらアミノ酸を蛍光標識アミノ酸に置換した環状ペプチドを数種類合成した。蛍光標識環状ぺプチドをEGFレセプター発現型の上皮がん細胞に作用させたところ、細胞より観測できる蛍光量がペプチド濃度依存的に増加することが判明した。測定条件についてはさらなる検討が必要であるが、本蛍光標識ペプチドは、がん細胞表面EGFレセプターへの親和性を評価できる新たな蛍光プローブになる可能性が示唆された。EGFレセプターは、一般の細胞では増殖や分化など多くの重要な生命現象に関わっている一方で、多くのがん細胞で過剰発現しており、その無秩序な活性化が細胞の異常増殖に関連している。本課題では、これまでに見出したEGFレセプター二量体阻害環状ペプチド1の構造最適化を指向したツール開発として、EGFレセプターの二量体界面に結合する新規ケミカルプローブを創製することを目指した。平成27年度は、これまでの研究成果を基に、EGFレセプター発現型のヒト上皮系がん細胞上で環状ペプチド1と競合作用を示す蛍光標識体を検討した。その結果、環状ペプチド1のN末端にフルオレセインを標識したペプチド2を上皮系がん細胞の一つである類表皮癌由来細胞において生理条件下、環状ペプチド1と競合させることに成功した。競合の程度は蛍光量の減少量として捉えることができたため、本フルオレセイン標識ペプチド2は環状ペプチド1の構造最適化研究および新規二量化阻害活性分子の探索に応用できると期待される。また、本フルオレセイン標識ペプチド2は、共焦点レーザー顕微鏡観察の結果、ヒト上皮系がん細胞に作用させると、細胞内のいくつかの小胞よりフルオレセイン由来の蛍光で染色される現象が観察された。そのため、本フルオレセイン標識ペプチドが生理条件下、細胞内に取り込まれることが示唆された。本現象とEGFレセプターとの関連性については、さらなる詳細な実験と検証が必要であるが、環状ペプチド1及び2は新たな細胞内輸送分子として応用できることを見出した。さらに上記フルオレセイン標識ペプチドの改変した化合物の中から、細胞内に取り込まれる改変ペプチドを数種類見出すことに成功した。本年度実施した環状ペプチドのアラニン置換体を利用した構造活性相関研究より、EGFレセプター二量化および自己リン酸化に対する阻害活性に与える影響の少ないアミノ酸部位を推定できた。また、本結果を考慮して合成した蛍光標識ペプチドを作用させたEGFレセプター発現型がん細胞より、ペプチド濃度依存的な蛍光量の変化を蛍光プレートリーダーにて定量することに成功した。これらの情報は本研究課題を達成するために、非常に有意義な結果だと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。創薬化学まずは昨年度に続き、がん細胞表面のEGFレセプターとの親和性を評価できる条件検討を進め、評価手法を決定する。本手法をもとに、種々に合成したペプチドや学内化合物ライブラリーの中から、EGFレセプターに親和性のある新たな化合物を探索する。

うまく見出すことができれば、EGFレセプターの二量化阻害試験や自己リン酸化阻害試験を実施し、各種阻害活性の有無を調査する。また同時に、光反応性ペプチドを用いて、環状ぺプチド1の結合部位の特定を目指す。結合部位が特定できれば、分子モデリング用のコンピュータソフトを利用し、より強力なEGFレセプター二量化阻害剤の精密設計・合成に着手する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
高効率・高精度レーザー加工のためのリアルタイムモニタリングシステムの開発

17年度の研究において、レーザー加工のリアルタイムモニタリング法として、プラズマの電子と電界との相互作用を利用する、誘導電流測定法を提案し、従来行われていたプラズマの発光をモニターする光学的方法に比較して、多くの優れた点をもつことを示した。18年度は特に、レーザ剤加工において重要なレーザーピアッシング工程のモニタリングに、誘導電流法が応用できるよう詳細な研究を行った。1)雰囲気ガスに関して誘導電流信号は雰囲気ガスの種類に非常に敏感であることが確認された。即ち空気に代わって高純度の窒素ガスを用いると信号は10倍以上も増大する。逆に炭酸ガスを用いると信号は殆どゼロとなる。酸素や炭酸ガスなど、活性ガスはプラズマの外側の電子を捕獲するためと考えられる。2)YAGレーザー(nsパルス)を用いたレーザー貫通検知実験レーザーピアッシングを行う試料の下側に、試料と平行に電極を配置することによって、レーザーが貫通した瞬間に、試料下側に現れるプラズマの電子によって誘導電流信号が観測され、これが貫通検知の鋭敏なモニタリングに使用できることがわかった。信号ピックアップ回路の抵抗を大きくすることで検出感度が増大することから、電極間隔を20mm程度までに広げることができ、これによってレーザー照射時のスパッタリングの影響を排除することが可能になった。3)CWCO_2レーザー加工機を用いたレーザー貫通検知実験実際の炭酸ガスレーザー加工機において、ステンレス材(厚さ1-1.5mm)を用いてレーザービーム貫通検知実験をおこなった。この場合、YAGレーザーの場合の平行電極方式は有効ではなく、加工金属材料をマイナス電極とし、上部にプラス電極を置く方式(縦型方式)で誘導電流が計測されることがわかった。この実験によって、誘導電流測定法の実用機への適用の可能性がたかまった。高精度のレーザー加工を行うには、レーザーエネルギーやレーザーの集光度等を最適条件に設定する必要がある。従来は試行錯誤によって条件を決めていたが、本研究では、レーザー加工時に同時に発生するプラズマによる誘導電流を計測することで、リアルタイムで加工状態をモニタリングする方法を開発した。また、実用化に向けたシステムを設計・製作し、応用例を示した。1)レーザー加工のためのリアルタイムモニタリングシステムの構築(1)加工表面動的観察(2)加工表面静的・精密観察(3)プラズマ誘導電流計測(4)プラズマ発光スペクトル計測(5)プラズマ発光時間変化計測の五つの機能からなるシステムを構築した。2)誘導電流計測のための電極構造・配置に関する検討加工試料の大きさに拘わらず誘導電流が測定できるようにするため、試料の上部2-3mm上方に試料表面に平行して正・負の電極を向き合って配置し、それによって作る電場がプラズマ部分に到達するよう工夫した。3)誘導電流計測法による加工モニタリングの応用例(1)レーザー集光度の検知レンズと試料表面との距離を変化させて誘導電流を測定した。その結果、焦点のところで先鋭的に誘導電流信号が極大となり、焦点からずれると急激に減少することがわかった。したがって誘導電流信号を測定することでレーザー加工時の焦点決めができることが分かった。(2)レーザービーム試料貫通検知レーザー照射による穴あけ加工のモニタリングに誘導電流信号が利用できることが分かった。即ち、レーザービームが試料を貫通する瞬間、レーザープラズマは減衰し、それに伴い誘導電流信号も減衰するので検知できる。プラズマの発光をモニタリングに使用する方法に対して、誘導電流信号を用いれば、室内光やレーザー光の妨害の問題が解決できることが分かった。(3)ITO膜のスクライビングに応用レーザー照射によるアブレーション量と誘導電流信号が比例することが確認できた。このことを利用し、誘導電流計測をITO薄膜除去加工のモニタリングに使用し、誘導電流信号から、レーザー繰り返し周波数等を考慮し、試料の最適送り速度を求めることができることを示した。
量的緩和政策と金融市場

当研究では、家計、3種類の企業、金融機関、中央銀行、政府が存在する中規模の動的・確率的一般均衡モデルを構築し、日本銀行の様々な金融政策が実体経済及び債券市場に与える影響の分析を行った。理論的貢献は、債券を割引債ではなくクーポン債としてモデル化した事、日本銀行と金融機関の予算制約式を、債券の売買を通して明示的に結びつけた事、日本銀行と政府を、仮想的な配当を通して明示的に結びつけた事、近年の日本銀行のイールドカーブコントロール政策まで含めて分析した事である。実証的貢献は、伝統的金利政策、量的緩和政策に加え、超過準備金への金利政策の影響まで考察し分散分解及びインパルス反応関数分析を行った事である。当研究では、量的金融緩和政策の債券価格及び保有期間収益率への影響を考察する事が目的である。そのため初年度は以下の作業を行った。まず第一に、日本銀行金融研究所のディスカッションペーパーであるKikuchi and Shintani(2012)が推計した公表データに基づき、日本国債(残存期間は0.5年から半年刻みで20年までで、標本期間は1999年1月4日から2011年12月30日まで)の各債券の日次データのゼロクーポンイールドから、四半期毎の各債券の価格を導出し、その四半期毎の各債券の価格から四半期毎の各債券の保有期間収益率を計算した。そして四半期毎の各債券の保有期間収益率の統計的性質(平均、分散、歪度、尖度、自己相関等)の検討を行った。第二に四半期毎の、政策金利(翌日物無担保コールレート)、名目GDP確定値(季節調整なし、HPフィルター済み),マネーストック変化率(マネーサプライ統計とマネーストック統計におけるM3を日本銀行ホームページ上の方法で接続)、名目政府最終支出確定値(季節調整なし、HPフィルター済み)を求めそれらの統計的性質を検討した。第三に、Bhattarai et al.(2014)における異なる満期を持った債券の理論モデル化を参考にし、Gali(2015)の第三章のような標準的なニューケインジアンモデルに、満期の異なる債券を組み込んだ理論モデルを作成した。具体的には長期利付き国債を、割引ファクターつきのコンソル債として理論モデル化した。第四に、TFPショック並びに金融政策ショック(金利ショック)をモデル化し、負のTFPショック及び負の金融政策ショックの、上記第一であげた変数、具体的にはGDPやインフレーション、政策金利、債券価格、債券保有期間収益率への影響を、標準的なパラメーターの仮定の下でDynareを使用して検討した。当初は、教育投資の効果を明示的に考察し内生的成長論の枠組みで量的緩和の実態経済への影響を分析するBasu(2014)のモデルを出発点とする予定であった。そしてBasu(2014)に、利付き国債のモデルを加える予定であった。具体的には、Barr et al.(2012)を参考に、割引国債から初めて満期の異なる割引国債の和として利付き国債をモデル化する予定であった。しかしBasu(2014)のモデルはすでに複雑なモデルであり、このモデルにさらに上記の方法で債券をモデル化すると、モデルが複雑化しすぎ、かつ理論的にも問題がでる可能性があった。具体的には、Barr et al.(2012)の確率的割引因子モデルを用いたモデルでは、効用関数の形状及びショックの分布の関数系の仮定より、満期の異なる割引国債の和として利付き国債をモデル化することに理論的問題はなかったが、動的確率的一般均衡モデルにおいてはそのようなモデル化を行う事は困難であった。その為、動的確率的一般均衡モデルではなく、Barr et al.(2012)とは異なった確率的割引因子モデルで同様の割引債のモデル化を目指したが、非常に限定的な効用関数及びショックの分布を用いない限り、モデル化が難しかった。そのため、Gali(2015)の第三章の、一般的ではあるが基礎的な動的確率的一般均衡モデルに立ち戻った。また債券価格についても、割引債から利付債とモデル化するのではなく、Bhattarai et al.(2014)の異なる満期の債券の理論モデルを参考にして、コンソル債を導入した。このように当初は非常に複雑なモデルにおいて非常に厳密な債券モデル化を目指したためやや進捗状況が遅れたが、その後基礎的なモデルに立ち戻る事によって、この研究の基礎となる理論モデルの構築ができた。そしてDynareによってそのモデルの分析を開始した。マクロ経済学の分野においては、実質の硬直性並びに名目価格の硬直性を考慮するモデルが1980年代に誕生している。そしてこれらのモデルの金融資産市場に与える影響の分析も様々な角度からなされている。しかしそれらの分析は、主として株式市場が対象であり、債券市場に対する分析はほとんどなされてきていないのが現状である。翻って、近年日本やアメリカにおいて、中央銀行における自国の国債の購入量が急速に拡大している。また日本においては国債発行残高が増加しており、国債発行残高/GDP比率も増加している。このような現状を背景として、動的確率的一般均衡モデルを用いて、金融政策の債券価格への影響に関する理論モデルを構築し、実証分析するのが当研究の目的である。本年度は7月に共著者のParantap BASU教授を招聘し、1)基本的モデルの検討、2)基本的モデルの実証、3)基本的モデルの拡張を検討した。その結果以下の結果を得た。Gali(2015)の第三章の標準的なモデルを、金融政策の債券価格への影響を分析するため拡張した。

市場は、財、労働、債券市場の3市場存在する。名目価格の硬直性は、Calvo(1983)における最終財市場の価格の部分調整モデルを用いた。金融政策は、中央銀行がより高いインフレーションや正の生産性成長率に対して、金利を上昇させるという金利政策によりモデル化した。ショックについては、生産性ショックと金融政策ショックを導入した。そしてDynareを用いて厳密な動的モデルをシミュレーションした。また観測可能な変数である1)日本のGDP、2)日本政府支出、3)金利の3変数を用いて同一のモデルをDynareを用いて推定した。後者の推定したモデルを用いて1)債券のイールド、2)債券の保有期間利回りを予測した。推定したモデルの債券のイールドに対する予測力は定性的には一定の評価ができる値であった。現在までに、標準的ではあるが簡素的なGali(2015)モデルを用いた債券価格のモデルに関して、1)モデル推定にインプットとして必要なマクロ経済変数の収集及び加工、2)モデルからアウトプットとして推定される変数に対応する、債券データの加工、3)厳密なモデルのシミュレーション及び推定モデルからの予測、4)推定モデルからの予測値と、それに対応する観測されたデータの比較が終了している。具体的には、1)GDPやインフレーション、政府最終消費支出等のマクロデータの収集及びHodrick-Prescott filterなど様々なフィルターを用いた加工、2)菊池-新谷(2013)の公開データを元に、0.5年から四半期毎に20年までの国債イールド、0.75年から四半期毎に20年までの国債価格、0.75年から四半期毎に20年までの国債保有期間利回りの算出、3)価格硬直性や政府負債/GDP比率などのパラメーターを変えた場合毎の推定結果の導出、4)様々なパラメーターの組み合わせ毎に、モデルから導かれる変数間の相関係数の導出及びモデルから推定される実質保有期間利回りの2次のモーメントと観測される2次のモーメントの比較が終了している。一例をあげると、5年満期の債券の3ヶ月の保有期間利回りの2次のモーメントの観測値は0.010だが、推定値は0.0082であり観測値と推定値は近いが、20年満期のものについては観測値が0.042、推定値が0.007と両者には大きな開きがある。研究代表者の知る限り、動的確率的一般均衡モデルを用いて、2000年以降の日本の債券の保有期間利回りを推定し、現実の観測値と比較検討した実証研究は当研究が初めてである。その点において、当研究は現時点において貢献がある。しかし、モデルからの推定値と現実の観測値に差がある点が現時点での課題である。当研究においては、動的確率的一般均衡モデル(DSGE)を用いて、日本銀行が導入した3つの金融政策の、実体経済及び債券市場への影響を分析した。研究成果は理論的成果と実証的成果に分かれる。まず理論的成果であるが、当研究では標準的DSGEにおいて、1債券を単なる安全資産金利としてではなくクーポン債としてモデル化し、2日本銀行及び銀行による国債の保有を明示的にモデル化し、3予算制約式を通して日本銀行と銀行及び日本銀行と政府を明示的に結びつけた点に貢献がある。
伴侶動物の腫瘍における免疫抑制因子を標的とした新規免疫療法の開発

本研究では、イヌの腫瘍治療を目的として免疫抑制因子Programmed death-1(PD-1)およびPD-ligand 1(PD-L1)の発現解析・機能解析を行う。さらに治療用抗PD-L1抗体を作成し、腫瘍罹患犬を用いた臨床研究を行い、その治療効果を評価することが最終目標である。前年度までにPD-L1発現解析による対象腫瘍の決定、必要な量の治療用抗体の準備を終え、臨床研究を開始した。本年度は臨床試験を継続することとし、腫瘍罹患犬に治療用抗PD-L1抗体を投与し、安全性や治療効果を評価したところ、悪性黒色腫または未分化肉腫罹患犬の一部で腫瘍が明確に縮小したほか、肺転移のある悪性黒色腫罹患犬では生存期間が延長された可能性が示された。この臨床試験では延べ9頭の腫瘍罹患犬に対し各々複数回の抗体投与を行ったが(総数63回)、タンパク質製剤を投与したことに起因するアレルギー反応等の有害事象は観察されなかった。また治療に起因すると考えられる自己免疫疾患等の免疫関連有害事象も観察されなかった。上記臨床研究の成果を原著論文にまとめ、Scientific Reports誌に誌上発表並びにプレスリリースを行った。さらにマウス腫瘍モデルにおいて抗PD-1/PD-L1治療と相乗効果を示し、イヌでの安全性がこれまでに確認されていた低分子医薬品2種類について併用治療を各2頭ずつ実施したが、明確な効果の増強は観察されなかった。本研究成果は抗PD-L1抗体がイヌ難治性腫瘍の治療薬として有用であることを明らかとし、さらなる評価の実施を強く後押しするものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。さらに治療用抗PD-L1抗体を作成し、腫瘍罹患犬を用いた臨床試験を行い、その治療効果を評価することが最終目標である。まず本治療法の対象腫瘍を決定するために、種々のイヌ腫瘍サンプルを用いて免疫染色を行い、PD-L1発現の網羅的解析を行った。口腔内メラノーマ、骨肉腫、血管肉腫、肥満細胞腫、乳腺腺癌、前立腺癌でPD-L1発現が認められた一方、リンパ腫ほか6種類の悪性腫瘍では発現が見られなかった。また、新鮮腫瘍サンプルより腫瘍浸潤リンパ球を分離し、リンパ球上のPD-1発現陽性率を測定したところ、口腔内メラノーマより分離した浸潤リンパ球でPD-1発現が正常コントロールに比べ高かった。この結果はイヌ口腔内メラノーマにおいてPD-1/PD-L1経路が免疫抑制に関与していることを裏付けるものであり、本治療法の標的となりうることを示すものであった。次に、イヌPD-1/PD-L1結合を阻害できることが明らかとなったラット抗PD-L1抗体の遺伝子配列から、抗PD-L1治療用抗体の発現ベクターを作成した。本発現ベクターを哺乳類細胞へ導入し、治療用抗体の安定発現細胞を樹立した。クローニングおよび遺伝子増幅処理(dhfr-MTX)法を段階的に行い、高発現細胞を樹立した。現在、170 mg/Lの抗体を産生する細胞株を得ており、最終的には1-2 g/Lの発現量を見込んでいる。腫瘍罹患犬での臨床試験を行う前に、安全性試験として実験用犬に抗PD-L1治療用抗体を投与した。ビーグル1頭に対し、2週間間隔で全3回、投与量2 mg/kgにて治療用抗体の複数回投与を行ったところ、アナフィラキシー等の急性の副作用は確認されなかった。当初の研究計画通り、種々の腫瘍におけるPD-L1発現解析や、腫瘍関連リンパ球上のPD-1発現解析を行い、本治療戦略の対象となりうる腫瘍を決定することができた。また治療用抗体の大量生産系の樹立では、過程を順調にこなし、28年度中の完了を実現させる見通しが立ちつつある。また治療用抗体の安全性試験にも着手し、アナフィラキシー他の明らかな免疫関連副作用は今のところ観察されていない。さらに、ネコにおいても抗PD-L1抗体が交差反応性を示し、免疫染色にて乳腺腺癌でのPD-L1発現を認めるなど、ネコ腫瘍治療への応用にも一定の成果が見られている。一方でPD-L1の予後因子としての有用性の検討は平成27年度中に完了することができなかったため、平成28年度でも継続して行う予定である。前年度までにイヌ腫瘍において網羅的にPD-L1の発現解析を行い、口腔内メラノーマをはじめとした対象腫瘍を決定した。またイヌPD-1/PD-L1結合を阻害する活性のある抗PD-L1抗体を選抜し、治療用抗体の設計及び発現ベクターの作成、安定発現細胞の樹立を完了した。本年度は樹立された安定発現細胞に対し段階的に負荷をかけることで抗体の発現量を増大させる処置を継続して行い、さらなる高発現細胞を樹立することに成功した。