hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＮＦーκＢ活性化抑制の臨床応用（新規抗癌剤療法と手術侵襲の軽減）

1NF-κB標的薬(IMD-0354)を用いて、(1)NF-κB活性化抑制によるヒト膵癌細胞株に対する抗腫瘍効果、(2)膵癌に用いられている抗癌剤(Gemcitabine)がNF-κB活性を増強、(3)抗癌剤によって増強したNF-κB活性をIMD-0354によって抑制し、抗腫瘍抑制効果が増強することを示した。2手術侵襲を評価する動物実験モデルとして、ブタの下大静脈、大動脈、上腸間膜動脈、腹腔動脈を遮断、血行動態の変化を測定するモデルを作成した。NF-κB活性化抑制による炎症性サイトカインの抑制については実験継続中である。転写因子Nuclear factor-κB(NF-κB)の活性化抑制に基づいた(A)抗癌作用と(B)抗炎症作用の臨床応用を主題とし、(A)においては新規NF-κB標的薬IMD-0354にてNF-κB活性を抑制、抗癌作用を確認、(B)においてはIMD-0354にて炎症性サイトカインを抑制することにより、手術侵襲の軽減化を目的とするものである。(A)ヒト膵癌細胞株に対してIMD-0354とGemcitabineを用い、腫瘍増殖抑制効果について検討した。1.IMD-0354、Gemcitabineの単剤、両剤併用にて、セルカウントでは、IMD-0354、Gemcitabine共に、濃度、時間依存性に細胞増殖抑制効果を認め、併用においてより細胞増殖抑制効果を認めた。NF-κBレポーターアッセイでは、IMD-0354ではNF-κB活性依存的転写活性が抑制されたのに対し、GemcitabineではNF-κB活性が増強された。定量PCRでは、ICAM1、survivin、cyclinD1の各々について、IMD-0354では減少するのに対して、Gemcitabineでは増加することが確認された。2.ヒト膵癌細胞株皮下腫瘍マウスモデルを作製、IMD-0354、Gemcitabineの単剤での腫瘍抑制効果を認め、さらに両剤併用により抑制効果が増強されることを確認した。(B)下大静脈切除再建時に伴う循環動態の変化をブタを用いたモデルにより測定、検討した。1.下大静脈、大動脈、肝動脈、上腸間膜動脈の血行遮断を行い、動脈内に留置した圧測定カテーテル、末梢血管超音波診断(IVUS)、体外超音波、レーザードップラーを用い、循環動態の変化を測定した。2.下大静脈遮断時の血圧低下に対して、大動脈遮断単独では循環動態が不安定であったが、上腸間膜動脈遮断を併施することにより循環動態の安定化が得られた。転写因子Nuclear factor-κB(NF-κB)の活性化抑制に基づいた(A)抗癌作用と(B)抗炎症作用の臨床応用を主題とし、(A)においては新規NF-κB阻害薬IMD-0354にてNF-κB活性を抑制することにより、抗癌剤としての臨床応用を目指し、(B)においてはIMD-0354にて炎症性サイトカインを抑制することにより、肝胆膵手術において最も手術侵襲の大きい血行再建手術において手術侵襲を軽減化することを目的とするものである。1.IMD-0354、Gemcitabineの各々と両剤を用い、セルカウント、NF-κBレポーターアッセイにて検証した。また、NF-κBに関連した標的について定量PCR法を行った。セルカウントでは、IMD-0354、Gemcitabine共に、濃度、時間依存性に細胞増殖抑制効果を認め、両剤併用においてより細胞増殖抑制効果を認めた。レポーターアッセイでは、IMD-0354ではNF-κB活性依存的転写活性が抑制されたのに対し、GemcitabineではNF-κB活性が増強された。定量PCRでは、ICAM1、survivin、cyclinD1の各々について、IMD-0354では減少するのに対して、Gemcitabineでは増加した。2.ヒト膵癌細胞株皮下腫瘍マウスモデルを用いて、in vivoの腫瘍抑制効果を判定中である。1.下大静脈、門脈、大動脈、肝動脈、上腸間膜動脈の血行遮断を、単独、または組み合わせて行い、動脈内に留置した圧測定カテーテル、末梢血管超音波診断(IVUS)、体外超音波、レーザードップラーを用い、循環動態の変化を測定した。転写因子Nuclear Factor-κB(NF-κB)の活性化抑制に基づいた(A)抗癌作用、(B)拡大手術における手術侵襲の軽減、を主題に研究を行った。

(1)IMD-0354、Gemcitabineの単剤、両剤併用にて、濃度、時間依存性に細胞増殖抑制効果を認め、併用においてより細胞増殖抑制効果を認めた。(2)IMD-0354ではNF-κB活性依存的転写活性が抑制されたのに対し、GemcitabineではNF-κB活性が増強された。(3)定量PCRでは、ICAM1、survivin、cyclinD1の各々について、IMD-0354では減少するのに対して、Gemcitabineでは増加することが確認された。(2)ヒト膵癌細胞株皮下腫瘍マウスモデルを作製、IMD-0354、Gemcitabineの単剤での腫瘍抑制効果を認め、さらに両剤併用により抑制効果が増強されることを確認した。(B)血行再建を伴う拡大手術における手術侵襲を評価するため、下大静脈切除再建時の循環動態の変化をブタを用いたモデルを作成、検討した。(1)下大静脈、大動脈、肝動脈、上腸間膜動脈の血行遮断を行い、動脈内に留置した圧測定カテーテル、体外超音波、レーザードップラーを用い、循環動態の変化を測定した。(2)下大静脈遮断時の血圧低下に対して、大動脈遮断単独では循環動態が不安定であったが、上腸間膜動脈遮断を併施することにより循環動態の安定化が得られた。(3)拡大手術における手術手技の工夫による低侵襲化、周術期のNF-κB活性化抑制による手術侵襲の軽減については実験継続中である。外科A)については、ヒト膵癌細胞株のみならず、ヒト肝細胞癌細胞株、ヒト胆管癌細胞株についても研究を行う予定であるが、現時点ではヒト膵癌細胞株に限り研究が進行している。また、(B)については、ブタを用いた実験モデルを確立、今後NF-κBによる手術侵襲における炎症反応の抑制を行う状況である。上記(A)については、ヒト膵癌細胞株のみならず、ヒト肝細胞癌細胞株、ヒト胆管癌細胞株についても研究を行う予定であるが、現時点ではヒト膵癌細胞株に限り研究が進行している。また、(B)についてはブタを用いた実験モデルを確立しつつある状況である。(A)5-FUとIMD-0354の併用療法を検証、ヒト胆管癌細胞株に対してもヒト膵癌細胞株、と同様に、IMD-0354の腫瘍増殖抑制効果について確認後、Gemcitabineとの併用療法による検証を行う。(B)ブタにおける血行再建手術時の手術侵襲を、各手術前後に血液を採取、調節性T細胞、VEGF、IL-6、IL-1、TNF-&#61537;などのサイトカイン、免疫能、主要臓器におけるp65、p50、p52などのNF-&#61547;Bファミリー、さらにNF-&#61547;Bシグナル伝達と関連が深い活性酸素(ROS)の計測、評価を行う。(A)ヒト肝癌細胞株に対してIMD-0354の抗腫瘍効果を確認後、5-FUとの併用療法を検証、ヒト胆管癌細胞株に対してもヒト膵癌細胞株、ヒト管癌細胞株と同様に、IMD-0354の腫瘍増殖抑制効果について確認後、Gemcitabineとの併用療法による検証を行う。(B)ブタにおける血行再建手術時の手術侵襲を、各手術前後に血液を採取、調節性T細胞、VEGF、IL-6、IL-1、TNF-αなどのサイトカイン、免疫能、主要臓器におけるp65、p50、p52などのNF-κBファミリー、さらにNF-κBシグナル伝達と関連が深い活性酸素(ROS)の計測、評価を行う。平成25年度には時間的な兼ね合いで、購入すべき抗体を使用する実験まで到達しなかったため。
唾液腺導管癌新規治療法開発に向けた機能性RNA分子ネットワークの解明

唾液腺に発生する唾液腺導管癌は、局所再発や遠隔転移を高頻度に起こすため極めて予後不良な癌であるが、唾液腺導管癌臨床検体を用いたゲノム解析研究は殆ど行われていない。本研究では、唾液腺導管癌臨床検体を用いた蛋白コード遺伝子と蛋白非コード遺伝子であるマイクロRNAの発現プロファイルを作成し、本疾患に特徴的な分経路の探索を行った。その結果、唾液腺導管癌において、細胞外マトリックスに機能分類される遺伝子群が高発現している事が判明した。また、マイクロRNA発現プロファイルから、唾液腺導管癌において発現が抑制されていたmicroRNA-29bは、細胞外マトリックス遺伝子群を抑制する事が示唆された。ヒトゲノム解析研究が終了し、その成果として、ヒトゲノム中には、蛋白をコードしない機能性RNA分子が多数存在する事が明らかとなった。機能性RNAの中で、僅か1922塩基程度の低分子RNAであるマイクロRNAは、蛋白コード遺伝子に配列依存的に結合し、分解や翻訳阻害により標的となる遺伝子(群)の発現制御を行う機能を有する。また、1種類のマイクロRNAは、数十数千の蛋白コード遺伝子の発現制御を行う事が報告されている。細胞内では、蛋白コード遺伝子とマイクロRNAの発現がタイトに制御されており、マイクロRNA-蛋白コード遺伝子の発現異常に伴う、機能性RNAネットワークの破綻が癌を含む様々な疾患の発症や進展に関与する事が報告されている。唾液腺に発生する唾液腺導管癌は、遠隔転移を高頻度で起こす、極めて予後不良な癌の1種である。現在も確固とした治療プロトコールが無く、その治療成績は極めて低い。そこで、本研究では、予後不良な癌のある唾液腺導管癌に対して、マイクロRNA-蛋白コード遺伝子の発現解析から、唾液腺導管癌のRNAネットワークの異常を見出す事を目的とした。平成25年度は、唾液腺導管癌の臨床検体から、蛋白コード遺伝子の網羅的発現解析を施行した。その結果、extracellular matrix (ECM) pathwayやFocal adhesion pathwayに含まれる遺伝子群が、唾液腺導管癌の癌組織で高発現している事が認められた。これら遺伝子の発現異常は、癌細胞の浸潤・遊走に関与する事が報告されており、唾液腺導管癌の遠隔転移と原因である事が示唆された。唾液腺に発生する唾液腺導管癌は、遠隔転移を来し易く、極めて予後不良な癌である。現在も確固とした治療プロトコールは存在せず、治療方針の検討も未だ十分には行われていない。本疾患については、発生頻度が非常に少ない事、また唾液腺癌の術前組織型診断が困難なことから、臨床検体を用いた解析がほとんど行われていない。近年、ヒトゲノム中には、蛋白をコードしない機能性RNAが多数存在し、転写されている事が判明した。その中で、マイクロRNAに分類されるRNA分子は、蛋白コード遺伝子の発現を負に制御する事から注目されている。1種のマイクロRNAは、数十から数百種類の蛋白コード遺伝子の発現を制御しており、ゲノム中の遺伝子の多くは、マイクロRNAの制御を受けている。本研究では、唾液腺導管癌臨床検体を用いた蛋白コード遺伝子の解析を行い、その上流を制御するマイクロRNA分子ネットワークの探索を施行した。解析の結果、唾液腺導管癌において1)Focal adhesionに分類される遺伝子群が異常発現していること、2)miR-29a/b/cがその上流を制御していることが示唆された。そこで、これらマイクロRNAの発現が抑制されている癌細胞株に、miR-29a/b/cを核酸導入したところ、癌細胞の遊走・浸潤能の顕著な抑制が認められた。この事から、miR-29a/b/cは、唾液腺導管癌における「癌抑制型マイクロRNA」である事が強く示唆された。更に、これらマイクロRNAが制御する蛋白コード遺伝子について検討した結果、miR-29a/b/cは細胞外マトリックスのレセプターの機能を有するintegrinを抑制し、癌細胞の遊走・浸の制御に関与している事が判明した。本研究により、唾液腺導管癌の遠隔転移に関わる分子経路の一端が明らかとなった。頭頸部癌唾液腺導管癌の臨床検体を用いた蛋白コード遺伝子の網羅的発現解析から、唾液腺導管癌の遠隔転移と原因となり得る遺伝子群を抽出した。これまでに、唾液腺導管癌のゲノム解析は殆んど行われておらず、今回の解析は、唾液腺導管癌の新規RNAネットワークの一端を明らかにした。今回の解析から、唾液腺導管癌で高発現が明らかとなった遺伝子については、免疫染色による他検体の検証が可能となり、今後の研究の方向性が示唆される。

(今後の推進方策)本年度は、唾液腺導管癌・臨床検体のマイクロRNA解析を軸にして、唾液腺導管癌において発現異常を認めるマイクロRNAを探索する。これまでに得られた「蛋白コード遺伝子の発現プロファイル」と合わせる事で、唾液腺導管癌に特徴的な機能性RNAネットワークを探索する。さらに、唾液腺導管癌で活性化されている分子経路を見出し、その遮断方法について検討する。具体的には、発現抑制されているマイクロRNAの核酸導入、発現が上昇している蛋白コード遺伝子のsiRNAによるノックダウン、シグナル伝達を阻害する分子標的薬の投与による癌抑制効果について検討する。(次年度の研究費の使用計画)唾液線導管癌類似細胞株を用いて、1)発現抑制されているマイクロRNAの核酸導入、2)発現が上昇している蛋白コード遺伝子のsiRNAによるノックダウン、3)シグナル伝達を阻害する分子標的薬の投与を行う。研究費は、核酸・siRNA、分子標的薬剤の購入に充てる。また、成果発表のための論文作成費用や印刷費に使用する。次に使用するべき物品の金額が当該年度の残金よりも多かったため。次年度の予算とあわせて物品を購入する予定である。
遊離組織移植の生着率向上のための血管吻合手技と管理法の確立

血管吻合状態の違いによる血流障害の発生:ラットを用いた吻合実験において、thrombogenic anastomosisを行った群では、高率に血行障害を生じた。これに対し、予防的ヘパリン皮下注による抗血栓療法は血栓形成を抑制できなかった。血管柄の屈曲は血流障害発生に影響を与えなかった。皮弁の虚血時間の違いによる血流障害発生とその対策:ラット広背筋皮弁、腹直筋皮弁移植モデルにおいて、虚血時間の延長に伴い、血流障害の発生率は上昇した。血流障害発生の予防対策として、虚血時間の間皮弁をヘパリン処理することで、血流障害の発生は抑制できた。離組織移植による口腔再建症例を対象にレーザードプラー血流計(LDF)を用い術後の血行動態を観察した。術後の皮弁血流は漸増して術後3日目ごろには血行は安定した。また、PGE1投与により30-40%の血流増加がみられ、血流増加時間は3-4時間であった。このように術後の皮弁血流は一定のパターンを示すことがわかった。一方、術後に皮弁の血流障害を生じた症例では、LFDによる血流パターンが異なっており、LFDによる注意深い血流監視は肉眼的な皮弁の変化に先だって、血流障害を早期に発見できる可能性がある(1)ラット広背筋移植モデルを用い、血管吻合の吻合部の状態が皮弁生着に及ぼす影響を検討する。(2)皮弁の虚血時間の違いが皮弁生着に及ぼす影響を検討する(3)レーザードプラー血流計を用いた術後皮弁管理法について検討する血管吻合状態の違いによる血流障害の発生:ラットを用いた吻合実験において、thrombogenic anastomosisを行った群では、高率に血行障害を生じた。一方、術後に皮弁の血流障害を生じた症例では、LFDによる血流パターンが異なっており、LFDによる注意深い血流監視は肉眼的な皮弁の変化に先だって、血流障害を早期に発見できる可能性がある1.ラットにおける広背筋移植(1)ラット広背筋血管柄の確認還流固定されたラットを用い広背筋血管柄の確認を行った。尾側より頭側へ前鋸筋上で広背筋を確認し挙上。広背筋を挙上し肩甲下動脈を確認し、さらに血管柄を中枢側へ追求し腋下動静脈を確認した。移植血管柄として脇下動静脈が使用できる。血管柄の外径は動静脈とも1mm以上はあった。(2)ラットを用いた遊離広背筋移植Wisterラットを用いた広背筋移植での生着率は60%程度であった。原因としては、小動物での微小血管吻合、遊離組織移植に不慣れであること、血管柄が予想以上に細かったことなどが考えられる。ラットにおける皮弁挙上・微小血管吻合への習熟が必要であり、現在他の実験で還流固定されたラットを用い手技の向上に努めている。また300g程度のラットでは血管柄が1mm以下のものが多いが、500g以上になると血管柄の径も1mm以上で安定してくるため、今後は500g以上を使用する予定である。2.口腔癌切除後再建術の遊離組織移植後の血行動態遊離組織移植による口腔再建症例を対象にレーザードプラー、超音波ドプラー血流計を用い術後の血行動態を観察した。術直後は血流が減少する症例、直後から増加する症例が見られたがいずれも漸増し術後3日目ごろには血行は安定し1週間後は、術前よりも皮弁血流は増加した。術後1週間目、2週間目、3週間目で皮弁血流に変化はなかった。術後3日目まではPGE1投与など決行改善の補助手段が必要と思われる。PGE1投与による血流変化は、1回の投与で50-100%の血流増加がみられ、そのピークは投与開始後90分前後であり、血流増加時間は3時間半から4時間であった。1日2回のPGE1投与で1日の血流増加時間は7時間から8時間程度であるが、血行が不安定な時期には意義があると思われる。今後動物においても確認する予定である。1.レーザードプラー血流計による移植術後血流管理の有用性遊離組織移植による口腔再建症例を対象にレーザードプラー、超音波ドプラー血流計を用い術後の血行動態を観察した。術後に血流障害を認めなかった症例では、術後経時的血流変化およびPGE1投与時の血流変化に一定のパターンを示すことがわかった。

術後の血流は漸増して術後3日目ごろには血行は安定し、術後1週間目、2週間目、3週間目で皮弁血流に変化はなかった。しかし約30%の症例で術後経過中の血流が減少する症例が認められた。それらは術直後に減少し、術後2日目までには増加していた。PGE1投与による血流変化は、1回の投与で50-100%の血流増加がみられ、そのピークは投与開始後90分前後であり、血流増加時間は3時間半から4時間であった。一方、術後に血流障害を生じた症例では、血流パターンに変化を認めており、肉眼的な皮弁の変化に先立ち皮弁血流障害を判定できたため、早期の対応が可能であり全例再手術により救済できた。以上のことからレーザードプラーによる血流監視は術後管理において有用の方法といえる。2.ラットにおける広背筋移植(1)ラットを用いた遊離広背筋移植Wisterラットを用いた広背筋移植での生着率は80%程度に向上した。以下の吻合部の状態の違いによる血栓形成の違いを検討した。(1)下流の血管内に上流の血管を入れる、(2)上流血管内に下流の血管断端を入れる、(3)吻合部に外膜組織を入れる。その結果、(3)(2)(1)の順で血栓形成する傾向にあり、血流障害につながった。今回の実験では静脈での血栓形成が多かった。3.次年度はさらに症例数を増やし傾向を確かめるとともに、虚血時間の違いによる皮弁血管内の変化、血栓形成の状態を検索し、血栓形成抑制法を検討する。1.遊離移植における血行障害の原因についての検討遊離組織移植による口腔再建症例58例を対象に吻合血管の状態と術中・術後の血流状態を観察し、血管吻合後血行障害との関連を検討した。吻合血管径の関係は頸部動脈径が皮弁動脈径より大きいか,皮弁静脈径が頸部静脈径より大きい血管径のdiscrepancyは29%に認められた,血管内腔の状態は内膜肥厚・剥離や血管内debrisなど血管の異常が40%に認められた.血行障害症例は9例で、発症時期は大部分が48時間以内であった.9例中血管径のdiscrepancyが3例,血管の異常が8例に認められた.術後再吻合症例4例中早期に再吻合できた3例が救済できた.以上より血管の異常は血行障害の誘因のひとつと考えられ、移植の生着率を向上のためには皮弁血流を慎重に観察し、血行障害の早期発見と早期対応が必要である.2.ラットにおける皮弁移植(1)吻合状態の違いによる血栓形成状況:吻合部を以下の状態(1)下流の血管内に上流の血管を入れる、(2)上流血管内に下流の血管断端を入れる、(3)吻合部に外膜組織を入れた状態で吻合したところ、(3)(2)(1)の順で血栓形成する傾向にあり、血流障害につながった。しかし、ヘパリン処理では血栓形成は抑制できなかった。(2)皮弁切離後虚血時間と血流障害:皮弁摘出後の虚血時間が2時間を超えると、動脈吻合後静脈還流を認めないか、不良であった症例が増加した。血流障害例に対し、皮弁内にヘパリン加生食を還流させても再灌流を認めない症例があったが、摘出時にヘパリン加生食を還流充満させていた場合の血流は良好であった。3.次年度は、(1)吻合血管の組織学的検索、(2)皮弁内をヘパリン加生食で満たした場合と、血液で満たした場合の血管内皮細胞の変化、(3)血管クリップによる血管形態、内皮細胞の変化を観察する。最終年度として、血行障害に関連する因子をまとめ、生着率向上に向けての管理法を検討する。1.ラット遊離皮弁の虚血時間と血流障害発生との関連についての検討
中高年に対する整形外科の術前術後リハビリテーション看護プログラムの開発

一般に、整形外科病棟においては、下肢の手術後、自立した生活が送れるように車椅子を用いるが、その場合、ふだん使いなれない車椅子に疲労感や筋痛を訴える患者が多く見られる。これは、健常者が日常的に行わない動作を行うため主動的に働く筋に疲労が生じたりすることや、術前術後のベッドレストによる廃用が筋疲労を招く主因であると考えられる。本研究は、(1)車椅子移動時に特異的に筋疲労が生じる筋群が上肢に存在するか否かを明らかにすることで、最も機能改善が必要な筋群を特定し、その結果から、(2)車椅子移動に有効な術前術後リハビリテーション看護プログラム開発を行い、(3)臨床現場においてその有用性を検討することであった。その結果、若年女性の車椅子移動時の筋活動データからは、僧帽筋、三角筋、上腕二頭筋および脊柱起立筋に筋疲労が生じやすいことが認められたが、中年女性では一様な傾向は認められず、個人差が大きいことが示された。また、個人別では筋疲労が生じている筋群が存在したため、上肢筋群を中心にした簡便なリハビリと-ション看護プログラムが考察された。本研究で用いたリハビリテーション看護プログラムを臨床現場で検討したところ、「簡単」で「継続性が高い」と評価された。また、リハプログラム実施者では、車椅子使用による筋疲労や筋通を訴える者がなく、本リハプログラムはベットレストによる廃用性の筋機能低下予防だけでなく、ADLを高めるためにも有用であると思われた。本研究は、整形外科術前術後に車椅子移動を余儀なくされる患者に対するリハビリテーション看護プログラムを開発するための基礎研究として位置付き、最も機能向上が必要な筋群を特定するために、車椅子移動時に特異的に筋疲労が生じる筋群が存在するか否かということを明らかにすることが主たる目的であった。測定参加の同意を得た健康な2030才の女性8名を対象に、-定リズム(1ストローク/2秒)による車椅子移動を直線距離60mの往復コースにおいて約10分間連続的に行わせた。その時の僧帽筋、三角筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、腕橈骨筋、尺側手根伸筋および脊柱起立筋の筋活動をホルター式筋電図計を用いて増幅した。筋活動は、コース中央(30mの位置)に引かれたラインを車椅子が横切ってから約10秒間記録し、それを1試行とした。10分間の車椅子移動でコースを56往復することができたので、1012試行分の筋電図データが収集された。各試行とも4ストローク分の筋電図積分値(iEMG)を各筋ごとに求め、筋活動の指標とした。初期効果を考慮し、2試行目と3試行目のiEMGの平均値(初期値)と終了前2試行分のiEMG平均値(終期値)を比較すると、僧帽筋、三角筋、上腕二頭筋および脊柱起立筋で、初期値に比べ終期値のiEMGが増加する傾向にあった。一般に、一定負荷運動中におけるiEMGの増加は筋疲労によると考えられているので、10分間車椅子移動時において僧帽筋、三角筋、上腕二頭筋および脊柱起立筋が他の筋群に比べ疲労しやすい可能性が示唆された。本研究における本年度の目的は、整形外科術前術後に車椅子移動を余儀なくされる患者に対する;リハビリテーション看護プログラムを考案することであった。参加の同意を得た中年女性6名に対し、一定リズム(1ストローク/2秒)による車椅子移動を直線距離60mの往復コースにおいて約10分間連続的に行わせ、その時の筋活動をホルター式筋電図計で測定し、筋電図積分値(iEMG)増加を筋疲労の指標とした。同様な測定を行った昨年度の若年女性の結果では、僧帽筋、三角筋、上腕二頭筋および脊柱起立筋に特異的に筋疲労が生じる傾向が見られたが、本年度の中年女性を対象者とした場合では、iEMG増加の個人差が大きく、対象者間で同一傾向を示さなかった。

また、同じ被検者を用い、車椅子-ベッドおよび車椅子-便座の往復移動をそれぞれ6回程度(約3分間)行わせ、その時の全身負担度を心拍数を指標として測定した。その結果、心拍数は約4050%HRreserveを示し、車椅子からの移動時に負担が大きいことが明らかとなった。主観的評価においても上肢に負担がかかることが示唆された。これらのことから、車椅子使用前に上肢を中心としたリハビリテーション看護プログラムが必要であると思われた。プログラムは、ベッド上で座位および臥位で実施可能なものとし、ストレッチングおよびゴムチューブを使用した筋力トレーニングが適当と判断して検討した。本研究は、整形外科病棟における下肢手術後の車椅子使用時に伴う疲労感や筋痛の軽減を目的にした上肢リハビリテーション看護プログラムを開発することが目的であった。我々は、平成9年度および10年度で得られた結果をもとに、上肢筋中心のリハビリテーション看護プログラムについて検討した。本年度の主たる目的は、開発したリハビリテーション看護プログラムを実際に患者を対象に行い、その評価を行うことであった。参加の同意を得た、人工膝関節置換術、骨きり術および人工股関節置換術の手術を行う5378歳までの女性患者8名(平均年齢65.9歳)に対して、上肢筋を中心に開発された4種類のリハビリテーション看護プログラム(セラバンドを用いた動的トレーニング)を術前3日から術後車椅子使用時まで1日23回行わせた。プログラム実施後、車椅子使用などを含めた主観的なアンケート調査を行い評価に用いた。その結果、開発されたリハビリテーション看護プログラムの評価として、実施は比較的容易でその効果を実感できた、とする者がほとんどであった。効果を実感できた理由としては、「車椅子へ乗るときに移動がスムースであった」「車椅子使用による筋痛がほとんどない」「自信を持って車椅子生活を送れた」「回復への意欲が高まった」などの回答が半数を占めた。これらのことから、本研究で開発されたリハビリテーション看護プログラムは臨床での活用が期待できると思われた。
グラフィックス処理のための視覚的自然さに関する感性工学的考察

グラフィックス処理の具体例として3次元メッシュによる曲面表示、および医用画像の一つである眼球血管画像について、感性工学的な立場から、視覚的な自然さとそれを表現する客観的な量としての「感性値」を定義し、感性値の多寡がどのように血管のパターン分類に影響するかについて考察を行った。また、人間が行う血管パターンの分類を計算機によって感性値にしたがって分類することにより、グラフィックス処理においても感性工学的な考察が重要であること確認したグラフィックス処理の具体例として3次元メッシュによる曲面表示、および医用画像の一つである眼球血管画像について、感性工学的な立場から、視覚的な自然さとそれを表現する客観的な量としての「感性値」を定義し、感性値の多寡がどのように血管のパターン分類に影響するかについて考察を行った。また、人間が行う血管パターンの分類を計算機によって感性値にしたがって分類することにより、グラフィックス処理においても感性工学的な考察が重要であること確認した本年度は形態測定学の標識点データを自動的に取得する方法の開発を行い、標識点データを自動取得した場合の、標識点位置の妥当性の評価に関する提案を行った。形態測定学は形状を標識点と呼ばれる点の集合で表わし、形状を統計学的手法で分析するための方法である。大量の標識点データを自動で取得できれば、複雑な形状を多変量として表わすことができ、感性分析による形状差と視覚的自然さとの関係分析に役立てることが出来る。ある点の集合が標識点データであるための条件の一つに、「それぞれの対応する点は、各対象形状の同じ部位に配置されていること(頂点位置の相同性)」ということがある。従来は主に手動で対応点を設定する必要があった。しかし、3次元車体形状のような滑らかな曲面の組み合わせで構成されている形状の場合、必要となる点が膨大となり、手動で設定することは事実上困難である。本年度の研究では、3次元車体形状を対象とし、「相同領域分割」という概念を導入し形状を構成する大まかな面に分割することで、形状の同じ部位を構成する面ごとに対応点の位置を自動的に取得する方法を開発した。この方法により、上記の条件を自動で満たすことができ、1,500点以上の標識点データを1分強で作成することが出来た。また、標識点データの妥当性評価に関しては、現在のところデータ作成者の目視による方法のみで、明確な基準が提案されていない。一方で、大量の点の位置を目視で評価することは困難である。そこで、同じ対象形状群から手動で取得した少数の標識点により表わした基準標識点データとの相関を調べることで、大量の標識点を使ったデータの妥当性を評価する方法を提案した。この評価法、および本研究法により作成された標識点データは、目視による頂点位置の相同性を確保した基準標識点データと同程度の頂点位置の相同性を持つと期待できる。21年度の研究成果を基にして、視覚的自然さを客観的に評価するための考察を広範に行なった。その中の一つとしては、解像度の異なる形状モデルに対して形状差の比較が可能な形状モデルの構築についての調査と考察が挙げられる。これは異なる解像度(異なる頂点数)で表現された形状差の比較は既存の形状分析法である形態測定学的方法では不可能であるためである。この問題に対して、メッシュラプラシアン行列の固有値分解によって得られる固有値と固有ベクトルに注目し、形状差のパラメータ化への応用について調査を行った。有限要素モデルに基づくメッシュラプラシアン行列の固有値列はShape-DNAとも呼ばれ形状探索などに応用されている。しかし、Shape-DNAは不可逆なパラメータ化であるため、サンプル間の形状差のパラメータ化はそのままでは不可能であり、付加情報を与えるなどのさらなる検討が必要である。一方、異なる解像度の形状モデルの形状差の比較方法として、CG分野の技術であるDisplacement mapを使った多重解像度表現が可能な簡素化メッシュモデル作成方法を開発した。この方法は、詳細なメッシュモデルから、簡素化メッシュモデルと詳細形状復元のためのDisplacement mapを同時に作成し、多重解像度表現可能はメッシュモデルを作成するものである。この形状モデルによって、一つの形状に対しては詳細形状の情報が含まれているDisplacement mapの分析により解像度の変化による形状差の比較が可能になり、解像度の違いによる視覚的自然さの評価に応用可能であると考えられる。また、異なる形状間で同一の簡素化メッシュモデルを共有することが出来れば、異なる形状間での異なる解像度による形状差比較も可能であると考えられる。[研究分担者担当分]本年度の研究において、頂点数・位相構造の異なるメッシュモデルの幾何学的な形状情報を2次元カラー画像に変換し、変換された画像を2次元フーリエ変換することで得られたフーリエ係数を、形状を表す多変量として形状分析を行う形状分析手法の提案を行った。メッシュモデルを2次元カラー画像に変換する際には3次元頂点の2次元平面パラメータ化を行うが、従来の方法では形態測定学の方法における比較部位の相同性が確保されない問題があった。そのため、比較部位の相同性問題を解決する拘束付き平面パラメータ化手法を提案した。本提案手法により、頂点数・位相構造が異なっていても、形態測定学の枠組みで3次元形状の分析を行うことが可能となる。また、フーリエ係数により形状を表現することで、対象形状の大まかな形状と詳細な形状を別々のパラメータで表現することができる。大まかな形状と詳細

形状を区別して表すことで、装飾的な要素を排除した形状分析など、形状表現の詳細度を考慮した形状分析が可能となり、物体表現の視覚的な自然さを、物体形状の局所的な要素からだけでなく巨視的な要素からも分析することができると考えられる。更に、本研究の主要なテーマである人間の感性を計算機によって模倣し、処理するということの具体的な例として、血管画像の分類(中国伝統医学にはこれを病気診断に用いているものも見られる)に適用し、人間が行う血管パターンの分類を計算機によってある程度シミュレーションすることに成功したことは、グラフィックス処理においても感性工学的な考察が重要であることを改めて確認できたことに等しい。
ヘテロ成長におけるローテーショナル・ツイン生成機構の解明とその制御

(111)面方位上のヘテロエピタキシャル成長におけるローテーショナルツインの制御をCaF_2/Si中心に検討を進め、昨年度開発したツインを抑制する2段階成長の機構の詳細な検討を進め、さらにこの方法で得られたヘテロ界面の構造に関する知見を得た。2段階成長法によるツインの抑制は、低温で形成する初期成長層の層厚が約8分子層程度の厚さがないと効果がないことがわかっていた。これは、初期層がこれより薄い場合は、成長初期にはツインがないタイプA成長であるものが、2段階目の高温成長に入る前の昇温時にその方位がツインのタイプBに回転するためであることを明らかにした。さらに、2段階成長の温度を逆転する逆2段階成長の実験から、タイプA成長がタイプB成長にたいして準安定状態であることを示した。また、X線CTR法を用いて、従来法でツインを生じたヘテロ界面と2段階成長で形成したツインの無いヘテロ界面の原子面間隔の観測から、前者ではFが一層欠落した原子配列をもった界面構造を形成していると結論した。これより、界面を高温で形成する従来法では、界面形成時にFの離脱が起こることによってツインとなるタイプB方位の安定な界面を形成するが、これを低温で形成する2段階成長の場合にはFの離脱は起こらずCaF_2のストイキオメトリーを保った状態で安定なタイプAの界面を形成するというモデルを提示した。
Bリンパ球アポトーシスおよび増殖調節におけるCdkインヒビターKip1分子の役割

B細胞株WEHI-231のsIg架橋によるG1期での細胞周期回転停止とアポトーシスはサイクリン依存性キナーゼインヒビターp27^<kip1>のアンチセンスオリゴにより阻害される。したがって、p27^<kip1>はsIg架橋による細胞周期回転停止とアポトーシスに関与する。また、細胞周期の停止がアポトーシスの誘因となると示唆される。マウス正常成熟B細胞においてもsIg架橋により、G1期での細胞周期回転の停止がアポトーシスに先駆けておこるので、細胞周期の停止がアポトーシスの誘因となる可能性が示唆される。この際に、G1サイクルの発現は上昇するが、p27^<kip1>の発現レベルは高い状態にあるので、p27^<kip1>が細胞周期の停止に関与すると示唆される。また、CD40シグナルはsIg架橋による正常B細胞の細胞周期停止とアポトーシスを阻害するが、この際、p27^<kip1>の発現レベルが低下する。したがって、正常B細胞においても、sIg架橋やCD40シグナルによる細胞周期回転やアポトーシスの調節において、p27^<kip1>が重要な役割を果すことが強く示唆される。NZBマウスなどの全身性自己免疫疾患自然発症マウスではsIg架橋によるアポトーシスに異常が見られるが、酸化ストレスなどによるアポトーシスは正常におこるので、アポトーシスの共通経路には異常がないと示唆される。さらに、自己免疫マウスのB細胞では、sIg架橋による細胞周期回転の停止はおこるので、細胞周期の停止がアポトーシスを引き起こす際の異常が示唆される。したがって、自己免疫マウスでのB細胞アポトーシス異常にはp27^<kip1>は関与しないと考えられる。
世界最高密度の新型超冷中性子源を用いた超対称性理論の研究

当初の目標を超え、パルス型加速器と中性子の同期収束を組み合わせた新しい原理を用いた世界最高密度の超冷中性子生成のための装置の提案を行い、J-PARCの直線加速器部分への配置と実際の実験提案に至ったことが最大の成果である。さらに技術開発のための超冷中性子のタービン型生成装置をJ-PARCに開発、実用に供することにも成功した。実験実現のための主要課題を抽出し研究開発の流れを作ることができた。本研究の目的は、現在阪大RCNPに敷設されている新型の超冷中性子(UCN)源の原理を用いた新しい中性子電気双極子能率(EDM)の測定のための開発・研究を行い、超対称性理論などの予言するEDMの値に感度を持つ新しい実験を詳細に検討、海外および特に東海村で運用が始まったJ-PARCにおいて世界最高密度のUCNを用いた新しい実験を提案することである。研究の基盤となるものは、(1)UCN源およびUCN輸送に関するシミュレーションを用いた定量的な評価、(2)中性子偏極に大きく影響を与える磁場配位の構築とその測定、(3)中性子輸送における効率的な光学輸送、(4)中性子検出器、である。平成20年度の研究において、RCNPのUCN源に関するシミュレーションをPSI研究所で開発されたGEANT4ベースの手法を改良することにより発生源内および輸送中における中性子捕獲反応、光学的反射、散乱の影響まで取り入れてできるようになった。中性子輸送光学に関しては、J-PARCのMLFのグループの知見を取り入れ、設計検討を開始した。中性子検出器に関しては、TPCをベースにした中性子検出器の検討を開始、データ収集方向に関しても波形を取りこんだDAQを完成させた。ラムゼー共鳴を用いたEDM測定装置の設計に関しては、プロトタイプの共鳴装置を構築し、データを収集するに至った。外部磁場遮蔽用のシールドを実製作し、磁場分布の精密測定を行い、当初予想していた磁場分布の解析に問題があることを見つけた。これらはH21年度に本格化する設計検討に大きく寄与する。これまでの研究成果は日本物理学会等で発表している。また、この目的を遂行するに当たって、広くこの分野の研究者の知見を集積するために自らが共同世話人となって中性子による基礎科学を目指す全国的な研究会を新しく立ち上げることができたことも大きな成果と言える本研究の目的は、加速器駆動型の中性子生成に新しい手法を導入することにより「世界最高密度の超冷中性子」生成の基盤技術を築き、超対称性理論の研究を格段に推し進めるための世界に先駆けた中性子の電気双極子能率(EDM)の測定実験を提案することである。平成21年度の研究において、J-PARCにおける実験の第一次の提案を公表するに至った。これは当初の予定を越える大きな進展である。研究実施はまず分野を横断した研究コミュニティーの創成を行い、KEK、JAEAや阪大・京大・東工大などの多くの研究者のアイデアを集約することに成功した。阪大RCNPでの知見およびJ-PARCのMLFでの低速中性子の実験手法を用い、まず基礎設計に着手し「Summary of the J-PARC UCN Taskforce」(arXiv:0907.0515)として公表した。次に、数値シミュレーションによるUCN生成炉・輸送系・実験感度の系統誤差の検討を進めるとともに、UCN測定器の研究のためにタービンによるUCN発生装置の試作機を作成し、平成22年度の研究のための準備を進めた。特に重要な発展としてパルス運転であることを最大限に利用した中性子収集のための特殊な輸送系の手法が発案された。この新しい手法を用いると建設中の東海村のJ-Parcを用いれば原理的にはこれまでの感度を2桁以上向上させることが可能であることが期待される。この新しい原理を用いた中性子の輸送・貯蔵を含めたUCN生成・輸送・測定装置の概念設計提案書を12月に完成させ、「Measurement of Neutron Electric Dipole Moment」(中性子基礎物理実験グループ(NOP)J-PARC・PAC-P33)として審査が開始された。研究内容および基本手法に関する高い評価を得ており、詳細提案に向けた課題の抽出に至った。本研究の目的は、加速器駆動型の中性子生成に新しい手法を導入することにより「世界最高密度の超冷中性子」生成の基盤技術を築き、超対称性理論の研究を格段に推し進めるための世界に先駆けた中性子の電気双極子能率(EDM)の測定実験を提案することである。新しい実験の全体構成と要素技術の開発の基礎となっている研究を進めた。東京大学およびKEK、京大、東工大、理研等、全国に跨る研究グループを共同で形成、実験計画および開発研究の具体的な検討を行い、既にJ-PARCにおいて世界最高強度のパルス型加速器である特性を最大限生かした世界最高密度のUCN源の原理および具体的な実験施設の提案をJ-PARCの審査会に正式提案した。系統誤差の評価方法、実験精度の研究、加速器駆動型のUCN発生装置、測定器構成をまとめ、最も本質的な3つの課題と最終的な測定感度の関係を明らかにしている。J-PARCのBLO5にタービンタイプのUCN源を製作・設置し、性能の確認に至った。

パルス型加速器であることを最大限用いたUCNの密度集積用の装置(Rebuncher)の設計を行い、実験を成立させるための3つの課題(輸送・圧縮・磁場計測)の研究手法を明確にすることができた。国際会議および国内での研究会議にて提案実験の全容を公開し、新しい手法に高い評価を得ている。Rebuncherの基盤となる構造体の準備、中性子反射測定による輸送の研究、系統誤差を減らすための磁気測定手法の提案、それらをまとめた実験に向けたR&D計画の具体化を行い、新規研究の方向を決定することに成功した。当初の予想を超え、パルス型加速器である利点を最大限に用いた更に密度の高いUCN源の提案を行うことができ、実現へ向けた具体的な要素技術開発の方向も定まったことは大変意義深い。
エナメル上皮腫におけるヘテロ接合性消失の検討

腫瘍の発生には癌関連遺伝子の遺伝的変化が重要であることが知られている。本研究では、代表的な歯原性腫瘍であり、いまだ決定的治療法のないエナメル上皮腫について、腫瘍特異的な癌抑制遺伝子の同定と解析を目的とし、ヘテロ接合性消失解析による広範な遺伝子レベルでの検索を行った。結果からは、エナメル上皮腫瘍の再発や顎骨侵襲性に関連する癌抑制遺伝子の存在が示唆され、同腫瘍の特異性を解明する一助となる成果が見られた。歯原性腫瘍特にエナメル上皮腫は,生物学的には良性とされているものの,顎骨侵襲能が高く,再発率が高い(15-75%)ことが知られている。さらに,再発エナメル上皮腫では細胞学的な悪性所見がみられ癌化する例が経験される。また,組織学的,細胞学的には悪性所見を示さす転移を起こす症例のあることが報告されている。本研究では,歯原性腫瘍特にエナメル上皮腫について解析し,腫瘍特異的な癌抑制遺伝子候補を同定,解析することを目的としている。平成19年度は本研究テーマの1年目であり,症例の選択と臨床病理学的解析を行った。その結果得られたエナメル上皮腫20症例についてパラフィンブロックからのDNA抽出を行いヘテロ接合性の消失解析(LOH解析)を行った。腫瘍組織の相同染色体(ヘテロ接合)の2本のDNAバンドのうち、1本において、正常組織のDNAバンドに比してバンド強度が50%以下の場合をLOHケースとして計測した。LOH解析に当たっては,本年度は特にINGファミリーに着目し,ING1, ING2, ING3, ING4, ING5に特異的なプライマーを作製し解析した。その結果,各INGファミリーメンバーによりLOH症例率には差が認められたものの,高率(約30-70%)にLOHが認められた。このことから,INGファミリー遺伝子の異常がエナメル上皮腫の発生に関与している可能性が考えられた。平成20年度は19年度の結果を踏まえ,症例数の増加およびマイクロダイセクションを用いたより詳細な解析を行う。また検索が可能な症例については,遺伝子変異の解析,および発現解析を行う予定である。【目的】エナメル上皮腫は生物学的には良性腫瘍とされるが、顎骨侵襲性が高く臨床的には準悪性として取り扱われる。本研究では、genome wideなスクリーニングを行い、同腫瘍に特異的な癌抑制遺伝子候補を同定、解析することを目的に、ヘテロ接合性消失(loss of heterozygosity: LOH)の検出による遺伝子レベルでの解析を行った。また、同腫瘍の発生や発育に関与するとされる分子について、免疫組織化学的手法を用いたタンパク発現レベルでの検討も行った。【結果】1.エナメル上皮腫におけるヘテロ接合性消失解析についてエナメル上皮腫において、有力な癌抑制遺伝子のひとつであるINGファミリーのヘテロ接合性消失が高頻度に出現していることが示され、臨床データとの比較検討から同遺伝子ファミリーが、エナメル上皮腫の浸潤性や再発に関与している可能性が示唆された。2.エナメル上皮腫の骨吸収に関与する分子の免疫組織化学的検討について骨吸収に関与する分子であるWntと、その抑制因子であるSFRPの発現を免疫組織化学的手法を用いて検討した。結果からは、腫瘍間質のタイプによってこれらの分子の発現パターンが異なり、骨吸収の動態との相関が示唆された。【考察】本研究では、広範な遺伝子レベルでの解析を世界で初めて行い、エナメル上皮腫の発生と進展に関わる癌抑制遺伝子候補が示された。また、腫瘍間質に注目して、エナメル上皮腫の骨吸収メカニズムについて考察した研究はこれまで報告がなく、独自性の高い研究成果と考えられる。これらの結果は、エナメル上皮腫の特異性を解明する一助となり、分子標的治療開発のための基礎研究として重要である。
パーフルオロケミカルを用いた腫瘍の局所酸素圧増強による放射線増感効果

(4)臨床面への応用;癌患者での局所PO×_2の変動:子宮癌、肺癌などの皮下転移巣を用い、PFCのPO×_2増加効果を調べた。PFCをi、v、に投与したのち、Carbogenを吸入して、PO×_2の変動を検査した。Carbogenのみの吸入では局所PO×_2は殆んど上昇しなかったが、PFC注入後、Carbogen吸入によりPO×_2の著明な上昇を見た。とくに15mmHgのPO×_2領域でも、部位によっては、著明なPO×_2の上昇が見られた。腫瘍内の低酸素細胞の存在が放射線抵抗性の主因であるといわれている.人工血液としてすでに使用されているPerfluorochemicals(PFCと略,実験には,これのemulsionである20%Fluosol-DAを使用)をCarbogen(95%O_2+5%CO_2)吸入下に用いてin vivoにおける放射線増感効果を調べた.(1)腫瘍局所PO_2の変動:実験腫瘍としてはRIF-1腫瘍を用い, 8-10mmになったものを使用した.局所腫瘍内酸素分圧測定には,ガラス微小電極を用い,ポーラログラフ法により測定した.一般に使用した腫瘍内のPO_2は, 025mmHgと低いが, Carbogen吸入により50mmHg前後に増加した.その時にFluosol-DAをone shotで尾静脈より注入し,経時的にPO_2を測定すると腫瘍の部位により種々異り, PO_2が急速にますものから,比較的にゆるやかに増加するものまで色々であった. Fluosol-DAのみではほとんど変化がみられなかった.腫瘍局所PO_2の色々の部位での平均をとると,腫瘍のみでは12.9mmHg, Carbogen吸入のみ39.4mmHg, Fluosol-DAのみ20.5mmHg, Fluosol-DA+Carbogen79.5mmHgとなった.(2)放射線増加効果;X線照射線量と腫瘍治癒率(%)との関係を調べた.Carbogen+Fluosol-DA群に放射線増感効果が認められ,これからTCD50(50%治癒線量)を求めた.一方,正常組織の障害として皮膚スコア法で調べた.増感効果は腫瘍に比べてきわめてわづかであることがわかった.以上について放射線増感率(dose modification factor;DMF)を求めた. Carbogenのみでは,皮膚反応は, DMF1.13±0.08であり, TCDSoは, 1.22でTherapentic Gain(TG)は, 1.08±0.08であった.しかし, Carbogen+Fluosol-DAでは皮膚反応はDMF1.15±0.12と小さく, TCD50では, 1.47となり, TGは1.28が得られた.腫癌内の低酸素細胞の存在が、放射線抵抗性の主因であるといわれている。人工血液として既に使用されているPerfluorochemical (PFCと略:実際にはこれのemulsionである20%FluosolDAを使用)をCarbogen (95%O_2+5%CO_2)吸入下に用い、放射線増感剤としての有効性を調べた。(1)臨床面への応用;a)癌患者での局所PO_2の変動:子宮癌、肺癌などの皮下転移巣を用い、PFCのPO_2増加効果を調べた。PFCをi,v,に投与したのち、Carbogenを吸入して、PO_2の変動を検査した。PO_2測定には、微小電極を用いポーラログラフ法により測定した。Carbogenのみの吸入では局所PO_2は殆ど上昇しなかったが、PFC注入後、Carbogen吸入によりPO_2の著明なPO_2の上昇が見られた。b)第II相臨床試験;放射線治療とPFCの併用による増感効果をPhaseIIStudyで検討した。治験の対象疾患として1)脳腫瘍、2)頭頸部腫瘍、3)肺癌、4)子宮癌の4つの研究グループに分け、各々2030施設がこれにあたっている。無投与群は、PFCは投与せず、酸素吸入と放射線治療を行い。投与群は、PFCを5ml/kg投与し、酸素吸入と放射線治療を行っている。(2)in vivoの実験;PFC+Carbogen+AngiotensinII併用の局所PO_2の変動:薬剤を腫瘍組織内に到達させるためにAGIIを併用した。大腿皮下(ラット)にAH109Aを移植して直径2.0になったのを用いた。腫瘍周辺部は、コントロールのPO_2は12.7±1.7mmHG、PFC使用群は20±3mmHGで両者は有意の差が見られた。更にAGIIを用いると26.3±4.2となり更に有意の増加となった。以上により、Carbogen吸入下にPFCを用いることにより、放射線増感効果を認めAGII併用で更にPO_2を増した。
DNAメチル化制御機構を標的にした新規精神疾患治療薬の創薬シーズの探索

BDNF遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化が精神疾患の発症に関与する可能性が示されている。本研究では、BDNF遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をNeuro2A細胞のゲノムに挿入することで、プロモーター領域のメチル化状態を簡便に評価できるアッセイ系を構築した。本アッセイ系は、BDNF遺伝子のプロモーター領域を脱メチル化できる創薬シーズを探索する際に有用である可能性が考えられる。本年度は、精神疾患との関連性が示唆される遺伝子であるbdnfのexon 4(bdnf4)に着目し、プロモーター領域500 bpの下流にレポーター遺伝子としてFirefly luciferaseを組み込んだpbdnf4-lucレポーターコンストラクトを作製した。現在、DNAのメチル化が転写活性に与える影響を解析するために、DNAメチル基転移酵素M.SssIとメチルドナーS-アデノシルメチオニンを用いて、作製したコンストラクトのDNAのメチル化を試みている。また、プラスミドを細胞内にトランスフェクションするだけではヌクレオソームを形成しないため、ヌクレオソームの構造変化を介したエピジェネティックな転写制御機構を評価することは不可能であると考えられる。そこで、pbdnf4-lucレポーターコンストラクトを組み込んだ組換えレンチウイルスベクターを作製し、神経芽細胞腫由来の株化細胞であるNeuro2Aのゲノムにインテグレートすることで、ヌクレオソームを形成することができるアッセイ系を構築した。一方で、コンストラクトをゲノムに組み込むことにより、DNAメチル基転移酵素M.SssIによるDNAのメチル化が不可能となるため、代替方法として、CMVプロモーターの下流にDNAメチル基転移酵素(DNMT1あるいはDNMT3a)のcDNAを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを作製し、DNAメチル基転移酵素の過剰発現を試みた。現在、DNAメチル基転移酵素の過剰発現によるコンストラクトのDNAのメチル化を解析している。精神疾患に関する遺伝子であるbdnfのDNAメチル化レベルを評価するため、人工的にメチル化した標的遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子を組み込んだルシフェラーゼアッセイの構築を進めている。同時に、今後の活性評価に使用するため、新たに植物エキスの作成や、含有成分の単離を行っている。DNAメチル基転移酵素M.SssIとメチルドナーS-アデノシルメチオニンを用いて、前年度までに作製したpbdnf4-lucレポーターコンストラクトのメチル化を行い、レポータージーンアッセイに供した。その結果、プロモーターのメチル化によりルシフェラーゼ活性、すなわち転写活性が減少することを確認した。本結果は、メチル化レポータープラスミドを用いることで、プロモーター脱メチル化活性を有する化合物をスクリーニングできる可能性を示すものである。また、pbdnf4-lucレポーターコンストラクトをゲノムに組み込んだ神経芽細胞腫由来株化細胞Neuro2Aにおける標的プロモーターのメチル化を試みた。DNAメチル基転移酵素の過剰発現やS-アデノシルメチオニンの添加等、様々な条件を検討したが、一定回数継代を重ねるのみで標的プロモーターのメチル化が効率よく亢進することを見出した。この標的プロモーターのメチル化が亢進した細胞ではルシフェラーゼ活性が著しく減少し、DNAメチル基転移酵素阻害剤である5-Aza-2'-deoxycytidineを添加することにより回復することを確認した。今回見られた標的プロモーターのメチル化の亢進は、外来遺伝子を不活性化する機構によるものだと考えられる。こうした機構によるDNAのメチル化においても脱メチル化が生じる可能性が示されたことから、5-Aza-2'-deoxycytidineをポジティブコントロールとして本アッセイ系を用いることで、プロモーター脱メチル化活性を有する化合物をスクリーニングできると考えられる。構築したアッセイ系を用いた活性評価の対象として、これまでに報告の少ないイリドイドを含有するモクセイ科、オオバコ科、ノウゼンカズラ科の植物エキスを作成すると共に、ヒノキ科植物よりビフラボノイドやリグナンなどのフェノール成分を単離構造決定した。精神疾患に関連する遺伝子bdnfのexon 4(bdnf4)のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだpbdnf4-lucレポーターコンストラクトを作製し、天然化合物の脱メチル化活性の評価法としてレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイとレポーター遺伝子をゲノムに組み込んだ細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを構築した。活性試験の評価対象としてモクセイ科、オオバコ科、ノウゼンカズラ科、ショウガ科、シソ科の植物エキス80種を作成すると共に、ヒノキ科植物よりビフラボノイドや新規リグナンなどのフェノール成分を単離構造決定した。本年度は、前年度までに作製したpBdnf4-lucを組み込んだNeuro2a細胞によるアッセイ系のバリデーションを試みた。前年度にポジティブコントロールの候補化合物として見出した5-Aza-2'-deoxycytidineを用いてSignal/Background ratio(S/B比)を測定したところ、試行毎にS/B比の変動が大きく、再現性の高いデータを得ることができなかった。これは、5-Aza-2'-deoxycytidineによるDNAの脱メチル化が細胞増殖に大きく依存する受動的な脱メチル化であるためだと考えられる。現在、再現性の高いアッセイ条件を探索するとともに、新たなポジティブコントロール候補の選定を行っている。また、細胞増殖に依存したDNA脱メチル化(受動的脱メチル化)活性を有する化合物では細胞増殖が見られない神経細胞に対して作用を示さない可能性が高く、神経細胞を標的とした化合物を探索する本研究の目的には合致しない。