hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
球脊髄性筋萎縮症に対するリュープリロレリン酢酸塩長期投与時の有効性評価

本研究において解明すべき「問い」は、神経変性疾患に対する疾患修飾療法(Disease-modifying therapy: DMT)の有効性が最も得られる患者層は何であるのか、であり、特に神経変性は進んでいるものの神経症状がわずかにしか出現していないprodromal(前駆)期の患者に対する有効性を明らかにする事が最も重要な目的である。名古屋大学神経内科が中心となり推進してきた医師主導治験の結果に基づいて、リュープロレリン酢酸塩(本薬)に「球脊髄性筋萎縮症(SBMA)の進行抑制」の効能が追加された。多くの神経変性疾患では、神経症状が顕在化する10年以上前からニューロン変性が進行することが明らかとなっており、未だ臨床的症状が明確になってはいない、いわゆるprodromal期にDMTを開始することがより適切であるとの議論が盛んになりつつある。そこで本研究では、現在までに進行したSBMA臨床研究を統合する新たな患者レジストリを確立し、それに登録された患者のうち、prodromal期のSBMA患者を対象として、リュープロレリン酢酸塩投与前後の運動機能変化、バイオマーカー変化を比較検討し、本薬長期投与時の効果を評価することを目的とする。名古屋大学神経内科では既に、目的が異なる複数の臨床観察研究を実施してきた。本研究では第一に、これらの臨床研究の臨床データを二次的に利用可能とする臨床研究を立案し、名古屋大学医学部生命倫理申請委員会からの承認を得た。さらに、これら複数の臨床観察結果も統合できるレジストリシステムを構築し、そこへのデータ格納を開始している。既存データを格納したうえで、引き続きデータ収集を継続することにより、上記目的を達する予定である。名古屋大学神経内科では、2006年から球脊髄性筋萎縮症(SBMA)に対する医師主導治験を、治験調整事務局を置く中心的な分担施設として実施してきた。SBMAは、本邦での罹患患者数が約2,000名程度と考えられている稀少疾患であるが、名古屋大学医学部附属病院に約200名程度が定期的に通院する等しており、その患者等を対象に、目的が異なる複数の臨床観察研究を実施してきた。本研究では第一に、これらの臨床研究の臨床データを二次的に利用可能とする臨床研究を立案し、名古屋大学医学部生命倫理申請委員会からの承認を得、さらに、これら複数の臨床観察結果も統合できるレジストリシステムを構築し、そこへのデータ格納を開始している。新たなレジストリシステムには、NU-Medの「電子連絡帳」を活用し、5つの異なった臨床研究におけるデータベース構造を変換し、1つの共通のデータベースとして格納するシステムを確立した。先述したように、2017年8月にリュープロレリン酢酸塩が「球脊髄性筋萎縮症の進行抑制」を効能として薬事承認を受けている。承認条件として、リュープロレリン酢酸塩を使用するすべての患者に対して、有効性・安全性の評価を実施することが付されており、現在多くのSBMA患者が当学大学病院等にて治療を受けている。リュープロレリン酢酸塩の実臨床下での有用性を検討し、特に有用と考えられる患者層を同定することは、本剤を使用する患者においてもその重要は認識されており、本研究への参加を妨げる状況にない。横断的検討については、本研究について当学関連病院も含めて広く周知しより多くの登録を進めていく。また、本剤の製造販売を担っている武田薬品工業が承認条件として付されている市販後の有効性・安全性の検討は、あくまでもリュープロレリン酢酸塩使用後の状況を調査するものであるのに対して、本研究のデータベースは、当該患者が本剤を使用する前から蓄積されているものである。同一被験者に対しても引き続き積極的にデータ収集を行い、より多くの縦断的データを蓄積する。

SBMAは、本邦での罹患患者数が約2,000名程度と考えられている稀少疾患であるが、名古屋大学医学部附属病院に約200名程度が定期的に通院する等しており、その患者等を対象に、目的が異なる複数の臨床観察研究を実施してきた。本研究では第一に、これらの臨床研究の臨床データを二次的に利用可能とする臨床研究を立案し、名古屋大学医学部生命倫理申請委員会からの承認を得、さらに、これら複数の臨床観察結果も統合できるレジストリシステムを構築し、そこへのデータ格納を開始している。新たなレジストリシステムには、NU-Medの「電子連絡帳」を活用し、5つの異なった臨床研究におけるデータベース構造を変換し、1つの共通のデータベースとして格納するシステムを確立した。既存データを格納したうえで、引き続きデータ収集を継続することにより、上記目的を達する予定である。先述したように、2017年8月にリュープロレリン酢酸塩が「球脊髄性筋萎縮症の進行抑制」を効能として薬事承認を受けている。承認条件として、リュープロレリン酢酸塩を使用するすべての患者に対して、有効性・安全性の評価を実施することが付されており、現在多くのSBMA患者が当学大学病院等にて治療を受けている。リュープロレリン酢酸塩の実臨床下での有用性を検討し、特に有用と考えられる患者層を同定することは、本剤を使用する患者においてもその重要は認識されており、本研究への参加を妨げる状況にない。横断的検討については、本研究について当学関連病院も含めて広く周知しより多くの登録を進めていく。また、本剤の製造販売を担っている武田薬品工業が承認条件として付されている市販後の有効性・安全性の検討は、あくまでもリュープロレリン酢酸塩使用後の状況を調査するものであるのに対して、本研究のデータベースは、当該患者が本剤を使用する前から蓄積されているものである。同一被験者に対しても引き続き積極的にデータ収集を行い、より多くの縦断的データを蓄積する。平成30年度でデータ入力者雇用を予定していたが、入力は研究協力者で行うことができ、予定していたメタボローム解析は、共同研究者からデータを得ることができたため、この経費を用いバイオマーカー用試薬に充当し、研究を進める。
相互作用描像による構造性多糖分子物性の真相究明

セルロースはD-グルコース残基を構成単位とする直鎖上の天然多糖である。分子間に形成される強固な水素結合のため、セルロースは非常に難溶性であるが、近年、数種のイオン液体がセルロースを非常によく溶解させるという報告がなされ、粘弾性やNMR測定からその溶液特性が盛んに検討されている。セルロースをはじめとする多くの多糖高分子は、溶液中でその高次構造や分子間/分子内相互作用が特異的な性質を発現させている。したがって、このような構造および相互作用の詳細を解明することが多糖分子物性において重要であり、多糖の特異性を活かした新規材料としての応用研究にもっながる。前年度には動的粘弾性と複屈折測定から、分子鎖のダイナミクスに相関がある動的なセグメントサイズ(Rouseセグメントサイズ)を求めた。今年度の研究では、動的および静的光散乱測定により、イオン液体を溶媒としたセルロース溶液の静的(幾何学的)セグメントサイズを決定した。ここで得られる幾何学的なサイズである静的なセグメントサイズと前年に求めた動的セグメント長との相関関係を調べ、セルロースの分子特性を議論した。セルロース溶解性イオン液体の多くは粘度が高く、また、不純物による蛍光を発するものもあり、光/X線散乱測定には適していない。したがって、光散乱測定に適したセルロース溶解性イオン液体を模索し、実験系を確立した。溶媒系をさまざま検討した結果、対アニオンがメチル酸エステルのイオン液体が低粘度かつ不純物による蛍光をフィルターで除去することができると分かった。これにより、これまで、ほぼ成功例のなかったセルロース/イオン液体系の光散乱測定が可能になった。この溶媒系による光散乱測定手法の確立は、今後のイオン液体/セルロース溶液特性研究を促進すると考えられる。測定結果から、上記1で求めたRouseセグメントサイズと矛盾しないKuhn長(14nm)が得られた。この値は、半剛直性分子として知られるセルロース分子鎖の特性を反映している。セルロース/イオン液体系における光散乱法の適用は本研究が初めての成功例である。また、前年度からの研究結果である動的セグメントサイズについての知見から、セルロースの静的セグメントと動的セグメントはほぼ一致することが分かった。この関係性は従来の高分子溶液の動的セグメントサイズに関する知見とは異なり、本研究は、単にセルロースの物性評価にとどまらず、高分子科学の基礎科学の発展にも大きく寄与するものとなった。さらに、上記の解析をアミロースおよびプルランにも適用し、幾何学的構造と動的剛直性の関係を明らかにした。これら屈曲的多糖類はセルロースにおける静的/動的セグメントの関係性とは大きく異なった。これにより、本研究目的である多糖高分子の静的剛直性とダイナミクスの相関性に関して知見を得ることに成功した。当初の予定では動的セグメント長のみの評価にて多糖物性を評価する予定であったが、静的セグメント長の評価にも成功したため、多糖の構造を評価するという目的を予定を上回り十分評価できた。セルロースについてはおおむね当初の目的を達成した。アミロース、プルランといったαグルカンについても大まかな知見は得られた。そこで、セルロース以外のβグルカン構造性多糖についても同様の評価を行い、多糖種について構造とダイナミクスについて系統的研究を行う。したがって、このような構造および相互作用の詳細を解明することが多糖分子物性において重要であり、多糖の特異性を活かした新規材料としての応用研究にもつながる。多糖の中でもセルロースは構造的に最も単純であり、他の構造性多糖分子の溶液特性を解明する上でも重要な端緒となることが見込まれる。これまでの研究により、セルロースの溶液特性においては、分子間および分子内に形成される水素結合による会合が重要な因子であるととが示唆されている。そこで本研究では、まず、動的粘弾性と複屈折の同時測定を行い、(1)分子間水素結合により影響を受ける分子鎖ダイナミクスと、(2)分子内水素結合により影響を受ける分子鎖の屈曲性について検討する。さらに、このような因子は、セルロースの生物学的由来および溶媒や温度によっても影響を受けるため、これらの因子について系統立てて検討すれば、セルロース溶解機構についても言及できる。我々はすでに上述の測定によって得られる応力光学係数(複屈折と応力の比;セグメントのサイズや屈曲性を反映)の値から、水酸基を置換し水素結合による会合を抑制したセルロース誘導体について粘弾性セグメントサイズを決定し、セルロース分子鎖の屈曲性の指標を得ることに成功している。これに照らし合わせ、今年度はイオン液体を溶媒としたセルロース溶液について応力光学係数およびセグメントサイズを決定し、セルロースの溶液中での動的剛直性についての指標を得た。その結果、イオン液体中ではセルロースは比較的屈曲的で、これまでに報告されている最小のセグメントサイズとほぼ同等の値であった。これはセルロースの分子間水素結合をイオン液体がよく切ることができるという可能性を示している。また、上記のような手法および解析をアミロースおよびプルランにも適応し、それぞれについてセグメントサイズを得ることに成功した。セグメントサイズは濃度依存性を持ち、ある濃度域まではそれぞれの多糖でその値に大きな差は見られないが、濃厚になるほどそれぞれの固有値を示すことが明らかになった。

分子間に形成される強固な水素結合のため、セルロースは非常に難溶性であるが、近年、数種のイオン液体がセルロースを非常によく溶解させるという報告がなされ、粘弾性やNMR測定からその溶液特性が盛んに検討されている。セルロースをはじめとする多くの多糖高分子は、溶液中でその高次構造や分子間/分子内相互作用が特異的な性質を発現させている。したがって、このような構造および相互作用の詳細を解明することが多糖分子物性において重要であり、多糖の特異性を活かした新規材料としての応用研究にもっながる。前年度には動的粘弾性と複屈折測定から、分子鎖のダイナミクスに相関がある動的なセグメントサイズ(Rouseセグメントサイズ)を求めた。今年度の研究では、動的および静的光散乱測定により、イオン液体を溶媒としたセルロース溶液の静的(幾何学的)セグメントサイズを決定した。ここで得られる幾何学的なサイズである静的なセグメントサイズと前年に求めた動的セグメント長との相関関係を調べ、セルロースの分子特性を議論した。セルロース溶解性イオン液体の多くは粘度が高く、また、不純物による蛍光を発するものもあり、光/X線散乱測定には適していない。したがって、光散乱測定に適したセルロース溶解性イオン液体を模索し、実験系を確立した。溶媒系をさまざま検討した結果、対アニオンがメチル酸エステルのイオン液体が低粘度かつ不純物による蛍光をフィルターで除去することができると分かった。これにより、これまで、ほぼ成功例のなかったセルロース/イオン液体系の光散乱測定が可能になった。この溶媒系による光散乱測定手法の確立は、今後のイオン液体/セルロース溶液特性研究を促進すると考えられる。測定結果から、上記1で求めたRouseセグメントサイズと矛盾しないKuhn長(14nm)が得られた。この値は、半剛直性分子として知られるセルロース分子鎖の特性を反映している。セルロース/イオン液体系における光散乱法の適用は本研究が初めての成功例である。また、前年度からの研究結果である動的セグメントサイズについての知見から、セルロースの静的セグメントと動的セグメントはほぼ一致することが分かった。この関係性は従来の高分子溶液の動的セグメントサイズに関する知見とは異なり、本研究は、単にセルロースの物性評価にとどまらず、高分子科学の基礎科学の発展にも大きく寄与するものとなった。さらに、上記の解析をアミロースおよびプルランにも適用し、幾何学的構造と動的剛直性の関係を明らかにした。これら屈曲的多糖類はセルロースにおける静的/動的セグメントの関係性とは大きく異なった。これにより、本研究目的である多糖高分子の静的剛直性とダイナミクスの相関性に関して知見を得ることに成功した。研究計画に記した主な今年度の目標は、イオン液体中セルロース、アミロースおよびプルランの溶解状態を粘弾性および流動複屈折の測定により得られるセグメントサイズで議論することであった。この目標は達成し、論文投稿は完了していないが、国内外のいくつかの学会で成果を発表することができた。
乳酸菌による新たな齲蝕発生メカニズムの解析

近年、小児の唾液中に存在する齲蝕原性細菌であるStreptococcus mutans菌数は減少する傾向にあり、齲蝕があるにも関わらず、S. mutansが検出されない小児が増加している。そこで、口腔内には、乳幼児の重度齲蝕において重要な位置を占めていると考えられている乳酸菌群が存在することから、本研究の目的は、乳酸菌が関連する新たな齲蝕発生メカニズムを明らかにすることである。岡山大学医歯薬学総合研究科倫理委員会承認のもと、岡山大学病院小児歯科を受診された患児のうち、齲蝕を認める患児の唾液を採取し乳酸菌を分離同定し、その齲蝕原性について検討を加えた。結果として乳酸菌単独では、スクロース依存性平滑面付着能はS. mutansと比較すると低下していたが、S. mutansと混合して培養した場合、乳酸菌単一で培養した時と比較して、付着率が有意に高くなった。また、バイオフィルムの構造を観察したところ、乳酸菌は固層表面に単独でもバイオフィルムを形成することが可能であることが明らかとなった。さらに、乳酸菌単一のバイオフィルと比較して、S. mutansと混合して培養した場合のバイオフィルムでは、密度が高くなり、高さも増加していた。そこで、培養中に乳酸菌を作用させたS. mutansから全RNAを抽出し、Real-Time Reverse transcription PCRにより、S mutansのグルカン合成酵素であるグルコシルトランスフェラーゼの発現を調べたところ、乳酸菌を作用させていないS. mutansと比較して有意に発現の上昇が認められた。これらのことから、乳酸菌の存在は、齲蝕の発生に大きく関与している可能性が示唆された。一方で口腔内より分離された乳酸菌のコラーゲン結合を調べたところ、S. mutansと比較してコラーゲン結合能が顕著に高い乳酸菌の存在が明らかとなった。この結果は、乳酸菌の存在は、象牙質齲蝕の進行に関連している可能性が示唆された。近年、S. nutansが検出されないにも関わらず、齲蝕に罹患している小児が増加している。これらの小児の口腔内細菌叢を調べたところ乳酸菌群が検出されることが明らかとなった。乳酸菌については、S. mutansを原因としない齲蝕の発症において検出されることが多く報告されているが、その齲蝕発症メカニズムについては不明な点が多い。本研究の目的は、小児口腔内から乳酸菌を分離し、用いることによって乳酸菌による齲蝕発生メカニズムを解析し、口腔内における乳酸菌のバイオフィルム形成への役割を明確にすることである。岡山大学医歯薬学総合研究科倫理委員会承認のもと、岡山大学病院小児歯科を受診された患児の齲蝕および健常部位よりプラークを採取し、乳酸菌の分離と同定を行った。これらの乳酸菌と、S. mutans MT8148株を用いて、スクロース依存性平滑面付着能およびバイオフィルム形成量の測定を行った。また2-コンパートメントシステムを用いてセルカルチャーインサート内で乳酸菌を、コンパニオンプレートにてS. mutansを同時に培養することにより、乳酸菌がS. mutansのスクロース依存性平滑面付着能に及ぼす影響について検討した。結果として、齲蝕部位から採取した全てのプラークから乳酸菌が分離されたが、健全部位からは30%の検出率であった。健全部位から検出された乳酸菌は、齲蝕部位から検出された乳酸菌と比較して、バイオフィルム形成量やスクロース依存性平滑面付着能が低下する傾向にあった。また乳酸菌を作用させて培養したS. mutans MT8148の付着率はS. mutans単独で培養した場合と比較して有意に上昇した。小児口腔内齲蝕部位から分離された乳酸菌は健全部位から分離された乳酸菌と比較して、付着率やバイオフィルム形成量の上昇が認められた。また、乳酸菌を作用させるとS. mutansの病原性が上昇したことから、乳酸菌の存在は齲蝕の進行に深く関与している可能性が示唆された。小児口腔内から、乳酸菌を分離することができた。それらの菌株を用いて生物学的特性を検討している。また、同一口腔内の齲蝕部位と健全部位からそれぞれ乳酸菌を分離し、それらの菌の生物学的特性を比較検討することによって乳酸菌による齲蝕発生メカニズムを検討している。

そこで、培養中に乳酸菌を作用させたS. mutansから全RNAを抽出し、Real-Time Reverse transcription PCRにより、S mutansのグルカン合成酵素であるグルコシルトランスフェラーゼの発現を調べたところ、乳酸菌を作用させていないS. mutansと比較して有意に発現の上昇が認められた。これらのことから、乳酸菌の存在は、齲蝕の発生に大きく関与している可能性が示唆された。一方で口腔内より分離された乳酸菌のコラーゲン結合を調べたところ、S. mutansと比較してコラーゲン結合能が顕著に高い乳酸菌の存在が明らかとなった。この結果は、乳酸菌の存在は、象牙質齲蝕の進行に関連している可能性が示唆された。これまでに分離された乳酸菌を用いて、乳酸菌の表層タンパクのプロファイリングを行うことにより、乳酸菌による齲蝕発生メカニズムを明らかにする。具体的には、2次元電気泳動を行って、齲蝕発生部位から分離された乳酸菌と健全部位から分離された乳酸菌とのタンパクの発現状態を比較検討し、齲蝕の発生に関連すると思われるタンパクを同定する。
咀嚼運動と自律神経系のクロストークの解明

Phox2bは自律神経中枢の発生に関与する転写因子の一種である。Phox2b陽性ニューロンは、咀嚼力制御に重要である三叉神経上核に密に存在する。そこで幼若期ラットの三叉神経上核に存在するPhox2b陽性ニューロンについて、電気生理学的特性および形態学的特性、さらに視床下部ニューロンが産生し摂食行動の誘発や覚醒レベルの上昇を起こすオレキシン投与の影響を調べた。実験には、Phox2b遺伝子の発現制御領域下に蛍光タンパク質EYFPを発現させたトランスジェニックラットを用い、in situ hybridizationにてPhox2b陽性ニューロンの神経伝達物質の種類を検索した。また、生後2-7日齢の同ラットの脳幹の前頭断スライス標本を作製し、パッチクランプ記録およびバイオサイチン注入によって記録したニューロン可視化し軸索の走行を解析した。その結果、Phox2b陽性ニューロンの大多数はグルタミン酸性ニューロンであるのに対し、Phox2b陰性ニューロンのほとんどはGABA性あるいはグリシン性ニューロンであった。また、Phox2b陽性ニューロンは自発発火を伴わない低頻度発火型ニューロンであるのに対し、陰性ニューロンは自発発火をともなう高頻度発火型ニューロンが多かった。さらに、Phox2b陽性ニューロンは陰性ニューロンと比較し三叉神経中脳路核から入力を受ける割合が低かった。一方、Phox2b陽性ニューロン、陰性ニューロンともに約半数が三叉神経運動核へ軸索を伸ばした。また、オレキシン投与で大多数のPhox2b陽性ニューロンが脱分極するのに対して、Phox2b陰性ニューロンでは脱分極が起きるものは少数であった。以上の結果から、Phox2b陽性ニューロンと陰性ニューロンは全く異なる特性を有し、吸啜や咀嚼を含む摂食行動の際の顎運動の調節に異なった関与の仕方をする可能性が示唆された。Phox2bは自律神経中枢の発生に関与する転写因子の一種であり、Phox2b陽性ニューロンは、咀嚼力制御に重要であると考えられている三叉神経上核を含む三叉神経運動核背側の網様体(以下RdVと略す)に密に存在することが知られている。そこで幼若期ラットのRdVに存在するPhox2b陽性ニューロンの電気生理学的特性および形態学的特性を調べた。実験には、Phox2b遺伝子の発現制御領域下に蛍光タンパク質EYFPを発現させたトランスジェニックラット(Phox2b-EYFPラット)を用い、in situ hybridizationにてPhox2b陽性ニューロンの神経伝達物質の種類を検索した。また、生後2-7日齢のPhox2b-EYFPラットの脳幹の前頭断スライス標本を作製し、Phox2b陽性ニューロンあるいは陰性ニューロンからパッチクランプ記録を行った。さらに、記録電極を介してバイオサイチンを記録したニューロン内へ注入してニューロンを可視化し軸索の走行を解析した。以上の結果から、Phox2b陽性ニューロンと陰性ニューロンは全く異なる特性を有し、吸啜や咀嚼を含む顎運動の調節に異なった関与の仕方をする可能性が示唆された。【研究実績の概要】に示したとおり、三叉神経上核に存在するPhox2b陽性ニューロンの電気生理学的および形態学的特性は、Phox2b陰性ニューロンとの比較もあわせて詳細に解析できた。ただし、Phox2b陽性ニューロン特異的に光感受性蛋白質のチャネルロドプシン2 (ChR2)あるいはアーキロドプシンTP009 (ArchT)を発現させたラットの作成に手間取っており、光遺伝学を利用した実験が遅れている。

さらに、Phox2b陽性ニューロンは陰性ニューロンと比較し三叉神経中脳路核から入力を受ける割合が低かった。一方、Phox2b陽性ニューロン、陰性ニューロンともに約半数が三叉神経運動核へ軸索を伸ばした。また、オレキシン投与で大多数のPhox2b陽性ニューロンが脱分極するのに対して、Phox2b陰性ニューロンでは脱分極が起きるものは少数であった。以上の結果から、Phox2b陽性ニューロンと陰性ニューロンは全く異なる特性を有し、吸啜や咀嚼を含む摂食行動の際の顎運動の調節に異なった関与の仕方をする可能性が示唆された。まず、Phox2b陽性ニューロン特異的にチャネルロドプシン2 (ChR2)あるいはアーキロドプシンTP009 (ArchT)を発現させたラットの作成の効率化を図る。さらに、超高感度タンパク質Ca2+センサー(GCaMP)をPhox2b陽性ニューロン特異的に発現させたラットを用い、同ニューロンの活動を蛍光Ca2+濃度変化として記録し、解析する。以下1、2に示すH29年度の実験計画を継続するとともに、新たに実験3を開始する。実験1.脳スライス標本上のChR2を発現させたPhox2b陽性ニューロンを光照射によって活動させて、閉口筋および開口筋運動ニューロンに対して興奮性と抑制性のどちらの出力を、各運動ニューロンに送るかを調べる。実験2.除脳ラット灌流標本を用い、錐体路の電気刺激によって咀嚼様運動を誘発する。光照射により、ChR2を活性化しPhox2b陽性ニューロンを強制的に活動させたとき、あるいはArchTを活性化し同ニューロンを抑制したときの、咀嚼様運動の変化を指標に、Phox2b陽性ニューロンが咀嚼に対して、促進的に働くか抑制的に働くかについて解析する。また、GCaMPによる蛍光Ca2+濃度変化を指標に、Phox2b陽性ニューロンの活動パターンと咀嚼様運動との関連を解析する。実験3.実験2.と同様に、光照射により、ChR2を活性化しPhox2b陽性ニューロンを強制的に活動させたとき、あるいはArchTを活性化し同ニューロンを抑制したときの、咀嚼運動の変化を指標に、Phox2b陽性ニューロンの咀嚼に対する影響を解析する。GCaMPによる蛍光Ca2+濃度変化を指標に、Phox2b陽性ニューロンの活動と咀嚼との関連を解析する。以上の実験結果を総合的に考察し、Phox2b陽性ニューロンの咀嚼運動と自律神経系のクロストークに対する役割の解明を目指す。平成29年度はPhox2b陽性ニューロン特異的に光感受性蛋白質のチャネルロドプシン2 (ChR2)あるいはアーキロドプシンTP009 (ArchT)を発現させたラットの作成に手間取り、光遺伝学を利用した実験が遅れため、平成29年度の使用額が当初の予定額より少なくなった。平成30年度は、平成29年度の遅れた分の研究計画に加えて光照射により、ChR2を活性化しPhox2b陽性ニューロンを強制的に活動させたとき、あるいはArchTを活性化し同ニューロンを抑制したときの、咀嚼運動の変化を指標に、Phox2b陽性ニューロンの咀嚼に対する影響を解析する。
医療依存度の高い患者を抱える家族の在宅継続を支援する看護者の臨床判断と介入方法の抽出

人工呼吸器・腹膜還流透析・HOT・胃医療依存度の高い在宅療養者とその家族への看護を行っている訪問看護ステーション所長・スタッフにインタビューした結果、看護者の行っている臨床判断として「療養者の身体症状の変化」「療養者のADL能力の変化」「介護者の健康状態」「介護者の介護力」「介護者の意欲」「生活状況の変化」「家族の経済状況の変化」があげられた。訪問看護師は、長期にわたって関わることで小さな変化をキャッチすることを重要視していた。そして医療依存度の高い療養者とその家族に対し、状況の改善や回復を望むのではなく、「安定した生活の持続」「日常性の維持」を目標に関わっており、悪化に対し予防的介入方法を用いることによって「変化しないこと」を肯定的に評価していることが明らかになった。訪問看護師の在宅継続を支援する介入方法は「予防的病状管理」「生活状況のモニタリング」「家族の主体性の尊車」「家族のエンパワメント」「家族のレスパイト支援」であった。数年数十年続く在宅療養者の身体状況や病状に対し、「拘縮予防」「誤嚥・肺炎予防」「褥瘡予防」といった「予防的病状管理」を行いながら、家族全体の「生活状況をモニタリング」し、何か変化があったときの対処法を選択する際には「家族の主体性を尊重」する関わりを行っていた。また、介護者の介護力・意欲を継続・向上できるよう「エンパワメント」しながら、必要時には、「家族のレスパイトを支援」していた。訪問看護師は、在宅継続を長期間のスパンで考え、療養者の入院については、家族の主体性を尊重し、家族がレスパイトする機会であると評価し、必ずしも在宅だけでの療養ではなく、入院その他のサービスを利用しながら継続することを支援している。在宅継続にとって介護者である家族の「レスパイト」は非常に重要な介入方法であるが、現在そのための資源は十分とは言えず、今後の課題であると考える。本年度は、医学中央雑誌へCNALによる文献検索を行い、「在宅療養の継続」「療養継続に関連する要因」「家族に対する看護師の臨床判断」についての概念の明確化と要素の抽出を行った。その上でインタビューガイドを作成し、以下の目的に沿って、臨床経験10年以上で、現在訪問看護に従事している看護師を対象に面接調査をおこなった。(1)在宅中心静脈栄養法および経腸栄養法を実施している家族に対して、看護者が家族看護を展開していくときに、どのような点についてアセスメントし、臨床判断を下しているかを明らかにする。(2)中心静脈栄養を実施している家族と経腸栄養法を実施している家族に対して、在宅療養継続要因、在宅療養阻害要因、それぞれの家族の力に関する看護者の臨床判断を明らかにする。(3)(2)で明らかになった療養継続要因、障害要因、家族の力に関して、どのような看護援助を行っているかを明らかにする。面接はすべて録音し、逐語録を作成している。事例ごとに逐語録から、家族看護におけるアセスメント、臨床判断、在宅継続の継続要因と阻害要因についての判断とそれに対する看護援助を抽出分類し、カテゴリー化を進めている。現在データ収集を続けると同時に、データ分析を進めている。平成15年度は、上記の結果を基に質問紙を作成し、一般の看護者が在宅療養を支える家族に対し、どのような臨床判断をしながら、どのような援助を行っているか、あるいは理想とする看護援助や必要な看護援助が行われていないかの実態調査と、それらの結果を基にしたガイドラインの作成を予定している。
マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルに基づく関節リウマチ原因遺伝子解析

関節リウマチ(RA)患者の軟骨及び滑膜を用いたDNAマイクロアレイ(Affymetrix社,HG-U133set)により健常対照に比し有意な発現の差を示したmRNAのうちgenome scanでの陽性領域上(1p32-1p36,1q32-1q42,2q34-2q35,3q27-3q29,4q13-4q24,5q11-5q14,6p22-6p25,6q15-6q23,8p22-8p23,9q33-9q34,12p11-12p12,14q13-14q24,16p11-16p13,16q12-16q23)に位置する83遺伝子をRA原因遺伝子の最重点候補遺伝子とし、遺伝統計解析を行った。その結果9遺伝子上の一塩基置換多型で有意な差を認めた。これらの遺伝子はRAにおける疾患原因遺伝子である可能性が高い。また本研究課題遂行の過程で多くの既知の疾患感受性遺伝子の追試を行った。この結果、日本人は白色人種におけるRAの遺伝的背景と必ずしも一致しないことが明らかとなった。例えば白色人種においてHLA領域外で最も関連が確からしいと考えられている遺伝子はPTPN22だが、日本人では全く関連が見られなかった。これに対し日本人で強く関連しているPADI4は白色人種では弱い関連しか認めないことが明らかになった。その他、日本人ではFCRL3、CTLA4のRAとの関連を追認できた。この結果は今回新たに同定した9つの疾患感受性遺伝子と合わせ、日本人RA患者における遺伝背景の全容解明に向けた大きな成果である。軟骨及び滑膜を用いたDNAマイクロアレイにより有意な発現の差を示す多くのmRNAを同定している。このうち既報のgenome scanでの陽性領域上に位置する83遺伝子を最重点候補遺伝子とした。患者試料として当施設で収集済みの約1300例、対照試料として健常成人約1000例を使用した患者対照研究を予定していたが、さらに患者試料の重症化を指標とした層別化を試み、重症例188例、非重症例188例、対照188例を用いたスクリーニングを行うこととした。これらは対照も含め全例女性とし、患者試料についてはseropositiveのものに限っている。SNP解析に用いる手法にはTaqMan法に基づくAssays-on-Demand、SNP Genotyping Products(アプライドバイオシステムズ社)を選択し、低コストかつハイスループットのタイピングを行っている。主な統計解析手法にはカイ二乗検定を用い、また必要に応じ、マンテルヘンツェル法によるメタ解析も使用している。これまでに6遺伝子、20SNPの統計解析を終えているが有意な差は得られていない。今年度中に最重点候補遺伝子上の200SNPsのスクリーニングとその結果得られる有力候補遺伝子については詳細な全例解析を行うことを予定している。新規疾患感受性遺伝子検索と合わせ、理化学研究所より関節リウマチの疾患感受性遺伝子として報告されたPAD14、SLC22A4、RUNX1について独立試料を用いた追試を行った。PAD14についてはイギリスから追認不可能との報告が出ていたが、患者対照研究及びイギリスの結果を合わせたメタ解析で有意な結果が得られ、真の疾患感受性遺伝子であることが示唆された。SLC22A4、RUNX1についてその関連が否定された。同じ遺伝的背景と生活習慣を共有する大規模な独立試料群を用いて追試を行うことは非常に意義がある。

軟骨及び滑膜を用いたDNAマイクロアレイにより有意な発現の差を示したmRNAのうちgenome scanでの陽性領域上に位置する83遺伝子を最重点候補遺伝子とし、一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングには患者試料の重症化を指標とした層別化を試み、重症例188例、非重症例188例の2群に分け、対照188例とともに関連解析に使用した。これらは対照も含め前例女性とし、患者試料についてはseropositiveのものに限っている。二次スクリーニングには患者試料として当施設で収集済みの1128例、対照試料として健常成人455例を使用した。当初対照試料には約1000例の使用を予定していたが、患者試料とsex matchさせた結果455例となった。二次スクリーニングでのSNP選択にはHapMapを利用した。SNP解析にはTaqMan法を用いた。主な統計解析手法にはカイ二乗検定及びフィッシャー直接確立検定を用いた。その他に並行して既知の疾患感受性遺伝子の追試を行っている。日本人は白色人種に対し異なる遺伝背景と生活習慣を有しているため、日本人の関節リウマチの遺伝背景を探ることは意義深い。これまでにCTLA4、PTPN22、CIITA、PDCD1の追試を行い、いずれも有意な関連を認めず、白色人種とは異なる疾患遺伝背景をもつことが示唆された。
ES細胞との細胞融合による体細胞核の初期化機構

研究の背景と目的)体細胞と胚性幹(ES)細胞の細胞融合という独創的な実験系を用いて体細胞核を未分化細胞様に再プログラム化(初期化)することに成功していた。当該研究では、細胞融合による体細胞核の多分化能獲得に関わるエピジェネティクス、特にクロマチン構造の変化から初期化機構の解明を目指して研究を進めてきた。結果)初期化を体細胞核クロマチン構造の変化として捉える目的で、マウス亜種間(Mus musculus domesticusとM. m. molossinus)で融合細胞を作製した。亜種間融合細胞ではDNA塩基配列多型によりDNAおよび転写産物の由来を決定することができる。細胞染色法やクロマチン免疫沈降法を用いて、細胞融合前後の体細胞核のクロマチン状態の変化をヒストンH3とH4のアセチル化およびH3のメチル化を目印に解析した。その結果、融合前の体細胞核はヒストンH3とH4の低アセチル化、H3の4番目リジン(K4)が低メチル化によって特徴づけられていた。一方、初期化された体細胞核では、ヒストンH3とH4の相対的高アセチル化、H3K4の高メチル化が目印となっていた。以上の結果から、初期化は、クロマチン構造の緩化による体細胞核記憶の消去と多能性幹細胞特異的エピジェネティクス(EPG)の獲得の少なくとも2段階プロセスからなる分子機構によると考えられた。多能性幹細胞特異的EPGの樹立重要な機能を果たすと考えられたNanog遺伝子の機能と発現調節機構をも明らかにした。特定研究の準備状況として、胚性幹(ES ; Embryonic Stem)細胞は細胞自身が多分化能や自己複製能をもつばかりでなく、体細胞の後生的修飾(EPG;エピジェネティクス)をES細胞様に書き換える、再プログラム化能をもつ事を細胞融合実験から明らかにした。本年度は、1)再プログラム化された体細胞核の分化能および2)再プログラム化の分子機構を明らかにする目的で研究を行った。1)体細胞核とES細胞核からの転写産物を区別する目的で、マウス亜種間での融合細胞を作製した。この融合細胞を体内または培養条件下で分化誘導し、体細胞核およびES細胞核からの遺伝子発現を解析した。その結果、ES細胞核と同様に、体細胞核からも分化組織特異的な遺伝子発現が観察され、その発現は元になった体細胞の種類に影響されず、分化した内・中・外胚葉組織に特異的であった。細胞分化に伴い、再プログラム化体細胞核はES細胞核と同様に機能できることが明らかになった。2)再プログラム化機構を探る目的で、ES細胞との細胞融合前後でのヒストンテール修飾の変化を追跡した。その結果、多分化能獲得に伴いヒストンH3およびH4のアセチル化の亢進、ヒストンH3-K4のメチル化の亢進が観察された。このことは、全体的に体細胞ではきついクロマチン構造が再プログラム化に伴い緩いクロマチン構造に変化したことを示している。我々は、再プログラム化の第1段階として体細胞のEPG記憶の消去(緩いクロマチンの構成)、続く多能性幹細胞特異的なEPG記憶の確立というモデルを提唱している。特に、消去の機構を明らかにする目的で次年度も研究を続ける予定である。
ロバスト性を考慮したポートフォリオとリスク計測手法の研究

リスク資産の変動過程に関して、我々は真のモデルを知ることはできないため、モデル選択においては常に不確実性が付き纏う。本研究では、このモデル選択の不確実性に起因する損失をできるだけ回避して最良のポートフォリオを構築する方法とそのリスク計測手法を探求した。その応用として、年金基金や投資信託、ヘッジファンド等の中長期投資で、このような動的でロバスト最適な投資戦略の構成法と実践法を示した。年金基金や保険会社のように特徴的な負債構造をもつ場合の資産運用、金融機関におけるデリバティブを含む市場性資産のリスク管理では、将来の給付、保険金の支払いに備えた最悪シナリオを避ける頑健な長期投資戦略の策定とその効率的計算方法の確立、選択したリスク管理・計測手法の妥当性、モデルリスクの考察が実務的,社会的観点から重要である。本研究では、以下の3点、(1)ロバスト・ポートフォリオとその年金、保険等への応用、(2)多期間ポートフォリオ問題の近似解法とロバスト性、(3)デリバティブ資産のマーケットリスク計測におけるモデルリスク、に焦点を当てて研究を進める計画を立てた。(1)に関しては、長期運用で重要なインフレリスクを考慮し、特に、わが国の特異な金利市場(ゼロ金利とその解除、そして物価連動国債の発行された債券市場、デフレ経済下での実質・名目金利形成等)に適合した名目、実質金利の期間構造を構築し、明示的に連続時間のロバスト最適化問題の中に取り込んだ。そして、株式、債券、物価連動債からなるポートフォリオのロバストな最適投資戦略の構築方法を研究し、その研究成果を日本ファイナンス学会で報告した。更に、年金基金のオールターナティブ投資の一環で、ヘッジファンド等に投資することがあるが、そのリスク・リターン構造を明らかにするため、ヘッジファンドの運用手法の一つであるコンバージェンス・トレーディングに関する理論研究を行った。上記と同様のロバスト投資戦略の枠組みで、最適投資戦略の構築に関して、スプレッドの収斂先が完全に観測可能とした完全情報の場合とそうではなく観測不可能とした部分情報の場合とでそれぞれ分析し、日本金融・証券計量・工学学会でその研究成果を発表した。(2)に関しては、Brandt=Santa-Clara(2006)による多期間ポートフォリオ問題の数学的な定式化と近似解法の可能性について、期中の消費を考慮した場合の理論的研究を進めた。今年、その成果を纏める予定である。(3)に関しては、研究分担者の一人が平成19年10月に民間に転出し、研究分担者からはずれたため、(3)の研究の進展はなかった。しかし、(1)の研究成果から、デリバティブのモデルリスクを考慮したプライシングに関して、効用関数を用いたロバストな確実性等価原理を用いた評価が可能であることがわかってきた。平成19年度の研究成果を発展させて、平成20年度には、ロバスト・ポートフォリオとモデルリスクに関する計量モデルに関して以下の4点の研究成果を挙げた。(1)債券ポートフォリオ運用への適用:イールドカーブ上の複数個のミスプライシングが解消することを利用する連続時間の動的ロバスト・コンバージェンス取引戦略の構成法について研究。アフィン型の確率金利モデル、相対エントロピー、確率微分効用、Bellman方程式などの概念を用いた。(2)流動性リスク:投資家、マーケット・メーカーの探索・交渉理論に基づく証券の流動性リスクプレミアムに新たにモデルの不確実性を考慮した計量モデルを提案した。(3)代理投資と直接投資問題:年金基金や投資信託、ヘッジファンド等の運用は、投資家(委託者)とファンドマネージャー(代理人)との間の契約に基づく代理投資であり、両者の情報の非対称性により、エージェンシー問題を抱えている。リスク鋭感的確率制御で使われる目的関数を、モデルの不確実性を考慮したロバスト版に拡張し、プリンシパル-エージェント理論の枠組みで、ファンドマネージャーの最適報酬や、平均回帰性のある危険資産に対する最適投資戦略を研究した。(4) managed portfolioの考え方を用いて、多期間ポートフォリオ問題をunconditionalな問題で近似できることを示した。unconditonalな問題とすることで、資産収益率の動的変化をモデル化する必要がなくなるため、モデルリスクの軽減につながる。現在、論文をまとめている最中である。その他、リスク計測手法の啓蒙のため、Duffie and Singletonの単行本の翻訳「クレジットリスク」を行った。
ＭＩＺＡＲ数学ライブラリの構築と大学数学向け高度遠隔教育用コンテンツ開発

Mizarシステムは形式化記述された定理証明の正しさを機械的に検証するプルーフチェッカーと呼ばれるソフトウェアである.申請者らは,これを用いた数学定理の形式化研究とそのライブラリ編纂を行う国際プロジェクトを推進してきたが,その成果を教育に利用するためe-learning用のCMSにこのMizarシステムを組み込むモジュールを試作し,大学院教育でその試験運用も進めてきた.本研究ではその成果をもとに,e-learningによる論理思考,数理的思考訓練の実用システムとその教材開発を行った。これは「学生の論理思考能力の育成」という高等教育の深刻な課題の一つに有効な解決手段の提供するものになっている.Mizarシステムは形式化記述された定理証明の正しさを機械的に検証するプルーフチェッカーと呼ばれるソフトウェアである.申請者らは,これを用いた数学定理の形式化研究とそのライブラリ編纂を行う国際プロジェクトを推進してきたが,その成果を教育に利用するためe-learning用のCMSにこのMizarシステムを組み込むモジュールを試作し,大学院教育でその試験運用も進めてきた.本研究ではその成果をもとに,e-learningによる論理思考,数理的思考訓練の実用システムとその教材開発を行った。これは「学生の論理思考能力の育成」という高等教育の深刻な課題の一つに有効な解決手段の提供するものになっている.師玉,和崎らは多変数関数,複素関数の微積分学に関する教材を作成するため,先ずそれらを構成する基礎定理とその証明の形式化記述を行い,その成果を専門学会論文誌Formalized Mathematics(以下F.M.と略記)に公表した。それと並行してその形式化記述を利用して,e-Learning用コースマネージメントシステムMoodleにMizarシステムを組み込んだシステム(以下Mizar-Moodleシステムと略記)により教材作成を作成した。同様に岡崎,山崎,和崎,カワモトらは線形代数学,離散数学,初等幾何に関する教材作成するため,同様に基礎定理とその証明の形式化記述を行ない,その成果をF.M.に公表,併せて上記Mizar-Moodleシステム上で教材を作成した。特に暗号論については,DES暗号システムの数学的正当性についての詳細な形式化記述を行ない,これと整数論の初等的な内容に関する教材をMizar-Moodleシステムにより作成した。開発された上記の教材群はhttp://cai2.cs.shinshu-u.ac.jP/mizar/moodle/で閲覧できる。集合論については,ポーランドの研究者らの協力を得て,集合演算や2項関係に関する教材を作成した。上記教材作成による論理思考訓練システムの構築と検証を行なうため,特に証明チェック時のエラーログから,学生の弱点等を抽出可能とする仕組みの検討,遠隔教育,ブレンディング教育上実用に供するかどうかの確認を行なうため,信州大学情報工学科・情報工学専攻で実際に教材として試用を開始した。特に和崎は,今後これらの教材システムを大規模人数の教育に用いる場合に備え,学習成果を自動収集するエージェントベースシステムの開発にまで考察を進めた。23年度は,22年度に作成したe-Learning用コースマネジメントシステムMoodleにMizarシステムを組み込んだ(以下Mizar-Moodle系と略記)論理思考訓練システムの改良および教材コンテンツの追加を行った.師玉らは22年度に引き続き,多変数関数,複素関数の微積分学に関する定理とその証明の形式化記述を行い,その成果を専門学会誌論文誌Formalized Mathematics(以下F.M.と略記)に公表し,その成果をもとに教材コンテンツを作成した.同様に岡崎,山崎,和崎,カワモトらは代数学,離散数学,初等幾何に関する教材作成するため,同様に基礎定理とその証明の形式化記述を行ない,その成果をF.M.に公表した.その成果の一部を上記Mizar-Moodle系上で教材を作成した.特に暗号理論については,公開鍵暗号に利用される有限体上の楕円曲線ついての詳細な形式化記述を行なった.楕円曲線の形式化は暗号理論に限らず,代数学,幾何学においても重要なコンテンツとして利用できる.開発された上記の教材群はで閲覧できる.さらに,和崎らを中心に,教材システムを大規模人数の教育に用いて学習成果を自動収集するエージェントベースシステムの開発を進めた.上記Mizar-Moodle系においてこの学習成果を自動収集するシステムを運用するための準備として,他の形式検証システムを用いて実運用を行い,システムの評価を行い,その成果を複数の国際会議にて発表した.本年度はこの課題の計画の最終年度であり,これまでに形式化・教材化したものを整理・体系化するとともに,それによるe-learning教材システムを申請者が所属する大学の学科の全学部学生,専攻の修士課程全学生を対象に運用,実証実験を行ないシステムの改善を行なった.これと並行して申請者らが主催した定理証明支援系の研究会や国際学会等でその研究成果公表を行った.本システムや手法の紹介,専門研究者との意見交換などによりシステムの改善,さらには利用普及促進の方策を検討した.申請者が開発した証明記述問題と計算機によるチェックを利用した論理思考訓練用の教材システムとその手法は,数学,情報工学に限らず,工学全般,さらには証明記述などを通じの論理思考訓練が必要な学術分野の教育に広く適用可能である.また教育機関所属の学生に限らず,企業技術者の訓練にも有効と考えられるためこれへの展開を目指してその準備を進めた.その教材の土台になる数学定理の形式化ライブラリ構築については昨年度に引き続きその充実化を進めた.

解析系では多変数関数の微積分,微分方程式論,関数空間論に関する基本定理を,代数系ではZ-加群や有限アーベル群,工学系では広範囲に利用され重要な最適化理論,離散系数学では,木構造を含むグラフ理論,数論アルゴリズム,さらには暗号などの計算機処理プログラムの動作の形式手法による正当性検証法などの研究を展開した.申請者らが所属する大学では,全学的な汎用のe-learningシステムが既に稼働しており,申請者らが開発した手法やシステムをこの全学システムにプラグインとして組み込むために必要な諸作業を行なった.さらに,上記のe-learningシステムはCMSとし広く利用されるオープンソースウェアのMoodleをもとに作成されているので,他機関への本教材システムの提供を行うための準備も行った.Mizarは形式化記述された数学定理証明の正しさを機械的に検証するソフトウエアである.申請者らは,本研究課題でこれを用いた数学ライブラリの構築と大学数学向けの教材開発,それをe-learning用CMSに組み込んで実用する実証実験を行なってきた。24年度は,前年度までに作成した教材コンテンツを用いて,論理思考,数理的思考訓練の実用システムを実際の授業で使用し評価,改善を行った.特に多数利用者の同時接続可能なシステムのスケーラビリティ検証と実運用ならびに運用実績に基づくシステム改善を行った.また,運用実績をもとに,教材のコンテンツ改良も行った.それらの成果はe-learning関連の学会などで公表した.さらに,研究目的を達成するため23年度に引き続き以下のライブラリ開発と教材化を行った.(1)多変数関数,ノルム空間上の関数の微積分やルベーグ積分論などの命題群の形式化,それらを基にした教材の作成を作成した.関数解析関連では閉グラフ定理や写像定理さらに連続微分可能な関数による関数空間など基礎的な形式化ライブラリの作成を行なった.(2)離散数学系,暗号,アルゴリズム,並列処理等の形式化ライブラリ作成と教材の作成,23年度までに作成した教材の改良を行なった.代数系では有限群や巡回群の基礎定理,拡張ユークリッド互除法や,中国人剰余定理に関する数論アルゴリズム,また暗号については,DES暗号システムやAES暗号システムの暗号化,復号アルゴリズム,さらに,Z-加群や楕円曲線論の基礎までの形式化ライブラリを作成した.ペトリネットや並列処理回路動作の形式化と検証等を行なった.(3)線形代数学に関するライブラリ作成とそれを用いた教材を行なった.特に,情報工学分野に関連し,これの数理形態学的手法画像処理への応用やBOOLE変数の多重対から構成される線形空間に関してのライブラリ充実も図った.ライブラリの作成,およびその教材化が順調に進んでいる.さらに教材用サーバの整備,強化を行い,本学において実際の授業(受講者が数十から百人規模を想定)での運用を行う準備が整ったことからも,おおむね順調に進展していると判断される.25年度が最終年度であるため、記入しない。大学数学の形式化
生殖質形成に関わる新規因子の解析

細胞の極性は,しばしばmRNAの細胞質内局在によって確立される。ショウジョウバエ卵の生殖質形成過程は,RNA局在研究の理想的モデル系の1つである。生殖質因子の一つであるVasaとGFPとの融合蛋白質を発現する系統を用いて,生殖質形成が異常となる突然変異体を多数単離した。これらの内の1つは,エンドソーム蛋白質であるRabenosyn-5の突然変異であった。詳細な解析により, Rabenosyn-5等のエンドソーム蛋白質が, Fアクチンの再編成を通して,生殖質因子の卵皮層への係留に関与していることを明らかにした。細胞の極性は,しばしばmRNAの細胞室内局在によって確立される。ショウジョウバエ卵形成過程では,oskar(osk)mRNAが卵母細胞後極に局在することにより生殖質が形成される。osk mRNAは2つのアイソフォーム(long Oskとshort Osk)を作り出すことが知られている。Short Oskは様々な生殖質因子をリクルートすることに機能する。一方,long OskはFアクチン系を制御すると共に生殖質因子の卵母細胞後極皮層への係留に必要であることが知られている。しかし,これらOskの持つ分子機能についてはよく分かっていない。我々は,生殖質因子の一つであるVasaとGFPとの融合蛋白質を発現する系統を用いて,生殖質形成が異常となる突然変異体を多数単離した。これらの内の1つは,エンドソーム膜輸送因子(Rab5)のエフェクター蛋白質であるRabenosyn5(Rbsn5)の突然変異であった。詳細な解析により,Rbsn5は微小管系の極性維持に必要であり,生殖質形成は微小管極性の異常により2次的に引き起こされていることを明らかにした。一方,Rbsn5を初めとするエンドソーム蛋白質が後極に局在する事,long Oskの卵母細胞前極への異所的発現によって前極にリクルートされることを見いだした。さらに,rbsn5を欠く卵母細胞でOskを前極に発現させると,本来皮層に係留されるはずの生殖質因子が,Fアクチンの凝集体と共に細胞質中に拡散することを明らかにした。すなわち,long Oskはエンドソーム経路を介したFアクチン系の制御を通して,生殖質因子を卵母細胞皮層に係留していると考えられた。mRNA局在は,神経細胞を初めとして広く体細胞でも観察される現象であることから,このような膜輸送系を介したmRNA局在による細胞極性制御機構は普遍的である可能性がある。ショウジョウバエ卵形成過程における生殖質アッセンブリーは,mRNA局在・係留機構の解析の良いモデル系の一つである。この過程では,oskar(osk)を始めとする様々なmRNAが卵母細胞後極に集積し,Fアクチン系の制御のもと,後極皮層に係留される。しかし,それら分子機構はまだよく分かっていない。我々は,生殖質をGFPで可視化することの出来るGFP-Vasa系統を利用した突然変異体スクリーニングにより,生殖質形成が異常となる系統を66単離している。そして,現在までに54系統が12遺伝子座のアリルであることを明らかにしている。本年度は,これら突然変異系統の解析を進めた結果,(1)アクチン重合に関わるCappuccino,Spireが,osk mRNAの後極への輸送・局在ばかりでなく生殖質因子の係留にも必要であること,(2)エンドソーム輸送系因子が,出芽酵母Mon2のホロモグであるCG8683と共に生殖質因子の係留に機能していること,(3)エンドソーム-Mon2経路の下流でCappuccino,Spireが関わっていることを見いだした。前年度までの研究から,long Oskアイソフォームがエンドソーム経路の活性化を介してFアクチン系を制御し,生殖質因子の係留に関わっていることを明らかにしてきた。本年度の研究は,今までの理解を飛躍的に前進させる可能性を秘めており,細胞極性確立,mRNA局在過程における膜輸送系と細胞骨格系との連携制御の一端を明らかにした点で重要な成果である。今後,研究を進め,さらに詳細な分子メカニズム解明を目指す予定である。