hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時空間構造を有する機能性ソフト界面の創製

本年度は基礎的な知見の蓄積にとどまらず、成果発信についてもより積極的に努めた。一定条件下で自律的に表面物性が変化する機能性ソフト界面に関する研究を中心に原著論文化を進め、Science Advances誌やSmall誌において成果を発表した。特に前者は東京大学の研究に関する広報サイトであるUTokyo Researchでもハイライトされ、国内外の研究者から大きな注目を集めた。第30回独創性をひらく先端技術大賞におけるフジテレビジョン賞の受賞は一般の新聞にも掲載され、一連の研究成果は各種媒体において取り上げられた。これらは研究成果の一般社会への還元という観点からも重要な成果発信であった。さらに、高分子修飾表面における反応拡散系についてさらなる知見を得ることができ、今後も大きな展開が期待される。具体的には、化学反応基質(硝酸、臭素酸ナトリウム、マロン酸)の濃度を系統的に変化させ、振動周期に及ぼす影響を調査した。その結果、各反応基質濃度に対する振動周期の依存性を明らかにすることができ、さらに基板固定しないフリーポリマー系や架橋構造を有するゲル微粒子系と比較してその依存性が異なることが示唆された。また、界面に修飾した高分子鎖の挙動について、電界効果型トランジスタを用いて温度応答性高分子の相転移挙動のリアルタイム検出が可能であることを見出した。総じて、採用最終年度である本年度も、さらにアクティビティーを高めて研究成果の蓄積と発信を行うことができた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究提案は化学振動反応とカップリングして自律的に高分子修飾表面の特性が変化する新しい機能性ソフト界面を創製するものである。本年度の研究内容としては当初の研究計画書に基づき、自律的に種々の物性変化を発現する新規機能性ソフト界面(自励振動ポリマーブラシ表面)に関する基礎検討を行った。SI-ATRP法を用いて鎖長・修飾密度が異なる自励振動ポリマーブラシ表面を系統的に調製し、効果的な振動反応が生起する表面の設計を試みた。調製した種々の自励振動ポリマーブラシ表面の振動特性を蛍光観察を用いて行った。その結果、表面に固定化する金属触媒の固定量が少な過ぎる場合にはBZ反応自体が生起せず、多すぎる場合には基質の消費速度が速いため振動持続時間が短くなった。すなわち、自励振動ポリマーブラシ表面において安定な振動を得るためには適切な設計が存在するということが示唆された。また、自励振動ポリマーブラシの膨潤・収縮挙動はQCM-Dを用いて評価した。以上の研究成果は国内外の学会で発表を行うとともに、現在、査読付き学会誌への投稿準備を行っている。また、今回設計したポリマーブラシと類似の組成を有するゲルを調製したところ、生体温度付近における体積振動にも成功した。本研究は生化学分野への応用を長期的な目標に据えており、生体温度での自励振動高分子(ゲル)の駆動に成功したことは、バイオマテリアルとしての応用を考慮しても重要な結果であると考えられる。さらに、当初の計画を超えて、イオン液体を用いた化学振動反応と高分子の力学的振動をカップリングさせることにも成功した。イオン液体をはじめとする関連する分野との融合した展開も期待される。本研究は化学振動反応とカップリングして自律的に高分子修飾表面の特性が変化する新しい機能性ソフト界面(自励振動ポリマーブラシ表面)を創製するものである。採用二年目である本年度は、これまでに確立した自励振動ポリマーブラシ表面の設計を基盤として、時空間機能の制御、具体的にはポリマーブラシ表面を伝播する化学反応波の方向制御を中心に検討を行った。化学反応波の方向制御を実現する設計として傾斜構造を有するポリマーブラシ表面が有効であると予測し、犠牲アノードATRPを利用して目的の高分子修飾表面を調製した。表面の構造解析はXPSによる表面元素分析と、蛍光顕微鏡による振動反応の触媒Ru(bpy)3の分布を観察することで行った。振動反応を観察したところ、誘導期間の後、Ru(bpy)3の固定量が少ない領域から多い領域に向けて安定な化学反応波がした。すなわち傾斜構造を有する自励振動ポリマーブラシ表面を調製することで、Ru(bpy)3の固定量が少ない領域から多い領域に向けた化学反応波が生起することが明らかになった。上記の研究結果は査読付き研究論文への投稿準備中であり、2016年5月の高分子学会年次大会において発表を予定している。また、自励振動ポリマーブラシ表面における化学反応波の伝播方向制御に関する他の試みとして、反応場の形状制御が考えられる。フォトリソグラフィーを利用したパターン化まで成功しており、現在、振動特性について評価を行っている。また当初の研究計画のみならず、イオン液体をはじめとする関連する分野との融合についても本年度はプロトン性イオン液体を用いたBZ反応によるゲルの体積振動を実現するに至っており、自律機能材料や高分子ゲルの設計に対しても大きな波及効果を生み出している。これまで受入研究室が蓄積してきた自己組織化に関する知見と、特別研究員が東京女子医科大学先端生命医科学研究所との共同研究を通して研鑽してきた高分子表面の精密設計技術が融合し、初年度から引き続き高いアクティビティーで研究を行うことができた。

研究業績としては、学会誌等への査読付き研究論文発表が1報(筆頭著者)、総説1報(筆頭著者)、国際学会発表が1件、国内学会発表が8件と積極的な研究成果発表に努めた。また、2016年1月のインテリジェント材料・システムシンポジウムでは口頭発表において奨励賞を受賞しており、本研究成果は学会においても高い評価を受けているといえる。本年度は基礎的な知見の蓄積にとどまらず、成果発信についてもより積極的に努めた。一定条件下で自律的に表面物性が変化する機能性ソフト界面に関する研究を中心に原著論文化を進め、Science Advances誌やSmall誌において成果を発表した。特に前者は東京大学の研究に関する広報サイトであるUTokyo Researchでもハイライトされ、国内外の研究者から大きな注目を集めた。第30回独創性をひらく先端技術大賞におけるフジテレビジョン賞の受賞は一般の新聞にも掲載され、一連の研究成果は各種媒体において取り上げられた。これらは研究成果の一般社会への還元という観点からも重要な成果発信であった。さらに、高分子修飾表面における反応拡散系についてさらなる知見を得ることができ、今後も大きな展開が期待される。具体的には、化学反応基質(硝酸、臭素酸ナトリウム、マロン酸)の濃度を系統的に変化させ、振動周期に及ぼす影響を調査した。その結果、各反応基質濃度に対する振動周期の依存性を明らかにすることができ、さらに基板固定しないフリーポリマー系や架橋構造を有するゲル微粒子系と比較してその依存性が異なることが示唆された。また、界面に修飾した高分子鎖の挙動について、電界効果型トランジスタを用いて温度応答性高分子の相転移挙動のリアルタイム検出が可能であることを見出した。総じて、採用最終年度である本年度も、さらにアクティビティーを高めて研究成果の蓄積と発信を行うことができた。本研究提案は化学振動反応とカップリングして自律的に高分子修飾表面の特性が変化する新しい機能性ソフト界面を創製するものである。採用一年目の本年度は、当初の研究計画を中心に行い、研究論文発表も1件掲載されるに至った。目的の界面の設計を確立するとともに、生体温度での自励振動高分子(ゲル)の駆動にも成功した。これらは、バイオマテリアルとしての応用のような今後の展開を鑑みても、基礎検討の段階ではあるが重要な結果である。さらに当初の計画を超えて、イオン液体を用いた化学振動反応と高分子の力学的振動をカップリングさせることにも成功した。特別研究員による高分子の精密設計に関する研究により、当研究室がこれまで開拓してきた自律機能材料において新たな展開が生まれつつある。最終年度はこれまでに得られた知見を集積し、実際の物質輸送・流体挙動制御や細胞培養システムへの展開を行う予定である。物質輸送システムについては、輸送対象となる微粒子と自励振動ポリマーブラシ表面との相互作用を光ピンセットを用いて評価することで、輸送の指針を立てる。また、BZ反応下における微粒子の挙動観察を行うことで輸送能の評価を行う。
医学研究における研究参加者個人のゲノム情報の通知に伴う倫理的問題に関する研究

本研究では、ヒトの全ゲノム解析を伴う医学研究における研究参加者個人へのゲノム情報の通知の在り方を検討することを目的に、文献調査及び国内の研究グループの動向調査を行った。1)全ゲノム配列の解析を伴う研究における倫理的課題を検討する際の枠組みが抽出され、また、2)国内外の研究コミュニティにおいて実際に研究参加者に通知すべき具体的な遺伝情報の検討や実践が蓄積されつつあること、並びに3)研究対象者の家族への影響についても検討すべきことが明らかとなった。各論点の評価は、将来的な解析技術の向上とゲノム医療の実用化の状況に応じて変わることから、今後も研究におけるゲノム情報の取扱い方を検討し続ける必要がある。本研究の目的は、ヒトの全ゲノム配列を用いて行う国内外の医学研究において、研究参加者個人へのゲノム情報の通知がどのように行われているかを明らかにし、今後の医学研究におけるゲノム情報の取扱いについて、望ましい通知の在り方を提示することである。平成26年度は、文献調査を通じて全ゲノム配列の解析を伴う研究における倫理的課題を整理した。その結果、1.研究参加者本人への事前の説明と同意、2.研究に使用するデータの範囲と結果の通知範囲、3.研究終了後のデータの使用/公開の範囲、4.家族への影響と事前の説明の必要性、という4つの枠組みが抽出された。特に、現在多くの雑誌が、学術論文の投稿に際し事前に塩基配列をデータベースに登録することを義務づけていることから、個々の研究における解析結果と同時に、ゲノムおよびその解析結果の公開に関する問題が重要であった。ゲノム配列は一生不変であることから、一度公開されれば、現在は明らかになっていない疾患との関連遺伝子が、将来研究が進むことによって明らかになる場合や、同意の撤回が不可能な場合も考えられる。さらに、公開されたデータから個人が特定される可能性も考えられ、プライバシーの保護も慎重に検討されなければならない。研究を実施するには、参加者からの十分な理解に基づく同意が必要だが、そもそも上述のようなゲノム研究における問題の複雑さを参加者が「十分に理解」できるかどうかが課題であり、理解を助ける、あるいは確認する方策が必要と考えられた。たとえば、個人の全ゲノム配列(遺伝型・表現型含む)を収集、解析、公開するPersonal Genome Projectでは、研究参加者はオンライン上のテストに回答し、全問正解した場合にのみインフォームド・コンセントのための説明を受けることが可能という工夫が取られていた。平成27年度は、医学研究における研究参加者個人のゲノム情報を通知(提供)する際の内容、方法、特に配慮すべき点について文献調査を通じて検討した。また、臨床医療における全ゲノム解析結果の返却について文献調査によって動向を把握し参考とした。臨床医療においては、米国臨床遺伝学会(American College of Medical Genetics and Genomics)が2013年に、患者の全ゲノムシークエンスを行った場合に検査機関が医療者に伝えるべき二次的所見(検査を発注した目的とは直接関係のない結果)として、56遺伝子のリストを発表するなど、個人のゲノム情報の積極的な通知についての議論があった。一方で研究においては、ゲノム情報の通知についての議論および実証研究が蓄積されてきていた。検討の結果、現時点においては、研究参加時の説明文書に記載していない限り、研究者は研究参加者個人のゲノム情報を積極的に通知する義務を負わないと考えられた。しかし将来的に、研究で実施される全ゲノム解析の分析的妥当性が向上し、解釈基準が統一され臨床的な有用性が高まり、かつ臨床におけるゲノム情報の活用が拡大・普及した際には、通知によってもたらされる利益とリスクが変化することから、より良い通知の在り方は、科学技術の発展に応じて継続して検討し続けるべきと考えられた。さらに、研究参加者個人のゲノム情報は参加者の家族(血縁者)にも共有されることから、家族への通知およびその影響に関しても検討を行った。その結果、家族に対する通知に関して検討すべき論点として、研究者が家族に負う責任の範囲、研究対象者の希望の尊重およびプライバシー保護、家族の範囲(代理人等)、許容されうる例外状況、研究対象者の死後、対象者が未成年の場合、が挙げられた。今後、日本の医学研究の文脈においてこれらの論点を検討する必要がある。全ゲノム解析を伴う研究における倫理的課題を整理することができ、当初の研究計画の前半を達成したと考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。生命・医療倫理学、研究倫理、公衆衛生学平成26年度に行った論点整理をもとに、実際の全ヒトゲノム解析研究を伴う研究における結果開示の方針についての調査を実施し、最終的に望ましいと考える方法を提示する。なお、当初の予定では研究者を対象とする質問票調査を検討していたが、予算の都合上困難であると判断されることから文献調査に変更する。
血管新生阻害薬によるたん白尿発現メカニズム解明と副作用回避法の研究

当初、研究実施計画としていたベバシズマブ(BEV)投与による蛋白尿発現のラットモデルを作成することはできなかったため、研究の方向を転換し、血管内細胞から産生され腎障害関連ペプチドとして知られるエンドセリン(ET-1)に着目して実験を行うこととた。ヒト臍帯静脈内皮細胞では、ET-1発現がVEGF受容体を介した機構によって制御されていることが報告されている。しかし、BEVによるET-1発現への影響はこれまでに検討されておらず、蛋白尿発現に関連する腎糸球体内細胞におけるVEGFの関与も不明である。そこで、ヒト腎糸球体内皮細胞を用い、ET-1発現に及ぼすBEVの影響および作用メカニズムについて検討することとした。これまでにヒト腎糸球体内皮細胞の初代培養系の確立、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いたET-1mRNA発現量およびタンパクの定量系の確立を行い、ET-1mRNA発現量に対するベバシズマブの影響の評価を行った。30年度は、ヒト腎糸球体内皮細胞においてVEGF処理によってET-1のタンパクレベルで減少すること、この抑制はBEVまたはVEGF受容体の下流にあるシグナル伝達の主要経路であるPI3K/AKTの阻害剤処理によって消失することを確認した。ET-1遺伝子の転写活性を制御する転写因子であるFOXO1はリン酸化を受けることで核内から細胞質に移行し、ET-1産生を転写レベルで抑制することが報告されている。そこで、VEGFのFOXO1に及ぼす影響を検討した。その結果、VEGF処理によってリン酸化FOXO1タンパクレベルで減少することを確認した。さらに、この反応はVEGF処理によるET-1タンパクと同様に,BEVまたはPI3K/AKT阻害剤により消失することを確認した。これらの結果からVEGFはFOXO-1を介した転写レベルの制御機構により、ET-1産生を調節していることが示唆された。当該年度当初は、ベバシズマブ投与による蛋白尿誘発モデルラットの作成を行った。試行を行ったものの我々の実験では、ベバシズマブ投与による蛋白尿発現のラットモデルを作成することはできなかった。そこで、実験の方向を転換し、血管内細胞から産生され腎障害関連ペプチドとして知られるエンドセリンに着目して、たん白尿の発現のメカニズム解明の実験を行うこととした。引き続き、エンドセリン発現に及ぼすVEGFおよびベバシズマブの作用メカニズムを検討するため、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いた実験を継続する。エンドセリン発現に対するVEGFのオートクライン機構関与の評価、アンジオテンシンや拮抗薬との関連性を評価し、シグナルのクロストーク、エンドセリン発現の抑制の検討から、蛋白尿発現の回避(腎保護)の検討を行う。ベバシズマブは、93%ヒトIgG1由来と7%マウス抗体由来のヒト化モノクローナル抗体であり、種特異性が問題となる可能性がある。ベバシズマブ投与による蛋白尿誘発モデルマウスの作成に関しては、ベバシズマブ5mg/kgを1週間で5回投与することで、著明な蛋白尿や血清クレアチニン上昇などの腎機能低下を認めた先行研究がある。ベバシズマブ(5-50mg/kg、週2回)を投与したSDラットでは、コントロールと比較して尿中蛋白量に有意な差を見つけることができなかった。試行を行ったのの我々の実験では、ベバシズマブ投与による蛋白尿発現のラットモデルを作成することはできなかった。実験の方向を転換し、血管内細胞から産生され腎障害関連ペプチドとして知られるエンドセリンに着目して実験を行うこととした。ヒト臍帯静脈内皮細胞では、エンドセリンの発現がVEGF受容体を介した機構によって制御されていることが報告されている。しかし、ベバシズマブによるエンドセリン発現への影響はこれまでに検討されておらず、腎糸球体内細胞におけるVEGFの関与も不明である。そこで、ヒト腎糸球体内皮細胞を用い、エンドセリン発現に及ぼすベバシズマブの影響および作用メカニズムについて検討することとした。ヒト腎糸球体内皮細胞の初代培養系の確立、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いたエンドセリンmRNA発現量の定量系の確立を行い、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いたエンドセリンmRNA発現量に対するベバシズマブの影響の評価を行った。そこで、実験の方向を転換し、血管内細胞から産生され腎障害関連ペプチドとして知られるエンドセリンに着目して実験を行うこととした。これまでにヒト腎糸球体内皮細胞の初代培養系の確立、ヒト腎糸球体

内皮細胞を用いたET-1mRNA発現量およびタンパクの定量系の確立を行い、ET-1mRNA発現量に対するベバシズマブの影響の評価を行った。30年度は、ヒト腎糸球体内皮細胞においてVEGF処理によってET-1のタンパクレベルで減少すること、この抑制はBEVまたはVEGF受容体の下流にあるシグナル伝達の主要経路であるPI3K/AKTの阻害剤処理によって消失することを確認した。ET-1遺伝子の転写活性を制御する転写因子であるFOXO1はリン酸化を受けることで核内から細胞質に移行し、ET-1産生を転写レベルで抑制することが報告されている。そこで、VEGFのFOXO1に及ぼす影響を検討した。その結果、VEGF処理によってリン酸化FOXO1タンパクレベルで減少することを確認した。さらに、この反応はVEGF処理によるET-1タンパクと同様に,BEVまたはPI3K/AKT阻害剤により消失することを確認した。これらの結果からVEGFはFOXO-1を介した転写レベルの制御機構により、ET-1産生を調節していることが示唆された。当該年度当初は、ベバシズマブ投与による蛋白尿誘発モデルラットの作成を行った。試行を行ったものの我々の実験では、ベバシズマブ投与による蛋白尿発現のラットモデルを作成することはできなかった。そこで、実験の方向を転換し、血管内細胞から産生され腎障害関連ペプチドとして知られるエンドセリンに着目して、たん白尿の発現のメカニズム解明の実験を行うこととした。引き続き、エンドセリン発現に及ぼすベバシズマブの作用メカニズムを検討するため、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いた実験を継続する。エンドセリンmRNA発現量に対するVEGFの影響の評価、エンドセリン発現に対するBEVとVEGF同時処理の影響の評価、エンドセリン発現に対するVEGFのオートクライン機構関与の評価を行う。引き続き、エンドセリン発現に及ぼすVEGFおよびベバシズマブの作用メカニズムを検討するため、ヒト腎糸球体内皮細胞を用いた実験を継続する。エンドセリン発現に対するVEGFのオートクライン機構関与の評価、アンジオテンシンや拮抗薬との関連性を評価し、シグナルのクロストーク、エンドセリン発現の抑制の検討から、蛋白尿発現の回避(腎保護)の検討を行う。研究成果発表のための旅費等を計上していたが、使用していなかったために次年度使用額が生じた。これを来年度に持ち越し、研究成果発表につなげたい。当該年度に物品購入が当初の予定より、超過し前倒し支払いを請求した。その後、物品の購入をやや控えたため。また、研究成果発表のための旅費等を計上していたが、使用しなかったため、次年度使用額が発生した。これを次年度に持ち越し、適正に使用し、研究成果の発表に繋げたい。
PINK1とParkinの解析による、パーキンソン病の発症メカニズムの解明

パーキンソン病(PD)の原因遺伝子産物PINK1とParkinの解析によるPDの発症メカニズムの研究において、ミトコンドリア品質に関わる両タンパク質の機能に注目が集まっている。PINK1はタンパク質リン酸化酵素、Parkinはユビキチン連結酵素(E3)として知られている。PINK1とParkinの作動機構や神経細胞での機能発現に関しては不明な点が残されている。今年度の研究では、PINK1がミトコンドリア膜電位の低下した不良ミトコンドリア上で複合体を形成することで、PINK1の分子間リン酸化が促進することが示唆された。また、この複合体形成は多くのPD患者由来の変異体PINK1で、異常が生じていることが示された。このPINK1の複合体形成とリン酸化による活性化はParkinのリン酸化を引き起こし、Parkinの不良ミトコンドリアへの局在化と活性化を促進する。この時のParkinの活性化はRBR型E3に見られる特徴的な様式であり、自身のシステイン残基を仲介しながらユビキチンを基質へ付加していた。これまでに、Parkinの不良ミトコンドリアへのユビキチン化はユビキチン認識タンパク質(p62, VCP)をリクルートすることが知られている。さらに今年度の研究でVCPのリクルートにはVCPのコファクターが必要であることとVCPの疾患関連変異がミトコンドリアへの局在化の阻害を受けていることが明らかとなった。一方で、PINK1とParkinの翻訳後修飾やシステインを介したParkinの活性化機構はマウス由来の初代神経細胞でも再現された。(抄録なし)(抄録なし)PINK1とParkinの解析によるパーキンソン病の発症メカニズムの研究において,近年,世界中でミトコンドリア品質に関わる解析に注目が集まっている.PINK1とParkinはパーキンソン病の原因遺伝子として同定され,精力的に研究されたことで遺伝学的な関係が明らかにされた一方,その分子メカニズムには不明な点が多く残されている.研究代表者はミトコンドリア膜電位低下時のPINK1の分子量の変化に気付き,PINK1の翻訳後修飾に着目した.PINK1がキナーゼであることから,自己リン酸化による制御を受けている可能性をリン酸基アフィニティーゲル電気泳動により検証した.予想通り,PINK1は膜電位の低下に伴い明瞭にリン酸化を受けていることが明らかになった.さらに,PINK1のキナーゼ活性の無い変異体ではこのリン酸化を検出することができなかった,また,このリン酸化は分子間で引き起こされることが分かり,PINK1の自己リン酸化が示された.加えて,パーキンソン病の患者から同定されたPINK1の変異により,PINK1の自己リン酸化の異常を認めることができた.次に,このリン酸化サイトの同定を試みた.LC-MS/MS解析とアミノ酸置換による変異体解析からリン酸化サイトの同定に成功した.このサイトをアラニンに置換しリン酸化されないようにすることでParkinの不良ミトコンドリアへの局在変化は観察されなくなる一方で,酸性アミノ酸への置換によりリン酸化を模倣することでParkinの局在変化を回復することができた.興味深いことに,このサイトは進化的にも保存されていた.これらのことから,ミトコンドリア膜電位低下によるPINK1の自己リン酸化がParkinによるミトコンドリア品質管理機構に非常に重要であることを示した.(論文投稿中)パーキンソン病は国内でも患者数が非常に多い神経変性疾患の1つである.PINK1とPARKINはこれまでにパーキンソン病の原因遺伝子として同定されている.本研究ではPINK1とParkinの正常な機能を理解することで,その機能破綻に伴う疾患の発症メカニズムの理解を目的としている.これまでに研究代表者はPINK1がParkinを膜電位の低下した不良ミトコンドリアに局在化させ,そのミトコンドリアを処理する機能があることを示してきた.一方で,PINK1がParkinを局在化させるメカニズムについては詳しく分っていなかった.本年度の研究においてPINK1がミトコンドリアの膜電位低下に伴い,自己リン酸化を引き起こすことがParkinの局在変化に重要であることを明らかにした.さらに患者由来の変異体ではこの機能に異常が生じており,その重要性が伺える.また,これまで不良ミトコンドリアの処理にはPINK1の「量」による制御が重要であると考えられていたが,本研究により「質」の変化も重要であることが明らかとなった.一方で,今回の解析結果から,今後PINK1のリン酸化抗体を作成することで不良ミトコンドリアをモニターできると考えられ,非常に有用な情報を得ることができた.また,LC-MS/MS,細胞生物学と生化学を用いた解析によりParkinの基質が複数の存在している可能性が示唆された.加えて,Parkinの活性化の分子メカニズムに関わる解析にも着手しており,PINK1依存的なParkinのリン酸化とチオエステル中間体を介したユニークな活性化が重要であることを示した(論文投稿中).パーキンソン病(PD)の原因遺伝子産物PINK1とParkinの解析によるPDの発症メカニズムの研究において、ミトコンドリア品質に関わる両タンパク質の機能に注目が集まっている。

また、この複合体形成は多くのPD患者由来の変異体PINK1で、異常が生じていることが示された。このPINK1の複合体形成とリン酸化による活性化はParkinのリン酸化を引き起こし、Parkinの不良ミトコンドリアへの局在化と活性化を促進する。この時のParkinの活性化はRBR型E3に見られる特徴的な様式であり、自身のシステイン残基を仲介しながらユビキチンを基質へ付加していた。これまでに、Parkinの不良ミトコンドリアへのユビキチン化はユビキチン認識タンパク質(p62, VCP)をリクルートすることが知られている。さらに今年度の研究でVCPのリクルートにはVCPのコファクターが必要であることとVCPの疾患関連変異がミトコンドリアへの局在化の阻害を受けていることが明らかとなった。一方で、PINK1とParkinの翻訳後修飾やシステインを介したParkinの活性化機構はマウス由来の初代神経細胞でも再現された。研究代表者は現在,(1)PINK1のミトコンドリアへの局在化のメカニズム,(2)PINK1によるParkinの局在制御メカニズム,(3)Parkinによるミトコンドリア品質の制御の役割を解析している.(1),(3)に関しては計画通りに進展しており,(2)に関して論文投稿中であり計画以上の進展が見られた.研究代表者は以前にPINK1の「量」の制御を明らかにしているが,さらにリン酸化という「質」の制御を明らかにした.このことはParkinの局在変化を理解するうえで重要であることが明らかになった.一方で,Parkinの内在性基質の同定を目指して研究を行ってきた.その結果,これまで報告のある複数の基質と同時に新規の基質としてヘキソキナーゼ1を同定し報告を行った.さらに,PINK1によるリン酸化を介したParkinの活性化の分子メカニズムを解析し,現在投稿中である.従って,PINK1の活性化メカニズムが明らかになったことで当初予定していた以上の結果が得られており,計画以上に進展している.(抄録なし)研究実績で述べたPINK1のリン酸化がどのように重要であるか,まだ,詳細な解析を行なう必要がある.キナーゼのリン酸化は活性に影響を与える可能性があるので,PINK1精製蛋白質を用いた活性測定を行なう必要があると考えられる.研究代表者はParkinの基質とミトコンドリアの運命についても解析を行なっているが,現在,培養細胞における内在性Parkinによってユビキチン化を受ける基質を複数同定するに至っている.一方で,これまで過剰発現のParkinによりユビキチン化されたミトコンドリアはオートファジーにより処理されるのみであるとされてきたが,最近ではその他にも外膜蛋白質の分解や外膜の断裂ミトコンドリアの輸送など複数の現象が報告され混沌としている.今後はこれらの現象を踏まえて,内在性のPINK1とParkinによるミトコンドリアへの影響を慎重に検討して行く必要が生じて来た.
高密度分散型光動力発生機構の開発

本研究ではMEMS分野で現在広く実施されている光放射圧を用いた研究を,実用可能なものにするための新しい取り組みを提案している.従来の高NA対物レンズを用いた作業領域に比べて複雑かつ三次元構造の大きな光学系を作業領域上方に設置する必要のない,2次元平面内に収めることのできる光の反射現象を用いた高密度分散型動力発生機構の開発を目指している.平成22年度においては,研究実施計画にもとづき,光導波路をシリコンウエハ上に作製し,同時に作製したローターフレーム内で,表面を白金コートしたシリカ球(直径4μm)のレーザー照射による回転特性を解析した.この結果に基づいて,入力パワーと回転特性を明らかとし,ローターの回転に伴う発生トルクを検討した.上記回転力検出実験とともに,光導波路をシリコン基板上にSiO_2によって張り巡らせる技術の開発を同時に進めた.前年度より懸案であった軸付ローターについては,高分子材料であるパリレンによる製作技術を確立し,軸に発生する摩擦の軽減を図る構造を検討した.この結果として,前年度からの取り組みであった単体としての「光駆動によるモーター」製作を光導波路よりレーザー光を照射することのできる状況を確立した.平成22年度に掲げた研究計画ほぼ達成することができた.本研究ではMEMS分野で現在広く実施されている光放射圧を用いた研究を,実用可能なものにするための新しい取り組みを提案している.従来の高NA対物レンズを用いた作業領域に比べて複雑かつ三次元構造の大きな光学系を作業領域上方に設置する必要のない,2次元平面内に収めることのできる光の反射現象を用いた高密度分散型動力発生機構の開発を目指している.平成20年度においては,研究実施計画にもとづき,本研究室が保有する基本技術を「光駆動によるモーター」開発の基礎データとして利用できるように整理した.また,「光駆動によるモーター」の心臓部となる「軸つきローターならびにケーシング」製作のためのシリコンプロセス技術を開発した.このローターの製作は,東京大学藤田研究室において開発されている「静電気力モーター」製作における直径100μmのローター製作技術を本研究で開発する軸つきローター製作技術へ置き換えることによって行うこととしている.したがって,本年度は本研究の最終目標である直径40μmのローター製作技術開発のために,直径100μmのローター製作技術を実機による製作のためのレシピーを完成させ,さらに,シリコンプロセスシミュレーターを用いて,直径40μmのローター製作レシピーとして完成させた.この製作レシピーにしたがって,直径100μmならびに,40μmのローターを製作した.現在,その製作されたローターの加工精度を検証している.ローターの回転特性をシミュレーションするとともに,光導波路としてのファイバー設置法をケーシングとの配置を考慮して検討した.研究成果ならびに製作時に用いた新たな計測技術を論文・学会発表によって公表した.本研究ではMEMS分野で現在広く実施されている光放射圧を用いた研究を,実用可能なものにするための新しい取り組みを提案している.従来の高NA対物レンズを用いた作業領域に比べて複雑かつ三次元構造の大きな光学系を作業領域上方に設置する必要のない,2次元平面内に収めることのできる光の反射現象を用いた高密度分散型動力発生機構の開発を目指している.平成21年度においては,研究実施計画にもとづき,グラスファイバーによる光導波路をシリコンウエハ上に作製し,同時に作製したローターフレーム内で,表面を白金コートしたシリカ球(直径4μm)をレーザー照射することによって,回転力発生状況を観察・確認した.入力パワーと回転特性については今後詳細に検討することができる段階にいたっている.上記回転力検出実験とともに,光導波路をシリコン基板上にSiO_2によって張り巡らせる技術の開発を同時に進めた.前年度より懸案であった軸付ローターについては,一部シリコン酸化膜作製条件の条件出しを行う必要があるものの,作製プロセスを構築することができた.この結果として,単体としての「光駆動によるモーター」製作を光導波路よりレーザー光を照射することのできる状況に至っている.平成21年度に掲げた研究計画は、ほぼ達成することができた.機械学会において成果を報告した.本研究ではMEMS分野で現在広く実施されている光放射圧を用いた研究を,実用可能なものにするための新しい取り組みを提案している.従来の高NA対物レンズを用いた作業領域に比べて複雑かつ三次元構造の大きな光学系を作業領域上方に設置する必要のない,2次元平面内に収めることのできる光の反射現象を用いた高密度分散型動力発生機構の開発を目指している.平成22年度においては,研究実施計画にもとづき,光導波路をシリコンウエハ上に作製し,同時に作製したローターフレーム内で,表面を白金コートしたシリカ球(直径4μm)のレーザー照射による回転特性を解析した.この結果に基づいて,入力パワーと回転特性を明らかとし,ローターの回転に伴う発生トルクを検討した.上記回転力検出実験とともに,光導波路をシリコン基板上にSiO_2によって張り巡らせる技術の開発を同時に進めた.前年度より懸案であった軸付ローターについては,高分子材料であるパリレンによる製作技術を確立し,軸に発生する摩擦の軽減を図る構造を検討した.この結果として,前年度からの取り組みであった単体としての「光駆動によるモーター」製作を光導波路よりレーザー光を照射することのできる状況を確立した.平成22年度に掲げた研究計画ほぼ達成することができた.
乳腺神経内分泌癌(B-NET)の発生機構およびその生物学的特性の病理学的解析

我々は、乳腺の神経内分泌型非浸潤性乳管癌(NE-DCIS)を報告し、non-NE-DCISとの比較分析からNE-DCISの独特な臨床病理学的特徴(血性乳頭分泌症状、低術前診断率、低悪性度の病理学的所見等)を明確に示すことで、DCISにおける特殊亜型としての意義を確立した。NE-DCISは、乳腺神経内分泌癌(B-NET)のpreinvasive counterpartとみなされることから、その発生機構や自然史を理解する上で重要な疾患概念である。乳腺における神経内分泌腫瘍(B-NET)は、WHOの乳腺腫瘍分類(2003年)において、消化管や肺のNETと類似の形態を示し、神経内分泌マーカーが50%をこえる腫瘍細胞に発現する原発性乳癌と定義されているが、その生物学的特性はいまだ不明な点が多い。さらに、神経内分泌形質を有する非浸潤癌に関しては、WHO分類の中で、非浸潤性乳管癌(DCIS)のunusual variantsの一つとしてわずかに記載されているのみであり、その臨床・病理学的意義は明確ではない。それゆえ、我々は、B-NETのpreinvasive counterpartとして位置付けられうる神経内分泌型非浸潤性乳管癌(NE-DCIS)にまず注目し、その臨床的意義と生物学的特性を明らかにする目的で、20症例のNE-DCISを、274症例のnon-NE-DCISと比較分析して検討を行った。その結果、NE-DCISは特徴的な臨床像(血性乳頭分泌症状、低術前診断率)および組織学的所見(腫瘍細胞の充実性増殖、発達した血管網、低異型度の病理所見等)を示すことが明確となり、乳腺のDCISにおける特殊な亜型としての意義を確立した[United States and Canadian Academy of Pathology(USCAP)Annual Meeting, 2010.日本病理学会秋期特別総会(B演説),2009]。さらに、我々は、NE-DCISの独特な細胞病理学的特徴(豊富な細胞採取量、形質細胞様腫瘍細胞の孤立散在像、腎糸球体様血管構築等)を明らかにし、本腫瘍の術前診断における穿刺吸引細胞診の有用性も示した[Cytopathology,2010(in press).USCAP Annual Meeting, 2010]。NE-DCISは、B-NETの発生機構、自然史を理解・解明する上で重要な疾患概念であり、これらの研究成果を基盤として、B-NETの生物学的特性を明らかにしていく。乳腺の神経内分泌腫瘍(B-NET)は、WHOの乳腺腫瘍分類(2003年)において、消化管や肺のNETと類似の形態を示し、神経内分泌マーカーが50%をにえる腫瘍細胞に発現する原発性乳癌と定義されているが、その臨床的意義や生物学的特性はいまだ不明な点が多い。さらに、B-NETのpreinvasive counterpartとみなされうる神経内分泌型非浸潤性乳管癌(NE-DCIS)に関しては、WHO分類の中で、DCISのunusual variantsの一つとしてわずかに記載されているのみであり、その臨床・病理学的意義は明確ではない。それゆえ、近年、我々はNE-DCISにまず注目し、その独特な臨床病理学的特徴を明確に示してきた[Histopathology, 2008. USCAP Annual Meeting, 2010.乳癌の臨床(総説),2009.日本病理学会秋期特別総会(B演説),2009]。本年度は、さらにNE-DCISの独特な細胞病理学的特徴[Cytopathology, 2011.診断病理(総説),2010.日本臨床細胞学会ポスター賞受賞,2010]、本腫瘍の診断に有用な神経内分泌マーカー(Pathol Int, 2011)について明らかにした。浸潤性B-NETに関しては、多数のB-NET症例を、B-non-NET症例と臨床・病理学的に比較分析し、B-NETの臨床的意義および生物学的特性を明確に示した(日本内分泌病理学会最優秀賞受賞,2010)。さらに、乳管内乳頭腫(中枢型)に由来する微小浸潤性B-NET症例を検討し、B-NETの発生機構や自然史に関する示唆を与えた(J Clin Pathol, in press)。また、血性乳頭分泌の臨床症状とB-NETの密接な関連性について報告した(USCAP Annual Meeting,2011)。
大規模コーパスを使用した日本語複合動詞データベース構築法に関する基礎研究

任意の日本語コーパスから自動的に複合動詞のデータベースを構築することのできるソフトウェアの開発においてどのような点が問題になるかに関する基礎的な諸問題について検討した。複合動詞の前項動詞、後項動詞、および複合動詞全体のそれぞれについて格パターンの抽出を行う手順を開発し、簡便なソフトウェアの実装を行った。今年度は、1)データベース作成方法の具体的な手順に関する考察、2)今年度に公表された2種類の複合動詞データベース(「Webデータに基づく複合動詞データベース」「複合動詞レキシコン」、いずれも国立国語研究所のホームページからアクセス可能)の検討を行った。1)については、小規模なテキストデータを使って複数の方法でデータ抽出を行った。その結果、形態素解析と係り受け解析によって複合動詞全体の格支配の抽出はある程度自動化できるものの、人手によるデータのチェックを行わなければ十分なデータが得られないことが分かった。また、表記上、一語として扱われるもの(「認める」「率いる」など)をどのように扱うかについても問題が生じることが分かった。2)に関して言えば、「Webデータに基づく複合動詞データベース」は格解析の手順について参照すべき点が多いことが分かったが、動詞の組み合わせが限られている点、受身・使役の形式が含まれない点に問題があると考えられる。また、「複合動詞レキシコン」については、格支配だけでなく意味情報を含んでいる点で本研究の目的に合致するものであるが、収録されている形式が限られており様々な動詞の組み合わせを網羅的に抽出するものではないことがわかった。また、これらのデータベースはいずれも特定のコーパスから一回的に抽出されたものであり、本稿が目的とする抽出の手順そのものの構築とは目的が異なることも分かった。今年度は、1)国際シンポジウム「日本語及びアジア諸言語における複合動詞・複雑動詞の謎」(国立国語研究所)への参加、2)テキストデータからの複合動詞の抽出を行うプログラムの実装、を行った。1)では、日本語とその他のアジア諸言語における複合動詞の基本的性質についての知見を深め、参加した他の研究者との交流からデータベース構築に当たってどのような情報が必要になるかを考察することができた。また、2)については、「Webデータに基づく複合動詞データベース」の構築方法(山口昌也2013)を参考にした。このプログラムによって、複数のテキストデータから複合動詞の形式、それを含む文、および、格要素をデータ化することができた。その一方で、今後解決すべき課題が多く残されていることも判明した。受身形や使役形については、結局適切な検索方法を開発することができなかった。また、意味情報との関連づけについてもほぼ着手できずに終わった。格要素の出現パターンと意味の間には一定の関係があると考えられ、その関係を明らかにすることで有益なデータが得られることが予測されるが、市販の日本語の辞書の記述は意味と格要素の関連がほとんど記述されていないため、その関連づけを明らかにするのが困難である。『日本語基本動詞用法辞典』のような格要素が明確に記述された辞書の利用を含めた検討が必要である。また、コンピューターの扱いにあまり詳しくない研究者や日本語学習者も利用できる簡便なシステムの開発も十分に達成できなかった。今年度は、データベース作成方法に関する基礎的な研究を行った。それらは主に二つに分類される。第一に、これまでの複合動詞に関する研究から意味と文法的特徴(特に格支配)との相関性を明らかにすることである。計画としては、「出す」「込む」「つける」「かける」を対象とする予定であったが、特に「出す」と「込む」について考察した。「出す」については、カラ格を必須とする用法として「外部への移動」(「ボールがフィールドから出た」)と「産出」(「ラッパから音が出た」)、ニ格を必須とする用法として「接近可能化」(「母が電話に出た」)、いずれをも必須としない用法として「出現」(「お化けが出た」)を認定した。また、「込む」についてはニ格を必須とする「内部への移動」(「水が側溝に流れ込んだ」)、ニ格を必須としない「縮小」(「お腹が引っ込んだ」)と「強化」(「父も最近はめっきり老け込んだ」)を認定した。これらのことから、一般に基本義に近い用法ほど後項による格支配力が強いことが明らかになったが、これは格支配と意味との関連性という観点からは注目すべき点であると考えられる。第二に、データベース作成のための技術的な側面に関して検討を行った。本研究は格支配という構文上の特性を扱うため、構文解析という観点から現在の研究の状況を検討した。現段階では、どのような実装を行うかは考察中であるが、Python、Perl、Rubyの利用を検討している。複合動詞の構成要素の網羅的組み合わせを抽出することにやや困難があることが判明し、その解決方法を考察するのにやや時間がかかったため、当初の予定からやや遅れている。また、ヴォイスを含む形式の扱いについても考察に時間がかかっている。多義と格支配の関係についてはほぼ計画通りであるが、アルゴリズムの実装についてはやや遅れている。これは、言語処理を専門とする人材が当初予想していたより見つかりにくかったことによる。自然言語処理を専門とする研究者に協力を仰ぎたいと考えている。

すでに、そのような研究者との非公式的な談話を始めており、今年度は共同で作業を行う予定である。今後は多義と格支配の関係についてさらに記述を進めるとともに、これまで明らかになった関係に基づいて試験的にデータ抽出を行う予定である。また、それと並行して実装方法についての検討をさらに進める。次年度は最終年度に当たるため、データベースの構築方法について具体的な成果を得たい。そのために、自然言語処理を専門とする研究者との打ち合わせを行う。また、成果を公開するための費用も必要となる。言語処理を専門とする人材の補助を得て、実装方法についての具体的な検討を行う必要があるため、謝金を使用する。また、そこで使用するための機器(コンピューターと周辺機器)及びソフト類(Visual Studioなど)を購入する予定である。さらに、新聞データベースなどのデータベースの拡充も必要である。
顔面・側頭部の触診トレーニング支援システムの開発

触診トレーニング用ファントムの開発触診トレーニング用ファントムはエポキシレジン製頭蓋模型を軟性シリコンゴムによる頭部と、咬筋、側頭筋に相当する部位の内部にプラスチック製のチャンバーを取り付けて液体を満たした耐圧性シリコンチューブから構成されている。顔面・側頭部の触診部の材質は可及的に人体に類似した触感覚が得られるように可塑剤の量を調整したシリコンゴムを使用した。ファントムには専用のスタンドを設定し術者立位にてファントム立位及び水平位に固定可能にした。チューブからの圧力は圧トランスジューサー(PS-5KB,共和)に接続され、8チャンネル歪みアンプ(NEC San-ei AH-8)により増幅した後、A/Dコンバータによりコンピューターに入力し、記録・分析を可能とした。測定した圧力値の表示及び解析には専用のソフトウエアを開発し、リアルタイムにモニターし視覚的にフィードバックを可能とした。キャリブレーションは島津製サーボパルサーを使用しチャンバー部に一定加重を加えコンピューターのソフトウエア上で行った。各触診部位での適正な圧をあらかじめ設定し視覚的にフィードバックを可能とした。触診トレーニング効果の確認は、被験者5名により日常臨床における触診圧を測定した後、今回試作した触診トレーニング用ファントムによりトレーニングを行い、再度日常的臨床における触診圧の測定を行う。トレーニング前後の圧力を比較検討することによりトレーニング効果を評価する予定であり、現在評価分析の途中である。
アルミニウムのエネルギー代謝への影響に関する研究

アルミニウムイオンは、酸性土壌における主要な作物生育阻害因子である。アルミニウムによる障害機構ならびに植物が持つ耐性機構について、エネルギー代謝(糖代謝)に着目し、主として、タバコ培養細胞株とタバコ植物体を用いて解析した。その結果、エネルギー代謝を呼吸から乳酸発酵に変換することで、アルミニウムが誘発するミトコンドリアの機能不全に基づく活性酸素種(ROS)の生成を抑制する新しい耐性機構を見いだした。アルミニウム(Al)による細胞レベルでの障害は、細胞伸長阻害と増殖能の低下(細胞死)であり、本研究は、この二つの現象の誘発機構を、糖代謝(エネルギー代謝)に焦点を当てて解明することを目的としている。これらの現象と強くリンクして、細胞内の遊離糖含量の低下がみられるが、遊離糖含量の低下は、水吸収の阻害を引き起こすことで、細胞伸長阻害の要因の一つと考えられ、さらに、細胞内ATP含量の低下を引き起こし細胞死の誘発に至る可能性が考えられた。そこで、本研究では、Alによる遊離糖含量の低下の機構について、糖の取り込みと、糖の消費の両面から、タバコ細胞を用いて解析した。その結果、タバコ細胞における糖の取り込み経路は、主として、細胞壁局在のインベルターゼによって培地のスクロースがヘキソースに分解され、ヘキソースとして取り込む経路であること、Alは細胞壁インベルターゼ活性を阻害しないが、ヘキソースの取り込みを阻害することを見出した。一方、Alは、糖の取り込みのみならず、細胞内の遊離糖の消費も促進し、遊離糖を何らかの形態で細胞外へ放出することを見出した。この放出される物質について、クエン酸やカロースの可能性を考えたが、これらがAl処理によって培地に放出される量は、細胞内遊離糖含量の消費量よりはるかに少なく、他の形態で放出されていることが示唆された。一方、植物体において、根におけるAl処理により、光合成産物の根への転流量が増加する。この現象は、植物体全体で根におけるAlストレスを防御する機構の存在を示唆している。本年度は、根部のAl処理で、一過的であるが光合成量(二酸化炭素吸収量)の増加が観察され、また、根端細胞の液胞インベルターゼ活性の増加を見出した。これらが、転流量の増加に関わる可能性が示唆された。本研究は、アルミニウム(Al)応答に関わる分子を生理学的解析ならびにメタボローム解析によって明らかにし、Al耐性に関わる遺伝子の同定を最終目標としている。本年度は、タバコの培養細胞株および植物体を材料に、糖の輪送体ならびにインベルターゼの解析を行った。さらに、Al耐性タバコ培養細胞株と野生株のメタボローム解析により耐性応答に関連すると思われる代謝経路を見出した。詳細は次の通りである。これまでの解析から、Alは糖の取り込みを抑制するとともに糖代謝を亢進している可能性が高い。液胞インベルターゼはスクロースを分解することで解糖系へ基質を供給するとともに細胞へのスクロースの取り込み促進することが考えられているが、実際、Alにより培養細胞と根の両方で一過的な活性上昇を見出した。一方、糖の取り込みに関して、タバコのスクロース遺伝子をクローニングし、培養細胞株と植物体に導入し発現量が変化した形質転換体を作成した。次年度は、形質転換体を用いてAl耐性度を評価する。Al耐性に関連したメタボローム解析として2セット行った。一つは、Al耐性培養細胞株と感受性株の比較、もう一つはコムギのAl耐性遺伝子ALMT1の導入で耐性を獲得した形質転換タバコ細胞株と非形質転換細胞株との比較である。ALMT1遺伝子はAlで活性化されるリンゴ酸輸送体をコードする。前者のAl耐性株では構成的に解糖系が亢進しTCA回路が抑制されていた。一方、ALMT形質転換細胞株ではAl処理によりリンゴ酸の減少とともに他の有機酸量の変動も引き起こしていた。以上の解析で見出した酵素活性や代謝変動についてAl耐性との関わりを次年度解析する。なお、ALMT1輸送体については、Alによる活性化機構についても解析し、N末端側にある3個の酸性アミノ酸が必要であることを明らかにした。本研究は、アルミニウム(A1)のエネルギー代謝(糖代謝)への影響を解明することによって、A1耐性に関わる遺伝子の同定を最終目標としている。本年度は、タバコ培養細胞系を用い、スクロース輸送体遺伝子(NtSUT)のA1耐性への関わりと、A1耐性タバコ培養細胞株と野生株を用いたエネルギー代謝ならびに細胞死誘発機構の比較解析を行った。昨年度、タバコ培養細胞を用い、NtSUT遺伝子の高発現株(OX)と発現抑制株(RNAi株)を作成したので、本年度はこれらの形質転換体と野生株を用いて解析した。野生株ではコントロール処理(A1無添加)中に、細胞内遊離糖含量の増加が見られ、それが水吸収の駆動力となっている。この現象がOX株では促進されRNAi株で抑制されていたことから、NtSUTがコントロール処理においてスクロース吸収に関与し、間接的に細胞伸長に関与していることが示唆された。しかし、コントロール処理培地へA1を添加すると、すべての株において、細胞内遊離糖の増加が強く抑制された。

従って、NtSUTを高発現させてもA1によるスクロース取り込み阻害は改善されず、NtSUTのA1耐性への貢献度は低いと判断した。A1耐性細胞株と野生株を用いて乳酸発酵と呼吸について比較したところ、A1耐性細胞株では乳酸発酵が高まり呼吸が低下していた。次に、A1による細胞死の誘発機構を比較した結果、誘発機構には2種類あり、野生株で見られるミトコンドリアの機能阻害と活性酸素の誘発を伴うものと、A1耐性細胞株で見られるVacuolar Processing Enzyme(VPE)が関与し液胞崩壊を伴うものであることが示唆された。以上、A1耐性に関わる代謝系として乳酸発酵、A1耐性に関わる細胞死誘発機構として液胞崩壊とVPEがそれぞれ新規なものとして見出され、これらの制御によるA1耐性獲得の可能性が示唆された。
骨系細胞の分化・活性・アポトーシスにおけるNFATシグナルの解析

NFATは炎症性サイトカインの産生を促す転写因子として研究され、calcineurinによって活性型となり、標的遺伝子の転写を開始する。免疫抑制剤であるCsAやFK506はcalcineurinを選択的に抑制することでNFATの機能を阻害し、免疫抑制作用を起こす。我々は最近、破骨細胞へのCsA投与がアポトーシスを誘導すること、破骨細胞にNFATが発現していること、破骨細胞分化因子であるRANKLによってNFATの発現が上昇すること、破骨細胞系株に活性型NFATを過剰発現させるとRANKL投与なしに骨吸収能を持つ破骨細胞へと分化することなどを発見した。また、破骨細胞がFas/FasL経路でアポトーシスを起こすことや、破骨細胞のFas発現にRANKLが関与していること、関節リウマチ部の滑膜の繊維芽細胞におけるVEGF産生にNFATが重要であり、VEGFは破骨細胞の活性化を促すこと、骨芽細胞にcalcineurinを過剰発現させると同化作用が進むこと、なども報告されている。本研究の目的はこれらの点を踏まえ、破骨細胞や骨芽細胞、繊維芽細胞といった骨系各細胞における、生存や活性、死に及ぼすNFATの役割を明らかにすることである。現在までにマウス骨髄由来の破骨細胞を用い、NFATの抑制によってERKやAktといった生存因子の産生が抑制されること、NF-κBには影響を与えていないことが判明した。また、骨芽細胞系細胞(MC3T3-E1)にmRNAレベルでNFATが発現していることを確認し、培養系においてNFATを抑制したところ、ミネラルノジュール形成が抑制され細胞の活性化も抑制された。マウス骨髄由来の繊維芽細胞に関してはCsA投与によって生存が抑制されることを確認し、マウス骨髄由来の骨芽細胞においてはCsA投与によってERKとAktの発現が蛋白レベルで抑制されることが確認された。我々は最近、破骨細胞へのCsA投与がアポトーシスを誘導すること、破骨細胞にNFATが発現していること、破骨細胞分化因子であるRANKLによってその発現が上昇すること、破骨細胞系株に活性型NFATを過剰発現させるとRANKL投与なしに骨吸収能を持つ破骨細胞へと分化することなどを発見した。また、破骨細胞がFas/FasL経路でアポトーシスを起こすことや、破骨細胞のFas発現にRANKLが関与していること、RA滑膜の繊維芽細胞におけるVEGF産生にNFATが重要であり産生されたVEGFは破骨細胞の活性化を促すこと、骨芽細胞にcalcineurinを過剰発現させると同化作用が進むこと、なども報告されている。本研究の目的は、これらの点を踏まえ、破骨細胞や骨芽細胞、繊維芽細胞といった骨系各細胞における、生存や活性、死に及ぼすNFATの役割を明らかにすることである。現在までにマウス骨髄由来の破骨細胞を用い、ウエスタンブロッティングにより、NFATの抑制によってERKやAktといった生存因子が抑制されること、NF-κBには影響を与えていないことが明らかになった。また、骨芽細胞系細胞(MC3T3-E1)の培養系においてNFATを抑制したところ、ミネラルノジュール形成が抑制され、細胞の活性が抑制された。繊維芽細胞に関しては現在、実験条件の調整中である。今後はNFATの抑制だけでなく、過剰発現を骨系各細胞に導入し、活性や分化、生存、アポトーシスに与える影響を検討する予定である。本研究はこれらの点を踏まえ、破骨細胞や骨芽細胞、繊維芽細胞といった骨系各細胞における、生存や活性、死に及ぼすNFATの役割を明らかにすることである。現在までにマウス骨髄由来の破骨細胞を用い、NFATの抑制によってERKやAktといった生存因子が抑制されること、NF-κBには影響を与えていないことが判明した。また、骨芽細胞系細胞(MC3T3-E1)にmRNAレベルでNFATが発現していることを確認し、培養系においてNFATを抑制したところ、ミネラルノジュール形成が抑制され細胞の活性化が抑制された。マウス骨髄由来の繊維芽細胞に関してはCsA投与によって生存が抑制されることを確認した。今後は骨芽細胞、繊維芽細胞におけるERKやAkt,NF-κBといった生存因子の発現状態を、蛋白レベルで検索する予定である。