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妊娠中の睡眠時無呼吸による低酸素血症が胎児に及ぼす悪影響の病態解明に関する研究

妊娠中の体重の増加によって脂肪が上気道を狭小化し、妊産婦に睡眠呼吸障害を生じることが米国などでは既に問題となっているため、現時点では妊産婦におけるSASの合併を早期診断し、CPAPにより早期治療することは母体よりもむしろ胎児のために非常に重要と考えられる。本研究の目的は、妊娠中の体重増加による肥満が睡眠時無呼吸症候群(sleep apnea syndrome ; SAS)を引き起こすか否かを明らかにし、さらに睡眠時無呼吸による夜間睡眠中の低酸素血症が胎児に流産や脳障害などの重篤な悪影響を及ぼすか否かの病態を解明し、それらの予防法や治療法を検討することである。平成17年度の研究成果は、横浜の第69回日本循環器学会総会ファイアーサイドセミナーの講演「循環器疾患における睡眠障害の診断と治療」、宇都宮の第30回日本睡眠学会学術集会シンポジウム「妊婦のSAS合併に対する早期診断と治療の重要性」、さらに全国の医師会や地方の研究会でも多数報告した。その反響は非常に多大であり、妊娠中のいびきやSASの合併に関する産科医や助産師の感想は「気づかなかった」、「いびきの妊婦は個室で管理した」などであった。この原因は、これまで一般に胎児は低酸素に強いという理由から母体の一過性低酸素血症の問題を軽視し、重度のSASを合併した妊婦では、夜間睡眠中に特にレム睡眠中に高度の低酸素血症(SaO_2<70%またはPaO_2<40torr)が生じるなど誰も予測しなかったからと推察される(塩見他,日本醫事新報,No.4232,2005)。現時点では、わが国で4人の重症SASを合併した妊産婦に対する在宅持続陽圧呼吸(CPAP)療法が行われているが、重度のSAS患者では未治療ならば高度の低酸素血症が毎晩レム睡眠中に生じることは事実である。CPAP治療が施行された4人のBMI(body mass index)は34.755.4kg/m^2と肥満で、SASもAHI(apnea-hypopnea index)が93.1132.8/hrの超重症例であった。また最近、シドニー大学のEdwardsらが報告(Am J Pespir Crit Care Med,162;2000)したように、子癇前症(preeclampsia)に対するCPAPの降圧効果も注目されており、肥満の妊婦については妊娠高血圧症候群もCPAP治療対象の一つとしてターゲットとして追加することが、母体のみならず胎児の安全において非常に重要であることは間違いない。今後、重度のSASの合併は、産科では妊娠高血圧症候群の原因の一つとして、さらに周産期医療では妊婦の肥満が胎児にもたらす悪影響の一つとして重視されるべきであると考えられる。本研究(平成1618年度)は、睡眠時無呼吸症候群(SAS)による夜間睡眠中の低酸素血症が胎児に悪影響を及ぼすか否かの病態を解明し、また妊娠中の体重増加による肥満がSASなどの睡眠呼吸障害を引き起こすか否かを明らかにし、さらにそれらの予防法や治療法を検討するために行った。平成18年度の研究成果は、第70回日本循環器学会総会ミートザエキスパートの講演、第21回東京及び第47回日本母性衛生学会学術集会の教育講演、さらに全国の医師会や地方の研究会でも多数報告した。また、本研究の一つとして夜間のパルスオキシメーターを用いた妊婦の研究を行い、第59回日本産婦人科学会学術講演会では、妊婦における睡眠呼吸障害(3%ODI>5/hr)の合併は妊婦86例中6例(7.0%)に認められ、妊娠の進行に伴って増える傾向があり、異常体重増加群に高率で、胎児発達遅延(IUGR)の一因となる可能性があることを報告した。これまで、産科医や助産師は妊婦のいびきやSASの合併を軽視してきた。
核酸結合蛋白質の高次構造形成と核酸結合における亜鉛イオンの役割

亜鉛フィンガーは真核生物の転写調節因子に含まれるDNA結合ドメインの最も普遍的なモチーフのひとつであり、逆平行βシートとαヘリックスからなるフィンガー構造の形成には亜鉛イオンの結合が必須である。亜鉛フィンガーは多種多様な核酸塩基配列に特異的に結合するが、核酸結合における多様性と特異性の分子機構は不明であり、フィンガー構造形成の過程も明らかにされていない。本研究では、亜鉛フィンガーの構造形成と核酸結合における亜鉛イオンの役割を明らかにすることを目的とした、蛋白質の二次構造と金属-配位子結合形成の機構およびDNAとの相互作用をラマン分光法を用いて解析した。1.マウスの転写調節蛋白質Zif268第3亜鉛フィンガーに対応する27アミノ酸残基のペプチド(ZF3)は、亜鉛イオン非存在下では主としてβシート構造をとるが、亜鉛が存在すると、N末端に近い2個のシステインが先ず亜鉛に配位し、次にC末端の2個のヒスチジンが配位することにより、一部のβシートがαヘリックスに構造変化し、フィンガー特有の構造を形成することが明らかとなった。2. ZF3のシステインとヒスチジンを交換したペプチドでは、亜鉛濃度の低い場合は、天然型と同様、システインへの優先的金属配位とβシートからαヘリックスへの部分的転移が生じるが、高濃度ではヒスチジンが配位するにも拘らず、2次構造転移は進行せず、フィンガー構造形成には至らなかった。この結果より、配位子配置および配位子の亜鉛イオンに対する親和性の相違が構造形成過程の制御に巧みに利用されていることが明らかとなった。3. ZF3の結合により、2本鎖DNAの構造は、通常のB型からA型へ一部変換することを見出した。このことは亜鉛フィンガーがDNAのみならず、A型構造に固定されている2本鎖RNAとも強く結合することと関連している可能性があり、現在、詳細な解析を進めている。
骨形成促進剤の探索を可能とする化合物ライブラリースクリーニングシステムの構築

骨芽細胞分化関連遺伝子の発現に伴いGFP蛍光を発現するように遺伝子操作したレポーター細胞を用いて,GFP蛍光量およびALPを指標に,小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い,検出された候補化合物が骨芽細胞分化に及ぼす影響を評価した。さらに,候補化合物を頭蓋骨欠損ラット実験モデルに投与し,骨組織再生を,評価した。その結果,GFP蛍光値およびALP活性を同時に促進した3種の候補化合物において,骨芽細胞分化促進作用を確認し,頭蓋骨欠損部位への候補化合物の投与は,骨再生量を増加させた。以上の結果から,本研究で構築したスクリーニングシステムは今後の骨再生医療,創薬に貢献することが期待される。機能的かつ審美的なインプラントおよび補綴歯科治療の実現には,低侵襲で確実な歯槽骨増生が不可欠であることから,骨補填材を用いた骨増生術にBMP2やPDGFなどの細胞成長因子を併用する試みが広く行われている。、本研究の目的は,骨芽細胞分化促進作用を有する化合物を簡便かつ高い信頼度で検出するためのスクリーニングシステムの構築,ならびに骨芽細胞分化促進作用および骨形成促進作用を有する化合物の探索することである。これまでに我々は,マウスの骨芽細胞分化マーカー(I型コラーゲン)を組み込んだ細胞を骨芽細胞分化誘導によってGFPが発光すると同時にマーカー遺伝子発現が亢進することを確認し,得られたクローナルな細胞株が,骨芽細胞への分化能を維持していることを,RT-PCR解析(Osterix, Osteopontin, Osteocalcin遺伝子発現),フォンコッサ染色により確認した。次にレポーター細胞株を用い,小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを,二つの骨分化指標についてハイスループットに行うった。レポーター細胞株を96ウェルプレートに播種し,骨分化誘導培地中に各化合物を添加,培養し,47日後に細胞のGFP発光量を,マルチプレートリーダー(GloMax-Multi Detection System, Promega社)でハイスループットに測定し,GFP発光量を亢進した小分子化合物を候補化合物とした。GFP測定後,引き続き分化誘導培地で培養し,誘導14日後にフォンコッサ染色を行い,基質の石灰化を促進した小分子化合物を候補化合物とした。機能的かつ審美的なインプラントおよび補綴歯科治療の実現には,低侵襲で確実な歯槽骨増生が不可欠であることから,骨補填材料を用いた骨増生術にBMP2やPDGFなどの細胞成長因子を併用する試みが広く行われている。しかし,これらの生理活性物質は,リコンビナントタンパク質であり,コストパフォーマンス,生体内における安定性,安全性等の点で改良すべき課題が残る。我々は,骨増生に用いる細胞活性因子として,分子量が小さく,安価で,化学合成・修飾が容易な小分子化合物に着目してきた。本研究の目的は,骨芽細胞分化促進作用を有する化合物を簡便かつ高い信頼度で検出するためのスクリーニングシステムの構築,ならびに骨芽細胞分化促進作用および骨形成促進作用を有する化合物を探索することである。平成26年度は,同定した化合物群が,実際にマウス骨髄由来未分化間葉系幹細胞の骨芽細胞分化に促進的に作用するか否かをALP活性および基質の石灰化,骨芽細胞分化特異的遺伝子発現,細胞毒性,細胞死に関して検討を行った。さらに,同定した化合物を,申請者がこれまでに確立してきたラットの頭蓋骨欠損モデルを用いた骨再生の評価法を用い,これが骨欠損部における新規骨再生材料となり得る可能性を,HE染色等の手法で骨再生を組織学的に評価することで,スクリーニングシステムの評価を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題であるスクリーニングのシステムの構築ならびにシステムの検出能力に関してセットアップが行われている。また候補となった化合物に関しても作用の検討が進行している。引き続きこれまでのシステムの構築のセットアップを行っていくのにあわせ,これまで明らかにした研究成果の詳細を検討していく予定である。
歯周病細菌感染によるマクロファージ泡沫化と血管傷害機構

近年、様々な研究により、動脈硬化に歯周病細菌や口腔レンサ球菌が関与している可能性が指摘されている。本課題では、動脈硬化の主要な原因となる泡沫細胞の形成にこれらの細菌が関与している可能性を研究した。ヒトマクロファージ株THP-1を用い、歯周病細菌および口腔レンサ球菌感染による泡沫細胞形成促進のメカニズムを調べた。いずれの細菌も菌の生死に関わらずマクロファージからの泡沫細胞形成を促進し、口腔レンサ球菌S.sanguinisに関しては、生菌感染の場合、菌数が多いとマクロファージが細胞死を引き起こすことが判明した。この細胞死に関してinflammasomeの関与の有無を調べたところ、caspase-1の活性化は見られず、むしろ活性酸素の関与が考えられた。口腔レンサ球菌がマクロファージの泡沫化を促進するという本研究の成果は新知見であり、これらの菌が感染性心内膜炎のみならず歯周病細菌と同様に心臓血管疾患にも関与している可能性を示唆するものである。本年度は,まず、マクロファージの泡沫化に及ぼす歯周病細菌感染の効果を検討した。マウスマクロファージ細胞株J774.1に歯周病細菌A.actinomycetemcomitans(A.a.)加熱死菌体あるいは同菌LPSを添加し、変性LDLを加えて培養したところ、50-60%の細胞においてオイルレッドで染色される油脂滴を細胞内に認め、泡沫化が促進されることが明らかになった。同様に、ヒト単球細胞株THP-1でも、マクロファージに分化させた後、A.a.菌体あるいはLPSを添加すると、泡沫化の促進が認められた。ただし、THP-1細胞の場合はFCSに含まれる脂肪成分が非特異的に取り込まれるらしく、LDL非添加対照培養でも約20%の細胞にオイルレッド陽性油脂滴が検出された。近年新しく発見されたサイトカインIL-32は様々な炎症応答に関与していることが報告されている。そこで、THP-1細胞に歯周病細菌A.a.加熱死菌体あるいはLPSを添加しIL-32の発現が促進されるかどうかを調べた。その結果、全菌体で刺激した場合はIL-32のmRNAレベルが数10倍、LPSで刺激した場合も5-6倍に上昇することが明らかになった。歯周病細菌P.pingivalis生菌を感染させた場合も、同様にIL-32の発現が促進された。次年度は、歯周病細菌感染によるマクロファージの炎症応答と泡沫化の関連をさらに追求すると共に、他の口腔細菌についても調べる必要があると考えている。本年度は、マクロファージの泡沫化に及ぼす口腔レンサ球菌感染の効果を検討した。ヒト単球細胞株THP-1をPMA存在下でマクロファージに分化させたものに口腔レンサ球菌Streptpcoccus sanguinisを感染させ、変性LDLを加えて培養したところ、50-60%の細胞においてオイルレッドで染色される油脂滴を細胞内に認め、泡沫化が促進されることが明らかになった。この泡沫化は加熱死菌体でも誘導されるが、一方、生菌感染ではMOI=50以上でマクロファージの細胞死が見られることが分かった。細胞死が起こるメカニズムを調べてみると、活性酸素(ROS)阻害剤の添加によって細胞死の抑制が見られ、生菌感染では感染マクロファージがROSを過剰産生することによって細胞死が引き起こされることが考えられた。他の病原レンサ球菌ではSLOやpneumolysinのようなpore-formingtoxinが細胞膜にダメージを与えてマクロファージの細胞死を誘導するが、S.sanguinisにはそのような毒素遺伝子は報告されていない。そこで、菌体表層に存在する線毛piliなど病原性に関与する可能性のある遺伝子をゲノム情報をもとにクローニングし、そのノックアウト株を作成してマクロファージの細胞死にどのような病原因子が関与しているのかを調べたところ、piliそのものは細胞死には関与していないものの、fibronectinと結合し、菌の細胞付着に関与していることが明らかになった。昨年度に引き続き、口腔レンサ球菌S.sanguinis感染によるマクロファージの泡沫化と細胞死に関する研究を行った。最初にS.sanguinisを感染させるとサイトカインIL-1が産生されること、ATPが培地中に遊離することが判明し、自然免疫応答に関与しているinflammasomeの活性化が起きている可能性が考えられた。

そこでcaspase-1の活性化をウエスタンブロット法などで検討したが、caspase-1の活性化が起きているという知見は得られなかった。細胞死に伴って活性酸素が産生されることから、IL-1の産生はinflammasomeの活性化の結果ではなく、感染による活性酸素が細胞にダメージを与える結果であると考えられた。A群レンサ球菌や肺炎球菌に関してはSLOやpneumolysinなどの毒素の作用によって細胞死が引き起こされることが知られている。S.sanguinisにはそのような毒素は報告されていないが、ゲノム遺伝子データを調査するとhemolysinに相同性のある遺伝子が見いだされた。そこで、これに対応する抗血清を調製し、S.sanguinisがこのhemolysin様のタンパク質を産生しているかどうかを調べたが、培地中にも菌体表層にも、抗血清と反応するタンパク質は見いだされず、遺伝子は存在するとしてもタンパクとしては発現していない可能性が考えられた。マクロファージの細胞死を誘導するS.sanguinisの病原因子は未解決の課題として残されたが、口腔レンサ球菌がマクロファージの泡沫化及び細胞死を誘導するという事実は、本菌の病原性あるいは本菌による心内膜炎の発症メカニズムを考える上で重要な知見であると考えられる。
糖尿病性足壊疽の感染増悪過程における好中球NETsの関与と新規治療法の開発

長年、糖尿病患者の易感染性が問題となっている。糖尿病性(diabetes mellitus; DM)足壊疽では、軽微な外傷から感染により蜂窩織炎や壊死性筋膜炎を発症し、広範囲の足壊疽から時には大切断に至る。DM足壊疽における易感染性はよく知られており好中球の機能異常がその要因の一つとされている。しかし、その詳細なメカニズムは不明であり、好中球に対する治療方法もみられない。好中球は感染部位に遊走・集積し活性化される。本研究では、好中球の機能異常として、好中球にみられる特殊な細胞死である「ネトーシス(NETosis)」に着目し、その誘導メカニズムを中心に解析を行った。マウス皮膚潰瘍モデルの潰瘍部に真菌由来のα-マンナンを投与すると、潰瘍部に好中球が停滞し、治癒が遅延することを明らかにした。免疫組織化学的に、潰瘍部に停滞する好中球はネトーシスマーカーであるシトルリン化ヒストン(Cit H3)を発現していた。さらに、Western blotting解析においても、α-マンナン投与群において明らかなCit H3発現を認めた。さらにこの現象は、α-マンナンの認識に関わるC型レクチン受容体であるデクチン(Dectin)-2を遺伝子欠損させたマウスに作成した潰瘍部では消失することを確認した。以上の結果より、好中球の機能異常として、好中球にみられる特殊な細胞死であるNETosisがDM足壊疽をはじめとする皮膚潰瘍の治癒遅延に関与していること、さらにNETosis誘導に真菌感染が関与している可能性が導かれた。DM足壊疽における易感染性はよく知られており好中球の機能異常がその要因の一つとされているが、詳細なメカニズムは不明であり、好中球に対する治療方法もみられない。本年度は、好中球機能異常としてNETosisに注目し、その誘導機序とNETosisへの好中球エラスターゼの関与に注目した。α-マンナンによるDectin-2刺激が創傷治癒とNETosis形成に与える影響について、野生型マウス(C57BL/6)を用いて解析した。マウスの創部にα-マンナンを投与し、創閉鎖率とNETosis形成について解析を行った。その結果、α-マンナンの投与によって、創閉鎖率の有意な低下、創部への好中球集積の増加を認めた。また、NETosisの増加及び好中球エラスターゼ活性の増加を認めた、好中球エラスターゼ阻害剤の投与により、遅延した治癒が回復した。さらに、α-マンナン投与による創閉鎖率の有意な低下、NETosisの形成は、Dectin-2遺伝子欠損マウスでは消失していた。本年度はNETosis形成へのDectin-2受容体の関与、好中球エラスターゼ阻害によるNETosisの阻害を明らかにすることができた。今後、糖尿病マウスにおける解析や他のCLRsであるDectin-1との関連やToll様受容体とのクロストークなどの解析が必要であるが、順調な進捗状況であると考える。創傷治癒過程において、NETosis誘導へのDectin-2および好中球エラスターゼの関与が明らかになったことから、今後は糖尿病マウスの創部においても同様の反応が起きているのか、またDectin-1やToll様受容体とのクロストークについて詳細な機序解析を予定している。
薬物の経鼻吸収メカニズムの解明とリンパ移行性の最適化に関する研究

薬物の経鼻吸収性とmucociliaryclearanceの関係を明らかにし、経鼻吸収性の改善のために投与製剤の鼻腔からの排出を抑える対応が有効であることを示した。その一つとして粘膜付着性添加剤を含む粉末状製剤化は有効であるが、膜透過性及び溶解速度が低い薬物では逆に吸収が低下することもあり、添加剤利用の条件設定の重要性を明らかにすることができた。さらに、鼻腔内投与によりmethotrexateが頸部リンパ節へ送達されることを明らかにし、リンパ節への癌転移などの治療の可能性を見出すことができた。本年度は、下記1)3)の検討項目につき、実験を遂行した。1) Caco-2及びヒト気道上皮培養細胞における薬物排泄トランスポーターの比較P-glycoprotein(P-gp)の基質薬物のヒト気道上皮細胞層(EpiAirway^<TM>)に対する透過性を評価するために、試験をAbsorption system社(米国)に委託した。P-gp基質薬物の細胞層透過性の絶対値には差があるものの、透過機構にはEpiAirwayとCaco-2細胞層に類似性があることが明らかとなり、P-gp基質薬物の気道上皮層に対する膜透過をCaco-2により評価できる可能性を見出すことができた。鼻粘膜繊毛細胞の繊毛運動によるmucociliary clearance(MC)の抑制と薬物吸収の関係について検討した。前処理として、MCを抑制する薬物をラット鼻腔内に投与しておくと、norfloxacinの経鼻吸収率は未処置群と比較して増大することが明らかとなった。逆に、MCを促進する薬物の処置群では、経鼻吸収率は低下した。MCの制御により、薬物の経鼻吸収性の改善が期待できることを明らかにした。また、粉末状製剤(乳糖顆粒及び倍散)を投与した際にMCが抑制される傾向が見られたため、製剤添加剤によるMC制御についての検討を継続して進めている。3)粉末状製剤からの薬物膜透過性評価粉末状製剤からの薬物膜透過と膜表面における水分量との関係を明らかにするために、培養細胞層による検討を行った。粉末状製剤のうち、膜表面の水分が取り込まれる製剤と取り込まれない製剤では薬物の溶出が異なり、薬物の膜透過に差違が生じることが明らかとなった。鼻粘膜吸収に適した製剤を選択するために、また、鼻粘膜表面の水分量と薬物吸収の関係を評価する上で重要な情報を得ることができた。本年度は、下記1)、2)の検討項目につき、実験を遂行した。平成23年度は、抗腫瘍薬methotrexate(以下、「MTX」とする)を溶液として鼻腔内投与したときのリンパ節移行性を中心に検討を行った。また並行して、リンパ節への薬物の移行量増大を目的とした粉末製剤投与時の予備情報として、水分量の少ない鼻粘膜上での溶出挙動を調べるための評価手法について検討を行った。1)鼻粘膜を介したmethotrexateの頸部リンパ節移行性評価:MTXのリン酸緩衝溶液をラット鼻腔内に灌流投与した後のMTXの頸部リンパ節への移行量は、点滴静注投与後の移行性に比べて有意に高くなることが示された。また、MTXのリン酸緩衝溶液のラット鼻腔内単回投与実験の結果も、同様に、急速静脈内投与に比べて高いリンパ節移行性を示した。両実験において、AUCを基準にしたリンパ節移行性を評価すると、明らかに鼻腔内投与が有効であり、MTXが鼻粘膜を透過した後に粘膜下の毛細リンパを経て頸部リンパ節に集積することが明らかとなった。この結果を受け、口腔癌及び舌癌を主症とする頸部リンパ節転移癌の治療を視野に入れ、更なる移行量増大を目的としたMTXの粉末及びエマルション製剤投与時のリンパ節移行性の評価を進行中である。2)鼻粘膜上環境を考慮した粉末状薬物の溶出性評価:鼻粘膜上の少量の水分に対する粉末状薬物の溶出性と生体膜透過の関係を明らかにするためのin vitro評価方法についての検討を行った。種々の物理化学的特性(溶解度及び生体膜透過性)を有する薬物について、細胞表面への投与後の溶出挙動とその後の生体膜透過に一定の関係を見出すことができた一方で、速度的な関係には相違が観察された。粉末状薬物の生体膜透過では、薬物の粉末からの溶出後は溶液投与と同様の膜透過を示すと考えてきたが、今回の検討においてそれとは異なる可能性が示唆され、その詳細について検討を継続している。本年度は、頸部リンパ節(CLN)転移癌に対するmethotrexate(MTX)経鼻投与の治療効果を評価することを最終目標として、CLN癌転移モデルマウス(モデル)の作成及びMTXの投与条件の検討を進めた。1)モデルの作成:MTXに感受性が確認できたヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株HSC-2を文献情報に従いヌードマウスの舌に移植し、4週後の舌癌の発症及びCLNへの転移を組織学的に評価した。

舌部には癌化組織が観察されたが、CLNへの転移は確認できなかった。そのため新たにヒト舌癌扁平上皮癌由来細胞株OSC-19を入手し、モデルマウスの作成を試みた。投与後4週が経過し、現在、癌転移評価に向けた組織標本の作製中である。2)CLN転移がん治療におけるMTX投与条件の設定:経鼻投与実験で得られたMTXのCLN移行性及び有効治療濃度から、モデルへの投与条件を設定した。CLNへのMTXの移行量を上昇させる最も効率の良い剤形は粉末であるとの結論に至ったが、ヌードマウスの外鼻孔及び鼻腔が極めて狭いため、粉末投与の定量性を確保することができなかった。現在、投与デバイスの最小型化を目指した改良を検討している。一方で、3mglmLMTX溶液10μLを点鼻投与すれば治療濃度に到達するとの計算結果が得られたので、治療効果の評価を溶液投与で実施することにした。溶液の投与は、先端を細く加工したポリエチレンチューブを装着したマイクロシリンジ(10μL)を用いて、ヌードマウスの両外鼻孔から5μLずつ投与した。ポリエチレンチューブの挿入は、ヌードマウスの鼻腔中心付近に到達するよう、外鼻孔から5mmとした。3)モデルを用いたCLN転移がんの治療効果の確認:モデルの作成が予定通り進行しなかったため、評価実験を実施することができなかったが、今後、モデル作成が確認でき次第、薬効評価実験を実施する予定である。23年度末までに、抗腫瘍薬methotrexateの鼻腔内投与後の頸部リンパ節移行の静脈内投与に対する優位性を確認し、さらに投与形態を大筋で絞り込むことができた。また、リンパ節内濃度推移の速度論的解析により、リンパ節内methotrexate濃度をコントロールするための投与設計が整いつつある。24年度には予定通り、頸部リンパ節転移癌マウスの治療効果の検討に移行できると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究助成最終年度となる24年度には、methotrexateの鼻腔内投与によるリンパ節移転癌に対する治療効果の確認を予定している。まず、頸部リンパ節転移癌モデルの作成に用いるヒト口腔上皮癌由来細胞NSC-2(予定)のmethotrexateに対する感受性を確認し、治療濃度の設定と投与計画を行う。その後、舌がん由来頸部リンパ節転移癌モデルを作成し、モデルの妥当性評価が確認された後、methotrexateの鼻腔内投与による転移癌に対する治療効果を評価し、研究課題をまとめる予定である。
動脈硬化症の原因となる発症初期の血漿酸化LDLの生成機序解明とその抑制

粥状硬化巣がほとんど見られない10週齢apoEノックアウトマウスの大動脈で、脂質過酸化物の沈着が内膜および中膜平滑筋部分にも認められた。この大動脈のタンパク質プロファイルを調べた。動脈硬化好発部位を含む起始部および弓部に対して、初期には病巣形成がほとんど見られない胸部および腹部の大動脈を比較したところ、抗酸化酵素ペルオキシレドキシン2(Prx2)、平滑筋細胞の分化マーカーであるSM22の発現が起始部・弓部<胸部・腹部下部であり、好発部位の平滑筋細胞の脱分化傾向が高く、酸化ストレスに対する抵抗性が低下している可能性が注目された。大動脈起始部のPrx2発現は、4週齢に比べ10および20週齢で低下していた。中膜でPrx2発現が高い部位では、隣接する内膜へのマクロファージの浸潤はほとんどみられなかった。内膜にごく少数のマクロファージの浸潤がみられた部位では中膜Prx2の発現が極めて低く、中膜Prx2の発現低下によりマクロファージが浸潤し易くなる可能性が考えられた。マクロファージが集積し内膜肥厚が進行し始めた部位では内膜、中膜ともPrx2の発現も増強していた。内膜へマクロファージの浸潤が進行し、炎症性細胞の増加とともに中膜のPrx2の発現は上昇する傾向があるのではないかと推察された。これらの結果から、大動脈に動脈硬化が進展する初期過程において、中膜平滑筋細胞で抗酸化タンパク質のPrx2の発現低下が生じ酸化ストレスが亢進することが、脂質過酸化を引き起こし、動脈硬化進展の引き金を引く初期イベントとして重要である可能性が示唆された。多くの研究から、酸化LDLと動脈硬化症との関連性が示されているが、生体内での酸化LDL生成機構は未だ明らかではない。我々は、動脈硬化巣進展に先立って血漿酸化LDLの亢進が起こること、大動脈中膜において酸化ストレスが亢進していることを見出している。そこで、血漿酸化LDLが亢進する動脈硬化発症のごく初期に注目し、生体内で酸化LDLの生成機構を解明することを目的とした。10週齢のapoEノックアウトマウスの大動脈を起始部から腎動脈との分岐部付近まで、部位の異なる4つの部位に分けて切片を作成し、脂質沈着の他、マクロファージ、apoB、脂質過酸化反応産物を免疫組織染色にてその分布を比較した。10週齢の大動脈では粥状硬化巣は起始部にわずかにできている程度で、胸部、腹部大動脈ではほとんど見られない。この傾向は、脂質沈着の他、マクロファージ、apoB、の分布が一致し、良く確認された。一方、酸化ホスファチジルコリンを認識するDLH3抗体では、内膜のみならず中膜部分にも沈着が認められた。脂質過酸化反応産物のアクロレインに対する抗体を用いた検討でも、内膜および中膜部分が陽性であった。また、これらの抗体とapoBに対する抗体との二重染色では、内膜において一部の抗原は共局在を示したものの、apoBとは一致しない過酸化脂質の抗原物質も沈着していた。これらの結果から、apoEノックアウトマウスの動脈硬化の粥状硬化巣が進展する以前の初期病変では、既に過酸化脂質の沈着が認められ、酸化ストレスの亢進が病変の形成に関わっている可能性が示唆された。過酸化脂質はapoB沈着のない中膜平滑筋層でも認められ、リポタンパク質の酸化変性のみならず、細胞膜等の脂質の編成も重要である可能性が考えられた。動脈硬化症の発症要因の一つである酸化LDLの生成機構は未だ明らかではない。

そこで、動脈硬化発症のごく初期に注目し、血管壁組織の変化について検討した。10週齢のapoEノックアウトマウスの大動脈を起始部から腎動脈との分岐部付近まで摘出し、外膜を除去した。動脈硬化好発部位である起始部および弓部(上部大動脈と呼ぶ)と、初期には病巣形成がほとんど見られない胸部および腹部大動脈部位(下部大動脈と呼ぶ)に分けて、ホモジェネートを調製し、二次元電気泳動によるタンパク質プロファイルを比較した。二次元電気泳動で、100個以上のスポットのタンパク質をMALDI-TOF MSにより同定した。両部分で発現量に差の見られたスポットについて注目したところ、以下の興味あるタンパク質を見出すことができた。(1)抗酸化酵素の一つであるペルオキシレドキシン2の発現は、上部大動脈<下部大動脈であり、組織抗酸化能の低下が動脈硬化の発症に先立って起こっている可能性が示唆された。(2)平滑筋細胞の分化マーカーであるtransgelin (SM22)の発現が上部大動脈<下部大動脈であり、好発部の平滑筋細胞の脱分化傾向が高いことが予想された。(3)接着斑タンパク質のlipomapreferredpartner (LPP)の発現は上部大動脈>下部大動脈であり、好発部位での細胞遊走性が高まっている可能性が示唆された。10週齢の大動脈では起始部にわずかに粥状硬化巣ができているものの程度で下部大動脈ではほとんど見られておらず、これらのタンパク質発現変化が病巣形成に先立って起こっている発症余韻である可能性について、さらに検討を進めたい。動脈硬化症の発症要因の一つである酸化LDLの生成機構は未だ明らかではない。我々は、動脈硬化巣進展に先立って血漿酸化LDLの亢進が起こり、大動脈中膜において酸化ストレスが亢進していることを見出した。そこで、動脈硬化発症のごく初期段階の血管壁組織の変化について検討した。10週齢のapoEノックアウトマウスの大動脈組織のプロテオミクス解析から、いくつかのタンパク質が動脈硬化好発部位での発現が変化していることを見出した。特に抗酸化酵素の一つであるペルオキシレドキシン2(Prxn2)の発現は動脈硬化好発部位で低下していることを、ウェスタンブロット、免疫組織染色で確認した。Prxn2は中膜平滑筋で発現しているが、病巣ができ始める前の段階で発現が低下した局所では、マクロファージの浸潤がみられる傾向があり、内膜肥厚が進行すると病巣周辺の細胞はPrxn2を強く発現する。酸化ストレスに対する防御能の低下が、マクロファージの浸潤、血管組織の極での炎症反応、脂質過酸化物の沈着を促進するきっかけを与えている可能性が強く示唆された。生体内酸化LDLの生成機構の解明に向けて、酸化LDL中の酸化性生物の詳細な分析を進め、マーカー分子を探索した。96穴のプラスチックプレートを用いて、酸化PCを認識するモノクローナル抗体DLH3が結合するヒトLDL中の抗原成分を回収した。有機溶媒で抽出された脂質成分をLC-MS解析したところ、吸着操作をしていないLDL画分と比べて酸化PCおよび酸化コレステリルエステルが明らかに増加しており、酸化脂質生成物が濃縮されていることが確かめられた。特に、酸化コレステリルエステルが多く検出されたことから、生体内酸化LDLの新たなマーカーとして利用できる可能性が考えられた
音声による対話能力を核としたマルチモーダル・コミュニケーション能力の教育評価

本研究は,わが国は元より世界規模で進行するグローバル化による多文化共生社会の到来を見据えて,多文化間コミュニケーション能力の総合的な教育評価の方法の開発を目的とする。そこでは,基本となる音声言語の運用能力の評価に加え,多文化社会で必要となる相手の特徴や意図を推測する対人的な認知能力,言語に留まらない外面的表現としての立居振舞いまで,測定対象として捉える。研究期間内は,マルチモーダルな新しいセンサーを利用して,リスニングテストを発展させた,対話場面でのコミュニケーション能力テストの開発を行うことをめざしている。本年度の主な研究成果は次の通りである。1.スペクトルの動的特徴を強調した英語音声によるリスニングテスト都内の国公立大学1年生262名を対象として,明瞭化音声を用いたリスニングテストの実施調査を行った。試験問題の素材として,前年度のセンター試験のリスニングの追試験の問題を用いた。この問題は,参加者が受験している本試験の後に行われた試験なので,参加者にとっては初出の問題となる。名城大学の坂野研究室の協力の下,計算機による信号処理でその英語音声の明瞭化を図った。その明瞭化音声を用いたリスニングテストを行い,その結果を2018年秋の音響学会で報告した。2.声の音色変化に伴う基本周波数の高低関係と声の高さの印象評価の逆転現象の精査話者の声質として伝達される声道長の要素が,声の特徴の認知に与える影響を検討した。基本周波数の高低操作とスペクトル周波数軸を伸縮させた声質変換音声を作成して,聴覚実験を行った。実験の結果,スペクトル重心の移動によって,基本周波数の高低関係と声の高さの印象評価に逆転が起こること,さらに,フラットな抑揚ではそれが消失することを見出した。その成果は,Acoustical Science & Technology (vol.40)に掲載された。そこでは,基本となる音声言語の運用能力の評価に加え,多文化社会で必要となる相手の特徴や意図を推測する対人的な認知能力,言語に留まらない外面的表現として立居振舞いや動作,表情まで測定対象として捉える。1.多文化共生教育における教育評価のための言語運用能力の評価観点の精査日本において,外国籍の幼児・児童のための早期教育に取組んでいる組織について調査を行った。具体的には,幼児期の子どもを対象とした初期日本語指導や,小学校への就学支援を行うためのプレスクール事業を行っている保育園・幼稚園・認定こども園において,児童の観察,保育者・教員の面接を進めた。その成果を環太平洋乳幼児教育学会議で発表した。2.声質変換リスニングテストの実験調査の実施音声の韻律的特徴の形で伝達される話者特徴に着目し,その対人的な推論能力を検討している。今年度は,話者の個人性を担う声質に関連して,声道長の制御を模した声質変換音声によるリスニングテストを作成し,聴覚実験を行った。また,声質表現語による主観評価に加えて,話し手の性格印象の評価課題も導入した。本研究の成果として,国際会議の参加や国内の学会での発表も行われており,おおむね順調に進展していると考えている。1.音声の韻律的特徴と話者の性格印象の関係性のモデル化音声コミュニケーション時の相手の話し方の特徴から,話者の性格特性を推測する対人的な認知のあり方について検討した。音声の発話速度,イントネーションの変動幅,母音の明瞭性を,計算機上で操作した実験音声刺激を作成し,話者の性格特性の印象を評価する聴覚実験の知見をまとめた。各韻律的特徴量と性格特性印象の間に,それぞれに固有の放物線状に変化する非線形な関係を見出し,それらをモデル化した。その成果は,国際心理学会(ICP 2016)で発表した。2.声質変換リスニングテストと話者の同定実験の実施声質として伝達される話者の特徴に着目し,話者の個人性について検討した。今年度も,声道長の制御を模した声質変換音声によるリスニングテストを作成し,聴覚実験を行った。声質表現語による主観評価に加え,話者の同定課題も導入して,声質と話者の個人性の関係を検討した。その研究成果は,日本音響学会誌(vol.73(3))に掲載されたところである。本研究の成果として,音響学会誌などの学術雑誌において論文が公刊され,学会や研究会での発表も行われており,おおむね順調に進展していると考えている。

本研究は,わが国は元より世界規模で進行するグローバル化による多文化共生社会の到来を見据えて,多文化間コミュニケーション能力の総合的な教育評価の方法の開発を目的とする。そこでは,基本となる音声言語の運用能力の評価に加え,多文化社会で必要となる相手の特徴や意図を推測する対人的な認知能力,言語に留まらない外面的表現としての立居振舞いまで,測定対象として捉える。研究期間内は,マルチモーダルな新しいセンサーを利用して,リスニングテストを発展させた,対話場面でのコミュニケーション能力テストの開発を行うことをめざしている。本年度の主な研究成果は次の通りである。1.高校生を対象とした英語リスニングテストの実施体験高校2年生を対象として,センター試験で使用するICプレーヤーを使った受験を体験する公開企画を行った。東北大学で行われた日本テスト学会の第15回大会にて,高校生約460名,教員,保護者,学会参加者を合わせた計531名が参加した。受験体験の他にも,センター試験の総得点と大学合格率の話題や,遅延聴覚フィードバックのデモも取り混ぜた企画を行うことができ,貴重なフィールド・ワークとなった。2.声の音色の変化に伴う基本周波数の高低と声の高さの印象の反転現象の検証声質として伝達される話者の特徴の中でも,声道長の要素が,聞き手の声の特徴の認知に与える影響を検討した。音声の基本周波数の高低操作と声道長の拡大縮小をを模した声質変換音声を作成し,聴覚実験を行った。声質表現語による主観評価の結果,声道長の影響で,基本周波数の高低関係と声の高さの印象評価に反転現象が起こることを見出した。その研究成果は,Acoustical Science & Technology (vol.39(2))に掲載されたところである。本研究の成果として,Acoustical Science & Technologyなどの学術雑誌において論文が公刊されたところである。また,学会での発表や公開企画の実施,さらにチュートリアル・ワークショップなども積極的に進められており,おおむね順調に進展していると考えている。1.スペクトルの動的特徴を強調した英語音声によるリスニングテスト都内の国公立大学1年生262名を対象として,明瞭化音声を用いたリスニングテストの実施調査を行った。試験問題の素材として,前年度のセンター試験のリスニングの追試験の問題を用いた。この問題は,参加者が受験している本試験の後に行われた試験なので,参加者にとっては初出の問題となる。名城大学の坂野研究室の協力の下,計算機による信号処理でその英語音声の明瞭化を図った。
心筋細胞活動電位数値計算モデルを用いた心疾患のメカニズムとその治療法に関する検討

KCNE1/KCNQ1発現量比の増加がI_<Kr>ブロッカーによる催不整脈性に与える影響や,I_<Kr>ブロッカー投与時の心電図波形に与える影響についてさらに評価するため,擬似心電図モデルに対してKCNE1/KCNQ1発現量比の異なるI_<Kr>チャネル動特性モデルを導入し,臨床で使用されている心室頻拍誘発プロトコルを基に設定した刺激プロトコルでシミュレーションを行った.その結果,KCNE1/KCNQ1発現量比が増加するほど活動電位持続時間が延長するため興奮波面が先行興奮の影響を受けて湾曲しやすくなり,また早期後脱分極(EAD)が生じやすくなることがわかった。さらに,KCNE1/KCNQ1発現量比が増加するほど貫壁性の再分極時間のばらつき(TDR)が増加することが明らかになった。TDRの増加は心室頻拍を生じさせやすくなることが知られており,KCNE1/KCNQ1発現量比の増加はI_<Kr>ブロッカーによる催不整脈性を強める可能性があることが示唆された.(2)I_<Kr>ブロッカーの一種であるnifekalantの薬理作用メカニズムに関する検討I_<Kr>ブロッカーのー種であるnifekalantのI_<Kr>亢進作用がnifekalantの不整脈停止・抑制作用にどのように寄与しているかを明らかにするため,nifekalantのI_<Kr>亢進作用がEAD及び遅延後脱分極(DAD)に及ぼす影響についてシミュレーションによって検証した.しかし,シミュレーション上はnifekalantにはEAD及びDADに対する抑制効果は見られず,むしろ悪化する結果が得られた。この結果については,今後シミュレーションにおける再現方法の検証及び臨床におけるnifekalantの効果との比較検討が必要であると考えられる.1.シミュレーション環境の構築2次元心筋組織興奮伝播モデルのうち,monodomain model(興奮伝播現象のみ再現可能)及びbidomain model(外部電場刺激に対する応答も再現可能)について文献調査を行った.また,2次元心筋組織興奮伝播モデルを構築し,さらに同モデルに心室壁の電気生理特性の貫壁性不均一性を導入することにより,擬似的に心電図波形を導出できる2次元心筋組織興奮伝播モデル(以下,擬似心電図モデルと呼ぶ)を構築した.2.KCNE1/KCNQ1遺伝子発現量比と心電図QT間隔の関係に関する検討先行研究において構築したKCNQ1遺伝子に対するKCNE1遺伝子の発現量比(以下,KCNE1/KCNQ1発現量比と呼ぶ)の異なるI_<Ks>チャネルの動特性モデルを擬似心電図モデルに導入し,KCNE1/KCNQI発現量比と心電図QT間隔の関連性について検証した.その結果,KCNE1/KCNQ1発現量比の増加に伴い最大I_<Ks>コンダクタンスの増加,I_<Ks>チャネルが活性化し始める膜電位(活性化閾値)の脱分極側へのシフト,I_<Ks>チャネルの開閉速度を規定する時定数の増加が生じ,結果的にI_<Ks>が減少し,活動電位持続時間及び心電図QT間隔が延長することを示した.3.抗不整脈薬の薬理作用メカニズムの検証種々のIII群抗不整脈薬のうち,I_<Kr>チャネルを選択的に抑制するI_<Kr>ブロッカーの一種であるnifekalantについて,その薬理作用メカニズムの検証を行うため,I_<Kr>チャネルと電気生理特性及び薬理特性の類似したHERGチャネルを用いてnifekalant作用下のHERGチャネルの動特性を計測し,nifekalant作用下のHERGチャネルの動特性モデルを構築した.KCNE1/KCNQ1発現量比の増加がI_<Kr>ブロッカーによる催不整脈性に与える影響や,I_<Kr>ブロッカー投与時の心電図波形に与える影響についてさらに評価するため,擬似心電図モデルに対してKCNE1/KCNQ1発現量比の異なるI_<Kr>チャネル動特性モデルを導入し,臨床で使用されている心室頻拍誘発プロトコルを基に設定した刺激プロトコルでシミュレーションを行った.その結果,KCNE1/KCNQ1発現量比が増加するほど活動電位持続時間が延長するため興奮波面が先行興奮の影響を受けて湾曲しやすくなり,また早期後脱分極(EAD)が生じやすくなることがわかった。TDRの増加は心室頻拍を生じさせやすくなることが知られており,KCNE1/KCNQ1発現量比の増加はI_<Kr>ブロッカーによる催不整脈性を強める可能性があることが示唆された.(2)I_<Kr>ブロッカーの一種であるnifekalantの薬理作用メカニズムに関する検討I_<Kr>ブロッカーのー種であるnifekalantのI_<Kr>亢進作用がnifekalantの不整脈停止・抑制作用にどのように寄与しているかを明らかにするため,nifekalantのI_<Kr>亢進作用がEAD及び遅延後脱分極(DAD)に及ぼす影響についてシミュレーションによって検証した.

しかし,シミュレーション上はnifekalantにはEAD及びDADに対する抑制効果は見られず,むしろ悪化する結果が得られた。この結果については,今後シミュレーションにおける再現方法の検証及び臨床におけるnifekalantの効果との比較検討が必要であると考えられる.
高効率コンバインド発電システム用SiC繊維強化酸化物マトリックス動翼材の開発研究

酸化物をマトリックスとする焼結SiC繊維強化複合材料の製造プロセス、および機棟的性質に関する検討を行った。製造プロセスとしては、溶融含浸法、スラリー含浸法、ともに可能であり、緻密なマトリックスを得ることが出来た。Al203-YAGマトリックスの場合は、1300°Cでの曲げ強度が780MPaであり常温の破壊エネルギーも14000J/m2に達した。しかし、界面強度調整のためのグラファイトの酸化問題と、強化繊維とマトリックスの線膨張係数の違いによるクラックの発生が問題となった。高温でプリフォーム中に酸化物を溶融含浸させるプロセスで作製したガラス+ムライトマトリックスの場合は、常温で曲げ強度1GPa,1300°Cでの曲げ強度が500MPa,常温破壊エネルギーは50000J/m2が得られている。線膨張係数の違いによるクラックはない。グラファイトを界面強度調整に用いた。酸化物に覆われているが、高温での酸化はまぬがれなかった。それゆえ、CVD-BNコーティングへの変更を実施した。窒素分圧を最適化することでコーティング膜の分解を抑制できた。残留応力状態は、マトリックス中のムライトの晶出量、すなわち、組成によって制御できることを、FEM解析およびプッシュアウト法で確認した。SiC強化繊維の線膨張係数は、シリカガラスとムライトの線膨張係数の間に存在する。それゆえ、ムライトの体積率を制御することで、複合材料中の残留応力を制御することができたものと考えられる。高温強度を向上させるためには、ムライトの体積率が大きい方が有利と予想されるため、50モル%アルミナ組成で複合材料を作製した。1650°C、30MPa,3.6ksecのホットプレス条件では、十分に緻密な組織が得られた。ホットプレス温度が1700°Cになると、繊維が損傷を受けることが分かっている。従って、より高い圧力での複合材料作製を検討している。酸化物をマトリックスとする焼結SiC繊維強化複合材料の製造プロセス、および機械的性質に関する検討を行った。Al2O3-YAGマトリックスの場合は、1300°Cでの曲げ強度が780MPaであり常温の破壊エネルギーも14000J/m2に達した。それゆえ、CVD-BNコーティングへの変更を検討することにした。

高温強度を向上させるためには、ムライトの体積率が大きい方が有利と予想されるため、50モル%アルミナ組成で複合材料を作製したが、1650°C、30MPa,3.6ksecのホットプレス条件では、十分に緻密な組織が得られていない。ホットプレス温度が1700°Cになると、繊維が損傷を受けることが分かっている。従って、より高い圧力での複合材料作製を検討している。酸化物をマトリックスとする焼結SiC繊維強化複合材料の製造プロセス、および機械的性質に関する検討を行った。製造プロセスとしては、溶融含浸法、スラリー含浸法、ともに可能であり、繊密なマトリックスを得ることが出来た。Al2O3-YAGマトリックスの場合は、1300°Cでの曲げ強度が780MPaであり常温の破壊エネルギーも14000J/m2に達した。しかし、界面強度調整のためのグラファイトの酸化問題と、強化繊維とマトリックスの線膨張係数の違いによるクラックの発生が問題となった。高温でプリフォーム中に酸化物を溶融含浸させるプロセスで作製したガラス+ムライトマトリックスの場合は、常温で曲げ強度1GPa,1300°Cでの曲げ強度が500MPa,常温破壊エネルギーは50000J/m2が得られている。線膨張係数の違いによるクラックはない。グラファイトを界面強度調整に用いた。酸化物に覆われているが、高温での酸化はまぬがれなかった。それゆえ、CVD-BNコーティングヘの変更を実施した。窒素分圧を最適化することでコーティング膜の分解を抑制できた。残留応力状態は、マトリックス中のムライトの晶出量、すなわち、組成によって制御できることを、FEM解析およひプッシユアウト法で確認した。SiC強化繊維の線膨張係数は、シリカガラスとムライトの線膨張係数の間に存在する。それゆえ、ムライトの体積率を制御することで、複合材料中の残留応力を制御することができたものと考えられる。高温強度を向上させるためには、ムライトの体積率が大きい方が有利と予想されるため、50モル%アルミナ組成で複合材料を作製した。1650°C、30MPa,3.6ksecのホットプレス条件では、十分に繊密な組織が得られた。製造プロセスとしては、溶融含浸法、スラリー含浸法、ともに可能であり、緻密なマトリックスを得ることが出来た。高温でプリフォーム中に酸化物を溶融含浸させるプロセスで作製したガラス+ムライトマトリックスの場合は、常温で曲げ強度1.1GPa,1300°Cでの曲げ強度が840MPa,同引張強度770MPa,引張強度常温破壊エネルギーは16,700J/m2が得られている。それゆえ、CVD-BNコーテイングへの変更を実施した。
ダウン症候群精神遅滞の発症におけるDSCAMの役割の検証

精神遅滞様症状を示すダウン症候群モデルマウス(Ts1Cje)を用い、DSCAM遺伝子のみを3倍体から2倍体に戻したマウスを作製することにより、DSCAMの役割を検討した。その結果、Ts1Cjeマウスで見られる体重減少、Y迷路試験での空間的作動記憶の異常、脳室拡大の各パラメーターに関して、DSCAMの関与は認められなかった。このことから、Ts1Cjeマウスで見られる上記表現型は、DSCAM遺伝子単独の過剰発現により発症しているのではないと考えられる。精神遅滞や特有な顔貌を主な特徴とするダウン症候群は、ヒト21番染色体トリソミーにより発症し、異数性染色体により引き起こされる精神遅滞の中では最も発症頻度が高く、約700人に一人の割合である。申請者は、ダウン症候群の多岐にわたる症状の中で精神遅滞に着目し、マウスモデルを用いることによりその発症機序の解明を目指して研究を行っている。ダウン症候群精神遅滞の発症には、21番染色体上遺伝子の過剰発現が関わっていることが考えられるが、実際にどの遺伝子の過剰発現が関与しているのかはよくわかっていない。本研究課題では、精神遅滞様症状を示し、ヒト21番染色体に相同なマウス16番染色体部分トリソミーであるダウン症候群マウスモデル(Ts1Cje)を用い、申請者が候補遺伝子の一つと考えている21番染色体上の遺伝子DSCAM(Down syndrome cell adhesion molecule)のヘテロマウスと交配を行い、トリソミー領域内のDSCAMのみを3倍体から2倍体に戻すことにより、精神遅滞様症状が改善されるかどうかを検討することを目的とする。平成20年度は、マウスの交配及び行動学的試験を中心に解析を行った。先ず、Ts1Cjeマウスで観察される体重の減少及び新奇環境での活動量の増加について解析をしたところ、DSCAMを2倍体に戻したことによる改善は見られなかった。また、精神遅滞様症状に関連する行動試験については、現在検討を行っている。この研究により、ダウン症候群精神遅滞の発症におけるDSCAMの役割について、動物個体レベルでの検討を行うことが可能であり、得られる結果は精神遅滞の発症機序を理解する上で有益な情報となり得ることが期待される。精神遅滞や特有な顔貌を主な特徴とするダウン症候群は、ヒト21番染色体トリソミーにより発症する。その発症には21番染色体上遺伝子(或は遺伝子群)の過剰発現が関与していると考えられているが、実際にどの遺伝子が関わっているのかはよくわかっていない。申請者は、ダウン症候群の症状の中で特に精神遅滞に着目し、その発症機序の解明を目指し研究を行っている。本研究課題では、ヒト21番染色体に相同なマウス16番染色体の部分トリソミーであり、且つ精神遅滞様症状を示すダウン症候群モデルマウス(TslCje)を用い、申請者が候補遺伝子の一つと考えているDSCAM(Down syndrome cell adhesion molecule)遺伝子のヘテロマウスと交配し、トリソミー領域内のDSCAMのみを3倍体から2倍体に戻したマウスを作製することにより、精神遅滞様症状が改善されるかどうかを検討した。平成21年度は、学習行動試験及び脳の形態学的な解析を行った。TslCjeマウスは、T迷路学習試験におけるalteration rateが正常マウスに比べて有意に低いことが報告されており、同様な試験であるY迷路学習試験を用いてDSCAM過剰発現の影響を調べた。また、TslCjeマウスにおいて観察された脳室の拡大についても検討を行った。未だ実験途中ではあるが、現在までに得られている結果では、DSCAMを2倍体に戻したマウスにおいて上記パラメーターの大幅な改善は見られていない。このことから、TslCjeマウスで見られる上記表現型への関与は、DSCAM遺伝子単独では殆どないものと考えられる。この結果は、ダウン症候群精神遅滞の発症におけるDSCAMの役割について、動物個体レベルでその関与を検討するものであり、有益な情報となることが期待される。