hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スタートアップ企業におけるMCSの精緻化プロセスに関する研究

本年度は,スタートアップ企業である株式会社エニグモを取り上げ,同社におけるマネジメント・コントロール・システム(以下,MCSsと略す)の精緻化の状況を検討し,次の諸点を明らかにした。第1に,MCSsの採用およびその精緻化に影響を及ぼす要因を明らかにした。同社の経営理念は,人材採用システムや人事考課システムといった他のMCSsを設計する際の基盤となっていることが明らかにされた。さらに,経営理念に基づいて設計されたそれらのシステムは,経営理念を強化する役割も果たしていた。企業規模はMCSsの採用およびその精緻化にも影響を及ぼしている。IPOは予算編成システムの精緻化に特に影響を及ぼしていた。さらに,予算編成システムの精緻化には,専門家の組織への参加および退出が影響を及ぼしていた。第2に,MCSsの精緻化とコントロールの対象の関係を明らかにした。人事考課システムや予算編成システムなどは,その精緻化のプロセスで,各々のMCSsが組織内で果たすコントロールの役割を拡大している。このことは,MCSsは当初ある目的またはあるコントロール対象を想定して採用されるが,それが組織内で定着し,展開するにつれて,いくつかのコントロール対象に向けて役割を遂行する方向で拡張されることを示している。さらに,本年度は,スタートアップ企業におけるMCSsの精緻化の概念のより明確な定義およびその測定を行うことを目的として文献レビューを継続的に行なっている。これは郵送質問票調査を行う上で不可欠の作業である。来年度,ケース研究で明らかにされた発見事項の一般化の可能性を検証する目的で,東証マザーズ上場企業を対象に質問票調査を行う予定である。その際に精緻化を一定の尺度で測定することが必要となる。現時点では,MCSsの精緻化の次元として,システムの質の側面と情報の質の側面から検討される必要があると考える。本年度はスタートアップ企業を対象に追加的なインタビュー調査を実施した。さらに,スタートアップ企業である株式会社エニグモの事例を取り上げ,同社におけるマネジメント・コントロール・システム(以下,MCSsと略す)の精緻化の状況を検討した。この検討によって次の2点を明らかにした。第1点目は,MCSsの精緻化を促進する要因を明らかすることができた。企業規模の成長,IPOおよび専門家の組織への参加と退出がMCSsの精緻化に大きな影響を及ぼしていた。さらに,MCSsの下位システム間の相互作用も精緻化の大きな要因の一つであった。これらの点は,本研究の目的であるスタートアップ企業の精緻化を促進する要因の解明と大きな関連性を有している。さらに,本検討を踏まえ,MCSsのコントロールの対象が組織内でのMCSsの精緻化に伴い拡張する傾向があることも発見された。この点は新しい発見であり,次年度に予定している質問票調査においてもその発見に一般化の可能性を明らかにしたい。また,本年度はMCSsの精緻化の測定尺度の開発に向けて,文献レビューを継続的に実施している。MCSsの精緻化は,大きく情報システムの質の側面と,それが生成する情報の質の2つの側面から検討することが可能である。しかしながら,管理会計研究では,これまで情報の質の一部,特に情報の範囲についてかなりの研究の蓄積があるが,その他の側面についての研究の蓄積が十分ではない。このために情報システム全般についての議論にまで文献レビューの範囲を広げ,精緻化の尺度の開発を行っている。以上の点から,概ね研究は予定通りに進んでいると判断した。ケース研究より明らかにされたMCSsの採用およびその精緻化を促進する要因に基づいて,スタートアップ企業におけるMCSsの精緻化に関する仮説の設定を行い,東京証券取引所のマザーズ上場企業を中心に,質問票調査を実施する予定である。質問票調査の目的は次の諸点である。第1に,ケース研究で発見されたMCSsの精緻化を促進する諸要因がスタートアップ企業横断的に妥当するものであるのかを明らかにする。このためには,MCSsの精緻化を測定することが必要となる。文献レビューおよびインタビュー調査を実施することで,MCSsの精緻化の尺度を開発することも今後の研究の目的の一つである。第2に,ケース研究で発見されたMCSsの精緻化のプロセスで,MCSsのコントロール対象が拡大する点についても質問票調査を通じて明らかにしたい。これは本研究の応募時に掲げた目的の一つであるスタートアップ企業におけるMCSsの採用目的との関連でも重要である。さらに,スタートアップ企業の資金調達状況や創業者の特性などの変数を加味することでMCSsの精緻化への影響要因を広範囲に捉える予定である。これらの質問票調査に加え,いくつかのスタートアップ企業とのインタビュー調査を実施する予定である。インタビュー調査によってMCSsの精緻化の状況を詳細に時間を追って観察することが可能である。これによって,MCSsの精緻化が組織ならびに組織成員に及ぼした影響を明らかにすることを意図している。

企業規模はMCSsの採用およびその精緻化にも影響を及ぼしている。IPOは予算編成システムの精緻化に特に影響を及ぼしていた。さらに,予算編成システムの精緻化には,専門家の組織への参加および退出が影響を及ぼしていた。第2に,MCSsの精緻化とコントロールの対象の関係を明らかにした。人事考課システムや予算編成システムなどは,その精緻化のプロセスで,各々のMCSsが組織内で果たすコントロールの役割を拡大している。このことは,MCSsは当初ある目的またはあるコントロール対象を想定して採用されるが,それが組織内で定着し,展開するにつれて,いくつかのコントロール対象に向けて役割を遂行する方向で拡張されることを示している。さらに,本年度は,スタートアップ企業におけるMCSsの精緻化の概念のより明確な定義およびその測定を行うことを目的として文献レビューを継続的に行なっている。これは郵送質問票調査を行う上で不可欠の作業である。来年度,ケース研究で明らかにされた発見事項の一般化の可能性を検証する目的で,東証マザーズ上場企業を対象に質問票調査を行う予定である。その際に精緻化を一定の尺度で測定することが必要となる。現時点では,MCSsの精緻化の次元として,システムの質の側面と情報の質の側面から検討される必要があると考える。本年度はスタートアップ企業を対象に追加的なインタビュー調査を実施した。さらに,スタートアップ企業である株式会社エニグモの事例を取り上げ,同社におけるマネジメント・コントロール・システム(以下,MCSsと略す)の精緻化の状況を検討した。この検討によって次の2点を明らかにした。第1点目は,MCSsの精緻化を促進する要因を明らかすることができた。企業規模の成長,IPOおよび専門家の組織への参加と退出がMCSsの精緻化に大きな影響を及ぼしていた。さらに,MCSsの下位システム間の相互作用も精緻化の大きな要因の一つであった。これらの点は,本研究の目的であるスタートアップ企業の精緻化を促進する要因の解明と大きな関連性を有している。さらに,本検討を踏まえ,MCSsのコントロールの対象が組織内でのMCSsの精緻化に伴い拡張する傾向があることも発見された。この点は新しい発見であり,次年度に予定している質問票調査においてもその発見に一般化の可能性を明らかにしたい。また,本年度はMCSsの精緻化の測定尺度の開発に向けて,文献レビューを継続的に実施している。MCSsの精緻化は,大きく情報システムの質の側面と,それが生成する情報の質の2つの側面から検討することが可能である。しかしながら,管理会計研究では,これまで情報の質の一部,特に情報の範囲についてかなりの研究の蓄積があるが,その他の側面についての研究の蓄積が十分ではない。このために情報システム全般についての議論にまで文献レビューの範囲を広げ,精緻化の尺度の開発を行っている。以上の点から,概ね研究は予定通りに進んでいると判断した。
ホップ不変量の安定性とホップ構成の研究

箱積と両側行列戸田積を含む様々な公式を証明し,ホップ不変量との関係を含む戸田による古典的な公式の一般化も得られた.LSカテゴリーと密接に関係する空間のクラスを定義し,被覆空間との関係を解明することにより,具体例を調べる可能性が広がった.指数位相と呼ばれる位相から定義される関数空間の位相を研究し,すべての位相空間に対して成立する指数同相定理を証明し,その定理の応用として種々の結果を得た.箱積と両側行列戸田積を含む様々な公式を証明し,ホップ不変量との関係を含む戸田による古典的な公式の一般化も得られた.LSカテゴリーと密接に関係する空間のクラスを定義し,被覆空間との関係を解明することにより,具体例を調べる可能性が広がった.指数位相と呼ばれる位相から定義される関数空間の位相を研究し,すべての位相空間に対して成立する指数同相定理を証明し,その定理の応用として種々の結果を得た.位相幾何学の一分野であるホモトピー論において,ホップ構成とホップ不変量に関連する研究を行った。この手法は非安定ホモトピー群と安定ホモトピー群で非零となる要素を探すことおよびLSカテゴリーを研究することに応用される。戸田積は球面のホモトピー群を決定するのに極めて有効であることが知られているが,二側行列戸田積を研究し,古典的な戸田積で知られている様々な定理を二側行列戸田積を用いて一般化することに成功した。箱結合に対しても戸田積の結果を一般化する公式を証明した。これらの公式は球面のホモトピー群等の生成元の間の関係式を研究するのに有効に応用されると思われる。戸田積の一般化として,箱結合が定義されているが,箱結合は古典的な戸田積だけでなく行列戸田積を含む。ホップ不変量は写像の非自明性を調べるために有効に用いられることがあるが,箱結合に対して,ホップ不変量の公式が得られた。さらに,写像空間の位相の研究,評価写像の代数的研究,分類空間の研究,いくつかの空間のLSカテゴリーの決定,一般チャーン指標に関して成果を得ることができた。学会で,位相空間の極小対象,関数空間の位相,二側行列戸田積を応用した新しい公式の導出,リー群,表現論,不変環と分類空間の研究,LSカテゴリー決定,ファイバーワイズ空間の研究,一般チャーン指標の研究と安定ホモトピーへの応用について発表した。ホモトピー論に関する研究会を福岡大学,京都大学,九州大学で行い,成果を得た。マルカム(オハイオ州立大学)と小田は2-カテゴリーにおいて,箱積と両側行列戸田積を含む様々な関係式を証明した.これらの定理の応用として,戸田による古典的な公式の一般化も得られた.具体的な応用例として,球面の非安定ホモトピー群における戸田積および箱積の計算をいくつかの場合に実行することができた.Wがムーア空間のとき,球面のW-ホモトピー群を山本の結果により球面の安定ホモトピー群を用いて記述し,W-ホップ不変量を用いて安定ホモトピー群の中で非零性を判定することにより,非安定W-ホモトピー群の周期族をいくつか見いだした.また,マルカム等のホップ不変量をファイブレーションとその双対へ拡張することができた.箱積等の2次結合の一般化の研究を行い,ホモトピー群の中で古典的な戸田積ではなく新しい方法で生成元を定義し,生成元の間の関係式を調べることができた.岩瀬則夫(九州大学),三村護(岡山大学),ユーン(ハンナム大学)と小田は共同研究により,T空間の一般化で,LSカテゴリーの性質をよく反映する空間の定式化に成功した.現在,応用として,射影空間,レンズ空間および胞体数の少ない空間を研究中である.平嶋康昌(関西大学)と小田は代数的位相幾何学の理論の展開のために適切な関数空間の位相を研究し,新しい関数空間の位相の定式化を行った.現在応用を研究中である.中岡史絵(福岡大学)と小田はガンマ作用素を用いた極小閉集合等に関する結果を得た.H. J. Marcumと小田の共同研究により一般化されたホップ構成と一般化されたホップ不変量の関係を調べ,2次結合との関係を含む定理を得た.Fibrationの分解とホップ不変量との関係が得られた.また,matrix Toda bracketとホップ不変量との関係も解明できた.具体例として,射影空間のホモトピー群について調べた.岩瀬則夫,三村護,小田とY. S. Yoonの共同研究により,Milnor・Stasheffによるfiltrationを用いた手法によりT空間の一般化を定式化することができた。被覆空間との関係を解明することにより,具体例を調べる可能性が広がった.この研究により,LSカテゴリーと関係する位相空間のクラスを定義した.代表的な例として,射影空間,レンズ空間,3個以下の胞体を持つ空間を調べ,LSカテゴリーとの関係等の結果を得た.平嶋康昌と小田は,基点付きの位相空間でexponential位相と呼ばれる位相から定義される関数空間の位相を研究し,基点をもつ任意の位相空間に対してexponential functionが全単射になる条件,連続な全単射になる条件,同相になる条件を得た.この位相は代数的位相幾何学への応用が可能である.CW-複体については,胞体構造を用いた幾何的な考察により精密な結果が得られた.また,関数空間のpairingの定理がいくつかの条件をみたす関数空間関手に拡張できることを証明した.この手法は同変空間の間の関数空間への群作用の研究に応用できることが示された.

これらの結果は,日本数学会の一般講演として2009年9月26日(大阪大学),2010年3月25日(応義塾大学)および2009年11月1日のホモトピー論シンポジウム(姫路市民会館)等で発表した.
生体内含カルシウム化合物の迅速溶解のためのジグリコールアミド利用法の創製

Caと高い反応性を示す新規な化合物、ジグリコールアミド、を用いて、生体内で生成した結石(胆石)の溶解試験を行った。3種の生体試料の溶解試験を行ったところ、ヒト男性の胆石の溶解について、これまでの溶解液よりも高い性能を持つことが明らかとなった。本年度は親水性DGAの取得、実験条件の調査、及び模擬試料(シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム)や性能比較のための錯形成剤(EDTA,クエン酸、ニトリロ三酢酸、ウルソデオキシコール酸)の入手を試みた。模擬試料としてのビリルビン酸カルシウム、脂肪酸カルシウム取得については現在継続中である。親水性DGA(N,N,N',N'-テトラエチルジグリコールアミド、TEDGA)を試薬メーカーに委託合成し、100g入手した。予算の都合上、当該研究進行に当り、TEDGAを水溶性DGAとして使用、検討を進める。必要に応じて、昨年度、親水性DGAの取得及び模擬試料(シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム)や(EDTA,クエン酸、ニトリロ三酢酸、ウルソデオキシコール酸)を入手した。親水性DGAの一つであるTEDGAの水溶液(水、硝酸)、有機溶媒(エタノール)中の溶解実験を行い、いずれの溶解液にも制限無く溶解でき、溶解溶液として利用できる事を確認した。又、エイムズ試験を実施し毒性評価を行った。試験の結果からTEDGAは突然変異能を有さないと判断できた。本年度は次の事を実施した。DGA化合物とその他の錯形成剤とCaとの反応におけるカロリメトリー試験を実施し、クエン酸との性能の比較を行った。両方の化学試薬共にカルシウム1に対して2分子結合すること、TEDGAは1分子目の結合定数は高いが、クエン酸は2分子結合の反応性が高いことなどが分った。このことから、濃度の低い条件でTEDGAはCa溶解に有効であると思われる。また、DGA化合物も2種検討したが、窒素にエチル基を導入したTEDGAがメチル基を持つTMDGAより反応性が高い。この結果より、TEDGAで実施・検討を進めることとする。模擬試料の作成を行い、実試料の溶解試験の前の基礎検討を行った。異なる組成のコレステロール:リン酸カルシウム粉末のペレット成型を試みた。ここでは、コレステロールの変性を避けるために加熱しない条件で加圧して成型可能かどうかを調べた。その結果、無機化合物のみではペレット化が困難であり、成型後も表面剥離や崩れやすい性質を持つが、コレステロールが混在する試料では十分な成型が可能である事を確認した。実試料でも無機、有機の混合体であり、実試料に対応する試料の成型が可能である事を確認した。一方実試料として、人の胆石、及び猫の胆石の入手に成功し、次年度の溶解実験に備える事ができた。昨年、一昨年で親水性DGAの取得及び模擬試料(シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム)や(EDTA,クエン酸、ニトリロ三酢酸、ウルソデオキシコール酸)を入手した。又、エイムズ試験を実施しTEDGAは突然変異能を有さないと判断した。また、DGA化合物とその他の錯形成剤とCaとの反応におけるカロリメトリー試験を実施し、両方の化学試薬共にカルシウム1に対して2分子結合すること、TEDGAは1分子目の結合定数は高いが、クエン酸は2分子結合の反応性が高いことなどが分った。加えて、模擬試料ペレットの作成を行った。本年は、まず模擬試料の溶解試験を行った。比較対象の溶液は、クエン酸、EDTA溶液とTEDGA溶液であり、これら溶解溶液として0.1M TEDGA,クエン酸、EDTAは0.23M NaClに溶解し、PH3.0に調製した。TEDGA溶液10mlをバイアル瓶に取り、各試料を入れ40°Cに加温振り混ぜた。溶解開始より300分後の溶液中のCa濃度を測定し、結果を比較した。シュウ酸カルシウム:コレステロール=70(%):30(%)或いはリン酸カルシウム:コレステロール=30(70):70(30)(%)の成型体はいずれもTEDGA溶液を用いた場合のカルシウム溶解量が高い。本実験からはTEDGAは従来からの胆石を溶解する溶解液よりも高い溶解性を示すことが分った。一方実試料として、人(男女)の胆石、及び猫の胆石の溶解実験を行った。その結果、TEDGAはヒト男性の胆石の溶解に最も高い効果を発揮したが、ヒト女性、猫についてはEDTAの性能が優れていることを確認した。なお、それぞれ生体試料の溶解性は、女性>男性>猫、の順であり、試料組成によって溶解性が異なることも確認された。
転写因子Nrf2活性化による鎌状赤血球症の新規治療法の検討

鎌状赤血球症はグロビン遺伝子の変異によって、赤血球が鎌状に変形する遺伝性疾患である。鎌状赤血球は毛細血管を間欠的に閉塞させることによって、周囲に酸化ストレスを惹起する(虚血再灌流障害)。Nrf2は酸化ストレス防御にはたらく転写因子である。鎌状赤血球症モデルマウスにおいて、Nrf2の抑制因子であるKeap1をノックダウンすることによって遺伝的にNrf2を活性化すると、鎌状赤血球症の症状である肝臓の壊死や肺の炎症の改善がみられた。さらにNrf2活性化剤の投与によっても同様の効果がみられた。これらの結果から、Nrf2を活性化が鎌状赤血球症の新規治療法となることが示された。鎌状赤血球症は、グロビン遺伝子の変異が原因となっておこる遺伝病であり、アフリカやアメリカに多くみられる。変異遺伝子をホモでもつ患者では、低酸素状態に陥ると、変異型グロビンを含むヘモグロビン(HbS)が赤血球内でポリマーを形成することによって、赤血球が鎌状に変形する。鎌状赤血球は、毛細血管内をスムーズに通過できず、間欠的に血管を閉塞させ、虚血再還流障害を引き起こす。また、鎌状赤血球は血管内で容易に溶血するため、赤血球から血漿中へ遊離ヘムや鉄が放出される。これらは、全身に酸化ストレスを惹起し、障害をもたらす。NRF2は、酸化ストレスの有無に応答して、ストレス防御に働く遺伝子の発現を誘導する転写因子である。ストレスのない状態においても、NRF2は常に生成されているが、KEAP1タンパク質によって捕捉され、分解され続けている。細胞がストレスに曝されると、この分解が停止し、NRF2は標的遺伝子の発現を活性化する。本研究では、鎌状赤血球モデルマウスとKeap1遺伝子ノックダウンマウスと交配することによって得た複合変異マウスを用いて、恒常的にNRF2を活性化させた場合の鎌状赤血球の改善効果を検討した。恒常的にNRF2を活性化した鎌状赤血球モデルマウスでは、肝臓の壊死や機能障害、肺の炎症が改善していた。溶血の程度はNRF2の活性化によって変化しなかったものの、血漿中の遊離ヘムおよびその代謝物であるビリルビン濃度が有意に減少していた。このことから、NRF2活性化によって、遊離ヘムの分解が促進され、組織の炎症や機能障害の抑制に繋がったものと考えられる。鎌状赤血球症は、アフリカや中東、インドに多くみられる遺伝病である。グロビン遺伝子の変異によって、赤血球内でヘモグロビンがポリマー状に連結し、赤血球が鎌状に変形する。鎌状に変形した赤血球は、毛細血管をスムーズに通過することができず、血管を閉塞させたり、再び開通させたりを繰り返す。血管が閉塞することによって虚血になった状態から、再び血流が開通すると、組織は突然大量の酸素にさらされるため、酸化ストレスが惹起される(虚血再灌流障害)。さらに鎌状赤血球は血管内で溶血しやすく、溶血した赤血球からヘムが流出する。ヘムもまた酸化ストレスを惹起し、周囲の組織を障害する。転写因子Nrf2は毒物や酸化ストレスに細胞がさらされた際に速やかに誘導され、解毒や還元にはたらく酵素群の発現を活性化する。現在、Nrf2の活性化剤が多くの企業で開発中であり、そのなかのひとつであるジメチルフマル酸は多発性硬化症の治療薬としてすでに欧米で認可されている。本研究では、Nrf2を活性化することによって鎌状赤血球症の症状が改善するかを、モデルマウスを用いて検証することを目的としている。27年度までに、遺伝的に全身でNrf2が活性化された鎌状赤血球症モデルマウスを作製し、解析を行った。その結果、Nrf2の活性化によって、炎症と組織障害が軽減することがわかった。一方で、鎌状赤血球症の原因である血管内溶血の改善はみられなかった。このことから、Nrf2の活性化が鎌状赤血球の溶血によって引き起こされる炎症および組織障害の改善にはたらくことが明らかになった。さらにNrf2活性化剤の投与によっても、遺伝的にNrf2を活性化した場合と同様の効果がみられたことから、Nrf2活性化剤が鎌状赤血球症の新規治療薬となる可能性が示唆された。ここまでの結果を論文にまとめ、PNAS誌に発表した。27年度までに、遺伝的に全身でNrf2を活性化させた鎌状赤血球症モデルマウスを用いた実験およびNrf2活性化剤の投与の実験から、Nrf2の活性化により、鎌状赤血球症の炎症および組織障害が改善することが明らかになった。ここまでの成果を論文にまとめ、PNAS誌に発表できたことから、おおむね順調に進展していると言える。鎌状赤血球症は、赤血球が鎌状に変形し、血管内溶血を起こす遺伝病である。本研究では、生体防御に働く転写因子Nrf2を活性化することによって鎌状赤血球症の症状が改善するかを、モデルマウスを用いて検証することを目的としている。27年度までに、遺伝的または薬剤誘導的に全身でNrf2を活性化した鎌状赤血球症モデルマウスを解析し、Nrf2の活性化によって炎症と組織障害が軽減することを明らかにしている。そこで28年度は、Nrf2の活性化によって鎌状赤血球症の症状を改善する責任細胞の同定を目指した解析を行った。

鎌状赤血球症は、血管内溶血が主な原因となっておこる疾患であるため、そのストレスに最初に曝される血管内皮細胞に着目した。血管内皮細胞特異的にNrf2を活性化させた鎌状赤血球症モデルマウスでは、単純な鎌状赤血球症モデルマウスよりも組織障害および炎症が改善しており、血管内皮細胞におけるNrf2の活性化が鎌状赤血球症の症状改善に重要であることが明らかとなった。マウスから採取した血管内皮細胞を用いた網羅的遺伝子解析(RNA-seq解析)を行ったところ、Nrf2の活性化によって抗酸化・ストレス応答に関わる遺伝子群および血管拡張に働く遺伝子群の発現が上昇しており、これらの遺伝子が症状改善に働いていることが示唆された。さらに、全身でNrf2を活性化した鎌状赤血球症マウスでは炎症の改善が観察されていることから、炎症細胞(好中球、マクロファージ)に着目した検討も行った。炎症細胞特異的にNrf2を活性化させた鎌状赤血球症モデルマウスを作製し、解析を行ったところ、単純な鎌状赤血球症モデルマウスよりも組織障害および炎症が改善していた。このことから、炎症細胞におけるNrf2活性化も全身の症状改善に貢献していることが明らかとなった。鎌状赤血球症はグロビン遺伝子の変異によって、赤血球が鎌状に変形する遺伝性疾患である。鎌状赤血球は毛細血管を間欠的に閉塞させることによって、周囲に酸化ストレスを惹起する(虚血再灌流障害)。Nrf2は酸化ストレス防御にはたらく転写因子である。鎌状赤血球症モデルマウスにおいて、Nrf2の抑制因子であるKeap1をノックダウンすることによって遺伝的にNrf2を活性化すると、鎌状赤血球症の症状である肝臓の壊死や肺の炎症の改善がみられた。さらにNrf2活性化剤の投与によっても同様の効果がみられた。これらの結果から、Nrf2を活性化が鎌状赤血球症の新規治療法となることが示された。鎌状赤血球モデルマウスとKeap1遺伝子ノックダウンマウスとの複合変異マウスの解析が順調に終了した。これにより、NRF2活性化が鎌状赤血球症の炎症と組織障害の改善に効果があることが示された。28年度は、Nrf2の活性化によって鎌状赤血球症の症状を改善する責任細胞の同定を目指した解析を行う。鎌状赤血球症は、血管内溶血が主な原因となっておこる疾患であるため、そのストレスに最初に曝される血管内皮細胞によるNrf2の活性化が症状改善に貢献する可能性を検討する。27年度までに、鎌状赤血球症モデルマウスと条件付きKeap1欠失マウスおよび血管内皮細胞特異的に組換え酵素Creを発現するマウス(Tie1-Creマウス)を交配させることによって、血管内皮細胞特異的にNrf2が活性化している鎌状赤血球症モデルマウスを得ている。このマウスの組織障害および炎症を解析したところ、単純な鎌状赤血球症モデルマウスよりも改善しており、血管内皮細胞におけるNrf2の活性化が鎌状赤血球症の症状改善に重要であることが示唆された。28年度は、さらにNrf2活性化による症状改善の分子メカニズムを明らかにすることを目指した解析を行う。血管内皮細胞において、鎌状赤血球症の症状を改善させるのに重要なNrf2の標的遺伝子を明らかにするため、マウスから採取した血管内皮細胞を用いた網羅的遺伝子解析を行う。さらに、全身でNrf2を活性化した鎌状赤血球症マウスでは炎症の改善が観察されている。過去の報告から、炎症細胞におけるNrf2の活性化は、炎症性サイトカインの発現を抑制することによって、炎症を抑制することが知られている。
ゼブラフィッシュをモデルとした化学物質の毒性機序解析とリスク評価

本研究では、ゼブラフィッシュをモデルとして化学物質の有害性評価と毒性発現機構の解明を目的とする。平成30年度は以下の成果を得た。(1)昨年度までに、in vivo CYP19A1b誘導能を指標としたビスフェノール類(BPs)のエストロゲン様作用の用量効果と最大効力は化合物ごとに異なることを明らかにした。そこで、本年度は各化合物の相対効力(REP)を算出した。REPによる比較では、Bis-MPが他のBPsと比べ一桁高い値を示した。さらにin silico解析により、CYP19A1b誘導のEC50はエストロゲン受容体(ER)サブタイプとの相互作用エネルギーと有意な相関関係を示したが、REPでは相関性は低かった。また、新たな水圏環境汚染物質として注目を集めている妊馬由来エストロゲン類について、本研究で構築したin vivo・in silico評価系によりエストロゲン様作用を評価したところ、BPsと同様の結果を得た。以上より、ERサブタイプとの相互作用をin silico解析することで、多様な化合物のin vivoエストロゲン様作用の用量効果を予測できることが示唆された。(2)高機能シーケンサーを用いたRNA-seq解析により、ゼブラフィッシュの雌雄に発現するCYP分子種mRNA発現量のpie chartの作成に成功した。雌雄でともに発現量が高かったCYP分子種は、CYP2AD2、CYP3A65、CYP1A、CYP2P9、CYP2Y3であった。発現量の雌雄差は、CYP1A、CYP1B1、CYP1D1、CYP2N13、CYP2AD2、CYP2P9で認められ、いずれも雄>雌であった。本研究により、ゼブラフィッシュの成魚肝臓に発現する主要なCYP分子種としてCYP2AD2やCYP2Y3などオーファンCYPの寄与が示され、これら分子種の肝臓における生理的・薬物代謝的な役割が推察された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、解析力の高いゼブラフィッシュをモデルとして化学物質の毒性機序解析とリスク評価を試みることを目的とする。平成27年度は以下の成果を得た。1.ゼブラフィッシュ胚で細胞内受容体を活性化し標的遺伝子の発現量を変動させる化学物質を探索した。このためエストロゲン受容体(ERs)に着目し、陽性対照として17β-エストラジオール(E2)、試験物質としてビスフェノール類(BPs; BPA, BPF, BPAF;各0.3μM30μM)を受精後72時間(72 hpf)の胚に曝露し、96 hpfで採材した。アロマターゼ(シトクロムP450 19A1b; CYP19A1b)遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCR法で測定したところ、試験したBPsは濃度依存的にCYP19A1bの発現量を増加させた。次いでE2およびBPAFを対象としてCYP19A1bの発現誘導機序を検討した。E2によるCYP19A1bの誘導はER拮抗薬処置でほぼ完全に抑制された。一方、BPAFの場合、ER拮抗薬処置によるCYP19A1b誘導の抑制は認められたものの、その抑制割合は約30%であった。こうした結果は、BPAFによるCYP19A1bの発現誘導にERsだけでなく他の機序も存在することを示唆している。2. Ah受容体(AHR)の最も強力な内因性リガンドの一つと考えられている6-formylindolo[3,2-b]carbazole(FICZ)をゼブラフィッシュ胚に曝露したところ、それ自体では毒性を示さなかったものの、CYP1Aノックダウン胚ではFICZによる循環障害が顕著に認められた。他方、CYP1AとAHR2の同時ノックダウン胚では、FICZによる循環障害は認められなかった。こうした結果は、AHR内在性リガンドの生理活性にCYP1A/AHR2のフィードバックループが重要であることを示唆している。平成27年度は当初計画どおり、「ゼブラフィッシュ胚で細胞内受容体を活性化する化学物質の探索」を試みた。これまでに、複数のビスフェノール類がゼブラフィッシュエストロゲン受容体を活性化し、CYP19A1b遺伝子のmRNA発現量を増加させることを明らかにした。また、実験結果より、ビスフェノール類によるCYP19A1bの発現誘導には、ERだけでなく他の機序が関与する可能性も指摘した。さらに、当初計画では平成28年度以降実施する予定であった、「細胞内受容体シグナル伝達系撹乱と発生毒性の関連性の検討」について、一部平成27年度に前倒しして実施し成果を得た。具体的には、CYP1Aノックダウン胚を用いたFICZの毒性試験により、CYP1A/AHR2フィードバックループの撹乱が、浮腫や血流障害などAHR2介在型発生毒性に関与することを示した。本研究では、解析力の高いゼブラフィッシュ胚をモデルとして化学物質の有害性評価と毒性発現機構の解明を目的とする。平成28年度は以下の成果を得た。1.初年度の予備検討の結果をもとに、17βエストラジオール(E2)や複数のビスフェノール類(BPs)についてin vivo曝露試験を行い、エストロゲン受容体(ER)標的遺伝子であるシトクロムP450 19A1b(CYP19A1b)のmRNA発現に対する影響を評価した。

その結果、E2および評価したBPsのほとんどについて濃度依存的なCYP19A1b mRNAの発現誘導がみられた。BPsの構造的特徴に着目すると、フェニル環のpara位にOH基が置換した物質が高い誘導能を示した。さらに、E2および一部のBPsについて、ER拮抗薬との共処置を行った結果、E2やBPsによるCYP19A1b mRNAの発現誘導は有意に抑制された。これらの結果から、E2と同様にBPsも、少なくとも一部は、ERを介してCYP19A1b mRNAを誘導すると考えられた。2.本年度は新たに、リン酸エステル系難燃剤(PFRs)とその代謝物について影響を評価した。PFRsの親化合物を用いたin vivo曝露試験の結果、リン酸トリフェニル(TPHP)などいくつかのPFRsは10 micromolarで全身血流の低下や心臓周囲浮腫を誘発した。さらにTPHPでは体躯の矮小も認められた。TPHPの主要代謝物を用いた曝露試験では、HO-p-TPHPのみ10micromolarで心血管毒性を示した。興味深いことに、TPHPでみられた体躯の矮小は、HO-p-TPHPでは認められなかった。これまでの結果より、複数のPFRsやその代謝物がゼブラフィッシュ胚に対して心血管毒性を引き起こすことが示唆された。理由は以下のように要約され、得られた結果は2年目の研究成果としては十分で、研究はおおむね順調に進展していると判断した。1)ゼブラフィッシュ胚において、BPAだけでなく複数の代替BPsがERを介してCYP19A1b mRNAを発現誘導すること、ならびにBPAと同等もしくはそれ以上の高いエストロゲン活性を有する代替BPsが存在することを明らかにした。2)当初計画にはなかったBPsとゼブラフィッシュERsの相互作用をin silicoでシミュレーションするため、分子シミュレーションソフトウェアを用いて、哺乳類ERsとの相同性モデリングによりゼブラフィッシュERα、ERβaおよびERβbの立体構造予測に成功した。3)PFRsやその代謝物についても新たに曝露試験を実施し、PFR代謝物が発生毒性を示すことを初めて明らかにした。本研究では、ゼブラフィッシュをモデルとして化学物質の有害性評価と毒性発現機構を解明することを目的とする。平成29年度は以下の成果を得た。(1)胚を用いて15種のビスフェノール類(BPs)のin vivo曝露試験を行ったところ、多くのBPsは濃度依存的にアロマターゼ(CYP19A1b)のmRNA発現を誘導した。さらに、化合物ごとにCYP19A1b誘導の用量効果や最大効力が異なることを明らかにした。また、in silicoシミュレーションにより算出したエストロゲン受容体(ER)サブタイプとの相互作用エネルギーが低い化合物ほど、in vivoにおけるCYP19A1b誘導能が高い傾向を示した。他方、部分アゴニスト作用を示したBPsは、E2誘導性のCYP19A1b発現を抑制した。これらBPsとERsの結合状態は、ヒドロキシタモキシフェンとERsの結合状態と類似しており、相互作用エネルギーも低い値であった。(2)胚を用いて4種のリン酸エステル系難燃剤(OPFRs)と一部代謝物のin vivo曝露試験を実施したところ、代謝物でエストロゲン様作用が増強したこと、ならびに代謝物を含む複数の化合物で心臓周囲浮腫や全身血流の低下が認められた。
泌尿器癌の浸潤・転移におけるガレクチン-3の腫瘍制御機構の解明

ガレクチン-3は多くの癌細胞で強発現が認められ、癌の浸潤・転移に重要なkey proteinであることが示唆されている。今回われわれは泌尿器科癌の浸潤・転移におけるガレクチン-3の役割を特にアポトーシス制御の観点から検討した。まず転移巣でのガレクチン-3の発現について評価を行った。腎細胞癌組織および正常腎実質組織、ヒト腎癌細胞株でのガレクチン-3の発現をWestern blottingおよびreal-time PCR法で検討した。ヒト腎癌細胞株すべてで、ガレクチン-3の高発現を認め、ヒト腎細胞癌組織、特に淡明型腎細胞癌組織では、正常実質部分と比較して有意にガレクチン-3の発現が高かった。転移を有する症例では、癌組織のガレクチン-3の発現量と正常腎実質部分でのガレクチン-3の発現量の比が有意に高かった。同様に転移症例においてはガレクチン-3の発現量に比例して血管新生、TRAIL誘導性アポトーシスに関連した遺伝子の発現が増強していた。以上の知見より、ガレクチン-3はhumanの腎細胞癌患者において、転移の予測因子となりうる可能性が示唆された。膀胱癌細胞株を用いたTRAIL誘導性アポトーシスに関する実験で、ガレクチン-3を過発現させた細胞株ではwild typeと比較してtotal Aktの発現レベルに変化はみられなかったが、active Aktの発現が増強されており、TRAIL抵抗性の獲得への関連が示唆された。siRNAによる約50%ノックダウン株での検討の結果、active Aktの発現はODレベルで約30-40%の減少が認められ、PI3K inhibitorsによるAktのdownregulationと同様に、TRAILへの抵抗性の減弱が認められた。今回、われわれはreal-timePCRを利用して、humanの検体での原発巣および転移巣におけるガレクチン-3の発現を測定した。手術により得られた63例の腎細胞癌組織および51例の正常腎実質組織、また5種類のヒト腎癌細胞株からtotal RNAを抽出し、ガレクチン-3の発現をWestern blottingおよびreal-time PCR法で検討した。5種類のヒト腎癌細胞株すべてで、ガレクチン-3の高発現を認めた。またヒト腎細胞癌組織、特に淡明型腎細胞癌組織では、正常実質部分と比較して有意にガレクチン-3の発現が高かった(418.6+137.3 vs 66.7+13.5,p=0.019)。転移を有する症例では、癌組織のガレクチン-3の発現量と正常腎実質部分でのガレクチン-3の発現量の比が有意に高かった(p=0.035)。次に、膀胱癌細胞株を用いてTRAIL誘導性アポトーシスにおけるPI3K/Akt pathwayの役割について検討を行った。RT4細胞株ではactive Aktの発現が低くTRAILに感受性を示したが、UM-UC-3やT24ではactive Aktの発現は高く、TRAILに抵抗性を示した。後者の細胞に部いてPI3K inhibitorsによるAktのdownregulationの結果、それらの抵抗性が減弱した。現在、前者の細胞にconstitutively active AktをtransfectionすることによるAktの活性およびTRAIL誘導性アポトーシスの抑制の有無について検討中である。ガレクチン-3は癌の浸潤・転移に重要なkey蛋白の1つであり、泌尿器科癌に対するガレクチン-3のアポトーシスおよび血管新生等の腫瘍制御機構の解明については将来的な遺伝子治療の可能性を含んでおり臨床的にも大変意義深い。

これまでのところわれわれは、microarrayを用いた腎細胞癌の網羅的研究において、腎細胞癌に共通して過発現している遺伝子群と予後予測に関わる遺伝子群を同定している。ヒト腎細胞癌組織、特に淡明型腎細胞癌組織では、正常実質部分と比較して有意にガレクチン-3の発現が高かった。また特に転移を有する症例では、癌組織のガレクチン-3の発現量と正常腎実質部分でのガレクチン-3の発現量の比が有意に高かった。同様に転移症例においてはガレクチン-3の発現量に比例して血管新生、TRAIL誘導性アポトーシスに関連した遺伝子の発現が増強していた。以上より、ガレクチン-3はhumanの腎細胞癌患者においては転移の予測因子となりうる可能性が示唆された。膀胱癌細胞株を用いたTRAIL誘導性アポトーシスの実験では、ガレクチン-3を過発現させた細胞株でactive Aktの発現が増強されることによってTRAILへの抵抗性の獲得に関係していた。またsiRNAによりガレクチン-3をノックアウトした細胞株の作成については、そのdown regulationの精度がやや低く約60%ノックダウン株での検討となったが、active Aktの発現はODレベルで約30-40%の減少が認められ、PI3K inhibitorsによるAktのdownregulationと同様に、TRAILへの抵抗性が減弱した。今回使用した膀胱癌細胞株においては、細胞外へのガレクチン-3蛋白の分泌量に有意差はなく、血管新生、TRAIL誘導性アポトーシスへのdirectの影響は少ないと考えられた。
e ラーニングシステムによる医・獣医学系の基礎教育の汎用自主学習システムの構築

従来は相互利用が難しかったとされていたeラーニングシステムのコースの作成や小テストの作成を小テストの要素およびコース要素を部品化・共通化して相互利用が可能なeラーニングシステムの構築を行った。本研究の応用として当初想定していなかった実験・実習科目においてもeラーニングシステムが効果的であることが実証できた。構築したsystemはすべて無償の仮想化OS Esxiの仮想機械上に実装できたため, LMS本体及びコースデータを含めてファイルとして再配布可能である。更に,VMPlayerなどで実際にインストールすることなくUSBメモリなどを用いて体験することも可能である。本年度は数理系科目の部品化の可能性を探り,これまでに作成した様々な小テストや課題などを汎用のXML形式で収集保存し,共通化の可能性を探った。また,語学系では単なる知識問題の課題ではなく,インタラクティブな応答が可能な課題を汎用の形式で保存,編集,公開できる可能性を探った。語学系においては日本国内での事例研究以外にも国外(英国・バーミンガム大学,カナダ・ブリティッシュコロンビア大学)でのe-learningシステムの利用状況を調査した。特に,上記2大学での調査で今後日本での語学教育に活かせる活用例を発見し,学会等での発表につながった。また,今後関連学会での発表講演も受理され発表する予定である。語学系においては当初の構想を超えて単なる知識問題の部品化にとどまらずLMSの特徴である双方向の課題の部品化の可能性も考えられるようになった。さらに,数理系においては当初の数学,物理,化学などの基礎科目の演習問題のレベルから,医学・獣医学を含めた,広く実験系学科の実験への応用の試みも開始した。初年度においては数理系基礎科目の演習問題と同程度の知識問題にとどまったが,一部実験科目の反転学習の助けとして実際の実験・実習の前に実験手順の動画の公開とその内容への基礎的な設問を付加し,事前学習の助けと,実験後のデータ解析の確認についてLMSが有効に機能することが確認されたのは収穫であった。この結果は平成28年度に研究発表を予定している。本研究においては,LMS(主にMoodle, Stack)のデータ構造の把握とそれらの汎用化について技術的な面でわからない部分が多かった。実際に今までのコースデータを詳細に分析したところ,非常にわかりやすい構造とファイル形式であることが確認された。そのため,データ構造の解析,特に,SQL databaseの取り扱いについて予定より格段に前進することができた。さらに,XML fileへの変換や変換後の解析も順調に進んだため汎用化のための基本構想を初年度で固めることができた。上記のように初年度に想定したいたもののうちLMSのデータ構造の解析と汎用化への手順がかなりの部分が早期に完了した。そのため,研究実績の概要でもふれた,実験・実習など,従来はLMSの利用が活発でなかった分野へのLMSを利用した反転学習や総合的な事前学習の導入の可能性を探ることができた。語学系においてもLMSの利点である双方向コミュニケーションが汎用化できる可能性がわかったことは大きな収穫であった。語学教育における語学教材の確保については著作権等の問題もあり国内での調達に不安があったが研究協力の形で相互利用できる可能性がでてきた。このような状況から平成28年度の実際のコースデータの作成を数理系のみならず語学系および実験系にまで含めることができると考えている。医・獣医学系の基礎教育の汎用化を目指してe-Learning教材の作成や実際に教育するための環境構築を目指した本研究も2年目を終え,多くの教材の作成および汎用化のための部品化も進んだ。特に,語学系ではe-Learning systemの教育効果改善が顕著であり,1年目より教育効果が確認でき,複数の研究発表と論文として出版された。また,数学系でも本研究のe-Learning sytemのベースであるMoodle + STACK環境で作成された教材をXML形式で保存,編集することができるようになり,他のe-Learning systemとの共通の汎用の問題とできることも確認できた。特に,理数系の問題作成にひつようとなるCASも本研究のCASであるMaxima以外にも対応している作成事例も得られ,研究発表をすることができた。ハードウェアも含めた環境も本研究の直接経費で購入したサーバ上に移植が容易な仮想OS(Esxi 6.0)の仮想マシンとして実装することができた。また,広くインターネット上に公開するための十分なセキュリティを確保することも本年度に完成した。これにより,地理的に離れた場所で研究をしている分担者間の協力もスムーズにできるようになった。完成年度には本研究の成果としてのe-Learning system serverを実際に構築している仮想化OS (Esxi)以外の仮想化OS(virtualbox等)の下でも容易に構築できるようになるものと思われる。現在,CentOS 7.0上のMoodle + STACKのベースシステムのEsxiのVMとしての配布は可能となっている。本研究は医・獣医学系における基礎教育の共通化と語学系科目,理数系科目の教材の汎用部品化を目標としていたが,研究代表者の所属する日本大学生物資源科学部で専門学科(農学系の応用生物科学科)の専門実験科目への適用も実践できた。ただし,そちらに対しては,今だ,汎用化・部品化には至っていないが,本研究の特徴である受講者への回答に対してきめ細かい応答が可能であるという点は,受講者一人一人の実験結果が異なる,すなわち,用意した正解自体が変わりうる,という学生実験科目への応用の可能性が示された。

将来は講義科目に限らず対応できるシステムへと発展させる契機が得られた。本来の語学系科目においては海外のe-Learning systemの現状を把握し,一部を導入することができ,医学部の語学教育の充実に寄与した。医学教育系の複数の学会や研究会で発表し期待した以上のよい評価を受けることができた。数学系の部品化では一つの問題作成によって同じ形式の多くの問題例を作成する方法が研究され,研究会で発表し,好評を得た。さらに,e-Learning systemの裏で動作する数式処理ソフト(本研究の場合はMaxima)への対応も汎用化の例(Mathematicaへの対応)が得られた。最終年度は構築したe-Learningsystemにおいて,語学系,数理情報系の汎用的モデルコースを基に作成した複数のコース,科目で講義を実施し利用効果を確認できた。特に,今年度から新規に本システムを利用した生物系の教員もあらかじめ用意された汎用コースを編集するという手法で使い慣れた教員と同程度のコースを簡単に作成することができるようになった。当初想定していた,語学・数学系での汎用問題のみならず,化学,生物学,農学系の実験科目用の汎用問題の作成も実現できた。加えて,当学部で先行導入されていたStarQuizの問題をMoodleに移植することも実現できた。H28年度において,座学である,語学・数学系のみならず農学系の実験科目にも本e-Learning systemを導入したがその教育効果は非常に高いことが実証された。加えて,学生の実習成果物の評価に置いて,本e-Learning systemとTensor flowによる機械学習での評価法を実現したがその効果は著しいものがあった。従来は学生実験の成果物の評価は熟練者である教員によってのみ可能であったが教師ありの機械学習の結果,本systemで十分に評価可能であることが実証された。これにより,実習での学生の成果物の評価の時間が大幅に短縮され,それまで一週間ほど評価にかかっていたのが実験当日に評価が確定し,その日のうちに実験の復習や追加実験を実施することが出来教育効果が格段に上がった。座学系の科目への汎用化システムの完成のみならず,実験・実習科目へのe-Learningsystemの導入の契機とできたのは大きな成果であった。従来は相互利用が難しかったとされていたeラーニングシステムのコースの作成や小テストの作成を小テストの要素およびコース要素を部品化・共通化して相互利用が可能なeラーニングシステムの構築を行った。本研究の応用として当初想定していなかった実験・実習科目においてもeラーニングシステムが効果的であることが実証できた。構築したsystemはすべて無償の仮想化OS Esxiの仮想機械上に実装できたため, LMS本体及びコースデータを含めてファイルとして再配布可能である。更に,VMPlayerなどで実際にインストールすることなくUSBメモリなどを用いて体験することも可能である。
筋萎縮性側索硬化症とＴＤＰ－４３：スプライシング異常の発見からその病態の解明へ

本研究は壮年期に発症する神経難病である筋萎縮性側索硬化症(ALS)の治療方法を開発するために、その病的機序の解明を目的とした。我々は病的タンパクであるTDP-43に注目した。遺伝子はスプライシングによって一つの遺伝子から様々な種類が作られるが、我々は、TDP-43のスプライシングによる多様体に注目し、それを解析し、病態との関係について検討した。また、このスプライシングを制御する機構について詳細に検討を加えた。その結果、TDP-43の遺伝子異常によってALSを引き起こすことがあるが、一部の遺伝子異常は、TDP-43の自己スプライシングを変化させる可能性が示唆された。本年度は、筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43異常に関連して、以下の研究を行った。1)神経系におけるTDP-43スプライシング多様体の解析。TDP-43は、このエクソン6内に、2カ所にイントロンを形成する。それにより形成されるスプライシング多様体の一部は、mRNAのナンセンス依存性分解機構で分解される。しかし、この一部では、ナンセンス依存性分解機構が惹起されず、結果として、C末が異なるTDP-43が産生される。これらの多様体のC末特異的な抗体を作成し、ヒト組織での存在の有無を検討した。その結果その存在を確認した。2)TDP-43のスプライシングを制御する因子の検討。mRNA前駆体のスプライシングはmRNA前駆体への抑制因子と促進因子の結合のバランスで制御されている。促進因子の代表的なものとしてSC35、抑制因子としてはhnRNPが挙げられる。TDP-43のエクソン6はこれらの因子の結合領域を多く含む。元来TDP-43はhnPNP結合蛋白であり、スプライシング抑制因子としての役割が推定されている。そこで我々は、TDP-43そのものがTDP-43のスプライシングに寄与すると考えた。スプライシング関連蛋白では、このような自身のスプライシングによる自己調節機序は広く知られており、その周辺塩基配列は齧歯類と比較しても広く保存されていることが報告されている。TDP-43もエクソン6内に齧歯類と広範囲にわたり完全に塩基配列の一致する領域を有しており、同様の機序で制御されている可能性が示唆された。我々はTP-43欠損マウスのヘテロ結合体にてTDP-43のmRNA量が減少していないこと、このマウス由来の線維芽細胞でスプライシング多様体の構成が変化していることを確認した。さらに、TDP-43エクソン6のミニジーンを作製し、これらのスプライシング因子存在、非存在下でのスプライシングを検証し、これを確認した。本研究はALSの分子病態を解明するために6項目の検討事項を設けて研究にあたった。以下、各項目ごとに述べる。1)神経系におけるTDP-43スプライシングバリアントの解析については、患者脊髄由来cDNAを検討し、TDP-43スプライシングバリアントの検討を行い、そのTDP-43封入体との関連を明らかとした。2) TDP-43のスプライシングを制御する因子の検討については、TDP-43エクソン6のミニジーンを作製し、TDP-43 mRNAに結合する複数のスプライシング因子存在、非存在下でのスプライシングを検証し、TDP-43のスプライシング管理機構を明らかとした。3) ALS10変異がTDP-43スプライシングに与える影響の検討については、一部のALS10変異によって自己のスプライシングが影響をうけるという知見を得た4) TDP-43スプライシングバリアントの蛋白質特性の検討については、本バリアントが易凝集性を持つことを示した。5) TDP-43により制御されるSKAR、U12依存性遺伝子産物のスプライシング異常の検討については、我々はTDP-43の喪失によりスプライシング異常がおこる遺伝子としてSKARを単離した。さらに、今までの解析でALS患者では、核内小体であるCajal小体(CB)が減少していること、同部で成熟が促進されるsnRNAのうちU12 snRNAの減少が認められることを免疫組織化学的、分子生物学的に明かにした。(6)家族性ALSの原因遺伝子の同定については、孤発性と同一の病理組織及びTDP-43免染所見を示す家族性ALSの2家系3剖検例の一家系からC9ORF72のG4C2リピートの異常伸張を、本邦で初めて見出した。当初の6項目の検討事案について、それぞれ成果を得た。TDP-43のエクソン内でのスプライシングは、このエクソン内に、2カ所にイントロンを形成することで制御されている。最初のイントロン1のスプライシングが極めて多様性に富む。

しかし、ここが正確なアクセプター、ドナーサイトを使用しない場合、ナンセンス依存性分解機構が惹起されず、結果として、C末が異なるいくつかのTDP-43バリアントが産生される。これらのバリアントのC末特異的な抗体を用い、ALS患者剖検組織にて、TDP-43封入体との関連を明らかとした。さらに、TDP-43のスプライシングを制御する因子について検討した。mRNA前駆体のスプライシングはmRNA前駆体への抑制因子と促進因子の結合のバランスで制御されている。抑制因子としてはhnRNPが挙げられる。元来TDP-43はhnRNP結合蛋白であり、スプライシング抑制因子としての役割が推定されている。我々は、TDP-43そのものがTDP-43のスプライシングに関与すると考えた。スプライシング関連蛋白では、このような自身のスプライシングによる自己調節機序は広く知られている。実際、KOマウスのヘテロ結合体にてTDP-43のmRNA量が減少していないこと、このマウスの線維芽細胞でスプライシングバリアントの構成が変化していることを既に確認しており、我々の仮説を支持する結果を得ている。この仮説を検証するために、TDP-43エクソン6のミニジーンを作製し、これらのスプライシング因子存在、非存在下でのスプライシングを検証した。その結果、この領域のスプライシングを制御するいくつかのスプライシング因子を同定した。剖検組織におけるTDP-43スプライシング産物の検証するために、スプライシング多様体特異的抗体を作成し、その抗体を用いて、ヒト組織でスプライシング多様体を検証し得たため。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目的である、TDP-43のエクソン内でのスプライシングの多様性については、C末が異なるいくつかのTDP-43バリアントを同定し、これらのバリアントのC末特異的な抗体を用い、ALS患者剖検組織にて、TDP-43封入体との関連を明らかとした。これは、当初の予定通り順調に推移している。我々は、TDP-43そのものがTDP-43のスプライシングに関与すると考えTDP-43エクソン6のミニジーンを作製し、これらのスプライシング因子存在、非存在下でのスプライシングを検証した。この成果も、当初の予定通り順調に推移している。研究は順調に伸展しており、当初の研究計画通りに遂行する予定である。神経系におけるTDP-43スプライシングバリアントの解析については、本年は、これらのスプライシングバリアントに特異的なRNA probeを用いin situ hybridizationにてmRNAレベルでの解析を行う。また、レーザマイクロダイセクション法を用い、運動神経細胞から良質なRNAを抽出する方法を確立した。