hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先進複合材料の曲げ特性試験法の研究

1.通常曲げ試験はJIS規定により、3点あるいは4点曲げで行われてきた。しかし一方向強化CFRP材のように高強度・高剛性で異方性の大きい先進複合材料に適用すると、負荷点圧子直下での応力集中で局部破壊し、所謂曲げ破壊とは云えず、望ましくないことがわかってきた。すなわち、スパンが長く、板厚が薄い方が曲げ強さは大きく、3点曲げ強さの方が4点曲げ強さより大きく、これは圧子荷重の増大による応力集中の影響によるものである。そこで圧子の下に薄いフィルムを挿入すると、応力集中の緩和で曲げ強さは3,4点曲げ強さより3040%も増大し、JIS法による試験法は再検討すべきことが明らかになった。2.そこで応力集中のない純曲げ方式のために2種の純曲げ治具を試作し、比較のために前述と同じ一方向強化CFRP材で曲げ試験をした。(1)先ず滑動枠(SF)型治具を試作して純曲げ試験を行った。この治具では、両端部の傾斜による曲げモ-メントの補正を行う必要が生じたが、補正後の曲げ強さは、3,4点曲げ方式による値より3040%も大きく、前述のフィルム挿入時と同程度の値が得られ、破壊様式も繊維方向の軸力による曲げ破壊で、大エネルギの放出で瞬時にバラバラになった。(2)次にSF型治具での補正の必要のないラックーピニオン(RP)型治具を試作し、純曲げ試験を行ったが、前述の補正値と同じ2.42.5GPaの曲げ強さが得られ、板厚2mmと3mmによる相異もなかった。3.以上の試験結果から、JIS法による3,4点曲げ方式を先端複合材料に適用することは望ましくなく、再検討すべきで、これに代る方法として純曲げ方式が真の曲げ特性の得られる試験法として望ましいことがわかった。複合材料の力学的特性試験は、構造設計のために必要な信頼性のある材料特性を提供するために行われるものなので、重要な課題であるにも拘らず、未だISOでも審議段階で整備されていない。特に高性能の先進複合材料では異方性が大きく、各種の特異現象のため、未だ研究段階である。そこで、最も重要な曲げ特性の試験法を取り上げ、最も普及し且つ、異方性の大きい一方向強化CFRP(T800)材を取り上げて実験および数値計算を行って考察した。1)従来通常行われてきた3点曲げ、4点曲げ方式では、負荷圧子下での応力集中で局部破壊し、所謂曲げ破壊しないため曲げ強度は低い。2)従って負荷点下にフィルムを挿入したり、負荷点圧子半径を大きくしたり、また試験片付法としてスパン/板厚比を大きくしたりすると、軸応力による曲げ破壊を起し、曲げ強さは3040%増加した。3)これらの静的曲げ実験結果は、曲げ疲労試験でも確認され、またFEM解析による数値計算結果によっても良く説明できる。4)そこで圧子近傍の局所脆性破壊が先行しないで曲げ破壊を発生させる曲げ試験法として、純曲げ試験治具を試作して実験すると、応力集中の影響もなく、3,4点曲げ方式より3040%大きい曲げ強度が得られ、先進複合材料の曲げ試験法として望ましいことがわかった。5)しかし本純曲げ治具では、曲げたわみが増大し、曲げモ-メント値にも影響することがわかったので、次年度に純曲げ治具を改良したい。6)純曲げ方式を採用する場合にも、曲げモ-メントたわみ関係は、両端部の吸い込み移動、大たわみ効果によって非線形となるので、有限線形理論によってこれらの関係を解析し、実験曲線をよく説明できた。

1.通常曲げ試験はJIS規定により、3点あるいは4点曲げで行われてきた。しかし一方向強化CFRP材のように高強度・高剛性で異方性の大きい先進複合材料に適用すると、負丹点圧子直下での応力集中で局部破壊し、所謂曲げ破壊とは云えず、望ましくないことがわかったきた。すなわち、スパンが長く、板厚が薄い方が曲げ強さは大きく、3点曲げ強さの方が4点曲げ強さより大きく、これは圧子荷重の増大による応力集中の影響によるものである。そこで圧子の下に薄いフィルムを挿入すると、応力集中の緩和で曲げ強さは3,4点曲げ強さより3040%も増大し、JIS法による試験法は再検討すべきことが明らかになった。2.そこで応力集中のない純曲げ方式のために2種の純曲げ治具を試作し比較のために前述と同じ一方向強化CFRP材で曲げ試験をした。(1)先ず滑動枠(SF)型治具を試作して純曲げ試験を行った。この治具では、両端部の傾斜による曲げモ-メントの補正を行う必要が生じたが、補正後の曲げ強さは、3,4点曲げ方式による値より3040%も大きく、前述のフィルム挿入時と同程度の値が得られ、破壊様式も繊維方向の軸力による曲げ破壊で、大エネルギの放出で瞬時にバラバラになった。(2)次にSF型治具での補正の必要のないラック-ピニオン(RP)型治具を試作し、純曲げ試験を行ったが、前述の補正値と同じ2.42.5GPaの曲げ強さが得られ、板厚2mmと3mmによる相異もなかった。3.以上の試験結果から、JIS法による3,4点曲げ方式を先端複合材料に適用することは望ましくなく、再検討すべきで、これに代る方法として純曲げ方式が真の曲げ特性の得られる試験法として望ましいことがわかった。
遺伝子情報と細胞内シグナル伝達系の解析による非ふるえ熱産生の調節機構の解明

代謝性体温調整の中核をなす非ふるえ熱産生の主要発部位である褐色脂肪組織(BAT)機能に果たすグルカゴン(G)の役割と、その作用の機序を検討し以下の結果を得た。1.Ca摂取ラットでは、ノルアドレナリン(NA)によるBAT温と直腸温の上昇は小さく、尾部皮膚温は、対照群とは逆に上昇した。CaはNAのBAT熱産生及び末梢血管収縮作用を抑制することが示唆された。Gは、BAT温、直腸温、尾部皮膚温の何れも対照群と同程度上昇させた。2.遺伝的耐暑ラットであるFOKの摂食量は、温暖馴化的、寒冷馴化時共対照ラットと差が無かった。3.寒冷馴化FOKでは、対照ラットに比べてNAによる酸素消費量の増加度が大きかった。又、Gによる直腸温の上昇度も大きかった。4.急性寒冷曝露時の血奬Gレベルの上昇度は、温暖馴化時、寒冷馴化時ともFOKで対照ラットより大きかった。5.FOKのBATでは、Gに対するEC_<50>が小さかった。6.新生期ラットのBATで、イノシトール・トリフォスフェート(IP_3)は用量に応じて酸素消費量を増加させた。7.プロラクチン(PRL)投与ラットでは、BATのGによる熱産生反応が低下していた。8.PCRによる解析の結果、BATでShort formのPRLリセプターmRNAシグナルが検出された。このシグナルは新生期ラットのBATが成体ラットより高かった。これらの結果は、遺伝的に耐暑性であると同時に耐寒性にも優れているFOKラットの非ふるえ熱産生発現にはGが重要な役割を果たしている事、及びBATでのGの作用IP_3-Ca^<2+>ルートを介して発現され、その作用はPRLによって抑制的に調整されている事を示している。耐寒性の亢進には非ふるえ熱産生(NST)の亢進が重要な役割を果たしている。NSTの主な発現因子はノルアドレナリン(NA)であるが、膵ホルモンのグルカゴンもNAに匹敵する強力な因子である事が知られている。本研究では、NSTの調節に果たすグルカゴンの役割と作用の機序を明らかにする為に、温暖馴化ラット、寒冷馴化ラット及びCaを過剰摂取させたラット(Ca-ラット)について、NA及びグルカゴンに対する反応性を調べ以下の結果を得た。1)温暖馴化ラットで、NA、グルカゴン持続静注は共に結腸温及びNSTの主要発現部位である褐色脂肪組織(BAT)温を著しく上昇させた。上昇作用はNAの方が大であった。2)寒冷馴化ラットでは、これら因子に対する反応性が亢進していた。3)温暖馴化ラットの尾部皮膚温及び血流量は、NAによって増加したが、寒冷馴化ラットでは逆に低下した。4)グルカゴンでは尾部皮膚温、血流量共変化が見られなかった。5)Ca-ラットでは、NAによる結腸温及びBAT温の増加の程度が抑制され、尾部皮膚温は低下した。グルカゴンでは対照群と差が無かった。これらの結果は、耐寒性の増強には皮膚血管運動の反応性の亢進も大きな役割を果たす事、及び過剰の2荷の陽イオンはBATの熱産生に対し抑制的に作用する事を示唆している。

NSTの主要発現部位は褐色脂肪組織(BAT)であり、主な発現因子はノルアドレナリン(NA)であるが、加えて膵ホルモンのグルカゴンもNAに匹敵する発現作用を持つことが示されている。しかし、高いNST能を持つ新生仔期で、グルカゴンのNST発現作用はNAより早い時期に低下する等生体内でNST発現に果たす意義がNAとは違っているものと考えられている。本研究ではNSTの調節に果たすグルカゴンの役割と作用の機序を明らかにする為の検討をラットで行い以下の結果を得た。1)グルカゴンの作用の抑制因子と推定されるプロラクチンを、浸透圧ミニポンプによって持続的に作用させたラット(プロラクチン投与群)では、対照群に比べBAT重量が有意に大きかった。これは細胞の脂肪含量の増加によるものと考えられる。2)上記ラットのBATについてNA及びグルカゴンによる酸素消費量の増加をin vitroで比較したところ、プロラクチン投与群では、基礎酸素消費が低くなっており、又グルカゴンによる酸素消費増加反応のみが抑制された。3)温暖馴化ラットのBATについてプロラクチン受容体発現mRNAを検定するためにPCRによるmRNAの増幅を試みたが、今回の検出法では検出出来なかった。これらの結果は、BATでのプロラクチン受容体の存在は示されていないものの、プロラクチンが直接BATに作用してグルカゴンのNST発現作用を抑制することを示唆している。耐寒性の増強には非ふるえ熱産生(NST)の亢進が重要な役割を果たしている。NSTの主要発現部位は褐色脂肪組織(BAT)で、主な発現因子はノルアドレナリン(NA)であるが、加えて膵ホルモンのグルカゴンもNAに匹敵する発現作用を持つことが示されている。しかし、高いNST能を持つ新生仔期で、グルカゴンの発現作用はNAより早い時期に低下するなどが示されており、生体内でNST発現に果たす意義がNAとは異なっているものと考えられる。本研究ではNSTの調節に果たすグルカゴンの役割と作用の機序を明らかにするための検討をラットで行い、以下の結果を得た。1)遺伝的に耐暑能が高いFOKラットは耐寒性にも優れているが、このラットのBATについてNA及びグルカゴンによる酸素消費量の増加度をin vitroで比較したところ、グルカゴンによる反応性はNAより高く、より低濃度で最高反応が得られると共にEC_<50>も有意に低かった。2)上記ラットの急性寒冷曝露時の血漿グルカゴンレベルの増加度は、対照群であるStd : Wistar及びWKAHよりも有意に大であった。3)Std : WistarについてBATのプロラクチン受容体発現mRNAを調べるためにPCRによるmRNAの増幅を行ったところ、成体♂ラットのBATにも上記mRNAが存在することが示された。また、新生仔期のBATでは成体より多量のmRNAが存在することが明らかとなった。これらの結果は、BATでのNSTにはグルカゴンが重要な役割を果たしていること、及びプロラクチンがBATに直接作用して、グルカゴンの作用を抑制性に調節していることを示唆している。
社会報酬反応の減退に関与する分子基盤に関する研究

本研究は、社会交流によって生じる報酬が成長に伴って減少するメカニズムの解明を目指し、自閉症等の社会相互反応や社会性行動に変化が生じる疾患の治療法開発に役立つ知見を見出すことを目的としている。本研究では、これまでに社会報酬条件づけ(SCPP)反応が3週齢のラットでは見られたものの、12週齢では減弱することを確認した。また、前頭野サンプルに対するマイクロアレイ法による発現比較により、いくつかのターゲット遺伝子や、オントロジー解析に基づくパスウェイの変化などを見出してきた。本年度は、マイクロアレイ解析で見つかったターゲット候補遺伝子の発現量の解析を行った。Pyroglutamylated RF amide peptide receptor (Qrfpr)は,マイクロアレイ解析では食物報酬(FCPP)およびSCPPのどちらでも加齢により0.5倍以下に減少した遺伝子であった。リアルタイムPCR解析では、FCPPでは加齢による減少を確認できたが、SCPPでは確認できなかった。ATPaseのサブユニットの一つであるATP2b3遺伝子も、マイクロアレイ解析とは異なり、社会報酬では発現量に顕著な変化は見られなかった。Familywith sequence similarity 111, memberA (Fam111a)は、SCPPでは加齢により発現量が増加する傾向が定量PCRでも確認できたが、同時に大きな個体差が見られた。しかしながら、反応はFCPPとSCPPで特異的に異なっていたため、今後、タンパク発現解析などの手法でその生理学的意義を確認する予定である。本研究の実施期間内では確認出来なかったターゲット遺伝子の候補がまだいくつか残っているため、Fam111a以外のターゲットについても、引き続き発現解析を行い、社会報酬の発生メカニズムについて解明の道筋を付けたい。本研究は社会報酬に対する行動学的反応が、ラットの成長に伴って弱まっていく現象の機序を解明することを目指している。この研究から得られた成果は、社会的な交流から快感を引き出すことが難しくなる社会的アンヘドニアの発症機序を明らかにすることに役立つ可能性がある。自閉症スペクトラムは社会的な場面で適切な行動を選択することが困難であり、うつ病や統合失調症の精神疾患は社会的なアンヘドニアの症状があら現れることがあるため、これらの精神疾患の治療ターゲットを見出すことを本研究の目的としている。これまでの条件づけ場所嗜好試験(SCPP)を用いた研究で、離乳直後の3週齢に比べて、成長の進んだ12週齢では社会報酬に条件付けられた場所の嗜好性が上がりにくくなっていることを見出している。本年度の研究でも、この現象を再現することが出来た。さらに、社会報酬反応に影響を与えると考えられる不安様行動、社会性行動と、SCPPにおける場所嗜好の変化との相関を調べた。報酬反応の強度と不安様行動の頻度の間に正の相関が見られ、また12週齢のマウスの方が不安様行動の頻度が高かった。この相関と不安様行動の週齢差を当てはめても、社会報酬反応の成長に伴う減弱を説明することは難しいため、他の要因を探索する必要が明らかになった。SCPPの嗜好性試験翌日の前頭葉および側坐核のサンプルを採取済であるため、今後はこれらのサンプルを用いて、トランスクリプトーム解析を手がかりとして、社会報酬反応の減弱に関係するターゲットを同定する予定である。研究期間の初年度が終わった時点で行動学的解析の状況を見ると、社会報酬を用いた条件づけ場所嗜好試験(SCPP)では、予備的な研究と概ね同様の結果が得られた。すなわち、離乳直後の3週齢のWistar系オスラットは、1日10分間のソーシャルインタラクションで条件付けられた場所の嗜好性が、そうでない場所よりも有意に増加したが、成長の進んだ12週齢のラットではこのような大きな変化は見られなかった。我々の先行研究では、社会報酬への反応が、その個体が示す不安様行動やうつ様行動と有意に相関することを見出している。そこで本年度はSCPPの前に不安様行動を高架十字迷路試験で、また社会性行動をソーシャルインタラクション試験を解析することで、それらと社会報酬反応に対する相関について調べた。3週齢に比べて、12週齢では高架十字迷路のオープンアームへの進入回数が減少したため、不安様行動の頻度は12週齢の方が高いことが示唆された。しかし、両方齢で不安様行動の頻度と社会報酬反応の強さは逆相関している、つまり不安様行動が多く見られる個体の方が報酬反応が強かった。この相関関係は先行研究と一致しているが、社会報酬反応の週齢による違いを不安様行動によって説明をつけることは出来ないことがわかり、この項目では本年度の達成目標には達したと考えられる。以上の結果は、第38回日本神経科学大会で発表した。SCPPに用いたラットの脳のサンプルを使ってトランスクリプトーム解析を次年度より開始する計画であったが、これは本年度途中から開始しており予定より早く取り掛かり始めることができている。一方で、オペラント学習試験を応用した社会報酬反応の解析は、実験装置の改造などを試みているものの、現状では社会報酬反応の再現性が低く、十分な解析ができていない。以上を総合して、本研究はおおむね順調に進展していると評価した。本研究では、社会交流によって生じる報酬が成長に伴って減少するメカニズムの解明を目指し、自閉症等の社会相互反応や社会性行動に変化が生じる疾患の治療法開発に役立つ知見を見出すことを目的としている。研究期間の初年度であった昨年度では、条件付け場所嗜好による行動学的解析を行い社会報酬への反応が3週齢のラットでは性別に関係なく見られたものの、12週齢ではこの反応が減弱し、ほとんど見られないことを確認した。

本年度では前年の行動解析の際に得られた脳サンプルを用いて、前頭野および腹側線状体において、社会報酬反応が減少する時に発現の変化する遺伝子の同定を試みた。まず脳サンプルから抽出したmRNAを用いて、cDNAマイクロアレイを用いて発現を定量した。次に、GeneSpringソフトウエアを用いて、発現量の比較を行った。BioAnalyzerによる解析や吸光度を用いたmRNA品質の解析は良好であった。次に、社会報酬への反応が強い3週齢と同反応が弱い12週齢のラットの前頭野における遺伝子発現を2ペアで比較したところ、発現量の2倍以上の増加もしくは0.5倍以下への低下が見られた配列が、それぞれ51と134であった。そのうち、アノテーション情報がある配列は16と62であった。一方、3週齢のラットにおいて、社会報酬と食餌報酬は報酬反応がともに見られたが、これらのラットの比較で強い変化を示した配列は4と44であり、上記の3週齢と12週齢を比較したものと比べて少ない傾向が見られた。本研究の遂行を基本的に一人で行っている研究代表が所属する研究機関を国立精神・神経医療研究センターに変更した。所属機関が変わったことに付随して、新たな研究を開始することになり、そのセットアップや予備的検討に割くエフォートが増加したため、本研究に対するエフォートが想定していたよりも少なくなった。また、現所属期間ではcDNAマイクロアレイ解析装置が設置されていたものの、長期間使用されておらず動作のチェックや軽微な修繕が必要になった。以上の理由により、想定よりも研究の進捗が遅れている。本研究課題は、ラットにおいて社会交流によって生じる報酬が成長に伴って減少する機序に着目し、社会相互反応が減弱する自閉症やうつ病などの治療にとって有用な知見を獲得することを目的としている。前年度までの行動学的解析では、社会交流によって生じる報酬(本研究課題では社会報酬と呼ぶ)を場所嗜好性試験で調べているが、3週齢のラットでは強い報酬反応が見られるが、12週齢では減弱することを確認している。本年度は、3週齢と12週齢の2つの週齢のラットを用いて、社会報酬学習課題を課した場合だけでなく、嗜好性のある食物への報酬を用いた学習を課した両週齢のラットの前頭野における遺伝子発現の比較をマイクロアレイ法にて行った。まず、両週齢間で2倍以上の変化を示した配列は社会報酬で205,食物報酬で179であり、Gene symbol等のアノテーションのある配列はそれぞれ110, 71であった。このうち、社会報酬学習課題と食物報酬学習課題で共通して変化した遺伝子は16あり、これは非特異的な加齢に伴った変化であると考えられた。このような変化を示した遺伝子の例としてHba1, Hba2といったヘモグロビンを構成するタンパクの遺伝子が見出された。社会報酬学習課題群で、両週齢の間に発現の変化が見られた遺伝子は94あったが、独立して行った2つのサンプルで共通して変化した遺伝子が2つあり、今後の詳細な機能解析を行う最有力の候補と考えられた。Gene Ontology (GO)
ゴム人工筋マニピュレータの制御性能向上と人間共棲型作業への応用

ゴム人工筋マニピュレータは本質的に柔軟なため,人間共棲型作業に適する反面,減衰性能が不十分であり運動制御は容易でない.そこで,電気粘性(ER)流体を用いた減衰力可変ダンパ(ERダンパ)を試作し,マニピュレータの関節部に装着した.空気圧サーボによるアクティブ制御とERダンパを用いた減衰力制御を併用することで,より滑らかな運動制御が実現できることを確認した.これと並行して,ゴム人工筋マニピュレータをリハビリテーション支援ロボットとして,人間の腕の機能回復訓練に応用した.すでに提案している機械インピーダンス制御を用いた機能回復訓練運動モードの統一的実現法の有効性を実験を通して確認した.また,自律的なリハビリテーション支援ロボットの実現を目的として,被訓練者の腕の状態を同定する方法を提案した.これは,人間の腕を2リンクアームとみなし,その特性を2次の機械インピーダンスモデルで表現するものである.腕の状態は機械インピーダンスモデルの慣性質量,粘性および剛性の各パラメータの値によって表現できると考え,ゴム人工筋マニピュレータにより機能回復訓練と同時に,これらのパラメータを適応同定アルゴリズムにより同定した.これにより,訓練動作と並行して被訓練者の腕の回復状態を知ることができ,より自律的な機能回復訓練ロボットを実現するための手段として期待される.今後は,同定パラメータを機能回復訓練運動にどのように反映させるかの問題を解決する必要があり,訓練動作と同定動作を統合するための,人間・ロボット協調統合システムの構築に関する研究が必要である.ゴム人工筋マニピュレータは本質的に柔軟なため,人間共棲型作業に適する反面,減衰性能が不十分であり運動制御は容易でない.そこで,電気粘性(ER)流体を用いた減衰力可変ダンパ(ERダンパ)を試作し,マニピュレータの関節部に装着した.空気圧サーボによるアクティブ制御とERダンパを用いた減衰力制御を併用することで,より滑らかな運動制御が実現できることを確認した.これと並行して,ゴム人工筋マニピュレータをリハビリテーション支援ロボットとして,人間の腕の機能回復訓練に応用した.すでに提案している機械インピーダンス制御を用いた機能回復訓練運動モードの統一的実現法の有効性を実験を通して確認した.また,自律的なリハビリテーション支援ロボットの実現を目的として,被訓練者の腕の状態を同定する方法を提案した.これは,人間の腕を2リンクアームとみなし,その特性を2次の機械インピーダンスモデルで表現するものである.腕の状態は機械インピーダンスモデルの慣性質量,粘性および剛性の各パラメータの値によって表現できると考え,ゴム人工筋マニピュレータにより機能回復訓練と同時に,これらのパラメータを適応同定アルゴリズムにより同定した.これにより,訓練動作と並行して被訓練者の腕の回復状態を知ることができ,より自律的な機能回復訓練ロボットを実現するための手段として期待される.今後は,同定パラメータを機能回復訓練運動にどのように反映させるかの問題を解決する必要があり,訓練動作と同定動作を統合するための,人間・ロボット協調統合システムの構築に関する研究が必要である.人間とロボットが空間や感覚を共有し一体となって作業を遂行するためには、人間に対する安全性が第一に要求される。空気圧ゴム人工筋マニピュレータは、人間に対する安全性の確保には最適であるが、空気の圧縮性による圧力応答の遅れや構造的な減衰性能不足のため、高度で複雑な運動制御に適用することは容易でない。本研究では、このような問題を解決するため、電気粘性(ER)流体を用いた減衰力可変ダンパ(ERダンパ)を試作し、これをマニピュレータの関節部に装着して制御性能の向上を図った。試作したERダンパは電気信号によって高速に減衰力を調整することが可能であり、これによりマニピュレータの減速制御を効率的に実施できることが明らかになった。電空制御弁を用いた空気圧サーボによるアクティブ制御とERダンパの減衰力を関節角速度にもとづいて調整するセミアクティブ制御を組み合わせたハイブリッド形制御を実施することにより制御系の速応性と安定性が両立できる。その結果、より複雑な軌道への追従制御が可能となり、マニピュレータの機能が大幅に向上する。今後、さらに効率的なハイブリッド形制御手法について検討する。また、得られた結果を2自由度マニピュレータにより構成される上肢筋肉の機能回復訓練用リハビリテーション支援ロボットに適用する。本研究を通して、人間共棲型ロボットに要求される基本概念と、その実現についてより深く考察する。ゴム人工筋マニピュレータは本質的に柔軟なため,安全性などの立場から人間共棲型作業に適する.反面,減衰性能が不十分であり精密な運動制御は容易でない.本研究では,まず,電気粘性(ER)流体を用いた減衰力可変ダンパ(ERダンパ)を試作し,これをマニピュレータの間接部に装着した.これを用いて,空気圧サーボによるアクティブ制御とERダンパを用いた減衰力制御を併用することによって,より滑らかな運動制御が実現できることが確認された.これと並行して,ゴム人工筋マニピュレータをリハビリテーション支援ロボットとして,人間の腕の機能回復訓練に応用する研究を実施した.すでに提案している機械インピーダンス制御を用いた機能回復訓練運動モードの統一的実現法の有効性を実験を通して確認した.また,自律的なリハビリテーション支援ロボットの実現を目的として,被訓練者の腕の状態を同定する方法を提案した.

これは,人間の腕を2リンクアームとみなし,その特性を2次の機械インピーダンスモデルで表現するものである.腕の状態は,機械インピーダンスモデルの慣性質量,粘性および剛性の各パラメータの値によって表現できると考える.ゴム人工筋マニピュレータによる機能回復訓練と同時に,これらのパラメータを適応同定アルゴリズムにより同定する.これにより,訓練動作と並行して被訓練者の腕の状態を知ることができ,より自律的な機能回復訓練ロボットを実現するための手段として期待される.今後は,同定パラメータを機能回復訓練運動にどのように反映させるかの問題を解決する必要があり,訓練動作と同定動作を統合するための,人間・ロボット協調統合システムの構築に関する研究が必要である.
新規へキサヒドロクマリン骨格を有する海産天然物の効率的不斉合成法の開発

新規へキサヒドロクマリン骨格を有する海洋産ジテルペノイド、キツンゴライドBの合成研究を行った。出発物質である3-メチル-2-ブテン-1-オールから3段階の変換により誘導したアルデヒドに対し、亜鉛とブロモ酢酸エチルを用いたレフォルマトスキー反応を行った。その結果アルデヒド部位への求核攻撃に続き、環化、脱離反応も同時に進行し、不飽和ラクトンを1段階で得た。続いて1,4-付加反応と閉環メタセシス反応を鍵反応とすることでトランス型二環性ラクトンを得ることに成功した。現在、ヘキサヒドロクマリン骨格部位の構築に向け検討を行っている。今年度はまず研究実施計画に基づきAB環部に相当する化合物からキツンゴライドBのABC環部の構築を目指した。それに先立ち、まず予備実験で確立したAB環部に相当する化合物の合成法を大量合成可能な経路へ展開しようとしたが実現することは出来なかった。そこで次に別経路でのAB環構築法の開発を行った結果、より効率的なAB環構築法を確立することができた。すわなち、3-メチル-2-ブテン-1-オールを出発原料とし,ホルムアルデヒドとのエン反応を行い対応するジオールを得た。続いてモノアセチル化とデス・マーチン酸化によりアルデヒドとした。得られたアルデヒドに対して亜鉛とブロモ酢酸メチルによるしフォルマトスキー反応を行ったところアルデヒドへの付加、アセチル基の転位、ラクトン化とアセトキシ基の脱離を伴い、対応するα,β-不飽和ラクトンを得ることが出来た。その後α,β-不飽和ラクトンへの銅アート錯体を用いた1,4付加反応続く閉環メタセシス反応によりAB環部の構築に成功した。このAB環部構築法はこれまでの合成法よりも短行程、高収率であるだけでなく、α,β-不飽和ラクトンに対する1,4付加反応の段階で種々の求核試薬を用いることで様々な二環性ラクトンの合成が可能であり、他の天然物合成法への展開が期待出来る。またモノアセチル化の段階で不斉アセチル化を実現することができれば不斉合成への展開も可能な合成ルートとなっている。今年度は前年度に引き続き、キツンゴライドBのABC環部の構築を目指すと共に、前年度確立したAB環部構築法をトランス型二環性ラクトンの一般的構築法へと展開することを目的とした。すなわちAB環部の構築の際利用した、α,β-不飽和ラクトンに対する1,4-付加反応、続く閉環メタセシス反応という方法論の一般化を試みた。その一環として始めに、δ-ラクトンとシクロノナン骨格がトランス型に縮環したxeniolide類の基本骨格の構築を目指した。まず、3-メチル-2-ブテン-1-オールを出発原料とし、ホルムアルデヒドとのエン反応を行い対応するジオールを得た。ジオールをTBS基で保護した後、アリル位をプロモ化し続くビニル基の導入、TBS基の脱保護を行うことで、閉環メタセシスの際反応点となる、末端二重結合を有するジオールとした。続いてモノアセチル化とデス・マーチン酸化により対応するアルデヒドへと変換した。得られたアルデヒドに対して亜鉛とプロモ酢酸メチルによるレフォルマトスキー反応を行ったところアルデヒドへの付加、アセチル基の転位、ラクトン化とアセトキシ基の脱離が一挙に進行し、対応するα,β-不飽和ラクトンを得ることが出来た。続いてxeniolide類の基本骨格の構築に必要な側鎖の1,4-付加反応による導入を試みた。モデル化合物として2-シクロヘキセノンを用い、別途調整したアリルハライドとの1,4-付加反応を種々検討したところ、亜鉛錯体から調整した銅アート錯体を用いることで反応が良好に進行することを見いだした。今後すでに合成しているα,β-不飽和ラクトンに対して確立した条件を用い1,4-付加反応を行い、続く閉環メタセシス反応によりxeniolide類の基本骨格の構築を行う予定である。またここで確立した1,4付加反応の条件をキツンゴライドBのABC環部の構築にも適用する予定である。今年度は前年度に引き続き、キツンゴライドBのABC環部に相当する三環性化合物の合成を目指した。まず一つ目の合成経路として、前年度までに確立したトランス型二環性ラクトン合成法を用い、C環部構築のための足掛かりとなる置換基を導入したAB環部の合成を目指した。すなわちAB環部の構築においてα,β-不飽和ラクトンに対する1,4-付加反応の際に用いた4-ブロモブテンの代わりに、水酸基を保護した2-ブロモメチル-3-ブテン-1-オールを用いることとした。しかしながら、マグネシウム錯体、および亜鉛錯体から銅アート錯体を調製し、1,4-付加反応を試みたが目的の付加体を得ることは出来なかった。

これは水酸基を保護した2-ブロモメチル-3-ブテン-1-オールを用いた場合、反応点近傍の立体障害が増加したために反応が進行しなかったものと考察した。そこでより立体障害の少ない求核剤として、2-ブロモメチル-1,3-ブタジエンから調製した銅アート錯体を用いた、α,β-不飽和ラクトンに対する1,4-付加反応を検討しており、得られる付加体から三環性化合物の合成を行う予定である。また二つ目の合成経路として、AB環部に対して、直接C環部構築の足掛かりとなる置換基の導入を試みた。すなわち、これまでに合成したAB環部に相当する二環性化合物に対して位置選択的なアリル位酸化を行い、対応する不飽和ケトンへと誘導した。続いて、得られた不飽和ケトンに対して位置選択的トリフラート化を行い、対応するトリフラート体を得た。得られたトリフラート体と別途合成したビニルスズ化合物とのパラジウム触媒を用いたカップリング反応を行い、C環部構築のために必要なすべての炭素数を有する側鎖の導入に成功した。現在は、導入した側鎖のアリルアルコール部位のカルボン酸への酸化とC環部の構築について検討を行っている。現在までに不斉合成への応用が可能なキツンゴライドBのAB環構築法を確立しており、今年度C環構築に必要な側鎖の1,4-付加反応による導入法の条件を見いだしている。まだ全合成を達成するには至っていないが、これら方法論を利用すれば、キツンゴライドBの不斉合成を実現出来ると考えている。またAB環部構築法を基にしたトランス型二環性ラクトンの一般的構築法の開発を検討しており、この点に置いては当初計画よりも進展しているといえる。よって総合的に判断するとおおむね順調に進展していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は予定通りまずキツンゴライドBの全合成を目指す。また新たな研究計画としてAB環部構築法を基にしたトランス型二環性ラクトンの一般的構築法の確立を行う予定である。これが実現できれば、トランス型二環性ラクトンを有する様々な天然有機化合物合成への応用が期待できると考えている。
非古典的MHCクラスI抗原であるマウスTL抗原に対するCTLの機能解析

マウスTL抗原は非古典的MHCクラスI分子群に属し、すべてのマウスの腸上皮と特定のマウス(A系やBALB/c)の胸腺T細胞に発現する。しかし正常胸腺には孔抗原を発現しないマウス(B6やC3H)でも、Tリンパ腫の発生に伴いTL抗原を発現することから、TL抗原は腫瘍特異抗原と考えることができる。TL拘束性のTCRαβ型CTLクローンを樹立して、その標的細胞特異性を検索したところ、TL陽性細胞すべてを傷害するもの(Type I)とTL陽性Con Ablastのみを傷害するもの(Type II)の2種類に大別された。Con Ablastとその他のTL陽性標的細胞の表面抗原を検索した結果、Con A blastがFas陽性であったのに対し、他の標的細胞はFas陰性であった。さらに両CTL群の性格を比較した結果、(1)Type Iの傷害性がPerforin依存性であるのに対し、Type IIの傷害性はFasLおよびPerforin双方によること、(2)Type IIはType Iと同程度のPerforinを発現しているにも拘らず、その放出能はType Iに比べて非常に弱く、TCR/CD3を介したシグナルに加えてCon A blast上に発現する補助分子との相互作用が必要であること、(3)ConAblast以外のTL陽性標的細胞はType IIを刺激してFasLの発現を誘導するが自身がFas陰性であるため傷害されないことが明らかとなった。また、Type IあるいはBulk CTLを養子移入することによってTL陽性T細胞の増殖抑制が観察され、TL抗原を標的とした腫瘍の養子免疫療法モデルを確立することができた。マウスTL抗原はMHCクラスIb分子群に属し、すべてのマウスの腸上皮と特定のマウス(A系やBALB/c)の胸腺T細胞に発現する。しかし正常胸腺にはTL抗原を発現しないマウス(B6やC3H)でも、Tリンパ腫の発生に伴いTL抗原を発現する。
植物防御が関わる害虫の寄主決定メカニズムの解明

ハモグリバエやアザミウマは農薬抵抗性を高度に発達させた難防除害虫であり、世界的に深刻な問題となっている。我々は、モデル植物を用いた植物防御機構の解析から、植物ホルモンであるジャスモン酸が制御する植物防御が、これらの害虫抵抗性において中心的役割を果たすことを明らかにし、植物防御を消失させると、害虫の寄主でなかった植物を寄主植物へ変換できることを報告している。本課題では、植物防御という視点から、害虫の寄主決定機構を明らかにすることで、植物と昆虫間相互作用の新たな理解につなげることを目指し、実際に、ハモグリバエの行動や生育に影響を及ぼす植物代謝産物を新たに同定し、その機能について解析を進めた。我々はこれまでにモデル植物を用いた、これらの虫害抵抗性に関わる植物防御機構の解析から、植物ホルモンであるジャスモン酸(JA)が制御する植物防御がこれらの虫害抵抗性において中心的な役割を果たしていることを明らかにしてきた。更に、JAが関わる防御機構を欠損させると、本来、ハモグリバエの寄主でなかったシロイヌナズナを寄主植物へと変換できることを報告し、固定的であると考えられていた寄主特異性が変換しうることを明らかにした。そこで、本研究課題においては、このような寄主特異性の変換に関わる現象メカニズムの解明を目指している。当該年度においては、ハモグリバエ寄主特異性の変換に関わる植物代謝成分を同定することを目的として、メタボローム解析を中心に課題を推進した。メタボローム解析においては、アルカロイドなどの耐虫性に関わる因子と考えられる成分に加えて、広く植物に存在する二次代謝成分についても分析を行った。これまでに、シロイヌナズナ野生株と植物防御を消失させた変異株などの植物体におけるハモグリバエ食害後のメタボローム解析結果を比較することにより、ハモグリバエ寄主特異性の変換に関わる可能性が示唆される複数の候補成分を同定することに成功している。同時に、上記植物体などを材料とし、ハモグリバエの嗜好性および産卵行動実験を行うことで、ハモグリバエ寄主特異性の変換に関連するハモグリバエの行動評価による、バイオアッセイ系の開発を行った。これにより、次年度において、得られた候補成分の評価を効率的に実施することが可能となった。ハモグリバエやアザミウマは農薬抵抗性を高度に発達させた難防除害虫であり、世界的にも深刻な問題となっている。我々はこれまでにモデル植物を用いた研究により、これらの害虫抵抗性に関わる植物防御機構の解析を実施し、植物ホルモンであるジャスモン酸(JA)が制御する植物防御がこれらの虫害抵抗性において中心的な役割を果たしていることを明らかにしてきた。更に、これらの植物防御を消失させると、害虫の寄主でなかった植物が寄主植物へと変換することを世界に先駆けて報告した。そこで、本課題では、このような寄主特異性の変換に関わる現象メカニズムの解明を目指している。本年度は昨年度に続き、寄主特異性の変換に直接関わるであろう植物二次代謝成分の特定を目指して、メタボローム解析やトランスクリプトーム解析、更にはハモグリバエを用いたバイオアッセイなどを中心に課題を推進した。その結果、ハモグリバエに対する誘引性を保持する植物二次代謝成分を特定することに成功した。更には、シロイヌナズナのゲノムリソースを活用することにより、当該成分の合成に大きな影響がおよんだ変異体においては、当該成分が大幅に欠損することにより、ハモグリバエによる被害が大きく減少することなども明らかにした。現在、本成分と寄主特異性の変換との関連について更に詳細な解析を進めているところである。また、寄主特異性の変換には、1つの成分だけではなく、複数の成分が関わっている可能性も充分に考えられることから、他の候補成分についても解析を進めている。現在、候補となる成分を直接、ハモグリバエに与えることにより、ハモグリバエのパフォーマンスに大きな影響を及ぼす成分はないか、順次、解析を実施中である。植物ホルモンであるジャスモン酸(JA)が制御する植物防御と寄主特異性の変換に関する研究は世界的にみても非常にユニークであり、これまでにほとんど報告がなされていない。一方で、寄主特異性の変換現象は、難防除害虫であるハモグリバエに関する新たな防除手法の確立にもつながることが考えられる。これまでの2年間において、当初の予定にしたがった課題内容を遂行し、ハモグリバエに対する誘引性を有した植物二次代謝成分を特定することに成功した。加えて、当該成分の合成に関わるであろう変異系等を用いた解析からも、本成分の機能について明らかにしてきた。興味深いことに、本成分は植物に広く存在する一連の成分であった。これら成分は一連の類縁成分の総称であるために、現在、本成分を詳細に分析すると共に、寄主特異性の変換との関連について更に詳細な解析を進めているところである。この他にも複数の候補となりえる成分を選定しており、これらについても、順次、バイオアッセイによる評価を行っているところである。以上のような解析を行うことにより最終年度に、主特異性の変換に関わる植物に次代謝物を明らかにし、寄主特異性の変換現象のメカニズム解明の道筋を確立する。

我々は、モデル植物を用いた植物防御機構の解析から、植物ホルモンであるジャスモン酸が制御する植物防御が、これらの害虫抵抗性において中心的役割を果たすことを明らかにし、植物防御を消失させると、害虫の寄主でなかった植物を寄主植物へ変換できることを報告している。本課題では、植物防御という視点から、害虫の寄主決定機構を明らかにすることで、植物と昆虫間相互作用の新たな理解につなげること目的とした。その中で、ハモグリバエに対して誘引性を有する複数の植物二次代謝物の同定に成功し、それらの合成に関わる遺伝子が破壊されたシロイヌナズナリソースなどを活用することで、それら植物二次代謝物を介した植物とハモグリバエの相互作用について解析を進めた。同時に、ハモグリバエだけでなく、アザミウマに対する効果についても検討を加えた。その結果、同じ植物二次代謝物であっても害虫種が異なることにより、植物と害虫間の相互作用における働きは異なることが明らかとなった。当然と思われることであるが、興味深い点だと考えている。更には、これらの植物二次代謝物が実際の害虫の行動に対して、どのような影響を及ぼすのか?逆に、害虫が、これらの植物二次代謝物を識別することにどのようなメリットがあるのかについても解析を行った。その他にも、害虫のパフォーマンスに直接影響するであろう植物二次代謝物も明らかにしており、現在、引き続き解析を進めているところである。ハモグリバエやアザミウマは農薬抵抗性を高度に発達させた難防除害虫であり、世界的に深刻な問題となっている。本課題では、植物防御という視点から、害虫の寄主決定機構を明らかにすることで、植物と昆虫間相互作用の新たな理解につなげることを目指し、実際に、ハモグリバエの行動や生育に影響を及ぼす植物代謝産物を新たに同定し、その機能について解析を進めた。本研究課題においては、当該年度の研究計画を概ね順調に実施していると考えている。ハモグリバエは農薬抵抗性を高度に発達させた、世界的に深刻な問題となっている難防除害虫であるが、我々はこれまでにモデル植物を用いた解析から、本来、ハモグリバエの寄主でなかったシロイヌナズナを寄主植物へと変換できることを発見した。そこで、そのような寄主特異性の変換メカニズム解明を本研究課題では目指すこととした。幾つかの方法論により、同時に解析を進めているところであるが、我々が最も重要視しているのは、寄主特異性の変換に関わる植物代謝成分の同定である。このような成分が同定できれば、ハモグリバエの防除に大きな可能性を開くことができ、大きな社会的な意義を有しているからである。そこで、当該年度においては、そのような寄主特異性の変換に関わることが考えられる候補成分の同定を行うことを最も重要な達成目標と定め、複数のメタボローム解析を実施し、これまでに複数の候補成分の同定に成功した。これら成分の多くは、植物ホルモンであるジャスモン酸(JA)が制御する植物防御において耐虫性成分として機能することが予想されるものであり、現在、これら成分の機能解析を順調に進めているところである。
精神疾患モデルマウスにおけるアストロサイト成熟異常の分子機序と機能的意義の解明

これまでの解析により、成体のSchnurri-2欠損マウスの海馬においてアストロサイトの成熟異常が示唆されている。本研究では、トランスクリプトームデータに基づいたバイオインフォマティクス解析などを主に行い、アストロサイト成熟異常の発生に関連する可能性のある分子、シグナルパスウェイの絞り込みを行った。免疫組織学的解析、および遺伝子発現パターン解析により、成体Shn2欠損マウスの海馬においてアストロサイトの成熟異常が示唆されている。このアストロサイトの成熟異常は脳内全体で生じ得る現象なのか、領域選択的に生じ得るのかを検討した。DNAマイクロアレイ解析より得られた、成体Shn2欠損マウスの前頭前野での遺伝子発現変化パターン(成体のShn2欠損マウスを基準にしたときの成体野生型マウスで有意に発現が変化していた遺伝子群)と、野生型マウスの幼若アストロサイトでの遺伝子発現変化パターン(30日齢野生型マウスを基準にしたときの7日齢野生型マウスで有意に発現が変化していた遺伝子群)をバイオインフォマティクスツールNextBioを用いて比較した。その結果、両者の遺伝子発現パターンは有意には似ていないことがわかった。つまり、これらの結果から、Shn2欠損マウスにおけるアストロサイトの成熟異常は、脳領域選択的に生じ得る現象であることが示唆された。そこで、海馬に着目して、Shn2欠損マウスと幼若アストロサイトとで共通して変化する遺伝子の発現パターンと逆の効果を持つ薬物・化合物の検索を行った。その結果、ある種の酵素阻害剤や有糸分裂のモジュレーターなど複数の薬物・化合物が候補として挙げられた。これらの薬物・化合物の投与によりShn2欠損マウスにおけるアストロサイトの成熟異常を正常化できる可能性がある。これらの中から脳血液関門を通過するものなどに絞って実際にマウスに投与し、その効果を検討する。動物飼育施設の改修工事などによりマウスの繁殖状況に影響が生じ、各種の解析に必要な匹数を確保することが困難な状況があったため。これまでの解析により、成体のShn2欠損マウスの海馬においてアストロサイトの成熟異常が示唆されている。具体的には、成体の野生型マウスと比べてShn2欠損マウスで発現変化しているの遺伝子の発現パターンと、成体野生型マウスのアストロサイト(単離細胞)と比べて幼若野生型マウスのアストロサイトで変化している遺伝子の発現パターンが似ているということなどがわかっていた。しかし、これらの解析においては、単離したアストロサイトのマイクロアレイデータを用いているため、Shn2欠損マウスと幼若アストロサイトで共通して発現が変化していた遺伝子がアストロサイト特異的な遺伝子なのかは不明であった。そこで、アストロサイトに選択的に発現している遺伝子セットも含めてメタ解析を行った。まず、公的データベースを用いたCELL TYPE(S) ENRICHMENT解析を行い、ニューロン、マイクログリア、オリゴデンドロサイト、内皮細胞と比較してアストロサイトで発現量が高い遺伝子を選出した。得られたアストロサイト選択的遺伝子セットと、成体Shn2欠損マウスの海馬で発現変動している遺伝子セット、幼若野生型マウスの単離アストロサイトで発現変動している遺伝子セットを用いてメタ解析を行い、これらの遺伝子セットに共通する遺伝子を絞り込んだ。得られた遺伝子についてGene Ontology解析を行ったところ、Oxidoreductaseの働きに関わる遺伝子が含まれていることがわかった。Shn2欠損マウスの海馬のアストロサイトにおいて、細胞内の酸化還元状態の異常に伴う成熟異常が生じていることが示唆される。動物飼育施設の改修工事も終了したため、マウスの繁殖を規模を拡大して行う。必要匹数が得られ次第、これまでの検討で得られた、アストロサイトの異常を正常化できる可能性のある薬物・化合物を実際にマウスに投与してその効果を検討する。まずアストロサイトの形態や分子発現などを指標に評価し、有効であった薬物・化合物については行動レベルでの評価を行う。神経科学動物飼育施設の改修工事の影響などにより、使用予定のマウスの繁殖にやや遅れが生じたため。マウスの交配及び繁殖は継続的に行っており、必要個体数が得られ次第、アストロサイト異常の正常化実験を中心に速やかに各種解析を行う。
アル白血病ウイルスの遺伝子と病態

本研究では、各種サルに感染しているSTLV-Iの遺伝子解析を行い、HTLV-I関連疾患との相互関係を解析し、病態との関連でSTLV-Iの遺伝子構造と機能を明らかにすることを目的とする。1)昨年に引き続きアフリカ産のアフリカミドリザル、サイクスモンキーおよびアジア産のニホンザル、ブタオザル、ボンネットモンキー、紅顔ザル、台湾ザルなどマカク属由来のSTLV-Iについて系統解析を進めたところ、アジア産のサル由来のSTLV-Iの多様性がさらに明らかとなった。2)昨年インドネシアの類人猿であるオランウータンよりSTLVを分離する事に成功したが、遺伝子系統解析の結果、アジア産のマカク族のサル由来のSTLV-Iに比較的近縁であることが明らかとなった。3)当研究室で飼育しているSTLV-Iプロウイルスゲノムのモノクローナリティーがかなり進んでいるSTLV-I自然感染アフリカミドリザルにおいて、引き続き経過観測しているが、眼底検査、血液検査、脊髄反射等の詳細な臨床検査でも、ヒトでHTLV-Iに関連して認められる白血病、神経疾患、関節炎、ブドウ膜炎、肺炎等の疾患の兆候となるような異常は今のところ認められていない。
脳血管関門(BBB)の通過と体内半減期の延長を目ざしたBDNF徐放製剤の検討

臨床応用可能な神経系DDS製剤の開発を目ざして脳神経細胞由来神経栄養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)とレシチン誘導体を結合したレシチン化BDNF(PCBDNF)を合成し検討した。まずBDNFの薬理活性が報告されているC57BL/KSJ-db/dbマウスにおける摂食抑制効果、血中グルコース抑制効果、体重増加抑制効果で検討した結果、PCBDNFはBDNFそのものに比較して著明な薬理効果の増強が見られた。用量で比較するとPCBDNFはBDNFそのものより20倍も活性が増強していることが示唆された。その薬理効果増強の機序が何に起因するのかを検討したところ血中半減期の長さに起因するのではなくPCBDNFの高い細胞親和性によることが示唆された。またIn vivoでの検討により中枢神経系への集積性が高くなっていることが観察され血液脳関門(BBB)の通過性が高くなっていることが示唆された。さらに神経系細胞であるPC-pAB1細胞を用いて活性化MAPKをウエスタンブロッティングで追いかけたところPCBDNF添加PC-pAB1細胞は持続的なMAPK活性化を示し、レシチン化によってBDNFに新たな機能が付加されていることが示唆された。持続的なMAPK活性化は細胞を分化の方向に誘導するとされており、これらが薬理効果の増強と大きな関係を持つと考えている。また最適レシチン導入数の同定のために有機合成したPCBDNFについて結合部位と結合数を分析したところ、結合部位は平均的に導入され、平均導入数はBDNF一分子あたりおおよそ3分子のレシチン誘導体が結合していることが判明した。そこでPC-BDNFが神経系にどれほどターゲットされているかをラットを用いて検討した。PC-BDNFのPC導入数の選定に関しては細胞増殖活性を指標にしてBDNF分子当たり23分子のPC誘導体を導入したPC-BDNFを作製した。Wistarラット(4W, Male)に10mg/kgのPC-BDNFを投与し30分、5時間後大脳、小脳、脊髄を摘出し組織中のBDNF量をELISAで測定した。その結果PC-BDNFはフリーBDNFに比較して小脳、脊髄において高いターゲット性を示し、PC-BDNFはこのことにより薬理効果の増強を得ていることが示唆された。PC-BDNFがどのような機序で脊髄神経系に集積するかについては今後検討する予定である。臨床応用可能な神経系DDS製剤の開発を目指して脳神経細胞由来神経栄養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)とレシチン誘導体を結合したレシチン化BDNF(PCBDNF)について作製し検討した。これまでC57BL/KSJ-db/dbマウスにおける薬理効果の著明に増強することを報告した。その薬理効果増強の機序を検討するために血中クリアランス、中枢神経系への集積について検討した。血中濃度についてはPCBDNF投与後は非修飾BDNFよりむしろ低濃度であった。また中枢神経系(脊髄、脳)への集積性はPCBDNFのほうが高い傾向が見られたが、予期していたほどではなかった。今年度は神経系PC12細胞を用いて細胞親和性を検討した。その結果PCBDNFはBDNFと比較して著明に細胞親和性が高く大過剰のBDNFの添加によっても置き換わらないことが判明した。活性化MAPKの発現をウエスタンブロッテイングで追いかけたところPCBDNF添加細胞は持続的なMAPK活性化を示し、レシチン化によってBDNFに新たな機能が付加されていることが示唆された。持続的なMAPK活性化は細胞を分化の方向に誘導するとされており、これらが薬理効果の増強と何らかの関係を持つと考えている。今後細胞形態学的にも分化誘導活性を詳細に検討する予定であり、幹細胞の分化誘導活性に相関すれば非常に興味深い化合物になると考えられる。また最適レシチン導入数の同定のために有機合成法で作製したPCBDNFについて結合部位と結合数を分析している。

さらに中枢神経系への効果を検討するために外傷性脊髄損傷モデルラットを作製しPCBDNFによる脊髄損傷回復効果を検討している。臨床応用可能な神経系DDS製剤の開発を目ざして脳神経細胞由来神経栄養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)とレシチン誘導体を結合したレシチン化BDNF (PCBDNF)を合成し検討した。これまでC57BL/KSJ-db/dbマウスにおける摂食抑制効果が著明に増強すること、その原因が血中半減期の長さに起因するのではなく高い細胞親和性によることが示唆された。In vivoでの検討により中枢神経系への集積は高い傾向が見られた。神経系細胞であるPC12細胞を用いて活性化MAPKおよび活性化p38の発現をウエスタンブロッテイングで追いかけたところPCBDNF添加PC12細胞は持続的なMAPK活性化およびp38活性化を示し、レシチン化によってBDNFに新たな機能が付加されていることが示唆された。持続的なMAPK活性化および活性化p38は細胞を分化の方向に誘導するとされており、これらが薬理効果の増強と何らかの関係を持つと考えている。また最適レシチン導入数の同定のために有機合成したPCBDNFについて結合部位と結合数を分析したところ、結合部位は平均的に導入され、平均導入数はBDNF一分子あたりおおよそ3分子のレシチン誘導体が結合していることが判明した。さらに、外傷性脊髄損傷モデルラットにEB(ES(embryonic stem)細胞をレチノイン酸でパルスしたもの)を移植すると、後肢運動機能回復が見られるが、レチノイン酸処理後さらにPCBDNFで処理するとさらに高い回復効果が見られた。今後はPCBDNFがEBをどの種の細胞に分化するのか、またニューライトの生成がどのようになっているかを検討する予定である。