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高等動物におけるJab1を介した細胞増殖制御に関する研究

Jab1は高等動物細胞の細胞増殖を制御する。細胞内では分子量が約450kDaのCOP9シグナロソーム複合体と分子量が約120kDaの複合体(JACS)を形成する。本研究課題では、Jab1が形成する複合体に注目し、Jab1による細胞増殖制御機構の解析を行った。TAP(tandem affinity purification)タグを付加したJab1が過剰発現する動物細胞株を樹立し、このタグを用いてJab1複合体の精製、アミノ酸配列の決定を行った。精製された分子には既知のJab1結合蛋白質(CSNなど)が複数含まれた。この結果から実験系が妥当であると考え、これまでJab1との結合が報告されていない分子について抗体を作製し、解析を行い、分子XがCOP9シグナロソーム複合体と動物細胞内で結合することを明らかにした。RNA干渉法を用いて、分子Xの発現量を抑制すると、Jab1の発現量が減少した。以上より、この分子はJab1の発現量を制御する可能性がある。Jab1が恒常的に発現するJab1トランスジェニックマウス(TGマウス)を作製したところ、一部の臓器(骨髄や脾臓)ではJACSの形成量が増加した。このマウスは生後6ヶ月以降、骨髄増殖性疾患を発症し、骨髄、脾臓中の造血幹細胞の割合が増加した。一方、Jab1遺伝子座の一つを欠損したJab1ヘテロマウス(HTマウス)ではJACSの形成量が減少した。このマウスは野生型のマウスに比べ、造血幹細胞の割合が減少し、造血能力が低下した。これらの分子機構を解析したところ、Cdkインヒビターの発現量がTGマウスでは低く、HTマウスでは高いことが分かった。以上のことは、Jab1が幹細胞の制御に関わり、その制御異常が疾患を発症させることを示している。本研究課題を遂行するにあたり、1 Jab1の形成する複合体の構成因子の同定と機能解析2 Jab1の生理学的機能の解析に焦点をあて研究を進めた。1では(2)このタグを利用してアフィニティーカラムによりJab1を含む複合体を精製(3)質量分析計を使用してJab1と一緒に精製されてきた複数の蛋白質のアミノ酸配列の決定を行った。決定したアミノ酸配列から精製標本に既知のJab1結合タンパク質が複数含まれることが明らかとなった。このことから、実験系が有効に機能していると考え、精製されてきた蛋白質の中で、これまでJab1と結合することが報告されていない蛋白質について遺伝子を得て、抗体を作製した。この抗体を用いたウエスタン解析および免疫沈降から、この分子がJab1と動物細胞内で結合することを確認した。現在、この分子の機能について解析中である。2では、Jab1遺伝子改変マウスを用いた解析を中心に(1)Jab1ヘテロマウスの寿命を観察(2)Jab1ヘテロマウスとCdkインヒビターp27や癌抑制遺伝子産物p53の遺伝子改変マウスとの交配(3)Jab1トランスジェニックマウスの作製と表現系の解析(4)経時的な血液検査を行った。これらの解析からJab1ヘテロマウスは短命であり、p27遺伝子に欠損がある場合、さらに短命になることが明らかとなった(一方、これまでのところp53遺伝子の欠損によって表現系に変化は認められない)。また、血液検査の結果から、Jab1トランスジェニックマウスとJab1ヘテロマウスでは加齢に伴い、造血系に異常が生じることが分かった。このことはJab1が造血系の維持に重要な役割を担う分子であることを示している。現在、その分子機構について解析を行っている。
大正期・昭和初期の司法省・検察に関する実証的研究：「平沼・鈴木閥」の動向を中心に

本年度は「平沼・鈴木閥」が司法省の刑事政策と検察にどのような影響を与えたのかについて、分析を進めた。具体的には、「山岡萬之助関係文書」、「平沼騏一郎関係文書」(国立国会図書館憲政資料室所蔵)や『法律日日』、『法律新聞』、『思想月報』、『思想月報』など、関連する史料や新聞、雑誌を幅広く収集し、分析を進めた。残念ながら、本年度中に論文としてまとめるまでには至らなかった。ただ、今年度の調査・分析を手がかりとして、歴史的実証をかためていくべき仮説を二つ得た。第一として、明治30年代半ばから大正期にかけて今日に通じる「精密司法」の源流が形成されていくが、それはいくが、平沼を中心とする検察の捜査、起訴便宜主義の徹底によりもたらされた可能性があることである。第二に、戦後に至るまで検察の犯罪者の更正、社会復帰の重視の姿勢が日本の刑事司法の特徴として挙げられるが、それは明治末期以降、新派刑法学の台頭と儒教的思想により形成されていったのではないかということである。その特徴の形成に影響を与えた平沼は人の本来の性質には徳がそなわっており、それを遂げさせることを法の基本とすべきと主張している。本年度は主に主に三つの点から研究を進めた。まず、「平沼・鈴木閥」の動向に関する史料収集と分析を行った。具体的には、国立国会図書館憲政資料室、亜細亜大学太田耕造記念館、日本大学総合学術情報センターなどを訪問し、調査を進めた。そして、その成果をもとに、平沼騏一郎がいかにして司法部内に、「平沼・鈴木閥」を形成し、その後、平沼・鈴木が司法部を離れた後も、いかなる形で司法部に対し、政治的影響力を保つことができたのか、という点を解明し、論文を作成した。当初、学術雑誌の査読に出す予定だったが、京都大学学術出版会から、単著『平沼騏一郎と近代日本:官僚の国家主義と太平洋戦争への道』の出版が決まったため、その第II部第1章に入れることにした(なお、『平沼騏一郎と近代日本』は2016年12月に刊行された)。また、単著の構想報告を「二〇世紀と日本」研究会、近代日本政治史研究会(大東文化大学国際比較政治研究所との共同開催)で報告した。次に、憲法など法に関する審査機関である枢密院における平沼の動向を分析し、その成果を日本政治学会研究大会で報告した。さらに、2016年夏、有力な弁護士出身の代議士鵜澤総明の文書が千葉県文書館に所蔵されていることを知り、遺族の承諾を得て、調査した。その結果、冊子複製版で30冊ほどある膨大な史料であることを発見した。そのため、急きょ、再度調査する必要が生じたため、前倒し請求を行い、2017年3月に再度調査を行い、昭和初期の日記などについてはコピーを終えた。当初、初年度においては、「平沼・鈴木閥」を形成過程・展開過程を分析する予定だったが、その作業が予想以上に進展し、論文を作成することができ、かつそれを単著の中に組みこみ、平沼騏一郎論としても、総合的に位置づけることができた。また、それに加えて、枢密院、弁護士の動向についても、既に調査を開始し、一定の成果を挙げることができたためである。本年度は主に以下の二つの方面から研究を進めた。まず、昭和初期の司法部において、最も重要な課題となったテロ・クーデタ未遂事件に対して、司法部が司法権を守るべくどのように対応したのかを減刑嘆願運動の展開に着目して分析した。減刑嘆願運動に着目した理由は、単なる社会運動ではなく、陸海軍等の政治勢力をも巻き込んだ政治的側面を持っていたためである。分析の結果、「平沼・鈴木閥」の影響が1930年頃から衰え、小山松吉・小原直らは「平沼・鈴木閥」と距離を取り、減刑嘆願運動とも距離を置くことで、他の政治勢力からの介入をさけるという意味の司法権の独立を志向したことを明らかにした。それらの成果を、東京歴史科学研究会例会、第二回東アジア日本研究者協議会国際学術大会、慶應義塾大学スーパーグローバルプロジェクト研究会などで報告した。また、学術雑誌にも投稿し、採択された。次に、「平沼・鈴木閥」が推進した治安維持法の制定過程を近代日本治安法の形成過程と外国法の文脈から研究を進めた。それは治安維持法の主たる取締り対象であった社会主義や共産主義、無政府主義といった概念は、そもそも欧米に由来し、それに伴う治安立法も欧米において先行していた。そのため、日本の司法省・内務省は欧米の治安立法例を収集し、それらを参考に法を立案していたためである。分析はまだ途中であるが、過激社会運動取締法案が治安法の画期であり、司法省は米法を参照していたことなどを明らかにした。その成果を日本史研究会近代史部会で報告した。また、来年度の日本政治学会研究大会の研究報告にも採用された。昭和初期の司法部の最重要課題であったテロ・クーデタ未遂事件とそれをめぐる司法権の動向について、「平沼・鈴木閥」の動向を踏まえ、初めて実証的に明らかにでき、それらを学術雑誌に投稿し、複数の学会でも報告した。また、続けて研究を進めている治安維持法についても、外国法という新たな観点から分析し、既に学会で報告を行い、来年度の日本政治学会研究大会の報告にも採択された。また、論文の執筆も進めているためである。

本年度は「平沼・鈴木閥」が司法省の刑事政策と検察にどのような影響を与えたのかについて、分析を進めた。具体的には、「山岡萬之助関係文書」、「平沼騏一郎関係文書」(国立国会図書館憲政資料室所蔵)や『法律日日』、『法律新聞』、『思想月報』、『思想月報』など、関連する史料や新聞、雑誌を幅広く収集し、分析を進めた。残念ながら、本年度中に論文としてまとめるまでには至らなかった。ただ、今年度の調査・分析を手がかりとして、歴史的実証をかためていくべき仮説を二つ得た。第一として、明治30年代半ばから大正期にかけて今日に通じる「精密司法」の源流が形成されていくが、それはいくが、平沼を中心とする検察の捜査、起訴便宜主義の徹底によりもたらされた可能性があることである。第二に、戦後に至るまで検察の犯罪者の更正、社会復帰の重視の姿勢が日本の刑事司法の特徴として挙げられるが、それは明治末期以降、新派刑法学の台頭と儒教的思想により形成されていったのではないかということである。その特徴の形成に影響を与えた平沼は人の本来の性質には徳がそなわっており、それを遂げさせることを法の基本とすべきと主張している。次年度も引き続き、研究計画に沿って、研究を進めていく。とりわけ、2017年2月に国立国会図書館憲政資料室において、大審院検事などを務めた太田耐造の関係文書が公開されたので、同文書を入念に調査する予定である。同文書は1000点以上に及び執務に関する史料であり、史料の残存状況の良くない司法省・検察において重要な位置を占めるものと推測される。今後は前年度に引き続き、治安維持法に関する研究報告及び論文執筆を進め、それらに関連して、「平沼・鈴木閥」のさらなる実態解明に努める。また、最終年度は「平沼・鈴木閥」がどのような秩序観、法思想を持っていたのかについても、研究を進め、より多角的に「平沼・鈴木閥」の実像を明らかにするように努める。
感覚機能代償における大脳皮質側方抑制の役割

本研究では抑制性神経伝達の変化に着目し、代償的な感覚機能の向上が長期的に維持されるメカニズムの解明を目的としている。視覚機能の剥奪後2日目において、体性感覚野の4層から2/3層で形成される興奮性伝達(大脳皮質の縦方向の神経伝達)が強化され、剥奪後7日目において興奮性伝達の強化は見られなくなるが、皮質2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達(側方抑制)が強化されるという事を明らかにした。さらにこのような抑制性伝達の強化には2/3層の抑制性神経細胞におけるセロトニンシグナルが関わっていることが明らかになった。これまでに視覚機能の剥奪後2日目において、体性感覚野(バレル皮質)の4層から2/3層で形成される興奮性伝達(大脳皮質の縦方向の神経伝達)が強化され、剥奪後7日目において興奮性伝達の強化は見られなくなるが、バレル皮質2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達(側方抑制)が強化されるという事を明らかになり、視覚剥奪初期において強化された4層-2/3層間の興奮性伝達は、2/3層の興奮性の錐体細胞だけでなく、抑制性の介在神経細胞への入力においても強化され、その入力により活性化され側方抑制が強化されているということも明らかにした。25年度は2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達の強化におけるセロトニンシグナルの役割について注目した。既に申請者が報告している論文において視覚機能の剥奪後2日目にバレル皮質でのセロトニン分泌量が上昇し、シナプスにおけるAMPA受容体の量を増加させ興奮性伝達を強化していることがわかっている。このことからセロトニンが抑制性の介在神経細胞にも作用し抑制性伝達も強化しているのではないかと仮説をたて、それについて検証した。視覚機能の剥奪後にセロトニン2A受容体の拮抗薬を投与することにより剥奪後2日目においてバレル皮質2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達の強化が見られなかった。さらに剥奪後7日目においても側方抑制の強化は見られなかった。このことから視覚機能の剥奪後2日目においてセロトニンの分泌が上昇し、2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達が強化されてその後も長期的に維持されているということが明らかになった。これまでに視覚機能の剥奪後2日目において、体性感覚野の4層から2/3層で形成される興奮性伝達(大脳皮質の縦方向の神経伝達)が強化され、剥奪後7日目において興奮性伝達の強化は見られなくなるが、大脳皮質2/3層-2/3層間の側方向への抑制性伝達(側方抑制)が強化されるという事を明らかにしてきた。しかしながら、はじめに縦方向の興奮性入力が強化され、その後側方向への抑制性入力が強化されるようになるための回路メカニズムが不明である。今回申請者は視覚剥奪初期において強化された4層-2/3層間の興奮性伝達は、2/3層の錐体細胞だけでなく、抑制性の介在神経細胞への入力においても強化され、その入力により活性化され側方抑制が強化されているのではないかという仮説を立て、その検証に取り組んだ。抑制性介在神経への興奮性伝達の変化を電気生理学的に解析するために、記録した神経細胞ごとにcurrent clamp法により神経細胞の発火パターンを確認したうえでその細胞への興奮性入力を記録することを試みた。その結果抑制性神経細胞様の発火パターンを示す神経細胞への興奮性伝達も強化されていることがわかった。今後は抑制性神経細胞特異的にAMPA受容体のドミナントネガティブ体の導入(ウィルスベクターは完成済み)による興奮性伝達抑制を行い、感覚機能向上おける側方抑制の役割を明らかにする。本研究は機能回復が難しいとされる成熟した神経回路において薬などによる外的な処置ではなく、内在性のメカニズムにより機能向上を示すことが出来た。このような知見は脳損傷後の回復期を過ぎた患者に対し、効率よく機能回復を誘導するための強力な新しいリハビリテーション法の開発へ大きく寄与できることが期待できる。前述のとおり、視覚機能の剥奪により体性感覚野の2/3層-2/3層間側方抑制が強化されるとともに、抑制性神経細胞への4層からの2/3層への縦方向の興奮性入力も強化されるという仮説を明らかにすることが出来たため、おおむね順調に研究計画が進展していると考えられる。今後は抑制性神経細胞特異的にAMPA

受容体のドミナントネガティブ体の導入(ウィルスベクターは完成済み)による興奮性伝達抑制を行い、感覚機能向上おける側方抑制の役割を明らかにするとともに側方抑制を強化する細胞外因子をセロトニンなどの神経修飾物質を中心にマイクロダイアリシス法を用い解析し、側方抑制強化が維持されるメカニズムを明らかにする。上記の今後の研究の推進方策を達成する上で、電気生理学実験、分子生物学実験、行動実験を行う必要があるため、実験動物、分子生物学実験消耗品、電気生理学実験消耗品、行動実験消耗品に研究費を使用する予定である。当初、ライカ社の急性脳切片作成用のビブラトーム購入のため200万円を計上していたが、国内企業の堂坂社(DSK)のリニアスライサーに変更し購入価格が安くなったため、繰越金が生じた。
人権条約からみた日本の出入国管理法制

本研究は、(1)条約機関の先例の収集と分析、(2)日本の裁判例の収集と分析及び(3)若干の諸外国の動向の把握及び関係文献の収集を中心とするものであるが、概ねその作業を完了した。(1)については、主として、欧州人権裁判所、規約人権委員会及び拷問禁止委員会の判決及び「見解」を収集し、入手可能な資料はすべて得た。(2)については、公式判例集及び公刊されている判例誌に掲載されている裁判例、並びにインターネット(最高裁ホームページなど)から収集可能な裁判例を収集した。また、弁護士から若干の判例集未登載の裁判例を得た。これについても、入手可能な資料はすべて得た。(1)及び(2)については、その内容を検討し、入国、在留及び強制的出国(犯罪人引渡し及び退去強制)の3場面に分けて整理し、分析を行った。(3)については、従来から関心をもっていたカナダ及びオーストラリアを中心に、主として両国の関係ホームページから裁判例・決定例などの収集を行ったほか、その他の関係文献を収集した。なお、収集した文献、特に日本の裁判例などの一部について、効率的な研究遂行のために電子データ化した。ただし、匿名化が必要な裁判例や著作権の関係などで公開はしていない。研究の成果は、検討の範囲が膨大であるため、そのすべてをとりまとめるには至っていないが、現在、日本における在留特別許可に関する法務大臣の裁量に関する裁判例・決定例の典型的論理を分析し、人権条約の解釈からみた評価を行う論文を執筆中であり、近々公表される予定である。19年度の研究実施計画に従い、文献調査を中心として研究課題の検討を進めた。具体的には、1、条約機関の先例の収集と分析、2、日本の裁判例の収集と分析及び3、若干の諸外国の動向の把握及び関係文献の収集、である。1、については、主として、欧州人権裁判所、規約人権委員会及び拷問禁止委員会の判決及び「見解」を収集し、2、については、公式判例集及び公刊されている判例誌に掲載されている裁判例、並びにインターネット(最高裁ホームページなど)から収集可能な裁判例を収集した。1、及び2、については、その内容を検討し、入国、在留及び強制的出国(犯罪人引渡し及び退去強制)の3場面に分けて整理し、論点抽出を行った。さらに、3、については、従来から関心をもっていたカナダ及びオーストラリアを中心に、主として両国の関係ホームページから裁判例・決定例などの収集を行ったほか、その他の関係文献を収集した。なお、18年5月から6月中旬まで、及び7月から8月中旬までの12週間にわたり、国連の「国際法委員会」に山田中正委員の補佐のため外務省からジュネーヴに派遣され、同委員会の検討課題のひとつである「外国人の追放」に関し現地で関係文書の収集と分析にあたった。次に、収集した文献、特に日本の裁判例などの一部について、効率的な研究遂行のために電子データ化した。今年度の研究成果の一部は「11」に記載した論文及び図書として公表したが、欧州人権裁判所が子どもの最善利益の観点から不法滞在者に対して滞在先の国における居住の継続を認めるべき旨を判示した重要な先例を見出す(雑誌欄に掲載した「ロドリゲスザシルバ対オランダ事件」を参照。)など、いくつかの新たな知見を得た。来年度には、本年度の研究成果を踏まえて、その集大成を行う予定である。具体的には、(1)条約機関の先例の収集と分析、(2)日本の裁判例の収集と分析及び(3)若干の諸外国の動向の把握及び関係文献の収集、である。【文献調査】(1)については、まず、条約機関の先例として、欧州人権裁判所、規約人権委員会及び拷問禁止委員会の判決及び「見解」などを収集し終えた。

(2)についても、公式判例集及び公刊されている判例誌に掲載されている裁判例、並びにインターネット(最高裁ホームページなど)から収集可能な裁判例の収集を終え、また、弁護士ら実務家から若干の判例集未登載の裁判例を得た。さらに、カナダ及びオーストラリアを中心に、主として両国の関係ホームページから裁判例・決定例などの収集を行ったほか、国連の「国際法委員会」における議題「外国人の追放」関係の資料も入手した。これらの資料については、その内容を検討し、入国、在留及び強制的出国(犯罪人引渡し及び退去強制)の3場面に分けて整理し、その内容の把握及び分析を行った。【現地調査】課題の検討の進展とともに、各国の出入国管理行政が、「9.11」以降の「テロ対策」との関係で一定の影響を受けていることから、アメリカの出入国管理行政の一端を解明するため、米国に赴き、関係する研究者と意見交換を行った。【成果】今年度の研究成果の一部は「11」に記載した論文及び図書として公表した。特に、2008年3月刊行予定の高阪章編『国際公共政策学入門』第2章では、家族・私生活の保護及び拷問などの迫害からの保護の観点からする外国人の追放制限の問題を論じた。その視点は、人権条約の履行監視機関の条約解釈と日本の実務及び裁判例との整合性如何というものであり、本研究の検討課題そのものである。本書は学部レヴェルの教科書ではあるが、その内容は、追放の場面における人権条約の統制に関する全体像を示したものである。なお、より専門的な研究成果は現在とりまとめ中であり、今年5月の成果報告書でその一端を公表する予定である。
電気化学堆積による酸化鉄pn接合太陽電池の作製

本研究では、酸化鉄薄膜を、メッキの技術である電気化学堆積によって作製し、薄膜太陽電池に応用する。FeSO4水溶液を用いた電気化学堆積によりFeOOH薄膜が得られ、それを空気中など酸化雰囲気でアニールするとFe2O3になる。無添加酸化鉄薄膜はn型の伝導性を示すので、初年度はpn接合に必要となるp型薄膜作製とその品質改善を目標とした。堆積溶液中のFeSO4濃度を20mMと固定し、CuSO4濃度を変えて堆積したところ、2mM以上でp型の伝導性が明確に観測された。しかしCu組成の増加につれ、膜はもろくなり、またオージェ電子分光による組成マッピングの結果、面内でわずかだが組成が不均一であることがわかった。そこで堆積に二段パルスを用いたところ、膜の平坦性と組成の均一性が改善された。二段パルス堆積では、酸化ステップ中に不安定な堆積物が溶解し、膜質の改善につながると考えらえれる。また空気中400°Cでアニールすることで膜はより緻密になり、壊れにくくなった。Cuの他にZn、Mgがp型の不純物として働くという報告がある。そこでZn添加を試みた。ZnSO4濃度を変えて堆積し、Znを含む酸化鉄薄膜の堆積に成功した。しかし伝導型はn型のままであり、p型薄膜を作ることはできなかった。p型の鉄化合物としてはFeS2が知られている。電気化学堆積では酸素を多く含むFeSxOy薄膜が得られ、伝導型はp型である。そこでFeSxOyもp型酸化鉄薄膜として用いて太陽電池作製を試みる。初年度はZnOとのヘテロ接合を作製し、整流性と弱い光起電力を観測した。FeSxOyで太陽電池が作られた報告は過去になく、これが初の成功例である。Cu添加酸化鉄薄膜作製においては、まずp型伝導性を確認した。さらに、二段パルス電気化学堆積を採用することで、膜の平坦性、均一性が向上した。この材料系で二段パルス堆積は初めての試みであり、意義のある成果と考えらえれる。ただ、二段パルス堆積はCuSO4濃度5mMを中心に行っており、今後、Cu組成をもっと広い範囲で変えて実験をする必要がある。Zn添加でp型薄膜が得られなかった原因は不明である。置換型不純物として入っていない可能性が考えらえれるが、一方で、過去の報告も一例あるのみであり、信頼性は必ずしも高くはない。p型薄膜が得られなかったことは残念であるが、研究方針を考えるうえで有益な知見、経験が得られたと言える。初年度は、Cu添加でp型酸化鉄薄膜が得られることを報告する論文を一編出版した。また、FeSxOyとZnOのヘテロ接合に関する論文を一編投稿した。研究の公表は順調に進んでいる。初年度の研究結果に基づき、今後はCu添加に集中し、Zn添加は基本的には行わない。Cu添加量や二段パルスのパラメータなど、最適化すべき条件は残っている。また、無添加n型酸化膜を積層し、酸化鉄pn接合太陽電池の作製もこれから重点的に行っていく。堆積時および熱処理の諸条件は、個別の膜に対して最適化されたものを用いるが、最終的には太陽電池特性が最良となるよう再検討する。また、積層にあたり、堆積の順番、二層目堆積前の熱処理の有無、膜厚などの条件を変え、良好な太陽電池特性実現を目指す。また、基礎的物性評価として、伝導型が反転する限界のCu濃度を見極める実験も行いたい。できるだけCu濃度を減らし、酸化鉄のみからなるホモpn接合の作製を目指す。同時に、FeSxOyもp型薄膜の一つと位置づけ、ZnOだけでなく無添加酸化鉄とのpn接合太陽電池作製を目指す。

初年度はZnOとのヘテロ接合を作製し、整流性と弱い光起電力を観測した。FeSxOyで太陽電池が作られた報告は過去になく、これが初の成功例である。Cu添加酸化鉄薄膜作製においては、まずp型伝導性を確認した。さらに、二段パルス電気化学堆積を採用することで、膜の平坦性、均一性が向上した。この材料系で二段パルス堆積は初めての試みであり、意義のある成果と考えらえれる。ただ、二段パルス堆積はCuSO4濃度5mMを中心に行っており、今後、Cu組成をもっと広い範囲で変えて実験をする必要がある。Zn添加でp型薄膜が得られなかった原因は不明である。置換型不純物として入っていない可能性が考えらえれるが、一方で、過去の報告も一例あるのみであり、信頼性は必ずしも高くはない。p型薄膜が得られなかったことは残念であるが、研究方針を考えるうえで有益な知見、経験が得られたと言える。初年度は、Cu添加でp型酸化鉄薄膜が得られることを報告する論文を一編出版した。また、FeSxOyとZnOのヘテロ接合に関する論文を一編投稿した。研究の公表は順調に進んでいる。初年度の研究結果に基づき、今後はCu添加に集中し、Zn添加は基本的には行わない。Cu添加量や二段パルスのパラメータなど、最適化すべき条件は残っている。また、無添加n型酸化膜を積層し、酸化鉄pn接合太陽電池の作製もこれから重点的に行っていく。堆積時および熱処理の諸条件は、個別の膜に対して最適化されたものを用いるが、最終的には太陽電池特性が最良となるよう再検討する。また、積層にあたり、堆積の順番、二層目堆積前の熱処理の有無、膜厚などの条件を変え、良好な太陽電池特性実現を目指す。また、基礎的物性評価として、伝導型が反転する限界のCu濃度を見極める実験も行いたい。できるだけCu濃度を減らし、酸化鉄のみからなるホモpn接合の作製を目指す。同時に、FeSxOyもp型薄膜の一つと位置づけ、ZnOだけでなく無添加酸化鉄とのpn接合太陽電池作製を目指す。
高分子電解質錯体による細胞培養基材の開発

〔1〕高分子電解質錯体(PEC)の合成と物性評価:成分高分子電解質の疎水性にほぼ対応して表面の親・疎水性のバランスが変化する。この際、コ-ティング基盤の疎水性によりPECの配向が変化する。また、混合組成比の設定により、表面荷電のバランスも容易に制御することが出来る。ミクロ相分離構造も発現する。〔2〕細胞の接着と機能評価:肝細胞;1)PECへ効率良く接着する。2)接着力の強さはポリアニオンの構造に依存する3)膜タンパク質が直接関与した接着であり、2価カチオンの影響は小さい。4)PECと肝細胞の接着は、生理的機構ばかりでなく、非生理的な機構(主に静電的な相互作用)も重要な因子の一つとなっている。5)比較的接着力の弱いPECで肝細胞を培養すると、コラ-ゲンに匹敵するか、もしくはそれを凌ぐ機能維持が起きる。インスリノ-マ細胞(株化膵臓細胞);1)PEC上でも細胞培養用ディッシュと同等の細胞増殖が可能である。2)比較的親水性のPEC上で培養すると、細胞集塊を形成し、高いインスリン合成・分泌活性を示した。3)細胞の凝集状態と機能に相関性があることを示唆した。L-細胞;1)2X系PECにおける増殖は、疎水性の等しいポリアニオンを用いた場合は荷電が負になるに従い、また荷電バランスが等しい時は、疎水性の高井PECで増殖能が発現される。2)PVBMA系PECでは荷電、ポリアニオンに依存せず良好な増殖を示す。3)荷電バランス(0)における増殖性は、多糖類系PEC>合成高分子系PEC、スルホン酸基>カルボキシル基となる。すなわち、細胞の機能を発揮させるためには、ある程度弱い接着力が必要である。組織細胞は接着依存性の細胞であり、これらの細胞をinvitroで培養するためには優れた細胞接着性基材が必要となる。本研究では、高分子電解質錯体(PEC)を用いて細胞(特に肝実質参謀、インスリン産生細胞株)の長期培養、機能評価を行ない、以下のような事を明らかにした。1.非活性細胞の接着、非生理的条件下での接着、裏打タンパク質の影響などの実験より、PECに対する肝実質細胞の接着は、コラーゲン、フィブリネクチンなどへの接着機構とは異なり、主に静電的相互作用、疎水性相互作用などを介した非生理的接着機構により接着する。2.接着した肝実質細胞の機能(アルブミン合成能、酵素活性など)は、最適なPECを選択することにより、従来最も良い細胞培養用基材として知られているコラーゲンと比較しても、同等もしくはそれ以上の機能を長期間に渡って維持する事が可能である。3.インスリン産性細胞株を用いた実験においては、PEC構造(特に疎水性)により細胞凝集状態が異なり、親水性PECでは3次元凝集塊を作るのに対し、疎水性が増すと共に、単層形成となる。またインスリン分泌量は3次元的に細胞凝集塊を作るものが最も高く、細胞凝集状態と細胞機能が深く関係している。4.細胞接着、機能維持に関して、細胞種により最適のPEC構造が異なる事が明らかとなり、他の細胞腫を対象とすることにより、細胞の認識という情報が得られる事が予想される。このように、PECは細胞培養基材として、従来とは異なる型の接着機構を有し、優れたものであることを明らかにした。本年度は主に、多糖類を構造成分とした高分子電界質錯体(PEC)と細胞の相互作用について検討を行った。

1)2Xと多糖類からなるPEC(O)へのL-細胞の接着率は血清添加によって低下し、血清タンパク質が接着に阻害的に関与していることが示唆された。2)また多糖類に着目すると、接着率は、アルギン酸>ヒアルロン酸>コンドロイチン硫酸(type-A)の順となった。3)これらのPEC上でL-細胞を増殖させると、接着率が高かった、アルギン酸、ヒアルロン酸を用いた場合は荷電バランス(-4)で、逆にコンドロイトン硫酸では(+4)の最適の増殖が認められた。4)L-細胞の増殖に関してポリアニオンの官能基で比較すると、スルホン酸基>カルボキアル基となる。5)L-細胞の増殖に関して合成高分子と多糖類を比較すると、多糖類>合成高分子となる。6)L-細胞の接着の強さは、スルホン酸基<カルボキシル基、多糖類<合成高分子となる。7)多糖類の骨格もL-細胞の増殖に影響を及ぼし、グルコ-スユニット>グルコサミンユニットとなる。8)多糖類に導入したアニオン席の位置は増殖にあまり影響を及ぼさない(コンドロチン硫酸のtype-Aとtype-c)が、導入率は高い方が増殖に適している。などの事が明かとなった。これらの結果より、増殖には細胞が基材の上を自由に動き回れるような、ある程度弱い接着力が必要であることが示唆された。
狂犬病ウイルス野外株のRNAによる新規複製・転写制御機構の解明

本研究は、狂犬病ウイルス(RABV)のRNAによる新規複製・転写制御機構を明らかにすることを目的に研究を行った。RABV野外株119検体の間で保存されているRNAモチーフを探索した結果、N遺伝子CDSの5'側とM遺伝子の3'UTRにRNAモチーフが同定された。RABVの3'UTR挿入したluciferase RNAを用いてレポーターアッセイを行った結果、MとGの3'UTRがmRNAの分解を促進することが明らかになった。また、ミニゲノムレポーターアッセイと組換えウイルスを用いた実験により、N CDSの高度保存領域はRABVの複製に必要なモチーフ配列をコードすることが明らかになった。GenBankに登録されている野外狂犬病ウイルス119検体の全長ゲノム配列を回収し、6塩基以上連続して98%以上の塩基一致率を示す遺伝子領域をスクリーニングしたところ、(1)N遺伝子5'末端の3'UTRからおよそ100塩基のコーディング領域の同義置換サイトと、(2)M遺伝子の3'UTRにおいて、数十塩基に渡りRNAレベルで高度に保存される遺伝子領域が明らかになった。これまでの他のウイルスにおける実験報告から予測される機能としては、例えば、N遺伝子のコーディング領域は、プロモーターやウイルスゲノムのパッケージングに関わっている可能性がある。また、M遺伝子の3'UTRは、例えば宿主蛋白質が結合することによって、M遺伝子の翻訳後調節を行っている可能性がある。さらに、塩基レベルで連続して保存される遺伝子領域ではRNAの二次構造が観察されることがある。そこでこれらの可能性について検証するために、最初に、狂犬病ウイルスの固定株であるRC-HL株のM遺伝子3'UTRのクローニングを行い、合成したRNAを用いてゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイに用いた蛋白質は狂犬病ウイルス感受性細胞であるマウス神経芽(NA)細胞およびベビーハムスター腎臓(BHK)細胞から回収した蛋白質であった。M遺伝子3'UTRに対するcompetitorも用いてゲルシフトアッセイを行った結果、M遺伝子の3'UTRに宿主蛋白質が結合することを確認した。そこでUV crosslinkingによりM遺伝子3'UTRに結合する宿主蛋白質の分子量を確認したところ、約140kDa付近の蛋白質が結合していることが明らかとなった。狂犬病ウイルスはマイナス鎖の非分節型RNAゲノムをもち、3'側からLeader-N-P-M-G-L-Traler遺伝子がコードされている。狂犬病ウイルス野外株119検体の全長ゲノムを解析することにより、Leader-N 5' CDSおよびM 3'UTRにRNAレベルで高度に保存されている領域が存在することが明らかになった。そこでこれら高度保存領域の機能を解析するために、前年度から引き続き、M 3'UTRにおいては結合する宿主蛋白質の同定作業および宿主蛋白質の結合領域を決定する作業を行っている。SP6ポリメラーゼを用いて作製したM 3'UTRにビオチンを結合し、アビジンビーズを用いてM3'UTRに結合する蛋白質の分子量をSDS-PAGEおよび銀染色によって解析したところ、40kDa-220kDaにかけて複数の蛋白質が結合することが明らかとなった。M3'UTR領域の複数箇所をdeletionしたRNAを合成し同様の作業を行ったところ、3'UTRの中央領域に蛋白質が結合する配列が存在することが示唆された。また、3'UTRはmRNAの翻訳後の発現調節に関わることがあるため、FireflyのLuciferaseレポーター遺伝子の下流にN,P,M,G,L遺伝子の3'UTRを挿入し、レポーターアッセイを行った。その結果。M 3'UTRはコントロールと比較してレポーターの発現量が低く、また、qPCRを用いた解析でもレポータ遺伝子の発現量の低下が確認されたことから、M 3'UTRはM mRNAの翻訳後の発現を抑制している可能性が示唆された。今年度はM3'UTRがmRNAの翻訳後調節に関わること、また宿主蛋白質が結合するRNA領域が明らかとなったため概ね順調に進展しているが、質量分析を用いたRNA結合蛋白質の同定作業に失敗しており、今年度は同定作業を最優先に行う。狂犬病は、狂犬病ウイルス(RABV)の感染によって引き起こされる致死性の人獣共通感染症である。RABVは感染しても宿主が発症するまで中和抗体が産生されない。また、RABVは複製速度が遅い方が早いRABVよりも中和抗体産生能が低く、病原性が高いことが報告されている。従って、RABVは宿主体内で厳密な複製・転写調節を行い、感染を成立させることが予測される。そこで本研究は、RABVの子孫ウイルスの産生に関わるRABVゲノムの新規複製・転写調節機構を明らかにすることを目的とした。RABVの複製に重要な塩基配列は高度に保存されていることが予測される。そこで、データベースに登録されているRABV野外株119検体の全長配列を解析したところ、N遺伝子CDSの5'末端領域とM遺伝子の3'非コード領域にRNA配列が連続的に保存された高度保存領域が同定された。そこで、N遺伝子の高度保存領域に同義変異を加えたRABV変異体を作製し親株と比較したところ、RABV変異体の子孫ウイルス産生量が100倍以上低下した。N遺伝子はウイルスゲノムの3'側にコードされているため、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)の認識に関わる配列をコードしている可能性がある。

そこで、luciferase遺伝子の上流にN遺伝子の高度保存領域を挿入したmini genome plasmidと、これに同義変異を加えたplasmidを作製し、RdRp発現ヘルパーplasmidsと共にBHK/T7-9細胞にトランスフェクションし、48時間後のluciferase活性を比較した。その結果、高度保存領域に同義変異を加えることによって、luciferase活性がおよそ70%近く低下した。従って、N遺伝子の高度保存領域は、RdRpの認識に関わるRNA配列をコードしている可能性があり、RABVの複製に重要な領域であることが明らかになった。本研究は、狂犬病ウイルス(RABV)のRNAによる新規複製・転写制御機構を明らかにすることを目的に研究を行った。RABV野外株119検体の間で保存されているRNAモチーフを探索した結果、N遺伝子CDSの5'側とM遺伝子の3'UTRにRNAモチーフが同定された。RABVの3'UTR挿入したluciferase RNAを用いてレポーターアッセイを行った結果、MとGの3'UTRがmRNAの分解を促進することが明らかになった。また、ミニゲノムレポーターアッセイと組換えウイルスを用いた実験により、N CDSの高度保存領域はRABVの複製に必要なモチーフ配列をコードすることが明らかになった。平成26年度に計画をしていた野外で流行している狂犬病ウイルスゲノムにおけるRNAレベルの高度保存領域の検出およびレポーターアッセイ等に使用するプラスミドの構築は終わっており、さらにM遺伝子3'UTRに結合するRNA結合蛋白質の存在も明らかになったため、本課題はおおむね順調に進展している。RNA結合蛋白質の同定作業を最優先に行う。また、同定された宿主蛋白質が狂犬病ウイルスの複製にどのように使われているのか、ノックダウン実験などを行うことによって明らかにする予定である。さらに、Leader-N 5'CDSの高度保存領域の解析はMini Genomeを用いたレポーターアッセイ(現在Plasmidを作製中)およびリバースジェネティクスを用いた狂犬病ウイルスのレスキュー実験によって解析を進める。ウイルス学(1)狂犬病ウイルスM遺伝子3'UTR結合蛋白質の同定:M遺伝子3'UTRに結合する宿主蛋白質の種類を同定するために、合成したM遺伝子3'UTRにビオチン標識を行い、アビジンビーズを用いてプルダウンアッセイを行う。プルダウンアッセイによって回収された結合蛋白質は、ペプチドシークエンスやLC-MSによって蛋白質の種類を同定する。また、同定された蛋白質が実際の狂犬病ウイルス感染においてもM遺伝子3'UTRに結合していることを確認するために、狂犬病ウイルスに感染した細胞から回収した蛋白質を用いて免疫沈降およびノーザンブロットを行う。(2)M遺伝子3'UTRがRNAの翻訳後調節に与える影響:M遺伝子3'UTRが翻訳後調節に関わっている可能性を検討するために、luciferase遺伝子の下流にM遺伝子3'UTRを挿入し、レポーターアッセイを行う。(3)RNA結合蛋白質の結合領域の同定:M遺伝子3'UTRはおよそ200ntにわたっており、RNAレベルで高度に保存されている領域は複数箇所に分かれて存在しているため、このような遺伝子領域がRNA結合蛋白質の結合領域である可能性がある。
FRETプローブによるヒストン修飾の時間空間的分析

FRETプローブ及び人工リジルエンドペプチダーゼを用いてヒストン修飾酵素活性を定量的に測定する全く新しい方法を開発し、これを用いて細胞内のヒストン修飾酵素活性を可視化する技術を確立した。本研究は、リジン特異的エンドプロテアーゼを分子プローブとする新しいリジン修飾イメージング法を開発し、ヒストン修飾活性の時間空間的動態を解析することを目的とします。本年度は、その基盤となるプロテアーゼの生化学的特性を、選択されたペプチドモデルを用いて検証し、基本技術を確立しました。具体的には、従来より検討を重ねてきたK4メチル化ペプチドに加え、K36メチル化ペプチドについて、より詳細な質量分析及びFRETペプチドによる解析を行い、標的リジンのメチル化の有無によってエンドペプチダーゼに対する反応速度が大きく異なることを見出しました。また、エンドペプチダーゼの標的配列認識特性として同じファミリーに属するトリプシンとの共通点を見出しました。さらに、類縁エンドペプチダーゼとの一次構造の比較により、FRETプローブの配列とリジン修飾感受性を決定する上で重要となるS1ポケットを規定するアミノ酸残基を同定しました。次いで、エンドプロテアーゼを分子プローブとしてリジン修飾酵素活性を定量する方法を確立するために、ヒストンメチル化酵素及び脱メチル化酵素を合成し、これらのリコンビナント酵素でFRETプローブを処理した後に、エンドペプチダーゼによるリジン修飾の定量を行いました。その結果、ヒストンメチル化酵素処理によるFRETプローブの発光の減少と、脱メチル化酵素によるメチル化FRETプローブの発光増加を観測しました。本法は、従来のリジンメチル化定量法に比べ、操作が簡便で短時間に大量の検体を処理することが出来るため、特異的阻害剤のハイスループット・スクリーニングとして重要な意味を持っています。本研究の目的は、蛍光色素でラベルしたペプチド基質を用い、新たなヒストン修飾酵素活性定量法を開発することである。本年度はこれまでの成果を踏まえ、まず蛍光プレートリーダーのフィルターセットにより最適化された蛍光及び消光色素の組み合わせを検討するために、新たK4またはK36を含むヒストンH3基質ペプチドを合成した。その結果、長波長で励起・発光するFRETペアを用いて、これまでより感度が高く、かつ細胞染色に応用した場合バックグラウンド発光の少ないヒストン修飾酵素活性の定量が可能となった。一方、修飾リジンの分子センサーとなるリジルエンドペプチダーゼについても、リコンビナント酵素の精製効率を高めるため新たにタグ付き発現ベクターを構築し、さらにホスト細胞をスクリーニングすることによって可溶性分画への抽出を大幅に効率化することに成功した。また、モノメチル化リジン及びジメチル化リジンを定量するために、野生型のリジルエンドペプチダーゼの基質結合部位(S1ポケット)に点変異を導入した酵素をデザイン・作成し、モノメチル化またはジメチル化リジンを含む基質を用いてその酵素活性を検討した。本年度のもう一つの目標は、FRETペプチドを用いて細胞内ヒストン修飾活性を可視化することであるが、βガラクトシターゼ染色法に準拠する組織固定法により、K36ジメチル化ペプチドを用いて核特異的染色を得ることに成功した。まだ予備実験の段階ではあるが、これまでに細胞内でヒストン修飾活性を示した報告は無く、まったく新しいクロマチン構造解析法として今後の応用が期待される。本研究の目的は、蛍光色素でラベルしたペプチド基質を用い、新たなピストン修飾酵素活性定量法を開発することです。これまでに、蛍光プレートリーダーのフィルターセットにより最適化された蛍光及び消光色素の組み合わせを検討するために、K4またはK36を含むピストンH3基質ペプチドを合成し、長波長で励起・発光するFRETペアを用いて、これまでより感度が高く、かつ細胞染色に応用した場合バックグラウンド発光の少ないピストン修飾酵素活性の定量が可能となっています。本年度は、修飾リジンの分子センサーとなるリジルエンドペプチダーゼについて、リコンビナント酵素の収率を改善するためprepeptide配列をN末端側に付加し、C末端側のHisタグを用いてNiカラムによって効率よく合成する方法を確立しました。さらに、前年度に引き続きS1ポケットの変異体スクリーニングを行い、モノメチル、ジメチル、トリメチル基質にそれぞれ選択性を有するリジルエンドペプチダーゼの変異体を得ることに成功しています。一方、基質となるヒストンペプチドについても、蛍光波長の長いFRETペアによって修飾されたペプチドの合成に成功しました。また、異なる発光波長をもつ基質を用いることによって複数のピストン修飾酵素活性を同時に定量する方法を確立しています。このようなペプチド基質とペプチダーゼの基質特異性を分子センサーとするピストン修飾酵素活性の測定はこれまでに報告がなく、今後選択的阻害剤など医薬品開発分野におけるハイスループットスクリーニングへの応用が期待されます。FRETペプチドおよびリコンビナント・リジルエンドペプチダーゼは、既に発明特許申請の学内承認を得ています。
アレルギー応答における亜鉛トランスポーターの役割解明

亜鉛は微量必須元素であり、その欠乏により免疫不全が引き起こされる。また、マスト細胞の顆粒に亜鉛が蓄積されていることが報告されていたが、その生理的意義は不明であった。本研究では、細胞内分泌顆粒亜鉛を調節する亜鉛トランスポーターZnT2/Slc30a2に焦点をあて、それら遺伝子欠損マウスの樹立、及びアレルギー•炎症反応における役割の解析を行った。生体内でのZnT2の役割を検討したところ、マスト細胞依存性の腹膜炎モデルにおいて、ZnT2-KOマウスはコントロールマウスに比べ生存率が優位に低下していた。以上の結果よりマスト細胞内分泌顆粒亜鉛が腹膜炎発症に関与している可能性が示唆された。マスト細胞はアレルギー・炎症病態に関与している免疫担当細胞である。マスト細胞は外来刺激をうけて、炎症誘発に関わるヒスタミン・プロテアーゼなどのケミカルメディエーターやサイトカインを分泌する。申請者は亜鉛キレーターを用いて微量必須元素の亜鉛が、上述したマスト細胞の機能発現にポジティブに関与していることを示してきた。本年度は、マスト細胞で高い発現が確認されている亜鉛トランスポーターSlc30a2/ZnT2に焦点をあて、昨年度に樹立したZnT2ノックアウトマウス(ZnT2-KOマウス)を用いて、マスト細胞おける役割の解析を行った。ZnT2-KOマウス由来のマスト細胞では抗原刺激依存的な脱顆粒・サイトカイン産生に機能異常が観察されなかったが、マスト細胞顆粒内亜鉛が優位に低下していた。これらの結果よりZnT2はマスト細胞顆粒内亜鉛を調節する亜鉛トランスポーターであることが判明した。さらに、生体内でのZnT2の役割を検討したところ、腹膜炎モデル(CLP:腸結紮穿刺法)において、ZnT2-KOマウスはコントロールマウスに比べ生存率が優位に低下していた。マウスの腹膜炎モデルでは血管収縮作用をもつエンドセリンが生体内に放出され、大量に分泌されたエンドセリンによって、マウスの死亡率が増加することが知られている。また、生体内ではエンドセリンを分解するカルボキシルペプチダーゼが存在しており、CPA3はマスト細胞に発現が特異的であり、その分子内に亜鉛結合領域を有している。そこで、ZnT2-KOマスト細胞においてCPA3の活性化を検討したところ、優位にCPA3活性化が減弱していることを突き止めた。以上の結果より、ZnT2-KOマウスではマスト細胞CPA3の活性化が減弱しており、エンドセリンを十分に分解できないために、腹膜炎モデルにおける生存率が減少したのではないかという結論に至った。マスト細胞/好塩基球はアレルギー/炎症病態に関与している免疫担当細胞である。マスト細胞/好塩基球は外来刺激をうけて、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターやサイトカインを分泌する。本研究では、細胞内分泌顆粒亜鉛を調節する亜鉛トランスポーターZnT2/Slc30a2及び、細胞質亜鉛濃度調節に寄与しているメタロチオネインに焦点をあて、それら遺伝子欠損マウスの樹立、及びマスト細胞や好塩基球における役割の解析を行った。蛋白・RNA解析を遂行し、ZnT2ノックアウトマウス(ZnT2-KOマウス)が樹立できたことを確認した。ZnT2-KOマウス由来のマスト細胞では抗原刺激依存的な脱顆粒・サイトカイン産生に異常が観察されなかったが、放出された亜鉛が優位に低下していた。この結果と一致して細胞内分泌顆粒亜鉛を亜鉛蛍光指示薬で調べたところZnT2-KOマスト細胞では蛍光シグナルが観察できなかった。これらの結果よりZnT2はマスト細胞顆粒内亜鉛を調節する重要な亜鉛トランスポーターであることが判明した。さらに、生体内でのZnT2の役割を検討したところ腹膜炎モデル(CLP:腸結紮穿刺法)において、ZnT2-KOマウスはコントロールマウスに比べ生存率が優位に低下していた。一方、メタロチオネインノックアウトマウス(MT1/2-KOマウス)より培養好塩基球を調整し、抗原刺激依存的なサイトカイン産生を調べたところTh2型サイトカインIL-4が転写レベルで障害されていることを見出した。また、MT1/2-KOマウスにおいても好塩基球由来のIL-4の産生が減少していた。以上の結果より細胞内亜鉛恒常性維持とアレルギー関連細胞機能発現との密接な関係が示された。マスト細胞/好塩基球はアレルギー病態に関与している免疫担当細胞である。マスト細胞/好塩基球は外来刺激をうけて、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターを分泌する。申請者は亜鉛キレーターを用いて微量必須元素の亜鉛が、上述したマスト細胞/好塩基球の機能発現に関与していることを示してきた。

本年度は、細胞内分泌顆粒亜鉛を調節する亜鉛トランスポーターZnT2及び、細胞質亜鉛濃度調節に寄与しているメタロチオネインに焦点をあて、それら遺伝子欠損マウスの樹立、及びマスト細胞や好塩基球における役割の解析を行った。蛋白・RNA解析を遂行し、ZnT2ノックアウトマウス(ZnT2-KOマウス)が樹立できたことを確認した。ZnT2-KOマウス由来のマスト細胞では抗原刺激依存的な脱顆粒・サイトカイン産生に異常が観察されなかったが、放出された亜鉛が優位に低下していた。この結果と一致して細胞内分泌顆粒亜鉛を亜鉛蛍光指示薬で調べたところZnT2-KOマスト細胞では蛍光シグナルが観察できなかった。これらの結果よりZnT2はマスト細胞顆粒内亜鉛を調節する重要な亜鉛トランスポーターであることが判明した。さらに、生体内でのZnT2の役割を検討したところ腹膜炎モデル(CLP:腸結紮穿刺法)において、ZnT2-KOマウスはコントロールマウスに比べ生存率が優位に低下していた。以上の結果よりマスト細胞内分泌顆粒亜鉛と腹膜炎発症になんらかの関連性が示唆された。一方、メタロチオネインノックアウトマウス(MT1/2-KOマウス)より培養好塩基球を調整し、抗原刺激依存的なサイトカイン産生を調べたところTh2型IL-4が転写レベルで障害されていることを見出した。また、MT1/2-KOマウスにおいても好塩基球由来のIL-4の産生が減少していた。以上の結果より細胞内亜鉛恒常性維持とアレルギー関連細胞機能発現との密接な関係が示唆された。申請者は亜鉛の恒常性維持とアレルギー・炎症反応との関係を調査すべく、亜鉛関連分子とアレルギー・炎症関連細胞であるマスト細胞/好塩基球を用いて、解析を遂行している。今年度は、マスト細胞で高い発現を示している亜鉛トランスポーターZnT2に注目し、マスト細胞における役割についての解析を行った。ZnT2はマスト細胞内の顆粒膜に局在が観察され、遺伝子ノックアウトマウスの解析から、顆粒内亜鉛の取り込みを調節している亜鉛トランスポーターであることを初めて示した。また、ZnT2-KOマウス由来のマスト細胞はヒスタミン遊離を中心とした脱顆粒や転写依存的なサイトカイン産生には影響を認めず、マスト細胞顆粒内亜鉛のみが減少するユニークな細胞であることを明らかとした。このマスト細胞を用いて、マスト細胞顆粒内亜鉛の役割を検討したところ、顆粒内に蓄積されているカルボキシルペプチダーゼCPA3の活性化が減少していることを見出した。さらに、ZnT2-KOマウスにおいては腹膜炎誘導における致死率が増化することも観察している。これらの結果はCPA3の活性化変異体導入マウスと同様の表現系を示していることから、ZnT2が顆粒内亜鉛を調節することによって、亜鉛結合蛋白のカルボキシルペプチダーゼの活性化を制御していることが示唆された。以上のことより、これまで不明であったマスト細胞顆粒亜鉛の生理学的な意義に関して、一連の解析により、明らかにできた点において、本研究提案の達成度として、評価に値できるものと考えている。申請者は亜鉛の恒常性維持とアレルギー反応との関係を調査すべく、亜鉛関連分子とアレルギー関連細胞であるマスト細胞/好塩基球を用いて、解析を開始した。
タンパク質ファミリーの系統樹集合からの頻出分岐・重複パターンの網羅的抽出と解析

木構造マイニングに用いられる手法を応用し、複数のタンパク質ファミリーの進化系統樹に共通して頻出する局所的な分岐・重複パターンの抽出法を開発した。本手法を真核生物のタンパク質セットのデータに適用し、頻出分岐パターンの網羅的抽出を行った。その結果、種の系統関係を反映する分岐パターンとその類似パターンが抽出された。また、この解析過程で発案した系統樹の木構造アライメントが機能アノテーションに応用可能であることを考案し、計算機実験により、一定の有効性を示した。本研究課題では、複数のタンパク質ファミリーの系統樹に共通して頻出する局所的な分岐・重複パターンの抽出法の開発を行い、抽出された頻出パターンの解析を行う。平成21年度は、解析に使用する大規模なタンパク質データファミリーの系統樹データ作成手順の確立と、一般的な木構造マイニングアルゴリズムを応用した頻出分岐パターンの抽出法の開発を行った。木構造マイニングの手法は、データマイニングの分野において複数のアルゴリズムが開発されているが、本研究では、より一般化された手法であるHashimotoらの手法(Hashimoto et al, 2008)をもとに、系統樹データへ適用を考慮した改変を行った。さらに、試験的に作成した系統樹データに適用した結果をもとに、実行速度や計算資源の問題も考慮して、アルゴリズムおよびパラメーターを決定し、抽出用のプログラムを作成した。また、あらかじめ予想されていたように、系統樹データからは類似したパターンや同型の分岐の繰り返しが大量に抽出されており、これらの中から生物学的に有意義な分岐・重複パターンを検出するため、得られたパターンの分類や有意性の評価の方法についての検討も行った。また、開発手法を真核生物の大規模な系統樹データに適用した結果、ゲノムシークエンスの不完全さなど人為的な理由と考えられるデータの欠損の影響がみられた。そのため、この問題への対応と一般的な分岐パターンの抽出への適用を考慮した、複数のラベルを持つ木構造マイニングの拡張手法を考案し、その開発も行った。本研究課題では、複数のタンパク質ファミリーの系統樹に共通して頻出する局所的な分岐・重複パターンの抽出法の開発を行い、抽出された頻出パターンの解析を目的とする。平成22年度は、前年度に開発した頻出分岐パターンの抽出法を用いて、真核生物のタンパク質ファミリーの系統樹の大規模データからの頻出分岐パターンの網羅的抽出と解析を行った。また、得られる分岐パターンには互いに類似するものが多数含まれており、これらの類似パターンには、データの人為的な欠損や系統樹作成法の不適合により本来の分岐パターンと僅かに異なるパターンを示しているものが多く存在していると判断された。正確な頻出パターンの解析には、これらのパターンの類似性に基づいて関連付けを行い、類似するパターンを同時に解析することが必要である。そのため、本年度はこれらを関連付けて可視化する手法を考案・利用して解析するとともに、分岐パターンの構造に基づいて類似性を求める手法の開発も行った。解析の結果、既知の種の系統関係を反映する分岐パターンとその類似パターンが頻出分岐パターンとして抽出されていた。この結果から、我々の開発手法は、複雑で専門知識を必要とする配列データの選別やアライメントの調整作業をすることなしに、大規模配列データから種の系統関係を明らかにする手法として応用可能であると考えられる。また、分岐パターンの類似性の検出については木構造アライメントアルゴリズムを応用した手法を開発した。この手法は類似パターンの関連付けだけではなく、未知のタンパク質の機能推定にも応用可能であり、計算機実験の結果、一定の有効性が示された。