hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液腺腫瘍におけるエストロゲンレセプターの役割

エストロゲンレセプター発現唾液腺癌由来細胞株は、エストロゲン処理により細胞増殖が亢進することが明らかとなった。そのため、エストロゲンレセプターの拮抗剤であるタモキシフェンにより、細胞増殖の抑制が期待される。また、耳下腺、顎下腺、舌下腺および口唇線、舌腺、口蓋腺といった小唾液腺の正常唾液腺組織および腺様嚢胞癌、粘表皮癌などの唾液腺癌組織のエストロゲンレセプター発現頻度は多くないと考えられた。唾液腺腫瘍由来培養細胞株HSG、HSY、ACCMのエストロゲンレセプター(ER)の発現についてwestern blottingにより検討を行った。その結果、いずれの細胞にもエストロゲンレセプターの発現を認めなかった。一般的に唾液腺腫瘍は培養が困難であり、ERを発現していない高悪性唾液腺腫瘍細胞が培養株化されているためと考えられた。そのため、計画していたとおり、Dr Chambonより供与されたER発現ベクターおよびコントロールベクターをリポフェクション法によりACCM細胞へ導入し、ER発現ACCM細胞およびコントロール細胞を製作した。これらの細胞を用いて、ER発現が細胞増殖に与える影響について検討をおこなった。具体的にはER発現培養細胞株およびコントロール細胞にエストロゲン(Eg)を加え、その細胞増殖に与える影響について検討をおこなった。その結果、ER発現ACCM細胞はEgの添加によりコントロール細胞の増殖が亢進することが明らかとなった。また、耳下腺、顎下腺、舌下腺および小唾液腺の正常唾液腺組織27例、および腺様嚢胞癌、粘表皮癌、唾液腺管癌といった唾液腺癌組織8例について、実際に乳癌においてホルモンレセプターの発現を調べるために臨床で応用されているDakoのシステムを用いて免疫組織学的検討を行った。その結果、正常唾液腺組織、および唾液腺癌組織ともにERの発現を認めなかった。これについては症例数を増やして、再度検討をおこなう予定である。昨年に引き続き、唾液腺組織におけるエストロゲンレセプターの発現頻度について検討をおこなった。具体的には実際に乳癌の診断に使用されているDakoのシステムを用いて、追加で唾液腺癌組織の免疫組織学的検索を行った.その結果、いずれもエストロゲンレセプターの発現組織を認めなかった。また、正常唾液腺組織並びに唾液腺癌織の初代培養についても取り組んだ。唾液腺癌は一般に増殖が遅く株化することが困難であり、確立された細胞株が少ない。エストロゲンレセプター発現唾液腺癌細胞株の確立を目的に実験を行ったが困難であった。本研究において制作したエストロゲンレセプター発現ACCM細胞株は、エストロゲン処理により細胞増殖が亢進することがわかっている。そのため、エストロゲンレセプターの拮抗剤であるタモキシフェン処理により細胞増殖の抑制ができることが期待できる。今後はこの細胞株を用いて、エストロゲン,タモキシフェンのそれぞれの唾液腺癌細胞の増殖に与える効果、cell cycle distributionの変化や、増殖関連タンパクであるP21、P27、c-mycの発現、あるいはテロメラーセ活性の変化、さらには浸潤・転移能、In vivofはおける効果などを検討する必要がある。そして、これら実験により、エストロゲン発現唾液腺癌においてはエストロケンにより悪性形質が増悪し、タモキシフェンにより悪性形質を抑制するという結果が期待できると考えている。
心臓大血管手術中ヘパリン投与下での自己濃厚血小板採取方法の確立に関する研究

ヘパリン投与下で採取された自己血小板が、ヘパリン投与前に採取されたものと採取血小板数、血小板機能ともに差がないことを示すためにブタを用いた動物実験を行った。全身麻酔したブタを用いてヘパリン投与前と後で自己血小板採取を行った。採取には成分採血装置COMPONENT COLLECTIONSYSTEM (HEMONETICS社)を用い、血小板凝集能はHEMATRACER 712 (HCM社)にて測定を行った。採取した自己濃厚血小板浮遊液中の血小板数は非ヘパリン群で153.6±67.6×10・4乗/μl、ヘパリン群で142.8±47.6×10・4乗/μlであり、有意差はなかった(p=0.69)。血小板凝集能はADP2μM凝集で非ヘパリン群32.1±9.2%、ヘパリン群で24.1±13.6%(p=0.183)と何れも有意差はなかった。これにより、ヘパリン投与が自己血小板採取に影響を与えないことが分かった。体外循環を用いた手術72例に対して、人工心肺開始早期に回路からヘモネティクス社製コンポーネントコレクションシステムL/N9000を使用して自己血小板製剤の作成を行い、プロタミン中和終了後に返血し、血小板数および血小板凝集能の変化について検討した。採血は手術開始時(A),プロタミン中和後(B),自己血小板返血後(C)の3回行った。採取した自己血小板製剤は平均233.3ml±43.5で、血小板数としては平均5.5単位(3-16)の採取がされていた。(A)から(B)で血小板数は平均11.8万/μl減少し、(B)から(C)で平均3.0万/μl増加した。血小板凝集能は(B)から(C)でADP1μM凝集では4.3±2.7ポイント、ADP3μM凝集では8.7±3.3ポイント増加した。心臓大血管手術中人工心肺回路から有効な血小板凝集能を持った自己血小板を採取することができ、それを返血することによって血小板数および血小板凝集能が改善することが確認された。人工心肺回路からの自己血小板採取は、これらの手術での出血量減少および血液製剤使用量の削減についての効果が期待できる。採取には成分採血装置COMPONENT COLLECTIONSYSTEM (HAEMONETICS社)を用い、血小板凝集能はHEMATRACER 712 (HCM社)にて測定を行った。血小板凝集能はADP2μM凝集で非ヘパリン群32.1±9.2%、ヘパリン群で24.1±13.6% (p=0.183)、コラーゲン2μ凝集で非ヘパリン群43.4±28.5%、ヘパリン群で28.8±16.4% (p=0.183)で何れも有意差はなかった。今回の結果でヘパリン投与前後で比較すると、採取した自己濃厚血小板浮遊液中の血小板数、血小板凝集能ともに差がなく、ヘパリン投与が自己血小板採取に影響を与えないことがわかった。動物実験による基礎研究研究データは概ね想定した結果が出ており、次の臨床研究に進む準備が着々と進んでいる。血小板凝集能はADP2μM凝集で非ヘパリン群32.1±9.2%、ヘパリン群で24.1±13.6%(p=0.183)、コラーゲン2μ凝集で非ヘパリン群43.4±28.5%、ヘパリン群で28.8±16.4%(p=0.183)で何れも有意差はなかった。

今回の結果でヘパリン投与前後で比較すると、採取した自己濃厚血小板浮遊液中の血小板数、血小板凝集能ともに差がなく、ヘパリン投与が自己血小板採取に影響を与えないことが分かった。体外循環を用いた手術24例に対して人工心肺開始後早期に人工心肺回路から自己血小板製剤を作成し、人工心肺離脱プロタミン中和後に返血した。平均5単位(314単位)の採取が可能であった。自己血小板製剤返血前後で血小板数は33,000増加し、血小板凝集能の改善もみられた。基礎データとなる動物実験の進行や、それを受けての臨床適応のための倫理審査などに手間取ったために臨床例での施行が遅れたが、すでに臨床例で24例の症例収集が行われ、順調に症例が蓄積されているので、平成29年度では大いに進展することは間違いない。ヘパリン投与下で採取された自己血小板が、ヘパリン投与前に採取されたものと採取血小板数、血小板機能ともに差がないことを示すためにブタを用いた動物実験を行った。全身麻酔したブタを用いてヘパリン投与前と後で自己血小板採取を行った。採取には成分採血装置COMPONENT COLLECTIONSYSTEM (HEMONETICS社)を用い、血小板凝集能はHEMATRACER 712 (HCM社)にて測定を行った。採取した自己濃厚血小板浮遊液中の血小板数は非ヘパリン群で153.6±67.6×10・4乗/μl、ヘパリン群で142.8±47.6×10・4乗/μlであり、有意差はなかった(p=0.69)。血小板凝集能はADP2μM凝集で非ヘパリン群32.1±9.2%、ヘパリン群で24.1±13.6%(p=0.183)、コラーゲン2μ凝集で非ヘパリン群43.4±28.5%、ヘパリン群で28.8±16.4%(p=0.183)で何れも有意差はなかった。体外循環を用いた手術58例に対して人工心肺開始後早期に人工心肺回路から自己血小板製剤を作成し、人工心肺離脱プロタミン中和後に返血した。平均5.5単位(316単位)の採取が可能であった。自己血小板製剤返血前後で血小板数は30,200増加し、血小板凝集能の改善もみられた。想定していたより除外対象となる重症例や抗血小板剤内服中の患者が多く、対象として研究できた症例の数が伸びなかった。血小板凝集能はADP2μM凝集で非ヘパリン群32.1±9.2%、ヘパリン群で24.1±13.6%(p=0.183)と何れも有意差はなかった。これにより、ヘパリン投与が自己血小板採取に影響を与えないことが分かった。体外循環を用いた手術72例に対して、人工心肺開始早期に回路からヘモネティクス社製コンポーネントコレクションシステムL/N9000を使用して自己血小板製剤の作成を行い、プロタミン中和終了後に返血し、血小板数および血小板凝集能の変化について検討した。採血は手術開始時(A),プロタミン中和後(B),自己血小板返血後(C)の3回行った。採取した自己血小板製剤は平均233.3ml±43.5で、血小板数としては平均5.5単位(3-16)の採取がされていた。(A)から(B)で血小板数は平均11.8万/μl減少し、(B)から(C)で平均3.0万/μl増加した。血小板凝集能は(B)から(C)でADP1μM凝集では4.3±2.7ポイント、ADP
脂質分散製剤における新規薬物消化管吸収性予測法の開発

脂質分散製剤(LBF)からの薬物吸収性予測法の開発を最終的な目的として、LBF調製法およびモデル薬物サキナビル(SQV)の消化管吸収実験を行った。実験計画書には低溶解性、低膜透過性のモデル化合物としてコエンザイムQ10を記載していたが、コエンザイムQ10はLBF中に十分溶解せず、動物実験において十分な投与量が確保できなかったため、SQVに変更した。【LBFの調製】長鎖脂肪酸で構成されたトリグリセリドを含むLBF (L-LBF)および中鎖脂肪酸で構成されたトリグリセリドを含むLBF (M-LBF)を調製しSQVを溶解させた。次にL-LBFおよびM-LBFを蒸留水に2.5または10 w/w%の濃度で分散させ、エマルションを調製した(それぞれL-LBF2.5、L-LBF10、M-LBF2.5、M-LBF10)。この時、SQV濃度は両L-LBFで0.607 mg/mL、両M-LBFで1.493 mg/mLである。【消化管吸収実験】各エマルションをラットに1mL経口投与後、経時的に採血し、血漿中SQV濃度を測定した。またSQV濃度はそれぞれのSQV投与量で補正し解析した。その結果、両L-LBF投与群の吸収性は両M-LBF投与群と比較して約1/2に低下した。これはリパーゼによるL-LBFの消化が、M-LBFよりも遅いため、SQVの消化管内の水相中濃度が低くなったためと考えられた。また、L-LBF10投与群のTmaxはL-LBF2.5投与群よりも1時間遅延した。これはL-LBF10ではSQV投与量に対するL-LBF量が多いため、消化に時間がかかったためと考えられた。従って、SQVの消化管吸収において、LBFの消化速度が大きく影響する可能性が考えられた。当初、モデル薬物としてコエンザイムQ10を使用したが、コエンザイムQ10はLBF中に十分溶解せず、動物実験において十分な投与量が確保できなかったため、SQVに変更した。その結果、当初の予想通り、LBFの消化速度が薬物吸収に影響することがin vivo吸収実験により示唆された。脂質分散製剤からの薬物吸収性を評価・予測するためには、吸収に影響を与える要因を明らかにしなければならない。これまでの検討で、LBFの消化速度がSQV吸収に大きく影響する可能性が示唆された。今後は、LBFの消化速度がSQV吸収に及ぼす影響をin vitro消化試験やin situ closed loop法などにより確認していく予定である。

モナシュ大学より、SQVおよびカラムなどの消耗品を頂いたため、次年度使用額が生じた。次年度使用額はラットおよびその他の消耗品、旅費に使用する予定である。
原因不明の間質性肺炎の発生機序解明(ヘルマンスキー・パドラック症候群をモデルとして)

1.ヒトHermansky-Pudlak症候群(HPS)マウスモテルのepマウスを飼育し、生後より3ヶ月までの肺組織像を光顕的、電顕的に観察した。光顕では生後4週より2型肺胞上皮の泡沫状腫大/変性が出現し、以後顕著になった。電顕では生後8日の組織で2型肺胞上皮の胞体内に巨大層状小体を認め、以後その大きさと数が増した(giant lamellar body degeneration;GLBD)。この変化はヒトHPS関連間質性肺炎(HPSIP)の2型肺胞上皮変化と同一であった。この新知見よりHPSIPの発生機序解明にepマウスが良いモデルとなることが示唆された。現在のところ、炎症細胞浸潤を伴う胞隔炎はみられず、更に長期の観察中である。2.間質性肺炎誘発実験としてアミオダロン400mg/kg/day、6週経口投与したepマウス肺で、肺胞中隔に単核球浸潤を伴う胞隔炎を認めた。更に長期の観察中である。3.HPS1遺伝子よりできる。1.5kb cDNAのカルボキシ末端23アミノ酸残基同一ペプチド鎖を合成してウサギポリクローナル抗体(HPS1/ep抗体)を作成した。HPS1/ep抗体及びSpritz博士より供与の抗HPSタンパク抗体(hHPS5)を用い、ヒト・マウス組織での同タンパクの局在を免疫組織化学的に調べた。同タンパク抗原は肺胞マクロファージ、腎尿細管上皮、メラノーマ細胞などの胞体に特に強い陽性を呈し、HPS1/ep抗体では2型肺胞上皮も陽性であった。HPSIP肺の2型肺胞上皮では強陽性例と陰性例のheterogeneityがみられた。epマウス肺では2型肺胞上皮胞体内の泡沫状小空胞の輪郭が強調されて染色された。HPSタンパクが2型肺胞上皮にも局在し、その機能異常がGLBDを起こしている可能性が示唆された。免疫電顕、共焦点レーザー顕微鏡により、更に同抗原の細胞内局在を検討する準備中である。1.epマウスを米国ジャクソン研究所に発注。凍結精子からマウスを起こすため、現在マウスの到着を待機中である。2.Hermansky-Pudlak症候群(HPS)に最も近縁のChediak-Higashi症候群のマウスモデルであるBeigeマウスの肺を光顕的・電顕的に観察した結果、ヒトHPS肺での2型肺胞上皮の泡沫状腫大とほぼ同一の変化を認め、電顕的にも巨大層状小体が確認された。3.アミオダロンを200mg/kg/day及び400mg/kg/dayにて4週及び8週経口投与したところ、C57BL/6Jマウスでは2型肺胞上皮の泡沫状腫大を認めたが、いずれの場合も腫大は僅かであり、投与量、投与期間期間による大きな差は認められなかった。Beigeマウスにおいては400mg/kg/day投与にて、泡沫状腫大が相加効果として認める印象を得、間質性肺炎への進展の有無を含め、現在追試中である。4.アミオダロン投与による2型肺胞上皮の形態変化を、肺胞上皮細胞癌培養細胞株(A549)を用いて検討した。

アミオダロンを培地中に5-100mg/ml添加したところ、一部の細胞では細胞質内に空胞状物質が増加したが、超微形態学的には層状小体ではなかった。現在、2型肺胞上皮としての分化形質がより明かと思われる細胞株H820を用いて検討を行っている。5.Mac Vector,Pep-Tool等のソフトを用いてペプチドのhydrophilicity、surface probability,flexibilityや、配列の特異性を検討した結果、HPSタンパク質のカルボキシ末端23アミノ酸残基が抗原部位として適していることが判明した。現在、同ペプチド鎖を合成してウサギに免疫しポリクローナル抗体を作成中である。1.ヒトHermansky-Pudlak症候群(HPS)マウスモデルのepマウスを飼育し、生後より3ヶ月までの肺組織像を光顕的、電顕的に観察した。光顕では生後4週より2型肺胞上皮の泡沫状腫大/変性が出現し、以後顕著になった。電顕では生後8日の組織で2型肺胞上皮の胞体内に巨大層状小体を認め、以後その大きさと数が増した(giant lamellar body degeneration;GLBD)。この変化はヒトHPS関連間質性肺炎(HPSIP)の2型肺胞上皮変化と同一であった。この新知見よりHPSIPの発生機序解明にepマウスが良いモデルとなることが示唆された。現在のところ、炎症細胞浸潤を伴う胞隔炎はみられず、更に長期の観察中である。2.間質性肺炎誘発実験としてアミオダロン400mg/kg/day、6週経口投与したepマウス肺で、肺胞中隔に単核球浸潤を伴う胞隔炎を認めた。更に長期の観察中である。3.HPS1遺伝子よりできる1.5kb cDNAのカルボキシ末端23アミノ酸残基同一ペプチド鎖を合成してウサギポリクローナル抗体(HPS1/ep抗体)を作成した。HPS1/ep抗体及びSpritz博士より供与の抗HPSタンパク抗体(hHPS5)を用い、ヒト・マウス組織での同タンパクの局在を免疫組織化学的に調べた。同タンパク抗原は肺胞マクロファージ、腎尿細管上皮、メラノーマ細胞などの胞体に特に強い陽性を呈し、HPS1/ep抗体では2型肺胞上皮も陽性であった。HPSIP肺、epマウス肺でも肺胞マクロファージや2型肺胞上皮細胞が強陽性となった。epマウス肺では2型肺胞上皮の胞体内の泡沫状小空胞の輪郭が強調されて染色された。HPSタンパクが2型肺胞上皮にも局在し、その機能異常がGLBDを起こしている可能性が示唆された。免疫電顕、共焦点レーザー顕微鏡により、更に同抗原の細胞内局在を検討する準備中である。
細胞の生存維持・増殖に必須なセレン含有因子の探索

セレン(Se)は必須微量元素であり,Se欠乏に伴う免疫能の低下など種々の機能障害が知られている。また,無血清培地での細胞培養には,インスリン(I),トランスフェリン(T)と共に亜セレン酸ナトリウム(S)の添加が必須であるとされている.グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)がSeを活性部位に含有する抗酸化酵素であることから,Seの添加の理由はGPxによる活性酸素除去能の保持と推測されている.しかし,これを証明した報告はない.我々はSeの細胞生存維持作用の機構を分子レベルで解明するため,まず,Seに依存した細胞生存維持を観察する系を確立した.また,Se欠乏細胞のレドックス制御系,細胞死の形態やSe含有蛋白について調べた.ITを含むRPMI1640無血清培地(IT培地)でTリンパ球腫Jurkatを培養した.細胞の生存率は36時間までは100%だが,その後急速に低下し72時間では10%以下となった.一方,ITにSeを加えたITS培地では72時間後でも100%だった.IT培地で36時間培養した細胞にSeを添加すると,添加したSe濃度に依存した増殖の回復が認められ,50nMで最大となった.IT培地で36時間培養した細胞ではITS培地の場合と比べ,より低濃度のH_2O_2添加で6時間後に細胞死が引き起こされた.このSe欠乏細胞のGPx活性はITS培地で培養した細胞の30%に低下していた.これらの結果はSe欠乏に伴う活性酸素消去能の低下を示唆している.Se欠乏細胞を電子顕微鏡で観察すると,核のクロマチンの凝縮や断片化等アポトーシスに特徴的な形態が認められた.また,^<75>Se標識細胞をSDS-PAGEで解析すると,GPx以外に十数種以上のSe含有蛋白の存在が認められた.現在,これらの細胞内分布,Se欠乏に伴う減少率を調べており,細胞生存維持に関与するSe含有蛋白を特定するべく検討中である.セレン(Se)は必須微量元素であり,Se欠乏に伴う免疫能の低下など種々の機能障害が知られている。また,無血清培地での細胞培養には,インスリン(I),トランスフェリン(T)と共に亜セレン酸ナトリウム(S)の添加が必須であるとされている.グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)がSeを活性部位に含有する抗酸化酵素であることから,Seの添加の理由はGPxによる活性酸素除去能の保持と推測されている.しかし,これを証明した報告はない.我々はSeの細胞生存維持作用の機構を分子レベルで解明するため,まず,Seに依存した細胞生存維持を観察する系を確立した.また,Se欠乏細胞のレドックス制御系,細胞死の形態やSe含有蛋白について調べた.ITを含むRPMI1640無血清培地(IT培地)でTリンパ球腫Jurkatを培養した.細胞の生存率は36時間までは100%だが,その後急速に低下し72時間では10%以下となった.一方,ITにSeを加えたITS培地では72時間後でも100%だった.IT培地で36時間培養した細胞にSeを添加すると,添加したSe濃度に依存した増殖の回復が認められ,50nMで最大となった.IT培地で36時間培養した細胞ではITS培地の場合と比べ,より低濃度のH_2O_2添加で6時間後に細胞死が引き起こされた.このSe欠乏細胞のGPx活性はITS培地で培養した細胞の30%に低下していた.これらの結果はSe欠乏に伴う活性酸素消去能の低下を示唆している.Se欠乏細胞を電子顕微鏡で観察すると,核のクロマチンの凝縮や断片化等アポトーシスに特徴的な形態が認められた.また,^<75>Se標識細胞をSDS-PAGEで解析すると,GPx以外に十数種以上のSe含有蛋白の存在が認められた.現在,これらの細胞内分布,Se欠乏に伴う減少率を調べており,細胞生存維持に関与するSe含有蛋白を特定するべく検討中である.
Dahl食塩高血圧ラット血管壁フォスフォリパ-ゼC遺伝子の発現及びその意義

血管平滑筋壁におけるフォスフォリパ-ゼC(PLC)は数々の受容体からの刺激の伝達に重要な働きをなしている。本酵素の調節機構について検討することは、平滑筋細胞の機能を理解し高血圧の発症維持の成因を究明するうえで極めて意義のあることといえる。われわれは各種高血圧モデル動物を使用し、血管平滑筋におけるPLC活性について検討したところ、高血圧自然発症ラットではPLC活性が有意に高値を示し一方、食塩高血圧のモデルであるDahl食塩感受性(S)ラット及びDOCA食塩高血圧ラットでは本酵素活性が低値を示すことを見いだした。Dahl Sラット血管平滑筋培養細胞を作成し、PLC活性及びその調節機構について検討した。Dahl Sラットの血管平滑筋培養細胞ではPLC及びフォスフォリパ-ゼA2(PLA2)活性が低下しており、プロスタグランジン産生能にも異常が観察された。一方、カルシウムイオノフォアまたはブラジキンによる最大刺激時の細胞膜からのアラキドン酸遊離には異常がみられず、カルシウムに対する感受性の低下が示唆された。また、細胞分裂時にはG1休止期早期にPLC活性が最大値をとることを明らかにした。G1休止期早期の血管平滑筋培養細胞を用いてPLCの精製を試みた。等電点クロマトフォ-カシングによる分析ではpH5.3とpH7.2に二つの最大活性を認めた。pH7.2のピ-クに関して基質特異性を検討したところ、フォスファチジルイノシト-ルに対する親和性がフォスファチジルイノシト-ルニリン酸に対するより高いことを見いだした。今後は本PLCの精製をさらに進め、活性中心のアミノ酸配列を決定し、核酸プロ-ベの作成を行う予定である。
精子運動への電磁場影響(精子の磁場配向)

非常に偏平な頭部と長い尾部からできているウシ精子を、電動水平磁場装置で発生させた最高1.7テスラの定常磁場に暴露した。精子は磁場に対して垂直方向に配向し、さらにその偏平な頭部を磁場に垂直に向けた。また、試料セルにレーザー光を導入し、透過光を検出して、いろいろな磁場強度での濁度変化を測定した。これによって求めたウシ精子の配向度は、磁場強度が上がるにつれてS字状に大きくなった。ところで、赤血球は、細胞膜の脂質二重層が持つ反磁性磁気異方性のために、その円盤面を磁場に平行に配向する。また血小板は、細胞骨格タンパク質マイクロツブルスの働きで、その円盤面を磁場に平行に配向する。これらの点から、精子は、赤血球や血小板と同じ方向に配向することが予想されたが、結果は逆であった。計算したウシ精子の異方的帯磁率は、赤血球の100倍以上になる。また、精子頭部だけの方が、体全体よりも強く配向することから、精子の磁場配向には頭部のDNAの磁気異方性が強く関与していると考察された。ウシ精子の鞭毛を無傷で採取できないので、構造の酷似したゾウリムシの繊毛を集めて磁場配向を観察したところ、長軸を磁場に平行に配向した。これは前述の考察と矛盾しない。ウシ精子は、非常に偏平な頭部と長い尾部からできている。その運動を、グルタルアルデヒド固定によって止めた。電動水平定常磁場装置にて、最高1.7テスラの定常磁場を発生させた。透過光測定実験では、試料セルにレーザー光を導入し、透過光をフォトダイオードにて検出して、いろいろな磁場強度での濁度変化を測定した。磁場内顕微鏡実験では、ビデオ撮影の静止画像から形態的観察を行い、精子の配向像を得た。精子は磁場に対して垂直方向に配向した。さらにその偏平な頭部は磁場の方向に対して垂直に配向した。また、透過光測定実験の結果、ウシ精子の配向度は磁場強度が上がるにつれてS字状に大きくなった。赤血球と比較した時、ウシ精子の磁場配向の特徴の一つは、その方向にある。赤血球は生のままの場合、細胞膜の脂質二重層と膜貫通タンパク質の反磁性磁気異方性のために、その円盤面を磁場に平行に配向する。この時、ヘモグロビンは影響しない。一方、固定した赤血球はその円盤面を磁場に垂直に向ける。これには、生体膜の内側に結合したわずかのメトヘモグロゼンの非常に強い常磁性磁気異方性が関与していると考えられる。これらの点から、精子は生の赤血球と同じ方向に配向することが予想されたが、結果は逆であった。ウシ精子の磁場配向のらう一つの特徴は異方的帯磁率の大きさ、つまりその配向の強さにある。ウシ精子は0.1Tの磁場強度ですでに影響を受け始め、1Tでほぼ100%配向する。その強さは生の赤血球の100倍以上になる。頭部のDNAにそう配向させるだけの非常に大きな磁気異方性があると考えられる。ビデオ撮影にて形態的観察を行うと、精子は磁場に対して垂直方向に配向し、さらにその偏平な頭部を磁場に垂直に向けた。また、試料セルにレーザー光を導入し、透過光をフォトダイオードにて検出して、いろいろな磁場強度での濁度変化を測定した。

また、精子頭部だけの方が、体全体よりも強く配向することから、精子の磁場配向には頭部のDNAの磁気異方性が強く関与していると考察された。非常に偏平な頭部と長い尾部からできているウシ精子を、電動水平磁場装置で発生させた最高1.7テスラの定常磁場に暴露した。精子は磁場に対して垂直方向に配向し、さらにその偏平な頭部を磁場に垂直に向けた。また、試料セルにレーザー光を導入し、透過光を検出して、いろいろな磁場強度での濁度変化を測定した。これによって求めたウシ精子の配向度は、磁場強度が上がるにつれてS字状に大きくなった。ところで、赤血球は、細胞膜の脂質二重層が持つ反磁性磁気異方性のために、その円盤面を磁場に平行に配向する。また血小板は、細胞骨格タンパク質マイクロツブルスの働きで、その円盤面を磁場に平行に配向する。これらの点から、精子は、赤血球や血小板と同じ方向に配向することが予想されたが、結果は逆であった。計算したウシ精子の異方的帯磁率は、赤血球の100倍以上になる。ウシ精子の鞭毛を無傷で採取できないので、構造の酷似したゾウリムシの繊毛を集めて磁場配向を観察したところ、長軸を磁場に平行に配向した。これは前述の考察と矛盾しない。
栄養飢餓ストレスにおける大腸菌DnaJシャペロンのアナログCbpAの分子機能

1)cbpAの欠失変異を構築し、その表現型を解析した。cbpAの単独変異は野生株同様の良好な生育を見せるが、cbpA/dnaJ二重変異株は生育可能温度領域が著しく狭く、高温感受性に加えて低温感受性を示す。さらにこの二重変異株は、セプタム形成異常に伴う細胞の伸張や、栄養源枯渇(炭素源)における生存率の低下などの表現型を示した。こうした表現型はdnaK欠失変異に特徴的に観察されるものと一致しており、CbpAとDnaJはDnaKと協調的に働くことで機能することを示唆している。2)cbpA/dnaJ二重変異株の低温感受性を抑制する多コピーサプレッサーを分離したところ、rpoD遺伝子を得た。これは二重変異の示す低温感受性が熱ショックタンパク質の過剰生産によるものであり、主要シグマ因子の増産によってそれが競争的に阻害されるためであると解釈できる。II.栄養飢餓ストレス応答機構の解明1)栄養飢餓ストレス応答の正の制御因子であるシグマ因子(シグマS)の発現制御にH-NSが負の調節因子として機能していることを見いだした。H-NSは栄養豊富な環境ではシグマSの翻訳を抑え、またシグマSタンパク質の不安定化を引き起こす。hns変異株中ではシグマSの脱抑制が起こり、細胞は対数増殖期においてもあたかも栄養飢餓状態にあるような生理状態にあることを見いだした。従ってH-NSは、利用可能な栄養環境に応答して細胞の生理的状態をスイッチする機能のキ-分子であると考えられる。2)シグマSの発現に関わる他の因子を検索し、一つの候補遺伝子を得た。
読みやすい電子書籍・電子新聞実現のための電子ペーパーの研究

従来、電子ディスプレイは文書情報を読む上では疲れやすく読みにくい現状にあり、本や新聞はやはり紙で読むのが理想的と思われている現状に対し、電子ペーパー技術により、読みやすい電子書籍や電子新聞を実現するための研究を進め、読みやすさや疲れにくさを実現するための要件を明らかにするとともに、その要件を実現するための表示方式の候補技術について表示原理レベルでの必要な知見を明らかにした。読み易い視覚表示媒体の実現をめざす電子ペーパーの研究として、望ましい表示形式を明らかにすることにより、電子ペーパーの理想像を示すことを目的とした実験的検討を進めた。現状のディスプレイ作業において文章理解度の低下をもたらし得る要因として、スクロール表示形式の常用を候補としてすでに抽出したが、次なる検討課題として、「文書1ページずつスクロールなしに一覧できれば充分読み易いのか、複数ページを同時に閲覧できるほうがより望ましいのか」という疑問を挙げた。液晶ディスプレイを用いて表示域を計4種類{(a)1/2ページ分呈示しスクロール使用、(b)1ページずつ呈示、(c)2ページずつ呈示、(d)4ページ並列呈示}設け、文章校正作業遂行における作業性比較を行なった。また一方で、媒体の違いによる作業性比較も行った。比較媒体は一般的な紙と液晶ディスプレイに加え、市販の電子ペーパーディスプレイ(Albirey)の3種類を使用(表示域は4ページで統一)した。読みやすい電子ペーパー実現に向け、望ましい表示形式を明らかにすることを目的とし、ページ間を往来参照する用途での作業性について調査した。実験の結果、異なるページ表示域での比較(作業効率・主観評価)の結果、「スクロール不要のページ全体表示」と「複数ページが同時閲覧可能」という要素は、世代に関係なく読みやすさ向上に繋がることが示唆された。また、異なる表示媒体の比較では、主観評価(見つけ易さ、好ましさ)において紙>電子ペーパー>ディスプレイの順となり、明確な嗜好の差が示され、ディスプレイは、紙・電子ペーパーに比べて、発見率の低下傾向と作業時間の短縮傾向があった。電子ペーパーは、発見率では紙とほぼ同等で、ディスプレイよりも客観・主観ともに優位であったことから、作業性の点で優れた媒体候補として期待される。I)ヒューマンインタフェース条件の研究:被験者を用いてのディスプレイ、紙媒体、電子書籍上での作業比較実験等により、特にi)視覚疲労の定量化手法としての近点距離測定手法と主観評価との対応明示、ii)電子ペーパーの低疲労性の確認とその原因明示、iii)既存ディスプレイ上作業の困難性と短期記憶能力との因果関係分析を達成した。これらは電子ペーパーにおける作業効率の向上、疲労の減少、使いやすさ向上を達成する上での設計指針明確化等に貢献する成果である。II)電子ペーパーを実現するための表示技術の研究:紙のような読みやすさを期待できる反射型候補技術1)電気泳動表示方式、2)ER流体を用いた表示方式について原理実験を進めた。III)電子教科書等への応用と活用方法の検討:1.教科書への適用検討:電子ペーパーの研究は、電子書籍、電子新聞等に利用される段階に達して初めて社会に貢献した形となる。このための検討の具体例として電子教科書として利用するための、授業での使いやすさ、復習や記憶段階への適合性を紙の本に劣らないものとするための要件について検討し、「読む」行為のパターン分類と要件の整理を行った。また基本構想について出版社との意識合わせを進めた。2.学会予稿集としての適用性の検討:厚く重い紙の予稿集に代わる電子予稿集について、国際学会での試用(2008年6月)を行い試用者60人からのアンケート結果の分析により、使用者の好意的な傾向を明らかにすると同時に要改善項目を抽出した。1.読みやすさを実現するヒューマンインタフェース条件の研究(1)短期記憶能力に着目したディスプレイと紙の作業性の定量比較:ディスプレイ画面における作業性低下の原因について、人間の短期記憶能力との関係に着目し、紙のように多数枚同時呈示形式で作業可能なことの優位性を定量評価により明らかにした。(2)ディスプレイの疲労原因の抽出:反射型/発光型の表示媒体の疲労比較について、様々な照明環境条件で実験評価を行い、反射媒体の有利となる環境条件を定量的に明らかにした。2.反射型表示技術の研究印刷に近い表示質感とコントラストが期待される反射型表示方式として、ER流体を用いた表示方式について表示実験を行い、基本表示特性を確認した。3.電子教科書等への応用と活用方法の検討(1)電子教科書の検討:ゆとりと到達度と省資源の同時達成を可能とする電子教科書のあるべき姿についてのコンセプトに立ち返っての基本検討を進めた。(2)電子新聞の検討:現在の紙面レイアウトにこだわらず現在の紙面内容を電子ペーハー上に最適展開する考え方に基づき新聞の電子化について検討し、電子ペーパーに求められる性能・機能の整理を進めた。(3)予稿集への適用検討:紙版では重く、CD等を用いた電子版では会場で読みにくい学会予稿集に電子ペーパー用いることによるコンパクトで読みやすく省資源型の予稿実現をめざし、2010年11月実施予定の実証実験の準備を進めた。
サイトカインのシグナル制御と免疫制御の分子機構

サイトカインはマクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞やT細胞などの獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインシグナルを制御するSOCSファミリーとSpred/Sproutyファミリーを中心に主に遺伝子改変マウスを用いて個体レベルでの解析を行って来た。その結果SOCS1やSOCS3は転写因子STATを制御することで、ヘルパーT細胞(Th17やTreg)の分化を調節することを見いだした。またSpred1が神経芽細胞腫の原因遺伝子であることなどを明らかにした。さらに新規のシグナル制御機構としてcAMPによるTLRシグナルの抑制にc-fosが関与することを見いだした。またSmad2/3がTGFβによる免疫抑制に必須であることも見いだした。サイトカインは免疫応答のみならず造血、炎症、癌など広範な疾患とも関連が深い。サイトカインはネットワークをつくり特にマクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞やT細胞などの獲得免疫系の細胞を制御する。これらの作用を細胞内のシグナル伝達の観点から理解し、新たな免疫調節の方法論を開発することが求められている。さらにTh17やiTregなどの新たな細胞集団も発見されこれらの発生、分化、機能制御を理解する上でも、サイトカインのシグナル制御についての理解が求められている。申請者らは世界にさきがけてサイトカインによって誘導されそのシグナルを負に制御する分子群CIS/SOCSファミリーとpred/Sproutyファミリーを発見した。本研究ではこれらの分子を各種臓器において特異的に欠失したマウス(cKOマウス)を作製し解析を行い、サイトカインシグナルの制御による免疫ホメオスターシス維持の分子機構とその破綻による免疫関連疾患の発症機構を解明することを目的とする。また未解明の免疫制御機構、例えばcAMPやTGFβによる免疫抑制の分子機構を解明し、炎症性疾患や自己免疫疾患との関係を明らかにする。SOCS-1はIFN-γをはじめとした様々なサイトカインのネガティブフィードバック分子として知られている。SOCS-1は胸腺に強く発現していることからT細胞への機能の関与が考えられるが、Th細胞の分化についての詳細な解析はまだ十分でない。この疑問点を解消するため、われわれはT細胞特異的にSOCS-1を欠損したコンディショナルノックアウトマウス(Lck-Cre SOCS-1マウス)を作製した。既報どおりこのマウスはCD8陽性T細胞が胸腺細胞において増加していたが、われわれの検討ではさらに2-3ヵ月後より自己免疫疾患様の皮膚炎に加え、遅延型過敏反応に代表されるTh1型の炎症性変化の増強、また驚いたことに実験性自己免疫性脳脊髄炎における症状の著明な減弱といったCD4陽性T細胞に起因すると考えられる変化を野生型マウスに比較して認めた。このメカニズムを解明するために抑制性T細胞とTh17細胞の解析を行なった。抑制性T細胞の機能はSOCS-1欠損CD4陽性T細胞において正常に保たれており、抑制性T細胞の主要な転写因子であるFoxp3の発現及び誘導は野生型と比し変化は、認められなかった。一方in vitroのTh分化実験において、SOCS-1欠損T細胞はTh1細胞への分化が促進し、逆にTh17細胞への分化は著明に抑制されていた。抑制性T細胞とTh17細胞の分化には、抑制性サイトカインであるTGF-βと炎症性サイトカインであるIL-6のバランスにより生じていることが知られており、SOCS-1の欠損によりT細胞のTGF-β、もしくはIL-6に対する感受性が変化している可能性が考えられる。われわれはこれらのサイトカインの下流に存在するとされるシグナル分子について詳細に検討した。TGF-βに対するCD4陽性T細胞におけるSmad-2のリン酸化は変化を認めなかったが、TGF-βとIL-6共添加時におけるSTAT3のリン酸化がSOCS-1欠損CD4陽性T細胞において著明に減弱している一方、SOCS-3の発現が増強していた。この変化は、Th17細胞の維持・増殖に重要とされているサイトカインであるIL-23による刺激においても同様であった。以上のことより、SOCS-1のCD4陽性T細胞における欠損はTh1/17の分化において重要な役割を果たしており、STAT3の活性化の変化がその原因のひとつであることが考えられたが、さらに詳細な解析が必要である。我々はSOCS1及びSOCS3の遺伝子欠損マウスの解析を通してSOCS1とSOCS3が免疫寛容の維持にそれぞれ重要な役割を演じていることを見出している。SOCS3に関して、SOCS3がT細胞で欠損するとTGFβ産生が亢進し抑制性のTh3(Foxp3+Treg)細胞の誘導が亢進すること、SOCS3欠損

樹状細胞はFoxp3+Th3細胞を効率よく誘導しEAEモデルにおいて抗原パルスした樹状細胞が病態発症を抑制することを明らかにした。このメカニズムの一つとしてSOCS3が欠損することでSTAT3が強く活性化され、TGFβの産生が亢進することを示した。一方SOCS1のヘルパーT細胞分化への役割を明らかにするために、我々はT細胞特異的SOCS1欠損マウス(cKO)を作成、樹立した。SOCS1欠損CD4陽性T細胞は主としてThlへと分化し、Th17への分化はわずかであった。SOCSl-/-IFNγ-/-T細胞は正常にTh17に分化することから、この表現型は主としてIFN-γに依存していることが明らかとなった。SOCS1欠損T細胞ではSTAT3の活性化が減弱し、SOCS3の強い誘導が認められた。IFNγ欠損T細胞ではSOCS3の誘導は認められずSTAT3の活性化も強かった。さらにSOCS3を強制発現するT細胞ではTh17分化が抑制されEAEの発症も軽微であった。以上の結果からSTAT1により強く誘導されるSOCS3が、Th17分化が低下するメカニズムのひとつであると結論づけた。さらにSOCS1欠損T細胞ではTGFβ-Smadシグナルが障害されていた。例えばSOCS1欠損T細胞ではTGFβによるIFNγ産生の抑制効果が減弱していた。またRORγtはTGFβによって濃度依存性に誘導されるが、SOCS1欠損T細胞ではTGFβによるRORγtの誘導が障害されていた。以上の結果はSOCS1が欠損することでIFNγによるTGFβ-Smadのシグナル抑制効果が強力に現れ、SOCS1欠損T細胞においてTGFβシグナルが抑制されていることを示している。以上の結果よりSOCS1はIFNγ-STAT1経路を適切に抑制し、IL-6-STAT3経路およびTGFβ-Smad経路が正常に進行するために必要であることが明らかとなった。またIFNγ-STAT1はSOCS3の誘導を介してIL-6-STAT3経路を抑制すること、TGFβ-Smad経路の抑制には未知のメカニズムが存在することが明らかとなった。本年度は脳梗塞モデルにおけるサイトカインの役割について研究を行った。最近脳梗塞における炎症においてもT細胞が促進的な役割を果たすことが明らかにされつつある。これらの炎症性T細胞の機能を抑制することができれば、新たな神経保護療法を開発できる可能性がある。そこでまず脳梗塞に対するFTY720の治療効果を検討した。FTY720は脳梗塞内へのマクロファージの浸潤は妨げないが、T細胞の浸潤を減らし、発症4日目の脳梗塞体積を有意に縮小することが分かった。したがって脳内にT細胞が浸潤することが脳梗塞の病態の進行に重要であると考えられた。
幼児期における姿勢運動制御機構の発達に関する基礎的研究

幼児期の姿勢運動制御の発達については客観的な指標を用い検討された報告は非常に限られている。本研究では基礎的データの蓄積を目的に定型発達児における歩行、片脚立位の姿勢運動制御の発達変化を明らかにすることを目的としている。さらに発達性協調運動障害のハイリスク因子とされる早産児と定型発達児を比較することで、早産児の姿勢運動制御の発達上の問題を明確化することを目指している。平成30年度は定型発達児でのデータの収集を中心に行った。310歳の定型発達児63例、早産児3例(いずれも予備実験含む)を対象に3次元動作解析システムと床反力計を用い、歩行と片脚立位動作を記録、計測した。歩行安定性および片脚立位の姿勢制御に関する解析を中心に進めた。その結果、定型発達児における歩行、片脚立位ともに様々な指標で発達的変化を見出すことができた。しかし、解析方法については検討中で様々な指標で解析を進めている段階である。また、成人において扁平足など足部の状況が姿勢コントロールに影響していることはすでに報告されているが、小児期(特に幼児期)の場合、足部の状態は成長過程であるが、それらに関する検討は行われていない。そこで、足部の状態として、内側縦アーチの形状を測定する機器を購入し、検討項目に追加することとした。次年度においては、データ計測を定型発達児だけでなく、早産児を対象に行い、データ解析と成果の公表を積極的に進める。予備実験後に足部の状況の測定を追加することとしたため、データ計測が十分に行えていないためである。さらに解析方法については検討中で様々な指標で解析を進めている段階であり、スケジュールが全体に遅れている状態である。目標としている姿勢運動制御の発達的変化に関する基礎的データの構築に関しては、着実にデータ測定を重ねたことで傾向を明らかにするに至っている。平成31年度は不足している早産児のデータ測定を積極的に進める。早産児では内側縦アーチの形成が遅れるケースをしばしば経験するが、それらが姿勢運動制御と関係することを明らかにすることができれば、足底板の使用や具体的な運動介入方法を検討する上で非常に重要な情報となりうる。内側縦アーチの形成過程との関連についても合わせて検討し、積極的な成果の報告を進めていく。平成30年度は予備実験から開始し、測定項目を増やすこととし、新たな機器を購入した。そのために物品費が大部分を占めた。旅費、人件費、謝金の予算分が不十分となったため、残りは次年度使用に当てることとした。
ヒストンの化学修飾を介したヌクレオソーム構造変換反応の解明

転写反応では、ヒストンのアセチル化やメチル化等様々なシグナル情報に応答してプロオーター領域周辺のヌクレオソーム構造が解離する。ヒストンのアセチル化を認識するブロモドメインと、ヌクレオソームの解離に際して働く因子との相互作用が報告されているが、ヒストン化学修飾とヌクレオソームの解離を連動させる構造的基盤は何ひとつ明らかにされていなかった。報告者は転写開始因子TFIIDのCCG1サブユニット中の繰り返しブロモドメインとヒストンシャペロンCIAとの複合体のX線結晶構造を3.3Aレベルの解像能で決定した。構造的、生化学的、生物学的解析により、繰り返しブロモドメインとCIAとの相互作用は転写活性化プロモーター領域における共局在性、ヒストン解離、そしてpolII導入にとって必要であった。更に今回の結晶構造解析では、ヒストンアセチル化とCIAを介したヒストンの解離とを連動させている特徴を見出した。転写活性化プロモーター領域における部位特異的なヒストンの解離において、CIAと繰り返しブロモドメインとの分子複合体が重要な鍵を握っていることを示している。報告者は、ヒストン化学修飾からヌクレオソーム構造変換に至るシグナル伝達の最初の構造基盤モデル(hi-MOSTモデル)を報告することに至った。(本概要には、真核細胞遺伝子発現制御の最大の課題を解明した点のみをここに記し、他の成果は4.に示した。)転写反応では、ヒストンのアセチル化やメチル化等様々なシグナル情報に応答してプロオーター領域周辺のヌクレオソーム構造が解離する。)本研究は、ピストンの化学修飾を介してヌクレオソーム構造変換反応が引き起こされるメカニズムを明らかにすることを目的とした。研究代表者が単離しその生化学的機能を明らかにした、進化的に高度に保存されたヒストンシャペロンCIA (CCGI-interacting factor A)が、ヒストン(H3-H4)2四量体に働きかけ、2分子のH3-H4二量体に分割する活性を有することを機能生物学的、構造生物学的観点から世界に先駆けて示すことに成功した(Nature,2007)。生体シグナルの一つの終着点であるヒストン化学修飾により、ヌクレオソーム構造変換反応が部位特異的にどのように引き起こされるのか、という課題にも迫った。CIAがTFIIDのサブユニットの一つであるCCGI(CellCycleGenel)中のアセチル化ヒストン認識ドメインであるプロモドメイン(以下、CCGIDBD(double bromodomains)と表記)と相互作用することは既に見出しており(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002)、この相互作用の構造基盤を解析することにより、ヒストンアセチル化とCIAによるヌクレオソーム構造変換反応の連関性を解明することを試みた。その結果、CIA-CCGIDBDの複合体結晶構造解析に成功し、その生化学的、遺伝学的解析を通して、CIAがCCGIDBDを介してアセチル化ヒストンを含むヌクレオソームに特異的にリクルートされ、その後、CIAがヒストンに受け渡されることによりヌクレオソームの破壊が進行するという分子機構モデルを提唱した(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010)。更に、ヒストンのN末テイルへの化学修飾に効果をもたらすC末コア領域をヒストン点変異体ライブラリーを用いて解析を行い、ヌクレオソームコア領域のある領域がヒストンH3/K36のメチル化制御に関与することを示した(投稿中)。以上の構造解析以外にヒストンシャペロンCIAの複製時における機能解析を行い、伸長段階に作用する知見を得た(投稿中)、更にCIA以外のヒストンシャペロンFACTについても機能解析を行い、複製時の伸長過程における反応速度を制御するといった知見を得た(投稿中)。本研究は、ヒストンの化学修飾を介してヌクレオソーム構造変換反応が引き起こされるメカニズムを明らかにすることを目的とした。生体シグナルの一つの終着点であるヒストン化学修飾により、ヌクレオソーム構造変換反応が部位特異的にどのように引き起こされるのか、という課題に迫った。

CIAがTFIIDのサブユニットの一つであるCCG1(Cell Cycle Gene1)中のアセチル化ヒストン認識ドメインであるプロモドメイン(以下、CCGIDBD(double bromodomains)と表記)と相互作用することは既に見出しており(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002)、この相互作用の構造基盤を解析することにより、ヒストンアセチル化とCIAによるヌクレオソーム構造変換反応の連関性を解明することを試みた。CIA-CCGIDBDの複合体結晶構造解析に成功し、その生化学的、遺伝学的解析を通して、CIAがCCGIDBDを介してアセチル化ヒストンを含むヌクレオソームに特異的にリクルートされ、その後、CIAがヒストンに受け渡されることによりヌクレオソームの破壊が進行するという分子機構モデルを提唱した(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010)。更に、ヒストンのN末テイルへの化学修飾に効果をもたらすC末コア領域をヒストン点変異体ライブラリーを用いて解析を行い、ヌクレオソームコア領域のある領域がヒストンH3/K36のメチル化制御に関与することを示した(Genes Cells,2010)。以上の構造解析以外にヒストンシャペロンCIAの複製時における機能解析を行い、伸長段階に作用する知見を得た(GenesCells,2010)、更にCIA以外のヒストンシャペロンFACTについても機能解析を行い、複製時の伸長過程における反応速度を制御するといった知見を得た(J.Biol.Chem,2011)。ヌクレオソーム構造変換レベルだけでなく、染色体レベルでの構造変換機構を解析する第一歩として染色体分配機構の解析を行なった(EMBOJ.,2011)。ヌクレオソーム構造変換反応機構の解析については、ヒストン(H3-H4)2四量体から2個のH3-H4二量体への変換(Nature, 446, 338-341, 2007)及びヒストン化学修飾からヌクレオソーム構造変換への反応機構(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107, 8153-8158, 2010)に関する重要な知見を、構造解析、生化学的及び遺伝学的解析を通して、世界に先駆けて得た。次の課題のひとつとして、以下の疑問の解明に着手した。ヒストンの化学修飾とヌクレオソーム構造変換反応の関係は、ヒストン化学修飾が起こるテイル領域と、ヌクレオソーム構造変換反応が起こるコア領域の機能関係に依存していると考えられる。そこでヒストンのテイル領域の化学修飾に効果をもたらすコア領域内の特定領域を決定することを試みた。まず、様々な核内反応の伸長反応に重要なヒストンH3-K36への化学修飾に効果をもたらすコア領域を決定することに成功した(Genes Cells, 17, 65-81, 2012)。この領域はすでに決められているヒストンH3-K4の化学修飾に効果をもたらす領域とは異なることが示され、テイル領域への化学修飾とそれに対して効果をもたらすコア領域との関係に、特異性が存在することを初めて示すことになった。更に、CIA以外のヒストンシャペロンFACTについても機能解析を行い、複製時の伸長過程における反応速度を制御するといった知見を得た(J.Biol.Chem., 286, 30504-30512, 2011)。
加齢造血幹細胞におけるメタロチオネイン遺伝子の機能解明

加齢造血幹細胞(Aged HSC)特異的に高発現している遺伝子としてMt1, Mt2を同定し、これらの遺伝子が加齢に伴う造血幹細胞の機能変化にどのような役割を担っているのかを調べている。第1に、Mt1/Mt2ダブルノックアウトマウス(Mt1/Mt2 DKO)をC57BL6Jマウス(コントロール)と共に1年間飼育し、4ヶ月毎に末梢血液のフローサイトメトリー解析を実施した。末梢血細胞では変化が見られず、1年齢の骨髄細胞についても有意な差は見られなかった。第2に、Mt1/Mt2 DKOマウスを用いて競合移植と二次移植を3度実施したが、コントロールと比較して有意な差が見られなかった。第3に、Mt1,Mt2を発現誘導するレンチウイルスを感染させた造血幹細胞を、致死量放射線照射したマウスに3度移植し解析を行なったが、有意な結果は得られなかった。今までのところMt1, Mt2の造血幹細胞機能への影響は認められていない。Aged HSC特異的に高発現している遺伝子としてMt1, Mt2以外にも候補があり、これら候補遺伝子の機能解析を進めている。Aged HSC特異的な遺伝子に着目して第1から第3の実験を実施したが、Mt1, Mt2の造血幹細胞機能への影響を認める結果を得ることができなかった。しかし、このような自体を想定して同時並行でMt1, Mt2以外にAged HSC特異的に高発現している候補遺伝子の機能解析を進めている。そのため、Aged HSC特異的な遺伝子が加齢に伴う造血幹細胞の機能変化に与える影響を調べるという目的を果たすための実験は継続できている。また第4の実験として、造血幹細胞に影響を与える骨髄ニッチ環境に着目した実験を新たに開始している。今年度実施した解析において、Aged HSCの遺伝子発現の変化は、加齢に伴うニッチの形質変化に起因する可能性を示す重要な結果を得ている。この結果を起点に、Mt1, Mt2を含むAged HSC特異的な発現を呈する候補遺伝子が、Aged HSCと骨髄ニッチ環境へ与える影響を解析することが期待できる。平成30年度で実施した解析において、若齢骨髄ニッチに生着したAged HSCの遺伝子発現プロファイルが、Aged HSCよりも若齢造血幹細胞の遺伝子発現プロファイルへ回復したという結果を得た。このような遺伝子プロファイル変化の原因として、Aged HSC特異的な遺伝子のDNAメチル化による遺伝子発現抑制が疑われた。そこで、Reduced Representation Bisulfite SequencingによるDNAメチル化解析を実施することを予定している。また、中間齢マウスとDNAメチル化阻害剤を用いて、実際にDNAメチル化がAged HSC特異的な遺伝子の骨髄ニッチ環境変化に伴う遺伝子発現変動に関与しているかを検討する。それに加えて、無処置移植されたAged HSCがレシピエントの骨髄組織のどこに分布しているのか調べるために、GFPやクサビラオレンジで蛍光標識されたAged HSCを無処置移植して解析を行うことを計画している。これらの実験と今までの解析結果をまとめた上で、平成31年度中の論文投稿を予定している。

平成30年度で実施した解析において、若齢骨髄ニッチに生着したAged HSCの遺伝子発現プロファイルが、Aged HSCよりも若齢造血幹細胞の遺伝子発現プロファイルへ回復したという結果を得た。このような遺伝子プロファイル変化の原因として、Aged HSC特異的な遺伝子のDNAメチル化による遺伝子発現抑制が疑われた。そこで、Reduced Representation Bisulfite SequencingによるDNAメチル化解析を実施することを予定している。また、中間齢マウスとDNAメチル化阻害剤を用いて、実際にDNAメチル化がAged HSC特異的な遺伝子の骨髄ニッチ環境変化に伴う遺伝子発現変動に関与しているかを検討する。それに加えて、無処置移植されたAged HSCがレシピエントの骨髄組織のどこに分布しているのか調べるために、GFPやクサビラオレンジで蛍光標識されたAged HSCを無処置移植して解析を行うことを計画している。これらの実験と今までの解析結果をまとめた上で、平成31年度中の論文投稿を予定している。