hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新型エンテロトキシン産生ブドウ球菌の疫学への分子生物学的手法の応用

近年、相次いで新型ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)H型、G型、I型の存在が報告された。これら新型SEの診断方法の確立とその生物活性の解明を目的とし、以下の研究を行った。1.新型エンテロトキシン(SE)の大腸菌発現系確立と抗SE血清の作成SEH, SEG, SEI遺伝子を発現ベクターpGEX-6P-1にクローニング、大腸菌に導入して大量発現系を確立した。この系を用いて精製組換え型SEG、SEHおよびSEIを調製し、これを抗原としてウサギに免疫し、特異抗血清を作製した。これらの抗血清を用いてSandwich ELISAによるSEG, SEHおよびSEI検出法、定量法を確立した。2.PCR法による毒素遺伝子検出法の確立4.Suncus murinusにおけるSEA-SEIの嘔吐活性の検討大腸菌発現系を用いて調整したSEA-SEIの嘔吐活性を、トガリネズミ(Suncus murinus)を用いて検討し、全ての毒素が嘔吐活性を持つことを示した(Infection and Immunityに発表)。5.新型エンテロトキシン遺伝子の検索SEA-SEI遺伝子を持たない食中毒由来株の遺伝子解析を行い、SEGに相同性を有する新型エンテロトキシン遺伝子を同定し、SERと命名した。SERを大腸菌で発現し、これを抗原として特異抗血清を作成し、Western blotを行うことにより実際にSERが産生されていることを証明した。さらに、SER遺伝子は少なくとも2種類のプラスミド上に、存在することを明らかにした(論文投稿中)。1990年代の半ばより、新型ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)H型、G型およびI型が相次いで報告された。本研究では、これら新型SE産生ブドウ球菌を分子疫学的に解析する方法を開発し、新型SEの食中毒への関与を評価するとともに、新型SE蛋白を遺伝子工学的に大量調整し、これらの生物学的性状を明らかにすることを目的とする。1.新型エンテロトキシン(SE)産生ブドウ球菌の分子疫学ならびに血清疫学的研究当教室で精製した組換え型SEG、SEHおよびSEIに対する抗毒素血清を用い、標識抗体を作成してSEG,SEH,SEI毒素を検出するSandwich ELISAを確立した。さらに、multiplex PCRによるseg,seh,sei遺伝子の検出系を確立した。これらの診断法を用い、新型SE遺伝子保有ブドウ球菌の自然界における分布、ならびにこれらの株の毒素産生能を評価するために、食中毒、健康ヒト、牛乳房炎および正常牛乳等から黄色ブドウ球菌を分離し、これらの菌株について新型SE遺伝子の保有状況、ならびに新型遺伝子陽性株についてはその毒素産生性について、調査を進めている。B.新型エンテロトキシンの生物学的性状に関する研究組換え型SEG,SEHおよびSEIを大腸菌発現系により大量調整した。さらに、SEASEEについても標準菌株より毒素遺伝子をクローニングし、これらについても大腸菌発現系により大量調整を可能にした。これら組換え型SEを用い、実験動物スンクスを用いてこれらの毒素の嘔吐活性を評価した結果、毒素型によって差は見られるものの、SEASEI全ての毒素がスンクスに対して催吐活性を示した。新型SEでは、SEIがもっともスンクスに対する催吐活性が強いことが認められた。次年度は、引き続き新型SE産生ブドウ球菌の疫学的調査を進めるとともに、新型SEの生物活性についても、スーパー抗原活性の評価も含めて進めていく予定である。近年、相次いで新型ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)H型、G型、1型の存在が報告された。これら新型SEの診断方法の確立を目的とし、以下の研究を行った。A.新型エンテロトキシン(SE)の大腸菌発現系確立と抗SE血清の作成SEH,SEG,SEI遺伝子を発現ベクターpGEX-6P-1にクローニング、大腸菌に導入して大量発現系を確立した。

これらの抗血清を用いてSandwich ELISAによるSEG, SEHおよびSEI検出法、定量法を確立した。上記のPCRとSandwlch ELISAを用い、食中毒由来、健康ヒト由来、ウシ乳房炎由来およびウシ生乳由来S. aureusのSE遺伝子保有状況とSEG, H, Iの産生性を検討し、SEH遺伝子保有菌株はSEHを産生するが、SEG, SEI遺伝子保有菌株ではSEG, SEI産生能が低いことを明らかにした。大腸菌発現系を用いて調整したSEA-SEIの嘔吐活性を、トガリネズミ(Suncus murinus)を用いて検討し、全ての毒素が嘔吐活性を不すことを明らかにした。E.新型エンテロトキシン遺伝子の検索SEA-SEI遺伝子を持たない食中毒由来株の遺伝子解析を行い、SEGに相同性を有する新型エンテロトキシン遺伝子を同定し、SEPと命名した。SEPを大腸菌で発現し、これを抗原として特異抗血清を作成し、Western blotを行うことにより実際にSEPが産生されていることを証明した。
応力状態を制御するインテリジェント複合平板の最適設計に関する基礎的研究

本研究では,耐熱性構造材料層の上に複数の圧電セラミックス層が接着された多層複合平板を対象に,アクチュエータ層に同心円状に電極が配置されたモデルを考え,底面に媒質加熱分布が作用したとき,各電極に電位差を印加して構造材料層の熱変位分布又は最大熱応力を適応的に制御する手法と,機能が最大限に発現されるように多層複合平板を最適設計する手法の確立を目的に理論解析と数値シミュレーションを行った.1.構造材料層における熱変位分布の制御に関する研究初めに,アクチュエータ層の応力制約条件の下に,各電極の印加電位差を決定することによって,熱変位分布の直接制御法を確立した.また,最大印加電位差が最小になるように多層複合平板を最適設計する手法も確立した.次に,センサ層とアクチュエータ層を有する多層複合平板において,センサ層の出力電位差分布から未知の媒質加熱分布を決定し,直接制御法を組合せることによって,熱変位分布の適応的制御法を確立した.2.構造材料層における最大熱応力の制御に関する研究熱変位分布の制御に関する研究成果を応用して,初めに,アクチュエータ層の応力制約条件の下に,各電極の印加電位差を決定することによって,構造材料層における最大熱応力の直接制御法を確立した.また,最大熱応力の抑制率が最高になるように,電極と多層複合平板を最適設計する手法も確立した.次に,センサ層とアクチュエータ層を有する多層複合平板において,センサ層の出力電位差分布から未知の媒質加熱分布を決定し,直接制御法を組合せることによって,構造材料層における最大熱応力の適応的制御法を確立した.以上の研究成果により,応力状態を制御するインテリジェント複合平板の最適設計法が確立できた.本研究では,耐熱性構造材料層の上に複数の圧電セラミックス層が接着された多層複合平板を対象に,アクチュエータ層に同心円状に電極が配置されたモデルを考え,底面に媒質加熱分布が作用したとき,各電極に電位差を印加して構造材料層の熱変位分布又は最大熱応力を適応的に制御する手法と,機能が最大限に発現されるように多層複合平板を最適設計する手法の確立を目的に理論解析と数値シミュレーションを行った.1.構造材料層における熱変位分布の制御に関する研究初めに,アクチュエータ層の応力制約条件の下に,各電極の印加電位差を決定することによって,熱変位分布の直接制御法を確立した.また,最大印加電位差が最小になるように多層複合平板を最適設計する手法も確立した.次に,センサ層とアクチュエータ層を有する多層複合平板において,センサ層の出力電位差分布から未知の媒質加熱分布を決定し,直接制御法を組合せることによって,熱変位分布の適応的制御法を確立した.2.構造材料層における最大熱応力の制御に関する研究熱変位分布の制御に関する研究成果を応用して,初めに,アクチュエータ層の応力制約条件の下に,各電極の印加電位差を決定することによって,構造材料層における最大熱応力の直接制御法を確立した.また,最大熱応力の抑制率が最高になるように,電極と多層複合平板を最適設計する手法も確立した.次に,センサ層とアクチュエータ層を有する多層複合平板において,センサ層の出力電位差分布から未知の媒質加熱分布を決定し,直接制御法を組合せることによって,構造材料層における最大熱応力の適応的制御法を確立した.以上の研究成果により,応力状態を制御するインテリジェント複合平板の最適設計法が確立できた.平成15年度は,応力状態を制御するインテリジェント複合平板についての研究を行うための準備として,応力制御問題よりも解析が容易な変位制御問題について次の研究を行った.1.耐熱性構造材料層に圧電セラミックス層が接着された二層複合平板を対象に,構造材料層に既知の媒質加熱分布が作用した場合,圧電セラミックス層の表面に同心円状に配置された円環状電極にステップ電位を印可することによって,構造材料層の熱弾性変位を要望された分布状態に制御する逆問題を解析した.次に,構造材料層の表面が初期の平面状態に保たれる場合について数値シミュレーションを行い,各電極に印加すべきステップ電位を最適化によって決定した.その結果,電極が5個の場合,熱弾性変位の最大値は約0.2%まで抑制された.2.耐熱性構造材料層の上にセンサ用とアクチュエータ用の圧電セラミックス層が接着された三層複合平板において,アクチュエータ用圧電セラミックス層の表面に印可用電極が上記1の場合と同様に配置されたとき,構造材料層の熱弾性変位を適応的に制御するインテリジェント問題を解析し,数値シミュレーションを行った.初めに,構造材料層に作用した未知の媒質加熱分布を,センサ用圧電セラミックス層に誘起された電位分布から決定した.次に,構造材料層の表面を初期の平面状態に保つために,アクチュエータ用圧電セラミックス層の各電極に印加すべきステップ電位を,応力制約条件の下に,最適化によって決定した.さらに,電位を印可した後の弾性変位と応力の分布を計算し,設定されたインテリジェント機能が発現されていることを検証した.以上の研究によって,熱弾性変位分布を適応的に制御するインテリジェント構造物における現実的な電位の印可方法が確立された.

平成16年度は,横等方性耐熱構造材料層に圧電セラミックス層が接着された複合円板において,圧電セラミックス層に数個のリング形電極が同心円状に配置されたモデルを対象に,構造材料層に媒質加熱分布が作用した場合を想定し,次の熱変位と熱応力制御問題に関する研究を行った.1.変位制御問題平成15年度に行った定常熱変位制御問題に関する研究で得られた成果を基に,実用化を踏まえ,圧電セラミックスが1層の場合について非定常熱変位制御問題の研究を行った.その結果,構造材料層の非定常熱変位を要望された分布状態に制御するために各電極に印可すべき非定常ステップ電位を最適化によって決定する手法が確立された.また,構造材料層の熱変位を制御するために圧電セラミックスに印可する電位の低減を図るために,圧電セラミックスを多層化した場合について,最大ステップ印可電位が最小になるように各圧電セラミックス層の厚さを応力制約条件の下に決定する最適設計法が確立された.2.応力制御問題圧電セラミックスが1層の場合について,構造材料層に生じた最大引張,圧縮及びせん断熱応力をそれぞれ許容応力以下に抑制するために,各電極に印可すべきステップ電位を最適化によって決定する研究を行った.このとき,印可電位によって圧電セラミックス層の応力が許容応力より大きくなるのを防ぐために,応力制約条件を設けた.得られた数値結果より,ステップ印可電位を決定し,構造材料層の最大応力を抑制できることが示された.また,最大応力の抑制率は構造材料層と圧電セラミックス層の厚さの比に大きく依存するため,層の厚さを最適に決定する手法の確立が必要であることが分った。耐熱性構造材料層に圧電セラミックス層が接着された二層複合平板において,圧電セラミックス層の表面に数個の電極が同心円状に配置され,構造材料層の自由表面に正規分布状の軸対称熱負荷が作用した場合を想定し,圧電セラミックス層の各電極にそれぞれ異なるステップ電位を印加することによって構造材料層に生じた最大引張,圧縮及びせん断応力を抑制する研究を行った.1.電極の設計電極の数と寸法が最大応力の抑制率(応力抑制率)に及ぼす影響を調査したところ,電極が多くなるのにつれて応力抑制率は大きくなることと,中心の電極幅が応力抑制率に及ぼす影響が最も大きいことが分かり,最適な電極数と中心の電極幅を明らかにすることができた.これらの数値結果に基づき,応力抑制率を評価して,全ての電極の最適寸法を決定するための近似最適設計手法を開発した.2.応力制約条件圧電セラミックス層の許容応力として応力制約条件を設け,制約条件の設定値が応力抑制率に及ぼす影響を調査したところ,ある条件において,応力制約条件を設けない場合の応力抑制率は17.1%であったのに対し,応力制約条件が厳しくなるのにつれて応力抑制率は4.0%まで低下した.従って,応力制約条件は応力抑制率の目標値と圧電セラミックス層の安全率を基に決定する必要があることが分った.3.三層複合平板圧電セラミックスが2層の場合について,応力制約条件を設けて数値シミュレーションを実行し,圧電セラミックスが1層の場合の数値結果と比較したところ,最大印加電位は71.2%に低減され,応力抑制率は2.5%大きくなった.ただし,圧電セラミックス層の厚さによっては,圧電セラミックスが1層の方が応力抑制率は大きい場合があり,今後,多層複合平板の最適設計を行う必要があることが分った.本年度は,1つの耐熱性構造材料層の上に複数の圧電セラミックス層が接着された多層複合平板において,アクチュエータ用圧電セラミックス層の表面に数個の電極が同心円状に配置された場合を対象に,昨年度までに行った熱応力の直接制御に関する研究で導かれた理論解,その理論解を基に確立された熱応力の直接制御法及び最適設計法を適応的応力制御問題に拡張した.
弾性表面波を用いた新成膜技術による金属人工格子ヘテロ界面のナノ構造制御

本研究の目的は、基板の弾性表面波励振により、成膜される金属薄膜の微細構造を制御する技術を、巨大磁気抵抗(GMR)効果を示す金属人工格子薄膜の作製に応用し、界面での異種金属原子同士の混合状態を最適に制御した金属人工格子薄膜を作製し、高感度磁気センサー等の実用素子の開発を行うことにある。本研究では先ず、金属人工格子薄膜の作製に必要不可欠な、薄膜初期成長過程のモニター手法の開発を目指した。その結果、弾性表面波を伝搬させた圧電体基板上に金属薄膜を成膜した場合に、極薄膜領域で観測される、圧電体基板の表面電界と薄膜中の電荷担体との相互作用に起因する弾性表面波の強い減衰が、薄膜の微細構造の変化に直接的に関与しており、この減衰が極大を示す膜厚が、薄膜の構造が、不連続な島状の構造から、連続状に変化する膜厚に相当する事を見出した。また、この手法を用いて、AgおよびCu薄膜の初期成長過程におよぼす極薄金属シ-ド層の効果を調べた結果、シ-ド層の島状の膜構造が、続いて成膜される金属膜の初期成長過程における膜成長の核となって、金属膜をより薄い膜厚で連続化させ、二次元性の高い極薄膜を形成するのに有効である事を明らかにした。さらに、連続化前の極薄領域で、AgおよびCuのような低融点薄膜の成膜を中断すると、島の凝集といった薄膜の微細構造の変化が見られ、弾性表面波による励振によりこの変化が強調される事を明らかとした。以上の知見を基に、弾性表面波で励起された基板上に、主に弾性表面波の振幅をパラメータとして、Co/Cu金属人工格子薄膜を作製し、磁界センシング特性を評価した結果、極小さい振幅で励振した場合に、人工格子の構造が最適化され、もっとも大きな磁気抵抗変化率を示す事が明らかとなった。本研究の目的は、基板の弾性表面波励振により、成膜される金属薄膜の微細構造を制御する技術を、巨大磁気抵抗(GMR)効果を示す金属人工格子薄膜の作製に応用し、界面での異種金属原子同士の混合状態を最適に制御した金属人工格子薄膜を作製し、高感度磁気式回転センサー等の実用素子の開発を行うことにある。本年度は、金属人工格子薄膜の作製に先立って、必要不可欠である以下の要素技術の研究を重点的に行った。1.高周波数励振用基板の作製:弾性表面波の波長をより短く、制御すべきナノ構造に近づけるために、これまでのf=45MHzに加え、70MHzと100MHz励振用のすだれ状電極を設計し、ニオブ酸リチウム単結晶基板上に形成した。f,3f,5fの周波数を利用して最大500MHzの励振・計測システムを構築した。2.単層薄膜微細構造に与える弾性表面波の影響の解明:上記で作製した励振基板に、種々の単一金属を真空蒸着法により成膜し、弾性表面波の及ぼす影響について検討した結果、Au,Ag,Al,Cu等の融点の低い金属では、弾性表面波の振幅増大あるいは周波数の増加にともなって、結晶粒径が増大し、表面性状の凹凸が大きくなるのに対して、Mn,Fe,Co,Ni等の融点の高い金属では振幅および周波数依存性がほとんど見られないことが判明し、弾性表面波による基板励振が金属薄膜に及ぼす効果は、基板温度を上昇させた場合と類似の効果を持つことが明らかとなった。

また、成膜中の表面弾性波の通過特性の測定と、薄膜の初期成長過程(膜厚100Å以下)における各段階の薄膜の磁気特性の測定・解析との対応関係から、弾性表面波の通過特性が極小値をとる膜厚が、薄膜の微細構造が島状から連続状に変化する膜厚に対応することが明かとなり、さらに、島状の強磁性薄膜に50Å程度の非磁性膜を積層した二層膜においてもGMR効果が観測されることを明らかにした。本研究の目的は、基板の弾性表面波励振により、成膜される金属薄膜の微細構造を制御する技術を、巨大磁気抵抗(GMR)効果を示す金属人工格子薄膜の作製に応用し、界面での異種金属原子同士の混合状態を最適に制御した金属人工格子薄膜を作製し、高感度磁気センサー等の実用素子の開発を行うことにある。本研究では先ず、金属人工格子薄膜の作製に必要不可欠な、薄膜初期成長過程のモニター手法の開発を目指した。その結果、弾性表面波を伝搬させた圧電体基板上に金属薄膜を成膜した場合に、極薄膜領域で観測される、圧電体基板の表面電界と薄膜中の電荷担体との相互作用に起因する弾性表面波の強い減衰が、薄膜の微細構造の変化に直接的に関与しており、この減衰が極大を示す膜厚が、薄膜の構造が、不連続な島状の構造から、連続状に変化する膜厚に相当する事を見出した。また、この手法を用いて、AgおよびCu薄膜の初期成長過程におよぼす極薄金属シ-ド層の効果を調べた結果、シ-ド層の島状の膜構造が、続いて成膜される金属膜の初期成長過程における膜成長の核となって、金属膜をより薄い膜厚で連続化させ、二次元性の高い極薄膜を形成するのに有効である事を明らかにした。さらに、連続化前の極薄領域で、AgおよびCuのような低融点金属薄膜の成膜を中断すると、島の凝集といった薄膜の微細構造の変化が見られ、弾性表面波による励振によりこの変化が強調される事を明らかとした。以上の知見を基に、弾性表面波で励起された基板上に、主に弾性表面波の振幅をパラメータとして、Co/Cu金属人工格子薄膜を作製し、磁界センシング特性を評価した結果、極小さい振幅で励振した場合に、人工格子の構造が最適化され、もっとも大きな磁気抵抗変化率を示す事が明らかとなった。
子宮筋腫細胞の増殖能とアポトーシスの調節機構に関する分子生物学的研究

1.性ステロイドによる子宮筋腫発育を増殖能より検討した。正常子宮筋に比して子宮筋腫細胞でPCNA陽性細胞比率は有意に高く、子宮筋腫細胞では増殖期に比して分泌期でPCNA陽性細胞比率は有意に高かった。また、正常子宮筋ならびに子宮筋腫細胞培養系においてestradiolが正常子宮筋ならびに子宮筋腫細胞のPCNA発現をともに亢進したのに対して、progesteroneは子宮筋腫細胞のPCNA発現のみを亢進した。子宮筋腫細胞ではestradiolならびにprogesteroneともに増殖促進因子であることが明らかとなった。次いで、この性ステロイドによる子宮筋腫細胞増殖能促進への局所因子epidernal growthfactor(EGF)の関わりを調べた。estradiolがEGF受容体発現を増強し、progesteroneがEGF産生を増加させたことより、estradiolとprogesteroneがEGF-EGF受容体系を介して補完的、協調的に作用することにより子宮筋腫細胞の増殖能を高めることを明らかにした。2.性ステロイドによる子宮筋腫発育の基礎的メカニズムを、性ステロイドの子宮筋腫細胞アポトーシスに及ぼす影響より検討した。子宮筋腫細胞ではアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2蛋白の強い発現を認めるのに対し、正常子宮筋細胞ではその発現は極めて弱かった。性周期との関連で増殖期に比して分泌期でBcl-2蛋白発現の増強が観察された。また、子宮筋腫細胞培養系において、progesteroneがBcl-2蛋白発現を著名に高めること、estradiolがBcl-2蛋白発現を若干低下させることを明らかにした。以上より子宮筋腫細胞にはBcl-2蛋白によるアポトーシス抑制機構の存在が推察され、性ステロイドは子宮筋腫細胞におけるBcl-2蛋白発現を調節しており、特にprogesteroneが子宮筋細胞におけるBcl-2蛋白発現を高めることから、progesteroneによるBcl-2蛋白を介するアポトーシス抑制機構の子宮筋腫発育への関与の可能性が示唆された。[目的]我々はBcl-2蛋白が子宮筋腫細胞に強く発現することを報告してきた。今回Bcl-2蛋白がTNFαによるアポトーシス誘導を抑制することに着目し、子宮筋腫細胞におけるTNFαの発現態度ならびに活性酸素発生下の子宮筋腫細胞アポトーシス誘導系におけるTNFα発現を調べ、子宮筋腫細胞アポトーシスへのTNFαの関わりを検討した。[方法]手術時にインフォームドコンセントを得て、増殖期と分泌期、さらに妊娠時子宮筋腫組織を採取し、ABA法による免疫染色ならびにWestern blot法でTNFα発現を調べた。また培養子宮筋腫細胞を用い、0.5mMH_2O_2処理により活性酸素を発生させ、経時的にTripane blue染色により生細胞数を、in situ DNA3'end labeling法によりDNA断片化シグナルを、Western blot法によりTNFα発現レベルを調べた。[結果]TNFαの発現レベルは正常子宮筋細胞に比して子宮筋腫細胞で強く、分泌期に比して増殖期で増強していた。妊娠時子宮筋腫細胞でのTNFα発現は観察されなかった。培養子宮筋腫細胞においてH_2O_2処理後5時間で生細胞数の減少とともにApoptotic cellが観察され、同時にTNFα発現が増強した。[結論]TNFαの発現が子宮筋腫細胞で観察され、その発現レベルは分泌期に比して増殖期に高く、さらに妊娠時子宮筋腫細胞で観察されなかったこと、H_2O_2によるアポトーシス誘導によりTNFα産生が高まったことより、TNFα、bcl-2によるアポトーシス調節機構が子宮筋腫発育に関与している可能性が示唆された。
化学物質過敏症看護外来システムの構築に関する研究

平成18年度より運営している化学物質過敏症看護外来(相談室)を引き続き運営しながら、研究最終年度の総括作業として、過去3年間の相談室利用者に関する統計的データ(利用者数・利用目的等),患者の健康状態(化学物質過敏症スクリーニングテスト・一般健康調査・QOL調査等)に関するデータ,当看護相談室における看護職者の役割等について分析を行い、学会報告を行った。具体的には、平成20年7月に旭川市で行われた臨床環境学会において、利用者70名の看護相談室の利用目的を分析した結果を発表した。発表内容は、「患者および家族を含む関係者が、病気と治療に関する情報の獲得(46%)、日常生活を安全にするための情報の獲得(22%)、社会的理解促進行動への期待(11%)、精神的サポート(21%)を求めて看護相談室を利用した」というものであり、看護職者の役割と相談室の設置効果が明らかになった。また、10月にBanffで行われたQualitative Health Research学会では、相談室を利用した患者13名に対する看護介入の内容とその効果を、スクリーニングテストの「自覚症状得点」を使い縦断的に調査した結果を報告した。これらの患者は看護介入によって自覚症状が軽減しており、看護職者による化学物質過敏症患者への支援方法と効果が明らかになったことにより、化学物質過敏症看護外来のシステムを構築する上での基礎資料が整った。これらの総括は、平成21年3月に作成した「研究成果報告書」内に詳細を記載しており、3年間の研究参加者(患者)および各種関係施設に配布予定となっている。平成18年4月、以前から運営していた化学物質過敏症看護相談室の広報活動を強化し、化学物質過敏症の患者に対応できる相談室内の環境を整えた。また、10月には、アメリカ合衆国ダラス州テキサス市にあるEnvironmental Health Centerと化学物質過敏症の患者が暮らすコロニーを視察した。広報活動の具体策としては、CS支援センター(患者支援団体)発行の会報上で当看護相談室を紹介し、相談室の利用と研究協力を呼びかけた。また、研究室のホームページ上でも看護相談室を紹介した。さらに、神戸、神奈川、三重で行った市民を対象とした4回の講演中にも、看護相談室について触れた。その結果、今年度中の相談件数は、メール40件(患者数40名)、電話5回(患者数5名)、学内カウンセリング30回(患者数16名)の利用状況となった。看護相談室の空気環境を整えるために、HCHO濃度測定機器とTVOC濃度測定機器、空気清浄器を購入し、光触媒加工による対策も行った。現在、HCHO濃度が20ppb以下、TVOC濃度が70ppb以下を保てるようになり、化学物質過敏症の患者からも「研究室内の空気は気持ちが良い」と評価される環境となった。また、化学物質の測定機器は、相談室を訪れる患者の生活環境中の空気質を測定するのに役立っている。アメリカにあるセンターと患者コロニーの視察では、診療や治療の状況、看護師の役割等について学ぶことができた。また、化学物質過敏症治療の第一人者である医師らとも交流することができ、看護相談室を運営していく上での有意義な情報を得ることができた。平成19年4月からと平成20年3月31日まで,化学物質過敏症看護外来(看護相談室)を,研究室内の環境を用いて行った。電話やメールにより,相談者と相談め上,面談日を決めて対応した。対応時間は平均2時間/人であった。また,メールや電話での相談にも応じており,相談室を設置してからの利用人数は65名に達した。相談内容の分類としては,「症状の悪化予防と生活改善の方法についての問い合わせ」や「受診行動や受診施設に関する相談」,「精神的サポートを求める相談」,「その他」である。看護師のアドバイスにより,未受診であった人が専門病院で確定診断を受けたケースが現在までに8例あり,また,症状改善が見られた患者も多く存在している。これらの結果を,7月に行われた日本臨床環境医学会総会において,「化学物質過敏症外来の設置効果に関する検証第1報-症状とQOLの改善がみちれた事例を通して-」として報告した。また,12月の日本室内環境学会において,「化学物質過敏症患者の生活状態-看護相談室に寄せられた愁訴の調査-」として報告した。さらに,化学物質過敏症患者の住める安全な住宅を造る目的で,実際のマンジヨシ(研究者が有する化学物質濃度の高い分譲マンション)の実験的改築を自費で行い,「問題住宅のホルムアルデヒド放散源の特定と抜本的対策の効果の検証」を日本室内環境学会において報告した。また,当看護相談室において使用している看護カルテをデータベース化させ,化学物質過敏症患者を支援する医療従事者が共有できる情報システムの基盤を構築中である。

発表内容は、「患者および家族を含む関係者が、病気と治療に関する情報の獲得(46%)、日常生活を安全にするための情報の獲得(22%)、社会的理解促進行動への期待(11%)、精神的サポート(21%)を求めて看護相談室を利用した」というものであり、看護職者の役割と相談室の設置効果が明らかになった。また、10月にBanffで行われたQualitative Health Research学会では、相談室を利用した患者13名に対する看護介入の内容とその効果を、スクリーニングテストの「自覚症状得点」を使い縦断的に調査した結果を報告した。これらの患者は看護介入によって自覚症状が軽減しており、看護職者による化学物質過敏症患者への支援方法と効果が明らかになったことにより、化学物質過敏症看護外来のシステムを構築する上での基礎資料が整った。これらの総括は、平成21年3月に作成した「研究成果報告書」内に詳細を記載しており、3年間の研究参加者(患者)および各種関係施設に配布予定となっている。
知的障害者継続教育の教育課程及びニーズに関する研究

特別支援学校高等部を卒業した知的障害者の進学率は0.5%である。これは、通常の高等学校卒業生の1%に満たない。この格差を是正するためには、知的障害者に対応した高等教育機関や継続教育機関が必要である。本来は、特別支援学校高等部専攻科がこの役割をになうべきであるが、現時点で、数が限られている。一方で、「学びの作業所」と呼ばれる自立訓練(生活訓練)事業所が、その役割を担う取り組みを始めている。専攻科の教育課程は、柔軟であり、また、職業訓練に偏重することも少なく、バランスがよい。また、「学びの作業所」は、知的障害者に学生期間を保障することに留まらず、学校教育の内包する課題の解決にも寄与している。本研究は、知的障害児に対する継続教育を実施している場として、特別支援学校高等部専攻科と「学びの作業所」を主たる対象としている。このうち、特別支援学校高等部専攻科については、全校への訪問調査を実施することができた。各校での見学、資料収集、インタビュー調査を通し、専攻科の教育課程が、専攻科以前の教育との接続性に対する方針によって影響されることなどを明らかにすることができた。また、その多くが、私立特別支援学校であるため、公立特別支援学校とは明確に異なる特色があり、その点が、公立校への汎化を困難にさせている要因ということもうかがえた。「学びの作業所」については、正確な存在数の把握が困難であるが、3箇所の訪問調査、関係する研究会への参加などから、おおよその全体像を確認することができた。今後、量的調査による把握を行う計画であるが、その準備として必要な情報は収集することができている。また、継続教育の教育内容として「性教育」と「キャリア教育」に焦点を絞って検討することも目的にしていた。「性教育」については、教育課程上の位置づけが明確になっている専攻科1校と「学びの作業所」1事業所において、詳細な聞き取りが実施することができた。また、この成果と従前に得ていた研究結果を合わせて検討し、8月に中国・成都で行われたアジア性教育学術会議で、10月に札幌で行われた日本特別ニーズ教育学会において報告するができた。「キャリア教育」については、多様性があり、今年度は、体系的なまとめを行うに至っていないが、次年度の量的把握の中で、整理できるものと考えている。本研究は、知的障害者の継続教育に位置づく特別支援学校高等部専攻科と「学びの作業所」を対象としたものであった。平成25年度は、特別支援学校高等部専攻科を中心に、研究最終年度である平成26年度は、「学びの作業所」を中心に検討した。なお、「学びの作業所」とは、障害者総合支援法に基づく自立訓練(生活訓練)事業所のうち、専攻科の代替として教育的機能を担う事業所を指し、当該事業所での聞き取り調査に加え、全自立訓練(生活訓練)事業所を対象とした質問紙調査も実施した。本研究を通しての、第1の目的は両者の教育課程の共通性と差異性を明らかにすることである。青年期教育論の中で整理された「5領域構想」が、両者ともに根付いているという共通性と同時に、学校教育上のカリキュラムである専攻科と、社会福祉実践としてのプログラムである「学びの作業所」では、その柔軟性に大きな差異があることが明らかになった。第2の目的は、あらゆる形態の継続教育を通じて重視されるべき教育内容とその在り方の検討であった。キャリア教育と性教育を重点テーマとして調査を進めたが、事例検討の域を出なかった。したがって、それらが重視されるべき内容であることは確認できたものの、その在り方の検討には至らなかった。第3の目的は、継続教育そのものニーズの明確化であった。この点は、すでに理論上は明らかであったわけであるが、その実践現場での聞き取り調査やアンケート調査を通して、1820歳の期間をいかに過ごすかということが知的障害のある青年の生涯発達において重要であり、その期間を学習の場で過ごすことの価値が確認された。障害児教育研究計画の1つ目として、「継続教育の教育課程の比較」を挙げたが、特別支援学校専攻科間の比較は完了し、すでに報告準備に入っている。しかし、専攻科と「学びの作業所」の比較については、数件の質的調査を追加する必要がある。研究計画の2つ目として、「継続教育の教育内容の精査」を挙げ、そのための準備を整えることを今年度の到達目標としたが、予定通り到達することができた。

研究計画の3つ目として、「知的障害者継続教育のニーズの検討」を挙げ、量的調査を行うための準備を今年度の到達目標としたが、調査票のデザインには至らなかったものの、おおよその調査計画を立てることはできた。特別支援学校専攻科に関わる研究は、おおよそ完了しており、学会(日本特殊教育学会、日本特別ニーズ教育学会)での発表に向けて進めていきたい。今年度は、「学びの作業所」に関わる研究が主となる。510箇所程度の質的調査(訪問調査)を実施すると同時に、障害者総合支援法に基づく自立訓練(生活訓練)事業所の量的調査を実施する。物品費については、想定よりも安価なものが入手できたこと、旅費ついては、同時に複数箇所の訪問を行ったことなどによって、次年度使用額が生じた。人件費、謝金については、謝金の支払いを想定していたが、現実には支払う必要がなかったため、次年度使用額が生じた。物品費については、引き続き計画的に無駄のないように使用していく。旅費については、「学びの作業所」の訪問回数を当初予定数に若干の上乗せする。人件費、謝金については、今年度は、量的調査実施のため、アルバイトの雇用を予定しており、その人件費にあてたい。
食道癌における新規抗癌剤効果規定遺伝子の同定と抗癌剤効果予測モデルの確立

二値化に基付く新規マイクロアレイデータ解析法により、食道癌における新規抗癌剤効果規定遺伝子候補として、5-FUに対して3遺伝子(CARD8, TMUB2, and EMX2)、CDDPに対して6遺伝子orf97, CCDC90B, IFITM1, TARBP1, TTYH2, and MARK1)を抽出し得た。また、同遺伝子群を用い、予測性の高い臨床効果予測モデルの設定に至った。昨年度の研究予定であった、下記「1、候補遺伝子の強制発現クローンの樹立」については、一部の抽出遺伝子について樹立が遅れていたため、本年度にまたがり研究を遂行した。一方、「2、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価」については、予定通り、本年度に遂行した。さらに、本年度は、「3、臨床検体組織および臨床データの収集」を研究予定に追加して遂行した。研究詳細は以下の通りである。1、候補遺伝子の強制発現クローンの樹立:昨年度、強制発現クローンの樹立まで至らなかった候補遺伝子のクローニング、さらに発現ベクターへの組込みを行った。次に、作製されたコンストラクトをヒト培養食道癌細胞株に導入し、Real-time RT-PCRを用いたmRNAの発現量及びウエスタンブロット法を用いたタンパク質発現の確認を行った。2、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価:候補遺伝子を過剰発現させたヒト培養食道癌細胞株に対してMTT assayを行い、抗癌剤感受性効果規定遺伝子としての可能性を検討した。予想通りの抗癌剤感受性変化が確認された遺伝子については、候補遺伝子の発現抑制を目的としたsiRNAのヒト食道癌細胞株への導入による抗癌剤感受性変化を確認した。3、臨床検体組織および臨床データの収集:術前化学療法症例の腫瘍組織の収集(凍結保存)ならびに臨床情報の収集(上部消化管内視鏡検査、CT、PET-CT検査による効果判定)を行った。最終年度の研究予定であった、「抗癌剤効果規定遺伝子の薬剤感受性に関わる分子機構の解明」及び「抗癌剤効果予測遺伝子群を用いた臨床効果予測モデルの設定(後ろ向き試験)」に関する研究成果は以下の通りである。1、抗癌剤効果規定遺伝子の薬剤感受性に関わる分子機構の解明:抽出された候補遺伝子のうち、複数遺伝子に関し、Ingenuity Pathways Analysis(IPA)によるパスウェイ解析にて解析を行い、関連遺伝子群及び分子機構について検索を行った。抗癌剤の薬剤感受性に関わる分子機構の解明につながりうる情報、結果を得る事が出来た。現在、パスウェイ解析にて得られた情報を基に、発現レベルの異なる候補遺伝子強制発現クローンを用い、更なる分子機構の解明を進めている。2、抗癌剤効果予測遺伝子群を用いた臨床効果予測モデルの設定(後ろ向き試験) :複数の抽出遺伝子を用いた効果予測については、各候補遺伝子の発現量を説明変数、IC_<50>値の対数変換値を目的変数とした重回帰分析を行うことにより設定した。また、解析には、外れ値を考慮した頑強な重回帰分析を行うために開発された解析ソフトNLRegを用いた。具体的には、食道扁平上皮癌症例(術前5-FU/CDDP療法施行症例を対象)における化学療法施行前の生検癌組織の各候補遺伝子発現レベルを説明変数、臨床効果(化学療法施行後の腫瘍縮小率)の対数変換値を目的変数とした重回帰分析を行うことにより臨床効果予測式を作成し、さらにテストサンプルを用いて予測精度の確認作業を行った。現在、前向き臨床研究への展開を目指し、準備を進めている。1、抗癌剤効果予測遺伝子の抽出:ヒト食道扁平上皮癌細胞株20株を用いたオリゴヌクレオチドマイクロアレイによる全遺伝子発現レベルとMTTアッセイによる5-FU、CDDPに対する感受性(IC50値)について順位相関解析を行い、順位相関係数が有意(P < 0.01)であり、かつ、遺伝子の発現状態に発現と非発現を仮定した新規統計解析手法により、IC50値の変化と強い関連性が認められた遺伝子を効果予測遺伝子候補として抽出、さらに、Real-time RT-PCRによる遺伝子発現レベルにおいても回帰分析で関連性が確認された遺伝子(P < 0.05)を最終的な抗癌剤効果予測遺伝子候補として抽出した。2、候補遺伝子の強制発現クローンの樹立:抽出遺伝子のうち複数の候補遺伝子につき、クローニング、さらに発現ベクターへの組込みを行い、作製されたコンストラクトをヒト培養食道癌細胞株に導入し、Real-time RT-PCRを用いたmRNAの発現量及びウエスタンブロット法を用いたタンパク質発現の確認を行った。医歯薬学今年度の研究計画、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価は、ほぼ計画通り研究が遂行された。また、本年度は、食道癌術前化学療法症例の化学療法前検体及び臨床データ(抗癌剤の効果判定結果)の収集を進める事ができた。以上より、交付申請書に記載した研究計画の通り、おおむね順調に進展していると考える。今年度の研究計画、1、抗癌剤効果予測

遺伝子の抽出、2、候補遺伝子の強制発現クローンの樹立、3、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価、の内、前者2項目については、ほぼ予定通り計画通り研究が遂行された。一方、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価については、クローンの樹立に予想以上の時間を要したため、同評価については次年度行う予定であるが、次年度の早い時期に計画は達成される予定である。以上より、交付申請書に記載した研究計画の通り、おおむね順調に進展していると考える。1、抗癌剤効果規定遺伝子の薬剤感受性に関わる分子機構の解明:抗癌剤感受性変化を来たした候補遺伝子強制発現クローンとコントロールベクター導入クローンを用い、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリング解析を行う。さらに、抗癌剤感受性に差がある強制発現クローンが樹立できれば、このクローン間の遺伝子プロファイルも比較する。この結果をIngenuity Pathways Analysis (IPA)によるパスウェイ解析で解析し、関連遺伝子及び分子機構を明らかにする。2、抗癌剤効果予測遺伝子群を用いた臨床効果予測モデルの設定(後ろ向き試験):複数の抽出遺伝子を用いた効果予測については、各候補遺伝子の発現量を説明変数、IC50値の対数変換値を目的変数とした重回帰分析を行うことにより設定する。また、解析には、外れ値を考慮した頑強な重回帰分析を行うために開発された解析ソフトNLRegを用いる。具体的には、食道扁平上皮癌症例(術前5-FU/CDDP療法施行症例を対象)における化学療法施行前の生検癌組織の各候補遺伝子発現レベルを説明変数、臨床効果(化学療法施行後の腫瘍縮小率)の対数変換値を目的変数とした重回帰分析を行うことにより臨床効果予測式を作成し、さらにテストサンプルを用いて予測精度の確認作業を行う。1、樹立クローンを用いた抗癌剤感受性評価:各候補遺伝子を過剰発現させたヒト培養食道癌細胞株に対してMTT assayを行い、抗癌剤感受性効果規定遺伝子としての可能性を検討する。予想通りの抗癌剤感受性変化が確認されれば、候補遺伝子の発現抑制を目的としたsiRNAのヒト食道癌細胞株への導入による抗癌剤感受性変化も確認する。2、抗癌剤効果規定遺伝子の薬剤感受性に関わる分子機構の解明抗癌剤感受性変化を来たした候補遺伝子強制発現クローンとコントロールベクター導入クローンを用い、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリング解析を行う。3、抗癌剤効果予測遺伝子群を用いた臨床効果予測モデルの設定(後ろ向き試験)複数の抽出遺伝子を用いた効果予測については、各候補遺伝子の発現量を説明変数、IC50値の対数変換値を目的変数とした重回帰分析を行うことにより設定する。
アルツハイマー病脳βアミロイド沈着と脂質ラフトの神経病理学

βタンパクオリゴマーとβアミロイド沈着初期の関係を探るため、ヒト脳組織を用いて両者の2重免疫電顕で検討すると、オリゴマーの局在はβアミロイド沈着部位とあまり関係ないが、アルツハイマー病ではシナプス部に特に多く、オリゴマーがシナプスに蓄積することが、アルツハイマー病における神経機能障害の原因の一つである可能性を示した。脂質ラフトマーカーのflotillin-1とAbeta42の免疫電顕では、脂質ラフトがAbeta42の蓄積が生じる膜の部分の一部であることを示した。また、βタンパクオリゴマーとβタンパク分解酵素であるネプリライシンの関係を、ネプリライシン欠損マウスとβタンパク前駆体(APP)Tgを掛け合わせたマウスを用いて検討した。免疫電顕で観察すると、ネプリライシン欠損マウスでは、シナプスにβタンパクオリゴマーの反応が有意に多く出現した。ネプリライシン活性の低下が、シナプスのβタンパクオリゴマー蓄積による認知機能低下を引き起こす。岩下はNPC欠損に伴うβアミロイドの蓄積へのラフトの関与を調べる目的で、細胞表面ラフトの異常を解析した。NPC1欠損CHO細胞等ではコレステロールに富むラフト様膜小胞の細胞表面への蓄積と異常排出が起きるのに対して、神経細胞のNPCモデル(薬剤処理したSH-SY5Y細胞)では細胞表面ラフトが減少し、異常排出は検出されなかった。森は、アポリポ蛋白E(apoE4)アイソフォーム特異的脳損傷増悪病変の病理発生と治療の可能性に関して、S100蛋白産生阻害を介してアストロサイト(AC)活性化を抑制する薬剤(Arundic acid)による効果をapoEノックイン(KI)マウスで検討した。その結果、改善効果は4/4 KIマウスで最も優っていた。また、4/4 KIマウス特異的な遷延性脳梗塞巣拡大も抑制された。Arundic acidが、4/4 KIマウスのAC活性化/S100発現の増強と脳損傷増悪を最も強く抑制したことからAC活性化の増強が重要なことを示した。βタンパクのオリゴマーがβアミロイド沈着初期と関係があるかどうかを探るため、瀰漫性老人斑の出現しているヒト脳組織を用いてβタンパクとβタンパクオリゴマーの2重免疫染色を電顕切片上で行って検討した。その結果、オリゴマーの局在はβアミロイド沈着部位とあまり関係ないが、アルツハイマー病ではシナプス部に特に多く、オリゴマーがシナプスに蓄積することが、アルツハイマー病における神経機能障害の原因の一つである可能性を示唆する所見を得た。また、脂質ラフトマーカーであるflotillin-1とAβ42のC末端を認識する抗体を用いて免疫電顕法を行い、脂質ラフトがAβ42の蓄積が生じる膜の部分の一部であることを示した。分担研究者の岩下は、脂質ラフトのアミロイドβ蓄積への関与を解析する目的で、脂質ラフトの生化学的分離法の検討を行った。従来法で調製したラフトはコレステロール含有率の高い膜と低い膜の混合物である事を見いだした。コレステロールはアルツハイマー病の危険因子とされていることから、脂質ラフトの中でもコレステロール含有率の高いラフトサブセットがアミロイドβ蓄積に関わる可能性が高いと考え、独自のプローブを用いて培養細胞からこのサブセットを分離する方法の開発を行った。分担研究者の森は、アポリポ蛋白E(apoE4)アイソフォーム特異的脳損傷増悪

病変の病理発生と治療の可能性に関して、S100蛋白産生阻害を介してアストロサイト(AC)活性化を抑制する薬剤(Arundic acid)による効果をapoEノックイン(KI)マウスで検討した。その結果、脳虚血負荷後5日目の脳損傷の程度は全KIマウスで改善され、その効果は4/4KIマウスで最も優っていた。また、4/4KIマウス特異的な遷延性脳梗塞巣拡大も抑制された。Arundic acidが、4/4KIマウスのAC活性化/S100発現の増強と脳損傷増悪を最も強く抑制したことから、apoE4アイソフォームによる脳損傷増悪病変に、AC活性化の増強が重要な役割を果たしていることが明らかになった。βタンパクのオリゴマーがβアミロイド沈着初期と関係があるかどうかを探るため、びまん性老人斑の出現しているヒト脳組織を用いてβタンパクとβタンパクオリゴマーの2重免疫染色を電顕切片上で行う研究を継続した。また、βタンパク前駆体(APP)の切断が何処で行われるのか、ラフトとの関係はあるのかを検討した。APPがBACEで切断されてできるフラグメントのC末端特異抗体を作成し、BACE切断の分泌型APP(sAPPbeta)の局在を免疫電顕で検討した。正常ヒト脳やマウス脳を固定後、ビブラトームで薄切し、免疫染色後エポンに包埋し、超薄切片を観察した。すると、sAPPbetaの局在は、ラフトのパタンとは大きく異なり、星形グリアの小さな突起内にびまん性に分布していた。このことは神経細胞の表面でBACEが働き、切断されて放出されたsAPPbetaは、直ちに星形グリアに取りこまれるものと考えられた。分担研究者の岩下は、NPC欠損に伴うβアミロイドの蓄積へのラフトの関与を調べる目的で、細胞表面ラフトの異常を解析した。NPC1欠損CHO細胞等ではコレステロールに富むラフト様膜小胞の細胞表面への蓄積と異常排出が起きるのに対して、神経細胞のNPCモデル(薬剤処理したSH-SY5Y細胞)では細胞表面ラフトが減少し、異常排出は検出されなかった。細胞種により異なる結果が得られた事から、これらの細胞表面ラフトの異常はβアミロイド蓄積につながる変化ではないと考えられた。分担研究者の森は、研究分担者である森が研究拠点とする動物実験施設において、ApoEヒト化マウスおよびTg2576APPトランスジェニックマウスのコロニー維持を含めた飼育管理を行い、最終年度の研究遂行にも十分な安定した動物供給体制を整備した。また、S100産生阻害を介してアストロサイト活性化を抑制する薬剤(arundic acid, (R)-(-)-2-propyloctanoic acid)を用いて、ApoE4アイソフォーム特異的な脳損傷増悪病変に、アストロサイト活性化の異常亢進が関与していることを明らかにした。主たる研究者の山口は、βタンパクのオリゴマーがβアミロイド沈着初期と関係があるかどうかを探る研究を続けた。びまん性老人斑の出現しているヒト脳組織を用いてβタンパクとβタンパクオリゴマーの2重免疫染色を電顕切片上で行う研究を継続したが、びまん性老人斑の領域内と外で、オリゴマーの反応にあまり差がみられなかった。また、βタンパクオリゴマーとβタンパク分解酵素であるネプリライシンの関係を、ネプリライシン欠損マウスとβタンパク前駆体(APP)トランスジェニックマウスを掛け合わせたマウスを用いて検討した。
糖尿病性歯周炎発症の分子機構の解明と治療薬開発のための基礎研究

インスリン非依存性のII型糖尿病は高血圧、動脈硬化などの重篤な合併症の他に糖尿病性歯周炎を誘発する。本研究では、II型糖尿病モデルマウスであるレプチン受容体欠損マウス(db/dbマウス)を用いた歯周炎モデルを作製し、糖尿病性歯周炎の病態メカニズムを明らかにした。db/dbおよび野生型マウス右第一大臼歯頬側歯肉にLPSを週3回、4週間注射すると、db/dbマウスでは多数の破骨細胞による歯槽骨の吸収の亢進が認められた。レプチンは破骨細胞前駆細胞のRANKおよびc-fmsの発現を抑制することおよび骨芽細胞のRANKLの発現の上昇を抑制することで、破骨細胞形成を抑制した。II型糖尿病患者は重篤な歯周炎を発症することが多いが、未だ糖尿病性歯周炎の発症機構が解明されておらず有効な打開策がないため、通常の歯周病治療では十分な効果が得られないことが多い。そこで本研究では、糖尿病性歯周炎の病態メカニズムを明らかにするために、II型糖尿病モデルマウスであるレプチン受容体欠損マウス(db/dbマウス)を用いた歯周炎モデルを作製した。野生型およびdb/dbマウス右側第一大臼歯頬側よりLPS(20 μg/匹)を週3回4週間投与し、第一大臼歯根分岐部でμCT撮影し歯槽骨の吸収状態を評価したところ、db/dbマウスでは著明な歯槽骨吸収が認められた。さらに吸収部位には多数の破骨細胞が認められた。また各マウスの下顎骨を採取し、器官培養をおこなうと、同様にdb/dbマウス由来の下顎骨でより多くのCaイオンが溶出された。野生型およびdb/dbマウス骨髄細胞と初代骨芽細胞を共存培養し、LPSで刺激すると両細胞ともdb/dbマウス由来の時に多数の破骨細胞が誘導された。糖尿病性歯周炎では、他の歯周炎に比べ重症化・慢性化がみられ、通常の歯周病治療では十分な効果が得られないことも多い。このことから糖尿病性歯周炎にはなんらかの重症化のメカニズムの存在が考えられる。マウス骨芽細胞および骨髄細胞はレプチン受容体を発現していた。さらにマウスの骨髄細胞と頭蓋冠由来の骨芽細胞をLPS存在下で共存培養し、レプチンを添加するとレプチンの濃度依存的に破骨細胞形成が抑制された。また、レプチンはLPS刺激による骨芽細胞のOPGの発現には影響せず、RANKLの発現の上昇を抑制した。一方、レプチンはマウス骨髄細胞にも作用してM-CSFとRANKLによって誘導される破骨細胞形成を抑制した。II型糖尿病患者は重篤な歯周炎を発症することが多く、糖尿病性歯周炎では、他の歯周炎に比べ重症化・慢性化がみられ、通常の歯周病治療では十分な効果が得られないことも多い。このことから糖尿病性歯周炎には何らかの重症化のメカニズムの存在が考えられる。そこで本研究では、II型糖尿病モデルマウスであるレプチン受容体変異マウス(db/dbマウス)を用いた歯周炎モデルを作製し、歯槽骨吸収の分子機構を解析した。まず、野生型およびdb/dbマウス右側第一大臼歯頬側よりLPS(20 μg/匹)を週3回4週間投与し、第一大臼歯根分岐部でμCT撮影し歯槽骨の吸収状態を評価したところ、db/dbマウスでは著明な歯槽骨吸収が認められた。病理組織標本を用いて骨吸収の程度をTRAP染色で評価したところ、db/dbマウスでは多数の破骨細胞が認められた。また、各マウスの下顎骨を採取し、器官培養をおこなうと、同様にdb/dbマウス由来の下顎骨でより多くのCaイオンが溶出された。一方、レプチンはマウス骨髄細胞にも作用してM-CSFの受容体c-fmsとRANKの発現を抑制することによって破骨細胞形成を抑制した。レプチンは破骨細胞前駆細胞のRANKおよびc-

fmsの発現を抑制することおよび骨芽細胞のRANKLの発現の上昇を抑制することで、破骨細胞形成を抑制した。骨芽細胞に作用してLPS刺激によるRANKL発現の上昇を抑制すること、さらに破骨細胞前駆細胞に作用してRANKとM-CSF受容体c-fmsの発現を抑制することで破骨細胞形成を抑制することがわかった。以上より、今年度計画した骨芽細胞および骨髄細胞におけるレプチンの作用点を明らかにすることができた。口腔病態病理学分野レプチン補充両方は既に脂肪萎縮症の治療等に臨床応用されていることから炎症性骨吸収に対する治療薬として歯周再生療法に応用できると考えられる。現在、今回確立した歯周炎モデルを用いてレプチンによる治療実験を実施しており、この実験結果と上記結果をまとめて論文として発表する予定である。In vivoおよびex vivoの解析は予定通り進んでいる。また野生型およびdb/dbマウス由来の骨髄細胞と初代骨芽細胞の共存培養にLPSを添加すると両細胞ともdb/dbマウス由来の時に多数の破骨細胞が誘導され、さらに培地中にレプチンを添加すると破骨細胞形成が抑制されることがわかった。現在、骨髄細胞および骨芽細胞における細胞内シグナル伝達経路について検討中である。レプチン補充両方は既に脂肪萎縮症の治療等に臨床応用されていることから炎症性骨吸収に対する治療薬として歯周再生療法に応用できると考えられる。今後確立した歯周炎モデルを用いてレプチンによる治療実験を計画している。