hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
都市空間における住民組織・活動の「コミュニティ戦略」についての文化人類学的研究

ノッティング・ヒル・サマープロジェクト、ロンドン・フリー・スクールについて、(3)上記に関するドキュメンタリー調査(British Library Newspaper、およびKensington Central Libraryにて)。(2)に関して、1960年代当時の活動家9名の方に、それぞれ長時間にわたり話を聞くことができ貴重な記録となった。そこで、2つのコミュニティ活動のかたちが浮き彫りになった。1つは、近隣住区を単位として、あるは拠点をおき、住民間の対面的な関係を重視した組織、活動(ネイバーフッド・カウンシル、コミュニティ・センターなど)と、もう1つは、さまざまなメディア(プリント、テレビ、カメラ、ビデオなど)と情報のネットワークを駆使し、地域住民のニーズや関心をとりこんだイベント実施(フリー・スクール、フェスティヴァルなど)である。1960年代後半において、これらの先駆な試みが、その後、ハマースミスでみてきたようなインナーシティでの地域の組織・活動の原型となり、今日ではインターネットなどによる情報ネットワークを利用したかたちで展開している。
カドミウムテルル結晶における高抵抗化メカニズムの解明

II-VI族化合物半導体では、低抵抗のp型あるいはn型結晶を得ることも目的として結晶中に不純物を添加しても結晶が高抵抗になる現象、所謂自己補償効果がしばしば観測される。本研究の対象であるカドミウムテルル(CdTe)においてもこの自己補償効果が観測され、CdTeを用いたデバイス作製にとって大きな障害となっている。本研究の目的は、CdTeで観測される自己補償効果の発生メカニズムを電気的特性評価から解明することにあった。具体的には高抵抗結晶の深い準位を調べるうえで有効な方法であるPICTS(Photo-Induced Current Transient Spectroscopy)の自動測定装置を製作し、高抵抗塩素ドープCdTeに応用した。その結果、次のような実験結果が得られた。1.価電子帯から約120-160[meV]に高抵抗塩素ドープ結晶に特徴的なアクセプタレベルが観測された。2.上記アクセプタに対応する準位の存在は、光学評価法であるフォトルミネッセンスのドナー・アクセプタ対発光の観測結果とも一致した。3.このアクセプタはTe過剰組成からの結晶では観測されるが、Cd過剰組成からのn型低抵抗結晶では観測されなかった。以上の結果から、塩素ドープCdTeの自己補償効果の発生メカニズムは、マイナス2価に帯電したCd空孔[<V2->___<cd>]とプラス1価に帯電した塩素ドナー[Cl^+]との複合欠陥[V_<cd>-Cl]がアクセプタとして作用して塩素ドナーを補償する結果、結晶が高抵抗になることが実験的に明かになった。
病態時に変動する転写因子活性のin vivoイメージングに基づく医薬品開発戦略

炎症などの病態時に活性化するAP-1やNF-kappaBなどの転写因子の活性変動を評価することで、種々疾患の病態解明ならびに医薬品候補化合物のスクリーニングが可能と考えられる。本研究では、レポーターアッセイをin vivoに適用することで、転写因子活性の生体内評価システムの開発を試みた。昨年度開発した、NF-kappaB活性に依存してホタルルシフェラーゼを発現するプラスミド(pNFkappaB-Luc)を利用した肝臓NF-kappaB活性評価システムを用い、癌転移時のNF-kappB活性変動について評価した。作製したモデルマウスに対し、門脈からマウス結腸癌細胞を注入したところ、肝臓中ルシフェラーゼ活性の一過性増大が観察された。この活性増大は、予め肝臓マクロファージであるKupffer細胞を機能的に除去することで消失した。また、結腸癌細胞に代えてマウスマクロファージを注入した場合には活性上昇が認められなかった。さらに癌細胞を注入した際の活性上昇は、肝臓指向型カタラーゼの投与により有意に低下した。以上の結果から、癌細胞が門脈から肝臓に流入すると、おもにKupffer細胞がこれを認識し、その過程において活性酸素、中でも過酸化水素が産生されることで肝細胞でNF-kappaBが活性化することが示唆された。一方、癌細胞内での活性化を評価するために、pNFkappaB-Lucを安定に導入した結腸癌細胞colon26/NFkappaB-Lucを樹立した。この細胞でのルシフェラーゼ活性は、マウスへの移植により大幅に増大したことから、癌細胞中のNF-kappaB活性も、癌細胞が門脈内に流入し、Kupffer細胞などとの相互作用により活性化することが示唆された。以上、転写因子活性の生体内評価システムの開発に成功した。本研究では、レポーターアッセイをin vivoに適用することで、転写因子活性をマウス個体で評価可能なシステムの開発に取り組んだ。まず、基本的な条件設定を行うために、NF-kappaB活性に依存してホタルルシフェラーゼを発現するプラスミド(pNFkappaB-Luc)を用いて評価を行った。pNFkappaB-Lucをハイドロダイナミクス法により投与したマウスの肝臓を評価対象とした。投与に関連するNF-kappaBの活性化により投与直後にはルシフェラーゼ活性が認められたが、投与1日後以降の活性は低いことが明らかとなった。このマウスに対し、肝臓のNF-kappaBを活性化することが報告されている腫瘍壊死因子(TNF)alphaを投与したところ、肝臓中ルシフェラーゼ活性の増大が確認された。この活性の増大は、TNF-alpha投与量に依存したことから、NF-kappaB活性の評価が可能と考えられた。そこで、肝障害を惹起するチオアセトアミド(TAA)を投与し、NF-kappaB活性をイメージングすることで肝障害の評価を試みた。その結果、TAAの投与により肝臓中ルシフェラーゼ活性が増大し、この増大は肝臓ターゲティング型カタラーゼ誘導体により顕著に抑制可能であった。さらに、血清中トランスアミナーゼ濃度などの肝障害の指標と、イメージングにより評価したルシフェラーゼ活性との間に有意な相関が認められた。以上より、本イメージングシステムが、肝臓での転写因子活性の変動に基づく肝障害評価に有用であることが明らかとなった。
アクチビンBによる精子形成開始の分子機構

本研究の目的は、アクチビンBによって誘起される日本産ウナギの精子形成の分子機構を明らかにすることである。まず、哺乳類のCHO細胞を用いてリコンビナントウナギアクチビンBを作成し、これを用いてアクチビンBの精子形成誘起能を器官培養系により解析した。その結果、ウナギアクチビンBはA型精原細胞に細胞分裂を起こさせ、B型精原細胞に移行させることがわかった。しかし、このような処理ではB型精原細胞が減数分裂を開始して精母細胞に分化することはなかった。これらの結果より、アクチビンB増殖因子であると考えられ、精原細胞から精母細胞への分化(減数分裂への移行)は他の因子が必要であると考えられる。この因子(減数分裂開始因子)の単離し、精製することが今後の最重要研究課題である。アクチビンBの情報伝達機構を明らかにする目的で、3種類のアクチビンI型受容体及び1種類のアクチビンII型受容体をコードするcDNAをクローニングした。I型受容体がリガンドと結合するためにはII型受容体の存在が必要であるが、II型は単独でリガンドとの結合が可能であることがわかった。また、これらの遺伝子はGTH処理前の精巣(精原細胞)ですでに発現していた。これらの結果から、アクチビンBは直接精原細胞に作用し、mitosisを誘起することが結論された。次に、種々の細胞分裂制御因子のcDNAをクローニングし、それらのいくつかについて特異的抗体を作成するとともに、精子形成開始時における発現の変動を調べた。その結果、ホルモンによる精子形成開始の誘起は、G1サイクリンE1のmRNAの発現が精原細胞で増加し、その結果として精原細胞のS期への進行が起こり、その後A2、B1、B2の発現によって精原細胞の分裂、増殖が起こると考えられる。次いで、減数分裂期にはいるとA1が重要な役割を果たすと推察される。これまでの研究で我々は、ウナギの精子形成は脳下垂体から分泌される生殖腺刺激ホルモンの作用により精巣のセルトリ細胞で生成されるアクチビンBの働きで起こることを示した。本研究の目的は、このアクチビンBがセルトリ細胞で生成される機構、及びアクチビンBが精原細胞に作用して精子形成が誘起される仕組みを分子・細胞レベルで明らかにすることである。今年度はまず、ウナギ未熟精巣をヒト胎盤性性腺刺激ホルモン(HCG)や11-ケトテストステロンとともに6日間器官培養し、その間におけるアクチビンA、B、ABの生産量をフレンド細胞の赤血球への分化促進能を指標として調べた。その結果、アクチビンBの生産量はHCGと11-ケトテストステロンのいずれによっても著しく増進されることが明らかになった。しかし、アクチビンAとAB生成量はアクチビンBの生成量に比して著しく少なく、また培養期間における変動もまったく認められなかった。また、ラジオイムノアッセイとノーザンブロット解析により、HCGはライディッヒ細胞での3β-ステロイド水酸基脱水素酵素遺伝子の転写活性を高めることにより11-ケトテストステロンの生成を促進することが判明した。したがって、HCGによるアクチビンB生成促進作用はセルトリ細胞に直接的ではなく、ライディッヒ細胞における11-ケトテストステロンの生成を介していると考えられる。また、ウナギ未熟精巣を大腸菌で合成させたヒトのアクチビンBと器官培養すると、精原細胞には活発な細胞分裂が起こった。しかし、精原細胞とヒトアクチビンBを細胞培養しても精原細胞の分裂増殖は認められず精子形成も起こらなかった。

現在、ウナギアクチビンBの合成およびアクチビンB受容体のクローニングを行っている。これまでの研究で我々は、ウナギの精子形成は脳下垂体から分泌される生殖腺刺激ホルモンの作用により精巣のセルトリ細胞で生成されるアクチビンBの働きで起こることを示した。本研究の目的は、このアクチビンBがセルトリ細胞で生成される機構、およびアクチビンBが精原細胞に作用して精子形成が誘起される仕組みを分子・細胞レベルで明らかにすることにある。今年度はまず、ウナギのアクチビンBを哺乳類のCHO細胞に大量発現させ、これを用いてその精子形成誘起能を調べた。A型精原細胞のみからなるウナギ精巣をウナギリコンビナントアクチビンBで器官培養すると、A型精原細胞に頻繁な細胞分裂が観察され、B型精原細胞の数が著しく増加した。しかし、B型精原細胞が減数分裂を開始し、精母細胞まで進行することはなかった。次に、アクチビンBの作用機構を解明する目的で、3種類のアクチビンI型受容体cDNAをクローニングし、これらを用いて行ったノーザンブロット解析から、アクチビンBmRNAが生殖腺刺激ホルモンの投与後の精巣で増加し、10日後に最高となることを示した。さらに、アクチビンBの作用によりA型精原細胞で起こる細胞分裂の機構を明らかにするために、細胞分裂制御関連蛋白質の遺伝子のクローニングを行った。これまでに、cdc2,cdk2、サイクリンA1、A2、B1、B2、D、EなどのcDNAを単離し、それらの全塩基配列を決定するとともに、そのいくつかについて抗体を作成した。現在、これらのcDNAおよび抗体を用いてA型精原細胞での細胞分裂開始機構について解析を行っている。
肺特異的低酸素応答と換気・血流比維持機構の解明

ヘム分解系酵素ヘムオキシゲナーゼのアイソザイムであるHO-2の欠損(-/-)マウスは、低酸素血症と低酸素換気応答の低下を呈する。HO-2(-/-)マウスの肺胞構造には明らかな異常が検出されないため、低酸素血症の原因として換気・血流不均等が推定された。この結果に基づき、HO-2が関与する肺特異的低酸素応答を解析し、以下の成果を得た。1)C57BL/6マウスを空気下および10%低酸素下で飼育し、動脈血中の一酸化炭素(CO)量の変化を解析した。COはヘム分解産物であり、全身におけるヘム分解量を反映する。COレベルは低酸素曝露後1日に最高値に達し、その後直ちに対照レベルに復帰した。さらに7日以降上昇に転じ、21日に再度最高レベルに達し、28日には対照レベルに復帰した。ウェスタンブロット解析と免疫染色解析により、低酸素(10%酸素)曝露28日後のマウス心筋においてHO-1とHO-2タンパクの発現増加を認めた。特に、肺静脈心筋では両タンパクが著明に増加した(論文投稿中)。2)換気・血流比維持に重要な気道神経上皮小体に由来するH-146小細胞肺がん細胞ではHO-2が優位に発現されている。ヘミン存在下における誘導型アイソザイムであるHO-1とHO-2の発現変化を解析した結果、HO-1mRNAは誘導されたが、HO-2mRNAの発現には明らかな変化を検出できなかった。一方、H-146小細胞肺がん細胞の電気的興奮能がヘムにより抑制される現象を発見した。肺循環の制御にヘムが関わっている可能性が示唆される。3)HO-2の機能発現に関わる新規分子を同定するため、Yeast two-hybrid法によりHO-2と相互作用する興味深い分子を同定した。既に、当該分子とHO-2が同一の細胞内局在を示すことを確認した。現在、当該分子に対するsiRNAによる機能の詳細を解析中である。ヘム分解系酵素ヘムオキシゲナーゼ(HO)の非誘導型アイソザイムであるHO-2を欠損する(-/-)マウスは、低酸素血症と低酸素換気応答の低下を呈する。すなわち、HO-2は適正な換気・血流比維持機構に関与すると考えられる。この予想外の結果に基づき、HO-2が関与する肺特異的な低酸素応答の分子基盤を解明する。換気・血流比維持に重要な気道神経上皮小体(neuroepithelial body)と肺動脈の代替えとして、気道神経上皮小体由来のH-146小細胞肺がん細胞と肺動脈平滑筋細胞を用い、両細胞におけるHO-2の発現を解析している。特に、H-146細胞ではHO-2が優位に発現されており、誘導型アイソザイムであるHO-1の発現量は相対的に低い。また、低酸素あるいはヘミン存在下におけるHO-1とHO-2の発現変化を解析している。低酸素換気応答に関与する新規因子を探索する目的で、種々系統のマウスを無麻酔・無拘束でボディープレチスモグラフ内に入れ、空気、10%酸素あるいは10%炭酸ガス呼吸下で即時換気応答を測定している。さらに、低酸素感知機構の分子基盤を解明するために、イーストのtwo-hybrid法を用いて、ヘム蛋白質でもあるHO-2と相互作用する因子をヒト骨髄由来のcDNAより単離し、現在その分子の発現と機能を解析中である。

3)HO-2の機能発現に関わる新規分子を同定するため、Yeast two-hybrid法によりHO-2と相互作用する興味深い分子を同定した。既に、当該分子とHO-2が同一の細胞内局在を示すことを確認した。現在、当該分子に対するsiRNAによる機能の詳細を解析中である。
ヘム酵素の軸配位子が多様な酵素機能を制御する機構の解明

生体内のヘム酵素は、活性中心にヘムを共通にもつが、活性中心のヘムが担う機能は多種多様である。ヘム酵素がもつ機能の多様性は、ヘムに配位する軸配位子やヘム周辺のタンパク質の作る反応場によると考えられているが、詳細は明らかでない。本研究では、生体内のベルオキシダーゼ、カタラーゼ、サトクロームP-450などのヘム酵素の軸配位子が、その酵素機能をどのように制御しているかをモデル錯体により研究した。本課題による主な成果はつぎの通りである。1.これらのヘム酵素は、その反応中にCompound Iと呼ばれる反応中間体を生成するが、その寿命が短いため酵素を用いた詳細な研究は困難である。そこで本研究では、これら酵素と同様な軸配位子をもつCompound Iモデル錯体の合成し、軸配位子の役割りを明らかにした。軸配位子を導入するため、対イオンに過塩素酸イオンを用いること、酸化剤にオゾンを用いることにより、ベルオキシダーゼ由来のイミダゾール基とカタラーゼ由来のフェノール基をもつCompound Iモデル錯体の合成に初めて成功した。2.合成したCompound Iモデル錯体の吸収スペクトルを測定した。軸配位子を導入したCompound Iモデル錯体は、軸配位子をもたない錯体に比べ吸収ピークが長波長側にシフトした。この変化を軸配位子の塩基性と比較すると、塩基性が大きくなるに従い、長波長側に変化することが明らかとなった。この結果は、Compound Iの吸収ピークが酵素により大きく異なるのは、軸配位子の塩基性の違いによることを示唆した。また逆に、Compound Iの吸収位置は、軸配位子からヘム鉄への電子供与の大きさをを反映することを示した。ヘム酵素の機能の多様性と活性中心のヘムに配位する軸配位子との関わりは多くの研究者の注目を集めているが、その詳細は明らかでない。本研究では、酵素反応中間体に対して軸配位子がもつ役割りを解明するため、酵素由来の軸配位子をもつ反応中間体モデル錯体(CompoundIモデル錯体)の合成を行った。これまでに報告されたCompoundIモデル錯体にイミダゾールやフェノールを添加しても、錯体自体が還元されるのみであった。失敗の原因として、溶媒由来のメタノールや酸化剤由来のベンゾエ-トが軸配位子として存在することが考えられた。そこで、配位力が弱く、外部の配位子と容易に交換可能なパークロレート錯体を用いること、酸化剤として配位性のイオンを生成しないオゾンを用いることにした。その結果、イミダゾールやフェノレートを軸配位子にもつ酵素反応中間体モデル錯体を初めて合成することができた。合成された錯体は、-80度以下で数分間安定に存在した。錯体の電子構造を種々の物理化学的測定により検討した。イミダゾールやフェノレートを軸配位子にもつCompoundIモデル錯体は、ペルオキシダーゼやカタラーゼのCompoundIと類似した吸収スペクトルを与えた。これは、軸配位子がCompoundIの電子構造を制御していることを示唆した。モデル錯体に導入した軸配位子が正常に配位していることは、配位子の^1H-NMR、^2H-NMRシグナルから確認された。また、軸配位子の導入によりポルフィリン環上のHOMO軌道の変化は観測されなかったが、各炭素上のスピン密度に変化が観測された。この結果は、酵素反応の際にポルフィリン環からの電子移動の速度に影響することを示唆した。
配位子(taec)の立体効果による錯体の安定化に関する研究

1.taec(N,N′,N′′,N′′′-テトラキス(アミノエチル)-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)のクロム(II)錯体Cr_2(taec)X_4(X=Cl,Br)をアルゴン雰囲気下で合成した.一般にクロム(II)化合物は空気中の酸素に対し極めて敏感であるのにもかかわらず,今回得られた結晶は, taecの立体効果から予想されたように,乾燥空気中で安定で, 1ケ月放置してもほとんど変化が認められなかった.2.taec類似の八座配位子tpmc(N,N′,N′′,N′′′-テトラキス(2-ピリジルメチル)-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)を合成し, 7種の銅(II)錯体Cu_2(tpmc)(ClO_4)_4(1),Cu_2(tpmc)(OH)(ClO_4)_3・2H_2O(2),Cu_2(tpmc)(OH)(BF_4)_3・H_2O(3),Cu_2(tpmc) (NO_3)(PF_6)_3(4),Cu_2(tpmc)(CH_3COO)(ClO_4)_3(5),Cu_3(tpmc)Br_6(6),Cu(tpmc)(ClO4)2・3H2O(7),および2種の銅(I)錯体,Cu_2(tpmc)(ClO_4)_2(8),Cu_2(tpmc)(PF_6)_2(9)を単離した.これらは(7)を除きすべて二核構造をとっている.このうち2と4についてX線結晶構造解析を行った.2は独立した二核錯陽イオン[Cu_2(tpmc)OH]^<3+>をもち,各Cuはシクラム環の2個の窒素と2個のピリジン窒素と結合し, OH^-はその二つのCuの間にあってその両方に配位している.4でもNO^-_3が二つのCuと二座配位で結合しているが,一方は軸配位であるが,他方は平面内配位となっている.銅(I)錯体8, 9はメタノール中で容易にO^2と結合するが,室温で直ちに分解して青色となる.一方低温(-70°-80°C)では, O_2と可逆的に結合することを^<18>O_2を用いた共鳴ラマンスペクトルによって確認することができた. ^<18>O_2を用いて銅酸素錯体の存在の確認された例はまだ二例ほど報告されたに過ぎないので,今回の結果は新しいヘモシアニン活性部位モデルとして興味深い.1.taec(N,N′,N′′,N′′′-テトラキス(アミノエチル)-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)のクロム(II)錯体Cr_2(taec)X_4(X=Cl,Br)をアルゴン雰囲気下で合成した.一般にクロム(II)化合物は空気中の酸素に対し極めて敏感であるのにもかかわらず,今回得られた結晶は, taecの立体効果から予想されたように,乾燥空気中で安定で, 1ケ月放置してもほとんど変化が認められなかった.2.taec類似の八座配位子tpmc(N,N′,N′′,N′′′-テトラキス(2-ピリジルメチル)-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)を合成し, 7種の銅(II)錯体Cu_2(tpmc)(ClO_4)_4(1),Cu_2(tpmc)(OH)(ClO_4)_3・2H_2O(2),Cu_2(tpmc)(OH)(BF_4)_3・H_2O(3),Cu_2(tpmc) (NO_3)(PF_6)_3(4),Cu_2(tpmc)(CH_3COO)(ClO_4)_3(5),Cu_3(tpmc)Br_6(6),Cu(tpmc)(ClO4)2・3H2O(7),および2種の銅(I)錯体,Cu_2(tpmc)(ClO_4)_2(8),Cu_2(tpmc)(PF_6)_2(9)を単離した.これらは(7)を除きすべて二核構造をとっている.このうち2と4についてX線結晶構造解析を行った.2は独立した二核錯陽イオン[Cu_2(tpmc)OH]^<3+>をもち,各Cuはシクラム環の2個の窒素と2個のピリジン窒素と結合し, OH^-はその二つのCuの間にあってその両方に配位している.4でもNO^-_3が二つのCuと二座配位で結合しているが,一方は軸配位であるが,他方は平面内配位となっている.銅(I)錯体8, 9はメタノール中で容易にO^2と結合するが,室温で直ちに分解して青色となる.一方低温(-70°-80°C)では, O_2と可逆的に結合することを^<18>O_2を用いた共鳴ラマンスペクトルによって確認することができた. ^<18>O_2を用いて銅酸素錯体の存在の確認された例はまだ二例ほど報告されたに過ぎないので,今回の結果は新しいヘモシアニン活性部位モデルとして興味深い.
新しい細胞増殖因子(BTC,HB-EGF)による膵β細胞分化増殖作用の研究

本研究では、絶対的あるいは相対的に膵β(インスリン分泌)細胞の減少をきたすヒトI型糖尿病(IDDM)あるいはII型糖尿病(NIDDM)に対し、膵β細胞の分化・増殖機構を利用することにより、膵β細胞の再生を促進するような治療法の可能性について検討を行っている。近年発見された細胞増殖因子betacellulin(BTC)およびheparin-bindingepidermal growthfactorlike growthfactor(HB-EGF)は、ともにEGF familyに属する細胞増殖因子であり、それぞれに対する特異的なreceptorは発見されていないが、両者ともEGF-receptorに結合し細胞内情報伝達を行うことが証明されている。これまでの私共の免疫組織学的手法を中心にした検討により、BTCおよびHB-EGFは、胎児膵組織の内分泌前駆細胞や正常ヒト膵島細胞の一部で産生が認められ、さらに両細胞増殖因子は、発現様式はやや異なるものの、ヒト膵島腫瘍(インスリノーマおよびグルカゴノーマ)および膵島細胞症(nesidioblastosis)の組織においても産生されていることを明らかにし、両細胞増殖因子が膵島細胞の分化、増殖機構に関与している可能性が強く示唆されることを報告(J.Japan Diab.Soc.37(suppl.1),315,1994)し、投稿中である。このような結果をもとに、正常ヒト膵組織およびヒトインスリノーマ組織に対し分子生物学的手法を用いて組織内mRNAの検出を行い、さらにin situ hybridizationにより組織内mRNA発現細胞の同定を試みている。また、ヒトインスリノーマ細胞およびインスリノーマ由来細胞株を用いたin vitroの実験系や、薬剤(alloxan)誘発による糖尿病状態の膵組織において、BTC、HB-EGF各分子の発現、産生を誘導する機序(転写因子や転写調節因子など)を解明するとともに、β細胞に対する両細胞増殖因子の発現、産生の影響を検討中である。さらに、本研究遂行中に、HB-EGFがヒト動脈硬化症発症過程に関与していることやヒト肝癌細胞の増殖に関与していることを発見したので報告した。
蛋白質のモルテン・グロビュール状態の構造と安定性とその生理的役割

モルテン・グロビュール状態はコンパクトで多くの特異的な二次構造を含むが、三次構造的には大きく崩れた中間的な構造状態である。同状態は、単にタンパク質の構造と物性という観点にとどまらず、細胞内での蛋白質の構造形成反応や膜透過とも関連して注目されている。本共同研究の目的は、「モルテン・グロビュール状態の構造と安定性の機構を実験と理論の両面から調べ、蛋白質の立体構造形成反応の普遍的原理を解明すること」である。さらに「モルテン・グロビュール状態の生理的役割を明らかにすること」も目標とした。モルテン・グロビュール状態に焦点を当てて、海外の研究者を含めた総合的な共同研究を行なうことにより、以下の成果を得た。1.モルテン・グロビュール状態の構造と安定性の分子機構、およびその理論的解析(1)構造片岡は、X線溶液散乱により、アポミオグロビンのモルテン・グロビュール状態を含むさまざまな構造状態を調べ、これらの慣性半径、球状性の程度、距離分布関数、二次構造要素の相関に基づく内部構造などを明らかにした。その結果、アポミオグロビンのモルテン・グロビュール状態は、ネイティブ状態よりは膨潤しているが、酸変性状態よりは明らかにコンパクトであることを示した。そして、モルテン・グロビュール状態は、コア構造とアンフォールディングした領域から形成されること、コア構造内の二次構造配置はかなり固定されていることを示した。他方、Dillは、統計力学的理論と格子モデルを用いて中間的構造の特徴を予測した。実験結果は、モデルから予測されたものとよく一致した。そこで、X線溶液散乱から得られたモルテン・グロビュール状態の特徴は、タンパク質の中間体の構造を考える上で、普遍的な重要性をもつと考えられる。(2)安定性後藤は、アポミオグロビンやシトクロムcのモルテン・グロビュール状態の安定化における静電的相互作用や疎水的相互作用の役割を、示差走査熱量計や滴定型熱量計を用いた熱測定、円二色性スペクトルなどによって調べた。その結果、静電的反発力が同状態を大きく不安定化することを示した。また、同状態の安定化には、ネイティブ状態と比較して約20-30%程度の疎水的相互作用が作用していることを示した。(3)構造形成のプロフィールX線溶液散乱や円二色性スペクトルより得られた構造情報、熱測定より得られた物性情報を総合して、アポミオグロビンとシトクロムcの構造形成反応のプロフィールを示した。その結果、高度にアンフォールディングした状態からスタートして、分子がコンパクトになるにつれ二次構造が形成されるが、疎水的相互作用は、フォールディングの最終段階で獲得されることを明らかにした。このようなプロフィールは、Dillが行った統計力学的モデルで予想されるものと一致した。2.分子シャペロンの作用機構の解析河田らは、大腸菌の分子シャペロンGroEの作用機構を解析を行った。蛍光標識したアポシトクロムcがGroEと特異的に相互作用することを、ゲルろ過法を用いて示した。蛍光ストップトフロー装置を用いて相互作用の速度を測定し、それが0.1秒以内に終了する速い反応であることを示した。これらの実験により、GroEは、標的蛋白質の表面に露出した疎水的クラスターを認識していることが明らかになった。また、GroEが標的蛋白質と相互作用するか否かは、標的蛋白質のフォールディング速度に依存していることが示唆された。他方、Finkらは、大腸菌の分子シャペロンDnaKの作用機構を解析した。GroEの場合とは対照的に、DnaKは、基質蛋白質のかなりアンフォールディングした状態を認識していることを示した。3.質量分析による解析小西らは、質量分析法を用いてモルテン・グロビュール状態を解析することを試みた。シトクロムcやβ-ラクトグロブリンのさまざまな構造状態を用いて、重水素交換実験を行い、質量分析法がモルテン・グロビュールの動的構造の研究に有効であることを示した。今後、更に発展させて行く予定である。

他方、Dillは、統計力学的理論と格子モデルを用いて中間的構造の特徴を予測した。実験結果は、モデルから予測されたものとよく一致した。そこで、X線溶液散乱から得られたモルテン・グロビュール状態の特徴は、タンパク質の中間体の構造を考える上で、普遍的な重要性をもつと考えられる。(2)安定性後藤は、アポミオグロビンやシトクロムcのモルテン・グロビュール状態の安定化における静電的相互作用や疎水的相互作用の役割を、示差走査熱量計や滴定型熱量計を用いた熱測定、円二色性スペクトルなどによって調べた。その結果、静電的反発力が同状態を大きく不安定化することを示した。また、同状態の安定化には、ネイティブ状態と比較して約20-30%程度の疎水的相互作用が作用していることを示した。(3)構造形成のプロフィールX線溶液散乱や円二色性スペクトルより得られた構造情報、熱測定より得られた物性情報を総合して、アポミオグロビンとシトクロムcの構造形成反応のプロフィールを示した。その結果、高度にアンフォールディングした状態からスタートして、分子がコンパクトになるにつれ二次構造が形成されるが、疎水的相互作用は、フォールディングの最終段階で獲得されることを明らかにした。このようなプロフィールは、Dillが行った統計力学的モデルで予想されるものと一致した。2.分子シャペロンの作用機構の解析河田らは、大腸菌の分子シャペロンGroEの作用機構を解析を行った。蛍光標識したアポシトクロムcがGroEと特異的に相互作用することを、ゲルろ過法を用いて示した。蛍光ストップトフロー装置を用いて相互作用の速度を測定し、それが0.1秒以内に終了する速い反応であることを示した。これらの実験により、GroEは、標的蛋白質の表面に露出した疎水的クラスターを認識していることが明らかになった。また、GroEが標的蛋白質と相互作用するか否かは、標的蛋白質のフォールディング速度に依存していることが示唆された。他方、Finkらは、大腸菌の分子シャペロンDnaKの作用機構を解析した。GroEの場合とは対照的に、DnaKは、基質蛋白質のかなりアンフォールディングした状態を認識していることを示した。3.質量分析による解析小西らは、質量分析法を用いてモルテン・グロビュール状態を解析することを試みた。シトクロムcやβ-ラクトグロブリンのさまざまな構造状態を用いて、重水素交換実験を行い、質量分析法がモルテン・グロビュールの動的構造の研究に有効であることを示した。今後、更に発展させて行く予定である。モルテン・グロビュール状態の構造と安定性とその生理的役割に関して以下の成果を得た。1.静電的相互作用と疎水的相互作用の役割チトクロムc、ミオグロビンなどのタンパク質やペプチドを用いて、モルテン・グロビュール状態の構造と安定性における静電的相互作用と疎水的相互作用の役割を調べた。その結果、同状態における疎水的相互作用の役割を定量的に示した。これを他の構造パラメータと比較することにより蛋白質の構造形成反応のプロフィールを示した。また、モルテン・グロビュールの安定化機構がネイティブ状態のものと異なっていることを示した。2.X線溶液散乱による分子構造の研究X線溶液
医療デバイスに対する力学的・生物学的応答評価を可能とする血管バイオモデルの構築

多くの国において死亡者数の高い循環器系疾患の低侵襲的な治療法として、カテーテルやステントを用いた血管内治療の導入が増加している。しかしながら、医療デバイスの接触、留置による血球破壊や凝集など、血球細胞が受ける影響が問題となっている。本研究では、デバイスに対する力学的・生物学的応答の評価を可能とする、多様な膜強度を持つ血球モデルの開発をおこなってきた。血球モデルとして扱いが簡便である脂質二重膜小胞(リポソーム)、および赤血球膜に作用してナノサイズの孔を開ける膜孔形成タンパク質を利用して、膜の物性を硬化・脆弱化させた血球モデルの開発を目指した。昨年度は、膜孔タンパク質として、黄色ブドウ球菌Hlg、大腸菌FhuAΔC/Δ4L、およびヒラタケPleurotolysin (Ply)を使用し、反応させる脂質の電荷および形状を変化させることにより、膜孔の形成効率および電気生理学的性質が変化することを明らかとしてきた。本年度は、平面脂質二重膜システムを使用してPlyの電気生理学的性質の解析を進め、Plyがスフィンゴミエリン(SM)脂質に特異的に作用し、膜孔が陽イオン選択性を有することを明らかとした。またCryo電子顕微鏡により、SMの脂肪酸側鎖の炭素数が18以上であることが膜孔の効率的な形成に必須であることを明らかとした。さらに、異なる電荷および形状を有する平面脂質二重膜を作成し、電圧負荷時に膜に生じる微少な電流ノイズを計測し、膜安定性を解析した。その結果、逆コーン型脂質であるSMが存在することで、膜安定性が減少することが示唆された。昨年度の研究成果から、脂質と膜孔のコンビネーションを変化させることが、脂質二重膜強度を制御する重要因子であることが明らかにされていたが、本年度の実験結果から、膜を構成する脂質の種類を変化させることも、様々な膜強度を有する血球モデルの開発に重要な要素であることが示唆された。(抄録なし)循環器系疾患は、多くの国において最も死亡者数の高い重大な疾患であり、画期的な治療法の開発が必要とされており、カテーテルやステントを用いた血管内治療の導入が増加している。一方、デバイスの接触、留置による血管細胞の傷害、溶血や血球の凝集、血栓による血管の閉塞が問題となっている。本研究においては、医療デバイスの評価システム構築およびオーダーメード型治療の開発に貢献するために、血管および血球の力学的・生物学的特性を有するバイオモデルの開発をめざしている。本年度は血球モデル開発に重点をあて、特に、血管疾患・血液疾患患者を想定した多様な膜強度を持つ血球モデルの開発を目指した研究をおこなった。赤血球膜に特異的に作用して、膜の物性を硬化・脆弱化させることが可能な膜孔タンパク質に着目し、詳細な構造解析を行い、構造の特性を利用した赤血球膜への作用機構について解析した。その結果、本膜孔タンパク質のサブユニットは、赤血球膜上で7量体を形成するが、7個のサブユニットは正七角形から若干のずれを伴って配置されていることが明らかとなった。この構造の特徴に伴い、赤血球膜上で膜孔集合体(クラスター)を形成すること、膜孔が単独で存在するときは細胞崩壊活性の増加は抑制されているが、クラスターを形成した場合に崩壊活性が促進されることを明らかとした。一方、本タンパク質を界面活性剤上で結晶化することに成功し、界面活性剤上では8量体を形成することが明らかとなった。これらの結果から、(1)膜孔タンパク質の濃度調節により、孔を形成するが膜を崩壊させず、膜強度を変化させることが可能であること、(2)本タンパク質を作用させる基盤(膜)の構造を変化させることにより、多様な構造を有する膜孔を形成できる可能性が示唆された。今後は膜孔タンパク質の反応性の制御と、膜構造の制御により、膜強度多様化血球モデルの開発を進めていく予定である本研究においては、多くの国において重大な疾患である循環器系疾患の医療デバイスの開発に貢献するために、デバイスの評価を可能とする血管および血球バイオモデル開発をめざしている。昨年度は、赤血球膜に特異的に作用して膜の物性を硬化・脆弱化させることが可能なブドウ球菌の膜孔タンパク質Hlgに着目し、患者の状態を反映した膜強度多様化赤血球モデルの開発の可能性を検討した。血球モデルとして脂質二重膜小胞を利用するため、脂質に対するHlgの反応性を解析した結果、Hlgは脂質膜には孔を形成しにくく、かつ膜上で凝集体を形成する性質があり、扱いが困難であった。そこで本年度は、異なる2つの膜孔を使用して、様々な脂質への膜孔の反応性を解析し、脂質の種類と膜孔の濃度変化から、膜強度を制御する可能性について検討した。大腸菌膜孔タンパク質FhuA、またはキノコ由来膜孔タンパク質Plyと平面脂質二重膜システムを使用して、数種の脂質膜上での、膜孔形成効率とその安定性を試験した。その結果、シリンダー型脂質膜上に形成されたFhuA膜孔は、より安定にopen状態を維持できることが明らかとなった。Plyの場合は、脂肪酸の炭素鎖が18以上の構造を有するスフィンゴミエリン膜上にのみ膜孔形成が認められた。また、FhuAは、反応系に30ng/ul以下、Plyは4ng/uL以下の濃度で添加することにより、膜孔数を計測できることが示唆された。

さらにCryo-TEMを使用して、Plyの高分解画像を取得することに成功し、Plyの孔径が、FhuAおよびHlgより2-4倍大きく、Plyは膜の脆弱化により影響を与えると示唆された。本研究結果から、膜孔の種類と濃度、脂質の種類を変化させることで、膜上の膜孔の数と性質に多様性が生じることが明らかとなり、膜強度多様化血球モデル開発の重要な基礎データとして活用できると考えられる。多くの国において死亡者数の高い循環器系疾患の低侵襲的な治療法として、カテーテルやステントを用いた血管内治療の導入が増加している。しかしながら、医療デバイスの接触、留置による血球破壊や凝集など、血球細胞が受ける影響が問題となっている。本研究では、デバイスに対する力学的・生物学的応答の評価を可能とする、多様な膜強度を持つ血球モデルの開発をおこなってきた。血球モデルとして扱いが簡便である脂質二重膜小胞(リポソーム)、および赤血球膜に作用してナノサイズの孔を開ける膜孔形成タンパク質を利用して、膜の物性を硬化・脆弱化させた血球モデルの開発を目指した。昨年度は、膜孔タンパク質として、黄色ブドウ球菌Hlg、大腸菌FhuAΔC/Δ4L、およびヒラタケPleurotolysin (Ply)を使用し、反応させる脂質の電荷および形状を変化させることにより、膜孔の形成効率および電気生理学的性質が変化することを明らかとしてきた。本年度は、平面脂質二重膜システムを使用してPlyの電気生理学的性質の解析を進め、Plyがスフィンゴミエリン(SM)脂質に特異的に作用し、膜孔が陽イオン選択性を有することを明らかとした。またCryo電子顕微鏡により、SMの脂肪酸側鎖の炭素数が18以上であることが膜孔の効率的な形成に必須であることを明らかとした。さらに、異なる電荷および形状を有する平面脂質二重膜を作成し、電圧負荷時に膜に生じる微少な電流ノイズを計測し、膜安定性を解析した。その結果、逆コーン型脂質であるSMが存在することで、膜安定性が減少することが示唆された。昨年度の研究成果から、脂質と膜孔のコンビネーションを変化させることが、脂質二重膜強度を制御する重要因子であることが明らかにされていたが、本年度の実験結果から、膜を構成する脂質の種類を変化させることも、様々な膜強度を有する血球モデルの開発に重要な要素であることが示唆された。本年度は、膜強度多様化血球モデルの開発を目指し、血球膜に特異的に作用する膜孔タンパク質の構造と作用メカニズムに関する研究をおこなった。本年度に得られた結果から、本タンパク質の濃度を調整すること、また、膜の素材を変化させることにより、膜強度を多様化したモデルの開発が可能であることが示唆され、今後の開発の方向性を明らかにすることができたといえる。昨年度におこなった血管モデル開発と合わせ、本研究目的はおおむね順調に進展しているといえる本年度は、昨年度に引き続き膜強度多様化血球モデルの開発を目指し、新たな膜孔タンパク質FhuAおよびPlyを用いて、様々な脂質に対する膜孔形成活性を解析した。本年度は、PLBSと新しい膜孔タンパク質を用いて、(1)脂質二重膜上に形成された孔数を計測するシステムが構築され、(2)脂質と膜孔タンパクの種類、および適切な濃度を用いることで、膜孔の数を制御しながら多様な膜孔を形成できる膜システムの基盤が構築された。以上のように本年度は膜強度多様化血球モデルの実現化にむけた重要な基礎データを取得することができ、平成22年度、23年度におこなった血管モデル、血球モデル開発と合わせ、本研究目的はおおむね順調に進展しているといえる。
呼吸器免疫系におけるホスホリパーゼＣεの役割

ホスホリパーゼCepsilon(PLCepsilon)は低分子量GTP蛋白質Ras/Rapの標的タンパク質で、非免疫細胞に高発現している。本研究の目的は、PLCepsilonの遺伝子改変マウスと喘息モデルを用いて、呼吸器免疫におけるPLCepsilonの役割を明らかにすることである。PLCepsilon欠損マウスでは、気道過敏性の亢進や気管支血管周囲の炎症細胞の浸潤が著明に抑制され、ヘルパーT細胞2型のサイトカインや、気道上皮細胞からのサイトカインの産生が抑制されることが明らかとなった。PLCepsilonは少なくともTh2を介する呼吸器免疫に重要な役割を果たしていることが示唆された。ホスホリパーゼCepsilon (PLCepsilon)の野生型(WT)マウスおよびノックアウト(KO)マウスを使用して、アレルギー性気道炎症におけるPLCepsilonの役割について解析を行った。卵白アルブミン(OVA)を抗原とする急性喘息マウスモデルを作成したところ、WTで見られる気道過敏性の亢進、気管支血管周囲の炎症、PAS陽性の粘液細胞の増加はKOでは著明に抑制されていた。また、気管支肺胞洗浄液中のヘルパーT細胞2型サイトカインはWTに比較してKOで著明に産生が抑制されていた。一方、OVA特異的IgGやIgEの産生、CD11c陽性樹状細胞の遊走能、肥満細胞の脱顆粒には遺伝子型による違いが見られなかった。マウスの急性気管支喘息モデルから肺を取り出し、qRT-PCRと免疫染色で炎症性サイトカインの発現を解析したところ、WTに比較してKOではCcl2やCxcl2などの炎症性サイトカインの発現が抑制されていた。WTとKOのマウスの肺から線維芽細胞と気道上皮細胞を単離、培養しin vitroでTNFalphaで刺激したところ、これらのサイトカインはin vivoでの実験と同様に発現が抑制されていた。以上の事から、PLCepsilonはヘルパーT細胞2型を介する気道炎症に重要な役割を果たしており、特に非免疫細胞からの炎症性サイトカインの産生に関与していることを明らかにした。この研究結果から、PLCepsilonが気管支喘息の重要な分子標的になる可能性が示唆された。Phospholipase Cepsilon (PLCepsilon)の野生型(WT)マウス、ノックアウト(KO)マウスの肺を卵白アルブミン(OVA)の再刺激の前後で取り出し、樹状細胞の表面マーカーであるCD11cのmRNAの量をqRT-PCRにより解析したところ、遺伝子型による違いは見られなかった。続いて、蛍光標識したOVAにより再刺激を行い、24時間後に領域リンパ節へ移動してくるCD11c陽性細胞とFITC標識OVAを2重免疫染色で観察したが、遺伝子型による違いを認めなかった。次に、それぞれのマウスの大腿骨、脛骨から骨髄細胞を取り出し、肥満細胞に分化誘導させた後、PLCepsilonの発現をRT-PCRで調べたが、他のPLC分子種とは異なりPLCepsilonは肥満細胞には発現しておらず、beta-hexosaminidase遊離試験により脱顆粒への影響も調べたが、遺伝子型による違いを認めなかった。一方で、WTマウス、KOマウスの領域リンパ節をOVAの再刺激の後で取り出しフローサイトメトリーにより解析したところ、WTマウスでみられる総細胞数、CD3epsilon陽性細胞数の増加が、KOマウスでは有意に抑制されていた。それぞれのマウスの肺を免疫染色したところ、PLCepsilonは上皮間葉系細胞、リンパ節の間質系細胞に発現しており、炎症性サイトカインであるCcl2、Cxcl2の発現がKOマウスではWTに比して抑制されていた。それぞれのマウス由来の線維芽細胞と気道上皮細胞を初代培養を行った後、TNFalphaで刺激させたところ、それら炎症性サイトカインのmRNAの発現がKOマウスでは有意に抑制されていた。以上の実験結果から、PLCepsilonは上皮細胞からの炎症性サイトカインの分泌に関与しており、アレルギー性気道炎症において重要な分子であることを明らかにした。喘息モデルの実験として計画していた1PLCepsilonの樹状細胞に与える影響の評価、2領域リンパ節周囲におけるPLCepsilonの発現解析、3上皮間葉系細胞の初代培養は、研究実績の概要に記載した通り全て終了しており、肺線維症モデルに関する実験を今年度に行なっていくのみとなっている。肺線維症の実験を行うにあたって、書類上の準備、必要マウスの準備は終了しており、計画書に記載した計画通りに実験を行なっていく。すなわちブレオマイシン肺線維症モデルを作成し、PLCepsilonのKOマウスとWTマウスおよびトランスジェニック(TG)マウスの間での表現型の差異をまず確認する。PLCepsilonが上皮間葉系細胞において炎症誘導に働いていると推測しており、PLCepsilonのKOマウスでは線維化の抑制が、TGマウスでは炎症反応の亢進による線維化の亢進が観察できると予想される。

続いてPLCepsilonのWTマウスの線維化モデルにおいて、線維化巣に存在し、線維化に重要な役割を果たしている筋線維芽細胞中にPLCepsilonが発現していると予想しており、免疫染色、RT-PCR等により解析する。さらに、上皮間葉系細胞におけるPLCepsilonの発現を解析し、ヘルパーT細胞を中心とした炎症細胞のサブセットを決定し、PLCepsilonが上皮系サイトカインの分泌を制御する機構について上皮間葉系細胞の初代培養を行い解析していく。消耗品費、旅費等の費用に分けて記載する。まず消耗品費に関しては、実験用試薬として病理標本作成用に10万円、分子生物学実験試薬に100万円、細胞培養用に10万円、実験用器具代としてプラスチック製品に10万円、ガラス製品に10万円の計140万円の使用を計画している。次に旅費等の費用として、国内の研究成果発表用に5万円、外国での研究成果発表用に25万円、実験動物の飼育管理費に20万円、研究成果投稿用の費用として10万円の計60万円の使用を計画している。
アポトーシスと口腔癌発生の関連性を解明するための実験病理学的研究

1.組織標本の染色手技に習熟するための予備実験として、ヒト口腔領域扁平上皮癌組織における種々のケラチンの発現状況を免疫組織化学で解明することを試みた。さらに、その結果と各扁平上皮癌症例の生存期間とを比較検討したところ、低分子量ケラチンの発現頻度が高い口腔領域扁平上皮癌症例の生存期間は、他の症例よりも短い傾向があることを見いだした。2.断片化したDNAを組織切片上で可視化する染色法であるTUNEL法の諸条件、例えばプロテアーゼ・TdT・UTP濃度などを比較検討した。その結果、至適条件が明らかとなり、陽性対照群において常に安定した染色結果が得られるようになった。3.ラットの正常舌粘膜上皮における細胞増殖活性と、DNA断片化細胞を組織切片上で観察した。正常上皮では基底層細胞のほぼ全体に増殖活性が見いだされたものの、DNA断片化細胞はほとんど認められなかった。4.発癌剤を経口投与して、ラット舌における扁平上皮癌発生を促したのちに、舌の組織標本を作製、観察した結果、扁平上皮癌と種々の程度の上皮異形成の発生をいずれも少数見いだした。5.上記病変における細胞増殖活性とDNA断片化とを免疫染色・TUMEL法にて組織切片上で解明したところ、異型上皮において、細胞増殖活性の亢進と少数のDNA断片細胞を認めた。6.以上のように「口腔扁平上皮癌の発生においては、正常で生じるアポトーシスから逸脱する細胞が重要な役割を果たす」という仮説を検証したが、今回の研究では正常組織・異形上皮組織・癌組織においてアポトーシス細胞がほとんど見いだされなかったことから、上記仮説の検討のためのさらなる研究を計画している。アポトーシス関連癌遺伝子の発現を免疫組織化学的に明かにするための予備実験として,ならびに免疫組織化学手技に習熟するため,ヒト口腔領域癌組織における種々のケラチンの発現状況を免疫染色によって明かにすることを試みた。その結果,高分子量および中分子量ケラチンの発現状況はいずれの癌症例でもほぼ同様であったが,低分子ケラチンの発現は各々の癌症例毎にかなり異なること,さらに,低分子量ケラチンの発現頻度が高い症例の生存期間は,他の症例よりも短い傾向があることが見出された。アポトーシスに陥った細胞に生じるDNAの断片化を可視化する組織染色であるTUNEL法行う前に,パラフィン包埋された組織のDNAがどの位の期間保たれているかを明かにすべく,DNAの組織化学的証明法であるフォイルゲン反応を,包埋後種々の期間を経たパラフィンブロックから作製した切片を行った。これにより,包埋後室温で4年経過したパラフィンブロックから作製した切片においてもフォイルゲン反応の陽性所見が観察され,過去蓄積された多数の口腔癌症例がTUNEL法の検索対象となりうることが判明した。次に、ラット腸管から作製したパラフィン切片にTUNEL法を施行したところ一部の上皮細胞に陽性所見が観察された。ただし,この染色結果は,各染色毎のばらつきが多かったことから,常に安定した染色結果が得られるようTUNEL法にさらに習熟する必要があると考えている。なお,TUNEL法陽性という所見は,その細胞でDNAの断片化が生じているという現象のみを明かにしているだけで,TUNEL法の陽性所見が,アポトーシスに陥っている細胞のみならず壊死細胞にも見られるらしいので,今後は,TUNEL法陽性細胞が,どの程度の割合で超微的なアポトーシス罹患細胞であるかを解明するための電子顕微鏡的研究が必要であると思われる。本年度はまず,アポトーシスに陥った細胞の核に生じるDNA切断を検出する組織化学であるTUNEL法染色に昨年度生じていた染色結果の不安定性を改善するために,TUNEL法染色の諸条件を検討し,TUNEL法染色結果を常に安定化することを目指した。

TUNEL法染色における試薬の濃度や反応時間を種々調節し,さらに,適切と思われる陽性・陰性対照群を含めて同染色を行ったところ,安定した染色結果が得られるようになった。すなわち,アポトーシスに陥っていると考えられている細胞と陽性対照とに常に陽性反応が観察され,陰性対照には陽性反応が観察されないという染色結果が得られるようになった。ところで,口腔癌発生とアポトーシスとの関連を解明するためには,口腔癌発生母地となる組織の細胞増殖態度やアポトーシス関連癌遺伝子の発現状況をTUNEL法染色細胞の分布様式とともに解明べきであると思われる。これを,一枚の組織切片上で行うためには,TUNEL法染色と免疫染色を組合わせた重染色を行う必要がある。このような重染色の技法に習熟すべく,二重蛍光免疫染色を試みたところ,レーザー顕微鏡で定量観察可能なほどの良好な染色結果を得ることができるようになった。次に,口腔癌の発生過程とアポトーシスとの関連を追究するため,ラットに口腔癌を発生させる実験;4-ニトロキノリン-1-オキシド(4NQO)の12週間連続投与を行った。投与終了ののち数週間経過を観察し,投与終了7週間後にラットを屠殺して標本採取を行った。採取時に肉眼観察したところ,舌に,不定形の斑状ないし軽度隆起性の病変が生じているのが見られた。現在,顎骨を含めた組織標本を作製しており,作製された標本でTUNEL法や免疫染色を行い,口腔癌の発生過程とアポトーシスとの関連を検討する予定である。