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亜鉛フィンガー融合型組換え酵素による革新的な野生型遺伝子ノックアウト法の開発研究

特異的なZFNの発現および自己切断における発現制御が可能となれば治療に向けた利用が期待される。平成23年度ではin vitroでの反応評価により標的配列に反応するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を選択することができた。現在は細胞内の評価に移行しているためほぼ予定通りに進行していると考える。今後は細胞内でのジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の発現確認およびhTERTプロモーター領域除去によるがん細胞増殖効率変化、テロメラーゼ活性変化、形態変化やアポトーシスの有無の評価を行う。さらに正常細胞にZFNを導入する場合と比較し、がん細胞特異的に切断反応が行われることを検出したいと考えている。最終的にがん細胞特異的に細胞傷害を引き起こすことが可能になればZFNを応用した新規バイオ医薬品開発に向けた基礎的知見になると考えている。
集積培養装置の革新によるnosZ clade IIタイプN2O還元細菌の獲得

高い温室効果とオゾン層破壊能を示す亜酸化窒素(N2O)の削減に向け、高効率なN2O消費が可能なnosZ clade IIタイプのN2O還元細菌の獲得を目指した。集積培養技術により、nosZ clade IIタイプのAzospira sp.の単離に成功した。この細菌は、効率的なN2O還元が可能であり、酸素への耐性があることを示した。さらに、Azospira sp. I13株のゲル包括固定を行った結果、微好気条件下でもN2O還元活性を示した。非脱窒性N2O還元細菌の獲得に向け、Anammoxリアクターに生息する細菌群を評価した結果、Chloroflexi門の細菌群が有望であることを示した。1.集積培養装置の改良:温室効果ガスおよびオゾン層破壊物質として知られている亜酸化窒素(N2O)の効率的な消費が可能なnosZclade IIの未培養細菌の集積・単離に向け、ガス透過膜を用いた集積培養装置の改良を行った。集積培養装置の酸素除去用カラムを設置することにより、酸素のコンタミネーションを防ぐことが可能になった。2. nosZ clade IIのN2O還元細菌の集積化に向けた植種バイオマス選定:亜硝酸イオン、硝酸イオン、一酸化窒素を電子受容体として利用しない偏性N2O還元細菌の集積化に向け、長期培養を開始した。種汚泥としてアナモックスリアクターのバイオマスを選定した。16S rRNA遺伝子に基づくアンプリコンシーケンスの結果、Chlorobi門やChloroflexi門などのnosZ clade IIに分類されるN2Oのみを電子受容体として用いる細菌群が存在していることが明らかになった。また、呼吸活性試験により、このバイオマスは外部電子供与体の添加を行わない条件でもN2O還元が起こることを示し、N2O還元速度を算出した。3.単離菌株のN2O還元特性:集積培養装置から集積・単離したnosZclade IIに分類されるN2O還元細菌であるAzospira属に属する2種の単離菌株を用いてN2O還元特性に関する評価を行った。nosZ clade Iに分類されるN2O還元細菌2種と比較して、獲得したAzospira属の単離菌株はN2Oに対する親和性が高いことが明らかになった。試験に用いた4種類の単離菌株のうち、Azospira属の単離菌株の1つは酸素の存在下においてもN2O還元能を有し、微好気的な条件でもN2O削減に寄与できる種類であることが明らかになった。研究に利用する機器のセットアップが完了していたため、また、共同研究者との議論を密に行えたため、予定していた計画を着実にこなすことができた。温室効果ガスかつ21世紀最大のオゾン層破壊物質の1つである亜酸化窒素(N2O)を効率的に窒素ガスまで無害化可能なN2O還元細菌の生理生態解明を目指した。特に、N2O還元性能が高いと報告されているclade IIタイプのN2O還元細菌の探索のため、これらの細菌群の集積とN2O還元活性の評価を行った。N2Oを唯一の電子受容体とし、酢酸塩を電子供与体としてバイオフィルムに連続供給した際、Beta-proteobacteria綱に属する脱窒細菌由来のclade IIタイプのN2O還元細菌が集積した。一方で、ペプトンをはじめとする混合有機物培地を電子供与体を用いると、上記の細菌群に加え、Bacterioidetes門に属する細菌群が集積した。次に、NH4+を電子供与体、NO2-を電子受容体とした有機物非添加の培地をバイオフィルムに連続供給した際、嫌気性アンモニア酸化細菌が優占化した微生物群集の中に、従属栄養性のChloroflexi門の微生物群が集積されることが明らかになった。さらに、これらの従属栄養性の細菌群は、nosZ clade IIタイプのN2O還元酵素をコードした遺伝子を保有し、亜硝酸還元酵素を有していない非脱窒性のN2O還元細菌であることが明らかになった。次に、N2O呼吸活性評価システムを構築し、これらの微生物群集のN2O還元性能を確認したところ、低いN2O濃度でも高効率にN2O消費を行えることを示した。以上より、嫌気性アンモニア酸化細菌が集積される、外部からの有機物添加のない環境にて生息するN2O還元細菌群が、有用なN2Oシンクになりうることを明らかにした。さらに、単離に挑戦したが、nosZ clade IIタイプのN2O還元細菌の単離には至らなかった。単離に関しては、培地の選定、培養条件の最適化等の詳細な検討が必要であることが示唆された。

1.偏性N2O還元細菌の集積化・単離前年度に引き続き集積培養装置の運転を行い、特にnosZ clade IIに属するN2O還元細菌の集積化・単離を引き続き行う。単離が行えた場合は、呼吸活性装置を用いた動力学的特性の解析を行うとともに、細菌のゲノムのドラフト配列を取得し、窒素に関する代謝経路予測や新奇代謝機構の予測と検証を行う。2.比較メタゲノム解析これまで獲得できているnosZclade IIに分類されるN2O還元細菌ゲノムのドラフト配列を取得後、完全ゲノムの獲得を目指す。また、nosZ clade Iとの比較ゲノム解析を行うことにより生理学的特性の違いについての考察を行う。環境バイオテクノロジー
メコンデルタにおける水圏生物多様性予測モデルの開発

本研究課題が対象とするメコンデルタは、ベトナム国で急激な成長を続ける農業・水産業地帯である。同地域は、非常に広大であるため、海外共同研究者が所属するテュイロイ大学(ホーチミン市)を拠点とし、魚類相情報および物理環境情報を収集した。本年度も前年度からの調査を継続し、ベンチェ省を対象に、魚類相調査は陸路を使用し、物理環境調査では船を使用して可能な限り広域での調査実施を試みた。その際、水生生物の捕獲には、現地で使用されている漁具を水域特性に応じて選択し、魚種や体サイズ、位置情報等を記録した。結果として、これまでの調査により、魚類相調査では、計66地点での調査により、67種を確認しており、塩分濃度によって魚種の分布が支配されることが確認できた。物理環境調査では、主要5河川(Tien川、Ham Luong川、Balai川、Ben Tre水路、Binh Chanh川)とその陸域に位置する水路において、計6回(2017年8月、同10月、2018年1月、同4月、同7月、2019年3月)の網羅調査により、水深および塩分濃度の鉛直プロファイルを計測した。これにより、塩分濃度の空間分布の概要が明らかになり、乾季に塩分濃度が上昇することが確認できた。また、これらの物理環境情報に加えて、水路の接続状況や水面幅を衛星画像等から取得し、対象水域の主要水路における流況解析のプロトモデルを構築した。これにより、流況に応じた塩分濃度の時空間変動解析が可能になり、最終目的である生物多様性予測モデルの構築に発展させる。物理環境情報については連続観測データに欠測があるが、現在、機械学習を用いたデータ解析により、対処しており、問題はほぼ解決している。また、物理環境調査による網羅的なデータは新規性が高いため、今後の発展的な利用が期待できる。魚類相調査の結果も概ね順調に進んでおり、現在、解析の準備を進めている。対象水域の主要水路における流況解析のプロトモデルを改良し、流況に応じた塩分濃度の時空間変動解析の再現性の向上を目指す。また、魚類相の空間分布モデルを構築し、流況-塩分濃度-魚類相の関係性を考慮した生物多様性予測モデルに発展させる。その際、ベンチェ省を対象に、魚類相調査は陸路を使用し、物理環境調査では船を使用して可能な限り広域での調査実施を試みた。水生生物の捕獲には、現地で使用されている漁具を水域特性に応じて選択し、魚種や体サイズ、位置情報等を記録した。結果として、これまでの調査により、魚類相調査では、計37地点での調査により、64種を確認しており、塩分濃度によって魚種の分布が支配されることが確認できた。物理環境調査では、主要5河川(Tien川、Ham Luong川、Balai川、Ben Tre水路、Binh Chanh川)とその陸域に位置する水路において、計3回(2017年8月、同10月、2018年1月)の網羅調査により、水深および塩分濃度の鉛直プロファイルを計測した。

また、これらの物理環境情報に加えて、水路の接続状況や水面幅を衛星画像等から取得し、対象水域の主要水路における流況解析のプロトモデルを構築するための情報を収集した。さらに、解析に使用するデータとして、現地機関が観測する水位等のデータを収集した。移動距離の都合上、地点数の激的な増加は期待できないが、魚類相・物理環境ともに、良好に調査が進行している。物理環境調査による網羅的なデータは新規性が高いため、今後の発展的な利用が期待できる。魚類相調査の結果も概ね順調に進んでおり、現在、解析の準備を進めている。対象水域の主要水路における流況解析のプロトモデルを改良し、流況に応じた塩分濃度の時空間変動解析の再現性の向上を目指す。また、魚類相の空間分布モデルを構築し、流況-塩分濃度-魚類相の関係性を考慮した生物多様性予測モデルに発展させる。対象水域の主要水路における流況解析のプロトモデルを構築し、流況に応じた塩分濃度の時空間変動解析の再現性について検討する。
教育の情報化・国際化に即応した統計教育とカリキュラムシステムの開発研究

国際統計協会(ISI)およびその統計教育分科会(IASE),国内統計関連学会・全国統計教育研究協議会・日本統計協会・総務省統計局など統計をひろく専門的に協議する諸学協会との連携の下に,日本における統計教育の基盤の確立と教育の情報化および国際化に即応する新教育環境の下での統計教育カリキュラムシステムの研究開発を行った。これらの研究成果は国内外の諸学会で発表され,同時に,学習指導要領への提言として文科省に提出された。本年度研究実績として,統計教育の重要性に関する提言書作成に向けて,下記の調査・資料分析研究を行い,提言書の基礎資料を作成した。1.「社会・企業における統計の需要度調査」を行い,統計活用の実態と期待度を分野別にまとめ,社会的要請としての統計教育の重要性を明白化した。2.小学校・中学校における義務教育での統計教育の適時性および学習プログラムおよび教員養成課程における統計学習プログラムに関する国際比較調査・分析を行った。3.小・中学校および高等学校での全教科の検定済み教科書の内容を統計教育の視点で教科間の関連性と学年進行に応じた継続性の妥当性を検討し,結果をまとめた。これらの結果は学会報告を踏まえ,関連8学会および関連する各産業協会等9組織,合計17学協会からの統計教育推進に関する要望書『21世紀の知識創造社会に向けた統計教育推進への要望書』として取りまとめられ,文科省および日本学術会議に提出された。要望書は,文科省の教育課程部会(算数・数学専門部会)で参考資料として取り上げられ,かつ,日本学術会議から対外報告「知識創造社会に向けた統計教育の推進について」の基礎となった。また,「プロフェッショナル育成のための統計教育に関するシンポジウム専門職大学院における統計教育と関連資格」を開催し,社会における高度専門職としての統計家の位置付けと統計実務家のコアコンピテンシーを明らかにし,統計教育とキャリア形成の枠組みを報告した。また,「統計教育の達成目標をさぐるリテラシーから統計的推論力、課題解決力へ」をテーマにしたJapan Conference of Teaching Statisticsを開催し,その中で,米国統計学会および英国統計学会など先進諸外国の統計学会が公表する統計教育の指針を比較調査した結果を報告し,日本における統計関連学協会の共同指針を討議・作成するための準備を行った。2005年に本研究グループが主体となり日本統計学会を始め関連17学協会で文部科学省に提出した『21世紀の知識創造社会に向けた統計教育推進への要望書』に関連して,2006年度2月中教審報告で次期指導要領改定に向けた理数系教育の改革の柱に統計教育の充実が挙げられた。これを契機に本年度の申請研究では,初等・中等教育課程の算数・数学教科におけるより具体的な統計内容のコースデザインを早急に,日本統計学会・数学教育学会等と連携して提出することを目的に,諸外国での統計教育の達成目標・カリキュラム・評価指標に関する国際比較研究をまとめ,関連学会で本内容に関する企画セッションをたて,招聘海外研究者も交えて国内外の諸統計専門家と集中討議を行い,日本における統計教育の課題を明示化し今後の方向性を論議した。具体的には,1.2006年度統計関連学会連合大会企画セッション『統計教育-統計的思考力育成に向けて』を企画し,米国統計学会統計教育分科会会長のJ.Utts教授を招き,米国統計学会が公表した統計評価と方法に関するガイドラインGAISEレポートを中心に論議した。2.2006年度日本行動計量学会統計教育特別セッション『アクションに繋がる統計教育カリキュラム国際比較にみる達成目標と評価のガイドライン」を企画し,統計教育に関する米国を始めアジア諸国のナショナルガイドラインの比較と今日的統計教育の達成目標を集中的に論議した。3.日本統計学会75周年記念事業シンポジウムにおいて,『知識創出のための統計科学研究の振興と教育政策』のセッションをオーガナイズし,統計科学研究推進の重要性と科学技術政策および次期指導要領の改定に向けた理数教育の強化と統計内容の位置付けの2テーマを論議した。4.2007年数学教育学会春季年会でのオーガナイズトセッション『世界トップレベルを目指す科学教育の中核をなす統計基礎カリキュラムの充実』において,「国際標準に即応した初等・中等教育での統計教育カリキュラムへの提言-アクションに繋がる統計教育の必要性」を発表した。5.『第3回統計教育の方法論ワークショップアクションに繋がる統計教育』を開催した。本研究は,大きく次の7テーマ((1)社会における統計需要度調査計画・実施,(2)初等・中等教育における統計教育の国際比較,(3)小中高における検定教科書内容検討,(4)海外の統計学協会が公表する教育指針の比較分析,(5)ISI多言語対応統計用語データベースの公開,(6)社会における高度専門職としての統計家の実態調査,(7)統計教育の情報化のためのe-learningモデル構築)の下で,研究を行っている。とくに本年度は,(1)に関して,常用雇用規模1000人以上の全企業,500人以上の全公営団体を対象に,『データ分析と統計知識の需要度調査』を実施し,社会における統計教育に対する細分化したニーズと学校教育における達成度に関して計量的な分析を加え,その結果を国内外の学会で報告した。

また,(2),(3),(4)に関しては,諸外国の統計教育のナショナルガイドラインを比較表にまとめ,日本の統計教育の現状と課題と共にその研究成果を,日本数学教育学会シンポジウム"学習指導要領の改訂に向けて",統計関連学会連合大会企画セッション"統計教育におけるカリキュラムと教材,評価システムの国際比較-国際標準化に向けて-"において,また,リスボンで開催された国際統計協会での統計教育招待セッション,中国赤峰で開催された高等統計教育国際会議においても招待論文として報告した。とくに,国際統計協会統計計算分科会アジアセクション特別会議で,統計教育の招待セッションをオーガナイズし,中国,フランス,韓国の統計教育研究者の講演を交え,統計教育の国際比較を踏まえて標準化への討議を行った。また,新学習指導要領が目指す統計活用力の育成をテーマにしたシンポジウムおよびワークショップを開催した。(5)と(7)に関しては,それぞれインターネット上のサイトとして公開を始めた。本研究は,次の7テーマ((1)社会における統計需要度調査計画・実施,(2)初等・中等教育における統計教育の国際比較,(3)小中高における検定教科書内容検討,(4)海外の統計学協会が公表する教育指針の比較分析,(5)ISI多言語対応統計用語データベースの公開,(6)社会における高度専門職としての統計家の実態調査,(7)統計教育の情報化のためのe-learningモデル構築を目的として研究を行った。とくに本年度は,研究課題の最終年度としてそれぞれのテーマに関する成果のまとめと全体の研究課題の総括を行った。具体的には,(1)に関しては,既に昨年度に企業,事業所を対象とした『データ分析と統計知識の需要度調査』を実施し結果を集約しているので,本年度はその結果を一部踏まえた上で,日本学術会議報告書「数理科学分野における統計科学教育・研究の今日的役割とその推進の必要性」がまとめられた。(2),(3),(4)に関しては,諸外国の統計教育のナショナルガイドラインを比較表にまとめ,その成果を同じく上記の報告書に掲載した。また新たに本年度行った,日本の大学における統計教育・研究実態調査の結果と併せて,日本の統計教育の現状と課題を,日本行動計量学会,統計関連学会連合大会など国内の諸学会年会における企画セッションや国際計算機統計学会(IASC2008)における招待セッションをオーガナイズし,報告した。(5)に関しては既に研究開発を終えており,本年度の活動はないが,(6)に関するヒアリング記録を使用したWeb上の統計基礎学習のためのe-learningモデルを設計し,放送大学内でローカルに公開した。
大学経営高度化を実現するアカデミック・リーダーシップ形成・継承・発展に関する研究

本研究は、大学の教育・学習部門におけるアカデミック・リーダーシップを形成・継承・発展するための具体的かつ有効な方策を検討した。その結果、以下の知見を得た。(1)国立大学で教育改善に責任を負う教育担当副学長は職務の膨大さ等多くの困難を抱える。(2)副学長のリーダーシップが発揮される範囲・機会はしばしば限定的である。(3)副学長の職務遂行を支援する学内の体制はしばしば不十分であり、力量形成機会も多くない。(4)諸外国、とくに米英では、執行部向けにリーダーシップ形成のための各種研修制度を設けるなど、彼らの職務遂行を支援する体制がある程度整備されている。本研究の目的は、大学の教育・学習部門におけるアカデミック・リーダーシップを形成・継承・発展するための具体的かつ有効な方策を検討することである。これは大学環境が厳しさを増す状況の中で、大学経営の高度化が強く求められている状況に対応するためである。具体的には以下の点を解明する。・日本と諸外国における大学経営陣のリクルート、経営陣着任前の準備の実態・諸外国との比較により、日本の大学における経営陣のリクルート・研修の特徴・大学経営陣が職務を遂行する上で必要な知識・スキルの内容、およびその習得方法・大学経営陣に必要な知識・スキル習得を支援するための研修の内容・方法・研修を提供する主体、および提供の方法平成22年度においては、以下のような研究を行った。・全国の主要大学の教育担当副学長(一部、経験者を含む)に対して、副学長の職務内容やリーダーシップ発揮の状況についてインタビューを行った。その結果、副学長は、付与される権限が限定される中でも、リーダーシップを発揮するために、多様な努力と工夫をしていること等を明らかにした。・全国の主要大学の教育担当副学長に対して、職務内容等についてアンケート調査を実施した。その結果、副学長は、学内で教育改革・改善活動を実施するに際して、学内の組織・事務職員の協力を得るなどの努力をしていること等を明らかにした。・アメリカ、イギリス、フランスにおける主要大学の経営陣向けの研修制度について、参与観察等の実地調査を行った。その結果、各国とも主要な大学関係団体が経営陣向けの研修を実施しており、多くの大学の経営陣が受講していること等を明らかにした。1)日本と諸外国における大学経営陣のリクルート、経営陣着任前の準備の実態、2)諸外国との比較により、日本の大学における経営陣のリクルート・研修の特徴、3)大学経営陣が職務を遂行する上で必要な知識・スキルの内容、およびその習得方法、4)大学経営陣に必要な知識・スキル習得を支援するための研修の内容・方法、5)研修を提供する主体、および提供の方法平成23年度には以下の研究を行った。a)アカデミック・リーダーシップに関する国内外の研究状況をフォローし、リーダーシップ概念の形成・発展過程および最新の研究成果・課題を明らかにした。これに関連して、リーダーシップ研究の専門家を招聘して討論を行った。b)アメリカ、イギリス、オーストラリア、フランスの各国の大学ガバナンスの態様や、大学の管理・運営・改革における執行部の役割、彼らを対象とするリーダーシップ形成のための研修状況について調査した。関連して、各国の主要大学等に代表を派遣し、これらの事項について調査した。また、フランスからこの問題の専門家を招聘し、研究会で討論を行うとともに、大学関係者向けのセミナーを開催した。c)大学教育学会において、ラウンドテーブルを開催し、大学執行部を対象とするリーダーシップ形成のための研修について、その可能性や内容・実施方法等について、参加者とともに討論した。e)高等教育学会において、研究成果の一部を報告した。f)繰越申請事由となったオックスフォード大学のデイビッド・ワトソン氏のセミナーを行った。g)以上の成果をふまえ中間報告書を作成した。1国立大学で教育改善に責任を負う教育担当副学長は職務の膨大さ等多くの困難を抱える。2副学長のリーダーシップが発揮される範囲・機会はしばしば限定的である。3副学長の職務遂行を支援する学内の体制はしばしば不十分であり、力量形成機会も多くない。4諸外国、とくに米英では、執行部向けにリーダーシップー形成のための各種研修制度を設けるなど、彼らの職務遂行を支援する体制がある程度整備されている。研究会のメンバーのほぼ全員が、アカデミック・リーダーシップに関するテーマで研究論文を執筆することができた。メンバー以外からの論考を得ることができた。

・繰越申請事由となったオックスフォード大学のデイビッド・ワトソン氏のセミナーを行うことができた。・メンバーおよび非メンバーによる研究論考をまとめて、中間報告を作成できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題を深めるために、今後は以下のような方策を予定している。1)個別大学における教育改革の実施状況の分析を行う。とくに、そのプロセスにおける大学執行部の役割・リーダーシップ発揮の状況について分析する。2)各大学における教育改革において、大学執行部がリーダーシップを発揮できるようにするために必要な条件整備について、国内および諸外国の事例を参考に検討する。3)大学執行部がリーダーシップを形成したり発揮したりする上で参考になるような、教材等を開発する。4)これまでの研究成果を大学教育学会大会において発表する。5)研究成果を、最終報告書としてまとめる。
嚥下機能に対する舌接触補助床の効果に影響を与える因子

近年,嚥下障害患者に対する舌接触補助床(以下PAP)の効果が,歯科のみならず医科からも注目されている.舌腫瘍術後患者や脳血管障害患者におけるPAPの有効性は多数報告されているが, PAPの形態の決定は経験的に行われているのが現状である.そこで,嚥下時におけるPAPと舌の接触様相について,舌圧センサシートを用いて確認しながらPAPの形態を調整し, PAP装着者の嚥下機能の客観的・主観的評価と舌圧との関係について分析を行う.近年,嚥下障害患者に対する舌接触補助床(以下PAP)の効果が,歯科のみならず医科からも注目されている.舌腫瘍術後患者や脳血管障害患者におけるPAPの有効性は多数報告されているが, PAPの形態の決定は経験的に行われているのが現状である.そこで,嚥下時におけるPAPと舌の接触様相について,舌圧センサシートを用いて確認しながらPAPの形態を調整し, PAP装着者の嚥下機能の客観的・主観的評価と舌圧との関係について分析を行う.本研究は,嚥下障害に対する舌接触補助床(以下PAP)の効果を明らかにするため,PAP装着者の嚥下機能の客観的・主観的評価と舌圧との関係について分析を行うこととした.本研究では,以下のような段階的目標を立てた.1.PAPと舌との接触状況を舌圧センサシートを用いて測定し,健常者の舌圧発現パターンを照らしてPAPの形態評価を行う.2.PAPを装着した舌腫瘍患者の嚥下機能を客観的・主観的に評価する.3.PAPの効果が不十分であると判断された患者には,舌圧測定の結果をもとに調整を行い,効果向上につなげていく.4,PAP装着から6ヶ月を限度に,PAPの効果に影響を及ぼすと考えられる因子について.舌圧を含めてレトロスペクティブに分析する.これらの段階的目標の中,現在.1,PAPの形態評価と2.嚥下機能の客観的・主観的評価を行っている段階である.平成23年度現在.大阪大学歯学部附属病院咀嚼補綴科に受診した舌腫瘍患者は6名.そのうち,日本老年歯科医学会ガイドラインによりPAPが適応とされた患者は2名であった.これらに対して,舌圧測定を行いながら術後PAPを製作した.結果,2名とも嚥下機能の改善は認めているものの,患者数が少なく,十分なデータを集積していない.現状では,欠損部位の大きさが大きく.また術後早期の段階で,PAPの効果は大きい傾向が認められた.まだデータ数が不十分であるため,嚥下機能の客観的・主観的評価と舌圧との関係を明らかにするには至っていない.今後引き続き,患者の経過を追うとともに,評価とデータ収集を行っていきたいと考えている.舌腫瘍術後患者を対象として、舌接触補助床(以下PAP)による嚥下機能の客観的・主観的評価と舌圧との関係について分析することを目的として、研究を開始した。対象人数が、当初予定した人数よりも少なかった。2年間での舌腫瘍術後患者は5名に過ぎず、また症例によって、PAPの適応でなく、結果、縦断的に経過を終えたのは、3名にとどまった。その中の1例を上げて説明する。舌腫瘍術後で、かつ上顎腫瘍術後の患者で、嚥下障害を主訴に紹介された。口蓋部は腫瘍時切除後皮弁再建されており、大きく下垂していた。また、舌の機能障害を顕著で、嚥下障害を認めた。申請者は、舌機能障害を評価するために、舌圧センサシートを使用して舌の口蓋への接触について調べた。その結果、口蓋部の正中前方部、中央部、後方部と左右2か所の合計5か所のセンサは全く反応せず、つまり、口蓋に舌が接触していないことが分かった。この対象者にPAPを製作した。当初立てた仮説に基づいて、前方部での接触をまず付与し、その後後方へ順序性を伴った接触様相になるように口蓋部の形態を形成した。仮説に基づいた様相を十分に表現できなかったが、これにより、主観的評価として、嚥下のしやすさが向上した。また、客観的評価として、発音の効果もみられた。30日ごとの評価の中で製作してから30日後の効果が顕著にみられたが、その後の変化は明らかではなかった。PAPの効果が得られなかった群を、本研究期間中に絞ることができず、PAPの効果に与える影響を十分に分析できていないのが現状である。
機械学習理論を実装した顎変形症診断支援データベースシステムの開発とその臨床応用

顎変形症の診断時に対象症例と類似した症例を自動認識して検索・提示する診断支援システムの開発を目的とし、歯列模型の形態的特徴のみから類似症例を提示するデータベースシステムを開発した。デジタル化した歯列模型から算出した様々な特徴パラメータをデータベースに蓄積し、対象症例とデータベース内の各症例の特徴パラメータの類似度を算出することで類似症例を決定した。今後、経験豊かな臨床医が選出した類似症例が検索されるように試行錯誤を重ねながらシステムを調整することにより、臨床での有用性が高まると考えられる。本研究の目的は、顎変形症の診断時に過去の類似症例を自動認識して検索・提示する診断支援システムを開発することである。本研究は顎変形症治療に関連した「資料のデジタル化」と「機械学習を実装したデータベースシステムの開発」を併進させる方針であった。平成26年度における「資料のデジタル化」については、外科的矯正治療が終了した顎変形症症例のうち、データベースに必要な全資料を有する症例を選択し、機械学習時のシステム開発に必要となる歯列模型から、デジタル化を行うこととし、これまで研究代表者が自らデジタル化を行ってきた模型と同じ症例を専門業者に委託しデジタル化を行い、デジタル化の条件設定を行った。歯槽部のパラメータ化に十分なデータが得られるように条件設定を変更した。これにより、データベース構築時に必要な歯列模型データの一部は専門業者に委託でき、研究の効率化が行えるようになった。また、本年度購入した高性能サーフェス変換ソフトウェアにより、研究者がデジタル化を行う模型についても従来より精度の高いデジタルデータを得ることが可能となった。「機械学習を実装したデータベースシステムの開発」の部分では、「特徴パラメータの抽出」については、これまで開発してきた歯列ー歯槽部形態会解析システムにおける座標設定部分でのプログラムの改変をおこなった。これによりより詳細なデータの取得が可能となった。これまでに抽出してきたデータについても新しいプログラムで再度パラメータ抽出を行う予定である。また、初期システムの構築のために用いる統計解析用フリーソフトウェアの「R」を導入した。また機械学習の資料収集を行い、システム構築の準備を行った。本研究では、研究計画を確実に遂行するため、顎変形症に関連した「資料のデジタル化」と「機械学習を実装したデータベースシステムの開発」を併進する方針を取っている。「資料のデジタル化」に関しては、昨年度、歯列模型のデジタル化の条件設定を行ったことにより、専門業者に委託した場合でもパラメータ取得に十分なデータを得ることが可能となったので、症例の選定を行いながら症例数を増加させた。また、顎矯正手術適応とならなかったが、歯列歯槽部に非対称が認められた症例についても、データに加え学習データとして用いることとした。これによって、外科的矯正手術と矯正単独治療のボーダーラインケースについても類似症例を提示することが可能になることを予測している。「機械学習を実装したデータベースシステムの開発」については、抽出するパラメータの見直しを中心に行った。本研究は学習データとして、歯列模型のデータから抽出したパラメータを用いて、類似症例を提示することを目的としている。しかしながら、これまで用いてきた歯列ー歯槽部形態分析システムは、上下顎それぞれの歯列ー歯槽部の形態を解析し、パラメータとして抽出可能であったものの、上下顎の三次元的な位置関係のパラメータ化はされていなかったので、類似症例を精度よく提示することは困難であった。これらを改善するために、本年度は新たに、上下顎の三次元的な相対位置関係をパラメータ化し、解析するシステムを開発、さらに三次元的位置関係を可視化を可能とした。本システムにより、より効率的な類似症例の提示が可能となることが予測される。また、上下顎の顎関係が可視化されることで、システム利用者にとっても症例の類似度性が、視覚的に確認可能となることで臨床的な有用性が向上すると考える。歯列模型のデジタル化については、昨年度より症例数は増加しているものの、当初の計画よりは、少ない状況である。症例数が増加しない原因としては、病院移転に伴う資料保管庫の分散化が生じ、治療が終了した症例の保管場所も複数あるため、検索が困難であること。また、治療終了後の症例が多く保管されている保管庫の場所も外来棟から離れているため、これらを運搬し、デジタルデータ採得が可能な状況まで歯列模型の状態を整えるために時間がかかることが、挙げられる。機械学習のシステム構築については、本年度はデータベースシステムのパラメータ部分の改善に専念することとなり、機械学習アルゴリズムの開発については遅延した。本研究の目的は、顎変形症の診断時に診断対象とする症例に類似した過去の症例を自動認識して検索・提示する診断支援システムを開発することである。「資料のデジタル化」については、引き続き対象となる症例の選定とデジタル化を行った。本研究においては、歯列模型から得られたパラメータをインデックスとして、類似した症例を検索するデータベースシステムを設計しているため、X線画像等のデータのデジタル化よりも模型のデジタル化を優先して進めている。「機械学習を実装したデータベースシステムの開発」については、これまで上下顎それぞれ単独の歯列ー歯槽部形態を解析し、パラメータとして出力することが可能となっていたが、上下顎の歯列や歯槽部の三次元的位置関係をパラメータとして出力することはできなかった。そこで、前年度より上下顎の位置関係を示すパラメータの出力を可能とし、さらにこれらを可視化して出力できる解析システムに改良した。

本年度も解析システムのパラメータの調整を行うとともに、歯列ー歯槽部に非対称が認められた症例のうち、外科的矯正治療を行った症例と矯正治療単独で治療を行った症例の初診時模型データを実際にシステムに入力し、解析を行った。その結果、外科的矯正治療を行った症例と矯正治療単独で治療を行った症例では歯槽部に対する歯列の三次元的な位置が異なっていた。外科的矯正治療を選択した症例の方が歯槽部に対する歯軸傾斜が著しい症例が多く認められ、また上下顎の歯槽部の水平的な偏位が大きい症例が多く認められた。改良した本システムにより、上下顎歯列ー歯槽部の位置関係を視覚的、定量的にとらえることが可能となり、臨床的な有用性が向上したと考える。前年度より効率的にデジタル化を進めることができたが、当初の予定よりも症例数がかなり少ないこと。また機械学習についても解析システムの改良に時間を費やしたため、遅延したと考える。本研究の目的は、顎変形症の診断時に診断対象の症例と類似した過去の症例を自動認識して検索・提示する診断支援データベースシステムを開発することである。本研究で開発したシステムは、デジタル化した歯列模型から算出した形態的特徴量のみをデータ検索用のパラメータとして用いている。また、データベースに登録したデータは、新潟大学医歯学総合病院矯正歯科診療室において動的治療が終了した顎変形症症例の初診時歯列模型を使用して算出した。形態的特徴量としては、上下顎それぞれについて、歯冠部・歯頚部・歯槽部の輪郭線データを作成し、これらの座標データに対してP型フーリエ変換を行ってパラメータ化した。また、上下顎関係についても各基準平面の空間的関係を特徴量としてパラメータ化を行った。これらパラメータの算出には、これまで開発してきた歯列ー歯槽部分析システムを使用した。本研究では、最終的な大規模データベースの構築の前段階として約100症例分のパラメータをデータベースに登録した。開発初期の検索アルゴリズムは、症例ごとにパラメータの類似度を求め、学習データとしてデータベースに蓄積していた。しかしながら、臨床的な整合性を高めるためには、経験を積んだ臨床医が選出した類似症例が上位に検索されるように、パラメータ間の重み付けによりシステムをチューニングする必要性が生じた。本研究で開発したデータベースシステムは、現時点では研究計画時より小規模に留まったが、歯列模型のみから類似症例を検索することが可能なデータベースの開発は遂行できた。今後症例数を増やし、さらに臨床的観点からのシステムの調整を行うことで、臨床応用が可能になると考える。顎変形症の診断時に対象症例と類似した症例を自動認識して検索・提示する診断支援システムの開発を目的とし、歯列模型の形態的特徴のみから類似症例を提示するデータベースシステムを開発した。
分裂酵母の液胞タンパク質輸送に関与する遺伝子群の解明とその応用に関する研究

出芽酵母において液胞へのタンパク質輸送に欠陥を示すvps(vacuolar protein sorting)変異株の解析から40種類以上もの遺伝子が、液胞タンパク質輸送に関与していることが明らかにされている。しかしながら分裂酵母においては液胞へのタンパク質輸送に関する機構は全く知られていない。そこで分裂酵母の液胞タンパク質マーカーとしてカルボキシペプチダーゼY(CPY)を単離して、本酵素の液胞への輸送機構について解析を行った。その結果、分裂酵母CPYは出芽酵母など他起源の酵母CPYとは異なり、高等な植物などと同様にヘテロダイマーとして存在することを明らかにした。また液胞へのCPYの輸送には高等動物とは異なり糖鎖部分は関与しないが、その糖鎖はERで合成される場合のタンパク質のフォールディングに重要であることがわかった。さらにCPYやインベルターゼなどの分裂酵母における糖タンパク質の分泌に欠陥を示す変異株を取得した。これらの変異株を相補する遺伝子の中には、出芽酵母のERからゴルジ装置のタンパク質の輸送に必須なErd1タンパク質や、ゴルジ間のタンパク質輸送に関与する低分子量G-タンパク質のypt6などのホモログ遺伝子であることがわかった。さらにCPYへの液胞への輸送シグナルはタンパク質のプロペプチド部分に含まれていることがわかった。分裂酵母CPYが誤って細胞表層へとミスソートされてしまう変異株を多数取得することができた。これらの変異株の中には、既に出芽酵母において液胞へのタンパク質輸送に関与することが知られているVPS34,VPS4,VPS5,VPS11,VPS19,VPS45などが合まれていることがわかり、これらのタンパク質が生物種を越えて広く真核生物のタンパク質輸送に関与することを明らかにすることができた。そこで分裂酵母の液胞タンパク質マーカーとしてカルボキシペプチダーゼY(CPY)遺伝子を単離して、本酵素の液胞への輸送機構について解析を行った。また液胞へのCPYの輸送には高等植物とは異なり糖鎖部分は関与しないが、その糖鎖はERで合成される場合のタンパク質のフォールディングに重要であることがわかった。これらの変異株を相補する遺伝子の中には、出芽酵母のERからゴルジ装置のタンパク質の輸送に必須なErdlタンパク質のホモログ遺伝子であることがわかった。分裂酵母CPYが誤って細胞表層へとミスソ-トされてしまう変異株を多数取得することができた。これらの変異株の中には、既に出芽酵母において液胞へのタンパク質輸送に関与することが知られているVPS34,VPS4,VPS5,VPS11,VPS19,VPS45などが含まれていることがわかり、これらのタンパク質が生物種を越えて広く真核生物のタンパク質輸送に関与することを明らかにすることができた。
三七人参の生体防禦機構活性化を有する多糖体の製造的分離精製に関する研究

1.三七人参の生体防御機構活性化多糖体の製造的分離精製,活性,構造:中国雲南省特産の重要薬用植物、三七人参の生体防御機構活性化多糖体をカーボンクリアランス試験を指標として追跡した。その大規模な精密分離について、従来用いられて来たセファデクス,セファロースなどの多糖体系ゲルによる開放型クロマトグラフの代わりに、新しい半硬質合成ポリビニルゲル、それにイオン交換性を持たした担体による中圧液体クロマトグラフ,更に親水性合成ポーラスポリマーの大口径カラムを用いた高速液体クロマトグラフの応用を検討し、活性分画を大量分離した。本分画は感染抵抗性,マクロフアージ活性化,抗腫よう活性等を示すことが明らかにされた。更にこれをグルコアミラーゼ処理して、グルカンを分解し、サンチナン-Aと命令した分子量1,600,000活性アラビノガラクタンを精製することに成功した。その構造をアラビノフラノシド類のNMRの研究結果を応用し、又各種の化学的手法を用いて決定した。2.竹節人参,薬用人参の生体防御機構活性化多糖体:三七人参の多糖体の分離に用いられた方法を適用して、竹節人参より3種の活性多糖体を得、その2種の構造を明らかにした。又、薬用人参からも活性多糖体を分離し、三七人参と比較検討した。3.アラビノシド,ガラクトシドのほう酸イオン交換液体クロマトグラフ:ガラクタン,アラビノガラクタンとグルカン等の分離に関連して、各種の天然或は合成アラビノピラノシド,アラビノフラノシド,ガラクトピラノシドのほう酸存在下でのイオン交換液体クロマトグラフを検討し、それらに対応するキシロシド,グルコシドとの分離が良好に行なわれることを明らかにし、その保持時間と構造との間に興味ある規則性を見いだした。1.三七人参の生理活性多糖体の分離、精製:中国雲南省で栽培された三七人参の生体防御機能活性化物質をカーボンクリアランステストを指標として追跡した。水エキスのエタノール沈殿物をセファデックスG-50カラム、DEAEトヨパール650Mカラムによるクロマトグラフィーで分画した。その活性画分を高分子化合物分離用、新製造的分離用大型HLCカラム、TSKgel4000PW(22mm×600mm)で精製し、分析用カラム、TSKgel5000PW、6000PWによるHLCで単一ピークを示す活性物質を充分量製造した。本物質(2A-1)はグルカンを主鎖とし、若干のアラビノース、ガラクトース鎖を持つ多糖体と考えられた。しかし、2A-1をグルコアミラーゼでグルカン部を加水分解しても、なお原物質と同一分子量の画分に、より強い活性を認めたので、2A-1は単純グルカンと活性多糖体(2A-1-AGと仮称)との混合物であることが明らかとなった。2.2A-1-AGの性状:水に可溶な白色粉末で、分子量は約1,500,000。加水分解するとアラビノース、ガラクトース(13:75の比)と少量のグルコースを与える。更に炭素-13核磁気共鳴、糖の配列分析、部分加水分解などの結果により、2A-1-AGは1、3及び1、6ガラクタンを主鎖としこれにアラビノフラノース鎖が結合したアラビノガラクタンであると考えられた。構造の最終的決定、生体防御機構活性化作用については61年度引き続き研究される予定である。

3.以上のようなグルカンとアラビノガラクタンの混合物の製造的規模での分離の予備的研究として、各種のアラビノシド、ガラクトシド、キシロシド、グルコシドのボレート:イオン交換モードの高速液体クロマトグラフを検討し、好結果を得た。その高分子化合物への応用研究は61年度に予定されている。4.2A-1-AGの構造研究に関連して、各種のアラビノフラノシドの合成とその炭素-13核磁気共鳴スペクトルの規則性研究を行なった。60年度において、三七人参の生体防御機構活性化多糖体を、半硬質の親水性ポリビニルゲル、それにイオン交換性を持たせた担体、更に親水性ポーラスポリマー樹脂を用いた高速液体クロマトグラフで分離し、更にグルコアミラーゼで処理して、サンチナン-Aと命名した活性多糖体を分離した。1.三七人参の生体防御機構活性化多糖体の研究:今年度はこのサンチナン-Aの化学構造を次のように決定した。本物質はガラクトースとアラビノース(3.3:1.0)で構成され、ゲルろ過法で測定した分子量は1.600,000である。更に、メチル化分析、C=13NMR、スミス分析等の結果、β-1,3-ガラクタンを主鎖とし、その6位に6-α-アラビノフラノシル-β-1,3-ジガラクトピラノシル残基を持つ多糖体であることを明らかにした。本物質はラットを用いたカーボンクリアランス試験で極めて強い活性を示し、三七人参の血液浄化作用・生体防御機構活性化作用に重要な役割を持つものと考えられた。2.竹節人参,薬用人参の生体防御機構活性化多糖体の研究:今回研究された多糖体の製造的分離の手法を用いて、竹節人参よりカーボンクリアランス試験で強い活性を示す多糖体3種を分離した。その内の一つはβ-1,4-ガラクタンであり、一つはその6位に5-α-アラビノフラノシル-α-アラビノフラノシド分枝を持つ多糖であることを明らかにした。薬用人参からも上述の手法を用いて、活性多糖体を得たが、三七人参とは異なり、その構成糖は遙かに複雑である。人参属植物において三七人参と薬用人参とはサポニン組成に関しては近似しているが、多糖体成分では何成りの差があることが証明され、今後の研究に方向性を与えることができたと考える。
新規フォトクロミック化合物の創成と高密度記録媒体への応用

1つの分子中に複数のフォトクロミック部位を導入した新規化合物による多重記録媒体の創成とマルチアドレスシステムの構築を目的として、スピロピラン(Sp)とアゾベンゼン(Az)をカップリング反応させて4種類の新規フォトクロミック色素(SpAz)を合成した。また、SpAzのフォトクロミック挙動をピコ秒蛍光寿命測定を用いることによって、SpとAz間における相互作用の有無について解明を行った。さらにSpAzの最適化を行うことでSpAzの両分子間の距離よりも個々の分子SpとAzの吸収スペクトル領域とモル吸光係数に依存することを突き止めた。Spの光異性体の熱安定性を改善するためカルボキシル基を導入した新規Sp誘導体も合成した。この化合物は、シリカをマトリックスとすることで、これまで報告されたSp類の退色反応の半減期と比較して5倍高い熱安定性を示し、そのメカニズムの解明を行った。この結果、分子構造の依存性よりシリカマトリックスの転化による未縮合の水酸基が大きく影響していることを突き止めた。また、安定化した薄膜の屈折率測定を行い、記録材料として十分な機能を有していることが分かった。蛍光色素とフォトクロミック色素を積層することにより単一紫外光による記録の書き込み、消去にも成功した。今回合成した新規フォトクロミック色素は、固体膜中でも効率良く異性化し、光スイッチングや光記録素子創成に向けて有用な知見を得た。1、種々の多重記録が可能と考えられるフォトクロミック色素の合成に成功した。2、得られたフォトクロミック色素の有機溶媒中での熱安定性を確認した。合成された化合物は、安定な状態としてスピロピラン部位が閉環体、アゾベンゼン部位がトランス体であった。この化合物のクロロホルム溶液に約400nmの紫外光を照射するとアゾベンゼン部位のシス-トランス異性化に帰属するスペクトル変化が認められ、約300nmの紫外光を照射した時は、新たにスピロピラン部位の開環体への異性化に帰属する吸収が認められ、個々の部位における光異性化を確認した。しかし、この変化を同時に起こすことは出来なかった。そこで、新たに分子間のスペーサーの長さを変え、個々のエネルギー移動をトラップする化合物を合成した。その結果、波長を選択することにより、これらの異性化を同時に誘起することに成功した。この結果は、論文に報告済みである。3、高分子マトリックス中での安定性を検討した。高分子マトリックスとしてPMMAを用い測定を行った。PMMA中では、アゾベンゼン部位のシス-トランスの異性化が起きにくかった。なぜなら、シス-トランス異性化を行うためには、マトリックス中で大きな自由体積を必要とするからである。そこで、液状ゴムをマトリックスに用いることによって僅かにシス-トランス異性化を起こすことに成功し、その問題を解決した。4、ラングミュア-ブロジェット(LB)法により膜を作製し記録の高密度化を検討し、紫外可視吸収測定等を行い試料の十分な評価を行った。液状ゴムをマトリックスに用いた時の結果と同様にシス-トランス異性化は僅かしか起きなかった。しかし、LB膜中では、スピロピラン部位の開環体の熱安定性が大幅に向上したことにより、会合体を形成したという新しい知見を得ることが出来た。1つの分子中に複数のフォトクロミック部位を導入した新規化合物による多重記録媒体の創成とマルチアドレスシステムの構築を目的として、スピロピラン(Sp)とアゾベンゼン(Az)をカップリング反応させて14種類の新規フォトクロミック色素(SpAz)を合成した。SpAzのフォトクロミック挙動は、SpとAz間に導入するスペーサ鎖の鎖長および導入する官能基の種類に依存していた。また、蛍光スペクトル測定によりマルチフォトクロミック挙動の一次スクリーニングをする手法を確立した。最適化した分子はポリメチルメタクリレート中に均一に分散し、照射する紫外光の波長により固体膜中で逢択的に3種の異性体を形成した。単一分子で初期構造を含む4種類の信号の取り出しに成功した。また、従来困難とされていたSpの光異性体の熱安定性を改善するためカルボキシル基を導入した新規Sp誘導体も合成した。この化合物は、シリカをマトリックスとすることで、これまで報告されたSp類の退色反応の半減期と比較して5桁高い熱安定性を示した。一方、可視光により速やかに初期状態に戻り、Sp分子による記録の安定保持に成功した。さらに、蛍光色素とフォトクロミック色素を積層することにより単一紫外光による記録の書き込み、消去にも成功した。

この化合物は、シリカをマトリックスとすることで、これまで報告されたSp類の退色反応の半減期と比較して5倍高い熱安定性を示し、そのメカニズムの解明を行った。この結果、分子構造の依存性よりシリカマトリックスの転化による未縮合の水酸基が大きく影響していることを突き止めた。また、安定化した薄膜の屈折率測定を行い、記録材料として十分な機能を有していることが分かった。蛍光色素とフォトクロミック色素を積層することにより単一紫外光による記録の書き込み、消去にも成功した。今回合成した新規フォトクロミック色素は、固体膜中でも効率良く異性化し、光スイッチングや光記録素子創成に向けて有用な知見を得た。
遺伝子組み換えによって得た融合蛋白質の構造とその熱安定性機構の研究

本研究は酵素の熱安定性を構造化学的に研究し、蛋白質工学等の手法により有用な分子を作り工業的に利用するための基本的原理を明らかにすることを目的とした。このため、3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を対象として選び、高度好熱菌由来の分子及び種々の割合で常温菌由来の分子と融合したキメラ酵素とこれらの変異体の立体構造を高分解能で精密に決定した。いづれもデータは1.9A分解能まで測定し精密化は2.1A分解能で行った。分子は同じ副単位が会合した二量体で、個々の副単位は2個のドメインから成立っていた。副単位の構造は、基本的にはα/βバレル構造で10本のβ構造が分子の中央部のβシートを形成しそのまわりをαヘリックスが取り囲んでいた。このうち一本のβ構造は分子の外に張り出しており副単位間の相互作用に役立っていた。他の分子もほゞ同じ構造をしていたが、4M6Tのキメラ分子は好熱菌の酵素と0.75Å,2T2M6Tと0.34Aの平均のずれがみられた。大きな構造変化は主として80,112番近辺に共通してみられた。これらの場所は二つのドメインの間で活性に関与すると考えられている部位なのでその構造変化が耐熱性に影響しているものと考えられる。耐熱性を獲得したI93L-2T2M6Tからペプチド鎖と側鎖との相互作用による歪みを解消することにより、また、S82R-2T2M6Tでは分子表面に新たに導入された水素結合によりループ部分が固定され耐熱性が回復したことをみいだした。これらの結果を踏まえ、熱安定性に関する理論的な検討を行い、キメラ分子のような多くのアミノ酸置換ではエントロピーが安定性に寄与していることをみいだした。しかし、詳細な検討のためには更に多くの分子構造を決定する必要がある。改変蛋白質の構造研究として本研究においてN末端側の1/3が常温菌Bacillus subtilis由来、C末端側の2/3が高度好熱菌Bacillus thermophilus HB8である融合遺伝子から3ーイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(キメラIPMDH)を作製し、その結晶構造解析を進めている。酵素の精製は、遺伝子を組み込んだ大腸菌を培養し、超音波処理によって破砕し60°Cで熱処理を行った後に、DEAEーSephacel、ButylーToyopearl、DEAEーToyopearlのカラムを通し、HPLCあるいは塩分画法によって行った。得らたた試料は比活性において熱処理後の15倍に達し結晶化に十分な純度であった。結晶化は蛋白質濃度10mg/ml、20mMリン酸緩衝液(0.5M硫酸アンモニウム、pH=7.6)のdropletを1.6M硫酸アンモニウム(pH=7.6)のreservoirにたいして蒸気拡散法によって平衡化することによって行った。得られた結晶は板状の小さいものであった。プレセッション写真および放射光による振動写真から、結晶は単斜晶系に属し、空間群P2_1、a=81.5(〕.SY.Angstrom.〔)、b=83.4Å、c=62.7Å、β=109°と決定できた。しかし、この結晶では高分解能の回折点が得られなかったのでより良好な結晶を得るための条件検索を更に行った。その結果、reservoirのpHを酸性側(pH=6.0)にすることによって六角両錐形の結晶を得ることに成功した。この結晶は長さが0.3mmから大きいもので1.5mmにも達しX線結晶解析には十分な大きさをもっていた。