hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
石灰化組織のハイドロキシアパタイト結合タンパク質のアパタイト結合ドメインの同定

1.プロテアーゼ消化によるハイドロキシアパタイト結合部位の検索骨や歯の基質中に存在するハイドロキシアパタイト結合タンパク質を、合成アパタイト結晶に吸着させてプロテアーゼ消化をおこなった。材料として用いたのは、象牙質に特有のリン・タンパク質であるフォスフォフォリンと骨の酸性糖タンパク質であるオステオネクチンである。フォスフォフォリンは多量のリン酸基によって修飾されているために、プロテアーゼに対して抵抗性を持つ。しかし、アパタイト結晶に吸着した状態では、プロテアーゼによって消化されたので、結晶表面上ではポリペプチド鎖が伸展した構造をとり、プロテアーゼ感受性部位が露出すると考えられる。一方、オステオネクチンをアパタイト結晶に吸着させてプロテアーゼ消化をおこなうと、分解されて、ドメイン1と2を含むフラグメントが結晶に吸着したままの画分に回収された。このことはアパタイト結晶結合部位がこれらのドメインの内部にあることを示している。2.ハイドロキシアパタイトに親和性を持つ合成ペプチドの作成上記のオステオネクチンのドメイン1にはGluに富む配列が存在する。また、フォスフォフォリンその他のアパタイト結合タンパク質にはAspやGluの連続配列が存在して、アパタイト結晶への結合部位であると想像されている。そこで、これらの配列のモデルとして、GluまたはAsp6残基よりなるペプチドを合成して、そのアパタイト結晶への親和性を測定した。これらのペプチドは10^6M^<-1>という高い親和性で結晶に結合した。したがって、これらの酸性アミノ酸連続配列がアパタイト結晶結合部を構成すると考えられる。1.主要な石灰化組織酸性基質タンパク質のハイドロキシアパタイト結合ドメインの同定骨の主要な酸性基質タンパク質であるオステオネクチンに関してハイドロキシアパタイト結合部位の検索をおこなった。オステオネクチンを、ハイドロキシアパタイトに吸着させたまま、プロテアーゼ消化をおこない、電気泳動およびクロマトグラフィーで分析した。その結果、ドメインIおよびIIを含むフラグメントが吸着されたまま残った。ドメインIにはグルタミン酸に富むカルシウム結合部位が存在するので、従来から想像されている通り、このドメインがハイドロキシアパタイト結合部位を含むと考えられる。2.酸性基質タンパク質のハイドロキシアパタイト結晶上での結合状態の観察。象牙質に特有のリンタンパク質であるフォスフォフォリンをハイドロキシアパタイトに結合させ、プロテアーゼ消化をおこなって、それに対する感受性から立体構造を推定した。フォスフォフォリンは、多量に存在するリン酸基のために、遊離の状態ではプロテアーゼに対して抵抗性を示す。ハイドロキシアパタイトに吸着した状態ではプロテアーゼに対して感受性を示すようになった。このことは、フォスフォフォリンは、溶液中では折れたたまれた構造をとっているが、アパタイトの表面上では伸びた構造をとって、プロテアーゼ感受性部位が露出していることを示している。これに対して、オステオネクチンの場合はアパタイトとの結合によって、逆にプロテアーゼに対する抵抗性が増加した。しかし、アパタイト結晶に吸着した状態では、プロテアーゼによって消化されたので、結晶表面上でポリペプチド鎖が伸展した構造をとり、プロテアーゼ感受性部位が露出すると考えられる。2.ハイドロキシアパタイトに親和性を持つ合成ペプチドの作成

上記のオステオネクチンのドメイン1にはGluに富む配列が存在する。また、フォスフォフォリンその他のアパタイト結合タンパク質にはAspやGluの連続配列が存在して、アパタイト結晶への結合部位であると想像されている。そこで、これらの配列のモデルとして、GluまたはAsp6残基よりなるペプチドを合成して、そのアパタイト結晶への親和性を測定した。これらのペプチドは10^6M^<-1>という高い親和性で結晶に結合した。したがって、これらの酸性アミノ酸連続配列がアパタイト結晶結合部を構成すると考えられる。
ケーススタディによる看護分野における国際協力活動に必要な基本的ファクターの研究

1.本研究の対象者は、国際協力事業団の協力を得て、青年海外協力隊に参加している平成9年度2次隊(平成9年12月赴任)から平成10年度1次隊(平成10年度7月赴任)までの保健婦隊員16名である。研究対象者の派遣地域別人数は、アジア・中近東地域5名、アフリカ地域7名、中南米地域4名である。派遣前には、対象者全員に研究者が面接調査を行い、対象者の背景についての基礎データを得ている。2.対象者が任地へ派遣後は、質問紙を45ヶ月ごとに送付し返答を得ている。一部質問紙が届かなかったり、返送されなかったことがあったが、概ね順調に返答を得ている。調査内容は、活動中期後半期における具体的なアクションプランの計画・実施・評価という国際協力活動の保健看護過程に焦点をあている。3.平成11年12月下旬に、平成9年度2次隊の3名が帰国し、2名は面接調査を行った。1名は帰国後面接を行い、1名は帰路変更途中に、研究協力者がタイで面接した。残りの1名については、日程調整が困難になったため、郵送による調査とし、返答を得ている。帰国時の調査では、活動の評価、対象者にとっての活動の意味や今後の展望などとした。4.平成9年度3次隊は、3月下旬から4月に帰国予定であり、帰国後の面接を予定している。2名の任期延長が決定しているため、引き続き調査する。また、平成10年度1次隊の帰国予定が平成12年7月頃になり、郵送による質問紙調査を次年度も引き続き継続する。5.看護職が国際協力活動を行うにあたって、初期における生じやすい困難さや対処について分析中であり、今後さらに縦断的あるいは、横断的に分析を行う予定である。今年度は、前半で、資料収集および国際協力事業団の協力、同意を得て、本研究の対象者の把握を行い、今年度後半からケーススタディのための調査を実際に開始した。研究の実施結果は以下のとおりである。1)現在、プライマリヘルスケア、国際保健に関する海外の文献を収集し、文献にみられる動向や共通の要素および、課題について分析を行っている。2)資料・情報を収集する中で、青年海外協力隊でプライマリヘルスケア領域に従事する看護隊員は、近年、保健婦、看護婦、助産婦と職種の広がりをみせていることがわかった。そこで、本研究では、対象者を国内外でプライマリヘルスケア領域に従事してきた歴史が長い保健婦にしぼることにし、青年海外協力隊報告書等から活動経過の共通性をさぐった。3)国際協力事業団から今後派遣される予定の青年海外協力隊の保健婦隊員の紹介を受けた。該当する対象者は平成9年度2次隊(平成9年12月派遣)3名と平成9年度3次隊(平成10年度4月派遣)5名であり、合計8名の協力を得ることができた。これは当初予定していた対象者数に近い。派遣前訓練の期間中に、協力を得られた8名全員に対象者の背景調査を行い、データを収集した。現在、すでに派遣が行われている3名については、派遣約1ヶ月後に質問紙を郵送し、返答を得ている。今後、任国における初期適応について関連すると思われる事柄を分析していく。なお、来年度前半(平成10年度1次隊、平成10年7月派遣)で67名の対象者を見込んでおり、本研究の対象者は合計15名程度となると考えている。郵送による質問紙調査はおおむね34ヶ月に1度の割合で経過を追っていく予定である。1.今年度も前年度に引き続き、国際協力事業団の協力で、青年海外協力隊員として派遣される保健婦8名の研究対象者が得られた。その結果、本研究の対象者は平成9年度2次隊(平成9年12月赴任)から平成10年度1次隊(平成10年7月赴任)までの保健婦隊員計16名となった。対象者全員に研究者が面接を行い、対象者の背景についての基礎データを得ている。2.対象者が任地へ派遣後は、質問紙を45か月ごとに送付し、順調に返答を得ている。調査頻度については、対象者の負担や郵便事情等を考慮し、予定より1か月間、調査間隔を遅らせた。現在、平成9年12月に派遣された対象者へは第4回目の質問紙を送付し終えている。3.今年度末で対象者全員の赴任後から約半年間の活動経過に関するデータが入手できるので、看護職(地域保健分野)が国際協力活動を開始するにあたって生じやすい困難さや、対処についての分析を行う予定である。4.来年度も引き続き、郵送による質問紙調査を継続する。来年度は特に活動後半の時期に展開される具体的な保健看護活動の過程に焦点をあてて、調査していく予定である。

一部質問紙が届かなかったり、返送されなかったことがあったが、概ね順調に返答を得ている。調査内容は、活動中期後半期における具体的なアクションプランの計画・実施・評価という国際協力活動の保健看護過程に焦点をあている。3.平成11年12月下旬に、平成9年度2次隊の3名が帰国し、2名は面接調査を行った。1名は帰国後面接を行い、1名は帰路変更途中に、研究協力者がタイで面接した。残りの1名については、日程調整が困難になったため、郵送による調査とし、返答を得ている。帰国時の調査では、活動の評価、対象者にとっての活動の意味や今後の展望などとした。4.平成9年度3次隊は、3月下旬から4月に帰国予定であり、帰国後の面接を予定している。2名の任期延長が決定しているため、引き続き調査する。また、平成10年度1次隊の帰国予定が平成12年7月頃になり、郵送による質問紙調査を次年度も引き続き継続する。5.看護職が国際協力活動を行うにあたって、初期における生じやすい困難さや対処について分析中であり、今後さらに縦断的あるいは、横断的に分析を行う予定である。
喉頭顕微鏡下手術(LMS)の基本理論の研究

音声外科は主に喉頭顕微鏡下手術の手法,あるいは他の内視鏡手術によって行われることが多い。そして患者は主として声を職業的に用いる立場の人がほとんどである。従ってもしも手術に失敗すると患者に与える影響は多大なものがある。声帯は小さく且つ微妙な器官である。特に発声中の声帯は高速に振動し,その基本は粘膜波動である。この超高速波動が起きるための重要な条件は粘膜に正常な柔らかさがあることである。しかし手術が行われると多かれ少なかれ,瘢痕が形成される。そのためこの手術はこの瘢痕形成を出来るだけ少なくすることである。まず粘膜波動の起こる部位についての研究が行われ,いわゆる声帯遊離縁を中心として粘膜波動が生じているのであり,声帯下面及び上面については無視はできないが過度の操作は必要でなく,とりあえずは遊離縁の粘膜を十分に保護しつつの手術操作が強く望まれるとした。以上の観点から声帯の手術操作はその回数が少なければ少ないほど望ましいと主張し,そのための基本手術操作,手術器具の選択についての論文を発表している。1.喉頭鏡の操作について:的確な角度と固定される深さが適性であることが必要で,一回の鉗子操作で摘出可能な声帯ポリ-プでも手術視野に間違いがあると数回の操作が必要となり,ある場合は泥沼に陥ることもあるとした。2.器具の選択について:この手術は確かにマイクロサージャリーであるが,だからといって常に小さな器具を選択する必要はないとした。すなわち相手に応じた器具を用いるべきで大きな声帯ポリ-プならば一回操作で摘出すべく大きな鉗子を選ぶべきでありとも述べた。特に絞断器の使用を進めている。この器具は繊細な微細手術にはなじまないように見えるが以後の手術操作の回数を減らすのに絶大な威力を発揮する。しかも無理ない絞断器の操作で遊離縁の粘膜は自然に逃げて保存されることを実際に示した。
キュバン型混合金属クラスター錯体の集積化

私たちは硫黄架橋不完全キュバン型モリブデン錯体[Mo_3S_4(H_2O)_9]^<4+>を原料とし、水溶液中および非水溶媒中での研究を行ってきた。このたび、上記錯体の塩化物[Mo_3S_4(H_2O)_9]Cl_4・nH_2O(A)および関連化合物を水素気流中で高温加熱することにより新しい反応を見出した。すなわち、Aの加熱により層状化合物MoS_2が生成し、また、錯体Aの代わりにモリブデンとニッケルを含むキュバン型混合金属錯体[Mo_3NiS_4(H_2O)_<10>]Cl_4・nH_2O(B)を用いるとシェブレル化合物Ni_2Mo_6S_8(C)になることを見出した。さらに興味深いのは錯体Aとニッケル粉末を混合し、加熱してもCが生成することである。この発見をもとにAとNi以外の各種金属粉末からもシェブレル化合物が得られた。すなわち、Aと金属粉末を混合し、ペレット状にして水素気流下で徐々に温度を上げ500900°Cの任意の温度で数時間保持した後、徐冷した。粉末X線回折で同定し、直流四端子法で電気抵抗測定を行なった。これまで試みた金属は鉄、コバルト、銅、カドミウム、銀、スズ、鉛であった。加熱温度により生成物が異なることも明らかになった。希土類元素に関しても検討を行なっている。シェブレル化合物はMo_6S_8骨格を持ちその多くは超伝導など興味ある物性を示す。従来の合成法に比べ今回見出したシェブレル化合物の新規合成法の特長は、短時間かつ操作が容易なことである。
インディカ米飯の弱い粘り(パサパサ)を発現する澱粉の生合成酵素系の解析

インディカ米を炊飯するとパサパサとして粘りがない。われわれは、インディカアミロペクチン分子には、ジャポニカには見られない特異な構造、すなわちアミロース様の長い側鎖(最長鎖)が組込まれていることが、その原因であることを示唆した。ここでは、この特異な構造の成因を明らかにするために、分岐をつくる枝つくり酵素をインディカ(西海184号)とジャポニカ(西海194号)の稲胚乳から精製して枝つくり作用を調べた。まず、西海184号と西海194号の稲胚乳澱粉のアミロペクチンの分子構造を分析した。最長鎖画分は、西海184号と西海194号で13と1%で、短鎖画分は、西海184号が64%、西海194号が74%であった。このようにインディカはジャポニカに比べて、最長鎖が非常に多く、短鎖が少ないことを確認した。次に、これら2種の稲胚乳(開花後20日)の枝つくり酵素の活性染色から、西海184号、西海194号ともに2種のアイソフォームがあり、量的に異なることを認めた。さらに、主成分の酵素画分をButyl-Toyopearl 650S、DEAE-Sepharose FF、Mono Q、Superose12、Amylose-Sepharose 6Bのクロマトグラフィーで精製し、アミラーゼ活性を含まない高度に精製した酵素標品を得た。これらの酵素標品は、ホスホリラーゼ活性促進法と分岐結合測定法による活性比はほぼ同じで、枝つくり作用は、いずれも長い側鎖を優先的につくる酵素であった。今後、副成分の酵素も精製し、結果を総合してアミロペクチンの分子構造との関係を考察したい。この技つくり作用は、トウモロコシ胚乳の2種の酵素のうちのBEIに類似するが、生じた短鎖の重合度分布が明らかに異なった。また、トラマメ種子に唯一存在する短い側鎖を優先的につくる酵素と異なった。これらは、植物種で枝つくり酵素の枝つくり作用が異なること示し、アミロペクチンの分子構造が植物種で個性のあることと関連して興味ある結果である。インディカ米飯はパサパサとして粘りがない.これは,アミロペクン分子にアミロース様の特異な構造(最長錯画分,LC+B4)が組込まれていることが原因であることを申請者は明らかにした.本研究では,この特異な構造の成因を明らかにするために,まず6種のコメアミロペクチンの分子構造を調べた後,インディカ種として西海184号を選び,ジャポニカ型の西海194号を対照として,それぞれの稲胚乳(開花後20日)から枝つくり酵素の精製を進めている.(1)アミロペクチンの分子構造の分析6種のコメから澱粉を調製し,分別して得たアミロペクチンの分子構造を分析した結果,西海184号では,最長錯画分(LC+B4,13%w/w)が最も多く,短錯画分(B1+A,64%)が最も少なかった.

一方,西海194号は,前者(1%)が最も少なく,後者(74%)が最も多かった.枝つくり酵素の精製西海184号と西海194号の稲胚乳から酵素を抽出し,硫安分画後,butyl-Toyopearlを用いてクロマトを行ったところ,2成分(F1,F2)に分画された.F1画分は,さらにDEAE-Sephadex FFで3成分(F1a,F1b,F1c)に分画された.西海184号は,西海194号と比べてF1aが多く,F1bとF1cが少ないという新しい知見を得た.このことから,アイソフォームの活性比の相違でアミロペクチンの分子構造が異なるることが示唆される.本酵素は,失活しやすく,この安定化剤として高濃度グリセリンを見つけるのに時間を要したが,今後これら画分の精製をさらに続け,枝つけ作用の特異性を調べて明確にしたい.インディカ米を炊飯するとパサパサとして粘りがない。われわれは、インディカアミロペクチン分子には、ジャポニカには見られない特異な構造、すなわちアミロース様の長い側鎖(最長鎖)が組込まれていることが、その原因であることを示唆した。ここでは、この特異な構造の成因を明らかにするために、分岐をつくる枝つくり酵素をインディカ(西海184号)とジャポニカ(西海194号)の稲胚乳から精製して枝つくり作用を調べた。まず、西海184号と西海194号の稲胚乳澱粉のアミロペクチンの分子構造を分析した。最長鎖画分は、西海184号と西海194号で13と1%で、短鎖画分は、西海184号が64%、西海194号が74%であった。このようにインディカはジャポニカに比べて、最長鎖が非常に多く、短鎖が少ないことを確認した。次に、これら2種の稲胚乳(開花後20日)の枝つくり酵素の活性染色から、西海184号、西海194号ともに2種のアイソフォームがあり、量的に異なることを認めた。さらに、主成分の酵素画分をButyl-Toyopearl、DEAE-Sephadex FF、Mono Q、Superose12、Amylose-Sepharose 6Bのクロマトグラフィーで精製し、アミラーゼ活性を全く含まないほぼ均一な酵素標品を得た。これらの酵素標品は、ホスホリラーゼ活性促進法と分岐結合測定法による活性比は同じで、枝つくり作用は、いずれも長い側鎖を優先的につくる酵素であった。今後、副成分の酵素も精製し、結果を総合してアミロペクチンの分子構造との関係を考察したい。この枝つくり作用は、トウモロコシ胚乳の2種の酵素のうちのBEIに類似するが、生じた短鎖の重合度分布が明らかに異なった。また、トラマメ種子に唯一存在する短い側鎖を優先的につくる酵素と異なった。これらは、植物種で枝つくり酵素の枝つくり作用が異なること示し、アミロペクチンの分子構造が植物種で個性のあることと関連して興味ある結果である。
悪性黒色腫の発癌におけるFHIT癌抑制遺伝子の関与について

本年度当初は、前年度に引き続き悪性黒色腫組織の収集を行っていたが、研究代表者の宮村が平成10年4月1日に秋田大学医学部皮膚科から名古屋大学医学部皮膚科に転任することになり・これに伴い使用予定の組織の大部分と実験に用いる機器の多くを失ってしまった。現在の名古屋大学医学部皮膚科において新たに悪性黒色腫患者の手術標本を収集し、研究材料となる組織を再度集めている状態である。今後充分量の材料が集まった段階で新たにFHIT遺伝子の解析を進める。資料収集の期間、止むを得ず平行して進めていた遺伝性対側性色素異常症(Dyschromatosis Symmetrica Herditaria,以下DSHと略す。)原因遺伝子座位の解明を中心に研究を行うことになった。この研究は、染色体上に散らばっているマイクロサテライトマーカーとDSH発症が、家系内で関連して遺伝しているかどうかを調べられる連鎖解析法を用い、DSHの原因遺伝子座位を明らかにするため行われた。その結果、半分以上の染色体においてDSHとの連鎖がないことを明らかにするとともに、以前に何らかの関連が疑われていたIdiopathic Torsion DystoniaとDSHの間に遺伝的関連が無いことも証明した。これらの結果は平成10年に行われた第97回日本皮膚科学会総会、日本人類遺伝学会第43回大会で発表を行った。また現在Journal of Dermatological Scienceに投稿しており、minor changeによりAcceptされることが確実な状況になっている。現在、検体を集めている最中である。組織採集に続いてのDNA,RNAの抽出及びLOHの検出に関しては、保留している。これには以下に述べる問題が関与している。1検体数の不足:本研究を行うため手術等で得られた組織を採集しているが、まだ数検体程度であり実験をするのに十分な量が採取できていない。またパラフィン包埋ブロックに関しても本研究に使用できるような状態の良いものは少ない。2悪性黒色腫組織の単離が困難:手術等で得られた悪性黒色腫組織は肉眼で正常組織との分離を行っているが、そのまま使用すればかなり大量の正常細胞が混入することが考えられる。このためDNA抽出前に悪性黒色腫組織の単離を行わなければならない。単離の方法としては、悪性黒色腫細胞表面に提示された特異的抗原を標的とする抗体を用い、フローサイトメトリーまたはマグネチックセルソータによって悪性黒色腫細胞のみを分離する方法、一次培養してメラノサイト由来の細胞以外の細胞を除去する方法がある。しかしいずれの方法も、使用する組織の量、回収の効率等に問題があるため現時点で使う事はできない。また、パラフィン包埋組織は、その保存期間に応じて回収できるDNAの長さ、量共に変化する。新しい組織だけでは検体数が不足するため、古い組織からも長い断片のDNAを効率良く回収する方法を検討中であるが、いまだ良い方法が見つからない。これらの問題の解決は困難を究めるが、自ら実験方法を開発すると共に文献を中心に情報収集を行うことで何とかしたいと考えている。DNA,RNA抽出後の実験法については既に確立されていることから、上記問題の解決後は順調に研究が進むと思われる。
胆汁の発癌性の研究ー逆流による胃発癌

胆汁を含む十二指腸液の胃癌発生について実験的に検討した。使用した動物はラットとビ-グル犬で、1)十二指腸上部と空腸上部を切断の後、十二指腸肛門側断端を盲端とし、空腸口側断端を胃体部に吻合し、十二指腸口側断端と空腸肛門側断端と吻合する(胆汁を含む十二指腸液が胃体部に流入し、胃内容は幽門、十二指腸から空腸へ排出される)、2)空腸上部を切断の後、その口側断端を盲端とし、空腸肛門側断端を胃体部に吻合する(胆汁は十二指腸から胃に逆流し、胃内容は胃体部から空腸へ排出される)、2種類の手術を施行し術後75週と100週で胃癌の発生率と癌の特性を調べた。75週と100週での胃癌の発生率は1の手術で43%、2の手術で68%で、癌は1の手術では胃体部吻合部、2の手術では幽門輪に近い部位に発生した。癌の組織型(腺癌)は1群と2群で差はなく、胃癌は濃厚な胆汁に曝される部位に生じていた。胆汁を含む十二指腸液の逆流で誘発した腫瘍の特性を、その浸潤性、ヌ-ドラットへの可移植性とrasの発現から調べてみた。その結果、術後100週飼育した2群の20匹のラットのうち3例に他臓器への浸潤癌を認めた。3例の癌をヌ-ドラットに移植したが、生着をみなかった。3例の腫瘍でrasの発現をp21に対する免疫組織化学で調べると、2例(66%)に発現をみた。これらの結果から、この腫瘍が悪性であることが確かめられた。ビ-グル犬2頭に1の手術、3頭に2の手術を施行し、現在経過観察をしているが、胆汁に曝される胃粘膜に前癌病変といわれる嚢胞状過形成性腺管が術後50週と75週に観察されている(犬についてはまだ癌の発生をみていない)。さらに、今年度は、十二指腸液に流入する胆汁と膵液を分離する手術を行い、それぞれの胃癌発生の有無を調べる実験と、胆汁を含む十二指腸液をラットの前胃に流入させ、前胃(ヒトの食道に相当)に癌発生について調べる実験を行っている。
難治性多発性骨髄腫のヒト化抗CD26モノクローナル抗体を用いた分子標的療法の開発

14種類の骨髄腫細胞株を用い、Hoechst33342による染色により、各々のSP分画の割合をフローサイトメトリー(FCM)を用い解析を行ったところ、2種類の細胞株において、SP細胞の存在が認められた。そこで、これら、SP分画を有する骨髄腫細胞株2株を用い、破骨細胞と共培養を行い得られた骨髄腫細胞におけるSP細胞、MP細胞のCD26発現についてFCMを用い、解析を行なったところ、双方ともにCD26陽性で、SP細胞では、MP細胞と較べCD26発現が増強することがわかった。これらの細胞株にレブラミド(0.5μM, 5μM)添加を行い、SP細胞の割合の変化をFCMを用い解析したところ、いずれの株でもSP細胞の割合の減少は認められなかった。次に、E/T比10でヒトNK細胞添加下、ヒト化抗CD26モノクローナル抗体10μg/ml添加を行うと、双方の株でSP細胞の割合は減少し、レブラミドと抗CD26抗体の併用投与を行うと、SP細胞の割合はさらに、著明に減少することが明らかとなった。次に、骨髄微小環境を構成する骨髄間質細胞と共培養を行った骨髄腫細胞株のCD26発現を免疫蛍光染色を用い、調べたところ、CD26発現が亢進することがわかった。そこで、Caclein-AMでラベルした3種類のCD26+骨髄腫細胞株を間質細胞で覆われたプレートに添加し、各濃度の抗CD26抗体添加を行い、4時間後に非接着系細胞を除去し、接着細胞の蛍光強度をプレートリーダーを用い測定を行った。すると、いずれも細胞も抗体濃度依存性に、間質細胞との接着能の低下を認めることがわかり、CD26抗体はCD26+骨髄腫細胞と間質細胞の接着阻害に関与することが明らかとなった。当初の予定とは少し異なるが、非常に興味深い結果であるため、最終的に得られる科学的な価値は高いと考えている。多発性骨髄腫の再発・治療抵抗性の原因として、骨髄腫幹細胞の存在や、抗体療法継続による骨髄腫細胞の表面抗原の発現変化との関連について解析を行い、新規抗体療法の有用性および機序について解析を行う。さらに、臨床サンプルを使用した骨髄腫細胞のCD26発現と臨床予後との関連についての解析も予定している。多発性骨髄腫は、骨髄内で骨髄腫細胞と破骨細胞は、相互に増殖および;活性化を促進し、溶骨性骨破壊を進行させつつ腫瘍増殖を促進するという悪循環を形成することから、骨髄腫の治療開発では、抗腫瘍効果と骨破壊抑制効果の双方を兼ね備えた治療の開発が重要である。我々は、ヒト破骨細胞にCD26が機能的に発現し、ヒト化抗CD26モノクローナル抗体は、ヒト破骨細胞発生過程の破骨前駆細胞分化段階に作用し、成熟破骨細胞への分化を抑制する機序を初めて明らかにし、さらに、骨髄腫患者骨髄において、CD26陽性破骨細胞・血管内皮細胞近傍にCD26陽性骨髄腫細胞が存在することを初めて見出した本研究では、骨髄腫の病的骨髄微小環境において、破骨細胞や間質細胞との共存における骨髄腫細胞のCD26発現と機能を解明することにより、骨髄腫における腫瘍進展および骨髄腫細胞が及ぼす骨代謝制御機構を明らかにすることを本研究の目的とした。まず、骨髄腫の病的骨髄微小環境(腫瘍ニッチ)の主要な構成細胞である破骨細胞や骨髄間質細胞との共存による、骨髄腫細胞のCD26発現の変化を調べたところ、骨髄腫細胞12株を用いた解析では、単独培養では、細胞の発現は陰性もしくは、弱陽性であったのに対し、破骨細胞や間質細胞との共培養を行うと、骨髄腫細胞のCD26発現は増強し、陽性となった。CD26は広汎なヒトがん細胞に発現し、がん発症に関連することから、骨髄腫でも、CD26が分子標的療法の治療標的となる可能性がある。この現象がいかなる機序によってもたらされ流のか、抗CD26抗体による治療の有用性と共に、今後明らかにしていきたい。今年度は、ハイリスク骨髄腫細胞株5種を用い、破骨細胞と共培養を行い得られたCD26陽性細胞にヒト化抗CD26モノクローナル抗体添加を行い細胞増殖に及ぼす効果について解析を行った。すると、抗体濃度10μg/ml以上の高濃度域において直接的な細胞増殖抑制効果を認めた。さらに、ヒト由来ナチュラルキラー(NK)細胞をエフェクター細胞として用い、抗体投与と同時に投与を行ったところ、エフェクター細胞/ターゲット細胞比(E/T比)依存性、かつ、抗体濃度依存性に細胞障害活性(ADCC効果)を認めた。一方、50%ヒト血清を補体ソースとして用い、CD26陽性骨髄腫細胞に、抗体と同時に投与を行うと、抗体濃度によらず、補体依存性の細胞障害活性(CDC効果)の有意な増加は認められなかった。次に、新規薬剤(プロテアソーム阻害剤:ベルケード、免疫調整薬:レブラミド)をCD26陽性骨髄腫細胞に添加し前処理を行なったのちに、ヒトNK細胞および抗体添加を行ったところ、抗体投与によるADCC効果は相乗的に増強することがわかった。レブラミド抵抗性株を用い、NK細胞をレブラミドで前処理後、CD26陽性細胞株に抗体投与を行った場合も、抗体単独投与時と比較し、ADCC効果は増強した。さらに、NOD/SCID

マウスを用い、皮下にヒト骨片を移植し2週後生着後、骨片内にCD26陽性骨髄腫細胞株の直接投与を行い、骨髄腫モデルマウス(NOD-SCID-hu)を作成した。4週後よりマウス腹腔内にCD26抗体投与(計12 dose)を行い、治療開始4週後に、皮下の骨片を回収し、病理学的解析を行った。すると、抗体投与群では、対照群と比較し、HE染色では腫瘍細胞は著明に減少し、抗体投与群では、対照群と比較し、CD26陽性骨髄腫細胞および、骨梁に沿って認められたTRAP陽性破骨細胞は減少し、抗腫瘍効果および溶骨性骨病変の改善が得られた。当初の予定とは少し異なるが、非常に興味深い結果であるため、最終的に得られる科学的な価値は高いと考えている。14種類の骨髄腫細胞株を用い、Hoechst33342による染色により、各々のSP分画の割合をフローサイトメトリー(FCM)を用い解析を行ったところ、2種類の細胞株において、SP細胞の存在が認められた。そこで、これら、SP分画を有する骨髄腫細胞株2株を用い、破骨細胞と共培養を行い得られた骨髄腫細胞におけるSP細胞、MP細胞のCD26発現についてFCMを用い、解析を行なったところ、双方ともにCD26陽性で、SP細胞では、MP細胞と較べCD26発現が増強することがわかった。これらの細胞株にレブラミド(0.5μM, 5μM)添加を行い、SP細胞の割合の変化をFCMを用い解析したところ、いずれの株でもSP細胞の割合の減少は認められなかった。次に、E/T比10でヒトNK細胞添加下、ヒト化抗CD26モノクローナル抗体10μg/ml添加を行うと、双方の株でSP細胞の割合は減少し、レブラミドと抗CD26抗体の併用投与を行うと、SP細胞の割合はさらに、著明に減少することが明らかとなった。次に、骨髄微小環境を構成する骨髄間質細胞と共培養を行った骨髄腫細胞株のCD26発現を免疫蛍光染色を用い、調べたところ、CD26発現が亢進することがわかった。そこで、Caclein-AMでラベルした3種類のCD26+骨髄腫細胞株を間質細胞で覆われたプレートに添加し、各濃度の抗CD26抗体添加を行い、4時間後に非接着系細胞を除去し、接着細胞の蛍光強度をプレートリーダーを用い測定を行った。すると、いずれも細胞も抗体濃度依存性に、間質細胞との接着能の低下を認めることがわかり、CD26抗体はCD26+骨髄腫細胞と間質細胞の接着阻害に関与することが明らかとなった。多発性骨髄腫における骨髄腫細胞、破骨細胞に発現するCD26を標的とした新規分子標的療法の有用性をその機序と共に検討し、免疫不全マウスを用いた解析も予定している。治療抵抗性多発性骨髄腫における骨髄腫細胞に発現するCD26を標的とした新規抗体療法の有用性について検討を行う。CD26発現が低下した骨髄腫に対する治療の打開策についても検討してを行う。多発性骨髄腫の再発・治療抵抗性の原因として、骨髄腫幹細胞の存在や、抗体療法継続による骨髄腫細胞の表面抗原の発現変化との関連について解析を行い、新規抗体療法の有用性および機序について解析を行う。さらに、臨床サンプルを使用した骨髄腫細胞のCD26発現と臨床予後との関連についての解析も予定している。H29年度の研究成果をまとめた論文が平成30年3月に発行され、投稿料の支払い(立替払い)が平成30年5月となる見込みである。フローサイトメトリーを用い、腫瘍細胞のソーテイング実験を行なう際の、機械使用料、技術料として使用するため、10万円の前倒し請求を行なった。
アルボウイルス感染に対するブユの感受性の検討

1.ブユのウイルス感染に対する感受性を検討する目的で、大分、熊本および神奈川の牛舎において採集したブユ8種2,584雌成虫個体の自然感染を調べた。採集したブユは未吸血および吸血群に分けた。吸血群は30%サトウ水を与えて、血液が消化される5日間飼育した。ブユ腫の同定後、数匹から約100匹のブユを1プールとして、乳剤をつくり、0.01Mリン酸緩衝液を加え、8,000rpm、15分、4°Cで冷却遠心した。上清0.02mmを哺乳マウスにそれぞれ脳内接種した。接種後、14日間発症の有無を観察し、神経症状、麻痺症状を呈したマウスの脳組織を採取し、2回目の脳内接種に供した。その結果、熊本で採集されたキアシツメトゲブユおよびヒメアシマダラブユの吸血個体群からそれぞれウイルスが分離された。神奈川で採集されたキアシツメトゲブユ、アシマダラブユ、アオキツメトゲブユ、オオユメトゲブユでは、初回のマウス接種で陽性プールを得ており、現在2回目の接種で確認をおこなっているところである。熊本のブユ2種から分離されたウイルス株は現在、培養細胞を用いてその性状を調べ、目下同定作業中である。ブユのウイルス実験感染は、人工血液を用いてブユに室内での吸血を誘導させる試みをおこなっているところである。これまで、血液の温度を調整したり、膜として用いるパラフィルムの厚さなどを検討し、一部のブユで吸血行動が認められている。この装置の改良を図り、安定した吸血が誘導できた段階でウイルスの経口感染を実施する予定である。
生物発光における鍵反応過程の分子機構と高性能化要因の解明

本研究では、ホタルとウミホタルの生物発光系を対象に、3つの鍵反応過程(1酸素化、2化学励起、3発光色制御)の反応機構を解明し、生物発光の高性能化要因の解明を目指した。1酸素化過程については、ホタルルシフェリン誘導体として、酸化電位を調整するために置換基変換したものを合成し、酸素分子と同様の酸化力を持つ電子受容性化合物との反応を検討した。この結果、酸素化のモデル反応となる付加反応を見出した。合成基質の酸化電位測定と反応速度の解析までを行い、結果を学会発表した。学術論文報告の準備を進めている状況にある。2化学励起過程については、ウミホタル生物発光系のモデル反応を検討した。ルシフェリン誘導体として嵩高い置換基を有するものを合成し分子内立体障害が中間体の配座を規制することを狙った。誘導体の化学発光量子収率を測定し、その化学励起効率を解析したところ、立体障害の効果が得られることを見出した。さらに、DFT計算による中間体の配座と分解遷移状態の電子的性質を調査して、反応機構の確立に結び付けたい。3発光色制御機構については、ホタル発光系について検討を進めた。酵素ルシフェラーゼ内での発光体分子の励起状態の安定性の調整が鍵を握るため、発光体と類似分子構造をもつ化合物について、酵素内包状態の蛍光性に関する知見を得ることとした。この結果、酵素の微小な構造変化で内包された化合物の蛍光性が変化することを見出した。さらに、発光体アナログを系統的に合成し、発光体分子自身の蛍光性を評価するための基盤を整えることができた。ホタルルシフェリンアナログの酵素内での発光特性評価と発光体を模倣した蛍光色素の物性について、共同研究による成果報告を行った。上記の研究の有機合成においては、導入した示差屈折計を含むリサイクル分取クロマト装置を活用して、化合物の精製を効率化できた。ホタルとウミホタルの生物発光系を対象とする3つの鍵反応過程(1酸素化、2化学励起、3発光色制御)に関する検討で、それぞれについて反応機構に関する重要な知見が得られた。具体的に、1酸素化機構についてはホタル発光系を題材に、ルシフェリン誘導体と電子受容性化合物の付加反応を構築することができ、このモデル反応と酸素化反応の反応速度論の対応も付きつつある。2化学励起機構については、ウミホタル発光系のモデルとなる化学発光において、嵩高い置換基を有するルシフェリン誘導体を用いた検討で分子内立体効果による化学発光量子収率への影響を見出すことができた。いずれも機構解明に直結する知見であり、今後の研究を進める基盤となった。3発光色制御機構については、ホタル発光系について、発光体オキシルシフェリン自身と酵素ルシフェラーゼに関する多角的な検討を進めることができた。発光中心である発光体の分子構造と分光学的性質の相関に関する知見と共に、発光色調整に関わる酵素活性部位が溶液条件に依存して物性変化を示す知見が得られており、反応機構の全体像を把握しながら研究が進んでいる。以上より、おおむね順調に研究が進展していると判断した。ホタルとウミホタルの生物発光系を対象に、引き続き3つの鍵反応過程(1酸素化、2化学励起、3発光色制御)の反応機構解明を目指して研究を進め、生物発光の高性能化要因の確立を目指す。酸素化機構については、ホタル発光系で見出された酸素化のモデル反応を確立すると共に、モデル反応と酸素化反応を対比しながら反応機構を確立する。さらに、この酸素化機構の概念を他の生物発光系にも拡張、適用して、酸素化反応機構の一般性を検証する。2化学励起過程については、ウミホタルルシフェリン誘導体の化学発光で得られた分子内立体効果に関する知見の一般性を検証すると共に、DFT計算も取り入れた高エネルギー中間体の分解過程と配座に関する情報を収集し、これを化学励起効率と相関させて評価することで反応機構の解明につなげる。3発光色制御機構については、発光体オキシルシフェリン自身の精密な分子構造と分光学的性質の相関を確立する。同時に、発光色調整に関わる酵素ルシフェラーゼの活性部位内の分子環境物性について、活性部位内にアクセス可能な化合物の内包時の蛍光性の評価に基づいて情報を収集する。このとき、酵素の溶液条件を系統的に変化させたときの活性部位内の分子環境変化を利用する。得られた知見は、ルシフェリンとそのアナログの生物発光特性およびルシフェラーゼの結晶構造の情報と照らし合わせて評価することで発光色制御機構の解明を目指す。

3発光色制御機構については、ホタル発光系について検討を進めた。酵素ルシフェラーゼ内での発光体分子の励起状態の安定性の調整が鍵を握るため、発光体と類似分子構造をもつ化合物について、酵素内包状態の蛍光性に関する知見を得ることとした。この結果、酵素の微小な構造変化で内包された化合物の蛍光性が変化することを見出した。さらに、発光体アナログを系統的に合成し、発光体分子自身の蛍光性を評価するための基盤を整えることができた。ホタルルシフェリンアナログの酵素内での発光特性評価と発光体を模倣した蛍光色素の物性について、共同研究による成果報告を行った。上記の研究の有機合成においては、導入した示差屈折計を含むリサイクル分取クロマト装置を活用して、化合物の精製を効率化できた。ホタルとウミホタルの生物発光系を対象とする3つの鍵反応過程(1酸素化、2化学励起、3発光色制御)に関する検討で、それぞれについて反応機構に関する重要な知見が得られた。具体的に、1酸素化機構についてはホタル発光系を題材に、ルシフェリン誘導体と電子受容性化合物の付加反応を構築することができ、このモデル反応と酸素化反応の反応速度論の対応も付きつつある。2化学励起機構については、ウミホタル発光系のモデルとなる化学発光において、嵩高い置換基を有するルシフェリン誘導体を用いた検討で分子内立体効果による化学発光量子収率への影響を見出すことができた。いずれも機構解明に直結する知見であり、今後の研究を進める基盤となった。3発光色制御機構については、ホタル発光系について、発光体オキシルシフェリン自身と酵素ルシフェラーゼに関する多角的な検討を進めることができた。発光中心である発光体の分子構造と分光学的性質の相関に関する知見と共に、発光色調整に関わる酵素活性部位が溶液条件に依存して物性変化を示す知見が得られており、反応機構の全体像を把握しながら研究が進んでいる。以上より、おおむね順調に研究が進展していると判断した。ホタルとウミホタルの生物発光系を対象に、引き続き3つの鍵反応過程(1酸素化、2化学励起、3発光色制御)の反応機構解明を目指して研究を進め、生物発光の高性能化要因の確立を目指す。酸素化機構については、ホタル発光系で見出された酸素化のモデル反応を確立すると共に、モデル反応と酸素化反応を対比しながら反応機構を確立する。さらに、この酸素化機構の概念を他の生物発光系にも拡張、適用して、酸素化反応機構の一般性を検証する。2化学励起過程については、ウミホタルルシフェリン誘導体の化学発光で得られた分子内立体効果に関する知見の一般性を検証すると共に、DFT計算も取り入れた高エネルギー中間体の分解過程と配座に関する情報を収集し、これを化学励起効率と相関させて評価することで反応機構の解明につなげる。3発光色制御機構については、発光体オキシルシフェリン自身の精密な分子構造と分光学的性質の相関を確立する。同時に、発光色調整に関わる酵素ルシフェラーゼの活性部位内の分子環境物性について、活性部位内にアクセス可能な化合物の内包時の蛍光性の評価に基づいて情報を収集する。このとき、酵素の溶液条件を系統的に変化させたときの活性部位内の分子環境変化を利用する。
ニューロン遊走における細胞核弾性率の調節機構およびDNA損傷保護機構の解明

多数の細胞が秩序正しく重層した脳構造は、ニューロン遊走によって形成される。ニューロン遊走に必須な細胞核移動を詳細に観察すると、著しい変形を伴って核が細胞質内を前進することが分かった。申請者の予備実験によりニューロン核の弾性率が低い(柔らかい)状態に調節されることで、核移動が促進されている可能性が示唆された。一方で、その柔らかさゆえに、外部より受ける機械的ストレスが増大した結果、細胞核内でDNAの損傷、修復が起こる可能性も示唆された。そこで本研究は、遊走中のニューロンがもつ細胞核の弾性率調節機構、およびDNA保護の機構を明らかにすることを目的としている。ニューロン核がもつ弾性率の調節機構を明らかとするために、細胞核移動前、移動中、移動後の発生ステージにある小脳よりニューロンを単離し、細胞核膜に局在する分子のタンパク質レベルを確認した。その結果、細胞核ラミナを構成するLaminAタンパク質のタンパク質レベルが細胞核移動後に上昇することを見出した。これが遺伝子の発現調節によるものであるかを確かめるために、同様の発生ステージにおけるLaminA遺伝子の発現レベルをリアルタイムPCR法によって解析した。その結果、このタンパク質レベルの変化はLaminA遺伝子の発現調節によるものであることが示唆された。一方、LaminAタンパク質と細胞核移動の関連を検証するため、細胞核移動前のニューロンにおいてLaminA遺伝子を強制発現し、生体内におけるニューロン核の移動が阻害されるかどうかを検証した。その結果、コントロールと比較して、細胞核移動が阻害されることを見出した。一方、自身の細胞体より狭い間隙をもつ基板に単離した遊走ニューロンを播種し、遊走させると狭い間隙を通過した後にDNA損傷マーカーが上昇することを確認した。またこのDNA損傷は24時間後には修復されることが明らかとなった。ニューロン核移動中の弾性率調節に寄与する分子が明らかとなったため。ニューロン核の弾性率はLaminA遺伝子の発現調節によってコントロールされている可能性が見出され、今後詳細な分子機構を調べていくための足がかりをつかむことができため今後の研究推進の方向性が定まった。また、狭い間隙を通過するニューロンにおいてDNA損傷マーカーの上昇、およびその後修復がみられたため、ニューロンがもつ柔らかい細胞核において機械的なストレスによってDNA損傷を受けることが示唆された。これまでに、損傷の種類および修復に関わる分子の同定を試みており、研究の方向性が定まりつつある。計画していたマイクパターン基板の新規作製に関して、条件検討に若干時間がかかってしまったが、研究協力者との共同作業によりこの問題を克服できたため、今年度以降さらに計画通りの研究を遂行する。ニューロン核移動中のLaminA遺伝子の発現調節の分子機構を調べていく。また、製作中のマイクロパターンを用いて機械的なストレスによるニューロン核内のDNA損傷、修復の動態を調べることで、両者の時空間的な関連を調べる。並行して、これらの修復に関わる分子機構を明らかとする。一方、これまでに、小脳発生過程においてLaminBreceptorタンパク質レベルがLaminAタンパク質レベルと逆の相関を示すことを見出している。両者は、細胞核内膜にクロマチンをアンカーする機能をもつため、これらのダイナミクスの変化が協調的に働くことで細胞核内のクロマチンのダイナミクスも変化することが予想される。細胞核弾性率の調節、DNA損傷、クロマチンダイナミクス、それぞれの関連も検証しつつ、計画書通りに研究を推進する。

また、狭い間隙を通過するニューロンにおいてDNA損傷マーカーの上昇、およびその後修復がみられたため、ニューロンがもつ柔らかい細胞核において機械的なストレスによってDNA損傷を受けることが示唆された。これまでに、損傷の種類および修復に関わる分子の同定を試みており、研究の方向性が定まりつつある。計画していたマイクパターン基板の新規作製に関して、条件検討に若干時間がかかってしまったが、研究協力者との共同作業によりこの問題を克服できたため、今年度以降さらに計画通りの研究を遂行する。ニューロン核移動中のLaminA遺伝子の発現調節の分子機構を調べていく。また、製作中のマイクロパターンを用いて機械的なストレスによるニューロン核内のDNA損傷、修復の動態を調べることで、両者の時空間的な関連を調べる。並行して、これらの修復に関わる分子機構を明らかとする。一方、これまでに、小脳発生過程においてLaminBreceptorタンパク質レベルがLaminAタンパク質レベルと逆の相関を示すことを見出している。両者は、細胞核内膜にクロマチンをアンカーする機能をもつため、これらのダイナミクスの変化が協調的に働くことで細胞核内のクロマチンのダイナミクスも変化することが予想される。細胞核弾性率の調節、DNA損傷、クロマチンダイナミクス、それぞれの関連も検証しつつ、計画書通りに研究を推進する。2018年度に計画していたマイクパターン基板の作製計画に若干の変更があったため。使用予定であった機器がマイクロパターン基板作製に十分でないことが分かったため、新しい機器をすみやかに購入して計画していた研究を進める。
細胞膜結合分子PCaPを介した細胞内情報の新しい変換機構の解明

本研究では、主要な情報因子であるCa2+とPIPの相互情報変換を担うPCaP1タンパク質の生理的作用機構を明らかにし、植物における新たな環境応答機構の解明と提案を目指す。機能欠損株および相互作用機能をもつN末端部分(ドミナントネガティブ)の過剰発現株を作製し、水・光・栄養・温度ストレス環境下での表現型を分析する。さらに、変異株におけるCa2+、PIP、細胞骨格の動態を野生株と比較し、PCaP1とこれら因子との共局在性を解析し、PCaP1の遺伝子発現の組織特異性、細胞内局在の変化も観察する。本研究を通して植物の発生・分化、ストレス応答におけるPCaP1の生理機能と情報伝達機構を解明する。カルシウム(Ca2+)による情報伝達は生物に普遍的なシステムである。しかし、Ca2+濃度上昇を多様な細胞機能の正確な調節に結びつける機構の全貌は解明途上である。本研究ではCa2+濃度の上昇をホスファチジルイノシトールリン酸(PIP)シグナルに変換する機能をもつ植物の新規情報変換分子PCaP1(Plasma membrane-associated Ca2+-binding Protein-1)に焦点を当てている。対象植物はシロイヌナズナと、陸上植物の進化の基部に位置するゼニゴケの2つを用いている。1年目である本年度は、シロイヌナズナにおいて、部位特異的プロモータでの相補実験から、PCaP1分子が根の内皮細胞に存在することが、根が水分の多い方向へと曲がる応答(水分屈性)に重要な機能を果たしていることを証明した。さらに、PCaP1-GFPの局在観察から、根に均一な浸透圧ストレスを与えると根の全ての細胞でPCaP1が細胞膜局在で無くなるのに対し、水分屈性を引き起こす水分勾配培地に置いた場合には根の内皮細胞でのみ細胞膜局在で無くなり、細胞内に移動している様子が観察された。これらの業績を投稿論文として発表した。ゼニゴケでの実験においては、PCaP1をCRISPR/Cas9で欠損させると、キメラの株しか取得できず、ゼニゴケにおいてはPCaP1の欠損が致死である可能性が見えてきた。また、ゼニゴケでのN末端部分の過剰発現株(ドミナントネガティブ)も作出し、N末端過剰発現株では、細胞分裂や組織の分化に著しい影響が見られることが分かってきた。PCaP1がシロイヌナズナにおいて、根の水分屈性に不可欠な機能を果たしていることを証明し、さらにその機能はPCaP1が根の内皮細胞に存在することが重要であることを組織特異的プロモータでの相補実験、PCaP1-GFPの局在観察から明らかにし、その成果を論文としてまとめることができた。また、ゼニゴケにおけるPCaP1機能解析も進み、順調に成果が見え始めているため、最終年度2年目にさらに掘り下げて解析を進めることにより、ゼニゴケとシロイヌナズナのPCaP1タンパク質の作用機構や生理的役割における共通点、進化的変化について明らかになってくると推測する。1ゼニゴケにおいて、PCaP1のConditional KO株を作出し、PCaP1が致死遺伝子であるのか否かを確認する。またPCaP1過剰発現株についても作出し、PCaP1が過剰になることでの影響についても観察する。2シロイヌナズナでのPCaP1遺伝子欠損株の成長発達過程を通して表現型を詳細に観察する。通常条件下のみでなく、水、光、栄養、温度、病原菌などのストレスに対する変化を解析する。欠失株にPCaP1を戻し表現型の解消を確認し、PCaP1を原因遺伝子とする表現型として確定する。3PCaP1の相互作用分子であるPIP (PIP reporter発現株)、細胞骨格(微小管、アクチン)を可視化したPCaP1遺伝子欠損株やPCaP1過剰発現株を交配等により調製し、PCaP1の存否が相互作用分子にどのような影響を与えるかを解析し、植物組織におけるPCaP1機能を分子レベルで確定する。4PCaP1のN端25残基領域(ミリストイル化、PIPとCa/CaMとの相互作用をする領域)を自己プロモータおよび過剰発現プロモータ(EF1αや35Sプロモータ)で発現させたゼニゴケとシロイヌナズナ株を作製し、成長と形態に与える影響を解析する。N端過剰発現株等におけるCa2+、PIP、細胞骨格の局在も野生株と比較する。とくにPCaP1とCa2+、PIP、細胞骨格との共局在性について、集中と分散の変化にも注目し検討する。これにより、N端領域の機能を明確化する。

しかし、Ca2+濃度上昇を多様な細胞機能の正確な調節に結びつける機構の全貌は解明途上である。本研究ではCa2+濃度の上昇をホスファチジルイノシトールリン酸(PIP)シグナルに変換する機能をもつ植物の新規情報変換分子PCaP1(Plasma membrane-associated Ca2+-binding Protein-1)に焦点を当てている。対象植物はシロイヌナズナと、陸上植物の進化の基部に位置するゼニゴケの2つを用いている。1年目である本年度は、シロイヌナズナにおいて、部位特異的プロモータでの相補実験から、PCaP1分子が根の内皮細胞に存在することが、根が水分の多い方向へと曲がる応答(水分屈性)に重要な機能を果たしていることを証明した。さらに、PCaP1-GFPの局在観察から、根に均一な浸透圧ストレスを与えると根の全ての細胞でPCaP1が細胞膜局在で無くなるのに対し、水分屈性を引き起こす水分勾配培地に置いた場合には根の内皮細胞でのみ細胞膜局在で無くなり、細胞内に移動している様子が観察された。これらの業績を投稿論文として発表した。ゼニゴケでの実験においては、PCaP1をCRISPR/Cas9で欠損させると、キメラの株しか取得できず、ゼニゴケにおいてはPCaP1の欠損が致死である可能性が見えてきた。また、ゼニゴケでのN末端部分の過剰発現株(ドミナントネガティブ)も作出し、N末端過剰発現株では、細胞分裂や組織の分化に著しい影響が見られることが分かってきた。PCaP1がシロイヌナズナにおいて、根の水分屈性に不可欠な機能を果たしていることを証明し、さらにその機能はPCaP1が根の内皮細胞に存在することが重要であることを組織特異的プロモータでの相補実験、PCaP1-GFPの局在観察から明らかにし、その成果を論文としてまとめることができた。また、ゼニゴケにおけるPCaP1機能解析も進み、順調に成果が見え始めているため、最終年度2年目にさらに掘り下げて解析を進めることにより、ゼニゴケとシロイヌナズナのPCaP1タンパク質の作用機構や生理的役割における共通点、進化的変化について明らかになってくると推測する。1ゼニゴケにおいて、PCaP1のConditional KO株を作出し、PCaP1が致死遺伝子であるのか否かを確認する。またPCaP1過剰発現株についても作出し、PCaP1が過剰になることでの影響についても観察する。2シロイヌナズナでのPCaP1遺伝子欠損株の成長発達過程を通して表現型を詳細に観察する。通常条件下のみでなく、水、光、栄養、温度、病原菌などのストレスに対する変化を解析する。欠失株にPCaP1を戻し表現型の解消を確認し、PCaP1を原因遺伝子とする表現型として確定する。3PCaP1の相互作用分子であるPIP (PIP reporter発現株)、細胞骨格(微小管、アクチン)を可視化したPCaP1遺伝子欠損株やPCaP1過剰発現株を交配等により調製し、PCaP1の存否が相互作用分子にどのような影響を与えるかを解析し、植物組織におけるPCaP1機能を分子レベルで確定する。4PCaP1のN端25残基領域(ミリストイル化、PIPとCa/CaMとの相互作用をする領域)を自己プロモータおよび過剰発現プロモータ(EF1αや35Sプロモータ)で発現させたゼニゴケとシロイヌナズナ株を作製し、成長と形態に与える影響を解析する。
日本語と中国語の結果複合動詞の分析：「視点」と「主観性/主体性」の観点から

結果複合動詞とは、前項動詞が原因となる動作行為を表し、後項動詞がその動作行為の結果を表すタイプの複合動詞を指し、日本語では「打ち壊す」、中国語では“打-碎(hit-break)"等が例として挙げられる。従来の研究では、日本語については動詞の組み合わせの制約、中国語では項解釈パターンの多様性等が中心的な研究課題となってきた。すなわち、中心的な課題がそれぞれの言語で異なっているということである。本研究では、両言語それぞれの特徴的な現象を、双方の言語について認知言語学における「視点」と「主観性/主体性」の観点から分析し、両言語における同形式の認知類型論的な特徴を日中双方向から明らかにする。