hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接合突起の比較プロテオミクスによる同型配偶子の接着と融合の分子メカニズムの解明

近年陸上植物から、配偶子の融合に働くタンパク質GCS1(GENERATIVE CELL SPECIFIC 1)が発見された(Mori et al. 2006Nat. Cell Biol.)。GCS1は、高等動植物を含む真核生物の幅広い系統で保存されているため、真核生物に共通する配偶子融合メカニズムの解明の糸口として注目されている。GCS1は、多くの生物で雄側の配偶子で働くことが知られていたが、「どのようなメカニズムによってGCS1の働きが雄側に限定されているのか」に焦点を当てた研究はなかった。本年度、二つの性(プラス/マイナス)の間で配偶子のかたちに差異のない同型配偶の緑藻ゴニウム(Gonium pectorale)を用いて、GCS1タンパク質がそれぞれの性で異なった制御を受けていることを明らかにした。ゴニウムでは両性の配偶子は、活性化するとそれぞれ前方部に突起状の構造(接合突起)を伸ばし、両性の接合突起が接着し融合することで接合が始まる。本研究の結果、マイナス交配型(雄に相当)配偶子では、活性化前はGCS1タンパク質が細胞の前方部(接合突起の原基)に局在し、活性化されると接合突起の表面に移行することが分かった。これに対し、プラス交配型(雌に相当)配偶子では、活性化前はGCS1タンパク質が細胞の内部に留まり、活性化に伴って消失することが分かった。これらの制御メカニズムにより、GCS1はマイナス交配型特異的に働くことができると考えられる(Kawai-Toyooka et al. 2014, Eukaryotic Cell)。また、ゴニウムのプラスとマイナス交配型それぞれの接合突起が集積した分画のSDS-PAGE解析を実施した。ゴニウムの全ゲノム情報が利用できるようになったので、両交配型でバンドの差をTOFMS解析して遺伝子を同定した。これらの遺伝子の中にGpFUS1の相互作用因子、GCS1の相互作用因子に関連したものが含まれている可能性がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。配偶子形態に大差がない原始的な有性生殖の同型配偶における配偶子の膜融合に着目することで、真核生物におけるアロ認証の基本的分子メカニズムが解明できると考え本研究は開始した。この為に雌雄性の進化と多細胞化のモデル生物群である群体性ボルボックス目(Hiraide et al. 2013, Mol. Biol. Evol.)の同型配偶ゴニウム(Gonium pectorale)に着目した。ゴニウムではプラスとマイナスの両交配型の配偶子が接合突起をもつので(Nozaki 1984, Jpn. J. Phycol)、単離した接合突起を材料としたタンパク質の比較解析が可能である。これまでの我々の研究から、ゴニウム配偶子の「接着」と「融合」に関する遺伝子FUS1 (Hamaji et al.投稿準備中)とGCS1(HAP2) (Kawai-Toyooka et al. 2014, Eukaryotic Cell)のホモログが明らかになり、それぞれの発現特性が調査された。従って、現在まで不明であるこれらのタンパクのカウンターパート遺伝子が比較プロテオミクスから探索できる可能性をもつ。この為にゴニウムのプラスとマイナスの両交配型の接合突起をもつ配偶子を単独で得る方法論を確立した(Mogi et al. J. Phycol. 2012)。

また、ゴニウムの全ゲノム配列情報が必要であったので国立遺伝学研究所の藤山研究室との共同研究でオルガネラネラゲノム完全配列(Hamaji et al. 2013, PLoS ONE)と核ゲノムドラフト配列(未発表)が構築された。接合突起の単離に関しては現在条件検討を実施している。25年度が最終年度であるため、記入しない。ゴニウムのプラスとマイナスの両交配型の接合突起をもつ配偶子を単独で得る方法論を確立し(Mogi et al. J. Phycol. 2012)、別々の性の接合突起を単離することとができるようになった。また、TOFMS解析で原因タンパクを同定するためのゲノムデータも整備した。両交配型の配偶子が接合突起をもつゴニウムを用いて接合突起の単離をプラスとマイナスの両交配型で実施し、単離した接合突起を用いてタンパク質プロファイルの比較をプラスとマイナスの交配型で実施する。次に、プラスとマイナスで異なるプロファイルのタンパク質をTOFMS解析で同定する。その結果、これまでにクラミドモナスで不明であった配偶子の膜接着因子GCS1と膜融合FUS1のカウンターパートを明らかにする。
心身の健康に寄与する音楽療法の社会実践研究　－地域実践モデルの比較検討－

人と人が音楽“act"によって自然と触れ合う音楽療法は、人間関係と心理的・身体的健康の回復を促進する。音楽療法の心理的・身体的健康の維持・増進などに効果的な実践方法の検討と、効果を明らかにすることを目的とした。音楽療法臨床では、活動を組み合わせて実施するため効果の特定化が困難となる。本研究では歌唱と楽器活動を分けて一定期間実施し客観指標を用いて効果を検討し、歌唱活動で後期高齢者、精神疾患入院患者の脈拍が有意に低下する結果を得た。発達障害幼児を対象に楽器活動を実施し、「歌いかけ」の有無によるアイコンタクトの継続時間の比較を行ったところ、歌いかけが有るほうが継続時間が有意に長いことが示された。平成24年度は1年目に実施した地域実践研究としての高齢者25名(平均年齢85.3歳)を継続して対象とした。歌唱と楽器活動に分けた6ヶ月間で12回の音楽療法を施行し、対照群は折り紙活動を行い、両群の前後に実施した生理指標および心理指標を分析した。結果、音楽療法を受療したグループは、歌唱、楽器活動のいずれの終了時にも脈拍が有意に安定し、STAI1による不安感が有意に低減した。楽器活動は初めて経験する活動であったが高齢者にストレスとならないことが示唆された。実施日の夜間の睡眠・不安感・抑うつ気分に関する質問紙調査12回(3,4クール)の結果は、(睡眠)よく眠れた80%、不眠2%、変わりない18%。(不安感)穏やか78%、不安2%、変わりない20%。(抑うつ気分)抑うつ気分なし82%、変わりない17%、抑うつ気分1%であった。音楽療法を受療した高齢者の80%は、不安感・抑うつ感を感じることがなく熟眠したことが示唆された。対照群の折り紙活動を施行したグループは、収縮期血圧に有意な増加が認められた。研究2年目は音楽療法の対象を精神科入院患者に拡大し、歌唱、楽器活動を分けた音楽療法を実施し、前後に生理・心理指標を施行した。24名の精神科入院患者を2グループ(A)(B)に分けて、4か月で2クール(12回)、音楽療法を実施した。結果、Aグループは歌唱活動により収縮期血圧、拡張期血圧が有意に低下し、楽器活動では拡張期血圧が有意に上昇した。Bグループは歌唱活動および楽器活動のいずれもSTAI1の不安が有意に低減する結果であった。対象患者24名に対する分析結果は、歌唱活動は収縮期血圧、拡張期血圧が有意に低下することが認められた。楽器活動では拡張期血圧が有意に上昇し、STAI1による不安感が有意に低減する結果となった。精神科入院患者の緊張と弛緩、解放感などの側面から検討する材料を得た。音楽療法では音楽の機能がセラピスト(以下Th)と参加者の関係性の中で作用して、対象者に変化(行動・気分・適応など)を起こす。臨床現場では歌唱・楽器活動など複数の活動を組み合わせて実施しているため、各活動の効果を限定するのは困難である。本研究は歌唱と楽器活動を分けて一定期間実施し生理的・心理的客観指標を用いて効果を検討し、歌唱活動では後期高齢者、精神疾患入院患者の脈拍が有意に低下する結果となった。最終年度は入所施設利用高齢者22名(認知症中度)、小規模通所施設高齢者12名(軽度認知症含む)および支援事業を利用する精神障害者6名の活動(歌唱、楽器)による音楽療法実施前後の生理指標の結果として、統計的に有意な差はなかったが脈拍が低下する傾向が認められた。またThとの関係性に着目した「歌いかけ」によるアイコンタクトの継続時間について、自閉症スペクトラム幼児を対象に楽器活動を実施した。療育センターに在籍する幼児20名(1クラス58名の3クラス)を対象に8回連続で実施した。一列に並んだ幼児に対して順番にThが楽器を差し出し、各回2巡行った。歌いかけ無し(言葉による支援有り)3回、歌いかけ有り(8小節構成のオリジナル曲を使用)5回をクラス毎に同一Thが実施した(1015分)。分析は持続時間記録法を用いて、DVD録画から各幼児の楽器演奏時間およびThとのアイコンタクト時間を観察者2名が計測した(1秒未満のデータは観察対象外とした)。結果の一致率は95.999.8%で、平均値をデータとしてt検定で統計処理した結果、自閉症スペクトラム障害の幼児16名について、歌いかけ(音楽)有り/無しのアイコンタクト時間の比較において、音楽ありに1%水準で有意差が認められた。慣れ親しみのない他者(Th)による限定された短期間の中で、歌いかけがアイコンタクトの持続時間を増加させることが確認された。

音楽療法研究の基礎的調査として、平成23年度に開催された国内外の音楽療法学術大会の発表抄録からそれぞれの動向を分析した。国際大会では実験研究/シングル・システム研究が最多であったが、国内大会では活動/事例報告が口頭57%、ポスター70%と半数以上を占めた。国内大会では臨床研究、対象は障害児に関する研究が最多であった。国際大会における口頭発表は記述的研究/質的研究や方法論・新技法の提案が多数を占め、実験的研究と同様に質的研究の手法が広く用いられる傾向がみられた。平成23年度は、地域実践研究としてICF((国際生活機能分類モデル)を用いて音楽療法における音楽活動の高齢者の心身の健康への作用について、高齢者グループへの音楽療法の効果を検討した。高齢者25名(平均年齢85.3歳)を対象に3ヵ月間、7回の音楽療法、前半は楽器表現(A)と折り紙作り(B)の2グループを設け、後半には両グループに歌唱、歌詞創作活動を行った。結果、グループAは、前半セッション後に高齢者うつ尺度(GDS)の得点が有意に低下し、グループBは、後半セッション後に生活満足度得点の有意な減少、収縮期血圧の有意な増加が認められた。表情カード(7種)による気分評定では、A「楽しい・愉快」45.7%、B「ニコニコ・快適」49%が最大値で、歌詞創作活動後は「楽しい・愉快」がAが71.4%、Bが48.9%となり、Aは大幅に増加した。楽器活動による抑うつ感の低下は、気分表現とあわせ、個別の静的な折り紙活動よりも集団での音楽療法により能動的な楽しさが創出されたことによる。後半の歌詞創作活動では、主体的な創作の取組みによる作品の内容分析から、情緒的な内的活動の活性化が推測され、音楽活動が後期高齢者の参加意欲、心身機能の促進、活動への関心を高め、ICFに示される健康促進の良循環に寄与することが示唆された。心身の健康に寄与する音楽療法の効果を対象別に検討する研究経過として、高齢者(後期高齢者)から開始し、精神疾患患者へと拡大した。高齢者の音楽療法を2年間で4クール実施した経緯から、精神疾患患者に対する音楽療法の期間も2年間の継続が望ましい。また「対象に応じた実践プログラムの検討」を目的としていることから、研究の発端となった失語症患者の音楽療法に取り組んできたが、対象の特性から対象人数および生理・心理指標によるデータが十分に確保できていない。一方、精神疾患の対象からは、音楽療法活動を歌唱と楽器活動を分けて提示したことが、対象者にとって取り組み易さの一因となったことが言語表現および積極的な参加として現れた。今後は歌唱および楽器活動による混合活動との比較を十分に行うことで、研究としての報告に繋がることから、3年目の課題になると考えている。心身の健康に寄与する音楽療法の実践モデル研究の1年目として、後期高齢者を対象とした音楽療法研究セッションを2クールまで実施し、継続的な研究セッションが設定できた。その他、医療領域における疾患別の音楽療法セッションのグループの手配が完了し、平成24年度に実施する就学前の子どもを対象とした音楽療法研究セッションのグループ設定が完了し、プレ研究を開始している。音楽療法実践モデルの研究セッションの対象および実施の設定が整ったことで、研究2年目の実践研究の取り組みの見通しが立っていることは、研究目的に設定した「対象に応じた実践プログラムの検討」および「音要素を基盤とする音楽および音楽療法の心身への効能に関する調査研究」を推進することができる。
リーマン面上の極値的長さ、双曲的長さとモデュライ問題

有限種数gを持つリーマン面Rに対し,その弱ホモロジー群の基底から決まるいくつかの元の極値的長さの平方根を辺の長さに持つ2g単体を2g次元ユークリッド空間内に構成することができる。この単体の体積Vは基底の取り方に依らずRだけで決まる量である。こうして得られる新しい等角不変量の性質を詳しく調べた。まず,Rがコンパクトならば,Vは2gの階乗の逆数aに等しいことを証明した。これより,閉リーマン面のホモロジー類の極値的長さの間には種数のみに依存するある代数的な関係式が成立することが分かる。さらに,Vは包含関係に関して単調減少であることを示した。すなわち,Rが同種数の別のリーマン面R ́に等角に埋め込まれれば,R ́に対応する体積V ́の値はV以下である。これより,Rがコンパクトではない場合,Vの値はaを下回らないことが知られるが,より詳しく,Vの取り得る値の範囲はa以上の実数全体に一致することを証明した。さらに,種数有限な開リーマン面の,同種数の閉リーマン面の中への等角的埋め込みの空間に関する柴・シュミーダーの定理を全く一般の場合にまで拡張することに成功した。この他に,加藤は,代数曲線論的手法を用いて,閉リーマン面上の高次数の線束について詳しく調べ,さらに,マルテンスの定理を拡張した。また,中内は,n-球面からリーマン多様体の中へのn-調和写像が存在することを証明し,この結果を応用して,最近のエルワージー・ローゼンバーグの定理の簡単な別証明を与えた。与えられた種数有限の印付き開リーマン面Rを等角に埋め込むことのできる同種数の閉リーマン面の全体Mは,タイヒミュラー空間Tの部分集合である.この集合Mを双曲的長さや極値的長さで記述することを試みた.種数が1より大きい場合,Tの元Sには双曲計量が入り,SがMに属せば,すなわち,RがSに等角に埋め込まれれば,Sの各双曲的閉測地線の長さは対応するRの双曲的閉測地線の長さを上回らない.しかし,逆は必ずしも成立しないこと,すなわち,この長さの大小関係が成立していてもRはSに等角に埋め込まれるとは限らないことを示した.種数が1の場合でも,Tとして,トーラスから一点を除いた面のタイヒミュラー空間を考えれば,同様の結果に到達する.一方,極値的長さに対しても,同様の不等式が成立する.RがSに等角に埋め込まれれば,Sの(弱)ホモロジー類の極値的長さは対応するRの弱ホモロジー類の極値的長さを上回らない.種数が1の場合,双曲的長さとは対照的に,逆も成立することを示した.特に,Rが種数と境界成分の個数がともに1である場合,ホモロジー類をホモトピー類に置き換えることができる.双曲的長さと極値的長さはよく似た性質を持っているが,ここでは,際だった違いを見出すことに成功した.この他に,柏木は,一昨年に橋本寛が発表した論文において示されたり引用されているブール行列に関する様々な性質を,シュレーダー同値を応用して,すべて関係代数的に証明した.また,富崎は,1次元拡散過程の到達時刻に関する極限定理を与え,河津はある種のブラウン運動の不変原理を論じた.有限種数gを持つリーマン面Rに対し,その弱ホモロジー群の基底から決まるいくつかの元の極値的長さの平方根を辺の長さに持つ2g単体を2g次元ユークリッド空間内に構成することができる。
溶解補助性添加物による医薬品製剤の使用性改善の試みとその評価

市販の製剤には患者の服薬ニーズや剤形の選択等に対応できにくにいものがある。例えば(1)簡易懸濁法では水への分散・崩壊・懸濁性に起因する薬剤の分離、容器・器具への付着、およびチューブ閉塞、或いは(2)濃粘稠性製剤では調剤および服薬時の計量操作・残薬性、さらに(3)製剤固有の味質が問題となっている。今回、添加物による使用性の改善を目的として種々ある添加物の中からシクロデキストリン(CD)系を主に用いその効果を検討した。まず、アミノレバンENでは服薬上の問題点である特有の臭い・味の改善効果について、高度分岐環状デキストリン、α-CD単独、又はβ,γ-CDの併用で最大10%添加後、溶液の官能味覚試験を行った。7段階の評価スコア(1:悪い7:良い)とした場合、無添加液のスコアを3と比較して、2程度の改善があった。次に濃粘稠性製剤のファンギゾンシロップに対するα-、HP-βCD、コレステリル硫酸Naの添加効果を、プラスチック傾斜板上に試料を滴下しその落下時間を比較する方法、及びメートルグラスを用いて計量シミュレーション後の残存量で比較したところ、添加前後で顕著な差は認められなかった。この濃粘稠性を改善できない主因は、グリセリンによるのではないかと推察した。経管投与時の分散、懸濁性が問題となる薬剤としてポンタールCapを選び、水剤用容器で強く振とうした場合の分散、懸濁性調べたが、α-CDの有無で相違は認められなかった。しかし脱Cap後、散を常水の入った薬杯に加えた場合24時間後もダマ状に浮遊していたが、10%のα-CD液では20分後に懸濁可能となりチューブ閉塞は回避できる状態となった。経管投与不可とされているクリアナール錠ではCDの添加効果は認められなかったが、シリンジ型のピルクラッシャー^<[○!R]>による実験では、極めて短時間での投与処理が可能であったことから、添加物以外にもこのような新しいツールを使用した方が顕著な効果を認める製剤もあることがわかった。
並列処理による高速経路探索に基づいた次世代光・IP連携ネットワークの研究

本研究では次世代光ネットワーク制御技術であるGMPLS(Generalized Multi-Protocol Label Switching)において、より高効率かつ柔軟なトラヒック制御を実現するための高速な最短経路探索アルゴリズムと、それに基づく新しい光パス決定方式を提案した。計算機シミュレーションと、リコンフィギュラブル並列プロセッサ上に実装した高速経路計算エンジンを用いた実験により特性評価を行い、提案方式の有効性を示した。本研究では、GMPLSにおいて、より高効率かつ柔軟なトラヒック制御を実現するための、現在よりも二桁三桁以上高速な最短経路探索手法と、それに基づく新しい光パス決定アルゴリズムを提案し、アーキテクチャとプロトコルに関して、理論および実装の両面からその性能を明らかにした。第一に、ダイナミックリコンフィギュラブル並列プロセッサという新しいアーキテクチャのハードウェアを用いて、並列演算とパイプライン演算を駆使した、超高速最短経路探索工ンジンを実装した。提案方式は、行列を用いて全ての経路を同時並列的に経路探索を行ない、最も早く目的地に到達したルートを最短経路としている。この計算は膨大な計算となるため、従来のシーケンシャルプロセッサでは計算が難しいが、新しいハードウェアと組み合わせることにより実現を可能にした。第二に、この計算エンジンをルータソフトウェアに組み込み、ソフトウェアのオフローディングエンジンとして用いるためのインターフェースを明らかにしてた。さらに、提案アルゴリズムを拡張し、コンテンツ配信に置けるレプリカ配置問題などさらに複雑な割り当てアルゴリズムを高速に解く手法を確立した。第三に、GMPLSネットワークにおいてこの計算エンジンを活用するための高速リソース情報伝搬方式として、資源予約プロトコルの経路確立時または開放時にOSPF-TEプロトコルを使用せず,経路上のすべての予約可能資源情報を1つのパケットに集約することによりパケット量を減少させる方式を提案し、計算機シミュレーションによりパケッド量を1桁減少させつつ、ブロック率を平分に抑制できることを示した。本研究では次世代光ネットワーク制御技術であるGMPLS (Generalized Multi-Protocol Label Switching)においてより高効率かつ柔軟なトラヒック制御を実現するための高速な最短経路探索手法と、それに基づく新しい光パス決定アルゴリズムの提案を目的としている。本年度では「高速最短経路オフローディングエンジンの実装」と「仮計算を用いたIPレイヤおよび光レイヤの相互影響を考慮するパス設計手法に関する研究」を行った。前者では、リコンフィギュラブルプロセッサDAPDNA2上に高速最短経路探索エンジンを実装した。そして、最も有名なソフトウェアルータであるGNU Zebraでの最短経路計算部分を、高速最短経路探索エンジンにオフローディングするように改造し、経路探索をオフローディング可能なルータを作成した。ノイマン型のプロセッサ(ペンティアム4)を使用した最短経路計算と比較して、計算実行時間を約2桁改善可能であることを示した。後者では、光パスの構築・切断がIPレイヤに与える影響を考慮した光パス設計手法を提案した。構築可能なすべての光パスに関して仮想的にパスを張った場合の最短経路を計算することで、最適な光パスの設計が可能となるが、計算量の増大が懸念される。そこで、従来の数学的な手法と違い、リコンフィギュラブルプロセッサDAPDNA2のチップ上に仮想ネットワークを構築し、パケットの動きによって現実のトラピック変動を求めるという実験的手法を提案した。第一段階として、チップ上への仮想ネットワークの実装と、仮想ネットワークを用いた最短経路計算を行い、動作を確認した。また、シミュレータおよび評価ボード上で評価を行い、計算実行時間を従来方式より改善できることを示した。次の段階として、大規模ネットワークの仮想化、マルチメトリックを考慮した計算手法の提案を進める予定である。本研究では次世代光ネットワーク制御技術であるGMPLS(Generalized Multi-Protocol Label Switching)においてより高効率かつ柔軟なトラヒック制御を実現するための高速な最短経路探索手法と、それに基づく新しい光パス決定アルゴリズムの提案を目的としている。本年度では「高速最短経路オフローディングエンジンの実装」と「仮計算を用いたIPレイヤおよび光レイヤの相互影響を考慮するパス設計手法に関する研究」について、大規模ネットワーク化に向けた高速最短経路探索エンジンオフローディング手法に関する研究や、経路コスト以外にコンテンツ配置やネットワークの省電力化を考慮した光パス決定アルゴリズム手法に関して研究を行った。前者では、リコンフィギュラブルプロセッサDAPDNA2のチップ上に仮想ネットワークを構築し、パケットの動きによって現実のトラヒック変動を求めるという実験的手法を提案した。大規模なネットワークトポロジに対応するために、トポロジを分割し、リコンフィギュラブルすることで分割トポロジを切り換え、パス計算のための評価パケットを転送する手法を提案した。シミュレータおよび実機での評価を行い、計算時間を従来方式より改善できることを示した。後者に関しては、光パスやサーバ資源といったリソースの使用を抑えてアプリケーションのレプリカ配置を決定するための計算手法や、ネットワーク全体の消費電力を抑えるためにトラヒックをあるリンクに集約し、空きリンク、ノードを意図的に作り出し、そのリンク、ノードを電源オフするという光パス確立方式を提案し、トラヒック状況に合わせて電源オフ可能なリンクをできるだけ多く作る光パス計算方式を提案した。提案方式により、経路コスト以外の要素も考慮しつつリソース使用量を抑えた光パス決定ができることをシミュレーション、実験で示した。
カイコ幼虫の摂食行動周期に関わる生体内分子の探索

昆虫の摂食行動に関わる生体内分子の探索を行なった結果、カイコ(Bombyx mori)の幼虫から新規のペプチド性因子を2つ見出すことができた。ともに機能は未知であるが、脂肪体で発現し体液中に分泌するペプチドであり摂食行動や栄養要求に関連することが示唆された。平成18年度は、カイコ(Bombyx mori)幼虫体内の摂食周期あるいは摂食行動により、体内で濃度の変動する2種類のペプチドを精製しその構造を明らかにした。1つは摂食行動を亢進するペプチド性の分子HemaP(Hemolymph major peptide)の構造を明らかにした。HemaPをコードするcDNAをクローニングし、このペプチドが脂肪細胞で主に発現していることを明らかにした。もう1つは、脂質成分を過剰に添加した餌を食べさせたときに、カイコ幼虫体液中の濃度が上昇するペプチドp4442を見出した。p4442をコードするcDNAをクローニングした結果、脂肪細胞で発現していることが明らかになった。これら2種類のペプチドは共に他の種では見られない新規な分子であることが明らかとなった。HemaPに関しては、昆虫種で保存されている分子であるかを明らかにするため、鱗翅目昆虫であるエビガラスズメ(Agrius convolvuli)とモンシロチョウ(Pieris rape)からもHemaP相同分子を幼虫体液から精製しそのアミノ酸配列を明らかにした。お互いに約30%の相同性を有していた。p4442は、摂食刺激によりその転写レベルが上昇することが明らかになった。そこで、転写レベルでの研究を行なうため、まず、カイコゲノムDNAからプロモーター配列部分を同定しその塩基配列を明らかにした。また、レポーター解析により転写調節機構を明らかにしようと試みている。現在、動物細胞を用いた系で基本転写因子群の結合領域が同定できた。平成18年度の成果では、カイコ(Bombyx mori)の幼虫体内における摂食行動調節をする候補因子として、2種の新規ペプチド性因子(p4442とHemaP)を同定したことを報告した。平成19年度では、両ペプチドの発現解析および幼虫体内での分子動態の解析を行った。p4442の発現定量解析は、定量PCRを用いて確立した。それを用いて、カイコ幼虫の脂肪体内のp4442のmRNAの発現量を解析した結果、幼虫の脂肪体におけるp4442の転写量は、摂食することにより上昇することが明らかになった。また、ステロールを過剰添加した餌に応答し、脂肪体内のp4442の転写レベルが上昇したことから、p4442の転写量は餌中の脂質成分に応答して制御されていることが示唆された。HemaPに関しての解析として、生体内の濃度変動を解析する目的で、LC-TOF-MSを用いた定量系を確立した。その定量系を用いてカイコ幼虫の終齢における脂肪体からの分泌量を定量した。その結果、HemaPの濃度は成長に伴う顕著な増減は認められなかった。しかし、絶食することにより、徐々にHemaPの濃度が上昇した。また、食餌を再開させることにより元のレベルまで減少することが分かった。さらに、分子動態を調べるため、放射性ヨード化標識HemaPを調製した。それを用いたところ、脂肪体から分泌されたHemaPは、食餌により脂肪体に取り込まれることが分かった。平成18年度および平成19年度には、カイコ幼虫の摂食行動に関わる2種の新規カイコ体液由来のペプチド性因子(HemaPとp4442)を同定した。平成20年度には、それぞれの生理活性の作用機序を明らかにする目的で、以下のような解析を行なった。HemaPの生体内動態を探るため、放射性ヨウ素で標識したHemaPを作製した。それを用いトレーサー実験を行なったところ、カイコ幼虫は摂食後に体液中のHemaP濃度が低下することが明らかになった。また、その低下は、脂肪体への再吸収によるものであることが明らかとなった。さらに、この濃度変動を調べるため、HemaPに対する抗体を作製し、ELISA法による定量法を確立し、それを用いて摂食周期と、HemaP濃度変動の解析を行なった。その結果、HemaP濃度は摂食周期と同調して変動していることが分かり、摂食行動のモチベーションがHemaPにより調節されていることが示唆された(投稿準備中)。p4442の体内での機能を探るため、その発現動態を調べた。まず、カイコ幼虫の各成長段階での発現量を調べたところ、脱皮前の眠と呼ばれる非摂食の時期において、p4442の発現量の顕著な低下が認められた。ところが、脱皮後に給餌すると、その発現量は回復した。一方、脱皮後に絶食すると、その発現量は低いままだった。また、ステロール過剰食でも発現量の上昇が認められたため、p4442の発現量は腸管内の餌のステロール量に応答している分子であることが示唆された。現在、LC-MSによる定量系を構築中であり、ペプチドレベルでの解析を行なったあとで、論文としてまとめ投稿予定である。
周期的沈殿からフラクタル凝集体への遷移についての実験的研究

寒天の濃度とヨウ素と硝酸イオンの濃度を変化させて,形態学的相図を作成した.次に,ヨウ化鉛の結晶化過程を理解すべく,その場観察を行い,結晶化前線の伝播速度を測定し,層状構造と枝分かれ構造で伝播速度が等しく,寒天の濃度の違いによるイオンの拡散係数の違いが,結晶化過程を直接支配しているのではないことを明らかにした.また,枝分かれ構造の形成過程を観察し,結晶表面での不均質核形成が枝分かれ構造の形成に深く関係していることを見つけた.さらに,この形態的遷移が均質核形成による結晶数密度の違いに依っていると推察し,寒天構造の観察と結晶数密度決定のために電子顕微鏡観察を行った.その際,寒天の構造を結晶の成長の様子をできるだけ保存した状態で観察するために,臨界点乾燥という手法を用いた.その結果,層状構造と枝分かれ構造とでは,結晶数密度(面密度)が1000倍程度違っていること,さらに,この違いは寒天の構造に起因する寒天表面積の違いによるものではないことが明らかになった.そして,結晶数密度の違いを生み出している核形成の機構に迫るべく核形成を起こす要因を特定する実験を行い,この系の核形成が溶解度積やヨウ化鉛モノマーの濃度だけで決まる単純なものではなく,余剰イオンが関係する複雑なものであることを明らかにした.新しく発見され未解明の部分が多かった現象に対し,これらの行った一連の実験の結果,形態的遷移現象の原因が核形成に対する寒天濃度の微妙な影響にあることを明らかにした意義は大きい.寒天の濃度とヨウ素と硝酸イオンの濃度を変化させて,形態学的相図を作成した.次に,ヨウ化鉛の結晶化過程を理解すべく,その場観察を行い,結晶化前線の伝播速度を測定し,層状構造と枝分かれ構造で伝播速度が等しく,寒天の濃度の違いによるイオンの拡散係数の違いが,結晶化過程を直接支配しているのではないことを明らかにした.また,枝分かれ構造の形成過程を観察し,結晶表面での不均質核形成が枝分かれ構造の形成に深く関係していることを見つけた.さらに,この形態的遷移が均質核形成による結晶数密度の違いに依っていると推察し,寒天構造の観察と結晶数密度決定のために電子顕微鏡観察を行った.その際,寒天の構造を結晶の成長の様子をできるだけ保存した状態で観察するために,臨界点乾燥という手法を用いた.その結果,層状構造と枝分かれ構造とでは,結晶数密度(面密度)が1000倍程度違っていること,さらに,この違いは寒天の構造に起因する寒天表面積の違いによるものではないことが明らかになった.そして,結晶数密度の違いを生み出している核形成の機構に迫るべく核形成を起こす要因を特定する実験を行い,この系の核形成が溶解度積やヨウ化鉛モノマーの濃度だけで決まる単純なものではなく,余剰イオンが関係する複雑なものであることを明らかにした.新しく発見され未解明の部分が多かった現象に対し,これらの行った一連の実験の結果,形態的遷移現象の原因が核形成に対する寒天濃度の微妙な影響にあることを明らかにした意義は大きい.層状構造と枝分かれ構造の遷移を調べるために,ミクロとマクロにおける,その場観察を行った.マクロ:寒天濃度が0.5wt%と3.0wt%の系について(それぞれ,枝分かれ構造と層状構造のみが現れる場合に対応している),試験管全体を実験開始直後からビデを撮影した(1分間当たり0.1秒の間欠撮影).寒天溶液の境界から沈殿物の先端までの距離を進行距離として測定した.この映像からパターンの進行距離を実時間で100分毎に測定した.その結果、初期に寒天濃度が0.5wt%のものがわずかに速く進み,その後ほぼ同じ早さでパターンが進行した.ミクロ:層状構造と枝分かれ構造の顕微鏡下でのその場観察を行った.層状構造では,微細な結晶(1mm以下)が均質核形成により周期的に大量に晶出し,結晶濃集帯が形成される.枝分かれ構造では,一つ一つの結晶が急速な成長のため不規則な形になり,不均質核形成が結晶表面の縁で起こる.これを繰り返すことによって連続した樹枝状の結晶集合体が形成される.マクロの観察から測定した寒天濃度の変化によるパターン進行速度の差は,拡散係数の差から予測される大きさよりも小さい.物質の供給である拡散が二つの構造の形成を支配しているのではないことがわがった.ミクロのその場観察から,層状構造では微結晶の大量晶出、枝分かれ構造では数少ない結晶の急速な成長が,それぞれ起こっていることがわかった.それ故,その結晶化様式の違いは,結晶の数密度であり,溶媒の寒天濃度による核形成頻度の違いが,沈殿物パターンが変化する主要因であると考えられる.寒天の濃度とヨウ素と硝酸イオンの濃度を変化させて,形態学的相図を作成した.次に,ヨウ化鉛の結晶化過程を理解すべく,その場観察を行い,結晶化前線の伝播速度を測定し,層状構造と枝分かれ構造で伝播速度が等しく,寒天の濃度の違いによるイオンの拡散係数の違いが,結晶化過程を直接支配しているのではないことを明らかにした.また,枝分かれ構造の形成過程を観察し,結晶表面での不均質核形成が枝分かれ構造の形成に深く関係していることを見つけた.さらに,この形態的遷移が均質核形成による結晶数密度の違いに依っていると推察し,寒天構造の観察と結晶数密度決定のために電子顕微鏡観察を行った.その際,寒天の構造を結晶の成と結晶数密度決定のために電子顕微鏡観察を行った.

その際,寒天の構造を結晶の成長の様子をできるだけ保存した状態で観察するために,臨界点乾燥という手法を用いた.その結果,層状構造と枝分かれ構造とでは,結晶数密度(面密度)が1000倍程度違っていること,さらに,この違いは寒天の構造に起因する寒天表面積の違いによるものではないことが明らかになった.そして,結晶数密度の違いを生み出している核形成の機構に迫るべく核形成を起こす要因を特定する実験を行い,この系の核形成が溶解度積やヨウ化鉛モノマーの濃度だけで決まる単純なものではなく,余剰イオンが関係する複雑なものであることを明らかにした.新しく発見され未解明の部分が多かった現象に対し,これらの行った一連の実験の結果,形態的遷移現象の原因が核形成に対する寒天濃度の微妙な影響にあることを明らかにした意義は大きい.
圧力下における含水マグマの構造と水の状態

本研究課題では、世界トップクラスの強度を誇るパルス中性子源J-PARCでの高圧中性子回折によって世界初となる含水マグマの構造を高圧その場で解明するべく、その技術開発とファーストデータの取得を目的とした実験的研究を行った。また、中性子回折データと併せて更に詳細な構造情報を得ることができる、X線回折実験をSPring-8の高エネルギーX線を用いて行い、無水、含水NaAlSi3O8ガラスの構造データの取得も行った。本年度は含水珪酸塩融体の高圧中性子回折実験に向けて、その予備的かつ相補的なデータとなる含水珪酸塩ガラスの合成を行った。中性子回折用に、水成分は重水素置換したものを作成した。KAlSi3O8組成ガラスをあらかじめ合成し、白金カプセル中の粉末試料に液体D2Oを直接滴下することで含水ガラスの出発物質とした。実験は愛媛大学地球深部ダイナミクス研究センター設置の3000tonプレスを用い、およそ3GPa、1200°C(電力見積)の条件で試料を融解、供給電力をカットすることで急冷し、試料のガラス生成を試みた。減圧回収された試料を白金カプセルから回収し、無色透明のガラス状のものであることを確認した。完全な重水化の確認には同センター設置のラマン分光装置を用いた。測定の結果、ガラス中に含まれる水はほぼ重水であるが、僅かに軽水が含まれていることがわかった。以前、同様の手法で作成したNaAlSi3O8ガラスでは、完全に重水化することができたことから、カリウムを含む組成では重水の軽水化がかなり早く起きてしまうことが予想される。中性子回折実験では、軽水の非弾性効果を避けるため完全な重水化が望ましいが、十分中性子回折を行うに値する試料であると判断した。更に本年度は、上記新規試料合成に加え、以前に作成、高圧中性子回折データの取得行っていた含水NaAlSiO8ガラスのより高圧(<10 GPa)での中性子回折データの取得をJ-PARCの高圧ビームライン(BL11, PLANET)にて行った。尚、本データは現在解析中である。本年度は、中性子回折による情報と相補的な情報を与えるX線回折による構造解析を行った。測定試料は、中性子回折実験にも用いた無水、含水(重水置換)NaAlSi3O8ガラス(含水量7.5 wt%)とした。含水ガラスは愛媛大学地球深部ダイナミクス研究センター設置の3000 ton油圧プレスを用いて、約3 GPaの圧力で合成し、無水ガラスは一気圧1300°Cで同組成となるよう秤量された酸化物粉末を溶融し、大気中で急冷することで作製した。測定にはSPring-8, BL04B2ビームラインの単色X線による角度分散法を用いた。エネルギーは61.37 keVに設定し、最高測定散乱ベクトルQmaxは25 A-1となるよう測定を行った。得られた構造因子をフーリエ変換し、無水、含水ガラスの動径分布関数およびそれらの差動径分布関数(無水ガラスの動径分布関数から含水ガラスのそれを引いたもの)を求めた。無水、含水ガラスの動径分布関数は、共に非常に良く似たパターンを示した。しかしながら、差動径分布関数中におよそ1.6 A付近に見られる負のピークは含水ガラスのSi, Al-O配位多面体における原子間の結合距離の存在度が相対的に小さいことを示している。これに対して、この負のピークの両側ではブロードな正のピークが見られた。これらはつまり、本ガラスの局所構造単位であるSi, Al-O四面体が無水ガラスでは含水ガラスより歪んだ形状をとっており、Si, Al-O結合距離に多様性があることを示唆する結果と言える。残念ながら25 A-1までの構造因子を用いた構造解析では動径分布関数中のSi-O, Al-Oの結合ピークを明瞭に分離するまでには至らなかった。これについては、以前に収集した中性子回折による構造データと比較を行い。詳細な構造情報を得る必要がある。本研究課題では、初年度よりJ-PARCのBL11(PLANET)に設置された大容量プレスを用いて8万気圧までの無水、含水珪酸塩ガラスの高圧中性子回折実験を行ってきた。更に、中性子線と相補的な情報を与えるX線回折実験も合わせて行い、多方面からの珪酸塩マグマの構造解析を行ってきた。最終年度では、目的の圧力下での含水マグマの中性子回折データを取得するべく高温高圧セルの開発及びその予備的な実験を行った。中性子線による回折強度はX線などと比べると格段に弱く、更にガラスや融液からの回折パターンは結晶質のものと比べシグナル/ノイズの比が小さいため、十分な試料体積、露光時間を確保することが必要不可欠である。この課題を解決するため、長時間かつ大容量の試料を安定的に溶融状態で保持できる高温高圧セルの開発及びその実証試験を行った。開発したセルは径4.0mm高さ3.5 mmの試料を封入することができるよう設計した。予備実験にはアルバイト(NaAlSi3O8)組成の酸化物粉末を用いた。実験条件は、2万気圧、1600°Cで行い、この温度圧力条件で、5時間の安定的な温度保持がなされた。更に、回収した試料は全て容器内でガラス化しており、高温高圧下で融液状態が達成されていたと考えられる。

従って、この高温高圧セルを用いることにより、2万気圧までの条件で珪酸塩融液の高圧中性子回折実験が十分可能になったと言える。尚、2015年度中に行う予定であったJ-PARCでの珪酸塩メルトの高圧中性子回折実験は、当該施設のターゲット不調により2016年度に繰り越されたため、2016年度中に実験を行う予定である。本研究課題では、世界トップクラスの強度を誇るパルス中性子源J-PARCでの高圧中性子回折によって世界初となる含水マグマの構造を高圧その場で解明するべく、その技術開発とファーストデータの取得を目的とした実験的研究を行った。また、中性子回折データと併せて更に詳細な構造情報を得ることができる、X線回折実験をSPring-8の高エネルギーX線を用いて行い、無水、含水NaAlSi3O8ガラスの構造データの取得も行った。本年度までに無水、含水ガラスについて、中性子回折、X線回折測定を終えることが出来た。また、圧力下での溶融珪酸塩の中性子回折実験のためのビームタイムが既に採択されており、本年度中に実験予定である。よって本研究課題は概ね予定通り進行していると考えられる。高圧地球科学本年度は、これまでに得られたガラス試料の高圧中性子回折実験のデータ解析をすすめ、動径分布関数による構造評価を行う。また、今年度J-PARCにて採択された溶融珪酸塩の高圧中性子回折実験のための技術開発を行い、世界初となるデータの取得を目指す。本年度は、J-PARCでのハドロン事故の影響で、ビームタイムの大幅減を余儀なくされたが、J-PARCの共同利用以外の方面から研究を進めることで、研究の進行の遅れを最小限にした。当初予定していた新規組成の重水化含水珪酸塩ガラスの高圧合成を行った。より高圧(<10 GPa)での含水NaAlSi3O8ガラスの高圧中性子回折データを取得した。当該年度は、J-PARCにおける事故、その他運転トラブルの関係で大幅にビームタイムが削減、遅延されたことにより、J-PARCでの実験を行うことが出来なかった。これにより中性子回折実験に係る経費に若干の未使用部分が生じた。本年度は運転再開したJ-PARCでの共同利用実験課題の申請を行うとともに、国内外の研究者と協力して高圧中性子回折実験を遂行する。また、これまで取得してきた中性子回折データの解析手法の確立と、動径分布関数の導出に向けて現地の専門家との議論を進める。本年度はJ-PARCでのビームタイムを既に申請、採択されている。次年度使用額は中性子回折実験およびそれに向けた予備実験の経費に充てる。当該年度はJ-PARCのハドロン研究施設における事故の影響で、J-PARCが長期にわたり使用できなかった。このため、高圧中性子回折実験およびそれに係る予備実験が遂行できなかったため、次年度使用額が発生した。2014年度(2013年度後期)よりJ-PARCは通常運転が開始されたので、昨年度行えなかった分の実験準備を整えるため、前年度未使用分をそれに充てる。
高速超塑性アルミニウム-SiC粒子複合材料の開発に関する研究

メカニカルアロイング法を用いて、体積率で5,10及び15%のSiC粒子を含む3種類の7075AI合金高速超塑性複合材料の製造法、及び高速超塑性特性と変形機構を、高温圧縮と引張試験さらにミクロ組織観察によって調べた。得られた結果を要約し以下に示す。(1)本研究で開発した簡便な圧粉法と加工熱処理で構成された結晶粒微細化法によって、1μm以下の著しく微細な平均結晶粒径を有する複合材料の製造が可能である。(2)圧縮及び引張り試験によって求めた各複合材の1ogσ-1ogε線図には、5x10^<-1>2x10s^<-1>の著しい高ひずみ速度範囲で,m値が約0.36以上の高い値を示すひずみ速度領域(領域2::超塑性領域)が認められた。その領域で各複合材は低い変形応力を示し、引張り試験では200%以上の超塑性伸びを示した。一方、低ひずみ速度ではm値が0.13以下に低下する領域1が存在する。(3)SiC粒子体積率の増大に伴い、領域2は高ひずみ速度側で現われ、外挿法で求めたしきい応力(σth)が高い値を示した。(4)各複合材の有効応力σe(=σ-σth)とひずみ速度の関係から求めた応力指数の値は2となり、転位運動で調整された粒界すべり超塑性機構から予測された値で説明できる。(5)変形後の試験片の表面組織観察の結果、領域2の変形条件では領域1におけるより、粒界すべりがより多くの粒界で起こることが分かった。(6)本実験で作成した複合材料の高速超塑性の主要な変形機構は、転位運動で律速された粒界すべりに基づくものであり、SiC粒子の粒界すべり抑制作用によってσthを生じたと考えられる。1.複合粉末の作成条件:素材混合粉末の製造条件として、(1)合金粉末の作成用素材であるIM7075Al-O.3wt%zr合金連続鋳造ビレットに、再結晶核形成サイトとなるη相過時効と再結晶粒成長抑制に有効なAl_gZr耐熱性粒子析出を兼ねて、753Kx7.2ks+673Kx43.2ks(空冷)の熱処理を加えること、2)混合時間は少なくとも3時間以上とすること、が必要である。2.加工熱処理条件:熱間圧粉成形予加工の一連の製造工程条件と、得られた複合材料の結晶粒微細化度の関係を、アトムビームエッチング装置と透過電子顕微鏡を用いて調べた結果、(1)圧粉条件として、圧粉温度603K又は773K、圧粉圧力100MPaとし、(2)予加工条件として、予加工温度773K、予加工ひずみ速度5x10^<-1>、予加工ひずみ3050%が最適であり、MA7075+10SiC合金複合材料で、平均粒怪で約0.8μmの極めて微細な結晶粒組織を得る事ができた。また、この製造条件をSiC体積率で0、5、15%の複合材料にも適用し、同様に微細粒を得ることができた。3.複合材料の高温圧縮変形特性とSiC粒子体積率の影響:(1)上記4種類の複合材料の試験温度793Kでのlogσ-logε線図には、5x10^<-1>10s^<-1>の極めて高ひずみ速度範囲でm値が0.3以上の超塑性領域が認められた。(2)SiC粒子体積率の増大にともない、超塑性領域が一層高ひずみ速度側へ移行した。

(3)低ひずみ速度領域には、しきい応力が認められ、その値は体積率の増大によって大きくなる。このしきい応力の発生原因は超塑性変形機構としての粒界すべりと関連あるものと考察した。1.複合板材の製造法:(1)SiC粒子を体積率で5%,10%及び15%含む3種類の7075Al複合材圧粉体は、温度500°C、ひずみ速度約5x10^<-1>s^<-1>で高速圧縮することによって厚さ5mmの健全な厚板とすることができ、(2)その後、5%と10%SiC複合材は温度250°Cで、また15%SiC複合材は350°Cで温間圧延する事により厚さ1.5mmの板材とすることが可能である。2.引張試験特性:(1)5x10^<-1>3x10s^<-1>の著しい高ひずみ速度範囲に於て、m値が約0.36以上の高い値を示し(領域2)、その領域2で各複合材は200%以上の最大伸びを示した。それより低ひずみ速度ではm値が0.13以下となる領域1が存在した。(2)SiC粒子体積率が増すと、領域2及び最大伸びを示すひずみ速度が高ひずみ速度側に移行し、また変形応力としきい応力σ_<th>が高くなった。(3)各複合材の有効応力σ_e(=σ-σ_<th>)とひずみ速度の値を両対数で整理して得た直線関係では、勾配(n値に相当)が約2となった。この値は、転位運動で調整された粒界すべり超塑性機構で予測された値に対応している。3.微視組織変化:(1)TEM組織観察の結果、変形前の平均結晶粒径で1μm以下の微細結晶粒組織は、変形にともないやや粒成長の傾向が認められる。(2)SEMによる表面組織観察の結果、領域2では領域1におけるより、粒界すべりが著しく多くの粒界で起こることが分かった。4.複合材料の高速超塑性の主要な変形機構は、転位運動で律速された粒界すべりに基づくものであり、SiC粒子の粒界すべり抑制作用によってσ_<th>を生じたと考えられる。このような観点で、今後、固相線より僅かに高い温度で変形し、生じる液相を利用による超塑性特性改善効果に関し検討する必要がある。
オルガネラソート技術開発によるミトコンドリア母性遺伝の分子メカニズムの解明

ミトコンドリアの母性遺伝は、様々な真核生物に共通に見られる現象である。本研究では、母性遺伝の鍵分子であるDNAヌクレアーゼを同定するために、大型のミトコンドリア核様体を持つ真正粘菌を用い、セルソーターを応用した「オルガネラソーター」の技術を開発し、接合子内でDNAが消去されつつある父方由来のミトコンドリア分画を目指した。しかし、回収段階でミトコンドリアが破壊されてしまうため、分画せずにミトコンドリア内のタンパク質をnanoLC-MS/MSを用いたショットガンプロテオミクスにより解析した。その結果、エンドヌクレアーゼGを含む9種類のDNAヌクレアーゼを同定することができた。ミトコンドリアの「母性遺伝」は、様々な真核生物に共通に見られる現象である。これまでに、父方のミトコンドリアDNAがヌクレアーゼで完全に分解されることの重要性が示唆されているが、鍵分子であるヌクレアーゼはまだ同定されていない。本研究では、大型のミトコンドリア核様体を持つ真正粘菌を用い、セルソーターを応用した「オルガネラソーター」の技術を開発し、接合子内でDNAが消去されつつある父方由来のミトコンドリアを回収し、ヌクレアーゼを同定することを目指している。27年度では、まず父方由来のミトコンドリアをセルソーターで検出できるように蛍光ラベルする方法を検討した。ミトコンドリアの蛍光ラベルによく用いられるマイトトラッカーを用いたところ、真正粘菌においては、蛍光が弱く、ほかの構造物も染色されてしまうことが分かった。そのため、さまざまな蛍光色素を合成し、ミトコンドリアが強く染色されるものをスクリーニングした。その結果、いくつかのカチオン性の蛍光色素でミトコンドリアが強く染色されることが分かった。また、より多くの接合子を回収するために、高効率に接合する条件の検討(生育温度、pH、細胞濃度、Caイオンの添加)も行った。その結果、pHが低い方が接合率が上昇し、pH4付近で最も接合率が高くなることが分かった。さらに、アメーバや接合時に発現している遺伝子を解析するために、アメーバーと接合子からRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて、トランスクリプトーム解析を行った。セルソーターを応用した「オルガネラソーター」の技術を開発するためには、ミトコンドリアを蛍光ラベルする必要がある。市販されているミトコンドリア染色試薬は、真正粘菌のミトコンドリア染色に適していなかったが、新たに染色できる試薬を見つけることができたため、今後、予定していたオルガネラソーターを用いた解析を進めることができる。また、今後予定しているプロテオミクス解析の準備として、次世代シークエンサーによるアメーバと接合子のトランスクリプトーム解析を行った。また、より多くの接合子を回収するために、高効率に接合する条件の検討を行い、酸性条件(pH4)が重要であることが分かったが、今後もさらなる高効率な接合条件を検討することが必要である。ミトコンドリアの母性遺伝は、様々な真核生物に共通にみられる現象である。母性遺伝のメカニズムとして、父方配偶子(精子)の大きさが母方配偶子(卵子)と比較して極端に小さく、精子形成過程においてmtDNA量が減少することや、ユビキチンやオートファジーによる受精後の父方ミトコンドリアが選択的に分解されることが重要であると考えられている。しかし、近年、雌雄同型配偶子を持つ真正粘菌(Physarum polycepharum)において、接合直後に父方ミトコンドリア内に存在するmtDNAが選択的に消失することが示された(Moriyama et al. 2003)。さらに、雌雄異型配偶子を持つメダカでも同様の事象が観察され(Nishimura et al. 2006)、生物普遍的な現象であることが分かった。また、この受精後の父方mtDNAの選択的消失は、ユビキチンやオートファジーによるミトコンドリア分解よりも必ず先立って生じており、母性遺伝の引き金となる重要なステップであることが予想される。しかし、その分子メカニズムはほとんど分かっていない。本研究では、大型のミトコンドリア核様体を持つ真正粘菌を用い、セルソーターを応用した「オルガネラソーター」の技術を開発し、接合子内でDNAが消失されつつある父方由来のミトコンドリアを回収し、選択的消失に関わるヌクレアーゼを同定することを目指している。平成28年度は、まず、母性遺伝における父方mtDNAの消失時期を調べるために、あらかじめアメーバのミトコンドリア核様体を生体染色し、接合過程を経時観察した。また、セルソーターを用いてミトコンドリアを分画するために、ミトコンドリアを単離法の改良をおこなった。さらに、接合子から単離したミトコンドリアをセルソーターにかけ、核様体の消失したミトコンドリアの検出およびソーティングの条件検討も行った。様々なDNA生体染色試薬を用いたところ、Hoechst33342では、核様体を可視化することができなかったが、SYTO11、SYTO64、SYBRGreen Iでは核様体を特異的に可視化することができた。また、SYBR Green Iは、SYTO11よりも輝度が高く、SYTO64よりも退色が遅かったため、SYBR Green Iを用いて解析を行うことにした。経時観察の結果、アメーバを混合して1-2時間目で細胞融合が生じ、2.5-4.5時間目で核膜の融合が生じ、3.5ー5時間目で核小体の融合が生じていることが分かった。

また、核様体の消失は、核小体融合期に観察された。経時観察の結果、アメーバを混合して1-2時間目で細胞融合が生じ、2.5-4.5時間目で核膜の融合が生じ、3.5ー5時間目で核小体の融合が生じていることが分かった。また、すでに報告された単離法では、単離バッファー内で細胞が急速にシストと呼ばれる固い壁をもつ状態になるため、単離が困難であったが、単離バッファーに含まれるスクロースをマンニトールに変更し、4°Cに冷却することでシスト形成を大幅に遅らせることに成功した。その結果、ミトコンドリアを大量に単離できるようになった。さらに、アメーバを混合して、5時間目の細胞から単離したミトコンドリアをSYBR Green Iとミトコンドリア染色試薬であるMito Tracker Redで染色し、セルソーターにかけた。セルソーターのレーザーパワーやサンプルプレッシャーを検討することで、核様体が消失したミトコンドリアと消失前のミトコンドリアとを区別して検出することができた。しかし、ソーティングの過程で、何らかの原因により、ミトコンドリアが回収できなかった。ミトコンドリアの「母性遺伝」は、様々な真核生物に共通に見られる現象である。母性遺伝がおこる一連の過程において、DNAヌクレアーゼによる父方のミトコンドリアDNA(mtDNA)の選択的な分解は母性遺伝の引き金となる非常に重要なステップである。しかし、その分子メカニズムはよくわかっていない。同形配偶子である真正粘菌は、父方と母方の配偶子は同数のミトコンドリアおよび大型のミトコンドリア核様体(mtDNA-タンパク質複合体)を持ち、接合後3ー5時間の間に父方の核様体のみが一斉に消失し、3日後にはミトコンドリアも消失する。本研究では、母性遺伝に関わるDNAヌクレアーゼを同定するために、まず父方mtDNAが消失している接合後7時間目の接合子から単離したミトコンドリアのショットガンプロテオミクス解析を行った。その結果、エンドヌクレアーゼGを含む9種類のDNAヌクレアーゼを検出した。エンドヌクレアーゼGは、ミトコンドリアの膜間に存在し、アポトーシス時に細胞核に移行し核DNAを分解するが、最近、線虫において受精後に父方ミトコンドリア内膜が崩壊することによりmtDNA分解にも関与する可能性が示唆されている。しかし、真正粘菌では父方mtDNA分解時には、まだミトコンドリアの内膜崩壊は生じていないため、母性遺伝に関与するかは不明である。さらに、接合前のアメーバや二倍体の変形体からもミトコンドリアを単離し、それらのDNAヌクレアーゼが存在するかどうかを調べた。その結果、接合子の時期のみに存在するDNAヌクレアーゼは同定されなかった。この結果は、接合前のアメーバのミトコンドリアにも母性遺伝に関与するDNAヌクレアーゼが存在するが、何らかの制御によりmtDNAの分解が抑制されており、接合後に父方ミトコンドリアのみでmtDNAの分解の抑制が解除され、父方mtDNAの選択的消失が生じる可能性を示唆している。ミトコンドリアの母性遺伝は、様々な真核生物に共通に見られる現象である。