hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成長円錐小胞に結合するSNARE複合体の新規制御意白の構造・機能解析

成長円錐で最も重要なsecond messengerはCa^<2+>であるが、成長円絆のCa^<2+>濃度の調節機構やCa^<2+>下流の情報伝達機構は明らかでない。本研究で、成熟シナプスと異なり、成長円錐においてはL型Ca^<2+>チャネルが量的にも多く、機能的にも活性があることを見出した。さらにこのチャネルから流入したCa^<2+>が、C-キナーゼとカルパインを独立に活性化することを証明した。成長円錐においてカルパインは脳スペクトリンを分解し、膜骨格のα-アクチニンが遊離することが分かった。以上の結果は、成長円錐において、種々の軸索ガイダンス分子によって生ずるL型チャネルの活性化が成長円錐の形態変化に重要な役割を担っていることを意味しており、成長円錐の2つの領域における情報伝達を同時に制御する可能性を示唆している。開口分泌の過程でSNARE機構とならんで、rab3A cyclingがあり、両者の相互作用は明らかでない。開口分泌を神経終末で惹起するLTXは成長円錐において、Ca^<2+>非依存性に伝達物質放出を惹起した。この応答はボツリヌス毒素感受性で、成長円錐のLTX依存性はSNARE機構の関与を介すると考えられた。この時、成長円錐ではLTX感受性は1/10程度で、rab3A結合性GDP/GTP変換も成長円錐小胞では起こりがたいことが分かった。この結果は、開口分泌におけるrab3A cyclingがシナプスに比べて低いことを意味する。Rab3A cyclingにおいて最も重要なGEPとrabphilinの成長円錐における分布を調べたところ、成長円錐ではシナプスに比べて共に極めて低いことが分かった(特異性の低いGEPであるMss4は成長円錐においてもかなり存在していた)。Rabphilin,Mss4,rab3 GEPを成長円錐に導入すると、伝達物質放出に関する成長円錐のLTX感受性とGTP型への変換が上昇した。神経成長円錐における細胞間相互作用とそれに基づく細胞内情報伝達系の研究を継続して行い、以下の知見を得た。a.成長円錐におけるシナプス終末への変化の過程をシナプス関連蛋白に着目して行っているが、今年はSNARE系(ATP依存性)とrab3A系(GTP依存性)の関連について、強制的に開口放出を引き起こすクモ毒素α-ラトロトキシンを用いて検討した。その結果、成長円錐ではrabphilin,rab-GEPの2種類の蛋白がきわめて少量で、rab3Aサイクリングが不完全であることを見出した。これらの蛋白を遺伝子的に作成して成長円錐に導入すると、成長円錐でもシナプスに近い効率で、開口放出を起こすことを確認した。これらのデータは、既に予想したように成長円錐ではSNARE機構は十分に発達しているが、rab3Aサイクリングはシナプス成熟に伴って発達することを強く示していた。またCa^<2+>センサー蛋白の発達も成長円錐に少なかった。b.成長円錐にはシナプス終末に比べて、L型Ca^<2+>チャネルが高密度に依存していることを証明した。その生理的意義を明らかにすべく、単離成長円錐で生化学的解析を続け、このチャネルの活性化が、1)C-キナーゼ依存性のMARCKS protein,GAP-43の蛋白リン酸化と、2)カルパインの活性化に基づく脳スペクトリンの分解を引き起こすことを証明した。これらの反応に基いて、膜骨格などの蛋白の分布に変化が生ずることを確認した。これらを総合すると、L型チャネルの活性化によって、C-キナーゼ系とカルパイン系が成長円錐の異なるドメインで作用することを強く示唆する結果を得た。

成長円錐は成長期の神経突起の先端の運動性に富んだ構造であり、シナプス前終末の前駆構造と考えられる。成長円錐における開口分泌の過程でSNARE機構とならんで、rab3A cyclingという機構があり、両者の相互作用は明らかでない。成長円錐で両者の関連性を明らかにする目的で研究を行った。強制的に開口分泌を惹起するα-Latrotoxin(LTX)は成長円錐でもCa^<2+>非依存性に伝達物質放出を惹起した。この応答はボツリヌス毒素に感受性で、SNARE機構の関与を介すると考えられた。受容体量は、結合実験でもブロッティングでもシナプス膜と成長円錐膜では差がなかった。しかし、成長円錐ではLTXに対する感受性は1/10程度であった。成長円錐小胞でLTXに対するrab3A結合性GTP/GDP変換がほとんどGDP型で変換が起こりがたいことが分かった。この結果は、開口分泌におけるrab3Aグアニンヌクレオチドのサイクリングがシナプスに比べて低いことを示唆する。これらの成長円錐における分布を調べたところ、成長円錐ではrabphilinがシナプスに比べて共に極めて低いことが分かった。Rabphilin,Mss4を成長円錐に導入すると、LTX依存性の伝達物質放出に関する成長円錐のLTX感受性が上昇して、GTP型への変換も上昇した。成長円錐のrab3A cylingは不完全で、シナプスに比較すると、rabphilin,rab3 GEP IIという2つの重要な成分の不足がその原因と考えられる。従って、これらの因子はシナプス形成の途中の過程で備わるものと考えられる。またこれらの因子を補充した際に、開口分泌の効率が増大したことから、これらの因子は成熟シナプスにおいて、開口分泌の基本的な機構であるSNARE機構を補助して、効率的な分泌を促進する役割を果たす調節的因子と考えられる。
蛋白凝集神経変性疾患に対するキサンチン酸化酵素阻害剤の病変進行遅延効果の機構解明

ECを設定にてAMPを添加し、ECの数値の低さと相関しXORの気質であるHXの増加が観られた。1)XORが脳中にはXORが存在しないことが確定された。2)AMP, IMPはそれぞれプリン合成の初期反応酵素を阻害することが確認された。allopurinolはsalvage反応阻害作用であることが判明した。3)メタボローム解析をマウスの脳を用い、purine salvageの基質や阻害剤にならない物質では有意にアデニンヌクレオチドの上昇を認めた。なおEC低下は正常ヒトでは急速に回復され、発症が進むのは脳血流の低下や老化が関連すると思われる。分担研究者はさらに老化に関連した解析を行った。1ALSモデルマウスを用い、febuxostat(Feb)による効果の再現性とともに、purine salvage増加効果をより明瞭に解析するため、Feb+基質前駆体の薬効評価を実施した。生存日数の比較よりFeb群は長寿の傾向が確認された。2マウスにおけるFeb投与時の末梢血中基質、尿酸の濃度変動をHPLCにより定量した。Febを腹腔内注射し、経時的変動を観察した。血漿尿酸値はFeb投与後30分ですでに検出限界以下となり、代わりに基質(Hx、X)がそれぞれ顕著に上昇した。基質濃度の上昇は4時間後まで高濃度が持続した。尿酸値は4時間後まで低濃度を維持していた。Febの効果は16時間後には低下し、そそれ以後は尿酸値上昇し、Hx、X濃度は低下した。効果が高い投与後2時間での血中のHx、X、尿酸の総量は減少しており、XOR阻害により蓄積したHx、Xがsalvageされ、プリンヌクレオチドに変化したことが推測された。3Feb投与が他の代謝経路に与える影響を検証するため、マウス脳組織のメタボローム解析を行った。マウス脳組織はサンプル調整中のATPの消費変化を測定した。メタボローム解析はFeb投与群において脳組織アデニンヌクレオチドの総量の増加を認めており、組織中に蓄積したHxがサルベージされATPへと再利用されていることが確認された。4活性酸素説を可否を検証するため既に作成してあるスーパーオキシド過剰産生変異XORマウスについてDNAアレイ解析、in situ hybridization解析、RTーPCRを行い、スーパーオキシドによる遺伝子変動を網羅的に解析した。アポトーシス関連を中心に多くの遺伝子の変動を認めた。5さらにin vitro実験として、阻害剤の作用をさらに明確にするためMD計算、活性酸素生成機構、NADとFADの反応機構を他のフラビン酵素とも比較してさらに詳細に解明した。以上のことからFebの作用は2つの機構の総合的なものである可能性が示唆された。1ALS動物実験の研究については順調に進められた。2薬剤効果の機構解析では実験をin vitroの細胞系実験に加え、より望ましいマウス脳の抽出系のメタボローム実験系を加えた。当初計画したアイソトープによるIMPへの取り込み実験ではIMPが様々なヌクレオチドへ変換されるからである。そのため進行はやや時間を消費したが、予期した以上の興味ある結果が系統的に得られている。一方培養細胞系の実験は予算不足の関係でやや遅れている。なお、活性酸素生成モデル系での研究を、裏をとる目的で行ったが、予想に反して大きな意味があることが推定された。すなわち、進行遅延効果は複数の要因である可能性が考えられた。3酵素の阻害機構についてより詳細な結果が得られ、阻害剤の作成方法に重要な示唆が得られた。4FADとNAD、酸素との反応調節機構に重要な解析結果が得られた。以上の結果は初年度のため学会発表が主であり、論文発表成果は次年度以降となる。1前年度の筋萎縮性側索ALS動物実験の再試験の検証に基づき、動物実験結果の公表を米国神経病理学会誌に公表を行なった。その効果の機構図が雑誌の表紙に掲載された。2アルツハイマーモデルマウスの特許出願が公表された。その結果に基づき他の薬剤を用いて検証する研究を連携研究者(鳥取大学加藤信介准教授)と行い、行動パターンと病理結果の関係解析法を考案し、薬剤効果を裏付ける結果を得ている。アルツハイマーモデルでもALSと同様の機構である結果を得ている。基質となるヒポキサンチン前駆体(核酸)やアミノ酸の食物との関連性も臨床的には重要因子となることが示唆された。3前年の脳内メタボローム解析(マススペクトルによる)を特にプリン体をHPLCで検証すると同時に、酵素のウェスタン分析を行った。脳内には薬剤のあるターゲットタンパク質であるXORは存在せず、効果は多くの臓器の内皮細胞や肝臓・腎臓でありそこで蓄積されるヒポキサンチンが脳内に流入するためという仮説を裏付けた。

また保存してある髄液内のプリン体の分析により検証した。4前年度の結果に基づき内皮細胞と酵素の相互関係を調べた。内皮細胞内で形成されるスーパーオキシドの作用(NOとの相互作用)が推定されるためである。5網状赤血球を用いてのプリン分解とATP再生については全アデニンヌクレオチドの変動(喪失・回復)は得られたもののATP回復は得られていない。ミトコンドリア機能によらないためと推定された。そのため実験系を動物実験系による解析を中心に据える計画にする予定である。培養細胞に置ける実験ではSOD1変異によるATP消費量の測定は実験継続中である。6阻害剤の酵素タンパク結合様式を分子動力学的解析を進め、酵素・基質結合様式のダイナミックな変動揺らぎが推察された。1)筋萎縮性側索硬化症について論文発表(米国神経病理学会誌)に掲載し、その号の表紙に薬物効果の機構図が掲載された。国際学会から招待を受け29年度に2回(欧州、米国)にて講演予定である。知財としては本研究課題の申請以前に取得している。一部は非公開になっている。2)同じ機構からアルツハイマー病にも効果が確かめられ出願した。ただしその基本は私学助成金にあり、本申請課題はその裏付けの研究である(申請書参照)。何も本研究により再現性が確かめられ、メタボローム解析により確かめられつつある。機構について裏付けられているデータを基に論文発表にできる状況は整いつつある。最終年度には補完実験を行う予定である。基本的には申請時に予定した計画通り実験研究を進める。さらにメタボローム解析に加え動物実験の人手が必要であり、そのため予算の関係でやや遅れている培養細胞系の実験をより簡素な実験系にして補いたい。また詳細な薬物の分子作用機構を解明させる。病態生化学来年度が最終年度であり、論文発表、国際学会発表が中心であり、いくつかの補足実験を行う。特に動物を用いたアデニンヌクレオチドの回復実験を行うと共に、培養細胞における代謝動態を追跡する。
可視域で透明な希土類磁性酸化物ガラスの開発と光デバイス化

現在,光ファイバーに利用されている光アイソレータは可視域の光に対して透明でないため,これに代わる可視域で機能する光アイソレータが望まれている.本研究室ではこれまでにEuO含有ガラスが可視域で大きなファラデー回転を示すことを報告してきた.ファラデー回転の大きさは磁化率に比例することが知られており,そこで本研究ではEuOの高濃度化,またガラスにFe^<2+>を加えることで磁気特性の改善を試み,ガラス組成の違いによる磁気特性の変化を調べることを目的とした.XANES測定結果から,いずれのガラスにおいてもf=90%程度の値を示しており,ほとんどのEuが2価の状態で存在していることを確認した.磁化率の温度依存性を調べたところ、60EuAl-40Siガラスは50EuAl-50Siガラスと比較して全温度域で磁化率が1.7倍程上昇した.これはガラス中のEu^<2+>濃度が上昇したためである.しかしながら70EuAl-30Siではむしろ磁化率は減少し,この差は赤外線加熱中、ガラス成分(SiO_2,Al_2O_3)が揮発するためであると考えた.一方、70Eu_<0.98>Fe_<0.02>Al-30Siガラスは最も大きな磁化率を示し,大きな負のキュリー温度(-186.2K)をもっていた.これはXRD測定の結果から, 70Euガラス中にFe_3O_4が析出したためであることが分かった.最も重要な点は,このガラスが依然として可視域で透明であることである.それゆえ磁化率の増加から可視域用ファラデー回転ガラスとして期待できることがわかった.現在,光ファイバーに利用されている光アイソレータは可視域の光に対して透明でないため,これに代わる可視域で機能する光アイソレータが望まれている.本研究室ではこれまでにEuO含有ガラスが可視域で大きなファラデー回転を示すことを報告してきた^<1)>.ファラデー回転の大きさは磁化率に比例することが知られており,そこで本研究ではEuOの高濃度化,またガラスにFe^<2+>を加えることで磁気特性の改善を試み,ガラス組成の違いによる磁気特性の変化を調べることを目的とした.XANES測定結果から,いずれのガラスにおいてもf=90%程度の値を示しており,ほとんどのEuが2価の状態で存在していることを確認した.磁化率の温度依存性を調べたところ、60EuAl-40Siガラスは50EuAl-50Siガラスと比較して全温度域で磁化率が1.7倍程上昇した.これはガラス中のEu^<2+>濃度が上昇したためである.しかしながら70EuAl-30Siではむしろ磁化率は減少し,この差は赤外線加熱中、ガラス成分(SiO_2, Al_2O_3)が揮発するためであると考えた.一方、70Eu_<0.98>Fe_<0.02>Al-30Siガラスは最も大きな磁化率を示し,大きな負のキュリー温度(-186.2K)をもっていた.これはXRD測定の結果から, 70Euガラス中にFe_3O_4が析出したためであることが分かった.最も重要な点は,このガラスが依然として可視域で透明であることである.それゆえ磁化率の増加から可視域用ファラデー回転ガラスとして期待できることがわかった.現在,光ファイバーに利用されている光アイソレータは可視域の光に対して透明でないため,これに代わる可視域で機能する光アイソレータが望まれている.本研究室ではこれまでにEuO含有ガラスが可視域で大きなファラデー回転を示すことを報告してきた.ファラデー回転の大きさは磁化率に比例することが知られており,そこで本研究ではEuOの高濃度化,またガラスにFe^<2+>を加えることで磁気特性の改善を試み,ガラス組成の違いによる磁気特性の変化を調べることを目的とした.XANES測定結果から,いずれのガラスにおいてもf=90%程度の値を示しており,ほとんどのEuが2価の状態で存在していることを確認した.磁化率の温度依存性を調べたところ、60EuAl-40Siガラスは50EuAl-50Siガラスと比較して全温度域で磁化率が1.7倍程上昇した.これはガラス中のEu^<2+>濃度が上昇したためである.しかしながら70EuAl-30Siではむしろ磁化率は減少し,この差は赤外線加熱中、ガラス成分(SiO_2,Al_2O_3)が揮発するためであると考えた.一方、70Eu_<0.98>Fe_<0.02>Al-30Siガラスは最も大きな磁化率を示し,大きな負のキュリー温度(-186.2K)をもっていた.これはXRD測定の結果から, 70Euガラス中にFe_3O_4が析出したためであることが分かった.最も重要な点は,このガラスが依然として可視域で透明であることである.それゆえ磁化率の増加から可視域用ファラデー回転ガラスとして期待できることがわかった.化学
マイノリティの子どもを包摂する学校参加制度に関する実証的研究

「開かれた学校」という制度の導入がマイノリティとされる子どもの包摂に資するかどうか、その鍵を握るのは、教員と異なる立場にある非専門家スタッフによる「アドボカシー」であることが明らかとなった。「アドボカシー」とは子どもの意思の代弁と権利の擁護から構成されるもので、その遂行には非専門家スタッフ同士のネットワーキングが重要な役割を果たす。非専門家スタッフによる「アドボカシー」は時に学校への異議申し立てを伴うが、子どもの最善の利益を保障するためには異質な価値のぶつけ合いが必要となる。本研究は、保護者・地域住民による「意思決定への参加」と「教育活動への参加」が制度化される状況をふまえ、マイノリティの子どもを包摂する学校参加制度の条件と特質を実証的に明らかにすることを目的としている。2014年度は主として、保護者・地域住民のボランティアによる「教育活動への参加」がマイノリティの子どもに不利益をもたらす可能性について検討を加えた。得られた知見としては、大きく次の二つである。まず、学びの場における子どもの最善の利益の保障という点に鑑みると、保護者・地域住民のボランティアによる「教育活動への参加」が広がる状況を過剰に礼賛するべきではないことが明らかとなった。同年齢の子どもたちは多少の個人差はあるとしても基本的に同質であるという前提や、ボランティアの手を借りることが原則的に許されないという学級の規範が揺らがない以上、授業に継続して携わるボランティアの存在は、教室での学習や生活から排除されがちな子どもに付与されるスティグマを維持・強化する要因にしかならない。学校側がボランティアの権限を制約し、マイノリティの子ども以外には手を貸さぬよう指示することは避けなければならない。しかし一方で、職責や地位に縛られることのないボランティアの参入が、教室での学習や生活から排除されがちな子どもの包摂に繋がる可能性もあることが明らかとなった。教師とは異なる存在として子どもに接することが可能なボランティアは、例外的な措置を受けているのが一部の子だけではないと示したり、教室空間の中であえて異質な存在を演じたりすることによって、スティグマの軽減・解消を図ることができる立場にあった。ボランティアの権限を特定の児童の介助だけに限定するのでなければ、学びの場における差別や排除の構造を転換させるのにボランティアの協力を得ることは有効な面があると言える。本年度は、マイノリティの子どもに対する排除や抑圧の構造を転換する「教育活動への参加」の在り様を模索するとともに、「意思決定への参加」を拡充することがマイノリティの子どもに不利益をもたらす可能性について、主に検討を行った。分析から明らかとなったのは以下の点である。まず、マイノリティの子どもに対する排除や抑圧の構造を転換するために重要となるのが、「教育活動への参加」を担うボランティアによる「アドボカシー」の遂行である。「アドボカシー」とは、子どもの意思を代弁しその権利を擁護するべく、教師とのコンフリクトをも厭わずにボランティアが現状への異議申し立てを行うことである。教師との間に上下の関係を認識するボランティアからすると、現状への異議申し立てを行うことには困難が伴うのだが、事例研究からは、脆弱な立場に置かれたボランティア同士が、子どもへの対応に関して意見や情報を共有するネットワークを構築することにより、「アドボカシー」の遂行が可能となることが示唆された。他方、「意思決定への参加」の拡充がマイノリティの子どもに不利益を及ぼす可能性については、やはり注意を払わねばならない。「意思決定への参加」と「教育活動への参加」の制度化が一体となって進む状況下において、差別や排除を生む学びの場の構造を保護者・地域住民が批判的に問い直すことができるかといえば、必ずしもそうではないことが明らかとなった。そこで、マイノリティの子どもの包摂に寄与する実践の在り様について多角的な視点から検討を図るべく、不登校児童生徒の支援を担うフリースクールが果たす役割にも注目した。フリースクールを事例としながら、マイノリティの子どもが教師ではない大人とかかわることの意義を探り、保護者・地域住民が学校参加を行う際に重要となるポイントの抽出を試みている。本研究の二年目は、マイノリティの子どもに対する排除や抑圧の構造を転換する「教育活動への参加」の在り様を模索することが中心的な課題であった。マイノリティの子どもに対する排除や抑圧の構造を転換するための鍵となるのがボランティアによる「アドボカシー」の遂行であること、子どもへの対応に関して意見や情報を共有するネットワークの構築が「アドボカシー」の遂行にとって重要であることが明らかにできたという点で、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本年度は、当初の計画を前倒しすることにより、マイノリティの子どもを包摂する学校参加の在り方を理論化・体系化することに注力した。とりわけ、学校ガバナンスの構造を転換する「開かれた学校」という制度の導入が、多様で異質な背景を有する子どもの包摂に繋がるまでの道程について、主に検討を加えた。分析から明らかとなったのは、学校ー家庭・地域が異質な価値をぶつけ合うことの重要性である。具体的には、家庭・地域から学校に対して異議申し立ての声が上がる状況を、マイノリティの子どもに向き合う責任を三者が分有する契機として積極的に評価すべきケースもあることを指摘した。それは、三者が同質の価値を共有するに至ることを「連携」や「協働」と捉える昨今の実践/研究の動向に、新たな視点を提供するものと言える。

また、マイノリティの子どもを包摂するための活動を地域に立ち上げた学校の事例から、「意思決定への参加」の場である学校運営協議会での議論が有効に機能する場合もあることを明らかにした。併せて、マイノリティとされる子どもの包摂に寄与する実践の在り様について多角的な視点から検討を行うべく、昨年度に引き続き、不登校児童生徒の支援を担うフリースクールが果たす役割についても分析を行った。学校生活のみならず家庭生活にも困難を抱える子どもを包摂するフリースクールの実践やそれを支える思想は、「開かれた学校」の在り方を考察するうえで参照すべきものと言える。また、マイノリティの子どもの包摂という観点から「多様な学び保障法」(当時)をめぐる議論が抱える問題点についても指摘を行った。出版助成を獲得することができたため、本研究の成果をいち早く刊行する機会を得た。そのため、当初は平成29年度(研究最終年度)に実施することを予定していた「マイノリティの子どもを包摂する学校参加の在り方の理論化・体系化」という課題に取り組み、その成果を発信することができた。また、マイノリティとされる子どもの包摂について多角的な視点から検討するため、不登校児童生徒の支援を担うフリースクールの実践について検討に付すことができていることも、本研究課題を計画以上に進展させる要因となっている。本研究の最終的なゴールとして設定していた「マイノリティの子どもを包摂する学校参加の在り方の理論化・体系化」については前年度までに一定の成果を発信できたことから、最終年度はその内容を応用・発展させることに注力した。具体的には、「マイノリティの子どもを包摂する学校参加の在り方の理論化・体系化」を行う過程で得られた知見をもとに、(1)「社会に開かれた教育課程」や「チームとしての学校」がもたらす影響に迫ること、(2)「社会に開かれた教育課程」や「チームとしての学校」を推し進めるうえで留意すべき点を明らかにすることが、主要な課題となった。その結果、「社会に開かれた教育課程」や「チームとしての学校」はマイノリティとされる子どもの包摂を約束するものではなく、学校そのものが多様性に開かれた場へと変革していかねばならない点を指摘するに至った。また、「社会に開かれた教育課程」がその理念として掲げる「学校教育を学校内に閉じずに、その目指すところを社会と共有・連携しながら実現させる」というのは、学校の内→外、官→民、教育→福祉というベクトルのみならず学校の外→内、民→官、福祉→教育というベクトルをも含むものでなければならないことが示唆された。研究期間全体を通じて実施した研究の成果として最も重要な点は、学校を開くことがマイノリティとされる子どもの包摂に資するかどうか、その鍵を握るのは教員と異なる立場にある非専門家スタッフによる「アドボカシー」であると明らかにしたこととなる。「アドボカシー」とは子どもの意思の代弁と権利の擁護から構成されるもので、その遂行には非専門家スタッフ同士のネットワーキングが重要な役割を果たす。非専門家スタッフによる「アドボカシー」は時に学校への異議申し立てを伴うが、子どもの最善の利益を保障するためには異質な価値のぶつけ合いが不可欠と言える。「開かれた学校」という制度の導入がマイノリティとされる子どもの包摂に資するかどうか、その鍵を握るのは、教員と異なる立場にある非専門家スタッフによる「アドボカシー」であることが明らかとなった。
インスリン抵抗性は冠動脈疾患と弁膜病変合併の促進因子である

心臓CTを施行した大動脈弁狭窄症患者の長期追跡から大動脈弁石灰化スコア高値は将来の心血管イベントの予測因子であった。エコーによる大動脈弁、上行大動脈、僧帽弁弁輪の石灰化をスコア化し、冠動脈イベント発生率の予測因子であることを明らかにした。インスリン抵抗性が大動脈弁硬化症患者において左室機能障害をきたしていることを心筋組織ドプラを用いて明らかにした。血中のインスリン値と血糖値からHOMA値を求めた。インスリン抵抗性群では左室長軸方向のストレインが低下し心筋収縮障害が進行していることを明らかにし、インスリン抵抗性の改善が将来の心不全予防に重要であることを示唆した。平成19年より「大動脈弁硬化症の診断と冠動脈疾患との関連性および追跡調査に関する研究(CT-AVC研究)」の患者登録を行っている。平成23年度までに約150例の症例登録予定をさらに延長し、24年7月まで300例をめどとして患者登録を継続中である。2.タリウム負荷心筋シンチグラフィーを行った約800例の後向き解析結果から、心エコーで検出される大動脈弁石灰化(AVC)は、一過性虚血陽性に対する独立した危険因子であり、特に無症候性患者においてその関係が顕著であったことを英文誌に報告した。すなわち、アデノシン負荷タリウム(Tl-201)心筋シンチグラフィー及び経胸壁心エコー検査の両方を施行された669例を解析対象と、その結果、AVCを有することは心筋虚血の存在(Sum difference score [SDS]≧3)に対する独立した因子であった(調整オッズ比[OR] =1.56; 95%信頼区間[CI] = 1.10ー2.23; p = 0.013)。さらに、無症候性患者311例での検討においても、AVC有りは心筋虚血の存在(SDS ≧3)(調整オッズ比= 1.98; 95%CI = 1.15ー3.45; p = 0.014)及び中等度から重症虚血の存在(SDS ≧8)(調整オッズ比= 4.31; 95%CI = 1.67ー12.8; p = 0.0043)に対しする独立した因子であった。心臓CTを用いたCT-AVC研究では症例登録を継続している。心エコーにて大動脈弁石灰化を認めた症例に心臓CTを施行し、大動脈弁石灰化は冠動脈粥状硬化との関連があることを明らかにしている。また、大動脈弁狭窄症症例の予後追跡を行ったところ、大動脈弁石灰化量が多いことは、その後の心イベント(死亡、大動脈弁置換術)の発生の予測指標となることを報告予定である。心臓CTを施行した大動脈弁狭窄症患者の長期追跡の結果、大動脈弁石灰化スコア高値は将来の心血管イベントの予測因子であった。冠動脈疾患の疑われる患者に対し心エコーによる大動脈弁、上行大動脈、僧帽弁弁輪の石灰化を評価しこれらをスコア化すると、将来の冠動脈イベント発生率の予測因子であることを明らかにした。弁膜石灰化と冠動脈疾患との密接な関係を明らかにした。インスリ抵抗性群では左室長軸方向のストレインが低下し心筋収縮障害が進行していることを明らかにし、インスリン抵抗性の改善が将来の心不全予防に重要であることを示唆した。1,平成19年より「大動脈弁硬化症の診断と冠動脈疾患との関連性および追跡調査に関する研究(CT-AVC研究)」の患者登録を行っている。すなわち、アデノシン負荷タリウム(Tl-201)心筋シンチグラフィー及び経胸壁心エコー検査の両方を施行された669例を解析対象と、その結果、AVCを有することは心筋虚血の存在(Sum difference score [SDS]≧3)に対する独立した因子であった(調整オッズ比[OR] = 1.56; 95%信頼区間[CI] = 1.10ー2.23; p = 0.013)。

さらに、無症候性患者311例での検討においても、AVC有りは心筋虚血の存在(SDS ≧3)(調整オッズ比= 1.98; 95%CI = 1.15ー3.45; p = 0.014)及び中等度から重症虚血の存在(SDS ≧8)(調整オッズ比= 4.31; 95%CI = 1.67ー12.8; p = 0.0043)に対しする独立した因子であった。タリウム負荷心筋シンチグラフィーを行った約800例の後向き解析結果から、心エコーで検出される大動脈弁石灰化(AVC)は、一過性虚血陽性に対する独立した危険因子であり、特に無症候性患者においてその関係が顕著であったことを英文誌に報告した。しかし、無症候性糖尿病患者においての関係についての有用性は明らかにするに至らなかった。心臓CTを用いたCT-AVC研究では症例登録を継続している。心エコーにて大動脈弁石灰化を認めた症例に心臓CTを施行し、大動脈弁石灰化は冠動脈粥状硬化との関連があることを明らかにしている。また、大動脈弁狭窄症症例について、予後追跡を行ったところ、大動脈弁石灰化量が多いことは、その後の心イベント(死亡、大動脈弁置換術)の発生の予測指標となることを明らかにしている。また、心膜脂肪量が冠動脈イベント発生と関連があることを明らかにした。大動脈弁石灰化と耐糖能障害との関連については、未だ十分な結果を得るに至っていない。さらなる追跡調査、血液マーカーとの関連を含めた検討を要すと考えられる。荷試験(OGTT)を施行するもので、研究期間中は血液サンプルの解析から主として耐糖能異常、アディポネクチンを含めたインスリン抵抗性と冠動脈、弁疾患との関連を明らかにする。さらに、症例の追跡調査から臨床転帰についても検討する予定である。CTーAVC研究:本研究は危険因子重積患者に対し心臓CTによる冠動脈と動脈弁の同時評価を行い、血液サンプルの保存、75g経口糖負荷試験(OGTT)を施行するもので、研究期間中は血液サンプルの解析から主として耐糖能異常、アディポネクチンを含めたインスリン抵抗性と冠動脈、弁疾患との関連を明らかにする。RI-AVC研究:論文化したシンチグラフィーのデータでは糖尿病患者に対する有用性が不十分であった。また、心エコー施行患者においてAVCが虚血性心疾患の検出マーカーとなりうるかどうかについては明らかでない。今後、心エコー検査患者baseにおいての臨床研究を推進していきたい。平成24年度に行う予定であった保存血清を用いた、各種バイオマーカーの測定に遅延が生じているため未使用額が生じた。平成25年度分と合わせて、これらバイオマーカー測定に主として使用する予定である。1.主に、凍結保存している血漿および血清サンプルを用いて1,5-Anhydroglucitol (1,5-AG、血中脂肪酸分析(エイコサペンタ酸/アラキドン酸比)、高分子アディポネクチン、オステオプロテジェリン(OPG)、骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)、血清カルシウム、リンなどの測定に研究費を使用していく予定である。
胸腺髄質微小環境のウイルス感染擬態

免疫応答に重要なTリンパ球が胸腺で分化する際、自己組織に反応しないTリンパ球だけが選択される。この選択機構に重要な胸腺髄質上皮細胞は、体内の様々な組織のタンパク質を多種類にわたり発現しており、このタンパク質発現に反応するTリンパ球を胸腺で除くことで、結果として自己組織に応答するTリンパ球が除かれる。本研究課題で、ウイルス感染で誘導されるタンパク質が、胸腺髄質上皮細胞では感染がない状況でも発現することが明らかとなった。胸腺の髄質上皮細胞は、臓器に特異的な抗原を異所的に発現、それを提示することで、自己臓器反応性T細胞を除去し、自己免疫を抑制する。これまでに、髄質上皮細胞の分化・成熟に必要なシグナルを明らかとしてきた。その過程で、髄質上皮細胞は"臓器に特異的な抗原"のみならず、1型インターフェロンで誘導される遺伝子を多種類にわたり発現する、との予備的な結果を得た。すなわち、胸腺髄質では、あたかもウイルス感染を"擬態"した微小環境が形成され、ウイルス感染時に誘導されるタンパク質に応答するT細胞も除去されていると仮説を立てた。I型インターフェロンで誘導される遺伝子がどのような分子機構で発現制御されているのか明らかにするために、まず胸腺髄質上皮細胞の分化に必要なシグナル伝達因子TRAF6やNIKに依存して胎仔胸腺ストローマで発現誘導される1型IFN誘導遺伝子群を同定した。ついでそれらの遺伝子群のプローモーター領域をin silicoで解析し、発現を制御する転写因子候補としてSTATIなど複数の転写因子を得た。これらの結果は、STAT1は胸腺髄質上皮細胞が機能的に分化する際に活性化されることを示唆する。そこで胸腺髄質上皮細胞の分化を誘導するTNFファミリーサイトカインRANKLの刺激により、STATlが活性化されるのか調べるために、胸腺ストローマ器官培養をRANKLで刺激した後、ウエスタンブロットで解析した。その結果、RANKL刺激に依存してSTATlのタンパク質発現およびリン酸化が亢進していることが判明した。胸腺内の負の選択は自己免疫寛容の誘導機構の一つである。負の選択により自己抗原を強く認識するT細胞は分化途中で除去されるが、その不全は自己免疫疾患の発症を引き起こす。胸腺髄質上皮細胞は、臓器に特異的な抗原を異所的に発現、それを提示することで、自己臓器反応性T細胞を除去し、自己免疫を抑制する。これまでに髄質上皮細胞は臓器特異的な抗原のみならず、I型インターフェロンで誘導される遺伝子を多種類にわたり発現するとの結果を得てきた。本研究課題では胸腺髄質では、あたかもウイルス感染を擬態した微小環境が形成され、ウイルス感染時に誘導されるタンパク質に応答するT細胞も除去されていると仮説を立て、その分子機構と生理的意義の解明を目指した.昨年度までに胸腺髄質上皮細胞の分化を誘導するRANKLシグナルによりSTAT1が活性化され、I型インターフェロンの標的遺伝子群が胸腺髄質上皮細胞で発現することを示唆する結果を得た。本年度は、I型インターフェロン標的遺伝子群の発現がI型インターフェロンを介しているのか、I型インターフェロン受容体の欠損マウスを用いて検討した。胎仔胸腺ストローマをI型インタフェロンレセプター欠損マウスより調製し、RANKL刺激後にI型インターフェロンおよびI型インターフェロン誘導遺伝子群が誘導されるのか定量的PCR法で解析したところ、I型インターフェロンの1つであるインターフェロンベータが誘導されること、さらにI型インターフェロン誘導遺伝子の発現の一部はI型インターフェロン受容体に依存していることが判明した。この結果を踏まえて現在、胸腺におけるI型インターフェロン誘導遺伝子群発現の生理的意義を検討している。
社会運動組織の内部環境と外部環境についての社会学的研究-神奈川県逗子市池子米軍家族住宅建設問題を事例にして

4月から7月までは、前年度の面接調査記録の整理・分析ならびに、それ以前に収集した調査データの整理・分析を進めた。これに基づいて、10月末実施の郵送(パネル)調査のため、8月末から過去に実施した対象者から再調査対象者を選定(1600人)、10月実査に入った。11月末までに574票を回収し、12月から集計・分析作業に入った。対象者の構成は、87年および89年にアンケート調査を実施した逗子市民と、87年ならびに91年に面接調査を実施した運動に関わる人々とからなっている。また、これより先、9月には、これまで面接調査を実施してこなかった運動の流れにある人への聞き取りを行った。郵送調査は、二種類の形成から成っている。A票は、90年以降の市レベルの選挙における投票行動ならびに所属団体についての調査(552票)、B票は、池子米軍住宅建設反対運動終焉についての自由回答による調査、であった(537票)。ともに分析途中であるが、B票からは、運動終焉についてはっきりと二種類の考え方があることがわかった。A票からは、90年の市議会議員選挙から、92年の市長選挙、94年の市議会議員選挙、94年末の出直し市長選挙に至る4選挙における、投票行動の推移傾向が読み取れる。逗子市民全般から選んだ対象者についても、87年、89年のデータで得られた投票傾向による対象者を層化し、これを今回の時系列的変化で見てみると、かなり著しい傾向の区別を見ることができた。さらに、運動に参加していた人について、このことを見ると、より著しい傾向を見ることができ、運動体が、まさに解体していった過程を再構成する重要なデータを得たことがわかる。『逗子の市民運動』と題して、過去の調査記録・論文も含めた著書が本年11月に出版される。94年度は、7月から11月にかけて池子米軍住宅建設反対運動に関わる人々(12人)に対して集中的な面接調査を行ない、現在、91年夏以来の諸出来事への関わりならびに運動の変化について記録を作成している。長い録音テープを文書にするとともに、これまで整理してきたデータと突き合わせ作業を始めている。さらに12月には市長選挙が行なわれ、これにも参与観察を行なって記録を収集したが、これについても、整理作業を始めたところである。さらに、これまで収集してきた膨大なインタビュー記録、電子計算機内のデータ、文書資料類の整理作業を実施し、明年度のまとめのための準備を進めている。5月に米軍住宅建設受け入れに市長の基本方針が変化し、これに伴い市内が粉糾し、年末に市長選挙が行なわれた。現職の敗退、受け入れ派の当選という結果を生んだが、すでにこうした趨勢へと変化していく気配は、現在精密に整理をしている91年以来の出来事について調べた本年度のデータからもわかる。かつての受け入れ反対運動の一枚岩的な結束が、ここ3年ほどの間に急速に崩れていっていったことが理解できる。かつて一枚岩を誇った運動組織も、問題の長期化に伴い、成員間の関心の相違や居住地域の差異から、内部でのグループ化が進み、グループ間の対立が、かなり激しくなっているところも確認することができた。かえって、かつて対立していた受け入れ派の一部と、受け入れ反対派の一部とが協力関係を結ぶような事態も確認することができたほどである。

12年に及ぶ運動が、急速に終息していく気配を見せているが、受け入れ派市長のものとで、これまで運動が残してきた遺産がどのように継承されるのか、あるいはまったく新しいものに取って代わるのか、さらには住民それぞれの意識の急速な変化をさらに記録するために6月から実施する半構造化した面接調査の項目作成作業を進めている。4月から7月までは、前年度の面接調査記録の整理・分析ならびに、それ以前に収集した調査データの整理・分析を進めた。これに基づいて、10月末実施の郵送(パネル)調査のため、8月末から、過去に実施した対象者から再調査対象者を選定(1600人)、10月実査に入った。11月末までに574票を回収し、12月から集計・分析作業に入った。対象者の構成は、87年および89年にアンケート調査を実施した逗子市民と、87年ならびに91年に面接調査を実施した運動に関わる人々とからなっている。また、これより先、9月には、これまで面接調査を実施してこなかった運動の流れにある人への聞き取りを行った。郵送調査は、二種類の形式から成っている。A票は、90年以降の市レベルの選挙における投票行動ならびに所属団体についての調査(552票)、B票は、池子米軍住宅建設反対運動終焉についての自由回答による調査、であった(537票)。ともに分析途中であるが、B票からは、運動終焉についてはっきりと二種類の考え方があることがわかった。A票からは、90年の市議会議員選挙から、92年の市長選挙、94年の市議会議員選挙、94年末の出直し市長選挙に至る4選挙における、投票行動の推移傾向が読み取れる。逗子市民全般から選んだ対象者についても、87年、89年のデータで得られた投票傾向による対象者を層化し、これを今回の時系列的変化で見てみると、かなり著しい傾向の区別を見ることができた。さらに、運動に参加していた人について、このことを見ると、より著しい傾向を見ることができ、運動体が、まさに解体していった過程を再構成する重要なデータを得たことがわかる。現在、『緑と主婦のシンボリズム』と題して、過去の調査記録・論文も含めた著者を執筆中である(5月末脱稿)。
メチル水銀毒性の発現とその調節に関わる細胞内機構の解明する研究

遺伝子レベルでの検索を行い、細胞内でユビキチン化を受け、かつ、メチル水銀毒性を増強または軽減する酵母およびヒトの蛋白質をそれぞれ数種ずつ同定することに成功した。それら蛋白質の作用機構およびユビキチン・プロテアソームシステムによる分解調節機構についても、これまで知られていなかった多くの新事実が判明し、細胞内では多くの因子が複雑に関係した機構によってメチル水銀毒性が決定されていることが示唆された。メチル水銀毒性の発現機構は水俣病の発症から半世紀が経過した現在も不明のままであり,解明のための糸口さえほとんど得られていない。我々は、出芽酵母を用いた研究によって、ユビキチン・プロテアソームシステム(UPシステム)がメチル水銀毒性に対して防御的に機能することを初めて見出した。UPシステムはメチル水銀毒性の増強と軽減に関与する蛋白質の分解に関わっており、これら蛋白質の作用機構と分解機構を明らかにすることによって永年の謎であったメチル水銀毒性発現機構のみならず、UPシステムによるメチル水銀毒性制御機構も解明されるものと期待される。そこで本研究は、UPシステムによって分解が促進されるメチル水銀毒性増強蛋白質およびメチル水銀毒性軽減蛋白質を同定し、それら蛋白質のメチル水銀毒性に対する作用機構を解明すると共に、UPシステムによるそれら蛋白質の分解調節機構を明らかにすることを目的とする。本研究は、ユビキチン・プロテアソームシステム(UPシステム)によって分解が促進されるメチル水銀毒性増強蛋白質およびメチル水銀毒性軽減蛋白質を同定し、それら蛋白質のメチル水銀毒性に対する作用機構を解明すると共に、UPシステムによるそれら蛋白質の分解調節機構を明らかにすることを目的としている。メチル水銀毒性を増強または軽減する蛋白質をsiRNA法で検索したところ、新たに数種の蛋白質を見出すことに成功した。現在これら蛋白質とUPシステムとの関係を検討中である。また、既に我々が見出している蛋白質について検討し、メチル水銀毒性増強作用を有するピルビン酸合成関連酵素(UPシステムによって分解される)に関しては、ピルビン酸のミトコンドリアへの取り込み量増加がメチル水銀毒性の増強に関わること、そして、ピルビン酸がTCAサイクルで代謝を受けることなくその作用を示すことが明らかとなった。また、UPシステムとメチル水銀毒性との関係を明確にするために、ユビキチン転移酵素の中でメチル水銀毒性に関与する分子種を検索したところ、Ubc1,Cdc34,Ubc4,Ubc5,Ubc11の5種の高発現およびUbc2,Ubc13の欠損がそれぞれ酵母にメチル水銀耐性を与えることが判明した。Ubc2欠損酵母にCdc34を高発現させたところ相乗的に耐性度が上昇したことから、両者に何らかの特異的な関係がある可能性も考えられる。本知見はUbc2の新しい機能の存在を示唆しており、本研究によってメチル水銀毒性の関係のみならず、各ユビキチン転移酵素の役割分担が明らかになる可能性がある。昨年度、ユビキチン転移酵素(E2)の中でメチル水銀毒性に関与する分子種を検索し、Ubc1, Cdc34, Ubc4, Ubc5, Ubc11(Aグループ)の高発現およびUbc2, Ubc13(Bグループ)の欠損がそれぞれ酵母にメチル水銀耐性を与えることを明らかにした。A5種はK48にユビキチンを連結して基質蛋白質の分解を促進し、B2種はK63にユビキチンを連結するが基質蛋白質の分解には関与しないことが分かっている。本年度はこれらE2について遺伝学的解析をした結果、Ubc2とUbc13は共にCdc34またはUbc4の機能に関連してメチル水銀毒性を増強する可能性が示された。また、我々はメチル水銀毒性増強蛋白質としてWhi2を見出しているが、AグループのE2はWhi2の細胞内レベルを低下させ、BグループのE2は逆に上昇させることが判明し、BグループがAグループの機能を負に制御することによってメチル水銀毒性を増強することが示唆された。さらに、前年度実施したスクリーニングによって同定されたヒトのメチル水銀毒性関連因子の中で、ヒトE2の1種であるUBE2B(酵母Ubc2のホモログ)およびUBE2WがノックダウンによってHEK293細胞に特に顕著なメチル水銀高感受性を与えることが明らかとなった。一方、ユビキチンリガーゼの一種であるF-bOX蛋白質の中でメチル水銀毒性に関連する分子種を検索したところ、既に我々が同定しているHrt3およびYlr224wに加えてYmr258cが同定された。Ymr258cはF-boxドメイン類似構造を有する蛋白質であるが、本蛋白質がF-box蛋白質として機能することによってメチル水銀毒性の軽減に関与することも確認された。今後さらに詳細な検討を行うことよって、ユビキチン・プロテアソームシステムによるメチル水銀毒性調節機構が解明されるものと期待される。メチル水銀毒性の発現に関わることが昨年度判明したユビキチン転移酵素分子種の1つであるUbc2の基質蛋白質を検索し、メチル水銀毒性を増強させる蛋白質として既に我々が同定しているD1d3の細胞内レベルがUbc2の欠損によって上昇することが判明した。

メチル水銀毒性に関わる脱ユビキチン化酵素の分子種について検討したところ、Ubp2、Ubp4、Ubp6およびUbp14がメチル水銀毒性増強作用を示し、Ubp7、Ubp13およびUbp15がメチル水銀毒性軽減作用を示すことが明らかになった。一方、タンデムユビキチンであるUbi4がエンドソームを介した液胞への蛋白質輸送を亢進することによってメチル水銀毒性増強作用を示すことも判明した。Ubp7、Ubp13およびUbp15は共にこのUbi4のモノユビキチンへのプロヤシングを亢進することによって蛋白質の液胞への輸送系を負に制御することによってメチル水銀毒性を軽減し、Ubp6はプロテアソーム上で機能してユビキチン化されたWhi2(我々が見出したメチル水銀毒性増強蛋白質)のプロテアソームでの分解を抑制することによってメチル水銀増強作用を示すことが明らかになった。さらに、ユビキチン化Whi2はシャトル蛋白質Rad23によってプロテアソームへ運搬され、Rpn10(ポリユビキチン鎖レセプター)に認識された後に分解されことも判明し、Ubp6はプロテアソームに運搬されてきたユビキチン化Whi2からユビキチンを解離させることによってWhi2のRpn10を介したプロテアソームによる分解を負に制御していることが示唆された。また、メチル水銀毒性の発現に影響を与え、かつ、メチル水銀によってユビキチン化が促進される蛋白質としてSis1を同定することに成功し、メチル水銀によるユビキチン化促進機構解明の突破口が開かれた。メチル水銀毒性を軽減し、かつ、ユビキチン・プロテアソームシステムによって分解される酵母蛋白質として我々が同定した脱N-グリコシル化酵素Png1は小胞体での蛋白質分解に関与することが知られているが、このPng1がメチル水銀によって誘発される小胞体ストレスを抑制することによってメチル水銀毒性を軽減している可能性が示唆された。また昨年度我々は、メチル水銀毒性を軽減し、かつ、メチル水銀によってユビキチン化が促進される蛋白質としてSis1を同定したが、本年度の検討により、リニアポリユビキチンUbi4が単体のユビキチンにプロセシングされることなくリニアポリユビキチンとしてSis1のユビキチン化に関与することが示唆された。プロセシングを受けていないUbi4のレベルが増加すると酵母の増殖が抑制され、リニアポリユビキチン蛋白質としてのUbi4のレベルがメチル水銀濃度依存的に増加することも判明し、メチル水銀毒性の発現にUbi4レベルの上昇が関与する可能性が示唆された。また、ヒトのリニアポリユビキチンであるUBBおよびUBCの発現抑制がそれぞれ細胞に高いメチル水銀耐性を与えることが明らかとなった。さらに、機能未知蛋白質TEX27の発現抑制も細胞に高いメチル水銀感受性を与えることが判明し、TEX27がUBBまたはUBCと同一の経路でメチル水銀毒性の軽減に関与している可能性が示唆された。TEX27はその構造中にZn-fingerドメインを有しているが、メチル水銀処理によってTEX27が核へ移行することが明らかとなったことからTEX27は核中でメチル水銀毒性軽減に関与していると考えられる。平成20年度にメチル水銀毒性に関わる酵母の脱ユビキチン化酵素を検索したが、本年度はヒトの脱ユビキチン化酵素の検索を行った。
Caspase非依存性細胞死の誘導剤探索とその分子機構

放射線増感作用のある8-Nitrocaffeineが誘導するネクローシス様の細胞死について検討した結果、8-NitrocaffeineはCaspase非依存的に細胞死を誘導することが明らかになった。8-Nitrocaffeineのニトロ基は細胞内で還元的代謝を受けるが、酸素が十分存在する条件ではニトロ基に再酸化されてこのとき同時に活性酸素が産生される。8-Nitrocaffeineと同時に抗酸化剤PDTC、BHA、Troloxで細胞を処理すると、8-Nitrocaffeineによる細胞死が顕著に抑制された。また無酸素状態で細胞を8-Nitrocaffeineで処理すると細胞死は全く認められなかった。これらの結果から、ニトロ基の酸化還元反応で産生される活性酸素が8-Nitrocaffeineによる細胞死に重要な役割を果たしていることが明らかになった。さらに8-Nitrocaffeine耐性細胞を樹立しその性状を解析した結果、この耐性細胞は抗癌剤による細胞死には感受性を示したが抗Fas抗体による細胞死誘導には耐性を示した。このことからFasによる細胞死誘導に活性酸素が関与する可能性が示唆された。IAPファミリータンパク質ApollonがCaspase9、Smacと結合し、ユビキチン・プロテアソーム系による分解を促進することによりアポトーシスを阻害することが明らかになった。Apollonのノックアウトマウスは胎生致死であり、Apollonが個体発生に重要な機能を持つ遺伝子であることが明らかになった。ApollonはIAPファミリータンパク質のひとつで、グリオーマ、卵巣がん、腎がん細胞などで発現している。Apollonを高発現したグリオーマは抗癌剤耐性を示すこと等から細胞死制御に関与すると推測されるが、その分子機構は明らかではない。Apollonの全長cDNA発現ベクターを作製し細胞に遺伝子導入したところ、500kDaのApollon全長タンパク質が発現し、細胞はアポトーシス耐性を示した。この結果から、Apollonは他のIAPファミリ-と同様アポトーシス阻害タンパクであることが明らかになった。ApollonのBIRドメインを含む領域はApollon全長タンパクと同様にアポトーシスを阻害したが、UBCドメインを含む領域ではアポトーシスを阻害しなかったことから、Apollonによる細胞死制御にはBIRドメインが重要であることが示された。in vitroでの解析の結果、ApollonのBIRドメインはCaspase3を阻害する事がわかった。またApollon結合タンパクを解析した結果、AppllonはSmacと強く結合することが明らかになった。これらの結果からApollonはSmac結合とCaspase阻害によりアポトーシスを制御していることが示された。ヒト単球系白血病細胞U937をetoposideなどの抗癌剤で処理すると数時聞でアポトーシス小体の形成を伴う典型的なアポトーシスが観察される。この細胞系を利用して、細胞形態の変化を指標にCaspase非依存性細胞死の誘導剤を探索した.その結果放射線増感作用のある8-Nitrocaffeineが、薬剤処理濃度及び処理時間によらず形態的にアポトーシスとは異なる細胞死をU937細胞に誘導することを見いだした.電子顕微鏡で8-Nitrocaffeineによる細胞死を詳細に観察した結果、8-Nitrocaffeine処理2時間後には細胞全体及び核やミトコンドリアに著しい形態変化が認められ、4時間後には細胞膜の絨毛の消失と細胞質に空砲形成が見られた。6時間後には細胞膜表面が荒れた感じになり、細胞質もスカスカになっていた。これら細胞死の形態的な観察から8-Nitrocaffeineがアポトーシスとは異なる細胞死を誘導していることが示された。8-Nitrocaffeineで処理した細胞では、染色体DNAのヌクレオソーム単位への分解は全く認められず、また細胞内でCaspaseの活性化も認められなかった。さらにCaspase阻害剤ZVADを同時に処理しても8-Nitrocaffeineによる細胞死は全く抑制されなかった。これらの結果から8-NitrocaffeineはCaspase非依存的にネクローシス様の細胞死を誘導することが明らかになった。

さらに8-Nitrocaffeine耐性細胞を樹立しその性状を解析した結果、この耐性細胞は抗癌剤による細胞死には感受性を示したが抗Fas抗体による細胞死誘導には耐性を示した。このことからFasによる細胞死誘導に活性酸素が関与する可能性が示唆された。IAPファミリータンパク質ApollonがCaspase9、Smacと結合し、ユビキチン・プロテアソーム系による分解を促進することによりアポトーシスを阻害することが明らかになった。Apollonのノックアウトマウスは胎生致死であり、Apollonが個体発生に重要な機能を持つ遺伝子であることが明らかになった。