hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胆石症における脂質トランスポーターのトラフィッキング異常機構のin vivo解析

肝毛細胆管膜に存在するコレステロールトランスポーター・Abcg5/Abcg8の機能亢進は、コレステロール胆石症を引き起こすと考えられている。我々はこれまでに過栄養状態が肝毛細胆管膜におけるAbcg5/Abcg8の機能、および発現を顕著に増加させることを見出したが、その機構に関しては不明であった。本研究では、過栄養状態がAbcg5/Abcg8のトラフィキング、および機能発現に与える影響について解析した。その結果、肝臓にコレステロールが蓄積した状態では、細胞内小胞に蓄えられたこれらトランスポーターの毛細胆管膜への移行が促進すること、その機構にcAMPシグナルが関与することを明らかにした。食の欧米化(高カロリー食中心の食生活)による過栄養状態は、生体のコレステロール恒常性を乱すことにより、動脈硬化症、脳血管疾患、心臓病、胆石症等の重篤な疾患を引き起こす。特にコレステロールの体外への主要な排泄経路である肝臓から胆管への胆汁排泄、およびそれを担うABCG5/ABCG8コレステロールトランスポーターの発現・機能変化は、これら疾患発症のメカニズムを解明するうえで極めて重要である。本研究は、申請者らが構築した新規in vivo動態解析法を用いて、ABCG5/ABCG8の過栄養状態における細胞内トラフィキングへの影響とコレステロール胆石症発症との関係について解明することが目的である。2013年度は、Abcg5-CFP/Abcg8-YFPをマウス肝臓に発現させ、その分布変動の経時変化を解析した。その結果、これらトランスポーターが粗面小胞体でヘテロダイマーを形成し、ゴルジ体から基底膜を経由することなく毛細胆管膜に到達するという移行経路が新たに解明された。また毛細胆管膜に到達する前に、一度エンドソーム画分に含まれる何らかの小胞に蓄えられる可能性が示唆された。さらに胆石症誘発食飼育マウスでは、これらトランスポーターの毛細胆管膜への到達が速くなること、また遺伝子導入1824時間後では普通食群に比べて毛細胆管での発現が増加し、エンドソーム画分での発現は減少していることを見出した。以上の結果から、肝臓に異常蓄積したコレステロールを排泄するために、ABCG5/ABCG8の毛細胆管膜への移行が促進されるという翻訳後調節が存在することが明らかになった。2013年度の成果より、Abcg5/Abcg8の肝細胞内における毛細胆管膜への移行経路が明らかになり、また胆石症誘発食負荷によりこれらトランスポーターの毛細胆管膜への移行が促進することが明らかとなった。2014年度はこの移行促進に関与する翻訳後調節機構について調べた。その結果、i)胆石症誘発食負荷による毛細胆管膜上でのAbcg5/Abcg8の発現増加がPKA阻害剤であるH-89で阻害されたこと、ii) cAMPアナログであるジブチリルcAMP (Bt2cAMP)をマウスに静脈投与することによりAbcg5/Abcg8の毛細胆管膜での発現が一過性に増加したこと、iii)胆石症誘発食飼育マウスでは肝毛細胆管膜にPKAが移行したことから、Abcg5/Abcg8の食事による毛細胆管膜への移行促進にはPKAが関与する可能性が示唆された。また毛細胆管膜でのAbcg5/Abcg8発現増加の生理的意義を確認するため、胆石症誘発食負荷マウスの胆汁脂質成分の分析を行った。その結果、毛細胆管膜でのAbcg5/Abcg8の発現量とコレステロールの胆汁排泄量の間に高い相関関係があることがわかった。コレステロール胆石症は、肝臓から胆汁中に分泌されるコレステロールが胆管・胆嚢内で固まって生じる結石によって引き起こされる症状であり、食の欧米化により近年日本でも急増している。胆石症発生の最大の要因は、胆汁中におけるコレステロールの過飽和であるため、コレステロール分泌を担う脂質トランスポーター・ABCG5/ABCG8の発現・機能変化を調べることは、疾患発症のメカニズムを解明するうえで極めて重要である。本研究では、蛍光タンパク質融合トランスポーターをハイドロダイナミック法により生きたマウス肝臓に発現させることにより、ABCG5/ABCG8の過栄養状態における細胞内トラフィキングへの影響について解析した。Abcg5-CFP/Abcg8-YFPを胆石症誘発食で飼育したマウス肝臓に発現させ、その詳細な動態を調べた結果、これらトランスポーターが粗面小胞体でヘテロダイマーを形成し、ゴルジ体から基底膜を経由することなく毛細胆管膜に到達すること、毛細胆管膜に到達する前に毛細胆管膜近傍に存在する小胞に蓄えられることを見出した。また、肝にコレステロールが蓄積した状態ではABCG5/ABCG8の細胞内小胞から毛細胆管膜への移行が促進することを見出した。

さらにこの移行促進に関与するシグナル伝達系について検討したところ、Protein kinase A (PKA)の関与を示唆するデータを得た。以上の結果から、高カロリー食によりコレステロールが過剰蓄積した肝細胞では、コレステロールを胆管へ排泄するためにABCG5/ABCG8が細胞内小胞から肝毛細胆管膜へ供給されること、またこの機構にPKAが関与する可能性が示唆された。肝毛細胆管膜に存在するコレステロールトランスポーター・Abcg5/Abcg8の機能亢進は、コレステロール胆石症を引き起こすと考えられている。我々はこれまでに過栄養状態が肝毛細胆管膜におけるAbcg5/Abcg8の機能、および発現を顕著に増加させることを見出したが、その機構に関しては不明であった。本研究では、過栄養状態がAbcg5/Abcg8のトラフィキング、および機能発現に与える影響について解析した。その結果、肝臓にコレステロールが蓄積した状態では、細胞内小胞に蓄えられたこれらトランスポーターの毛細胆管膜への移行が促進すること、その機構にcAMPシグナルが関与することを明らかにした。2013年度はAbcg5/Abcg8の細胞内動態をin vivoで解析する系を確立し、それを用いて翻訳されてから毛細胆管までの移行経路を解明した。また胆石症誘発食負荷により、この移行が促進されることを見出した。2014年度はこの食事による移行促進にPKAを介したシグナル伝達系が関与する可能性を見出した。本成果は、食事や栄養状態の変化が肝トランスポーターの細胞内トラフィッキングに影響を及ぼすことを実験的に証明した初めての知見であり、コレステロール胆石症発症メカニズムを解明するために非常に重要な知見が得られたと考えている。さらにマウス肝臓に発現させたAbcg5-FLAG/Abcg8-YFPを免疫沈降で単離し、沈降物を解析した結果、翻訳後修飾としてAbcg8のチロシン残基がリン酸化される可能性を示唆するデータを得ることはできたが、ABCG5/ABCG8の小胞輸送を制御する新規分子の同定に関しては、進展を得ることはできなかった。医歯薬学平成27年度は、過栄養状態により誘導されるABCG5/ABCG8の膜局在化に関与する翻訳後修飾、およびその修飾機構について解明する。具体的にはチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異Abcg8-YFP発現遺伝子を構築し、Abcg5-FLAG/変異Abcg8-YFPをハイドロダイナミック法により高脂肪食負荷マウス肝臓に発現させる。摘出した肝臓から粗膜画分、肝毛細胆管膜画分、エンドソーム画分をショ糖密度勾配遠心方により調製し、抗YFP抗体でそれぞれ免疫沈降する。沈降物を電気泳動で分離し、抗チロシンリン酸化抗体によりリン酸化の有無を確認することでリン酸化部位を同定する。変異部位が同定されたら、その部位をフェニルアラニンに置換した変異Abcg8-YFP、およびAbcg5-FLAGを普通食飼育マウス肝臓にin vivo導入し、生体内における変異体のトラフィキング、およびコレステロール輸送能を調べる。さらに胆石症発症への関与が指摘されているSNPを導入した変異ABCG8-YFP発現遺伝子を構築し、マウス肝臓にABCG5-FLAGとともにin vivo導入し、生体内における動態とコレステロール輸送能を調べる。
グルタメイトレセプターの同定とイオンチャネルの動態解析

グルタミン酸は脳神経系における主要な伝達物質として働いているが,グルタミン酸のレセプターの協力な阻害物質をジョロウグモ中に見出し,これを用いて各種神経組織におけるグルタミン酸レセプターの機能をしらべた.イセエビ歩脚神経筋シナプスに対してジョロウグモ毒素(JSTX)は微量で不可逆的な阻害効果を示すが,神経刺戟による興奮性シナプス後電流の解析の結果,毒素の作用は膜電位依存性がなく,また電流の下降相の時定数にも大きな変化が見られなかった.この事はクモ毒素がレセプター分子のうち,電圧依存性部分とは離れた部位に結合する事を示唆している.JSTXの中枢神経細胞に対する効果をモルモット脳のスライス標本を用いてしらべた.海馬CAI鐘体細胞に対するシナプス後電位およびグルタミン酸電位はJSTXにより抑制された.薬理学的な実験結果から, JSTXは非UMDA型レセプターを遮断すると考えられる.JSTXの化学構造を東大薬学部と共同研究により明らかにした.この結果はジョロウグモ毒素は構造類似物質を数種含み, 24-ジヒドロオキシフエニル酢酸,アスパラギン,カタベリンを共通構造とする事が分った.この構造に基づきクモ毒素の化学合成を行い,活性を確認した.さらに各種の合成アナログ化合物を作成し,構造と活性連関をしらべた.この結果,クモ毒素構造のうち, 24-ジヒドロキシフエニル酢酸,アスパラギン,カダベルリンはグルタメイトレセプターの阻害発現に必須の構造であること,また残りのポリアミン基が毒素とレセプター分子との結合性に関連あるものと考えられる.合成クモ毒素を放射性ヨードで標準化し,オートラジオグラフィーによる,グルタメイトレセプターの可視化に成功した.グルタミン酸は脳神経系における主要な伝達物質として働いているが,グルタミン酸のレセプターの協力な阻害物質をジョロウグモ中に見出し,これを用いて各種神経組織におけるグルタミン酸レセプターの機能をしらべた.イセエビ歩脚神経筋シナプスに対してジョロウグモ毒素(JSTX)は微量で不可逆的な阻害効果を示すが,神経刺戟による興奮性シナプス後電流の解析の結果,毒素の作用は膜電位依存性がなく,また電流の下降相の時定数にも大きな変化が見られなかった.この事はクモ毒素がレセプター分子のうち,電圧依存性部分とは離れた部位に結合する事を示唆している.JSTXの中枢神経細胞に対する効果をモルモット脳のスライス標本を用いてしらべた.海馬CAI鐘体細胞に対するシナプス後電位およびグルタミン酸電位はJSTXにより抑制された.薬理学的な実験結果から, JSTXは非UMDA型レセプターを遮断すると考えられる.JSTXの化学構造を東大薬学部と共同研究により明らかにした.この結果はジョロウグモ毒素は構造類似物質を数種含み, 24-ジヒドロオキシフエニル酢酸,アスパラギン,カタベリンを共通構造とする事が分った.この構造に基づきクモ毒素の化学合成を行い,活性を確認した.さらに各種の合成アナログ化合物を作成し,構造と活性連関をしらべた.この結果,クモ毒素構造のうち, 24-ジヒドロキシフエニル酢酸,アスパラギン,カダベルリンはグルタメイトレセプターの阻害発現に必須の構造であること,また残りのポリアミン基が毒素とレセプター分子との結合性に関連あるものと考えられる.合成クモ毒素を放射性ヨードで標準化し,オートラジオグラフィーによる,グルタメイトレセプターの可視化に成功した.本研究代表者らがジヨロウグモ毒腺中に見い出したグルタメイト(セプタ一阻害物質(Joro Spider toxin JSTX)は発見以後4年を越す精製作業の結果、東京大学薬学部中嶋研究室の協力を得てその構造を決定した(Ayamaki et al 1986)。クモ毒素は数種の有効成分から成り、何れも2,4-dihydroxy-phenylacetyl-asparaginyl-cadaverinを共通骨格とすることが明らかになった。この構造に基づいて人工合成物の作成を進めている。JSTXを用いて、中枢神経細胞に対する作用を検討した。モルモット海馬のスライス標本を作成し、CA1野の錐体細胞より細胞内記録を行い、入力線維の刺激によって生ずるシナプス後電位はJSTXにより庶断された。多管電極を用い、グルタミン酸やそのアゴニストを電気泳動的に錐体細胞の樹状突起に与え、生ずる脱分極電位に対するJSTXの効果を検討した。JSTXはグルタミン酸やキスカル酸による脱分極を強力に抑制したが、アスパラギン酸やN-メチル-Dアスパラギン酸(NMA)に対する作用は弱かった。NMA型エセプターに対する特抗物質であるADVなどの効果との比較を行い、海馬CAl野の錐体細胞に対する入力線維はグルタミン酸を伝達物質としており、レセプターは非NMA型であることを明らかにした(Saito et al 1986)。
不適切な行動の抑制にかかわる神経基盤とその発達の解明

さまざまな脳機能イメージングの先行研究によって,抑制機能において重要な役割を持つことが明らかにされてきた。本研究課題は,そのような抑制機能と前頭前皮質の関係について,1前頭前皮質とほかの領域との関係,2子どもの発達に伴う脳活動の変化を検討することを目的としたものであった。本目的を達成するため,前頭前皮質の使用度合の異なることが予想される複数の実験課題を開発し,それにより機能的MRIを用いてアプローチしようというものであった。本年度は国内の学会等に参加し,研究動向及び関連研究の調査を行った。また,関連研究の文献調査を行った。研究動向調査では,MRI研究を行う上で有用なさまざまな解析方法や撮像方法についての最新知見を得た。また,抑制機能やその発達に関して本研究に有用な知見を得た。特に,関連研究の文献調査においては,抑制機能に類似する概念や関連すると考えられる概念,実験パラダイム等の情報収集および整理を行った。また,それらの発達的知見について心理学的研究を中心に整理し,抑制機能の発達との関連性について考察した。また,本研究における仮説脳領域に関する脳の構造・機能発達の知見を収集・整理等を行った。実験実施予定であった機能的MRIについては,MRI撮像実施機関へ申請中であった実施手続きについて実施機関からの許可を得たものの,課題の再検討や本務業務量の増加による実施時間捻出の困難など影響によりMRIデータの取得には至っていない。実験の実施が困難であった場合に備え,計画を一部変更し,過去に取得した大人のMRIデータの活用やそれにあわせた子ども用のMRI実験の計画,および解析方法の検討を行った。研究課題申請当時と比べ,申請者の所属・職種・職務内容の変更に伴うエフォートの大幅な変更があり時間の予定通りの確保が難しかった。手間取っていた実施機関との調整は済んだものの,今年度は本務の教育・管理運営業務が昨年度までと比べ大幅に増加したため,MRI実験を実施することが困難であった。早期にMRI実験を実施する。MRIの撮像が時間的に困難な場合は,過去に実施した大人のMRIデータを活用した解析も含めて検討を行い時間の短縮を図り,研究を進める。子どものデータについてはERPやNIRS,行動実験への転換を検討し,効率的に研究を進める。さまざまな脳機能イメージングの先行研究によって,抑制機能において前頭前皮質が重要な役割を持つことが明らかにされてきた。本研究課題は,そのような抑制機能と前頭前皮質の関係について,1前頭前皮質と他の領域との関係,2子どもの発達に伴う脳活動の変化を検討することを目的としたものであった。本目的を達成するため前頭前皮質の使用度合の異なることことが予想される複数の課題を開発し,それにより機能的MRIを用いてアプローチしようというものであった。本年度は課題の検討を行うととともに,機能的MRIだけでなく近赤外光分光法(NIRS)や事象関連電位(ERP)の使用可能性も含めた,実験手法の再検討を行った。実験手法については当初計画では機能的MRIの使用のみを想定していたが,MRI撮像の実施が困難な状況が発生したことから行ったものである。課題については小学校高学年の子どもでの使用も考慮し,NIRSやERPに適用可能なものを開発した。さらに,計画段階では予定していなかった心理尺度を追加導入し,課題間の統制を図ることを検討している。また,機能的MRIだけでなくNIRSやERPの使用可能性も含めた実験手法の再検討については,使用が困難になったMRIの調整が進み使用可能の目処が立ったことから基本的に機能的MRIを中心とすることとし,機能的MRIの実施を行った上で年齢的な問題からデータ取得が困難だった場合にはNIRS,ERPを使用することとした。NIRSについては実験の準備が完了し,ERPについては現在準備を行っているところである。MRIの撮像実施予定機関の機器更新と連携の見直しによるMRIの使用中断,申請者の所属・職種・職務内容の変更に伴うエフォートの大幅な変更等があり,課題の開発は行ったものの当初予定していたMRI実験を実施することができなかった。機能的MRIが使用できない場合に備え,他の実験手法に切り替える検討を行うとともに,MRI実施に向けた実施予定機関との調整を行うなど,当初の計画とは大幅に異なった対応を行った。本年度は国内外の学会等に参加し,最新研究動向の調査を行うとともに,それを受けた実験課題の再検討を行った。最新研究動向調査では,MRI研究を行う上で有用なさまざまな解析方法や撮像方法についての最新知見を得た。特に,実験に用いる課題については前年度までに完成していたが,子どもに適用するには課題遂行に必要な時間が長すぎる等の問題点があった。国内外の研究動向調査により,この点についての改善につながるアイディアを得たため,新しい実験課題の開発に取り組んだ。機能的MRIについては旧課題にて年度後半に実験実施予定であったが,課題の再検討やMRI撮像実施機関との調整に手間取った影響によりデータの取得には至っていない。

現在,MRI撮像実施機関への実施手続きを申請し,実施機関からの許可を待っている状態である。また,MRI撮像が困難になった場合に使用予定のNIRSおよびERPの準備についても実施した。そのほか,抑制機能に関連した認知課題を用いて行動実験を行った。研究課題申請当時と比べ,申請者の所属・職種・職務内容の変更に伴うエフォートの大幅な変更があり時間の予定通りの確保が難しかった。また,研究動向調査等を踏まえて当初予定していなかった課題の再検討を行った。平成29年度後半にMRIの撮像を行う予定であったが,実施機関との調整に手間取り,撮像実施には至らなかった。さまざまな脳機能イメージングの先行研究によって,抑制機能において重要な役割を持つことが明らかにされてきた。本研究課題は,そのような抑制機能と前頭前皮質の関係について,1前頭前皮質とほかの領域との関係,2子どもの発達に伴う脳活動の変化を検討することを目的としたものであった。本目的を達成するため,前頭前皮質の使用度合の異なることが予想される複数の実験課題を開発し,それにより機能的MRIを用いてアプローチしようというものであった。本年度は国内の学会等に参加し,研究動向及び関連研究の調査を行った。また,関連研究の文献調査を行った。研究動向調査では,MRI研究を行う上で有用なさまざまな解析方法や撮像方法についての最新知見を得た。また,抑制機能やその発達に関して本研究に有用な知見を得た。特に,関連研究の文献調査においては,抑制機能に類似する概念や関連すると考えられる概念,実験パラダイム等の情報収集および整理を行った。また,それらの発達的知見について心理学的研究を中心に整理し,抑制機能の発達との関連性について考察した。また,本研究における仮説脳領域に関する脳の構造・機能発達の知見を収集・整理等を行った。実験実施予定であった機能的MRIについては,MRI撮像実施機関へ申請中であった実施手続きについて実施機関からの許可を得たものの,課題の再検討や本務業務量の増加による実施時間捻出の困難など影響によりMRIデータの取得には至っていない。実験の実施が困難であった場合に備え,計画を一部変更し,過去に取得した大人のMRIデータの活用やそれにあわせた子ども用のMRI実験の計画,および解析方法の検討を行った。手間取っていた実施機関との調整は済んだものの,今年度は本務の教育・管理運営業務が昨年度までと比べ大幅に増加したため,MRI実験を実施することが困難であった。MRI撮像予定機関との調整はほぼ完了し,現在早期に実験実施が可能な状況である。遅れている成人でのMRI実験を実施するとともに,その解析を行い,前頭前皮質と他の領域との関係について検討を行う。また,MRIのバックアップとしてのERP実験の準備を進める。MRI実施機関への申請手続きは済んでおり,相手方機関からの許可が下り次第実験を実施予定である。
太陽観測用補償光学装置の実用化

太陽大気中の様々な活動現象は、恒星一般の物理の基本としてまたプラズマ物理の天然の実験室として、そしてさらには地球環境に多大な影響を及ぼすことでも近年その研究の重要性が注目されている。このような活動現象の解明においては太陽の表面構造を詳細に空間分解して観測することが本質的に重要である。我々はそのためのキーテクノロジーである太陽観測用補償光学を実用化してまず現存の望遠鏡で回折限界を達成し、これによって将来口径1m以上の望遠鏡での回折限界の観測の実現について明確な見通しをつけることを目的として研究を行ってきた。本研究は、まず補償光学装置全体の光学設計を行い、これに基づく全体の部品配置、波面制御において鍵となる可変形鏡の導入、専用のエレクトロニクスを組み上げ、といった装置開発の最も基礎的な部分からスタートした。単に装置の製作だけではなく、可変形鏡を干渉計の前に置いてその鏡面をモニターしながらコンピューターから信号を送り、鏡面の形状と入力信号の関係を確立するなど、実運用上の基礎パラメーターの取得なども行った。さらに波面検出と制御を高速で行うリアルタイム制御のソフトウェアの開発も行った。これにより装置として一応完成したものを作製するのに成功した。実際に望遠鏡に取り付けたときの動作を確認するため、京都大学飛騨天文台へ装置一式を持ち込んだ実際の太陽像を用いた実験を2度にわたって行った。残念ながらちょうど太陽活動静穏期にあたっており、補償光学において位置の基準とすべき黒点が無いことが多く、十分な実験を行うには至らなかったが、各コンポーネントの基本動作を確認することができた。これら装置開発の成果についてはいろいろな研究会での発表も行ってきた。本研究は今年度で終了であるが、本研究での成果に基づき、さらに発展した装置の検討を現在北見工大・京都大学と進めているところである。我々はそのためのキーテクノロジーである太陽観測用補償光学を実用化してまず現存の望遠鏡で回折限界を達成し、これによって将来口径1m以上の望遠鏡での回折限界の観測を実現することに明確な見通しをつけ、新世代の太陽観測装置の足がかりとなることを目的として研究を行っている。本年度は、補償光学装置全体の光学設計を行い、これに基づいて全体の部品配置を行った。また波面制御において鍵となる可変形鏡を購入し、専用のエレクトロニクスを組み上げた。これによって可変形鏡のコントロールが可能になったので、可変形鏡を干渉計の前に置いてその鏡面をモニターしながらコンピューターから信号を送り、鏡面の形状と入力信号の関係を確立し、自由に波面を制御するための基礎パラメーターの取得を行った。これら装置開発の一方で実験計画と経過を国内外の学会で発表するとともに、次年度以降予定している京都大学などでの観測のための打ち合わせを行い、また現地で使用する機器類の準備も行った。本年度は、まず補償光学装置を動作させる実際のソフトウェアの開発まで進め、太陽光を入れた実験ができるよう装置全体の組み

上げを行った。その上で京都大学飛騨天文台へ装置一式を持ち込み、実際の太陽像を用いた実験を行った。残念ながらちょうど太陽活動静穏期にあたっており、補償光学において位置の基準とすべき黒点がまったくなく、コントラストの低い白斑で動作チェックを行わざるを得なかったが、光学系の各コンポーネント、シャックハルトマンセンサーや像位置検出装置などの正常動作を確認することができた。現在、この実験において判明した細かい問題点についてのソフトウェアの修正など来年度の実験のための準備をおこなっており、次回の実験で黒点の画像を用いて最終的な機能実証を行う予定である。これら装置開発の一方で、実験計画と経過を国内外の学会で発表した。太陽大気中の様々な活動現象は、恒星一般の物理の基本としてまたプラズマ物理の天然の実験室として、そしてさらには地球環境に多大な影響を及ぼすことでも近年その研究の重要性が注目されている。このような活動現象の解明においては太陽の表面構造を詳細に空間分解して観測することが本質的に重要である。我々はそのためのキーテクノロジーである太陽観測用補償光学を実用化してまず現存の望遠鏡で回折限界を達成し、これによって将来口径1m以上の望遠鏡での回折限界の観測を実現することに明確な見通しをつけ、新世代の太陽観測装置の足がかりとなることを目的として研究を行っている。本年度は、前回の京都大学飛騨天文台のドームレス太陽望遠鏡における実際の太陽光を導入した実験で明らかになった問題点等について改良を行い、装置そのものの製作としては完了した。この装置を再び飛騨天文台に持ち込み、稼動実験を行い、波面追跡のために必要となる黒点が1日しか観測できないという悪条件下ではあったが、基本的な動作パラメーターの取得には成功した。その結果、基本的なコンポーネントのひとつである像安定化装置について、その動作を確認しただけでなく、黒点以外にも白斑のようなコントラストの弱い構造でもパターンを追跡できる能力があることを確認した。また、最も重要なコンポーネントである波面検出装置自体についても、黒点を用いることで波面乱れの基礎データを得ることができた。また、これら開発の成果について研究会等で発表を行った。本研究での成果に基づき、本研究で使用したものとは別の新しい可変形鏡の評価を現在北見工大と共同で行っており、これによってより性能のよい補償光学装置の実現を目指している。また、平成19年度から京都大学と共同で、飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡に補償光学装置を常設し、基本的な共同利用装置として公開していくための基礎開発を開始することになっている。
微小磁気プローブを用いた磁性半導体の磁区構造解明

磁性半導体の磁区構造を直接評価するため、低温で動作する磁気力顕微鏡装置(MFM)の開発を行なった。低温MFMの場合、冷却効率を向上させるため、MFMヘッド部を極力小型化する必要がある。カンチレバーの制御方式には通常光テコ方式が使用されるが、これではヘッド部周囲にスペースを要するため、本研究では自己検知型カンチレバーを採用した。また、低温ではピエゾ素子の圧電定数が低下し、走査範囲が限定される。そこで、2つの円筒型ピエゾを組み合わせ、極低温でもμm角以上の走査範囲を実現した。本装置では、磁場印加による磁区構造の変化を観測するため、MFMの外部に電磁石を設置した。同電磁石により、水平方向に最大3kOeの磁場を印加することが可能である。また、MFMヘッド(試料面は垂直方向)を慣性駆動の回転ステージの上に装着した。従って、ステージを回転することにより、試料面に対する磁場の角度を090度の間で任意に設定できる。MFMでは、磁気力の外に、表面の凹凸の情報も同時に観測する。これらを分離するため、以下のような方法を用いた。まず、探針を試料に接近させ、近距離力である原子間力を検知しつつ、表面のトポグラフィー(凹凸像)を測定する。続いて、探針を離した上体に固定し、先に測定した凹凸に応じて探針を上下させ、凹凸の影響を除外しつつ、遠距離力である磁気力を観測する。まず上記低温MFMの性能を確認するため、ハードディスクの観察を行った。その結果、液体窒素温度でも明瞭な磁気ビットパターンを観測した。同イメージより、空間分解能は100nm以下と見積もられる。つづいて、低温で強磁性転移を示すマンガン酸化物の磁区観察を行った。その結果、200nm程度の磁区構造を始めて捉えることに成功した。本研究では、微小磁気プローブを用いて磁性半導体の磁区構造を組成、膜厚、温度の関数として詳細に調べ、標準データとして蓄積するとともに、その背景にある物理の理解を目的とした。このため、磁区構造を直接観察するための高分解能磁気プローブの開発を行った。また同時に、室温磁性半導体として注目されているコバルト添加に酸化チタン薄膜の合成ならびに物性評価を行った。高分解能磁気プローブとしては、幅広い測定環境に対応できるシステムとして、超高真空・温度可変・磁場印加型磁気力顕微鏡(MFM)の試作を行った。その結果、極低温(10K)でもナノスケールの空間分解能を達成するに至った。また同装置は、試料面に対する磁場の方向を任意に設定できるという特徴を持つ。さらに、磁気光学効果を2次元マッピングする装置も試作した。装置開発と平行して、コバルト添加に酸化チタン薄膜の合成を行い、磁性と薄膜作成上権との関係について系統的に検討した。その結果、電導性を示す試料でのみ強磁性が発現し、かつより還元雰囲気(高温、低酸素分圧)ほど磁化が増大することを見出した。この事実は、強磁性の発現にキャリアが関わっていることを示唆する。そこで、キャリアの効果についてより積極的に調べるため、ニオブを添加してキャリア量の制御を試みた。添加したニオブは、ほぼ100%イオン化し、n型のキャリアを生じるが、キャリア量に比例して磁性も増大するという結果を得た。このことは、電導キャリアがコバルトスピン間の強磁性相関を媒介するRKKYメカニズムを支持する。
潰瘍性大腸炎患者制御性T細胞の培養増殖法・分化誘導法の研究

CD4^+CD25^+制御性T細胞(Treg)のin vitroでの培養増殖・分化誘導が可能であれば、Tregの潰瘍性大腸炎(UC)治療への応用に有用である。UC患者に対する血球成分除去療法産物より臨床応用可能なグレードで分離されたTregを抗CD3/抗CD28抗体ビーズ、IL-2で刺激した。細胞数は10日間で約18倍に増加し、TregのマーカーであるFOXP3発現細胞の割合は保たれた。また、通常のCD4^+T細胞との共培養で細胞増殖を抑制した。次に、CD4^+CD25^-non-TregからTGF-β1存在下にTregの誘導を試みた。誘導後、TregのマーカーであるCD25^+FOXP3^+細胞が増加し、CD4^+T細胞との共培養で細胞増殖を抑制した。以上より、Tregがin vitroで培養増殖・分化誘導可能である事が示された。更にrapamycin(RAPA)によりCD4^+T細胞からTregがin vitroで誘導可能か、誘導Tregに大腸炎抑制能があるかどうかマウスモデルで検討した。Balb/cマウス脾臓よりCD4^+T細胞を分離し、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2にてRAPA存在下に刺激培養した。RAPA存在下で培養した細胞の17%がCD25^+FoxP3^+であったのに対して、RAPA非存在下で培養した細胞はほとんどCD25、FoxP3を発現していなかった。CB-17 ScidマウスにBalb/cマウス由来CD4^+CD62L^+CD25^-T細胞1x10^6を腹腔内投与して大腸炎を誘導し、同数の分離・培養Tregを同時移入した。RAPA存在下で培養したCD4^+T細胞は、マウス脾臓より分離したTregと同様に大腸炎の発症を抑制した。RAPA誘導Tregは分離Tregと同様に大腸炎抑制能を有する事が示された。潰瘍性大腸炎(UC)に対する血球成分除去療法にて分離された白血球より磁気ビーズを用いて制御性T細胞(Treg)分画(CD4+CD25^<high>T細胞)を分離した。Treg特異的転写因子FOXP3発現細胞の割合を解析した。培養前FOXP3^+/CD4^+は56.8±4.9%であった。<制御性T細胞の分離・培養>分離されたTregをTGF-β1 2ng/ml存在下、非存在下に抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2により刺激し10日間培養した。FOXP3^+/CD4^+は、TGF-β1非存在下では培養後28.8±13.3%と低下したが、TGF-β1存在下では47.4±14.7%と培養前と同程度に維持された。10日間の培養にてCD4^+FOXP3^+Tregを320倍に増加させる事ができた。どちらの条件で培養されたTreも、正常CD4^+T細胞との共培養にて細胞増殖した。分離したTregをin vitroで増殖させる事が可能であり、TGF-β1により割合を維持することが可能であった。<制御性T細胞の誘導>UC患者

末梢血より分離したCD4^+CD25^-T細胞(非Treg)を上記刺激条件で培養した。培養前のFOXP3^+/CD4^+は5.0±2.6%であった。培養後のFOXP3^+/CD4^+はTGF-β1非存在下で16.9±8.5%、TGF-β1存在下で38.9±14.8%であった。TGF-β1非存在下に培養した細胞は正常CD4^+T細胞との共培養で細胞増殖を抑制しなかったが、TGF-β1存在下に培養した細胞は、分離したTregと同様にCD4^+T細胞増殖を抑制した。非TregよりTGF-β1存在下にTregをin vitroで誘導する事が可能であった。以上より、UC患者末梢血よりex vivoに増殖させたTregやin vitroで誘導したTregの治療への応用が期待できる。次にRAPA誘導Tregの大腸炎抑制能を検討した。CB-17 ScidマウスにBalb/cマウス由来のナイーヴcd4^+T細胞(CD4^+CD62L^+CD25^-)1×10^6を腹腔内投与して大腸炎を誘導し、同数の分離・培養Tregを同時移入した。以下の5群を作成し検討した。A)PBS腹腔内投与群、B)ナイーヴCD4^+T細胞単独投与群、C)ナイーヴCD4^+T細胞、脾臓より分離したfresh Treg同時投与群、D)ナイーヴCD4^+T細胞、RAPA誘導Treg同時投与群、E)ナイーヴCD4^+T細胞、RAPA非存在下で培養したCD4^+T細胞同時投与群。B、E群で大腸炎が誘導とれ、C、D群で大腸炎の発症が抑制された。よってRAPA誘導Tregはfresh Tregと同様に大腸炎抑制能を有する事が示された。
寿命制御機能・自己損傷治癒機能を備えた超高温用材料システムの構築

本研究は,単結晶Ni基超合金(以下,単結晶材と呼ぶ),および,これに施す遮熱,耐食コーティングを対象とし,寿命制御機能を備えた超高温用材料システムの構築を目的として研究を行った.本年度は,昨年度の研究成果を発展させ,1.単結晶材の高温疲労と組織形態変化を統一的に扱う力学モデルの構築,2.遮熱・耐食コーティング材の熱サイクル損傷試験,ならびに,3.単結晶材の組織形態変化を応用した高温力学場の検出技術への展開についての検討を行った.得られた主な結果を以下に示す.1.Hybrid Compositeモデルの考え方を基に,昨年度から提案していた力学モデルを修正・改良した.そのモデルは,単結晶材の高温疲労寿命予測に加え,同材の組織形態変化の予測,さらには,組織形態が高温疲労強度に及ぼす影響についての統一的な検討が行えるものであり,それを用いた解析は昨年度に得られた実験結果ともよく一致した.2.ボンドコート被膜材質が異なる3種の遮熱・耐食コーティング試験片を作成し,各試験片に対する熱サイクル損傷試験を行った.その結果,コーティング材の熱サイクル損傷特性はボンドコート被膜材質に大きな影響を受け,本研究で提唱していた損傷治癒効果を持つボンドコートは熱サイクル損傷に対する耐性を大きく低下させる可能性があることが明らかになった.3.単結晶材の組織形態変化を用いた高温力学場の検出技術について,単結晶材薄膜を用いた塑性ひずみ検出手法を提案し,その工業的妥当性と実用化の方向について検討した.その結果,単結晶材薄膜の組織形態変化により,塑性ひずみの大きさ・方向・履歴をある程度推定し,検出できることが明らかになった.本研究は,単結晶Ni基超合金,および,これに施す遮熱,耐食コーティングを対象とし,寿命制御幾能を備えた超高温用材料システムの構築を目的として,研究を進めている.本年度は,主に,1.単結晶Ni基超合金の高温疲労特性評価、2.数種のボンドコート被膜の基礎物性値の測定,ならびに,ボンドコート被膜材質が遮熱コーティング材の熱サイクル損傷特性に及ぼす影響の評価,を行い,以下の結果を得た.1.単結晶Ni基超合金CMSX-4に対する,様々な条件下での高温低サイクル疲労,ならびに,熱機絨疲労試験を行った。その結果,単結晶Ni基超合金が,他の耐熱金属材料とは異なる独特な高温度労特性を持ち,これらの特性に対しては,従来の巨視的力学パラメータでは評価が困難であることを明らかにした.この問題点解決のため,Eshelbyの等価介在物理論,Mori-Tanakaの近似法を基に,超合金特有のγ/γ'微細構造を考慮した寿命評価モデルを提案した.提案したモデルは,今後,改良すべき点がいくつかあるものの,従来の手法では評価困難であった特性のいくつかを定量的に予測することができるものとなった.2. 3種のボンドコート被膜を準備し,様々な温度環境下における被膜単体での各種基礎物性値の測定を行った.また,EB-PVD遮熱コーティング試験片を作成し,その熱サイクル損傷特性に与えるボンドコート被膜材質の影響を検討した.その結果、ボンドコート被膜の熱膨張係数,弾性係数などの機械的特性のみならず、酸化特性等の化学的特性の相違が熱サイクル損傷特性に大きな影響をおよぼすことが明らかとなった.本研究は,単結晶Ni基超合金(以下,単結晶材と呼ぶ),および,これに施す遮熱,耐食コーティングを対象とし,寿命制御機能を備えた超高温用材料システムの構築を目的として研究を行った.本年度は,昨年度の研究成果を発展させ,1.単結晶材の高温疲労と組織形態変化を統一的に扱う力学モデルの構築,2.遮熱・耐食コーティング材の熱サイクル損傷試験,ならびに,3.単結晶材の組織形態変化を応用した高温力学場の検出技術への展開についての検討を行った.得られた主な結果を以下に示す.1.Hybrid Compositeモデルの考え方を基に,昨年度から提案していた力学モデルを修正・改良した.そのモデルは,単結晶材の高温疲労寿命予測に加え,同材の組織形態変化の予測,さらには,組織形態が高温疲労強度に及ぼす影響についての統一的な検討が行えるものであり,それを用いた解析は昨年度に得られた実験結果ともよく一致した.2.ボンドコート被膜材質が異なる3種の遮熱・耐食コーティング試験片を作成し,各試験片に対する熱サイクル損傷試験を行った.その結果,コーティング材の熱サイクル損傷特性はボンドコート被膜材質に大きな影響を受け,本研究で提唱していた損傷治癒効果を持つボンドコートは熱サイクル損傷に対する耐性を大きく低下させる可能性があることが明らかになった.3.単結晶材の組織形態変化を用いた高温力学場の検出技術について,単結晶材薄膜を用いた塑性ひずみ検出手法を提案し,その工業的妥当性と実用化の方向について検討した.その結果,単結晶材薄膜の組織形態変化により,塑性ひずみの大きさ・方向・履歴をある程度推定し,検出できることが明らかになった.
破骨細胞の骨基質認識に関わる遺伝子群の網羅的機能解析

申請者らが同定したCthrc1のカルシウム依存性遺伝子発現誘導のメカニズムを解明するために破骨細胞の骨基質認識制御に関わる遺伝子をマイクロアレイを用いて検索し、カルシウムにより発現上昇する遺伝子としてインテグリンβ3、カルシトニン受容体、及びAtf3/7などを同定した。Atf3/7を破骨細胞で強制発現するとCthrc1やインテグリンβ3の遺伝子発現が上昇することを突き止めた。さらに、インテグリンβ3/αvは骨基質中のヒドロキシアパタイトを直接認識することを明らかにした。以上のことから、破骨細胞は骨吸収を介して自身の活性化とカップリングを促進することが示唆された。マウス骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導し、1) BMM(骨髄由来マクロファージ)、2) pOC(単核TRAP陽性プレ破骨細胞)、3) mOCp(プレート上の破骨細胞)、4) mOCd(デンチン上の活性化破骨細胞)、5) mOCdd(脱灰したデンチン上の破骨細胞)、6)mOCpCa(カルシウム添加プレート上の破骨細胞)、7) mnOCsp(低接着性プレート上の単核破骨細胞)、8) mOCsp(低接着性プレート上の多核成熟破骨細胞)の8種類のRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。破骨細胞においてカルシウムや骨基質により発現上昇する遺伝子を検索し、発現特異性を解析した。その結果、インテグリンαv (Itgav)とβ3 (Itgb3)の発現は骨基質とカルシウムの両方で発現が上昇した。骨吸収機能に関与するAcp5 (Trap)、Atp6(13種類)、Car2、Clcn7、Ctsk、Mmp9は骨基質やカルシウム添加による変動はなかった。カップリング因子であるC3とCthrc1の発現はカルシウムで上昇した。Pdgfaは骨基質とカルシウムで発現上昇した。破骨細胞特異的遺伝子であるCalcr、Casr、cーfms、Dcstamp、OscarやRankには変化がみられなかったが、Trem2とCalcrはカルシウムによりそれぞれ4倍と2.5倍に上昇した。転写因子であるAtf3とAtf7の発現はカルシウムでそれぞれ4倍と5倍に上昇した。そこで、BMMにAtf3とAtf7を強制発現させ破骨細胞に分化させた後にカルシウムで発現制御される遺伝子を解析したところCalcr、Itgb3及びCthrc1のいずれも発現上昇した。これらのことから破骨細胞において細胞外カルシウム濃度の上昇によりAtf3/7の発現上昇を介してCalcr、Itgb3やCthrc1遺伝子の転写活性を促進することが明らかとなった。破骨細胞分化と骨吸収機能における外的要因による遺伝子発現を網羅的に解析するためにマウス骨髄細胞からM-CSFとRANKLを用いて骨髄由来マクロファージ(BMM)、単核プレ破骨細胞(pOC)、非活性型破骨細胞(mOCp)、活性型破骨細胞(mOCd)、脱灰デンチン上破骨細胞(mOCdd)、カルシウム存在下破骨細胞(mOCpCa)、高接着性単核プレ破骨細胞(mnOCsp)、及び高接着性破骨細胞(mOCsp)の8種類の細胞を調整し、RNAを用いてマイクロアレイ解析を行った。その結果、主にこれまで報告されている破骨細胞分化や骨吸収機能に関与する遺伝子を中心にカルシウムの添加や骨基質との接触、及び細胞接着により発現変動するかどうかを比較検討した。その結果、インテグリンにおいてはα2とβ3がカルシウムにより、α2、α5、αvとβ3が骨基質により発現上昇した。また、β3は高接着細胞で発現上昇した。その他の遺伝子ではAnxa8、C3、Pdgfa、Calcr、Nrp、Trem2、Atf3、及びAtf7がカルシウムにより、Anxa8、Pdgfa、Pdgfb、Vegfa、Vegfc、Fcgr2b、Dscr1l1、c-Fos、及びMitfが骨基質により発現上昇した。また、Atp6v0d1、Atp6v0d2、Car2、Clcn7、Mmp9、Anxa8、Pdgfb、Opn、Vegfb、Calcr、c-Fms、Dap12、Dcstamp、EphrinB2、Oscar、及びSphkは高接着細胞で高発現した。従って、骨吸収により骨基質から遊離したカルシウムなどのイオンのみならず骨基質によりインテグリンを中心とした受容体を介して破骨細胞分化と骨吸収機能に関連した遺伝子発現を制御することが分かった。破骨細胞分化、及び骨吸収機能に重要な要素として骨基質内に含まれ骨吸収により骨基質から遊離するカルシウムと骨基質タンパクに着目し、骨吸収により制御される遺伝子群を網羅的に解析し、カルシウムにより発現誘導される遺伝子を複数同定した。

さらに、カルシウムにより発現上昇する2つの転写因子であるAtf3とAtf7を同定し、これらの転写因子が破骨細胞の機能に必須なものとして知られているインテグリンβ3 (Itgb3)やカルシトニンレセプター(Calcr)のみならず、申請者が骨カップリング因子として同定したCthrc1とC3の発現を制御するとこを明らかにした。これまでに骨吸収により制御される転写因子に関する報告はなく、申請者が見出したことは極めて新しい発見である。骨細胞生物学、骨代謝学Atf3はbZIPファミリーに属する転写因子であり、痛みに関するマーカー遺伝子として知られている。Atf3ノックアウトマウスは正常であり、生体防御の維持に重要であることが知られているが、その他の機能についてはほとんど分かっていない。本研究課題によりAtf3/7が細胞外カルシウム濃度の上昇により発現上昇し、骨吸収機能に重要な遺伝子発現を制御することが明らかになったので、次にこれらのことが骨吸収のトリガーになるのかどうかを検証する。特にインテグリンαv/β3はビトロネクチンの受容体として知られており、破骨細胞の重要な分化マーカーとして知られているが、カルシウムによる発現制御を受けていることは知られていない。このインテグリンが骨基質のみならずハイドロキシアパタイトを認識し骨吸収のトリガーとして働いているという仮説を実証する。また、このインテグリンの発現制御にAtf3/7がどのように関与しているのかを解析する。購入予定であった細胞培養用試薬及び分子生物学用試薬は実験の都合上少量のみでだったので来年度に繰り越した。国内学会参加予定はキャンセルのため不参加となり、来年度の研究打ち合わせのために使用する。高額の骨解析はマウスの数が準備できなかったので平成27年度に使用することにした。分子生物学用試薬及び細胞生物学用試薬で約190万円、骨解析で約94万円、及び旅費で約10万円を使用する。
液体噴流における内部攪乱と表面波動の相互干渉に関する研究

液体噴流に見られる液柱の分裂現象は流体力学上の基礎的な問題として古くから興味がもたれ,多くの研究がなされてきた.また,実際の工業技術においても幅広い分野に応用されている.しかしながら,この液体の分裂過程にはさまざまな流体力学的因子が複雑に関与しており,この現象が完全に解明されるには至っていない.特に,噴流内部の内在的な攪乱因子と表面張力による非線形性の強い不安定要因との関係についてはほとんど研究されていないのが現状である.そこで本研究では同心の二重円管ノズルを用いて噴流内部にせん断層を作ることによって噴流内部の攪乱を制御し,それと噴流の分裂特性の関係を実験的に調べた.噴流の分裂特性を定量的に調べるために,分裂点近傍における噴流表面波動の周波数解析と自己相関関数解析を試みた.その結果,以下の知見を得た.(1)噴流分裂過程の規則性を噴流表面変動の自己相関関数を調べることによって評価できることを明らかにした.(2)単管ノズルの液体噴流では,規則性の高い分裂形態は滴下領域で見られ,層流噴流の液柱分裂では安定性理論によって予測されるような規則性の高い分裂形態が必ずしも実現されないことが示された.(3)二重円管ノズルを用いて噴流内部の速度分布を制御すると液柱の分裂長さや分裂形態を変えることができ,ある条件では極めて規則性の高い分裂形態を実現できることがわかった.(4)二重円管ノズル噴流に周波数解析の手法を適用した結果,液柱の分裂点近傍では表面波動に極めて高い周波数成分が現れ,多くの場合に分裂点上部の周波数成分が保存されないことが示された.液体噴流に見られる液柱の分裂現象は流体力学上の基礎的な問題として古くから興味がもたれ,多くの研究がなされてきた.また,実際の工業技術においても幅広い分野に応用されている.しかしながら,この液体の分裂過程にはさまざまな流体力学的因子が複雑に関与しており,この現象が完全に解明されるには至っていない.特に,噴流内部の内在的な攪乱因子と表面張力による非線形性の強い不安定要因との関係についてはほとんど研究されていないのが現状である.そこで本研究では同心の二重円管ノズルを用いて噴流内部にせん断層を作ることによって噴流内部の攪乱を制御し,それと噴流の分裂特性の関係を実験的に調べた.噴流の分裂特性を定量的に調べるために,分裂点近傍における噴流表面波動の周波数解析と自己相関関数解析を試みた.その結果,以下の知見を得た.(1)噴流分裂過程の規則性を噴流表面変動の自己相関関数を調べることによって評価できることを明らかにした.(2)単管ノズルの液体噴流では,規則性の高い分裂形態は滴下領域で見られ,層流噴流の液柱分裂では安定性理論によって予測されるような規則性の高い分裂形態が必ずしも実現されないことが示された.(3)二重円管ノズルを用いて噴流内部の速度分布を制御すると液柱の分裂長さや分裂形態を変えることができ,ある条件では極めて規則性の高い分裂形態を実現できることがわかった.(4)二重円管ノズル噴流に周波数解析の手法を適用した結果,液柱の分裂点近傍では表面波動に極めて高い周波数成分が現れ,多くの場合に分裂点上部の周波数成分が保存されないことが示された.
定型言語としての句動詞の第二言語習得・処理・産出及びその体系的指導について

本研究では、ひと固まりとして記憶に蓄積される(される必要のある)定型言語の習得、認知、産出について、多角的にデータ収集し、第二言語における習得の難しさの原因を特定し,その体系的習得・教授の必要性と方法について提示する。特に句動詞に着目し、その統語的・意味的特徴についての言語的分析を行いながら定型言語の重要性を明確にし、言語教育の中でそれを体系的に指導して習得を促していくことが自然な言語運用のためには必要不可欠であることを提案する。
頭頚部癌細胞におけるIdの働きと抗癌剤・放射線感受性への影響の検討

2、頭頸部癌組織切片による検討から、癌化およびその予後を規定する因子としてId2が関与する可能性が高いことを突き止めていたので、まずId2に対する検討を試みることとした。Id2-mRNAの発現は、Ho-1-u-1,HSC3,T3M1に発現が認められないか、もしくはごく少量であったため、頭頸部癌細胞株として我々が頻用しているT3M1に対しId2発現ベクターを用いId2-cDNAの導入を行った。その結果、導入効率が予想外に悪く、20%程度の細胞にしか導入されないという結果であった。3、Id2-mRNA発現の少ないT3M1の親株と、Id2-cDNAを導入後のT3M1との間で増殖能の変化について検討を行った。有意差は出なかったがId2-cDNA導入後のT3M1は親株に比べて増殖率が高く、増殖能が充進している傾向を認めた。2.頭頸部癌組織切片による検討から、癌化およびその予後を規定する因子としてId2が関与する可能性が高いことを突き止めていたので、まずId2に対する検討を試みることとした。Id2-mRNAの発現はHo-1-u-1,HSC3,T3M1に発現が認められないか、もしくはごく少量であったため、頭頸部癌細胞株として我々が頻用しているT3M1に対しId2発現ベクターを用いId2-cDNAの導入を行った。3.Id2-mRNA発現の少ないT3M1の親株と、Id2-cDNAを導入後のT3M1との間で増殖能の変化について検討を行った。有意差は出なかったがId2-cDNA導入後のT3M1は親株に比べて増殖率が高く、増殖能が亢進している傾向を認めた。4.Id2を中心とした発現ベクターの頭頸部癌細胞株への導入効率が予想以上に悪いため、抗癌剤および放射線感受性に対する実験にまで到っていないのが現状である。今後、発現ベクターの作成とそのチェックを含め検討して行く予定である。
高温超伝導80K相Bi系単結晶基板を用いたSーNーS構造デバイスの作製とその評価

80K相BiーSrーCaーCuーO(Bi系)バルク単結晶の清浄表面上に金属あるいは絶縁物をエピタキシャル成長させる。その上に、超伝導体をエピタキシャル成長させることによって、超伝導体S_1(酸化物高温超伝導バルク単結晶)ー金属N(Ag,Auなど),絶縁体I(Y_2O_3,Bi_2O_3など)ー超伝導体S_2(Pb,Nb、最終的には酸化物超伝導薄膜)構造を持つ超伝導エレクトロニクスデバイスを作製する。本研究は、デバイスの作製と各々のエピタキシャルさせた表面を種々の表面分析法により評価することを目的としている。主な研究成果を箇条書にする。(1)大型でしかも高品質な80K相Bi系バルク単結晶の作製条件を明らかにした。Bi:Pb:Sr:Ca:Cu=1.7:0.3:1:1:2の原材料組成を用いて、940°Cの溶融温度と830°Cの炉冷開始温度で作製することにより、7K相とのインタ-グロ-スの極めて少ない大型の単結晶(板状で5×5mm^2の大きさ)を作製することができた。(2)表面が平坦なBi系超伝導薄膜の作製条件を明らかにした。rfマグネトロンスパッタ法により、混合粉末タ-ゲットを用いて基板温度400°Cで堆積し、大気中でポストアニ-ルを行うことによって表面が非常に平坦で80K単相の薄膜を得ることができた。(3)80K相Bi系バルク単結晶の清浄表面が大気中劈開し真空中での加熱、あるいは真空中劈開により得られることを明らかにした。(4)平坦なBi系超伝導薄膜の表面は、不純物層で覆われていることを明らかにした。(5)80K相Bi系バルク単結晶表面上にAgが島状エピタキシャル成長している。(6)SiやNbは、バルク単結晶表面上に島状成長している。(7)SーIーSやSーNーS構造を持つ超伝導デバイスを作製するためには、Bi系バルク単結晶表面上に層状成長する金属や絶縁体を開発する必要がある。
エナメル質形成の分子機構解明とその一般的方法論の構築

我々の研究室では、常染色体劣性遺伝性のエナメル質形成不全を呈するラット(AMIラット)の解析を通じて、エナメル質形成の分子機構を明らかにする事を試みている。我々は既に、AMIラットの原因遺伝子の候補となりうる遺伝子群の網羅的解析から、AMIラットのある遺伝子(以下、遺伝子Xと記載する)上に変異を見いだしている。そのため、本研究では、遺伝子Xに着目して、AMIラットの遺伝学的解析を行っており、以下の成果をあげた。1.野生型遣伝子Xを導入したTransgenic ratの選別野生型遺伝子X発現コンストラクトを保持するTransgenicライン13系統を得る事ができた。これらのラインを繁殖させ、生後6日目の臼歯でのtransgeneの発現量を定量し、発現量の多い3つのラインを選別した。2.AMIラットヘの、遺伝子X発現Transgeneの導入野生型遺伝子X発現コンストラクトを保持するラットをAMIラットに2回バッククロスする事によって、変異型遺伝子Xをホモで持ち、transgene由来の野生型遺伝子Xを保持するラットを作製した。このラットでのエナメル質形成の度合いを今後解析する予定である。3.AMIラットでの、歯以外での遺伝子X発現領域における異常の発見野生型遺伝子Xは、口ひげの毛胞で発現する事が知られている。それに関連して、我々は、AMIラットの口ひげの形態に異常(波形の形態)がある事を見出した。今後はさらに組織学的、分子的に詳細な解析を行う。我々は既に、AMエラットの原因遺伝子の候補となりうる遺伝子群の網羅的解析から、AMIラットのある遺伝子(以下、遺伝子Xと記載する)上に変異を見いだしている。1.野生型遺伝子Xと変異型遺伝子Xを区別する実験系の構築野生型遺伝子Xと変異型遺伝子Xを区別するPCRプロトコールを作製した。変異を持つ塩基部分に特異的なプライマーの設計と、プライマー濃度やアニーリング温度の最適化をする事で、これらの遺伝子の区別を可能とした。2.遺伝子Xの変異とAMI表現型の関連性の確認野生型とAMI型ラットを交配したヘテロラット(F1)をさらにAMI型ラットと公判させて子孫を得た(F2)。このF2世代のラットにおいて、遺伝子Xの遺伝子型とエナメル質形成能の関連性を解析し、これらが完全に相関する事を確認した。(n=27)3.野生型遺伝子Xを導入したTransgenic ratの作成AMIラットの原因遺伝子が遺伝子Xである事を証明するために、野生型遺伝子Xを発現するtransgeneをAMIラットに導入し、エナメル質形成を回復できるかの検討を行っている。現在、transgeneコンストラクトの作成、そこからの遺伝子Xの発現の確認、transgenicラットの作成、transgenicラットからの遺伝子Xの発現の確認を完了した。現在、transgeneをAMIラットに導入するべく交配を行っている。