hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外光を用いた顕微鏡下の生体微小領域の温度測定技術の開発とその応用

空間分解能40μm、温度誤差0.1°Cで温度予測が可能な測定システムを開発した。システムは、近赤外用生物顕微鏡と2台の分光器で構成され、試料内の異なる2点の透過光スペクトルを同時に時間分解能5 msで測定できる。2つの透過光スペクトルは共通の光源および光学系を経ているため、共通影響因子、例えば光源強度のゆらぎ、ガラス表面の反射、温熱環境変化に伴う試料全体の温度変動などによるスペクトル変化をキャンセルすることができた。このような空間温度差の検出は将来的な温度イメージングの可能性も示唆した。精度検証後に培養細胞測定を行った。先ず、細胞を顕微鏡下で長時間維持し、測定に適した50umの厚さに試料を調整できる試料容器を開発した。細胞培養された一般的な60mm径のdishをそのまま測定に使用できるよう工夫されている。測定対象としては、特異的な発熱反応を示す褐色脂肪細胞を用いた。測定スペクトルから温度依存性を示す1908nmの吸収係数を等吸収点補正により求めることで、外乱成分を除去し、時間的に安定したデータを取得することを確かめた。細胞発熱の無い状態での温度較正実験により単回帰係数(温度係数)として0.74×10^3°C/Absが得られた。この場合、温度以外の変動成分はなかったため、主成分回帰分析を適用しても予測誤差は同程度であった。次に、褐色脂肪細胞の発熱を誘起させるノルアドレナリンを投与した場合のスペクトルデータを収集し、その解析を行った。ノルアドレナリンの影響と思われる光量変化が観測された。ただし、細胞の温度変化に起因したものかは現段階では結論付けられなかった。近赤外用生物顕微鏡と2台の分光器を組み合わせ、試料内の異なる2点の近赤外吸収スペクトルを同時に測定できるシステムを開発した。分岐型光ファイバーの先端を顕微鏡三眼鏡筒の結像面に設置することで、光ファイバーの面配置と同じ試料内位置の透過光スペクトルを得ることができた。1つの測定領域の直径を40um、2つの中心間距離を110 umと設定した。これらの2つの透過光スペクトルは共通の光源および光学系を経ているため、共通する影響因子、例えば光源強度のゆらぎ、溶解成分による光吸収、ガラス表面の反射、温熱環境変化に伴う試料全体の温度変動などによるスペクトル変化をキャンセルできる。そのため、一方をリファレンスとして他方(注目領域)との温度差を測定できた。測定波長範囲は1300nm 2200 nmとしたが、この範囲には最大吸光度の異なる2つの水の吸収バンドが存在するため、その2つを使い分けることによって、測定可能な試料厚さを50um1000 umと比較的広い範囲とすることができた。先ず純水およびグルコース水溶液の校正実験を行い、重回帰分析もしくはPartial-Least-Squares法により0.1°C程度の予測誤差を得た。次に、試料内部に発熱体を挿入して加熱することで温度分布を形成させ、温度差測定を実施した。2点間の温度差および0.5s以下の高速な温度変化を測定できることを示した。それらの結果については伝熱シミュレーションによっても妥当性を確かめた。
口唇の面積による咬合高径の臨床的決定法

咬合高径の臨床的な決定法として安静位空隙利用法、嚥下運動利用法、顔面計測法、発音利用法などがあるが、いずれも確実な方法でなく、これらの決定法を用いて総合的な観点から咬合高径を決定すべきであるといわれている。最近、適切な咬合高径では上下唇の面積が一致するという臨床報告がなされているが、定量的に評価した報告はみあたらない。そこで、適切な咬合高径を有する成人有歯顎者の上下唇の面積が一致するかどうか、また、年齢による差異の有無を調べることにした。前年度は、20歳代20名と30歳代20名の合計40名の成人有歯顎者の上下口唇の面積を調べたが、本年度は、成人有歯顎者40名(40歳代20名、50歳代20名)を被験者として選択し、中心咬合位における正貌の上下口唇の各面積を調べた。結果は、以下の通りである。1. 40歳代20名と50歳代20名の合計40名の成人有歯顎者を被験者として選択した。被験者の基準は、全身と咀嚼系に臨床的な異常が認められず、第3大臼歯を除く天然歯列を有し、上下第1大臼歯の近遠心関係がAngle I級の咬合状態であり、適正な前歯被蓋を有する者とした。2. 40歳代20名と50歳代20名の上口唇の面積は、どちらも個人差が認められた。3. 40歳代20名と50歳代20名の下口唇の面積は、上口唇と同様にどちらも個人差が認められた。4.前年度の被験者40名(20歳代20名と30歳代20名)と本年度の被験者40名(40歳代20名と50歳代20名)の合計80名について、上下口唇の各面積を上下口唇間で比較した結果,各被験者ともにほぼ同じ値を示し,両者間に有意差が認められなかった。また、各年代毎に上下口唇の面積を比較しても両者間に有意差が認められなかった。5.これらの結果から,正常有歯顎者の中心咬合位における前頭面で見た上下口唇の各面積は,個人差があるものの,同一個人ではほぼ同じであり,この観察が咬合高径の解剖学的指標になる可能性が示唆された。本年度は、成人有歯顎者40名(20歳代20名と30歳代20名)を被験者として選択し、中心咬合位における正貌の上下口唇の各面積を調べた。1.20歳代20名と30歳代20名の合計40名の成人有歯顎者を被験者として選択した。2.20歳代20名と30歳代20名の上口唇の面積は、どちらも個人差が認められた。3.20歳代20名と30歳代20名の下口唇の面積は、上口唇と同様にどちらも個人差が認められた。4.被験者40名の上下口唇の各面積を上下口唇間で比較した結果,各被験者ともにほぼ同じ値を示し,両者間に有意差が認められなかった。

被験者の基準は、全身と咀嚼系に臨床的な異常が認められず、第3大臼歯を除く天然歯列を有し、上下第1大臼歯の近遠心関係がAngle I級の咬合状態であり、適正な前歯被蓋を有する者とした。2. 40歳代20名と50歳代20名の上口唇の面積は、どちらも個人差が認められた。3. 40歳代20名と50歳代20名の下口唇の面積は、上口唇と同様にどちらも個人差が認められた。4.前年度の被験者40名(20歳代20名と30歳代20名)と本年度の被験者40名(40歳代20名と50歳代20名)の合計80名について、上下口唇の各面積を上下口唇間で比較した結果,各被験者ともにほぼ同じ値を示し,両者間に有意差が認められなかった。また、各年代毎に上下口唇の面積を比較しても両者間に有意差が認められなかった。5.これらの結果から,正常有歯顎者の中心咬合位における前頭面で見た上下口唇の各面積は,個人差があるものの,同一個人ではほぼ同じであり,この観察が咬合高径の解剖学的指標になる可能性が示唆された。
長鎖ノンコーディングＲＮＡの転写を介したクロマチン制御機構の解析

真核生物ゲノムでは、タンパク質情報をもたない領域から長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)が数多く転写されている。しかし、lncRNAの分子機能には不明な点が多い。申請者の所属研究室は、真核細胞のモデル生物である分裂酵母において、グルコース飢餓応答に関わるlncRNAを見出だし、これをmlonRNA(metabolic stress-induced long noncoding RNA)と名付けた。グルコース飢餓が起こると、mlonRNAは糖新生遺伝子fbp1の転写制御領域から転写され、この領域のクロマチン構造を脱凝縮させる。その結果、fbp1遺伝子の転写が大規模に活性化される。しかし、mlonRNAがどのような分子機構によってクロマチン構造変換を引き起こすのか、またfbp1で見出されたクロマチン制御機構が他の遺伝子でも用いられているかは不明であった。本研究の1・2年目の成果により、mlonRNAが転写されることで転写活性化因子Atf1がfbp1転写制御領域に効率的に結合できるようになり、その結果クロマチン構造変換およびfbp1の転写活性化が引き起こされることがわかった。そこで、当該年度はmlonRNAがどのようにしてAtf1の結合を促進するかを検討した。その結果、mlonRNAは転写抑制因子であるTup11・Tup12の機能を阻害することでAtf1の結合を促進していることが明らかになった。また、ゲノムワイド解析を行った結果、同様の制御を受けているストレス応答遺伝子を多数見出した。以上から、転写制御領域から生じるlncRNAが転写制御タンパク質の結合を制御することで、遺伝子発現が巧妙に制御されていることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年、タンパク質情報をもたない長鎖ノンコーディングRNA (1ncRNA : long noncoding RNA)が様々な機能をもつことが明らかにされ、生命の複雑性を生み出す鍵として注目されている。研究代表者の所属研究室は、グルコース飢餓応答に関わる1ncRNAを分裂酵母で発見し、これをm1onRNA (metabolic stress-induced long noncoding RNA)と名付けた(Hirota et al., 2008)。m1onRNAは、糖新生に関わるfbp1遺伝子の上流から転写され、その領域のクロマチン構造を緩ませることでfbp1の転写を活性化させる。本研究では、クロマチン制御と密接に関わるヒストン修飾が、m1onRNAによる遺伝子発現制御とどう関わるかを検証した。まず、fbp1領域のピストン修飾状態をクロマチン免疫沈降法により調べた。その結果、クロマチン弛緩に関わるヒストンアセチル化などの修飾が、fbp1の活性化時に亢進することがわかった。また、このアセチル化に関わる因子として、種間で広く保存されているヒストンアセチル化酵素Gcn5を同定し、この因子が実際にfbp1のクロマチン制御や転写活性化にも関わることを見出だした。さらに、m1onRNAの転写を起こらなくした株では、ヒストンアセチル化が阻害されることがわかった。以上から、Gcn5を介したヒストンアセチル化がm1onRNAの転写によって促進され、その結果fbp1の活性化が起こることが示唆された。1ncRNAとヒストン修飾の関連はいくつかの生物種で報告されているが、その分子機構については不明な点が多い。本研究で用いている分裂酵母は遺伝子改変が容易であり、かつ動物細胞とも類似性が高い。このことから、本研究のさらなる進展により、1ncRNAによるヒストン修飾制御の分子メカニズムについて有益な知見が得られると期待される。真核生物では、タンパク質情報をもたない長鎖RNA(長鎖ノンコーディングRNA、lncRNA)が多数転写されているが、その生理的意義については不明な点が多い。当研究室は、分裂酵母のグルコース飢餓応答に関わるlncRNA (mlonRNA)を以前に発見した。mlonRNAの転写は、クロマチン構造を弛緩させることで下流に位置する糖新生遺伝子fbp1の発現を促進する。本研究では、クロマチン制御と関わりが深いヒストン修飾に着目し、mlonRNAの転写がクロマチン構造制御にどう関わるかを検証した。1年度目の研究により、mlonRNAが転写されることでヒストンアセチル化酵素Gcn5がfbp1領域に呼び込まれ、その結果ヒストンアセチル化が促進され、クロマチン弛緩が効率的に起こることが明らかにされた。そこで2年度目は、この過程の分子メカニズムについて詳細に検証することにした。その結果、当該年度において(1)mlonRNAが転写されることで、転写因子Atf1がfbp1領域に効率的に結合できるようになること、(2)Atf1の結合が逆にmlonRNAの発現を促進することで、正のフィードバックが形成されること、(3)Atf1がヒストンアセチル化を促進することで、fbp1領域のクロマチン構造を制御することを明らかにした。本研究により、lncRNAがストレス応答性の遺伝子発現にどう寄与するのかについて、分子レベルでの知見が得られることが期待される。当該年度の研究により、mlonRNAが転写活性化因子を呼び込むことでクロマチン制御に寄与するかが明らかになった。この進捗は概ね当初の研究計画通りであった。

申請者の所属研究室は、真核細胞のモデル生物である分裂酵母において、グルコース飢餓応答に関わるlncRNAを見出だし、これをmlonRNA(metabolic stress-induced long noncoding RNA)と名付けた。グルコース飢餓が起こると、mlonRNAは糖新生遺伝子fbp1の転写制御領域から転写され、この領域のクロマチン構造を脱凝縮させる。その結果、fbp1遺伝子の転写が大規模に活性化される。しかし、mlonRNAがどのような分子機構によってクロマチン構造変換を引き起こすのか、またfbp1で見出されたクロマチン制御機構が他の遺伝子でも用いられているかは不明であった。本研究の1・2年目の成果により、mlonRNAが転写されることで転写活性化因子Atf1がfbp1転写制御領域に効率的に結合できるようになり、その結果クロマチン構造変換およびfbp1の転写活性化が引き起こされることがわかった。そこで、当該年度はmlonRNAがどのようにしてAtf1の結合を促進するかを検討した。その結果、mlonRNAは転写抑制因子であるTup11・Tup12の機能を阻害することでAtf1の結合を促進していることが明らかになった。また、ゲノムワイド解析を行った結果、同様の制御を受けているストレス応答遺伝子を多数見出した。以上から、転写制御領域から生じるlncRNAが転写制御タンパク質の結合を制御することで、遺伝子発現が巧妙に制御されていることが示唆された。mlonRNAが転写されることで、Atf1の結合がどのように促進されるかを分子レベルで解明する。一部のlncRNAは、標的タンパク質と相互作用することでその機能を制御することが示唆されている。この知見を踏まえ、mlonRNAがAtf1と相互作用するか、またそれが実際にAtf1の結合に重要かを生化学的・遺伝学的に検証する。また、mlonRNAの転写が他の因子を介して間接的にAtf1の結合を制御する可能性も考えられるので、その点についても検証する。さらに、所属研究室で既に実施されているゲノムワイド解析を基に、fbp1におけるクロマチン制御機構が他の遺伝子にもみられるかを調べ、得られた知見の一般性について検証する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。ヒストンアセチル化の責任因子としてGcn5を同定したこと、またGcn5によるアセチル化がm1onRNAの転写によって促進されることを見出だし、「m1onRNAの転写とヒストン修飾がどう連携しながらクロマチン制御を行うかを検証する」という研究目的を分子メカニズムにまで踏み込んで達成する目処が立ったため。Gcn5によるヒストンアセチル化とm1onRNAの転写がどのように共役するかを分子レベルで解明する。まず、m1onRNAのGcn5の物理的な相互作用を検証し、これがfbp1領域でのアセチル化に重要かどうかを調べる。一方、Gcn5はDNA結合タンパク質によって遺伝子上に呼び込まれるという知見があることから、m1onRNAの転写がDNA結合タンパク質を介して間接的にGcn5の働きを制御する可能性も考えられる。
斜視の神経生理・解剖学的研究

前2年に引続き、主として基礎医学の研究法を応用して両眼視の研究と斜視の病態解明に取組んだ。その成果を解剖的研究と神経生理学的研究に分けて報告する。1.解剖学的研究発達期ラットの一次視覚野にセロトニン線維終末の集積が一過性に存在するが、これは生直後眼球摘出により視覚入力をなくすると独特の変化を示した。これによりセロトニン線維の一過性集積は視覚の発達と関係のあることが分った(論文1)。またこのニュ-ロンは視覚野への投射は止めても死滅せずに存在し、発達過程で投射を当めるか、投射を変更するかであると考えられ、可塑性のあるアミンニュ-ロンであることが分った(論文2)。2.神経生理学的研究(1)心理物理的研究視覚の検査法の最も基本的な視力測定において時間特性を研究し、この特性が眼疾患によって異なることなど臨床的な応用にまでひろげた(論文3)。また視覚空間寄せ集め現象を視覚誘発電位からも検討した(論文4)。(2)眼球運動の研究両眼視機能の基本である融像は上下と水平とでは著しく異なるのでこれの運動成分についてファンダスパプロスコ-プを用いて解析を行った(論文5)。MRIによる眼球運動の画像診断は本年度も多くの症例で検討をつづけ、その有用性を確認するに至った(論文6)。また正常者における外眼筋の形状測定を行い、診断面で基礎になる値を得たので、今後は定量的な方向に研究をすすめている。これらは平成4年度日本眼科学会総会において発表する。斜視の臨床的研究は極めて詳細に行われほぼ限界近くまで成果をあげている。本研究はこれに基礎医学における視覚の研究法を応用して斜視のより基礎的な病態を研究しようとするものである。その成果を解剖学的研究、神経生理学的研究に分けて報告する。1.解剖学的研究斜視における網膜視細胞レベルでの変化は全く無いとされているが、視覚入力系の最初の入力部における変化をあらためて再検討するために視機能に関係の深いtaurinの局在変化の追求を免疫組織学的に研究し、基本的な結果についてまとめることができた。(発表図書1)視覚の中継点である外側膝状体は斜視・弱視において変化をきすことはすでに知られているが、このシナップスでの変化が中枢への影響する問題について基礎的に検討した。(発表論文1)斜視においては視中枢における変化が最も重要視されている。視覚の生後発達の遅延について検討するために生後一過性に出現する脳内のセロトニンニュ-ロンに注目し、これが視覚形成に深い関係があることをつきとめた。(発表論文2)2.神経生理学的研究(1)心理学的手法によりヒトの網膜Y細胞、X細胞受容野について、視力との関係について詳細な検討を行い、受容野密度について新しい算出ができた。(発表論文3,4)(2)眼球運動系の研究近年新しく発達した磁気共鳴装置を新しく眼球運動記録できるように工夫し、Cine Modeによって眼球運動を画像として記録することに成功した。これによって眼球運動の生理とくに眼窩内における位置関係が詳細に解析され、一部病的眼球運動障害例の解析も行うことができた。(発表論文5,6)平成元年度に引続き、主として基礎医学における研究法を応用して両眼視の研究と斜視の病態解明に取組んだ。その成果を前年度同様、解剖学的研究と神経生理学的研究に分けて報告する。1解剖学的研究斜視や弱視においては網膜視細胞レベルの変化はないとされているが、視覚に重要な役割を果たしているtaurinを免疫組織学的に研究した結果ではやはり変化は検出できなかった。(図書1)視覚の中継点である外側膝状体は斜視や弱視で細胞レベルでの変化が起ることはよく知られているが、実験時に視神経障害を与えたときに中枢にどのような変化を起こすかについて病理解剖学的に検討中であるがまだ結論を出すに至っていない。研究続行中(論文未完成)斜視における視中枢での変化は最も重要であり、特に生後の視覚発達が重要である。弱視における視覚発達遅延を検討するために発達途上に出現するセロトニンニュ-ロンの局在を二重標識法により検討し、これら視覚形成に関係することを確認した。(論文3)2神経生理学的研究(1)心理学的手法により視覚のOFF効果、特に色覚機構依存性について検討した。(論文1,2)(2)眼球運動系の研究年々性能の向上しているMRIにおいてCine Modeで眼球運動を記録することに成功したので、これを用いて正常者において眼球の回旋点の計測,決定,外眼筋の収縮,視神経の動きなどの画像解析をすすめている。臨床応用として斜視、特に麻痺性斜視のMRI所見を手術,前後を比較して解析をすすめている。一部異常所見を把握したものについては学会に報告した。(論文4,5.図書2)この研究は目下進行中で、来年時日本眼科学会特別講演として発表予定。

またこのニュ-ロンは視覚野への投射は止めても死滅せずに存在し、発達過程で投射を当めるか、投射を変更するかであると考えられ、可塑性のあるアミンニュ-ロンであることが分った(論文2)。2.神経生理学的研究(1)心理物理的研究視覚の検査法の最も基本的な視力測定において時間特性を研究し、この特性が眼疾患によって異なることなど臨床的な応用にまでひろげた(論文3)。また視覚空間寄せ集め現象を視覚誘発電位からも検討した(論文4)。(2)眼球運動の研究両眼視機能の基本である融像は上下と水平とでは著しく異なるのでこれの運動成分についてファンダスパプロスコ-プを用いて解析を行った(論文5)。MRIによる眼球運動の画像診断は本年度も多くの症例で検討をつづけ、その有用性を確認するに至った(論文6)。また正常者における外眼筋の形状測定を行い、診断面で基礎になる値を得たので、今後は定量的な方向に研究をすすめている。これらは平成4年度日本眼科学会総会において発表する。
関節拘縮の病態と治療に関する研究

関節拘縮は罹患関節に機能障害を遺す重要な病状であるが、その治療は経験に基づいており、科学的根拠に乏しい。その大きな理由の一つは、ヒトの関節拘縮に類似する適切な動物モデルが存在しないからである。再現性のある関節拘縮動物モデルを作成して関節周囲組織に起こる変化を観察することにより拘縮の病態を明らかにし、拘縮の予防や治療に応用できる方法を見いだすことを目的に本研究を行った。動物モデルとしては家兎の膝関節を創外固定する関節拘縮モデルを開発し、このモデルを用いて実験を行った。この結果、拘縮に伴う関節周囲組織の変化はかつて報告されていたような線維性結合組織の増殖による癒着ではなく、関節を構成する周囲軟部組織の結合織成分の増加によるものであることが明らかになった。ヒトの拘縮の病態を明らかにするために、進行性に関節拘縮をきたす疾患である強直性脊椎炎患者の人工股関節手術時に得られた関節周囲軟部組織を分析した。その結果、臨床的にはほとんど可動域のない高度の拘縮を呈していたにもかかわらず、非可逆的変化は存在せず、拘縮モデルの結果と同様に結合織の主成分であるコラーゲンやエラスチンの増生を示した。以上の結果から二次性炎症を生じさせない範囲の可動域訓練が有効と判断し、人工膝関節手術後の患者に対して早期の自動可動域訓練を導入し、以前から行なっていた持続的他動運動訓練装置を用いた方法と比較することによりその効果を判定した。その結果、早期の自動可動域訓練は人工膝関節手術後の可動域獲得に有効であることが明らかになった。本研究によって関節拘縮の病態は可逆性であり、自動的に可動域訓練を行なわせることが治療上有効であることが明らかになった。1)関節拘縮モデルの作製:当初は成熟家兎の膝関節周囲をギプス固定して膝関節に拘縮を作製する予定であったが、ギプス内で後肢が動き一定の拘縮を作製することは困難であることがわかった。このため、大腿骨・脛骨に鋼線を刺入しこの鋼線をレジンで固定する創外固定法を採用した。この方法によると4週の固定で関節拘縮を作製できることがわかった。さらに拘縮の程度を評価する方法として、他動運動による関節可動域と下腿の一定点に重量の異なる重錘をおき関節が動き始める重さを測定することによって拘縮の程度を測定することとした。この方法で評価すると、創外固定法によって均一な関節拘縮を作製することが可能であることがわかった。2)関節構成体の組織学的変化の検索:拘縮した膝関節を筋肉、関節包靭帯を付けたまま大腿骨と下腿骨で切断し、骨・軟骨を含んだ薄切標本を作製した。ヘマトキシリン・エオジン及びトルイジン・ブルー染色を行い、さらに現在抗コラーゲン抗体と抗エラスチン抗体を用いた免疫組織染色を行っている。4週固定後の組織変化は主として筋腱移行部に起こっていることがわかったが、詳細は現在検討中である。3)イン・サイツー・ハイブリダイゼーション:ヒトI型・III型コラーゲンのcDNAをプラスミドに組み込んで増幅し、cDNAのフラグメントを得た。このプローブは家兎のコラーゲンのmRNAとクロス・ハイブリダイズすることをノーザン・ブロットで証明した。cDNAプローブをもとにジゴキシゲニンでラベルした標識RNAを作製し、アルカリで部分分解した。このRNAプローブを用いて家兎の靭帯組織におけるI型・III型コラーゲンメッセージの発現を検知ことに成功した。平成4年度は拘縮モデルの作製と細胞間基質の変化を組織学的・免疫組織化学的に検討し現在論文にまとめている。

本年度はこの細胞間基質の変化がどのような段階でおこるか、また筋肉組織の変化はどのようにおこるのかを解明する目的で研究を行なった。関節構成組織の細胞間基質の変化はインターロイキン1を介して起こると推測しインターロイキンのmRNAの発現をみる目的でインターロイキンcDNAのオリゴプローブを用いて検出する方法を検討した。4週・10週の拘縮モデルから摘出した内側々副靭帯、前十字靭帯、膝蓋上滑液包内の滑膜組織を用い、イン・サイツー・ハイブリダイゼーションを行なった。また筋肉組織の変化をみるために大腿四頭筋の腱への移行部を材料として、ミオシン・ヘビー・チェーンのcDNAオリゴプローブを用いて同時期のインサイツー・ハイブリダイゼーションを行なった。IL-1のmRNAの発現は靭帯にわずかに認められたのみで滑膜は脂肪変性に陥いり明確な発現は検知できなかった。ミオシン・ヘビーチェーンの発現は検知できたが、筋肉組織のみであり腱への移行部では明確な発現は検知できなかった。この組織についてはI型コラーゲンのmRNAの発現を現在検索中である。ヒトの拘縮病態である強直性脊椎炎患者の手術をする機会を得たので切除した関節包を用いて組織学的、生化学的検索を行ない、関節包そのものに炎症性変化があることを解明した。平成4年度に拘縮モデルを作製し細胞間基質の変化を組織学的・免疫組織化学的に検討した。平成5年度にはこの細胞間基質の変化はどのような段階で起こるか、また筋肉組織の変化はどのように起こるのかを解明する目的でインサイツ-ハイブリダイゼーションの手法を用いて、コラーゲン、これの代謝のメディエーターであるインターロイキン1,筋肉組織の主要タンパクであるミオシンヘビーチェーンのmRNAを検出を試みた。軟部組織のI型およびIII型コラーゲンmRNAの発現はC-DNAをテンプレートにしたRNAプローブを用いて検出することができた。しかし、IL-1およびミオシンヘビーチェーンについてはオリゴプローブを用いたため明らかに検出することはできなかった。本年度はまずオリゴプローブの妥当性について検討したが、クロスハイブリダイズとプローブの不安定性のため、方法論的に摂理があることが明らかになった。このためIL-1とミオシンヘビーチェーンのC-DNAを入手しこれをテンプレートにして作製したRNAプローブを用いてインサイツ-ハイブリダイゼーションを行ない4週、10週の関節創外固定の家兎から摘出した内側々創靱帯、前十字靱帯、膝蓋上滑液包、大腿四頭節筋腱移行部におけるI、III型コラーゲン、IL-1、ミオシンヘビーチェーンのmRNAの発現を観察した。さらに3日、1週、2週のモデルを作製し、拘縮早期におけるこれらのmRNA発現についても検索した。現在dataを整理し、論文にすべく準備中である。ヒアルロン酸は拘縮予防に有効な薬剤と考えられるが細胞外基質に与える直接的な影響は不明である。靱帯部分切断モデルに対するヒアルロン酸の効果を検討した。
DVD映画を用いたCALLシステムによる看護学生のための英語教育手法の研究

「いつでも・どこでも英語映画を利用した英語学習ができるCALL」の実現を目指し、ESP教材開発を実施した。これまでの映画教材の実践から、医療・看護系学生を中心とした学習者に評価の高い、邦題「レナードの朝」(原題"Awakenings")のDVD映画を教材化した。これを全学習者が所有し、全編を通じたリスニング・ライティング用の教材・練習問題と同期して、ノートPC上で動くCALLシステムで提供する。学習者は意識的に勉強しようと構えることなく「いつでも・どこでも」学ぶことが可能となり、英語学習時間の増加が見込まれるという仮説を検証した。WBTやビデオストリーミングとテキスト教材を組み合わせるといった形式ではない、新しいeラーニングの構築を行った。映画を利用する場合、シナリオ・俳優などの個別要素が教材としての質を左右するため、モデル化し難いが、ベストセラーとして著名な原書を基にし、医師である作者の専門的知識が導入された本映画の教材化は、職業と直結する看護学部で学ぶ学習者に、医療系教材として質の高さを保障することが明らかになった。さらに"知りたい・理解したい"といった学習者の自然な学習意欲を喚起し学習効果を上げる結果に結びついた。本研究は、英語映画が英語教育の教材としての価値を認められながらも教育現場で活かしきれなかった諸問題を解決し、eラーニング環境において市販されているDVD映画の利用を可能にしたという点で画期的であると考える。また、娯楽作品のオリジナル性を損なわず教材化するという研究手法は意義深い。高画質のDVD-Videoをテキスト教材と同期して扱う仕組みは、英語教育以外の分野でも応用が見込まれる。学習の効率化・学生の動機付け・学習履歴の有効活用などを目指し、e-ラーニングシステムSmile for Me(Synchronized Multimedia Interactive Learning environment for Multimode Education)を用いて授業実践を行った。ESPの概念に基づき実際の患者と医療者との関わりを描いたDVD映画を利用し、学生の専門知識が高まるよう、医療関係者の協力を得ながら教材を開発した。リスニング力向上に焦点を当てJACET聴解力基礎テストA(実施前)と同じくテストB(実施後)を比較したところ、実施前の平均点が52.1点で実施後の平均点が56.8となり、t検定の結果両群に有意な差があった(p<0.05)。(研究内容は外国語教育メディア学会で発表し同学会全国研究大会発表論文集に掲載)。アクション・リサーチの手法を取り入れ、システムの整備・改良を行った。研究分担者同士で授業を観察したり、授業内容の記録、改善を繰り返したりすることで、学生の声を反映させ、画面を大きく見やすくし、問題の提示方法をよりuser-friendlyにし、学生同士、学生と教員のインタラクションを増加させた。これが授業の改善につながったかどうかを2003年度一年生のCALL授業に対する満足度平均点と、2004年度一年生のCALL授業に対する満足度平均点を比較して調べた結果(学内の満足度調査結果による)、両群に有意な差があった(p<0.01)。2005年度一年生のCALL授業実践にあたり2004年度で成果が得られたリスニング力向上プログラムに加え、正確なイントネーション・英語のリズムの向上を目指し、動画にあわせてセリフを言ったり録音したりする事ができるロールプレイシステムを組み込んだ。アンケート集計結果と聴解力テスト統計結果について投稿準備中である。複数の教師が同一タイトルのDVDをそれぞれ所持することにより、一部分のスクリプト作成(チャプター単位の管理が原則)に参加し、他者の作成したスクリプト修正を行ったり、空所補充問題作成を行ったりして、効率的、効果的な指導体制をとった。学習者は、Webサイトからチャプター番号で教材を指定・ダウンロードして学習した。このとき録音された、音声ファイルはサーバにアップロードさせて、指導・評価の対象とした。
マウスにおける高炭水化物食の肥満および代謝症候群に及ぼす影響

近年、日本では、肥満、メタボリックシンドローム、2型糖尿病が増加しており、動脈硬化性疾患の急増が危惧されている。我々は、これら日本人の肥満関連疾患の増加の原因として、高炭水化物食が影響を及ぼしている可能性を示唆してきた。そこで、高炭水化物食が肥満、メタボリックシンドロームに及ぼす影響の解明を目的とした。昨年度の結果を基に、8週齢のマウスのオスに高炭水化物食と対照食を2週間、4週間投与した。体重に関して、投与4週間では、高炭水化物食投与群は対照食投与群に対して有意な体重の増加が認められた。肝臓、副睾丸脂肪組織の重量も有意に増加していた。血液生化学検査でも、中性脂肪、遊離脂肪酸、総コレステロールが有意に高値、HDLコレステロールが有意に低値であった。高炭水化物食で体重、肝臓、副睾丸脂肪組織に有意な増加がみられ、日本人のメタボリックシンドロームの病態に近いと考えられる炭水化物誘導のモデルマウスとなった。肝臓での脂質新生(denovo lipogenesis)を明らかにするため、肝臓での脂質合成関連遺伝子の発現量を比較解析した。脂肪酸合成酵素の中心的役割であるfas、accが高炭水化物食投与群は明らかに高値であった。中性脂肪合成遺伝子であるscd1も有意に高値であった。コレステロール合成遺伝子であるhmgrも有意に高値であった。これらの遺伝子発現解析、血液生化学検査、特に遊離脂肪酸の挙動を総合的に判断すると、肝臓、白色脂肪組織での遊離脂肪酸を介した異常な脂質代謝が行われていることが考えられる。以上のように、同じ摂取熱量でも、高炭水化物食を摂取したマウスは、4週間という短期間に肥満を発症し、肝臓での脂質新生が盛んに行われ、白色脂肪組織との間での脂質代謝異常が考えられた。今後は、白色脂肪組織、膵臓を含めた脂質代謝異常発症のメカニズムを検討する必要がある。そこで、マウスを用い、高炭水化物食が肥満、メタボリックシンドロームに及ぼす影響の解明を目的とした。8週齢のICRマウスのオスに高炭水化物食と対照食を2週間、4週間投与した。体重に関して、投与14日目(2週間)までは、高炭水化物食投与群は対照食投与群に対して有意な体重の増加は認められなかったが、投与16日目以降では、有意な体重の増加を示した。最終的に投与4週間では、対照食群に対して、高炭水化物食投与群は、12%体重が多かった。副睾丸白色脂肪組織重量では、2週間投与後では有意な差はなかったが、4週間投与後では、高炭水化物食投与群で有意な増加が認められた。肝臓重量では、2週間、4週間投与後ともに有意な差はなかった。血液生化学試験では、2週間投与後では有意な差はなかったが、4週間投与後では対照食投与群に対して、高炭水化物食投与群では中性脂肪、遊離脂肪酸、総コレステロールで有意な高値が認められた。また、HDLコレステロールでは、2週間、4週間投与後ともに、有意な低値が認められた。血糖値に関しては、2週間、4週間投与後ともに有意差はなかった。肝臓の中性脂肪含量では、有意差は認められなかったものの、4週間投与後で、対照食投与群に対して、高炭水化物食投与群で、総含量、相対含量ともに明らかな高値が確認された。グリコーゲン含量では、2週間、4週間投与後ともに有意な差はなかった。体重に関して、投与2週間では、高炭水化物食投与群は対照食投与群に対して有意な体重の増加は認められなかったが、投与16日目以降では、有意な体重の増加を示した。投与4週間では、対照食群に対して、高炭水化物食投与群は、12%体重が多かった。高炭水化物食で体重、肝臓、副睾丸脂肪組織に有意な増加がみられたため、肝臓での脂質新生(de novo llipogenesis)を明らかにするため、肝臓での脂質合成関連遺伝子の発現量を比較解析した。脂肪酸合成酵素の中心的役割であるFASが有意な差は認められなかったものの、高炭水化物食投与群は明らかに高値であった。脂肪酸合成の初期に働くACCは、有意に高値であった。中性脂肪合成遺伝子であるSCD1は、4週間投与後では有意に高値であった。解糖系酵素であるPKFは、2週間、4週間投与後ともに有意な差はなかった。コレステロール合成遺伝子であるHmgrは、有意に高値であった。以上のように、同じ摂取熱量でも、高炭水化物食を摂取したマウスは、4週間という比較的短期間に肥満を発症し、肝臓での脂質新生が盛んに行われていることが明らかとなった。今後は、脂肪組織なども含め、肥満発症のメカニズムを検討する必要がある。

近年、日本では、肥満、メタボリックシンドローム、2型糖尿病が増加しており、動脈硬化性疾患の急増が危惧されている。我々は、これら日本人の肥満関連疾患の増加の原因として、高炭水化物食が影響を及ぼしている可能性を示唆してきた。そこで、高炭水化物食が肥満、メタボリックシンドロームに及ぼす影響の解明を目的とした。昨年度の結果を基に、8週齢のマウスのオスに高炭水化物食と対照食を2週間、4週間投与した。体重に関して、投与4週間では、高炭水化物食投与群は対照食投与群に対して有意な体重の増加が認められた。肝臓、副睾丸脂肪組織の重量も有意に増加していた。血液生化学検査でも、中性脂肪、遊離脂肪酸、総コレステロールが有意に高値、HDLコレステロールが有意に低値であった。高炭水化物食で体重、肝臓、副睾丸脂肪組織に有意な増加がみられ、日本人のメタボリックシンドロームの病態に近いと考えられる炭水化物誘導のモデルマウスとなった。肝臓での脂質新生(denovo lipogenesis)を明らかにするため、肝臓での脂質合成関連遺伝子の発現量を比較解析した。脂肪酸合成酵素の中心的役割であるfas、accが高炭水化物食投与群は明らかに高値であった。中性脂肪合成遺伝子であるscd1も有意に高値であった。コレステロール合成遺伝子であるhmgrも有意に高値であった。これらの遺伝子発現解析、血液生化学検査、特に遊離脂肪酸の挙動を総合的に判断すると、肝臓、白色脂肪組織での遊離脂肪酸を介した異常な脂質代謝が行われていることが考えられる。以上のように、同じ摂取熱量でも、高炭水化物食を摂取したマウスは、4週間という短期間に肥満を発症し、肝臓での脂質新生が盛んに行われ、白色脂肪組織との間での脂質代謝異常が考えられた。今後は、白色脂肪組織、膵臓を含めた脂質代謝異常発症のメカニズムを検討する必要がある。
エクジステロイド脱リン酸化酵素の精製と遺伝子解析

エクジステロイド脱リン酸化酵素は,エクジステロイド(脱皮ホルモン)のリン酸抱合体(不活性型)を基質として遊離型エクジステロイド(活性型)の生成を触媒する酵素である.この酵素は,昆虫体内のエクジステロイドホメオスタシスの調節(すなわち胚発生や脱皮と変態の調節)に重要な役割を果たしていると考えられている.しかし,この酵素の酵素化学的性状については全く解明されていない.そこで,本研究は,エクジステロイド脱リン酸化酵素を精製し,基質特異性や反応速度など酵素の性状を明らかにすること,およびこの酵素の遺伝子をクローニングすることを目的として行われた.本酵素は,カイコの非休眠卵(産卵後3日目)を材料としてイオン交換,ハイドロフォービック,ゲルろ過など各種クロマトグラフィーにより,電気泳動的に単一のバンドとして精製できた.本酵素の細胞内分布や基質特異性,各種インヒビターによる阻害実験などから,新規のホスファターゼであることが明らかとなった.次に,精製された酵素のアミノ酸配列をもとにしてRT-PCR法によりcDNAのクローニングと塩基配列の解析を行った.得られたcDNAは1620bpで331残基のアミノ酸を持つタンパク質をコードしていた.アミノ酸配列の相同性の検索からも新規のタンパク質であった.このタンパク質をSf9細胞で発現させ,精製したのちに活性を測定したところ,エクジステロイド脱リン酸化酵素が検出された.エクジステロイド脱リン酸化酵素は,エクジステロイド(脱皮ホルモン)のリン酸抱合体(不活性型)を基質として遊離型エクジステロイド(活性型)の生成を触媒する酵素である.この酵素は,昆虫体内のエクジステロイドホメオスタシスの調節(すなわち胚発生や脱皮と変態の調節)に重要な役割を果たしていると考えられている.しかし,この酵素の酵素化学的性状については全く解明されていない.そこで,本研究は,エクジステロイド脱リン酸化酵素を精製し,基質特異性や反応速度など酵素の性状を明らかにすること,およびこの酵素の遺伝子をクローニングすることを目的として行われた.本酵素は,カイコの非休眠卵(産卵後3日目)を材料としてイオン交換,ハイドロフォービック,ゲルろ過など各種クロマトグラフィーにより,電気泳動的に単一のバンドとして精製できた.本酵素の細胞内分布や基質特異性,各種インヒビターによる阻害実験などから,新規のホスファターゼであることが明らかとなった.次に,精製された酵素のアミノ酸配列をもとにしてRT-PCR法によりcDNAのクローニングと塩基配列の解析を行った.得られたcDNAは1620bpで331残基のアミノ酸を持つタンパク質をコードしていた.アミノ酸配列の相同性の検索からも新規のタンパク質であった.このタンパク質をSf9細胞で発現させ,精製したのちに活性を測定したところ,エクジステロイド脱リン酸化酵素が検出された.エクジステロイド脱リン酸化酵素は,エクジステロイドのリン酸抱合体を基質として遊離型エクジステロイドの生成を触媒する酵素である.この酵素は数あるステロイドホルモンの中でもリン酸抱合体を形成するエクジステロイドのみで見いだされたユニークな酵素である.しかし,この酵素の酵素化学的な性質についてはほとんど解明されていない.そこで,本年度の研究は,脱リン酸化酵素を精製し,基質特異性などの性状やキネテックスを明らかにすることを目的として行われた.本酵素は,カイコ卵の非休眠卵を材料として陰イオン交換,ゲルろ過,疎水クロマトグラフィーなどにより,電気泳動的にほぼ単一のバンドまで精製できた.しかし,まだ多少の來雑物を含んでいるため,さらに精製を進める予定である.本酵素は可溶性画分に存在し,リソソーム型のホスファターゼやタンパク質ホスファターゼのインヒビターでは抑制されないことから,新規の酵素であることが示唆された.この酵素の精製の途中で,基質であるエクジステロイドリン酸抱合体は,生体内では卵黄タンパク質の一種ピテリンと複合体を形成しており,このビテリン-エクジステロイドリン酸抱合体複合体は,エクジステロイド脱リン酸化酵素によって脱リン酸化されないことが明らかとなった.このことから,生体内でリン酸抱合体から遊離型エクジステロイドが生成されるためには,まずエクジステロイドリン酸抱合体がビテリンから遊離するプロセス(おそらくタンパク分解酵素によってビテリンが分解される)が必要であると推定された.エクジステロイド脱リン酸化酵素は,エクジステロイド(脱皮ホルモン)のリン酸抱合体を基質として遊離型エクジステロイドの生成を触媒する酵素である.この酵素は,昆虫体内のエクジステロイドホメオスタシス(すなわち胚発生や脱皮と変態の調節)に重要な役割を果たしている.しかし,この酵素の性状については全く解明されていない.そこで,本研究は,エクジステロイド脱リン酸化酵素を精製し,基質特異性や反応速度など酵素の性状を明らかにすること,およびこの酵素の遺伝子をクローニングすることを目的として行われた.本酵素は,カイコの非休眠卵を材料としてイオン交換,ゲルろ過クロマトグラフィーなどにより,電気泳動的に単一のバンドとして精製できた.本酵素の細胞内分布や基質特異性,各種インヒビターによる阻害実験などから,新規のホスファターゼであることが明らかとなった.現在,精製された酵素のアミノ酸配列をもとにしてRT-PCR法によりcDNAのクローニングと塩基配列の解析を行っている.エクジステロイドリン酸抱合体は,卵巣一卵系では卵黄蛋白質の一種ビテリンと複合体を形成しており,エクジステロイド脱リン酸化酵素の基質となるためには,あらかじめビテリンが蛋白質分解酵素によって分解される必要のある事も明らかとなった.
福島原発事故による放射性ヨウ素の汚染と事故後の環境動態に関する研究

本研究では、福島原発事故の初期被ばく線量評価で重要な放射性ヨウ素の汚染実態を明らかにすることを目的とし、ICP-MS/MSを用いた高感度放射性ヨウ素分析法の開発を進めている。本年度は、極微量のI-129を高感度で測定するための試料導入法の改良を行った。ICP-MS/MSでは通常、噴霧器を用いて溶液試料を霧状にしてプラズマに導入する方法が用いられる。この方法では、大きな水滴は捨てられてしまうため、試料の導入効率は10%以下とされている。本研究では、ICP-MS/MSの試料導入効率の向上を目指し、ヨウ素を電熱器により加熱気化させる方法(加熱気化法)と溶液中のヨウ化物イオンを元素状ヨウ素として酸化気化する方法(酸化気化法)の二つを検討した。加熱気化法を用いた場合、ヨウ素の高感度は達成されなかった。これは、試料中のヨウ化物イオンがヨウ化ナトリウムとして析出し、フィラメント上で効率良く気化しなかったためと考えられる。また、加熱気化法では、レニウムフィラメントの気化によりICP-MS/MSの試料導入部がレニウムに汚染されることがわかった。一方、ヨウ素の酸化気化法を用いた場合、10倍程度の高感度化が達成された。これは、ヨウ化物イオンが定量的に元素状ヨウ素として質量分析計に気相導入できたためと考えられる。以上の結果から、今後は酸化気化反応を用いた気相導入法の改良を進めていくことにより、世界最高レベルの高感度化を目指す。本年度開発した酸化気化ヨウ素導入法により10倍程度の高感度化が達成されたため。本研究では、高感度放射性ヨウ素分析法の開発が重要な位置を占めている。極微量のI-129を高感度で測定するための試料導入法として、溶液中のヨウ化物イオンを元素状ヨウ素として酸化気化する方法の改良を進め、さらに真空インターフェースの改良により感度を数倍向上させ、本研究で狙っている世界最高レベルの高感度化を達成させる。消耗品として計上した試料分析用ガスの交換が次年度以降になったため、該当助成金が生じた。該当助成金は次年度請求分と合わせて試料分析用ガスの交換に使用する予定である。
ウイルスの標的化、細胞内侵入、エンドソーム脱出能を移植した新規ナノキャリアの開発

本研究では、B型肝炎ウイルス(HBV)の外皮Lタンパク質粒子(バイオナノカプセル;BNC)の研究を通して得られたHBV由来「能動的標的化機構、細胞内侵入機構、エンドソーム脱出機構」を解析及び活用し、リポソーム(LP)等の脂質ナノキャリアに同機能を再構成することを目指す。本年度は、HBVの能動的標的化機構、細胞内侵入機構を担う当ペプチドを中性LPに提示し、ペプチドのモル比、提示されたペプチドLPの粒子径やゼタ電位などの物性条件を検討し、臨床応用に近い化成品の最適化をした。また、作製されたペプチドLPにLuciferase siRNAや緑色蛍光タンパク質発現プラスミドを内封し、細胞質送達を行ったが、エンドソーム脱出が不十分のため、細胞内の遺伝子発現は検出されなかった。今後、効率的なエンドソーム脱出機構の搭載が必要と考えている。本研究の成果は、HBV治療薬の全く新しい創薬ポイントを提供する。また、HBV初期感染機構を分子レベルで明らかにしたものであり、ウイルス由来でありながら人工DDSナノキャリアの実用化に大きく貢献する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。B型肝炎ウイルス(HBV)感染に重要なLタンパク質のペプチドを中性リポソーム(LP)の表層に提示した。ヒト肝癌由来細胞HepG2とNa-taurocholate co-transporting polypeptide(NTCP)過剰発現HepG2を用い、蛍光標識したペプチド提示型LPの細胞内取り込みを解析した。その結果、pre-S1(9-47)-LPは、NTCPの有無と関わらず、HepG2細胞と結合後、エンドサイトーシスにより細胞内に侵入したことが明らかになった。次に、pre-S1領域の断片化ペプチドを用い、HepG2細胞との結合及び侵入能を担うドメインを解析したところ、pre-S1(30-42)領域が最も強いことが判明した。また、同活性はヘパリンにより濃度依存的に阻害され、グリコサミノグリカン硫酸化を阻害剤sodium chlorateで処理したHepG2細胞、あるいはグリコサミノグリカン切断酵素heparinase Iで処理したHepG2細胞において著しく低下した。さらに、ヘパリン固定化ビーズと強く結合し、HBVジェノタイプ間でよく保存されたアミノ酸残基(Asp-31、Trp-32、Asp-33)に変異導入により、同残基群がヘパリン結合能の中心的役割を担うことが判明した。本pre-S1(30-42)ペプチドはHBVの初期感染機構において、細胞表層heparan sulfate proteoglycanと相互作用することが重要と考えられた。最後に、Pre-S1(30-42)ペプチドはin vitroにおいてヒト肝臓由来細胞への高い親和性を有していたことから、抗がん剤ドキソルビシンを封入した該ペプチド提示LPによりHepG2に対する高い細胞傷害活性を証明した。以上から、pre-S1(30-42)ペプチド提示したLPは、新規HBV模倣ナノキャリアとして有望と考えられた。B型肝炎ウイルス(HBV)由来の「能動的標的化機構、細胞内侵入機構、エンドソーム脱出機構」を人工ナノキャリアに再構成するため、HBV初期感染機構の分子レベルの解析は不可欠と考えられる。昨年度では、HBVの標的化及び細胞内侵入機構を解析した。その結果、HBVの標的化及び細胞内侵入に必要なドメインを同定した。当ドメインを機能性ペプチドとしてナノキャリアの表層に再構成することに成功した。In vitroにおいてヒト肝臓由来細胞への高い親和性を有していたことから、抗がん剤ドキソルビシンを封入した該ペプチド提示リポソームによりヒト肝臓由来細胞HepG2に対する高い細胞傷害活性を証明した。以上から、pre-S1(30-42)ペプチドを提示したナノキャリアは、新規HBV模倣ナノキャリアとして有望と考えられた。上記の研究成果は、国際学術雑誌2報に公表し、国内外の学会で発表を7回行った。以上から、期待以上の研究の進展があったと判断している。HBV由来「能動的標的化機構、細胞内侵入機構、エンドソーム脱出機構」を解析及び活用し、リポソーム(LP)やLNP(lipid nanoparticle)等の脂質ナノキャリアに同機能を再構成する。

その結果、生体内投与可能で、ヒト肝臓細胞特異的に侵入後、エンドソームから効率的に脱出して細胞質内に内封物を送達できる、臨床応用に近い化成品から構成される人工ナノキャリアの開発を最終目的とする。能動的標的化機構、細胞内侵入機構、エンドソーム脱出機構を搭載した脂質ナノキャリア(LPとLNP)に、PEG等のステルス化分子を修飾し、近赤外蛍光色素(DIRなど)で標識したLuciferase発現ヒト肝がん由来細胞を有するヌードマウスに静脈内投与し、In vivoイメージング装置で生体内動態を解析するとともに、Luciferase siRNA封入リポソームを用いてIn vivoでも効率よく遺伝子発現抑制するか検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
集団食中毒事例で検出された新規Stx2ファージの機能解析と疫学研究

2011年集団食中毒事例において、腸管出血性大腸菌(EHEC)O111およびO157が検出され、一部の重症の患者便からプラーク形成能をもつII型制限修飾遺伝子を保有するStx2ファージが回収された。II型制限酵素の遺伝子を破壊したStx2ファージを作製し、解析したところ、EHECO111およびEHECO157の共存下で、II型制限酵素が毒素産生を促進することを示唆する結果を得た。また、Stx2ファージの食品検体等から検出を試みたが検出されなかった。今年度は、II型制限修飾遺伝子を保有したStx2溶原菌から、制限修飾遺伝子のノックアウト株の作製を試みた。方法としては、遺伝子ノックアウト株を作成することを目的とした市販のキットを用いて、作成の準備を行った。また、本食中毒事例で分離された血清群O157のStx2プロファージの配列を解析したところ、EHECO111由来と思われるStx2ファージ(II型制限修飾遺伝子を保有)がO157のargWサイトにプロファージとして存在していることが判明した。本事例では、重症患者から、血清群O111あるいはO157のEHECがおのおの単独、あるいはともに分離されており、患者消化管内でO111とO157株のStx2ファージの交差感染が強く疑われる結果となった。これらの結果は、本食中毒事例の特に重要患者には、2つの血清群のEHECと2つのStx2ファージ(ひとつはII型制限修飾遺伝子を保有)が存在したことが、重症化の要因のひとつと考えられた。そこで、II型制限酵素遺伝子の役割を解析するための道具として、EHECO157からStx2ファージの分離と非病原性大腸菌C600のStx2溶原化実験を開始した。その結果、初めてEHECO157由来のStx2ファージのプラーク形成に成功し、現在、Stx2ファージの溶原菌分離を試みている。また、Stx2ファージの疫学データを得る目的で、食品や肉加工施設で検査目的にサンプリングされるドリップ中のStx2ファージ検出のための方法を検討した。その結果、非病原性大腸菌C600を指示菌として、増殖後、ファージ粒子濃縮操作を実施することで、プラークを形成に成功した。この方法を用いて、実際の食品や肉加工施設でサンプリングされたドリップ等、合計260検体を検査したところ、30検体からプラークを検出した。しかし、いずれもStx2ファージではなかった。今年度は、II型制限修飾遺伝子を保有しているStx2溶原菌から、制限(R, restriction)修飾(M, modification)遺伝子のノックアウト株を作製するため、市販のキットを用いて、作成の準備を行った。しかし、本研究では、制限修飾遺伝子をノックアウトした溶原菌あるいは、RM遺伝子のノックアウトStx2ファージを作製し、RM遺伝子の毒素産生性への効果について調べることが目的であり、主な効果の測定は、2つ以上の細菌を混合したときの培地中の毒素産生性を調べるため、現在、本研究の組換え実験は、大臣確認が必要とのことで現在、手続き中である。一方で、作製したノックアウト株と混合培養する株の選別を目的として、本食中毒事例で分離されたStxファージの特徴の解析を試みた。本食中毒事例では患者消化管内でO111とO157株のStx2ファージの交差感染が強く疑われており、分離された血清群O157株は、同一集団発生株でありながら、遺伝子型別やStx遺伝子の保有パターンについて、多様な分離株が検出されている。従って、本食中毒事例に関連したStx2ファージの特徴を明らかにするため、血清群O111及びO157株の複数株から、Stxファージの分離を試み、非病原性大腸菌C600株を用いて、溶原菌作製を試みたが、分離することはできなかった。唯一、ある患者から分離したO111stx2株から分離したStx2ファージを用いたとき、大腸菌C600で溶原菌が成立し、安定に継代することができた。現在、このようなファージの特徴をStx2プロファージの塩基配列から解析中である。また、Stx2ファージの疫学データを得る目的で、食品検体等からStx2ファージ検出を試みたが、ファージの存在を示すプラークを検出したが、Stx2ファージの検出には成功していない。II型制限酵素のノックアウト株あるいはII型制限酵素および修飾酵素のダブルノックアウト株は未だ得られていない。理由II型制限修飾酵素遺伝子のノックアウト実験は、病原細菌を用いた遺伝子組換え実験を実施するため、大臣確認申請が必要であり、手続き等により若干遅れており、実際の実験が遅れている状況である。今年度は、II型制限修飾酵素遺伝子を保有するStx2ファージ中の制限修飾酵素のノックアウト株の作製を行い、特に制限酵素活性が毒素産生に及ぼす影響を調べた。このStx2ファージは、2011年の集団食中毒事例において、患者便および分離株のマイトマイシンC処理後の培養上清からプラーク形成能をもつファージとして回収されたことから、患者腸管内で、ファージ粒子として放出され、感染可能な腸管内細菌叢に存在する大腸菌等に再感染することにより、毒素産生量に影響していることが予想された。ノックアウト株の作製には、目的遺伝子を破壊するTargeTron Gene Knockout Systemを使用した。