hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リバースエンジニアリングとしての建築史学，古代ローマ遺跡のソースコードを読み解く

古代ローマの三大都市遺跡であるポンペイ,ヘルクラネウムやオスティアに見られる一般的な建造物群をリバースエンジニアリングの考え方をつかって読み解いた結果,以下のことが判明した。1)建物の上下階で隔壁の位置を同じにしないと壁の荷重が偏り不安定となるが,ヘルクラネウムやオスティアの多層階の建物では,多くがズレており,現在のような構造的な合理性は認められない。2)部屋も正確に矩形のものは存在せず,壁は平行,直角とならないのが一般的で,むしろ完全に矩形のモザイクがその部屋の機能や格式を示していた。3)ポンペイでは荷車の交通に規制はなく,むしろ自由な往来の中での自己責任によって交通の秩序を保っていた。4月から6月まで英国Leverhulme財団の客員教授として英国ケント大学に赴任,レーザースキャニングの考古学への応用とその実践について連続講義,セミナーを実施した。滞在中にポンペイ研究のレイ・ローレンス教授,およびオスティア研究のルーク・ラヴァン博士と本科研の研究計画および発展性について討議を繰り返し行った。また,4月にはオックスフォード大学にてオスティア都市・建築研究のジャネット・ディレーン博士と意見交換をし招待講演を行った。6月にはロンドン大学の公開セミナーでもモザイク研究に関するレーザースキャニング技術応用について招待講演を行い高い評価を得た。9月,10月にポンペイ,オスティアで調査を行った。ポンペイではスクオレ通り,レジーナ通り,イシデ通りのスキャニングを完了。中央広場からスタビア通りにいたる交通規制の実態が解明されつつあり,11月には日本建築学会へ論文を投稿(3月末時点で査読中)。また3月にはポンペイのカプア門付近で出土の獣骨の分析作業を開始,後62-79年に獣骨廃棄が集中しており62年の震災で発生した廃棄物の処理に深く関連していることが明かとなった。また,食肉処理のみならず道具としての利用を示す加工の痕跡なども確認された。オスティアにおいてはデクマヌス・マキシムスの東端,西端部でデータの収集を完了した。今後の都市形成過程に関する研究の進展が期待される。夏期に予定していた非公開の「ミューズのインスラ」,「ジョーヴェとガニメデの家」の実測調査が遺跡監督所の要請で延期されたため,「カーセ・ア・ジャルディーノ」とよばれるハドリアヌス帝時代の開発地区の実測を開始した。「ミューズのインスラ」について予備調査から得られた成果を2月に日本建築学会へ論文投稿した(3月末時点で査読中)。一部調査の延期要請にしたがって3月に追加調査を実施し,上記2軒に加えて「黄色い壁のインスラ」の調査も行った。予定通り8月から9月にかけてポンペイ,ヘルクラネウム,およびオスティアにて調査を実施した。レーザースキャナ三台を導入し,機動的かつ効果的に実測調査を遂行し,期待を上回る精度でデータを収集できた。また,カラーデータについても取得を試み,実験的ではあるが,Web上でのデータ公開の準備を完了した。その結果,研究,調査の目的において示された1)上部空間の構成原理(堀担当:ポンペイでの初期複層建築とオスティアでの高層建築の比較研究)については,計画通り実測データを取得,データの分析を行い,その結果を国際論文として発表した。成果として従来,レーザースキャニングは保存,管理ツールとして使われてきたが,調査・研究ツールとして非常に有効であり,地形測量や高層建築の実測を通じて,新しい学術的成果をもたらす可能性があることを示した。2)モザイクと建築空間の関連性(堀担当:ポンペイ,オスティア住宅空間のソースコード)については,本年度までに研究をほぼ完了し,論文として発表した。ここではモザイクの精密な実測を通じて,オスティアを代表する住宅である[ミューズの家」の空間構成について新たな知見を示した。また国際論文1編として,新たな測量技術としてSFMの可能性を示した。3)リスク管理空間としての都市(堀・池口担当:災害対応,廃棄物処理,交通規制が都市空間におよぼす影響)についてはデータ収集をほぼ完了し,分析をすすめ,その途中経過を論文として発表した。ここでは,ポンペイの都市内交通が従来のように統制されたものではなく,あくまでも衝突をさけるために規制に重点が置かれていたことを示した。このように研究計画を大きく上回る進捗状況を達成し,また期待を大きく超える成果が得られた。本研究は,イタリアにおける3大ローマ都市遺跡,ポンペイ,ヘルクラネウム,オスティアにおいて,レーザー・スキャニング技術を通じて調査データを3次元化し,その密度,精度を飛躍的,革新的に向上させ,建築・都市遺構をリバースエンジニアリング的発想により,その設計,建築プロセスを復元,理解することを目的とした。具体的なテーマ以下の三点であり,期待を上回る成果を得た。加えて,新しい課題の発券も含め,さらなる研究の発展が見込まれる。1)上部空間の構成原理について,ポンペイに変えてより残存状況の良好なヘルクラネウムにおいて調査を行った。地上階と上階の隔壁の配置を比較したところ古代ローマにおける一般的な住宅においては,多層建築物であっても壁体配置に構造的合理性がないことが判明した。同時代を代表する大規模構築物における構造技術とは異質と考えられる。2)モザイクと建築空間の関連性については,オスティアのミューズのインスラにおいて,各室のモザイクの配置を詳細に検討した結果,お互いに直交,並行関係をもつモザイクのグループが確認され,そのグループが建築空間の機能と対応していることが判明した。本成果は建築学会の論文として発表済みである。

3)リスク管理空間としての都市については,ポンペイの轍の分析を通じて,都市門を通過する荷車交通の実態の一部を解明した。最新の研究では,両側交通が可能な街路については,右側通行が可能との説が有力になっているが,本研究では道路の中央を走る荷車の轍が多く確認され,こうした交通規制は確認できなかった。また,門に荷車がすれ違えるほどの幅がなく,荷車の待避場が整備されていることを指摘した。本成果は建築学会の論文として発表済みである。古代ローマの三大都市遺跡であるポンペイ,ヘルクラネウムやオスティアに見られる一般的な建造物群をリバースエンジニアリングの考え方をつかって読み解いた結果,以下のことが判明した。1)建物の上下階で隔壁の位置を同じにしないと壁の荷重が偏り不安定となるが,ヘルクラネウムやオスティアの多層階の建物では,多くがズレており,現在のような構造的な合理性は認められない。2)部屋も正確に矩形のものは存在せず,壁は平行,直角とならないのが一般的で,むしろ完全に矩形のモザイクがその部屋の機能や格式を示していた。3)ポンペイでは荷車の交通に規制はなく,むしろ自由な往来の中での自己責任によって交通の秩序を保っていた。国際査読論文2編,国内著名学会査読論文掲載2編・査読中1編という成果発表は計画された成果をはるかに超えた達成度を端的に示している。平成25年度に招聘されたイギリスの学会における特別講演を経て,国際的にも高評価を得ており,ポンペイ遺跡監督局からは調査の中間報告の作成依頼を受けている。また,オスティア遺跡監督所より,今後の調査についても全面的な協力の表明を所長よりいただいており,研究成果の高い評価を示す証左といえる。さらに,準備中の論文も数編あり,計画以上に研究が達成されていることは間違いない。27年度が最終年度であるため、記入しない。西洋建築・都市史本年度は既収集のデータの分析に専念し,その結果を論文として本年度中に公開する。同時にWeb上に3次元データの閲覧空間を設置する(6月まで)。「ミューズの家」と「イエロドゥーレの家」を予定。本件については,5月までにオスティア遺跡監督所の許可を得るとともに,加えて本監督所公式HPからのリンクも依頼する。さらに,研究が当初の計画より飛躍的に進捗したため,11月に海外から研究者を招いて国際シンポジウムを開催する。すでに,オスティア遺跡監督所のジェルモーニ所長,モレッリ管理部長にはご参加の内諾,さらにオランダ,ライデン大学よりオスティアにおける複合建築の空間構造について研究を進めているシュティーガー博士のご参加内諾をいただいている。現在,オスティアの新港であるポルトゥスで総合的研究を進める英国,サザンプトン大学のケイ教授にも内諾を得た。内容はオスティアにおける古代ローマ都市・建築研究の最新動向について,研究成果を発表するとともに,意見交換,討論を行う。オスティアにおいて8,9月に予定していた非公開地区の調査が延期になったが,3月に追加調査が実現し,次年度に調査を予定していた「黄色い壁の家」の調査が実現したこと。
二重ベータ崩壊測定のための高性能フッ化カルシウム結晶開発

本研究では、濃縮48Caの化学形態である塩化カルシウムから、フッ化カルシウムを製造する技術を開発する。また、二重ベータ崩壊測定にフッ化カルシウム結晶を用いる際の性能を評価することを目的とする。二重ベータ崩壊測定のためには、フッ化カルシウム結晶は透過率が高く、かつ含有放射性不純物が少ない必要がある。これは、放射性不純物が、二重ベータ崩壊測定のバックグラウンド起因となるのを避けるためである。ほか、蛍光熱量検出器として用いることができる必要がある。そのために、1、放射性不純物であるウラン・トリウムの低減、2、塩化カルシウムからフッ化カルシウムを製造する技術開発、3、フッ化カルシウム蛍光熱量検出器の信号読み出し開発、を行う必要がある。1、低放射能化:異なるフッ化カルシウム原料から製造したフッ化カルシウム結晶の不純物測定を行った。原料の放射性不純物はGe検出器を用いて、また、フッ化カルシウム結晶内部の放射性不純物は、214Bi→214Po→、および、220Rn→216Po→の連続崩壊を測定することで行った。結果として、選定されたフッ化カルシウム原料から、実際に二重ベータ崩壊測定用の高純度フッ化カルシウム結晶を製造できた。2、塩化カルシウムからフッ化カルシウムを製造する技術の開発:フッ化水素酸を用いて、塩化カルシウムからフッ化カルシウムへの合成を行った。この合成フッ化カルシウムを蛍光X線分析によって組成評価した。結果、塩素が0.2%弱混入していること以外は、フッ化カルシウム以外の元素が含まれず、予定通り合成ができていることを確認した。3、蛍光熱量検出器の信号読み出し開発:蛍光を吸収しない熱信号読み出しを実現するために、フッ化カルシウムへの熱センサー用銀等金属蒸着を行った。また、Euをドープしないフッ化カルシウムを用いた蛍光熱量検出器のデータを解析し、エネルギー分解能1.9%を達成した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、濃縮48Caの化学形態である塩化カルシウムから、フッ化カルシウム結晶を製造する技術を確立する。また、その結晶の、二重ベータ崩壊測定のための性能を評価することを目的とする。二重ベータ崩壊測定のためには、フッ化カルシウム結晶は透過率が高い必要がある。これは、フッ化カルシウム結晶からの蛍光を減少させずに検出するためである。また、この結晶は含有放射性不純物が少ない必要がある。そのために、1、低放射能化(塩化カルシウム水溶液の高純度化で、放射性不純物であるウラン・トリウムの低減が必要)、2、高透過率化(塩化カルシウムからの結晶化技術の開発で、塩素や軽金属の除去が必要)、を行う必要がある。本研究ではどちらもイオン交換樹脂を用いた泳動過程によって実現する。初年度である本年は、下記を行った。低放射能化:フッ化カルシウムの放射性不純物の高性能測定システムを構築した。これは、フッ化カルシウム内部の放射性不純物である、214Bi→214Po(半減期164μsec)、および、220Rn→216Po(半減期145msec)の連続崩壊を測定するためのシステムである。このシステムを用いて、これまで行ってきたフッ化カルシウム結晶の放射性不純物測定と同様に、フッ化カルシウム溶融品でも放射性不純物測定ができることを示した。これによって、結晶ではないフッ化カルシウムの放射性不純物測定感度を、2桁改善した。また、高純度フッ化カルシウムの製造のために、クリーンブースを構築した。クリーンブース内部にドラフトを設置することで、クリーン環境での泳動過程(塩素除去、および、ウラントリウム除去)のテストを行える環境を構築した。塩素除去方法の確立を先に行う予定であったが、実際には、高純度化のための装置構築等の進度が早くなった。総合的には、予定通り進展しているといえる。そのために、1、放射性不純物であるウラン・トリウムの低減(低放射能化)、2、塩化カルシウムから結晶化する技術の開発(高透過率化)、を行う必要がある。本研究ではイオン交換樹脂を用いた泳動過程によって実現する。本年度は下記を行った。低放射能化:異なるフッ化カルシウム原料から製造したフッ化カルシウム結晶の不純物測定を行った。また、これは、フッ化カルシウム結晶内部の放射性不純物である、214Bi→214Po(半減期164μsec)、および、220Rn→216Po(半減期145msec)の連続崩壊を測定することで行った。なお、来年度も継続してフッ化カルシウム原料選定を行う。

塩化カルシウムから結晶化する技術の開発:塩化カルシウムから結晶化する技術開発として、塩化カルシウム→塩素を分離→酢酸カルシウムとして回収、のテストが必要である。そのため、本年度は、泳動システムとイオン交換樹脂を用いて、塩化カルシウムから塩素の弁別を行った。結果、カルシウム溶液の流速を調整することで、吸着量は低いものの、イオン交換樹脂にカルシウムのみを吸着させることに成功した。また、イオン交換樹脂から確実にカルシウムを脱着させることに成功した。陰イオン交換樹脂を用いて塩素を吸着させる予定であったが、結果的には陽イオン交換樹脂でカルシウムを吸着させることとなった。生産効率は下がるが、不純物の低減効率は高いため、総合的には、予定通り進展しているといえる。本研究では、濃縮48Caの化学形態である塩化カルシウムから、フッ化カルシウムを製造する技術を開発する。また、二重ベータ崩壊測定にフッ化カルシウム結晶を用いる際の性能を評価することを目的とする。二重ベータ崩壊測定のためには、フッ化カルシウム結晶は透過率が高く、かつ含有放射性不純物が少ない必要がある。これは、放射性不純物が、二重ベータ崩壊測定のバックグラウンド起因となるのを避けるためである。ほか、蛍光熱量検出器として用いることができる必要がある。そのために、1、放射性不純物であるウラン・トリウムの低減、2、塩化カルシウムからフッ化カルシウムを製造する技術開発、3、フッ化カルシウム蛍光熱量検出器の信号読み出し開発、を行う必要がある。1、低放射能化:異なるフッ化カルシウム原料から製造したフッ化カルシウム結晶の不純物測定を行った。原料の放射性不純物はGe検出器を用いて、また、フッ化カルシウム結晶内部の放射性不純物は、214Bi→214Po→、および、220Rn→216Po→の連続崩壊を測定することで行った。結果として、選定されたフッ化カルシウム原料から、実際に二重ベータ崩壊測定用の高純度フッ化カルシウム結晶を製造できた。2、塩化カルシウムからフッ化カルシウムを製造する技術の開発:フッ化水素酸を用いて、塩化カルシウムからフッ化カルシウムへの合成を行った。この合成フッ化カルシウムを蛍光X線分析によって組成評価した。結果、塩素が0.2%弱混入していること以外は、フッ化カルシウム以外の元素が含まれず、予定通り合成ができていることを確認した。3、蛍光熱量検出器の信号読み出し開発:蛍光を吸収しない熱信号読み出しを実現するために、フッ化カルシウムへの熱センサー用銀等金属蒸着を行った。また、Euをドープしないフッ化カルシウムを用いた蛍光熱量検出器のデータを解析し、エネルギー分解能1.9%を達成した。年度前半は、主に、フッ化カルシウムの高純度化に関する開発を進める。年度後半は、カルシウムと軽金属の弁別を重点的に行う。生産量が予定より少ない分、泳動システムを大型化する必要ができた。段階的に大型化することで、カルシウム分離量を増やせるようにシステム開発を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
呼気中の揮発性脂肪酸の分析及び歯肉縁下細菌叢の検索による口臭症診断法の確立

歯周病原性細菌として注目を集めている黒色色素産生性グラム陰性桿菌(BOP)が、その代謝産物として脂肪酸を産生しているにもかかわらず、口臭との相関は得られていない。そこで以下の点を中心に検討した。1.歯肉縁下プラークの細菌学的検討6mm以上の歯周ポケットを有する患者を、海津らによる口臭判定基準に従って他覚的に口臭を認める群(官能評価値「2」以上、以下口臭群とする)と、口臭を認めない群(評価値「1」以下、以下非口臭群)に分け、それぞれの歯周ポケットから歯肉縁下プラークを採取してブルセラHK血液寒天培地に接種し、嫌気培養した。その結果、生菌数に占めるBOPの割合は非口臭群に比べ口臭群で高く、またBOP数も官能評価値の大きい患者ほど多い傾向にあった。しかし、まだ例数が少ないため、今後例数を増やしたうえで統計学的検討を加えたい。また、BOPの中でどの菌種が優位かを調べるため、各菌種に適した選択培地等を用いて分離、検索したいと思う。2.口臭症患者からの揮発性脂肪酸(VFA)の検出口臭群の患者からの口腔内気体試料を、SHINCARBONAを担体とするカラムを備えたFID検出器ガスクロマトグラフ(GC)に導入したが、各VFAの吸収スペクトルのピーク高が低いうえ、分離能が悪く、それぞれのピークが近接するたえ、分析に供せられる程度のクロマトグラムパターンが得られなかった。そこで、担体の粒度の異なるカラムを用いたり、昇温プログラムを変えたりして分析可能なクロマトグラムが得られるよう条件を模索している。その後、患者の口腔内気体ならびに歯肉溝浸出液等のサンプルをGCに導入し、VFAの同定を行なう予定である。また、VFA試薬を用いて作成した標準曲線から各VFA量を定量できるかどうかを検討したい。
脂質ナノ粒子を用いたアミロイドβ自己会合の制御による凝集機構の解明

アルツハイマー病アミロイドβタンパク質が脂質膜に結合し、凝集・毒性体形成を起こす過程において、初期会合体の形成はターニングポイントである。しかし、初期会合体の詳細な構造と凝集における機能は明らかでない。そこで、脂質ナノ粒子上にアミロイドβを隔離することで、凝集初期の自己会合状態を制御し、会合体を解析することを試みた。その結果、調製したナノ粒子の脂質二重層の直径によって結合したアミロイドβの構造および凝集能が変化することが明らかとなり、ナノ粒子上に凝集中間体を捕捉できる可能性が示された。申請者らは、これまでにアルツハイマー病アミロイドβタンパク質が脂質膜に結合し、凝集・毒性体形成を起こす過程を明らかにしてきた。しかし、凝集過程のターニングポイントとなる初期会合体の、詳細な構造と凝集における機能は明らかでない。そこで、申請者の開発している脂質ナノ粒子上にアミロイドβを隔離することで、凝集初期の自己会合状態を制御し、会合体を解析できると仮説を立てた。ナノ粒子上のアミロイドβの会合数、二次構造、線維形成能を計測し、この仮説を検証し、初期会合体の機能構造を明らかにする。2016年度は、アミロイドβと強く相互作用する脂質ナノ粒子を作成した。バッファーに懸濁した脂質ベシクル(リポソーム)に、両親媒性ペプチドを加えることで、自発的にディスク形状の脂質二重膜を持つナノ粒子が形成されることを確認した。この際、混合する脂質-ペプチド比を任意に調節することにより、連続的に粒径の異なるナノ粒子が形成される。さらに混合後、チオールであるメルカプトフェニル酢酸(MPAA)共存下でインキュベートすることで、粒子中のペプチドが分子間でネイティブケミカルライゲーション反応を起こして重合し、安定なナノ粒子が形成される。MPAAは透析によって除いた。本法によって、脂質二重膜のディスク径を15-30 nmの範囲で制御した粒子を形成できることを、アミロイドβとの結合が報告されている酸性リン脂質で確立した。このナノ粒子存在下でアミロイドβの線維形成を評価したところ、粒子サイズ依存的に線維形成速度が変化することを見出している。アミロイドβとの相互作用が報告されている酸性リン脂質を用いて、脂質ナノ粒子が形成できることを確認した。また、この粒子と両親媒性ペプチドのモル比を調節することで粒子サイズを制御できることを明らかにした。また、アミロイドβと脂質ナノ粒子の相互作用が、ナノ粒子のサイズに依存する可能性を示した。以上から、本研究課題は当初の研究計画通りに進展していると考えられる。2017年度は作成したナノ粒子存在下とアミロイドβの相互作用およびアミロイド線維形成への影響について詳細に評価した。ナノ粒子存在下でアミロイドβを緩衝液中でインキュベーションすると、チオフラビンT蛍光強度の増大が見られたことからアミロイド線維の形成が示唆された。透過型電子顕微鏡観察によって線維状の凝集体が形成されていることが確認された。ナノ粒子を構成する脂質としてDMPC/DMPG(1/1)混合膜を用いた場合、径の大きいナノ粒子ではアミロイドβの線維形成が促進されたのに対して、粒子径の小さい粒子ではアミロイド線維が形成されなかった。また、ナノ粒子に結合したアミロイドβの構造を調べるため、ナノ粒子形成に使用する両親媒性ペプチドASPP1を構成するアミノ酸をD体に置換したD-ASPP1を合成した。ASPP1ナノディスクとD-ASPP1ナノディスクを等量混合することで、ナノ粒子由来のCDシグナルがほぼ完全に消失し、共存するアミロイドβのシグナルを観測することが可能となった。その結果、粒子径の大きい粒子に結合したアミロイドβはβシート構造を取り、小さいナノ粒子存在下ではランダムコイル構造を取ることが明らかとなった。今後は、蛍光異方性測定を用いたアミロイドβと脂質ナノ粒子の結合測定、蛍光励起エネルギー移動を用いたアミロイドβ分子間会合の測定を行う。脂質ナノ粒子サイズが相互作用にどのように影響しているかを明らかにすることで、ナノ粒子上のアミロイドβ初期会合体の物理化学的性質を解明する。生物物理化学ペプチド固相合成器を購入予定であったが、研究室既設の合成器の混雑状況が緩和されていたため、本年度は購入を見送ることとした。
Bowl型反応場を用いる含ヘテロ原子不安定化学種の安定化

不安定な官能基を持つ化合物は、一般に高い反応性を持つので、その合成の研究は従来にない反応性の発現を可能にするのみならず、結合論における新たな知見をもたらすと考えられる。本研究では、そのような不安定化学種としてヘテロ原子を含む-X-Y=Z型化合物である-S-N=O、-O-N=Sを取り上げた。この不安定化学種を持つS-ニトロソチオール(-S-N=O)は、脂肪族では比較的安定に存在する例もあるが、芳香族では単離例が報告されていない。一方、O-チオニトロソアルコール(-O-N=S)は、これまで合成された例はない。そこで、我々が開発したbowl型反応場であるBmt基を立体保護基として用い、その合成について検討した。まず、Bmt骨格を有するチオールを亜硝酸t-ブチルと反応させることにより初めての安定な芳香族S-ニトロソチオールを合成することに成功した。また、そのX線結晶構造解析を行い、芳香族S-ニトロソチオールの分子構造を初めて明らかにした。さらに、その反応性についても検討した。次に、O-チオニトロソアルコールは、かさ高さが異なる2,6-Dipp_2C_6H_3基を用いてもその合成について検討し、Bmt基と比較検討した。それぞれ、フェノールへの変換は、対応するハロゲン体のリチオ化およびそれに続くトリメトキシボランとの反応、さらに過酸化水素による酸化により達成した。次に、ヒドロキシルアミンへの変換は、Bmt基の場合、種々のアミノ化剤との反応を検討したが、O-アミノ化は進行せず、C-アミノ化した化合物のみが得られた。そのうちの一つは、興味深い転位反応をした。2,6-Dipp_2C_6H_3基では、(2,4-dinitrophenoxy)amineを用い反応条件を検討することにより、対応するヒドロキシルアミンに変換することに成功した。目的とした初めてのO-チオニトロソアルコールは、このヒドロキシルアミンを二塩化硫黄と反応させることにより合成できたが、単離にはいたらなかった。有機化合物は官能基の組合せによって構成されているので、新しい官能基の創製は、新しい構造、反応性、物性などの期待される新しい種類の有機化合物の合成につながる。不安定な官能基を持つ化合物は、一般に高い反応性を持つので、その合成の研究は従来にない反応性の発現を可能にするのみならず、結合論における新たな知見をもたらす点で高い学術的意味を持つ。本研究では、そのような不安定化学種としてヘテロ原子を含む-X-Y=Z型化合物を取り上げた。本年度は、そのうちの一つである-S-N=Oについて検討した。このS-ニトロソチオールは、脂肪族では比較的安定に存在する例もあるが、芳香族では単離例が報告されていない。そこで、我々が開発したbowl型反応場である4-t-butyl-2,6-bis[(2,2"-6,6"-tetramethy-m-terphenyl-2'-yl)methyl]phenyl基(Bmt基)を立体保護基として用い、このbowl型構造により反応性の高い官能基が保護され分解が抑制できると考えた。まず、S-ニトロソチオールの前駆体として、Bmt骨格を有するチオールを対応するブロミドのリチオ化およびそれに続く硫黄との反応で合成した。

得られたチオールを亜硝酸t-ブチルと反応させることにより初めての安定な芳香族S-ニトロソチオールを合成することに成功した。また、そのX線結晶構造解析を行い、芳香族S-ニトロソチオールの分子構造を初めて明らかにした。これにより、C-S-N-O骨格はsyn配座をとり、また、脂肪族のものに比べC-S結合長が著しく短いことが示された。さらに、芳香族S-ニトロソチオールの反応性についても検討した。有機化合物は官能基の組合せによって構成されているので、新しい官能基の創製は、新しい構造、反応性、物性などの期待される新しい種類の有機化合物の合成につながる。不安定な官能基を持つ化合物は、一般に高い反応性を持つので、その合成の研究は従来にない反応性の発現を可能にするのみならず、結合論における新たな知見をもたらす点で高い学術的意味を持つ。本研究では、そのような不安定化学種としてヘテロ原子を含む-X-Y=Z型化合物を取り上げた。本年度は、そのうちの一つである-O-N=Sについて検討した。この不安定化学種を持つO-チオニトロソアルコールは、これまで合成された例はない。そこで、我々が開発したbowl型反応場である4-t-butyl-2,6-bis[(2,2"-6,6"-tetramethy-m-terphenyl-2'-yl)methyl]phenyl基(Bmt基)を立体保護基として用い、このbowl型構造により反応性の高い官能基が保護され分解が抑制できると考えた。まず、Bmt骨格を有するフェノールは、対応するブロミドのリチオ化およびそれに続くトリメトキシボランとの反応、さらに酸化により合成した。次に、O-チオニトロソアルコールの前駆体であるヒドロキシルアミンへの変換は、得られたフェノールをアミノ化することにより達成できると考えた。最初に、アミノ化剤として一般に知られているO-mesitylenesulfonylhydroxylamineを用いたが、ヒドロキシルアミンへの変換は達成できなかった。その後、種々のアミノ化剤との反応を検討し、最終的に(2,4-dinitrophenoxy)amineを用いることにより、対応するヒドロキシルアミンに変換することに成功した。目的としたO-チオニトロソアルコールは、このヒドロキシルアミンを二塩化硫黄と反応させることにより、合成できると考える。本年度も昨年に引き続きそのうちの一つである-O-N=Sについて検討した。そこで、我々が開発したbowl型反応場である4-t-butyl-2,6-bis[(2,2"-6,6"-tetramethy-m-terphenyl-2'-yl)methyl]
高性能RFHR・2D・PAGEによる一細胞一分子プロテオーム解析

プロテオミクスにおいて現在最もよく普及しているのはO'Farrellが考案した等電点2次元電気泳動法にもとづくIPG法である。しかし最近、このIPG法の深刻な弱点がプロテオミクスの蛋白分離の段階に困難を齎している。一つは塩基性蛋白質の分離が不十分であること、もう一つは蛋白スポットが人為的に分裂することである。こうした弱点が等電点法の本質そのものに由来するため、これを克服するには分離原理のことなる新しい方法が必要であるが、われわれが開発したRFHR 2D PAGEは等電点法を採用せず、等速電気泳動に基づくため、この要請にこたえることが出来る。本研究の目的はRFHR法の分離能をさらに向上させ、極微量の蛋白質の検出・同定を可能にすることと、改良されたRFHR法による大腸菌と真核生物のプロテオーム解析を推進することである。先ずRFHR法の分離能向上について1.水冷方式の装置を考案し、厳密な温度制御を可能にした。その結果、4°C、1次元500V、2次元300Vの泳動では分離能の大幅な向上が見られ、大腸菌全蛋白質に対してIPG法の2倍を超える568の蛋白遺伝子を同定した。これはCBB染色で検出できた700スポットの80%を超える高い同定率である。分画をさらにきめ細かくすれば、極微量の蛋白質の検出・同定を実現できる。2.0次元ゲルを廃止し、蛋白質を1次元ゲルに直接濃縮させるように0次元濃縮過程を改良した。これによって、今後装置の自動化に取り組むことが容易になった。次いで真核生物のプロテオミクスについて1.ラット肝プロテオミクスを進める上で、懸案である蛋白の可溶化を促進するため、2Mチオウレアの導入を試み、難溶性のより大きい蛋白質や膜結合性蛋白質の分離能を向上させた。2.第3年度からヒトcell lineのプロテオミクスへの取り組みを開始した。引き続き取り組んでいく。1.RFHR法とO'Farrell法の比較われわれが主張してきたように、O'Farrell法では蛋白質のスポットが人為的に分裂する。これはO'Farrell法にとって極めて深刻な弱点であるが、これまでにその原因と実態について、われわれを含む4つの研究グループによって解明が進められた。先ずBervenらと他の二つのグループはスポットの分裂の原因が等電点法の泳動中に蛋白質が複数のコンフォメーションに分かれ、それぞれが異なった等電点をもつことにあることを明らかにした。われわれはこのスポットの分裂の規模について、O'Farrell法で大腸菌のプロテオーム解析を進めるグループSWISS・2D・PAGEのデーターを統計学的に解析、推定した結果、ひとつの蛋白質が平均して10個から12個のスポットに分裂するはずであることを明らかにした。この分裂の規模はBervenらの実験結果とよく一致する。さらにRFHR法をO'Farrell法と比較した結果、RFHR法ではスポットの人為的分裂が全く起こらないことがわかった。この両法の比較はこの分裂がO'Farrell法の本質である等電点法そのものによって生み出されるartifactであることをつよく示唆している。2.水没型RFHR装置の考案冷却水中にゲルコンテナを水没させて効果的に温度制御できる「水没型RFHR装置」を考案した。

4°C下で蛋白分子の拡散を抑制した結果、よりシャープなスポットパターンがとれるようになり、スポットが密集する弱酸性領域の詳細な解析が可能になった。3.大腸菌全蛋白質のプロテオーム解析水没型で定常期の蛋白質を分析し、現在までに約700個のスポットを検出、そのうち516個の蛋白遺伝子を同定した。これはChurchらのO'Farrell法による同定数223個の2倍をはるかに超えている。現在、定常期の分析をほぼ終えて、対数期の蛋白質に取り組んでおり、当面の遺伝子同定の目標を700個に置いている。前年度に考案した水没型RFHR装置を使って、今年度もプロテオミクスに取り組んだ。1.至適温度の設定4°Cでの泳動を確立し、中性酸性領域の二次元ゲルパターンの検討を繰り返した。その結果比較的小さい蛋白質に対しては、十分な分離能を達成できたが、分子量10万ないしはそれ以上の蛋白質において、一次元方向にたなびく、あるいはtailingする傾向が見られた。これは室温で操作する標準法では見られなかった問題であるので、その原因をさしあたって一次元の温度に求め、温度上昇による拡散の増加との妥協点を見出そうとして、1020°Cの範囲で検討中である。2.0次元泳動の改善現行のpH5.5の0次元は塩基性蛋白質を想定して確立されたが、応用範囲が広くpI:4付近まで適用できることがわかっている。したがってほぼすべての蛋白質を収容できる方法になっているが、酸性蛋白質はサンプルゲルを挿入して一次元を開始したとき、一時的に負極に向かって泳動し、Uターンして陽極に向かって走る。この一定の混乱が分離能の低下を齎しても不思議ではない。そこで既に考案してあったpH10.3の0次元を用いるとともに一次元に挿入する直前にバッファー交換して、この混乱を解消した。3.プロテオミクスの取り組み引き続き大腸菌蛋白に取り組んだ。CBB染色で約700スポットを検出し、560個の遺伝子を同定した。同定率は80%で、IPG法と比較すると同定数は2.5倍、同定率は一桁大きい。今後全スポットの同定を目指していく。またヒト血液の血清と血球の全蛋白をも対象に実施し始めている。今年度は研究目的として、プロテオミクスの新たなツールRFHR2次元電気泳動法の更なる性能向上を掲げ、以下の3点を実施することにした。1.検出・同定能力の更なる向上を目指す試み特に中性酸性領域の分離能向上を最大の課題として取り組んだ。現行の0次元泳動の濃縮過程は負極方向であり、主として塩基性領域に向いている。これを中性酸性領域に適用するため、Cl^-をleading ionに、Argをtrailing ionに用い正極に向かう0次元を、pIが10以下の蛋白質を網羅的に収容できるように改良した。もう一つはより根本的な改良であるが、0次元泳動後0次元ゲルからサンプルゲルを作成して1次元ゲルの途中に挿入する方式に代えて、0次元のバッファーは用いるが、0次元ゲルを廃止して1次元ゲルに直接濃縮詠動させ、その後1次元のバッファーに代えて1次元泳動を行う方式を検討した。結果はスポットを鮮明にさせるのに顕著な効果があることを示した。三つ目としてゲルバッファーへのチオウレアの導入が蛋白可溶化に有効であることが明らかになった。今後は、チオウレアが泳動速度に与える影響を調査しなければならない。
語形成と超分節的要素のメカニズムに関する通言語的研究

平成30年度は前年度と同様に語形成における超分節的要素の保存を焦点に当て、複数の言語で研究を進めてきた。まず、東京方言の複合語のプロセスにおける韻律情報(すなわちアクセント)の保存、また左側の要素がアクセントを決める語を調べ、複合語アクセントと主要部の関係について理論分析や調査を実施してきた。アクセントが弁別的である言語の多くは、複合語を形成したときに、前部要素か後部要素のアクセントで複合語のアクセントを予測することができる。日本語東京方言の複合語は従来、アクセントが右側の後部要素によって決められると言われている。しかし、一連の研究によって左側の要素もアクセントを決めることがあるということが判明した。ではなぜ左側の要素がアクセントを決める力を持つかというと、左側の要素が語の内部構造にいては主要部であるからなのではないかと考えられる。しかし、主要部の定義はまだ議論する余地があるため、実例を収集し、複合語アクセントと主要部の関係を慎重に検証する必要がある。本研究は昨年度に右側要素主導型以外のデータを収集し、従来の理論で分析してみた。複合語アクセント規則を再考し、左側主要部の語のアクセント規則を一般化する試みもした。そして超分節的要素が弁別的である他の言語(いわゆる他の声調・アクセント言語)でも、台湾語のトーンとメロディーの関係を調べ、声調がどのようにメロディーで保存されるかを統計分析によって明らかにした。有標性制約が声調の保存において大いに関わることがわかった。当該年度に実施した研究調査により、超分節的要素が複合語やメロディーなど異なるコンテクストでどのように保存されるかを垣間見ることができた。本研究は平成30年度、予定通りに日本語東京方言のデータを整理し、更に左側主要部の複合語の考察を行い、韻律階層ではどのように実現されるかを従来の理論の枠組で解釈した。行った分析を学会などで発表し、多くの意見を得られた。台湾語の調査のほうでも台湾で楽譜などを入手し、声調とメロディーの関係について調べ、国際学会で発表することができた。語形成における超分節的要素の保存は様々な言語で起きる現象である。この研究課題は当初、日本語や台湾語など超分節的要素が弁別的である言語における韻律情報の保存を広く考察し、一般化する試みをしようとしたが、今年度はそれだけではなく、一つの言語の中でどのような保存現象が観察されるかについて記述・分析する予定である。主に東京方言の左側主要部の複合語アクセントに注目し、複合語アクセント規則の補完、そして理論的に考察することを目標にしている。また、調査においては辞書の資料だけでなく、母語話者のデータも収集する予定である。昨年度、語形成における超分節的要素の保存を焦点に当て、複数の言語で研究を進めてきた。特に複合や畳語のプロセスにおける韻律情報の保存、また保存が失敗したときにどのように話者によって評定されるかなどの許容度調査を実施してきた。主に複合、畳語、母語話者による不保存時の許容度評定にわけて研究を行った。複数の形態素が結合する際のアクセントを観察し、音韻現象によって特定の要素のみを参照する偏好性がある。例えば日本語東京方言では日本語東京方言のデータを整理し、和語と漢語の分析を実施した。その結果、日本語東京方言でも一部の語では右側要素ではなく左側要素を保存する例があることが判明した。畳語のプロセスでは、台湾中国語の愛称畳語を分析することによって、以下のことがわかった:まず、同じ言語の中でも、畳語のうちの左右どちらの超分節的要素を保存するかは方言レベルで違いが見られる。このことは上記の日本語でも観察される。東京方言では多くの語で右側要素のアクセントが保存されるが、長崎方言などの方言では左側要素のアクセントが保存されるのが一般的である。つまり、複合などのプロセスにおいて片方の情報しか保存しない場合、どちらの要素の韻律情報を参照するかは方言によって異なる。そして上述の複合と畳語は話者の産出データを中心に探求されているのに対し、超分節的要素が話者のレキシコンにあるものと不一致したときにどのように評定されるかの調査も実施した。具体的には台湾語の連続変調が間違って適用された場合の許容度や、日本語東京方言における専門家アクセントと語形成(複合語/単純語)の許容度を調査した。前者の調査では台湾語の声調間で不保存時の許容度の差が観察され、この差を有標性階層で説明できることを示した。そして後者では専門家アクセントが複合語構造では単純語より許容度が低い上、音節構造による差も観察された。本年度は語形成における超分節的要素の通言語的考察の中で特に超分節的要素の保存をテーマとして日本語(和語・漢語)の複合における語形成や、台湾語・中国語の畳語形成のデータ収集を行った。また、今年度は既存の言語データだけではなく、分節的要素が話者のレキシコンにあるものと不一致したときにどのように評定されるかの許容度実験も実施したため、おおむね順調にに進展していると言える。

アクセントが弁別的である言語の多くは、複合語を形成したときに、前部要素か後部要素のアクセントで複合語のアクセントを予測することができる。日本語東京方言の複合語は従来、アクセントが右側の後部要素によって決められると言われている。しかし、一連の研究によって左側の要素もアクセントを決めることがあるということが判明した。ではなぜ左側の要素がアクセントを決める力を持つかというと、左側の要素が語の内部構造にいては主要部であるからなのではないかと考えられる。しかし、主要部の定義はまだ議論する余地があるため、実例を収集し、複合語アクセントと主要部の関係を慎重に検証する必要がある。本研究は昨年度に右側要素主導型以外のデータを収集し、従来の理論で分析してみた。複合語アクセント規則を再考し、左側主要部の語のアクセント規則を一般化する試みもした。そして超分節的要素が弁別的である他の言語(いわゆる他の声調・アクセント言語)でも、台湾語のトーンとメロディーの関係を調べ、声調がどのようにメロディーで保存されるかを統計分析によって明らかにした。有標性制約が声調の保存において大いに関わることがわかった。当該年度に実施した研究調査により、超分節的要素が複合語やメロディーなど異なるコンテクストでどのように保存されるかを垣間見ることができた。本研究は平成30年度、予定通りに日本語東京方言のデータを整理し、更に左側主要部の複合語の考察を行い、韻律階層ではどのように実現されるかを従来の理論の枠組で解釈した。行った分析を学会などで発表し、多くの意見を得られた。台湾語の調査のほうでも台湾で楽譜などを入手し、声調とメロディーの関係について調べ、国際学会で発表することができた。昨年度は、同じ形態構造の中でも音韻構造によって超分節的要素の情報がレキシコンと不一致したときに許容度が異なることがわかった。このような結果を踏まえて、今後は音韻階層における異なるレベルの保存に注目し、形態構造および統語構造との関連を考察する予定である。具体的には、複合や畳語、そして他の言語階層における超分節的要素の保存を首尾一貫の法則(例:有標性、形態構造の主要部など)で説明することを目指している。また、昨年度の調査により方言レベルでも保存現象が異なることが判明したため、今年度は他の言語も含めて超分節的要素保存における普遍性と特殊性を考察する。本研究期間終了までには期待通りの研究成果を達成できるものと見込まれる語形成における超分節的要素の保存は様々な言語で起きる現象である。この研究課題は当初、日本語や台湾語など超分節的要素が弁別的である言語における韻律情報の保存を広く考察し、一般化する試みをしようとしたが、今年度はそれだけではなく、一つの言語の中でどのような保存現象が観察されるかについて記述・分析する予定である。主に東京方言の左側主要部の複合語アクセントに注目し、複合語アクセント規則の補完、そして理論的に考察することを目標にしている。また、調査においては辞書の資料だけでなく、母語話者のデータも収集する予定である。
嗅覚一次中枢・嗅球のニューロン構成を形態的に再考する

嗅覚一次中枢主嗅球局所回路ニューロンで近年特に注目されているドーパミン(DA)-GABAニューロンの解析を前年度に引き続き進めた。DA-GABAニューロンの形態的特徴を、次の3つの方法で解析した。第1は鼻孔閉鎖による機能的入力除去後の免疫組織化学。残存した少数のチロシン水酸化酵素(TH)免疫陽性のDA-GABAニューロンの解析。第2はTH-GFPマウスの固定嗅球スライスでの蛍光色素細胞内注入によるニューロン標識。第3は脳固定装置を用いたビオチン化デキストランの電気泳動的注入による嗅球糸球体近傍ニューロン標識。これらの方法で得られた所見を総合することで、嗅球DA-GABAニューロン群の形態学的多様性が明確になり、少なくとも3つのタイプが認識できた。第1は大型で樹状突起を1数個の糸球体内にタフト様に分岐し、軸索を側方に伸ばし、更に糸球体内へと伸ばしている、以前の逆行性トレーサー実験で抑制性糸球体近傍連合ニューロンと名付けたニューロンに対応する。特に、アンキリンGを軸索初節部のマーカーとして軸索を同定し、連続切片で軸索及び樹状突起を追跡する方法で、このニューロン群の形態が明らかにできた。このニューロン群では2、3本の軸索を有するものもかなり高い頻度で見られたことも特徴的である。第2は小型の傍糸球体細胞である。重要なことは軸索を有する細胞と無軸索の傍糸球体細胞、両者の存在が確認できた。但し、形態的には軸索と考えられてもアンキリンG陽性の軸索初節部を有する軸索は極めてまれであった。第3は側方に長い樹状突起を伸ばし、複数の糸球体を貫いている、以前我々がtransglomerular cellsと名付けたニューロンである。しかし、この3タイプに当てはまらないニューロンも多く、どれかのサブタイプと考えてよいのか別のニューロンタイプとすべきか検討している。DA-GABAニューロンの形態解析が、異なる4つの方法で順調に進み、それぞれが相補的で想像以上の多様なニューロン群の存在が明らかになりつつある。DA-GABAニューロンについては現在の方法で所見が得られつつあるが、それぞれの方法で得られた所見を比較検討すると、定性的には一致するが、細胞の大きさ等、定量的な面でやや不一致がみられる。これまでの検討ではそれぞれの方法で用いる標本で収縮率等が異なっているように考えられるので、適正な補正の可能性を検討したい。嗅覚一次中枢主嗅球局所回路ニューロンと考えられるニューロン群のうち本年度は特に、ドーパミン(DA)-GABAニューロンを中心に解析を進めた。DA-GABAニューロンの形態的特徴を明らかにするため、主に以下の3つの方法を用いた、第1は鼻孔閉鎖により機能的入力除去を行い、チロシン水酸化酵素(TH)免疫組織染色で残存した比較的少数のDA-GABAニューロンを解析。第2はカテコールアミンニューロンに蛍光色素GFPを発現している遺伝子改変マウスの固定した嗅球スライスを用いて蛍光色素lucifer yellowを細胞内注入し個々のニューロンを標識。第3は野生型及び遺伝子改変マウスで、脳固定装置を用いて生体でビオチン化デキストランを嗅球糸球体層に注入し近傍のニューロン群を標識し、化学的性質を同定してその形態を解析。これらの異なる方法で検討した結果、嗅球DA-GABAニューロンは形態学的にはこれまで考えられていたよりはるかに多様であることが示唆された。更に、アンキリンGを軸索初節部のマーカーとして軸索を同定し、連続切片で軸索及び樹状突起を追跡した。樹状突起を糸球体内にタフト様に分岐し、軸索を側方に伸ばし、更に軸索終末が糸球体内に分布している大型のDA-GABAニューロンの形態が初めて明らかになりつつある。また、小型のいわゆる傍糸球体細胞と考えられるDA-GABAニューロン、側方に長い樹状突起を伸ばしているDA-GABAニューロン等もあり、DA-GABAニューロンをいくつかサブグループに分類するにはより多くの観察が必要である。また、ビオチン化デキストラン標識標本ではセクレタゴーギン、カルレチニン等の他の化学的マーカーでの染色も行い検討している。DA-GABAニューロンの形態解析が、異なる3つの方法で順調に進み、想像以上の多様なニューロン群の存在が明らかになりつつある。それぞれの方法で標識されやすいニューロン群はある程度異なっているが、3つすべての方法で明らかに同一タイプと考えられるニューロン群も確認されている。従って、これらの3つの方法は相補的で、本解析には有効であると考えられる。

第1は大型で樹状突起を1数個の糸球体内にタフト様に分岐し、軸索を側方に伸ばし、更に糸球体内へと伸ばしている、以前の逆行性トレーサー実験で抑制性糸球体近傍連合ニューロンと名付けたニューロンに対応する。特に、アンキリンGを軸索初節部のマーカーとして軸索を同定し、連続切片で軸索及び樹状突起を追跡する方法で、このニューロン群の形態が明らかにできた。このニューロン群では2、3本の軸索を有するものもかなり高い頻度で見られたことも特徴的である。第2は小型の傍糸球体細胞である。重要なことは軸索を有する細胞と無軸索の傍糸球体細胞、両者の存在が確認できた。但し、形態的には軸索と考えられてもアンキリンG陽性の軸索初節部を有する軸索は極めてまれであった。第3は側方に長い樹状突起を伸ばし、複数の糸球体を貫いている、以前我々がtransglomerular cellsと名付けたニューロンである。しかし、この3タイプに当てはまらないニューロンも多く、どれかのサブタイプと考えてよいのか別のニューロンタイプとすべきか検討している。DA-GABAニューロンの形態解析が、異なる4つの方法で順調に進み、それぞれが相補的で想像以上の多様なニューロン群の存在が明らかになりつつある。DA-GABAニューロンについては現在の方法で所見が得られつつあるが、他の方法に比較してまだ所見が少し不足しているので、それらの固定スライスでの蛍光色素標識標本を追加する。また、標本がかなりそろってきたので解析、特に、画像解析装置による3次元構造解析に力を入れる。他のニューロン群についてもビオチン化デキストラン標識を中心に標本作成・解析を進める。DA-GABAニューロンについては現在の方法で所見が得られつつあるが、それぞれの方法で得られた所見を比較検討すると、定性的には一致するが、細胞の大きさ等、定量的な面でやや不一致がみられる。これまでの検討ではそれぞれの方法で用いる標本で収縮率等が異なっているように考えられるので、適正な補正の可能性を検討したい。予定していた学会発表がWeb発表で出張の必要がなくなったため旅費を使用しなかった。また、適当な実験補助者が見つからなかったため謝金を使用しなかった。今年度は地元開催の学会に参加が多く、旅費の使用が抑えられたことと、適当な人材が不足しており、人件費、謝金を使用しなかった。今年度は旅費、人件費を使用予定である。
選択的オートファジーにおける新規アダプター分子の検索

選択的オートファジーでは、隔離膜が標的を認識する際、隔離膜上に存在するLC3は、標的に存在するp62などのアダプター因子群とLIR(LC3 interacting region)を介して結合する。LIRを持ちLC3と相互作用する因子はOptineurinや、NDP52、NBR1など多数同定されている。本研究では、新たなLIR因子を同定することを目的とし、LC3結合因子の検索を行った。野生型LC3と結合するが、LIRへの結合に必要であるK51をアラニンに置換した変異体LC3には結合しない因子を比較定量プロテオーム解析にて複数同定した。我々は、そのうちのひとつをLIRP8と名付け更なる解析を行った。LLOMe処理によって誘導されるリソファジーではLIRP8が損傷膜に特異的にリクルートされることが確認された。LIRP8には4カ所のLIR様配列が存在する。末端欠損変異体とアミノ酸置換変異体の解析より、N末端側のLIRのみがLC3への結合に重要であることが示された。また、この結合は精製蛋白質を用いても確認されることから、直接の相互作用であることが示された。さらに、LIR欠損変異体でも損傷膜にリクルートされ、ATG5欠損細胞、FIP200欠損細胞においても損傷膜への局在が確認されることから、オートファジー隔離膜によって標的が認識される前にこの分子は損傷膜に局在することが考えられる。この他に、ゲル濾過解析により400kDa程度のホモオリゴマーを形成していること、また、質量分析によりリン酸化修飾を受けることを見いだしている。LIRP8欠損細胞ではA群連鎖球菌の増殖が亢進していることからLIRP8が細胞質内に侵入したゼノファジーに何らかの役割を持っている可能性が示された。さらに、p62やNBR1と相互作用し、これらアダプター因子の安定性に関与していることが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内に侵入した病原体に対する選択的オートファジーには標的を識別する機構があり、その破綻は感染症を始め様々な疾患発症と深く結びついている。この認識機構は、標的物のユビキチンとオートファゴソーム上のATG因子:LC3に結合するアダプター分子よって説明されている。アダプター分子群は自身がもつLIR (LC3 Interacting Region: W/Y/FxxL/I/V consensus)を介してLC3と結合し、標的ユビキチンとLC3を橋渡しする因子群として現在までにp62など複数同定されている。近年、損傷ミトコンドリアを選択的に分解するオートファジー(マイトファジー)に関与しているアダプター因子は、これまで言われていたp62ではなくNDP-52とOPTNの2種類が相補的に機能していることが報告され、選択的オートファジーは複数のアダプターによって制御されていることが明らかになった。本研究ではLC3AのK49をアラニンに置換したLIR高親和性変異体LC3A-K49Aと、K51をアラニンに置換したLIR低親和性変異体LC3A-K51Aの二つの変異体を用い、高親和性変異体により強く結合するLC3結合因子群を、比較定量プロテオミクスによって同定した。この解析によって、p62よりも高いスコアにて、高親和性LC3変異体に強く結合し、且つ、ユビキチンに結合する性質を持つ新規LIR因子群(LIRP1-10)見出した。そのうちLIRP8が、セファロースビーズを用いたゼノファジーにおいて、LC3と共に隔離膜に特異的にリクルートされることを明らかにした。また、LLOMe添加により誘導されるリソファジー、もしくは鉄のキレート剤であるdesferoxamine添加により誘導されるマイトファジーにおいてもLC3と共に隔離膜に特異的にリクルートされることを明らかにした。現在までに、10種類のLIRP因子群の遺伝子をクローニングし、それらを各細胞に発現させ、種々の選択的オートファゴソーム形成において、隔離膜にリクルートされるかどうか調べたところ、LIRP8がセファロースビーズを用いたゼノファジーまたは、LLOMe添加により誘導されるリソファジー、もしくは鉄のキレート剤であるdesferoxamine添加により誘導されるマイトファジーにおいてLC3と共に隔離膜に特異的にリクルートされることを明らかにした。LIRP8には4箇所のLIR配列が存在しておりどのLIR配列が機能しているか調べた。N末端側に位置する1つのLIR配列を欠損させるとLIRP8はLC3と結合しなくなることから、4箇所のうち1箇所のLIR配列がLC3との結合に重要な役割を担っていることが示された。また、このLIR欠損変異体の局在を調べたところ、この変異体は各種選択的オートファゴソームへの局在が失われることを明らかにした。この結果は、LIRによるLC3との結合がLIRP8の選択的オートファゴソームでの機能に必須であることを示している。さらに、ATG5欠損細胞にてLIRP8の挙動について調べたところ、ATG5欠損細胞においても野生型細胞と同様に選択的オートファゴソームに局在が見られたことから、LIRP8はLC3-II形成過程よりも上流にて作用している可能性が示された。また、他のアダプター因子であるp62と共局在することを明らかにした。選択的オート