hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ショウジョウバエを用いた染色体機能ドメインの形成過程の解析

(3)最近、米国のHenikoffらによってin vivoで特定のDNA結合性因子が結合している領域を決定する"damID"という方法を用いて、DREFやMi2がin vivoで結合しているサイトを含むDNA断片(500bp前後)を濃縮精製する。得られたDNA断片をプローブに用いて、ショウジョウバエcDNA(あるいはゲノム)マイクロアレイを解析し、DREFおよびMi2が結合している領域のプロファイリングを行うための準備を整えた。1.昨年度に樹立したDREFとMi-2を組織特異的にノックダウンできる遺伝子導入ハエに加えて、染色体境界領域の形成や維持に関与することが示唆されている染色体境界領域結合因子(boundary element associated-factor ; BEAF)を組織特異的に発現するためのUAS-BEAF系統ならびに組織特異的にノックダウンするためのUAS-BEAF RNAi系統の遺伝子導入ハエを樹立した。2.UAS-BEAF系統を用いて複眼でBEAFを強制発現すると軽いrough eye表現型を示したが、UAS-BEAF RNAi系統を用いて複眼原基や翅原基でのBEAFの発現をノックダウンしても複眼や翅の形態形成に異常はなかった。しかしながら、発生の初期に全身でBEAFの発現をノックダウンすると発生は著しく遅れた上に1齢幼虫で致死となった。このことは、BEAFが形態形成時よりむしろ発生の初期に必要であることを意味する。3.熱ショックによりその転写が一過性に誘導されるhsp70遺伝子領域を1つの染色体機能ドメインのモデルにして、熱ショックの前後にDREF,Mi-2,BEAFの挙動を調べた。形成される染色体機能ドメイン興味深いことに、hsp70遺伝子領域に結合する量は変化しないのに対し、DREFとMi-2はともに、熱ショック後数十分以内にhsp70遺伝子領域にリクルートされることがわかった。今後、熱ショック後のDREFとMi-2の結合量を時間経過を追って詳しく調べる予定である。また、DREFまたはMi-2をノックダウンした培養細胞を用いて、hsp70遺伝子の熱に応答した発現が影響を受けるかどうかについても調べる準備が整った。4.damID"という方法を用いて濃縮精製した、DREFやMi2がin vivoで結合しているDNA断片(500bp前後)をプローブに用いて、ショウジョウバエcDNA(あるいはゲノム)マイクロアレイを解析し、DREFおよびMi2が結合している領域のプロファイリングを行った。現在、実験をくり返し行うことで、DREFとMi-2の結合しているゲノム領域を特定する作業にとりかかっている。
アミメキリンにおける代謝プロファイルテストによる繁殖への取組

本研究では,動物園で飼育しているキリンを対象とし,血液・栄養学的データから栄養代謝を評価する代謝プロファイリングを実施し,飼育管理の適正化および繁殖成績の向上を目指すことを目的とした。個体の栄養状態評価のため,血液データ,体格および給餌している飼料を評価した。血液は,京都市動物園で飼育しているキリン4頭から採取し,データを比較した。体格は,ボディコンディションスコアリング(BCS)により評価した。これらの値を比較することで,個体の正確な栄養状態の評価が可能となった。それらを基礎に,個体毎の給餌内容の見直しを行った。アミメキリンは樹葉を主食とするブラウザー型草食獣に分類される。しかし,これまで樹葉給餌量の推定は困難であり,栄養分析を行った例はほとんど認められなかった。今回,特にこの点に着目し,樹葉の餌としての有用性を確立するため,樹葉重量推定法の確立と樹葉の栄養分析を行った。対象樹種は,日本でキリンに一般的に給餌されている4種(ニセアカシア,シラカシ,トウネズミモチおよびヤマモモ)を対象とした。樹葉重量推定法では,アロメトリー解析により,枝直径から樹葉重量を推定可能となった。これにより,一般的な給餌時の状態である枝に付いた状態で,樹葉重量が推定可能となった。樹葉の栄養分析結果から,樹種毎の栄養特性とその季節変化が明らかとなった。特に,繊維成分や蛋白質組成が牧草と大きく異なることが明らかになった点は,樹葉を利用する上で極めて重要であると言える。これらの結果から,キリンの消化器特性に応じた,適切な樹葉給餌による栄養管理が可能となった。今後,これらの情報を日本の動物園で共有することで,日本全体のキリンの飼育管理の適正化および繁殖率の向上につながることが期待できる。
1950年代アメリカの文学と文化におけるポストモダニズムの形成過程

本研究では、第2次世界大戦から1950年代末に至る、アメリカの文学と文化にみられるポストモダニズムの生成および変成のプロセスを、カルチュラル・スタディーズの手法を用いて考察し、下記のような成果をあげることができた。1.「失われた世代」の作家たちの1950年代ヘミングウェイとフォークナーは、メディア及び政府期間の積極的関与により、冷戦期に世界的名声を獲得する。彼らの文学作品と冷戦期の文化の政治に関する考察は、2003年にケント州立大学出版より刊行される論文集Hemigway and Cubaに掲載されるほか、2002年にイタリアで開催された国際ヘミングウェイ学会での口頭発表、『フォークナー』誌の掲載論文において公開した。2.諜報文化とポストモダニズム第二次大戦中のOSSから戦後のCIAに引き継がれる諜報文化は、ポストモダニズムの知の編成全体に大きな影響を与えたものであることが、合衆国における資料調査によって明らかになった。この成果は論文「ショック両方時代の文学と文化」として公表した。3.精神病理学とポストモダンな主体論文「クレイジオロジー」において精神病理学が、冷戦初期の知の枠組みとして機能していることを明らかにした。この論文では精神病理学者で、ファシストと青少年犯罪者の精神分析に関わったロバート・リンドナーの残した文学作品に焦点を当てたが、この視座から1950年代の主要な文学作品についての考察を今後順次発表する。4.冷戦とアメリカン・ナラティヴ研究期間中に起こった「9月11日」事件とその後のアメリカの軍事行動は、アメリカ研究に新たな課題をもたらした。冷戦初期における国民的記憶の再編については、同期の騎兵隊映画と戦争映画の分析を行い、この成果は2003年5月のアメリカ学会で発表する。しかしへミングウェイ、フォークナーのノーベル賞受賞に際しての国務省の積極的関与にみられるように、1950年代のアメリカ文学の制度的形成は、こうした戦時下の文化政策のほとんど直接的な産物とさえ言える。50年代アメリカ文学史と冷戦時代の政治の関係性を再考するうえで、これは避けて通れない課題であるという確信を得た。上記の研究と平行して、合衆国議会図書館において、戦時中および戦後初期の犯罪心理学書の網羅的な分析に着手した。こうしたテクストは、サリンジャーに代表される告白体の非行少年小説とのあいだに、見過ごすことできない間テクスト的関係を持つものといえる。両者のあいだで循環する、プライヴァシーの言説化の問題に関しては、次年度中に研究論文として成果を公表する予定である。本年度は、2002年4月刊行の拙著『モダンの黄昏-帝国主義文化の改体とポストモダニズムの生成』(研究社)のための最終的な作業を行った。これは2000年12月に本学に提出した博士論文を母胎とするものだが、第7章と「あとがき」を新たに書き下ろし、終章を全面改訂した。ドキュメンタリー写真家ドロシア・ラングを論じた第7章では、この写真家に関して論じられる機会の少ない1950年代の作品群にも注目し、そこで1930年代的な民衆表象が、ポストモダニズム的な主体の分散に接合していくプロセスを明らかにした。いっぽう終章では2001年9月11日のテロ事件に言及しつつポストモダニズム論の今日的な視野の在り方について論じた。同書の改訂を経た終章と、2002年3月末刊行予定の論文集『アメリカ文学とテクノロジー』(筑波アメリカ文学会)に寄稿した「ショック療法時代の文学と文化」により、本研究の基幹となる議論を発表し終えたことになる。

以上と並行し、昨年度導入した機器を用いつつ、1940年代フィルム・ノワール、1950年代のSFホラー映画および聖書に取材したスペクタクル映画について基礎研究を行い、その成果を本学大学院博士課程の「映像文化論」において提示し、参加者から有益な反応を得ることができた。これにより、本研究を最終的に刊行する際の映画研究に関わる部分の全体像がほぼ完成したことになる。本研究では、第2次世界大戦から1950年代末に至る、アメリカの文学と文化にみられるポストモダニズムの生成および変成のプロセスを、カルチユラル・スタディーズの手法を用いて考察し、下記のような成果をあげることができた。1.「失われた世代」の作家たちの1950年代ヘミングウェイとフォークナーは、メディア及び政府機関の積極的関与により、冷戦期に世界的名声を獲得する。彼らの文学作品と冷戦期の文化の政治に関する考察は、2003年にケント州立大学出版より刊行される論文集Hemingway and Cubaに掲載されるほか、2002年にイタリアで開催された国際ヘミングウェイ学会での口頭発表、『フォークナー』誌の掲載論文において公開した。2.諜報文化とポストモダニズム第二次大戦中のOSSから戦後のCIAに引き継がれる諜報文化は、ポストモダニズムの知の編成全体に大きな影響を与えたものであることが、合衆国における資料調査によって明らかになった。この成果は論文「ショック療法時代の文学と文化」として公表した。3.精神病理学とポストモダンな主体論文「クレイジオロジー」において精神病理学が、冷戦初期の知の枠組みとして機能していることを明らかにした。この論文では精神病理学者で、ファシストと青少年犯罪者の精神分析に関わったロバート・リンドナーの残した文学作品に焦点を当てたが、この視座から1950年代の主要な文学作品についての考察を今後順次発表する。4.冷戦とアメリカン・ナラティヴ研究期間中に起こった「9月11日」事件とその後のアメリカの軍事行動は、アメリカ研究に新たな課題をもたらした。冷戦初期における国民的記憶の再編については、同期の騎兵隊映画と戦争映画の分析を行い、この成果は2003年5月のアメリカ学会で発表する。
低酸素誘導因子 (HIF)-1αの新規経路に着目した進行胃がん治療戦略の開発

本邦での胃がんの予後は,進行例でいまだに不良であり,新規治療法の開発が急務である.低酸素誘導因子(HIF)-1αがNF-κBサブユニットであるRELを発現させる遺伝子経路が発がんとがんの進行に重要であることが示唆されている.また,肺がん細胞でたばこ抽出物への暴露がHIF-1αを発現させることが報告されている.本研究では, HIF-1αREL経路の胃がんの発生や進行における役割と,喫煙者に生じる胃がんの特徴を同経路の活性化の有無を含め解析する.本研究によりHP除菌後胃がん時代における有効な進行胃がんの治療戦略の開発を目指す.本邦での胃がんの予後は,進行例でいまだに不良であり,新規治療法の開発が急務である.低酸素誘導因子(HIF)-1αがNF-κBサブユニットであるRELを発現させる遺伝子経路が発がんとがんの進行に重要であることが示唆されている.また,肺がん細胞でたばこ抽出物への暴露がHIF-1αを発現させることが報告されている.本研究では, HIF-1αREL経路の胃がんの発生や進行における役割と,喫煙者に生じる胃がんの特徴を同経路の活性化の有無を含め解析する.本研究によりHP除菌後胃がん時代における有効な進行胃がんの治療戦略の開発を目指す.
モーションメディアを活用したコンピュータ支援学習システム

本研究の目的は,ロボットの導入により,動作や身体性をインタラクディブなコミュニケーションのための情報媒体として活用することで,学習意欲を持続するコンピュータ支援学習システムを構築することである平成22年度においては,前年度に研究協力者((室蘭工業大学・大鎌広准教授)の元で製作した簡易型上半身ロボットを,Cプログラム学習に関するe-ラーニングシステムに導入した.さらにwebカメラによる学習者の顔認識を行って,その情報を元に強化学習を利用してロボットを動作させるシステムを構築した.その結果の一部を電気・情報関係学会北海道支部連合大会で発表した一方,研究代表者の研究室では,同ロボットを英単語発音に関するe-ラーニングシステムに導入し,制御系設計論におけるフィードバック誤差学習のアーキテクチャの上で,自己決定感やメタ認知などの認知工学を利用したロボット動作設計のモデルを構築した.また本モデルの有効性を検証するために,心電生理信号を用いた,人の集中状態の計測のための準備を行った.結果の一部は平成23年9月に開催予定の第59回工学教育研究講演会で発表予定である本研究の目的は,ロボットの導入により,動作や身体性をインタラクディブなコミュニケーションのための情報媒体として活用することで,学習意欲を持続するコンピュータ支援学習システムを構築することである.平成20年度においては,上記目的を達成するための基本的インフラストラクチャを整備した.すなわち,まず,ロボティクスや認知工学に関する最新状況に関する文献調査を行った.次に,関連国際シンポジウムに参加し, e-ラーニングとロボティクスに関する知見・情報を得るとともに,連携研究者(広島市立大学・岩城教授)とモーション・メディアの活用法に関する情報交換を行った.同時にロボットの直感的操作について連携研究者(室蘭工業大学・大鎌准教授)と情報交換を行った.さらに市販ヒューマノイド型ロボットを導入し,ゲーム用インタフェースを用いて基本的な操作を行わせるためのハードウエア,通信システムを構築し,およびプログラミングを行った.その上で本システムを用いて,単純なヒューマン・ロボット・インタラクションである「ロボット支援によるフィットネス訓練システム」を試作した.これはwiiバランスボードとパーソナルヒューマノイドロボットnuvoを接続し,自分の動作を模擬したロボット動作を参考に,人が飽きずにバランスをうまく保つ訓練を行うためのシステムである.これらの結果により,研究目的を達成するための基本的実験環境に関する準備が整った.本研究の目的は,ロボットの導入により,動作や身体性をインタラクディブなコミュニケーションのための情報媒体として活用することで,学習意欲を持続するコンピュータ支援学習システムを構築することである.平成20年度に導入したロボットを用いた基本的インフラストラクチャ(ロボットの遠隔操作のため野通信システム,インタフェース)を構築した.一方,利用する市販のロボットは何れも,本研究の目的を達成するためには動作の柔軟性・自由度が不足しているか,または複雑過ぎて適切なリアルタイム制御が困難であるという問題が明らかになった.そこで,平成21年度においては,研究力者(室蘭工業大学・大鎌広准教授)の元で新たに動作自由度の高い簡易型ロボットを自作した.室蘭工業大学において,本ロボットをe-ラーニングシステムに導入し,学習効果を検討する研究を開始した.北見工業大学では本ロボットを英単語発音評定システムに導入したシステムを構築した.一方で,これらのシステムをヒューマン・ロボット・インタラクションの立場で総合的に解析するためには,人間の判断・動作を定量的にモデル化することも重要である.このため,人の行動に関するモデル化の研究を開始し,例として追従運転時のドライバ動作モデルを構築した.以上の研究成果の一部を電子情報通信学会総合大会,計測自動制御学会北海道支部等で口頭発表した.本研究の目的は,ロボットの導入により,動作や身体性をインタラクディブなコミュニケーションのための情報媒体として活用することで,学習意欲を持続するコンピュータ支援学習システムを構築することである平成22年度においては,前年度に研究協力者((室蘭工業大学・大鎌広准教授)の元で製作した簡易型上半身ロボットを,Cプログラム学習に関するe-ラーニングシステムに導入した.さらにwebカメラによる学習者の顔認識を行って,その情報を元に強化学習を利用してロボットを動作させるシステムを構築した.その結果の一部を電気・情報関係学会北海道支部連合大会で発表した一方,研究代表者の研究室では,同ロボットを英単語発音に関するe-ラーニングシステムに導入し,制御系設計論におけるフィードバック誤差学習のアーキテクチャの上で,自己決定感やメタ認知などの認知工学を利用したロボット動作設計のモデルを構築した.また本モデルの有効性を検証するために,心電生理信号を用いた,人の集中状態の計測のための準備を行った.結果の一部は平成23年9月に開催予定の第59回工学教育研究講演会で発表予定である
環境ストレス応答におけるポストゴルジオルガネラのダイナミクスと生理的意義の解明

トランスゴルジ網(TGN)には、ゴルジ体のトランス槽側に存在するGA-TGN (Golgi-associated TGN)とゴルジ体とは独立して存在するGI-TGN (Golgi-released independent TGN)の2種類が存在する。本年度は、うどんこ病菌応答におけるGI-TGNのダイナミクスを観察した。その結果、うどんこ病菌に対する抵抗応答時において、GI-TGNの数が増加することを発見した。抗菌物質の分泌のために分泌経路が活性化されことに伴い、GI-TGNもその動態を大きく変化させると考えている。また、当研究室で開発された超解像ライブイメージン顕微鏡(SCLIM: super-resolution confocal live imaging microscopy)を用いてトランスゴルジ網(TGN)の観察を行った結果、TGNに局在するタンパク質は一様に存在しているのではなく、ドメイン構造を有していることが示唆された。次に塩ストレス応答におけるオルガネラダイナミクスの観察を行った。その結果、高塩ストレス下ではTGNおよび単膜系オルガネラが凝集体を形成することを見出した。また、TGN機能が損なわれたsyp4変異体ではNHX6の細胞内局在が異常になることから、syp4変異体が高塩ストレスに弱くなる原因の一つとしてNHX6が正しく局在できないために細胞内の塩濃度を調整できないことが考えられた。ストレス環境下でのポストゴルジオルガネラのダイナミクスをライブイメージングにより明らかにするための観察システムの構築を継続して行った。高速撮影が可能なニポウディスク方式の倒立共焦点レーザー顕微境に多点画像取得機能と自動フォーカス機能を搭載したシステムを構築したが、根などの厚みのあるサンプルでの長時間イメージンについてはまだ良い結果が得られておらず現在改良中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。膜交通は、タンパク質などを細胞内の正しい場所へと輸送するために必須の機構であり、細胞の多様な機能を発現するうえでも重要な役割を果たしている。本研究では、環境ストレスに対するポストゴルジオルガネラのダイナミクスを、ライブイメージングにより徹底的に明らかにする。また、外部環境刺激の「受容」や刺激に対する「応答」と膜交通の接点で機能する因子を、膜交通関連変異体の外部環境刺激への応答を詳細に調べることにより探索する。これにより、ポストゴルジ膜交通の環境刺激応答における役割を明らかにすることを目指す。本年度は、ストレス応答におけるオルガネラダイナミクスの観察を行った。その結果、高塩ストレス下ではTGNが多くの小胞を形成していることが示唆された。うどん粉病菌に対しても、syp4変異体では分泌小胞の挙動が異常になっていることも見いだしている。これらの結果から、TGNがストレス応答における重要なオルガネラであると考えている。また、ストレス環境下でのポストゴルジオルガネラのダイナミクスをライブイメージングにより明らかにするための観察システムの構築もおこなった。高速撮影が可能なニポウディスク方式の倒立共焦点レーザー顕微境に多点画像取得機能と自動フォーカス機能を搭載したシステムを構築した。しかしながら、根などの厚みのあるサンプルでの長時間イメージンについてはまだ良い結果が得られておらず現在改良中である。

高塩ストレス化でTGNが小胞化するという新規の発見は、塩ストレス応答における膜交通の役割を考えていくなかで非常に重要な発見であった。また、積み荷タンパク質の候補としてNHX6を同定したことは当初の予定よりも早く研究が進んだ成果である。今後は、環境ストレス応答前と応答後のオルガネラの挙動についてSCLIMを用いて観察することで微細なオルガネラ動態の解析を目指す。また、長時間ライブイメージングの観察システムを構築することで、どのようにオルガネラが変化していくかについて解析を行う。また、TGNが関与する塩ストレス応答の実行因子としてNHX6がどのように機能しているかについて詳細に解析を行う。TGNが担う環境ストレス下での葉緑体機能の発現維持機構の解明に向けて、ストレス条件下で生育させた際にsyp4変異体の葉の黄化・白化の表現形が抑圧される変異体いついて、遺伝子マッピングもしくは次世代シーケンサーにより原因遺伝子の同定を目指す。
カーボンナノチューブ1本の熱伝導率計測

カーボンナノチューブ(CNT)をデバイスへ応用するには電気的性質に加えて熱物性の把握が欠かせない.特に,正確な熱物性データを取得するには直径など性質が異なった集合体から一本のCNTを取り出して計測する必要がある.今年度は,フラーレンピーポッドなどバンドル状態で供給される単層カーボンナノチューブ(SWNT)から1本を取り出してT字一体型ナノセンサによって熱伝導率を計測するためのMEMS技術の開発に取り組んだ.成功した手順は以下の通りである.1)超音波分散させたSWNT分散液を酸化膜付きシリコンウエハ上に滴下,2)高解像度SEMで1本だけになったチューブの位置を把握,3)電子線レジストをスピンコートした上で電子線描画装置を用いてT字一体型ナノセンサのパターンを直接描画,4)プラチナを蒸着してリフトオフ法でパターニング,5)BHFおよびCF_4プラズマでSi酸化膜とSiを等方的エッチング.この工程中においてSWNTの位置とセンサの位置を合わせることで,センサとSWNTがともに基板から浮いた状態、すなわち熱計測の必要条件を実現することができた.ただし,リフトオフの工程でSWNTによってセンサが傷ついてしまう問題が発生しており,今のところ熱伝導率計測の完了までには至っていない.これはリフトオフ等の条件の改善で解決できるものと考えている.また,平行して行った理論研究において,SWNTに存在する格子欠陥が熱の整流作用を生み出すことを予見し,非平衡分子動力学法によって確認した.さらに,この熱整流作用の基本的物理機構を1次元格子モデルで明らかにすることができた.カーボンナノチューブ(CNT)をデバイスへ応用するには,電気的性質に加えて熱物性の把握が欠かせない.特に,正確な熱物性データを取得するには集合体から一本のCNTを取り出して計測する必要があるがそれは非常に困難な実験である.しかも, CNTの熱物性は長さや直径など多くのパラメーターに依存するためできるだけ多くの信頼できるデータの収集が望ましい.本研究では,理論解析とも比較できるように十分な高分解能TEM観察を行った各種のCNTを対象として, T字一体型ナノセンサという独自の手法を用いてそのCNT1本1本の計測を実施することとしている.本年度は, GSIクレオスから提供された直径100nm程度のCVD法によるナノチューブを測定対象とした.この試料はカップスタックという特殊なタイプであり,原子構造を学内共同利用のHRTEMを用いて詳細に調べたところ,カップが積層した形状である結晶層の周囲をアモルファスカーボンが付着していることがわかったので,大気中500度での熱処理を行ってアモルファス層を除去し,直径190nmで内径140nm,長さ10ミクロン程度の結晶層のみの繊維を準備した.これを当方製作のナノセンサに取り付けて熱伝導率を計測したところ約40W/mK程度であることがわかった.これは理論的に予測できる値の200倍以上であり,熱が弾道的に伝導している可能性を意味している.このメカニズムを解明するために非平衡分子動力学計算を行ったところ,カップスタック特有の構造が一次元調和振動子に類似の挙動を示すために,このような弾道的な熱伝導を生み出していることがわかった.カーボンナノチューブ(CNT)をデバイスへ応用するには電気的性質に加えて熱物性の把握が欠かせない.特に,正確な熱物性データを取得するには直径など性質が異なった集合体から一本のCNTを取り出して計測する必要がある.今年度は,フラーレンピーポッドなどバンドル状態で供給される単層カーボンナノチューブ(SWNT)から1本を取り出してT字一体型ナノセンサによって熱伝導率を計測するためのMEMS技術の開発に取り組んだ.成功した手順は以下の通りである.1)超音波分散させたSWNT分散液を酸化膜付きシリコンウエハ上に滴下,2)高解像度SEMで1本だけになったチューブの位置を把握,3)電子線レジストをスピンコートした上で電子線描画装置を用いてT字一体型ナノセンサのパターンを直接描画,4)プラチナを蒸着してリフトオフ法でパターニング,5)BHFおよびCF_4プラズマでSi酸化膜とSiを等方的エッチング.この工程中においてSWNTの位置とセンサの位置を合わせることで,センサとSWNTがともに基板から浮いた状態、すなわち熱計測の必要条件を実現することができた.ただし,リフトオフの工程でSWNTによってセンサが傷ついてしまう問題が発生しており,今のところ熱伝導率計測の完了までには至っていない.これはリフトオフ等の条件の改善で解決できるものと考えている.また,平行して行った理論研究において,SWNTに存在する格子欠陥が熱の整流作用を生み出すことを予見し,非平衡分子動力学法によって確認した.さらに,この熱整流作用の基本的物理機構を1次元格子モデルで明らかにすることができた.
生理指標をもちいた電子メディア情報の感性科学的評価

この研究では、電子メディアから供給される音響を対象に、人間に感性反応をもたらす周波数成分の構造について、それがどのようなものであるかを生理学的・心理学的・音響物理学的にあきらかにし、これによって、感性の生理学的評価手法と定量化手法とを開発し、感性と生理学的指標との対応について新たな知見を得ることを目的としている。まず、フィルターのカットオフ周波数の設定を変更できるシステムを構築し、カットオフ周波数を26キロヘルツおよび22キロヘルツというふたつの条件を設定した。そしてそれぞれの音響を、聴取中の被験者の脳波計測および心理学的評価実験を行った。その結果、どちらのカットオフ周波数においても、高周波成分をカットしない音の方が脳波α波ポテンシャルが有意に増大することが見出された。また心理学的評価実験により、高周波をカットしない音の方が、より耳当たりよく、快適に知覚されることが見出された。次に、可聴域上限をこえる高周波成分を豊富に含む音源について、そのミクロな時間帯域におけるゆらぎ構造を排除した人工性の高い音響とを比較呈示し、聴取中の被験者の脳波計測および心理学的評価実験を行った。その結果、ゆらぎ構造を含む音響と含まない音響とでは、ゆらぎ構造を含む音響を聴取中の被験者の脳波α波ポテンシャルが有意に増大することが示された。ただしそのふたつの音響の違いは被験者に検知されなかった。さらに、自然性の高い高周波成分を豊富に含む音響を呈示したときに、被験者の脳波α波ポテンシャルがミクロな時間領域において一時的に抑制される現象を見出した。この研究では、人工的な情報環境のなかで重要な位置をしめる電子メディアから供給される視聴覚感性情報を対象に、人間に感性反応をもたらす周波数成分の構造がどのようなものであるかを生理学的・心理学的にあきらかにすることを通じて、感性の生理学的計測と定量化手法を開発し、感性と生理的指標との対応について新たな知見をえることを目的としている。今年度はおもに下記の成果がえられた。(1)感性効果をもつ高周波成分のもつ高周波成分の構造の検討すでに申請者らは、22kHz以上の高周波による感性効果を見いだしている。しかし、この効果をもたらす周波数成分の構造についてはまだ実証的な知見を得るに至っていない。そこで、呈示する高周波帯域の上限・下限を任意に設定できるシステムを構築し、高周波成分を豊富に含む音源を録音、編集して音響試料を複数編集した。これらをもちいた予備的実験により、少なくとも30kHzに達する帯域の高周波成分の効果を示唆する結果をえた。(2)ミクロな時間領域における脳波の挙動分析手法の開発これまで開発してきた脳波を指標とする生理学的感性評価システムを高度化し、最大エントロピー法を応用して、ミクロな時間領域の脳波の挙動を高い信頼性で解析しうるシステムを開発した。これによって、高周波を豊富に含む音を提示したときには、約7秒間にわたって脳波α波ポテンシャルが低下することが統計的に有意に見いだされた。(3)視覚情報の精細度の生理学的・心理学的評価メディアから供給される画像の精細度が人間におよぼす影響を生理学的・心理学的に評価するために、3種類の精細度をもたせた静止画および動画をもちいた評価実験をおこない、映像の精細度が高いほど脳波α波ポテンシャルが高まる傾向が見いだされた。平成10年度は、まず、フィルターのカットオフ周波数の設定を変更し、カットオフ周波数を26キロヘルツおよび22キロヘルツというふたつの条件を設定した。

その結果、どちらのカットオフ周波数においても、高周波成分をカットしない音の方が脳波α波ポテンシャルが有意に増大することが見出された。また心理学的評価実験により、高周波をカットしない音の方が、より耳当たりよく、快適に知覚されることが見出された。次に、可聴域上限をこえる高周波成分を豊富に含む音源について、そのミクロな時間帯域におけるゆらぎ構造を排除した人工性の高い音響とを比較呈示し、聴取中の被験者の脳波計測および心理学的評価実験を行った。その結果、ゆらぎ構造を含む音響と含まない音響とでは、ゆらぎ構造を含む音響を聴取中の被験者の脳波α波ポテンシャルが有意に増大することが示された。ただしそのふたつの音響の違いは被験者に検知されなかった。さらに、高速標本化1ビット方式の音響と、マルチビットのハイザンプリング方式による音響との比較のための予備的な実験を行った。その結果、音質としては1ビット方式の方が高い評価をえた。
Er:YAGレーザー堆積法を用いたTooth Wearの修復と進行抑制技術の開発

アンチエイジングとQOLの向上に寄与するために、未だ治療法や抑制・予防法が確立されていない第3の歯科疾患であるTooth wearに対して、新しく開発したエナメル質修復技術であるEr:YAG-PLD法が有効かどうかを調べることが本研究の目的である。そのために、本研究ではEr:YAG-PLD法で歯質上に作製した堆積膜のエナメル質欠損部分の修復効果の確認、Tooth wearから歯質を守る抑制効果の付与技術の確立、歯質上に堆積した膜の人工エナメル質としての長期口腔内安定性の評価を行う。
一次求心性ニューロンの電気生理学的特性と化学受容性:一次求心路の機能構築との関連

1.ウシ蛙後根神経節細胞はテトロドトキシンで消失する活動電位を持つAs細胞と、消失しない活動電位を持つAr細胞とC細胞に分類される。それぞれの細胞の神経線維の伝導速度はAs細胞で16-50m/s、Ar細胞で4-25m/s、C細胞で0.2-0.8m/sであった。後根神経節細胞体の電気生理学的特性と化学受容性の関係を整理した。a)Ar細胞とC細胞の半数以上がアセチルコリンに感受性を示したがAs細胞は反応しなかった。b)セロトニンにはC細胞が良く反応し、80%で過分極、50%で経過の速い脱分極、10%で遅い脱分極が見られた。Ar細胞では過分極は起こらず、約半数で小さな遅い脱分極、8%で経過の速い脱分極が見られた。c)GABAにはどの細胞型も反応したが、As細胞が最も顕著な反応を示した。d)P物質とATPに対してはAs細胞とC細胞だけが感受性を示し、その結果遅い脱分極を発生した。2.家兎の節状神経節C細胞において、膜透過性のc-AMPアナログは低濃度(10-100nM)で過分極を起こし後過分極を増強したが、高濃度(10μM以上)では脱分極を起こし後過分極を抑制した。ForskolinやCaイオノフォアなどを用いて検討した結果、c-AMPは細胞内のカルシウム緩衝機構に作用しカルシウム依存性のカリウム・チャネルの透過性をモジュレートするものと思われる。3.一次求心路形成の素過程を研究するために、E-20のラットの後根神経節を分離・培養した。培養約1週間後の後根神経節細胞の成長錐に接して別途単離した海馬細胞を置いた。培養した後根神経節細胞の細胞体に接触させたガラス電極を通してパルス電流を与えて電気的に刺激すると、海馬細胞から内向き電流がホールセルパッチクランプ法で記録された。内向き電流は膜コンダクタンスの増大を伴い、+10mV付近に逆転電位を持つことが分かった。以上より、培養したラット後根神経節細胞の活動に伴って成長錐から何等かの生理活性物質おそらく神経伝達物質が放出されたと考えることが出来る。
インターフェロン誘導性タンパク質DAXXが担うB細胞アポトーシス機構の解明

I型インターフェロンが生体内で果たす作用のひとつとしてプロB細胞への細胞死誘導があり、B細胞発生の恒常性維持に寄与している。その過程にはインターフェロンによって誘導される核タンパク質DAXXが必須であると報告されたが細胞死促進機序の詳細は不明であった。本研究では転写因子STAT3のはたらきに依存して増殖するプロB細胞株を用いた解析により、DAXXによるSTAT3機能の抑制が細胞死誘導と関連することを含め新たな知見を得た。さまざまな細胞を抗ウイルス状態に導く作用や免疫系B細胞に対してはアポトーシス誘導作用を有するサイトカイン, I型インターフェロン(IFN)のシグナル伝達機構の理解は免疫疾患に対するあらたな治療法開発や,臨床で行われているIFN療法をさらに効果的にするために有用である. IFNによるB細胞アポトーシスの機序にはIFN受容体に会合するチロシンキナーゼTyk2と, Tyk2の下流で誘導されるタンパク質Daxxが関与すると明らかにされているがその機序の詳細は不明である.本年度は,細胞の増殖や生存維持に重要な転写因子STAT3の活性に対するDaxxの影響に着目して解析を行い,研究の進展が得られた.培養細胞を用いて構築したモデル細胞系での解析から, DaxxはSTAT3と細胞内で会合していること,細胞内のDaxx量を減少させると転写標的遺伝子プロモーターへのSTAT3の結合が増強される結果が得られ, DaxxはSTAT3が標的DNAに結合することを妨げる役割を持つことが判明した.加えて, DaxxはSTAT3に対する抑制機能とは独立に,細胞死抑制タンパクBc1-2の発現を抑制する結果も得られ, DaxxはSTAT3依存的及び非依存的な少なくとも二つの機序により細胞の増殖・生存塗抑制することが示唆された.また, Tyk2が関与するIFNシグナル伝達の新たな制御機構の発見を目指しスクリーニングにより既に同定していたTyK2新規結合タンパクの候補分子の解析においても研究が進展した.特にTyk2との結合が哺乳細胞内でも確認されたタンパク(Tyk2-BP)について,この発現を細胞内で抑制した結果, IFNシグナルの伝達が抑制されたことから, Tyk2-BPは新たなTyk2制御タンパク質であることが初めて示唆された.I型インターフェロン(IFN)は細胞死関連タンパク質DAXXのはたらきを介してリンパ球の増殖抑制・細胞死を誘導し、B細胞レパトアを調節すると考えられているが、分子機構の詳細が不明であるため本研究で解明することを目的とした。今年度はDAXX遺伝子発現を司るキナーゼとして報告されているTYK2チロシンキナーゼの機能制御に着目し解析を進めた。酵母two-hybrid法によって単離されたTYK2新規結合タンパクのひとつJun activation domain-binding protein 1(JAB1)は現在までIFNシグナルへの関与は知られていない。本研究においてsiRNAによるJAB1発現抑制に伴いIFNシグナル伝達分子TYK2,STAT1・3の活性化やその標的遺伝子発現が抑制された。またJAB1発現抑制によって、IFN受容体を構成するIFNAR1サブユニットの細胞内総量が減少した。siRNAによるTYK2発現抑制によりIFNAR1タンパク量が減少するという既知の結果も再現されJAB1減少による効果と一致した。JAB1はイソペプチダーゼ酵素活性をもつが、活性を担う領域に存在する151番目のアスパラギン酸に点変異を導入し活性を失わせた分子を過剰発現させても野生型と同様にIFNAR1安定化能を示した。以上よりTYK2新規結合タンパク質JAB1はその酵素活性とは独立にIFNAR1安定化に関与し、IFNシグナル伝達に寄与することが新たに示唆された。またIFNによるDAXX発現誘導経路について、マウス由来細胞株と各種経路阻害薬を用いた解析からJNK経路の部分的関与を示す結果が得られた。一方、マウスの系と異なりヒト由来細胞株を用いた解析ではIFNによるDAXX誘導が観察されなかった。よってDAXXの、特に遺伝子発現についてはマウスとヒトとでIFNの寄与が異なることが判明した。
肝微小環境において炎症性発がんを制御するantagomirの標的創薬と前臨床試験

慢性肝炎から肝細胞がん(肝がん)に至る微小環境において、マイクロRNAに対して制御効果を発揮する核酸分子(antagomir)の標的創薬を目的とした。B型慢性肝炎モデルで同定された8個のマイクロRNAについて、経時的肝組織における発現解析、形質転換作用の検討、宿主遺伝子の発現調節作用、がん化に関わる分子病態おける評価を実施した。これより、本研究のマイクロRNAが肝がんを制御するantagomir創薬における標的となる可能性が示された。独自に開発した慢性肝炎モデル(Nakamoto et al.:Cancer Res.64:3326,2004)の発がん過程で検出された8個のマイクロRNA分子(miR-21,24,31,101,126,146,148,194)について、がん化の微小環境における役割をin vitro及びin vivoの実験系を組み合わせて機能的に解析した。(1)マイクロRNAの発現解析:Real-time定量的RT-PCR法を用いて、慢性肝炎モデルにおける経時的な発現レベルの変化を定量すると、肝炎発症15ヵ月目から著明な発現の亢進を認めて18ヵ月目に肝がんを発症した。これより、発がん過程においてマイクロRNAの変化ががん化に先導しており、促進的に作用している可能性が示唆された。(2)形質転換作用の検討:マイクロRNAの機能的解析を行う目的で、培養細胞株(ヒト肝由来;HepG2,TTNT16)のマイクロRNA発現量を検討したところ、肝組織に比較して著明な高発現をみた。これは当初に計画したマイクロRNAの導入法による機能解析が困難であることを示唆した。そこで、インヒビターを用いることによる抑制実験を施行したところ、マイクロRNAの発現は抑制され、細胞増殖が低下した。これより、マイクロRNAが機能的に細胞増殖を促進していた可能性が示された。(3)宿主遺伝子の発現調節作用の検討:(2)で用いた細胞株において宿主遺伝子の定量系を確立した。独自に開発した慢性肝炎モデル(Nakamoto et al. : Cancer Res.64 : 3326, 2004)の発がん過程で検出された8個のマイクロRNA分子(miR-21,24,31,101,126,146,148,194)について、がん化の微小環境における役割をin vitro及びin vivoの実験系を組み合わせて機能的に解析した。(1)ヱイクロRNAの発現解析:Real-time定量的RT-PCR法を用いて、慢性肝炎モデルにおける経時的な発現レベルの変化を定量すると、肝炎発症15ヵ月目から著明な発現の亢進を認めて18ヵ月目に肝がんを発症した。そこで、インヒビターを用いることによる抑制実験を施行したところ、マイクロRNAの発現は抑制され、コロニー形成能が低下し細胞増殖の抑制効果がみられた。(3)宿主遺伝子の発現調節作用の検討:(1)(2)で顕著な変動を示した2つのマイクロRNA分子について、インヒビターを用いて培養細胞株での宿主遺伝子の発現レベルを定量した。その結果、2つの宿主遺伝子(GSTA2,APOA4)に対する制御作用が明らかになった。マイクロRNAはこれらの宿主遺伝子の発現レベルを調節することによって、がん化に作用したことが示唆された。(1)マイクロRNAの発現解析: Real-time定量的RT-PCR法を用いて、慢性肝炎モデルにおける経時的な発現レベルの変化を定量すると、肝炎発症15ヵ月目から著明な発現の亢進を認めて18ヵ月目に肝がんを発症した。(2)形質転換作用の検討:マイクロRNAの機能的解析を行う目的で、インヒビターを用いることによる抑制実験を施行したところ、マイクロRNAの発現は抑制され、コロニー形成能が低下し細胞増殖の抑制効果がみられた。(3)宿主遺伝子の発現調節作用の検討: (1)(2)で顕著な変動を示した2つのマイクロRNA分子について、インヒビターを用いて培養細胞株での宿主遺伝子の発現レベルを定量した。その結果、2つの宿主遺伝子(GSTA2, APOA4)に対する制御作用が明らかになった。(4)がん化に関わる分子病態おける評価:慢性肝炎モデルのがん化過程における網羅的発現遺伝子研究との比較解析を行ったところ、119個の遺伝子(群)からなるがん化特異的な分子病態とマイクロRNAとの新たな関連性が示唆され、さらなる検討の必要性が示された。

本研究においては、慢性肝炎モデルの発がん過程で検出されたマイクロRNA分子の役割について、機能的に検討する実験を計画していた。マイクロRNAに関する発現解析、形質転換作用、宿主遺伝子の調節作用について成果が得られており、予定通りの進展と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、今後は肝臓の炎症性発がんの微小環境を念頭において、炎症刺激下におけるマイクロRNAの作用について詳細な機能的解析を進めるとともに、生体内でマイクロRNAに対する抑制作用を発揮する核酸分子(antagomir)の合成を検討する。
骨髄由来多能性幹細胞を用いた難治性肝疾患の再生医療開発に関する研究

骨髄幹細胞が肝細胞増殖因子(HGF>を初めとする各種因子の存在下で肝細胞に分化しうることが報告されるようになり、骨髄の多能性幹細胞から目的の組織・臓器を再生できることは不可逆性の障害に対して究極の治療法とえられ、イヌの骨髄細胞から肝細胞の分化誘導法について検討を行った。最初に、HGFの刺激を細胞内に伝えるレセプターであるイヌc-Metの遺伝子クローニングを行った。すなわち、健康なイヌの肝臓組織よりRNAを抽出し、ヒト、ラット、マウスのc-Metの塩基配列を基にprimer設計し、24種のprimerを用いてPCRを行い、これらのPCR産物のアガロース電気泳動を行って目的サイズのPCR産物をpCR2.1-TOPO plasmid vectorに組み込み、このプラスミドを大腸菌内で増殖させた後、蛍光標識してシークエンスを行った。その結果、イヌc-Metは4419塩基でシグナルペプチドとえられる24のアミノ酸領域と1358のアミノ酸コード領域を含む1383のアミノ酸で構成されていた。次いで、(2)骨髄細胞から肝細胞の分化誘導について検討を行うために、イヌ骨髄細胞に分化誘導因子と考えられているHGF(遺伝子組み替えネコHGF)を添加培養すると共に、ヒトの肝疾患の治療に用いられている「ヒト胎盤抽出液(ラエンネック)」を添加培養して肝細胞への分化誘導について検討した。すなわち、骨髄穿刺により得られた骨髄細胞を比重遠心法により単核球に分離しHGM培地に牛胎児血清を10%に添加したものを基本培地として培養を行った。コントロール群(基本培地にEGF添加)、胎盤抽出物添加群(基本培地にEGFとラエンネック添加)、HGF添加群(基本培地にEGFとリコンビナント・ネコHGF添加)の3群について、7日、14日、21日、27日後に肝細胞のマーカーと考えられるアルブミンmRNAならびにアルブミン、サイトケラチン(CK)18、サイトケラチン(CK)8について免疫染色を行いその発現を観察した。胎盤抽出物添加群では培養開始14日目に形態的に肝細胞様に変化し、アルブミンmRNAを発現し、アルブミンおよびCK18の蛋白は陽性を示した。HGF添加群では培養28日目に胎盤抽出物添加群と同様な変化を示しアルブミンmRNAの発現、アルブミンおよびCK18蛋白陽性を示した。しかし、c-Metシグナルを選択的に抑制する合成ペプチドを添加培養した場合に細胞の増殖・分化は困難であった。これらの結果より、イヌ骨髄細胞はHGF存在下で肝細胞に分化可能であることが明らかになり、さらに、ヒト胎盤抽出物にはHGFと共に作用して肝細胞への分化誘導を促進させる因子が含まれることが示唆された。(特許申請中)骨髄幹細胞が肝細胞増殖因子(HGF>を初めとする各種因子の存在下で肝細胞に分化しうることが報告されるようになり、骨髄の多能性幹細胞から目的の組織・臓器を再生できることは不可逆性の障害に対して究極の治療法とえられ、イヌの骨髄細胞から肝細胞の分化誘導法について検討を行った。(特許申請中)

平成15年度は、骨髄幹細胞が肝臓細胞へ分化しうる能力を有することを検証するために、(1)イヌのHGFレセプタ-(c-Met)の遺伝子クローニング、(2)骨髄細胞の純化、(3)骨髄細胞から肝臓細胞への培養について検討を行った。本年度では、イヌのHGFレセプタ-(c-Met)の遺伝子クローニングを行い、全長の塩基配列解析を終了した。その結果、イヌのc-Met cDNAのコード領域が4419塩基、1383個のアミノ酸で構成され、アミノ酸レベルでヒトやマウスと90%前後類似していることが明らかとなった。さらに、犬の主要臓器におけるc-Met遺伝子の発現を検討したところ、肝臓と同様に骨髄細胞においてもc-Met遺伝子の発現が認められることが明らかとなり、骨髄細胞へHGFが作用する可能性を示唆した(Neo et al.,J Vet Med sci,投稿中)。そこで現在、セルソーティングシステムを用いて、抗CD34抗体やSP細胞および骨髄細胞に特異的な表面抗原に対する抗体を用いて、骨髄細胞から造血幹細胞を多数含有する細胞集団を試み、条件設定等を行い検討している。さらに、HGF存在下で骨髄幹細胞を短期培養し、得られた細胞が肝臓細胞であるかどうかをアルブミンやα-フェトプロテインなどのm-RNA発現により検討しているが、これらも現在解析中である。本研究では、まず現在まで不明であったイヌのc-Met cDNA完全長のクローニングを行うと共に、組織分布の検討を行った。その結果、イヌc-Met cDNAは4419bpで、Open reading frameは24のシグナルペプチドと1358のタンパク翻訳領域を含んでいることが明らかになった。また、イヌのc-Met遺伝子は、ヒト(89%)、マウス(85%)、ラット(87%)、ニワトリ(68%)、およびカエル(80%)と高い相同性があることも明らかになった。さらにイヌc-Met遺伝子は、臨床上健康なイヌでは、肝臓以外にも末梢血単核球、骨髄、腎臓、肺といった24種の組織において発現が認められ、これら組織の発生や再生に関与している可能性が考えられた。また、再生肝におけるc-Met遺伝子の発現量の検討したところ、肝部分切除72時間後のc-Metの発現量は、切除前と比較して、約2倍に上昇していることが明らかとなり、肝再生時にHGF/c-Metシグナル伝達が重要な役割を果たしているものと考えられた。次に骨髄細胞から肝臓細胞への分化が可能であるか検討するため、イヌ骨髄細胞に肝細胞増殖因子(HGF)を添加して培養を行い、肝臓細胞への分化誘導を試みた。その結果、培養28日目には肝臓細胞様の形態の細胞へと分化したことが認められたばかりでなく、アルブミン遺伝子の発現も認められた。さらに、これら細胞を肝臓細胞に特異的なタンパクであるアルブミンおよびCK18にて免疫染色を行なったところ陽性細胞が検出され、肝臓細胞の性質をもつ細胞へ分化したことが証明された。さらに、骨髄細胞から肝細胞の分化誘導において、HGF/c-Metシグナル伝達系が関与しているかどうか検討するために、c-Metの自己リン酸化を特異的に抑制するc-Met改変ペプチドを用いた検討を行なったところ、肝細胞の分化誘導は著しく阻害された。本研究の結果から、イヌの骨髄細胞から肝臓細胞の特徴を有する細胞を分化誘導することが可能であることが明らかとなり、その分化にはHGF/c-Met伝達経路が重要な役割を果たしていることが示唆された。
変形性関節症の治療のための凍結保存関節軟骨細胞の増殖と移植

変形性関節症における欠損した関節軟骨に軟骨細胞を移植し修復するために、凍結した関節軟骨細胞にっいて基礎的実験を行った。実験1.実験動物の軟骨細胞による検討幼若雌豚より採取した軟骨細胞を分離し、-196°Cで凍結保存した。保存期間による生存率、proteoglican (PG)合成能、collagen合成能にっいて、さらに各種成長因子を添加して検討した。その結果、(1)凍結軟骨細胞の生存率は、凍結保存期間2週までは90%、12週までは80%であった。(2)凍結軟骨細胞のPG及びcollagen合成能は無凍結軟骨細胞に比し、2,4,8,12週の凍結期間において有意差を認めなかった。(3)各種成長因子(TGF-β、IGF-1、b FGF)によるPG, collagenの合成能の促進は12週の長期凍結軟骨細胞においても維持されていた。実験2.人関節軟骨細胞による検討患者の了解を得て、大腿骨頸部骨折手術時に採取した大腿骨頭の軟骨を採取し上記の方法で経時的に凍結軟骨細胞の細胞活性、基質合成能、各種成長因子に対する反応を検討した。その結果、(1)凍結軟骨細胞の生存率は、凍結保存期間2週で82.7%、4週で80.7%、8週で78.2%であった。(2)凍結軟骨細胞のPG及びcollagen合成能は無凍結軟骨細胞に比し、28週までの凍結期間においては有意差を認めなかった。(3)各種成長因子(TGF-β、IGF-1、b FGF)によるPG, collagenの合成能の促進は8週の凍結期間の軟骨細胞でも維持された。以上、実験1,2より、凍結保存期間812週においても軟骨細胞は80%が生存し、PG, collagen合成は保たれており、成長因子にも反応することから凍結軟骨細胞は移植として使用可能と判定した。今後、軟骨欠損のあるOAモデルを作成し、欠損部に細胞移植を行う予定である。凍結保存した軟骨細胞の成長因子に対する反応への影響について研究した。軟骨細胞を凍結期間を変えて保存し、解凍後の軟骨細胞に各種成長因子を添加しproteoglycan(PG)とcollagenの合成能を測定した。生後2ヶ月の幼若雌豚の四肢より軟骨細胞を採取し、collagenase Iを含有した10%FBS、modiffied-Ham'sF12で培養し、軟骨細胞を分離した。軟骨細胞に10%DMSOを加え4°Cで30分、-20°Cで2時間、-80°Cで24時間保存した後、-196°Cで凍結保存した。保存期間は0日、2週、4週、8週とし、冷凍せずに無添加で培養したものをコントロールとした。それぞれの軟骨細胞を解凍後に各種成長因子(TGF-β、bFGF、IGF-I、IL-1α)をそれぞれ添加した。PGの合成の指標として^<35>S-sulfateを、collagenの合性能の指標として^3H-prolinを加え培養し液体scintilation counterにて^<35>S、^3H-prolinのup takeを測定した。(1)無添加群において解凍後のPGの合成能およびcollagenの合性能は低下した。(2)無添加群において凍結期間による各合成能の差は認めなかった。(3)bFGFおよびIGF-I添加群は無添加群と比べすべての凍結保存期間においてPGの合成能およびcollagenの合性能は増加した。

(4)TGF-β添加群は各合成能に影響を与えなかった。(5)IL-1添加群は各合性能を低下させた。以上より凍結保存し、解凍した軟骨細胞においてもTGF-β、bFGF、IGF-I、IL-1αに対する反応性は維持されていることが示唆された。今後この情報を元に凍結により軟骨細胞に与える影響をRT-PCR法による各種サイトカインのmRNAの発現の変化、ウエスタンプロット法による蛋白発現、insitu PCR法による軟骨細胞内のmRNAの発現について解析を行う予定である。変形性関節症の治療のための軟骨細胞を凍結保存し、その生存率、代謝活性、また成長因子に対する反応について実験を行った。(方法)幼若雌豚の四肢関節軟骨を採取し浮遊培養後、期間を変え凍結保存し、1)各凍結期間の軟骨細胞の生存率(trypan blueを用い判定)、2)各凍結期間のproteogrican(PG)及びcollagen合成能、3)各種成長因子(TGF-β,b-FGF, IGF-1)添加後のPG及びcollagen合成の変化を検討した。凍結保存は-196°Cの液体窒素を用いた。凍結期間は1日、3日、1週間、2週間、4週間、12週間とした。PG合成の指標として^<35>Sを、collagen合成の指標として^3H-prolineを用いた。(結果)1)軟骨細胞の生存率は、2週間までは90%以上、12週間までは80%以上であった。2)凍結後軟骨細胞の^<35>Sのuptakeは、無凍結軟骨細胞の^<35>Sのuptakeと比べ、各凍結期間において有意差を認めなかった。^3H-prolineのuptakeも、無凍結軟骨細胞の^3H-prolineのuptakeと比べ、各凍結期間において有意差を認めなかった。3)成長因子添加群の^<35>S uptake及び^3H-prolineのuptakeは、1週間、2週間、4週間、12週間の長期保存でもTGF-β、IGF-1、b-FGF (P<0.05)において有意に高値を示した。よって凍結期間長期の12週においてもPG及びcollagenの合成は保たれ、各成長因子添加によるPG及びcollagen合成の促進は維持されていた。(考察)凍結保存期間12週において生存率は80%であり凍結保存後もPG及びcollagen合成は保たれていることより、凍結軟骨細胞が移植として使用可能であることが示唆された。また、移植時に各成長因子を添加することで、移植母床での軟骨細胞の合成活性が促進されることが示唆された。凍結軟骨細胞の保存添加剤としてヒアルロン酸の可能性を検討するためヒアルロン酸の軟骨変性抑制作用について実験した。(方法)幼若雌豚4週齢の脛骨関節面の軟骨組織を採取し,直径3mm厚さ1mmの均一な円柱形の軟骨片を作成した.この軟骨片を用い(1)コントロール群,(2)IL-1(10ng/ml)添加群,