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英国ルネサンス期演劇における「記憶術」受容の研究

本研究によって明らかになったことは次の二点である。1.英国ルネサンス期演劇がその伝承を継承した中世道徳劇に「記憶術」特有の空間概念・形象を応用したものがあること、2.シェイクスピア劇の中に「記憶術」の主題を扱ったものがあること、劇の一場面が「記憶術」の装置となって劇の政治的文脈を浮かびあがらせるものがあること。第一の知見--中世演劇と「記憶術」の連関--についてはイェイツ(F.Yates)のダンテ『地獄篇』についての指摘--『地獄篇』は地獄と罰を、いろいろな段階の場所についての形象を使って記憶させるための記憶法--を採用したものである。たとえば中世道徳劇『堅忍の城』は神の慈悲による人間の救いを劇化したものであるが、劇が上演された野外円形劇場は「記憶術」の空間配置にヒントをえた舞台構造をもっている。堀に囲まれた舞台の中央に「堅忍の城」が立ち、舞台の北に「悪魔」(Devil)の櫓、北東に「貧欲」(Covetousness)の櫓、南に「肉体」(Flesh)の櫓、西に「現世」(World)の櫓、東に「神」(God)の櫓が配されていて「人間」(Mankind)は『地獄篇』のダンテと同じく、「善」「悪」「罪」が場所によって記憶される「記憶術」の宇宙を遍歴するてことになる。本研究の第二の知見--シェイクスピア劇と「記憶術」の連関--について二つの劇を例にあげる。『ハムレット』は、現王が破壊したハムレットの記憶に残る「楽園」を、「記憶術」によって回復する劇であり、記憶術の起源を語る逸話--倒壊した建物の下敷きになった遺体を人びとのいた場所から思い出すこと--を劇化したものといえる。『マクベス』の一幕三場の凱旋の場は、1559年にエリザベス女王の前で上演された「記憶術」を応用したパジャント--「真実は時の娘」の寓意を主題にしたもので、「時」「真実」の寓意人物、舞台の二つの丘と洞窟は「記憶術」の寓意の空間配列に着想をえている--を反映している。
超偏極希ガスの連続フロー型製造装置開発と脳機能磁気共鳴研究への応用

連続フロー型超偏極希ガス製造装置の開発を終え、本装置により超偏極^<129>Xeガスのバッチ式製造時で約35%、連続フロー式製造時では約57%の偏極率が得られることを確認した。即ち、信号強度として、バッチ式製造時で約7万5千倍、連続フロー式製造時において約1万倍の感度増強に到達し、開発当初の目標を達成した。連続フロー式製造時における^<129>Xeガスの流量は、偏極率を維持しながら約35ml/分、即ち約2l/時間まで制御可能とした。上述の装置を用いて製造した超偏極^<129>Xeガスをマウスに定常的に供給することにより、マウス肺空洞内に存在するガス相、及びマウス肺組織に溶解した溶解相の^<129>XeのNMR信号を確認するとともに、各々の相のMRI画像取得に成功し、局所肺換気能を評価するための新規なパラメータである肺胞組織における化学交換速度の定量的評価を可能とした。更に、肺から血流を介して脳組織へ移行した^<129>XeのNMR信号を明瞭に観測し、この信号の取り込み-洗い出し過程を解析することにより、脳組織内における^<129>Xeの緩和時間を14.1(±1.6)秒と定量的に見積もることに成功した。このインビボ緩和時間はインビトロ緩和時間と同程度であることから、緩和時間の変化から脳組織温度および酸素飽和度、酸素摂取率などのパラメータを定量的に見積もることが可能であることを示唆した。^<129>Xeの核磁気共鳴(NMR)信号は、周囲の環境を反映して特徴的な化学シフトによる分離を示す。この現象を利用することにより、各種組織に溶解した^<129>Xeを分離して観測することができ、緩和時間等のパラメータを利用した詳細な機能診断への応用が期待される。本研究では、感度不足というNMRに固有の従来の問題を乗り越えるため、超偏極希ガス製造装置を開発し、これを連続フロー型としてNMRに導入することにより、飛躍的に感度の増強された^<129>XeのNMR信号の連続観測を可能とした。本装置では、超偏極希ガス製造時においてバッファーガスとしてヘリウム(^4He)、及びクエンチングガスとして窒素ガス(N_2)を混入させることにより、偏極率を飛躍的に向上させ、バッチ式製造時で約35%、連続フロー式製造時において約3%の偏極率を得た。即ち、信号強度として、バッチ式製造時で約7万5千倍、連続フロー式製造時において約6000倍の感度増強を達成した。この連続フロー式製造時における^<129>Xeガスのフロー量は約35ml/分、即ち約2l/時間であった。本装置を用いて定常的に超偏極^<129>Xeガスを供給することが可能となったので、これをマウスに吸入させたところ、マウス肺空洞内に存在するガス、及びマウス肺組織に溶解した^<129>XeのNMR信号を明瞭に観測することができた。これにより、肺換気能を評価するための新規なパラメータとして、肺胞組織における化学交換速度を定量的に評価することを可能とした。更に、これら肺組織に溶解した^<129>XeのNMR信号に加えて、肺から血流を介して脳組織へ移行した信号を明瞭に観測することができた。この結果から、脳内の超偏極^<129>Xe緩和時間を測定することが可能となるので、今後、この緩和時間の変化から脳血流量および酸素飽和度、酸素摂取率などのパラメータを定量的に見積もることを試みる。本研究では、感度不足というNMRに固有の従来の問題を乗り越えるため、超偏極希ガス製造装置を開発し、これを連続フロー型としてNMRに導入することにより、飛躍的に感度の増強された^<129>XeのNMR信号の連続観測を可能とする。平成14年度では、超偏極^<129>Xeガスの連続フロー式製造時において約6000倍の感度増強を達成した。本年度では更なる偏極効率の追求を行い、光ポンピング法による超偏極希ガス製造時に使用するレーザーの高出力化、及び希ガス組成、圧力の最適化により、連続フロー式製造時において約10000倍の感度増強を達成した。本装置を使用してマグネット内のマウスに定常的に超偏極^<129>Xeガスを供給し、肺から血流を介して脳組織へ移行した^<129>Xe-NMR信号を観測したところ、血漿中に溶解したガスに由来する信号に加えて、脳組織に溶解したガスに由来する2本の信号を明瞭に認めた。また、この脳組織に溶解した信号を利用して、国内で初めて脳形態画像の取得に成功した。超偏極^<129>Xeを持続投与したのち、投与をやめた時の脳からの^<129>Xe-NMR信号の時間変化から得られる洗い出し曲線を解析することにより、局所脳血流速度を定量的に評価した結果、速度として93±41(ml blood/100g tissue/min)を得た。この値は、核医学的手法により得られた値とほぼ同程度であり、被爆を避けることができるなど、本手法の優位性を確認することができた。

今後、測定精度の更なる向上を目指すとともに、緩和時間の変化から酸素飽和度、酸素摂取率などのパラメータを定量的に見積もることを試みる。連続フロー型超偏極希ガス製造装置の開発を終え、本装置により超偏極^<129>Xeガスのバッチ式製造時で約35%、連続フロー式製造時では約57%の偏極率が得られることを確認した。即ち、信号強度として、バッチ式製造時で約7万5千倍、連続フロー式製造時において約1万倍の感度増強に到達し、開発当初の目標を達成した。連続フロー式製造時における^<129>Xeガスの流量は、偏極率を維持しながら約35ml/分、即ち約2l/時間まで制御可能とした。上述の装置を用いて製造した超偏極^<129>Xeガスをマウスに定常的に供給することにより、マウス肺空洞内に存在するガス相、及びマウス肺組織に溶解した溶解相の^<129>XeのNMR信号を確認するとともに、各々の相のMRI画像取得に成功し、局所肺換気能を評価するための新規なパラメータである肺胞組織における化学交換速度の定量的評価を可能とした。更に、肺から血流を介して脳組織へ移行した^<129>XeのNMR信号を明瞭に観測し、この信号の取り込み-洗い出し過程を解析することにより、脳組織内における^<129>Xeの緩和時間を14.1(±1.6)秒と定量的に見積もることに成功した。このインビボ緩和時間はインビトロ緩和時間と同程度であることから、緩和時間の変化から脳組織温度および酸素飽和度、酸素摂取率などのパラメータを定量的に見積もることが可能であることを示唆した。
唐代文学の研究-特に詞の源流に関して

本研究は、我が国の雅楽が中国では失われた唐代音楽の原型をかなりの程度保存している事に着目し、これを資料に中唐に起こった新しい韻文「詞」の源流を考察することを目的に、平成7年度より開始した。日本雅楽に関する各種の資料と中国の古文献の記載とを総合的に対照した結果、次のような領域で成果を上げることができた。(1)古楽譜・舞譜の解読に関する問題ー日本雅楽の基礎的事項を学ぶ中で発見した、古楽譜・舞譜の各種記号の解釈や調性等の問題に対し、日中双方の研究を結びつけることによって解決を試みた。「関於古楽譜解読的若干問題」、「天平琵琶譜“番仮崇"調性新探」及び「敦煌舞譜的対舞結構試析」の3篇の論文が、その成果である。(2)曲調と曲辞に関する問題-詩のように一句の字数が一定していない詞は、どのような音楽的背景から生まれたかを、古楽譜を通して考察した。本研究の当初の課題に対する一つの解答となるもので、論文「従古楽譜看楽調和曲辞的関係」がその成果である。(3)日本雅楽と隋唐舞楽に関する問題ー「蘭陵王」など日本雅楽のあるものに対しては、従来インド起源説が唱えられてきた。中国の文献に対する精査に基づき、従来の説を検討し、さらに雅楽の全ての曲について隋唐の音楽・文学・及び歴史とのとの関わりを考察した。この成果は(1)(2)で挙げた論文と合わせ『日本雅楽和隋唐楽舞-隋唐五代楽府文学背景研究-』という一冊の著書として、日中両国で出版する予定である。平成11年2月現在、第一稿が完成しており、今後さらに検討を重ね、2000年度の出版を目標としている。本年度は主として1)中国音楽関係の資料の収集と読解、2)日本雅楽関係の資料の収集と読解という基礎作業にあたった。また3)雅楽の上演の参観4)中国音楽に関する絵画・工芸品などの参観にもつとめた。さらにこれらと平行して5)中国の文学と音楽の関わりを、古代にさかのぼって考察する作業を進めた。1)から4)は、まだ基礎作業の段階にあり、今年度新たな知見が得られたのは5)の分野である。研究の結果、中国の韻文は漢代以降、音楽とは切り離されたものである「詩」と、楽曲から発達したもう一つのジャンルという二種によって構成されてきたことが明確になった。すなわち、漢より中唐は詩と楽府、晩唐より南宋は詩と詞、元以降は詩と曲である。これら二種の韻文は、それぞれ異なる二種の表現機能をもち、各時代の人間の精神を相互補完的に表現していた。そして音楽に関わる一つのジャンルの交替期は、思想史上の転換期にあたり、中国の思想文化史上、音楽のもつ意味が大きく変化したことを物語っている。このような考察の結果は、『中国思想史入門(仮題)』(東大出版会、1996年刊行予定)の「詩」の項にまとめた。
1GHz領域自動掃引フーリエ変換マイクロ波分光器の試作

比較的大型分子(A=1000MHz以下)の高分解能分光を行うため、低周波数領域(4GHz以下)において高感度を有する分子流型フーリエ変換マイクロ波分光器を試作することが目的である。第一段階としてGrabow(Kiel大)Lovas(NIST)等の助言に従い分子流の方向をマイクロ波パルスの伝搬方向に一致させ、感度および分解能を向上させた。その成果の一つとして2-クロロフェノールの塩素の核四極子結合定数を決定した。(日化第74春年会)第二段階は直径550mmの凹面鏡ミラーによるファブリーペロー空洞の構築である。ミラーを直接真空容器のフランジに取付け、シリンダー型の周波数同調機構を採用した。ミラー背部が外部に接しているため固体試料の加熱等が容易になった。しかし数種類の試作品を検討した結果、2枚のミラーの中心軸合わせおよび周波数同調機構がスムーズに動かないことが問題となり、現在、以下の仕様の分光器を設計・製作中である。(1)既存真空容器の外部に精密レールを敷設し、容器の両側のフランジを正確に平行にそのレールに取付ける。(2)両側フランジに直径550mm凹面鏡を改良シリンダー型機構にて取付ける。(3)フランジと容器本体は特殊な真空保持機構を採用し軸合わせを用意にする。(4)大型ミラー製作のための冶具を考案し、今回は予算的に入手できなかったが、安価に自作できる目途がついた。一方自動掃引機構については購入部品により回路を構成し、掃引プログラムの移植を進めている段階である。我々は生物化学関連分子と水(複数)との水素結合錯体の構造決定を目標としている。具体的には安息香酸水、カテコール水などの錯体の測定を既存分光器で試みているが現在のところ遷移は観測されていない。これら固体試料の気化方法の工夫が、レーザーアブレーションを含め今後の課題である。申請者はキ-ル大学(1996年4月9月)およびNIST(10月12月)に滞在し、低周波数領域自動掃引FTマイクロ波分光器試作のための多数の有益な資料の提供をうけた。また同所において最新の自動掃引分光器を実際に使用した経験をふまえ、本研究費により既存の真空容器を改造した新たにマイクロ波空洞を製作することとした。空洞は2枚の凹面鏡(Al製、直径500mm)により構成され、1枚は真空容器の現フランジの位置に固定し、その鏡の外側より直接試料ならびにマイクロ波を導入できる設計である。ノズル位置の変更などにより感度及び操作性の向上が期待される。現在、設計が完了し可動鏡のための直動モーター等を調達した段階にある。一方、周波数自動掃引機構についてはキ-ル大学2号機およびNIST3号機の回路を参考に必要な電子部品(プログラマブルマイクロ波減衰器、SPDTスイッチ、低ノイズミキサ-など)を購入した。現在それら部品を既存分光器へ組み込み、テスト中である。掃引プログラムは主にNIST(Leonov & Zuban、Grabow作成)を参考に書き換え中である。我々は本分光器により比較的サイズの大きい分子の分光を目指している。申請者は本年度固体のビフェニルエーテル、4-フルオロビフェニルなどの大きな分子の帰属に成功しており、目的の生化学的分子(さらに水との錯体をも含む)の分光の可能性が増したと考えている。次年度前期には凹面鏡を製作(学外業者に発注)する予定である。

比較的大きな分子(A=1000MHz以下)の高分解能分光を行うため、低周波領域(4GHz以下)において高感度を有するフーリエ変換マイクロ波分光器を試作することが研究の目的である。既存の分光器(2枚の350φミラーにより構成)を2段階に分けて改造した。第一にGrabow(キ-ル大学)およびのLovas(NIST)等の助言に従い、分子流の方向をマイクロ波パルスの伝播方向に一致させ、感度および分解能を向上させた。その成果の一つとして2-クロロフェノールの塩素核のhfsの解析より、核四極子結合定数の非対角項を決定した。(日化第74春年会)第二は高沸点液体ないし固体試料の測定を容易にするため、真空容器に直接ミラーを取り付ける事である。この直結方式の設計製作は、当初申請者のキ-ル大学およびNISTにおける同型器の使用経験をもとに取り掛かった。しかし本来目的の大型ミラー(約550φ)の装着について検討したところ、大幅な修正が必要となり、真空容器のフランジにシリンダー型の周波数同調機構を取り付ける事にした。この方式は手持ちのYAGレザーによる固体試料の加熱が容易になるとともに、ミラーの位置決めが外部より可能となり周波数自動掃引が簡便になる事が期待できる。大幅な設計変更により製作はやや遅れ、平成10年2月末現在50点におよぶ部品が出来上がり、組み立てているところである。またフランジ吊り上げ時の安全のために真空容器周辺にウインチ等を製作組み立てた。この装置は大型ミラーへの改造の準備段階でもある。自動掃引機構のための部品は、次年度校費により購入が決定しているマイクロ波アンプを除きすべて調達できた。測定を予定している分子は生化学関連物質(カテコール、安息香酸など)と水との水素結合錯体である。既存分光器で測定を試みているが現在のところ遷移は観測されていない。
電極間伸長固定されたDNA/導電性高分子高次組織体単一鎖の光電機能

単一鎖レベルで,(光吸収・電荷分離・電荷輸送)過程や(電荷輸送・電荷再結合・発光)過程などの高次機能を有するDNA高次組織体を電極間に伸長固定し,単一鎖レベルでの高次構造と光電機能の関係から,分子レベルでのDNA物性の理解を深め,革新的な光電機能を示す次世代分子デバイス創製を目的としている。平成27年度は,まず,前年度用いた電極間隔25μm櫛形電極が,単一鎖からなるDNAナノワイヤーの位置選択的構築には困難であったため,電極間隔3μmの対向尖端形状電極を用い,単一鎖DNAナノワイヤー作成を行った。一方で,光電機能単一鎖デバイス実現のための基礎知見収集を目的として,DNAナノワイヤーに光機能Ru錯体,さらには導電性高分子ポリアニリン(PAn)を複合したナノワイヤーの電気物性を測定した。結果として、1)基板上に形成された,鋭角の先端を持つ金電極が先端間隔3μmで対向する対向尖端形状電極間にDNA希薄溶液を滴下し,電極間に高周波高電界を与えることで,DNAの電極間単一鎖伸長固定を行った。電界が先端に集中するため,電極間隔25μm櫛形電極よりも条件設定が困難であり,周波数,印加電圧を幅広く検討することで,単一鎖で先端電極間に電界伸長されたDNAナノワイヤーの構築が可能であることを確認した。しかしながらまだ再現性に乏しく,高効率な方法論の確立が必要である。2)前年度に電極間隔25μm櫛形電極間に構築したDNAナノワイヤーとそれに光機能性Ru錯体を導入したナノワイヤー,さらにはPAnを複合したナノワイヤーの電流電圧特性を評価した。電流値はRu錯体複合により大きく上昇したが,Ru錯体導入後とPAn導入後の電流値には大きな差が認められなかった。AFMより,PAn複合ナノワイヤー上にPAnの凝集構造が多く認められており,導電パスの不連続性が原因であることが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。特徴ある電子機能を示すDNAに導電性および発光機能を有する異種分子を複合した組織体を,櫛型電極間に伸張固定した光電機能DNAナノワイヤーを作成し、集合体レベル,単一鎖レベルでの電子・光特性を定量的に測定,組織体構造との相関を明確にすることを目的とする。具体的には,DNAを鋳型として利用し,光触媒でアニリン(An)二量体(PPD)を光重合すると,光触媒を分子レベルで含み構造的・光電機能的に特徴あるDNA /導電性ポリアニリン(PAn)複合体を合成できる。得られる高次複合体は,特徴ある電子機能を示すDNA,p型導電性高分子PAn,受光・発光分子である光触媒が高次に配列された構造を持つ。このDNA複合体を電極間に伸張固定したDNA組織体分子ワイヤーを今年度作成した。1.主鎖長56μmのDNA溶液を電極間隔25μm櫛型金電極表面に展開し,電極間に1 MV/m・500 kHzの高周波・高電界を与えることで,DNAを電極間に単一鎖レベルでナノワイヤーとして伸長固定した。AFMによる高さ解析から,伸長固定されたDNAナノワイヤーはDNA13分子から構築されていることが明らかとなった。2.このDNAナノワイヤー基板をカチオン性Ru錯体を含む水溶液に浸漬した。DNAナノワイヤーの蛍光顕微鏡観察において洗浄後もRu錯体に基づく発光が認められ,Ru錯体がDNAナノワイヤー上へ安定的に固定されていることが示唆された。3.このDNA/Ru錯体ナノワイヤーを用いてアニリン二量体(PPD)の光重合を行った。AFM像観察から,得られた組織体はワイヤー構造は取っているもののワイヤー表面に100nm程度の凝集体が確認された。光触媒であるRu錯体がナノワイヤー上に偏在したためPAnの凝集体が形成されたと考えられる。次年度に向け、DNA複合体単分子ワイヤー作成のための最適条件を確立する。

電界が先端に集中するため,電極間隔25μm櫛形電極よりも条件設定が困難であり,周波数,印加電圧を幅広く検討することで,単一鎖で先端電極間に電界伸長されたDNAナノワイヤーの構築が可能であることを確認した。しかしながらまだ再現性に乏しく,高効率な方法論の確立が必要である。2)前年度に電極間隔25μm櫛形電極間に構築したDNAナノワイヤーとそれに光機能性Ru錯体を導入したナノワイヤー,さらにはPAnを複合したナノワイヤーの電流電圧特性を評価した。電流値はRu錯体複合により大きく上昇したが,Ru錯体導入後とPAn導入後の電流値には大きな差が認められなかった。AFMより,PAn複合ナノワイヤー上にPAnの凝集構造が多く認められており,導電パスの不連続性が原因であることが明らかとなった。高周波・高電界による静電伸長法を用いることで,主鎖長56μmのDNAを電極間隔25μm櫛型金電極間に,DNA13分子からなる分子ナノワイヤーとして伸長固定できることが明らかとなった。また,このDNAナノワイヤー基板をカチオン性Ru錯体を含む水溶液に浸漬することでRu錯体をナノワイヤー上に安定固定でき,発光性を示す光電機能DNAナノワイヤーの作成も可能となった。Ru錯体固定DNAナノワイヤーはDNAナノワイヤーよりも優れた電流電圧特性を示すことも確認している。さらに,このナノワイヤーに固定されたRu錯体を光触媒としてアニリン二量体PPDの光重合を行ったところ、DNAナノワイヤー上へのPAnの形成が認められた。ここまでにおいてほぼ計画通り順調に研究は進行している。現時点での問題点は,PAnを複合化させたDNA/PAnナノワイヤーにおいて,得られた組織体はワイヤー構造は取っているもののワイヤー表面に100nm程度の凝集体が確認されたことである。光触媒であるRu錯体がナノワイヤー上に偏在したためPAnの凝集体が形成されたと考えられる。目的がDNAとPAnが単一鎖レベルで複合化したDNA複合体単分子鎖ナノワイヤー作成であるため、特にPPD光重合の条件を精査し,最適条件の確立が必要である。しかしながら,この課題に関しては今後の研究の推進方策に示す方法論で解決の糸口を見いだせると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。前年度課題の解決と新しい電極系でのDNA複合体単一鎖ナノワイヤーの実現,さらにはDNA複合体ナノワイヤーの光電機能の評価に重点を置き研究を推進する。1.前年度課題としてDNA/PAnナノワイヤーは作成できたもののワイヤー表面に100nm程度のPAn凝集体が確認された。光重合をPPD溶液に漬けたまま行っているため,PPDの過剰供給が要因として考えられる。希薄溶液系の利用やPPDを静電固定したのちに光重合を行うなど解決策を見出すことができると考えている。2.前年度,電極間隔25μmの櫛型電極を用いたため単一鎖での電極間伸長が困難であった。今後は電極間隔3μmの鋸歯電極を用いて検討を行う。これまでの櫛形電極系におけるDNAナノワイヤーの構築,評価に関する方法論の確立も併せて,鋸歯電極においても単一鎖からなるDNA/Ru錯体ナノワイヤーの構築を図る。さらにPAnをナノワイヤーに均一に修飾するための光重合最適条件を確立する。3.得られた単一鎖DNA/PAnナノワイヤーの光・電子特性を解析,評価する。これまでにPAnを組織化した方で高い電流電圧特性が得られており,DNA/PAn単一鎖ナノワイヤーにおいても確認を行うとともに,Ru錯体のみを固定した系との違いについても評価する。
脱灰・再石灰化による歯牙ミネラル量変化の新評価法開発と変化ミネラルの質的解明

脱灰・再石灰化された歯牙硬組織のミネラル量変化を定量化するため、以下の2種類の新評価法を開発した。また、高分解能透過型顕微鏡を用いて脱灰あるいはレーザー照射によって変化したミネラルの質的な評価を行った。1ミネラル定量化の新評価法1)ディジタルサブトラクションを用いた単一切片歯牙硬組織ミネラル量変化の定量法の検討同一エナメル質切片の脱灰前と後のマイクロラディオグラフィーをデンシトメータでスキャンしディジタル画像として読み込み、この二つの画像をコンピューター上で重ね合わせて各画素のグレイレベルをサブトラクションすることで、脱灰によりミネラルが変化した領域だけを画像上に視覚的に表示させるテクニックを開発した。また、変化ミネラル量をアルミニウム厚さ当量として定量化する事も可能となった。2)CCDカメラ画像を用いた歯牙硬組織ミネラル定量法の検討脱灰・再石灰化処理後の歯根切片のマイクロラディオグラフィーをCCDカメラを介してコンピューター画像として取り込み、画像上画素のグレイレベル値をアルミニウム厚さ当量に変換することによって、任意の領域におけるミネラル量を画像上で直接測定できる方法を開発した。2変化ミネラルの質的検討高分解能電子顕微鏡による結晶学的分析の結果、脱灰後レーザー照射したエナメル質は、ハイドロキシアパタイトからαまたはβTCPに変化している可能性が高いことが示唆された。ヒト・エナメル質を約100μmの厚さに薄切し,切片の両切断面をnail varnishで被覆し,エナメル質表面だけを露出させた。この切片を10段階からなるアルミニウムスッテプウェッジとともにマイクロラジオグラフを撮影した。同一切片を一定時間脱灰し,再度マイクロラジオグラフを撮影した。この二つのX線写真をマイクロデンシトメ-タ-を用いて512×512画素からなる画像としてディジタル化した。脱灰によって変化のなかった部分の画素は同じグレイ値を持つが,変化のあった部分の画素は異なったグレイ値となる。これら二つのディジタル画像をコンピュ-タのモニタ-上に表示させ,二つの位置を重ね合わせ,同一位置の画素間のグレイ値を引き算してイメ-ジ画像としてモニタ-上に表示させることによって,脱灰によって変化した範囲を二次元的に視覚化することができた。さらに,アルミニウムステップウェッジの厚みとそのX線写真のグレイ値との関連式から,脱灰によって変化した部分の画素のグレイ値をアツミニウムの厚さ当量に換算することによって,変化部分のミネラル量の定量化を行った。また,既知の厚さのアルミニウム板を同様の方法で定量化し,その正確性を検討した結果,実際の厚みが6,12,24μmのアルミニウム板が,計算上では,8.3,11.8,30.1μmという値となり,やや正確性に難点が残ることが今後の検討課題となった。ミネラルの画像定量法の検討前年度までに確立された画像処理によるミネラルのアルミニウム当量への変換手順について、その再現性と精度を検討した。すなわち,厚さ既知(実測値:102.0μm)のアルミニウム箔試料6例のマイクロラジオグラフを対象に,画像入力を行い,画像変換による厚さ計測値とマイクロメーターによる実測値との比較を行った。その結果,(画像定量値/実測値)の値は1.002-1.044の範囲に分布し,いずれも1.00にきわめて近似していることから,本法は高い精度を保持していることが確認された。また,同一アルミニウム箔試料について画像入力からアルミニウム当量変換ならびに測定に至る一連の操作を計20回繰り返し再現性を検討した。その結果,測定値のCV値[(mean/S.D.)×100]の平均は2.56%に留まり,本法は比較的高い再現精度を有することが確認された。さらに,単一切片法との組み合わせにより作成した脱灰あるいは再石灰化前後のサブトラクション画像に関しては,等濃度ミネラル領域の面積計測が定量的評価に最適であることを確認した。以上より,申請者らが確立した画像定量法は,マイクロラジオグラフからの歯質ミネラル評価に応用可能であることが示唆された。

ヒト小臼歯の歯根から厚さ125mumの切片を切り出し、歯根表面の一部を実験面として残し、その他の部分をネイルバーニッシュで被覆した。この試料を脱灰液(0.01M乳酸緩衝液pH=5.1)に48時間浸漬して人工的に初期齲〓を形成した後、再石灰化液に7日間浸漬した。脱灰直後ならびに再石灰化1,2,7日後の計4回同一試料切片のX線マイクロラジィオグラム(MR)をアルミニウムステップウェッジ(ALW)とともに撮影した。MR写真の光学顕微鏡像をCCDカメラを介して画像解析装置に入力し、グレイスケール256階調、512×480画素のディジタル画像を得た。各MRごとに、ALW各段階のディジタル画像上でのグレイ値とアルミニウム厚さ値の3次回帰式を決定し、この式からディジタル画像上の歯根試料のグレイ値をアルミニウム厚さ等価値に読み換え可能にした。さらに各画像の歯根健全部のアルミニウム厚さ等価値が厚さ100mumの健全歯根切片になるように変換して、画像間での比較を可能にした。深さ方向に1画素(0.91mum)水平方向に55画素(50mum)のスキャンの大きさでアルミニウム厚さ等価値を走査した。また各ディジタル画像は定量的に定義されたカラースケールによる疑似カラー化を行うことによって再石灰化の進行過程を評価した。これらの方法により、同一試料の再石灰化によるミネラル量の変化が経時的に定量化できるとともに、どの部位においてミネラルの変化が起こっているかということが疑似カラー化によって評価できた。
グルタメイト脱水素酵素異常による高インスリン高アンモニア血症の発症機構の解明

高インスリン高アンモニア血症(HI/HA)はglutamate dehydrogenase (GDH)のGTPの抑制制御が失われるためGDH活性の上昇をきたし、肝臓では高アンモニア血症を、膵β細胞では高インスリン血症をきたすとされている。これまで同定されたHI/HAの遺伝子変異は1)Pivot helixのGTP結合部位、2)アンテナ様構造のα-helix、3)エクソン6と7領域のGTP結合部位の3カ所である。各領域の変異GDHcDNAをGDHcDNA-pCDNA3からsite-directed mutagenesis法で作製し、変異蛋白発現試験を行った。また、正常及び変異GDHcDNAアデノウイルスを作成し、COS細胞に感染させ、GDH基礎活性とGTPの抑制効果を測定した。HI/HA自験2例のGDHの酵素解析と分子遺伝学的解析では、G446DとL413Vの変異をde novoで各1対立遺伝子に同定した。基礎GDH活性はG446D変異では正常と同等で、L413V変異では上昇し、両者ともGTPによるGDH活性抑制の低下があった。GDHの制御機構の異常が変異蛋白発現試験(変異のホモ接合体)では患者リンパ芽球(ヘテロ接合体)の2倍であることから、異常遺伝子のgene dosageの存在が明らかとなった。抗GDH抗体の解析ではGDH活性の上昇はspecific activityの上昇であった。G446DはPivot helixの結合部位に存在し、L413Vは少し離れたアンテナ様構造のα-helixに存在する。変異のGDH立体構造上での位置によりGDH活性とGTP抑制効果の違いをもたらした。以上のようにHI/HAではその臨床症状は相似であったとしてもその遺伝子変異により、GDH活性に与えるメカニズムは異なっていると考えられた。他の異常GDHcDNA遺伝子(265、296、410、445変異)についても同様の結果が得られた。高インスリン高アンモニア血症は1996年にZammarchiらによってはじめて独立した疾患として提唱され、1998年Stanleyらはその原因がglutamate dehydrogenase(GDH)異常であり、その遺伝子変異を同定している。本疾患はGDH酵素のGTP結合部位の遺伝子異常-蛋白異常によりGTPの抑制制御が失われるため、GDH活性の上昇をきたし、肝臓では高アンモニア血症を膵β細胞では高インスリン血症をもたらすと推定されている。高インスリン高アンモニア血症の2自験例ではジアゾキサイドによる低血糖に一定の治療効果が認められたが、、高アンモニア血症に対して安息香酸ナトリウムや低蛋白食療法を行うも著効を得られていない。自験例2症例についてGDHの酵素解析と分子遺伝学的解析を行った。EBウイルスで確立した両患者のリンパ芽球細胞ではGDH活性の上昇とGTPによるGDH活性阻害の低下、すなわち、GDH活性の制御機構の異常が生じていた。遺伝子解析では各患者からG446BとL413Vの変異を各1対立遺伝子で同定し、また、両変異ともde novoに発生したことを両親の遺伝子解析から明らかにした。site-directed mutagenesis法で変異GDHcDNAを作成した後、COS細胞に導入し、GDH活性およびGTPとADPのキネテイック・スタデイを行い、両変異が原因遺伝子であることを確認した。抗GDH抗体を用いた解析では両変異のCRM量はコントロールと同等で、GDH活性の上昇はspecific activityの上昇によると考えられた。また、遺伝子変異により異なる臨床的重症度を示すことが推測された。

高インスリン高アンモニア血症は1996年にZammarchiらによってはじめて独立した疾患として提唱され、1998年Stanleyらはその原因がglutamate dehydrogenase(GDH)の異常であることを明らかにし、その遺伝子変異を同定している。本疾患はGDH酵素のGTP結合部位の遺伝子異常-蛋白異常によりGTPの抑制制御が失われるため、GDH活性の上昇をきたし、肝臓では高アンモニア血症を膵β細胞では高インスリン血症をもたらすと推定されている。遺伝子変異L413VとG446Dの分子構造上の位置とGDH活性に与える影響の関連について、変異GDHcDNAをCOS細胞に導入し、GDH活性とGTP抑制効果で検討した。L413V変異ではGDH活性が上昇し、G446D変異ではGDH活性は正常コントロールとほぼ同等であるが、GTPによるGDH活性への抑制効果は著明に低下していた。このことから、両変異のGDH制御機構への影響が機能的に異なると考えられた。抗GDH抗体を用いた解析では酵素蛋白量には変化がないこと、また、異常遺伝子の量的増加に従って、GDH活性の制御機構に与える影響が増大することを明らかにした。この両変異のGDH活性へ与える影響の違いは、G446DはGDHの活性発現に最も重要であるPivot helixのGTP結合部位に存在し、L413Vは少し離れたアンテナ様構造のα-helixに存在するという、GDH立体構造上の部位の違いによる。逆このことからアンテナ様構造がGDH活性の制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。高インスリン高アンモニア血症の発症原因として、glutamate dehydrogenase (GDH)の異常が同定されている。本疾患はGDH酵素のGTPの抑制制御が失われるためGDH活性の上昇をきたし、肝臓では高アンモニア血症を膵β細胞では高インスリン血症をきたすとされている。これまでヒトで同定された高インスリン高アンモニア血症の遺伝子変異は1)Pivot helixのGTP結合部位、2)アンテナ様構造のα-helix、3)エクソン6と7領域のGTP結合部位の3カ所である。それぞれの領域について、正常GDHcDNA-pCDNA3からsite-directed mutagenesis法で変異GDHcDNAを作製し、FLP-FRT組み換えシステムを用いて正常及び変異GDHcDNAアデノウイルスベクターを作成した。COS細胞に感染させ、GDH酵素基礎活性とGTPの阻害効果を測定した。COS細胞のみの基礎のGDH活性と比較して、正常GDHcDNAを感染させたCOS細胞は5倍の基礎GDH活性を示し、異常GDHcDNA遺伝子(265、296、410、413、445、446変異)を感染させたCOS細胞は正常GDHcDNAと同等から2.5倍の基礎GDH活性を示していた。基礎値を100%とした場合のGTPの制御効果は、Lacz、正常GDHcDNAでは著名なGTP制御効果が認められた。一方、異常ではその抑制効果の減弱は少なく、410と413がそれに次ぎ、265と296は抑制効果がほとんど認められなかった。
ヒトデ生殖巣刺激ホルモン(GSS)の作用機構に関する研究

繁殖期に日本各地(5月:横須賀、9月:浅虫)で採集したイトマキヒトデ(Asterina pectinifera)を用いて、以下の実験をおこなった。・GSSの産生機構イトマキヒトデから生殖巣、幽門盲嚢、神経系、胃、管足を単離し、GSSの含有量を定量した。その結果、GSSは放射神経や周口神経など、主に神経系に含まれることを確認した。管足や胃にも僅かのGSSは認められたが、生殖巣や幽門盲嚢には検出されなかった。さらに、GSS活性は、未成熟な生殖巣を持つ個体や放卵後の個体の体腔液には検出されなかったが、人為的に放卵を誘起させた個体の体腔液中に見出された。これらの結果から、ヒトデでは放卵・放精時において、神経系から生殖巣刺激ホルモンGSSが分泌され、体腔液を介して、生殖巣に作用し、放卵・放精を引き起こすことが明らかになった。・GSSの作用機構卵黄形成期と繁殖期の各個体からGSSの標的細胞である卵濾胞細胞を調整し、GSSに対する影響を調べた。その結果、GSSは繁殖期の濾胞細胞に対して、卵成熟誘起ホルモン、1-メチルアデニン(1-MeAde)と細胞内サイクリックAMP (cAMP)の生産を誘起したが、卵黄形成期の濾胞細胞では、1-MeAdeおよびcAMPの生産を誘起しなかった。また、ヨード化ラベルのGSSを用いて受容体との相互作用を解析したところ、卵黄形成期の濾胞細胞の受容体は繁殖期の場合と比較して、GSSに対する親和性が低かった。このことから、GSS受容体は卵の発達状態に応じて、化学的性質が変わり、繁殖時には親和性が高まることが明らかになった。・GSSの作用機構イトマキヒトデから卵巣、濾胞細胞、卵母細胞、精巣、間細胞、精子、肝膵臓、放射神経を単離し、^<125>I-GSSと非標識GSSとの競合実験をおこなった。その結果、卵巣、精巣、濾胞細胞、間細胞にGSSは特異的に結合することが示された。卵巣や精巣にはそれぞれ濾胞細胞および間細胞が存在することから、GSSの標的細胞は卵巣では濾胞細胞で、精巣では間細胞であると考えられる。Scatchard解析から濾胞細胞および間細胞に対するGSSの解離定数(Kd)は4-7nMで、最大結合数(Bmax)は0.5-3pmoles/mg proteinと推定された。一方、イトマキヒトデの合成GSSはマヒトデ(Asterias amurensis)の卵巣に作用し、放卵を誘起したが、トラフナマコ(Holothuria pervicax)やニセクロナマコ(Holothuria leucospilota)に対しては何ら影響をもたらさなかった。・GSSの産生過程GSS-A鎖およびGSS-B鎖の一部を抗原とする特異的抗体をラットで調整した。得られた抗体はWestern Blotには利用でき、粗放射神経抽出液からGSSを検出できたが、抗体価が低かったため免疫組織学手法やELISA法への利用までには至っていない。

その結果、GSSは放射神経や周口神経など、主に神経系に含まれることを確認した。管足や胃にも僅かのGSSは認められたが、生殖巣や幽門盲嚢には検出されなかった。さらに、GSS活性は、未成熟な生殖巣を持つ個体や放卵後の個体の体腔液には検出されなかったが、人為的に放卵を誘起させた個体の体腔液中に見出された。これらの結果から、ヒトデでは放卵・放精時において、神経系から生殖巣刺激ホルモンGSSが分泌され、体腔液を介して、生殖巣に作用し、放卵・放精を引き起こすことが明らかになった。・GSSの作用機構卵黄形成期と繁殖期の各個体からGSSの標的細胞である卵濾胞細胞を調整し、GSSに対する影響を調べた。その結果、GSSは繁殖期の濾胞細胞に対して、卵成熟誘起ホルモン、1-メチルアデニン(1-MeAde)と細胞内サイクリックAMP(cAMP)の生産を誘起したが、卵黄形成期の濾胞細胞では、1-MeAdeおよびcAMPの生産を誘起しなかった。また、ヨード化ラベルのGSSを用いて受容体との相互作用を解析したところ、卵黄形成期の濾胞細胞の受容体は繁殖期の場合と比較して、GSSに対する親和性が低かった。このことから、GSS受容体は卵の発達状態に応じて、化学的性質が変わり、繁殖時には親和性が高まることが明らかになった。本研究で得られた成果は日本動物学会第78回大会(弘前大学、弘前)、第32回日本比較内分泌学会大会(日光)および第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(横浜)で発表した。
共鳴X線光電子分光法による分子クラスターの電子状態の解明

クリプトンクラスターのX線吸収分光測定を行い、X線照射により内殻電子がRydberg軌道に遷移されて一価イオンとRydberg電子となったのちに、Rydberg電子と最近接原子の間の交換相互作用によって、エネルギー準位が不安定化されることを見出した。また共鳴オージェ電子分光の結果、二価イオンにおけるRydberg軌道の交換相互作用が増大することを確認した。これは二価イオンによりRydberg軌道が収縮されて、最近接原子との重なりが増えたためであり、交換相互作用がクラスターの内殻励起過程に重要な役割を果たすことを明らかにした。数個の分子が集合して形成するクラスターは、単独の分子で構成される気体と無数の分子が周期構造を形成する固体の中間の状態であり、気体や固体では見られない特徴的な電子状態を示す。本研究では希ガスであるクリプトンのクラスターを作成して、その共鳴光電子分光測定を極端紫外光研究施設(UVSOR)の軟X線ビームラインBL3Uにおいて行った。まずクラスターのX線吸収分光測定を行うために必要な飛行時間型質量分析計を作成した。そしてクラスターにX線を照射してイオン化して、その時のダイマーイオンを飛行時間型質量分析計で観測するのを、X線エネルギーを変えながら行うことにより、クリプトンクラスターのX線吸収スペクトルを得た。この結果、ガスの状態では見られない新たなピークを観測した。次に励起X線エネルギーを吸収スペクトルで得られたクフスターのピーク位置に合わせることにより、共鳴オージェ電子分光測定を、半球型電子分光器を用いて行った。その結果、クラスター由来のピーク位置が同じ状態に属するガスのピーク位置とずれることが分かった。またガズのスペグトルでは見られなかった新たなピークも観測された。クラスターにはバルク部分と表面部分があるが、励起する箇所を変えた共鳴オージェ電子分光測定を行い、電子状態のバルクと表面における違いについても調べた。現在これらの測定結果をまとめて、学術誌に投稿ずる準備を始めている。また得られた成果は国際会議においても発表する予定である。数個の原子の集合体であるクラスターの内殻励起過程は、原子間相互作用により単独原子には見られない特徴的な現象を示す。本研究では、15個程度の小さいサイズのクリプトンクラスターの内殻励起過程をX線吸収分光法、共鳴オージェ電子分光法を用いて調べた。実験はUVSORの軟X線アンジュレータービームラインBL3Uで行った。クラスターは高圧ガスをノズルから真空中に放出することにより作成した。昨年度に作製した飛行時間型質量分析計を用いて、クラスターへのX線照射により生成したダイマーイオンの総量の測定を、X線エネルギーを変えながら行った。この過程の終状態は一価イオンとRydberg電子となるが、クリプトン原子の5p軌道の平均距離が原子間距離に近いため、Rydberg電子と最近接原子との間の交換相互作用に起因するエネルギーシフトが観測された。6p軌道はより広がっているため、交換相互作用は弱くなる。次に半球型電子分光器を用いて、クリプトンクラスターの共鳴オージェ電子スペクトルの測定を行った。この過程の終状態は二価イオンとRydberg電子となるが、このときのクラスターのエネルギーシフトから、Rydberg軌道の交換相互作用が二価イオンになると増大することが分かった。これは二価イオンによりRydberg軌道が収縮されるためであり、Rydberg軌道と最近接原子の重なりが増大したことによる。このようにクラスターの内殻励起過程において、Rydberg軌道の交換相互作用が重要な役割を果たしていることを明らかにした。交換相互作用は短距離相互作用であるため、Rydberg軌道の交換相互作用はクラスターの構造を調べる上で有用である。
導電性兀共役複素環ポリマ-の新合成

導電性兀共役複素環ポリマ-を合成する方法として、主にゼロ価ニッケル錯体によるジハロゲン化複素芳香環化含物の脱ハロゲン化反応を用いた。たとえば、ビス(1,5ーシクロオクタジエン)ニッケル(0)錯体と2,2'ービピリジンの混合系に、3ーアルキルー2,5ージヨ-ドチオフェンを反応させると、脱ハロゲン化重縮合が進行し分子量15000150000のポリ(3ーアルキルー2,5ーチエニレン)PRThが生成する。このPRThはクロロホルム等に可溶であり、溶液中で糸まり状構造をとっている。また、このポリマ-を白金電極上にフィルムとして形成させ、支持塩存在下直流電源により酸化すると黄色から青色へとフィルムの色の変化が起こりアニオンド-ピングが起った。この現象は可逆的であり、PRThを用いるエレクトロクロミズム素子への応用が可能であることを示している。上記のゼロ価ニッケル錯体を用いる重合法により、電子吸引性に2,5ーピリジンジイル基と電子供与性の2,5ーチエニレン基から成る共重合体を合成した。この共重合体はその特異な電子構造のため、電気化学的な酸化ド-ピング状態を特に安定化させる効果を持つ。これらの上記のポリマ-の他、導電性兀共役複素環ポリマ-を合成し、その酸化還元挙動電子移動等について研究した。また、ポリマ-合成の基礎である錯体化学の研究を行なった。分子内に2個のハロゲンを有するπ共役系複素環化合物をモノマ-として用い、ニッケルゼロ価錯体と反応せしめてモノマ-の脱ハロゲン化重縮合を行うことにより、主鎖に沿ったπ共役系を有し、空気中で安定な導電性π共役複素環ポリマ-を合成した。上記の合成法では、ニッケルゼロ価錯体種、配位子の添加、重合温度、モノマ-中のハロゲン等を検討することにより、生成するポリマ-の収率、分子量を向上させることができることを見出した。この合成法で得られたポリ(2,5-チエニレン)、ポリ(P-フェニレン)は他の合成法で得られた同ポリマ-に比べ、分子構造が制御されしかも長鎖を有するポリマ-であり、非常に高い結晶性を有することが分かった。また、同合成法で2,5-ジブロモピリジンの重縮合を行うことにより、溶媒への溶解性を有し、高誘電率の異方性を示すポリ(2,5-ピリジンジイル)が合成可能となった。そして、このポリマ-をコ-トしたポリ(ビニルアルコ-ル)フィルムを延伸することにより、特有の波長の光に対して偏光特性を有する複合フィルムが得られ、ポリマ-の分子量の高いものほど良子な偏光特性を示すことが明らかとなった。さらに、ピリジンニ量体である2,2'-ビピリジンのジハロゲン化物をモノマ-として用い、重縮合反応を行うことにより、分子結合に規則性を有するη型導電性ポリマ-が得られることが見出された。導電性π共役複素環ポリマ-を合成する手段として、主にゼロ価ニッケル錯体によるジハロゲン化複素芳香環化合物の脱ハロゲン化反応を用いた。たとえば、ビス(1,5ーシクロオクタジエン)ニッケル(0)錯体と2,2'ービピリジンの混合系に、3ーアルキルー2,5ージヨ-ドチオフェンを反応させると、脱ハロゲン化重合が進行し分子量15000150000のポリ(3ーアルキルー2,5ーチエニレン)PRThが生成する。また、このポリマ-を白金電極上に形成させ、支持塩存在下直流電源により酸化すると黄色から青色への変化が起こりアニオンド-ピングが起こった。この現象は可逆的であり、PRThを用いるエレクトロクロミズム素子の形成が可能であることを示している。上記のゼロ価

ニッケル錯体を用いる重合法により、電子吸引性の2,5ーピリジンジイル基と電子供与性の2,5ーチエニレン基から成る共重合体を合成した。この重合体はその特異な電子構造のため、電気化学的な酸化ド-ピング状態を特に安定化する効果を持つ。これら上記のポリマ-の他、導電性π共役複素環ポリマ-を合成し、その酸化還元挙動、電子移動等について研究した。また、ポリマ-合成の基礎である錯体化学の研究を行なった。
造精機能障害に対するエピゲノム創薬を目指したヒストン修飾酵素Kdm5aの機能解析

In vitroにおけるKdm5aの機能解析では、精子幹細胞の初代培養を確立することが困難のため、精原細胞の培養株であるGC-1細胞を使用している。また次世代シーケンサーの手技の準備に時間がかかっている。ChIP assayを用いて次世代シーケンサーによる解析を行った上で、In vivoにおけるKdm5aの機能解析を予定している。
移植神経側面への端側縫合における開窓形態の影響

広範な顔面神経欠損に対する再建手術などにおいてしばしば用いられる神経端側縫合において、移植神経側面に設ける開窓部をどの程度の深さで作成すると側方への神経再生が最も優れているのかを解明するためにラット動物実験モデルを作成した。実験では無開窓、神経上膜開窓、神経周膜開窓の3群で検証を行ったが、神経周膜開窓群で最も多くの軸索再生が認められ、より深く開窓することでより多くの軸索再生が得られる可能性が示唆された。近年神経再建において、移植した神経そのものの側面に更なる端側縫合を行っても縫合部を通って神経再生することが分かり、耳下腺腫瘍切除後の顔面神経再建など多くの神経再建が必要とされる部位ではより少ない神経採取で簡便に再建が行えるなどのメリットも報告されている。神経再生の過程においては移植神経内の神経軸索は一度ワーラー変性をきたし、残されたシュワン細胞の存在が神経再生を促進すると考えられている。再生神経が移植神経の開窓部まで到達した際、バリアとなる膜構造がより少ないほうが側面方向への神経再生を促しやすいとも考えられるが開窓操作によって端側縫合部に瘢痕形成をきたすためむしろ軸索伸長に悪影響を及ぼす可能性もあり本研究を行った。方法:8週齢、雄のLewisラット顔面神経を両側とも本幹から各枝末梢まで摘出した顔面神経麻痺モデルを作成し、異なるLewisラットより摘出した坐骨神経を移植した。移植神経を右顔面神経本幹と端々縫合した後、前額皮下トンネルを通して左下顎縁枝と端々縫合を行った。更に左頬筋枝と端側縫合を行ったがこの際に神経上膜開窓、神経周膜開窓、無開窓の3群を作成し、術後の機能回復を比較した。結果:いずれの群でも端側縫合した頬筋枝への回復がみられたが、逆行性トレーサーによる顔面神経核染色では神経周膜開窓群において最も多くカウントされ、無開窓群との間に有意差が認められた。トルイジンブルー染色による頬筋枝内の再生軸索数においても神経周膜開窓群では無開窓群より有意に多くカウントされた。考察:無開窓群においても軸索再生が認められ、移植神経側面からも神経上膜を貫通して軸索再生しうると考えられた。神経周膜開窓群ではより多くの軸索再生が認められ、このことからより深く開窓することでより多くの軸索再生が得られる可能性が示唆された。われわれは移植神経側面の開窓形態による側方方向への軸索再生の影響について実験を行ったが、再生神経が移植神経の開窓部まで到達した際、バリアとなる膜構造がより少ないほうが側面方向への神経再生を促しやすいことを示唆する傾向が認められた。このことから、より深い開窓を行った方が移植神経内のヴュングナー帯に対してより多くの損傷を与え、マクロファージの流入や瘢痕形成を介し、成長円錐に対する軸索分枝を誘導するのではないかと考えた。移植神経側方への端側縫合では、移植神経中枢端から端側縫合部位までの距離によって再生軸索が神経分岐部にいたるまでの時間が変化するため、端側縫合の部位によって軸索分枝に影響を及ぼすと考えられる。そこで、あらかじめ一定期間(0、1、2、4週間)のpre-degenerationを行ったマウス腓骨神経をYFP-transgenicマウス腓骨神経に作成した長さ5mmの神経欠損部位に移植し移植日より10日後に移植神経内の再生軸索長、軸索分岐数を評価した。この実験からはpre-degenerationを行った神経を移植した群においてより長い再生軸索長、より多くの軸索分岐が認められた。つまり、移植神経内の端側縫合部位は中枢端におけるソース神経との縫合部位からある程度末梢に設けた方がより多くの側方方向への軸索再生が得られると考えられた。移植神経の中枢端だけでなく、末梢断端にも更なるソースとなる神経との縫合を付加したいわゆるネットワーク型神経再建は、中枢端からのみならず末梢断端からの軸索再生を期待するものである。移植神経両断端をソースとなる神経に縫合し、移植神経内の異なる2箇所に端側縫合部位を設けたモデルでは、移植神経内を双方向に再生軸索が伸長し、両方のソースから両方の端側縫合部位へと神経再生するものと考えられる。来年度は、このラット双方向軸索再生モデルを用いて各端側縫合部位からの側方への軸索伸長についての研究を行う予定である。

われわれは移植神経側面の開窓形態による側方方向への軸索再生の影響について実験を行ったが、再生神経が移植神経の開窓部まで到達した際、バリアとなる膜構造がより少ないほうが側面方向への神経再生を促しやすいことを示唆する傾向が認められ、より深い開窓によって移植神経内のヴュングナー帯に対してより多くの損傷を与え、成長円錐に対する軸索分枝を誘導するのではないかと考えられた。顔面神経再建においては移植神経を複数の神経へと縫合し、移植神経内への再生軸索のソースを多く確保することで、より多くの再生軸索流入を期待するいわゆるネットワーク型神経再建が試みられている。ネットワーク型神経再建は、中枢端からのみならず末梢断端等からの軸索再生を期待するものであり、移植神経両断端をソースとなる神経に縫合し、移植神経内の異なる2箇所に端側縫合部位を設けたモデルでは、移植神経内を双方向に再生軸索が伸長し、両方のソースから両方の端側縫合部位へと神経再生するものと考えられる。そこで、両側顔面神経を顔面神経本幹から顔面神経各枝末梢まで欠損させた顔面神経麻痺モデルに対し坐骨神経を移植する際に、右顔面神経本幹に坐骨神経末梢側を端端縫合し、坐骨神経側面に左右の顔面神経頬筋枝を端側縫合、坐骨神経中枢断端を左顔面神経本幹に端端縫合したラット双方向軸索再生モデルと、左顔面神経本幹を結紮処理し、坐骨神経中枢断端を左顔面神経頬筋枝に端端縫合した従来型のcross face nerve graftによる顔面神経再建モデルとを作成し、神経再生の比較を行ったところ、ラット双方向軸索再生モデルにおいてはより早期からの両側顔面神経機能回復が観測され、神経筋電図からは両側顔面神経本幹からの神経再生を示唆する結果が得られた。