hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分化における基本転写因子の新規制御機構の解明

細胞の分化は発現遺伝子の大規模な変化によって引き起こされる。発現遺伝子の選択は基本転写因子と転写因子の協調的な働きによって行われるが、基本転写因子の制御機構は不明であった。本研究課題では、細胞分化過程において基本転写因子の構成タンパク質が積極的に分解され、その機能が変化すること、およびこの分解にはユビキチン・プロテアソーム系が関与することを見出した。さらに、筋分化過程と上皮間葉移行過程においては分解の標的となる構成タンパク質が異なっており、上皮間葉移行過程における構成タンパク質の分解は、分化刺激によって発現誘導されるユビキチンリガーゼの働きによって引き起こされることを明らかにした。本研究では、細胞分化に伴う基本転写因子の変化に対するユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク質分解の関与を検証することを目的としている。この目的のために平成25年度には、1)細胞分化に伴ってタンパク質量が変化する基本転写因子構成タンパク質を同定する、2)このうちユビキチン-プロテアソーム系によって分解されるタンパク質を同定する研究計画を立案し、研究を遂行した。細胞分化に伴ってタンパク質量が変化する基本転写因子構成タンパク質の解析では、まず初めにマウス筋芽細胞C2C12の分化誘導法を確立した。C2C12の分化効率は細胞の由来によって異なることが知られているため、由来の異なる3種類のC2C12について分化効率を調べ、最も効率的に分化誘導することができた細胞を今後の実験で使用した。次に、分化過程のC2C12においてタンパク質量の変化が認められる基本転写因子構成タンパク質を解析したところ、増加するものが2種類、減少するものが2種類同定された。このうち増加するタンパク質ではmRNA量の増加も認められたため、主に転写レベルで発現量が制御されていると考えられたが、減少するタンパク質ではmRNA量の有意な変化が見られなかったことから、タンパク質レベルでの制御が疑われた。実際、1種類のタンパク質に関しては、外来プロモーターで安定的に発現させたGPFタグ付きタンパク質においても分化に伴ってタンパク質量が減少することを見出した。ユビキチン-プロテアソーム系によって分解される基本転写因子構成タンパク質の解析では、プロテアソーム阻害薬を用いた実験により、細胞分化過程でタンパク質量が減少する上記のタンパク質2種類が、細胞分化過程においてプロテアソームによって分解されることが明らかとなった。本研究では、ユビキチン-プロテアソーム系による基本転写因子の構成タンパク質の分解と、それが細胞分化過程に果たす役割を検証することを目的としている。平成25年度において、筋分化刺激に伴ってユビキチン-プロテアソーム系によって分解される2つの基本転写因子構成タンパク質を同定した。平成26年度では、これらのタンパク質の分解に関わるユビキチンリガーゼの同定を試みたが、分化刺激によって変化するシグナル伝達系が多岐にわたり、注目すべきユビキチンリガーゼが多数あったため、本計画期間内に同定することは困難であると判断した。そこで、用いる細胞をマウス乳腺上皮細胞NMuMGに変更し、TGF-β刺激によって誘導される上皮間葉移行(EMT)過程を調べることとした。初めにEMTに伴ってプロテアソーム活性依存的にタンパク質量が減少する基本転写因子構成タンパク質を、1種類同定した。この減少は刺激後12時間から認められたため、刺激誘導性のユビキチンリガーゼによって分解が誘導されていると考えられた。そのため、TGF-β刺激によって発現誘導されるユビキチンリガーゼをマイクロアレイのデータから同定し、1つのユビキチンリガーゼが上記基本転写因子構成タンパク質と結合すること、およびユビキチン化と分解を誘導することを見出した。つぎにこの分解経路がEMT過程に果たす役割を解析するため、この基本転写因子構成タンパク質が結合するDNA領域をゲノムワイドに同定したところ、翻訳に関わる遺伝子の上流に結合しその発現を制御することが判明した。また上記ユビキチンリガーゼを発現抑制すると、これらの遺伝子の発現変化が減少することを見出した。以上の結果から、EMT過程において、本研究によって同定されたユビキチンリガーゼが、基本転写因子構成タンパク質を変化させることにより、タンパク質の翻訳を制御していることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度の研究目標であった1)細胞分化に伴ってタンパク質量が変化する基本転写因子構成タンパク質の同定では、C2C12細胞の筋分化過程において増加するタンパク質を2種類、減少するタンパク質を2種類同定することができた。購入可能な抗体を用いて今回調べることができたのは基本転写因子構成タンパク質の約半数であったため、これらの他にもタンパク質量が変化する構成タンパク質がある可能性がある。これらのタンパク質に関しては、遺伝子をクローニングして外来的に発現させた細胞を作製し解析することが可能であるが、これらの遺伝子が比較的大きいものが多くクローニングに時間がかかることが予想されること、および候補タンパク質がすでに2種類存在することから、今回は解析しなかった。もう一つの目標であった

2)ユビキチン-プロテアソーム系によって分解されるタンパク質の同定では、上記タンパク質2種類が、ともにプロテアソームによって分解されることを明らかにした。これらのことから、筋分化系においては、当初の計画通りに研究が進展していると考えられる。しかし、平成25年度に行う予定であったマウス脂肪前駆細胞3T3-L1およびマウス多能性幹細胞(ES細胞)の分化系の実験は、マウス筋芽細胞C2C12の効率的な分化誘導法の確立、マウス細胞で用いることのできる抗体とプライマーの選別、および反応条件の検討などで時間を取られてしまい、遂行することが出来なかった。これらのことを総合的に考慮して、本研究者は平成25年度の研究達成度をやや遅れていると判断した。平成26年度においては、C2C12細胞を用いた実験と並行して、3T3-L1およびES細胞の分化系の確立を急ぐとともに、同様の試薬を用いて同様の実験を行い、異なる分化系においても同様の機構で基本転写因子の変化が制御されているか解析する予定である。平成25年度の研究の結果、2種類の基本転写因子構成タンパク質がC2C12の分化過程においてプロテアソームによって分解されることが明らかとなった。この結果に基づいて平成26年度においては、これらのタンパク質(以下、当該タンパク質と表記)のプロテアソーム分解に必須なユビキチン付加酵素(ユビキチンリガーゼ)を同定するとともに、これらのタンパク質の減少と筋分化の関係を明らかにする。また、同様の分子機構が他の分化系にも機能しているかを、マウス脂肪前駆細胞3T3-L1およびマウス多能性幹細胞(ES細胞)の分化系を用いて調べる。ユビキチンリガーゼの同定では、siRNAライブラリーを用いてユビキチンリガーゼを網羅的に発現抑制し、当該タンパク質の分化に伴う分解に必須なユビキチンリガーゼを単離する。その後、同定されたユビキチンリガーゼが実際に当該タンパク質をユビキチン化するか確認するため、ユビキチンリガーゼの発現抑制または過剰発現を行い、内存性の当該タンパク質のユビキチン化レベルの変化を調べる。同時に当該タンパク質の発現量も調べ、ユビキチン化レベルと逆相関することを確認する。当該タンパク質の減少と筋分化との関係の解明では、細胞分化前に当該タンパク質を発現抑制または過剰発現し、細胞分化効率に対する影響を調べる。また、その際に発現変化が見られる遺伝子と、当該タンパク質を含む基本転写因子が結合している遺伝子の重複を調べ、当該タンパク質の減少と遺伝子発現変化の関係を解析する。当該タンパク質の結合遺伝子はクロマチン免疫沈降後、次世代シークエンサーを用いて同定する。また、遺伝子発現変化は、RNAシークエンス法により検出する。これらと並行して、脂肪前駆細胞3T3-L1およびES細胞の分化系を確立し、C2C12の筋分化系で得られた結果が他の分化系でも同様に機能しているか調べる。
太陽係外惑星の存在を周星ダスト円盤の構造から導き出す理論モデルの構築

ダストおよびガス円盤の構造から、惑星の存在を導き出す手法について継続して研究を行った。惑星の存在を導くには、円盤内ダストの力学的プロセスを詳細に理解することが重要である。近年提案された、ダストの光泳動という、まったく新しいプロセスについて研究を行った。その結果、光泳動によって、原始惑星系円盤のダストは移動し、サイズに依存する特定の場所に蓄積することを示した。その結果、1mm程度より小さいダストは10AU以遠に、1mm程度より大きいダストは0.1-10AUに溜まり、0.1AU程度の穴が中心に開くことが分かった。光泳動は、惑星が形成するのと同じような穴を円盤内に作る。しかし、穴の半径は、ダストの大きさとガス密度のみによって決定され、ダストの物性には依らないという性質があることを明らかにした。この性質を用い、惑星が作る穴と区別することができることを提案した。また、光泳動が働くための条件を求めた。そのため、中心星の幅射がダストに直接届くための条件、および、ダストの自転によって光泳動が抑えられる条件を求めた。その結果、ベガ型星の周りにあると思われるガス円盤では、中心星の輻射がダストを直接照らし、光泳動が生じうることを示した。また、ガス乱流によって生じるダストの回転は、光泳動を抑えるには有効に働かないが、光泳動自身によって生じるダストの回転は十分速くなりうるため、光泳動による移動を減速する可能性があることを明らかにした。また、ガス円盤の分光観測から内部の物理的状態を導き出す手法の開発をおこなった。そのため、理論数値計算で得られた結果から、輻射輸送計算を行い、各周波数でどの程度の強さの輻射を観測することができるかを計算する数値コードを・非熱平衡幅射輸送過程まで考慮して開発した。輻射輸送計算の仕方に工夫を加えることで計算量を圧縮し、効率よく輝線プロファイルの計算を行うことに成功した。星のまわりにある円盤の構造が、惑星や伴星の重力でどのようにゆがむか、ガスとダストそれぞれの成分について、モデル化する手法の開発を行った。まず、ダストのみがある円盤の場合について、ダストの軌道を制限3体問題を解くことにより求め、その軌道を多数のダストについて重ね合わせることにより、円盤の構造を求めるコードの開発を行い、ほぼ完成させた。このコードを使い計算を行った結果、以下のことが明らかになった。形成される円盤の構造は、円盤を構成するダストのサイズによって大きく変わってくる。ダストのサイズが大きいほど、惑星からより遠い共鳴に捕獲され、より長い時間捕獲が維持されるためである。その結果、大きいダストが作る構造は、大きなスケールになり、小さなダストは、小さいスケールの構造を形成することがわかった。また、惑星質量が大きい場合も、より遠い共鳴にダストが捕獲され、大きなスケールの構造ができることがわかった。次に、ガスがある場合については、伴星の重力によってどのような構造が形成されるかを、半解析的に導き出す手法を開発した。ガス流体素片の軌道要素の時間進化の式を、永年摂動論を使って求めた。この定式化において、ガスの圧力を摂動と見なすと、強制力のあるシュレーディンガー方程式に帰着されることを見いだした。この方程式を解き、円盤の構造を求めると、円盤内にバナナ様の構造が形成されることがわかった。これは、若い星である、HD142527のまわりにある円盤の構造と酷似している。この星には、まだ発見されていない伴星があり、その重力によってバナナ様の構造が形成された可能性があることを指摘した。
オーストラリア・アボリジニ社会のおける知識・情報・価値の文化人類学的研究ー先住民土地権の制度化に伴う伝承体系の再編成ー

本研究の目的は、現代アボリジニ社会における知識・情報の分布・継承の様態について、先住民土地権の制度化(1997年、北部準州土地権利法の運用、1994年先住民土地原法の施行)という状況に応じて新たに生じつつある動向に注意しつつ、民族誌的な記述と分析を試みることである。本年度も、国立民族学博物館所蔵の木皮画の写真を現地に持ち込み、木皮画に描かれている神話の語りを聞き取る作業を中心に調査を行った。先住権原法の施行、エコツアー・エスニックツアーなど観光開発や土産芸術品生産へのアボリジニ自身の積極的関与、部族意識と個人意識の乖離、など様々な状況を反映して、神話の個々の語りに変化のきざしが見られ、また地域固有の神話の特徴を融合した神話が創り出されてグローバル化する、といった現象も各地に起こっている。それと同時に,グローバル化した神話が非アボリジニ社会に流布し、新たなアボリジニのイメージを形成するといった現象が起き始めており、近年普及したインターネットがこれを促進している。自然環境に優しい生活スタイル、精神世界の豊かさ、などのキーワードで代表されるイメージが世界の各先住民に付与され、それに対する西欧社会のファン達がインターネット上で活発な発言を続けており、オーストラリア・アボリジニもその例外ではない。アボリジニ社会の側にも、こうした外部世界が抱くアボリジニ観を観光開発に活用しようとする者、「正しい」神話の伝統が変容することを憂える者、など、様々な反応が現れ始めた。これらアボリジニ側の議論もまた、インターネットを始めとする様々なメディア上で展開されており、コミュニケーションのグローバル化、遠隔地域に住む人々を結んだ新たなコミュニティ意識の芽生え、など、極めて興味深い現象が生じつつある。このように大きく変化しつつある状況の中で、神話をはじめとする知識体系がどのように継承されていくのかを現在追跡することの重要性は、ますます高まっていると言える。本研究の目的は、現代アボリジニ社会における知識・情報の分布・継承の様態について、先住民土地権の制度化(1977年北部準州土地権利法の運用、1994年先住民土地権原法の施行)という状況に応じて新たに生じつつある動向に注意しつつ、民族誌的な記述と分析を試みることである。平成7年度は、具体的な方法として、国立民族学博物館所蔵の木皮画資料250点のうち100点を選び、その写真を各自現地に持ち込んで、そこに描かれている神話の語りを聞き取る調査を行った。この場合、木皮画の作者だけでなく、その神話を認知しているクランの成員、あるいは近縁の住民がインフォーマントである。従来は、同一の神話として一くくりにされている木皮画の語りに、語り手によって微妙な差異のあることが確認できた。個々の語りには、先住民土地権の制度化に伴って、重点の置き方の変化、ジェンダーの問題、住民側の土地権意識の差異、などが反映していると考えられる。また、観光地と隣接する地域、保護区時代から続く隔離地域、鉱山開発に関わって航空アクセスの発達した地域、など、特性の異なるア-ネムランドの各地域の特性も語りに反映されていると予想される。調査結果の分析においては、これらの地域性の把握も考慮する。さらに、言語学的調査とともに、父系だけでなくクラン間の交錯といった神話伝承システムの解明にも留意して分析を進める。調査結果は、知識伝承とその変化を総合的に記録するために木皮画1点に複数の語りをリンクさせる構造のデータベースとして組織化する。本研究で開発するデータベースは、オーストラリアの各研究機関や美術館で構想されているアボリジニ芸術データベース構築との連係も考慮し、インターネットでの公開も視野に含める。

本研究の目的は、現代アボリジニ社会における知識・情報の分布・継承の様態について、先住民土地権の制度化(1977年、北部準州土地権利法の運用、1994年、先住民土地権原法の施行)という状況に応じて新たに生じつつある動向に注意しつつ、民族誌的な記述と分析を試みることである。平成8年度は、前年度に引き続き、国立民族学博物館所蔵の木皮画資料250点の内100点を選んで各自が現地に持込み、そこに描かれている神話の語りを聞き取る調査を行った。先住民原法の施行、エコツアー・エスニックツアーなどの観光開発や土産芸術品生産へのアボリジニ自身の積極的関与、部族意識と個人意識の乖離、など様々な状況を反映して、神話の個々の語りに変化のきざしが見られ、また地域固有の神話の特徴を融合した神話が創り出されてグローバル化する、といった現象も各地に起こっている。さらに、太陽光発電装置や通信衛星を使った電話網がブッシュ内の村々にも行き渡るなど、生活インフラとともに情報インフラの変化もめざましく、インターネットを始めとするコンピュータ化がアボリジニ・コミュニティにも広がり始めるという、数年前には予想だにしなかった状況が急速に進行している。これに伴って、アボリジニ自身のコミュニケーションがグローバル化し、また同時に、遠隔地域に住む人々を結んだ新たなコミュニティ意識の芽生えなど、極めて興味深い現象も生じつつある。このように大きく変化しつつある状況の中で、神話がどのように継承されていくのかを現在追跡することの重要性はますます高まっていると言える。今年度の調査では、現地でのオーラルな語りとしての神話だけでなく、アボリジニ・テーマパークでの語り、インターネット上での語り、など、多面的な語りの収集に努めており、現在、それら相互の関係を明らかにし、変化の方向を探るべく、分析を進めている。それと同時に、前年度から開始した木皮画データベースの構築を引き続き進めている。本研究の目的は、現代アボリジニ社会における知識・情報の分布・継承の様態について、先住民土地権の制度化(1977年、北部準州土地権利法の運用、1994年先住民土地権原法の施行)という状況に応じて新たに生じつつある動向に注意しつつ、民族誌的な記述と分析を試みることである。本年度も、国立民族学博物館所蔵の木皮画の写真を現地に持ち込み、木皮画に描かれている神話の語りを聞き取る作業を中心に調査を行った。先住権原法の施行、エコツアー・エスニックツアーなど観光開発や土産芸術品生産へのアボリジニ自身の積極的関与、部族意識と個人意識の乖離、など様々な状況を反映して、神話の個々の語りに変化のきざしが見られ、また地域固有の神話の特徴を融合した神話が創り出されてグローバル化する、といった現象も各地に起こっている。それと同時に、グローバル化した神話が非アボリジニ社会に流布し、新たなアボリジニのイメージを形成するといった現象が起き始めており、近年普及したインターネットがこれを促進している。自然環境に優しい生活スタイル、精神世界の豊かさ、などのキーワードで代表されるイメージが世界の各先住民に付与され、それに対する西欧社会のファン達がインターネット上で活発な発現を続けており、オーストラリア・アボリジニもその例外ではない。
安全で繊細な小児高難度内視鏡手術のための鉗子先端圧検出システムの開発と妥当性評価

小児高難度内視鏡手術は、力触覚が得られ難い上、組織脆弱性や狭小空間という小児特有の制約から普及が進まない。そのため、術前トレーニングの必要性が認識されているが適切なツールがない。そこで、本研究では新生児や乳児内視鏡手術で求められる鉗子操作を正確に評価し、効率的なトレーニングを可能とする鉗子先端に発生する力触覚情報を取得できるセンサ付き鉗子を開発し、手技評価やトレーニングにおける妥当性を検証する。
MRIによる温度分布計測可能な組織内照射加温併用システムの開発

平成9年度は高線量率192-Ir-RALSと併用可能でかつ臨床用MRI装置内で使用可能な電極の設計開発を行い、大型コンピュータにて磁界強度、電界強度を計算しRF誘電型組織内加温装置の設計を行った。また、温度分布計測ソフトのMRI装置内への設置を行い、MRI装置で純粋ファントムによる基礎実験を行い、プロトン科学シフトを主とする温度依存パラメータの精度の検討を行った。平成10年度は傾斜磁場と加温装置のRP磁場ノ相互作用を検討し、磁場ゲートシステムを開発した。この加温装置、温度計測システムを用いて、実験動物の加温実験を行い、安全性・精度を確認した。また、加温治療中の画像変化と実験動物の病理組織の変化を比較検討した。平成11年度は平成9年度から10年度までに得られた知見をまとめ、臨床応用の検討を行った。様々の非磁性体金属で電極を試作して、寒天ファントムの間に挟んで画像を撮像して磁場への影響を検討した。その結果、モリブデン製、タングステン製が磁場への影響が少なく、弾性も有しており、組織内電極に適したことがわかった。また、動物実験として、本システムによる家兎のin vivo組織内加温中の温度変化表示を0.2-T開放型IVR用MRI装置に頭部用コイルを使用して試みた。In vivoの大腿部組織内加温中の温度変化画像を作成し、局所の+8°Cの温度上昇を温度変化画像上で表示できた。温度変化画像の作成に要する時間は約5秒であった。使用したタングステン製の組織内電極と外部電極によるアーチファクトは軽微であった。これによってRF組織内加温中のリアルタイム温度モニター実現の可能性が示唆された。1.高線量率192-Ir RALSと併用可能なRF誘電型組織内加温装置の開発(1)RF誘電型組織内加温用電極の設計RALS用アプリケータに挿入可能でかつ柔軟性を持つ組織内加温用電極を設計した。加温方法は組織内に挿入したRALSアプリケータ内の針型内部電極と、平板状外部電極間に高周波電界を与え内部電極周囲にジュール熱を集中させるものである。(3)電極の温度上昇分布の実験的検討試作した針型内部電極とプロトタイプのRF発振器で、寒天ファントムの加温実験を行い、温度上昇分布を検討した。(4)臨床用MRI装置内で仕様可能なRF組織内加温装置の開発出力・周波数可変式、8チャンネルの高磁場対応型RF組織内加温装置を作成した。2.臨床用MRI装置を用いた温度分布計測システムの開発Interventional Radiology用0.2-TオープンマグネットMRI装置で、硫酸銅水溶液ファントムを用いた基礎的実験を行った。低磁場装置でのプロトン化学シフトを用いた温度分布計測法の精度を検討した。また、動物骨格筋を用いて温度分布画像の作成を行った。1. MRI用寒天ファントムの試作従来RF加温の実験で使用していた筋肉等価寒天ファントムは本研究で使用するMRシーケンスでは良好な画像が撮像できなかった。また、既存のMRI用ファントムは硫酸銅あるいは硫酸ニッケル水溶液で液体状のため組織内加温の実験には不向きである。そこで、筋肉等価寒天ファントムに0.12%硫酸ニッケルを添加し、MRI用寒天ファントムを試作した。2. MRI装置内で使用可能な、RF誘電型組織内加温用電極の開発2.1.組織内電極の試作様々な非磁性体でスプリング型電極を試作し、組織内加温用RALSアプリケータに挿入可能で柔軟性と弾性を持つ金属を選択した。すなわちタングステン製(直径1.14mm,有効長10cm)が最適であった。

2.2.外部電極の試作平板状外部電極はまず銅製板を試作したが、MR装置内では誘導渦電流が発生しノイズの原因となるため、これを解決する目的で櫛状の電極とした。2.3.上記1のファントムに2.1の組織内電極を刺入、2.2の外部電極を使用してMRI画像を撮像したところ、アーチファクトの少ない良好な画像が得られた。3.昨年度開発したRF組織内加温装置をMRI磁場シールド外に設置した。磁場シールドを貫通するトンネルを通ってリード線を電極に接続する。出力・周波数のパソコン表示を可能とした。RF加温装置とMR装置のインターロック機構の開発が次年度の課題である。4. MRI装置コンソール上での温度計測シーケンスの作成Interventional Radiology用0.2TオープンマグネットMRI装置コンソール上に温度計測用シーケンスを作成した。上記1のファントムに2.1、2.2の電極を使用して3.の加温装置で加温前後の温度変化画像をMRIコンソール上で作成した。1.MRI装置内で使用可能なRF誘電型組織内加温用電極の開発MRI装置で使用する加温用電極としては、非磁性体であること、誘導電流によって磁場を乱さないこと、外部ノイズを導入しないことが要求される。さらに我々の開発するシステムで使用するためには、5Frナイロン製組織内加温用RALS用アプリケータに挿入可能で臨床利用に耐えうる柔軟性と弾性を持つ組織内電極が必要である。様々の非磁性体金属で電極を試作して、寒天ファントムの間に挟んで画像を撮像して磁場への影響を検討した。その結果、モリブデン製、タングステン製が磁場への影響が少なく、弾性も有しており、組織内電極に適していた。2.動物実験本システムによるin vivo組織内加温中の温度変化表示を試みた。装置は0.2-T開放型IVR用MRI装置に頭部用コイルを使用した。全身麻酔下の雌家兎の大腿骨格筋内に高線量率RALS用カテーテルを刺入し、さらに直径1.17mm、長さ50mmのタングステン製内部電極を挿入した。発信周波数9.0-12.5MHz,出力1.0-7.0Wで加温した。In vivoの大腿部組織内加温中の温度変化画像を作成し、局所の+8°Cの温度上昇を温度変化画像上で表示できた。温度変化画像の作成に要する時間は約5秒であった。使用したタングステン製の組織内電極と外部電極によるアーチファクトは軽微であった。RF組織内加温中のリアルタイム温度モニターの実現の可能性が示唆された。
生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞樹立による固有魚類の保全

琵琶湖固有魚種の生存数は近年激減し、絶滅が危惧されている。本研究は、幹細胞生物学を用いて、個体作成が可能な細胞として固有種を保存する方法の確立を目的とした。まず琵琶湖固有種(ホンモロコ)の精巣、卵巣、受精卵由来細胞の培養、細胞株樹立方法を確立した。同時に、樹立細胞を用いて、内分泌かく乱物質・ノニルフェノールがホンモロコ精巣において雄性ホルモンを抑制することを初めて明らかにすると共に、様々な分化段階の生殖細胞の定量解析方法を開発した。さらに精原細胞をin vitro培養し、受精能を有する精子を形成することに成功し、精原細胞の凍結保存の併用による固有種遺伝資源の新たな保存方法を確立した。1.繁殖期、非繁殖期における琵琶湖固有種ホンモロコの精巣由来、及び卵巣由来細胞株の樹立と精原細胞の増殖条件の検討昨年度、樹立した条件を用いて繁殖期から非繁殖期にかけて様々な時期でのホンモロコの精巣由来細胞株(セルトリ細胞)、及び卵巣由来細胞株の樹立を試み、各時期においてそれぞれの細胞株樹立に成功した。遺伝子発現解析、および精巣切片での抗体染色の結果、精巣由来細胞はセルトリ細胞(Sox9a)、また卵巣由来細胞は、夾膜細胞(WT1a)由来と推定された。それら細胞株は樹立時期により、形態が類似したもの、異なるもの等様々であった。また遺伝子発現を比較すると、セルトリ細胞株ではCyp19a, Foxl2, Dmrt1を発現している株としていない株が認められた。さらにこれらの細胞株がエストロジェン、アンドロジェン、プロジェステロン、グルココルチコイド受容体を発現しており、環境水中のホルモン様物質が固有種ホンモロコのセルトリ細胞、夾膜細胞に与える影響を直接検出可能なテーラーメードバイオセンサーとして利用可能であることを見出した。樹立したセルトリ細胞株をフィーダーとして、精巣細胞の培養条件を検討し、セルトリ細胞の上に接着してコロニーを形成するvasa陽性の精原細胞を約1ヶ月維持することができた。しかしその数は徐々に減少し、さらなる検討が必要であることが示された。2.ホンモロコにおける精子のin vitro分化系の確立一方で非繁殖期の精巣からin vitroによる、精子分化実験を行い、尾と運動能を有した精子を分化させることに成功した。BrdUの取り込み実感により、これらの精子が精原細胞から分化したものであることがわかった。またFACS解析により、1倍体の核相を有することが示された。すなわち琵琶湖固有種ホンモロコにおいて、精子のin vitro分化系が確立できた。ホンモロコの受精卵由来細胞株の特性解析および培養条件の検討を行った。その結果、受精卵で高い発現を示すOct4(Pou2), nanog, sox2, klf4は発現していないが正常な染色体数を維持していること、また様々な核レセプターを発現していることが明らかとなった。本研究で樹立した細胞株がエストロジェン、アンドロジェン、プロジェステロン、グルココルチコイド受容体を発現していることから、セルトリ細胞由来細胞にMMTV/pGL4.36ベクターを導入し、内在性の核内レセプターを用いたアンドロジェン、プロジェステロン検出系を構築した。その結果、本細胞株は魚類特有のアンドロジェン,11KTおよびプロジェステロン,DHPに特異的、濃度依存的に反応するが、テストステロンには反応しないこと、内分泌攪乱作用を持つとされるノニルフェノールが、琵琶湖固有種ホンモロコのセルトリ細胞に対して抗アンドロジェン作用を持つこと、またビスフェノールAがアンドロジェン様作用を有することが明らかとなった。これらの結果は、本細胞株が固有種特有のホルモン応答、内分泌攪乱作用を検出するテーラーメードバイオセンサーとして利用可能であることを示唆した。次にホンモロコにおける精子のin vitro分化系の確立を目的とし、繁殖期、非繁殖期の成魚精巣に加え、稚魚精巣を用いてin vitro分化実験を行い、運動能を有した精子分化に成功した。フローサイトメトリー解析により、1倍体精子の形成が確認されたことからin vitroで減数分裂が正常に進行していると考えられた。また、ゼブラフィッシュ受精卵由来の初代培養細胞を用い、ヒトOct4,Sox2, Klf4,c-Myc遺伝子をエレクトロポレーションにより導入し、iPS細胞の樹立実験を試みたところ、アルカリフォスファターゼ弱陽性コロニーの形成が認められた。1.琵琶湖固有種ホンモロコの精巣由来細胞株(セルトリ細胞)の樹立精原細胞の樹立に先立ち、その維持、成熟生殖細胞分化に必要とされる精巣に存在する体細胞(セルトリ細胞)の樹立を行った。琵琶湖固有種であるホンモロコはコイ目、コイ科である。そこで同じコイ科に属するゼブラフィッシュのセルトリ細胞株の樹立、培養条件を参考にして細胞株の樹立を試みた。

その結果、初期は順調に増殖するが、継代が進むと急激に増殖が落ち、増殖しなくなるという現象が見いだされた。そこで様々な増殖因子を添加し、ホンモロコ細胞が増殖可能な培養条件を見いだした。この方法で培養することにより、ホンモロコから精巣由来の細胞株樹立に成功した。樹立した細胞株の遺伝子発現を調べたところSox9a,WT1,等の精巣特異的遺伝子発現が認められた。一方でVasa, Ziwi等の生殖細胞特異的遺伝子発現は認められなかったことからホンモロコのセルトリ細胞株が樹立できたと考えられた。2.セルトリ細胞株樹立条件下における精原細胞の増殖条件の検討上記、精巣由来の細胞株樹立条件で培養するとセルトリ細胞の上に接着してコロニーを形成する精原細胞も培養初期に観察された。その増殖はある程度維持されたが継代を重ねるにつれてそれらの数は減少し、最終的に失われた。培養液にマウス生殖幹細胞(GS)の増殖に必要な因子GDNF, LIFを添加し、精原細胞の増殖を観察し、精原細胞樹立条件の検討を行ったが、体細胞の増殖が早く、生殖細胞培養には体細胞の混入を最小限にすることが重要であると考えられた。一方で精原細胞は常に体細胞の上に接着して存在したことからその培養にはフィーダーとしての体細胞が必要であることが示された。さらにセルトリ細胞株の樹立条件でホンモロコの受精卵由来の細胞株も樹立することができた。生物の保全においては配偶子等細胞の凍結保存法の開発が必要となる。そこで精原細胞の凍結保存を試みたところ、ガラス化冷却法を用いることにより、精原細胞を効率良く保存できることがわかった。さらに精原細胞培養、およびin vitro精子分化に関して、培養条件の至適化を試み、体細胞の増殖を抑制する事により、効率良く精子分化が進行し、天然の精子を用いた時とほぼ同等の受精率を得る条件を見いだす事ができた。次にin vitro分化により得られた精子の配偶子としての機能を確認するため、人工授精実験を行った。その結果、非繁殖期精巣から採取した生殖細胞を分化させて得られた精子が実際に受精能を有することが示された。すなわち本研究で確立した精原細胞のin vitro分化により、機能的な精子を形成できることが明らかとなった。さらに他魚種の未受精卵を使用することにより、受精能の検証が可能であることも示した。また、精原細胞培養、および精子分化培養において、核DNAのPI染色とvasa抗体染色を併用し、フローサイトメトリーにより、体細胞と生殖細胞、さらに精原細胞、精母細胞、精子を区別して定量出来る分析系を確立した。iPS細胞樹立実験においては、ホンモロコ受精卵由来細胞からは、iPS細胞様のコロニーは検出されなかった。一方、ゼブラフィッシュ細胞から、弱いアルカリフォスファターゼ活性、vasaを発現するコロニー形成が認められたがOct4, Nanog等多能性マーカーの発現は、認められなかった。以上本研究により、琵琶湖固有種において、精原細胞の凍結保存と、in vitro精子分化系を組み合わせ、受精能を有する精子を作製する新規の保存方法を確立する事ができた。
森林を利用した温暖化ガス固定対策における土壌呼吸の評価に関する研究

森林を利用した温暖化ガス固定対策における土壌呼吸の評価を行うため、土壌呼吸の計測装置の開発、その計測ソフトフェア開発および計測システム化を用いて土壌呼吸の評価を行うことにある。装置の概略:土壌呼吸用チェンバー、空気流量設定および流路切り替え装置(最大6チャンネル)、外線ガス分析装置などで構成される。装置の仕様:測定方式:差動型バッチ式通気法(5+1系統)差動型バッチ式通気法(3+3系統)差動型連続式通気法(1+1系統)・チェンバー:200Wx100Dx10H容積:200ml温度・湿度成り行き・通気流量:25 l/m、精度:±3%FS濃度差によって可変・切り替えインターバル:11440分チャンネルごと可変・計測項目:チェンバー内温度(熱電対)通気流量、CO2濃度絶対値、CO2濃度差、H2O濃度絶対値、H2O濃度差・演算項目:CO2/H2Oフラックスおよびこれらの積算値計測ソフトウェアの調整に膨大な時間を要し、現場での測定は科研の年度中には不可能になった。従来の測定法の検討:アルカリ吸収法(ソーダライムとKOH)と通気法を用いて各種測定法の検討した。その結果、実際の森林で土壌呼吸を測定する場合には、ソーダーライムを5-10グラムを密閉した容器に入れ、その重量変化を測定するのが最も簡便で能率がよい。ただし、土壌含水比が25%を越えるような場合には、ソーダライムが水分も吸収するため、アルカリ吸収法がよい。通気法は他の方法に比べて最も精度が良かった。森林を利用した温暖化ガス(主として炭酸ガス)固定対策における土壌呼吸の評価を行うため、本研究では土壌呼吸の測定装置の開発、計測ソフトフェア開発およびこれらのトータルシステム化を計ることにあるが、本年度は研究の重点を測定装置の開発に置いた。装置の概略:土壌呼吸用チェンバー、空気流量設定および流路切り替え装置(最大6チャンネル)、赤外線ガス分析装置などで構成される。装置の仕様:・測定方式:差動型間欠式通気法(5+1系統)差動型間欠式通気法(3+3系統)差動型連続式通気法(1+1系統)これらの三つのモードをソフトウェアによって作動させる。・チェンバー:200W×100D×10H容積:200ml温度と湿度は成り行き・通気流量:25l/m精度:±3%FS濃度差によって可変・切り替えインターバル:11440分チャンネルごと可変・計測項目:チェンバー内温度熱電対050°C±0.5°C通気流量マスフローコントローラ010l/m ±1.5%CO2濃度絶対値赤外線ガス分析計01000ppm ±1%FSH2O濃度絶対値赤外線ガス分析計03% ±1%FS・演算項目:C02/H2Oフラックスおよびこれらの積算値森林を利用した温暖化ガス(主として炭酸ガス)固定対策における土壌呼吸の評価を行うため、土壌呼吸の計測装置の開発、その計測ソフトウェア開発およびこれらのトータルシステム化を行うことにあるが、本年度は研究の重点を従来の測定方法の検討と昨年度試作された計測装置の調整およびソフトウェアの修正を行った。装置の試作およびその調整:土壌呼吸用チェンバー、空気流量設定および流路切り替え装置(当面最大6チャンネル)、外線ガス分析装置などで構成される。・計測項目:チェンバー内温度熱電対050°C±0.5°C」通気流量マスフローコントローラ010l/m ±1.5%」CO2濃度絶対値赤外線ガス分析計01000ppm ±1%FS」H2O濃度絶対値赤外線ガス分析計03% ±1%FS」・演算項目:CO2/H2Oフラックスおよびこれらの積算値研究の重点は計測ソフトウェアの改良をおもに行った。ソフトウェアの調整が可能になったのは年末になってからなので、現場での測定は次年度に持ち越された。

従来の測定法の検討:アルカリ吸収法(ソーダライムとKOH)と通気法を用いて、各種測定法の検討した。その結果、実際の森林で土壌呼吸を測定する場合には、ソーダーライムを5-10グラムを密閉した容器に入れ、その重量変化を測定するのが最も簡便で能率がよい。ただし、土壌含水比が25%を越えるような場合には、ソーダライムが水分も吸収するため、アルカリ吸収法がよい。通気法は他の方法に比べて最も精度が良かった。森林を利用した温暖化ガス固定対策における土壌呼吸の評価を行うため、土壌呼吸の計測装置の開発、その計測ソフトフェア開発および計測システム化を用いて土壌呼吸の評価を行うことにある。装置の概略:土壌呼吸用チェンバー、空気流量設定および流路切り替え装置(最大6チャンネル)、外線ガス分析装置などで構成される。装置の仕様:測定方式:差動型バッチ式通気法(5+1系統)差動型バッチ式通気法(3+3系統)差動型連続式通気法(1+1系統)・チェンバー:200Wx100Dx1OH容積:200ml温度・湿度成り行き・通気流量:25 l/m精度:±3%FS濃度差によって可変・切り替えインターバル:11440分チャンネルごと可変・計測項目:チェンバー内温度熱電対、通気流量、CO2濃度絶対値、CO2濃度差、H2O濃度絶対値、H2O濃度差・演算項目:CO2/H2Oフラックスおよびこれらの積算値計測ソフトウェアの調整に膨大な時間を要し、現場での測定は科研の年度中には不可能になった。
組換え体セントロメア蛋白質のDNA結合能を用いたセントロメアDNAの単離

1.DNA結合能を持つ新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の同定DNA結合活性を持つセントロメア蛋白質(CENPs)を同定するため、ヒトcDNAライブラリーより抗セントロメア血清に反応するクーロンをスクリーニングし、この中からセントロメア蛋白質B(CENP-B)、セントロメア蛋白質C(CENP-C)、ヘテロクロマチン蛋白質1(HP1)をコードする遺伝子を得た。大腸菌に発現させた組換え体蛋白質を用いた解析により、これらがDNA結合能をもつことを明らかにした。続いて、ゲル移動度シフト法、サウスウェスタンブロット法によりこれらの蛋白質のうち、DNA結合能を持つ領域の限定を行った。その結果、CENP-BについてはN末端135アミノ酸残基の領域に、CENP-Cは内部の104アミノ酸残基の領域に、HP1については内部の64残基の領域に存在することが明らかになった。また、CENP-CとHP1については、そのアミノ酸配列に類似性が存在した。2.DNAアフィニティー沈降法を用いたCENP-B結合配列の単離ヒトCENP-Bについてはセントロメア領域のサテライト(アルホイド)に存在する幾つかの配列に結合することが知られているが、その結合配列の詳細は不明であった。そこで、標的配列を単離・解析するため、ヒト組換え体CENP-Bを用いたDNAアフィニテイー沈降法を開発した。これを用い、ヒトゲノムライブラリーより、CENP-Bの結合するセントロメアルホイドDNAを単離した。実際、塩基配列を解析した結果、新たなCENP-B結合配列が存在していた。この研究は、組換え体ヒトセントロメア蛋白質の特異的DNA結合能を積極的に活用し、各種真核生物の染色体に存在するセントロメアDNA配列を単離、解析することを目的としている。1.DNA結合活性を持つ新たなヒトセントロメア蛋白質の同定現在までにDNA結合能を持つ蛋白質としては、セントロメア蛋白質B(CENP-B)のみが知られていた。CENP-Bの他に、DNA結合能を持つセントロメア蛋白質としては、セントロメア蛋白質A及びC(CENP-A、CENP-C)が候補に考えられた。そこで、ヒトCENP-Cの遺伝子をクローン化し、大腸菌に発現させた組換え体蛋白質を用いた解析を行った。その結果、新たにヒトCENP-CもDNA結合能を持つことが明らかとなった。現在、このCENP-Cが結合するヒトゲノムDNA配列について解析を行っている。既に、組換え体ヒトCENP-BのDNA結合能を利用したDNA免疫沈降法を用いて、ヒトゲノムDNAライブラリーより直接、CENP-B結合配列を多数含むセントロメアDNA配列(アルホイドDNA)を単離する事に成功している。CENP-B遺伝子は少なくとも哺乳動物においてよく保存されている事より、ウシ染色体においてもCENP-B結合配列が存在することが予想された。そこで、先と同様な手法を応用し、ウシゲノムDNAよりヒトCENP-Bが結合する配列としてのウシセントロメアDNA配列を単離することを試みた。得られたDNAの塩基配列を解析したところ、ヒトCENP-B結合配列と相同性を示した。しかも、その配列はヒトCENP-Bにより認識された。現在、この配列がウシセントロメアDNA配列であるかどうかの検討を行っている。1。DNA結合能を持つ新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の同定昨年度までに、ヒトセントロメア蛋白質B(CENP-B)、及びセントロメア蛋白質C(CENP-C)について、これらがDNA結合能をもつことを明らかにしている。今回、これ以外の新たにDNA結合活性を持つセントロメア蛋白質を同定するため、ヒトcDNAライブラリーより抗セントロメア血清に反応するクローンをスクリーニングし、この中からCENP-B、CENP-C両遺伝子ではないものを選択した。その結果、3つの独立したクローンが得られた。

これらの塩基配列を決定したところ、二つは未知の蛋白質の異なる長さの領域を、もう一つはショウジョウバエで同定されているヘテロクロマチン蛋白質(HP1)のホモログをコードしていた。哺乳動物のHP1は最近になって、セントロメア領域近傍に存在することが明らかにされている。そこで、HP1遺伝子を大腸菌に発現させ、ゲル移動度シフト法、サウスウェスタンブロット法によりDNA結合能を解析したところ、ヒトHP1もDNA結合活性を持つことが明らかとなった。2。オリゴDNAを用いたヒトCENP-Bが結合する最小塩基配列の決定ヒトCENP-Bはセントロメア領域のサテライト(アルホイド)に存在する幾つかの配列に結合することが知られているが、その結合配列の詳細は不明であった。そこで、標的配列と思われる塩基を2塩基ずつ置換したオリゴヌクレオチドを作成し、組換え体CENP-Bを用いたDNAアフィニティー沈降法により個々の配列のCENP-B結合性を検討した結果、ヒトCENP-Bの結合配列にはかなりの多様性があることが判明した。1。DNA結合能を持つ新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の同定DNA結合活性を持つセントロメア蛋白質(CENPs)を同定するため、ヒトcDNAライブラリーより抗セントロメア血清に反応するクローンをスクリーニングし、この中からセントロメア蛋白質B(CENP-B)、セントロメア蛋白質C(CENP-C)、ヘテロクロマチン蛋白質1(HP1)をコードする遺伝子を得た。大腸菌に発現させた組換え体蛋白質を用いた解析により、これらがDNA結合能をもつことを明らかにした。続いて、ゲル移動度シフト法、サウスウェスタンブロット法によりこれらの蛋白質のうち、DNA結合能を持つ領域の限定を行った。その結果、CENP-BについてはN末端135アミノ酸残基の領域に、CENP-Cは内部の104アミノ酸残基の領域に、HP1については内部の64残基の領域に存在することが明らかとなった。また、CENP-CとHP1については、そのアミノ酸配列に類似性が存在した。2。DNAアフィニティー沈降法を用いたCENP-B結合配列の単離ヒトCENP-Bについてはセントロメア領域のサテライト(アルホイド)に存在する幾つかの配列に結合することが知られているが、その結合配列の詳細は不明であった。そこで、標的配列を単離・解析するため、ヒト組換え体CENP-Bを用いたDNAアブィニティー沈降法を開発した。これを用い、ヒトゲノムライブラリーより、CENP-Bの結合するセントロメアルホイドDNAを単離した。実際、塩基配列を解析した結果、新たなCENP-B結合配列が存在していた。
胃・大腸がんの腹膜、リンパ節転移に対する新しい光イメージングの基礎的研究

本研究では期間内に以下の3点を達成した。1)胃がん細胞株からLuc発現細胞株を作成、マウス腹腔内に接種し、Luc発光を指標としてICG標識したEGFR抗体による腹膜転移の蛍光イメージング法を確立した。2)ICGに対して高感度なCCDカメラ、硬性鏡と光源を組み合わせた蛍光腹腔鏡システムを試作し、抗体プローブを用いて腹膜転移巣の腹腔鏡による蛍光イメージングに成功した。3)上記胃癌細胞株をマウス胃奨膜に包埋同所移植を行い、胃所属リンパ節転移モデルの作成に成功した。以上,デバイスとモデルの両面から胃がんの腹膜転移、リンパ節転移に対する蛍光腹腔鏡イメージングの前臨床的な基盤を確立した。本研究は胃がんの腹膜転移、リンパ節転移の早期診断,治療効果モニタリングのための体外および体内(腹腔鏡)イメージング法に関する基盤技術を確立することである。本年度は体内イメージングについて以下の3点を明らかにした。1)EGFR, HER2発現の異なる胃がん細胞株にLuciferase(GFP)遺伝子の発現ベクターを導入し、安定細胞株を作成した。これらの細胞株をマウス腹腔内に接種し、Luciferase発光(GFP蛍光)を陽性コントロールとして近赤外蛍光色素(ICG)標識したCetuximab, Trastuzumab抗体による腹膜転移の蛍光イメージングをIvisを用いて行った。その結果、EGFRを発現する胃がん細胞株すべてについて、腹腔内接種により作成した腹膜転移の発光イメージに一致したICG蛍光イメージを取得することに成功した。2)一方、上記プローブを用いて体内(腹腔鏡)イメージングシステムを試作した。ICGに対して高感度なCCDカメラを接続した硬性鏡と、各種光源(ハロゲン,レーザー光,波長800 nm)を接続した硬性鏡を試作し、暗視野でマウス腹膜転移巣を観察した。その結果、発光(GFP蛍光)イメージとICG蛍光イメージとが重なり合うことを確認した。3)リンパ節転移の体内イメージングのために、リンパ節転移能を有するGCIY-GFP細胞の皮下移植腫瘍を摘出し,1 mm角に細切した後、ヌードマウスの胃奨膜に同所移植を行った。1ヶ月後に開腹し、頻度は低いながらも胃の所属リンパ節に転移を認めた。現在,この転移腫瘍を培養し、胃リンパ節高転移性株を作成中である。これをもとに今後、微小リンパ節転移の体内イメージングに取り組む予定である。本研究の目的は発光、蛍光等の光イメージング法を駆使して、胃がんの臨床上最重要課題である腹膜転移、リンパ節転移の早期診断,治療効果モニタリングのための体外および体内(腹腔鏡)イメージング法に関する基盤技術を確立することである。本年度は体内イメージングについて以下の2点を明らかにした。1)ICGに対して高感度なCCDカメラを接続し、その画像をリアルタイムにモニター上で観察できる蛍光腹腔鏡を試作し、各種光源(ハロゲン,レーザー光,波長800 nm)を用いた蛍光イメージングシステムを作製した。また近赤外蛍光色素(ICGあるいはICG封入リポゾーム)標識したcetuximab, trastuzumab抗体を予め転移を形成しておいたマウス腹腔内に注射し、1日後にマウスを屠殺•開腹し、腹膜転移巣、リンパ節転移巣を暗視野で観察し、Ivis Lumina IIを用いた発光(ICG蛍光)イメージと腹腔鏡型ICG蛍光イメージを比較することで本蛍光復腔鏡イメージングシステムの感度,特異性などの性能を検証した。2)EGFR (HER2)発現の異なる胃がん細胞株4株(GLM-1, MKN-28, MKN-45およびGCIY)にLuciferase(GFP)遺伝子をコードする発現ベクターを導入し、遺伝子発現の強い安定細胞株を作成する。腹膜転移は上記細胞を復腔内接種することにより作成した。胃癌のリンパ節転移モデルはリンパ節転移能を有するGCIYーGFP細胞の皮下移植腫瘍を摘出し,1 mm角に細切した後、ヌードマウスの胃奨膜に包埋同所移植を行うことにより作成した。本モデルを用いて移植2ヶ月後に開腹し、GFP蛍光イメージングを行うと、胃から食道に至る胃所属リンパ節転移巣に蛍光を認め、リンパ節転移モデル作成に成功した。本年度は体外イメージングについて以下の2点を明らかにした。1)EGFR, HER2発現の異なる胃がん細胞株4株(GLM-1, MKN-28, MKN-45およびGCIY)にLuciferase遺伝子をコードする発現ベクターを導入し、遺伝子発現の強い安定細胞株を作成した。

これらの細胞株をマウス腹腔内に接種し、Luciferase発光を陽性コントロールとして近赤外蛍光標識(Xenolight750)したCetuximab, Trastuzumab抗体による腹膜転移の蛍光イメージングをIvis lumina IIを用いて行った。その結果、EGFRを発現する上記の4種類の胃がん細胞株すべてについて、腹腔内接種により作成した腹膜転移の発光イメージに一致した蛍光イメージを取得することに成功した。2)同様に、HER2陽性胃がん細胞GLM1-Lucの腹膜転移モデルを用いて近赤外蛍光標識抗体Xeno750-Trastuzumabによる蛍光イメージングを行った。その結果、蛍光イメージと発光イメージが重なり合うこと、Xenolight750-Retuximab(CD20抗体)では転移巣の蛍光イメージは認められないことから、転移巣への集積の特異性が示された。さらにXenolight750の代わりに臨床で使用され、安全性の確立した近赤外蛍光色素(ICG)で標識した場合でもXenolight750とほぼ同様な感度を有することを明らかにした。胃がんのLuciferase(GFP)導入細胞を用いて、ICGで標識したCetuximabおよびTrastuzumab抗体の腹膜転移の体外蛍光イメージングを行い、感度と特異性を確認した。胃リンパ節転移のイメージングに関してはモデルを作成中であることから、計画の達成率はほぼ80%と考える。4種類のEGFR/HER2発現の異なるLuciferase導入細胞を用いて、Xenolight 750で標識したCetuximabおよびTrastuzumab抗体の腹膜転移の体外蛍光イメージングを行い、感度と特異性を確認した。このことから、計画の達成率はほぼ100%と考える。1)現状では腹腔鏡蛍光メージの取得に数秒の時間を要するため、リアルタイムなイメージングができない。今後、最適な光源を検討し、リアルタイムイメージングを達成する。2)胃がん、大腸がんのリンパ節転移の体内メージングの検討;胃がんの所属リンパ節転移モデルを完成し、上記、蛍光腹腔鏡システムでリンパ節転移を特異的にイメージングが可能か否か検討する。1)リンパ節転移性胃がん、大腸がん細胞株と蛍光標識Cetuximabによるリンパ節転移の体外光イメージング;上記の腹膜転移と同様に、これまでに樹立した胃がん、大腸がんのリンパ節転移モデル(GCIYおよびCOLM-5)にLuciferaseリポータプラスミドをTransfectionし、Luciferase assayにより高発現株を分離する。これを用いて皮下移植によるソケイリンパ節転移ならびに胃獎膜(or盲腸)移植による所属リンパ節転移の体外イメージングが可能か否か検討する。2)胃がん、大腸がんの腹膜転移ならびにリンパ節転移の体内メージングの検討;上記の近赤外蛍光標識Cetuximab (Trastuzumab)を用いた体外イメージング法をまず腹膜転移の体内(腹腔鏡)メージング法に応用すると同時に、胃がんのリンパ節転移モデルを作成し、これを特異的に検出できる体内イメージングが可能か否か検討する。
浸透媒体検出によるファイン焼結微細クラック自動検出法の研究

磁性体や電子部品に使用しているファイン燃結体には、複雑な形状を有したり、表面粗さが粗いものがあり、微細クラックの検出が困難である。本研究では被検体を一度溶媒に浸し、クラック内に浸透した溶媒を検出する技術を開発した。溶媒には各種の炭素化合物の中から検出感度、安全性を考慮してエタノールを選定した。エタノールの検出には、検出感度の高いFID(Flame Ionization Detector)を使用した。被検体をエタノールに浸し、取り出した後20秒間自然乾燥し、被検体表面に沿って直径10mmのプローブを0.1mmの間隙をもって走査する。ブローブの後方に真空ポンプとFIDを設け、プローブ先端から吸入りた被検体表面の空気をFIDに送ると、ここでこの空気中に含まれる微量のエタノール(10^<-10>グラム/s以上)を検出する。被検体がファイン燃結体の場合には、焼結体自体にもエタノールが浸透するため、クラック部分と表面から出るエタノールが共に検出される。そのため表面から出るエタノール以上の量を放出するクラックが検出可能である。また検出速度を向上させるためには、FIDに送る流量を増す必要がある。本研究では最適条件を検討した結果4ml/sの空気送入を可能にした。被検体にフェライト焼結体を用いて、表面クラックの検出実験を行った結果、プローブの送り速度30mm/s、最小検出クラック幅23μmを実現した。なおクラックは目視観察が困難であるので、本FIDで検出した後、被検体の表面を研磨し、顕微鏡で拡大して幅を測定した。今後は検出用プローブの改良と、検出応答速度の向上を図り、本検出方式の実用化を図る予定である。