hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
尿管閉塞モデルにおける腎間質性線維化発症の分子機構

マウスの尿管を片側性に結紮する(UUO)と腎臓は水腎症となり腎間質性線維化症を引き起こす。その分子機序としてUUOの刺激によりTGF-βが分泌され腎尿細管上皮細胞がオートクライン・パラクライン機構を介して反応し間葉系細胞に形質転換(EMT)を起こす結果、間質の線維化をきたすことが知られている。我々はこのEMTがTGF-βの細胞内シグナル分子の一つであるSmad3を介して起こる事をSmad3ノックアウトマウスを用いて示した。本研究では腎尿細管上皮細胞がEMTを起こす時、細胞内におけるSmad3の他の分子との分子間相互作用を解明する目的で行った。CMVプロモーター下にSmad3を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成した。このマウスでは、生後10週頃から眼のレンズ上皮細胞がEMTを起こしレンズが白濁することを見出した。またTNF-αノックアウトマウスにおいてUUOを行った実験では、UUO後2週までは腎間質性線維化症の程度は野生型マウスと比較して変化は見られなかったが、UUO後4週では明らかに線維化の程度が増大していた。この時EMTのキー分子の一つであるSnai1の発現はαSMAおよびI型コラーゲンと共に増大していた。この機序として我々はTNF-αのTGF-βに対する拮抗作用を考え、TNF-αの細胞内シグナル分子であるNF-κBなどの分子に注目しその挙動をTGF-βシグナル分子との関連性において研究を進めている。またレンズ上皮細胞または角膜上皮細胞で見られたように、UUOにおける腎尿細管上皮細胞のEMTまたは腎尿細管上皮細胞にTGF-β添加して起こるEMTがSamd7,Bmp7,Id2/3アデノウイルスベクター投与により抑制されることを観察する予定である。マウスの尿管を片側性に結紮する(UUO)と腎臓は水腎症となり腎間質性線維化症を発症する。これはUUOの刺激によりTGF-βが分泌され腎尿細管上皮細胞がそれに反応して間葉細胞に形質転換(EMT)を起こすことにより間質の線維化をきたすことが知られている。我々はTGF-βの細胞内シグナル分子であるSmad3のノックアウトマウスではUUOを行っても腎尿細管上皮細胞はEMTを起こさない事を見出した。このことから腎尿細管上皮がTGF-βの刺激を受けて間葉細胞に形質転換するのはSmad3を介することを明らかにした。本研究では腎尿細管上皮細胞がEMTを起こす時細胞内におけるSmad3の他の分子との分子間相互反応を解明する目的で研究を行っている。Smad3のシグナル経路をより明確にするためにSmad3の過剰発現マウスの作成を本年度の主な目標として実験を行った。Smad3 cDNAの全長をPCRクローニングし、それをCMVプロモータに連結したものをベクターとしてトランスジェニックマウスを作成した。現在野生型マウス、Smad3ノックアウトマウス、および本年度作成したSmad3過剰発現マウスを用いてUUOを行うことにより腎間質性線維化を作成し、Smad2,3,4,7の発現量およびそれらのリン酸化の程度をノーザンブロットおよびウエスタンブロットにより検索を行っている。さらにSnailの発現とEMTとの関係について研究を進めていく予定である。

その分子機序としてUUOの刺激によりTGF-βが分泌され腎尿細管上皮細胞がオートクライン・パラクライン機構を介して反応し問葉系細胞に形質転換(EMT)を起こす結果、間質の線維化をきたすことが知られている。我々はこのEMTがTGF-βの細胞内シグナル分子の一つであるSmad3を介して起こる事をSmad3ノックアウトマウスを用いて示した。本研究では腎尿細管上皮細胞がEMTを起こす時、細胞内におけるSmad3の他の分子との分子間相互作用を解明する目的で行っている。CMVプロモーター下にSmad3を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成した。このマウスでは、生後10週頃から眼のレンズ上皮細胞がEMTを起こしレンズが白濁することを見出した。またTNF-αノックアウトマウスにおいてUUOを行った実験では、UUO後2週までは腎間質性線維化症の程度は野生型マウスと比較して変化は見られなかったが、UUO後4週では明らかに線維化の程度が増大していた。この時EMTのキー分子の一つであるSnailの発現はαSMAおよびI型コラーゲンと共に増大していた。この機序として我々はTNF-αのTGF-βに対する拮抗作用を考え、TNF-αの細胞内シグナル分子であるNF-κBなどの分子に注目しその挙動をTGF-βシグナル分子との関連性において研究を進めている。
イオン伝導性カーボネート型共重合体の高収率合成を可能にする連続式リアクターの開発

本研究では、当該科研費(基課題)の基幹材料であるCO2/エポキシド共重合体(ポリカーボネート)の高収率合成に必要不可欠な未反応CO2・モノマーの分離・回収・再利用システムを開発し、それらをリアクターとしてラボスケールで完成させ、スケールアップの可能性を見出すことを目的としている。本研究の目的達成のために、材料化学分野だけでなく化学工学分野の観点から新たな反応系構築のための知見や技術を取り入れる。現在のポリカーボネートの合成法では、大量の液化CO2をモノマー(エポキシド)と触媒が入った圧力容器中に供給するバッチ式で反応させている。反応終了後、余剰CO2は大気中へ、未反応モノマーは生成物との分離操作を行って廃棄される。この合成法では、CO2やモノマーが浪費されるだけでなく、一定の反応時間経過後にある程度の量の反応物が反応して化学平衡状態になるため、生成物の収率向上は望めない。熱力学的観点から、ポリマー生成側への反応を進行させて収率の向上を図るためには、生成するポリマーを回収するとともに、反応物側に常に多くのCO2とモノマーを触媒存在下で供給する必要がある。さらに、反応による副生成物や不純物を除去しながらCO2とモノマーを高純度化していく必要もある。そこで本研究では、平均収率50%以上の高収率合成を可能にする連続式リアクターを新たに開発し、科研費研究のさらなる進展を図る。本年度は、準備段階として、海外共同研究者の所属機関を訪問し、以降の研究計画を打ち合わせるとともに、渡航先の研究環境や設備などの状況を把握することを行った。本年度は、当該科研費(基課題)の最終年度であり、CO2/エポキシド共重合体(ポリカーボネート)型固体高分子電解質(SPE)の優れたイオン伝導特性に着目し、室温で10-3 S/cm以上のイオン伝導度かつ0.8以上のLiイオン輸率を達成するSPEの構成素材(共重合体・Li塩・無機フィラー)を決定し、セパレーター不要のフレキシブル電池の開発を目指した。最適な共重合体およびLi塩種・濃度を決定し、SPEとしての基礎物性を明らかにした。特に、FT-IR測定によるイオン溶存状態の解析が進み、前倒しで研究成果が得られているほか、新たなポリマーブレンドや末端修飾による電解質特性の改善に関する研究成果も得られた。電池特性評価に関しては、研究分担者や海外協力者の協力を得ながら十分な研究成果が得られた。これまでに得られている最適な構成素材(EO/EC共重合体・Li塩・無機フィラー)からなるSPEを用い、既設の電池作製システムを用いたコインセルの電池特性評価(充放電試験・サイクル特性)を行い、セパレーターを兼ねる電解質材料として実用化へ向けた性能を評価した。本研究の遂行のため、海外共同研究者の所属機関を訪問し、以降の研究計画の打ち合わせを行った。渡航先の研究環境や設備などの状況を把握し、当該科研費(基課題)の問題点であるポリマー収率の向上のための具体的な研究計画を明らかにした。さらに、本研究からの派生効果として、ポリカーボネートの持つ高い酸素バリア性をさらに向上する新しい材料の開発を行う具体的な研究内容も計画することができた。当該科研費(基課題)では、ポリマーの低収率(通常10%以下)が研究の進展における大きな課題である。触媒の検討など材料化学的なアプローチだけでは限界があり、化学工学的な観点から合成の最適化を図る必要がある。そこで、未反応CO2・モノマーの分離・回収・再利用システムの設計指針をまとめ、リアクターの開発につなげる。海外共同研究者は、主に化学工学の観点から、共重合体合成の高収率化に必要な連続式リアクター開発のための基礎知見の提供や、モデル設計を進める上での専門的アドバイスを行う。渡航先では、未反応のCO2とエポキシモノマーの混合物を反応容器外に取り出し、それぞれに分離し精製するユニットモデルの開発を検討する。常温常圧で液体のプロピレンオキシドやシクロヘキセンオキシドをモデルモノマーとして用い、吸着層に通して微量のCO2などをモノマーから除去する精製ユニットを考案することで、混合物からの目的のポリマーの分離を容易にすることを検討する。さらに、分離回収後のCO2とエポキシモノマーを再び反応容器に導入する循環系モデルの開発を検討する。並行して触媒溶液も別途導入する流路の設計を検討する。続いて、CO2・モノマー分離回収ユニットの開発、CO2・モノマー循環系の開発を海外共同研究者と連携しながら進める。海外共同研究者との連携を続けながら、具体的な連続式リアクターの全体設計および評価を行う。分離回収ユニットおよび循環系を反応容器や配管系統などと統合し、反応系全体としてのリアクターモデルの設計、最適化および評価を行い、ポリマーの収率向上を目指す。最終的には、フレキシブル蓄電池の実用化に必要不可欠なポリマー生成のためのスケールアップおよび高効率化を達成し、基研究の加速を目指す。内定年度:2017本研究では、当該科研費(基課題)の基幹材料であるCO2/エポキシド共重合体(ポリカーボネート)の高収率合成に必要不可欠な未反応CO2・モノマーの分離・回収・再利用システムを開発し、それらをリアクターとしてラボスケールで完成させ、スケールアップの可能性を見出すことを目的としている。

現在のポリカーボネートの合成法では、大量の液化CO2をモノマー(エポキシド)と触媒が入った圧力容器中に供給するバッチ式で反応させている。反応終了後、余剰CO2は大気中へ、未反応モノマーは生成物との分離操作を行って廃棄される。この合成法では、CO2やモノマーが浪費されるだけでなく、一定の反応時間経過後にある程度の量の反応物が反応して化学平衡状態になるため、生成物の収率向上は望めない。熱力学的観点から、ポリマー生成側への反応を進行させて収率の向上を図るためには、生成するポリマーを回収するとともに、反応物側に常に多くのCO2とモノマーを触媒存在下で供給する必要がある。さらに、反応による副生成物や不純物を除去しながらCO2とモノマーを高純度化していく必要もある。そこで本研究では、平均収率50%以上の高収率合成を可能にする連続式リアクターを新たに開発し、科研費研究のさらなる進展を図る。本年度は、準備段階として、海外共同研究者の所属機関を訪問し、以降の研究計画を打ち合わせるとともに、渡航先の研究環境や設備などの状況を把握することを行った。本年度は、当該科研費(基課題)の最終年度であり、CO2/エポキシド共重合体(ポリカーボネート)型固体高分子電解質(SPE)の優れたイオン伝導特性に着目し、室温で10-3 S/cm以上のイオン伝導度かつ0.8以上のLiイオン輸率を達成するSPEの構成素材(共重合体・Li塩・無機フィラー)を決定し、セパレーター不要のフレキシブル電池の開発を目指した。最適な共重合体およびLi塩種・濃度を決定し、SPEとしての基礎物性を明らかにした。特に、FT-IR測定によるイオン溶存状態の解析が進み、前倒しで研究成果が得られているほか、新たなポリマーブレンドや末端修飾による電解質特性の改善に関する研究成果も得られた。電池特性評価に関しては、研究分担者や海外協力者の協力を得ながら十分な研究成果が得られた。これまでに得られている最適な構成素材(EO/EC共重合体・Li塩・無機フィラー)からなるSPEを用い、既設の電池作製システムを用いたコインセルの電池特性評価(充放電試験・サイクル特性)を行い、セパレーターを兼ねる電解質材料として実用化へ向けた性能を評価した。本研究の遂行のため、海外共同研究者の所属機関を訪問し、以降の研究計画の打ち合わせを行った。渡航先の研究環境や設備などの状況を把握し、当該科研費(基課題)の問題点であるポリマー収率の向上のための具体的な研究計画を明らかにした。さらに、本研究からの派生効果として、ポリカーボネートの持つ高い酸素バリア性をさらに向上する新しい材料の開発を行う具体的な研究内容も計画することができた。当該科研費(基課題)では、ポリマーの低収率(通常10%以下)が研究の進展における大きな課題である。触媒の検討など材料化学的なアプローチだけでは限界があり、化学工学的な観点から合成の最適化を図る必要がある。そこで、未反応CO2・モノマーの分離・回収・再利用システムの設計指針をまとめ、リアクターの開発につなげる。海外共同研究者は、主に化学工学の観点から、共重合体合成の高収率化に必要な連続式リアクター開発のための基礎知見の提供や、モデル設計を進める上での専門的アドバイスを行う。渡航先では、未反応のCO2とエポキシモノマーの混合物を反応容器外に取り出し、それぞれに分離し精製するユニットモデルの開発を検討する。
タンパク質三次元モチーフデータベースの作成と立体構造の自動分類への応用

タンパク質三次元モチーフ構造の解析は、その構造-機能相関解析や立体構造の構築原理解明の問題とも密接に関連する極めて重要な問題の一つである。本年度研究では、配列レベルのモチーフ辞書であるPROSITEを参考に、これに対応する三次元モチーフデータベースの作成を試みた。PROSITEでは一種の正規表現を用いてモチーフパターンを定義している。ここでは立体構造既知のタンパク質情報をもとにこのパターンに一致する部位を検索し、その対応する三次元部分構造(Cα原子の座標情報)を抽出した。PDB(Rel.89)から選択した874タンパク質に対して、PROSITE(Rel.16.0)に登録されている1,299件のパターンを用いてデータベース作成実験を試みたところ、少なくとも一つの三次元構造が対応したモチーフは464件であった。また、複数が対応したものについては必要に応じて構造クラスに分類した。本研究では、注目する二つの部分構造間の対応する全ての2点間(Cα原子間)距離の差の平均値をこれらの相違度と考え、それに基づきクラス分類を行なった。また、同一クラスに属する他の全ての構造との相違度の和が最小のものをクラスの代表構造と定義した。カルシウム結合部位として知られるEF-handモチーフの例では、対応した12件の部分構造が四つのクラスに分類され、このうち孤立するものは本モチーフに該当しないノイズ成分であることが確認できた。さらに、主クラスの代表三次元構造を質問構造として、これまでに開発した三次元モチーフ検索プログラムによる検索を試みたところ、配列パターンをキーとした検索ではヒットしなかった新たなEF-handモチーフの対応部位を検出することができた。以上、本研究で作成したデータベースならびに関連プログラムは局所構造特徴に基づくタンパク質構造情報解析のための有用な情報を提供するものと考える。タンパク質の三次元モチーフ構造の解析は、その構造-機能相関解析や三次元構造の構築原理の解明の問題とも密接に関連する極めて重要な問題の一つである。本研究は、網羅的な三次元構造特徴探索による三次元モチーフデータベースの作成、さらにはこれを基礎としたタンパク質立体構造の自動分類への応用を目指すものである。本年度研究では、まずPDB(Protein Data Bank)から調整したテストデータセットを作成するとともに、これまでに開発した基本アルゴリズムをもとに、探索対象タンパク質の指定から結果の表示までの一連の操作を対話的に行うためのユーザインターフェースを含めたシステムの開発を行なった。本システムはWWW(World Wide Web)上で動作し、ネットワークを介して利用することができる。特に、探索結果についてMDL社のプラグイン機能を利用して、選択したタンパク質の全体構造及び探索された共通構造特徴をグラフィックス表示することで直感的/視覚的に検証できるように工夫した。また、同定された構造特徴(モチーフ候補部位)を質問構造パターンとした三次元モチーフ検索(部分構造検索)を行うことにより、新規モチーフ候補部位の発見から、それに関連するタンパク質のデーターベース検索、並びに結果の検証までの一連の操作が容易に行えるようになった。次に、タンパク質三次元構造の新たな抽象化表現について検討した。ここでは、ランダムコイル部分に注目し、連続する数個のアミノ酸残基を平均化した一つの仮想の点で代表して表現した。また、これまで再帰法により実装していた探索アルゴリズムを動的メモリ割り当てによるものへと改訂することで、より大規模なグラフの探索に対応することができた。今後はこれらの成果をもとに、三次元モチーフデータベースの構築に向けて引き続き研究を進める。
密度行列繰り込み群による量子相転移の理論的研究

Yb_4As_3は、小数キャリアーの近藤系として知られていた。しかし、その重い電子的な比熱の振舞いが、電荷秩序によって形成された一次元ハイゼンベルグスピン鎖によるのではないかという指摘がFulde達によってなされ、実際神木達はスピン励起がdesCloizeax-Pearsonモードになっていることを中性子散乱によって確認した。しかし、一つの疑問点が残っていた。一次元ハイゼンベルグスピン鎖のスピン励起であるdesCloizeax-Pearsonモードは、磁場中でも連続スペクトルを形成し比熱の磁場依存性はあまり強くないのに対し、実際に観測される比熱には小さな磁場でギャップが現れる。われわれは、Yb_4As_3の構造を解析することによって、交替するDzyaloshinskii-Moriya相互作用が存在することを指摘し有効ハミルトニアンを求めた。その低エネルギーの有効理論はサインゴルドン場の理論であるが、磁場依存性の全体、また温度依存性の全体を議論するには不十分で、現在密度行列繰り込み群を用いた解析を行なっている。二次元でスピンギャップと磁化プラトーを示す直交ダイマーの系については、二個のトリプレット励起について調べ、一個のトリプレット励起よりも大きな分散を示すことを明らかにした。当研究課題に関する今年度の成果は三つのグループに分けることができる。第一は基底状態に対する密度行列繰り込み群を用いた量子相転移の研究で、1) t-J'模型におけるハイゼンベルグスピン鎖の融解2) SU(4)対称性を持つスピン軌道系の臨界状態などを明らかにし、論文として公刊することができた。第二のグループとしては、密度行列繰り込み群を量子転送行列に適用することにより有限温度の動的構造因子を計算するアルゴリズムの開発、およびその近藤格子模型への適用がある。その結果、伝導電子の状態密度が温度の低下とともにギャップを形成していく過程をつぶさに調べることができるようになった。また、スピン及び電荷に関する動的構造因子も求め、チャンネルによるギャップの違い、最低エネルギースケールであるスピンギャップ程度の温度スケールによる励起スペクトルの急激な変化などの結果が得られた。これらによって、強相関絶縁体としての近藤絶縁体の特徴を明らかにすることができた。第三のグループの仕事として、密度行列繰り込み群の二次元系への拡張の試みの準備的研究を行なった。二次元量子スピン系の秩序・無秩序転移を調べるため、フラストレーションがある場合の典型例であるトレリス格子の帯磁率を、転送行列の直接計算、比較的フラストレーションに強いループアルゴリズムによる量子モンテカルロ法などによって調べた.一次元におけるスピンと軌道が結合した系の臨界的性質について、密度行列繰り込み群を用いた研究を行なった。昨年度に研究したSU(4)という高い対称性を持ったシステムから、対称性を下げるに従ってどのように分岐していくが、軌道とスピンの結合の様子を明らかにしていくことになる。まず、磁場によって起きるSU(4)からSU(2)へのクロスオーバーの様子を明らかにした。つぎに、SU(4)からSU(2)xSU(2)への低下の様子も密度行列繰り込み群を用いて明らかにした。そのボゾン化法により相図の解明については、大阪大学の川上教授のグループと共同研究をした。ボゾン化法については、パリ大学のAzaria氏たち、UBC大学のAffleck教授たちも相前後して研究に取り組み、我々の計算と合わせてその全体像が明らかになった。二次元でスピンギャップと磁化プラトーを示す直交ダイマーの系については、その三次元構造の影響を調べるとともに、量子転送行列法を用いて、有限温度の帯磁率、比熱を調べた。また、磁化プラトーの超格子構造について調べ、1/3および1/4のプラトーではストライプ構造が出来ていることを明らかにした。しかし、その重い電子的な比熱の振舞いが、電荷秩序によって形成された一次元ハイゼンベルグスピン鎖によるのではないかという指摘がFulde達によってなされ、実際神木達はスピン励起がdes Cloizeax-Pearsonモードになっていることを中性子散乱によって確認した。

一次元ハイゼンベルグスピン鎖のスピン励起であるdes Cloizeax-Pearsonモードは、磁場中でも連続スペクトルを形成し比熱の磁場依存性はあまり強くないのに対し、実際に観測される比熱には小さな磁場でギャップが現れる。われわれは、Yb_4As_3の構造を解析することによって、交替するDzyaloshinskii-Moriya相互作用が存在することを指摘し有効ハミルトニアンを求めた。その低エネルギーの有効理論はサインゴルドン場の理論であるが、磁場依存性の全体、また温度依存性の全体を議論するには不十分で、現在密度行列繰り込み群を用いた解析を行なっている。二次元でスピンギャップと磁化プラトーを示す直交ダイマーの系については、二個のトリプレット励起について調べ、一個のトリプレット励起よりも大きな分散を示すことを明らかにした。
核外遺伝子(ミトコンドリアDNA)の遺伝的変異性による魚類の繁殖構造の解析

母系遺伝をし、交又しないとされている核外遺伝子のミトコンドリアDNAは、核内遺伝子(アイソザイム)と遺伝様式が異なることから、集団の世代を越えた繁殖構造を母系の観点から捉えることができる遺伝標識として近年脚光を浴びてきている。しかし、集団構造の解析に効果的に応用するためには、多くの個体の分析を簡単に行える手法の開発と、魚類のmtDNAの基本となる制限酵素切断地図の作成を行い、切断型の変異が塩置換によることを確認しなければならない。本研究はヤマトゴイおよびサクラマス類を対象として以下のことを明らかにした。(1)ヤマトゴイとサクラマス類のmtDNA精製度の高い簡易単離法として、木島ら(1990)のアルカリ処理法にグラスビ-ズによる精製法を加えた一連の手法を開発した。(2)ヤマトゴイのmtDNAを15種類の制限酵素で切断し、5種類のハプロタイプの存在を明らかにした。(3)これらの制限酵素切断型変異から5種類のハプロタイプの制限酵素切断地図を二重消化法によって作成した。(4)作成した制限酵素切断地図の比較によってヤマトゴイの制限酵素切断型の変異が単純な塩基の置換によって起こっていることを示唆した。(3)(2)によって、制限酵素切断片の長さの比較(RFLP)によってヤマトゴイのmtDNA分析による比較ができることを確認できた。また、魚類においても同様にRFLP法によってmtDNAの制限酵素切断型変異の比較ができることを示唆した。(4)そこで6塩基認識の6種類の制限酵素を用いてサクラマス2系統、ヤマメ1系統、アマゴ1系統の養殖集団のmtDNAの切断型変異を明らかにし、特別な選択を行っていないサクラマスとヤマメは天然からいくつかの母系が起源となって繁殖されているが、パ-に選択を重ねたアマゴは単一母系から生産されているという繁殖構造が推定された。核外遺伝子の指標であるミトコンドリアDNA(mtDNA)と核内遺伝子の指標であるアイソザイムを用いてコイ科およびサケ科魚類の集団構造を明らかにすることを最終目的として、今年度はヤマトゴイとニシキゴイのmtDNAの制限酵素切断地図を作成すると共に、シロサケのmtDNAの超遠心法によらない簡易単離方法の確立および制限酵素切断による変異性の定量を行った。また、サクラマスの養殖集団のmtDNAによる母系数の推定も併せて行った。その結果、15種類の6塩基認識の制限酵素の切断部位を2重消化法によってヤマトゴイ、ニシキゴイ(紅白、大正、昭和)を調べたところ、12制限酵素で切断片の位置が推定でき、両品種ともにまったく同じ切断地図が得られた。このことから、人為的に作成され、約200年間隔離されて繁殖しているニシキゴイの起源がヤマトゴイと起源を同じくし,遺伝子分化が極めて小さいという興味ある結果となった。シロサケの凍結組織をコイと同じアルカリーnonーidet処理法によってmtDNAを単離したところ、精製度が悪いので、グラスビ-ズによる精製工程をいれたところ良い結果となった。これによって得られたシロサケのmtDNAを5制限酵素で切断したところ、切断パタ-ンの差は認められず、遺伝的変異性が低い可能性を示した。一方、サケ科のサクラマス養殖集団のmtDNAの制限酵素切断パタ-ンの変異を見ると、各養殖集団には特有のハプロタイプが存在し、シロサケよりも著しく高い変異性を示した。以上の結果とアイソザイム分析の結果から、mtDNAは集団の母系数の推定に有効であり、繁殖構造の解析に有力であることが示された。次年度はアマゴを解析に加えて母系数からみた繁殖構造の解析を進める予定である。

母系遺伝をし、交叉しないとされている核外遺伝子のミトコンドリアDNAは、核内遺伝子(アイソザイム)と遺伝様式が異なることから集団の世代を越えた繁殖構造を母系の観点から捉えられる遺伝標識として期待されている。本研究はサクラマス北海道系、森支場系、ヤマメ花山系およびアマゴ岐阜系の養殖系統を対象として、ミトコンドリアDNAの簡易分析方法を確立し、制限酵素切断による遺伝的変異を検出し、集団の遺伝的変異性を調べた。その結果、(1)グラスビ-ズを用いることによって精製度の高いミトコンドリアDNAが単離抽出できることが分かった。(2)6塩基認識の制限酵素の6種類で抽出できたミトコンドリアDNAを切断し、遺伝的変異の有無を調べたところ、サクラマス2系統とヤマメ1系統には遺伝的変異が存在し、それらは塩基の置換により起こっていると推定できた。(3)各制限酵素切断型を基にミトコンドリアDNAのハプロタイプを分析したところ、ハプロタイプ数はサクラマス2系統は7つ、ヤマメ1系統は6つ、アマゴ岐岐系は1つであった。(4)得られた結果から、集団の遺伝的変異性の指標となる塩基多様度(π)を求めたところサクラマス2系統とヤマメ1系統では0.00170から0.00253となり、天然集団に比べて大きく変異性が低下していなかったが、アマゴは単一母系に固定している可能性を示唆した。(5)これらの結果と前年度の結果を総合すると、サケ科魚類の養殖は天然に近い繁殖構造を取り、コイ科魚類は養殖場によって特徴のある母系を中心に繁殖されていることが分かった。また、系統作成や品種作成における選択は特定少数の母系を起源として行われていることが示唆できた。
機能性酸化物の超高靭性化に向けた挑戦

本研究は、耐熱性・耐環境性・耐薬品性・低熱伝導性・寸法安定性・耐摩耗性等に極めて優れた特性を有する酸化物材料の超高靭性化を実現するための基礎研究である。一般的にセラミックスをはじめとする酸化物材料は、上述した優れた特性を有しながら、破壊靭性つまり粘り強さが極めて低く脆いことから構造材料としての利用は著しく制限されている。一方、我々は混合導電性材料を中心に検討する中で電子状態をある条件にすることで破壊じん性が向上することを見出した。ただし、現段階においては飛躍的な靭性向上は期待できず、新たな方法論の構築が急務であった。そのような中、九州大の石原らが開発したナノポーラスNi-Feが我々の材料コンセプトと合致し、評価・検討ならびに靭性向上メカニズムの解明を行った。本年度は、昨年度に引き続きナノポーラスNi-Feの応力ーひずみ変形挙動の詳細評価することでこれまでに得られた知見の再現性を示した。それにより粒子表面にできる無数のナノポーラス構造が延性化に寄与することを分子動力学を用いた計算科学アプローチによって示すことに成功した。また、我々が長年取り組んできた混合電子構造モデルについては、今後、Ce系、Co系、Ni系、Fe系の材料についてより詳細に検討していく予定である。加えてじん性向上のみならず電気的特性、耐熱特性、耐衝撃特性、耐薬品生をはじめとする機能性に関しても今まで以上に検討し、世界に類を見ない超機能性セラミックスの創成を目指す。本研究は、耐熱性・耐環境性・耐薬品性・寸法安定性・耐摩耗性等に極めて優れた特性を有する機能性酸化物材料の超高じん性化を実現するための基礎研究である。セラミックスをはじめとする機能性酸化物材料は優れた特性を有しながら、じん性の低さから構造材料としての利用は多くされていない。一方、我々は混合導電性材料を中心に電子構造を制御することでじん性が向上することを明らかにしている。ただし、理論上大きなじん性向上を期待することは困難であり、新たな方法論の構築が急務であった。その中、九州大学の石原らが燃料電池用に開発したナノポーラスNi-Feが我々の材料コンセプトと合致し、評価を行った。高温還元雰囲気では予想どおりNi-Feは一般的な金属材料同様、大きな延性挙動を示した。一方、酸化環境でのNi-Fe酸化物は我々の当初の予想を大幅に上回るNi-Feよりも大きな延性挙動を示し、その有用性を示した。この現象がナノポーラスによる構造因子によるものなのかそれとも材料の組み合わせによる材料因子によるものなのかを見極めるため、一般に製造される溶解鋳造法で作製したNi-Feとの比較を行った。結果、溶解鋳造法による方法では現れない延性挙動を示し、この現象がナノポーラスによる構造因子が起因していることが明らかになった。そこで、SEM, TEM, BET,ディラトなどの方法を用いてナノポーラス構造の微細構造を解析した。SEM等で観察されたμmレベルのポアに加えて表面をnmクラスのポアが覆っていることが新たに明らかになった。ガスはそのナノポアを通り流れることも明らかになった。本当に構造因子が原因でセラミックスの超延性化が引き起こされるのかを特定するための解析を計算科学を用いて今後検討する予定である。本年度は当初の予定どおり、Ni-Fe材料を用いてセラミックスの高じん性化へ向けた予備的試験を行うことができた。当初の予定では多少の延性化は期待されていたが、我々が開発した複合環境制御評価装置を用いた評価によって金属状態よりもセラミックス状態(酸化状態)のほうが大きく延性化が進むことを明らかにしたことは特筆すべき点である。また、溶解鋳造法で作製した同じ組成のNi-Feと比較して全く反対の結果が出たことは、材料起因の変化ではなく構造に起因した延性化を明らかにしたことは成果としては極めて大きい。また、酸化・還元サイクルを複数回行い、大きな挙動の変化がないことがわかり繰り返し環境変化による劣化が著しく少ないことも明らかにした。材料起因でなく構造起因によるじん性向上が明らかになれば様々な材料で応用される可能性を秘めており今後の研究に大きな影響を及ぼす可能性がある。そのため当初の計画以上に進展していることとした。本研究は、耐熱性・耐環境性・耐薬品性・寸法安定性・耐摩耗性等に極めて優れた特性を有する金属酸化物材料の超高じん性化を実現するための基礎研究である。一般的にセラミックスをはじめとする金属酸化物材料は、優れた特性を有しながら、じん性が極めて低く脆いことから構造材料としての利用は著しく制限されている。一方、我々は混合導電性材料を中心に電子状態を制御することでじん性が向上する可能性を見出している。ただし、現段階で飛躍的にじん性向上を期待することは困難であり、新たな方法論の構築が急務であった。その中、九州大学の石原らが開発したナノポーラスNi-Feが我々の材料コンセプトと合致し、評価を行った。前年度に引き続き酸素分圧を制御した環境で機械的特性の評価を系統的に行った。強度や特性のばらつきは極めて低く、また、応力に対するひずみ挙動も延性的であった。酸化環境では従来、材料が酸化するため脆性的な破壊挙動を想定していたが、より延性挙動を示し、また、同様に極めて小さいばらつきであった。

昨年、評価したSEM, TEM, BET,ディラトによるナノポーラス構造の微細構造をより詳細に解析したところ、μmレベルのポアに加えて表面をnmクラスのポアが覆っていることが発見された。一見、ある程度緻密に見えるバルク体であったがナノポアをガスが通過することで高い機能性を有することが明らかになった。現在、分子動力学法を用いて実験との比較を行っている。本年度は当初の予定通り、Ni-Fe材料を用いてセラミックスの高じん性化へ向けた本格的な試験を行うことができた。昨年度、大きな研究進展がありセラミックスにも関わらず飛躍的なじん性向上が見られた。また、微細構造観察において緻密に見えた粒子表面に多数のナノポアが存在し、ガスタイトでありながら構造を保つために有用な構造であることを見出したのは特筆すべき点である。一方、それに伴い大幅なモデル変更がなされているため計算に遅れが生じており、今後、構造起因によるじん性向上に関する知見を早急に掘り進める予定である。それが明らかになればNi-Feに限らず様々な材料で応用される可能性を秘めており今後の研究に大きな影響を及ぼす可能性がある。本研究は、耐熱性・耐環境性・耐薬品性・低熱伝導性・寸法安定性・耐摩耗性等に極めて優れた特性を有する酸化物材料の超高靭性化を実現するための基礎研究である。一般的にセラミックスをはじめとする酸化物材料は、上述した優れた特性を有しながら、破壊靭性つまり粘り強さが極めて低く脆いことから構造材料としての利用は著しく制限されている。一方、我々は混合導電性材料を中心に検討する中で電子状態をある条件にすることで破壊じん性が向上することを見出した。ただし、現段階においては飛躍的な靭性向上は期待できず、新たな方法論の構築が急務であった。そのような中、九州大の石原らが開発したナノポーラスNi-Feが我々の材料コンセプトと合致し、評価・検討ならびに靭性向上メカニズムの解明を行った。本年度は、昨年度に引き続きナノポーラスNi-Feの応力ーひずみ変形挙動の詳細評価することでこれまでに得られた知見の再現性を示した。それにより粒子表面にできる無数のナノポーラス構造が延性化に寄与することを分子動力学を用いた計算科学アプローチによって示すことに成功した。また、我々が長年取り組んできた混合電子構造モデルについては、今後、Ce系、Co系、Ni系、Fe系の材料についてより詳細に検討していく予定である。加えてじん性向上のみならず電気的特性、耐熱特性、耐衝撃特性、耐薬品生をはじめとする機能性に関しても今まで以上に検討し、世界に類を見ない超機能性セラミックスの創成を目指す。本年度は、ナノポーラスNi-Feと溶解鋳造法で作製した同じ組成のNi-Feの変形挙動を評価することで構造因子による延性化メカニズムを提唱した。一方、定性的には説明できるものの、なぜ、粒子表面に多数存在するナノポーラス構造が延性化に寄与するのかは全くわからない。そこで、これまでの、SEM, TEM, BET,ディラト等の観察方法で得られた構造情報だけでなく分子動力学や第一原理計算を用いた計算科学アプローチによる変形挙動メカニズムの解明を目指す予定である。また、これまで我々が行ってきた混合電子構造も併用することでより大きなかつ様々な材料への応用ができる材料開発指針を作り上げたいと考えている。具体的な材料としてセリア系、ランタンコバルト系、Ni系、鉄系の材料についてより詳細に検討していきたい。
下咽頭インピーダンス検査およびLPR動物モデルを用いた咽喉頭逆流症の病態解明

咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動・慢性咳嗽などの症状の一部には,咽喉頭への酸逆流(LPR)に起因するものがあると指摘されている.しかし, PPI抵抗例も少なくなく, LPRの計測ができなかったため,その正確な診断は困難であり, LPRの解明は停滞していた.本研究は,咽喉頭逆流症(LPRD)の病態解明を行うことを目的に行うものである.臨床試験の対象は,原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された方で,本試験を説明し,同意していただいた方とし,近年開発されLPRの測定を可能とした「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」を用い,正確なLPRD診断を行う.同時に喉頭所見・食道所見・食道内圧所見・唾液中ペプシン値・症状スコアを採取する.LPRDと診断され希望があった場合は逆流防止手術を行,治療効果を観察する.LPRD群と非LPRD群を比較検討し,その特性,症状,他覚的所見,唾液中ペプシン値,噴門形成術治療成績から,本邦におけるLPRDを検討するものである.2018年度は10名のLPRD患者に対し上記の検査を行った。来年度は、臨床研究に並行して、基礎研究を開始し、LPR動物モデルを作成し,反回神経・上喉頭神経・横隔神経・舌下神経を同定し,双極銀電極を留置する.安静時・刺激時・発声時の上記神経活動をモニターしLPRによる異常喉頭運動の存在を検討する.予想通りの本研究対象者を確保しているため。原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された患者様に対し,本試験を説明し,同意していただいた方の中で,「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」検査を行った患者数は10名に達し、順調に進展している。原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された方で,本試験を説明し,同意していただいた方とし,近年開発されLPRの測定を可能とした「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」を用い,正確なLPRD診断を行う.同時に喉頭所見・食道所見・食道内圧所見・唾液中ペプシン値・症状スコアを採取する.LPRDと診断され希望があった場合は逆流防止手術を行,治療効果を観察する.LPRD群と非LPRD群を比較検討し,その特性,症状,他覚的所見,唾液中ペプシン値,噴門形成術治療成績から,本邦におけるLPRDを検討するものである.2019年度はさらに40名のLPRD患者に対し上記の検査を行う予定である。2019年度は、臨床研究に並行して、基礎研究を開始し、LPR動物モデルを作成し,反回神経・上喉頭神経・横隔神経・舌下神経を同定し,双極銀電極を留置する.安静時・刺激時・発声時の上記神経活動をモニターしLPRによる異常喉頭運動の存在を検討する予定である.咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動・慢性咳嗽などの症状の一部には,咽喉頭への酸逆流(LPR)に起因するものがあると指摘されている.しかし, PPI抵抗例も少なくなく, LPRの計測ができなかったため,その正確な診断は困難であり, LPRの解明は停滞していた.本研究は,咽喉頭逆流症(LPRD)の病態解明を行うことを目的に行うものである.臨床試験の対象は,原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された方で,本試験を説明し,同意していただいた方とし,近年開発されLPRの測定を可能とした「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」を用い,正確なLPRD診断を行う.同時に喉頭所見・食道所見・食道内圧所見・唾液中ペプシン値・症状スコアを採取する.LPRDと診断され希望があった場合は逆流防止手術を行,治療効果を観察する.LPRD群と非LPRD群を比較検討し,その特性,症状,他覚的所見,唾液中ペプシン値,噴門形成術治療成績から,本邦におけるLPRDを検討するものである.2018年度は10名のLPRD患者に対し上記の検査を行った。

原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された患者様に対し,本試験を説明し,同意していただいた方の中で,「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」検査を行った患者数は10名に達し、順調に進展している。原因不明とされた咽喉頭症状(咽喉頭異常感・嗄声・喉頭肉芽腫・喉頭痙攣・奇異性声帯運動(PVFMD)・慢性咳嗽など)を主訴に千葉大学耳鼻咽喉科を受診された方で,本試験を説明し,同意していただいた方とし,近年開発されLPRの測定を可能とした「24時間下咽頭インピーダンス検査(HMII)」を用い,正確なLPRD診断を行う.同時に喉頭所見・食道所見・食道内圧所見・唾液中ペプシン値・症状スコアを採取する.LPRDと診断され希望があった場合は逆流防止手術を行,治療効果を観察する.LPRD群と非LPRD群を比較検討し,その特性,症状,他覚的所見,唾液中ペプシン値,噴門形成術治療成績から,本邦におけるLPRDを検討するものである.2019年度はさらに40名のLPRD患者に対し上記の検査を行う予定である。2019年度は、臨床研究に並行して、基礎研究を開始し、LPR動物モデルを作成し,反回神経・上喉頭神経・横隔神経・舌下神経を同定し,双極銀電極を留置する.安静時・刺激時・発声時の上記神経活動をモニターしLPRによる異常喉頭運動の存在を検討する予定である.本年度は基礎研究は予備的実験にとどめており、来年度からの本格的な研究を行う予定である。モルモットを購入し、除脳非動化後、各神経電位を確保し、胃酸刺激による喉頭運動を検討する。銀線、麻酔薬、手術道具などを購入する予定である。
デンドリマーの自己組織化によるバイオインスパイアードマテリアルの創製

昨年度までの研究にて、表面にグアニジニウム基、リンカーとしてオキシエチレングリコール鎖を有するデンドリマー(第一世代第三世代)の合成法を確立した。これらのデンドリマーと無機化合物とのハイブリッド化を検討しところ、自身の大部分が水よりなる(>95%)にも関わらず、様々な特性を兼備する極めて興味深いヒドロゲルを開発するに至った。すなわち、水中に少量の粘土(重量で23パーセント)を分散させ、ここに第三世代デンドリマーを極微量添加して撹拌すると、直ちに透明なヒドロゲルが形成される。この材料は、ほとんどが水でありながら機械的強度が非常に高いため、形状維持性の自立材料として成形加工できる。また、損傷を受けても迅速かつ完全に自己修復する能力を併せ持つ。さらに、この材料を形成する際に加熱や化学反応などの処理を必要としないため、触媒機能などの生理活性を有するタンパク質を内包できる。これらすべての特徴を併せ持つヒドロゲルは過去に報告されていない。注目すべきは、この材料が一般には弱い非共有結合的相互作用のみによってできているという点であり、自立性などの著しい特性を可能にしているのが、複数の接着性末端にて粘土成分と結合できるよう設計された蝶ネクタイ型の樹木状分子である。下記の論文にて発表したこれらの成果は、産学や国内外を問わず、多方面からの注目を集めており、各種の2次メディアでも紹介された(学術誌のハイライト、新聞記事、テレビ番組報道など)。当研究課題では、樹木状分子デンドリマーの表面に多数の相互作用部位を配置することで、デンドリマーと様々な分子との間で多価相互作用をはたらかせ、結果的に非常に強い相互作用を実現することを目指している。さらに、このような手法により分子を高度に集積化し、分子間相互作用を利用した新規材料を創製することを目指している。今年度は、まず本研究の目的物質である樹木状分子デンドリマーの分子設計を行なった。様々な環境下で、適切な強さで分子間相互作用を起こす相互作用部位の選択と、これらを3次元あるいは2次元的に配置する、立体的な配置のパターンを適切に設計することが、本研究課題を円滑に進める上で極めて重要である。このよな、分子間相互作用を利用した自己組織化に適切なデンドリマーのブランチ構造の設計を行った。この際、様々な官能基導入を可能とするような合成ルートが、できるだけ簡便になるような方向で分子設計を行った。続いて、実際に、そこで計画した合成手法の妥当性について検討を行った。いくつか反応条件を検討した結果、表面に相互作用部位を有するデンドリマーの第1世代から第3世代の合成法について、これらを比較的良好な収率で得られるルートの開拓を行うことができた。さらに、分岐鎖のパターンをいくつか検討し、分岐鎖の多いデンドリマー、少ないデンドリマーなど、様々なバリエーションのデンドリマーを、比較的良好な収率で得ることに成功した。
包括的高感度遺伝子発現プロファイリングに基づく高効率エタノール発酵細菌の育種

石油代替輸送用液体燃料であるセルロース系バイオエタノールの発酵生産に最適な新規のエタノール発酵性細菌(Zymobacter palmae)の発酵ストレス耐性強化を目的とした。HiCEPとDNAマイクロアレイの解析技術をもちいて、Zb. palmae細胞内でストレスに応答して発現する遺伝子群のプロファイリングを行い、ストレス耐性獲得に働く代謝経路を探索した。その結果、Zb. palmaeにアミノ酸合成代謝系酵素群の活性発現を伴う酸性ストレス応答機構を初めて見いだした。Zymobacter palmaeは、1995年に沖縄の椰子汁発酵液から分離した新種のエタノール発酵細菌であり、酵母やZymomonas mobilisよりも優れた発酵特性を示す。申請者は、Zb.palmaeに対して集中的に育種を加え、リグノセルロース連続糖化並行発酵菌を創出するための研究を世界に先駆けて実施してきた。これまでに、Zb.palmaeの宿主・ベクター系を独自に開発し、セロオリゴ糖糖化発酵性やヘミセルロースに由来するキシロースとマンノース発酵性の付与に成功するとともに、Zb.palameのゲノム解析も実施して全ゲノムの完全解読に成功している(未発表)。平成22年度では、新たなトランスクリプトーム解析法として開発されたHiCEP(High Coverrage Expression Profiling:包括的高感度遺伝子発現プロファイリング)技術とDNAマイクロアレイ解析技術を利用して、組換えZb.palmaeのエタノール発酵条件下における糖輸送代謝およびストレス応答に密接に関連した遺伝子群とその発現制御の全容を解明した。先ず、HiCEP解析条件の最適化のために、Zb.palmae細胞からのtotal RNA抽出法とmRNAの精製法を確立し、HiCEP解析に供した。一方、同条件下で調製したtotal RNAを用いたDNAマイクロアレイにより発現遺伝子の解析を行った。HiCEP解析技術とDNAマイクロアレイ解析技術から得られた結果を比較することにより、両解析技術の併用が網羅的遺伝子解析に有効であることを明らかにした。これら解析条件に基づきZb.palmaeに対してストレス負荷環境下での遺伝子発現解析を行った。その結果は、酸性ストレス条件下において、ある種のアミノ酸生合成経路を構成する酵素遺伝子群が発現上昇することを見出した。Zymobacter palmaeは、沖縄の椰子汁発酵液から分離した新種のエタノール発酵細菌であり、酵母やZymomonas mobilisよりも優れた発酵特性を示す。これまでに、Zb.palmaeの宿主・ベクター系を独自に開発し、セロオリゴ糖糖化発酵性やヘミセルロースに由来するキシロースとマンノース発酵性の付与に成功するとともに、Zb.palameのゲノム解析も実施して全ゲノムの完全解読に成功している。平成23年度では、新たなトランスクリプトーム解析法として開発されたHiCEP(High Coverrage Expression Profiling:包括的高感度遺伝子発現プロファイリング)技術とDNAマイクロアレイ解析技術を利用して、組換えZb.palmaeのエタノール発酵条件下における糖輸送代謝およびストレス応答に密接に関連した遺伝子群とその発現制御の全容を解析し、酸性ストレスに応答したアミノ酸生合成関連酵素遺伝子群の発現上昇を見出した。さらに、アミノ酸生合成系の発現上昇を制御するシグマ因子の存在を明らかにした。Zymobacter palmaeは、沖縄の椰子汁発酵液から分離した新種のエタノール発酵細菌であり、酵母よりも優れた発酵特性を示す。申請者は、食糧と競合しない未利用のリグノセルロース系バイオマスからの第2世代バイオエタノール生産のための発酵素子としてのZb. palmaeの潜在的な能力に着目して集中的に育種を加え、リグノセルロース糖化並行発酵菌の創出を世界に先駆けて実施してきた。これまでに、Zb. palmaeの全ゲノム完全解読に成功し、得られたゲノム情報を活用してセルロース糖化発酵性とC5・C6糖並行発酵性を賦与して木質系バイオマスからのバイオエタノール製造プロセスへの利用を検討している。しかし、発酵菌には高温耐性、副生阻害物耐性、酸耐性など、更なるRobust化が求められている。平成24年度ではZb. palmaeの酸耐性の強化を目指して、平成23年度までにHiCEP技術とDNAマイクロアレイ解析技術により明らかにした酸ストレス応答遺伝子の機能を解析した。その結果、酸性ストレスに応答したアミノ酸生合成関連酵素遺伝子群の発現上昇を見出すとともに、ストレス負荷下で発現上昇するシグマ因子のGene dosage effectにより酸ストレス耐性の向上を可能にした。HiCEPとマイクロアレイの組み合わせにより、新規発酵細菌のエタノール発酵下での遺伝子発現の網羅的な解析が終了し、特徴的な糖輸送・糖代謝関連酵素遺伝子群を特定できた。さらに、ストレス負荷により、ある種のアミノ酸生合成がシグマ因子により活性化することを明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。高効率なエタノール発酵を可能にするために、H23年度までに特定した糖代謝系のキー酵素遺伝子の活性化を検討し、発酵速度の向上を図る。さらに、ストレス応答シグマ因子遺伝子のクローニングと機能解析を行い、ストレス耐性強化を図る。
環境中の感染性ノロウイルスの即時現場検出を実現する高感度アプタセンサー技術の創出

本年度は、ヒトノロウイルスのモデルとしてマウスノロウイルスを使用し、環境水中の感染性ノロウイルスの迅速検出のための電気化学センサー技術の開発を進めた。スクリーンプリント金電極(SPGE)にマウスノロウイルス親和性アプタマーを固定化した後に、夾雑物の非特異的吸着を防ぐためにメルカプトヘキサノールにより電極のブロッキングを行い、アプタマー修飾電極を作製した。アプタマーが電極上に固定されていることを視覚的に確認するため、蛍光色素で修飾したアプタマーを金電極に固定し、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、金電極上にのみ固定したアプタマーに由来する蛍光シグナルが観察された。マウスノロウイルスを検出するためには、電気化学測定テクニックの一つである矩形波ボルタンメトリー(SWV)を使用した。アプタマー修飾した電極上に段階希釈したマウスノロウイルスを添加し、酸化還元体を含んだリン酸緩衝液中でSWV測定を行うことでセンサーのマウスノロウイルス検出能と電気化学反応のウイルス濃度依存性を調べた。その結果、ウイルス濃度に応じた電気化学反応(すなわちSWVピーク電流値の低下)が見られ、検量線には高い直線性が認められた。しかし、ウイルス以外の夾雑物による非特異反応も確認されたため、非特異反応の低減に向けてセンサー測定条件の検討を進めている。また、マイクロ流体工学に基づく電極デバイスの作製にも取り組んだ。ガラス基板に電極形状をパターニングし、EB蒸着装置でクロムを、抵抗加熱蒸着装置で金を積層して微小金電極を作製した。加えて、素材としてPDMSを用いたマイクロ流路も作製した。本年度に実施した研究では、ノロウイルスの迅速検出のための電気化学アプタセンサー技術の開発に必要となる基盤技術と測定条件を検討し、本技術の創出に向けた基礎的知見を得た。環境中のノロウイルスの迅速検出のための電気化学アプタセンサーの開発に向け、測定条件の検討を重ねてきている。具体的には、電極材質、支持電解質や酸化還元体濃度など、最適測定条件を検討してきた。これまでの検討で、電極上へのアプタマーの固定化を確認した上で、ウイルスを添加して測定した際にはウイルス濃度に応じた電気化学反応が見られ、検量線にも高い直線性が認められている。また、マイクロ流体工学を応用したセンサーデバイスの開発に向け、微小金電極やマイクロ流路の作製にも着手している。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると言える。これまではヒトノロウイルスのモデルとして培養が容易なマウスノロウイルスを実験に用いて研究を進めてきた。今後は、本技術を用いて実際にヒトノロウイルスを検出することを目指し、ヒトノロウイルス親和性アプタマーとウイルス様粒子(virus-like particles, VLPs)を使用して条件検討を実施する。また、塩素やオゾンなどの消毒処理により不活化したウイルスがアプタマーにより捕捉されるかどうかを調べ、最終的にはアプタセンサーが感染性ウイルス粒子のみを検出可能であることを実験的に示す。

本研究の一年目である本年度は、アプタマーで修飾した電気化学センサーチップを作製し、測定条件を最適化するとともにウイルス検出性能を評価した。サイクリックボルタンメトリー(CV)および矩形波ボルタンメトリー(SWV)により電気化学測定のプローブ(酸化還元体)および電極の最適条件を決定した。まず、作用電極に金ナノ粒子修飾スクリーンプリント炭素電極(GNPs-SPCE),スクリーンプリント炭素電極(SPCE)およびスクリーンプリント金電極(SPGE)の3種類の異なる材質の小型電極表面上での電気化学反応を比較した。SPGEを用いた場合に最も高い反応性が認められ、本研究の電気化学アプタセンサー開発にあたってはSPGEが最適電極材質であると判断した。次に、支持電解質として塩化ナトリウム(NaCl)を用い、4mM K3[Fe(CN)6]を酸化還元体とした電気化学測定系において異なるNaCl濃度によるSWVピーク電流値を決定し、最適NaCl濃度を検討した。1M NaClを支持電解質として用いた場合にSWVピーク電流値が最大となり、この濃度条件が最適であると判断した。酸化還元体としては、4mM K3[Fe(CN)6]に加えて30 μM [Ru(NH3)6]Cl3を添加した場合に最も高いSWVピーク電流値が得られた。また、以上の検討結果から最適と判断された測定条件(電極チップとしてSPGE、支持電解質として1M NaCl、酸化還元体としてK3[Fe(CN)6] + 30 μM [Ru(NH3)6]Cl3を使用)を用いて、SWV測定によるマウスノロウイルス(MNV)検出能を評価した。本研究では、電気化学アプタセンサーによるノロウイルスの高感度・迅速検出を実現するための最適測定条件に関する新たな知見を得ることができたと言える。本年度の到達目標は、ノロウイルスの迅速・高感度検出のための電気化学アプタセンサーの最適測定条件を決定することであった。電気化学アプタセンサーの検出効率に関わる電極材質、支持電解質、酸化還元体といった様々なパラメータを多角的に考慮しながら、最適測定条件を見出した。検出対象にはヒトノロウイルスのモデルとしてマウスノロウイルスを使用し、最適測定条件下におけるウイルス検出能を評価した。当初の計画に従ってノロウイルス電気化学アプタセンサーの研究開発を進めてきており、研究はおおむね順調に進展していると言える。これまではヒトノロウイルスのモデルとして培養が容易なマウスノロウイルスを実験に用いて研究を進めてきた。今後は、本技術を用いて実際にヒトノロウイルスを検出することを目指し、ヒトノロウイルス親和性アプタマーとウイルス様粒子(virus-like particles, VLPs)を使用して条件検討を実施する。また、塩素やオゾンなどの消毒処理により不活化したウイルスがアプタマーにより捕捉されるかどうかを調べ、最終的にはアプタセンサーが感染性ウイルス粒子のみを検出可能であることを実験的に示す。ヒトノロウイルスのモデルとして引き続きマウスノロウイルスを使用し、ウイルス検出能の検討を進める。本年度の研究で見出した最適測定条件下で異なるウイルス濃度に対する電気化学反応(SWVピーク電流値の低下)を調べ、検量線を作成する。