hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヌクレアーゼ抵抗性修飾核酸を搭載した多機能性ナノ構造体による新規核酸医薬の創製

4種の核酸塩基(A,G,C,U)を持つ2'-OMe体は,がん細胞に対する細胞毒性を示さず,また,天然の2'-OMeヌクレオシドを含むRNAよりヌクレアーゼに対する安定性が40倍以上であることから,今後は2'-OMe-4'-チオ体をキャリアに搭載することにした.一方,本研究中に,4'-チオdCTPと4'-チオdTTPを酵素的に取込んだ長鎖shDNAをヒト細胞に導入したところ,そこから転写されるshRNAは,対照とした天然DNAプラスミドから転写されるshRNAよりRNA干渉能が高かった.この点については,4'-チオDNAの細胞内での安定性の反映であると考えている.さらに,デコイ法の候補としての曲がったDNAの設計に成功し,デコイ法に適用可能な環状DNAをクリック反応を用いて合成する方法を確立した.一方,〈キャリアとしてのMENDの最適化〉については,siRNAを搭載し、遺伝子発現を抑制するシステムの開発に成功した.また、遺伝子発現の細胞間ヘテロジェネイティーの原因を探求し、細胞分裂に起因したヒストン蛋白の重要性が示唆された.さらに、遺伝子デリバリーにおけるウイルスベクターと非ウイルスベクターの遺伝子発現効率の差に関しても遺伝子翻訳過程に大きな差があることを見いだした.〈ヌクレアーゼ抵抗性核酸〉1)酸素や硫黄と同族原子であるセレンを4'位に持つ2'-O-メテル-4'-セレノウリジン(McSeUrd)をD-リボースからセレノPummerer反応を鍵反応として合成し、それを含むRNA (MeSeRNA)を世界で初めて合成した. MeSeUrdを4個含む15 merのMeSe RNA 1と天然型RNA二本鎖のTm値は、天然型RNA二本鎖のTm値より5.3°C高かった.さらに、5'-エキソヌクレアーゼに対してMeSe RNA 1は対応する天然型RNAより2.3倍安定であり、50%ヒト血清中では約3900倍安定であった. 2)4'-チオDNA (SDNA)はエンドヌクレアーゼに対する抵抗性に優れ、天然型DNAよりもむしろRNAに対する親和性が高いことからRNA様の構造をしていると予測していた.そこで12 mer SDNA二本鎖のNMRによる構造解析を行ったところ、ほとんどのヌクレオシド糖部は3'-endo配座をとり、主溝は狭く深く、副溝は広く浅く、天然型RNA二本鎖のA型構造の特徴を備えていた. 3)2'-O-メチル-4'-チオヌクレオシドを含むRNA (MeSRNA)はエンドヌクレアーゼに対してSDNAより安定であり、RNA選択性に優れている.現在、このヌクレオシドを含むsi RNAを蛍ルシフェラーゼGL3安定発現細胞(HeLa-Luc細胞)でアッセイしており、天然型si RNAよりも1.64倍安定な修飾様式を見出した.〈MENDの最適化〉トランスフェリン修飾したMENDのエンドソーム脱出を促進するために、pH-感受性膜融合ペプチドGALAを導入して、遺伝子発現を飛躍的に向上させた.また、肺血管内皮細胞を選択的に認識するペプチドリガンド(IRF)を見いだした.IRFでMEND修飾を行ない、si RNAを搭載すると、効率的に遺伝子発現を抑制した.2'-OMe-4'-thio体(MeS)の位置および数を変えた21mer siRNA
日本のアヴァンギャルド芸術における境界と周縁-1920年代～50年代

1.長谷川三郎に関する作品・資料調査を甲南学園長谷川三郎記念ギャラリー、宇都宮美術館で実施した。また、従来、一部しか知られていなかった長谷川三郎の写真作品の画像を収集し、データベース化を進めた。今後、この作業を進めていくことによって、長谷川という作家の全体像がより明確になるはずである。2.瑛九の油彩画とフォトデッサンに関する作品調査を、宮崎県立美術館で行った。また、愛知県立美術館の山田光春アーカイヴを調査し、瑛九に関する基礎調査を進めた。特に、戦前期の瑛九の活動に関する新たな事実の発見があった。3.山田光春のガラス絵に関する作品調査を、愛知県立美術館、宮崎県立美術館で行った。山田は、主に瑛九研究者として知られており、作家としての活動は本格的に行われてこなかった。山田のガラス絵を調査・研究することは、長谷川三郎、瑛九の制作とも関連性や1930年代後半の前衛美術の流れを再考する上で重要な意味がある。4.上記13の基礎調査を踏まえ、メディア環境やメディア・テクノロジーとの関わりという観点から、1920年代50年代の日本の前衛芸術を総体的に考察した。その成果の一部は、『昭和期美術展覧会の研究』所収の論文として発表し、さらに現在も学位申請論文「近代日本の前衛芸術とメディア、テクノロジー」として発表準備を進めている(2010年度提出予定)。同様のテーマから日本の前衛芸術を考察した先行研究は、個人作家論にとどまっていたが、本研究では近代日本の視覚文化をを総体的に捉えようとしている。その意味において近代日本美術史研究に新たな視点をもたらすはずである。19201950年代の日本のアヴァンギャルド芸術を対象とし、背景となる理論的枠組み、作品・活動の実態を多面的に研究することを目的に、研究を進めた。事前に提出した研究計画は、諸般の事情により多少変更し、下記の成果をあげた。1「戦前と占領下の東郷青児に関する調査。特に、占領下における二科会の動向との関連、及び「性の解放」の風潮との関連についての調査する」件に関しては、東郷青児と戦後の二科会に関する調査を行い、貴重な1次資料である帝都座関連資料を入手することができた。現在、論文を執筆中で、来年度には投稿予定である。2「花田清輝と戦後のアヴァンギャルド芸術に関する調査・研究。針生一郎氏、池田龍雄氏等の関係者への聴き取り調査、刊行文献の調査・整理」に関しては、花田清輝と岡本太郎を中心に文献を渉猟、精読し、また関連作品を美術館等で観覧した。池田龍雄氏には2度のインタビューを行い、また1950年代の美術出版社を知る元編集者にも数回にわたって聞き取り調査を行った。3日本におけるレオナルド・ダ・ヴィンチ受容について、主にアヴァンギャルド美術との関わりからまとめ、シンポジウムでの発表および著書(共著)の刊行を行った。4上記以外に、博士論文の基礎となる枠組み作りと、基礎調査を重点的に行った。結果的に刊行論文等の成果が少なくなってしまったが、研究全体の見通しや方法論の吟味を行うことができた。1.1930年前後の美術と映画との関係を調査し、作品面、言説面から検討を行った。その結果を口頭発表、および論文の形で公表した。2.1930年代後半から1940年代初頭の前衛絵画と、写真などの機械的な視覚メディアとの関連を調査・検討した。その結果を、論文「機械的視覚メディアの「影響」から見る昭和10年代の絵画-瀧口修造「影響について」(昭和14年)を手掛かりに-」(『昭和期美術展覧会の研究』)として発表した。3.芦屋市立美術博物館において、吉原治良の旧蔵資料の調査を行った。特に吉原撮影の写真の調査、旧蔵書の調査を行うことで、1930年代後半の前衛美術と機械的な視覚メディアとの密接な関わりを検証することが目的で、今後も調査を継続して行う予定。4.甲南大学長谷川三郎記念ギャラリーにおいて、長谷川三郎の作品及び資料の調査を行った。現在も、調査を継続中。戦前期の長谷川三郎の作品に関する論文としてまとめ、博士論文におさめる予定。5.メディアやテクノロジーとの関わりという切断面から、1920年代50年代の日本のアヴァンギャルド芸術を考察することを、2009年度に提出予定の博士論文のテーマに決定し、東京藝術大学に予備申請を行った。

4.上記13の基礎調査を踏まえ、メディア環境やメディア・テクノロジーとの関わりという観点から、1920年代50年代の日本の前衛芸術を総体的に考察した。その成果の一部は、『昭和期美術展覧会の研究』所収の論文として発表し、さらに現在も学位申請論文「近代日本の前衛芸術とメディア、テクノロジー」として発表準備を進めている(2010年度提出予定)。同様のテーマから日本の前衛芸術を考察した先行研究は、個人作家論にとどまっていたが、本研究では近代日本の視覚文化をを総体的に捉えようとしている。その意味において近代日本美術史研究に新たな視点をもたらすはずである。
膵癌に対するiPS細胞由来樹状細胞を応用した革新的ペプチドワクチン療法の開発

膵癌患者3症例の末梢血単核球よりセンダイウイルスベクターを用いてYamanaka 4 factorを導入しiPS細胞を誘導した.その後iPS細胞からの樹状細胞(DC)への分化誘導を行った.健常人と膵癌患者で得られたiPS細胞由来DCの細胞表面マーカー,抗原提示能および遊走能は同等であった。さらに膵癌患者iPS-DCにカクテルペプチド(KIF20A, MUC16, Mesot helin, VEGFR1/R2)をパルスし,in vitroで細胞傷害性Tリンパ球を誘導したところ,患者由来の膵癌細胞を特異的に傷害することを世界で初めて確認した.その後はカクテルペプチド刺激DCの作製を行った.5種類のカクテルペプチド(KIF20A, MUC16, Mesothelin, VEGFR1, R2)のHLA-A2402拘束のペプチドをパルスし、2日間培養した.1.膵癌患者からのiPS-DCの誘導平成27年度は昨年度に引き続きiPS-DCの誘導を行った.昨年度に健常人からのiPS細胞を樹立する際にセンダイウイルスベクターを用いることで,飛躍的に導入効率が高くなった点から,膵癌患者からのiPS細胞の樹立に際してもセンダイウイルスベクターを用いた.センダイウイルスベクターを用いてYamanaka 4factor (c-myc, oct3/4, Klf4 Sox2)を導入しiPSコロニーをpick upしクローニングを行いiPSを誘導した.膵癌患者3人からiPSを誘導した.その後iPSからのDCへの分化誘導を行った.これまでどおり,4ステップ法を用いて各種サイトカイン添加培養にてDCへの分化誘導を行った.その後FACSでiPS-DCの細胞表面マーカーを確認した.結果、CD11c MHC class I/IICD40 CD83 CD86の発現ならびにサイトカイン分泌能(IFN-g IL-12)をELISAを用いてチェックした.膵癌患者由来のiPS-DCはナイーブなDCと変わらない成熟能を有することを確認した.その後DCの遊走能をチェックし,ナイーブDCと変わらないことを確認した.2.膵癌患者におけるカクテルペプチド刺激とCTLの誘導膵癌患者から誘導したiPS-DCのカクテルペプチドワクチン療法の可能性をin vitroで研究を行った.KIF20AMUC16 MSLN VEGFR1/2の混合ペプチドをiPS-DCに添加し,そのbinding affinityをチェックした.現在ペプチドパルスiPS-DCのin vitro刺激によるCTL誘導を行っている.膵癌患者からのiPS-DCの誘導は困難かと思われたが,センダイウイルスベクターを用いることでほぼ100%iPS細胞が樹立できること,またその後のDCへの分化誘導もスムーズに行えるようになったため,短期間での樹立が可能になった.また作業仮設どおりにDCが機能したため、現在はCTL誘導を行っている.本年度は倫理委員会の承認を得た後に膵癌患者を用いた実験を行った(UMIN000021105)。1.膵癌患者からのiPS-DCの誘導:当科を受診した切除不能膵癌患者から健常人と同様のCiRA protocolでiPS細胞を誘導した。健常人と膵癌患者で得られたiPS由来DCの細胞表面マーカーの相違、抗原提示能および遊走能を指標とした成熟能の相違をFACS,IL-12 ELISA,IFN-gamma ELISAで確認した。結果、膵癌患者iPS細胞由来樹状細胞は健常人と同様に細胞表面マーカーの発現ならびに成熟能を認めた。さらに、癌抗原遺伝子の発現がないかFACSを用いたところ、WT1を1例にCEAを1例に認めた。2.膵癌患者におけるカクテルペプチド刺激と細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導:GMPグレードの5種類のペプチド(KIF20A, MUC16, Mesothelin, VEGFR1, R2)をiPS-DCにin vitroでパルスし、2日間培養し、ペプチド刺激後のDCの表面マーカーCD80, CD83, CD86, MHC-classI,classIIおよびCCR7, Toll-like receptor(TLR)2, 4の発現確認をflow cytometryで検討し、健常人と比較した。結果、健常人と同様のペプチドbindingaffinityを認め、成熟能も同等であった。続いて、カクテルペプチドで刺激したiPS由来DCと同一患者から採取した末梢血単核球を混合培養し、ペプチド特異的なCTLを誘導した。現時点でCTL誘導能をクロムリリースアッセイならびにLDHアッセイで測定中である。本研究の第I相臨床試験への前臨床試験研究は今後は新規基盤A(17H01580)をもとに推進していく予定である。さらに膵癌患者iPS-DCにカクテルペプチド(KIF20A, MUC16, Mesot helin, VEGFR1/R2)をパルスし,in vitroで細胞傷害性Tリンパ球を誘導したところ,患者由来の膵癌細胞を特異的に傷害することを世界で初めて確認した.平成26年度に計画した項目1健常人からのiPS細胞樹立2iPS-DCの分化誘導3カクテルペプチド刺激DCにおけるin vitroCTL誘導能のすべてにおいて研究終了しており、特に研究計画を変更することなく進んでいるため、当初の計画以上に進展しているとした.

特にiPS細胞樹立はもともとレトロウイルスを使用していたが、誘導能はあまり高くなく、時間も要していたが、センダイウイルスベクターに変更してからは、樹立効率は飛躍的に高く、またiPSへの樹立も1ヶ月以内となった.今後の研究のスピードアップも期待される.現在行っているカクテルパルスiPS-DCのin vitroCTL誘導研究を早急に行い,有用な結果が得られれば,実際のワクチン効果を検討する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。膵臓外科ここまでは特に問題なく研究は進んでいる。今後は予定通り、膵癌患者からのiPS-DCの誘導、CTL誘導の研究をすすめていく.具体的にはHLA-A2402膵癌患者のリクルートとiPS細胞の樹立(今後は皮膚繊維芽細胞ではなく末梢血由来PBMCからのiPS細胞樹立を行う.)とDCへの分化誘導を行う.さらにカクテルパルスiPS-DCのin vitroでのCTL誘導をCD8T細胞をresponderとして行う.現在はHLAA24拘束の膵癌腫瘍株をTargetと考えているが、可能であれば自己の腹水から樹立したlineを用いる系も考慮している.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
弾塑性逆解析による金属および金属/樹脂積層板の構成モデル材料パラメータの同定

本研究の目的は,金属および金属/樹脂積層板そのものの材料試験結果を用い,弾塑性逆解析により構成各層の材料特性を決定(弾塑性構成式中の材料パラメータを同定)する方法を確立することである.本研究で得られた主な結果は次のとおりである.(1) 2層金属クラッド板については,引張りおよび繰返し曲げ試験のデータを用いた材料パラメータ同定法を提案した.本研究では,ステンレス/アルミニウムクラッド板を対象として,移動硬化則および等方硬化則に含まれる合計16個の材料パラメータの同定に成功した.また,この妥当性を各層ごとの引張り試験により確かめた.(2)樹脂サンドイッチ金属板のV曲げ試験における上下板のせん断ずれ量の分布から逆解析により樹脂の構成式中の材料パラメータを同走する方法について提案した.2枚のアルミニウム板を樹脂接着した試験片を用いて実験を行い,そのデータを用いて樹脂の構成式に含まれる2個の材料パラメータの同定を行った.重ね合わせ継手の引張りせん断試験から得られた樹脂の応力-ひずみ関係(材料パラメータ)と同定した値がほぼ一致したことにより,本方法の妥当性が確かめられた.(3)本方法の特長のひとつは,材料パラメータを試行錯誤的に探索するのではなく,非線形最適化手法を用いてこれを精度良く行うことにある.さらに,本方法によれば,金属および金属/樹脂積層板について,ある層を機械工などで除去したリせず,積層板そのものの材料試験結果から構成各層の材料特性を決定(弾塑性構成式中の材料パラメータを同定)できるので,この実用的価値は大きい.本研究の目的は,金属および金属/樹脂積層板そのものの材料試験結果を用い,弾塑性逆解析により構成各層の材料特性を決定(弾塑性構成式中の材料パラメータを同定)する方法を確立することである.本研究で得られた主な結果は次のとおりである.(1) 2層金属クラッド板については,引張りおよび繰返し曲げ試験のデータを用いた材料パラメータ同定法を提案した.本研究では,ステンレス/アルミニウムクラッド板を対象として,移動硬化則および等方硬化則に含まれる合計16個の材料パラメータの同定に成功した.また,この妥当性を各層ごとの引張り試験により確かめた.(2)樹脂サンドイッチ金属板のV曲げ試験における上下板のせん断ずれ量の分布から逆解析により樹脂の構成式中の材料パラメータを同走する方法について提案した.2枚のアルミニウム板を樹脂接着した試験片を用いて実験を行い,そのデータを用いて樹脂の構成式に含まれる2個の材料パラメータの同定を行った.重ね合わせ継手の引張りせん断試験から得られた樹脂の応力-ひずみ関係(材料パラメータ)と同定した値がほぼ一致したことにより,本方法の妥当性が確かめられた.(3)本方法の特長のひとつは,材料パラメータを試行錯誤的に探索するのではなく,非線形最適化手法を用いてこれを精度良く行うことにある.さらに,本方法によれば,金属および金属/樹脂積層板について,ある層を機械工などで除去したリせず,積層板そのものの材料試験結果から構成各層の材料特性を決定(弾塑性構成式中の材料パラメータを同定)できるので,この実用的価値は大きい.本研究では,異種の二層金属積層板のそれぞれの層について構成式モデル中の材料パラメータを(一方の層を除去することなく)同定する方法について検討した.本年度の研究で得られた主な結果は次のとおりである.1.実験二層金属積層板について上記の材料パラメータ同定を行うためには,少なくとも二つの異なる種類の材料挙動の実験データが必要となる.そこで,ステンレス/アルミニウム積層板を用いて,引張り試験を行い,「引張り荷重(平均応力)と軸ひずみの関係」,また繰り返し曲げ試験を行い,「曲げモーメントと曲率の関係」を求めた.2.材料パラメータの同定与えられた構成式(線形移動硬化および非線形移動・等方硬化)の材料パラメータを仮定し,上記の二種類の材料挙動の数値シミュレーションを行った.実験データと数値シミュレーション結果が最も一致するような材料パラメータを最小自乗法を基礎とする最適化手法によって同定することができた.結果の妥当性の検証積層板からアルミニウム層を除去したステンレス試験片の引張り試験より得られた応力一ひずみ曲線(また複合則より求めたアルミニウムの)と同定した材料パラメータを用いて計算した応力-ひずみ曲線を比較したところ,両者はよく一致していることがわかった.ただし,線形移動硬化構成式では初期降伏点近傍の応力一ひずみ曲線の非線形挙動が表現できないため,加工硬化係数が大きめに同定されるという問題点があることがわかった.本研究では,金属および金属/樹脂積層板について,ある層を機械加工などで除去したりせず,積層板そのものの材料試験結果から構成各層の材料特性を決定(弾塑性構成式中の材料パラメータを同定)する方法を提案した.本研究で得られた主な結果は次ぎのとおりである.(1) 2層金属クラッド板については,引張りおよび繰返し曲げ試験のデータを用いることによりかなり複雑な形の弾塑性構成式を用いても材料パラメータを同定することができた.本研究では,ステンレス/アルミニウムクラッド板を対象として,移動硬化則および等方硬化則に含まれる合計16個(それぞれの層に対して8個)の材料パラメータの同定に成功した.(2)樹脂サンドイッチ金属板のV曲げ試験における上下板のせん断ずれ量の分布から逆解析により樹脂の構成式中の材料パラメータを同定する方法について提案した.2枚のアルミニウム板を樹脂接着した試験片を用いて実験を行い,そのデータを用いて樹脂の構成式に含まれる2個の材料パラメータの同定を行った.

重ね合わせ継手の引張りせん断試験から得られた樹脂の応力-ひずみ関係(材料パラメータ)と同定した値がほぼ一致したことにより,本方法の妥当性が確かめられた.(3)本方法の特長のひとつは,材料パラメータを試行錯誤的に探索するのではなく,非線形最適化手法を用いてこれを精度良く行うことにある.
ササラダニ類の油腺分泌物に関する研究

京都府亀岡市の京都学園大学敷地内に生息するササラダニ類について,油腺分泌物の天然物化学研究を行った.2005年にササラダニから同定された矢毒蛙アルカロイドであるプミリオトキシンとは分子骨格が異なるアルカロイドを,GC/MS分析により新たに検出した.また,ハムシ幼虫の防御物質として知られるイリドイドモノテルペンを初めて検出し,エナンチオ選択的合成により絶対立体配置を明らかにした.さらに,近縁のコナダニ類から発見した雌特異的なノルモノテルペン2種の立体化学を,キラルカラムを装着したGC分析により決定した.京都府亀岡市の京都学園大学敷地内に生息するササラダニ類について,油腺分泌物の天然物化学研究を行った.2005年にササラダニから同定された矢毒蛙アルカロイドであるプミリオトキシンとは分子骨格が異なるアルカロイドを,GC/MS分析により新たに検出した.また,ハムシ幼虫の防御物質として知られるイリドイドモノテルペンを初めて検出し,エナンチオ選択的合成により絶対立体配置を明らかにした.さらに,近縁のコナダニ類から発見した雌特異的なノルモノテルペン2種の立体化学を,キラルカラムを装着したGC分析により決定した.大学敷地内の各所土壌からササラダニ類を分離し、GC/MSにより分泌化合物の構造解析を行った。その結果、矢毒蛙アルカロイド類縁体を産生していると推定できる未同定ダニを数種発見した。ササラダニから検出できるアルカロイドは微量で、各種分析機器を利用した構造解析が困難である。そこで、これまで報告されている脂溶性矢毒蛙アルカロイドのGC/MSスペクトルデータを可能な限り収集した。これらとササラダニから検出したアルカロイドのマススペクトルデータとを比較することにより、アルカロイドの基本骨格および官能基を推定した。それらの中で、これまで報告のない新奇骨格をもっと考えられるアルカロイドについては、NMRおよびIRスペクトルを測定できる量が必要となる。そこで、ササラダニの安定した繁殖を可能にする飼育条件を検討した。餌としてクロレラあるいは乾燥酵母を一定湿度条件で与えた場合、飼育は可能であったが繁殖速度を上げることはできなかった。そこで、野外でのササラダニ類の生育環境を精査して最適な飼育条件を確立し、増殖率を高める人工飼料の開発を進めている。また、ササラダニ類タテイレコダニ科ダニ約10種の共通成分としてイリドジアールを検出した。まず、ラセミ体の化学合成により平面構造を決定した。現在、絶対立体構造を決定する目的で、エナンチオ選択的合成法を検討している。本化合物はこれまで昆虫の防御物質としての報告がある。反応性の高いジアール構造を有することから、本科ダニの防御物質あるいは何らかの情報化学物質としての機能を推測している。そこで、土壌中の生物に対する忌避活性およびフェロモン活性などを定量的に評価する予定である。ササラダニ類からプミリオトキシン237Aをはじめとする多くの矢毒蛙アルカロイドが同定されて以来,ササラダニ類は矢毒蛙アルカロイドの起源生物として強く疑われている.ササラダニはそれらアルカロイド類を利用して,昆虫や土壌生物などの捕食者に対して化学防御していると考えられる.ササラダニの防御物質を探索する中で,タテイレコダニ科ダニ10種が共通して比較的大量に分泌するイリドイド類のジアール化合物を新たに検出した.本化合物はハムシの防御物質として知られるが,その類縁体はクサカゲロウの誘引物質,カミキリムシやナナフシの防御物質,アルゼンチンアリのバイタルサインなどの生物活性が報告されている.そこで本研究では,タテイレコダニ科ダニ由来イリドイドの,アリなど捕食者に対する忌避活性に加え,未知の生物機能を解明するため,まず天然物の絶対立体配置を決定することを目的として合成を行った.シトラールを出発原料として数段階でジアール体の立体異性体混合物を合成し,天然物とGC保持時間,マススペクトルの比較を行い,相対立体配置を決定した.次に絶対立体配置を決定するため,シクロペンテノンとシリルケテンアセタールを原料として,ビスオキサゾリンと銅の不斉リガンドを用いた向山-Michael反応で,エナンチオ選択的にアルキルエステル側鎖を導入した.そのあと,エノールエステルを経て数段階でイリドイド骨格をもつジオール体に誘導した.別途調製したラセミ体はGCキラルカラムで分離可能であったため,天然物を還元してジオールに誘導し絶対立体配置を決定した.現在,ジオールを酸化して調製したジアールのエナンチオマーとラセミ体を用いて,アリやムカデなど捕食者に対する忌避効果およびフェロモンなどの生物活性を多角的に検討している.
脳神経膠腫における再発,悪性転化の原因遺伝子群に関する研究

本研究においては、再発多形性膠芽腫に特異的に出現する既知並びに未知の遺伝子変異を検出すべく第22番染色体についてLOH (loss of heterozygosity)解析を行い、共通欠失領域に在る遺伝子群を同定し、更にこの領域に座位する遺伝子群のgeneticおよびepigeneticな変化を解析し、多形性膠芽腫への悪性転化や再発のメカニズムを解析することを目的とした。【研究の成果・進捗状況】現在まで遺伝子解析を施行した神経膠腫は、星状細胞腫(WHO grade II)20例、退形成星状細胞腫(WHO grade III)8例、多形性膠芽腫(WHO grade IV)66例(うちprimary glioblastoma (PGBM)40例、secondary glioblastoma (SGBM)26例)、再発膠芽腫12例である。これらの各組織(凍結標本並びにパラフィンブロック)からDNAを抽出し、microsatellite markerを用いて22番染色体の20 locusについてLOH解析を行った。検出できた共通欠失領域は多形性膠芽腫に関しては、22番染色体の22q12.3-13.2のlocusであり、再発性膠芽腫も症例は少ないものの同様の共通欠失領域であった。更に、SGBMにおいてはPGBMとは異なる共通欠失領域(22q12.2)が1cM以内の範囲に同定でき、Blast ResearchやGeneMapなどのdata baseの検索から、関心領域にある遺伝子として数個の遺伝子をpick upした。現在、これらの遺伝子のうちその発現とLOHとの相関がみられたものについて、geneteic及びepigeneticな遺伝子変異について検索中である。本研究においては、再発多形性膠芽腫に特異的に出現する既知並びに未知の遺伝子変異を検出するため第22番染色体についてLOH(loss of heterozygosity)解析を行い、共通欠失領域に在る遺伝子群を同定し、更にこの領域に座位する遺伝子群のgeneticおよびepigeneticな変化を解析し、多形性膠芽腫への悪性転化や再発のメカニズムを解析することを目的とした。
ビーシージーミコール酸を用いた新規癌治療製剤の開発

ミコール酸(MA)リポソーム製剤はプロトタイプが完成し、マウス皮下接種モデルでの抗腫瘍効果を検討した。コントロールマウスに比べて、著明な腫瘍径の縮小を認めた。病理学的には壊死組織を中心に周囲にリンパ球と思われる細胞を多数認め、局所に免疫反応を引き起こしている可能性が示唆された。今後の課題として、工業化を目指すには、ロット間での製剤のバラツキをなくすことが必要である。MAをリポソームに包埋する際の圧力や、装填温度の検討を行う必要がある。現在皮下接種モデルでの抗腫瘍効果の再検をしているとともに、正所性モデルでの膀胱内注入による抗腫瘍効果判定を検討している。Mycobacteriumabovis bacillus Calmette-Guerin (BCG)の膀胱内投与は、既存の癌免疫療法の中でもっとも有効性が確立した治療法であるが、全身投与ができないため適応は筋層非浸潤性膀胱癌に対する膀胱内注入療法のみに限られている。一方で、最近では、結核菌細胞莢膜のミコール酸がCD1抗原として強力な細胞性免疫誘導を示すことが明らかとなってきた。しかし、ミコール酸単独では、疎水性であるため、投与しても効果を得ることができない。そこで本研究ではBCGミコール酸(MA)の高い細胞性免疫賦活作用に着目し、これをオクタアルギニンリポソームに搭載することによって全身投与可能な新規癌治療製剤の開発を目指した。MAリポソーム製剤はプロトタイプが完成し、マウス皮下接種モデルでの抗腫瘍効果を検討した。皮下接種モデルでの抗腫瘍効果の検討では、コントロールマウスに比べて、著明な腫瘍径の縮小を認めた。そのためには、リポソームの粒子径を一定にする必要がある。我々のリポソーム製剤は、高圧乳化法で作成しているが、その際の問題点として、どのくらいの圧力をかけるか、その際の装填温度を何度にするかの検討を行う必要がある。現在MAリポソーム製剤の皮下モデルでの抗腫瘍効果の再検をしているとともに、正所性モデルでの膀胱内注入による抗腫瘍効果判定を検討している。今回我々が開発中のリポソームは、脂質2重膜エンベロープの構造を有し、核酸や抗原タンパク質などの様々な物性を有する高分子を濃縮的にパッケージすることが可能でほぼ100%の細胞に効率的に内在化することができる。最も重要な課題はBCGの高い免疫活性効果を有する成分を利用した、安定かつ安全な非生菌製剤を開発することにある。これまでの基礎研究からBCGによる免疫反応は、菌の細胞壁の特徴的な物質すなわち、cell wall skelton(CWS)、ミコール酸(MA)、Lipomannan、lipoarabinomannanといった多数のワックス様脂質が、樹状細胞に貪食されても長期間細胞質内に生存し、宿主の免疫を刺激し続けるといった特有の性質に関連している。これらの中でミコール酸(MA)がCD1抗原として強力な細胞性免疫誘導を示すことが明らかとなってきた。そこでMAが、生菌に代わる抗腫瘍効果を示すのではないかと考え、北海道大学、BCG研究所とともに、細胞親和性を高め細胞質内にMAを効率的に輸送できるliposome vectorを開発した(リポソーム-MA)。このリポソーム-MAを用いて、新しい癌治療を提唱することを目標としている。製剤化を目指す上で、現在の研究の主眼は大きく3つに分けられる。まずMAの抽出によるロット間のばらつきをなくし、基準となるMAを決めること。2つめはリポソーム化の製造方法を決定すること。3つめは製造したリポソーム-MAに抗腫瘍効果があることを検討すること。現時点において、、基準となるMAの抽出は終了し、種々の方法を用いてリポソーム化しているところである。適切なリポソーム化にむけて調整しつつ、完成したリポソームを用いて、マウス皮下接種モデルで実際に抗腫瘍効果が得られるかを検討しているところである。まず、原薬としてのMAの開発に着手した。これまでの基礎研究で用いてきたMAは菌体から直接抽出していたため、MA以外の成分の混入が考えられた。そこでまず、MA原薬の抽出方法を検討し、MA以外の成分の混入を最小限にすることを目標にし、最終的に基準となるMA抽出に成功した。前段階のMA製剤と、新たに抽出したMAとをMALDI/TOFMS解析をすると、phenolic glycolipid (PGL)spotの部分に差がみられた。

もともとPGLについては、2011年に発表されたNakaらの論文(Journal of Biological Chemistry,286,44153-44161,2011)によると、強いサイトカイン誘導の活性が報告されている。Toll-like receptor2のリガンドとして働いて、TNFαなどのサイトカインを誘導する。このことからも、PGLが抗腫瘍効果に影響を与える可能性があることが示唆された。そのため、これまでの基礎研究で得られた、マウス皮下接種モデルでの抗腫瘍効果で強い効果が得られたのも、このPGLが寄与している可能性も考える必要が出てきた。そこで今後PGL分画も抽出し、抗腫瘍効果があるか検討する予定である。また、現在開発中の基準となる純粋なMAを用いたリポソーム-MAにおいては、C3Hマウスの皮下にリポソーム-MAとMBT-2細胞を同時に接種する皮下腫瘍モデルで、day8から22日目において、軽度の腫瘍体積を減少させる抗腫瘍効果が示唆された。皮下接種における細胞数と、リポソーム-MAの濃度の問題、接種回数の調整を検討すれば、より強い抗腫瘍効果を得られる可能性が示唆された。リポソーム-MAに抗腫瘍効果の可能性があることが確認できつつあり、さらにはPGLにも活性がある可能性が考えられた。そこで、MAだけではなく、PGLも抽出し、リポソーム化するとともに、リポソーム-MAのみで製剤化するか、あるいはPGLも添加物として製剤化するかを検討していく。今後の抗腫瘍効果の検討には、皮下接種実験だけではなく、ラットを用いた膀胱化学発癌モデル、あるいは膀胱癌細胞株を膀胱内に注入した正所性膀胱癌モデルを作成し、膀胱内注入療法で抗腫瘍効果を検討していく。ラットを用いた膀胱化学発癌モデルは、すでに確立した化学発癌モデルの実験系を用いて、リポソーム-MAを実際の臨床に即した投与方法である膀胱内注入療法で抗腫瘍効果を検討することを目的とする。正所性膀胱癌モデルは、膀胱内に膀胱癌細胞を移植し、正着したことを確認後、リポソーム-MAを膀胱内注入し抗腫瘍効果を検証する。皮下接種あるいは膀胱内注入実験で有効性が確認できた後に、肺転移モデルを用いた転移巣への抗腫瘍効果を検証する。ルシフェラーゼ導入MBT-2細胞を尾静注することで、肺転移を形成することは基礎実験データですでに得ている。そこで、肺転移形成初期時にリポソーム-MAを隔日で5回静注する、あるいは、リポソーム-MAをあらかじめ送達させたルシフェラーゼMBT-2細胞を尾静注し、転移形成時とともに、リポソーム-MAを隔日で5回静注することで転移巣への治療効果の有無を明らかにする。以上のように、皮下接種、膀胱内、転移巣への抗腫瘍効果を確認できたら、腫瘍免疫のメカニズムを検討する。脾臓などの免疫細胞の豊富な組織を摘出し、リンパ球分画を測定し、メカニズムの解明を行う。正所性膀胱癌モデルを用いた抗腫瘍効果の検証:C57BL/6マウス膀胱癌細胞であるMB49細胞を正所性にマウスに移植する。移植を確認後にリポソーム-MAを膀胱内注入実験し抗腫瘍効果を検証する。ラット自然膀胱発がんモデルを用いた抗腫瘍効果の検証:ラットは、(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine )
セラム島の植物の分類学的研究

植物学的に定義されるマレーシアには世界で最も豊かな熱帯植物相が成立し,原始的植物から特殊化したものまで多種多様な種が生育する.これらの植物は生物の進化学的多様性を解明しようとする分類学的研究にとって興味深い対象である.そのような研究においては,資料標本を収集して研究の基礎資料を得,植物相と植物地理についての基礎研究を行うことが必須である.マレーシアは東西南3州に区分され,東マレーシアはさらに3地域に細分される.セラム島は,ゴンドワナ植物相が高山に残存するニューギニア,西マレーシアに接するセレベス,さらに北には西マレーシアのフィリピンの囲まれる.またセラムは熱帯多雨林域に位置するだけでなく, 3000mに達する高山があり,全島石灰岩形成物からなる地形地質特性をももつ.そのためセラムは隣接島興とさまざまな植物地理的関係を保ちながら,独特の植物相を成立させていると推定される.1986年の現地調査で3400点の維管束植物と2300点のコケ植物およびそれらの重複品を収集した.セラム島でアルコール固定した収集標本を日本で乾燥後,風乾したコケ植物標本とともに,野外観察記録のラベルをつけて研究用標本として完成した.その結果,過去2回の調査の分を含めた総点数は維管束植物11000点,コケ植物5000点となった.この点数はセラム島から我々の調査以前に収集されたものの2倍に相当し,植物学的に貴重なコレクショである.一部についてはベータベース化を行い資料標本取り扱いの効率化を計った.これらの各セットは東京大学,京都大学の植物標本室に収蔵されるほか,インドネシアのボゴール植物標本館,オランダのライクスハーバリウム,アメリカのミズリー植物園にも送付され,内外の研究者の植物学研究に供される.資料標本について可能な限り同定作業をすすめ,以下のような研究を行った.(1)コケ植物ーセラム島の苔類は未知の種類を多く抱えた植物学的に興味深い群であり,共同研究者の協力を得て,現在確認しているだけでも1新属(Hattoriolejeunia), 8新種, 3新変種が含まれることことがわかった.また,蘚類についてもいくつかの科でセラム島における種属誌的研究をすすめ, Polytrichaceaeなど9科について発表の準備をすすめている.さらにマレーシアの新記録科であるCalomniaceaeを確認した.(2)シダ植物ー四国と同面積であるにもかかわらず700種のシダ植物がセラム島に生育することが明らかになり,同島が世界でも屈指の豊かなシダ植物相をもつ地域であることを確かめた.植物地理的研究を行って,ニューギニアとの高い近縁性を確かめた.また,次の特定群について分類地理学的研究をすすめた.モルッカ諸島のTaenitis属の研究をおこない2新種1新亜種を記録するとともに,本属は全体としては東マレーシア起源であっても,そのうちのTaenitis節は西マレーシアに分布拡大後適応放散したと推定される. Diplazium flavovirideは葉の形態と胞子の表面模様の比較から北米東部のD.pycnocarponと極めて近縁であり,両種は北米ー東アジア(東南イジア)隔離分布型の一例であり,セラム島シダ植物の中では特異な植物地理的関係を示すことを明らかにした.収集した液浸標本を用いて比較形態学的研究を行い,ミヤコジマハナワラビが種子植物とよく似た腋芽をもつことを確かめ,ハナヤスリ科が生きた前裸子植物であるという見解に支持をあたえた.また,イワヒバ科の担根体が根ではなくマツバラン科の地下茎と比較できる軸状構造であることを確かめた.(3)種子植物ーツツジ科(既報11種と東マレーシア系の2新種を含む)など19科について種属の分類学的研究をおこないチェックリストをつくった.科属について,野外記録に形態,解剖学的観察を加えた拡大データを付加した.これによって今後の研究が一層進展することが期待できる.収集した液浸標本を用いて木本多心皮群の比較形態学的研究をすすめた.それによって,これまで異論の多かったHimantandra科のカリプトラが萼と花冠と相同な器官であることを確かめ,この科の多心皮群での系統に推察を加えた.植物学的に定義されるマレーシアには世界で最も豊かな熱帯植物相が成立し,原始的植物から特殊化したものまで多種多様な種が生育する.これらの植物は生物の進化学的多様性を解明しようとする分類学的研究にとって興味深い対象である.そのような研究においては,資料標本を収集して研究の基礎資料を得,植物相と植物地理についての基礎研究を行うことが必須である.マレーシアは東西南3州に区分され,東マレーシアはさらに3地域に細分される.セラム島は,ゴンドワナ植物相が高山に残存するニューギニア,西マレーシアに接するセレベス,さらに北には西マレーシアのフィリピンの囲まれる.またセラムは熱帯多雨林域に位置するだけでなく, 3000mに達する高山があり,全島石灰岩形成物からなる地形地質特性をももつ.そのためセラムは隣接島興とさまざまな植物地理的関係を保ちながら,独特の植物相を成立させていると推定される.1986年の現地調査で3400点の維管束植物と2300点のコケ植物およびそれらの重複品を収集した.セラム島でアルコール固定した収集標本を日本で乾燥後,風乾したコケ植物標本とともに,野外観察記録のラベルをつけて研究用標本として完成した.

その結果,過去2回の調査の分を含めた総点数は維管束植物11000点,コケ植物5000点となった.この点数はセラム島から我々の調査以前に収集されたものの2倍に相当し,植物学的に貴重なコレクショである.一部についてはベータベース化を行い資料標本取り扱いの効率化を計った.これらの各セットは東京大学,京都大学の植物標本室に収蔵されるほか,インドネシアのボゴール植物標本館,オランダのライクスハーバリウム,アメリカのミズリー植物園にも送付され,内外の研究者の植物学研究に供される.資料標本について可能な限り同定作業をすすめ,以下のような研究を行った.(1)コケ植物ーセラム島の苔類は未知の種類を多く抱えた植物学的に興味深い群であり,共同研究者の協力を得て,現在確認しているだけでも1新属(Hattoriolejeunia), 8新種, 3新変種が含まれることことがわかった.また,蘚類についてもいくつかの科でセラム島における種属誌的研究をすすめ, Polytrichaceaeなど9科について発表の準備をすすめている.さらにマレーシアの新記録科であるCalomniaceaeを確認した.(2)シダ植物ー四国と同面積であるにもかかわらず700種のシダ植物がセラム島に生育することが明らかになり,同島が世界でも屈指の豊かなシダ植物相をもつ地域であることを確かめた.植物地理的研究を行って,ニューギニアとの高い近縁性を確かめた.また,次の特定群について分類地理学的研究をすすめた.モルッカ諸島のTaenitis属の研究をおこない2新種1新亜種を記録するとともに,本属は全体としては東マレーシア起源であっても,そのうちのTaenitis節は西マレーシアに分布拡大後適応放散したと推定される. Diplazium flavovirideは葉の形態と胞子の表面模様の比較から北米東部のD.pycnocarponと極めて近縁であり,両種は北米ー東アジア(東南イジア)隔離分布型の一例であり,セラム島シダ植物の中では特異な植物地理的関係を示すことを明らかにした.収集した液浸標本を用いて比較形態学的研究を行い,ミヤコジマハナワラビが種子植物とよく似た腋芽をもつことを確かめ,ハナヤスリ科が生きた前裸子植物であるという見解に支持をあたえた.また,イワヒバ科の担根体が根ではなくマツバラン科の地下茎と比較できる軸状構造であることを確かめた.(3)種子植物ーツツジ科(既報11種と東マレーシア系の2新種を含む)など19科について種属の分類学的研究をおこないチェックリストをつくった.科属について,野外記録に形態,解剖学的観察を加えた拡大データを付加した.これによって今後の研究が一層進展することが期待できる.収集した液浸標本を用いて木本多心皮群の比較形態学的研究をすすめた.それによって,これまで異論の多かったHimantandra科のカリプトラが萼と花冠と相同な器官であることを確かめ,この科の多心皮群での系統に推察を加えた.
Sotos症候群の治療基盤確立のためのモデルマウス樹立と発症メカニズムの解明

Sotos症候群(SoS)の基本的特徴は、過成長、特異的顔貌、学習障害である。学習障害は、成人期に自立できる軽度のものから、自立困難な重度のものまであり、その程度は様々である。その他にも、骨年齢促進、心奇形、腎奇形、脊柱側彎などを合併する場合がある。その原因遺伝子は、ヒストンH3リジン36メチル化酵素をコードするNSD1遺伝子であり、そのハプロ不全によって発症する。過去にNSD1のノックアウトマウスが作製されたが、ハプロ不全に相当するヘテロ欠損マウスの表現型は正常であり、一方、ホモ欠損マウスは胚性致死を示し、ヒトとは異なる表現型を示した。本研究では、Nsd1遺伝子を大脳皮質、海馬、嗅球特異的にノックアウトすることによって、SoSの学習障害モデルマウスの作製を試みた。ノックアウトマウスの大脳皮質、嗅球、肝臓の組織からRNAを抽出し、RT-PCRにて、大脳皮質、嗅球特異的にNsd1がノックアウトされていることを確認した。またこのノックアウトマウスは野生型に比べて、生後6週までは低体重を示すが、それ以降は正常と体重は変らず、通常の発育を示し、雄、雌共に生殖能力を有していた。しかしながら、このマウスは出生後の生存能力が野生型に比べて弱く、出生後、野生型の仔を一部間引きしなければ、生存できない特徴を持っていた。このことは、このマウスが何らかの脳の障害を持っている可能性を示唆する。現在、このマウスの戻し交配を6回終え、行動表現型解析を行うため、マウスを繁殖させている。一方、Nsd1タンパクの標的遺伝子を同定するために、CRISPR/Cas9により、Nsd1遺伝子の下流に3xTY1タグを挿入したマウスの作製を試みているが、現在のところうまくいっていない。さらなる工夫をすることによって作製する予定である。原因遺伝子は、ヒストンH3リジン36メチル化酵素をコードするNSD1遺伝子であり、そのハプロ不全によって発症する。過去にNSD1のノックアウトマウスが作製されたが、ハプロ不全に相当するヘテロ欠損マウスの表現型は正常であり、一方、ホモ欠損マウスは胚性致死を示した。このように現在のところ、SoSの表現型を呈するモデルマウスは樹立されていない。本研究の目的は、SoSモデルマウスを樹立し、学習障害の発症メカニズムを解明することである。将来的には、このモデルマウスをエピジェネティック治療薬(ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬など)のスクリーニングに用いることにより、SoSの治療基盤を確立することが可能になると考えている。研究成果1NSD1のエクソン5の上流と下流にloxP配列が挿入されているNSD1 floxマウスを樹立した。その後、薬剤耐性マーカーであるNeo耐性遺伝子をCreトランスジェニックマウスとの交配により除いた。現在、NSD1 floxマウスを繁殖中である。2背側終脳(大脳皮質)特異的にCreを発現するEmx1-CreトランスジェニックマウスをRIKENより購入し、現在、繁殖中である。NSD1 floxマウスの繁殖が予想通りに進まず、CRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術を用いて、NSD1のC末端に3xFLAGを挿入したNSD1 floxマウスの作製が遅延している。今年度は、過去に報告されたとおり、ヘテロ欠損マウスが正常で、ホモ欠損マウスが胚性致死を示すことを確認した。次に、Nsd1遺伝子を大脳皮質、海馬、嗅球特異的にノックアウトしたSoSの学習障害モデルマウスの作製を試みた。このマウスは野生型に比べて、生後6週までは低体重を示すが、それ以降は正常と体重は変らず、通常の発育を示す。また、雄、雌共に生殖能力があった。しかしながら、このマウスは出生後の生存能力が野生型に比べて弱く、出生後、野生型の仔を一部間引きしなければ、生存できない特徴を持つ。今後、マウスの行動表現型解析を行う予定である。一方、Nsd1タンパクの標的遺伝子を同定するために、CRISPR-Cas9により、Nsd1遺伝子の下流にタグを挿入したマウスを現在作製中である。今後このマウスを利用してNsd1タンパクの標的遺伝子の同定を行う予定である。NSD1 flox

マウスの繁殖が予想通りに進まず、CRISPR-Cas9法によるゲノム編集技術を用いて、NSD1の遺伝子の下流にタグを挿入したマウスの完成が遅れているため。Sotos症候群(SoS)の基本的特徴は、過成長、特異的顔貌、学習障害である。学習障害は、成人期に自立できる軽度のものから、自立困難な重度のものまであり、その程度は様々である。その他にも、骨年齢促進、心奇形、腎奇形、脊柱側彎などを合併する場合がある。その原因遺伝子は、ヒストンH3リジン36メチル化酵素をコードするNSD1遺伝子であり、そのハプロ不全によって発症する。過去にNSD1のノックアウトマウスが作製されたが、ハプロ不全に相当するヘテロ欠損マウスの表現型は正常であり、一方、ホモ欠損マウスは胚性致死を示し、ヒトとは異なる表現型を示した。本研究では、Nsd1遺伝子を大脳皮質、海馬、嗅球特異的にノックアウトすることによって、SoSの学習障害モデルマウスの作製を試みた。ノックアウトマウスの大脳皮質、嗅球、肝臓の組織からRNAを抽出し、RT-PCRにて、大脳皮質、嗅球特異的にNsd1がノックアウトされていることを確認した。またこのノックアウトマウスは野生型に比べて、生後6週までは低体重を示すが、それ以降は正常と体重は変らず、通常の発育を示し、雄、雌共に生殖能力を有していた。しかしながら、このマウスは出生後の生存能力が野生型に比べて弱く、出生後、野生型の仔を一部間引きしなければ、生存できない特徴を持っていた。このことは、このマウスが何らかの脳の障害を持っている可能性を示唆する。現在、このマウスの戻し交配を6回終え、行動表現型解析を行うため、マウスを繁殖させている。一方、Nsd1タンパクの標的遺伝子を同定するために、CRISPR/Cas9により、Nsd1遺伝子の下流に3xTY1タグを挿入したマウスの作製を試みているが、現在のところうまくいっていない。さらなる工夫をすることによって作製する予定である。NSD1 floxマウスを繁殖させ、CRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術を用いて、NSD1のC末端に3xFLAGを挿入したNSD1 floxマウスの作製を急ぐ。同時に、背側終脳(大脳皮質)でCreを発現するEmx1-Creトランスジェニックマウスの繁殖させ、上記のマウスと交配させることにより、SoS学習障害モデルマウスの樹立を試みる。CRISPR-Cas9法によるゲノム編集技術を用いて、NSD1の遺伝子の下流にタグを挿入したマウスの完成を急ぐ。また、行動表現型解析に必要なマウスの数を確保しその解析を行う。NSD1 floxマウスの繁殖が遅れ、次の段階に進めなかったため。(理由)Nsd1 floxとNsd1コンディショナルノックアウトマウスの繁殖が遅れ、次の段階に進めなかったため。(使用計画)Nsd1 floxとNsd1コンディショナルノックアウトマウスを繁殖させ、次の段階に必要な数を確保次第、当初の計画通りに進める予定である。NSD1 floxマウスを繁殖させ、次の段階に必要な数を確保次第、当初の研究計画通りに進める予定である。
神経変性疾患発症機序の解明:シナプスに局在する新規の脱ユビキチン酵素との関連

様々な脳神経変性疾患におけるユビキチン/プロテアソーム系異常の関与が明らかにされつつある。ユビキチン化されたタンパク質は、アルツハイマー病の神経原線維、パーキンソン病のレビー小体、トリプレットリピート病の核封入体など種々の神経変性疾患の不溶化凝集体の共通成分である。本来プロテアソームで分解されるべきユビキチン化タンパク質の凝集、異常蓄積はユビキチン/プロテアソーム系の機能異常を示唆する。synUSPは申請者がクローニングに成功した新規した新規脱ユビキチン酵素である。この酵素が1036アミノ酸から構成され、N末に脱ユビキチン活性ドメインを持ち、C末にユビキチン様領域を有し、大脳のシナプス後肥厚部(PSD)画分に濃縮され、モデル基質に対して脱ユビキチン活性モデル基質に対して脱ユビキチン活性を有することを明らかにした。更に、酵母Two-hybridや培養細胞系を用いて、Secretogranin III(SgIII)を含む三つsynUSPの基質候補を同定した。synUSPの機能を明らかにするために、synUSPのdominant negative mutantを樹立した。シナプス後部にmRNAが局在する遺伝子(Dem遺伝子)を網羅的に同定しようとするプロジェクトにおいて発見した新規の遺伝子について,完全長のcDNAのクローニングとそれらの性質,および機能解析を進めた.いくつかの新規完全長遺伝子をクローニングし遺伝子登録を行った.新規のubiquitin-specific protease(USP)については以下の所見を得た.cDNAの全長は5378bp.1036アミノ酸をコードするORFを有するUSP familyに属する新規遺伝子である.GSTとのfusion proteinはUSP活性を有しており,mRNAはdendriteに局在する.カイニン酸痙攣誘導により発現が増加した.抗体を作製し,subcellular分布を調べるとタンパクはPSD画分に局在した.他に,神経変性疾患のうち,特にアルツハイマー病との関連が示唆される新規遺伝子として以下のものも同定した.ssLRP(short form synaptic LDL receptor-related protein):cDNAは約6.8kbp.コードされるタンパク質は膜貫通ドメイン1個を持ち,複数のEGFリピート等を持つ新規遺伝子で,細胞接着やそれに付随する細胞内シグナル伝達系に繋がる,ある種のレセプタータンパク質をコードすると予想される.mRNAはdendriteに局在する.カイニン酸痙攣誘導により発現が増加する.C末でPSD-95,SAP97と結合した.免疫組織染色で神経細胞の樹状突起に局在した.細胞外にAb,ApoEAPP等との結合を示唆するドメインを有していたので,Alzheimer病の発症に関わっている事が示唆された.様々な脳神経変性疾患におけるユビキチン/プロテアソーム系異常の関与が明らかにされつつある。