hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パーキンソン病における神経変性を可視化する細胞内タンパクイメージング法の開発

パーキンソン病患者における神経細胞の変性・脱落では、細胞内可動性タンパクが減少するため、細胞内タンパクイメージングは神経変性を鋭敏に捉えることができるものと思われる。そこで、パーキンソン病の神経変性を可視化するために、パーキンソン病患者においてAPTイメージングの取得を行った。パーキンソン病患者10名と健常者7名との間で、unpaired t検定を用いて、黒質、赤核、尾状核、淡蒼球、被殻のAPT値を比較したところ、黒質では、パーキンソン病患者のAPT値は、健常者より低値であった。それに対し、赤核、尾状核、淡蒼球、被殻では、パーキンソン病患者のAPT値は健常者より高値であった。しかしながら、いずれの部位においても有意差はみられなかった。また、パーキンソン病の重症度分類として、広く用いられているヤール分類による重症度と黒質のAPT値との間に相関は見られなかった。本院における、パーキンソン病患者の受診者数が少なく、十分な症例を取得することが困難であった。そのために、有意差が得られる症例数に達していないのかもしれない。今後の症例の蓄積に期待したい。パーキンソン病患者(PD)においてAPTイメージングの取得を行った。PD10名と健常者7名との間で、unpaired t検定を用いて、黒質、赤核、尾状核、淡蒼球、被殻のAPT値を比較した。黒質ではPDのAPT値は健常者より低値であった。一方、赤核、尾状核、淡蒼球、被殻では、PDのAPT値は健常者より高値であった。いずれの部位でも有意差はなかった。また、PDの重症度分類のヤール分類と黒質のAPT値との間に相関は見られなかった。本院における、PDの受診者数が少なく、十分な症例を取得することが困難であった。そのため、有意差が得られる症例数に達していないのかもしれない。各科におけるパーキンソン病患者を把握していく予定である。またCESTイメージングはごく微量の信号変化を捉える手法であり、現時点では、パーキンソン病患者における特異的所見は捉えられていない。今後症例を蓄積して、さらなる検討を進めていく予定である。神経内科を中心にパーキンソン病関連疾患患者の症例をさらに蓄積していく予定である。またCESTイメージングはごく微量の信号変化を捉える手法であり、現時点では、パーキンソン病関連疾患患者における特異的所見は捉えられていない。放射線診断学研究の進捗状況が当初の予定通り進んでおらず、予定していた学会発表が出来なかったため。研究を進め、次年度に学会発表する予定である。
エストロゲンが摂食・飲水行動に及ぼす影響とその脳内機構の解明

エストロゲンが摂食行動と浸透圧調節機能に及ぼす影響とそのメカニズムを明らかにすることを目的とした。7週齢の雌ラットの卵巣を摘出し、エストロゲン補充(E2)群とプラセボ補充(Pla)群に分けた。Pla群では、E2群に比べ摂食量が増加し、弓状核におけるc-Fos発現が有意に多かった。Pla群では、明期の摂食量の割合がE2群に比べて有意に大きくなった。視交差上核の明期のc-Fos発現は、Pla群ではE2群に比べて有意に少なく、明期と暗期のc-Fos発現量の差が小さくなった。これらより、エストロゲンが直接または間接的に視交差上核に作用し摂食パターンを変化させている可能性が示唆された。48時間絶食後の摂食量および弓状核におけるc-Fos発現の増加に両群間の差は認められなかった。エストロゲンは絶食により誘導される摂食行動には影響を及ぼさないが、自発的摂食行動に影響することが示された。次に浸透圧調節に及ぼすエストロゲンの影響を検討した。E2群とPla群で浸透圧刺激(1.5M NaCl;3.3ml/kg)に対する飲水量を比較すると、E2群でPla群に比べて有意に少なかった。中枢における浸透圧調節関連部位のc-Fos発現は、終板器官(OVLT)、室傍核(PVN)視索上核(SON)においてE2群の方が少なかった。また、PVN、SONのバゾプレッシン陽性ニューロンにおけるc-Fos発現の割合はE2群で有意に低かった。脳室内アンギオテンシンII投与に対する飲水量もE2群でPla群よりも少なく、OVLT、脳弓下器官(SFO)、正中視索前核(MnPO)およびPVN、SONにおけるc-Fos発現量が少なかった。SONのバゾプレッシン陽性ニューロンにおけるc-Fos発現の割合はE2群で有意に低かった。エストロゲンは浸透圧刺激性の飲水およびバソプレッシン分泌反応を抑制し、この浸透圧調節反応の抑制は、少なくとも一部は脳内アンギオテンシンIIに対する反応性の低下を介するものであると推察される。本年度は主にエストロゲンが摂食行動に及ぼす影響のメカニズムを明らかにすることを目的とし、卵巣摘出雌ラットへのエストロゲン補充が摂食行動に及ぼす影響について検討した。7週齢の雌ラットの卵巣を摘出し、皮下にエストロゲンペレットを埋め込んだエストロゲン補充ラットとプラセボを埋め込んだプラセボ補充ラットにおいて摂食行動および、神経活動のカーカーであるc-Fosの視床下部における発現を検討した。プラセボ補充ラットでは、エストロゲン補充ラットに比べ著しく体重増加が大きくなった。この体重増加の差は、主に摂食量の差によるものであった。通常の摂食行動に関連する部位である弓状核におけるc-Fos発現は、プラセボ補充ラットでは、エストロゲン補充ラットに比べて有意に多かった。プラセボ補充ラットの摂食量は、明期、暗期ともにエストロゲン補充群に比べて多かったが、プラセボ補充群では明期の摂食量の割合がエストロゲン補充群に比べて有意に大きくなった。そこで、生体リズムの中枢である視交差上核のc-Fos発現を明期の初めと暗期の初めで観察した。

視交差上核におけるc-Fos発現は、明期に多く、暗期に少ないという日内リズムがあるが、プラセボ補充ラットにおいては、明期のc-Fos発現が、エストロゲン補充ラットに比べて有意に少なく、明期と暗期のc-Fos発現の差が小さくなった。このことより、エストロゲンが直接または間接的に視交差上核に作用して摂食パターンを変化させている可能性が示唆された。また、48時間絶食後の摂食量および弓状核におけるc-Fos発現の増加に両群間の差は認められなかったことより、エストロゲンは刺激(絶食)により誘導される摂食行動には大きな影響を及ぼさないが、自発的摂食行動(spontenous feeding)に影響する可能性が示された。本年度は主にエストロゲンが飲水行動に及ぼす影響とそのメカニズムを明らかにすることを目的とした。卵巣摘出雌ラットへのエストロゲン補充が血漿浸透圧の上昇と脳室内アンギオテンシンII投与によって誘発される飲水行動に及ぼす影響について検討した。7週齢の雌ラットの卵巣を摘出し、皮下にエストロゲンペレットを埋め込んだエストロゲン補充ラットとプラセボを埋め込んだプラセボ補充ラットにおいて飲水行動および、神経活動のマーカーであるc-Fosの視床下部における発現を検討した。静脈内高張性食塩水投与(1.5M NaCl;3.3ml/kg)および、脳室内アンギオテンシンII投与(5ng)によって誘発される飲水行動は、飲水量で比較すると、エストロゲン補充群でプラセボ補充群に比べて有意に少なかった。浸透圧刺激時には、終板器官(OVLT)におけるc-Fos発現は、エストロゲン群ではプラセボ群よりも少なく、室傍核(PVN)外側におけるc-Fos発現も、エストロゲン群で少なかった。また、PVN、視索上核(SON)のバゾプレッシン陽性ニューロンにおけるc-Fos発現の割合はエストロゲン群で有意に低かった。脳室内アンギオテンシンII投与に対して、脳弓下器官(SFO)、正中視索前核(MnPO)、SONにおける、c-Fos発現はエストロゲン群において有意に少なかった。また、SONのバゾプレッシン陽性ニューロンにおけるc-Fos発現はエストロゲン群で有意に低かった。以上より、エストロゲンは浸透圧刺激性の飲水およびバゾプレッシン分泌反応を抑制することが明らかになった。エストロゲンは、脳内アンギオテンシンIIに対するこれらの反応を抑制することから、エストロゲンによる浸透圧調節反応の抑制は、少なくとも一部は脳内アンギオテンシンIIに対する反応性の低下を介するものであると推察される。
人のような空間認識能力を持つ多自由度アクチュエータ駆動二眼カメラシステムの開発

本研究では,ロボットに搭載するビジョンシステムのための,多自由度アクチュエータを用いた相対運動可能な二眼カメラシステムの構築およびその制御を目的とする。既存の多自由度アクチュエータは構造が複雑かつ大型な制御装置が必要なことから,小型化が困難であった。そこで本年度においては,二眼カメラシステムに搭載するための振れ補正と三自由度駆動が可能な多自由度アクチュエータを提案した。提案したアクチュエータは三個のコイルのみで三自由度駆動を可能とし,従来と比べて構造が単純化されるとともに簡素な制御装置で駆動可能である。その試作機により動特性を検証し,提案した磁気構造及び動作原理が有効であることを実証した。振れ補正システムの制御システムとしては,未知外乱に対する高いロバスト性が求められる。そこで,提案したアクチュエータの動的モデルを導出し,非線形制御法の一つであるスライディングモード制御を適用し,外乱に対してロバストな姿勢制御手法を構築した。また,他の制御器との比較により,その有効性を示した。さらに,制御系設計において重要であるアクチュエータの数理モデル及び物理パラメータを入出力データから推定するため,部分空間法に着目したシステム同定手法を提案した。入力として電圧値,出力として姿勢のデータを得ることで,アクチュエータのモデルを同定可能であることを数値計算をもとに示した。最後に,システム全体の小型・軽量化を目的として,拡張カルマンフィルタによるセンサレス姿勢推定手法を提案し,数値計算により高精度に姿勢を推定可能であることを示した。産業用マニピュレータやロボットをはじめとして,多自由度機構は様々な分野で活用されている。そのため,一台で多自由度駆動可能である多自由度アクチュエータの適用による小型・軽量化及び位置決め精度の高精度化が期待されている。しかし,既存の多自由度アクチュエータは多数のコイルを三次元上に配置し,それらの励磁を切り替えて三自由度駆動する原理上,構造及び制御装置の大型化が課題となっていた。本年度において提案した多自由度アクチュエータは,これらの課題を解決するものであり,簡素な構造と制御装置によって三自由度駆動可能である。そのため,研究課題である二眼カメラシステムの駆動部としての活用が期待できる。加えて,本年度提案した制御手法は実環境に置いて発生する多自由度振動に対して有効であることを確認しており,二眼カメラシステムへの搭載時に,認空間識精度の向上に貢献することが期待できる。今後の推進方策として,まず本年度に提案したセンサレス姿勢推定手法の実機による精度検証を行う。本手法では,提案したアクチュエータの動的モデルをもとに数値計算によってその有効性を確認している。しかし,実機による精度検証を行っておらず,実環境での有効性は未だ検証されていない。そのため,提案した姿勢推定手法が実環境においても有効であるかを検証する。そして,提案した多自由度アクチュエータを二つ搭載した二眼カメラシステムを構築する。さらに,その動作特性を検証するとともに,カメラを用いて視標の位置測定,視標の高速な切り替えによる視標認識検証,視標追跡実験を行い,システムの有効性を検証する。

加えて,本年度提案した制御手法は実環境に置いて発生する多自由度振動に対して有効であることを確認しており,二眼カメラシステムへの搭載時に,認空間識精度の向上に貢献することが期待できる。今後の推進方策として,まず本年度に提案したセンサレス姿勢推定手法の実機による精度検証を行う。本手法では,提案したアクチュエータの動的モデルをもとに数値計算によってその有効性を確認している。しかし,実機による精度検証を行っておらず,実環境での有効性は未だ検証されていない。そのため,提案した姿勢推定手法が実環境においても有効であるかを検証する。そして,提案した多自由度アクチュエータを二つ搭載した二眼カメラシステムを構築する。さらに,その動作特性を検証するとともに,カメラを用いて視標の位置測定,視標の高速な切り替えによる視標認識検証,視標追跡実験を行い,システムの有効性を検証する。
多細胞生物の発生における糖鎖発現パターンの体系的技術と解析ソフトの開発

糖脂質は,細胞間認識等の機能を持つ物質交代で生合成される物質であるが,糖脂質の研究例は乏しく,ゲノムワイド解析の技術も開発されていない.そこで本年度は,ゲノムワイド解析技術の開発とマボヤの糖脂質構造と細胞局在を決定した.(1)糖脂質構造予測システムの構築半システムは,PSD解析データからフラグメント抽出プログラムにより抽出したフラグメント間の分子量差から構成糖を予測し,(1)この操作を親マスから順に行うことで糖鎖配列を作成する,(2)作成された糖鎖配列から還元末端糖を見出す,(3)その糖鎖配列を基に糖鎖構造を推測し,推測構造をPSD解析した場合に観測されうるフラグメントを作成し,実際の観測データとマッチングすることで,糖鎖構造予測を行う,(4)出力の順位付けは,予測に用いたフラグメントのイオン強度和の降順とした.予測精度の検証は,計算により予測対象となる全ての構造の擬似フラグメントを作成し,それを入力データとして調べたところ,全ての予測対象構造が1位に予測され,ノイズを混入した場合でも正解構造が上位に予測されることを確認した.そこで,本システムを用いて,既知8構造に対して予測を行ったところ,全構造に対して上位(1位は7/8)に予測された.我々の研究室では,脊椎動物や発生のモデル生物であるホヤのスフィンゴ糖脂質構造解析を進め,新規の糖脂質化学構造を決定してきている.マボヤH.roretziこおいては,新規酸性糖脂質と数種類の中性糖脂質の構造を決定している.本研究では,その機能解明に向け,まずはそれら糖脂質の組織別分布を,肝膵臓とそれ以外の組織(主に筋膜体等)の2つに分画して調べた.肝膵臓と筋膜体等において,弱アルカリ安定脂質画分中の総糖脂質画分の割合はそれぞれ28.1%と3.2%で,総糖脂質画分中の酸性糖脂質画分の割合は77.1%と29.2%であった.(1)ホヤの酸性糖脂質の決定単細胞生物とは違い多細胞生物シミュレーションには、細胞間相互作用を考慮しなければならない。一方、スフィンゴ糖脂質は細胞間相互作用に非常に重要であるが、ホヤならびに線虫ではその研究例は乏しい。よって、まずは3種のホヤから新規酸性糖脂質の構造を解析し、多くの新規構造を決定した。発生過程における糖脂質発現の解析には、自動的に糖脂質を決定できるシステムが必要であることから、そのシステムの開発を行った。現時点では、2分岐型糖脂質まで対応できるシステムが構築している。糖脂質は,細胞間認識等の機能を持つ物質交代で生合成される物質であるが,糖脂質の研究例は乏しく,ゲノムワイド解析の技術も開発されていない.そこで本年度は,ゲノムワイド解析技術の開発とマボヤの糖脂質構造と細胞局在を決定した.(1)糖脂質構造予測システムの構築半システムは,PSD解析データからフラグメント抽出プログラムにより抽出したフラグメント間の分子量差から構成糖を予測し,(1)この操作を親マスから順に行うことで糖鎖配列を作成する,(2)作成された糖鎖配列から還元末端糖を見出す,(3)その糖鎖配列を基に糖鎖構造を推測し,推測構造をPSD解析した場合に観測されうるフラグメントを作成し,実際の観測データとマッチングすることで,糖鎖構造予測を行う,(4)出力の順位付けは,予測に用いたフラグメントのイオン強度和の降順とした.予測精度の検証は,計算により予測対象となる全ての構造の擬似フラグメントを作成し,それを入力データとして調べたところ,全ての予測対象構造が1位に予測され,ノイズを混入した場合でも正解構造が上位に予測されることを確認した.そこで,本システムを用いて,既知8構造に対して予測を行ったところ,全構造に対して上位(1位は7/8)に予測された.我々の研究室では,脊椎動物や発生のモデル生物であるホヤのスフィンゴ糖脂質構造解析を進め,新規の糖脂質化学構造を決定してきている.マボヤH.roretziこおいては,新規酸性糖脂質と数種類の中性糖脂質の構造を決定している.本研究では,その機能解明に向け,まずはそれら糖脂質の組織別分布を,肝膵臓とそれ以外の組織(主に筋膜体等)の2つに分画して調べた.肝膵臓と筋膜体等において,弱アルカリ安定脂質画分中の総糖脂質画分の割合はそれぞれ28.1%と3.2%で,総糖脂質画分中の酸性糖脂質画分の割合は77.1%と29.2%であった.
糸状菌人工染色体の作出とトマト萎凋病菌の水平伝搬・病原性変異の再現解析

トマトに重要病害を引き起こすトマト萎凋病菌の小型染色体には病原性関連遺伝子やトランスポゾン等の反復配列が集中的に座乗しており,トマトへの病原力を支配している。小型染色体は生存に必須でないため,細菌のプラスミドのように水平伝搬して病原性を獲得し,変異蓄積によって病原性を変化させる。本研究では独自のゲノム編集技術を用いることで,この小型染色体内の不要遺伝子領域を取り除き,糸状菌の人工染色体の作出する。作出した人工染色体の新たな遺伝子工学的有用性を検証すると共に,植物病原菌のゲノム機能・構造ならびに進化機構の解析に用いることで「創って解析・理解する」新たな研究手法の確立に挑戦する。F. oxysporumに最適化したCRISPR/Cas9はほぼ想定通りの活性を示し,計画通りに研究を展開することができた。確立したゲノム編集技術をベースとして小型染色体独自のゲノム編集技術および不要領域を取り除いた人工染色体の開発に引き続き取り組んでいく。条件検討過程で得られる大規模欠損小型染色体の機能解析を平行して進めていく。DNA合成,シークエンスおよびNGSシークエンスの汎用性が高まり,本年度から想定していたよりも安価に利用することができるようになった。翌年度請求した助成金と合わせて,計画している遺伝子数,ゲノム領域を拡大してさらなる研究の発展を目指す。
根面齲蝕の保存処置法および二次齲蝕予防に関する研究

加齢と共に増加し、歯周疾患の罹患と関連性が深いと考えられている根面齲蝕に対する適切な修復法、二次齲蝕予防ならびに予防法の検討は急務と思われる。本研究プロジェクトは成人、特に中高年の齲蝕として問題となると考えられる根面齲蝕の保存修復法を、予防学的見地から検討するために計画され、以下に示すような研究成果を得た。1.正確で再現性のある剪断接着疲労試験を試作し、4種象牙質接着剤の疲労に対する抵抗性を検討した結果、静的剪断接着強さには明瞭な差は認められなかったが,繰り返し疲労試験では明らかな差が認められ、口腔内で受ける咬合のストレスをシュミレ-トした動的試験法の必要性が示された(歯科材料・機械,10,1991;接着歯学,8,1990)。2.コンポジットレジン修復の辺縁封鎖性を改善するため、傾斜分割填塞法を評価した。コンポジットレジン修復の辺縁封鎖性は傾斜分割填塞法により、また、水中浸漬の期間の延長に従い改善された(日歯保誌,34,1991)。3.鋳造修復物の二次齲蝕を予防するため、フッ素ーランタン二段処理法をセメント合着前に窩壁に適用した。フッ素ーランタン二段処理法は効果的に酸の侵入を阻止し、象牙質表層の構造を維持した(日歯保誌,35,1992)。4.象牙質の脱灰に対するフッ素ーランタン二段処理法の有効性を明確にするためSEMにて検討を加えた。脱灰前、フッ素ーランタン二段処理法を適応した象牙質面は微細な球状反応物が0.51.0μmの層で覆われ、この反応物は脱灰後も残存し、象牙細管開口部もデンティナルプラグで栓塞されていた。フッ素ーランタン二段処理法を適応した象牙質はAPFや対照に比較して病巣の形成が浅かった(日歯保誌,35,1992)。以上の実験結果より根面齲蝕の修復に用いる材料の試験には疲労試験が不可欠であり、象牙細管の走行を考慮して修復材の硬化時収縮を補償するような填塞法を適用すること、さらにはフッ素ーランタン二段処理法を適応することにより効果的に予防することが可能であることが示された。平成2年度における研究成果は以下のようである。1)in vitroにてウシ抜去歯根部象牙質を2%NaF,APF,およびそれらと1%塩化ランタンを用いる二段処理法にて処理し,0.1M乳酸緩衝ジェル(pH4.0)に1時間浸漬して耐酸性試験を行い,CMR,SEMおよびEPMAにて比較検討した。その結果,APFーランタン二段処理法を施した群はフッ化ランタンと思われる非晶質の沈澱物により被覆され,細管開口部も完全に閉鎖されていたのに対し,他群は脱灰され,開口部は拡大されていた。以上の結果より,APFーランタン二段処理法は他の処置法に比べ極めて高い耐酸性を象牙質に与えることが示された。

この研究成果は平成3年4月に開催される第69回IADRにおいて報告する。2)ウシ歯根部象牙質試片に窩洞を表面および歯髄側より形成し,辺縁封鎖性に関わる水分および象牙細管の走向について検討した結果,主として窩洞に関わる水の影響が多大であることが示唆され,第93回日本歯科保存学会秋期学会にて報告した。3)コンポジットレジン修復における重合収縮を補償する填塞法として傾斜分割填塞法を用い,温熱刺激を与えて色素浸透試験を行い一括填塞法と比較た結果,傾斜分割填塞法は重合収縮をある程度補償することが示された。この成果は1991年日本歯科保存学雑誌第34巻第2号に掲載される。4)37°C水中において剪断接着疲労試験が行える試験機を試作し,象牙質に対し接着性コンポジットレジンシステムを適用し,それらの疲労特性を検討した。RTSー200の剪断接着力は象牙質の凝集破壊を伴う有意に高い値であった。疲労試験ではScotchbond2,Tripton,Clearfil photo bondの順に高い疲労耐久性を示し,RTSー200は試験疲労試験機では疲労を認めることができなかった。これらの成果は第72回神奈川歯科大学学会例会にて報告し,試作剪断接着疲労試験機の構造と特性については歯科材料・機械1991年第10巻4号に掲載予定である。平成3年度における研究成果は以下の通りである。1.根面窩洞は歯冠に比較して保持形態が得られにくいため,その修復には象牙質接着材料が望ましい。修復物は口腔で絶えず繰り返し応力を受けるための接着力の検討には疲労試験が最も適している。そこで37°C水中において剪断接着疲労試験が行える試験機を試作し,その特性を検討した結果,小型試料の接着疲労試験機として極めて信頼性の高い事が判明し,歯科材料・機械1991年第10巻5号に掲載した。2.ウシ前歯根部象牙質に対しin vitroにてAPF,およびAPFと1%塩化ランタンを用いる二段処理法を適応し,pH4.0の0.1M乳酸脱灰ジェルに4日間浸漬する耐酸性試験を行い,SEMにて比較検討した。その結果,APFーランタン二段処理法を施した象牙質表面はフッ化ランタンと思われる非晶質の球状反応物により被覆され,細管開口部もデンティナルプラグにより完全に閉鎖されていたのに対し、APF群は脱灰され象牙細管開口部はロ-ト状に拡大していた。以上の結果より,APFーランタン二段処理法は他のフッ化物処置法に比べて極めて高い耐酸性を象牙質に与えることが示された。この研究成果は1992年第69回IADRにおいて報告し、日本歯科保存学雑誌第35巻3号に掲載予定である。3.象牙質窩洞に辺縁封鎖性に関わる因子として象牙細管の走向および水分について検討するため,陶材を利用したモデル実験を行った結果,窩壁に関わる水の影響が多大であることが示された。研究成果は1992年日本歯科保存学雑誌第35巻5号に掲載予定である。4.ウシ象牙質に対しAPFおよびAPFーランタン処理を施したウシ象牙質試片をダクロンガ-ゼで被覆し、Intraoral Cariogenicity Testを用い検討した。その結果,APFーランタン二段処理法を施した象牙質はin vivoにおいても優れた抗齲蝕性を示した。本結果は1992年秋期日本歯科保存学にて発表予定である。
アグリカナーゼの内因性インヒビターによる慢性関節リウマチ治療のための基礎的研究

我が国での患者数が約80万人と推定される関節リウマチ(RA)は原因不明の全身性自己免疫性疾患であり、その主病変は滑膜炎に始まる多関節炎である。関節軟骨は細胞成分である軟骨細胞と細胞外基質から成り立っている。軟骨基質の破壊が軟骨細胞の傷害につながり、軟骨組織の崩壊喪失へと進む。軟骨組織の破壊には多数の分解系酵素が関与していることが報告されている。関節軟骨の基質の主たる構成成分はタイプIIコラーゲンとプロテオグリカン(その90%がアグリカン)である。アグリカンの分解に関わる酵素として従来からよく研究されてきたのはマトリックスメタロプロテアーゼであった。しかし、最近では変形性関節症やRAに関連した軟骨変性(アグリカンの分解)に関与する主要な酵素はaggrecanase-1(agg-1)であることが明らかになりつつある。そこで、本研究ではRAなどの軟骨変性に関与するagg-1の内因性インヒビターを同定し、それを生体内で発現させ、軟骨変性を制御するということを最終的な目的とした。agg-1のcatalytic domainをbaitとして酵母two-hybrid法を行ったところ、agg-1がα1-antitrypsin(AT)やα1-antichymotrypsin(ACT)と相互作用した。ATやACTはセリンプロテアーゼインヒビターであり、これらはagg-1のような金属プロテアーゼとは反応しないという従来の概念に反する興味深い知見が得られた。また、本研究遂行中に、細胞外基質を構成するプロテオグリ,カンの一種であるデコリンのロイシンリッチリピート領域が細胞骨格タンパク質であるfilamin-Aと結合すること、ウシ軟骨細胞に牽引負荷を与えると軟骨細胞表面に存在するヒアルロン酸の低分子化が起こることなどを明らかにした。今後、in vivoにおいてagg-1の酵素活性をATやACTが阻害するかどうか、阻害するならば、その活性中心ドメインの同定や活性に糖鎖が及ぼす影響などが検討課題になると考えられる。既に報告されているaggrecanase-1 mRNA塩基配列を参考にして、PCRによるクローニングのためのprimerを設計し、ヒト肺線維芽細胞cDNAライブラリーよりaggrecanase-1 cDNAをクローニングした。2.酵母two-hybrid法によるaggrecanase-1結合タンパク質のスクリーニング(1)上記のようにクローニングしたヒトaggrecanase-1のcatalytic domainをbaitとした。これとreporter plasmidで酵母EGY48を形質転換し、さらにprey vectorに組み込んだヒト肝臓cDNAライブラリーで形質転換した(一次スクリーニング)。ここで得たクローンをβ-ガラクトシダーゼ活性とLeu要求性を併用して二次スクリーニングを行い、両方のアッセイで陽性になったもののみを最終的な陽性クローンとした。(2)約2.58×10^6個の形質転換体をスクリーニングし、一次スクリーニングでは75個、二次スクリーニングでは8個の陽性クローンを得た。これらのクローンの塩基配列を解析したところ、3個がα_1-antitrypsin(AT)、2個がα_1-antichymotrypsin(ACT)であった。(3)aggrecanase-1はAT、ACTと相互作用することが示唆された。ATやACTがaggrecanase-1とin vivoでも結合するか、その場合、aggrecanase-1活性を阻害するかどうか、また、どの部位がaggrecanase-1との結合に関与するかなどを今後検討する予定である。1.aggrecanase-1と相互作用するタンパク質のスクリーニング2.aggrecanase-1とα1-antitrypsinよびα1-antichymotrypsinの相互作用

(1)Ag-1タンパク質全長のC末にFLAG tagを付加したもの(Ag-1FLAG)を培養細胞(COS-7)で強制発現させ、培養上清中に分泌させた。Ag-1FLAGとATおよびACTを免疫沈降法で結合を検討したところ、いずれも共沈しなかった。また、AT、ACTの糖鎖をN-Glycanaseにより酵素的に取り去り、Ag-1との相互作用も免疫沈降法で調べてみたが、結合は見られなかった。(2)ATおよびACTをニトロセルロース膜に固定し、Ag-1FLAGと反応させイムノブロット法で検討したところ、Ag-1FLAGとATおよびACTはいずれも結合しなかった。関節軟骨の基質の主たる構成成分はタイプIIコラーゲンとプロテオグリカン(その90%がアグリカン)である。アグリカンの分解に関わる酵素として従来からよく研究されてきたのはマトリックスメタロプロテアーゼであった。しかし、最近では変形性関節症や関節リウマチ(RA)に関連した軟骨変性(アグリカンの分解)に関与する主要な酵素はaggrecanase-1(agg-1)であることが明らかになりつつある。そこで、本研究ではRAなどの軟骨変性に関与するagg-1の内因性インヒビターを同定し、それを生体内で発現させ、軟骨変性を制御するということを最終的な目的とした。agg-1のcatalytic domainをbaitとして酵母two-hybrid法を行ったところ、agg-1がα1-antitrypsin(AT)やα1-antichymotrypsin(ACT)がpreyタンパク質として同定された。さらに、Agg-1とATの全長cDNAを発現ベクターpSG5に組み込んで、真核細胞COS7に同時にトランスフェクションし発現させ、免疫沈降実験を行ったところ、Agg-1とATは全長タンパク質同士でも結合した。ATやACTはセリンプロテアーゼインヒビターであり、これらはagg-1のような金属プロテアーゼとは反応しないという従来の概念に反する興味深い知見が得られた。また、本研究遂行中に、細胞外基質を構成するプロテオグリカンの一種であるデコリンのロイシンリッチリピート領域が細胞骨格タンパク質であるfilamin-Aと結合すること、ウシ軟骨細胞に牽引負荷を与えると軟骨細胞表面に存在するヒアルロン酸の低分子化が起こることなどを明らかにした。今後、in vivoにおいてagg-1の酵素活性にATやACTがどのように関わっているのか、またagg-1の酵素活性をATやACTが阻害するならば、その活性中心ドメインの同定や活性に糖鎖が及ぼす影響などが検討課題になると考えられる。
複製ストレスに起因する治療誘導性細胞老化の分子機序

がん化学療法において、細胞死を伴わなくとも細胞増殖を不可逆的に停止する「治療誘導性細胞老化」と呼ばれる現象が近年注目されている。申請者は、新規抗腫瘍薬FTD/TPIの薬効成分でフッ化チミジンアナログであるトリフルリジン(FTD)が細胞レベルで非常に効率よく細胞老化を誘導することを見出した。前年度の解析から、p53活性化がこの細胞老化誘導に非常に重要な役割を果たしていることが示唆されたため、今年度は、p53欠損モデルがん細胞株を樹立し、FTD及び既存抗腫瘍薬に対する細胞応答過程について、p53野生型の親株との比較検証を行った。(1)p53欠損がん細胞株樹立CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用い、ヒト大腸がん細胞株HCT-116のp53遺伝子破壊を行った。2つの相同染色体上のp53遺伝子座が破壊され、機能的にもp53が欠損した細胞株を樹立することに成功した。(2)p53欠損細胞株のFTD曝露時の細胞応答解析親株と同様にFTDに曝露した時の細胞応答について解析し、p53欠損株ではFTDによる細胞老化誘導率が有意に減少し、細胞死を起こす細胞が増加することを見出した。M期進行に異常が発生することが予想され、現在検討を続けている。(3)複製ストレス惹起メカニズムHCT-116細胞を用い、3連4重極質量分析器を用いて、FTD曝露時の細胞内dTTP, FTD3リン酸化型代謝物(FTD-TP)の定量解析を行った。FTD曝露によって、dTTPが減少し、FTD-TPが蓄積することを検出することができた。当初計画していたFTD及び既存抗腫瘍薬による細胞老化誘導過程の追跡とp53の関与について明らかにすることができた。次年度に向けて、必要な細胞株も樹立することができ、一部解析も開始することができている。当初の計画通りにおおむね順調に進展していると考えている。これまで主にトリフルリジンを用いて行ってきた実験条件を他剤についての解析にも応用することで、抗腫瘍薬によって引き起こされる細胞老化の生物学的意義に迫っていく。申請者は、新規抗腫瘍薬TFTDの薬効成分でフッ化チミジンアナログであるトリフルリジン(FTD)が細胞レベルで非常に効率よく細胞老化を誘導することを見出した。そのメカニズム解明に向けて、今年度はFTD及び既存抗腫瘍薬による細胞老化誘導過程の追跡を行った。具体的には(1)生細胞ライブイメージングによる治療誘導性細胞老化に至る過程の追跡、および(2)既存の複製ストレスを伴う抗腫瘍薬による影響との比較を行った。(1)生細胞ライブイメージングによる治療誘導性細胞老化に至る過程の追跡FTD曝露時に細胞老化マーカーSA-β-Gal染色陽性細胞が出現する過程について、Fucci技術を利用し、FTD曝露時のがん細胞の細胞周期進行モニタリングを行った。レンチウイルスを用い、Fucciシステム観察用の蛍光タンパクを発現したHCT-116細胞を樹立し、観察したところ、FTD曝露後に主に2周目にM期スキップが起こること、さらにM期スキップが起こる前にS-G2期進行にかかる時間の延長が観察されることを定量的に確認した。(2)既存の複製ストレスを伴う抗腫瘍薬による影響との比較ピリミジン系ヌクレオシドアナログ(ジェムシタビン)、DNAポリメラーゼ阻害剤(アフィディコリン)では、強くDNA複製が阻害され、細胞老化も誘導されるが、1周目にM期スキップを観察することが多かった。フッ化ピリミジン型抗腫瘍薬(5-FU)では、細胞老化は誘導されるが、DNA複製ストレスによる老化等ではなく,別の反応が起きていると考えられた。当初計画していたFTD及び既存抗腫瘍薬による細胞老化誘導過程の追跡については、おおむね行うことができ、FTDによる細胞老化誘導メカニズムの特徴・特異性について、明らかにすることができた。

(3)複製ストレス惹起メカニズムHCT-116細胞を用い、3連4重極質量分析器を用いて、FTD曝露時の細胞内dTTP, FTD3リン酸化型代謝物(FTD-TP)の定量解析を行った。FTD曝露によって、dTTPが減少し、FTD-TPが蓄積することを検出することができた。当初計画していたFTD及び既存抗腫瘍薬による細胞老化誘導過程の追跡とp53の関与について明らかにすることができた。次年度に向けて、必要な細胞株も樹立することができ、一部解析も開始することができている。当初の計画通りにおおむね順調に進展していると考えている。今後は、他の細胞株における細胞老化誘導の有無について、検討する。細胞老化誘導には、p53が必須であることが知られているが、申請者の注目する抗腫瘍薬による細胞老化誘導におけるp53の寄与について明らかにするために、ゲノム編集技術を用い、p53遺伝子を欠損したヒトがん細胞株を作製し、FTDおよび既存抗腫瘍薬による細胞老化誘導の有無について検証する。これまで主にトリフルリジンを用いて行ってきた実験条件を他剤についての解析にも応用することで、抗腫瘍薬によって引き起こされる細胞老化の生物学的意義に迫っていく。
縮重π電子系の異方的構造制御と機能化

ダイアモンド格子を有するモット絶縁体(ET)Ag4(CN)5の基底状態を核磁気共鳴実験等を用いて調べた結果、高温(102 K)での反強磁性磁気秩序を見いだした(Physical Review B, 2019, in press)。さらに、圧力下(2GPa)では、195 Kまで転移温度が上昇することを発見した。これは、π電子系として世界最高記録を更新する成果である。新規フラストレート磁性体に特有の物性を開拓するために、Russian Academy of Scienceとの共同研究により、カゴメ格子をもつフラーレン錯体(Bu3MeP)C60を新たに合成し、磁気的な基底状態調べた。その結果、低温まで磁気秩序が起きない量子スピン液体の可能性があることを突き止めた(Phys. Chem. Chem. Phys., 2019, 21, 1645)。フラーレン錯体の量子スピン液体としては、初めての例である。異方的な電子状態と輸送特性の相関を解明するために、様々な層間相互作用をもつ超伝導体Z[Pd(dmit)2]2 (Z = Me4N,Et2Me2As,EtMe3P)の電気抵抗率の圧力変化を調べた結果、等方的な系と異方的な系とで電子-電子散乱の性質が大きく異なることを見出した(Physical Review B, 2018, 97, 125107)。幾何学的なフラストレーションを有するカイラルなラジカル塩(TBA)1.5(NDI-Δ)の基底状態について極低温までの物性測定を行った結果、量子スピン液体で期待される特異な振る舞いを観測した(Physical ReviewLetters, 2017, 119,057201)。三次元的なπ電子系では最初の例である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。量子スピン液体などのエキゾティックな電子状態が期待されるフラストレートπ電子系の基底状態を核磁気共鳴によって用いて調べた。特に3つの新規物質において、磁気秩序が起こらないスピン液体状態を示唆する結果を得た。まず、三次元的なカイラル有機ラジカル塩であるナフタレンジイミド化合物において、14N-NMR測定を行った結果、0.38Kの極低温まで長距離磁気秩序が存在しないことを明らかにした。比熱と帯磁率の結果と合わせて、ギャップレスの量子スピン液体が三次元系で実現している初めての例を示した。また、カゴメ格子を有するC60錯体における13C-NMR実験の結果、80Kあたりまで、分子回転が持続していること見出した。電子スピンは1.5Kまで無秩序状態であることが分かった。さらに、スパイラルな三次元構造を有するフェナントレン錯体においても、0.4Kまで長距離秩序の兆候が観測されなかった。ただし、基底状態から20K程度のギャップのある励起が観測され、連続的な2量体化が起きていることが分かった。また、π電子系としては初めてとなる三次元ダイアモンド格子を有する物質を見出した。その高圧下の13C-NMR測定によって、反強磁性秩序転移温度が世界最高となる195Kまで上昇することを明らかにした。第一原理計算を共同研究者とともに行い、ダイアモンド格子では三次元的なディラック半金属が実現する可能性があることを見出した。新たに3つ系において、量子スピン液体を見出すなど、順調に成果を上げている。国際共同研究、および領域内の共同研究も積極的に推進しており、さらなる進展が期待される。

様々なフラストレートスピン系において、異方的な構造変形と組み合わせた実験によって、基底状態の変化を詳細に明らかにする予定である。特に、良質単結晶試料が得られているκ-(ET)2X系における一軸性歪下のNMR実験を行い、量子スピン液体から反強磁性秩序相への連続制御を試みる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
複素多様体の解析的集合に関する配置問題の複素幾何的研究

位相的障碍が存在しクザン第2問題が解けない場合の研究はそれほど進んでいない。クザン第2問題の条件を弱め、与えられた集合を零集合の一部分としてもつ正則関数を求める問題は、スタイン多様体においては任意のクザン第2分布に対して解けることが知られている。一方で、幾何学的にはこの問題の解が定める零集合は、与えられた集合に干渉する可能性がある。そこで余零問題について考察し次の結果を得た:2次元スタイン多様体では肯定的に解ける。また、3次元以上では反例を具体的に構成した。余零問題は複素多様体の解析的集合に対する正則関数の存在問題であり,領域およびその解析的集合の解析性および幾何学性の両方に関係する問題である.申請者は2007年(Kyushu Journal of Math)に, C^2の直積領域における任意の相対コンパクトでは余零問題が肯定的に解けることを明らかにしたが, C^2の領域全体で肯定的に解けるかどうかについては未解決であった. (一方, C^n(n≧3)については上記の論文において反例を構成した.)そこで,その問にと対して肯定的解答を与えると共に,さらに拡張された2次元スタイン空間でさえも余零問題は肯定的にとけることに成功した: Xを被約スタイン空間, cをH^2(|c|, Z)=0であるX上のCartier因子とする.このとき, cについての余零問題はX上で解をもつ.すなわち, X上の正Cartier因子dが存在し, |c|〓|d|=φかつline bundle[c+d]はholomorphically trivialである.この結果から次の系を得る: Xを2次元被約スタイン空間とする.このとき, X上の任意のCartier因子についての余零問題は, X上で解をもつ.証明にはH. A. HammおよびN. Mihalache等による,スタイン空間の解析的集合はあるスタイン近傍が存在するという結果を用いた.この成果は現在"Extrazero problem of Okaona Stein space"(Makoto Abe and Sachiko Hamano)として投稿中である.古典的なWeierstrassの定理の高次元化可能性を問うクザン第2問題は,多変数関数論における複素領域の大域的な性質に関して重要で基本的な問題の一つであり,岡,Cartan,Serreらによって,その位相的障碍の非存在という形での必要十分条件が与えられるに至り,一応の解決を見た,また,クザン第2問題の条件を弱め,与えられた集合を零集合の一部分としてもつ正則関数を求める問題は,スタイン多様体において任意のクザン第2分布に対して解けることが示されている(岡,Stein).一方で幾何学的には,この問題の解が定める零集合は与えられた集合に干渉する可能性がある.そこで,それらが交わらないような正則関数を求める問題(余零問題)について考察した.この問題は複素多様体の解析的集合に対する正則関数の存在問題であり,領域およびその解析的集合の解析性および幾何学1生の両方に関係する問題である.本年度は領域の変分問題に関して以下の研究結果を得た.複素パラメータと共に滑らかに動くリーマン面上のL_1主関数の2階変分公式を得た.そして,その領域の変動が擬凸状領域ならば,等角写像で重要な働きをするL_1-主関数から誘導されるL_1-定数は劣調和関数であることを示した.この応用として,各ファイバーが種数2以上のコンパクトリーマン面であるような特異点のない正則族ならば,各コンパクトリーマン面のショットキー被覆面からなる変動はB×P^1の単葉領域に一意化可能である.余零問題について、3次元以上の領域において余零問題の解が存在しない具体例を、K.Steinの複素2次元の領域におけるクザン第2問題が解けない解析的集合を利用して、新たに構成することに成功した。領域の変分問題に関し、昨年度得られたL_1-主関数の変分公式を手がかりにして、本年度はL_0-主関数に関する次の研究結果を得た。複素パラメーターtと共に滑らかに動くプラナーリーマン面R(t)上の、対数極を2つもつL_0-主関数について2階変分公式を求めた。そして、その領域の変動が擬凸状領域ならば、等角写像で重要な働きをするL_0-主関数から誘導されるL_0-定数はtについて優調和であることを示した。一方、対数極を1つもつL_0-主関数については同様のタイプの変分公式は成立しないことを明らかにした。さらに、対数極を2つもつL_1-主関数およびL_0-主関数の変分公式を結合して得られる調和スパンの2階変分公式を明記し、領域の変動が擬凸状の場合には調和スパンが劣調和に動くことを明らかにした。その具体例として、ハルトックス領域での調和スパンの具体表示を求めた結果、ポアンカレ距離に関する応用を得ることに成功した。

得られた結果をまとめた論文Variation formulas for principal functions (II) Application to variation forharmonic spans (S.Hamano, F.Maitani and H.Yamaguchi)はNagoya Mathematical Journalに受理された。また、領域の変分問題に関する研究結果を日本数学会函数論分科会の特別講演で報告した。
インターネットを通じた候補者・有権者間の情報-投票サイクルの研究

2010年参議院選挙および2011年大阪市長選挙におけるインターネット・ユーザーを対象とした調査によって、以下のことが明らかになった。(1)投票先の決定におけるインターネットからの影響の受けやすさに対して、政治知識が及ぼす影響は非線形的であった。すなわち、投票先の決定においてインターネット上の選挙情報から影響を受けにくいのは、政治知識の程度が低い有権者およびそれが高い有権者であった。それに対して、最も影響を受けやすいのは、政治知識の程度が中程度の有権者であった。(2)投票先の決定におけるインターネットからの影響の受けやすさに対しては、年齢の及ぼす効果はきわめて限定的であった。本研究の目的は、議員・候補者による情報発信行動と有権者による投票行動との相互作用に焦点を合わせて、その様態を明らかにすることである。今年度は2010年参議院選挙を対象として、候補者ウェブサイトについての調査およびインターネットをつうじた有権者の選挙情報接触に関するサーベイ調査を実施した。2010年参院選候補者ウェブサイトについての調査の結果からは、以下のことが明らかになっている。第1に、サイトを開設していた候補者は87.0パーセント(437名中380名)であった。国政選挙におけるサイト開設率は上昇していく傾向にあり、飽和状態に近づきつつあるといえる。第2に、候補者サイトへのアクセス数は、得票数に有意な正の影響を与えていた。これは、候補者による情報発信と有権者による投票行動との関連を示唆する結果である。第3に、アクセス数が得票数に及ぼす影響は、候補者の特性によって異なる。すなわち、大政党の候補者および現職候補者におけるその影響は、中小政党の候補者及び現職以外の候補者のそれよりも強くなる傾向があった。これは、通常化仮説を支持する結果である。有権者の選挙情報接触に関するサーベイ調査については、参院選についての情報にインターネットをとおして接触した有権者618名をサンプルとするデータを用いて、現在分析を行っている。これらの研究成果の一部は、欧州大学院大学(イタリア)における国際会議Democracy Observatory Conference : Internet and Votingで発表された。また、選挙啓発を目的とする講演会や市民大学講座などにおいて、研究代表者による研究の紹介が研究成果の社会還元の一環として行われた。この研究の目的は、議員・候補者による情報発信行動と有権者による投票行動との相互作用に焦点を合わせて、その様態を明らかにすることにある。今年度の実績は以下のとおりである(1)前年度に実施した2010年参院選におけるインターネットをつうじた有権者の選挙情報獲得行動に関する調査結果の分析を行って成果をまとめた(2012年度発表予定)。政治知識が低い有権者及び高い有権者は、投票先の決定においてインターネット上の選挙情報から影響を受けにくく、意識の高さが中程度の最も影響を受けやすいことが、日本のデータを用いた分析で初めて明らかになった。(2)急速に普及しているソーシャル・メディアと選挙との関連についての研究を進めるため、2011年4月に実施された大阪府議会議員選挙候補者によるツイッター利用について予備的調査を行った。ツイッター利用の有無に関しては、ウェブサイト利用において日本で見いだされてきた「通常化」の進行は見られない。この結果は今年度中に国際会議で発表予定である。(3)2011年11月に実施された大阪市長選挙時に、インターネットをつうじた有権者の選挙情報獲得行動と投票意思決定との関係についてのアンケート調査を実施した。結果として、インターネットをとおして市長選に関する情報に接触した大阪市の有権者から、309サンプルが得られた。データのクリーニングが完了し、分析に取りかかる準備が整えられた。2012年度は、(1)2011年に実施された大阪市長選における候補者のツイッター利用状況の分析、および(2)同選挙において大阪の有権者がどのようにインターネット上で選挙情報に接触したか、そしてその接触が投票行動にどのような影響を及ぼしたのかを明らかにするための分析作業を中心に研究活動を行った。(1)については、現在のところ、候補者によるツイートの頻度とツイッターのフォロワー数との間には、弱いながらも関連があることが明らかにされた。(2)については、どのような有権者がインターネットから影響を受けて投票へと至るかについては、どの候補者に投票したかによって、影響を受けやすい有権者の属性が異なること、また、候補者のウェブサイトとツイッターを比較したときにも、その属性が異なることが明らかにされた。さらに、

(a)有権者は自分が支持する政党が支持・推薦した候補者によるウェブサイトおよびツイートからは、特に影響を受けやすい傾向があること(特に「大阪維新の会」支持者は、橋下徹候補によるウェブサイトおよびツイートから影響を受けやすい)、(b)政治知識が中程度の層がインターネットからの影響を受けやすいこと、(c)モバイル機器の使用頻度が高い有権者ほど影響を受けやすいこと、(d)年齢の低い有権者ほど影響を受けやすい傾向があることなどが分析によって示された。また、2012年においては年末に衆議院解散・総選挙が行われたため、当選挙における候補者のインターネット利用状況(ウェブサイト、ツイッター、フェイスブック)についての調査および有権者を対象としたインターネットでの選挙情報利用についての調査を実施した。調査結果の分析は進行中である。「研究実績の概要」で示したように、インターネット上の選挙情報と接触することによって、投票意思決定にあたって有権者がどのような影響を受けるかという問題については、新たな知見が得られた。さらに、大阪市長選における大阪市有権者の情報接触と投票意思決定についての調査データを得ることができ、上記の問題について異なった選挙データを用いて、さらなる分析を加えることが可能となった。候補者の情報発信行動については、大阪府議会議員選候補者によるツイッター利用の有無および大阪市長選候補者によるツイート数の時系列変化についての調査データを得ることができた。これらの点から、研究目的はよく達成されているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究年度の最終年度にあたる2012年には衆議院の解散・総選挙が実施される可能性が高くなっている。その場合には2010年参院選及び2011年大阪市長選時のデータとの比較が可能となるような調査を行い、インターネット上の情報と投票意思決定との相互作用に関する分析をさらに進めていく。また、上述のようにソーシャルメディアが急速に普及しており、それを利用する議員も増えてきている。今後は議員・候補者によるツイッターおよびFacebookの利用についても分析の対象として研究を進める。