hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インプラント周囲炎に対する先制医療戦略の基盤構築

またカルシウムとリンの割合はグルコース濃度が8.0mMでは減少し、グルコース濃度の上昇とともに増加に転じることが明らかになった。これらの結果から,グルコース濃度はチタン表面上の骨量と骨質に大きく関与しており,高グルコース状態であっても,ナノ表面改質を施すことで,通常グルコース濃度と同等の骨質と骨量を獲得できる可能性が明らかになった。このナノレベルでの表面改質をインプラントフィクスチャーに応用できれば,糖尿病患者のインプラント治療におけるオッセオインテグレーションの獲得がより確実になり,糖尿病患者におけるインプラント治療の適応範囲が拡大されていくのではないかと期待される。とくに問題なく研究計画を遂行している.ヒト歯根膜幹細胞は高い増殖能と骨芽細胞分化能を持っており,歯周組織再生で重要な働きをすることが分かっている.今までヒト歯根膜幹細胞の増殖や硬組織分化能に対するLED照射の影響の報告がほとんどない.我々はLED照射を歯周組織再生に応用できないかと考え,LED照射のヒト歯根膜幹細胞の増殖能や硬組織分化能に対する影響を検討した.その結果,ヒト歯根膜幹細胞は,LED照射によってERK 1/2経路を介して増殖および硬組織分化を助長することが示唆された.インプラント周囲炎を模倣して,ヒト骨芽細胞においても増殖能と硬組織分化能に対するLED照射の影響について検討した。ヒト骨髄間葉系幹細胞は短時間で照射エネルギー量を得ることができる同様のLEDを用いて,照射時間を変えることでエネルギー量を調節(0, 2, 4, 6, 8 J/cm2)し照射した.その結果, LED照射群で細胞増殖が有意に促進され、6 J/cm2の照射で最も有意に促進された.また硬組織分化能も細胞増殖の結果と同様にLED照射群で硬組織分化能を示すALP活性や石灰化物形成が有意に促進され, 6 J/cm2の照射で最も有意に促進された.したがって,高出力赤色LEDはヒト歯根膜幹細胞同様,骨髄間葉系細胞の細胞増殖と硬組織分化を促進することによって新生骨形成を促すことが示唆された.これらの実験結果は高出力赤色LEDが顎骨再生の新たな医療デバイスとしての可能性を示している.さらに,歯周治療の領域やjavascript:onModoru();インプラント周囲骨増生だけでなく口腔外科領域における顎骨再建にも有効なツールになる可能性が示唆される.しかし,我々が用いた高出力赤色LEDは照射エネルギー量依存的に細胞毒性が認められるという結果も得ており,照射エネルギー量の検討や様々な処置における至適条件について,今後の臨床応用へ向けた課題であると考えられる.インプラント周囲炎モデルの実験系は炎症惹起因子として,IL-1beta, TNF-alphaなどの歯周病原性の炎症性サイトカインやPorphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitansなどの歯周病原細菌を濃度を振り分けて行う。細胞増殖試験などで至適濃度を策定し最終的には1種類の濃度で硬組織分化誘導を行う。また,講座研究室内に糖尿病患者から採取した上記歯周病原細菌の臨床分離株を多数所有しており,標準株での炎症惹起実験での実験を終了後,その結果を対照に比較検討する。
ホモロジーのないアミノ酸配列からのタンパク質構造・機能情報の抽出

ゲノム計画の結果、ひとつの生物体の持つすべてのDNA塩基配列が報告されるようになってきている。これによって、それらの生物体の持つすべてのタンパク質のアミノ酸配列が得られるようになっている。それらのアミノ酸配列の中には、分子構造や機能がすでに分かっているタンパク質と類似性の高いものがかなりある一方、ホモロジーが全くないアミノ酸配列もまた多く存在している。ホモロジーのあるアミノ酸配列の場合は、アライメントによる機能や立体構造の推定が主な情報処理の手法として用いることができる。しかし、ホモロジーのないアミノ酸配列に対する情報処理はほとんど手がついておらず、その重要性にもかかわらず今後の課題に残されている。そこで本研究では、ホモロジーのないアミノ酸配列に対して、そのタンパク質のタイプを分類し、二次構造を予測することを目的とする。ホモロジーのないアミノ酸配列の判別と二次構造予測を行うために、すでに立体構造の分かったタンパク質を用いて、タンパク質の特徴とアミノ酸配列の持つ物理的な性質との間の関係を詳細に調べる。タンパク質の判別については、結合相手による判別を行う。代表的な結合相手は生体膜であり、最も疎水性の高い膜貫通ヘリックスの性質を調べることによって、膜タンパク質の判別はほとんど99%の精度で出来ることが分かった。さらに、膜タンパク質の二次構造である膜貫通ヘリックスも96%の精度で予測でき、。それらをwwwホームページで公開した。
P-N接合デバイスにおける低周波雑音特性

本研究は、光通信・計測に大きな役割を持つ半導体レーザの雑音を低減するため、レーザ光の雑音発生メカニズムを解明するための基礎研究として、P-N接合デバイスの低周波雑音特性について行った。まず、P-N接合デバイスの低周波雑音を測定するシステムを構成した。測定は、P-N接合ダイオード、バイポーラトランジスタ、レーザダイオードについて周波数依存性、電流依存性などを測定した。測定デバイスは基本的にP-N接合を持つもので、周波数特性としては1/fスペクトルを示すものが多い。電流依存性はP-N接合に流れる電流に対して雑音が比例して増加する傾向がみられた。これはP-N接合領域における拡散によるものと考えられている。また、半導体レーザの光出力雑音とレーザダイオードの雑音との相関性を調べた結果、かなり高い相関を持つことが分かった。この相関性を持つことを利用して、レーザ光の雑音低減について試みた。レーザ光をフォトダイオードで検出し、その光ゆらぎをレーザダイオードに帰還することによってレーザ光の雑音を低減することができる。また、シングルモードレーザダイオードに帰還をかける時、適切な領域まではシングルモードを保持し、それを越えるとマルチモードに変わることが分かった。これは光通信において非常に重要なことで、更に最適帰還量を調べる必要がある。また、これからの課題としては、P-N接合デバイスにおける1/f雑音の拡散による依存性について計算機シミュレーションを行い、より低雑音のデバイスが得られることを期待する。
ITを利用した双方向性コミュニケーションによる患者支援システム

在宅認知症患者とその家族を対象に、患者の認知症悪化予防と家族の介護負担軽減を目的に研究を行った。介入群には、スカイプ(テレビ電話)を通して主に看護師が相談に応じた。認知機能検査の結果は、介入群の得点に改善傾向が見られた。ADL機能評価は変化がみられず、記憶が少し改善されたとしても、それが身体の活動性に影響を与えるまでには至らなかったといえる。介護者の自記式アンケートでは「性格が明るくなった」「活動的になった」など患者同様に介入を良い印象として捉えていたようである。1.対象として、過去6ヶ月以内に京大病院神経内科を受診し、現在も通院中の認知症患者とその家族を選定した。介入群はその中で、自宅でSkypeのビデオ通信ができる環境が整備されており、操作できる方(家族が操作できる場合も可)が存在することを条件とした。セッティングとスカイプのテストは研究者側で行った。2.対象者の情報収集として認知機能検査(MMSE等)及び介入初回アンケート(ADL機能評価等)を行った。3.IT支援グループチームの形成:(1)京都大学医学部人間健康科学科スタッフ(申請者である久保田、および研究支援者である老年看護学教授木下、さらにケアマネージャーの資格を有する看護師、介護認定の経験を持つ看護師など数名のグループ)と(2)京都大学医学部附属病院神経内科認知症担当専門医数名からなる看護師・医師のグループを形成した。4.ケアプラン作成:(1)ITツール購入:ウェブカメラ、コンピュータ、専用ハードディスク、セキュリティソフト等を購入した。(2)ウェブカメラによる相談は患者又は家族と日程を調整し、週1回、30分程度の相談で、12週間継続することとした。交信の内容については、健康状態の観察や助言、日常生活での相談、服薬指導、椅子に座ってできる簡単な運動等とする。会話はSkype録画・録音ソフトで患者または家族の了承の下、録画・録音することとした。対象のうち数名は既にスカイプによる介入を開始している。(3)介入による変化を観察する為、介入群・対照群の患者に対し、認知機能検査(MMSE、HDS-R)、ADL機能評価(Barthel Index: BI)を行い、測定時の患者自身の心境について主観的に解答してもらうこととした。家族に対し、抑うつ尺度(Zung式抑うつ尺度、ベック式抑うつ尺度)、介護負担度(J-ZBI-8)、Pinesのバーンアウトスケールを用い、夜起きる回数、睡眠時間、測定時の患者の態度についての印象を主観的に解答してもらうこととした。介入群6名、対照群7名である。介入群には、インターネット上で無料ダウンロードできるソフトであるスカイプ(テレビ電話)を自宅のパソコンにダウンロードし、スカイプを通して主に看護師が相談に応じた。高度先進医療病院(京大病院)と、対象者の自宅を双方向性に結び、週1回、30分程度の相談で、12週間継続した。交信の内容については、健康状態の観察や助言、日常生活での相談、服薬指導、椅子に座ってできる簡単な運動等であった。会話はSkype録画・録音ソフト(Tapur)で患者または家族の了承の下、録画・録音した。対照群には特に定期的な相談は行わなかった。認知機能検査(MMSE、HDS-R)の結果は、介入群の得点に改善傾向が見られた。ADL機能評価(Barthel Index:BI)は変化がみられず、記憶が少し改善されたとしても、それが身体の活動性に影響を与えるまでには至らなかったといえる。家族に対しては、抑うつ尺度(Zung式抑うつ尺度、ベック式抑うつ尺度)、介護負担度(Zarit介護負担尺度日本語版の短縮版:J-ZBI-8)、Pinesのバーンアウトスケールを測定したが、大きな変化はみられなかった。しかし、介護者の自記式アンケートでは「性格が明るくなった」「活動的になった」など患者同様に介入を良い印象として捉えていたようである。医療者側の意見としては、HDS-RやMMSEなどがテレビカメラを通して外来と同じように全く問題なく施行できたことや、交信中に家族から内服についての質問があり、更新を続けながら主治医にチャットで確認し、リアルタイムで即答できた等新たな可能性を見いだせたのではないかと感じている。また、週に1度30分間マンツーマンで患者と向き合うことは外来で交流する以上に十分に訴えを傾聴でき、患者と家族介護者の変化をきめ細かく把握するという点で、スカイプが有用であることを示唆している。
腎癌微小環境のエネルギー産生におけるＦＡＢＰ７の機能解明と発癌予防に向けた探索

我々は腎癌のマーカー遺伝子の探索を進めており、その候補として脳型脂肪酸結合蛋白質(FABP7)に注目して研究を進めている。そこから長鎖不飽和脂肪酸が腎癌に与える影響についての解析を行なった。腎癌細胞株の培養中に長鎖不飽和脂肪酸を高濃度添加すると細胞増殖阻害が起こる傾向があり、ω-3脂肪酸はω-6脂肪酸より低濃度で細胞増殖阻害を起こす傾向があった。またFABP7を強制発現させるとω-3脂肪酸のDHAの細胞増殖阻害がより低濃度で起こった。そこからDHAの投与を増やした条件でFABP7を発現させる事は腎癌を抑制する効果が期待出来る。腎癌で高発現しているFABP7は、TUHR14TKB株を継代することで消失することを見出した。このFABP7発現を失った細胞株にFABP7を恒常的は発現するベクターを組み込んだ細胞株を樹立した。そこでそれぞれの細胞株の機能解析を行ったところ、FABP7発現の消失は、細胞増殖と運動能が亢進していること発見した。一方、FABP7は多価不飽和脂肪酸を親和性が高く、この性質が腎癌にどのように影響するかを確認するために、ヌードマウス皮下に腎癌細胞株を移植し、ω3脂肪酸であるDHAと炎症性サイトカインを誘導するとされるリノール酸をそれらのマウスに強制投与し、移植した細胞株の状況を観察する実験を開始した。FABP7を発現している腎癌細胞株や発現していない細胞株を用いて、ω3脂肪酸であるDHAと炎症性サイトカイン誘導するとされるリノール酸を負荷して、細胞増殖能を検討した。ω3脂肪酸であるDHAの負荷で細胞増殖抑制がみられた。FABP7を発現しない胎児正常腎細胞株にFABP7を発現させ、その運動能を解析した。明らかな運動能の変化は、認めなかった。細胞株への脂肪酸負荷実験は、非常に不安定な条件下での実験で予備実験に少々時間を要したため、想定内での進行度ではあるが、やや遅れぎみである。計画に準じて研究が進行している。(1)ヌードマウスの皮下にFABP7発現腎癌細胞株を接種し、脂肪酸を与え、腫瘍増殖に与える影響について検討する。(2)腎癌におけるFABP7発現の意義をエネルギー産生の観点から検証するために実際に正常腎細胞株にFABP7を過剰発現させ、細胞内ATP濃度を測定し、それが低酸素環境下でどの程度影響を受けるか検討する。また、同時に細胞内各種アミノ酸濃度を測定し、さらにフマル酸呼吸やグルタミン酸からのエネルギー産生についても検討する。(3)FABP7の発現が細胞内の脂肪酸濃度を上昇させ、また細胞内アミノ酸濃度に影響を与えている可能性がある。そこでFABP7発現腎癌細胞株とFABP7非発現腎癌細胞株で上記の各々の細胞培養条件における各種脂肪酸の細胞内濃度を液体クロマトグラフィーで測定する。また、細胞内各種アミノ酸濃度もキャピラリー電気泳動で測定する。また、オートファジーのLC3システムとFABP7との関連を調べる。(4)腎盂に浸潤のないような腎癌の尿中にFABP7のmRNAが検出される点についてはexosomeの関与が推定される。そこで術前、術後の尿をDNAase、RNAaseで前処理したサンプルでのmRNAの検出を試みる。(1) in vitroで細胞増殖抑制効果が認められたDHAとあまり有意な影響を及ぼさなかったリノール酸を自由接触させたヌードマウスの皮下、FABP7を発現している腎癌細胞株や発現していない細胞株を接種し、腫瘍の発育状態を観察する。また、同様のマウスの尾静脈から、上述の細胞を注射して、転移巣の状況について検討する。(3) FABP7の発現が細胞内の脂肪酸濃度を上昇させ、また細胞内アミノ酸濃度に影響を与えている可能性がある。

そこでFABP7発現腎癌細胞株とFABP7非発現腎癌細胞株で上記の各々の細胞培養条件における各種脂肪酸の細胞内濃度を液体クロマトグラフィーで測定する。また、細胞内各種アミノ酸濃度もキャピラリー電気泳動で測定する。また、オートファジーのLC3システムとFABP7との関連を調べる。(4)ヌードマウスの皮下にFABP7発現腎癌細胞株を接種し、前述の実験で細胞増殖抑制が認められた脂肪酸を与え、腫瘍に与える影響について観察する。(5)腎盂に浸潤のないような腎癌の尿中にFABP7のmRNAが検出される点についてはexosomeの関与が推定される。そこで術前、術後の尿をDNAase、RNAaseで前処理したサンプルでのmRNAの検出を試みる。平成24年度研究計画に準じて、引き続き消耗品の購入主体で使用する。平成23年度研究計画に準じて、引き続き消耗品の購入主体で使用する。
大学入試時の受験者の進路選択を援助する意思決定支援システムの開発

本研究は、大学入学者選抜時における受験者の進路選択の意思決定支援システム開発をめざし、下記の調査・分析を行った。1大学受験時の意思決定方略と学部適応度との関連の定量的な把握を目的とした質問紙調査(平成15年度)2受験者の意思決定過程のモデル化と進路選択支援システム構築のための基礎資料となる大学入学者選抜に関する意見の構造に関する質問紙調査(平成14年度、15年度)3受験者の進路選択を支援するために大学側が提供すべき情報の精査(平成16年度)最終年である本年度は、昨年度12月に独立行政法人大学入試センター所長裁量経費で実施されたモニター調査で得られたデータについて、"大学入学者選抜に関する公平感"という観点から再分析を行った。分析結果については、日本テスト学会第2回大会、日本行動計量学会第32回大会において発表した。モニター調査では、リスニングテスト中に、騒音が混じる条件と、混じらない条件が設定されていたが、条件に関わらず、成績の表示方法として、いわゆる素得点表示である配点に基づく得点、及び得点率の方が、条件差を解消した大学全体、文理別の偏差値より、成績を知る上で有用であると思われていた。また、得点調整への態度は、騒音の有無の条件ではなく、本人の成績に影響されることが示され、上位群の方が肯定的であることがわかった。さらに、試験成績を通知することは、受験生に非常に望まれていること、大学入試の年複数回実施に関しては、あまり肯定的な意見を持たれていないことが、明らかになった。上記分析のほか、大学側が説明会等を通じ、高校生に対して提供している情報の有用性について、内容面からの検討を行った。本研究は、大学入学者選抜時における受験者の進路選択の意思決定支援システム開発をめざし、下記の調査・分析を行っている。1大学受験時の意思決定方略と学部適応度との関連の定量的な把握を目的とした質問紙調査2不適応を生じさせる意思決定のミスについて検討することを目的とした不適応事例の面接調査3大学入学者選抜時における受験者の意思決定過程のモデル化と進路支援システム構築研究初年度である本年度は、高校生3年生の大学進学意識について把握することを目的とし、大学入試センター研究開発部で平成11年度から13年度にかけて行われた、共同研究I「大学入学者選抜における評価の標準化に関する研究」中で得られたデータについて、"進学校における大学受験に関する意識"という観点から再分析を行った。分析結果については、日本行動計量学会第30会大会において発表し、また論文としてまとめたものを「進路指導研究」に投稿した。分析の結果、性別、成績といった要因が、進学校の高校3年生の進路選択、受験行動に影響を与えていることが明らかとなった。主な知見は、以下の通りである。1女子の方が自分の成績や多様な入学試験が行われているかなどの、より合格可能性を重視した大学選択を行っている。2男子は大学の偏差値、自分の成績、大学の社会的評価において全ての成績レベル間で相対的に成績の高い方がこれらの選択基準を重視するといった差がみられ、女子よりも成績要因の影響が顕著である。3大学入試の容易化が進んでも、競争型の受験システム内に位置する限り、自らの合格可能性が重要な意思決定要因である。1大学受験時の意思決定方略と学部適応度との関連の定量的な把握を目的とした質問紙調査2不適応を生じさせる意思決定のミスについて検討することを目的とした不適応事例の面接調査3大学入学者選抜時における受験者の意思決定過程のモデル化と進路支援システム構築研究2年目である本年度は、一昨年度末に終了した共同研究I「大学入学者選抜における評価の標準化に関する研究」中で得られたデータについて、"大学入学者選抜に関する意見の構造"という観点から再分析を行った。分析結果については、日本行動計量学会第31会大会において発表した。結果からは、大学入学者選抜に関する意見は、1.学力試験に対する負担感、2.適性・関心評価での選抜への態度、3.学力試験、成績での選抜への態度、4.面接・小論文での選抜への態度の4つめ成分に分かれることが示された。また4つの成分全てにおいて、職業要因の主効果が有意であり、大学入学者選抜に関する意見は、1.高校生、2.高校教員、3.大学教員といった回答者の立場によって異なることが明らかになった。更に今年度は、大学1年生を対象に、特に大学入学後に学部・学科に応じて必要とされる思考力、判断力について検討を行うための調査を平成15年12月に実施した。現在、データの入力作業は終了し、分析中である。

分析結果については、日本テスト学会第2回大会、日本行動計量学会第32回大会において発表した。モニター調査では、リスニングテスト中に、騒音が混じる条件と、混じらない条件が設定されていたが、条件に関わらず、成績の表示方法として、いわゆる素得点表示である配点に基づく得点、及び得点率の方が、条件差を解消した大学全体、文理別の偏差値より、成績を知る上で有用であると思われていた。また、得点調整への態度は、騒音の有無の条件ではなく、本人の成績に影響されることが示され、上位群の方が肯定的であることがわかった。さらに、試験成績を通知することは、受験生に非常に望まれていること、大学入試の年複数回実施に関しては、あまり肯定的な意見を持たれていないことが、明らかになった。上記分析のほか、大学側が説明会等を通じ、高校生に対して提供している情報の有用性について、内容面からの検討を行った。
腸上皮バイオカプセルを用いた新規薬剤デリバリーシステムの開発

腸上皮バイオカプセル作成法の確立に向け、安定してバイオカプセルを作成し得る独自の培養条件を同定し、同バイオカプセルは幹細胞を豊富に含む細胞群から成る事を明らかとした。また薬剤含有バイオカプセル作成技術の開発に於いて、P-Glycoprotein基質であるRhodamine123が内腔に集積する性質がある事を示した。これらは腸上皮由来バイオカプセル作成の基本技術として重要な成果であると考えている。腸管上皮バイオカプセル作成法の確立:マウス腸管組織からのバイオカプセル作成法の最適化を行い、以下の成果を得た。1)マウス大腸組織より安定してバイオカプセルを培養し得る独自の技術を確立した。その必須因子としてWnt3a, BSA, EGF, HGF, Nogginを同定した。2)腸管上皮幹細胞特異的遺伝子LGR5のコード領域をEGFP並びにCreリコンビナーゼで置換したマウスを用いる事により、同手法により確立したバイオカプセルは腸管上皮幹細胞を豊富に含む上皮細胞群で構成されている事を明らかとした。3)上記方法によるバイオカプセル作成法は単一の幹細胞からも樹立可能であり、DSS投与により誘発された粘膜欠損・潰瘍面に選択的に生着し、潰瘍面を被覆する性質を有し、かつ長期に渡り生着し得ることを明らかにした。これにより、DSS腸炎の臨床的経過を改善し得ることも明らかとした。4)上記バイオカプセル作成法はヒト消化管内視鏡生検検体を用いたバイオカプセル作成へも応用可能であることを確認した。薬剤含有バイオカプセルの作成技術の確立:上記方法につき、薬剤含有バイオカプセルとして応用可能であるか、検討を行った。1)外面にP-Glycoprotein基質であるRhodamine123を添加することにより、Rhodamine123がバイオカプセル内腔へ経時的に集積することを確認した。2)上記にて観察したRhodamine123の集積はP-Glycoproteinの阻害薬であるverapamilにより濃度依存的に解除されることを明らかにした。上記の成果は、腸管上皮由来バイオカプセルが上皮再生治療のツールとして技術的に実現可能であり、なおかつP-Glycoproteinを介した内向きの輸送系が薬剤含有バイオカプセルの作成に有用である可能性を示した重要な成果であると考えている。本年度は研究計画に基づき、以下の解析を行った。(1)腸管上皮バイオカプセル作成法の確立:消化管内視鏡生検検体からのバイオカプセルに先立ちマウス腸管組織からのバイオカプセル作成法の最適化を行い、以下の成果を得た。1)マウス小腸及び大腸組織より安定してバイオカプセルを培養し得る独自の技術を確立した。さらに同手法により確立したバイオカプセルを構成する上皮細胞は腸上皮幹細胞を豊富に含むことを明らかとした。2)上記方法により作成したバイオカプセルを大腸炎モデルマウスに経肛門的に投与することにより、腸管上皮を構成するクリプトとして長期生着することを確認した。さらにバイオカプセルがDSS投与により誘発された粘膜欠損・潰瘍面に選択的に生着し、潰瘍面を被覆する性質を有し、損傷粘膜に対する高い指向性を持つことを明らかにした。3)上記成果に基づき、ヒト消化管内視鏡生検検体を用いたバイオカプセルの作成を行い、マウス腸管組織と同様のバイオカプセル作成が可能であること確認した。(2)薬剤含有バイカプセルの作成技術の確立:上記方法にて作成したマウス腸管上皮由来バイオカプセルにつき、薬剤含有バイオカプセルとして応用可能であるか検討を行い、以下の成果を得た。1)バイオカプセルの外面にP-Glycoproteinの基質であるRhodamine123を添加することにより、バイオカプセル内腔へのRhodamine123の集積をライブイメージングにより経時的に観察することが可能であった。2)上記にて観察したRhodamine123は濃度勾配に逆行してバイオカプセル内に集積するのみならず、維持することが可能であることを確認した。上記の各成果は、腸管上皮由来バイオカプセルが上皮再生治療のツールとして技術的に実現可能であり、なおかつ臨床的有用性が期待できることを明確に示した重要な成果であると考えている。本年度は、当初計画通り、マウス及びヒト腸管上皮初代培養技術を発展させ、バイオカプセルとして応用する技術の確立に成功した。具体的には、P-Glycoproteinの能動輸送を利用することにより、バイオカプセルに機械的侵襲を加える事なく、基質薬剤をカプセル内に高濃度に蓄積させるための基本技術と、蓄積濃度を制御するための輸送動態のモニタリング技術及び輸送チャンネル機能調節法の確立に成功した。このような技術的基盤の確立は全く他に類を見ない画期的かつ独自の技術と視点に基づくものであるばかりでなく、バイオカプセルに封入する薬剤の種類・量を容易に制御可能とした点で、汎用性の高い重要な知見を得たものと考えている。

さらに当初計画を前倒しし、生体疾患モデルへの移植によりバイオカプセル単独による組織再生能の評価を行い、上記バイオカプセルそのものが生着することにより、粘膜再生を通した臨床的有用性を発揮し得ることを既に明らかとしている。上記成果は、バイオカプセルそのものの粘膜再生能を示したのみならず、バイオカプセルが欠損粘膜への強い指向性を持ってホスト腸管粘膜内へと生着・統合されることも明確にしており、本研究が目指す「損傷粘膜局所へのビンポイント薬剤輸送システム」が技術的に実現可能であること改めて確認できた重要な成果である。今後、含有させる薬剤の選択や安定した薬剤含有バイオカプセル作成技術の確立及び保存方法の開発と言った課題は残るものの、一部は当初計画を超える予定で既に成果を得ており、概ね順調に進行していると評価することが妥当と考えている。本年度は、当初計画通り、マウス及びヒト腸管上皮初代培養技術を発展させ、バイオカプセルとして応用する技術の確立に成功した。具体的には、P-Glycoproteinの能動輸送を利用することにより、バイオカプセルに機械的侵襲を加える事なく、基質薬剤をカプセル内に高濃度に蓄積させるための基本技術と、蓄積濃度を制御するための輸送動態のモニタリング技術及び輸送チャンネル機能調節法の確立に成功した。このような技術的基盤の確立は全く他に類を見ない画期的かつ独自の技術と視点に基づくものであるばかりでなく、バイオカプセルに封入する薬剤の種類・量を容易に制御可能とした点で、汎用性の高い重要な知見を得たものと考えている。次年度は当初計画に則り、以下の課題を追求する予定である。1)内視鏡生検検体からのバイオカプセル迅速作製法の確立:マウス腸管上皮にて確立したバイオカプセル作成法をヒト腸管内視鏡検体へと応用し、ヒト腸管上皮由来バイオカプセル作成法を最適化する。2)薬剤含有バイオカプセルの作製・保存技術の確立:バイオカプセルが本来有するP-Glycoproteinを介した能動輸送を利用し、高効率で内腔に蓄積可能な化合物を追求する。これを担体とした薬剤含有バイオカプセルの作成を検討する。3)薬剤含有バイオカプセルの大腸炎治療効果の解析:上記にて作成した薬剤含有バイオカプセルをDSS腸炎モデルに移植することにより、その臨床的効果等を解析する。
ソフトウェア構成のためのオブジェクトベ-スの研究

本研究代表者、分担者は本年度以下のような研究実績をあげた。(1)ソフトウェア構成オブジェクトベ-スのための計算モデルOOAGのための実行機構のプロトタイプMAGEを作成し、この計算モデルを用いたソフトウェアデ-タベ-スの構成を行い、OOAGがソフトウェアデ-タベ-スの記述体系として適切まものであることを確認することができた。特に、OOAGのもつ変更伝搬のメカニズムはソフトウェアデ-タベ-スの簡潔な記述に有効であることが判った。(片山)(2)オブジェクト指向言語C++クラスライブラリの再利用を目的とするC++プログラムベ-スの設計・構築を行ったが、ソフトウェア部品の再利用性の実現に有効であることが判明した。また、並列ソフトウェアオブジェクトベ-スを開発するためのベ-スのひとつとして、マルチマイクロプロセッサ上で稼働する並列オブジェクト指向システムABCL/C+を稼働させるために必要とするオペレ-ティングシステムを開発した。(土居)(3)既存のデ-タベ-ス言語SQLを拡張し、ポリモルフィックな質問メソッドを表現できるようにするとともに、質問メソッドをル-ルベ-スを用いて、デ-タベ-ス中のデ-タや質問結果のデ-タに動的に束縛できる機構を実現した。これにより、ソフトウェア開発をサポ-トするために構築された既存の(関係型)デ-タベ-スをオブジェクトベ-ス化することが可能となった。また、ソフトウェアデ-タベ-スを構成する際に基本的に問題となる、知識や情報の表現法と照会の処理機能を備えたデ-タベ-スモデルを得る目的で、関係デ-タベ-スと同程度に豊かな照会処理の可能なオブジェクトベ-スを構成するために、関係デ-タベ-スからオブジェクトベ-スへの等価変換の問題を検討し、そのためのシステムの構築を行った。(徳田)本研究代表者、分担者は本年度以下のような研究実績をあげた。(徳田)
超軽量化を目指した衛星搭載型断熱消磁冷凍機用超伝導磁石の開発とその実証

平成23年度は、超軽量化を目指した超伝導磁石の製作と実証化を目標に開発研究を行った。研究年度の前半は、主に超伝導磁石の設計検討に主眼を置いた。並行して超伝導磁石の製作に必要な極細専用のテンショナー付線材繰り出し機を導入し、その整備を平成23年度9月に完了した。超伝導磁石の設計の設計期間は平成23年10月末完了を目標とし、次の検討を行った。(1)断熱磁気消磁冷凍機の性能を決定するソルトピルの容積確保のため、超伝導磁石のボアサイズを70mm径とし、中心磁場は最大で3T、平均で2Tを目指す。(2)超伝導磁石励磁に伴って発生する交流損失が前段の機械式冷凍機の熱負荷となるため、励磁パターンによる交流損失をそれぞれ求め検討する。(3)超伝導磁石の安定性解析と磁石保護について検討する。以上の検討結果から、超伝導磁石を軽量化構造とするため、超伝導磁石の構造をボビンレスとして構造設計を行った。この設計を基にボビンレスコイルを巻く巻き枠の設計・製作を行い、φ0.1mmの絶縁被覆付銅線を極細超伝導線(φ0.12mm)のダミー線とした仮巻きを行った。この仮巻きから、ボビンレスコイルを巻く際に超伝導線に加える張力や巻き枠速度等の製作パラメータを確認した。また、仮巻きで製作したダミー線製ボビンレスコイルの強度試験並びに断面構造の確認を行い、ボビンレス構造を持つ磁石が励磁の際に必要な強度を持つことを確認した。上記の設計検討とは別に平成23年6月に米国で開催される低温会議(CEC/ICEC2011)に出席し、研究に必要な情報を収集した。平成22年度は、超軽量化を目指した超伝導磁石の設計と磁石用超伝導線の調達を主に行った。超伝導磁石の設計は平成22年10月末に完了し、設計にあたって次の検討を行った。(1)本磁石が使用される冷凍機(ADR)の先端に取り付けられる超高感度センサーへの漏れ磁場を検討するため、超伝導材を使ったアクティブシールド方式と磁性体を使った磁気シールド方式の2方式を設計し、それぞれの重量や漏れ磁場量の比較(2)ソルトピルが挿入される超伝導磁石のボアサイズは46mm径とし、中心磁場は最大で3T、平均で2T(3)超伝導磁石の安定性解析と磁石保護の検討これらの検討から、超伝導磁石の構造を軽量化構造とするためボビンレスを採用した。並行して、超伝導磁石に用いる高温超伝導線の選定を行った。磁石に用いる超伝導線は、現時点でもっとも安定した性能を発揮するNbTi製極細線(線径φ0.1mm)を採用した。以上の検討結果を基に設計を行った超伝導磁石の製作に使用するコイル巻き線に使用する巻き線機類の整備を行った。超伝導線の購入と巻き線機整備は平成23年度3月に完了した。
アジア地域における飲用井戸水汚染の現状把握と発癌予防対策

重金属をはじめとする無機物質は強い毒性を持ち、癌等のヒトの生命に直接的に関わる重大疾患を誘発するので、最優先で健康リスクが検討されるべきである。本研究では、飲用井戸水の無機物質汚染に焦点を当て、まず、アジア地域における海外学術調査により、複数の無機物質に汚染された飲用井戸水の現状を把握する。次に、単独および複数の無機物質曝露の発癌毒性を評価し、井戸水から除去すべき無機物質を特定する。以上のように、本研究では、海外学術調査を起点とし、飲用水の健康リスクの評価を介してアジアの公衆衛生の向上に貢献する。【背景・目的】地球温暖化により干ばつ地域の拡大を介した水の量的不均衡を是正し、安定的な飲用水の「量」を確保のために、井戸水(地下水)の飲用利用の重要性がますます重要になってくる。しかし、飲用井戸水の汚染状況すら十分に把握されていない地域も少なくない。一方、重金属をはじめとする無機物質は強い毒性を持ち、癌等のヒトの生命に関わる重大疾患を誘発するので、最優先で浄化が検討されるべきである。本研究では、飲用井戸水の無機物質汚染に焦点を当て、海外フィールドワークにより、無機物質に汚染された飲用井戸水の現状を把握し、飲用水レベルの無機物質汚染を勘案して発癌毒性を評価し、井戸水から浄化すべき無機物質を特定し、発癌性無機物質を除去可能な浄化剤を開発し、現地の井戸水から有害無機物質を除去できることを証明する、ことを目的として研究を遂行する。1.井戸水に含まれる有害無機物質の現状把握:ベトナム・バングラデシュ等のアジア地域において、海外フィールドワークを行い、井戸水およびヒト検体(尿・毛髪・爪等)を採取した。2.無機物質の発癌毒性評価:アジア地域の井戸水に含まれるレベルの低濃度ヒ素・マンガン・バリウム等の無機物質を単独でマウスに経口投与し、各組織に蓄積する濃度をICP-MSにて定量する研究を開始した。また、無機物質の発癌以外の毒性(神経毒性等)も一部検討した。さらに、無機物質が、皮膚癌における細胞増殖・細胞浸潤/転移への影響を解析し、一部の成果を発表した。加えて、従来、低濃度では発癌性が無いと考えられていた無機物質が発癌毒性を持つ可能性を発見した。3.浄化剤の開発と海外フィールドワークによる浄化の実践:飲用井戸水に含まれるレベルの無機物質を標的とし、浄化剤の開発を開始し、一部の成果を発表した。本研究では、アジア諸国において、飲用井戸水に含まれる元素濃度を測定する環境モニタリング調査およびヒト検体(爪・毛髪・尿等)採取を推進している。当該年度の研究では、当初想定していなかったPlacental Growth Factor(PlGF)分子が、ヒ素誘発皮膚癌の制御に中心的に働いている可能性がでてきたので、PlGFに着目して研究を推進した。まず、バングラデシュの飲用井戸水ヒ素汚染地域と非汚染地域住民の尿におけるPlGF濃度を比較したところ、汚染地域の住民で有意に高いことがわかった。PlGFが発癌誘導に作用していることを示す過去の報告を合わせて考えると、本成果は、飲用井戸水によるヒ素曝露がPlGFの上昇を介して癌を誘発している可能性を示している。本仮説を検証するために、ヒト非癌化角化細胞(HaCaT細胞)とヒト皮膚癌細胞(A431細胞)を用いて、試験管レベルの研究を推進した。HaCaT細胞におけるPlGF発現レベルは、A431細胞に比較して有意に低いことを確認した後、飲用井戸水に含まれるレベルのヒ素曝露で、HaCaT細胞におけるPlGF発現レベルが有意に上昇することを示した。次に、HaCaT細胞の浸潤能はヒ素曝露で亢進するものの、siRNAによりPlGF発現レベルを低下させたHaCaT細胞では、ヒ素による浸潤能の亢進は、ほぼキャンセルされることを示し、細胞におけるPlGF発現レベルが細胞浸潤に関与している可能性を示した。加えて、ヒ素曝露によりHaCaT細胞から分泌されるPlGFの量が増加することを示した。さらに、PlGFの受容体や下流のシグナル伝達分子に着目し、PlGFが皮膚癌を誘発する分子機構を一部解明し、PlGFはヒ素誘発癌に中心的に働く可能性を提案した。一方、光線療法による皮膚癌の予防技術についても検討した。【背景と目的】地球温暖化により干ばつ地域の拡大を介した水の量的不均衡を是正し、安定的な飲用水の「量」を確保のために、井戸水(地下水)の飲用利用の重要性が今後ますます重要になってくると予想される。一方、重金属をはじめとする有害元素は強い毒性を持ち、ヒトの生命に関わる重大疾患を誘発するので、最優先で浄化が検討されるべきである。本研究では、飲用井戸水の元素汚染に焦点を当てて海外フィールドワーク研究を行い、どのような種類の有害元素に、どのくらいの濃度で汚染されているかを把握するとともに、細胞および動物レベルで元素の毒性と作用機序を調べる。さらに、飲用井戸水から有害元素を浄化できる技術に加え、有害元素の摂取により誘発される疾患を予防できる新療法の開発をめざす。【結果】1)アジア地域において、過去に飲用井戸水の元素汚染が報告されている地域とコントロールの非汚染地域でフィールドワーク研究を実施した。特に、バングラデシュでは、汚染地域と非汚染地域でヒト検体(尿・毛髪・爪)も採取した。

さらに、ICP-MSを用いて、飲用井戸水およびヒト検体に含まれる元素濃度を測定する研究を推進した。2)実際に飲用井戸水からヒトが曝露されうるレベルの有害元素を飲用した場合の元素蓄積量を、動物実験により調べる研究を推進している。3)ベトナム国立大学との国際共同研究により、ヒ素の両方向性作用(発癌と抗癌の作用)の分子機構を一部解明した。4)バングラデシュのダッカ大学との国際共同研究により、ヒ素誘発性疾患を予防療法にユカンという植物の葉が有効である可能性を提案した。重金属をはじめとする無機物質は強い毒性を持ち、癌等のヒトの生命に直接的に関わる重大疾患を誘発するので、最優先で健康リスクが検討されるべきである。本研究では、飲用井戸水の無機物質汚染に焦点を当て、まず、アジア地域における海外学術調査により、複数の無機物質に汚染された飲用井戸水の現状を把握する。次に、単独および複数の無機物質曝露の発癌毒性を評価し、井戸水から除去すべき無機物質を特定する。以上のように、本研究では、海外学術調査を起点とし、飲用水の健康リスクの評価を介してアジアの公衆衛生の向上に貢献する。26年度が最終年度であるため、記入しない。従来には報告されたいなかったPlacental Growth Factor(PlGF)分子が、ヒ素誘発皮膚癌の制御に中心的に働いていることを証明することで、ヒ素誘発癌の健康リスクを評価できる可能性のある新しい分子を提案できた。さらに、PlGFは、ヒ素誘発癌の予防に有効な分子標的療法である可能性を持っている。以上より、ヒ素誘発癌に対する健康リスク評価と予防に貢献できる可能性のある画期的な分子候補を提案できたので、研究は、おおむね順調に進展していると判断した。衛生学・皮膚科学・毒性学ヒト疫学研究をさらに推進し、ヒ素誘発癌の健康リスクを評価できるバイオマーカとして有効かどうかについて、検討を進める予定である。さらに、短期間での達成は困難であると予想されるが、ヒ素誘発癌の分子標的予防療法の開発を推進したい。当初予定していた研究は、ほぼ予定通りに研究が推移している。さらに、従来、低濃度では発癌性がほとんど無いと考えられていた無機物質が発癌毒性を持つ可能性を発見した。本研究では、当初予定していた研究を、計画通りに進めると同時に、想定外の新規知見に関する解析を開始しているので、おおむね順調と評価できる。当初の予想に反し、従来とは異なる分子がヒ素誘発皮膚癌の制御に働いていることが明らかとなった。研究遂行上、この現象の本質を見極めることが重要であることから、有識者との議論を踏まえて研究方式を決定することとなったので、次年度使用額が生じた。H24年度の研究成果を踏まえ、下記のような計画で、飲用井戸水の無機物質汚染に焦点を当て、無機物質に汚染された飲用井戸水の現状を把握し、飲用水に含まれるレベルの無機物質汚染における発癌毒性を評価し、井戸水から浄化すべき無機物質を特定し、発癌性無機物質を除去可能な浄化剤を開発する研究を遂行する。A.井戸水に含まれる無機物質の現状把握:アジア地域において採取した井戸水およびヒト検体を対象とし、ICP-MSを用いて無機物質(元素)濃度を測定する。
倫理調整における精神看護専門看護師の倫理的意思決定過程

本研究の目的は、精神看護のエキスパートである精神科専門看護師及びリエゾン精神専門看護師が、日々患者との間や医療スタッフ間で起こる倫理的な問題や葛藤に対し、それをどのように認識して倫理的意思決定を行っていくのか、そのプロセスを明らかにすることである。そのため、まず看護における「倫理的意思決定」の概念分析を行い、構成概念を明らかにしたのちに、全国の精神科病院や一般科で、実際に精神専門看護師として働き、「倫理調整」にかかわった経験のある看護師20名へのインタビュー調査を実施、その結果を逐語録にまとめる。さらに、逐語録からSCAT法を用いた分析を行い、全体のストーリー・ラインを紡ぎだし、理論を導く。
肺癌進展における肺気腫の関与とその機序の解明

マウスにエラスターゼを投与し、肺気腫マウスを作製した。肺気腫マウスにLewis(3LL)肺癌細胞で転移性腫瘍を形成させた。肺気腫マウスでは2mm以上腫瘍結節数が多かった。肺気腫マウス肺ではlatentMMP-2が高値を示した。肺細胞を48時間培養した液で3LL細胞を培養した。肺気腫マウスの培養液で3LL細胞数が増加し、培養上清でactiveMMP-2とMT1-MMPが増加した。ヒト肺気腫合併肺癌組織は、非合併に比べ、PCNA、CD105、MMP-2が高発現していた。ヒト肺癌標本を用いた、肺気腫の合併が肺癌の進展に関与する因子を特定するための実験本年度はヒト肺癌標本(過去に当院で手術を受けた肺癌患者から)を用いて、肺気腫と癌の臨床的悪性度との関係を分子レベルで検討することを目的に研究を行った。過去に当院で臨床病期I期の非小細胞肺癌にて手術を受けた患者から、気腫肺を有する症例30例と気腫肺を有しなし症例30例の手術標本(パラフィンブロック)を選定した。選定した標本から組織切片を作成した。細胞外基質分解酵素の発現を評価するために抗MMP-2抗体、MMP-9抗体を用いて免疫染色を行った。血管新生因子の発現を評価するために抗VEGF抗体、新生血管密度を評価するために抗vWF,CD34,CD105抗体を用いて免疫染色を行った。細胞の増殖指数を評価するために抗PCNA(Ki67)抗体を用いて免疫染色を行った。細胞のアポトーシス指数としてTUNEL法を用いて測定した。現在染色されたこれらの標本に対して定量評価を行っている。マウス肺気腫モデルの作成エラスターゼの毒性試験一至適容量・濃度試験を行った。その結果、エラスターゼは20μg/50μL/bodyが至適容量・濃度であることが分かった。その後、実際にマウス気管内にエラスターゼを投与し、肺気腫モデルを作成した。エラスターゼ処理後パルスオキシメーターで肺機能を評価しつつ、2週後、4週後、8週後の経時的にマウスを犠牲死させマウス肺標本を採取した。生理食塩水のみを投与したものをコントロールとして、HE染色ならびにEVG染色により肺胞構造組織破壊を観察し肺気腫病変が確立する時期を特定した結果、エラスターゼ投与後3-4週目が妥当であることが分かった。本研究では肺気腫特有の肺組織微小環境に着目し,肺気腫が肺腫瘍の進展に関与する機序を解明することを目的としている,肺気腫では様々なmatrix metalloproteihase(以下MMP)の過剰発現が報告されているため,我々は肺気腫肺の環境ではMT1-MMP/MMP-2 axisを介して肺腫瘍の進展が促進するという仮定に至った.当該年度は動物モデルを用いて肺気腫の存在が肺腫瘍の増大を促進させることを検証した.1.C57BL/6マウス(8週齢雄)に豚膵エラスターゼを経気管的に投与し,3週間後に肺を摘出し,病理組織学的に肺気腫モデルの完成を確認した.2.肺気腫モデルマウス(以下Eマウス)と対照マウス(以下Cマウス)を用いて各々にLewis肺癌細胞(3LL)を尾静脈投与し,転移性腫瘍を形成させた.3週間後に肺を摘出したところEマウスでは肺重量,肺表面の腫瘍結節数が有意に多かった。3.EマウスとCマウスの肺を摘出し,各々の肺ホモジネート液中の1atentMMP-2,activeMMP-2をGelatin-zymography、MT1-MMPをELISA法を用いて測定した.Eマウスの肺ではlatentMMP-2が有意に高値を示したが,activeMMP-2,MT1-MMPに有意差を認めなかった:4.EマウスとCマウスの肺を各々に24時間初代培養し,同培養液で3LL細胞を培養した,Eマウス群では3LL細胞数が有意に増加し,培養3日目にはCマウス群より有意に多かった.Eマウス群の培養上清activeMMP-2,MT1-MMPは経時的に増加し,activeMMP-2は培養3日目には有意に高値を示した,以上の結果から肺気腫の存在が肺腫瘍の増大を促進させたこと,肺気腫肺は癌細胞の増殖を促進させる環境で,我々は同程度の喫煙歴があるI期非小細胞肺癌完全切除症例を検討し、肺気腫合併症例は術後死亡率・再発率が有意に高いことを示した。

前年度の基礎研究で、肺気腫肺で高発現のMMP-2(潜在型)が3LL細胞膜上のMT1-MMPを介し、MMP-2自身を活性化する可能性を示唆できた。今年度はヒト肺切除標本を利用し、検討を行った。臨床病期I期の原発性非小細胞肺癌48例を対象とし、術前CTで肺気腫を診断し、肺気腫群と非肺気腫群に群分けし、肺癌とその周囲の肺組織を免疫組織化学染色で評価した。その結果、腫瘍細胞のPCNA陽性率、腫瘍内のCD105陽性血管密度は肺気腫群で有意に高値であった。腫瘍細胞、腫瘍間質細胞のMMP-2(潜在型)、MMP-9とMT1-MMPの発現について評価し、染色強度は4段階にスコア化した。全患者における腫瘍細胞におけるMMP-2、MT1-MMPそれぞれの染色強度の間には正の相関関係を認めた。肺気腫群ではMMP-2 Score1(低スコア)の割合が有意に少なく、MMP-2 Score2、3(高スコア)の割合が多かった。MT1-MMPの染色強度の割合に差はなかった。また腫瘍間質細胞では肺気腫群で、MMP-2(潜在型)とMMP-9の染色強度が有意に高かった。肺気腫に生じた肺腫瘍では腫瘍進展の促進に寄与するMT1-MMP/MMP-2 axisが刺激され、肺腫瘍進展が促進する可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画通りに遂行する予定である。
糖質加水分解酵素の触媒メカニズムの改変

アミノ酸配列・立体構造の類似した糖質加水分解酵素が異なる触媒機構を示す原因を立体構造解析・部位特異的変異酵素の解析により明らかにした.触媒機構の保持型酵素と反転型機構の相互変換することを試みた。しかし活性を有する変異酵素を得ることをできなかった.この結果は進化の過程のかなり早い段階で触媒残基の置換が起こり,さらに二つの触媒機構を有する酵素群は分子進化してきているものと考えることができた.アミノ酸配列・立体構造の類似した糖質加水分解酵素が異なる触媒機構を示す原因を立体構造解析・部位特異的変異酵素の解析により明らかにした.触媒機構の保持型酵素と反転型機構の相互変換することを試みた。しかし活性を有する変異酵素を得ることをできなかった.この結果は進化の過程のかなり早い段階で触媒残基の置換が起こり,さらに二つの触媒機構を有する酵素群は分子進化してきているものと考えることができた.本申請研究では糖質加水分解酵素の元来全く異なる2つの触媒機構であるアノマー保持型機構とアノマー反転型機構の相互変換を目的としている。アミノ酸配列並びに構造類似性を持つにも関わらず、異なる触媒機構を有する2つの酵素をモデルとして、相互変換を試みた。まずアノマー反転型酵素を保持型酵素に変換することを試みた。反転型酵素では触媒基は塩基触媒基と酸触媒基により構成されている。一方、保持型酵素では求核触媒基と酸/塩基触媒基により構成されている。反転型酵素の酸触媒基は酸/塩基触媒基として働くことが可能であると考え、もう一方の塩基触媒基を取り除き、求核触媒基を導入した。求核触媒基の導入位置の選定を2つのモデル酵素の立体構造アライメントを元に行った。しかし、この変異酵素は変異酵素活性を有さなかった。そこで、求核触媒基が求核触媒基として働くことができるような環境を整えることを試みた。保持型酵素の立体構造を元に、求核触媒基と相互作用を取り得るアミノ酸残基を選定し、反転型酵素の対応するアミノ酸残基をこれらに置換した変異酵素を数種作製した。しかしこれら変異酵素も触媒活性を有さなかった。一方、保持型酵素を反転型酵素に置換するストラテジーの過程で、求核触媒基を取り除いた変異酵素が反応性の高い基質を用いた際に糖転移反応をよく触媒することを副産物的に発見した。このメカニズムを解明するため、この変異酵素の立体構造を解析するべく、酵素タンパク質の結晶化条件を決定した。本申請研究は糖質加水分解酵素の元来全く異なる2つの触媒機構であるアノマー保持型機構とアノマー反転型機構の相互変換を目的として行った。これは,アミノ酸配列ならびに構造類似性を持つが、一方はアノマー保持型,もう一方はアノマー反転型の触媒機構を有する酵素群が存在する,というところから発想を得たものである.2つの触媒機構の相互変換が可能になること有用糖の生産の効率化,バイオマスの低分子化の効率化を見込めると考えている.実際には前述のアノマー保持型,アノマー反転型の触媒機構の酵素を有する酵素群の触媒機構の相互変換を試みた。まず,アノマー保持型酵素の立体構造,触媒メカニズムに関する投稿論文を発表した.前年度までの研究で反転型酵素の塩基触媒基を取り除いたのちの求核触媒基の導入,保持型酵素の求核触媒基を除いたのちの塩基触媒基の導入,また触媒残基周辺残基の改変で,触媒活性を得られなかったため,さらに反応の遷移状態を安定化させるようなアミノ酸残基の導入,触媒残基近傍の"saturation mutagenesis"を行ったが触媒活性を有する変異酵素作製には至らなかった.本申請研究において,単純な触媒残基の置換,触媒残基周辺の置換で触媒活性を有する酵素を得られなかったことから,進化の過程のかなり早い段階で触媒残基の置換が起こることで,これら二つの触媒機構を有する酵素群は分岐しており,各々はさらに分子進化してきているものと考えることができる.また本申請研究に役立てるためアノマー反転型酵素の触媒過程におけるカルシウムイオンの必要性,カルシウムを失った酵素の立体構造解析,重水素ラベルした基質による触媒機構の解析を行った.また本申請研究と遠縁の関係にある酵素の触媒メカニズム,反応特異性について解析を行い報告した.
暖温帯～熱帯域の浅海生物の遺伝的多様性からみた起源に関する研究―甲殻異尾類を例に

暖温帯から熱帯に分布する種の起源を調べるために、浅海性ヤドカリ類をモデル生物として種内の遺伝的分化を調べた。ホンヤドカリは親潮域から黒潮域まで幅広く分布し、親潮域の集団は夏繁殖型で短期間に繁殖し、オス同士の闘争は激しい。一方黒潮域の集団は冬繁殖型であるが繁殖期は長期にわたり、オス同士の闘争は緩やかである。日本各地の集団についてmtDNAのCOI遺伝子の変異をみたが顕著な差はなく、表現形変異である可能性が示唆された。イソヨコバサミは関東地方から広くインドー西太平洋の熱帯域に分布する。そのcox遺伝子を調べたところ、東南アジアの一部集団は日本とは異なることが明らかになり種分化の萌芽が見られた。イソヨコバサミClibanarius virescens(甲殻亜門:軟甲綱:十脚目:異尾下目:ヤドカリ科)は、広くインド洋から西太平洋の主として熱帯域の硬質底潮間帯に分布するが、本年度においては沖縄の石灰岩質の隆起サンゴ礁に生息している熱帯域集団の個体と、本州の温帯域の火山岩または堆積岩質の岩礁に生息している温帯域集団の個体の遺伝的、生態的、形態的違いを調べる目的で、調査を行った。まずイソヨコバサミのmtDNAのCOI遺伝子を調べること、および生時の色彩、行動・生態観察を飼育観察下で行う目的で、沖縄本島のうるま市にある具志川河口周辺の潮間帯の磯で採集調査を行った。また連携研究者らと協力して、mtDNAのCOI遺伝子および形態を調べることを目的として、房総半島、紀伊半島、鹿児島の岩礁潮間帯で個体の採集をおこなった。これらの集団の標本は冷凍し、首都大学東京の青塚研究室に送り、DNAの抽出を行っている。また生きている個体は,神戸大学の朝倉研究室にて飼育を開始した。その結果、現在までに判明したことは、沖縄の集団の個体は鉗脚、第二歩脚、第三歩脚が緑色で、歩脚の指節に黄色いバンドが1本入る個体が大部分であるが、5%程度2本のバンドがみられる。一方、房総半島の集団の個体では、鉗脚、第二歩脚、第三歩脚が濃い藍色で、歩脚の指節に黄色いバンドが2本入る個体が大部分を占める、ということである。また微細な地理分布でみると、沖縄の集団は黒潮水のよくあたるサンゴ礁にはむしろ少なく、河口域近くなどの、あまりサンゴヤドカリ類が生息していない場所に多かった。一方、温帯域集団では、黒潮の流れが直接あたるような外洋性海岸に多かった。本年度は、日本の温帯域の岩礁集団として房総半島、伊豆半島、紀伊半島、九州の北西部からイソヨコバサミClibanarius virescensを採集し、ミトコンドリアDNAのCOI遺伝子の解析をおこなった。また熱帯域の集団としては沖縄の沖縄本島、また海外からは、台湾およびホンコンからイソヨコバサミを採集し、同様の解析を行った。これらの調査地のうち、沖縄のみがサンゴ礁の集団でありリーフフラットの比較的上部に生息するものである。それに対してほかの集団は、主として火山岩(特に玄武岩が多い)性の岩礁の潮間帯の下部に生息するものである。その結果の遺伝子の類似度を調べたところ、サンゴ礁集団が、他の地域とやや異なることが見出された。これはサンゴ礁集団だけが、遺伝的分化をおこしていることを示唆するのかもしれない。またサンゴ礁集団と岩礁集団において、歩脚の色彩や模様の違いを調べたところ、有意な差を見出すことができた。サンゴ礁集団の個体は第二、三歩脚では緑が主たる地の色であり、また指節が全体として黄色い模様がはいる傾向にある。一方、岩礁集団の個体は第二、三歩脚では濃い藍色が主たる地の色であり、また指節には2つの黄色いリング模様がはいる傾向にある。また形態的には大きな違いはないものの、プロポーションにおいては、やや違いがあり、サンゴ礁集団においては甲が幅広い傾向にある。さらに両集団から幼生(第一ゾエア)をとることができたので、その色彩と形態の比較を行ったが有意な差は見られなかった。岩礁潮間帯性ヤドカリ類について、北海道、東北、関東、紀伊、四国、九州、沖縄、台湾、ホンコンから得られたサンプルについての遺伝的な組成を調べた。ミトコンドリアDNAのCO1領域を用いた。ホンヤドカリPagurus filholiにおいては、北海道では夏に繁殖のピークがあり、関東九州にいたる地域においては冬に繁殖のピークがある。またメスをめぐるオスの行動は、北海道では攻撃性が相対的に高い傾向が見られた。しかしながら、ミトコンドリアDNAのCO1において遺伝的な差は見られなかった。