hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳腫瘍の発生に関わる新規分子の同定とその分子基盤を標的とした化合物の探索

我々はこれまでGBM発生マウスモデルを用いた解析から共通して増幅する遺伝子領域を見出した。本研究では、解析マウスを増やして発がんに関わる責任遺伝子の同定を行うと共に、それらの遺伝子の機能解析および作用を阻害する小分子化合物についての解析を行った。本マウスモデルではHMT-1が腫瘍発生過程の早期より過剰発現するが、増幅遺伝子領域中にはHMT-1と結合する別のタンパク質HMT-2が存在することを見出した。HMT-1、HMT-2の阻害は、in vitro、in vivoで効果的にGBMの増殖を抑制することから、本研究の成果を発展させることで、今後新たなGBM治療薬の開発が期待できると考える。膠芽腫(グリオブラストーマ, GBM)は原発性脳腫瘍のうち高頻度にみられる極めて悪性度の高い腫瘍である。浸潤性の強い腫瘍で再発することが多く、化学療法や放射線治療が併用されるが必ずしも治療効果は高くない。すなわち有効な治療法の開発が喫緊の課題である。本年度はGBM発生マウスモデル(Mosaic Analysis with Double Markers, MADM; Tp53およびNf1遺伝子が欠失)を樹立した。さらにそのゲノム・エピゲノム解析から、我々が新規発見した高頻度遺伝子増幅領域に着目し、その領域に存在する発がんの責任遺伝子について解析を行なった。複数のMADMマウスをもちいて解析したが17遺伝子より絞り込むことはできなかった。さらに遺伝子が増幅する時期は生後90日前後であることを見出した。従ってこれらの遺伝子群の増幅が発がんの後期に関与している事象であると考えた。公共データベースThe human genome atlas (TCGA)を用いてヒトGBMを解析した結果、Tp53およびNf1が欠失し、さらに同遺伝子領域が増幅しているGBMはproneural typeのGBMに集積していることを見出した。同遺伝子領域にはヒストン修飾タンパクをコードする遺伝子が含まれている(HMT-A)が、HMT-Aは正常細胞には存在しない複合体形成をしていることを免疫沈降法から見出した。本研究では、グリオブラストーマの発生に関わる新規がん関連遺伝子の同定およびその機能解析、さらに同定した発がん分子機構を標的とする小分子化合物のスクリーニング系の確立を行う。本年度は下記の研究を行った。本研究で用いたマウスは、胎児期の神経幹細胞で相同組み換えが起こり、p53、Nf1のアレルが欠失する。欠失した細胞のみが緑色蛍光を呈し、緑色蛍光をもつ細胞集団が腫瘍化する。従って緑色細胞を解析することにより、膠芽腫前駆細胞から膠芽腫形成までの過程を追跡することが可能である。これまでの膠芽腫細胞のゲノム・エピゲノム解析の結果、腫瘍細胞において共通して増幅が観察される遺伝子領域が存在した。この領域で高発現している遺伝子には膠芽腫の悪性化に関わると考えられる3遺伝子、すなわちエピゲノム修飾タンパク質、Notchシグナル関連タンパク質、転写複合体構成因子をコードする遺伝子であった。さらにRNA干渉法によるノックダウンを行い、膠芽腫細胞の増殖能、浸潤能、腫瘍形成能について解析を行った結果、エピゲノム修飾タンパク質、Notchシグナル関連タンパク質が重要である可能性が得られた。エピゲノム修飾タンパク質の活性阻害剤についての共同研究を開始した。本研究では、有効ながん治療を目指すため、がん細胞に特異的な弱点を見つけその分子基盤を標的とした分子標的薬の開発を目指す。本年度は我々が新規発見した高頻度遺伝子増幅領域の解析を行なった。その領域に存在する遺伝子について、がんに関わる責任遺伝子をより少数まで絞り込むことを目的として、MADMマウスの数を増やし解析を行なったが、当初の17遺伝子より絞り込むことはできず、これらの遺伝子群が発がんに関与していると考えた。それらの遺伝子に、ヒストン修飾に関わる酵素(HMT-A)が含まれていた。HMT-Aはこれまでの報告から幹細胞性、未分化性の維持に必須なタンパク質であることがわかっていることから、HMT-Aについての解析をさらに進めた。その結果HMT-Aはがん細胞特異的な異常複合体形成に関わることを見出した。以上のように当初の計画通りに研究は進んでおり、来年度に向けて基盤的データの構築をほぼ終了している。がんエピジェネティクス平成26年度の結果を踏まえ、1) HMT-Aおよびその異常複合体についての機能解析。2)同定した発がん関連遺伝子を標的とした小分子化合物のスクリーニング系の構築を今後は目指す。具体的には1) HMT-Aが異常複合体を形成する機序について解析を行なう。

特にTp53の有無が異常複合体形成に関与する予備実験結果を得ており、その検証および詳細な機序について研究を進める予定である。2) HMT-Aと異常複合体形成をするタンパク(WDP)をそれぞれ蛍光ラベル化しAlphaテクノロジーでスクリーニング系の構築を行う。またエピゲノム修飾酵素の場合には、修飾部位を認識する抗体を蛍光ラベル化し、細胞ベースのスクリーニング系を構築する。予定より少ないマウスの解析で26年度の計画を達成できたため。今年度はin vitroでの解析を中心に研究を行う。研究計画のうち特にタンパク質の相互作用を中心にした解析に研究費を使用する予定である。
体外心肺補助中における光を用いた血液の非侵襲連続診断

長期間安全で信頼性の高い体外補助循環を実現するために、光を用いた血液の非侵襲モニタリング技術は大いに貢献できると考えられるが、補助循環路を流れる血液の光学モデルは確立されていない。そこで、ECMO回路管内血液の光伝播をシミュレーションするpciMC (photon-cell interactive Monte Carlo simulation)を開発し、実際にpciMCを使用してヘマトクリットおよびヘモグロビンを非侵襲に定量することを試みた。in vitroにおいて模擬ECMO回路を構成し、新鮮豚血液を循環させた。He-Neレーザーを光源として用い、光ファイバで導き人工肺アウトフロー部のチューブに入射した。光軸上に設置した受光ファイバにて透過型計測を行い、光電子増倍管にて受光強度を求めた。その結果、ポンプ流量を上昇させていくと透過光強度が低下していくことがわかり、1L/min以上程度で一定となっていった。この実験結果を実際に再現できるpciMCモデルを開発した。pciMCは、従来のMCと異なり、光吸収散乱体である赤血球が実際にモデル内で定義されている。光子が赤血球に衝突したとき、幾何光学に基づいて赤血球表面上で光子のベクトルが変化して、赤血球内外を伝播していく。光の吸収は、光子が赤血球内を伝播しているとき、Beer-Loambertの法則に基づき、赤血球内光路長および赤血球内ヘモグロビン濃度にしたがって表現される。空間モデリングに関して、流量が生じると幾つかの赤血球が流線上に配向していくと仮定した。配向の定義は、赤血球の長軸が流れ方向と平行になり、流れ方向を軸とした回転自由度があるとした。全体の血球数に対する配向した赤血球の割合を「配向率」とし、各流量における実験値とシミュレーション値が一致するときの配向率を求めることで、ECMO回路管内の光伝播モデルを確立した。得られた光伝播モデルを用いて、ヘマトクリットおよびヘモグロビン値を光計測結果に基づき予想したところ、それぞれ0.97%および0.32g/dLの誤差精度で定量可能な結果が得られた。
電磁力応用機器材料システムの電磁破壊力学的研究

本研究は、電磁材料システムの破壊・変形挙動に及ぼす電磁場の影響解明に関する理論的・実験的研究を行ったものである。すなわち、電磁力応用機器の設計及び信頼性・安全性評価に資することを目的に、3年間の研究を実施し、以下の成果を得た。1.貫通き裂を有する導電性・磁性材料平板の磁気弾性解析を行い、曲げモーメント拡大係数に及ぼす磁場・波動場の影響を解明した。2.磁性材料平板の曲げ試験を行い、変形挙動に及ぼす磁場の影響を明らかにした。また、平板曲げ試験に関する磁気弾性解析を行い、理論解析結果と実験結果を比較して理論の妥当性を検証した。さらに、き裂を有する磁性材料平板の曲げ試験及び磁性材料の双片持ちはり試験を行い、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響を明らかにした。3.超伝導マグネット用構造材料母材及び溶接材の極低温・強磁場下における破壊・変形実験及び数値シミュレーションに関する基礎的研究を実施し、検討を加えた。4. (a)き裂を有する圧電材料及び圧電複合材料の電気弾性解析(応力拡大係数、エネルギー解放率、疲労き裂成長速度)を行い、電気破壊力学的挙動を解明した。また、表面電極を有する圧電セラミックスの電気弾性挙動を理論解析し、電極端近傍における応力及び電束密度を解明した。(b)き裂を有する誘電材料の電気弾性波散乱解析を行い、動的応力拡大係数に及ぼす電場の影響を解明した。5. (a)圧電積層板の曲げ試験・有限要素解析を行い、電気弾性変形挙動を解明した。(b)圧電セラミックスの圧子圧入試験・有限要素解析を行い、電気破壊・変形挙動を解明した。また、圧電セラミックスの予き裂導入破壊試験を行い、圧子圧入法による電気破壊靭性評価式を提案した。6.電磁場と力学場の相互干渉を考慮した電磁材料力学・破壊力学に関する数値シミュレーションを行った。また、理論・実験両面からの検討結果を有機的に結合し、電磁力応用機器材料システムの設計・開発・評価に資する有益な結果を得た。本研究は、電磁力応用機器の設計及び安全性評価に資することを目的に、電磁材料システムの破壊および変形挙動に及ぼす電磁場の影響解明に関する理論的・実験的研究を行ったものである。得られた成果を要約すると以下の通りである。1.一様磁場内における貫通き裂を有する導電性平板および軟磁性平板の磁気たわみ波散乱問題を取り上げ、き裂の動的磁気弾性挙動を理論的に解明した。2.磁場内におけるフェライト系ステンレス鋼平板の曲げ実験を行い、変形挙動に及ぼす磁場の影響を解明した。また、実験に対応する磁気弾性解析を行い、理論解析結果と実験結果を比較して理論の妥当性を検証した。さらに、き裂材の曲げ実験を行い、モーメント拡大係数に及ぼす磁場の影響を明らかにした。3.超伝導マグネット用構造材料母材及び溶接材の極低温・強磁場下における破壊・変形実験及び数値シミュレーションに着手し、一部興味ある結果を得ている。4.縦せん断下におけるき裂を有する圧電セラミックス帯板の静的・動的電気弾性解析を行い、応力拡大係数及びエネルギー解放率に及ぼす電場、波動場の影響を解明した。また、貫通き裂を有する対称圧電積層板の静的・動的電気弾性解析を行い、モーメント拡大係数に及ぼす電場の影響を解明した。5.圧電積層板の曲げに関する実験・有限要素解析及び電気弾性解析を行い、電気弾性相互干渉に関して考察した。

また、圧電セラミックスの圧子圧入試験及び圧電積層板の動的・熱的負荷による破壊・変形実験に関しては、試験治具を製作し、一部実験を開始した。6.電場内における二次元き裂を有する誘電体の調和電気弾性波散乱問題を取り上げ、き裂の動的電気弾性挙動を理論的に解明した。7.電磁場と力学場の相互干渉を考慮した電磁材料力学・破壊力学に関する基礎理論を検討し、数理解析法開発に着手した。本研究は、電磁力応用機器の設計および信頼性・安全性評価に資することを目的に、電磁材料システムの破壊および変形拳動に及ぼす電磁場の影響解明に関する理論的・実験的研究を行ったものである。本年度は、昨年度の検討結果より、解析モデルおよび実験方法の妥当性を考察し、問題点をまとめ、新たな解析および実験を行なった。得られた成果を要約すると以下の通りである。1.一様磁場内における貫通き裂を有する導電性Mindin平板および軟磁性Mindlin平板の磁気たわみ波散乱問題を取り上げ、き裂の動的磁気弾性挙動を理論的に解明した。2.フェライト系ステンレス銅SUS430およびオーステナイト系ステンレス銅SUS316溶材(フェライト含有量2.58%)を対象に、磁場内おけるき裂材の曲げ試験を行い、モーメント拡大係数に及ぼす磁場の影響を明らかにした。3.超電動マグネット用構造材料母材および溶接材の極低温・強磁場下における破壊・変形実験の試験冶具を製作し、一部実験を開始した。4.圧電セラミックスの疲労き裂成長挙動に関する数理解析を行ない、具体的にき裂を有する圧電セラミックス、緑に平行および垂直なき裂を有する圧電セラミックス帯板の面外せん断問題を取り上げ、疲労き裂成長に及ぼす電気弾性相互干渉の影響を解明した。5.圧電セラミックスの圧子圧入試験を実施し、き裂長さに及ぼす分極方向および電場の影響を明らかにした。また、実験結果に理論的検討を加えるため、圧子圧入試験に関する有限要素解析を実施予定である。6.電磁場と力学場の相互干渉を考慮した電磁材料力学・破壊力学に関する基礎理論を整備し、数値シミュレーション法開発に着手した。本研究は、電磁力応用機器の設計及び信頼性・安全性評価に資することを目的に、電磁材料システムの破壊・変形挙動に及ぼす電磁場の影響解明に関する理論的・実験的研究を行ったものである。本年度も、昨年度までの検討結果に引き続き、解析モデル及び実験方法の妥当性を考察し、問題点をまとめ、新たな解析及び実験を行った。また、正しい電磁破壊力学パラメータを求め、電磁破壊靭性試験について詳細に検討し、電磁破壊靭性評価に関する基礎的研究を行った。1.貫通き裂を有する導電性・磁性材料平板の動的磁気弾性挙動を理論解析し、動的曲げモーメント拡大係数に及ぼす磁場の影響を解明した。2.近接する2枚の磁性材料平板の曲げ試験を行い、変形挙動に及ぼす磁場の影響を明らかにした。また、強磁場下における磁性材料の双片持ちはり試験を行い、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響を明らかにした。3.超伝導マグネット用構造材料母材及び溶接材の極低温・強磁場下における破壊・変形実験及び数値シミュレーションに関する基礎的研究を実施し、検討を加えた。4.き裂を有する圧電セラミックスの電気弾性解析(応力拡大係数、エネルギー解放率、疲労き裂成長速度)を行い、電気破壊力学的挙動を解明した。
高解像度固液混相流モデルによる混合粒径砂の鉛直分級機構の計算力学的研究

河川および海岸構造物建設後の河床変形および海浜変形の事前評価は、環境を議論する上で重要である。砂粒子を多く含む粒子流の内部構造を実験より計測することは非常に困難である。そこで本研究では、河床および海底土砂輸送機構を数値シミュレーションから検討し、高濃度粒子流の構造を計算力学的な観点から明らかにし。得られた知見は、河床変形や海浜変形過程の詳細な機構の理解に資するものと考える。混合粒径流砂・漂砂の流送過程で見られる異る粒径砂の選択輸送による分級現象は、河床または海底地形の変動を予測する上で、あるいは、水理環境を議論する上で重要な現象である。分級過程は、高濃度粒子流送現象であり、力学的には底質構成材料である粒子・粒子および粒子・流体間の活発な相互作用による運動量交換が支配的な固液混相流現象である。また、分級現象は、個々の粒子運動の集積によって支配されるため、その詳細な理解には、粒子スケールよりも細かい視点から照査することが重要である。当該年度では、個別要素法(DEM)を砂粒子追跡モデルに採用し、また、砂粒子スケールよりも細かい計算格子を用いたCIP-CUP法ベースの流れ場ソルバーとのカップリングによって鉛直2次元場での混合粒径砂の鉛直分級を対象とした数値シミュレーションを実施した。なお、鉛直分級を対象としたシミュレーションの前には、構築したコードの基本的な動作確認のために、粒子群の沈降・堆積過程を対象にした数値シミュレーションおよび簡易な水理実験を実施した。また、鉛直分級が発現する状態は固液混相乱流状態であるため、DEMとCIP-CUP法を融合した固液混相流モデルの枠組みにサブモデルとしてSmagorinskyモデルによるLESの枠組みを整備した。本年度の後半にはモデルの3次元化へ取組んだ。3次元モデルの再現性について検討するため、単一粒子の沈降過程を対象にした水理実験を実施し、同条件での3次元数値シミュレーションを通じて、双方の結果を比較した。本研究では数値流砂水理学的な観点から混合粒径砂の鉛直分級機構を検討するため、砂粒子スケール以下の解像度を有する計算格子を用いて数値シミュレーション(LES)を実施した。本年度(22年度)は数値コードを3次元に拡張して混合粒径砂の鉛直分級機構について検討した。21年度の数値シミュレーションでは固液相間の相互作用力が不十分な取扱であったため、22年度の初期には、先ず計算格子レベルの運動量収支の観点から固液相間の相互作用力を表現したサブプログラムを作成した。その後、このサブプログラムを導入した数値コードの再現性確認のため、単一粒子や単一ブロックの静水中での自由落下過程を対象とした数値シミュレーションを実施した。そして、数値シミュレーションによって得られた粒子周りの渦構造は、水理実験から得られた渦構造を概ね良好に再現することを確認した。なお、水理実験の粒子周りの渦構造は、初年度の研究予算で購入したレーザーシートと流体解析ソフトウェアを用いてPIV計測したものである。単一粒子沈降過程に対する数値モデルの一定の再現性を確認した後、22年度中期から後期には多数粒子群の沈降過程や混合粒径砂の鉛直分級現象へこの数値モデルを適用した。これらのシミュレーションによって得られた粒子挙動は実験結果を概ね良好に再現性することが確認できたことから(ただし、鉛直分級現象のシミュレーションでは計算機のメモリ制約から十分な計算領域が確保できず、既往の実験と同一条件でシミュレーションの実施は不可能であった。)、実験計測が困難である高速で流動する高濃度粒子流動層(シートフロー層)の内部構造を検討するための数値コードが準備できたと考える。シミュレーションから得られる乱れ構造の情報は粒子流動層の詳細な理解や簡易な混相モデル開発などの一助となることが期待される。本研究課題においてこれまで粒子流を詳細に検討するための数値実験ツールとしてEuler-Lagrangeカップリング型の固液混相流モデルの開発に取組み、粒子流のラージ・エディ・シミュレーション(粒子流LES)実施のための準備を進めてきた。当該年度は、前年度からの継続課題として混合粒径シートフロー漂砂の鉛直分級過程を対象とした数値シミュレーションの実施と、その結果の既往の実験との比較を実施した。粒子流動層の瞬間像と粒径別の濃度重心時系列より、数値シミュレーションで得られた粒子運動の再現性を確認した後、実験計測が困難である粒子流動層の位相毎の流れ場(流速ベクトル分布、レイノルズ応力分布、乱れエネルギー生成分布)を計算力学的に検討した。これらのデータから、加速位相の中期から減速位相の初期にかけて粒子流動層の表層で乱れエネルギーの顕著な生成領域が発達し、鉛直分級が促進されることが確認された。当該年度の後半では、シートフロー漂砂における粒子流動層での歪み速度と粒子間衝突に起因した平均せん断応力の位相変化(レオロジー)の特性について検討を進めた。シートフロー漂砂が周期的変動を伴った高速・高濃度の非定常土砂輸送現象であるため、一様濃度の定常流を対象とした固液混相流の研究と比較してその知見は乏しい。

本研究課題で開発した粒子流LESのための固液混相流モデルを使用して、シートフロー層のレオロジーについて数値実験より検討し、Bagnold則が概ね成立する領域の半周期特性を示した。これらの内部構造の情報は、シートフロー層の内部構造を検討する上で基礎的な情報として意義がある。
疾患モデルマウスを用いた関節リウマチの遺伝的要因の解析

我々はHTLV-I遺伝子を導入したTgマウス(HTLV-I-Tg)を作製し、このウイルスが関節リウマチに良く似た自己免疫性の関節炎を引き起こすことを見いだした。また、この関節炎の発症にはIL-1やIL-6な、どのサイトカインの過剰発現が重要な役割を果たしていることを示し、さらにIL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1Ra)KOマウスも同様の自己免疫性の慢性関節炎になることを示した。本年度はこれらのモデルマウスを用いて発症関連遺伝子の網羅的探索を行った。市販の高密度オリゴアレイを利用し、両モデルマウスの関節で野生型マウスと比較して発現の変化している遺伝子を調べた結果、3倍以上の変動のある遺伝子が約1400であった。その内、発現の亢進している遺伝子が約83%、低下している遺伝子が約17%であった。また、HTLV-I-TgとIL-1RaKOでは遺伝子発現に強い相関があることが示された。バイオインフォマティクスの手法を用いてこれらの遺伝子の全長を明らかにしたところ、共通に強発現している遺伝子にはサイトカインやMMP、急性期タンパク質など炎症に関連のある遺伝子が多く含まれていたが、機能未知の遺伝子も約30見いだされた。今後はこれらの遺伝子と関節炎発症の関連を調べる予定である。
廃棄ＦＰＤ・ＣＲＴ・プリント配線板等からの有用金属リサイクル技術の開発

廃棄プラズマ・液晶ディスプレイパネル、ブラウン管、プリント配線板、蛍光管、集積デバイスなどからの有用金属リサイクル技術の開発を行った。各種金属・金属酸化物の各種酸水溶液への溶解性、電気化学的測定、析出・回収物の結晶構造解析、不純物分析などを行った結果、1金属、金属酸化物は、HF、HF/H2O2、などの酸水溶液に可溶で、廃棄物の室温同時一括処理が可能であること、2貴金属、レアメタル等の金属、金属酸化物を、金属ごとに分離・回収できること、3析出したAu、Ag、In、Cuの濃度が7295重量%であること、などがわかった。また、リサイクルInの透明導電薄膜への応用可能性が高いことがわかった。平成24年度は、PDP、LCDパネル、プリント配線板(PWB)、MEMS、LSIからの有用金属リサイクルと、リサイクルInの透明導電膜への応用のための基礎検討を行った。49wt.%HF/30wt.%H2O2水溶液に、各種ガラス粉末、PWBを個別、あるいは同時に浸漬・溶解し、ろ過して水溶液と不溶物に分離した。また、MEMS・LSIは粉砕し、20wt.%HF/15wt.%H2O2水溶液に浸漬・溶解した。LCD、PDP、PWBでは、各種金属の酸化還元電位を測定し、各種酸処理と段階的電気分解により有用金属回収を行った。PDPでは、結晶性のAg、Pb、PbO2、Pb代替Bi、Ybが析出した。定量分析結果から、Ag、Biの含有量が、それぞれ95.3wt.%、91.1wt.%であり、Al、Ca、Zn、Mg、などの不純物を検出した。PDP・LCD同時処理では、同様にAg、Bi、In2O3の析出を確認した。析出In2O3と不溶物からは、各種酸溶解と段階的電気分解により、それぞれIn、Ybの析出を確認した。LCD・PDP/PWBの同時一括処理では、Ag主成分の含有金属の陰極析出物と不溶物から、同様にCu、Pb、Inの析出を確認した。MEMS・LSIからは、結晶性Cuの析出を確認した。リサイクル金属応用では、ITO薄膜形成を検討した。In2O3、SnO2をHClに溶解・加熱して形成したInCl2粉末、SnCl2粉末のエタノール溶液をスプレイし、500°C加熱の石英ガラス基板上にITO薄膜を形成した。シート抵抗174Ω/□を得たが、従来のITO薄膜よりも2桁高かった。各種廃棄物をHF/H2O2水溶液に溶解し、各種酸処理と段階的電気分解により、金属ごとの高い分離性能を実証したこと、分離メカニズム解明のための基礎データの蓄積が進んだこと、などに本研究の意義・重要性がある。平成25年度は、PDPパネル、MEMS、LSIからの有用金属リサイクルと、リサイクルInの応用可能性の検討を行った。廃棄PDPパネルガラス粉末を、HCl水溶液に溶解・ろ過し、直流電圧を1.5、2.0、4.0 Vで段階的に増加させて電気分解を行った。1.5 V、2.0 Vで得られた析出物はGd、Yであり、4.0 VではGdCl3の可能性が高いことがわかった。LSI、MEMSをパッケージごと粉砕した後、HCl/HNO3水溶液(王水)に浸漬し、含有金属を溶解・ろ過して処理溶液を調製した。LSI、MEMSからの処理溶液の酸化還元電位の測定結果から、AgCl4の含有を確認した。これらの処理溶液を、直流電圧2.53.5 Vで電気分解を行い、Auの析出を確認した。また、LSI、MEMSからの析出物のAu濃度が、それぞれ、95 wt.%、0.6 wt.%であった。リサイクルInと市販In2O3、SnO2を用いてInCl3とSnCl2を調製し、これらのエタノール溶液を噴霧・焼成し、ガラス基板上にリサイクルITO薄膜を形成した。可視光透過率は60%程度、抵抗率は約1×10ー3 Ω・cmであり、透過率は市販原料で形成したものよりも小さかったが、抵抗率は同等であった。本研究期間を通して、酸化還元電位、段階的電気分解、結晶構造解析などを検討し、PDP・LCDパネル、CRT、プリント配線板、MEMS、LSIなどの廃棄物から、In、Ag、Au、Cu、Bi、Pb、Sb、Tb2O3、Yb、Y2O3、Eu2O3、Eu3O4の回収を可能にした。各種酸処理と段階的電気分解により、レアアース、貴金属の分離・回収の高い可能性を示したこと、リサイクル金属の応用可能性を実証したこと、などに本研究の意義・重要性がある。今後、回収・リサイクル装置の設計・製作、連続処理プロセスの構築、最適化などが必要である。

また、リサイクルInの透明導電薄膜への応用可能性が高いことがわかった。平成23年度は、In2O3、ZnO、CuのHF水溶液、HF/H2O2水溶液への溶解度測定、各種金属の酸化還元電位測定、電気分解析出物の結晶構造解析、不純物分析を行った。In2O3、ZnOの溶解度は、HF水溶液濃度が、それぞれ10 wt.%、40 wt.%で最大の3.9 g/100g-HF、12.5 g/100g-HFであること、HF濃度を20 wt.%で固定したときのCuの溶解度が、H2O2濃度15 wt.%で最大の5.08 g/100g-HF-H2O2であることがわかった。また、FPDガラスをHF水溶液、プリント配線板、各種はんだをHF/H2O2水溶液に浸漬・溶解し、電気化学分析の結果、Ag、In、Sb、Cu、Sn、Pbの酸化還元電位(Ag/AgCl参照電極)が、それぞれ0.52 V、ー0.54 V、ー0.047 V、0.175 V、ー0.44 V、ー0.405 Vであった。さらに、各種廃棄物を溶解したHF水溶液、HF/H2O2水溶液から電気分解して得た析出物のX線回折測定から、析出物が結晶性金属のIn、Ag、Cu、Pb、Sb、結晶性金属酸化物のTb2O3、Y2O3、Eu2O3、Eu3O4であることが判明した。ICP-MS法、原子吸光分析法により、廃棄FPD/プリント配線板の同時処理水溶液から電気分解・析出させたIn、Cuの純度が、それぞれ7485 wt.%、72.9 wt%であること、In中にPb、Cu、Sb、Ni、K、Feなど、Cu中にAl、Cr、Fe、Sn、Znなどの不純物を含有することがわかった。各種廃棄物を浸漬・溶解したHF水溶液、HF/H2O2水溶液からの電気分解による有用金属リサイクルの可能性、酸化還元電位差を利用した金属ごとの分離の高い可能性を示したこと、分離メカニズム解明のための基礎データを得たことなどに本研究の意義・重要性がある。本研究は、CRT、FPD、蛍光管、プリント配線板、ICウエハ・チップなどの廃棄物から、これらを分別せず、かつ同時に低温処理(40°C以下)により、In、Ag、Cu、Y、Eu、Auなどの有用金属を分離・リサイクルする技術を確立することを目的としている。平成24年度は、各種廃棄物を浸漬・溶解したHF/H2O2水溶液からの電気分解、および各種酸処理と段階的電気分解による有用金属リサイクルを実証したこと、酸化還元電位差を利用した金属ごとの高い分離性能を実証したこと、分離メカニズム解明のための基礎データの蓄積が進んだことなどの成果があった。また、希土類金属のリサイクル可能性や、リサイクルInのITO薄膜への応用可能性を示したことも成果であった。しかし、CRT、蛍光管、PDPに含有する希土類金属酸化物の回収量が微量であるため、酸化還元電位測定と金属分離については検討が不十分であった。平成23年度は、各種廃棄物を浸漬・溶解したHF水溶液、HF/H2O2水溶液からの電気分解による有用金属リサイクルの可能性、酸化還元電位差を利用した金属ごとの分離の高い可能性を示したこと、分離メカニズム解明のための基礎データを得たこと、液晶ディスプレイ(LCD)パネルガラスからのInと、プリント配線板からのCuについて不純物分析結果を得たことなどの成果があった。
EPIを用いた腹部領域の拡散強調画像に関する研究

上腹部のEPI拡散強調画像から拡散係数(ADC)を算出し臨床応用の可能性について検討した。GE社製のSigna Horizon Ver.5.5を用い、使用コイルは、body coil及びTorso coilを用いた。TR:4000msec,TE:70msec,matrix:128×128,スライス厚:8mm,ギャップ:2mm,撮像時間:4secで10-15スライスを呼吸停止下に撮像した。x軸方向にb-factorを3.9,55,251s/mm^2の3種類に変化させ、SE型single-shot EPIにより拡散強調画像を撮像した。ADCは、StatViewJ-4.5にて算出した。臨床応用の結果は、肝硬変8例の平均ADCは、1.49±0.3×10^<-3>で、正常例よりも有意に低値であった(P<0.05)。肝細胞癌22結節の平均ADCは、3.13±1.02×10^<-3>で、転移性肝癌10結節の平均ADC(2.38±0.33×10^<-3>)よりも高い傾向であったが、有意差は認めなかった(P=0.052)。また、肝癌TAE後経過良好の2結節では、0.54×10^<-3>と低値を示した。肝嚢胞2例の平均ADCは、4.25±2.47×10^<-3>と高値であった。萎縮腎3例の平均ADCは、3.77±0.68×10^<-3>で正常例よりもやや低い傾向がみられたが有意差は認めなかった。腎癌1例のADCは、6.37×10^<-3>でやや高値であった。腎嚢胞9個の平均ADCは、4.48±1.31×10^<-3>で有意差は認めなかった。腎硬塞の1例では、3.05×10^<-3>mm^2/secと低値であった。今回用いたb-factor:251では、組織灌流の影響を加味したADCを求めているためにADCがやや高値を示したものと考えられるが、比較的良好な画像がえられた。single-shot EPIを用いることにより上腹部臓器の拡散強調画像の撮像が可能で、腫瘍の質的診断、肝硬変などの機能評価への臨床応用が期待できる。上腹部領域の拡散強調画像をEPIを用いて撮像し,正常臓器の拡散係数(ADC)を算出して臨床応用の可能性について検討した。MRI装置はGE社製Signa Horizon Ver.5.5を用いた。拡散強調画像は,SE型single-shot EPIを用いてMPG length:40msecとし,MPGの振幅を変化させることにおりb値を変化させた。GE社製のQD phantomを用いて。

TR:4000msec,TE:120msec,スライス厚8mmとし,撮像は、x,y軸方向に各々b値を24s/mm^2,113,380,825,1448に,z軸方向にb値を24s/mm^2,200,569,1130に変化させて拡散強調画像を撮像し,ADCを算出した。正常ボランティア5例について,TR:4000msec,TE:103msec,matrix:128×128,body coilまたはGPFlex coil,スライス厚8mm,15スライスの拡散強調画像を4秒の呼吸停止下に撮像した。x軸方向にb値を9s/mm^2,41,98,236,365に変化させて撮像し,各臓器にROIを設定して信号強度を測定しADCを算出した。結果は,phantom実験でADCはx軸方向で2.20×10^<-3>mm^2/s,y軸方向で2.09×10^<-3>,z軸方向で2.24×10^<-3>とほぼ等しい値がえられた。正常例での検討では,肝の信号が低く,b値を236s/mm^2以上とするとノイズレベルとなった。脾,腎ではb値365s/mm^2においても充分な信号がえられ,腎では髄質と皮質の分離も可能であった。平均ADCは,肝2.51×10^<-3>mm^2/s,脾臓3.74×10^<-3>,腎皮質6.59×10^<-3>であった.従来の報告と比較してADCが高く,更に症例を重ねて検討する必要がある。b値を大きくした場合には画像が劣化するため,b値を100s/mm^2以下に設定すれば,肝でのROI設定も可能であったが,低いb値でADCを計算しているために誤差が大きくなったものと考えられる。以上の結果からSE型single-shot EPIを用いることにより上腹部に拡散強調画像の臨床応用が可能であると考えられた。上腹部のEPI拡散強調画像から拡散係数(ADC)を算出し臨床応用の可能性について検討した。GE社製Signa Horizon Ver.5.5を用い,使用コイルは,body coil及びTorso coilを用いた。TR:4000msec,TE:70msec,matrix:128×128,スライス厚:8mm,ギャップ:2mm,撮像時間4secで10-15スライスを呼吸停止下に撮像した。x軸方向にb-factorを3.9,55,251s/mm^2の3種類に変化させ,SE型single-shotEPIにより拡散強調画像を撮像した。ADCは,StatViewJ-4.5にて算出した。臨床応用の結果は,肝硬変8例の平均ADCは,1.49±0.3×10^<-3>で,正常例よりも有意に低値であった(p<0.05)。肝細胞癌22結節の平均ADCは,3.13±1.02×10^<-3>で,転移性肝癌10結節の平均ADC(2.38±0.33×10^<-3>)よりも高い傾向であったが,有意差は認めなかった(p=0.052)。また,肝癌TAE後経過良好の2結節では,0.54×10^<-3>と低値を示した。肝嚢胞2例の平均ADCは,4.25±2.47×10^<-3>と高値であった。萎縮腎3例の平均ADCは,3.77±0.68×10^<-3>で,正常例よりもやや低い傾向がみられたが有意差は認めなかった。腎癌1例のADCは,6.37×10^<-3>で,やや高値であった。腎嚢胞9個の平均ADCは,4.48±1.31×10^<-3>で有意差は認めなかった。腎硬塞の1例では,3.05×10^<-3>mm^2/secと低値であった。今回用いたb-factor:251では,組織灌流の影響を加味したADCを求めているためにADCがやや高値を示したものと考えられるが,比較的良好な画像がえられた。single-shotEPIを用いることにより上腹部臓器の拡散強調画像の撮像が可能で,腫瘍の質的診断,肝硬変などの機能評価への臨床応用が期待できる。
原子空孔が反発し合う金属は存在するか？

塑性変形・急冷・結晶成長・高エネルギー粒子照射等によって、原子空孔が結晶性材料中に過飽和に導入されると、しばしば空孔同士が会合し、ボイドなどの空孔の集合体を形成し、材料の機械的性質を著しく劣化させてしまう。集合体形成の要因は、空孔どうしの相互作用が引力的であることにある。空孔の引力相互作用は、これまでの材料科学の常識であった。もし空孔どうしの相互作用が反発的であれば、集合体の形成は抑制されると期待される。そのような金属は存在しないのだろうか?本研究では、超高圧電子顕微鏡実験によってタングステン中の空孔の集合過程を調べ、空孔の反発相互作用を支持する結果を得た。集合体形成の要因は、空孔同士の結合エネルギーが正であることにある。正の結合エネルギーは、従来の材料科学の常識であった。もし空孔の結合エネルギーが負であれば、空孔同士は反発しあい、集合体の形成は抑制されると期待される。そのような金属は存在しないのだろうか?本研究では、最近の第一原理計算により空孔の負の結合エネルギーが予測されている高融点金属を対象にして、超高圧電子顕微鏡法により、負の結合エネルギーを実験的に検証することを目的とする。本研究では、超高圧電子顕微鏡を用いて、高エネルギー電子照射による点欠陥生成場における点欠陥集合体形成過程のその場観察を行い、空孔の結合エネルギーの正負に関する情報を得る。平成25年度は、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されている高純度タングステンおよび第一原理計算によって正の結合エネルギーが予測されているタンタルを対象として研究を進めた。タンタルは電子ビーム熔融によって高純度化をおこない、両金属における純度をほぼ同程度にした。広い温度範囲で2 MeV電子照射を行い、空孔集合体の一種であるボイドの形成過程を調べた。融点で規格化した複数の温度において、両材料中におけるボイド密度の点欠陥生成量依存性を比較した結果、実験を行った全ての温度において、タングステンにおけるボイド形成能が顕著に低いことが明らかとなった。また、タンタルにおけるボイド密度の温度依存性は単調であったのに対して、タングステンにおけるそれにはアノマリーが見いだされた。これらの結果は、タングステンにおける空孔挙動の特異性を示すものと考えている。集合体形成の要因は、空孔どうしの結合エネルギーが正であることにある。正の結合エネルギーは、これまでの材料科学の常識であった。もし空孔の結合エネルギーが負であれば、空孔どうしは反発し合い、集合体の形成は抑制されると期待される。そのような金属は存在しないのだろうか?本研究では、最近の第一原理計算により空孔の負の結合エネルギーが予測されている高融点体心立方金属を対象にして、超高圧電子顕微鏡法により、負の結合エネルギーを実験的に検証することを目的とする。高エネルギー電子照射下では、孤立した点欠陥(空孔および自己格子間原子)が生成される。したがって、電子照射下における点欠陥集合体の形成過程は、点欠陥の性質を反映したものになると期待される。本研究では、超高圧電子顕微鏡内での高エネルギー電子照射および点欠陥集合体形成過程のその場観察によって、空孔の結合エネルギーの正負に関する情報を得る。平成24年度は、主に、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されているタングステン及び正の結合エネルギーが予測されているタンタルを対象として、融点の0.3倍程度の温度域において2 MeV電子照射を行い、空孔集合体の一種であるボイドの形成能を調べた。試料には、何れも99.9999%の高純度材を用いた。その結果、タングステンにおいてはタンタルにおいてよりも、生成されるボイドの密度が極めて低かった。この結果は、タングステンにおける空孔の負の結合エネルギーを示唆するものである。

正の結合エネルギーは、従来の材料科学の常識であった。もし空孔の結合エネルギーが負であれば、空孔同士は反発しあい、集合体の形成は抑制されると期待される。そのような金属は存在しないのだろうか?本研究では、最近の第一原理計算により空孔の負の結合エネルギーが予測されている高融点金属を対象にして、超高圧電子顕微鏡法により、負の結合エネルギーを実験的に検証することを目的とする。本研究では、超高圧電子顕微鏡を用いて、高エネルギー電子照射による点欠陥生成場における点欠陥集合体形成過程のその場観察を行い、空孔の結合エネルギーの正負に関する情報を得る。本年度は、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されている高純度タングステンおよび第一原理計算によって正の結合エネルギーが予測されているタンタルを対象とした研究を進めた。昨年度までに、タンタルにおける電子照射誘起ボイドの体積密度の温度依存性は単調であるのに対して、タングステンにおけるそれにはアノマリーが存在することを見いだしている。本年度は、ボイドの体積密度をより精密に計測する方法を検討し、実験データの精密化をおこなった。研究協力者であるフランスCEA-Saclayのグループとの連携によって、実験データにおけるアノマリーを説明し得る空孔の特異挙動が明らかになりつつある。また並列して、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されている合金であるハフニウムータンタル合金の作製および実験を行った。格子欠陥現時点までに、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されているタングステンにおいて、広い温度範囲にわたって空孔集合体であるボイドの形成能が低いという、空孔の負の結合エネルギーを示唆する実験結果を得ることができた。さらに、ボイド密度の電子照射温度依存性におけるアノマリーを見出すことができた。これは、研究開始以前には予期していなかった、空孔挙動の特異性を反映した重要な結果である。体心立方金属における空孔集合体の形態としては、ボイドあるいは転位ループが考えられる。現時点までに、第一原理計算によって空孔の負の結合エネルギーが予測されているタングステンにおいて、ボイドの形成能が低いという実験結果を得ることが出来た。これは少なくとも、第一原理計算の予測に矛盾しないものであり、研究は順調に進展していると言える。これまでにタングステンおよびタンタルについて、融点の0.2-0.35倍程度の温度範囲での高エネルギー電子照射およびボイド形成過程の観測をおこなった。今後は、更に低温にまで測定の温度範囲を拡張する。また、ハフニウム-タンタル等の合金へも実験を拡張する。第一原理計算によって負の結合エネルギーが予測されているタングステンにおいて、低密度であるとは言え、ボイドが形成された理由は、空孔の負の結合エネルギーの絶対値が小さければ、高温域においては熱揺らぎによって空孔同士が会合し得るためであると解釈できる。そのような熱揺らぎの効果を極力抑えるために、より低温域での空孔集合体の形成の可否を調べる。低温域では、点欠陥は転位ループとして集合しやすい。そこで、電子顕微鏡法により極小転位ループの型判定をおこなう技術を開発し、これを適用することにより、上記の目的を達成する。繰越金は、消耗品の購入見通しのずれにより生じた。これは、今年度の消耗品購入に充てる。研究費の使用計画は次のとおりである。
葉緑体RNAエディティングの部位認識に関する研究

1.RNAエディティング部位の解析(1)タバコ(N.tabacum)葉緑体で新たにndhD mRNAに2ヶ所を見出した。これにより、タバコでは合計38ヶ所のエディティング部位が同定されたことになり、高等植物では最も多い。(2)タバコの祖先種であるN.sylvestrisとN.tomentosiformisについても再調査したところ、ndhD mRNAの第1部位のACGからAUG開始コドンをつくるエディティングが後者だけは見られなかったが、栽培条件を変えると一部エディティングされることを見出した。次いで、タバコ葉緑体in vitro翻訳系でndhD mRNAの翻訳活性の解析を進めた。2.in vitroRNAエディティング系の改良:蛍光ダイデオキシヌクレオチドを用いるアッセイ法を更に改良し、より高速・簡便な系を確立した。3.RNAエディティングのシス配列の同定上記の系を用いて、タバコの5種のndh mRNAの19部位のエディティング活性を測定した。ndhF mRNAのシス配列が、離れた2ヶ所の-1から-15の15ヌクレオチドと上流の-36から-40の5ヌクレオチドと同定した。これは2種のトランス因子が関与している可能性を示唆する。4.RNAエディティングの新しいトランス因子の同定蛍光標識したmRNAを使用する簡便法の開発を試みたが、同定にまでは至らなかった。5.部位認識因子の解析psbE mRNAエディティングの56kDaトランス因子をタバコ葉10kgより単離し、その部分一次構造を決定したが、既知の配列と一致するものは無かった。1.RNAエディティング部位の解析:タバコ(N.tabacum)葉緑体で34ヶ所のエディティング部位以外に、ndhG mRNAに1ヶ所新たに実験的に同定した。この解析中に偶然前方に新しいエディティング部位を発見した。この部位は進化的にアミノ酸を保存しない方向に変わるもので、従来の予測法では見出せないものであった。この発見は、RNAエディティングがゲノムDNAの修復をするという従来の考えも否定するもので、RNAエディティングの意義を考え直すものである。蛍光ダイデオキシヌクレオチドを用いる活性アッセイ法を更に改良し、より高速・簡便な系を確立した。この方法はエディティング活性を定量的に測定できるものである。3.RNAエディティングのシス配列の同定:タバコの5種のndh mRNAの19ヶ所のエディティング部位につき、新たに改良を加えた高速アッセイ法で測定したところ、部位によりエディティング活性にかなり変動が見られることを明らかにした。このうち活性の強いndhB mRNAの部位2につきシス配列の解析をした。エディティング部位前方の-6から-10の5ヌクレオチドがエディティングに必須であることを示した。しかしこのモチーフと同じ配列はタバコ葉緑体ゲノム上に100ヶ所以上あるので、他にも必要は配列が存在するはずである。4.RNAエディティングの新しいトランス因子の同定:ndhB mRNAの部位2では離れた領域にもシス配列の存在が予測されたため、対応するトランス因子の同定に先立ち、新しい別のシス配列の同定を進めている。5.部位認識因子の単離:psbE mRNAの56kDa因子を、タバコ緑葉10kgより葉緑体を単離し大量精製を試み、ほぼ単一のタンパク質を得た。1.RNAエディティング部位の解析a)タバコ(N.tabacum)葉緑体で同定したRNAエディティング部位を基準に他の植物の部位を比較するなどして、新たにndhDmRNAに2ヶ所を見出した。これにより、タバコでは合計38ヶ所のエディティング部位が同定されたことになり、現在のところ高等植物では最も多い。b)タバコの祖先種であるN.sylvestrisとN.tomentosiformisについても再調査したところ、ndhD mRNAの第1部位のACGからAUG開始コドンをつくるエディティングが後者だけは見られなかったが、栽培条件を変えると一部エディティングされることを見出した。

次いで、タバコ葉緑体in vitro翻訳系でndhD mRNAの翻訳活性の解析を進めた。2.RNAエディティングのシス配列の同定アイソトープを用いないin vitro RNAエディティングアッセイ系を用いてndhF mRNAエディティングのシス配列が、離れた2ヶ所にあることを見出した。エディティング部位の直前の-1から-15の15ヌクレオチドと上流の-36から-40の5ヌクレオチドである。これは2種のトランス因子が関与している可能性を示唆する。3.RNAエディティングの新しいトランス因子の同定4.部位認識因子の解析psbE mRNAエディティングの56kDaトランス因子の部分一次構造を決定したが、既知の配列と一致するものは無かった。
原発性胆汁性肝硬変の成立・進展機構に関する研究

原発性胆汁性肝硬変(PBC)生検肝組織において細胞骨格系であるmicrofilament(MF)および中間径filament(IF)の分布を透過型電顕で観察するとMFは胆管上皮細胞内,特に管腔側形質膜直下に存在し、IFは胆管上皮細胞質内に豊富に認められた。蛍光抗体間接法によるPBC患者血清中抗actinfilament(AF),抗IF抗体の検討では,T_3およびPtK_2培養細胞内に各々線維状の特異蛍光が認められ,PBC患者血清は全例に抗IF(cytokeratin:CK),抗AF抗体陽性を示した。この抗CK抗体はCK1(52kD),CK2(45kD)のsubclassに分けられた。それぞれCKsubclassに対するモノクロン抗体を作製し,PBC患者血清中の抗CK1,CK2抗体価をsand wich inhibtionELISA法を用いて測定すると,健常者,他の肝疾患感謝血清の抗体価に比して有意に高値を示し,特に,抗CK1抗体価は胆管破壊(CNSDC)の最も顕著なstageI-IIで高力価を,stageIVで低下を認め,抗CK1抗体価は胆管破壊を反映していると推定された。症候性(S-),無症候性(a-)PBC患者の長期ursodeoxy cholic acid(UDCA)経口投与前後における抗CK1,抗M2抗体価はs-,a-PBCの両者で投与前値に比して経時的に低下を示し,長期UDCA療法の免疫系への関与が示唆され,特に胆管破壊の結果産生された抗CK1抗体価の低下は病態是正を表わすと考えられた。次に、PBCにおける自己免疫異常と胆管破壊機構の関係を免疫酵素抗体法にて検討した。細胞間接着分子であるICAM-1が,特にONSDCの所見を示す中等大胆管上皮細胞形質膜上に強く表出され,同時に胆管上皮細胞内にはHLA-DRの存在が認められた。さらに、ICAM-1の表出される胆管周囲にCD4あるいはCD8陽性かつLFA-1陽性のリンバ球が浸潤し,一部は胆管上皮細胞に接着しており,活性化された両リンバ球が細胞表面のLFA-1を介してHLA-DR陽性の胆管上皮細胞形質膜上に表出されたICAM-1と特異的に接着し,PBC胆管破壊機構に深く関与すると推察された。原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者肝組織の免疫酵素抗体間接法による観察では、慢性非化膿性破壊性胆管炎(CNSDC)の所見を示す胆管周囲の浸潤リンパ球の多くはLeu 2a陽性細胞(cytotoxic/suppr essor T cell)に相当した。さらに、主要組織適合抗原class IIであるHLAーDRの発現を同様な方法により検索すると、胆石患者の生検肝組織においてHLAーDRは肝類洞内皮細胞内に認められたが、胆管上皮細胞内にはみられなかった。

一方、PBC患者の生検肝組織においては肝類洞内皮細胞の他に門脈域内の胆管上皮細胞内にHLAーDRの局在を示すperoxidase陽性反応が観察された。生検肝組織において細胞骨格系であるmicrofilments(MF)及びintermedaiate filaments(IF)の分布を透過型電顕で観察するとMFは毛細胆管周囲に存在し、胆管上皮細胞内では特に管腔側形質膜直下に存在するが、IFは胆管上皮細胞内に豊富に認められる。actinをブタ子宮筋から、cytokeratinを継代培養細胞株PtK_2から抽出、後者をさらにSDSーpolyacrylamide gelelectrophoresisにより52kDのCK1と45kDのCK2に分け、各々Balb/cマウスに免疫し、骨髄腫細胞株P3U1と融合させhybridomaを作製、単クロ-ン抗体を作製した。これらの単クロ-ン抗体を用い生検肝組織を酵素抗体間接法により観察すると、actinは既述のMFの分布に一致して存在し、CK1はIFの局在に一致して胆管上皮細胞内に豊富に存在、CK2は肝細胞内に少量存在した。PBC生検肝組織においてもCK1の局在を示すperoxidase陽性反応が胆管上皮細胞に限局して認められた。以上より、PBCにおいては胆管上皮細胞に表出されるHLAーDRをcytotoxic Tcellが認識し、胆管破壊の引き金になると考えられる。胆管破壊に引き続き胆管上皮細胞の最大構成分であるIF、すなわちCK1が細胞外に流出し、macrophageあるいはB cellが異常に反応し、CK1に対する自己抗体が形成され、これが免疫複合体を形成し、PBCの進展機構に関与することが推定される。平成3年度は原発性胆汁性肝硬変(primary biliary cirrhosis:PBC)における胆管破壊機構解明の基盤となるactin filaments(AF)及びcytokeratin(CK)の亜分画CK1(52kD),CK2(45kD)に対する単クロ-ナル抗体を作製し,PBC患者血清中の抗AF抗体及び抗CK1,CK2抗体価を半定量的に分析するためのELISA法を確立し,各抗体価をPBCの病期別に測定した。その結果,抗CK1抗体価は早期のPBCstageI,II期がstageIII,IV期に比して高値であることが証明され,PBC病期診断にきわめて有用である。また,抗CK1抗体価を160倍希釈血清を用い他の肝疾患,急性肝炎,慢性肝疾患(代償期,非代償期),自己免疫性肝炎及び健常者の血清を用いて測定したところいずれも有意な上昇を認めなかった。以上から,高力価の抗CK1抗体の存在はPBCに特異的と考えられ,胆管破壊を反映しているものと推測された。一方,抗CK2抗体価は抗CK1抗体価と同様PBC患者血清に対して,他の肝疾患に比して高い陽性率を示すが,その抗体価はstageI,IIの病初期の抗CK1抗体価ほどの高力価は認めなく,病期別に有意な変化を示さなかった。PBC患者血清中に出現する抗AF抗体は,胆管形質膜の障害の結果流出した胆管上皮細胞内のAFに対して形成される可能性があるが,抗AF抗体価は特にPBC病期との相関は得られていない。PBCの病理組織学的特徴である慢性非化膿性破壊性胆管炎(CNSDC)における胆管上皮細胞とリンパ球サブセット,主要組織適合抗原さらにはICAM(intercellular adhesion molecule)ー1の局在との関係を追求した。すなわち,各々単クロ-ナル抗体を用いて,PBC患者生検肝組織を免疫酵素抗体間接法で観察した結果,胆管上皮細胞に密接するリンパ球はLeu2a陽性細胞(cytotoxic/suporessor Tcell)であり,胆管上皮細胞質内及び形質膜上に主要組織適合原classIIのHLAーDRが存在すると共に胆管上皮形質膜上にICAMー1が同時に表出されることが証明された。
抗酸化食品因子の生物活性に関わる投与量依存性の解析

食品由来の抗酸化性物質の摂取は各種の生活習慣病のリスクを低減するものと考えられている。しかし,1990年代に発表されたβ-カロテンの介入試験での否定的な結果及びその後の多くの研究から,抗酸化性物質の過剰投与はプロオキシダント作用により生体に障害を及ぼす危険性があることを示唆している。したがって,食品由来抗酸化性物質を効率的で安全に利用するためには,特に,摂取量あるいは生体内濃度に依存した生物活性の発現を解析する必要がある。本年度は培養細胞に高濃度のカロテノイドを蓄積させるためのカロテノイド可溶化法を開発し,細胞に蓄積されたカロテノイドの抗酸化性を高濃度領域まで範囲広げて解析した。液中乾燥法によりDMEM培地(10%牛胎児血清を含む)に80μMまでの高濃度のカロテノイドを可溶化する方法を構築した。テトラヒドロフラン(THF)に溶解させたカロテノイドをDMEM培地に分散した後,減圧下で細胞毒性を示すTHFを0.001%以下までに留去した。本法により高濃度のβ-カロテン,ルテイン,α-トゴフェロールのDMEM培地への再現性の良い可溶化が可能になった。得られた高濃度カロテノイド培地をヒト肝癌由来HepG2細胞とインキュベーションすると,カロテノイドが高濃度に集積し,ヒト肝臓カロテノイド濃度の約5倍以上のレベルに達することが分かった。このようにカロテノイドを集積させた細胞をtert-ブチルヒドロペルオキシドで酸化ストレスを負荷し脂質過酸化に対するカロテノイドの抗酸化性を調べた。β-カロテンは濃度依存的に抗酸化性を示し,調べた濃度範囲及び酸化ストレス負荷条件ではプロオキシダント作用は認められなかった。しかし,高濃度のカロテノイドは細胞障害を引き起こすことを見出した。その原因及びプロオキシダント作用との関連は不明であり,今後この点をさらに解析することによって,高濃度領域での生体影響を明らかにする必要がある。本年度は培養細胞系におけるカロテノイド濃度が抗酸化性に与える影響について解析を行った。培養i細胞としてはヒト肝癌由来HepG2細胞を用い,過酸化水素,メナジオンtert-ブチルヒドロペルオキシド(BHP)を酸化ストレス誘導剤として用いた。フルオレセイン誘導体の蛍光を利用した細胞内過酸化物の測定及びTBARSの蛍光HPLC分析にる脂質過酸化物の測定によって酸化をモニターした。水系に活性酸素を発生させる過酸化水素やメナジオンによって誘導される酸化ストレスに対してはカロテノイドは抗酸化性を示さず,より疎水性が高いBHPによる酸化ストレスに対しては抗酸化性を示した。また,ルテインはβ-カロテンより高い抗酸化性を示したことから,BHPが生体膜の表層に近い部位で酸素ラジカルを生成し,極性の高いルテインが効率的にラジカルを捕捉したものと考えられた。ルテインは10μM程度の濃度までは濃度依存的に抗酸化性を示したが,それ以上の濃度は培地への可溶化が困難なため検討できなかった。高濃度カロテノイドの適切な可溶化法を今後設定する必要がある。