hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオン液体中における光化学反応のシンクロトロン光による構造解析に基づく高効率化

イオン液体として硝酸エチルアンモニウムを,光増感剤としてテトラスルホナートフェニルポルフィリン(TPPS)を用い,光増感反応中の凝集体構造について,シンクロトロン放射光を用いた小角X線散乱(SAXS)および紫外可視吸収スペクトルの測定を行い,得られた結果について理論的な解析を行った.解析の結果,温度および硝酸エチルアンモニウム中のプロトンイオン濃度がTPPS凝集体の構造に大きく影響することが判明したため,温度を制御可能なセルを作成し,イオン液体についても種々pHに調整しながら合成を行った.その結果,常温低pHにおけるTPPSは直径50nmの球状の凝集体を形成しているのに対し,常温高pHにおける凝集体の構造は直径14nm,長軸40nmの棒状であることがSAXSの結果より明らかとなった.また温度上昇に伴い,いずれの凝集体も単量体の比率が上昇するとともに大きさが数十%程度小さくなる.これらの複雑な構造変化はこれまでの水,有機溶媒系では見られなかったイオン液体固有の現象である.また温度変化に伴う構造変化にヒステリシスがある点でも特徴的であり,構造形成にイオン液体中のイオン種が関与していることを示唆している.現状では得られた構造と光増感反応の効率との比較ができていないため,硝酸エチルアンモニウム中における光増感反応の高効率化にいずれの構造が寄与しているのか明らかではない.現在,各種条件で光増感反応の速度定数を算出し,イオン液体中で高効率で光増感反応が進行するメカニズムを解析中である.イオン液体中におけるポルフィリン類の光増感反応と凝集構造との相関をを解析するため,イオン液体の種類,ポルフィリンの官能基を変えてそれぞれ,1)小角X線散乱による凝集体の構造解析,2)紫外可視吸収スペクトルによる解析,3)光照射に伴う1重項酸素発生量に関する実験を温調セル中10°C60°Cについて行った.使用したイオン液体で最もカチオンのアルキル鎖の短い硝酸エチルアンモニウム(EAN)と,アニオン性のポルフィリンTPPSに関して,光増感反応による1重項酸素発生量の温度依存性を計測したところ,温度が上昇するにつれて光増感反応の効率が大幅に減少した.一方,アルキル鎖の長いイオン液体に関しては,このような依存性が見られなかった.紫外可視吸収スペクトルの測定,および小角X線散乱の測定においても,EANとTPPSの組み合わせの際にスペクトルの変化が観測され,いずれも低温において会合体が形成され,高温において会合体が消失ないしサイズが減少するという結果を示唆するものであった.会合体の構造を解析するために各種モデル構造と散乱パターンをフィッティングした結果,10°C40°Cにおいては直径12-15 nmの円盤状の構造を形成していることが明らかとなった.アルキル鎖が長いイオン液体においては,このような構造形成が観測されず,会合体の構造形成にはイオン液体のカチオン種が寄与していることが予想される.以上の結果を総合すると,ポルフィリンのアニオン性置換基とイオン液体のカチオン種の電荷相互作用が会合体の形成に寄与している可能性が高い.イオン液体中,特にEAN中で光増感反応が顕著に進行する理由として,会合体の形成によりポルフィリンの運動が制約され,励起状態の寿命が伸びている可能性が示唆される.今後励起寿命の測定などにより上記仮説を検証する予定である.
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた安全・安心な細胞治療を行うための基盤整備研究

樹立骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を使用して、ES細胞用無血清培地にて検討を行った。MSCのマーカー遺伝子であるCD90 (Thy-1)、CD105 (Endogrlin)および未分化ヒトES細胞で発現が認められる遺伝子Oct3/4、Nanogは、POWEREDBY10あるいはhESF7培地にFGF-1、FGF-2、LIF、アクチビンAあるいはヘパリンをそれぞれ添加したいずれの条件のMSCにおいても発現が認められた。また、hESF9およびhESF10培地で培養したMSCでも同様に発現が認められた。MSCの未分化性の指標となる可能性が示唆された。顎骨より採取した骨髄液中に存在する骨髄細胞を含む骨髄液を無血清培地にて初代培養を試みた。先行研究で開発したLekemia inhibitory factor (LIF)を除去したマウスES細胞用に開発された無血清培地ESF7にFibroblast growthfactor - 2 (FGF-2)およびヘパリンを添加した培地を用いたところ、十分な増殖能を有する骨髄細胞を培養することが可能であった。詳細な培養条件の検討は、臨床試料を用いた初代培養では難しいことから、樹立骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を使用して検討を行った。MSC細胞株についてヒトES細胞用無血清培地からFGF-2およびヘパリンを除いたhESF7培地を用いてFGF-1,FGF-2、LIF、TGF-β1、アクチビンA、ヘパリンの細胞増殖能への影響を検討した結果、FGF-2、TGF-β1およびヘパリンがMSCの細胞増殖に関与することが明らかとなった。これらは、感染因子の混入防止としての空調管理をはじめ、種々の機器管理、個別化したインキュベータの使用による徹底した管理体制のもとで研究を行った。管理体制、培養技術は年々向上しており、充分な細胞の品質管理が可能であった。MSCのマーカー遺伝子であるCD90 (Thy-1)、CD105 (Endogrlin)および未分化ヒトES細胞で発現が認められる遺伝子Oct3/4、Nanogは、POWEREDBY10、あるいはhESF7培地に、FGF-1、FGF-2、LIF、TGF-β1、アクチビンAあるいはヘパリンをそれぞれ添加した、いずれの条件で培養を行ったMSCでも発現が認められた。これらは、感染因子の混入防止とし徹底した管理体制のもとで研究を行った。顎骨より採取した骨髄液中に存在する骨髄細胞を含む骨髄液をESF基礎培地のみ、基礎培地に基本因子を添加したESF6培地、ESF6培地にLIFを添加したマウスES用無血清培地ESF7、あるいは、ESF6培地にFGF-2とヘパリンを添加したESF8培地と混合し、初代培養を試みた。先行研究で開発したマウスES細胞用無血清培地ESF7に、FGF-2およびヘパリンを添加した培地を用いたところ、十分な増殖能を有する骨髄細胞を培養することが可能であった。この研究では、既に開発したhESF9をもとに、無血清培養条件の検討を行った結果、FGF-2、TGF-β1およびアスコルビン酸は濃度依存的にMSCの細胞増殖を促進した。そこで、hESF9にTGF-β1を加えたhESF10培地と血清を含む指定維持培地POWERDBY10間での各種遺伝子発現を比較検討した。その結果、hESF10培地ではヒトES細胞の未分化マーカーであるNanog、Oct3/4、Sox2の発現はPOWERDBY10よりも高く、また、hMSCマーカーであるCD90、CD105、integrin β1およびtype I collagenも高発現を認めた。一方、骨分化マーカーであるbone sialoprotein、osteopontin、osteocalcin、osteonectinの発現は、POWERDBY10に比べて低いことがわかった。以上のことから、hESF10は、未分化性と多分化能を維持したhMSC細胞の増殖を促進していることが示唆された。

また、空調管理をはじめとした内部環境、種々の機器管理を徹底し、施設面を含めた環境整備に努めた。さらに、培養課程での管理体制、再現性の確保、培養技術の向上をはかり、細胞の品質管理に注意して対応した。間葉系骨髄幹細胞の未分化状態を維持する培養条件の確立については、種々の遺伝子発現、細胞の増殖能についての検討を重ねているが、無血清培養下での条件ではまだまだ満足できる状況とは言えない。管理体制、培養技術は向上しており、細胞の品質管理が可能である体制ではあるものの、今後幹細胞を利用した再生医療を実施するためには、抗原性、病原性を持つ感染因子の除去や骨髄由来幹細胞におけるin vitro、in vivoでのさらなる遺伝子発現、分化制御機構、分化制御機構、形質転換を検討する必要があり、癌遺伝子、癌抑制遺伝子の発現を解析し、ヌードマウスを用いて造腫瘍性の有無を検討する必要がある。施設面では、環境整備や細胞の品質管理については、徹底したリスク管理を追求していかければいけない。間葉系骨髄幹細胞の未分化状態を維持する培養条件の確立に関しては概ね目途がたってきているように思われるが、まだまだ充分満足できる状況とは言えない。幹細胞を利用した再生医療を実施する上で、ウィルスやマイコプラズマ等の混入、汚染防止に対する品質管理として血清、細胞養液、培養細胞における細菌・真菌培養検査、エンドトキシン定量およびマイコプラズマ検査を行うことによる抗原性、病原性を持つ感染因子の検討および骨髄由来幹細胞におけるin vitro、in vivoでの分化制御機構、造腫瘍性を検討する必要がある。また、施設面を含めた環境整備や細胞の品質管理については現状以上に引き続いて徹底したリスク管理が求められる。幹細胞を利用した再生医療を実施する上で、細胞の品質管理、倫理規定の標準化および細胞の機能を評価するシステムを確立することは必要不可欠である。今後は、抗原性、病原性を持つ感染因子の検討およびin vitro、in vivoでの分化制御機構、形質転換を検討して、癌遺伝子、癌抑制遺伝子の発現を解析し、ヌードマウスを用いて造腫瘍性の有無を検討する必要がある。幹細胞を利用しての将来の再生医療が行われるためには、ヒト骨髄由来幹細胞を骨髄幹細胞マーカーの発現、細胞未分化マーカーを用いた未分化性を検討し、その分化制御機構を解明し、分化をコントロールする必要がある。従ってヒト骨髄由来間葉系幹細胞の分化能および増殖能について、様々な角度から検討する。また、施設面の環境整備、細胞の品質管理については、現状以上を目指して徹底的に行っていく。幹細胞を利用した再生医療を実施する上で、感染因子の混入防止、幹細胞の分化・増殖を制御し、実際の臨床応用で細胞治療に使用される細胞の安全性の確保、細胞の品質管理、倫理規定の標準化および細胞の機能を評価するシステムを確立することが必要不可欠である。今後は、抗原性、病原性を持つ感染因子の検討および骨髄由来幹細胞におけるin vitro、in vivoでの分化制御機構、造腫瘍性を検討する。また、幹細胞を利用した再生医療を開発する上で、骨髄由来幹細胞を特定の細胞に分化・誘導するためには、その分化制御機構を解明し、分化をコントロールする必要がある。そこでヒト骨髄由来間葉系幹細胞の分化能および増殖能の検討を行っていく。
X線CT画像を用いた顎関節の補綴学的三次元再構築と顆頭位診断への評価

顎関節骨形態の定量的評価や機能的適合性に関する情報を得るために,コンピュータ断層撮影(CT)を利用した測定法を開発し,これを顆頭位の臨床診断に繋げることを目的とする。そこで,CT画像による顎関節部の再構築像から関節空隙を三次元的に計測して,顎関節の骨形態と同時に顆頭全体の位置を表示し,さらに歯の要素の情報の一つとして咬合平面を画像内に組み入れることで,より臨床的に,顎関節の視認性を高める方法について検討した。結果の概要を,以下に示す。1.考案したCT撮影治具を用いることで,CT画像内に補綴学的基準面を設置することが可能になった。したがって,一回の軸位断面撮影CT検査で,設定した基準面に対応した関節窩の位置および,これに対する顆頭の三次元形態を左右両側同時にとらえることができて,生体への負担や侵襲を軽減し得た。2.近接面距離分布図を作製することで,顆頭形態と同時に,顆頭の相対的位置および,関節空隙量を視覚的に評価することができた。3.健常有歯顎者の咬頭嵌合位における関節空隙量(顆頭-関節窩間距離)は,2-3mmが顆頭全体の約44%と最も広い範囲を占め,次いで1-2mmが34%の範囲を占めた。関節空隙量が1mm以下の部位は,2%と小さい。4.視覚的に表示した近接面距離分布図からみると,個体差はあるが,顆頭は下顎窩のほぼ中央に位置する。5.これらの臨床的に有益と考える情報を含む顎関節の三次元構築画像を,特別の処理装置を用いないで,汎用パーソナルコンピュータで作製することができた。6.以上から,本法は顆頭形態および顆頭位を臨床的に評価するうえで極めて有用だといえる。コンピュータ断層撮影(CT)を利用して,顎関節骨形態の定量的評価や機能的適合性に関する情報をとらえ得る測定法を開発し,これを顆頭位の臨床診断に繋げることを目的とする。顎関節CT画像に補綴学的に重要な基準面を設けることができるように,まずCT撮影治具を考案し,次いで基準面に対応した生体の両側顎関節骨形態を三次元的に再構築し、関節窩に対する顆頭の位置を再現して,顆頭位の情報を視覚的に且つ定量的にとらえた。1.CT撮影治具を用いることにより,CT画像中に,補綴学的基準面を設定することが可能になった。したがって,一回のCT(軸位断面撮影)検査で,設定した基準面に対応させた関節窩の位置と,これに対する顆頭の三次元形態を両側同時にとらえることが可能になり,生体への負担や侵襲を軽減することができた。2.乾燥頭蓋骨を用いて,三次元座標計測装置で実測した顆頭の形状と,CT画像から再構築した顆頭形態とを比較した結果,再構築誤差は0.5mm以下であった。3.顆頭-関節窩間距離を1mm間隔で5段階に区分して,各区分ごとに,顆頭における面積を算出し,いわゆる関節空隙量の分布図をCRT上に抽出する方法を案出した。4.健常有歯顎者の咬頭嵌合位における顆頭-関節窩間距離が5mm以下の部位の面積は,平均284mm^2であった。そのうち,3mm以下の顆頭-関節窩間距離を示した部位の面積は平均81%を占めた。一方,関節空隙量が1mm以下の部位は平均で2%を占めるに過ぎなかった。

そこで、CT画像による顎関節部の再構築像から関節空隙を三次元的に計測して,顎関節の骨形態と同時に顆頭全体の位置を表示し,更に歯の要素の情報の一つとして咬合平面を画像内に組み入れることで,より臨床的に,顎関節の視認性を高める方法について検討した。結果の概要を,以下に示す。1.考案したCT撮影治具を用いることで,CT画像内に補綴学的基準面を設定することが可能になった。したがって,一回の軸位断面撮影CT検査で,設定した基準面に対応した関節窩の位置および,これに対する顆頭の三次元形態を左右両側同時にとらえることができて,生体への負担や浸襲を軽減した。2.近接面距離分布図を作製することで,顆頭形態と同時に,顆頭の相対的位置および,関節空隙量を視覚的に評価することができた。3.健常有歯顎者の咬頭嵌合位における関節隙量(顆頭-関節窩間距離)は,23mmが顆頭全体の約44%と最も広い範囲を占め,次いで12mmが34%の範囲を占めた。関節空隙量が1mm以下の部位は,2%と小さい。4.視覚的に表示した近接面距離分布図からみると,個体差はあるが,顆頭は下顎窩のほぼ中央に位置する。5.これらの臨床的に有益と考える情報を含む顎関節の三次元再構築画像を,特別の処理装置を用いないで,汎用パーソナルコンピュータで作製することができた。6.以上から,本法は顆頭形態および顆頭位を臨床的に評価する上で極めて有用だといえる。
神経活動制御におけるＨＮＫ－１を中心としたＮ型糖鎖機能の解析

近年、脳の高次機能に糖鎖が深く関わることが次々に示され、神経系における糖鎖研究の重要性が増している。本研究では神経可塑性の調節に重要な役割を持つHNK-1糖鎖、およびシナプス可塑性調節に中心的な役割を担うAMPA受容体に発現するN型糖鎖を中心に解析を行った。その結果、AMPA受容体上のN型糖鎖が、その細胞表面発現量、細胞表面上での側方拡散の調節などに関わることを明らかにした。また、ペリニューロナルネット上に存在する新規HNK-1糖鎖を同定し、神経可塑性調節に重要なコンドロイチン硫酸鎖の合成を制御していることを明らかにした。今年度は主に以下の成果が得られた。1)HNK-1糖鎖の発現制御機構の解析HNK-1糖鎖発現は厳密にコントロールされており、その発現制御機構の解明はHNK-1糖鎖の機能を理解する上で重要となる。そこで本年度はHNK-1糖鎖の内部構造としてN-アセチルラクトサミン(Galβ-1-4GlcNAc)に着目して研究を行った。脳内ではいくつかのガラクトース転移酵素が存在するにもかかわらず、B4GalT2の遺伝子欠損マウスにおいて脳内でのHNK-1糖鎖がほとんど消失していることを明らかにした。そこで、何故B4GalT2の遺伝子欠損マウスでHNK-1糖鎖の消失が引き起こされるのかについて解析した結果、このB4GalT2が脳内でGlcAT-Pと分子複合体を形成していることが明らかとなった。またその相互作用は非常に特異的であり、B4GalTファミリー内で最も相同性の高いB4GalT1とは相互作用しないことも明らかとなった。以上の結果から、B4GalT2とGlcAT-Pとの特異的な分子複合体がHNK-1糖鎖合成に重要であると考えられた。2)N型糖鎖によるシナプス可塑性の制御機構AMPA受容体はGluA14のサブユニットからなるヘテロ四量体として存在し、シナプス後膜での量的変化がシナプス可塑性の調節に重要であると考えられている。そこで、今年度はAMPA受容体の主要な構成成分であるGluA1およびGluA2についてそのN型糖鎖付加部位に変異を加えた変異体を作製し、細胞表面発現量に関して解析を行った。その結果、GluA1のN末から1番目の糖鎖付加部位、4番目の糖鎖付加部位に変異を加えると細胞表面発現量が大きく減少することが明らかとなった。GluA2ではN末から2番目の糖鎖付加部位の変異により細胞表面発現量が減少した。従って、特定のGluA1やGluA2の特定のN型糖鎖が細胞発現調節に関与している可能性が示された。1) HNK-1糖鎖に関する機能解析HNK-1糖鎖は特徴的な硫酸化グルクロン酸を糖鎖末端に有し、その生合成にはグルクロン酸転移酵素(GlcAT-P)が主に関与している。その遺伝子欠損マウスでは脳内の大部分のHNK-1糖鎖が消失し、スパイン形成異常やシナプス可塑性の低下を伴う記憶学習能力の低下が観察された。現在までの研究により一部の神経機能異常はシナプス後部で機能するAMPA型グルタミン酸受容体GluA2に存在するN型糖鎖上のHNK-1糖鎖に起因することが明らかとなっている。本年度はHNK-1糖鎖の関与する脳の高次機構調節機構の全体像を明らかにすることを目的として、O型HNK-1の主なキャリア分子の同定および糖鎖構造の解析を行った。その結果、O型HNK-1の主なキャリア分子がホスファカンであることを同定した。また、その糖鎖構造を質量分析により解析した結果、マンノースを還元末端に持つ、いわゆるO-マンノース型糖鎖上に存在することが明らかとなった。2) N型糖鎖によるシナプス可塑性の制御機構に関する研究AMPA受容体はGluA14のサブユニットからなるヘテロ四量体として存在し、シナプス後膜での量的変化によりシナプス可塑性が調節されていると考えられている。本年度は実際の脳内に存在するAMPA受容体の主要な構成サブユニットであるGluA1を精製し、それぞれの糖鎖付加部位ごとにどのような糖鎖が発現しているのかを質量分析で解析した(部位特異的な糖鎖構造の解析は川崎博士との共同研究)。その結果、N末端に近い側の糖鎖付加部位には主に高マンノース型糖鎖が存在し、リガンドとの結合部位に近い側の糖鎖付加部位には複合型糖鎖が存在していることを明らかにした。1)AMPA型グルタミン酸受容体に関しては、実際の脳内に存在する受容体の主要な構成サブユニットであるGluA1およびGluA2を精製し、それぞれの糖鎖付加部位ごとにどのような糖鎖が発現しているのかを質量分析で解析した。その結果、糖鎖付加部位ごとに特徴のある糖鎖の存在が明らかとなった。2)NMDA型グルタミン酸受容体はAMPA型受容体と同様興奮性のシナプス後部に集積し、シナプス可塑性調節に関与する重要な分子である。NMDA型受容体の構成サブユニットの1つであるGluN1上のN型糖鎖には、通常の膜タンパク質には観察されない高マンノース型糖鎖が発現した。そこでこの高マンノース型糖鎖の付加制御に関与する部位を調べたところ、C末端領域に存在していることが明らかとなった。

さらにGluN1のC末端領域を用いてYeast Two-hybrid法を用いて相互作用分子を探索し、候補となる分子を得た。3)HNK-1糖鎖と同様神経系で特徴的な発現様式を示すLewis X糖鎖抗原の発現制御機構について解析を行った。マウス脳において、Lewis X抗原はO-マンノース型糖鎖上に存在し、その主要なキャリアータンパク質は受容体型フォスファターゼRPTPβとそのスプライシングバリアントphosphacanであることを見出した。またその生合成にはガラクトース転移酵素B4GalT2が関与していることを明らかにした。本年度は以下を中心に研究を行った。1)AMPA型グルタミン酸受容体上のN型糖鎖に関する研究に関しては、GluA2の糖鎖付加部位変異体を用いて細胞表面発現量およびHNK-1糖鎖発現に深く関与する糖鎖付加部位を同定し、その結果をPLOS ONEに報告した。また、前年度明らかにしたGluA1やGluA2上のフコースを持つ複合型糖鎖の機能に関して解析を行い、GluA1とGluA2の相互作用の調節に重要であることを明らかにした。従って、AMPA受容体を構成する主要なサブユニットであるGluA1とGluA2の糖鎖はAMPA受容体の機能発現に深く関与していることが示された。2)ペリニューロナルネットに存在するHNK-1糖鎖抗原に関しては、HNK-1糖鎖の合成に関与していると考えられているGlcAT-PやGlcAT-Sではなく、プロテオグリカンの橋渡し4糖構造の合成に関与するGlcAT-Iがその合成に関与していることを明らかにした。また、そのキャリアー分子がAggrecanであることを同定し、実際にAgrecan上にHSO3-GlcA-Gal-Gal-Xylという硫酸化四糖構造が存在することを質量分析により確認した。この新たに見出されたHNK-1糖鎖抗原の役割として、Aggrecan上のコンドロイチン硫酸鎖の伸長を阻害する可能性を示す結果を得た。これらの結果についてはPLOS ONEに報告した。近年、脳の高次機能に糖鎖が深く関わることが次々に示され、神経系における糖鎖研究の重要性が増している。本研究では神経可塑性の調節に重要な役割を持つHNK-1糖鎖、およびシナプス可塑性調節に中心的な役割を担うAMPA受容体に発現するN型糖鎖を中心に解析を行った。その結果、AMPA受容体上のN型糖鎖が、その細胞表面発現量、細胞表面上での側方拡散の調節などに関わることを明らかにした。また、ペリニューロナルネット上に存在する新規HNK-1糖鎖を同定し、神経可塑性調節に重要なコンドロイチン硫酸鎖の合成を制御していることを明らかにした。今年度は主に以下に示す成果が得られた。1)N型糖鎖によるシナプス可塑性の制御機構AMPA型グルタミン酸受容体はGluA14のサブユニットからなるヘテロ四量体として存在し、シナプス後膜での量的変化がシナプス可塑性の調節に重要であることが知られている。シナプス後膜での量的な変化には、細胞内から細胞表面への輸送、細胞表面での側方移動、細胞内への取り込みなどの様々な過程で調節が行われている。今年度は細胞表面上での側方移動に糖鎖がどのように関与するかを調べる目的で、まずAMPA受容体の代表的な構成サブユニットであるGluA1, GluA2の細胞表面上での動きについて領域内の鈴木博士と共同で1分子イメージング用の発現プラスミドを作成し、解析した。その結果、野生型のGluA1とGluA2の細胞表面上での拡散係数、会合時間などの様々なパラメータを得ることに成功した。2)ペリニューロナルネット(PNN)におけるHNK-1糖鎖の役割GlcAT-P
高IgE症候群における病態解明

I型高IgE症候群(STAT3異常症)におけるアトピー性皮膚炎発症のメカニズムを検討するため、IL-10のシグナル伝達異常に着目した。健常人では、単球由来樹状細胞(Monocyte deriveddendritlc cell: MoDC)に比較して、IL-10で処理した単球由来樹状細胞(IL-10-MoDC)では、PD-L1,PD-L2,ILT-3,ILT-4などの抑制性分子の発現上昇が認められたが、本症候群のIL-10-MoDCでは、これら抑制性分子の発現上昇が障害されていた。また、健常人のIL-10-MoDCと共培養した健常人のナイーブCD4陽性T細胞はFOXP3の発現を上昇させたが、本症候群のIL-10-MoDCでは健常人のナイーブCD4陽性T細胞に対するFOXP3発現上昇を誘導できなかった。さらに、健常人のIL-10-MoDCで誘導されたFOXP3陽性T細胞は、他のT細胞の増殖とTh1/Th2サイトカイン産生を抑制したが、本症候群のIL-10-MoDCで誘導されたT細胞には、このTreg活性が認められなかった。また、健常人のIL-10-MoDCとナイーブCD4陽性T細胞を共培養する際にPD-L1,ILT-4,またはTGFβの中和抗体を加えておくことでFOXP3の発現上昇が抑制されたことから、FOXP3の発現上昇にはPD-L1,ILT-4,およびTGFβが重要であることが示唆された。以上の結果より、高IgE症候群では、樹状細胞のIL-10シグナル伝達障害により、抑制性樹状細胞の分化障害と誘導性の制御性T細胞(iTreg)の機能異常によりアトピー性皮膚炎と高IgE血症が発症する可能性が考えられた。この機序により高IgE症候群における高IgE血症、アトピー性皮膚炎発症の少なくとも一部が説明できる可能性が考えられる。高IgE症候群は、血清IgE高値、黄色ブドウ球菌による皮膚・肺の感染症、重症アトピー性皮膚ならびに骨・歯牙異常を主症状とする原発性免疫不全症である。我々は、この疾患がシグナル伝達分子STAT3の遺伝子変異によるサイトカイン・シグナル伝達障害病であることを明らかにした。しかし、本症例におけるアレルギー症状や骨・歯牙異常がどのようなメカニズムによって引き起こされるのかは未解決である。そこで本研究では、患者末梢血サンプルから各種免疫細胞を単離し、サイトカイン反応性、活性化能、抑制能、増殖能、サイトカイン・ケモカイン産生能などの機能解析をおこない、アレルギー病態誘導の機構を明らかにすることを目的とした。アレルギー反応を惹起する要因としてあげられるのが、ヘルパーT細胞サブセット(Th2細胞)からのIL-4産生過剰などがある。我々は、まず、naive CD4陽性T細胞をTh2誘導条件下で刺激したときのTh2細胞への分化を評価した。その結果、高IgE症候群では、健常人と比較し、Th2細胞への著しい分化は認められなかったことから、Th2細胞分化障害によるアレルギー病態誘導の可能性は否定的である。次に、我々は、Th2細胞の分化誘導を調節している樹状細胞に着目し、患者末梢血から分離した単核球から樹状細胞を分化させ、さらにIL-10を含む抑制性サイトカインによる抑制性樹状細胞への分化障害の有無を調べた。その結果、高IgE症候群の樹状細胞ではIL-10のシグナル伝達障害により、樹状細胞表面上の抑制因子の発現上昇が認められず、抑制性樹状細胞への分化が障害されていることが分かった。このIL-10誘導型制性樹状細胞が、naiveなT細胞に対しどのように作用して、増殖あるいはサイトカイン産生の調節をしているのかを明確にし、高IgE症候群ではこの樹状細胞がどのように働いているのかということを検討していくことが、今後の大きな課題の1つである。前年に引き続き、STAT3異常症におけるアトピー性皮膚炎発症のメカニズムを検討する目的で、Th1細胞、Th2細胞、制御性T細胞(Treg)および樹状細胞(DC)の分化および機能を検討した。STAT3異常症では、Th1、Th2細胞分化の異常は認められなかった。しかし、STAT3異常症の末梢血単核球全体を、抗CD3+CD28で刺激すると、健常人と比較してTh2サイトカイン産生の有意な亢進が認められた。そこで、末梢血由来単球をGM-CSFとIL-4存在下で培養することにより単球由来樹状細胞(MoDC)を作製したところ、STAT3異常症のIL-10添加DC(IL-10/MoDC)では抑制性分子であるPD-L1、PD-L2、ILT-3、ILT-4の発現がほとんど見られず、このIL-10/MoDCと共培養したアロのナイーブCD4T細胞では制御性T細胞の指標であるFoxp3、CTLA4、GITRの発現が障害されていた。さらにSTAT3異常症のIL-10/MoDCと共培養して得られたCD4+CD25+T細胞では、ResponderT細胞の増殖抑制とTh2サイトカイン産生抑制が認められなかった。加えて、健常人のIL-10/MoDCのFoxp3発現誘導能力は、TGFβとほぼ同等であった。また、健常人のIL-10/MoDCは、TGFβを加えることでIL-10単独に比べより相乗的にT細胞のFOXP3発現誘導がみられるが、STAT3異常症ではこの誘導が認められなかった。

さらに末梢血中に存在するpDC、cDCにおいてもIL-10で刺激後の抑制性分子の発現障害が認められたことから、これまでのin vitroでの実験結果は、生体内を反映していると考えられる。以上のことから、高IgE症候群における高IgE血症とアトピー性皮膚炎発症に抑制性樹状細胞とiTregの分化・機能障害が関与している可能性が示唆された。I型高IgE症候群(STAT3異常症)におけるアトピー性皮膚炎発症のメカニズムを検討するため、IL-10のシグナル伝達異常に着目した。健常人では、単球由来樹状細胞(Monocyte deriveddendritlc cell: MoDC)に比較して、IL-10で処理した単球由来樹状細胞(IL-10-MoDC)では、PD-L1,PD-L2,ILT-3,ILT-4などの抑制性分子の発現上昇が認められたが、本症候群のIL-10-MoDCでは、これら抑制性分子の発現上昇が障害されていた。また、健常人のIL-10-MoDCと共培養した健常人のナイーブCD4陽性T細胞はFOXP3の発現を上昇させたが、本症候群のIL-10-MoDCでは健常人のナイーブCD4陽性T細胞に対するFOXP3発現上昇を誘導できなかった。さらに、健常人のIL-10-MoDCで誘導されたFOXP3陽性T細胞は、他のT細胞の増殖とTh1/Th2サイトカイン産生を抑制したが、本症候群のIL-10-MoDCで誘導されたT細胞には、このTreg活性が認められなかった。また、健常人のIL-10-MoDCとナイーブCD4陽性T細胞を共培養する際にPD-L1,ILT-4,またはTGFβの中和抗体を加えておくことでFOXP3の発現上昇が抑制されたことから、FOXP3の発現上昇にはPD-L1,ILT-4,およびTGFβが重要であることが示唆された。以上の結果より、高IgE症候群では、樹状細胞のIL-10シグナル伝達障害により、抑制性樹状細胞の分化障害と誘導性の制御性T細胞(iTreg)の機能異常によりアトピー性皮膚炎と高IgE血症が発症する可能性が考えられた。この機序により高IgE症候群における高IgE血症、アトピー性皮膚炎発症の少なくとも一部が説明できる可能性が考えられる。
放射線治療計画におけるDual Energyを用いた新しいCT値－電子密度変換

本研究の目的は、がんの放射線治療における無駄な被曝低減のために、より正確な3次元線量分布計算を実現可能とする、Dual-Energyを用いた全く新しい『CT値ー電子密度変換法』の開発である。本目的達成のため研究期間内に、臨床用Dual-Energy CT装置や放射線治療計画装置への本手法の導入・実行を通して、本手法の基本原理の妥当性を実証するとともに、放射線治療計画における線量分布計算の精度を検証した。本研究の目的は、がんの放射線治療における無駄な被曝低減のために、より正確な3次元線量分布計算を実現可能とする、Dual-Energy(DECT)を用いた全く新しい『CT値ー電子密度変換法』の開発である。本目的達成のため研究期間内に、臨床用Dual-Energy CT装置や放射線治療計画装置への本手法の導入・実行を通して、本手法の基本原理の妥当性を実証するとともに、放射線治療計画における線量分布計算の精度を検証する。本年度の研究計画項目は、1エネルギー差分CT値と電子密度との対応関係の実証、2各種撮影条件変化の影響調査、の2点である。「エネルギー差分CT値と電子密度との対応関係の実証」では、理論的に予測されている"エネルギー差分CT値"と"電子密度"間の比例関係を実験的に確認するとともに、本手法の適用可能な電子密度範囲を明らかにするため、実際に臨床で使用されているDECT装置と電子密度ファントムを用いて「エネルギー差分CT値ー電子密度変換」のCT実験を行った。その結果、空気からアルミニウムまでの広い電子密度範囲でエネルギー差分CT値と相対電子密度に間に比例関係が成り立つことを実証した。一方「各種撮影条件変化の影響調査」に関して今年度は、電子密度ファントムの中心部(頭部に相当)あるいは周辺部のみ(胸部に相当)を被写体として使用し、そのサイズ変化によって生ずるビームハードニング効果の『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』への影響を調べた。その結果、"エネルギー差分CT値"と"電子密度"間の比例関係は被写体サイズの変化に対しても十分に安定であることが確認できた。また、高電圧側X線管に錫フィルタを付加することは、『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』の安定化や、被曝線量の低減に有効であることを明らかにした。本研究の目的は,がんの放射線治療における無駄な被曝低減のために,より正確な3次元線量分布計算を実現可能とする,Dual-Energy(DECT)を用いた全く新しい『CT値ー電子密度変換法』の開発である.本目的達成のため研究期間内に,臨床用DECT装置や放射線治療計画装置への本手法の導入・実行を通して,本手法の基本原理の妥当性を実証するとともに,放射線治療計画における線量分布計算の精度を検証する.本年度の研究計画項目は,13次元線量分布の計算結果の精度や安定性を検証,2撮影条件の最適化,の2点である.項目1では,「エネルギー差分CT値ー電子密度変換法」を放射線治療計画装置に導入し, DECT装置と電子密度ファントムおよび人体ファントムを用いて得られる線量分布の精度・安定性を従来のsingle energy CTによる「CT値ー電子密度変換法」と比較した.骨組織などの高電子密度領域の画素頻度の小さい軟部組織等価領域を主とした放射線治療計画においては,「エネルギー差分CT値ー電子密度変換法」および「CT値ー電子密度変換法」ともにビームハードニング効果の影響が少なく,両手法の線量分布計算の安定性に有意の差はみられなかった.しかし,大量の歯や骨組織を含み,高電子密度領域の画素頻度の大きい口腔部の放射線治療計画では,「CT値ー電子密度変換法」において線量分布にビームハードニング効果の影響が顕著に表れた.一方,「エネルギー差分CT値ー電子密度変換法」では,歯や骨を含むような部位においてもビームハードニング効果の影響が極めて少なくなることが明らかとなった。項目2に関して,高電圧側X線管に錫フィルタを付加する100kV-140kV/Snの条件では,付加しない場合,あるいは付加しても80kV-140kV/Snの条件で撮影した場合と比較して,より安定した線量分布が得られることが確かめられた.本研究の目的は,がんの放射線治療における無駄な被曝低減のために,より正確な3次元線量分布計算を実現可能とする,Dual-Energy(DECT)を用いた全く新しい『CT値ー電子密度変換法』の開発である.本目的達成のため研究期間内に,臨床用Dual-Energy CT装置や放射線治療計画装置への本手法の導入・実行を通して,本手法の基本原理の妥当性を実証するとともに,放射線治療計画における線量分布計算の精度を検証する.最終年度の研究計画項目は,1患者体内に人工歯根等のインプラントが存在することを想定した,金属ロッドを電子密度ファントムに挿入して生ずるメタルアーチファクトの『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』への影響を調べる,23年間の研究結果に基づき,『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』の精度およびその臨床上の適用性について総括する,の2点である.「メタルアーチファクトの影響」では,X線吸収の大きな金属ロッドが電子密度ファントムにある場合,「CT値ー電子密度変換法」においてビームハードニング効果の影響が顕著に表れた.一方,「エネルギー差分CT値ー電子密度変換法」では,ビームハードニング効果の影響をかなり低減できることが明らかとなった。3年間の研究結果から、『エネルギー差分CT値ー電子密度変換法』の放射線治療計画における有効性を実証できた。本手法の最大のメリットはその「簡便性」にある,つまり,DECT装置を持つ施設であれば,本手法を容易に実行可能となる.

したがって,DECT装置が世界の医療施設に導入されつつある現状から,本手法が短期間で広く波及することが期待される.本研究の目的は、がんの放射線治療における無駄な被曝低減のために、より正確な3次元線量分布計算を実現可能とする、Dual-Energyを用いた全く新しい『CT値ー電子密度変換法』の開発である。本目的達成のため研究期間内に、臨床用Dual-Energy CT装置や放射線治療計画装置への本手法の導入・実行を通して、本手法の基本原理の妥当性を実証するとともに、放射線治療計画における線量分布計算の精度を検証した。当初計画していた「3次元線量分布の計算結果の精度や安定性を検証」と「撮影条件の最適化」の2点を実施し,『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』の放射線治療計画における有効性をある程度実証できている.医学物理学今後,以下に重点を置き推進する.1各種撮影条件変化の影響について:患者体内に人工歯根等のインプラントが存在することを想定し,金属ロッドを電子密度ファントムに挿入して生ずるメタルアーチファクトの『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』への影響を調べる.2総括:3年間の研究結果に基づき,『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』の精度およびその臨床上の適用性について総括する.当初計画していた「エネルギー差分CT値と電子密度との対応関係の実証」と「各種撮影条件変化の影響調査」の2点を実施し、『CT値ー電子密度変換法』の基本原理の妥当性をある程度実証できている。研究発表のための関連旅費が不要であったため,若干の次年度使用額が生じた.今後、以下の3点に重点を置き推進する。1各種撮影条件変化の影響について:患者体内に人工歯根等のインプラントが存在することを想定し、金属ロッド(例えばチタン)を電子密度ファントムに挿入して生ずるメタルアーチファクトの『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』への影響を調べる。23次元線量分布の計算結果の精度や安定性を検証:様々な撮影条件で取得した『エネルギー差分CT値ー電子密度変換』の結果が、3次元線量分布計算に与える影響を定量的に検証する。3撮影条件の最適化:より確かに、より低い被曝で放射線治療計画を実行するためのDual-Energy CT装置の撮影条件(管電圧,管電流,付加フィルタなど)を最適化する。研究成果をまとめた論文投稿のための英文校正費として使用する予定である.当初購入予定であった高純度金属ロッドの種類やサイズ等仕様の最適化が年度を跨り進行中であること、また、年度内の研究発表がなく関連旅費が不要であったため。高純度金属ロッド(チタンやアルミニウムなど)の購入、研究発表および治療計画装置を使った3次元線量分布計算に関する調査等の旅費として使用する予定である。
味細胞受容から味神経への味情報伝達経路の構築とATPの役割に関する研究

味細胞のうち、甘味・うま味・苦味を受容するII型細胞は味神経とシナプス形成をせず、酸味を受容するIII型細胞は味神経とシナプスを形成している。III型細胞の味情報は、セロトニンを介して伝達される。III型細胞は、「ATP受容型III型細胞」と「酸味受容型III型細胞」2種類に分化していると先行研究で明らかにしたのでこれらのIII型細胞が、それぞれ味神経とシナプス形成をして情報伝達を行っているかを調べた。その結果、「酸味受容型」III型細胞はセロトニンを有しておらず、「ATP受容型」III型細胞はセロトニンを有していることが明らかとなった。すなわち、「酸味受容型」III型細胞が味神経とシナプス形成をしていないことが示唆された。味細胞の味応答頻度が味神経応答頻度と一致しないことから、その途中になんらかの情報の整理整頓が行われていると考えるのが一般的である。味蕾のなかに4種の味細胞が存在しI型はグリア様、II型は甘味・苦味・うま味受容、III型は酸味受容、IV型は前駆細胞と考えられている。これまでの研究の成果からIII型味細胞には酸味受容する細胞とは独立してATPを受容する細胞が存在するという成果を得た。ATPはII型味細胞から放出され、味情報のメッセンジャーと考えられている。そこで本研究では、ATPを受容するIII型細胞が味神経へ情報を伝達していること、II型味細胞に存在するATP受容体の役割を明らかにし、味情報伝達の整理が舌上皮中において行われ味神経に伝達されていることを明らかにすることを目的としている。本年度は、III型味細胞におけるセロトニンの存在を調べた。味神経には味情報がセロトニンで送られているとの研究結果が数多く存在する。ATP受容するIII型味細胞が味神経に情報を送っていれば、セロトニンが存在するはずである。実験方法として、免疫組織染色によって味細胞をセロトニン抗体およびII型、III型味細胞マーカー抗体で染色した。III型味細胞マーカーに炭酸脱水素酵素抗体(Car-4)およびNCAM抗体を用いた。II型味細胞マーカーにPLCβ2抗体およびGαGustducin抗体を用いた。その結果、II型味細胞マーカーとセロトニンは共存しないことを確認できた。また、III型味細胞マーカーでもCar-4とセロトニンは局在性が異なるという結果を得た。NCAMで染色された細胞にセロトニンで染色される細胞が含まれることも明らかにした。これらの結果から、III型味細胞の一部にセロトニンが発現し、その細胞は酸味を受容しないことが明らかになった。昨年度、実験結果が従来と異なることから使用している共焦点顕微鏡のレーザーが非常に弱くなっていることに気がつき、新規購入し交換し再度実験をやり直した。そのため研究の開始が遅くなった。しかし、レーザーの出力が高くなったことにより、28年度当初には挽回できるほど研究ははかどっている。申請者の研究の成果からIII型味細胞には酸味受容する細胞とは独立してATPを受容する細胞が存在するという成果を得た。そこで本研究では、ATPを受容するIII型細胞が味神経へ情報を伝達していること、II型味細胞に存在するATP受容体の役割を明らかにし、味情報伝達が舌上皮中において行われ味神経に伝達されていることを明らかにすることを目的とする。28年度は29年度に予定していたIII型味細胞で受容される酸味に関して直接味神経に情報が伝達されるのか、ATP受容III型味細胞を介するのかを調べた。手法としては酸味応答する細胞がセロトニンを細胞内に持つかどうかを調べた。また、免疫組織染色により酸味受容体とセロトニンの存在様式を調べた。その結果、酸味受容をしているIII型細胞はセロトニンを持つ割合が低かった。これに関しては29年度にさらに細胞数を増やして確かめる予定である。免疫染色の結果らから酸味受容をしている細胞もセロトニンを持つ細胞の割合が少なかった。III型細胞には2種類あることを申請者らは明らかにしているので、III型マーカーを持つ細胞に関してセロトニンの有無を調べた結果、高確率でセロトニンが存在していた。27年度の結果から、28年度は29年度に行う計画の方を先に行うことにした。それに関して順調に進んでいた。ただ12月に行ったマウスの保育施設のモニタリング調査の結果ウイルス感染したマウスが見つかったため施設内のマウスが全頭処分となり、クリーニング後のモニタリング結果まで飼育がストップし、すなわち生動物を用いる実験である細胞応答に関しては現在行えていない状態である。しかし、保存していた試料を用いた免疫染色を先に進めているので、大幅な遅れはない。各味溶液に対して応答を示した細胞におけるセロトニンの有無を明らかとするため、カルシウムイメージング法と免疫細胞染色法を行った。前者の手法により、ATP応答細胞と酸味応答細胞を選別し、後者の手法により、各細胞のセロトニンの有無を観察した。

その結果、ATP応答細胞がセロトニンを必ず有する一方で、必ずしも全ての酸味応答細胞がセロトニンを有しているわけではないことが示された。これより、酸味受容型III型細胞が、味神経とシナプス形成をしているという従来の情報伝達機構を有していない可能性が示唆された。続いて、この可能性を味細胞における受容体発現の面からも確認するため、免疫組織染色を行い、味蕾内の各種味細胞におけるセロトニンの分布を調べた。その結果、II型細胞はセロトニンを発現しない一方で、III型細胞マーカーのNCAM発現細胞の全てがセロトニンを発現しているわけではないことが示された。さらに、酸味受容型III型細胞マーカーのCAR-4およびPKD2L1を発現する多くの細胞が、セロトニンを有していないことが示された。これより、受容体発現の面からも、結果の妥当性があること示された。考察。一連の結果から「酸味受容型」III型細胞はセロトニンを有しておらず、間接的に「ATP受容型」III型細胞はセロトニンを有していることが分かった。これにより、「酸味受容型」III型細胞がシナプス形成をしておらず、新たな情報機構を持つ可能性が示唆された。そこで、「酸味受容型」III型細胞から「ATP受容型」III型細胞へ味情報が伝達され、伝達された味情報が「ATP受容型」III型細胞からのセロトニンにより味神経に伝達される、と仮説モデルを提唱した味細胞のうち、甘味・うま味・苦味を受容するII型細胞は味神経とシナプス形成をせず、酸味を受容するIII型細胞は味神経とシナプスを形成している。III型細胞の味情報は、セロトニンを介して伝達される。III型細胞は、「ATP受容型III型細胞」と「酸味受容型III型細胞」2種類に分化していると先行研究で明らかにしたのでこれらのIII型細胞が、それぞれ味神経とシナプス形成をして情報伝達を行っているかを調べた。その結果、「酸味受容型」III型細胞はセロトニンを有しておらず、「ATP受容型」III型細胞はセロトニンを有していることが明らかとなった。すなわち、「酸味受容型」III型細胞が味神経とシナプス形成をしていないことが示唆された。、カルシウム蛍光指示薬をローディングした味細胞をイメージング法に供しATPによって細胞内カルシウム上昇を示す味細胞を選択する。それらをセロトニン抗体およびIII型味細胞マーカー抗体で染色する。詳細には以下のとおりである。細胞応答で得られるATP応答をする細胞にはII型味細胞もIII型味細胞もするため、その中からマーカー抗体染色によってIII型味細胞を選び出す。セロトニン抗体との二重染色によってATP受容III型味細胞(IIIB型味細胞)が一致するのかを明らかにする。研究課題に際した研究方法を最終年度であるため、重要な部分をしっかり押さえるよう再構築した。酸味受容をする細胞がセロトニンを持たない可能性が高くなったので、その確認と酸味受容体を持たないIII型細胞がATPを受容しセロトニン放出をすることを明らかにするために、以下のことを行う。ATP受容するIII型味細胞がセロトニンをもつのかを調べる。
人工呼吸器離脱プロトコールを用いた看護師によるウイニング実施の効果

1本研究の目的は、人工呼吸器離脱プロトコール導入の効果を明らかにすることである。対象者は、48時間以上人工呼吸器を装着した患者36名と集中治療室でケアをした44人の看護師とした。人工呼吸器離脱プロトコール導入前後に患者の呼吸機能データ、SAT・SBTの評価、人工呼吸器装着期間と看護師の呼吸ケアの実践と認識について測定した。その結果、集中治療室滞在日数、人工呼吸器装着期間が導入前の18人の患者に比べ導入後の18人の方が短縮していた。看護では、呼吸リハビリの実践が導入前に比べ導入後の方が増えた。また、呼吸ケア技術とチーム医療の意識も導入後高くなった。本研究の目的は、人工呼吸器離脱プロトコールを用いて看護師が主体的にウイニングを実施する効果を明らかにすることである。研究方法は、前向き前後比較研究であり、介入は人工呼吸器に関連する3学会が合同で策定した人工呼吸器離脱プロトコールの導入である。介入の効果は、患者関連指標と、看護師による呼吸ケアスキル関連指標を評価するものである。人工呼吸器離脱プロトコールの導入前には、対象となる看護師に教育期間を設け、SATの開始・評価・実施、SBTの開始・実施、抜管チェックリスト評価など人工呼吸器離脱に必要な知識とプロトコールの説明を行う。本研究により人工呼吸器離脱プロトコールの有効性が検証されれば、医師の包括的な指示のもと看護師やその他の医療者からなる医療チームでウイニングに取り組むことが期待される。本年度は、10月11月まで、救命救急センターと集中治療室で人工呼吸器を装着している患者とそのケアを実施する看護師の測定内容を抽出した。その内容は、患者関連指標(換気量、気道内圧、酸素濃度等の呼吸生理学データ、人工呼吸器装着期間、気管挿管日数、集中治療室滞在日数、再挿管の有無等)と、看護師による呼吸ケアスキル関連指標(呼吸ケアの観察視点、呼吸ケア技術、チーム医療)とした。12月からは、人工呼吸器離脱プロトコール導入予定がある施設に研究協力を依頼した。その後、研究協力の同意が得られた施設から、人工呼吸器離脱プロトコール導入前調査をした。平成27年3月までに、人工呼吸器離脱プロトコール導入前のデータ収集を終了する予定であったが、十分なデータを収集していない状況であった。そのため平成27年の4月も継続してデータ収集をしている。本年度は、研究協力の同意を得られた施設から、人工呼吸器離脱プロトコール導入前の患者関連指標(換気量、気道内圧、酸素濃度等の呼吸生理学データ、人工呼吸器装着期間、気管挿管日数、集中治療室滞在日数、再挿管の有無等)と看護師の呼吸ケアスキル(呼吸ケアの観察視点、呼吸ケア技術、チーム医療)の調査を実施した。導入前調査が終了した施設から、人工呼吸器離脱プロトコール導入教育期間を1か月設け、看護師に人工呼吸器離脱について教育を行った。その後、教育が終わった施設から、人工呼吸器離脱プロトコール導入後の患者関連指標と看護師の呼吸ケアスキルの調査を実施した。分析の結果、患者関連指標では、集中治療室滞在日数(導入前8.83±3.79日、導入後5.67±2.63日)、人工呼吸器装着期間日数(導入前5.11±1.77日、導入後3.89±1.45日)、気管挿管日数(導入前5.06±1.83日、導入後3.89±1.45日)が導入前に比べ導入後のほうが短縮されていた。看護師の呼吸ケアスキルでは、呼吸リハビリの実施(導入前2.73±0.88点、導入後3.55±1.05点)、人工呼吸器を装着した患者に関わる医療チーム間での情報共有(導入前3.29±1.0点、導入後4.05±0.72点)が導入前に比べ導入後の実践回数が増えていた。平成27年6月までに人工呼吸器離脱プロトコール導入前データを収集し、平成27年7月に人工呼吸器離脱プロトコール導入教育を行う。その後、平成27年8月以降に人工呼吸器離脱プロトコール導入後データを収集し、分析を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学27年度が最終年度であるため、記入しない。
皮膚癌の浸潤、転移能における表皮接着分子の直接的関与についての解析

本年度の研究では、表皮水疱症(EB)患者から得られた細胞、遺伝子を用いたこれまでの研究に加え、昨年度の研究にて作成した遺伝子改変マウスのフェノタイプの解析と、皮膚癌モデルの作成を行った。A)変異ヒトVII型コラーゲントランスジェニックマウスのフェノタイプの解析表皮基底膜に発現するケラチン14タンパクのプロモーター下流に、VII型コラーゲンタンパクのC末にpremature terminal codonを生じる変異ヒトVII型コラーゲン遺伝子(7444delG)を組み替えたトランスジェニックマウスを作成した。作成した変異ヒトVII型コラーゲントランスジェニックマウスでは明らかなフェノタイプが見られなかったため、VII型コラーゲンヘテロノックアウトマウスと交配し、皮膚基底膜に変異ヒトVII型コラーゲンのみを発現する変異VII型コラーゲンヒト化マウスを作成した。このマウスは、コントロールマウスと比較して成長障害が認められるものの、生後6ケ月まで生存可能で、成長に伴って皮膚のびらん、潰瘍、手指、足趾の癒合、前頭部の脱毛などEB患者類似のフェノタイプが認められた。これらフェノタイプは出生直後には明らかでなく、出生後徐々に出現し、2ケ月後にはほぼ全ての個体にフェノタイプが認められた。B)変異VII型コラーゲンヒト化マウスを用いた皮膚癌発症モデルの作成トランスジェニックマウスの皮膚にDMBA、TPAを塗布し皮膚癌の誘発を行った。その結果、コントロールマウスと比較して誘発される頻度、時間に明らかな差異は認められなかった。今後はこのモデルマウスを用いてin vivoにおける癌の浸潤、転移の動態、および原発巣、転移巣における各種接着分子の発現解析を計画している。本年度の研究では、表皮水疱症(EB)患者から得られた細胞、遺伝子を用いたこれまでの研究に加え、新たに導入した動物マウスモデルを用いて、変異・欠損した基底膜分子が扁平上皮癌の浸潤・転移に与える影響の解析を行った。1.VII型コラーゲンノックアウトマウスを用いた癌細胞の浸潤、転移能の解析VII型コラーゲンノックアウトマウスの皮膚にDMBA、TPAを塗布した発癌モデルで化学発癌を誘発し、皮膚癌の浸潤、転移の動態を試みたが、VII型コラーゲンノックアウトマウスの多くが生後3週以内に死亡するため十分な解析が困難であった。そこで、VII型コラーゲンノックアウトマウスに、変異ヒトVII型コラーゲン遺伝子を導入した新たな動物モデルの作成を行った。2.変異ヒトVII型コラーゲントランスジェニックマウスの作成表皮基底膜の角化細胞に発現する分子であるケラチン14タンパクのプロモーター下流に正常ヒトVII型コラーゲンcDNAを組み込んだ発現ベクター(pK14-Col7a1)に、VII型コラーゲンタンパクのC末にpremature terminal codonを生じる変異ヒトVII型コラーゲン遺伝子(7444delG)を組み替え、トランスジェニックコンストラクトを作成。完成したコンストラクトをC57BL/6マウスの受精卵にマイクロインジェクションし、皮膚基底膜に変異ヒトVII型コラーゲンを発現するトランスジェニックマウスを作成した。作成した変異ヒトVII型コラーゲントランスジェニックマウスでは明らかなフェノタイプが見られなかったため、VII型コラー・ゲンヘテロノックアウトマウスと交配し、皮膚基底膜に変異ヒトVII型コラーゲンのみを発現するVII型コラーゲンヒト化マウスを作成した。このマウスでは、生後しばらくしてから皮膚のびらん、潰瘍、手指、足趾の癒合、前頭部の脱毛など栄養障害型表皮水庖症患者類似のフェノタイプが認められた。今後はこのVII型コラーゲンヒト化マウスを用いて以下の検討を行う予定である。A)トランスジェニックマウスの皮膚にDMBA、TPAを塗布し皮膚癌を誘発する。誘発された皮膚癌の浸潤、転移の動態を臨床的、組織学的に観察しワイルドタイプコントロールマウスと比較する。B)上述の方法にて誘発された皮膚癌の原発巣、転移巣における各種接着分子の発現を免疫組織学的に検討する。また各組織における遺伝子発現プロファイルをGeneChip、RT-PCR法にて解析する。