hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TDP-43によるmicroRNA制御機構に着目したALS病態機序の解明

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態に深く関与するTDP-43の生理的機能の解析を行った.TDP-43は、核内でDrosha複合体と、細胞質ではDicer複合体と結合し、特定のマイクロRNAの生成を促進することを解明した.TDP-43の発現を抑制すると、neuriteの伸長が障害され、ここにTDP-43が制御するマイクロRNAの一つmiR-132を共発現させると、伸長障害が改善された.この結果から、TDP-43によるマイクロRNA制御は、neuriteの伸長促進に関与していることを解明した.筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態に深く関与するTDP-43の生理的機能の解析を行った.TDP-43は、核内でDrosha複合体と、細胞質ではDicer複合体と結合し、特定のマイクロRNAの生成を促進することを解明した.TDP-43の発現を抑制すると、neuriteの伸長が障害され、ここにTDP-43が制御するマイクロRNAの一つmiR-132を共発現させると、伸長障害が改善された.この結果から、TDP-43によるマイクロRNA制御は、neuriteの伸長促進に関与していることを解明した.RNA結合タンパク質TDP-43は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態に深く関与している。このため、TDP-43の生理的機能、特にmicroRNA生成に果たす役割を明らかにすることから、ALS病態解明への貢献を目的として本研究をスタートさせ、以下の結果を得た。1) FLAG-Droshaを安定発現するHEK293T細胞株から、免疫沈降法によって得たDrosha複合体を解析した結果、本複合体にはDGCR8など既知の構成因子に加え、TDP-43が含まれていた。次に、FLAG-TDP-43を安定発現するHEK293T細胞株を樹立し、TDP-43複合体を精製・解析した結果、Droshaが本複合体に含有されており、TDP-43がDrosha複合体の一構成因子であることを明らかにした。2) Drosha複合体をRNase処理した結果、TDP-43はほとんど複合体から解離せず、主にRNA非依存的に結合していると考えられた。このため、結合に必須のドメインを決定するため、様々なTDP-43のdeletion mutantを作製し、FLAG-Drosha安定発現細胞株に導入した。この結果、TDP-43のC端の一部分が結合に必須であることが分かった。3) HeLa、Neuro2a、SH-SY5Yの3つの異なる細胞株で、TDP-43をRNAi法によりノックダウンし、発現量が変動するmicroRNAをマイクロアレイを用いてスクリーニングした。この結果、10個程度のmicroRNAの発現量が有意に低下しており、定量RT-PCR法でも再現された。一方、これらmicroRNAの前駆体量には変動を認めなかったことから、発現量低下は、転写後調節障害に原因があると考えられた。今後これらのmicroRNA発現が、Drosha複合体中のTDP-43によって制御されているのかどうかを解析していく予定である。RNA結合タンパク質TDP-43は、筋萎縮性側索硬化症(AILS)の病態に深く関与している。このため、TDP-43の生理的機能、特にマイクロRNA生成に果たす役割を明らかにすることから、ALS病態解明への貢献を目的として本研究をスタートさせ、本年度は以下の結果を得た。TDP-43を細胞株中でノックダウンすると約10個のマイクロRNAの発現が低下し、これらは転写レベルではなく、転写後レベルでの生成障害が原因と考えられた。このため、TDP-43が実際にどのように転写後レベルでこれらマイクロRNAの生成に関与するのか解析を進めた。その結果、核内でDrosha複合体とC末端領域を使って結合し、特定のマイクロRNAの生成を促進する役割を果たしていることを解明した。さらに、TDP-43は、一部細胞質中にも存在しており、Dicer複合体と結合していることを発見した。この結合には、Drosha複合体よりも長いC末端領域が必要であることを見出した。TDP-43は、この複合体中でさらに特定のマイクロRNAの生成を促進する役割を果たしていることを解明した。Neuro2a細胞株で、TDP-43をRNAi法によりノックダウンするとneuriteの伸長が障害され、ここにTDP-43が制御するマイクロRNAの一つmiR-132を共発現させると、伸長障害が改善されることを見出した。この結果から、TDP-43によるマイクロRNA制御は、neuriteの伸長を促進する役割に関与していることを解明した。以上の結果をまとめ、米国科学アカデミー紀要に論文として発表した。来年度は、さらにTDP-43が果たすRNA制御機能の全体像を明らかにする予定である。RNA結合タンパク質TDP-43は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態に深く関与している。このため、TDP-43の生理的機能、特にマイクロRNA生成に果たす役割を明らかにすることから、ALS病態解明への貢献を目的として本研究をスタートさせた。これまでに、TDP-43は、核内でDrosha複合体とC末端領域を使って結合し、特定のマイクロRNAの生成を促進する役割を果たしていることを解明した。TDP-43は、これら複合体中で特定のマイクロRNAの生成を促進する役割を果たしていることを解明した。Neuro2

a細胞株で、TDP-43をRNAi法によりノックダウンするとneuriteの伸長が障害され、ここにTDP-43が制御するマイクロRNAの一つmiR-132を共発現させると、伸長障害が改善されることを見出した。この結果から、TDP-43によるマイクロRNA制御は、neuriteの伸長を促進する役割に関与していることを解明した。本年度は、さらにTDP-43が果たすRNA制御機能の全体像を明らかにするため、培養細胞を用いてPAR-CLIP法の樹立と、その後の情報解析手法の構築を目指した。これまでに試行錯誤を繰り返し、最終的に、ライブラリーを構築しdeep sequenceした結果、TDP-43の結合モチーフなど予想された結果が得られるようになった。また、結合するRNAの種類や部位なども明らかにすることができた。現在、ALSで同定されている遺伝子変異の入ったTDP-43についても、PAR-CLIPを行ったので、結合するRNAが野生型と比較してどのような差異があるのかを解析中である。当初目的としたTDP-43によるマイクロRNA制御機構のメカニズムの解析は、培養細胞を用いて予定通り進み、すでに論文としてまとめることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、主として培養細胞を用いてTDP-43が制御するマイクロRNAと、その制御メカニズムを明らかにした。来年度は、よりALS病態と直接関連するマイクロRNAを同定するため、マウス脊髄運動ニューロンを用いた実験を行う予定。さらにTDP-43が果たすRNA制御機能の全体像を明らかにする計画である。
カルシウムイオン流入抑制によるニホンナシ形質転換系の開発

16品種のニホンナシ子葉から、5μM NAAと10-25μM BAのホルモン組合せを用いた場合、`今村秋'と`安下庄支那梨'が高効率で再分化することを明らかとした。緑色蛍光タンパク(GFP)遺伝子を持つアグロバクテリウムをニホンナシ子葉に感染させた。カルシウムのキレート剤で防御反応を抑制するEGTAと、物理的に傷をつける超音波処理について検討したところ、EGTA処理はGFP蛍光の発現効率には効果が認められず、超音波処理で効果が認められた。`安下庄支那梨'子葉から1個体形質転換体が得られた。また、`今村秋'子葉から着色遺伝子myb導入で形質転換体が3個体得られ、再現性が示唆された。ニホンナシではこれまで形質転換系が確立されていなかった。そこで、ニホンナシ4品種(`安下庄支那梨'、`伯帝竜'、`幸水'、`なつしずく')およびニホンナシ雑種1品種(`二宮')の完熟種子由来子葉を材料として、アグロバクテリウム感染の効率化を目指した。アグロバクテリウム感染時にオキシダティブバーストを抑制するためにカルシウムキレート剤を用いたり、あるいは物理的に細胞壁に傷を付けるために超音波処理を行うなどの検討を行ったところ、ニホンナシ`安下庄支那梨'完熟種子由来子葉の両処理を行った処理区から1個体の形質転換体が得られた。そこで形質転換のさらなる効率化のため、子葉からの再分化効率の高いことを明らかにしたニホンナシ`今村秋'の子葉を材料として、子葉の発育ステージに沿ってアグロバクテリウムの感染実験を行った。ブドウ由来のmyb遺伝子を導入し、myb遺伝子よる組織の赤い着色によって形質転換のスクリーニングを行ったところ、完熟あるいは完熟に近い種子を材料として用いる方が良いことが明らかとなり、赤い着色の認められるシュートが得られた。これらの結果をあわせると、ニホンナシにおいて低率ではあるものの複数個体の形質転換シュートを得ることができた。これまでの実験で、選抜培養中にアグロバクテリウムのオーバーグロースによる子葉の枯死が多いことを観察していた。そのため、今年度除菌効果の高い抗生物質の検討を予定していたが、培養作業部屋のフィルターの不具合により培養実験に支障を来し、期間延長申請が認められたため、次年度検討を行う。ニホンナシはこれまで形質転換系が開発されていなかった。それは、ニホンナシへのアグロバクテリウムの感染時に防御反応(オキシダティブバースト)が起こっているためであると考え、防御反応を阻害する細胞外カルシウムイオンキレート剤(EGTA)を共存培養に用いた。また、物理的に細胞壁に傷を付け形質転換効率化に有効であると報告されている超音波処理を行った。これまで形質転換体を4個体得、形質転換効率は約0.2%であった。形質転換のさらなる効率化を考えたとき、選抜過程でのアグロバクテリウムのオーバーグロースによる致死が効率化の妨げの一つとなっていたので、除菌作用の強い抗生物質であるバンコマイシンについて、通常用いられるセフォタキシムと比較検討した。アグロバクテリウム感染後2ヶ月での外植片の生存率は、カルシウムキレート剤を用いた場合ではバンコマイシンを用いた区の方が高かったが、キレート剤を用いない場合ではバンコマイシンとセフォタキシムの差は認められなかった。また、カルシウムキレート剤ではBaptaについても検討したが、形質転換系の効率化には至らなかった。pBI121のGUS遺伝子部分をブドウ由来myb遺伝子で置き換えたTiプラスミドを持つアグロバクテリウム(EHA105)を感染させて、経時的に観察したところ、感染後2ヶ月ではmybを発現した赤い不定芽様組織が認められたが、5ヶ月後ではほとんどが枯死した。そのため、今後、不定芽様組織の生育を止めないような方法を試みる必要がある。ニホンナシ品種`安下庄支那梨'、`伯帝竜'、`幸水'、`なつしずく'およびニホンナシとセイヨウナシの雑種である`二宮'の子葉を用いてGFP遺伝子を持つアグロバクテリウムの感染実験を行った。感染から2週間のトランジェント、5ヶ月のステーブルな状態でのGFP蛍光の観察による形質転換効率を検討した。GFP蛍光は、カルシウムイオンのキレート剤であるEGTA処理および超音波処理を行ったトランジェントな状態の`安下庄支那梨'の85%の子葉で認められ、ステーブルな状態では、EGTA処理および超音波処理を行った`なつしずく'の68%の子葉で認められた。

アグロバクテリウム感染時における超音波処理は、超音波処理を行わなかった処理区と比較してトランジェントおよびステーブルな状態で、5%レベルで有意に効果が認められた。EGTA処理はトランジェントおよびステーブルな状態ともに有意な効果は認められなかった。18個体の再分化個体が得られ、超音波処理に加えてEGTA処理を行った区からGFP蛍光を示す1個体の形質転換個体が得られた。本研究で初めて多数のGFP蛍光を示すカルスが得られたが、植物体はカルスからの再分化ではなく、子葉から直接再分化したものであった。ニホンナシでは`安下庄支那梨'および`今村秋'で子葉からの再分化効率が高いことを明らかにしたので、今後これらの再分化効率の高い品種を重点的に材料として用いることで形質転換の効率化を検討する。また、実験途中にアグロバクテリウムのオーバーグロースにより、枯死する子葉が多かったため、形質転換植物体獲得効率が上がらないことが考えられた。そのため、アグロバクテリウムの除菌効果の高い抗生物質について検討を行い、形質転換の効率化を目指す。今年度予定していた、除菌効果の高い抗生物質を用いたアグロバクテリウムのオーバーグロース防止による形質転換効率の効率化に関しては、培養作業部屋のフィルターの不具合により培養実験に支障を来したため、期間延長申請を行い、次年度検討を行うことで承認を得ている。子葉へのアグロバクテリウム感染時に超音波処理を行うことにより、GFP蛍光を示す子葉およびカルスが多数認められ、率も有意に高かったことから、アグロバクテリウムの感染は効率よく起こっていると考えられる。また、子葉からの再分化効率の高いニホンナシ品種(`安下庄支那梨'および`今村秋')を明らかにした。今年度予定していた、除菌効果の高い抗生物質を用いたアグロバクテリウムのオーバーグロース防止による形質転換効率の効率化に関しては、培養作業部屋のフィルターの不具合により培養実験に支障を来したため、次年度検討を行う。アグロバクテリウムの感染は効率よく起こっていると考えられるが、植物体はカルスからの再分化ではなく、子葉から直接再分化したものであった。そこで子葉からの再分化効率が高いことを明らかにした`安下庄支那梨'および`今村秋'を重点的に材料として用いることで形質転換の効率化を検討する。平成23年度に実験を行った段階でアグロバクテリウムのオーバーグロースによる枯死が多いことが分かり、平成24年度は除菌効果の高い抗生物質について検討を始めていたが、培養作業部屋のフィルターの不具合により、培養実験に支障を来した。今年度末ころに修理が完了したため、次年度は平成24年度に計画していた抗生物質についての検討を行い、形質転換の効率化を目指す。未使用額はその経費に充てることとしたい。本研究課題遂行のため、次年度の研究費は交付申請時の計画通りに使用する。なお、次年度使用額241,839円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と併せて研究計画遂行のために使用する。
ブチルヒドロキシトルエンのTh1およびTh2免疫応答のバランスに与える影響

ディーゼル排気微粒子中に含まれる環境因子であり、医薬品・食品添加物としても用いられるブチルヒドロキシトルエンがTh1およびTh2免疫反応に与える影響についてマウスを用いて解析を行った。予備実験では、day 0に卵白アルブミンで免疫したマウスに50μgのブチルヒドロキシトルエンをday 0からday 20まで21日間投与することにより、day 21における血清中の卵白アルブミン特異的IgG、IgG2a、IgG1の産生が増強される結果を得ていた。しかし、その後、予備実験と同様の方法でブチルヒドロキシトルエンの濃度のみを0.5、5、50μgと変更して検討を行ったところ、ブチルヒドロキシトルエンの免疫増強作用が認められなかった。そこで再検討を続けたが、増強効果が明確に現れる投与条件を明らかにすることはできなかった。また、上述の検討とともに、Th2反応に依存して誘導されるI型アレルギー反応に対してブチルヒドロキシトルエンが与える影響についても検討した。まず、I型アレルギー反応のin vitroモデルである肥満細胞株RBL2H3のIgE刺激による脱顆粒反応に対するブチルヒドロキシトルエンの作用について検討を行ったところ、ブチルヒドロキシトルエンはIgEで感作されたRBL2H3の抗原刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇を促進させることにより、脱顆粒反応を促進させることを示唆する結果が得られた。さらにラットのPCA反応を指標にin vivoでのIgE依存性のアレルギー反応に対するブチルヒドロキシトルエンの効果について検討したところ、ブチルヒドロキシトルエンによりPCA反応が増強された。これらのことから、ブチルヒドロキシトルエンはin vitroおよびin vivoにおいてIgE依存的な肥満細胞の脱顆粒を促進し、I型アレルギー反応を増悪させる可能性があることが示唆された。ディーゼル排気微粒子中に含まれる環境因子であり、医薬品・食品添加物としても用いられるブチルヒドロキシトルエンがTh1およびTh2免疫反応に与える影響についてマウスモデルを用いて解析を行っている。しかし、予備実験と同様の方法で、ブチルヒドロキシトルエンの濃度のみを0.5、5、50μgと変更して検討を行ったところ、50μgのブチルヒドロキシトルエンにおいても免疫増強作用が認められなかった。そのため、同一の条件で再検討を行うとともに、増強効果が明確に現れる投与条件の探索を行っている。また、Th2反応に依存して誘導されるI型アレルギー反応のin vitroモデルである肥満細胞株RBL2H3のIgE刺激による脱顆粒反応に対するブチルヒドロキシトルエンの作用についても検討を行っている。ブチルヒドロキシトルエンはIgEで感作されたRBL2H3の抗原刺激による脱顆粒反応を濃度依存的に増加させた。ブチルヒドロキシトルエンがIgEで感作されたRBL2H3の抗原刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇を速く、また大きくしたことから、ブチルヒドロキシトルエンの脱顆粒反応促進作用には、細胞内カルシウム濃度の上昇促進作用が関与している可能性が考えられた。今後はin vivoのIgE依存性のアレルギー反応に対するブチルヒドロキシトルエンの効果について検討する予定である。
水環境保全のための処理技術に関する反応工学的総合評価

全地球的な水環境保全・水資源の有効利用に対応した高度な処理技術・水圏浄化技術を開発し,その総合的な評価基準を確立するため,各種処理技術の評価及び各種汚濁原水・処理水の利用目的の評価の2つの面から反応工学的な評価基準の選定について検討を行った.各分担研究者は,処理技術・汚濁原水を組合せた系をそれぞれ分担し,詳細なる検討を行った.様々な知見が得られているが,その要約を以下に記す.1.汚濁湖沼水の生物処理では,障害藻類の分解に対する微小後生動物の役割に関する知見を得た.2.回分式活性汚泥法では,排出量の変動の大きい生活系排水を対象に, (1)窒素・リンの同時除去に対する嫌気/好気運転サイクルを選定し,安定した除去率を得た.(2)リンの摂取に及ぼす炭素源濃度の影響を明らかにした.3.海水浄化の活性汚泥法では,リンの過剰除去に海水中のマグネシウムが有効なことが判明した.4.流動層法では,三相流動層型装置の長期間安定運転を実現した.また,反応過程の解析から生物膜法全般にわたる処理速度の評価法を提出した.5.土壌浄化法では,モデルを用いた解析により安定処理のための目づまりの防止条件について検討した.6.余剰汚泥の処理では,脱水法の操作性能を評価し,新しいゲル脱水法を提案した.7.凝集沈澱法では,河川水中の濁質除去にポリ塩化アルミニウムを使用した方法の性能評価を行った.8.オゾン酸化法では, (1)産業廃水中のリグニンのオゾン分解機構をモデルによって推算し,実現象と良好な相関を得た.(2)紫外線照射下でのオゾン自己分解速度を測定し,水処理におけるオゾンの利用効率を推算した.9.好気的消化法では,断続曝気のDO制御, ORP制御法の有効性について検討した.10.土壌還元法では,土壌中での有機物の安定化を検討した.11.浄水処理では,水道水源の水質悪化に対応した浄水システムを設定し,その最適設計について検討した.全地球的な水環境保全・水資源の有効利用に対応した高度な処理技術・水圏浄化技術を開発し,その総合的な評価基準を確立するため,各種処理技術の評価及び各種汚濁原水・処理水の利用目的の評価の2つの面から反応工学的な評価基準の選定について検討を行った.各分担研究者は,処理技術・汚濁原水を組合せた系をそれぞれ分担し,詳細なる検討を行った.様々な知見が得られているが,その要約を以下に記す.1.汚濁湖沼水の生物処理では,障害藻類の分解に対する微小後生動物の役割に関する知見を得た.2.回分式活性汚泥法では,排出量の変動の大きい生活系排水を対象に, (1)窒素・リンの同時除去に対する嫌気/好気運転サイクルを選定し,安定した除去率を得た.(2)リンの摂取に及ぼす炭素源濃度の影響を明らかにした.3.海水浄化の活性汚泥法では,リンの過剰除去に海水中のマグネシウムが有効なことが判明した.4.流動層法では,三相流動層型装置の長期間安定運転を実現した.また,反応過程の解析から生物膜法全般にわたる処理速度の評価法を提出した.5.土壌浄化法では,モデルを用いた解析により安定処理のための目づまりの防止条件について検討した.6.余剰汚泥の処理では,脱水法の操作性能を評価し,新しいゲル脱水法を提案した.7.凝集沈澱法では,河川水中の濁質除去にポリ塩化アルミニウムを使用した方法の性能評価を行った.8.オゾン酸化法では, (1)産業廃水中のリグニンのオゾン分解機構をモデルによって推算し,実現象と良好な相関を得た.(2)紫外線照射下でのオゾン自己分解速度を測定し,水処理におけるオゾンの利用効率を推算した.9.好気的消化法では,断続曝気のDO制御, ORP制御法の有効性について検討した.10.土壌還元法では,土壌中での有機物の安定化を検討した.11.浄水処理では,水道水源の水質悪化に対応した浄水システムを設定し,その最適設計について検討した.昨年度の研究成果に基づき、今年度は各種原水・廃棄物に対しての各種処理技術の適用効果の明確化を行った。以下に研究過程、新たに得られた知見を示す。1.流動層法では、パイロットプラントでドラム缶洗浄廃水を処理し、この処理法の有用性を実証した。2.接触酸化法では、原生動物が糸状藍藻類を捕食し、カビ臭物質を同時除去することが判明した。3.回分式活性汚泥法では、(1)嫌気-好気式脱リンにおいて、嫌気時汚泥中の全リン量が増加すると基質消費量が減少することが判明した。(2)好気回分-嫌気連続プロセス、好気-嫌気域間汚泥循環プロセスを考案し、窒素,リン除去特性を検討した。(3)制限曝気法で小規模廃水を処理し、窒素,リンの高除去率を得た。(4)海水の浄化においては、嫌気時の硫化水素発生によりリン過剰除去が不安定となった。4.土壌浄化法では、(1)酸素拡散係数、二次元的不飽和浸透流の分布と微生物増殖を実験的に観察した。(2)ポテンシャル分布、不飽和浸透水流量を数値計算し、実験結果をシミュレートした。5.凝集沈殿法では、(1)強カチオン性凝集剤の使用により汚泥の濾過・脱水速度が向上することが判明した。

(2)画像処理を用いたフラクタル次元の解析により、最適濁質除去撹判強度においてフラクタル次元が最小となることが判明した。6.オゾン酸化法では、(1)リグニンモデル物質の分解機構と反応速度式の適用性を明確にした。(2)紫外線照射下におけるオゾン自己分解速度からオゾン消費効率を求め、河川水の前処理へのオゾン酸化適用評価を行った。7.好気性消化法では、半回分処理において汚泥分解率の実測値と計算値を比較した。8.土壌還元法では、豚糞尿及びメタン発酵脱離液を農地還元し、有機物分解過程、農作物への影響を実測した。9.公共水域の水質悪化に対応した経済的水道システムの設計についてモデルを設定し、定式化を試みた。
がんの診断と治療

がん細胞に生じた遺伝子増幅を種々のゲノム・遺伝子解析手法を利用して調べた結果、抗がん薬耐性などを規定する「がんの個性診断」の基礎研究が進んだ。また、遺伝子発現情報を利用した抗がん剤感受性予測法なども成果が上がり、実用化を視野に入れた臨床研究を実施している。免疫分野では、抗原提示能の高い樹状細胞を誘導する研究などが進んだことや、それらを利用したがん免疫療法の基盤研究が急速に進展し、すでに臨床応用へ向けた展開が急速に進みつつある。がん治療のための分子標的研究に関しては、幅広い範囲での分子の同定が進みつつあり、これらを利用した治療法やこれらを標的とする治療薬の開発が行われている。新規抗がん剤の探索に関しても有望な物質が見いだされ、臨床試験に入っているものもある。遺伝子治療分野では細胞特異的に高発現する機能や細胞特異的に感染する機構を持つアデノウイルスベクターの改良が進みつつある。さらに、遺伝子の発現を抑える新しい技術なども開発されてきている。放射線治療についても、感受性を規定する遺伝子に関する研究が進み、それらの情報が放射線治療の効率を高める治療法への応用につながりつつある。以下の研究方針を設定し、それらの基準に基づいて、研究を推進するために47名の計画班員を選定した。診断については、それぞれの患者の特性やがんの「個性」を診断して、最小限の副作用で最大限の効果が期待できるような的確な「オーダーメイド」治療を行うことのできる指針を提供することが、がん患者のQuality of Lifeをよりよいものにする観点から、がんの「個性」診断の基礎的研究を行う研究者7名を選定した。分子細胞生物学や免疫学・発生工学などの成果によってがん化の分子機構やがんに対する免疫の仕組みが明らかになってきている。したがって、治療については、これらの基礎研究の発展こそが治療への応用につながることを念頭に、さらに基礎研究を推進していくことや、これら基礎研究の臨床への橋渡し的な研究の推進に対しても積極的にサポートする方針を決定した。このような観点から、新規制がん剤の開発を中心に9名、放射線療法の基礎的な研究を推進する目的で8名の計画班員を選んだ。遺伝子治療については欧米に比して大きな遅れをとっているが、ウイルスベクターや他の遺伝子導入法等の開発などの重点的推進が必要であり、この領域の研究推進のため、7名の計画班員を選出した。また、がんの免疫療法や分子標的療法などについては、最近、臨床応用につながりそうな研究が報告されているので、これら応用への期待のつながる研究について免疫療法7名、分子標的治療9名の重点的支援を行うことを決定した。以下の研究方針を設定し、それらの基準に基づいて、研究を推進するために38名の計画班員を選定した。診断については、それぞれの患者の特性やがんの「個性」を診断して最小限の副作用で最大限の効果が期待できるような的確な「オーダーメイド」治療を行うことのできる指針を提供することががん患者のQuality of Lifeをよりよいものにする観点から、がんの「個性」診断の基礎的研究を行う研究者6名を選定した。したがって、治療については、これらの基礎研究の発展こそが治療への応用につながることを念頭にさらに基礎研究を推進していくことや、これら基礎研究の臨床への橋渡し的な研究の推進に対しても積極的にサポートする方針を決定した。このような観点から、新規制がん剤の開発を中心に8名、放射線療法の基礎的な研究を推進する目的で7名の計画班員を選んだ。遺伝子治療については欧米に比して大きな遅れをとっているが、ウイルスベクターや他の遺伝子導入法などの開発などの重点的推進が必要であり、この領域の研究推進のために5名の計画班員を選出した。また、がんの免疫療法や分子標的療法などについては、最近、臨床応用につながりそうな研究が報告されているので、これら応用への期待のつながる研究について免疫療法5名、分子標的治療7名の重点的支援を行うことを決定した。5名の評価委員によって、計画班員・公募班員の評価を行った。これらの評価をもとに総括班メンバーで計画班員の見直しを行い、平成14年度は以下の研究方針を軸として70名の計画班員を選定した。診断については、がんの早期診断やがんの「個性」診断の基礎的研究を行う。それぞれの患者の特性やがんの「個性」を診断して最小限の副作用で最大限の効果が期待できるような的確な治療指針を提供することは、がん患者のQuality of Lifeをよりよいものにする観点からきわめて重要である。必要な患者に対してのみ、必要な治療を行う「オーダーメイド医療」もしくは「個別化医療」(personalized medicine)は21世紀の医療の目指すべき方向であり、がんの診療にもこのような考え方を生かしていくことは、不必要な治療によって患者の予後を悪くすることがそれほど稀ではない現在のがん診療の問題点を解決するために非常に重要である。治療については、免疫療法・遺伝子治療・化学療法や分子標的療法・放射線療法・新規分子標的薬開発の5分野の基礎研究をさらに発展させる。特に、近年、分子標的治療薬として開発された抗癌剤が、効果的である上に、副作用が非常に少ないことから注目を浴びている。本研究班においても、分子細胞生物学や免疫学・発生工学などの成果によってがん化の分子機構やがんに対する免疫の仕組み・化学療法剤や放射線ががん細胞を殺す機序などが明らかになってきており、分子標的治療薬の開発につながるものと期待される。また「がん特定」のその他5領域と連携して、シンポジウムを開催した。

がんの診断と治療に関する基礎的・基盤的な幅広い研究の推進を目的とし、研究を推進した。診断については、分子レベルで、それぞれの患者の特性やがんの「個性」を診断して最小限の副作用で最大限の効果が期待できるような的確な治療指針を提供することを目指した。その結果、癌細胞におこった遺伝子増幅を解析した結果、抗癌薬耐性や放射線治療抵抗性に関与するアポトーシスインヒビターの同定など「がんの個性診断」の基礎研究が進んでいる。治療については、分子細胞生物学や免疫学・発生工学などの成果によってがん化の分子機構やがんに対する免疫の仕組みが明らかになってきていることなどを踏まえた形で、これまでの免疫療法・化学療法・放射線療法・分子標的治療・遺伝子治療の5分野の基礎研究をさらに発展させた。免疫分野では、抗原提示能の高い樹状細胞を誘導する研究などが進んだことにより、それらを利用した癌免疫療法の基盤研究が急速に進展している。癌治療のための分子標的研究に関しては、幅広い範囲での分子の同定が進みつつあり、これらを利用した治療法やこれらを標的とする治療薬の開発が行われている。新規抗癌剤の探索に関しても有望な物質が見いだされ、臨床試験に入っているものもある。遺伝子治療分野では細胞特異的に高度に発現する機能や細胞特異的に感染する機構を持つアデノウイルスベクターの改良が進み、動物実験でもその有望性が示されつつある。放射線治療についても、感受性に関与する遺伝子研究や感受性を規定する遺伝子に関する研究が進み、それらの情報が放射線治療の効率を高める治療法への応用につながりつつある。がん細胞におこった遺伝子増幅を種々の遺伝子解析手法を利用して調べた結果、抗がん薬耐性や放射線治療抵抗性に関与するアポトーシスインヒビターの同定など「がんの個性診断」の基礎研究が進んだ。さらに、遺伝子の発現情報を利用した抗がん剤の投与前感受性予測法なども成果が上がり、実用化を踏まえた段階に達しつつある。免疫分野では、抗原提示能の高い樹状細胞を誘導する研究などが進んだことにより、それらを利用したがん免疫療法の基盤研究が急速に進展している。一部では、すでに臨床研究が開始されている、がん治療のための分子標的研究に関しては、幅広い範囲での分子の同定が進みつつあり、これらを利用した治療法やこれらを標的とする治療薬の開発が行われている。新規抗がん剤の探索に関しても有望な物質が見いだされ、臨床試験に入っているものもある。さらに、遺伝子の発現を抑える新しい技術なども開発されてきている。
明治期長野県の小学校における学年学級制の定着とその影響に関する実証的研究

1.研究の方法本研究では,明治期長野県の小学校における学年学級制の定着に関し,国および県レベルの法規,長野県内の小学校約100校の小学校誌(沿革史),および日野尋常小学校関係史料(中野市立図書館所蔵)の分析を行った。2.研究の成果学年学級制の制度化の前提条件として,就学年令の統制に関する歴史的過程の解明を試みた。その結果,明治前半期では就学年令および就学時期に相当のばらつきがあり,その統制が政策的な課題となっていたこと,また,およそ明治20年代後半にはそのばらつきが縮小し,徐々に就学年令と就学時期の統制が厳密化され,定着していったことが明らかになった。さらに,就学年令の統制は子どもの心身の発達に注目する学校衛生学的観点がら正当化されたが,近代学校の成立そのものが子どもの生活における「遊」の段階と「学」の段階を分断し,子どもの発達への注目を促したことを明らかにした。また,日野尋常小学校の学校日誌等の分析を通じて,学校年度および学年暦の制度化の歴史的過程についても明らかにした。そこでは,明治前半期の試験を区切りとする個別的な時間サイクルが,学校年度の制度化と定着,学校行事の定着,進級試験の廃止などを通じて,ほぼ明治30年代になると4月1日から3月末日をサイクルとし,学期や学校行事によって区切られる学年暦が定着してくることが明らかになった。そのほか,長野県内の小学校における学校規模と学級編成の変遷等の分析を行った。
新規分子ＣＡＭＤＩによる大脳皮質構築の制御と精神疾患発症の関連研究

これまでに統合失調症関連蛋白質DISC1と結合する新規の蛋白質CAMDIを発見した。CAMDI遺伝子のノックアウトマウスを作製した結果、神経細胞の移動異常、樹状突起の短縮、スパイン密度の増加が認められた。そこで本年度は行動学的な解析を行い、精神疾患様の表現型の有無を調べた。その結果、多動や社会性の低下、繰り返し行動の増加など、自閉症を含む発達障害とよく似た表現型が認められた。CAMDI遺伝子は染色体2q31の領域に存在するが、この領域は自閉症患者におけるリスク領域であることも知られている。CAMDIの異常が発達障害の発症に関与する可能性が示唆された。統合失調症は人口の約1%で発症すると言われており、躁(そう)や鬱(うつ)の症状を示す。その多くは思春期以降に発症し慢性、進行性の症状を示す。しかしその根本的な発症要因は未だ解明されておらず、遺伝的、環境的な要因が存在すると考えられている。CAMDIは胎児発生中の大脳皮質中間帯に発現が認められた。秩序だった神経細胞の移動により、将来の大脳皮質6層構造の形成が行われることが知られている。これらのことから、子宮内遺伝子導入法を用いてマウス胎児においてCAMDI遺伝子の発現を抑制したところ、有意に神経細胞の移動が阻害された。次に、CAMDI遺伝子のノックアウトマウスを作製した。子宮内遺伝子導入法を用いることでノックアウトマウスにEGFP遺伝子を発現させ、個体内における個々の神経細胞の移動や突起伸長、スパインを可視化させて詳細な観察を行った。その結果、神経細胞の移動異常、樹状突起の短縮、スパイン密度の増加が認められた。これらの所見は、精神疾患患者の剖検脳でも確認されていることから、CAMDIノックアウトマウスを精神疾患モデルマウスとして考えることができる可能性が示唆された。そこで行動学的な解析を行い、精神疾患様の表現型の有無を調べた。これらのことから、CAMDIが脳の発達に重要な役割を担うこと、さらにCAMDIの異常が発達障害の発症に関与する可能性が示唆された。統合失調症は人口の約1%で発症すると言われており、躁(そう)や鬱(うつ)の症状を呈す。しかしその根本的な発症要因は未だ解明されておらず、遺伝的、環境的な要因が存在するといった漠然とした考察があるのみである。秩序だった神経細胞の移動は将来の大脳皮質6層構造の形成に重要な役割があることも知られている。これらのことから、子宮内遺伝子導入法を用いてマウス胎児においてCAMDI遺伝子の発現を抑制したところ、有意に神経細胞の移動が阻害されることを申請者は明らかにしてきた。この結果を受けて本年度は、CAMDI遺伝子のノックアウトマウスを作製した。CAMDI遺伝子ノックアウトマウスは外見的には正常に生育し、生殖も可能であった。大脳皮質層構造のマーカー蛋白質(II/III層:Cux1, V層:Ctip2)に対する抗体を用いて大脳皮質の染色を行った。その結果、II/III層の神経細胞を標識するCux1抗体で染色される細胞が、V, VI層にも存在することが明らかとなった。このことは、II/III層の神経細胞の移動が異常であることを示す。更に、子宮内遺伝子導入法を用いることでノックアウトマウスにEGFP遺伝子を発現させ、個体内における個々の神経細胞の移動や突起伸長、スパインを可視化させて詳細な観察を行った。これらの所見は、精神疾患患者の剖検脳でも確認されていることから、CAMDIの異常が精神疾患の発症に関与する可能性が示唆された。ノックアウトマウスの作成において、動物舎の改築があり多少の時間的ロスが発生したものの、概ね順調に作成することが出来ている。子宮内遺伝子導入法を用いた発現阻害実験での神経細胞移動の異常という結果をノックアウトマウスにおいても再現出来ている。実際のヒト精神疾患患者の剖検脳における所見と似た表現型が認められたことから、今後は更なる研究を進めていく。

組織学的な解析として、ヒト精神疾患患者の剖検脳において異常所見があると報告されている前頭前野内側部や海馬歯状回、CA1領域などを中心に解析を行う。様々な精神疾患において、興奮性入力と抑制性入力のバランスの異常が原因ではないかという仮説が近年疑われている。そこで、抑制性神経のマーカーである、GABAやPVを発現する神経細胞について解析を進める。子宮内遺伝子導入法による解析から、CAMDI遺伝子の発現を抑制すると脳の高次機能に直接的な影響を与えていると考えられる。そこで行動学的な解析として、CAMDI遺伝子のノックアウトマウスを用いて記憶形成や行動学的な解析を行い、精神疾患様の表現型の有無を調べる。現在、C57BL/6マウス系統へのバッククロスを終了した。妊娠時に手術を行うと子育てをする確率がかなり減少する傾向が認められている。鬱(うつ)の指標となる試験や、新規環境(ストレス)への適応、社会的相互作用などを中心に解析を行う。いずれの研究も進行状況を踏まえながら行うが、前年度に引き続きノックアウトマウスの解析を行うため、マウスの飼料や繁殖に必要な消耗品を購入する。また、組織学的解析を主に行なうことから、抗体や組織染色のための消耗品を購入する。また、初代細胞やスライス培養を用いた培養系における研究を行うため、プラスティックディシュなどを必要とする。平成25年度はノックアウトマウスの行動解析に加え、酵母を用いた新規結合蛋白質のスクリーニングを行う。プラスミドの精製やライブラリーの作製、購入を必要とする。また、成果発表、研究成果投稿料が必要であると考えられる。
イタリアンライグラスにおけるセルロース合成変異の分子遺伝学的研究

セルロースは反芻家畜において重要な栄養源であり、近年ではエタノールの原料としての利用にも注目が集まっている。本研究では、植物のセルロース合成機構解明のため、茎葉が非常にもろい「カマイラズ」と呼ばれる形質を示すイタリアンライグラス系統の飼料成分分析を実施し、同系統のセルロース含量が極端に低く、それを相補するようにヘミセルロース含量が高いことや、正常系統と変異系統をもとに養成した戻し交配集団の表現型の調査により、カマイラズが劣性の1遺伝子支配形質であることを明らかにした。さらに、戻し交配集団を用いたバルクDNA解析により、カマイラズ形質関連遺伝子座のライグラス第4連鎖群上の座乗位置を明らかにした。本年度は変異系統の飼料成分分析を行った。その結果、変異系統の総繊維含量は他の品種・系統よりも低く、セルロース含量が他の品種系統の半分程度の値であることが明らかとなった。一方、ヘミセルロース含量においては他の品種・系統より高い値を示すことを見出し、本系統がセルロース合成の変異系統であることを確認した。また本変異に関与する遺伝子座特定のためのDNAマーカー解析では、昨年度養成したカマイラズ系統および正常系統のF1集団において、出穂茎の強度調査および飼料成分分析を行ったが表現型分離が認められなかったことから、カマイラズ形質が劣性遺伝することが示唆された。そこで、各F1集団から個体を選び、シブクロスあるいはカマイラズ系統親個体へのバッククロスによりさらに世代を進め、15の解析集団(バッククロス5+シブクロス10集団)を養成した。このうちバッククロス由来1集団の表現型を調査した結果、表現型が1:1に分離することを確認できたことから、DNAマーカー解析に利用できる集団の獲得に成功したことが明らかとなった。さらに本課題を推進するため、細胞壁合成変異(カマイラズ)系統における細胞壁合成関連遺伝子の発現解析をリアルタイムPCRにより行った。種々の遺伝子を解析した結果、リグニン合成関連遺伝子4CLの発現量が正常系統の5060分の1に減少していることを発見した。本発現解析の情報を上記DNAマーカー解析に統合し、活かすことで、本小課題の研究の質がより高まると同時に進捗が加速すると思われる。なお、発現解析で得た本知見は、セルロース合成変異がリグニン合成にも何らかの影響を与えていることを示唆するものであり、セルロースおよびリグニンの同調的な合成機構解明の足掛かりになるものとして、学術および実用面において大変興味深いものである。本課題の全研究期間を通じて以下の成果を得ることができた。2011年度は変異系統の特性の調査を行った。即ち、変異系統のカマイラズ形質は茎葉の柔軟性が他の品種より極端に低く、特に出穂茎においてその違いが明らかであったことから、これらの特性を数値化するため、出穂茎の物理的強度をフォースゲージにより測定し、本系統が既存品種・系統の出穂茎が折損する負荷の55%程度で折損し、折損部が乖離するという特徴を明らかにした。また、飼料成分分析を行い、変異系統の総繊維含量は他の品種・系統よりも低く、セルロース含量が他の品種系統の半分程度の値であり、ヘミセルロース含量においては他の品種・系統より高い値を示すことを見出した。2012年度はカマイラズ形質遺伝子座解析するため、当初、変異系統と正常系統を交配して得た5つのF1集団を養成した。これら集団が解析に利用できるかを確認するため、曲げ強度や飼料成分分析による表現型調査を実施したが、明瞭なカマイラズ形質を示す個体はどの集団にも存在せず、集団内において表現型分離を認めることが出来なかった。このことからカマイラズ形質は少なくとも優性遺伝しないことが示唆された。そこで、F1集団から個体を選び、シブクロスあるいはカマイラズ親へのバッククロスによりさらに世代を進め、15集団(バッククロス5+シブクロス10)を養成した。2013年度では、バッククロス由来1集団(BC1F1集団)の表現型がカマイラズ形質と正常形質で1:1に分離しことから、カマイラズ形質が遺伝的に劣性の1遺伝子により支配されていることを確認した。さらに、BC1F1集団および126個のライグラスSSRマーカーを用いたバルク分離型解析により、5個のマーカーをスクリーニングした。既存のライグラス連鎖地図においてこれらのマーカーの位置情報から、当該遺伝子座が第4連鎖群上に存在することを明らかにした。本研究では、セルロース合成系に変異を持つと思われるイタリアンライグラスのカマイラズ系統を分子遺伝学的手法により解析し、イネ科植物の細胞壁合成機構解明を試みる。(1)カマイラズ系統の特性解明カマイラズ系統および既存の8品種・系統をワグネルポットに個体植えして育成した。

予備試験の結果から、本研究で用いている系統のカマイラズ形質は茎葉の柔軟性が他の品種より極端に低く、特に出穂茎においてその違いが明らかであったことから、育成した個体を春化処理して出穂を促し、品種・系統間の比較を行った。開花期に達した出穂茎を個体ごとにサンプリングし、5本束にした際の物理的強度をフォースゲージにより測定した結果、カマイラズ系統の出穂茎は既存の8品種・系統の出穂茎が折損する負荷の55%程度で折損し、折損部が乖離するという特徴を示した。現在、この特徴が何に由来するかを細胞壁構成成分から明らかにするため、各品種・系統の飼料成分分析を行っている。(2)DNAマーカー解析用集団の養成カマイラズと正常系統を交配して得た5つのF1集団を各集団につき50粒程播種し、集団内におけるカマイラズ形質の表現型分離を調査した。今回は出穂に至っていない育成途中の個体について葉の折損に関する予備調査を行った。出穂茎同様、カマイラズ系統の葉は柔軟性に欠き、折り曲げると折損部位の繊維が葉脈に沿って露出するが、正常系統にはそのような傾向はない。これを指標に各個体の葉の葉身を折り曲げて調査したところ、明瞭なカマイラズ形質を示す個体はどの集団にも存在せず、集団内において表現型分離を認めることが出来なかった。このことからカマイラズ形質は少なくとも優性遺伝しないことが示唆された。現在、出穂茎においてもカマイラズ形質の表現型分離が認められない場合を想定して、F1集団をカマイラズ系統に戻し交配し、新たな解析用分離集団の養成を試みている。研究計画当初、平成24年度はDNAマーカー解析中心に研究を進める予定であったが、劣性形質を解析するめの集団を養成した分、DNAマーカー解析そのものには遅れがある。しかし、それを補う形で、当初予定されていなかった二次細胞壁合成関連遺伝子の遺伝子発現解析を行い、変異系統のリグニン合成関連遺伝子4CLの発現量が特徴的であることを見出すことに成功している。カマイラズ形質がF1解析集団において表現型分離しない劣性形質である可能性があることから、F1集団に由来する個体のカマイラズ系統への戻し交配の必要性が出てきている。ここまでは想定内であったが、カマイラズ系統の生育が当初の予想よりもかなり遅いことから、その分、次世代の解析用集団養成に時間がかかると思われる。新たに養成した解析集団を用いて、SSRプライマーによる多型解析を行うとともに、解析集団における二次細胞壁合成関連遺伝子の発現解析を行い、変異系統に特異的な発現様式を示す新規遺伝子の有無を調査する。SSRにより遺伝子座を特定した後、イネのEST情報等により、比較ゲノム解析を行い、当該遺伝子座近傍のマーカーを高密度化する。飼料成分分析によりカマイラズ系統および正常系統の細胞壁構成成分を解析して系統間の違いを明らかにするとともに、既知の細胞壁合成関連遺伝子の発現解析を実施し、カマイラズ形質との関連を調査する。また、カマイラズ系統および正常系統を交配して得たF1個体をカマイラズ系統へ戻し交配してDNAマーカー解析用集団を養成した後、解析集団の形質調査、連鎖地図作製、セルロース合成変異形質のQTL解析を行う。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、物品費・旅費・謝金(英文校閲、実験補助)・その他(プライマー合成)に使用する。
下垂体の転写因子間ネットワークの解析と細胞形質の改変

平成15年度は表記課題を達成するための準備期間として、下記のような実験を進めた。1)継続的に転写因子間のネットワークを解析し、前年度は下垂体の転写因子で我々が独自にクローニングした転写因子POU-2に相互作用する共役因子であるCLIM2について、さらに他の因子と相互作用する因子を複数クローニングしたが、これらの因子の解析を行った。2)その結果、CLIM2はPOU-2のようなLIMホメオドメイン構造をもち、DNA結合ドメインを持たないLIM only因子グループのうちLMO1,LMO4およびLMO1のホモログDAT1に結合することが明らかになった。中でもDAT1は、幾つかの下垂体ホルモン遺伝子の発現調節に関わる脳が分泌するシグナルホルモン分子であるドーパミンによって転写レベルが調節されていることが報告されている分子であり、脳からのシグナル-共役因子-転写因子-ホルモン遺伝子発現という調節経路の一端が明らかになった。さらに興味あることに、一本鎖DNA結合タンパク質(SSBP2:single strandded binding protein2)がCLIM2に対する相互作用因子としてクローニングされたことで、このことによりLH2がRNAポリメラーゼの働く転写点へと機能する分子機構の一部が実証されたことになる。3)以前より作成した下垂体転写因子を発現ベクターに組み込んだクローンを用いて、生殖腺刺激ホルモン遺伝子の転写に対する効果の有無を検討し、幾つかの因子が転写の促進や抑制に働くことを確認した。また、結合領域を共有する複数の因子間に相互にその活性を促進する関係を見出した。しかも、その作用に対して常に抑制的に働く因子も存在することも明らかになった。平成12年度は表記課題を達成するための準備期間として、下記のような実験を進めた。1)下垂体で発見された48種の転写因子クローンのコレクションを作った。2)それぞれのクローンを大腸菌にトランスフォーメーションして、クローンの保存を行った。また、プラスミドDNAを調製しての、それぞれのベクターの特異プライマーを設計・合成して、塩基配列を決定した。30種のクローンについて、塩基配列を確認し、1種のクローンについては、異種の遺伝子が送付されていたために再送付を依頼した。残るクローンについては、特異プライマーを再設計しているところである。3)各クローンのDNAを発現ベクターに組込むため、翻訳開からのcDNAのみを調製するためのPCR用特異プライマーを設計し、発現ベクターに合わせたDNA断片にした後に、順次、それぞれを大腸菌、酵母、動物細胞用の発現ベクターに組み込む作業を行った。これまで6種のクローンについて組換えを進めており、それらの組込み部位の塩基配列解析を行った。4)転写因子間相互作用の解析を展開するために、酵母の発現系の準備を進めた。昨年度、明治大学に研究場所が移動になり、それまでに用意した実験系を一時中断し、また、実験スタッフの変更や、放射性物質が使えないなどの条件のため、改めて、酵母系やインビトロ実験系を稼働させるために手間取った。しかし、感度や必要時間などの点で、従前の状態に近い実験系を立ち上げた。5)転写因子の下垂体ホルモン遺伝子の発現調節への機能を解析するために、培養細胞発現系の準備を行った。インビトロ相互作用検出系のについても実験系を組み直し、さらに、バクテリアを使う相互作用検出系を導入するため、ベクターの構築と検出系の改良を始めた。平成13年度は表記課題を達成するための準備期間として、下記のような実験を進めた。1)下垂体で発見された48種の転写因子クローンのコレクションの整理を行い、データベース化をすすめた。また、プラスミドDNAを調製しての、それぞれのベクターの特異プライマーを設計・合成して、塩基配列を決定し、'30種のクローンについて、発現ベクターに組み込むために合成プライマーを作製して、コード領域を増幅作業を進めた。

3)これまで12種のクローンについて、動物細胞、酵母、大腸菌での発現ベクターへの組換えを進めている。また、蛍光タンパク質を融合させた発現ベクターへの組込みも進行中である。順次にそれらの組込み部位の塩基配列解析をおこない、最終的な発現ベクターの構築を完了する。4)転写因子間相互作用の解析を展開するために、酵母の発現系の準備を行い、14年度の研究の遂行の準備が整った。5)転写因子の下垂体ホルモン遺伝子の発現調節への機能を解析するために、培養細胞発現系の準備を行った。バクテリアを使う相互作用検出系を導入するため、ベクターの構築と検出系の検討を行ったが、非特異的陽性クローンの頻発のためにアッセイ系に用いることが現時点では困難で有ることが確認された。6)下垂体で発現する転写因子群の網羅的な解析を行うために、転写因子のDNAチップを用いたマイクロアレイ解析による大量解析系の検討を始めた。平成14年度は表記課題を達成するための準備期間として、下記のような実験を進めた。1)下垂体で発見された48種の転写因子クローンのコレクションのDNAの整理し、それぞれのクローンを大腸菌にトランスフォーメーションして、クローンの保存を行った。2)それぞれのベクターの特異プライマーを設計・合成して、塩基配列を決定し、30種のクローンについて、発現ベクターに組み込むために合成プライマーを作製して、コード領域を増幅をし、18種のクローンについて発現ベクター各種に挿入した。3)転写因子間相互作用の解析を展開するために、酵母の発現系を確立し、転写因子のcDNAをpBDGAL4に組み込み、pADGAL4に組み込んだ下垂体cDNAライブラリーとともに酵母細胞に導入して発現させて、相互作用因子のクローニングを行った。その結果、LH2にはCLIM2が相互作用することが判明した。さらに、CLIM2に対する相互作用分子をクローニングし、LHと共通するドメイン構造LIMを持つ複数の分子が結合することを明らかにした。また、そうした構造を持たない基本転写因子群に含む分子が新たにクローニングされ、下垂体ホルモン遺伝子発現に関わる転写因子ネットワークの一端が明らかになった。4)転写因子の下垂体ホルモン遺伝子の発現調節への機能を解析するために、培養細胞発現系を整えた。F生殖腺刺激ホルモン遺伝子の転写開始点上流をアルカリフォスファターゼに連結したレポーターベクターを用いて、CHO細胞やLβT2細胞に転写因子を発現させて調べた。その結果、複数の因子がホルモン遺伝子の転写を促進すること、いくつかは抑制的に働くこと、また、協調した転写促進などが確認でき、そうした転写因子の転写ネットワークの全体像の解明を進めている。表記課題を達成するための平成1215年度の期間で、下記のような実験を進めた。