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ミトコンドリア外膜蛋白質の輸送機構とその破綻の生理的意義

ミトコンドリア外膜複数回膜貫通蛋白質は細胞質で合成された後、ミトコンドリア外膜へと輸送される。ミトコンドリア蛋白質輸送機構の研究は酵母を用いた遺伝学あるいは生化学的手法によりかなりの部分について明らかにされてきているが、複数回膜貫通蛋白質輸送の分子機構については現在まで全く不明であった。そこで本研究では複数回膜貫通蛋白質に焦点を当ててその輸送分子機構の解明を目指した。蛋白質が正しくその機能を発現するためには発現のタイミング、量およびその局在部位への輸送が厳密に制御される必要がある。ミトコンドリア蛋白質は細胞質リボソームで合成された後にミトコンドリアへと輸送され個々の蛋白質特有の機能を発現する。私は本研究で輸送の最初のステップである膜への標的化機構を明らかにする目的でミトコンドリア外膜蛋白質の網羅的発現抑制を行い複数回膜蛋白質輸送に異常を呈する因子の検索を行った。その結果、ミトコンドリア外膜蛋白質Tom70を同定した。Tom70をRNAiにおより発現抑制するとミトコンドリア複数回膜貫通蛋白質の輸送が障害された。逆に過剰発現すると輸送が亢進された。さらにこれまで多くのミトコンドリア蛋白質輸送に際して重要な役割を果たすと考えられてきた外膜輸送チャネルTom40は複数回膜貫通蛋白質輸送には必要ないことを明らかにした。生化学的解析により複数回膜貫通蛋白質輸送にはATPを必要とすることも併せて明らかにした。数回膜貫通蛋白質のトポロジー形成には膜間スペース成分の要求性も認められた。本研究によりこれまで謎であったミトコンドリア外膜の複数回膜貫通蛋白質のトポロジー形成の分子機構の一端を明らかにすることができた(Journalof Cell Biology 2007)。前年度までにミトコンドリア(以下Mt)外膜のポリトピック蛋白質のモデル蛋白質として末梢型ベンゾゼアゼピン受容体PBR(Mt外膜5回膜貫通蛋白質)の輸送機構を生化学的に解析するため半透過性細胞(セミインタクト細胞)を用いた試験管内輸送反応系を立ち上げた。本年度はPBRの輸送初期過程すなわちMt外膜標的化に必要な外膜受容体を同定するため既知の膜受容体のRNAiスクリーニングを行いPBRの輸送への影響を網羅的に探索した。その結果、これまで外膜受容体としてはあまり機能が知られていないTom70の発現抑制によりPB Rの輸送が顕著に阻害されることを見いだした。さらにPBRはTom70の細胞質領域と結合することからTom70がMt外膜ポリトピック蛋白質の外膜受容体として機能することを明らかにした。その他のMt外膜ポリトピック蛋白質(Mfn2:2回膜貫通、MITOL:4回膜貫通)についても調べたところPBRと同様の結果が得られたことからTom70がMt外膜ポリトピック蛋白質全般の外膜受容体として機能する可能性を示した。さらに輸送機構に関連して以下のことを明らかにした。(1)エネルギー要求性について調べたところPBRのMt外膜標的化以降の過程にATP加水分解エネルギーが必要であること、(2)明確な輸送中間複合体を形成せず膜標的化後は速やかに膜内配向性を形成することを明らかにした。以上、全く解明されていなかったMt外膜ポリトピック蛋白質輸送機構について新しい知見を得ることができた。

PBRの輸送に関して外膜Tom70が機能することを明らかにした。またその他のMt外膜ポリトピック蛋白質(Mfn2 : 2回膜貫通、MITOL : 4回膜貫通)についても調べたところPBRと同様の結果が得られたことからTom70がMt外膜ポリトピック蛋白質全般の外膜受容体として機能する可能性を示した。さらに輸送機構に関連して以下のことを明らかにした。(1)エネルギー要求性について調べたところPBRのMt外膜標的化以降の過程にATP加水分解エネルギーが必要であること、(2)明確な輸送中間複合体を形成せず膜標的化後は速やかに膜内配向性を形成することを明らかにした。以上、全く解明されていなかったMt外膜ポリトピック蛋白質輸送機構について新しい知見を得ることができた。今年度は外膜輸送装置複合体構成因子であるTom20の分解がユビキチンープロテアソーム経路に依存すること、さらにその分解抑制が細胞の生存に重要であることを見出した。
キメラ遺伝子の発がん機構

申請者は、染色体転座に起因するキメラ癌遺伝子による腫瘍化のメカニズムを明らかにすべく、t(12;16)が原因とされる粘液型脂肪肉腫に注目し、Cre-loxPシステムを用いてin vivoでTLS-CHOPキメラ遺伝子を発現するコンデイショナルノックインモデルマウスの作成に成功した。しかし、現在まで、本マウスの皮膚組織及び脂肪組織にTLS-CHOP陽性細胞の存在は確認されているが、腫瘍性病変は確認されていない。このような事実から、正常の個体においては、細胞増殖に対してはTLS-CHOP遺伝子産物は何ら影響を与えないことが示唆された。本研究においては、昨年度TLS-CHOPコンディショナルノックインマウスとp53-/-マウスを交配し、TLS-CHOP陽性細胞数の変化、腫瘍化能の検討をしてきたが、排除機構の同定は非常に難しいと考えられた。さらに、今年度この現象がTLS-CHOP以外のキメラ遺伝子でみられるかどうか検討するため、骨髄性白血病のTLS-ERGキメラ遺伝子のモデルマウスを作成することを試み現在キメラマウスを得ている。一方、キメラ遺伝子が発現することにより、細胞分裂にネガティブな機構が働くと想定した場合、細胞周期チェックポイントが活性化することが予測される。このようなことから、実際にTLS-CHOPが発現している粘液型及び円形細胞型脂肪肉腫の検体において、G2/M期チェックポイントが働いているかどうか検討した。具体的には、Chk1遺伝子のSer345のリン酸化をリン酸化認識抗体で検出することにより検討した。その結果、検討した5例の症例すべてにおいて、腫瘍細胞の40から60%にChk1遺伝子のリン酸化が確認された。正常の脂肪細胞では、Chk1遺伝子のSer345のリン酸化は見られないことから、TLS-CHOPがゲノム維持機構に何らかのストレスを与える可能性が示唆された。今後は、ゲノムストレスも含め、その詳細を検討して行く予定である。
看護系大学が示すべき「高校生の自己特性と看護とのマッチングに有効な要素」の明確化

大学数の増加等により、自己の特性と看護との親和性をよく検討しないまま看護系大学に進学する学生が増えている。一方で、看護系大学側から進学希望者に対し看護職・看護学生として求められる資質について明確な情報提供をしているとは言い難い。これらのことから本研究では、進路選択の際の自己特性と看護とのマッチングに着目し、看護系大学、看護系大学生とその保護者、高校教師への調査を行い、看護系大学が示すべき「高校生の自己特性と看護とのマッチングに有効な要素」を明らかにする。
改良型温室効果ガス3成分同時分析法開発に関する研究

温室効果ガス3成分同時分析法(既開発)を改良し、分離カラム構成の見直し、添加ガスの選択や、自動注入に関する手法の考案することで、より簡便かつ安価なシステムを開発した。ECD検出器の代替としてPDD(パルス放電イオン化)検出器の使用の目処がたった。従来2槽の恒温槽を要する設計を改良し1槽で分析可能とした。改良型ガス自動注入器の実用に目処が立った。既に製作済みの試作機で得られたガスクロマトグラフ保持時間にもとつくシミュレーション計算を活用して、さらなる好適条件を検討した。当初の研究計画では、以下のような改良ポイントを想定した。1:これまで分離特性の面から扱いが困難であったキャピラリーカラムの活用も検討する。2:ガスクロマトグラフ恒温槽を1槽化(従来は2槽)の可能性について検討する。3:電子捕獲型検出器(ECD)による高感度の亜酸化窒素(N_2O)検出について、より一層の好適条件を、温度、流量、メークアップガス混合比等の組み合わせによって検討する。4:メタン(CH_4)検出に使用する水素炎イオン化検出器(FID)に替わる検出器(脚注参照)(PID、PDDなど)の使用可能性を検討し、性能を比較する。5:注入方法について、従来の既製のガスクロマトグラフ部品のみならず、効率的な手法について検討し、試料の注入過程の効率化をはかるこの中で、平成19年度計は、改良ポイント1,2について特にシミュレーション計算によって検討した。1については、分離能そのものの性能では、充填カラムの優位性は変わらなかったが、3段分離のうち1段ないし2段目を充填カラムとし、最終段をキャピラリーカラムとする(この最終段にはPoraBONDQ25m 0.53μmというものを使用する)手法について、可能性があること結論した。この改良によって、検出器に進入する際のピークシグナルが大幅にシャープとなることが期待される。実際の適用については20年度に実施し、これを使用した上で、35についての適用性についても検討する予定である。また、2については、2段目の充填カラムの温度条件如何にかかわる問題で、恒温槽全体を100°C120°Cにすれば、1槽での3成分分離も可能とシミュレーションしたが、これについても、20年度に実際に検証する。温室効果ガス3成分同時分析法の改良のため、課題開始時に掲げた具体な、分析手法改良ポイシト(5点)を以下に再列挙する。2:ガスクロマトグラフ恒温槽の制御方法について、より省スペースな方法を検討する。3:電子捕獲型検出器(ECD)による高感度の亜酸化窒素(N2O)検出について、より一層の好適条件を、温度、流量、メークアップガス混合比等の組み合わせによって検討する。4:メタン(CH4)検出に使用する水素炎イオン化検出器(FID)に替わる検出器(脚注参照)(PID、PDDなど)の使用可能性を検討し、性能を比較する。5:注入方法について、従来の既製のガスクロマトグラフ部品のみならず、効率的な手法について検討し、試料の注入過程の効率化、低コスト化をはかる。上記のポイントを踏まえ、平成20年度は、1については、特に二酸化炭素と亜酸化窒素のキャピラリーカラムを活用した完全分離手法について検討した。大気中濃度が二酸化炭素の方が1000倍高いため、良好な分離条件を見出すのに難航したが、一部液体窒素を活用した低温濃縮法を採用することで、分離そのものは可能となった。ただし、実用化のためには、冷媒を使用しないより簡便な手法が求められる。2については、既存のガスクロマトグラフでない安価な保温用オーブンを活用することでコスト削減に道筋ができた。3については、ECDへのメタンの添加比率等を詳細に検討し、混合比の最適条件を見出した。4については、PDDを活用したN2Oの検出が可能となった。これにより、3成分を1検出器で計測できる可能性が拓けた。5については、自動注入法に関する試作器の開発に着手した。但し、未だ動作安定性の面で問題があるため、製品化にむけて試作機の完成度(エラー率の低減等)向上をはかりたい。温室効果ガス3成分同時分析法の改良のため、課題開始時に掲げた具体的な、分析手法改良ポイント(5点)を以下に再列挙する。3:電子捕獲型検出器(ECD)による高感度の亜酸化窒素(N20)検出について、より一層の好適条件を、温度、流量、メークアップガス混合比等の組み合わせによって検討する。

5:注入方法について、従来の既製のガスクロマトグラフ部品のみならず、効率的な手法について検討し、試料の注入過程の効率化、低コスト化をはかる。上記のポイントを踏まえ、平成21年度は、過去2カ年で残された課題である5の試料自動注入について試作をさらに進めた。試料びんの重力式搬送機構と空圧駆動のガス注入シリンジ動作、回転式試料びん装填等の機構を見直した結果、エラー率(分析中に誤動作等で停止する等のトラブル)は、大幅に縮減し、従来の100回に1度から500回に1度程度まで向上した。残る課題は、ビンの個体差から生じる搬送動作の不安定さであるが、これは次期研究課題において解決したい。
エボラウイルス・ヌクレオカプシド形成機構の解析

エボラウイルスVP35はRNAポリメラーゼの補因子であり、NPやVP24とともにヌクレオカプシドを形成する。我々はNPとVP35の相互作用に関して解析を行い、NPのC末端を介してVP35が相互作用することを明らかにした。さらに、過剰量のVP35を発現させると、inclusionbodyの形成が阻害されること、あらに、NP-RNA複合体の形成量が減少することを見出した。以上の結果は、NPとVP35の発現量がヌクレオカプシドの形成に重要であること、すなわちエボラウイルスの増殖に重要であることを示している。エボラウイルスはヒトを含む霊長類に対して高い致死率の出血熱を引き起こす。しかし、その高い病原性から、感染性ウイルスを用いた研究はBSL4施設内に限られており、その研究はあまり進んでいない。エボラウイルスのゲノムRNAはNP、VP30、VP35、Lとともに、転写・複製の基本単位であるヌクレオカプシドを形成する。本研究課題では、成熟型ヌクレオカプシドの構成因子であるNP、VP35、VP24に焦点を当て、エボラウイルスのヌクレオカプシド形成機構を明らかにすることを目的とした。初めに蛋白質発現系を用いて、各ウイルス蛋白質の発現量がヌクレオカプシド形成に与える影響を調べた。その結果、正常なヌクレオカプシド構造の形成には、NPとVP35の発現量比が重要であること、VP35が過剰に発現するとヌクレオカプシドが形成されないことを明らかにした。次に、クライオ電子顕微鏡法を用いて、ヌクレオカプシドの構造解析を行った。ヌクレオカプシドのらせん構造のコアを形成するのはNPであること、NPにVP24とVP35が相互作用することで成熟型ヌクレオカプシドを形成することを見出した。さらに、電子線トモグラフィー法と単粒子解析法を組み合わせて、世界で初めてヌクレオカプシドの3次元構造を高分解能で明らかにした。以上の2年間の成果から、エボラウイルスのヌクレオカプシドの構造ならびに形成機構の一端を明らかにすることができた。申請者はこれまでに、電子顕微鏡法により、エボラウイルスのNP-RNA複合体が成熟型ヌクレオカプシドのコアとなることと、成熟型ヌクレオカプシド形成にNP,VP24,VP35が必須であることを明らかにした。本研究では、さらに詳細なヌクレオカプシド形成機構を明らかにするために、i) NPのリン酸化、ii)VP35の機能、iii)ヌクレオカプシドの立体構造に着目し、生化学的・分子生物学的・構造学的手法を用いて、ヌクレオカプシド形成機構の解析を進めていく。エボラウイルスが属するモノネガウイルス目には、公衆衛生学上重要な感染症を引き起こすウイルスが多く含まれる。NP-RNA複合体の基本構造に類似性が認められることからもわかるように、ヌクレオカプシド形成機構の骨子は、モノネガウイルス目で共通する点が多いと考えられる。本研究でエボラウイルスのヌクレオカプシド形成機構が明らかになれば、他のモノネガウイルス目の増殖機構の解明にも寄与できると考えられる。本研究では、i)NPのリン酸化の意義、ii)VP35の機能、iii)ヌクレオカプシド立体構造の再構築、の3つの目標を設定した。現在までに、ヌクレオカプシド形成においてNPとVP35の存在比が重要であることを明らかにし、国際誌に報告した(J Infect Dis, 2012)。また、ヌクレオカプシドの立体構造をクライオ電子顕微鏡により再構築し、その成果を国際誌に報告した(Proc Natl Acad Sci USA, 2012)。以上、目標の3つのうち2つを達成したため、当初の計画以上に進展していると考えられる。今後は、NPのリン酸化がウイルス増殖に与える影響に着目し、研究を推進する。具体的には、申請者が質量分析法にてすでに同定した5か所のリン酸化部位に変異を導入し、ミュータントシリーズを作製する。従来までにNPが有することが明らかにされている機能(ゲノムRNAの転写・複製能、細胞内輸送およびウイルス粒子内への取り込み効率を含むマトリクスタンパク質との相互作用)に着目し、リン酸化がそれらにどのような影響を与えるかを調べる。次年度は、生化学的アッセイならびに分子生物学的アッセイを行うため、細胞培養液・試薬・酵素・キット類などの消耗品を多数購入する。
時空間バターンの非線形マニフォールドによる表現とジェスチャー認識への適用

時空間バターンは特徴空間内のベクトル集合(マニフォールド)で表現するでき,グラフ距離に基づく自己組織化マツブを用いてこのマニフォールドを近似し、さらに高階の自己組織化マツブにより学習したニフォールド間の類似関係を解析する.ジェスチャ-の中には,特異な形状のニフォールドを構成するものがあり,高階自己組織化マツブのアルゴリズムの変更を行うことで,学習安定性の向上を実現した。24年度は、非線形マニフォールドを学習するグラフ距離に基づく自己組織化マップの学習安定性について、その問題点の明確化および改善策の提案を行い、ジェスチャ認識への応用の可能性について検討した。本申請研究では、ジェスチャである動画像を画像の集合と考え、ジェスチャが作る画像空間内の軌跡を非線形マニフォールドとして表現することがアイディアである。申請者らが提案しているグラフ距離に基づく自己組織化マップを用いて非線形マニフォールドを学習し、様々なジェスチャの学習結果をさらに上位の自己組織化マップで学習することで非線形マニフォールド間の関係性を解析することを目的としていた。23年度までの研究成果でジェスチャの識別が可能となることを示唆していたが、特定の非線形マニフォールドを示すジェスチャの学習が適切に行われないことが分かった。この要因を特定するために、下位および上位の自己組織化マップの学習パラメータを様々に変更し、学習の様子を観測した。その結果、下位のグラフ距離に基づく自己組織化マップの学習と上位の自己組織化マップの学習を交互に行う際、上位の結果を下位の学習に利用するコピーバックと呼ばれる操作が主要因であることが分かった。これは、下位の自己組織化マップにおいて、グラフ距離を用いているため、十分な学習を行わないと学習結果に歪みが生じ、非線形マニフォールドを学習できないことである。よって、下位の自己組織化マップを適切に学習するために、下位と上位の学習量を適切に配分するパラメータ決定法を実現した。これにより任意の形状の非線形マニフォールドの学習が適切に行うことができ、ジェスチャ認識という実問題への適用可能性が十分であることを示唆した。本研究の目的は,ジェスチャの認識であり,具体的には,動画像から手首より先の部分を抽出,追跡し,その形状の時間変化から動作の意味を認識することである.2年間の研究予定の1年目である平成23年度は,(1)対象の追跡,(2)対象を表現する特徴量の検討,(3)ジェスチャをマニフォールドで表現する際の表現方法,について検討を行った.(1)パーティクルフィルタと呼ばれる手法を用いて対象の追跡を試みた.ジェスチャの場合は,対象が高速かつ複雑に移動する場合も多く,通常のパーティクルフィルタでは,高精度で追跡することができない場合が多々あった.本研究では,対象の動きをモデル化してパーティクルに埋め込む手法を採用しているが,様々な動きを想定したモデルをパーティクルに埋め込み,異なるモデルが混合したパーティクルフィルタを提案した.シミュレーションにより,高速移動や急激な方向変化にも従来手法と比較して頑健に追跡できることを確認した.(2)対象である手首より先の画像に対して,認識に適した特徴量について検討した.従来から認識問題でよく用いられているSIFTやHOGと呼ばれる特徴量について検討したが,この問題の場合,SIFTでは対象の形状が表現されていないこと,HOGでは,対象の回転や並行移動に対応できないこと,があり,良好な認識結果を得ることができなかった.現在,SIFTとHOGのそれぞれの特長を活用した新しい特徴量について検討を行っている.(3)マニフォールドの表現方法として,まず,データ点の集合体として表現する方法を検討したが,データ点に疎密があり,適切な表現はできなかった.混合ガウス分布を用いることで各マニフォールドを適切に表現することができた.現在,マニフォールド間の距離系を定義を検討している.本研究の目的は,ジェスチャの認識であり,動画像中の手首より先の部分を追跡し,その形状の時間変化から動作の意味を認識することである.平成23年度は以下を中心に研究を行った.(1)画像の前処理手法の検討においては,対称物体(ここでは手)の追跡に関して研究を行った.具体的には,パーティクルフィルタを用いて,動画像中に含まれる肌色を高精度で追跡することを目的として,異なる特性を有するパーティクルを混在させる手法を提案し,高速かつ不規則な動きをする対象を高精度で追跡できることを確認した.(2)特徴抽出の検討においては,これまで画像認識で一般的に用いられているSIFTやHOGなどの特徴量について検討を行った.SIFTは対象の回転や並行移動には頑健であるが,形状の表現が適切に行えないこと,一方,HOGは,対象の形状を表現できるが,回転にに対する頑健性が弱いことがあり,個別の方法ではジェスチャ認識の特徴量として利用することは不十分であることを示した.(3)対象形状の時間変化をマニフォールドとして表現することで,時間伸縮に頑健な認識手法を目指している.これまでは,マニフォールドを各時刻の特徴量の集合として取り扱ってきたが,データ分布の疎密がある場合良好な結果を得ることができなかったので,混合ガウス分布で表現することを検討した.

まず,昨年度に進めた研究で不十分であった以下の点について集中的に検討を行う.(1)特徴抽出において,SIFTとHOGのそれぞれの特長を利用した新しい特徴量を検討する.それにより,対象の並行移動や回転に頑健でかつ対象の形状を適切に表現できる特徴量を提案することを目的とする.(2)マニフォールドの表現方法として,混合ガウス分布をより詳細に検証する.混合ガウス分布により表現方法は,データ点の集合での表現方法と比較して,複数のマニフォールド間の距離を定義しやすい点が特長である.しかしながら,昨年度はマニフォールド間の距離に関する検討を行っていないので,今年度は,それを検討することを目的とする.次に,研究開始当初の計画である以下の項目を実施する.(3)マニフォールド間の距離系の検討については,(2)で各マニフォールドを混合ガウス分布で表現することを検討するので,Kullbuck-Leibler情報量を用いることが適切であると考えられる.しかし,データ点の分布に偏りが大きい場合など,適切なKullbuck-Leibler情報量が得られないと考えられるので,必要に応じて混合ガウス分布の改善を行う.(4)上記の要素技術を見直し,ジェスチャ認識システムを構築する.その際,各要素技術間の調整が必要となる.また,動画像を対象としているので,毎秒30フレームの処理速度の実現を目指す.背景や照明条件のことなる環境下でシミュレーションを行い,性能の検証を行う.平成24年度に予定していた研究打合せを行うことができず,本年度に研究費を繰り越している.予定していた研究打合せを本年度に行う.また,今年度は,高速演算用のパソコンを購入する.また,研究打合せや成果発表のための旅費,論文投稿料,データ取得や整理のための謝金を支払う予定である.
IP_3誘導Ca^<2+>放出チャネルの構造・機能相関

IP_3受容体はIP_3によって活性化される細胞内Ca^<2+>放出チャネルで、その構造・機能を解析した。1.タイプ1のIP_3結合領域(アミノ末端側734アミノ酸)を大腸菌で発現させる系を開発した。IP_3は負のリン酸基を3つもつので、この領域内にある正のLysとArgを部位特異的置換することによりリガンド結合アミノ酸を解析した。その結果、Arg-265、Lys-508、Arg-511はIP_3結合に必須であった。また、Arg-568のGlnへの置換はIP_3と1,3,4,5-IP_4の結合親和性を低下させた。2.カルモジュリン結合領域を解析した。タイプ1では、cAMP依存性キナーゼのリン酸化基質となるSer-1588の近傍の配列(Lys-1564からArg-1585)が結合に必須であった。タイプ2の類似した配列(Lys-1565からArg-1587)も結合した。タイプ3ではこの配列が存在せず、カルモジュリンによる制御の違いが示唆された。3.IP_3誘導Ca^<2+>放出(IICR)のキネティクスを精製受容体/人工リポソーム/fluo-3系で解析した。IICRは二相性(速い相(f相)と遅い相(s相))を示し、初速度のEC_<50>は100nM IP_3であった。Hill係数は1.8と正の協同性を示した。f相の見かけの速度定数(k_<fast>=0.3-0.7s^<-1>)はs相(k_<slow>=0.03-0.07s^<-1>)の約10倍であった。f相によるCa^<2+>放出はIP_3濃度に依存して増加(量子的放出)を示したが、s相によるCa^<2+>放出量はほぼ一定であった。これより、IP_3受容体は2つのIP_3結合状態をもち、f相は低親和性、s相は高親和性の状態であることが示唆された。4.カビの代謝産物であるアデノフォスチン(AP)は、拮抗的でより強力なアゴニスト作用をもつ。AP誘導Ca^<2+>放出もIICRとよく似たキネティクスを示したが、高い協同性(Hill係数3.9)があった。〔^3H〕-IP_3結合の拮抗阻害実験では、IP_3に協同性はないが(Hill係数1.1、Ki=41nM)APは正の協同性(Hill係数1.9、Ki=10nM)を示した。
抗膵癌Gd^<3+>標識ビオチン化キメラモノクローナル抗体による新規MRI造影剤の開発

ビオチン化キメラ化A7-Fab分画とGd^<3+>との結合にはキレート剤を用いた。ビオチン化キメラ化A7-Fab分画とキレート剤DTPAとをcyclicDTPA法で結合後に、G-25カラムでゲル濾過してビオチン化キメラ化A7-Fab分画とDTPAの結合物を精製した。DTPA結合ビオチン化キメラ化A7-Fab分画にGd^<3+>を加えた後にG-25でゲル濾過して、Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画を作成した。ヌードマウスにヒト膵癌細胞株を皮下注射してヒト膵癌移植ヌードマウスを作製し、^<125>I標識Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画を静脈注射して、30分後にアビジンを静脈注射した。さらに30分後に犠牲死せしめ、血液と腫瘍、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、小腸、大腸を採取して各重量を測定後に放射能を測定した。各組織の単位重量当たりの放射能を算出して^<125>I標識Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画の分布を%dose/gramで表した。その結果、アビジンを投与していないときは腎臓への集積がやや多かったが、アビジンを投与した群では腎臓への集積は減少した。血液への集積はアビジンを投与した群で低値を示した。腫瘍への集積はアビジンを投与してもほとんど変化はなかった。以上のように、Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画を静脈注射して、30分後にアビジンを静脈注射することにより腫瘍への集積を減少することなく正常組織への集積を減少させることが可能となったため、この複合体を膵癌に対するMRIの造影剤として用いた場合にコントラストの良い画像が得られる可能性が示唆された。膵癌の術前診断に核磁気共鳴画像(MRI)が応用されているが、癌病巣の明確な描出による質的診断能は充分でない。近年、MRIの造影剤として常磁性金属イオンGd3+やFe3+の化合物が開発され、肝臓の網内系組織に取り込まれる性質を応用して肝臓の腫瘍の鑑別診断に用いられている。しかし、従来の造影剤は癌病巣に特異的(能動的)に取り込れないため、膵癌診断のための造影剤としては応用できない。もし、膵癌に特異的に集積する常磁性金属イオンを用いた造影剤が開発されれば、MRIの磁場の中で高い磁化率を示すためT1やT2強調画像で著しい信号強度の変化を発することにより、膵癌組織と他の組織とは明確に区別できる。NHS-ビオチンとキメラ化A7Fab分画とを4°Cで90分反応させた後、さらに室温で30分反応させてビオチン化キメラ化A7-Fab分画を作成した。Gd^<3+>はキレート化すると毒性が著しく軽減されるため、ビオチン化キメラ化A7-Fab分画とGd^<3+>との結合にはキレート剤を用いた。

DTPA結合ビオチン化キメラ化A7-Fab分画にGd^<3+>を加えた後にG-25でゲル濾過して、Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画を作成した。Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画の抗体活性をヒト膵癌培養細胞株HPC-YSを用いてbinding inhibition assayで測定し、抗体活性が保持されていることを確認した。Gd^<3+>標識ビオチン化キメラ化A7-Fab分画はヒト血清中でも7日間安定であることを確認した。膵癌の術前診断に核磁気共鳴画像(MRDが応用されているが、癌病巣の明確な描出による質的診断能は充分でない。近年、MRIの造影剤として常磁性金属イオンGd3+やFe3+の化合物が開発され、肝臓の網内系組織に取り込まれる性質を応用して肝臓の腫瘍の鑑別診断に用いられている。しかし、従来の造影剤は癌病巣に特異的(能動的)に取り込れないため、膵癌診断のための造影剤としては応用できない。もし、膵癌に特異的に集積する常磁性金属イオンを用いた造影剤が開発されれば、MRIの磁場の中で高い磁化率を示すためT1やT2強調画像で著しい信号強度の変化を発することにより、膵癌組織と他の組織とは明確に区別できる。NHS-ビオチンとキメラ化A7Fab分画とを4°Cで90分反応させた後、さらに室温で30分反応させてビオチン化キメラ化A7-Fab分画を作成した。Gd^<3+>はキレート化すると毒性が著しく軽減されるため、ビオチン化キメラ化A7-Fab分画とGd^<3+>との結合にはキレート剤を用いた。ビオチン化キメラ化A7-Fab分画とキレート剤DTPAとをcyclicDTPA法で結合後に、G-25カラムでゲル濾過してビオチン化キメラ化A7-Fab分画とDTPAの結合物を精製した。
光符号分割多重方式を活かした新たな光ネットワーク構成手法に関する研究

光符号分割多重(CDM)方式は、制御が容易で多重度が高く、将来の超高速ネットワークの基盤技術として期待されているが、現在の研究の多くは、低レイヤでの基本特性の評価に留まっている。本研究では、可変長パケットを非同期で扱うことができ、IPネットワークとも親和性の高い光CDM方式の特性を十分に活かして、アプリケーションサービスレベルまでを考慮したネットワークアーキテクチャを提案した。さらに狭帯域、広帯域アプリケーションを効率よく多重するトラフィック制御手法と併せ性能を測ることにより、理論解析、実証実験を通じて提案するネットワークアーキテクチャの評価を行い、その有効性を明らかにした。本研究では、可変長パケットを非同期で扱うことができ、IPネットワークとも親和性の高い光CDM方式の特性を十分に活かして、アプリケーションサービスレベルまでを考慮したネットワークアーキテクチャを提案する。本年度は、1.光CDM網におけるIPネットワークで提供されるアプリケーショントラフィックを収容するためのネットワークアーキテクチャ、ならびに光CDMパスの設定手法の提案、2.マルチ粒度パスに応じた狭帯域アプリケーショントラフィック、広帯域アプリケーショントラフィックの収容手法の提案、を行った。1.では、光CDM網でMAIの伝搬によってサイクルアタックが生じる問題があり、それらを解決するため、自律型論理ツリー構成によるネットワークアーキテクチャ、ならびにそのツリー状アーキテクチャ上でサイクルアタックを回避してパス設定を行うOSTP手法を提案した。シミュレーション評価の結果、従来手法に比べ非常に効果があることを明らかにした。2.では、広帯域、挟帯域のアプリケーションのそれぞれのユーザのユーザ満足度を同等に考え、それらのトータル満足度を最大にすることを目的としたトラフィック収容方式を提案し、評価した。残帯域から収容すべきか判断する閾値について評価を行い、適切な値が得られることを明らかにした。本研究は、大きく分けて、(1)光CDM網におけるIPネットワークで提供されるアプリケーショントラフィックを収容するためのネットワークアーキテクチャ、ならびに光CDMパスの設定手法の提案、(2)マルチ粒度パスに応じた狭帯域アプリケーショントラフィック、広帯域アプリケーショントラフィックの収容手法の提案、(3)光CDM方式を用いたネットワークでのIPトラフィック収容特性に関する検証、(4)実験ネットワークの構築と特性評価、の4段階、3カ年計画を予定している。前半では、理論解析、シミュレーションによる評価、後半では実証実験による評価を行い、その有効性を明らかにする。本年度では、(1)の後半、(2)の後半、(3)の前半について取り組んだ。(2)の後半においては、前年度検証した呼の大きさを2種類固定した環境から、要求帯域幅が振れる呼が混在する環境を対象にトラヒック収容手法の提案を行い、評価した。その結果、提案手法は有効に機能することがわかった。(1)の後半、(3)の前半では、前年度提案したパス設定手法の結果、呼の継続時間とパス設定の時間のバランスにより、性能差が生じることが分かったため、IPトラフィックのように呼の継続時間が短い場合にパス設定を行わずにブロードキャスト転送する手法ならびにネットワークアーキテクチャを提案した。その結果、小さな呼に対しては呼設定時間を大きく改善できることがわかったが、負荷増加や呼の継続時間に対し呼損率が上昇する傾向が顕著であることがわかった。したがって、要求帯域の大きな呼と要求帯域の小さな呼をある閾値でわけ、パス設定を行う通信、パス設定を行わない通信を行うことが必要と考えられる。本年度では、(3)の後半、および(4)に取り組んだ。前年度提案した、IPトラフィックのように呼の継続時間が短い場合にパス設定を行わずにブロードキャスト転送する手法ならびにネットワークアーキテクチャにおいては、負荷が低い場合でも呼損率が小さくならない問題があった。これは、ブロードキャストを行うため、途中ノードにおいて衝突を起こす確率が大きいためである。そこで、途中ノードで衝突を生じないよう、最も次数の高いノードをルートノードとし、ルートノードからバスで書くノードを接続するようなトポロジーを構成するアーキテクチャを提案し、評価した。その結果、負荷の高い場合にはバス型の影響を受け呼損率は小さくならないが、負荷の低い場合には呼損率を小さくすることができ、その有効性を確認した。実証実験およびその評価については、ハードウェアの進展がまだ十分ではなく、今後の課題と考えている。当初予定した研究計画に基づいて着実に実行し、研究会、国際会議においてその成果を発表している。24年度が最終年度であるため、記入しない。
炭素-水素結合切断を基軸とする非平面芳香族縮環分子の新合成戦略

パラジウム触媒を用いた直接的なアリール化反応を活用して、ヘリセンやベンゾアセナフチレンといった、非平面芳香族縮環分子の新たな合成法を開発することに成功した。これまでの予備的な活性化のための煩雑な工程を必要とせず、短段階で化合物を合成できる方法にて、これらの化合物を高収率にて得ることができた。また、アセナフチレン誘導体の蛍光特性についても検討を行った。本研究課題では、次世代の電子材料として注目を集めているヘリセンやセミバックミンスターフラーレンなどの非平面芳香族縮環化合物について、炭素-水素結合切断を鍵とした合成法を活用することで、短工程で効率のよい合成法を確立することを目的としている。2008年度は、さらなるヘリセン類の基質展開を目指してジブロモナフタレンを出発原料に活用する新規なルートでヘリセン類の合成を試みた。その結果、目的とした反応が進行せずに、分子内でC-H活性化を伴う炭素-炭素結合が生成し、アセナフチレン骨格が合成できることが分かった。このアセナフチレン骨格はフラーレンに見られる構造である。そこで、この反応を活用して、同じく非平面縮環化合物であるセミバックミンスターフラーレンの合成に適用することを計画し、検討を行っている最中である。さらにアセナフチレン類は、蛍光を有することから、様々な置換アセナフチレン類の蛍光挙動についても合わせて検討を行っていくことを計画している。2009年度では、C-Hアリール化反応による光学活性なヘリセン化合物を合成する方法を確立する目的で、予め軸不斉を有するビナフチルモノハライドとビストリメチルシリルアセチレンとをPd触媒存在下で反応を行い、アセチレン挿入の後にC-Hアリール化を行い、所望の光学活性ヘリセンへと導くことを検討した。その結果、X線による構造解析には至っていないものの、2つのビナフチル化合物を1つのアセチレンからなるダブルヘリセン様の化合物が合成できたのではないかと推測している。また、光学活性なビナフチル化合物から出発した際には、ほぼ単一の化合物を得ることができた。今後、誘導体の合成とX線による構造確認、ならびに別法による合成ルートの確立を目指して検討を行う。2010年度では、光学活性なヘリセン誘導体の合成にも適用可能な方法論の開拓を目的として、新たなC-Hアリール化反応を経由するルートを検討した。その結果、まだ低収率ではあるが、C-Hアリール化反応を活用した[5]アザヘリセンの簡便な合成ルートを開発する事に成功した。アザヘリセンは、有機分子触媒としての利用が可能であり、今後ますます注目を集める化合物群である。また、本反応における出発原料を光学活性な軸不斉ビアリール化合物を用いることにより、光学活性アザヘリセンの合成に、適用可能である。今後は、収率の向上と適用範囲の拡大を目指して、さらに検討を行っていく事を予定している。
環境保全をめざした森林の地域共同管理に関する研究

森林環境保全をランドスケープレベルで考えることが強く求められるようになっている。しかし、ランドスケープレベルにおいては多数の私有林所有者が含まれることが一般的であり、危機的な林業経営環境下で、これら私有林所有者の多くは施業放棄状況を自ら改善することは困難であり、さらに環境保全に向けた経営転換を行なう余裕はほとんどない。また従来の林業行政は環境保全型経営へ転換を支援するシステムをもっていないばかりか、目標なき分権化のなかで林業を支える地域専門集団の確保さえおぼつかなくなっている。このため、ランドスケープレベルでの森林環境保全の実現には、このレベルに包含される数多くの森林所有者が、地域住民・自治体・森林組合などとの共同関係を構築することによって、互いに協力しつつ森林経営を環境保全型へと転換することが不可欠となる。そこで本研究では、環境保全をめざした森林経営への転換の条件および手法と、これをささえる地域共同関係構築のあり方について提示を行うことを目的とした。ここで本研究の成果を簡単にまとめれば、第1に今日分権化が進む中での森林管理にかかわってガバナンスという考え方を導入して、多様な関係者の協働による政策形成の必要性を示した。第2にガバナンス構築に当たって、行政が当面の中心的役割を果たさなければならないが、市町村にフルセットでこの役割を期待するのは困難であり、行政システムの複線化を図る必要がある。第3に森林所有者は自己森林に対して適切な管理をしたいと思いつつも、高齢化などによって困難となっており、長期委託などの選択肢に前向きの意向を示すものが多くなっている。ここには所有と経営を政策的に分離できる可能性が存在している。本年度は下川町において基礎的な調査を行った。下川町森林組合および町役場に対する調査を行い、町有林購入と組合による加工施設の整備が林業生産基盤を整備してきていることを明らかにした。また産業クラスター研究会を中心として、地域活性化の方向性に関わる議論が行われているが、このなかで森林認証の取り組みが進められており、これをきっかけとして共同管理を構築できる可能性を検証することができた。一方、施業履歴の資料収集を通して、森林所有者の高齢化が進み後継者の問題が顕在化していること、林業経営条件が厳しいことから、森林施業を積極的に行っているのは組合役員層などかなり限定されている状況が明らかとなった。これに対しては森林組合が林地流動化などの対策は行っているものの、問題を根本的に解決できることはできず、認証などでカバーできないこの部分での新しい政策展開の必要性が確認された。このほか、共同管理の方向性を探るための事前調査として、北海道内の森林の新規取得者の現状についてアンケート調査を実施した。このなかで、新規取得者は量としては少ないが、管理意欲が旺盛で、周辺に対する教育効果もあることから、担い手として一定の役割を果たすことができる可能性が確認された。ただし後継者確保、また不在村所有を拡大する可能性、小規模分散化の助長などの問題点があることも明らかとなり、政策的な応用には慎重を期すべきである。また、三重県において森林ゾーニングと、森林環境保全に関わる政策枠組みについての調査を行い、森林環境保全と雇用創出を組み合わせた政策展開が可能であることが明らかとなった。本年度は森林所有者の政策対応に対するアンケート調査を主体として行った。森林調査簿に基づき下川町内に森林を所有する530名全員についてアンケート調査を実施し、218名から回答を得ることができた(有効回答率41.1%)。政策対応としては、(1)森林認証の取得、(2)森林組合への長期委託、(3)全額公費により環境保全型管理を行うかわりに所有者の管理権を制限(以後『三重方式』)の三つを想定し、それぞれに対する所有者の意識を分析した。

単純集計から、全体の64%が直近5年間に何らかの森林管理活動をおこなっており、さらには全体の44%が環境配慮にともなう施業制限をある程度受け入れると答えていることが判った。将来の森林管理の担い手を考える場合に、(1)森林管理に積極的に取り組んでいる層、(2)環境に配慮する意思のある層の動向が特に重要と考え、前者を『管理歴あり』グループ、後者を『環境配慮』グループとして、それぞれの意向を見ることとした。前者の特徴は、所有の境界をわかっている人が多く、また日本の木材自給率・枝打ち間伐補助金の支給対象林齢に対する正答率が高いなど、自己山林・林業に対する認識が相対的に高いといえる。後者のグループは、環境に配慮した森林管理を行う意思があるかという設問に積極的な回答をしたグループ(「環境保護グループ」)である。このグループは97名であり、うち75名は管理歴ありグループにも属していた。両グループともに森林組合への長期委託を最も強く選好している。森林認証は三つの中では相対的に低い。三重方式については環境配慮グループが高い選好を示すことが明らかとなった。また、実際に森林管理を行っている所有者の中に、少なからず環境配慮グループが存在すること、所有・経営を一定程度分離できる可能性があることが明らかとなった。構想なき分権化の矛盾が最も現れている市町村レベルを対象として、このレベルで取り組むべき森林政策とは何か、そしてその政策は誰が担うべきかを研究。現状では、大多数の市町村は権限が移譲された森林政策に関心を持っておらず、実行する能力も欠如している。この状況で「受け皿」論を展開する限り効率化を目的とした市町村合併に行き着かざるを得ない。市町村はまちづくり・総合的な土地利用政策を最優先課題とし、森林行政に関しては専門化された広域行政システムを構想するなど、森林行政システムの再編を考えるべきである。また、森林政策はまちづくりという大きな枠組みがあって始めて機能するものであり、優れた政策がトップダウンでおろされてきても機能しない。政策は行政の独占物ではなく、多様な主体が協働で形成し、担うべきものである。こうした意味で、森林や環境保全を目的としたローカルガバナンスの構築が求められている。ローカルガバナンスは、までの政府による一元的な権力的統治ではなく、多様な主体が主体的に参加して協働で地域の自治を担っていくことと定義される。あくまでも住民自治が基本なのであり、森林政策はその中に位置付けられるものであり、林野庁から市町村へと縦割りで貫かれるものが森林政策なのではない。基礎自治体としての市町村の最も重要な役割はまさにこうしたガバナンスの構築を支援し、その実行に積極的に参加することであり、こうした過程の中で始めて地域において取り組むべき森林政策のあり方が見えてくる。
欽定訳聖書を中心とする英訳聖書におけるメタファーの認知意味論的研究

旧約聖書原典におけるヘブライ語のメタファー表現を抽出し、それをギリシャ語訳聖書とラテン語訳聖書における古典語訳表現、及び、欽定訳聖書を中心とする英訳聖書における英訳表現と比較・対象し、ヘブライ語メタファーの英訳聖書における受容と変容の過程を明らかにした。具体的内容欽定訳聖書の比喩表現と古英語及び中英語訳聖書の比喩表現を収集、それらを原典のヘブライ語表現と比較・対照し、英訳聖書の比喩表現は古代ヘブライ語の比喩表現に由来していること、飜訳過程で古代ヘブライ語の比喩表現が変質していること等について、杏林大学助教八木橋宏勇氏、ケンブリッジ大学東洋学部教授Robert Gordon博士と議論し、英訳聖書の比喩表現を分類した。意義英訳聖書の比喩表現、「旧約聖書」の比喩表現は、原典のヘブライ語表現と比較・対照しながら分析することはほとんど行われていないので、本分析の意味するところは、今後の英訳聖書の比喩表現の分析に有意義である。重要性飜訳によって出現した英語の比喩表現の内部構造を分析したこと。本研究課題の目的は、旧約聖書原典のヘブライ語のメタファ比喩表現を抽出し、その構造を認知意味論の観点から分析した後、対応する英訳聖書のメタファ表現と比較・対照し、英訳聖書におけるメタファの構造を明らかにすることである。研究計画にしたがい、(1)古代ヘブライ語のメタファ表現の構造と、その英訳によって英訳聖書に出現した英語のメタファ表現の構造を分析し、(2)古代ヘブライ語のメタファ構造と、英訳によって英訳に出現したメタファ構造の異同、および、(3)翻訳の結果、原典とは異なるメタファ表現が英訳聖書に出現する原因と仕組みおよび変容の過程を考察した。認知言語学において、メタファ表現は共時的な観点から分析する傾向が強く、通時的かつ異文化的観点からの分析は少ない。本研究課題における考察の視点は、メタファ研究に新しいデータを与える。研究計画に基づいた分析と考察の結果次のことが明らかになった。古代パレスチナ地方の社会と文化および気候・風土の中で生まれたメタファ表現のなかには、固有の香りを強く反映し、そのままの表現構造では英語文化に受け入れられないメタファがあることが明らかになった。初期の英訳聖書では、その意味が解明されていなかったために、古代ヘブライ語のメタファが直訳されていることが多いが、近代になるにしたがって、パレスチナの香りを強く反映した古代ヘブライ語のメタファ表現の多くは、イギリス社会と文化に許容可能な表現に変容されていることが明らかになった。一方で、メタファは人間が共通に持つ概念化の手段の一つであるので、メタファの表現方法が異なっていてもメタファ構造そのものには普遍的な側面が強いことも明らかになった。
課題研究の効果的な指導を目的とした指導項目の体系化およびその教材開発

新指導要領において,「理科課題研究」が新設された。しかし,課題研究に対する体系的な指導が行われておらず,そのための教材もない。そこで,課題研究を通して習得させるべき「科学的に探究する能力と態度」の育成のための体系的指導法を確立し,教材開発を試みた。課題研究は,(1)仮説の設定,(2)実験の計画,(3)実験による検証,(4)実験データの分析・解釈,(5)推論,(6)報告書の作成・プレゼンテーションの大きく6つの過程にわけられる。それぞれの過程において,「探究する能力と態度の育成」に必要不可欠な習得内容が存在する。そこで本研究では,講義形式ではなく,1つの題材を通して,生徒が主体的に実験や実習を行うことで習得できる教材を開発した。特に,(2)実験の計画の過程では「対象実験の設定」,(3)実験による検証では「測定方法や測定範囲,測定値の妥当性の検証」,(4)実験データの分析・解釈では「誤差や有効数値の検討,統計処理の手法」を修得できる教材を開発した。この教材は,「環境と水質分析」を題材に,6時間の実習を通して,生徒自身が思考しながら実習することで,上記の項目に気づき,意識化できるものである。また1つの題材であるため,パックテストと分光光度計のみで実施可能である。さらに,生徒達がグループで思考をしながら進めていくため,多くの生徒を対象とした一斉授業でも実施可能である。この開発教材を用いて,本校の高1生徒を対象に実践を行なった。事後の生徒アンケートにおいては80%の生徒が「理解できた」と回答している。今後の課題は,2点ある。まず1点目は,上記の(1)仮説の設定,(5)推論,(6)報告書の作成・プレゼンテーションに対応する教材の開発。2点目は,PISAの科学リテラシーに関する問題による教材の評価を予定していたが,PISAの公開問題数が少なく,開発教材を評価する妥当な問題を見いだすことができなかった。PISA以下の評価方法を開発する必要がある。
迷走神経系の活動が日本人の心身の健康に与える影響

経済的な水準が同様の他国と比較して、日本は例外的に循環器系の疾患率が低い一方、抑うつや人口減少の程度は高いとされている。本研究においては現代的な生活習慣(例えばデスクワークの時間の増加や通勤時間の長さ、単身世帯の増加など)がどの程度社会関係や身体的健康、毎日の健康維持に関する習慣、心理的な健康に影響を検討する。その際心拍数変動などに着目し、身体と社会関係の関連性を包括的に検討する。
グルタミン酸脱水酵素欠損症の発症機構の解析

脊髄小脳変性症,非定型パーキンソン症候群の一部で,末梢血白血球におけるグルタミン酸脱水素酵素(以下GDH)低下例が報告され,病因との関連に興味がもたれている.我々は,脊髄小脳変性症,非定型パーキンソン症候群患者の白血球GDH活性とスクリーニングし,活性値が有意に低下している患者4名を抽出した.これら, 4名の活性値は,正常のほぼ50%であり,いままでPartial GDH deficiencyとして報告されている症例と同程度であった.我々は,次に活性低下が酵素蛋白の質的異常に起因するのかを知る目的で, Radioimmunoassayによる蛋白量測定を試みた.その結果, GDH比活性(酵素活性値/酵素蛋白量)は,正常対象群, GDH活性正常疾患群, GDH活性低下群の間で差異を認めなかった.GDHは現在までのところisozymeは見いだされておらず,活性低下の原因として,酵素蛋白の質的異常よりも酵素産生低下または分解亢進を示唆している.一方,これらの症例では経口グルタミン酸負荷テストにて負荷前後の血清グルタミン酸の高値傾向がみられ,全身的なグルタミン酸代謝の異常が示唆された. GDH活性低下例4名のうち, 3名について皮膚線維芽細胞を採取しGDH酵素活性を測定したところ,白血球と同様,活性の低下を見いだした.このことは, GDH活性低下が全身的であることを示唆している.つぎに, GDH活性低下例の皮膚線維芽細胞におけるグルタミン酸の毒性を検討するため,培養液中に高濃度グルタミン酸を添加し,一定時間培養後生細胞数を計測したところ, GDH活性低下例ではグルタミン酸耐性の低下を認めた.今後, FDH活性低下とグルタミン酸耐性低下との関連について生化学的検討を加える予定である.また,現在この皮膚線維芽細胞を使い, ^<35>S-MethionineをtracerとしてIn VitroでのGDH蛋白産生,分解について検討中である.脊髄小脳変性症,非定型パーキンソン症候群の一部で,末梢血白血球におけるグルタミン酸脱水素酵素(以下GDH)低下例が報告され,病因との関連に興味がもたれている.我々は,脊髄小脳変性症,非定型パーキンソン症候群患者の白血球GDH活性とスクリーニングし,活性値が有意に低下している患者4名を抽出した.これら, 4名の活性値は,正常のほぼ50%であり,いままでPartial GDH deficiencyとして報告されている症例と同程度であった.我々は,次に活性低下が酵素蛋白の質的異常に起因するのかを知る目的で, Radioimmunoassayによる蛋白量測定を試みた.その結果, GDH比活性(酵素活性値/酵素蛋白量)は,正常対象群, GDH活性正常疾患群, GDH活性低下群の間で差異を認めなかった.GDHは現在までのところisozymeは見いだされておらず,活性低下の原因として,酵素蛋白の質的異常よりも酵素産生低下または分解亢進を示唆している.一方,これらの症例では経口グルタミン酸負荷テストにて負荷前後の血清グルタミン酸の高値傾向がみられ,全身的なグルタミン酸代謝の異常が示唆された. GDH活性低下例4名のうち, 3名について皮膚線維芽細胞を採取しGDH酵素活性を測定したところ,白血球と同様,活性の低下を見いだした.このことは, GDH活性低下が全身的であることを示唆している.つぎに, GDH活性低下例の皮膚線維芽細胞におけるグルタミン酸の毒性を検討するため,培養液中に高濃度グルタミン酸を添加し,一定時間培養後生細胞数を計測したところ, GDH活性低下例ではグルタミン酸耐性の低下を認めた.今後, FDH活性低下とグルタミン酸耐性低下との関連について生化学的検討を加える予定である.また,現在この皮膚線維芽細胞を使い, ^<35>S-MethionineをtracerとしてIn VitroでのGDH蛋白産生,分解について検討中である.近年、脊髄小脳変性症、パーキンソン症候群の一部に線維芽細胞、末梢血白血球におけるグルタミン酸脱水素酵素(以下GDH)低下例が見いだされている。この酵素異常の機作を明らかにすることはこれら神経変性疾患の病因解明に一つの糸口を与えると考えられる。我々は当科外来受診中の脊髄小脳変性症パーキンソン症候群の白血球GDH活性を測定し、4例の部分欠損例を見いだした。これらの症例ではミトコンドリア局在のGDH活性(heat labile component)のみ低下しており、またradioimmunoassay法により測定したところ、同時にGDH蛋白低下が認められた。比活性値(酵素活性値/蛋白量)は健常者、GDH活性正常症患群、GDH活性低下群でほぼ一定であった。これらの事実はGDH活性低下は酵素の質的異常よりもむしろ酵素蛋白産生量の異常に因ることを示唆するものである。以上の結果をふまえ以下の方針で研究を進めている。1)患者群では血中アミノ酸値の異常を認めた。そこで患者の皮膚線維芽細胞を培養し、本酵素低下により考えられるエネルギー代謝、アミノ酸代謝の異常を分析している。さらに各種アミノ酸の細胞毒性についても検討し、中枢神経変性に至る本症の発症機構の解明をめざしている。2)GDH蛋白は遊離ポリゾームで前駆体として合成され、ミトコンドリアマトリックスに局在するpepticlaseによりextrarpeptideが切断され成熟GDHとなる。GDH部分欠損機序としてこのミトコンドリアへの転送・プロセッシングの障害の有無を検討する。

まず末梢血リンパ球を分離培養、【^(35)S】メチオニンでパルス標識する。抗GDH抗体とリンパ球抽出液を反応させ、沈澱物をSDS-PAGEにて展開、auto-radiographyをおこなう。正常リンパ球GDHサブユニットは分子量約54,000の前駆体として合成され、数分後には分子量約50,000の成熟型に移行することを確認しており、現在GDH欠損例について検討している。