hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規転写調節因子Dlxin-1ノックアウトマウスの病理組織学的解析

Dlxin-1ノックアウトマウスの雄を作製し、全身解剖、血液生化学検査にて異常所見のスクリーニングを行ったところ、組織学的に明らかな形態形成の異常は認められないが、ノックアウトマウスには正常コントロールマウスと比較して体重が多く、軽度の耐糖能異常が認められた。また高脂肪食負荷によりノックアウトマウスはより高度の体重増加を示した。Dlxin-1は脳および脂肪細胞で高い発現がみられ、これらの代謝異常は中枢性および末梢性の双方の機序が考えられる。遺伝的背景を均質化するためにC57BL/6JおよびBalb/cJへの戻し交配をそれぞれ9回行い、Dlxin-1ノックアウトマウスを近交系化した。その結果、Balb/cJ系統のノックアウトマウス雄には同様の所見が認められたが、C57BL/6J系統のノックアウトマウス雄には体重の差が明らかではなく、上記の形質には遺伝的背景が影響すると考えられた。またDlxin-1ノックアウトマウスの雄とヘテロマウスの雌を交配し、ノックアウトの雌を得たところ、雌は外観上明らかな異常所見は認められないが8週頃より自発運動の低下、異常反射などの神経学的異常が認められた。これらの変化はBalb/cJ系統でより強くみられた。Dlxin-1が脳・神経系に高い発現を示すこと、p75NTRやUNC5Hなど神経細胞の増殖・アポトーシスや軸索の伸長に重要な機能を果たす分子との相互作用が報告されていることから、Dlxin-1ノックアウトマウスは特異的なニューロンの成長障害をもつことが示唆される。Dlxin-1のノックアウトマウスの雄と野生型の雄の脳よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果いくつかの興味深い分子の発現レベルの変化が検出された。このうちNF-Mに着目してその発現を検討したところ、蛋白レベルではむしろノックアウトマウスで発現が上昇していた。最近老化ラットの末梢神経でNF-Mの蛋白量が増えていることが報告されており、Dlxin-1ノックアウトマウスにおいて神経系の老化に類似した所見も認められる可能性が示唆された。これまでの研究で、新規転写調節因子Dlxin-1の機能を解析するため、Dlxin-1ノックアウトマウスを作製した。今回Dlxin-1ノックアウトマウスの雄の個体について、まず全身解剖を行った。肉眼的に明らかな発生異常、奇形は認められず、主要臓器の組織学的検索にても明らかな組織構築の異常は見い出さなかった。しかし一部の臓器、組織の大きさがコントロールの野生型マウスと異なっており、その異常を反映する生化学的データも得られた。現在、戻し交配によるノックアウトマウスの純系化を行い、その異常が系統の多型性のよるものではないことを確認中である。Dlxin-1のmRNAの発現はubiquitousであることが確かめられているが(Masuda et al., JBC. 2001)、蛋白レベルの発現をWestern blotにより検討した。その結果、調べた臓器の中では脳と精巣のみに発現が認められた。Dlxin-1とホモロジーをもつMAGE A-CのmRNAが脳と精巣に限られることを考えると興味深い所見と思われる。mRNAの発現があるのにも関わらず蛋白レベルの発現がみられない理由として、ユビキチン・プロテアソーム系による分解の可能性が考えられるが(Sasaki et al., JBC. 2002)、その臓器特異性の機序については今後検討が必要と考えられた。脳内のDlxin-1蛋白の発現部位については、さらに免疫組織学的手法により詳細な検討を行う予定である。Dlxin-1ノックアウトマウスにみられる臓器、組織の大きさの異常の分子メカニズムを解明するために、現在Dlxin-1をノックアウトされたによる遺伝子変化をDNA microarrayで、Dlxin-1結合蛋白の探索をYeast 2-hybrid法でそれぞれ検索中である。前年度までにDlxin-1ノックアウトマウスの雄を作製し、全身解剖にて異常所見のスクリーニングを行ったところ、組織学的に明らかな形態形成の異常は認められないが、一部の臓器の大きさに差が認められた。遺伝的背景を均質化するためにC57BL/6JおよびBalb/cJへの戻し交配をそれぞれ8回行い、Dlxin-1ノックアウトマウスを近交系化した。その結果、Balb/cJ系統のノックアウトマウス雄には同様の所見が認められたが、C57BL/6J系統のノックアウトマウス雄には上記の臓器の大きさの差が明らかではなかった。またDlxin-1ノックアウトマウスの雄とヘテロマウスの雌を交配し、ノックアウトの雌を得たところ、Balb/cJ系統のノックアウト雌は外観上明らかな異常所見は認められないが8週頃より自発運動の低下、'異常反射などの神経学的異常が認められた。一方C57BL/6J系統のノックアウト雌は生後約1日で死亡し、解剖を行うと脳の形成に組織学的異常が認められた。Dlxin-1が脳・神経系に高い発現を示すこと、P75NTRやUNC5Hなど神経細胞の増殖・アポトーシスや軸索の伸長に重要な機能を果たす分子との相互作用が報告されていることから、Dlxin-1ノックアウトマウスは何らかの神経学的異常をもつことが示唆される。現在、その神経学的所見の詳細について、また、マウスの性別、系統により表現型が大きく異なるメカニズムについて検討中である。

Dlxin-lのノックアウトマウスの雄と野生型の雄の脳よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果いくつかの興味深い分子がノックアウトマウスで有為に減少しており、また表現型との関連が示唆された。Dlxin-1ノックアウトマウスの雄を作製し、全身解剖、血液生化学検査にて異常所見のスクリーニングを行ったところ、組織学的に明らかな形態形成の異常は認められないが、ノックアウトマウスには正常コントロールマウスと比較して体重が多く、軽度の耐糖能異常が認められた。また高脂肪食負荷によりノックアウトマウスはより高度の体重増加を示した。Dlxin-1は脳および脂肪細胞で高い発現がみられ、これらの代謝異常は中枢性および末梢性の双方の機序が考えられる。遺伝的背景を均質化するためにC57BL/6JおよびBalb/cJへの戻し交配をそれぞれ9回行い、Dlxin-1ノックアウトマウスを近交系化した。その結果、Balb/cJ系統のノックアウトマウス雄には同様の所見が認められたが、C57BL/6J系統のノックアウトマウス雄には体重の差が明らかではなく、上記の形質には遺伝的背景が影響すると考えられた。またDlxin-1ノックアウトマウスの雄とヘテロマウスの雌を交配し、ノックアウトの雌を得たところ、雌は外観上明らかな異常所見は認められないが8週頃より自発運動の低下、異常反射などの神経学的異常が認められた。これらの変化はBalb/cJ系統でより強くみられた。Dlxin-1が脳・神経系に高い発現を示すこと、p75NTRやUNC5Hなど神経細胞の増殖・アポトーシスや軸索の伸長に重要な機能を果たす分子との相互作用が報告されていることから、Dlxin-1ノックアウトマウスは特異的なニューロンの成長障害をもつことが示唆される。Dlxin-1のノックアウトマウスの雄と野生型の雄の脳よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果いくつかの興味深い分子の発現レベルの変化が検出された。このうちNF-Mに着目してその発現を検討したところ、蛋白レベルではむしろノックアウトマウスで発現が上昇していた。最近老化ラットの末梢神経でNF-Mの蛋白量が増えていることが報告されており、Dlxin-1ノックアウトマウスにおいて神経系の老化に類似した所見も認められる可能性が示唆された。
協調的位置同定を行う群ロボットシステムの開発

昨年度までに提案した,複数ロボットにより未知/不整地環境での高精度な位置同定を可能にする「群ロボットによる協調ポジショニング法,Cooperative Positioning System,CPS」に対して、今年度は本手法の有効性を確認するための実証システムを試作した.本システムは自動相対位置計測システムと無線による自律誘導システムを搭載し,屋外不整地での走行が可能な1台の親ロボットと2台の子ロボットからなる.親ロボットは,コーナーキューブの自動探索機構を有するレーザ距離計測装置(AP-L1,(株)トプコン製)と2軸傾斜計センサ(CMS-05A-XY,桑野電機(株)製)を搭載しており,スレーブロボットに搭載されたコーナーキューブからの反射光を検知することにより,子ロボットまでの距離と方位を自動的に高精度に計測することができるようにしている.また傾斜計センサは,本体上を円弧状に移動可能な平板を取りつけられ,この平板を重力方向と垂直になるように制御することにより,レーザ距離計測装置による距離計測精度を高めている.また子ロボット上部には,6つのコーナーキューブを垂直軸回りに放射状に等間隔で配置し,これにより任意の方向から投射されたレーザ光をその投射された方向へ正確に反射できるようにしている.各ロボットはマイクロコンピュータ(8086-8MHz),バッテリ(Yuni-Z,湯浅電池(株)製),無線システム(HRF-600,ヘルツ電子(株)製),DCモータ(親ロボット出力190W,子ロボット出力90W,日邦電機製),及び本研究室で開発したモータ駆動回路(TITECH MOTOR DRIVER)を搭載し,RS232Cによる無線通信を介してオペレータのコンピュータ(Pentium Pro 200,TriGem製)により集中制御する構成としている。このシステムを用いて屋外での移動測定実験を行い,本システムの基本動作性能を確認した.昨年度までに提案した,複数ロボットにより未知/不整地環境での高精度な位置同定を可能にする「群ロボットによる協調ポジショニング法,Cooperative Positioning System,CPS」に対して、今年度は本手法の有効性を確認するための実証システムを試作した.本システムは自動相対位置計測システムと無線による自律誘導システムを搭載し,屋外不整地での走行が可能な1台の親ロボットと2台の子ロボットからなる.親ロボットは,コーナーキューブの自動探索機構を有するレーザ距離計測装置(AP-L1,(株)トプコン製)と2軸傾斜計センサ(CMS-05A-XY,桑野電機(株)製)を搭載しており,スレーブロボットに搭載されたコーナーキューブからの反射光を検知することにより,子ロボットまでの距離と方位を自動的に高精度に計測することができるようにしている.また傾斜計センサは,本体上を円弧状に移動可能な平板を取りつけられ,この平板を重力方向と垂直になるように制御することにより,レーザ距離計測装置による距離計測精度を高めている.また子ロボット上部には,6つのコーナーキューブを垂直軸回りに放射状に等間隔で配置し,これにより任意の方向から投射されたレーザ光をその投射された方向へ正確に反射できるようにしている.各ロボットはマイクロコンピュータ(8086-8MHz),バッテリ(Yuni-Z,湯浅電池(株)製),無線システム(HRF-600,ヘルツ電子(株)製),DCモータ(親ロボット出力190W,子ロボット出力90W,日邦電機製),及び本研究室で開発したモータ駆動回路(TITECH MOTOR DRIVER)を搭載し,RS232Cによる無線通信を介してオペレータのコンピュータ(Pentium Pro 200,TriGem製)により集中制御する構成としている。このシステムを用いて屋外での移動測定実験を行い,本システムの基本動作性能を確認した.
レオウイルスの感染・増殖機構の理解を目指した原子構造と分子間ネットワークの解明

イネ科作物の重要な病原ウイルスであるイネ萎縮ウイルス(RDV)がどのようにして宿主に感染し宿主内で増殖していくかというライフサイクルを原子レベルで明らかにしていくことを目指し,構造生物学・生化学・ウイルス学的手法を駆使して研究を進めた.その結果,粒子形成機構の解明,構造蛋白質やウイルスー宿主間相互作用因子および感染や増殖に必要な主要因子の構造決定などに成功した.また,RDV完全粒子の構造解析を目指したX線結晶構造解析による高分解能構造解析とクライオ電子顕微鏡による非対称構造の決定に向けた条件決定,結晶を必要としない新しい構造解析法であるコヒーレント回折イメージング法の開発を進めた.平成25年度は以下の研究を行った.1.ウイルス粒子の構造解析P2蛋白質を有したRDV粒子については,結晶化条件の検討を進めたが結晶を得ることはできていない.一方,クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による低分解能構造解析により,5回軸周りにP2蛋白質と思われる構造を観察することができた.この構造はP2蛋白質のおよそ半分の体積を持つと考えられる.このことと,単独で発現させたP2蛋白質の電子顕微鏡による観察でP2がほぼ中央付近で大きく折れ曲がる構造を示すことから,P2がウイルス表面に柔軟な突起構造を作り,昆虫の細胞と相互作用するモデルが考えられる.この成果は現在論文としてまとめている.RGDV粒子に関しては,大量調製の条件検討を進めたが,構造解析に十分は収量は得られていない.2.ウイルス各蛋白質の大量調製及び構造解析RDVのバイロプラズマ構成蛋白質Pns12の結晶構造解析を,セレノメチオニン置換体を利用した多波長異常分散法や重原子同形置換法により進めたが,現時点で位相問題の解決に至っていない.重原子同形置換体のスクリーニングと平行して,電子顕微鏡による低分解能構造を基にした分子置換法を適用するために,電子顕微鏡観察を行った.現在2次元平均構造の取得を進めており,その後に3次元モデル構築と分子置換法を行う予定である.それ以外のウイルス蛋白質についても,平行して発現系の構築を進めている.3.ウイルスの細胞内動態の解析クライオ電子顕微鏡トモグラフィーによりウイルスを感染させた細胞の観察を行い,昆虫細胞および植物細胞内での局在および感染過程の観察に成功し,論文に報告した.1.ウイルス粒子の構造解析高圧凍結したRDV粒子の結晶から,2.5A分解能を超える高分解能の回折点を観測する事に成功した.高圧凍結の適用により1つの結晶から3.4A分解能のフルデータ収集に成功した.このデータを用いた構造精密化を進めている.また,X線自由電子レーザー施設LCLSにおいてコヒーレント回折イメージング実験を行い,RDV単粒子からのスペックルの観測に成功した.2.ウイルス蛋白質の大量調製及び構造解析RDVのバイロプラズマ主構成蛋白質Pns12の結晶構造を2.1A分解能で決定する事に成功した.これまで知られている他のレオウイルス属由来のバイロプラズマとは異なる新規なオリゴマー構造であることが明らかとなった.RDVのRNAキャッピング酵素P5の大量調製・結晶化に成功し,分解能2.1Aの回折強度データを得る事に成功した.新規構造であるため,位相決定を目指した重原子置換体の作製と回折実験を試みている.RDVの内殻中で核酸を保持する機能を有すると推定されている核酸結合蛋白質P7の大量調製と高純度化に成功した.結晶化スクリーニングの結果,X線回折を得るには不十分であるが結晶様の沈殿が得られており,引き続き結晶化条件の最適化を行っている.3.ウイルスの細胞内動態の解析クライオ電子線トモグラフィーによりウイルスを感染させた昆虫培養細胞の観察を行い,ウイルス感染後期において,ウイルスが細胞からエキソサイトーシスにより放出される様子を詳しく観察することに成功した.その成果を現在論文としてまとめている.また,宿主内でどのようにウイルスが増殖・伝搬しているのか調べるために,Serial block-face SEM用の試料を作製した.今後,それらの試料を使ってデータ取得ならびに解析を進めていく.クライオ電子顕微鏡トモグラフィーによりウイルスを感染させた細胞の観察を行い,昆虫細胞および植物細胞内での局在および感染過程の観察に成功し,論文に報告した.1.ウイルス粒子の構造解析放射光ビームラインの整備を行い、RDVの様な超分子複合体の構造解析に必要な超低分解能データ(400A以下)の収集を可能とした。さらに高分解能X線結晶構造解析を目指し、新たに導入した高圧凍結装置の整備と高圧凍結方法の検討を行い、2.4A以上の高分解能データ収集を進めた。X線自由電子レーザー施設LCLSにおいてコヒーレント回折イメージング実験を行い、論文としてまとめた。クライオ電子顕微鏡法による正二十面体対称を仮定しない構造解析については、装置の制限により期間内に解析に必要な数のデータを集めることができなかったが、データ収集条件は決まったのでH27年度末に導入された新しい装置を利用することで解析の可能性は限りなく高まったと考えている。2.ウイルス各蛋白質の大量調製および構造解析キャッピング酵素P5の構造決定に成功し、さらに各種反応基質との複合体の構造解析を行った。核酸結合蛋白質P7は、新たにバキュロウイルス昆虫細胞発現系による高純度大量調製系を確立し、結晶化スクリーニングを実施した。

バイロプラズマ主構成成分であるPns12の全長構造を位相差クライオ電子顕微鏡により観察し、N末端領域に柔軟な構造を有し、N末端部位を利用した会合が生じていることと一部が球状の構造をとっていることを明らかにした。N末端の構造を有する部位の同定と結晶構造解析を目指した結晶化サンプル調製に取り組んだ。3.ウイルスの細胞内動態の解析昆虫細胞への侵入に必須の蛋白質P2の構造解析を論文として報告した。昆虫細胞への侵入過程にあるウイルス粒子を電子線トモグラフィー法により可視化し、P2を介したウイルスの細胞侵入過程を詳しく調べることに成功した。X線結晶構造より提唱されたRDVの外殻形成機構を生化学的に証明するために、外殻蛋白質P8の変異体を用い、クライオ電子顕微鏡により、RDVの外殻形成が順序正しく進行することを明らかにした。イネ科作物の重要な病原ウイルスであるイネ萎縮ウイルス(RDV)がどのようにして宿主に感染し宿主内で増殖していくかというライフサイクルを原子レベルで明らかにしていくことを目指し,構造生物学・生化学・ウイルス学的手法を駆使して研究を進めた.その結果,粒子形成機構の解明,構造蛋白質やウイルスー宿主間相互作用因子および感染や増殖に必要な主要因子の構造決定などに成功した.また,RDV完全粒子の構造解析を目指したX線結晶構造解析による高分解能構造解析とクライオ電子顕微鏡による非対称構造の決定に向けた条件決定,結晶を必要としない新しい構造解析法であるコヒーレント回折イメージング法の開発を進めた.クライオ電子顕微鏡トモグラフィーによる感染細胞観察が順調に進展し,論文としてまとめることができる結果を得ることができた.現在論文作成中である.RDV由来の蛋白質について,Pns12の2.1A分解能の構造解析に成功し,現在論文にまとめるための生化学データの収集を進めている.また,P5の2.1A分解能の回折データを収集することができ,現在位相決定を進めている. P7については,高純度の試料を大量に得るプロトコルを確立し,結晶化スクリーニングを進めている.P2を欠損したウイルス粒子については,1つの結晶から3.4A以上の分解能のフルデータセットの収集に成功した.さらに高圧凍結により.2.5Aを超える回折像は得られており,平成27年度中にフルデータセットの取得と構造解析を目指す.以上の理由により,「おおむね順調に進展している」とした.27年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学Pns12,P5のX線結晶構造解析を論文としてまとめるとともに,P7など他のウイルス蛋白質の構造解析を進める.
米・小麦・そばのダイレクト糊化とテクスチャー制御技術の開発

ダイレクト糊化における高速せん断加工用ミキサーの回転数、加熱・冷却条件などの操作パラメータを操作して米ゲルを調製し、操作パラメータと米ゲル物性(動的粘弾性)の関係を二次曲面モデルで定量化することを目的とした。実験はダイレクト糊化物性制御システムを用いて行った。米ゲルの加水量(米を1としたときの加える水の量)を2.85倍、せん断速度(回転数)を5003000 rpm、せん断時間を110 minとし、米ゲルを調製した。実験条件は完全実施要因計画に準じ、計24点の調製条件で実験した。なお、原料米としては、高アミロース米(H20年度埼玉県産モミロマン)を用いた。加えて、米ゲルの物性測定は、調製後、直径20 mm、厚さ2 mm厚に成形した後、室温で3 h静置した後に、動的粘弾性測定装置(AR-G2,TA Instrument)を用いて、25°C、周波数1 Hz、応力1 Paにて米ゲル試料の動的粘弾性の計測を行った。また、得られたデータに交互作用付二次曲面モデルを適用した。結果、せん断時間とともに、貯蔵弾性率G'(弾性の指標)は減少、tanδ(流動性の指標)は増加した。つまりゲルはせん断時間が増加につれ、柔らかくなる傾向があった。一方、ゲルの動的粘弾性の値はせん断速度に依存した。また、ゲルの動的粘弾性に対する、加工条件の標準化回帰係数の値から、せん断速度の影響が最も大きく、せん断時間、ついで加水量の順となった。つまり、米ゲルの物性を制御するにはせん断速度が最も重要であることがわかった。一方、交互作用の影響はほとんど見られなかった。今後は上記の得られた結果に基づき、大量生産のためのスケールアップ技術の開発が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。ダイレクト糊化の基盤技術の開発のために、高速せん断加工用ミキサーのせん断条件を操作して米ゲルを調製し、操作パラメータと米ゲル物性の関係を把握した。実験はダイレクト糊化物性制御システムを試作して行った。本システムはコンプレッサー、ボイラー、およびボイラーより供給される温水および冷却水が循環するジャケットに覆われたボウルで構成される。せん断速度を5003000rpm、せん断時間を110minと変化させて米ゲルを調製した。米ゲルの物性(動的粘弾性)は、調製3h後に動的粘弾性測定装置を用いて測定した。その結果、貯蔵弾性率G'および損失弾性率G"は回転数の増加に伴い増加した。また、せん断時間が5minを超えるとゲル物性は平衡状態に達する傾向があり、さらに平衡後の動的粘弾性は回転数によって異なる値を示した。一方、麺用素材の開発のために、加工条件と米ゲル麺の物性との関係を調べた。ダイレクト糊化により調製された米ゲルを素材とし、押し出し式の製麺機を用いて米ゲル麺を調製した。糊化米調製時の加水量は重量比で米の1.0倍あるいは1.2倍、せん断速度は1500rpm,撹拌時間は13分間で米ゲルを調製した。さらに、撹絆時の圧力が物性に与える影響を調べるため撹搾時の圧力を0.010.07MPaに減圧操作して米ゲルを調製した。測定項目は、米ゲルの動的粘弾性、米ゲル麺は破断試験とした。その結果、炊飯時の加水量が少ないほど、撹拌時間が長いほど、さらに撹拌時の圧力が低いほど米ゲルのG'およびG"の値は大きく、また米ゲル麺の破断応力は大きくなった。また、冷凍うどんと同程度の硬さをもつ米ゲル麺を調製可能であった。

つまり、米ゲルの物性を制御するにはせん断速度が最も重要であることがわかった。一方、交互作用の影響はほとんど見られなかった。今後は上記の得られた結果に基づき、大量生産のためのスケールアップ技術の開発が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究の第1段階であるダイレクト糊化の基礎技術の開発は、試作装置も完成し順調にデータも取得できている。さらに、第2段階の製麺技術の開発にまで到達しており、製パン技術に関しても現在データ取得中である。以上より、米を素材にしたダイレクト糊化技術に関しては当初の計画以上に進捗しているが、一方そば、小麦に関しては26年度より着手予定である。これは、まず米で技術をおおむね確立してから、他の素材の研究に着手した方が効率的であると判断した結果である。ダイレクト糊化の加工条件とゲル物性の関係については、せん断速度、せん断時間、および温度などのパラメータと動的粘弾性の応答曲面を作ることを目標としている。また、米麺に関しては押し出し成形だけでなく、大規模生産用に麺帯に加工して製麺する技術の開発や、米粉とのハイブリッド製麺法に着手することも計画している。
腫瘍特異的リンパ球をドラッグキャリアに用いた皮膚悪性腫瘍に対する新規治療法の開発

本研究は、腫瘍に対する免疫応答で活性化したリンパ球が腫瘍特異的に腫瘍部位に浸潤することを利用して、腫瘍特異的リンパ球をドラッグキャリアとする新しいcell-mediated drug deliverysystemによる皮膚悪性腫瘍治療の開発を行うことを目的として実験を行った。まず、リンパ球に取り込ません抗がん剤含有ナノ粒子を作成した。抗がん剤にはドセタキセルを、ナノ粒子にはPLGAを選択した。薬剤およびPLGAを有機溶媒に誘拐させ、界面活性剤水溶液中でエマルジョン化した。続いて、抗がん剤と同様の化学的特性をもつ蛍光物質(クマリン)を含有したナノ粒子を代替とし、PLGAナノ粒子とリンパ球との共培養によりその取り込みを蛍光顕微鏡ならびに共焦点レーザー顕微鏡にて検討したところ、リンパ球内にクマリンの取り込みが確認できた。次に、ドセタキセル含有PLGA粒子をリンパ球と共培養させ、ドセタキセルのリンパ球への取り込みを検討したところ、ナノ粒子の取り込み量が少なく、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)による定量評価は困難であった。現状ではHPLCより高感度な薬剤検出方法がなくリンパ球に取り込まれたドセタキセル含有量の評価は今後の課題である。上記で作成したドセタキセル含有リンパ球を用いて血管肉腫に対する治療効果を検討するために、ドセタキセル含有リンパ球と血管肉腫細胞株との共培養を行い、細胞増殖試験、フローサイトメトリーを行ったが、優位な細胞増殖抑制効果、アポトーシス誘導効果は認められなかった。この結果はリンパ球に取り込まれたドセタキセルの量が少なかったためかリンパ球からの放出が出来なかったためであると考えられた。結論として、リンパ球をドラッグキャリアとするdrug deliverysystemを確立するためにはリンパ球への薬剤の取り込み効率をさらに上げていく必要があると考えた。本研究は、腫瘍に対する免疫応答で活性化したリンパ球が腫瘍特異的に浸潤することを利用して、腫瘍特異的リンパ球をドラッグキャリアとする新しいcell-mediate drug deliverysystemによる皮膚悪性腫瘍治療の開発を行うことが目的とし、本年度は1.抗癌剤含有PLGAナノ粒子の作成2.作成した抗癌剤含有PLGAナノ粒子の腫瘍特異的リンパ球への取り込み効果の検討を行った。抗癌剤含有PLGAナノ粒子は薬剤およびPLGAを有機溶媒に溶解させ界面活性剤水溶液中でエマルションにすることで作製した。粒子径およびゼータポテンシャルを測定し、粒子中の薬剤含有量は高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて測定した。リンパ球へ取り込みについては、抗癌剤と同様の化学的特性をもつ蛍光物質を含有するナノ粒子を代替として用い、PLGAナノ粒子とリンパ球との共培養後、視覚化し評価する。評価には共焦点レーザー顕微鏡・蛍光顕微鏡を用いた。抗癌剤はタキサン系抗癌剤であるドセタキセルを選択した。ドセタキセル含有PLGAナノ粒子の作成は成功したが、ナノ粒子のリンパ球への取り込みついて、効率の良い至適条件の設定に苦慮している。リンパ球への取り込みについてはクマリン含有PLGAナノ粒子の取り込みを共焦点レーザー顕微鏡で確認することができたが、取り込まれたナノ粒子が少なく、HPLCなどによるリンパ球内に取り込まれた抗癌剤の定量評価が困難であった。リンパ球へのさらなるナノ粒子の高率のより取り込みに対する工夫が必要と考えた。抗癌剤含有PLGAナノ粒子の作成は予定通り進行しているが、リンパ球への効率的なナノ粒子の取り込みについて、至適条件がまだ設定できずに苦慮している。リンパ球は近年腫瘍免疫の要として治療への応用が期待されている。実際、CAR-T細胞療法など新規治療が出てきているが、リンパ球の腫瘍向性を利用して、薬剤を効果的に腫瘍組織内部にまで届けるための細胞キャリアとして使うことを目的として本研究を行なっている。まず、抗がん剤含有PLGAナノ粒子の作成を昨年度より継続して行なった。クマリン-6とポリ乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)をジクロロメタンで溶解し、ポリビニルアルコール水溶液と混合して超音波で乳化後、ジクロロメタンを揮発させて、純水による洗浄で余剰のポリビニルアルコールを除去した。凍結乾燥によって乾燥粒子を得た。動的光散乱法により測定した粒子径は、水中分散の状態で、288±143 nmであった。続いて、マウスsplenocytesを磁気ビーズでCD14+群とCD14ー群とに分離し、クマリン含有PLGAナノ粒子を培養液に加えて1h incubate, wash,蛍光顕微鏡で観察したところ、リンパ球(CD14ー)におけるナノ粒子の取り込みは、単球(CD14+)と比較して約1/3程度であった。次に、ナノ粒子取り込み(200μg/ml or 400μg/ml in medium)後のリンパ球を凍結融解および超音波により破砕し、ジクロロメタンを加えて色素の溶出、蛍光プレートリーダーで定量を試みた。培養液中の粒子懸濁濃度と相関して粒子の取り込みを認めた。以上より、リンパ球へのPLGAナノ粒子を用いた薬剤の取り込みは、単球と比較して1/3程度と低かったが、容量依存性に取り込みが増えることも検討できた。リンパ球への効率的なナノ粒子の取り込み至適条件の設定に時間がかかったため。

まず、リンパ球に取り込ません抗がん剤含有ナノ粒子を作成した。抗がん剤にはドセタキセルを、ナノ粒子にはPLGAを選択した。薬剤およびPLGAを有機溶媒に誘拐させ、界面活性剤水溶液中でエマルジョン化した。続いて、抗がん剤と同様の化学的特性をもつ蛍光物質(クマリン)を含有したナノ粒子を代替とし、PLGAナノ粒子とリンパ球との共培養によりその取り込みを蛍光顕微鏡ならびに共焦点レーザー顕微鏡にて検討したところ、リンパ球内にクマリンの取り込みが確認できた。次に、ドセタキセル含有PLGA粒子をリンパ球と共培養させ、ドセタキセルのリンパ球への取り込みを検討したところ、ナノ粒子の取り込み量が少なく、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)による定量評価は困難であった。現状ではHPLCより高感度な薬剤検出方法がなくリンパ球に取り込まれたドセタキセル含有量の評価は今後の課題である。上記で作成したドセタキセル含有リンパ球を用いて血管肉腫に対する治療効果を検討するために、ドセタキセル含有リンパ球と血管肉腫細胞株との共培養を行い、細胞増殖試験、フローサイトメトリーを行ったが、優位な細胞増殖抑制効果、アポトーシス誘導効果は認められなかった。この結果はリンパ球に取り込まれたドセタキセルの量が少なかったためかリンパ球からの放出が出来なかったためであると考えられた。結論として、リンパ球をドラッグキャリアとするdrug deliverysystemを確立するためにはリンパ球への薬剤の取り込み効率をさらに上げていく必要があると考えた。昨年度に引き続き、抗癌剤含有PLGAナノ粒子の腫瘍得的リンパ球への効率的な取り込みについて、至適条件を検討する。そしてリンパ球への充分量の取り込みが可能となれば、引き続いてin vitroならびにin vivoでの抗腫瘍効果の検討にうつる予定である。次年度は作成した抗がん剤含有リンパ球の遊走能、腫瘍縮小効果についてin vitro, in vivoともに検討予定である。
がん遺伝子治療の基礎的研究

(1)相同組み換えの効率化に向けて、相同組換えのホモロジー長さへの依存性についてのランダムウォークモデルを用い、その理論的・実験的考察を行った。(2)遺伝子標的法の開発を目的し、リボザイムが認識可能な全く新規のRNAモチーフを発見し、その特性を生かした転座によるキメラ遺伝子発現のダイマー型ミニザイム法による制御技術を確立した。またアンチセンスK-rasRNA発現ベクター導入はK-ras遺伝子に異常のある複数のがん細胞に対して有効であること、および、PTI-遺伝子の活性化が本ベクターによる増殖抑制効果の規定因子の1つである可能性を示した。(3)腫瘍細胞ターゲッティング法開発を目的に、Tf(トランスフェリン)-DNA複合体の作製、アルファフェトプロティン(AFP)のプロモーターとレトロウイルス(ecotropic retrovius)のレセプター遺伝子を持つアデノウイルスベクターの作製、癌特異的ブロモーターと部位特異的組換え酵素Cre/loxPアデノウイルスベクター系の作製、VSVシュードタイプベクターの作製、新規HVJ-リポソーム法の開発を行い、それぞれについて有望な結果を得た。(4)より信頼性の高い前臨床動物系の確立を目的に、マウスならびにコモンマーモセット個体への各種ベクターを用いた遺伝子治療をおこない、その有効性と安全性を評価した。(5)3種類のがんに対する遺伝子治療臨床プロトコールが各施設内遺伝子治療委員会や厚生・文部両省専門委員会レベルで検討中である。以上のように本研究班では、がんに対する遺伝子治療開発の基礎から臨床展開に及ぶ広範囲の研究を行ってきており、本邦における臨床遺伝子治療分野における着実な進歩に寄与しつつある。癌遺伝子治療計画では、免疫、薬剤感受性、癌関連遺伝子の3方面からのアプローチがとられているが、その臨床応用を考えた場合、導入遺伝子、発現ベクター系、癌細胞ターゲティングの面で更に開発を加える必要がある。この観点から本年度は、(1)癌免疫遺伝子治療法開発については、特に脳腫瘍、白血病ならびに腎細胞癌に焦点をあて研究を行っており、臨床応用への展開も図っている。(2)自殺遺伝子治療を用いた癌細胞ターゲテイング法の開発として、TK遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をレトロウイルスベクターやリポソームを用いて腫瘍局所へ導入し、in vivoでも明らかな効果があることを確認した。(3)新しいリボザイムとして、従来のハンマー型リボザイムを改変したミニザイムの有効性を示し得たことに加え、現在リンパ性白血病での染色体転座部位を標的とした抗白血病作用の検討を行っている。(4)アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、リポソームの各ベクター系に関して、引き続きその高発現性と安全性確保にむけて本邦独自の、臨床実用化をめざした検討が進められている。(5)相同組換え法の開発はその機構解明に焦点をしぼった研究をおこなった。現在その効率を上げ遺伝子点突然変異由来のガンの増殖抑制にむけて研究を進めている。(6)霊長類モデルであるコモンマーモセット骨髄細胞中へ、レトロウイルスベクターを用いて多剤耐性(MDR)遺伝子をin vitroで比較的高率に導入できた。現在遺伝子導入骨髄細胞を移植し、固形がん治療の大量化学療法時のin vivo骨髄細胞動態に関する検討をマ-モセットを用いて行い、ヒトへの応用に向けての安全性を検討する予定である。この研究班ではこれ迄がん遺伝子治療の開発を行う目的で、(1)遺伝子ターゲッティング法の開発、(2)細胞ターゲッティング法の開発、(3)免疫遺伝子治療法の開発、(4)疾患モデル動物の開発ならびに、(5)臨床プロトコールの作製を行ってきている。すなわち、(1)ではホモロガスリコンビネーションの効率化をめざしてその実践的理論を構築するとともに、リボザイムの改良型であるダイマー型ミニザイムを作製し、特異的遺伝子配列を認識、切断できるリボザイム系をより汎用性のある方法に進化させることができた。また(2)では細胞特異的プロモーターの発現増強系をCre/loxPシステムを用いて作製することに加え、トランスフェリンやアシアロ糖タンパクリセプターを用いた肝細胞のターゲッティング法の改良、HIVエンベロープを用いた細胞ターゲッティングモデル系、さらには抗Thy-1抗体を用いた血球系細胞ターゲッティング法の開発などが検討され、それぞれ将来的に有望な方法と考えられた。また、局所投与による細胞ターゲッティング法として、膀胱がん、腹膜播種性膵臓がんを対象に自殺遺伝子導入が、脳腫瘍を対象にインターフェロンβ遺伝子導入が各種ウイルスベクターを用いて、さらに肝細胞を対象にArtificial Viral Envelopeリポソームを用いたマーカー遺伝子導入法が検討され、明らかな前臨床動物実験効果が得られており、これらはより実践的な方法を用いていることから臨床研究の早期実行が可能であるものと考えられた。(3)ではIL-12,GM-CSF,B7-1などのサイトカイン遺伝子を用いた研究に加え、腫瘍抗原遺伝子を用いた免疫遺伝子治療の前臨床動物実験が行われ、一部では臨床応用も既に計画されており、ヒトでの効果に期待が持たれている。(4)ではマウスはもちろん小型サルであるコモンマーモセットを用いた研究が進められており、いくつかの疾患モデルの作製が行われており、ヒトにより近い前臨床試験動物として新規遺伝子導入ベクターの安全性ならびに効果面の評価系として期待が持たれている。(5)ではすでに転移性腎細胞がんに対するGM-CSF遺伝子導入自家腎細胞がん細胞を用いた免疫遺伝子治療の臨床プロトコールが厚生・文部の省者に提出されており、再発あるいは進行乳ガン症例に対するMDRI遺伝子導入自家造血幹細胞臨床

プロトコールならびに脳腫瘍に対するインターフェロンβ遺伝子導入臨床プロトコールが各施設内遺伝子治療審査委員会で検討されている。以上のように本研究班では、がんに対する遺伝子治療開発の基礎から臨床展開に及ぶ広範囲の研究を行ってきており、着実な進歩を遂げている。(1)相同組み換えの効率化に向けて、相同組換えのホモロジー長さへの依存性についてのランダムウォークモデルを用い、その理論的・実験的考察を行った。(2)遺伝子標的法の開発を目的し、リボザイムが認識可能な全く新規のRNAモチーフを発見し、その特性を生かした転座によるキメラ遺伝子発現のダイマー型ミニザイム法による制御技術を確立した。またアンチセンスK-rasRNA発現ベクター導入はK-ras遺伝子に異常のある複数のがん細胞に対して有効であること、および、PTI-遺伝子の活性化が本ベクターによる増殖抑制効果の規定因子の1つである可能性を示した。(3)腫瘍細胞ターゲッティング法開発を目的に、Tf(トランスフェリン)-DNA複合体の作製、アルファフェトプロティン(AFP)のプロモーターとレトロウイルス(ecotropic retrovius)のレセプター遺伝子を持つアデノウイルスベクターの作製、癌特異的ブロモーターと部位特異的組換え酵素Cre/loxPアデノウイルスベクター系の作製、VSVシュードタイプベクターの作製、新規HVJ-リポソーム法の開発を行い、それぞれについて有望な結果を得た。(4)より信頼性の高い前臨床動物系の確立を目的に、マウスならびにコモンマーモセット個体への各種ベクターを用いた遺伝子治療をおこない、その有効性と安全性を評価した。(5)3種類のがんに対する遺伝子治療臨床プロトコールが各施設内遺伝子治療委員会や厚生・文部両省専門委員会レベルで検討中である。以上のように本研究班では、がんに対する遺伝子治療開発の基礎から臨床展開に及ぶ広範囲の研究を行ってきており、本邦における臨床遺伝子治療分野における着実な進歩に寄与しつつある。
GFP遺伝子導入による胃癌腹膜微小転移形成とその進展機構の解析

胃癌の腹膜転移は根治手術後の再発様式の半数以上を占め、最も重要な予後因子である。本研究(平成16-17年度)はこの腹膜再発の予防をめざし、腹膜転移の初期過程である微小転移形成とその後の播種性進展の分子基盤を解明し、それに基づく新しい治療法を開発することを目標とする。期間内に以下の諸点を明らかにした。1)糖鎖被覆リボゾーム(ローダミン標識)およびGFP導入胃癌腹膜転移細胞の腹腔内接種(蛍光2重標識法)により胃癌の初期(微小)転移巣が大網などに存在する小節外リンパ組織である乳斑に選択的に形成されること、2)大網乳斑に生着した胃癌細胞の微小転移巣における発育に及ぼす血管新生の役割をCD31の免疫染色により検討し、血管新生はDay3から始まりDay7でほぼ完成するが、ヒト化抗VEGF抗体の早期腹腔内投与によりこの血管新生は阻害され、微小転移の発育が有意に抑制されること、3)微小転移形成はTNF-αノックアウトマウスにおいて阻害されないが、腹壁腹膜など乳斑の存在しない腹腔内臓器への播種性進展が顕著に抑制され、腹水貯留や生存日数の有意な延長が認められること、4)このKOマウスにおける播種性進展の抑制は野生型マウスの骨髄を移植したキメラマウスにおいて解除されることなどを見出し、腹腔炎症細胞の分泌するTNF-αが腹膜播種性進展に重要な関与をすることを明らかにした。さらに5)ヒト胃癌腹膜転移モデルにおいてもヒト化抗TNF-α抗体の腹腔内投与により腹膜播種性進展が有意に抑制され、癌細胞自身のTNF-αも播種性進展に関与する可能性を示唆した。以上の結果は胃癌の腹膜転移の発生・進展には癌細胞自身の増殖能や転移能と並んで、血管新生や炎症細胞に由来するサイトカイン(TNF-α)など宿主側の要因が重要であることを強く示唆している。これらの知見にもとづき、現在、糖鎖被覆リボゾームを用いた腹膜微小転移巣に特異的に抗がん剤を送達できるドラッグデリバリーシステムの構築や、抗VEGF抗体や抗TNF-α抗体を用いた播種性進展抑制法の開発を推し進めている。本年度はGFP遺伝子を導入して作成した種々の胃癌・大腸癌の腹膜転移モデルと各種ノックアウトマウス等を用いて腹膜転移のin vivoにおける発育・進展過程を解析し、以下の諸点を明らかにした。1)糖鎖被覆リポゾーム(ローダミン標識)を腹腔内接種するとマクロファージに取り込まれ大網の節外リンパ組織である乳斑にホーミングする。この性質を利用して、GFP導入胃癌腹膜転移細胞が乳斑に一致して微小転移巣を形成すること、すなわち初期転移巣が組織特異的であることを蛍光2重染色法により明らかにした。2)大網乳斑の構成細胞と考えられるγδT細胞やそれらのエフェクター分子であるTNF-αなどのサイトカインを欠失したノックアウトマウスを用いて、同系マウス(C57BL)由来のGFP-遺伝子導入Lewis肺癌細胞の腹膜転移の初期・進展過程に及ぼす両分子の役割を検討した。

その結果、TNF-αノックアウトマウスにおいて初期転移巣形成率が低い傾向が見られると共に、組織学的に腹壁腹膜や横隔膜など乳斑の存在しない腹腔内組織への播種性進展が抑制され、また生存日数の有意な延長が認められたことから、炎症性サイトカインであるTNF-αが腹膜転移促進に重要な関与をすることが明らかになった。3)大腸癌は胃癌と異なり、腹膜転移をきたしにくい。この機構を明らかにすることは胃癌の腹膜転移に対する全く新しい治療法の開発に繋がる可能性がある。腹膜転移性胃癌細胞株(MKN-45)と大腸癌由来で腹膜にドーマントな転移しか形成しない細胞株(COLM-2)を用いて両者の差異について検討した。胃癌細胞株と大腸癌細胞株の皮下腫瘍の発育に差は認められなかったが、腹膜転移では大腸癌の腫瘍重量は胃癌の1/10以下であった。また組織学的に大腸癌の腹膜転移巣ではアポトーシスと炎症細胞浸潤の亢進および繊維化などの変化が認められ、大腸癌腹膜転移のドーマンシーと炎症とが間連する可能性が示唆された。本年度はGFP遺伝子導入ヒト胃癌・大腸癌のヌードマウス腹膜転移モデルおよびノックアウト(KO)マウスモデルを用いて腹膜転移のin vivoにおける発育・進展過程を解析し、以下の諸点を明らかにした。1)胃癌細胞株の腹腔内接種後に大網乳斑に生着した微小転移巣ではDay3から血管新生が始まりDay7でほぼ完成することがCD31の免疫染色から判明した。ヒト化抗VEGF抗体であるBevacizumabの早期腹腔内投与によりこの血管新生は阻害され、微小転移の発育が有意に抑制され、生存延長も認められた。2)TNF-αKOマウスにおいては野生型マウスに比べ、マウスLewis肺癌細胞の腹腔内初期生着および増殖に有意な変化は認められなかったが、腹壁腹膜などへの播種性進展が抑制され、その結果生存日数の有意な延長が認められた。この播種性進展の抑制は野生型マウスの骨髄を移植したキメラマウスにおいて解除されたことから、腹腔炎症細胞の分泌するTNF-αが腹膜播種性進展に重要な関与をすることが明らかになった。またヒト胃癌腹膜転移モデルにおいてもヒト化抗TNF-α抗体の腹腔内投与により腹膜播種性進展が有意に抑制され、癌細胞自身のTNF-αも播種性進展に関与する可能性が示唆された。3)ヒト大腸癌腹腔洗浄液中の遊離癌細胞を定量CEA RT-PCR法で検討した。その結果、大腸癌患者でも胃癌と同程度に腹腔内に癌細胞が遊離していること、しかし大腸癌ではこれが腹膜再発に結びつかないことが判明した。大腸癌細胞が胃癌細胞に比べ腹膜転移能が低い可能性が示唆されたことから胃癌細胞株(MKN-45)と大腸癌細胞株(COLM-2)を用いて両者の腹膜転移能の差異について検討したところ、大腸癌の腹膜転移重量は胃癌の1/10以下であり、腹膜転移能が低いことが判明した。以上の結果は消化器癌の腹膜転移の発生・進展には癌細胞自身の転移能と血管新生や炎症細胞など宿主側の要因がともに重要であることを示唆している。
「わかっているができない」現象の情報処理過程の解明

今年度は,「運動課題の理解と遂行に及ぼす練習環境のデザイン」をテーマに,運動課題の明示的呈示がない場合にも,練習方法(環境)の設定によって,その環境の制約にしたがって身体運動が環境との相互作用の中から生成される可能性を考えた.そこで,サッカーのパスにおいて,3人でパスをまわす条件と,防御者を一人加えて防御者にボールを奪われないようにパスを回すという条件を設定し,未経験者のパス動作を動作解析した.その結果,防御者を設定しない場合よりは,設定した場合の方がボールをコントロールしてからキックするまでの時間が短縮されるが,パスの正確性には影響がないことが明らかになった.このことは遂行者がディフェンダーにボールを奪われないようにとすることが,結果的に動作時間の短縮に結びついており,「早くパスを出す」ことを理解するよりも,「相手にボールを奪われない」ことを理解することによって動作遂行が異なったと考えられる.また,ボールを受けるときの待球姿勢に違いが見られ,防御者を設定した方が,左右どちらにでもパスを送れるような姿勢でボールを受けていることが明らかになった.この待球姿勢の変化も,遂行者が必ずしもその姿勢の有効性を「理解して遂行」しているわけではなく,課題の制約,あるいは練習環境によって「理解しなくても遂行」できた,言い換えればそうした課題の制約や練習環境に適応した結果と考えられる.したがって,運動学習においては,認知的な学習課題と異なり,必ずしも「知識の伝達→理解→遂行」という図式を取る必要はなく,「学習環境の設定(課題の制約)→遂行→理解」という学習過程の可能性を示唆するものである.本年度は,「わかっていてもできない」学習課題としての無意味動作系列の作成を中心に研究を進めた.その一つは,肘・肩関節と股・膝関節の屈曲と伸展を組み合わせて,前額面で左右対称な姿勢を44姿勢作成し,この44姿勢間の移動によって生じる関節変化数のマトリックスから,左右合わせて関節変化数がすべて1となる9姿勢からなる系列と11姿勢からなる系列を2系列ずつ作成し,また同様に関節変化数が4となる系列も9姿勢の系列と11姿勢の系列をそれぞれ2つずつ作成した.これらの4種類の2系列ずつ,合計8系列について,実写モデルによる撮影を行った.各姿勢の停止時間を1秒間とし,また各姿勢間の移動時間も1秒間となるように指示し,系列を練習後,メトロノーム音にあわせて実施し,撮影した.しかしながら,撮影した系列を分析したところ,各姿勢の停止時間ならびに姿勢間の移動時間にばらつきが見られ,学習課題系列としては不十分であることが判明した.また,「わかる」ことと「できること」を区別するため,再認及び再生(模倣)課題を行うには,系列数が少なく,その原因は基本姿勢の数にも関係することから,次に,基本姿勢を非対称姿勢とし,これらの姿勢系列をコンピュータグラフィクス(CG)で作成することを試みた.ここでは,変化する関節は肩関節,肘関節の2関節とした.またその肢位は肩関節の0度,45度,90度,135度,180度のそれぞれ外転位,肘関節の0度と90度の屈曲位の組み合わせで片側5×2の10肢位であるが,肩関節180度外転位と肘関節90度の屈曲位の姿勢は特徴的であると考えられたため除外し,片側9肢位とした.したがって,これらの左右の組み合わせから9×9の81姿勢を基本姿勢とした.対象姿勢のときと同様,これら81姿勢間の関節変化数に関するマトリックスを作成し,三関節変化数が1と4という異なる関節変化数になる系列が作成できるようにした.現段階では,この関節変化数が1と4の2種類の姿勢系列について,その長さが1から6までの6種類の異なる長さの系列をそれぞれ8種類ずつ用意するようにした.そしてまず,これらの81の基本姿勢をCGとして表現し,その後,姿勢系列になるように姿勢間の移動を2姿勢間の補完により作成した.本年度は,「わかっていてもできない」課題として,実際のスポーツ技能である走り幅跳びの踏み切り調整とサッカーの選択的パス動作について観察検討した.走り幅跳びの踏み切り動作では,踏み切り線を踏み越えずに最大距離の跳躍が要求される.そうした明示的規則にもかかわらず,ファールと呼ばれる踏切線の踏み越しが見られる.この走り幅跳びの助走動作における歩幅調整に注目し,そのダイナミクスを検討した.つまり,踏み切り直前までの歩幅調整の様相とその際の身体協応から,どのような情報処理が行われているのかを推察した.その結果,固定的な助走動作ではなく,個人差はあるものの,踏み切り数歩前から腰の回転を小さくし,下肢の調整可能性を高める方略が採用されていることが明らかになった.つまり,事前に決められた固定的な運動プログラムのフィードフォワード制御ではなく,体幹部の固定による遠位の自由度を高め,環境との相互作用の中で調整を継続するという情報処理過程であると考えられる.さらに,こうした調整過程と比較的固定的な過程が連続的に切り替わっていることから,こうした制御方略の滑らかな切替が「できる」ためには重要であると考えられる.このことは,運動技能における「わかっていてもできない」現象では,概念的あるいは意識的に「わかる」必要がなく,逆に意識的にわかろうとすることが妨害的に働くことも考えられた.サッカーのパス動作では,ボールをける方向を指示するタイミングを実験的に操作し,「わかる」タイミングとそれが「できる」タイミングについて検討を加えた.

これは,ボールが転がってくる途中でパスすべき方向をLEDで呈示し,その動作を分析した.まだ予備段階で,いつパスすべき方向を呈示すると,「わかっていてもできない」状況を操作できるかを検討中である.今年度は,「運動課題の理解と遂行に及ぼす練習環境のデザイン」をテーマに,運動課題の明示的呈示がない場合にも,練習方法(環境)の設定によって,その環境の制約にしたがって身体運動が環境との相互作用の中から生成される可能性を考えた.そこで,サッカーのパスにおいて,3人でパスをまわす条件と,防御者を一人加えて防御者にボールを奪われないようにパスを回すという条件を設定し,未経験者のパス動作を動作解析した.その結果,防御者を設定しない場合よりは,設定した場合の方がボールをコントロールしてからキックするまでの時間が短縮されるが,パスの正確性には影響がないことが明らかになった.このことは遂行者がディフェンダーにボールを奪われないようにとすることが,結果的に動作時間の短縮に結びついており,「早くパスを出す」ことを理解するよりも,「相手にボールを奪われない」ことを理解することによって動作遂行が異なったと考えられる.また,ボールを受けるときの待球姿勢に違いが見られ,防御者を設定した方が,左右どちらにでもパスを送れるような姿勢でボールを受けていることが明らかになった.この待球姿勢の変化も,遂行者が必ずしもその姿勢の有効性を「理解して遂行」しているわけではなく,課題の制約,あるいは練習環境によって「理解しなくても遂行」できた,言い換えればそうした課題の制約や練習環境に適応した結果と考えられる.したがって,運動学習においては,認知的な学習課題と異なり,必ずしも「知識の伝達→理解→遂行」という図式を取る必要はなく,「学習環境の設定(課題の制約)→遂行→理解」という学習過程の可能性を示唆するものである.
幹細胞導入による頭蓋顎顔面領域の機能的再生外科学の創生

ポリマー深部で播種細胞を健全な状態で維持生存させるためには、ポリマーの酸素や栄養素の透過性が問題になることがわかった。このため、酸素透過性を有することが明らかになっている生分解性天然型ポリマーを選択し、透過性全般について検討した。天然型ポリマーをシート状に加工して、透過性を検討したところ、酸素透過性は生分解性合成型ポリマーであるポリカプロラクトンより有意に優れていた。その他、分子量1000前後の微量栄養素を透過したことから、アミノ酸やペプチドなどの分子量の低い物質も透過性があることが推測された。この天然型ポリマーで円柱型スポンジを作成する方法を確立した。将来の臨床応用を考慮し、有機溶媒を用いる方法だけでなく、有機溶媒を用いない方法も考案した。塩と水を利用する方法のため無害であり、塩顆粒溶解後のスポンジ構造はつぶれることなく、良好に維持されていた。スポンジ構造内部で軟骨再生は表層だけでなく、深部でも得られることが確認された。ただし、家兎軟骨細胞軟骨再生には少なくとも2ヶ月から3ヶ月以上の長期間がかかることが明らかになった。骨髄実質幹細胞は増殖を維持するためには常に細胞密度を多く保たなければ、細胞が平坦化し、細胞分化が誘導されてしまうため、播種密度が低い状態から細胞増殖を維持することはできなかった。また、骨髄間質幹細胞、および、軟骨膜前駆細胞、軟骨細胞から、軟骨再生誘導を比較検討したところ、軟骨再生にかかる時間、および、成長因子の投与量は骨髄間質幹細胞>軟骨膜前駆細胞>軟骨細胞の順で多くなる傾向が示唆され、実質的な医療経済性を考慮すると、軟骨再生に関して幹細胞に頼る必要性は必ずしも高くないことが推察された。今年度は軟骨再生に関与する前駆細胞である軟骨膜に存在する軟骨前駆細胞の培養技術と細胞シグナル制御による分化誘導技術に関して検討した。培養細胞として家兎耳介軟骨膜を2型コラゲナーゼで3時間消化することで、軟骨前駆細胞を単離し、10ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および10%胎児牛血清を添加したHam's F12培養液で増殖させることができた。現在、さらに骨髄間質幹細胞の増殖能を検討中である。長期移植時の形状安定性に関係するスポンジ状ポリマーの強度を検討した。歯科用印象剤と皮膚生検パンチを利用して円柱形をくりぬき、250-500μm径の顆粒を有する蔗糖で円柱型鋳型を作成した。生分解性ポリマーの重合度を変化させ、分子量7万および27万ポリカプロラクトン(PCL)から合成したスポンジ状ポリマーの圧迫強度を比較した。弾性係数は7万PCLが10.9±2.5kPa、27万PCLが6.3±2.7kPaであり、有意差を認めた。このことから、ポリマーの重合度はスポンジ状ポリマーの強度に影響することが明らかになったが、重合度の増加と弾性係数の低下との関係は現在検討中である。来年度はポアサイズを100μm前後および500μm以上に変化させ、ポアサイズが強度に及ぼす影響を引き続き検討する。家兎軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ誘導するためには、円柱形スポンジ状ポリマーに軟骨前駆細胞を播種し、組織転換成長因子(TGF-β)およびインスリン様成長因子(IGF-I)、ITS(インスリン、トランスフェリンなどの混合液)を添加することにより相乗効果が生じ、II型コラーゲン、グリコサミノグリカン産生が効率的に誘導されることが、I型およびII型コラーゲン、プロテオグリカンに対する免疫染色を用いて明らかにされた。今年度は移植する再生組織の形態に関する研究で、生分解性ポリマーによる三次元立体形状の再現方法を比較検討した。