hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物色素ベタレインの種を超えたエンジニアリング基盤の構築

ベタレイン色素はナデシコ目植物特有に含まれる色素であり、鮮明な赤紫ー黄色を呈し、強い抗酸化作用を有することが知られている。本研究ではナデシコ目植物以外におけるベタレイン色素の蓄積を目指して、ベタレイン色素生合成関連遺伝子の導入を行い、タバコ、トレニア、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、リンドウの葉、花、果実、塊茎など様々な器官において、ベタレイン色素を蓄積する植物の作出に成功した。本研究成果は、ベタレイン色素の植物における生理学的機能の解析や機能性等の研究に活用が可能である。ベタレイン色素のエンジニアリングを目指して、各種植物形質転換用バイナリーベクターを構築した。オシロイバナのMjDOD(DOPA 4,5-dioxygenase)、Mj5GT(cyclo-DOPA 5-O-glucosyltransferase)、シイタケのチロシナーゼ(LeTYR)、赤ビートのBvCYP76AD1遺伝子の発現ベクターを構築した。構成的発現を示すCaMV35Sプロモーターに加えて、LeTYRとBvCYP76AD1については、花弁特異的プロモーターとしてトレニアDFRとDEFプロモーター、塊茎特異的プロモーターとしてジャガイモのPatatinプロモーター、果実特異的プロモーターとしてトマト(E8pro)を用いた。上記ベクターを用いてタバコ、トレニア、ジャガイモ、トマト、リンドウの形質転換を行った。その結果、Patatin pro-LeTyrと35SproMjDOD遺伝子を導入したジャガイモにおいて、塊茎が黄色くなりベタキサンチンの蓄積が認められた。また、35SproでBvCYP76AD1,MjDOD, Mj5GTを同時に導入した植物ではカルス及び、再分化後の茎葉が赤色を呈した。さらに花色は元々の着色に加えて赤味がかった色を呈した。タバコとトレニアにおいてLC-MS解析により、本赤色色素はベタニンであることが確認され、本花弁においてはアントシアニンとベタシアニンの共存が認められた。また、形質転換ホストとして用いるためCRISPR/Cas9システムにより、トレニアとタバコのF3H編集個体を作出した。BvCYP76AD1組換えタンパクにより酵素活性を測定したところ、チロシナーゼからL-DOPAへの変換活性が認められた。タバコ懸濁培養細胞BY2においてもベタシアニンの蓄積が確認されたことより、本酵素は生体内においてもBifunctionalな活性を有することが確認された。アントシアニンとベタレイン色素の共存する植物の作出に成功した。また、各種植物形質転換用のベクターも予定通り構築し、植物の形質転換を開始した。タバコ、トレニア、リンドウでは花弁、トマトでは果実、ジャガイモでは塊茎の各種植物器官における蓄積を誘導するためプロモーター改変も行っており、結果が期待される。また、BvCYP76AD1についてはチロシンを水酸化する活性を有することが示されたが、他の研究者によっても確認されている。そのため、ベタシアニンのエンジニアリングについてはシイタケチロシナーゼを有しないベクターでの検討にも取組むこととし、当初計画どおり、プロモーターと器官特異的着色との相関を解析できるよう再構築した。ベタレイン色素による植物のエンジニアリング基盤の確立に向けて、タバコ、トレニア、リンドウ、ジャガイモ、トマトの形質転換体を作出し、解析を継続して進めている。ベタシアニン色素については、構成的発現プロモーターと花弁特異的プロモーターを用いて、花では、タバコ、トレニア、リンドウで花色改変、ベタシアニンの蓄積に成功した。また、構成的プロモーターと果実特異的プロモーターを用いてトマトの実で、構成的プロモーターと塊茎特異的プロモーターを用いてジャガイモのマイクロチューバーでベタシアニンの生産に成功している。タバコ、トマトにおいては後代の種子を採種し、外来遺伝子の発現、ベタシアニン蓄積の安定性、遺伝性を解析中である。ジャガイモについては閉鎖系温室へ順化し、栽培中であり、今後、塊茎での遺伝子発現、ベタシアニンの蓄積を解析する予定である。ベタキサンチン色素についてはシイタケチロシナーゼ遺伝子により塊茎特異的プロモーターを用いて、ジャガイモ塊茎での蓄積に成功しているが、花においては未達成であるため、現在、新たな花弁特異的プロモーターによるベクターを構築し、トレニア、タバコ、リンドウへの形質転換を進めている。タバコにおいては、構成的プロモーターを用いてベタキサンチンの蓄積を試みたが、葉でのベタキサンチンの蓄積が濃い系統では生育不良が認められ、ほとんどが開花に至らなかった。その中で1系統のみではあるが、開花が見られ、黄花の花が獲得されたため、後代の種子を採種した。これら作出中の形質転換体と後代について、次年度、解析を進める予定である。花、塊茎、果実ともにベタシアニン色素を蓄積した形質転換体の作出に成功している。今後、これら形質転換体の解析を進めることにより、植物におけるベタレイン色素エンジニアリングの基盤が構築されると期待される。ベタキサンチン色素についてはシイタケチロシナーゼ遺伝子を用いて塊茎での蓄積に成功したが、花や果実等については別の遺伝子と器官特異的プロモーターの組み合わせを用いて形質転換体の作出を進めており、最終年度までに結果が得られる見込みである。タバコについては黄花化した個体も得られているが、ベタキサンチンの蓄積によると思われる生育不良の問題があり、器官特異的プロモーターを利用したベクターコンストラクトを行い、再導入を諮っている。トレニア、リンドウについても形質転換体を作出中であり、ベタレインのエンジニアリングの可能性を最終年度までに追究できる予定であるため、概ね順調に進展していると考えられる。

ベタレイン色素による植物のエンジニアリング基盤の確立に向けて、タバコ、トレニア、ペチュニア、リンドウ、ジャガイモ、トマトの形質転換体を作出し、解析を進めている。最終年度として、これまで作出した形質転換植物の表現型ならびベタレイン色素の解析を行った。また、昨年度までの結果から、ベタキサンチン色素について構成的プロモーターを用いた花弁での蓄積が困難であったが、本年度、タバコ及びトレニアを用いて花弁特異的プロモーターを用いることで、黄花花が獲得された。その際、タバコについてはF3Hゲノム編集系統とCHS RNAi系統を用いて、リンドウF3'5'Hプロモーター、5ATプロモーターにより作出した。トレニアについては、F3H突然変異系統を用いてトレニアDFRプロモーターにより作出した。また、トマトについては果実特異的プロモーターを用いて作出したベタシアニン蓄積系統を果実発達4段階にわけて解析した結果、成熟ステージで急激にベタシアニン(ベタニンとイソベタニン)の蓄積が生じていることが示された。更にトマト果実のRNA-seq解析により発現プロファイルを得た。ジャガイモについては閉鎖系温室で栽培を行い、鉢栽培でもベタレインが塊茎に蓄積することが確認された。リンドウについてはCaMV35Sプロモーターのサイレンシングが生じることより、代替えプロモーターとして構成的発現を示すCmYLCVプロモーターを用いて、白花品種におけるベタシアニン色素の蓄積を検討したところ、ベタニン色素の蓄積による薄赤-ピンク花色への変化が認められた。なお、本形質転換体においては茎葉においても着色が認められた。さらにペチュニアについても花弁特異的InMYB1プロモーターによりベタシアニンに蓄積による花弁の薄ピンク化系統が得られており、花弁特異的にベタシアニンを作らせることにも成功した。ベタレイン色素はナデシコ目植物特有に含まれる色素であり、鮮明な赤紫ー黄色を呈し、強い抗酸化作用を有することが知られている。本研究ではナデシコ目植物以外におけるベタレイン色素の蓄積を目指して、ベタレイン色素生合成関連遺伝子の導入を行い、タバコ、トレニア、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、リンドウの葉、花、果実、塊茎など様々な器官において、ベタレイン色素を蓄積する植物の作出に成功した。本研究成果は、ベタレイン色素の植物における生理学的機能の解析や機能性等の研究に活用が可能である。引き続き、植物の形質転換体作出、得られた植物におけるベタレイン色素の動態を解析し、作物におけるベタレインエンジニアリングの系を構築する。なお、最近、赤ビートから初段階特異的酵素BvCYP76AD6も報告されたため、本遺伝子についてもベクターを追加構築し、検討を進める予定である。これまでに作出した形質転換体におけるベタレインの動態(遺伝子発現と蓄積量、細胞内分布等)について、特に、花色改変への適用を中心に解析を勧める。また、トマトにおいてはRNA-seq等を活用して、網羅的遺伝子発現解析により、果実でのベタレイン蓄積の影響を調査する。
涙腺上皮分泌顆粒とドライアイ発症機序

長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ(VDT群)を対象として、シェーグレン症候群ドライアイ群と正常群で比較し、涙腺における分泌顆粒(SV)の蓄積がVDTドライアイに関連するか否かを調査した。組織学的所見の解析結果より、VDT群の涙腺にはSVが過剰に蓄積していることが判明した。以上のことから、VDT群ではVDT作業による瞬目低下の影響で、涙液の産生は行われているが分泌が障害されSVが蓄積するという新たなメカニズムの関与が考えられた。長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ(VDTドライアイ)の発症メカニズムに、涙液分泌障害が関与しているか否かを調査するため、今年度は涙腺における自律神経について検討した。自律神経である副交感神経は、涙液分泌に重要な役割を果たしており、VDT作業により瞬目が低下しているVDTドライアイ群では、副交感神経に何らかの変化を来たしているのではないかと考えた。涙腺のパラフィン切片を用いて、アセチルコリンエステラーゼの免疫染色を施行した。VDTドライアイ群と、涙液産生障害型のシェーグレン症候群タイプのドライアイ群とを比較したところ、有意な差は得られなかった。続いて涙液分泌の際に、重要な役割を果たす神経筋接合部に注目した。涙腺腺房は筋上皮細胞に囲まれ、自律神経の刺激により筋上皮細胞が収縮し涙液が分泌される。透過型電子顕微鏡において、両群の神経筋接合部の観察を行ったが、有意な差は認められなかった。長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ(VDT群)を対象とし、シェーグレン症候群タイプのドライアイ群(SS群)と正常コントロール群と病理組織学的に比較検討し、涙腺上皮の分泌顆粒(secretory vesicles : SV)の観点から、その発症メカニズムを考察した。その結果、VDT群の病理組織像では涙腺腺房が腫脹し導管が狭窄していた。電子顕微鏡による超微形態の観察では腺房上皮細胞質に過剰なSVが蓄積していた。続いて、成熟したSVに認められるRab3Dの免疫染色では、VDT群の涙腺腺房上皮細胞質に強い発現を認めたことから、VDT群では過剰なSVが細胞質に蓄積していることが示された。また、涙液外分泌を調節する分子であるVAMP8の免疫染色においては、正常群とその発現の分布が異なっていた。以上のことからVDT群では涙液分泌障害が起きている可能性が示された。つまりVDT群のうち重症例は涙液分泌障害で起こるという新たな発症機序の一端を解明した。ドライアイには涙液分泌減少型と蒸発亢進型があるが、今まではVDT群は瞬目が低下することで涙液蒸発量が亢進して発症すると考えられてきた。しかし本研究で、VDT作業により瞬目が低下することで涙液の産生は行われているが、分泌が障害されるという新たなメカニズムの関与が考えられた。この結果を論文にまとめPLoS ONEに投稿し採択された。今後はますます視覚情報化が進むと考えられ、VDT作業者数はさらに増加していくであろう。VDTドライアイの病態解明は急務であると考えられる。本研究が涙液分泌障害という新たなドライアイ発症メカニズムの一端を解明した点では有意義であると思われる。平成26年度は、体調不良のため思うように研究が遂行できなかった。長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ(VDT群)を対象として、シェーグレン症候群タイプのドライアイ群・正常群とで涙腺を組織学的に解析し比較した。VDT群では、HE染色像、電子顕微鏡像ともに涙腺の腺房上皮細胞に多量の分泌顆粒が蓄積し涙腺腺房が腫脹してた。また免疫染色像において、VDT群では多量の成熟した分泌顆粒が貯留し、外分泌に関連する分子の分布異常が認められた。以上より、VDT群では長時間のVDT作業に伴う瞬目低下により、涙腺の涙液分泌障害が惹起され、成熟した分泌顆粒が多量に蓄積している可能性が示された。つまり、VDTドライアイ群では涙液の産生は行われているが、分泌が障害されていると考えられた。続いて、VDT群の涙液分泌障害に自律神経の影響がある可能性を考え、副交感神経に関連する分子の免疫染色を施行した。しかし3群の間に有意な差は認められなかった。さらに涙液分泌に関連する神経筋接合部について調査したが、有意な差は得られなかった。今後は視覚情報化がさらに進み、VDTドライアイの病態解明は急務である。今までに分泌顆粒の観点から、ヒト涙腺におけるドライアイの発症メカニズムを考察した報告はなかった。本研究では、ヒト涙腺を組織学的に解析し、ヒトのVDTドライアイにおいて涙液の分泌障害という新たなドライアイ発症メカニズムが関与している可能性を示した点で有意義であると考えられる。

以上のことから、VDT群ではVDT作業による瞬目低下の影響で、涙液の産生は行われているが分泌が障害されSVが蓄積するという新たなメカニズムの関与が考えられた。体調不良のため通院加療を要し研究が遅れている。眼科体調回復に努め、研究を進められるよう最大限努力する。免疫学的手法を用いて涙腺の解析を行うことを検討している。長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ(VDTドライアイ)の発症メカニズムに涙液分泌障害が関与している可能性を検討するため、自律神経に着目した。アセチルコリンエステラーゼの免疫染色や、透過型電子顕微鏡による神経筋接合部の観察を行った。現時点では明らかな差は見出せておらず、上記のように評価した。VDT群、SS群、正常コントロール群における涙腺の病理組織学的解析により、VDT群では涙腺の腺房上皮細胞質に多量のSVが蓄積していることが判明した。そして涙液外分泌をコントロールする分子であるVAMP8の免疫染色において、VDT群では発現の分布が正常コントロール群と異なっていた。このことから、VDT群では涙液分泌障害が起きている可能性が示された。VDT群は従来では瞬目低下により涙液蒸発量が亢進して発症すると考えられていたが、病理組織学的な解析結果より涙液分泌障害という新しい発症メカニズムが関与している可能性を示すことができた点で、上記のように判断した。体調不良のため通院加療を要し研究が思うように行えなかったため。ドライアイは様々な要因で発症するが、酸化ストレスなどの影響も報告されている。本研究における長時間のVDT作業に伴う非シェーグレン症候群タイプのドライアイ群においても、酸化ストレスが関与しているか否か、酸化ストレスマーカーである分子の免疫染色などを検討している。今までの研究でVDT群では瞬目低下により涙液分泌障害が起こり、涙腺腺房上皮細胞質にSVの過剰な蓄積が惹起される可能性が示された。今後はSVの蓄積を引き起こすさらに上流の原因を探っていきたい。着眼点としては、VDT作業による瞬目低下という刺激の減少が涙液分泌に与える影響(自律神経との関連)、長時間VDT作業によるストレスの影響、涙腺腺房上皮細胞における細胞内輸送に関する分子の影響、などが挙げられる。これらに影響を与えると考えられる分子を、免疫染色により調査することを検討している。免疫学的手法を用いて涙腺の解析を行う。試薬等の物品費支出が中心となり、その他解析代や論文投稿料、発表のための旅費の支出が見込まれる。涙液の分泌障害に神経系の影響があると考えているが、免疫染色等で有意な結果が得られず研究計画の方向性を模索していたため。平成25年度の研究費に未使用額が生じたが、平成26年度の物品購入に充てる予定である。平成26年度の研究計画としては、酸化ストレスが長時間のVDT作業に伴う非シェーグレンタイプドライアイに影響があるか否か検討していきたいと考えている。昨年秋に私が出産したため、平成24年度の研究費に未使用額が生じたが、平成25年度の物品購入に充てる予定である。平成25年度の研究計画としては、VDT作業に伴う瞬目低下により、涙液分泌を引き起こす刺激が減少することから、副交感神経の状態を調査したい。アセチルコリンエステラーゼの免疫染色を行い、各群における神経分布に差があるか否か調査することを検討中である。
論理による発見・創造過程のモデル化に関する研究

高階概念獲得のモデルを、新述語の導入に還元する新しい枠組を構築した。すなわち、必要とする高階概念を新述語として背景知識に与え、Stephen Muggleton等によるPROGOLのような帰納論理プログラミングシステムを用いて機械学習を実行することによって、高階概念を一階論理の学習システムの枠組で獲得できることを明らかにした。さらに、データベースを利用して、背景知識、正事例、負事例、およびPROGOLを走らせるためのモード宣言などの制御情報を自動的に定義する一般的な枠組を提案し、その具体化のために、PreAmpと呼ばれるシステムを試作した。このシステムは、PROGOLをMainAmpとして繋げることによって全体としてDBAmpを構成し、それによって、データベースからの知識獲得を行なうことが出来ることが明らかとなった。この試作システムを用いて、実際に電子メイルによる機器の故障の問い合わせを自動分類するための専門家システムを構築した。電子メイルの文章を正負の事例として与え、さらに、用語の概念辞書を背景知識として与え、これらの情報からなるデータベースを構築し、それに対してDBAmpを適用することにより、故障の問い合わせの分類のための規則を自動抽出することに成功した。合わせて、帰納論理プログラミング・システムの実行効率の向上を狙いとし、PROGOLの並列アルゴリズムを検討し、Prologによる試作を行なった。とくに、MGTP (Model Generation Theorem Prover)を用いることによって、アルゴリズム全体が簡潔に記述できることを明らかにした。発見・創造過程のモデル化のための基本的な検討を目的として、アーサー・ケストラーの“創造活動の理論"を調査し、科学的発見過程の一つのモデルとして、二つの直交する思考平面の間のインタラクションを中心とするモデルを検討した。さらに、Stephen Muggletonの“Foundation of Inductive Logic Programming"からのアイディアとして、最小汎化が発想過程に果たす役割を考察した。それらの考察を基に、論理に基づく発想・帰納推論システムのプロトタイプをPrologのメタ言語機能を用いて構築し、例として、二つの思考平面が交差して推論が進められる簡単な類推プログラムを実現し、電気の流れと水の流れの間になり立つ圧力、流量、抵抗などの概念の対応を取って既知の領域の知識を利用した未知の領域における問題解決の簡単なシミュレーションを行なった。その結果、類推の基になる二つの系における概念間の関連づけの生成の重要性を認識した。この関連づけを機械的に行なう手段として、Muggletonが、帰納論理プログラミングシステムGOLEMの中で用いている最小汎化、あるいは相対最小汎化の利用の妥当性を検討した。また、最小汎化プログラムをProlog上に実現し、上に述べた類推プログラムへの応用を行ない、その妥当性を検証すると共に、この問題に適用するために必要な、最小汎化アルゴリズムの拡張すべき機能を明かにした。発見・創造過程の理論モデルを、アナロジーを中心に考えてきたが、帰納論理プログラミングの調査の結果、全体の枠組としては、帰納論理プログラミングシステムを採用することが、モデル化にとってより適していることが明らかとなった。すなわち、帰納論理プログラミングシステムを発見・創造過程のモデルの中心に置き、それを拡張する形で、その外側にアナロジー機能を付け加えれば良いことが明らかとなった。アナロジー機能は、高階概念とも密接に関係しており、それを、新述語の導入によって実現し、そのように拡張された背景知識を帰納論理プログラミングシステムに供給することによって、高階概念、あるいは、アナロジーを伴った発見・創造過程をモデル化できる見通しを得た。この新述語の導入法は、帰納論理プログラミングの機能拡張となっていることも明らかにした。すなわち、応用領域に関する適当な概念階層を新述語の導入によって定義することによって、帰納論理プログラミングシステムにおける学習がより進んだり、学習速度が著しく向上したりする。ただし、概念階層が不適当であったり、例外を含んでいるような場合には、簡単ではない。このような概念化の延長として、誤差や、曖昧性の扱いを検討中である。帰納論理プログラミングの実行効率の向上については、PROGOLというシステムの並列化を現在進めており、そのための基本設計をほぼ完了した。技能獲得については、現在、予備調査の段階である。データの解析手法についての検討を行なった。

すなわち、必要とする高階概念を新述語として背景知識に与え、Stephen Muggleton等によるPROGOLのような帰納論理プログラミングシステムを用いて機械学習を実行することによって、高階概念を一階論理の学習システムの枠組で獲得できることを明らかにした。さらに、データベースを利用して、背景知識、正事例、負事例、およびPROGOLを走らせるためのモード宣言などの制御情報を自動的に定義する一般的な枠組を提案し、その具体化のために、PreAmpと呼ばれるシステムを試作した。このシステムは、PROGOLをMainAmpとして繋げることによって全体としてDBAmpを構成し、それによって、データベースからの知識獲得を行なうことが出来ることが明らかとなった。この試作システムを用いて、実際に電子メイルによる機器の故障の問い合わせを自動分類するための専門家システムを構築した。電子メイルの文章を正負の事例として与え、さらに、用語の概念辞書を背景知識として与え、これらの情報からなるデータベースを構築し、それに対してDBAmpを適用することにより、故障の問い合わせの分類のための規則を自動抽出することに成功した。合わせて、帰納論理プログラミング・システムの実行効率の向上を狙いとし、PROGOLの並列アルゴリズムを検討し、Prologによる試作を行なった。とくに、MGTP(Model Generation Theorem Prover)を用いることによって、アルゴリズム全体が簡潔に記述できることを明らかにした。
稀突起膠細胞の病理から神経疾患を解明する

稀突起膠細胞の前駆細胞(OPC)と髄鞘形成性の稀突起膠細胞(OL)からなるOL系譜細胞の傷害と当該細胞が誘導する脳や脊髄血液関門(BBB/SBB)の機能障害が脱髄、変性、虚血等の多数の神経疾患の発症や予後に共通する重要な病態として注目されている。本研究の目的は、現在見出している血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)が制御する血管周皮細胞(Pericytes)や幹細胞、およびOL系譜細胞の機能制御とBBB/SBBの保護を起点として、神経難病の病態を解明し治療方法を確立することである。昨年は、血小板由来増殖因子受容体アルファ(PDGFRa)遺伝子の誘導型ノックアウトマウスと筋萎縮性側索硬化症(ALS)を発症する変異型SODのTransgenic mouseの間で人工授精を実施し、受精卵を凍結保存した。本年はこれらの一部を用いて系統的な行動実験を実施した。当該遺伝子のノックアウトがALSの進行に関与し得ることや、運動神経以外にも大きな影響を及ぼすことを示唆する結果を得た。さらに残りの受精卵を用いて追試実験を実施する予定である。上記と平行して脳血管特異的にPDGFRa発現を抑制したモデルマウスの開発が軌道に乗った。これを用いてBBBにおけるPDGFRaの機能解明に向けた実験を準備中である。上記と平行して、PDGFRaが成体脳のOPCや血管周囲の幹細胞、および側脳室下帯に分布する神経幹細胞の生存、分化、増殖を強力に制御することを明らかにし、一部を報告した(Dang et al., Cell Rep)。神経上皮由来の脳の構成細胞が成体脳でも大規模に改変をし得ること、その中で髄膜等の間葉系細胞が脳に動員されて改変に関与することを始めて示したものである。また、皮膚線維芽細胞を用いてほ乳類の壁着細胞で初めて化学遊走の様式を明確に定義する機序を解明した(業績参照)。ALSマウスにおける行動実験が予定どおり、小規模の実験ながら最後まで実施することができた。BBBにおけるPDGFRaの機能評価gが直接可能なモデルマウスの確立が進んだ。脳のPDGFRaには予想を上回る大きな機能があることを見出すことができた。従来の予定通りに研究を遂行する。予想を超えた機能を見出しつつあるので研究を拡大する可能性がある。当該研究を遂行するために、本年はPdgfra遺伝子の誘導型ノックアウトマウスと筋萎縮性側索硬化症(ALS)を発症する変異型SODのTransgenic mouseの間で人工授精を実施し、受精卵をおよそ1000個凍結保存した。これらを順次実験に使用していく予定である。またALSを発症するマウスの飼育し、Phenotypeを確認し、実験を予定通り実施できることを確認した。上記と並行して、PDGFRaがそれぞれ成体脳のOPCや血管周囲に分布する幹細胞、および側脳室下帯に分布する神経幹細胞の生存、分化、増殖を強力に制御することを明らかにした(それぞれ論文投稿中)。PDGFRbによるPericytesの制御は脳梗塞巣でのBBB機能回復を介して病像を改善、その制御の低下は肥満や糖尿病時の肪組織の血管新生を介して病像を悪化させることを示した(業績参照)。脳Pericyteの一部が卵黄嚢のマクロファージに由来することを示した(業績参照)。新たなPDGFRによる血管機能の制御における役割やPericyteの動態を明らかにしたものであり、本研究を実施する上での重要な基礎的な知見を与えた。その他、記憶についての神経科学的知見や糖尿病病態の基礎的な知見の確立にも寄与した(業績参照)。ALSのモデルマウスのPhenotypeを確認したうえで、これらの個体とPdgfra遺伝子の誘導型ノックアウトマウス(iCre-aKO)の間に、実験に必要な個体数を得るための受精卵を人工授精により確保した。これに平行して、iCre-aKOマウスはPdgfra遺伝子のノックアウトの後にも明らかな欠失を示さず、長期にわたり生存が可能であることを確認した。また、中大脳動脈の梗塞を導入する実験も実施し、iCre-aKOマウスがストレスに対しても十分な耐性を有することを確認した。これらの実験によってALSマウスにPdgfraノックアウトを誘導し、その後の観察を実施することが可能であることを確認した。新年からの研究実施の基盤を準備することができた。

本研究の目的は、現在見出している血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)が制御する血管周皮細胞(Pericytes)や幹細胞、およびOL系譜細胞の機能制御とBBB/SBBの保護を起点として、神経難病の病態を解明し治療方法を確立することである。昨年は、血小板由来増殖因子受容体アルファ(PDGFRa)遺伝子の誘導型ノックアウトマウスと筋萎縮性側索硬化症(ALS)を発症する変異型SODのTransgenic mouseの間で人工授精を実施し、受精卵を凍結保存した。本年はこれらの一部を用いて系統的な行動実験を実施した。当該遺伝子のノックアウトがALSの進行に関与し得ることや、運動神経以外にも大きな影響を及ぼすことを示唆する結果を得た。さらに残りの受精卵を用いて追試実験を実施する予定である。上記と平行して脳血管特異的にPDGFRa発現を抑制したモデルマウスの開発が軌道に乗った。これを用いてBBBにおけるPDGFRaの機能解明に向けた実験を準備中である。上記と平行して、PDGFRaが成体脳のOPCや血管周囲の幹細胞、および側脳室下帯に分布する神経幹細胞の生存、分化、増殖を強力に制御することを明らかにし、一部を報告した(Dang et al., Cell Rep)。神経上皮由来の脳の構成細胞が成体脳でも大規模に改変をし得ること、その中で髄膜等の間葉系細胞が脳に動員されて改変に関与することを始めて示したものである。また、皮膚線維芽細胞を用いてほ乳類の壁着細胞で初めて化学遊走の様式を明確に定義する機序を解明した(業績参照)。ALSマウスにおける行動実験が予定どおり、小規模の実験ながら最後まで実施することができた。BBBにおけるPDGFRaの機能評価gが直接可能なモデルマウスの確立が進んだ。脳のPDGFRaには予想を上回る大きな機能があることを見出すことができた。今後は本実験に向けた残りの予備実験を実施する。ALSマウスにPdgfraをノックアウトする実験群の行動実験はPdgfraをノックアウトしたマウスを対照群として実施する予定であるが、Pdgfraをノックアウトしたマウスそのものについての系統的な行動実験は実施していない(実験1)。また、ALSの発症時期が10週齢前後であるのに対して、Pdgfra遺伝子のノックアウト時期を決定する必要がある。生後4(実験2)または8週齢(実験3)の双方でのノックアウト誘導について、それぞれがALSの経過に及ぼす影響を確認する予定である。これら1から3の実験について、準備した受精卵の一部を用いて、比較的小規模な予備的実験として実施し、本実験への移行準備を進める。従来の予定通りに研究を遂行する。予想を超えた機能を見出しつつあるので研究を拡大する可能性がある。
「鍵と鍵穴」の進化を解く：植物自家不和合性を用いた理論と再現実験によるアプローチ

共進化する生物同士にはしばしば,特定の相手としか相互作用しないというパートナー選択の特異性がみられる.このような特異性を担う分子的実体の多くは受容体とリガンドのような「鍵と鍵穴」のシステムであるが,新しい特異性,すなわち「新しい鍵と鍵穴のセット」はどのように進化するのかという問題が以前から指摘されていた.鍵と鍵穴のいずれかが変化すれば互いに認識されず,特異性は崩れてしまう.このような中間状態を乗り越え新しい特異性はどう進化するのか.本研究では,自家受精を防ぐ自己認識機構である植物の自家不和合性を対象に,シミュレーションモデルとアミノ酸置換実験によりS対立遺伝子の進化過程を予測・再現することを通して,特異性のゆらぎと新しい鍵と鍵穴の進化可能性との関係を,理論と実験の両面から探ることを目的としている.進化シミュレーションモデルを作成し,新しいS対立遺伝子の進化と特異性のゆらぎの関係を探索した.その結果,特異性のゆらぎがあることでたしかに新しいS対立遺伝子とその祖先のS対立遺伝子の共存が促進されること,特異性のゆらぎが中程度のとき,もっとも共存が起こりやすいことなどが明らかになりつつある.また,胞子体型自家不和合性で知られているS対立遺伝子間の優劣性もモデルで考慮したところ,新しいS対立遺伝子の優劣性がもっとも劣性でない限りは新しいS対立遺伝子が進化可能であることも明らかになった.これらのモデル解析と並行して,現在アミノ酸置換実験を進めているところである.モデル解析に関しては概ね順調であるが,アミノ酸置換実験に関しては,形質転換に時間がかかることもあり,まだ明確な結果は出ていない状況である.モデルに関しては,現在あるシミュレーションモデルをさらに詳しく解析するとともに,Billiard et al. (2007)に基づいた数理モデルによる解析も進め,現在得られている結果の妥当性を確認する.また,アミノ酸置換実験で得られる結果について,モデルで予測されるデータかどうかを検討する.共進化する生物同士にはしばしば,特定の相手としか相互作用しないというパートナー選択の特異性がみられる.このような特異性を担う分子的実体の多くは受容体とリガンドのような「鍵と鍵穴」のシステムであるが,新しい特異性,すなわち「新しい鍵と鍵穴のセット」はどのように進化するのかという問題が以前から指摘されていた.鍵と鍵穴のいずれかが変化すれば互いに認識されず,特異性は崩れてしまう.このような中間状態を乗り越え新しい特異性はどう進化するのか.本研究では,自家受精を防ぐ自己認識機構である植物の自家不和合性を対象に,シミュレーションモデルとアミノ酸置換実験によりS対立遺伝子の進化過程を予測・再現することを通して,特異性のゆらぎと新しい鍵と鍵穴の進化可能性との関係を,理論と実験の両面から探ることを目的としている.進化シミュレーションモデルを作成し,新しいS対立遺伝子の進化と特異性のゆらぎの関係を探索した.その結果,特異性のゆらぎがあることでたしかに新しいS対立遺伝子とその祖先のS対立遺伝子の共存が促進されること,特異性のゆらぎが中程度のとき,もっとも共存が起こりやすいことなどが明らかになりつつある.また,胞子体型自家不和合性で知られているS対立遺伝子間の優劣性もモデルで考慮したところ,新しいS対立遺伝子の優劣性がもっとも劣性でない限りは新しいS対立遺伝子が進化可能であることも明らかになった.これらのモデル解析と並行して,現在アミノ酸置換実験を進めているところである.モデル解析に関しては概ね順調であるが,アミノ酸置換実験に関しては,形質転換に時間がかかることもあり,まだ明確な結果は出ていない状況である.モデルに関しては,現在あるシミュレーションモデルをさらに詳しく解析するとともに,Billiard et al. (2007)に基づいた数理モデルによる解析も進め,現在得られている結果の妥当性を確認する.また,アミノ酸置換実験で得られる結果について,モデルで予測されるデータかどうかを検討する.
被爆のない血管内治療外科の確立に関する研究

カテーテルを用いた治療を行う際にはX線透視画像を用いて病変部に器具を誘導する.磁気共鳴画像(MRI)を用いて誘導を行うことが出来れば,放射線被曝をなくすことが出来る.治療に用いられる器具をMRI画像で描出し,それを追従する試みを行い臨床応用を目指す.治療に用いる細径のカテーテル,ガイドワイヤーをMRI画像で描出するために,様々な撮像方法による静的画像による描出の検討を行った.さらに,X装置の透視画像に値する連続撮影によるカテーテルの描出を行い,描出能の評価を行った.カテーテルの描出は良好な結果が得られたが,さらに細径となるガイドワイヤーの描出が難しいと考えられた.初年度の目標として,実際の治療に用いられる細径のカテーテル,ガイドワイヤーを静止状態で明瞭に可視化することを目標とした.1.5 tesla MRI装置を用いてカテーテル,ガイドワイヤーの可視化を検討した.細血管の治療に用いる2Fr (0.66mm)のカテーテル,0.010inch (0.25mm)ガイドワイヤーを静止画像で明瞭に描出することで次年度の連続透視下での可視可へとつなげる.カテーテル追尾に用いるリアルタイム撮影用には,fully refocused steady-state freeprecession (SSFP)撮影を用いた.連続透視のためには,最高10フレーム毎秒の撮影が可能となることを目標にすると,撮影時間を100ms以内にすることを目標にシーケンスの調節を行った.カテーテル,ガイドワイヤーを数種の撮影時間で良好なsignal to noise (S/N)比が得られる撮影シーケンスを得,off-lineコンピューターを用いることなく,画像再構築の時間を短縮させてモニター上でのリアルタイム透視画面表示を可能とした.SSFP以外に透視画像としてunspoiledand spoiled gradientecho,echo-planner, balanced and radial imaging等の撮影を時間分解能,空間分解能の両視点からカテーテル,ガイドワイヤーの視認性を検討した.これらの検討から,SSFPで得られる3F/sの撮影画像で良好なS/N比が得られることを確認できた.機材の動きをストレスなく描出するには更なる撮影時間の短縮(7F/s以上)が望ましく,今後の検討課題と考える.前年度までの検討により,拍動血管ファントムを導入して人体と環境を同じくした拍動血流を模倣した条件下では,細径の機材の静止状態,動きの視認性が低下することがわかったため,透視画像であるfully refocused steady-state free precession (SSFP)撮影の撮像条件の再検討を行った.これまでの検討で行った3F/sの透視を使用して,カテーテル,ガイドワイヤーの追従性を検討し,生体に模した拍動流ファントムの撮影で得られるMR andiography (MRA)を標的血管の目標レファレンスとして用いる検討も加えた.前年度と同じく,拍動血流の中では,比較的太い機材(カテーテル)の表示は可能であったが,治療に使用する極細径カテーテル(1.5Fr,0.51mm)では可視化は難しかった.ガイドワイヤーに関しても,極細径(0.014inch,0.36mm)の機材はその視認性は失われてしまい,可視化は難しかった.前年度問題となったMRA画像のオーバーラップに関しても,機材の視認性が低下したため,同時に表示することは難しく,今後の検討課題と考えた.カテーテルを用いた治療を行う際にはX線透視画像を用いて病変部に器具を誘導する.磁気共鳴画像(MRI)を用いて誘導を行うことが出来れば,放射線被曝をなくすことが出来る.治療に用いられる器具をMRI画像で描出し,それを追従する試みを行い臨床応用を目指す.治療に用いる細径のカテーテル,ガイドワイヤーをMRI画像で描出するために,様々な撮像方法による静的画像による描出の検討を行った.さらに,X装置の透視画像に値する連続撮影によるカテーテルの描出を行い,描出能の評価を行った.カテーテルの描出は良好な結果が得られたが,さらに細径となるガイドワイヤーの描出が難しいと考えられた.脳神経外科学初年度に目標としたIVRに用いる機器の静止状態での可視化を行った.静止画像としては可視化を行うことが可能であったが,次年度に目標としている連続透視撮影での治療機器の動きのスムーズな可視化を行うには,更なる撮影時間の短縮が必要である.このため,引き続き撮影シーケンスの検討を行う.静止状態での機器の描出から得られたデータを基に,連続透視下と同じ撮影が可能なように主として撮影時間の短縮を目的とした撮像シーケンスの更なるチューニングを行う.また,現在治療に用いられる様々な素材による描出能の違いを検討し,至適撮像条件を絞り込む.一方で,血管に見立てたファントムから得られる血管構造は,カテーテルナビゲーション用のロードマッピングとして使用するために,カテーテルとのコントラストから至適撮像条件を検討する.
肝細胞と肝癌細胞におけるGenomics

SAGE法を用いて、正常肝、C型慢性肝炎および肝細胞癌組織における遺伝子発現プロフィールを解析し報告した。正常肝組織からは30,982の遺伝子断片を分離し、そのうち8,596はユニークな遺伝子であった。これらの肝臓で発現している遺伝子のうち、最も豊富に発現していたのは血清蛋白をコードする遺伝子であり、全体の21.8%をしめていた。次いで細胞質蛋白(8.6%)、酵素(4.8%)、プロテアーゼ阻害物質(1.7%)であった。また分離した遺伝子のうち13.9%はGenebankに報告されていない未知の遺伝子であった。次いで、C型慢性肝炎肝組織から10,172遺伝子、肝細胞癌組織から13,372遺伝子を分離し、その発現プロフィールを比較した。全24,464のユニーク遺伝子のうち、4.260(17.4%)は正常肝でのみ発現が認められ、5,771(23.6%)遺伝子はC型肝炎組織でのみ、8,871(36.3%)遺伝子は肝癌組織でのみ発現を認めた。インターフェロンガンマ誘導遺伝子、酸化ストレス関連遺伝子の発現はC型肝炎、肝細胞癌に共通して発現を認めた。このように、SAGE法を用いることにより肝臓組織における遺伝子発現をその未知遺伝子を含めて疾患別に詳細に解析することが可能であった。DNA microarrayを用いてC型およびB型慢性肝炎組織あわせて24例、肝細胞癌組織10例、肝癌細胞株の遺伝子発現プロフィールを解析し、報告した。解析には我々が独自に収集した1080遺伝子を配置したDNA microarrayを用いた。この遺伝子パネルはアポトーシス関連遺伝子、細胞周期関連、癌遺伝子等種々の領域の遺伝子を網羅したものである。DNA microarrayの解析においてはクラスター解析を用いることにより、遺伝子の発現プロフィールのパターン化が可能である。特定の遺伝子発現パターンを示す疾患あるいは遺伝子群の同定が可能となる。今回の解析においてはC型とB型慢性肝炎組織は対照的な遺伝子発現パターンを有しており、特にアポトーシスおよび細胞周期関連遺伝子群、細胞接着関連遺伝子群等で顕著であった。このことは同じウイルス肝炎であっても遺伝子発現パターンが大きく異なり、肝発癌のメカニズムも異なっている可能性が示唆された。また、AFP陽性肝癌細胞株は陰性肝癌細胞株と遺伝子発現パターンが異なることを明らかにした。肝癌組織に於ける解析では19遺伝子が非癌部肝組織と有意に異なる変動を示したこと、また肝癌組織の分化度と相関する遺伝子22遺伝子を同定した。肝細胞と肝細胞癌におけるGenomicsを明らかにするため、以下の研究を行った。1)正常肝組織における発現遺伝子の種類、発現頻度のSAGE法による解析正常肝組織より抽出した30982個のmRNA全ての遺伝子の塩基配列を解析しcomputer searchにて検討したところ、8596個は単独の遺伝子であった。

発現頻度に関する検討では、正常肝細胞で最も多く発現されている遺伝子は血漿タンパク質で全転写産物の21.8%を占めていた。次いで細胞質タンパク(8.6%)、諸酵素(4.8%)、蛋白分解酵素阻害蛋白(1.7%)、補体(1.1%)、凝固因子(0.75%)であった。13.9%の遺伝子はこれまでに報告されていない未知の遺伝子であった。これらの正常肝細胞における発現遺伝子種と頻度に関する知識は、肝癌細胞における遺伝子発現を検討する上での基礎的資料であると同時に、DNA microarrayer作成に用いる遺伝子群選択の重要な資料となる。2)DNA microarray法による肝細胞癌、癌部・非癌部の遺伝子発現比の検討936既知遺伝子でDNA microarrayerを作成し、臨床検体を用いた解析条件の設定を行った。この条件下で肝細胞癌10症例個々の癌部・非癌部より抽出したmRNAの発現比を検討した。5例以上の症例に共通して、非癌部に比して癌部で発現量が2倍以上亢進している遺伝子が14種同定された。反対に0.5倍以下に発現量が低下している遺伝子が9種同定された。これらの遺伝子は肝細胞癌を特徴付ける遺伝子と考えられる。慢性肝炎、高分化型肝細胞癌のSAGEが終了し、それぞれにおける遺伝子発現プロファイルを明らかにした(BBRC in print)。既に終了していた正常肝のSAGE libraryとあわせ、約9万の転写産物を解析し、24,464のユニーク遺伝子を同定した。このうち30.2%はGenBank未登録の未知の遺伝子であった。24,464遺伝子のうち5,771(13.6%)遺伝子は慢性肝炎組織においてのみ発現が認められ、8,871(36.3%)遺伝子は高分化肝細胞癌においてのみ発現が認められることを見いだした。正常肝、慢性肝炎、高分化型肝細胞癌のSAGE libraryを比較することによって、それぞれに特徴的に発現増強あるいは減少している遺伝子を同定し、慢性肝炎、肝細胞癌と進展するに伴って変化する遺伝子発現プロファイルを明らかとした。現在、このようにして同定された未知の遺伝子のクローニング及び機能解析を行っている。さらに、SAGE libraryより少なくとも2ヒット以上認めた4,465遺伝子を選択し、次世代の肝臓特異的DNAチップを作成するための候補遺伝子とした。約1200遺伝子のDNAチップを用いて、慢性肝炎、肝細胞癌細胞株、肝細胞癌の解析を行った。慢性肝炎においてはB型およびC型慢性肝炎組織において、同様の病理組織像を示すにもかかわらず、クテスター解析によって対照的な遺伝子発現パターンを示すことを明らかとした(Hoda et al.Gastroenterology)。肝細胞癌細胞株では不死化正常肝細胞株と比較して919%の遺伝子で有意は発現変化を認めるのみならず、肝臓の脱分化マーカーでありかつ腫瘍マーカーであるα-fetoprotein(AFP)陽性の肝癌細胞株は陰性の肝癌細胞株と比較して共通の遺伝子発現パターンを持つことを明らかにした。さらにAFPと最も発現パターンが類似している18遺伝子を同定し、その解析を行っている(Kawai et al.Hepatology)。
水晶振動子を用いた環境汚染物質認識センサの開発

代表的な温室効果ガスであるCO_2ガスと悪臭の原因物質であるNH_3ガスを検出対象ガスとし,アクリルニトリルスチレン(AS),ポリアクリル酸(PAA)を感応膜として塗布した水晶振動子(QCM)をこれらの環境汚染物質検出センサとして開発した.また,湿度測定用センサとしてPEIを塗布したQCMも開発した.これらのセンサにCO_2ガス,NH_3ガス等の環境汚染物質を導入し,このときのセンサ出力をニューラルネットで処理してガスの識別を行い所望の結果を得た.代表的な温室効果ガスであるCO_2ガスと悪臭の原因物質であるNH_3ガスを検出対象ガスとし,アクリルニトリルスチレン(AS),ポリアクリル酸(PAA)を感応膜として塗布した水晶振動子(QCM)をこれらの環境汚染物質検出センサとして開発した.また,湿度測定用センサとしてPEIを塗布したQCMも開発した.これらのセンサにCO_2ガス,NH_3ガス等の環境汚染物質を導入し,このときのセンサ出力をニューラルネットで処理してガスの識別を行い所望の結果を得た.最近,シックハウス症候群とかシックカー症候群という言葉を耳にする機会が増えたが,住居や車などの住空間を構成している部材には過敏症を誘発する化学物質を放散するものが多い.また,工場等からの二酸化酸素の排出は地球温暖化の原因となっているし,車等から排出される窒素酸化物の健康への影響も懸念されている.これらの環境汚染物質を監視することは,過敏症対策,地球環境の保全,排ガス対策等の観点から重要である.本研究は,水晶振動子の共振周波数が電極表面の微小な質量変化に比例して変化することを利用したもので,水晶振動子の電極上に脂質膜を塗布し,これに吸着された環境汚染物質の量を水晶振動子の周波数変化から検出しようとするものである.このセンサは環境汚染物質の局所情報を簡単に取得できるセンサである.平成19年度は,まず,科学研究費により購入したスピンコーターによる成膜技術のノウハウを蓄積し,これにより水晶振動子表面に5種類の脂質膜(ポリ塩化ビニル(PVC),アクリルニトリルスチレン(AS),ポリビニルピリジン,ポリビニルピロリドン(PVP),ポリエチレンイミン(PEI))を成膜した,つぎに,脂質膜は環境汚染物質のみならず水分も吸着すると考えられるので,これら5種類の脂質膜を成膜した水晶振動子の湿度に対する周波数変化の特性を調べた.この結果,ポリエチレンイミン(PEI)を塗布した水晶振動子の周波数は極端に湿度に依存し,高感度高分解能の湿度センサとして使用できることが分かった.さらに,膜厚と湿度に対する感度の関係についても明らかにした.これらについては,日本機械学会関西支部2007年度技術情報交流会,日本エネルギー学会関西支部第52回研究発表会,石油学会関西支部第16回研究発表会で報告した.地球温暖化の原因となっているCO_2濃度を手軽にリアルタイムで測定できるセンサとして,水晶振動子の共振周波数が表面付着物の微量質量変化に高感度で応答することを利用したセンサ(QCM)を開発する.このセンサは,水晶振動子両面の電極にCO_2吸着用脂質膜を塗布し,これにCO_2を吸着させ,このときの水晶振動子の質量変化をその周波数変化として出力することによりCO_2濃度を検出しようとするもので,CO_2の局所情報を簡単に取得できるセンサとなる.平成20年度は,科学研究費補助金で購入したスピンコーターを使って水晶振動子表面にアクリルニトリルスチレン(AS)膜をほぼ一様に塗布したQCMについて,湿度,乾燥CO_2,湿ったCO_2それぞれに対する出力(周波数変化量)を調べた.その結果,AS膜を塗布したQCMで湿ったCO_2を測定したときの出力は,湿度に対する周波数変化量と乾燥CO_2に対する周波数変化量の和になっていて,それぞれに対する周波数変化量が重ね合わされていることが明らかになった.大気は必ず水蒸気を含んでいるので,昨年開発した水晶振動子にポリエチレンイミン(PEI)を塗布した湿度検出用QCMにより別途湿度を検出して,AS膜を塗布したQCMの出力から湿度分を差し引くことによりCO_2濃度を測定できることが明らかになった.本研究は,環境汚染物質を手軽にリアルタイムで測定できるセンサとして,水晶振動子の共振周波数が表面付着物の微量質量変化に高感度で応答することを利用したQCMをもちいて実現することを目的としたものである.このセンサは,水晶振動子両面の電極に環境汚染物質を吸着する感応膜を塗布し,これに環境汚染物質を吸着させ,このときの水晶振動子の周波数変化から環境汚染物質濃度を検出しようとするもので,環境汚染物質の局所情報を簡単に取得できる.平成21年度は,科学研究費補助金で購入したスピンコーターを使って,水晶振動子表面にアクリルニトリルスチレン(AS),ポリアクリル酸(PAA),ポリエチレンイミン(PEI)をほぼ一様に塗布した各々のQCMについて,湿度,乾燥CO_2ガス,湿ったCO_2ガス,NH_3ガス,Heガスそれぞれに対する特性評価を行った.また,各種の環境汚染物質を識別するため,ASを塗布したQCM,PAAを塗布したQCM,PEIを塗布したQCMを配置した空間に各種の環境汚染物質を導入し,このときの各々のQCMの出力をニューラルネットワークに入力してガスの識別を行い,所望の結果を得た.
害虫個体群のモニタリングのための統計学的手法の開発に関する研究

総合的害虫管理(IPM)の基礎として不可欠な、害虫個体群のモニタリングシステム確立のため、数種の重要農業害虫を対象に、野外調査デ-タをもとに統計生態学的見地から詳細な検討を行った。イネ害虫のトビイロウンカについて、日本及びインドネシア、フィリピンなどで得られた広範なデ-タを用いて水田における個体群の空間分布様式の特性を統一的に解明し、この知見をもとに、逐次抽出による密度の推定・検定法及び存在頻度法による省力密度推定技術が日本のみならず、その被害が現在甚大な東南アジア地域においても、広く本種の発生予察・個体群管理システムの基幹技術として適用できることを示し、特に現地研究者との共同研究を進めているインドネシアの個体群に対して、個体群生長特性の解析と併せて具体的な調査・管理計画を立案し、これらの技術の実用化への途を開いた。柑橘害虫にカイガラムシ類、特にヤノネカイガラムシ及びルビ-ロウムシについては、和歌山県下の省農薬ウンシュウミカン園における個体群調査デ-タを解析して樹内及び樹間の分布の特性を明らかにし、それをもとにグレ-ド法を中心とした簡易個体数推定技術を開発して、正確な密度評価が困難なこれらカイガラムシ類の個体群管理におけるその有用性を示した。また、一般に、害虫根絶計画や植物検疫に関連した調査では、対象害虫の密度が実質的に"ゼロ"とみなしてよいかどうかの判定(いわゆる"ゼロ確認")を迫られる場面が多いが、このような場面に常に適用可能な、ゼロ・サンプルの連続数に基づく簡易逐次検定法を導いた。有限母集団を想定したこの新しい方法では、母集団サイズに応じた効率のよい検定が可能になり、いろいろな場面で実用価値があると考えられる。イネ害虫のトビイロウンカに関して、水田における分布様式の統計学的解析を、本年度は主としてインドネシアにおける共同研究で得られたデ-タをもとに行い、その基本特性を明らかにした。すなわち、ほん種の水田内分布は負2項分布型の集中分布で各地独自のパラメ-タ値を持つことが示された。この結果は定性的には従来明らかにされていた日本における本種個体群の場合とよく一致しているが、パラメ-タ値に示される定量的特性は、日本の個体群やフィリピンの個体群のいずれとも異なっていた。この結果をもとに、本種個体群の密度を推定し、また薬剤防除をするか否かの意志決定を行うための統計学的技術の詳しい検討を行った。その結果、簡易・省力調査法としての逐次推定法、逐次確率比検定法、及び、存在頻度法(在虫株率法)が、これらの地域においても本種個体群の発生予測及び管理のための基礎技術として有効に利用しうるとの見通しが得られた。一方、ミカン害虫のヤノネカイガラムシなどの数種のカイガラムシ類に関して、グレ-ド法による簡易推定技術の検討を行った。グレ-ド法は個体数の正確な係数の代わりに大まかなグレ-ド分けを行って生息密度を推定する方法であり、個体数変動幅が大きく計数に多労を要するカイガラムシ類などの簡便調査法として有用である。本年度はグレ-ド法によってえられたデ-タから、ミカンの樹内及び樹間のカイガラムシ個体群の分布様式を解析する方法の開発に向けて、和歌山の無農薬栽培ミカン園においてデ-タ収集を行い、現在、個体数の推定誤差が空間分布特性に与えるバイアスを補正する作業を進めている。

イネ害虫のトビイロウンカについて、前年度にはその水田内分布様式の特性を日本及びインドネシアやフィリピンでこれまでに得られている広範なデ-タをもとに明らかにしたが、本年度はこれらの知見を集大成して、逐次抽出による密度の推定・検定法及び存在頻度法による省力密度推定技術が日本のみならず、その被害が現在甚大な東南アジア地域においても、広く本種の発生予察・個体群管理システムの基幹技術として適用できることを示し、特に現地研究者との共同研究を進めているインドネシアの個体群に対して、個体群生長特性の解析と併せて具体的な調査・管理計画を立案し、これらの技術の実用化への途を開いた。一方、柑橘カイガラムシ類に関しても、前年に続いて和歌山の省農薬栽培ウンシュウミカン園での野外調査デ-タをもとにグレ-ド法を中心とする省力調査技術の開発研究を行い、前年のヤノネカイガラムシに続いて、本年は特にルビ-ロウムシとツノロウムシについて、個体群の樹内分布の特性と形成機構を解明して調査技術確立への基礎を固めた。また、一般に、害虫根絶計画や植物検疫に関連した調査では、対象害虫の密度が実質的に"ゼロ"とみなしてよいかどうかの判定を迫られる場面が多いが、このような場面に常に適用可能な、ゼロ・サンプルの連続数に基づく簡易逐次検定法を導いた。有限母集団を想定したこの新しい方法では、母集団サイズに応じた効率のよい検定が可能になり、根絶計画における"ゼロ確認"をはじめ、いろいろな場面で実用価値があると考えられる。