hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
計算機を用いた暗号プロトコルの安全性に関する研究

近年、暗号プロトコルはさまざまな要求に答えるために日々複雑になってきている。暗号プロトコルが複雑になるにつれて安全性評価は困難になるため、人為的なミスが発生しやすくなる。そのため、評価に誤りがある論文が多数存在し問題となっている。そこで本研究では、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性評価の有効性に着目し、暗号プロトコルの安全性評価を厳密に行うことができる手法の実現に向けた検討を行った。本研究の成果は、暗号プロトコルの複雑化に伴う評価の誤りの増加といった深刻な問題に対して、有効な解決手段を提供するものとなる。1、暗号プロトコル安全性自動証明ツールCryptoVerifにおける観測等価性を満たすことの証明をMizarプルーフチェッカ上で実現するために、不足しているライブラリの充実化を図った。実数値関数上の差分(forward difference、backward difference、central difference)の形式化記述は既に存在するが、ベクトル値関数上の差分の形式化記述は存在しない。ベクトル値関数上の差分は、観測等価性を満たすことの証明(特に、共通鍵暗号方式の安全性)を実現するために重要であるため、その形式化記述を行った。結果として、不足しているライブラリの充実化を図ることに成功した。2、計算機を用いたさまざまな暗号プロトコルの安全性検証として、ProVerifを用いた暗号プロトコルの安全性検証を行った。まず、Yehらの提案したBluetoothのセキュアシンプルペアリングの方式に対して、ProVerifによる形式的検証を行った。結果として、なりすましに対する脆弱性を発見することに成功した。さらに、その脆弱性に対する対策法を提案することに成功した。次に、Isawaらの提案したワンタイムパスワード認証方式に対する形式的検証を行った。結果として、サーバに保存されている情報を利用し、なりすましを行う攻撃(Hybrid Theft Attack)及びサーバに保存されている情報を利用し、サーバとユーザ間の認証を不可能にする攻撃(Theft DoS Attack)に対する脆弱性を発見することに成功した。計算機を用いた暗号プロトコルの安全性検証(評価)として、暗号プロトコルの安全性自動検証ツールProVerifを用いた暗号プロトコルの安全性検証を行った。1.インターネット技術の標準化推進団体IETFにおいて標準化の議論が進められているTLS 1.3(Transport Layer Security TLS Protocol Version 1.3)のハンドシェイクプロトコルに対してProVerifを用いて形式的に記述し、その安全性検証を行った。具体的には、TLS 1.3のドラフト06以降の仕様を継続的に形式化し、その検証を行った。結果として、TLS 1.3ハンドシェイクプロトコルに対する安全性(秘匿及び認証)を示すことに成功し、その結果をTLS 1.3の標準化に反映させることに成功した。また、本成果は国際的な協力体制で暗号プロトコルの安全性評価に取り組んでいる暗号プロトコル評価技術コンソーシアム(CELLOS)の活動にも貢献した。2.ProVerifは(暗号プロトコルの構成部品である)暗号プリミティブの形式化の正しさを検証する仕組みがないため、その検証は困難である。よって、ProVerifにおける暗号プリミティブの形式化に関する研究を行った。結果として、暗号プリミティブを暗号プロトコルの一種として形式化することで、形式化の正当性を検証する手法を提案することに成功した。これにより、ProVerifにおける暗号プリミティブの形式化表現能力を向上させることに成功した。CryptoVerifにおける観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現するためのライブラリ開発を現在進めているが、やや遅れている。一方で、ProVerifを用いた暗号プロトコルの安全性検証(評価)を行い、世界的な注目を集めている暗号プロトコル(TLS1.3)に対して安全性を検証することに成功し、さらにProVerifにおける暗号プリミティブの形式化表現能力を向上させることにも成功したため、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性証明のさらなる厳密化の可能性を探ることには成功した。以上より、おおむね順調に進展している部分とそうでない部分があるため、全体としてはやや遅れていると判断される。1.現在標準化の議論が進められているTLS 1.3(Transport Layer Security TLS Protocol Version 1.3)のハンドシェイクプロトコルに対してProVerifを用いて形式的に記述し、その安全性検証を行った。具体的には、TLS 1.3のドラフト仕様を継続的に形式化し、その安全性検証を行った。結果として、TLS 1.3ハンドシェイクプロトコルに対する安全性(Secrecy、Authentication、さらにはForward Secrecy)を示すことに成功した。2.ProVerifをはじめとする暗号プロトコルの安全性自動検証ツールは、暗号プリミティブの形式化が正しく行われているかどうかの評価は人手で行う必要がある。すなわち、暗号プリミティブの形式化の正当性を検証する手段が用意されていない。具体的には、昨年度提案した方法である、ProVerifで形式化した暗号プリミティブをProVerif自身の検証器を用いて形式化の正当性を検証する方法を拡張した。結果として、公開鍵暗号方式に求められる安全性の概念であるCCA(CCA1、CCA2)安全性の形式化及び検証に成功した。これにより、ProVerifにおける暗号プリミティブの記述能力の向上、さらには安全性検証の信頼性を高めることに成功した。

暗号プロトコルが複雑になるにつれて安全性評価は困難になるため、人為的なミスが発生しやすくなる。そのため、評価に誤りがある論文が多数存在し問題となっている。そこで本研究では、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性評価の有効性に着目し、暗号プロトコルの安全性評価を厳密に行うことができる手法の実現に向けた検討を行った。本研究の成果は、暗号プロトコルの複雑化に伴う評価の誤りの増加といった深刻な問題に対して、有効な解決手段を提供するものとなる。CryptoVerifにおける観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現するためのライブラリ開発が順調に進んでいる。また、CryptoVerifは「ある暗号プロトコルがある安全性を満たす」ということを自動証明できるが、暗号プロトコルに脆弱性が存在した場合にその脆弱性を発見することはできない。脆弱性を発見可能であるProVerifを用いて暗号プロトコルの安全性検証を行い、いくつかの脆弱性を発見することに成功、すなわち、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性証明のさらなる厳密化の可能性を探ることに成功したことからもおおむね順調に進展していると判断される。観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現するために必要なライブラリの充実化を図る。上記成果をもとに、CryptoVerifにおける観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現し、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性証明を厳密にできる手法を提案する。また、本研究が計画通りに進まない場合の対応策として、ProVerifを用いた暗号プリミティブの形式化のアイディアを応用し、観測等価性を満たすことの評価をProVerif上で実現する。これにより、計算機を用いた暗号プロトコルの安全性証明を厳密にできる手法を提案する。情報セキュリティ、フォーマルメソッド観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現するために必要なライブラリのさらなる充実化を図る。さらに、CryptoVerifを用いた暗号プロトコルの安全性証明を行い、ProVerifを用いた安全性検証も同時に進める。これらの成果をもとに、CryptoVerifにおける観測等価性を満たすことの証明をMizar上で実現する。なお、CryptoVerifは証明対象となる暗号プロトコルへの攻撃モデル及び安全性の根拠となる暗号プリミティブの安全性を与えると、暗号プロトコルの安全性を自動証明できる。
融合遺伝子型染色体転座における受容体型、非受容体型チロシンキナーゼの解析

私たちは、血液悪性疾患において受容体型のチロシンキナーゼの転座遺伝子として、t(5;14)(q33;q32)転座におけるCEV14-PDGFβR融合遺伝子、非受容体型チロシンキナーゼの転座遺伝子としてt(9;12)(q22;p13)転座におけるTEL-Syk融合遺伝子を分離同定し報告した。本研究の結果からTEL-Syk融合タンパクは、MAPキナーゼ、PI3キナーゼ系およびSTAT5などのシグナル伝達分子を恒常的に活性化し、これらが血液悪性疾患の病態と関連があると考えられた。Sykの阻害剤であるPiceatannolは、TEL-Syk遺伝子を導入したBaF3細胞の増殖および、STAT5の活性化を阻害したが、IL-3存在下でのBaF3の増殖もかなり阻害し、Sykチロシンキナーゼに対する特異性に不満が残った。TEL-Syk融合遺伝子は、Sykチロシンキナーゼに対する阻害薬を開発することに対して有用であると思われる。また、蛍光抗体法でTEL-Syk融合タンパクの細胞内局在を観察したところ、細胞質に局在が見られた。もう一つの融合遺伝子CEV14-PDGFRβのチロシンキナーゼが活性化しているか確認するため、まずshort及びlongのCEV14-PDGFRβの発現ベクターを293細胞にトランスフェクトし、細胞のライセートをPDGFRβ抗体を用いて免疫沈降を行った。次に免疫沈降物をウェスタンブロットし活性化チロシン抗体を用いた検索を行ったところshort及びlongいづれにおいてもCEV14-PDGFRβのチロシンの活性化を示す結果が得られた。CEV14-PDGFRβ融合遺伝子においてはPDGFRβ遺伝子の細胞外領域がCEV14遺伝子と置き替わることにより、PDGFRβのチロシンキナーゼの恒常的活性化が引き起こされ、この症例において白血病のクローナルエボルーションに関与したと考えられる。TEL/SYK融合遺伝子において、その下流にあるチロシンキナーゼのシグナルについて検討した。IL3依存性細胞株BAF3に、レトロウイルスベクターにてTEL/SYK遺伝子(BAF/TS)及びTEL/SYKΔPNT遺伝子(BAF/TSΔPNT)を導入した細胞を用いて、幾つかの細胞内チロシンキナーゼについて検討したところ、BAF/TSのみにSTAT5,PI3K,AKT,VAV,PLCγ2の恒常的活性化が認められた。TEL/SYK導入細胞ではSTAT系のみでなくPI3K系にも恒常的活性化が生じていることが確認できた。TELの分子会合領域であるPNT領域を除いたものではこれらの活性化は認められず、TEL/SYKタンパク同士の分子会合が自己活性化に必要であると考えられた。また、これらの活性化は、SYKチロシンキナーゼの阻害剤であるpicetanolにより抑制されBAF/TS依存性であることを確認した。BAF/TSではIL-3非依存性の細胞増殖が認められるが、それがどのシグナル系に依存するか調べるため、JAK系のインヒビターであるJABをBAF/TSに遺伝子導入したが細胞増殖の抑制は見られず、STAT5の活性化はJAK系を介さない可能性が考えられた。STAT5のアンチセンスあるいはdominat negativeSTAT5を用いた抑制実験も行っているが、現在のところうまく抑制が得られていない。

一方、PI3Kの抑制薬Wortomannin.LY294002を加えた実験も行っており細胞増殖の抑制が認められている。これまでのところ、どちらのシグナル系が細胞増殖に強く関与しているかの断定は出来ないが、これらのシグナル異常が白血病の発症に関与してることが明らかにされた。免疫蛍光染色で、TEL-SYK融合遺伝子は細胞質に存在することが確認されている。私たちは、血液悪性疾患において受容体型のチロシンキナーゼの転座遺伝子として、t(5;14)(q33;q32)転座におけるCEV14-PDGFβR融合遺伝子、非受容体型チロシンキナーゼの転座遺伝子としてt(9;12)(q22;p13)転座におけるTEL-Syk融合遺伝子を分離同定し報告した。今年度は後者の転座遺伝子を検討した。私たちはM7と診断された患者においてt(9;12)(q22;p12)の染色体転座を持つ症例を経験した。12番染色体上の短腕p12には、白血病においてしばしば転座により融合遺伝子を形成するTEL遺伝子が存在するため、TEL遺伝子を用いてサザンブロット解析を行ったところ、再構成バンドを得た。TEL近傍において染色体再構成を起こしていることが判明したため、PCR RACE法によりTELと融合する相手遺伝子を検索したところ驚いたことにその遺伝子はSYK遺伝子として既に報告されているものであった。SYKは非レセプター型のチロシンキナーゼで血液免疫系の細胞全体に発現しており、様々な機能に関与している。SykはB細胞レセプター、FcγレセプターなどのITAMモチーフに結合し、細胞内でのシグナル伝達を仲介しているが、TEL-Syk融合遺伝子では、そのシグナルに異常が生じ発癌に大きく関与していると考えられたため、融合遺伝子全体をクローニングし検討をおこなった。TEL-Syk融合遺伝子をIL-3依存性マウス白血病細胞株であるBaF3にレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入したところ、BaF3(BaF3/TEL-Syk)をIL-3非依存性にトランスフォームすることが判明した。一方、TEL遺伝子の多量体化に関与するPNT領域を欠失したTELΔPNT-Sykを導入したBaF3(BaF3/TELΔPNT-Syk)では、IL-3非依存性の細胞増殖が得られず、IL-3を除去すると細胞は死滅した。これらの細胞において、SykのC末端領域に対する抗体で免疫沈降を行い、抗リン酸化チロシン抗体PY20でウエスタンブロットを行ったところBaF3/TEL-Sykにおいてのみ、Sykチロシンキナーゼの恒常的活性化が認められた。このことから、TEL-Syk融合遺伝子においては、TELのPNT領域がSykの恒常的活性化に重要な役割を果たしており、Sykチロシンキナーゼの恒常的活性化が、BaF3細胞のIL-3非依存性の増殖を可能にしていると考えられた。
住宅所有と家計行動のミクロ計量経済分析：家計消費と労働移動に与える影響

本研究課題では、(1)住宅価格の変動が家計の消費および世帯形成に及ぼす影響、(2)住宅所有が家計の労働移動に及ぼす影響、の2点について、計量経済学的な検証を行った。(1)の研究課題については、複数のデータセットを活用した住宅資産効果の計測、および住宅資産効果の背後にある行動経済学的なメカニズムの検証を試みた。(2)の研究課題については、集計データと個票データの双方を活用して、家計の住宅所有と労働移動の関係を検討した。これらの研究成果については、国内外の学会・研究会での発表を行うとともに、計4編の研究論文として学術誌および書籍の形で公表している。平成25年度は、主として本研究課題の第1のテーマである家計消費に対する住宅の資産効果に焦点を当てて研究を行った。以下では、主な研究活動の内容とその成果について、概要を述べる。年度前半には、先行研究のサーベイを行うとともに、分析に必要なデータセットの収集・構築・整備作業を行った。データセットについては、当初の計画に沿って「慶應義塾家計パネル調査」(KHPS)を利用するとともに、これを補足する形で、公表統計である住宅・土地統計調査の都道府県別集計データも利用した。これらのデータセットを利用し、年度後半には予備的な分析を開始した。分析に当たっては、複数のデータセットを併用した分析を行うことで、得られた知見の定量的な比較可能性を検討した。この研究成果については、直井(2014a)として発表している。また、住宅資産効果の背後にある経済学的なメカニズムの解明という観点から、家計の損失回避性と住宅資産効果に焦点を当てた分析を行い、直井(2014b)として発表している。さらに、そこでの研究成果を進展させた形で、さらなる分析を行い、Naoi (2014)を執筆し、査読付き学術誌に投稿を行った。この論文については、現在当該誌からの依頼を受けて再分析・改訂作業を行っている。【発表論文等】平成26年度の主な研究活動の内容とその成果について、概要を述べる。年度前半には、前年度に引き続き、家計消費に与える住宅資産の影響についての研究を行った。主たる研究成果として、選好の損失回避性が住宅資産効果に及ぼす影響を分析したNaoi (2014)を執筆し、研究会・ワークショップなどで報告を行った。これらの研究会・ワークショップで得たコメントを踏まえ、現在さらなる改訂作業を行っている。また、これと関連する研究として、住宅資産が家計の出生行動に与える影響を分析したIwataand Naoi (2014)を執筆し、学会・ワークショップでの報告を行った。当該研究成果については、査読付き学術誌への投稿準備を行っている。年度後半には、第2の研究課題である住宅所有と労働移動に関する研究の予備的な分析作業を実施した。具体的には、関連研究のサーベイ、データセットの構築、予備的な分析作業を実施した。【発表論文等】本研究課題は、(1)家計消費に対する住宅の資産効果、および(2)住宅所有と労働移動、という2点に焦点を当てて、住宅所有が家計の消費および就業行動に与える影響を明らかにすることを目的としている。以下では、平成27年度に実施した研究活動、ならびに研究期間全体を通じて実施した研究の成果について、その具体的内容を述べる。平成27年度は、当初計画に沿った形で、主としてこれまでの研究成果の総括と成果の発信に努めた。年度前半には、第1の研究課題に関連する研究として、選好の損失回避性が住宅資産効果に及ぼす影響を扱ったNaoi (2014)における分析を拡張するともに、論文の改訂を行った。また、前年度に引き続き、住宅資産が世帯形成に及ぼす影響についての分析を進め、査読付き学術誌への投稿を行った(Iwata and Naoi, 2015)。年度後半には、第2の研究課題である住宅所有と労働移動の関係について、前年度の研究成果を受けて、構築したデータセットを利用した分析を行い、研究成果の取りまとめを行った。当該研究成果については、現在公表準備中である。また、年度前半に投稿を行ったIwata and Naoi (2015)について、学術誌からのコメントを受けて分析の拡張・改訂作業を行い、再投稿を行った。研究期間全体を通じて実施した研究の成果としては、以下の内容が挙げられる。第1の研究課題である住宅の資産効果については、複数のデータセットを活用した家計消費の住宅資産効果の定量的把握(直井, 2014a)、家計の損失回避性と住宅資産効果の関連(直井, 2014b; Naoi, 2014)、住宅資産と世帯形成の関連(Iwata and Naoi, 2015)などを扱った一連の研究論文を執筆し、学術誌への投稿論文および書籍の形で公表した。第2の研究課題である住宅所有と労働移動の関係については、集計データと個票データの双方を用いた分析を行い、研究論文としての取りまとめを行った。

平成26年度に関しては、当初の計画では、損失回避性や借入制約といった要因を考慮した分析を行い、住宅資産効果の背後にあるメカニズムを明らかにすることを目標としていたが、Naoi (2014)においてこれらを行った。加えて、第2の研究課題である住宅所有と労働移動に関する研究の予備的な分析作業を行い、より一層の進展をみることができた。都市経済学平成27年度には、現在投稿中、ないしは投稿準備中の複数の研究成果について、査読付き学術誌への公刊を目指す。また、本研究課題の第2の研究テーマである住宅所有と労働移動の関係についても、平成26年度におこなった予備的な分析結果を踏まえて研究成果のとりまとめを行う。そのうえで、各種学会などでの報告、研究成果の公刊を目指す。平成25年度に関しては、当初の計画では、データセットの構築・整備とそれを用いた予備的な分析を行うことを目標としていたが、上述の通り、2本の研究論文を執筆・公刊することができた。住宅所有と労働移動に関する分析で利用・購入予定であった、地理情報データ(ArcGISデータコレクションシリーズ)について、予備的な分析作業に当たっては、代替的なデータセットを利用可能であったため。平成26年度には、現在英文査読誌に投稿中の研究成果を公刊することを目指す。そのうえで、当初計画に沿って、(1)計量経済学的な手法の精緻化、(2)異なるデータに基づく分析結果の詳細な比較・検討、に焦点を当てて、さらなる研究活動を行っていく。具体的に、(1)に関しては、家計資産の測定の問題、住宅資産の保有に関する内生性、観察できない異質性の存在などを考慮した計量経済モデルの構築を目指す。(2)に関しては、「消費生活に関するパネル調査(JPSC)」および「くらしと健康の調査(Japanese Study of Aging and Retirement, JSTAR)」などの国内で利用可能なマイクロデータを活用し、現時点で得られた知見のさらなる検討を進めていく。これと並行して、本研究課題の第2のテーマである住宅所有と労働移動に関しても、データセットの構築・整備とそれを用いた分析を開始する。そのうえで、各研究テーマから得られた知見を統合し、研究課題全体としての成果の発信に努める。平成27年度以降に実施する分析作業に当たっては、上記データセットに含まれないより詳細な情報が必要とされるため、適宜これらの購入に充てることを検討している。分析用データの構築に必要であったGISソフトウェアについて、予備的な作業に関しては所属大学の計算機室にある設備・備品を利用して実施可能であったため。平成26年度以降に実施する分析作業に当たっては、上記の設備・備品では対応できない作業が発生するため、追加パッケージを含めた当該ソフトウェアが必要となる。そのため、次年度使用額はこの購入に充てることを予定している。
上皮系細胞におけるEBウイルス増殖による細胞融合機構の解析

我々は上咽頭癌初代培養細胞とアデノイド由来上皮系細胞株との細胞融合によってEBウイルス産生性の上皮系細胞株NPCーKTを世界ではじめて樹立化することに成功した。さらにNPCーKTの高ウイルス産生性のサブクロ-ンであるs61細胞はウイルス産生時にヘルペスウイルスに特徴的な多核巨細胞、封入体を形成することを報告した。融合細胞形成はウイルスDNA合成阻害剤であるアシクロビル、又はグリコシレイション阻害剤2ーデオキシグルコ-スにより阻害されることからウイルス感染後期に発現する糖タンパクが関与することが示唆された。またこれらの阻害剤によりs61細胞のウイルス抗原発現細胞の割合は細胞融合を起こさない親株NPCーKT細胞のレベルまで低下する。一方NPCーKT細胞ではこれらの阻害剤による抗原陽性細胞の低下は認められなかった。これらのことからs61細胞ではウイルス増殖サイクルが細胞融合によって広がって行くことが示唆された。トリチウムチミジンにより核を標識したs61細胞を用いてs61細胞の細胞融合はウイルスセプタ-を持たない細胞とも起こることがin situオ-トラジオグラフィ-により確認された。従来、EBウイルスが上皮系細胞に感染することによって起こる上咽頭癌の発生機序、特に感染機構については不明であったが、このことはEBウイルスのウイルスレセプタ-陰性の上皮系細胞への感染が細胞融合によって起こる可能性を示している。上咽頭癌由来上皮系細胞株NPCーKTよりサブクロ-ニングしたBBウイルス高産生性のcl.S61細胞はEBウイルス産生時にヘルペスウイルス増殖に特徴的な細胞融合、封入体形合などの細胞変性効果を呈する世界で唯一の細胞株である。EBウイルスによるこれら細胞変生効果は臨床面でも興味深いものであるが、同時に細胞融合現象はEBウイルスのウイルスレセプタ-不在の細胞への感染機構としても注目されている。すなわち上咽頭癌発症には上皮系細胞へのEBウイルス感染が深く係わっていると考えられているが上皮系細胞表面にEBウイルスレセプタ-は確認されずその感染機構は不明であるが細胞融合を介しての感染の可能性も指摘されている。ウイルス遺伝子DNA末端反復配列を細胞およびウイルスのクロ-ナリティ-のマ-カ-として種々のEBウイルス産生細胞について検討した結果、ウイルス遺伝子DNAは環状DNAとして安定に保持されるために、末端反復配列はcl.S61細胞を除くすベてのEBウイルス産生細胞において、常に一定のコピ-数を維持していた。これらの細胞より産生されるウイルス粒子中の線状はDNAは、環状DNAから線上DNAを合成する過程で、不均一なコピ-数の末端反復配列を持ち、感染により再び環状化した際には不均一な末端反復配列を持つようになる。cl.S61細胞では、他のウイルス産生細胞と異なりウイルス増殖による細胞融合の結果、ウイルス感染に対応するような不均一な末端反復配列を有する環状DNAが出現し以後安定な環状DNAとして保持される。この結果は、ウイルスレセプタ-を有しないcl.S61細胞においては細胞融合によるウイルス再感染の可能性を強く示唆するものであり上皮系細胞への感染機構を研究するうえで極めて重要な知見である。NPCーKE細胞は上咽頭癌初代培養細胞とアデノイド由来上皮系細胞株との細胞融合によって得られたEBウイルス産生性の上皮細胞である。NPCーKTの高ウイルス産生性のサブクロ-ンであるs61細胞はウイルス産生時にヘルペスウイルスに特徴的な多核巨細胞、封入体を形成する。融合細胞形成はウイルスDNA合成阻害剤であるアシクロビル、又はグリコシレイション阻害剤2ーデオキシグルコ-スにより阻害される。これらの阻害剤によりs61細胞のウイルス抗原発現細胞の割合は細胞融合を起こさない親株NPCーKT細胞のレベルまで低下する。一方NPCーKT細胞ではこれらの阻害剤による抗原陽性細胞の割害の低下は認められなかった。これらのことからs61細胞ではウイルス増殖が細胞融合によって広がって行くことが示唆された。トリチウムにより核を標識したs61細胞を用いてs61細胞の細胞融合はウイルスレセプタ-を持たない細胞とも起こることがin situオ-トラジオグラフィ-により確認された。

従来、EBウイルスが上皮系細胞に感染することによって起こる上咽頭癌の発生機序、特に感染機構については不明であったが、このことはEBウイルスのウイルスレセプタ-陰性の上皮系細胞への感染が細胞融合によって起こる可能性を示している。
線維芽細胞増殖因子溶出型ハイドロゲル化ステントグラフト開発に関する実験的研究

【目的】大動脈瘤に対するステントグラフト内挿術において大動脈壁と人工血管膜との間の生物学的固着を積極的に促進させ治療効果を能動的に高めることを目標とし、本研究では線維芽細胞増殖因子(以下、bFGF)溶出型のステントグラフトを開発、生体内で生じる組織変化を評価検討し、薬剤溶出型ステントグラフトの臨床応用の可能性を模索することを目的とした。【対象と方法】薬剤キャリアとしてハイドロゲルを用いた。ステントグラフトは頭側より1.A群(非ハイドロゲルコーティンググラフト+蒸留水)、2.B群(ハイドロゲルコーティンググラフト+蒸留水)、3.C群(ハイドロゲルコーティンググラフト+bFGF)とし、6頭の生体ブタの腹部大動脈にそれぞれ留置した。30日後の血管造影、血管内超音波及び組織標本(HE染色、EVG染色、α平滑筋アクチンによる免疫染色)にて宿主血管壁との間に生じる組織変化を比較した。【結果】新生内膜比(%、血管断面積における新生内膜の占める面積比)は、A群9.26±1.39(SEM)、B群12.6±1.71、C群21.3±3.04であり、A-C群、B-C群において有意差を示した(P<0.05)。C群ではグラフトの織り込まれた繊維内にα平滑筋アクチン陽性細胞を多数認め、この細胞数はA,B群と比し有意に多かった。【結論】bFGFの徐放により新生内膜形成及びグラフト繊維内へのα平滑筋アクチン陽性細胞の侵入が促進されることが示唆され、宿主動脈壁と人工血管膜との間に強固な固着が生じることが期待できると思われた。現在は、ステントグラフト自体の大動脈壁に対する適合性を高める研究を進めており、今後適合性に優れたステントグラフトに本研究の結果を応用し、より積極的な大動脈ステントグラフト治療の臨床応用が実現化できれば、大動脈疾患に対する低侵襲治療として遠隔成績が期待され、外科手術治療に対する高危険群患者にとって朗報になりうると考えられる。【目的】大動脈瘤に対するステントグラフト内挿術において、人工血管膜と大動脈壁は生物学的に固着しないことが知られており、微小なエンドリークやエンドテンションの原因となっていることが予想される。今回、大動脈壁と人工血管膜との間の生物学的固着を促進させることを目的とし、線維芽細胞増殖因子(以下、bFGF)溶出型のステントグラフトを開発、生体内で生じる組織変化を評価検討する。【結果】

新生内膜比(%、血管断面積における新生内膜の占める面積比)は、A群9.26±1.39(SEM)、B群12.6±1.71、C群21.3±3.04であり、A-C群、B-C群において有意差を示した(P<0.05)。C群ではグラフトの織り込まれた繊維内にα平滑筋アクチン陽性細胞を多数認め、この細胞数はA, B群と比し有意に多かった。【結論】線維芽細胞増殖因子の徐放により新生内膜形成及びグラフト繊維内へのα平滑筋アクチン陽性細胞の侵入が促進されることが示唆された。より適したシステムと観察期間の延長により、宿主動脈壁と人工血管膜との間に強固な固着が生じることが期待できる。本研究は動脈硬化などで障害された血管壁,主として動脈瘤や動脈破綻を血管内から積極的に治療することを目的とするステントグラフト治療において,その治療効果を高め,より能動的な血管修復が可能なデバイスを開発することを最終的な目標として計画されたものである。つまり大動脈瘤に対するステシトグラフト内挿術において,人工血管膜と大動脈壁は生物学的に固着しないことが知られており,これら大動脈壁と人工血管膜との間の生物学的固着を促進させることを当初の目的とし,線維芽細胞増殖因子溶出型のステシトグラフトを開発,生体内で生じる組織変化を評価検討してきた。前年度に,薬剤キャリアとしてハイドロゲルを用いたハイドロゲルコーティンググラフトを作成し,それに線維芽細胞増殖因子を塗布したステントグラフトを作成し,生体ブタの腹部大動脈への留置実験を行った。30日後の血管造影,血管内超音波及び組織標本(HE染色,EVG染色,α平滑筋アクチンによる免疫染色)にて宿主血管壁との間に生じる組織変化を比較し,グラフトの織り込まれた繊維内にα平滑筋アクチン陽性細胞を多数認めることがわかった。今年度は,これらの結果を解析し,考察を加えた後に学会報告ならびに医学術誌上で発表した。結論としては,線維芽細胞増殖因子の徐放により新生内膜形成及びグラフト繊維内へのα平滑筋アクチン陽性細胞の侵入が促進されることが示唆され,宿主動脈壁と人工血管膜との間に強固な固着が生じることが期待できると思われた。現在は,ステントグラフト自体の大動脈壁に対する適合性を高める研究を進めており,今後適合性に優れたステントグラフトに本研究の結果を応用し,より積極的な大動脈ステントグラフト治療の臨床応用を現実化したいと考えている。
自動車部品サプライヤーの製品範囲・顧客範囲拡大戦略と経営成果に関する研究

本研究では、日本の自動車部品サプライヤー(以下「部品サプライヤー」)を対象として、「製品範囲」(product scope)と「顧客範囲」(customer scope)の二軸から成長戦略を捉え、当該戦略のあり方と経営成果との関係を、パネルデータ分析やマッチング・ペア分析の手法を用いて、定量的・定性的に検証していく。あわせて本研究では、得られた結果の背景にあるロジックを探る中から、部品サプライヤーにとっての望ましい成長戦略のあり方や取引ネットワーク戦略のあり方についての知見を得ていくことを目指す。
新生児の自然免疫応答の解明を基盤としたRSウイルス経鼻ワクチンの開発

RSV蛋白に対する新生児および成人の免疫応答は弱く、効果的なRSVワクチンの開発にはアジュバントが必要である。出芽酵母の細胞壁成分であるZymosanは、TLR2/TLR6ヘテロ二量体に対するリガンドであるが、成人と同等の自然免疫応答を臍帯血の免疫担当細胞に惹起できることから、新生児・乳児のRSV感染症に対する経鼻ワクチンのアジュバントとして有用である可能性が示唆された。我々は臍帯血を用いた新生児の自然免疫応答の解析をすすめ、成人と比較した新生児の自然免疫の未熟性は免疫担当細胞やTLR作動薬によって異なることを明らかにした(Nohmi K, Tokuhara D. J Pediatr 2015)。具体的には、臍帯血および成人血から分離した単球(Mo)、樹状細胞(DC)、単球由来樹状細胞(MoDC)をLPS (TLR4リガンド), Pam3CSK4 (TLR1/2リガンド), flagellin (TLR5リガンド), zymosan (TLR2リガンド), poly(I:C) (TLR3リガンド), imiquimod (TLR7リガンド),ならびにCpG (TLR9リガンド)を用いて刺激し、各種細胞から産生される炎症性サイトカインの濃度を測定した。LPS、Pam3CSK4、Flagellin刺激では、炎症性サイトカイン産生はMoにおいて成人血で高く、DCでは成人血と臍帯血間に差はなく、MoDCでは臍帯血が成人血よりも高い傾向にあった。poly(I:C)、imiquimod、CpGは成人血・臍帯血のどの種類の細胞においても炎症性サイトカインの産生は低値であった。一方、TLR2の作動薬であるZymosan(出芽酵母や真菌壁の多糖成分)は、成人血および臍帯血の各免疫担当細胞において炎症性細胞産生を誘導するとともに、臍帯血の各細胞における炎症性サイトカインの産生量が成人と同等であることを見いだした(Nohmi K, Tokuhara D. J Pediatr 2015)。これらの結果はZymosanが成人と同様の自然免疫応答を新生児に惹起しうることを示しており、Zymosanが新生児の効果的なワクチンアジュバントになりうることを示唆すると考えられる。以上の結果は国内外の学会で発表し、Journal of Pediatricsに受理された。これまでの我々の研究成果から、成人と比較した新生児の自然免疫応答の低さはTLRや免疫担当細胞の種類によって異なることがわかっており、酵母由来成分であるzyomosanは成人と同等の自然免疫応答を新生児にも惹起することによって新生児ワクチンの効果的なアジュバントとなりうることを示してきた(Nohmi K, Tokuhara D. J Pediatr 2015)。本年度は、その知見をさらに深めるべく、zymosanを含めたTLR作動薬が惹起する新生児の自然免疫応答に与える母体因子を検索した。最も重要な母体の合併症のひとつである糖尿病と新生児の自然免疫との関係を示唆する研究はこれまでなかったことから、本年度は母体糖尿病が新生児の自然免疫に与える影響について研究をおこなった。方法としては、母体を妊娠中に糖尿病(DM)に罹患した母体群(DM群, n=8)とDMや感染症に罹患していない対照群(n=7)の2群に分け、出産後の胎盤から臍帯血を採取し、単球を分離し、単球にTLR作動薬を反応させ、12時間培養した後の培地中サイトカインを測定した。TLR作動薬として、zymosan、flagellin、Pam3CSK4、MALP、LPSを用いた。その結果、LPS、zymosan、MALPで刺激した場合にはDM群と対照群の2群間のサイトカイン産生に差はみられなかったが、Pam3CSK4刺激ではIL8とTNFalphaの産生が対照群よりもDM群で高く、flagellin刺激では対照群よりDM群でIL8産生が高いことがわかった。このことから、母体のDMは新生児期の自然免疫を過剰に活性化する事で感染症の増悪に関わる可能性があるのではないかと推測した。以上の成果は現在Journal of Reproductive Immunologyに投稿中である(リバイス投稿中)。また、我々がこれまでの研究で見いだした新生児ワクチンアジュバント候補であるzymosanに関しては、zymosanによる新生児免疫の誘導効果はDMという母体因子の影響を受けないことがわかった。本研究課題の要となる新生児のワクチンアジュバントについてはzymosanが有用である事を前年度に示した。本年度は、その結果をさらに発展させ、新生児の自然免疫は母体因子に左右され、母体の糖尿病は新生児の自然免疫応答を過剰に惹起し感染症による全身性免疫を増悪させる可能性のあることを世界で初めて示唆する事ができた。一方、zymosanによる自然免疫応答は母体DMという母体因子の影響を受けない事から、新生児のワクチンアジュバントして今後さらに有用性を追究するという道筋をつけることができた。

臍帯血および成人末梢血から分離した単球にRSウイルス抗原を加え刺激することによるサイトカイン産生ならびに表面分子の差異について検討を重ねた。その結果、臍帯血由来単球では、成人血とは異なりMHC-class I分子の発現が弱く、IL-6およびTNF-alphaの産生が低いことがわかった。また、本研究の過程で、糖尿合併妊娠ではTLR5とTLR1/2を介した自然免疫応答が過剰に誘導されることを見出し、妊娠中の母体の合併症が新生児のワクチンへの反応性にも影響を与える可能性が示唆された。一方、RSウイルス抗原に対する効果的な免疫応答を新生児に誘導するためには、上記の研究成果から効果的なアジュバントが必要であることも明らかとなった。アジュバント検索のため、臍帯血および成人末梢血の単球、樹状細胞(DC)、ならびに単球から分化させたDC(MoDC)にLPS、Pam3CSK4、Flagellin、Zymosan (TLR2リガンド)、Poly(I:C)を添加し、培養上清中のサイトカイン濃度を測定した。その結果、LPS,Pam3CSK4,flagellin,Poly(I:C)で刺激した場合、単球は成人よりも臍帯血群で低い炎症性サイトカイン産生を示したが、DCでは両群に差はなく、MoDCは臍帯血群が成人よりも高い炎症性サイトカイン産生を示した。一方、Zymosanで刺激した場合、単球・DC・MoDCにおける炎症性サイトカイン産生は成人と臍帯血の両群において差を認めなかった。このことから、Zymosanは成人と同等の自然免疫応答を臍帯血の免疫担当細胞に惹起でき、RSウイルスに対するワクチンのアジュバントとして有用であることが考えられた。以上の結果から、RSV抗原にzymosanを添加したワクチンを用いて、幼若動物への免疫実験を行う準備を進めている。我々は、酵母や真菌の壁の多糖成分であるZymosanが、単球・樹状細胞・単球由来樹状細胞において成人血と同等の免疫応答を臍帯血においても誘導できることを見いだし、論文として公表した(Nohmi K, et al. J Pediatr. 2015. in press)。同結果は、成人血と臍帯血の間の炎症性サイトカイン産生度の差が少なく、各TLRリガンドの中でサイトカイン産生能および細胞の成熟化の高いものをワクチンアジュバント候補として見いだすという、初年度(平成26年度)の目標を達成した。以上の理由から、「おおむね順調に進展している」と評価した。本年度は、zymosanによる新生児の自然免疫応答誘導システムについて、サイトカインのみならず細胞表面分子マーカーを含めたさらなる解明を行い、RSウイルスの抗原とzymosanを同時に免疫担当細胞に反応させた際の免疫応答についても明らかにし、RSウイルスに対するzymosanをアジュバントとして用いた新生児・乳児ワクチンの有用性について検討をすすめていく。新生児TLR2はRSVの認識に関わり、TLR2を介したRSVに対する免疫応答が樹状細胞の活性化に重要な役割を果たす事が知られていることから(Murawski MR. J Virol 2009)、Zymosanが新生児の自然免疫を成人同等に活性化するという我々の知見は、RSVに対するワクチン開発に効果的に応用できると考えられる。したがって今後は、ZymosanをアジュバントとしたRSVワクチンの効果の検証をすすめていく。
抑制性免疫受容体アラジン－１を標的とした重症喘息の病態解明と新規治療法の開発

アレルギー性喘息に対する治療法を確立するにはその病態の理解が重要となる。我々は、抑制性免疫受容体、Allergin-1遺伝子欠損マウスを用いて、House Dust Mite (HDM)抽出物による喘息モデルを検討し、Allergin-1が、気道抵抗、肺胞浸潤好酸球数および血清IgE抗体価を抑制することを見出した。さらに、これらの喘息症状のうち、気道抵抗は肥満細胞上のAllergin-1が担っており、一方、肺胞浸潤好酸球数と血清IgE抗体価は樹状細胞上のAllergin-1が制御することを明らかにし、Allergin-1が喘息治療における標的分子となることを示した。「研究目的」気管支喘息患者の約1096はステロイド抵抗性の重症喘息である.抗IgE抗体療法が重症喘息で有効性を示すことから.IgE抗体およびIgE受容体陽性細胞が重症喘息の病態に関わることが示されているが,詳細な分子機構は不明である.申請者らは,IgE受容体のシグナルを抑制する免疫受容体,アラジン-1(Allergin-1)を同定した.Allergin-1遺伝子欠損マウスにダニ抽出物で喘息を誘導したところ,血清1gE抗体価及び気道抵抗が亢進した.このことから,Allergin-1は喘息の症状を抑える働きがあり,重症喘息治療の標的分子となる事が示唆された.そこで,Allergin-1の喘息症状を抑える分子機構を明らかにすることを目的として,平成24年度では,Allergin-1リガンドを同定することを試みた.「研究成果」1,Allergin-1リガンド発現細胞を明らかにした:Allergin-1の発現局在を明らかにするため,ヒトAllergin-1細胞外領域とヒトIgGlFc領域を融合したAlg-Fcキメラ蛋白を用いてフローサイトメトリー法により解析し,Alg-Fc蛋白が結合する細胞株を見出した,さらに,この結合は抗Allergin-1抗体により完全に阻害されることから,Allergin-1に特異的に結合する分子がこの細胞株に発現することが示された.2,Alg-Fc結合分子のプロテオーム解析:Alg-Fcが結合する細胞溶解液からAlg-Fcを用いてAlg-Fc結合分子を免疫沈降後,プロテオーム解析し,Alg-Fcに結合する細胞膜分子を明らかにした.また,この分子のリコンビナント蛋白がAllergin-1発現トランスフェクタントに結合することも確認した.「研究目的」気管支喘息患者の約10%はステロイド抵抗性の重症喘息である.抗IgE抗体療法が重症喘息で有効性を示すことから.IgE抗体およびIgE受容体陽性細胞が重症喘息の病態に関わることが示されているが,詳細な分子機構は不明である.申請者らは,IgE受容体のシグナルを抑制する免疫受容体,アラジンー1(Allergin-1)を同定した.Allergin-1遺伝子欠損マウスに喘息を誘導し,Allergin-1が重症喘息治療の標的分子となりえる可能性を見出した.そこで,Allergin-1の喘息における役割を明らかにすることを目的として,平成25年度では,Allergin-1リガンドを同定することを試みた.更に,肥満細胞欠損マウスを用いて,肥満細胞上におけるAllergin-1の機能を明らかにした.「研究成果」1,マウスおよびヒトAllergin-1Fcが分子Xに結合することを新たに見出した.更に,これが機能的にもAllergin-1リガンドであることを肥満細胞を用いたin vitroの系で明らかにした.2,Mas-TRECKマウスにジフテリア毒素を投与した後,野生型またはAllergin-1遺伝子欠損型肥満細胞で再構築して,肥満細胞特異的にAllergin-1を欠損するマウスを樹立し,喘息を誘導し,肥満細胞上のAllergin-1の喘息における機能を明らかにした.【背景・目的】気管支喘息患者の約10%はステロイド抵抗性の重症喘息である。抗IgE抗体療法が重症喘息で有効性を示すことから、IgE抗体および高親和性IgE受容体(FcεRI)陽性細胞が重症喘息の病態に関わることが示唆される。申請者らはFcεRIシグナルを抑制する免疫受容体Allergin-1を同定した。Allergin-1遺伝子欠損マウス(KO)にHouse Dust Mite (HDM)抽出物を経鼻投与してアレルギー性喘息を誘導すると、野生型と比較してKOマウスで肺胞浸潤好酸球数と血清IgE抗体価の亢進に加え、メサコリン誘導性の気道抵抗値が増悪する現象を見出した。本課題では、この病態の分子機構の解明と新規治療法開発を目的として、1Allergin-1リガンドの同定、2好酸球数および血清IgE抗体価の亢進機序、3気道抵抗増悪の分子機構の解析を行った。【結果】

1マウスおよびヒトAllergin-1に結合する分子を新たに見出し、in vivoおよびin vitroで機能解析を行ない、この分子が肥満細胞のIgE依存的な脱顆粒反応を抑制し、さらにIgE依存性局所(耳介)アナフィラキシー反応をAllergin-1を介して抑制することを明らかにした。2血清IgE抗体価および肺胞浸潤好酸球数の抑制は樹状細胞上のAllergin-1によることを明らかにした。3気道抵抗の抑制は肥満細胞上のAllergin-1によることを明らかにした。【成果】以上の結果から、新たに同定したAllergin-1リガンドを用いることで、喘息症状を人為的に制御することが可能であることを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度では,Allergin-1リガンドを同定することを目的として研究を行った結果,Allergin-1に特異的に結合する細胞膜分子を同定する成果を得た.計画通りの成果が得られたため,おおむね順調に進展していると評価した.平成25年度ではAllergin-1リガンドとして2つの分子を同定した。さらに、Allergin-1遺伝子欠損マウスにおいて,肥満細胞上のAllergin-1の喘息における役割を明らかにした.26年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,マウス喘息モデルにおけるAllergin-1とAllergin-1リガンドの分子機構を明らかにする.1,平成26年度では、in vivoにおけるAllergin-1リガンドの機能を明らかにする。具体的にはリガンド分子を生体に投与することで、局所のアナフィラキシー反応の病態を指標に評価する.2,さらに、in vivoにおけるリガンド分子の局在を明らかにし、Allergin-1とリガンド分子の共局在を明らかにする.3,樹状細胞上のAllergin-1の喘息における役割を引き続き解析する.26年度が最終年度であるため、記入しない。
A.actinomycetemcomitans表層タンパクの同定及び病原性解析

歯周病原因菌Aggregatibacter actinomycetemcomitansの表層タンパクの病原性解析を行った。本研究ではトリプシンを菌体表層に作用させることにより、菌体表層に突出したタンパクの同定を試みた。その結果、既知の病原性外膜タンパクOmp100, EmaAを含む数種の表層タンパクが同定された。しかしながら、同定されたタンパクの多くはリボソームタンパクや酵素などの細胞質タンパクであった。これらの一部は、トリプシン処理により傷害を受けた死菌由来であることが考えられた。今後は、菌体表層に特異的な因子を解析する方法を確立し、本菌の病原性に強く関連する因子を同定する。平成27年度はAggregatibacter actinomycetemcomitansの表層タンパクの同定をLC-MSにより行った。菌体表層タンパクの分離にはトリプシンを用いた。グラム陰性菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansは表層構造がグラム陽性菌と比較し強固でないため、菌体の溶解に注意する必要が考えられた。そこでトリプシン作用時のbufferをPBS, HEPES等に浸透圧調整用のスクロース、トリプシン反応を促進するためのカチオンの量を調整し解析を行った。しかしながら、得られた結果には表層タンパクと考えられるものだけではなく、多くのリボソームタンパクやシャペロン類、エノラーゼ等が多く含まれていた。これらが菌体表層に付着する例は他菌の解析により知られているものの、今回の結果では菌体の溶解由来のタンパクが多く検出されたと考えている。より菌体表層特異的なタンパクを回収する実験法の確立を現在行っている。Aggregatibacter actinomycetemcomitansは、過去の報告例より、カタラーゼにより他菌由来の過酸化水素を無毒化すること、また他菌の出す代謝物を利用し、口腔内に定着していることが示唆されている。これらの因子のvivoにおける役割を解析するために、遺伝子破壊株の作成しやすいStaphylococcus aureusにてこれらの解析を行った。結果、他菌との共局在やマウス毒性に有意な違いが認められる株が得られたのでAggregatibacter actinomycetemcomitansの表層因子解析においても、該当する因子が同定された際は優先的に病原性解析をすることにする。菌体表層タンパクのTrypsin shavingによる同定は数回なされている。溶菌由来のタンパクを除く解析法も達成できると考えている。Aggregatibacter actinomycetencomitansのTrypsin shaving法による、病原性を示す新規表層因子の同定には至らなかった。理由の一つとしては、表層が比較的脆弱なグラム陰性菌であるAggregatibacter actinomycetencomitansにおいて細胞質タンパクの混入を防ぐことが困難であることであった。しかしながら、他菌の解析において、溶解した死菌由来のリボソームタンパクやシャペロンなどの細胞質タンパクが、副産物的に菌体表層に付着し、宿主に対する病原性に関与することが示唆されている。よって、本菌においても、これらの細胞質由来タンパクの表層における病原性も検討課題のひとつと考えられる。グラム陰性菌に比べ表層の強固なグラム陽性細菌(黄色ブドウ球菌、ミュータンスレンサ球菌)においては、スクロースやトレハロースなどを用いた高浸透圧を含むBuffer中においてTrpsin処理により、トリプシン未処理のコントロール実験と比較し、顕著に多くのペプチドをHPLCにより検出した。黄色ブドウ球菌MW2株を用いたLC-MS解析から、本菌において主要な表層タンパクProtein A、フィブロネクチン結合タンパク、表層タンパクSasHなどを同定することが可能であった。当解析により、その他機能未知タンパクや細胞質局在性タンパクも検出されたことから、これらの表層における病原性への関与も今後の検討課題の一つとなる。菌体表層特異的なタンパクの同定を複数の培養条件において行い、興味深い因子においては欠損株もしくは大腸菌における強制発現株を作成し、病原性に及ぼす影響を解析する。口腔細菌学
海馬錐体細胞樹状突起スパインダイナミクスの可視化技術の開発

GFP-actinによるスパイン内アクチン動態可視化の実験系を効率的に得る目的で実験を行い、次のような成果を得た。C57BL/6の遺伝背景へ戻し交配中のGFP-actinマウスを繁殖させ、GFP-actinマウス同士を交配させ、transgeneを両アレルに持つ個体を複数作成した。これらのオス・メス同士を交配させることにより、このようなラインをなるべく多く作成することを試みた。しかし、ホモ化されたラインはいずれも繁殖能が落ちていた。現在、さらにヘテロのラインを増やし、スライス作成に十分貢献可能なラインを樹立する工夫を行っている。マウス海馬スライス培養系をセットアップし、遺伝子銃・ウィルス等によるGFP-actin, mRFP1-actin, Venus-actinなどの導入後、蛍光シグナル観察のタイムラプスを行えるための最適化な条件設定を実施した。この過程で、海馬錐体細胞のみならず、小脳顆粒細胞や小脳プルキンエ細胞におけるGFP-actin動態観察も可能となり、現在並行して観察を行っている。