hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深部損傷褥瘡（DTI）における炎症誘導機序の解明と治癒促進ケア技術の確立

本研究は、深部損傷褥瘡(Deep Tissue Pressure Injury: DTPI)の炎症誘導機序の解明とDTI発生初期およびDTI治癒調整・促進の適切な看護ケア技術の開発を行うことを目的としている。今年度は、圧迫創の創中心部は好中球遊走が遅延し、それに伴い創傷治癒過程の遅延が認められることに着目し、圧迫創における好中球の動態と役割確認を目的として実験を行った。実験はJcl/ ICR雄性マウスを用い、対照(無処置)群、好中球枯渇群(各群各サンプリングn=4)に分けた。実験方法は好中球枯渇群は、anti-mouse Ly6Gモノクローナル抗体を用い腹腔内に投与し、対照群はアイソタイプコントロールのIgGを投与して作製した。対照群と好中球を枯渇した対象動物に我々の手法で圧迫創を作製し、創の作製後0、3時間、1、3、7日目にサンプリングした。組織は圧迫創の皮膚筋層と対側の非圧迫部位を摘出し、パラフィンブロック標本用およびフローサイトメトリー用に1/2ずつ分けた。組織観察用標本は、10%ホルマリン固定し、定法に従って作製したパラフィンブロックから切片を作製後HE染色を施した。また、フローサイトメトリー解析はCytometric Bead Array(CBA)を用いてサイトカインの多項目同時定量解析を行った。肉眼的所見では枯渇群の創は治癒に遅延傾向が認められた。サイトカインの変化は好中球の枯渇群は、ケモカイン(KC)が持続的に対照群より増加し、炎症性サイトカイン(MCP-1,IL-1β、TNF)は上昇が遅延しており、炎症期が遷延したと考えられた。初期の炎症が遷延し炎症性サイトカインの増加が後発することにより炎症が増悪することで、創傷治癒の遅延を引き起こす可能性が示唆された。圧迫創において、初期の好中球の遊走が適切に行われることが慢性炎症への移行を防ぐ可能性が示唆された。ほぼ計画に準じて進行しているため今後は、好中球の役割の検証を行うためn数を増やし、KCおよび炎症性サイトカインの圧迫創における局在性や分布についても確認したい。さらに臨床における看護ケア方法への応用を考慮し、好中球の遊走のためのケア開発や炎症を遅延・悪化させないよう看護ケア介入時期に拠る対応の仮説検証実験を計画する。炎症の抑制や促進など、創傷治癒調整の可能性を探り、介入方法を検討する。本年度は、深部損傷褥瘡(Deep Tissue Pressure Injury: DTPI)の炎症誘導機序の解明と適切な看護ケア技術の開発を目的とした。我々が作製した圧迫創モデルマウスの改良を行い、臨床における所見との相似性を検討するとともに創傷治癒過程の再現性を確認した。看護ケア方法として臨床で一般的な看護ケア技術である冷罨法と温罨法を用いた。実験にはJcl/ ICR雄性マウスを用い、無処置群、冷罨法群、温罨法群に分けた。圧迫創に与える冷温処置の影響は炎症期に初動する好中球の動態および炎症抑制に作用するといわれるIL-10反応性細胞の分布に着目して評価した。組織標本は、ホルマリンで固定した組織を定法に従ってパラフィンブロックを作り、切片を作製した上でHE染色および免疫組織化学染色した。肉眼的所見では冷罨法群の創面積が最も縮小率が高かったが、創は痂疲を形成し治癒創が瘢痕化する傾向を示した。一方、温罨法群は創面積の縮小率は最も低いものの、創傷の外表所見は痂疲形成が比較的少なく瘢痕形成を伴わずに穏やかに経過する傾向を示した。組織学的所見は、3時間1日目の冷罨法群において創中心部への好中球遊走時期が最も早かった。IL-10反応性細胞は1日目で温罨法群の表皮・真皮表層および皮下・筋層の深層双方で他の群より多く認められた。創傷治癒過程において、冷罨法群では真皮・皮下組織層、筋層でより活性化した線維芽細胞が認められたが、温罨法群では筋層の再修復が遅延する所見が認められた。好中球の遊走時期と創傷治癒への影響およびIL-10、および他のサイトカインなどの因子との関連性について今後詳細な検討が必要である。動物実験モデルの作製から改良を行い再現性を確認している。そのモデルを基盤に看護ケアの評価系に用い、看護ケアの評価を肉眼的、組織学的に行うことができている。しかし、創傷治癒に関連する他のサイトカインとの関連性は現在実験中のためやや遅れていると判断した。

対照群と好中球を枯渇した対象動物に我々の手法で圧迫創を作製し、創の作製後0、3時間、1、3、7日目にサンプリングした。組織は圧迫創の皮膚筋層と対側の非圧迫部位を摘出し、パラフィンブロック標本用およびフローサイトメトリー用に1/2ずつ分けた。組織観察用標本は、10%ホルマリン固定し、定法に従って作製したパラフィンブロックから切片を作製後HE染色を施した。また、フローサイトメトリー解析はCytometric Bead Array(CBA)を用いてサイトカインの多項目同時定量解析を行った。肉眼的所見では枯渇群の創は治癒に遅延傾向が認められた。サイトカインの変化は好中球の枯渇群は、ケモカイン(KC)が持続的に対照群より増加し、炎症性サイトカイン(MCP-1,IL-1β、TNF)は上昇が遅延しており、炎症期が遷延したと考えられた。初期の炎症が遷延し炎症性サイトカインの増加が後発することにより炎症が増悪することで、創傷治癒の遅延を引き起こす可能性が示唆された。圧迫創において、初期の好中球の遊走が適切に行われることが慢性炎症への移行を防ぐ可能性が示唆された。ほぼ計画に準じて進行しているため今後は、温罨法および冷罨法の効果や影響を先行研究の組織学的評価を発展させる必要がある。フローサイトメトリーやウエスタンブロッティングなどの分子生物学的な手法を用いて、より詳細な解析を行っている。炎症性細胞の活性に関わるサイトカインの測定結果を基に創部に効果的な看護ケア方法の条件の開発につなげたい。今後は、好中球の役割の検証を行うためn数を増やし、KCおよび炎症性サイトカインの圧迫創における局在性や分布についても確認したい。さらに臨床における看護ケア方法への応用を考慮し、好中球の遊走のためのケア開発や炎症を遅延・悪化させないよう看護ケア介入時期に拠る対応の仮説検証実験を計画する。炎症の抑制や促進など、創傷治癒調整の可能性を探り、介入方法を検討する。研究分担者に配分した直接経費において、当該年度に使用していない分が生じたため。今後、実験の進行に伴い必要経費として使用の予定である。一昨年度の研究進行がやや遅れたことにより、研究の検討会の遅延があり、研究分担者の研究費の使用が遅れたため。
植物のAlストレスに対する応答反応の解析と耐性植物の作出に関する基礎研究

準同質遺伝子系統コムギのET8(Al耐性)とES8(Al感受性)は、リンゴ酸放出に関わる遺伝子座Alt1が異なる。両系統から調製したcDNAを用いてサブトラクション法を行ない、ET8に特異的に発現する遺伝子(ATS1, aluminum tolerant specific)を単離した。形質転換イネおよびアフリカツメガエル卵母細胞の遺伝子発現系を用いてATS1の機能を調べた。CaMV35Sプロモーターの下流にATS1をつないだプラスミドをアグロバクテリウム法によりイネに導入し形質転換体を得た。野生株イネでは全くリンゴ酸放出は認められなかったのに対して、形質転換稲ではAl処理時に高いリンゴ酸放出を示した。また、ランタンや鉄などの3価イオンではリンゴ酸放出が起こらなかったことから、リンゴ酸放出はAlに特異的であることが示された。これらの結果から、ATS1はAl特異的なリンゴ酸放出機構に関与する遺伝子であり、遺伝子座Alt1と同じであることが示された。次に、アフリカツメガエル卵母細胞にATS1のcRNAを注入してタンパクを発現させ、さらにリンゴ酸を注入した後、細胞外液にAlを添加して電気生理学的測定を行った。その結果、膜電位のマイナス方向への過分極にともなった内向き電流の増大(マイナス電価の流出)が観察された。このことからATS1がリンゴ酸のチャンネルである可能性が示された。Al処理されたエンドウ(Pisum sativum cv. Alaska)の根端のAl障害部位を用いて、ミトコンドリア活性の指標として呼吸量とATP含量を測定した。呼吸量ならびにATP含量はともに、根伸長阻害と同様に、Al濃度とAl処理時間の増加に依存して低下した。次に、ジヒドロエチジウムを用いた組織化学的染色法により、Alによる活性酸素種(ROS)の誘発は根伸長阻害と同時期に始まり増加し続けた。Alによる根伸長阻害へのミトコンドリア機能阻害ならびにROSの誘発の関わりは時間的にも空間的にも強く認められた。以上の結果より、Alによるミトコンドリアの機能阻害によって生じた細胞内ATP含量の低下ならびにROSの誘発が根の伸長を阻害している可能性が示唆された。タバコ培養細胞を用い、Alの細胞内遊離Ca^<2+>と微小管の構造変化に与える影響について検討した。Alの影響は細胞の生育時期により大きく変動した。対数期の細胞ではAl(50μM)によりフラグモプラストと紡錘体の構造が消滅した。またAlにより分裂細胞の紡錘体の脱重合が観察された。一方、表層微小管は短時間のAl処理では変化しなかったが、処理時間を長くすると脱重合が認められた。他方、定常期の細胞ではAlによって表層微小管の安定化が認められ、脱重合には100μMのAl処理を必要とした。対数期の細胞ではAlによる細胞内Ca^<2+>の増加が認められたが、定常期の細胞では認められなかった。またCa^<2+>の増加は処理に用いたAlの濃度に依存した。さらにこれらCa^<2+>の変動は、A_<23187>やCPA(Cyclopiazonic Acid)処理によるCa^<2+>の変動と類似していた。一方、Al耐性機構について以下の研究を行った。

タバコ培養細胞からアルミニウム耐性株として分離されたALT213は、脂質過酸化誘発剤に耐性を示す。本研究では、その耐性機構を解明するため、2次元電気泳動法を用い、親株より多く発現する蛋白質を2個見いだし、、アミノ酸の部分配列をN末端から各々15個と10個決定した。ホモロジ-検索の結果、1つはミトコンドリア型のMalate dehydrogenase (MDH)、他方はNucleotide dephosphate kinase (NDPK)laもしくはllと相同性が高かった。ALT213株から調製した粗抽出液におけるMDHの比活性は親株に比べて4割高く、特に親株のALT213感受性期である対数増殖期において顕著であった。以上の結果より、MDHやNDPKの過剰発現がALT213株の脂質過酸化防御機構に関与している可能性が示唆された。コムギ根端におけるAl応答性のリンゴ酸放出特性とタンパク質リン酸化の役割を検討した結果、Al耐性種Atlasの根端では、Alの有無に短時間で応答してリンゴ酸の放出量を増減させることが明らかとなった。この制御は低温に感受性を示すことから、Alを受容してからリンゴ酸を放出するまでの過程には、代謝活動を必用とすることが示唆された。プロテインキナーゼに特異性を持つ阻害剤K-252aを前処理すると、Al応答性のリンゴ酸放出が強く抑制されることが明らかとなり、Alに応答してリンゴ酸を放出するためにはタンパク質のリン酸化を必用とすることを示した。K-252aを前処理したAtlasでは、根端のAl集積量の増加やAlによる根の伸長阻害の亢進が認められることから、コムギのAl耐性には根端から放出されるリンゴ酸に強く依存することを示した。Atlas根端では、48kDaのプロテインキナーゼがAlに対して一過的に活性化されるとともに、この活性化はK-252aを前処理すると消失することが判明した。このAlに対して活性化されるプロテインキナーゼは、Alシグナルを伝達してAlストレス応答が発現するために何らかの役割を果たしていることを示している。タンパク質リン酸化によるシグナルが最終的に伝達されるリンゴ酸の放出経路を推定するため、Atlas根端の無機陰イオンと有機酸含量の変化を追跡した結果、Alに対して有機酸含量は急激に減少するが、無機イオン含量は変化しないことがわかった。これらの結果は、Alに応答して放出されるリンゴ酸は、有機酸特異的に通過するアニオンチャンネルを経由することを示しており、このチャンネルの制御にタンパク質リン酸化が関与することが示唆された。コムギ根端におけるアルミニウム(Al)誘導性のリンゴ酸放出に関与するアニオンチャンネル・トランスポーターの同定と機作の解明は、耐性応答が制御されたAl耐性植物を作出するため重要である。リンゴ酸放出経路を特定するために、Al耐性コムギ品種Atlasと感受性品種Scoutの根におけるチオリンゴ酸の輸送能を調べた。1mMまでのチオリンゴ酸を含む0.5mM塩化カルシウム溶液(pH4.5)において、両品種ともに根の伸長はほとんど抑制されなかった。しがし、pH4.2以下ではチオリンゴ酸による根の伸長抑制ならびに屈曲が、Atlasに顕著に認められたが、Scoutにおいて認められなかった。
中国の都市計画における歴史的環境保護に関する研究-歴史文化都市保護制度を中心に-

本研究は、平成8年4月から平成9年3月までの1年間において、概ね4つの作業によって行った。1)文献資料の収集・検討日本において、中国の都市建設・計画、文化財保護に関する学術図書と各種の非出版物を収集した。中国において、主に各種の政令、記録、都市計画図、研究論文、研究報告書、写真等を収集した。2)ヒアリング調査日本において、中国の都市計画、特に保存計画に関する研究を行っている者(国際連合地域開発センター、東京大学、京都大学、大阪大学、立命館大学等1996.7、1996.11)を対象に調査を行った。中国において、本研究に関係の深い研究者(主に清華大学、同済大学、天津大学及び中国城市規劃設計研究院等のコンサルタント)と行政担当者(主に中国建設部、中国国家文物管理局、中国城市規劃学会等)を対象に調査を行った(1996.6 1996.9)。3)事例都市フィールドサ-ヴェイ北京市を中心に、歴史文化都市保護制度に基づき指定された保護地区(国子監保護区)を通じて、都市計画における各レベルの保護規制手法を考察し、保護制度の問題点を検討した(1996.8、1996.9)。4)資料・結果の検証及び研究のまとめ。本研究の結果からは、1)中国大陸における歴史的環境保護に関する全体の発展経緯は「建造物・建造物群都市地区」という3つのレベルに軸を置き、段階的に生成してきたこと、2)都市計画における面的保護体制は都市総体規劃(マスタープラン)、分区規劃(ゾーニング)、詳細規劃(実施計画)という3つの都市計画制度及びその規制によって成立していること、3)歴史文化都市保護制度は事実上は都市計画制度であり、都市計画に「保護」という視点をもたらしたとはいえ、その役割は都市計画の枠組みに限定されていること、という3点が明確に導き出された。今後、中国の国家級歴史文化都市(1997年3月現在99都市)で策定された保護計画を主な題材として現在中国の都市計画における保護のあり方の全体像を体系的に提示する研究を予定している。
操作性に優れた簡易型電気化学的促進酸化法の研究開発

本研究は、通電操作のみにより稼働できる新しい電気化学的促進酸化処理法について、処理性能の実験的並びに理論的検討を行った.その結果、SnO2陽極、SPE膜および粒状陰極よりなる電解セルは管路内に設置でき、オゾン還元によって生成されるOHラジカルにより、被処理水中の抗生物質、天然・合成ホルモンや下水三次処理水等を効率良く浄化できることがわかった.また、通電量と処理性能を表わす数学モデルを構築し、その妥当性を検証した.本研究は、通電操作のみにより稼働できる新しい電気化学的促進酸化処理法について、処理性能の実験的並びに理論的検討を行った.その結果、SnO2陽極、SPE膜および粒状陰極よりなる電解セルは管路内に設置でき、オゾン還元によって生成されるOHラジカルにより、被処理水中の抗生物質、天然・合成ホルモンや下水三次処理水等を効率良く浄化できることがわかった.また、通電量と処理性能を表わす数学モデルを構築し、その妥当性を検証した.操作管理が極めて容易な電気化学的処理法に関する基礎資料を得るために、通電操作により陽極でオゾンを生成させ、陰極で還元してOHラジカルを生成させる処理法について実験的検討を行った。その結果、電極材料の性状・形態、配置および維持管理に関する以下のような知見を得た。1)SnO2電極を陽極として用いることにより、オゾンを安定して生成することができる。ここで、オゾン生成効率は,SnO2層のコーティング回数および電流密度に影響を受け、コーティング回数および電流密度の増加につれ上昇する傾向にあった。本研究では、2030mA/cm2の条件で約12%程度の電流効率が得られた。2)メッシュ状SnO2電極(陽極)と粒状電極(陰極)の間に固体高分子電解質(SPE)膜を挟んだ電解装置を用いることにより、またp-クロロ安息香酸(p-CBA)を用いた実験より、連続的にオゾンの生成反応および還元反応(OHラジカル生成反応)を進行させることができる。オゾン生成に要する電流は主としてSPE膜内を流れるため、オゾン生成能力は被処理水の電気伝導率に影響を受けない。すなわち、支持電解質が存在しない純水中でもオゾン生成が可能であると考えられる。3)実排水の連続処理の際に問題となる陽極材の不活化過程に対してサイクリックボルタンメトリー(CV)で検討した結果、被処理水中にフェノール化合物等が存在すると、電極表面に酸化被膜が生成されて電極活性が大きく低下することがわかった。しかしながら、極性を反転させて、オゾン生成/還元反応を進行させることにより、電極を元の状態に再生することが可能である。操作管理が極めて容易な電気化学的処理法の設計・操作条件に関する基礎資料を得るために、前年度の結果に基づいて、陽極にSnO2電極、陰極に粒状および繊維状電極を用いた電解槽を作製し、異なる操作条件下の処理性能について実験的並びに理論的検討を行った。その結果、以下のような知見を得た。1)OHラジカルプローブとしてp-クロロ安息香酸(p-CBA)を用いた連続処理実験を異なる電極面積、通電条件、処理時間で行った結果、本法は安定してp-CBAを除去できることがわかった。特に、陰極の比表面積を大きくすることにより、処理時間を数分程度に減少させることができた。2)抗生物質(テトラサイクリン)、天然および合成エストロゲン(E1, E2, EE2)等を含む異なる合成排水に対する連続処理実験から、本法は対象汚染物質を効率良く除去できることがわかった。しかしながら、抗生物質の処理実験では全有機性炭素(TOC)を十分に除去できなかった。このことは、処理の過程で中間生成物質が生成されていることを示している。一方、エストロゲン類は電極表面上で酸化・ポリマー化することにより除去されるが、オゾン存在下で極性転換後に還元するとほぼ完全に分解され、同時に電極が再生されることが分かった。3)1)の実験結果に基づいて、オゾン生成、オゾン還元およびOHラジカル生成の各速度を表わす数学モデルを構築した。本モデルにより、異なる設計・操作条件に対するOHラジカル生成等を予測することができる。操作管理が極めて簡単な電気化学的促進酸化処理法の設計・操作条件に関する資料を得るために、異なる人工排水および実排水に対する連続処理試験および実証試験を行った。その結果、以下のような知見が得られた。1)地表水中に比較的に高頻度で検出されている抗生物質(テトラサイクリン、スルファメトキサゾール、エリスロマイシン)を含む人工水を用いた連続処理実験より、本処理法は効率良くこれらの抗生物質を除去できることがわかった。また、処理によって抗菌作用が大きく減少することを明らかにすると共に、主要な中間生成物を同定した。2)天然および合成エストロゲンを含む合成排水に対する連続処理実験より、本法はエストロゲン類を高効率で除去できることを明らかにした。また、エストロゲン類は陽極表面で酸化されポリマー化するが、電気化学的な電極再生(オゾン還元によって生成させたヒドロキシラジカルによるポリマー分解)により、安定して連続処理が可能であることを示した。また、単位容積当りの電極面積が大きいカーボンフェルトを用いると処理時間を数分に設定できることを明らかにした。3)実下水処理再生水を用いた実証試験を行い、本法により再生水中の残留TOCを60%、色度を80%程度除去することができた。

陽極材として粒状活性炭を用いることにより、残留汚濁物質が活性炭に一旦吸着され、同時にヒドロキシラジカルが生成されるため、残留物質が効率良く浄化されると考えられた。処理に要する電力はこれまで提案されている促進酸化法と同程度か、あるいはそれ以下であった。また、高速処理により単位容積当りの処理性能が向上する傾向にあることが分かった。26年度が最終年度であるため、記入しない。工学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度に計画していたように、電極材料および電解槽の設計・操作に関する基礎資料が得られている。最終年度に計画している実排水処理実験を行うための基礎資料が得られている。エネルギー効率が最大となる最適な設計・操作諸元について、既往水処理技術では対応できない難分解性物質に対する処理実験を含めて検討する。下水再利用水および高度処理が必要な上水を対象として、フィールド試験を行い、処理性能の検証と維持管理法について検討する。支出が一部予定より少額(8,259円)になったが、H25年度は分析装置(TOC計)を購入し、また実験装置材料、分析消耗品、旅費等に予定額を使用する予定である。分析機器の消耗品費および試薬等購入費が当初の計画より若干少なくなり、次年度使用額が計上された。次年度の実排水を用いた実験における分析消耗品費等に使用する予定である。
フラッシュメモリのための制約符号，およびその性能評価

フラッシュメモリとは不揮発高密度の記録媒体で,USBやSSDなどに利用されている.フラッシュメモリでは,フローティングゲートと呼ばれるセルに電荷を注入してデータを保存し,電荷量を量子化することで読み出しを行う.電荷の注入はセル毎にできるが,セルの電荷量を減らすには,そのセルだけでなくそのセルと同じブロック(集合)に属するセルを一度初期化せねばならない(この処理をブロック消去と呼ぶ).ブロック消去は寿命にも影響を与えるため,電荷量を減らさずにデータの上書きをすることが要求される.一方で,セル間の電荷がお互い干渉し合うことで量子化の際にエラーが起こってしまう要因(セル間干渉)も考慮する必要がある,本研究では,フラッシュメモリへデータを保存する際の「上書きにおける制約」と「インプットデータにおけるデータ列制約」を同時に考慮した効率的な符号化方式を提案することを目的とする.特に今年度は,フラッシュメモリにどれだけ情報を書き込めるかの指標となる「sum-rate」に関して,与えられた条件を満たした上でどこまで高めることができるかを解析した.具体的には,de Souzaらが提唱したConstrained system with unconstrained positionsを元に,どのシンボルをあてがったとしてもデータ制約を受けないセルのみ用いて行う符号化方式を提案して,そのsum-rateを求めた.また,そのsum-rateを最大sum-rateと比較して提案手法の有効性について検討した.特に,あるラン長制約に関しては,提案手法が漸近的に最適になること(漸近的に最大sum-rateに近づくこと)を確認した.セル間干渉の場合も,最適に近く傾向にあることは確認できたため,今後最適になるかどうか突き詰めていく予定である.不揮発性・高密度記録媒体として近年注目されているフラッシュメモリは(例:USB,SSDなど),保存したいメッセージをあるデータ列d=d_1d_2...d_Nに対応させ,i番目のセルに電荷レベルがd_iになるまで電荷を注入することでデータ列を書き込む.また,各セルの電荷レベルを量子化してデータ列を復元し,データ列に対応したメッセージを返すことでメッセージ読み出しを行う.フラッシュメモリでは,セルの電荷が隣接するセルの電荷に引きずられて,所定の電荷量以上と判断されるセル間干渉(Inter Cell Interference:以下ICI)が典型的な誤りとして挙げられる.デバイスの小型化につれて,ICIを防ぐようにデータ列を保存することがより重要となる(データ列制約).一方,コストと寿命の観点から,セルに蓄えられた電荷は下げずにデータ列を保存していくことが好ましい(上書き制約).これらの問題を解決すべく,ICIに影響を受けやすいデータ列を禁止語(保存するデータ列の中に現れてはいけない系列)とする制約符号の観点から研究に取り組んでいる.平成27年度は,制約符号のグラフ表現(経路に沿ってラベルを読んでいくことで生成される記号系列は,制約符号の禁止語を含まないグラフ)を準備し,グラフの頂点をメッセージと対応させ,メッセージ書き換えをメッセージに対応する頂点間の経路で表す符号化を提案した.提案手法を用いて保存されたデータ列は,ICIに弱いデータ列は含まないためICI耐性がある.また,一回の書き換えで使用するセル数は経路長と等しいため,経路長を短くすることで書き換え可能回数を増やすことができる.そこで,与えられた制約符号のグラフ表現の中で直径(2頂点間の最短経路の最大長)が最小となるグラフを求めた.また,そのグラフをもとに,メッセージ数が与えられたときのグラフ表現の直径の見積もりも行った.平成27年度は.制約符号を表現するラベル付き有向グラフもとにデータ列制約と上書き制約を満たす符号化を提案し,国際・国内学会で発表した.学会発表後にいただいたフィードバックや他の研究者との議論を通して,提案手法の有効性を主張するために必要な比較や,これからの方向性について新たな知見を得られたことは非常に有益であった.また,制約符号に関する入門講義を担当できたのは大きな収穫であった.基礎的部分を中心に行った講義だったが,皆興味深く聴講していただき,制約符号をフラッシュメモリへの応用する研究の有効性を発信することにも尽力できた.フラッシュメモリは,メッセージをデータ列d=d_1d_2...d_Nとして表現した際に,i番目のセルに電荷量がd_iになるまでを電荷を注入することでメッセージを保存し,各セルの電荷量を量子化することでメッセージの読み出しを行う.フラッシュメモリのセルの電荷量を増やすことはセル単位で行えるが,電荷量を減らすことはコストがかかり且つ寿命を縮めることになるため,電荷量を下げないようにメッセージを保存することが必要である(時系列制約).また,セルに蓄えられた電荷同士が干渉しあうことで,データ読み出しの際に誤りが生じる誤り(セル間干渉)を防ぐことも求められる.この2つの問題を同時に満たす符号化方式を提案することで,長寿命で高い信頼性のフラッシュメモリ作成に貢献することを目標としている.平成27年度は,セル間干渉を受けやすいデータ列を排除するために,そのようなデータ列が軌跡中に現れないラベル付き有向グラフを用いてデータの書き換えを行う符号化方式を提案した.だが,その符号化方式では,書き換えに利用するセル数は削減できるものの,一度使用したセルは再利用できない問題点があった.そこで平成28年度は,フラッシュメモリにおけるデータ列制約と時系列制約を同時に考える手段として,二次元制約を満たすパターン(許可パターン)を全て表すことができるグラフ表現を提案した.各頂点から縦・横方向の辺を規則にのっとりあてがったグラフは,経路に沿ってラベルを割り振っていくことで許可パターンをすべて列挙することができる.

これまで二次元(一般に多次元)のグラフ表現に関する試みはあるものの,有限個の頂点を用いた厳密なグラフ表現はこれまで発表されていない.今回提案したグラフは,頂点数が有限な厳密なグラフ表現であるため,このグラフ表現を用いて,時系列制約とデータ列制約を満たす効率良い符号化方式提案への新たな道が見出せた.フラッシュメモリにおける時系列制約とデータ列制約を同時に満たすには,二次元で制約を考える必要がある.これまで難しいとされていた二次元(一般に多次元)の問題にアプローチする際に,一次元制約の解析の核となるグラフ表現を二次元の場合にも考えられないかと考え,その問題に真摯に取り組んだ.結果として,(ある特定の場合に限られるものの)厳密なグラフ表現を提案し国際学会で発表することができたので,当初の目標は達成できた.また今回の結果は,フラッシュメモリの制約だけでなく,多次元制約が必要な分野にも応用可能であるため,社会への貢献度も高いと考える.総合的にみて,本研究の目的に向かい着実に成果を上げてきている.また,その成果を世界にきちんと発表していることから,順調に進展していると判断した.29年度はフラッシュメモリに適した符号化として,まずバランス制約(データ中の0と1の数が等しい制約)を課した符号に着目した.具体的には,バランス制約とデータのラン長制約を兼ね備えた符号の最大符号化率を,組み合わせ論の観点から考察した.その結果,ラン長制約にバランス制約を加えたとしても,ラン長制約のみの場合と比較して最大符号化率に変わりがないことを証明した.制約を兼ね備えた場合の最大符号化率は,一般的にその制約を表現するグラフの隣接行列の最大固有値から求められるが,バランス制約の場合には表現するグラフがないため上記の方法が使えない.しかし今回の結果から,グラフ表現があるラン長制約を用いて,バランス制約を兼ね備えた場合も容易に最大符号化率が求められることがわかる.この結果は情報理論のトップコンファレンスであるIEEE International Symposium on Information Theoryにおいて発表した.現在は,その結果をさらに拡張して論文にまとめる作業を進めている.また,フラッシュメモリの各セルに保存されているデータから次に保存できるデータも制約されるため,セルの時系列制約は異なる.この点に着目し,周期的な制約を兼ね備えたPeriodic-Finite-Type Shift(PFT)を用いて,フラッシュメモリに一般的なデータ列制約と時系列制約が与えられた場合の符号化率について基礎的な解析も行った.この結果は,ドイツとアメリカで行われた国際ワークショップで発表した.ISITで発表したバランス制約とラン長制約を兼ね備えた場合の明確な最大符号化率は,シンプルな数え上げ法を元にしているが,非常に綺麗な形にまとまった.またPeriodic-Finite-Type Shiftについても新たな観点からのアプローチとして提案できた.特にPFTについては博士課程時代に知識を得ていたため,その応用としてフラッシュメモリが考えられたのは,さらなる研究視野の拡大につながった.
排卵と活性酸素・・・生殖器における活性酸素関連遺伝子, 排卵酵素遺伝子の制御・・・

排卵現象における活性酸素の役割を検討する目的で、活性酸素関連酵素を中心に、いわゆる排卵酵素やその他排卵現象に関与する様々な分子の遺伝子発現を検索するための実験(in situハイブリダイゼーション法、ISH法)を行った。ISH法に必要な合成オリゴヌクレオチドプローブを作製するにあたり、放射性(^<35>S)、非放射性(ジゴキシゲニン)のマーカー分子を多標識するプローブ合成法を初年度から次年度にかけて確立した。すなわち、論文に報告されたcDNAから、93-merのセンスおよびアンチセンスの配列を選び、その両端に5′リン酸化したEcoRI/HindIIIのcohesive ends(付着末端)をもたせた合計99-mer長の合成DNAの凍結乾燥品(5′-AATTC----------------A-3′と3′-G----------------TTCGA-5)を得て、これをもとにセンスまたはアンチセンスプローブの合成用鋳型DNAを作成する方法である。この方法により、多くの標識が挿入され、高感度での検出が可能となった。マンガンタイプのsuperoxide dismutase(Mn-SOD)が排卵過程で卵巣のみならず、子宮・膣にも発現されることは既に報告した。特に卵巣における発現は、ホルモンに誘発されたステロイド(プロゲステロン)合成に関与している可能性があり、活性酸素や過酸化水素が細胞内代謝に関与することを示した。同じ活性酸素関連酵素の1種であるphospholipid hydorperoxideGlutathione Peroxidase(PHGPx)を上述の方法で作製し、生殖器における発現を観察した。卵巣における発現はほとんど観察されなかったが、精細管内で、ステップ7-13の精子細胞を中心に強い発現が観察され、精巣においても過酸化水素など活性酸素分子種が、精子形成に伴う細胞内代謝そのものに深く関与していることが明らかとなった。排卵現象における活性酸素の役割を検討する目的で、活性酸素関連遺伝子を中心に、いわゆる排卵酵素遺伝子や排卵現象に関与する様々な分子の遺伝子発現について、in situハイブリダイゼーション法を試みた。動物については、正常ラットおよびマウスのほか、アカタラセミアマウス、ヒポカタラセミアマウスなど、カタラーゼを欠損し、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)によって活性酸素からつくられる過酸化水素を処理できない遺伝子欠損のマウスを準備し、排卵誘発実験後、ビタミンE欠乏食実験後や発情周期各相に、卵巣を採取した。プローブについては、pGEM4Zベクターに組み込まれたcDNAよりジゴキシゲニン-UTP又は^<35>S-UTPを組み込んだSenseおよびAntisenseのプローブを作成したが、排卵酵素のcDNAは入手困難であったため、合成プローブの新しい作成法を試みた。この方法は、論文から得たセンスおよびアンチセンスの配列の両端にEcoR IおよびHind IIIを認識する配列をもつ、合計99-merの長さの合成DNAを得て、これをもとにセンスまたはアンチセンスプローブの合成用鋳型DNAを作成する方法である。最近ではEcoRI/HindIIIカットされた状態の配列で、5'リン酸化した2本の相補的な配列を持つ合成DNA(5'-AATTC--------------------A-3'と3'-G--------------------TTCGA-5)の凍結乾燥品を得て、同様の方法でプローブを作成している。多くの標識が挿入され、高感度での検出が可能となった。

この方法により、Mn-SOD、コラゲナーゼなど必要なプローブを一部既に合成し、また、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、プラスミノーゲンアクチベータ、カリクレイン等については合成の途中にある。排卵現象における活性酸素の役割を検討する目的で、活性酸素関連酵素を中心に、いわゆる排卵酵素やその他排卵現象に関与する様々な分子の遺伝子発現を検索するための実験(in situハイブリダイゼーション法、ISH法)を行った。まず、ISH法に必要な合成オリゴヌクレオチドプローブを作製するにあたり、放射性(^<35>S)、非放射性(ジゴキシゲニン)のマーカー分子を多標識するプローブ合成法を確立した。すなわち、論文に報告されたcDNAから、93-merのセンスおよびアンチセンスの配列を選び、その両端に5'リン酸化したEcoRI/HindIIIのcohesive ends(付着末端)をもたせた合計99-mer長の合成DNAの凍結乾燥品(5'-AATTC----------------A-3'と3'-G---------------TTCGA-5)を得て、これをもとにセンスまたはアンチセンスプローブの合成用鋳型DNAを作成する方法である。この方法により、多くの標識が挿入され、高感度での検出が可能となった。マンガンタイプのsuperoxide dismutase(Mn-SOD)が排卵過程で卵巣のみならず、子宮・膣にも発現されることは既に報告したが、同じ活性酸素関連酵素の1種であるphospholipid hydorperoxide GPx(PHGPx)を上述の方法で作製し、生殖器における発現を観察した。卵巣における発現はほとんど観察されなかったが、精巣の精細管内で、精子が形成される過程(ステップ7-11の精子細胞を中心に)で強い発現が観察された。現在、classical GPx、カタラーゼなど酵素の他、plasminogen activator inhibitor、interleukin各種のプローブを作製し、生殖器におけるISH法を行っている。
がん早期診断のためのエクソソーム非標識カウンティングデバイス

本研究では、ナノ空間が生み出す回折光を利用したエクソソームの非破壊・非標識カウンティングデバイスの開発を行った。直径100 nm程度のエクソソームを1分子レベルで非標識に検出するために、高さ150 nm・幅150 nmのナノ空間や、直径数10数100nmのナノ構造体を有する微小流路を作製した。その後、それら流路に参照試料として血漿・尿・細胞上清液等の生体サンプル(エクソソーム無し)を、検出試料としての血漿・尿・細胞上清液等の生体サンプル(エクソソーム有り)を導入することにより、参照信号と検出信号を測定し、エクソソームの高感度検出に成功した。平成25年度は、申請者がこれまでに作製したマイクロ流路内にピラー構造体を有するデバイス(Micro Total Analysis Systems 2012, 2012, 1, 1234)を改良することで、血液からのエクソソーム抽出デバイスの開発を行った。研究開発開始以前のマイクロ流路内にピラー構造体を有するデバイスでは、直径50-100 nmのエクソソームと赤血球・白血球・血小板(大きさ約2-14 um)を分離することはできなかったが、本年度では、DNA分離用に開発したナノピラー構造体(ACS Nano, 2011, 5, 7775)やナノワイヤ構造体(ACS Nano, 2013, 7, 3029)の知見より、新規ナノデバイスを開発し、エクソソーム分離を行った。新規ナノデバイスの開発においては、エクソソームと血球細胞のサイズに応じた分離に影響を及ぼすピラー直径、ピラー間隔、ピラーの幾何学的配置について検討を行った。本デバイスにおいて一定量のエクソソーム回収を達成することに成功したが、エクソソーム回収率のさらなる向上を行うために、マイクロ流路内に直径100 nm・高さ2 umのナノワイヤ構造体を組み込んだ新規ナノワイヤデバイスの開発を行った。ナノワイヤデバイスは、マイクロ流路内に10億本程度のナノワイヤ構造体を有しており、エクソソームを静電相互作用やナノワイヤ間のナノ空間にて捕捉することが可能である。そして、本ナノワイヤデバイスを用いることで、従来法と比べ、血液中エクソソームの高効率な回収を達成した。本研究課題では、ナノ空間が生み出す回折光を利用したエクソソームの非破壊・非標識カウンティングデバイスの開発を行った。申請者は、ナノ空間が生み出す回折光を利用した非標識検出法を開発し、200 nmのナノ空間を用いて1分子DNAを非標識検出することに成功した。さらに、本非標識検出法はナノ流路に導入された物質の屈折率変化に応じた非標識検出を行っていることを実証し、世界で初めてDNA増幅過程を非標識で検出することに成功した。また、直径100 nm程度の粒子を1分子レベルで非標識に検出するために、粒子を導入した際の内部の屈折率変化が大きくなるように高さ150 nm、幅150 nmのナノ空間や、直径数10数100nmのナノ構造体を有する微小流路を作製した。それら流路に参照試料として血漿や尿等の生体サンプル(エクソソーム無し)を、検出試料としての血漿や尿等の生体サンプル(エクソソーム有り)を導入することにより、参照信号と検出信号を測定し、エクソソームの高感度検出に成功した。また、屈折率変化による回折光の変化に基づいた非標識検出法だけでなく、電流値の変化による非標識検出法の開発にも取り組んだ。次に、正常細胞とがん細胞のエクソソームを非破壊・非標識でカウンティングし、信号強度の分布の変化により、正常細胞とがん細胞の違いを認識することに成功した。また、エクソソームの高感度非標識検出を達成した後、エクソソームに内包されるmiRNA量の増減を検出し、miRNAの発現量の差による信号強度の差をデータ処理することで信号強度に応じた分布図の作成を行った。本研究成果は、がん診断応用やがん発症機構解明・iPS細胞のがん化検出等に応用可能であると考えられる。ナノバイオテクノロジー平成25年度は、申請者がこれまでに作製したマイクロ流路内にピラー構造体を有するデバイス(Micro Total Analysis Systems 2012, 2012, 1, 1234)にDNA分離用に開発したナノピラー構造体(ACS Nano, 2011, 5, 7775)やナノワイヤ構造体(ACS Nano, 2013, 7, 3029)の知見を加えることで、直径50-100 nmのエクソソームと赤血球・白血球・血小板(大きさ約2-14 um)を分離することに成功した。

さらに、エクソソーム回収率のさらなる向上のため、マイクロ流路内に直径100 nm・高さ2 umのナノワイヤ構造体を組み込んだ新規ナノワイヤデバイスを開発することに成功した。本ナノワイヤデバイスは、マイクロ流路内に10億本程度のナノワイヤ構造体を有しており、エクソソームを静電相互作用やナノワイヤ間のナノ空間にて捕捉することが可能であり、従来法と比べ、血液中エクソソームの高効率な回収を達成した。本ナノワイヤデバイスは血液のみならず、1 mLのエクソソーム含有液(尿・唾液・細胞上清液等)をナノワイヤ構造体に送液するだけでエクソソームを高効率に分離を行うことが可能であることも見出した。特に、尿中エクソソーム由来miRNAの解析による効果的な未知のバイオマーカー探索や低侵襲診断を行うためには、少ない溶液量から得られる情報量の多さが重要であるが、既存の手法ではエクソソーム分離及びmiRNA抽出に数Lの尿が必要であったのに対し、本デバイスでは1 mLの尿からエクソソームを高効率に分離・エクソソーム由来miRNAの高効率抽出に成功し、本デバイスの有用性を示すことができた。平成26年度はナノ空間が生み出す回折光を利用したエクソソームの非破壊・非標識カウンティングデバイスの開発を行う。申請者は、これまでにナノ空間が生み出す回折光を利用した非標識検出法を開発し、200 nmのナノ空間を用いてわずか14分子程度のDNAを非標識検出することに成功している(Anal. Chem., 2011, 83, 635(IF=6))。さらに、本非標識検出法はナノ流路に導入された物質の屈折率変化に応じた非標識検出を行っていることを実証し(Micro Total Analysis Systems 2011, 2011, 1, 647)、世界で初めてDNAの増幅過程を非標識で検出することに成功した(Micro Total Analysis Systems 2012, 2012, 1, 25)。直径100 nm程度の粒子を1分子レベルで非標識に検出するためには、粒子を導入した際の内部の屈折率変化が大きくなるように高さ150 nm、幅150 nmのナノ空間を設計・試作する予定である。エクソソーム内包miRNA量の増減の検出のための十分な感度が得られない場合は、参照流路と検出流路のナノ流路を2本作製する。それぞれの流路に参照試料としての血漿サンプル(エクソソーム無し)を、検出試料としての血漿サンプル(エクソソーム有り)を導入することにより、参照信号と検出信号を同時に測定し、微弱信号の高感度検出が可能であるかどうかを検証する。エクソソームの高感度非標識検出後は、エクソソームに内包されるmiRNA量の増減を非標識検出し、miRNAの発現量の差による信号強度の差をデータ処理することで信号強度に応じた分布図の作成を行う。この際、内包miRNAの発現量の差による信号強度の差に有意差が見られない場合は、内部のmiRNAと相互作用する物質を導入することにより信号強度の増強を行う予定である。最終的には、正常細胞とがん細胞のエクソソーム内包miRNAを非破壊・非標識でカウンティングし、信号強度の分布の変化により、がん診断応用やがん発症機構解明・iPS細胞のがん化検出を検証する予定である。当初の計画以上に研究が進展したため、当該助成金が生じた。本来であれば、デバイスは試行錯誤により作製する予定であり当初に計画した費用が必要であったが、当初の計画以上に研究が進展したため、試行錯誤の回数を少なくすることができ、チップ作製に伴う消耗品類(チップ基板、薬品等)に必要とする費用を計画よりも抑えることができた。そのことによる当該助成金が生じた。
局所mRNAメチル化修飾による神経細胞遺伝情報「地方分権型」制御メカニズムの解明

本プロジェクトの実施に初年度は健康なマウス成体脳のシナプスにおけるm6A-seqを行い、シナプスに局在するm6A修飾の全貌を明らかにするとともに特徴を捉えることを目標とした。その目標が達成され、シナプスに存在するm6A-RNAをおよそ3千種類およびメチル化サイトを5千箇所弱を同定した。メチル化される遺伝子群の機能的特徴としては、シナプス形成、形態、構造、およびコミュニケーションに大きく寄与する遺伝子がエンリッチされ、メチル化されたものとそうではないものの間に機能的な分業機構の存在が明らかになった。この分業システムは新規なRNA制御システムであり、本研究で初めて明らかになった。さらに、マウス海馬由来の神経培養系を用いて、メチル化酵素や、メチル化RNAターゲットを認識するタンパク質のノックダウンを行い、mRNA化学修飾経路の機能を調べた。その結果、メチル化酵素METTL3は神経細胞の生存に必須であることや、リーダータンパクが興奮性シナプスが座するスパインの形態や機能に必要とされることが明らかになった。さらに、メチル化されるmRNAのうち、Apc遺伝子に注目し、m6A修飾を認識するリーダータンパクの発現低下がAPCタンパク質の発現低下につながる結果が得られた。以上の研究結果から、神経シナプスには多くのmRNAはメチル化修飾を受け、その修飾は機能的である結論が得られた。Apc遺伝子は神経突起形成やシナプス機能に重要であることが先行研究で示され、m6A修飾はターゲット遺伝子の翻訳制御を通して、神経発達に役割を果たすことが示唆された。本研究はカリフォルニア大学ロサンゼルス校および京都大学理学部と医学支援センターとの共同研究で実施された。初年度の目標は達成できた。計画通りの内容に分野で新しく開発された研究手法を取り入れる。
中学校社会科歴史的分野における地域学習モデル構築に関する研究

中学校歴史的分野において現行の教育課程において新たに導入された「学び方を学ぶ」学習において、歴史的分野の前期および後期において、どのような学習モデルが有効かについて臨床的な研究を行い次のような結論を得た。(ここでいう前期とは、原始から中世までをいい、後期とは近世以降をいう。)(1)前期段階においては、生徒の生活する市町村において、実際に確かめることのできる歴史的な事象を扱うことが歴史認識の形成においては重要となる。それは、生徒が現在生活している時間との連続性において、過去の歴史も存在するのだということを知ることによって、歴史認識の形成のための時間の「ものさし」を形成するという意味合いからである。(2)後期段階においては、既に時間のものさしが形成されている生徒が、そのものさしを使うことで、客観的な歴史というものは存在せず、歴史はある視点において形をあらわにするということに気づく必要がある。そのためには、前期段階と同様な地域学習ではなく、県単位の地域において、既習の通史をも相対化するようなダイナミックな歴史的事象を取り扱うことが重要となる。なお、このような知見を得るためには、複数の観察者による授業観察を実施し、同時に、授業におけるワークシート等のデータを収集して、分析を行った。地域学習は、一斉授業ではなく、グループ学習で行われることが多いため、授業分析の手だてとしては、複数による授業観察者が必要なためである。この分析を通して、授業中での発言や、ワークシートによって、生徒がどのように思考し、歴史認識を形成していくかについてある程度正確に知ることができることが明らかになり、複数の観察者による授業観察の重要性が再確認された。このことは今日行われている絶対評価の在り方をよりよくするための具体的方法として、以上の分析が有効であることを示唆するものである。中学校社会科歴史的分野における「学び方を学ぶ」という位置づけがなされている地域学習について、歴史学習および「学び方を学ぶ」学習の初期段階としての中世と、発展段階としての近代の教材開発を行い、授業における検証を行った。中世に関しては、初期段階ということを考慮し、生徒の生活している身近な場所にある地域の歴史を教材とすることとし、栃木県小山市という場所を考慮して、「中世小山氏」の歴史を教材化した。近代については、小山市という場所を考慮しすぎることのないよう、すなわち地域の範囲を栃木県という広い範囲で考え「田中正造の生涯と近代」を教材化した。教材化にあたっては、生徒の実態調査を行い、それを分析して、どのような歴史学習のあり方がのぞましいかについて検討した。その上で授業を構想し、両度か試行して問題をあきらかにし改善した。実際の授業は、全国中学校社会科教育研究会の全国大会において実施した。ここでは、とりわけ「田中正造の生涯と近代」における「さまざまな立場から歴史を考える」について立場が偏る傾向が指摘された。そのため、あたらに教材研究を行う必要から、廃村のため北海道常呂郡佐呂間町に明治44年に入植した農民について、佐呂間町役場、図書館、佐呂間町字栃木の調査を行った。今年度の成果については現在整理を行い、報告書の作成に向けて作業を進めている。

それは、生徒が現在生活している時間との連続性において、過去の歴史も存在するのだということを知ることによって、歴史認識の形成のための時間の「ものさし」を形成するという意味合いからである。(2)後期段階においては、既に時間のものさしが形成されている生徒が、そのものさしを使うことで、客観的な歴史というものは存在せず、歴史はある視点において形をあらわにするということに気づく必要がある。そのためには、前期段階と同様な地域学習ではなく、県単位の地域において、既習の通史をも相対化するようなダイナミックな歴史的事象を取り扱うことが重要となる。なお、このような知見を得るためには、複数の観察者による授業観察を実施し、同時に、授業におけるワークシート等のデータを収集して、分析を行った。地域学習は、一斉授業ではなく、グループ学習で行われることが多いため、授業分析の手だてとしては、複数による授業観察者が必要なためである。この分析を通して、授業中での発言や、ワークシートによって、生徒がどのように思考し、歴史認識を形成していくかについてある程度正確に知ることができることが明らかになり、複数の観察者による授業観察の重要性が再確認された。このことは今日行われている絶対評価の在り方をよりよくするための具体的方法として、以上の分析が有効であることを示唆するものである。
ＴＡＣＲ１遺伝子エピジェネティック修飾解析を用いた麻薬による嘔吐発症機序の解明

ニューロキニン1(NK1)受容体をコードする遺伝子であるTACR1遺伝子の発現調節が術後悪心嘔吐の強度に関与するという仮説を構築した.ヒトとマウスで血液由来、あるいは脳の嘔吐中枢由来のゲノムDNAを用いて、エピジェネティック修飾の1つであるTACR1遺伝子のプロモーター領域のメチル化を調べた。TACR1遺伝子のプロモーター領域のメチル化率が高いほど術後悪心嘔吐が弱いことが明らかになった。この研究結果は手術前のTACR1遺伝子のメチル化率を測定することにより、一般的に個人差の大きい術後の悪心嘔吐の重症度を術前に予測できる可能性がある。申請者らは本研究を通じて、ヒトにおいてTACR1遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化率は術後嘔気嘔吐(PONV)と関連することを発見した。このことはTACR1遺伝子は当初の予想通りPONVに関係しており、その発現はPONVの程度と相関することを示し、平成24年度米国人類遺伝学会に発表した。また本研究の中で、エストロゲン応答配列(ERE)近傍の遺伝子多型がPONVの程度と大きく関与することを発見した。これまでエストロゲンの血中濃度がPONVの程度と関係することはよく知られていることであるが、その機序は不明であった。本研究により女性がなぜPONVの発生頻度が高いのか、またその程度が男性と比較して重度であるのか、その機序の一端が解明できると思われる。さらにマウスによる動物実験を通じて、血中TACR1遺伝子プロモーター領域と相関が認められる一部の脳神経核を発見した。さらにmRNAの発現解析を通じ、遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化率とmRNAの発現量は逆相関が認められた。またパイカ行動(異食行動)によるマウスの嘔吐関連行動もTACR1遺伝子のメチル化状態およびmRNAの発現量がPONVと関与することを示唆した。以上の結果を総合し、TACR1遺伝子の発現状態およびメチル化率と、またエストロゲンによる当該脳神経核における増減をモニタリングする実験系を確立し、その上でエストロゲン存在下で嘔吐が誘発される機序の一端を解明した。今年度はその知見を発表する予定である。申請者らは本研究を通じてヒトにおけるTACR1遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化率は術後悪心嘔吐(PONV)と関連することを発見した。このことはTACR1遺伝子はPONVに関係しており、その発現はPONVの程度と相関することを示している。また本研究を通じ、ヒトにおけるエストロゲン応答配列(ERE)内の一塩基多型(SNP)はPONVの強度を変化させることを発見し、このことはエストロゲンの血中濃度がPONVの発症と関与する分子生物学的機序の一端である可能性が示唆された。この仮説を証明するべく、平成25年度、申請者らはマウスを用いた術後悪心嘔吐モデルを作製し、術後悪心嘔吐モデルマウスにおいてエストロゲンはオピオイドの存在下にPONVの強度を増大させることを行動学的に証明し、その機序としては脳内の嘔吐中枢におけるTACR1遺伝子のmRNAおよび受容体蛋白の発現量が増大していることに起因する可能性を発見した。【目的】われわれはこれまで麻薬(オピオイド)投与後の嘔吐にμレセプタ遺伝子多型のハプロタイプが関連することを見いだした(文科省科学研究費:若手(B)2008-2010;課題番号20791085).さらにわれわれはオピオイド鎮痛時の悪心・嘔吐の発症機序に嘔吐関連遺伝子の後天的な遺伝的変異も関連していると仮説を立てている.本研究は制吐剤の標的の1つであるNK1受容体をコードするTACR1遺伝子のエピジェネティック修飾を調べることにした.【研究計画】全研究期間を通じて予定している具体的研究項目は,(1)TACR1遺伝子のDNAメチル化の解析,(2)TACR1遺伝子のヒストン修飾の解析,(3)TACR1遺伝子のクロマチンリモデリング因子の解析,(4)実際の手術患者での検証,である.【初年度の結果】今年度,われわれは術後患者96人からゲノムDNAを抽出し,TACR1遺伝子のプロモータ領域にあるCpGアイランドのメチル化率をMethylation Specific High Resolution Melting法を用いて検討した.メチル化率が1%以下であった患者は全体の60%であったが,5-20%の患者も存在した.メチル化率が高くなるほど術後の悪心嘔吐の発症率と重症度は減少することが新たに解明された.当初まではTACR1遺伝子の発現を調節する因子であるプロモーター領域にメチル化率と臨床症状との関連を着目していたが、本研究の結果はエストロゲンによりTACR1遺伝子が高度に調節されていることを新たに発見した。