hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトサイトメガロウイルス感染に必須な宿主細胞遺伝子の遺伝子トラップ法による同定

1.スプライシングアクセプターとIRES配列の下流にneo遺伝子を配し、loxPを含み転写開始活性がない3'LTRをもつMLV由来のレトロウイルスベクター産生用のプラスミドを構築した。このプラスミドとVSV-G蛋白をコードするプラスミドをMLVのgag-polを産生するパッケージング細胞にトランスフェクトしてレトロウイルスベクターを得た。得られたベクターの力価をHeLa細胞を用いて測定したところ約10^4/mlであったが、CMV感受性細胞であるテロメラーゼ遺伝子により不死化された繊維芽細胞hTERT-BJ1、神経芽種由来細胞株U373MG、及び網膜上皮由来細胞株ARPEでの力価は約10^3/mlと低かった。作製した約10^4の細胞ライブラリーを限界希釈後、96穴プレートにて培養し、いくつかのレプリカを用意した。各ウェルにCMV感染後、CMV産物によりガンシクロビル(GCV)が活性化され感染細胞は死滅することを利用してGCV存在下で培養し生き残る細胞があるかを検討したが、この方法での選択からは変異細胞を得ることができなかった。そこで、LacZを発現するCMV株を感染させ、Xgalによる染色での選択も検討した。その結果、CMVに対して若干感受性が低下したと思われる細胞株を数株得たが、細胞そのものの増殖性が低下し培養が困難なためその後の解析ができなかった。2.CMV実験室株は繊維芽細胞トロピズムを有するが、内皮細胞トロピズムを失っている。一方、新鮮分離株は内皮細胞トロピズムも有する。この差をもたらす宿主因子を検討するために、テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化させた臍帯血管内皮細胞を樹立し、内皮細胞トロピズムCMVに対する感受性を確認した。また、CMV感染によりISG54K遺伝子の活性化やIL-6の産生誘導が起こること、staurosporinにより誘導したアポトーシスが抑制されることなどを見出した。[目的]胚性幹細胞の分化に必須な遺伝子群の解析を目的とした研究において確立された遺伝子トラップの方法論を取り入れ、サイトメガロウイルス(CMV)感受性の細胞株にレトロウイルスベクターを用いてランダムな変異を導入した細胞ライブラリーを構築し、次にこの変異細胞ライブラリーから、CMVの感染・増殖、特に感染初期過程に欠損を生じた細胞クローンを得て、CMVの感染・増殖に必須な宿主細胞遺伝子群の同定を試みる。[結果]1.スプライシングアクセプターとIRES配列の下流にneo遺伝子を配し、loxPを含み転写開始活性がない3'LTRをもつMLV由来のレトロウイルスベクター産生用のプラスミドを構築した。得られたベクターの力価をHeLa細胞を用いて測定したところ約10^4/mlであった。2.CMV感受性細胞であるテロメラーゼ遺伝子により不死化された繊維芽細胞hTERT-BJ1、神経芽種由来細胞株U373MG、及び網膜上皮由来細胞株ARPEにレトロウイルスベクターを感染させ、G418耐性となる細胞ライブラリーの構築を行った。これらの細胞上での力価は約10^3/mlとHeLaに比して低かったことから、現在上流のプロモーター活性が弱い場合にも細胞が生き残るようにレトロウイルスベクターの改変を行っている。3.細胞ライブラリーを限界希釈後、96穴プレートにて培養し、いくつかのレプリカを用意した。各ウェルにCMV感染後、ガンシクロビル(GCV)存在下で培養し生き残る細胞があるかを検討した。これは、CMVが増殖する細胞ではCMV産物によりGCVが活性化され感染細胞は死滅することを利用してCMV増殖が阻害された可能性がある細胞を検索しようというものであるが、この方法での選択からは変異細胞を得ることができていない。そこで、LacZを発現するCMV株を感染させ、Xgalによる染色での選択も検討している。

一方、新鮮分離株は内皮細胞トロピズムも有する。この差をもたらす宿主因子を検討するために、テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化させた臍帯血管内皮細胞を樹立し、内皮細胞トロピズムCMVに対する感受性を確認した。また、CMV感染によりISG54K遺伝子の活性化やIL-6の産生誘導が起こること、staurosporinにより誘導したアポトーシスが抑制されることなどを見出した。
水素貯蔵合金の表面改質

本研究は、耐不純物ガス機能が期待でき、かつ,水素溶解あるいは透過等のデータが比較的多いパラジウム(以下「Pd」と略記)を表面改質材料として使用し、貯蔵合金には筆者らが従来から水素同位体の吸蔵・脱離速度の測定/評価を行っているZr系の合金を用い,1.無電解Pdめっき法の適用性、2.めっき界面の表面科学的観察、3.めっきPd膜の温度変化、4.水素同位体の吸蔵・脱離速度に及ぼす影響、5.めっきPd膜の耐不純物ガス特性、について調べることを目的とした。その結果、再現性良く貯蔵合金表面を被覆でき、しかも密着性も良好であることから無電解Pdめっき法がZr系貯蔵合金の表面改質方法として適用可能であること、さらに、600°C以上の加熱により厚み6μm以上にわたる試料表面層では、めっきPdと基質元素のZr等が界面を介して相互拡散し、試料表面にはPdによる改質層が形成されていることを明らかにした。また、このPd改質層の水素同位体吸蔵・離脱に及ぼす影響を調べるため、Pd改質前後における重水素(D_2)の吸蔵および離脱速度を測定した結果、吸蔵・脱離機構に変化のないこと、および、吸蔵・離脱の活性化エネルギーもさほど変化しないこと、即ち、改質による影響が小さいことを明らかにした。さらに、耐不純物ガス特性を調べるために炭酸ガス(Co_2)、および、窒素ガス(N_2)の前接触が重水素ガス(D_2)の吸蔵速度に及ぼす影響を調べた結果,Pd改質層による耐不純物ガス性能の向上が認められ本法の有効性が確かめられた。なお、不純物ガスにさらされる操作温度が高温(500°C)になるとPd本来の耐不純物ガス特性のさらなる発現が期待され、この点に関しては今後充分に検討が必要であると考えられる。平成5年度は、水素貯蔵合金(Zr3A12)表面を無電解めっきの手法を用いてパラジウム(Pd)被覆することを試みるとともに以下の成果を得た。1.当初の目標通り、試料(Zr3A12)表面におよそ2μmのPd皮膜を形成する無電解めっき条件を実験的に決定することができた。2.水素貯蔵合金の活性化方法の一つである真空加熱下での表面状態の変化を、X線光電子分光法(XPS)および走査電子顕微鏡(SEM)観察を用いた表面分析により行い、以下の知見を得た。・500°C以上の真空加熱で、界面を介したPdと基盤元素の相互拡散が起こる。・900°Cの真空加熱で、表面のPd皮膜の顕著なシンタリングが起こる。・Pdは常に金属状態で表面に存在する。・Zrは600°C付近から観測されはじめ金属状態であった。・表面の吸着炭素がZrと反応して一部炭化物になる。3.水素同位体(重水素)の吸蔵/脱離の機構を主として圧力測定(圧力計は平成5年度購入備品)により評価した。その結果、Pdめっきの有無に関わらず吸蔵過程は圧力の一次に、他方、脱離過程は試料表面における水素同位体原子の会合反応が律速であることが明らかになった。以上が平成5年度の成果の概略であり、当初の計画に対してほぼ計画通りに研究を進めることが出来た。平成6年度は、これらの知見に基づき水素同位体の吸蔵/脱離における不純物ガスの影響を定量的に評価する計画である。

本研究は、耐不純物ガス機能が期待でき、かつ、水素溶解あるいは透過等のデータが比較的多いパラジウム(以下「Pd」と略記)を表面改質材料として使用し、貯蔵合金には筆者らが従来から水素同位体の吸蔵・離脱速度の測定/評価を行っているZr系の合金を用い、1.無電解Pdめっき法の適用性、2.めっき界面の表面科学的観察、3.めっきPd膜の温度変化、4.水素同位体の吸蔵・離脱速度に及ぼす影響、5.めっきPd膜の耐不純物ガス特性、について調べることを目的とした。その結果、再現性良く貯蔵合金表面を被覆でき、しかも密着性も良好であることから無電解Pdめっき法がZr系貯蔵合金の表面改質方法として適用可能であること、さらに、600°C以上の加熱により厚み6μm以上にわたる試料表面層では、めっきPdと基質元素のZr等が界面を介して相互拡散し、試料表面にはPdによる改質層が形成されていることを明らかにした。また、このPd改質層の水素同位体吸蔵・脱離に及ぼす影響を調べるため、Pd改質前後における重水素(D_2)の吸蔵および脱離速度を測定した結果、吸蔵・脱離機構に変化のないこと、および、吸蔵・脱離の活性化エネルギーもさほど変化しないこと、即ち、改質による影響が小さいことを明らかにした。さらに、耐不純物ガス特性を調べるために炭酸ガス(CO_2)、および、窒素ガス(N_2)の前接触が重水素ガス(D_2)の吸蔵速度に及ぼす影響を調べた結果、Pd改質層による耐不純物ガス性能の向上が認められ本法の有効性が確かめられた。なお、不純物ガスにさらされる操作温度が高温(500°C)になるとPd本来の耐不純物ガス特性のさらなる発現が期待され、この点に関しては今後充分に検討が必要であると考えられる。
レーザー加温がラット前立腺α_1-receptorの局在におよぼす影響

最近、前立腺肥大症に対するレーザー療法が登場し、臨床治療で効果をあげている。実際の臨床において、我々は、前立腺肥大症21例に対してレーザー治療を行った。レーザーの総照射量は17,80070,035J、平均39,772Jであった。治療結果は治療前、治療3ヵ月後、治療6ヵ月後、治療1年後の値をそれぞれ示すが、自覚症状スコア:18.9,7.0,6.8,7.9、最大尿流量率(ml/sec):8.5,11.6,12.4,12.2、残尿量(ml):83.8,38.3,39.9,46.1、前立腺重量(g):37.7,29.2,26.7,23.8と自覚症状は改善し、他覚所見も著しい改善を認めた。今回の実験の目的は、前立腺肥大症に対するレーザー療法の作用機序を解明することにあり、そのためレーザー加温による前立腺のα_1-receptorの変化をRadioreceptor assay法を用いて検討した。【結果】1、加温によりラット前立腺α_1-receptorの密度の減少を認めた。Bmaxの平均値はコントロール群で27.07(fmol/mg protein)加温治療群では17.91(fmol/mg protein)と加温によりBmaxの値は有意に低下した。一方、Kd(receptorの性質)は、有意の変化は認めず、平均値はコントロール群、0.1032(nM)、加温治療群0.0988(nM)であった。2、ラット前立腺の病理組織像の変化が強いものほど、receptorの密度の減少(Bmax値の低下)を認めた。3、α_1-receptorの局在分析(in vitroオートラジオグラフィー)を行ったがレーザー加温におけるラット前立腺α_1-receptorの局在の変化を証明することはできなかった。今後、前立腺レーザー治療の効果の長期経過観察を行い、α_1-receptorの長期の変化を観察する予定である。
卵巣内における卵胞発育動態のライブイメージング解析

周期的におこる排卵活動を維持するために、卵巣内で起こる卵胞発育制御メカニズムを明らかにするための実験系を構築した。卵母細胞と細胞核を可視化できる遺伝子改変マウスの卵巣組織を培養し、タイムラプス撮影する事によって卵巣内における卵胞発育過程をリアルタイムに観察する事ができる実験系を構築することができた。今後、この実験系を用いて卵巣組織内における卵胞発育制御メカニズムを明らかにしていく。マウス卵巣内における卵胞発育動態をライブイメージング解析するために、原始卵胞の段階から卵母細胞特異的に発現するoog1遺伝子のプロモーターにAcGFP遺伝子を結合した遺伝子をもつ遺伝子改変マウスと、ヒストンタンパク質histone2BにmCherryを結合した遺伝子をもつ遺伝子改変マウスを導入し、繁殖を開始した。2系統のマウスをかけ合わせる事によって卵母細胞や顆粒層細胞等の動態がリアルタイムに観察できるため、卵胞の発育過程を連続的に観察することができる。両遺伝子をもつマウスの卵巣を用いてタイムラプス撮影の条件検討を行い、組織にダメージを与えずに卵胞発育過程がトレースできる条件を確定した。培養卵巣組織のタイムラプス撮影によって得られたデータがin vivoでも見られるものかを検証するため、生後1日目から12ヶ月齢までのICRマウス卵巣を経時的にサンプリングし、H.E.染色後、組織切片の3次元構築を行い、解析を行った。この解析によって卵巣内における卵胞の経時的な変化を位置情報を紐付けして観察、解析することができる。現在解析中であるが、生後1日目から4週齢までの卵胞発育動態に関しては、両者で相関関係があることが確認できた。連続的なデータを卵巣組織培養、ライブイメージング解析で取得し、生体内の卵胞発育動態は経時的にサンプリングした卵巣組織切片の3次元構築画像からデータを取得することによって、卵巣内での卵胞発育動態を解析するための実験系が構築できた。この手法は卵巣組織内の動態をリアルタイムで解析できる新しい実験方法であり、今後の実験によって新しい知見が多く得られることが期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。生殖生理27年度が最終年度であるため、記入しない。
初期胚の割球分離による1卵性8つ子生産の効率化に関する研究

一卵性多子生産は一つの受精卵から数多くの同一遺伝子構成の個体を複製するという点で、胚の効率生産のみならず、遺伝的検定材料としての利用面に貢献できるものと思われる。しかし胚発生の過程において細胞は増殖と分化を繰り返して個体に発生する。胚の単離割球が個体に分化発生するためには全能性(個体への発生能力)を保持しているか、人為的に賦与させる必要がある。マウス胚では2細胞期の胚ゲノムの活性化が起こり、4細胞期胚の個々の単離割球全てには個体への発生能力がみられていない。しかし羊では8細胞期胚の単一割球の発生能力が報告されている。本研究ではウシとヤギ胚の初期胚の単離割球の発生能を調べると共に、それらの1卵性多子生産を試みた。胎児部と胎盤部に発生する部分に分化した胚盤胞期胚を均等に2分離して1卵性双生児は容易に作出された。金属刃での顕微操作で90%以上の確立で分離され、ウシでは60%以上の受胎率と20対以上の産子が得られた。8細胞期由来2割球(2/8)からはヤギではウサギ卵管中で37%の胚盤胞が得られ、4個の移植から1頭の産子が得られた。ウシでは同様にして20%の胚盤胞が得られた。他にウシでは初期分割期胚の回収が困難なため体外受精由来胚が実験に供され、1/8割球と2/8割球の胚盤胞への発生能はウサギ卵管中で20%であった。ヤギやウシでの1/8と2/8細胞の胚盤胞への発生能が認められたので、2/8細胞に1/21/4細胞又は1/8細胞を集合させて2/8細胞の胚盤胞期以後の発生能を改善しようとした。さらに1/8細胞に未受精除核卵母細胞を電気融合させて、受精卵を再構成させた。ヤギ及びウシとも体内受精発育卵及び体外受精発育卵を材料として、8細胞からの割球の単離、融合用の除核卵母細胞の調整、及びそれらの電気融合、再構成胚の胚盤胞期への発生能の検定など一連の基礎技術が開発され、ヤギ・ウシ胚とも胚盤胞が得られているので今後の一卵性8つ子の生産が期待させる。ウシとヤギの胚盤胞分断による双子生産の成功率を高めるために、研究者らが開発した金属刃を使って、初期及び後期の胚のステージごとの分断成功例を比較した。胚を微少ピペットで吸引保定することなしに、透明帯の上から直接金属刃で圧迫して、内部細胞塊を2等分するように押し分けた後、引き裂くように細胞質を分断するため、透明帯が脆弱で拡張した後期胚盤胞の方が透明帯からの胚細胞質の破裂崩壊なしに効率よく胚を分断することができた。首尾よく胚細胞質の損傷なしに分断されたヤギとウシの2分離胚の内の90%は体外培養の30分後に胞胚腔の再拡張による回復が観察された。ヤギ胚の一例では別の透明帯に再封入した2分割胚の3対を1対ずつ移植して2対1片方計5匹の子山羊の得られた好例もある。

ウシ胚では分割した57対の内、13対を13頭に移植して、6頭(46%)が妊娠継続中で、他の対は寒天包埋して凍結保存している。8細胞期の山羊胚を過剰排卵処置後の外科的手術法で回収し、1つの8細胞期卵子を2割球ずつ分離した4組の割球群の発生能を調べ、一卵性4つ子の作出の可能性を試みた。この4組の割球群を寒天包埋して家兎卵管内で4日間培養した後に胚盤胞期胚を回収した。15個の8細胞期胚から54個の2/8割球胚を移植して、18個(37%)の胚盤胞が得られた。その内、5例8個の移植によって、1子のみを生産し、他にも妊娠継続中のものがある。このように、ヤギの2/8割球由来胚盤胞は満期まで発育することが確認された。しかし各分割球の4組全てが発育する例が少ないことや、1/8分割球の発育性の検討が問題として残された。牛受精卵子の割球分離法や分離割球の発育性に関する研究は、体外成熟卵子の体外受精卵子の家兎卵管内での胚盤胞への発育が低率ながらも観察されたことから、今後体外受精由来の8細胞期卵子を使った単離割球の発育性の検討が計画されている。1.単離割球の発育性:牛の28細胞期の初期胚は卵管に存在することから生体潅流すら得ることは困難とされるため,体外受精由来の卵子が実験に供された.牛体外受精48時間後の2細胞期胚の割球分離によって得られた対に単離割球が家兎卵管へ移植された.低率ではあるが胚盤胞が回収され,それらを受卵牛へ移植して産子への発育を観察中である.1例ではあるが生体卵管潅流によって6個の8細胞期胚を回収し,2/8割球ずつ4つに分割した6セットの初期発育を家兎卵管培養で調べた.回収した一部の胚盤胞期胚を移植された受卵牛は妊娠に至らなかった.今後は体外受精由来の48細胞期胚を使った1/41/8単離割球を発育性を調べる予定である.山羊胚の単離割球は48細胞期胚由来の1/42/8割球すら成る4個1セットの再構成胚の家兎卵管での発育率が調べられ,37%の胚盤胞が回収された.発育率を向上させるために余分の割球を補足させて細胞数を増やすか,割球を融合させて細胞質量を増やす実験を進めている.次の段階として,1卵性8子生産のため, 1/8割球由来の8個1セットの再構成卵の発育性を調べる予定である.2.培養細胞との共培養系の確立:単離割球の発育能を調べるために,現在では細胞培養との共培養法が最も早道と考えられている.ラット肝細胞由来の継代培養細胞系は,マウス2細胞期胚および牛体外受精由来24細胞期胚の発育を支持しなかった.牛卵管上皮の継代培養系を確立し,同様の共培養を行なったが胚への発育効果は認められなかった.しかし桑実期胚から孵化胚盤期即ち着床前期胚の発育効果は著しかった.卵丘細胞は静置培養によって黄体化し,本来の卵丘細胞の機能は果さなくなり,しかも継代培養は困難であった.この初代細胞は牛体外受精由来2細胞期胚を胚盤胞期まで発育させることが示された.この培養系の温度が気相条件などの改善とともに,得られた発生胚の産子への発育性を調べている.初期胚の単離割球を利用した一卵性多子生産の作出に関する研究は、胚の単離操作、単離割球の体外培養法、単離割球の全能性が問題となる。胚の単離操作は前年度までにほぼ確立されたので、本年度は単離割球の再構成法と体外培養法、単離割球の全能性が問題となる。胚の単離操作は前年度までにほぼ確立されたので、本年度は単離割球の再構成法と体外培養や器官培養による発生能が検定された。体内発生されたヤギとウシの、及び体外受精発生させたウシの8細胞期胚が用いられた。8細胞胚由来の単離割球を2個合わせた2/8再構成胚の発生能が調べられた。ヤギでは37%の胚盤胞へ発育を示したが、ウシでは20%を越えなかった。ウシ体外受精胚由来の2細胞期胚と8細胞期胚の単一割球のウサギ卵管での発生能が調べられたが、いずれの区も20%が胚盤胞期胚に発育した。これらの結果はウシの初期分割胚の実験発生学において、体外受精胚が材料として利用できることが示されれた。
細胞内輸送工学に基づく異種分泌タンパク質の安定化と効率的分泌生産

微生物を用いたタンパク質の分泌生産は培養・精製コストの面から最も有望なタンパク質生産システムである。真核細胞の分泌タンパク質は巧みな品質管理を受け、正しい立体構造をもつ分子のみが分泌される。正しい立体構造が得られなかったタンパク質は、分泌過程の様々な場所で分解される。この品質管理機構は、細胞の恒常性維持には必要な機構であるが、工学的には異種タンパク質の分泌生産量の低下をもたらすことが考えられる。分泌過程における第一の分解コンパートメントは小胞体であり、液胞がそのバックアップ機能を果たしていると考えられている。本年度は出芽酵母を用い、異常分泌タンパク質の小胞体での分解(小胞体関連分解;ERAD)の回避メカニズムとそれに続く液胞での選択的分解機構の解析を行った。変異型カルボキシペプチダーゼY(CPY*)はフォールディングに欠損があり、小胞体で分解される。この変異タンパク質に出芽酵母の正常分泌タンパク質であるインベルターゼを融合したCPY*-インベルターゼ(CPY*-Inv)を発現させその分解機序を解析した。CPY*がERADに依存して分解されるのに対し、CPY*-Invは小胞体で分解されず、その分解は液胞機能に依存していた。また、CPY*-Invがゴルジ体特異的な糖鎖修飾を受けていたことから、CPY*-Invは小胞体からゴルジ体を経て液胞に輸送され分解されたことが示された。今後は、CPY*-InvがERADを回避するメカニズムの詳細な解析が課題となる。CPY*-Invは分泌されることなく液胞へ選別輸送され分解された。そこで、CPY*-Invの液胞への選別機構について解析した。CPY*-Invは野生型CPYと同様に液胞タンパク質の選別レセプターであるVps10により液胞へ選別されていたが、競合実験や点変異解析の結果、CPY*-Invの認識機構はCPYのそれとは異なることが明らかとなった。今後は、Vps10におけるCPYおよびCPY*-Inv認識ドメインの同定を行うことが課題となる。本研究により、異常分泌タンパク質として認識されるタンパク質を分泌生産させる基本技術が確立された。正しい立体構造が得られなかったタンパク質は、分泌過程(主に小胞体)において分解される。この問題を回避するために、計画に従い研究を進めた。そこで、CPY*の小胞体への蓄積を回避するマルチコピーサプレッサーの取得を試みた。Unfoldedprotein responseが誘導されない出芽酵母株におけるCPY*の過剰発現は致死である。この致死性を抑制するマルチコピーサプレッサーのスクリーニングを行った。出芽酵母ゲノムDNAを含むマルチコピープラスミド・ライブラリを導入し、候補クローンを約20クローン得た。しかし、得られたクローンはすべてCPY*を過剰発現するために用いたGALプロモータを含む配列であった。つまり、GALプロモータのコピー数が増加する事によるGAL転写制御因子のタイトレーションアウトが起こり、CPY*の発現量が低下し、致死性を抑制したと考えられた。そこで、CPY*のカルボキシ末端にインベルターゼを融合したタンパク質を発現させ、CPY*の小胞体での分解を回避し、ゴルジ体まで輸送される変異株を取得する事とした。CPY*-インベルターゼ融合タンパク質は野生株では小胞体で分解されるが、ある変異により小胞体を経てトランスゴルジまで到達すればインベルターゼが細胞外に分泌されるようにデザインされている。現在、分泌されたインベルターゼ活性を指標として、変異株のスクリーニングを行っている。

そこで、CPY*-Invの液胞への選別機構について解析した。CPY*-Invは野生型CPYと同様に液胞タンパク質の選別レセプターであるVps10により液胞へ選別されていたが、競合実験や点変異解析の結果、CPY*-Invの認識機構はCPYのそれとは異なることが明らかとなった。今後は、Vps10におけるCPYおよびCPY*-Inv認識ドメインの同定を行うことが課題となる。本研究により、異常分泌タンパク質として認識されるタンパク質を分泌生産させる基本技術が確立された。
負の剛性を利用したアクティブ除振装置の開発

本課題では,負の剛性を持つ支持機構を利用したアクティブ除振装置の実用化を目指した研究を実施した.(1)負の剛性を持つ支持機構としてゼロパワー磁気浮上機構を利用した装置では,負の剛性の大きさが除振テーブル上の搭載物の重量によって変化するため,直動外乱に対する剛性が低下してしまうという問題がある.この問題の解決方法として非線形補償法を提案し,浮上対象物の1自由度を制御する磁気浮上基礎実験装置において,提案する非線形補償によって負の剛性の大きさが一定に保たれることを実証した.(2)負の剛性を持つ支持機構をリニアアクチュエータを利用して実現することを提案し,そのための制御方法を明らかにした.さらに,空気圧アクチュエータを利用して除振テーブルの垂直方向の3自由度の運動をアクティブに制御する除振装置を試作し,性能の評価を行った.(3)ゼロパワー磁気浮上機構を利用した除振装置のもう一つの問題は,従来の構造では永久磁石の吸引力によって除振テーブルの全重量を支えなければないので,実用的には除振テーブルの大面積化が難しいことである.この問題を解決する方法として,荷重支持機構を導入することを提案した.支持機構によって,除振テーブルに作用する重力より大きな上向きの力を発生するようにすれば,ベース一正のばね-中間台-ハイブリッド磁石-除振テーブルと単純に下から積み上げていく構成が可能となることを示した.(4)荷重支持機構を備えた6自由度アクティブ除振装置の試作を行なった.垂直方向の3自由度の運動に対して,4つのハイブリッド磁石によるモード制御を適用することによって,直動外乱に対する高剛性を実現できることを実験的に確認した.さらに,非線形補償を導入することによって,除振テーブルに大きな直動外乱が作用しても,高い剛性が維持されることを実証した.本課題では,負の剛性を持つ支持機構を利用したアクティブ除振装置の実用化を目指した研究を実施した.(1)負の剛性を持つ支持機構としてゼロパワー磁気浮上機構を利用した装置では,負の剛性の大きさが除振テーブル上の搭載物の重量によって変化するため,直動外乱に対する剛性が低下してしまうという問題がある.この問題の解決方法として非線形補償法を提案し,浮上対象物の1自由度を制御する磁気浮上基礎実験装置において,提案する非線形補償によって負の剛性の大きさが一定に保たれることを実証した.(2)負の剛性を持つ支持機構をリニアアクチュエータを利用して実現することを提案し,そのための制御方法を明らかにした.さらに,空気圧アクチュエータを利用して除振テーブルの垂直方向の3自由度の運動をアクティブに制御する除振装置を試作し,性能の評価を行った.(3)ゼロパワー磁気浮上機構を利用した除振装置のもう一つの問題は,従来の構造では永久磁石の吸引力によって除振テーブルの全重量を支えなければないので,実用的には除振テーブルの大面積化が難しいことである.この問題を解決する方法として,荷重支持機構を導入することを提案した.支持機構によって,除振テーブルに作用する重力より大きな上向きの力を発生するようにすれば,ベース一正のばね-中間台-ハイブリッド磁石-除振テーブルと単純に下から積み上げていく構成が可能となることを示した.(4)荷重支持機構を備えた6自由度アクティブ除振装置の試作を行なった.垂直方向の3自由度の運動に対して,4つのハイブリッド磁石によるモード制御を適用することによって,直動外乱に対する高剛性を実現できることを実験的に確認した.さらに,非線形補償を導入することによって,除振テーブルに大きな直動外乱が作用しても,高い剛性が維持されることを実証した.(1)開発する除振装置の機構設計や制御系の最適化について,提案する方式が最も効果的である鉛直方向の除振に焦点を絞って検討するために,空気圧アクチュエータを利用した3自由度アクティブ除振装置を試作した.試作した装置は,除振テーブル,中間台,中間台から除振テーブルを支持する空気圧アクチュエータ(3個),ベース,ベースから中間台を支持する空気圧アクチュエータ(3個)から構成されている.そして,基本的には,前者の空気圧アクチュエータは負の剛性を持つ支持機構,後者のアクチュエータは正の剛性を持つ支持機構を実現するのに用いた.(2)中間台から除振テーブルを支持する空気アクチュエータを利用して所定の大きさの負の剛性を持つ支持機構を実現した.(3)(2)で設計した制御系を実現し,地動外乱に対する振動絶縁特性や,直動外乱に対する制振性能を評価した.(4)荷重支持機構を備えた基礎的な1自由度除振装置を試作し,荷重支持機構の有効性について,理論・実験の両面から検証した.この研究で扱う方式では,ばね定数の大きさ(絶対値)が等しい正のばねと負のばねとを直列に結合した支持機構に対し,さらに並列にばねを接続しても,全体のばね定数が無限大のままであることを利用する.試作した実験装置では,負の剛性を持った支持機構を実現するのに,ゼロパワー磁気浮上機構を利用した.除振テーブル及び中間台は,鉛直1自由度の並進運動をするように,それぞれベースからエデンばねによって支持した.(5)ゼロパワー制御系を実装した状態で除振テーブルに静的な荷重を加えていき,そのときの除振テーブル,中間台の変位を測定し,直動外乱に対する剛性を実験的に評価した.前年度に実施した荷重支持機構を備えた除振装置の研究結果を踏まえて,荷重支持機構を備えたユニット型アクティブ除振装置の開発を行った.

(1)荷重支持機構を備えたユニット型アクティブ除振装置の設計・製作前年度の研究を踏まえて,荷重支持機構によってアクチュエータにかかる荷重を軽減するという方式を採用したユニット型アクティブ除振装置の設計・試作を行った.荷重支持機構としては,当初は,パッシブな除振装置で最もよく用いられている空気ばねを用いる予定であったが,非線形性が強く,制御性が良くないので,最終的にはコイルばねを用いた.また,負の剛性を実現するには,コスト面からゼロパワー磁気浮上機構を利用した.従来,ゼロパワー磁気浮上機構を利用すると,除振テーブルの吸引力が作用する部分を中間台の下側に設ける必要があるので,除振装置の構造が複雑になり,装置の設計の自由度を狭めてしまうという問題があった.これに対し,本年度の研究では,荷重支持機構によって除振テーブルに作用する重力より大きな上向きの力を発生させることによって,除振テーブルの磁石の吸引力が作用する部分を中間台の下側に設ける必要をなくし,装置全体の構造を単純化することに成功した.(2)除振制御系の設計と実装試作したユニット型除振装置の制御系の設計・実装を行った.(3)除振性能の評価と最適化ゼロパワー制御系を実装した状態で除振テーブルに静的な荷重を加えていき,そのときの除振テーブル,中間台の変位を測定し,直動外乱に対する剛性を実験的に評価した.前年度に開発した荷重支持機構を備えた除振ユニットを利用して,ユニット型多自由度アクティブ除振装置の開発を行った.(1)ユニット型3自由度アクティブ除振装置の実現前年度開発した除振ユニットを3台用いて3自由度アクティブ除振装置を実現した.開発した除振ユニットでは,荷重支持機構によって除振テーブルに作用する重力より大きな上向きの力を発生させることによって,除振テーブルの磁石の吸引力が作用する部分を中間台の下側に設ける必要をなくしているので,装置全体の構造が単純になっている.本研究では,このユニットを3台用いて,除振テーブルの垂直方向の3自由度をアクティブに制御する除振装置を実現した.(2)除振制御系の設計と実装実現した3自由度アクティブ除振装置の制御系の設計・実装を行った.(3)除振性能の評価除振ユニットのいろいろなパラメータをいろいろと変化させながら,(2)で設計した制御系を実現し,地動外乱に対する振動絶縁特性や,直動外乱に対する制振性能を評価した.(4)ユニット型6自由度アクティブ除振装置の実現前年度開発した除振ユニットを6台用いて,6自由度アクティブ除振装置の実現を試みた.具体的には,このユニットをパラメータメカニズムの出力リングとして用いることによって,除振テーブルの6自由度をアクティブに制御する除振装置を実現する.パラレルメカニズムは,アミューズメント機器,工作機械などに利用され,高剛性,高精度,応答性が良いという特徴を有しているが,動作範囲が狭いことが欠点とされている.しかしながら,除振テーブルの位置・姿勢を一定に保つ除振装置では,大きな動作範囲は必要ないので,この欠点は問題とならない.実験の結果,提案する方式によって除振テーブルの6自由度をアクティブに制御できるとの知見を得た.
触媒作用を有する人工金属フィンガータンパク質の創製

本研究では、転写因子に含まれるDNA結合ドメインの1つである亜鉛フィンガータンパク質を用い、それらを人工的にデザインすることによって、新しい機能を付加しようとする検討を実施した。亜鉛フィンガータンパク質の1つのドメインは、わずか30個程度のアミノ酸残基から形成されているのだが、その中に「DNA結合能」および「金属イオン結合能」の2つの精密な分子認識機能を有している非常にユニークなモチーフである。ここでは、亜鉛イオンの配位に関与するアミノ酸について注目し、それらを化学合成および遺伝子工学的手法により変異させ、作成した各変異体の亜鉛イオンに対する結合能および新しい触媒機能に関する検討を行った。具体的には、ヒトの転写因子の1つであるSplに含まれる亜鉛フィンガータンパク質をターゲットタンパク質として用いた。Spl亜鉛フィンガータンパク質は3つのフィンガードメインから含まれており、すべてのドメインの亜鉛イオン配位部位はCys2His2の4つのアミノ酸から構成されている。そこでそれぞれのフィンガーのCysをHisに置換したHis4型人工Sp1亜鉛フィンガータンパク質を作成した。その結果、フィンガー1および2のHis4方亜鉛フィンガーでは、亜鉛イオンの存在下、天然と類似の二次構造を形成することがCDスペクトルより明らかとなった。一方、フィンガー3の場合は、亜鉛イオン存在条件でも、二次構造を形成しなかった。また、DNAのリン酸エステル結合のモデル化合物であるBNPPを用いて加水分解能について検討を行ったところ、いずれの変異体においてもエステル結合を加水分解することが明らかとなった。特に、フィンガー1のHis4変異体は他の変異体に比べて約10倍近い切断活性を持っていることが明らかとなった。さらに、フィンガー2のHis4においては、一般的には切断が困難と言われているペプチド結合を切断できることが明らかとなっており、今後、人口ペプチダーゼの研究に展開できると考えられる。本研究では、転写因子に存在するDNA結合ドメインである亜鉛フィンガータンパク質を用い、それらを人工的にリデザインすることにより新しい機能を有する人工機能性タンパク質の創製を試みている。本来、亜鉛フィンガータンパク質は特定のDNA配列を認識し、選択的に結合する能力は持っているが、何らかの生体反応を触媒する酵素のような機能は持ち合わせていない。一方、亜鉛フィンガータンパク質の構造に注目してみると、一つのフィンガードメインは僅か30残基のアミノ酸から構成されており、その形状はコンパクトに折りたたまれた球状タンパク質であるが、亜鉛イオンなどの金属イオンとの配位結合能およびDNA配列認識、結合能の2つの精密な分子認識能を持ち合わせた非常に高機能なタンパク質ドメインである。したがって、亜鉛フィンガータンパク質をリデザインする際に、これらの金属結合およびDNA結合部位は格好のそのターゲットとなりうる。本研究では亜鉛イオン結合部位に注目し、亜鉛イオン以外の金属イオンを導入した`金属フィンガータンパク質'の創製に取り組んだ。ここでは転写因子の1つであるGAGAファクターの亜鉛フィンガー型DNA結合ドメイン(GAGA-DBD)を用いて、野生型および金属配位部位のシステイン(C)およびヒスチジン(H)変異を加えた変異体を作製し、種々の金属イオンとの相互作用について検討を行った。その結果、野生型であるC2H2型GAGA-DBDにおいてコバルトイオンを導入することにより亜鉛イオンと同様の二次構造誘起を起こし、さらに特定のDNA配列に野生型とほぼ同様の親和性で結合することが分かり、いわゆる`コバルトフィンガータンパク質'の創製に初めて成功した。さらに、作製した変異体の中でCHHHおよびHCHH型では、他の金属イオンは配位しなかったものの、亜鉛イオンを加えた際にエステル結合を加水分解する能力があることを発見し、現在も詳細に検討中である。
住血吸虫症における病態の重症化抑制に有用な分子の探索と機能解析

住血吸虫症では、産生された虫卵が組織内に沈着する事によって,特徴的な肉芽腫形成とそれに続く線維化等の後、組織障害を残し慢性疾病となる。本研究では感染マウスモデルを用いて病態の重症化に対して、抵抗性あるいは感受性マウスの免疫応答をT細胞応答及び主要抗原分子の探索に焦点をあてて詳細に解析した。マンソン住血吸虫感染では特異的CD4^+T細胞を刺激誘導させる物質が病変成立に関与すると考えられる。虫卵中のこの抗原成分を特定するため、MHC H-2ハプロタイプが異なり、病態が顕著に異なるマウスストレインから得た抗原特異的T-Tハイブリドーマおよび感染及び免疫マウスから得たヘルパーT-細胞を用いてスクリーニングを行った結果、いくつかの抗原成分が特定できた。虫卵成分中強い免疫応答を誘導する事が知られていたSm-p40に加えて、新しく特定したマンソン住血吸虫虫卵由来phosphoenolpyruvate carboxykinase(Sm-PEPCK),及びthioredoxin peroxidase (Sm-TPx-1)についてアミノ酸配列、免疫学的特性について調べた。Sm-p40はH-2^kであるCBA及びC3Hマウスにおいて顕著に強いTh1に偏った応答を促し、重い病態を惹起するのに対し、Sm-PEPCK及びSm-TPx-1は、比較的マイルドな病態を辿り、H-2^bであるC57BL/6マウスにおいて強いT細胞応答を促し、よくバランスのとれたTh1/Th2応答を誘導した。またレコンビナント蛋白ではいずれの分子によってもTh1に偏向した応答を誘導する事が判り、ネイティブ分子に伴っていると考えられる糖鎖の重要性が推測された。マンソン住血吸虫感染に於いては、虫卵の沈着による虫卵周囲肉芽腫形成とそれに続いておこる組織の線維化が主要な病因となる。この肉芽腫形成は抗原特異的CD4陽性のヘルパーT細胞及びアクセサリー細胞上のMHCクラスIIに厳密に依存している。我々はこれまでに、症状の異なるマウスストレイン間ではヘルパーT細胞応答に大きな差異が認められることを報告し、ヘルパーT細胞を刺激する抗原に特に焦点をあててT細胞応答の解析をすすめてきた。本年度は主要なT細胞抗原の一つとして虫卵から新規にthioredoxin peroxidase(TPx-1)が特定された。虫卵抗原の26kDa成分に感染マウスの特異的ヘルパーT細胞に対する刺激活性を認めたことから、部分アミノ酸配列を決め、ホモロジー検索を行った。その結果マンソン住血吸虫の成虫から我々がすでに遺伝子クローニングしたTPx-1と一致した。DNA配列を基に185のアミノ酸から成るレコンビナント蛋白を作製し、ネイティブのTPx-1に対するヘルパーT細胞応答と比較検討した。両者とも感染マウスのヘルパーT細胞をよく刺激誘導したがサブセットの誘導に差異が認められた。さらにTPx-1に対する高い抗体産生が産卵の時期と一致して検出された。また本抗原は虫卵の卵殻とミラシジウムとの間に局在しており、また卵外に分泌されることが確認された。マンソン住血吸虫感染においては、虫卵の組織内沈着による虫卵周囲肉芽腫形成とそれに続いて起こる組織の繊維化が主要な病因となる。このことから私達はヘルパーT細胞を刺激誘導する抗原に特に焦点を当ててT細胞応答の解析をすすめてきた。これまでに主要虫卵抗原(Sm-p40), phosphoenolpyruvate

carboxykinase (Sm-PEPCK), thoredoxin peroxidase (Sm-TPx)について特定し、遺伝子クローニングを行い、それらの分子特性、免疫学的特性について明らかにしてきた。本年度ではさらに、150/166kDa(Sm-prealbumin),29kDa(Sm-GST),25kDa(IL-4 inducing factor)をT細胞抗原として特定し、その免疫学的特性を調べた。Sm-prealbuminについては遺伝子クローニングを行い、そのアミノ酸配列を決定した。今後はこれらの抗原のT細胞エピトープの決定と、アナログペプチドを用いたT細胞応答のモジュレーション効果について検討を行う予定である。住血吸虫感染においては、虫卵の組織内沈着による虫卵周囲肉芽腫形成とそれに続いて起こる組織の線維化が主要な病因となる。この肉芽腫形成は抗原特異的CD4陽性のヘルパーT細胞およびアクセサリー細胞上のMHCクラスIIに厳密に依存している。この事から私達は特異的ヘルパーT細胞を刺激誘導する抗原およびそのエピトープに特に焦点を絞り、T細胞応答の解析をすすめてきた。これまでに主要虫卵抗原(Sm-p40),phosphoe nolpyruvate carboxykinase(Sm-PEPCK),thioredoxin peroxidase(Sm-TPx),150/166kDa(Sm-prealbumin),29kDa(Sm-GST),25kDa,19kDa成分をT細胞抗原として特定し、いくつかについては遺伝子クローニングを行い、アミノ酸配列を決定し、その免疫学的特性を調べた。本年度は特に25kDa成分について詳細に調べた。この成分はヒト好塩基球からIL-4を誘導する虫卵成分(IPSE)として報告されたものと部分配列が100%同一であった事から、データベースのアミノ酸配列に従ってレコンビナント蛋白を作製し、免疫学的特性を調べ、ネイティブ抗原を用いた場合と比較検討した。両者ともIFN-gamma産生、特異抗体産生を促したが、全体的にC57BL/6よりもCBAマウスに強い応答が誘導された。Th2タイプのサイトカインであるIL-4,IL-5の産生はネイティブ抗原によって、C57BL/6マウスに強く認められた。抗体産生は産卵開始の時期と一致して急激に上昇した。一方、これまでの色々な結果から、それぞれのT細胞応答モジュレーションに抗原のグリカンの特性および程度が強く関連している事が推測され、この観点からも詳細な検討が重病化抑制の新規手段を開発するために必要であると考えられた。
唾液腺多形腺腫の悪性化における発癌機構の解析

多形腺腫は、最も多くみられる良性の唾液腺腫瘍であり、最近になってこの腫瘍の発生に深く関与する遺伝子(PLAG1)がクローニングされ注目を集めている。その多形腺腫の1割弱の症例に悪性化(多形腺腫内癌)を来すことが知られている。しかし、多形腺腫内癌における発癌機構の解析は、大腸癌の多段階発癌の解析に比べてかなり立ち遅れているのが現状である。今回我々は、まず多形腺腫内癌の標本を組織学的に検討した。その結果、悪性部分の組織型は、未分化癌、腺癌(唾液導管癌が最も多かった)あるいは筋上皮性癌であることがわかった。さらに、多形腺腫と癌腫との境界部分では、癌細胞は多形腺腫成分と混在して認められ、特に腺癌では多形腺腫の腺管部分を置換するようにして癌細胞が増殖していた。このことから癌細胞は多形腺腫の腺管から発生したであろうことが示唆された。しかし、前癌状態を示唆するような多形腺腫のdysplasiaの像は明らかではなかった。免疫組織化学的に30例の多形腺腫内癌症例において悪性部分は明らかにMIB-1陽性率が高く、約半数の症例では悪性部分にのみp53が陽性であった。つぎに、多形腺腫内癌25症例のHE標本からDNAを抽出し、PCR-direct DNA sequence法によりH-,K-,N-ras遺伝子のcodon12,13および61のpoint mutationの有無を検索した。その結果、検索したいずれの症例においてもras遺伝子の異常を見出し得なかった。今後さらに、β-cateninの異常の有無、多型性マーカーを用いたLOHの検出、p53遺伝子の変異様式についても引き続いて検討していきたいと考えている。多形腺腫は、最も多くみられる良性の唾液腺腫瘍であり、ごく最近になってこの腫瘍の発生に深く関与する遺伝子がクローニングされ注目を集めている。多形腺腫の1割弱の症例に悪性化(多形腺腫内癌)を来すことが知られている。その発癌機構を解析することは唾液腺癌における多段階発癌を考える上で非常に重要である。しかし、その症例数が少ないこともあってか、その免疫組織化学的、遺伝子的な解析はほとんど行われていない。そこで今回、まず新たに多形腺腫内癌の組織標本を見直した結果、悪性部分の組織型は、ほとんどが未分化癌あるいは腺癌(唾液導管癌が最も多かった)であることがわかった。つぎに、多形腺腫内癌25症例のHE標本から正常唾液腺組織、良性の多形腺腫部分、癌部分をmicrodissection法により慎重に削り取り、DNAを抽出した。H-,K-,N-ras遺伝子のcodon12,13および61を含む形でprimerを設定し、抽出したDNAについてPCR-direct DNA sequence法(ABI 310 Genetic Analyzerを使用)によりpoint mutationの有無を検索した。その結果、検索した全ての症例の多形腺腫部分、癌部分ともにいずれのras遺伝子の上記3つのcodonにはpoint mutationを見出し得なかった。今後さらに、免疫組織化学的な癌遺伝子・癌抑制遺伝子産物や細胞周期関連蛋白の発現、多型性マーカーを用いたLOHの検出、p53遺伝子の変異様式についても引き続いて検討していきたいと考えている。
Ta/Cu/Ta薄膜で発現する特異なTaキャップ効果

Si基板上にスパッタ法によりTaバリア層(35nm)、Cuを順次成膜したTa/Cu、更にTaキャップ(5nm)を付加したTa/Cu/Taについて、弾性率測定、X線回折実験および走査電子顕微鏡観察を行った。Cu膜は<IH>配向性が高く、Cu(III)からのX線回折強度Icu(III)の膜厚依存性を調べた。膜厚500nm以下ではIcu(III)の理論値は膜厚に比例して減少する.Ta/CuからのIcu(III)は、膜厚200nm-30nmの間は膜厚に比例して減少するが、30nm以下では階段状に数分の1に低下する.オメガスキャンの結果から、30nm以下でIcu(III)が低下するのは<III>配向性分布が大きくなったためであることが分かった.試料積層時には膜厚は連続的に増えるから、30nmを越すとCuキャップ効果により既存の30nm部分の結晶粒の<III>配向性が高くなることを意味する.TalCu1Taでは、Icu(III)の30nm以下での低下はなだらかになっており、Taキャップ効果により既存の30nm部分の結晶粒の<III>配向性が高くなることを意味する.一方、Cu弾性率が、tCu<100nmでは理論値から外れて低い値を示し、その程度はTa1Cu1Taで著しいが、この弾性率低下はナノ構造における結晶粒界層の擬弾性に起因している。金ナノ結晶ではクリープ変形は結晶粒の回転により進行することから、CuキャップおよびTaキャップによる応力発生に起因して<IH>配向性を高めるような粒回転が起きたと推測される.30nm前後でCuキャップ効果が異なることは、配線幅が30nm以下になると組織変化が起きる可能性を示唆する.先進電子機器の配線幅あるいは薄膜厚はナノメートル域に入っている。最近、Ta/Cu/Ta薄膜(Taキャップ層/Cu層/Taバリヤ層)について、Taキャップ層を積層すると、すでに積層されている結晶質Cu層/Taバリヤ層の性質が変化する様に見える新現象が見出された。本現象は、互いに固溶しない金属多層膜にキャップ層を後付けすることによるものであり、ナノスケールでの特異的あるいは普遍的な現象であるといえ、電子配線や薄膜の観点から重大である。この新現象に係る実験を進め、以下の結果を得た。Cu薄膜の弾性率(ヤング率)の膜厚保依存性は、Cu/Taの場合、膜厚が1000nmから10nmの範囲で内部応力の効果を補正したバルクCuの値とよい一致を示すが、Ta/Cu/TaではCu膜厚80nm以下で大きな低下を示す。ナノ結晶Cu薄膜の内部摩擦は、主として結晶粒界層での擬弾性を反映しており、その値はCu/TaとTa/Cu/Taでほとんど同じであった。膜厚方向の平均結晶粒径はCu/TaとTa/Cu/Taでほとんど同じであるが、膜面方向の平均結晶粒径はTa/Cu/Taの方が大きく、Taキャップにより結晶成長したことを示唆する。また、エレクトロマイグレーション(EM)実験で得られる活性化エネルギーはCu/TaとTa/Cu/Taで共に約0.3eVであり、この値はバルクCuでの粒界拡散の活性化エネルギーと比べて1/4程度の低さである。以上の結果を総合すると、ナノ結晶薄膜に特有な結晶粒界層の性質はTaキャップにより変化しないが、ナノ結晶の性質がTaキャップにより変化していると言え、これらの実験結果は論文として公表した。また、X線回折実験では、TaキャップによりCu膜厚80nm以下でのCuからのX線回折強度が大きく低下することが観測され、現在追求中である。関連研究として、ナノ結晶並びに非晶質合金について実験研究を進めた。Si基板上にスパッタ法によりTaバリア層(35nm)、Cuを順次成膜したTa/Cu、更にTaキャップ(5nm)を付加したTa/Cu/Taについて、これまでCu弾性率測定、EM効果実験、X線回折実験を行い、本年度は、CuからのX線回折強度I_<Cu>異常を中心に調べた。I_<Cu>は、Ta/CuおよびTa/Cu/Ta共にCu膜厚が30nm以下で理論値より低い値を示し、その程度はTa/Cuの方が著しい。これは、結晶粒界層は非晶質でその厚さt_<GB>はTa/Cuでは3nmを仮定すると説明できる。Taキャップにより、Cuの膜厚方向の結晶粒径D_⊥は不変に留まるが、膜面方向の結晶粒径D_<11>は大きくなっており、Ta/Cu/Taでは結晶粒界層割合が減少していると言え、I_<Cu>がTa/CuよりTa/Cu/Taの方が大きいことは説明できる。また、Taバリア層(β-Ta)からのX線回折ピークの半値幅W_<β-Ta>はCu膜厚t_<Cu>が30nm以下になるとTaキャップにより広がる。10<t_<Cu><100nmでは、膜面に垂直方向のCu(111)面間距離d_<Cu111⊥>は、Ta/Cuではバルクの値から0.10.3%の低下を示すが、Ta/Cu/Taではバルクの値を示す。β-Taの半値幅W_<β-Ta>およびd_<Cu111⊥

>の結果は、TaキャップによるCuの膜面方向の結晶成長に起因している可能性が高い。しかし、t_<Cu><10nmではd_<Cu111⊥>がバルクの値から外れて上昇に転じ、その程度はTa/Cu/Taで著しいことは説明できない。また、t_<Cu><100nmでは、Cu弾性率が理論値から外れて低い値を示し、その程度はTa/Cu/Taで著しいことは、結晶粒界層の寄与が増大していることを示唆しており、I_<Cu>異常から推測されることとは逆である。金属ガラスの研究では、原子の集団運動の励起により、弾性率が大きく低下することが見いだされ、Cu弾性率が理論値から外れて低い値を示すことは同様な機構が結晶粒界層で働いている可能性を示唆し、今後の課題である。Si基板上にスパッタ法によりTaバリア層(35nm)、Cuを順次成膜したTa/Cu、更にTaキャップ(5nm)を付加したTa/Cu/Taについて、弾性率測定、X線回折実験および走査電子顕微鏡観察を行った。Cu膜は<IH>配向性が高く、Cu(III)からのX線回折強度Icu(III)の膜厚依存性を調べた。膜厚500nm以下ではIcu(III)の理論値は膜厚に比例して減少する.Ta/CuからのIcu(III)は、膜厚200nm-30nmの間は膜厚に比例して減少するが、30nm以下では階段状に数分の1に低下する.オメガスキャンの結果から、30nm以下でIcu(III)が低下するのは<III>配向性分布が大きくなったためであることが分かった.試料積層時には膜厚は連続的に増えるから、30nmを越すとCuキャップ効果により既存の30nm部分の結晶粒の<III>配向性が高くなることを意味する.TalCu1Taでは、Icu(III)の30nm以下での低下はなだらかになっており、Taキャップ効果により既存の30nm部分の結晶粒の<III>配向性が高くなることを意味する.一方、Cu弾性率が、tCu<100nmでは理論値から外れて低い値を示し、その程度はTa1Cu1Taで著しいが、この弾性率低下はナノ構造における結晶粒界層の擬弾性に起因している。金ナノ結晶ではクリープ変形は結晶粒の回転により進行することから、CuキャップおよびTaキャップによる応力発生に起因して<IH>配向性を高めるような粒回転が起きたと推測される.30nm前後でCuキャップ効果が異なることは、配線幅が30nm以下になると組織変化が起きる可能性を示唆する.