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有機ホウ素分子を活用した位置及び立体選択的β-マンノシル化反応の開発と応用

天然には、β-マンノシドやβ-ラムノシドに代表される1,2-cis-β-グリコシド結合を有する生物活性物質が数多く存在しており、その構造活性相関の解明に関する研究が精力的に行われるようになってきている。そのため現在、これら配糖体天然物および類縁体の合成的供給が強く求められている。しかし、1,2-cis-β-グリコシド結合の立体選択的な構築は、糖供与体の2位保護基による隣接基関与やアノマー効果が利用できないことから、未だ困難であり、解決すべき課題の一つである。本研究では、有機ホウ素化合物の化学的特性を活用した1,2-cis-β-グリコシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と応用を目的として行った。研究の最終年度である本年度は、具体的に以下の研究を行い、成果を得た。1、ビス(4-フルオロフェニル)ボリン酸触媒を用いた、1,2-アンヒドロラムノースと各種モノオールとのグリコシル化反応が速やかに進行し、望むβ-ラムノシドが高収率かつ単一異性体として得られることを初めて見出した。次に、13C KIE及びDFT計算を用いた反応機構解析を行った結果、本反応が高分離性の協奏的なSNi型の反応機構で進行することを見出した。2、1,2-アンヒドロラムノースと4,6位水酸基が遊離のジオール糖受容体とのグリコシル化反応を、4-ニトロフェニルボロン酸触媒を用いて検討した。その結果、本反応が、アセトニトリル溶媒中、高位置および立体選択的に進行しβ(1,4)-ラムノシドが高収率で得られることを初めて見出した。次に、本反応が、種々の4,6-ジオール糖受容体を用いた場合でも適応可能であることを明らかにした。さらに、本手法を用いることで、肺炎球菌の糖鎖抗原の部分構造を効率的に合成することに成功し、本グリコシル化反応の有用性を明らかにした。天然には、1,2-cis-β-グリコシド結合を有する生物活性物質が数多く存在しており、その構造活性相関の解明に関する研究が精力的に行われるようになってきている。本研究では、有機ホウ素化合物の化学的特性を活用したβ-マンノシド(1,2-cis-β-グリコシド)の位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と配糖体天然物合成への応用を目的として行った。研究の初年度である本年度は、具体的に以下の研究成果を得た。1、1,2-アンヒドロマンノースとモノオール存在下、ビス(4-フルオロフェニル)ボリン酸とモノオールを複合化したボリン酸-糖受容体エステルを触媒量作用させることで、その他の試薬を添加することなく、β-マンノシドを立体選択的に合成する新規グリコシル化反応を開発した。さらに、本反応を鍵反応とした天然生物活性糖脂質アクレモマンノリピンAの全合成を達成し、本手法の有用性を明らかにした。2、4-ニトロフェニルボロン酸とcis-1,2/1,3-ジオールを有する糖受容体とを複合化したボロン酸-糖受容体エステル触媒と1,2-アンヒドロマンノースを糖供与体として用いたβ-マンノシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発に成功した。さらに、本反応を鍵反応とした大腸菌O75由来LPSの部分構造(四糖鎖)の立体選択的かつ効率的な合成を達成した。本研究の目的である、ボリン酸-糖受容体エステル触媒を用いた立体選択的β-マンノシル化反応の開発と天然生物活性糖脂質アクレモマンノリピンAの全合成を達成したため。さらに、ボロン酸触媒を用いたcis-1,2/1,3-ジオールに対する位置及び立体選択的β-マンノシル化反応の開発と大腸菌O75由来糖鎖の合成を達成したため。本研究では、有機ホウ素化合物の化学的特性を活用したβ-マンノシドを含む1,2-cis-β-グリコシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と配糖体天然物合成への応用を目的として行った。本研究の2年目は、具体的に以下の研究を行い、成果を得た。1、4-ニトロフェニルボロン酸触媒を用いた、1,2-アンヒドロマンノースと無保護糖受容体とのグリコシル化反応が水共存下、高収率かつ位置及びβ立体選択的に進行することを見出し、本反応のさらなる有用性を明らかにすることに成功した。2、本研究の初年度に開発したボリン酸触媒を用いたβ-マンノシル化反応を鍵反応とした天然糖脂質マンノシルエリスリトールリピッド(MEL)類の全合成と抗菌活性に関する構造活性相関研究を行った。

その結果、マンノースの4位および6位のアセチル基の数と位置が異なる4種類のMEL-A,B,C,およびDの構造を有し、かつマンノース2位および3位の脂肪鎖の長さ(n = 5, 7, 9, 11,および13)が種々異なる計20種類のMEL類の全合成を達成した。さらに、合成したMEL類の各種菌に対する抗菌活性を評価した結果、MEL類の抗菌活性の発現には、脂肪鎖長が深く関与し、ある種のMELがバンコマイシン耐性菌を含むグラム陽性菌に対して高い抗菌活性を示すことを初めて見出した。本研究の目的である無保護糖受容体に対する位置および立体選択的β-マンノシル化反応の開発に成功したため。また、本研究の初年度に開発したボリン酸触媒を用いた立体選択的β-マンノシル化反応を鍵反応とした天然糖脂質MEL類の網羅的な全合成を達成したため。さらに、合成したMEL類の抗菌活性を評価した結果、MEL類の抗菌活性の発現には、脂肪鎖長が深く関与すること、および、ある種のMELがバンコマイシン耐性菌を含むグラム陽性菌に対して高い抗菌活性を示すことを見出したため。天然には、β-マンノシドやβ-ラムノシドに代表される1,2-cis-β-グリコシド結合を有する生物活性物質が数多く存在しており、その構造活性相関の解明に関する研究が精力的に行われるようになってきている。そのため現在、これら配糖体天然物および類縁体の合成的供給が強く求められている。しかし、1,2-cis-β-グリコシド結合の立体選択的な構築は、糖供与体の2位保護基による隣接基関与やアノマー効果が利用できないことから、未だ困難であり、解決すべき課題の一つである。本研究では、有機ホウ素化合物の化学的特性を活用した1,2-cis-β-グリコシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と応用を目的として行った。研究の最終年度である本年度は、具体的に以下の研究を行い、成果を得た。1、ビス(4-フルオロフェニル)ボリン酸触媒を用いた、1,2-アンヒドロラムノースと各種モノオールとのグリコシル化反応が速やかに進行し、望むβ-ラムノシドが高収率かつ単一異性体として得られることを初めて見出した。次に、13C KIE及びDFT計算を用いた反応機構解析を行った結果、本反応が高分離性の協奏的なSNi型の反応機構で進行することを見出した。2、1,2-アンヒドロラムノースと4,6位水酸基が遊離のジオール糖受容体とのグリコシル化反応を、4-ニトロフェニルボロン酸触媒を用いて検討した。その結果、本反応が、アセトニトリル溶媒中、高位置および立体選択的に進行しβ(1,4)-ラムノシドが高収率で得られることを初めて見出した。次に、本反応が、種々の4,6-ジオール糖受容体を用いた場合でも適応可能であることを明らかにした。さらに、本手法を用いることで、肺炎球菌の糖鎖抗原の部分構造を効率的に合成することに成功し、本グリコシル化反応の有用性を明らかにした。引き続き、本研究の目的である有機ホウ素化合物の化学的特性を活用した1,2-cis-β-グリコシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と配糖体天然物合成への応用を指向し研究を行う。特に、糖供与体および糖受容体の基質一般性の向上を図る。なお、今後の研究の障害となる問題点はない。次年度も引き続き、本研究の目的である有機ホウ素化合物の化学的特性を活用した1,2-cis-β-グリコシドの位置及び立体選択的グリコシル化反応の開発と応用を指向した研究を行う。
相対論的輻射輸送・相対論的輻射流体の基礎研究

相対論的輻射流体力学は、適切なクロージャー関係が未発見なため、、モーメント方程式系をうまく閉じさせることができない。本研究では、平行平板や球対称など簡単化した状況で、相対論的輻射輸送方程式を厳密に解いて適切なクロージャー関係を見いだし、限定的ではあるが、相対論的輻射流体力学の定式化を完成させる。それらの基礎方程式系は、ブラックホール周辺での高エネルギー現象に適用できる。さらに、現在はまだほとんど研究されていない、相対論的輻射流体力学における振動現象や波動現象や安定性などの基礎研究も行う。まず、基礎研究部分については、平行平板流(Fukue 2015)や球対称流(Fukue 2016)などである程度は実績を積んできた。その上で、当該年度については、ブラックホール降着円盤風を念頭に置いて、中心天体の重力場が働いている中で、降着円盤の強い輻射場によって鉛直方向に駆動される輻射圧駆動風を、相対論的輻射輸送方程式を厳密に解きながら、輻射場の逐次近似と、輻射場と流体場の逐次近似という二重逐次近似で解くことができた(Takeda and Fukue 2019)。さらにこれまでに培ってきた相対論的輻射流体力学の知見を使い、輻射流体力学における波動現象の一つとして、輻射性衝撃波の問題に取り組んだ。まず、円盤降着流においてはじめて(非相対論的な)輻射性衝撃波の問題を取り扱い、衝撃波前駆領域の構造を解くことに成功した(Fukue 2019a)。さらに相対論的な輻射性衝撃波の問題に進み、単純な1次元輻射性衝撃波と円盤内の輻射性衝撃波の構造を、それぞれ解くことにも成功した(Fukue 2019b, c)。輻射性衝撃波の問題は現在もまだ解析を進めているところである。輻射性衝撃波への展開は当初予定にも念頭にあったが、当該年度で3件もの論文になるほど発展するとは予想していなかった。相対論的輻射流体力学の定式化については一段落ついたと考えている。相対論的輻射流体力学の応用として、ブラックホール降着円盤風や宇宙ジェットへの適用はまだまだ可能性があり、今後も発展させる予定である。また、当初予定よりはるかに進展した輻射性衝撃波の問題については、現在も研究を進めている最中で、今後もさらなる発展が期待できる。当該年度末の3月に行われた日本天文学会春季年会の旅費として計上していたが、大学からの補助が多少あったため、少しだけ残額が生じた。
破骨細胞におけるカテプシンEの局在と機能

破骨細胞は骨吸収において主役を担う細胞であり、通常数個から数十個の核を有する多核巨細胞である。破骨細胞は波状縁から酸(H^+)と各種加水分酵素を分泌し、骨の脱灰と有機基質の分解を行って骨吸収を進行させる。骨基質特にコラーゲンの分解には破骨細胞由来のリソゾーム性プロテアーゼ(カテプシン群)が重要な役割を果たすと考えられている。これまで筆者らはカテプシンB,D,Lが破骨細胞の波状縁部に存在し、骨吸収機構において機能分担を行っている可能性を示唆してきた。しかしカテプシンEの破骨細胞における局在や機能は全く明らかにされていない。そこで、破骨細胞に於けるカテプシンEの細胞内局在について検討した。生後5週令雄性ラット大髄骨を4%パラホルムアルデヒド、0.1%グルタールアルデヒド含有0.1Mカコジル酸バッファー(pH7.4)で4時間4度で固定し、0.3%過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼを除去後、ラットカテプシンE特異的ポリクローナル抗体で反応させ、さらにABCベクタステインキットにて二次抗体およびアビシン-ビオチン複合体反応による免疫染色後、DAB反応を行った。光顕用にはパラフィン包埋し、電顕用にはオスミウム固定後、脱水しエポン812で包埋後、超薄切片を作製して電顕観察した。光顕レベルでは、カテプシンEの免疫反応物は活性化破骨細胞に顕著に認められた。これに対し、近接している骨芽細胞にはカテプシンEの免疫反応物は殆ど認められなかった。電顕観察では、カテプシンEの免疫反応物はの波状縁部とそれに続く空胞様構造に偏在すること、骨面の反対側や骨面から解離した部分の細胞膜には存在しないことが示された。更にin vitroの実験からカテプシンEは酸性条件下でI型コラーゲンの対し分離能を有したことから、カテプシンEが細胞外での骨基質の分離と細胞内へ取りこまれた有機基質の分離に関与するものと推察される。
臍帯血移植後の移植片対白血病効果誘導を目的とした腫瘍関連抗原ワクチン療法の開発

白血病細胞及び臼血病細胞由来樹状細胞に発現しているGITRLは,T細胞上のGITRと結合することによって,腫瘍関連抗原であるCDK2に特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を阻害し,CTL活性も抑制した.また,GITR/GITRL結合によって白血病細胞内ではインドールアミン酸素添加酵素が活性化され,細胞外に分泌されるキヌレニンによってもT細胞の活性化が抑制された.臍帯血移植後に,CDK2ペプチドワクチンと伴に抗GITR抗体,あるいはIDO阻害剤を同時に投与することによって,CDK2特異的CTLが効果的に誘導され,白血病再発を予防出来る可能性が示唆された.白血病細胞及び臼血病細胞由来樹状細胞に発現しているGITRLは,T細胞上のGITRと結合することによって,腫瘍関連抗原であるCDK2に特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を阻害し,CTL活性も抑制した.また,GITR/GITRL結合によって白血病細胞内ではインドールアミン酸素添加酵素が活性化され,細胞外に分泌されるキヌレニンによってもT細胞の活性化が抑制された.臍帯血移植後に,CDK2ペプチドワクチンと伴に抗GITR抗体,あるいはIDO阻害剤を同時に投与することによって,CDK2特異的CTLが効果的に誘導され,白血病再発を予防出来る可能性が示唆された.Cyclin dependent kinase 2(CDK2)由来HLA-A*2402拘束性の2つの9merペプチド(CDK2_<158>,CDK2_<178>)は我々が同定した腫瘍関連抗原である.これまで我々は,白血病細胞由来樹状細胞に発現する抑制性補助刺激分子Glucocorticoid-induced TNFR-related protein(GITR)のリガンド(GITRL)が,健常ドナーのナイーブCD8^+T細胞からCDK2ペプチド特異的細胞傷害性T細胞(CDK2-CTL)の誘導を阻害することを明らかにしている.臍帯血移植(UCBT)後にCDK2-CTLを効果的に誘導する移植後白血病再発予防法の開発を目的として,GITRLによるCTL抑制のメカニズムを検討した.骨髄性白血病患者18例中9例の診断時白血病細胞上にGITRLの発現が認められ,初診時血清および単球性白血病細胞株THP-1細胞上清中には健常人血清に比べて高濃度の可溶性GITRL(sGITRL)が検出された[白血病患者0.31(0.10-0.76)ng/ml,THP-1 0.52ng/ml,健常人0.21(0.14-0.25)ng/ml].汎T細胞,CD4^+T細胞,CD8^+T細胞はTHP-1細胞上清中でCD3/CD28刺激後の増殖が45.0%,36.4%,34.2%抑制されたが,抗GITR抗体でGITR/GITRL結合を阻害すると増殖が回復した.また,THP-1由来exosome上にはGITRLが検出され,純化GITRL^+esoxomeは濃度依存性にT細胞の増殖を抑制したことから,白血病細胞由来のsGITRLとGITRL^+esoxomeがCTL活性を抑制することが示唆された.トリプトファン(try)代謝酵素であるインドールアミン酸素添加酵素(IDO)は免疫寛容を誘導する.THP-1および骨髄性白血病患者5例の診断時白血病細胞にsGITR-Fcを添加し,細胞表面上のGITRLと結合させると培養上清中にtryの代謝産物キヌレニン(kyn)が検出され,sGITR-Fcと伴にIDO抑制剤1-メチルートリプトファン(1MT)を添加するとkyn産生が抑制された(THP-1,sGITR-Fc;8.6μM,GITR-Fc+1MT;1.0μM,p<0.05).KynはT細胞の増殖活性を濃度依存性に抑制したことから,GITR/GITRL結合によってIDO活性が高まったGITRL^+白血病細胞から細胞外に分泌されるkynによって,CDK2-CTLの活性化が阻害される可能性が示唆された.UCBT後にCDK2ペプチドをワクチンする際,抗GITR抗体とIDO阻害剤を投与することによって効果的にCDK2-CTLを誘導できる可能性がある.Cyclin dependent kinase 2(CDK2)由来HLA-A*2402拘束性の2つの9merペプチド(CDK2_<158>CDK2_<178>)は我々が同定した腫瘍関連抗原である.これまで我々は,(1)骨髄性白血病細胞および白血病細胞由来樹状細胞(LDC)が,抑制性補助刺激分子の一つであるGITRのリガンド(GITRL)を発現していること,(2)LDC上のGITRLがドナーのナイーヴCD8^+T細胞上のGITRと結合することによって,ナイーヴCD8^+T細胞からCDK2ペプチド特異的細胞傷害性T細胞(CDK2-CTL)の誘導が抑制されること,(3)白血病細胞由来の可溶性GITRL(sGITRL)がCDK2-CTLの活性を抑制すること,(4)GITR/GITRL結合によって白血病細胞内でインドールアミン酸素添加酵素(IDO)活性が高まり,その結果白血病細胞でトリプトファンが代謝され,細胞外に分泌されるキヌレニンによってCDK2-CTLの活性が抑制されることを明らかにしてきた.臍帯血移植(UCBT)後にCDK2-CTLの効果的な誘導による白血病再発予防法の開発を目的として,GITRLによる白血病細胞のドナー免疫監視機構からのエスケープ機序を破綻させうるか検討を行った.CDK2_<158>をパルスしたHLA-A2402

遺伝子導入T2細胞を抗原提示細胞として,健常者ナイーヴCD8^+T細胞から誘導したCDK2_<158>-CTLの,CDK2^+GITRL^+骨髄性白血病細胞と5日間共培養後の増殖活性を,CDK2_<158>/HLA-24pentamerを用いたCFSE assayで検討したところ,1回のみであったCDK2_<158>-CTLの分裂回数が抗GITR抗体を添加することによって4回に増加した.また,共培義の際にIDO阻害剤である1-MTを添加すると分裂回数は3回に増加した.CDK2^+GITRL^+骨髄性白血病細胞と共培養後CDK2_<158>-CTLの5.3%に認めたIFNγ陽性細胞が,抗GITR抗体の添加によって9.1%に増加したことより,IGITR/GITRL結合の阻害やGITR/GITRL結合後白血病細胞内で高まるIDO活性を阻害することによって,GITRL^+骨髄性白血病細胞に対するCDK2-CTLの細胞増殖活性と細胞傷害性が増強することを明らかにした.UCBT後にCDK2ペプチドをワクチンする際,抗GITR抗体とIDO阻害剤を投与することによって効果的にCDK2-CTLを誘導できる可能性がある.
ホメオヘムプロテイン

本研究では、活性酸素を生成する既存のヘムタンパク質に塩基配列特異的DNA結合能を持つ転写因子を融合させ、配列特異的に遺伝子を切断する人工ヘムタンパク質を構築した。具体的には、4本のα-ヘリックスからなるヘリックスバンドル型タンパク質であるシトクロムb562を構造的な土台とし、これのアミノ末端にホメオドメインタンパク質であるAntpのDNA認識ドメインを遺伝子工学的に融合させた。両者をつなぐリンカーとしてグリシン5残基を挿入した。この融合蛋白質のDNA結合能を、ゲルシフト法を用いて評価した。Antpの認識配列(5'-CCATTA)を含む18塩基対からなる短鎖DNAを用いて調べたところ、このDNAと融合タンパク質は1:1で結合することがわかった。そこで、さらに長い200塩基対からなるDNA断片を用いてDNaseIによるフットプリントアッセイを行ったところ、この融合蛋白質はAntp認識配列に結合することが確認できた。そこで、このDNAを用いて酸化的遺伝子切断を行い、「切れ味」を評価した。過酸化水素の添加により反応を開始させたところ、数ヶ所でDNAの切断が見られたものの、Antp認識配列の近傍にて最も高い切断頻度を示すバンドが観測された。これらのことから、本研究で作成した融合タンパク質が、特異的塩基配列を認識し、その近傍において、DNAを切断できることが明らかとなった。この知見に基づき、Antpを他のホメオドメインに置換すれば、塩基配列特異性の異なった新規融合タンパク質が構築できると考えられる。
廃棄物政策のインセンティブ設計

本研究は、廃棄物政策における有効な経済的インセンティブの設計について検討をおこなった。市町村におけるごみ有料化のリバウンド効果や都道府県における産廃税の最終処分量抑制効果について、パネルデータ分析の手法を用いた推定をおこない、経済的インセンティブの有効性と限界について考察した。また、政策実験や表明選好法を用いた分析をおこない、廃棄物の発生抑制や再利用を促進するための政策デザインについて考察した。本年度は、廃棄物政策における有効な経済的インセンティブの設計について明らかにすることを目的とした理論・実証研究をおこない、以下のような主な成果が得られた。第1に、市町村におけるごみ有料化のリバウンド効果や都道府県における産廃税の発生抑制効果について、パネルデータ分析の手法を用いた実証的な検討をおこない、経済的インセンティブの有効性と限界について考察した。第2に、廃棄物抑制に向けた消費者行動を促進する仕組みづくりについて検討するため、環境省が実施したペットボトルのリユース実験や、大学生協で販売される弁当容器におけるデポジット制度の効果について、具体的なデータを用いた検討をおこなった。第3に、エコポイント制度をはじめとする環境配慮行動促進型ポイント制度の概念と特徴について整理し、今後の可能性について展望をおこなった。第4に、公害紛争処理制度に関するミクロレベルデータを用いた実証分析をおこない、処理の迅速性に着目した検討をおこなった。第5に、これらの成果を公表し、幅広い研究者との積極的な議論を促進するために、国内外で活躍する環境経済学者を招聴したワークショップを2回にわたって(2009年6月、2010年3月)開催し、当該分野の新たなネットワーク創造に努めた。以上の成果は、詳細なデータと最新の分析手法の活用に基づいて廃棄物の経済分析を進化させるという深い意義を持っており、循環型社会の形成と推進に関する具体的な政策評価と制度設計を可能にする点で重要である。第1に、市町村におけるごみ有料化のリバウンド効果や都道府県における産廃税の自治体間移出入への影響について、パネルデータ分析の手法を用いた実証的な検討をおこない、経済的インセンティブの有効性と限界について考察した。第2に、廃棄物抑制に向けた消費者行動を促進する仕組みづくりについて検討するため、環境省が実施したペットボトルのリユース実験や、大学生協で販売される弁当容器におけるデポジット制度の効果について、具体的、なデータを用いた検討をおこなった。第3に、家電リサイクル法の副次的影響として懸念されていた不法投棄の発生において地域特性が及ぼす影響と自治体の実施する対策がもたらす効果を検討した。第4に、グローバルな資源循環が所得分配に与える影響について理論的に検討した。第5に、これらの成果を公表し、幅広い研究者との積極的な議論を促進するために、国内外で活躍する環境経済学者を招聘したワークショップを2011年2月に開催し、当該分野の新たなネットワーク創造に努めた。第2に、自治体の分別政策に関する定量的な分析をおこない、地域の特性に応じた効率的な政策実施がおこなわれているかどうか検討をおこなった。第3に、省包装商品に対する消費者選好を評価し、ごみ有料化政策やリサイクル政策が消費者選好に与える影響について検討した。第5に、EUと北米における廃棄物発生抑制の取組の動向を概観し、その内容を対象物、取組手法、国の3つの視点から整理した。第6に、これらの成果を公表し,幅広い研究者との積極的な議論を促進するために、国内で活躍する環境経済学者を招聘したワークショップを2012年1月に開催し、当該分野の新たなネットワーク創造に努めた。
胚発生を制御するリゾホスファチジン酸シグナルの時空間的制御機構の解明

本研究課題はゼブラフィッシュを用いて、リゾリン脂質の一つ、リゾホスファチジン酸(LPA)の作用機序解明を目的とした。過剰なLPAシグナルは、癌、肺線維症等の様々な病態に関与することが示されているが、異常なLPAシグナル病態を引き起こす分子機構は明らかでない。代表者は個体レベルでこれを明らかにするため、ゼブラフィッシュを用いた。ゼブラフィッシュ胚にLPA産生酵素を過剰発現させたところ、二股心臓の表現型が見られた。この表現型は、スフィンゴシン1リン酸シグナル異常時に見られる表現型に酷似しており、過剰なLPAシグナルは、スフィンゴシン1リン酸シグナルを抑制する可能性を示した。申請者は、ゼブラフィッシュ胚発生時の心臓形成に対する、過剰なリゾホスファチジン酸シグナルの影響に関する論文を発表した(J. Biochem, 2014)。さらに、前年に引き続き、脂肪酸鎖長の大きい極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質、および極長鎖脂肪酸含有リン脂質について、高速液体クロマトグラフィー質量分析器を用いた定量測定計の構築を行った。各種リン脂質に関するISを用いる事で、従来相対的にしか各脂質量を評価できなかったのに比べて、半絶対的に各脂質量を計測する事が可能になった。また、ヒト病態サンプルにおける極長鎖脂肪酸含有リン脂質の定性的解析に関する論文を発表した(Lipids, 2013)本研究課題はゼブラフィッシュを用いて、リゾリン脂質の一つ、リゾホスファチジン酸(LPA)の作用機序解明を目的とした。申請者は、リゾリン脂質の中でも、特に脂肪酸鎖長の大きい極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質について、高速液体クロマトグラフィー質量分析計を用いた定量測定系の構築を行った。生体中では、極長鎖脂肪酸はペルオキシソーム内で分解されており、皮膚や精巣などの一部の臓器を除き非常に低濃度に抑えられている。この分解機構が破綻すると、極長鎖脂肪酸含有脂質が蓄積し、副腎白質ジストロフィー等の疾患に代表される、脱髄等の諸症状を呈する。しかしながら多様な極長鎖脂肪酸含有脂質がどのように脱髄に関与するかという点について、殆ど明らかにされておらず、有効な治療薬等が見出されていない。近年、極長鎖含有リゾリン脂質が脱髄の原因物質であるとの報告があるが、具体的な脂質の種類、およびその作用機序は不明である。モデル動物であるゼブラフィッシュはミエリンを有している。さらに、胚が透明であることから、各種脂質の産生、代謝を制御する遺伝子のミエリン動態における機能の解析に適する。極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質の定量系を構築したことにより、ミエリンの動態と各種極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質自体の相関性を評価することが可能になった。申請者は、極長鎖脂肪酸含有リン脂質および極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質について、多段階MRM法を用いた半網羅的定量法を構築した。本法は、従来の網羅的測定法であるスキャン法では測定できなかった微量成分も測定できることから、元来微量にしか存在しない極長鎖脂肪酸含有リン脂質および極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質を効率良く定量できる。ノックアウトマウスと野生型マウスの脳由来脂質の比較をパイロット実験として行ったところ、従来法では約20の脂質分子種について有意差を検出したのに対して、本法を用いた場合、約200種類の脂質分子種について有意差を検出できた。脂質生化学申請者は極長鎖含有リン脂質およびリゾリン脂質について、定量系をほぼ確立した。内部標準物質をそろえる事で、各脂質分子種について、半絶対的な量を測定できるようになったことにより、極長鎖脂肪酸の生体内代謝機構を定量的に把握する事ができるようになった。特に、定量測定系の構築において、数マイクログラム程度の標品の存在は必要不可欠であるが、対象とする極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質の標品は商業的には入手不可能である。そこで、申請者は極長鎖脂肪酸含有脂質が蓄積することが明らかにされている分裂酵母変異体を用い、その抽出脂質を用いて標品の代用とすることで定量測定系を構築した。申請者は極長鎖含有リン脂質およびリゾリン脂質について、定量系をほぼ確立した。今後は、その病理的意義を明らかにするため、極長鎖含有リン脂質が蓄積することが知られているヒト病態サンプルについても本定量系を適用して、様々な脂質分子種の絶対量を測定する。極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質の定量系を構築したことにより、ミエリンの動態と各種極長鎖脂肪酸含有リゾリン脂質自体の相関性を評価する。

また、副腎白質ジストロフィーなどの極長鎖脂肪酸含有脂質を蓄積する疾患の患者由来の、血液、皮膚などの組織標本由来の脂質を網羅的に質量分析計を用いて解析し、病態との相関性のある新たな極長鎖脂肪酸含有脂質を見出す。脂質抽出寺の生体サンプル破砕が容易ではなかったこと、および液体クロマトグラフィーのカラムの劣化が激しかったため、サンプル測定が予定ほど進まず、その結果、測定に関連する試薬等の発注が行われなかったため。生体サンプル破砕を効率的に行うツールおよびカラム劣化を防止するツールを購入する。極長鎖含有脂質を含む各種標品脂質の入手ができなかった為、次年度使用する研究費が発生した。当該研究費並びに翌年度以降に請求する研究費と合わせた研究費は、高速液体クロマトグラフィー質量分析器による脂質分析の為に用いる。移動相、フィルター、チューブなどの各種消耗品の他、新規脂質の分析の為に、HPLCカラムを購入する。また、患者皮膚切片より線維芽細胞を樹立し、維持するための血清、培地等を購入する。
単分子スピンラベルと走査トンネルスピン分光を用いた酸化物表面欠陥の触媒機構解明

本研究は酸化膜表面上での触媒化学反応を解析するため、従来のマクロな手法から発展させ、ナノの空間領域で化学分析が可能な解析手法を開発するものである。その目的達成のために走査型トンネル顕微鏡(STM)を利用することは多くの試みが有る。しかしながら空間分解能が十分であっても化学分析に用いるだけの分子識別ができないのが実情である。本研究では分子の化学分析に高い能力を持つと知られているスピンの分析を用いる。その目的のため、STMを用いたスピンの分析を高精度で行う手法を開発しており、特にスピンをラベルとして用いる方法で分子の分光を高精度化しようとしている。本年度の実績として、スピン偏極STM(SP-STM)を用いて、分子の磁石としての向き(スピン偏極方向)を決定する技術を開発し、分子磁石がN極S極を反転させる様子を世界に先駆けて観察した。実験には強磁性薄膜であるコバルト2重層島を金表面上に成長したものを基板として用い、一つの分子でも磁石として働く単一分子磁石(SMM)テルビウム・フタロシアニン2層錯体(TbPc2:Pcフタロシアニン)錯体をその表面上に吸着させた。また分子の磁石の向き(スピンの方向)はSTM探針をスピン偏極させ、トンネル磁気抵抗によって分子のスピンがそれと平行か反平行であるかによってトンネル電流が増減することを用いた。その結果として分子のスピンの向きが、コバルト薄膜の磁石の向きと反対に揃う(反強磁性的)様子を観測し、さらに分子が磁石としてスピンの向きを保持しようとする性質をもって磁場履歴現象を示すことに成功した。本実験により、SMMは表面で独立した磁石として振る舞うことが初めて示され、スピンラベルとして有用であることが実証された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本基盤研究の中心は酸化膜表面上での触媒化学反応をスピンをラベルとして明らかにしようとする実験である。そこでは走査トンネル分光を用いた原子レベルでスピンを検知する精度が鍵となる。特に再現性の良いスピン偏極度を持つ探針の評価法の開発が必須である。そのことを鑑み、本年度は金(111)表面に層状成長したコバルトの2層膜用いて、それをスピン偏極STMの標準試料として用いる技術を開発した。コバルトで被覆された探針を用い、外部磁場を変化させながらトンネルコンダクタンスを測定することで、面外に容易軸を持ったコバルト2層膜の強磁性的な磁気ヒステリシス明瞭に検知されることを見出した。学術的に興味深い点として、コバルト島の大きさに依存した磁気異方性エネルギーを求めることが出来、その異方性エネルギーは銅を基板とする場合に比べて、金を基板とし場合大変高い値が得られることを初めて見出した。第一原理計算と組み合わせることで、軌道スピン軌道作用により大きな磁化反転エネルギーが得られることを世界に先駆けて示した。同時に、この手法が探針のスピン偏極度を評価する大変優れた手法であることを示した。この評価を用いることで安定した探針スピン偏極度を得られる技術である。この技術を用いて、酸化膜のスピン検知を行った。酸化膜表面としてFe(110)を用いた極薄酸化膜を形成し、その磁性の原子レベルでの振る舞いを調べた。Fe(110)表面上に形成されるFeO(111)を用い、その反強磁性的な挙動をスピン偏極STSで検知した。本基盤研究の目的は、走査トンネル分光を用いた原子レベルでスピンを検知する、技術を開発し、従来まで困難であった表面触媒反応をスピンをラベルとして用いることで新しい解析手法を開発しようとするものである。特にそのターゲットとして酸化物セリア(CeO2)に代表される「還元される酸化物」は注目される対象である。それらは、容易に酸素欠陥を生じる性質を持ち、欠陥サイト周辺での特徴ある触媒反応に注目が集まる。これらの機構を理解するためには、欠陥サイトでの化学反応を原子レベルで基礎的に理解すること必須である。本研究では原子レベルで化学分析が可能なSTMを用いた局所分光を手法として、これらの課題に取り組む。その中でもスピン検出手法は有望である。その手法であるスピン偏極トンネル分光は探針がスピン偏極電流を供給できることが必須条件となる。過去の報告においても、必ずしもその再現性は高くなく、いかに探針の特性を制御するかということが重要である。従って、H28年度には、確実に探針の評価ができるようにAu(111)上のCo島の磁気特性を計測し、学術的にも興味深い結果、すなわち基板を銅と金の場合を比べた場合、スピン・軌道相互作用が大きい金基板上で成長させたCo島が大きな磁気異方性を持つという結果を得た。この実験はまたCo島を標準試料として今後の探針の評価に最も適した対象として用いることが可能であることを示すことが出来た。H28年度には酸化物のスピンとしてFe(110)の極薄酸化膜の磁性を調べたが、その酸化膜はいろいろなフェーズを持ち、また反強磁性を示すなど興味深い磁気物性を検出する能力を持つことを示した。これらの技術は、原子レベルでスピン状態を検出する技術を利用して、欠陥での化学反応素過程を解明するために不可欠の技術であり、それらが達成できたことで研究は順調に進行していると判断した。本研究は酸化膜表面上での触媒化学反応をスピンをラベルとして明らかにしようとする実験である。

原子レベルで基板や分子のスピンを検知するためには、スピン偏極STM(SP-STM)は重要であり、スピンの存在に加え、その方向や時間発展なども対象となっている。しかしながら世界的に見てもどのような標準物質でこの測定手法の評価を行うか定まっていない。H29年には強磁性薄膜であるコバルト2層膜で形成されるナノサイズの島について、実験と第一原理計算がうまく融合し、強磁性薄膜であるコバルト2層膜で形成されるナノサイズの島についてスピン偏極マッピング像の観測に成功し、そのマッピングコントラストから島がN極かS極か区別が可能であることを示した。この技法を利用し、反転に必要な外部磁場の強さを多くの島で計測し、磁気異方性エネルギー(MAE)を正確に測定した。銅と金を基盤として用いた結果を比較すると、銅と比較して金の基板に成長させたコバルト島には約2倍のMAEが観察された。三重大・中村浩次らの理論計算との比較により、金の大きなスピン軌道相互作用の影響によって、コバルトに大きなMAEが観察されたことが理解され、Nano Lettersに掲載することができた(. Mishra, Z. K. Qi, H. Oka, K. Nakamura, T. Komeda, Nano Lett. 17 (2017) 5843-5847.)。この技術を用いて、酸化膜のスピン検知を行った。酸化膜表面としてFe(110)を用いた極薄酸化膜を形成し、その磁性の原子レベルでの振る舞いを調べた。Fe(110)表面上に形成されるFeO(111)を用い、その反強磁性的な挙動をスピン偏極STSで検知した。本基盤研究の目的は、走査トンネル分光を用いた原子レベルでスピンを検知する、技術を開発し、表面触媒反応をスピンラベルを開発し新しい解析手法を開発しようとするものである。ナノ磁性材料に関する最も重要な特性である磁気異方性エネルギー(MAE)をナノ構造と同時に可視化・測定した。MAEの大きさが重要なことは、磁気記録の高密度化が進むと、単一ビットあたりの磁性体原子の数が減少し、その反転エネルギーが低下、安定な記録が出来なくなることが大きな問題となることなどに見ることができるが、同時に化学分析においても不可欠な情報である。そのためにはMAEの現象を原子レベルで理解することが必要である。今回の測定には原子レベルで磁気特性を測定可能なスピン偏極走査トンネル顕微鏡(SP-STM)の手法を利用し、観察対象として金属基板に成長させた強磁性薄膜であるコバルト2層膜のナノサイズの島を用いた。この薄膜の島は、N極・S極のどちらかが表面から飛び出す方向を向いている。外部から磁場を印加した場合、最初磁場と反対を向いていた島も、ある強さの外部磁場の印加で、それと同じ方向に反転する。この外部磁場の強度から、MAEを測定することが可能である。共に非磁性金属である銅と金を基板とした場合、銅と比較して金の基板に成長させたコバルト島には約2倍のMAEが観察された。理論計算との比較により、金の大きなスピン軌道相互作用の影響によってコバルトに大きなMAEが観察されたことが理解された。この技術は、原子レベルでスピン状態を検出する技術を利用して、欠陥での化学反応素過程を解明するために不可欠の技術であり、それらが達成できたことで研究は順調に進行していると判断した。
犠牲水素還元によるポリマー保護金クラスターの精密合成

構成原子数およそ百以下まで微細化されたポリマー保護金クラスターはサイズ特異的な触媒能を示すことが知られている。また、異種金属との合金化により金クラスターの触媒能を改良することが可能である。一方でサイズおよび異種金属導入量の両パラメーターを原子数精度で制御することは未だ困難である。そこで本研究ではポリマー保護金クラスターのサイズ・組成を原子数精度で制御するための手法として、犠牲水素還元法を用いた金クラスターのボトムアップ合成を提案する。すなわち、金クラスター上の吸着水素により金または異種金属イオンを還元・析出させ、サイズ・組成を精密に制御し、触媒能との相関を包括的に明らかにする。
ラジカルポリマーを用いた有機メモリ素子の創出

安定有機ラジカルをレドックス席として高密度に置換したラジカルポリマーを用いて、次世代メモリに位置付けられる有機ポリマーメモリの鍵物質を創出した。SOMOレベルを制御したポリマーを精密合成し、固体での電荷注入機構の解明をもとに、ON/OFF比10^5以上で繰返し耐久性および状態保持力高い不揮発性メモリ素子を試作した。印加電圧に応じてON/OFF状態が切り替わって状態維持する電気的双安定性を支配する因子を明確にし、全有機メモリの設計指針を明らかにした。具体的には、ラジカルポリマー層を電極で挟んだ構造の薄膜素子を用いて動作実証するとともに、ラジカルポリマーに期待される特異な電荷注入・輸送現象を分子構造と相関させて解明し、低電圧でも駆動するポリマーを創出した。印加電圧に応じてON/OFF状態が切り替わってその状態を維持する、電気的双安定性を有する高分子無定形固体の創出と、それを用いた全有機メモリ素子の実現を目的とする。特に、安定ラジカルを高密度に置換した高分子であるラジカルポリマーを対象とし、SOMOレベルを制御したポリマーの精密合成を基盤として、電荷注入と空間電荷の挙動に関わる基本現象を解明する。シリコン基板に依存した現在のメモリ素子を代替する次世代超高密度メモリに位置付けられるポリマーメモリを、資源に制約のない有機分子のみで創出する研究を切り口として、高分子固体の電気的双安定性の支配因子を解明する。本年度の成果を以下に列記する。1)電荷注入効率の高いポリマーの設計と合成:ニトロキシド、ニトロニルニトロキシド、ガルビノキシル、トリアリールアミニウムなど安定ラジカル種を側鎖として繰り返しユニット当り高密度に有するポリマーを合成し、スピンコート等により得られる薄膜の基礎的性質を分子構造と相関させて明らかにした。電極表面での1電子移動による電子授受が安定有機ラジカル種で可逆性高く生起するため、ポリマー固体中で密集したラジカル席へ効率高く電荷注入されることを実証した。2)有機メモリの予備特性評価:合成されたポリマーを用いて、有機層を電極で挟んだ構造を有し、閾値以上の電圧印加により高抵抗状態から低抵抗状態へ変化し、逆方向に電圧を印加すると所定の閾値において再び高抵抗状態が復帰する挙動を観測した。ラジカルポリマー特有の速い電極反応、効率高い自己電子交換および優れた成膜性に着目し、精密合成されたポリマー層を電極で挟んだ構造の薄膜素子を作製し特性評価に着手している。安定ラジカルを高密度に置換したラジカルポリマーを対象とし、電荷注入と空間電荷の挙動に関わる基本現象を解明する。次世代高密度メモリに位置付けられるポリマーメモリを有機分子のみで創出する研究を切り口として、高分子固体の電気的双安定性の支配因子を解明する。具体的には、ポリマーの薄膜素子を用いて、ON/0FF比10万以上、状態保持力数万サイクル以上、繰返し耐久性数千サイクル以上の性能を実現するとともに、ラジカルポリマーに期待される特異な電荷注入・輸送現象を分子構造と相関させて解明し、3V以下の低電圧でもON/OFF比が10,000桁で駆動するポリマーを創出する。1)電荷注入効率の高いポリマーの設計と合成ニトロキシド、ニトロニルニトロキシド、ガルビノキシル、トリアリールアミニウムなど安定ラジカル種を側鎖として繰り返しユニットあたりに有するラジカルポリマーを合成し、電荷注入特性試験に供した。2)有機メモリ素子の作製と特性評価ラジカルポリマー層内に誘電体薄膜を挿入し、注入された電荷が形成する空間電荷層の挙動を制御し、記録保持性および駆動安定性を向上させた。電荷が誘電体界面で蓄積される不揮発性メモリを構築し、1-V曲線の解析から駆動電圧を明確にした。また、スイッチング機構をSchottky障壁とPoole-Frenkel効果に関連させて明らかにした。次いでラジカルポリマーを拡張し、メモリ特性を指標に最適なSOMOレベルを有するラジカル種を絞り込んだ。電極/ポリマー界面でのラジカル席密度や、ホールおよび電子注入層を介在させた構造も援用し、電荷注入効率を最適化した。印加電圧に応じてON/OFF状態が切り替わってその状態を維持する、電気的双安定性を有する高分子無定形固体の創出と、それを用いた全有機メモリ素子の実現を目的とした。安定ラジカルを高密度に置換した高分子であるラジカルポリマーを対象とし、SOMOレベルを制御したポリマーの精密合成を基盤として、電荷注入と空間電荷の挙動に関わる基本現象を解明した。資源に制約のない有機分子のみでメモリ素子を創出する研究を切り口として、高分子固体の電気的双安定性の支配因子を解明した。

具体的には、ラジカルポリマー層を電極で挟んだ構造の薄膜素子を用いて、ON/OFF比高く状態保持力を有し、繰返し耐久性数千サイクル以上の素子性能を実現し、ラジカルポリマーに期待される特異な電荷注入・輸送現象を分子構造と相関させて解明したことにより、低電圧でも駆動するポリマーを創出した。本年度の成果を以下に列挙する。1)空間電荷層の観測とその動的制御法の確立ラジカルポリマーおよび関連する誘導体を電極で挟んだ単層型素子を対象として、空間電荷制限電流に基づく極性転換型メモリを創出し、電極からの電荷注入および輸送現象に関わる固体物理を解明した。ラジカルポリマーに注入された電荷の挙動を自己電子交換効率から見積もり、適度な空間電荷制限電流を与えるポリマーの設計に役立てた。単層素子の極性転換機構を明らかにするとともに、ラジカル部位の酸化状態を制御して、低電圧駆動を可能とする素子構成を工夫した。2)空間電荷の動的挙動の解析ラジカルポリマー固体における空間電荷の動的挙動を、高速パルス応答やインピーダンススペクトルなどから明らかにした。単一ラジカルポリマーを電極で挟んだ素子で、パルス電圧印加直後の残余電流、電極界面でのオキソアンモニウムカチオンの生成、R-V曲線から空間電荷制限電流の発生を明らかにし、極性転換型メモリとして具体化した。
外有毛細胞シナプスにおけるグルタミン酸受容体の局在の同定と難聴発症機序の解明

本研究の目的はグルタミン酸受容体の蝸牛有毛細胞での局在と機能を明らかにすることである。デルタ型受容体のサブタイプのデルタ1受容体(GluD1)は小脳と内耳に強く発現し、GluD1欠損マウスは高音障害型難聴を示すことが知られている。また共同研究先である慶應義塾大学生理学教室での研究から、デルタ型受容体がCbln1と共役してシナプスの形成と維持に寄与していることがわかっている。我々はGluD1欠損マウスの聴力の変化を経時的に観察した。その結果、月齢3か月から高音域より聴力の閾値の上昇が始まり、ホモは有意に難聴の進行が速いことが分かった。また外有毛細胞の機能を反映するDPOAEもホモは急速な低下を示し、月齢7か月でほぼ消失した。有毛細胞における局在を調べるためにGluD1の共役の相手であるCbln1の解析を行った。Cbln1にHA tagをした遺伝子改変マウスで外有毛細胞遠心性シナプスに局在を確認した。さらにGluD1の機能不全による遠心性シナプスの形態の変化を調べた。その結果、ホモで有意に有毛細胞1個当たりの数が減少するが、個々のシナプスの面積は増大を認めた。しかしその変化は予想に反して軽微なものであり、透過型電子顕微鏡による観察でも、有意な変化を確認できなかった。これらの結果から、GluD1の欠損によって何らかの代償作用が働いているのではないかと考え、同じサブタイプのGluD2の蝸牛での発現量をRT-PCRで定量した。その結果、ホモでGluD2の発現が有意に増加していることが確認された。以上より、GluD1は外有毛細胞の遠心性シナプスの形成と維持にかかわり、内耳機能において重要なはたらきを有することが示唆された。また内耳においてGluD1とGluD2が相補的な関係である可能性が示唆された。この成果は2019年2月のARO学会(ボルチモア)で報告した。GluD1欠損マウスとCbln1タグマウスを用いることで、GluD1の内耳における機能と局在を明らかにすることができた。またGluD1の機能をGluD2がある程度代償している可能性を示すことができた。Cbln1欠損マウスがGluD1欠損マウスで観察された表現型を再現できるかを調べたい。またGlluD1自体の局在を明らかにしたい。対応策としては、慶応義塾大学生理学教室が保有するCbln1欠損マウスを導入する。GluD1の局在については、現在新たな染色条件を検討中である。あるいはGluD1タグマウスを作成する。本研究の主要な目的は興奮性神経伝達物質として神経系で普遍的に作用するグルタミン酸の受容体がシナプス可塑性と神経変性に重要な働きをしているグルタミン酸受容体のとくに外有毛細胞シナプスにおける局在を明らかにすることである。現在われわれはグルタミン酸受容体の中でデルタ受容体に注目している。デルタ受容体はAMPAなどその他のイオン透過型グルタミン酸受容体と構造の相同性がありながら単独では受容体機能は有さない。またサブタイプの一つであるデルタ1受容体(GluD1)はとくに小脳と内耳に強く発現し、GluD1ノックアウトマウスは高音障害型難聴を示すことが知られている。先行研究からデルタ受容体がCblnと共役してシナプスの安定化に寄与していることがわかっている。慶応義塾大学生理学教室との共同研究として、GluD1ノックアウトマウスの聴覚の表現型の解析とGluD1の有毛細胞シナプスにおける局在を解析中である。現在までに、Cbln1が外有毛細胞の遠心性シナプスに局在することが免疫染色によって判明した。生化学的な手法によりGluD1とCbln1が共役することがわかっているので、GluD1がCbln1と共役して外有毛細胞シナプスの安定化に寄与している可能性が十分考えられる。またラット、マウスの蝸牛の非脱灰標本を用いてTEM(透過型電子顕微鏡)画像を取得することにも成功した。これらの技術によって、GluD1の欠損がもたらす有毛細胞シナプスの形態学的変化を明らかにすることができると考えられる。慶応義塾大学生理学教室との共同研究として発展し、GluD1ノックアウトマウスを用いた解析が可能となった。現在までに、ホールマウント蝸牛標本を用いた実験から、Cbln1が外有毛細胞の遠心性シナプスに局在することが判明した。また本学研究支援センターの市野瀬志津子先生の協力・指導のもと、マウスおよびラット蝸牛の非脱灰標本を用いてTEM(透過型電子顕微鏡)画像を得ることができた。現在は、シナプスに発現するたんぱく質がアルデヒド系の固定に非常に敏感でホールマウント染色によるアプローチは困難であるとの結論に至り、蝸牛の凍結標本から切片を作成して免疫染色を試みている状況である。本研究の主な目的は神経系で普遍的に発現し神経伝達に重要なはたらきをしているグルタミン酸受容体の蝸牛有毛細胞での局在と機能を明らかにすることである。主な研究手法は、ノックアウトマウス(KO)を用いて、聴性脳幹反応(ABR)やDPOAEによる聴覚機能の評価と、免疫組織化学と共焦点顕微鏡や電子顕微鏡を用いた形態学的評価である。

現在は特にグルタミン酸受容体のなかでも特異な存在であるデルタ型受容体に注目して研究を行っている。デルタ型受容体はAMPA型などその他のイオン透過型グルタミン酸受容体と構造の相同性がありながら単独では受容体機能を有さない。またサブタイプであるデルタ1受容体(GluD1)はとくに小脳と内耳に強く発現があり、GluD1-KOは構音障害型難聴を示すことが知られている。さらに共同研究先である慶應義塾大学生理学教室による先行研究から、デルタ型受容体がCbln1と共役してシナプスの安定化に寄与していることがわかっている。GluD1-KOを用いた現在までの研究から、1)KOは高音域から始まる進行性の難聴を示すこと、2)GluD1の免疫染色は技術的に困難であるが、GluD1の共役の相手であるCbln1は外有毛細胞遠心性シナプスに発現していると考えられること、3)GluD1-KOおよび野生型マウスの非脱灰標本を用いた透過型電子顕微鏡による観察で外有毛細胞の遠心性シナプス間隙に形態学的に有意な変化が見られないことが分かった。以上の結果から、GluD1-Cbln1は内耳機能において何らかの重要なはたらきを有することが示唆されるが、GluD1の局在と機能を形態学的に解明することは現時点で困難であることが予想される。今後の方針として、Cbln1-KOとTagマウスを用いて機能と局在の解析を行い、間接的にGluD1の内耳における機能的意義を明らかにしていきたい。本研究の目的は内耳機能におけるGluD1の重要性を明らかにすることである。GluD1-KOを用いた聴覚機能の評価では、高音域から始まる進行性難聴を示すことが示されつつあるが、研究室のABR測定システムの動作不良のため解析が途中で止まっている。またGluD1の局在と形態学的評価については、免疫染色の手法でさまざまに条件検討を行ったがGluD1の有意な標識を得ることができなかった。また透過型電子顕微鏡でもGluD1-KOでシナプスの形態に有意な変化が観察されなかった。しかしGluD1の共役の相手であるCbln1が外有毛細胞遠心性シナプスに発現していることが免疫組織化学で示唆されている。本研究の目的はグルタミン酸受容体の蝸牛有毛細胞での局在と機能を明らかにすることである。デルタ型受容体のサブタイプのデルタ1受容体(GluD1)は小脳と内耳に強く発現し、GluD1欠損マウスは高音障害型難聴を示すことが知られている。また共同研究先である慶應義塾大学生理学教室での研究から、デルタ型受容体がCbln1と共役してシナプスの形成と維持に寄与していることがわかっている。我々はGluD1欠損マウスの聴力の変化を経時的に観察した。その結果、月齢3か月から高音域より聴力の閾値の上昇が始まり、ホモは有意に難聴の進行が速いことが分かった。また外有毛細胞の機能を反映するDPOAEもホモは急速な低下を示し、月齢7か月でほぼ消失した。有毛細胞における局在を調べるためにGluD1の共役の相手であるCbln1の解析を行った。Cbln1にHA tagをした遺伝子改変マウスで外有毛細胞遠心性シナプスに局在を確認した。さらにGluD1の機能不全による遠心性シナプスの形態の変化を調べた。その結果、ホモで有意に有毛細胞1個当たりの数が減少するが、個々のシナプスの面積は増大を認めた。しかしその変化は予想に反して軽微なものであり、透過型電子顕微鏡による観察でも、有意な変化を確認できなかった。これらの結果から、GluD1の欠損によって何らかの代償作用が働いているのではないかと考え、同じサブタイプのGluD2の蝸牛での発現量をRT-PCRで定量した。