hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電位依存性ナトリウムチャネルの機能を制御する中分子グアニジンアルカロイドの創製

電位依存性ナトリウムチャネル(NaVCh)は、重要な生命活動電位を担う膜タンパク質である。NaVChは10種のサブタイプが報告されている。これらの中で、ふぐ毒テトロドトキシンに対し非感受性を示すTTX-抵抗型NaVChは、がん性疼痛に対する優れた分子標的であるにも関わらず、これを特異的に阻害するリガンドは数少ない。山下(東北大学)等は、矢毒ガエルからSTXの中分子型類縁体としてゼテキトキシン(ZTX)を単離し、これがTTX-抵抗型NaVChを含む全てのNaVChに対して、TTX、STXを上回る極めて強力な阻害活性を示すことを報告している。そこで本研究では、ZTXの基本骨格合成法を確立し、ZTXの特異な大環状構造とN7位に着目した構造展開を行うことで、TTX-抵抗型NaVChを特異的に阻害するリガンドの創製を目的した。ZTXの基本骨格を合成するにあたり、STX骨格中、C11位への炭素-炭素結合形成とC13位の水酸基の酸化を行う必要がある。C11位への炭素-炭素結合は、向山型アルドール縮合反応を用いる効率的な合成手法を確立した。またC13位に関しては、酸化剤としてAZADOを用いることで、1級水酸基をカルボン酸へ酸化することができ、ついで得られたカルボン酸と環状イソキサゾリジンを反応させることで、ZTXに見られる特徴的なアミド構造の構築にも成功した。これらの合成手法を基盤として、C11が官能基化された新規ZTX誘導体を合計5種類合成することができた。得られた化合物について、NaVChに対する阻害活性評価をパッチクランプ法により評価行った。その結果、TTX-抵抗型NaVCh(NaV1.5)に対して特異的に阻害活性を示す化合物を見いだすことができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。NaVChは10種のサブタイプが報告されており、個々に痛覚、心拍、筋収縮等の生命活動と密接に関係しており、いずれも重要な創薬標的である。これら10種類は、ふぐ毒テトロドトキシンに対する感受性の違いによりTTX-感受性型とTTX-抵抗型に分類される。TTX-感受性型NaVChを阻害する化合物は、テトロドトキシン、貝毒サキシトキシン等が知られているが、TTX-抵抗型NaVChを特異的に阻害するリガンドがない。従って、TTX-抵抗型NaVChを標的とする創薬研究(がん性疼痛薬、抗不整脈剤)が遅れている。山下(東北大学)等は、矢毒ガエルからSTXの中分子型類縁体としてゼテキトキシン(ZTX)を単離した。ZTXは、TTX-抵抗型NaVChを含む全てのNaVChに対して、TTX、STXを上回る極めて強力な阻害活性を示す。しかしTTX-抵抗型への特異性はない。そこで、本研究では、ZTXの基本骨格合成法を確立し、ZTXの特異な大環状構造とN7位に着目した構造展開を行うことで、TTX-抵抗型NaVChを特異的に阻害するリガンドの創製を目的した。今年度はまずC11位へZTXの大環状骨格を構築するための足がかりとなるイソキサゾリジンアルデヒドの導入を検討した。その結果、向山型アルドール縮合反応を用いることで、20-30%の収率で目的とする縮合化合物を得ることができた。またC13位に関しても、酸化剤としてAZADOを用いることで1級水酸基をカルボン酸へ酸化することができ、ついでカルボン酸を環状イソキサゾリジンと反応させ、アミド構造の構築に成功した。本年度は、ゼテキトキシン(ZTX)の基本骨格を合成するための基盤構築を検討した。ZTXは、サキシトキシン(STX)の骨格中に特徴的な大環状構造を有する。検討の結果、向山型アルドール縮合反応、AZADOを用いた酸化反応を用いることで、大環状構造の構築を行うために必要な全ての官能基化を行うことができた。またこれに加え、大環状構造構築のための合成中間体であるシリルエノールエーテルを用い、様々なアルデヒドと向山型アルドール縮合反応を行うことで、C11が官能基化されたZTX誘導体を合計5種類合成することができた。これらについて、NaVChに対する阻害活性評価を行うこともできたことから、研究は当初の計画とおり順調に進んでいると判断した。

そこで本研究では、ZTXの基本骨格合成法を確立し、ZTXの特異な大環状構造とN7位に着目した構造展開を行うことで、TTX-抵抗型NaVChを特異的に阻害するリガンドの創製を目的した。ZTXの基本骨格を合成するにあたり、STX骨格中、C11位への炭素-炭素結合形成とC13位の水酸基の酸化を行う必要がある。C11位への炭素-炭素結合は、向山型アルドール縮合反応を用いる効率的な合成手法を確立した。またC13位に関しては、酸化剤としてAZADOを用いることで、1級水酸基をカルボン酸へ酸化することができ、ついで得られたカルボン酸と環状イソキサゾリジンを反応させることで、ZTXに見られる特徴的なアミド構造の構築にも成功した。これらの合成手法を基盤として、C11が官能基化された新規ZTX誘導体を合計5種類合成することができた。得られた化合物について、NaVChに対する阻害活性評価をパッチクランプ法により評価行った。その結果、TTX-抵抗型NaVCh(NaV1.5)に対して特異的に阻害活性を示す化合物を見いだすことができた。当初の計画とおり、ZTXの基本骨格の合成を検討する。基本骨格を構築するための手法は確立したので、特徴的なZTXの大環状骨格の構築を検討する。この際、C11で炭素-炭素結合を形成することで大環状構造を構築する方法、またC13位で大環状アミド化を行う手法、の2通りが考えられる。いずれの方法も検討を行ない、より効率よい合成手法を確立する。また、基本骨格合成研究と並行して、ZTXの誘導体合成を検討する。C11に加え、N7位に着目した誘導体の合成を検討し、合成した化合物のNaVChに対する阻害活性をパッチクランプ法により評価することを計画する。これにより、TTX-抵抗型NaVChに対する阻害活性を有する化合物の創製を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
機能性ペプチドを用いた神経再生医療の開発

蛋白質の機能は、その蛋白質内に存在する機能性ドメインに由来する。その機能性ドメインを構成するアミノ酸配列を合成したペプチドを細胞内へ導入することによって、多分化能を有する幹細胞の分化制御を行うことが可能であれば、再生医療におけるドナー細胞として分化誘導した細胞を用いることが可能である。本研究では、すでに蛋白全体として神経幹細胞からの神経分化誘導機能が明らかにされているvon Hippel-Lindau腫瘍抑制蛋白(VRL)の内で、神経分化を誘導するドメインの候補としてVHLのリガンドであるelonginBCの結合部位のアミノ酸配列の15個のアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、神経幹細胞へ導入すると、ニューロンへの分化が確認された。このペプチドに蛋白導入ドメイン(TATなど)を結合すると、可視化されたペプチドが短時間でほぼすべての細胞内に容易に入ることが観察された。細胞内に入ったペプチドはその後機能し始めて、約8時間後には神経突起の伸長、神経特異的蛋白の発現を認めた。こうした神経分化誘導ペプチドの作用は、神経幹細胞のみならず、多くの多分化能を有する幹細胞(皮膚幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、ES細胞)に対しても認められ、更に、幹細胞から神経分化誘導された細胞を神経疾患モデル(パーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞)動物に移植して神経を再生させることにより症状の改善を認めており、移植した細胞が脳・脊髄内で神経細胞へ分化していることを確認した。また、このVHLに由来する神経分化誘導ペプチドの配列は、elonginBCに結合する蛋白群(BC-box motif)の1つであることから、BC-box motifは幹細胞から神経細胞への分化誘導の共通のドメインであることが示唆された。これらの知見から、BC-box motif配列を持つ機能性ペプチドを用いた神経再生医療が将来的に臨床応用されることが期待できる。本研究では、すでに蛋白全体として、神経幹細胞からの神経分化誘導機能が明らかにされているvon Hippel-Lindau腫瘍抑制蛋白(VHL)の内で、神経分化を誘導するドメインの候補としてVHLのリガンドであるelonginB/Cの結合部位のアミノ酸配列を考え、この部分の15個のアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、神経幹細胞へ導入すると、ニューロンへの分化が確認された。こうした神経分化誘導ペプチドの作用は、神経幹細胞のみならず、多くの多分化能を有する幹細胞(皮膚幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、ES細胞)に対しても認められ、更に、幹細胞から神経分化誘導された細胞を神経疾患モデル(パーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞)動物に移植して神経を再生させることにより症状の改善を認めており、移植した細胞が脳・脊髄内で神経細胞へ分化していることが確認できた。また、このVHLに由来する神経分化誘導ペプチドの配列は、elonginB/Cに結合する蛋白群(BC-box motif)の1つであることから、BC-box motifは幹細胞から神経細胞への分化誘導の共通のドメインであることが示唆された。これらの知見から、BC-box motif配列を持つ機能性ペプチドを用いた神経再生医療が将来的に臨床応用されることが期待できると考えられた。
北極海の海氷分布の変動とグローバルな天候の異変

近年の地球温暖化傾向を逆光するように、北日本では1980年以降冷夏による冷害が多発するようになってきた.これには地球規模の異常気象をもたらす大気大循環の変調が深く関係している.本研究ではまず北日本に冷夏をもたらす冷たい東北気流(ヤマセ)と大気大循環の変調との関係を調べた.ヤマセは,梅前線が日本列島の東方に張り出す時に,太平洋高気圧の一部がオホーツク海にのびてオホーツク海高気圧が形成されるために吹いてくる北東気流である.この時500hPa面高度(約5.5km上空)では,オホーツク海西方で偏西風が東北に分流している.詳しく調べるとこの偏西風(ジェット気流)の分流は,上層(1012km)では偏西風が南にあり(亜熱帯ジェット),下層(3km)では北(シベリア上空)にある時に発生している.この亜寒帯ジェットは暑夏には見られず,北極海・シベリア周辺の海氷面積や積雪面積に深く関係していることが示唆される.そこで人口衛星から観測された北極海の海氷分布と大気大循環の変動の関係を調べた.北極海ではカラ海・バレンツ海が最も北極点に近い氷海であり,暖候期(58月)には海氷面積の変動が最も大きな海域である.海氷面積と大循環の関係を合成図を作って調べてみると,バレンツ海周辺の海氷面積が例年より広い時にオホーツク海西方で偏西風が分流している.また500hPa面では偏西風が北上できずに南偏している.これらは典型的なヤマセ時の大循環場の特徴である.以上の結果は,北極海(カラ海・バレンツ海)の海氷分布がシベリア上空の亜寒帯ジェットの形成,中層の偏西風の分流,そしてヤマセの発生に深く関係していることを示唆している.近年の地球温暖化傾向を逆光するように、北日本では1980年以降冷夏による冷害が多発するようになってきた.これには地球規模の異常気象をもたらす大気大循環の変調が深く関係している.本研究ではまず北日本に冷夏をもたらす冷たい東北気流(ヤマセ)と大気大循環の変調との関係を調べた.ヤマセは,梅前線が日本列島の東方に張り出す時に,太平洋高気圧の一部がオホーツク海にのびてオホーツク海高気圧が形成されるために吹いてくる北東気流である.この時500hPa面高度(約5.5km上空)では,オホーツク海西方で偏西風が東北に分流している.詳しく調べるとこの偏西風(ジェット気流)の分流は,上層(1012km)では偏西風が南にあり(亜熱帯ジェット),下層(3km)では北(シベリア上空)にある時に発生している.この亜寒帯ジェットは暑夏には見られず,北極海・シベリア周辺の海氷面積や積雪面積に深く関係していることが示唆される.そこで人口衛星から観測された北極海の海氷分布と大気大循環の変動の関係を調べた.北極海ではカラ海・バレンツ海が最も北極点に近い氷海であり,暖候期(58月)には海氷面積の変動が最も大きな海域である.海氷面積と大循環の関係を合成図を作って調べてみると,バレンツ海周辺の海氷面積が例年より広い時にオホーツク海西方で偏西風が分流している.また500hPa面では偏西風が北上できずに南偏している.これらは典型的なヤマセ時の大循環場の特徴である.以上の結果は,北極海(カラ海・バレンツ海)の海氷分布がシベリア上空の亜寒帯ジェットの形成,中層の偏西風の分流,そしてヤマセの発生に深く関係していることを示唆している.海氷は太陽放射を反射し,融解するとき周囲から融解熱を奪う.このため,夏期の北極海は巨大な冷熱源となる.この冷熱源は北半球の夏の気候に大きな影響を与えていると予想されるので,本研究では北極海の海氷分布と大気循環の関連を詳細に調べた.夏期北極の寒気団は南下し,南の気団と熱交換を行なうが,南下の仕方は経度方向に一様ではない.高層気象データの解析によれば,北極気団は地形の影響を受けて主にベーリング海峡,カナダ北西地方,そして西シベリア平野の3ヶ所を通って南下している.このうち西シベリア平野付近の寒気の南下が通常より強い時は,上空5500mの大気大循環がこれらの場所でトラフとなる3波数循環を形成し,それに伴い極東域では偏西風が南北に分流して,海面高度ではオホーツク海周辺に高気圧が出現する.この様な状況下で,ベーリング海から流れ出た寒気は,北東気流ヤマセとなって北日本に押し寄せ,しばしば冷害をもたらす.マイクロ波放射計による人工衛星からの海氷密接度の観測データを解析すると,夏期の北極海の海氷分布は,バレンツ海・カラ海周辺で最も大きな変動を示す.バレンツ海周辺の海氷密接度(海氷面積)別に500hPa面高度の合成図を作成すると,海氷が広く分布している時には,大気は3波数循環となり,極東域で偏西風が南北に分流するヤマセ型の循環となる.この時850hPa面の気温分布から,北極の寒気の中心は極付近ではなくバレンツ海・カラ海周辺にあることがわかる.言い替えれば,バレンツ海・カラ海周辺に寒気の中心があり海氷が広く分布している夏は,大気循環は3波数型となり,極東域で偏西風の分流が生じてヤマセが吹き易い状況となることが明かとなった.

近年の地球温暖化傾向と逆行するように,北日本では1980年以降冷夏による冷害が多発するようになってきた.これには地球規模の異常気象をもたらす大気大循環の変調が深く関係している.本研究ではまず北日本に冷夏をもたらす冷たい北東気流(ヤマセ)と大気大循環の変調との関係を調べた.ヤマセは,梅前線が日本列島の東方に張り出す時に,太平洋高気圧の一部がオホーツク海にのびてオホーツク海高気圧が形成されるために吹いてくる北東気流である.この時500hPa面高度(約5.5km上空)では,オホーツク海西方で偏西風が南北に分流している.詳しく調べるとこの偏西風(ジェット気流)の分流は,上層(1012km)では偏西風が南にあり(亜熱帯ジェット),下層(3km)では北(シベリア上空)にある時に発生している.この亜寒帯ジェットは暑夏には見られず,北極海・シベリア周辺の海氷面積や積雪面積に深く関係していることが示唆される.そこで人工衛星から観測された北極海の海氷分布と大気大循環の変動の関係を調べた.北極海ではカラ海・バレンツ海が最も北極点に近い氷海であり,暖候気(58月)には海氷面積の変動が最も大きな海域である.海氷面積と大循環の関係を合成図を作って調べてみると,バレンツ海周辺の海氷面積が例年より広い時にオホーツク海西方で偏西風が分流している.また500hPa面では偏西風が北上できずに南偏している.これらは典型的なヤマセ時の大循環場の特徴である.以上の結果は,北極海(カラ海・バレンツ海)の海氷分布がシベリア上空の亜寒帯ジェットの形成,中層の偏西風の分流,そしてヤマセの発生に深く関係していることを示唆している.
新規なピロール系三脚配位子を用いた混合原子価多核錯体の創成

1.三核銅クラスター構築のための混合三脚配位子の分子設計と合成:マルチ銅酸化酵素の構造モデルとしてキノリルジピリルメタンの種々の誘導体から三核銅錯体を合成し、その構造と電子状態との関係についてX線結晶構造を基にして詳細な議論を行った。特に、低温のX線結晶解析からキノリル基の動的挙動を明らかにした。構造的により良いモデルの合成に関しては現在進行中である2.ピロールを含む非対称混合三脚配位子の合成: 2,3,4-トリメチル-5-エトキシカルボニルピロールの2位メチル基を臭素化して得られる臭化物と種々のアミンとの反応について検討を加え、ビス(ピロリルメチル)ピリジルメチルアミン、ビス(ピロリルメチル)ベンジルメチルアミン、および、ビス(ピリジルメチル)ピロリルメチルアミン等の新規配位子を得ることができた。3.混合三脚配位子と銅(II)との錯体形成反応:今回合成した新規なビス(ピロリルメチル)アミン配位子のピロール部のα位にはエトキシカルボニル基が置換している。このカルボニル酸素はピロール窒素と同時にキレート配位する場合もあるが、配位圏外に位置して水素結合部位として機能することを明らかにした。ベンジル体では水分子が配位結合と2点の水素結合によって捕捉された銅錯体が得られたが、同様に配位水を有する構造を持つ錯体は亜鉛、コバルトでも得られた。特にピリジルメチル体と銅との錯体形成では、この配位水が活性化された結果として、Cu(II)-O-Cu(II)構造を持つ4核銅錯体が得られた。この4核錯体の磁化率測定の結果、4つの銅(II)の間の興味ある相互作用が示唆されたので、その詳細な解析を行い、金属集積化による機能の開発に結びつけたい。また、これらの錯体は加水分解酵素のモデルと考えられるものであり、これを利用した金属触媒の開発は今後の検討課題である。
マツノマダラカミキリのアイソザイムによる地方個体群の系統分析

マツ類の枯損被害は依然としてわが国で最大の森林病虫害であり,病原のマツノザイセンチュウは北米からの侵入病害であることが明らかである。病原線虫に関してはマツノザイセンチュウ及び近縁種の世界的な分布,病原性,形態等の解析が交配実験やDNA解析等を通じて進み,材線虫種群間の地方変異性等の関係が明らかになりつつある。このような基礎的研究を基に原産地における抵抗性発現機構や天敵の働きが明らかになり,侵入地での防除に画期的な展開が期待できるようなった.これに対し,媒介昆虫,マツノマダラカミキリは日本の在来種で広く東アジアにも分布することは古くから知られているが,媒介昆虫としてマツ枯損防止に関わる生理生態的特性の地方変異性等はほとんど知られていない。効果的な枯損防除には媒介昆虫の各地域における生活史特性の把握が肝要である。被害は近隣諸国にも及び防除や被害拡大防止にはに国際的協力が必要な時代になった.各地域における本種の生理生態的な特徴や系統的な相互関係などを解明しておくことが重要となり,エステラーゼアイソザイムによる系統解析を,国内および30産地の成虫・幼虫を対象に行った.海外からは南京,広州,台湾産を森林総研で継代飼育中のものを用いた。国内産の間では形態的な差異はほとんど認められないが,海外産では前胸背の赤色紋が鮮明である。成長発育生理に関しては台湾産は非休眠性で,発育零点も極めて高い。国内でも北方産ほど有効積算温量は少なく,偏差が大きい。アイソザイムに関しては国内産と中国産とでザイモグラフパターンに明らかに差が認められた。国内産の間では明らかな差はないが,地域によっては特徴のあるパターンを示すものもあった。現在のわが国の地方個体群の分布は,長年にわたる人為的なマツ被害丸太の移動によって大幅に攪乱されて全国的に均質化していることを示すものと考えられる.邦産と中国・台湾産とは亜種相当の違いがあることを示唆している.マツ類の枯損被害は依然としてわが国で最大の森林病虫害であり,病原のマツノザイセンチュウは北米からの侵入病害であることが明らかである。現在のわが国の地方個体群の分布は,長年にわたる人為的なマツ被害丸太の移動によって大幅に攪乱されて全国的に均質化していることを示すものと考えられる.邦産と中国・台湾産とは亜種相当の違いがあることを示唆している.(1)生体試料の収集供試する地方個体群の収集についてほぼ見通しがついて。すなわち、各地方ごとに国公立試験研究機関あるいは行政機関と連絡をとり、マツノマダラカミキリの主として幼虫を採集する準備を完了した。(2)生体試料の取り扱いマツノマダラカミキリ生体試料の取り扱いについて、採集、飼育、保存、酵素の抽出等について最適な手順・方法を検討した。虫態ステージに関しては、卵および幼虫が採取効率がよく、またその後の取り扱いに便利であることが判明した。(3)マツノマダラカミキリにおけるアイソザイム分析技術の確立4つの成育ステージ(卵、幼虫、蛹、成虫)、3種類の抽出液および24酵素種の染色液によるアイソザイム分析の予備実験を行った。その結果、成育ステージが進むにつれ泳動像が不鮮明になる傾向があり、卵において最も鮮明な泳動像が得られた。また、用いた3種類の抽出液の違いによっても泳動像に多少の差がみられた。さらに、分析した24酵素種のうち6酵素種(EST、AAP、PGM、MDH、6PDおよびPGI)において比較的鮮明な泳動像が得られ、個体間に多型が確認された。代表者の勤務先変更に伴い研究環境が変わったため,取りあえず酵素種をエステラーゼに絞ることにした。

供試昆虫の収集,飼育管理については千葉県他数県,約10地方の国内個体群を集めることができ,海外産では森林総合研究所で輸入して継続飼育中の台湾及び中国産3産地のマツノマダラカミキリを供試することが出来た。活性染色を行うため非変成ポリアクリドアミドゲルを用いた。虫態別では幼虫,蛹,成虫,組織別では消化管,前胸部,全虫体等の活性の比較を行い,それぞれの最適蛋白質濃度を明らかにした。同じ虫態では同一地方個体群内でほぼ同一の像が得られたが,幼虫と成虫とでは異なった。産地間の比較では,中国産は日本産とは明らかに異なるパターンが得られ,形態(色)や休眠性の違いに対応した結果が得られた。マツ類の枯損被害は依然としてわが国で最大の森林病虫害で,その病原はかって北米から侵入したことが明らかにされている。病原線虫に関してはマツノザイセンチュウ及び近縁種の世界的な分布,病原性,形態等の解析が交配実験やDNA解析等を通じて進み,材線虫種群間の地方変異性等の関係が明らかになりつつある。これに対し,媒介昆虫,マツノマダラカミキリは日本の在来種で広く東アジアにも分布しているが,地方変異性等はほとんど知られていない。枯損防除は専ら媒介昆虫が対象で,効果的な防除に地域における生活史特性は最も重要である。材線虫侵入後は,本来ならば樹木の枯損には関わらない枝樹皮の摂食が自らの繁殖好適木を増やす結果となり,カミキリ-材線虫の共生群集はマツがなくなるまで増え続け,高密度を維持する。在来種ではあっても分布の様相は変化しており,近隣諸国に分布する本種との系統的な関係など変異性について,客観的な指標を基に区分することが必要である。そのためにアイソザイムによる系統分析を試みた。当初十数種類の酵素をとりあげたが、研究環境の変更もあって安定した多くの泳動像の得られるエステラーゼに絞って解析を行った。供試虫の産地は幼虫態で16,海外からは南京,広州,台湾の3カ所,成虫は国内23,海外1であった。国産では形態的な差異はほとんど認められないが,海外産では前胸背の赤色紋が鮮明である。台湾産は非休眠性である。国内産でも有効積算温量には地域による差異が認められた。アイソザイムに関しては,幼虫では国内産と中国産とで多くのバンドで出現に違いがあり,約100頭ずつの千葉・台湾産成虫を比較すると発現するバンドパターンに明らかに差があった。国内産の間では大差はないが,地域によっては特徴のあるパターンを示した。現在の地方個体群の分布は人為的なマツ被害丸太の移動によって大幅に攪乱されて全国的に均質化しており,そのためザイモグラフに共通点が多いといえよう。
石炭生物脱硫のチオ-ルペプチド促進吸着を利用した効率化

石炭の燃焼利用に伴って発生する硫黄化合物による酸性雨の発生源対策として,比較的産業基盤の脆弱な地域でも可能な,チオバチラス属またはスルフォロバス属細菌を用いた石炭脱硫技術を,(1)組換え体作成を通した微生物育種,および(2)野外での目的微生物検出に関する技術を開発することにより強化することを目的とした。(1)Thiobacillus thiooxidans(チオバチラスチオオキシダンス)の形質転換には,RSF1010由来のモビライザ因子mobとpUCt8由来のマルチグロ-ニングサイトを持つよう構築したpMOB2020を用いた。トランスコンジュゲ-ション法により,T.thiooxidansの形質転換体は作成できたが,T.versutus(チオバチラスベルスタス)では安定であったpMOB2020は,T.thiooxidansでは不安定であったため,ベクタ-の改良が必要であることが判明した。(2)微生物検出,同定のために,染色体のDNA配列のランダムネス測定手法を新たに考案した。この手法の骨子は,PCR(ポリメレ-スチェインリアクション)法で用いるプライマ-に許容される不適合度を利用することにある。まず,塩基数1020のプライマ-について,ランダム状態での反応生成物が生ずる期待値を確率論的に計算した。次いで任意のプライマ-対を設定し,デ-タベ-スGeneBankにてシミュレ-ションした。そのシミュレ-ション結果より,5対のプライマ-対を選択し,それらを用い大腸菌,シュ-ドモナス属細菌,チオバチラス属細菌等の染色体DNA配列のランダムネス測定を行い,各バクテリアを特徴づけた。これらの結果より,たとえ野外であろうと目的微生物を検出,同定できる手法の基盤が形成できた。
非喫煙者における、CYP2A6ならびにUGT1A7多型と肺癌リスクの関連の検討

今年度の研究では、癌原生化学物ベンツピレンの解毒酵素UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)1A7の遺伝的多型が肺がん発生リスクに及ぼす影響について、同じくベンツピレンの解毒酵素であるグルタチオンs-トランスフェラーゼ(GST)M1との関連をふまえた上で、日本人の非喫煙女性集団において検討した。平成9-13年度に行った「受動喫煙と肺がんに関する症例対照研究」において、薬物代謝にかかわる遺伝子の多型解析の承諾が文書により得られた人を対象として、UGT1A7についてはUGT1A7*1とそれ以外(*2または*3)、GSTM1については欠損型、非欠損型の判定を行った。遺伝的多型と肺癌発生リスクの関連については、年齢、調査地域、配偶者による受動喫煙について調整したロジスティック分析によるオッズ比とその95%信頼区間をもとに判定した。解析対象としたのは380人(症例157人、対照223人)で、配偶者の喫煙による受動喫煙歴をもつ割合は症例で67.9%、対照で66.2%であった。UGT1A7*1/*1を基準として、UGT1A*1を1本のみ有する集団、1本も有しない集団における肺癌罹患のオッズ比は各々1.20(0.78-1.84)、1.62(0.62-4.28)と上昇がみられたものの有意ではなかった。UGT1A7とGSTM1、ならびに両者の交互作用項を含むモデルを構築した場合、GSTM1欠損型のオッズ比は1.32(0.76-2.28)、UGT1A7*1が1本以下の集団のオッズ比は1.21(0.64-2.30)とやはり上昇を認めたが有意ではなかった。また、両者の交互作用はオッズ比1.04(0.45-2.41)であった。今回の研究では有意差を認めなかったが、UGT1A7,GSTM1の活性低下を伴う遺伝的多型は各々肺がん発生リスクを上昇させる方向にあり、両者の効果は相加的であることが考えられた。さらに大きな集団において解析することによりこれらの効果が有意となる可能性があり、GSTM1欠損型の集団の肺がん発生リスクにおけるUGT1A7多型の効果を中心にひきつづき検討が必要と思われる。今年度の研究では、ニコチンの代謝に関わる主要な酵素であるとともに、タバコ煙中に含まれる癌原性化学物質ニトロソアミンの代謝的活性化に関係するとされるチトクロームP450(CYP)2A6について、その活性喪失をきたす全欠損型遺伝的多型が肺がん発生リスクに及ぼす影響を、日本人の非喫煙女性集団において検討した。平成9-13年度に行った「受動喫煙と肺がんに関する症例対照研究」において、薬物代謝にかかわる遺伝子の多型解析の承諾が文書により得られた人を対象として、CYP2A6の遺伝的多型のうちwild-type(CYP2A6*1A、*1B)、deletion-type(CYP2A6*4C)について調べた。CYP2A6遺伝的多型と肺癌発生リスクの関連については、年齢、調査地域、配偶者による受動喫煙について調整したロジスティック分析によるオッズ比とその95%信頼区間をもとに判定した。解析対象としたのは322人(症例127人、対照195人)で、配偶者の喫煙による受動喫煙歴をもつ割合は症例で70.9%、対照で66.1%であった。累積受動喫煙時間の中央値と範囲は症例で3,264(0-145,152)時間、対照で1,572(0-282,240)時間であった(P=0.252)。CYP2A6遺伝的多型と配偶者の喫煙による累積受動喫煙時間の関係では、全欠損型多型をもつ場合に受動喫煙を避ける傾向は認められなかった(P=0.666)。CYP2A6遺伝的多型と肺がんリスクに関して、*1A/*1Aを基準とした場合の*4C/*4Cにおける肺癌罹患のオッズ比は単変量で0.56(0.15-2.06)、多変量で0.58(0.16-2.18)と低下がみられたものの有意ではなかった。全欠損型多型をもたない集団、全欠損型ヘテロ、全欠損型ホモの3群に分けた場合のオッズ比は単変量でヘテロ0.98(0.60-1.59)、ホモ0.60(0.18-1.97)、多変量でヘテロ0.91(0.55-1.51)、ホモ0.62(0.18-2.05)と、やはり有意な低下は認めなかった。今回の研究では、非喫煙女性において、CYP2A6遺伝的多型と肺がんリスクの間には有意な関連を認めなかった。ただし全欠損型多型は肺がんリスクを低下させる方向にあり、メタアナリシスなど検出力を高める方法により、CYP2A6遺伝的多型や環境要因との相互作用について検討する価値があるものと思われる。

平成9-13年度に行った「受動喫煙と肺がんに関する症例対照研究」において、薬物代謝にかかわる遺伝子の多型解析の承諾が文書により得られた人を対象として、UGT1A7についてはUGT1A7*1とそれ以外(*2または*3)、GSTM1については欠損型、非欠損型の判定を行った。遺伝的多型と肺癌発生リスクの関連については、年齢、調査地域、配偶者による受動喫煙について調整したロジスティック分析によるオッズ比とその95%信頼区間をもとに判定した。解析対象としたのは380人(症例157人、対照223人)で、配偶者の喫煙による受動喫煙歴をもつ割合は症例で67.9%、対照で66.2%であった。UGT1A7*1/*1を基準として、UGT1A*1を1本のみ有する集団、1本も有しない集団における肺癌罹患のオッズ比は各々1.20(0.78-1.84)、1.62(0.62-4.28)と上昇がみられたものの有意ではなかった。UGT1A7とGSTM1、ならびに両者の交互作用項を含むモデルを構築した場合、GSTM1欠損型のオッズ比は1.32(0.76-2.28)、UGT1A7*1が1本以下の集団のオッズ比は1.21(0.64-2.30)とやはり上昇を認めたが有意ではなかった。また、両者の交互作用はオッズ比1.04(0.45-2.41)であった。今回の研究では有意差を認めなかったが、UGT1A7,GSTM1の活性低下を伴う遺伝的多型は各々肺がん発生リスクを上昇させる方向にあり、両者の効果は相加的であることが考えられた。さらに大きな集団において解析することによりこれらの効果が有意となる可能性があり、GSTM1欠損型の集団の肺がん発生リスクにおけるUGT1A7多型の効果を中心にひきつづき検討が必要と思われる。
脂肪肝切除後の分子病態解明と抗酸化能増強による易障害性、易転移性克服法の開発

【当該年度の研究内容】H30年度は、H29年度までに確立したラット脂肪肝モデルを用いて、1)肝温虚血再灌流障害の評価を行った。全身麻酔下で開腹し、脳動脈瘤クリップを用いて70%の部分温虚血を行い、閉腹した。麻酔覚醒後、飲食は自由とした。以下の時点で全身麻酔下で再開腹し、血液と肝組織をサンプリングしてAST/ALTおよび病理組織を評価した。1単開腹のみ(Control群)、245分温虚血終了時(EWI45群)、375分温虚血終了時(EWI75群)、445分温虚血→1時間再灌流終了時(I45/R1h群)、575分温虚血→1時間再灌流終了時(I75/R1h群)、675分温虚血→6時間再灌流終了時(I75/R6h群)。さらに、2)ラット70%肝切除モデルを確立した。また、3)ラット脂肪肝温虚血再灌流障害モデルにおいて質量分析イメージングを用いた評価を行った。4)肝癌細胞の培養を行った。【当該年度の研究結果】1)血中ALT、AST活性では、正常肝・脂肪肝ともにI75/R6h群でControl群と比べて有意に高値を示したが、脂肪肝では著明に上昇した。病理組織学的評価による傷害スコアはControl群とEWI45群、EWI75群では、それぞれ群間に有意差を認めなかった。I75/R6h群では正常肝・脂肪肝ともに高度のうっ血と空胞化を認めた。その傷害は脂肪肝で有意に増強した。さらに、脂肪肝の門脈周囲ではうっ血が非常に強く、ネクローシス途上の所見も確認された。2)安定した70%肝切除モデルを確立した。全例生存しえた。3)Lysophosphatidylinositol(LPI)は障害の程度に応じてASTやALTよりも、ごく早期に上昇することを見出し、脂肪肝における虚血再灌流障害のバイオマーカーとなりうる可能性があることがわかった。4)肝癌細胞を安定して培養しえた。肝発癌モデルおよび線維化モデルが確立できなかった。研究者が臨床業務の比重が多く、十分に時間を確保できなかった。発癌モデルに関して、免疫不全モデルを用いる。また、研究についても申請者のみならず大学院生とも連携をして進めていく。H29年度はラットを用いて以下のごとく、動物モデルを作成し、その治療法を検討・評価した。週齢7週の雄のSDラットを用いて、脂肪肝モデルは、2日間絶食後、高炭水化物食を3日間摂取させる方法で確立した。脂肪肝モデルとしては非常に安定した結果を得ることができた。ラットを上記処置後に1週間飼育した後、摘出した肝臓のオイルレッドO染色で、コントロール群ではほとんど脂肪滴が認められなかったのに対して、脂肪肝群では脂肪滴が形成された。なお、高炭水化物食を2日間摂取させる方法ではmicrosteatosisであったが、3日間摂取させるとはmacrosteatosisができた。肝重量比と脂肪滴面積比は、どちらもコントロール群と比較して脂肪肝群で有意に高値を示した。脂肪肝の線維化、発癌モデルに関しては薬剤の変更、投与量の変更などを行い検討したが安定した結果が得られず、いまだに難渋している。そのため、発癌モデルとしてラット肝癌細胞株を投与するモデルを検討している。そのためのラット肝癌細胞株の培養法の条件検討を行っているところである。また、ラット脂肪肝虚血再灌流モデルおよび肝切除モデル対しての水素ガス、硫化水素ナトリウムによる治療効果を検証した。質量分析イメージングおよび病理検査、肝酵素においての評価はできたが残念ながらサイトカインやケモカインなどメカニズムに関わる各種分子生物学的評価には至っていない。今後のさらなる検討を要する。また、肝線維化モデルおよび肝癌モデルに関しては確立できておらず、その治療効果の検証はまだできていない。線維化、肝癌モデルを作成できておらず、その評価・機序解析に至っていない。

I75/R6h群では正常肝・脂肪肝ともに高度のうっ血と空胞化を認めた。その傷害は脂肪肝で有意に増強した。さらに、脂肪肝の門脈周囲ではうっ血が非常に強く、ネクローシス途上の所見も確認された。2)安定した70%肝切除モデルを確立した。全例生存しえた。3)Lysophosphatidylinositol(LPI)は障害の程度に応じてASTやALTよりも、ごく早期に上昇することを見出し、脂肪肝における虚血再灌流障害のバイオマーカーとなりうる可能性があることがわかった。4)肝癌細胞を安定して培養しえた。肝発癌モデルおよび線維化モデルが確立できなかった。研究者が臨床業務の比重が多く、十分に時間を確保できなかった。H28年度はラットを用いて以下のごとく、動物モデルの作成、解析技術の確立を中心に実施した。1)脂肪肝モデル2)脂肪肝の線維化、発癌モデル3)正常肝の部分肝切除(PH)、Pringle法併用部分肝切除(P-PH)モデル脂肪肝モデルは、文献的に報告されてる種々の方法を用いて作成した。その結果、2日間絶食後、高炭水化物食を3日間摂取させる方法で、脂肪肝モデルとしては安定した結果を得ることができた。ラットに対する部分肝切除はすでに確立されているので、モデル作成は容易であった。MALDI-IMS法については、ラット温虚血再灌流モデルに対して行ったが、傷害の早期予測マーカーとなりうる脂肪酸を同定できた。脂肪肝の線維化、発癌モデルに関してはSolt & Farber法に準じ、2-Acetylaminofluoren (2-AAF; 0.02%含有食)、Diethylnitrosamine (DEN; 10-200 mg/kg ip.)を用いて現在、行っている最中であるが、線維化、発癌ともに安定した結果が得られず、確立できていない。なお、ラット脂肪肝虚血再灌流モデルおよび肝切除モデル対しての水素ガス、硫化水素ナトリウムによる治療効果を検証した。安定した脂肪肝動物モデルの確立と、脂肪肝の虚血再灌流、肝切除のモデルの安定化に時間を要したため、当初予定よりもやや遅れた。しかし、これらのモデル作成に並行して一般的な評価方法と質量分析イメージングの条件検討を行った。線維化モデルについては薬剤の変更、投与量の変更を行う。肝癌モデルについてはラット肝癌株を培養したのちに直接接種して作成することとした。発癌モデルに関して、免疫不全モデルを用いる。また、研究についても申請者のみならず大学院生とも連携をして進めていく。脂肪肝の線維化、発癌モデルがうまくいかないようであれば、先に脂肪肝モデルで循環腫瘍細胞(CTC)の存在状態を作成し、網羅的解析を行う。脂肪肝の線維化、発癌モデルが確立できておらず、その分子生物学的評価ができていないことによる。研究の進捗の遅れにより次年度使用額が生じた。線維化モデルおよび免疫不全マウスの購入のために使用予定。H28年度は動物モデルの作成、解析手法の確立が中心であったため、解析に至っていない。それゆえに、解析にかかる外注費や緒費用が支出されていないため。動物モデルから採取した検体の各種解析を行う。
担子菌ネナガノヒトヨタケにおける子実体形成の形態学的研究

担子菌ネナガノヒトヨタケにおける子実体形成の過程を、エネルギー産生の細胞小器管であるミトコンドリアの形態的・数的変化と関連付けて、動的形態学の立場で研究を行い、下記のような知見を得た。1.エネルギー産生状態にあるミトコンドリアを検出する細胞化学的方法として、DAB法が最適であることが分った。この方法は、ミトコンドリアに特異的な呼吸酸素の一種チトクローム・オキシダーゼの活性を3.3'-ジアミノ・ベンジジン(DAB)によって、オスミウム・ブラックとして検出するもので、活性のあるミトコンドリアは黒く染まる。2.上記の方法を用いて、子実体発生に伴うミトコンドリアの形態変化を調べた。栄養二核菌系細胞のミトコンドリアはヒモ状であり、この形態はごく若い子実体原基の構成細胞のミトコンドリアにも引き継がれている。原基の発生が進み、菌柄が分化すると、柄の上部と下部とでは、それを構成する細胞の外形やミトコンドリアの形態に明らかな変化が観察された。すなはち、柄下部は楕円形細胞から構成され、そのミトコンドリアはヒモ状であったが、成熟時に急激な伸長を行う柄上部細胞は円筒形となり、そのミトコンドリアは顆粒状に変形していた。さらに、成熟過程中の柄細胞のミトコンドリアは、上部・下部とも全て顆粒状となった。一方、菌傘を構成する細胞のミトコンドリアは、子実体発生の全過程を通して終始ヒモ状のままであった。3.菌柄伸長の著るしい柄上部では、伸長率に応じて細胞当りの活性ミトコンドリア数が増減したが、伸長しない柄基部では、ミトコンドリア数の変動は認められなかった。菌柄伸長に欠損のある変異子実体では、柄の上部は伸長しないにも拘らず、ミトコンドリア数は上記の正常子実体の場合とほぼ同傾向の増減を示した。すなはち、この変異体における菌柄伸長欠損は、ミトコンドリアと無関係である。
アテナイ公職者制度の研究

本年度も昨年に引き続き、古典期アテナイ(前5-4世紀)の公職者制度、特に財政における公職者の役割について、並びにヘレニズム期以降(前4世紀末以降)の公職者顕彰制度について研究を進めた。特に用いた史料は伝アリストテレス『アテナイ人の国制』やアッティカ法廷弁論といった文献史料、および決議碑文や会計報告碑文といった碑文史料である。加えて、本年度はアルカイック期(前8-6世紀)まで研究の射程を広げた。中でも、ソロンの改革(前6世紀初頭)以前のアテナイ社会や公職者制度を考える上で避けて通ることのできないゲノス(従来「氏族」と訳されてきた)の問題に関して研究を進めた。特に着目したのは「デーモティオーニダイ決議」ないし「デケレイエイス決議」と呼ばれる碑文史料である。この碑文はフラトリア(擬似的血縁原理に基づいたポリス下部集団)の3つの決議を記録したものであるが、従来アルカイック期のアテナイ社会を知るための手がかりとされてきた。2017年3月に歴史学研究会西洋古代史部会例会における口頭報告では、上記決議碑文の解釈のための前提に関するE.Carawanの新説を検討した。そして、アルカイック期アテナイ社会、公職就任を含めたゲノス成員の政治的権力の様相についての見通しを示した。また、京都大学にて開催されたギリシア碑文研究会に参加した。来日中だった外国人研究者も参加しており、碑文学に関する世界レベルの最新の研究成果を学ぶことができた。国内の各種学会・研究会にも積極的に参加した。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は、研究対象であるアテナイ公職者制度に関し、特に司法的側面に着目して研究を行った。特に利用した史料は、伝アリストテレス『アテナイ人の国制』、アッティカ法廷弁論、アリストパネス喜劇、トゥキュディデスやプルタルコス『対比列伝』といった叙述史料、前5-4世紀の碑文史料等であり、合わせて関連する英語・仏語・独語の研究文献も参照した。そうした研究の成果の一部として、アテナイの公職者、特に五百人評議会と深い関わりをもつエイサンゲリア(弾劾裁判)と呼ばれる訴訟手続きについて、2度にわたって研究報告を行った。この研究報告は、エイサンゲリア手続きに関し、特に2001年に公刊されたフランスの古典学者ルイ・ジェルネの遺稿で展開された議論をベースにしながらも、それをさらに発展させるかたちで論じたものであり、従来のアテナイ裁判手続きに関する通説的理解を大きく覆すものであると考えている。また、本研究の対象と密接な関わりをもつアテナイ財政制度に関する英語文献の書評を執筆し、当該年度中に掲載された。さらに、平成26年6月には京都大学図書館にて、伝アリストテレス『アテナイ人の国制』パピルス断片のファクシミリを閲覧・調査したほか、同年8月にはギリシアおよびイギリス・オックスフォード大学にて研究調査を行った。現地の考古学的遺物・碑文を実見し、日本では入手不可能な文献を閲覧するとともに、国外の研究者と自身の研究について議論し、有益な助言を得ることができた。平成27年度は、研究対象であるアテナイ公職者制度に関し、前年度に引き続いて司法的側面について分析を進めるとともに、古典期(前5-4世紀)からヘレニズム期(本年度は前2世紀まで)にかけての公職者顕彰、および財政制度に関し研究を行った。用いた史料としては、伝アリストテレス『アテナイ人の国制』、法廷弁論、喜劇、プルタルコス『対比列伝』といった文献史料に加え、特に顕彰や財政については、決議碑文や公職者会計文書といった碑文史料が挙げられる。さらに、合わせて関連する英・独・仏の研究文献を参照した。また、近年いわゆる「アルキメデス・パリンプセスト」の解読によって発見され、本研究とも深い関わりをもつ弁論家ヒュペレイデスの新断片についても研究を行った。その成果の一部として、同断片のイントロダクション・日本語訳注を執筆(共著)し、2016年5月に公刊されることとなった。これは、新断片はもとより、従来知られていた作品を含め、ヒュペレイデスの弁論についての初の日本語訳である。さらに、2015年8-9月には、イギリス・オックスフォード大学およびギリシア・アテネに滞在した。前者では日本では入手困難な文献の閲覧・収集を行うとともに、同大学の研究者と面会し、自身の研究について有益な助言を得ることができた。後者においては、現地で碑文をはじめとする考古学的史料について実見調査を行った。また、京都大学において開催された碑文学の研究会に出席し、碑文学についての知見を深めることができた。本年度は研究対象を広げ、前年度に比して特に碑文史料の分析を進めることができた。また夏期のイギリス・ギリシアでの研究調査の折には、文献収集や碑文の実見調査などを予定通り進めることができた。研究成果の公刊に関しても、ヒュペレイデス新断片の翻訳(共著)が公刊される運びとなった。中でも、ソロンの改革(前6世紀初頭)

以前のアテナイ社会や公職者制度を考える上で避けて通ることのできないゲノス(従来「氏族」と訳されてきた)の問題に関して研究を進めた。特に着目したのは「デーモティオーニダイ決議」ないし「デケレイエイス決議」と呼ばれる碑文史料である。この碑文はフラトリア(擬似的血縁原理に基づいたポリス下部集団)の3つの決議を記録したものであるが、従来アルカイック期のアテナイ社会を知るための手がかりとされてきた。2017年3月に歴史学研究会西洋古代史部会例会における口頭報告では、上記決議碑文の解釈のための前提に関するE.Carawanの新説を検討した。そして、アルカイック期アテナイ社会、公職就任を含めたゲノス成員の政治的権力の様相についての見通しを示した。また、京都大学にて開催されたギリシア碑文研究会に参加した。来日中だった外国人研究者も参加しており、碑文学に関する世界レベルの最新の研究成果を学ぶことができた。国内の各種学会・研究会にも積極的に参加した。平成26年度は、研究に関連する史料・研究文献の収集および読解を予定通り進めることができた。また、ギリシアおよびイギリス・オックスフォード大学においては文献収集の他、日本では研究困難な考古学的・碑文学的知見を得ることができ、現地の研究者からの助言も得られた。研究成果の公表に関しても、2度の学会発表において、アテナイ裁判手続きに関する新たな知見を提示することができた。平成26-27年度は、特にアテナイ公職者の司法・財政・顕彰といった側面に焦点を当て、特に古典期からヘレニズム期にかけての時代を研究してきたため、28年度は公職者制度の他の側面まで研究対象を広げ、時代的にもアルカイック期までを含めていきたいと考えている。さらに、26年度に行った学会報告を基にした論文については、27年度中の投稿に至らなかったため、28年度中の公刊を目指していきたい。また、26-27年度におこなった海外での研究調査についても、継続して行っていきたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は特に司法的側面に着目して研究をすすめたため、今後はアテナイ公職者制度の他の側面についても研究を行い、その成果を積極的に公表していきたいと考えている。また、平成26年度に行った学会報告については当該年度中の論文公刊には至らなかったものの、既に論文としての骨格は有していると考えているため、論文執筆・投稿の準備を進め、平成27年度中の公刊を目指したい。さらに、現地ギリシアでの研究調査についても、継続して行っていきたい。
マイクロ空間制御分析による微粒子/溶液系の物質移動解析

マイクロメートル空間での溶液中の速い拡散を利用し,顕微分光法及び電気化学法を用いて,多孔性粒子系の化学・物理プロセスを計測する手法を確立し,クロマトグラフィーや固相抽出等に関連した多孔性微粒子/溶液系のポア・表面拡散,粒子表面での細孔への取り込み・放出過程,粒子外拡散等を定量的に解明することを目的とした。ジメチルホルムアミド-水混合溶媒系でクマリン102を分配平衡としたODSシリカゲル(粒径3マイクロメートル,細孔径12 nm)の単一粒子を,顕微鏡下で1064 nm Nd:YAGレーザーを用いて捕捉し,408 nm半導体レーザー光を高速シャッターで短時間粒子全体に照射することで色素を退色させ,低強度半導体レーザー光を用いて,周囲の溶液から微粒子に色素が取り込まれる過程を蛍光計測した。測定から得られた蛍光回復曲線を一次反応型として速度定数を算出したところ,ジメチルホルムアミドの割合に依存して,速度定数が変化した。この結果を粒子外拡散,粒子内拡散モデル等で解析・シミュレーションし,律速段階を解明できるようになった。また,ODSシリカゲル粒子(粒径3マイクロメートル,細孔径12 nm)から水相への,クマリン102(中性)とカチオン性及びアニオン性のクマリン誘導体の放出過程を検討した。分配平衡に達した単一ODSシリカゲル粒子を薄層セルの電極上でレーザー捕捉し,電解で溶液中の色素濃度を短時間でほぼゼロとし,単一粒子からの色素放出過程を蛍光強度の時間変化として計測した。放出過程は二成分の減衰で解析可能であり,粒子外拡散と粒子内拡散(ポア拡散と表面拡散)だけでは説明できない過程を観測した。平成30年度は,前年度に開発した手法を用いて,単一多孔性ODSシリカゲル微粒子/溶液系におけるクマリン誘導体の取り込み,放出過程の解析を行った。逆相クロマトグラフィーでしばしば行われるように,水相に有機溶媒を添加した混合溶媒系で物質移動過程を測定し,細孔内拡散等について明らかにしつつある。研究全体としては,おおむね順調に進展していると考えている。平成29年度に開発したレーザー捕捉法と顕微分光法,電気化学法を組み合わせた手法を用いて,多孔性粒子/溶液系における粒子外物質移動,粒子表面での細孔への取り込み・放出過程,細孔内での表面拡散とポア拡散等の関係を解明する。これら素過程にて得られた速度論的データから,クロマトグラフィーや触媒等,多孔性粒子が関係する物質移動過程を議論する。マイクロメートル空間での特徴的な拡散を利用し,分光学及び電気化学的に化学・物理プロセスを制御・計測する手法を確立し,クロマトグラフィーや固相抽出,触媒反応に関連した多孔性微粒子/溶液系のポア・表面拡散,粒子表面での細孔への取り込み・放出過程,粒子外物質移動等を定量的に解明することを目的とした。光学顕微鏡にCW-YAGレーザーの1064 nm光を導入し,溶液中で直径3マイクロメートルの球状オクタデシル化学修飾シリカゲル粒子(C-18,細孔直径12 nm)をレーザー捕捉できるようにした。408 nmの半導体レーザー光を捕捉レーザー光と同軸で導入し,単一粒子に分配したクマリン101色素の蛍光スペクトルが測定できるようにした。簡易共焦点光学ユニットを設置したところ,通常の色素濃度では測定困難であったが,3マイクロメートルの単一粒子であれば粒子中の全ての色素を光退色や電気分解でき研究目的は達成できるので,単一粒子の顕微蛍光測定で行うこととした。高強度半導体レーザー光を単一粒子全体に高速シャッターで0.1秒間照射できるようにした。これにより粒子中の全てのクマリン101を退色させることが可能となった。さらに,低強度半導体レーザー光を用いて,周囲の溶液から微粒子に色素が取り込まれる過程が0.2秒間隔で蛍光計測できるようにした。この手法を用いて,溶液相からC-18中に蛍光色素が10秒程度で分配する速度を観測できるようになった。細孔内拡散と粒子表面での細孔への取り込み及び粒子外物質移動を分離して議論するため,比較的大きなC-18粒子(直径4060マイクロメートル)の中心近傍のみを光退色させ,細孔内拡散のみ観測した。細孔内拡散をポア-表面拡散モデルで解析したところ,表面拡散で細孔内拡散が進行していることを明らかにした。平成29年度は,単一多孔性微粒子をレーザー捕捉しながら,(1)高強度のレーザー光で単一粒子の蛍光色素を短時間(0.1秒)で退色させ,周囲から微粒子に取り込まれる過程(蛍光回復する過程)を0.1秒の時間分解能で計測できる手法,(2)水相中の蛍光色素を電気分解し色素の粒子からの放出過程を計測できる新規手法開発を目指した。(1)は予定通り作製し,大きな粒子の内部測定による細孔内拡散速度と小さな粒子での取り込み速度を比較検討する段階まで研究が進み,当初の計画以上に進展している。(2)は電気分解とともに単一微粒子の蛍光強度が減少することを確認しているが,現在,十分な時間分解能での測定には至っていない。これらの理由で,研究全体としては,おおむね順調に進展していると考えている。

ジメチルホルムアミド-水混合溶媒系でクマリン102を分配平衡としたODSシリカゲル(粒径3マイクロメートル,細孔径12 nm)の単一粒子を,顕微鏡下で1064 nm Nd:YAGレーザーを用いて捕捉し,408 nm半導体レーザー光を高速シャッターで短時間粒子全体に照射することで色素を退色させ,低強度半導体レーザー光を用いて,周囲の溶液から微粒子に色素が取り込まれる過程を蛍光計測した。測定から得られた蛍光回復曲線を一次反応型として速度定数を算出したところ,ジメチルホルムアミドの割合に依存して,速度定数が変化した。この結果を粒子外拡散,粒子内拡散モデル等で解析・シミュレーションし,律速段階を解明できるようになった。また,ODSシリカゲル粒子(粒径3マイクロメートル,細孔径12 nm)から水相への,クマリン102(中性)とカチオン性及びアニオン性のクマリン誘導体の放出過程を検討した。分配平衡に達した単一ODSシリカゲル粒子を薄層セルの電極上でレーザー捕捉し,電解で溶液中の色素濃度を短時間でほぼゼロとし,単一粒子からの色素放出過程を蛍光強度の時間変化として計測した。放出過程は二成分の減衰で解析可能であり,粒子外拡散と粒子内拡散(ポア拡散と表面拡散)だけでは説明できない過程を観測した。平成30年度は,前年度に開発した手法を用いて,単一多孔性ODSシリカゲル微粒子/溶液系におけるクマリン誘導体の取り込み,放出過程の解析を行った。逆相クロマトグラフィーでしばしば行われるように,水相に有機溶媒を添加した混合溶媒系で物質移動過程を測定し,細孔内拡散等について明らかにしつつある。研究全体としては,おおむね順調に進展していると考えている。単一多孔性微粒子をレーザー捕捉しながら,高強度のレーザー光で単一粒子の蛍光色素を短時間で退色させ,周囲から微粒子に取り込まれる過程を計測できる手法開発は行えたので,微粒子への取り込み速度の混合溶媒効果,細孔サイズ効果について,詳細に検討する。水相中の蛍光色素を電気分解し色素の粒子からの放出過程を計測できる手法については,用いる電極の最適化等を行い,十分な時間分解能で測定できた場合は,微粒子からの放出速度を,上記と同じ観点から詳細に検討する。以上の研究結果をもとに,本手法の性能と有用性,多孔性粒子/溶液系における粒子外物質移動,粒子表面での細孔への取り込み・放出過程,細孔内での表面拡散とポア拡散等の関係を解明する。これら素過程の得られた速度論的データから,クロマトグラフィー等の多孔性粒子が関係する物質移動過程を考察する。平成29年度に開発したレーザー捕捉法と顕微分光法,電気化学法を組み合わせた手法を用いて,多孔性粒子/溶液系における粒子外物質移動,粒子表面での細孔への取り込み・放出過程,細孔内での表面拡散とポア拡散等の関係を解明する。これら素過程にて得られた速度論的データから,クロマトグラフィーや触媒等,多孔性粒子が関係する物質移動過程を議論する。