hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
選択的スプライシング依存的なシナプス形成制御の構造基盤

シナプス誘導を有する細胞接着因子であるシナプスオーガナイザーの細胞外ドメイン間のヘテロな複合体形成と選択的スプライシングによる相互作用制御の機構について、結晶構造解析、定量的相互作用解析、さらに培養神経細胞を用いたシナプス誘導解析を組み合わせた解析を行った。まずシナプスオーガナイザー複合体のうちLRRTMとニューレキシンとの複合体について、LRRTM2とそれに特異的に結合するニューレキシンのスプラシングバリアント(-S4バリアント)との複合体の結晶構造を決定した。次に、表面プラズモン共鳴による定量的相互作用解析と、共培養法によるシナプス誘導解析を行った。それらの結果、LRRTM2とニューレキシンはカルシウムイオンを介して相互作用しており、ニューレキシンの選択的スプライシングによるS4ペプチド挿入が相互作用を強く阻害することを明らかにした。また、ヒトに存在する4種のLRRTM(LRRTM1-4)のうち、LRRTM1, LRRTM2のみがニューレキシンと結合しうることを示した。また、同じくシナプスオーガナイザーであるIIa型プロテインホスファターゼの一つPTPδと、それと相互作用するSALMファミリータンパク質であるSALM2, SALM4との複合体のそれぞれの結晶構造を決定した。さらに、表面プラズモン共鳴による定量的相互作用解析と共培養法によるシナプス誘導解析を行った。PTPδとSALMは、二量体を形成したSALMに対して、PTPδが二分子結合した2:2の化学量論比からなる複合体を形成していた。SALMの二量体形成を阻害するような変異を導入したSALMではシナプス形成を誘導できないことから、SALMの二量体形成を軸とする新たなシナプス形成機構が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ヒト由来のLRRTMとNeurexinの細胞外ドメインの遺伝子をpEBMultiベクター(Wako Chemical)にクローニングした。この発現ベクターをヒト培養細胞(Expi cell, Invitrogen)に導入し、一過性で発現させた。発現させたタンパク質をNiカラムによって精製し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。精製した両者を混合して複合体を形成させて結晶化サンプルとした。さらに、微量自動結晶化装置を用いてシッティングドロップ蒸気拡散法によって結晶化を行い、結晶を得ることができた。得られた結晶の回折データを、大型放射光施設SPring-8やPhoton Factoryにて測定した。得られた回折データを基に、分子置換法によって構造解析を行ったところ、LRRTM単体の結晶であることが明らかになった。さらに構造精密化を行い、ヒト由来のLRRTMとして初めての構造解析に成功した。一方、SALM-RPTP複合体についても同様にヒト培養細胞を用いた発現系を構築し、同じくアフィニティー精製とゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。精製したサンプルを用いて混合して複合体を形成させ、結晶化を行い、様々な結晶を得ることに成功した。SPring-8やPhoton Factoryでの回折データ測定の結果、SALM単体について3.5 Å分解能の回折データと、複合体については4 Å分解能の回折データを得ることが出来た。それぞれについて類似分子の立体構造を基にした分子置換法によって位相決定に成功した。LRRTMとNeurexinについては、両者のサンプル調製と結晶化まで進める事が出来た。但し、得られた結晶はLRRTM単体のものであったため、複合体の調整も含めて更なる改善が必要である。一方、SALM-RPTP複合体についても同様に結晶化まで進展させる事が出来た。得られた回折データは十分に高分解能とはいえず、完全な精密化にまでは至っていないが、位相決定には既に成功しており、今後の結晶の改善で解決出来るものと期待される。今後は精密化をさらに進めると共に結晶を改善してより高分解能データの測定も行う。以上の結果を踏まえて、概ね順調に進展していると言える。昨年度は、SALMとPTPδとの複合体の結晶構造解析に成功した。立体構造に基づいた変異体を作製し、表面プラズモン共鳴による定量的な相互作用解析と、共培養によるシナプス形成解析を行い、相互作用に必須な残基を同定したと同時に、相互作用とシナプス形成の関連を示すことができた。また、SALM独自のメカニズムとして、SALMの二量体形成を新たに見出した。二量体化の阻害によって、PTPδとの複合体形成は影響を受けないにも関わらず、シナプス形成を著しく阻害することが明らかとなり、二量体化によるシナプス形成という新たなメカニズムを見出した。これらの結果をまとめて、Nat. commun.誌(Goto-Ito, S., 2018)に投稿した。一方、LRRTMとNeurexin (Nrxn)についても、複合体の結晶構造解析に成功した。同じく、立体構造に基づいた変異体解析によって、相互作用に必須な残基を同定すると共に、相互作用の阻害がシナプス形成に影響を与えることを明らかにした。構造とそれに基づく解析により、LRRTMとNrxnの相互作用がNrxnの選択的スプライシングによって制御されるメカニズムを明らかにした。また、立体構造から、LRRTMファミリーの中でLRRTM1とLRRTM2のみがNrnxと結合し、LRRTM3とLRRTM4はNrxnと結合できないことを予想し、実際に相互作用解析によりそれを証明した。現在、これらの結果をまとめ、論文投稿中である。

本申請は、二つのシナプスオーガナイザー複合体(SALM-PTPδ、LRRTM-Nrxn)について結晶構造解析と、それに基づいた相互作用解析及びシナプス形成解析を行い、複合体形成とそれによるシナプス形成の機構を明らかにすることを目的としている。現在までに、SALM-PTPδについては全ての解析が終了し、投稿論文の形で発表することができた。また、LRRTM-Nrxnについても現在論文投稿中であり、恐らく今年度中の発表が可能と思われる。以上より、(2)おおむね順調に進展している状況と言える。シナプス誘導を有する細胞接着因子であるシナプスオーガナイザーの細胞外ドメイン間のヘテロな複合体形成と選択的スプライシングによる相互作用制御の機構について、結晶構造解析、定量的相互作用解析、さらに培養神経細胞を用いたシナプス誘導解析を組み合わせた解析を行った。まずシナプスオーガナイザー複合体のうちLRRTMとニューレキシンとの複合体について、LRRTM2とそれに特異的に結合するニューレキシンのスプラシングバリアント(-S4バリアント)との複合体の結晶構造を決定した。次に、表面プラズモン共鳴による定量的相互作用解析と、共培養法によるシナプス誘導解析を行った。それらの結果、LRRTM2とニューレキシンはカルシウムイオンを介して相互作用しており、ニューレキシンの選択的スプライシングによるS4ペプチド挿入が相互作用を強く阻害することを明らかにした。また、ヒトに存在する4種のLRRTM(LRRTM1-4)のうち、LRRTM1, LRRTM2のみがニューレキシンと結合しうることを示した。また、同じくシナプスオーガナイザーであるIIa型プロテインホスファターゼの一つPTPδと、それと相互作用するSALMファミリータンパク質であるSALM2, SALM4との複合体のそれぞれの結晶構造を決定した。さらに、表面プラズモン共鳴による定量的相互作用解析と共培養法によるシナプス誘導解析を行った。PTPδとSALMは、二量体を形成したSALMに対して、PTPδが二分子結合した2:2の化学量論比からなる複合体を形成していた。SALMの二量体形成を阻害するような変異を導入したSALMではシナプス形成を誘導できないことから、SALMの二量体形成を軸とする新たなシナプス形成機構が示された。LRRTMとNeurexinについては、生化学的実験によってその結合にカルシウムイオンが必須である事を見いだした。今後は、カルシウムを含む形で複合体の形成と精製を再度行い、複合体での結晶化を行う。得られた結晶の回折データは、大型放射光施設SPring-8やPhoton Factoryにて測定し、昨年度解析したLRRTM単体の立体構造を用いた分子置換法によって構造解析を行う。SALM-RPTP複合体については、結晶の改善をさらに行う。必要に応じて結合に必要の無いドメインの削除や、ディスオーダー領域の切り詰めを行う。また構造解析によって結合に重要な残基を見いだし、その変異体を作製し、結合に及ぼす影響を表面プラズモン共鳴法によって解析する。
刺激応答性ロタキサン型分子シャトルの設計・合成および機能評価

移動(シャトル)可能な環状分子としてα-シクロデキストリン(α-CyD)およびβ-シクロデキストリン(β-CyD)、線状化合物内の光駆動部位および第1ステーションとしてアゾベンゼン基、第2ステーションとしてメチレン基、第3ステーションとしてプロピレン基、環状化合物の禁停滞部位としてビオローゲン基を持つ2種類のロタキサン(α-CyD1とβ-CyD2)を分子設計した。ここで、α-CyD1のストッパーは2,4-ジニトロベンゼン、β-CyD2のストッパーはアミノH酸誘導体である。α-CyD1を合成した。同定は^1H-NMRスペクトル、IRスペクトル、、紫外可視吸収スペクトル、円偏向二色性スペクトル及び元素分析により行い目的物であると判断した。紫外光照射前後、および温度可変前後の^1H-NMRスペクトル、紫外可視吸収スペクトル、円偏向二色性スペクトル測定を行った。その結果、1)紫外光照射によるアゾベンゼン部位のトランスーシス光異性化に伴い、α-CyDが第1ステーションであるアゾベンゼン部位から第2ステーションのメチレン部位へと移動する(しかしながら異性化率は立体障害のため数%である)、2)温度可変に伴い、α-CyDが第3ステーションであるプロピレン部位へと移動する、ことが分かった。この分子は、応答の違いによりステーションを変えることができる興味深い例である。α-CyD1ではα-CyDと線状分子のシス体との間の立体障害のため異性化率が低かった。そこでα-CyD1と同じ方法で合成した線状分子とβ-CyDおよびアミノH酸誘導体を反応させβ-CyD2の合成を試みた。しかしながら、得られた化合物は全ての溶媒に難溶であり、β-CyD2と同定するには至らなかった。環状分子及び移動(シャトル)分子としてα-シクロデキストリン、光駆動部位及び第1ステーションとしてアゾベンゼン基、第2ステーションとしてエチレンオキシド基、第3ステーションとしてプロピレン基、移動分子の障壁としてビオローゲン基そして末端ストッパーとしてジニトロフルオロベンゼン基を有するロタキサンを分子設計した。この分子は刺激を与えないと移動分子が第1ステーションであるアゾベンゼン基に停滞しているが、光刺激を加えるとアゾベンゼン基のトランス-シス異性化に伴い移動分子が第2ステーションであるエチレンオキシド基へと移動する。しかしながら立体障害などの理由により第3ステーションのプロピレン基には移動できない。熱刺激を加えることで初めて第3ステーションのプロピレン基まで移動可能となる。
離散構造を学習する並列知識発見しステムの開発

本課題では,離散構造を学習する並列知識発見システムの開発の研究を行ない,平成10年度は次の2つの結果を得た.1.大規模なデータベースから知識発見を行うときには,データベースの探索手法の開発とともに,データの見方であるビューの確立が必要である.本課題では,最初に,ビューの数学的定式化を行なった.それに基づいて,多種多様な構造を持つデタに対応できる複数の異なるビューを持った知識発見システムのプロトタイプを作成し,分子生物学的データベースを対象として並列計算機上で実験を行なった.従来のデータマイニングの枠組みでは,より複雑な構造を持つ自然科学のデータベースからうまく知識を得ることが難しい.そこで,我々は,ユーザがビューを自由に設計でき,また必要ならばユーザがプラグインとして新たなビューを追加できる新しい知識発見システムの開発を行った,2.本年度は,機能や構造が未知であるデータに対する知識発見方式の定式化に基づいて,項木言語の学習可能性について,昨年度に証明した結果の拡張を行った.これにより,タンパク質やRNAといったような離散構造を持つデータから自明でない特徴を見出すためのビューの確立を目指した.項木とは,変数を持つ辺にラベルを付した木である.これは,文字列パターンと同様に,その変数に任意の木を代入することで,ある複数の部分木を持つすべてのラベル付き木を表現することができる.キャタピラは,タンパク質やRNAのトポロジカルな構造を直感的に表現した木の部分クラスである.本年度は,キャタピラをベースとする項木をビューとして確立するために,昨年度の結果より広いクラスについて,キャタピラの項木言語の機械学習可能性を証明した,また,このビューを用いた知識発見システムを構築するにあたって,そのコアとなる多項式時間探索アルゴリズムのいっそうの効率化を行った.本課題では、離散構造を学習する並列知識発見システムの開発の研究を行い、平成9年度は次の2つの結果を得た。1、機能や構造が未知であるデータに対して、それらの機能や構造を説明するルールを発見する方式を、項グラフ言語の学習として定式化した。項グラフとは文字列におけるパターンを超グラフへ拡張したものであり、定数文字でラベル付けされた辺と変数文字でラベル付けされた超辺を持つ。項グラフは、その変数文字をラベルとして持つ超辺に任意のグラフを代入することにより、項グラフ言語を定義する。一方、たんぱく質やDNAの構造をグラフとして表現し、分子生物学的問題をグラフの問題として解いて成功した例もあるが、グラフとしての表現方法は確立しない。キャタピラとは、ある直線的な構造を持ったグラフの部分クラスでありたんぱく質やDNAのトポロジカルな構造をほぼ自明に抽出したものである。本課題では、データがグラフとして与えられたとき、その共通構造を項キャタピラとして出力する多項式時間アルゴリズムを与えた。さらに、項グラフ言語の部分クラスである項キャタピラ木言語のある部分言語が多項式時間帰納推論可能である事を示した。2、自然科学的データベースから知識を得るために2分決定グラフを用いた新しいデータマイニングの枠組みを構築した。大規模なデータから知識を発見するためには、その知識表現の確立とともに高速な探索アルゴリズムの開発が必要である。一般にデータマイニングと総称される知識探索技法は、商業分野で大きな成功を納めている。しかし、従来のデータマイニングの枠組みでは、より複雑な構造を持つ自然科学のデータベースからうまく知識を得ることが難しい。そこで、我々は2分決定グラフを用い、表現可能な知識発見システムのプロトタイプを作成し、大腸菌のDNAを対象として計算機実験を行った。本課題では,離散構造を学習する並列知識発見システムの開発の研究を行ない,平成10年度は次の2つの結果を得た.1.大規模なデータベースから知識発見を行うときには,データベースの探索手法の開発とともに,データの見方であるビューの確立が必要である.本課題では,最初に,ビューの数学的定式化を行なった.それに基づいて,多種多様な構造を持つデタに対応できる複数の異なるビューを持った知識発見システムのプロトタイプを作成し,分子生物学的データベースを対象として並列計算機上で実験を行なった.従来のデータマイニングの枠組みでは,より複雑な構造を持つ自然科学のデータベースからうまく知識を得ることが難しい.そこで,我々は,ユーザがビューを自由に設計でき,また必要ならばユーザがプラグインとして新たなビューを追加できる新しい知識発見システムの開発を行った,2.本年度は,機能や構造が未知であるデータに対する知識発見方式の定式化に基づいて,項木言語の学習可能性について,昨年度に証明した結果の拡張を行った.これにより,タンパク質やRNAといったような離散構造を持つデータから自明でない特徴を見出すためのビューの確立を目指した.項木とは,変数を持つ辺にラベルを付した木である.これは,文字列パターンと同様に,その変数に任意の木を代入することで,ある複数の部分木を持つすべてのラベル付き木を表現することができる.キャタピラは,タンパク質やRNAのトポロジカルな構造を直感的に表現した木の部分クラスである.本年度は,キャタピラをベースとする項木をビューとして確立するために,昨年度の結果より広いクラスについて,キャタピラの項木言語の機械学習可能性を証明した,また,このビューを用いた知識発見システムを構築するにあたって,そのコアとなる多項式時間探索アルゴリズムのいっそうの効率化を行った.
札幌扇状地の伏流水を利用した暖冷房システムの実現可能性調査

本研究は,主要地域が豊平川扇状地に位置している札幌に適したエネルギーシステムとして,扇状地特有の河川伏流水を用いた暖冷房システムの構築の可能性を検討するものであり,研究実施計画に基づいて本年度得られた主たる研究成果は以下の通りである.1.札幌における既存の地下水観測井戸における測定値の収集及び整理を行い,札幌扇状地の不圧地下水流動系の広域的な把握を行った結果,札幌は広範囲にわたって,極めて豊富な高流速の伏流水が存在する可能性が高いことが示唆された.2.地下熱利用のための基礎資料の作成を目的として,地中温度・不圧地下水位等の長期定点測定を実施した.地中温度の測定は,過去に例の少ない不易層到達深度にて行われ,不圧地下水位の変動特性及び不易層温度に関するデータベースを構築した.3.熱水分同時移動,粘性圧縮現象による積雪の変成過程,凍結・融解現象を考慮した積雪寒冷地に適用可能な地中温度シミュレーターを作成し,実測値との比較を行った結果,地中温度,積雪深等の計算値は,実測値を比較的良く再現することを示した.4.扇状地の伏流水を利用した暖冷房システムの設計フローを構築するとともに,伏流水の影響を考慮した地中熱交換器の熱解析モデルを作成し,地下水の流速,凍土形成,土壌の熱伝導率等の要因が採熱量に及ばす影響を示した.以上により,札幌扇状地の伏流水の広域的な流動系,地中熱環境に関するデータベースが構築され,暖冷房のための地中熱交換器の敷設規模の原単位が札幌について明らかになった.本研究は,主要地域が豊平川扇状地に位置している札幌に適したエネルギーシステムとして,扇状地特有の河川伏流水を用いた暖冷房システムの構築の可能性を検討するものであり,研究実施計画に基づいて本年度得られた主たる研究成果は以下の通りである.1.札幌における既存の地下水観測井戸における測定値の収集及び整理を行い,札幌扇状地の不圧地下水流動系の広域的な把握を行った結果,札幌は広範囲にわたって,極めて豊富な高流速の伏流水が存在する可能性が高いことが示唆された.2.地下熱利用のための基礎資料の作成を目的として,地中温度・不圧地下水位等の長期定点測定を実施した.地中温度の測定は,過去に例の少ない不易層到達深度にて行われ,不圧地下水位の変動特性及び不易層温度に関するデータベースを構築した.3.熱水分同時移動,粘性圧縮現象による積雪の変成過程,凍結・融解現象を考慮した積雪寒冷地に適用可能な地中温度シミュレーターを作成し,実測値との比較を行った結果,地中温度,積雪深等の計算値は,実測値を比較的良く再現することを示した.4.扇状地の伏流水を利用した暖冷房システムの設計フローを構築するとともに,伏流水の影響を考慮した地中熱交換器の熱解析モデルを作成し,地下水の流速,凍土形成,土壌の熱伝導率等の要因が採熱量に及ばす影響を示した.以上により,札幌扇状地の伏流水の広域的な流動系,地中熱環境に関するデータベースが構築され,暖冷房のための地中熱交換器の敷設規模の原単位が札幌について明らかになった.
数学教育における「学校知」の形成過程に関する実証的研究

本研究は,数学の授業において「学校知」が形成されてゆくプロセスの一端を,実際の授業を観察し,そこにおいて反復して生起する社会的相互作用のパターン,あるいはそのパターンの背後にある暗黙のルールを記述するとともに,そのような組織的なパターンが教師と生徒の相互作用的作業によって安定したルーティンとして社会的に構成される過程を,構成的エスノグラフィーという方法論を用いて実証的に明らかにすることを目的とした。この目的に鑑み,金沢大学附属小学校第一,第四,第五学年の算数の授業を週3回,第三学期のみ非参与観察をする。各授業をビデオ記録し,各授業ごとにそのプロトコールを作成した。分析方法は,まず,2か月間の授業のプロトコールから,特に教師が相互作用を執拗にネゴシエ-トする場面や,生徒の授業参加をする上でのルール違反が制裁される場面に注目しながら「学校知」の特質とその形成過程に関する仮設を抜き出した・次に,これらの仮設を以後の授業の相互作用において説明できるかを吟味しながら、当初の仮設を修正,棄却しながらより妥当性のある命題に洗練していった。その結果,それぞれのクラスにつき、「学校知」の形成上,影響があると考えられる教師と児童との相互行為の特徴の一端が見いだされた。
II-VI族化合物半導体中の3d遷移金属不純物の電子状態-物質設計-

不純物と母体原子を含む単位胞を無限に並べたス-パ-セル法と密度汎関数法に立脚したノルム保存型擬ポテンシャル法とによって、結晶構造や対称性を仮定することなく不純物原子と母体原子を原子レベルで動かしながら電子状態や結晶構造を非経験的にきめるDynamical Simulated Annealing(DSA)法と呼ばれる計算方法の開発を行った。DSA法では、非経験的分子動力学法に基づいて格子緩和の最適化と電子状態の計算を同時に行なう。青色発光ダイオ-ドの開発に必要なp型ZnSeをつくる場合に問題になっているLiをアクセプタ準位の候補として選び、DSA法を用いてZn置換位置周辺でのLiの移動エネルギ-と構造安定性を計算し、Liアクセプタとしての不安定を解明した。考慮した不純物系に対して計算された全エネルギ-を比較すると、Li_<zn>→Li_i+V_<zn'>の反応に必要なエネルギ-は電荷の移動を考えない場合1.5eVである。ここで、Li_<zn>、Li_<zn>はそれぞれZn位置、格子間位置にあるLiを表し、V_<zn>はZn位置の原子空孔を表す。電荷の移動とp型の化学ポテンシャルを考慮すると、Li_iからV_<zn>への電荷の移動により約3eVのエネルギ-利得が期待される。したがって、Li_<Zn>はLi_i^+とV_<Zn>の形成に関して不安定になると結論することができる。低温でド-プされたLiが、室温ではアクセプタ中心としては不安定であるのはこのためであると考えられる。
カチオンラジカルの構造歪みと結合伸縮交替のダイナミックス

1.野外観測結果の地中温度,地中熱流量の測定データを基に地中熱フラックスの解析を行なった。その結果,夏季は日変化はあるものの平均的には深度60cmまで下向きの熱フラックスが見られ、秋季には深度60cmと30cmの間に熱の収束面があることが分った。炭化水素の骨格炭素の一個を炭素と同族の第IVb族元素に置換した化合物を低温固相マトリックス中でイオン化放射線で一電子酸化してカチオンラジカルを生成し、その電子構造およびダイナミックスを電子スピン共鳴(ESR)分光法で観測した。研究実績の概要は次の三項目にまとめられる。1.シクロブタンの骨格炭素を一個ケイ素に置換したシラシクロブタン(cSiC3)系カチオンラジカルの電子構造およびダイナミックスに関する研究を行なった。選択的に重水素およびメチル基を導入した試料を用いて、ESRスペクトルの確実な解析を行い、また高精度な磁気パラメータを得ることに成功した。その結果、中性分子は非平面C_s構造をとるが、一電子酸化で生成するカチオンラジカルの極限構造はSi-C結合の一方が伸び、非対称に歪んだC_1構造をとることが解った。さらに、等価な二つの非平面C_1構造間で四員環の反転を観測できた。環反転の速度定数の温度変化を評価し、さらに環反転の活性化エネルギーを評価すると1Kcal/mol以下と小さな値が得られた。4Kの低温でも環の反転がおきることより、量子力学的トンネル機構が示唆される。2.シクロヘキサン骨格炭素の一個をケイ素に置換したシラシクロヘキサン(cSiC5)は、一電子酸化を受けると、中性の椅子型C_s構造からSi-C結合の一方が伸び、非対称に歪んだC_1構造に変化することが解った。さらに、4Kの低温でも、二つのSi-C結合間で結合伸縮交替が観測でき、この現象も量子効果で説明可能である。3.IVb族元素を中心原子(M)とするテトラメチル化合物、M(CH_3)_4、カチオンラジカルは中心原子(M)が炭素、ケイ素、ゲルマニュムおよびスズのとき、各々、C_3_v、C_2_v、C_2_vおよびC_3_v構造をとることが解った。これらの成果の一部は、昨年秋の討論会(分子構造、ESR,放射線化学)にて口頭発表し、また学会誌に報告した[Chem,Phys,Lett 188,93-99(1992);200,580-86(1992)]。
絵画制作者としての公家の基礎的研究－江戸時代中後期を中心に－

本研究は、江戸時代中期および後期の公家がどのような絵画表現を試みていたのかを明らかにすることを目的とした。その結果、100名を超える公家が絵画制作に携わり、約200点の現存作例を確認した。作例は人物、山水、花鳥画など広範囲の画題を確認した。またその表現は、江戸時代中期に活動した公家は、狩野派や土佐派などの表現を採る者が多くいた。江戸時代後期になると、土佐派や狩野派に加えて、新興の流派ではあるが、広く人々に受け入れられた円山派、四条派、岸派、南蘋派などの新たな表現を取り入れた公家の作品が多数確認できた。よって絵画を手掛けた公家は、同時代の絵画表現の動向に機敏であったことが明らかとなった。本課題は、江戸時代中期および後期における公家の作画活動の概要を把握することを主目的としている。まずは作画した公家がどれだけいるのかを確認すべく、江戸時代から昭和初期にかけて発刊された画家人名録を中心に抽出・集成を行い、約100名を把握した。続いて江戸時代に発刊された書画展観録を調査し、絵画の公開に応じていた公家の存在の確認を進めた。これにより10名ほどの確認ができ、この作業からは嗜みとしての絵画制作を越えた活動を行っていた公家の存在を明らかにすることができた。文献からの調査と並行して作品の調査や把握も進めた。図録や美術書籍、売立目録などの書籍からは、海外所在の作品があることも確認した。実作品の調査も行い、約50点ほどを実見することができ、図書資料と合わせて約100点以上の作品の存在を確認することができた。画風は比較的簡便なものが多いが、江戸時代初期から中期にかけては狩野派や土佐派風、江戸時代後期には円山派風の作品が多く残されていることが明らかになった。本年度の研究からは、作画した公家は江戸時代初期から幕末までの時代に存在し、その作風はおおむね同時代の絵画的風潮に応じたものであることを確認し、突出した表現を行った例は見られなかった。本年度は主に個人に所蔵される公家の絵画および関係する文献を調査した。調査した作品の主な作者としては、九条尚忠、一条忠香、広幡前豊、大原重成、小倉宜季、岩倉具選、豊岡治資、慈光寺実仲、伏原宣光らを挙げることができる。彼らの家格に着目すれば、九条家や一条家は摂家、広幡家は清華家、大原家や小倉家、岩倉家は羽林家、豊岡家は名家、慈光寺家や伏原家は半家などと家格に関わらず作画を手掛ける当主のいたことを確認した。それらはこれまで調査の対象になった作品ではなく、そのデータや画像など全く記録がなされていなかった作品であり、基礎的なデータが得られたこと自体に意義があると考える。またそれらの作品には、狩野派、土佐派、南蘋派、四条派など多様な表現が見られた。これまでは公家の絵画は墨画による略筆の神像や狩野派風の作品などごく限られた表現による作品が紹介されているにとどまるが、本年度の調査を通じて多様な表現がなされていたことを確認できた点において大いに意義があったと考える。なかでも武家による作画と同じく、江戸時代半ば以降には公家においても南蘋風絵画の影響を受けた作例を実見できたことは、南蘋風絵画の影響がいかに大きかったかを知ることができた。文献では『文政己丑御遺物帖写』(中京大学名古屋図書館蔵)や『石井行忠卿記』(個人蔵)等を閲覧した。前者は白河藩主松平定信の遺品を配分した記録であり、その中には久世通根らの公家の描いた絵画が含まれており、武家階級にも公家の絵画が受容されていたことが明らかになった。また後者には勅使として関東に下った石井行忠らが江戸城内において狩野派絵師による席画で歓待されたことが記載されており、狩野家の画技を目前にする機会があったことが明らかになった。作例と合わせてこれら文献面からも公家絵画の受容や制作状況の一端を確認することができた。江戸時代において作画を手掛けた公家の存在を約100名確認し、かつ複数の作品の確認もできたものの、個々の作品の詳細な分析や作画を手がけた公家が著した日記類の閲覧を通じての作画活動の確認が想定より進んでいないため。本年度も引き続き作例の調査と文献の検索を行った。その結果、新たに約50点の公家の手になる作品を確認した。そのうちには花山院常雅(17001771)、持明院基時(16351704)ら、これまで作品が紹介されたことのなかった公家について、画業がはじめて確認できた例も複数含まれる。これらの作例確認により、公家が手掛けた作風が狩野派に類する漢画、土佐派に近いやまと絵のみならず、当時流行していた南蘋派や円山派や四条派にも及んでいたことが明らかとなった。本年度は特に江戸時代の公家で作画を良くした慈光寺実仲(17871861)に着目し、その画歴や画風の変遷、解析を行った。公家としての家格は半家であり、堂上家の中では下位であるものの、他の絵画制作を手掛けた同時代の公家のなかでは抜きん出て現存作例が多く確認できた。

それらの作品には、岸駒様式の虎図、四条派ー特に景文ーに親しい表現を採る水月図、桜町天皇や霊元天皇らが手掛けた作例に近似した雷鳥図、近侍した皇親の肖像画など多岐にわたる作風・作品を残しており、職業画家に迫るほどの幅広い活動を確認することができた。文献では、昨年度に引き続き大名家に収蔵されていた作例を知り得た。井伊直亮著『懸物記』(彦根城博物館蔵)には、「本九拾九番〔以上朱書〕一白梅ニ月の画高辻大納言殿筆一幅横」との記載があり、大名家での作品享受が確認できた。公家の手になる絵画の受容状況については、前年度確認の松平定信と本事例以外には明確にはできず、今後の課題としたい。本研究は、江戸時代中期および後期の公家がどのような絵画表現を試みていたのかを明らかにすることを目的とした。その結果、100名を超える公家が絵画制作に携わり、約200点の現存作例を確認した。作例は人物、山水、花鳥画など広範囲の画題を確認した。またその表現は、江戸時代中期に活動した公家は、狩野派や土佐派などの表現を採る者が多くいた。江戸時代後期になると、土佐派や狩野派に加えて、新興の流派ではあるが、広く人々に受け入れられた円山派、四条派、岸派、南蘋派などの新たな表現を取り入れた公家の作品が多数確認できた。よって絵画を手掛けた公家は、同時代の絵画表現の動向に機敏であったことが明らかとなった。人名や作例の把握など、基礎的な事項はおおむね把握できたため、順調に進んでいると判断できる。江戸時代における身分の面からみると、武家にも多数の作画をした人物がおり、かなりの数が確認されている。武家と公家では人口数が大きく異なるため、武家ほど確認数は多くはなかったが、時代的・作風的にも幅広さが確認でき、今後の詳細な分析の基盤はおおむね整ったといえる。公家の中には所領を有していた家もあり、その地域における作品の伝存なども研究対象としているが、本年度は自治体史(誌)のみの調査で、実地踏査には着手できなかった点が、来年度以降の大きな課題のひとつとなる。宮内庁書陵部や京都府立総合資料館に当該資料が複数所蔵されるためそれらの調査を行う。あわせて公家の所領が存在した地域の自治体史を精査し、ゆかりのある地域に該当する資料が残されていないかを確認する。調査を進めるなかで、公家とともに宮廷おいて重きをなした親王や宮家、門跡の手になる作例も確認した。これらも公家の絵画と同じく絵画史においてはこれまでに研究対象となってはおらず、基礎的な研究の必要性を感じた。日本絵画史引き続き、課題にかかわる公家の伝記と作例の集成を進める。合わせて彼らが描いた作品が鑑賞絵画としてのみの存在であったのかどうかの確認作業を進める。日光例幣使の道中で記された公家の短冊には除災機能が付与されていたことが知られているが、絵画作品にも類似のことがあったのかどうかを、作画した公家にゆかりのある地域に伝存する作品の調査・検討を行う。公家が描いた作品には賛が記される作品が複数あり、その賛の解読と意味の解析を専門家に依頼する予定であったが、本年度に調査した作品においては研究代表者自身による解読ができたため。公家が地方に有する所領での現地調査を計画していたが、本年度は行わなかったため。来年度に調査する作例において、難読の賛文を伴う作例があった場合に専門家にその解読を依頼するために使用する。公家が地方に有していた所領、おもに現在の兵庫県下における調査旅費に用いる。
視野闘争における空間的・時間的交互作用

1.視野闘争の空間的交互作用を探る実験:Grossberg(1987)は、メカニズムの異なる2つのタイプの視野闘争があると述べている。1つは両眼対応部に呈示される異なる傾きをもつ刺激間の闘争(競合)であり、今1つは空間的に少し離れた同じ傾きの刺激間の競合である。ここでは後者に関し、その両眼間抑制の空間的特性を調べた。即ち、一眼に線刺激を先行呈示することにより他眼の線分の検出がどの程度抑制されるかを凝視点からの距離の関数として調べた。結果は、抑制刺激からの距離が視角15分のとき最大の抑制効果を示し、約30分でその抑制効果が消失した。又、抑制刺激の強度を閾レベル,閾上0.5 log unit,閾上1 log unitの3条件としたが、抑制の深さは刺激強度から独立であった。2.時間的側面:視野闘争事態でその刺激呈示時間を200ms以下に短くすると、もはや両眼刺激情報間で闘争がおこらず、両眼融像図形がみられることが知られている。この異常融像象を用いて、両眼性プロセスについて探った。多くの種類の視覚的順応において、その残効が両眼間転移し、しかもその転移した残効量は順応した眼で直接測定された残効量より小さいことが知られている。これは、単眼性プロセスとORゲ-ト的な働きをする両眼性プロセスを考えることで説明されてきた。では、両眼性ANDプロセスは存在するのかというと、これには存否両方の結果が報告されている。そこで、もし両眼性ANDプロセスがあるのならそれによる順応がすすむことが期待されるようなランダムドットステレオグラム(RDS)を用いて視覚的順応をおこさせ、検査するときにはORプロセスしか働きえないような異常融像刺激を呈示した。その結果、ORプロセスしか働かないと考えられる状況下でもRDSによる順応の顕著な残効が示された。この結果は、両眼性ANDプロセスを想定する必要がないことを示唆するものと解釈される。
チロシンキナーゼ型神経成長因子受容体の遺伝子異常による先天性無痛無汗症の分子病態

1.先天性無痛無汗症(CIPA)の日本人23家系と海外8家系の解析を進めて、すべての患者にTRKA遺伝子の変異を検出した。またTRKA遺伝子内に位置する多型部位を見出した。これをもとに、日本人の家系についてハプロタイプ解析を行い、日本人患者の半数以上に検出される変異(R548fs)が共通の祖先に由来する創始者変異であること示唆する結果を得た。2.遺伝形式がメンデルの常染色体劣性遺伝形式に従わないCIPA症例と両親について解析を行った。TRKAが位置する1番染色体の多型マーカーの分析では、この患者はホモ接合体であり、しかも遺伝子変異を有すると考えられる父親の染色体に由来することを示唆する結果が得られた。その他の染色体は、父親と母親の両者に由来し、メンデル遺伝している結果が得られた。以上から、この患者は1番染色体の父性片親性アイソダイソミーにより発症したことが推察された。3.エキソントラップ法を用いて、TRKA遺伝子のスプライス枝分かれ部位の変異(IVS7-33T>A)がスプライス異常を起こすことを明らかにした。また、32家系のCIPAにおいて検出された11個のミスセンス変異について神経細胞株での発現実験を行い、TRKAタンパクのプロセッシングとNGF依存性の自己リン酸化を観察した。細胞外ドメインの変異体のうち2個(L93P, L213P)は、正常とは異なるプロセッシングを受け、リン酸化反応は減弱していた。チロシンキナーゼドメインの変異体5個(G516R, G571R, R643W, R648C, G708S)のプロセッシングには異常は認めないが、どの変異体でもリン酸化反応が著しく減弱していた。3個のミスセンス変異(R85SとH598Y ; G607V)は、特定の人種(民族)にのみに特異的に検出される多型であると考えられた。また、残るD668Y変異体は非常にまれな多型か、もしくはリン酸化反応に影響を与えることなくTRKAタンパクの機能を阻害する可能性が示唆された。平成13年度1.変異解析:我々が確立したゲノムDNAからTRKA遺伝子のすべてのエキソンを増幅し直接塩基配列を決定する方法を用いて日本人先天性無痛無汗症(CIPA)患者家系とそらに海外から依頼された症例の解析を進めた。3.日本人CIPA患者での創始者変異の証明:患者の遺伝子変異とハプロタイプの相関を調べ、日本人CIPA患者の半数以上に検出される変異(R548fs)が正常コントロールには非常にまれなハプロタイプと連鎖するという結果が得られた。これにより、このR548fs変異は共通の祖先に由来する創始者であることが強く示唆された。4.エキソントラップ法を用いたスプライス枝分かれ部位の変異(IVS7-33T>A)の証明:TRKA遺伝子のエキソン7/イントロン7/エキソン8を含む2.6kbのDNA断片を、LongPCR法により患者および正常コントロールから増幅し、エキソントラップベクターであるpSPL3ヘサブクローニングし実験に用いた。COS-1細胞にトランスフェクションすることにより得られたTRKAmRNAをRT-PCR法により解析することによりIVS7-33T>A変異がスプライス変異を起こすことを明らかにした。

5.1番染色体の片親性ダイソミーの証明:患者と両親について、TRKA遺伝子が位置する1番染色体および2番から22番染色体に約10cM間隔で設定されているマイクロサテライトマーカーを用いて、allelotypeを解析した。1番染色体に位置するマーカーの分析では、この患者はがホモ接合体であり、しかも遺伝子変異を有すると考えられる父親の染色体に由来することを示唆する結果が得られた。さらに、その他の染色体について父親と母親の両者に由来しメンデル遺伝している結果が得られた。以上から、この患者は父性片親性アイソダイソミーによりCIPAを発症したことが推察された。平成14年度1.TRKA遺伝子への部位特異的変異導入:正常TRKAcDNA発現プラスミドベクターを準備し、これに国外8家系・国内24家系(合計32家系)の先天性無痛無汗症患者(CIPA)において検出された11個のミスセンス変異を導入した。2.発現プラスミドの培養細胞へのトランスフェクション:正常および変異TRKAを含むcDNAを、リポゾーム法を用いて、TRKAを発現していない神経細胞由来の細胞株にトランスフェクションした。3.発現細胞のシグナル伝達機能の解析:トランスフェクションした細胞のNGFに対する応答をTRKAタンパクの自己リン酸化されたチロシン残基を検出することにより調べた。4.結果:正常TRKAタンパク質前駆体は、神経細胞株において細胞内プロセッシィングを受け、NGF依存性に自己リン酸化されることが観察された。細胞外ドメインの変異体のうち2個(L93P, L213P)は、正常とは異なるプロセッシングを受け、神経細胞株でのリン酸化反応は減弱していた。チロシンキナーゼドメインの変異体5個(G516R, G571R, R643W, R648C, G708S)のプロセッシングには異常は認めないが、どの変異体でもリン酸化反応が著しく減弱していた。一方、海外のCIPA症例において、ダブル変異とトリプル変異として検出されたミスセンス変異(R85SとH598Y ; G607V)は、いずれも正常と同等の自己リン酸化反応を示し、他の研究者からの多型解析の報告とも合わせて、おそらく特定の人種(民族)にのみに特異的に検出される多型であると考えられた。また、残るD668Y変異体は非常にまれな多型か、もしくはリン酸化反応に影響を与えることなくTRKAの機能を阻害する可能性が示唆された。
活性酸素DNA損傷修復酵素欠損の病態

活性酸素性DNA損傷7,8-dihydro-8-oxoguanine(8-oxoG)による突然変異生成について、次の4点を明らかにした。1)8-oxoGに起因する変異が特定の塩基配列に局在するかどうかを調べるために、8-oxoG修復欠損株(mutM mutY欠損株)で生じた変異体の配列を解析した結果、特定の4箇所に変異が局在した。この部位では、PuGpu配列中央のGがホットスポットになっていた。そこで、変異はプリン基に囲まれたグアニンで生じやすいという仮説を提案した。2)この仮説の真偽を明らかにするために、ホットスポット配列AGAに注目した。この配列の3'側の塩基をT、G、Cに変化させたAGA、AGT、AGG、AGC配列を作り、変異率を調べたところ、3'側の塩基がプリン基の時はピリミジン基の時よりも変異が生じやすいこと即ち、前後の塩基配列に影響されることが分かった。3)変異生成が前後の塩基配列に影響される原因として、ポリメラーゼの忠実度が塩基配列に影響される可能性を検証した。8-oxoGを持つ4つの配列を人工合成し、それを鋳型とした突然変異を調べたところ、3'側の塩基がA、T、G、Cの時に各々13.8%、13.1%、16.1%、11.9%であった。つまりDNAポリメラーゼが8-oxoGをバイパス合成する時、周辺配列はその忠実度に影響しないことが分かった。4)8-oxoG修復酵素の活性と周辺配列について調べた。8-oxoGの3'側の塩基がA、T、G、Cの時、Fp9/MutMは各々22.9%、23.2%、24.7%、94%の割合で切断し、MutYは各々0.03%、5.82%、1.89%、2.53%の割合で切断した。Fpg/MutMは3'側の塩基がシトシンの時は活性が低いこと、MutYは3'側の塩基が,アデニンの時は活性が低いことが分かった。
グループホーム入居者の認知機能、ＡＤＬ、脳皮質下病変に関する前向き観察研究

高齢者を対象とした前向き研究は、大脳皮質下病変が認知障害、抑うつ、転倒、誤嚥など老年病症候群と呼ばれる精神・身体疾患に関連することを示した。しかし、本邦ではこのような前向き観察研究は極めて乏しい。本研究ではグループホーム入居者30名を対象として老年病症候群関連症状の推移とMRI,心機能検査などの経時的観察を中心とした3年間の前向き研究を実施した。対照として市中病院循環器内科または脳外科外来に通院する年齢を適合させた30名にも同様の観察をおこなった。研究の目的高齢者を対象とした前向き研究(LAIDS study、BMJ2009)は、大脳皮質下病変が認知障害、抑うつ、転倒、誤嚥など老年病症候群と呼ばれる精神・身体疾患に関連することを示した。本研究ではグループホーム入居者を対象として老年病症候群関連症状の推移とMRIの経時的観察を中心とした2年間の前向き研究を実施する。平成23年7月1日から、グループホームに入居している方々のうち30名を対象として2年間の前向き研究を行い、脳血流に影響を与える心臓の機能と脳微小循環障害の結果生じるとされる脳皮質下病変が、グループホームの入居者の認知機能および日常生活活動度とどのように関係しているかに関して、前向き観察研究を開始した。実施して検討する。検討項目1)介護状況の定量的評価:入浴回数、介護日誌による歩行状況の確認、家族の面談頻度と面談時間の確認、排泄の実施状況の確認、食事状況の確認等。2)認知機能、運動機能評価:MMSE(Mini-Mental State Examination)により評価を行う。運動機能評価に関しては要介護度認定調査票を用いて評価を行う。3)頭部MRI検査、または脳外科医あるいは神経内科医による神経学的評価:脳血管障害の有無や脳皮質下病変の有無、海馬傍回定量評価等を行い、脳の器質的変化について評価する。4)心機能検査:心電図、胸X線検査、ホルター心電図検査、心エコー図検査を実施し、脳塞栓症の原因となる不整脈や心拍出量低下の原因となる心機能低下の有無を検証する。5)採血検査:末梢血、肝機能、腎機能、心筋バイオマーカー、脂質、多価不飽和脂肪酸、他。現在観察開始から9ヶ月が経過した。高齢者を対象とした前向き研究(LAIDS study、BMJ2009)は、大脳皮質下病変が認知障害、抑うつ、転倒、誤嚥など老年病症候群と呼ばれる精神・身体疾患に関連することを示した。本研究では、グループホーム入居者を対象として、老年病症候群関連症状の推移とMRI、心機能検査、採血検査の経時的観察を中心とした3年間の前向き研究を実施した。本研究において、グループホームの入居者と、それに年齢をマッチさせた外来通院患者を対照群として臨床観察研究を実施し、高齢者の認知機能および日常生活活動度、脳皮質下病変や心臓機能および採血検査所見の2年間の変化を、前向き観察研究を実施して検証した。検査開始時点において、グループホーム入居者は外来通院者と比べて認知機能が低く、日常生活活動度が明らかに低下していた。心機能検査では両群ともに心電図上左室肥大、左心房負荷の所見を高頻度にみとめ、上室性不整脈を高頻度に合併した。両群の比較では不整脈の発生頻度に差異は無かった。心エコー図では左室壁厚の増加を左心房径の拡大を認めた。両群の比較では壁厚、左心房径に有意な差異を認めなかった。脳MRI所見については引き続き解析中である。採血検査所見では不飽和脂肪酸値に差異が認められた。すなわちグループホーム入居者は特定の不飽和脂肪酸値が低く、他の不飽和脂肪酸値が高値であった。食生活習慣にも差異が認められた。2年間の観察研究では死亡率に明らかな差異が認められた。死亡率の差異がいずれの因子を密接に関連するのかを多変量解析等で解析中である。本研究ではグループホーム入居者を対象として老年病症候群関連症状の推移とMRIの経時的観察を中心とした3年間の前向き研究を実施する。これまで研究代表者は、グループホームで生活能力の拡大を志向する介護法に関する後ろ向き研究を実施し、通常の介護法に比較し要介護度の進行を抑制し、転倒骨折率、病院への入院率や他施設への移行率を低下させる傾向にあることを明らかにした。

本研究において、介護法が在宅介護に比べて均質となるグループホームの入居者を対象として臨床観察研究を実施し、高齢者の認知機能および日常生活活動度に、脳皮質下病変や心臓機能が与える影響を、前向き観察研究を実施して検証する。平成23年度はグループホームに入居している方々のうち30名を対象とした2年間の前向き研究の初年度として、介護状況の記録、認知機能・運動機能評価、頭部MRI検査・X線検査、心機能検査、採血検査等を実施した。これらは、脳血流に影響を与える心臓の機能と脳微小循環障害の結果生じるとされる脳皮質下病変が、グループホームの入居者の認知機能および日常生活活動度とどのように関係しているかに関する評価の基礎となる。当初の計画における(1)介護状況の定量的評価(2)認知機能、運動機能評価(3)頭部MRI検査、または脳外科医あるいは神経内科医による神経学的評価(4)心機能検査(5)採血検査:末梢血、肝機能、腎機能、心筋バイオマーカー、脂質、多価不飽和脂肪酸、等はグループホーム入居者の体調等により実施の可否が大きく影響するが、現在までのところ概ね順調に進んでいる。平成24年度は、平成23年度に開始した研究計画を継続する。7-8月に検討項目のうち、頭部MRI検査を除く項目の検討を実施する(介護状況の定量的評価、脳外科医あるいは神経内科医による神経学的評価、認知機能、運動機能評価、心機能検査、採血検査)。平成25年度は、平成23年度に開始した研究計画を6月末日で終了する。終了直前に介護状況の定量的評価、頭部MRI検査、または脳外科医あるいは神経内科医による神経学的評価、認知機能、運動機能評価、心機能検査、採血検査を実施する。さらに7月以降の期間に、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。平成23年度の研究は概ね順調に進展したものの、複数のグループホーム入居者の状態が完全に同一ではないため、検査の内容に若干の差異が発生した。そのため研究費を51,736円繰り越すこととなった。当該研究費は、平成24年度に同様の検査を行うための費用とする。平成24年度の研究は概ね順調に進展したものの、複数のグループホーム入居者の状態が完全に同一ではないため、検査の内容に若干の差異が発生した。そのため研究費を90円繰り越すこととなった。当該研究費は、平成25年度に研究成果の取りまとめを行うための費用とする。
心筋でのスルホニルウレア剤とKチャンネル開口薬受容体分子の相関性の解明

心筋のスルホニルウレア受容体(SUR)とATP-Kチャンネルの分子実体と機能協関を明らかにすることを目的に研究を開始した。本年度に得られた成果を以下に述べる。(1)心筋のSURをタンパク質レベルで明らかにすべく、そのリガンド[^3H]-glibenclamideにより光アフィニテイラベルを行ったところ、SUR2遺伝子の翻訳産物とは分子量が明らかに異なる80kDaのポリペプチド(p80)がラベルされることがわかった。この手法を膵β細胞由来のHIT細胞に適用した場合には、予想通りSUR(140kDa)分子がラベルされる事実も、一連の光ラベルが特異的であることを裏付ける。光ラベルされたp80を精製単離し、アミノ酸シークエンサーで解析したところ、N末端から39残基配列が解析できた。この配列はSUR2とはホモロジーがなく、高いホモロジーをもつ分子として検索されたのは、CD36や脂肪酸輸送タンパクであった。これらのタンパクは、コレステロール代謝と関連するスカベンジャー受容体スーパーファミリーに属するものである。インスリン非依存性糖尿病の治療薬として用いられるSU化合物が、動脈硬化と関連するといわれるスカベンジャー受容体とも結合するとの結果は初めてであり、病態の上からも糖尿病と動脈硬化の関連が指摘されているだけに、この結果は興味深い。(2)心筋K-ATPチャンネルの有力候補の一つであるuKATP(Kir6.1)のアミノ酸配列の一部に対する抗体を作製し、これを用いて心筋中には45kDaの分子(uKATP)の存在が確認できた。また、この抗体を用いて虚血ラットにおけるKATP量の変化を調べたところ、uKATP(Kir6.1)の選択的な増加が観察された(京都大学医学部・堀江稔博士との共同研究)。
ペリサイト消失による血液網膜関門の不可逆的破綻機構

生後1日に抗PDGFRβ抗体(クローンAPB5)を腹腔内に単回投与されたマウスの網膜では、血管壁のペリサイト消失に伴い、生後6日にマクロファージ浸潤、生後8日に血管透過性亢進、生後10日に網膜剥離が連続的に惹起される(Ogura et al. JCI Insight 2017)が、平成30度の研究により、生後14日以降に網膜下の線維化が進行することが明らかとなった。線維化組織では、ペリサイトと網膜色素上皮細胞に由来する筋線維芽細胞の周囲に、多数のマクロファージが浸潤することが明らかとなった。こうした過程では、生後14日にIL-6, CCL2, TNFαの発現が、生後21日にIL-4. IL-10, IL-13の発現が上昇することが明らかとなった。さらに、生後14日から生後21日かけてマクロファージの極性が劇的に変化することが明らかとなった。さらに、網膜内を表層から深層に移動するマクロファージから分泌されるシグナル分子が、網膜色素上皮細胞に作用し、外側血液網膜関門を破綻させることが明らかとなった。こうした研究成果から、ペリサイトを消失した網膜では、マクロファージを軸とした炎症と線維化が進行すると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。糖尿病網膜症では網膜毛細血管壁を被覆するペリサイトの消失が血管壁バリア機能を破綻させ、透過性亢進および網膜浮腫の原因になると考えられてきた。そこで我々は、新生仔マウスに抗PDGFR抗体を投与して網膜血管壁のペリサイトを消失させることにより、糖尿病網膜症と同様の病態を再現する実験モデルを開発した。ペリサイトを消失した内皮細胞では炎症反応が惹起され、血管周囲に多数のマクロファージが浸潤した。マクロファージから分泌されるVEGFおよびPlGFは、内皮細胞のVEGFR2とマクロファージのVEGFR1を活性化した。一方、内皮細胞から分泌されるAngiopoietin-2(Ang2)は、内皮細胞のTie2を不活化して血管異常を増悪させた。こうした状況でVEGF、PlGF、Ang2を同時に阻害すると、網膜浮腫・出血が顕著に抑制されたことから、本治療の糖尿病網膜症における有効性が示唆された。当初の予定通り、順調に進展している。出生直後から血管発生が開始するマウス網膜では、内皮細胞が分泌する血小板由来増殖因子(PDGF)Bが、PDGF受容体beta(PDGFRbeta)を発現するペリサイトの増殖・遊走を促進する。我々は、新生仔マウスに抗PDGFRbeta抗体を投与するとことにより、網膜血管壁へのペリサイト集積を阻害し、糖尿病網膜症と同様の血管異常を再現できることを報告している(Uemura et al. J Clin Invest. 2002)。さらに網膜血管発生過程におけるペリサイト消失は、成体に至るまで改善せず、バリア破綻と炎症を遷延させることを明らかにしてきた(Ogura et al. JCI Insight. 2017)。また、網膜浮腫や網膜剥離の発生に伴って、線維化が進行することを確認している(論文投稿準備中)。平成29年度は、こうしたペリサイト消失網膜症モデルマウスにて、急性炎症から慢性炎症への移行過程における細胞・分子プロファイリングの解析を進めた。とくに、qRT-PCR法による炎症および血管新生に関連する遺伝子の発現解析、フローサイトメトリー法と免疫組織化学染色法による血球表面マーカーの発現解析、共焦点蛍光顕微鏡および2光子蛍光顕微鏡を用いた生体マウス網膜イメージング解析などを融合することにより、マクロファージが不可逆的バリア破綻と線維化の進行に深く関与することが明らかとなった。また、こうした過程ではSDF1-CXCR4シグナルが重要なはたらきをもつことが、連携研究者の村田らとの共同研究により明らかとなった(論文投稿中)。ペリサイト消失網膜症モデルマウスにおいて、炎症が遷延化し、線維化が誘導される細胞・分子機構を解明する。平成30年度は、ペリサイト消失網膜の急性・慢性炎症においてマクロファージの動態を制御するシグナル分子の解析を進める。

まずは、フローサイトメトリー法により生体マウス網膜から精製したマクロファージを用いてRNAseq解析を行い、分泌型および膜型シグナル分子を同定する。次に、クロファージ由来分子の発現局在を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法により確認する。さらに、これらのシグナル分子のリコンビナント蛋白質や阻害剤(抗体・低分子化合物など)をペリサイト消失網膜症モデルマウスの眼内に投与し、血管壁バリア機能や炎症の改善効果を検証する。こうした解析をもとに、糖尿病網膜症治療における新規創薬標的分子の探索を進めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。