hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
石灰質温泉堆積物を利用した深部・表層環境情報抽出

希土類元素分析では、キレート処理によってより精度のよい希土類元素パターンが得られるようになったが、処理方法を選定するのにやや時間がかかった。また、得られたユウロピウム異常は当初期待していたよりも小さかった。また、溶存鉄の連続観測では、対象とした温泉施設が、消毒剤として次亜塩素酸ナトリウムを源泉に自動散布していた。この影響で、観測日の最初の2日間のデータが使用できず、日光と鉄の溶存状態の影響は最終日にのみ観測された。10月下旬に再実験を試みたが、再現性のある結果は得られなかった。一因として、この期間に南中高度が低下し、日光の直射量が減少したことが考えられる。非火山性温泉の化学的・同位体的特徴の地理的特性を調べる野外調査では、中央構造線沿いに新たに10箇所の温泉施設と大衆浴場で採水を行った。分析項目は、主要溶存成分、リチウム-ホウ素-塩素ダイアグラムによる分類、同位体組成、および希土類元素パターンとし、総合的な解析に努めた。昨年度実施した調査地点と合わせて、計17地点となり、紀伊半島から四国の一部を含む広範囲について網羅的に調査することができた。このうち、プレートの脱水に関連した深部流体の可能性が高いのは、同位体組成と希土類元素パターンで異常が認められた4地点となり、これらの主要溶存成分パターンは、海水型火山型に対応することがわかった。一般に、有馬ー宝塚温泉の同位体パターンは、天水と深部5060キロメートルからの脱水流体の混合曲線によって説明されているが、今回調査した和歌山県きのくに温泉の酸素・水素同位体比は、海水と深部30キロメートル前後の比較的浅いスラブ脱水流体の混合で説明できることが明らかになった。一方、日周期の鉄沈殿メカニズムの解明を目指した研究では、入之波温泉を対象に、光分解で発生する過酸化水素と鉄の状態変化のその場測定を昨年度から引き続き実施した。昨年度は、過酸化水素の定量時に、錯塩が生じて比色分析が困難になる場面があったため、pH緩衝液をリン酸ベースからグッドバッファーに変更して分析を実施した。この結果、沈殿を完全に抑制して比色分析が可能になった。野外調査では、2018年度は天候に恵まれず、十分な過酸化水素の検出が認められなかった。そのため、溶存鉄の状態変化は、一時的に酸素分圧に支配される結果となった。異なる地域の温泉堆積場に研究範囲を拡大し、微量元素濃度と希土類元素パターンを解析して、温泉水の起源と上昇経路を明らかにする。これにより、国内に点在する類似した石灰質の温泉堆積場について、発生メカニズムを明らかにするとともに、地下深部における物質動態が堆積物に記録されている可能性を検証する。また、鉄質沈殿物については、鉄の酸化過程を検証するため、比色計を新たに導入して分析を実施する。最終年度は、中央構造線沿いにさらに温泉調査を行い、リチウムの相対濃度や希土類元素パターンを用いて、温泉水の熱源とその温度を推定する方法を検証する。また、溶存鉄の連続観測を島根県の小屋原温泉で実施する。小屋原温泉は、含鉄のナトリウム・マグネシウム塩化物炭酸水素塩泉であり、これまで調査してきた奈良県の入之波温泉と似たようなトラバーチンマウンドを形成する。ここでは、申請者が、2011年に調査を実施しており、過酸化水素の日周期変化が観測されることを確かめている。小屋原温泉の結果と入之波温泉の結果を比較し、鉄の酸化過程における光の効果を検証する。3月中旬に東北大学で実施された研究集会に参加し、研究成果を発表する予定だったが、申請者の母親が急逝したため、研究集会への参加をキャンセルし、キャンセル料のみを請求した。
高頻度オシレーション換気中の機能的残気量測定に関する臨床的研究

高頻度オシレーション換気(HFOV)を施行されている新生児の機能的残気量(FRC)を、HFOVを施行したまま測定できるシステムを開発し、次に実際の症例で経時的にFRCを測定、肺病変の改善の程度を定量的に評価した。(1)FRC測定法の開発:アルゴン洗い出し法を応用し、HFOVを中断せずにFRC絶対値を測定する方法を開発した。呼吸器回路の終末と、サンプリング点との間にLow pass filterを置くことによって、その後方のガスの揺れを減衰させた後、ガス流速およびアルゴン濃度を測定するようにした。HFOV定常流としてまず10%アルゴンガス+90%酸素混合ガスを流し、電磁弁により定常流を純酸素に切り替えた。これと同時にマイクロコンピューターがガス流速とアルゴン濃度の積の積分を行い、これから人工呼吸器死腔量と患者FRCの合計値(Aml)を求めた。予め呼吸器回路のTアダプターを閉塞し人工呼吸器死腔量(Bml)を測定しておけば、この2つの差(A-B)から患者のFRCを求めることができた。モデル肺を用いて本測定法の精度を検討したところ、モデル肺の実際のFRC(X)と測定で求めたFRC(Y)との間には、Y=0.9996×-0.288(P<0.001)と良好な相関関係が認められた。(2)臨床例でのFRC測定:次にわれわれの施設に収容された先天性横隔膜ヘルニア術後の新生児を対象として、12時間毎にHFOV換気中のFRCを測定した。重篤な低酸素血症を呈する患児においても安全にFRCを測定できた。胸部レ線、動脈血液ガスの経過の良い症例ではFRCが順調に増加していくのが認められ、肺の拡張ならびに肺合併症発生を、肺容量の面から定量的に評価することができた。1.測定法の確立高頻度オシレ-ション換気(HFOV)中にHFOVを中断することなく、機能的残気量(FRC)を測定する方法を確立した。測定原理はアルゴンガス洗い出し法を応用した。すなわちHFOV回路呼気側終末とFRC測定ポイントとの間に、Low pass filterを置き、その後方の流速、アルゴン濃度の揺れを減衰させた。減衰しほぼ一定となった呼気流速・アルゴン濃度を測定し、吸入ガスをアルゴン酸素混合ガスから純酸素へ切り替えた際に回路から洗い出されるアルゴンガスを計算することで、FRCを測定する方法である。2.測定法の精度の検討まずモデル肺を対象として精度を検討した。one compartmentからなるモデル肺を用いて設定FRCと測定FRCの関係を求めると両者はよく一致した(測定FRC=0.9996×設定FRCー0.288)設定FRCと測定FRCの平均誤差は0.41%であった。次に家兎のFRCを測定した。体重約3kgの家兎に気管切開を施行しHFOV下のFRCを測定したところ、約40mlの値が得られたが、このFRC値はすでに報告されている家兎のFRC値とよく一致した。3.今後の研究計画集中治療部に収容されるボホダレックヘルニア術後の新生児を対象として12時間毎にHFOV換気中のFRCを測定する。さらに症例をボホダレックヘルニア術後、IRDSのほか、一般外科術後、開心術後の新生児に拡大し、FRCがどのように変化するか、FRCモニタ-が呼吸管理に有用かどうかを調べる予定である。
ポリフェノールの免疫活性化を介した抗結核作用の解析と予防・治療への有効性の検討

結核は世界最大級の感染症で有り、治療のための投薬期間が長いことから、より安全で副作用の少ない結核薬が求められる。我々はヒト単球由来細胞株THP1に感染した結核菌の増殖を抑制するポリフェノールの探索を実施し、ケンフェロール、ルテオリンがその作用を有し、かつ細胞毒性も低いことを見いだした。作用機作解明のために実施したマイクロアレー解析の結果、ケンフェロールの存在下で41の遺伝子がTHP1細胞内の結核菌増殖抑制に関与していることが明らかになった。結核菌は世界最大の細菌感染症である結核症を引き起こす。結核菌は一旦感染が成立すると人の体内から排除されることなく増殖を停止した状態で人のマクロファージ内に寄生し、栄養状態や高齢化による感染者の免疫力の低下とともに再増殖をはじめ、結核を発症する。本研究はマクロファージ内に寄生する結核菌に対して増殖抑制効果を有する安全なポリフェノールを作用することで結核発症予防および補助的な治療を目指している。ヒト単球系細胞株THP1細胞をマクロファージに分化し、それに感染した結核菌に対して増殖抑制活性を有し、かつ細胞障害性の微弱なケンフェロールの作用に焦点を当て、網羅的解析を実施した。結核菌感染細胞(INF-non)は非感染細胞(Cont-non)に比べ、2倍以上発現が増加した遺伝子が1468、0.5以下に減少したものが1556見いだされた(Cont-non vs INF-non)。ケンフェロールの作用のみで変動する遺伝子数は増減ともに約半数であり(Cont-non vs Cont-ken)、結核菌感染細胞に対してケンフェロールの作用により変動をうける遺伝子数も同様に増減ともに約半数であった(INF-non vs INF-ken)。結核菌感染により、Toll like receptorを介するシグナル伝達、I型およびII型インターフェロンのシグナル伝達、酸化ストレス応答経路、オートファジーなどが活性化されるが、ケンフェロールの存在によりこれらの経路が抑制されることがパスウェイ解析より、明らかとなった。細胞内結核菌の殺菌に対して抑制的作用を持つインターロイキン4(IL-4)のシグナル伝達経路も感染により活性化されるがケンフェロールはこの経路も抑制した。また、ルテオリン、ケンフェロールはマウスマクロファージ細胞株RAW264.7中で活性酸素消去能を持つことも明らかとなった。結核菌の感染は発病に至るとは限らないが、感染成立後に人の免疫系は細胞内寄生菌である結核菌を完全に排除することはできず、増殖を停止した休眠状態で人の体内に潜伏し、このうちの510%が一生涯に、糖尿病やHIV感染者ではさらに高い確率で感染菌の再増殖により結核を発症する。本研究は食品成分である安全なポリフェノールによる免疫活性化を介した抗結核作用を検討することを目的としている。本年度はヒトを対象としたポリフェノールの結核菌増殖抑制能を探索する目的でヒト単球系細胞株THP1を用い、PMA( Phorbol 12-Myristate 13-. Acetate)で活性化しマクロファージに分化したのち、結核菌の感染前、あるいは感染後にポリフェノールを添加して細胞内の菌増殖抑制能を検討した。感染前にポリフェノールを添加した場合はルテオリンで顕著な増殖抑制がみられた(100 μM, 50 μM)。感染後の添加ではルテオリン、クルクミン、ケンフェロールで顕著な増殖抑制がみられた(100 μMおよび50 μM)。一方、菌に対する直接的な増殖抑制がみられるポリフェノール濃度はいずれもこれらよりも高く、50 μMではどのポリフェノールでも増殖抑制はみられなかった。この現象はポリフェノールがTHP1細胞の免疫活性化を介して菌の増殖を抑制していると考えられる。細胞内結核菌増殖抑制に効果的とされているTNF-alphaやIFN-gammaについて検討した。しかし、培養上清中のTNF-alpha産生量はポリフェノール添加群とコントロール群での差はなく、感染後にIFN-gammaを添加してTHP1を活性化した場合も顕著な差が見られなかった。現在、THP1細胞内の菌増殖抑制機序を解析するためにRNAを採取してマイクロアレー解析を実施中である。結核菌は一度感染が成立した個体から排除されることなく、無症候状態で潜伏感染する。結核発症の多くは感染者の免疫力の低下とともに再増殖をはじめた結核菌により引き起こされる。HIV感染や糖尿病は発症のリスクファクターであり、発症者の増加が危惧されている。本研究は安全な食品機能性成分であるポリフェノールによる結核発症予防および補助的な治療を目指している。昨年度、ヒト単球系細胞株THP1細胞をマクロファージに分化し、結核菌感染の有無、ケンフェロール(すでに我々が結核菌増殖抑制作用を明らかにしている)の有無でマイクロアレー解析を実施した。本年度はその結果の信頼性を確認するために再度、試料を調整して解析を実施した。

それぞれの解析でmRNAレベルにおいて有意に2倍以上の増加(2 up)、半分以下への低下(0.5 down)が見られる遺伝子は5272361であった。しかし、2回の実験のいずれにも増減が見られた遺伝子は非感染時、ケンフェロールの作用で2 upが55, 0.5 downが73、感染のみで変動する遺伝子数は2 upが734, 0.5 downが484であった。結核菌感染時にケンフェロールが存在することで発現が変動する遺伝子は2 upがわずかに17,0.5 downが24と少なかった。結核菌感染時にケンフェロールの存在により菌の増殖が抑制されるが、菌感染のみで発現が制御される遺伝子数が非常に多く、ケンフェロールの増殖抑制作用に関連する遺伝子は検出されにくいが、これらの17および24の中に含まれているはずである。これらについて非感染、ケンフェロール無添加のコントロールを基準として発現量を比較した結果、蛋白質holding,プロスタグランジン合成、ヒストンの安定化に関する遺伝子発現の有意な増加、アポトーシス、炎症性シグナル伝達に関わる遺伝子発現の有意な減少が観察された。細菌学結核感染が成立した結核菌はマクロファージ内で生息し、その増殖抑制も細胞の活性化を介して行われると考えられる。最初は細胞内結核菌の殺傷に関わると予想されるタンパク質に焦点を絞ってリアルタイムPCRを実施する予定であったが、ポリフェノールという要素が絡んでくると増殖抑制メカニズムが予想できないためにmRNAの発現量の網羅的解析が可能なマイクロアレー解析に切り替えた。mRNAを採取するためには多量の細胞数と菌数が必要であり、96穴マイクロプレートで実施した増殖抑制効果を検討する系とはスケールが異なるため、この系を確立することに予想外の時間を要した。また、結核菌の取り扱いにはバイオセーフティーレベル3(BSL3)の設備が必要である。代表者の所属機関(園田学園女子大学)も客員研究員として所属している大阪市立大学もこの設備を所有していない。このため、最初は特殊な設備を必要としない牛型弱毒結核菌BCG感染細胞でサンプルを準備していたが解析量が高価なため、最終目標である結核菌に切り替えた。分担者(田丸)の所属機関はBSL3の設備を有しているが時間的制約のあるなかでの実施であったので予想外の時間を要した。以上の理由により、メカニズム解析の進行は遅れたが、ルテオリン、ケンフェロールが細胞内で活性酸素消去能を有することが明確となり、また、これらのポリフェノールがマクロファージの分化も制御することがわかったため、予想外の結果も得られた。本研究は食品成分であるポリフェノールによる安全で、精神的抵抗が少なく、かつQuality of Lifeを尊重した、新規の結核治療や結核予防の開発を目指している。ポリフェノールは現行の抗結核薬のような治療薬とは異なるため、短期間での劇的な効果を期待することはできない。しかし、抗結核薬のような副作用はなく、日常、食品からあるいはサプリメントというかたちで長期間、安全に服用できるという利点がある。このように軽微ではあるが確実なポリフェノールの抗結核作用を検討する場合は細胞レベルでの実験が必要になる。
スズメガ科性フェロモンシステムの種特異性：成分多様性と嗅覚応答特性の俯瞰的解析

本研究では,スズメガ科の性フェロモンによる種認識機構を明らかにすることを目的としており,今年度は,スズメガの性フェロモン同定に加えオスの行動解析,生合成機構の解析を行った。1.スズメガの性フェロモンの同定スズメガ科の一種であるクロスキバホウジャク(Hemaris affinis)から性フェロモンとして,3成分,(Z)-11-hexadecenalと(10E, 12Z)-及び(10E,12E)-10,12- hexadecadienalsの45:20:35混合物を同定した(Uehara et al. 2015)。また,ホシヒメホウジャクから3成分(a, b, c)の97:1:2混合物を性フェロモンとして同定した。2.ホシヒメホウジャクの性誘引行動の解析ホシヒメホウジャクから検出された性フェロモンの3成分(a, b, c)それぞれの機能を,室内の行動アッセイ系である風洞装置で精査した。その結果,それぞれの成分は,オスに対して全く異なった機能(a成分は誘引活性,b成分は誘引活性阻害,c成分は誘引にも抑制にも寄与しない)を持つことが明らかになった。誘引活性阻害を引き起こすb成分は,ホシヒメホウジャクと時空間的に同期発生する他種が性フェロモンとして利用している成分でもあるため,b成分に対するオスの忌避性が性フェロモンの種特異性に貢献する可能性が考えられる。3.性フェロモン生合成経路の解析昨年度,サザナミスズメから奇数炭素鎖を持つ新規性フェロモン化合物を同定した。メスの性フェロモン分泌腺中の脂肪酸前駆体の分析および標識化合物の取込み実験から,新規性フェロモン化合物の生合成経路と生合成のための生化学反応を推定した。今年度は,これらを分子レベルで裏付けるため,次世代シーケンサーを用い性フェロモン分泌腺で発現しているmRNAの網羅的解析を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,スズメガ科の性フェロモンによる種認識機構を明らかにすることを目的としており,今年度は,予定通りスズメガの性フェロモン同定を進めるとともに,うち一種については,その性フェロモンの生合成機構について研究した。1.スズメガの性フェロモンの同定スズメガ科の性フェロモンの多様性を明らかにするため,これまでに研究対象としていた15種に加え,新たに2種のフェロモン同定に着手した。いずれの種もこれまでに報告者が同定している種と同様にボンビカール((10E,12Z)-10,12-hexadecadienal)系列の性フェロモンを使用していることを突き止めた。また,スズメガ科の一種である,サザナミスズメ(Dolbina tancrei)からは新規性フェロモン化合物である(9E,11Z)-9,11-pentadecadienal)を同定した(Uehara et al. 2013)。2.性フェロモン生合成経路の解析サザナミスズメの新規フェロモンは奇数炭素鎖を持ち,他種では確認されていない化合物である。また,これまでの研究で分かっているスズメガのフェロモンよりも炭素鎖が一分子だけ少ないという特徴を持つ。このことは,本種が他の虫とは異なる性フェロモンの生合成経路を採用する可能性を示している。そこで,本種性フェロモンの特異性が生じる機構を探るため,サザナミスズメの性フェロモン分泌腺中の性フェロモン前駆体を調査し,前駆体の構成から性フェロモンの生合成経路を推定した。また,同位体標識脂肪酸を用いて推定生合成経路を確認した。その結果,カイコ等と同様に本種の特異的な性フェロモンは,炭素数16のパルミチン酸から生合成されることが明らかになった。

3.性フェロモン生合成経路の解析昨年度,サザナミスズメから奇数炭素鎖を持つ新規性フェロモン化合物を同定した。メスの性フェロモン分泌腺中の脂肪酸前駆体の分析および標識化合物の取込み実験から,新規性フェロモン化合物の生合成経路と生合成のための生化学反応を推定した。今年度は,これらを分子レベルで裏付けるため,次世代シーケンサーを用い性フェロモン分泌腺で発現しているmRNAの網羅的解析を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。性フェロモンの同定が進展している。また,サザナミスズメの性フェロモン生合成機構について,生化学実験による裏付けがとれた。今年度の研究でサザナミスズメの性フェロモン生合成の独自性は,脂肪酸の炭素分子を1分子だけ短縮するところにあると示された。そこで,今後は,この炭素一分子短縮に関わる遺伝子の同定を主軸に進めていく予定である。しかし,フェロモン生合成に関わる当該遺伝子は未だ報告が無いため,次世代シーケンサーを用いた解析を検耐している。
ハイパーサーミアによる免疫監視機構の再構築

ハイパーサーミアは、癌組織の免疫逃避機構をほぼ完全にブロックする(免疫抑制性サイトカインの分泌抑制、癌細胞上の癌抗原の発現増強、Tregの抑制など)。また、がん患者の免疫系に関しては、ハイパーサーミアを受けた患者のリンパ球のTh1サイトカインの産生能が亢進することも見いだした。また、NK細胞活性は、ハイパーサーミアにより増強し、未熟樹状細胞もハイパーサーミアによって成熟し、抗原の取り込みも亢進することも明らかとなった。以上のことから、ハイパーサーミアは、癌の免疫逃避機構を破壊し、正常な免疫機構を再構築するものと考えられる。今後は、ハイパーサーミアと免疫療法の臨床での検討を考えたい。平成25年度は、7月1日から私の所属大学が変更となり、主たる研究施設も京都府立医科大学から財)ルイ・パストゥール医学研究センターに移動したため、十分な研究を行うことができなかった。ただし、研究の具体的準備は進めており、平成26年4月からは、予定通り(あるいは予定より速やかなペースで)研究を進めることができる。ハイパーサーミアそのものは、腫瘍局所を加温することにより、抗癌効果を期待した治療法である。放射線療法や化学療法と併用すると相乗効果が得られることが知られている。我々は、腫瘍組織を加温するとどのような生物学的影響があるのかを検討している。これまでの研究成果としては、(1)加温により腫瘍組織表面にMHC class Iや癌抗原の発現が増強すること、(2)腫瘍組織全体として(癌細胞、間質細胞、浸潤マクロファージ、MDSCなど)、免疫を抑制するサイトカイン、特にTGFbやIL-6, IL-10の産生減少が見られる。(3)腫瘍組織中に浸潤している制御性T細胞が減少する、といった現象を確認した。ただし、これらの現象は、腫瘍を43度、60分加温して24時間後の現象である。また、細胞実験では、癌細胞をTGFbで刺激して、EMTを誘導し、これをE-Cadherinの減少、Vimentineの増加、あるいは、PCRにて細胞内シグナル伝達物質の変動で評価したが、細胞を加温することにより、このEMTをほぼ完全に抑制することができた。さらに、ある種の抗癌剤はEMTを引き起こすことが報告されているが、我々は、このような抗癌剤によるEMTも細胞を加温することで、EMTを抑制することが可能であることを示した。この観察も、温熱処理24時間後である。このことから、ハイパーサーミアは、直接的な抗癌作用以外に、免疫療法を増強する効果、および、EMTを抑制する効果、すなわち転移抑制効果を有することが示唆されており、今後は、ハイパーサーミア施行後、どのタイミングでこのような現象がもっとも増強するのかを検討する必要がある。温熱療法で加温された腫瘍組織での免疫に関する環境はどのように変化するのだろうか。また、癌細胞内では、転移・浸潤の関与しているEMTについても検討を加えた.【研究方法と結果】1)新規免疫療法「NaiveT細胞リッチT細胞移入療法」の進行消化器癌・肺癌に対する第1相臨床試験:標準治療後の残存あるいは再発症例の消化器癌・肺癌で文書同意の得られた20歳以上80歳未満でPSが0-2の症例9例を対象とした。全9症例に重篤な有害事象は認めなかった。治療効果は奏効率22 %、病勢コントロール率は66.6 %であった。2)癌免疫監視機構についての動物実験:Balb/cマウスの背部にcolon26を皮下移植し、形成した腫瘍に、43°C・1時間温熱処理を行い、24時間後に腫瘍を摘出し、腫瘍内のIL-10, TGF-beta, VEGFをRT-PCRおよびWB法で、また、腫瘍内のTregをIHCおよびFoxp3のWB法で評価した。温熱処理により、腫瘍内のIL-10, TGF-beta, VEGFの発現量は、有意に低下した。腫瘍内のTreg(Foxp3陽性リンパ球)数は、腫瘍の増大により増加したが、温熱処理によりその数は有意に低下した。3)ハイパーサーミアのEMTへの影響:ヒト膵癌細胞株と大腸癌細胞株を用いて、TGF-b刺激で誘導されるEMTに対する温熱処理の影響を検討:温熱処理はTGF-b刺激に先行して行なったが、温熱処理はTGF-b刺激により誘導される細胞の形態変化(紡錘形変化)を抑制しEMT上皮系マーカー(E-cadherin)発現低下を抑制した。間葉系マーカー(vimentin)発現亢進を認めた。【考察】本結果からは、温熱療法は各種免疫療法の効果を増強することが出来ると考えている。また、温熱療法は、EMTを抑制することで転移・浸潤を抑えている可能性があるハイパーサーミアは、癌組織の免疫逃避機構をほぼ完全にブロックする(免疫抑制性サイトカインの分泌抑制、癌細胞上の癌抗原の発現増強、Tregの抑制など)。

現時点では、温熱処理は、動物実験でも細胞実験でも、癌を加温後24時間の1ポイントで検討している。従って、例えば、放射線療法なら、放射線照射直後、抗がん剤なら、抗がん剤投与中もしくは直後が、最も好ましいハイパーサーミアの施行時期であることが科学的に証明されているが、免疫療法との併用に関しては、場合によっては、ハイパーサーミア直後の免疫療法が併用効果が強い可能性もあり、その点を今後明らかとしたい(免疫チェックポイント抗体の投与時期も含めて)。また、移入する免疫細胞も現在は、常温(25度)で点滴移入しているが、最適な温度についても検討したい。癌免疫、ハイパーサーミア、化学療法今後は、動物実験において、ハイパーサーミア施行後、経時的に腫瘍組織を解析し、最も免疫抑制が強く解除され、また、MHC classIおよび癌抗原の発現の強い時期を見極める。すなわち癌組織の免疫監視機構が最も強くなっている時期を見つけ出す。そうすれば、この時期に免疫療法を施行するのが、免疫療法の効果発現が強く出ると考えられる。また、移入リンパ球(ナイーブT細胞、NK細胞)が、癌に対する攻撃力の最も強い温度を調べる(現在は常温で細胞移入している)。好中球の場合は、活性酸素の産生能の最も高いのは、42度であった。平成25年度は、7月1日から私の所属大学が変更となり、主たる研究施設も京都府立医科大学から財)ルイ・パストゥール医学研究センターに移動したため、十分な研究を行うことができなかった。ただし、研究の具体的準備は進めており、平成26年4月からは、予定通り(あるいは予定より速やかなペースで)研究を進めることができる。昨年度は、研究室の異動などがあり、研究を一時止めた期間もあったため、本年度への繰り越し金があったが、本年度はほとんど予定通りの研究が進められたため、かなりの物品費を必要とした。来年度は、前述した通り、ハイパーサーミアと免疫療法のタイミングの問題と、細胞移入する免疫細胞に適した温度、あるいは、適した体温について検討する。平成25年度には、研究の具体的準備は進めており、平成26年4月からは、予定通り(あるいは予定より速やかなペースで)研究を進めることができる。大きくわけて、動物実験と細胞実験の2つを計画する。(1)動物実験:担癌マウスにハイパーサーミアを施行し、その直後から24時間後まで、経時的に腫瘍組織の免疫逃避機構について、検討する。検討項目は既に24時間後に見ている項目と同様とする。(2)細胞実験に置いては、がん細胞側の温度を変えて、免疫細胞は常温で投与する場合と、がん細胞は、37度で培養し免疫細胞の培養温度を変化させるという、2つの見方で、至適温度を判断する。ただ、研究準備は進めていたので、平成25年度から、研究の遅れを取り戻すべく、平成24年度の使用残額と平成25年度の使用額を用いて、研究を進める。平成27年度を主として研究内容をまとめる年度にしているため、研究予定は、27年度にずれ込むが予定研究範囲はすべて終了する計画である。これまでの基礎的検討で把握している、ハイパーサーミアによる免疫抑制分子の産生抑制や免疫抑制細胞の浸潤抑制などで免疫反応性が回復しているかどうかを確認する。
鋼酸化物高温超伝導体における擬ギャップと凝集エネルギーの研究

高温超伝導の発現を考える上で前駆現象である"小さな擬ギャップ"の果たす役割を理解することが非常に重要である。これまで我々は、常伝導相の電子比熱係数の振る舞いやT_cまでフェルミ準位にエネルギーギャップが残ることなどからLa214系でも小さな擬ギャップが成長することを指摘してきたが、最近、中性子散乱実験やNMRの緩和時間でその直接的証拠が報告された。また、角度分解光電子分光実験からLa214系のフェルミ面もBi2212系と同様に擬ギャップの形成に伴って(π/2,π/2)近傍を中心とするアーク状(フェルミアーク)になることが明らかにされた。一方、高温超伝導体ではアンダードープ領域で超伝導の凝集エネルギーU(0)が大きく減少することが知られている。これまでに我々は「U(0)の大きな減少は小さな擬ギャップが成長すると超伝導の特性エネルギーがΔ_0からβpΔ_0(β=constでpはホール濃度)に変わることで説明できる」ことをLa214系について示してきたが、本年度は、より広いホール濃度についてこの点を確認した。そしてNMRのナイトシフトの結果等も参考にして「超伝導の特性エネルギーの変化は、小さな擬ギャップの成長に伴って形成されるフェルミアークと関連している」ことを指摘した。しかし、擬ギャップの成長が顕著となるアンダードープ領域では超伝導相と常伝導相との相分離が起こり、このためU(0)が大きく減少するとの指摘がある。このため、Bi2212系の走査トンネル分光(STM/STS)実験から超伝導のナノスケールでの一様性も調べたが、T_cはまだ高いがU(0)は大きく減少する少しアンダードープ域ではそのような相分離は見られないことを明らかにした。これまで多くのグループが走査トンネル顕微鏡(STM/STS)や角度分解型光電子分光(ARPES)によりBi2212系の超伝導ギャップと擬ギャップの測定を行ってきたが、それらのホール濃度依存性は再現性に難点があった。STM/STSやARPES実験では試料をへき開した後に測定を行うが、Bi2212系のオーバードープ試料は高温(室温)・高真空中でへき開を行うと試料表面の酸素が離脱し、ホール濃度が大きく変化する可能性がある。このため超伝導ギャップや擬ギャップのホール濃度依存性の再現性がよくなかったと思われる。そこで、本年度の研究では新しく購入した極低温で試料へき開が可能なSTM/STS装置(稼動温度範囲:10K300K)の立ち上げを行い、試料の一部をSTM/STSの探針としたSISトンネル測定を行った(break-junction法)。その結果、オーバードープ領域でも再現性の良い超伝導ギャップや擬ギャップのホール濃度依存性が得られた。今回得られた超伝導ギャップに関する結果は、たまたま大気中でへき開した試料について測定できた結果と良く合っており、やはり高温(室温)・高真空中でへき開を行うと試料表面のホール濃度が変わることが分かった。また、Bi2212系の擬ギャップの温度依存性を詳細に調べ、これまで我々のグループ等が指摘してきたようにd波超伝導体に対する平均場の特性温度(2Δ_o/4.3k_B)付近から擬ギャップがクロスオーバー的に成長し始めることが明らかになった。さらに、本研究では超伝導および擬ギャップに対する不純物効果の研究も行い、擬ギャップが超伝導の前駆的現象であることを指摘した。高温超伝導体を特徴づける現象の1つとして常伝導相で発達する擬ギャップが知られている。特に、T_cで超伝導ギャップに連続的に移行する"小さな擬ギャップ"は高温超伝導の前駆現象と考えられ、これまでに膨大な量の研究が行われている。しかし、小さな擬ギャップの発達が顕著となる温度は測定手段に依存するという報告もあり、その性質の理解はまだ十分と言えない。特に、典型的な高温超伝導体の1つであるLa214系では小さな擬ギャップの存在は未だ確定していない。そこで、本研究ではBi2212系における小さな擬ギャップが成長し始める温度をトンネル分光の実験から、またLa214系での小さな擬ギャップの有無を電子比熱とトンネル分光実験から調べた。その結果、Bi2212系では小さい擬ギャップがd波超伝導体に対する平均場の特性温度T_<co>付近から急速に成長することが分かった。一方、La214系については1)T_<co>付近で電子比熱C_<el>(=γT)に小さなピークが現れ、その低温側でγが状態密度の低下によって減少すること、2)トンネル分光実験からフェルミ準位のエネルギーギャップがT_cでもまだ明瞭に残っていることを明らかにし、La214系でもBi2212系と同様にT_<co>付近から小さな擬ギャップが成長することを結論した。また、La214系とBi2212系のT_<co>のホール濃度依存性は、それぞれの系のT_cの最大値で規格化すると互いにスケールすることを示した。さらに、La214系の電子比熱の測定から超伝導の凝集エネルギーU(0)を求め、U(0)が小さな概ギャップの形成と共に大きく低下することを明らかにした。高温超伝導の前駆現象である"小さな擬ギャップ"の理解は高温超伝導の発現を考える上で重要であるが、この擬ギャップの発達が顕著となる温度は測定手段に依存するという報告もあり、その理解はまだ十分と言えない。

特に、典型的な高温超伝導体の1つであるLa214系では、T_cでも超伝導ギャップがまだ明瞭に残っていることから小さな擬ギャップの存在が強く示唆されるが、未だ確定的な結論に至っていない。そこで、本年度の研究では、La214系の超伝導凝集エネルギーから小さな擬ギャップの発達の有無を調べた。具体的にはLa214系の電子比熱係数γ(=C_<el>/T)はd波超伝導体に対する平均場の特性温度T_<co>付近でブロードなピークを示すが、このピークがオプティマルからアンダードープ領域で成長すると共に超伝導の凝集エネルギーU(0)が大きく減少することに着目した。そして、このT_<co>付近のピークが小さな擬ギャップの成長に由来すると考えるとU(0)の大きな減少を説明できることを示した。一方、Bi2212系についてはブレイクジャンクション法によるトンネル分光の実験から小さな擬ギャップを詳細に調べ、オプティマル、アンダードープ、オーバードープの3つの典型的なホール濃度領域で平均場の特性温度佑付近からこの擬ギャップが急速に成長することを確認した。また、超伝導ギャップの精密測定からディップと呼ばれる微細構造がT_<co>以下で特徴的な温度変化を示すことが分かってきた。今後、更に詳細な測定を進める予定である。高温超伝導の発現を考える上で前駆現象である"小さな擬ギャップ"の果たす役割を理解することが非常に重要である。これまで我々は、常伝導相の電子比熱係数の振る舞いやT_cまでフェルミ準位にエネルギーギャップが残ることなどからLa214系でも小さな擬ギャップが成長することを指摘してきたが、最近、中性子散乱実験やNMRの緩和時間でその直接的証拠が報告された。また、角度分解光電子分光実験からLa214系のフェルミ面もBi2212系と同様に擬ギャップの形成に伴って(π/2,π/2)近傍を中心とするアーク状(フェルミアーク)になることが明らかにされた。一方、高温超伝導体ではアンダードープ領域で超伝導の凝集エネルギーU(0)が大きく減少することが知られている。これまでに我々は「U(0)の大きな減少は小さな擬ギャップが成長すると超伝導の特性エネルギーがΔ_0からβpΔ_0(β=constでpはホール濃度)に変わることで説明できる」ことをLa214系について示してきたが、本年度は、より広いホール濃度についてこの点を確認した。そしてNMRのナイトシフトの結果等も参考にして「超伝導の特性エネルギーの変化は、小さな擬ギャップの成長に伴って形成されるフェルミアークと関連している」ことを指摘した。しかし、擬ギャップの成長が顕著となるアンダードープ領域では超伝導相と常伝導相との相分離が起こり、このためU(0)が大きく減少するとの指摘がある。このため、Bi2212系の走査トンネル分光(STM/STS)実験から超伝導のナノスケールでの一様性も調べたが、T_cはまだ高いがU(0)は大きく減少する少しアンダードープ域ではそのような相分離は見られないことを明らかにした。
高等動物の大きなタンデム反復配列内および近傍における組換え

本年度の最大の成果は、ヒト4p15から単離した単位長4746bpがらなるRS447タンデム反復配列について、詳細なマッピング、コピー間の変異度、集団内のコピー数の多型度、さらに、種間保存性を踏まえて提唱していた「メガサテライトDNA」という新しい概念をついに公式に認められたことである(Gondo et al.,Genomics54:39-49,1998)。7月に福岡で開催された国際集団遺伝学シンポジウムにおいて、分子進化の面からも注目されるとともに、2月にはKeystoneシンポジウム「DNA複製と組換え」においても発表する。さらなる成果として、家系解析の高解像パルスフィールド電気泳動法を確立、親子間における実際のコピー数を比較し、得られた10%というメガサテライトDNAの超可変性について、投稿準備中である(Okada,Gondo et al.)。また、この4746bp反復単位にコードされているタンパク質の解析も進み、活性をもつ脱ユビキチン化酵素をコードし発現していた。これも投稿準備中である(Saitoh,Ikeda et al.)。また、これまでは、ヒトの遺伝子であったため、家系分析と培養細胞系に実験解析が限られていた。そこで、哺乳動物種間に保存されていることを利用し、モデル動物作成に取りかかった。すでに、チャイニーズハムスターから、RS447メガサテライトDNAの相同遺伝子を単離することに成功した。このチャイニーズハムスターのRS447相同遺伝子クローンを用いることによって、これまで不明瞭な結果しか得られなかったラット、マウスからも明確な解析結果が得られる様になった。ラットにはRS447メガサテライト相同配列があることが判明した。一方、マウスにおいては、RS447相同遺伝子自体は存在するらしいものの、タンデム構造をとらない最初の例となった。
肺線維化における制御性B細胞の役割の検討

肺線維化におけるB細胞の役割は明らかではない。抗CD20抗体を事前に投与してB細胞を除去したマウスにブレオマイシンを投与したところ、コントロール抗体を投与したマウスに比べ肺線維化は増悪した。遺伝的にB細胞を欠損したマウスにブレオマイシンを投与したところ野生型マウスに比べ肺線維化は増悪したが、事前に野生型マウスの制御性B細胞を移入したところ肺線維化は野生型マウスと同程度まで軽減した。以上より、肺線維化の発症期においてB細胞は抑制的に働いていることが示唆された。抗CD20抗体を用いたB細胞除去療法は、B細胞由来悪性リンパ腫のみならず、関節リウマチや全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患に幅広く用いられている。しかし、全身性強皮症の代表的合併症である肺線維症に対する有用性は確立していない。B細胞は抗体産生以外に様々な機能を有していることが明らかになってきているが、なかでも炎症をコントロールする制御性B細胞の存在が明らかになった。しかし、線維化において制御性B細胞を含めたB細胞がどのような役割を果たしているかは明らかではない。本研究ではブレオマイシン誘発肺臓炎モデルを用いて肺線維化におけるR細胞の役割と抗CD20抗体療法の効果について検討した。抗CD20抗体を事前に投与してB細胞を除去したマウスにブレオマイシンを投与したところ、コントロール抗体を投与したマウスに比べ肺の線維化は増悪していた。一方、ブレオマイシンを投与した3日後の炎症期に抗CD20抗体を投与したマウスでは、コントロール抗体を投与したマウスに比べ肺の線維化は改善していた。また、遺伝的にB細胞を欠損したマウスにブレオマイシンを投与したところ、野生型マウスに比べ肺の線維化は増悪していたが、事前に野生型マウスの制御性B細胞を含むB細胞分画を移入することで、増悪した肺の線維化は野生型マウスと同程度まで軽減した。以上より、肺の線維化においてB細胞の役割には2面性があり、発症期と炎症期では異なっている可能性が示唆された。すなわち、発症期では主に制御性B細胞が炎症をコントロールしている可能性が考えられた。また、炎症期に抗CD20抗体を投与することで、線維化を抑制できる可能性があることが示唆された。全身性強皮症に合併する肺線維症は予後を規定する重大な合併症であるが、これまで肺線維症に対する有効な治療法は確立していない。B細胞に特異的に発現しているCD20を標的とした抗CD20抗体を用いたB細胞除去療法は、関節リウマチや全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患に幅広く用いられているものの、肺線維症に対するB細胞除去療法の有用性は確立していない。本研究ではブレオマイシン誘発肺臓炎モデルを用いて肺線維化におけるB細胞の役割と抗CD20抗体療法の効果について検討した。本年度は、(1)制御性B細胞の肺線維化に対する抑制効果、(2)ブレオマイシン誘発肺臓炎における浸潤細胞、の2点についてした。遺伝的にB細胞を欠損したマウスにブレオマイシンを投与したところ、野生型マウスに比べ肺の線維化は増悪していたが、事前に野生型マウスの制御性B細胞(B220^+CD5^+CD1d^<high>B細胞)を移入することで、増悪した肺の線維化は野生型マウスと同程度まで軽減した。一方、非制御性B細胞(B220^+CD51^<low>CD1d^-B細胞)を移入しても肺の線維化は抑制されなかった。また、IL-10を欠損したマウスから分離した制御性B細胞をB細胞欠損マウスに移入しても、肺の線維化は抑制されなかった。また、ブレオマイシン投与7日後の肺における浸潤細胞を検討したところ、B細胞除去療法により好中球とマクロファージの浸潤が減少し、肺の線維化の程度と相関していた。また、B細胞除去療法はM1マクロファージとM2マクロファージにも影響を及ぼしていた。以上より、肺の線維化においてIL-10を産生する制御性B細胞は発症期に重要な役割を担っていること、B細胞除去療法はマクロファージをはじめとする炎症細胞浸潤をコントロールすることが明らかになった。これらの知見は、肺線維化の新たな治療戦略を考える上で有益であると考えられた。
コンピュータネットワークと双方向ブラウザJavaによる遠隔実験システムの開発

マルチメディアをキーワードとして学内LANの整備が進んでいる。学内LANはさらに全国・全世界にネットワークされ、共同研究を進める上で地理的な制約を排除できる゚すばらしい環境を与えてくれる。特に最近では専門分野を越えた学際的な研究が必要となってきており、ネットワークの利用は急速に拡大すると予想される。インターネットの利用方法は、電子メールや電子ニュースに代表される文字ベースの情報交換から、WWWに代表される画像や音の情報まで取り扱うブラウザが一般的になってきた。また、数年前までは音や動画を扱ってはいてもそこには時間的な要素はなく、時系列データを実時間では取り扱えない状況、すなわちサーバーの情報をクライアントから引き出すだけの一方的ブラウザであった。しかし、最近ではネット電話などの時系列データを実時間で取り扱うブラウザも出現してきた。初期の目的は学内に敷設されたコンピュータネットワークに慢性実験系を接続し、遠隔地から刺激のパラメータの設定や導出されたデータの収集を行うためのソフトウエアを開発することにあった。具体的には、1)稼働中の慢性動物実験系から得られる生体信号と、動物のbehaviorをテレビカメラで記録したビデオ信号とを学内LANに接続し、2)学内LANに接続されるワークステーション上にこれらのデータを実時間で表示し、3)これらの端末からデータ収集や刺激パラメータの設定を遠隔操作でき、かつ、4)生体信号を実時間でデジタル処理し、その結果を即座に検索・表示できるようなソフトウエアを、コンピュータネットワークで使用可能な双方向ブラウザソフトJavaで開発することであった。3年の研究を経て、生理学的実験を全て実時間処理するにはデータの転送速度やコンピュータの処理能力が不足しているが、遠隔実験は可能であり、その利便性が確認できた点で研究の目的は達成できたと結論できる。本研究は動物を使った慢性実験において、「データの収集および実験機器の操作を学内LANを利用して遠隔操作できるシステム」の構築を目的として企画された。初年度はデータ収集用パソコンと解析用サーバシステムによるclosedなネットワークシステムを構築し、動物実験から得られたデータの送受信を実現することを中心に研究を進めた。具体的には、山田が担当して動物実験室のビデオカメラ・生体信号記録装置をパソコンと接続し、これらのデータをLAN接続によりサーバシステムに転送する作業を行った。宮村はアナログデータの解析ソフトをLAN環境で使うための検討を行い、ナショナル・インスツルメンツ社が開発し、工学の分野でデファクト・スタンダードになっているLabVIEWをベースに開発することを提案し、開発に取り組んでいる。初期の計画通り、初年度はJavaを使わずアプリケーションソフト(LapLink)によるデータ転送を試みた。その結果、アナログデータの転送はバイナリーデータで実行した場合には十分な速度で実行できた。しかし、実験室のパソコンの画面をそのまま転送した場合、現状のLAN環境では同じセグメント内でかつラインを占有できる場合には実験叶であるが、現実には転送速度が追いつかないことが予想された。上記の計画を持って木竜はボストン大学のDr.DeLucaを訪れ、研究計画のレビューを依頼した。そこでの議論では、インターネット環境で共同研究を進めるには,大量の生理データをセキュリティを確保しながら取り扱える仕組みが必要であるとの結論を得た。今後、インターネット環境で次第にコンポーネント化されつつあるJavaやActiveXへの対応を早急に進める予定である.初年度に開発したLab Viewをベースとした生体信号処理ソフトは、(1)処理速度が遅い、(2)操作性が悪い、(3)生理学的に必要な計測項目に欠ける、などの問題があった。平成10年度はまず、これらの問題を解決することに力を注いだ。処理速度の問題の多くは、コンピュータの計算速度が年々引き上げられ、現状ではまだ満足のゆく速度ではないが、解決できない問題ではないことが判明した。

しかし、これは生体信号処理ソフトをネットワークから切り離して使用する場合であり、実際にネットワークを通した試験を実施したところ、新たに2つの問題が浮かび上がった。それは、生体信号処理ソフトだけでもパソコンに大きな負担がかかり、計算速度の低下が懸念されるが、ネットワーク管理ソフトと同時に作動させることで、さらに大きな負担がパソコンにかかることである。この問題を解決するため、生体信号処理ソフトの一部、特に生体信号の取り込みと、その表示の部分をC言語で書いたソフトに置き換えることでその解決を試みた。現状では、生体信号のサンプリング速度の上限を筋電図などの比較的遅い信号に限れば使用可能なまでに改善された。しかし、我々の目的とする単一神経活動を記録できるように、速い信号を扱えるように改善する必要がある。次の問題は、学内ランの転送速度の問題である。現在、毎秒10M-byteの転送速度のランが敷設されている。この速度は、専用回線であれば問題ないが、新潟大学歯学部のラン使用状況は平均を遥かに上回るため、少なくともネットワークを使って、常時生体信号をモニターすることは不可能であるとの結論を得た。幸い、ネットワークの容量を拡張する計画があり、少しは改善できる可能性も残された。最終年度にはJavaを使って双方向の遠隔実験を実施する予定である。最終年度にあたり、生体信号計測ソフトを完成させた。生体信号データ収集装置は生体信号増幅器とPCMCIAタイプのA/Dコンバータで接続されたノートブックコンピュータからなる。プログラムは起動と同時に待機状態を維持し、遠隔地からネットワークを経由してデータ収集を開始する。データ収集部分のプログラムは個々のOSやハードウエアに依存せざるを得ないが、収集した生体信号の表示には、Javaを用いた。すなわち、計測側PCにダイナミックにIPアドレスを割り当ててJava Serverを立ち上げ、ネットワークにつながれたClient PCで生体信号の表示ができるようにした。この場合、膨大な生体信号データをClient PCに直接ダウンロードしなくとも表示できるので、効率の良い1次スクリーニングが可能である。生体信号計測では電極やセンサ増幅器などをセットアップした後、オシロスコープで信号を見ながら膨大な量をデータレコーダに記録し、日をおいて解析する。したがって、有効なデータが計測されたかどうかは、その時点では不明な点が多い。本システムはこのような見込み実験を減らすことが可能である。実験者は計測対象の状態を見ながら遠隔操作でデータ収集プログラムを起動し、コンピュータネットワーク接続先で解析結果を一次スクリーニングできる。遠隔実験として、本システムをスキー運動時の運動機能の変化を探る実験に応用した。この実験では、限られた期間内に高品質のデータを手に入れる必要がある。
胎生期脳発生における活性酸素シグナル機能の解明

平成24年度は、マウス胚に内在する活性酸素が脳発生を制御する可能性を検証するために、活性酸素量を人為的に操作する手法の開発を重点的におこなった。研究計画に従い、全胚培養時の抗酸化剤添加による脳発生への影響を調べた。胚発生に大きな障害が生じず、脳発生特異的に影響を与える培養条件の決定を目標に、抗酸化剤の濃度、培養に用いる胚のステージ、培養時間等を詳細に検討した。その結果、胎生8.5日目のマウス胚を最終濃度10mMのN-acetylcysteine(NAC)を含む100%ラット血清を用いて、24時間から36時間全胚培養した場合に脳発生特異的に異常が認められた。この培養条件を本研究の最適条件とした。条件検討の過程から、NACの濃度を数mM上げるだけで胚発生が著しく阻害されることがわかった。このことは、内在性活性酸素が脳発生以外の胚発生イベントにも関与していることを示唆している。また、胎生9日目の胚を全胚培養に用いた場合、脳発生への影響は胎生8.5日目胚を用いた場合に比べて少なかった。この結果は、内在性活性酸素がシグナル分子として機能するのは胚発生過程の極めて短い期間であることを意味する。最適条件下で培養したマウス胚は、脳、特に前脳の著しい縮小が認められた。NAC処理胚頭部の凍結切片を作製し、免疫染色法により神経細胞と神経前駆細胞の検出をおこなった。その結果、NAC処理により神経前駆細胞が減少することが明らかとなった。また、細胞分裂期の細胞を検出するマーカーを用いた解析により、神経前駆細胞の細胞分裂能が低下していることがわかった。この結果は、活性酸素が神経幹細胞の増殖に必須であるという過去の知見と一致する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
軽度発達障害児の自己意識の発達と教育環境力促進のための縦断的研究

「目的(1)軽度発達障害児をとりまく社会的環境について実態調査する」に関して:軽度発達障害児の母親98名を対象に、育児肯定感と、父親の育児に対する母親の認識との関連性について、調査を行い、この研究成果を投稿論文としてまとめ、特殊教育学研究誌上に研究資料として掲載された。また、軽度発達障害児の父親を対象に育児意識の変容過程について面接調査した結果は、第44回日本特殊教育学会で発表された。「目的(2)軽度発達障害児の自己意識のありかたを検討する」に関して:軽度発達障害児の自己意識の発達について、障害の告知と自己への問いとの観点から検討した結果について、東北大学大学院教育学研究科研究年報に論文を発表した。注意欠陥多動性障害児の自己意識の発達について、課題遂行に対する原因帰属からの検討を行なった。この研究成果は第44回日本特殊教育学会で発表された。また、自己評価と自尊心との関連から自己意識について検討し、この研究成果は第44回日本特殊教育学会で発表された。高機能広汎性発達障害児の自己意識の発達については、課題遂行に対する原因帰属からの検討を行なった。この研究成果は第15回日本LD学会で発表された。自己認識に関する発達的検討をすすめるため、定型発達児を対象に調査を行い、この研究成果は、東北大学大学院教育学研究科教育ネットワーク研究室年報7巻において掲載された。「目的(3)軽度発達障害児に対する心理臨床的援助、教育支援についてその方法の有効性や変容のプロセスを解明する」に関して:心理劇的ロールプレイを用いた軽度発達障害児のグループワークにおける他者への志向性の過程および子どもの対人関係の困難さを主訴として来談した親に対する集団心理面接過程に関する縦断的な検討を行った。(1)軽度発達障害児を取り巻く周囲の教育的・心理的環境に関する実態調査小学校通常学級の担任を対象に、行動面、学習面、情緒面での教育的援助の内容、専門機関・医療機関などとの連携状況などについて実態調査を行なった。現在、調査研究の結果を分析中であり、来年度の関連学会で発表し、今後学会誌への投稿論文としてまとめる予定である。(2)自己意識に関する文献研究軽度発達障害児の自己意識の発達に関する文献研究を行った。ADHD児の自己意の研究動向については東北大学研究年報に論文をまとめた。(3)軽度発達障害児の自己意識の発達に関する調査研究自己意識の発達について、対象児とその保護者を対象に面接調査を行い、その結果の一部については2003年度日本特殊教育学会総会と日本教育心理学会総会で発表した。また、健常児の自己意識の発達をとらえるため、小学生約650名を対象に質問紙調査を行い、現在統計による分析を行っている。また文化的側面も合わせて検討するため、韓国光州市において約1000名の小学生・中学生を対象に質問紙調査を行い、これもあわせて現在統計分析を行っている。(4)軽度発達障害児を対象とした心理臨床的研究心理臨床的援助については、大学の発達相談ならびに研究代表者が非常勤として勤務している医療機関において、高機能広汎性発達障害をもつ青年期のグループ・セラピーを継続して行っている。その変容をVTRにより録画し逐語録をもとに、その有効性と自己意識との関連について現在検討し、さらなる援助的関わりへとつなげている。「目的(1)軽度発達障害児をとりまく社会的環境について実態調査する」に関して:の軽度発達障害児が在籍する通常学級の担任教師による支援(学習支援・行動支援・情緒支援・他者との関係づくり支援)について、通常学級の担任教師186名を対象に調査を行った。この研究成果は、第13回日本LD学会において発表した。さらに、この調査研究に基づき、その具体的な事例を"周りの子どもにどう伝えよう"という冊子としてまとめた。