hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光および植物ホルモンによるグルタミン合成酵素誘導機構の解明

(1)レタス吸水種子中より,ほぼ全長のGS-cDNA(1450bp)を単離し,全塩基配列を決定した.推定されたGSサブユニットは358アミノ酸からなり,レタスcytosolGSサブユニットの分子量とよく一致する.他の植物GSとのコード領域での相同性は,アルファルファcytosolGSに対して80%(アミノ酸配列で88%)であり,エンドウchloroplastGSに対して75%(同上, 78%)であった.(2)このGScDNAをプローブとして吸水種子中のmRNA量を比較すると,光の効果は典型的なフィトクローム依存であること,ジベレリン処理によってGS-mRNAが増加することが明らかとなった.(3)レタス種子発芽に関するフィトクロームのescape反応は約6時間必要とするが, GSmRNAの合成とそのescape反応との間にはtime lagが認められるので,たとえば核内のフィトクロームが直接GS遺伝子を発現させるのではなく,フィトクロームの信号を受け取るなんらかの反応系が介在するものと推定される.(4)光およびジベレリンの作用を分子レベルで解明するために,レタスGS遺伝子のクローニングを行なった.まず,レタス発芽種子からSarcosyl法により得た高分子量DNAを, Sau3AIを用いて平均20kbの部分分解断片に調製し, λEMBL3をベクターとして核遺伝子ライブラリーを作製した.GScDNAプローブに対して強く反応するクローンを複数得,これらのクローンからSouthern blot等によりGS遺伝子の制限酵素地図を作製した.現在,その構造を解析中である.(1)レタス吸水種子中より,ほぼ全長のGS-cDNA(1450bp)を単離し,全塩基配列を決定した.推定されたGSサブユニットは358アミノ酸からなり,レタスcytosolGSサブユニットの分子量とよく一致する.他の植物GSとのコード領域での相同性は,アルファルファcytosolGSに対して80%(アミノ酸配列で88%)であり,エンドウchloroplastGSに対して75%(同上, 78%)であった.(2)このGScDNAをプローブとして吸水種子中のmRNA量を比較すると,光の効果は典型的なフィトクローム依存であること,ジベレリン処理によってGS-mRNAが増加することが明らかとなった.(3)レタス種子発芽に関するフィトクロームのescape反応は約6時間必要とするが, GSmRNAの合成とそのescape反応との間にはtime lagが認められるので,たとえば核内のフィトクロームが直接GS遺伝子を発現させるのではなく,フィトクロームの信号を受け取るなんらかの反応系が介在するものと推定される.(4)光およびジベレリンの作用を分子レベルで解明するために,レタスGS遺伝子のクローニングを行なった.まず,レタス発芽種子からSarcosyl法により得た高分子量DNAを, Sau3AIを用いて平均20kbの部分分解断片に調製し, λEMBL3をベクターとして核遺伝子ライブラリーを作製した.GScDNAプローブに対して強く反応するクローンを複数得,これらのクローンからSouthern blot等によりGS遺伝子の制限酵素地図を作製した.現在,その構造を解析中である.
小児炎症性腸疾患における免疫学的検討と免疫調節薬の効果

近年、炎症性腸疾患の低年齢化が進んでおり、食生活や衛生環境の変化が大きく関与していると考えられている。発達過程である小児領域の炎症性腸疾患の免疫学的変化の検討と免疫調節薬による治療効果を検討した。活動期の潰瘍性大腸炎、クローン病ともにIL-4とIL-6の発現が有意に上昇しており、更に活動期の潰瘍性大腸炎では、GATA3とSTAT4の有意な発現を認め、IL-4の上昇とGATA3、STAT4の有意な発現は小児潰瘍性大腸炎の活動期に大きく関与していると考えられた。また、免疫調節薬6MPは、欧米と比べ少ない投与量で維持されていたが、代謝産物6TGNは約1.5倍高値であり、代謝に関する人種差、他の薬剤との併用による影響が関与していると考えられた。当科にてクローン病(CD)と診断もしくは治療をされた3-15歳の患児7名と潰瘍性大腸炎(UC)と診断もしくは治療をされた6-15歳の患児8名で、活動期と非活動期の血清中サイトカイン値を測定した。さらに活動期におけるCD5名とUC5名で内視鏡検査を施行し、腸管粘膜におけるシグナル伝達分子(Th1 : T-bet及びTh2 : GATA3)の発現をreal time PCR法で検討した。血便などを主訴に内視鏡検査を施行し、正常粘膜を認めた5症例の生検組織を対照とした。その結果、血清サイトカイン値では、CDにおいて非活動期に比べ活動期にIL-4およびIL-6が有意に増加していた(p<0.05)。また、UCにおいてはIL-4が非活動期と比較して有意に増加していた(p<0.05)。real time PCR法では、正常粘膜と比較すると、CDとUCのいずれにおいてもTbetとGATA3の発現が増強していた。UCではGATA3の発現がT-betに比べ有意に増強していた(p<0.05)。一方、CDにおいてはT-betとGATA3の発現に有意な差は認められなかった。また、そのうちCD4名とCD8名から使用している免疫調節薬6MPの血中濃度と白血球、肝機能、膵機能、TPMT遺伝子多型などの血液検査を行い安全性の確認を行い、TPMT遺伝子多型はなく、6MP濃度と白血球数、肝機能、膵機能と相関は認めなかった。今後はIL-17やTGF-betaなどの調節系T細胞の発現をRORgamma-tやFoxp3を指標に同様に検討して行く予定である。当科にて潰瘍性大腸炎(UC)またはクローン病(CD)と診断された症例のうち、免疫調節薬(6MPまたはAZA)を内服しているUC33例とCD20例を対象に6MPの代謝産物である6TGN血中濃度とTPMT遺伝子多型の有無、副作用の発現について検討した。また、そのうちUC20例、CD12例の活動期と非活動期の血清サイトカイン値を測定し比較検討した。更に、UC8例とCD8例とコントロールとして内視鏡所見で正常粘膜であった8例の生検組織を用いて、転写因子をreal-time PCR法で比較検討を行った。結果は、6TGN濃度は活動期と非活動期で有意差は認めず、平均500.80pmol/8×10^8と欧米の報告より高値であったが、免疫調節薬の使用量は低値であった。活動期は非活動期と比べ免疫調節薬の使用量が有意に多く、白血球数が有意に高かった。TPMT遺伝子多型は全例認めなかったが、膵炎や脱毛などの症状が出現した症例もいた。以上から、小児炎症性腸疾患には、比較的安全に免疫調節薬(AZAまたは6MP)を使用可能であるが、遺伝子多型の有無にかかわらず少ない量で6TGN濃度は上昇しやすいため、投与初期は少量から副作用の有無を確認して使用する事が推奨される結果となった。血清サイトカイン値は、活動期と非活動期を比べると、UCとCDともにIL-4値とIL-6値が有意に高く、IL-5,TNF-α,IFN-γ,TGF-β,IL-17,IL-23は有意差を認めなかった。転写因子では、UCがコントロールと比べ、GATA-3、STAT4で有意差を認めたが、CDにおいては、GATA-3, T-bet, STAT4, STAT6いずれも有意差は認めなかった。以上のことから、小児炎症性腸疾患の調節系T細胞は血清中の関与は少なく、大腸粘膜では、小児UCには、IL-4、GATA-3が強く関与していることが示唆された。
タンパク質リジンアシル化修飾の調節による幹細胞システムの制御とその加齢変化

本研究では、主にSIRT7を足がかりに、幹細胞システムにおけるアセチル化以外のアシル化修飾による遺伝子発現制御機構について研究した。平成30年度は以下の研究を実施した。Sirt7 KOマウス由来骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が損なわれている分子機構として、SIRT7がOsterix(OSX)のC末端側にあるK368のアシル化修飾を取り除くことでOSXのN末端側の転写活性化能を増加させていることを明らかにした。WTとSirt7 KOマウスの骨から内在性OSXを免疫沈降してアシル化状態を調べた結果、アセチル化レベルに変化は認められなかったがプロピオニル化が亢進していることを突き止めた。質量分析と点変異体を用いたウェスタンブロットの結果、プロピオニル化していた主なリジンはN末端側にある41と45番目であることが判明した。さらに、SIRT7はOSXのK368の何かしらのアシル化修飾を取り除くことでOSXのN末端側の脱プロピオニル化を促進させることが明らかとなった。高プロピオニル化状態のOSXタンパク質を直接細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行なった結果、低プロピオニル化OSXに比べて転写活性が低いことが明らかとなった。最後に、SIRT1がOSXのN末端側に結合して脱プロピオニル化すること、SIRT7とSIRT1が協調的に働いてOSXの脱プロピオニル化および転写の活性化を行うことが明らかとなった。以上の結果から、骨芽細胞におけるSIRT7は, OSXの脱プロピオニル化を促進することで転写活性化能を正に調節し,骨芽細胞分化を正常に維持する重要な核内因子であることが明らかとなった。骨におけるSIRT7の発現は加齢に伴い低下することも明らかになったことから、加齢性の骨粗鬆症にSIRT7が関与している可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、主にSIRT7を足がかりに、幹細胞システムにおけるアセチル化以外のアシル化修飾による遺伝子発現制御機構について研究している。平成29年度は以下の研究を実施した。1)SIRT7の分子酵素学的解析:12種類のアシル基をリジン残基に導入したペプチドを合成し、リコンビナントSIRT7タンパク質を用いてin vitro酵素反応を行い、質量分析にて脱アシル化されたペプチドとO-Acyl-ADPrを検出することにより、脱アシル化活性を測定した結果、SIRT7は中鎖脂肪酸由来のアシル基を取り除く活性が非常に強いことを発見した。さらに、この脂肪酸アシル化リジン残基を認識する特異的抗体の作製を行った。2)間葉系幹細胞の維持や分化における、SIRT7の役割とその分子機構の解明:Sirt7 KOマウス由来の骨髄間葉系幹細胞を分離し、骨芽細胞への分化が損なわれていることを明らかにした。また、Sirt7 KOマウスの骨組織を解析し、骨形成が低下していることを明らかにした。さらにその分子機構として、SIRT7がOsterixを脱アシル化することで転写活性を促進していることを発見し、現在論文に投稿中である。3)神経幹細胞の維持や分化における、SIRT7の役割とその分子機構の解明: Sirt7 KOマウスを用いて、学習・記憶行動を解析した結果、Sirt7 KOマウスは恐怖刺激に対する記憶の固定に関与することを発見し、論文に発表した。また、Sirt7 KOマウス海馬由来神経幹細胞(ニューロスフェア)では、自己複製能と神経細胞への分化能が低下していることを見出した。さらに、神経幹細胞を用いたDNAアレイの結果、Sirt7 KOマウスでは神経幹細胞で重要ないくつかの遺伝子の発現が低下していること、また、ある特定の転写調節因子で制御される多くの遺伝子群の発現が増加していることを明らかにした。神経幹細胞についての研究は順調に進んでおり、まずは論文を一報発表した。また、間葉系幹細胞については、骨芽細胞への分化に関して論文を投稿中である。

最後に、SIRT1がOSXのN末端側に結合して脱プロピオニル化すること、SIRT7とSIRT1が協調的に働いてOSXの脱プロピオニル化および転写の活性化を行うことが明らかとなった。以上の結果から、骨芽細胞におけるSIRT7は, OSXの脱プロピオニル化を促進することで転写活性化能を正に調節し,骨芽細胞分化を正常に維持する重要な核内因子であることが明らかとなった。骨におけるSIRT7の発現は加齢に伴い低下することも明らかになったことから、加齢性の骨粗鬆症にSIRT7が関与している可能性が示唆された。1)間葉系幹細胞・神経幹細胞の維持や分化における、SIRT7の役割とその分子機構の解明a) Sirt7 KOマウス由来の骨髄間葉系幹細胞を分離し、間葉系幹細胞の自己複製能や骨芽細胞と脂肪細胞への分化のスイッチングについてin vitroで解析する。さらに、Sirt7 KOマウスの骨組織を用いて老化による脂肪髄の増加について解析する。分子機構の解明として、昨年度取得したSIRT7の結合タンパク質を用いた脱アシル化反応の解析を行う。b) Sirt7 KOマウス海馬から神経幹細胞を培養し、神経幹細胞の自己複製能や、神経細胞・アストロサイト・オリゴデンドロサイトへの分化についてin vitroで解析する。さらに、Sirt7 KOマウスを用いて学習・記憶行動の解析を行い、SIRT7の海馬における役割について解析する。分子機構の解明としては、昨年度解析したDNAアレイの結果をもとに、標的分子の解析を進める。c)中長鎖脂肪酸にアルキンを結合させたアルキン脂肪酸を幹細胞に添加し、タンパク質のアルキン脂肪酸アシル化をおこさせる。その後、アルキンに特異的に結合するTag-アジドを反応させ、抗Tag抗体によるアフィニティーカラムによりアシル化タンパク質の網羅的精製を行い、質量分析によるタンパク質同定を行う。d)幹細胞から免疫沈降法により得られたヒストンを質量分析にて解析し、未知の翻訳後リジンアシル化修飾を検索する。2)アセチル化以外のアシル化修飾の加齢変化と間葉系幹細胞・神経幹細胞の老化についてこれまでの研究で得られた結果をもとに、間葉系幹細胞・神経幹細胞における転写因子とヒストンのアシル化修飾が加齢によりどのように変化していくかを解析する。さらに、間葉系幹細胞・神経幹細胞におけるSIRT7の発現が加齢により変化するか否かについても解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
収量・品質のばらつき要因の解析に基づくコメ生産システム診断法の開発

コメ生産現場で利用可能な収量・品質の改善に資する「コメ生産の診断法」を開発することを目的とした。まず、多様な環境(気象,土壌)・管理方法の水田において収集した、水稲の収量・品質およびその影響因子のデータを活用した診断方法を開発するために、パターン認識による方法を検討した.この方法は個々の水田の診断精度は高くないが、対象地域の典型的な問題点を特定し、対策を講じるのに有益であった。一方、穀物生育モデルを用いた方法は、水管理の影響を考慮することが困難であり,モデルパラメータが多数ある、さらには精玄米収量の予測が困難であり、生産現場におけるコメ生産の診断に利用するのは困難と判断した。中山間地、平野部および海岸域の多様な環境の水田において、管理方法が異なる約20名の農家のコメ生産事例約100件について、精玄米収量のばらつき要因を解析した。当初の予定では、土壌(土性、CEC、地力窒素)、水利(用水配分量)および気象(気温、日射量、雨量)条件の指標を用いて水田環境の分類した上で、要因解析を行うことにしていた。しかし、収集データは分類可能な構造を有しておらず、環境面での分類はできなかった。したがって、収集データを前処理なしに直接パターン認識手法(サポートベクター)を用いて解析した。解析は登熟の良否と収量の関係に絞り、籾数、幼穂分化期から登熟中期の間の窒素供給量および登熟期の日照時間を説明変数として、高・中・低の3段階の収量水準を予測するモデルを作成した。予測モデルの正答率は70%程度であり、個々の事例の収量の大小の理由を精度良く説明できる水準ではなかった。この結果から、登熟の良否と収量の関係に解析対象を絞ったとしても、ばらつき要因の精度の高い解析は困難であることが示された。このことは、各事例の収量のばらつきは解析対象地域において一般的に抽出できるようなパターンを持っているのではなく、個々の生産者や水田別に解析する必要があることを示している。したがって、生産者と水田を固定してデータセットにおいて、収量水準、標準偏差および年次変動を求め、他のデータセットと比較するようなアプローチを取る必要があると考える。他方、穀物生育モデルを用いた収量の解析も行った。解析プログラムの作成とパラメータの推定を行い、藁および籾収量の予測精度を評価した。現時点ではモデルによる予測値は大きな誤差を伴っているが、土壌の保肥力や水管理による生育抑制等の因子を考慮する必要性が示されるなど、課題の整理を行うことができた。多様な環境の水田における、様々な管理方法でのコメ生産事例(土壌環境、気象、生産管理履歴、生育、収量、品質データ)の収集については順調に進んでいる。平成27年度は33事例のデータを新たに蓄積した。多変量解析手法を用いた収量のばらつきの解析については、H27年度に予定していた水田環境の分類が機能せず、パターン認識による予測モデルの作成についても成果を上げることができなかった。アプローチ法を見直すことにより、計画の遅れを取り戻す必要がある。穀物生育モデルについては、初年度で解析プラットフォームの構築と課題の整理が完了し、順調に進んでいる。多様な環境・管理方法の水田において20102015年の期間に収集した、精玄米収量のデータ(n=85)について、ばらつき要因を解析した。籾数、幼穂分化期登熟中期の無機態窒素供給量および登熟期の気温・日照時間を候補の説明変数として、高・中・低の3段階の収量水準を予測するモデルを作成した。モデルの作成にはサポートベクターマシンを用いた。候補変数の全組み合わせで予測精度を比較した結果、籾数と幼穂分化期から登熟中期の間の無機態窒素供給量の2変数を説明変数にした際の正答率が79%で最大であった。また、収量の影響因子として特定された籾数の予測モデルを、幼穂分化期の草丈、茎数、SPAD値、稲体の窒素吸収量、幼穂形成期出穂期の無機態窒素供給量・平均気温・平均日照時間を候補変数として作成した。その結果、茎数、SPAD値および幼穂形成期出穂期の無機態窒素供給量の3変数を説明変数とし場合の正答率が67%で最大であった。生産現場のデータであるので、水管理や病虫害などの考慮していない籾数をばらつかせる要因が存在する。したがって、パターン認識を用いたアプローチは高い正答率は期待できないが、対象地域の典型的な問題点を特定し、対策を講じるには有益な方法と考えられる。また、パターン認識手法によるアプローチと比較するために穀物生育モデルを用いた収量解析を行った。2015年および2016年の2か年のデータを用いて評価した。その結果、現在の穀物生育モデルは水ストレスの影響を考慮していないため、初期落水や中干などの水管理を伴った場合に大きな誤差を伴う、局所的な環境に対して決定する必要があるパラメータが多数ある、さらには精玄米収量の予測が困難であることから、環境や管理方法が多様な生産現場における作業意思決定支援に利用するのは困難と判断した。平成28年度は27事例のデータを新たに蓄積した(ヒノヒカリn=139、元気つくしn=34)。

多変量解析手法を用いた収量のばらつき要因の解析については、守備範囲が整理できたので成果のまとめを行う。穀物生育モデルについては、2年間の解析により生産現場における作業意思決定支援への活用には不向きであると結論付けられた。本研究では,水稲の収量構成要素である籾数,登熟歩合および千粒重を対象にして,パターン認識を用いて予測モデルを作成することにより,各構成要素の決定要因を明らかにすることを目的とした.予測モデルの作成には,福岡県糸島市のヒノヒカリ栽培水田で20102016年の期間に収集した延べ99事例のデータセットを使用した.説明変数の候補として,籾数については幼穂形成期の草丈,茎数/m2,SPAD値および推定窒素吸収量,幼穂形成期出穂期の期間の無機態窒素供給量,さらに同期間の平均気温および平均日照時間の7変数を準備した.登熟歩合と千粒重については,幼穂形成期出穂期および出穂期登熟期(出穂後30日)の平均気温,平均日照時間,無機態窒素供給量に加えて,幼穂形成期登熟期の無機態窒素供給量,籾数の8変数を準備した.サポートベクターマシーンを用いて,各収量構成要素について低中高の3水準を予測するモデルを作成した.その結果,籾数については, SPAD値,推定窒素吸収量,幼穂形成期出穂期の期間の無機態窒素供給量の3変数を選択した場合に正答率が68%と最大になった.また,籾数の少・中・多の時の説明変数領域の可視化により,追肥前の幼穂形成期のSPAD値が38以下になると籾数が不足する傾向が確認された.登熟歩合については,出穂期登熟期の平均気温・日照時間および籾数の3変数を選択した場合に正答率が62%と比較的高かった.また,登熟歩合の低・中・高の3水準を達成する説明変数領域の可視化により,籾数が24000 m-2以下で日照時間が4.4時間以上の時,登熟歩合が高い水準になることが明らかになった.千粒重については,特徴的な決定要因は検出されなかった.以上,パターン認識手法を用いて多様な環境・管理方法の水田データから,一部の収量構成要素の決定要因を特定できることが示された.コメ生産現場で利用可能な収量・品質の改善に資する「コメ生産の診断法」を開発することを目的とした。まず、多様な環境(気象,土壌)・管理方法の水田において収集した、水稲の収量・品質およびその影響因子のデータを活用した診断方法を開発するために、パターン認識による方法を検討した.この方法は個々の水田の診断精度は高くないが、対象地域の典型的な問題点を特定し、対策を講じるのに有益であった。一方、穀物生育モデルを用いた方法は、水管理の影響を考慮することが困難であり,モデルパラメータが多数ある、さらには精玄米収量の予測が困難であり、生産現場におけるコメ生産の診断に利用するのは困難と判断した。収量のばらつき要因の解析については、同一生産者と同一水田のコメ生産事例を基本のデータセットとして解析する。平均値、標準偏差および年次変動の傾向を、他のデータセットと比較することにより、ばらつきの要因を解析する。穀物モデルについては、生産現場における計測項目を増やすことにより(生育指標の変動、地力窒素の無機化等)、現在の誤差発生の理由を詳細に解析する。また、その結果に基づきモデルの修正を行う。H28以降に予定していた「コメ生産システム診断チャート」の作成は、収量のばらつき要因の解析の成果が出た段階で着手する。研究機関最終年度であるので、現在の所有している全データを用いて解析を行い、論文としてまとめて投稿する。
肺線維化におけるプロテアソームの役割

肺線維症患者の気管支肺胞洗浄液(BALF)では健常群やサルコイドーシス患者と比較し20Sプロテアソーム活性が高い傾向があった。プロテアソーム活性の増加と肺線維症との関連が示唆された。一方、12週間の喫煙曝露を行ったプロテアソーム抑制マウスは野生型と比較し有意に気腔が拡大し、アポトーシス細胞の増加がみられ、プロテアソーム抑制は喫煙に対する肺胞破壊が増強することが示された。線維芽細胞はタバコ煙刺激後にプロテアソーム阻害薬を加えることによってアポトーシス細胞の増加がみられ小胞体ストレスも増加した。プロテアソームが肺の線維化に与える影響を明らかにするために、生体における肺線維症患者の気管支肺胞洗浄液(BALF)でのプロテアソーム活性や発現を調べた。プロテアソーム活性はProteasome-Glo TM assay systems, Promegaを用いて20S proteasomeの発光強度をスタンダードとしBALFあたりの活性を測定した。プロテアソーム抑制薬なしの値とありの値の差を結果に用いた。特発性肺線維症患者(IIP)36名、薬剤性肺障害患者7名、膠原病関連間質性肺炎(CVD-IP) 23名ではChymotrypsin-様活性は3群に変化がなかったものの、Trypsin-様活性とCaspase-様活性はIIP群やCVD-IP群に比べて薬剤性肺障害群が有意に高値であった(Trypsin-様活性p<0.001, Caspase-様活性p=0.006)。健常者17名、サルコイドーシス患者27名およびIIP群の検討では有意ではなかったものの、IIP群が他の2群に比べてChymotrypsin-様活性が高い傾向があった(p=0.089)。年齢とプロテアソーム活性には相関を認めなかったが、健常者(53±3 SE歳)、サルコイドーシス(57±2)、IIP(65±2)と有意にIIPの年齢が高値であった。IIP患者のBALFにおけるChymotrypsin-様活性が高い傾向であったことは、Chymotrypsin-様活性が肺線維化形成に何らかの影響を与えていると考えられる。薬剤性肺障害はIIP群やCVD-IP群と比べChymotrypsin-様活性は変わりなくTrypsin-様活性とCaspase-様活性が高値であったことは、プロテアソームの活性首座の変化が種類の異なる間質性肺炎の発症や障害メカニズムに影響している可能性がある。喫煙刺激に対しプロテアソーム機能の抑制がどのような影響を及ぼすかを調べるため、C57BL/6の野生型マウス(WT)もしくはプロテアソーム活性が減弱したトランスジェニックマウス(Tg)に5%、60分間の喫煙曝露(柴田化学SIS-CS)を週5日間で12週間行った。Mean linear interceptを測定すると喫煙曝露を行ったTgマウスはWTと比較し有意に気腔が拡大しており、プロテアソーム抑制は喫煙に対する肺胞破壊が増強することが示された。TUNEL染色を行ったところ、TgマウスではWTと比較し有意にアポトーシス細胞の増加がみられた。そこで、プロテアソーム活性抑制の有無で喫煙刺激によるアポトーシスが異なるかどうかを検討した。Primary mouse lungfibroblast cell line, primary human lung fibroblast cell line,皮下から分離したfibroblastをプロテアソーム阻害薬(PS-341:10nM)の有無で32時間プレインキュベートした後、1%タバコ煙抽出液を含む培地で16時間培養した。動物種別や採取した部位に関わらず、タバコ煙刺激後のfibroblastはプロテアソーム阻害薬を加えることによってannexin V陽性細胞が増加した。しかし、primary肺胞上皮細胞ではプロテアソーム阻害薬の有無で差はなかった。TgマウスとWTマウスより採取したfibroblastを1%タバコ煙抽出液で培養すると、Tgマウスから得られたfibroblastではWTと比較しannexin V陽性細胞とpropidium iodide陽性細胞の陽性比率が増加していた。プロテアソーム活性低下ではタバコ煙という酸化ストレス下でaggresome formationも増加することが確認された。タバコ煙がもたらす細胞死のメカニズムを検討するためERストレスの指標を検討したところ、glucose-regulated protein 78はタバコ煙を曝露したTgマウスのfibroblastで増加していたが、caxpase-3は変化がなく、アポトーシスはcaxpase非依存性経路で起こっていると考えられた。生体における肺線維症患者の気管支肺胞洗浄液(BALF)でのプロテアソーム活性や発現を調べた。IIP群が健常群やサルコイドーシス群に比べてChymotrypsin-様活性が高い傾向があった(p=0.089)。新たに20S proteasome活性と呼吸機能との関連を検討したところ、肺活量(VC)実測値および最大吸気量(IC)が正の相関を示したが(r=0.66およびr=0.82)、一秒率とは負の相関を示した(r=0.72)。比較的経度の患者のプロテアソーム活性が高いことがわかった。喫煙刺激に対しプロテアソーム機能の抑制がどのような影響を及ぼすかを調べるため、C57BL/6の野生型マウス(WT)もしくはプロテアソーム活性が減弱したトランスジェニックマウス(Tg)に5%、60分間の喫煙曝露を週5日間で12週間行った。

喫煙曝露を行ったTgマウスはWTと比較し有意に気腔が拡大しており、プロテアソーム抑制は喫煙に対する肺胞破壊が増強することが示された。TgマウスではWTと比較し有意にアポトーシス細胞の増加がみられた。動物種別や採取した部位に関わらず、タバコ煙刺激後のfibroblastはプロテアソーム阻害薬を加えることによってannexin V陽性細胞が増加し、ERストレスも増加した。アポトーシスはcaspase非依存性経路で起こっていると考えられた。8週令のβ5t-Tgマウスおよび同腹のWild typeマウスに0.05 Uのブレオマイシンを経気管支投与した。β5t-TgマウスではMasson- trichrome染色の染まりが弱くみられた。また、肺組織におけるTotal soluble collagenはβ5t-Tgマウスでは21日後にはブレオマイシン投与前の値と同じであったが、同腹のWTは高値を示した。Collagen 3 mRNA発現はWTマウスが高い傾向がみられたが、β5t-Tgマウスは経気管投与による死亡回避が難しく統計的に有意な検討は困難であった。肺線維症患者の気管支肺胞洗浄液(BALF)では健常群やサルコイドーシス患者と比較し20Sプロテアソーム活性が高い傾向があった。プロテアソーム活性の増加と肺線維症との関連が示唆された。一方、12週間の喫煙曝露を行ったプロテアソーム抑制マウスは野生型と比較し有意に気腔が拡大し、アポトーシス細胞の増加がみられ、プロテアソーム抑制は喫煙に対する肺胞破壊が増強することが示された。線維芽細胞はタバコ煙刺激後にプロテアソーム阻害薬を加えることによってアポトーシス細胞の増加がみられ小胞体ストレスも増加した。本年度はプロテアソーム活性の違いがタバコ曝露下における気腫病変の進展や線維芽細胞におこる変化に着目した論文が受理された。呼吸器内科学今までの研究により、プロテアソームの機能低下は酸化ストレスに対する細胞死を過剰に誘導することが分かった。今後は線維芽細胞における機能変化に着目し研究をすすめる。BALFの検討は順調に進んでいる。動物実験モデルは実験条件設定にやや時間がかかっているものの、おおむね順調であると考えられるプロテアソーム抑制Tgマウスを使用し、野生型マウスとの線維化モデル比較実験を継続する予定であったが、Tgマウスの繁殖が遅れており、十分な匹数の実験マウスを準備することが出来なかったため、コントロールとなる野生型マウスの購入を先延ばしにしたためβ5t-Tgマウスを用いた動物実験モデルはブレオマイシンと平行してLPSや喫煙刺激などのモデルも作成し、肺障害の程度やプロテアソーム活性について深めていく予定である。Tgマウスの繁殖ができ次第、野生型マウスを購入し、実験を開始する。
アウグスティヌス『告白』第11巻の研究－回心とその知的準備について－

本研究の目的は『告白』第11巻の議論の構造論的分析を通じ、同書の統一的主題を明らかにすることにあった。前年度までの研究成果を踏まえた上で、本年度では、まず思想史的観点から、11巻の時間論が有するギリシア哲学との連続面と断絶面を、同議論とアリストテレスやプロティノスとの比較によって論じた。これにより、アウグスティヌスの独創性が人間の個別霊魂の意志作用に時間計測の基礎を置いた点にあることが明らかとなった。また構造論的分析により、11巻の議論が時間の計測の基準を物体的なものに置くことの困難から、内的な心象にそれを求めることの妥当性の論証へ進み、魂の意志の働きの記述を経た後、最後にこの意志の働きが人間のあらゆる生の活動の基底にあることを宣言するという流れを有していることが明らかとなった。この一連の記述の流れは、外的なものから内的なものへの意志の向け変えという『告白』前半巻のライトモチーフの反復であり、またその意志作用が人間のあらゆる活動の根底にあると主張する点で、彼の回心の基底にあったものが何であるかを論証的に示すものである。ここから『告白』の時間論は読者に対し前半巻の回心の物語を自由意志の問題として理解するように導く機能を有していることが明らかとなった。前半巻と後半巻とを貫く主題として自由意志の問題があることを解明したことにより本研究は所定の目標を達成したものと考える。本研究の目的は、『告白』第11巻の議論の構造論的分析を通じ、同書の統一的主題を明らかにすることにある。『告白』前半巻(1-10巻)に関しては、アウグスティヌスが自らの生涯を一例として回心体験を軸に、神に導かれる人間の姿を描いたものであるという解釈が広く受け入れられている。しかしこうした人間論の提示が同書後半巻(11-13巻)とどのような関係にあるかについては、未だ決定的な解釈が提示されていない。これに対し本研究では、11巻の時間論が前半巻と後半巻とを繋ぐ要の役割を有しているものと想定し、『告白』内部の文脈の内に時間論を再度位置づけることを試みる。平成23年度に於いては以下の個別的研究を実施した。(1)『告白』前半巻の構成上の特徴であるキアスムス構造内でどのように新プラトン主義が位置付けられているかを分析することを通し、同著作に於いてアウグスティヌスが読者に対し、先行するヘレニズム哲学に替わる真理探究の為の道としてキリスト教を提示していることを明らかにした。本研究成果は『告白』の回心の物語が知的観点から過去の体験を再構成していることを示唆しており、次年度の研究の為の重要な基礎を提供するものと考える。(2)思想史的観点から『告白』11巻の時間論を分析することを通し、同議論が先行するヘレニズム哲学の議論を十分に踏まえながらも、新たに議論を意志論という問題系の内に位置づけていることを明らかにした。本研究の重要性は、アウグスティヌスが時間論を通し、時間計測に於ける魂の注視の働きに焦点を充てることで、人間の行為一般に対する意志作用の根底的性格を読者に提示しているという点を指摘したことにある。これは彼の時間論が読者に対して前半巻の回心の物語を自由意志の問題、として理解するように導いていることを示唆するものであり、本研究課題全体にとって非常に重要な意義を有しているものと考える。上記研究実績の概要の内、(1)は『告白』前半巻の構成上の構造を明らかにするものであり、(2)はこの前半巻が後半巻で明らかにされた意志という観点から読まれるべきであるという『告白』の著者が想定した読解上の観点を示すものであると言える。これら(1)(2)の研究の進展は『告白』前半巻と後半巻との統一的主題を明らかにするという本研究課題の目的に大きく資するものである。なお、研究成果の発表については次の通り。

(1)に関しては日本宗教学会にて発表を行い、『宗教学・比較思想学論集』13号に掲載が決定(印刷中)。(2)に関しては中世哲学会に於いて発表を行い、『中世思想研究』に論文を投稿(査読中)。平成23年度の研究により、『告白』11巻の時間論が読者を信仰へと駆り立てる役割を有していることが分かった。同一の主題が『告白』前半巻に於いてもまた見出せるのか否かを、回心の物語を意志論の観点から捉え直すことによって論じる。研究に際しては、同書1巻、6巻、10巻の記述に特に着目し、アウグスティヌスが、マニ教の誤謬に陥る以前と誤謬からの復帰の最初の段階、そして『告白』執筆当時、という三つの段階をそれぞれどのような意志の状態にあるものとして捉えていたかを論じる。研究成果の発表に関しては、2件の口頭発表と、1件の論文投稿を予定している。
都市の広域化と環境変化の国際比較分析

1都市への人口集中・都市の広域化に伴う急激な環境変化について、その時系列的変化を把握し、その特性を明らかにし、国際比較に資することを目指す研究の一年目の成果として、次のような結果を得た。2(1)遠隔計測デ-タによる土地被覆の遷移過程把握について、カテゴリ-数を多く求めることはできないにしても大まかな遷移を知ることが可能であることが明らかになった。今後、自動化処理によって処理時間の短縮を図ることとしたい。(2)資料の乏しい途上国における環境状態把握のため、エネルギ-使用量の原単位と都市基本デ-タによる推計の手法について、まず日本国内デ-タによって検討した結果、デ-タ入手可能な地域についてはその応用の目処が立った。(3)都市の発展段階と環境変化を各種の経済統計資料を加えて検討することにより、経済発展の段階による座標を移動させた比較検討によって、変化傾向を国際比較する手掛かりを得、さらに途上国を含めたデ-タ入手のための情報ネットワ-クを構築した。(4)広域都市圏の環境変化を社会・経済デ-タをも取り入れたモデルによって分析検討する手法を開発し、国内及び12の海外都市についてその応用を試みた。またモデルの応用のためのデ-タベ-スの構築にも取り組んだ。(5)都市圏の環境変化の地球温暖化についての影響モデルの構築のため、国別の影響モデルの構築を行い、あわせて、環境資源勘定に関する研究レビュ-による評価体系の設計を行った。3平成2年度は、今後の研究の展開のための基礎的作業を中心とし、国際比較検討の手法開発に努め、主に国内デ-タによってモデル設計や実用性の検証を行った。次年度は初年度開発したモデル等を海外諸都市について適用する作業をすすめ所定の成果を得たい。
動脈硬化形成におけるマクロファージ由来レジスチン様分子の作用の解析

マクロファージから分泌されるRELMβの引き起こすinnateimmune反応が、粥状動脈硬化の形成に重要であることを明らかにした。マクロファージから分泌されるRELMβの引き起こすinnate immune反応が、粥状動脈硬化の形成に重要であることを明らかにした。・本研究はマクロファージから分泌されるRELMβの引き起こすinnate immune反応が、粥状動脈硬化の形成に重要である、という仮説を検証する目的である。そのためRELMβ欠損マウス(RELMβnull-ES cell、背景129/B16)を入手した。マウスは通常動脈硬化抵抗性でC57/B16が最も動脈硬化が誘発されやすく、また動脈硬化モデルマウスのApoE欠損マウスの背景がC57/B16なので、スピードコンジェニック法(マイクロサテライトを用いてC57/B16に近い個体を選別し、顕微授精により早期から精子を交配に供した)によりC57/B16コンジェニック化RELMβ欠損マウス作出した。さらに、動脈硬化モデルマウスであるApoE欠損との二重欠損マウスを作出できた。・大血管microarrayと細胞内シグナル伝達解析:上行胸部大動脈を摘出してmRNAを抽出、microarrayによって血管壁に生じる変化を網羅的に解析を行っている。解析では、KeyMolnet(IMMD社)を用い、炎症反応をはじめとした血管病変の形成にRELMβがかかわることが示唆された。また形態的変化については、動脈硬化性病変におけるマクロファージの集族化、泡沫化が抑制されたていた。今後はLPSや動脈硬化誘発食に対するRELMβKOによる反応性の違いを解析する。・腹腔マクロファージex vivo/in vitro解析:RELMβ欠損マウスでは野生型の腹腔マクロファージに比べ炎症性サイトカインの分泌が抑制されていた。今後は泡沫化などの機能解析を行う。・本研究の継続、発展によって、RELMβが動脈硬化の発症進展に関して、マクロファージからの分泌で動脈硬化を直接的に進行させるという全く新規な病態を明らかにできると考えている。1.研究開始当初の背景:我々の報告により、レジスチン様分子(RELM)βがインスリン抵抗性に関与することが明らかとなりつつあった。また、血管内皮機能障害への関与を明らかとしたが、同時にヒトマクロファージからの分泌を見出した。2.研究の目的:本研究はマクロファージから分泌されるRELMβの引き起こすinnate immune反応が、粥状動脈硬化の形成に重要である、という仮説を検証する。3.研究の方法:C57/B16コンジェニック化RELMβ欠損マウス作出した。さらに、動脈硬化モデルマウスであるApoE欠損との二重欠損マウスを作出し、以下の点を検討した。・大血管microarrayと細胞内シグナル伝達解析:上行胸部大動脈を摘出して形態的変化を検討した。・腹腔マクロファージex vivo/in vitro解析:RELMβ欠損マウス及び野生型の腹腔マクロファージの炎症性サイトカイン分泌および泡沫化を検討した。4.研究成果:(i)ApoE欠損マウスにおいて、RELMβをも欠損させたマウスを得た。本マウスでは、動脈硬化性病変におけるマクロファージの集族化、泡沫化の抑制を認めた。(ii)腹腔マクロファージex vivo/in vitro解析:RELMβ欠損マウスでは野生型の腹腔マクロファージに比べ炎症性サイトカインの分泌が抑制されていた。また、WHHLウサギ血清投与やAcLDL投与によるマクロファージ泡沫化についてもRELMβ欠損マクロファージでは抑制を認めた。RELMβ欠損マクロファージではスカベンジャー受容体の発現が抑制されていた。2年間の研究予定はほぼ達成し、今後はマクロファージ由来および腸管由来のRELMβのヒトからの分泌についての測定を進め、動脈硬化症等との関連を検討する。
MBE法によるGaAs上1.5μm帯InAs/GaInAsSb量子ドットレーザ

次世代光通信のキーデバイスとして面発光レーザ(VCSEL)が期待されている.実用的な特性の実現には,GaAs基板上における1.5μm帯の長波長帯発振が必要であり,新たな材料とその形成技術の確立が必要である.活性層にInAs量子ドットを用い,GaInAsをドットのカバー層に用いた構造は長波長帯材料の候補だが,GaAs基板に対し高歪化することによる発光効率の劣化が課題であった.一方,結晶成長表面に作用するサーファクタントにアンチモン(Sb)を用いた高歪結晶の形成が検討され,GaIAsSb量子井戸において低しきい値レーザが報告されている.そこで,本研究では『Sbを導入したGaAs基板上長波長帯材料による量子ドットレーザの実現』を目標とし,研究を遂行している.昨年度までにGaAs基板上に成長可能な長波長帯材料としてInAs/GaInAsSb系自己形成量子ドット(QD)を提案し,室温PLにおいて1.5μm帯までの長波長化と発光効率の向上を達成している.AFM観察とその粒子解析の結果,歪カバー層による高さの増大と幅の収縮かつ平均体積の増加が観測され,カバ-層へのIn添加に較べ,Sb添加の場合にはサイズ揺らぎを抑える方向が顕著であることを見出した.本年度は,種々の特徴量をもとにSb導入によるQDの形成過程とその偏光特性への影響について検討した.具体的にはカバー層へのSbの導入により,結晶品質を損なうことなく長波長面発光型受動デバイスの偏波無依存化が期待でき,さらにInを加えることで偏光度差の面方位依存性を最小に出来ることがわかった.本手法が進行波型デバイスの偏波無依存化への応用にも有効であることを示した.カバー層の最適成長条件について詳細に検討を進め,GaInAsSb高歪薄膜を低速度で形成することの重要性を示し,実際に端面出射レーザ構造において1.4μm帯電流注入動作を確認した.次世代光通信のキーデバイスとして面発光レーザ(VCSEL)が期待されている.実用的な特性の実現には,GaAs基板上における1.5μm帯の長波長帯発振が必要であり,新たな材料とその形成技術の確立が必要である.活性層にInAs量子ドットを用い,GaInAsをドットのカバー層に用いた構造は長波長帯材料の候補だが,GaAs基板に対し高歪化することによる発光効率の劣化が課題であった.一方,結晶成長表面に作用するサーファクタントにアンチモン(Sb)を用いた高歪結晶の形成が検討され,GaInAsSb量子井戸において低しきい値レーザが報告されている.そこで,本研究では『Sbを導入したGaAs基板上長波長帯材料による量子ドットレーザの実現』を目標とし,研究を遂行している.本年度は,InAs/GaInAsSb系量子ドットの基礎的な結晶成長技術を確立し,所望の特性(波長帯域・ドット密度等)を実現するため,ドット構造や発光波長の結晶成長条件依存性を検討した.具体的には,GaAs基板上長波長帯活性層としてGaInAs系量子ドットを採用し,長波長化に伴う結晶品質の劣化を抑制するため,Sbの導入を初めて提案した.提案した手法により作成したSb系量子ドットのAFM解析像から,QD-カバー界面やカバー層におけるSbの導入がドット密度に大きく影響しないことを示した.これらの粒子解析から歪系カバー層による高さの増大・幅の収縮・平均体積の増加が見積もられたが,カバー層へのIn添加に較べ,Sb添加の場合にはサイズ揺らぎを抑える方向が顕著であることを見出した.また,光学特性との比較においても長波長化・スペクトル線幅の減少がこれらの結果を支持することから,Sbの導入が量子ドットの均一性を向上させながら,肥大化させる有効な手段であることを示した.次世代光通信のキーデバイスとして面発光レーザ(VCSEL)が期待されている.実用的な特性の実現には,GaAs基板上における1.5μm帯の長波長帯発振が必要であり,新たな材料とその形成技術の確立が必要である.活性層にInAs量子ドットを用い,GaInAsをドットのカバー層に用いた構造は長波長帯材料の候補だが,GaAs基板に対し高歪化することによる発光効率の劣化が課題であった.一方,結晶成長表面に作用するサーファクタントにアンチモン(Sb)を用いた高歪結晶の形成が検討され,GaIAsSb量子井戸において低しきい値レーザが報告されている.そこで,本研究では『Sbを導入したGaAs基板上長波長帯材料による量子ドットレーザの実現』を目標とし,研究を遂行している.昨年度までにGaAs基板上に成長可能な長波長帯材料としてInAs/GaInAsSb系自己形成量子ドット(QD)を提案し,室温PLにおいて1.5μm帯までの長波長化と発光効率の向上を達成している.AFM観察とその粒子解析の結果,歪カバー層による高さの増大と幅の収縮かつ平均体積の増加が観測され,カバ-層へのIn添加に較べ,Sb添加の場合にはサイズ揺らぎを抑える方向が顕著であることを見出した.本年度は,種々の特徴量をもとにSb導入によるQDの形成過程とその偏光特性への影響について検討した.

具体的にはカバー層へのSbの導入により,結晶品質を損なうことなく長波長面発光型受動デバイスの偏波無依存化が期待でき,さらにInを加えることで偏光度差の面方位依存性を最小に出来ることがわかった.本手法が進行波型デバイスの偏波無依存化への応用にも有効であることを示した.カバー層の最適成長条件について詳細に検討を進め,GaInAsSb高歪薄膜を低速度で形成することの重要性を示し,実際に端面出射レーザ構造において1.4μm帯電流注入動作を確認した.
ミクロとマクロな視点からの両親媒性高分子ゲルの構造と分子運動の解析

従来特定の構造をもたないアモルファスなものがほとんどであった合成高分子ゲルが規則的な構造をとれば、生体にみられるゲルのように物質・エネルギー・情報の輸送・変換・貯蔵を高効率で遂行できるようになると考えられる。本研究の目的は、疎水性官能基と親水性官能基を同時に導入して両親媒性高分子ゲルを合成し、規則的な構造の形成を試みるとともに、モノマー組成・温度などの条件とゲルの構造・分子運動の関係を動的に解析することである。親水性モノマーであるアクリル酸(AA)と疎水性を示すアクリル酸ステアリル(SA)を共重合して両親媒性ゲルを合成し、その構造解析を行なうとともにモノマーの共重合組成比F(F=[SA]/[SA]+[AA])を系統的に変え、規則的な構造の形成条件を調べた。その結果、ポリ(アクリル酸-アクリル酸ステアリル)共重合(poly(SA-co-AA))ゲルはF≧0.15で規則的な構造をとり、広角および小角X線回折測定からF=0.25では0.40と5.88nmの面間隔をもつことがわかった。これは、それぞれ側鎖の長鎖ステアリルエステル基がβ構造をとって配列した構造と主鎖間の間隔に対応すると考えられる。また、このゲルは、昇温時には約50°Cに降温時には約40°Cに転移点をもって可逆的な構造の秩序-無秩序を起こし、そのミクロな構造転移にともなってマクロな力学特性であるヤング率が100倍も変化することが明らかとなった。さらにゲルはこの秩序-無秩序転移に基づいた形状記憶性を示すことがわかった。
心血管系におけるKチャネルの多様性に関する分子生物・薬理学的研究

心筋・平滑筋においてAタイプK電流を担うKチャネルは異なる遺伝子産物であるという可能性が、単離細胞を用いた電気生理・薬理学的実験結果から得られた。そこでRT-PCR法を用いてこの可能性を検討し、かつ平滑筋のAタイプKチャネルをクローニングした。AタイプKチャネルをコードする遺伝子として脳や心筋でKv1.4,4.2,4.3が挙げられている。これらのmRNA発現レベルをラット平滑筋組織で検討し、心筋・脳と比較したところ、平滑筋ではKv4.3が主要なものであった。さらに平滑筋のKv4.3はこれまで脳で報告されていたKv4.3(Kv4.3M)の遺伝子多形の一つで、C端末付近に新規の連続したアミノ酸配列19個を含むことが明らかとなった(Kv4.3L)(FEBS Letter,1997)。ラット心筋では従来報告されていたKv4.3Mよりも4.3LがmRNAのレベルで多かったが、脳ではKv4.3Lが少なかった。また、Kv.1.4,4.2,4.3M,4.3LをHEK293細胞に発現させ、その電気生理学的性質を比較検討した。Kv4.3Mと4.3Lは活性化・不活性化の電位依存性や不活性化からの回復時間およびアラキドン酸感受性に関して有意な差が無かった。19アミノ酸が付加されている生理的意義についてはまだ不明である。一方、大コンダクタンスCa^<2+>依存性K^+チャネルと電位依存性L型CaチャネルのmRNA発現を各種平滑筋で比較検討し、興奮性の差異の説明が一部可能であることを見出した。すなわち興奮性の低い大動脈と高い精管の平滑筋細胞において、細胞全体のBKチャネルおよびCaチャネル電流密度は明らかに精管において数倍高い。一方、mRNAの発現はCaチャネルでは精管で数倍高いものの、BKチャネルでは同等であった。摘出パッチ法を用いた単一チャネル記録を行うと、確かにBKチャネルの密度は大動脈と精管で同等であった。大動脈においてCaチャネル電流が増大しても流入するCa量の増大によりBKチャネル活性かそれ以上に増大されるので興奮性は増大しない。以上よりCaチャネルの発現が少ない平滑筋においてもBKチャネルは高発現しており、低興奮性(膜電位の安定性)に大きく寄与していると思われる。RT-PCR法を用いてウサギ腸間膜動脈第3分枝の平滑筋細胞の内向き整流性Kチャネルをクローニングしたところ、ウサギ心室筋由来のもの(IRKl)と100%相同であった。第3枝から単離した平滑筋細胞100にμM Ba2+により選択的に抑制される内向き整流性K電流が僅かではあるが存在すること、そして血管内革を除去した腸間膜動脈灌流標本でBa2+により5mmHg程度の灌流圧上昇が見られることを見出した。すなわち、IRKl遺伝子から発現した内向き整流性Kチャネルが量間膜動脈平滑に存在し、静止膜電位と静止張力の調整に一部寄与していることが明らかとなった(投稿中)。

心筋と平滑筋(精管・結腸・尿管)の早期不活性化(Aタイプ)K電流はその性質が非常に類似しているにもかかわらず、アラキドン酸により後者が選択的に抑制されることを見出し、この選択性は細胞内情報伝達の違いによるものではないことを明らかにした(Am. J. Physiol.)。そこで心筋・平滑筋においてAタイプK電流を担うKチャネルの遺伝子が異なる可能性を検討するため、RT-PCRを用いてKv1.4、4.2および4.3のmRNA発現量を定量的に比較した。その結果、平滑筋においてKv4類の寄与が大きく、心筋においてはKv1.4の寄与がより大きい可能性を明らかした(投稿準備中)。この結果はアラキドン酸がKv4類を選択的に抑制する可能性を示唆するものである。大コンダクタンスCa依存性K(BK)チャネルαサブユニットとL型Caチャネルα1サブユニットのmRNA発現量を興奮性の低い大動脈・気管と高い膀胱・精管の各平滑筋間で定量的RT-PCRを用いて比較した。その結果、BKチャネルαサブユニットmRNAは興奮性の高低に関らず高レベルに発現しているが、L型Caチャネルα1サブユニットmRNAは低興奮性平滑筋では高興奮性のものの20%以下であった。これらの結果は単離細胞で測定した最大電流値と対応するため、興奮性の違いをよく説明するものである(投稿準備中)。11月に今泉と大矢がGiles教授の研究室を訪ね、綿密な研究打ち合わせと単一細胞でのPCR法を研修した。帰国後、関連の実験を行い、3月始めにGiles, Walsh両教授と今泉・村木が北米生物物理学会で会い、再度結果について研究打ち合わせすることになった。そのため1月にGiles教授が来日する予定であったが、教授の希望もあり、取りやめた(Canadian Medical Councilの会合が急遽開催されることになった由)。研究遂行には全く支障が無かった。早期不活性化K^+電流は神経・心筋・平滑筋に広く存在し、活動電位の発生調節や再分極相の形成に重要な役割を持っている。その電流を担うチャネルに関しては遺伝子的に異なる数種類が心筋や脳で知られているが、平滑筋においては全く不明であった。心筋と平滑筋(精管・結腸・尿管)の早期不活性化AタイプK電流はその電気生理学的性質が類似しているにも関らず、アラキドン酸により後者が選択的に抑制されることを見出した(Am.J.Physiol.,1997)。そこで心筋・平滑筋においてAタイプK電流を担うKチャネルは異なる遺伝子産物であるという可能性をRT-PCR法を用いて検討し、かつ平滑筋のAタイプKチャネルをクローニングした。AタイプKチャネルをコードする遺伝子として脳や心筋でKv1.4,4.2,4.3が挙げられている。これらのmRNA発現レベルをラット平滑筋組織で検討し、心筋・脳と比較したところ、平滑筋ではKv1.4の寄与は殆どなく、Kv4.3が主要であった。さらに平滑筋のKv4.3はこれまで脳で報告されていたKv4.3(Kv4.3M)の遺伝子多形で、C末端付近に新規の連続したアミノ酸配列19個を含むことが明らかとなった(Kv4.3L)(FEBS Letter,1997)。ラット心筋では従来報告されていたKv4.3Mよりも4.3LがmRNAのレベルで多かった。また、Kv.1.4,4.2,4.3M,4.3LをHEK293細胞に発現させ、その電気生理学的性質を比較検討した。