hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
漢方薬・生薬中のアリストロキア酸（腎障害惹起物質・発がん物質）の検出法の確立

漢方薬原料である生薬中のアリストロキア酸を分析するための公定法は、生薬由来の妨害を受け、アリストロキア酸の含有の有無を明確に判断することが困難なケースがあった。今回、高感度かつ選択性の高い分析法の確立を目的として、固相抽出法と高速液体クロマトグラフィー/質量分析計を組み合わせることにより、生薬・漢方薬中のアリストロキア酸の選択的な分析法を確立した。【目的】漢方薬原料である生薬中のアリストロキア酸Iを分析するための公定法は、生薬由来の妨害を受け、アリストロキア酸Iの含有の有無を明確に判定できない場合がある。本研究では、固相抽出法と蛍光誘導化などの手法を組み合わせることにより、高感度かつ特異性の高い分析法の確立を目指す。【方法】安全性情報において、アリストロキア酸が混入する可能性が指摘されている4種類の生薬を配合する漢方薬を対象として、アリストロキア酸I・IIの分析法の検討を行うこととした。また、分析方法は、平成24年度に生薬中のアリストロキア酸Iを対象として検討した分析法である陰イオン交換系の固定相を用いた固相抽出カートリッジと夾雑物の影響を受けにくい液体クロマトグラフ/質量分析計を用いることとした。【結果】分析法の妥当性について検討したところ、今回検討した分析法は、11種類の漢方薬中のアリストロキア酸I・IIを選択的に分析することが可能であると考えられた。【まとめ】今回検討した分析法は、選択的な分析が可能であることから、アリストロキア酸の含有が疑われた際の分析に有用であると考えられた。今後、確立した分析法を用いて市場に流通する漢方製剤を分析し、実態調査を行う。また、生薬の多くは漢方薬や生薬エキスへと加工される。製剤化においては抽出温度、抽出時間、様々な条件があることから、アリストロキア酸を含有するウマノスズクサ科の植物を用いて製剤化における挙動について検討する。さらに、健康食品からもアリストロキア酸が検出された事例があることから、その分析法について検討し、市場に流通する健康食品についても分析し、実態調査を行う。【方法】安全性情報において「注意を要する生薬」とされ、アリストロキア酸の混入が懸念されている4種類の生薬を対象として、分析法の検討を行うこととした。また、分析方法は、陰イオン交換系の固定相を用いた固相抽出カートリッジと夾雑物の影響を受けにくい液体クロマトグラフ/質量分析計を用いることとした。【結果】4種類の生薬を対象として、分析法の妥当性について検討したところ、今回検討した分析法は、安全性情報において「注意を要する生薬」とされ、アリストロキア酸の混入が懸念されている4種類の生薬中のアリストロキア酸を選択的に分析することが可能であると考えられた。【まとめ】今回検討した分析法は、選択的な分析が可能であることから、公定法等によりアリストロキア酸の含有が疑われた際の分析に有用であると考えられた。特に偽陽性を否定することが可能となれば、薬用資源の有効活用につながると考えられる。生薬の多くは漢方薬や生薬エキスへと加工される。製剤化においては抽出温度、抽出時間など様々な条件があることから、今後は生薬・漢方薬の分析を行うとともに、アリストロキア酸を含有するウマノスズクサ科の植物を用いて製剤化における挙動について検討する。また、日本薬局方に定められていない植物などを使用した健康食品などにアリストロキア酸が混入することが考えられる。本研究では、生薬、漢方薬、健康食品にアリスロトキア酸が含まれていないことを確認するための選択的な分析法と健康被害発生時などの原因究明のための簡便かつ迅速な分析法を確立する。【方法】固相抽出法と夾雑物の影響を受けにくい液体クロマトグラフ/質量分析計を組み合わせ、特異性の高い分析法について検討する。また、分析法の選択肢を増やすために誘導体化とガスクロマトグラフ/質量分析計を組み合わせた分析法についても検討する。【結果】平成26年度においては、誘導体化とガスクロマトグラフ/質量分析計を組み合わせた健康食品中のアリストロキア酸の分析法を確立した。【まとめ】研究期間全体を通じての成果は以下のとおりである。1.生薬・漢方薬を対象とした固相抽出法と液体クロマトグラフ/質量分析計を組み合わせた選択的な分析法を確立した。これにより、公定法ではアリストロキア酸の含有の有無を明確に判定できない場合においても、明確な判定をすることが可能となった。

2.健康食品を対象とした誘導体化とガスクロマトグラフ/質量分析計を組み合せた分析法を確立した。これにより、分析法の選択肢を増やすことができ、その場に応じた分析法を選択することが可能となった。分析化学本研究では、漢方薬中のアリストロキア酸I・IIを分析するための高感度かつ選択性の高い分析法の確立を目指した。漢方薬は複数の生薬から構成されることから、生薬そのものよりも妨害となる成分が多い。しかし、平成24年度の検討を基に分析法の妥当性を確認したところ、陰イオン交換系の固定相を用いた固相抽出カートリッジと夾雑物の影響を受けにくい液体クロマトグラフ/質量分析計を用いることにより、漢方薬を対象としたアリストロキア酸I・IIの選択的な分析法を確立することができた。本研究では、漢方薬原料である生薬中のアリストロキア酸Iを分析するための高感度かつ特異性の高い分析法の確立を目指した。検討の結果、陰イオン交換系の固定相を用いた固相抽出カートリッジと夾雑物の影響を受けにくい液体クロマトグラフ/質量分析計を用いることにより、生薬中のアリストロキア酸Iの選択的な分析法を確立することができた。当該年度の検討はおおむね順調に進んだことから、交付申請書の通り次年度は、製剤化におけるアリストロキア酸の挙動について検討する。また、生薬・漢方薬を対象とした実態調査を行う。さらに、健康食品を対象として分析法の妥当性を確認し、実態調査を行う。当該年度の検討はおおむね順調に進んだことから、交付申請書の通り次年度は漢方薬を対象としたアリストロキア酸Iの高感度かつ選択的な分析法について検討する。また、生薬・漢方薬の分析を行うとともに、アリストロキア酸を含有するウマノスズクサ科の植物を用いて製剤化における挙動について検討する。当該年度の検討はおおむね順調に進んだが、次年度に使用する予定の研究費が生じた。次年度交付予定の金額と合わせ、効率的に研究を行う。予定通り製剤化におけるアリストロキア酸の挙動について検討する。当該年度の検討はおおむね順調に進んだが、次年度に使用する予定の研究費76508円が生じた。次年度交付予定の1500000円と合わせ、予定通り漢方薬を対象とした分析法について検討する。
新規肥満症関連E3-ユビキチンリガーゼWWP1の機能解析

がん抑制遺伝子p53は種々のE3 ubiquitin ligaseの発現を制御し、またp53自身はこれらE3 ubiquitin ligaseにより翻訳後修飾を受けて細胞機能に影響を及ぼしていることが明らかとなっている。我々は過去にp53に関連すると報告されている全18個のE3 ubiquitin ligaseの中から、WWP1がp53依存的に、肥満に関連して脂肪組織において発現が増加することを見いだした。このタンパク質の発現はインシュリンにより負に制御されており、脂肪細胞株でのこのタンパク質のノックダウンは脂肪細胞の分化を抑制した。以上より、WWP1は新規の肥満病態の増悪因子であり、その発現はp53とインシュリンにより制御されている可能性が示唆された。[目的]がん抑制遺伝子p53が脂肪細胞や脂肪組織の機能に密接に関連すること、またp53タンパク質は核内だけでなく細胞質にも局在し、様々な機能を果たしていること、このp53の転写活性や安定性、細胞内局在は、種々のE3-ユビキチンリガーゼにより制御されていることが明らかとなってきた。我々は、全18種のp53に対するE3-ユビキチンリガーゼの中から、HFD(高脂肪食負荷)に特異的で、脂肪組織選択的、且つ、p53により誘導されるE3-ユビキチンリガーゼとして、WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 (WWP1)遺伝子を同定した。そこで、本研究提案では、脂肪細胞分化およびマウスHFD状態下でのWWP1の機能について解析した。[結果]1)マウスWWP1に対するウサギポリクローナル抗体を作製し、Western blotに応用可能な抗体を得た。2)この抗体を用いたタンパク質発現およびreal-time RT-PCR法を用いたmRNAレベルの解析においても、HFDマウス脂肪組織の脂肪細胞フラクションおよびマクロファージを含む非脂肪細胞フラクションともに、HFDによる肥満によりWWP1の発現は増加していた。3)レトロウィルスベクターを用いたWWP1のノックダウンにより3T3-L1細胞の分化は促進されたが、脂肪滴の蓄積は抑制傾向にあった。[考察]以上、in vitroおよびin vivoの解析結果を考え併せると、WWP1は肥満病態においてその進行を促進する方向に機能している可能性が示唆された。
慢性疼痛難治例の症例対照研究：中枢性感作に関する愛着・認知・情動とバイオマーカー

慢性疼痛難治例において、愛着(オキシトシン系の異常)、認知(中枢性感作、安静時脳活動の異常)とそれに伴う情動系の異常(失感情&失体感)とそれを発散するための行動面の結果(自律神経系の機能異常、筋肉や関節の疲弊)に関与するバイオマーカーを検索し、慢性疼痛難治化に関連する中枢性感作とそれに伴う多様な病態を明らかにする。
プラスチックの嫌気生分解の解析

4種のプラスチック(ポリ乳酸(PLA),ポリカプロラクトン(PCL),ポリヒドロキシ酪酸(PHB),ポリブチレンサクシネート(PBS))の、37°Cと55°Cでの嫌気生分解試験を行った。また、これらのプラスチックの嫌気生分解に関与している微生物群を、RT-PCR-DGGE法で分析した。分子量を落としたPLAフィルムを作成し、分子量による嫌気生分解速度の差を調べた。山田バイオマスプラントで採取した液体肥料を、55度で20日程度インキュベートして55度の嫌気汚泥を作った。嫌気汚泥の上層の溶液部分と4種のプラスチックサンプル(ポリ乳酸(PLA),ポリカプロラクトン(PCL),ポリヒドロキシ酪酸(PHB),ポリブチレンサクシネート(PBS))を混合してMODA-B装置に封入し、プラスチックの嫌気分解試験を行った。PHBは14日で90%、PCLは50日で80%、PLAは75日で75%嫌気分解された。PBSは100日経過後も全く嫌気分解されなかった。プラスチック分解中に働いている微生物群を解析するため、分解の各段階で汚泥を採取し、汚泥のRT-PCR-DGGE分析をテクノスルガラボに委託して行った。PCLの嫌気分解過程では細菌の主要な5つのRT-PCR-DGGEバンドが現れ、このうちの3バンドは単離されている細菌とは近い相関を示さなかった。PCLのメタン発酵によるバイオガスの放出が始まる直前から、1つの主要な細菌のRT-PCR-DGGEバンドが現れ、これに対応する細菌がPCLの最初の分解に関与していると考えられる。PCLの嫌気分解に関与する古細菌としては、Methanothermobacter marburgensis (99%)および未単離の古細菌が検出された。PHBの嫌気分解過程では細菌の主要な3つのバンドが現れ、Peptococcaceae bacterium、Bacteroides plebeius, Catenibacterium mitsuokaiと97%、100%、98%の相同性を示した。PHBのメタン発酵に関与している古細菌としては、Methanosarcina thermophile (99%), Methanosarcina barkeri (95%)が検出された。山田バイオマスプラントの液体肥料を、37度で16日培養して液体肥料内の有機物を消費させた。液体肥料の上層の溶液部分と4種のプラスチックサンプル(ポリ乳酸(PLA),ポリカプロラクトン(PCL),ポリヒドロキシ酪酸(PHB),ポリブチレンサクシネート(PBS))を混合してMODA-B装置に封入し、プラスチックの嫌気分解試験を行った。PHBは9日で90%嫌気分解された。PCLは277日で3および22%嫌気分解された。PLAは277日で29および49%嫌気分解された。PBSは277日経過後も全く嫌気分解されなかった。プラスチック分解中に働いている微生物群を解析するため、分解の各段階で汚泥を採取し、RT-PCR-DGGE分析を行った。細菌用のRT-PCR-DGGEでは、PLAの嫌気分解過程で主要な5つのバンドが現れ、このうちの2バンドはXanthomonadaceae bacteriumとmesorhizobium sp.に100%の相関を示し、残る3バンドは単離されている細菌とは近い相関を示さなかった。PCLの嫌気分解過程では、主要な6つのバンドが現れ、このうちの1バンドはAcrobacter thereiusと98%の相関を示し、残りの5バンドは単離されている細菌とは近い相関を示さなかった。PHBの嫌気分解過程では、主要な3つのバンドが現れ、Acrobacter thereius, Clostridium sp.,Clostridium sp.と98%、98%、98%の相同性を示した。PLAとPCLの嫌気分解に関与する古細菌としては、Methanobacterium petrolearium (95%)およびMethanosaeta concilii(97%)が検出されたが、PHBのメタン発酵に関与している古細菌は、DGGE上でははっきりとしたバンドとして検出されなかった。プラスチックの分子量による嫌気生分解速度の差を調べるために、分子量を落としたポリ乳酸(PLA)を作成した。PLAフィルムをイオン交換水中55°Cで31日および70日インキュベーとした。31日インキュベートしたPLAフィルムの分子量はMn9000,Mw18000。70日インキュベートしたPLAフィルムの分子量はMn2800、Mw6500。元のPLAフィルムの分子量はMn94700, Mw173300。31日および70日水中でインキュベーとしたPLAフィルムとインキュベーとしていないPLAフィルムの55°Cでの嫌気生分解試験を行った。山田バイオマスプラントで採取した液体肥料を55°Cでインキュベートして55°Cの嫌気汚泥を作り、その上清を嫌気生分解試験に用いた。31日水中でインキュベートして分子量を落としたPLAフィルムは、14日で20%前後、21日で35及び53%分解した。70日水中でインキュベートして分子量を落としたPLAフィルムは、14日で20%、21日で37%分解した。無処理のPLAフィルムは、14日で8%、21日で30および36%分解した。

28日以降は、無処理のPLAフィルムと31日インキュベーとしたPLAフィルムの各1つの反応容器を除いて、同じ分解速度で分解した。水中でインキュベートして分子量を落としたPLAフィルムは、分解初期の分解は早くなったが、最終的な分解速度は3通りのフィルムで違いが現れなかった。4種のプラスチック(ポリ乳酸(PLA),ポリカプロラクトン(PCL),ポリヒドロキシ酪酸(PHB),ポリブチレンサクシネート(PBS))の、37°Cと55°Cでの嫌気生分解試験を行った。また、これらのプラスチックの嫌気生分解に関与している微生物群を、RT-PCR-DGGE法で分析した。分子量を落としたPLAフィルムを作成し、分子量による嫌気生分解速度の差を調べた。研究計画書の中の研究計画の1つに、「55度でのプラスチックの嫌気分解試験で用いたノウハウを、37度でのプラスチックの嫌気分解試験に適応し、37度でのプラスチック分解試験を行う」という項目がある。これに関連して、2014年度は、37度でのプラスチックの嫌気生分解度を測定し、37度でのプラスチックのメタン発関与する細菌と古細菌についての解析を行った。天然物化学分子量を落としたPLAを作成し、分子量の違いによる生分解速度の差を確かめる。研究計画書の中の研究計画の1つに、「55度でのPLA以外の代表的な生分解性プラスチック(ポリブチレンサクシネート(PBS),微生物ポリエステル(PHB),ポリカプロラクトン(PCL))の嫌気分解の試験をする。また、それぞれの試験物質の分解試験中の汚泥をRT-PCR-DGGEで分析し、55度での嫌気汚泥中のプラスチック分解に関与する微生物を検出し、生分解性プラスチック分解に関わっている微生物群を明らかにする。」という項目がある。これに関連して、2013年度は、55度でのプラスチックの嫌気生分解度を測定し、55度でのプラスチックのメタン発関与する細菌と古細菌についての解析を行った。37度でのプラスチックの嫌気生分解度を測定し、37度でのプラスチックのメタン発酵に関与している細菌と古細菌について解析する。55度でPLA,PCLのメタン発酵に関与している微生物の中には、データベース上のものと近い相関を示さない種類のものが示唆されたので、これらが単離できるかどうか試してみる。DGGEバンドの塩基配列解析を発注する場合は、本数をまとめたほうが単価が安くなるため。2014年度に、DGGEバンドの塩基配列解析に使用する。
囲食膜を標的とした害虫防除技術開発のためのタンパク質フゾリンの効率的利用法の研究

微生物の殺虫効果を増大させるタンパク質フゾリンの作用機作の一環として、フゾリンが昆虫中腸内の囲食膜に直接作用することを、虫体の免疫組織化学的手法により初めて明らかにした。さらに、プロテアーゼ阻害剤を食したカイコ囲食膜のフゾリンによる破壊程度が低下する現象を発見し、破壊プロセスの終盤に中腸内プロテアーゼが関与している可能性を発見した。更に、海外の研究者らとの共同研究によりフゾリンの立体構造解析等を行い、フゾリン類がキチンモノ酸化酵素であり、消化液の高アルカリによってその結晶体から遊離して初めて活性を発揮することを明らかにした。また、フゾリン添食後の囲食膜形態の定性的変化を詳細に明らかにした。囲食膜破壊がフゾリンによる直接作用と間接的作用のいずれなのかを解明するために、カイコ3齢幼虫に囲食膜が大きく壊れない低濃度のスピンドルを食させ、消化管内でのフゾリンの分布状態、囲食膜への結合の有無を、中腸のパラフィン包埋切片に対する免疫組織化学的手法で解析した。これにより、フゾリンが囲食膜に直接結合することがin vivoで初めて示された。また、フゾリンは、囲食膜の前部から後部まで全体的に結合していた。次に、囲食膜崩壊プロセスの最終段階に中腸内プロテアーゼが関与しているかどうかを解明するために、プロテアーゼ作用を抑制した場合に膜崩壊の抑制が起こるかどうかをその指標となるウイルス感染率の変化の有無で調査した。カイコ幼虫にEDTA(セリンプロテアーゼ抑制)、プロテアーゼ抑制カクテル(数種類のプロテアーゼ活性の抑制)を食させて、核多角体病ウイルス感染率の変化を観察したところ、EDTA処理区で感染率の低下傾向が認められた。このことから、フゾリン投与における囲食膜の崩壊へ少なくともセリンプロテアーゼが関与している可能性が示唆されたが、同時に虫への薬害の影響も認められたため、厳密な実験が更に必要と考えられた。フゾリンの立体構造と機能との関連を解明するためのフゾリン発現系を確立するために、大腸菌にフゾリン遺伝子の機能部位(5'側。全長の2/3)を組み込んだ。その結果、大量発現に成功し、次年度の変異体作成のための基盤を確立した。フゾリン大量生産用の酵母外来遺伝子発現系の開発を目的に、作成済みの組換え酵母50クローンをBMMY培地等で培養し、菌体および培養上清でのフゾリン発現をSDS-PAGE、ウエスタンブロッティングにより解析した。現時点では、発現の確認に至っていないスピンドル投与による囲食膜崩壊のプロセスに、中腸内プロテアーゼが加担しているかどうかを解析するために、スピンドルと同時に、プロテアーゼ阻害剤カクテル(各種プロテアーゼ阻害)またはEDTA(メタロプロテアーゼ阻害)をカイコ3齢幼虫に添食した後、囲食膜の状態を解剖にて観察した。カクテル投与の場合は囲食膜がほぼそのまま残っていたのに対して、EDTA投与では逆に、スピンドル単独投与の場合以上に囲食膜崩壊が進行していた。このことから、プロテアーゼが囲食膜崩壊プロセスの後半で崩壊に関与していることと、フゾリンがメタロプロテアーゼにより分解を受け機能が低下している可能性を見出した。これらの事から、スピンドル(フゾリン)投与による囲食膜崩壊は、以下の様な2段階のステップで生じる可能性が高いと考えられた。第一段階で、スピンドルが溶解して生じたフゾリンが囲食膜に結合・作用し、膜の立体構造が変化するとともに、膜のキチンの酸化分解を起こす。次に、膜立体構造の変化により膜のタンパク質にアクセス可能となったプロテアーゼがタンパク質を分解するために、キチン膜が露出しぜい弱化を進める。これにより、フゾリンのキチンへの結合とその分解が一層進み、大規模な崩壊へといたる。AcEPVの非宿主昆虫(カイコ、ハスモンヨトウ)の中腸内でのスピンドルの溶解性を解明するために、同幼虫のin vitroにおける消化液中や体内でのスピンドルの溶解性を光学顕微鏡で観察した。その結果、鱗翅目幼虫中腸内ではスピンドルは難溶性であることを見出した。大腸菌で発現させた活性部位のみのフゾリンをカイコ3齢幼虫に1頭当たり24μg食させた後、カイコNPV感染増進活性を調査したが、カイコNPV感染増進活性はきわめて弱かったことから、糖鎖が付加されない場合は、活性にC末端が必要なことが示唆された。酵母発現系での発現が確認されていない点は遅延とも考えられるが、囲食膜崩壊のプロセスがかなり明瞭になってきたことや、フゾリンとプロテアーゼの関係についての知見が新たに明らかになった点は進歩と考えられる。本年度は、フゾリンによる囲食膜の破壊が、本研究のモデル昆虫であるカイコの他品種でも観察されるかどうか、また齢による違いがあるかどうかを調査するために品種キンショウ×ショウワやカイコ4,5齢幼虫を供試した。その結果、本品種でも囲食膜の破壊が観察され、あらたに4、5齢でもそれが観察された。これらにより、フゾリンの作用はカイコの種々の品種、幅広い齢に作用することが判明した。更に、カイコ消化液によるNPV多角体の溶解実験を行い、クワ葉または人工飼料育いずれの幼虫の消化液でも良好な溶解は特定の条件下で生じる可能性を見出した。また、所外の研究者と共同で、フゾリン配列を加工して酵母外来遺伝子発現系で同タンパク質を発現させる実験に着手した。

期間全体としては、フゾリンが囲食膜に直接作用することを、免疫組織化学的手法によりin vivoで初めて明らかにし、さらに、囲食膜の前部から後部まで、また内部にもフゾリンが結合することも解明した。さらに、プロテアーゼ阻害剤を食したカイコ囲食膜の破壊程度が低下する現象を発見し、破壊プロセスの終盤に中腸内プロテアーゼが関与している可能性が高いことを発見したことにより、破壊プロセスの全貌を解明しつつある。更に、海外の研究者らとの共同研究によりフゾリンの立体構造解析を行い、フゾリン類が多糖類モノ酸化酵素であることを明らかにした。また、フゾリン添食後の囲食膜形態の定性的変化を詳細に明らかにした。一方、立体構造が変化した活性部位のみのフゾリンを大腸菌で発現させNPV感染増進活性を調査したが、その活性がきわめて弱かったことから(死亡までの時間は半日程度短縮)、糖鎖が付加されない場合、活性にはC末端が必要なことが示唆された。また、AcEPVのフゾリン結晶体は、非宿主昆虫(カイコ、ハスモンヨトウ)の消化管内では難溶性であることを解明した。微生物の殺虫効果を増大させるタンパク質フゾリンの作用機作の一環として、フゾリンが昆虫中腸内の囲食膜に直接作用することを、虫体の免疫組織化学的手法により初めて明らかにした。さらに、プロテアーゼ阻害剤を食したカイコ囲食膜のフゾリンによる破壊程度が低下する現象を発見し、破壊プロセスの終盤に中腸内プロテアーゼが関与している可能性を発見した。更に、海外の研究者らとの共同研究によりフゾリンの立体構造解析等を行い、フゾリン類がキチンモノ酸化酵素であり、消化液の高アルカリによってその結晶体から遊離して初めて活性を発揮することを明らかにした。囲食膜破壊のメカニズムの研究に進展が見られたことや、大腸菌発現系でフゾリンの発現に成功したことなどのため。プロテアーゼが関わる囲食膜上のタンパク質の同定作業や、高活性フゾリンのデザイン等を行う。フゾリンの量産方法として、植物体(ブロッコリー)での発現を試みる。昆虫病理学酵母発現系では培養条件の検討を行なう。他は予定に沿って実施する。フゾリンの機能と立体構造の関係に関する詳しい解析を先送りしたためである。フゾリンの立体構造解析を次年度(2015年度)に先送りしたため、このための経費が次年度にまわった。フゾリンの機能と立体構造の関係に関する解析フゾリンとその変異体の立体構造解析をこの予算を使用して行なう。
微生物成分が誘導するヒト樹状細胞遺伝子群の網羅的解析

1.ヒトTLR1,TLR2,TLR3,TLR6,の抗体を作製した。TLR4の抗体は三宅博士(東大医科研)より入手した。各TLRの相互関係とリガンド応答性の機能解析中である。これらの抗体でヒト樹状細胞を検討した。樹状細胞にはTLR3を多く発現するpopulation, TLR2・4を多く発現するpopulationが存在し、subset-specificのTLR発現プロフィールが示唆された。この結果は樹状細胞が一様の細胞群ではなく、微生物認識において多様性をもつsubsetsの集合であること、RT-PCRなど従来の報告は蛋白発現と相違していることを示唆した。3.個体差についてgene chipで解析を開始した。まだcluster解析、profiling解析を開始した時点なので、個体差を議論できるまでに至っていない。疾患別の樹状細胞応答は次年度の目標とする予定である。
環境放出されたIT製品由来のインジウムの動態と有害性評価

インジウムは汎用電子機器には欠かせない金属である一方,これら機器類の大量廃棄や不法投棄に伴う漏出による環境汚染が懸念される。本研究は,IT廃棄物に由来して環境中に放出されるインジウムの拡散量,化学形態とその可動性,土壌微生物や植物の生育に与える有害性を明らかにする。サブテーマ構成は,1)IT廃棄物が降雨暴露された場合のインジウムの溶出特性に関する評価,2)各種土壌の中で起こりうるインジウムの化学形態とその可動性に関する評価,3)インジウム汚染が土壌の生物活性や成育におよぼす有害性の評価。以上の新たな知見により,IT廃棄物に由来して環境中に放出されるインジウムの詳細なリスク評価が可能となる。
体系的遺伝子機能破壊による線虫ゲノムの機能解析

本研究では、多細胞生物における遺伝子カスケードおよび遺伝子ネットワークのアウトラインを明らかにすることを目的とし、(1)RNAi法と(2)欠失変異体の作成、という二つの遺伝子機能破壊法を用いて線虫C.elegansの体系的な遺伝子機能解析を行った。(1)線虫の約6,000遺伝子についてRNAi-by-soaking法による表現型解析を行い、その約30%が発生過程に必要であることを示した。そのうち胚性致死表現型を示した833遺伝子について、二次解析として微分干渉顕微鏡による表現型解析を行った。本研究で新たに開発した表現型プロファイリング法を用いることにより、表現型の類似性に基づいた遺伝子クラスタリングが可能となった。この手法は機能未知遺伝子の機能予測に有効であることが確認できた。以上の成果はC.elegans RNAiフェノームデータベースとして公開した。また、胚性致死遺伝子の孵化後発生における機能を時期特異的RNAi法(L1-soaking法)によって解析した。(2)ゲノム/EST情報から推定される転写制御因子遺伝子の新規欠失変異体の網羅的分離を行い、437遺伝子の変異体を分離した(全転写因子の3分の2以上)。一方で、転写因子以外の分離済みの変異体の表現型解を介して、個別の遺伝子機能解析を進めている。G蛋白質シグナリングに関わっているags-3について、頭部ニューロンで発現していること、多種類の感覚受容が異常であること、体の大きさが小さいこと、運動性が低下していることなどなどの表現型を見いだした。変異体の表現型は、egl-4変異体(PKGをコード)により、抑圧を受け、G蛋白質経路の新しいシグナル伝達機構と考えられる。AGS-3哺乳類ホモログは麻薬中毒の発症メカニズムに重要であることが知られているが、AGS-3とEGL-4の分子間相互作用は、線虫およびマウスで保存されていることを見いだした。本研究では、線虫C.elegansをモデル型として、1、RNAi法と2、欠失変異体の作成、という二つの遺伝子機能破壊法を用いて体系的な遺伝子機能解析を行い、多細胞生物における遺伝子カスケードおよび遺伝子ネットワークのアウトラインを明らかにすることを目的とした。1、体系的RNAi法による発生に必須な遺伝子群の網羅的回定とその解析(杉本)ハイスループットRNAi-by-soaking法によって体系的な遺伝子機能破壊を行い、発生に必須な機能を果たしている遺伝子群(致死性・不稔性を示すもの)についてはRNAi表現型をノマルスキー顕微鏡で詳細に観察した。表現型データをコンピューター解析に利用できるように、表現型プロファイルを多次元の独立した項目についてあらかじめ定義した語彙を用いて記述する方法を確立した。さらに、この手法で記録した胚性致死表現型プロファイルを用いて表現型の類似性に基づいた遺伝子クラスタリングを行った。2、転写因子群の欠失変異体の網羅的作成および解析・(三谷)線虫ゲノム上にホモロジー検索により見つかる転写因子は約650程度であるが、その内の、300遺伝子以上について、欠失変異体株の分離ができている。このうち、ホモ接合体生存可能な株が約85%、致死または不妊の株が約15%を占める。致死または不妊となる率があまり高くないのは、核内受容体の変異体株で、致死または不妊となる遺伝子が少ないこと(約100遺伝子のうち数%程度)を反映していると考えられる。核内受容体の機能には、冗長性が高い可能性がある。全体の変異体株の中でも、Etsファミリーに着目し、詳細な表現型解析を進めている。

1.これまでに線虫C. elegansの約6,300遺伝子についてRNAi-by-soaking法による表現型の一次解析を完了し、約900の胚性致死遺伝子を同定した。そのうち約650遺伝子について、二次解析として微分干渉顕微鏡による最終表現型解析を終えた。RNAiによる表現型は情報科学的に処理する目的で、われわれが開発した表現型プロファイリング法(複数の独立な指標についてあらかじめ定義した語彙をて記述)によって記録した。さらに、この表現型プロファイルの類似性に基づいて遺伝子クラスタリングを行った。この手法は機能未知遺伝子の機能予測に有効であることが確認できた。胚性致死表現型プロファイルおよび遺伝子クラスタリングデータについては、公開用データベースを作成した。また、胚性致死遺伝子の孵化後発生における機能を解析する時期特異的RNAi法(L1-soaking法)を確立し、約350遺伝子についての解析を完了した。また、一次解析で不稔となった遺伝子の生殖細胞の表現型も解析した。2.ゲノム/EST情報から推定され、かつ、過去に線虫研究者が分離していない転写制御因子を中心とする遺伝子の欠失変異体の網羅的分離を行い、361遺伝子の変異体を分離した。全転写因子の半数以上を我々の研究室でカバーしたことになる。一方で、代表的な転写因子の変異体の機能解析を行った。Etsファミリーのホメオボックス転写因子変異体の表現型解析を行い、頭部のサブセットの少数ニューロンで発現していること、多種類の感覚受容が異常であること、体の大きさが小さいこと、運動性が低下していることなど、多彩な表現型が見いだされた。
波長可変パルスを用いた分子内ホールの超高速ダイナミクスの測定

前年度から行ってきた位相差測定装置開発を完了させ、クリプトン、アルゴンおよび窒素分から発生する高次高調波の位相差測定を行った。Ti :sapphire増幅器から出た波長800 nm光のを基本波として気体のジェット中に集光し、高次高調波を発生させた。この高調波を基本波と軸に合わせ、ピエゾ素子駆動の遅延ステージによって両者の時間差を変えながらアルゴンのガスジェット中に集光した。発生した光電子を速度マップ型のイメージング装置で観測した。高次調波と基本波の時間差を変えると、それぞれの光子一つずつが寄与する2光子イオン化の信号が変動し、そこから隣り合う次数間の位相差を抽出することができる(RABITT法)。クリプトン、アルゴン、窒素から発生する高次高調波について位相差を測定し、結果を比較した。観測した全ての次数において、クリプトンの位相差はアルゴンおよび窒素のものより大きい値をとっていた。この結果は、高次高調波の発生過程で電子が獲得する位相がイオン化ポテンシャルに比例するという半古典的なモデルで説明できる。実際、クリプトンのイオン化ポテンシャルはアルゴンや窒素に比べて有意に小さく、半古典モデルに基づいて行ったシミュレーション結果は実験で得られた違いをよく再現した。一方、実験で得られた位相差ではイオン化閾値に近い領域においてアルゴンと窒素に明確な違いが現れた。この結果は上述のモデルでは説明できず、イオンの作るクーロンポテンシャルの形状の違いが寄与している可能性がある。現在この成果を論文にまとめて投稿準備中である。(抄録なし)本研究は、原子や分子に強いレーザー光を照射したときに発生する高次高調波について位相と強度の両方のスペクトルを測定し、分子の中に生じるホールのダイナミクスを調べることを目標としている。平成24年度は、高次高調波の位相スペクトルを測定するための装置の開発を行った。位相を測定する方法として、高次高調波と基本波を同時に希ガスに集光し、2光子イオン化によって出てきた電子のエネルギースペクトルから位相を得る、RABITT(Reconstruction of Attosecond Beating by Interference of Two-photon Transitions)と呼ばれる手法を採用することにした。高次高調波は波長が短いので、凹面鏡で集光する際に鏡へ入射する角度を浅くしなければ高い反射率が得られない。そこで、入射角が約78。のときに希ガスのジェット上に集光するような曲率を持つトロイダルミラー(縦と横で曲率の異なるミラー)を設計した。高次高調波は真空紫外領域の波長を持ち空気中では吸収されてしまうため、集光も真空中で行わなければならない。そのため、トロイダルミラーを格納する真空チェンバーを作成し、ミラーの位置と向きを電動ステージでチェンバーの外から制御できるようにした。所属する研究室にあるVelocity map imaging装置を用いて、高次高調波を窒素ガスのジェット上に集光すると光イオン化が起こることを確認した。以上のように開発した装置を用いて、平成25年度は希ガスおよび窒素分子から出る高次高調波の位相スペクトルの測定を行う予定である。高次高調波の位相測定に用いる装置を組み立て終え、実際に高次高調波をガスに集光すると光イオン化が起きることを確認できた。このことから、装置開発はおおむね順調に進展していると考えられる。高次高調波と基本波による二光子イオン化が起きていることを確認してから、装置のデモンストレーションとして希ガス原子から発生する高次高調波の位相測定を行う。その後、配列した分子から発生する高次高調波のスペクトルを、基本波の波長をいくつか変えて測定し、分子内ホールのダイナミクスを調べる。(抄録なし)
超原子価6配位炭素化合物および新規安定炭素三重項種の創製

新規に開発した1,8-ジメトキシチオキサンテン配位子を二つ有するアレン化合物を合成し,2つの硫黄原子をメチル化することで超原子価6配位炭素化合物の合成に世界で初めて成功した。ジメチル化してスルホニウムジカチオンヘ誘導することで中心炭素上の電子密度が減少し,周りの酸素原子との吸引的な相互作用が強くなることが分かった。単結晶X線構造解析の結果,中心の炭素原子と周りの酸素原子間の距離は2.64-2.75Aで炭素と酸素のvan der Waals半径の和(3.25A)よりも短いことが分かった。精密電子密度解析の結果,中心の炭素原子と4つの酸素原子間すべてに電子密度が分布していることが分かり,炭素酸素間に吸引的な相互作用が存在していることを明らかにした。またDFT計算(B3PW91/6-31G(d)level)を用いたAIM解析の結果,同様に炭素原子と4つすべての酸素原子間に吸引的相互作用の存在を確認することができた。世界初の成果として,Chemistry and Industryのhighlightに取り上げられた。三重項カルベンは非常に短寿命な中間体である。最も長寿命のもので,溶液中で約二週間存在できるものが報告されているが,単離しX線構造解析によって構造が確認された例はない。新規な三座配位子を二つ有するアレン化合物を二電子酸化することでジラジカルジカチオン種が得られると考えられる。本研究で開発した配位子を二つ有するアレン化合物の二電子酸化が可能であることが分かり,安定な三重項カルベンを合成するための新しい経路を提案することができた。配位子を改良することで安定な三重項カルベンを得ることができる可能性があり,実際計算では安定な三重項カルベンとなる系を見つけた。実験的な検討も始めることが出来た。本研究では、新規に開発した1,8-ジメトキシチオキサンテン配位子を二つ有するアレン化合物を合成し、それをジメチル化することで超原子価6配位炭素化合物の合成に世界で初めて成功した。単結晶X線構造解析の結果、中心の炭素原子と周りの酸素原子間の距離は2.64-2.75オングストロームで、炭素と酸素のvan der Waals半径の和(3.25オングストローム)よりも短いことが分かった。精密電子密度解析および理論計算の結果、炭素原子と4つの酸素原子間すべてに電子密度が分布していることが分かり、その炭素-酸素間に吸引的な相互作用が存在していることが示された。硫黄原子上の置換基の効果について実験的に証明するために骨格にメトキシ基とフェノキシ基を二つずつ有するアレン化合物を新規に合成し、さらにジスルホキシド、ジスルホニウムへと誘導した。これらの化合物のX線構造解析の結果から、理論計算によって予想されたように、硫黄上の置換基の電子吸引性が強くなるにつれてその炭素と酸素原子間の吸引的な相互作用が強くなることが分かった。また、メトキシ基の酸素原子の電子供与性のほうがフェノキシ基の酸素原子のものよりも強いことを反映して、メトキシ基の酸素原子の方が中心炭素により近くなっていることが分かった。これらの結果から中心炭素と周りの4つの酸素原子の間に吸引的な相互作用が存在していることを示すことができ、本研究の第一の目的であった超原子価6配位炭素化合物の合成に成功した。
旋律認知の基礎となる音の高さの動的知覚のメカニズム

広い意味での旋律の認知が生ずるためには、静的な音の高さだけでなく、動的な音の高さが知覚されなければならない。本研究の目標は、こうした動きの知覚が、複合音を構成する各成分音の周波数が、時間的にどのように変化したときに生ずるかを調べ、知覚印象を分析することによって、相対的な音の高さの知覚の仕組みを明らかにすることである。まず、横軸に対数周内数、縦軸に音圧レベルをとった座標上で、一定の台形スペクトル包絡および非オクタ-ブのスペクトル周期性をもつ複合音のセットを作り、これを用いて音の高さの一対比較実験を行い、音の高さの循環性(推移律の不成立)について検討した。Shepard(1964)の示したような音の高さの循環性は、非オクタ-ブの周期についても生ずること、周期性が必ずしも厳密ではなくても生ずることが確認された。次に、非オクタ-ブの間隔で並ぶ成分音が、対数周波数軸上で、同じ速度で上昇あるいは下降するような背景音の、同じ方向あるいは反対方向に同じ速度で移動する純音を信号音として重ねて呈示すると、信号音が反対方向に移動する場合のほうが、背景音からはっきりと分離して聴きとりやすいことが判った。また、純音の代わりに、日本語母音のスペクトル・エンベロ-プをもった、非調波複合音を信号音として用い、背景音中の母音の認閾を求める実験を行い、これによっても同様のことを確認した。全体を通して、多くの成分音が一斉に、同じ方向に、同程度の速度で動くとき、全体として音の高さの上昇感、下降感が生ずるとの見解を得た。これは、ゲシタルト心理学における「共通運命の原理」からも導かれる考え方であり、非調波構造のスペクルを用いて示されたのは、これが初めてである。横軸に対数周波数、縦軸に音圧レベルをとった座標上で、台形のスペクトル包絡をもつ複合音のセットを構成し、Burns(1981)の示したような音の高さの循環性について検討した。スペクトル包絡を固定したまま、1400セントの周期をもったスペクトルを70セントずつ高いほうにずらせることによって、1つのセットについて20の複合音を得る。ここで音が作られる順に、120の番号をつける。この際、スペクトル成分が1400セントごとに置かれてスペクトル周期を形成し、各周期はさらに、420:980630:770の比率にもう一つの成分によって分割される。この比率を変えることによって、6種類のセットを得た。各セットについて、20個の複合音全てを用いて、音の高さの一対比較を被験者に求めた。一部の条件ではまだ結果が出揃っていないが、これまでの結果によれば、スペクトルの各周期が420:980に分割されているセットでは、被験社は1400セントの厳密な意味での周期性に反応し、一対比較の結果を多次元尺度構成法(2次元)によって分析すると複合音が円形に近い布置となり、複合音を番号順に辿ると1回転する。各周期が630:770に分割されているセットでは、被験者は700セントの概周期に反応し、同様の分析でやはり円形に近い布置が得られるが、複合音を番号順に辿ると2回転する。これらの結果から、Shepard(1964)の示したような音の高さの循環性は、非オクタ-ブ(すなわち1400セントあるいは700セント)の周期についても生ずること、また、周期性が必ずしも厳密でなくても生ずることが確認された。

他のセットにおいては、この二つの例と殆ど同じ反応、あるいは、その中間に位置づけられるような反応が生じた。この実験と関連させて、多次元尺度構成の結果を、実際に音で聴きながら理解させるようなデモンストレ-ションを、数多く作成し、音の上昇感・下降感の生ずる仕組みを考察した。これまでに、対数周波数軸上で、複合音の多くの成分音が、同じ方向に同じ程度だけ移動するとき、全体としての音の上昇感ないし下降感が生ずることを、成分音が非オクタ-ブの周期で並んだ複合音を用いて確めてきた。今回は、このことに関する総まとめの実験を行った。対数周波数/対数音圧、の座標上で台形のスペクトルを持ち、成分音によって1400セントごとの周期に区切られた。一種の無限音階複合音を用いた。各スペクトル周期は、もう一つの成分音によって、さらに一定の比率(例えば、560:840)に分割されている。この分割の比率が、1:1に近いときには、被験者は700セントの「概周期」に着目した聴きかたを示し、1:1から離れるにしたがって、1400セントの「厳密な周期」に着目した聴きかたに連続的に移行する。このことは、これまでにも示唆されていたが、今回は、被験者一人あたり数十時間におよぶ測定によって、このことを厳密に確かめた。また、個人差を考慮した多次元尺度構成法(INDSCAL)によって、音色の明るさに着目する被験者もいることが判った。これとは別に、非オクタ-ブ(例えば500セント)の間隔で並ぶ成分量が、対数周波数軸上で、同じ速度で上昇あるいは下降するような背景音に、同じ方向あるいは反対方向に同じ速度で移動する純音を重ねて呈示すると、純音が反対方向に移動するばあいのほうが、背景音からはっきりと分割して聴きとりやすいことを、デモンストレ-ションによって確かめた。この現象は、「共通運命の要因」から予測されることではあるが、非調波構造のスペクトルを用いて示されたのは、これが初めてである。このことを精神物理学的な測定によって検討するために、信号音として、純音の代りに、日本語母音「ア」、「イ」のスペクトル・エンベロ-プを持った、非調波複合音を信号音として用いて、背景音中の母音の認知閾を求めた.上述の傾向は、定量的に確認された.いくつかのスペクトル成分が、一斉に、同じ方向に、同じ程度の距離だけ動いたときに、全体としての、音の高さの上昇感、下降感が得られるとの、これまでに得た考え方を確かめるために、二つの予備実験と、二つの本実験とを行った。(うち一つは昨年度から継続している。)。例えば、いくつかの成分音が一斉に、0.5秒程度の時間をかけて、数百セントくらい上昇するような状況を考える。このとき、全体としての音の高さの上昇が知覚される。この知覚現象自体、これまでに得た考え方を支持するものであるが、ここでは、この複合音を「背景音」と名付け、これに、マスキングの実験におけるマスク音のような役割を与える。背景音と重ねて、それと同じ方向、あるいは反対の方向に動く、日本語母音、純音などの「信号音」を呈示し、信号音の動きの方向が、その知覚されやすさに影響するかどうかを調べた。このさい、成分音の動きの効果のみを分離して取り出すために、背景音、母音のいずれも、調波構造が生じないような非日常的な複合音とする。また、背景音のスペクトルは充分広い周波数範囲にわたっている。信号音のレベルを変化させることによって、信号音の認知閾を測定したとこめ、母音、純音のいずれにおいても、信号音と背景音とが逆の方向に動いたときのほうが、信号音が認知されやすいとの結果が得られた。信号音の動きの方向によって生じた認知閾の差異は、4db程度であった。
ポリチアヘテロヘリセンの新しい合成と分子ソレノイドの創出

純有機物質での「分子ソレノイド」(有機導線でつくられたナノサイズの電磁石)はその特異な光学特性や高度に制御された三次構造から新たな物質系として期待される。本研究では、チオフェン環を含むらせん型芳香族高分子「ポリチアヘテロヘリセン」を設計・合成した。さらにらせんの巻き性の新たな制御法を見出し、またらせんに沿った電子伝導の生起をシミュレーションから理論予測した。(1)ベンゾチオフェン型共役らせん高分子の合成とヘリシティの制御Pd触媒を用いたカップリング反応によりキラルアルキルチオ置換ポリ(1,3-フェニレン)を合成、側鎖を酸化した。続いて、強酸中での分子内閉環を経て、ポリ(チアヘテロヘリセン)を構造欠陥なく得た。前駆未閉環体はクロロホルム/アセトニトリル(貧溶媒)混合溶液中では270-310nmの領域に3つのCotton効果を示し、そのCD強度は溶液塩度とともに著しく減少した。それに対し閉環重合体のCDはクロロホルム溶液中でも275-330nmに4つのCotta効果を示し、そのCDスペクトル・強度はともに溶媒、溶液温度に依存することなく一定であった。これより、得られたポリチアヘテロヘリセンが巻き性が制御されかつ剛直ならせん構造を有していることが明らかとなった。(2)らせんに沿った電子伝導の理論予測分子ソレノイドを見据えて、ポリチアヘテロヘリセンの電子伝導をシミュレーションから理論予測した。モデルとしてベンゾチオフェンが4つ縮合した分子を設定し、これを2つの金電極間に金-チオール結合で結合させたものに対して、電極間の電圧と電子透過度の関係を計算した。電圧-電子透過度の計算結果は金のフェルミ準位付近でのらせん鎖に沿った電子透過を示した。これは低い電圧下でもらせん鎖に電流が発生することを示唆しており、分子ソレノイド創出の確かな足掛かりとなった。本研究では、複素五員環の非対称性を利用してチオフェン環を含むらせん型芳香族高分子「ポリチアヘテロヘリセン」を新たに設計・合成する。さらに、電気・磁気・光学特性を明らかにすることで、「分子ソレノイド」の創成の足掛かりにする。(1)フェノキサチイニウム型らせん高分子の合成とヘリシティの制御p-メトキシフェノールを出発物とし、2ステップを経てフェノール水酸基の2位にメチルチオ基を導入した。スルフィドの不斉酸化は水酸基が存在すると進行しない。4-メチルスルフィニル-4-メトキシフェノールの水酸基を保護し、側鎖を不斉酸化した後、脱保護した。保護基を適当に選択することで、キラルな(R),(S)のスルホキシドを有するフェノールを光学純度高く合成した。(R),(S)体ともに銅/ピリジン錯体を用いて酸化重合し、前駆ポリ(1,2-フェニレンオキシド)を得た。強酸中、立体選択的な分子内閉環反応を生起させ、対応するフェノキサチイニウム型らせん高分子((R)-(+)体、(S)-(+)体)を合成した。(R)-(+)体、(S)-(+)体の円偏光二色性スペクトルは紫外・可視スペクトルに対応して正、負のCotton効果を示し、スルホニオ基の分子内閉環反応によるヘリシティ(らせん巻き方向)の制御が可能であることを明らかにした。(2)ベンゾチオフェン型共役らせん高分子の合成分子ソレノイドへの適用を見据え、共役高分子を主鎖骨格に有する剛直π-共役連鎖を合成した。p-ニトロトルエンの臭素化、ニトロ基の還元、脱アミノ基反応、さらにGrignard反応によるボロン酸エステルの導入を経て、1,3-フェニレンビスボレートを得た。一方、1,3-ベンゼンジチオールをメチル化し、4,6位に臭素を置換することで、4,6-ビス(メチルチオ)-1,3-ジブロモベンゼンを収率高く合成した。得られたボロン酸エステル体とジブロモベンゼンを塩基性下、Pd触媒を用いて重合し、ポリ[4,6-ビス(メチルチオ)-1,3-フェニレン-alt-2-メチル-1,3-フェニレン]を乳白色粉末として得た。側鎖メチルチオ基を定量的に酸化し、さらに、トリフルオロメタンスルホン酸と反応させスルホニオ基で架橋されたらせん骨格を有する閉環重合体が濃茶色粉末として得られた。吸収スペクトルは最大吸収波長、吸収端ともに前駆体に比べ長波長シフトしており、共役平面性はらせん構造においても拡大していることを明らかにした。(1)ベンゾチオフェン型共役

らせん高分子の合成とヘリシティの制御Pd触媒を用いたカップリング反応によりキラルアルキルチオ置換ポリ(1,3-フェニレン)を合成、側鎖を酸化した。続いて、強酸中での分子内閉環を経て、ポリ(チアヘテロヘリセン)を構造欠陥なく得た。前駆未閉環体はクロロホルム/アセトニトリル(貧溶媒)混合溶液中では270-310nmの領域に3つのCotton効果を示し、そのCD強度は溶液塩度とともに著しく減少した。それに対し閉環重合体のCDはクロロホルム溶液中でも275-330nmに4つのCotta効果を示し、そのCDスペクトル・強度はともに溶媒、溶液温度に依存することなく一定であった。これより、得られたポリチアヘテロヘリセンが巻き性が制御されかつ剛直ならせん構造を有していることが明らかとなった。(2)らせんに沿った電子伝導の理論予測分子ソレノイドを見据えて、ポリチアヘテロヘリセンの電子伝導をシミュレーションから理論予測した。モデルとしてベンゾチオフェンが4つ縮合した分子を設定し、これを2つの金電極間に金-チオール結合で結合させたものに対して、電極間の電圧と電子透過度の関係を計算した。電圧-電子透過度の計算結果は金のフェルミ準位付近でのらせん鎖に沿った電子透過を示した。これは低い電圧下でもらせん鎖に電流が発生することを示唆しており、分子ソレノイド創出の確かな足掛かりとなった。
胎盤特異的発現を示す細胞融合抑制タンパク：サプレシンのin vivo機能解析

サプレシン(Suppressyn)は細胞融合を負に調節する細胞融合抑制タンパクである。この機能をより生体に近い状態で解析するため、ヒト胎盤に由来する絨毛初代培養細胞を用いた融合抑制効果の検証と、マウスサプレシン遺伝子の単離・同定を計画した。本研究助成により、当研究室独自の絨毛初代培養細胞の単離・培養法が確立され、より詳細な機能解析が可能となった。さらに、ノックアウトマウス作製の為、マウスサプレシン遺伝子の単離を試みた結果、4つの候補遺伝子を得ることができた。今後これらの結果を発展、応用することにより、in vivoでのサプレシンタンパクの融合抑制能解明が期待される。サプレシンは我々が新規に単離・同定した細胞融合抑制タンパク質である。胎盤に必須な機能である細胞融合を調節するタンパクとして、非常に重要な役割を持つことが予想されていた。しかし、これまでヒト生体内(in vivo)での融合抑制効果は確認されていない。ヒト生体内での生理学的意義解明の最初のステップとして、ヒト個体間におけるサプレシン遺伝子配列の保存度を調べる多型解析、ならびに種を超えて保存されているかを確認する為の霊長類相同遺伝子の単離と機能解析を遂行した。この結果、ヒト個体間において7つの多型が存在することが明らかとなった。確認された多型にはタンパク質の合成を止めるようなストップコドンの挿入は確認されなかったが、アミノ酸の置換を伴っていた。また、これらの塩基置換を伴うサプレシン遺伝子配列の機能を解析した結果、いずれの配列も細胞融合抑制効果を保持していた。このことから、サプレシン遺伝子配列がヒトで高度に保存されていることが明らかとなり、ヒト生体内でのタンパク機能の重要性が示唆された。次に、霊長類(チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、アカゲザル、ヒヒ)の相同サプレシン遺伝子を単離し、その機能解析を行った。この結果、チンパンジーからアカゲザルまでその遺伝子配列ならびにタンパク機能が保存されていることが証明された。以上の結果から、間接的な証明ではあるが、サプレシン遺伝子が生体にとって重要な遺伝子であり、その機能が霊長類における胎盤形成に深く関わっていることが示唆された。我々は、胎盤特異的に発現し細胞融合を負に調節するタンパク:サプレシン(Suppressyn)を見いだした。(Sugimoto etal. Sci Rep2013)今回、サプレシンタンパクの細胞融合抑制能をより生体に近い状態で解析するため、ヒト満期胎盤由来絨毛初代培養細胞を用いた融合抑制効果の検証と、マウスサプレシン遺伝子の単離・同定を計画した。これまでに報告されてきた単離・培養方法をアレンジすることで、当研究室独自の絨毛初代細胞培養法を確立し、この細胞を用いてサプレシン遺伝子のノックダウンを試みた。この結果、サプレシン特異的なsiRNA処理を行った絨毛細胞では、コントロールに比べ、融合していない細胞が15%程度減少することが明らかとなった。これは、サプレシンの細胞融合抑制タンパクとしての機能を示唆するものであると考えている。マウスサプレシン遺伝子単離・同定に関しては、すでにデータベース上に登録されているマウス胎盤由来RNAseq解析結果をもとに、胎盤で発現するレトロウイルス配列を抽出した。この結果、胎盤特異的に高発現する非常に興味深い候補遺伝子1つを含む、4つの遺伝子を明らかにした。現在これらのマウス遺伝子をクローニングし、細胞融合抑制効果の有無をin vitroで検証している。以上のように、本研究助成により、絨毛初代培養細胞の単離・培養法を確立し、生体環境に近い機能解析を行うことが可能となった。また、in vivo機能解析の最終目的であるノックアウトマウス作製の為のマウスサプレシン遺伝子単離も、候補遺伝子を4つに絞ることができた。今後、これらの解析を発展・応用することにより、サプレシンタンパクの細胞融合抑制能を証明することができると考える。分子生物学サプレシン遺伝子の遺伝学的、進化学的アプローチによる解析はほぼ終了し、目的を達成したと考える。また、昨年度の目的の一つであるヒト胎盤初代細胞をもちいた機能解析に関しては、順調に進展していると考える。帝王切開予定の妊婦から同意を得ていただいた胎盤サンプルを用いて、目的の絨毛細胞を効率よく単離する方法を確立した。現在これらの細胞を用いて、サプレシンによる細胞融合抑制効果を確認している。目的の表現型(細胞融合)を示す絨毛細胞を単離する方法が確立できたことから、融合抑制能を定量的に解析することが可能となり、予定通りの進展が期待される。今年度から、もう一つの研究課題であるマウスサプレシン遺伝子の単離を開始する。これまでの解析により、サプレシン遺伝子はヒトで高度に保存されており、さらに霊長類でもその機能が保存されていた。