hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい語彙の般化における潜在的・明示的学習と統合の役割

(2)中間時点でのデータの分析と、考察。仮説の提示。実験は、一人の参加者に対し、2度参加してもらう必要がある。2度目は、初回参加時のちょうど一週間後に参加してもらう必要がある。この条件を満たす(一週間後にも参加できる。)参加者が非常に限られていること、また実験実施者の大学授業の空き時間と、参加学生の空き時間の調整の難しさのため、当初予定の半分程度しか、実験を実施できなかった。本研究は、どのような学習をした際に(incidental or explicit)、文法性判断のどの側面に(正答率か反応時間か)、いつ(直後、1週間後)、形態統語知識の学習効果が見られるか、またその判断の基となる知識がどのような種類のものか(主に、implicitか、explicitか)を明らかにする試みである。本研究は、今までほとんど対象として扱われていない日本人英語学習者(中級程度の英語力)を対象にして、文に埋め込んだ新語(本研究では12種類の英語の接尾辞を新しい語幹に付けたもの;例: fimisik)を、incidentalとexplicitで学ばせ、学習直後、1週間後の2つの異なる時点で、文法性判断テストにおける正答率と反応時間を指標に、形態統語知識の学習と般化能力を測定する。これによって、日本人英語学習者の新しい語彙・文法獲得における、学習法と時間経過の効果と役割について検討する。初年度(平成27年度)の実験材料の選定・作成、刺激提示ソフトのプログラミング・調整、平成28年度の実験開始(3群のそれぞれに、10人ずつ、計30人に対し、実験を実施)に引き続き、平成29年度は、本実験を終了した(3群のそれぞれに、20人ずつ、計60人に対し、実験を実施)。現在、データの分析と、考察を行っている。平成28年度には本実験を開始したが、必要実験参加者数60人(3群それぞれ20人)の内、半数の30人にしか実施できなかった。続く、平成29年度に、残りの30人に対し実験を行った。本実験の遂行に丸2年を要した理由は以下のとおりである。実験参加者は、中級程度の英語能力を有し、かつ、当日とちょうど一週間後の2度参加してもらう必要がある。この条件を満たす参加者が非常に限られていたこと、また実験実施者の大学での空き時間と、参加学生の空き時間の調整の難しさのため、実験実施に予想以上の時間がかかった。新しい語彙・文法はどのように学べば、より定着するだろうか。本研究は、英語の接尾辞を持つ新語(例bodisness)の形態統語知識に関して、偶発的に学んだ(incidental learning)学習者、明示的に学んだ(explicit learning)学習者、学習を経ない統制群の3群が、学習直後と1週間後に、文法性判断テスト(正答率と反応時間を測定)受け、形態統語知識の般化程度を調べる。
電荷秩序の光励起による破壊のダイナミックス

電荷秩序絶縁体から金属への光誘起相転移が観測されている有機伝導体(BEDT-TTF)_2Xでの電荷秩序状態における光励起状態の物理的性質を理論的に調べた。光吸収スペクトルの低エネルギー領域は電荷秩序を保持した電荷秩序絶縁体への励起によるものであり、高エネルギー領域は金属状態への励起によるものであることがわかった。このことから、光励起により金属ドメインが直接励起される可能性があることが明らかになった。「研究計画」で述べたように、2茨元電荷秩序状態の光励起による破壊がなぜ極めて高い収率で起きるのか、なぜ超高速で起きるのか、を解明し、この知見を基に、幾何学的フラストレーションや電荷揺らぎなどの電荷秩序状態の興味深い性質の理解を進めることを目的とし、2次元電荷秩序状態の光励起による破壊のダイナミックスの理論研究に取り組んだ。本年度は、破壊や光誘起相転移の核となる光励起状態の性質を調べた。異方的な2次元三角格子上のtight-bindingハミルトニアンにクーロン相互作用項を加えたモデルを用い、クーロンパラメーターおよび格子歪みに依存して、光吸収スペクトル、基底状態および光吸収スペクトルに主要な寄与をするエネルギー固有状態、がどのように変化するかを調べた。このモデルにおいては、電荷秩序状態だけではなく、金属状態、強磁性金属状態、ストライプ上のCDW状態など、多様な状態が基底状態となり得ることがわかった。(BEDT-TTF)_2Xのθd相に適当なパラメーターを用いた場合、光吸収スペクトルの低エネルギー側では、電荷秩序状態からストライプ上のCDW状態への遷移による鋭いピーク、高エネルギー側には通常の金属状態への遷移によるブロードなピークが支配的あることがわかった。このことは、従来考えられてきたように光誘起相転移の核としてホールがひとつ動いた状態を考察することは適当ではなく、微小な金属領域が直接光励起によってつくられることを示唆しており、この系の光誘起相転移に新しい知見をもたらすものである。「研究計画」では、光励起後のダイナミックスについても調べる予定であったが、ダイナミックスの研究はまだまとまっていない。光励起後のダイナミックスを理解するためには、光励起状態の性質を解明することが重要となる。そこで、今年度はふたつの系において、光物性を支配する重要な光励起状態の物理的性質を調べた。1次元鎖および2次元正方格子における強相関half-filled系での代表的電荷秩序状態のひとつである電荷密度波(CDW)状態とスピン密度波(SDW)状態との量子相境界をまたいで、光励起状態の性質がどのように変化するかを調べた。1次元系においては、相境界付近のSDW(CDW)基底領域において、ホロン・ダブロン対(スピン1重項対)ストリング状態が量子揺らぎとして重要な役割を果たし、これらのストリング状態が重なり合ったCDW(スピン1重項対)ドロプレット状態が光吸収スペクトルを支配する。これらのドロプレット状態は、相境界をまたいでCDW領域と中性領域の割合が連続的に変化し、光励起状態には相転移が起きないことがわかった。2次元系においては、相境界付近でも、CDWもしくはスピン1重項対クラスター状態は、クラスターの界面エネルギーのため揺らぎとして重要な役割を果たさず、光吸収スペクトルを支配する光励起状態は相境界で不連続に変化することがわかった。光誘起相転移が観測されているα-(BEDT-TTF)2Xにおける電荷秩序状態には多様な光励起状態が存在することを明らかにした。特に、低エネルギー領域での巨大なピークのいくつかは、高温で実現される金属状態と類似した電子構造を持つ光励起状態への励起によるものであり、従来考えられてきた単純な電子遷移によるものとは異なる集団励起によるものであることなどがわかった。これらの光励起状態を励起した後のダイナミックスは、光励起状態の特異な性質を反映したものとなる。今年度で得られた知見により、このような視点からダイナミックスの研究を進めることが可能となった。2次元有機導体α型(BEDT-TTF)_2Xにおける電荷秩序状態においては、光吸収スペクトルの低エネルギー領域での巨大なピークは電荷秩序をもつ絶縁状態への励起によるのに対して、高エネルギー領域でのブロードな構造は、電荷秩あ序をもたない金属状態への励起であること、この金属状態は高温相の金属状態よりも低エネルギー側に遷移モーメントが集中したより良い金属状態であること、がわかった。このため、低エネルギー領域での巨大なピークを励起した場合と、高エネルギー領域に対応するフォトンで励起した場合では、光励起後のダイナミックスが異なることがわかった。最初に低エネルギー領域に対応するフォトンでの励起による結果について述べる。弱励起時には、最初に基底状態と励起状態の非対角成分に由来する電荷の振動が発生し、少数のエネルギー固有状態がこの領域での遷移モーメントを独占しているために、この振動は減衰しない。その後、励起状態の重みが増すにつれて電荷分布がわずかに均一になっていくが、電荷秩序は破壊されない。

強励起時には、多光子励起状態の寄与が支配的になるにつれて、電荷分布はほぼ均一になり電荷秩序が破壊されることがわかった。次に高エネルギー領域に対応するフォトンでの励起による結果について述べる。この場合には弱励起時と強励起時のダイナミックスに顕著な違いはみられなかった。電荷の振動が位相緩和によって減衰し、膨大な数のエネルギー固有値が光励起状態に寄与していることがわかった。さらに、金属的な状態が光励起により直接的に励起されることがわかった。このことから、α型電荷秩序状態における光誘起相転移の初期過程は、従来考えられていたものとは異なる可能性があることがわかった。
カーボンナノチューブにおける電子相関の理論

本年度はカーボンナノチューブや一次元有機導体を対象にして以下のような一次元電子系の研究を行った。●カーボンナノチューブカーボンナノチューブにみられる二種類の金属状態、即ちゼロ磁場で実現される金属状態(二つの谷を持つ)と半導体カ-ボンナノチューブに軸に平行な磁場を印加することによって実現される金属状態(一つの谷を持つ)の電気抵抗と光学伝導度をボルン近似を用いて計算し、電子間長距離クーロン相互作用の効果の違いを議論した。その結果、二種類の金属状態とも電子間相互作用は電気抵抗の非整数巾的な温度依存性をもたらすが、その効果は谷が一つの状態の方が強いという結果を得た。また、光学伝導度に関しては、低振動数領域、高振動数領域の両方で二種類の金属状態とも電子間相互作用により非整数巾の振動数依存性がみられるが、その効果は谷が一つの状態の方が強いことを示した。このように、電子間相互作用の効果は谷が一つの金属状態で強く現れることが判った。また、カーボンナノチューブの振動子強度をタイトバインディング模型を用いて計算した。そして、いくつかの普遍的な関係式を導き、カーボンナノチューブへの電子もしくはホールのドープ量を決定するための有用な式を得た。●一次元有機導体昨年度の研究を拡張して、ボソン化法にくりこみ群を援用し、格子内斥力U、最近接格子間斥力V_1、次近接格子間斥力V_2をもつ1/4充填一次元電子系の電子状態の研究を行なった。そして、基底状態の相図を決定し、それからの低エネルギー励起に関して様々な知見を得た。本研究中で、スピン励起にギャップを持つ状態が、V_1の大きさによらずU<2V_2で実現するを示した。この状態は従来の平均場近似による研究で得られていなかったものであり、本研究で完全に取り入れられている量子揺らぎが本質的な役割を果たすことによって実現した状態であると考えられる。本年度はカーボンナノチューブの輸送現象に対する電子相関の効果を中心に研究を行った.カーボンナノチューブではクローン相互作用を遮蔽する電子が存在しないため,長距離相互作用を考慮しなければならない.その効果によって,不純物散乱による電気抵抗は相互作用がない場合に比べ増加する.また電子波の局在が効かないような温度領域では,電気抵抗は相互作用を無視した場合には温度によらず一定であるが,相互作用によって温度の減少に伴い巾的に増加することを示した.これらの現象は電子間相互作用によって電荷揺らぎが抑制されることに起因している.さらに低温の局在領域では谷内後方散乱と谷間後方散乱とは共存できないことを見出した.光学伝導度に関しては,その周波数依存性が相互作用によって影響を受け,高周波数領域では相互作用を無視した場合のω^<-2>に比べ,速く減衰することを示した.また,擬一次元有機導体に関する知見を得るため,1/4充填一次元電子系に関して研究を行った.まず,格子内斥力Uだけを持つモデルに対して繰り込み群を適用し二量体化と交替ポテンシャルによる電荷ギャップの解析的な標式を導いた.その結果を用いて,(TMTSF)_2X,(TMTTF)_2X(Xは一価のアニオン),及び[(TMTSF)_<1-x>(TMTTF)_x]ReO_4の電荷ギャップを議論した.さらに,Uと最近接格子間斥力Vを持つ1/4充填一次元電子系のU-V平面での相図を繰り込み群を用いて決定し,数値的対角化と定性的に一致する結果を得た.この系ではUとVが共に大きい領域で絶縁体状態が現れる.この絶縁体領域では,2k_F-スピン密度波の揺らぎと共存する4k_F-電荷秩序(k_Fはフェルミ波数)が実現されることを示した.ここで得られた2k_F-スピン密度波の揺らぎは3次元性により秩序となる.したがって,電荷秩序の特徴的な温度はスピン秩序の特徴的な温度よりも大きいことが期待できる.以上の結果は(DI-DCNQI)_2Agで観測されている電荷整列と磁気秩序の共存を定性的に証明する.本年度はカーボンナノチューブや一次元有機導体を対象にして以下のような一次元電子系の研究を行った。

●一次元有機導体昨年度の研究を拡張して、ボソン化法にくりこみ群を援用し、格子内斥力U、最近接格子間斥力V_1、次近接格子間斥力V_2をもつ1/4充填一次元電子系の電子状態の研究を行なった。そして、基底状態の相図を決定し、それからの低エネルギー励起に関して様々な知見を得た。本研究中で、スピン励起にギャップを持つ状態が、V_1の大きさによらずU<2V_2で実現するを示した。この状態は従来の平均場近似による研究で得られていなかったものであり、本研究で完全に取り入れられている量子揺らぎが本質的な役割を果たすことによって実現した状態であると考えられる。
ダイバータグラファイト質量移行時のトリチウム取り込み機構

本申請の研究費により製作したRFプラズマ反応装置を用いて、重水素プラズマを作成し、プラズマ対向材料ターゲット物質として等方性黒鉛と304SSを、再付着層形成基盤材料として石英ガラスおよび304SSを用いて、プラズマ反応装置内の各所に置かれた基盤上に生成された再付着層について5日または10日の連続実験を行い、1)黒鉛又はステンレス再付着層生成量を重量法で2)再付着層に取りこまれた重水素量の量をTDS(Thermal Desorption Spectroscopy)法を用いて3)重水素プラズマパラメーターをラングミュアープルーブ法でそれぞれ測定した。その結果次のようなことが判明した。1)グラファイト再付着層は電極上に置かれた基盤では殆ど成長せず、少し離れた場所に置かれた基盤上での成長が著しかった。再付着層に取り込まれた重水素量も同じ傾向を示した。これは、エッチング反応と再付着層形成反応の相対的効果によるものと考えられる。2)ステンレス再付着層の場合はグラファイトの場合とは異なり、電極上に置かれた基盤上での成長の方が大きく、重水素取り込み量も同様の傾向を示した。3)単針法により求めた電子温度は電極上では3eV、離れた点では6eVであった。電子密度はそれぞれ1.4x10^9cm^3と1.3x10^8であった。これからそれぞれの点におけるバイアス電圧は9.9および21eVと求められた。Dの炭素材へのスパッタリング閾値は10eV程度であるが電極上に基盤が置かれた場合はエッチングの効果が大きいと言う結果が得られた。4)D/C値はほぼ0.03であった。この値は再付着に際してC-H結合が先ず形成されると言う考え方は必ずしも正しいとはいえないことを示している。JETのトリチウム燃焼実験でダイバータグラファイトの再付着現象に関わるトリチウム挙動の解明が問題提起されて以来、主としてグラファイトの移行について材料学の観点からの検討が進められようとしているが、トリチウムの挙動を化学工学的反応工学の観点より実験的、解析的に追跡しようと言う研究は行われていない。本申請研究ではトリチウムRFプラズマをグラファイト面に照射し、種々の条件下で発生、堆積するグラファイト粒子中や低温度面への再付着層中のトリチウム量を測定することからトリチウム取り込み機構を解析する。本年度は先ずグラファイトの質量移行実験を行うための高周波プラズマ反応実験装置を製作した。予備実験で良好な水素プラズマを得ることが出来た。また、等方性グラファイトに水素プラズマを照射し、ガラス表面に質量移行したグラファイトをSEM観察した所ごく薄膜の再付着層はSEMの分解能範囲で一様であった。同時に等方性グラファイトやC/C複合体表面での気相中の水素分子と表面に捕捉されたトリチウム間の同位体交換反応(筆者等の命名による同位体交換反応1)の反応速度を定量した。既に測定済みのステンレス鋼やアルミニウム、銅等の金属表面、またはLiセラミック固体増殖材表面では同位体交換反応速度に同位体効果が認められなかったのに対し、今回測定したグラファイト表面では顕著な同位体効果が測定された。製作したRFプラズマ反応装置を用いて、プラズマ対向グラファイトの温度や水素圧力を変化させて、ガラスまたはステンレス面への再付着グラファイト層の生成速度を測定している。また、グラファイト表面におけるトリチウムと水素間の同位体交換反応速度を定量した。この成果と既に求めているグラファイト中の水素の溶解度と拡散係数を用いて、グラファイトダスト、ステンレスダストおよび膜状に形成されたグラファイトやステンレス膜からのトリチウム放出挙動のシミュレーションコードを作成し、各種ダストからのトリチウム除染法の検討を行った。

製作したRFプラズマ反応装置を用いて、重水素プラズマを作成し、プラズマ対向材料ターゲット物質として等方性黒鉛と304SSを、再付着層形成基盤材料として石英ガラスおよび304SSを用いて、プラズマ反応装置内の各所に置かれた基盤上に生成された再付着層について1)黒鉛又はステンレス再付着層生成量を重量法で2)再付着層に取りこまれた重水素量の量をTDS(Thermal Desorption Spectroscopy)法を用いて3)重水素プラズマパラメーターをラングミュアープルーブ法でそれぞれ測定した。その結果次のようなことが判明した。1)グラファイト再付着層は電極上に置かれた基盤では殆ど成長せず、少し離れた場所に置かれた基盤上での成長が著しかった。再付着層に取り込まれた重水素量も同じ傾向を示した。2)ステンレス再付着層の場合はグラファイトの場合とは異なり、電極上に置かれた基盤上での成長の方が大きく、重水素取り込み量も同様の傾向を示した。3)単針法により求めた電子温度は電極上では3eV、離れた点では6eVであった。電子密度はそれぞれ1.4xl0^9cm^3と1.3x10^8であった。これからそれぞれの点におけるバイアス電圧は9.9および21eVと求められた。Dの炭素材へのスパッタリング閾値は10eV程度であるが電極上に基盤が置かれた場合はエッチングの効果が大きいと言う結果が得られた。4)D/C値はほぼ0.03であった。
神経が顎顔面形成に与える影響を考える－顔面半側萎縮症と顔面半側肥大症の病因解明－

顎顔面領域の形態異常は外表奇形の中でも最も割合が高く、著しい不正咬合を呈することから、歯科領域において重要な疾患の一つである。しかし、多くの疾患の発症機序はほとんど解明されておらず、有効な治療方法も開発されていない。本研究課題では、顎顔面領域の成長期における正常な形態形成には、Shhを介した神経細胞による幹細胞の制御が重要な役割を担っており、この制御機構が崩れると顔面半側萎縮症や顔面半側肥大症など顎顔面領域の形態異常が起こるのではないか、との学術的「問い」を立てた。したがって、本研究の目的は、マウスの三叉神経および顔面神経が、Shhを介して成長期の顎顔面の形態形成に及ぼす影響を明らかにし、顔面半側萎縮症や顔面半側肥大症など顎顔面領域の形態異常の発症機序を解明することである。本年度の研究は、まず実験1として、三叉神経および顔面神経が、成長期の顎顔面領域の形態形成にどのような影響を及ぼすのかを明らかにするための実験を行なった。顔面半側萎縮症のモデルとして、三叉神経および顔面神経を切断する神経活動遮断実験を、顔面半側肥大症のモデルとして、三叉神経および顔面神経に電気刺激を加える神経活動賦活化実験を行った。その結果、ラットの三叉神経切断による神経活動遮断実験において、切歯の形成速度の低下や歯髄の石灰化、エナメル芽細胞や象牙芽細胞の配列の乱れが認められた。このようにラットの三叉神経切断による神経活動遮断を行うことによって、ヒトの顔面半側萎縮症(ロンベルグ症候群)で認められる臨床所見に類似した所見が認められた。本研究では、顎顔面領域の正常な形態形成には、神経細胞による幹細胞の制御が重要な役割を担っており、この制御機構が崩れると顔面半側萎縮症や顔面半側肥大症など顎顔面領域の形態異常が起こるのではないかとの仮説を立てていた。本年度の研究結果から三叉神経の神経活動遮断によって顎顔面領域の正常な形態形成が阻害されるというということを証明することができ、本研究の仮説が正しいということを示すことができたため、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。平成31年度(令和元年度)では、平成30年度に引き続き、ラットの三叉神経および顔面神経を切断する神経活動遮断実験と、三叉神経および顔面神経に電気刺激を加える神経活動賦活化実験の実験結果解析を行なっていく。また、同時に実験2および実験3で必要な遺伝子改変マウス作成を行なっていく。平成30年度では、実験1は予定よりも順調に進んだため研究費が少なくてすんだことと、実験2および実験3で必要な遺伝子改変マウス作成を行わなかったため、次年度使用額が生じた。平成31年度(令和元年度)では、実験2および実験3で必要な遺伝子改変マウス作成に次年度使用額を使用していく。
α-synuclein変異体とオリゴデンドロサイトへの輸送・凝集体形成能の解析

多系統委縮症(MSA)はわが国の脊髄小脳変性症で最も多く厚生労働省の特定疾患に指定されている難病の一つである。病理学的にはパーキンソン病の原因因子の一つと考えられるα-synuclein(α-syn)がグリア細胞であるオリゴデンドロサイトに蓄積しGCI形成することを特徴とする。近年、MSA患者脳から抽出したα-synタンパクをα-syn Tgマウス脳内に投与し、α-synタンパクのpropagationを示した。またPD患者から抽出したα-synタンパクではpropagationを認めないことからMSAとPDにおけるα-syn strainsの違いが注目を集めている。MSAにおけるGCI形成はその病態理解に極めて重要な知見であるが、その分子基盤は明らかでない。我々は通常、神経細胞主体に発現すると考えられるα-synが、MSAにおいて神経細胞からオリゴデンドロサイトに輸送され凝集体を形成するとの仮説の実証を試みた。家族性PDにおいても、いくつかの変異α-synにおいて特異的にGCIが認められる。G51D変異もGCIを認める家族性PDであり、この変異を有する患者は、より早期に発症し、錐体路兆候、精神症状および自律神経障害のような重度の臨床的特徴を示す。G51D α-synタンパクをフィブリル化し、マウス黒質に接種することで、G51D α-synフィブリル接種マウスよりも有意にリン酸化α-syn陽性封入体の凝集体を広範囲に、より多く認め、さらに黒質ドパミン神経細胞の変性とそれに伴う運動機能障害を示す、よりヒトの病態に類似したモデルを作成した。またこのマウスでは、少数ではあるがオリゴデンドロサイト内でのα-syn凝集体を認めること、新規PDモデルマウスを作成したことを現在論文にして報告準備中である(Hayakawa H,et al.submitted.2018)。マウス黒質へのG51D α-synフィブリル投与により、野生型α-synフィブリル投与マウスよりも、より多く、より広範囲にリン酸化α-syn凝集体を形成する新規PDモデルマウスを作成した。α-syn変異を用いたオリゴデンドロサイトへの取り込み、凝集体形成、細胞死の過程を解析しMSAの病態解明を目指す。In vitroでのα-synのオリゴデンドロサイトへの取り込みを培養細胞系、オリゴデンドロサイト初代培養系に対してαsyn変異型を用いて取り込み機序を生化学的に比較解析し、αsyn取り込みに関わる修飾因子を同定。取り込み後のGCI形成能、細胞機能の変化などの解析。1神経細胞とオリゴデンドロサイト共培養の確立神経細胞-オリゴデンドロサイト間でのαsynの伝播について検証することを目的とした。αsyn発現SH-SY5Y細胞(WT及びG51D, A53E変異型αsynを導入)とオリゴデンドロサイト共培養系の確立およびオリゴデンドロサイトでのαsynの取り込み、蓄積を評価した。カルシウム刺激やexosomeを刺激する薬剤を使用し、細胞から放出されるαsynを細胞上清中で確認した。今後、神経細胞、オリゴデンドロサイトにおいてどちらがよりαsynの取り込みを行うか評価する。細胞に試薬を添加後、細胞上清のsyn量をELISA法を使用し測定する。また細胞を回収し細胞内のsyn量をウェスタンブロットで測定する。αsyn発現オリゴデンドロサイトと正常型神経細胞を用い、神経細胞へのαsynの取り込み、蓄積をsyn抗体、リン酸化syn抗体を用い免疫組織学的に評価する。またPLP/DMを含有するオリゴデンドロサイト由来exosomeを超遠心を用いて測定する。共培養系はE-plate insert(Rhoche社)を使用することで間接的相互作用を観察することが可能である。2オリゴデンドロサイトでのin vivo強制発現系の構築・AAV 8ベクターもオリゴデンドロサイトへの遺伝子導入が報告されており、同様にAAV 8-EGFP、AAV8-αsynを作成した。今後マウスの黒質線条体に投与する予定である。当初、ヒトオリゴデンドロサイト培養系であるKG1C細胞系を用い、WTおよびG51D, A53E変異αsynを導入したstable cell lineを作製を試みたが、トランスフェクション効率の低さ、細胞増殖能が遅いためstablecell lineの作製を断念した、神経細胞とオリゴデンドロサイト共培養の確立を行った。神経細胞-オリゴデンドロサイト間でのαsynの伝播について検証することを目的とする。αsyn発現SH-SY5Y細胞(WT及びG51D, A53E変異型αsynを導入)とオリゴデンドロサイト共培養系の確立。共培養系transwell(costar社)を使用することで間接的相互作用を観察することが可能である。上皿にαsyn発現SH-SY5Y細胞、下皿にオリゴデンドロサイトであるKG1C細胞を培養した。数時間後KG1C細胞においてαsynの取り込み認めた。・マウスモデルの確立。MSAの病理学的特徴を完全に再現したマウスモデルはまだ開発されておらず病態解析が進展しない遠因となっている。その為、新たなマウスモデルの確立を目的とする。・野生型マウスに対してwild type αsyn-fibrilまたはGCI形成能があるG51D, A53E変異型αsyn fibirlを脳内直接投与を行う。作成したマウスモデルに対してロータロッドによる行動学的解析、組織標本を用いOlig2抗体、MBP抗体を用いたオリゴデンドロサイトの障害を検証する。

またsyn抗体、リン酸化syn抗体を用いて凝集体の形成の有無を確認する。・神経細胞-オリゴデンドロサイト間でのαsynの伝播について検証することを目的とする。αsyn発現SH-SY5Y細胞(WT及びG51D, A53E変異型αsynを導入)とオリゴデンドロサイト共培養系の確立およびオリゴデンドロサイトでのαsynの取り込み、蓄積を評価する。細胞に試薬を添加後、細胞上清のsyn量をELISA法を使用し測定する。また細胞を回収し細胞内のsyn量をウェスタンブロットで測定する。オリゴデンドロサイトとαsyn発現神経細胞を用い、神経細胞からαsynの分泌をsyn抗体、リン酸化syn抗体を用い免疫組織学的に評価する。またオリゴデンドロサイトへの伝播に神経細胞由来exosomeが関連するかを評価する。共培養系はtranswell insert plate(coster社)を使用することで間接的相互作用を観察する。マウスモデルの確立。野生型マウスに対してwild type αsyn-fibrilまたはGCI形成能があるG51D, A53E変異型αsyn fibirlを脳内直接投与を行った結果、作成したマウスモデルに対してロータロッドによる行動学的解析では運動機能低下は認めなかったが、アポモルフィンによる回転運動では野生型syn投与マウスと比較し、回転運動の増加を認めた。またsyn抗体、リン酸化syn抗体を用いて凝集体の形成を確認した。神経細胞-オリゴデンドロサイト間でのαsynの伝播について検証した。αsyn発現SH-SY5Y細胞(WT及びG51D, A53E変異型αsynを導入)とオリゴデンドロサイト共培養系の確立およびオリゴデンドロサイトでのαsynの取り込み、蓄積を認めた。また細胞を回収し細胞内のsyn量をウェスタンブロットで測定した。オリゴデンドロサイトとαsyn発現SH-SY5Y細胞を用い、神経細胞からのαsynの分泌、オリゴデンドロサイトへの蓄積をsyn抗体、リン酸化syn抗体を用い免疫組織学的に評価した。多系統委縮症(MSA)はわが国の脊髄小脳変性症で最も多く厚生労働省の特定疾患に指定されている難病の一つである。病理学的にはパーキンソン病の原因因子の一つと考えられるα-synuclein(α-syn)がグリア細胞であるオリゴデンドロサイトに蓄積しGCI形成することを特徴とする。近年、MSA患者脳から抽出したα-synタンパクをα-syn Tgマウス脳内に投与し、α-synタンパクのpropagationを示した。またPD患者から抽出したα-synタンパクではpropagationを認めないことからMSAとPDにおけるα-syn strainsの違いが注目を集めている。MSAにおけるGCI形成はその病態理解に極めて重要な知見であるが、その分子基盤は明らかでない。我々は通常、神経細胞主体に発現すると考えられるα-synが、MSAにおいて神経細胞からオリゴデンドロサイトに輸送され凝集体を形成するとの仮説の実証を試みた。
顎骨腫瘍・嚢胞による骨吸収機序の研究―破骨細胞形成機序の解析―

顎骨腫瘍や顎骨嚢胞による顎骨吸収の分子メカニズム明らかにするために、腫瘍・嚢胞が産生するサイトカインよる間質線維芽細胞の破骨細胞活性化因子RANKL発現調節機構と破骨細胞活性化の機序の解明を行った。本研究結果から、1)角化嚢胞性歯原性腫瘍やエナメル上皮腫の内容液中には上皮細胞が産生する歯原性高濃度のTGF-bとIL-1aが含有されており、相乗作用で間質線維芽細胞のRANKL発現を誘導すること、2)TGF-bは間質線維芽細胞のRANKL遺伝子転写を促進すること、3)TGF-bは破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化を促進する、3つのメカニズムが明らかとなった。顎骨病変による骨破壊、骨吸収機序を明らかにすることを目的とし、顎骨嚢胞・腫瘍性病変が産生するサイトカイン、特にTGF-betaに焦点を当て、病変間質繊維芽細胞での破骨細胞活誘導因子、RANKLの発現機序を検討した。顎骨腫瘍間質繊維芽細胞は破骨細胞誘導因子であるRANKLを発現し、間質繊維芽細胞を介する破骨細胞誘導、骨吸収、腫瘍浸潤が引き起こされることが示された。顎骨腫瘍・嚢胞を構成する歯原性上皮はTGF-betaとIL-1alphaを産生し、それぞれのサイトカインは周囲の間質線維芽細胞のRANKL発現を誘導することが示された。IL-1alphaはCOX-2タンパク、PGE2合成を介してRANKL発現を促進し、TGF-betaはIL-1シグナルによるNF-kBシグナル活性化を促進効果する効果と、RANKL転写を促進する直接作用の二つの経路を有することが示された。TGF-betaシグナルによるRANKL遺伝子発現誘導の分子メカニズムを検索するため、ヒトRANKL遺伝子転写開始点上流2.3kbプロモーター配列をクローニングし、ルシフェラーゼを連結したベクターを作成した。そして、様々な長さのプロモーターコンストラクトを作成した。このベクターを間質線維芽細胞に遺伝子導入しTGF-beta刺激によるルシフェラーゼ活性を測定しTGF-betaが間質線維芽細胞のRANKL転写を調節するか検討した。その結果、ヒト顎骨腫瘍由来間質繊維芽細胞は高いヒトRANKL遺伝子プロモーター活性を示した。そして、TGF-betaは-176bpのプロモーター配列のルシフェラーゼ活性を上昇させた。つまり、TGF-betaは顎骨腫瘍の間質繊維芽細胞のRANKL遺伝子転写を促進し、破骨細胞誘導、骨破壊をきたす分子機序が示唆された。顎骨病変による骨破壊、骨吸収機序を明らかにすることを目的とし、顎骨嚢胞・腫瘍性病変が産生するサイトカイン、特にTGF-betaに焦点を当て、病変間質細胞での破骨細胞活誘導因子、RANKLの発現機序を検討した。顎骨病変の内容液を保存し試料とした。病変間質細胞を分離しRANKL発現を検討した。免疫組織染色で顎骨嚢胞・腫瘍歯原性上皮細胞はTGF-beta陽性、間質線維芽細胞はRANKL陽性、リン酸化smad3陽性であった。また、病変内容液中には非常に高濃度のTGF-betaを含有し、角化嚢胞性歯原性腫瘍、エナメル上皮腫、濾胞性歯嚢胞、の順で高かった。また、顎骨病変はIL-1alphaも高濃度に含有していた。IL-1は線維芽細胞でのCOX-2タンパクを上昇させ、PGE2生合成を上昇させた。その結果、RANKL発現を促進することが示唆された。しかし、TGF-betaはこれとは異なりCOX-2やPGE2合成を促進しなかった。一方で、TGF-betaはIL-1刺激によるCOX-2上昇、PGE2合成上昇を相乗的に促進した。TGF-betaによるRNAKL誘導はタンパク質合成を介さず、直接RANKL転写を促進することが示された。以上より、顎骨腫瘍・嚢胞を構成する歯原性上皮はTGF-betaとIL-1alphaを産生し、それぞれのサイトカインは周囲の間質線維芽細胞に作用し、破骨細胞誘導因子RANKL発現を誘導することが示された。IL-1alphaはCOX-2タンパク、PGE2合成を介してRANKL発現を促進し、TGF-betaはIL-1シグナルの相乗的な促進効果と、RANKL転写を促進する直接作用の二つの経路を有することが示された。顎骨病変による骨破壊、骨吸収機序を明らかにすることを目的とし、顎骨農法・腫瘍性病変が産生するサイトカイン、特にTGF-betaに焦点を当て、顎骨病変の間質線維芽細胞での破骨細胞活性化因子であるRANKLの発現機序を検討した。昨年度までに、顎骨腫瘍・嚢胞がサイトカイン、TGF-betaおよびIL-1 alphaを産生し、間質線維芽細胞のRANKL発現を促進すること、かつ、二因子に相乗効果があることを見出していた。そして、TGF-betaはRANKL遺伝子の転写を促進する可能性が示唆されたためその詳細をRANKL遺伝子のプロモーター活性を指標に検討した。その結果、TGF-betaは間質線維芽細胞のRNAKLプロモーター領域の上流176bpを含む領域のルシフェラーゼ活性を促進することが明らかとなった。このプロモーター領域をヒト

骨芽細胞に導入してTGF-beta刺激を加えてもルシフェラーゼ活性は促進されず、骨芽細胞とは異なり、間質線維芽細胞特有の反応である可能性が示唆された。顎骨に発生する顎骨腫瘍、顎骨嚢胞による周囲骨の破壊、骨吸収機序を明らかにすることを目的とし、それらの産生するサイトカイン、特にTGF-beta, IL-1alphaに焦点を当て、病変の間質線維芽細胞での破骨細胞活性因子RANKL発現機序を検討した。本年度は、フリーザー故障によって失った、種々の病変由来間質線維芽細胞の再樹立と、その細胞を用いたRANKL遺伝子プロモーター領域での制御、を検討した。その結果、1)本研究で、ヒトRANKL遺伝子プロモーター領域を-2360 kbpから-138 bpまでの種々の長さのレポーターコンストラクトを構築した。2)ヒト骨芽細胞様細胞MG63、角化嚢胞性歯原性腫瘍由来間質線維芽細胞、エナメル上皮腫由来間質線維芽細胞、歯胚由来歯嚢線維芽細胞、にレポーターkンストラクトを導入してレポーター活性を測定したところ、間質線維芽細胞にも転写活性がみられた。3)TGF-betaはヒト骨芽細胞のレポーター活性を抑制した。4)TGF-betaはエナメル上皮腫の間質線維芽細胞、角化嚢胞性歯原性腫瘍の間質線維芽細胞のレポーター活性を促進した。5)TGF-betaの促進するレポーター活性は、-176 bpから-138 bpに存在するAP-1配列が関連していることが変異レポーターを用いた解析で明らかとなった。顎骨病変の間質線維芽細胞でのRANKL発現調節は、骨芽細胞における転写調節とは異なる機序が存在する可能性が示唆された。顎骨腫瘍や顎骨嚢胞による顎骨吸収の分子メカニズム明らかにするために、腫瘍・嚢胞が産生するサイトカインよる間質線維芽細胞の破骨細胞活性化因子RANKL発現調節機構と破骨細胞活性化の機序の解明を行った。本研究結果から、1)角化嚢胞性歯原性腫瘍やエナメル上皮腫の内容液中には上皮細胞が産生する歯原性高濃度のTGF-bとIL-1aが含有されており、相乗作用で間質線維芽細胞のRANKL発現を誘導すること、2)TGF-bは間質線維芽細胞のRANKL遺伝子転写を促進すること、3)TGF-bは破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化を促進する、3つのメカニズムが明らかとなった。平成26年度、研究期間中、細胞を凍結保存していた冷凍庫の故障が生じ、本研究に用いていた顎骨病変より分離した間質線維芽細胞をすべて失った。同時に、一部の抗体等をも失った。特に、間質線維芽細胞は各種顎骨病変から分離した細胞で、購入や譲渡を受けられないため、再度、同意の得られた患者の臨床検体から細胞を分離、培養する必要が生じたため、研究の遂行に支障が生じた。口腔外科学種々の顎骨病変から間質線維芽細胞を分離、培養し、細胞実験可能な状態にある。1)TGF-betaシグナルによるRANKL遺伝子制御のメカニズムを検索する。
硫黄、セレン、テルルを配位原子として含む金属錯体の合成と反応性に関する研究

2-ピリジンセレノラト(pySe)を含むコバルト(III)錯体としては、[Co (pySe)(en)_2]^<2+>,[Co (pySe)(bpy)_2]^<2+>,[Co (pySe)_2(bpy)]^+,fac-[[Co (pySe)_3]を新たに合成した。[Co (pySe)(en)_2]^<2+>のX線構造解析により、セレノラトのトランス影響(シス位のCo-Nに比べてトランス位のCo-N結合が0.045†長い)を明らかにするとともに、セレノラトの立体化学的性質(fac-[[Co (pySe)_3]のみが得られる)をチオラトのもの(mer-[Co (2-pyridinethilato)_3]のみが得られる)と比べ、セレノラトの方が、共有結合半径が大きいことと、トランス影響が大きいことによる幾何異性の偏りと考えられるなどの新しい知見を得た。また、これらのセレノラト錯体は、空気中で酸化分解を徐々にし、不安定だった。ロジウム(III)錯体としては、[Rh (pySe)_2(PPh_3)_2」^+,[Rh (pySe)_3]を新たに合成した。[Rh (pySe)_3]錯体は、コバルト錯体と同じく、fac構造のみが得られた。パラジウム(II)錯体としては、[PdCl_2 (pySeBz)_2]を新たに合成し(pySeBzは(2-ピリジル)ベンジルセレニド)、固体状態での熱分解により、[Pd (pySe)_2]が生成することを、熱重量・熱示差測定とNMR,XPSスペクトル,蛍光X線分析を明らかにした。[PdCl_2 (pySeBz)_2](pySBzは(2-ピリジル)ベンジルスルフィド)も合成し、同様に熱分解したところ、類似の反応により熱分解して、[Pd (pyS)_2](pySは2-ピリジンチオラト)が、得られた。[PdCl_2(Me_2S)_2]錯体では、熱分解して、PdSが生成することが知られているが、それらとは異なる熱分解をすることがわかった。S-C結合よりもSe-C結合が切断しやすいこと、切断の機構が、アルキルアリール基の性質によりかなり異なることを明らかにした。ところが、[PdCl_2 (pySeBz)_2]をクロロホルム中で、室温で、再結晶すると[PdCl_2(pySepy-N,N')]に(pySepyは2,2'-ジピリジルセレニド)、錯体を反応場として配位子カップリングをすることを見いだした。[PdCl_2(pySepy-N,N')]については、X線構造解析をして構造を決定した。このような新規で、合成有用な反応を見いだすことができた。

ところが、[PdCl_2 (pySeBz)_2]をクロロホルム中で、室温で、再結晶すると[PdCl_2(pySepy-N,N')]に(pySepyは2,2'-ジピリジルセレニド)、錯体を反応場として配位子カップリングをすることを見いだした。[PdCl_2(pySepy-N,N')]については、X線構造解析をして構造を決定した。このような新規で、合成有用な反応を見いだすことができた。2-ピリジンチオラト(pySと略)の硫黄原子をセレンに変えた2-ピリジンセレノラト(pySeと略)を合成し、そのCo^<3+>,Pd^<2+>錯体を合成した。2-ピリジンセレノラトとエチレンジアミン(enと略)の混合配位子コバルト(III)錯体の一連を合成、単離し、この配位子の性質を対応する、2-ピリジンチオラト錯体と比較検討した。[Co(pySe)(en)_2](ClO_4)_2の単結晶X線構造解析をし、セレンのトランス影響の大きさを決定した。対応する硫黄のトランス影響に比べて少し大きいことがわかった。またこの結晶は自然分晶していた。また[Co(pyS)_3]はmer構造の錯体のみが得られるが、今回合成した[Co(pySe)_3]はfac構造のみが得られた。これは、硫黄とセレンの原子半径がセレンの方が大きいことやトランス影響の大きさの違いに起因していることが考えられる。また配位セレン原子の酸化反応も検討した。2)カルコゲンのα-炭素のC-H活性化による錯形成反応(2-ベンジルチオ)ピリジンにブチルリチウムを加え、硫黄のα位の炭素をアニオンに変え、この炭素の非結合電子対とピリジンによりキレート形成をした、パラジウム錯体を合成した。(2-メチルチオ)ピリジンについても、同様の反応を確認した。特にこの(2-ベンジルチオ)ピリジンの配位炭素は不斉になり、光学分割可能であり、現在これを検討中である。この配位子の硫黄も酸化可能で、不斉硫黄になりうるので、不斉源を複数持ち、その性質に興味が持たれる。2-ピリジンセレノラト(pySe)を含むコバルト(lll)錯体としては、[Co(pySe)(en)_2]^<2+>,[Co(pySe)(bpy)_2]^<2+>,[Co(pySe)_2(bpy)]^+,fac-[Co(pySe)_3]を新たに合成した。[Co(pySe)(en)_2]^<2+>のX線構造解析により、セレノラトのトランス影響(シス位のCo-Nに比べてトランス位のCo-N結合が0.045Å長い)を明らかにするとともに、セレノラトの立体化学的性質(fac-[Co(pySe)_3]のみが得られる)をチオラトのもの(mer-[Co(2-pyridinethiolato)_3]のみが得られる)と比べ、セレノラトの方が、共有結合半径が大きいことと、トランス影響が大きいことによる幾何異性の偏りと考えられるなどの新しい知見を得た。また、これらのセレノラト錯体は、空気中で酸化分解を徐々にし、不安定だった。ロジウム(lll)錯体としては、[Rh(pySe)_2(pph_3)_2]^+,[Rh(pySe)_3]を新たに合成した。[Rh(pySe)_3]錯体は、コバルト錯体と同じく、fac構造のみが得られた。パラジウム(ll)錯体としては、[PdCl_2(pySeBz)_2]を新たに合成し(pySeBzは(2-ピリジル)ベンジルセレニド)、固体状態での熱分解により、[Pd(pySe)_2]が生成することを、熱重量・熱示差測定とNMR,XPSスペクトル,蛍光X線分析から明らかにした。[PdCl_2(pySBz)_2](pySBzは(2-ピリジル)ベンジルスルフィド)も合成し、同様に熱分解したところ、類似の反応により熱分解して、[Pd(pyS)_2](pySは2-ピリジンチオラト)が、得られた。[PdCl_2(Me_2S)_2]錯体では、熱分解して、PdSが生成することが知られているが、それらとは異なる熱分解をすることがわかった。
非可積分系に対する厳密解とカオス的集合の実験数学的構成

C)Anosov微分同相写像の分類に関する研究成果について研究集会で次の標題の口頭発表を1件した。A)研究分担者との共同研究についての論文のプレプリントB) Smaleの第11問題とFatou予想(1918年)に関する研究成果が得られた。C)Anosov微分同相写像の分類に関する研究成果が得られた。本年度中に上記で述べたA)、B)、C)に関連して下記のことを行う:A)について、1)と2)の論文を年度の中盤までに完成させ投稿する。また、より多くの数値データを求め、その結果を実験数学の雑誌に投稿する。B)とC)の研究成果に関する論文を完成させ、投稿する。これらの研究成果は、逐次口頭発表などでも発表していく。また、必要な研究連絡を行う。
単一分子分光法による温度応答性高分子の一本鎖ダイナミクスの評価

一本鎖あたり1個の蛍光分子を導入した温度応答性高分子を合成した。希薄水溶液の吸収・蛍光スペクトルより、色素の多くが水溶液中で会合し、一部が単量体に近い状態で存在することが示唆された。試料は水中で約2000本の分子鎖からなる会合体を形成し、その粒径は温度上昇と共に減少した。また、昇温時の色素のスタッキングが、粒径・濁度・蛍光スペクトルのヒステリシスの原因と考えられた。ガラス基板上にスピンコートした試料では単一鎖由来と思われる輝点が観測されたものの、温水の滴下によりそれが消失した。これは、分子鎖が基板から剥離してしまったためと考えられた。蛍光性分子であるペリレンテトラカルボン酸ジイミド(PTCDI)の両末端に臭化イソブチリル基を導入した誘導体を合成し、これを重合開始剤とする原子移動ラジカル重合により、一本鎖あたり1個の蛍光分子を導入した温度応答性高分子ポリ(Nーイソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)を重合した。得られた高分子は、数平均分子量が26000、分散は1.4となり、リビング重合で得られ試料としてはやや多分散であった。1 wt%水溶液を用いた濁度測定より、試料は昇温時に32度、降温時に23度で相転移し、大きなヒステリシスを示すことがわかった。また、室温における希薄水溶液の吸収スペクトルは、有機溶媒中のそれとは形状が異なり、一方蛍光スペクトルについては、有機溶媒中とほぼ同様の形状を示した。これらのことから、PTCDI部分の多くが水溶液中で会合し、一部が単量体として存在することが示唆された。またヒステリシスを示した理由は、相転移によりPTCDI部がスタッキングして会合体を形成し、それが解離するためには通常の相転移温度よりも低温にする必要があるためと考えられた。昨年度合成した一本鎖あたりPTCDIを1分子含むポリ(2ーイソプロピルー2ーオキサゾリン)の場合、希薄水溶液中でも単量体を形成しなかった。今回得られた試料は、十分希薄にすることによって水溶液中でも単量体として存在することが示唆されたことから、単一分子分光法による単一鎖ダイナミクスの解析に用いることができることがわかった。そこで、有機溶媒中の希薄溶液からガラス基板上にキャストした乾燥試料を用いて単一分子分光を行ったところ、単一鎖中のPTCDIからの蛍光を観測することに成功した。現在、前述の試料に温水を滴下し、徐冷しながら単一鎖の相転移時における蛍光挙動の解析を試みている。蛍光性分子であるペリレンテトラカルボン酸ジイミド(PTCDI)の両末端にブロモメチル基を導入した誘導体を合成し、これを重合開始剤とするカチオン開環重合により、一本鎖あたり1個の蛍光分子を導入した温度応答性高分子ポリ(2ーイソプロピルー2ーオキサゾリン)(PiPOx)を重合することに成功した。得られた高分子は、数平均分子量が4,800、5,500および6,500の3種であり、分散は1.161.21と比較的単分散であった。試料水溶液の濁度測定より、試料が33 °C付近に下限臨界溶解温度を示すことがわかった。一方、試料水溶液の吸収および蛍光スペクトルは、有機溶媒中のそれとは大きく形状が異なったことから、疎水性であるPTCDI部分が水溶液中で会合しミセルを形成していることがわかった。当初の計画では、得られた試料の希薄水溶液を温度制御下で単一分子分光測定することにより、コイルーグロビュール転移における一本鎖ダイナミクスに関する知見を初めて得る予定であった。しかし、希薄水溶液中であっても会合して一本鎖にならないことから、本系での単一分子分光測定を断念せざるを得なくなった。希薄水溶液中でも会合した理由として、PiPOx鎖が比較的剛直であるため疎水性のPTCDI部位を一本鎖が取り囲んで安定化させるようなコンフォメーションを取り難かったことが考えられた。この結果は、本研究の目的を別にすれば、近年注目度を増しているPiPOx水溶液の性質に関する新たな知見を与えるものといえる。そこで、温度応答性高分子をより柔軟なポリ(Nーイソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)に変更することとした。一本鎖あたりに1個のPTCDIを含むPNIPAMを合成するため、原子移動ラジカル重合の開始剤となるPTCDI誘導体の合成を行い、現在精製を終えた段階である。前年度に合成して得られた、蛍光性分子を中央付近にもつポリ(Nーイソプロピルアクリルアミド)(PTCDI-PNIPAM)について、その水中での温度応答挙動を詳細に評価するため、静的および動的光散乱測定を行った。

静的光散乱測定より、希薄水溶液中において、PTCDI-PNIPAMはおよそ2000本程度の高分子鎖からなる球状の会合体を形成することがわかった。また、動的光散乱測定より、その25°Cにおける流体力学的直径は150190 nmであった。流体力学的直径は、温度上昇と共に減少し、33 °C以上では65 nm程度となる一方、降温過程では増加するものの、27 °C以下において昇温時よりも1020 nm小さい値を示した。これらの結果および前年度までに得られた知見から、PTCDI-PNIPAMは、PTCDI部分がスタッキングにより会合したミセル単位が複数個集まった球状会合体を形成することが示唆された。この会合体は、昇温に伴いPNIPAM鎖の収縮によりその粒径が減少する一方、会合体同士がさらに凝集することはない。また、いったん昇温によりPTCDI部分のスタッキングが強くなると、降温過程でそれらが昇温時と同程度に解離することはなく、粒径・濁度・蛍光スペクトルにおいてヒステリシスが観測されると考えられた。有機溶媒中の希薄溶液からガラス基板上にキャストした乾燥試料を用いて単一分子分光を行ったところ、単一鎖中のPTCDI由来と思われる蛍光を観測することができた。しかし、その試料に温水を滴下したところ、輝点が不明瞭となり、蛍光が観測できなかった。これは、水温が曇点以上であっても、分子鎖が基板から剥離してしまった、もしくは、何らかの原因で消光が起こりやすくなったためと考えられる。光機能高分子「研究の成果」欄に記載したように、一本鎖あたり1個の蛍光性部位を含む新たな温度応答性高分子を合成し、その水溶液の温度応答性および各温度での吸収・蛍光スペクトルを測定した。またその希薄溶液をキャストした基板上における乾燥状態での単一分子からの蛍光観測に成功した。しかし、計画書に記載した1本鎖の相転移ダイナミクスの観測にはまだ成功していない。この計画の遅れの理由は、昨年度に合成した高分子が期待通りの性質を示さなかったために分子設計をやり直したことが主な原因である。「研究の成果」欄に記載したように、一本鎖あたり1個の蛍光性部位を含む温度応答性高分子の合成に成功したものの、希薄水溶液中でも会合し一本鎖とならないことがわかったため、試料を変更して合成をやり直すこととなった。そのため当初計画よりも研究の進行に遅れが生じることとなった。しかし、現時点で新たな重合開始剤の合成および精製を終えており、計画の遅れはそれほど大きいとはいえない。現在、高分子鎖末端の基板への固定化を試みていると同時に、基板上に固定化しない系を用いて降温過程中の単一鎖の相転移ダイナミクスの観測に挑戦中である。具体的には、ガラス基板上に高分子鎖をごく希薄な濃度でキャストもしくはその片末端を固定化し、水中・温度制御下での単一分子分光を行う。その際の偏光度の時間変化を測定することにより、温度応答性高分子一本鎖の相転移ダイナミクスに関する知見を初めて得る予定である。「研究の成果」欄に記載したように、温度応答性高分子としてPNIPAMを用いることにして、その重合開始剤の合成・精製を終えている。今後、原子移動ラジカル重合により一本鎖あたり1個の蛍光性部位を含むPNIPAMを合成し、濁度測定などの基礎データを得た上で、当初計画通り温度制御下において単一分子分光に挑戦する予定である。具体的には、ガラス基板上に高分子鎖の片末端をごく希薄な濃度で固定化し、水中・温度制御下での単一分子分光を行う。
タンパク質のS-ニトロソ化修飾を介する植物機能制御の解明

タンパク質システイン残基の活性窒素種による部位特異的S-ニトロソ化修飾は,多様なタンパク質を標的としてその機能調節を担う翻訳後レドックス修飾である。本研究では,活性窒素の1種であるS-ニトロソチオール(RSNO)の代謝を司るS-ニトロソグルタチオン還元酵素(GSNOR)を,この翻訳後修飾の主要な制御因子と位置づけ,(1)植物タンパク質のS-ニトロソ化におけるにおけるRSNO代謝の重要性と,(2)RSNO代謝の鍵酵素であるGSNORによる植物代謝機能,特に窒素同化機能の制御に関して調査した。(1)硝酸などの無機窒素栄養や二酸化窒素・NO供与薬剤などの活性窒素を与えることにより・シロイヌナズナではRSNO含量が著しく増大することを明らかにした。これらのRSNOの多くは高分子量画分に回収されることから,その実体はS-ニトロソ化タンパク質と推定された。そこでビオチンスィッチ法を適用し,シロイヌナズナにおけるRSNOレベルとS-ニトロソ化タンパク質レベルの変動の相関を調査した。NO供与薬剤処理により,野生株ではS-ニトロソ化タンパク質レベルが上昇するが,GSNOR過剰発現株では,その上昇が有意に抑制されることを明らかにした。これらの結果から,主要なRSNOの実体の1つはS-ニトロソ化タンパク質であること,ならびにGSNORがタンパク質のS-ニトソロ化修飾に重要な役割を果たしていることが支持された。(2)重要な植物代謝機能である窒素同化の制御におけるS-ニトロソ化修飾の関与について調査し,窒素栄養状態に依存してタンパク質のS-ニトロソ化レベルが変動すること,また窒素飢餓からの回復過程において,窒素源として硝酸或は二酸化窒素を与えた場合,いずれの場合もGSNORの過剰発現がこれらの無機窒素栄養(が吸収と向化を有意に促進することを見出した。これらの結果は,GSNORに制御されたS-ニトロソ化修飾が窒素代謝機能調節に関与していることを示唆するとともに,GSNORが窒素同化能向上の分子育種の標的となる可能性も示している。S-ニトロソグルタチオン還元酵素(GSNOR)は申請者が植物から初めて同定し,新規な生体生理活性物質であるS-ニトロソ化合物の代謝を司る鍵酵素と推定されている。GSNORの活性を遺伝子工学的に改変した形質転換シロイヌナズナを用い,本酵素と新規な翻訳後機能調節メカニズムである蛋白質S-ニトロソ化修飾との生理的関連などを中心に調査し,今年度は以下の点を明らかにした。(1)硝酸などの無機窒素処理や二酸化窒素・NO供与薬剤などの活性窒素処理により,シロイヌナズナではS-ニトソロ化合物含量が著しく増大することを明らかにした。これらのS-ニトソロ化合物の大半は高分子量画分に回収されることから,その実体はS-ニトロソ化蛋白質と推定された。(2)ビオチンスイッチ法を適用し,シロイヌナズナにおけるS-ニトソロ化合物レベルとS-ニトロソ化蛋白質レベルの変動の相関を調査した。その結果,NO供与薬剤処理により,野生株ではS-ニトロソ化蛋白質レベルが上昇するが,GSNOR過剰発現株では野生株で観察されたその上昇は有意に抑制されることが明らかとなった。この結果から,S-ニトソロチオールの実体がS-ニトロソ化蛋白質であることのみならず,GSNORが蛋白質のS-ニトソロ化修飾に重要な役割を果たしていることが支持された。