hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水中微小気泡内放電による水質環境の改善

(1)2枚のディフユーザを用いた泡部領域での活性種の生成と水処理:波長領域300-335nmのOHラジカルからの発光測定を酸素、Arおよび空気を用いて測定した。水は精製水を用いた。OHラジカルからの放射光強度は充電電圧の増大と共に大きくなった。H_2O_2の最大濃度40mg/l(酸素)および35mg/l(空気)が得られた。この場合のガス流量は51/minで、電圧14.5KVで放電処理時間は10分である。インジゴ法で測定した水中溶存オゾン濃度は最大で0.13mg/lであった。(2)水中微小気泡内放電による活性種の生成と水処理:水中気泡内放電で生じたオゾンのうち、水面上に排出されたガス(酸素)中のオゾン濃度は最大で約6.4g/Nm^3であった。一方、水中オゾン濃度は約0.3mg/lであった。発光分光法によりOHラジカルの生成を確認し、印加電圧の増加とともにOHラジカルも比例的に増加した。青色を呈するインジゴカルミン水溶液が本方式により脱色することが確かめられた。(3)分解物質(酢酸)水溶液の放電処理:本方式により酢酸水溶液の放電処理を行ったが、その効果は確認できなかった。このため、新たに気層-液層界面放電方式を用いて処理を行ったところ、酢酸の処理が可能であることが確かめられた。水は精製水を用いた。互いに平行に設置された2板のディフューザを用い,それらの下部から空気(または酸素ガス)を供給し,それらの中間部から水を流し,上部ディフューザ領域に泡部を生成する.生成された泡部には電極対が設置されており,ブルームラインを用いて発生させた高電圧パルスを印加して,泡部でオゾン,OHラジカル,H_2O_2などを生成し,これらを水処理用として用いる.ブルームラインの充電電圧が11-12kVになると泡中での放電が目視で観測できるが,それ以下では困難であった.泡中の放電の様子はICCDカメラで観測された.泡中の放電により生じるオゾン(ガス)は充電電圧とともに増加し,最大オゾン濃度220ppm(空気)及び600ppm(酸素ガス)が得られた.オゾン(ガス)濃度は泡中での放電状態(一様か否か)に大いに依存する.アーク状放電になるとオゾン(ガス)濃度は減少する.一方,インジゴ法で測定した水中の溶存オゾン濃度は,最大で0.13mg/dm^3であり,充電電圧(13-15kV)とともに増加した.放電による処理時間を3,5,10及び15分とした場合,溶存オゾン濃度はごく少ししか増大しなかった.例えば,3分と15分を比べると14kV充電時でその差は0.02mg/dm^3であった.次に300-335nm領域のOHの発光を酸素,アルゴン及び空気を用いて測定した.水は精製水を用いた.また,OHラジカルからの放射光強度は充電電圧の増大とともに大きくなった.更に,H_2O_2の最大濃度40mg/dm^3(酸素)及び35mg/dm^3(空気)が得られた.この場合のガス流量は5dm^3/minで充電電圧は14.5kVで放電処理時間は10分である.本研究は、水中に発生させた微小気泡(約1mmの径)内にパルスパワー発生技術により生じた高電圧パルスを印加して放電を発生させることにより、オゾン、酸素原子、H_2O_2およびOHラジカルなどの活性ラジカルを発生することから始まる。更に、これらの活性ラジカルを用いて上水、下水などの水処理に利用し、その可能性を調べることである。その結果、次のことが明らかとなった。(1)原料ガスに酸素を用いて、精製水中の実験において、気泡内放電により生成したオゾンのうち、水槽から排出されたガス中のオゾン濃度は最大で約6.42g/Nm^3であった。

一方、水中オゾン濃度は約0.3mg/lであった。(2)発光分光法によりOHラジカルの生成を確認し、電源部充電電圧の増加とともにOHラジカルも比例的に増加した。(3)H_2O_2濃度は放電継続時間を増加すると比例的に増加した。(4)青色を呈するインジゴカルミン水溶液が本方式により脱色することが確かめられた。本研究の最終目的は,水中気泡内放電方式を用いて難分解性物質の除去を行うことである.本研究では,水中微小気泡内放電の基礎的研究と,水処理への応用に関する研究を行った.得られた結果は次の通りである.(1)水中気泡内放電発生の確認とその基礎的特性を調べた.また,溶存オゾンおよび水面上に排出されたオゾン濃度(約6.42g/Nm^3)を測定した.(2)微小気泡内放電により,OHラジカルの発生を発光分光法により確認した.(3)インディゴカルミン水溶液を用いた脱色実験を行い,脱色が可能であることを確認した.しかしながら,酢酸水溶液の放電処理を行ったが,その効果は確認できなかった.このため,新たに気層-液層界面放電方式を用いて処理を行ったところ,酢酸の処理が可能であることが確かめられた.
デトネーション応用による簡素かつ高比推力な超小型衛星用ロケットエンジンの実現

本研究では,素早い燃焼完結性を有するデトネーション燃焼をロケットエンジンに取り入れることで,ロケットエンジンの性能を低下させること無くそのサイズを小型化することを狙っている.デトネーションを利用して小型ロケットエンジンを実現させる際には,大きな熱負荷密度に対応する熱設計の実現がキー技術となる.これを達成すべく,新たに構築する光学的な計測システム(火炎を透過して,燃焼器の温度変化を高い時間精度で計測するシステム)による熱流束同定を試み,デトネーションロケットエンジンにおける熱特性の解明を目指す.本研究では,素早い燃焼完結性を有するデトネーション燃焼をロケットエンジンに取り入れることで,ロケットエンジンの性能を低下させること無くそのサイズを小型化することを狙っている.デトネーションを利用して小型ロケットエンジンを実現させる際には,大きな熱負荷密度に対応する熱設計の実現がキー技術となる.これを達成すべく,新たに構築する光学的な計測システム(火炎を透過して,燃焼器の温度変化を高い時間精度で計測するシステム)による熱流束同定を試み,デトネーションロケットエンジンにおける熱特性の解明を目指す.
老人斑アミロイド蛋白質の免疫生化学的研究

アルツハイマー病(AD)脳よりこの病変に関連すると思われる不溶性蛋白質の分離精製、ならびに生化学的検策を試みた。1.不溶性蛋白の可溶化条件の検討(1)90%ギ酸抽出脳より生理食塩水、コラゲナーゼ処理、1%SDS処理により可溶画分を完全に除去した試料を、90%ギ酸中で4°C24時間保ち、その後15000rpmで可溶画分を分離した。この処理で約15%が可溶化された。不溶性画分はさらにCNBnで酸化解裂を行い可溶化を試みた。この処理では約60%が可溶化された。それぞれの画分の蛋白成分を、SDS-disc電気泳動で分析したところ、前者からは高分子成分以外に約5Kの成分が得られ、また後者からは、高分子成分以外に70K,55K,30K,20K成分が得られた。(2)エチレンジアミン水酸化第二銅抽出6%エチレンジアミン水酸化第二銅(EDCU),pH13.5溶液で、不溶画分を4時間処理し、沈心上清を蒸留水に透析したのち凍結乾燥した。SDS-disc電気泳動で検策したところ、高分子成分子成分の他に、70-40K領域および5K成分が認められた。抽出効率は良好であった。2.可溶画分の精製およびアミノ酸分析ギ酸およびEDCU可溶画分を8M尿素溶液中でHPLCを行ったところ、電気泳動パターンと類似の画分が得られた。(1)で分画されたそれぞれの画分をさらに高度に精製するため、HPLCを利用した。ギ酸可溶画分からは7種類の、またEDCUPK【II】からは4種の成分が得られた。アミノ酸分析の結果いづれの画分も、酸性アミノ酸およびグリシン、バリン、ロイシン含量が高かった。
早期喫煙暴露とＣＯＰＤ患者における頸動脈内膜中膜複合体肥厚度の関係

頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)を用いて、動脈硬化による血管壁の肥厚を測定し、心血管イベントの発症リスクと早期喫煙暴露の関係を調べた。結果、COPDを合併した患者群では、非合併群よりも動脈硬化の状態が進行していた。特にCOPDにおける早期喫煙暴露群でIMT値の有意な上昇を認めた。本成績は、早期喫煙暴露はCOPD患者の中でも動脈硬化性変化を一段と助長し、脳血管障害のみでなく、心血管イベント発症の危険とも相関し、COPDにおけるこれらの合併症の発症リスクを高めることに繋がることが示唆された。今後、IMTの計測を行うことで、COPDにおける併存症・合併症の予測因子になることが考えられる。2011年度から全国的に喫煙率が高いとされる北海道えりも町にて早期喫煙暴露の影響に対し疫学的調査研究を実施した。昨年度の研究で得られた結果では、早期喫煙暴露と慢性呼吸器疾患の関係では、早期喫煙暴露歴(20歳未満の習慣的喫煙)を有し喫煙年数が多いほどCOPD罹患率は上昇傾向を示すことが示唆された。今年度は、頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)を用いた動脈硬化による血管イベントの発症リスクを、早期喫煙暴露歴を有するCOPD単独患者群と他の疾患を合併するCOPD患者群(糖尿病・脂質異常症・高血圧症等)に分け比較した。結果として喫煙暴露歴が大きく合併症を伴うことでIMTの肥厚傾向がみられ、血管内皮障害の進行が大きいことが示唆された。以下、方法・結果等に関し示す。COPD単独の患者群をG1(男性28人、女性14人)(70.3 ±8.7歳)、糖尿病・高血圧症・脂質異常症等の合併症を持つCOPD患者群をG2(男性23人、女性7人)(72.8 ±9.8歳)とし、説明と同意の下、データ解析を行った。【結果】G1:G2 IMT±SD (1.36±0.63:1.46±0.98,p=0.07)、合併症・併存症を有するCOPD群ではIMTは上昇傾向を示した。【結論】Systemiceffectsによる併存症が内在するCOPDに加え、動脈硬化に関連する合併症を持つ患者ではIMTの上昇傾向を認めた。これらの結果から、日常診療でのIMTの測定はCOPD患者での心血管イベントの予測因子に繋がる可能性が示唆された。【考察】各々の群では、COPDの他、糖尿病、脂質異常症、高血圧といった、血管系に影響を及ぼす疾患の合併が含まれるが、早期喫煙暴露はIMTの肥厚の一つの重要な因子になる可能性が示唆された。様々な健康被害を及ぼす喫煙が、糖尿病等の生活習慣病に合併することでIMTの変化へ大きな影響があることを示すことは禁煙活動へのさらなる啓発につながり、国民的な健康増進に寄与するものと考えられる。早期喫煙暴露とCOPD患者における頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)の関係について研究を実施中である。現在、IMTを用いて、動脈硬化による血管壁の肥厚を測定し、併存症や合併症として重要な脳梗塞や心筋梗塞など心血管イベントの発症リスクと早期喫煙暴露の関係を比較検討している。研究方法としては、えりも町診療所に通院する患者のうち説明と同意(IC)がとれた152人(72±10歳SD)の患者を対象として、以下の3つの群に分けて解析を実施している。A群;早期喫煙暴露歴を有するCOPD患者群:41人(68±9平均年齢±SD),B群;早期暴露歴を有さないCOPD患者群:80人(71±11),C群; COPDを有しない他の患者群:31人(69±10)。各々の群間で、動脈硬化の指標としてのIMTを比較し有意差検定を行い、早期喫煙暴露の影響との相関関係を調べる。現段階で得られているデータ集計の結果では、IMT:A群1.34±0.12mm、B群1.23±0.13mm、C群1.12±0.16mmで、COPD患者群では、COPDを有しない他の患者群よりもIMTの値が高く、動脈硬化の状態がより進行していると考えられる。特にCOPDにおける早期喫煙暴露群においてIMT値の上昇傾向が認められている。以上の結果から、現段階での本成績は、早期喫煙暴露はCOPD患者の中でも動脈硬化性変化を一段と助長し、脳血管障害(脳梗塞・脳出血)のみでなく、心血管イベント(狭心症・心筋梗塞)発症の危険性とも相関し、COPDにおけるこれらの合併症の発症リスクを高めることに繋がることが示唆される。

以上より、今後さらなる疾病予防のためには、喫煙暴露の影響とCOPDという疾患への理解を広く社会全体に啓発し、禁煙の重要性を理解してもらう契機に繋がるものと考えられる。本研究の主な目的としては、早期喫煙暴露とCOPD患者における頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)の関係についてデータ解析を実施し、IMTの値から、動脈硬化の程度を、COPD群と他の疾患群に分けて検討し、さらに早期喫煙暴露の影響がある群と無い群との比較を行い、早期喫煙暴露の影響を明確にすることである。現時点で、これらのデータはある程度集計ができており、今あるデータの解析はほぼ終了している。統計処理の結果では、早期喫煙暴露歴があるCOPD群と、早期喫煙暴露歴が無い群との比較では、有意差はつかなかった。しかし、早期喫煙暴露歴があるCOPD群と、他の疾患群との比較では有意差を認めた。現在の登録患者数では、統計上の検定に際しての問題があり、今後、さらに患者数を多くし、禁煙をしたあとの状況や、早期喫煙暴露歴があっても、成人後禁煙した場合と、喫煙を継続した場合の動脈硬化の程度の比較を加えていきたい。また、繰り返してのIMT計測を実施し、相関関係を調べていくことで、より精度の高い比較に繋がり、COPD自体の血管障害の進行度合いと、さらに早期喫煙暴露の影響が、どの程度動脈硬化を助長し合併症との因果関係に繋がるかを検討していく予定である。今後の研究推進方策としては、さらに登録患者数を増やし、より多くの患者データを盛り込むことで、より精度の高いデータとして行きたい。また、COPD患者群の中でも、禁煙をした場合、IMTの経過でどのような変化が起こるかについての追跡検査を実施していくことを検討している。早期喫煙暴露歴があっても、成人後に禁煙した場合と、喫煙を継続した場合の動脈硬化の程度の比較を加えていきたい。繰り返してのIMT計測実施は、それらの群間での相関関係を調べていく中で、より精度の高い比較に繋がり、COPD自体の血管障害の進行度合いと、さらに早期喫煙暴露の影響が、どの程度動脈硬化を助長し合併症との因果関係に繋がるかの解析に寄与するものと考えられ、今後これらの検討を加えて行く予定である。他の疾患群における内訳では、高血圧(39%)、糖尿病(23%)、脂質異常症(10%)が主なものであった。しかし、これらの患者では、基本的に投薬治療を受けており、コントロールの良い患者群と、必ずしもコントロールが安定していない群が存在している。これらの検査データから、それらの疾患の状態を層別化して行き、COPDのある・なしでの群との比較を行う計画である。COPD群でも、他の疾患の合併がある群と無い群では、血管内皮に与える障害の影響も異なると考えられる。これらのことを念頭に置いた詳細なデータ解析が必要と考えられる。該当なし
発達障害院生の主体性は発達するか：主体性発現・発達プロセスの支援モデル構築

本研究は、大学院生の発達障害傾向、適応感及び学生相談への援助志向性の実態を把握し、要支援群に対してグループ居場所支援を縦断的に行い、主体性なき主体といわれる発達障害院生の主体性が発現し、発達するプロセスを明らかにすることを目的とした。最終年度となる今年度は、これまでの実践を継続し、研究結果を総合的に検討することで、関係性理論に基づく大学生の心理的支援モデルを考案した。大学院生に対する縦断調査では、発達障害院生の1年目、2年目と同様、主にASDとAD/HDに関する支援ニーズが一定して高いことが認められた。とりわけ、研究科ごとに、ASDとAD/HDの特徴や困り感、及び、支援ニーズが異なっていたことから、研究科の特徴に応じたきめの細かい支援方法が必要であることが明らかとなった。また、発達障害傾向の高い大学院生に対する個別心理面接を行った結果、彼らの大学適応感や援助志向性が低い傾向にあることが示唆された。次に、グループ居場所支援では、ボードゲームなどを用いたグループ活動と、研究室の中へカウンセラーが入ってコミュニケーションをはかるグループ活動に2つを展開させ、その過程を関係性理論の観点から分析した。前者では、ゲームの勝敗にこだわった体験が主体性の発現に貢献し、自らボードゲームを製作するなど、彼らなりの主体的な行動が生起する場合も認められた。後者では、カウンセラーとの情緒的なコミュニケーション体験が院生の主体性向上を促進していた。高学歴の発達障害院生の場合、児童期における同性との遊び体験が少ないことが示唆され、青年期において児童期を再体験することが彼らの主体性の発現を促している可能性が示唆された。これらの内容を関連学会および専門雑誌に発表し、情緒的な対人関係から彼らが主体性を伸ばしていく過程を明らかにし、今後の大学における学生支援のあり方について考察した。本年度は、3カ年計画の1年目である。発達障害院生に関する文献を収集し、文献研究をおこなった。主体性の発現は可能であるが、発達の速度は緩やかであることが推察された。大学院生への質問紙調査では、1年生を対象とし、質問項目には、1AQ(The Autism-Spectrum Quotient:自閉症スペクトラム指数)2ASD・ADHD統合版困り感尺度(高橋,2012)3大学生用適応感尺度(大久保・青柳,2003)4学生相談・学生相談機関に対する4項目を採択した。調査は、本学ポータルサイトを通じて2016年度末に実施した。結果の分析は次年度に実施する。次年度に実施予定であった、個別心理面接と、グループ居場所支援を、試行的に実施した。個別心理面接では、発達障害傾向にある28名の学部生と大学院生を対象として、405回実施した。グループ居場所支援では、週1回、ボードゲームやテレビゲームなどを用いて、グループ活動を展開させた。対象者は、研究代表者と研究分担者が個別支援を実施している大学院生と学部生の中から協力を得られた者とした。実施回数は40回で、延べ121名が参加した。また、協力の得られた研究室において、所属院生を対象とした継続的なグループ居場所支援も、並行しながら、試行的に実施した。実施回数は37回で、延べ117名が参加した。関係性原理と、対象者の自己表現の促進との関連性については、今後の研究による更なる検討が必要である。ロンドン大学スチューデント・サイコロジカル・サービスの所長と副所長と、発達障害院生に関するシンポジウムを開催し、日本人の事例について、ディスカッションを行った。今年度は、文献研究を十分に行うことができた。また、次年度に実施予定であった個別面接支援とグループ居場所支援を試行的に展開させることができた。その一方で、大学院1年生を対象とした質問紙調査は、実施時期が年度末になったために、データの分析を次年度に実施することとなった。研究1「横断的調査研究」を実施し、現在、分析をしている。研究2では「要支援群に対する横断的実践研究」として、「要支援群」の大学院生に対して、(1)個別心理面接支援と(2)グループ居場所支援を実施した。(1)個別心理面接支援では、安全感と安心感を礎としながら,支援者は発達障害院生との間で対人交流や相互作用を促進した。これは第6回精神分析的心理療法フォーラムにおいて発表した。また、ある研究室を対象として、カウンセラーがカウンセリングルームに滞在し、個別心理面接をベースとした自由な会話を軸に、対人交流をうながした。その結果、主体性の向上と個別心理面接機能の有効性が検証された。これは、名古屋大学地域貢献事業シンポジウム「苦戦する青年を育てる」において発表された。(2)グループ居場所支援では、「要支援群」を対象としたグループ活動を実施した。具体的には、毎週、ボードゲームを介したグループ活動を行なった。対象者の自己表現を促し、発達障害院生の主体性の発達を促した。主体性の尺度や情緒的な尺度においては、有意な変化は認められなかったが、彼らの行動には顕著な変容・進化が認められた。これは、第51回全国学生相談研究会議、ならびに、名古屋大学地域貢献事業シンポジウム「苦戦する青年を育てる」において発表した。計画通り、そして、仮設通りに発達障害院生への支援が実践できており、その意味でもおおむね研究は順調に進んでいるといえる。

本研究は、大学院生の発達障害傾向、適応感及び学生相談への援助志向性の実態を把握し、要支援群に対してグループ居場所支援を縦断的に行い、主体性なき主体といわれる発達障害院生の主体性が発現し、発達するプロセスを明らかにすることを目的とした。最終年度となる今年度は、これまでの実践を継続し、研究結果を総合的に検討することで、関係性理論に基づく大学生の心理的支援モデルを考案した。大学院生に対する縦断調査では、発達障害院生の1年目、2年目と同様、主にASDとAD/HDに関する支援ニーズが一定して高いことが認められた。とりわけ、研究科ごとに、ASDとAD/HDの特徴や困り感、及び、支援ニーズが異なっていたことから、研究科の特徴に応じたきめの細かい支援方法が必要であることが明らかとなった。また、発達障害傾向の高い大学院生に対する個別心理面接を行った結果、彼らの大学適応感や援助志向性が低い傾向にあることが示唆された。次に、グループ居場所支援では、ボードゲームなどを用いたグループ活動と、研究室の中へカウンセラーが入ってコミュニケーションをはかるグループ活動に2つを展開させ、その過程を関係性理論の観点から分析した。前者では、ゲームの勝敗にこだわった体験が主体性の発現に貢献し、自らボードゲームを製作するなど、彼らなりの主体的な行動が生起する場合も認められた。後者では、カウンセラーとの情緒的なコミュニケーション体験が院生の主体性向上を促進していた。高学歴の発達障害院生の場合、児童期における同性との遊び体験が少ないことが示唆され、青年期において児童期を再体験することが彼らの主体性の発現を促している可能性が示唆された。これらの内容を関連学会および専門雑誌に発表し、情緒的な対人関係から彼らが主体性を伸ばしていく過程を明らかにし、今後の大学における学生支援のあり方について考察した。今後の方向性として、質問紙調査の結果分析を行いながら、大学院1年生への質問紙調査を実施する。また、研究2の「個別面接支援」と「グループ居場所支援」を予定通り、実施する。平成29年度に引き続き、研究1「横断的調査研究」と研究2「要支援群に対する縦断的実践研究」を実施する。そして、研究3「関係性原理に基づいた支援モデル構築に関する研究」を実施する。研究1、研究2により明らかとなった発達障害院生の主体性の発達プロセスを実践的に検証し、「関係性原理に基づいた支援アプローチ」の実践的有用性と妥当性を検討していく。そして、支援モデルを提唱する。研究分担者に実施してもらう研究が、次年度に実施となったため、その分担金が繰越となった主な理由としては、学会開催地が近隣大学であったため、旅費の使用額が想定していたよりも少額となったこと、グループ活動に使用していたボードゲームの金額が想定よりも少額で対応できたことがあげられる。次年度は、国際学会での発表や、米国の大学との共同研究を実施することで、翌年度分として請求した助成金と合わせて使用する計画である。個別支援(研究2)と、モデル構築(研究3)において、使用予定である
シナプス特異結合の分子機構:ショウジョウバエをモデル系とした解析

本研究は、ショウジョウバェの神経系(主に神経筋結合系)をモデル材料として、神経回路形成のメカニズムを探ることを目的とした。このため異所発現トラップ法を用い、生体における軸策伸長への影響を直接指標にし、新規の軸策誘導分子を探索することを試みた。約500株について筋肉全体での異所発現を誘導し、運動神経軸索誘導における異常を検索した。その結果、運動神経軸策の伸張、シナプス形成に異常を起こすものを7系統単離することに成功した。これらについて、原因遺伝子を同定するため、トラップ株において強制発現され表現型を引き起こしている転写産物の候補をRT・PCR法によって回収し、末端配列を決定した。得られた塩基配列をgenebank検索にかけることにより、これらが既知の遺伝子への挿入であるのか、あるいは新規の遺伝子であるのかを決定した。また新規の遺伝子についてその正常発生過程における発現パターン等を調べることにより、神経軸索誘導への関与の可能性について検討した。以上のような解析により、軸索誘導に関連した新規の膜蛋白質1092および3011を同定することに成功した。1092はまったく新しいタイプの膜蛋白質(Forked endと名付けた)をコードし、中枢、末梢において1部の細胞において発現している。その筋肉全体における異所発現および機能欠失が特定の運動神経時軸索の投射パターンに異常を生じることから、新規の軸索ガイド分子であることが示唆された。また3011はセマフォリンドメインをもつ膜蛋白質(Scma5c)をコードし、その転写産物は末梢において特定の領域において発現する。その筋肉における異所発現が特定の運動神経のシナプス形成を阻害することから、反発性の軸索ガイド分子として働くことが示唆された。本研究は比較的構成が単純で、遺伝学的アプローチが可能なショウジョウバエの神経系(主に神経-筋結合系)をモデル材料として、神経回路形成のメカニズムを探ることを目的とする。特に標的細胞の認識過程およびシナプス形成の初期過程に関連した機能分子の同定をめざす。このため最近開発された異所発現トラップ法を用い、新たな機能分子を同定することを試みた。GAL4は酵母由来の転写因子で標的DNA配列UASに結合し下流遺伝子の転写を活性化する。異所発現トラップ法は、トランスポゾンP因子を用いUAS配列をゲノムの様々な遺伝子領域に挿入した“標的株"を多数作製し、GAL4を特定のパターンで発現する“パターン株"に掛け合わせることにより、“標的"近傍遺伝子を異所発現させる遺伝学的スクリーニングである。本研究においては“パターン株"としてGAL4をすべての筋肉において発現するものを利用し“標的"遺伝子を筋肉全体で強制発現させ、その運動神経シナプス形成過程への影響を免疫組織化学的に調べた。この方法により、本来は特定の神経や筋肉に発現し、標的特異性を決定しており、その異所発現がシナプス結合の特異性を変化させるような分子を単離できると予想した。1000株についてスクリーニングを行った結果、神経結合のパターンに特異的な変化をもたらすものが約15株単離された。これらについて強制発現されている原因遺伝子をRT-PCR法により回収し末端配列を決定したところ、新規の遺伝子に加え、これまでに神経-筋標的認識に関与することが示されているcapricious、netrinB、fasciclinIIなどが同定された。以上の結果は、この実験系の有効性を示している。現在さらに大規模なスクリーニングを進めるとともに、単離された新規の遺伝子について全長配列や発現パターンの決定等より詳細な解析を進めている。本研究は、ショウジョウバエの神経系(主に神経-筋結合系)をモデル材料として、神経回路形成のメカニズムを探ることを目的とする。

昨年度計画において、異所発現トラップ法を用い、筋肉全体での異所発現が標的認識の特異性を変化させるような新規遺伝子をいくつか同定した。本年度はこれらについて正常発生過程における機能を推定するため、まず転写産物の発現様式を調べた。その結果2つ(系統名1092、1085)について神経系内の特定の細胞において発現することが判明した。このことはこれら遺伝子が、神経結合の特異性生成に関与することを強く示唆する。さらにタンパク質の1次構造の情報を得るためcDNAの単離を試み、1092について全長cDNAを得た。シークエンスを決定した結果、1092遺伝子は新規の膜タンパク質をコードすることが判明した。以上の構造、発現、異所発現の効果の解析結果は1092が新しいタイプの軸索誘導分子であることを強く示唆している。現在、遺伝子機能欠損株の作製等により1092遺伝子の機能についてのより詳細な機能解析を行っている。以上のように異所発現トラップ法により、現在までに新たな軸索誘導分子の候補を1つ同定することに成功した。今後1085等の他の株についても同様の解析を進めることにより、特異的シナプス形成過程に関わる新規分子をさらに同定できると期待している。本研究は、ショウジョウバエの神経系(主に神経-筋結合系)をモデル材料として、神経回路形成のメカニズムを探ることを目的とする。特に標的細胞の認識過程およびシナプス形成の初期過程に関連した機能分子の同定をめざす。昨年度計画において、異所発現トラップ法を用い、新規軸索ガイド分子の候補として1092系統を同定した。1092系統を筋肉全体において発現すると、筋肉12を支配するはずの運動神経が近傍の筋肉13にもシナプスを形成するという表現系を幼虫において示す。遺伝子クローニングの結果から1092系統近傍に存在する原因遺伝子の候補として、新規の膜タンパク質をコードするものを同定した。またこの転写産物は中枢神経内および末梢において一部の細胞において特異的に発現していた。今年度は本遺伝子が1092系統において見られた表現系の原因遺伝子であることを確かめるため、cDNAをUASの下流につないだコンストラクトをショウジョウバエ個体に導入し、24BGAL4株に掛け合わせ同じ表現系が見られるかを調べた。その結果確かにこの遺伝子が観察された表現系を生じていたことが確認された。また本遺伝子の機能欠失株を作製しその表現系を調べた。その結果筋肉12を支配する運動神経の走行に異常が見られた。以上の構造、発現、機能解析の結果は本遺伝子が神経-筋特異結合に関わる新規軸索誘導分子をコードすることを強く示唆している。特に軸索伸長過程やシナプス形成の初期過程に関連した軸索ガイド分子の同定をめざす。昨年度までの計画において、異所発現トラップ法を用い、新規軸索ガイド分子の候補として3011系統を同定した。
複素力学系の分岐によるパラメータ空間の構造の研究とその可視化

反正則二次多項式族におけるMandelbrot集合の対応物はtricornと呼ばれる。この族における双曲パラメータ集合の連結成分(双曲成分)で周期が奇数のものは、計算機で描いた絵を見ると、多くはデコレーションが重なり合って集積しており、tricornの外からは到達不可能であるように見える。実際双曲成分の周期が高くなればなる程、その双曲成分の近傍でのtricornの補集合はどんどん「細く」なる。従って十分周期が高い場合には、到達可能であるものは非常に例外的であろうと考えられる。これに関する部分的な結果も既に得られており、現在より強いことを示すべく研究を進めているところであるが、一方で、Chebyshev多項式に収束するある奇数周期の双曲成分の族を考えると、十分Chebyshev多項式に近いものは全て到達可能であることを示すことができた。これはtricornの双曲成分の近傍の位相的性質が様々であることを示す新しい性質であり、複素力学系の複素2次元以上のパラメータ空間の複雑さを示す新しい例であると捉えることができる。また、複素2次元のフラクタル集合の可視化については、現在バーチャルリアリティ(VR)用のゲームやアプリの開発に広く用いられているゲームエンジンUnityの上で開発している。Pcxという、Unity上で3次元の点群を表示するためのアセットを拡張して、4次元の点群のデータを扱えるようにした。これによって様々な4次元空間内の対象を容易に可視化し、両眼視差や運動視差などを用いた様々な表示方法や操作方法を実装して試すことができるようになった。宇敷重廣氏らによるHenon写像のJulia集合を近似的に計算するプログラムも移植し、リアルタイムに計算して表示ができるようになった。4次元可視化のためのVRアプリの開発は、ゲームエンジンのUnityの利用によって、これまでのOpenGLとC++で基礎的なことから実装していた時に比べるとずっと容易になり、本質的な部分に集中して開発ができるようになった。これによって4次元の物体を両眼視差や運動視差などを用いてどのように可視化するか、またどのようにすれば直感的な操作が可能になるか、そういった部分の開発・実装を大きくスピードアップできると考えている。フラクタルのような複雑な対象を、構造を理解する為に必要な部分を適切に計算し可視化することは未だ困難であるが、表現方法・操作方法が改善することで、何をどのように可視化するべきかということに対する理解にもつながると考えている。反正則二次多項式族(tricorn)の奇数周期の双曲成分の到達不可能性に関しては、現在までのところ、特別な種類の族に対して、しかも境界を構成する3つの滑らなか曲線のうち、1つのみが到達不可能である、という非常に限られた結果しか得られていない。しかしながら、今回の到達可能性の証明を到達不可能性について適用できれば、双曲成分全体が到達不可能であるという結果が比較的弱い条件の下で示すことができ、この意味で将来性のある結果だと考えている。またくりこみ可能なパラメータの具体的な構成についてもいくつか新しいアイディアがあり、それらの詳細を詰めていくことで、新しい結果が示せると考えている。反正則二次多項式族(tricorn)の到達不可能な双曲成分の存在を示す。今回の到達可能性の議論では、双曲成分の収束先であるMisiurewiczなパラメータのJulia集合が十分「複雑」であれば、双曲成分の到達不可能性が示される。その「複雑」さを厳密に定式化し、それを満たすパラメータの存在を示す。Mandelbrot集合の自己相似性はよく知られている。自己相似を与える写像はstraighteningと呼ばれ、この逆写像はtuningと呼ばれる。tuningを具体的に構成することは、高次多項式のstraighteningの全射性を調べる上で重要であるが、一般的な構成は知られていない。この一般的な構成法をまず二次多項式に対して与える。高次の多項式に対しても、Riemann写像と擬等角変形に関する技術的な問題が解決することによって一般化できると考えている。重要な未解決問題であるMandelbrot集合の局所連結性予想は、もし正しければ小Mandelbrot集合たちの減少列の共通部分が常に1点になることを意味している。これが三次多項式では成り立たないことを示す。より正確には、このような共通部分は、与えられた組み合わせで無限回くりこみ可能なパラメータ集合に一致しているので、このようなパラメータが複数存在する組み合わせが存在することを、擬等角手術によって具体的に構成して極限を取ることで示す。VRによる可視化については、より洗練された表示・操作方法について検討する。特にMukherjee氏とのMisiurewiczなパラメータによる近似に関する結果や、中根-Roeschのstretching rayに関する結果は複素2次元のパラメータ空間の構造に関するものであり、それをVRを用いて目で見て理解できるように表現したい。

これに関する部分的な結果も既に得られており、現在より強いことを示すべく研究を進めているところであるが、一方で、Chebyshev多項式に収束するある奇数周期の双曲成分の族を考えると、十分Chebyshev多項式に近いものは全て到達可能であることを示すことができた。これはtricornの双曲成分の近傍の位相的性質が様々であることを示す新しい性質であり、複素力学系の複素2次元以上のパラメータ空間の複雑さを示す新しい例であると捉えることができる。また、複素2次元のフラクタル集合の可視化については、現在バーチャルリアリティ(VR)用のゲームやアプリの開発に広く用いられているゲームエンジンUnityの上で開発している。Pcxという、Unity上で3次元の点群を表示するためのアセットを拡張して、4次元の点群のデータを扱えるようにした。これによって様々な4次元空間内の対象を容易に可視化し、両眼視差や運動視差などを用いた様々な表示方法や操作方法を実装して試すことができるようになった。宇敷重廣氏らによるHenon写像のJulia集合を近似的に計算するプログラムも移植し、リアルタイムに計算して表示ができるようになった。4次元可視化のためのVRアプリの開発は、ゲームエンジンのUnityの利用によって、これまでのOpenGLとC++で基礎的なことから実装していた時に比べるとずっと容易になり、本質的な部分に集中して開発ができるようになった。これによって4次元の物体を両眼視差や運動視差などを用いてどのように可視化するか、またどのようにすれば直感的な操作が可能になるか、そういった部分の開発・実装を大きくスピードアップできると考えている。フラクタルのような複雑な対象を、構造を理解する為に必要な部分を適切に計算し可視化することは未だ困難であるが、表現方法・操作方法が改善することで、何をどのように可視化するべきかということに対する理解にもつながると考えている。反正則二次多項式族(tricorn)の奇数周期の双曲成分の到達不可能性に関しては、現在までのところ、特別な種類の族に対して、しかも境界を構成する3つの滑らなか曲線のうち、1つのみが到達不可能である、という非常に限られた結果しか得られていない。しかしながら、今回の到達可能性の証明を到達不可能性について適用できれば、双曲成分全体が到達不可能であるという結果が比較的弱い条件の下で示すことができ、この意味で将来性のある結果だと考えている。またくりこみ可能なパラメータの具体的な構成についてもいくつか新しいアイディアがあり、それらの詳細を詰めていくことで、新しい結果が示せると考えている。反正則二次多項式族(tricorn)の到達不可能な双曲成分の存在を示す。今回の到達可能性の議論では、双曲成分の収束先であるMisiurewiczなパラメータのJulia集合が十分「複雑」であれば、双曲成分の到達不可能性が示される。その「複雑」さを厳密に定式化し、それを満たすパラメータの存在を示す。Mandelbrot集合の自己相似性はよく知られている。自己相似を与える写像はstraighteningと呼ばれ、この逆写像はtuningと呼ばれる。
悪性星細胞腫細胞株におけるPI3K/Akt生存シグナル経路の抑制に関する研究

本研究の目的の概略は、PI3K/Akt経路阻害剤によるin vitroでの悪性グリオーマ細胞に対する細胞増殖抑制効果、抗癌剤との併用効果などを検討することにより、同腫瘍罹患患者の化学療法において抗癌剤の作用を効果的に増強すると期待されるPI3K/Akt経路阻害剤を探求することである。H17年度の研究実施計画の概要は以下のようであった。1.ヒト悪性グリオーマ細胞におけるPI3K/Akt経路への阻害作用を有する薬剤による細胞増殖抑制効果、アポトーシス誘導効果を検討する。2.作用機序の異なる種々の抗癌剤がもたらす細胞増殖抑制効果のPI3K/Akt阻害剤による増強を検討する。3.各種抗癌剤が誘導するアポトーシスのPI3K/Akt阻害剤による増強を検討する。1について、申請者らはFTY720の入手申請を当該製薬会社に行ったが未だ薬剤を得られていない。このため入手可能であったAkt阻害剤であるAkt inhibitor、Akt inhibitor II、PI3K阻害剤LY294002、LY294002の類似物質でPI3K阻害作用をほとんど示さないLY303511、RhoキナーゼおよびPKC阻害作用を有し、くも膜下出血後の血管攣縮治療薬として人体に使用されているFasudilなどの薬剤を用い、培養ヒトグリオブラストーマ細胞株LN229に対する増殖抑制効果をWSTアッセイにより検討した。これら薬剤はLN229の増殖を濃度依存性に抑制し、IC_<50>値はそれぞれ15.3±2.9μM、46.7±7.2μM、17.3±9.3μM、65.8±15.8μM、56±8.9μMであった。2について、Akt inhibitorによりシスプラチン、エトポシドの細胞増殖抑制効県は増強された。他の組合せについては実験中であり、また3についても検討中で未だ結果を得られていない。
新しい一分子分光によるDNA鎖の構造変換機構の研究

生命はDNA、RNA、タンパク質などの働きによって司られている。これら生体高分子は一般に複雑な構造を持つが、常温で多くの異なる構造を取ることが可能で、生命の分子過程においては多彩な構造変化を起こしている。理研では新しい一分子分光法である二次元蛍光寿命相関分光法(2D-FLCS)を開発し、このような生命活動で本質的な役割を果たしている生体高分子の構造揺らぎを、マイクロ秒の時間分解能で計測可能にした。本研究ではこれをさらに発展させ、マイクロ秒の分解能で生体分子の構造ダイナミクスを秒まで追跡可能とし、また反応途中に現れる中間状態の構造揺らぎの観測を実現する。
IADLにおける微かな行動の淀みの工学的モデル化：MCIの早期発見技術への応用

本研究では,神経心理学領域の専門家を加えた研究体制を構築し,(1)MEの発生条件,(2)時系列のセグメンテーション基準,(3)セグメントレベルでのMEとタスク困難度との関連性を説明する3つのモデルを開発し,MEの工学的モデル化を実現することを目的としている.本年度は、MEの発生条件に関する研究を行った.具体的には、形や色の違いがMEの発生確率に与える影響と操作性困難度との関係について調査を行った.本研究では、カラータスクとシェイプタスクという二つの実験タスクを設計し実験を行った.これらのタスクは、先行研究で開発した料理の準備タスクを簡略化し、リーチングと選択という動作に限定したタスクである.実験は健常な大学生に協力してもらい、認知負荷をかけた状態と認知負荷をかけていない状態の2条件で行った.また、タスクの手続きとしては、注視点を注視した後、1つのターゲットオブジェクトと複数のディストラクタオブジェクトがランダムに画面に表示され、できるだけ早くターゲットオブジェクトをタッチするという試行を200試行行った。実験の結果,ターゲット刺激の周辺にディストラクタオブジェクトを複数配置した時、ターゲットのオブジェクトの色や形に近いディストラクタオブジェクトでMEが多く発生することが分かった.また、MEは、操作性の困難度が高くなるにつれてその発生確率が高くなることが分かった。本年度は、予定通りMEの発生条件に関する知見についてまとめることができた。次年度は、本年度に計測したデータをもとにMEの時系列のセグメンテーション基準について議論を進める予定である。予定していた研究打ち合わせなどが都合によりキャンセルされ、次年度に持ち越しとなったため
歯周病原菌が産生するタンパク質分解酵素ジンジパインによる骨吸収メカニズムの解明

Porphyromonas gingivalisは、破骨細胞による歯槽骨破壊を特徴とする歯周病の主要な病原細菌である。本菌が産生するシステインプロテアーゼであるジンジパインは、その切断部位から、Lys特異的ジンジパイン(Kgp)とArg特異的ジンジパイン(Rgps)に分類される。本研究では、破骨細胞分化に対するジンジパインの効果を解析した。マウス骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養での活性型ビタミンDによる破骨細胞分化をKgpは促進した。すなわち、Kgp存在下では、生理的濃度(0.1 nM)の活性型ビタミンDによって、薬理学的濃度(10 nM)の活性型ビタミンDに匹敵する破骨細胞分化が誘導された。一方、RgpBにはその作用は認められなかった。Kgpは、LPSをはじめとする種々のTLRリガンドによる破骨細胞分化も強く促進した。Kgp存在下に形成された破骨細胞は骨吸収活性を有していた。血清存在下に、KgpはOPGを分解したが、RgpBはOPG分解活性を示さなかった。Kgpによる破骨細胞分化促進効果は、OPGの分解と相関しており、Kgpのプロテアーゼ活性を阻害することで消失した。Kgpによる破骨細胞分化促進作用は、過剰のOPG添加により減弱した。さらに、OPG欠損マウス由来骨芽細胞を用いた共存培養系では、Kgpによる破骨細胞分化促進は認められなかった。以上より、Kgpは、破骨細胞分化の抑制因子であるOPGを分解することで、破骨細胞分化を促進することが示唆された。歯周病に伴う歯槽骨吸収における歯周病原菌Porphyromonas gingivalisの役割を明らかにすることを目的として研究を行っている。我々は、同菌が産生するタンパク分解酵素gingipainsが生理的な骨吸収因子である活性型vitamin Dによる破骨細胞分化誘導を強力に促進することを発見した。そこで本年度は、細菌リポ多糖を始めとする各種菌体成分による破骨細胞分化誘導におけるgingipainsの役割を解析した。その結果、gingipainsの中でも、特にLysine特異的gingipain(Kgp)が大腸菌LPS、P. gingivalis LPS、CpG DNA、peptidoglycan、poly(I:C)RNAなどの各種Toll様受容体(TLR)リガンドによる破骨細胞分化誘導を強力に促進することを発見した。このことは、各種細菌が混合感染している歯周病に伴う歯槽骨破壊にKgpが重要な役割を果たしていることを示唆する。さらに、Kgpの破骨細胞分化促進作用が、骨芽細胞が産生する破骨細胞分化抑制因子であるosteoprotegerin (OPG)の分解に依存していることをOPG遺伝子欠損マウスの骨芽細胞を用いて証明した。これらの活性は、血清α_2-macroglobulinによって阻害されるArginine特異的gingipain (Rgp)には認められなかった。さらに、各種TLRリガンド等の刺激で誘導される炎症性サイトカインによる破骨細胞分化誘導に対するKgpおよびRgpの効果を解析したところ、KgpはIL-1βおよびTNFαによる破骨細胞分化を強力に促進することが明らかとなった。一方、IL-17による破骨細胞分化誘導に対しては、Kgpによる促進は認められなかった。これらのサイトカインによるKgpの作用の違いは、Kgpによる分解に対するサイトカインの抵抗性の違いを反映していることが示唆された。一方、Rgpは炎症性サイトカインによる破骨細胞分化にまったく影響を及ぼさなかった。以上の結果は、Kgpが歯周病性歯槽骨破壊予防を目指す上で重要を標的となることを示唆している。歯周病に伴う歯槽骨破壊における歯周病原細菌Porphyromonas gingivalisの役割を明らかにすることを目的として研究を行っている。

我々のこれまでの研究から、同菌が産生する主要なプロテアーゼであるジンジパインの中でも、リシン特異的ジンジパイン(Kgp)が、骨芽細胞が産生する破骨細胞分化阻害因子であるosteoprotegerin(OPG)を速やかに分解することで、各種Toll様受容体(TLR)リガンドによる破骨細胞分化を強力に促進することを見出した。このことは、各種細菌に混合感染の場としての歯周病巣付近の骨破壊にKgpが重要な役割を果たすことを示唆している。TLRリガンドの一種であるLPSとKgpをマウス頭蓋骨膜下に投与したところ、LPS単独投与に比較して強い骨吸収と破骨細胞形成が観察されたことから、Kgpは、in vivoでも重要な骨破壊因子であることが確認された。また、歯周病において産生が亢進する各種炎症性サイトカインによる破骨細胞分化に対するKgpの効果をin vitroで解析したところ、それぞれのサイトカインとOPGのKgpに対する相対的な分解性により、Kgpの効果は破骨細胞分化促進あるいは抑制の二面性を示すことが示唆された。以上の結果から、TLRリガンド、カルシウム調節ホルモン、炎症性サイトカインによる破骨細胞分化に対するKgpの効果の大きな部分は、KgpによるOPG分解によってもたらされることが示唆されたことから、KgpによるOPGの分解部位を解析した。その結果、Kgpは、OPGのRANKL結合領域ではなく、さらにC末側を最初の標的として切断することが示唆された。これによりOPGは二量体形成ができず、RANKL結合能を失ったと考えられる。以上より、KgpによるOPG切断部位に変異を導入した組換えOPGは、歯周病性歯槽骨破壊の予防あるいは進行阻害に有効な薬剤になる可能性が考えられた。歯周病はPorphyromonas gingivalis等の歯周病原菌感染により発症する慢性炎症で、歯槽骨の吸収を伴う。P. gingivalisが産生するタンパク分解酵素ジンジパインは、歯周病の病態形成に重要な役割を演じることが知られている。ジンジパインは基質分解部位から、Arg特異的ジンジパイン(Rgp)とLys特異的ジンジパイン(Kgp)に分類される。我々は、Kgpが破骨細胞分化阻害因子OPGを分解することでLPSその他のTLRリガンドによる破骨細胞分化誘導を促進する一方、Rgpにはその活性がないことを明らかにした。そこで、P. gingivalisのRgp欠損株、Kgp欠損株および野生株をマウスの頭部皮下に感染させ、頭蓋骨における破骨細胞形成を観察したところ、野生株で見られた破骨細胞形成に比べ、Kgp欠損株感染での破骨細胞分化は抑制されていたが、Rgp欠損株は野生株と同程度の破骨細胞形成を誘導したことから、骨吸収におけるKgpの重要性が確認できた。KgpによるOPGの優先的な分解部位がデスドメイン様領域であることが示唆されたことから、LysをAlaに置換した多種類の変異OPGを調製し、Kgpによる分解を調べたところ、野生型OPGとの有意な差が見出せなかった。このことから、KgpはOPGのデスドメイン様領域の複数のLysのC末側を同程度に分解するものと思われる。KgpによるOPGの分解と破骨細胞分化誘導性の炎症性サイトカインの分解を定量的に比較したところ、OPGより安定なTNF-αやIL-1βでは破骨細胞分化がKgpによって促進されたのに対し、OPGより分解されやすいIL-
遺伝子置換法を用いた新しいアデノウィルスベクター作製法の開発

本研究により以下の成果が得られた。1)Creによる遺伝子置換反応を応用してアデノウイルスベクターの作製を行うために、Creの本来の標的配列であるloxPとは独立に認識される変異型loxPの検索を行い、効率・特異性ともに高い変異型loxPとしてVを同定した。またin vitro法を用いてloxPとVの遺伝子置換効率を調べた結果、約10%と非常に高い効率であることを示した。2)第1世代アデノウイルスベクターの作製のためのrecipientウィルスは、ウィルスパッケージングシグナル(Ψ)の両側をloxPで挟み、Creの欠失導入によりΨが切り出せるように設計した。Ψと目的遺伝子をloxPとVで挟んだ目的遺伝子用プラスミドとrecipientウイルスをCre発現293細胞へ導入し、得られた粗ウイルス溶液をCre発現293細胞で5回継代を繰り返したところ、遺伝子置換反応により目的遺伝子を発現するアデノウイルスベクターが生成した。3)粗ウィルス溶液を293細胞を用いて限界希釈を行うことで簡便に目的ウィルスのみを単離する事が可能であった。4)ウィルス遺伝子のほぼ全長を目的遺伝子と置換したguttedベクターを構築するため、ヘルパーウイルスとしても機能するrecipientアデノウイルスを作製した。またguttedベクター用コスミドカセットは、目的遺伝子やstufferには大きな遺伝子の挿入を行うため、クローニングサイトとして8塩基認識の平滑末端切断の酵素を選択し計4種類構築した。現行のアデノウイルスベクターでは、ウイルスゲノムから微量に発現するウイルス蛋白に対する免疫源性が指摘され、また7kbという限られたクローニングサイズのためヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターの作製が急がれてきた。しかしウイルス蛋白は非常に細胞毒性が高く、また多くのヘルパーウイルスの混入からヘルパー依存型でのウイルスベクターの作製は困難であった。近年部位特異的組換え酵素であるCreを用いてウイルスパッケージングシグナル(Ψ)を除去する方法が編み出され、このベクター(guttedベクター)作製法が試み始められているが、ベクター増殖に必須な293細胞が非常に増殖がゆっくりでCre発現細胞株の樹立化が困難であること、またCreが何らかの細胞への影響を持つため強力なプロモーターから直接Creを発現する細胞株の樹立化が不可能であること等問題点が指摘されていた。我々はまず293細胞の特徴を鑑み薬剤耐性株をクローニングすることなく実験に供する事が可能であるmultiple cloning cosmid (mulcos)を応用してCre発現293細胞株の作製を試みた。SV40early pormoterからCreを発現する発現単位を16個有するmulcosを作製しCre発現293細胞プールの作製を行った。その結果この細胞プールでは細胞内で1万コピーまで増殖するアデノウイルスベクターの約4割のΨの切り出しに成功した。そこで現在はより強力なSRαプロモーターを用いて検討を始めている。来年度はmulcosを用いて8割以上のパッケージングシグナルを切り出す事が可能な293細胞株を作製するとともに、Creによる「遺伝子置換反応」を応用した全く新しいアデノウイルスベクター作製法を確立する。現在「遺伝子置換反応」に必要なプラスミド、ゴスミドの作製は完了している。Creによる遺伝子置換反応を応用した新しいアデノウイルスベクターの作製法を確立するために、まずE1欠失型アデノウイルスベクター(第1世代)の作製を行い、次いでウイルスゲノムの大半を目的遺伝子と置換したヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクター(guttedベクター)作製のためのrecipientウイルス及びコスミドカセットの構築を行った。第1世代アデノウイルスベクターの作製のためのrecipientウイルスは、ウイルスパッケージングシグナル(Ψ)の両側をCreの標的配列loxPで挟み、Creの欠失導入によりΨが切り出されるように設計した。その下流にLacZあるいはFLP発現単位と野生型loxP(V)を挿入した。

またこの粗ウイルス溶液を293細胞を用いて限界希釈を行うことで簡便に目的ウイルスのみを単離する事も可能であった。次にguttedベクターを構築するためのヘルパーウイルスとしても機能するrecipientアデノウイルスを作製した。このrecipientウイルスは第1世代ベクター用とほぼ同じ構造をしているが、Vはウイルスゲノムの右端に挿入されている。またguttedベクター用コスミドカセットはΨと目的遺伝子発現単位クローニングサイト、stufferクローニングサイトをloxPとVで挟んでいる。目的遺伝子やstufferには大きな遺伝子の挿入を行うため、クローニングサイトとして8塩基認識の平滑末端切断の酵素を選択し計4種類構築した。現在guttedベクターの生成を試みている。