hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉緑体光合成遺伝子発現制御シグマ因子をコードする核遺伝子の発現調節機構

葉緑体における光合成遺伝子の転写を司る細菌型RNAポリメラーゼは,そのコアを構成するα,β,β',およびβ"サブユニットが葉緑体(プラスチド)ゲノムにコードされており,転写される遺伝子のプロモーターを認識していると考えられるシグマ(σ)因子が核ゲノムにコードされている.本研究者らは,シロイヌナズナを用い,3種類のσ^<70>因子ホモログの遺伝子(SIG)のcDNAおよび核ゲノム遺伝子をクローニングし,これらSIG遺伝子産物の葉緑体局在および緑葉組織特異的発現を見いだした[Isono et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:14948-14953].すなわち,核にコードされるSIGの発現により葉緑体光合成遺伝子発現が制御されていると考えられる.SIG産物の機能を解明するとともに,SIGの転写制御機構を解明した.SIG遺伝子をCaMV35Sプロモーターの制御下に置いたコンストラクトを作製し,これらをタバコ従属栄養培養細胞BY-2およびシロイヌナズナに導入した.BY-2および暗順応シロイヌナズナ葉においては,内在性SIGの遺伝子発現が低下している.これらの系において,各σ因子を強制発現させ,その際の内在性葉緑体遺伝子および外来性改変葉緑体遺伝子プロモーター制御下のβ-glucuronidase(GUS)遺伝子(uidA)の発現をモニターした.各σ因子を強制発現させたタバコ培養細胞BY-2および暗順応シロイヌナズナにおける葉緑体光合成遺伝子psbA(光化学系II反応中心D1タンパク質遺伝子),psbD(光化学系II反応中心D2タンパク質遺伝子),およびrbcL[リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Rubisco)Lサブユニット遺伝子]の発現を調べたところ,BY-2において,全てのSIG遺伝子は,psbA,psbD,およびrbcLの発現を促進したが,その程度は各SIGにより異なっていた.これらの結果から,高等植物シロイヌナズナのσ^<70>因子ホモログはσ因子として機能している.一方,細菌のσ^<70>因子と異なり,多様なプロモーター特異性を持っていることが明らかとなった.現在,各σ因子のプロモーター特異性についてさらに詳しく検討している.葉緑体における光合成遺伝子の転写を司る細菌型RNAポリメラーゼは,そのコアを構成するα,β,β',およびβ"サブユニットが葉緑体(プラスチド)ゲノムにコードされており,転写される遺伝子のプロモーターを認識していると考えられるシグマ(σ)因子が核ゲノムにコードされている.本研究者らは,シロイヌナズナを用い,3種類のσ^<70>因子ホモログの遺伝子(SIG)のcDNAおよび核ゲノム遺伝子をクローニングし,これらSIG遺伝子産物の葉緑体局在および緑葉組織特異的発現を見いだした[Isono et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:14948-14953].すなわち,核にコードされるSIGの発現により葉緑体光合成遺伝子発現が制御されていると考えられる.SIG産物の機能を解明するとともに,SIGの転写制御機構を解明した.SIG遺伝子をCaMV35Sプロモーターの制御下に置いたコンストラクトを作製し,これらをタバコ従属栄養培養細胞BY-2およびシロイヌナズナに導入した.BY-2および暗順応シロイヌナズナ葉においては,内在性SIGの遺伝子発現が低下している.これらの系において,各σ因子を強制発現させ,その際の内在性葉緑体遺伝子および外来性改変葉緑体遺伝子プロモーター制御下のβ-glucuronidase(GUS)遺伝子(uidA)の発現をモニターした.各σ因子を強制発現させたタバコ培養細胞BY-2および暗順応シロイヌナズナにおける葉緑体光合成遺伝子psbA(光化学系II反応中心D1タンパク質遺伝子),psbD(光化学系II反応中心D2タンパク質遺伝子),およびrbcL[リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Rubisco)Lサブユニット遺伝子]の発現を調べたところ,BY-2において,全てのSIG遺伝子は,psbA,psbD,およびrbcLの発現を促進したが,その程度は各SIGにより異なっていた.これらの結果から,高等植物シロイヌナズナのσ^<70>因子ホモログはσ因子として機能している.一方,細菌のσ^<70>因子と異なり,多様なプロモーター特異性を持っていることが明らかとなった.現在,各σ因子のプロモーター特異性についてさらに詳しく検討している.
ブリユアン光散乱法による薄膜及びフィルムの非破壊・非接触評価に関する研究

本研究プロジェクトの目的は、非破壊・非接触計測による高分子膜・フィルムや金属・半導体薄膜の弾性測定手法の確立である。測定手法としてはブリユアン光散乱法を使用する。この手法は、材料中のフォノンの音波伝搬特性から極めて薄い試料の弾性的性質を知るものであり、3桁以上の精度で各種のパラメータ下における計測が可能である。しかし、これまでのブリユアン光散乱は物性計測に用いられ、非破壊評価法ではなかった。これは、弱い散乱光強度や、測定系の動作安定性などに問題点があるためである。そこで本プロジェクトでは、主にμm厚の汎用高分子フィルムや次世代半導体基板であるSiC薄膜を測定対象に、以下の研究を行った。まず、高分子フィルムの評価では、各方向に伝搬する音波速度から、弾性的性質を測定する手法を提案した。特に応力を負荷時のフィルムの超延伸過程の連続測定に成功し、また音速と屈折率の測定が可能であることを見出した。その結果、試料の弾性的異方性と光学的異方性の同時測定を実現した。また、μmオーダーの厚さの高分子接着層中の音速の非破壊・非接触測定に成功し、接着層にせん断応力が負荷された場合、接着層の破壊過程における音速変化が測定可能であることを示した。ヘテロ構造のSiCのnm薄膜の非破壊・非接触評価では、分光器の動作の安定化と光学系の工夫により、薄膜のせん断弾性が膜状を伝搬する変形レイリー波の測定を実現した。測定結果より、SiCの結晶構造が、レイリー波速度に影響することを示し、nm厚さの薄膜でも、音速はバルクと同様な傾向を示すことを確認した。また、マグネトロンスパッタで作製された一方向面内配向ZnO薄膜の弾性異方性をブリユアン光散乱法で測定し、X線回折結果と一致して大きな弾性異方性が確認できた。このように、これまで不可能であった薄膜・フイルムの非破壊・非接触弾性計測としてのブリユアン光散乱法を確立した。金属薄膜表面からのブリユアン表面凹凸散乱を測定できるように散乱光集光用の光学系を改良した。とくに表面測定用に入射光の精密な軸合わせ機能を検討し、シリコン基板上を伝搬するレイリー波のブリユアン光散乱の測定ができるようになった。散乱光のフォトンカウンティング部分についても、微弱な信号を効率良く測定するためカウンティング時間の調節を行い、適切な測定時間を決定した。改良された光学系を用いて、分子イオンビーム法でシリコン基板上にヘテロエピタキシャル堆積されたSiC薄膜試料(膜厚、数nm^-十数nm)上を伝搬する変形レイリー波の測定に成功した。RHEED測定より推定される構造の異なる2試料(立方晶系、正方晶系)の変形レイリー波音速が異なることを確認し、特に正方晶系の薄膜では音速が明確に低下することを確認し、nmオーダーの薄膜でもバルク材料と同様なせん断弾性率の低下がみられることをはじめて指摘した。このような薄膜材料の弾性的性質は従来の機械的測定とくに硬さ測定では困難である。ブリユアン光散乱法を用いることで、相対的ではあるが弾性率変化を非接触・非破壊測定できることを示した。PE、PPなどの高分子フィルム(膜厚50μm)のブリユアン散乱測定を行い、散乱光測定の精度を向上するため、サンプル支持部の光学窓の改良を行った。

また、透過型の90A散乱配置が可能で、常温か300°Cまで測定可能な温度制御装置を試作設計した。制御装置内の温度分布を測定すると共に、温度安定度が0.1°C程度となるよう、制御プログラムを設計・改良した。前年度に確立したnmオーダーの金属薄膜(不透明)中の超高周波音速の測定手法をさらに拡張するため、本年度はZnOなどの透明薄膜中の音速測定手法について検討した。薄膜に反射用アルミ膜を付加し、RIΘA散乱配置の利用と光学系の改良により、数μm程度の膜厚をもつ透明高分子フィルム試料の音速測定に成功した。また音速の伝搬方向を入射光角度により調節し、膜の弾性的異方性の測定が可能となった。次に透明な試料として次世代横波用超音波センサとして期待されるZnO一方向面内配向膜をマグネトロンスパッタリングにより作成し、弾性的異方性を測定したところ、X線回折の測定結果と一致する大きな音速異方性が確認された。この音速異方性を単結晶薄膜の文献値と比較検討し、試料の結晶性について検討した。種々のパラメータ下におけるブリュアン散乱測定として、数十μm程度の膜厚の結晶性高分子フィルム(ポリプロピレン、ポリエチレンなど)に応力を付加し、応力効果によるフィルムの異方性発現を音速測定により確認した。また、入射光の偏光を変えるとともに、後方散乱と90A散乱の二種類の散乱の同時測定手法を開発し、フィルムの光学的異方性の連続測定に成功した。その結果を試料の応力-ひずみ関係と比較検討し、応力付加によりフィルムの複屈折が生じるプロセスを明らかにした。ブリュアン光散乱法の工学的応用の一例として、μmオーダーのエポキシ樹脂接着層の測定を行った。接着層の温度を外部ヒーターで制御し、接着層にせん断方向の応力を付加しながら音速を連続測定した。その結果、応力の効果は測定温度によって大きく変化した。測定温度が接着層樹脂のガラス転移温度より低い場合は、応力により樹脂に微小クラックが生じ、マクロな音速は低下した。ガラス転移温度より高い場合は、ゴム状態の樹脂がずり変形し、高分子鎖の配向が生じて音速が増大した。
文科系学生向け経営工学学習プログラムの構築～知識と実践の結合を目指して～

本研究の目的は,利益率の低い企業を想定して,経営工学の主テーマである生産管理や原価管理,作業研究を文科系学生にも体験できる教育プログラムを構築する.特徴としては,理工系の実験のように,学生間でチーム制を組み,学生が持っている知識を管理者側が理解し,それを引き出す仕組みである.そして,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って手を動かしながら企業の実態を疑似体験させる.このような実験実習を通じて知識と実践の結合を目指す.本研究では,利益率の低い企業を想定して,経営工学の主テーマである生産管理や原価管理,作業研究を文科系学生にも体験できる教育プログラムを構築する.特徴としては,理工系の実験のように,学生間でチーム制を組み,学生が持っている知識を申請者側が理解し,それを引き出す仕組みである.そして,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って手を動かしながら企業の実態を疑似体験させる.本研究は3年計画の2年目が終了した.平成24年度では,「知識」を如何に企業現場・現状と関連付け,そして「手を動かしながら」学ばす仕組みを作るかが目標となる.授業での導入を目指すので,半期15週を3ステップに分けて,効率的に学ばせる方法を検討してきた.また,簡易版ではあるが支援システムを構築し,実際に学生に演習させることができた.ここから学生には検討する時間を長くでき,それが効率的学習につながることができた.より具体的には,平成24年度では,23年度に明確にした「知識」を如何に企業現場・現状と関連付け,それを「手を動かしながら」学ばす仕組みを作るかということが主としてきた.授業での導入を目指すので,3ステップに分けて,支援システムを利用しながら効率的に学ばすことを考えた.第1ステップ(5週分)は「問題点抽出ー改善案提案」として,原価低減,作業改善案を提案した.第2ステップ(5週分)では「改善案の実施」として,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って,工程分析,作業分析,時間研究も行った.第3ステップが25年度に実施する予定である.ここまでの成果は,25年度に学会発表や国際会議に報告する予定である.本研究では,利益率の低い企業を想定して,経営工学の主テーマである生産管理や原価管理,作業研究を文科系学生にも体験できる教育プログラムを構築する.特徴としては,理工系の実験のように,学生間でチーム制を組み,学生が持っている知識を申請者側が理解し,それを引き出す仕組みである.そして,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って手を動かしながら企業の実態を疑似体験させる.本年度は3年計画の最終年度であった.平成24年度では,「知識」を如何に企業現場・現状と関連付け,そして「手を動かしながら」学ばす仕組みを構築することができ,仮ではあったが実際の授業で導入してみた.最終年度である平成25年度では,「知識の結合」の仕組み検討と教育プログラムのと本格実施,そしてプログラムの有効性の検証が目的であったが,授業での実施はすることができた.ただし,システム的な課題は未だ存在するので,今後精緻化を図っていきたい.また,3年間の成果を,国際会議および英文論文誌に発表することができた.本研究の目的は,利益率の低い企業を想定して,経営工学の主テーマである生産管理や原価管理,作業研究を文科系学生にも体験できる教育プログラムを構築する.特徴としては,理工系の実験のように,学生間でチーム制を組み,学生が持っている知識を管理者側が理解し,それを引き出す仕組みである.そして,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って手を動かしながら企業の実態を疑似体験させる.このような実験実習を通じて知識と実践の結合を目指す.平成23年度の主な目的は「引き出す知識」の調査であった.申請者はまず授業やゼミを通じて学生に「経営学・会計学の知識がどの程度備わっているか」を,在校生約2,000人に「(1)学生知識習熟度調査」としてアンケート調査を行った.そこから見えてきたのは,当初の予測通り,経営学と会計の知識に関して,それぞれは十分備わっている学生がほとんどであったが,一方,その関係になると95%の学生は理解していないことがわかった.また,「(2)学習内容と企業・現場の関連調査」の一環として,共同研究先や企業協力者からもヒヤリングすることができ,新入社員も理解していないどころか,中堅社員も全員が理解していないということもわかった.また「社会人として必要な問題解決能力および知識」も国内・海外の企業約300社に対して,アンケート調査を行うことができた.このような調査から,本プログラムに必要な学習項目,また社会人として最低限必要な能力を明確にすることができたと思っている.来年度は「(3)教育プログラムの構築」の「知識の引き出し」部分に取り組んでいきた.平成24年度では,23年度に明確にした「知識」を如何に企業現場・現状と関連付け,それを「手を動かしながら」学ばす仕組みを作るかということが主とし,実際に体系化することができたと考えている.また,簡易版ではあるが,実際に授業で行うことができ,25年度に向けての課題ややることが明確になった.23年度の目的であるアンケート調査をすることもでき,またその集計も人件費を通じて終了することができた.このことから順調に進んでいる.特に,学生が学んでいる項目と社会で必要な能力との差異がわかったことは,教育者として有意義なものであった.費用支出も,アンケート費用,ヒヤリング出張費などで順調に利用できた.

平成25年度では,第3ステップ(4週分)の「知識の結合」の仕組み検討,システム完成,試験実施,本格実施とそれらの有効性の検証と成果発表が主となる.「知識の結合」の方法としては,シミュレーションを通じて,知識がどのような場面や活動で利用されるのかを復習できる仕組みにしたい.なぜならば,学生の頭の整理,かつ教員側が「学んで欲しかったこと,今後役立て欲しいこと」を伝えることができるからである.システム完成後に大学院生向けに試験実施を行いたい.これは,プログラムの問題点,不足点を明確にしたいからである.それらを改善後,25年度後期に,ゼミ学生30人を対象に本格実施する.授業本格導入後は,本プログラムの有効性と問題点を把握するためにアンケートを行いたいと考えている.現段階で検討している質問の概要としては,1学生が持つ知識と実践との関連が理解できたか,2改善活動が企業活動や財務活動に与える影響が理解できたか,3支援システムの利便性や視覚効果,などである.平成24年度では,23年度に明確にした「知識」を如何に企業現場・現状と関連付け,それを「手を動かしながら」学ばす仕組みを作るかということが主となる.授業での導入を目指すので,半期14週を3ステップに分けて,支援システムを利用しながら効率的に学ばすことを考えている.第1ステップ(5週分)は「問題点抽出ー改善案提案」として,原価低減,作業改善案を提案させる.工夫としては,それぞれの改善案の候補を検討する際,支援システムを通じて23年度に得られた学生の知識,社会人として今後必要な知識と改善案との関連が確認できる仕組みにする.また,以前構築した「経営学理論・手法学習シミュレータ」を再利用,簡易修正をすることで研究時間短縮も考えている.第2ステップ(5週分)は「改善案の実施」として,ミニベルトコンベアーと模型自動車を使って,工程分析,作業分析,時間研究も行いたいと思っている.それぞれの計算,計測および図表現は支援システムを通じて行えるようにする.そうすることで,学生の考える,検討する時間を長くし,効率的な学習につながると考えている.ここまでの成果も,学会発表や国際会議に報告する予定である.予算の計上項目としては,主に国内学会及び国際会議などへの成果発表である.それらに参加・発表し,学識者のみならず,企業研究者からも意見を頂き,研究及びシステムのさらなる精緻化をはかる予定である.平成24年度は,新実験を始めるための準備としてミニベルトコンベアーの購入を検討している.経営工学を取り扱う理工学部ならば実験部屋などがあるが,申請者の所属大学では,そのような場所がない.そのため小さいもので移動ができ,どこでも教育プログラムができるようしたいのでミニコンベアー購入を考えている.そして,可能ならば仮実施をしてしたいと思っている.そのために24年度に計上した.また,支援システムのプログラム(コード)開発は一部を大学院生に支援してもらう予定である.また,繰り越しに関して,プログラミングに関する書籍が4月以降に発刊されることから,それ相当額を繰り越した.研究計画の大幅な変更は生じていない.
福祉・介護サービス提供に係る医療・福祉職のあるべき業務分担・連携と介護保険の評価

本補助金による各医療・福祉施設等の視察・調査、及びそれらを基にした検討を通じて、介護保険の適用下におかれる施設入所サービスでは、ターミナル(終末期)にまで及ぶケアが求められざるを得ないにもかかわらず、施設類型・法定配置人員・介護報酬などの面で、従来の制度枠組みがそのまま維持されることから、とりわけ福祉施設における包括的介護サービスの提供に限界があることが明らかになった。一つには、こうした施設類型(療養型病床群、老人保健施設、特別養護老人ホーム)の枠組みを取り払い、医療職と福祉職を組み合わせた施設体系の一本を図るべきである(配置人員に一定の幅をもたせ、施設毎の裁量に委ね、特色を出させるとの対応はあり得る)。第二に、医療職(とりわけ看護職)と福祉職のうち、後者がなし得る業務の範囲を広げる(具体的には、ターミナルケアにあたり、酸素吸入装置の操作など最低限の処置を行うことを認める)ことが不可欠であり、そのためにも教育制度の高度化が必要である。少なくとも、介護福祉士の養成カリキュラムの強化や、現在の1級、2級、3級ヘルパー養成制度に代わる国家資格の導入が目指されるべきである。在宅サービスについては、ケアプランの作成にあたり、在宅サービス提供の中核となる介護支援専門員につき、実務に就くことを前提として、定期的研修義務の付加など、資質の向上を図るための試作の整備が不可欠である。なお、本研究と関連して、国立社会保障・人口問題研究所『季刊社会保障研究』36巻2号(2000年9月刊行)に「介護保険制度と利用者の権利擁護」と題する論文を掲載準備中である(未脱稿)。本年度は、良質のケアを提供していると一般に評価されており、ケアプランの作成等介護保険への積極的対応を行ってきた病院、老人保健施設、特別養護老人ホーム(関西近辺の施設のほか、研究代表者が以前住し研究活動の拠点であった北海道の施設を含む)などの医療・福祉施設を視察し、医療・福祉職の業務分担がどのようになっているのかを聞き取り調査した。とりわけ、医師が常駐せず、看護職の配置人員も少ない特別養護老人ホームにおいて、ターミナル(終末期)にまで至る包括的なケアを行おうとすればするほど、それが本来的に医療的要素を本来的に含まざるを得ないことから、医師法・保健婦助産婦看護婦法などの医事法制との抵触を生じかねない事態が存在することを認識することができた。在宅でも同様の問題は生じるものの、専門職たる介護職よりも家族介護が中心となるため、かえって医事法上の問題を生じる余地が少ないどの側面があるのではないかと考えた。介護保険に明しては、自治体訪問(大阪府四条畷市・兵庫県伊丹市)を行い、施行準備状況をヒアリングする等の活動を行った。2000年4月施行に向け、各自治体とも準備に追われているなかで、政省令等の遅れにより制度の細部が必ずしも明確になっていない面がある、しかしながら、施設サービスに関しては、施設類型・法定配置人員・保険給付金額などの面で、従前の医療・福祉サービスにおける体制に本質的な変更はなされないものと考えられる。介護保険法の施行状況自体が流動的であるため、本年度は実態調査等を中心に行ったが、これを踏まえて来年度は、次第に整えられるであろう介護保険の実施体制を踏まえて、本格的な理論的分析に入る予定である。
遺伝性蓄積性疾患の遺伝子組換えによる治療法の基礎的研究

本研究は、細胞内小器官(リンゾ-ム、ミトコンドリア、ペルオキシソ-ム)の形成、機能発現に異常を来す遺伝性代謝異常症について、将来的な遺伝子治療に対する基礎デ-タの集積を目的として、分子生物学的方法により病因病態の解析を行ったものである。以下に4年間での主な研究成績を述べる。(1)B-グルクロニダ-ゼ欠損症(ムコ多糖症VII型)の3症例について世界ではじめて病因となる遺伝子変異部位を発見し、酵素発現異常のメカニズムを考察した。(2)ミトコンドリア、B-ケトチオラ-ゼ欠損症の異常酵素について細胞内プロセッシングやmRNAレベルで解析し、その結果より病因病態が多様であることを論じた。さらにラットおよびヒトのB-ケトチオラ-ゼcDNAのクロ-ニングに成功した。本症の遺伝子解析を進める上で貴重な成果である。(3)Zclloveger症候群に代表されるペルオキシソ-ム欠損症は、臨床・病理像と分子生物学的特徴によって分類されていたが、さらに相補性解析により遺伝子上の異質性を検討した。それにより再分類の必要性を確認し、確立されつつある。また研究を進める中で、新しいペルオキシソ-ム病も発見した。細胞内小器官が関与する代謝異常症の遺伝子治療法の開発に当っては(1)目的とする酵素もしくは蛋白質が精製され、アミノ酸配列の一部が同定されているか、抗体が調製されていること。(2)cDNAがクロ-ニングされ、さらにgenopic DNAが解析されていること。(3)それぞれの疾患の病態が正確に分子レベルで解明されていることが必要条件である。本研究は上記の3点に的をしぼって進められたが、多くの成果を上げることができた。そして本研究の成果が治療法を検討する上で少なからず貢配するものと確信する。1)β-グルクロニダーゼのcDNAの調製okayama-Berg法の発現ベクターにラットの包皮腺poly【A^+】RNAより合成したcDNAを組み込み、ラットcDNAライブラリーを作製した。当初、抗β-グルクロニダーゼ抗体を用いてこのcDNAライブラリーのスクリーニングを行ったが陽性コロニーは得られなかった。そこでヒトβ-グルクロニダーゼcDNAはPvu【II】-Sst【I】切断端の196bpのみの塩基配列が報告されているので、その中の60塩基よりなるオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてラットcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性コロニーをピックアップした。陽性コロニーから得られたcDNAの制限酵素地図及びサンガー法による塩基配列決定にて、ラットβグルクロニダーゼcDNAのクローンを確認した。次にヒトβ-グルクロニダーゼcDNAを得るべくヒト胎盤由来のλgtll cDNAライブラリーをスクリーニングし、2個の陽性クローンを得た。その大きさは完全長のものではなかったが、それぞれ2.3kbと1.5kbであった。上記より現在までにラット及びヒトβ-グルクロニダーゼのcDNAを得、このクローンを利用して完全長の塩基配列を決定しつつ、患児の解析に利用し、また各種のシャトルベクターに取り込み、真核細胞内への導入について検討していく予定である。2)イズロネイトスルファターゼの精製及び抗体作製ヒト胎盤より硫安分画.Con-Aセファロースのバッチ法による分画を行ない、ファルマシア製FPLCシステムを用いて、イズロネイトスルファターゼの精製を行ない、DEAEクロマトにて2つのピークが得られ、それぞれ3000倍、1000倍まで精製されたが、SDS-PAGEで単一のバンドにはならなかった。そこでこの部分精製した酵素蛋白を用いてマウスに免疫して、単クローン抗体を作製する予定である。

1).SVー40ori^-の複製開始点を欠失したウィルスDNAをトランスフェクトして, T抗原が発現し,増殖能の高まった患者由来の培養皮膚線維芽細胞を作製した.SVー40ori^-DNAをリン酸・カルシウム法にて患者由来培養由来培養皮膚線維芽細胞にトランスフェクトすることによりトランスフォームした線維芽細胞を得た.この細胞からタンパクを抽出し,抗T抗原単クローン抗体を用いて,ウェスタン・ブロッティングを行ない,この細胞にT抗原が発現していることを確認した.またトランスフェクトの前後にてもライソゾーム酵素活性に変化がないことを示した.2).ゴーシェ病の欠損酵素であるβーグルコシダーゼのcDNAをSVー40のエンハンサー領域を持ったシャトルベクターpSVLに組み込み, 1)にてトランスフォームしたゴーシェ病患者由来の培養皮膚線維芽細胞にDEAEーdextran法にてトランスフェクトした.72時間培養後ハーベストし, DNA,total RNA,poly(A)^+RNA,酵素タンパク試料を得た.トランスフェクトした細胞から得られたDNA,poly(A)^+RNAは,ドット・ブロッティング,サザン・ブロッティング,ノザン・ブロッティングのいずれにおいても高い発現をみた.またβーグルコシダーゼ活性は,トランスフェクトした細胞は,トランスフェクトしなかった細胞に比べて約5倍の活性増加を認めた.3).同様の手技にて,ムコ多糖症VII型(βーグルクロニダーゼ欠損症)の欠損酵素であるβーグルクロニダーゼのcDNAを上記のシャトルベクターpSVLに組み込み, 1)にてトランスフォームしたムコ多糖症VII型の患者由来の培養皮膚線維芽細胞にトランスフェクトしたところ,トランスフェクトしなかった細胞に比べて約30倍の酵素活性の増加を確認することができた.1.βーグルクロニダーゼ欠損症の遺伝子解析(1)本症4例の培養皮膚線維芽細胞よりpolyA^+RNAを抽出・精製し、ヒトβーグルクロニダーゼcDNA(PHUGP13)をプローブとして1ザンブロッティングを行なったところ、サイズ・量ともに正常対照と差を認めなかった。このことより患児のcDNAに大きな欠失は無いものと考えられる。(2)本症4例の白血球または培養皮膚線維芽細胞よりDNAを分離し、上記cDNA断片をプローブとしてサザンブロッティングを行ないRFLPを検討したが、患児、保因者診断に有用な制限酵素は見出されなかった。(3)本症1例の培養皮膚線維芽細胞より抽出精製したpolyA^+RNAを用いてλgt10をベクターとして、患児のcDNAライブラリーを調製した。ここでcDNAを合成する際にヒト正常βーグルクロニダーゼcDNA上の3カ所の塩基配列より得たオリゴマーをプライマーに使用し、患児βーグルクロニダーゼのcDNAを増幅合成させることを試みた。この患児cDNAライブラリーより正常ヒトcDNA断片をプローブとしてスクリーニングを行なったところ、21個のポジティブクローンを得ることができた。現在このクローンについて塩基配列を決定し、変異部位を検討中である。
小学校英語の必要性意識に関する日本・タイ比較研究

日本とタイの英語教育は,母語の使用,文法中心など多くの共通点を有するが,小学校への英語導入については制度面や政策面で大きな違いがある。本研究は,タイでの現地調査をもとに,小学校英語に対する必要性意識は両国でどのように異なっているかを明らかにしようとするものである。小・中・高校生を対象にした調査結果では,小学校英語への必要性意識はタイの方が高い傾向にあることがわかった。英語による授業,小学校における英語専科の導入,教員養成期間の延長など,タイの積極的な制度改革にそれが反映されていると言える。日本への示唆として、小学校への英語導入については、タイとの国情のちがいを踏まえながら,先行実施を十分参考にして、あらゆる角度からの時間をかけた検討が必要である。1.研究目的本研究は、初等教育に外国語(英語)を導入する政策が実現するためには、どのような要因(教育的、社会的、経済的、言語的など)が作用しているのかを、タイと日本の小学校における英語教育政策を比較することによって、探ろうとするものである。具体的には、小学校への英語導入に関して、その政策上大きな違いを生じさせている要因は何なのかを明らかにすることである。2.実施した研究活動(1)タイでの現地調査(2週間:89月)(2)タイの研究協力者の招聘と共同研究(12日間、10月)(3)国際学会(2008.1)、研究会(2007.12)への出席3.平成19年度の研究成果初年度の研究活動のまとめとして、英文報告書を研究協力者と共同執筆し、日本とタイの現状を比較して、以下の諸点を明らかした。・保護者や社会一般には、小学校への英語導入を求める声が強いことが共通して認められる。タイではそれを受けて文部省の強力な指導のもと、教科としての英語授業と現職教員研修が全国的に実施されているが、日本ではそのような積極的な推進政策がとられていない。・有資格の教員を確保することはタイでも困難な課題となっている。・両国とも私立小学校では英語教育はしっかりと根付いており、Immersion Programなど意欲的な取り組みが実践され、中等学校との連携もとれている。・タイでは、公立学校でも、主要教科を英語で教える試みが開始された。・タイにおける小学校英語についての賛否論は、日本ほど顕著ではなく、否定論や消極論はほとんど聞かなかった。・タイの英語教科書は、英語国で発行されたコースブックに基づいており、タイ人執筆者による独自の教科書が発行されていない。教材開発についての英語教育インフラは、日本と大きく異なる点である。本研究の目的は、初等教育に外国語(英語)を増入する政策が実現するためには、どのような要因が作用しているのかを、タイと日本の小学校における英語教育推進政策を比較することによって、探ろうとするものである。以下は、そのために実施した研究活動とその成果である。詳細は次頁掲戟の英文報告書にまとめた。1.タイでの現地調査(1週間:9月)タイ側研究協力者の支援を得て,小学校、中学校、高等学校の英語授業を参観するとともに,教員や教員養成担当教員への聴取り調査とアンケート調査を実施した。(1)生徒・学生のキャリアパスにおける英語の比重:小5、小6、中1,高1の学年で、英語の必要性についてアンケート調査を実施した。英語の重要度意識はタイの生徒の場合かなり高いものがある。(2)小学校英語教員の養成:大学の教員養成学部での小学校課程は全国的に5年に延長されており、5年目は教育実習に当てられていた。また、英語はその他の主要教科とともに、クラス担任ではなぐ専科教員に担当させるカリキュラムに改訂されていたことは注目に値する。(3)文部省のその後の方針:旧知の小学校英語担当宮を再訪して,小学校英語に関する最新の施策情報を聴取した。教師教育も含めて、小学校英語の充実のための施策を一層推進するとのことであった。2.タイの研究協力者の招肋と共同研究(9日間、10月)タイの英語教育専門家3名を日本(神戸)に招へいし、小学校英語も含めてわが国の英語教育の現状を視察してもらうとともに、両国の英語教育政策について情報交換と共同研究を行った。3.学会発表(2008.8):タイで収集したデータに基づいて、中間報告を行った。本研究の最終年度となる平成21年度は,必要性意識についてのアンケート調査を両国で実施し,それをもとに本研究の成果を学会等で発表することを主たる活動目標とした。本年度の成果は,以下のようにまとめることができる。日本とタイの英語教育は、双方EFL国として多くの共通点を有するが、小学校英語については制度面や政策面で大きな違いがある。

本研究は、両国の英語学習者を対象にしたアンケート調査により、英語学習についての必要性意識が双方の教育政策とどのように関係しているかを検証しようとするものである。調査結果の分析から、中等学校の英語学習に対する小学校英語の役立ち度、就職や進学における英語の重要性、保護者が考える英語の重要性、母語の相対的重要度や力量、英語学習に対する態度について、日本とタイの回答者間で有意な差が認められた。本調査の範囲では、小学校英語への必要性意識はタイの方が高い傾向にあることがわかった。2国間の違いとして無条件の一般化はできないが、英語による主要教科の授業(English Programmes)、小学校における英語専科の全面導入、教員養成期間の延長(5年制)など、タイ文部省の積極的な制度改革施策と社会的な英語への必要性意識とは無関係ではないと言える。日本への示唆として、小学校への英語導入については、タイの先行実施を十分参考にして、あらゆる角度からの時間をかけた検討が求められる。とりわけ、制度改革については、英語導入と初等教育の理念とはある時点から一致しない面も含んでいるので,慎重な対応が求められる。このような考察を含んだ研究成果を2回(8月鳥取での全国学会,1月バンコクでの国際学会)にわたって,学会で発表し,両国の違いやその要因について議論を深めることができた。
抗HIV/抗CD3 ハイブリッド抗体によるAIDS治療法の開発

HIV(HTLV-IIIB)を持続感染した培養細胞株(HIV-CEM)を未感染細胞株であるCEMに添加すると1週間以内にほとんどの細胞に感染が起こり、gp120に対するモノクローナル抗体である0.5betaで免疫染色されるようになる。ここに、0.5betaのFab'とCD3に対するモノクローナル抗体であるUCHT-1のFab'とを人工的に会合させたbifunctional antibody(BFA)を反応させた末梢血リンパ球を添加した。このBFAを反応させたリンパ球にはBFAのanti-CD3部分がTリンパ球のT細胞レセプター(TCR)に反応し、その結果BFAのanti-gp120をTCRに賦与した形になる。すなわち、TCRに本来の標的結合部位の他にgp120に対するレセプターを人工的に持たせることになる。このようなBFA処理リンパ球を添加することによりHIVの試験管内での感染を防ぐことが出来た。感染の広がりを防ぐだけでなく、gp120を細胞表面に持っている感染細胞を全て排除できることもわかった。しかし、gp120を細胞表面に発現していない感染細胞を排除することは出来なかった。gp120を発現していない感染細胞は休眠状態の感染細胞とみなすことが出来るので、BFAは患者の体内から少なくとも活動型の感染細胞を除去する方法として臨床応用が可能であると期待できた。そこで、HIV感染患者の末梢血からHIVを分離し、そのウイルスをPHAでブラスト化した末梢血リンパ球や培養株化したTリンパ球に感染させ、それらの感染細胞膜上に出現するウイルス抗原に対する反応性を持ったモノクローナル抗体の探索を行った。反応性が認められたモノクローナル抗体のFab'とUCHT-1のFab'とでBFAを作成した。このBFAで処理した末梢血リンパ球を^<51>Crで標識した患者HIV感染リンパブラスト細胞に作用させると細胞障害作用を認めることができた。細胞障害効率のより高い条件を見つけ臨床応用への可能性を探っている。
心臓における自然炎症制御機構の解明とその心リモデリングにおける役割の検討

本研究では、心臓における自然炎症制御機構の解明とその心リモデリングにおける役割を検討した。まず、心組織における炎症性サイトカインIL-1βの活性化にNLRP3インフラマソームと呼ばれるタンパク複合体が重要であることに着目し、NLRP3インフラマソームの活性化機構を検討した。我々は細胞実験により、心組織を構成する細胞におけるNLRP3インフラマソームの活性化に細胞外ATPが重要であることを明らかにした。また、動物実験により、交感神経系の物理的障害もしくは薬物学的抑制が圧負荷時の心臓における細胞外ATP濃度の上昇及びIL-1βの産生を抑制し、交感神経系の薬物学的刺激が細胞外ATP濃度を上昇させることが分かった。さらに、心臓からの求心性神経線維の障害により、圧負荷時の心臓における細胞外ATP濃度の上昇及びIL-1βの産生が抑制された。以上から、圧負荷時の心臓における自然炎症は心脳連関により制御されていることが明らかとなった。次に我々は、自然炎症が心不全を誘導するメカニズムを解明するため、自然炎症の誘導に重要な役割を果たすNF-κBシステムの転写制御因子IκBζに着目した。野生型マウスとIκBζのヘテロノックアウトマウスに圧負荷を加えたところ、野生型マウスでは時間の経過とともに心不全が誘導されたが、IκBζヘテロノックアウトマウスでは心不全への移行は認められなかった。心組織における炎症性サイトカインの発現を評価すると、IL-1βとIL-6の発現パターンが異なっていた。以上から、IκBζは圧負荷時の心臓における炎症性サイトカインの発現パターンを制御し、心不全の誘導に重要な役割を果たすことが分かった。本研究の成果により、心リモデリングにおける自然炎症の重要性及びその制御機構が明らかとなった。今後、自律神経系や転写制御因子を標的とした心不全の新たな治療法の開発につながるものと考えられる。
1パス超強加工によるスーパーファイン機能素材の一発創成

本研究では、1パス超強加工として、1パスで90%以上の圧下を与えることができる、ガラスを潤滑材とした押出しに着目する。1パス超強加工である押出しによるスーパーファイン機能創成の研究は過去に無い。スーパーファイン機能とは、構造材料については高い機械的特性を意味する。強度、伸び、じん性などの機械的特性は内部構造敏感な性質である。そこで、スーパーファインな内部構造を、超強加工を利用して一発創成し、機械的特性を改善あるいは制御できることを明らかにした。具体的な研究項目としては、中炭素鋼を対象とし、結晶粒径2ミクロン以下(400MPa級ベース組成でTSは700MPa以上)、伸びが25%以上ある素材を、断面直径5mm以上のサイズで、連続的に製造・加工できる条件を実験・理論の両面からの検討によりにし、さらに内部組織の形態について詳細な検討を加えた。さらに、スーパーファイン機能を持つ金属粉末ベースの複合材料の一発創成に、1パス超強加工を展開した。具体的には、ミクロサイズのアルミ合金A6061粉末を基材とし、ナノサイズのカーボンナノチューブ(CNT)を均一分散させた素材を1パス超強加エすることで、CNTを1.0wt%以上含有するA6061系複合材料を創成した。温間温度域での超強加工を利用することで焼結→圧粉加工を一気に行うことができ、そのため、稠密で機械的特性が優れ、なおかつ、含有するCNTの特性を損なうことが無い金属系複合材料の創成が可能となった。尚、金属系CNT複合材料の製造は、このことは世界に先駆けて行われた研究である。機能としては、優れた耐摩耗性、導電性、水素吸蔵製などが考えられるが、本研究では、導電性について検証し、A6061と比較して25%程度向上することを確かめた。本研究は、材料加工・処理の分野において中心課題の一つとなっている組織制御に関するものである。昨年度までの予備実験の結果、1パス超強加工として、熱間押出し加工が優れた加工法であることがわかった。そこで、熱間押出し加工での押出し温度・押出し比を既存の押出し加工プレスの能力限界(90tonf)まで上げ、押出し温度1000°C、押出し比411において、平均結晶粒径が3ミクロンを下回るファイン内部組織を一発で創成することに成功した。この結果をもとに、平成16年度実施した研究実績の概要は以下の通りである。(1)予備実験での最低押出し温度は900°Cで、このとき既存の押出しプレスは能力の限界に達していた。1パス強加工による微細結晶組織創成と加工温度とは強い関連があり、そのため900°C以下の温度で加工できる押出しプレスを新規に導入する必要があった。市販の機械プレスを基本構造とし、これに本研究の特殊性(制御冷却装置など)を加味した主パワーが250tonf、副パワーが50tonfの押出しプレスを新たに設計・製作した。(2)新たに導入した押出しプレスによる実験と、昨年度まで行ってきた実験を比較するために、押出し温度、押出し比、押出し速度、冷却条件を同じ条件に設定して、プレス機械の違いによる比較・再現性について調査した。その結果、同一押出し条件では同一の粒度・組織となることを確認した。(3)新たな挑戦として、押出し温度を700°Cまで下げた押出し実験を新たに導入した押出しプレスで行い、平均結晶粒径が2ミクロンとなる材料の作製に成功した。(4)新プレス導入による実験結果から、新たな可能性の検討ならびに問題点の整理を行った。

主に0.2%炭素鋼のフェライト(α)組織微細化に伴うスーパーファイン機能の向上を目指し,1パス超強加工法である押出し加工に関する調査を行っている.本年度では,最大平均歪み3,最大平均歪み速度50[1/s]の押出し加工において,γ静的再結晶を最低限に抑える700°Cまでの低温熱間加工およびそれ以下の600°C温間加工について,内部組織変化観察(光学観察・EBSP観測)と共に,その微細粒鉄鋼素形材の引張試験および冷間圧縮試験を行い,機械的特性および冷間鍛造性を調査した.1100°Cから700°Cへ加工温度を下げることに伴い,初期α平均粒径17μmのS20C(JIS規格材)が平均粒径7μmから1μmへ順々に微細化が進展した.中でも加工温度700°Cにおいては平均粒径1μm近傍の大角粒界(方位差15°以上)に囲まれた等軸微細α組織が得られた.一方,600°C加工においては1μm強の微細な組織が得られるものの,粒内転位が残存することや小角粒界(方位差515°)が多く含まれる一般的な温間加工に類似した組織であった.押出し微細粒鋼の引張試験結果は,素材焼鈍材がTS(引張強度・真応力):500MPa,EL(均一伸び・真歪み):18%であったの対し,800°C加工材までにTS:700MPa,EL:911%と,ELを落としながら高強度化が進展した.さらに,700°C加工材ではTS:700MPaを保ちつつELを最高16%に伸ばした.これは,α変態までの時間が極めて短いために,α粒界付近に点在するパーライト組織までもが微細化および離散化されたことによるものであると考えられる.600°C加工材ではTS:650MPa,EL:8%と機械的特性の低下が確認された.80%大圧下の冷間圧縮試験においても,ファインな機械的特性をもつ押出し微細粒鋼について加工硬化が見られ,良好な冷間鍛造性が確認された.本年度、以下の研究を行った。(1)低温・大ひずみ速度加工が鉄鋼材料の内部組織におよぼす影響これまで、0.2%C鉄鋼において、加工温度が、より微細なフェライト組織を創成する上で重要であることを示した。一方、加工速度(ひずみ速度)が内部組織におよぼす影響については依然不明のままであった。本研究では、ひずみ速度を5/sと30/sの2水準に変化させた実験を行い、ひずみ速度が内部組織におよぼす影響について、光学顕微鏡ならびにEBSP(Electron Back Scattering Pattern)を使い、明らかにした。その結果、材料の結晶粒径に関しては、今回のひずみ速度の範囲では影響が少ないこと、ただし、粒度分布は、ひずみ速度の大きい方がより均一になることを明らかにした。(2)1パス強加工により作製した微細組織鉄鋼材料の機械的特性検証1パス強加工した材料を熱処理等は行わず押し出されたままの状態で用い、引張り試験と圧縮実験を行った。その結果、引張り試験では、材料の平均結晶粒度が2.4から1.8ミクロンメーターに微細化すると、均一伸びは約0.15から約0.1に、降伏強度は約470から約500MPaに、引張強さは約650から約700MPaに変化する。圧縮実験(室温)では、1パス強加工によって結晶組織を微細化した材料は、高さ方向に約70%圧下しても、内外面とも割れなどは起こらず、ひずみの増加とともに加工硬化による正常な応力上昇が見られた。これは、1パス強加工による結晶組織微細化材料の良好な冷間鍛造性を示す結果である。
輸送系の改変による有用有機酸高生産のための糸状菌セルファクトリの創製

クエン酸生産糸状菌Aspergillusnigerを宿主として活用し、バイオベース有機酸生産のためのセルファクトリ創製を検討した。ミトコンドリア膜局在型クエン酸輸送体遺伝子の機能解析、クエン酸資化性微生物の探索、新奇酵素を利用したクエン酸からのtrans-アコニット生産への応用、について新規かつ重要な成果が得られた。さらに、クエン酸生産糸状菌の潜在能力と新奇な酵素の組み合わせによるセルファクトリ創製の可能性を見出した。(1)有機酸輸送系の改変を目的とした有機酸輸送系遺伝子の解析と利用ゲノム解析が終了したA. nigerCBS 513.88やATCC 1015の遺伝子情報をもとにして、クエン酸生産糸状菌に13個の有機酸輸送系遺伝子の候補を見出した。さらに、RT-PCRにより各種の培養条件下で10個の遺伝子の転写を確認し、数個の遺伝子については遺伝子破壊株を作製し、増殖とクエン酸等の有機酸の生産性について検討した(論文未発表のため詳細省略)。有機酸高生産株の作製を目的として、目的遺伝子のプロモーター領域を高発現プロモーターに置換する方法を考案し、高発現株の作製を進めている。(2)クエン酸生産糸状菌を宿主とした異種遺伝子の発現による有用有機酸生産糸状菌の作製オキサロ酢酸加水分解酵素遺伝子の高発現により、30 g/Lのグルコースから29 g/Lのシュウ酸を生産することに成功した。一方、機能性樹脂の原料となるトランス-アコニット酸(TA)の生産について検討した。大腸菌を宿主としたアコニット酸イソメラーゼ遺伝子とアコニターゼ遺伝子の共発現株を作製した。当該組換え大腸菌を生体触媒として利用し、30 minの反応で100 mMのクエン酸から35 mMのTA生産を達成した。(1)有機酸輸送系の改変を目的とした有機酸輸送系遺伝子の解析と利用前年度の検討で、クエン酸生産糸状菌Aspergillusnigerに8種の有機酸輸送系遺伝子の転写を確認した。その中の1つであるミトコンドリア局在型クエン酸輸送体タンパク質(CTP)ホモログをコードする遺伝子の機能解析を実施した。真核微生物においてミトコンドリアと細胞質間の共役輸送を司るのはリンゴ酸-クエン酸シャトルが代表例で、その本体であるCTPホモログ遺伝子をA. nigerよりクローニングした。さらに当該遺伝子破壊株を作製し、CTPホモログが糸状菌においては、培養初期の菌体の生育や、クエン酸代謝に影響することを明らかにした。現在、有機酸高生産株の創製を目的として、前年度および本年度の検討で得られた糸状菌における有機酸輸送系の知見を基に、基質となる有機酸の細胞内輸送と生成物としての有機酸の菌体外輸送の効率化を、遺伝子工学的な手法により検討している。(2)クエン酸生産糸状菌を宿主とした異種遺伝子の発現による有用有機酸生産糸状菌の作製機能性樹脂の原料となるトランス-アコニット酸生産について検討した。細菌由来のアコニット酸イソメラーゼ遺伝子を、クエン酸生産糸状菌を宿主として異種発現させた。当該異種発現株を利用して、グルコースを原料としたトランス-アコニット酸生産に成功した(論文未発表のため詳細省略)。現在、輸送系の改変と組み合わせることで、さらなる収量および収率の向上を検討している。(1)有機酸輸送系の改変を目的とした有機酸輸送系遺伝子の解析と利用初年度(平成25年度)の検討で、糸状菌Aspergillus nigerにおいてクエン酸生産条件下で8種の有機酸輸送系遺伝子の転写を確認した(論文発表2)。その中の1つであるミトコンドリア局在型クエン酸輸送体タンパク質(COC)ホモログをコードする遺伝子の機能解析を実施した。COCは酵母においてミトコンドリアと細胞質間の2-オキソグルタル酸-クエン酸の共役輸送を司る輸送体タンパク質であり、そのホモログを遺伝子をA. nigerよりクローニングした。さらに当該遺伝子破壊株を作製し、COC遺伝子破壊が糸状菌においては菌体の増殖にほとんど影響を与えず、その一方でクエン酸生産量の著しい減少を引き起こすこと明らかにした(論文投稿準備中のため詳細省略)。現在、有機酸高生産株の創製を目的として、これまでの研究で得られた糸状菌における有機酸輸送系に関する新規な知見を集大成し、遺伝子工学的な代謝経路の改変を進めている。(2)クエン酸生産糸状菌を宿主とした異種遺伝子の発現による有用有機酸生産糸状菌の作製糸状菌を利用したポリケタイド生産を目的として、A. niger由来III型ポリケタイド合成酵素(PKS)の機能解析を行った。ポリケタイドは、一般にフラボノイドやポリフェノールと呼称される化合物を含む二次代謝産物の一群であり、食品や医薬品またはその前駆体として利用されている。ポリケタイドの炭素骨格は、コエンザイムA(CoA)により活性化された脂肪酸である脂肪酸アシルCoA同士を縮合することにより形成されるが、その反応は生体内においてはPKSが担っている。当研究室が保有するクエン酸生産糸状菌由来のIII型PKSは、既報のそれらとは異なり、マロニル-CoAを開始基質として認識する、短鎖の脂肪酸アシル-CoAを開始基質としてテトラケタイドピロンを合成可能といった新規な特徴を有していることを明らかにした(論文発表3)。クエン酸生産糸状菌Aspergillus

nigerを宿主として活用し、バイオベース有機酸生産のためのセルファクトリ創製を検討した。ミトコンドリア膜局在型クエン酸輸送体遺伝子の機能解析、クエン酸資化性微生物の探索、新奇酵素を利用したクエン酸からのtrans-アコニット生産への応用、について新規かつ重要な成果が得られた。さらに、クエン酸生産糸状菌の潜在能力と新奇な酵素の組み合わせによるセルファクトリ創製の可能性を見出した。「有機酸輸送系の改変を目的とした有機酸輸送系遺伝子の解析と利用」については、遺伝子破壊によりクエン酸生産に影響を与える遺伝子を複数見出せている。クエン酸生産以外の有機酸を含め、細胞内外の濃度変化の再確認を行いながら慎重に機能解析を進めているが、有意義な成果が得られている。「クエン酸生産糸状菌を宿主とした異種遺伝子の発現による有用有機酸生産糸状菌の作製」については、トランス-アコニット酸の生産について、前年度の大腸菌を宿主とした検討による予備的知見をもとに、クエン酸生産糸状菌を宿主とした世界初のグルコースを原料としたトランス-アコニット酸の発酵生産に成功している。以上を通して、おおむね順調に進展と評価している。新規かつ有意義な成果が得られており、関連専門誌への論文投稿を準備している。農学糸状菌における有機酸生産に寄与する輸送系に関する研究例は少なく、A. nigerにおいてクエン酸生産に影響を与える輸送系遺伝子群の存在を、本研究課題で初めて明らかにした。今後は当該遺伝子群のより詳細な機能解析を進めていくとともに、当該輸送系の改変によるバイオベース有機酸の高生産を可能にする糸状菌セルファクトリの構築に取り組む予定である。「有機酸輸送系の改変を目的とした有機酸輸送系遺伝子の解析と利用」については、相同的組換えを効率的に行うことが可能な供試菌を使用することで、特定した有機酸輸送系遺伝子についての網羅的解析を進める道筋が拓けた。遺伝子破壊によりクエン酸生産に影響を与えると予想された遺伝子が実際には大きな影響を与えず、一方では予想外の遺伝子が生育やクエン酸生産に影響を与えることが確認されるなど、意外性のある成果も得られた。後者については再確認を行いながら慎重に検討を進めているが、有意義な成果が得られている。「クエン酸生産糸状菌を宿主とした異種遺伝子の発現による有用有機酸生産糸状菌の作製」については、オキサロ酢酸加水分解酵素遺伝子の高発現により、世界的な最高収率(理論収率の64%)を達成したことが意義深い。既報にある値をはるかに超える収率や生産量を達成しており、培地成分の改変等によりさらなる収率向上が可能なことを明らかにしつつある。また、トランス-アコニット酸の生産については大腸菌を宿主とした検討により、クエン酸生産糸状菌を宿主とした高効率生産への予備的知見が得られている。以上を通して、おおむね順調に進展している。新規かつ有意義な成果が得られており、関連学会大会での発表や専門誌への投稿を行っている。有機酸生産に関与する代謝工学や輸送系に関する研究例は少なく、バイオベース有機酸の高生産を目的とした糸状菌セルファクトリの構築に関する研究は皆無である。本年度の研究により、A. nigerでは有機酸の輸送系が有機酸生産の質と量に極めて重要な役割を担っていることを突き止めている。とくに、i)