hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
長距離電子スピン状態転送を実現する荷電状態制御単一光子素子の研究

本研究では、自己形成量子ドットを含むp-i-nダイオード構造に対して、高度な電子制御が可能な縦型単電子素子と同構造であるサイドゲート型ピラー構造を作りこみ、単一量子ドットEL(電流注入発光)を得ることに成功した。本素子はp-, n-電極に加え、電子状態制御のためのサイドゲートを持つため、表面が金属でほぼ覆われ、従来の方法では、効率的な光取り出しは難しい。そこで今回、素子作製に加え、このためのフリップチップ型の実装を行い、裏面からの光子取り出し手法を開発し、低温(4-15K)、電流注入時においても、裏面から高解像度の素子像をえることができた。これにより、数百nmの発光領域にアクセスすることができる。実際にこの手法により、電流注入による単一ドットからのEL観測に成功した。本素子は、量子ドット中の電子状態制御と単一光子発生を両立することが可能であり、主要な量子伝送の担い手である“光子"をもちいて、主要な量子演算の担い手である“電子スピン"間の量子もつれ発生へ応用できる。本素子のゲート電圧印加により、スピンー光子量子もつれした単一光子が発生する電子状態へ制御し、その光子を2素子から発生させ、2光子干渉させると、理想的には1/4の確率でそれぞれの素子内の残存スピン間に量子もつれが生じると予想される。25年度が最終年度であるため、記入しない。サイドゲート制御型量子ドット単一光子素子を発展させ、所望の特性を得るため、下記を実施した。1半導体素子構造の最適化:基本となる半導体を、これまでの知見を踏まえ、以下、良好な単一量子ドット発光特性と良好なダイオード特性とを両立する構造へと最適化した。新たに構築した顕微発光測定系により、同構造中の単一量子ドットからの発光を測定し、どの成長条件が適しているか探索した。さらに、評価用ダイオード構造を用いたI-V測定と多数の量子ドットからの電流注入発光の効率を評価し、適切な構造を得た。特に量子ドット近傍のノンドープ層に一定以上の厚みが必要であることがわかった。2サイドゲート型素子用の高効率顕微測定法開発:本素子は金属電極に囲まれており、素子上部への光取り出し効率は低い。このため、顕微電流注入発光測定は素子下部(基板裏面)から行う。このため、素子をステージによりスキャン移動、レーザー反射光をモニターする。光学系を構築し、反射光による素子像を得た。現状1素子画像を得るのに多大な時間を要するため、測定手法の改善を進めている。3サイドゲート型素子の設計・プロセス技術開拓1,2の結果を踏まえ、高効率な光子発生が可能でかつゲート制御可能な構造を設計し、必要なプロセス技術を開拓した。プロセスは電子ビーム描画とフォトリソグラフィーを駆使した多数のプロセスからなる。特に、適切なサイドゲート構造のためには、素子形状を高精度な制御した特殊なドライエッチングが必要であり、その条件と、ドライエッチング後の薬品処理の条件を見出した。前年度の研究により複数のプロセス技術を開拓し、目的の素子構造を作成できた。しかしながら、実験を進める中で、リーク電流の低減を初めとするさらなるプロセス技術の開拓が必要であることがわかり、現在これを進めている。さらなるプロセス技術の開拓を進める。具体的には、電流注入に用いているメサ部分の微細化とゲート電極への絶縁層導入を計画している。これらの改善を、I-V測定とゲート制御下における顕微発光分光により評価する。達成後、高効率な電流注入発光測定とサイドゲート制御の両立をすすめていく予定である。
人間の技巧的動作実現のためのゼロダイナミクス制御

ゼロダイナミクスとは,系の自由度に対し入力の数が少ない劣駆動系において,設定した系の出力を零化した際に残る不可観測な非線形性に基づく内部動特性のことである.本研究課題では,様々な人間の技巧的動作を劣駆動系として表現し,人間の運動を観察することで出力関数を設定し,出力零化により現れるゼロダイナミクスを上手く活用することで所望の運動が実現できることを,制御理論的・制御実験的に明らかにした.ゼロダイナミクスとは,系の自由度に対し入力の数が少ない劣駆動系において,設定した系の出力を零化した際に残る不可観測な非線形性に基づく内部動特性のことである.本研究課題では,様々な人間の技巧的動作を劣駆動系として表現し,人間の運動を観察することで出力関数を設定し,出力零化により現れるゼロダイナミクスを上手く活用することで所望の運動が実現できることを,制御理論的・制御実験的に明らかにした.今年度は,人間の技巧的動作としてデビルスティックを用いた持続回転運動としなりのある鉄棒での振り上げ運動を考えてきた.デビルスティックとは曲芸の一種であり,手にした1本のハンドスティックを操作することで,空中に浮いたもう1本のセンタースティックを落下させずに持続的に回転させ続ける技巧的な運動である.この運動におけるゼロダイナミクスを解析・不安定化することで得た持続回転運動を実現するための条件に基づいた数値シミュレーションでは十分な持続回転が得られるが,汎用マニピュレータを用いた実験では回転周期が早まる傾向が確認していた.そこで,ゼロダイナミクスの解析を再度行った結果,2本のスティックの接触点に依存して,回転周期が変化することがわかった.そこでセンタースティックの回転速度に応じてこの接触点の位置を動的に変化させることでほぼ一定の回転周期を保持したまま持続回転運動が実現できることを示し,軽量化を主とした改良を行った実験装置により,これまでの数回転から最大37回転の持続回転運動が実現できることがわかった.しなりのある鉄棒での振り上げ運動とは,体操選手が使用するようなしなりを有する鉄棒において,そのしなりを効果的に活用した振り上げ運動の実現を目指すものである.本年度においては,しなりの効果を利用しやすい2リンクのロボットを対象に,鉄棒のしなりのエネルギーとロボットのエネルギーに注目した運動解析を行った結果,両者の間にエネルギーの相互作用が存在することが明らかになった.そこでその相互作用を適切に制御することで,より効果的に鉄棒のしなりを利用して振り上げ運動が実現できることを示し,実機による検証実験でもその有効性を確認した.平成19年度においては,技巧的動作として人間の動特性を考慮した投球運動を考えてきた.人間は様々なスポーツの中で技巧的な動きを利用していると考えられており,その中で投球運動については熟練した者と素人の動作には運動に大きな違いが見受けられる.一般的な投球運動は3次元的な運動でその全てを解析することは困難であるため,ここでは平面モデルを用いて目標方向への投球運動制御を行ない,技巧的な特徴を実現することでエネルギー的に効率の良い投球運動を行うことを試みた.まず,熟練された投球運動における技巧的な特徴を考察すると,身体の関節をタイミング良く動かすことで手先のボールをエネルギー的に効率よく加速させている点がある.また,肘関節には回転軸が一つしか存在しないため,上腕の運動する向きによっては拘束された状態が存在する.この拘束状態を利用した肩関節回りの回転が行なわれている点や,肘関節の伸展トルクがあまり利用されていない点も特徴といえる.これらの技巧的な特徴を実現可能なモデルとして,上腕と前腕を模した平面2リンクマニピュレータにおいて,拘束状態と肘の伸展トルクを利用しない点を考慮し,第二関節が非駆動の劣駆動モデルを考え,この第二関節に腕の剛性を模したバネを有するものと,完全な物理拘束のみを有する二つのモデルを提案した.バネモデルではボールを持つ手先の位置を制御する出力零化制御を行なうことで,手先を直線軌道にのせ,その軌道上を加速していくようなゼロダイナミクスにより,目標方向への投射が実現できることを数値シミュレーション及び検証実験により確認した.一方,物理拘束モデルでは,入力トルクやパワーを制限した状態でバンバン制御を行なうことで,単なる1リンクのモデルで同様な投球動作を行なう場合に比べてエネルギー的に有効であることを数値シミュレーションにより示した.平成20年度においては,技巧的動作として陸上競技の一種である幅跳び運動を考えてきた.動物や人間の歩行や走行において,重心位置の変化による重力効果や慣性の効果を利用する不安定な歩行形式である動歩行がある.この動歩行の一形態として,跳躍歩容と呼ばれるものがある.これは,一連の動作において,脚が地面から離れ体が宙に浮いている期間があるような歩容形態であり,脚が接地している状態と離れている状態が連続して切り替わる可変拘束システムとなるため,制御が非常に難しいものとなる.そこで跳躍歩容の最もシンプルな構成要素として幅跳びのような1回の跳躍のみを考え,跳躍動作の本質を見極めるため,人間の上半身と下半身を模擬する2リンク1アクチュエータで構成されるAcrobot型の劣駆動システムを対象とした.このAcrobotにおいて上手く跳躍するためには,接地時のバランスを失うことなく2つのリンクの動きをうまく協調させながら重心位置を滑らかに移動させる必要があるが,劣駆動であるため自由に2つのリンクを制御することはできない.

そこで,まず接地時においては,Acrobotの重心位置と姿勢に関する関数を出力関数として設定し,その出力関数を零化した際に残るゼロダイナミクスが安定になることを利用してAcrobotのバランスを維持する.次に離陸時においては,Acrobotの重心位置を目標とする離陸方向となる直線上に乗るような出力関数を設定し,その出力関数を零化した際に残るゼロダイナミクスが不安定になることを利用してAcrobotの跳躍を実現する.数値シミュレーションにより提案手法の有効性の検証を行った結果,所望の運動が実現できることを確認した.また,重力と摩擦を軽減するために製作したエアーテーブル上で自由に運動することができるAcrobotの実験機を製作し検証実験を行った結果,ある程度所望の運動が実現できることを確認できた.
北海道の伝承芸能を「舞踊譜」で保存する試み

無形文化財(無形民俗文化財)として指定されている北海道内の獅子舞の継承保存のために、舞踊譜の作成による方法論の提示を試みた。その典型事例として千歳市指定の無形民俗文化財「泉郷獅子舞」を取り上げた。バレエなどヨーロッパを起源とする舞踊譜記譜法とは異なる視点に立ち、本研究を担った赤川のオリジナル記譜法によって舞踊譜を作成した。この方法論の提示によって、継承保存が途絶えかけている獅子舞の復元を可能にできると考える。北海道内各地域において無形文化財に指定されている伝承芸能、特に「獅子舞」について、舞踊譜による保存を試みるために、初年度は「千歳市泉郷獅子舞」を研究課題の糸口と位置付け、現地聞き取り調査、映像資料の撮影、文献の収集を実施した。この「千歳市泉郷獅子舞」に加えて道央圏の6つの無形文化財指定の獅子舞(「丘珠獅子舞」「芦別獅子舞」「富良野獅子舞」「納内猩々獅子」「猩々獅子五段くずし」「多度志獅子舞」)についても現地調査を実施、映像資料、及び文献資料の収集を行った。さらに、当初計画の調査対象に付け加えるべき無形文化財としての獅子舞が、新たに2008年度に無形文化財に指定されたものも含めて、存在することが調査の過程で判明した。同時に、文化財保護法にその根拠を置く行政における支援のあり方、伝承芸能を地域の中で伝えるための後継者問題なども含めて、後世に伝え残す舞踊譜の果たす役割の重要性を改めて認識している。当該研究のテーマである「舞踊譜」による記述保存については、世界的にも高い評価を得ている舞踊譜「ラバノーテーション」の表記方法では対応できない問題、特に踊り手の上半身が胴幕によって隠れてしまう点をどう舞踊譜に記述するかという問題に直面した。それゆえに当該研究者によるオリジナルな舞踊譜表記法の検討が必要であると考えている。保存継承のために肝要なのは、あまりにも専門的すぎないようにすることの一点に尽きるのであり、従って、「ラバノーテーション」よりさらに簡便といえる舞踊譜記述法によっても、復元が可能といえるものを検討していくべきだと考える。「ラバノーテーション」の基本概念の上に立って、より簡便な舞踊譜記述方法を検討すること、及びモーションキャプチャー技術の応用を目指すことに大きな意義があると考える。映像資料については、舞踊譜記述の方法論から共通の視点に立った撮影が必要である。既に撮影済みのものについては、その共通の視点に立って再度撮影を実施する必要がある。平成21年度の調査研究の評価は以下の通りである。典型的事例の「千歳市泉郷獅子舞」の現地調査、文献の収集についてはほぼ終了したが、映像資料の撮影については、舞踊譜記述の方法論との関係から再度実施し、2方向からの撮影を行った。同時に、当該研究のテーマである「舞踊譜」による記述保存については、世界的にも高い評価を得ている舞踊譜「ラバノーテーション」の表記方法では対応できない問題、特に踊り手の上半身が胴幕によって隠れてしまう点をどう舞踊譜に記述するかという問題の解決のために獅子の胴幕を外し、舞手の手の動き、上半身の動きを捉える試みも実施した。当該研究の基礎と位置づけるこの「千歳市泉郷獅子舞」に加えて道央、道東の無形文化財指定獅子舞について現地調査を実施。映像資料、及び文献資料の収集を行った。並行して舞踊譜作成の方法として詳細な身体の動きをイラスト化することを検討、イラスト図版作成の専門家との検討作業を開始、当該研究者によるオリジナルな舞踊譜記述法の方法論を模索している。一方、平成21年度当初、調査対象としてあげた30余の無形文化財の獅子舞への現地調査が不完全のまま年度が終了、北海道内獅子舞の被伝承地である富山県への訪問調査も未実施に終わっている。本年度は、当該研究の最終年度であることから、積み残した調査対象へのアプローチを積極的に行い、可能な限り、映像資料、文献資料の収集、整理を試み、舞踊譜記述による無形民俗文化財の保存に貢献して行きたい。本研究では、北海道の開拓期に本州から移住と共に持ち込まれた伝承芸能を調査し、その地域と産業と人々にもたらした舞踊の役割、変遷を背景に、今日、少子化による継承者不足や市町村合併や産業の移り変わりなどによって、伝承が危ぶまれている地域や、すでに伝承が途絶えてしまった地域も含め、これら伝承芸能を後世に残すべく、調査し保存することを試みてきた。2.研究の進捗状況(1)初年度の2008年度は、本研究の典型事例と位置付けた千歳市無形民俗文化財「泉郷獅子舞」を核に、無形文化財、あるいは、無形民俗文化財に指定をされている獅子舞に焦点を絞って、現地調査を実施した。(2)2009年度は、北海道各地に伝承されている無形民俗文化財の獅子舞を中心に、現地での映像による撮影や伝承経緯の聞き書き、文献の収集による採符と調査、舞踊譜制作のための舞踊記譜法の研究を行った。

(3)最終年度の2010年度は、2年間の研究を踏まえ、ひとつのまとめとして伝承芸能・獅子舞を舞踊譜で保存するための考察とアーカイブズ化の方法論を検討、典型事例として千歳市の「泉郷獅子舞」の詳細な分析、それによる舞踊譜の作成を行った。3.研究の成果(1)舞踊譜の作成は典型事例として取上げた千歳市の泉郷獅子舞について完了している。この舞踊譜作成の方法論の提示、及び、調査対象としてあげた無形文化財、無形民俗文化財の現状調査をしたものを報告書(およそ9万字)としてまとめた。(2)現地調査の対象として北海道内には54件の無形文化財、無形民俗文化財としての獅子舞が存在する。そのうち、実際に現地における調査を実施できたものが、13件、アンケート調査による現状把握ができたものが40件余である。
テストの構造的性質が能力評価に及ぼす影響のモデル化に関する研究

本年度は,中学3年生を対象に,1国語読解テストにおける回答欄の字数制限が能力評価に及ぼす影響,2国語読解テストにおける解答類型の設定方法が能力評価に及ぼす影響に関する2つの研究を行った。1については,公立高校入試問題を基に作成された国語読解テストを用いて,3つの設問を対象にA条件とB条件の2つの回答欄を設定した。具体的には,設問Iでは,A:「九十字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIでは,A:「四十五字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIIでは,A:「七字で抜き出しなさい」,B:字数制限なし,を設定した。中学3年生543名が受検し,回答時間は45分であった。分析の結果,設問Iでは,A条件とB条件ともに中程度の得点率であり,両条件に差が見られなかった。設問IIでは,B条件の方がA条件よりも高い得点率となった。設問IIIでは,A条件の方がB条件よりも高い得点率となった。識別力に関しては,全ての設問において両条件で差が見られなかった。2については,1と同様の国語読解テストを用いて,3つの設問を対象に2種類の解答類型(A,B)を設定した。解答類型Aは,全ての設問に共通しており,類型1:「正答」,類型9:「その他の回答(誤答)」,類型0:「無回答」,の3つの類型を設定した。解答類型Bは,解答類型Aの内容に,例えば「準正答」などの類型を加えたものを設定した。受検者は設問Iが272名,設問IIが269名,設問IIIが543名であり,回答時間は45分であった。分析の結果,解答類型Bに部分点が与えられる設問Iと設問IIIでは,解答類型Bで評価した方が解答類型Aで評価するよりも識別力が若干高くなった。また,全ての設問において解答類型Bで評価することにより,受検者の回答内容を詳細に把握することが可能となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は, 1公立高校入試問題の国語読解テストにおける記述式問題の分類及び出題傾向の把握, 2回答欄の字数制限が能力評価に及ぼす影響に関する学年間の比較,の2点に関する検討を行った。1については,過去5年間47都道府県で実施された論説文・説明文(計240題)を対象とし,その著者,作品名,ジャンル及び記述式問題(773問)における構造的性質について検討した。その結果,各都道府県における問題本文の出題に関して,一部複数回用いられる特定の著者や作品が確認された。また,例示の効果が明らであり,論理展開が明確な文章を選定することが良質な問題本文の出題につながると考えられた。設問の出題に関しては,問題本文の理解力について構造的に測定する場合,「文脈考慮」や「図・表」の設問が設定され,該当箇所の具体例や言い換えを問う場合は「対応・言い換え」の設問が設けられると考えられた。さらに,理解力に加え,特に表現力を測定したい場合は,「説明」,「まとめ」,「自分の考え」を求める内容の設問に加え,長い記述を求める回答欄を設ける必要があると考えられた。2については,高校入試問題を基に作成された国語テストを用いて,特定の設問における回答欄の字数制限を操作し,その違いが受検者の能力評価に及ぼす影響について検討した。具体的には, A :四十五字以上五十五字以内で書きなさい, B :五十五字以内で書きなさい, C :字数制限を行わない,の3条件を設定した。中学2年生242名,中学3年生236名,翌年の中学3年生236年(先に述べた中学2年生と同一集団)が受検した。その結果,字数制限のない条件(C条件)の方が制限のある条件に比べ(A条件とB条件),回答として求められる情報を記述する割合が高く,また,字数制限を設けないことが得点率と識別力を高くすることが示唆された。さらに,回答方法の違いは,学年集団が異なることにも影響することが示された。本年度は,1社会科テストの設問設定が能力評価に及ぼす影響の検討,2国語読解テストにおける回答欄の字数制限が能力評価に及ぼす影響に関する予備調査,の2点を行った。1については,社会科テストを用いて,3つの設問設定を行った。具体的に,設問IはA:設問中に法隆寺の図があるもの,B:図がないもの,設問IIはA:回答の際の資料となる表や図に関する会話文があるもの,B:会話文がないもの,設問IIIはA:水産業がかかえる問題について問うもの,B:水産業が将来直面するであろう問題について問うものを設定した。中学3年生408名が受検し,回答時間は30分であった。その結果,設問IではA条件とB条件ともに中程度の得点率であり,両条件に差が見られなかった。識別力に関しても,両条件には差が認められなかった。設問IIではA条件とB条件ともに低い得点率となり,両条件に差が見られなかった。識別力に関しても,条件間の差は認められなかった。

設問IIIでは,A条件の方がB条件より高い得点率となったが,回答内容を検討すると,A条件よりB条件の方が,評価基準で回答として求められている内容を回答する受検者が多く観測された。識別力に関しては,条件間の差はほとんど見られなかった。2については,国語テストを用いて予備調査を行った。本研究では,3つの設問の回答欄を設定した。具体的に,設問IはA:「九十字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIはA:「四十五字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIIはA:「七字で抜き出しなさい」,B:字数制限なしを設定した。中学3年生31名が受検し,回答時間は中学生45分であった。その結果,設問IではB条件の方がA条件よりも高い得点率となった。設問IIにおいてもB条件の方がA条件よりも高い得点率となった。設問IIIでは,これまでとは逆の結果となり,A条件の方がB条件よりも高い得点率となった。本年度は,中学3年生を対象に,1国語読解テストにおける回答欄の字数制限が能力評価に及ぼす影響,2国語読解テストにおける解答類型の設定方法が能力評価に及ぼす影響に関する2つの研究を行った。1については,公立高校入試問題を基に作成された国語読解テストを用いて,3つの設問を対象にA条件とB条件の2つの回答欄を設定した。具体的には,設問Iでは,A:「九十字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIでは,A:「四十五字以内で書きなさい」,B:字数制限なし,設問IIIでは,A:「七字で抜き出しなさい」,B:字数制限なし,を設定した。中学3年生543名が受検し,回答時間は45分であった。分析の結果,設問Iでは,A条件とB条件ともに中程度の得点率であり,両条件に差が見られなかった。設問IIでは,B条件の方がA条件よりも高い得点率となった。設問IIIでは,A条件の方がB条件よりも高い得点率となった。識別力に関しては,全ての設問において両条件で差が見られなかった。2については,1と同様の国語読解テストを用いて,3つの設問を対象に2種類の解答類型(A,B)を設定した。解答類型Aは,全ての設問に共通しており,類型1:「正答」,類型9:「その他の回答(誤答)」,類型0:「無回答」,の3つの類型を設定した。解答類型Bは,解答類型Aの内容に,例えば「準正答」などの類型を加えたものを設定した。受検者は設問Iが272名,設問IIが269名,設問IIIが543名であり,回答時間は45分であった。分析の結果,解答類型Bに部分点が与えられる設問Iと設問IIIでは,解答類型Bで評価した方が解答類型Aで評価するよりも識別力が若干高くなった。また,全ての設問において解答類型Bで評価することにより,受検者の回答内容を詳細に把握することが可能となった。本年度予定していた社会科テストの実施において,設問中の図の有無,会話文の有無,特定の文言の有無が能力評価に及ぼす影響に関する知見を得ることができたため。また,昨年度検討した国語読解テストにおける回答欄の設定に関する課題に対し,新たな国語読解テストを作成し,その予備調査を行えたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に実施した2の本調査を中学3年生約600名に実施したので,今後は回答の採点と分析を行い,回答欄の字数制限の有無の違いが能力評価に及ぼす影響に関して,より詳細に検討する予定である。本年度は,国語読解テストにおける記述式問題の分類及び出題傾向を把握することにより,国語読解テストにおける研究課題を見出すことができた。また,その課題の一部となる回答欄の字数制限に関して,中学生を対象に学年間の検討を行い,回答欄の字数制限の有無が能力評価に影響を及ぼすことが確認できたため。今回検討した回答欄の設問は,「2つの条件の回答を求める設問」という特定の設問に関する知見であった。
ミクロデータによる主観的思想決定構造解析の理論との応用

既応の研究において包除被覆が、ファジィ積分で表現されるシステムの構造解析に関して重要かつ有益な概念であることが示されてきた。しかしながら、包除被覆を同定、発見することは、きわめて困難であった。事実、システムの入力が8属性以上になると、実時間での同定は、おおよそ不可能であった。これに対しては遺伝的アルゴリズム等のアルゴリズム技術によって、一応の解決は見られたが、そこで得られた結果が最適なものであるかどうかの理論的保証は全くない。本研究ではメビウス反転の概念を通して、包除被覆を特徴付けた。これによって、これまできわめて困難であった包除被覆の同定問題が非常に平易な問題に帰着された。また、ショケ積分モデル自体もメビウス反転を用いた表記においてパラメータ同定を行う方がモデル解析においては、有益であり、かつ簡単であることも示している。更に、ファジィ積分によって表現されたモデルのもつ特徴を表現するための、いくつかの指標も提案した。これらをと通して、メビウス反転がファジィ積分で表現されたモデルの構造を表現するために、極めて、重要かつ本質的な指標となることを示した。これと同時にファジィ積分モデル.ファジィ測度論に対して、協力ゲームの理論における知見を導入することができた。逆に、協力ゲームの分解可能ゲームに対して、包除被覆モデルに関して得られた知見が、応用されうる可能性が示された。また、これらの理論を背景にしたアプリケーションシステムの構築にも着手した。
子宮内膜症の発症・進展における内膜幹細胞の役割とEMT/METの関係の解明

ヒト子宮内膜幹細胞候補であるSide Population(SP)細胞、CD146+PDGFRβ+細胞、W5C5細胞はそれぞれ異なる細胞集団であるが、一部の細胞は重複していることが判明した。子宮内膜症の特徴である浸潤能に注目し、子宮内膜細胞と子宮内膜SP細胞の遊走性をin vitroで確認した。また、その遊走性はEMT阻害薬により抑えられることをin vitroで明らにした。現在In vivoにおけるEMT阻害剤の浸潤能抑制効果を確認中である。【1】子宮内膜幹細胞候補同士の関係および細胞系譜の解明SP細胞、W5C5+細胞、CD146+PDGFRβ+細胞といった子宮内膜幹細胞候補について各々の細胞群の比較検討は行われていないのが現状である。そこで、我々がこれまでに確立してきた研究手法を用いて、それぞれの内膜幹細胞候補を分離し、それぞれの細胞群が発現している遺伝子やタンパク質を比較し細胞系譜を検討することで、幹細胞ヒエラルキーにおける位置付けを行うことを目標とした。方法としては、(1)一つのヒト子宮内膜検体から分散内膜細胞を調整し、フローサイトメトリーによりSide Population(SP)細胞、W5C5+細胞、CD146+PDGFRβ+細胞を分離するとともに表面抗原解析を行い相互関係の解明を目指した。また、(2)我々の開発した内膜症モデルマウス(Masuda et al. PNAS 2007)を作成し、モデル病変のW5C5免疫染色を行った。フローサイトメトリーによるヒト子宮内膜SP細胞にはCD146+PDGFRβ+細胞がenrichされていることが確認できた。また、W5C5の発現についてはSP細胞と非SP細胞を比較した際に、有意差がでなかった。内膜症モデルマウスの作成については、移植部位において100%の確率でモデル病変が作成され、HE染色にて子宮内膜様腺管構造も確認した。しかし、W5C5の染色については一切陽性細胞が確認されなかった。検体は4%PFAにて固定したパラフィン切片であったが、我々の用いたW5C5抗体がパラフィン切片では使用できない可能性があり、凍結切片にて再度染色する予定とした。(1)フローサイトメトリーによりSide Population(SP)細胞、W5C5+細胞、CD146+PDGFRβ+細胞の表面抗原解析を行い相互関係の調べることを複数検体で行った。ヒト子宮内膜SP細胞にはCD146+PDGFRβ+細胞がenrichされていることが確認できたが、W5C5の発現についてはSP細胞と非SP細胞を比較し有意差がでなかった。(2)NOGマウスの腎皮膜下にヒト子宮内膜細胞を移植した系を作成し100%の確率で再構築組織ができ子宮内膜様腺管構造も確認できたが、W5C5の染色については一切陽性細胞が確認されなかった。条件変更を重ねても陽性例がとれないことより、4%PFA固定のパラフィン切片ではW5C5抗体が機能しないと推測し、凍結切片での染色を予定している。(3)SP細胞がin vivoでもつ浸潤能をin vitroで再現するため、SP細胞とnon-SP細胞を用いてTranswellmigration assayを行った。その結果、SP細胞はnon-SP細胞に比べて高い浸潤能を持つことがわかった。同様の系において、SP細胞培養群にEMT阻害剤を投与し、浸潤能の低下を確認しているが、nが少なく有意差に至っていない。(4)より簡潔に遊走能(浸潤能)を確認するため、SP細胞を2次元培養しwoundhealingassayを施行した。EMT阻害薬添加群と非添加群の比較により、添加群では遊走能の低下が明らかとなった。この結果は、EMT阻害薬がSP細胞の遊走能(間葉的性質)を押さえる可能性が示唆された。(5)In vivoにおけるEMT阻害剤の浸潤能抑制効果を見るため、NOGマウスの腎皮膜下にヒト子宮内膜細胞を移植した系を用いて、再構築組織の組織学的評価を行っている。浸潤能を見るため免疫組織化学染色によるヒト由来細胞の動態とEMTマーカーの発現を検討中である。生殖内分泌平成25年度の研究開始時期が遅れてしまったことに加え、ヒト子宮内膜検体はホルモン療法を施行していない良性疾患に対する手術の検体から採取しているが、その検体自体の数も少なかったため。まずは、【1】子宮内膜幹細胞候補同士の関係および細胞系譜の解明として、各子宮内膜幹細胞候補のヒト子宮内膜組織内での位置関係を免疫組織染色の2重染色等にて解析することを目指す。また同時に、内膜症モデル病変での位置関係も確認し、異所性に再生した内膜ではどのような動態を示すかを解析する。正所性と異所性の内膜で幹細胞候補の位置関係等を比較することから、内膜症における幹細胞の役割を検討する。

そして、内膜症モデルマウスにBrdUを打ち込みLabel retaining cellsの解析を行うことで、異所性内膜(内膜症病変)における幹細胞の役割をさらに探求する。その後は、内膜症とEMT/METの関係を証明するため研究実施計画にそって【2】子宮内膜症における子宮内膜幹細胞の役割に関する検討の項に順次移っていく予定である。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。次年度の研究費と併せて消耗品購入に充てる予定である。
分子スケール物性評価に向けた多探針原子間力顕微鏡の開発

原子間力顕微鏡(AFM)は、高分解能な表面形状観察だけでなく、ナノ材料の力学特性,電気特性,磁性,圧電性などの物性計測,微細加工,マニピュレーションなど、多様な用途に応用されている。また、動作環境を選ばないことも重要な長所であり、真空下での清浄表面構造観察、さまざまなガス中での物性計測、液中での生体試料の構造・機能計測など、多方面で活用されている。しかしながら、用いる探針が1つであるという点が制限となり、面内方向の導電性や局所刺激印加に対する応答の面内相関などを調べるためには、微小電極の作製や他の計測手法との併用が求められる。こうした背景では、ナノ材料を対象とした多角的な計測を実現しうる計測装置として2探針AFM(Dual-Probe AFM : DP-AFM)が有効であり、本研究では「ナノスケールの計測、評価へ向けたDP-AFMシステムの開発」を目的とした。これまで独立駆動可能な2本の探針を有するDP-AFMを開発してきたが、このDP-AFMの光てこ探針変位検出系ではカンチレバー背面に斜め上方向からレーザ光を照射する配置をとっており、高倍率の光学顕微鏡との複合が可能である一方、3次元的に複雑な光学配置であるため、真空下や液中観察への応用が難しかった。本年度は特に真空や液中環境での動作が可能なシステムの開発に取り組んだ。一般的なAFMと同様に、直上からレーザ光を照射する直上入射光てこ法を採用したDP-AFMを開発した。2つのビームスプリッタを用い、カンチレバーおよび試料観察用の対物レンズがレーザの集光レンズを兼ねることで、2つのカンチレバーに対して直上からのレーザ光照射を可能とした。それと同時に光学系と観察ユニットを空間的に分離し、試料部を大気中のみならず真空下もしくは液中において観察、測定が可能となった。今後、真空下におけるナノ構造の電気計測や、液中での生体試料に対する刺激-応答計測などへの応用が期待できる。本研究ではナノエレクトロニクスの進展に寄与する2探針原子間力顕微鏡の開発を目的とした。原子間力顕微鏡(AFM)の2探針を試料上の任意の場所に接触しうるプローブ電極とし、ナノテスターとして用いることで、微小試料の自由な多端子電気測定が可能となるほか、直接的な力学刺激の印加、構造解析、さらに局所的電荷分布、磁気力測定などを組み合わせることで、広くナノスケールの「刺激-応答」測定が可能となる。ナノスケール構造体の物性評価に適応する高い分解能を実現するため、カンチレバー変位検出系の高感度化を図った。一般的なAFM装置で用いられる、レーザー光を直上から入射する配置の高感度な光てこ法を2探針に対して適応するため、また同時に高倍率な光学顕微鏡との複合を可能とするため、それら光学系の設計を行った。同時に、ナノスケール構造体はその表面状態が物性に大きく寄与するため、真空・大気・ガス雰囲気といった環境による影響を評価することが必要不可欠である。よって、観察環境制御への適応へ向けてAFMヘッドの小型化、密閉化を試みた。また、このような小型化、密閉化は振動ノイズ、熱ドリフト低減のためにも有効である。上記「カンチレバー変位検出の高感度化」「小型化、密閉化」の2点をふまえた2探針AFM装置を設計し、現在構築中である。一方、これまでに開発した2探針AFMの性能を評価するために、シリコン酸化膜上に堆積した有機半導体ペンタセン薄膜に対し、導電性の2つのカンチレバーを微小電極としてコンタクトさせ、電界効果トランジスタ特性を計測した。表面形状において確認した単一ドメイン内へ2探針を配置した状態で良好なゲート変調を確認した。同一の方法で試料基板上の任意の位置に対して測定が可能なため、今後、探針距離、ドメイン境界、膜厚、探針金属種、結晶性などへの依存性について多角的な評価が可能である。本研究では、分子エレクトロニクス/バイオエレクトロニクスにおける評価技術として有用な、近接位置決め可能な多探針原子間力顕微鏡の開発、およびナノスケール材料に対する応用計測の実現を目的とする。原子間力顕微鏡(AFM)の探針を試料上の任意の2点にあてる電極とし、ナノテスターとして用いることで、微小試料の自由な多端子電気測定が可能となるほか、直接的な力学刺激の印加、構造解析、さらに局所的電荷分布、磁気力測定などを組み合わせることで、広くナノスケールの「刺激-応答」測定が可能となる。本年度、この2探針AFM/KFMを用いてポリジアセチレン結晶においてその電気伝導率の異方性を評価することに成功した。へき開によって得たpolydiacetylene para-toluene sulfbnateのbc面に一方のプローブ(Probe-1)をコンタクトさせ、結晶裏面に対して電圧を印加すると同時に、Probe-1に近接した他方のプローブ(Probe-2)により表面電位をKFM観察した。この結果、ジアセチレン主鎖方向に平行に、Probe-1による電圧印加点から伸びる輝線が観察された。これは、Probe-1から注入された電荷のジアセチレン主鎖方向への特異的伝導を可視化したものである。一方、ナノスケールの構造体の物性はその表面状態に強く影響を受けることから、測定環境を制御し、表面状態を安定させることがその物性評価には不可欠である。したがって、新たに真空動作可能な2探針AFM装置の開発を行った。

原子間力顕微鏡(AFM)は、高分解能な表面形状観察だけでなく、ナノ材料の力学特性,電気特性,磁性,圧電性などの物性計測,微細加工,マニピュレーションなど、多様な用途に応用されている。また、動作環境を選ばないことも重要な長所であり、真空下での清浄表面構造観察、さまざまなガス中での物性計測、液中での生体試料の構造・機能計測など、多方面で活用されている。しかしながら、用いる探針が1つであるという点が制限となり、面内方向の導電性や局所刺激印加に対する応答の面内相関などを調べるためには、微小電極の作製や他の計測手法との併用が求められる。こうした背景では、ナノ材料を対象とした多角的な計測を実現しうる計測装置として2探針AFM(Dual-Probe AFM : DP-AFM)が有効であり、本研究では「ナノスケールの計測、評価へ向けたDP-AFMシステムの開発」を目的とした。これまで独立駆動可能な2本の探針を有するDP-AFMを開発してきたが、このDP-AFMの光てこ探針変位検出系ではカンチレバー背面に斜め上方向からレーザ光を照射する配置をとっており、高倍率の光学顕微鏡との複合が可能である一方、3次元的に複雑な光学配置であるため、真空下や液中観察への応用が難しかった。本年度は特に真空や液中環境での動作が可能なシステムの開発に取り組んだ。一般的なAFMと同様に、直上からレーザ光を照射する直上入射光てこ法を採用したDP-AFMを開発した。2つのビームスプリッタを用い、カンチレバーおよび試料観察用の対物レンズがレーザの集光レンズを兼ねることで、2つのカンチレバーに対して直上からのレーザ光照射を可能とした。それと同時に光学系と観察ユニットを空間的に分離し、試料部を大気中のみならず真空下もしくは液中において観察、測定が可能となった。今後、真空下におけるナノ構造の電気計測や、液中での生体試料に対する刺激-応答計測などへの応用が期待できる。
ナノ世界のインターフェイス構築へのタンパク質工学的デザイン学

本研究は、研究代表者がこれまで研究してきた機能抗体断片を構成要素として接合対象素材によらず目的素材間をナノレベルで正確に接合・アセンブリ制御できるバイオインターフェイス分子を創出するプラットフォーム技術を開発し、様々な生体分子・細胞・工学ナノ材料に応じたインターフェイス分子の迅速な適応・進化を可能にする接合分子デザイン工学を提言することを目的とする。そのために、本年度は、下記の研究を行った。1.タンパク質フォーマットを利用した組換えバイオインターフェイス分子の構築異なった機能を有する複数の免疫グロブリンフォールドを機能・構造単位と捕らえ、抗体分子骨格を母体として高次多重特異性を持つ組換えバイオインターフェイス分子を、X線結晶構造解析情報を基に作製するため、抗体の抗原結合ドメインのみをペプチドリンカーで融合した二重特異性抗体を大腸菌発現系で調製し、リンカーの設計によってタンパク質の発現量が変化することが分かった。2.組換えバイオインターフェイス分子の構造・機能解析1.より作製したバイオインターフェイス分子の構造解析をX線結晶解析などによって行う検討を始めた。細胞架橋用バイオインターフェイス分子については、単独結晶化による構造解析へ向けたサンプル調製の最適化のプロセスを設計した。また、ナノ工学材料特異的抗体断片に関しては、電子顕微鏡によるバイオインターフェイス分子による観察を行うために最適なサンプル調製を見出した。1.がん免疫療法へ向けたがん細胞・リンパ球表面特異的抗体断片の人工選択操作による取得がん細胞とリンパ球を接合するインターフェイス分子の構成要素として、がん細胞とリンパ球表面に特異的な抗体断片を人工選択系により取得する研究を行った。がん細胞に関しては、リンパ球へ結合する抗体断片と融合した際に高親和な機能を発現するフォーマット改良を試みた結果、細胞傷害性を向上させることに成功した。2.ペプチド移植と分子進化成熟操作による材料高親和性抗体の作製ペプチド移植と分子進化工学を組み合わせた抗体取得法を利用して、有機・無機ナノ材料に高親和な抗体断片の取得を行った。その際に、粒子径や表面状態などを変化させて選択操作を行ったところ、特定の結晶面に特異的な抗体断片を取得することができた。3.取得抗体断片の構造・機能解析(1)細胞表面特異的抗体断片:可溶化断片のみから成るEGFRと抗EGFR抗体のFab断片とでの共結晶の作製を行うための蛋白質調製系を確立できた。また、二重特異性フォーマットにおける結合特性を表面プラズモン共鳴と等温滴定カロリーメータで行ったところ、フォーマットの変化は抗原結合特性に影響を与えないことが分かった。(2)ナノ工学材料特異的抗体断片:酸化亜鉛結合性抗体の同位体標識を行った。その結果、NMR測定に十分な濃度を調製することに成功した。そして、NMRを用いて1H-13C二次元NMRを測定したところ、構造解析に十分な分解能を得ることができた。(1)タンパク質フォーマットを利用した組換えバイオインターフェイス分子の構築異なった機能を有する複数の免疫グロブリンフォールドを機能・構造単位と捕らえ、抗体分子骨格を母体として高次多重特異性を持つ組換えバイオインターフェイス分子を、X線結晶構造解析情報を基に作製した。具体的には、抗体の抗原結合ドメインのみをペプチドリンカーで融合した二重特異性抗体とIgG型の抗体骨格を利用した多重特異性抗体の開発を行った。そして、設計された組換え体の調製は最適な発現系(大腸菌,無細胞,バキュロ細胞, CHO細胞)を選択し、高効率なタンパク調製を行った。その結果、融合ドメイン数が2以下では、大腸菌での発現が最も簡便でかつ安定的に組換えタンパク質を調製できた一方、ドメイン数が3以上のものは、大腸菌では、凝集タンパク質からの再生プロセスを用いても十分な収量を得ることが難しい分子種が多く、CHO細胞を用いる必要性があることが分かった。(2)組換えバイオインターフェイス分子の構造・機能解析(1)より作製したバイオインターフェイス分子の構造解析をX線結晶解析などによって行う検討を始めた。細胞架橋用バイオインターフェイス分子については、単独結晶化とともに2つの認識受容体との複合体の共結晶の作製を行った。その結果、バイオインターフェイス分子の特性として構造が揺らいでいる可能性が分かり、結晶化には純度を非常に高く上げて行う必要があることが分かった。また、表面プラズモン共鳴と等温滴定カロリメトリーの測定からナノ接合の構造・機能評価のパラメータ化を行った。その結果、架橋構造の変化のみでは、標的分子自身への結合特性は変化しないことが分かり、最も重要な点は、架橋構造と標的分子を提示しているナノ表面との立体傷害である可能性が示唆された。2.組換えバイオインターフェイス分子の構造・機能解析

1.より作製したバイオインターフェイス分子の構造解析をX線結晶解析などによって行う検討を始めた。細胞架橋用バイオインターフェイス分子については、単独結晶化による構造解析へ向けたサンプル調製の最適化のプロセスを設計した。また、ナノ工学材料特異的抗体断片に関しては、電子顕微鏡によるバイオインターフェイス分子による観察を行うために最適なサンプル調製を見出した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
低容量超音波による血管内皮細胞への情報伝達

本研究の目的は、組織に温度上昇やキャビテーションなどによる障害を与えない程度の低容最の超音波を照射し、血管内皮細胞へ情報伝達を行うことが可能かどうかについて検討することである。直径3cm厚み5mmのPZT平面振動子を直径35mm高さ1cmの円盤状のシャーレ中心に取り付け、インキュベータ中に設置可能なサイズの小型超音波照射装置を作製した。外部の超音波発生装置(ファンクション・ジェネレータ)にて周波数、超音波強度をコントロールし、超音波照射装置に信号を入力した。ウシ大動脈血管内皮細胞(Bovine Aortic Endothelium Cell:以下BAEC)を使用して実験を行った。35mmのディッシュにDulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)と10%ウシ胎児血清を加え、CO2濃度5%、温度37?に設定されたインキュベータ内にてBAECをconfluentな状態になるまで培養した。BAECをPhosphate Buffered Saline(PBS)で2回洗浄した後、カルシウムイオンに対する蛍光色素であるCa gree-1(2μM)を加えて室温で30分間細胞内に取り込ませた。細胞内に取り込まれなかった蛍光色素を洗浄し、DMEM4mlを加えたものをコントロール群と超音波照射群にわけて観察を行った。超音波照射群に対しては周波数1MHzの微弱超音波をディッシュの下方より照射し、蛍光顕微鏡にて経時的な細胞内カルシウムイオン濃度の変化を3分間にわたって観察した。超音波照射群では照射開始直後に約10%の一過性の蛍光強度の上昇が観察され、コントロール群ではこのような上昇は観察されなかった。これは微弱超音波がメカニカルな刺激となり、細胞内でのカルシウムイオン濃度を上昇させたためと考えられた。本研究の目的は、組織に温度上昇やキャビテーションなどによる障害を与えない程度の低容量の超音波を照射し、血管内皮細胞へ情報伝達を行うことが可能かどうかについて検討することである。直径3cm厚み5mmのPZT平面振動子を直径6cm高さ1cmの円盤状のシャーレ中心に取り付け、インキュベータ中に設置可能なサイズの小型超音波照射装置を作製した。対象として培養ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(以下HUVEC)を用いた。35mmディッシュにDulbecco's modified Eagle's mediumと10%ウシ胎児血清を加え、CO2濃度5%、温度37°Cにコントロールしたインキュベータ中にてHUVECを培養した。12時間後にNOの蛍光抗体であるDAF-2DA(diaminofluorescein-2 diacethyl)10μMを溶解したKrebs-Ringer-Phosphate緩衝液(KRP)に取り替え、細胞に色素を取り込ませた。位相差顕微鏡にてHUVECがほぼConfluentな状態に達したことを確認し、DAF-2DAを10μM溶解したKRPに取り替え、インキュベータ中にて超音波の照射を開始した。超音波照射前と60分後に蛍光顕微鏡にて細胞内の蛍光を定量的に観測し、10視野での平均強度にてNO濃度の相対的変化について検討した。超音波60分後では照射前に比較して蛍光強度が7%上昇し、これは有意な上昇であった。この研究成果により、薬物の全身投与ではなく体外から超音波を標的臓器に集中照射することで、冠動脈や脳動脈のスパズム予防や、肺毛細血管拡張による呼吸不全の改善などの新しい治療方法が創出されることが期待された。
Microdialysis法を用いた脳内神経伝達物質の日内リズム

数年来取り組んだマイクロダイアリシス法を確立し、その方法論についての問題点を論文として発表した(Nakahara et al.in Biogenic Amines)。また本方法の応用として線条体と前頭葉におけるド-パミン系の遊離調節機構について比較し、従来の方法では明確化されなかった前頭葉におけるド-パミン系遊離の調節の可能性を発表した(Ozaki et al.in J of Neurochemistry)。ついで脳内自己刺激行動において側坐核ド-パミン系が関与しており、ド-パミン取り込み阻害剤を併用することによって顕在化させうることを発表した(Nakahara et al.in Brain Research, Nakahara etal.Neuroscience Letters)。上述したこれまでの実績を踏まえた上で、ラット視交叉上核のインド-ルアミンをマイクロダイアリシス法で測定を始めた。手術侵襲から回復した段階で、自由行動下に視交叉上核のセロトニンと5-ヒドロキシインド-ルアミン酢酸の基礎値の測定に成功し、アンフェタミンに対するインド-ルアミンの反応を確かめ、用量依存的にセロトニンがアンフェタミンによって遊離が行われることを実証しつつある。今後、マイクロダイアリシスの利点である行動のモニタ-を併用し、行動のリズムと視交叉上核のインド-ルアミンのリズムの関係について検討する予定である。また名古屋大学農学部のグル-プとも共同し、鳩の松果体でのマイクロダイアリシスを始めており、生理的状態で松果体のメラトニンを経時的に計測する手法を確立しつつある。今後、鳥類でのリズムを本方法論を用いて検討を加えたいと思っている。
硝子体ゲルおよび硝子網膜界面における分子構築の研究(硝子体膜病変への応用)

本研究では、主に凍結割断ディープエッチング法を工夫してニホンザル,ウサギ,マウス眼の硝子体ゲルの微細構造を三次元的に観察した,さらに網膜内境界膜の微細構造とその荷電関門に関する構造を超薄切片法による透過型電子顕微鏡にて観察した。まず凍結時の氷晶やグリコサミノグリカンの流出などの問題を解決するため、cetylpyridinium chloride(CPC)を固定液に追加して固定し氷晶防止剤なども工夫した。その結果硝子体線維が形成する格子に絡まるグリコサミノグリカンの細線維が明瞭に観察され硝子体ゲルの2重網目の微細構造を形態学的に証明できた。網膜内境界膜近傍では、硝子体線維同士を連結する梯子状の細い線維も認められた。またニホンザル眼においては、眼球の部位別による硝子体線維の走行の違いが観察できた。一方では臨界点乾燥表面レプリカ法による網膜内境界膜の観察を行った。その結果網膜内境界膜は、網目構造をとり分子篩が三次元的に重なり広がっていた。さらに凍結割断ディープエッチング法による無固定網膜内境界膜の観察も行い分子篩が観察された。一方陽イオントレーサーのポリエチレイミン(PEI)による浸漬法を用いて網膜内境界膜の陰性荷電部位を透過型電子顕微鏡で観察した。その結果PEI粒子は網膜内境界膜の透明層中にほぼ均等に分布付着していた。眼球周辺部では網膜内境界膜の透明層におけるPEI粒子の分布は疎で、不均一に付着していた。網膜内境界膜の緻密層にはPEI粒子の付着は認められなかった。一方硝子体ゲルの傷害モデルとして生体眼に振動を負荷し硝子体の粘度や微細構造に変化が生じることも観察した。さらに硝子体腔内に自家血を注入し、その後に生じた網膜内境界膜の亀裂やミューラー細胞の基底部遊離面の変化も確認した。今後はこれらの方法を駆使し増殖性硝子体網膜症や増殖性糖尿病性網膜症における網膜内境界膜の変化やミューラー細胞の態度につき観察していく予定である。硝子体ゲルの真の微細構造を観察するため、凍結割断法を工夫し、硝子体線組の走行と硝子体線維間の構造について観察した。材料としてマウス眼の全硝子体、一部はニホンザル眼および白色ウサギ眼の硝子体組織片を用い、眼球は、セテルピロディニウムクロライドを固定液に加えて固定した。凍結眼球は、凍結割断ディープエッチング法でレプリカを作成し、一方ではDMSO凍結割断レプリカ法でレプリカを作成し、透過型電子顕微鏡にて観察した。その結果硝子体線維は、直線的に走り、密な格子を形成していた。低濃度のエタノール浸漬によるディープエッチング法を用いることにより、硝子体線維の格子に絡むグリコサミノグリカンの細線維が明瞭に観察された。このことにより硝子体腔内における2重網目の微細構造を証明することができた。一方では、コラゲナーゼ処理と臨界点乾燥表面レプリカ法を用いウサギ眼の網膜内境界膜の超微細構造を観察できた。とくに網膜内境界膜の硝子体側を広範囲かつ鳥瞰図的に観察できた。すなわち網膜内境界膜は、網目構造をとり、篩が三次元的に重なり広がっていた。篩の孔の直径は、1025nmに集中し、部位になる有意差は認められなかった。

網膜の周辺部では、硝子体線維が密に残り、網膜内境界膜の透見できる部分が非常に少なく、分子篩の分布が疎でその形も他と多少異なっていた。今回の結果より、これらの網膜内境界膜の篩は、網膜硝子体間の物質の移動の関門の役割を果たすと考えられた。篩の分布が疎で硝子体線維が密な網膜周辺部より網膜後極部などで物質の移動がより多く行われているのではないかと推察した。また網膜内境界膜の分子篩孔は、無固定試料の凍結割断ディープエッチング法でも確認することができた。本年度は主に微細振動による硝子体の変化ことに硝子体の粘度と硝子体ゲルの微細構造の変化について検討した。ウサギ・マウスおよびモルモットの眼球に間接的あるいは直接的に振動を加え、その粘度の変化を測定した。また振動を与えた時に生じる硝子体ゲルの形態的変化を、フリ-ズフラクチャ・ディ-プエッチング法を用い電顕的に観察した。また今年度より新たに開発したt-ブチルアルコ-ルを用いての凍結割断法を用い走査型電子顕微鏡で硝子体ゲルの構造の変化を観察した。ウサギ眼では、無麻酔にて、他の動物では、全身麻酔下で、ペンシルミキサ-を用い、約6000C/Sの振動を眼窩上縁に5分間与えた。ウサギ眼では市販のマッサ-ジ器にて50007000C/Sで5分間、眼窩上縁または眼瞼上に振動を与えた。振動を与えた直後および34日目に眼球を摘出し、直ちに眼球を切割し、全ての硝子体を採取し、粘度を測定した。粘度の測定には、昨年と今年度に購入したE型回転式粘度計(0.8°コ-ン)を用いて行った。一方振動を与えた直後のマウスの眼を摘出し、上記の方法で硝子体ゲルの変化を透過型および走査型電子顕微鏡で観察した。振動を与えた直後の硝子体の粘度は、粘度計の低回転側で有意に低下していた。また眼瞼に直接振動を与えたものでは、やはり低回転側で著明な粘度の低下を認めた。一方振動を与えて34日目のものでも、有意な硝子体粘度の低下を認めた。また振動を与えた直後のマウス眼をフリ-ズフラクチャ-・ディ-プエッチング法で観察すると、硝子体線維の正常な格子構造が保たれているところに混じって、硝子体線維の格子構造がなくなり、硝子体線維も屈曲し、硝子体線維間が空虚なところがみられるなど多彩な変化を生じていた。今回の実験により硝子体腔への振動刺激により、硝子体ゲルは、形態的にも粘度の点においても、変化をきたすことが判明した。本年度は主に網膜内境界膜を中心とした網膜硝子体間の荷電関門を形態学的に証明することにした。網膜内境界膜の荷電状態を形態学的に観察するためには,浸漬法が可能なトレ-サ-物質が必要である。そこで今回polyethylenemine(PEI)という陽イオントレ-サ-を用いて,PEIの分子量,濃度,浸漬時間,使用する緩衝液および固定液らを変えて検討し,超薄切片法,透過型雲顕により網膜内境界膜の陰性荷電部位の観察に成功しまた眼球の部位別に陰性荷電部位の状態を検討できた。摘出した成熟白色家兎の眼球を視放部,髄翼部,周辺部に分けてPEI溶液に浸漬した。前記のごとくPEIの分子量,濃度,浸漬時間,緩衝液を変えて比較した。使用する薬剤はすべてpH7.4,400mOsmに調整した。超薄切片を作成し,透過型電子顕徴鏡にて観察した。結果は、視放部と髄翼部では,分子量1800のPEI粒子が網膜内境界膜の緻密層から透明層にほぼ均等に付着していた。PEI粒子の直径は平均20mmで透明層では、4050mmの間隔で並んでいた。