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熱帯熱マラリア原虫の47および23KD分子の純化と防御抗原性に関する研究

今、分子生物学があらゆる分野に応用される時代となってマラリア原虫からワクチン候補物質を特定する作業の原理と方法が遺伝子工学にほぼ落ちつくに至っている。本研究はそのような趨勢の中で進められるマラリアワクチン開発研究に際して、まず疫学および臨床上の検討からマラリア原虫の分裂体の細胞膜表面に表現される47kDポリペプチドが急性熱帯熱マラリア患者の血清中で防御免疫誘発上一定の役目をもつことが想定されることに端を発し、この分子を純化し、免疫学的解析を加えることを目標に進めてきた。さらにフィリピンにおける血清疫学調査の結果23kDポリペプチドは脾腫を示し慢性化した熱帯熱マラリア患者の血清と特異的に反応する抗原物質であることも見いだされた。このようにして特定された原虫抗原はワクチン候補として検討に値するためタンパク化学の技法により純化精製する試みが開始された。まず多量の熱帯熱マラリア原虫がin vitro培養により準備され可溶化処置の後model 491 Prep Cellのシステムにより電気泳動度の差によりポリペプチドを8.5mlずつ40のフラクションを分両した。得られた各フラクションから15μlをサンプリングし薄層ポリアクリルアミドゲル電気泳動キットExcelGel SDS gradient 8-18 (Pharmacia Biotech)で泳動度を測定した。分子量47kDを示す2832番のフラクションをプールし抗47kDモノクローナル抗体をカプリングされたAffi-Gel Hz Immunoaffinityに捕捉されたポリペプチドを回収し凍結乾燥させて保存した。なお2次元電気泳動法により目標となるタンパクを単離純化する方法を最初に計画したが、この実験には、予想をはるかに上回る大量の培養原虫を必要とするため、現在実験を保留してある。保存されたポリペプチドは患者からの白血球と反応させin vitroの系で免疫反応を営ませる機会を待っているところである。47kD分子に対する2つのモノクローナル抗体PfIC5およびPfIID5を用いて、その分子の局在を共焦点レーザー走査顕微鏡により検討したところ、PfIC5は分裂体内のメロゾイトの中央部分のエピトープを認識し、PfIID5はメロゾイト表面抗原を認識している像が得られた。2つのモノクローナル抗体による局在像の違いは、3つの異なった分離株(SGE1株:ガンビア、FCB2株:コロンビア、TAK株:タイ・ミャンマー国境地域)間で同じ結果を得た。よって、2モノクローナル抗体によって捉えられたエピトープは、分離地域が異なった原虫間で共通に提示されている分子であることが示された。また、PfIID5よって認識される分子の局在はメロゾイト表面にあることから、免疫システムにそれが取り込まれやすいであろうことが示唆された。SGE1株を6年度申請設備備品のマルチガスインキュベータ-を用いて大量に培養することに成功し、その寄生赤血球より熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク分子をグラムオーダーで得た。得られたタンパク分子をSDS処理し、電気泳動後ウエスタンブロット法により転写された抗原分子と流行地で採取した急性期および慢性期患者血清とを反応させ、47kD、23kDのそれぞれの分子との反応性を確認した。さらに6年度申請備品のプレップセルシステムを用い、上記抗原タンパク分子の連続分取を開始した。分取したタンパク分子画分につきSDS-PAGE、HPLCによりその純度を確認している段階にある。今後純化された抗原分子が大量に収集できたことが確認されれば、即刻ヨザルより得たリンパ球と反応させ、幼若化現象に始まる免疫原性に関する研究を開始することができる段階にある。

平成7年度において長年続けられた本研究はようやく最終段階に到達した。本研究の目標は、マラリア流行地から得た患者血清を(1)急性期で臨床症状を呈している患者からの血清(2)マラリアが慢性化し脾腫が顕著な患者で原虫に感染しながら臨床的に発症していない患者からの血清グループに分けて、おのおのの血清が特異的に反応する熱帯熱マラリア原虫分画抗原をWesternblot法により検出すること、さらに進んで検出された分子量のマラリア原虫抗原を純化された物質として一定量を用意すること、そしてその物質がマラリア抗原として防御に関与した免疫反応を生体に惹起させることができるかどうかをまずin vitroの系でしらべ、有望な結果がみられた場合ヨザルを使ってin vivoの実験を進め、マラリアワクチン候補抗原を特定すること、以上のような研究計画が立てられ実施されてきた。まず、(1)の血清を使い、急性マラリアを乗り切るときに47kDポリペプチドが、何らかの免疫に関与していることが判明したため、熱帯熱マラリア原虫からDNAをとりだし、cDNAあるいはgDNAのライブラリーを作った。用意されたライブラリーを使って47kDポリペプチドを作り出すことは、結果的に失敗に終わった。そこで今般はタンパク化学の技法を採用し大量培養された原虫から47kDポリペプチドを純化単離し、さらに得られた分画をaffinity chromatographyにより抗47モノクロナール抗体に結合する分子をゲル内に捕捉し余分な成分を洗い流したのちにelution bufferを使って回収した。このようにして得られた分子は現在、マラリア患者から採取した抗原提示細胞とリンパ球よりなる培養系に作用させて、in vitro系での免疫反応を確かめるべく現在保管されている。慢性マラリア状態を反映する23kDポリペプチドについては、Prp-cell econo-automationsystem (Bio Rad)により電気泳動分画された状態で保管されてある。
女性聴覚障害者の職業選択と就労に関する研究

2006年に採択された国連の「障害者権利条約」、UNESCOのEducation for Allの提唱、教育基本法の改正、あるいは、大学や企業の社会的責任の高まりに見られるとおり、近年、高等教育における障害者支援の問題は、わが国において重要な政策課題の一つに掲げられている。本研究はこうした流れと呼応して、高等教育卒業後における女性聴覚障害者の就労に視点を当てた研究である。そこで本研究では、女性聴覚障害者(18名)にインタビューを実施し、障害の受容のプロセス、アイデンティティ、就労、家庭、教育・生活環境等におけるバリアについてどのようなものがあるかを明らかにした。最終年度となる平成25年度は、前年度に実施したインタビュー調査の分析を行った。インタビューは、本研究の目的に沿って、高等教育を卒業し現在働いている聴覚障害をもつ女性(18名)に対して行われた。今回の調査協力者18名は、26歳から50歳までの高等教育を終えた有職者であった。彼女らは、経済的自立や自己実現を求めて就職したわけであるが、就職後に数多くのバリアを経験している。また、ライフステージの変化(具体的には、結婚・出産・育児・離婚)によってやむなく、離職・転職を経験している人もいた。障害女性の場合、条件が整備されていない状況で働き続ける要因のひとつにパートナーや家族の理解を得られるかどうかが大きなポイントとなっている人もいた。現在の厳しい就職状況において、例え、障害をもち、なおかつ女性でありながら就職できたとしても、個々人の事例からは、すさまじい努力を積み重ねている様子が読み取れた。このことは、聴覚障害女性が働き続けられるかどうかの条件の大きな理由として、個人の努力や能力に大きく委ねられている側面があることを示している。今後は、「就労」の本来の意味を女性聴覚障害者の視点からとらえ直し、課題を発信していくことが重要である。そのためには障害をもつ女性がどのような課題を抱えているかをより一層、ジェンダー視点から明確にしていく必要がある。なお、これらの研究成果は、日本社会福祉学会第61回秋季大会(北星学園大学)において報告した。報告タイトルは、「女性聴覚障害者の職業選択と就労に関する研究」(報告者:吉田仁美、2013年9月)である。また、インタビュー調査を報告書としてまとめた。報告書タイトルは、「女性聴覚障害者の職業選択と就労に関する研究調査報告書」(発行者:吉田仁美、2014年3月発行)である。平成24年度は、主にインタビュー調査を実施した。調査協力者は1215名程度を予定していたが、最終的には18名になった。調査協力者は、きこえない女性の団体“Lifestyles of Deaf Women"、DPI女性障害者ネットワークのメーリングリストで参加者を呼びかけ、募集した。23名からの応募があったが、調査参加者の条件(高等教育卒業後に就職し、職業経験が2年以上の女性聴覚障害者に限定し、年齢構成は20代後半から就職活動の時期が男女雇用機会均等法対象者である40歳代半ばまでとした)に当てはまる18名の女性聴覚障害者から協力を得た。調査実施時期は平成24年9月から平成25年の3月までであった。調査方法は、すでに上記でふれたとおり、インタビュー調査(半構造化インタビューを基本とし、一部デプスインタビューを取り入れる)を用いた。吉田がインタビュー対象者の希望場所に伺いインタビュー調査を行うことにしていたので、調査対象者の自宅、職場にうかがうこともあったが、多くは大学の研究室(大学2号館東棟5T45)で行われた。インタビューは吉田による手話、口話(補聴器を用いた聴覚活用をあわせた会話手法)、音声会話が中心であり、場合によっては筆談等で補足した。その際、手話でのインタビューの場合は記録用にビデオカメラで撮影し、会話が可能な聴覚障害者を対象とした場合には、ICレコーダーで記録をとった。これについてはすべて調査協力者の了解を得ている。以上の調査実施にあたって、昭和女子大学倫理委員会に申請し調査の許可を得ている。聴覚障害に限定した理由は、聴覚障害者の就労に関する研究が非常に少なく、さらに女性聴覚障害者に限定するのは、女性であることと、障害をもつことで、社会において二重の不利益を被り、自立がより困難な状態におかれている事実があることによる。近年、女性聴覚障害者の高等教育進学率の高まりに伴い、卒業後の活躍の場が広まってきている。しかし、彼女らの就労の実態を捉えた研究は国際的にみても数少ない。本研究はこうした問題意識の基本に立ち、聞き取りインタビュー調査を中心に行われた。

現在は、調査のデータ分析を実施しているが、今回の調査協力者はすべて高等教育卒業以上であり、なおかつ職業にありついている人たちであった。18名のうち、5名は企業勤務(すべて一部上場企業)、5名が高校・大学の教職員、フリーランス・自営業が3人、NPO等の非営利団体が3名、公務員が1名、病院勤務が1名という結果であった。そのうち、教員、看護師等の専門職で勤務している人が5名であった。専門職として働いている5名は大学入学前からのキャリアデザインが明確である一方で、それ以外の職種(企業、フリーランス等)は、大学卒業後に転職を経験している人が多くいた。専門職についている5名のうち4名は大学院修士課程あるいは博士後期課程修了者であり、高学歴者が多くいたことも特徴的であった。また年齢は30歳代が一番多く11名、20歳代が5名、40歳代が2名という構成であった。平成25年度は、調査の分析を行い、日本社会福祉学会等で発表、論文の投稿を実施する。調査協力者には、異なる三つのタイプ「ろう者」「ろう・難聴者」「難聴者」に分類されるが、それぞれの三つの異なるタイプがどのような職業選択を行い、就労後のキャリア形成にどのような特徴がみられるのか、アイデンティティとの関連はあるのか、あるいはそれほど差異はないのかを分析・考察する。なお調査分析のポイントは以下のとおりである。(1)個々人の聴力レベル、聴覚障害者として自身のアイデンティティはどのようなものであるかを確認し、(2)現在の仕事内容について質問し、(3)仕事に就くまでのプロセスや就労後のキャリアについて、仕事内容や職場の人間関係等、(4)そのほか聴覚障害を持ちながら働くことに際し、どのようなバリア(障壁)があるのか、「人と環境の相互作用」の視点からアプローチする。これらの一連の過程において当事者視点からのアプローチにより掘り下げを行う予定である。さらに加えて、本研究はジェンダー、女性視点による分析・考察を行うので、国際的、国内的な障害者ジェンダー統計整備についても同時に調べ、整理する予定である。障害者ジェンダー統計については、経済統計学会ジェンダー部会で発表予定である。平成25年度の研究費使用計画は以下のとおり予定している。1設備備品(文献資料)100,000円、2消耗品(論文別刷等)100,000円、3旅費交通費(成果発表)日本社会福祉学会等100,000円、4人件費謝金(英文校閲等)200,000円、5その他(印刷・通信費)504,000円である。1の文献資料は、研究に必要な国内・国外の文献を使用予定である。2の論文印刷は成果発表した論文の印刷抜き刷りに使用予定である。3の旅費交通費は、日本社会福祉学会等(北海道:北星学園大学)で発表予定のために使用予定である。4の人件費は論文を英文で作成予定のため、人件費謝金に使用予定である。5の印刷製本費は平成24年度に実施した調査報告書の作成と協力者及び希望者に郵送予定の通信費として計上した。
ペリ環状反応を活用した生物活性多置換カルバゾールアルカロイドの合成研究

以下の三項目について研究を行った。・2-(アレニル)インドールをジエンとした[4+2]環化反応による多置換カルバゾール合成を再検討した。Lewis酸の添加あるいは新たな試みとしてマイクロ波照射下で[4+2]環化付加反応を行ったが、α,β-不飽和ケトン体が得られるのみであった。これは、基質中のアレン部のエノールエーテルが反応条件中で不安定であることが、原因の1つと考えられる。続いて、より安定な2-(アレニル)インドールを設定し、その合成を検討したが達成することができず本ルートでのカルバゾール合成は断念した。・neocarazostatin Bおよびcarquinstathin Aの全合成に対して、次の方法を実施した。まず、アレンを組込んだ共役ヘキサトリエン型熱電子環状反応を活用し、カルバゾール骨格構築後、まずカルバゾールの1位ヘアセトニル基を導入した。これをNaBH_4還元に付し(R,S)-2-ヒドロキシプロピル基に誘導した後、酵素を利用した不斉アセチル化反応を検討した結果、2種の光学活性な1-(2-ヒドロキシプロピル)カルバゾールを得る条件を確立できた。現在、最終工程を検討しており、不斉全合成を達成するとともに新たな知見を得た結果について論文発表を準備中である。・epocarbazolin A、Bの全合成に対し、アレンを組込んだ共役ヘキサトリエン型熱電子環状反応を活用し、カルバゾール骨格構築を計画した。この場合、4,7-ジ置換インドール誘導体が出発原料として必要となる。そこで、まず種々合成ルートを検討した結果、7-methoxyindole-2-carboxylateより望む4,7-ジ置換インドール誘導体を合成するルートを確立できた。続いて、得られた4,7-ジ置換インドール誘導体より4行程を経て所望のカルバゾール骨格合成を達成できた。現在全合成を継続中である。本研究の目的は、(1)2-(アレニル)インドールをジエンとして設定し、ジエノフィルに種々のアルキン類あるいはアルケン類を用い、[4+2]環化反応を行うことで多置換カルバゾール骨格の新規合成法の開発を行う。(2)ペリ環状反応[(1)の手法あるいは当研究室で推進中の熱電子環状反応]を活用し、一連の抗酸化作用を持つカルバゾールアルカロイドの全合成を行い、抗酸化剤としてのリード化合物探索を行う。平成13年度は、以下の3項目を実施した。(1)2-(アレニル)インドールをジエンとした[4+2]環化反応の条件検討を実施し、カルバゾール骨格合成法の確立を目指した。その結果、本反応条件(Lewis酸を使用)において、基質であるジエンが不安定であるため現段階では目的とするカルバゾール骨格合成を確立するに至っていない。基質となるジエンの置換基等を変更し検討中である。(2)別ルートとして当研究室で開発したアレンを含む共役ヘキサトリエン型熱電子環状反応を鍵反応として利用する方法にて、標的化合物として設定しているneocarazostatin Bの不斉全合成を実施した。現在天然物の骨格合成および酵素を利用したエステル交換反応により本基質の1位置換基上にあるキラルアルコール部の合成法は確立し、最終ステップを検討している段階である。(3)次年度全合成を実施する予定のepocarbazoline類およびcarbazomadurin類の出発原料となる4,7-ジ置換インドールの合成ルートの開発を検討した。その結果、4位のヒドロキシメチル基導入の手がかりとなる4-ブロモ-7-メトキシインドール体を合成することができた。
高強度合金の低温疲労において形成する転位下部組織と応力集中のモデル化

代表的な高強度金属材料において観察される内部疲労破壊について、これまでの研究をまとめ、モデルを発展させた。また、耐疲労破壊設計指針を提案した。繰返し回数が増すにつれて、ある部位の局所応力(内部応力場)が大きくなり、それを解放するために新たな塑性変形、あるいは割れが生じる。実験と解析結果より、引張内部応力場は{0001}上に蓄積容易であると分かった。その方位は起点部として報告されている結晶面と一致する。一方、せん断内部応力場は、起点部と報告されている{0001}面上ですべり集中を誘起し、転位を導入する。以上の結果から微小き裂は、特定のすべり面上に導入されるすべり集中(転位群=欠陥)を局所的な引張内部応力場が開口応力することにより生じると指摘した。転位列長さが長くなるほど、局所応力は大きくなる。そこで、堆積長さを短くして、局所応力の最大値を小さくするために、加工熱処理による結晶粒の微細化をnear-α型Ti合金のモデル材に施した。ただし、加工材は繰返応力軸方向に{1010}垂直方向が配向した集合組織を有する。モデル材と加工材の疲労特性を293Kと77Kで評価した結果、293Kで、モデル材と比較して加工材の高サイクル疲労強度は約10%上昇した。一方、77Kでは高サイクル疲労強度は向上しなかった。77Kで破断した試験片の内部疲労き裂発生点は、同一結晶面で割れた結晶粒{1010}が集合しており、集合組織の影響を反映している。したがって、局所応力集中低減による微視割の抑制のみならず、微小き裂の進展を阻害することも必要である。内部疲労き裂発生を回避して高サイクル疲労強度向上を図るには、マクロスケールでの塑性変形の均一化を得るように転位の堆積長さを短くする結晶粒の微細化の他に、集合組織の影響のない結晶方位のランダム化が求められる。代表的な高強度合金において観察される内部疲労破壊形成のモデル化を行った。α-チタン合金(hcp構造)の内部疲労破壊起点部である{0001}ファセット面上では、塑性変形跡が観察される。これは、微小き裂の発生後、応力拡大係数範囲ΔK_Iの下限値ΔK_<th>以下で塑性変形に起因した微小き裂のき裂進展があることを示唆する。き裂を開口するモードとして、引張ならびにせん断の応力場を考え、それぞれの応力場に対する塑性変形を評価した。その結果、{0001}面上で、引張応力場は蓄積されるが、塑性変形は生じず、ファセット面上で観察された微小き裂進展時の塑性変形跡は引張応力場(Mode I)に起因する現象ではないことが分かった。せん断の応力場が存在する時、{0001}<11-20>の活動が非常に活発であり、転位によるシールディングが、き裂先端部で生じ易い。従って、ファセット面上で塑性変形を伴うき裂進展は、すべり変形によって形成される表面ステップと同様の現象で、せん断モード(Mode IIとMode III)において、{0001}<11-20>の活動によりき裂先端部で新たな面を形成させ、微小き裂を進展させた可能性がある。また、高強度化したオーステナイト鋼(fcc構造)においても、結晶粒界を起点部としたファセットが観察される。そこで、ひずみ不整合による粒界割れの新たな解析モデルを用い、評価した結果、粒界面を引き離そうとする応力場の存在を示した。

内部疲労き裂発生を回避して高サイクル疲労強度向上を図るには、マクロスケールでの塑性変形の均一化を得るように転位の堆積長さを短くする結晶粒の微細化の他に、集合組織の影響のない結晶方位のランダム化が求められる。
宇宙ステーション用画像分光望遠鏡の地上積極運用による共同利用環境構築と月地質観測

画像分光望遠鏡の本格運用を開始した。ユーザーのメーリングリストを立ち上げ、観測協力者および観測テーマを募り、海外遠征観測チームを組織した。観測地は大気や雲の影響が少ない米国ハワイ州マウイ島のハレアカラ山頂である。大阪大学での観測訓練の後、8月と12月の2回、ハワイへの観測遠征を行った。参加者は大阪大学5名、JAXA2名、秋田大学、東北大学、神戸大学、九州大学、JFEテクノリサーチ社それぞれ各1名の合計12名となった。現地ではハワイ大学のMEES太陽観測所の観測支援施設、および、東北大学の岡野研の天文ドームを使用させていただき、画像分光望遠鏡本体は日本からその都度空輸した。準備や悪天候を除いて夏冬合計で15夜分の月面分光データを得た。解析が終わったテーマから順次公表する予定であるが、ここではまもなく国際誌に発表予定の例を二つあげる。ひとつは月面の高精度の反射率マップを製作することに成功した。米国のクレメンタイン衛星の成果として公開されている月面反射率画像は実際よりも反射率が高すぎることがわかり、2007年の日本の月探査機のカメラ露光時間の運用計画立案に貢献できる。また、月の玄武岩の反射率スペクトルの詳細な比較により、リモートセンシングとしては世界で初めて、輝石のFe/Mg比の違いによると思われる吸収ピークのシフトを検出することに成功した。洪水玄武岩の中には噴出の過程でFe/Mg比が変化しているものがあることがわかり、月マントル中で部分溶融度が高い層があったことを示唆するデータが得られた。一方、月科学の成果の公開・普及のためのウェブサイトを整備した。本サイトでは、本研究課題で得られた成果から公表可能になったもの、および大阪大学屋上に整備した観測ドームより得られる新たな情報を順次公開する。そして、2007年の国産月探査計画が終了するまで、月科学の普及のために運用を続ける。1.宇宙航空研究開発機構筑波宇宙センターの積分球を使用して、月面観測用画像分光望遠鏡ALISの輝度較正試験を行った。較正により、観測対象物の輝度を正確に測定できるようになった。2.米国ハワイ州マウイ島にて17年度の月観測の準備を行った。ハワイ大学のハレアカラ山頂観測所を借りる手続きを行い、山頂設備の試用や観測所から観測可能な方向の測定を行った。3.ハレアカラ山頂に屈折式望遠鏡と冷却CCDカメラを運び、恒星を時間を変えて連続観測した。観測画像から大気の透過率を計算したところ、大気の透明性と安定性が極めて高く、17年度の月観測が問題なく行える環境にあることが確認できた。4.大阪大学理学部屋上にALIS用の電動格納庫を設置した。また、ALISの月観測と同時に恒星を観測し大気の状態をモニターするなど、多目的な支援観測を行う液晶フィルタ式望遠鏡も設置した。当初は単波長望遠鏡を4連装とする予定であったが、液晶フィルタ式に変更し、1本の望遠鏡で多数の波長が測定できるように機能を上げた。5.大阪で月及び恒星の観測を開始した。大阪の空はハワイの高山に比べて遥かに光の透過率が低いが、数回の測定のうち1度は透過率は低いものの変動は少ない日があることがわかった。歩留まりは悪いが、大気が安定していればプラスマイナス数%以内の精度で月測光観測が可能であることがわかった。6.筑波と大阪にてALISによる月観測を行いデータをユーザーに配布した。次年度のハワイ観測に備えて、各ユーザーがそれぞれの解析目的にあわせた解析ソフトの開発を行った。
レプチン抵抗性における細胞内シグナル異常の解明及び抗肥満薬スクリーニング系の開発

レプチントランスジェニックマウスはわずか1週間の高脂肪食負荷で、体重が肥満の表現型を示していないにもかかわらず、レプチン抵抗性を示した。さらにこの時、脳内神経核でのレプチン反応性を神経活性化マーカーやレプチンの細胞内シグナル分子などの免疫組織染色で解析したところ、レプチンの主要な作用標的である弓状核においてはレプチン抵抗性が生じているが、海馬や延髄の孤束核では抵抗性が生じていないことを明らかにした。海馬は長期の高脂肪食負荷でレプチン抵抗性を来すことが報告されており、レプチン抵抗性の出現には神経核ごとの感受性、あるいは出現のタイムコースに違いがあると考えられた。本研究においては、レプチン抵抗性モデルである高脂肪食負荷レプチントランスジェニックマウス(以下Tgマウス)を用いて、レプチン抵抗性状態における、神経核ごとの異常、細胞内シグナル伝達分子ごとの異常を検出しその病態生理的意義を明らかにしたうえで新規レプチン抵抗性改善薬スクリーニングに活かすことを目的としている。研究初年度においては、レプチンTgマウスがわずか1週間の高脂肪食負荷で、体重が依然としてやせの表現型の状態で、外因性レプチンに対する摂食抑制作用、主要神経核における神経活性化マーカーであるc-fosの発現をアウトプットとしてレプチン抵抗性を呈していることを明らかにしたのに続き、当該年度においてはレプチンの主要な細胞内シグナルであるpSTAT3、pERKについても主要な神経核においては同様な変化が起きていることを確認した。またこの際cfosとpSTAT3で検出した際の結果の違いにより、このモデルでレプチン受容体陽性細胞ではないニューロンでレプチン反応性が低下している神経核を新たに同定した。さらに本モデルの特徴をより詳細に明らかにするために、当該年度においては、既報での代表的なレプチン抵抗性マウスモデルである長期間(8週間及び16週間)の高脂肪食負荷野生型マウス、持続する高レプチン血症と老化の要素を持つ、レプチンTgマウス老化モデルにおいても同様の検討を行なった。本研究のモデルである1週間の高脂肪食負荷レプチンTgマウスは、長期間の高脂肪食負荷マウス、持続する高レプチン血症マウスとは、抵抗性をきたす神経核のパターンが異なっていることを明らかにし、レプチン抵抗性を来す因子により抵抗性の起こり方が違うことを明らかにした。この際、弓状核はいずれのモデルにおいても障害を受けていたことから、スクリーニング系の構築においては弓状核を対象をすることが最適であることを明らかにした。本研究においては以下のことを示した。肝臓でレプチンを正常の約5-10倍に過剰発現するレプチントランスジェニックマウス(Tgマウス)は通常食ではやせの表現型を示すが、わずか1週間の高脂肪食負荷で、体重が肥満の表現型を示していないにもかかわらず、外因性レプチンに対する摂食抑制作用が減弱していた。これに対して1週間の高脂肪食負荷野生型マウス、通常食のレプチンTgマウスでは外因性レプチンに対する摂食抑制作用は保たれており、高レプチン血症と高脂肪食の相互作用でこのような表現型が出現したと考えられた。この時、免疫組織学的検討において、主要神経核における神経活性化マーカーであるレプチン誘導性c-fosの発現,レプチンシグナルの主要経路であるSignal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3)のリン酸化が減弱しており、このマウスでは肥満がないにもかかわらずレプチン抵抗性を呈していることを明らかにした。さらにこの時レプチンの主要な作用標的である弓状核においてはレプチン抵抗性が生じているが、海馬や延髄の孤束核では抵抗性が生じていないことを明らかにした。海馬はレプチンの抗うつ作用に重要と考えられており、海馬においては16週間の高脂肪食負荷でレプチン抵抗性が生じるとの他の研究者からの既報がある。また、孤束核は末梢からの迷走神経入力の統合点と考えられており、孤束核でのレプチン受容体のノックダウンが肥満の表現型を示すとの他施設の既報などと合わせて考慮すると、レプチン抵抗性の出現には神経核ごとの感受性、あるいは出現のタイムコースに違いがあると考えられた。このような神経核ごとの反応性の違いはレプチン抵抗性の表現型を考えるうえで非常に興味深いと思われた。本研究においては、著しいレプチン抵抗性モデルである高脂肪食負荷レプチントランスジェニックマウス(以下Tgマウス)を用いて、レプチン抵抗性状態における、神経核ごとの異常、細胞内シグナル伝達分子ごとの異常を検出しその病態生理的意義を明らかにしたうえで新規レプチン抵抗性改善薬スクリーニングに活かすことを目的としている。

研究初年度においては、レプチンTgマウスがわずか1週間の高脂肪食負荷で、体重が依然としてやせの表現型を示しているにもかかわらず、外因性レプチンに対する摂食抑制作用、主要神経核における神経活性化マーカーであるc-fosの発現をアウトプットとしてレプチン抵抗性を呈していることを明らかにした。さらにこの時レプチンの主要な作用標的である弓状核においてはレプチン抵抗性が生じているが、海馬や延髄の孤束核では抵抗性が生じていないことを明らかにした。海馬はレプチンの抗うつ作用に重要と考えられており、海馬においては16週間の高脂肪食負荷でレプチン抵抗性が生じるとの他の研究者からの既報がある。また、孤束核は末梢からの迷走神経入力の統合点と考えられており、孤束核でのレプチン受容体のノックダウンが肥満の表現型を示すとの他施設の既報などと合わせて考慮すると、レプチン抵抗性の出現には神経核ごとの感受性、あるいは出現のタイムコースに違いがあると考えられた。今後この神経核ごとの違いをさらに網羅的に解析し、レプチン抵抗性に重要な神経核を明らかにしていく。本研究の最も重要なポイントであるモデルマウスの妥当性の確認を研究初年度で確認したのに引き続き、当該年度においてはそれをさらに詳細に検討するとともに他のモデルとの比較も行っており、本研究の基盤をより強固に固めたと言える。すなわち、本研究のモデルマウスでやせの表現型にもかかわらずレプチン抵抗性を来たすことが確認できており、肥満の影響なしにレプチン抵抗性を解析するという、スクリーニング系確立のために重要なポイントをクリアしている。さらに、他のモデルとの比較で抵抗性惹起因子ごとに抵抗性が起こるメカニズムが違っていることを示唆する結果を得ているほか、ターゲットとなる神経核について最も重要と考えられる弓状核について確認できているとともに、新たな神経核も同定できており、こちらも十分な進展と考える。またFRETプローブによる検出系については本研究計画申請時にはFRETプローブを恒久的に十分量発現する細胞株の作成は不可能とされていたため、細胞株を使用した研究は計画中に含んでいなかったが、この間の方法論の発展により、恒久的に十分なFRETプローブの発現量を細胞レベル、生体レベルにおいて維持する方法が相次いで報告されたことを受けて、現在恒久的安定発現細胞株の作成に取り組んでいる。これに伴い、申請時には生体レベル、脳スライス標本レベルとしていたレプチン抵抗性の解析を、細胞レベルでも行うことが可能となる。対象の神経細胞株としてはカナダのBelshamらの開発した不死化視床下部神経細胞株であるHypoE-44を入手し、基礎的性格のを検討したがスクリーニング系には適さないと判明したため、現在同様のHypoE-41細胞及びヒトのneuroblastoma由来の細胞株であるSH-SY5Yを用いた実験系の構築に取り組んでいる。以上よりおおむね順調に進展していると考える本研究の最も重要なポイントであるモデルマウスの妥当性の確認を研究初年度で確認できており、当初の計画以上の進展と考える。具体的には本研究のモデルマウスでやせの表現型にもかかわらずレプチン抵抗性を来たすことが確認できており、肥満の影響なしにレプチン抵抗性を解析するという、スクリーニング系確立のために重要なポイントをクリアできていると考える。さらに詳細な解析を進める上でターゲットとなる神経核についてある程度の候補となる核を複数確認できており、こちらも十分な進展と考える。
マルチスケール計測による高機能ヘテロ構造材料の4次元損傷評価

本研究では,大きさの異なるミクロ組織をマクロに周期配置させた3次元ヘテロ構造材料の高機能化メカニズムを解明する.とくに「強さ」と「しなやかさ」の両立という特異な力学特性を解明するため,ヘテロ構造材料のミクロ・マクロ変形の双方を捉えるマルチスケール計測法を構築し,3次元ヘテロ構造における材料損傷挙動の時間的変化を評価(4次元材料損傷評価)する.本研究では,大きさの異なるミクロ組織をマクロに周期配置させた3次元ヘテロ構造材料の高機能化メカニズムを解明する.とくに「強さ」と「しなやかさ」の両立という特異な力学特性を解明するため,ヘテロ構造材料のミクロ・マクロ変形の双方を捉えるマルチスケール計測法を構築し,3次元ヘテロ構造における材料損傷挙動の時間的変化を評価(4次元材料損傷評価)する.
不完全接着された積層複合板の剥離進展挙動に関する研究

本研究では、不完全接着した繊維強化型積層複合板の剥離挙動について研究を行った。ここで、提案した剥離モデルは、積層間にエポキシ樹脂などの接着層(ボンド層)を仮定している。接着層または繊維強化層に初期損傷を持つ逆対称クロス・プライ積層板の弾塑性応答解析を行い、接着層の剥離伝播挙動や剥離進展特性について明らかにすることを目的としている。平成6年度と7年度の研究から得られた主な成果を示すと、以下のように纏められる。1.面外荷重を受けるエポキシ樹脂で接着し多層構造に設計された繊維強化型積層複合板の剥離挙動は、接着樹脂(ボンド層)の面外せん断強度に大きく依存し、またその大きさにより剥離伝播性状にも差異が見られた。特に、周辺固定され、2層から成る逆対称クロス・プライ積層板の剥離挙動は接着層のせん断強度に大きく依存し、せん断強度の低下により、時間の経過とともに接着層の剥離が固定辺周辺に沿って急激に伝播し、板中央部に進展することが明らかになった。接着層のせん断強度を大きくすると、固定辺から楔形に剥離が板中央部に向かって伝播して行くことが明らかになった。2.衝撃荷重を受ける繊維強化型積層複合板の剥離挙動に与える初期損傷(局部的な不完全接着)の影響について検討を行い、接着層(ボンド層)の剥離伝播挙動や剥離進展特性について明らかにしている。これにより、接着層に局所的な初期損傷(不完全接着)を持つ場合には、その損傷位置により、かなり異なった剥離挙動が示される。不完全接着部の周辺に局部的な応力集中が見られ、剥離がその周辺部から進展してくる。一方、ボンド層を挟む繊維強化層には、強化繊維委方向と垂直な応力が卓越し、時間の経過とともに強化層の塑性化も生じてくることなどを明らかにしている。また、繊維強化型積層板で補強されたコンクリート床版の剥離応答解析を行いその剥離伝播性状について検討を行った。本研究から得られた主な成果を示すと、以下のように纏められる。特に、周辺固定され、2層から成る逆対称クロス・プライ積層板の剥離挙動は接着層のせん断強度に大きく依存し、せん断強度の低下により、時間に経過とともに接着層の剥離が固定辺周辺に沿って急激に伝播し、板中央部に進展することが明らかになった。2.衝撃荷重を受ける繊維強化型積層複合板の剥離挙動に与える初期損傷(局部的な不完全接着)の影響について検討を行い、接着層(ボンド層)の剥離伝播挙動は剥離進展特定について明らかにしている。これより、接着層に局所的な初期損傷(不完全接着)を持つ場合には、その損傷位置により、かなり異なった剥離挙動が示される。

一方、ボンド層を挟む繊維強化層には、強化繊維委方向と垂直な応力が卓越し、時間の経過とともに強化層の塑性化も生じてくることなどを明らかにしている。今後、これらの研究成果を基に、コンクリート床版の力学特性に与える繊維強化型積層板の補強特性について研究を行う予定である。本研究では、不完全接着した繊維強化型積層複合板の剥離挙動について研究を行った。ここで、提案した剥離モデルは、積層間にエポキシ樹脂などの接着層(ボンド層)を仮定している。接着層または繊維強化層に初期損傷を持つ逆対称クロス・プライ積層板の弾塑性応答解析を行い、接着層の剥離伝播挙動や剥離進展特性について明らかにすることを目的としている。平成7年度の研究から得られた主な成果を示すと、以下のように纏められる。1.面外荷重を受けるエポキシ樹脂で接着し多層構造に設計された繊維強化型積層複合板の剥離挙動、接着樹脂(ボンド層)の面外せん断強度に大きく依存し、またその大きさにより剥離伝播性状にも差異が見られた。特に、周辺固定され、2層から成る逆対称クロス・プライ積層板の剥離挙動は接着層のせん断強度に大きく依存し、せん断強度の低下により、時間の経過とともに接着層の剥離が固定辺周辺に沿って急激に伝播し、板中央部に進展することが明らかになった。接着層のせん断強度を大きくすると、固定辺から楔形に剥離が板中央部に向かって伝播して行くことが明らかになった。2.衝撃荷重を受ける繊維強化型積層複合板の剥離挙動に与える初期損傷(局部的な不完全接着)の影響について検討を行い、接着層(ボンド層)の剥離伝播挙動や剥離進展特性について明らかにしている。これより、接着層に局所的な初期損傷(不完全接着)を持つ場合には、その損傷位置により、かなり異なった剥離挙動が示される。不完全接着部の周辺に局部的な応力集中が見られ、剥離がその周辺部から進展してくる。また、繊維強化型積層板で補強されたコンクリート床版の剥離応答解析を行いその剥離伝播性状について検討を行った。
粘弾性流動シミュレーションを用いた高分子流体の定常流動特性測定系の改良および開発

急縮小流れをベースにした伸長粘度の測定方法を確立する目的で、まず、慣性の影響の無視できない高分子溶液考え、それと同様な弾性を有しかつ慣性を無視した仮想流体を設定し、有限要素法による急縮小流れの粘弾性流動計算を行った。伸長粘度の算出に必要な入口圧力損失(入口圧損)は、同程度の弾性の下では慣性の増加とともに値は大きくなり、その上昇分は流体のもつ物性により異なることがわかった。また、計算で得られた入口圧損からCogswellの理論を用いて伸長粘度を試算した。同程度の伸長速度で比較すると、入口圧損をベースに算出された伸長粘度は、慣性の影響により値は大きくなるが、流入角をベースに算出された伸長粘度は、逆に値が小さくなる傾向が見られた。計算で用いた粘弾性モデルの特性との比較を行うと、値は両者とも低くなったが、値の増減の傾向は捕らえることができた。上述の結果から、Cogswellの理論の妥当性や慣性の影響による測定値の補正方法などの検討が必要であるが、誤差範囲内で傾向を捕らえることに限ると、現段階では入口圧損をベースにした算出方法が測定の容易さからも有用であると思われる。次に、急縮小流れを利用した伸長粘度測定装置を試作し、PAA水溶液(0.10.5wt%)の入口圧損を測定を行い、Cogswellの理論を用いて定常伸長粘度の算出を試みた。測定できた伸長速度(約0.13/s)の範囲内では、PAAの濃度を上げると伸長粘度は同じ伸長速度で大きくなり、いずれも伸長速度が上昇するとともに減少する結果が得られた。伸長速度の増大とともに高分子鎖が伸長方向に配向し、変形に必要な伸長応力の増加量が押えられたためと考えると定性的には妥当な結果であると判断できる。今後は、測定値の妥当性は精度の向上などについて実験と計算との両面からのさらなる詳細な検討を行い、精度よい測定系の確立を目指したい。円錐円板型、平行円板型の回転式レオメータ内の粘弾性流動について、流体-空気の界面で位置が変化しない完全滑りの境界条件を入れ、二重管ダイスウェル計算で高せん断速度領域までの計算が可能となった手法を用い、有限要素法による数値シミュレーシヨンを実施した。弾性の影響により二次流れが発生するが、その流速は主流に比べて数%以下と低く、また計算結果から求められた第一法線応力差やせん断粘度の測定値は粘弾性モデルから得られる理論値と相対誤差も高せん断速度領域においても1%以下と小さく、今回の計算条件では測定値に及ぼす影響が小さいことがわかった。コーン角やスリット間隔を拡げると二次流れも強くなるが、今回の計算条件では測定値に顕著な影響を及ぼすほどではなかった。また、粘度の低い高分子溶液を対象とするために慣性の影響も考慮した計算も、同じ境界条件の下で実施した。慣性の影響により発生する二次流れは弾性による二次流れとは流れ方向が異なり、流速も弾性による二次流れと比べて大きくなった。さらに、無次元せん断速度λ_γ(λ緩和時間、_γ:せん断速度)=100以上の高せん断速度領域になると、計算結果から得られた第一法線応力差の計算値が粘弾性モデルの理論値よりも小さくなった。第一法線応力差の理論値に対する計算値の相対誤差も、λ_γ=100以上ではλ_γの増加とともに指数関数的に増加した。慣性の影響の無視できない粘度の低い高分子溶液については、第一法線応力差に関してせん断速度の測定限界があることが示され、高せん断速度におけるデータを取得する際には慣性の影響を考慮しなければならないことが示唆された。
機能性材料の格子欠陥の原子スケール解析

機能性材料の特性に及ぼす原子構造・欠陥の影響をX線・電子顕微鏡により原子的スケールで解析することを目的として研究を行った。超伝導酸化物:YBa_2Cu_3ーO超伝導体の材質の良し悪しの基準を、マイスナー効果の多少により評価し、その電子顕微鏡的組織の相異を検討しその中の格子欠陥、双晶のラメラ結晶の厚さの分布も重要な要素であろうとした。BiーSrーCaーCuーO系超伝導物質の、高温Tc相の単相作成を試みた。TiーNi形状記憶合金:この物質ではマルテンサイト変態が重要であることは指摘されている。常温で観測される散漫散乱の複雑な逆格子空間内での分布を調べた。散乱強度分布の特徴は、結晶内に〈123〉方向に長い波長を持つ原子のひずみ波が存在することが散漫散乱の原因であるとした。人工薄膜の格子欠陥:MBE法で作られた〔(GaAs)_4(AlAs)_4〕150多層膜、CVD法でSi(001)面上に成長させた(MgAl)204薄膜の観察の結果、ランダムな配向を示すものを見出した。X線回折・電子回折両方法を併用した評価の必要性を示した。B19型MgCd規則合金の構造相転移に伴う特徴的粒界構造を、高分解能電子顕微鏡により見出し、双晶粒界交差点の回位、および星型回位の概念を用いて説明した。このような考え方に立つと、多くの物質中に回位が存在する可能性を示唆した。新素材開発への応用が期待される。ラーフェス相構造の粒界構造を、積層構造の持つ一般的な特徴としてとらえ、高分解能電子顕微鏡による構造像を解析した。新しい考えに基づくDSC格子を用いて周密面粒界および対称粒界の構造の理解が可能となった。粒界設計の一つのモデルになりうる。Ceの金属間化合物の電気抵抗、熱起電力、熱膨張、結晶格子変態などの測定を行い、この物質の異常を明らかにし、この諸特性を検討した。機能性材料の特性に及ぼす原子講造・欠陥の影響をX線・電顕により原子的スケールで解析することを目的として下記の実験・研究を行った.1.超伝導酸化物:高温超伝導体の発見にともない,この物質の微細組織の解明を目指した.対象とした物質は主としてY Ba_2Cu_3O_<7-δ>系酸化物である.超伝導体の材質の良し悪しの基準を,マイスナー効果の多少により評価し,その電子顕微鏡的組織の相異を検討した.その結果,アモルファス物質の混在・格子欠陥がその材偵を決める第一の要素であるが,第二点として双晶のラメラ結晶の厚さの分布も重要な要素であるという実験結果を得た.2.TiーNi形状記憶合金:この物質ではマルテンサイト変態が重要であることは指摘されている.常温で観測される散慢散乱は,非常に複雑でこれまでその逆格子空間内での分布でさえよく研究されていなかった.この散慢散乱はマルテンサイト変態の前駆的現象の一つと考え,まず逆格子空間内の分布を電子回折とX線回折を併用して決定した.又この散乱強度分布の特徴より・結晶内にく123〉方向に長波長を持つ原子のひずみ波が存在することを見出し,このひずみ波が散慢散乱の原因であるとした.

3.人工薄膜の格子欠陥:MBE法で作られた〔(GaAs)_4(AlAs)_4〕_<150>多層膜について電子回折,電顕観察を行った.試料中には目指した8層周期の超格子以外に8層,9層周期が不規則に分布したものも存在した.またCVD法でSi(001)面上に結晶成長させたMgAl_2O_4薄膜が電子回折・電顕観察の結果,X線回折実験と反してランダムな配向を示すものが見出され,X線・電子回折両方法を併用した評価が必要であることが認識された.BiーSrーCaーCuーO系超伝導物質:現時点で見出されている最高の超伝導転移温度を持つこの系の、高温Tc相の単相作成を試みた酸化物超伝導物質の作成は一般に、各々の酸化物Bi_2O_3(99.999%)、SrCo_3(99.99%)、CaCo_3(99.99%)、CuO(99.999%)の粉末の仕込み、その後、混合→仮焼→粉砕→ペレットへの整形→焼結、とのプロセスをとる。本年度は、仕込み組成比焼結時間、焼結温度、ペレットの圧力等を変化させて、種々の試料を作成した。作成した試料の電気抵抗、X線粉末回折の測定を行い、EPMA及び電子顕微鏡を用いてその組織の観察を行った。その結果、Bi、Sr、Ca、Cuの仕込み組成を4:3:3:7、焼結温度1151K、焼結時間は100時間で最も高温Tc相の多い試料が得られた。X線回折の結果では約70%の含有率が認められる。この条件で作成された試料は、電気抵抗は120Kで低下し始め、107Kでゼロ抵抗を示す。二段階の変化はしない。光学顕微鏡および反射電子像の観察結果、この試料は結晶粒が大きく、しかも密になっていることがわかった。EPMAの分析結果では、BiとCuの組成比は、1:1.4、CaとSrの組成比は1:0.9となり、高温Tc相と低温Tc相との混合であることが分かる。また第三の相として半導体または20Kクラスの超伝導物質Bi_2(SrCa)_2CuOの存在が、分析結果から予想されるが、Biの濃度がかなり過剰である。Bi原子がSrあるいはCaのサイトに入っていることも考えなければ分析結果の説明がつかない。電子顕微鏡観察によると高温Tc相、低温Tc相、その他の相がC軸を共有してインターグロースしているが高温Tc相が主体であることが分かった。
機械学習と分子シミュレーションの連帯による標的型分子ドッキング法の開発

高精度リガンド-タンパク質質の結合構造予測を目的に「機械学習と分子シミュレーションの連帯による標的型分子ドッキング法の開発」を行う.具体的にはアポ型タンパク質の分子動力学シミュレーションを用い,(1)結合ポケットの形状変化を含めたレセプターの「アンサンブル構造」をサンプルする.これらレセプター構造に対して(2)機械学習アルゴリズムを用いた結合ポケットのリガンド会合性判定を行い,ドッキングさせるリガンドとの構造や相互作用の補償が良いレセプター構造の選出を行う.最後に選出したレセプター構造に対して,レセプターの結合サイトの構造変化を考慮した(3)分子ドッキング計算と結合自由エネルギー評価を行い,高精度なリガンドの結合構造予測を実現する.開発した計算手法を(4)創薬対象の重要ターゲットタンパク質に適用し、分子スクリーニングによる新規のリード化合物の特定と最適化を行う。本年度は(3)の研究課題に取り組み,タンパク質の結合ポケットの形状サンプリングと機械学習を用いたリガンド会合性判定を計算アルゴリズムの開発も含め実地した.前年度に実施したMD計算で生成したアンサンブル構造に対する分子ドッキングと相互作用の評価から,最適なリガンド結合構造の特定を試みた.さらに,ドッキング後のリガンド-タンパク質複合体構造に対して構造最適化を行った。これにより分子ドッキングによる基質の誘導適合結合が表現され,より高精度な結合構造予測が可能となった.分子ドッキング後は計算によって得られた上位ランクの結合ポーズに対して,自由エネルギーレベルでの相互作用を評価し結合構造予測の精度を向上させた.開発した分子ドッキングシステムを用いて,タンパク質の結合ポケット形状の違いや,誘導適合モデルへの効果について十分な検証計算を行い,計算に用いるパラメータの最適化を行った.ドッキングによって予測された全ての基質配座のスコア値(結合自由エネルギー)をRMSD値に対してプロットした結果、RMSDの値が小さくなるに従って結合エネルギーが低くなる結果が得られ、開発した手法の有効性が示された。最も結合エネルギーが低かった時のリガンド分子の結合構造のRMSD値は結晶で解かれた基質配座とほぼ一致する結果を示した。機械学習モデルに関しては,いくつかの記述子を用いたモデルの検証を行っているが,高精度の予測モデルとするには,さらなるモデル・計算パラメータの検証が必要となる。これらは今後の課題となる。機械学習を用いたレセプターの結合ポケット形状のDruggability判定の計算アルゴリズム開発を行う.実験により解かれた様々なリガンド-タンパク質質の結晶構造やドッキングによって得られた結合構造をデータソース(正解データ)として,レセプターへのDruggableな結合ポケットの特性を学習させる.また最終年度は様々なリガンド-タンパク質系への適用・応用計算を行い,開発した手法の有効性・汎用性について検証する.創薬対象の重要標的タンパク質への分子ドッキング計算を実施し,新規のリード化合物の特定と化合物の最適化を行う。本申請研究では「高精度なリガンドータンパク質の結合構造予測」を目的に「機械学習と分子シミュレーションの連帯による標的型分子ドッキング法の開発」を行う.具体的にはリガンドが結合していないアポ型タンパク質の分子動力学シミュレーションを用い,(1)結合ポケットの形状変化を含めたレセプターの「アンサンブル構造」をサンプルする.これらレセプター構造に対して(2)機械学習アルゴリズムを用いた結合ポケットのリガンド会合性(Druggability)判定を行い,ドッキングさせるリガンドとの構造や相互作用の補償が良いレセプター構造の選出を行う.最後に選出したレセプター構造に対して,レセプターの結合サイトの構造変化を考慮した(3)誘導適合(Induced-fit)分子ドッキング計算と結合自由エネルギー評価を行い,高精度なリガンドの結合構造予測を実現する.開発した計算手法を(4)創薬対象の重要ターゲットタンパク質に適用し、分子スクリーニングによる新規のリード化合物の特定と最適化を行う。今年度は(1),(2)の研究課題に取り組み,タンパク質の結合ポケットの形状サンプリングと機械学習を用いたリガンド会合性判定を計算アルゴリズムの開発も含め実地した.基質が結合していない状態のタンパク質の長時間MDシミュレーションを実施し,タンパク質の結合ポケットの形状変化を詳細に観測・サンプリングし,分子ドッキングのための十分な「アンサンブル構造」を作成した.サンプリングした結合ポケットの特徴量(体積・疎水性・親水性等)を詳細にモニターし,ドッキングさせる化合物との会合性マッチングを評価する計算アルゴリズムについて検討した.数種類のタンパク質のマイクロ秒オーダの長時間MDシミュレーションを実施し,タンパク質の結合ポケットの形状変化を詳細に観測・サンプリングし,分子ドッキングのための十分な「アンサンブル構造」を作成できた.サンプリングした結合ポケットの特徴量(体積・疎水性・親水性等)を詳細にモニターし,ドッキングさせる化合物との会合性マッチングを評価する計算アルゴリズムについて検討できた.本研究では高精度リガンドータンパク質の結合構造予測を目的に「機械学習と分子シミュレーションの連帯による標的型分子ドッキング法の開発」を行う.具体的にはアポ型タンパク質の分子動力学シミュレーションを用い,(1)結合ポケットの形状変化を含めたレセプターの「アンサンブル構造」をサンプルする.これらレセプター構造に対して(2)機械学習アルゴリズムを用いた結合ポケットのリガンド会合性(Druggability)判定を行い,ドッキングさせるリガンドとの構造や相互作用の補償が良いレセプター構造の選出を行う.最後に選出したレセプター構造に対して,レセプターの結合サイトの構造変化を考慮した(3)分子ドッキング計算と結合自由エネルギー評価を行い,高精度なリガンドの結合構造予測を実現する.開発した計算手法を(4)創薬対象の重要ターゲットタンパク質に適用し、分子スクリーニングによる新規のリード化合物の特定と最適化を行う。本年度は(3)の研究課題に取り組み,タンパク質の結合ポケットの形状

サンプリングと機械学習を用いたリガンド会合性判定を計算アルゴリズムの開発も含め実地した.前年度に実施したMD計算で生成したアンサンンブル構造に対する分子ドッキングと相互作用の評価から,最適なリガンド結合構造の特定を試みた.さらに,ドッキング後のリガンドータンパク質複合体構造に対して構造最適化を行った。これにより分子ドッキングによる基質の誘導適合結合が表現され,より高精度な結合構造予測が可能となった.分子ドッキング後は計算によって得られた上位ランクの結合ポーズに対して,自由エネルギーレベルでの相互作用を評価し結合構造予測の精度を向上させた.開発した分子ドッキングシステムを用いて,タンパク質質の結合ポケット形状の違いや,誘導適合モデルへの効果について十分な検証計算を行い,計算に用いるパラメータの最適化を行った.ドッキングによって予測された全ての基質配座のスコア値(結合自由エネルギー)をRMSD値に対してプロットした結果、RMSDの値が小さくなるに従って結合エネルギーが低くなる結果が得られ、開発した手法の有効性が示された。最も結合エネルギーが低かった時のリガンド分子の結合構造のRMSD値は結晶で解かれた基質配座とほぼ一致する結果を示した。機械学習モデルに関しては,いくつかの記述子を用いたモデルの検証を行っているが,高精度の予測モデルとするには,さらなるモデル・計算パラメータの検証が必要となる。これらは今後の課題となる。高精度リガンド-タンパク質質の結合構造予測を目的に「機械学習と分子シミュレーションの連帯による標的型分子ドッキング法の開発」を行う.具体的にはアポ型タンパク質の分子動力学シミュレーションを用い,(1)結合ポケットの形状変化を含めたレセプターの「アンサンブル構造」をサンプルする.これらレセプター構造に対して(2)機械学習アルゴリズムを用いた結合ポケットのリガンド会合性判定を行い,ドッキングさせるリガンドとの構造や相互作用の補償が良いレセプター構造の選出を行う.最後に選出したレセプター構造に対して,レセプターの結合サイトの構造変化を考慮した(3)分子ドッキング計算と結合自由エネルギー評価を行い,高精度なリガンドの結合構造予測を実現する.開発した計算手法を(4)創薬対象の重要ターゲットタンパク質に適用し、分子スクリーニングによる新規のリード化合物の特定と最適化を行う。本年度は(3)の研究課題に取り組み,タンパク質の結合ポケットの形状サンプリングと機械学習を用いたリガンド会合性判定を計算アルゴリズムの開発も含め実地した.前年度に実施したMD計算で生成したアンサンブル構造に対する分子ドッキングと相互作用の評価から,最適なリガンド結合構造の特定を試みた.