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乳癌リスクとその治療感受性における不飽和脂肪酸の役割

本研究では、乳がん症例とがん検診目的で受診した対照群を用いて、年齢、肥満度、およびその他の生活習慣・出産歴等の分布を考慮しながら、血清中のn-3系高度不飽和脂肪酸と乳がんリスクとの関連を検討した。症例群と対照群では、血清中のアラキドン酸/EPA比、アラキドン酸/DHA比のいずれにおいても両群間に有意な差は認めなかった。また乳がん患者の抑うつ状態とアラキドン酸/DHA比との間に弱い正の相関傾向があった。これまでの動物実験やin vitro実験における結果より、ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)などのn-3系高度不飽和脂肪酸(n-3HUFAs)ががんの発症リスクを下げる可能性が示唆されている。乳がんにおいても、これまでの先行研究から、魚介類に多く含まれるn-3HUFAの生体内における役割は、乳がんの発がん過程のみならず、その治療効果やQOLにも大きく影響を与えている可能性が示唆されているが、それを総合的に検討した報告はない。そこで本研究では、乳がんのケース・コントロール研究において、血中のn-3HUFAs濃度と乳がんリスクと関連、遺伝子多型など宿主要因による相互作用の有無、血中のn-3HUFAs濃度による治療効果への影響および患者の抑うつ状態との関連を検討することを目的としている。本年度は、鹿児島大学医学部・歯学部附属病院および鹿児島市内の相良病院で診断・加療目的で入院した乳がん患者への説明を行うとともに、書面による同意を得た上で、血液採取および質問調査による生活習慣の把握を開始した。対照群については、現在、関連病院と調整し、次年度より調査を開始する予定である。また、血中のn-3HUFAs濃度測定のための予備的検討を行い、分析可能な体制を整えつつあるところである。ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)などのn-3系高度不飽和脂肪酸(n-3HUFAs)ががんの発症リスクを下げる可能性が示唆されている。乳がんにおいても、これまでの先行研究から、魚介類に多く含まれるn-3 HUFAの生体内における役割は、乳がんの発がん過程のみならず、その治療効果やQOLにも大きく影響を与えている可能性が示唆されているが、それを総合的に検討した報告はない。そこで本研究では、乳がんのケース・コントロール研究において、血中のn-3 HUFAs濃度と乳がんリスクと関連、遺伝子多型など宿主要因による相互作用の有無、血中のn-3 HUFAs濃度による治療効果への影響および患者の抑うつ状態との関連を検討することを目的としている。昨年度に引き続き、鹿児島大学医学部・歯学部附属病院で診断・加療目的で入院した乳がん患者への説明を行うとともに、書面による同意を得た上で、血液採取および質問調査を継続している。対照群については、現在、関連病院と調整中である。そこで本研究では、乳がんのケース・コントロール研究において、血中のn-3 HUFAs濃度と乳がんリスクと関連等について検討することを目的としている。平成22年度に収集した乳がん患者群および対照群の人数はそれぞれ49名と67名であった。これまでに収集した患者・対照群226名とあわせ年齢分布を調整した上で解析を行った結果、患者群において「肥満」、「不規則な生理周期」、「運動習慣なし」、「就寝時の部屋の明かりを消さない」および「乳がんの家族歴あり」の頻度が高かった。血液中の脂肪酸をガスクロマトグラフィーを用いて測定し、アラキドン酸(AA)とDHA比およびAA/EPA比を求めた。AA/DHAおよびAA/EPA比は、年齢や子どもの数、授乳期間と有意な負の相関を示した。魚の摂取頻度は対照群と比べて低い傾向にあったものの、ケースとコントロールでAA/DHA比およびAA/EPA比に統計学的有意差は認められなかった。また、n-6/n-3HUFAsにおいても患者群と対照群で有意な違いは認められなかった。
ブルーベリーの二季成りおよび四季成りに関わる遺伝子発現と生物学的意義の解明

ブルーベリーを9月に開花させオフシーズンに果実を収穫する方法を開発した.ブルーべリーが二季成りや四季成りになる開花制御条件を明らかにしたうえで,cDNA塩基配列の網羅的解読と発現解析を行った.7月からの低温・短日条件で9月に新梢の頂芽に開花させることができる.開花後から低温・短日にすると連続開花性(四季成り)となり,高温・長日にすると二季成りなることが明らかとなった.RNA-Seqにより,四季成り条件下で栽培したブルーベリーの新葉では,シロイヌナズナの花成関連遺伝子と高い相同性を示す複数の遺伝子の発現が確認され,ブルーベリーにもシロイヌナズナと同様に複数の花成経路が存在することが示唆された.ブルーベリーを9月に開花させオフシーズンに果実を収穫する方法を開発した.ブルーべリーが二季成りや四季成りになる開花制御条件を明らかにしたうえで,cDNA塩基配列の網羅的解読と発現解析を行った.7月からの低温・短日条件で9月に新梢の頂芽に開花させることができる.開花後から低温・短日にすると連続開花性(四季成り)となり,高温・長日にすると二季成りなることが明らかとなった.RNA-Seqにより,四季成り条件下で栽培したブルーベリーの新葉では,シロイヌナズナの花成関連遺伝子と高い相同性を示す複数の遺伝子の発現が確認され,ブルーベリーにもシロイヌナズナと同様に複数の花成経路が存在することが示唆された.本研究の目的は,ブルーベリーを特定な日長およびび温度条件下で栽培するとできる二季成りおよび四季成りの開花制御条件をより詳細に明らかにしたうえで,cDNA塩基配列の網羅的解読と発現解析を行い、二季成りおよび四季成りになる機構を遺伝子レベルで解析し、生物学的意義を考察することである.そこで平成25年度は二季成りおよび四季成り個体の作成(日長と温度の影響)と花芽の形態観察を行い,二季成りは低温短日によって花芽形成が誘導されること,四季成りは高温長日で花芽形成が誘導されることを明らかにした.また,高温長日処理によって四季成りを誘導できる品種は花器の発育が早い特性を持つことを明らかにした.さらに,次世代シーケンサーを用いた比較トランスクリプトーム解析によるブルーベリーの四季成り性・二季成り性遺伝子群候補の選抜のために,二季成り性を誘導したブルーベリー株(品種`Sharpblue')の葉からtotal RNAを抽出し,FT遺伝子配列を特定した.本研究の目的はブルーべリーを特定な日長および温度条件下で栽培するとできる四季成りの開花制御条件をより詳細に明らかにしたうえで,cDNA塩基配列の網羅的解読と発現解析を行い,四季成りになる機構を遺伝子レベルで解析し,生物学的意義を考察することである.これまで,四季成り個体の作成と花芽の形態観察を行い,四季成りは短日条件下の高温もしくは低温で誘導され,開花後に低温に維持することよって連続性が維持されることが明らかとなった.また,一度連続開花を誘導した樹では,日長が長くなる夏季に寒冷紗を被覆して遮光し低温を保つことによって,その後も連続的に花芽形成が誘導された.さらに,次世代シーケンサーを用いた比較トンスクリプトーム解析によるブルーべリーの四季成り性遺伝子候補の選抜のために,次世代シーケンサー(イオンプロトン)の稼働試験をして,ブルーベリーの花成に関与する遺伝子群を洗い出すことに成功した.特に,シロイヌナズナで報告されているように複数の花成経路が存在することが示唆された.また,収穫後のブルーベリーの葉における網羅的発現解析ではジベレリンやスクロース関連の遺伝子が花成に関与することが示唆されたが,既に花芽を形成している樹に着生した葉では日長の感知に関わる遺伝子群の発現増加が認められ,これらが連続開花に関与していることが示唆された.今後は,四季成りではどのような遺伝子がどのような経路で関与するのかを対応分析やGO解析を用いて明らかにする予定である.園芸学学術雑誌(1報うち査読有1報),学会発表・招待講演(3件),図書(3件),特許(1件)などを成果として公表している.具体的には,二季成りおよび四季成り個体の作成について,その環境条件の検討を行い,学会発表などで公表している.また,開花を誘導する花芽の分化時期と発育過程の観察を行い,二季成りや四季成りとなる品種の花芽分化の特性を明らかにした(未発表).さらに,次世代シーケンサーを用いた比較トランスクリプトーム解析によるブルーベリーの二季成り性・四季成り性遺伝子群候補の選抜のために,二季成り性を誘導したブルーベリー株(品種`Sharpblue')の葉からtotal RNAを抽出し,参照配列の構築を試みた.平成25年度は二季成り性および四季成りを誘導するための環境条件,四季成り個体の花芽の形態について明らかにした他,二季成り個体におけるトランスクリプトーム解析の準備を行ったが,平成26年度は二季成りと四季成りを誘導する環境条件や花芽の誘導課程について更に詳細に明らかにする予定である.また,RT-PCRを用いて二季成り,四季成り個体と一季成り個体との遺伝子発現解析を行う予定である.平成25年度12月に次世代シーケンサーを用いた比較トランスクリプトーム解析を行うため購入予定であった器具(Ion Proton II chip,ライフテクノロジー社)の販売が平成26年度5月以降に延期されたことから,その購入予定金額分が次年度使用額となった.器具が販売され次第,それを購入するために使用する予定である.

平成25年度12月に次世代シーケンサーを用いた比較トランスクリプトーム解析を行うため購入予定であった器具(Ion Proton II chip,ライフテクノロジー社)の販売が平成26年度5月以降に延期されたことから,その購入予定金額分が次年度使用額となった.器具が販売され次第,それを購入するために使用する予定である.
多細胞体制の形成機構

(1)班会議および幹事会をそれぞれ2回ずつ行なって、成果をレビューし公開発表会および成果刊行物の出版の実施案を立てた。(2)本研究組織の主宰による公開講演会を名古屋において開催した。(3)3年間の成果をとりまとめて印刷刊行した。この刊行物は、特定研究に参加した各人が研究経過、結果を執筆したもの、および各人がこの間発表した代表的な論文を編集して印刷した。(4)本研究組織の代表者を含め4名が、公開シンポジウム「大学と科学」第一回において、本特定研究の成果を発表した。将来の展望については、本特定研究の成果に立脚して多細胞体制の形成と維持を遺伝子レベルで直接研究する段階に達したことが確認された。
マイクロRNAによる浸潤性膵癌特異的な高効率アポトーシス誘導治療の開発

本研究においては浸潤性膵癌を標的とした新規治療の開発のため、膵癌の浸潤傾向を規定するmicroRNAの同定とその標的遺伝子の解析を行った。浸潤性膵癌においてはmiR-126の発現が低下していることを見出し、細胞遊走能と浸潤能を抑制していることを確認した。miR-126の標的遺伝子としてADAM9を新規に同定し、miR-126の下流で細胞遊走能・浸潤能を制御することを確認した。miR-126/ADAM9を介する経路は浸潤性膵癌特異的な治療標的となりうるものと考えられた。膵癌転移機構に関与している重要な機序として上皮一間葉形質転換: epithelial tomesenchymaltransition(EMT)が考えられている。EMTは上皮細胞が間葉系の性質を持ち移動能力を獲得する現象であり、癌の浸潤、転移機構のfirst stepと推測される。本研究の最終目的はEMTが誘導されている膵癌細胞に対してapoptosisを特異的に誘導する治療法を開発することである。本年度は膵癌細胞のEMTに関与するmiRNAや分子の同定のために以下の研究を行った。1)膵管内乳頭粘液腫瘍(IPMN)のパラフィン包埋組織より厚さ10μmの切片をマイクロトームで薄切し、microdissectionによって、非浸潤癌病変のみを削りだした。その病変からmiRNAを抽出し、膵癌細胞株から抽出したmiRNAとともにmiRNAarrayを行い、その発現の差違を比較検討した。IPMNと比べ膵癌で発現の高かったmiR205、miR18a群などのmiRNAをEMT誘導に関与するmiRNA候補として選別した。2)膵癌細胞株Panc-1にBMP4を投与し、EMT誘導前後のRNAを用いてmicroarrayを行い、EMT関連分子として新たにS100Pを同定した。siRNAによってS100Pを発現抑制した膵癌細胞株Panc-1ではBMP4による細胞移動能の亢進作用が消失していた。3)1)にて、選別したmiRNAについて、手術摘出膵癌組織における発現をreal-timeRT-PCRにて検討した。その結果、miR18a群が膵癌組織において高発現していることを確認した。膵癌転移機構に関与している重要な機序として上皮-間葉形質転換:epithelial tomesenchymaltransition(EMT)が考えられている。本年度はIPMNのmiRNA発現プロファイルと浸潤性膵癌組織のmiRNA発現プロファイルを比較し、悪性化に関与するmiRNAの同定を目的として以下の研究を行った。1)膵癌手術検体の凍結保存標本より厚さ8μmの切片をcryostatで薄切し、microdissectionによって癌の腺管構造のみを削りだした。そのサンプルからmiRNAを抽出し、miRNA arrayを行って癌における発現プロファイルを以前にIPMN組織より得られた発現プロファイルと比較した。その結果、IPMNと比べ膵癌で発現が有意に低下しているmiR145、miR363群などのmiRNAをEMT誘導に関与するmiRNA候補として選別した。2)以前より、膵癌細胞にEMTを誘導することが判明している転写因子、MSX2を膵癌細胞株BXPC3に強制発現させ、それにより生じるmiRNA発現プロファイルの変化をmiRNA arrayにて検討した。その結果、本実験系においてもmiR363発現はEMT誘導に伴って低下することが確認された。3)1)にて、癌組織特異的に発現低下がみられるmiR145前駆体を膵癌細胞株BXPC3にトランスフェクトしたところ、細胞増殖抑制効果が確認された。本年度はEMTに関与するmiRNAの候補をさらに絞り込むべくIPMA6例、IPMC6例、浸潤性膵癌5例の手術検体からのmicrodissection検体およびヒト膵癌細胞株5種より抽出した検体を用いてmiRNAアレイを施行し、クラスター解析を行って有意な発現変動を認めるmiRNAを抽出した。1)IPMAとIPMC検体の間ではmiRNA発現プロファイルの有意な変化は極めて少なく、IPMA/IPMCと浸潤性膵癌/膵癌細胞株とのmiRNA発現プロファイルが大きく異なることが判明した。浸潤性膵癌および膵癌細胞株にて有意に発現が上昇するmiRNAとしては既報にて浸潤性膵癌での発現増加が報告されているmiR-21が抽出され、本検討で用いた手法の妥当性が確認された。対照的に、浸潤性膵癌および膵癌細胞株において有意に発現低下が認められるmiRNAとしてはmiR-126が同定された。

2)膵癌細胞株であるPanc-1およびASPC-1においてmiR-126前駆体をトランスフェクションすることにより上皮系マーカーであるE-cadherinの発現増加が確認され、細胞遊走能・matrigelへの浸潤能が低下することが確認された。この結果は浸潤性膵癌において発現が低下しているmiR-126が細胞遊走能・浸潤能を制御していることを示すものと考えられた。3)データベース解析によりmiR-126の標的遺伝子には腫瘍増殖に関与することが報告されているCRK(v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog)などが確認された。これらの標的遺伝子のうち、癌細胞の浸潤能との関連が報告されているADAM9はmiR-126の強制発現により実際にその発現レベルが低下することがPanc-1およびASPC-1において確認され、miR-126がADAM9の発現制御を介して膵癌細胞の浸潤性を規定することが判明した。以上の結果は膵癌の浸潤性増殖を抑制するmiRNAとしてmiR-126を新規に同定したものであり、今後の治療応用が期待される。
赤外励起ナノスケール表面分光測定装置の開発と高分子超薄膜-水界面の解析への応用

本研究では、水溶液あるいは固体状態の高分子近傍の水構造を、振動分光法を用いて明らかにした。水溶液系での、モノマー一残基当たりの水素結合の欠損数(N_<corr>)は、カルボキシベタインのような双性イオン型では常に小さく、また両性高分子では正負電荷数がほぼ拮抗しているときに最小を示した。また、非水溶性の単量体をコモノマーとした固体膜では、双性イオン型、あるいは正負電荷数が拮抗している両性高分子では、O-H伸縮振動帯の形状が自由水に類似しており、水溶液系と同様の傾向を示すことが判明した。さらに、真空乾燥と重水との接触を繰り返し、一次水和水の寄与を排除した30003700cm^<-1>のスペクトルをバックグラウンドとして、膜の極近傍の水のO-H伸縮振動を見たところ、ベタイン型の材料では自由水のスペクトルに類似していることが判明した。原子間力顕微鏡観察では、乾燥状態と、湿潤状態で、膜表面の構造に変化があることが示唆された。また、これらの高分子薄膜に対する血小板や線維芽細胞の付着数が、非常に少ないことがわかった。これらの結果は、我々が従来から主張している、「水に対して優しい材料は、体に対しても優しい」という仮説を裏付けるものである。また、水の水素結合ネットワーク構造に対する影響小さく、かつ優れた生体適合性が見出されているカルボキシメチルベタインポリマーを表面に集積させた金ナノ粒子について、局在表面プラズモン共鳴法によりタンパク質分子の吸着を見たところ、タンパク質の荷電に関わらす非常に少ないことが見出された。高分子近傍の水構造への擾乱の少なさが、材料表面へのタンパク吸着を抑制し、補体活性化の抑制、血小板吸着の低下につながっていることが確認された。今年度は、振動分光法による高分子近傍に存在する水構造解析を進めた。まず双性イオンであるスルホベタイン基を側鎖に有する単量体とn-ブチルメタクリレートとの共重合体薄膜中に存在する水の構造が、自由水に近似していることを全反射赤外分光法により見いだした。水構造に関する同様の知見は、分子両端にアミノ基及びカルボキシル基を有するアミノ酸や、スルホベタイン基あるいはカルボキシベタイン基等の両性イオン基を有する界面活性剤水溶液中の水構造の偏光Raman分光解析によっても得られた。さらに、スルホベタイン構造を有する高分子膜へのヒト血小板の付着数が、ガラスや、ポリ-2-ヒドロキシルメタクリレート(PHEMA)、さらにはポリ-n-ブチリメタクリレートと比べ、きわめて少ないことを確認した。一方、双性イオン型高分子を集積した表面へのタンパク質の吸着が起こりにくいことを、電気化学的手法(サイクリックボルタンメトリー)や分光学的手法(局在表面共鳴プラズモン法)により見いだした。これまでの知見と併せると、高分子薄膜の血液適合性は、膜近傍の水構造が乱されていないこと、膜へのタンパク質の吸着が微少であることと強い相関があることが判明した。当科学研究費補助金で購入した波長可変赤外線レーザーは、納入が予定よりも大幅に遅れ2005年3月にようやく研究室に搬入された。したがって、今年度の研究に直接活かすことは出来なかった。次年度以降は、同光源を用いて、膜表面近傍の水構造の直接観測を実施する予定である。昨年度に引き続き、種々の高分子材料近傍の水構造について、O-H伸縮振動帯を対象として検討を行った。双性イオン型のカルボキシベタインモノマー(CMB)を単独で、あるいはn-ブチルメタクリレート(BMA)と共に重合させた物質を、それぞれ水溶液あるいは薄膜とし、その近傍に存在する水構造を、振動分光法により調査した。

いずれの系においても、水構造に対する擾乱効果は、水溶液中の高分子電解質、あるいは薄膜系のBMAや2-ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)等からなる高分子に比べて遙かに小さかった。さらにCMBとBMAの共重合体薄膜について血小板の付着数や、補体活性化、さらには線維芽細胞の付着数を調査したところ、極めて良好な抗血栓性、生体適合性を有することが明らかとなった。水構造に対する擾乱効果の少なさと、抗血栓性、生体適合性との間には明確な相関があることが強く示唆された。さらに、モノマー残基中に双性イオン基を有するCMBに替えて、カルボキシル基を有するメタクリル酸(MA)と、4級アンモニウム基を有する3-メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド(MAPTAC)の共重合体(両性高分子)について、その組成と近傍の水構造との関係を調査した。共重合体の組成やメタクリル酸残基の中和度を変化させて検討したところ、高分子側鎖の正負の電荷数がほぼ拮抗した場合に、水構造が最も良く保持される(自由水に近い構造をとる)ことが明らかとなった。これまでに、アミノ酸や、スルホベタインポリマー、ホスホベタインポリマー等で見出した、正負電荷の近接による水擾乱効果の低減が普遍的なものであること、また医用材料としては、「水に優しい」双性イオン型高分子が有効であることが、水構造という物理化学的な特性評価から示された。本年度は、水溶液あるいは固体状態の高分子近傍の水構造を振動分光法を用いて明らかにした。水溶液状態の場合、正あるいは負電荷を側鎖に有するメタクリル酸およびジメチルアミノプロピルメタクリルアミド共重合体について、水分子間の水素結合ネットワークに帰属されるO-H伸縮振動帯の解析により、モノマー残基辺りの水素結合の欠損数(N_<corr>)を算出した。その結果、正負電荷数がほぼ拮抗しているときに、N_<corr>値が最小を示し、水の構造にする擾乱効果が非常に小さいことが示された。また、非水溶性のn-ブチルメタクリレートをコモノマーとした固体膜では、正負電荷数が拮抗している場合に、O-H伸縮振動帯の形状が、自由水に類似しており、水溶液系と同様の傾向を示すことが判明した。さらに、この両性高分子薄膜に対する血小板の付着数は、正負電荷の拮抗している場合に、相対的に最も少ないことがわかった。これらの結果は、我々が従来から主張している、「水に対して優しい材料は、体に対しても優しい」という仮説を裏付けるものである。さらに、各種高分子膜について、真空乾燥と重水との接触を繰り返し、一次水和水の寄与を排除した30003700cm^<-1>のスペクトルをバックグラウンドとして、膜の極近傍の水のO-H伸縮振動を見たところ、ベタイン型の材料では自由水のスペクトルに類似していることが判明した。また、水の水素結合ネットワーク構造に対する影響小さく、かつ優れた生体適合性が見出されているカルボキシメチルベタインポリマーを表面に集積させた金ナノ粒子について、局在表面プラズモン共鳴法によりタンパク質分子の吸着を見たところ、タンパク質の荷電に関わらす非常に少ないことが見出された。高分子近傍の水構造への擾乱の少なさが、材料表面へのタンパク吸着を抑制し、補体活性化の抑制、血小板吸着の低下につながっていることが確認された。
スリット状建物開口部のための機械学習型アクティブ騒音制御手法

本研究では数値シミュレーションおよび実物大模型実験を併用して研究を遂行し,その具体的成果として,(1)機械学習アルゴリズムが従来の適応制御アルゴリズムに対して,より高い周波数域の騒音まで追従して干渉音を生成することができるという優位性を把握し,(2)スリット中心部と端部近くの合計3か所に2次音源スピーカーを組み込んだ,スリット開口部からの透過音をアクティブ騒音制御するためのANCフードを考案し,(3)制御位置(マイクロホン設置位置)をスリット中央と端部近くの2か所に設けることが,スリット開口部全般の遮音性能を向上させるためには効果的であることを明らかにした。本研究では,与えられた年限(3年間)で次の3つの課題に取り組んでいる。(1)スリット開口部のための機械学習型ANC手法の考案,(2)スリット状のANC開口ユニットの設計,(3) ANC開口ユニットの試作および実証実験,である。2年度目の平成25年度は,主として課題(2)に取り組み,研究代表者の所属機関が有する音響実験室内に実物大のスリット開口部を設け,ANCを適用する際の適切な制御位置について実験的に検討を行った。すなわち,騒音が到来する際のスリット周辺における複雑な音圧分布を計測し,周波数によって異なる最大音圧の位置を把握した。スリット開口を透過する騒音は,周波数によってスリット中心部の音圧が大きくなるもの(160, 250, 315, 400, 630 Hz)と,スリット中心部から離れた箇所の音圧が相対的に大きくなるもの(200, 500, 800 Hz)に大別された。このような現象は,スリット開口周辺では端部からの回折波が重なり合うことから生じると思われ,スリット開口のための制御位置を決定する際は,例えば,制御位置を1点ではなく複数点にするなどの工夫が必要であることが示唆された。課題(2)の研究成果は,日本建築学会九州支部研究報告にて公表した。さらに,前年度に引き続き課題(1)に取り組み,騒音の到来方向の判別手法(1-C)の検討を円筒形の住宅換気口を想定して行い,その成果を日本騒音制御工学会秋季研究発表会および日本建築学会大会学術講演にて公表した。また,(フィードフォワード型のANCに必要な)参照マイクロホンの特性を適切なものにするために,ビームフォーミング(遅延和法)を用いて指向性を付与する試み(1-D)も併行して検討した。本研究では,与えられた年限(3年間)で次の3つの課題に取り組む。(1)スリット開口部のための機械学習型ANC手法の考案,(2)スリット状のANC開口ユニットの設計,(3) ANC開口ユニットの試作,および実証実験である。初年度の平成24年度は,課題(1)に取り組み,FDTD法による3次元の数値シミュレーションプログラムの基礎コードを記述した(1-A)。さらに,最終的に提案するANC開口ユニットの実用性を高めることを意図し,より大きな制御効果を得るための,建物開口部のANCシステムにおける適切な制御位置の検討(1-B),および,ANCシステムを安定動作させるための,騒音の到来方向の判別手法の検討(1-C)を,円筒形の住宅換気口を想定して行った。(1-A)については,記述したコードで,建物開口部周辺の音場をシミュレーションできることを,パーソナルコンピュータで確認した。(1-B)では,制御位置によって制御効果が大きく異なること(約8 dB)を実験的に検討し,対象空間の音場を踏まえて適切な制御位置を設定することが重要であることを明らかにした。そして,道路交通騒音のような広帯域な騒音を制御するための適切な制御位置の論理的な設定手順を提案した。(1-C)では,制御対象としていない生活音がANCシステムに混入すると動作が不安定になる恐れがあるため,制御効果に対する生活音の影響の抑制に注力した。2つのマイクロホン間の相互相関を利用して音の到来方向を判別する手法を実験的に検討し,開口部周辺のような複雑な音場では,マイクロホンの設置位置を吟味する必要があることを明らかにし,2つのマイクロホン間の距離を踏まえて正答率を上げるための工夫を施した判別手法を提案した。なお,(1-B)と(1-C)の研究成果は,日本建築学会九州支部研究発表会で公表した。3年度目の平成26年度は,主として課題(3)に取り組み,研究代表者の所属機関が有する音響実験室内に設けた実物大のスリット開口部に対し,ANCの適用実験を行った。まず,昨年度に把握したスリット開口周辺における音圧分布を踏まえて,複数の2次音源を組み込んだスリット開口用の遮音フードを設計・製作した。

次に,そのフードによって得られるパッシブな遮音効果を計測し,フードのパッシブ効果は630 Hz以上の周波数帯で顕著に現れ,3-4 dBの遮音性能の向上が得られることを把握した。そして,ANCの適用効果について,制御位置を1点とする場合と2点とする場合を実験的に比較検討し,100-160 Hzのように波長が長い周波数域では制御位置(および数)に関わらず一定の効果が得られること,200-500 Hzでは音圧の大きな位置で制御することで制御効果を大きくすることができ,またANCの逆効果を抑制するためには2点を同時に制御しなければならないことを明らかした。したがって,スリット状の建物開口部に対して広い空間で遮音性能を向上させるためには,音圧が大きくなる2点の位置でアクティブ制御する手法としなければならないこと,そして,その手法の適用効果は,フードのパッシブ効果と合わせて10 dB程度が見込まれることを明らかにした。また,前年度に引き続き課題(1)に取り組み,従来の制御アルゴリズムに対するニューラルネットワークの優位性を数値シミュレーションにより検討した。その結果,アクティブ制御対象の100-800 Hzの全般において,精緻な制御信号の生成が可能であることを明らかにした。建築環境,騒音予測,騒音対策2年度目の平成25年度は,主として課題(2)スリット状のANC開口ユニットの設計に取り組み,また前年度に引き続き課題(1)に取り組み,一定の成果を上げることができた。当初の計画どおり,引き続き,課題(1)および(2)を推進しつつ,これまで得られた成果を集約し,課題(3) ANC開口ユニットの試作に向けて研究を進捗させる。初年度の平成24年度は,課題(1)スリット開口部のための機械学習型ANC手法の考案に取り組み,一定の成果を上げることができた。引き続き,課題(1)を推進しつつ,併行して課題(2)スリット状のANC開口ユニットの設計にも着手する状況にある。当初の計画どおり次年度は,新しいアルゴリズムと,スリット状の開口部の音場特性の検討を,数値シミュレーションと実物大の模型実験により推進していく。2年度目の平成25年度は,研究手段として実物大の模型実験を採用した。ANCの効果を検討するためには,このような実験的検討が必要不可欠である。その一方で,実験ではANC効果が想定どおり得られない場合の原因追及には,数値シミュレーションによる音場の視覚化が有効であると考えている。そのため,本研究の推進にあたっては,実物大模型実験と数値シミュレーションに併行して取り組んでいく予定である。課題(1)機械学習型ANC手法および,課題(2)開口部の音場特性を数値シミュレーションで検討する際,パーソナルコンピュータでは検討に必要な時間長(例えば10秒間)の演算に膨大な時間がかかってしまうことから,大型計算機の利用を計画してコードの修正を行っていく。また,本学の音響実験室に実物大のスリット開口部を設けて,課題(1)・(2)を模型実験により検討していく。このように,本研究の推進にあたり,数値シミュレーションと実物大の模型実験に併行して取り組んでいく予定である。該当なし
一株当たり四半期利益平準化戦略と監査との関係

特別損益項目計上と一株当たり利益水準との関係を検討することが本研究の目的である。この目的を、日本において承認された会計原則に基づいて『四半期決算短信』を作成している日本企業(金融および損保を除く業種に分類される企業)を分析対象にして、解決する。当初の研究目的に基づいて、収集可能なデータの変更等の調整を行いながら、今後につながる研究成果を得ることができた。とりわけ、事業構造改善損失計上をめぐる会計処理手続きに着目した研究は、日本企業の経営者の意思決定構造を理解することに役立つと思われる。平成24年度から開始しているデータ確保を継続して行うことが本年度に行う活動であった。本年度は平成24年度に行った四半期決算短信の悉皆調査の結果と四半期財務報告に開示されている減損損失と事業構造改革費用の計上状況との比較分析を開始する。この目的は監査の有無が当該費用項目の認識測定に与える影響を観察するためである。なお、この作業は統計手法を用いるのではなく会計実践の類型を試みる記述理論の構築を指向した実証分析である。本年度の実績について述べる。会計年度を絞り込んだパイロットテストを行った結果、当初想定したデータ数を確保できず、汎用性の乏しいケーススタディーにならざるを得ない可能性が出てきた。できる限りデータ数を増やすため、来年度の開示情報を追加し、最善な記述理論の構築を心みたい。または分析対象をさらに広げ、サンプル数そのものを増やすことも考えている。他方、発生主義項目に基づいて算定するキャッシュ・コンバージョン・サイクルについて再度検討を重ね、公刊した。四半期決算短信に開示された費用項目の計上額が主要財務指標に与える影響に着目し、当該会計実践を指向する経営者のインセンティブが一株当たり四半期損益の顕著な変動の回避(平準化)にあるか否かを検証することが本研究課題の内容である。上述の研究課題に基づいて本年度に行った研究は事業構造改革費用を巡る経営者の財務会計行動を説明するために設定する仮説構築に役立てるいくつかのシナリオを提示したことである。その含意は次の通りである。当期業績主義に基づく期間損益計算を指向する行動規範を根底に据えている点を考慮すれば、事業構造改革費用を見越し計上する利益平準化策よりも、因果関係を見出し得ないものの、特別損失として期間損益計算を実施する会計処理手続きを日本企業の経営者は選好すると期待される。上述の研究を行う過程で調べた先行研究は制度の概要の検討に特化したものが大半であった。これは価値関連性および/または経営者の財務会計行動を分析対象にした研究成果が今後、公刊され、研究成果の蓄積がすすむものと期待されるということを意味する。本研究課題は今後の実証分析の実施を予定しているものの、まずは会計実践の動向を把握したいという関心事項に基づいて、事例分析の調査を行うべく準備したい。この準備の一環として次の研究成果も得た。次に、前述の仮説構築に活用するシナリオに基づいて行う実証分析に使用するデータ・ベースの更新を目指すべく、連結決算短信および四半期財務報告書および有価証券報告書のダウンロード作業を行った。これらの資料(ダウンロードされたPdfファイル)は東京証券取引所および大阪証券取引所に上場している日本企業である。具体的には、日経225(NIKKEI TOPIX)に組み込まれている銘柄からなる上場企業のうち金融業を除く上場会社およびJASDAQ上場企業である。本年度は四半期財務報告に開示されている事業構造改革費用の計上状況との比較分析を開始した。この作業は会計実践の類型を試みる記述理論の構築を指向した実証分析である。日本基準の規定と国際基準のそれとの詳細さの違いに着目し、事業構造改善引当金を計上している期間と当該勘定科目の計上基準の記載内容の詳細さとの関係を検討した。調査結果得られた主な結果は次の通りである。1事業構造改善に要する時間が長期にわたると判断する経営者は事業構造改善引当金の計上基準の具体的な記載を選好する。2発生する特別損失の額を合理的に見積もることができる経営者は、それにともなって必要となる流動性の維持管理に対する意識が高いと同時に特別損失の発生時期を適切に把握している可能性が高い。上述の結論を得るために設けたリサーチ・デザインは次の通りである。事業構造改善引当金の計上基準の事例を2013年11月末日現在の日経平均株価の構成銘柄に含まれている日本企業から収集した。なお、次の条件をすべて満たす銘柄の企業とした。(1)日本において一般に承認されている会計原則に基づいて連結財務諸表を作成している企業、(2)金融機関(その他金融も含む)、損害保険、公共性の強い企業(電気・瓦斯・空輸・鉄道)ではないこと、そして(3)3月31日に会計年度末決算日を設けている企業である。前記の三つの条件を満たす日本企業は126社である。(4)2008年3月31日から2013年3月31日までの連続する21四半期間に関する四半期報告書および有価証券報告書が入手できることを条件とした(124社)。そして、(5)連結貸借対照表に事業構造改善引当金の計上を少なくとも一回(四半期単位)行っている日本企業とした。この結果、分析対象企業数が41社になり、分析対象事例件数は48社/四半期であった。

この目的を、日本において承認された会計原則に基づいて『四半期決算短信』を作成している日本企業(金融および損保を除く業種に分類される企業)を分析対象にして、解決する。当初の研究目的をに基づいて収集可能なデータの変更等の調整を行いながら、今後につながる研究成果を得ることができた。とりわけ、事業構造改善損失計上をめぐる会計処理手続きに着目した研究は、日本企業の経営者の意思決定構造を理解することに役立つと思われる。特別損益項目計上と一株当たり利益水準との関係を検討することが本研究の目的である。当初の研究目的に基づいて、収集可能なデータの変更等の調整を行いながら、今後につながる研究成果を得ることができた。当初の研究計画と比較して、事業構造改革引当金を計上している企業が顕著な自社株買いを実施していないことに基づいて、統計手法に基づいた実証分析の実施が極めて困難な状況になっている。発行済み株式数が顕著に減少する自社株買いではなく、単位未満株の売買に基づく発行済み株式数の軽微な増減事例しか見当たらない。かかる状況をある程度見込んでいたため、研究手法を悉皆調査に基づく事例研究に変更し、記述理論の構築を指向した実証分析というアプローチを選択している。会計学[現在までの達成度]に記載した内容に基づいて、記述理論の構築を指向した実証分析の実施を試みる。当該研究手法の変更があったものの、当初の研究計画に記載した研究課題を致命的な問題に直面することなく引き続き遂行することができると考えている。必要なデータのダウンロードが計画通りに進まないことに加え、既に収集したデータを概観し、仮説を構築するさいのヒントと先行研究とのすり合わせが困難な状況になっている。先行研究の含意を再検討し、新たな仮説を構築する必要を検討する必要性を感じている。下記に示した研究計画に基づいて必要なデータの収集に努めた。達成度が100%ではないものの、データ収集に要する時間の「ズレ」を予め加味した上での本年度の計画であったため、次年度中に必要なデータを完備できれば当初の計画通り、研究目的を達成できると考えている。想定内であるものの、当年度に着手できなかった作業は収集したデータをデータベースに入力する作業である。データ入力に要する補助(アルバイト)を雇用する必要性が当初の見込みよりも大幅に小さくなったことに起因して、次年度使用額として¥89,054が生じた。引き続き必要なデータのダウンロードを行いたい。と同時に、入手済みのデータを確認しながら、方法論の選択(実証分析またはケーススタディー)を早急に決め、当初の研究課題を遂行したいと考えている。「現在までの達成度」に記したとおり、想定済みの研究計画との「ズレ」を解消すべく収集済みのデータを既存のデータベースに追加入力する作業と会計実践の事例分析を行うための悉皆調査に着手することが次年度に行う主たる研究活動になる。四半期決算短信から構築したデータ・ベースの更新と四半期財務報告のダウンロードが本年度に行う主たる活動になる。
神経機能を加味した誤嚥ラットモデル作成と感覚刺激に対する嚥下評価法の検討

ラット咽頭喉頭・軟口蓋において、カプサイシン受容体(TRPV1)、高温度(52°C以上)のセンサー(TRPV2)、神経ペプチドであるgalaninの免疫染色を行った。TRPV1やgalaninを含む神経線維は粘膜固有層に多く、一部は上皮内にも侵入していた。TRPV1線維は咽頭鼻部や喉頭蓋粘膜で最も多く、galanin線維は咽頭喉頭部・喉頭蓋・軟口蓋粘膜でみられた。TRPV2線維の分布は一部を除いて不明であった。更にTRPV1線維は、主に迷走神経上神経節や舌咽神経節由来である事が判明した。また神経伝達物質輸送を阻害するコルヒチンを迷走神経及び上喉頭神経に注入しても明らかな嚥下障害は見られなかった。嚥下機能は重要な機能の1つである。現在、高齢者の誤嚥性肺炎が問題視されており、誤嚥性肺炎の患者の肺から口腔内細菌が検出されるなど歯科においても重要度の高い問題である。本研究では、嚥下反射の評価法の確立と嚥下に対する病的変化(加齢)と味覚、嗅覚などの各種感覚刺激の嚥下反射改善効果を体系的に評価するために、誤嚥ラットモデルを作成し、咽頭喉頭領域の知覚や運動に関わる舌咽、迷走神経の入力や出力に関わる神経節や嚥下の制御に関わる脳幹の神経核、更には大脳の変化について明らかにすることを目的としている。今年度は、咽頭各部の粘膜における感覚神経の分布や由来について調べた。実験には正常ラット5匹を用いて、麻酔後、Zamboni固定液で潅流し、鼻腔、口腔、咽頭、喉頭及び上位の食道,気管を一塊に取り出し、凍結切片作製、免疫染色を行った。その結果、カプサイシンレセプターであるVR1、TRPV1、を含む神経線維が咽頭粘膜に豊富に観察された。これらの神経線維は粘膜固有層に数多く認められ、それらの一部は上皮内に侵入していた。TRPV1を含む神経線維は咽頭鼻部や喉頭蓋の喉頭側粘膜で最も多く観察された。52°C以上の高温度に対するセンサーであるVRL-1, TRPV2は上皮内や固有層の樹状細胞に認められたが、TRPV2を含む神経線維の分布は不明であった。咽頭鼻部と喉頭部の境界部や軟口蓋にトレーサーを注入した結果、迷走神経上神経節や舌咽神経節、さらに迷走神経下神経節の吻側部における感覚ニューロンがTRPV1やTRPV2を含む神経線維の由来であることが明らかとなった。更に、神経伝達物質の輸送を阻害すると考えられるコルヒチンを迷走神経及び上喉頭神経に注入したが明らかな嚥下障害は見られなかった。今後、神経筋疾患モデルマウスにおける咽頭や喉頭における筋の萎縮について観察し、それらの嚥下機能について検討する予定である。嚥下機能は重要な機能の1つであるが、現在、高齢者の誤嚥性肺炎が問題視されており、誤嚥性肺炎患者の肺から口腔内細菌が検出されるなど歯科においても重要度の高い問題である。本研究では、嚥下機能の評価法の確立と嚥下に対する病的変化(加齢)と味覚、嗅覚、冷温覚など各種感覚刺激の嚥下反射改善効果の体系的評価のため、誤嚥ラットモデルを作成し、咽頭喉頭領域の知覚や運動に関わる舌咽、迷走神経の入力や出力に関わる神経節や嚥下の制御に関わる脳幹の神経核更には大脳の変化について明らかにすることを目的とした。最終年の今年度は、舌咽神経や上喉頭神経切断により、誤嚥ラットモデルの作成を行う予定であったがこれらの神経切断のためには、その手術の際に咽頭や周囲組織の挫滅が生じる。誤嚥を生じさせることができたとしても、それが感覚異常のためか、咽頭筋などの変性によるものか判断できない。そこで、感覚神経損傷のマーカーであるgalaninの分布を正常及び誤嚥(神経切断)ラットの咽頭及び舌咽・迷走神経節の感覚ニューロンで明らかにすることにした。まず正常ラット咽頭や周囲組織の粘膜におけるgalaninを含む神経の分布について正常ラット4匹を用いて調査した。動物を麻酔後、Zamboni固定液で潅流し、鼻腔、口腔、咽頭、喉頭、上位の食道、気管を一塊に取り出し、凍結切片作製後免疫染色を行った。その結果、galaninを含む神経線維が咽頭やその周囲組織で豊富に観察された。これらの神経線維は粘膜固有層に数多く認められ、それらの一部は上皮内や味蕾内に侵入していた。galaninを含む神経線維は咽頭喉頭部・喉頭蓋喉頭側・軟口蓋粘膜で最も多くみられた。舌咽、迷走神経節においては、galaninは、多くの小型ニューロンに認められた。期間内に、誤嚥ラット咽頭におけるgalaninの分布や舌咽、迷走神経節における感覚ニューロンの変性については明らかにできなかったので、今後の検討課題としたい。

TRPV1線維は咽頭鼻部や喉頭蓋粘膜で最も多く、galanin線維は咽頭喉頭部・喉頭蓋・軟口蓋粘膜でみられた。TRPV2線維の分布は一部を除いて不明であった。更にTRPV1線維は、主に迷走神経上神経節や舌咽神経節由来である事が判明した。また神経伝達物質輸送を阻害するコルヒチンを迷走神経及び上喉頭神経に注入しても明らかな嚥下障害は見られなかった。嚥下機能は重要な機能の1つである。しかし現在、高齢者の誤嚥性肺炎が問題視されており、誤嚥性肺炎の患者の肺から口腔内細菌が検出されるなど歯科においても重要度の高い問題となっている。本研究では、嚥下反射の評価法の確立と嚥下に対する病的変化(加齢)と味覚、嗅覚、温度感覚など各種感覚刺激の嚥下反射改善効果を体系的に評価するために、誤嚥ラットモデルを作成し、咽頭喉頭領域の知覚や運動に関わる舌咽神経や迷走神経の入力や出力に関わる神経節内や嚥下の制御に関わる大脳、脳幹の変化について明らかにすることを目的としている。しかしながら、現在にいたるまで正常ラットの咽頭粘膜や咽頭筋の神経支配については報告が少なく、ほとんど明らかではない。したがって、今年度では、まず咽頭各部の粘膜における感覚神経の分布や由来について調べた。実験には正常ラット5匹を用いた。動物を麻酔後、Zamboni固定液で潅流し、鼻腔、口腔、咽頭、喉頭及び上位の食道,気管を一塊に取り出し、凍結切片作製後、免疫染色を行った。その結果、神経ペプチドであるCGRPやPACAPを含む神経線維が咽頭粘膜に豊富に観察された。これらの神経線維は粘膜固有層に数多く認められ、それらの一部は上皮内に侵入していた。CGRPやPACAPを含む神経線維は咽頭鼻部と喉頭部の境界や喉頭蓋の喉頭側粘膜で最も多く観察された。また、これらの神経線維は味蕾の直下にも分布していた。咽頭鼻部と喉頭部の境界部にトレーサーを注入した結果、迷走神経上神経節や舌咽神経節、さらに迷走神経下神経節の吻側部における感覚ニューロンがCGRPやPACAPを含む神経線維の由来であることが明らかとなった。今後、誤嚥ラットモデルを作製し、咽頭粘膜におけるCGRPやPACAP或いは感覚刺激に対するセンサーの分布の変化を調べる予定である。現在まで正常ラットの咽頭粘膜における感覚神経の分布や由来について明らかにしてきた。免疫染色によりカプサイシンレセプターであるvanilloid receptor subtype 1 (VR1, TRPV1)、52°C以上の高温度に対するセンサーであるvanilloid receptor subtype 1-like receptor (VRL-1, TRPV2)を含む感覚神経や樹状細胞の分布を咽頭粘膜で調べた結果、今年度までの研究で咽頭と喉頭及び口腔との境界に、TRPV1を含む神経線維が豊富であるという結果が得られた。またTRPV1およびTRPV2を含む神経線維の由来を、逆行性軸索輸送による実験により明らかにした。咽頭粘膜に注入したトレーサーは舌咽神経節及び迷走神経上神経節の小型から中型の感覚ニューロンに認められた。しかしながら迷走神経下神経節ではまれであった。これらのニューロンを含む切片に間接蛍光抗体法を用いて免疫染色を行うと、多くの咽頭粘膜を支配しているニューロンにTRPV1やTRPV2の反応が観察された。以上の結果から、咽頭粘膜におけるTRPV1やTRPV2を含む神経線維は、舌咽神経節及び迷走神経上神経節由来であると考えられた。嚥下障害の原因の一つとして、老化及びさまざまな疾患による感覚神経の変性などが考えられる。本研究の過程で観察されたTRPV1及びTRPV2を含むニューロンと誤嚥との関係については、さらなる検討が必要とされる。
遺伝子発現を利用した青果物の鮮度評価技術の開発

野菜の鮮度の客観的な評価法を開発するため、特に鮮度低下の激しい葉菜類を対象に、野菜の収穫の鮮度低下に伴って発現が増加あるいは減少する遺伝子群を特定し、それらの発現を検出することによって、鮮度を推定する方法を検討した。ホウレンソウ、ブロッコリー、レタスの貯蔵前後で発現量に差のある約500個の遺伝子の塩基配列を決定した。これらのうち、数個の遺伝子の発現をマルチプレクスRT-PCRによって検出し、鮮度を推定する評価法を開発した。さらに、ホウレンソウのシステインプロテアーゼ配列をもとに設計したディジェネレートプライマーを使って、ホウレンソウとブロッコリー共通の鮮度マーカーとなることを見いだした。野菜の「鮮度」は、主に外観で評価され、物性、内容成分の変化も補助的に用いられるが、栽培時期によって、収穫時の物性や内容成分の傾向は異なっているため、これらの数値のみで野菜の鮮度を客観的に評価することは困難であった。そこで、特に鮮度低下の激しい葉菜類を対象に、野菜の収穫後に起きる生理変化と、その原因となる遺伝子の発現に着目して、鮮度低下に伴って発現する遺伝子群を特定し、それらの簡易な検出法を新たに開発することを目的とする。これにより、従来は困難であった野菜の客観的鮮度評価が可能となり、流通過程の具体的な改善を通じて、生産者と消費者に利益をもたらす。平成24年度は、ブロッコリーを20°Cで貯蔵し、貯蔵開始時と花蕾が黄化した貯蔵4日目の試料を用いて発現量に差のある遺伝子を濃縮したライブラリーを作り、178個の遺伝子の塩基配列を決定した。Blast検索により、ブロッコリーの黄化に伴って発現量が増加する遺伝子として、ペルオキシダーゼ、システインプロテアーゼ、ACCオキシダーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ等のホモログが特定された。17個のクローンについてノーザンブロット分析を行い、貯蔵に伴う発現パターンによってグループ分けした。これらのうち、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは397 bp,暗黒誘導タンパク質は293 bp,ペクチナーゼは198 bpのフラグメントを検出するプライマーを設計し、それらを組合せたRT-PCRで、温度別に貯蔵した花蕾の鮮度低下の兆候を、外観では判断が難しい貯蔵1日目の段階から検出できた。また、レタスでも同様の試験を行い、貯蔵によって変化する137個の遺伝子の塩基配列を決定して、Blast検索を行うとともに、カタラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、感染特異的タンパク質、プロテアーゼインヒビターの組合せでRT-PCRにより鮮度評価を行うことが可能になった。野菜の「鮮度」は、主に外観で評価され、物性、内容成分の変化も補助的に用いられるが、栽培時期等によって大きく異なるため、これらの数値のみで野菜の鮮度を客観的に評価することは困難である。平成23年度は、ホウレンソウの貯蔵前後で発現量に差のある遺伝子177個の塩基配列を決定した。これらのうち、クロロフィル結合タンパク質、ポリガラクチュロナーゼ前駆体、システインプロテアーゼ様タンパク質、塩誘導疎水性タンパク質のフラグメントが増幅されるようにPCRプライマー(25 mer)を設計して、これらを鮮度マーカーとして、外観変化が現れる前から鮮度低下の兆候を検出可能なマルチプレクスRT-PCRによる鮮度評価法を開発した。24年度は、ブロッコリーで同様の実験を行い、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、暗黒誘導タンパク質、ペクチナーゼをマーカーとして、鮮度低下を検出可能な方法を開発した。また、レタスでも同様の試験を行い、カタラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、感染特異的タンパク質、プロテアーゼインヒビタの組合せで鮮度評価が可能になった。25年度は、ホウレンソウとブロッコリーにおいて、先に明らかにした遺伝子の塩基配列情報からリアルタイムPCR用のプライマーを設計し、発現量の変化が大きい遺伝子を選抜した。さらに、植物種の異なるホウレンソウとブロッコリーで、共通して鮮度低下を検出できるプライマーの組合せを検討した結果、ホウレンソウのシステインプロテアーゼ配列をもとに設計したディジェネレートプライマーのうち、増幅されるフラグメントが506 bpとなる組合せが、共通の鮮度マーカーとなることを見いだした。

これにより、従来は困難であった野菜の客観的鮮度評価が可能となり、流通過程の具体的な改善を通じて、生産者と消費者に利益をもたらす。平成23年度は、ホウレンソウを10°Cで貯蔵し、貯蔵開始時と、葉が黄化した貯蔵4日目の試料を用いて発現量に差のある遺伝子を濃縮したライブラリーを作り、177個の遺伝子の塩基配列を決定した。Blast検索により、ホウレンソウの黄化に伴って発現量が増加する遺伝子として、タンパク質分解酵素、糖加水分解酵素、傷害誘導タンパク、germin様タンパク質等を特定した。一方,クロロフィル結合タンパク質は、貯蔵に伴って発現量が減少した。他にも機能未知の遺伝子ホモログ(71個)や未報告(48個)の遺伝子が得られた。既知遺伝子と類似性を示す27個のクローンについてノーザンブロット分析を行い、貯蔵に伴う発現パターンによってグループ分けした。これらのうち,クロロフィル結合タンパク質は509 bp,ポリガラクチュロナーゼ前駆体は403 bp,システインプロテアーゼ様タンパク質は309 bp,塩誘導疎水性タンパク質は170 bpのフラグメントが増幅されるようにPCRプライマー(25 mer)を設計して、混合比を最適化した結果、マルチプレクスRT-PCRによって、外観では判断が難しい葉の鮮度低下の兆候を貯蔵2日目の段階から検出可能な鮮度評価法を開発できた。ブロッコリーとレタスを用いて、貯蔵開始時と、花蕾および葉が黄化した試料を用いて発現量に差のある遺伝子をサブトラクション法で濃縮したライブラリーを作り、それぞれ178個および137個の遺伝子の塩基配列を決定した。Blast検索により、ブロッコリーおよびレタスの黄化に伴って発現量が増加あるいは減少する遺伝子と、既知の遺伝子の対応を明らかにした。既知遺伝子と類似性を示すクローンについてブロッコリーは17クローン、レタスは19クローンのノーザンブロット分析を行い、貯蔵に伴う発現パターンの変化を明らかにして、グループ分けした。これらのうち、ブロッコリーはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、暗黒誘導タンパク質、ペクチナーゼに対応したPCRプライマー、レタスは、カタラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、感染特異的タンパク質、プロテアーゼインヒビターに対応したPCRプライマーを設計して、混合比を最適化した結果、外観で判断が難しい鮮度低下の兆候を、それぞれ貯蔵1日目の段階から検出可能な鮮度評価法を開発できた。以上により、24年度の研究実施計画にある研究目標をすべて達成できた。さらに、野菜の鮮度指標のひとつであるビタミンCの分析法についても迅速化の検討を行い、遺伝子発現解析との比較が効率的になった。ホウレンソウを用いて、貯蔵開始時と、葉が黄化した貯蔵4日目の試料を用いて発現量に差のある遺伝子をサブトラクション法で濃縮したライブラリーを作り、177個の遺伝子の塩基配列を決定した。Blast検索により、ホウレンソウの黄化に伴って発現量が増加あるいは減少する遺伝子と、既知の遺伝子の対応を明らかにした。既知遺伝子と類似性を示す27個のクローンについてノーザンブロット分析を行い、貯蔵に伴う発現パターンの変化を明らかにして、グループ分けした。