hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内陸断層との比較研究に基づくプレート境界断層の物質・力学的キャラクタリゼーション

(1)四万十付加体における地質調査と物質解析:昨年度に引き続き四国西部における四万十付加体の地質調査を行い,本研究における調査予定地域全域(仏像構造線から足摺岬まで)の構造調査を完了した.その結果,本調査地域では四万十帯北帯に7帯,南帯に2帯の地質図スケールの変形集中帯が存在することが明らかとなった.また,ほぼ全域においてビトリナイト反射率を求め,最高被熱温度が南方ほど高くなる傾向を認めた.最も浅部の変形を記録していると考えられる調査地域最北部の変形集中帯については,構造解析と断層岩試料の解析(薄片・研磨片作成)を行い,剪断センスの決定と変形条件の推定を行った.これにより,南海付加体で採取されている断層帯試料や岩石変形実験などで得られている付加体浅部の現象との対比が可能となった.(2)沈み込み帯浅部における断層弱化機構と組織発達:昨年度の研究において,粘土鉱物を含む断層が中速高速摩擦すべりに対して動的強度弱化を示すことを明らかにし,その理由として粘土鉱物が少量でも含まれる事によって断層の透水率が大幅に低下し,間隙水圧上昇プロセスによって強度低下することを示した.本年は断層中の組織の発達を調べるために薄片を作成し,光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて詳細に調べた.その結果,断層帯内部での破砕の進行は極めて低調であり,非対称構造などの組織もほとんど発達しないことが明らかとなった.(3)巨大分岐断層浅部コア試料の解析結果:IODP第338次研究航海で採取された巨大分岐断層浅部コア試料の研磨片非破壊分析を行うとともに,主要な変形帯の薄片を作成し,光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いた詳細な組織観察を行った.また,コア試料の年代の食い違いから断層変位前の地層の復元を行い,変位量を見積もった.その結果,コア試料中に求められる変形構造は,見積もられた変位量と比べて発達の程度が低いことが明らかとなった.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.四万十帯を対象とした付加体中の地質構造調査と被熱構造解析本年度は,四万十帯横断方向の統一的・網羅的な変形分布を把握するため,四国西部の四万十帯ほぼ全域で連続的な地質横断調査を行った.その結果,変形が著しく,海洋プレートに由来する物質を含む計4帯のメランジュ帯を見いだした.また, 2帯のメランジュ帯からはより後期に形成されたと考えられる脆性断層帯が認められた.ビトリナイトの反射率測定から推定される最大被熱温度は約200-350°Cと調査地域内で幅を持つが,温度変化のない,もしくは変化が連続的な地域と不連続的に変化する箇所が存在し,後者については地質調査で見いだしたメランジュ帯中の脆性断層帯の位置と一致した.2.沈み込み帯浅部断層の力学・水理学的特性理解のための透水・摩擦実験粘土鉱物(スメクタイト)を含む海溝型地震断層浅部の力学・水理学的特性を決定するため,多様な速度条件と粘土量比のもと,粘土質断層の変形実験を行った.その結果,粘土質断層は低速度条件下では強い摩擦強度を示す一方,これまで顕著な動的強度低下は起こさないと考えられてきた中速度領域で劇的なすべり弱化を示すことが判った.周囲の岩石の浸透率を変えた検証実験や間欠的な変形実験,透水率測定などから,すべり弱化の要因は断層の透水率の低さと間隙圧の上昇プロセスであることが明らかとなった.結果は論文としてまとめ,国際誌に投稿した.3. IODP第338次航海で得られた断層試料の構造解析過去の付加体中に記録されている断層と現世の地震発生帯浅部の断層を比較するため, IODP第338次研究航海で採取された断層試料の構造解析を行った.本年度は試料の研磨片作成と肉眼観察が終了した.来年度以降,薄片作成と顕微鏡分析,機器分析を行う予定である。(1)四万十付加体における地質調査と物質解析:昨年度に引き続き四国西部における四万十付加体の地質調査を行い,本研究における調査予定地域全域(仏像構造線から足摺岬まで)の構造調査を完了した.その結果,本調査地域では四万十帯北帯に7帯,南帯に2帯の地質図スケールの変形集中帯が存在することが明らかとなった.また,ほぼ全域においてビトリナイト反射率を求め,最高被熱温度が南方ほど高くなる傾向を認めた.最も浅部の変形を記録していると考えられる調査地域最北部の変形集中帯については,構造解析と断層岩試料の解析(薄片・研磨片作成)を行い,剪断センスの決定と変形条件の推定を行った.これにより,南海付加体で採取されている断層帯試料や岩石変形実験などで得られている付加体浅部の現象との対比が可能となった.(2)沈み込み帯浅部における断層弱化機構と組織発達:昨年度の研究において,粘土鉱物を含む断層が中速高速摩擦すべりに対して動的強度弱化を示すことを明らかにし,その理由として粘土鉱物が少量でも含まれる事によって断層の透水率が大幅に低下し,間隙水圧上昇プロセスによって強度低下することを示した.本年は断層中の組織の発達を調べるために薄片を作成し,光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて詳細に調べた.その結果,断層帯内部での破砕の進行は極めて低調であり,非対称構造などの組織もほとんど発達しないことが明らかとなった.(3)巨大分岐断層浅部コア試料の解析

結果:IODP第338次研究航海で採取された巨大分岐断層浅部コア試料の研磨片非破壊分析を行うとともに,主要な変形帯の薄片を作成し,光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いた詳細な組織観察を行った.また,コア試料の年代の食い違いから断層変位前の地層の復元を行い,変位量を見積もった.その結果,コア試料中に求められる変形構造は,見積もられた変位量と比べて発達の程度が低いことが明らかとなった.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。四万十帯での広域地質調査は当初の予定よりも順調に進んでおり,来年度予定していた調査もほぼ完了している.また,沈み込み帯浅部物質の力学・水理学的特性の理解については,計画していた段階にまで至っている.一方で,断層帯・メランジュ帯に焦点を絞った個別調査と, IODP第338次航海で得られた試料の解析は当初の予定よりもやや遅れている.総合すると,全体の進展度合いとしては「おおむね順調に進展している」状況である.今年度までに明らかとなった「沈み込み帯浅部断層の力学的特性を支配する素過程」について,天然の断層でも起こりうるのか(起こっているのか)を解明するために,天然の断層と実験後の模擬断層の内部組織や物質を詳細に解析し,対比を行う.また,沈み込み帯深部での変形機構や力学的特性を明らかにするために,これまでとは異なる試験機を用いた変形実験を行う予定である.実験は国内の既存試験機では技術的困難が生じるため,海外の研究機関との連携(申請者の海外渡航)を予定している
階層意識形成の媒介要因としての空間性への計量的アプローチ

平成19年度の研究では、(1)実査データと地域データとの合併作業、(2)データ分析、(3)分析成果の一部を用いた学会発表、(4)データ寄託に向けた準備、が行われた。まず、(1)としては、具体的には平成18年度の実査において収集されたデータを、やはり平成18年度に収集した当該調査地域に対応する国勢調査の小地域統計と合併することで、本課題研究のマルチレベル分析を行うためのデータ作成が行われた。(2)のデータ分析は、(1)で作成されたデータについて、マルチレベル分析の手法によって行われた。分析にはHierarchical Linear Modelが適用可能な統計ソフトHLM6を用い、階層帰属意識に対する地域の効果について、市区町村レベルよりさらに細かい小地域単位で分析を行うことにより、地域特性が人びとの階層意識にどのような媒介的効果を持っかが検討された。現在も様々な地域データを用いて検討が繰り返されており、それらの成果は学術論文として投稿準備中である。(3)については、分析結果の一部を、5月に同志社大学で行われた関西社会学会第58回大会において「階層意識に対する従業上の地位の効果について」という題目で、9月に広島修道大学で行われた数理社会学会第44回大会において「階層意識に対する『失業』と『フリーター』の効果について」という題目で学会発表を行い、今後研究成果を論文にまとめていくための有益なアドバイスを得ることが出来た。(4)については、本研究終了後に、実査データをSSJDAへ寄託することを予定しており、そのための準備作業が行われた。ただ、小地域情報を含めた個票データは個人の特定がされやすくなるという問題があり、どの程度までの情報が公開にふさわしいかという点について引き続き検討中である。(2)実査(調査票の配布と回収)については、3都府県の6市区町内の、各5投票区から抽出されたサンプルに対して郵送調査法によって行われ、1200の計画サンプルのうち回収サンプルは454(回収率37.8%)であった。続いて(3)コーディングが学生アルバイトを用いて行われた。(4)データ分析については、コーディングとクリーニングを経て完成したデータを用い開始された。具体的には、地域の空間特性の違いが階層帰属意識などの階層意識そのものの高低やその規定要因にどのような影響を持っているかという研究監視にもとづく、複数の作業仮説について統計的手法によってデータ分析を行った。この作業は、現在も継続中されており、平成19年度の報告書作成に向けた検討作業が進行中である。
ブレインマシンインタフェースへの応用に向けた運動軌道生成システムの開発

本研究では、将来のブレインマシンインタフェースへの応用を目指し、人間らいしい運動軌道を生成するシステムの開発を目指した.特に、腕の二点間到達運動を様々な運動を構成する基本的な要素単位(運動プリミティブ)と仮定し、それらを適切に組み合わせることにより経由点が存在する複雑な到達運動に関して人間と同様の特徴を持った軌道を生成できることが確かめられた.本研究では、将来のブレインマシンインタフェースへの応用を目指し、人間らいしい運動軌道を生成するシステムの開発を目指した.特に、腕の二点間到達運動を様々な運動を構成する基本的な要素単位(運動プリミティブ)と仮定し、それらを適切に組み合わせることにより経由点が存在する複雑な到達運動に関して人間と同様の特徴を持った軌道を生成できることが確かめられた.人間の被験者を対象とした経由点のある腕の到達運動の計測実験,および,計算論的な運動制御モデルを用いて計測された運動軌道を再現する計算機シミュレーションを行った.計測実験では,肩を含む矢状面内において,始点と終点の間に経由点がある到達運動の手先の軌道を計測した.その結果,始点と終点を結ぶ直線に対して対称に配置されたそれぞれの経由点を通過する二つの到達蓮動では,手先の軌跡が対称とならないこと,また手先の速度波形も異なる特徴を持つことが確かめられた.この実験結果は,水平面内における到達運動において従来から確かめられてきたものと同様の傾向を示しており,到達運動が腕の動特性を考慮して生成されていることを示唆している.また,計算機実験では,始点と経由点,およひ経由点と終点を結ぶ二つの二点間到達運動を時聞的にシリアルにつなげることにより,計測実験で得られた人の運動軌道が計算機上で再現できることを確かめた.ただし,人間が行っているような滑らかな運動を生成するためには,前半の二点間到達運動の目標点を実際の経由点と少しずらした位置に設定すること,また実際に手先が前半の運動の目標点に到達する前に後半の運動に切り替える必要があることが確かめられた.これは,経由点のある滑らかな到達運動を二つの二点間到達運動をつなげて生成するために,前半の運動の目標位置および二つの運動を切り替えるタイミングという二つのパラメータを始点,経由点,終点の位置に応じて適切に決定すれば良いことを示す結果であり,運動の開始から終了までの各時刻の目標軌道を決定しなければならない従来の運動計画モデルよりもはるかに少ないパラメータで人間の到達運動が再現できる可能性があることを本年度では示すことができた.肩を含む矢状面内において,始点と終点の間に経由点が存在する到達運動に関する計測実験および計算機シミュレーション実験を行った.計測実験では,人間の被験者に複数のパターンの到達運動を行ってもらい,運動中の腕の軌道を三次元計測装置で観測するとともに腕の表面筋電信号を計測し筋肉の活動度合いを観測した.また,計算機シミュレーションでは,始点と経由点,および経由点と終点を結ぶ二つの二点間到達運動を時間的にシリアルにつなげることにより,経由点を通過する到達運動を再現した.この際,一つ目の運動の目標点および,二つの運動を切り替えるタイミングをパラメータとして設定し,手先の軌跡ができるだけ被験者のそれと近くなるように二つのパラメータを最適化した.その結果,手先の軌跡のみならず,手先の接線方向の速度波形も被験者のそれと非常に近い特徴が再現できた.これは,二つのパラメータを自律的に学習する運動計画モデルを構築する際には,手先位置に関する情報のみを評価関数に含めることで,手先の速度も人間に近い物が得られる可能性を示している.一方,運動中の筋肉の活動を比較した結果,被験者においては運動の後半における屈筋・伸筋の同時活性化が観測されたが,シミュレーションではそれらを再現することができなかった.これは,二点間到達運動制御モデルに同時活性度を調節する機構を追加する必要があることを示しており,そのような機構を追加することは今後の課題である.
腸管内の食物の存在形態が消化吸収に及ぼす影響,特に消化管内のカードの形態の影響

(1)異なる特性を有するカードの調製:育児粉乳は脱脂粉乳をベースとして調製されており、原料の脱脂粉乳の性質が消化管中のカード(ゲル)の状態に影響する。脱脂乳および新鮮脱脂乳から調製したカゼインミセル液を試料とした。種々の温度(60-80C,10-30min)で試料を加熱処理した後、凝乳酵素キモシンで処理し、カードを形成させ、その弾性率を測定した。加熱温度の上昇にともないカードの弾性率は減少し、カード形成開始時間が遅くなる。カード軟化の原因物質と考えられているのβ-ラクトグロブリンをカゼインミセル溶液に添加、加熱後、その結合量や-SH量の測定、電気泳動などを行ない、β-ラクトグロブリンのカゼインミセルへの結合や吸着が弾性率の低下をもたらす原因の一つであることが確認された。Caイオンの影響については乳清中のCa濃度を調節し、その影響を粘弾性測定により、調べ、Caイオン濃度の減少がカードの軟化をもたらす事を明らかにした。以上のように、温度処理の条件やCa濃度をコントロールすることにより、容易に異なる性質を有するゲルの調製が可能であることが明かになった。(2)異なる分子量を有するアミノ酸オリゴマーの消化性:オリゴメチオニン(OM)はパパインによるメチオニンエステルの酵素的重合により得られる5-12量体の混合物で、低カゼイン飼料に補足してラットを飼育すると成長をを促進するが、低大豆タンパク質(SPI)に補足した場合は結果が一定せず、5-7量体のの比率が高い場合のみ補足効果がある。SPIに補足効果を示さない8-9量体の比率が高く、且つ粒子が大きいOMを水中で超音波処理、次いでポリトロンにより均一化後、乾燥して、軽い多孔鱗片状のOMを調製し消化性を調べた結果、OMの表面積の増加により、酵素作用を受けやすくなり、SPIによる補足効果が上昇する傾向が示された。
組織事故の観点からの事故解析方法論とヒューマンエラー未然防止方法

本研究は、ヒューマンエラーの原因を対象システムや管理組織内に追究するための解析方法を検討し方法論として確立することが目的であり、下記の5つの観点で研究を進めた。1.既に発生した事故の組織事故としての解析と方法論:ヒューマンエラーに原因があると考えられる事故を組織事故として解析し直し、背後に存在する重要な観点、見落としがちな側面、特に情報のコミュニケーションプロセスなどに着目、事故解析の方法論の構築を試みた。2.組織事故の共通モデル:近年発生した地下鉄脱線事故、臨界事故、食中毒事故などを具体的に解析し、日本での法規制や慣習も考慮して、分野の異なる事故に共通する枠組みを抽出、組織事故解析のための共通モデルを提案した。3.事故調査・事故報告書の現状分析と有効活用のための体制と仕組み:日本での事故調査方法や調査主体の構成などを具体的に調べ、特に、報告書を活用する人の視点から問題点を明確にし、報告書から学ぶための新しい社会的仕組みや制度、報告書のあり方を提案した。様々な分野、業界に留まらず、業界を超えて事故情報が利用されるために、事故情報の共有システムの構築、情報の有効活用のための仕組みの確立を提言した。4.組織事故の未然防止とヒューマンファクターズ:組織事故を未然に防ぐためのインシデント・レポーティング・システムの航空業界や医療分野での活用状況を調査し、導入効果や運用上の問題点を抽出、分析した。5.信頼とリスク・コミュニケーション:ヒューマンエラーの要因の一つと考えられる人間の信頼感(trust)に着目、過信や不信のメカニズムを追究した。法規制や慣習が及ぼす影響、安全情報の解釈や安全に対する考え方など安全文化に依存する信頼の構造は、認知実験で解き明かした。組織事故の観点から人間エラーを未然に防止するための指針に結び付けられる可能性が大きい。本研究は、ヒューマンエラーの原因を対象システムや管理組織内に追究するための解析方法を検討し方法論として確立することを目的としている。特に情報のコミュニケーションプロセスと事故の背後に存在する組織文化に着目する。平成12年度は、河川事故、原子力、医療、航空業界の具体的な事故事例と取られている未然防止策の情報収集、及びその解析を行なった。(1)事故事例として、玄倉川遭難事故(1999.8)と原子力施設での臨界事故(1999.9)を取り上げ、組織事故として新しい観点から解析した。玄倉川事故発生当時は、流されたキャンパーの判断の甘さが事故原因と考えられていたが、信頼性工学手法のFTA(故障の木解析)手法を利用して原因を解析した結果、ダムの放流による増水を的確に知らせていないなど情報伝達過程での問題と、情報を流すべきダム管理事務所と警察との間で意思の不統一があった点など、情報発信側の問題が抽出された。臨界事故でも、情報伝達上の問題が浮かび上がった。これらの結果を、ポリエージェントシステムモデルで検討、望ましい情報伝達のシステムを考察した。(日本災害情報学会で発表)(2)未然に組織事故を防ぐための現状の対策状況を探った。初めはインシデント・レポーティング・システム(IRS)に着目、取り組みが始まったばかりの医療分野での現状を調査、導入効果や運用上の問題点を把握した。ある病院に協力を依頼し、英国ランカスタ大学開発のソフトシステム方法論によるアクションリサーチを行った結果、IRSは未だ有効に活用されておらず、IRSでは覆うことのできない対象領域があることもわかった。(情報システム学シンポジウムで発表)また、航空分野での取り組み状況を知るために、航空関係者による講演会を実施、最近の国内外でのIRSの状況を概観することができた。人間のシステムに対する信頼、確率論的評価の観点からも考察を進めている。

本研究は、ヒューマンエラーの原因を対象システムや管理組織内に追究するための解析方法を検討し方法論として確立することを目的としている。特に情報のコミュニケーションプロセスと事故の背後に存在する組織文化に着目する。平成12年度は、河川、原子力、医療、航空業界での組織事故解析と、事故後に実施された未然防止策の問題点を抽出した。平成13年度は、各分野での特徴を整理した後、分野間に共通する要因を抽出、統一的な方法論の構築に向けて、基本となる概念を提案した。1.組織事故を解析するための方法論の構築と評価に関して日本での法規制や慣習を考慮し、新たに発生した地下鉄脱線事故、環境汚染、食中毒事故などの解析を加えて、分野の異なる事故に共通する要因をまとめた(国際会議QMOD2001にて発表)。しかし、対象分野に依存しない事故解析方法論の構築には未だ至っていない。また、発生した事故の解析、事故報告書がどの程度読まれたか、有効に利用されたかについて、主要医療機関にアンケート調査し回収、現在解析を進めている。2.組織事故未然防止のための方法論に関して上記で抽出した共通要因をもとに、未然防止の為のリスクマネジメント方法論を構築すべく、学習型マネジメントシステム導入の重要性とリスク認知獲得に関する提案を行った(QMOD2001)。同時に、医療業界でのリスクマネジメントにおけるインシデント・レポーティング・システムについて、現場での誤ったアプローチを指摘、効果的位置付けを提案した(日本品質管理学会にて発表)。航空業界では、パイロットの自動化に対する態度・信頼の状況を調査し、ヒューマンエラーを起こす背景にある日本人の慣習や安全文化を考察中である。また、情報の提供方法によりリスク・コミュニケーションの効果に差異がある点に注目し、認知実験も継続している。特に情報のコミュニケーションプロセスと事故の背後に存在する組織文化に着目、平成12年度は、河川、原子力、医療、航空業界での組織事故解析と事故後に実施された未然防止策の問題点を抽出、13年度は各分野での特徴を整理した後、分野間に共通する要因を抽出、統一的方法論の構築に向けて、基本概念を提案した。14年度は下記の2点を行なった。1.組織事故を解析するための方法論の構築と評価に関して社会的事故の事故報告書がどの程度まで有効に利用されたかについて、ある医療事故の調査報告書に着目し主要医療機関にアンケート調査、その結果を学会で発表した。さらに3年間にわたり様々な分野の事故報告書を検討した結果をもとに現状の問題点を整理し、組織事故を解析するための対象分野に依存しない事故解析方法論の枠組みを構築、学会で発表した(安全工学シンポジウム、JSQC)。第3者機関による解析支援サポートが必要であることを提案している。2.組織事故未然防止のための方法論に関して未然防止の為のリスクマネジメント方法論として、インシデント・レポーティング・システムを活用し、リスク認知の獲得を目指した学習型リスクマネジメントシステムの提案を行った。
複合材料の表面・界面構造解析を目指したスピンコントラスト中性子反射率法の開発

スピンコントラスト中性子反射率法の確立に向けて核偏極装置に改良を施すとともに、その装置を用いてポリスチレン単層膜および積層構造を持つスチレン・イソプレン共重合体薄膜の核偏極反射率実験を行った。装置の改良に関しては、従来の核偏極装置では試料の裏面からしか中性子を入射することができなかったのに対して、改良型装置では全反射信号を得ることで絶対反射率が決まるように表面からも入射できるようにレイアウトを変更した。また、マイクロ波モードを考慮した試料セル形状にすることで、試料厚さ方向のみならず面内方向の核偏極度の均一性も考慮した設計とした。ポリスチレン単層膜のスピンコントラスト中性子反射率測定では、試料の水素核偏極度に対して偏極中性子反射率曲線が理論予測どおりに変化することが示された。本結果は、設計どおりに試料は均一に核偏極されていることを実証するものであり、核偏極度の不均一性を憂慮することなく構造が決定できる手法となったことが実証された。本実験で用いたスチレン・イソプレン共重合体薄膜はポリスチレン層とポリイソプレン層が互いに積層した構造を持つことが知られている。従来の無偏極中性子反射率測定では、一試料から一つの反射率曲線しか得られず、その反射率曲線を再現する積層構造は無数に存在していた。それに対して我々は、核偏極度によって変化する複数の反射率曲線を測定することにより、構造が強く限定されることを立証した。中性子反射率測定に合わせて設計した核偏極装置の試料セルが非常によく機能し、核偏極度の高さもさることながら、ポリスチレン単層膜の核偏極反射率曲線からは核偏極度の均一性を担保する大変綺麗な結果が得られた。多層膜材料の標準試料として用いてスチレン・イソプレン共重合体薄膜の反射率曲線からも従来の結果と矛盾の無い成果が得られた。これらは、学会発表においても高く評価された。本結果はさっそく論文にまとめてJournal of Applied Crystallography誌に投稿した。これまでは構造が既知のいわゆる標準試料を用いた性能確認試験を行ってきたが、2年目となる令和元年度からは核偏極中性子反射率法を用いた好研究例を輩出してそのメリットを広く伝えていきたい。具体的には、株式会社アート科学と組んでプラスチック(高分子)食器に用いるガラスコーティングの開発を主導すべく研究を開始している。従来の中性子反射率法では、最も知りたいガラスコーティング-高分子界面からの反射信号が、ガラスコーティング表面および高分子-シリコン基板界面からの強い反射信号に隠れて抽出することができない。それに対して、核偏極中性子反射率法によって得られる複数の反射率曲線を解析すればその抽出が可能になると考えている。

平成30年度に購入を計画していた試料セルの仕様変更が発生し、業者からの購入ではなく自機関において内製できることとなったため物品費が当初計画に比べて低く抑えることができ、次年度使用額が生じることとなった。使用計画としては令和元年度分経費と合わせてプラスチック製食器用ガラスコーティング試料の製作費(一部重水素化物使用)および装置の改良に用いる予定である。
肝在住の樹状細胞stem cellの証明と解析

ラットアロ肝移植後に、ホストリンパ組織の高内皮細静脈をtransmigrationして、ホストT細胞とクラスターを形成する樹状細胞(DC)様ドナー細胞が、多重免疫染色法により、未熟なDCを含むことを証明した.マウスの系で、感染リンパ節をtransmigrationする骨髄由来の未熟DC亜群(plasmacytoid DC)の存在を証明した.2.肝臓内のDCstemの精製と解析:DC様ドナー細胞を精製・FACS蛍光解析し、1.にほぼ一致する結果を得た.さらに、transmigrationしたドナー細胞が、マウスと同様にplasmacytoid DCを含むことを確認した.3.ドナー肝DC分画の細胞移入によるDCstemの証明:酵素消化処理のためか、ドナー細胞がホスト内で急激に消失したため、現在、精製過程の細胞障害を防ぐ方法を検討中である.4.DCstem分画の免疫寛容誘導能力:ドナー特異的輸血(DST)を臓器移植前に行うと、免疫寛容が起こりやすくなる.異系ラット肝移植モデルでDSTをおこなうと、ホスト血中にドナー特異的な細胞障害性抗体が出現し、ドナー細胞のホスト内遊走を阻止したので、肝の遊走性DCはむしろ拒絶反応を誘導することと、この細胞の遊走阻止により寛容促進がおこるという可能性が示唆された.5.コンジェニックラットへの肝移植によるDCstem生着:肝移植後24ヶ月のホストにはドナー細胞が認められたが、ドナーDCは検出されなかったので、現在、免疫抑制したホストで検索中である.コンジェニックラットを用いて小腸移植の実験をおこない新生児小腸の移植促進効果を認めた.6.骨髄に存在するDCstem分画:FACS蛍光解析により、月刊蔵同様に未熟なDCの存在を認めた.ラットアロ肝移植後に、ホストリンパ組織の高内皮細静脈をtransmigrationして、ホストT細胞とクラスターを形成する樹状細胞(DC)様ドナー細胞が、多重免疫染色法により、未熟なDCを含むことを証明した.マウスの系で、感染リンパ節をtransmigrationする骨髄由来の未熟DC亜群(plasmacytoid DC)の存在を証明した.2.肝臓内のDCstemの精製と解析:DC様ドナー細胞を精製・FACS蛍光解析し、1.にほぼ一致する結果を得た.さらに、transmigrationしたドナー細胞が、マウスと同様にplasmacytoid DCを含むことを確認した.3.ドナー肝DC分画の細胞移入によるDCstemの証明:酵素消化処理のためか、ドナー細胞がホスト内で急激に消失したため、現在、精製過程の細胞障害を防ぐ方法を検討中である.4.DCstem分画の免疫寛容誘導能力:ドナー特異的輸血(DST)を臓器移植前に行うと、免疫寛容が起こりやすくなる.異系ラット肝移植モデルでDSTをおこなうと、ホスト血中にドナー特異的な細胞障害性抗体が出現し、ドナー細胞のホスト内遊走を阻止したので、肝の遊走性DCはむしろ拒絶反応を誘導することと、この細胞の遊走阻止により寛容促進がおこるという可能性が示唆された.5.コンジェニックラットへの肝移植によるDCstem生着:肝移植後24ヶ月のホストにはドナー細胞が認められたが、ドナーDCは検出されなかったので、現在、免疫抑制したホストで検索中である.コンジェニックラットを用いて小腸移植の実験をおこない新生児小腸の移植促進効果を認めた.6.骨髄に存在するDCstem分画:FACS蛍光解析により、月刊蔵同様に未熟なDCの存在を認めた.(1)肝臓内の樹状細胞幹細胞(DCstem)をラット肝移植の系で証明(番号は申請時の研究目的を示す)ラットアロ肝移植後に、移植片由来の細胞がホストの血管から全身のリンパ組織に入り、T細胞増殖性応答を惹起することを見いだした.この細胞は一部増殖能を持ち、I型およびII型主要組織適合抗原とICAM1陽性だが、それ以外のDCマーカーやリンパ球・マクロファージマーカーについては陰性であり、DCstemである可能性が強く示唆された(投稿準備中).これに関連して、ラットクッパー細胞を精製・培養し、LPS投与すると、DC前駆体を誘引するケモカインであるMIP1aやIP10を数時間単位で大量に産生することを証明した(発表論文).(2),(6)ドナー肝と骨髄のDCstem分画の解析肝の非実質細胞分画からDC粗分画を集め、蛍光標識して細胞移入をおこなった。酵素処理のためか、肝移植に比しドナー細胞がホスト内で急激に消失することがわかり、現在、精製過程の細胞障害を防ぐ方法を検討中である.(3)コンジェニックラット間の肝移植を行い、ホスト内へのDCstemの生着を検索する現在15匹あまりのコンジェニックラットの肝移植が済み、長期観察(318ヶ月)を開始したところである.他に、同じ組み合わせで、胸管リンパ球細胞移入、脾臓移植、骨移植を行い、比較観察中である.一部の成果として、静脈投与したドナー胸管リンパ球が、4ヶ月後でも多数ホスト内に存在することがわかり、長寿命の再循環リンパ球がラットでも存在することを明らかにした(学会発表:The XIIth International Symposium on Molecular Cell Biology of Macrophages. Utsunomiya, Japan, June 19,2003).1.異系ラット肝移植の解析

(1)蛍光染多重免疫色法を確立し、2種類のモノクローナル抗体と増殖細胞(BrdU)と組織の骨組み(IV型コラーゲン)の4重蛍光観察ができるようになった。これにより、パイエル板に高内皮細静脈をtransmigrationしてT細胞領域に集積したドナーMHCII陽性細胞が、T,B,マクロファージマーカーを持たず、樹状細胞(DC)であることを証明した(投稿準備中)。(2)同様にマウスの系で、インフルエンザ感染リンパ節の高内皮細静脈をtransmigrationして集積するDC前駆体亜群の存在を証明した(発表論文1)。(3)ドナー特異的輸血(DST)を移植7日前に行うと、免疫寛容が起こりやすくなることが知られている。今年度の研究で、異系ラット肝移植モデルでDSTをおこなうと、アロ抗体が産生され肝由来のリンパ球や未熟なDCのホスト内遊走をほぼ完全に阻止すること、その結果ドナーDCによるホスト内移植抗原感作が抑制されることを見いだした(投稿準備中)。(4)ラット腸移植の系で、新生児の腸組織が血管新生能力を持つことを示し(発表論2)、DCとの関連を検索した。2.コンジェニックラット肝移植の解析現在、移植後6ヶ月と12ヶ月の組織を作成し、検索中であるが、ホスト側の免疫能を抑制していないので、あまりDC様ドナー細胞が認められない。今後放射線照射で免疫抑制を行った後に肝移植を行う予定である。1.異系ラット肝移植の系で、移植肝からパイエル板に遊走したMHCII陽性DC様ドナー細胞の解析2)さらに、B220に関しては、陽性群と陰性群に分かれた.B220陽性群はラットのplasmacytoid DC(pDC)のフェノタイプをもち、肝移植後に肝臓からパイエル板にtransmigrationするpDCであることをほぼ証明できた.並行して、マウスでpDCの前駆体が高内皮細静脈をtransmigrationし、ヘルペスウイルスに対する細胞障害性T細胞誘導の促進をすることを明らかにした(論文2).上の所見は、ラットでもdanger signalに呼応してtransmigrationするpDC細胞集団が存在することを示している.3)バイエル板連続切片を免疫染色してみると、ホストBrdU+細胞とクラスターを形成するMHCII+ DC様ドナー細胞のフェノタイプは、B220陰性であった.一方、増殖能を持つDC様ドナー細胞はTcR+のものが多く、MHCII+のT細胞であることがわかり、ドナーDCの増殖能はまだ証明できてない.2.コンジェニックラット肝移植の解析1)移植後24ヶ月のホストラットが2匹作成できたので組織を免疫染色したところ、ドナー細胞が少数認められたが、DC様ドナー細胞はほとんど認められてない.2)本課題のコンジェニックラットを用いて小腸移植の実験をおこなった.新生児小腸はたとえ凍結保存しても移植後再生するが、生後10日目の小腸だと再生できないこと、その時に両者を一緒に移植すると、生後10日目の小腸も再生することがわかった.これは、新生児小腸が血管新生を促進するためであると示唆された.新生児小腸の移植促進効果を解析してゆけば、拒絶応答の阻害法にヒントが得られるものと思われる(論文3).
乳汁κ-カゼインの免疫抑制作用に関する研究

平成8年度及び9年度に「乳汁κ-カゼインの免疫抑制作用に関する研究」という課題のもとに研究を行い、得られた成果は以下の通り要約される。1.牛乳κ-カゼインのTーリンパ球増殖抑制メカニズムについて検討を行い、κ-カゼインはそのκ-カゼイノグリコマクロペプチド(CGP)域(106-169域)のシアル酸を含む糖鎖を介して単球・マクロファージに結合し、IL-1レセプターアンタゴニストの大量生産を誘導することと、CD4+Tーリンパ球に直接結合し、その膜表面へのIL-2レセプターの発現を阻害することにより、Tーリンパ球の増殖を抑制する。なお、CGPは、IL-1レセプターアンタゴニストと同じIL-1ファミリーのサイトカインであるIL-1αやIL-1βの生産には影響を与えない。2.κ-カゼインは本来、マクロファージの食作用や活性化を抑制する作用を有しているが、その作用はペプシン消化では直ちに消失するが、トリプシンやキモトリプシン消化を行っても殆ど変化しない。3.CGPをマウスの飼料に混合し、経口投与すると、経口投与抗原や腹腔内投与抗原に対する特異抗体の生産が顕著に低下し、その原因はサブレッサーTーリンパ球の数が機能、あるいはその双方が増大していることによる。4.人乳CGPはマウスのT、B、両リンパ球に対してアポトーシス誘導能を有する。5.牛乳κ-カゼインをトリプシンで消化するとアポトーシス誘導能を有するペプチドが生じ、そのペプチドはパラ-κ-カゼイン(1-105)域とCGP域の双方から生じる。以上のように、牛乳κ-カゼインによるTーリンパ球の増殖抑制メカニズムを明らかにするとともに、人乳κ-かゼインのペプシン消化により生じるCGPにはアポトーシス誘導能があることや、牛乳κ-カゼインでも直接、トリプシン消化するとアポトーシス誘導ペプチドが生じることを明らかにした。牛乳κ-カゼイノグリコマクロペプチド(CGP)がTリンパ球の増殖を抑制することは、既に筆者の研究グループが明かにしているところであるが、まず、その抑制機構について検討を行った。その結果、牛乳CGPはマクロファージに結合し、マクロファージにインターロイキン-1レセプターアンタゴニストを生産させることと、CD4+Tリンパ球に結合し、インターロイキン-2レセプターの発現を阻止することがTリンパ球の増殖を抑制することを明かにした。次いで、牛乳CGPのマウスへの経口投与が抗体生産に及ぼす影響を調べた。その結果、牛乳CGPを含む飼料で5週間飼育したマウスにおいて、経口抗原と腹腔内に投与した抗原に対する抗体の生産が、CGPを含まない飼料で飼育した場合と比べて有意に低下していることを明かにした。一方、人乳からカゼインを調製し、キモシン消化後、人乳CGPを分離し、そのリンパ球の増殖に対する作用や抗体生産に対する作用を調べた結果、人乳CGPもリンパ球の増殖を抑制するとともに、抗体生産を抑制することが示された。加えて、人乳CGPには牛乳CGPには見られなかった細胞傷害性があることを見出した。そこで、人乳CGPの細胞傷害性について検討を行い、細胞傷害はT,B両リンパ球に対して起こるが、単球/マクロファージに対しては起こらないこと、細胞傷害はアポトーシスの誘導であることを明らかにした。平成8年度及び9年度に「乳汁-κカゼインの免疫抑制作用に関する研究」という課題のもとに研究を行い、得られた成果は以下の通り要約される。

1.牛乳κ-カゼインのTーリンパ球増殖抑制メカニズムについて検討を行い、κ-カゼインはそのκ-カゼイノグリコマクロペプチド(CGP)域(106-169域)のシアル酸を含む糖鎖を介して単球・マクロファージに結合し、IL-1レセプターアンタゴニスとの大量生産を誘導することと、CD4+Tーリンパ球に直接結合し、その膜表面へのIL-2レセプターの発現を阻害することにより、Tーリンパ球の増殖を抑制する。なお、CGPは、IL-1レセプターアンタゴニストと同じIL-1ファミリーのサイトカインであるIL-1αやIL-1βの生産には影響を与えない。2.κ-カゼインは本来、マクロファージの食作用や活性化を抑制する作用を有しているが、その作用はペプシン消化では直ちに消失するが、トリプシンやキモトリプシン消化を行っても殆ど変化しない。3.CGPをマウスの飼料に混合し、経口投与すると、経口投与抗原や腹腔内投与抗原に対する特異抗体の生産が顕著に低下し、その原因はサブレッサーTーリンパ球の数か機能、あるいはその双方が増大していることによる。4.人乳CGPはマウスのT、B、両リンパに対してアポトーシス誘導能を有する。5.牛乳κ-カゼインをトリプシンで消化するとアポトーシス誘導能を有するペプチドが生じ、そのペプチドはパラ-κ-カゼイン(1-105)域とCGP域の双方から生じる。以上のように、牛乳κ-カゼインによるTーリンパ球の増殖抑制メカニズムを明らかにするとともに、人乳κ-カゼインのペプシン消化により生じるCGPにはアポトーシス誘導能があることや、人乳κ-カゼインでも直接、トリプシン消化するとアポトーシス誘導ペプチドが生じることを明らかにした。
超電導コイル強磁場中プラズマ利用新機能性フラーレン分離・精製法の開発

(1)現有設備の超電導コイルにより4テスラの強磁場を大空間(直径40cm,長さ40cm)に発生させた.この中に真空容器を設置し,その一端からスパイラル状のタングステン電極を加熱することにより発生させた熱電子を,その前面のグリッドで加速することで電子ビーム及び直流放電アルゴンプラズマを生成した.一方,昇華用オーブン内に導入されたフラーレンは,オーブンを約350°Cに加熱することによってガス化され,そこに電子ビームまたはアルゴンプラズマが照射されることで電離し,フラーレンイオンが生成される.なお,今回は質量分離を行う観点から,C_<60>,C_<70>混合フラーレンを用いた.(2)まず,高周波電場を印加しサイクロトロン共鳴の原理を利用する質量分離法が,極端に高質量のフラーレンに適用できるかを確認するため,上記の原理に基づくオメガトロン質量分析器を用いてフラーレンイオンの検出を行った.その結果,最大2.4テスラまでC_<60>,C_<70>イオンに相当する質量の位置に独立したスペクトルピーク信号が検出され,しかもそれらの半値幅から算出される質量分解能が磁場強度の二乗に比例して増加していくことが観測された.これらの結果は,理論的に算出される質量分解能にほぼ一致しており,この質量分離法がテスラ級の強磁場下で高質量のフラーレンにも適用可能であることが明らかになった.また,テスラ級の強磁場が質量分解能の向上という点で非常に有用であることが示された.(3)次に,この質量分析器を発展させ,フラーレンの大量分離・精製を行うことが可能であるヘリカルアンテナ型質量分離装置の開発を行った.このヘリカルアンテナは大電力の投入が可能であり,また高密度のフラーレンプラズマ中へ高効率に高周波電磁場を浸透させることができる.この装置で上記混合フラーレンの質量分離を行った結果,オメガトロン質量分析器の場合と同様に,C_<60>,C_<70>イオンをそれぞれ分離して検出することに成功し,さらにアンテナへの投入電力に比例して検出電流の強度が増加することが明らかになった.これは,フラーレンイオン分離・精製量の向上を意味しており,この質量分離装置の実現可能性を実証した.(1)現有設備の超電導コイルにより4テスラの強磁場を大空間(直径40cm,長さ40cm)に発生させた.この中に真空容器を設置し,その一端からスパイラル状のタングステン電極を加熱することにより発生させた熱電子を,その前面のグリッドで加速することで電子ビーム及び直流放電アルゴンプラズマを生成した.一方,昇華用オーブン内に導入されたフラーレンは,オーブンを約350°Cに加熱することによってガス化され,そこに電子ビームまたはアルゴンプラズマが照射されることで電離し,フラーレンイオンが生成される.なお,今回は質量分離を行う観点から,C_<60>,C_<70>混合フラーレンを用いた.(2)まず,高周波電場を印加しサイクロトロン共鳴の原理を利用する質量分離法が,極端に高質量のフラーレンに適用できるかを確認するため,上記の原理に基づくオメガトロン質量分析器を用いてフラーレンイオンの検出を行った.その結果,最大2.4テスラまでC_<60>,C_<70>イオンに相当する質量の位置に独立したスペクトルピーク信号が検出され,しかもそれらの半値幅から算出される質量分解能が磁場強度の二乗に比例して増加していくことが観測された.これらの結果は,理論的に算出される質量分解能にほぼ一致しており,この質量分離法がテスラ級の強磁場下で高質量のフラーレンにも適用可能であることが明らかになった.また,テスラ級の強磁場が質量分解能の向上という点で非常に有用であることが示された.(3)次に,この質量分析器を発展させ,フラーレンの大量分離・精製を行うことが可能であるヘリカルアンテナ型質量分離装置の開発を行った.このヘリカルアンテナは大電力の投入が可能であり,また高密度のフラーレンプラズマ中へ高効率に高周波電磁場を浸透させることができる.この装置で上記混合フラーレンの質量分離を行った結果,オメガトロン質量分析器の場合と同様に,C_<60>,C_<70>イオンをそれぞれ分離して検出することに成功し,さらにアンテナへの投入電力に比例して検出電流の強度が増加することが明らかになった.これは,フラーレンイオン分離・精製量の向上を意味しており,この質量分離装置の実現可能性を実証した.(1)現有設備の超電導コイルにより4テスラの強磁場を大空間(直径40cm,長さ40cm)に発生させた.この中に真空容器を設置し,その一端から酸化バリウム電極を加熱することにより発生させた熱電子を,その前面のグリッドで加速することで電子ビームを生成した.まず,高周波電場を印加しイオンサイクロトロン共鳴の原理を利用するオメガトロン型質量分析器の強磁場中での動作を確認するため,真空容器内に導入したアルゴンガスに上述の電子ビームを照射することでアルゴンプラズマを生成し,その質量分析を行った.その結果,最大4テスラまでアルゴンイオンに相当する質量の位置にピーク信号が検出され,しかもその半値幅から算出される質量分解能も磁場強度に比例して増加していくことが明らかになった.さらに,磁場強度を強めることによって,これまで測定が不可能であった0.1Pa台の高ガス圧力中でも質量分析が行えることが新たに判明した.これらの結果は,テスラ級の強磁場が質量分解能の向上という点で非常に有用であることを示している.

(2)次に,オメガトロン型質量分析器の直上にフラーレンを塗布したプレートを設置し,これに上述の電子ビームを照射することによってフラーレン正イオンを生成し,フラーレンの質量分析を行った.ここではまず,フラーレンとして質量が既知であるC_<60>のみを用いてC_<60>正イオンを生成した.その結果,非常に微小な信号ではあるがC_<60>の質量の位置にピーク信号が検出され,このイオンサイクロトロン共鳴の原理を用いた質量分析がテスラ級の強磁場下で高質量のフラーレンにも適用可能であることが示された.また,この時の信号強度は,オメガトロンに印加する高周波および直流電場強度に大きく依存し,それらの最適値が存在することが明らかになった.(3)フラーレンの大量分離・精製を行う場合に使用する,四位相型ヘリカルアンテナの電磁場解析を行い,上述の高周波および直流電場強度の最適値も考慮し,アンテナの設計・製作を行った.(1)現有設備の超電導コイルにより4テスラの強磁場を大空間(直径40cm,長さ40cm)に発生させた.この中に真空容器を設置し,その一端からスパイラル状のタングステン電極を加熱することにより発生させた熱電子を,その前面のグリッドで加速することで電子ビーム及び直流放電アルゴンプラズマを生成した.一方,昇華用オーブン内に導入されたフラーレンは,オーブンを約350°Cに加熱することによってガス化され,そこに電子ビームまたはアルゴンプラズマが照射されることで電離し,フラーレンイオンが生成される.なお,今回は質量分離を行う観点から,C_<60>,C_<70>混合フラーレンを用いた.(2)まず,高周波電場を印加しサイクロトロン共鳴の原理を利用する質量分離法が,極端に高質量のフラーレンに適用できるかを確認するため,上記の原理に基づくオメガトロン質量分析器を用いてフラーレンイオンの検出を行った.その結果,最大2.4テスラまでC_<60>,C_<70>イオンに相当する質量の位置に独立したピーク信号が検出され,しかもそれらの半値幅から算出される質量分解能が磁場強度の二乗に比例して増加していくことが観測された.これらの結果は,理論的に算出される質量分解能にほぼ一致しており,この質量分離法がテスラ級の強磁場下で高質量のフラーレンにも適用可能であることが明らかになった.また,テスラ級の強磁場が質量分解能の向上という点で非常に有用であることが示された.(3)次に,この質量分析器を発展させ,フラーレンの大量分離・精製を行うことが可能であるヘリカルアンテナ型質量分離装置の開発を行った.このヘリカルアンテナは大電力の投入が可能であり,また高密度のフラーレンプラズマ中へ高効率に高周波電磁場を浸透させることができる.この装置で上記混合フラーレンの質量分離を行った結果,オメガトロン質量分析器の場合と同様に,C_<60>,C_<70>イオンをそれぞれ分離して検出することに成功し,さらにアンテナへの投入電力に比例して検出電流の強度が増加することが明らかになった.これは,フラーレンイオン分離・精製量の向上を意味しており,この質量分離装置の実現可能性を実証した.
粥状硬化発症および発症阻止機構における血管壁細胞の動態

第一に血流下における内皮の増殖と粥状硬化発症の関連を検討した。層流性ずり応力に比べ乱流性ずり応力は内皮の増殖と単球接着を増加させた。内皮の増殖を抑制するp21^<Sdi/Cip/Waf1>(p21)は乱流による単球接着増加、内皮のTXNIP,VCAM-1,CCL5,CXCL10,L-selectin発現を抑制した。血流下でp21は単独で、または内皮の増殖抑制を介して、内皮のレドックスバランスを抗酸化状態へ導き、接着や遊走因子発現を阻止し、単球接着を抑制して抗粥状硬化性に作用すると思われる。第二に、粥状硬化発症への歯周病菌(Pg)の関与を検討した。ヒト大動脈のAtheromaのマクロファージにPg由来r40kDa蛋白が存在し、Fatty streak,DIT、冠動脈のAtheromaには認めなかった。Pg由来LPSで刺激した単球の培養上清は内皮のTLR2 mRNAを発現させ好炎症性に作用した。目的:われわれの観察では増殖内皮細胞(内皮)数および内皮へ接着した単球数は共に、層流性ずり応力(層流)に曝される血管非分岐部(抗粥状硬化)に比べ乱流性ずり応力(乱流)領域の分岐入口部(好粥状硬化)で2倍高かった。そこで、内皮の増殖と病変発生(内皮への単球接着を指標)との関連を検討した。結果:層流に比べ乱流は内皮の増殖と単球接着を共に増加させたが、この乱流による増殖と単球接着増加は共に内皮増殖を抑制するp21^<sdi/cip/waf1>(p21)遺伝子導入により抑制された。遺伝子の網羅的解析から内皮の増殖と単球接着をリンクする候補因子としてThioredoxin interacting protein( TXNIP)、Chemokine(C-C motif)ligand5(CCL5)、Chemokine( C-XC motif)ligand10(CXCL10)、SelectinL( SELL)が見つかった。TXNIPはThioredoxin(TRX)の機能を抑制して微小環境を酸化方向へ導く。内皮のTXNIP mRNA・蛋白発現は増殖の高い乱流下で高く層流下では低く、この乱流による内皮TXNIP mRNA・蛋白発現誘導はp21遺伝子導入により有意に抑制された。TXNIP発現はMAP3Kを介してVCAM-1発現を誘導するが、p21遺伝子導入はVCAM-1発現を抑制する傾向を示した。CCL5,CXCL10,SELLは病巣へ白血球遊走を媒介するが、乱流下内皮のこれらの発現もp21導入で抑制された。上記VCAM-1とCCL5発現は酸化状態で亢進すると考えられている。よって我々の結果は、p21による増殖抑制は内皮のTXNIP発現を抑制し、TRX作用を亢進させて微小環境を抗酸化状態に変え、その結果、内皮の接着因子発現や白血球遊走因子分泌を抑えて単球接着を抑制する事を示唆する。前年度の研究では、層流に比べ乱流は培養内皮の増殖と単球接着を共に増加させるが、この増加は共に内皮増殖を抑制するp21^<sdi/cip/wafl>(p21)遺伝子導入により抑制された。増殖と単球接着をリンクする候補因子として酸化促進作用を示すThioredoxin interacting protein (TXNIP)が見つかり、乱流はTXNIP発現を促進したが、この乱流によるTXNIPとVCAM-1発現誘導はp21遺伝子導入により有意に抑制された。以上の結果は血流下での内皮増殖が酸化、細胞接着因子の発現を調節する事により単球接着(粥状硬化発生)を左右する可能性を示唆する。そこで本年度はこの結果を更に立証するためにsiRNAでp21発現をdown regulationしてTXNIPの発現を検討した。GAPDH,p21に特異的なsiRNAの導入により各標的遺伝子の発現が約90%抑制された。DNA合成はp21 siRNA導入により対照siRNA(Nc#1siRNA)に比し有意に増加した。また、siRNAによる細胞障害は認めなかった。次にp21 siRNA導入内皮に層流と乱流を負荷後、TXNIP mRNAの発現を調べた。非siRNA

導入内皮では乱流は層流に比しTXNIP mRNA発現を増加させたが、p21 siRNA導入により層流・乱流間に有意差がなくなった。p21は内皮のapoptosisも抑制する。そこでp21による内皮への単球接着抑制機序にp21-apoptosis経路が関与するかを検討した。過去にラット大動脈を観察した際、apoptosis内皮は肋間動脈分岐部(乱流部)に多く、他の部位(層流部)では少なかった。これは乱流が内皮のapoptosisを促進する事を示唆する。そこでp21を強発現した内皮を乱流に暴露して活性を測定したところ、caspase-3活性はp21により低下傾向を示した。研究目的:歯周病菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)は粥状硬化の進展に関与する可能性がある。我々は異なる流れ(層流vs乱流)下内皮細胞(内皮)における増殖・酸化・炎症因子の発現が、歯周病菌により変化するかを検討することを目的とした。本年は(1)抗P.g外膜蛋白(r40k)特異抗体を用いてヒト大動脈粥状硬化巣に歯周病菌が存在するかを調べた。(2)歯周病菌リポ蛋白(Pg-LPS)による培養ヒト内皮(HUVEC)の炎症因子発現を検討した。結果:1.ヒト粥状硬化巣;1)r40kはヒト粥状硬化のマクロファージ内に存在し、Atheromaの12/15症例(80%)15/21検体(71%)にr40k含有マクロファージを見た。2)r40kは40歳以上で出現、30歳以下は陰性。年齢が上がるに従い発現頻度・強度が増加した。3)r40kはFatty streakに殆ど存在せずDITは認めなかった。4)冠動脈粥状硬化は陰性だった。5)Westernblottingではr40kは認めなかったが一人に37-kDaと44-k蛋白を認め、全員に50-kDaバンドを認めた。6)DNA解析では全員にP.gDNAを認めなかった。2.HUVEC:1)マクロファージ(THP1細胞)をPg-LPSで刺激後、3回洗浄してPg-LPSを除去し、通常の培養液で6時間培養した。この培養液でHUVECを培養したところ、対照に比べHUVECのTLR2mRNA発現が増強した。2)Pg-LPS刺激によりTHP1細胞は培養液中にIL8,IFN-γ,MCP-1,MIP-1を分泌した。結論:P.gはヒト粥状硬化に存在し、P.g刺激マクロファージから分泌されるサイトカインは内皮機能を変化させて好粥状硬化性に働く可能性がある。