hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Alport症候群のモデルマウスの作成および遺伝子治療法の開発

マウスCOL4a4のゲノム遺伝子において、NCドメイン部分を含む約3.5kbの断片を取り除き、この部分にneo遺伝子を組み込んだターゲテイングベクターを用いてジーンターゲティング法によりOL4a4ノックアウトマウスを作成した。NCドメインを含むcDNA断片を用いNorthern blotを行ったところ、ノックアウトマウス腎では、COL4a4の発現は認められず、NCドメインはノックアウトされていることが確認された。6種類のIV型コラーゲンα鎖のモノクロナール抗体を用いた免疫組織化学では、IV型コラーゲンα鎖4のみならず、IV型コラーゲンα鎖3および5も全く検出されなかった。また、IV型コラーゲンα鎖1および2は、コントロールでは主に糸球体のメサンギウム基質に限局して染まるのに対し、ノックアウトマウスでは染色範囲が拡大し、基底膜も明瞭に染まった。臨床症状は、血尿、蛋白尿が認められ、血中尿素窒素、クレアチニンは、生後10週頃より急激に増加し、大部分のノックアウトマウスは、生後13-16週頃に腎不全により死亡した。光顕および電顕所見もヒトAlport症候群の組織像と一致した。以上の解析より、本ノックアウトマウスは、ヒトAlport症候群のモデル動物に成り得るものと考えられた。本ノックアウトマウスを用いて遺伝子治療の可能性を検討した。CAGプロモーターを有するアデノウイルスペクターカセットpAxCAwtに全長のCOL4a4cDNAを挿入したコスミドpAxCOL4a4を用いてCOS-TPC法により組換えアデノウイルスを作成し、腎動脈に注入した。免疫染色では、IV型コラーゲンα鎖4が弱く染まる糸球体が少数認められたが、病理組織所見および尿所見では、遺伝子導入による有意な改善は認められなかった。糸球体に効率良く遺伝子導入する新しい方法の開発が必要と考えられた。1)COL4a3およびCOL4a5ノックアウトマウスの作成COL4a3およびCOL4a5のゲノム遺伝子のnon-collagenous domain部分にneomycin耐性遺伝子neoを挿入したtargeting vectorをelectroporationによりES細胞に導入し、G418とGANCによるpositive-negative selectionを行った。Southern blotにより、G418^rかつGANC^rクローンの中からhomologous recombinantを選び出し、homologous recombinantをBALB/cおよびC57BL/6マウスのblastocystにmicroinjectionし、キメラマウスを作成した。現在、キメラマウスが成体に成長するのを待っている段階である。今後、キメラマウスを野生型マウスと交配することにより、ヘテロないしヘミ接合体を得る。さらに、ヘテロないしヘミ接合体間の交配により、ホモ接合体を得る予定である。oligo dT primingおよびrandom priming法により作成されたマウス胚の腎cDNAライブラリーのスクリーニングにより、現在、COL4a3については約5kb,COL4a5については約4.5kbをカバーするcDNAクローンが得られ、その塩基配列を決定した。完全長のcDNAのクローニングには、もう一歩のところにあり、今後、5^l-RACE法などを用いて完全長のcDNAを取って行く予定である。平成8年にCOL4a3欠損マウスが欧米の2ヵ所の研究室で作成されたため、当初研究を進めていたCOL4a3欠損マウスの作成は一時中止し、COL4a4およびCOL4a5欠損マウスをgene targeting法を用いて作成することにした。すなわち、COL4a4およびCOL4a5のゲノム遺伝子のNCdomainを欠失させたtargeting vectorをelectroporationによりES細胞に導入し、G418とGANCによるpositive-negative selectionを行い、Southern blotにより数個のhomologous recombinantsを選び出した。

homologous recombinantsをC57BL/6のblastocystsにmicroinjectionし、ES細胞の寄与率の高いキメラマウスを作成することができた。COL4a5については、昨年度に作成した数匹のキメラではgermline transmissionに成功しなかったため、培養からやり直し、新たにキメラマウスを作成した。現在、germline transmissionの有無を調べているところで、数ヵ月以内にホモ接合体が得られると見込まれる。2)完全長のマウスCOL4a4およびCOL4a5cDNAのクローニングほぼ完全長のマウスCOL4a5cDNAをクローニングした。また、COL4a4cDNAは、現在約4kbをカバーするクローンを得て、完全長まであと一歩の所に来ている。3)腎臓における遺伝子導入・発現方法の検討アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入法を予備的の検討した。すなわち、各種日齢の正常マウス腎動脈よりlac z遺伝子を上記ベクターを用いて腎組織に導入し、lac zの発現部位、発現時期について経時的に調べ、腎への遺伝子導入の至適な方法および条件を検討した。平成8年にCOL4a3欠損マウスが欧米の2ヵ所の研究室で作成されたため、研究を進めていたCOL4a3欠損マウスの作成は中止し、COL4a4およびCOL4a5欠損マウスをgene targeting法を用いて作成することにした。本年度は、両遺伝子ともに昨年度に作成したキメラマウスではgermline transmissionに成功しなかったため、別のES細胞株を用いて新たにキメラマウス作成し直した。現在、germline transmissionの有無を調べているところで、今回は比較的質の高いキメラマウスを得ることができたのでgermline transmissionに成功するものと見込んでいる。2)腎臓における遺伝子導入・発現方法の検討アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入法を検討した。すなわち、正常マウス腎動脈よりlac z遺伝子を上記ベクターを用いて腎組織に導入し、lac zの発現部位、発現時期について経時的に調べ、腎糸球体への遺伝子導入の至適な方法および条件を検討した。次に、全長のCOL4a4cDNAにTagを付加し、アデノウイルスベクターを用いて腎組織に導入し、糸球体基底膜形成に外来性のCOL4a4コラーゲンが寄与するか調べた。
脂肪酸結合蛋白I-15Pのステロイドホルモン代謝に関する分子生物学的検討

ラット小腸粘膜より単離された蛋白質I-15Pは、その一次構造の解析より、脂肪酸結合蛋白ファミリーに属していると推定されたが、脂肪酸結合能を欠き、その特異リガンドおよび生理活性は依然不明である。しかしその組織分布(回腸、副腎皮質、卵巣黄体)は、I-15Pがステロイド代謝または回腸における胆汁酸の再吸収に関与する可能性を示唆している。
パイロクロア格子系に創出する革新的熱・エネルギー変換材料

本課題では、パイロクロア格子系の遷移金属化合物に現れる高エントロピー電子相が、従来材料を超える高いエネルギー変換効率をもつ熱電変換材料・固体冷凍材料を実現する可能性に着目する。平成30年度において、(a)ブリージングパイロクロア格子をもつ硫化物LiGaCr4S8とLiInCr4S8の磁歪、(b)Ta4SiTe4系熱電変換材料の性能向上を中心に研究を行った。(a)大小の正四面体が交替したパイロクロア格子である「ブリージングパイロクロア格子」をもつ硫化物LiGaCr4S8とLiInCr4S8焼結体試料が低温で磁場誘起歪を示すことを見出した。LiInCr4S8では等方的な磁歪が現れ、体積増加は9 Tの磁場中において最大で750 ppmに達する。一方、LiGaCr4S8では磁場を印加することで磁場と垂直方向により大きく歪むような異方的な磁場誘起歪を示した。これらの特徴的な磁場誘起歪にとって、ブリージングパイロクロア格子上で反強磁性相互作用と強磁性相互作用が共存していることが重要な役割を果たしていると考えられる。(b)平成29年度までの研究により、低温でn型の高い性能を示すことを見出したTa4SiTe4の性能向上を行った。まず、同族元素からなるNb4SiTe4においても化学ドープにより実用材料の水準を上回る高い熱電変換性能が現れることを見出した。また、Ta4SiTe4とNb4SiTe4の混晶系の合成に成功し、高い熱電変換性能が維持されることを明らかにした。混晶系の合成は、熱伝導率を低減し、熱電変換材料のエネルギー変換効率を改善するために必要不可欠である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本課題では、パイロクロア格子系の遷移金属化合物に現れる高エントロピー電子相が、従来材料を超える高いエネルギー変換効率をもつ熱電変換・固体冷凍材料を実現する可能性に着目する。パイロクロア格子系の遷移金属化合物は、d電子のもつスピン・軌道・電荷自由度の秩序形成に伴うエントロピー放出が幾何学的フラストレーション効果により阻害されるため、他の系と比較して巨大な電子エントロピーをもちうる。この電子エントロピーを、ケージ内包イオンのラットリングや金属絶縁体転移の外場制御と組み合わせることで発電・冷却機能として取り出す。このような方針に従い、パイロクロア格子系において集中的に材料開拓を行うことで高性能な熱・エネルギー変換材料を開発する。H28年度は、ケージ構造をもつパイロクロア格子系であるβパイロクロア酸化物CsW2O6の熱電変換性能に着目した。放電プラズマ焼結法によりCsW2O6焼結体試料の、気相輸送法によりCsW2O6単結晶試料の合成に成功した。両試料の熱電変換物性を測定することにより、CsW2O6が金属としては大きな熱起電力と、ガラス並みの小さな熱伝導率を示すことを明らかにした。現時点の熱電変換性能は実用水準に達しないが、パイロクロア格子系物質が熱・エネルギー変換材料として有望であることを示す結果である。また、パイロクロア格子系以外においても熱・エネルギー変換材料の開拓を行い、逆ペロフスカイト酸化物Ca3SnOにおいて高い熱電変換性能が現れることを明らかにした。H28年度において、主にβパイロクロア酸化物CsW2O6の熱電変換特性に着目し、各種の熱輸送特性の測定を行った。その結果、CsW2O6が金属的な振る舞いを示す物質としては大きな、室温で約-60 μV K-1の熱起電力を示すことを明らかにした。また、室温の熱伝導率は焼結体試料において8 mW cm-1 K-1程度、単結晶試料において17 mW cm-1 K-1と、ガラス並みまたはそれ以下の小さな値をとった。熱伝導率の温度依存性も通常の結晶固体の示す振る舞いとは異なり、アモルファスの試料に現れるような温度依存性を示すことがわかった。この結果は、CsW2O6において粒界だけでなくCs+イオンのラットリング振動が顕著なフォノン散乱機構として働いていることを示唆する。CsW2O6が熱電変換材料として有望であることを示すだけでなく、パイロクロア格子系の熱・エネルギー変換材料としてのポテンシャルの高さを示唆する。また、パイロクロア格子系以外でも熱電変換材料を中心とする熱・エネルギー変換材料の開拓を進め、逆ペロフスカイト酸化物Ca3SnOをはじめとするいくつかの系において高い熱電変換性能が現れることを明らかにした。このように、本課題における熱・エネルギー変換材料の開発は順調に進んでいるといえる。H29年度において、(a)βパイロクロア酸化物CsW2O6において特異な二段階構造相転移が起こること、(b)ブリージングパイロクロア格子をもつ硫化物LiGaCr4S8において負熱膨張が現れること、(c) Ta4SiTe4が低温で高い熱電変換性能を示すことを見出した。(a) βパイロクロア酸化物CsW2O6はスピン・軌道・電荷の複合自由度をもつパイロクロア格子系の遷移金属化合物である。

H28年度までに、本物質の単結晶試料の合成に成功し、215 Kの金属絶縁体転移において特異な立方晶から立方晶への構造相転移を示すことを明らかにした。H29年度は、さらに結晶構造解析および各種物性測定を進めることで、90 Kにおいて立方晶から単斜晶への対称性の低下を伴う別の構造相転移が現れることを見出した。(b)ブリージングパイロクロア格子をもつCrスピネル硫化物LiGaCr4S8の焼結体試料の熱膨張測定を行うことにより、負熱膨張が現れることを見出した。この負熱膨張は反強磁性秩序直上の常磁性領域で現れる。今後、負熱膨張の発現機構の解明が期待される。(c) Ta4SiTe4の針状結晶が、100-200 Kにおいて2 mΩcm程度の低い電気抵抗率と、-400 μV K-1を超える大きな負の熱起電力を示すことを明らかにした。元素置換により、出力因子は250 Kにおいて最大170 μW cm-1 K-2に達し、現在室温付近で使用される実用材料の水準を大きく上回る。これまで不可能であった、室温を大きく下回る低温領域における局所冷却や冷熱発電に道を拓く成果と言える。H29年度まで、βパイロクロア酸化物CsW2O6の熱電変換特性やブリージングパイロクロア硫化物LiACr4S8の熱膨張特性に着目し、合成した単結晶・焼結体試料を用いた各種の物性測定を行ってきた。その結果、CsW2O6が金属的な振る舞いを示す物質としては大きな、室温で約-60 μV K-1の熱起電力を示すことを明らかにした。また、室温の熱伝導率は単結晶試料においても17 mW cm-1 K-1と小さく、Cs+イオンのラットリング振動が顕著なフォノン散乱機構として働いていることが示唆された。LiACr4S8については、LiGaCr4S8において負熱膨張が現れることを見出した。この負熱膨張は、反強磁性秩序直上の常磁性相において現れる。幾何学的フラストレート系の局在磁性体が負熱膨張や磁場誘起体積変化といった熱体積機能の舞台となることを示す成果である。また、パイロクロア格子系以外にも熱電変換材料の開拓を進め、逆ペロフスカイト酸化物Ca3SnO、一次元テルル化物Ta4SiTe4やNb4SiTe4などのいくつかの系において高い熱電変換性能が現れることを明らかにした。このように、本課題における熱・エネルギー変換材料の開発は順調に進んでいるといえる。本課題では、パイロクロア格子系の遷移金属化合物に現れる高エントロピー電子相が、従来材料を超える高いエネルギー変換効率をもつ熱電変換材料・固体冷凍材料を実現する可能性に着目する。平成30年度において、(a)ブリージングパイロクロア格子をもつ硫化物LiGaCr4S8とLiInCr4S8の磁歪、(b)Ta4SiTe4系熱電変換材料の性能向上を中心に研究を行った。(a)大小の正四面体が交替したパイロクロア格子である「ブリージングパイロクロア格子」をもつ硫化物LiGaCr4S8とLiInCr4S8焼結体試料が低温で磁場誘起歪を示すことを見出した。LiInCr4S8では等方的な磁歪が現れ、体積増加は9 Tの磁場中において最大で750 ppmに達する。一方、LiGaCr4S8では磁場を印加することで磁場と垂直方向により大きく歪むような異方的な磁場誘起歪を示した。これらの特徴的な磁場誘起歪にとって、ブリージングパイロクロア格子上で反強磁性相互作用と強磁性相互作用が共存していることが重要な役割を果たしていると考えられる。
自己組織化による機能性多孔質材料の構築と凝集変換に基づくセンシングシステムの創製

古くから吸着・分離・触媒など様々な用途で用いられてきた多孔性材料は近年、新しい用途を指向して光電子特性を付与する研究開発が盛んに行われている。機能性有機低分子を用いて光電子特性を導入した多孔質構造は、センシング素子やバイオイメージングなどへの応用も期待でき、それらの研究開発には大きな意義があると言える。本研究では、機能性有機酸と特定の有機塩基を組み合わせた有機塩から構築される超分子集合体を階層的に集積させ、外部刺激応答性を有した光電子機能多孔質構造を構築することを目的としている。本年度は、初年度および二年目に得られた成果をもとに多様な細孔構造と機能性を有した有機多孔質構造を系統的に構築する手法を確立した。本研究ではこれまで、有機酸として多環式芳香族モノスルホン酸、有機塩基としてトリフェニルメチルアミンを用いることで、スルホン酸の種類によらず多孔質構造が得られることを見出している。この結果から、スルホン酸の種類を水素結合性モノスルホン酸やジスルホン酸に拡張したところ、いずれの場合においても同様の多孔質構造を構築することができた。興味深いことに、これらの多孔質構造は導入したスルホン酸の種類に応じて機能性が多様に変化しており、内包分子に応じた柔軟な構造から、起因した高い気体吸着能を示す強固な構造など、幅広い多孔質構造を系統的に構築することに成功した。またこれらの構造は、分子応答的な発光色調も示しており、センシングシステムとしての応用も期待できるものである。今回これら一連の多孔質構造を『多孔質有機塩』と名付け、その構築手法と合わせて『Hierarchical Construction of Porous Organic Salts ComPosed of Ammonium Sulfonates Based on Supramolecular Approach』という題目で学位論文に総括している。超分子集合体を用いた階層的な構築手法によって、多孔質構造への簡便な機能付与を実現した本系は、有機多孔質構造を構築する上での新しいアプローチとして非常にインパクトのあるものだと言える。有機分子を用いた多孔性材料は、従来までの多孔質物質が有する吸着・分離などの機能に加え光・電気磁場などの特性の付与が可能であるため、近年盛んに研究が行われている。特に光電子特性を有する多孔質構造は、センシング素子やバイオイメージングなどへの応用も期待でき、それらの研究および開発には大きな意義がある。本研究では、有機塩によって構築される超分子集合体を階層的に集積させる手法を用いた、外部刺激応答性を有する光電子機能多孔性材料の構築を目的としている。有機低分子の自己組織化によって形成する超分子集合体をビルディングブロックあるいは一つの大きな擬似分子と考えることで、高度な合成を経由せず複雑な分子設計や機能の導入を行うことが可能となる。また、超分子集合体の集積によって構築される柔軟な多孔質構造と光電特性を組み合わせることで、外部刺激として構造内に取り込まれるガスや有機分子などの分子形状の違いを構造変化によって認識でき、相互作用変化と分子形状の両方を認識した発光変調が期待できる。本年度は多孔質構造内に導入する機能性分子としてアミノフェニルシアノアクリル酸誘導体を用いた。この分子は分子内でCT相互作用が可能な発光性有機色素であり、取り込まれる分子種の変化を鋭敏に感知した発光特性が発現すると考えた。ビルディングブロックとして用いる超分子集合体は、従来までに当研究室で報告されている超分子クラスターを用いた。その結果、構造内に取り込むゲスト分子に応じて青から黄色までの発光を示す多孔質結晶を得ることに成功した。この発光変調は、構造変化に起因した幅広い変調領域を達成しているだけでなく、ゲスト種の置換基などのわずかな違いにも応答して発光変調しており、分子集合体を用いた柔軟な多孔質構造ならではの特性が得られている。また、可逆的なゲスト分子の脱離吸着も可能であり、センシングシステムとしての応用も期待できる。多孔性材料は、古くから吸着・分離・触媒など様々な用途で用いられてきた。一方近年、従来のこれらの機能に加えて光電子特性を付与する研究が機能性有機低分子を用いて盛んに行われている。光電子特性を有した多孔質構造は、センシング素子やバイオイメージングなどへの応用も期待できるため、それらの研究開発には大きな意義があると言える。本研究では、機能性有機酸と有機塩基からなる有機塩によって構築される超分子集合体を階層的に集積させることで、外部刺激応答性を有した光電子機能多孔性材料を構築することを目的としている。有機塩の自己組織化によって形成する超分子集合体をビルディングブロックとすることで、高度な合成を経由することなく複雑な分子設計や機能化を行うことが可能となる。本年度は、機能性有機酸としてスチルベンジスルホン酸などビニル基を有した蛍光性スルホン酸誘導体を用いた。ビニル基を有した蛍光性有機酸は蛍光特性だけでなく光による二量化や異性化が期待できることから、取り込まれた分子に応答した蛍光発光特性と光応答的な特性変化が可能ではないかと考えた。また、ジスルホン酸によって超分子集合体同士を強く連結することで、多孔質構造の安定性の向上を狙った。その結果、取り込まれた分子の吸着脱離によらず細孔構造を安定に維持した多孔質構造の構築に成功した。またこの多孔質構造は、選択的な気体吸着特性を示した。さらに、アントラセン部位にビニルスルホン酸基が置換されたジスルホン酸を用いたところ、高い構造安定性と分子応答的に蛍光を青から赤まで変化させる多孔質構造が得られた。

このような有機多孔性物質は前例のないものであり、超分子集合体を用いることで簡便な機能付与を実現した本手法ならではの結果であるだけでなく、センシングシステムとしての応用も期待できる。古くから吸着・分離・触媒など様々な用途で用いられてきた多孔性材料は近年、新しい用途を指向して光電子特性を付与する研究開発が盛んに行われている。機能性有機低分子を用いて光電子特性を導入した多孔質構造は、センシング素子やバイオイメージングなどへの応用も期待でき、それらの研究開発には大きな意義があると言える。本研究では、機能性有機酸と特定の有機塩基を組み合わせた有機塩から構築される超分子集合体を階層的に集積させ、外部刺激応答性を有した光電子機能多孔質構造を構築することを目的としている。本年度は、初年度および二年目に得られた成果をもとに多様な細孔構造と機能性を有した有機多孔質構造を系統的に構築する手法を確立した。本研究ではこれまで、有機酸として多環式芳香族モノスルホン酸、有機塩基としてトリフェニルメチルアミンを用いることで、スルホン酸の種類によらず多孔質構造が得られることを見出している。この結果から、スルホン酸の種類を水素結合性モノスルホン酸やジスルホン酸に拡張したところ、いずれの場合においても同様の多孔質構造を構築することができた。興味深いことに、これらの多孔質構造は導入したスルホン酸の種類に応じて機能性が多様に変化しており、内包分子に応じた柔軟な構造から、起因した高い気体吸着能を示す強固な構造など、幅広い多孔質構造を系統的に構築することに成功した。またこれらの構造は、分子応答的な発光色調も示しており、センシングシステムとしての応用も期待できるものである。今回これら一連の多孔質構造を『多孔質有機塩』と名付け、その構築手法と合わせて『Hierarchical Construction of Porous Organic Salts ComPosed of Ammonium Sulfonates Based on Supramolecular Approach』という題目で学位論文に総括している。超分子集合体を用いた階層的な構築手法によって、多孔質構造への簡便な機能付与を実現した本系は、有機多孔質構造を構築する上での新しいアプローチとして非常にインパクトのあるものだと言える。機能性有機酸として新たにジスルホン酸を用いることで、多孔質構造の安定化の向上を今回達成している。また、これまで得られた結果を基に設計した蛍光性ジスルホン酸を導入した結果、高い構造安定性と分子応答的蛍光特性を両立した多孔質構造の構築に至っている。この分子応答的な蛍光特性は取り込んだ分子との相互作用と置換基の立体障害に起因している。これらの結果は、分子応答的な発光特性を有した多孔性材料を用いた、有機低分子の選択的・高感度システムにつながる大きな成果だと言える。これまで多様な蛍光性分子の設計を行ってきたが、今後はこれまでに構築した構造の構造的評価や特性評価を重点的に行っていく。現在までに構造決定が行えていないものについては、放射光施設SPring-8などを用いた構造決定を行っていく。
生命の起原研究についての科学史的研究:1920年代から1950年代まで

生命の起原研究についての学説史的研究としては、H.Kammingaの学位論文(1980)他があるが、本研究は、それらの研究と重複しない形で、A.I.オパーリンの生命の起原説の展開とロシア・ソ連の情況、国際的な研究への寄与等を中心に置いて調査、研究した。1.オパーリンは、その生命起原説の初期の段階から、基本的には一貫して、自然選択による物質の進化の経過の中で生命が発生したとの意想をもっていた。しかし、唯物論哲学やコロイド化学、天文学、地質学などの新しい成果のとりこみによって、細部には、漸次変化がみられる。2.J.B.S.ホールデンが20年代末にその生命の起原論を提示したあとはほとんど展開させなかったのに対して、オパーリンは学術書、啓蒙書とも継続的に発表した。彼の生命の起原論の著作は、三つの系統を成す。第一の系統は学術的なもので、常に新しい科学の諸成果の受容に努めて著されている。第三の系統は全くの啓蒙的なもので、疑似科学への迎合的な側面もみられる。第二の系統は中間的なもので、最晩年の著作もこの系統に置けると思われるが、詳細は今後の課題である。3.“化学進化"の語は、生命起原説との関連で、最近、多用されるが、この語は、40年代から使われ始めた。報告書の調査では、J.D.バナールが最も早いが、それ以前の使用例の可能性も残されている。4.生命の起原研究、その他の科学的活動に注目してオパーリンの研究活動の時期を区分すると、初期(1917)中期(1924)後期(1939)晩期(195780)となるが、生命の起原研究が国際的にとり組まれるのは50年代以降であり、アメリカで行われた実験的研究の成果以来、広くとり組まれる課題となり、57年にモスクワで最初の国際シンポジウムが開催されたが、ここに至るまで、オパーリンの寄与があった。本年度は、生命起原研究史のうちの最も初期に当るオパ-リンの1924年の論文を中心に分析し、その結果、以下の5点が明らかになった。(1).生命の発生の考察において生物進化における自然選択の概念を援用しているが、24年論文もそれが基調になっている。オバ-リンは極く初期から、ダ-ウィニズムの伝統の中にいたことがわかる。(2).後の、物質の弁証法的発展としての生命の発生という解釈に対し、“コロイド液中に偶然に、凝固物あるいはゲル"が生じ、それが生物になっていったとしており、必然性を強調していない。(3).コロイド化学には初期から注目しており、1930年代にB.de Jongによってコアセルヴェ-トの概念が使われるようになる以前には、(2)のような表現であるが、36年2は、その語を使用している。(4).物質の進化における生命の起原という考え方は上記のように初期からあったが、“化学進化"は使われず、“有機物質の進化"のようなことばで表現している。(5).方法論的にはアナロジ-による考え方が多く使われ(コロイドの凝固物と原形質、白金と代謝における酵素など)、この点でも、ダ-ウィンの方法と比較することができる。

まとめ:オパ-リンは物期から生命の源原の問題について基本的には後の考え方と同一で、初期から一貫して、自然選択による物質の進化の経過の中での生命の源原、を想定していた。唯物論哲学や、コロイド化学上の概念のとりこみなどによって細かい部分には変化がみられる。A.I.オパーリンの1924年論文を主に分析した昨年度に続いて今年度は,′′化学進化′′という概念について,また,オパーリンの36年以降の諸著作の展開を中心に調べ,以下のことが明らかになった。1.現在,化学進化による生命起原論をオパーリン・ホールデン学説と称することがあるが,′′化学進化′′の話は,1949年,J.D.バナールによって使われている。その後,オパーリン著作の英訳者S.モルグリスによって52年に使われ,M.カルヴィンによって50年代後半以降,普及された。ただし,バナール以前の使用例の有無については未検討である。(『サジアトーレ』No.21に発表)。2.オパーリンの最初の生命起原論のあと,それを発展させ,オパーリンの特徴として「コアセルヴェート説」といわれるようになった36年版以降の諸著作の展開の系統を図示すると,のように三系統に分れる。常に新しい科学の成果の受容に努めて著された,自然科学の専門家を対象とする学術的な第一系統に対して,第三系統は全くの啓学的なもので,内容にもソ連の政治的な情况が反映しているともいわれる。第二の系統は,中間的なもので,自然科学とともに哲学的側面をも含んでいる。(図中〓は,邦訳のあるもの)3.オパーリンと異って,J.B.S.ホールデンは,29年の発表以後,ほとんど,その生命起原論を展開していない。1今年度は特に、化学進化による生命の起原説を当時の文化および社会との関連でとらえることを目的としたが化学進化説の提出者の一人J.B.S.ホールデンについては、その生命の起原についての化学進化説の意味、背景を含めて、H.Kamminga “Studies in the History of Ideas on Origin of Lifefrom 1860"(1980)に記されている以上のことを明らかにすることはできなかった。2.生命の起原の研究史はユーリー、ミラーの実験までは、オパーリンが中心であるため彼の1938年までの基礎的および応用分野の生化学研究の発表論文を調査し、生命の起原研究との関連を考察した。また、オパーリンの科学活動の時期の区分を提示し、ソ連社会の情況を考慮にいれつつ分析した。3.ロシアのダーウィニズムは生存闘争概念を避ける、あるいは排除するものだという主張(D.Todes 1989他)がある。しかし、オパーリンの生命の起原説は、自然選択を鍵とするものであり、"生存闘争"を排除する思想ではない。化学進化説は、ロシアの場合にも、イギリス同様、ダーウィニズムの正統の継承であることを明らかにした。4.20世紀初頭の文化との関連では、亀山郁夫『終末と革命のロシア・ルネサンス』(1993)が示唆的である。特に1920年代、「不死と復活とをめぐる議論」が広がったことと、"生命の起原"がとりあげられたこととは無関係ではないと思われる。「疑似科学がさかんに生み出された」ソ連において、チミリャーゼフ(Todesは、生存闘争を容認した、ロシアでは例外的なダーウィニストとする)以来のダーウィニズムの継承者としてのオパーリンの意図を明らかにしたいところであるが、この点は未検討に終った。
in vitro発癌モデルの開発と臨床応用を目指した胃型化・腸型化メカニズム解明

平成30年度の研究計画調書記載内容と照らし合わせた研究の進行度は、以下の如くである。4.Helicobacter pylori関連因子を用いたin vitroでのマウスおよびスナネズミ胃培養腺管の腸型化プロセスの解明:in vitro三次元培養系で、マウス腺胃由来組織を化学発癌剤であるMNU及びHelicobacter pylori関連因子(CagA、VacA、など)と共培養し、胃型粘液上皮マーカー(MUC5AC、MUC6)・腸型粘液上皮マーカー(MUC2、villin)の発現を含めて発癌過程及び腸型化を検索中である。5.炎症性腸疾患関連因子を用いたin vitroでのマウス腸培養腺管の胃型化の制御機構の解析:ラット及びマウス大腸由来組織を上記の長期in vitro三次元培養系で化学発癌剤であるPhIPや炎症性腸疾患関連因子(TNF、IL-6、など)と共培養し、胃型・腸型粘液上皮マーカー発現を含めて発癌過程及び胃型化を検索中である。6.長期経過の潰瘍性大腸炎に合併したcolitic cancer cellの胃型化の分子病理学的解析:潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌(colitic cancer)症例について、胃型・腸型形質発現の観点から発癌過程を検索中である。また、TNFに対する抗体製剤(adalimumab及びinfliximab)を投与した潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病の各症例について臨床的な検討を行い、英語論文を作成した(Dig Liver Dis., in press, 2019.; Case Rep Gastroenterol., 13, 37-49, 2019.; JGH open, in press, 2019.)。以上より、区分は(2)と考えられる。我々は、研究計画調書記載内容と照らし合わせて今後の研究の推進方策につき以下のことを考えている。まず前述の「4.Helicobacter pylori関連因子を用いたin vitroでのマウスおよびスナネズミ胃培養腺管の腸型化プロセスの解明」、「5.炎症性腸疾患関連因子を用いたin vitroでのマウス腸培養腺管の胃型化の制御機構の解析」、については、さらに検討を進める。特に、胃から腸(腸型化)あるいは腸から胃(胃型化)への形質転換の解明に重点を置いて解析を進める予定である。具体的には、Helicobacter pylori関連因子(CagA、VacA、など)と腸型化、炎症性腸疾患関連因子(TNF、IL-6、など)と胃型化の関連性について検討したいと考えている。さらに、「6.長期経過の潰瘍性大腸炎に合併したcolitic cancer cellの胃型化の分子病理学的解析」にも力点をおいて研究を進める予定である。我々は、すでに潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌(colitic cancer)症例の胃型・腸型形質発現を含めた病理学的解析を進めている。加えて、TNFに対する抗体製剤(adalimumab及びinfliximab)を投与した潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病の各症例について臨床的な検討を行い、英語論文を作成した(Dig Liver Dis., in press, 2019.; Case Rep Gastroenterol., 13, 37-49, 2019.; JGH open, in press, 2019.)。これらの臨床的な解析もさらに進めていく予定である。我々は、研究目的である「臨床に外挿できるin vitro胃・大腸発癌モデルの樹立」を確立するため種々の検討を行い、平成29年度は、以下のような研究成果を得た。以上が、平成29年度の研究実績である。平成29年度の研究計画調書記載内容と照らし合わせた研究の進行度は、以下の如くである。1.長期三次元培養系でのin vitroマウス胃発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析:マウス腺胃組織由来の切片をin vitro三次元培養系で培養し、定着したgastrospheresに化学発癌剤であるMNUなどを加えて長期培養し、胃型(MUC5AC、MUC6)・腸型(MUC2、villin)形質発現を含めて発癌過程を検索中である。また、幹細胞マーカーのLgr5、Bmi1、Musashi-1について、RNA in situ hybridizationなどで可視化を試みている。2.長期三次元培養系でのin vitroスナネズミ胃発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析:Helicobacter pylori感染胃発癌モデルとして有名であるスナネズミの腺胃組織由来の切片を前述のin vitro三次元培養系で培養し、長期培養を試みている。3.長期三次元培養系でのin vitroラット大腸発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析:in vitro三次元培養系でラット大腸由来の切片を培養し、化学発癌剤であるPhIPなどを加えて長期培養し、発癌過程を異常陰窩巣(Aberrant crypt foci:ACF)の解析を含めて検索中である。上記に加えて、colitic cancer症例の病理学的な解析や、adalimumabあるいはinfliximabを投与している難治性潰瘍性大腸炎症例において、臨床的な検討も行い英語論文を作成した(Medicine (Baltimore), 96, e7800, 2017.)。

4.Helicobacter pylori関連因子を用いたin vitroでのマウスおよびスナネズミ胃培養腺管の腸型化プロセスの解明:in vitro三次元培養系で、マウス腺胃由来組織を化学発癌剤であるMNU及びHelicobacter pylori関連因子(CagA、VacA、など)と共培養し、胃型粘液上皮マーカー(MUC5AC、MUC6)・腸型粘液上皮マーカー(MUC2、villin)の発現を含めて発癌過程及び腸型化を検索中である。5.炎症性腸疾患関連因子を用いたin vitroでのマウス腸培養腺管の胃型化の制御機構の解析:ラット及びマウス大腸由来組織を上記の長期in vitro三次元培養系で化学発癌剤であるPhIPや炎症性腸疾患関連因子(TNF、IL-6、など)と共培養し、胃型・腸型粘液上皮マーカー発現を含めて発癌過程及び胃型化を検索中である。6.長期経過の潰瘍性大腸炎に合併したcolitic cancer cellの胃型化の分子病理学的解析:潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌(colitic cancer)症例について、胃型・腸型形質発現の観点から発癌過程を検索中である。また、TNFに対する抗体製剤(adalimumab及びinfliximab)を投与した潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病の各症例について臨床的な検討を行い、英語論文を作成した(Dig Liver Dis., in press, 2019.; Case Rep Gastroenterol., 13, 37-49, 2019.; JGH open, in press, 2019.)。以上より、区分は(2)と考えられる。我々は、研究計画調書記載内容と照らし合わせて今後の研究の推進方策につき以下のことを考えている。まず前述の「1.長期三次元培養系でのin vitroマウス胃発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析」、「2.長期三次元培養系でのin vitroスナネズミ胃発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析」、「3.長期三次元培養系でのin vitroラット大腸発癌モデルの樹立と継時的・動的な発癌プロセスの解析」、については、さらに検討を進める。特にHelicobacter pylori感染胃発癌モデルとして有名なスナネズミの腺胃のin vitro三次元培養系の確立に力点を置きたいと考えている。これらに加えて、研究計画調書に記載した「6.長期経過の潰瘍性大腸炎に合併したcolitic cancer cellの胃型化の分子病理学的解析」にも力点をおいて研究を進める予定である。すでに、colitic cancer症例の病理学的解析を進めており、加えてadalimumabあるいはinfliximabを投与している難治性潰瘍性大腸炎症例での臨床的な検討も行い英語論文も作成しているため(Medicine (Baltimore), 96, e7800, 2017.)、これらの症例の解析をさらに進めていく予定である。
食品安全におけるレギュラトリーサイエンスと立法・行政のあり方に関する比較法制研究

本研究では、東アジア地域における食品安全の基準設定プロセスに関する法制度と取り組みのほか、その基準の運用や執行等に関し、類似する面と相違する面に注意を払いつつ、調査・検討を行う。また、主に国内法研究について、(A)リスク管理者による未来志向の社会的・規範的価値判断(リスク評価)およびそれに基づくリスク管理措置の選択や実施のタイミングと、(B)食中毒発生時などの緊急時において権限行使等に必要な科学的知見・エビデンスの解明度合い等を主な対象として調査研究を進め、食品安全における科学・技術の成果を社会において利用する場合の規律と調和に資する応用科学と立法・行政のあり方に関する検討を行う。
代謝システムを再現した人工生体感染モデルの構築と抗インフルエンザ薬の検索

高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1がパンデミックを起こす可能性が懸念される中、タミフル耐性のウイルスが出現し、新たな抗ウイルス活性を示す化合物が求められている。抗ウイルス活性を示す化合物を探索していく上でウイルスの細胞に対する傷害メカニズムを解明していくことは薬のターゲットを絞る上で重要である。本研究ではインフルエンザの自然宿主であるブタの呼吸器上皮より分離した初代培養細胞を用いてH5N1の病原性を検討した。1才齢のブタ肺胞上皮より分離した初代培養細胞にA/Crow/Kyoto/53/2004(H5N1)、および対照として過去に分離されたH5型ウイルスA/Duck/HongKong/342/78(H5N2)、A/Duck/Hong Kong/820/80(H5N3)を感染させたところ、ウイルス産生量はほぼ同程度であり、それぞれのウイルス感染細胞では高率にウイルス抗原を発現していた。一方、ウイルス感染細胞においてH5N1感染細胞でのみ強い細胞傷害性が認められた。肺胞上皮感染細胞のTUNEL染色ではH5N1感染細胞でのみTUNEL陽性の細胞が認められ、同時にCapsase3、8、9の活性がH5N2、H5N3感染細胞に比べて有意に上昇していた。さらにヒト細気管支由来の初代培養細胞を用いて上記の実験を行ったところ、同様の傾向が認められた。以上の結果よりH5N1の病原性の一因子として、哺乳動物(ヒト)呼吸器上皮における、強いアポトシーシス誘導が関係していることが示唆された。これらの結果はCapsase3、8、9の活性を特異的に抑制することで感染細胞を細胞死から回避させることが可能であることを示唆しておりCaspaseが新たな抗インフルエンザ薬のタニゲットとなり得ることが本研究により明らかとなった。現在、薬物代謝システムを備えたラット肝培養細胞とブタの呼吸器初代培養細胞を組み合わせた人工生体モデルを作製すべくブタの肺組織から呼吸器上皮細胞を分離・培養し増殖させている。組織からの細胞の分離は酵素処理により行っている。また、抗インフルエンザウイルス薬を検索するための前段階として現在問題となっている高病原性トリインフルエンザウイルスのうちの強毒株(H5N1)、弱毒株(H5N2、H5N3)のブタの呼吸器初代培養細胞に対する影響を比較検討している。H5N1株、H5N2株、H5N3株は発育鶏卵で増殖させ、精製後感染実験に用いている。それらのウイルスをブタの呼吸器初代培養細胞に感染させ、感染後に産生された感染性ウイルス粒子の量をTCID50で評価し、また細胞内のウイルス抗原を抗HAモノクローナル抗体を用いたImmunofluorescence Assayで評価している。また同時にこれらのウイルスの細胞傷害性についてMTT Assayで比較検討している。現在は次のステップとして実際に薬物代謝能を備えたラット肝細胞とブタの呼吸器初代培養細胞を共培養し、ウイルス感染に影響を与える可能性のある化合物を用いてH5N1株、H5N2株、H5N3株の呼吸器初代培養細胞に対する感染への影響を検討する予定である。本研究は研究遂行のため大阪大学微生物病研究所の「ヒト・実験動物研究倫理委員会」の規定および「組み換えDNA実験指針」の規定に基づいて研究を行っている。
日本人人体有限要素モデルによる自動車衝突時の後席乗員保護に関する研究

自動車の衝突時の後席乗員について,標準日本人を想定し骨盤形状とそのまわりの軟部組織を有する人体有限要素モデルを作成し,ラップベルトと骨盤に働く力の関係を調べた.骨盤形状や軟部組織はラップベルトに働く力に対して及ぼす影響は小さいが,初期の乗員の骨盤角度,ラップベルトのアンカー角度がサブマリンの発生に,ショルダーベルトの位置が乗員挙動と加速度に影響を及ぼすことがわかった.さらに,子ども乗員についても,傷害発生メカニズムを明らかにした.自動車の衝突時の後席乗員について,標準日本人を想定し骨盤形状とそのまわりの軟部組織を有する人体有限要素モデルを作成し,ラップベルトと骨盤に働く力の関係を調べた.骨盤形状や軟部組織はラップベルトに働く力に対して及ぼす影響は小さいが,初期の乗員の骨盤角度,ラップベルトのアンカー角度がサブマリンの発生に,ショルダーベルトの位置が乗員挙動と加速度に影響を及ぼすことがわかった.さらに,子ども乗員についても,傷害発生メカニズムを明らかにした.本研究は自動車の衝突時の後席乗員保護を対象とするもので,日本人体格に対応した人体有限要素モデルを作成し,傷害リスクを減少させるシートベルト特性を明らかにすることを目的とする.本年度はまず,標準体格男性ダミーと小柄女性衝突ダミーを用いて衝突速度50km/hを想定した加速度を与えた台車試験を行い,乗員挙動を把握するとともに傷害値を計測した.両ダミーともに胸たわみが大きな値となり,許容値を超えており,傷害の可能性が高いことが示された.後席では拘束装置がシートベルトのみとなるため,ラップベルトと腰部,ショルダーベルトと胸部の相互作用が重要となる.人体有限要素モデルで標準日本人を想定し骨盤形状とそのまわりの軟部組織を修正し,ラップベルトと骨盤に働く力の関係を調べた.また,着座姿勢やシートベルトジオメトリィと,ラップベルトが骨盤から外れて腹部に移動するサブマリンの発生との関係を調べた.その結果,骨盤形状や軟部組織はラップベルトに働く力に対して及ぼす影響は小さい一方で,初期の乗員の骨盤角度,ラップベルトのアンカー角度がサブマリンの発生に大きな影響を及ぼすことがわかった,さらに,車両による乗員傷害値低減の可能性を明らかにするため,シートベルト特性,ベルトプリテンショナ,車両加速度と乗員傷害値の関係を調べた.車両加速度は全ての体格の乗員に対して,傷害値に及ぼす影響が非常に大きく,拘束装置の適用が限られている後席乗員の保護は,車両の衝突特性に強く依存することがわかった.今年度は後席乗員の基本的な衝撃応答を明らかにした.次年度は人体有限要素モデルによる解析を進め,サブマリンの発生プロセスを明らかにするとともに,後席乗員保護のための方法について検討していく.本研究は自動車の衝突時の後席乗員保護を対象とするもので,日本人体格に対応した人体有限要素モデルを作成し,傷害リスクを減少させるシートベルト特性を明らかにすることを目的とする.標準体格男性と小柄女性ダミーを用いて衝突速度50km/hを想定した加速度を与えた台車試験を行い,乗員挙動を把握するとともに傷害値を計測した.両ダミーともに胸たわみが大きな値となり,許容値を超えており,傷害の可能性が高いことが示された.後席では拘束装置がシートベルトのみとなるため,ラップベルトと腰部,ショルダーベルトと胸部の相互作用が重要となる.標準日本人を想定し骨盤形状とそのまわりの軟部組織を有する人体有限要素モデルを作成し,ラップベルトと骨盤に働く力の関係を調べた.また,着座姿勢やシートベルトジオメトリイと,ラップベルトが骨盤から外れて腹部に移動するサブマリンの発生との関係を調べた.その結果,骨盤形状や軟部組織はラップベルトに働く力に対して及ぼす影響は小さい一方で,初期の乗員の骨盤角度,ラップベルトのアンカー角度がサブマリンの発生に大きな影響を及ぼすことがわかった.さらに,車両による乗員傷害値低減の可能性を明らかにするため,シートベルト特性,ベルトプリテンショナ,車両加速度と乗員傷害値の関係を調べた.車両加速度は全ての体格の乗員に対して,傷害値に及ぼす影響が非常に大きく,拘束装置の適用が限られている後席乗員の保護は,車両の衝突特性に強く依存することがわかった.後席のCRS使用時の子ども乗員についても,人体有限要素モデルと衝突ダミーを用いた検討を行い,傷害発生率の高い側面衝突について,発生メカニズムを明らかにした.
光学活性スピロシランを鍵構造とする新規キラルらせん高分子の開発

本研究は,新規光学活性らせん高分子として光学活性スピロシランとオリゴチオフェンとを鍵構造とする高分子の開発を主目的とする.光学活性スピロシラン骨格の導入により,生成する高分子は絶対配置が一義的に制御された堅固ならせん構造をとることが予想される.触媒的不斉分子内ヒドロシリル化および触媒的カップリング反応などの有機合成的手法を駆使し,その合成について検討を図るものである.本年度の成果は以下のようにまとめられる.すでにスピロシランの触媒的不斉合成およびその官能基化については前年度報告した.本年度は,得られたジブロモスピロシランおよびジスタンニル化スピロシランを用いたパラジウム(0)触媒クロスカップリングにより,オリゴマーおよびポリマーの合成について検討した.まず,オリゴマーを単離する目的でジブロモ体とジスタンニル化物を3:1の比で反応させ,得られた混合物をリサイクルGPCで分取することにより,ポリマーと共に三量体から六量体までのオリゴマーを得ることができた.また同様の反応を,ジブロモ体とジスタンニル化物を1:1の比で用いて行うことによりポリマーを得た.これに対し同様の反応を高希釈条件下(0.001M)で行ったところ,環状四量体を得ることができた.環状四量体はD_4対称のキラルな正方形の構造をもち,コンピューターモデリングによるとその一辺は約1.2ナノメートルであると見積もられる.また,得られたこれらのオリゴマーおよびポリマーについてCDスペクトルを測定し,その3次元構造について検討した.環状四量体の異方性因子g値は,他のオリゴマーのそれと比べ約2倍大きく,このことは環状四量体の堅固なキラル環状構造によるものと考えられる.本研究は,新規光学活性らせん高分子として光学活性スピロシランとオリゴチオフェンとを鍵構造とする高分子の開発を主目的とする.光学活性スピロシラン骨格の導入により,生成する高分子は絶対配置が一義的に制御された堅固ならせん構造をとることが予想される.触媒的不斉分子内ヒドロシリル化および触媒的カップリング反応などの有機合成的手法を駆使し,その合成について検討を図るものである.本年度の成果は以下のようにまとめられる.すでにスピロシランの触媒的不斉合成およびその官能基化については前年度報告した.本年度は,得られたジブロモスピロシランおよびジスタンニル化スピロシランを用いたパラジウム(0)触媒クロスカップリングにより,オリゴマーおよびポリマーの合成について検討した.まず,オリゴマーを単離する目的でジブロモ体とジスタンニル化物を3:1の比で反応させ,得られた混合物をリサイクルGPCで分取することにより,ポリマーと共に三量体から六量体までのオリゴマーを得ることができた.また同様の反応を,ジブロモ体とジスタンニル化物を1:1の比で用いて行うことによりポリマーを得た.これに対し同様の反応を高希釈条件下(0.001M)で行ったところ,環状四量体を得ることができた.環状四量体はD_4対称のキラルな正方形の構造をもち,コンピューターモデリングによるとその一辺は約1.2ナノメートルであると見積もられる.また,得られたこれらのオリゴマーおよびポリマーについてCDスペクトルを測定し,その3次元構造について検討した.環状四量体の異方性因子g値は,他のオリゴマーのそれと比べ約2倍大きく,このことは環状四量体の堅固なキラル環状構造によるものと考えられる.
RNAポリメラーゼIIを中心とした蛋白質相互作用による転写調節機構の解析

1.RNAポリメラーゼII(RNAPII)を構成するRpb1-Rpb12の12種類のサブユニット蛋白質の分裂酵母細胞内での存在状態について以下の研究を行った。(1)RNAPII各サブユニットに対する抗体を利用し、増殖期にある酵母細胞内の各サブユニット蛋白質の分子数を定量した。各サブユニット蛋白質は、RNAPI、IIIとの共通性を考慮しても発現量が揃っておらず、サブユニット集合の核になるRpb3が最も少なく、調節的な機能をもつRpb4が最も多い。(2)細胞抽出液の密度勾配遠心により、発現量の最も少ないRpb3は殆どRNAPIIに集合しているが、その他のサブユニットはRNAPIIへの集合状態と乖離状態の両方で存在していることを示した。これにより1細胞当たりのRNAPII分子数は約1万と決定された。(3)遺伝子置換により、Rpb1、3、4を緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現する分裂酵母株を作製し、蛍光顕微鏡でその局在を観察した。Rpb1、3は核内のヌクレオソーム領域に局在するが、Rpb4は核と細胞質の両方に存在することが判った。2.RNAPIIと相互作用する蛋白質因子を単離・同定するため、遺伝子置換法によりFLAG-タグが付加されたRpb3を発現する酵母株を作製し、タグに対する抗体を利用して、RNAPIIを含む複合体を単離した。その際、細胞抽出液の調整方法を検討し、細胞内でRNA合成途中にあったリン酸化型RNAPII、DNAから遊離していた非リン酸化型RNAPII、それぞれを含む複合体を分離した。後者の複合体中の蛋白質は質量分析により、基本転写因子TFIIFとRpb1のC末端領域(CTD)特異的ホスファターゼFcp1であると同定された。これは新規の複合体である。また、分裂酵母のTFIIFが高等動物型ではなく、予想に反し、出芽酵母型の3サブユニット構成であるという新知見も得た。さらに、組換えFcp1蛋白質を用いた解析でRNAPIIとFcp1が直接結合することを確認した。