hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規免疫チェックポイント分子DC-HILを標的としたがん治療の研究

糖タンパク質GPNMB/DC-HILは、免疫系や中枢神経系に発現し、免疫調節作用や神経細胞保護作用など多彩な機能を持つことが報告されている。近年、創傷治癒過程においてマクロファージの発現するGPNMBがCD44分子を介して間葉系幹細胞の増殖を促進することが明らかとなってきた。また、GPNMB/DC-HILは、骨肉腫などの間葉系悪性腫瘍に留まらずトリプルネガティブ乳癌など一部の上皮系悪性腫瘍の細胞膜上にも発現しており、腫瘍細胞の浸潤や転移など腫瘍病態進展との関連が報告されている。このことからGPNMB/DC-HILがCD44などの分子を介して腫瘍細胞と宿主由来細胞の双方の機能を調節し、腫瘍進展に関わる微小環境形成に影響を及ぼしていると考えられる。そこでGPNMB/DC-HILと腫瘍内微小環境形成との関係を明らかにすることを目的として、本研究ではゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムによりGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトするためのガイドRNA配列を決定し、それを利用して関連遺伝子をノックアウトしたマウス腫瘍細胞株を樹立した。以上の研究を通じて関連遺伝子のうちのCD44を非常に効率よくノックアウトすることが可能なガイドRNAが得られた。本年度は、Phenotypeとして解析しやすいCD44を標的として、上述のガイドRNA配列を利用したCRISPR/Cas9システムを生体内腫瘍組織に効率よく運搬できるベクター系の開発を目指した。CD44は腫瘍組織内のみならず正常組織にも発現する分子であることから、当初予定していたアデノ随伴ウイルスベクターではなく、より腫瘍組織特異的に集積するベクターシステムを利用することとし、in vitro実験において、新しいベクターシステムが腫瘍組織に特徴的な環境に集積することが確認できた。昨年度までに作製したCRISPR/Cas9システムを生体内に適応するため、本年度は新しいベクターシステムの開発に取り組んだ。標的分子は腫瘍組織だけでなく正常組織にも発現することから、腫瘍に特異的に集積するベクターを用いる必要があり、当初予定していたアデノ随伴ウイルスベクターから全く新しいベクターシステムに変更することとなった。この変更により進捗に遅れが生じた。新規ベクターに上述のガイドRNA配列を利用したCRISPR/Cas9システムを搭載し、腫瘍細胞のゲノム編集が可能なことをin vitro実験で確認する。さらに、腫瘍モデルマウスに本ベクターシステムを投与して、生体内腫瘍組織特異的にベクターが到達していること、腫瘍組織内にCRISPR/Cas9システムが送達されていること、腫瘍組織内細胞のゲノム編集が引き起こされていることを確認する。糖タンパクGPNMB/DC-HILは、免疫系や中枢神経系に発現し、免疫調節作用や神経細胞保護作用など多彩な機能を持つことが報告されている。近年、創傷治癒過程においてマクロファージの発現するGPNMBが間葉系幹細胞の増殖を促進することも明らかとなった。このことはGPNMB/DC-HILが腫瘍細胞と宿主由来細胞の双方の機能を調節し、腫瘍進展に関わる微小環境形成に影響を及ぼしていることが考えられる。本研究はGPNMB/DC-HILと腫瘍内微小環境形成との関係を明らかにすることを目的としている。本年度では、ゲノム編集技術の一つであるCRISPR/Cas9システムを用いてGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトしたマウス腫瘍細胞を樹立した。WebツールCRISPRdirectにより複数のガイドRNA配列を設計し、それに基づき人工合成したオリゴDNAをCRISPR/Cas9発現ベクターに組み込み、腫瘍細胞株に遺伝子導入した。標的遺伝子の切断はT7E1アッセイにより確認した。標的分子が発現していない細胞はセルソーターで分取し、その後、限界希釈法によりGPNMB/DC-HIL関連遺伝子ノックアウト細胞クローンを樹立した。樹立したノックアウト細胞は、遺伝子ノックアウトを行なっていないコントロール細胞と同様の細胞形態及びフェノタイプを示し、in vitroでの細胞増殖能に顕著な変化は認められなかった。今年度はGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトするためのCRISPR/Cas9システムを確立し、ノックアウト細胞株を樹立した。しかし、Off-targetによる細胞表現系の変化や増殖能の検討など、ノックアウト細胞株作製に予定以上の時間を費やし、生体内でのGPNMB/DC-HILシグナルのノックアウトに使用する組換えアデノ随伴ウイルスの作製には着手できなかった。そこでGPNMB/DC-HILと腫瘍内

微小環境形成との関係を明らかにすることを目的として、本研究ではゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムによりGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトするためのガイドRNA配列を決定し、それを利用して関連遺伝子をノックアウトしたマウス腫瘍細胞株を樹立した。以上の研究を通じて関連遺伝子のうちのCD44を非常に効率よくノックアウトすることが可能なガイドRNAが得られた。本年度は、Phenotypeとして解析しやすいCD44を標的として、上述のガイドRNA配列を利用したCRISPR/Cas9システムを生体内腫瘍組織に効率よく運搬できるベクター系の開発を目指した。CD44は腫瘍組織内のみならず正常組織にも発現する分子であることから、当初予定していたアデノ随伴ウイルスベクターではなく、より腫瘍組織特異的に集積するベクターシステムを利用することとし、in vitro実験において、新しいベクターシステムが腫瘍組織に特徴的な環境に集積することが確認できた。昨年度までに作製したCRISPR/Cas9システムを生体内に適応するため、本年度は新しいベクターシステムの開発に取り組んだ。標的分子は腫瘍組織だけでなく正常組織にも発現することから、腫瘍に特異的に集積するベクターを用いる必要があり、当初予定していたアデノ随伴ウイルスベクターから全く新しいベクターシステムに変更することとなった。この変更により進捗に遅れが生じた。本年度作製したノックアウト細胞を用いて、腫瘍細胞及び宿主由来各種細胞の挙動についてin vitro/in vivo検討を進める。また、GPNMB/DC-HILを発現しない宿主細胞のソースとして、ノックアウト細胞作成に使用したガイドRNA配列を利用したGPNMB/DC-HILノックアウトマウスの作製を進めたい。新規ベクターに上述のガイドRNA配列を利用したCRISPR/Cas9システムを搭載し、腫瘍細胞のゲノム編集が可能なことをin vitro実験で確認する。さらに、腫瘍モデルマウスに本ベクターシステムを投与して、生体内腫瘍組織特異的にベクターが到達していること、腫瘍組織内にCRISPR/Cas9システムが送達されていること、腫瘍組織内細胞のゲノム編集が引き起こされていることを確認する。2017年度はAAVベクター作製に着手できず、そのため次年度使用額が生じた。次年度使用額は2018年度以降、AAVベクター作製などに使用する計画である。ベクターシステム変更により、研究進捗に遅れが生じたため次年度使用額が生じた。次年度使用額は2019年度以降、新規ベクター作製やそれを用いたin vitro/in vivo実験に使用する計画である。
フォンビルブランド因子とその調節因子の構造-機能相関を中心とした血栓形成の制御

1)ヘビ毒由来C型レクチンの構造と性質C. ruberヘビ毒からC型レクチン(CRL)を精製し全アミノ酸配列を決定した。CRLは、C. atroxヘビ毒レクチン(CAL)と高いホモロジーを示した。CRLとCALでは、金属イオン要求性に差異が見られ、アミノ酸置換が金属イオン結合サイトの立体構造に影響するものと思われた。2)ボトロセチン遺伝子のクローニングとリコンビナント発現B.jararacaヘビ毒腺のcDNAライブラリーの中から、ボトロセチンの遺伝子クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を解析したところ、α鎖では4残基のアミノ酸置換と、1残基の欠失が見られた。一方、βサブユニットに関しては、ボトロセチンβ鎖と87-88%の相同性を持ったクローンを得た。クローニングしたボトロセチンα、β両鎖のcDNAを発現ベクターに組み込み293T細胞にトランスフェクションした。培養液を回収し、濃縮後に非還元条件下でSDS電気泳動にかけ、抗ボトロセチン抗体でウエスタンブロッティングをおこなったところ、ポトロセチンと同じ移動度に陽性バンドを認めた。多血小板血漿を調製し、培養細胞から得られた培養液を一部加えたところ、フォンビルブランド因子(VWF)依存性の血小板凝集が起こった。培養細胞系でリコンビナント・ボトロセチンの産生に初めて成功した。3)キングコブラ毒由来VWF結合性因子の単離キングコブラ毒からVWF結合性で血小板凝集を阻害する分画を見出し、部分精製をおこなった。非還元条件でこの成分はVWFと結合したが還元すると活性は消失した。また、この活性成分はカルシウムイオン依存的に血小板凝集を阻害した。4)ADAMTS13分子に存在する糖鎖の解析ADAMTS13に存在する糖鎖をSSA, MAM, RCAI20, PNAなどのレクチンを用いて探索した結果、非還元末端はシアル酸であり、その内側はβ1-4またはβ1-3結合したガラクトースと考えられた。一方、VWFに見られるようなABO血液型糖鎖は存在しなかった。1)ビチセチンのVWF活性化機構の解析血小板からGPIbをグリコカリシンとして調製し、一部をビオチンで標識した。固相化したグリコカリシンに対してVWFの結合は見られなかったが、ビチセチンやボトロセチンの共存下ではVWFのグリコカリシンへの結合が見られた。一方、ビチセチンを固相化した場合、VWFの結合は見られたが、そこにグリコカリシンを添加してもグリコカリシンはビチセチン-VWF複合体に結合しなかった。このことから、ビチセチンとグリコカリシンは、同じ側に存在する必要があり、VWFの同じ面に結合することが示唆された。2)ヘビ毒由来C型レクチンの立体構造解析C.ruberヘビ毒から、C型レクチンを精製し、N-末端配列解析、ピリジルエチル化後に限定分解し、HPLC分画したペプチドのアミノ酸配列、質量分析を行い、全アミノ酸配列を決定した。このレクチン(CRL)は、C. atroxヘビ毒レクチン(CAL)と高いホモロジーを示した。CRLとCALの性質の違いを現在検討中である。3)ボトロセチン遺伝子のクローニングB. jararacaヘビ毒腺のcDNAライブラリーの中から、ボトロセチンの遺伝子クローニングを試みた。

他のヘビ毒から見つかっているC型レクチン様タンパク質の遺伝子では、シグナル配列部分の保存性が高いことに注目して、ボトロセチンにも同様の配列があると仮定した。この配列と、予備的に得られたαサブユニットのC末端側の塩基配列をプライマーとしてPCRを行ったところ、ほぼ予想された大きさのバンドが得られた。このバンドの塩基配列を解析したところ、ほぼ既知のα鎖のアミノ酸配列と一致したが、4残基のアミノ酸置換と、1残基の欠失が見られた。一方、βサブユニットに関しては、縮重プライマーを用いて解析中である。1)ガラガラヘビ毒由来C-typeレクチンの構造と機能昨年度までに一次構造を決定したCrotalus ruber毒由来のレクチン(CRL)は、C.atrox毒由来のレクチン(CAL)との間で、5箇所のアミノ酸のみが異なるが、今年度は、このアミノ酸置換とレクチンの性質にどのような相違が認められるかを解析した。糖認識特異性では、双方ともβ-ガラクトシド、GalNAcに高い親和性を示した。CALは単独でも血小板凝集を惹起すると報告されているが、CAL, CRLともに血小板凝集活性はなく、VWFによる血小板凝集にも影響しなかった。2価金属イオン要求性を調べたところ、CRLでは、Mn^<2+>、Ni^<2+>、Ba^<2+>によって、また、CALではBa^<2+>によってレクチン活性が阻害されることがわかった。CALの立体構造が最近明らかにされたが、該当するアミノ酸置換は糖認識特異性には影響しないものの、金属イオンの配位に重要であることが示唆された(論文準備中)。2)ボトロセチン遺伝子のクローニング昨年度から引き続き、B.jararacaヘビ毒腺のcDNAライブラリーの中から、ボトロセチンの遺伝子クローニングを試みた。残されたβサブユニットに関しては、縮重プライマーを用いてPCRを行い、得られたバンドのシークエンス解析から内部シークエンスを調べた。3'末端に関しては、poly Tをリバースプライマーとして用いたPCRで検索した。その結果、ボトロセチンβ鎖と87-88%の相同性を持ったクローンを得た。これ以上の高い相同配列は得られなかったことより、以後この配列を用いて発現実験を行うことにした。その他、PCRでの副産物としてGPIb結合タンパク質のβ鎖と、ボトロジャラシンβ鎖のクローンも取れた。現在、発現ベクターへの組み込みを検討中である。3)キングコブラ毒由来新規VWF結合タンパク質の精製と性質キングコブラ(Ophiophagus hannah)毒中にVWF結合性タンパク質を発見し、その精製を行うとともに、血小板凝集に与える影響を解析中である。1)リコンビナント・ボトロセチンの発現昨年度までにクローニングしたボトロセチンα、β両鎖のcDNAを2箇所のクローニングサイトを持つ発現ベクターであるpTandem-1に組み込んだ。このプラスミドをヒト胎児腎由来の293T細胞にトランスフェクションし、一過性の発現を試みた。培養液を回収し、濃縮後に非還元条件下でSDS電気泳動にかけ、抗ボトロセチン抗体でウエスタンプロッティングをおこなったところ、ボトロセチンと同じ移動度に陽性バンドを認めた。
ヒ素による酸化的DNA傷害と発がん機序の解明

1無機ヒ素代謝産物であるモノメチルアルソン酸(MMA)、ジメチルアルシン酸(DMA)、トリメチルアルシンオキサイド(TMAO)の肝発がん促進作用と膀胱発がん促進作用の分子生物学的に解析した結果、肝におけるチトクロームp450の総量およびハイドロキシラジカルはMMA、DMA、TMAO投与のいずれの場合も有意に増加した。また、DMA投与膀胱およびTMAO投与肝臓において酸化的DNA傷害の指標である8-OHdGの形成の有意な増加に伴い、細胞増殖能亢進が認められた。さらに、マイクロアレー法を用いた遺伝子発現解析では、異物代謝に関わるPhaseIおよびPhaseII酵素、酸化的ストレス反応遺伝子の発現上昇が認められた。以上により、ヒ素投与により酸化的DNA傷害が惹起し、細胞増殖関連遺伝子の発現亢進により、発がんに至ったと考えられた。2酸化的DNA傷害修復酵素であるOGG1の欠損マウスおよび野生型マウスを用いてDMAの発がん性を検討した実験では、OGG1欠損マウスにおける肺腫瘍の発生頻度および個数は、対照群に比べDMA^V投与群で有意に増加した。一方、野生型マウスにおいては、肺腫瘍の発生はみられなかった。これらの結果から、DMAはOGG1欠損マウスの肺に発がん性を示し、その機序に酸化的DNA傷害が関与していることが明らかになった。3 MMAおよびTMAOの2年間発がん性実験で、対照群に比較してTMAO群で肝腺腫の発生が有意に増加したことから、TMAOはラット肝発がん促進作用のみならず、肝発腫瘍性も有することを明らかにした。一方、MMAの単独投与は膀胱の粘膜の過形成と肝臓の前がん病変のマーカーであるGST-P陽性細胞巣を増加させるものの、腫瘍を誘発しないことが判明した。以上より、ヒ素発がんには酸化的DNA傷害の惹起が主な原因であるが明らかとなり、それの発生を防御することによりヒ素発がんを予防する可能性が示唆された。本研究課題の成果はヒ素発がん機序の解明のみならず、ヒ素発がんの予防にも寄与するものと期待される。研究1無機ヒ素代謝産物であるモノメチルアルソン酸(MMA)、ジメチルアルシン酸(DMA)、トリメチルアルシンオキサイド(TMAO)の肝発がん促進作用の分子生物学的解析【はじめに】我々は無機砒素のほ乳類での主な代謝産物である有機砒素化合物のMonomethylarsonic acid(MMA),dimethylars inic acid(DMA)and trimethylarsineoxide(TMAO)の肝発がん促進作用を明らかにしている。今回は、これらの肝発がん促進作用を分子生物学的に解析を試みた。【方法】動物は雄性F344ラットを用い、200ppmのMMA、DMA、TMAOを飲水投与し、5、10,15,20日後に肝を摘出し、遺伝子の発現をcDNAマイクロアレー法を用いて解析すると共に、発現している遺伝子をRT-PCR法で確認した。【結果】肝におけるチトクロームp450の総量はMMA、DMA、TMAO投与のいずれの場合も有意に増加し、ハイドロキシラジカルは10-15日のヒ素処置から発生した。cDNAマイクロアレー法を用いた遺伝子発現解析では、生体異物の代謝に関わるPhase IおよびPhase II酵素の誘導されていた。また、酸化的DNA傷害のマーカーである8-OHdGの形成はDMAおよびTMAO処置20日に著明に増加していた。また、細胞増殖に関わる遺伝子およびアポトーシスに関わる遺伝子も20日には誘導されていた。【結論】

ヒ素投与によりPhase IおよびII酵素が誘導され、酸化的DNA傷害が惹起し、細胞増殖関連遺伝子の発現亢進により、肝発がん促進に至ったと考えられた。研究2 MMA、TMAOの発がん性の検討【目的】2年間発がん性試験をF344ラットを用いて、MMAおよびTMAOの発がん性を明らかにするとともに、その発生機序の解明を試みた。【方法】動物は雄性F344ラットを用い、200ppmのMMA、TMAOを飲水投与し、2年間飼育したのち全身臓器の腫瘍発生を検討した。【結果】TMAOには肝発腫瘍性が認められたが、MMAには、発腫瘍性は認められず、肝前がん病変のGST-P陽性細胞巣の増加と膀胱の過形成病変の発生のみ認められた。TMAO処置ラット肝では、酸化的DNA傷害のマーカーである8-OHdGの形成が有意に増加し、細胞増殖能の亢進が認められ、これらが発がん機序に関与していることが明らかとなった。【結論】TMAOには肝発がん性が認められることが明らかとなった。OGG1遺伝子欠損マウスを用いたヒ素の発がん性試験ヒ素は疫学的に皮膚、膀胱、肝臓、腎臓などに発がん性を示すことが明らかにされてきている。また、我々はこれまでに無機ヒ素の代謝産物であるジメチルアルシン酸(DMA)はラット膀胱に発がん性を示すこと、ヒ素の発がん性機序の一つに酸化的DNA傷害が関与していることを明らかにしてきた。今回は、DMAによる酸化的DNA傷害と発がん性との関係を明らかにするため、酸化的DNA傷害により形成される8-OHdGを修復する酵素の遺伝子であるOGG1を変異させたOGG1遺伝子欠損マウスを用いてDMAの発がん実験を検討した。OGG1遺伝子欠損マウスのホモ(OGG1^<-/->)、ヘテロ(OGG1^<+/->、野生型(OGG1^<+/+>)の雌雄にDMAを200ppmの濃度で飲料水にて投与した。それぞれの対照群には水道水を投与した。78週間後にマウスを屠殺し、全臓器について腫瘍の発生の有無を検索した。DMA投与群において、OGG1^<-/->で100%、OGG1^<+/->で67%、OGG1^<+/+>で50%の腫瘍発生率を認め、OGG1遺伝子欠損マウスがDMAに高感受性であることを示した。DMA非投与の対照群ではOGG1^<-/->で0%、OGG1^<+/->で20%、OGG1^<+/+>で59%の腫瘍発生率を認めDMA投与OGG1^<-/->では悪性リンパ腫と肺腫瘍を高頻度に認めた。肺における8-OHdGのレベルはOGG1^<-/->、OGG1^<+/->、OGG1^<+/+>において、DMA投与群が非投与群に比べ上昇傾向を示した。また、OGG1^<-/->ではすべての動物に膀胱上皮の過形成を認めた。以上より、OGG1遺伝子欠損マウスにおいてDMAの発がん性が明らかとなり、また、DMAによる酸化的DNA傷害が発がんに関与することが改めて確認された。
胃食道逆流症における神経成長因子と侵害受容器に関する研究

ラット食道への酸刺激により、脊髄後根神経節(DRG)および食道粘膜内で、胸焼けなどの知党に関与する受容体(TRPVl)および神経伝達物質(substance P、NGF)の産生が元進することが明らかとなつた。胃食道逆流症患者における知覚過敏のメカニズム解明につながる研究成果であり、酸分泌抑制剤でコントロール不良な患者では、将来、TRPVl, substance P. NGFなどを標的とした創薬が期待される。近年、内視鏡検査にて粘膜病変を認めないが強い胸焼け症状を呈する機能性疾患(非びらん性胃食道逆流症(NERD)が増加している。NERDの自覚症状発現の機序は不明であるが、本症患者では食道粘膜の知覚過敏の存在が指摘されている。本研究では、食道知覚過敏のメカニズムを解明する目的で以下の検討を行った。1)NERD患者の食道粘膜より生検を行い、粘膜中のサブスタンスP(SP),CGRPのタンパク、および酸感受性侵害受容器TRPV1,ASIC3のmRNAおよび免疫組織染色を行った。その結果、NERD患者では食道粘膜内のSPタンパクおよびTRPV1mRNAの有意な増加を認めた。免疫染色では粘膜直下固有層までSPおよびCGRP陽性神経の伸長がみられた。胸焼け症状の強さとSP濃度の間には有意な正の相関が認められた。ASIC3およびCGRPに関してはNERD患者と正常者の間に有意な変化を認めなかった。2)バルーンを用いてラットの食道胃接合部に塩酸を直接暴露して、食道粘膜中のSP,神経成長因子NGF, TRPV1を測定した。その結果、酸暴露により、粘膜中のSPおよびNGFタンパクの増加、TRPV1mRNAの発現亢進が認められた。TRPV1拮抗剤であるカプサゼピンの前処置により酸刺激による食道粘膜内SP増加は有意に抑制されたが、NGFには変化が見られなかった。以上の結果,NERDの知覚過敏にはTRPV1依存性のSP増加が関与していること、SPおよびTRPV1の増加にはNGFが関与していることが示唆された。今後、食道粘膜内のみならず、食道の知覚神経が連絡する脊髄後根神経節でのTRPV1, SP, NGFの変動を検討する予定である。【目的】われわれは、平成20年度においてNERD患者の食道粘膜内で酸感受性侵害受容器であるtransient receptor potential vanilloid receptor subtype1(TRPV1)およびTRPV1刺激により神経終末より放出されるsubstance Pが増加し、胸焼け症状の強さと相関することを報告した。最近、炎症細胞、肥満細胞などから産生される神経成長因子NGFがTRPV1の産生を高め、末梢での熱や痛みの感受性を亢進させることが示唆されている。今回、ラットの食道に酸を直接暴露させるモデルを作成し、食道粘膜および脊髄後根神経節(DRG)におけるNGF/TRPV1/substance P発現を検討し、酸と食道知覚の関係について考察した。【方法】Wistar系雄性ラットに先端バルーン付きカテーテルを経口的に挿入し、pH1の塩酸または生理食塩水をカテーテルの側孔より食道内に注入し、胃噴門直下でバルーンを拡張させることにより注入液を食道内に留まらせるようにした。薬剤を回収後食道粘膜およびDRG(Th7-9)を採取し、substance P、CGRP、TRPV1、NGFの変化を定量的に評価した。さらに、免疫染色にて、DRGでのTRPV1およびsubstance P発現を検討した。【成績】ラット食道粘膜にpH1の塩酸を暴露することにより、食道粘膜およびDRGにおいてTRPV1のmRNAおよびタンパクの発現増加、substance Pタンパク増加を認めた。免疫染色ではDRG神経細胞体の細胞質内にTRPV1、substance P発現を確認した。NGFタンパクも食道粘膜内およびDRG内で増加していた。TRPV1拮抗剤の投与はsubstance P発現を抑制した。【結語】今回の研究の結果、食道粘膜への酸暴露により、食道粘膜およびDRGでのTRPV1依存性の神経炎症が惹起されることが明らかとなり、食道粘膜の知覚過敏における酸とTRPV1の重要性が示唆された。
調節性Ｔ細胞制御による放射線療法後遠隔転移の抑制法に関する研究

【目的】直腸癌放射線治療後の遠隔転移増加のメカニズム解明、抑制法開発のため、調節性T細胞を中心とした免疫機構に注目し研究を行った。【方法】Balb/cヌードマウスの直腸前壁を切開、後壁に癌細胞(HT-29)5×106個を移植。移植後7日目から局所放射線治療群と非照射群で各免疫因子につき比較検討した。【結果】腫瘍中Foxp3,Notch1,Jagged1 mRNA発現に差を認めなかった。腫瘍+放射線照射群では、Control群、腫瘍単独群と比較し脾臓中のFoxp3が高い傾向を認めた。【結論】腫瘍に放射線治療を加えると血中Foxp3が上昇し免疫寛容誘導により、遠隔転移が増加する可能性が示唆された【目的】直腸癌に対する放射線治療では局所再発は制御されるものの遠隔転移が増加し、結果的には生存率の改善に結びつかないことが指摘されている。放射線治療によって起こる遠隔転移増加のメカニズムおよびその抑制法の開発のため、調節性T細胞、また発癌や癌の進展に関与しているNotchシグナルを中心とした免疫機構に注目して研究を行い、放射線治療の効果向上を目的とする。【これまでの研究成果】Balb/cヌードマウスの直腸前壁に切開を加え、後壁に癌細胞(HT-29) 5×106個を移植し、遠隔転移モデルを作成、安定して遠隔転移モデルを作成することが可能となった。癌細胞移植後7日目から局所放射線治療を開始する群と非照射群を設定、比較検討した。放射線照射群は1.5Gy×5日間で合計7.5Gyを照射した。放射線照射群は非照射群と比較して照射後1,2,3週間後いずれにおいても有意にTumor volumeが小さかった。PCR測定による腫瘍中Foxp3, Notch1, Jagged1 mRNA発現は両群間で有意差を認めなかった。これまでの検討では有意な免疫学的因子の差を認めていないが、これまで放射線治療による遠隔転移増悪のメカニズム解明とその抑制に関する研究は無く、今後、検討数を増加し、FACS-scan、Western blot法、免疫組織化学染色等を用いた検討を行い、有用な結果が得られれば、放射線治療成績向上に本研究が大きく寄与する可能性があると思われる。【目的】放射線治療の効果向上を目指し、放射線治療によって起こる遠隔転移増加のメカニズムおよびその抑制法の開発のため、調節性T細胞を中心とした免疫機構に注目して研究を行う。また放射線治療の効果向上を目指して発癌や癌の進展に関与している癌幹細胞に注目して研究を行う。【方法】1Balb/cヌードマウスの直腸前壁に切開を加え、後壁に癌細胞(HT-29) 5×106個を移植。移植後7日目から局所放射線治療を開始する群と非照射群でTreg細胞の分化、生存に必要な因子(Foxp3)について比較検討した。2ヒト大腸癌細胞株HT-29を用いて培養24時間後に抗CD47抗体投与とradiationを以下の4群で施行した。【結果】1腫瘍+放射線照射群(n=3、3.967±1.626)では、Control群(n=3、3.133±0.681)、腫瘍単独群(n=3、3.633±0.666)と比較して脾臓細胞中のFoxp3が高い傾向を認めた。2CD47とそのリガンドであるTHBS1についてCD47・THBS1ともにHT-29で高発現していた。抗CD47抗体投与で濃度依存的に細胞増殖が抑制された。また放射線照射は5Gyで有意に細胞増殖を抑制した。抗CD47抗体投与と放射線照射の併用において、併用群で細胞増殖が有意に抑制された。【結論】腫瘍に放射線治療を加えることで血中Foxp3が上昇し免疫寛容を誘導する結果、遠隔転移形成の一因となる可能性が示唆された。また大腸癌細胞において、CD47抑制により放射線感受性が増強される可能性が示唆された。【結論】腫瘍に放射線治療を加えると血中Foxp3が上昇し免疫寛容誘導により、遠隔転移が増加する可能性が示唆された【目的】放射線治療の効果向上を目指し、放射線治療によって起こる遠隔転移増加のメカニズムおよびその抑制法の開発のため、調節性T細胞、また発癌や癌の進展に関与しているNotchシグナルを中心とした免疫機構に注目して研究を行う。【方法】Balb/cヌードマウスの直腸前壁に切開を加え、後壁に癌細胞(HT-29) 5×106個を移植。移植後7日目から局所放射線治療を開始する群と非照射群で以下の項目について、癌原発部・周囲非癌部、遠隔転移・周囲非癌部を採取し、比較検討する。(検討項目)1)免疫細胞因子(NK細胞数、Treg細胞数)

2) Treg細胞の分化、生存に必要な因子(Foxp3, IL-2, TGF-β, VEGF)3) Notch関連因子(リガンド(Delta, Jagged)とターゲット遺伝子(Hes-1, Hes-5, PTα))免疫細胞因子はFACS-scanを行い、Treg細胞の分化、生存に必要な因子、Notch関連因子はmRNAをPCRで、タンパクレベルでの測定をWestern blot法、免疫組織化学染色(抗Delta1,3,4、Jagged1,2抗体など)で検討する。【結果】放射線照射群は非照射群と比較して有意にTumor volumeが小さかった。癌原発組織中Foxp3, Notch1, Jagged1 mRNA発現は両群間で差を認めなかった。【結論】癌原発組織中のこれまでの検討では、Treg、Notch関連因子に有意な差を認めなかった。今後、検討数を増加し遠隔転移・周囲非癌部についても検討を行う予定である。平成23年度1)遠隔転移モデルの作成2)放射線治療効果判定いずれも両群間で有意差を認めなかった。平成24年終了時点で遠隔転移モデルの作成、放射線治療効果については安定して作成が可能となっている。有意差は出ていないが、腫瘍中の免疫因子の発現も確認でき、以上のことから本研究は順調に進んでいると考えられる。動物モデル作成手技については習得、安定しており、癌原発部についての検討は行えている。今後、遠隔転移部位等の検討に円滑に移行可能である。これまでに作成した遠隔転移モデル、放射線治療モデルを用いて以下の項目を検討予定である。1)免疫細胞因子(NK細胞数、Treg細胞数)3) Notch関連因子(リガンド(Delta, Jagged)とターゲット遺伝子(Hes-1, Hes-5, PTα))免疫細胞因子はFACS-scanを行い、Treg細胞の分化、生存に必要な因子、Notch関連因子はmRNAをPCRで、タンパクレベルでの測定をWestern blot法、免疫組織化学染色(抗Delta1,3,4、Jagged1,2抗体など)で検討する。局所癌組織、遠隔転移腫瘍組織ならびに局所、遠隔転移周囲の非癌部についても免疫細胞因子を検討する予定である。検討数を増やし、検討項目に挙げた免疫細胞因子の他、Treg細胞の分化、生存に必要な因子、Notch関連因子検討を、遠隔転移部位、周囲非癌部についても行う。次年度への繰越額は消耗品に使用予定である平成24年度は、樹状細胞にNotchリガンドを発現させることによる癌転移抑制法の可能性を明らかにするため、Notchリガンド(Delta1)を過剰発現させた樹状細胞を作成し、担癌同所性モデルに対する放射線治療による転移抑制効果を検討する。また、平成23年度より検討項目を増やす予定である。平成23年度から繰越した235,482円は消耗品費の一部を充当する予定である。
脳毛細血管内皮細胞と周皮細胞における線溶蛋白の発現および増殖因子による調節

ヒト脳血管病変の理解に重要な微小血管内皮細胞の線溶調節を検討し,以下の結果を得た。血管内皮増殖因子(VEGF),塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2),腫瘍壊死因子-α(TNF-α),インターロイキン-1β(IL-1β)および形質転換増殖因子-β(TGF-β)の作用について微小血管内皮細胞の細胞培養系を用いて,線溶蛋白の発現と放出量の変化およびフィブリンザイモグラフィーによる線溶系への作用を調べた。検討したサイトカインの中でVEGF_<165>は内皮細胞の培地へのPAI-1の蓄積には影響を及ぼさないが,t-PAの蓄積を有意に増加させた。そこでVEGF_<165>の濃度依存的な作用を調べたところ濃度依存的なt-PAの増加が確認された。t-PA mRNAの発現はVEGF_<165>によって上昇したが,u-PA mRNAおよびPAI-1 mRNAには変化は認められなかった。培地中の線溶活性はVEGF_<165>で内皮細胞を処理すると活性の上昇が確認された。その他のサイトカインでは,FGF-2はt-PAおよびPAI-1の培地への蓄積に影響を与えず,TNF-αおよびIL-1βはt-PAの蓄積には影響を与えずに,PAI-1の蓄積を有意に増加させた。TGF-βはt-PAおよびPAI-1の蓄積に影響を与えなかったが,さらに詳細な検討が必要である。ヒト脳微小血管内皮細胞においてVEGF_<165>はPAI-1の合成に影響を及ぼさずにt-PAの合成を選択的に誘導して液相の線溶活性を上昇させる特異な因子であることが明らかになった。脳微小血管内皮細胞および周皮細胞の細胞培養系を用いて,線溶蛋白(組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA),ウロキナゼー型プラスミノーゲンアクチベーター(u-PA)およびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1))の発現と放出量の変化およびフィブリンザイモグラフィーによる線溶活性を指標として,トロンビンの作用について検討し,以下の知見を得た。1.脳微小血管内皮細胞線溶蛋白に対するトロンビンの作用脳微小血管内皮細胞において線溶蛋白が発現していることが示され,トロンビンに曝露するとすべての線溶蛋白の放出が促進された。その結果トロンビンに曝露したときの線溶活性は内皮細胞では上昇することが示された。2.周皮細胞線溶蛋白に対するトロンビンの作用周皮細胞についても線溶蛋白を発現していることが示され,内皮細胞と比較するとt-PAおよびu-PA放出レベルが低いことが示された。トロンビンに曝露するとt-PAおよびu-PAの放出には影響を与ずにPAI-1の放出だけが促進することが示された。その結果,線溶活性はトロンビン曝露によって周皮細胞では低下することが示され,このトロンビンによる周皮細胞PAI-1放出の促進は,PAR-1によって介在されていることが示唆された。以上より,トロンビンによる線溶活性の調節は,脳微小血管内皮細胞では血管内腔の血栓除去に,周皮細胞では血管破綻の際の血栓の維持を通じた止血機序に寄与するものと推察される。
咀嚼器官によるアルツハイマー病の予防効果に関する研究

本研究では、咬合干渉や持続的な軟性食餌といった咀嚼不全をラットに与えることによって、脳内酸化ストレスの発現量(ヒドロキシラジカル:HO^-、スーパーオキサイド:O_2^<->)が,増加することが分かった。また、ドパミン塩酸塩とHO^-およびO_2^<->の混合によりHO^-、O_2^<->は有意に消去されたことから、咀嚼不全による脳内ドパミンの変化は、酸化ストレスが関与している可能性が示唆された。これらのことは、咀嚼器官が高次脳機能(認知機能)に及ぼすメカニズム解明の一助になるもと考えられた。歯を半数以上喪失している者には、アルツハイマー病(AD)に罹患するリスクが有意に高いことやかみ合わせの不良、食物の硬さ、歯の喪失が高次脳に影響を及ぼすことが報告されている。しかしながら、これら口腔環境因子と脳機能との関連性については、未だ不明な点が多い。このようなことから、本研究は、口腔環境因子特に咀嚼不全(かみ合わせの不良と歯の喪失)とアルツハイマー病との関連性を知る目的で、海馬におけるニューロン新生率と脳内フリーラジカルの動態について調べる。口腔環境因子が高次脳へ何らかの影響を及ぼしていることは示唆されているもののアルツハイマー病(AD)の発症との関連性についての報告はない。このようなことから、本研究は、口腔環境因子がADの発症を予防あるいは遅延することが出来るか否かを知る目的で、脳内の神経伝達物質やフリーラジカルの動態について調べる。本年度は、神経伝達物質の一つである5-HTをターゲットに実験を行なった。実験方法は、3週齢のWistar系ラットをnormal硬食群およびnormal軟食群,アルツハイマー(AD)モデルrat硬食群およびADrat軟食群の4群に分け,離乳直後から硬食群には固形の飼料を,軟食群には粉状の飼料を与え飼育した.ADrat群には10週齢の時点からβ-アミロイド蛋白(1-40)(Aβ1-40)を2週間にわたり持続的に注入した.硬食および軟食で10週齢まで飼育したラットを,全身麻酔下で右側側脳室にBRAIN INFUSION KIT(Alzet社製)を埋入・固定し,浸透圧ミニポンプ(Alzet社製)を背部皮下に挿入した後,再度,切開部を縫合してさらに2週間飼育した.Aβ1-40は0.1%トリフルオロ酢酸を含む35%アセトニトリルに溶解し,浸透圧ミニポンプを用いて300pmol/12μl/dayの注入速度でラット側脳室に注入した.1213週齢の時点で,全身麻酔下においてプローブを埋入固定し,脳脊髄液の潅流を行った.その後,高濃度のカリウムにより30分間刺激し,再び脳脊髄液を還流した.マイクロダイヤリシス法により,5-HTの経時的な変化を観察したところ,normal群およびADrat群ともに基礎遊離量に違いは認められなかった.また、高濃度のカリウムで刺激したところnormal群では変化は見られなかったものの、ADrat群においては、硬食において有意な増加が見られた。以上の結果から,食物性状の違いによる口腔環境因子の差異が,脳内の神経伝達物質である5-HTの遊離能に影響を及ぼす可能性が示唆された.咀嚼不全や軟性食事などの口腔環境因子が高次脳へ何らかの影響を及ぼしていることは示唆されているもののアルツハイマー病(AD)を含めた認知症の発症との関連性についての報告はない。本年度は、脳内のフリーラジカルの動態について実験を行った。今回は実験動物として老化アミロイドーシス、学習・記憶障害を発症する老化促進モデルマウス(以下SAMPと略す)を使用した。実験方法はSAMPマウスの2ケ月齢時に上顎臼歯部を全て抜歯し、抜歯群(咀嚼不全群)と非抜歯群(コントロール群)に分類し、1カ月後、ESR装置を用いて脳内のフリーラジカルの変化を測定し、比較検討を行った。その結果、抜歯後1ケ月後では両群間に有意な差は認められなかった。これは臼歯喪失の期間が短く若齢期で老化がほとんど進んでいないため影響が少なかったと考えられる。SAMマウスの特徴として46ケ月齢で老化が急速に進行するという報告があることから、今後は抜歯してから測定までの期間を長くして検討していく必要がある。近年、歯の喪失や咬合干渉によって引き起こされる咀嚼機能不全は、高次脳へ影響を及ほすことが示唆されている。

このようなことから、本研究は、口腔環境因子とアルツハイマー病をはじめとした認知症との関連性を知る目的で、脳内の神経伝達物質やフリーラジカルの動態について調べる。本年度は、昨年に引き続き脳内のフリーラジカルの動態について2つの実験を行った。実験1:歯の喪失による影響実験動物として老化アミロイドーシス、学習・記憶障害を発症する老化促進モデルマウス(以下SAMPと略す)を使用した。実験方法はSAMPマウスの2ヶ月齢時に上顎臼歯部を全て抜歯し、抜歯群(咀嚼不全群)と非抜歯群(コントロール群)に分類し、3、6、8ヵ月後、ESR装置を用いて脳内のフリーラジカルの変化すなわち脳のMC-PROXYLの減衰速度を測定し、比較検討を行った。その結果、抜歯後3,6,8ヶ月後では両群間に有意な差は認められなかったものの、抜歯群の方が非抜歯群(コントロール群)に比べて、MC-PROXYLの減衰速度が増加する傾向を示した。今後は、再実験と例数を増やすことによって、この結果の妥当性を検証する予定である。実験2:咬合干渉による影響実験動物にはWistar-Kyotoラットを使用し、5ヶ月齢時の上顎臼歯部に実験的咬合干渉を付与し、コントロール群との比較検討を行った。その結果、咬合干渉群ではMC-PROXYLの減衰速度が有意に増加し、酸化ストレスが誘導されていることが明らかになった。今年度は,アルツハイマー型認知症の要因と考えられている脳海馬の神経伝達物質遊離と活性酸素種による酸化ストレスの発現が,食物性状の違いにより脳内でどのような変化を及ぼすかについて検証を行った.実験には,雄性Wister ratを用いた.3週齢の離乳直後より固形食飼育(以下H群)と粉末食飼育(以下S群)に分類し,それぞれ12週齢まで飼育を行い,飼育期間終了後以下の実験を行った.実験1.脳内の酸化ストレスの評価:ラット尾静脈より酸化ストレス評価測定用スピンプローブ剤(MC-PROXYL)を投与した.30秒後に脳を摘出し電子スピン共鳴(ESR : Electron Spin Resonance)法を用い,脳内の酸化ストレス発現を評価した.実験2.海馬内のドパミン遊離能の動態評価:マイクロダイアリシス法にてドパミン遊離量の検出を行った.還流液として高濃度カリウムを用いることにより,ドパミン遊離能の動態を検証した.脳内酸化ストレスの発現量は,H群と比較しS群において有意な増加が認められた(P<0.05).マイクロダイアリシス法によるドパミン遊離能は,高濃度カリウム刺激後,H群に比べS群において有意な減少が認められた(P<0.05).ドパミン塩酸塩とHOの混合によりHOを有意に消去し,L-Tyrosineとの混合より高い消去能を示した.以上の結果より,食物性状の違いによる顎口腔系への刺激の違いが,脳内の酸化ストレスの発現量とドパミン遊離能に影響を与え、そしてそれらには相互作用があることが示唆された.
精神科外来看護師の診療待ち患者に対する臨床判断のプロセス

看護師が「何か変」と感じ、早期に何らかの看護が必要かどうかの臨床判断を形成するプロセスを明らかにする目的で、精神科外来看護師8名を対象に半構成インタビューを行い質的記述的分析を行った。結果、自身の経験や知識からくる認識を元に11のプロセスを辿りつつ瞬時の看護を行っていた。今後は、看護・外来看護の楽しさ、苦しさを伝えつつ、患者に寄り添う意味を模索するような研修や多岐にわたるアセスメント力向上の研修をもとにした看護師教育プログラム開発が期待される。精神科外来の診療待ちの患者で、看護師が、「何か変」と感じ、早期に何らかの看護が必要かどうかの臨床判断を形成するプロセスを明らかにし、精神科外来看護師のケアの質向上やモチベーションアップにつながることを検討することを目的として、研究に取り組んだ。今年度は、データに信頼性を、より持たせるため、面接調査の対象者を増やした。F県内の2病院の精神科病院に研究協力依頼をし、必要時、病院の倫理審査委員会にも提出した。研究対象者の選択については、管理者からの推薦後、再度研究者からの説明、同意を得られたあとに研究協力してもらった。面接調査時の内容は研究対象者の了解を得て、ICレコーダーに録音、録音の了解が得られない場合は、対象者の発言内容をメモに記載した。その結果、研究依頼をした2病院の精神科外来看護師4名を対象として、半構成的面接調査を行った。面接時間は昨年度同様、1人40分1時間程度であった。面接前には、管理者からの外来受診状況、外来看護の仕事内容等も把握した。昨年度の面接協力者を合計すると4病院、8名の精神科看護師に半構成的面接調査を行うことができた。「何か変」と感じるきっかけとなるものとして、患者の表情、行動、家族からの情報だけでなく、患者が言語化した場合は、前もった情報がなくとも言葉の中にある重要なフレーズをキャッチしていることがわかった。その上で、その言葉を活用しながら、患者に寄り添い、介入すべき事柄をしぼっていた。精神科外来の診療待ちの患者で、看護師が「何か変」と感じ、早期に何らかの看護が必要かどうかの臨床判断を形成するプロセスを明らかにし、精神科外来看護師のケアの質向上やモチベーションアップにつながることを検討することを目的として、研究に取り組んだ。まず、「臨床判断」、「精神看護」、「外来看護」をキーワードに、文献検討を行った。インタビューガイドは、文献等を参考に作成し、今までの精神科外来看護をしている経験の中で、診療待ち患者で印象に残った介入場面等を中心に語ってもらい、対象者が自発的に話す内容に加えて1印象に残った理由、2患者のどのような状態をみて、「何か変」と感じたのか、3懸念はどんなものがあったか、4介入した場合、何を考えながら介入をしたか、5介入後何を考えたか、等の回答が引き出せるように工夫した。その他の書類(研究依頼書、同意書等)の作成も行なった後、倫理審査を福岡県立大学研究倫理委員会に申請した。研究倫理委員会承認後、F県内、S県内の精神科病院に研究協力依頼し、必要時、病院の倫理審査委員会にも提出した。研究対象者の選択については、管理者からの推薦の後、再度研究者からの説明、同意を得られたあとに研究協力してもらった。インタビュー前には、管理者からの外来受診状況、外来看護の仕事内容等も把握した。現在、2病院、4名の精神科外来看護師に対して、半構成的面接調査を行なった。時間は、1人40分から1時間程度であった。その結果については、インタビュー内容を逐語録に起こし、現在、質的帰納的に分析中である。患者の表情や行動、家族からの情報をもとにして第一歩の介入を行い、その後、より介入の必要性を感じていることが明らかになっている。今後は、質的帰納的に分析を進めると共に、インタビューガイドの内容の洗練を行い、内諾を得ている研究協力者への面接調査と共にさらなる対象者数を増やしていきたい。産前産後の休暇又は育児休業による中断:平成25年8月12日平成27年3月31日補助事業期間延長承認:平成25年12月19日以上のことにより、今年度は、研究実績はない。精神科外来看護師8名を対象として行った面接調査の内容を逐語録に起こし、最終年度は、看護師が「何か変」と感じ、早期に何らかの看護が必要かどうかの臨床判断を形成するプロセスに焦点を当て、特定の理論に基づかない質的記述的分析の洗練を行った。その結果、精神科外来看護師は、後悔の経験からくる悔しさや看護観のもとになるものの経験をしていることから<看護のばねになるもの><外来看護への想い>が生まれ、これらが重なり合い、<患者と関わる姿勢>に繋がっていた。また、<気になる状況の候補>をベースとしながら<五感のフル活用>をしつつ、<介入の必要性のある患者状況を探す>ことをしていた。その後、<気になる状況を確信に変える方法>にて<アセスメントのし直し>や<介入>を繰り返し、<介入後の結果>を受け、<自分の看護の評価>に繋がっていた。臨床判断を形成するプロセスには、自身の経験や知識からくる認識がベースとなり瞬時の看護をしようとする動力や視点があった。そのため、精神科外来看護師のケアの向上やモチベーションアップにつながるようにするには、第一に<看護のばねになるもの><外来看護への想い

>を確固としたものにしていくように、看護・外来看護の楽しさ、苦しさを伝えつつ、患者に寄り添う意味を模索するような研修が必要である。第二には、瞬時の看護を強化するために、多岐にわたるアセスメント向上をしていく必要がある。また、医師等への遠慮もあり、自分の看護に価値を見いだせず、自分流の看護ができない状態もあることが明らかになった。そのため、第三として、第一、第二をもとにした、多職種との交渉を苦手としない力をつけていけるような看護師教育プログラム開発が期待される。看護師が「何か変」と感じ、早期に何らかの看護が必要かどうかの臨床判断を形成するプロセスを明らかにする目的で、精神科外来看護師8名を対象に半構成インタビューを行い質的記述的分析を行った。結果、自身の経験や知識からくる認識を元に11のプロセスを辿りつつ瞬時の看護を行っていた。今後は、看護・外来看護の楽しさ、苦しさを伝えつつ、患者に寄り添う意味を模索するような研修や多岐にわたるアセスメント力向上の研修をもとにした看護師教育プログラム開発が期待される。本年度は、産前産後の休暇又は育児休業による中断にて研究は進んでいないが、データ収集はできており、分析を行っていく段階まで進んでいる。精神看護最近の精神医療の進歩や精神保健福祉法の改定などの確認とともに、文献検索、検討を行う。同時に、インタビューデータの整理、分析を行い、考察していく。また、その後、学会発表準備もしくは論文投稿の準備を行っていく予定とする。補助事業期間延長承諾申請書にて研究再開後の実施計画を提出している。8名に面接調査を行うことができ、データー入力もすることができた。予定では、研究協力依頼病院への依頼や倫理審査委員会への書類提出までとなっていたが、研究協力して頂く病院の配慮もあり、4名の研究協力者に面接調査を行うことができた。しかし、インタビュー人数に関してはまだ少ない。平成24年度中に後3名の面接調査の内諾はできている。育児休業による中断により、本年度は助成金を使用することはなかった。仕事復帰時より、研究も再開し、精神医療の進歩や改訂されている精神保健福祉法等もあるため、再度、文献検索、検討を行い、分析を洗練する予定とする。今後は、内諾を得ている研究者への面接調査と共に、再度、異なる研究協力依頼病院の倫理審査委員会に書類提出・研究依頼を行っていく。インタビューデータ入力を行い、質的帰納的に分析を進めていく。8月からは産休・育休に入るため、研究は一時中断をする予定である。文献取り寄せ代金、本購入代金、データ分析のためのパソコン関係の物品費、情報収集のための学会参加旅費等として使用予定。妊娠により参加できない学会があるとともに、産前産後の休暇又は育児休業による中断により、本年度に予定していた予算を使用することができないものが発生した。平成27年度に研究を再開する予定。文献取り寄せ代金、本購入金、データ分析のためのパソコン関係の物品費、学会の交通費等で使用する予定である。平成24年度の残額「243,926円」となった理由としては、国内外の文献の取り寄せまでは行っておらず、学内で入手できる文献に限ったことと共に、翻訳の賃金としてとっていた研究費を、翻訳ソフトやスキャナーに変更したことがある。
河内晩柑果皮に含まれるシネフリンの抗炎症効果と作用機構の解明

愛媛県の特産柑橘の一つである河内晩柑について、果皮水溶性抽出物が過剰炎症状態のマクロファージに対して抗炎症効果を示すことが明らかになった。また、抽出物には活性物質が複数含まれており、その一つはアルカロイドの一種であるシネフリンと同定された。本研究は、河内晩柑果皮水溶性抽出物、およびシネフリンの生体内外における抗炎症効果とその作用機構を明らかにし、機能性食品への応用に向けた基礎的データを蓄積することが目的である。本研究により、将来的には河内晩柑果皮を活用した機能性食品へと応用展開し、食による健康寿命の延伸に寄与することを目指す。
線条体神経細胞でのドーパミン情報伝達系、特にD1/D2レセプター相互作用の解析

線条体に選択的に発現するDARPP-32(dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein,Mr 32kDa)は、ドーパミン作用が効率的に発現するために必須のリン酸化蛋白である。DARPP-32はThr34残基がプロテインキナーゼA(PKA)によりリン酸化されるとプロテインホスファターゼ1抑制蛋白として作用する。ドーパミンD1レセプター刺激ではPKAによるThr34残基リン酸化が促進されるが、D2レセプター刺激ではカルシニューリンによるThr34残基脱リン酸化が促進され、D1/D2レセプターはDARPP-32/Thr34残基リン酸化を拮抗的に調節する。しかし、D1/D2レセプターはそれぞれ線条体-黒質神経路神経細胞と線条体-淡蒼球神経路神経細胞に発現しているとされており、D1/D2レセプター相互作用のメカニズムは明らかではない。DARPP-32リン酸化を指標とした検討で、ギャップ結合抑制物質がDARPP-32/Thr34残基リン酸化調節におけるD1/D2レセプター相互作用を抑制するという結果を得た。線条体-淡蒼球神経路神経細胞に発現するD2レセプターは、ギャップ結合様構造を介して線条体-黒質神経路神経細胞のDARPP-32リン酸化を調節していると考えられる。また、DARPP-32抗体にて線条体神経細胞を免疫染色し共焦点レーザー顕微鏡にて解析した結果、神経細胞体間で細胞膜が接触する所見を数多く認めた。接触部位を電顕にて解析したところ、細胞膜は直接接触しており接触部位に一致して細胞内Ca^<2+>プールとして機能する表面下槽の構造を認めた。これらの結果は、ギャップ結合様構造や表面下槽を伴う細胞体接触が線条体神経細胞間コミュニケーションに関与することを示唆しており、引き続き機能的・形態学的解析をすすめている。線条体ではドーパミンにより制御される蛋白質DARPP-32(Dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr32kDa)が選択的に発現している。Thr34残基がプロテインキナーゼA(PKA)によりリン酸化されたDARPP-32は、プロテインホスファターゼ1(PP-1)と結合しPP-1活性を抑制する。ドーパミンなどの神経伝達物質は、DARPP-32リン酸化レベルおよびPP-1活性を調節することにより、イオンチャンネルやNa^+,K^+-ATPaseの機能、さらには神経細胞の興奮性をコントロールしている。ドーパミンD1/D2レセプターによるDARPP-32/Thr34残基リン酸化調節の検討で、D1レセプター刺激によりPKAによるDARPP-32リン酸化は促進されるが、D2レセプター刺激ではカルシニューリンによるDARPP-32脱リン酸化が促進され、D1レセプターとD2レセプターは拮抗的に作用することを報告した(J.Neurosci.17:8147-55,1997)。線条体神経細胞には、D1レセプターを主として発現する線条体-黒質神経路神経細胞とD2レセプターを主として発現する線条体-淡蒼球神経路神経細胞の2種類が存在する。D1/D2レセプターは異なる神経細胞上に発現しおり、D1/D2レセプター相互作用のメカニズムは明らかでない。私たちは、ギャップ結合抑制物質がDARPP-32リン酸化調整におけるD1/D2レセプター相互作用を抑制するという結果を得た。この結果は、線条体神経細胞間のコミュニケーション、特に細胞内情報伝達系の相互作用にギャップ結合が関与することを示唆している。

これらの結果は、ギャップ結合様構造や表面下槽を伴う細胞体接触が線条体神経細胞間コミュニケーションに関与することを示唆しており、引き続き機能的・形態学的解析をすすめている。