hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミヤコグサとのシンテニーを利用したダイズのゲノム構造の解析

1.ミスズダイズと秣食豆公503に由来するRILの連鎖地図を基準にして、ミヤコグサの塩基配列情報を利用して比較地図を作製した。F2連鎖地図を用いた結果と同様にダイズの染色体はミヤコグサ連鎖ブロックのモザイクとなっていた。相同染色体は1対ずつで、染色体レベルでは2倍体である。2. Williams82のゲノム塩基配列から同祖領域を探索したところ、領域の大きさは最大約12.4MBにわたっていることがわかった。同祖領域の分布は極めて複雑でダイズゲノムは複数の倍加と再編成を経て形成されたと考えられる3.ミヤコグサの花の対称性に関わる遺伝子cyc3のオーソログGmcyc3aを含むBACクローンとGmcyc3aの同祖遺伝子Gmcyc3bを含むBACクローンを異なる蛍光色素でラベルしてパキテン期染色体に同時に貼り付けるとそれぞれ同じ領域にシグナルが観察され、一方のシグナルが強いところは他方のシグナルが弱く見かけ上2つのシグナルがはっきりと認められた。同じことが、同祖遺伝子NFR1a、NFR1bなどでも観察された。また開花期関連遺伝子FT3を含むダイズのTACクローンと相同なミヤコグサのTACクローンは同じ位置にシグナルが見られ強弱が逆転していた。一般にミヤコグサのTACクローンはダイズのBACクローンに比較してシグナルが弱かった。4.ダイズのゲノムはマメ科植物の中で、極めて特異的であることがわかった。マクロシンテニー、マイクロシンテニーの解析から、倍加と再編成の結果、現在のゲノム構造が生じたと考えられる。ホモロジーの極めて高い同祖遺伝子は、一般に2つ存在していてそれは最も新しい時期の倍加による結果だと考えられる。それらの遺伝子間では機能の分業が生じていて、ダイズは遺伝子レベルでも2倍体としてのシステムを獲得していると言える。1.「ミスズダイズ」と「秣食豆公503」に由来する組換え近交系(RIL)を用いてEST由来のSSRマー力ーを中心とした935のマーカーを位置づけ、全体で1131マーカーから成る連鎖地図を構築した。これを同じ両親のF2連鎖地図と統合して、比較地図作製に利用する予定である。2.ミヤコグサの花の対称性に関わる遺伝子のダイズオーソログGmCYC3aを含むBACクローンをブローブとして、パキテン期染色体に貼り付けると1箇所に強いシグナル、もう1箇所に弱いシグナルが見られた。同じことが、開花期関連遺伝子FT2を含むBACクローン、FT3を含むTACクローン、Nodファクター受容体遺伝子NFR1a、NFR1bを含むそれぞれのBACクローンでも観察された。これらのことは、ダイズの同祖領域は2つずつ存在するが、それらは完全に一致する配列ではないことを示している。
神経膠細胞の分化に関与する遺伝子の同定

われわれは、神経膠細胞の分化増殖に関連する遺伝子の同定方法として、Liangらによるdifferential display法を用いている。この方法は従来の方法と比較して、比較的簡単に、複数種の組織間において発現の異なる遺伝子を同定することができ、すでにいくつかの遺伝子が報告されている。また、われわれはラット脳から、阿相らの方法により,oligodendrocyteとtype-2 astrocyteの前駆細胞であるO-2Aprogenitor細胞を、McCarthyらの方法によりoligodendrocyteを分離培養した。このO-2A progenitor細胞とoligodendrocyteの間で発現の異なる遺伝子を、differential display法を用いて検索したところ、数種の遺伝子が得られた。その内の一種はO-2A progenitorに多く、oligodendrocyteに少なく発現しており、また全脳組織では加齢に伴い減少していた。すでにわれわれは、この遺伝子(RB610)のアミノ酸コード領域全長を含むcDNAをクローニングしている。GenBankデータベースによるホモロジー検索では、RB610はこれまでに報告されていない遺伝子であり、そのコードするアミノ酸配列は、VASP(vasodilator-sitimulated phosphoprotein)という蛋白に類似していることを確認している。VASPはリン酸化されて、profilin(アクチンフィラメントの重合シグナルを伝達し、細胞骨格や接着斑の形成および細胞の運動を制御する蛋白)に結合することが確認されており、VASPの存在下でアクチンの重合が促進されるという報告もある。このため、RB610も細胞骨格や細胞の運動性に関与することが推測される。またRB610はある種の神経膠種ではその発現を欠いており、腫瘍細胞の接着性の低下や転移機構に関わっている可能性も考えられ、現在その詳細な機能を解析中であり、今後も主にこの遺伝子について解析していく予定である。近年、神経膠細胞の分化過程が明らかになりつつある。その中でも、oligodendrocyte及びastrocyte共通の前駆細胞であるO-2A projenitorはvimentin陽性、GFAP陽性の細胞であるが、培養を継続することにより、vimentin陰性GFAP陽性のtype II astrocyte、及びMBP陽性のoligodendrocyteへと分化していくことが知られている。またこの現象は、CNTFやPGDFを投与することにより誘導可能である。このように神経膠細胞の分化過程が次第に明らかになりつつあるが、それに関与する遺伝子の解析は未だないのが現状である。我々は、神経膠細胞の分化において発現し、神経膠細胞の分化を制御する遺伝子を単離しその機能を解析することを本研究の目的としている。その方法としては、今年度は、まずMaCarthyらの方法により胎児ラット脳より神経膠細胞の培養を開始した。この培養により、type1 astrocyte及びO-2A projenitorの培養を開始し、CNTF及びPGDFにより分化を誘導し、type2 astrocyte、oligodendrocyteへと培養を継続した。その後、それぞれの細胞集団よりmRNAを採取し、逆転写酵素によりcDNAを合成し、PCRを行い、各分化段階の神経膠細胞に発現する遺伝子のcDNAを得、differential display法により各分化段階に特異的に発現する遺伝子の単離を試みた。この方法によりoligodendrocyteに発現する遺伝子断片を数個pick upし、部分的にseaquenceしたところ、ferritin等のoligodendrocyteに多く発現している既知の遺伝子以外に未知の遺伝子と考えられる遺伝子断片を1個単離した。現在はPC12細胞のcDNA libraryよりの遺伝子を単離中であり、その後全塩基配列決定し、その遺伝子の機能解析に移行する予定である。

この方法は従来の方法と比較して、比較的簡単に、複数種の組織間において発現の異なる遺伝子を同定することができ、すでにいくつかの遺伝子が報告されている。また、われわれはラット脳から、阿相らの方法により,oligodendrocyteとtype-2astrocyteの前駆細胞であるO-2Aprogenitor細胞を、McCarthyらの方法によりoligodendrocyteを分離培養した。このO-2Aprogenitor細胞とoligodendrocyteの間で発現の異なる遺伝子を、differential display法を用いて検索したところ、数種の遺伝子が得られた。その内の一種はO-2Aprogenitorに多く、oligodendrocyteに少なく発現しており、また全脳組織では加齢に伴い減少していた。すでにわれわれは、この遺伝子(RB610)のアミノ酸コード領域全長を含むcDNAをクローニングしている。GenBankデータベースによるホモロジー検索では、RB610はこれまでに報告されていない遺伝子であり、そのコードするアミノ酸配列は、VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)という蛋白に類似していることを確認している。VASPはリン酸化されて、profilin(アクチンフィラメントの重合シグナルを伝達し、細胞骨格や接着斑の形成および細胞の運動を制御する蛋白)に結合することが確認されており、VASPの存在下でアクチンの重合が促進されるという報告もある。このため、RB610も細胞骨格や細胞の運動性に関与することが推測される。またRB610はある種の神経膠種ではその発現を欠いており、膠瘍細胞の接着性の低下や転移機構に関わっている可能性も考えられ、現在その詳細な機能を解析中であり、今後も主にこの遺伝子について解析していく予定である。
出芽酵母における栄養源認識機構の解明

申請者は現在までに、Two-Hybrid法を用いて酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて栄養源のシグナル伝達に関与していると考えられている3量体GTP結合タンパク質αサブユニットであるGpa2タンパク質と相互作用するタンパク質遺伝子のスクリーニングを行い、膜タンパク質をコードしていると考えられる遺伝子GPR1(G-protein coupled receptor)をクローニングした。GPR1遺伝子は961アミノ酸を持つ7回膜貫通型タンパク質をコードしており、典型的なGTP結合タンパク質とカップリングする受容体タンパク質であると考えられた。本年度においては、Gpr1pを介するシグナル伝達経路の解明を目的として実験を行った。昨年度の研究結果より、Grp1pは、グルコースを認識して細胞内cAMPレベルの調節を行うグルコースレセプターである可能性が示唆された。出芽酵母Saccharomycescerevisiaeでは、細胞内cAMPレベルが上昇するとcAMP依存的キナーゼの活性化が起こり細胞がG1期に停止できなくなるため熱に対して感受性となることが知られている。そこで、cAMP経路に関与する因子の遺伝子破壊株の構築を行い、熱に対する感受性を調べた。その結果、GRP1遺伝子破壊株、GPA2遺伝子破壊株では、野生株と比べて熱に対して耐性となり、逆に多コピープラスミドにて遺伝子を導入した場合には熱感受性となった。さまざまな遺伝学的、生化学的解析の結果Gpr1pからのシグナルは、Gpa2pを介してアデニル酸シクラーゼの活性化を促していることが明らかになった。本年度においては、Gpr1pの機能解析を目的として実験を行った。出芽酵母Saccharomycescerevisiaeでは、グルコース飢餓状態におかれた細胞にグルコースを添加すると、一過的に細胞内cAMPレベルが上昇しおよそ1分にピークが認められることが知られている。そこで、野性株およびGPR1遺伝子破壊株について、グルコース添加に対するcAMPのレスポンスを調べた。また、グルコース以外の発酵性炭素源であるフルクトースやマンノースついても同様のレスポンスが知られていることからそれらについても野性株およびGPR1遺伝子破壊株におけるcAMPレベルの変化を調べた。その結果、GPR1遺伝子破壊株においては、グルコース、及び他の発酵性炭素源の添加による細胞内cAMPレべルの一過的な上昇は、全く認められなかった。このことから、Gpr1タンパク質は、グルコース依存的にcAMPレベルを調節するレセプターであることが考えられた。以上の結果、本年度における研究計画は、すべて達成された。
情報ネットワークによる空間データ基盤整備に関する研究

情報ネットワーク上に空間データ基盤を構築するための試作的研究を行った。日本大学文理学部地理学科のホームページ上にある「地理情報分析室」をクリックすると、地理情報分析室の案内に入る。その中で、「空間データ基盤」をクリックすると、そこで提供されるデジタル地図を見ることができる。デジタル地図としては、道路ネットワーク図、グリッド網図、サービス施設の立地図などがある。これらの地図は、地理情報システム(GIS)ソフトウェアのARC/INFOを利用し作成された。ホームページ上で見ることのできるこれらの地図は、拡張子.htmを持った画像ファイルであり、それらを自分のコンピュータに転送して各自のGISソフトウェアで加工することはできない。空間データ基盤の本来の意義は、情報ネットワーク上で共用できる空間データを提供するものであり、そのデータを利用してさらに付加価値を与えることができるような環境を整備することである。そこでWWWサイトのほかに、デジタル地図のファイルそのものを入手できるようにするため、ftpサイトを設けた。ここには、上記のデジタル地図をARC/INFOの出力ファイル形式(.e00)とArcViewのShapeFile形式(.shp)で用意してある。これらのファイルをftpで自分のコンピュータにダウンロードし、GISで処理・加工するならば、それらの地図を基図としてさらに新しい展開が可能となる。ここで取り上げられた地図は、試作的な研究のためのものである。基本的空間データは、本来は公共機関で整備しネットワーク上で流通させるべきである。
レーザー転写を用いた酸化物ガラス微小球のオンデマンド作製技術の開発

微小球オプティクスの新奇オンデマンド作製技術の開発を目指し、独自のレーザー誘起ドット転写法を酸化物に適用した。その結果、酸化物固体原料を用いることで高い材料設計自由度を活かしつつ、任意の基板上に酸化物微細構造体をマイクロメートルスケールの位置精度でオンデマンド作製できることを実証した。微小球オプティクスは,素子の小型集積化を可能にするだけでなく,光閉じ込め効果による独自機能を有する,次世代オプティクスとして注目を集めている。ただし,その応用には,マイクロメートルサイズの微小球自体ではなく,微小球を組み込んだ光回路としてのハンドリングが要求される。よって,微小球オプティクス作製には,微小球の構造・物性制御だけでなく,光回路中の必要部位に再現性良く位置制御して固定化するオンデマンド作製技術が不可欠である。本研究では,我々が独自開発したナノ秒パルスレーザーアブレーションにより生じる推進力を用いた微小液滴のレーザー転写法を新たに酸化物材料に適用し,サイズ・堆積位置を高度に制御した酸化物ガラス微小球のオンデマンド作製技術の開発を目指す。本年度は当該レーザー転写法を酸化物に新規適用し,酸化物の微細パターニングに成功した。具体的には,紫外波長域まで高透明性を有するシリカガラス透明支持板を用い,その上にインジウム錫複合酸化物薄膜をスパッタリング法により室温成膜,転写用原料膜を調製した。作製した原料膜に対して,ナノ秒紫外パルスレーザー光を,透明支持板側からシングルショット集光し,レーザーフルエンス等照射条件を最適化することで,対向基板上へのマイクロメートルスケールでの転写を可能とした。更に,ガルバノミラー/fθレンズ走査集光系を本レーザー転写システムに新規導入することで,マスクレスでの微細ドットパターニングを実現できた。また,本研究の最終目的である微小球のオンデマンド作製に向けて,基板上堆積位置を現状より高精度に決定できるシステム構築を行った。微小球オプティクスは、素子の小型集積化を可能にするだけでなく、光閉じ込め効果による独自機能を有する、次世代オプティクスとして注目を集めている。ただし、その応用には、マイクロメートルサイズの微小球自体ではなく、微小球を組み込んだ光回路としてのハンドリングが要求される。よって、微小球オプティクス作製には、微小球の構造・物性制御だけでなく、光回路中の必要部位に再現性良く位置制御して固定化するオンデマンド作製技術が不可欠である。本研究では、我々が独自開発したナノ秒パルスレーザーアブレーションにより生じる推進力を用いた微小液滴のレーザー転写法を新たに酸化物材料に適用し、サイズ・堆積位置を高度に制御した酸化物ガラス微小球のオンデマンド作製技術の開発を目指す。本年度は、前年度レーザー転写法をインジウム錫複合酸化物に新規適用し得られた知見を基に、多成分酸化物ガラス原料膜の当該レーザー転写により、酸化物ガラス微小球形成の検討を行った。昨年度、インジウム錫複合酸化物では、微細構造を50ミクロンアレイにパターニングすることに成功していたが、結晶性を反映したような特殊形状を有し、球状の微細構造は得られていなかった。そこで本年度は、インジウム錫複合酸化物より非晶質化傾向を有する多成分ガラスを原料膜として新たに調製し、微細構造の球状化を検討した。具体的には、紫外波長域まで高い透明性を有するシリカガラス透明支持板上に、白板ガラスターゲットのパルスレーザー堆積法により多成分酸化物ガラス原料膜を成膜した。得られた原料膜に対して、透明支持板側から紫外ナノ秒レーザーパルスを集光照射することで、対向配置した基板上に微細構造を堆積させた。その時果、原料膜厚の不均一性に起因するとみられる転写位置精度の制御性の低下が見られたが、インジウム錫複合酸化物では難しかった半球状の微細構造の転写を確認することに成功した。
温度変化によって誘導されるインフラマソームを介した炎症惹起機構の解明

NLRP3の恒常活性型変異は、発熱や炎症を繰り返すクリオピリン周期熱症候群(CAPS)と呼ばれる自己炎症症候群を引き起こす。そこで、CAPSのNLRP3変異であるL353PおよびD303Nを薬剤誘導性に発現するマクロファージ細胞株を作製し、温度変化による影響を検討した。どちらの変異NLRP3発現細胞でも、低温環境によりインフラマソーム活性化が起こり、IL-1β産生や細胞死が誘導されて炎症反応の増強が認められた。一方、通常の危険シグナルであるNanosilicaやNigericinによるインフラマソーム活性化は、低温環境により減弱された。さらに、変異NLRP3発現細胞における低温環境によるインフラマソーム活性化は、EGTAやBAPTA-AMにより抑制されたことからカルシウム依存性が示唆されたが、TRPA1やTRPV4の阻害薬では抑制されなかった。また、飽和脂肪酸(パルミチン酸・ステアリン酸)によりマクロファージ細胞質内に結晶形成が起こり、リソソーム傷害を介したインフラマソームの活性化が引き起こされることを見出した。この結晶形成およびインフラマソーム活性化は、不飽和脂肪酸(オレイン酸)によって阻害されたことから、飽和・不飽和脂肪酸の不均衡がこの反応を制御していることが示された。また、低温環境では、この脂肪酸不均衡による結晶形成がさらに促進され、インフラマソーム活性化によるIL-1β産生も増強されることが明らかになった。以上の結果から、無菌性炎症の中心経路であるインフラマソームの活性化が温度変化によって影響を受ける分子機構の一部を明らかにすることができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。NLRP3の遺伝子変異を持つ患者(クリオピリン関連周期熱症候群:CAPS)では、過剰なインフラマソームの活性化によるIL-1β産生を介して発熱・炎症が引き起こされ、寒冷刺激によって炎症が惹起される家族性寒冷自己炎症症候群(FACS)と、寒冷刺激によらない慢性乳児神経皮膚関節炎症候群(CINCA)がある。そこで、FCASのL353P変異とCINCAのD303N変異の低温条件(32°C)における炎症惹起機構について検討した。ヒト単球細胞株にレンチウイルスベクターを用いてテトラサイクリン(Dox)誘導性にL353P・D303Nを発現する系を作製した。NLRP3-L353Pでは低温条件において著明にIL-1β産生が増強され、インフラマソーム活性化指標であるASCの不溶性複合体形成も促進されたが、NLRP3-D303Nでは低温条件によるインフラマソーム活性化の増強効果は減弱していた。一方、既知のインフラマソーム活性化因子によるIL-1β産生は低温条件において有意に抑制された。さらに低温である27°C条件では、NLRP3-L353Pにより誘導されるIL-1β産生も抑制された。また、TRPチャネル(A1・V4)阻害剤はNLRP3-L353Pによって誘導されるIL-1β産生に影響を与えなかった。これらの結果から、FCAS変異によりマクロファージにおいて低温感受性が獲得され、TRPチャネル以外の経路が関与していることが示唆された。マクロファージにおけるNLRP3-L353PおよびNLRP3-D303Nの誘導発現系を構築し、低温条件によるインフラマソーム活性化およびIL-1β産生への反応を検証することができた。また、既知の危険シグナルによるインフラマソーム活性化に対する低温条件およびNLRP3変異の影響についても結果を得ることができた。平成29年度は、これまでに構築したNLRP

3変異誘導発現系を用いて、インフラマソーム活性化における低温感受性のより詳細な分子機序を解析するとともに、低温条件による細胞死(Pyroptosis)への影響を検討する。また、危険シグナルによるインフラマソーム活性化が低温条件下で抑制される機序についても、TRPチャネルなどの温度センサーの関与や低温による細胞代謝への影響等の面から検討を行う。さらに、肝虚血細流傷害が、温度変化によって影響を受けることを観察していることから、このマウス病態モデルに低温条件を負荷し、この病態のインフラマソーム依存性が温度変化によって影響を受けるかについて、インフラマソーム構成分子の欠損マウスを用いて評価する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
肺の生体防御機構における加齢と喫煙の影響

喫煙関連肺疾患が高齢者に多いことは加齢もしくは長期喫煙により肺の防御機構が傷害されていることを示唆する。長期喫煙、COPDの有無で気道被覆液におけるVascular Endothelial Growth Factor(VEGF)関連遺伝子の発現に差異が認められるかを検討した。目的:気道上皮におけるVEGFとそのレセプター発現を年齢・喫煙歴・COPDで分類した5群で比較検討する。方法:若年者15名(非喫煙者7名、喫煙者8名)(23±3SD yr)、および中高年者26名(非喫煙者6名、喫煙者5名、COPD患者15名)(64±6SD yr)を対象に、気管分岐部及び45次分岐(末梢側)から気道上皮細胞を擦過採取した。VEGF、VEGF receptor-1、VEGF receptor-2のmRNA発現をRT-PCR法で定量し、細胞溶解液のVEGF蛋白量をELISA法で測定した。結果:末梢側気道上皮細胞では若年非喫煙者と比較し中高年者は3群ともVEGFmRNA発現量が有意に低下していた(p<0.05)が、若年喫煙者では優位差を認めなかった。中高年者3群のみの検討では中高年非喫煙者及び喫煙者と比較しCOPD群は気道上皮のVEGFmRNA発現量が有意に低く(p<0.05)、VEGF蛋白量が低い傾向がみられた。VEGFreceptor-1の気道上皮での発現は非常に低く、それぞれの群での優位差を認めなかった。VEGF receptor-2の発現は若年で高い傾向があったが中高年群と優位差を認めなかった。気管分岐部の気道上皮細胞ではこれらの項目はすべての群で差を認めなかった。結論:気道上皮におけるVEGFの発現は加齢で減少し、COPD群ではさらに低下していた。この低下は同じ気道上皮細胞であっても気管分岐部という中枢側では認めず、より末梢の気管支において明らかであった。近年、NADPHoxidase homologであるDualoxidase(Duox)が気道上皮にも存在することが示され、気道上皮細胞の過酸化水素産生能に寄与することが明らかになった。気道上皮を経気道的に擦過採取し、酸化還元関連物質の発現を各群で比較することによって加齢や喫煙、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の有無での差異を検討するため、実験1として健常若年者と中高年者の非喫煙者および喫煙者を対象に気管支鏡を用いて気管と45次分岐の気管支上皮を採取し、Duox1とDuox2のmRNA発現を調べた。実験2として、手術肺組織からlaser capture microdissection(LCM)法を用いて細気管支上皮を、18ゲージ針で不必要な部分を除くことにより肺胞領域の細胞を採取し、非喫煙者、COPDのある過去喫煙者とない過去喫煙者で同様に比較した。その結果、若年者では気管および気管支上皮において、Duox1及びDuox2発現は喫煙者と非喫煙者間で差がなかった。中高年喫煙者では同年齢の非喫煙者と比べて気管上皮および気管支上皮両方でDuox1発現が有意に低下したのに対し、Duox2発現は有意に上昇した。細気管支上皮のDuox1発現は非喫煙者、COPDのない過去喫煙者と比べてCOPDのある過去喫煙者で有意に低下していた。細気管支上皮のDuox2発現は非喫煙者に比べCOPDのない過去喫煙者、COPDのある過去喫煙者共に低下していたが、COPDの有無ではDuox2発現に差を認めなかった。肺胞領域ではDuox1とDuox2両方とも3群間に有意な差を認めなかった。気道上皮および、肺胞領域におけるDuoxの発現は経年喫煙とCOPDに関連すると考えられた。
肝がん微小環境におけるヒト肝星細胞由来老化関連分泌因子の機能解析

近年、肝星細胞の老化に伴って分泌される液性因子が、肝がんの病態進行に寄与することが報告されているが、ヒト慢性肝疾患における老化肝星細胞の実態やその生理的意義については不明な点が多い。本研究は、ヒト肝星細胞の老化関連分泌因子に着目し、肝がんの病態における、その生理的意義を解明することを目的としている。老化肝星細胞と肝がんを結ぶ機序を明らかにすることで、肝がんに対する新規機序の治療薬開発へとつながる知見を得ることを目指すとともに、ヒト肝組織切片における老化肝星細胞の識別法を探索し、その分布や肝がん発症との相関を検証することで、C型肝炎治癒後肝発がん予測への有用性を検証する。
小児癌細胞における細胞死誘導耐性化機序の解明とその克服手段の開発

細胞死受容体刺激によりアポトーシスが誘導される急性リンパ性白血病(ALL)細胞において、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3の活性化は、細胞周期に対する依存性が認められた。即ち、カスパーゼ-8の活性化された細胞は、GO/G1期に認められ、cyclin A/B1/E陰性を示した。カスパーゼ-3の活性化された細胞は、GO/G1期からS期に認められ、cyclin E/D1陽性、cyclinンA/B1、p27/kip-1、Ki67陰性であった。また、細胞回転がGl早期に休止すると、細胞死、カスパーゼの活性化は抑制された。以上より、カスパーゼ-8は、GO/G1期に、カスパーゼ-3は、G1後期からS期早期にて活性化されると考えられた。細胞死受容体を介したアポトーシス誘導に対して耐性を獲得したALL細胞においては、Aktのリン酸化が誘導されており、PI3 Kinase阻害剤の処理により、その耐性が克服された。耐性細胞におけるAktのリン酸化の亢進は、PTEN(phosphate and tensin homologue deleted on chromosome 10)のリン酸化(不活性化)によると考えられた。MEK/MAPK経路に関しては、JNKとp38は、全てのALL細胞において活性化していた。これに対して、ERK1/2の活性化は、B細胞系ALL、T細胞ALLともに約30%の細胞において活性化が認められた。さらにERK1/2活性の抑制により、細胞増殖が抑制される細胞群と、細胞死が誘導される細胞群が見られた。細胞死受容体を介したシグナル伝達系とPI3 Kinase/Akt系、MEK/MAPK系とのクロストークにより、細胞増殖・抑制、細胞死誘導の決定がなされていることが示唆された。抗Fas抗体、あるいはTRAIL刺激によりアポトーシス細胞死が誘導される白血病細胞を用いて、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3の活性化がどの細胞周期において誘導されるかを明らかにすることを目的に以下の解析を行った。カスパーゼ-8、カスパーゼ-3の活性化の検討には、抗活性化カスパーゼ-8、抗活性化カスパーゼ-3抗体、および活性化カスパーゼ-8、活性化カスパーゼ-3に特異的に結合する標識ペプチドを用いて、抗Fas抗体、あるいはTRAILにて刺激した白血病細胞株を染色し、その反応(結合)性をフローサイトメトリーにて解析した。また、細胞周期(回転)の検索には、propidium iodide染色によるDNA量測定法を用い、フローサイトメトリーにて解析した。その結果、カスパーゼ-8の活性化された細胞分画は、G0/G1期の細胞集団から連続性に認められた。また、カスパーゼ-3の活性化された細胞分画は、G0/G1期からS期の細胞集団から連続性に認められた。さらに、カスパーゼ-8、あるいはカスパーゼ-3の活性化の細胞周期特異性の有無を詳細に検討するために、カスパーゼ-8、あるいはカスパーゼ-3の活性化した細胞における細胞周期特異的サイクリン蛋白の発現プロフィールを検索した。サイクリン蛋白の発現は、抗サイクリンA(S期特異的)抗体、抗サイクリンB1(G2-M期特異的)抗体、抗サイクリンE(late G1-early S期早期特異的)抗体にて染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。その結果、カスパーゼ-8の活性化された細胞、カスパーゼ-3の活性化された細胞は、ともにサイクリンA陰性、サイクリンB1陰性、サイクリンE陽性を示した。

以上の結果より、細胞死受容体を介して誘導されるカスパーゼの活性化には細胞周期特異性が認められ、カスパーゼ-8の活性化は、G0/G1期において、カスパーゼ-3の活性化は、G0/G1期からearly S期にかけて誘導されることが示唆された。次年度においては、細胞回転を阻害することにより、細胞死受容体を介する刺激によるカスパーゼの活性化が抑制され、その結果として細胞死の誘導が障害されるかを検討する予定である。また、細胞周期による、細胞死シグナル伝達に関与する種々の蛋白分子(カスパーゼ、アポトーシス抑制蛋白)の発現の変化についても検討を加えたい。抗Fas抗体刺激によりアポトーシス細胞死が誘導される白血病細胞株を用いて、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3の活性化がどの細胞周期において誘導されるかを明らかにした。その結果、カスパーゼ-8の活性化は、G0/G1期において、カスパーゼ-3の活性化は、G0/G1期からearly S期にかけて誘導されることが示唆された(平成17年度実績)。今年度においては、抗Fas抗体刺激によりカスパーゼ-3の活性化された細胞をセルソーティングにより分離し、細胞周期調節蛋白の発現を検討したところ、サイクリンE、サイクリンD1陽性、サイクリンA、サイクリンB1、p27/kip-1、Ki67陰性であり、カスパーゼー3の活性化は、G1後期からearly S期にかけて誘導されていることが確認された。また、PI3 Kinase/Akt経路と並んで細胞増殖/生存に重要なMEK/MAPK経路に関しても検討を加える予定である。抗Fas抗体刺激によりアポトーシス細胞死が誘導される白血病細胞株を用いて,細胞回転の休止の細胞死誘導への関与を検討した。PhobolEster処理により細胞回転をG1早期に休止させることにより,抗Fas抗体刺激により誘導される細胞死,およびカスパーゼの活性化は著しく抑制された。この結果は,カスパーゼ-8の活性化がG0/G1期に,カスパーゼ-3の活性化はGO/G1期からearlyS期にかけて誘導されるという結果(平成17/18年度実績)とよく一致していた。さらに,PI3Kinase/Akt経路と並んで細胞増殖/生存に重要なMEK/MAPK経路に関して,急性リンパ性白血病(ALL)細胞における役割について検討を加えた。MAPKのうち,JNKとp38に関しては,解析した全てのALL細胞において活性化しており,細胞間の差異は認められなかった。これに対して,ERK1/2の活性化は,B細胞系ALL,T細胞ALLともに約30%の細胞において活性化が認められた。さらにMEK1/2活性剤,U0126を用いてERK1/2活性を抑制することによる細胞増殖/細胞死への影響を検討した。その結果,ALL細胞においては,U0I26添加によりERK1/2活性は常に抑制されたが,細胞増殖が抑制され聖る細胞群と,さらに細胞死が誘導される細胞の2群に分けられた。細胞死誘導受容体を介したシグナル伝達系とPI3 Kinase/Akt系(平成18年度実績),あるいはMEK/MAPK系(平成19年度実績)との関連性の検討は,複数のシグナル伝達系のクロストークによる細胞増殖、抑制の決定機構の解明に結びつく興味ある結果であると思われる。
カイラル対称性の破れにともなう物理の定量評価

素粒子クォークとグルーオンを記述する量子色力学(QCD)は強い相互作用をしており、そのふるまいを定量的に解析するのが難しい理論である。近年の格子ゲージ理論による数値シミュレーションの進展で、第一原理からのQCDの解析が進んでいるものの、「カイラル対称性」というクォークの持つ重要な性質を扱えるようになったのはここ数年のことである。特に、カイラル対称な理論の扱いは大きな計算コストを要求し、その代償としてシミュレーションの体積を小さくせざるを得ない。従って、格子QCDの結果から真の物理量を抽出するには、体積が有限であることの補正が必要になる。本研究はパイ中間子有効理論(カイラル摂動論)の解析とカイラル対称な格子QCDシミュレーションを組み合わせて、有限体積効果を精密に補正し、物理量を精確に理論計算することを目標に進めてきた。本年度は、パイ中間子の3点関数に的を絞り、共同研究者の大阪大学大学院生の鈴木貴志氏とカイラル摂動論の計算を進めた。その結果、運動量を注入した形で、さらに異なる運動量を持つ演算子の比をとることで、有限体積効果の大部分を自動的に消去できるということを見いだした。また、JLQCD共同研究の一員として進めてきた格子QCDの結果もこのカイラル摂動論の結果をよく再現し、そこからえられた電磁半径は実験値をよく再現するものであった。当初の計画から若干の遅れは否定できないものの、私たちの見いだした手法は一般のハドロンの形状因子に応用可能であり、今後もさらなる進展が期待できるものとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。物の重さ、質量とは何か?1961年の南部陽一郎博士の研究により、物質の質量とは、それを構成する素粒子の持つ対称性が自発的に破れることによって生じることが示された。なかでもカイラル対称性の破れは、われわれの身近な物質の構成要素である原子の90%以上もの質量を生成していると考えられ、素粒子論における最も重要な対称性の1つである。しかし、そのダイナミクスは、基礎理論である量子色力学(QCD)が強結合で解析が困難なことから、現代でもなお難しい課題である。本研究は、近年ようやく実現されたカイラル対称性を厳密に保つ格子QCD数値計算を用いて、カイラル対称性の破れにともなう物理の定量評価を行うことを目的とする。この目標を達成するためには、JLQCD共同研究における大規模格子QCD数値計算と、カイラル摂動論による解析計算の両者を相補的に用いて、クォーク質量ゼロ付近、および有限体積補正を正確にコントロールする必要がある。本年度の研究成果は、パイ中間子の相関関数のふるまいを解析的に明らかにし、パイ中間子質量およびその崩壊定数を決定できたことである。筑波大の青木慎也氏との共同研究[Phys.Rev.D84:014501,2011]により、パイ中間子が有限体積において双曲線関数に定数を加えたシンプルな関数系で記述できることが示された。これは、これまでに知られていたカイラル摂動論のε展開による結果とp展開による異なる関数の両者を包含し、しかも滑らかに内挿している。さらに、この式を用いて、パイ中間子の質量および崩壊定数をJLQCD共同研究の大規模数値計算結果から正確に抽出することに成功した。この数値計算の結果については国際学会"29th International Symposium on Lattice Field Theory"にて発表、現在本論文の発表を準備中である。パイ中間子の2点関数については、予想外にシンプルな関数系で正確な有限体積効果、クォーク質量の効果を記述できることが明らかになった。さらに、3点関数についても(未発表であるが)有限体積の効果に一番寄与の大きいゼロ運動量モードの寄与をほとんど相殺可能であることがわかった。本研究は順調に進展していると言える。
脂肪酸受容体を介する脂肪細胞機能調節機構の解明

オーファン受容体のリガンド探索研究の成果として、我々は、GPR120が長鎖不飽和脂肪酸をリガンドとする受容体であり、腸内分泌物質に発現しGLP-1の分泌に関与する重要な代謝調節受容体であることを見いだした。またCCKの分泌にも関与する事を見いだした。このGPR120が各種脂肪組織に発現していることをmRNAレベルで確認した。さらに、GPR120の脂肪細胞におけるmRNA量をリアルタイムPCRで検討したところ、分化過程に対応して発現量が増加することを確認できた。また、分化過程の様々な時期にGPR120を活性化する脂肪酸(α-リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸)または活性化しない脂肪酸(オクタン酸など)を添加して、脂肪細胞の分化に及ぼす作用を検討した。その結果、GPR120を活性化する脂肪酸のみが細胞内への脂肪の蓄積及び増殖の抑制の両方に強く関与していることが明らかになった。一方で、GPR120に対するsiRNAを投与したところ、脂肪細胞への分化の抑制が認められた。このことから、GPR120は、脂肪細胞の分化過程に重要な役割を果たす受容体であることが示唆された。また、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌にも作用する事を見いだした。GPR120に特異的なアゴニスト、アンタゴニストの探索のため、化合物スクリーニングを行った結果、GPR120に特異性を有する天然物由来の化合物を見いだした。さらに、GPR120ノックアウトマウスの作成にも成功し、GPR120の発現の有無による脂肪組織レベルでの変化と、特異的化合物を用いたGPR120の機能解析とを行った。オーファン受容体のリガンド探索研究の成果として、我々は、GPR120が長鎖不飽和脂肪酸をリガンドとする受容体であり、腸内分泌細胞に発現しGLP-1の分泌に関与する重要な代謝調節受容体であることを見いだした。さらに、GPR120の脂肪細胞における機能の解析を試みた。3T3-L1細胞をモデルとし、脂肪細胞分化過程におけるmRNA量をリアルタイムPCRで検討したところ、分化過程に対応して発現量が増加することを確認出来た。さらに、分化過程の様々な時期にGPR120を活性化する脂肪酸(α-リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸)または活性化しない脂肪酸(オクタン酸など)を添加して、脂肪細胞の分化に及ぼす作用を検討した。またGPR120に対するsiRNAを投与したところ、脂肪細胞への分化の抑制が認められた。このことからGPR120は、脂肪細胞の分化過程に重要な役割を果たす受容体であることが示唆された。また、GPR120に特異的なアゴニスト、アンタゴニストの探索のため、化合物スクリーニングを行いGPR120に特異性を持った化合物を見いだした。さらにGPR120ノックアウトマウスの作成にも成功した。これらのツールを用いてより詳細な脂肪組織におけるGPR120の機能を検討中である。
核スペックルとESR1遺伝子座の協調による転写調節

遺伝子の適切な発現は、発生・分化・再生をはじめ、あらゆる生命活動に重要でその破綻は疾患に関連する。本研究では、転写の開始前、開始、伸長、の転写サイクル内の段階が、細胞核内の3次元空間でどのように構築されているかを明らかにすることを目指した。具体的には、乳がん細胞をホルモン枯渇下で培養することによって転写活性となる、エストロゲン受容体遺伝子座(ESR1)に着目した。乳がん細胞MCF7細胞を長期にわたって、エストロゲン非存在下で培養すると、細胞の増殖に関わる核内受容体のESR1遺伝子の転写が活性化し、細胞がエストロゲン高感受性となり、低濃度のエストロゲンの存在下でも増殖可能となる。この過程でのESR1遺伝子座の核内空間での転写様式を調べた。ホルモン枯渇処理細胞のESR1遺伝子座をFISH (fluorescence in situ hybridization)により可視化した実験などより、ESR1遺伝子座内とその付近より新規非コードRNA(ncRNA)が産生されていることを見いだした。また、このncRNAがESR1mRNAの転写活性維持に重要であること、エストロゲン枯渇乳がん細胞株および乳がん患者組織において、核内でクラウドとよばれる分布を示していることを見いだした。このncRNAクラウドと、既知の核スペックルやPMLボディー、核小体などとの相互作用は明らかではなかったが、ESR1遺伝子座上で転写活性に関わる因子をリクルートしたり、染色体の高次構造の構築にかかわるなどの可能性が示唆された。また、ESR1と協調的に転写活性化される遺伝子群のゲノムワイドな解析と、これらのプロファイリング解析に着手した。25年度が最終年度であるため、記入しない。
インプラント上部構造と天然歯の咬合力負荷時の咬合接触に関する研究

本学歯学部附属病院を受診した部分欠損患者で、インプラント治療が適応となり、天然歯と連結しない、インプラント支持の上部構造を装着後、1カ月以上問題なく経過した患者20名を対象に、咬合接触および筋活動量の同時計測を行い、データを記録した。咬合接触状態はデンタルプレスケールによって記録し、筋活動量は両側咬筋浅部より表面電極を用いて導出した。計測は以下の手順で行った、1.最大咬みしめ時(100%MVC)および25、50、75%MVCの4種の咬みしめ強さの左右側咬筋の筋活動量の計測、2.ヴィジュアルフィードバックをかけ各MVCにおいて、デンタルプレスケールを用い、咬合接触状態をそれぞれ3回ずつ計測を行った。デンタルプレスケールに記録された咬合接触状態はオクル-ザで読み込んだ後、パーソナルコンピュータのハードディスクに記録し、解析を行った。解析にあたっては、1.各MVCでの全顎の咬合力、接触点数、接触面積を算出、2.各MVCでのインプラント部の咬合力、接触点数、接触面積を算出し、さらにインプラント部咬合負担率を算出し、インプラントの咬合負荷時の挙動を調べた。これによりインプラントの咬合負荷時の挙動が天然歯と異なり、咬合力の増加の傾向が異なることが明らかになった。また片側遊離端、両側遊離端のように欠損様式が異なるとインプラントの咬合負荷時の挙動が異なることが示唆された。咬合力分布解析表示ソフト(オクルーザー)と咬合力測定フィルム(プレスケール)による咬合力解析システムを構築した。本研究計画に先立ち、測定法ならびに測定システムの検定を行う必要があった。まず、測定術式の統一を計ることを目的に、正常な被験者を用いて、術者の技量を含めた測定フィルムの口腔内挿入手順、挿入位置などの技術的な検討を行った。次に最大筋活動時の測定フィルム発色の再現性の検討を行い、さらに筋電図計測システムを用いて筋活動の規定を行い、筋活動の変化に応じた咬合力測定結果を分析した。その結果、測定フィルムの発色限界を含めたシステム自体の測定限界、誤差、筋活動との相関性を把握することができ、本研究目的に対するシステムの信頼性と方法論の妥当性を得ることができた。こういった予備実験と並行して、インプラント埋入も進んでおり、上部構造装着患者の咬合力分布解析も開始することができた。特に筋活動の変化に応じたインプラント部と天然歯の咬合力分布の違いについて、興味あるデータを収集した。このデータは、咬合力負荷時のインプラントと天然歯の挙動の違いに関する貴重な情報であり、上部構造に与える咬合支持形態に新たな知見を提供する可能性をもっている。今後、測定数をさらに増やし、臨床診査結果も併せ、総合的に解析することにより、インプラント上部構造の咬合接触関係の把握、さらに歯牙の欠損状態に対応したインプラント上部構造の付与方法の確立に努める予定である。本学歯学部附属病院を受診した部分欠損患者で、インプラント治療が適応となり、天然歯と連結しない、インプラント支持の上部構造を装着後、1ケ月以上問題なく経過した患者20名を対象に、咬合接触および筋活動量の同時計測を行い、データを記録した。

これによりインプラントの咬合負荷時の挙動が天然歯と異なり、咬合力の増加の傾向が異なることが明らかになった。また片側遊離端、両側遊離端のように欠損様式が異なるとインプラントの咬合負荷時の挙動が異なることが示唆された。
蛋白質変性に対する圧力効果

1.これまで山田が開発を手がけてきた、高圧NMRの手法を高感度の400MHzパルスFT-NMR装置に適用可能とし、これを用いて、1-2000atmの圧力範囲、7.5°C-40°Cの温度範囲で代表的な蛋白質としてribonuclease Aの熱力学的構造安定性を調べた。2.His εプロトンの信号を用いてフォールド、アンフォールドした状態の割合を測定した。フォールド、アンフォールド状態におけるGibbs自由エネルギー差を、温度変化に対する圧力関数、圧力変化に対する温度関数として求めた。アンフォールディングに伴う体積変化△Vは負の値を示した。△Vは温度依存性を示し、7.5°Cにおける-10ml/molから37°Cにおける-30ml/molまで減少した。実験的に決められたGibbs自由エネルギー差を温度と△C_pを含む理論式で最小二乗法最適化することにより、様々な圧力下、7.5-40°Cの温度領域における△G, △H, △S及び△C_pの最適値を決定した。特筆すべきことは△C_pが圧力依存性を示し、1atmにおける1.79kcal/molKから2000tmには非極性側鎖の水和状態が、この条件下におけるribonuclease A構造の圧力依存性を決定する重要な要因であることを示した。
クローン病の増悪因子である胆汁酸の転写因子としての側面の解析

TNFαのpromoter領域0-1000bpに対して、FXRおよびRXR発現plasmidを作製し、更にin vitro translationにより生成したFXRおよびRXR proteinを用いてDNA footprint法を施行したが、明らかなFXR結合部位を確認することはできなかった。マクロファージ細胞株を用いて、単独およびlipopolysaccharide存在下にてchenodeoxycolic acid添加によるTNFαmRNAの転写の変化を調べたが、いずれの場合においてもTNFαmRNAの転写増加が認められた。DNA footprint法では明らかなFXR結合部位は確認できなかったがTNFαのpromoter部の塩基配列の解読により-350bp近辺にFXR/RXRの結合配列であるIR-1と相補性の高い配列を認めたため、in vitro translationにより生成されたFXRおよびRXR proteinを用いて、この配列に対しelectrophoretic mobility shift assayを施行した。この配列に特異的なbandを認め、また抗FXR抗体によるsuper shiftを認め、この配列とFXR/RXRとの結合能が確認された。次に、TNFαのpromoter部を組み込んだluciferase plasmidを作製し、マクロファージ細胞株にtransfectさせ、luciferase reporter assayを施行した。chenodeoxycolic acid添加により活性の上昇を認めたが、FXR/RXR結合配列を含まないものでは活性の上昇は認められなかった。また、ursodeoxycholic acid添加では活性の上昇は認められず、FXR/RXRの活性化によりTNFαの転写が促進されることが示された。
アームドサイクレン配位子を基盤とするd-f複核錯体における発光特性の解明

アームドサイクレン配位子を活用して希土類イオン(f金属イオン)と高周期遷移金属イオン(d金属イオン)を配位したd-f複核錯体の段階的構築法を開発した。希薄溶液内で形成される安定な4重らせん錯体構造を分光学的測定およびX線構造解析により明らかにした。d-f複核錯体は、遷移金属錯体由来の強い可視吸収と希土類イオン由来の近赤外発光機能を合わせ持ち、従来と比べて高い可視-近赤外変換効率を示したことから、近赤外センシングやイメージング材料としての有効性が示された。1.アームドサイクレン型多座配位子を利用した複核錯体のテンプレート合成:ピリジン環を側鎖に有するアームドサイクレン-希土類錯体をテンプレートとして、白金イオンやレニウムイオンなど高周期遷移金属イオンとの複核化を行い、高収率で3d-4f複核錯体が得らることを明らかにした。X線結晶構造解析により、希土類錯体の中心軸上に遷移金属錯体が形成された高い対称性をもつ錯体構造であること、およびUV、NMR、MS法による解析により、この錯体構造が溶液状態でも保持されていることを明らかにした。4重らせん構造をもつ不斉な複核錯体が高収率で得られる優れた構築法を開発することができた。2.分子内励起エネルギー移動を利用した希土類イオンの近赤外発光:近赤外領域に発光を示すネオジム(III)、イッテルビウム(III)、またはエルビウム(III)イオンとレニウム(V)イオンを含む複核錯体において、レニウム錯体部位の可視吸収帯を光励起すると、分子内励起エネルギー移動による増感発光が室温・溶液状態で観測された。可視部に吸収帯を持たない、溶媒中の水による失活を受けやすいなど、近赤外発光を得る上で希土類錯体に付随する欠点が、レニウムとの複核錯体化により克服できたことから、結果的に発光効率の大幅な説上が達成できた。複核錯体では希土類イオンがレニウム錯体の電子状態に影響しており、その錯体構造ばかりではなく、発光特性や酸化還元電位が大きく変位していることが分かった。次年度はレニウム錯体の電子状態のより詳細な解析を行うことにより、発光メカニズムの解析をさらに進める予定である。アームドサイクレン配位子を活用して、分子内に希土類イオンとジオキソレニウムイオンを配位させたd-f複核錯体を合成し、その可視-近赤外変換特性や電子状態解析を行った。既知の近赤外色素との相対法により発光量子収率を決定したところ、ネオジムおよびイッテルビウムから放出される近赤外発光効率は溶液サンプルとしては既報の近赤外発光錯体の中で、もっとも高い部類に入ることが分かった。発光強度に対する溶媒効果の検討や発光寿命解析の結果、d金属との複核化による希土類発光効率の増大には、d金属錯体部位から希土類イオンへの分子内励起エネルギー移動効率の増大が大きく寄与していることを明らかにした。また、d-f金属間に強い静電的な相互作用が働き、光吸収帯やラマン吸収帯が希土類イオンの大きさによって系統的に大きく変化するなど、希土類イオンを用いることでd金属錯体の物性を精密にコントロールできることを明らかにした。また、複核錯体の高いカチオン性と分子内の2種類の錯体キラリティーに着目して、溶液内での不斉アニオンセンシングを検討した。複核錯体では不斉アニオンとの相互作用によって可視部のレニウム錯体の吸収帯に円二色性が誘起されたが、レニウム単核錯体では同様のシグナルはまったく観測されなかったことから、希土類錯体からレニウム錯体への分子内不斉転写が実現していることを明らかにした。高カチオン性の複核錯体は低濃度でもアニオンと強い相互作用を示したことから、アニオンのキラリティーに対する高感度検出の可能性を見出した。
白色脂肪の褐色化機構の解明:新規肥満治療法の開発に向けた基礎研究

褐色脂肪は脂肪を燃やして熱を産生する特殊な脂肪組織であり、肥満予防・治療のターゲットとして注目されている。褐色脂肪による抗肥満効果を得るためには、それを活性化する方法と増加させる方法が考えられる。本研究では、増加させる方法について検討した。一般に脂肪細胞は前駆細胞が増殖・分裂し、それらが成熟脂肪細胞に分化することで増加すると考えられている。本研究では、褐色脂肪は成熟分化後にも分裂・増加する可能性を新たに見いだした。当初の実験計画にしたがって、レンチウイルスベクターを用いて脂肪組織特異的に目的遺伝子を発現させるための系の確立を試みた。レンチウイルスベクターの作製とin vitroでの発現確認には成功したものの、in vivoでは実験に十分な発現量が得られなかったため、実験計画を変更した。脂肪細胞特異的に細胞周期が停止するトランスジェニックマウスは褐色脂肪に関して興味深い形質を示すことがわかった。すなわち、トランスジェニックマウスは褐色脂肪組織をほとんど持たず、褐色脂肪による熱産生が重要である寒冷環境下(4度)では体温を維持することができなかった。トランスジェニックマウスにおいて褐色脂肪の形成が著しく抑制されるメカニズムを探るため、ウェスタンブロット法により褐色脂肪組織におけるいくつかのタンパク質の発現量を調べた。すると、トランスジェニックマウスの褐色脂肪では細胞増殖マーカーであるPCNAの発現量が低下し、反対に細胞増殖を抑制する因子であるリン酸化Rbタンパク質量は増加していた。これらの結果から、褐色脂肪の組織形成には成熟褐色脂肪細胞の分裂・増殖が必須である可能性が考えられた。一般的に脂肪組織は、前駆脂肪細胞の増殖とそれらの成熟脂肪細胞への分化により維持されていると考えられている。上記のトランスジェンックマウスから得られた結果は、これまでの想定を大きく覆す可能性があるため、現在褐色脂肪形成不全のメカニズムについて詳しく解析を行っている。前年度に引き続き、脂肪細胞特異的に細胞周期が停止するトランスジェニック(Tg)マウスの解析を行った。このマウスは、細胞周期のブレーキにあたるp27タンパク質を、脂肪細胞特異的に過剰発現している。前年度の研究により、Tgマウスは褐色脂肪組織をほとんど持たず、褐色脂肪による熱産生が重要である寒冷環境において体温を維持することができないことがわかった。そこで、Tgマウスにおいて褐色脂肪の形成が著しく抑制されるメカニズムを探るため、ウェスタンブロット法により褐色脂肪組織におけるいくつかのタンパク質の発現量を調べた。すると、Tgマウスの褐色脂肪では細胞増殖マーカーであるPCNAの発現量が低下し、反対に細胞増殖を抑制する因子であるリン酸化Rbタンパク質量は増加していた。この結果から、Tgマウスでは、褐色脂肪細胞の分裂・増殖が抑制されているため、褐色脂肪組織の形成が抑制されていると考えられた。p27タンパク質が褐色脂肪細胞の分化調節にも関わっている可能性を調べるために、Tgマウスから胎児繊維芽細胞を単離し、初代培養を行った。In vitroで分化誘導すると、Tgマウスから得た胎児繊維芽細胞は分化効率が悪く、褐色脂肪細胞のマーカー分子であるUCP1の発現も少なかった。したがって、p27は褐色脂肪細胞の分化調節に関与している可能性が考えられた。以上の結果から、褐色脂肪の組織形成には成熟褐色脂肪細胞の分裂・増殖が必須である可能性が考えられた。また、p27タンパク質が褐色脂肪の分化調節に関わる可能性が示唆された。したがって、本研究から得られた結果は、これまでの想定を大きく覆す可能性があり、新たな肥満対策法の開発の基礎となることが期待される。