hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外国人労働者の定着と協働を目指す受け入れ環境の構築

2018年12月に改正入管法(出入国管理法改正)が成立し、外国人労働者の受け入れは国家戦略として急速に進められている。本研究は、外国人労働者の中でも高度人材(日本語人材)と受け入れ側(日本企業、日本語母語話者)を主な対象とし、「実態調査」「教材作成」「教育・研修」を結びつけた学際的な研究を目指している。2年目である平成30年度の研究業績の概要は次のとおりである。(1)日本国内のサービス業、特に人材派遣業で働く日本人社員と外国人社員に対する研修プログラムを継続して実施した。本年は「新人研修プログラム」として1年間、協働を土台とした企業の受け入れ環境を改善することを目的とした研修であった。また、異業種に勤務する外国人日本語人材を対象としたケース学習型研修を実施した。(2)海外は、フランス、中国等を訪問し、日本語人材や日本人駐在員に対しインタビュー調査を行った。収集したデータは内容分析等を行い、ケース教材を作成している。(3)フランスの経営大学院で、MBAの教員及び大学院生に対し、これまでの研究成果と、ケース学習の理論や企業研修プログラムの立案について講演を行った。日本語教師に対してはケース教材作成法を中心とした研修を行い、教師に求められる能力についても検討を進めた。送り出し国であるインドネシアではシンポジウムを企画し、研究成果を発信するとともに現地の教員に対し研修を行った。上記の成果は、職場の環境整備、協働学習、プログラム開発の観点から論文、図書、学会発表、招聘講演を通じて国内外で公表した。当初計画の目的の一つに、国内のサービス業、特に外国人の人材派遣に関して調査を行うことがあった。これについてデータを収集するとともに、研修を行い、PDCAサイクルで縦断的に検証を順調に進めている。国外の調査としてはヨーロッパの国を複数挙げていたが、予算に限りがあるため、フランスを調査対象国とした。訪問時には現地の日本語教師に対して研修を実施し、以前の研修受講者についてフォローアップ調査も行うことができた。国立大学のMBAの教員や大学院生に対しても、これまでの研究で得た知見や新たなプログラム開発について発表や研修を行ったことにより、学際的な学術交流をすることができた。さらに、インドネシアでは国際大会(シンポジウム)を企画し、200名を超える参加者(インドネシア、日本、その他の国籍)があった。研究成果の発表はもとより、貴重な学術交流を行うことができた。ビジネス日本語教育や介護・看護分野との連携を深めることができた。年間を通じて、調査、論文発表、図書の刊行、講演等を行った。共同研究者の研究(協働、参加型授業、介護他)も順調に進んでおり、全体的に一定の成果をあげたと考えている。本研究の3年目となる今年度は、次の通り研究を進める予定である。平成30年度までに行った国内外の調査研究(企業研修を含む)を随時発信していく。例えば、人材派遣業と製造業での企業研修について、外国人労働者の定着と協働の観点から日本語教育学会において成果の一部を発表する。形式は企業関係者と日本語関係者に登壇していただくパネルセッションで、外国人を雇用する企業の取り組みと環境整備について研究から得た知見を共有し、定着に向けた議論を行う予定である。さらに、秋に国内の企業関係者と日本語教育関係者の協働によるシンポジウムを行い、調査結果を明示した上で企業の受け入れ体制の強化の必要性を述べるとともにネットワーク構築を行う。海外(送り出し国)では、まずベトナムにおいて現地の日本語教師に対し研修を行う。主な内容はケース学習の理論に関する講義とケース学習の体験授業である。キルギスにおいても教師研修を行い、研修前後の受講者の意識の変化について質的に分析をする。韓国では、「青年の日本就職活性化のための日本語研究の新しいパラダイム」というテーマで、大学教員を主な対象とした研修を行う。大学教育において、働く上での摩擦やトラブルを教材とし、それを用いたケース学習に関する受講者の考え方や受けとめ方を明らかにする。さらに、ベトナムでは介護と看護の研究会とビジネス日本語研究会が連携をし、環境整備に関するシンポジウムを実施、送り出し国と受け入れ国(日本)双方の多様な連携が必要であることを示す予定である。訪問国では企業を訪問しインタビュー調査を行い、トラブルや摩擦を抽出し、引き続きケース教材を作成していく。国内の企業研修においては、人材派遣業を中心に研修プログラムを開発、検証を進めていく予定である。少子高齢化や企業の海外展開により日本国内の労働力不足が深刻化する中、外国人の雇用と定着に向けた企業の受け入れ環境の整備が喫緊の国家課題となっている。本研究では、「実態調査」「教材作成」「教育・研修」を結び付けた学際的な研究を目指している。目的は次のとおりである。(1)外国人高度人材に対する日本企業の受け入れ環境を調査し、ケースメソッドにより、日本人と外国人の間の摩擦を素材とした教材を作成する。(2)その教材を用いた教育・研修を行い、参加者の意識の変化を分析する。(3)送り出し国で行われている日本語教育、ならびに外国人雇用の実績のある国々における企業の受け入れ環境整備の実態について調査する。初年度である平成29年度の研究業績の概要は次のとおりである。(1)日本国内のサービス業、特に人材派遣業界で働く日本人社員と外国人社員、医療関係に従事する日本人社員と外国人社員を対象に半構造的インタビューにより調査をした。現在、内容分析を行いケース教材の作成をしている。(2)ケース学習による研修プログラムを開発した。その一つは「若手リーダー育成プログラム」として、1年を通して企業で実施した。

これは日本人社員と外国人社員の協働を目指すと共に、企業の受け入れ環境を改善をすることを目的とした研修である。(3)送り出し国であるベトナムとマレーシア双方で、日本語教育機関と日系企業を訪問し、教育現場や企業の現状と課題について情報収集をした。インドについては日本語教育機関への訪問と「グローバルパートナーシップサミット」で基調講演およびパネルセッションを行い、日本語教育のあり方と企業の環境整備の必要性について提言した。介護分野はモンゴルで調査や研修を行った。上記の成果は、職場の課題や改善案、協働学習の観点から学会等で発表をした。図書や論文でも研究結果を公表した。当初計画では、第一の目的として、外国人労働の実態を半構造的インタビューにより調査を行い、日本企業における高度人材に関わる問題点と摩擦について内容分析をすることであった。これについては日本国内、ベトナム、マレーシアで調査を実施し内容分析を行った。現在、ケース教材の作成に着手している。第二の目的として、ベトナムで現地での日本語教育や人材育成について横断的な調査を開始することであったが、これも計画通りであった。第三の目的としてマレーシアで現地調査を行うこと、ビジネス日本語教育と協働学習に関する研修を行うことであったが、これも予定通り実施することができた。計画にはなかったが、インドのグローバルパートナーシップサミットに招聘されたため、現地で現状の把握や日本語教育関係者との意見交換をすることができた。研究発表として、研修プログラムの開発と教師教育に関する内容を発表した。介護分野に関しては、EPA介護士を中心に日本語教育の観点から調査研究を進めた。2018年12月に改正入管法(出入国管理法改正)が成立し、外国人労働者の受け入れは国家戦略として急速に進められている。本研究は、外国人労働者の中でも高度人材(日本語人材)と受け入れ側(日本企業、日本語母語話者)を主な対象とし、「実態調査」「教材作成」「教育・研修」を結びつけた学際的な研究を目指している。2年目である平成30年度の研究業績の概要は次のとおりである。(1)日本国内のサービス業、特に人材派遣業で働く日本人社員と外国人社員に対する研修プログラムを継続して実施した。本年は「新人研修プログラム」として1年間、協働を土台とした企業の受け入れ環境を改善することを目的とした研修であった。また、異業種に勤務する外国人日本語人材を対象としたケース学習型研修を実施した。(2)海外は、フランス、中国等を訪問し、日本語人材や日本人駐在員に対しインタビュー調査を行った。収集したデータは内容分析等を行い、ケース教材を作成している。(3)フランスの経営大学院で、MBAの教員及び大学院生に対し、これまでの研究成果と、ケース学習の理論や企業研修プログラムの立案について講演を行った。日本語教師に対してはケース教材作成法を中心とした研修を行い、教師に求められる能力についても検討を進めた。
c-Ha-ras遺伝子導入マウスを用いたヒトのヘリコバクター感染モデル系の確立

Helicobacter pyloriは、ヒトの胃炎、胃潰瘍の原因菌としてばかりでなく、疫学的研究から、胃癌との関連性が指摘されている。また、一方でヒトープロト型c-Ha-ras遺伝子導入(Tg)マウスでは発癌物質の投与によって早期に腫瘍が多発することが、知られている。今回我々は、無菌(GF)-Tgマウス(BALB/cByJ×B6rasH2F1)での菌の定着性および肉眼的、組織学的変化を検討し、胃癌モデルとしての有用性を検討した。東海大学医学部第6内科で、消化管潰瘍患者より内視鏡にて採取したH.pylori(No.130株)を、4週齢,GF,c-Ha-ras遺伝子導入Tgマウスに、一日あたり10^9個、3日間連続経口投与し、さらに菌投与一週間後胃癌誘発剤であるN-methyl-N-nitrosourea(MNU)を10mg/kg腹腔内接種した。胃の材料は、菌投与後3および18週間目に行なった。胃内菌数は、GFTgMNU+(n=3),GFTgMNU-(n=3),GFnon-TgMNU+(n=4),GFnon-TgMNU-(n=4)およびGFBALB/cMNU-(n=4)の各群で、感染後3週で1.00×10^5、18週では1.09×10^5から1.89×10^5となり、いずれの群においても良好に菌が定着しているのが認められた。肉眼病変は、いずれの群においても認められず、また病理学的検索においても胃における炎症、糜爛、および腫瘍等は認められなかった。以上の結果から、本遺伝子導入マウスをH.pylori感染胃癌モデルとして用いるためには、菌株の選択、MNUの投与量および観察期間などさらなる検討が必要であると思われた。
疾病媒介蚊の殺虫剤抵抗性獲得メカニズム解明

平成30年度は、過去にピレスロイド剤の使用報告があるが、電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のkdr変異の調査がほとんどされていない地域として、ネパールのポカラを選択した。シマカ(Aedes)採集は主に市街地の道路沿いに点在する放置タイヤに発生する幼生の採集により行った。採集地点数は13箇所であった。採集した幼虫にd-アレスリンを用いた簡易的な殺虫試験を行い、ピレスロイド感受性の高低を判断した。幼虫は個体別にアルコールに漬けて持ち帰り、外部形態による同定を行った後にDNAを抽出してダイレクトシーケンス解析を行い、電位依存性ナトリウムチャンネルの変異解析を行った。その結果、以下のことが明らかになった。1.形態学的解析の結果、殺虫剤抵抗性解析に用いたものの78%がネッタイシマカ、22%がヒトスジシマカであった。2.ネッタイシマカはピレスロイド抵抗性を示す傾向を示した。ヒトスジシマカは感受性が高かった。3.ネッタイシマカの電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子にV1016G、F1534C、S989Pの変異が見つかった。頻度は、V1016Gが最も高かった。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のHEK293培養細胞への導入プロトコールに関しては、昨年度までに既に確立してきたが、導入後チャネルのプロファイル測定を安定して行うことができなかった。そこで、平成30年度は電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。そのコントラクトを用いて、HEK293培養細胞に導入した結果、安定してプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、その電流量が阻害剤アッセイを行うためには不十分であった。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子をHEK293培養細胞へ導入するプロトコールの改良を行い、電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であり、さらに改良する必要が明らかになったため。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現させることにより、安定してチャネルのプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であるという課題が残った。そこで、本課題の解決のために、細胞の培養条件の詳細な検討を行う。また、導入するαサブユニット遺伝子にはvariantが多数見られるため、導入遺伝子を変更する。これらにより課題の解決を行い、研究を推進していく予定である。平成29年度は、過去にピレスロイド剤の使用報告があるが、電位依存性Na+チャンネル遺伝子のkdr変異の調査がほとんどされていない地域として、ネパールのカトマンズとバラトプルを選択し、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)の採集を主に市街地の道路沿いに点在する放置タイヤに発生する幼生の採集により行った。採集地点数は,カトマンズ12箇所,バラトプル22箇所であった。採集した幼虫をd-アレスリンを用いた簡易的な殺虫試験によって幼虫のノックダウン時間をスコア化し、感受性インデックスを算出することによってピレスロイド感受性の高低を判断した。幼虫は個体別にアルコールに漬けて持ち帰り、外部形態による同定を行った後にDNAを抽出してダイレクトシーケンスを行い、電位依存性ナトリウムチャンネルにおけるミューテーションの有無を調べた。その結果,ネッタイシマカにおいてV1016Gのミューテーションがいずれの地域においても発見され,ミューテーション頻度とピレスロイド低感受性の間には顕著な相関が見られた.V1016Gの遺伝子頻度はカトマンズの方が高く約50%に達し、ホモ個体の頻度は25%であった.他のミューテーション(L982W, S989P, I1011M(or V), F1534C)の頻度はゼロであった。電位依存性Na+チャンネル遺伝子の培養細胞への導入プロトコールに関しては、既に確立してきたが、導入後チャネルのプロファイル測定を安定して行うことが難しいことが明らかになったため、再度検討を進めている。ネパールを採集場所に選択し、現地に行き、ネッタイシマカの幼生を採集した。その後の解析を含めて、研究計画通り順調に進めることができた。一方、培養細胞にCrispr/Cas9システムを用いて、電位依存性Na+チャンネル遺伝子を導入した結果、そのプロファイル測定が安定しなかった。電位依存性Na+チャンネル遺伝子がタンパク質まで翻訳されていることは確認したので、活性を持たせて安定して発現させるシステム構築が必要であることが明らかになった。以上により、現在の研究進度は「やや遅れている」と判断した。

1.形態学的解析の結果、殺虫剤抵抗性解析に用いたものの78%がネッタイシマカ、22%がヒトスジシマカであった。2.ネッタイシマカはピレスロイド抵抗性を示す傾向を示した。ヒトスジシマカは感受性が高かった。3.ネッタイシマカの電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子にV1016G、F1534C、S989Pの変異が見つかった。頻度は、V1016Gが最も高かった。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のHEK293培養細胞への導入プロトコールに関しては、昨年度までに既に確立してきたが、導入後チャネルのプロファイル測定を安定して行うことができなかった。そこで、平成30年度は電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。そのコントラクトを用いて、HEK293培養細胞に導入した結果、安定してプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、その電流量が阻害剤アッセイを行うためには不十分であった。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子をHEK293培養細胞へ導入するプロトコールの改良を行い、電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であり、さらに改良する必要が明らかになったため。フィールドの蚊サンプル採集、解析は平成29年度と同様に進めていく。電位依存性Na+チャンネル遺伝子を培養細胞で安定して(活性を持たせて)発現させるシステムに関しては再検討が必要であることが明らかになった。これに関しては、タグの再検討、ベータサブユニットの共発現を行うことにより解決を試み、研究を推進していく予定である。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現させることにより、安定してチャネルのプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であるという課題が残った。そこで、本課題の解決のために、細胞の培養条件の詳細な検討を行う。また、導入するαサブユニット遺伝子にはvariantが多数見られるため、導入遺伝子を変更する。これらにより課題の解決を行い、研究を推進していく予定である。電位依存性Na+チャンネル遺伝子の培養細胞への導入プロトコールの再検討が必要となり、引き続いてのプロファイル解析を行えなかったため、当該用途の使用額が未使用となったため。電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子の培養細胞への導入
前立腺癌骨転移微小環境におけるCCL2を介した癌細胞増殖・浸潤機構の解明

以前、腫瘍随伴マクロファージがCCR2を介して前立腺癌の転移を促進することを報告した。乳癌細胞ではCCL17とCCL22の受容体CCR4シグナルを介し、転移が促進されると報告されている。本研究で初めてヒト前立腺癌細胞株および前立腺癌組織でCCR2とCCR4が発現していることを明らかにした。腫瘍随伴マクロファージは前立腺癌細胞からのCCL2とCCL22の分泌を促進し、さらにそれぞれの受容体の発現も亢進させた。これらのケモカインは前立腺癌細胞の遊走能を亢進させたが、受容体に対する阻害薬で阻害された。ケモカインシグナルの下流にはAKTのリン酸化が促進され、遊走能を亢進させることが明らかとなった。前立腺癌細胞株LNCaP、LNCaPから樹立されたアンドロゲン受容体有するが去勢抵抗性と考えられているC4-2およびC4-2Bアンドロゲン受容体のないPC3にて実験を行う予定とした。まずC4-2において浸潤能や転移能がより高い癌細胞を選別すべく、遊走能試験を繰り返した癌細胞を採取した。親細胞と高浸潤能を有する細胞との間にCCL2やTGFβ1の発現の差がないかどうかを調べるため、CCL2に関してはELISA法を、TGFβ1に関しては定量的PCR法を用いて解析を行った。CCL2の一定細胞数あたりの分泌量は親細胞に比べ、高浸潤能の細胞で有意に高いことが明らかになった。また、TGFβ1の遺伝子発現レベルも親細胞に比べ、高浸潤能の細胞で有意に高いことが明らかになった。そして、表現型の違いを見てみると、遊走能試験では親細胞に比べ、高浸潤能の細胞で有意に遊走能が高いことが明らかになった。遊走した細胞の形態を観察すると、親細胞よりも高浸潤能の細胞で、より紡錘形となり、突起が多く出ていることが明らかとなった。遊走のあとにディッシュの底に接着した細胞の数も親細胞よりも高浸潤能の細胞で著しく増加していることが分かった。高浸潤能の細胞が高接着能をもつという逆説的な結果を示唆する所見であり、今後のさらなる詳細なメカニズムの解析を行っているところである。詳細なメカニズムが明らかになれば新たな治療ターゲットとなる可能性があり、さらなる研究促進が必要と考えられる。これまでに、前立腺癌細胞の浸潤・転移能獲得過程においてはTGF-β1とCCL2が重要な役割を果たしている可能性を明らかにした。引き続いて前立腺癌骨転移微小環境でのTGF-β1とCCL2の役割を明らかにすることとした。ヒトの手術検体から得られた骨組織から初期培養し得られた骨間質細胞がTGF-β1を分泌することは以前報告したが、今回はこれらの骨間質細胞と、ヒト骨芽細胞様細胞株SaOS2が持続してTGF-β1を分泌することが可能か検証した。すなわち、前立腺癌骨転移微小環境において、これら骨由来細胞と前立腺癌細胞が接触している状態で、前立腺癌細胞が持続的にTGF-β1にさらされうるかという点を調べた。ELISAを用いて調べた結果、24時間後よりも48時間後が有意にTGF-β1の培養上清中の濃度が上昇していた。次に、様々な条件で前立腺癌細胞にTGF-β1やCCL2を添加し、その分子細胞学的な変化を観察した。前立腺癌細胞はSaOS2と共培養すると、TGF-β1の発現が亢進したが、CCL2は変化がなかった。一方、TGF-β1を加えるとCCL2の発現が軽度上昇した。TGF-β1とSaOS2それぞれ前立腺癌細胞に加えると、CCL2の特異的受容体CCR2の発現が亢進し、両方同時に加えると相加的に発現が亢進した。現在、これらの変化が次に何をもたらすのかを明らかにしている過程であるが、いくつかのケモカインの発現亢進が認められており、どのケモカインが表現型の変化に重要な役割を果たしているかを明らかにしていく予定である。3年間の予定を100%とした場合、65%程度と考えられる。in vitroの実験の80%が終了した段階であり、今後in vitroの実験の残りと、in vivo、ヒト組織を予定している。予定されていた実験の中で、大筋の実験の流れは順調に進んでいると考えられる。引き続いて前立腺癌骨転移微小環境でのTGF-β1とCCL2の役割を明らかにした。前立腺癌細胞にTGF-β1やCCL2を添加し、その分子細胞学的な変化を観察した。これらTGF-β1とSaOS2それぞれ前立腺癌細胞に加えると、CCL2の特異的受容体CCR2の発現が亢進し、両方同時に加えると相加的に発現が亢進した。これらの結果はCCL2とTGF-β1が協調してCCL2-CCR2シグナルを活性化していることを示している。そこで、次にCCL2-CCR2シグナルの下流としてはたらく機構を明らかにした。前立腺癌細胞にTGF-β1とCCL2を加えた上、造骨性骨転移を想定し、ヒト骨芽細胞様細胞であるSaOS2と共培養を行ったところ、CCL17とCCL22の発現が亢進した。

さらに、これらの受容体であるCCR4の発現も亢進した。前立腺癌細胞はCCL2の下流としてCCL17/22が存在することも明らかとなった。前立腺癌細胞株にはCCR4が相当量発現していることも明らかにした。このCCL17/22-CCR4シグナルは最終的にAktのリン酸化を誘導し、前立腺癌細胞の遊走能を亢進させることが明らかとなった。Aktのリン酸化を阻害することで、CCL2によって誘導された前立腺癌細胞の遊走能が阻害されることが明らかとなた。また、CCR4の発現が高い前立腺癌は病期が進行していることも明らかにした。非常に興味深いことにCCR2の発現とCCR4の発現には相関が認められ、前立腺癌の予後予測マーカーとなることが示された。以前、腫瘍随伴マクロファージがCCR2を介して前立腺癌の転移を促進することを報告した。乳癌細胞ではCCL17とCCL22の受容体CCR4シグナルを介し、転移が促進されると報告されている。本研究で初めてヒト前立腺癌細胞株および前立腺癌組織でCCR2とCCR4が発現していることを明らかにした。腫瘍随伴マクロファージは前立腺癌細胞からのCCL2とCCL22の分泌を促進し、さらにそれぞれの受容体の発現も亢進させた。これらのケモカインは前立腺癌細胞の遊走能を亢進させたが、受容体に対する阻害薬で阻害された。ケモカインシグナルの下流にはAKTのリン酸化が促進され、遊走能を亢進させることが明らかとなった。3年間の予定を100%とした場合、25%程度と考えられる。in vitroの実験の約半分が終了した段階であり、今後メカニズムを含むin vitroの実験の残りと、in vivo、ヒト組織を予定している。予定されていた実験の中で、大筋の実験の流れは順調に進んでいると考えられる。前立腺癌細胞にTGF-β1とCCL2を添加した上で、さらにSaOS2(あるいは骨間質細胞)と共培養を行い、発現変化が認められるケモカイン等を特定する。それらの受容体の変化とともに、前立腺癌細胞に直接そのケモカインを添加することで、浸潤・転移能が変化するかを確認する。また、下流側としては、AktやErkなどのリン酸化が認められるかどうかを明らかにしたい。さらにヒト組織を用いた免疫組織学的な検討と、マウスを用いたin vivoの実験も行う予定である。泌尿器腫瘍学高浸潤能をもつ細胞が親細胞と比較し、高い遊走能をもつメカニズムを明らかにする。骨間質細胞や骨細胞からのCCL2やTGFβ1の分泌量について定量する。これらの癌細胞や骨細胞からの分泌量が、それぞれ共培養においてどのように変化するのかを検証する。これらが癌細胞の浸潤能を高めているかどうかを中和抗体やノックダウン法などで確認する。メカニズムで明らかにした中心的な役割を果たすシグナル経路を同様に阻害し、浸潤能亢進の原因となっていることを確認する。特定のケモカインを複数購入し用いる予定であったが、その段階まで到達しなかったため多少の残額が生じている。複数の細胞株での実験を予定していたが、今のところ一部の細胞株ではまだ実験が行われておらず、その分の残額が生じている。すでにキーとなる分子はほぼ特定できており、次年度に購入することになると考えている。さらに細胞株を絞って、より深くメカニズムをあきらかにするため、抗体を追加して購入する費用に充てる予定である。今後は細胞株を絞って、より深いメカニズムの探索のため、サイトカインアレイを追加して行う費用に充てる予定である。
イネ茎部の非構造性炭水化物組成の遺伝的改変に向けた代謝制御因子の探索

本研究では、イネの茎部(葉鞘・稈)における非構造性炭水化物(以下NSC;主にデンプンとショ糖)の蓄積量や組成の制御に深く関与する遺伝子の同定を試みた。主な成果として、(1)茎部NSC代謝に関わる遺伝子として、デンプン分解酵素β-アミラーゼBAM2、BAM3、イソアミラーゼISA3、ショ糖分解酵素のINV2を同定した。また、(2)茎部のNSC蓄積量および組成は穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではなく、(3)高NSC品種はそれぞれ特有のNSC蓄積メカニズムを有することが明らかとなった。本研究では「たちすずか」、「たちあやか」、「リーフスター」、「日本晴-突然変異体」を供試材料として、イネの茎部(葉鞘・稈)におけるデンプン・糖の含有率の決定に深く関与する代謝制御因子を明らかにすることを目的としている。青木(東京大学)は、各供試材料の茎部重や穂重などの形態的特徴、および登熟期間中の茎部(葉鞘・稈)におけるデンプンおよびショ糖の蓄積パターンの特徴を検討した。その結果、イネの茎部におけるデンプン・糖の蓄積量は、穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではなく、「たちすずか」や「たちあやか」では通常品種に比べてショ糖を高濃度で蓄積する特有のメカニズムが存在する可能性が示された。さらに、これらの茎部サンプルを用いて次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析(RNA-seq)を行い、各供試材料および対照系統の茎部における遺伝子発現パターンに関するデータを得た。廣瀬(農研機構)は、日本晴を用いてショ糖分解系およびデンプン合成系の酵素(ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖合成酵素、液胞型インベルターゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、イソアミラーゼ)のアイソジーン解析を行った。RT-PCRによる発現解析等の結果から、茎部のショ糖・デンプン蓄積に関与する候補アイソジーンを絞り込んだ。平野(名城大学)は、日本晴を用いてデンプン分解系の酵素(α-アミラーゼ、β-アミラーゼ)のアイソジーン解析を行った。RT-PCRによる発現解析等の結果から、茎部のデンプン蓄積に関与する候補アイソジーンを絞り込んだ。また、これまで茎葉部では測定が困難であったβ-アミラーゼについて信頼度の高いアッセイ系を開発した。このアッセイ系は、上記「たちすずか」などの茎部におけるデンプン蓄積の分子機構を明らかにする上で重要な手法になる。本研究では、イネの茎部(葉鞘・稈)におけるデンプン・糖の含有率の決定に深く関与する代謝制御因子を明らかにするために、1)茎部における非構造性炭水化物(NSC:主にデンプンとショ糖)の蓄積パターンの特徴を明らかにしながら、2)NSCの合成および分解経路を代謝レベル(酵素機能解析、転流機能解析)または遺伝子レベル(アイソジーン解析、網羅的遺伝子発現解析)で解析している。本年度の成果として、主に以下のことが挙げられる。・穂が小さく、収穫期において茎部にショ糖(およびデンプン)を高濃度で蓄積する、高ショ糖品種「たちすずか」や「たちあやか」、および「日本晴-短穂変異体」や高NSC品種「リーフスター」について、1)の解析を行った結果、イネ茎部におけるNSCの蓄積量および組成は穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではなく、高NSC品種はそれぞれ特有のNSC蓄積メカニズムを有することが示唆された。・上記の3つの高NSC品種およびそれらの親品種の茎部(出穂後20日)における網羅的遺伝子発現解析(RNA-seq)から、デンプンまたはショ糖濃度と発現量との間に強い正の相関が認められる遺伝子のリストを得た。このリストはイネ茎部における高NSC形質や高ショ糖形質に関与している遺伝子を含んでいると考えられる。・「日本晴」を用いた茎部NSC関連酵素遺伝子のアイソジーン解析から、デンプン分解酵素β-アミラーゼのBAM2、BAM3およびBAM5が、またイソアミラーゼのISA3が、茎部におけるデンプン分解に関与していることが明らかになった。この他にも、ショ糖リン酸合成酵素のSPS1やショ糖分解酵素のINV2およびINV3の茎部NSC蓄積機構への貢献度が明らかになりつつある。イネ茎部におけるNSCの蓄積量および組成は穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではないということは、シンク・サイズなどの穂形質を変えずにNSCの蓄積量やショ糖/デンプン比を遺伝的に改変することが可能であることを意味しており、このことを実証できたことは大きな成果であるといえる。また、茎部NSC関連酵素遺伝子のアイソジーン解析も順調に進んでおり、茎部のデンプン分解に関与するβ-アミラーゼとイソアミラーゼのアイソジーンが新たに明らかになった。「たちすずか」や「たちあやか」などの高ショ糖形質に関わるアイソジーンや新規遺伝子の特定はやや遅れているが、上記RNAseqのデータを活用することによって有望遺伝子を絞り込むことが可能である。以上のことから、本研究課題は概ね順調に進展していると考える。

本研究では、イネの茎部(葉鞘・稈)における非構造性炭水化物(主にデンプンとショ糖;以下NSC)の含有率決定に深く関与する代謝制御因子を明らかにするために、収穫期の茎部にショ糖(およびデンプン)を高濃度で蓄積する、高ショ糖(高NSC)品種「たちすずか」や「たちあやか」、および「日本晴-短穂変異体」や高NSC品種「リーフスター」について、1)茎部NSCの蓄積パターンの特徴を明らかにしながら、2)NSCの合成および分解経路を代謝レベル(酵素機能解析、転流機能解析)と遺伝子レベル(アイソジーン解析、網羅的遺伝子発現解析)で解析している。本年度の研究成果としては主に以下を得た。・1)の解析結果から、イネ茎部のNSCの蓄積量および組成は穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではなく、高NSC品種はそれぞれ特有のNSC蓄積メカニズムを有することが明らかとなった(Hirose et al. 2017)。・上記の品種およびそれらの親品種の茎部(出穂後20日)における網羅的遺伝子発現解析(RNA-seq)から、デンプンまたはショ糖濃度の決定に深く関与すると思われる代謝酵素遺伝子、および転写因子などの発現制御遺伝子のリストを得た(原著論文を準備中)。・「日本晴」を用いた茎部NSC関連酵素遺伝子のアイソジーン解析から、デンプン分解酵素β-アミラーゼのBAM2およびBAM3が、茎部におけるデンプン分解に関与していることが明らかになった(Hirano et al. 2016、平野ら2017)。また、α-グルカンホスホリラーゼのPHO1およびPHO2(樋口ら2016)や、ショ糖分解酵素のINV2が茎部NSC代謝に関与していることが明らかになった。・平成29年3月の日本作物学会においてミニシンポジウム「イネ茎部で働く遺伝子たち」を開催した(平野ら2017、岡村ら2017)。本研究では、イネの茎部(葉鞘・稈)における非構造性炭水化物(以下NSC;主にデンプンとショ糖)の蓄積量や組成の制御に深く関与する遺伝子の同定を試みた。主な成果として、(1)茎部NSC代謝に関わる遺伝子として、デンプン分解酵素β-アミラーゼBAM2、BAM3、イソアミラーゼISA3、ショ糖分解酵素のINV2を同定した。また、(2)茎部のNSC蓄積量および組成は穂の大きさ(シンク・サイズ)のみによって決定されるものではなく、(3)高NSC品種はそれぞれ特有のNSC蓄積メカニズムを有することが明らかとなった。本年度の研究により、イネ茎部におけるデンプン・ショ糖の蓄積パターンの品種間差が明らかになった。これにより、酵素機能解析や網羅的遺伝子発現解析などを行う上でどの生育ステージのどこの部位を用いるのが最も効果的かが明確になった。実際に当初の予定どおり、デンプンやショ糖濃度に明確な品種間差がみられる時期のサンプルを用いてRNA-seqのデータが得られており、現在進めている解析に期待が持てる。また、アイソジーン解析も順調に進んでおり、イネ茎部のデンプン・ショ糖代謝に関与する酵素のアイソジーンが明らかになりつつある。候補アイソジーンのデンプン・ショ糖代謝への関与を検証するためのノックアウト/ノックダウン系統(原品種:日本晴)の確立も進んでおり、一部については既に解析を始めている。「たちすずか」や「たちあやか」など特定の品種におけるアイソジーン解析はやや遅れているが、今後、上記RNA-seqのデータを活用することによって有望アイソジーンを絞り込むことが可能である。以上のことから、研究は概ね当初計画どおりに進展していると考える。引き続き茎部のデンプン・糖の合成および分解経路を代謝レベル(酵素機能解析、転流機能解析)または遺伝子レベル(アイソジーン解析、網羅的遺伝子発現解析)で解析する。
地域の文化財に触れる中学校美術科の鑑賞題材の開発

【研究目的】新しい学習指導要領で「我が国の美術についての学習を重視し,美術文化の継承と創造への関心を高める」ことの重要性が指摘されている。一方で,カリキュラム上の位置付けや具体的な教材の準備,外部の人材との連携をどう進めるかなど,学習効果を上げるためには課題も少なくない。そこで本研究は,地域の文化財への理解を促すために,地域の文化財・美術館と連携して,どのような授業展開をすればよいか,準備する教材の内容,活動内容の設定,教師と外部人材の適切な役割について研究することが目的である。【研究方法】平成17年度から実践を始めた「大津の宝:蘆花浅水荘(ろかせんすいそう)を味わおう」の授業の工夫・改善に取り組んだ。本校の学区内に存在する「蘆花浅水荘」は,山元春挙(大津市出身の日本画家)が大正中期に琵琶湖岸に建てた別荘で,近代の和風建築や,山元春挙の画業などに親しむことができる貴重な文化財(大津市指定名勝,重要文化財)である。これまでの実践では,教室で資料を提示してクイズ形式の授業を進めていたが、蘆花浅水荘管理者の山元寛昭氏と連携を進めて次のような授業改善に取り組んだ。(1)授業後に実際に蘆花浅水荘を訪れる機会を設定する。(2)山元寛昭氏に施設を案内していただき,説明を聞く。(3)生徒に写真撮影させて,能動的な見方を引き出す。【研究成果】教室で学習するだけにとどまらず,上記のような工夫改善を行った結果,特に以下の3点について,顕著な効果が認められた。(1)蘆花浅水荘の建物に入り,その空間づくりの面白さについて理解を深められた。(2)山元春挙の存在を身近に感じるとともに,文化財を守る思いを知ることができた。(3)カメラのレンズを通して見ることによって,対象をより丁寧に観察することができた。
コレステロール酸化物の食品学的および栄養生化学的研究

1.培養肝細胞に対する7-ketocholesterolの細胞毒性とビタミンEによる保護機構前年度の研究結果より、7-ketocholesterolが肝細胞に対して細胞毒性を示し、細胞死を招くことが明らかとなった。そこで、本年度は、その作用メカニズムの検討を行った。cholestrol添加群をコントロール群として検討したところ、培養開始初期において7-ketocholesterolを添加群ではNOラジカルのみならずO^-_2ラジカルの発生が有意に高いことが示された。また、7-ketocholesterolを添加する1時間前にビタミンEを添加しておくと、ラジカルの発生が抑制されるばかりでなく、細胞の生存率が有意に高くなることが示された。そこで、実際にどれくらいの7-ketocholesterolが細胞に取り込まれているのかを検討したところ、ビタミンE添加群では非添加群に比し、培養8時間までは取り込みが有意に抑制されていることが示された。培養24時間後では7-ketocholesterolの取り込み量に差は認められなかったが、ビタミンE添加群では生存率は有意に高値を示し、ビタミンEの細胞保護効果が認められた。Triolはその化学的性質より細胞膜に取り込まれ細胞毒性を発現するという説と、変性LDLを生じLDLレセプターを介して細胞に取り込まれ毒性を発現するという説がある。前年度の研究結果よりTriolがIEC-6細胞に対して強い細胞毒性を示し、細胞死を招くことが明らかとなった。そこでその作用メカニズムの検討を行ったところ、その毒性発現には僅かなFCSの存在が必須であり、FCS中の未知の物質がTriolの細胞への取り込みに深く関与していることが明らかとなった。その本体は明らかではないが、かなり高分子量のもので、耐熱性の因子であることが示された。まず、当該年度は、わが国特有の水産加工食品中にどのような分子種のコレステロール酸化物が含まれているかを明らかにする目的で、“ししゃも"と“するめ"を選び、検討を行った。その結果、量的には非常に微量ではあるが“ししゃも"、“するめ"いずれにおいても7-OH-cholesterolの他5α,6α-Epoxide,7-Ketocholesterol等が含まれていることが同定された。そこで、一般的に細胞毒性が強いと報告されているTriolを含め、これらコレステロール酸化物について、培養肝細胞および小腸上皮クリプト細胞(IEC6)を用い、細胞毒性について検討を行った。肝細胞においては、7-Ketocholesterolによる傷害も最も高く、著しい細胞の生存率の低下が認められた。しかしながら、培養液中へのLDHの漏出は殆どなく、細胞死のメカニズムを検討する目的でDNAの断片化を検討したところ、アポトーシスが生じていることが示された。また、ラジカルの一つである一酸化窒素(NO)の生成との関連を検討したところ、アポトーシスに、NOが一部関与していることが示された。小腸上皮細胞においては、7-Ketocholesterolは細胞毒性を示さず、Triolによる細胞毒性が最も強く認められた。この場合はLDHの培養液中への漏出にともなう細胞死が観察され、Triolによる細胞毒素は細胞膜の傷害が原因と考えられた。以上のように、食品中に含まれているコレステロール酸化物は非常に微量のため、それらが直接生体に及ぼす影響は少ないと考えられる。しかしながら、血清中には生体内で作られたかなりの量のコレステロール酸化物が含まれていることが報告されており、本研究でも示唆されたように、用いた細胞の種類によって、毒性を示すコレステロール酸化物の分子種が異なること、またその作用メカニズムも異なることから、今後、それらの作用メカニズムをより詳細に検討するとともに、細胞の保護についても検討していく予定である。1.培養肝細胞に対する7-Ketocholesterolの細胞毒性とビタミンEによる保護機構前年度の研究結果より、7-ketocholesterolが肝細胞に対して細胞毒性を示し、細胞死を招くことが明らかとなった。

そこで、本年度は、その作用メカニズムの検討を行った。cholesterol添加群をコントロール群として検討したところ、培養開始初期において7-ketocholesterolを添加群ではNOラジカルのみならずO_2ラジカルの発生が有意に高いことが示された。また、7-ketocholesterolを添加する1時間前にビタミンEを添加しておくと、ラジカルの発生が抑制されるばかりでなく、細胞の生存率が有意に高くなることが示された。そこで、実際にどれくらいの7-ketocholesterolが細胞に取り込まれているのかを検討したところ、ビタミンE添加群では非添加群に比し、培養8時間までは取り込みが有意に抑制されていることが示された。培養24時間後では7-ketocholesterolの取り込み量に差は認められなかったが、ビタミンE添加群では生存率は有意に高値を示し、ビタミンEの細胞保護効果が認められた。Triolはその化学的性質より細胞膜に取り込まれ細胞毒性を発現するという説と、変性LDLを生じLDLレセプターを介して細胞に取り込まれ毒性を発現するという説がある。前年度の研究結果よりTriolがIEC-6細胞に対して強い細胞毒性を示し、細胞死を招くことが明らかとなった。そこでその作用メカニズムの検討を行ったところ、その毒性発現には僅かなFCSの存在が必須であり、FCS中の未知の物質がTriolの細胞への取り込みに深く関与していることが明らかとなった。その本体は明らかではないが、かなり高分子量のもので、耐熱性の因子であることが示された。
南北両半球観測による銀河宇宙線強度の恒星時異方性の研究

地下ミューオン強度変動(E<1TeV)の南北両半球観測データを解析し、゙Loss-cone"どTail-in"という二つの成分異方性が共存する定量的強度分布モデルを導いた。また、太陽風と恒星間プラズマとのMHDシミュレーションから得られた太陽圏モデル内で宇宙線粒子の軌道計算を行い、500GeV程度のエネルギーの宇宙線はほとんどすべてがheliotailの方向から内部太陽圏へ伝播してくることを明らかにした。これらの計算結果をもとに、今後゙Loss-cone"および゙Tail-in"異方性の起源を調べてゆく予定である。さらに゙Tail-in"異方性のエネルギー依存性を調べるため、チベットでの空気シャワー観測データを用いて10TeV領域での恒星時日周変動を調べた。その結果、10TeVでの観測結果も上記強度分布モデルと良くあっており、"Loss-cone"と"Tail-in"ともに大きなエネルギー依存性は見られなかった。しかしながら、モデルの特徴である緯度(赤緯)依存性を調べるには未だ空気シャワー観測の統計が不十分であり、確定的な結論は今後の研究に待たねばならない。一方、将来の南北両半球観測の可能性を調べるため、比例計数管100本を4層に並べた小型の狭角ミューオン計を製作し、予備実験および特性評価を行った。その結果、ミューオンの入射方向をイベントモードでパソコンに判定させる記録システムが、十分利用可能であることを確認できた。今後、観測の安定性等についての評価を行ってゆく予定である。
高効率熱電変換酸化物セラミックスのキャラクタリゼーション

本研究は、高温で使用可能な酸化物導電性材料を熱電変換材料として応用するための基礎的な研究である。まず、高温で使用可能なゼ-ベック係数の測定装置を製作し、次に、電気伝導度測定装置の改良を行った。それに伴い、ゼ-ベック係数測定用のソフトウエア開発と測定手法の確立を行い、いくつかの既知の複酸化物によってその信頼性を確認した。また、電気伝導度の自動測定のためのソフトウエア開発を行った。これらの装置を用いて、初めに、ランタンと銅を含む複酸化物のゼ-ベック係数と電気伝導度を測定した。その結果、これらの物質の高い熱電性能指数を確認し、さらに、銅イオンの位置に亜鉛イオンを一部置換することにより、高温における電気伝導度がより金属的になり、低温において半導体的になることを明らかにした。また、亜鉛イオンによりバレンス付近の電子構造が変化していることも明らかとなった。次に、ランタンとニツケルを含む酸化物(La_2Nio_4)に対して、電気的測定を行なった所、ゼ-ベック係数は1030muV/Kの程度であまり大きくはなく、温度上昇に伴って上昇する傾向にあることがわかった。また、電気伝導度の測定により500°C付近で金属-絶縁体転移を起こし,この温度はニツケルイオンの位置に亜鉛イオンを置換しても、変化しない事が分かった。さらに、新化合物(Ca,Ce)_2Sn_2O_7および(Sr,Ce)_2Sn_2O_7の電気伝導度とゼ-ベック係数を測定した結果、これらの化合物がn型の電気伝導を示し、キャリアの生成がCeイオンの価数によって支配されている事を見出した。現在,以上の測定結果を踏まえて、ランタンとコバルトの複酸化物、インジウムを含む複酸化物について、熱電変換性能指数を検討している。
Nano Focusingを戦略とするESI-MSの超高感度化に関する研究

極微量の重要イオン性分子の分析を可能にする手法の開発を目的に、ナノリットル体積への収束を行うCEオンライン濃縮とESI-MS検出を結合した高感度検出法の基礎を確立し、DNA中の飲酒由来損傷塩基の検出を行った。その方法では、5'-ヌクレオチドとしてDNAから抽出した損傷体を動電過給法で3000倍濃縮し、ESI効率を高めるためにオンラインでPhostag錯体化して、最後にESI-MSに導入して検出する。直接検出に比べて、3万倍以上の感度向上を達成した。これまでに行ったことは、1ヌクレオチドを分析ターゲットとした、キャピラリー電気泳動法(CE)によるオンライン濃縮とESI-MS検出の結合による高感度検出の実現と、2CE-ESI-MSが有する本質的な高感度化要素であるナノESI化の実現をめざした、装置の試作と実測検討である。まず、1について、オンライン濃縮法として過渡的に等速電気泳動の仕組みを使った動電過給法によって、dGMP及びその損傷体2種について、1 mLの試料溶液から3000倍の濃縮を達成した。一方で、ヌクレオチドは一般にイオン化の効率が悪いため、一種の誘導体化法として、CE上でオンライン錯体化を行い10倍以上イオン化効率向上できる方法を開発した。濃縮と錯体化、そしてESI-MS検出できることをシステム上で確認し、相乗作用で、1万倍程度の検出シグナル強度の上昇を観測した。濃度感度では10 pM程度を得た。これはCE-MS分析では注目すべき高感度の獲得といえる。次に、2について、シース溶液を使わないナノ流量のCE溶出液を直接導入するシステムを作成して本法に適用して検討した。まず、ESIを促進する溶液組成を調整できるシース溶液が存在しないため、濃縮とESIの両立する組成への泳動液の最適化を検討した。最終的に、CE濃縮-ナノESIでのdGMPの検出を達成した。しかし、濃縮に必要な塩によるイオン化抑制が課題として残り、該当年度内では解決には至らなかった。これらの結果は、本法の方法論としての新規性と発展性において重要な成果である。また、ここで分析対象とする損傷ヌクレオチドは、個人の習慣、体質、遺伝素養、環境を反映する発がんリスクマーカーとして重要性の高いものであり、それらの高感度分析法の開発の意義は大きい。27年度の計画は、1損傷ヌクレオチドの動電過給法による高倍率濃縮とESI効率を顕著に高めるPhos-tag錯体化をCE上オンライン上で達成し、これをESI-MS検出すること、及び2この手法においてナノESI化を実現することであった。1については、dGMP及びその損傷体であるエチル化体(Et-dGMP)、サイクリックプロパノ体(CPr-dGMP)について、リーディングイオンとなる酢酸イオンを含む泳動液を用いて、動電過給条件を最適化し、それぞれ3000倍程度の濃縮を得た。さらに、Phos-tag亜鉛錯体とヌクレオチドの三元錯体化を行い、これが泳動中にも比較的安定で、ヌクレオチドそのものの場合に比べて15倍の効率でESI-MS検出できることを示した。また、動的に流路上で出会わせることによっても定量的錯体化がおこり、濃縮と両立できることを示し、dGMP、Et-dGMP、CPr-dGMPそれぞれで、10 pM濃度感度での検出を可能にした。2については、液量の増加原因であるシース溶液を使わずに、CE本来のナノ流量を維持したうえでESI効率を高めるため、アセトニトリル:水=1:1程度の有機溶媒混合泳動液を使った。そして、水系泳動液と同程度の濃縮倍率で動電過給濃縮できることを示した。一方で、十分な濃縮が起こる塩濃度の泳動液では、顕著なイオン化抑制が生じて、ナノ流量による増感効果を相殺してしまうことが分かった。このことは微小量シース液の利用による溶出液のESI検出に合わせた組成調整が、CE濃縮とESI-MSの結合には有用な手段であり、次年度以降の改良の一指針となった。以上、当初の目的を多く達成し、判明した問題点も本法を実現するための有用な知見となった。28年度は、前年に構築したCE濃縮注入-オンライン錯体化-ESI-MS検出の原理を使って、DNA試料から飲酒由来の損傷体を検出する実用手法の開発を行い、調製したモデル損傷DNAから損傷体検出を行うこと、一方で、分析原理を、更なる高感度化と高実用性の観点から発展させることを計画した。牛胸腺DNA(CT-DNA)を素材に、分析法評価のための標準損傷DNAの調製を行った。DNA中の損傷グアニンを、アセトアルデヒド(AA)と試薬の添加により発現させた。損傷頻度は、AAの反応濃度、及び加温急冷による一本鎖への解離を組み合わせて良い再現性で調節可能であった。CT-DNAは、A-T : G-C比率が分かっており、酵素反応の定量性を評価できる。ヌクレアーゼS1、ヌクレアーセP1は損傷部位を基質としない一方、ヌクレアーゼBal 31は定量的に損傷部位を切り出すことが判明した。これら基礎検討を元に、モデル損傷DNAから、Bal31による酵素反応前処理を行い、本法での、実分析に近い状況での、損傷塩基の検出に成功した。分析手法面での進展は、まずCE濃縮時のリザーバー体積と電極の配置の最適化による導入効率(=使用試料に対する導入量の割合)の向上があげられる。

1 mLエッペンドルフでの注入は3-5%程度であるが、20 μLで直線的なチューブでの導入は80%程度まで改善でき、実質感度で1ケタ以上の向上を達成できた。一方、本手法の手技の複雑さ、再現性の問題を解決するために、錯体化を伴わず、検出形態をイオン化効率の低いヌクレオチドからヌクレオシド、塩基へとシフトすることも検討した。これらの形態のイオン化効率を詳細に比較し、塩基、ヌクレオチドが、ヌクレオチドより8倍程度イオン化効率が高いことが判明した。ヌクレオシド、塩基が溶液内で荷電する環境でEKSできるか現在検討中である。28年度は、実分析への課題の解決に注力した。この面では、順調に進展したといえる。実試料分析の一つとして計画しているALDH2マウスDNAの分析は最終年度に行うこととした。分析手法面での進展は、更なる高感度検出にむけた基礎的な技術開発面で行われ、最終年度以降の計画実現のための重要かつ必要な知見を得ている。一方、当初計画から大きな目標としているナノESI化への取り組みは最終年度へ持ち越した。これは、前年度に判明したEKSに用いる泳動液によるイオン化干渉に対するシース液の正の効果を超える(ナノESI採用時の)対策を見出せなかった点が主な理由である。実用分析法の構築には、分析対象モデルとなる標準試料が必須であると考える。今回の損傷体の分析では、最終的に目的損傷塩基を有するヌクレオチドに変換するが、この際に酵素反応を利用し、そのヌクレアーゼが損傷体を基質として認識し、定量的に加水分解することを確認する必要がある。また、CT-DNAはその塩基組成が既知であるため、損傷体の分解が定量的であることを確認できる。実際に、検討した3種のヌクレアーゼのうち、1種類のみがこの要件を満たした。これらの点で、損傷DNA分析にとって必須な知見を提供できたと考える。また、実際の加水分解試料はそのままでは本法の濃縮注入ができないことが分かり、精製のプロセスを導入した。これらの手法の発展は現在進行中であり、最終評価には至っていない。ただし、各ステップでの改良は進んでいる。EKSの導入効率向上により貴重な生体試料の実質的な感度向上につながる成果を得た。また、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基のイオン化特性を確認し、より操作しやすい汎用的手法開発につながる重要な知見を得た。研究期間内に実施したことは、ナノリットル体積への収束を可能にするCEオンライン濃縮とESI-MS検出を結合した、DNA中の損傷ヌクレオチドの高感度検出法の基礎をほぼ確立したことである。生体内における膨大な正常体の共存下でのごく微量の損傷体の検出は、分析化学にとってチャレンジングなターゲットであると同時に、損傷体は個人の発がんリスクマーカーとして非常に重要なターゲットである。「損傷部位」を基質とする酵素の検索、前処理を含めた総合的な手法の整備も行った。すなわち、オンライン濃縮法として過渡的等速電気泳動の仕組みを持つ動電過給法(EKS)を用いて条件を最適化し、飲酒由来のdGMP損傷体2種について、1 mLの試料溶液から1ステップで3000倍の濃縮を達成した。さらに、導入部の構造の改良で導入効率を上昇させて前濃縮過程と組み合わせることで1万倍まで倍率を向上した。また、ヌクレオチドはESI-MSでの検出効率が塩基、ヌクレオシドに比較して10%程度と低いため、EKS濃縮との一連の過程で、オンラインでの亜鉛錯体化過程を組み込み、15倍のイオン化効率向上を実現した。