hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ領域イメージングを用いた血管内皮細胞の焦点接着斑の力学応答ダイナミクス

内皮細胞の形態変化の際に生じる焦点接着斑の配置の変化に対する細胞底面部のアクチンフィラメントの役割を明らかにすることを目指して,予めRFP/FATおよびGFP/アクチンのベクターを遺伝子導入したウシ大動脈由来内皮細胞を用いて,主として流れによるせん断応力の力学刺激を負荷した.FATおよび焦点接着斑に結合している細胞底面付近の細胞骨格に注目し,近接場光を用いて動的な挙動を観察した.また,細胞骨格の成分でもあるマイクロチューブルの働きにも注目し,その役割を抑制するノコダゾールを投与した際の応答についても検討した.その結果,次の結論が得られた.1.内皮細胞が配向するためには,流れの方向に対して傾きをもつアクチンフィラメントの収縮と脱重合,上流および下流方向への葉状仮足の発達が必須である.2.次の順に従う葉状仮足の発達の機構が考えられた.(1)葉状仮足発達方向への微小管の発達,(2)微小管発達部位における焦点接着斑の出現,(3)出現した焦点接着斑間におけるアクチンフィラメントの発達3.形態変化メカニズムや葉状仮足発達メカニズムは同一の機構であり,せん断応力を負荷した場合は形態変化に方向性が生じるだけであることが示唆された.4.FAK (focal adhesion kinase)がアクチンフィラメントともインテグリンとも構造的に直接連結していない可能性が示唆され,焦点接着斑の新しいモデルを提案すべく,今後同様の実験を継続していくこととした.その他,不均質なひずみ場を形成するシリコーン膜を成形して,膜上で内皮細胞を培養し,伸展刺激を負荷した.同一細胞内でもひずみの大きい箇所で最初にアクチンフィラメントの発達がみられるとともに核の高ひずみ側への偏移を観察した.今後このメカニズムについても検討することとした.力学的刺激を受けた場合の内皮細胞の応答機構を明らかにする観点から主として以下の2種類の研究を行った。1.不均一シリコーン膜を用いた張力負荷による細胞骨格の形成マイクロマシニング技術を用いてシリコン基板表面に微細な凹凸を形成した。凹凸のパターンとしては、なるべく細胞にかかる力学刺激が不均一になることを考慮して、マイクロポストの形成を利用した。これを鋳型としてシリコーン膜に凹凸を転写した。シリコーン膜上の内皮細胞に張力刺激を負荷した状態で内皮細胞の応答状態をアクチンフィラメントの分布から観察した。その結果、平滑な表面上に培養した細胞では、張力負荷の方向とは直交方向にアクチンフィラメントの発達がみられるのが一般的であり、その点を確認することができた。しかしながら、凹凸パターンをもった膜上で培養した細胞に張力負荷を与えた場合には、負荷方向にアクチンフィラメントが配向する特徴的な傾向が見られた。この現象については、現時点では確定的な結果とは言えないため、次年度以降も引き続きデータの蓄積を行う予定である。2.流れ刺激、静水圧刺激同時負荷による焦点接着斑および細胞骨格の動的挙動観察流れ刺激に加えて静水圧刺激を同時に負荷し、焦点接着斑および細胞骨格の動的挙動において流れ負荷刺激および静水圧負荷刺激をそれぞれ単独の場合に得られたとの比較・検討を行った。
幕末から明治初期にかけての和学・漢学の継承の実態とその近代文学に対する影響についての研究

久保田は、成島家関係の資料調査と収集、近藤芳樹の日記と周辺資料の収集に研究の主眼を置いた。成島信遍の伝記研究が成島家の漢学・和学の継承の実態を探る上で前提となるため、一時中断していた年譜稿の執筆を再開し、元文元年の1年の記事を網羅することを心がけた。なお、同年中の記述はまだ完結していない。また、近藤芳樹の日記は全冊を写真撮影して解読と校訂に着手し、第1冊より順次公刊を開始した。孫は、前年度に引き続き中島敦と中国思想との関係をより深く究明するために、中島敦の研究文献を網羅的に収集すると共に、主に中島敦家の蔵書(日本大学図書館所蔵)と中島敦の原稿や同家の遺物(神奈川県立近代文学館所蔵)などの全貌をより細かく調査し、その全体の傾向を把握した上、特に中島敦家と中国思想(特に儒学・道学関係を中心に)との関係を示す資料、また中島敦の書入れと思われる部分について調査、収集した。更なる綿密な調査や考証をする必要があると思われるが、本年度の調査により、中島敦及び中島敦家と中国思想との関係はより一層明瞭になったと考えている。本研究は今年度を以て終了することとなったが、今後の研究の基礎を築くという点では十分な成果があったと考える。特に成島家、近藤芳樹、中島家という3つの観点から幕末・明治の和学・漢学の展開を考究するための基本資料は収集できたので、今後もそれぞれに研究を進めていきたい。
頭頸部癌末梢循環腫瘍細胞の量的質的解析を目的とした捕捉チップ開発に関する研究

癌のいわゆる悪性度を規定する細胞はその一部であり、正確な悪性度評価には悪性度の高い細胞を選別して解析する必要がある。末梢循環癌細胞(Circulating Tumor cell; CTC)は原発巣癌細胞集団の中でも上皮間葉移行(Epithelial Mesenchymal Transition; EMT)を生じた浸潤や転移能力が高い、悪性度・生物学的特性を最も反映する集団と考えられる。富山県工業技術センターで開発された抗体とマイクロ流体デバイスとを組み合わせたポリマー性マイクロチップを用いて上咽頭正常上皮細胞株NP69、上咽頭癌細胞株C666-1、舌癌由来OSC19を用いたセットアップを行なったのち、4名の臨床検体を用いてCTC捕捉を試みた。当初は抗EpCAM抗体を用いることで臨床検体においてもCTCが捕捉可能と考えていたが極めて回収効率が悪いことが判明した。さらにこのシステムで回収された細胞の量的評価は臨床的な癌悪性度を十分反映しないことが示唆された。一方でpodoplamin抗体をコートしたCTCチップで回収効率が改善することが判明した。29年度のCTC定量システムと治療効果予測に有用な臨床的パラメーターとの関連性を解析を行なった。頭頸部癌全体を対象にCTCの捕捉と臨床病期や腫瘍体積、そして、リンパ節ならびに遠隔転移との関連について検討し、それぞれの方法で捕捉されるCTC量が反映する臨床的意義は直接的に悪性度を反映すると予測していた。すなわち、EpCAM抗体を用いることで臨床検体においてもCTCが捕捉可能と考えていたが極めて回収効率が悪いことが判明した。CTCチップにコートする抗体を各種EMT関連抗体に変更し、podoplamin抗体で回収効率が改善することが判明した。したがって2019年度はこの条件においてc研究を加速することができると考えられる。また、CTC捕捉システムについても改良が進んでいるため、さらにCTC研究を加速することが期待できる。連携研究者である富山工業センター大永博士と相談の上、上皮系細胞が血球系細胞よりも大きいことを指標とした物理的細胞のサイズに基づくソーティングによるCTCを試み、CTC回収の最効率化を図る。さらに、抗EpCAM抗体に加えEMTマーカー抗体カクテル(抗Vimentin, Fibronectin, N-cadherin抗体)癌幹細胞マーカー候補(抗CD44v, CD133, CD271抗体)、さらに上咽頭癌ではEpstein-Barrウイルス膜蛋白LMP1に対する抗体でコートしたチップ、を用いてそれぞれのチップにより捕捉される細胞を定量し、EMTが生じているCTC定量のための条件設定をさらにチューンアップする。次にそれぞれの抗体で捕捉されるCTCの生物学的特性、質的な評価を目的として、抗癌剤感受性や遺伝子発現解析を行う。まず抗EpCAM抗体、EMTマーカー抗体カクテル、癌幹細胞マーカー候補抗体、および抗LMP1抗体チップを用いて捕捉したCTCをin vitroコラーゲンゲル上で三次元培養を行う。ついでシスプラチン、ドセタキセル、5FUに加え、セツキシマブ、抗PDー1抗体に対する感受性についてCTC由来患者の原発巣の反応と比較検討する。癌の正確な悪性度評価には悪性度の高い細胞を選別して解析する必要がある。末梢循環癌細胞(Circulating Tumor cell; CTC)は浸潤や転移能力が高い、悪性度・生物学的特性を最も反映する集団と考えられいる。現在頭頸部癌においてCTC定量のために最適なマーカーが確立されていない。29年度は、将来各種の癌に応用可能なCTC捕捉システム開発の第一段階として頭頸部癌のCTCに焦点を当て、「1)頭頸部癌CTC捕捉に適したマーカーの同定と捕捉用チップを開発し、頭頸部癌CTC捕捉システムを最適化することを目的として抗EpCAM抗体のコーティング条件と感度、特異度を最適化すべく、条件設定を行った。上咽頭癌細胞株C666-1細胞や舌癌細胞株OSC-19細胞などの細胞株を用いてを健常ドナー末梢血7.5mlに、それぞれの細胞ごとに1細胞/ml、10細胞/ml、100細胞/mlとなるように混入し最適化した条件では、1細胞/mlでも検出可能であった。遠隔転移を有する臨床検体で回収できるCTCは全血5ml当たりで5個以下ながら回収は可能であった。一方で遠隔転移を有しない臨床検体からでは細胞回収が極めて低く、この原因が、真に臨床検体中にCTCが含まれていないのか抗EpCAM抗体による本回収方法の設定に問題があるのかを30年度検証する必要がある。従来の、GFP発現増殖型アデノウィルスおよびテロメスキャンによる細胞回収効率よりも抗EpCAM抗体のコーティングによるCTC捕捉チップの回収効率は低い傾向にあることから、後者の方が原因である可能性が高いと考えられる。29年度は遠隔転移を有する臨床検体で回収できるCTCは全血5ml当たりで5個以下と回収効率は低いものの可能であった。遠隔転移を有しない臨床検体からの細胞回収が極めて低い原因が未解明であるが、初年度に構築したCTC捕捉システムは培養細胞を含むサンプルからは再現性よく細胞を捕捉できることから第一段階はクリアしたと判断した。

末梢循環癌細胞(Circulating Tumor cell; CTC)は原発巣癌細胞集団の中でも上皮間葉移行(Epithelial Mesenchymal Transition; EMT)を生じた浸潤や転移能力が高い、悪性度・生物学的特性を最も反映する集団と考えられる。富山県工業技術センターで開発された抗体とマイクロ流体デバイスとを組み合わせたポリマー性マイクロチップを用いて上咽頭正常上皮細胞株NP69、上咽頭癌細胞株C666-1、舌癌由来OSC19を用いたセットアップを行なったのち、4名の臨床検体を用いてCTC捕捉を試みた。当初は抗EpCAM抗体を用いることで臨床検体においてもCTCが捕捉可能と考えていたが極めて回収効率が悪いことが判明した。さらにこのシステムで回収された細胞の量的評価は臨床的な癌悪性度を十分反映しないことが示唆された。一方でpodoplamin抗体をコートしたCTCチップで回収効率が改善することが判明した。29年度のCTC定量システムと治療効果予測に有用な臨床的パラメーターとの関連性を解析を行なった。頭頸部癌全体を対象にCTCの捕捉と臨床病期や腫瘍体積、そして、リンパ節ならびに遠隔転移との関連について検討し、それぞれの方法で捕捉されるCTC量が反映する臨床的意義は直接的に悪性度を反映すると予測していた。すなわち、EpCAM抗体を用いることで臨床検体においてもCTCが捕捉可能と考えていたが極めて回収効率が悪いことが判明した。CTCチップにコートする抗体を各種EMT関連抗体に変更し、podoplamin抗体で回収効率が改善することが判明した。したがって2019年度はこの条件においてc研究を加速することができると考えられる。また、CTC捕捉システムについても改良が進んでいるため、さらにCTC研究を加速することが期待できる。上述のごとく、遠隔転移を有する臨床検体で回収できるCTCは全血5ml当たりで5個以下ながら回収は可能であった。一方で遠隔転移を有しない臨床検体からでは細胞回収が極めて低く、この原因が、真に臨床検体中にCTCが含まれていないのか抗EpCAM抗体による本回収方法の設定に問題があるのかを30年度検証する必要がある。そのために、抗体だけでなく細胞サイズによる分画設定を行い、29年度同様にまずは培養細胞を用いて、次に臨床検体を用いて、抗EpCAM抗体によるCTCチップ法との比較検討を行い頭頸部癌に最適なCTCチップ開発をめざす。連携研究者である富山工業センター大永博士と相談の上、上皮系細胞が血球系細胞よりも大きいことを指標とした物理的細胞のサイズに基づくソーティングによるCTCを試み、CTC回収の最効率化を図る。さらに、抗EpCAM抗体に加えEMTマーカー抗体カクテル(抗Vimentin, Fibronectin, N-cadherin抗体)癌幹細胞マーカー候補(抗CD44v, CD133, CD271抗体)、さらに上咽頭癌ではEpstein-Barrウイルス膜蛋白LMP1に対する抗体でコートしたチップ、を用いてそれぞれのチップにより捕捉される細胞を定量し、EMTが生じているCTC定量のための条件設定をさらにチューンアップする。次にそれぞれの抗体で捕捉されるCTCの生物学的特性、質的な評価を目的として、抗癌剤感受性や遺伝子発現解析を行う。
TLR4リガンド認識による抗原提示プラットホームの活性化とその分子基盤

樹状細胞などの抗原提示細胞による抗原提示は、感染時の免疫応答において獲得免疫誘導の最初の一歩であり、自然免疫応答において惹起される。しかしながら、その時空間的な活性化制御機構については、未だ不明な点が多い。自然免疫学分野における細胞生物学的な解析から、これまでTLRリガンドによる活性化については動員されるシグナル伝達分子によって多く議論されてきた。しかし近年、新しく細胞内の空間制御による活性化プラットホームという概念が与えられつつある。インターフェロン産生、炎症性サイトカイン産生、さらに活性酸素についてそのプラットホームが次々と解明されていく中、抗原提示についても既に微小管依存的な管状リソソーム形成が中心的役割を担うとして報告されているが、その分子機構についてはLPS依存的かつMyD88非依存的であるということ以外何もわかっていなく、本研究では、その抗原提示活性化のプラットホームの活性化と分子基盤の解明に迫った。一部相反する応答をもたらすTLR4リガンド、LipidAとMPLによる刺激後の受容体及びアダプター分子の動態解析を行い、その動態と会合分子から抗原提示プラットホームとその応答の分子基盤の解明を試みた。特徴的な分子動態を示したアダプター分子TR間に注目し解析を進めた。結果、その会合分子について、Lc-Ms/Msを用いて、2つのリガンドの間に会合の異なる分子を複数同定した。現在その分子を対象とした詳細な検討を加えている。更に本研究で得られた成果の一部は国内及び国際学会で発表する機会をもてた。
地域間産業連関表から見た道州制

本研究では、道州制が実行される際に重要となってくる区割り(都道府県の組み合わせ)の判断材料となる指標を提示する。現在、3つの区割り案が提案されている。これらを比較、検討するために、47都道府県産業連関表を作成したのち、3つの区割り案に対応する地域間産業連関表を作成する。地域間の経済波及効果のうち自地域のみの経済波及効果を測ったAPLGapという指標を導入し、3つの区割り案ごとに、自地域内での経済波及の状況を考察する。
口腔癌のリンパ節転移に対する遺伝子治療の研究

口腔癌で高頻度にみられるリンパ節転移は頸部郭清手術で治療されるが、表在性に散発するリンパ節転移に対応する有効な治療法はない。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)を用いた腫瘍融解療法の研究において、乳癌患者の転移リンパ節転移にHSV-1 HF10を投与することで腫瘍抑制効果がみられたと報告されており、リンパ節転移の新しい治療法として期待が寄せられている。本研究では臨床研究段階にある神経毒性遺伝子_<γ1>34.5遺伝子を欠失したHSV-1 R849とHF10が由来するHF株を用いて、これらの抗腫瘍効果を増強させる併用治療法について検討を行い、以下の結果を得た。1)肺転移を生じた患者より樹立した口腔扁平上皮癌細胞のヌードマウス頬部皮下移植で頸部リンパ節転移ならびに肺転移が認められた。2)R849を口腔扁平上皮癌細胞に感染しウイルス産生量を測定したところ、ウイルス産生の増加にともなって細胞生残率が低下した。感染後より白血病細胞の分化誘導剤ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)を存在下させると、HSV-1の前初期遣伝子の転写が亢進し、ウイルス産生量はさらに増加した。3)口腔扁平上皮癌を移植したヌードマウス腫瘍にR849を投与した群あるいはR849投与に加えHMBA腹腔内投与を行った群では、HMBA投与群で腫瘍が強く抑制され生存率も延長した。4)感染症では活性酸素が産生されるためHSV-1を感染に及ぼす影響を検討したところ、過酸化水素は上皮細胞からのウイルス放出を促進することが明らかとなった。5)HSV-1のHF株を用いた検討では、細胞融合によって巨大な多核巨細胞が形成され、細胞死が誘導された。口腔癌に対してもHFの抗腫瘍効果は十分期待できる。口腔癌患者では平均して30%に頸部リンパ節転移がみられる。転移が浅頸リンパ節に波及したり周囲に浸潤した場合、病変を完全に切除することは困難となる。このような進展症例に対する口腔癌のウイルスベクター遺伝子治療を成功させるためには、原発巣と頸部リンパ節転移巣を対象とした研究が必要である。1)肺転移能を有する口腔扁平上皮癌細胞FIをヌードマウス頬部に移植した結果、皮下腫瘍の形成と顎下リンパ節転移ならびに肺転移が認められた。2)単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)の神経障害遺伝子であるγ_134.5遺伝子を欠損した変異型HSV-1R849を各種口腔癌細胞に感染しウイルス産生量を測定した結果、感染多重度に依存してウイルス産生が増加した。さらにMTTアセイとトリパンブルー排除試験にて、R849の複製に伴って口腔扁平上皮癌細胞の生残率が低下することを確認した。3)口腔癌細胞におけるR849による腫瘍細胞融解効果を増強するために、白血病細胞の分化誘導剤でありHSV-1の再活性化を誘発することが報告されているヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)存在下でR849感染を行ったところ、ウイルスの前初期遺伝子ICP0、ICP4、ICP27の転写の亢進がみられ、R849の産生量は増加した。4)HSV-1感染の局所では免疫細胞による活性酸素の産生がみられる。そこで、HSV-1感染に対するH_2O_2の影響につき検討した。その結果、H_2O_2処理にて感染上皮細胞からのウイルス放出が顕著に促進されることが明らかとなった。さらに電子顕微鏡観察で、細胞膜の断裂、細胞間境の拡大がみられ、これに伴ってウイルス粒子の細胞外への漏出、細胞間境からの拡散が認められた。

このようなHSV-1複製過程に影響を及ぼす因子の研究を通じて、R849の実験動物での口腔癌融解効果の増強を図る方針である。複製可能型変異単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)を用いた癌治療は、ウイルスがもつ細胞変性効果を利用して腫瘍細胞を融解するものである。HSV-1の神経傷害性遺伝子_<γ1>34.5を欠損した変異型HSV-1 R849を培養口腔癌細胞に感染し、癌細胞の分化誘導剤であるヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)で処理したところ、HSV-1の前初期遺伝子の転写が亢進し、R849の産生量は増加した。そこで、生体での抗腫瘍効果を明らかにするため、頬部に口腔扁平上皮癌細胞を接種して形成された腫瘍内にR849を単独で投与する群、R849の腫瘍内投与に加えてHMBAを腫瘍内あるいは腹腔内に投与する実験群を設定し、実験を行った。その結果、腫瘍にR849を投与することで腫瘍形成は抑制されたが、R849の腫瘍内投与に加えてHMBAを腫瘍内あるいは腹腔内投与した場合、腫瘍抑制はより顕著で、投与50日まで腫瘍の退縮を認めた。R849単独投与では腫瘍は一旦縮小するものの再増殖し腫瘍の増大に伴って腫瘍死する動物がみられた。HMBA投与群では再増殖も抑制され、生存率をカプランマイヤー法で求めるとHMBA腹腔内投与群で最も生存率が延長した。これらR849とHMBA投与を行った群では、ウイルス遺伝子のICP0、ICP4、TK、VP16の発現が亢進しており、in vivoにおいてもHMBAはウイルス遺伝子発現を介して細胞傷害増強効果を示すことが明らかとなった。腫瘍細胞では核染色、FACS解析でアポトーシスが確認された。また、ウイルス感染によって生じる炎症時に発生するフリーラジカルに関する研究では、H_2O_2はHSV-1を感染させた上皮細胞からのウイルス放出を促進することが明らかとなり、活性酸素のHSV-1感染への関与が示唆された。表在性、散発性に出現した口腔癌の頸部リンパ節転移に有効な治療はないが、乳癌の転移リンパ節転移に対してはHSV-1 HF10の投与で抑制効果が報告されており、リンパ節転移の新しい治療法として期待されている。1)神経毒性遺伝子γ_134.5遺伝子を欠失したHSV-1 R849株を用いて抗腫瘍効果につき検討した結果、口腔扁平上皮癌を移植したヌードマウス腫瘍にR849を投与した群あるいはR849投与に加え白血病の分化誘導剤であるヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)腹腔内投与を行った群では、HMBA投与群で腫瘍が強く抑制されマウスの生存率も延長した。2)ウイルス感染症では炎症に伴って活性酸素が産生される。HSV-1を感染に及ぼす影響を検討したところ、過酸化水素は上皮細胞からのウイルス放出を細胞膜の透過性亢進によって促進することが明らかとなった。3)乳癌のリンパ節転移に対して効果があるHSV-1 HF10はHFのクローンウイルスである。HF株を用いた検討では、細胞融合によって巨大な多核巨細胞が形成され、口腔癌細胞の細胞死が誘導された。口腔癌に対してもHFの抗腫瘍効果は十分期待できる。4)ホウ素化合物をあらかじめ口腔癌細胞に取り込ませたのち中性子線を照射し、飛程距離の短い放射線を発生させ腫瘍を死滅させるホウ素中性子補捉療法は進展口腔癌に極めて有効であった。今後、HSV-1との併用を考える上で有用な選択的放射線治療といえる。
生殖母体表面蛋白を用いた新規三日熱マラリア伝搬阻止ワクチンの作成

生殖母体表面蛋白Pvs47及びPvs48を抗原として用いた伝搬阻止ワクチンが新たに作成できれば、現在開発中のオーキネート表面蛋白を抗原とした三日熱マラリア伝搬阻止ワクチンとは作用点が異なるため、Pvs25ワクチンと併用時の相乗/相加効果が期待でき、また、免疫後原虫に感染した時に抗体価のブーストが期待できる。1.DNA免疫法を用いた特異抗血清の作成三日熱マラリア原虫生殖母体表面蛋白Pvs47及びPvs48はシステインに富む3つのドメインを持つ。そこでドメイン全長、又は最後の「6Cys」のみを、DNAワクチン用プラスミドVR1020に組み込んだ。これらのプラスミドをマウス、及びラットの耳介皮内に注射してDNA免疫を行い、Pvs47及びPvs48の立体構造を認識する抗体を誘導することを試みた。その際、Alumアジュバント、またはDNAワクチン用に開発されたアジュバントVaxfectinを用いて免疫を行った。その結果、Pvs47及びPvs48いずれも全長を含むプラスミドにおいて昨年度のpJW4304を用いた免疫の際よりも高い抗体価がマウスに誘導された。これらの抗血清と三日熱マラリア原虫生殖母体を抗原に用いた間接蛍光抗体法により、Pvs48は原虫表面に、Pvs47は原虫細胞質内にも発現していることが明らかとなった。2.Pvs47及びPvs48の遺伝子多型の解析タイ、バヌアツ、コロンビアのマラリア流行地において得られた23分離株の解析から、Pvs47では3カ所の同義置換、15カ所の非同義置換が認められ、非同義置換は前半部の6Cys-2Cysの部分に集中していた。Pvs48では4カ所の同義置換、7カ所の非同義置換が認められ、非同義置換はC末端に近い6Cysの部分に比較的多数認められた。また、Pvs47、Pvs48いずれも多型に地域的偏りが認められた。これらのデータの集団遺伝学的解析から、少なくともPvs47は、何らかの選択圧によって多型が生じていることが示唆された。また、Pvs48においても、最後の「6Cys」ドメインは選択圧にさらされていることが示唆された。
光コム顕微鏡を用いた非侵襲生体イメージング法の創出

本研究では,極限的光源である光コムを利活用し,その光強度と位相同時計測能を用いた新たな光学顕微鏡「光コム顕微鏡」を実現する.これにより,これまで実現困難であったサブマイクロメートルの分解能を有する3次元光学定数分布イメージングを実現する.また,開発した光コム顕微鏡を細胞や生体組織イメージングへ応用することで,これまで可視化が難しかった生体組織や細胞の3次元屈折率分布・構造異方性分布・偏光解像度分布の可視化を行い,3次元光学定数分布に基づき生体構造を可視化する新たな無侵襲生体イメージング法を創出する.2018年度は,光コム顕微鏡の基本光学系の開発と,生体イメージングへ向けた基礎的検討を行った.光コム顕微鏡の基本光学系の開発では,研究代表者である南川が主担当として,まず光コムを光源としてレーザースキャナーを有した顕微光学系の開発と最適化を行った.光源には自作のErファイバーベースのデュアル光コムシステムを用い,光源を本研究目的のために安定化,最適化を行った.また,研究代表者の南川や研究分担者の浅原が主担当として,効果的に信号を取得できる光コムの条件について探求した.特に,光コム計測により得られる時間波形のAD変換方法,データ保存・処理方法,また得られた強度,位相情報の回復方法,2次元可視化法の考案を行った.その結果,安定して高い信号/ノイズ比で検出可能な光コム顕微鏡の条件を明らかにした.さらに,研究分担者の安井が主担当として,生体イメージングへ向けた基礎的検討を行った.その結果,光コムを用いた屈折体計測への可能性を明らかにした.当初の計画通り,光コム顕微鏡の基本光学系の開発と生体イメージングへ向けた基礎的検討を実施し,本手法の原理検証を行うことができたため.2018年度は,当初の計画通りに研究が進んだ.そのため,今後も研究計画に則り,研究を推進していく.本研究では,極限的光源である光コムを利活用し,その光強度と位相同時計測能を用いた新たな光学顕微鏡「光コム顕微鏡」を実現する.これにより,これまで実現困難であったサブマイクロメートルの分解能を有する3次元光学定数分布イメージングを実現する.また,開発した光コム顕微鏡を細胞や生体組織イメージングへ応用することで,これまで可視化が難しかった生体組織や細胞の3次元屈折率分布・構造異方性分布・偏光解像度分布の可視化を行い,3次元光学定数分布に基づき生体構造を可視化する新たな無侵襲生体イメージング法を創出する.2018年度は,光コム顕微鏡の基本光学系の開発と,生体イメージングへ向けた基礎的検討を行った.光コム顕微鏡の基本光学系の開発では,研究代表者である南川が主担当として,まず光コムを光源としてレーザースキャナーを有した顕微光学系の開発と最適化を行った.光源には自作のErファイバーベースのデュアル光コムシステムを用い,光源を本研究目的のために安定化,最適化を行った.また,研究代表者の南川や研究分担者の浅原が主担当として,効果的に信号を取得できる光コムの条件について探求した.特に,光コム計測により得られる時間波形のAD変換方法,データ保存・処理方法,また得られた強度,位相情報の回復方法,2次元可視化法の考案を行った.その結果,安定して高い信号/ノイズ比で検出可能な光コム顕微鏡の条件を明らかにした.さらに,研究分担者の安井が主担当として,生体イメージングへ向けた基礎的検討を行った.その結果,光コムを用いた屈折体計測への可能性を明らかにした.当初の計画通り,光コム顕微鏡の基本光学系の開発と生体イメージングへ向けた基礎的検討を実施し,本手法の原理検証を行うことができたため.2018年度は,当初の計画通りに研究が進んだ.そのため,今後も研究計画に則り,研究を推進していく.
トランスコーディングエージェントの動的配置による柔軟な相互通信環境の構築

平成16年度は、平成15年度に実装したシステムを基盤として、マルチメディア会議のためのアプリケーションとプロトタイプシステムを構築した。今年度開発した機能の1つであるミキサー機能は、本システムの利用価値とスケーラビリティを向上させる機能であり、利用者環境に応じた数十拠点間通信を動的に実現するためのアルゴリズムを試すことが可能となる。また、多地点通信で有用となるビデオウィンドウ自動配置機能を実現した。この機能は、複数のビデオストリームをディスプレイへ表示する際、ウィンドウサイズと位置の調整を容易にする。実際、本システムの利用した通信イベントでは、ウィンドウの配置や表示切り替えを円滑に行うことが可能であった。また、ギガビットイーサネットによるLANにおいて、16本のDVストリームを16本のMPEG4+PCMストリームへ変換するトランスコーディング機能を、4台のMidField Systemで負荷分散しながらリアルタイムに実現できることを確認した。一方、DVストリームによる4者間通信セッションに、MPEG4+PCMストリームを用いる2者を加えた6者間通信セッションを動的に構成できることも確認した。本システムを用いることにより、DVストリームを用いた数者間通信や、MPEG4+PCMストリームを用いた10数者間での通信が可能となり、利用者環境や拠点数、通信に必要となる帯域幅や計算機資源に応じて、複数のフォーマットを組み合わせた柔軟な通信セッションを実現することが可能となった。平成15年度は,下記(a)(f)の関連研究調査と必要技術の検討を行った.(a)アクティブネットワーク,マルチメディア会議システムおよびエージェント指向アーキテクチャ(b)ATMシステムアーキテクチャとQoS保証機能,ネットワーク層より上位層のQoSを考慮したアーキテクチャ(c)必要な機能の動的な組織を実現するための仕組み(d)各メディアのQoSパラメータと,OSやネットワーク固有のパラメータの調査およびマッピング手法(f)DV,MPEG1/2/4,H.261などの圧縮方法,および遅延,ジッタなどの制御方法また,下記(a)(e)の項目を実現するためのシステムアーキテクチャを設計し,基本的な機能の実装を行った.(a)ネットワーク層より上位層におけるQoS保証・適合機能(b)必要となる機能の動的な組織化(c)複数利用者を対象としたQoS交渉および調整(d)蓄積,リアルタイムおよび連続,非連続メディアの統合(e)トランスコーディング機能の動的利用本研究成果の1つとなるプロトタイプシステムでは,DVストリームとMPEG4ストリームが混在する相互通信環境を,移動エージェントによるトランスコーディング機能を用いて動的に構築することが可能となった.しかしながら現在,プロトタイプシステムは現在評価段階であり,引き続き改良が必要な状態である.平成16年度は、平成15年度に実装したシステムを基盤として、マルチメディア会議のためのアプリケーションとプロトタイプシステムを構築した。
味覚受容体の卵形成・初期発生への関与：一卵性の双子が生まれる分子機構の解明

H30年度は、流水飼育システムを構築し、メダカ飼育環境を整えた。その上で、味覚受容体遺伝子遺伝子編集メダカが産卵した受精卵の発生時に異常が見られた表現型を再現するため、同じ部位を標的とし、CRISPR/Cas9法で変異を導入する追試を実施した。前回表現型が得られたd-rR/TOKYOと新たに実施するOK-Cabの2系統で遺伝子編集を実施したが、成育後の交配で得られた受精卵に同じ表現型は見られず、それ以外の発生や行動などにも目立った異常は見られなかった。また、実験したうち正常な産卵が見られた2匹のメダカについては、受精率・孵化率・稚魚の生存率について、野生型での文献値と大きな違いは見られなかった。なお、これらのG0メダカのジェノタイピングを実施した結果、産卵数および受精率が顕著に低かった1匹のG0メダカと産卵に異常の見られなかった2匹のG0メダカとで、味覚受容体に導入されていた変異は同一であったことから、産卵能と味覚受容体変異との関係性は判明しなかった。さらに遺伝子編集メダカの交配を進めたが、H30年度内に得られたF1世代、F2世代においては、発生や行動などに目立った表現型は得られなかった。これらの結果から、味覚受容体遺伝子編集メダカが産卵した受精卵で見られた発生異常は、味覚受容体変異によって一般的に起こる現象ではなく、当該の変異メダカに導入された特異的な変異が原因であった可能性、当該メダカの生殖系に特異的に導入された変異が原因であった可能性、当該メダカの特異的な遺伝的背景が必要である可能性が示唆された。上述の実験に加え、味覚受容体ノックアウトメダカの系統化を目指し、F1世代のジェノタイピングを実施し、交配を進めるとともに、遺伝子編集による追試をさらに進めるため、異なる部位を標的とするガイドRNAを設計し、受精卵へのインジェクションを実施した。H30年度は、異なる2系統について味覚受容体遺伝子編集の追試を実施し、本研究課題の目的となる発生時に異常の見られる卵を産卵する表現系の取得を試みたが、残念ながら期待される表現系を示した個体は得られなかった。また、H30年度中に、これらの遺伝子編集メダカからF1, F2世代まで交配を進めたが、現在までのところでは、これらの世代についても目立った異常は見られておらず、味覚受容体と卵形成・発生との関連性はまだ明確になっていない。これらの状況から、本課題は現在のところ当初の計画よりやや遅れていると自己評価する。一方、H30年度には飼育環境を構築し、正常なメダカであればH29年度と比較して生存率が高い状況でメダカを維持できる研究環境を整えた。また、上述のように味覚受容体遺伝子編集メダカの交配を進めており、H31年度前半にはホモノックアウトメダカを確立できる見込みである。ホモノックアウトメダカを用いて、ヘテロノックアウトメダカや野生型メダカと比較した表現型比較が可能になることで、味覚受容体と卵形成・発生との関連性がこれまでより明確にできるものと考えられることから、当初の研究目的の達成を目指す予定である。さらに、「今後の研究の推進方策」に示すように、作製したノックアウトメダカについて、卵形成・発生に限定しない表現型解析を実施することで、味覚受容体の生体内での幅広い器官における生理機能解明という、本課題の目的よりも一段視野を広げた目的での成果達成を目指すことも検討する。H30年度に交配を進めた味覚受容体遺伝子編集メダカのF2世代のジェノタイピングとさらなる交配を進め、味覚受容体ホモノックアウトメダカ系統の作製を行う。味覚受容体ホモノックアウトメダカが得られれば、以前発生に異常が見られたときと同様に野生型オスメダカとの交配を行い、以前得られた表現型が再現できるかどうかを確認する。加えて、卵形成や初期発生時などの表現型を確認するだけではなく、食餌行動など、その他の生理機能や行動などに異常が見られるかどうかを、ヘテロノックアウトメダカや野生型メダカと比較した表現型解析を実施する。何らかの生理機能に異常が見られれば、その生理機能に関連する組織・器官での味覚受容体の発現を野生型のメダカの免疫染色により確認するとともに、ノックアウトメダカと野生型メダカを解剖学的に比較し、組織・器官形成への異常の有無を確認する。これらの解析から、生体内の様々な組織における味覚受容体の発現と生理機能との関係を明らかにする。一方、H30年度の解析の結果から、以前観察された発生時に異常を示す表現系は、味覚受容体への変異導入により一般的に起こる現象ではなく、当該メダカのみに導入された変異など、何らかの特異的な条件が関わる可能性も示唆された。そこで、当該メダカで見られた変異型味覚受容体の発現解析や機能解析を実施し、卵形成・発生時異常が見られたメダカが持っていた味覚受容体機能の様相を解明する。さらに、CRISPR/Cas9法での遺伝子編集時において、当該変異が得られる確率が低い可能性も勘案し、CRISPR/Cas9法による多重変異同時導入や、プロモーター領域への変異導入などにより、引き続き同じ表現型が見られるG0メダカの作製も試みる。

味覚受容体遺伝子T1r3をCRISPR/Cas9法によりノックアウトしたG0メダカが産卵し、発生時に異常が確認されたF1世代の胚および稚魚と、同じノックアウトメダカが産卵し、通常の表現型で発生した胚および稚魚について、ジェノタイピングを実施した。その結果、発生時に異常が確認された個体で見られたindel変異と、通常の表現型で発生した個体で見られたindel変異は、基本的に同一のものであったことから、味覚受容体のノックアウトによる発生時の異常は、導入された変異の種類によらず起こることを明らかにした。F1世代で確認されたindel変異のうちの2種類は、フレームシフト変異で、その他の変異は偽遺伝子化を引き起こす変異であった。これらの変異は受容体の細胞外領域に導入されていたため、フレームシフト変異のうちの1種類を導入した変異体を作製し、昆虫培養細胞を用いて細胞外領域部分の組換え発現を行った。その結果、野生型と同様に分泌発現が見られることを確認し、フレームシフト変異体についても、ある程度の受容体構造を保って発現している可能性を見出した。これらの変異体についてそれぞれ系統化を試みた。しかしながら、F1, F2世代ともに、繁殖能自体は有していたものの、野生型と比較し死亡率が高く寿命が短い傾向が見られ、本年度内に系統化を達成できなかった。そこで、drRとCabの2系統について、課題開始前に行ったのと同様の方法で受精卵にgRNAのインジェクションを実施し、T1r3のノックアウトメダカをさらに追加作製した。本年度は、発生時に異常が見られた味覚受容体T1r3遺伝子ノックアウトメダカについてジェノタイピングを実施し、変異の導入部位、変異の様式およびフレームシフト変異の場合の発現タンパク質の性状について明らかにした。これらの結果をもとに、発生時に異常が発生するか通常の表現型で発生するかは、導入された変異の種類によらず決定されることを明らかにした。これらの項目に関しては、本年度の実施項目の目標を達成できており、研究が順調に進捗していると言える。一方、ここから先に研究を進め、味覚受容体変異がどのように発生異常を引き起こすかを解明していくためには、これらの変異体の系統作製が重要であるが、残念ながら年度内の系統作製には至らなかった。この原因として、当初には十分予期ができていなかったことであるが、味覚受容体ノックアウトメダカが野生型と比較し死亡率が高く寿命が短いことが判明し、順調な交配が進まなかったことが挙げられる。また、これまで研究代表者にメダカ飼育実験の経験がなく、本課題開始と同時に飼育環境の構築を開始したが、安定した条件を確立するのにやや時間を要してしまったことも一因である。この項目に関しては、残念ながら当初計画より進捗がやや遅れている。以上から、本年度計画していた項目のおおむねについて順調に進展したものの、一部の重要な研究項目で当初計画より進捗がやや遅れていることから、本課題は現在のところ当初の計画よりやや遅れていると自己評価する。なお、本年度の研究実施において味覚受容体変異メダカの死亡率・寿命についての情報が得られたこと、ある程度のメダカ飼育環境の構築ができており、環境を改善した新システム導入について情報収集と準備を進めていること、すでに変異メダカの追加作製を進めていることから、課題全体としては深刻な遅れがなく進めていけるであろうと考えている。H30年度は、流水飼育システムを構築し、メダカ飼育環境を整えた。その上で、味覚受容体遺伝子遺伝子編集メダカが産卵した受精卵の発生時に異常が見られた表現型を再現するため、同じ部位を標的とし、CRISPR/Cas9法で変異を導入する追試を実施した。
国際語としての「日本英語」の談話的特徴の分析：コーパス準拠の仮説検証アプローチ

本研究の主たる目的は、日本人英語使用者コーパス(JUCE)等を活用し、先行研究(藤原, 2014)にて確認された国際英語としての「日本英語」の談話的特徴の多層的な追検証を行うことである。アジア人の英語使用者コーパスであるAsian Corpus of English (ACE)の一部のデータの質的分析(Fujiwara, 2014)、日本人以外の学習者コーパスや使用者データの量的かつ質的分析(Fujiwara, 2016)を行った結果、この「内容語依存」や「定型性」の特徴が、日本人の言語特徴を表しているのみならず、広範囲の第二言語使用者全体に同定し得る特徴でもある可能性が示唆された。本研究は,日本人英語使用者コーパス(JUCE)等を活用し,国際英語としての「日本英語」の談話的特徴の多層的な追検証を目的とする。JUCEとは,国際英語コーパス(ICE)を参考にし,日本人英語使用者,即ち「日本語を母語とし,日本で小中高の教育課程を経て,仕事で英語を使用するもの」(藤原2006, Fujiwara 2007)により用いられた英語の集積データである。報告者の過去の研究にて得られた談話的特徴の追検証を行い,「日本英語」の特徴をより明確かつ詳細に示す予定である。今年度においては,「内容語依存」,すなわち日本人英語使用者は内容語に依存し,英語母語話者ほど,機能語を用いないという特徴と,「定型性」,すなわち同じ語をある程度繰り返し使用する傾向の2つに焦点を当てて,ケース・スタディを行った。報告者はアジア人の英語使用者コーパスであるtheAsian Corpus of English編纂プロジェクトに関与している。そのプロジェクト内で得られた話し言葉のデータの一部を質的に分析し,同じ名詞の反復使用の傾向が一定程度伺える調査結果を得た。これらの「内容語依存」や「定型性」を示唆する特徴が品詞,語彙のマクロな分析等で検出されているものの,今後さらにミクロな追検証が必要とされる。このような記述的研究を蓄積することにより,二言語併用者としての日本人英語使用者の英語の特質を体系的に記述することが期待される。その蓄積の暁には,現状の無理に英語母語話者の鋳型にはめる単一言語話者ベースの英語教育から,日本人英語使用者を目指す二言語併用者ベースの英語教育を構築することを可能にする意義がある。本研究は,日本人英語使用者コーパス(JUCE: Japanese User Corpus of English)等を活用し,国際英語としての「日本英語」の談話的特徴の多層的な追検証を目的とする。JUCEとは,国際英語コーパス(ICE)を参考にし,日本人英語使用者,即ち「日本語を母語とし,日本で小中高の教育課程を経て,仕事で英語を使用するもの」(藤原2006, Fujiwara 2007b)により用いられた英語の集積データである。他の英語使用者コーパス(the Asian Corpus of English)を用いた分析(Fujiwara, 2014)や報告者の一時的分析等においても,「日本英語」の「定型性」を示唆する結果が得られつつある。平成26年度,平成27年度,両年度とも研究に取り組んだものの,十分なレベルまでの研究に達していない。その主たる理由は,所属機関の関連業務の運営,および報告者の異動により,本研究に対する時間が十分にとれなかったため。本研究の主たる目的は、日本人英語使用者コーパス(JUCE,藤原, 2014)等を活用し、国際英語としての「日本英語」の談話的特徴の多層的な追検証を行うことであった。この研究期間においてはとりわけ「内容語依存」、すなわち日本人英語使用者は内容語に依存し、英語母語話者ほど機能語を用いない特徴と、「定型性」、すなわち同じ語をある程度繰り返し使用する傾向の2つに焦点を当てて、研究を行った。まずアジア人の英語使用者コーパスであるAsian Corpus of English(ACE)の一部のデータを質的に分析し、同名詞の反復使用の傾向が一定程度伺える調査結果を得た(Fujiwra, 2014)。次にこのJUCEの分析によって得られた結果を、日本人以外の学習者コーパスや使用者データを利用して、量的かつ質的に分析を行った。その結果、この「内容語依存」や「定型性」の特徴が、日本人の言語特徴を表しているのみならず、第二言語使用者全体に同定し得る特徴でもある可能性が示唆された(Fujiwara, 2016)。本研究の内容はさらに掘り下げられ、2017年6月、フィンランドで開催される国際学会、10th Anniversary Conference of English as a Lingua Francaで発表される予定である。これらの「内容語依存」や「定型性」が日本人英語使用者のみならず、世界の多くの英語の第二言語使用者に共通する特徴であるならば、現在の母語話者依存の英語教育へ一石を投じることができる。つまりこのような記述的研究を蓄積することにより、「国際共通語としての英語」(English as a Lingua Franca)のコミュニケーションに資する一方、現状の無理に英語母語話者の鋳型にはめる単一言語話者ベースの英語教育から、二言語併用者ベースの英語教育への転換を図ることができる。

アジア人の英語使用者コーパスであるAsian Corpus of English (ACE)の一部のデータの質的分析(Fujiwara, 2014)、日本人以外の学習者コーパスや使用者データの量的かつ質的分析(Fujiwara, 2016)を行った結果、この「内容語依存」や「定型性」の特徴が、日本人の言語特徴を表しているのみならず、広範囲の第二言語使用者全体に同定し得る特徴でもある可能性が示唆された。平成26年度内に射程としていた分析対象項目には予定通り焦点をあて,取り組んだものの,十分なレベルまでの研究に達していない。その主たる理由は,所属機関の関連業務の運営や研究の都合で,本研究に対する時間が十分にとれなかったため。今後の研究推進方策としては,転出後の研究環境を整え次第,最終年度を迎える本研究課題を進める予定である。研究を遂行する上での大きな課題は,検証を可能にする別の日本人による「英語使用者」レベルのコーパスが,報告者の知る限り,存在しないか,利用可能でないことである。「検証」において望ましい手法は,あるデータで確認できた傾向が他のデータで確認できることである。そのため,報告者はthe Asian Corpus of Englishなどの「使用者」コーパスの構築に協力をしてきた。本研究目的に合致した比較検討可能なコーパスがあると,より多層的な分析が可能になるだろう。応用言語学今後の研究の推進方策として,積極的に情報発信を行うことにより,関連の国内外の専門家よりフィードバックを得て,研究を進めることを考えている。また別の研究プロジェクトの運営業務や研究活動からも,大変貴重なフィードバックを得ることは多々ある。そのため,全体の業務に着実に取り組み,本研究課題の推進も行っていきたい。旅費が当初の予定よりも少額に抑えることができたため。当初予定していた統計ソフトウェア等の購入を見送ったため。本研究課題を遂行中に転出したため,年度当初に研究環境の整備を行う必要がある。また研究成果を公開するための旅費などに助成金を使用する予定である。平成27年度に関連ソフトウェア等の設備やコーパス関連の図書を充実させ,本研究に注力する予定である。
臨床入手可能な細胞を用いた体外培養下における歯・歯周組織ユニットの再生

ヒトで応用できるように臨床で入手可能な細胞を用いて、歯・歯周組織ユニットの再生を目指した。まず、有用な細胞源として、抜去歯からマラッセ上皮遺残細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞を分離した。分離した細胞を用いて、内部に歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズの表面にマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)を作製した。歯根膜細胞シートを作り、これで細胞ビーズを包み、スキッドマウスの腹腔内に移植した。1ヶ月後に開腹し、組織形成物を探したところ、実体顕微鏡下で歯・歯周組織様ユニットの組織形成物が確認された。臨床で入手可能な細胞で、しかも再生歯が必要となる年齢の歯を用いて歯・歯周組織ユニットを再生する為に、まず生体と一致した構造の歯冠の形成を試みた。歯冠形成に有用な細胞源として、エナメルを形成する能力を維持していると考えられ、分離培養しやすいブタのマラッセ上皮遺残細胞とマラッセ上皮遺残細胞のエナメル上皮細胞への分化を促進する為にヒトの歯髄細胞を用いた。マラッセ上皮遺残細胞の分離は以下の方法で行った。ブタの抜去歯から歯根膜を尖刀でこそぎ落とし培養すると、線維芽細胞のシートの中にマラッセ上皮遺残細胞コロニーが散在した。ここからマラッセ上皮遺残細胞をcolonial cloningし、マラッセ上皮遺残細胞を分離した。細胞の同定はCytokeratin14・Amelogenin・Ameloblastin・Enamelin・Tuftelinの免疫染色とRT-PCRで行い、発現を確認した。In vivoで生体と一致した構造の歯冠を形成させるために、内部にヒト歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズにブタマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)を56週齢のスキッドマウスの腹腔内に移植し、14日、28日後に開腹し細胞ビーズを探したところ、ほとんど見つけることが出来なかった。その原因の1つとして、コラーゲンの分解速度が関係していると考えられ、分解速度が早いと歯冠様組織の形成前に足場であるコラーゲンがなくなってしまう為、うまく形成できなかったと考えられた。そこで、ヒト歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズを作製するときにビーズを固めに作製し、ブタマラッセ上皮遺残細胞を付着させ、スキッドマウスの腹腔内に移植し14日後に摘出したところ、細胞ビーズが確認された。ビーズの周囲で、しかもビーズに接した部分には大型の細胞が存在した。この細胞がエナメル上皮か否か検討中であるが、ビーズ内に膠様組織(胎児の臍帯に見られる結合組織)に類似した細胞が観察された。歯冠形成に有用な細胞源として、エナメルを形成する能力を維持していると考えられ、しかも分離培養しやすいブタのマラッセ上皮遺残細胞を用いた。マラッセ上皮遺残細胞からエナメル上皮細胞への分化を促進する為にヒトの歯髄細胞を用いた。ブタの抜去歯の歯根膜なか1/3を尖刀でこそぎ落とし培養すると、線維芽細胞のシートの中にマラッセ上皮遺残細胞コロニーが散在した。ここからマラッセ上皮遺残細胞をcolonial cloningして、分離した。細胞の同定はCytokeratin14・Amelogenin・Ameloblastin・Enamelinの免疫染色とRT-PCRで行い、これらエナメル特有蛋白の発現を確認した。In Vivoで生体と一致した構造の歯冠を形成させる為に、内部にヒト歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンにブタマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)を5-6週齢のスキッドマウスの腹腔内に移植した。1ヶ月後に開腹し細胞ビーズを探したが、形成物の発見に至るのに困難があった。歯冠のみの形成だと組織形成物が小さく腹腔内での確認が難しいと考えられたため、歯周組織形成に有用な細胞源であるヒトの歯根膜細胞を用いて、歯・歯周組織ユニットの形成を試みた。すなわち歯根膜細胞をover confluentに培養し、歯根膜細胞シートを作り、これで上記の細胞ビーズを包み、スキッドマウスの腹腔内に移植した。1ヶ月後に開腹し、組織形成物を探したところ、小臼歯様・歯周組織様ユニットの組織形成物が確認された。この組織形成物については現在解析中である。In vivo(腹腔内移植)で生体と一致した構造の歯冠および歯・歯周組織ユニットの作製に時間がかかったためまた、再現性が乏しいため歯は一度失うと元の歯と同じ機能を取り戻すのは難しいのが現状であり、もし、歯・歯周組織ユニットを再生し、顎骨の中に生着できれば、元の歯と同じ機能を取り戻せると考えられる。そこでヒトに応用できるように臨床で入手可能な細胞を使い、歯・歯周組織ユニットの再生を目的とした。歯・歯周組織ユニットの再生に有用な細胞源として、エナメルを形成する能力を維持していると考えられるマラッセ上皮遺残細胞(分離培養しやすいブタの歯根膜由来)を使用した。更に、マラッセ上皮遺残細胞の分化を促進するためにヒト歯髄細胞を、歯周組織の形成にヒト歯根膜細胞を使用した。抜去歯の歯根

中央部から歯根膜を尖刃でシャーレ内の培養液中に削ぎ落とし静置培養すると、線維芽細胞シートの中にマラッセ上皮遺残細胞コロニーが散在した。ここからマラッセ上皮遺残細胞を濾紙法にてcolonial cloningし、分離した。細胞の同定はCytokeratin14・Amelogenin・Ameloblastinの免疫染色とRT-PCRで行い、発現を確認した。In vitroで生体と一致した構造の歯冠を形成させる為に、内部にヒト歯髄細胞を密に入れたアテロコラーゲンにブタマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)をスキッドマウスの腹腔内に移植し、1ヶ月後に開腹し細胞ビーズを探したが、歯冠のみの形成だと組織形成物が小さく腹腔内での形成物の発見に至るのに困難があった。そこで、歯周組織に有用なヒト歯根膜細胞を用いて、歯・歯周組織ユニットの形成を試みた。歯根膜細胞をover confluentに培養し、歯根膜シートを作り、これで上記の細胞ビースを包み、スキッドマウスの腹腔内に移植した。1ヶ月後に開腹し、組織形成物を探したところ、実体顕微鏡下で小臼歯・歯周組織様ユニットの組織形成物が確認された。ヒトで応用できるように臨床で入手可能な細胞を用いて、歯・歯周組織ユニットの再生を目指した。まず、有用な細胞源として、抜去歯からマラッセ上皮遺残細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞を分離した。分離した細胞を用いて、内部に歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズの表面にマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)を作製した。歯根膜細胞シートを作り、これで細胞ビーズを包み、スキッドマウスの腹腔内に移植した。1ヶ月後に開腹し、組織形成物を探したところ、実体顕微鏡下で歯・歯周組織様ユニットの組織形成物が確認された。In vivoで細胞ビーズに歯根膜細胞シートをまき、生体と一致した構造の歯・歯周組織ユニットの形成を行う。また再現性が乏しいため、再現効率をあげる条件を検討する。また、ビーズの吸収速度の調製や移植期間をかえるなどし、歯・歯周組織ユニットに至るまでの様子を確認する。In vivoで歯・歯周組織ユニットの形成を確認できたら、その結果をふまえてin vitroでも形成できる条件を検討する。再生医療In vivoでヒト歯髄細胞とマラッセ上皮遺残細胞を用いた細胞ビーズで生体と一致した構造の歯冠の形成を行う。歯冠の形成にはコラーゲンの分解速度との兼ね合いがあると考えられるため、ヒト歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズの固さを検討する。また、スキッドマウスの腹腔内に28日間移植するなど、歯冠形成に至れる条件を検討する。In vivoで歯冠の形成が確認できたら、その結果をふまえてin vitroでも形成できる条件を検討する。また、内部にヒト歯髄細胞を入れたアテロコラーゲンビーズにブタマラッセ上皮遺残細胞を付着させたもの(細胞ビーズ)の周囲を歯根膜シートで巻いたものでスキッドマウスの腹腔内に移植して、歯・歯周組織ユニットを完成させる。In vitroでも歯・歯周組織ユニットを作製できる条件検討を行う。今年度の実験予定だったin vitroの実験での培養関係の試薬や器具を購入する予定にしていたが、実験が次年度にのびたため次年度使用額が生じた。In vivoの実験における実験動物の購入やin vitroでの実験における培養液関係の試薬、ピペットやシャーレなどの培養消耗器具の購入に使用する。