hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい手法を用いたヒト乳頭腫ウイルスによる皮膚病変の発症機構の解明

HPV関連皮膚腫瘍のサンプルの蓄積・保存を施行し、サンプルのDNAを採取、smartAmpによるHPVウイルスの感染の有無を検討、シークエンスによるHPVの型判定・タイピングを施行。APOTassayによるHPVの染色体への挿入の判定を随時遂行した。病変の癌関連遺伝子の網羅的検索は次世代シークエンサーを用い、TruSeq Amplicon Cancer Panelで癌関連遺伝子を増幅・変異を検索、臨床組織学的特徴や予後との比較検討をした。DNAバイスルファイト処理化にてHPVメチル化の測定、難治性良性病変へのHPV染色体挿入の確認をAPOT assayで追加解析した。平成26年度予定し実施した計画は3つである。1)症例の蓄積とサンプルの追加保存:HPV関連新生物と考えられるボーエン病、ボーエン様丘疹症、疣状癌、その他有棘細胞癌などから生検を行い、DNAおよびRNA採取、凍結サンプルを収集した。2)HPVウイルス型の迅速診断:従来のPCRを用いたHPVのL1領域をPCRで増幅し、シークエンスを行いHPVの型を決定する手法は、PCR増幅エラーや型が多いという点で問題だった。近年開発されたsmartAmp法は、プライマーを5本使用しDNAへの特異性を高め、新規Aac DNA polymeraseは、一定温度で二本鎖DNAを解離しつつ、新しいDNA鎖を合成することが可能な酵素で、60度で等温増幅が可能となり反応時間も30分と短く、増幅エラーは抑制されるのが最大の特徴である。このsmartAmp法でPVウイスルの有無を確認し、さらにシークエンスを行い、HPVのタイプを決定した。3)HPVの染色体への挿入の判定HPVは通常エピゾーマルな状態で核に存在するが、癌化などの時は染色体に挿入がおこる。それを検出するのが、amplification of papillomavirus oncogenic transcript (APOT) assayである。これは、染色体への挿入がおこるとHPVの遺伝子の決失がおき、またヒトの染色体の配列もmRNAの中に組み込まれる。その結果、HPVのmRNAをcDNAに逆転写しPCRで増幅すると、エピゾーマルのタイプに比較して短くなり、シークエンスを行うとヒトの配列も読め、HPVの染色体挿入部位もわかる、という原理である。サンプルからmRNAを採取し、cDNAを合成、HPV特異的プライマーにて増幅しサイズと挿入部位を確認する。特にボーエン病、ボーエン様丘疹症では、変異と、臨床、組織、経過を比較し、解析中である。1)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索:パーソナル型の次世代シークエンサーであるイルミナmiSEQを用いて、TruSeq Amplicon Cancer Panelにて癌関連遺伝子を増幅し変異を検索した。癌関連遺伝子48について検索を行った。さらにボーエン病、ボーエン様丘疹症において、それらの変異と、臨床、組織、経過との相関性について比較検討した。2)HPVのメチル化の測定:HPVのL1遺伝子とthelong controlregion領域についてバイスルファイトシークエンスを行った。サンプルからDNAを採取、重亜硫酸ナトリウム処理にて処理。PCRを行い、シークエンスを実行した。バイスルファイト処理をしたもの、しないものの塩基配列を比較して、メチル化の部位を同定した。メチル化の有無によって、臨床症状、組織、経過などに違いが生じるか解析を試みた。3)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入を確認:良性にもかかわらず治療抵抗性の疣贅などでは、低リスク型のHPVが染色体に挿入され、病変が持続されるのではないかと考え、良性の疣贅などについて、DNAや凍結サンプルを保存し、臨床的に難治性であったサンプルの染色体への挿入の有無を調べるためにAPOT法を施行し、解析中である。平成27年度に予定していた3つの計画、すなわち1)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索、2)HPVのメチル化の測定、3)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入を確認、に関してはおおむね予定した内容で実行できており、結果も出てきている。ゆえにおおむね順調に進展しているものと自己判定している。平成28年度に予定し実施した計画は以下の3つである。平成26年度から施行してきた1)HPV関連皮膚腫瘍(ボーエン病、ボーエン様丘疹症、疣状癌、難治性疣贅、その他の有棘細胞癌)からの蓄積とサンプルの追加保存、2)HPVウイルス型の迅速診断smartAmpによるHPVウイルスが病変に感染しているかの有無の確認やシークエンスによるHPVのタイプの決定を行い、3)amplification of pappillmavirus oncogenic transcript (APOT) assayを用いたHPVの染色体への挿入の判定、に関しては本年度も引き続き症例数の上乗せ、結果の解析を継続的に本年も行ってきた。また同時に平成27年度に施行した3つの計画、すなわち1)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索と臨床組織学的特徴や臨床経過との比較検討、2)DNAバイスルファイト処理化によるHPVのメチル化の測定、3)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入の確認、を引き続き症例数の上増やし、結果の解析を継続してきた。平成26年度以降継続してきた

1)HPV関連皮膚腫瘍の蓄積とサンプルの追加保存、2)smartAmpによるHPVウイルスの有無の確認及びシークエンスによるHPVタイピング、3)amplification of pappillmavirus oncogenic transcript (APOT) assayを用いたHPVの染色体への挿入の判定、さらに平成27年度から新規に実行してきた3つの計画、すなわち1)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索、2)HPVのメチル化の測定、3)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入を確認、に関しては予定した内容でおおむね実行してきており、結果も出てきている。おおむね順調に進んでいるものと自己判定している。ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)の関連する悪性や良性の皮膚病変は多いが、HPVの感染から発症に至る機序に関しては不明な点も多い。本研究では、1)その悪性病変で、高リスクHPVの型、染色体へHPVの挿入、癌関連遺伝子の変異の病変形成への関与、2)難治性良性病変での低リスクHPVの染色体への挿入や癌関連遺伝子の変異、3)HPVのメチル化の病態への影響を新しい手法を用いて解明することを目的とした。HPV関連皮膚腫瘍(ボーエン病、ボーエン様丘疹症、疣状癌、難治性疣贅、有棘細胞癌とその亜型)の蓄積およびサンプルの保存。HPVウイルス型の迅速診断を施行した。amplification of pappillmavirus oncogenic transcript (APOT) assayを用いたHPVの染色体への挿入の判定も継続的に実行した。上記の実験に加え、以下の6つの実験に関しても追加実験を重ねた。すなわち、1)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索、2)HPVのメチル化の測定、3)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入を確認、4)病変の癌関連遺伝子の網羅的検索をパーソナル型の次世代シークエンサーイルミナmiSEQを用いて、TruSeq Amplicon Cancer Panelにて癌関連遺伝子を増幅し変異を検索、さらに臨床組織学的特徴や臨床的予後経過との比較検討、5)DNAバイスルファイト処理化によるHPVのメチル化の測定、6)難治性良性病変でのHPVの染色体への挿入の確認に関しても症例数の上乗せ分もamplification of pappillmavirus oncogenic transcript assayにより追加解析をし、総合的に解析検討した。以上の様に、計画立案した内容に関しては、大きな軌道修正もなくおおむね順調に施行できた。HPV関連皮膚腫瘍のサンプルの蓄積・保存を施行し、サンプルのDNAを採取、smartAmpによるHPVウイルスの感染の有無を検討、シークエンスによるHPVの型判定・タイピングを施行。APOTassayによるHPVの染色体への挿入の判定を随時遂行した。病変の癌関連遺伝子の網羅的検索は次世代シークエンサーを用い、TruSeq Amplicon Cancer Panelで癌関連遺伝子を増幅・変異を検索、臨床組織学的特徴や予後との比較検討をした。DNAバイスルファイト処理化にてHPVメチル化の測定、難治性良性病変へのHPV染色体挿入の確認をAPOT assayで追加解析した。平成26年度に予定したいた3つの計画、すなわち1)症例の蓄積とサンプルの追加保存、2)HPVウイルス型の迅速診断、3)HPVの染色体への挿入の判定、に関しておおむね予定していた内容で実行できており、結果も出てきている。
大腸がん幹細胞性制御カリウムチャネルの同定

がんの発生や再発の根源である「がん幹細胞」において機能的に必須な新規分子を同定する事は極めて重要である。そこで本研究は、大腸がん幹細胞に特異的に発現するカリウムチャネルを同定し、新たな抗がん剤としての治療標的を探索することを目的とした。アメリカ食品医薬品局で癌以外の治療薬として承認されているカリウムチャネルブロッカーのうち、数種類の化合物が大腸がん幹細胞の増殖を顕著に抑制することが明らかとなった。マウス移植腫瘍を用いた今後の検討により、抗腫瘍効果を示したカリウムチャネルブロッカーは速やかに抗がん剤としての適用拡大が可能であり、臨床現場での貢献が大いに期待できると考えられる。がん幹細胞は造腫瘍性や治療抵抗性の根源であると考えられており、幹細胞性の維持に必須な新規分子を同定する事は極めて重要である。カリウムチャネルは神経細胞や心筋細胞等において活動電位を調節する普遍的なイオンチャネルであるが、がん幹細胞における発現、及び機能的な役割に関しては全くわかっていない。そこで本研究は、大腸がん幹細胞に特異的に発現するカリウムチャネルを同定し、幹細胞性制御における機能的な役割を明らかにする事を目的としたものである。本研究により同定したがん幹細胞制御性カリウムチャネルは革新的な新規がん治療薬の標的となると考えられるため、臨床応用への発展も期待できる。当該年度は、大腸がん幹細胞特異的に発現するカリウムチャネルを同定するため、以下の項目を実施した。(1)大腸がん幹細胞で発現していないカリウムチャネルを除外するため、DNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析により、大腸がん幹細胞におけるカリウムチャネルの発現の有無を確認した。(2)大腸がん幹細胞において発現している事が確認されたカリウムチャネルと大腸がん幹細胞、及び分化細胞に特徴的な遺伝子に関して、シングルセル遺伝子発現解析用のプライマーを設計し、バリデーションを行った。(3)現在は、大腸がん幹細胞由来マウス皮下腫瘍よりフローサイトメトリーを用いて単一腫瘍細胞を単離し、がん幹細胞、及び分化細胞に特徴的な遺伝子とカリウムチャネル遺伝子の定量PCRを行う事によりシングルセル遺伝子発現解析を行っている。シングルセル遺伝子発現解析用のプライマーの設計と半定量PCRによるバリデーションに時間を要したが、概ね順調であると考える。腫瘍組織は種々の細胞から構成される不均一な細胞集団である。幹細胞性を有するがん細胞(がん幹細胞)はその特性から造腫瘍性や治療抵抗性に深く寄与するため、がんの発生や再発の根源であると考えられている。その故、がん幹細胞性の維持に必須な新規分子を同定する事は極めて重要である。カリウムチャネルは神経細胞や心筋細胞等において活動電位を調節するイオンチャネルであるが、がん幹細胞における発現、及びその機能的な役割に関しては全くわかっていない。本研究により同定したがん幹細胞制御性カリウムチャネルは革新的な新規がん治療薬の標的となると考えられるため、臨床応用への発展も大いに期待できる。今年度は大腸がん幹細胞特異的に発現するカリウムチャネルを同定するためのシングルセル遺伝子発現解析と並行して、入手可能なカリウムチャネルブロッカーの大腸がん幹細胞の増殖に対する効果を検討した。その結果、18種類のカリウムチャネルブロッカーのうち、4種類の化合物が大腸がん幹細胞の増殖を顕著に抑制することが明らかとなった。今後は、大腸がん幹細胞由来マウス皮下腫瘍を用いて、4種類のカリウムチャネルブロッカーによる抗腫瘍効果を検討する予定である。今回使用したカリウムチャネルブロッカーはアメリカ食品医薬品局(FDA)で既に癌以外の疾患の治療薬として承認されている医薬品であるため、ヒトに対する安全性は保証されている。その為、抗腫瘍効果が認められたカリウムチャネルブロッカーは速やかに抗がん剤としての適用拡大が可能であり、臨床現場での貢献が大いに期待できると考えられる。(1)同定したカリウムチャネルが大腸がん幹細胞に特異的に発現している事を検証するため、大腸がん幹細胞由来マウス皮下腫瘍よりフローサイトメトリーを用いて大腸がん幹細胞と分化がん細胞を分取する。リアルタイムPCR法、及び入手可能な抗体がある場合にはウエスタンブロット法により、がん幹細胞で特異的に発現している事を確認する。また、マウス皮下腫瘍、及びヒト原発大腸がん組織において免疫組織化学染色法により、同定したカリウムチャネルががん幹細胞特異的に発現している事を検証する。(2)同定したがん幹細胞特異的カリウムチャネルが幹細胞性の維持に機能的に必須であるかを検証する。RNAi法やCrispr/Cas9による発現抑制、及び入手可能な特異的阻害剤による活性阻害により、大腸がん幹細胞の増殖、スフェロイド形成、及び幹細胞性関連タンパク質の発現等の幹細胞特性に対する効果を検討する。
超微小世界における技能作業ロボットシルテムの構築

本研究の目的は,微小体力学場において超微細作業を技能的に実施できる超微細技能作業ロボットシステムを実現することにある.平成8年度は,超微細作業システムを完成させること,微小体の力学を実際の作業に適用可能となるまで解明し,微細作業を確実に遂行するための技能作業手法を確立すること,作業実験により超微細技能作業ロボットシステムの有効性を検証することが目的であった.(1)超微細作業システムの完成:前年度に製作した基本ハードウェアに加え,今年度は制御のためのソフトウェアおよびヒューマンインターフェイス部を作製した.これにより人間の操作情報を分析したり,新たに開発した作業アルゴリズムを実際に試行することが可能となった.(2)微小体力学の解明:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験により,それが帯電電位の他に表面粗さにも依存することを明らかにし,それらの間になりたつ関係式を導出した.また,実験的に電子顕微鏡下での微小体の帯電電位が数10100Vであることを明らかにした.以上の結果から,数10μmの大きさの微小体に作用する吸着力が数100nNであることがわかった.また,工具と対象物の対向面積を変えることで吸着力が制御できることもわかった.(3)技能作業アルゴリズムの開発:1本の工具の角度を変える接触面積減少法,2本の先端径の異なる工具を用いる接触面積置換法についての力学を検討し,微小物が高い信頼性で基板上の目標位置にプレースできることを確認した.またそのためのロボットの軌道を求めた.(4)作業実験によるシステムの評価:直径20μmのハンダ球のプレース作業を試み,有効性を確認した.本研究の目的は,微小体力学場において超微細作業を技能的に実施できる超微細技能作業ロボットシステムを実現することにある.平成8年度は,超微細作業システムを完成させること,微小体の力学を実際の作業に適用可能となるまで解明し,微細作業を確実に遂行するための技能作業手法を確立すること,作業実験により超微細技能作業ロボットシステムの有効性を検証することが目的であった.(1)超微細作業システムの完成:前年度に製作した基本ハードウェアに加え,今年度は制御のためのソフトウェアおよびヒューマンインターフェイス部を作製した.これにより人間の操作情報を分析したり,新たに開発した作業アルゴリズムを実際に試行することが可能となった.(2)微小体力学の解明:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験により,それが帯電電位の他に表面粗さにも依存することを明らかにし,それらの間になりたつ関係式を導出した.また,実験的に電子顕微鏡下での微小体の帯電電位が数10100Vであることを明らかにした.以上の結果から,数10μmの大きさの微小体に作用する吸着力が数100nNであることがわかった.また,工具と対象物の対向面積を変えることで吸着力が制御できることもわかった.(3)技能作業アルゴリズムの開発:1本の工具の角度を変える接触面積減少法,2本の先端径の異なる工具を用いる接触面積置換法についての力学を検討し,微小物が高い信頼性で基板上の目標位置にプレースできることを確認した.またそのためのロボットの軌道を求めた.(4)作業実験によるシステムの評価:直径20μmのハンダ球のプレース作業を試み,有効性を確認した.本研究の目的は,微小体力学場において超微細作業を技能的に実施できる超微細技能作業ロボットシステムを実現することにある.平成7年度は,そのためにまず光学顕微鏡と電子顕微鏡の双眼および双腕とから構成される技能ナノロボットを構築すること,微小体に働く力を分析しモデル化すること,人間の操縦による微細作業技能を分析しモデル化することが具体的な目的であった.(1)技能ナノロボットの構築:双眼(光学顕微鏡と電子顕微鏡)および双腕を持つ技能ナノロボットを設計・製作した.このロボットの特徴は以下のように整理される.・集視・集動構成:2台の顕微鏡の視野および,全てのロボットの動きを微小な作業空間に集中させる.・主作業腕と固定作業腕:主作業腕を補助するために,作業台上に対象物を固定する固定作業腕を設ける.・作業台パッケージ:確実な微細作業遂行のために作業に必要な全要素を内蔵した作業台パッケージを用いる.(2)微小体力学の解明:試作した微小力測定システムで微小体に働く力の大きさや距離依存性を実測し,微小体に働く力は主に静電力であり,帯電状態,電気的導通状態,表面の微細形状の影響を強く受けることを明らかにした.これらの知見から微小球に作用する静電力をモデル化し,実測結果とよく一致することを確認した.(3)超微細作業技能の分析:(2)の結果からも微小物体どうしの接触面積により吸着力が制御できることがわかったが,実際に操縦者はそのことを経験的に体得して作業をしていることが明らかになった.これらの知見から,工具の微小部品に対する角度を変えて吸着・離脱制御する方法,先端面積の異なる2本の工具の協調作業により吸着・離脱制御する方法の2つの超微細作業技能モデルを確立することができた.本研究の目的は,微小体力学場において超微細作業を技能的に実施できる超微細技能作業ロボットシステムを実現することにある.

平成8年度は,超微細作業システムを完成させること,微小体の力学を実際の作業に適用可能となるまで解明し,微細作業を確実に遂行するための技能作業手法を確立すること,作業実験により超微細技能作業ロボットシステムの有効性を検証することが目的であった.(1)超微細作業システムの完成:前年度に製作した基本ハードウェアに加え,今年度は制御のためのソフトウェアおよびヒューマンインターフェイス部を製作した.これにより人間の操作情報を分析したり,新たに開発した作業アルゴリズムを実際に試行することが可能となった.(2)微小体力学の解明:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験により,それが帯電電位の他に表面粗さにも依存することを明らかにし,それらの間になりたつ関係式を導出した.また,実験的に電子顕微鏡下での微小体の帯電電位が数10100Vであることを明らかにした.以上の結果から,数10μmの大きさの微小体に作用する吸着力が数100nNであることがわかった.また,工具と対象物の対向面積を変えることで吸着力が制御できることもわかった.(3)技能作業アルゴリズムの開発:1本の工具の角度を変える接触面積減少法,2本の先端径の異なる工具を用いる接触面積置換法についての力学を検討し,微小物が高い信頼性で基板上の目標位置にプレースできることを確認した.またそのためのロボットの軌道を求めた.(4)作業実験によるシステムの評価:直径20μmのハンダ球のプレース作業を試み,有効性を確認した.
新たに発見された嫌気的ポルフィリン生合成古代経路の解明

硫酸還元菌は、水田などの土壌、海洋の堆積物、廃水、ヒトを含む動物の腸管など、自然界に広く分布し、それぞれ重要な役割を果たしている。硫酸還元菌におけるヘムの生合成は、ポルフィリン骨格へのメチル基の導入を含む先例のない経路で行われており、現在のところ、本菌群でしか確認されていない。本研究は、この新規生合成経路の全貌を解明し、進化論的な位置を明らかにすることであり、以下の成果が得られた。1.硫酸還元菌を含む嫌気性菌のヘム生合成は、遺伝子のレベルで全貌が既に解明されている場合でも、in vitroで各遺伝子の産物である酵素の機能が確認されていないことが多い。本研究は、酵素活性をin vitroで測定し反応機構を明確にするというコンセプトで進めている。生合成中間体の高感度分析定量法を確立した。ポルフィリンについては、メチルエステル化しない遊離型のままでの分析が不可欠で、多波長モニターによるスペクトル分析を導入した。(MS/MS分析可能な質量分析器をこの系に直結することを急いでいる。)2.二原子酸素添加酵素であるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを利用し、酸素濃度レベルが0.1μM以下の厳密な嫌気下での反応を、簡易にかつ多数の試料について同時に行う方法を確立した。本酵素のX-線結晶解析をおこない、その立体構造と基質(カテコールと酸素分子)活性化機構について詳しく検討した。微量酸素の測定と制御のために、本酵素のタンパク質工学的改変と基質のスクリーニングを進めている。3.新中間体(12,18-)ジデカルボキシプレコリン-2を経由する新規ヘム生合成経路の仮説を提案した。4.S-アデノシルメチオニン-ウロポルフィリノーゲンIIIメチル基転移酵素などの遺伝子の単離を進めてきた。ゲノム解析のデーターを参考に、今後系統的に進める予定である。硫酸還元菌は、ウロポルフィリノーゲンIII脱炭酸酵素活性をもたず、S-アデノシルメチオニオン依存性にプロトポルフィリンIXを生合成する。本菌以外にこのような生合成経路は知られておらず、その完全な解明をめざしている。今年度の研究で以下の成果が得られた。1、ウロポルフィリノーゲンIIIは、他の生物と同様に、5-アミノレブリン酸から生合成される。グルタミン酸-1-セミアルデヒドの新しい化学合成法とその分析法を確立した。グルタミン酸-1-セミアルデヒドから5-アミノレブリン酸が生合成されるか詳細に検討している。予備的な実験結果は、C_5経路(グルタミン酸-1-セミアルデヒドはこの経路の中間体)による5-アミノレブリン酸の生合成を示唆している。2、ウロポルフィリノーゲンIIIにS-アデノシルメチオニオンのメチル基を転移してプレコリン-2を生成する反応を触媒する酵素の迅速精製法を確立した。本酵素は、ホモダイマーでサブユニットの分子量は44,000である。本菌では、プレコリン-2がプロトヘム合成とシロヘム合成の共通の中間体と考えられる。本酵素は、精製が進むとともに活性が低下し、また、N-エチルマレイイミドやプロテアーゼ阻害剤のPMSFなどで容易に不活性化される。遺伝子のクローニングと高発現系の確立を急いでいる。3、本菌の特異な生合成経路を解明するためには、極めて酸化・分解され易いプレコリン-2や(12,18-ジデカルボキシ)プレコリン-2を反応容器の中で定量的に生成させなければならない。反応液中の酸素濃度のμMレベルでの制御と測定のために、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼを利用する方法を確立した。また、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼのX-線結晶解析をおこない、その立体構造と基質(カテコールと酸素分子)活性化機構について詳しく検討した。

3.新中間体(12,18-)ジデカルボキシプレコリン-2を経由する新規ヘム生合成経路の仮説を提案した。4.S-アデノシルメチオニン-ウロポルフィリノーゲンIIIメチル基転移酵素などの遺伝子の単離を進めてきた。ゲノム解析のデーターを参考に、今後系統的に進める予定である。硫酸還元菌は、水田などの土壌、海洋の堆積物、廃水、ヒトを含む動物の腸管など、自然界に広く分布し、それぞれ重要な役割を果たしている。硫酸還元菌におけるヘムの生合成は、ポルフィリン骨格へのメチル基の導入を含む先例のない経路で行われており、現在のところ、本菌群でしか確認されていない。本研究は、この新規生合成経路の全貌を解明し、進化論的な位置を明らかにすることであり、以下の成果が得られた。1.硫酸還元菌を含む嫌気性菌のヘム生合成は、遺伝子のレベルで全貌が既に解明されている場合でも、in vitroで各遺伝子の産物である酵素の機能が確認されていないことが多い。本研究は、酵素活性をin vitroで測定し反応機構を明確にするというコンセプトで進めている。生合成中間体の高感度分析定量法を確立した。ポルフィリンについては、メチルエステル化しない遊離型のままでの分析が不可欠で、多波長モニターによるスペクトル分析を導入した。(MS/MS分析可能な質量分析器をこの系に直結することを急いでいる。)2.二原子酸素添加酵素であるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼを利用し、酸素濃度レベルが0.1μM以下の厳密な嫌気下での反応を、簡易にかつ多数の試料について同時に行う方法を確立した。本酵素のX-線結晶解析をおこない、その立体構造と基質(カテコールと酸素分子)活性化機構について詳しく検討した。微量酸素の測定と制御のために、本酵素のタンパク質工学的改変と基質のスクリーニングを進めている。
利用者に自律的に助言する論理学学習システムの開発

本研究は、小学校高学年学生から大学院博士後期課程大学院生まで幅広い範囲の学生を対象として、論理学に対する興味を培い、推論の妥当性に対する判断力や物事に対する論理的思考力、そして、新しい概念の創造力を伸ばすための論理学知識、それらを身に付けるための学習用教材と学習環境を、インターネットを通じて誰でも何時でも何処でも利用できるように提供することを目指している。今年度は、主に下記の研究成果があった。(1)利用者に自律的に助言する論理学教授・学習システムHILBERTの要求定義:HILBERTと名付けた、利用者に自律的に助言する論理学教授・学習システムに対する要求、利用者(学生と教師)に提供しなければならない機能、用意しなければならない学習用教材の範囲とレベルを明確にし、研究開発の基準を定めた。(2)HILBERTシステム全体構成のアーキテクチャーの設計:自律進化情報システムを実現するために、自己計測原理に基づいて、計測、記録、監視、制御とシステムバスを中心としたシステム・アーキテクチャーを設計した。(3)前向き帰結演算システムEnCalの高速化:自律進化知識処理に不可欠な推論エンジンの役目を果たす前向き帰結演算システムEnCalの実用化のために、その処理の高速化を行った。(4)HILBERTシステムの利用者管理:教授者・学習者の個人、グループ管理機能を実現した。(5)論理学学習用教材の開発:論理学に関する一般知識、古典数理論理の学習用教材を用意した。
主要フィトカンナビノイドによるヒトCYP1A1遺伝子の発現誘導機構の解明

本研究では、大麻の薬理・毒性研究の一環として大麻喫煙による有害作用に着目し、大麻成分が環境化学物質による発がんリスクを決定する1つの要因と考えられている酵素CYP1A1の発現を誘導するか否かを解析した。その結果、大麻の非幻覚成分であるカンナビジオールがヒト肝由来の細胞でCYP1A1の発現を誘導することを明らかにした。その機構として、これまで知られている一般的な経路と特殊な経路を利用している可能性を示すことができた。CBD(5-50μM)をヒト肝がん由来HepG2細胞に6時間処理したとき、CYP1A1 mRNAの発現量は濃度依存的に増加した。CYP1A1 mRNAの発現量の変化を経時的(0-12時間)に解析したところ、25μM CBD処理後6時間で最も高い誘導能を示し、その後減少した。CYP1A1は芳香族炭化水素受容体(AhR)を介して誘導されることが知られている。そこで、CBDによるCYP1A1の発現誘導におけるAhRの関与について検討した。AhRアンタゴニストであるレスベラトロールおよびクエルセチンを前処理したとき、いずれもCBDによるCYP1A1 mRNAの発現誘導を有意に抑制した。また、AhR siRNAを細胞内に導入しAhRをノックダウンさせた場合でも、発現誘導が有意に抑制された。これらの結果から、CBDはAhRを介してCYP1A1遺伝子の発現を誘導することが示唆された。CBDは、テルペン骨格とレゾルシン骨格からなる化合物である。そこで、CBDによるCYP1A1の発現誘導にCBDのどの構造が重要なのかを明らかにするため、CBD関連化合物を用いて、CYP1A1の発現誘導能を比較検討した。その結果、d-リモネン(テルペン骨格に相当)、CBDのモノメチルエーテル体およびジメチルエーテル体は、CYP1A1 mRNAの発現を誘導しなかった。また、オリベトール(レゾルシン骨格に相当)はCYP1A1 mRNAをわずかに誘導したが、その誘導能はCBDに比べて顕著に低かった。これらの結果から、CYP1A1の発現誘導には、CBDのテルペン骨格とレゾルシン骨格の両方が必要であり、また両フェノール性水酸基も重要な役割を果たしていることが示唆された。ヒト肝がん由来HepG2細胞において、CBDがAhRを介してヒトCYP1A1の発現を誘導するさらに詳細な機構を明らかにするため、CB_1およびCB_2受容体の発現をPCR法により解析した。その結果、HepG2細胞には、いずれのカンナビノイド受容体も発現していなかった。したがって、CBDによるCYPIA1の発現誘導において、少なくともこれら受容体の関与はないものと考えられた。これまでに、AhRを介したCYP1A1の発現誘導機構として、3-メチルコラントレンの様なAhRリガンドがAhRに直接作用し転写を活性化させるものと、オメプラゾールの様にAhRには直接作用しないが、細胞膜に局在するチロシンキナーゼ(PTK)などの細胞内シグナル伝達経路を介してAhRを活性化するものが知られている。そこで、CBDによるCYP1A1発現誘導におけるPTKの関与を明らかにするため、PTK阻害剤(herbimycin-A)を用いて発現解析を行った。その結果、CBDによるCYP1A1の発現誘導能は、herbimycin-A処理により有意に抑制された。本実験条件は、オメプラゾールによるCYP1A1の発現誘導能をherbimycin-Aが効果的に抑制するのに対し、3-メチルコラントレンによるCYP1A1の発現誘導能は抑制しないことを確認している。これらの結果から、CBDによるCYP1A1の発現誘導機構には、オメプラゾールの様なPTK活性化経路も存在することが示唆された。ヒト肺がん由来A549細胞におけるAhR、ARNTおよびAhRRの発現量は、HepG2細胞に比べて低い傾向を示した。また、A549細胞には、HepG2細胞と同様、いずれのカンナビノイド受容体も発現していなかった。これらのことから、検討した遺伝子の発現パターンではHepG2細胞とA549細胞におけるCBDおよびCBNのCYP1A1発現誘導機構の差を説明できないことが示された。
「アジア主義」思想の形成と展開の諸相―岡倉天心の思想と人脈を中心に

岡倉天心の活動や人脈を辿ることで、アジア主義の風潮が勢いをもった時代、どういった時代背景がその風潮の広がりを後押ししたのか、またその風潮の中で天心その人の活動はどのような影響を世界に与えたのか、を考察する本研究であるが、最終2018年度は前年度までのインドに引き続き、アメリカ・ボストンでの天心の活動に焦点をあてて実地調査、収集資料の分析を進めた。天心が晩年、ボストン美術館の東洋部長として活躍したのはあまりに有名である。このとき天心の指導のもと同美術館が蒐集した東洋美術のコレクションは、その数の面でも質の面でも今日西洋における東洋美術コレクションの最高峰に位置するものと自他ともに認められている。そのコレクションの中でも、報告者がとりわけ注目すべきと考えるのは、中国に関するものである。これが単なる珍品や佳作の寄せ集めにならず、歴史的、学術的価値の高いコレクションとなっているのは、最初の方向付けを行った初代東洋部長の天心に、「インド・中国というアジアの二大文明の流れは日本に終帰する」という確固たる大局的な文明史観があったからである。中国最古の仏教寺院・白馬寺由来の仏像入手のために手を尽くしたエピソードは、審美眼のみならず文明史的視野を持って蒐集にあたった天心の本領をよく伝えている。ボストンでの彼は、美術館での活動に留まらず、ガードナー婦人の相談役となったり、ハーヴァード大学の学士たちと日常的に交流を持つなど、持ち前の語学力と社交性でボストンの名だたる名士たちのただ中で精力的に活動し、日本や東洋の文化の普遍的価値に西洋人の目を開かせる伝道師の役割を果たし続けた。天心亡き後もボストン美術館は歴史的価値の高い良質の美術品を自然と引き寄せる引力を留めているが、これは東洋美術の真価を理解する人士が育つ環境の礎を天心が残していったからでもある。その功績は正当に評価されるべきであろう。本研究は、明治期にその萌芽を見せその後今日まで続く「アジア主義」の思想潮流について、その形成の過程を、岡倉天心の思想ならびに活動の足跡を追いながら再構成してみようという試みである。とりわけ同氏の影響について、発信側の資料からよりもむしろ、受信側の資料をもとに見ていこうと企画している点が、従来の同種の研究と一線を画すところである。そのため、初年度である平成27年度には、二年次以降の調査の中心となるコルカタ(インド)、ボストン(アメリカ合衆国)と天心との繋がりがどのように形成されたのか、という点を明らかにすべく準備的な調査の遂行に注力した。具体的には、天心が仏教美術=アジアの文化的価値に開眼する契機を与え、後に彼のボストン行きの道筋をつけたアーネスト・フェノロサならびにビゲロウとの関わり、また、コルカタにおいて邂逅し、相互に大きな影響を受けたと考えられるラーマクリシュナ・ミッションのヴィヴェーカーナンダ師ならびにラビンドラナート・タゴールとの関わりについて、文献資料と実地調査により知見を深めた。(岡倉天心全集、ヴィヴェーカーナンダ全集ならびに各種研究書の入手と滋賀・奈良・京都ならびに福岡の実地調査の実行)以上のごとき現報告者個人において進めることのできる研究を進める一方で、国外調査を行なう際に十分な支援を得られる環境を整えるべく、国外における協力者/団体の確保にも努めた。とりわけ、インド思想の全世界的な普及を目指す団体であるラーマクリシュナ・ミッションはインド国内はもとより、アメリカにおける調査候補地ボストンにも支部を置いていることから、本研究の調査を進める上で大きな支えとなることが期待される。そうした目論見から、同団体の日本支部を訪問し、責任者とコンタクトを取った。また、インド在住のタゴール研究者ともコンタクトをとり、協力を取り付けることに成功した。岡倉天心の思想ならびにその影響力を、その受け手の側の資料をもとに考察することを目的とする本研究では、良質な各種資料(証言等の無形のものも含む)の入手が実りある成果を得る上での生命線となると認識している。その意味で、現在までに入手できた資料や、報告対象年度中に実施した近畿・九州の実地調査により、天心の打ち出したアジア主義という構想の形成過程について大まかな方向性が見えてきたこと、また、当初の計画通り、初年度において今後の調査を進める上で当てにすることのできる協力者を得ることができたことは、研究の進捗度という点において、おおむね満足できる結果であると考えられる。おおむね、と限定的な表現を用いているのは、協力者は得られたものの、具体的な支援内容そのものについてはまだ確保されていないことを勘案してのものである。H28年度には当初、岡倉天心の第二の活躍の場となったアメリカ・ボストンへの渡航調査を企画していたが、勤務先大学のスケジュールの関係で渡航が難しく、ボストンでの調査はH29年度に回すこととした。その分、インドでの調査に力を入れ、当初は一部文献調査で終わらせるつもりでいたアジャンタ、エローラ石窟の調査の他、ムンバイ、ベナレスなど、天心自身がインド調査時に訪れた地を入念に調査して回った。昨年に引き続き訪れたラビンドラナート・タゴールゆかりの大学のあるシャーンティニケータンでは、協力を取り付けた研究者(ヴィシュヴァバーラティ大学日本学院の助教授、アリウル・アシム博士)と打ち合わせを行い、緊密に連絡をとりながら研究を進めていくことを再確認した。

また、同じく昨年に引き続き訪問したコルカタでは、今回は本研究において、天心と交流をもったインド人としてキーパーソンとなるヴィヴェーカーナンダおよび彼の周辺の人物について(とりわけ、ジョセフィン・マクラウド婦人など)の調査に力をいれ、ラーマクリシュナ・ミッション文化センターを訪れ資料を収集した。コルカタではさらに、先述のタゴールの旧居が大学に改装されて存続しているラビンドラ・バーラティ大学も訪れた。同大学にはタゴールの事跡に関する博物館も併設されており、タゴールの日本訪問時の貴重な写真などを観覧し、当時の意外な人物交流図を知ることが出来た。インド渡航およびその間に彼が経験した人的交流は、その後の天心のアジア観を考える上で一つの大きな契機ともなり、また彼の影響がインド人の国民意識に訴えた側面も強く、丁寧に研究する必要があると考えている。所属を移し、研究環境が大幅に変わったことが、研究の遅れの主な原因となっている。遅れというのは予定した海外渡航調査の時期を順延したことと、本プロジェクトのテーマでの研究発表ができていないことを指すものであるが、在籍する大学、また学会ではなかなか本テーマでの研究発表は難しそうな見通しであるため、WEBサイトを利用した研究成果の公表など、手法を工夫する必要があることも懸案事項となっている。本研究では、明治期以降の日本の言論界に広く観察された「アジア主義」の対外的な影響力を、岡倉天心と接触のあった外国人の言説を通して評価することを目的としている。したがって、研究の中心となるのは、天心の外国における主な活動地域であった、インド・ベンガル地方ならびにアメリカ・ボストンという両地域における現地調査(資料収集と現地研究者との共同研究)である。これまで、インドの当該地域には数回足をはこび、現地の状況調査、資料収集ならびに現地研究者との共同研究を進めてきているが、もう一方の対象地域であるアメリカについては、渡航予定時期に異常気象に見舞われたこともあり、渡航調査を実施できていない。インド方面については、天心がタゴール一族と深い交流関係にあったことを突き止めた。とりわけノーベル賞文学賞受賞詩人である有名なラビンドラナート・タゴール本人よりもむしろ、彼の親戚筋との間で深い交流を持っていたことが調査により具体的に明らかになってきたことが、本研究にとって非常に重要であると考えている。タゴールの親戚筋にはファイン・アート方面で活躍をした者が多く、その点が彼らが天心に接近する契機となるとともに、逆にそのルートで、天心のアジア主義的側面が彼らに伝わったものと考えられるからである。この方面については、天心の弟子筋にあたる横山大観や菱田春草などのその後の動向などとも絡めながら、現地研究者の研究の紹介も行いつつ、よりその輪郭を明確にしていきたい。アメリカ方面については、上記のように、渡航調査を実施できていない状況があり、現状ではほとんど進展がないと言わざるをえない。ただし、天心をボストンに招聘することになるフェノロサ、ビゲローといった人物については、園城寺(三井寺)との関係等、日本国内で辿れる範囲の研究は進めている。本研究の企画段階からの柱の一つであるアメリカ・ボストンへの渡航調査が、近年の現地の異常気象(交通機関が機能不全に陥るほどの寒冷・大雪・吹雪)により、2年連続で予定キャンセルとせざるを得なかったこと。この影響は甚大であり、研究計画の遂行を大きく妨げている。(期間延長を許可されて望む本年は、同様の異常気候の影響を避けて、夏季もしくは秋口に渡航調査を済ませる予定でいる。)
未就学児をもつシングルマザーの育児および健康支援に向けた包括的アプローチの検討

平成30年度は、未就学児をもつシングルマザーの育児ストレスや蓄積疲労の実態を検討した。その結果、未就学児をもつシングルマザーの育児ストレスや蓄積疲労には、複数の社会的に不利な背景があることが影響しており、特に支援がないというシングルマザーの背景が、育児ストレスや蓄積疲労を高めている特徴的な背景であることが明らかとなった。また、このような両親家庭とは異なる背景で育児をしている未就学児をもつシングルマザーは、両親家庭の母親とは異なる思いを抱き育児を行っていると考えられたため、未就学児を育児中のシングルマザーが、どのような思いを抱いているのかを検討した。その結果、シングルマザーはひとりで全てを背負い生きていくことでの孤独や、経済的基盤が確立しないことから生じる不安や辛さがある一方で、周囲や子どもに支えられることで前向きになるという思いを抱いていることが明らかとなった。これらのことより、未就学児をもつシングルマザーは周囲から支えられていると感じ育児ができる支援状況が、必要だと考えられた。そこで、現在行われている自治体によるシングルマザーに対する支援を検討した。また、未就学児をもつ母親に対する育児支援および健康に関する支援体制や、現在の支援体制に関する課題についての文献検討を行った。加えて、未就学児をもつ母親に対する育児支援の実態や課題についての文献検討を行い、シングルマザーの育児支援に対して必要だと考えられる視点を整理した。年度内に所属施設が変更となったため研究に割く時間の確保が難しく、データ収集まで及ぶことができず調査が遅れている。研究計画書を倫理審査へ申請し、承認された段階で、未就学児をもつシングルマザーに関わる専門職に対して、アンケート調査を行っていく予定である。平成29年度は、平成28年度まで若手研究(B)で行っていた、「未就学児をもつシングルマザーが体験している育児上の困難とストレス要因の検討」の結果をもとに、地域住民の女性に対してセミナーを開催した。セミナーでは、未就学児をもつシングルマザーの生活の実態や、そのような生活状況のなかで育児を行うことにより生じる育児ストレスや育児上の困難についての講演を行い、参加者との意見交換を行う機会を設けた。また、国内で行われている学会へ参加し、未就学児をもつ母親に対する育児支援および健康支援の現状について、情報収集を行った。加えて、国内における未就学児をもつ母親に対する育児や健康に関する専門職間の支援体制について文献検討を行い、未就学児をもつシングルマザーの育児および健康支援に対して必要と考えられる視点を整理した。当初の計画ではアンケート調査の実施までを予定していたが、研究に割く時間の確保が難しく、未就学児をもつシングルマザーの育児および健康支援に必要となる視点の整理に時間がかかり、実際のデータ収集まで及ぶことができなかった。海外文献についての文献検討も行い必要な視点を整理した上で、アンケート調査用紙の作成を行う。その後研究計画書を倫理審査に申請し、承認された段階で、未就学児をもつ母親への育児および健康支援を行っている専門職に対して、アンケート調査を行っていく予定である。アンケート調査にかかる経費を計上していたが実施に至らなかったため、調査用紙や封筒の印刷費、通信費等の使用ができなかった。そのため繰り越し金額についてはアンケート調査実施時に、当初予定していた諸経費としてそのまま繰り越して使用する。今年度に予定していた調査が行えなかったため、次年度の使用額が生じた。次年度は調査に関する印刷紙や通信費、旅費等に使用する予定である。
葉と心皮の発生を制御する転写因子の機能特異性の分子メカニズム

生物の形作りは様々なタンパク質により調節される。代表的な調節タンパク質として、遺伝子のスイッチのオン・オフに関わる転写因子がある。転写因子には様々な種類があり、異なる器官の調節には異なる転写因子が関与するのが普通であるが、単一の転写因子が異なる器官の発達を調節することも多い。本研究ではアプラナ科植物のシロイヌナズナにおいて葉と果実の両方の発達を調節する転写因子CUC2の機能をしらべ、各器官でCUC2のはたらき方を変化させるメカニズムの一端を明らかにした。本研究により植物の形作りの基礎的な理解が進むとともに、その成果を応用することで作物における果実や葉の質の向上にも役立つ可能性がある。複数の発生過程を調節する転写因子が、なぜ異なる器官ごとに異なる機能を発揮できるのかは不明である。シロイヌナズナの転写因子であるCUP-SHAPED COTYLEDON2 (CUC2)は、葉では鋸歯の形成を、心皮では胚珠の形成を促進する。本研究では、これら二つの器官におけるCUC2の機能特異性の分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。平成23年度は以下の成果を得た。1)機能誘導型CUC2タンパク質(CUC2-GR)を発現する形質転換体を作製した。作製した形質転換体の中から、非誘導時には表現型が現れず、DEX処理による誘導時には葉ではっきりとした表現型(鋸歯の形成の促進)が現れる個体を選抜した。この選抜した系統を用い、さらに花での表現型を効率的に引き起こせるようなDEXの処理条件を検討し、最適化した。これで、CUC2により発現が誘導される遺伝子を網羅的に同定するための基盤となる植物材料が確立できた。一方、CUC2の結合配列をChIPにより同定するためFLAGタグをCUC2のゲノム配列にin frameで結合したコンストラクトを作製した。このコンストラクトをcuc2変異体に導入したところ、表現型を相補することが出来ず、今後の使用に問題があることが分かった。そこで、現在タグをMycに換え、CUC2と融合する場所も変えた別のコンストラクトを作成中である。2)器官特異的なCUC2機能調節因子を同定するため、CUC2を過剰発現する変異アリルcuc2-1dを変異源処理し、葉の表現型や心皮の表現型を特異的に抑制する変異体のスクリーニングを行っている。3)CUC2タンパク質の胚発生における標的遺伝子であるLASについて、CUC2がin vitroで結合する配列ことをゲルシフト実験により見いだした。これにより、CUC2タンパク質とDNAとの結合を解析するための技術的な基盤を確立できた。1)器官特異的CUC2誘導遺伝子の同定CUC2の機能誘導系であるCUC2-GRおよび機能獲得型突然変異体cuc2-1dを用いてトランスクリプトーム解析の際のRNAの抽出条件を検討し、最適化を行った。2)CUC2作用領域の同定培養細胞を用いたレポーターアッセイにより、CUC2が下流遺伝子に作用する部位を明らかにした。miRNA164耐性型のCUC2 cDNAを過剰発現させるコンストラクトをエフェクターとして用い、すでに同定されているCUC標的候補遺伝子であるSTM、LAS、KLUの調節配列に対してレポーターアッセイを行った。その結果STMのコード配列上流配列4.4kb断片内に二箇所のCUC2作用部位を同定できた。一方、LASおよびKLUに関しては培養細胞で顕著な活性を持つ調節配列を見いだせなかったが、GUSおよびYFPを用いた植物個体でのレポーター解析により、CUC2が発現する胚頂端部での活性に必要な領域を見出すことができた。3)CUC2相互作用因子の同定心皮形成に関与する転写因子CRCに着目し、このタンパク質とCUC2との相互関係を明らかにすることを目的として、両者の遺伝的相互作用の解析を行った。その結果crcの表現型がcuc2との二重変異体では強められるが、cuc1 cuc2との三重変異体では抑制されることが明らかになった。この相互作用の原因を明らかにするため、各変異体での遺伝子発現解析と、CUC2-CRCタンパク質間相互作用の解析を行うための各種コンストラクトの作製と交配を進めた。また、予備的なY2H解析から、両タンパク質が物理的に相互作用することが示唆された。

1)機能誘導型CUC2タンパク質(CUC2-GR)を発現する形質転換体を用い、葉および花での下流遺伝子の発現が効率的に誘導されるようなDEXの処理条件を検討し、最適化した。この条件を用いてRNA Seq解析に用いるためのサンプル調製を進めた。2)器官特異的なCUC2機能調節因子を同定するため、CUC2を過剰発現する変異アリルcuc2-1dの葉の表現型や心皮の表現型を特異的に抑制する変異体のスクリーニングを行い、葉の表現型を抑制する20の変異体候補を得た。また、Y2H法で同定されたCUC2の相互作用因子候補についてCRES-T法による機能阻害実験を行い、鋸歯形成を抑制する候補遺伝子を一つ得た。3)CUC1およびCUC2の主要な標的遺伝子の一つ、STMのプロモーターについて、培養細胞を用いた一過的発現系により、両CUCタンパク質が作用する領域を約200bpまでに限定し、さらに作用に必須な配列を二つ同定した。4)CUC2の相互作用因子としてCRCを同定し、両者が培養細胞において相互作用することを明らかにするとともに、CRCがCUC1およびCUC2の発現を抑制することで心皮の融合を促進することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物発生学26年度が最終年度であるため、記入しない。CUC2により発現が誘導される遺伝子の同定、およびChIPによる標的遺伝子の同定では、特に必要な形質転換体の確立が遅れている。一方、CUC2のゲルシフトによる結合実験が確立できたのは、当初の計画以上の進展と言える。CUC2が下流遺伝子に作用する領域を特定できた。また、一方、器官特異的なCUC2誘導遺伝子の同定に関しては、RNA抽出の条件を最適化できた。さらに心皮特異的な転写因子CRCに着目し、CUC2との遺伝的相互作用を明らかにできた。CUC2の機能誘導系が確立できた一方、ChIPは技術的な難易度が高いため、今後は機能誘導系を用いた実験系を中心に進めていく予定である。また、cuc2-1dのサプレッサースクリーニングを精力的に進める。ゲルシフトによるCUC2結合配列の同定も併せて行っていく。1)CUC2の機能誘導系を用いて器官特異的なCUC2誘導遺伝子の同定を行う。2)ゲルシフト解析により、CUC2結合配列の同定を進める。3)CRCとCUC2とのタンパク質間相互作用および遺伝子間の相互関係を明らかにする。4)CUC2相互作用因子について機能解析を進める。
扁平上皮癌の増殖・糖代謝の制御に関わる時計遺伝子DECの機能解析

ヒト食道扁平上皮癌細胞株を用いた検討では、ポドプラニン発現をDEC1が促進しDEC2が抑制するといった、DECのリンパ管新生制御機構が示された。またDECが、上皮間葉転換EMT誘導因子であるTGF-βのエフェクターとして働き、増殖浸潤に関わることも明らかとなった。FDG陽性集積・陰性集積症例の手術摘出から抽出したRNAや免疫染色を用いた検討では、FDG陽性集積例でHIF-1α・VEGF・GLUT1発現の上昇が見られた。DEC1はE-cadherinの発現を制御し、低酸素誘導性EMTに関与することも、ヒト肝細胞癌を用いた実験で明らかとなった。時計遺伝子(Clock genes)は、およそ24時間周期で振幅発現する遺伝子であり、その機能により、24時間周期を示す生物活動を制御している。時計遺伝子DEC1およびDEC2は、Basic-helix-loop-helix(bHLH)型転写因子であり、時計中枢である視交叉上核のみならず、全身の組織および細胞で、概日リズムを形成している。また、免疫応答系や様々な組織分化の制御、癌化や低酸素応答、アポトーシス制御など、生体内における多彩な制御機能を担っている。我々は、時計遺伝子発現が、ヒト扁平上皮癌細胞株のリンパ管新生(リンパ節転移)に及ぼす影響を検討した。3種の分化度の異なるヒト扁平上皮癌細胞株(TE5,TE10, TE11)のうち、ポドプラニン発現はTE11で強く、TE5では弱かった。一方、TE10ではポドプラニン発現は認められなかった。TE11におけるDEC1 overexpressionでは、ポドプラニン発現は促進された。逆に、TE11におけるDEC2 overexpressionではポドプラニン発現は抑制された。これらの結果から、DECはポドプラニン制御を介して、ヒト食道癌細胞株のリンパ管新生を制御していることが示された。ヒト食道癌細胞株とポドプラニンとの関係を検討することより、ヒト食道癌細胞株における時計遺伝子の意義を一部明らかにすることができた。我々はこれまでに、概日リズムを制御する時計遺伝子の機能解析を行ってきた。癌の増殖・進展には、癌細胞の代謝、癌細胞-間質相互作用・腫瘍血管新生などの様々な因子が関係する。本研究では、食道癌細胞において、時計遺伝子DECが糖代謝を制御しながら、癌の浸潤・増殖に関わっている機能を解析することを目的とする。前回我々は、3種の分化度の異なるヒト扁平上皮癌細胞株(TE5, TE10, TE11)を用いた実験で、DECがポドプラニン制御を介して、ヒト食道癌細胞株のリンパ管新生(リンパ節転移)を制御していることを明らかにした。今年度我々は、実地臨床の扁平上皮癌におけるFDG集積(FDG-PET検査, SUVmax)とリンパ節転移との関係について外科切除材料を用いた検討を行い、FDG集積(SUVmax)とリンパ節転移とに相関があることを明らかにした。実地臨床の扁平上皮癌におけるFDG集積(FDG-PET検査, SUVmax)とリンパ節転移との関係についての検討を行い、FDG集積(SUVmax)とリンパ節転移とに相関があることを明らかにすることができた。時計遺伝子は、およそ24時間周期で振幅発現する遺伝子であり、その機能により生物活動を制御している。また、免疫応答系や様々な組織分化の制御、癌化や低酸素応答、アポトーシス制御など、生体内における多彩な制御機構を担っている。本研究の目的は、癌細胞の増殖・浸潤・代謝などの病態進展を制御する時計遺伝子DECの分子機構を解析し、臨床応用することである。本研究では、ヒト食道癌細胞において、DEC1過剰発現がリンパ管マーカーであるpodoplaninと正の相関関係を有し、DEC2が負の相関関係を有することが示された。また、ヒト食道癌細胞において、時計遺伝子DECが、上皮間葉転換EMT(epithelial-mesenchymal transition)誘導因子の1つであるTGF-βのエフェクターとして働いていることが明らかとなった。ところで低酸素誘導因子HIF-1αは細胞に低酸素状態が生じると誘導され、VEGF・各種解糖系酵素・グルコース輸送体(GLUT1など)・エリスロポイエチンなどの発現を誘導することが知られており、先行研究ではDEC2がHIF-1α/ARNT1を介して抗血管内皮増殖因子(VEGF)遺伝子発現を制御することが報告されたが、ヒト肝細胞癌細胞においては、低酸素誘導因子HIF-1αを介してDEC1がE-cadherinの発現を抑制し、EMTに関与することが明らかとなった。