hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢ラットにおける肺静脈心筋細胞異常自動能発生のメカニズムの解明

若年ラット(12W)を麻酔開胸下心肺摘出しランゲンドルフ灌流と表面灌流をし、サイトカラジンDで心収縮を抑制し、ガラス微小電極により心房心筋細胞および肺静脈心筋細胞の活動電位を記録した。また、Ca感受性色素であるRhod-2によるCa transientの光学的記録を行った。その結果、イソプロテレノール投与下で連続刺激終了後に肺静脈起源の期外収縮が連発する現象を認め、活動電位記録では刺激終了第一拍目の再分極第3相に早期後脱分極、光学的記録では連続刺激終了第一拍目のCa transientの増大を認めた。Ca transient増大の程度は肺静脈心筋細胞において心房心筋細胞に比してより大であった。高齢ラット(22W)で同様の検討を行ったところ、若年ラットと同様にイソプロテレノール投与下の連続刺激終了後の期外収縮の連発、活動電位記録上の第3相再分極相における早期後脱分極、Ca transientの増大を認めた。しかし高齢ラットでは期外収縮が肺静脈起源とは限らず心房起源のものも誘発され、心房心筋細胞と肺静脈心筋細胞との間で刺激終了後第一拍目のCa transientの増大の程度に差を認めず、高齢ラットでは心房心筋における異常自動能も亢進していることが示唆された。また、期外収縮をトリガーとした短い持続時間(<2s)の心房細動や心房頻拍を高齢ラットでは認め、期外収縮に対する心房の受攻性も亢進していると考えられた。高齢ラットにおける肺静脈心筋細胞異常自動能発生のメカニズムの解明という研究において、本年度は当モデルにおける光学的マッピング手法の開発と基礎的なデータを得ることを目標に研究を行った。まず、若年ラットを用い心房と肺静脈心筋細胞の細胞内Caの光学的マッピング手法確立のため、Ca感受性色素であるRhod-2の投与を様々な方法で行った。大動脈からの投与により心房はよく染色され記録されたが、肺静脈心筋細胞は少量の色素を表面に直接塗布しさらに肺静脈内腔に少量を注入することによりCa transientの光学的signalを記録することができた。Motion artifactを除くためにelectro-contraction uncouplerであるサイトカラジンDを用いた。心室の記録に用いる濃度である2.5μMでは心房収縮が残存するため5μMを用いたところ心房収縮が消失した。しかしながら、当濃度においては様々なイオンチャンネルが修飾されるためか、微小電極で記録される活動電位時間が著明に延長した。サイトカラジンD非使用下ではイソプロテレノール投与の上で心房から連続刺激を行うと肺静脈異常自動能を示唆する期外収縮の連発を認めたが、サイトカラジンD5.0μM使用下ではそのような不整脈は全く出現しなかった。そのため若干心房収縮の残存する2.5μM使用下で、透明なカバーで物理的に心房の動きを抑制しながら記録を行い、良好な記録が得られるようになった。その結果、連続刺激後の第一心拍におけるCa transientの波高が心房心筋細胞に比し肺静脈心筋細胞において著明に大きく、それに引き続き期外収縮が連発し、肺静脈におけるカルシウム動態が異常自動能発生に大きく関与していることが示唆された。
アルコール・心理ストレスによる動脈硬化性プラ－ク不安定化の機転に関する研究

アルコールと動脈硬化誘発飼料併用マウスでは、血管内皮細胞層修復遺伝子発現量の低下・単球走化性蛋白質1と蛋白質分解酵素MMP9遺伝子の過剰発現を引き起こし、動脈硬化の進行(血管エコー上に内中膜複合体厚(動脈硬化の程度)と低輝度(易破綻)プラーク形成率の増大)が促進される。慢性心理的ストレス、特に高脂血症下で、これを受けたマウスは内皮細胞機能と関連する血管内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子発現量の低下とレクチン様酸化LDL受容体遺伝子の過剰発現がみられ、動脈硬化進行の促進と心血管イベントフリー生存率の低下を認めた。本研究は法医学に無論のこと、動脈硬化の治療法と予防法の開発にも貢献することが期待される。1.研究の意義:動脈硬化症におけるアルコールが動脈硬化進行にもたらす影響を確認し,アルコール・心理ストレスによるプラーク不安定化機転としての交感神経活性化の役割を解明する基礎研究である。3.研究の結果:アルコール慢性消費によって、血中総コレステロールの上昇,IMTの増大,MCP-1とCD34遺伝子発現量の増加が引き起こされた。4.研究の重要性:過剰な飲酒は高脂血症および動脈硬化を増悪させる可能性が示唆された。アルコールによるMCP-1の過剰発現が単球の内皮細胞へ接着,動脈壁への侵入を促進すること、また単球の動脈壁への侵入が内膜肥厚の引き金であることを示唆した。1.研究の意義:動脈硬化症における慢性心理的なストレス・アルコールが動脈硬化進行にもたらす影響を確認し,アルコール・心理ストレスによるプラーク不安定化機転としての交感神経活性化の役割を解明する基礎研究である。2.研究の内容:(1)平成25年度の研究成果により,動脈硬化誘発食(AD)投与による動脈硬化は過剰な飲酒により増悪した。平成26年度に腹部大動脈組織を用いて内皮細胞層修復能を反映するCD34と内皮機能障害を反映するMCP-1の遺伝子発現量を確認した。(2)慢性的な心理的ストレス(CMS)が動脈硬化進行にもたらす影響を確認するために,13週令雄マウス(C57BL/j)をコントロール,コントロール+CMS,AD単独投与,AD + CMSの4群に分けて16週間飼育した。(3)プラークの不安定化因子を選出するために,動脈硬化モデルマウス(Apoe・Ldlrダブルノックアウトマウス)とC57BL/jを一年間かけて動脈性塞栓症および突然死の発症を観察している(2015年年内に終了予定)。(4)CMS・アルコール消費とプラークの不安定化に関わるメカニズムを解明するために,Apoe・Ldlrダブルノックアウトマウスを安定に繁殖させながら雄Apoe・Ldlrダブルノックアウトマウスを用いて実験中である。3.研究の結果:過剰な飲酒は,内皮細胞層修復能の低下と内皮機能障害の増悪により動脈硬化の進展を促進する(学会発表1)。慢性心理的なストレスは動脈硬化進展の重要な関連因子であることを示唆した(学会発表2)。4.研究の重要性:過剰な飲酒と慢性心理的なストレスは動脈硬化を促進する可能性が示唆された。内皮細胞層修復能の低下と内皮機能障害の増悪が動脈硬化進展の引き金であることを示唆した。1.研究の意義:動脈硬化症における慢性心理的なストレス・アルコールが動脈硬化進行にもたらす影響を確認し,アルコール・心理ストレスによる動脈硬化巣(プラーク)不安定化機転を解明する基礎研究である.2.研究の内容:(1)先天的動脈硬化マウス36匹と野生型マウス34匹を28週間と1年間にわたって追跡,心・血管イベントの発症を確認し,慢性心理的ストレスによる動脈硬化進展と心・血管イベント発症との関連について検討した.(2)先天的動脈硬化マウスを動脈硬化誘発飼料単独(6匹)またはアルコールと併用(8匹)にて16週間飼育し,慢性アルコール投与によるプラーク脆弱化の促進について検討した.3.研究の結果:(1)心理的ストレスを一ヶ月負荷した先天的動脈硬化マウスの28週間心・血管イベントフリー生存率は顕著に低下し,心理的ストレスを受けなかった先天的動脈硬化マウスの1年間心・血管イベントフリー生存率と同様となり,プラークの形成率は最大であった(学会発表1, 2).(2)アルコールと動脈硬化誘発飼料併用した先天的動脈硬化マウスでは,腹部大動脈内中膜複合体厚の増加および高脂血症を認め,腹部大動脈組織中の蛋白分解酵素(MMP-9)遺伝子発現量の増加が引き起こされ,低輝度プラーク(脆弱化プラーク)は見られた(雑誌論文,学会発表3).4.研究の重要性:(1)心理的ストレスは動脈硬化進行の促進を介し,心・血管イベントに対する強い関連因子であると考えられる.(2)慢性アルコール投与は動脈硬化巣脆弱化を促進させる可能性が示唆された.アルコールと動脈硬化誘発飼料併用マウスでは、血管内皮細胞層修復遺伝子発現量の低下・単球走化性蛋白質1と蛋白質分解酵素MMP9遺伝子の過剰発現を引き起こし、動脈硬化の進行(血管エコー上に内中膜複合体厚(動脈硬化の程度)と低輝度(易破綻)プラーク形成率の増大)が促進される。

本研究は法医学に無論のこと、動脈硬化の治療法と予防法の開発にも貢献することが期待される。アルコール・心理ストレスによる動脈硬化の増悪およびプラーク不安定化の転機に関する研究目的について研究計画に準じて研究を実行した。研究結果を学会で発表した。法医学次年度(平成27年度)に研究計画に準じて実験動物の数を増やし,1腹部大動脈組織を利用し,組織細胞生物学的に動脈硬化の進展およびプラークの安定性を調べる。2血液および腹部大動脈組織を利用し,全身および腹部大動脈の交感神経活性化,動脈硬化プラーク不安定化関連因子の変動を検討する。研究結果として「マウスにおける低炭水化物・高タンパク質食とアルコールの動脈硬化進展への影響」を学会で発表した。次年度(平成26年度)に研究計画に準じて実験動物の数を増やし、1心電図をモニターしながら心理ストレス負荷試験を行う。2腹部大動脈を利用し,組織細胞生物学的に動脈硬化の進展およびプラークの安定性を調べる。3血液および腹部大動脈組織を利用し,全身および腹部大動脈の交感神経活性化、動脈硬化プラーク不安定化・炎症反応・心筋ストレス・心筋障害・blood-brain障壁機能障害関連因子の変動を検討する。
GnRHによるNorepinephrineの分泌調節についての研究

(1) NeurotransmitterとしてNoradrenaline、Forskolin、TPA、Caionophore (A2381)を使用した。Noradrenalineでは10^<-8>Mから10^<-6>Mで用量依存性にGnRHを分泌し、Forskolin10^<-4>Mから10^<-6>MでGnRHの分泌亢進、A23187でも著明なGnRH分泌亢進が認められた。但し、T.P.A.では著明な分泌亢進は認められなかった。
心不全患者の療養生活支援のためのセルフモニタリング評価尺度実用化プログラムの開発

心不全患者がより良い病状を維持するためには、患者自身の病気への関心と留意事項の遵守が非常に重要であると考えられる。心不全はその病状悪化による再入院が非常に多く、再入院を予防して可能な限りその人らしい生活を維持できるようにするためには、病状の変化や日々の体調を自ら把握するとともに、病状の悪化を防ぐ、もしくはその兆候を早期発見する日常生活行動を継続することが必要である。その健康管理の過程においては、自らの病状や健康管理状況を把握するセルフモニタリングが非常に有効であると考えられる。本研究では先行研究で信頼性と妥当性を検証した「心不全患者のセルフモニタリング評価尺度」(Evaluation Scale for Self-Monitoring by patients with Heart Failure)の簡易版の作成をめざし、その質問項目の分析的検討を行った。その結果、ESSMHFの初版では、先行研究で明確化したセルフモニタリングの概念に基づき「認識」と「測定」を21項目で測定し、「解釈」の側面を16項目で測定していたが、すべての側面を14項目で測定可能であると確認した。この新しく14項目で構成された短縮版は、患者の調査への負担を減らすとともに、セルフモニタリングの実践状況を把握する上で最低限必要なことを看護師が速やかに把握するため、高い有用性があると考えられる。今回のプロジェクトでは、短縮版の質問項目の内容妥当性は検証できたが、実際の患者への利用可能性の検証は途上であるため、今後の課題である。平成26年度は、先行研究で開発した心不全患者の療養生活支援のためのセルフモニタリング評価尺度(Evaluation Scale for Self-Monitoring by Patients with Heart Failure:ESSMHF)を心不全患者の健康管理の適切さや困難状況を的確に把握できるツールとして実用化することを目指して、質問項目の見直しと評価方法の再検討を行った。ESSMHFの対象となる方に、質問項目のわかりやすさ、回答しやすさ、回答中の印象、問題点の状況等を確認する調査を実施した。その結果、質問項目がわからないという事はないものの、質問数が多く負担感があること、回答の際に迷う項目があることがあきらかになった。その一方で、調査項目を見て、どのような健康管理が必要なのか、自分自身ができていない対応が感じられてくると、自己を振り返る質問項目で構成されており、質問項目の内容は妥当であることも明らかになった。引き続き、ESSMHFの構成概念妥当性の検証を行いながら、質問項目の調整を行い、より回答しやすい、活用しやすいESSMHFの作成を目指す必要があると考えられた。また、幅広い対象者がESSMHFを活用し、健康管理に関する知識を得られる媒体として、ESSMHFをセルフチェックとして実施できるホームページを開設し、アクセスしやすい環境整備に取り組んだ。今年度は、セルフチェックとその説明で構成するシンプルなホームーページを作成するにとどまっており、今後は、ホームページに健康管理および心不全兆候の早期発見と早期対応に関する情報を掲載したり、セルフチェックの結果、各自がどのような健康管理状況にあるのか、またどのような改善が必要なのかを示唆できるホームページに拡大していくことを目指し、心不全患者支援の基盤作りに励む必要があると考えられる。平成27年8月11日から産前後の休暇又育児業による中断1年目は、先行研究で開発したESSMHFの課題抽出を行ない、2年目はその改良に着手する予定であったが、現在、産前後の休暇又育児業による中断(平成27年8月25日届出)のため、その途中で停止している。本来であれは、2年目に改良したESSMHFの質問項目を抽出するところであるが、現在は、抽出する方針が決定している段階でとどまっているため、復帰し次第着手する予定である。平成27年8月11日から平成29年3月31日まで産前後の休暇また育児業による中断1年目は先行研究で開発した心不全患者の療養生活支援のためのセルフモニタリング評価尺度(Evaluation Scale for Self-Monitoring by Patients with Heart Failuer:ESSMHF)の課題抽出を行い、2年目はその改良に着手する予定であったが、平成27年8月11日から平成29年3月31日まで産前後の休暇また育児業による中断(平成27年8月25日届出)のため、途中で停止している。本来であれば、改良したESSMHFの質問項目抽出に着手するところであるが、復帰後の平成29年度以降の作業へと遅らせることとなっている。心不全患者の療養生活支援のためのセルフモニタリング評価尺度の質問項目の見直しと評価方法の再検討を行った結果、質問項目のわかりやすさ、解答しやすさ、回答中の印象などに課題があり、回答の際に迷う項目があることが明らかとなった。その一方で、調査項目を見てどのような健康管理が必要なのか、自分自身ができていない対応が感じられてくると、自己を振り返る質問項目で構成されており、質問項目の内容は妥当であることも明らかになってきた。この結果を踏まえて、質問項目の統廃合を行い、「簡易版」として質問項目数を減らした尺度構成を検討した。質問項目の見直しでは、逆転項目が生じないように配慮を行った。また、質問項目が「自覚」と「測定」と「解釈」の分類の中で類似している点が改善されるように、重複感のない尺度構成を目指して実施した。その尺度構成の信頼性と妥当性を確保するために、質問項目に関するインタビュー調査を行い、尺度への印象、回答しやすさ、問いに対して感じることを分析したが、大きな問題点はなく使いやすいものへと刷新されていると評価された。また、簡易版の尺度で調査を行い、統計学的な信頼性係数を算出し、妥当性の検証を行った。

心不全患者のセルフチェックと心不全のセルフモニタリングに関する知識獲得が可能なホームページの作成をめざし、コンテンツの充実にも取り組んだ。上記の尺度「簡易版」を療養生活する営む心不全患者が不安なこと、心配なことを解決しながら、健康管理能力を高める知識を得られるように利用可能性を高めることが課題となっている。大きな課題となっていた尺度の見直しが完了し、心不全患者のセルフチェックと心不全のセルフモニタリングに関する知識獲得が可能なホームページのコンテンツも追加で行っていることから、概ね順調に進展していると言える。まだ尺度の利用可能性の確認と公表が未着手であるため課題である。また、ホームページもさらなる充実を図るとともに尺度を利用できるように仕組みを作る検討を行う必要が残っている。心不全患者がより良い病状を維持するためには、患者自身の病気への関心と留意事項の遵守が非常に重要であると考えられる。心不全はその病状悪化による再入院が非常に多く、再入院を予防して可能な限りその人らしい生活を維持できるようにするためには、病状の変化や日々の体調を自ら把握するとともに、病状の悪化を防ぐ、もしくはその兆候を早期発見する日常生活行動を継続することが必要である。その健康管理の過程においては、自らの病状や健康管理状況を把握するセルフモニタリングが非常に有効であると考えられる。本研究では先行研究で信頼性と妥当性を検証した「心不全患者のセルフモニタリング評価尺度」(Evaluation Scale for Self-Monitoring by patients with Heart Failure)の簡易版の作成をめざし、その質問項目の分析的検討を行った。その結果、ESSMHFの初版では、先行研究で明確化したセルフモニタリングの概念に基づき「認識」と「測定」を21項目で測定し、「解釈」の側面を16項目で測定していたが、すべての側面を14項目で測定可能であると確認した。この新しく14項目で構成された短縮版は、患者の調査への負担を減らすとともに、セルフモニタリングの実践状況を把握する上で最低限必要なことを看護師が速やかに把握するため、高い有用性があると考えられる。今回のプロジェクトでは、短縮版の質問項目の内容妥当性は検証できたが、実際の患者への利用可能性の検証は途上であるため、今後の課題である。1年目は、先行研究で開発した心不全患者の療養生活支援のためのセルフモニタリング評価尺度(Evaluation Scale for Self-Monitoring by Patients with Heart Failure:ESSMHF)を心不全患者の健康管理の適切さや困難状況を的確に把握できるツールとして実用化することを目指して、質問項目の見直しと評価方法の再検討を行う予定としていた。再検討にはまだ余地があるので継続する必要があるものの、課題は明らかになったため、順調に進んでいると評価できる。今後は、改善点をどのように反映するかを吟味し、修正案を出す必要があると考えられる。
新規可溶化剤と溶液NMRを用いた薬剤耐性S31N変異体M2チャネルの構造解析

膜タンパク質の立体構造解析に用いる新規可溶化剤とモデル膜タンパク質バクテリオロドプシン(bR)の合成と精製方法を最初に確立した。予備検討として、bRで新規可溶化剤の物性評価を行ったところ、可溶化能・熱安定性・時間耐久性・ミセルサイズなどが既存の可溶化剤よりも格段に優れていることが分かった。次に、大腸菌合成系でM2タンパク質の発現と精製方法の確立に成功したが、分子間でのジスルフィド結合が不十分だった。そこで、架橋形成を促進するために自己会合型コイルドコイル配列を導入した変異体を作製した。今後、二量体形成を確認して溶液NMRで立体構造解析に取り掛かりたいと考えている。(1)新規可溶化剤の合成およびバクテリオロドプシンを用いた物性評価Cholyl-PCの合成および酵素ホスホリパーゼDを用いたCholyl-PCからCholyl-PAへの変換法を確立させてきた。条件検討の結果、収率(原料Lyso-PCに対するモル比率)を4%から12%に向上させることに成功した。新規可溶化剤の物性評価を行うため、これまでに幅広く研究されているバクテリオロドプシンの生合成および精製方法の確立を行った。可溶化能や熱安定性、時間耐久性、ミセルサイズなどを既存の可溶化剤と比較した結果、最も安定的かつ長時間(40°Cで少なくとも1週間以上)にわたって膜タンパク質の構造を保持出来る事を明らかにした。また、膜タンパク質と可溶化剤の複合体の合計分子量が平均69 kDaと、溶液NMRに応用可能な最小サイズで可溶化できる事も分かった。(2)無細胞合成系を用いた蛍光標識体M2タンパク質の合成本研究は、A型インフルエンザウイルスM2プロトンチャネルの二量体の構造解析を溶液NMRで行う事を目指している。初めに、新規可溶化剤のミセル中におけるM2タンパク質の会合状態を確認するため、無細胞合成系で蛍光標識体M2タンパク質を合成し、蛍光相関分光法(FCS)測定で会合状態を算出する。ウェスタンブロットにより、無細胞合成キットでM2タンパク質の合成可能である事が確認されたが、単量体と二量体のバンドが検出された。これは、分子間でのジスルフィド架橋が部分的にしか起こっていない事に起因している。そこで、分子間でジスルフィド結合がより形成されやすいように、M2タンパク質のN末端に、強固な相互作用を示すcoiled-coil配列E3とK3をそれぞれ導入することにした。現在、蛍光標識したE3およびK3ペプチドを固相合成によって作製し、界面活性剤存在下でもE3-K3間の相互作用に影響が無いかどうかを調べている段階である。(1)無細胞合成系を用いたM2タンパク質合成の条件検討/ウェスタンブロットで、His6タグとFactor Xaサイトを付加したM2タンパク質(His6-Xa-M2)の発現を確認することが出来た。しかしながら、生体膜上でM2タンパク質はジスルフィド結合により二量体を形成しているのに対して、無細胞合成系では大部分が単量体で存在していることが分かった。酸化型と還元型グルタチオンを様々な比率で混ぜ合わせて二量体形成を促進させたが、結果は好転しなかった。還元剤DTTを含まない合成キットでは二量体形成がやや促進されたが、大幅な改善には至らなかった。加えて、キット間で実験結果の再現性を取ることが難しく合成量も芳しくなかったため、無細胞合成系を断念して大腸菌での合成系に切り替えた。(2)大腸菌を用いたM2タンパク質合成の条件検討/上記のHis6-Xa-M2を大腸菌で様々な条件検討を行ったところ、大量発現の確立に成功した。しかしながら、依然として二量体形成が完全でないことと、Niカラムを用いた精製法では不純物を完璧に取り除くことが出来なかったことから、二量体形成の促進および目的タンパク質の純度向上が課題として残った。(3)大腸菌を用いたM2タンパク質合成の条件検討/二量体形成を促進するために自己会合型コイルドコイル(ERE4)をM2タンパク質に導入した(非常に親和性が高く、Kd値はサブnMオーダーと予測される)。純度を向上させるために、His6タグとStrepタグの両方を用いて様々なバリエーションのM2プラスミドを作製した(例:His6-Strep-ERE4-Xa-M2, Strep-ERE4-Xa-M2など)。しかしながら、申請者のポストの任期切れにより異動を余儀なくされ、半年間を残して研究を中断せざるを得なくなった。

以前は、新規可溶化剤の物性評価に、ドライパウダー状で販売されているバクテリオロドプシンを使用していたが、先行研究で、凍結乾燥させたバクテリオロドプシンが本来の構造と異なる可能性が示唆されていた。そのため、native状態のバクテリオロドプシンで新規可溶化剤の物性評価を行うため、高度好塩菌を用いたバクテリオロドプシンの生合成および精製方法の確立に着手したが、予想以上に時間を要した。また、ドライパウダー状で販売されているバクテリオロドプシンとnative状態のバクテリオロドプシンでは、実験結果に食い違いが生じたため、全てのデータを取り直す必要があった。例えば、可溶化時間では前者では1時間で済むのに対して、後者は24時間必要であった。加えて、前者ではChplyl-PC / PA混合時の方が構造を安定的に保たれたのに対して、後者ではCholyl-PA混合により、顕著な変性が観られた。ただ、Cholyl-PC単体でバクテリオロドプシンの構造を40°Cで1週間以上、安定に保持できることを新たな発見した。ドライパウダー状で販売されているバクテリオロドプシンはnative状態と性質的に大きく異なる可能性が考えられる。本研究では、高度好塩菌から採取したnative状態のバクテリオロドプシンで得られた結果を基に、新規可溶化剤の評価を行って行く予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。物理化学(1)無細胞合成系を用いた蛍光標識体S31Nタンパク質の合成と、FCSを用いた会合状態の算出界面活性剤存在下で、E3-K3ペプチド間の相互作用に影響がないことを確認した後、E3およびK3配列をN末端に組み込んだM2タンパク質の合成を行い、分子間のジスルフィド結合の形成度合をウエスタンブロットで確認する。バックアップ案として、ホモダイマー形成すると報告されているGCN4配列を採用することも考えている。目的タンパク質の合成と精製が終了すれば、FCSを用いて会合数を算出する。単量体のスタンダード膜タンパク質として既に確認が取れているグライコフォリンA変異体(GpA*)を用いる。単量体GpA*に比べてM2タンパク質から2倍の輝度が得られれば、二量体のチャネルを形成していると判断できる。また、拡散時間から複合体の合計サイズを見積もり、溶液NMRで測定可能な分子量の範囲内(80 kDa以内)に収まっていることを確認する。(2)溶液NMR測定と分子動力学シミュレーション高分解能溶液NMR(650および950 MHz)による縦緩和、横緩和時間、DOSY測定から複合体の大きさを見積もる。HSQCスペクトル測定を行い、S31N変異体の二次構造解析を行う。構造解析の可能な最適条件が見つかれば、13C-グルコースおよびD2Oも用いて標識を行い、ピークの帰属と立体構造解析を行う。同様の実験を野生型M2タンパク質でも行う。野生型と変異体の二量体構造を比較し、S31N変異体が定常的に二量体を形成する原因を究明する。また、AmとS31N変異体の相互作用を解析し、結合の有無や結合部位の特定を行う事で、S31N変異体のAm耐性メカニズムを解明する。シミュレーションの計算結果と溶液NMR測定結果を照らし合わせて、S31N変異体M2チャネルのプロトン透過経路を総合的な観点から推定する。
好中球の細胞膜表面上の遊走担当分子のcDNAクロ-ニング

好中球の遊走能の機構を解明するために、KO^^ ̈hler & Milstein法に準じて、ヒト好中球の遊走能を特異的に抑制するモノクロ-ナル抗体TM316を作製した。この抗体が認識する抗原分子は約150kの膜蛋白であった。この分子を規定する核酸配列を明らかにするために、前述のモノクロ-ナル抗体を用いて、ヒト白血球由来のcNDAライブラリ-よりスクリ-ニングを行った。その結果、約400塩基対からなるcDNA断片のクロ-ニングに成功した。このcDNAクロ-ンから大腸菌蛋白発現ベクタ-pEX2ヘサブクロ-ニングし、部分的タンパク質を作製し、これをウサギに免疫して抗血清を得ることを試みた。現在のところ低力価ながらも、モノクロ-ナル抗体TM316が認識する好中球膜タンパク質と相同の分子量の分子と反応するポクロ-ナル抗体が得られた。より力価の高い抗血清を得、ヒト好中球の遊走活性を抑制することを確かめるために、cDNA断片より得られる部分的タンパク質を更にウサギに免疫中である。また。TM316が認識する膜タンパク質はヒト好中球に特異的に発現していることから、上述の実験と平行してヒト末梢血より好中球を分離し、ヒト好中球由来のcDNAライブラリ-を作製した。スクリ-ニングにはTM316およびヒト好中球膜表面上のTM316対応抗原を免疫して得たポリクロ-ナル抗体をプロ-ブとして用いた。その結果、数個の陽性クロ-ンを得た。これらのクロ-ンについては現在検討中である。また。
NMRによるc-myc蛋白質-DNA相互作用の研究

これまでの研究で我々は大腸菌を使ってc-Mycタンパク質のbHLH/LZ領域の生産を試みてきたが効率よく生産させることが出来なかった。今年度は、この原因が、この領域中にある2つの連続する大腸菌の希なコドン(ARG;AGG)に起因するのではないかと考え、ここを他のコドンに置換したc-Myc遺伝子からのタンパク質発現を試みた。PCR法でこの領域のコドンを置換後、発現ベクターpQEにクローン化し、大腸菌M15[pREP4]とSG13009[pREP4]株に形質転換し発現誘導したが、c-Mycタンパク質の発現はみられなかった。2.Maxタンパク質生産系の確立とその構造学的特性の解析今年度はc-Mycと二量化するパートナーで、似た構造をもつMaxタンパク質の大腸菌による生産系の確立も行った。ヒト胎児脳cDNAライブラリーよりPCR法で得たMax遺伝子を発現ベクターpQEにクローン化し大腸菌M15[pREP4]に形質転換し発現誘導したところ1リットル培地から約20mgの純粋なMaxタンパク質を得ることが出来た。これを再生した後、CD解析を行ったところ約50%のα-ヘリックス含量を示した。また、これに特異的結合配列を含むDNAオリゴマーを加えるとヘリックス含量が急激に増加することがわかった。さらに、このタンパク質のDNA結合能をゲルシフトアッセイで解析したところ高い結合能を示した。これらのことから、今回作成したMaxタンパク質は生物学的機能を有することがわかり今後NMR等で高次構造の解析を行うことにしている。本研究の目的は、細胞のがん化に関係する正常細胞遺伝子c-mycの発現産物であるタンパク質(Myc)のDNA結合領域と、その認識DNAオリゴマーとの相互作用をNMRにより解析し、その認識機構を分子レベルで解明することである。今年度は、MycのDNA結合領域の大量発現系を構築することを主な目標とした。Mcyはその354番のバリンから439番のアラニンまでの領域に、塩基性領域-ヘリックス・ループ・ヘリックス-ロイシンジッパーというモチーフを有し、この部分がDNA結合に必須であることがわかっているので、この領域のペプチド(Myc354ペプチド)を大腸菌を用いて大量生産する系について検討した。まずヒトc-mycのcDNA上の対応するDNA領域を、適当なプライマーを用いたPCR法により増幅した。次にこの遺伝子DNAを用いて、Myc354ペプチドの発現プラスミドベクターを2種類構築した。まず最初に、プロテインAとMyc354ペプチドとの融合タンパク質の発現ベクターを構築した。この発現系の利点は、融合タンパク質をIgGセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製することができることである。そして次にヒスチジン6個からなるオリゴペプチドとMyc35マペプチドとの融合タンパク質の発現ベクターを構築した。この系の利点は、融合タンパク質をニッケルキレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製することができることである。これら2種類の発現ベクターにより大腸菌を形質転換し、Myc354融合タンパク質の生産を試みた。しかしながら、目的とするMyc354ペプチドの生産は確認されなかった。現在、プロモーター及び遺伝暗号などを変えて発現効率の改善を検討している。

2.Maxタンパク質生産系の確立とその構造学的特性の解析今年度はc-Mycと二量化するパートナーで、似た構造をもつMaxタンパク質の大腸菌による生産系の確立も行った。ヒト胎児脳cDNAライブラリーよりPCR法で得たMax遺伝子を発現ベクターpQEにクローン化し大腸菌M15[pREP4]に形質転換し発現誘導したところ1リットル培地から約20mgの純粋なMaxタンパク質を得ることが出来た。これを再生した後、CD解析を行ったところ約50%のα-ヘリックス含量を示した。また、これに特異的結合配列を含むDNAオリゴマーを加えるとヘリックス含量が急激に増加することがわかった。さらに、このタンパク質のDNA結合能をゲルシフトアッセイで解析したところ高い結合能を示した。これらのことから、今回作成したMaxタンパク質は生物学的機能を有することがわかり今後NMR等で高次構造の解析を行うことにしている。
データ駆動型アプローチによる核融合プラズマの突発的崩壊現象の研究

核融合エネルギーの実現を目指した磁場閉じ込めプラズマの研究分野では,炉心となる高温プラズマを安定に定常維持することが基本的な課題である.しかし,炉心プラズマ中では様々な突発的崩壊現象が存在する.これらを解明・制御することは核融合プラズマ研究の最重要課題の1つである.本研究では,ヘリカル方式のプラズマ中の突発的崩壊現象を対象とし,大型ヘリカル装置(LHD)のプラズマ実験データに基づいたデータ駆動型アプローチによって現象に潜在する物理機構を理解し,崩壊現象を予知することを目指す.また,トカマク方式のプラズマ中の突発的崩壊現象との比較を通して,現象の物理機構の普遍性を検証する.核融合エネルギーの実現を目指した磁場閉じ込めプラズマの研究分野では,炉心となる高温プラズマを安定に定常維持することが基本的な課題である.しかし,炉心プラズマ中では様々な突発的崩壊現象が存在する.これらを解明・制御することは核融合プラズマ研究の最重要課題の1つである.本研究では,ヘリカル方式のプラズマ中の突発的崩壊現象を対象とし,大型ヘリカル装置(LHD)のプラズマ実験データに基づいたデータ駆動型アプローチによって現象に潜在する物理機構を理解し,崩壊現象を予知することを目指す.また,トカマク方式のプラズマ中の突発的崩壊現象との比較を通して,現象の物理機構の普遍性を検証する.
新規クルクミン誘導体を用いた新しいがん薬物療法の開発

86種類の新規クルクミンアナログを作成し、抗腫瘍活性が増強されたアナログを複数合成することに成功した。これらは様々な種類のがんに有効で、NF-κBシグナル伝達の阻害活性を示した。また、大腸がん幹細胞の増殖を抑制した。動物モデルにおいても有用性が認められ、新規クルクミンアナログを用いた新たながん化学療法の可能性が示唆された。16種類のがん細胞パネルを用いた抗腫瘍活性評価では86種類の新規誘導体についての評価を終え、ディアリルペンタノイド構造を持ついくつかの誘導体の抗腫瘍活性がin vivoでも増強している事を見いだした(投稿中)。新規誘導体GO-Y030はIKK betaに対する直接阻害活性を有し、強力なNF-kB阻害剤となりうることを示した(Cancer Science, 2011)。また、ミエローマ細胞に対してGO-Y078,GO-Y030は強い抗腫瘍活性を示し、その標的分子はNF-kB, IRF-4, c-Myc, IL-6など多岐にわたることを示した。これらの化合物はミエローマの新たな治療薬として期待できる(2010年日本癌学会総会、投稿中)。また、新規クルクミン誘導体はKSRPと直接結合することが示され、これはc-Mycの発現制御に関連すると考えられた(ACS Medicinal Chemistry Letters, 2010)。また、GO-Y-78はHUVECに対して血管新生阻害活性を有し、その活性はSunitinibと同等以上であった。現在、Xenopusを用いたin vivoの系で検証中である。また、転移抑制活性についてもgelatin zymogramなどで示されており、同じくin vivoの系で検証中である。胃がんモデルマウスを用いたin vivoの抗腫瘍活性についても検証中である。さらに放射線性腸炎に対する防護効果を示唆するデータが得られており、現在、検証を行っている。16種類のがん細胞パネルを用いた抗腫瘍活性評価によって86種類の新規誘導体のアッセイを終え、さらに活性が増強していたディアリルペンタノイド構造を持つ誘導体がマウスモデルの腹水がんを抑える等、抗腫瘍活性がinvivoでも増強している事を見いだした(BMC Pharmacology,2011,Kudo C,et al.)。新規誘導体GO-YO30はIKKbetaのキナーゼ活性に対する直接阻害活性を有し、強力なNF-kB阻害剤となりうることを示した(Cancer Science, 2011, SatoA et al.)。また、ミエローマ細胞に対してGO-YO78, GO-YO30は強い抗腫瘍活性を示し、その標的分子はNF-kB,IRF-4,c-Myc,IL-6など多岐にわたることを示した。これらの化合物はミエローマの新たな治療薬としても期待できる(Anticancer Research, 2011, Kudo C, et al)。GO-YO78はヒト血管内皮細胞HUVECに対して血管新生阻害活性を有し、その活性はSunitinibと同等以上であった。現在、カエルのオタマジャクシを用いたinvivoの系でも血管新生を抑制した。また、転移抑制活性についてもgelatinzymogramなどで示されており、同じくinvivoの系で検証中である。胃がんモデルマウスを用いたinvivoの抗腫瘍活性についても検証中である。さらに放射線性腸炎に対する防護効果を示唆するデータが得られている。クルクミンは抗腫瘍活性、腫瘍血管阻害活性、転移抑制活性、発がん予防活性を有するマルチターゲット分子標的薬剤であるが、生体内での有用性が乏しい。新規のクルクミン誘導体(ディアリルペンタノイド型、DP型誘導体)にはクルクミンを上回る抗腫瘍活性が存する。そこで本研究の「目的」としてDP型誘導体をリード化合物として、マルチターゲットで、より強力な抗腫瘍薬の合成を目指してきた。「研究実施計画」は、1.がん細胞パネルによる抗腫瘍活性の検討、2.がん標的分子の発現に与える影響、3.抗がん剤との併用、4.浸潤能、転移能阻害活性の検討、5.可溶性に関する検討、6. in vivoにおける有効性、毒性の検討であるが、「4」を除く計画は前年度までに成果を得ている。残る計画4であるが、浸潤能、転移能阻害活性、および腫瘍血管阻害活性についてXenopusの胎仔やHUVEC細胞を用いて検討した。その結果、DP型誘導体のGO-Y078はXenopusの胎仔の血管新生を阻害し、HUVEC細胞のsproutingを阻害した。この活性は既に市販されているマルチターゲット分子標的薬であるソラフェニブやスニチニブに相当するものであった。DP型誘導体には腫瘍血管阻害活性があること、HUVEC細胞にアポトーシスを誘導する事、Wound Healing AssayにおいてHUVEC細胞の移動能を阻止する活性がある事などが明らかになった。2011年、クルクミンアナログに関する論文発表を4編、総説1編、学会発表2回を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。血管新生阻害活性、抗炎症作用などについて検討を進める。
初期発生胚におけるミトコンドリア分布形態の推移に関する研究

マウス初期発生胚のin vitro発生停止の原因を明らかにする目的で、受精後の第一、第二細胞周期における初期胚のミトコンドリア細胞内分布の経時的変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討し,さらにその超微形態についても解析を行った。【方法】ICR系雌マウス46週齢にPMSG5単位,48時間後にhCG5単位をそれぞれ腹腔内投与して過排卵処理を施し、同系成熟雄マウスと一晩同居させ翌朝膣栓を認めたマウスを実験に用いた(vivo胚)。また過排卵処理マウスから排卵卵子を回収・媒精し,得られた受精卵を実験に供した(vitro胚)。hCG投与後12時間以降54時間まで、6時間ごとに卵管より胚を回収し蛍光色素rhodamine123を用いて胚内のミトコンドリア(MT)を染色し,共焦点レーザー顕微鏡(CLMS)下で観察した。さらに透過型電子顕微鏡(TEM)による超微形態学的変化を経時的に検討した。【結果】vivo胚、vitro胚ともにMTは細胞周期に従って胚内を移動し、核周囲凝集型,細胞周囲凝集型,均一型,凝集塊形成型の4型に分類され、数種類の型が同一胚に混在するものもみられた。またvitro胚では受精卵の99%が2細胞期で発生停止し,TEM下でMTの変性像(クリステの崩壊,ミエリン形成)の経時的増加が認められた。2細胞期vitro胚ではBrdU陽性細胞が74.8%を占め、超微形態学的にM期の特徴的所見は認められず、CLMS下でM期直前に特徴的な細胞膜直下のMT集合像がhCG投与66時間後の胚の54.3%に認められ、vitro胚では主として第二細胞周期S期以降M期直前に発生停止していることが明らかとなった。
咬合感覚異常についての補綴学的研究

本研究ではまず次に示す咬合感覚診査システムを開発した.歯根膜感覚:厚さの異なる(8,12,16,20,24,28,32,3βμm)ストリップス(Bausch製Arti-Fol, ARTus製Registration strips)を用いた歯根膜厚さ分別能の測定(フォイルテスト)筋感覚:1センチメートル前後の厚さの異なる(9,9,5,9.75,10,10.25,10.5,10.75,11mm)ブロック・プラスチック板を用いた筋紡錘の厚さ分別能の測定(スティックテスト)顎関節感覚:2センチメートルの開口位を術者の誘導によりとらせ,一度閉口後再度自発的に同じ開口位をとらせその再現性を測定(TMJテスト)粘膜感覚:小ピース5個(円形、楕円形,三角形、四角形、長方形)を用いたステレオグノスティックテスト本システムは簡便で安価であり咬合感覚診査の臨床応用が可能となった.次に,咬合感覚異常をもたない正常被験者20名を対象にこれら4つの感覚診査を行いそれらの正常値のプロファイルを導出した.引き続き咬合感覚異常者を対象に感覚診査を行った.4つのテストの結果群間差が認められたのはフォイルテストのみであった.フォイルテストの結果、正常被験者の識別値は14μm(中央値)となり,従来の歯根膜の識別閾の報告と同程度の値を示した.興味深いことに咬合感覚異常者の識別値は正常者のそれより低い傾向が認められ,中央値が6μmとなった.特に1名の患者を除き他の患者はすべて10μm未満の識別値を示した.本研究結果はこれら患者群の咬合感覚の異常が何らかの形で鋭敏化された歯根膜感覚受容器が微細な咬合の変化を検知できるようになったことに起因している可能性を示唆しでいる.歯科臨床において咬合紙を用いた咬合診査・調整を10μm以下の精度で行うことは事実上不可能である.つまり,咬合診査で異常が認められなくても、咬合感覚異常を訴える患者に遭遇した場合,臨床家は現在の医療技術で検出できないほど微小な咬合異常が存在する可能性があることを認識する必要性があること示唆している.同時に,そのような患者の訴えを十分なスクリーニングもせず,精神心理学的要素と安易に結び付けて理解しようとすることには注意を要することを示唆している.今回選択された被験者は本学附属病院へ来院中のConvenient sampleであり,被験者数も少なく,群間差が統計的に有意ではなかったこと等から,本研究結果を一般化するには更に研究を継続する必要があるが,前述のように7例中6例において非常に高い識別能が認められたことは特筆すべきである.本研究ではまず次に示す咬合感覚診査システムを開発した.歯根膜感覚:厚さの異なる(8,12,16,20,24,28,32,3βμm)ストリップス(Bausch製Arti-Fol, ARTus製Registration strips)を用いた歯根膜厚さ分別能の測定(フォイルテスト)筋感覚:1センチメートル前後の厚さの異なる(9,9,5,9.75,10,10.25,10.5,10.75,11mm)ブロック・プラスチック板を用いた筋紡錘の厚さ分別能の測定(スティックテスト)顎関節感覚:2センチメートルの開口位を術者の誘導によりとらせ,一度閉口後再度自発的に同じ開口位をとらせその再現性を測定(TMJテスト)粘膜感覚:小ピース5個(円形、楕円形,三角形、四角形、長方形)を用いたステレオグノスティックテスト本システムは簡便で安価であり咬合感覚診査の臨床応用が可能となった.次に,咬合感覚異常をもたない正常被験者20名を対象にこれら4つの感覚診査を行いそれらの正常値のプロファイルを導出した.引き続き咬合感覚異常者を対象に感覚診査を行った.4つのテストの結果群間差が認められたのはフォイルテストのみであった.フォイルテストの結果、正常被験者の識別値は14μm(中央値)となり,従来の歯根膜の識別閾の報告と同程度の値を示した.興味深いことに咬合感覚異常者の識別値は正常者のそれより低い傾向が認められ,中央値が6μmとなった.特に1名の患者を除き他の患者はすべて10μm未満の識別値を示した.本研究結果はこれら患者群の咬合感覚の異常が何らかの形で鋭敏化された歯根膜感覚受容器が微細な咬合の変化を検知できるようになったことに起因している可能性を示唆しでいる.歯科臨床において咬合紙を用いた咬合診査・調整を10μm以下の精度で行うことは事実上不可能である.つまり,咬合診査で異常が認められなくても、咬合感覚異常を訴える患者に遭遇した場合,臨床家は現在の医療技術で検出できないほど微小な咬合異常が存在する可能性があることを認識する必要性があること示唆している.同時に,そのような患者の訴えを十分なスクリーニングもせず,精神心理学的要素と安易に結び付けて理解しようとすることには注意を要することを示唆している.

今回選択された被験者は本学附属病院へ来院中のConvenient sampleであり,被験者数も少なく,群間差が統計的に有意ではなかったこと等から,本研究結果を一般化するには更に研究を継続する必要があるが,前述のように7例中6例において非常に高い識別能が認められたことは特筆すべきである.当年度はまず,咬合感覚を下記の4感覚に分け,それぞれに対応した診査システムを開発し,これらを正常被験者3名を対象にテストし、必要に応じて診査システムの改良を行った.歯根膜感覚:厚さの異なる(8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36μm)ストリップス(Bausch製Artl-Fol, ARTUS製Registration strips)を用いた歯根膜厚さ分別能の測定筋感覚:1センチメートル前後の厚さの異なる(8, 8.5, 9, 9.5, 9.75, 10, 10.25, 10.5, 10.75, 11, 11.5, 12mm)ブロック・プラスチック板を用いた筋紡錘の厚さ分別能の測定顎関節感覚:2センチメートルの開口位を術者の誘導によりとらせ,一度閉口後再度自発的に同じ開口位をとらせその再現性を測定粘膜感覚:大ピース,小ピースそれそれ5個(円形、楕円形,二角形、四角形、長方形)を用いたステレオグノスティックテスト次に,咬合感覚異常をもたない正常被験者10名を対象にこれら4つの感覚診査を行いそれらの正常値のプロファイルを導出した.歯根膜感覚:平均8.8μm,標準偏差6.0133μm,最大18μm,最小4μm筋感覚:1)テストブロックが厚い時平均0.821mm,標準偏差0.249mm,最大1.25mm,最小0.375mm2)テストブロックが薄い時平均・0.411mm,標準偏差0.2082mm,最大・0.625mm,最小・0.125mm顎関節感覚:平均・0.191mm,標準偏差0.169mm,最大・0.36mm,最小・0.022mm粘膜感覚:小ピース正解率平均70%,標準偏差19.8%,最大100%,最小30%大ピース正解率平均96%,標準偏差12%,最大100%,最小60%次年度には,咬合感覚異常群からのデタを収集し標準値との比較から検査値としての妥当性を統計的に検証する.当年度はまず,初年度に考案した,歯根膜感覚(Foilテスト),筋感覚(Stickテスト),顎関節(TMJテスト),感覚.粘膜感覚(Sterognosisテスト)の4つの感覚を対象とした診査システム(平成13年度報告書参照)の改良・手順の標準化を行い同シス払を完成した.次に本システムを用いて正常被験者15名を対象に感覚テストを用いMean+/-SDの範囲を求め,この値は統計的に正常者の70%をカバーするため,咬合感覚検査値の正常者の標準値とした.以下にその結果を示す.Foilテスト被験歯種:中切歯.左右は8μのアルミ箔で引き抜き試験を行い咬合関係が緊密な側,生活歯.動揺度が小さい等の基準で選択検査機器:8μ32μの4μ間隔のアルミ箔7種類とアルミ箔のなしの計8種類のホルダー被験動作:切端咬合位にて2秒間咬合,回答:箔を咬んでいると感じたら"ある",咬んでないと感じたら"ない"Stickテスト被験歯種:Foilテストと同様検養機器:標準ブロック10mm,標準より厚いテストブロック,薄いテストブロック各6個計13個被験動作:最初に標準のブロックを咬み,次にテストブロックを2秒間咬む回答:テストブロックが標準と比べて"同じ","厚い","薄い"解析:Foilテストと同様標準値:厚いテストブロック:0.82+/-0.2mm,薄いテストブロック:O.41+/-0.2mmSterognosisテスト検査機器:丸,楕円,三角.正方形.長方形の5種類のsample pieceと大小2種類のtest piece被験動作:test pieceを舌の上にのせ,口の中で形を30秒間で感知する.テストは5種類各4回ずつ乱数表にてランダムに合計20回施行回答:sample pieceを選択,解析:正解率,標準値:小ピース正解率:70+/-20%,大ピース正解率:96+/-12%
糖尿病白内障形成の原因および食品成分による抑制の試み

糖尿病では血糖値の上昇に伴いタンパク質の糖化反応が進行し、同時に過酸化反応も促進されることが知られている。これらの反応により、腎症、網膜症、神経障害、白内障等の合併症を引き起こすことが推測されている。従って、抗酸化剤の投与により、生体内の過酸化反応を抑制し、糖尿病合併症を予防出来ることが期待されている。本研究では食餌性抗酸化剤による糖尿病合併症の抑制効果について、1年目は、糖尿病ラットを対照群、抗酸化剤として市販されているプロアントシアニジン高含有ブドウ種子抽出物0.5%投与群(PA群)およびトコフェロール500ppm投与群(T群)とに分け、ラットの白内障の発症・進行状況を観察し、解剖後は血糖値、糖化ヘモグロビン、過酸化脂質量を測定した。2年目はさらに、同様の実験系において、投与量をPA群0.1%、T群100ppmにおさえ、さらにT、PA混合群(TPA群)、およびお茶成分であるカテキン0.1%投与群(Ca群)を設定した。その結果、一年目は対照群との比較において、血糖値、糖化ヘモグロビン共に、PA群は有意に低下し、血清中の過酸化脂質量もT群およびPA群は低い傾向を示した。また、白内障もT群、PA群共に抑制したが、PAの方がより有効であった。2年目では濃度を下げたのにもかかわらず、前年度とほぼ同様の効果が得られた。また、TPA群およびCa群も白内障の形成を抑制し、抑制率についてはプロアントシアニジンが最も効果が高いことが明らかにされた。これらの反応は血管障害、腎障害、白内障などの合併症と深く関連していることが推測されている。従って、抗駿化剤の投与により糖尿病合併症を抑制できる可能性があると考えられる。そこで、今回は抗酸化剤として市販されているプロアントシアニジン高含有ブドウ種子抽出物を用い、糖尿病ラットにおける合併症の抑制効果について検討した。Wistar系ラット(雄、10週齢、体重約270g)にSTZ(50mg/kg体重)を投与して糖尿病ラットを作成した。糖尿病ラット20匹を(1)対照群、(2)トコフェロール投与群(T群、飼料に対して500ppm)、(3)プロアントシアニジン群(PA群、飼料に対して0.5%)に分け、約4ケ月間飼育した。その間、ラットの白内障の進行状態を観察し、ラット解剖後、血糖値、糖化ヘモグロビン、過酸化脂質(TBA法)を測定した。以上の実験の結果から次のことが明らかとなった:(1)血糖値においては対照群と比べて、T群およびPA群は低値を示し、特にPA群は有意に低下した。(2)糖化ヘモグロビンA_<1c>についても対照群と比べてPA群の方が有意に低値を示した。(3)血清中の過酸化脂質量も対照群と比べてT群およびPA群の方が低い傾向にあった。(4)白内障もTまたはPAにより抑制されたが、TよりもPAの方が有効であった。糖尿病では血糖値の上昇に伴い、タンパク質の糖化反応が進行し、同時に過酸化反応も促進されることが知られている。これらの反応は血管障害、白内障などの合併症と深く関係していることが推測されている。従って、抗酸化剤の投与により糖尿病合併症を抑制できる可能性がある。そこで、本研究はin vivoにおいて、白内障形成抑制効果について、抗酸化剤のぶどう種子のプロアントシアニジンの濃度依存性およびお茶成分カテキンの有効性を検討した。Wistar系雄ラットにSTZを投与し、糖尿病ラットを作製し、0.1%プロアントシアニジン(PA)、PAとトコフェロール(100ppm)の混合(TPA)および0.1%カテキン(Ca)を約3ヶ月間投与する。

その後、解剖し、血糖値、糖化ヘモグロビン、過酸化脂質などを測定し、白内障の形成においてレンズ中のグルコース、フルクトース、ソルビトールおよび過酸化脂質を測定した。その結果は昨年の実験の結果とほぼ同様な傾向であり、TPA、PAおよびCaも白内障の形成を有効に抑制した。しかも、PAはTあるいはCaよりも白内障抑制率が高かった。以上の結果により、プロアントシアニジンおよびカテキンは糖尿病改善効果を示し、糖尿病合併症の一つである白内障を有効に抑制することが明らかとなった。