hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子間相互作用と膜蛋白ミクロアレイ解析に基づいた多発性硬化症の分子標的療法開発

日本人脱髄性疾患では、疾患表現型に関わらずDRB1*0901が共通の疾患抵抗性遺伝子である一方、疾患感受性遺伝子は疾患表現型により異なることを明らかにした。IL7RA遺伝子は欧米白人同様に疾患感受性遺伝子となっており、さらにCC遺伝子型とDRB1*0405アリルの両者を有する場合にのみ、MS疾患感受性に寄与していた。IL2RA遺伝子は、rs7090512のCアリルはHLA-DRB1*0405、またはHLA-DRB1*1501と相互作用するときにのみ疾患感受性に寄与する可能性が示された.無細胞タンパク質合成系を利用して、CIDPにおいてBalo病より有意に多い自己抗原としてLUZP1が、MSにおいてCIDPとBalo病より有意に多い自己抗原としてSOX6が得られた.高感度抗AQP4抗体測定法により、IgG1は罹病期間と関連し、IgG2は脊髄病変長と逆相関があった日本人脱髄性疾患では、疾患表現型に関わらずDRB1*0901が共通の疾患抵抗性遺伝子である一方、疾患感受性遺伝子は疾患表現型により異なることを明らかにした。IL2RA遺伝子は、rs7090512のCアリルはHLA-DRB1*0405、またはHLA-DRB1*1501と相互作用するときにのみ疾患感受性に寄与する可能性が示された.無細胞タンパク質合成系を利用して、CIDPにおいてBalo病より有意に多い自己抗原としてLUZP1が、MSにおいてCIDPとBalo病より有意に多い自己抗原としてSOX6が得られた.高感度抗AQP4抗体測定法により、IgG1は罹病期間と関連し、IgG2は脊髄病変長と逆相関があった特発性再発性中枢神経脱髄性疾患(視神経脊髄炎,多発性硬化症),その他の炎症性中枢神経疾患,非炎症性神経疾患,健常者を対象にELISA, aquaporin-4 (AQP4)蛋白を発現させたHEK293細胞を用いたフローサイトメトリおよび間接蛍光免疫法による3者で抗AQP4抗体の測定を行い,NMOに対する感度・特異度明らかにした。感度・特異度はフローサイトメトリを用いた測定法がもっとも高かった(それぞれ51.7%, 100.0%)。またELISAによる測定方法も従来の間接蛍光免疫法に劣らない感度特異度であった。フローサイトメトリを用いた測定方法により抗AQP4抗体のIgGサブクラスを確認し,IgG1によるmean fluorescence intensity (MFI) ratioと罹病期間に正の相関がある一方,IgG2サブクラスのMFI ratioは脊髄病変長と逆相関していることを明らかにした。抗AQP4抗体のIgG2サブクラスは神経保護的に作用している可能性がある。またこれらの測定法を用いて特発性再発性中枢神経脱髄性疾患を厳密にNMO, non-NMO MSに分類し,その遺伝的背景を健常者群と比較した。この結果IL-7受容体α鎖(IL7RA)遺伝子のSNPが欧米白人同様に疾患感受性遺伝子となっていることを発見した。サイトカイン/ケモカイン解析においてはMO患者髄液ではIL-17, IL-8,IL-6, GCSFの濃度がnon-NMO MSや非炎症性神経疾患群と比較して高いことを見いだした。日本人脱髄性疾患をNMO/NMOSD(NMO;視神経脊髄炎)とnon-NMO/NMOSD MS(MS;多発性硬化症)に分類し、HLA-DRB1およびDPB1アリルを健常者と比較した。その結果、MS患者では、DRB1^*0405とDPB1^*0301が疾患感受性遺伝子、DRB1^*0901とDPB1^*0401が疾患抵抗性遺伝子となっていた。一方、NMO患者では、DRB1^*1602とDPB1^*0501が疾患感受性遺伝子、DRB1^*0901が疾患抵抗性遺伝子となっていた。また、DRB1^*1602とDPB1^*0501は抗AQP4抗体陽性のNMOのみで疾患感受性遺伝子となっていた。以上の結果から、日本人脱髄性疾患では、疾患表現型に関わらずDRB1^*0901が共通の疾患抵抗性遺伝子である一方、疾患感受性遺伝子は疾患表現型により異なることを明らかにした。次に、昨年度我々が発見した日本人MSの疾患感受性遺伝子であるIL-7RA rs6897932のCC遺伝子型とDRB1^*0405との相互作用を検討した結果、CC遺伝子型とDRB1^*0405アリルの両者を有する場合にのみ、日本人のMS疾患感受性遺伝子に寄与することを見いだした。小麦胚芽を用いた無細胞タンパク質合成系で作製された蛋白ライブラリとアルファスクリーンによりMSに特徴的な自己抗体プロファイルの作成と新規自己抗体の検索を行なった。ミエリンや炎症関連抗原に限定せずに2182種類の蛋白質を用いて、MS患者で自己抗原となりやすい、反対になりにくい蛋白質の候補が得られ、引き続く後期スクリーニングの選定が進んだ。

さらに、これまでに準備できた182種類の蛋白質を用いて、MS患者再発期、健常者、筋萎縮性側索硬化症(ALS)重症筋無力症(MG)とGuillain-Barre症候群(GBS)患者血清での結果と比較検討し、自己抗原と判定された抗原数は、ALS特異的は6種類、MS特異的は2種類、GBS特異的は0種類、MG特異的は1種類、健常者特異的は2種類あった。MS患者に多い自己抗原として、potassium channel tetramerisation domain containing 14、transcription factor B1、mitochondrialなどがあった。日本人脱髄性疾患をNMO/NMOSD(NMO;視神経脊髄炎)とMS(MS;多発性硬化症)に分類し、欧米人では疾患感受性遺伝子として報告されているIL2RAの3つのSNP(rs2104286,rs12722489,rs7090512)を検討した.その結果、MS患者と健常者,NMO/NMOSDと健常者での比較では,いずれのSNPでも遺伝子型の頻度に有意差は無かった.しかしMSの疾患感受性遺伝子であるHLA-DRB1*0405を有するサブグループではrs7090512のCアリルの頻度がMSで健常者より有意に高かった.同じくMSの疾患感受性遺伝子であるHLA-DRB1*1501を有するサブグループではrs7090512のCアリルの頻度がMSで健常者より有意に高く,NMO/NMOSDも健常者より有意に高かった.rs7090512のCアリルはHLA-DRB1*040またはHLA-DRB1*1501と相互作用するときにのみ疾患感受性に寄与していた.rs7090512自体が疾患感受性の本態なのか,それともrs7090512と強い連鎖不平衡にあり,rs2104286,rs12722489とは連鎖不平が弱いと予測される真の疾患感受性変異があるのかは検討課題である.小麦胚芽を用いた無細胞タンパク質合成系で作製された蛋白ライブラリーとアルファスクリーンにより,これまでに判明していたMS患者で自己抗原となりやすい、反対になりにくい蛋白質の候補に関して,MS患者10例、Balo病9例,慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIDP)患者5例の血清で比較検討した.CIDPにおいてBaloより有意に多い自己抗原としてLUZP1が,MSにおいてCIDPとBaloより有意に多い自己抗原としてSOX6が得られた.それらの意義に関しては検討課題である.MS及びNMOの疾患感受性遺伝子となっているHLAクラスII遺伝子及び非HLA領域の遺伝子を同定し、MS発症に寄与する遺伝子間の相互作用を明らかにしたこと。網羅的髄液サイトカイン解析と膜蛋白を標的とした自己抗体のantigen microarray解析により病態特異的な免疫プロフィールを明らかにしたこと。以上のことから、(2)と区分した。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの解析で得られた疾患感受性遺伝子・疾患抵抗性遺伝子とサイトカインバランス、自己抗体プロフィールから、MSの病態をネットワーク解析し、疾患特異的な病態のフローチャートを作成する。同定された疾患感受性遺伝子を導入にしたトランスジェニックマウスを用い、病態フローチャートで疾患特異的な役割を担う免疫分子を標的とするモノクローナル抗体を作成し、治療効果を検証し、新規治療法を開発する。
量子輸送現象における近藤効果の理論的研究

1.非線線系応答領域の量子ドットに適用可能な非摂動的アプローチを開発し非平衡状態における近藤効果の全貌を調べるための研究を進めた。一般的なKeldyshのGreen関数法は非摂動的な計算への応用は難しいため、我々は非平衡定常を記述する密度行列から出発し量子ドットと結合しない伝導電子の自由度に関するHilbert空間の部分和を解析的に実行することに成功した。最近の発展の基礎を築いた。2.超伝導体接合された量子ドットの近藤効果を課題の2点目として調べた。この系の基底状態は超伝導ギャップと近藤温度の大きさにより、スピン・シングレットか磁性を持ったダブレットのどちらかになる。従来は、近藤温度によるスケールされるパラメータ領域が主として問題にされていた。我々は、量子ドットではスケーリングからのずれの効果が、ギャップがクーロン相互作用より大きな場合には重要であり、しかもこの性質が簡単化された模型により理解されることを明らかにした。3.量子ドットのGreen関数のω依存性を調べた。特に、超伝導ギャップ中に現れるAndreev束縛状態のエネルギーなどの動的な性質の概要を数値くりこみ群による精密な計算から明らかにした。また、Josephson接合中での量子ドットにおける物性の超伝導ギャップの位相差による変化を詳細に調べ、トンネル接合の非対称性が近接効果と磁性に強く影響を与えることを示した。4.超伝導-量子ドット-常伝導接合系の低エネルギーの物性が局所Fermi流体として理解されることを示し、かつこの局所Fermi流体のLandauパラメータの値を数値くりこみ群を用いて精密に決定した。電子間の相互作用は、量子ドット、量子細線などの輸送現象に多彩なバリエーションを与える。我々は、様々な状況の中で起こる近藤効果に関連する現象の研究を進めている。近藤効果は、平均して奇数個の電子が量子ドットを占有する場合、高温では電子間の斥力のため量子ドットに局所磁気モーメントが現れ、このモーメントが低温では伝導電子との混成により低温でsinglet対を形成し遮蔽されることにより起こるが、低温の性質を系統的に調べるには高度な理論計算が必要とされる。我々は研究の第1点目として、2個の超伝導金属に挟まれた量子ドット系の低エネルギーの性質をWilsonの数値くりこみ群を用いて精密に調べた。この系では、超伝導ギャップと近藤効果の競合により、基底状態は磁気モーメントを持つ場合と遮蔽される場合があり、転移がおこると量子ドット通過するJosephson電流の向きが変わるなど興味深い振る舞いを示す。我々は、トンネル接合の非対称性が基底状態の転移に大きな影響を与えることを見出し、基底状態の性質を対称性の観点から総合的に論じ論文にまとめた。論文は、近々New Journal Physics誌へ掲載される。また、我々は超伝導-ドット-常伝導系におけるAndreev散乱と近藤効果に関した詳細な計算も行った、興味深い結論が得られた。論文は現在、投稿中である。研究の第2点目として、非線系応答領域の量子ドットに適用可能な非摂動的アプローチを開発し、非平衡状態における近藤効果の詳細を明らかにすることを目指している。非平衡状態の定式化にはKeldyshのGreen法が知られている。この方法は、摂動的な計算には有効であるが、非摂動的な拡張は難しい。我々は、非平衡定常を記述する密度行列から出発し、量子ドットと結合しない伝導電子の自由度に関するHilbert空間の部分和を解析的に実行することに成功し、Phys.Rev.誌に発表した。今年度は特に、超伝導体に接続された量子ドットにおける近藤効果、Josephson効果、Andreev散乱の競合が、輸送現象と磁性に与える影響を中心に研究を進めた。以下、主要な成果を列記する。(1)超伝導体中の近藤系の基底状態は、超伝導ギャップと近藤温度より大さに依存し、非磁性のシングレットか、磁性を持ったダブレットのどちらかになる。

我々は、量子ドットではスケーリングからのずれが重要であることを指摘した。我々は、この効果は特にギャップがクーロン相互作用より大きな場合には現れることを確認し、この性質が簡単化された模型により良く理解されることを明らかにした。(2)量子ドットのGreen関数のω依存性の計算を行い、超伝導ギャップ中に現れるAndreev束縛状態のエネルギー・重みなど、1粒子スペクトル関数の詳細を数値くりこみ群による計算から明らかにした。また、Josephson接合中で超伝導ギャップの位相差により基底状態が受ける影響を広いパラメータの範囲で詳細に調べ、トンネル接合の非対称性が近接効果と磁性に強く影響を与えることを示した。(3)超伝導-量子ドット-常伝導接合系の低エネルギーの物性が局所Fermi流体として理解されることを示し、かつこの局所Fermi流体のLandauパラメータの値を数値くりこみ群を用いて精密に決定した。
肺癌発生に及ぼすディ-ゼル排ガスの影響乳幼仔期の一定期間ばく露の影響及び高感度動物によるばく露実験

ディ-ゼルエンジン排気ガスは多環芳香族炭化水素、ニトロアレン類などの発癌物質を多量に含み、マウス・ラット等での動物吸入実験による肺腫瘍発生も報告されている。しかし、一定期間の暴露後の呼吸器病変についての詳細な検討はなく、特に若年時からの発癌刺激が後年に修復されるか、発癌するかについては明らかでない。そこで本研究は、若齢期のディ-ゼル排気ガス暴露が老齢期における肺癌発生に及ぼす影響を検討するためにC57BLマウスと妊娠16日目にENUを0,0.0125,0.25 mM/Kg B.W.経胎盤投与したB6C3F1マウスを用いて新生仔期から9ヶ月間の暴露を行い、30ヶ月齢まで肺腫瘍の発生を観察した。ディ-ゼルエンジン排気ガス暴露は、小型ディ-ゼルエンジン(ヤンマ- NCAー40E)を用い、その排気ガスを48倍に希釈し、一日4時間、週4回、NO2:24ppm、CO:40100ppm、粒子状物質:24 mg/m^3などの条件で行った。暴露終了後、肺におけるディ-ゼル粒子は30ヶ月でも存在し、呼吸器の病変も持続していた。C57B1マウスとB6C3F1マウスにおける肺腫瘍の発生は19ヶ月から見られ、暴露群における肺腫瘍の発生は、非暴露群のそれより高かった。ENUを投与したB6C3F1マウスでは、肺腫瘍の発生は9ヶ月以前から観察され、ディ-ゼル暴露群における肺腫瘍の発生は、非暴露群のそれより有意に高かった(P<0.01)。肺腫瘍はすべて腺腫と腺癌であり、腺癌はディ-ゼル排気ガス暴露を受けたマウスで多かった。以上から、若年期に受けたディ-ゼル排気ガス暴露は老齢期において肺腫瘍発生を引き起こすとともに、腫瘍発生を促進し、悪性腫瘍を増加させることが示唆された。ディーゼルエンジンの排ガスは多環芳香族炭化水素、ニトロアレン類などの発癌物質を多量に含み、マウス、ラット等での動物吸入実験による肺腫瘍発生も一部で報告されている。しかしながら、一定機関のばく露後の呼吸器(気管、気管支、肺実質)病変についての詳細な検討はなく、若年時からの発癌刺激が後年に修復されるか、発癌するかについては明らかではない。本年度は、肺腫瘍嫌発系マウス(C57BL/6N)への新生仔期から9カ月間の吸入暴露実験を行い、以降は一般飼育条件下で放置し、最長30カ月までの肺腫瘍発生について検討した。方法としては、生後24時間以内のC57BL/6Nマウス、雌雄を用い、新生仔期より、週4日、1日4時間、小型でィーゼルエンジン排ガス(粒子状物質:24mg/m^3、NO_2:24ppm、CO40100ppm)を吸入暴露した。9カ月以後放置された匹数は、対照無処置群、雄60、雌60、計109匹、暴露群、雄62、雌64、計126匹であった。〔結果の概要〕9カ月で両側肺胸膜に針頭大からゴマ粒大の集蔟性黒色斑点がみられ、以降放置飼育によっても粉じん沈着量は変化を認めない。組織学的には、最長放置期間20カ月でも黒色粉じんは肺胞膣内マクロファージに貧喰され存在し、又II型肺胞上皮の増生を認めた。

肺腫瘍は、対照群の雄に1例の良性腺腫を認めたのに対し、暴露群では、雌2例に腺腫、雄4例に腺腫を認め、そのうち雄での2例は組織学的に悪性化を示すものであった。以上の結果は、幼若、若齢期のディーゼル排ガス暴露が老齢期の肺腫瘍発生を起こす原因であることを示唆しているが、現在、マウス系統を、B6C3F_1(C57BL/6NX C3H/HeN)とし同様の実験を行っている他、同系マウスの経胎盤的な弱イニシエーションに対する排ガス吸入の促進的作用の有無についても検討を開始した。ディ-ゼルエンジンの排ガスは多量の有害ガスや粉じんを含み、動物吸入実験による肺腫瘍発生も報告されている。しかし、一定期間の暴露後の呼吸器(気管、気管支、肺実質)病変について詳細な検討はなく、老齢期の発癌に対する若年時の発癌刺激の影響については明かではない。本年度は、肺腫瘍嫌発系マウスへの新生仔期から9ケ月間の吸入暴露実験を行い、以降は一般飼育条件下で装置し、最長30ケ月までの肺腫瘍発生について検討した。方法は、C57BLマウス雄とC3H雌の自家繁殖(B6C3F1)マウス(暴露群:雄51、雌77、対照群:雄37、雌48)およびC57BLマウス(暴露群:雄74、雌83、対照群:雄60、雌73)を用い、生後24時間以内より9カ月暴露を行い、以後30カ月まで放置飼育。排気ガス暴露の方法と条件は、ヤンマ-NSAー40CE発電機を用い、その排気ガスを48倍に希釈し、1日4時間、週4回(NO_2=24ppm,CO=40100ppm,粒子状物質=24mg/m^3などの条件)吸入暴露した。結果の概要:前年度は排気がス暴露後の肺の病理学的変化について報告したが、その後の長期観察では、いずれの系統のマウスも、最長放置期間21カ月でも黒色粉じんは肺胞腔内マクロファ-ジに貧食され存在し、II型肺胞上皮の増生も見られた。さらに24カ月以後にはC57BL暴露群の雄13例、雌8例、対照群の雄6例、雌5例、B6C3F1暴露群の雄9例、雌6例、対照群の雄5例、雌2例に肺腫瘍が見られ、そのうちC57BL暴露群の雄4例、雌2例、対照群の雄1例、雌1例B6C3F1暴露群の雄4例、雌2例、対照群の雄1例、雌1例は組織学的に悪性であった。統計学的に有意差はないが、両系統のマウスとも排ガス暴露によって肺腫瘍発生は増加傾向を示し、悪性化の傾向も見られ、幼若・若齢期に受けたディ-ゼル排ガス暴露は、老齢期には肺腫瘍発生を起こすことが示唆された。次年度はB6C3F1マウスの経胎盤的なイニシエ-ションに対する排ガス吸入の発癌促進作用の有無について検討する。ディ-ゼルエンジン排気ガスは多環芳香族炭化水素、ニトロアレン類などの発癌物質を多量に含み、マウス・ラット等での動物吸入実験による肺腫瘍発生も報告されている。しかし、一定期間の暴露後の呼吸器病変についての詳細な検討はなく、特に若年時からの発癌刺激が後年に修復されるか、発癌するかについては明らかでない。そこで本研究は、若齢期のディ-ゼル排気ガス暴露が老齢期における肺癌発生に及ぼす影響を検討するためにC57BLマウスと妊娠16日目にENUを0,0.0125,0.025mM/Kg B.W.経胎盤投与したB6C3F1マウスを用いて新生仔期から9ヶ月間の暴露を行い、30ヶ月齢まで肺腫瘍の発生を観察した。ディ-ゼルエンジン排気ガス暴露は、小型ディ-ゼルエンジン(ヤンマ-NCAー40E)を用い、その排気ガスを48倍に希釈し、一日4時間、週4回、NO2:24ppm、CO:40100ppm、粒子状物質:24mg/m^3)などの条件で行った。暴露終了後、肺におけるディ-ゼル粒子は30ヶ月で存在し、呼吸器の病変も持続していた。C57BlマウスとB6C3Flマウスにおける肺腫瘍の発生は19ヶ月から見られ、暴露群における肺腫瘍の発生は、非暴露群のそれより高かった。ENUを投与したB6C3Flマウスでは、肺腫瘍の発生は9ヶ月以前から観察され、ディ-ゼル暴露群における肺腫瘍の発生は、非暴露群のそれより有意に高かった。(P<0.01)。
多元ＬＤＰＣ符号による二次元磁気記録の高密度化に関する研究

4Tbit平方インチの高面記録密度想定した二次元磁気記録再生系モデルに低密度パリティ検査(LDPC : low-density parity-check)符号を誤り訂正符号として用い,複数の再生素子を有するアレイヘッド再生により得られた再生波形を用いた二次元等化を行い計算機シミュレーションを用いてビット誤り率(BER : bit error rate)特性による性能評価を行った。その結果,アレイヘッドと二次元等化器を用いることで,より大きなヘッドスキュー角の場合においても良いBER特性を示すことが明らかとなった。高密度記録状態におけるTDMR方式は開発途上にあり、記録再生実験によって得られた実波形を信号処理方式の開発に用いることは困難であるため、記録再生系モデルを用いた計算機シミュレーションを繰り返し行いながら方式検討を実施せざるを得なかった。しかし、面記録密度200Gbit/inch2程度のヘッド・媒体をスピンスタンドに装着して再生波形を得たのち、この記録密度の記録再生チャネルにスケールを合わせてシミュレーションを行ったモデル波形を比較した結果、モデル波形は実験波形を良く再現できていることが明らかとなった。そのため今後は、この記録再生系モデルを用いてTDMR方式の検討を進める。また現在は、簡単のため記録ヘッドからの記録磁界の計算は線形と仮定して、ヘッド磁界の計算をしているが、これが記録された磁化パターンに与える影響が大きいことが明らかとなった。記録ヘッドの磁界をマイクロマグシミュレーションで計算した値に変更することも要検討である。トラック間干渉を制御するため、3つのヘッドで両隣接のトラックの波形まで用いた二次元等化方式をBinary LDPC符号化繰返し復号化方式に適用した結果、トラック間干渉を考慮しない等化方式に比べて良好な特性が得られることが明らかっとなった。また、2ヘッドで再生した再生波形を用いるだけでも、隣接トラックからの干渉を軽減できることが明らかとなった。今後はNon-binary LDPCを適用して、どの程度まで特性を改善できるか、またトラック間の情報を用いた繰返し復号の検討を行う予定である。ハードディスク装置の高記録密度化を実現する記録方式としてシングル(瓦)磁気記録に着目し、その信号処理方式の開発を行っている。離散ボロノイ図を用いたグラニュラ媒体モデルは精緻な磁気記録媒体モデルを用いたシミュレーション結果とほぼ酷似した計算結果を示し媒体モデルはほぼ完成しており、今後は高速化が望まれる。平成26年度は、低密度パリティ検査(LDPC:low-density parity check)符号をシングル磁気記録再生系モデルに実際に適用して、複数の再生素子を有するアレイヘッドにより再生された複数の再生波形を二次元等化器により波形等化して、LDPC符号の誤り訂正能力を評価した。その結果、二次元等化を行うことで、誤り訂正前の記録再生系で発生する誤りを低減でき、LDPC符号による誤り訂正が可能であることが明らかとなった。ハードディスク装置の高密度化を実現できるシングル(瓦)磁気記録に低密度パリティ検査(LDPC : low-density parity-check)符号を利用した繰返し復号による誤り訂正方式を適用してビット誤り率(BER : bit error rate)特性による評価を4テラビット平方インチの面記録密度を想定して行った。また,二次元信号処理方式として,複数の再生素子を有したアレイヘッドを適用し,再生素子のトラック上の走査配置を変えて得られた複数の再生信号を二次元有限インパルスフィルタにより波形等化し, BERを求めることで評価した。その結果,適切な走査位置に再生素子を配置することによって,二次元等化器でトラック間干渉の影響を低減できBER特性が良くなることが明らかとなった。また,ハードディスク装置の機械構造上問題となるヘッドスキューの影響を考慮して,その耐性についてBER特性を用いて評価を行った結果,再生ヘッドを磁化パターンの信頼度に合うように回転させることで,品質の良い再生信号を得ることが可能となり,大きなヘッドスキューに対して, BER特性の劣化を防ぐ耐性を持たせることができることが明らかとなった。これからの成果により,今後,現状の一次元の信号処理方式よりも二次元の信号処理方式を用いることで,より高密度な面記録密度においても良いBER特性を得られことが予想される。記録再生系モデルの構築自体は予定通り進んでいるが、GPUを用いた並列計算による高速化を行う予定であったが、シミュレーターの構造上、シリアル演算部分が多く存在するため、並列化が困難であることが判明した。信号処理開発自体は順調に進んでおり、アレイヘッド再生による複数再生波形を得る場合の問題点等も見えてきた。多元LDPC符号の適用も完了して性能評価段階に入っている。工学多元LDPC符号を構築した記録再生系モデルに適用して性能評価を行うと共に、昨年度問題が浮上したアレイヘッド再生による複数再生波形を得る場合にヘッドスキュー角が変わると、想定した再生波形が得られない問題の解決を行い、研究成果を国内外の学会で発表する。

面記録密度200Gbit/inch2程度のヘッド・媒体をスピンスタンドに装着して再生波形を得たのち、この記録密度の記録再生チャネルにスケールを合わせてシミュレーションを行ったモデル波形を比較した結果、モデル波形は実験波形を良く再現できていることが明らかとなった。そのため、ほぼ計画通りに進展しいる。研究成果は、電子情報通信学会2014年総合大会や電気関係学会四国支部連合大会をはじめとした国内学会で発表した。また、2014年5月にドイツドレスデンで開催される国際会議Intermag 2014で成果報告すると共にIEEEの学会誌に論文投稿を行った。購入物品の構成が変更になったため。今回作成したヘッド・媒体モデルを用いて10Tbit/inch2の超高密度記録におけるトラック間干渉の影響を繰り返し復号における状態遷移確率計算に導入して性能改善を図る。超高密度記録状態においては、数個の磁性粒子に1ビットの情報を記録しなければならないため、隣接トラックの記録パターンによって記録しようとしている情報が誤って記録される状況が発生することが予想される。したがって、隣接トラックの復号パターンまたは再生波形により状態遷移確率に重みを付けて計算する方法を確立する。また、多次元LDPC符号は、複数の情報ビットを一つの符号シンボルとして取り扱うためトラック間干渉を減できる符号配列の検討を行う。旅費や論文印刷で使用する予定。予定していた学会への参加ができなかったため、旅費が余った。平成25年度に行けなかった調査を平成26年度に行う。
仮想IaaSクラウドの実現に向けた高速で柔軟なVM再配置の研究

本研究では、ネステッドVMを用いて既存のIaaSクラウドの上に仮想IaaSクラウドを構築し、よりセキュアなIaaSクラウドを迅速に提供できるようにした。仮想IaaSクラウドによるコストの上昇を抑えるために、稼働率の低いVMを迅速に集約することによってコストダウンを図る瞬間マイグレーションを開発した。また、セキュリティVMと監視対象VMを独立してマイグレーションできるようにすることで、より柔軟なVM再配置を実現した。今年度は、ホストVM間の瞬間マイグレーション(課題(1))とセキュリティVMの柔軟なマイグレーション(課題(2))に取り組んだ。課題(1)については、VMの中でVMを動作させる技術(ネステッドVM)に対応した仮想化ソフトウェアのXen-Blanketを用いることを検討したが、その過程でアーキテクチャ上の問題が見つかった。そこで、ネステッドVMを実験的にサポートし始めたXen 4.2を用いることにした。ホストVM間でゲストVMのメモリをスワップする機構を実装し、それを用いたマイグレーションを開発した。実験の結果、開発したマイグレーション手法はゲストVMのメモリのサイズにあまり依存せずにマイグレーションを行えることが分かった。768MBのメモリをもつゲストVMをマイグレーションすると、従来のマイグレーション手法と比べて40%高速化できた。課題(2)については、セキュリティVMがリモートの監視対象VMのカーネルメモリ上のデータを取得できるようにした。このリモートメモリ監視機構をVM監視基盤であるVM Shadowに組み込み、既存の監視ソフトウェアを動作させられるようにした。監視性能を測定した結果、ナイーブな実装では監視に従来の15倍の時間を要することが分かった。その内訳を調査したところ、通信に64%の時間が費やされていることがわかった。さらに、監視対象VMとセキュリティVMが同一ハイパーバイザ上で動作している場合に、監視を継続したまま一緒にマイグレーションする機構も開発した。これらに加え、ネステッドVMを用いた時にゲストVMがどの物理サーバ上で動作しているかを検出する機構を開発した。実装にはEucalyptusを用い、ゲストVMを管理するEucalyptusのフロントエンドとホストVMを管理するEucalyptusのフロントエンドの情報を突き合わせて物理サーバを特定する。今年度も、ホストVM間の瞬間マイグレーション(課題(1))とセキュリティVMの柔軟なマイグレーション(課題(2))に取り組んだ。課題(1)については、ホストVM間でのマイグレーションにおけるダウンタイムの削減について検討した。その結果、ゲストVMのメモリをスワップする方式ではある程度以上、ダウンタイムが削減できないことが分かった。そのため、ゲストVM間でメモリを高速にコピーする方式および、ゲストVM間でメモリを移動する方式を開発した。実験によりこれらの二つの手法の詳細な比較を行い、どちらの方式もダウンタイムを同程度に削減できることが分かった。一方、マイグレーション時間はメモリを移動する方式のほうが短いことが分かったため、こちらの方式を採用した。これにより、提案手法は従来のマイグレーション手法の最大5.8倍高速にマイグレーションを行うことができるようになった。課題(2)については、昨年度の時点ではリモート監視を行うと従来の15倍の時間を要していた。今年度は、セキュリティVMが監視対象VMのメモリ情報を4KBのページ単位で取得するように最適化し、その情報を適切にキャッシュするようにした。これにより、リモート監視にかかる時間を従来の3.6倍にまで削減することができた。また、メモリのリモート監視だけでなく、ネットワークとディスクのリモート監視にも対応した。さらに、セキュリティVMと監視対象VMが同一ホスト上の別々のホストVMで動作している際には、ホスト・ハイパーバイザ経由で直接監視できるように最適化を行った。それに加えて、セキュリティVMの機能拡張を行い、監視対象VMに気づかれることなく、セキュリティVMを経由した帯域外リモート管理を行えるようした。さらに、ハイパーバイザに機能を追加することで、セキュリティVMに侵入されたとしてもリモート管理の情報が漏洩しないようにした。今年度は、ホストVM間の瞬間マイグレーション(課題(1))とセキュリティVMの柔軟なマイグレーション(課題(2))に加え、VMの物理配置に応じた最適化(課題(3))にも取り組んだ。課題(1)については、ホストVM間の瞬間マイグレーションの評価を行った。本評価においては、仮想IaaSクラウドと既存のIaaSクラウドでの従来のマイグレーションおよび先行研究との比較を行った。その結果、マイグレーション時間は622倍高速になった。また、マイグレーション時にはネットワーク負荷とメモリ負荷はほぼゼロとなり、CPU負荷も従来の30%以下となることが分かった。加えて、瞬間マイグレーションを活用して仮想IaaSクラウドのインスタンス配置を動的に最適化できるシステムの開発も行った。課題(2)については、VMのリモート監視の評価を行った。メモリ監視については性能が従来の8%程度にまで低下したが、ディスク監視については3%程度の性能低下で済むことが分かった。一方、VM監視基盤を用いて既存の監視ソフトウェアを動作させたところ、ディスクの整合性検査では性能が8%低下したが、マルウェア検査では13%向上した。パケット検査では攻撃の検出時間の増加は2%程度であった。また、AMTと呼ばれる監視用ハードウェアを仮想化した仮想AMTの開発も行った。加えて、仮想IaaSクラウドに依存しない監視手法の検討も行った。課題(3)については、IaaSクラウドを構築し、その上にEucalyptusを用いて仮想IaaSクラウドを構築した。

そして、IaaSクラウドと仮想IaaSクラウドを連携させ、仮想IaaSクラウド上のインスタンスがどの物理ノード上で動作しているかという位置情報を管理できるようにした。これにより、物理ノードと仮想ノードの両方における負荷分散を考慮したインスタンス配置を行えるようになった。本研究では、ネステッドVMを用いて既存のIaaSクラウドの上に仮想IaaSクラウドを構築し、よりセキュアなIaaSクラウドを迅速に提供できるようにした。仮想IaaSクラウドによるコストの上昇を抑えるために、稼働率の低いVMを迅速に集約することによってコストダウンを図る瞬間マイグレーションを開発した。また、セキュリティVMと監視対象VMを独立してマイグレーションできるようにすることで、より柔軟なVM再配置を実現した。当初の計画通り、課題(1)について、マイグレーションの高速化およびダウンタイムの削減を行うことができた。また、瞬間マイグレーションをソフトウェア若化に応用することができた。課題(2)について、リモートメモリ監視機構の高速化を行うことができ、ディスクとネットワークの監視にも対応することができた。さらに、ネステッドVMを用いた場合におけるリモート監視の最適化まで行うことができた。それに加えて、セキュリティVMの機能拡張を行い、リモート管理にも応用することができるようになった。情報学今後は、ホストVM間の瞬間マイグレーション(課題(1))とセキュリティVMの柔軟なマイグレーション(課題(2))の詳細な性能評価を行う。課題(1)については、Xen-Blanketを用いた既存手法との性能比較を行う。また、VMのメモリ書き換え頻度がマイグレーションに与える影響についても調査する。課題(2)については、監視対象VMのメモリ、ネットワーク、ディスクを監視するIDSをセキュリティVM上で動作させ、リモート監視の性能を測定する。また、ホスト・ハイパーバイザを経由した最適化を行った場合の監視性能についての測定を行う。さらに、セキュリティVMを帯域外リモート管理のために用いる場合についても詳細な評価を行う。それに加えて、リモート監視のシームレスな切り替え(課題(3))にも取り組む。現状では、ネットワークを用いたリモート監視とホスト・ハイパーバイザを経由したリモート監視を個別に動作させることができているが、セキュリティVMをマイグレーションした際に最適なリモート監視手法を用いることができるようにする。そのためには、セキュリティVMにマイグレーションしたことを通知できるようにし、動的に監視手法を切り替えられるようにする必要がある。平成26年度、27年度の研究実施計画を一部先取りして、ネステッドVMを用いた際にゲストVMが動作している物理サーバの特定まで行うことができた。
拡大EUにおける4タイプの企業の多国籍化にかんする実証比較・理論の国際共同研究

平成16年度は、次年度の本格的調査のための準備としての基本的文献の研究整理、海外への予備調査と打ち合わせを中心に行った。予備調査は欧州へ計3回、研究打ち合わせはドイツHalle研究所、ハンガリー科学アカデミー世界経済研究所などである。研究成果として、10編の論文を公表した。平成17年度は、欧州の日系企業の競争力について考察するための本格的調査を行った。調査対象は、チェコ、ハンガリー、ポーランド、スペイン、イギリスの日系企業である。調査は、主として前年度作成のアンケート項目にもとづき行われた。調査の特徴は、3つのタイプの多国籍企業活動を捉えるべく企業によっては海外の研究者との共同で行った点である。特に、研究代表者・分担者が調査困難なハンガリー、チェコなどの日系企業以外の外資系企業については、それぞれの国の専門的研究者との共同調査を進めた。また、調査研究は、欧州の日系企業に限定せず、企業活動の意思決定の構造を把握することを目的に、自動車関連の日本の本社、欧州統括会社への調査を合わせて行うとともに、2年にわたる研究成果と最終年度のまとめの方向性について、2度にわたる研究会を国内で開催した。最終年度の18年度は、過去2年度で捕捉できなかった幾つかの調査を行うとともに、まとめのための国際ワークショップ開催に向けての準備を中心に進めた。国際ワークショップは、2007年2月23、24日の両日、ハンガリー科学アカデミー世界経済研究所にて開催された。報告件数は7件、予定討論は2件である。報告の内訳は、国内の報告が4件(田中宏、稲葉和夫、家本博一、ユイスバイス)、海外からの報告が3件(Bojoen Jindra(ドイツHalle研究所)、Petr. Pavlinek(アメリカネブラスカ大学)、Zoltan Bossa(Jetro, Budapest))である。3年間の共同研究を通じて、欧州と日本との国際競争力の比較を『内向きの組織力』と『外向きの組織力』という2つの軸で整理することができること、また、チェコにおける多国籍企業をドイツ型、米国型、日本型、現地型に分類できることが明らかになった。なお、3年間の研究成果は、すでに公表した科学研究費報告書、および国際ワークショップ報告書において明らかにしている。全体:来年度の本格的調査のために準備が順調に進行しつつある。これまで10編以上の論文(共著書を含む)を発表している。これまで実施した研究作業は以下のとおりである。(1)EU企業および日系企業のヒアリング調査項目の確定、共通化、(2)調査企業への調査依頼の文章の作成、一部配布、(3)家本博一のポーランド現地調査(9月実施)、(4)稲葉和夫・家本博一の第2回ポーランド現地調査(2月下旬)、(5)ユイスの欧州企業調査(3月初旬)、(6)田中宏、9月末欧州比較経済体制学会での報告(日本の観点からみたEUの東方拡大)およびEU系多国籍研究グループとの接触、(7)英国サセックス大学のダイカー教授のセミナー開催(テーマ:対東欧直接投資と東欧のキャッチアップ)、(8)EU研究プロジェクト・チーム"EU Integration and the Prospects for Catch-up Development in CEECs"の責任者Dr.Jphannsen Stephan(ドイツHalle経済研究所)との研究交流、(9)A.ヘルナジ氏(ハンガリー科学アカデミー世界経済研究所)の来

学、調査の基本線の協議、研究課題の分業を進める、(10)米国、経済地理学者パブリネク氏との研究共同の進行、(11)韓国の対EU直接投資・多国籍企業研究者Choel-Won Leeとの研究交流の開始、(12)田中宏と大石達良のドイツ、スロヴェニア、オーストリア、ハンガリー他の現地調査と研究協力・組織化の旅行(3月初め中旬)、また(13)報告者ペーター・ホームズ助教授(サセックス大学)テーマ:「EUとWTO:その関連と比較」の開催を3月下旬に予定にしている。2004年度の研究調査活動では、もっと研究課題を絞り、主に在欧州特に在東欧の日系企業の活動とその競争力の展開を中軸に据え、それとの比較で3つのタイプの多国籍企業の活動について調査する形にしていく。全体:来年度は3年目になり、研究のまとめとするワークショップのための準備を順調に進めつつある。これまで実施してきた研究作業は以下のとおりである。(1)ユイスが2004年3月にスペイン企業と在スペイン外資系企業にたいする拡大EUの影響の関する調査をおこなった。(2)2005年7月2日研究・打合せ会(立命館大学BKC)を実施した。報告は以下の通り:田中宏「東欧の直接投資に関する2つの報告書」、家本博一「中間報告-2004年度2005年度-」、大石達良「日系電気機械企業の欧州地域総括会社の役割」、池本修一「Japanese investment in CZ」、「EU加盟後のチェコの投資動向」。近年の東欧での日系企業の設立の増加傾向、その欧州総括本部の機能をどのように評価するのかを中心に討論した。報告討論の後、各人が1年間の研究計画を報告し、2006/07年度の最終的な国際ワークショップをどのような形式でどこで開催するのかについて議論した。(3)6月、韓国対外経済政策研究所Choel-Won Lee研究員と拡大EUにおける韓国系の活動に関する調査委託。(4)6月、浜松スズキ本社・工場の見学、鈴木会長等からのヒアリング。(5)ドイツ・ハレー研究所所長ウルリヒ・バラム氏との間で、拡大EUにおける各国別多国籍企業の活動の比較研究に関する調査委託。(6)同月、ハンガリー科学アカデミー世界経済研究所A.ヘルナジ氏とハンガリーにおける外資系企業の調査委託。(7)同月、米国、ネブラスカ大学経済地理学者パブリネク氏とチェコとスロヴァキアにおねる外資系企業の調査分析の調査委託。(8)8月初旬、稲葉和夫、パブリネク氏とともに在チェコとスロヴァキアの外資系企業の共同調査実施。(9)9月中旬、田中宏、ハンガリー企業、特にサプライヤー企業に関する調査。(10)9月中旬、稲葉、家本、ポーランド日系企業調査、その後稲葉、ハンガリー調査。(11)9月中旬、A.ヘルナジ氏(ハンガリー科学アカデミー世界経済研究所)の来学、調査についての協議。(12)10月、田中宏、国際経済学会で「ハンガリーの直接投資」に関する報告。
内因性極微弱発光の直接検出による中枢神経系組織酸化の分子機構の解明

痴呆症やパーキンソン病など多くの神経変性脱落疾患の原因として酸化ストレスが重要な因子として近年注目されつつある。本研究では、実際に生きている神経組織がどのような状態で酸化ストレスを受けるのかを無侵襲的に、かつリアルタイムに観察するために、生体からの内因性極微弱発光の検出を考案し検討した。神経組織にはラット小脳由来の培養顆粒神経細胞を、さらに極微弱発光の検出には(株)浜松ホトニクス社製光電子増倍管を用いた。コントロール実験として、神経組織及びさまざまな抽出タンパク質を人工的に酸化し、内因性の発光現象が観察されることを確認した。さらにそれらの発光は組織酸化時に形成されるケトン基やアルデヒド基に化学結合するジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)処理によって消失することも確かめられた。次に実際に活動している培養神経組織から5-10cpsときわめて微弱ではあるが内因性の発光をとらえることに成功した。さらにその発光もDNPH添加により消失することより、内因性の組織酸化ストレスに由来することがわかった。この発光現象は、細胞外液中へのカリウムイオン添加による神経細胞膜脱分極刺激(-30mV)により5cpsほど増強した。逆にカルシウムイオンの除去やテトロドトキシン添加による神経活動抑制時には5-10cps減弱した。つまり神経活動状態が組織酸化の進行に密接に関わっていることがわかった。今後、どのような神経発火パターンや回路結合の様式が組織酸化を進めよいのか、疾患予防の観点から検討を加えたい。また、本法は観察対象物に対して無侵襲なためヒト組織にも応用可能であり、今後組織の酸化進行状態の判定や薬物のスクリーニングにも威力を発揮すると期待される。中枢神経活動をリアルタイムにかつ無侵襲的に観察することを目的として、活動中の神経細胞が極微弱ではあるが光子を放出するかどうか、可視光域の光子検出において最も感度の優れた光電子増倍管を用いてその検出を試みた。光子の放出は生きた細胞内で引き起こされるさまざまな生化学反応に由来するものと想定して実験を開始した。ラット小脳の顆粒細胞を培養した直径4cmのシャーレに、ほぼ完全に近い暗室中で光電子増倍管を接近させて極微弱発光の検出を試みたところ、細胞外液への50mMカリウムイオン添加による顆粒細胞膜電位の脱分極刺激(-30mV)に相関した約5cps(counts/second)の発光を検出した。この発光は膜の脱分極刺激の間持続し、その後の細胞外からのカリウムイオンの除去により速やかに消失した。また、通常の組織外液中にテトロドトキシンを投与したところ、約5cps分の発光量の減少が観察され、その後の薬物除去により発光量は速やかに回復した。これらの発光量の変化はカルシウムイオンを除いた細胞外液中では観察されなかったことから、神経活動に相関した極微弱発光であると考えられた。これらの発光の由来となる細胞内生化学反応を同定するためフィルターを用いて極微弱発光光子の波長解析を行ったところ、その多くが400-500nmの波長を有することがわかった。来年度は、この研究をさらに押し進めて発光波長の同定と由来する生化学反応を追求する。また、さらに光子の検出域を近赤外領域まで広げて神経活動に相関した発光検出量の増加を図り、内因性極微弱発光の検出が神経科学分野における新しい研究法となりうるかどうか探っていきたい。
胎児脳におけるヒストンアセチル化修飾を介した神経細胞分化制御機構の解析

マウス胎児脳の初期発生過程において、神経幹細胞は自己複製を行うとともに神経細胞を産生するが、この過程にヒストンアセチル化修飾がどのように関わっているかはよく分かっていない。本研究では、ブロモドメインを介してヒストンアセチル化修飾に結合し、転写制御に働くことが示唆されているBETファミリータンパク質(BET)に着目した。BETが結合するH4K5acとH4K12acの発現パターンを解析すると、神経幹細胞のS期で強く発現することが分かった。さらに、BETの機能を阻害する化学薬剤を用いた解析から、BETは幹細胞の未分化性維持に重要な役割を果たす遺伝子群の転写に必要であることを明らかにした。BETファミリータンパク質はN末側に2つのブロモドメインを持ち、ヒストンH4のアセチル化修飾(H4K5ac,H4K8ac,H4K12ac,H4K16ac)に特異的に結合し、転写を制御することが知られている。本研究は、未分化な幹細胞から神経細胞へ分化する過程におけるヒストン化学修飾パターンの変動に注目し、特にBETファミリータンパク質を介したヒストンアセチル化修飾の細胞分化制御に対する役割について明らかにすることを目的としている。平成26年度は、神経幹細胞と神経細胞におけるヒストン化学修飾の発現パターンを、特異的な抗体を用いた免疫染色により比較解析した。正常なマウス胚の前脳(終脳)領域において、増殖を行っている神経幹(神経上皮)細胞が神経細胞の産生を開始する時期は胎齢10.5日目頃であるため、胎齢9.512.5日目胚を用いて解析を行い以下の結果を得た。1)BETファミリーが結合するアセチル化修飾の中でも、H4K5acおよびH4K12acは、神経幹細胞と神経細胞の両方で核内のユークロマチン領域にシグナルが見られたが、特にBrdUを取り込むS期の幹細胞で強い発現を示した。一方で、H4K8acやH4K16acは上記の特異的な発現パターンは認められず、神経幹細胞と神経細胞で発現に大きな差異は見られなかった。2)転写抑制化に関与するH4K20me3やポリコームタンパク質が結合するH3K27me3は、神経細胞で非常に強い発現を認めた一方で、転写活性化の目印であるH3K4me3は、神経幹細胞と神経細胞において特に発現の変化を認めなかった。3)P19C6細胞を導入し、レチノイン酸添加による神経分化誘導系を立ち上げた。P19C6細胞では、特にヒストンアセチル化修飾のシグナルはマウス胚と同様で主にユークロマチン領域に局在すること、1細胞レベルでの詳細な解析には個体より適していることが分かった。前年度に得られた結果を基にして、平成27年度は、BETファミリータンパク質が持つ、ヒストンアセチル化修飾を読み取る機能を阻害した場合、幹細胞の増殖・維持や神経分化にどのような影響が見られるかについて明らかにするために、以下の解析を行い、結果を得た。1)前年度に確立したP19C6細胞培養系において、JQ1試薬(BETファミリーのヒストンアセチル化修飾への結合を阻害する試薬)を培養液に添加し、細胞を培養後、免疫染色法にて発現を解析した。JQ1処理後、BETファミリーが特異的に結合するヒストンアセチル化修飾(H4K12acなど)に関しては、未分化幹細胞および神経細胞ともに、特に差異は認められなかった。ところが、RNAポリメラーゼII (PolII)の状態変化に関して、特に未分化幹細胞では、転写開始に関わるPolIIC末端ドメインセリン5番目のリン酸化シグナル(PolIIpSer5)が核内で強く集積しており、その集積数も増加する傾向にあった。さらに、Oct3/4の発現低下も認められた。これらのことから、BETファミリータンパク質におけるヒストンアセチル化修飾の読み取り機能を阻害することで、未分化幹細胞の維持と関連する遺伝子の転写に影響が見られることが示唆された。2) JQ1処理によって、未分化幹細胞に対する特異的な異常が認められたため、当初予定していた神経胚期の全胚培養に代えて、未分化幹細胞の解析や観察により適している胚盤胞期(受精後3.5日目胚)の培養を立ち上げた。胚盤胞においても、JQ1処理後、ICMの核内でPolIIpSer5シグナルが集積し、特にICMの維持に関わるOct3/4やNanogの発現低下が認められた。これらの結果は、P19C6細胞で得られた結果とよく一致していた。前年度に確立したP19C6細胞培養系と薬剤処理を組み合わせて行い、免疫組織化学法を用いた発現解析は順調に進めることができた。また、当初予定していたマウス胚の全胚培養は、材料をより発生段階の早い胚盤胞に変更したものの、胚の培養法は確立でき、発現解析を行うことができたため、おおむね順調に進展していると言える。平成28年度は、BETファミリータンパク質が関与するヒストンアセチル化修飾は、どのような下流遺伝子の発現制御を介しているかについて明らかにすることを目的とし、以下の解析を行った。1) BETファミリータンパク質のヒストンアセチル化修飾を読み取る機能を阻害(JQ1処理)し、発現変動が見られる遺伝子を網羅的に調べるために、マイクロアレイを行った。これまでの結果を考慮し、材料は未分化な幹細胞を個体で解析するのに適しているマウスの胚盤胞を用いた。マイクロアレイの結果、JQ1処理で発現が低下した遺伝子は、発現が上昇した遺伝子より多いことが分かった。

特に、発現低下した遺伝子には、幹細胞の形成・維持に重要な役割を果たすNanog遺伝子が含まれていた。そこで、幾つかの発現低下が見られた遺伝子についてWhole-mount in situhybridizationを行ったところ、マイクロアレイ同様にmRNAレベルでの発現低下が確認できた。2) BETファミリータンパク質は転写の制御に関与することが示唆されているため、JQ1処理で見られた遺伝子の発現低下は、転写の異常が原因であるかについて調べるために、RNA蛍光in situ hybridization (RNA-FISH)を行った。作製した蛍光プローブはイントロン配列を含み、新規に転写された未成熟な(スプライシングを受けていない)RNAを検出できる。解析に用いた胚盤胞は、内部細胞塊(ICM)とそれらを取り囲む栄養外胚葉で構成されているが、ICMでは幹細胞を維持するNanogと内胚葉分化へ向かわせるGata6が拮抗して発現することが知られている。RNA-FISHの結果、JQ1処理胚のICMの核内では、Nanogの蛍光シグナルが消失した一方で、Gata6には変化が認められず、幹細胞形成に働くRNAの転写が停止していることが示唆された。前年度の結果を考慮し、マウス胚の全胚培養系から胚盤胞の培養系に変えたものの、マイクロアレイを用いた網羅的な発現解析の結果を得ることに成功した。さらに、予定していたRNA-FISHを用いた発現解析を行うことができたため、おおむね順調に進展していると言える。平成29年度は、ヒストンアセチル化修飾に結合して働くBETファミリータンパク質が、下流遺伝子を介してどのように幹細胞維持に働いているか明らかにすることを目的とし、以下の解析を行った。前年度に引き続き、解析材料には未分化な幹細胞を個体で解析するのに適しているマウスの胚盤胞(受精後3.5日目胚)を用いた。1)前年度に行ったマイクロアレイで得られたデータを用いて、BETファミリータンパク質のヒストンアセチル化修飾への結合を阻害したときに発現変動する遺伝子群が、どのような生物学的機能を持っているかについて、Ingenuity Pathway Analysisを行った。その結果、BETの機能阻害によって発現が低下した遺伝子群は、胚性幹細胞の分化多能性や転写制御に関わる遺伝子群であること、さらにはJAK/STATシグナル経路と関連していることが分かった。2) BETファミリーは転写伸長に関わることが示唆されているため、BET機能阻害によって発現低下したNanogなどの遺伝子では、RNAポリメラーゼIIは転写開始点で停止しているか、もしくは転写伸長途中で停止していることが考えられた。そこでまず、DNA-FISHを行い、核内におけるNanog遺伝子座の位置を可視化した。さらにBETを機能阻害した胚盤胞を用いてRNA-FISHとDNA-FISHを組み合わせて行い、Nanog遺伝子座においてRNA合成が低下していることを確認した。次に、RNAポリメラーゼIIC末ドメインのセリンリン酸化状態の変化をNanog遺伝子座付近で観察するために、DNA-FISHと免疫染色の二重染色を行ったが、安定した結果を得るためにはさらなる条件検討が必要となった。