hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理活性に着目した有機フッ素化合物の不斉合成手法の開発と創薬への展開

グルタミン酸の3,4位をジフルオロ置換シクロプロパン構造にした2-(2-カルボキシシクロプロピル)グリシン(F_2CCG)のすべての異性体を合成し神経薬理学的評価を行った結果、L-F_2CCG-I(2S,1'S,2'S-異性体)が代謝調節型グルタミン酸受容体アゴニストとして高い活性と受容体選択性を有することが明らかになった。さらに、F_2CCGの安定配座に関してフッ素置換シクロプロパンカルボン酸の計算化学的な配座解析を検討したところ、分子内水素結合に基づく配座の固定が示唆された。加えて、L-F_2CCG-Iの酸性度をNMRで測定したところ、フッ素導入による顕著な酸性度の増大が確認された。(2)光学活性なフッ素置換三級炭素構築法の開発と応用光学活性なフッ素置換三級炭素構築法の開発は含フッ素生理活性物質の効率的な合成のために重要である。この課題に対して申請者らは、2-フルオロアルリル酸誘導体の不斉Diels-Alder反応を検討し、不斉補助基としてメンチル誘導体を用いることにより光学純度が極めて高いフッ素置換三級炭素の構築が可能であることを見出した。シクロペンタジエンとの付加体を用いて、ノルボナン骨格を有する配座固定型グルタミン酸アナログの合成に成功した。(1)配座固定型グルタミン酸アナログの合成申請者らは、グルタミン酸受容体のグルタミン酸認識機構と受容体各サブタイプの生理的役割の解明さらに脳機能改善を指向した創薬への展開を目的として、フッ素置換配座固定型グルタミン酸アナログの合成と評価に関する研究を行ってきている。昨年度に光学活性なフッ素置換三級炭素構築法として2-フルオロアクリル酸誘導体の不斉Diels-Alder反応を用いる方法を開発した。本反応の応用として、シクロペンタジエンとの付加体を用いてノルボルナン骨格を有する配座固定型グルタミン酸アナログの合成に成功した。(2)フッ素置換メチレンシクロプロパン誘導体の合成法の開発と応用申請者はメチレンジフルオロシクロプロパン誘導体がフッ素の特異的な置換基効果によりシクロプロピルメチルセレノキシドの脱離反応により合成できることを報告しているが、本反応には適用基気質に制約があった。今回より一般性に富んだ方法としてシリル基置換シクロプロピルカルビノール誘導体を用いる反応の開発に成功し、その応用として脂肪酸代謝のうちでベータ酸化酵素阻害活性を有するメチレンシクロプロピルグリシンのフッ素アナログの合成に成功した。
ソーシャル・イノベーションの普及理論の構築

本研究で調査したビジネスモデルは、当初から出来上がっていたのではなく、実際に事業活動を遂行する中で少しずつ洗練させていったものであった。ソーシャル・イノベーションのプロセスは、必ずしもリニアーな(線形的な)ものになるとは限らない。フローレンスのケースが示しているのは、当初は赤字経営が当たり前とさえ言われた病児保育事業分野において、行きつ戻りつの試行錯誤を経て、現在のように採算のとれるビジネスモデルが構築されたということである。ソーシャル・イノベーションの実現プロセスは、リカーシブな(再帰的な)側面を有するものであった。本研究は「社会的課題の解決に取り組むビジネスを通して、新しい社会的価値を創出し、経済的・社会的成果をもたらす革新」を意味する「ソーシャル・イノベーション」が、どのような主体によって、どのようなパターンを経て特定の地域から他地域に広がっていくのかについて明らかにすることを目的としている。近年、ソーシャル・イノベーションという用語は、組織経営分野のみならず都市開発や、デザインの分野においても頻繁に用いられており、その定義も論者によってさまざまに行われている。本研究では、ソーシャル・イノベーションを「社会的課題の解決に取り組むビジネスを通して、新しい社会的価値を創出し、経済的・社会的成果をもたらす革新」と定義している。この定義の特徴は、4つのポイントがあり、第1に社会的課題の解決を目指したものであること。第2に、社会的課題の解決に対してビジネスの手法を用いること。第3に、最終的な成果として経済的成果と社会的成果の双方を求めていること。第4に、新しい社会的価値を創出するということ、である。平成26年は病児保育事業を展開しているNPO法人フローレンスを調査対象とし、1非施設型の病児保育サービス、2保険・共済型経営の導入、を基本コンセプトとする新しいビジネスモデルをソーシャル・イノベーションとして位置づけてこれらがどのように実現され、また普及しているのかを定性的な調査により明らかにした。その結果、フローレンスのソーシャル・イノベーションの実現プロセスは、リカーシブな側面を有するものであること、また「訪問型」の病児保育事業が創出されたことにより、これらは従来の小児科等での看護を中心とする「施設型」の病児保育と基本的な考え方が大きく異なっていること、そして両者が今後どのような関係性を構築できるかが病児保育市場全体の鍵を握っていることが明らかになった。本研究は、「社会的課題の解決に取り組むビジネスを通して、新しい社会的価値を創出し、経済的・社会的成果をもたらす革新」を意味するソーシャル・イノベーションが、どのような主体によってどのようなパターンを経て特定の地域から他地域に広がっていくのかについて明らかにすることを目的としている。平成27年度は、前年度まで実施してきたフィールド調査のとりまとめを行った。具体的には日本国内のソーシャル・イノベーションの事例として、病児保育事業を展開しているNPO法人フローレンスの創業期から現在までのビジネスモデルの構築のあり様や、そのモデルの広がり、また新しい社会的価値の広がりという点についてまとめ、『ソーシャル・ビジネス・ケース』(中央経済社、第2章、共著)として出版した。さらに、ソーシャル・イノベーションの成立を左右することになる消費者からの支持の獲得の構造について、従前より調査を行ってきたヤマトグループの「宅急便1個につき10円寄付活動」を事例として論文としてまとめている(共著)。また本研究の補足的な調査として、近年アメリカで急速に普及している、B Corp認証およびBenefit Corporation法人格の調査についても進めてきた。これらの調査では、「企業形態でソーシャル・ビジネスを行う場合、その“社会性"をどのようにして“正統性あるもの"としてさまざまなステイクホルダーに対して示していくか」が大きな問いとなっている。こうした企業全体への認証制度や新しい法人格の普及が、アメリカにおけるソーシャル・イノベーションの創出と普及にどのように関わってくるのかが今後の検討課題になっている。当初予定していた調査はおおむね終了しているが、補足的な調査として位置づけていた海外調査の実施については日程的な関係で実施することができなかったため、今後の検討課題としている。今年度は補足的な文献調査と研究全体のとりまとめを行った。これまでの筆者らの研究において、ソーシャル・イノベーションのプロセスは、「社会的課題の認知」、「ソーシャル・ビジネスの開発」、「市場社会からの支持」、「ソーシャル・イノベーションの普及」の4つの段階として捉えてきた。ソーシャル・イノベーションの海外の論文・文献サーベイの結果からも、アイデアの創出、プロトタイプの開発、評価、普及など、同様の捉え方は数多く見られている(Mulgan et al.207)。本研究では、谷本他(2013)における先行研究をもとに、ソーシャル・イノベーションの普及にかかる分析視点としてマルチ・ステイクホルダー・プロセスを前提とし、ソーシャル・アントレプレナーの多様な役割(チェンジ・エージェント機能、他領域への進出等)、ビジネスモデルの普及における新たなイノベーションの必要性(1次的イノベーションから派生的イノベーションへ)を確認してきた。ソーシャル・イノベーションは複雑な社会的課題の解決を必要とし、ビジネスイノベーション以上に、多様なステイクホルダーとの協働・協業が必要となる。今後、このマルチ・ステイクホルダー・プロセスをさらに精緻化させる為には、Bhattacharya(2013)も指摘するように、ステイクホルダー分析を、対象とする組織(ソーシャル・イノベーションの推進組織)と各ステイクホルダーとの関係でみる「垂直的な」関係性分析のみならず、ステイクホルダー同士の関係でみる「水平的な」関係性分析にも着手していく必要がある。

水平的関係性分析を行う事で、当該ソーシャル・イノベーション領域とは異なる別のネットワークメンバーとの交流を考察する事が可能となり、新しい社会的価値がどのように社会全体に普及し、ソーシャル・イノベーションの普及が実現されるかを分析することが可能となると考えられる。本研究で調査したビジネスモデルは、当初から出来上がっていたのではなく、実際に事業活動を遂行する中で少しずつ洗練させていったものであった。ソーシャル・イノベーションのプロセスは、必ずしもリニアーな(線形的な)ものになるとは限らない。フローレンスのケースが示しているのは、当初は赤字経営が当たり前とさえ言われた病児保育事業分野において、行きつ戻りつの試行錯誤を経て、現在のように採算のとれるビジネスモデルが構築されたということである。ソーシャル・イノベーションの実現プロセスは、リカーシブな(再帰的な)側面を有するものであった。当初予定していた調査はほぼ予定通り実行され、2015年度内に研究成果としてケース集が刊行されることになっている。ソーシャル・イノベーションやソーシャル・ビジネスの普及戦略を考えるにあたって、アメリカで社会的に責任ある事業体の法人格として普及しつつあるBenefitCorporation法人格の広がりや、非営利組織B LabによるB Corp認証の広がりについても現在調査を進めている。こうしたアメリカの動きは、日本におけるソーシャル・ビジネスや社会的企業に対する新しい法人格創設の動きにも繋がって行くと考えられる。経営学ソーシャル・イノベーションの調査対象として、当初予定していた対象以外に、イギリスにおいてフェアトレード事業を展開しているCafedirect, Divine ChocolateLTD等も候補として検討している。このため、現在はフェアトレードにかかわるイギリスのソーシャル・ビジネスが巨大企業に支配された市場においてどの程度競争力を有しているのかについて先行研究を中心に整理している段階である。海外調査の日程が確保できず調査を延期したため渡航費等が翌年に持ち越しすることになったため。アルバイト人件費(アルバイト時間)が当初予定金額を下回り、翌年に繰り越し使用することになったため。今年度の調査計画の中で、昨年度実施できなかった調査について新たな調査先を検討し実施する予定となっている。物品費、旅費、人件費・謝金を予定通り使用していく。
地磁気地電流法を用いた石造構造物探査

地中に埋没している古墳などに用いられる大型石材は,その周囲の土壌とは異なる電気伝導度を持つ。このため非破壊の手段で石造構造物を探査するのに電気探査法が有効であることは知られている。しかし,遺跡の所在する場所では水田のような地表が湿潤である場所が多く,大量の電流を流さなければ地中深くまで探査できないという欠点がある。更に電流を流すための電極を地中に打ち込む作業に多くの労力を必要とすることから探査効率が悪いという欠点もある。そこで本研究では比抵抗法以外に人工電磁場を利用して電場と磁場の変動から地下の電気伝導度を求める地磁気地地電流法(マグネトテルリーク法,MT法)特にVLF波を用いた探査を行った。現在使用されている地磁気電流法は主に地下深部の構造を探査するために開発されたものであり,そのままでは遺跡のように浅部に埋没している物には有効であるかどうかまだ不明な点もある。本研究では石造構造物探査を目的としているが,実際の遺跡では常に石造構造物がある訳ではなく,住居跡や土坑が発掘されることも多い。地磁気電流法の有効性を検証するためここでは石造構造物と限定するのではなく一般的な遺跡をフィールドに選び探査を行った。一般的な遺跡で有効であれば比抵抗変化の大きい石造構造物にはより強力な手段となりうるからである。VLF探査がどの程度有効かを調べることを目的としているため物理探査を実施した後で発掘調査が行われ,探査結果と比較できることが望ましい。このためにまだ発掘調査はされていないが後で発掘が行われる予定の場所である秋田県大館市,池内遺跡を調査地とした。池内遺跡は大館市萩ノ台に位置する遺跡で,縄文前期-中期,平安時代の両遺物が確認されている。フラスコ状ピットや竪穴式住居跡がいくつか既に発掘されている。この池内遺跡ではまで発掘されていない場所を選びVLF探査を実施した。発掘調査により明らかにされた比較的深い土坑を選び出せばVLF探査の結果とある程度対比できた。測定メッシュ間隔が2mと粗いために小さな土坑の形を明らかにすることは出来なかったが,土坑の集中している場所のような大きな構造はある推定すすことが可能であった。メッシュ間隔を小さくして測定すれば土坑の形の推定が可能となると思われる。石造構造物の場合,比抵抗は土壌よりも大きいため,今回得られた結果よりもコントラストが強く現われ,より明解に構造を示すことが出来ると予想できる。いずれにしても簡単に実行できるVLF探査は遺跡探査に有効な手段であることを実証した。
水溶性マラリアワクチンの化学合成とワクチン-抗体相互作用の分子構造解析

(1)序論マラリアは熱帯亜熱帯地方に流行する寄生虫感染症であるが、現在でも臨床応用されているワクチンが無い。共同研究者の鈴木と狩野らは流行地の疫学調査から、熱帯熱マラリア原虫が産生するエノラーゼは流行地住民の血清中に抗体が多く存在することを明らかにしてきた。そこで我々はAla256-Asp277の部分ペプチド(AD22)を用いた人工抗原研究を行っている。平成19年度は合成面(AD22の多抗原化高分子)と構造面(AD22の構造解析)から研究を行った。(2)ワクチン分子の化学合成本研究の合成面での検討として、AD22配列とポリリジンとの複合体を合成した。(3)ワクチン分子のコンフォメーション解析AD22についてPBS中でのコンフォメーション解析を行った。15Nラベル化AD22の3次元NMR測定を抗AD22抗体の存在下と非存在下で測定した。その結果、AD22分子の各シグナルについて帰属と温度依存性の解析に成功した。スペクトル中には明瞭なtransfer NOEは観測することができなかった。更に測定条件を精査して再測定することで、今後実施するワクチンの分子設計に役立つと期待される。現在我が国を含めて、経済活動の拡大に伴い、地球規模での人や物資の移動が盛んになってきている。これに時期を同じくして日本人渡航者および入国者による輸入マラリアが急激に増え、特に1980年代より熱帯熱マラリア(Pf)の症例増加が顕著である。マラリアは熱帯地域を中心に蔓延し、日本人の感染例も増えつつある世界最大の寄生虫感染症である。我々はこれまでにマラリアワクチンを目指して熱帯熱マラリア原虫由来酵素、エノラーゼに注目して研究を行ってきた。最近行われたヨザルに対する動物実験の結果、酵素部分配列Ala256-Asp277(AD22)を含む多抗原ペプチドがワクチン候補として有用であると明らかにされた。本研究の目的はワクチン実用化への化学的な検討であり、具体的には以下の2点を検討する。一つは(a)実用的なワクチンペプチドの合成研究(水溶性の向上、大量合成法)であり、もう一つは(b)ワクチンペプチドの作用機序(ワクチンペプチドとIgG抗体の分子認識構造の解析)である。(a)実用的なワクチンペプチドの合成研究(b)ワクチンペプチドの作用機序ワクチンペプチドとIgG抗体の分子認識構造の解析を目的としてワクチンペプチドのNMR測定を開始した。現在15N-同位体標識したワクチンペプチドの合成と3次元NMR測定が進行中である。(1)現在我が国を含めて、経済活動の拡大に伴い、地球規模での人や物資の移動が盛んになってきている。例えば近年は症例のうち46%を占めることが報告されている。日本人にとってPfによる症例は、高度の緊急性をもつ急性疾患であり、早期診断と適切な処置が必要である。また世界に於ける薬剤耐性マラリアの拡散は極めて急速で、これに対応した薬剤の選択は困難である。(2)ワクチン分子の化学合成我々はこれまでにマラリアワクチンを目指して熱帯熱マラリア原虫由来酵素、エノラーゼに注目して合成面から研究を行ってきた。(AD22=Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp)これまでにワクチン分子について実用的な合成ルートを確立することができた。合成したペプチドは患者血清を用いたELISA検査より、この抗原は日本人に多い急性期患者の診断に特に有効であることや病態の経過を見るのに適している。本年度は、製造方法の徹底的な改良を行い、特許の国際出願を行った(PCT加盟国およびタイ王国)。(3)コンフォメーション解析生理条件でのワクチンコンフォメーションの解析を開始した。計画通り15Nラベル化は国立国際医療センター研究所にて、3次元NMR測定は大阪大学で行った。マシンタイムの確保が困難なため、来年度に引き続き測定を行う。現在は得られたスペクトルについて、シグナルの帰属を続けている。

スペクトル中には明瞭なtransfer NOEは観測することができなかった。更に測定条件を精査して再測定することで、今後実施するワクチンの分子設計に役立つと期待される。
Soxファミリー転写調節因子による細胞分化の制御

細胞分化をすすめる転写制御因子の中でもSOXファミリー因子群は、細胞分化の決定に中心的な役割を果たしていると考えられる。1.20数種類が知られているSOX因子は、そのアミノ酸配列の類似性から、AからGまでグループに分類されている。いずれのSOX因子もHMGドメインによって、DNAのAACAA(A/T)配列に結合しながら、制御標的遺伝子も、制御する細胞分化のレパートリーもグループ毎に異なる。特にBグループのSOX因子に照準をあてて、それらの間の活性と発現の特性について詳しく解析した。その結果、SOX1-3が特に中枢神経系で重複した発現を示すとともに、転写活性化を担う因子として同様な活性を持つこと、SOX14,SOX21は転写抑制に関わる因子であり、SOX1-3(B1グループ)とは、HMGドメインとそのC末側のGroup Bhomology領域を除いては全く相同性がなく、B2という独立したグループを構成することを示した。2.SOX2を例として、δクリスタリン遺伝子のエンハンサーに対する制御機構を解析した。SOX2は単独では転写制御活性を示さず、パートナー因子との相互作用が必要であることをまず示した。δクリスタリンエンハンサーの活性化に関わるSOX2のパートナー因子がPax6であることを示した。そしてSOX2,Pax6,エンハンサーDNAの3者の共存によってはじめて、強い転写活性化複合体が形成される。このSOX2とPax6の協同による遺伝子の活性化が、水晶体分化の開始反応であると考えられる。3.本研究で中心としてとりあげたBグループSOXに限らず、SOX因子は、それ単独でDNAに結合しただけでは、SOX因子自体が持つ転写活性化機能を発揮することができず、DNA上の近傍に結合したパートナー因子との協同作用によってはじめて制御活性をあらわすという一般的なモデルを示した。SOXやパートナー因子の発現の変化に連動して、SOXの制御下にある遺伝子のセットが劇的に切り替わることが細胞分化の重要な制御機構の一つであると考えられる。細胞分化をすすめる転写制御因子は多数が知られているが、その中でもSOX因子群は、細胞分化の決定に中心的な役割を果たしていると考えられる。SOX因子が単独では何ら活性を示し得ず、それが結合した領域のの近傍に結合したパートナー因子との共同作用によってはじめて制御活性を示すことに特徴があり、SOXやパートナー因子の発現の変化に連動して、SOXの制御下にある遺伝子のセットが劇的に切り替わることが細胞分化の重要な制御機構の一つであると考えられる。SOX2を例として、既知の制御標的遺伝子δクリスタリン遺伝子のエンハンサーに対する制御機構を解析した。δクリスタリンエンハンサーのSOX結合サイト等に突然変異を導入したものをβガラクトシダーゼ遺伝子の上流につなぎ、トランスジェニックマウスを作製して解析した結果、2箇所のSOX結合サイトと、近傍のδEF3結合サイトが、エンハンサー活性に必要であることが明らかになった。δEF3は、SOX2パートナー因子の一つである。δEF3の候補分子を、酵母細胞の中での遺伝子活性化反応によってクローンニングした。このSOX2とδEF3の協調による遺伝子の活性化が、水晶体分化の開始反応であると考えている。SOX2は、水晶体のほか、鼻プラコードをはじめ、様々な感覚器の原基であるプラコードで発現されている。ニワトリ胚の頭部にSOX2を強制発現するとプラコード構造が誘導されることを確認した。従って、SOX2は、感覚プラコードの分化に直接的に関与している。

細胞分化を調節する主要な転写調節因子群であるSOXのうち、特にSOX2に注目して研究を進めた。SOX2遺伝子発現の開始が、中枢神経系や、水晶体プラコードの分化の開始に深くかかわっている。このことから、これらの組織の分化において、SOX2の発現誘導が、分化誘導の初期反応である可能性がある。そこで、SOX2遺伝子座を含む広いゲノム領域をクローニングし、その領域を断片化して、それぞれの断片をGFPをコードする遺伝子に連結して、初期中枢神経系や水晶体プラコードでエンハンサー活性をもつかどうかを調べた。その結果、SOX2遺伝子の上流と下流に分かれて、初期水晶体及び初期中枢神経系に対応したエンハンサーが同定された。このように誘導されたSOX2は、単独では転写調節活性を示さない。SOX2蛋白質は、DNA上でパートナー因子と複合体をつくってはじめて、転写活性化能を示す。水晶体におけるSOX2のパートナー因子を、酵母細胞の中での遺伝子活性化反応によってクローニングしたところ、それはPax6であった。Pax6とSOX2を胚の外胚葉で強制発現すると、その場所に、異所的な水晶体プラコードが分化した。ニワトリ胚の中でSOX2とPax6をともに発現する組織、たとえば下垂体原基ではクリスタリン遺伝子が発現されている。更に、ゼブラフィッシュのyot突然変異体は、下垂体原基から水晶体を分化させる。これらのことから、SOX2とPax6がパートナーとして作用することが水晶体分化を開始させることが裏付けられる。SOX2は、中枢神経系、感覚器原基など、細胞系譜の大きな変遷をもたらす細胞分化の調節因子であり、胚発生にとって最も重要な制御因子の一つである。SOX2の制御標的の一つであるδクリスタリン遺伝子のエンハンサーに対する制御機構を解析した。SOX2は蛋白質構造の中に転写活性化ドメインを持つものの、単独では遺伝子転写を制御せず、パートナー因子Pax6との相互作用によって転写制御活性を示すようになることを示した。SOX2,Pax6,エンハンサーDNAの3者の共存によってはじめて、強い転写活性化複合体が形成されることを確認した。このSOX2とPax6の協同による遺伝子の活性化は、特にクロマチン上の制御領域との相互作用において著しい。水晶体誘導過程においては、まず頭部外胚葉にPax6発現領域があらわれ、その中に眼胞からの誘導によるSOX2発現領域が生じ、それらの細胞の中で、SOX2とPax6が相互作用を始める。これが水晶体分化の開始反応であると考えられる。実際、SOX2,Pax6を頭部外胚葉で強制発現すると、異所的な水晶体分化がおきる。このSOX2とPax6の協同的な作用は、他のSOX因子の作用機構に対しても範例を示すこととなり、Genes and Development誌に発表した論文は大きな反響を呼んだ。中枢神経の分化の開始にはSox2遺伝子の活性化が必要である。Sox2遺伝子の神経誘導に対応するエンハンサーを同定した。このエンハンサーの活性には複数の転写制御因子がかかわると考えられる。
リンゴ果実内部品質の非破壊的評価方法に関する研究

著者らは,前年度に構築した果実の硬度を非破壊的に測定するシステム,及び新たに考案したリンゴ果実形状選別への三次元計測システムを用い,以下の結果を得た。リンゴ果実,品種"つがる""ふじ"については,室温で放置されていたものの硬度変化を振動出力の第1共鳴周波数と破壊的に計測した硬度の間には,高い相関があることを明らかにしたとともに,その実用可能性を確認した。また,本システムは,追熟中のラ・フランスや収穫した緑,ピンク,赤色のトマトの硬度変化も計測することができ,将来の選別システムへの応用の可能性を確認した。さらに,新たに構築した三次元計測システムを用いることにより,リンゴ果実の3次元形状を正確に再現でき,またその情報を利用することにより,果実の比重の計測,虫食い傷,打撲傷の識別などを可能にした。特に,果実の円形度,いびつ度などのいくつかの形状係数を導入することにより,現在の選果システムで計測できないリンゴ果実のいびつ形状を表現できた。これらの形状係数を用いることで,更なる高付加価値のリンゴ生産に寄与できることが示唆された。申請者らは,本年度まず果実の硬度を非破壊的に測定するシステムを構築し,その動作確認及び制御用ソフトの開発を行った。具体的には,小型加振装置,制御信号の増幅機器,小型加速度計,レーザードップラー速度計,振動の出力信号をFFT解析するソフト等を購入して,それらを制御するソフトウェアならびにハードウェアを製作・開発し,動作確認及び予備実験等を行った。そして,ラ・フランス果実の追熟中における硬度変化を非破壊的に測定した結果,本システムで計測された振動出力の第1共鳴周波数と破壊的に計測した硬度の間には,R^2=0.8716とかなり高い相関があることがわかった。即ち,追熟により柔らかくなっていくラ・フランス果実の硬度を非破壊的に計測できることが示唆された。また,品種"つがる"のリンゴ果実については,室温で放置されていたものの硬度変化を同じく振動出力の第1共鳴周波数と破壊的に計測した硬度の間には,R^2=0.7483とかなり高い相関があることを確認した。今年度新たに構築した三次元計測システムでは,リンゴ果実の3次元形状を正確に再現でき,さらにその情報を利用することにより,果実の比重の計測,虫食い傷,打撲傷の識別などを可能にした。また,いくつかの形状係数を導入することにより,現在の選果システムで計測できないリンゴ果実の歪な形状を表現できた。
反応性熱流動による表面反応処理過程のナノスケール現象の解明

本年度は,反応性熱流動による表面反応処理過程のナノスケール現象の解明のために,実験的アプローチとして局所発光計測実験および分光実験を行った.次に,表面近傍の熱流動解析および表面反応解析のために,表面近傍のナノ構造が熱流動および反応に及ぼす影響を解析する分子動力学プログラムを新たに作成して,数値解析を行った.1.反応性熱流動からの局所発光計測実験および分光実験100マイクロメートルから20マイクロメートルの内径をもつステンレス管,ニードルバルブと光学立体顕微鏡,電気ヒータを用いて,界面近傍の局所から反応領域からの化学発光を計測するシステムを構築した.100マイクロメートルの微小反応および界面での化学発光種の失活の様子を分光計測することができた.しかし,計測領域のさらなる微小化が今後の課題である.2.表面近傍熱流動反応解析プログラムの作成表面に付着する分子1個から数十ナノメートルの構造物がある場合の表面近傍反応性熱流動解析分子動力学プログラムを作成して,エネルギ伝達および反応確率変化を数値解析した.その結果,サブナノメートルおよびナノメートルの特性長さを持つ構造物が界面エネルギ伝達を上昇させるメカニズムについて,知見を得た.さらに,界面近傍でのナノスケールの構造物が,表面反応におよぼす影響について解析を行った.これらの界面近傍ナノスケールの熱流動と界面との干渉に関する解析成果は,反応性およびエネルギ伝達特性に分けて,論文として公表した.本年度は,反応性熱流動による表面反応処理過程のナノスケール現象の解明のために,実験的アプローチとしてサブミクロン以下の局所発光計測実験と微小反応領域の作成実験を行った.次に,表面近傍の熱流動解析および表面反応解析のために,表面近傍の構造が熱流動に及ぼす影響を解析する分子動力学プログラムを新たに作成した.実験的アプローチは,サブミクロン以下の反応領域による自発光計測法の開発を目的とし,更なるスケールダウンを目指し,解析的アプローチでは表面近傍の分子スケールから数百ナノメートルの流動の直接解析を目的として,スケールアップを目指している.1.反応性熱流動からの局所発光計測実験および微小反応領域の作成実験500マイクロメートルから20マイクロメートルの内径をもつステンレス管,ニードルバルブと光学立体顕微鏡を用いて,サブミクロン以下の反応領域の作成を試みた.管径が200マイクロメートル以上では,常温下でメタンを燃料とする拡散火炎および予混合火炎が作成可能であった.燃料に水素を用いると管径が100マイクロメートルまで常温で連続的反応を持続することができた.また,反射型光学系を用いてそれらの微小反応領域からの励起ラジカルの発光を計測することが可能であった.しかし,本年度では,空間分解能および反応領域ともにサブミクロン以下の領域の計測までは至らなかった.2.表面近傍熱流動反応解析プログラムの作成表面に付着する分子1個から数十ナノメートルの構造物がある場合の表面近傍熱流動解析分子動力学プログラムを作成した.現在は,作成したプログラムを用いて,総分子数が数万個程度の系で数ナノ秒間における表面近傍での熱流動計算を試行している.また,金属表面での酸素分子の解離吸着解析プログラムを用いて,解離吸着確率と反応性熱流動の温度条件の関係を解析した.本年度は,反応性熱流動による表面反応処理過程のナノスケール現象の解明のために,実験的アプローチとして局所発光計測実験および分光実験を行った.次に,表面近傍の熱流動解析および表面反応解析のために,表面近傍のナノ構造が熱流動および反応に及ぼす影響を解析する分子動力学プログラムを新たに作成して,数値解析を行った.1.反応性熱流動からの局所発光計測実験および分光実験100マイクロメートルから20マイクロメートルの内径をもつステンレス管,ニードルバルブと光学立体顕微鏡,電気ヒータを用いて,界面近傍の局所から反応領域からの化学発光を計測するシステムを構築した.100マイクロメートルの微小反応および界面での化学発光種の失活の様子を分光計測することができた.しかし,計測領域のさらなる微小化が今後の課題である.2.表面近傍熱流動反応解析プログラムの作成表面に付着する分子1個から数十ナノメートルの構造物がある場合の表面近傍反応性熱流動解析分子動力学プログラムを作成して,エネルギ伝達および反応確率変化を数値解析した.その結果,サブナノメートルおよびナノメートルの特性長さを持つ構造物が界面エネルギ伝達を上昇させるメカニズムについて,知見を得た.さらに,界面近傍でのナノスケールの構造物が,表面反応におよぼす影響について解析を行った.これらの界面近傍ナノスケールの熱流動と界面との干渉に関する解析成果は,反応性およびエネルギ伝達特性に分けて,論文として公表した.
ダンピング性能を有する機能性木質材料の開発に関する基礎的研究

環境問題に関する社会的な規制が急速に厳しさを増している。人間が正常な生活を営むためには健康的で快適な環境が保証されなければならないのは言うまでもない。環境を乱す要因としてはいろいろあり、そのそれぞれに対して適切な科学的処方を明らかにすることは科学技術者に課せられた重大な使命である。本研究はこのうちの騒音問題に係わる機能性材料開発の可能性を追求したものである。木材は建築材料、包装材料、その他様々な用途に使われているが、振動の減衰が非常に重要な要素になる場合が多い。接着剤は粘弾性体であるからある比較的狭い温度・周波数範囲内で損失係数が極端に大きくなる。従って化学構造や内部の高次組織をコントロールして、必要な使用条件下で必要な減衰を示す高分子材料を合成し、これを接着剤に使えば、振動減衰能を備えた新しい木質機能材料を作ることができることになる。我々は、まず積層材の横振動と縦振動に及ぼす接着剤の影響を調べ、騒音低下には前者が重要であることを実験的にの確認した。次に積層材のたわみ振動による貯蔵弾性率、損失弾性率ならびにtansの測定法を考案し、これらに対する接着剤の粘弾性の影響について一つの法則性を見出した。また、積層材の振動減衰に及ぼす積層構造の影響についても検討し、対称的な多層構造にすれば減衰効果が大きくなることを確認した。つぎに、より優れた減衰性接着剤を開発するために一連のlPNやポリマーブレンド系を調製し、これを含む複合材料の減衰挙動を測定した。最後に、木材/接着剤/木材積層構造体の衝撃音を分析し、接着剤の損失係数と音の減衰との関係を明らかにした。本研究で得られた知見は新しい機能性材料の開発のための指針として利用できると思われる。最近、快適な住環境に対する要求が高度化するにつれて、床や壁から発生する衝撃音が騒音公害として認識されるようになってきており、騒音の発生を抑制するための技術革新が社会的要請になってる。本研究は天然素材としての優れた特徴をもつ木材と振動エネルギーを吸収する特別な接着剤とを組み合わせることにより、室温を中心とした広い温度範囲において可聴周波数の振動を減衰する機能性木質材料を創りだすことを目的としている。平成5年度においては、木材/接着剤/木材のサンドイッチ構造複合系のダンピングに及ぼす接着剤の粘弾性の影響を縦振動法ならびにたわみ振動法によって検討した。また、直張り木質床の衝撃音に及ぼす施工接着剤の影響を調べた。その結果、複合系の複素弾性率は高柳の理論によって記述できること、床衝撃音の低減効果はたわみ振動法による損失係数と相関関係を示し、積層材のダンピングの評価にはたわみ振動法が適していることなどを明らかにした。積層材のたわみ振動に及ぼす接着剤の影響をさらに詳しく検討するために、まず、ダンピングの温度依存性および周波数依存性を測定する方法として、レオバイブンを改造し、両端支持・中心荷重による棒の曲げ振動法を開発した。このことによって積層材のダンピングを正確かつ迅速に評価することが可能になった。引続き、接着剤の化学構造を系統的に変化させて(例えば、共重合体、ブレンド、IPNなどを調製して)、接着剤の動的粘弾性と木材/接着剤/木材の積層材のダンピング特性との関係を明らかにする研究をすすめている。この研究によって、振動を減衰する機能性木質材料の製造に適した接着剤が具備すべきレオロジカルな条件が解明されていくだろう。そして、これはそのような接着剤を分子設計する際の重要な指針となるであろう。

環境を乱す要因としてはいろいろあり、そのそれぞれに対して適切な科学的処方を明らかにすることは化学技術者に課せられた重大な使命である。本研究はこのうち騒音問題に係わる機能性材料開発の可能性を追及したものである。木材は建築材料、包装材料、そのた様々な用途に使われているが、振動の減衰が非常に重要な要素になる場合が多い。接着剤は粘弾性体であるから比較的狭い温度・周波数範囲内で損失係数が極端に大きくなる。従って、化学構造や内部の高次組織をコントロールして、必要な使用条件下で必要な減衰を示す高分子材料を合成し、これを接着剤に使えば、振動減衰能を備えた新しい木質機能性材料を作ることができることになる。我々は、まず積層材の横振動と縦振動に及ぼす接着剤の影響を調べ、騒音低下には前者が重要であることを実験的に確認した。次に、積層材のたわみ振動による貯蔵弾性率、損失弾性率ならびにtan δの測定法を考案し、これらに対する接着剤の粘弾性の影響について一つの法則性を見出した。また、積層材の振動減衰に及ぼす積層構造の影響についても検討し、対称的な多層構造すれば減衰効果が大きくなることを確認した。つぎに、より優れた減衰性接着剤を開発するために一連のIPNやポリマーブレンド系を調製し、これを含む複合材料の減衰挙動を測定した。最後に、木材/接着剤/木材積層構造体の衝撃音を分析し、接着剤の損失係数と音の減衰との関係を明らかにした。本研究で得られた知見は新しい機能性材料の開発のための指針として利用できると思われる。
血液細胞分化と酸化ストレス応答におけるDECODEシステムの比較解析

転写因子Bach1、Bach2、MafKが形成するDECODE複合体をそれぞれ精製し、質量分析を行い、構成因子を特定した。Bach1は癌抑制因子p53と結合し、p53による酸化ストレス応答性細胞老化を抑制することを示した。この抑制機構として、Bach1はヒストン脱アセチル化酵素HDAC1をp53標的遺伝子に動員し、ヒストン脱アセチル化を促進し、遺伝子発現を抑えることを証明した。細胞老化実行遺伝子の最小セットを特定した。この他に、Bリンパ球分化を制御するDECODE回路を同定し、その機能を解明した。遺伝子発現の制御プログラムには,多きく二つの様式があると考えられる。一つは,恒常性維持のプログラムであり,例えば酵素遺伝子が必要な時にonになり,必要なくなるとoffになるメカニズムを支えている。もう一つは,非可逆的変化を生み出すプログラムであり,例えば細胞分化に使われる。このプログラムでは,ある遺伝子が発現することにより細胞が次の段階へと非可逆的に進む。この二つのプログラムの基本原理の違いは未だに不明だが,遺伝子発現のスイッチとして作用する転写因子がクロマチンレベルでどのように作用するか(すなわち,エピジェネテイック効果を有するか否か),下流標的遺伝子にエピジェネテイック効果を有するものがあるか否か,などにより規定されていると予想される。転写因子Bach1とBach2を例として,この仮説を検証することを目指している。本年度は,Bach1とBach2がそれぞれ形成する蛋白質複合体の精製と解析を進めた。まず,レトロウイルスベクターを用いて,FLAG-HA-Bach1を発現する赤芽球株,FLAG-HA-Bach2を発現するBリンパ球株をそれぞれ作成した。そして,これら細胞の大量培養(8L)を行った後,核抽出液を調整した。そして抗エピトープ抗体を用いたアフィニティー精製と密度勾配遠心法を用いて,Bach1やBach2を含む転写制御複合体を精製した。現在,質量分析計を用いて,複合体要素の同定を進めている。遺伝子発現の制御プログラムには、多きく二つの様式があると考えられる。一つは、恒常性維持のプログラムであり、例えば酵素遺伝子が必要な時にonになり、必要なくなるとoffになるメカニズムを支えている。もう一つは、非可逆的変化を生み出すプログラムであり、例えば細胞分化に使われる。この仮説を検証するために、細胞分化と酸化ストレス応答を制御する転写因子Bach1およびBach2に注目し,そのDECODE複合体とDECODE回路の実体を解明することを試みた。具体的には以下の実験を行った。1.Bach1複合体の精製:赤白血病細胞MEL細胞にエピトープ付加Bach1を発現させた。大量培養の後,核抽出液を調製し,抗エピトープ抗体を用いたアフィニティー精製とグリセロール密度勾配遠心により複合体を得た。質量分析により構成蛋白質を同定した。2.Bach2複合体の精製:同様にBach2をBリンパ球細胞株Bal17で発現し,Bach2複合体を精製した。質量分析により構成蛋白質同定に成功した。3.BTBドメインの解析:大腸菌でBach1のBTBドメインを発現・精製し,結晶を得た。そしてX線回折計等を用いて立体構造を決定した。4.新規Bach1標的遺伝子:ジーンチップを用いて野性型およびBach1欠損線維芽細胞間で発現比較を行い,Bach1標的遺伝子候補を得た。そのシスエレメント解析を行い,Bach1が結合して抑制すること,この抑制は今まで知られていた分子機構(Bach1/Mafヘテロ二量体のDNA結合)とは全くことなることを見いだした。FLAGとHAエピトープをタンデムで融合したBach1,あるいはBach2を発現する細胞株を樹立した。Bach1に関してはマウス赤芽球系のMEL細胞を,Bach2に関してはマウスBリンパ球系Bal17細胞を用いた。これら細胞株の大量培養を行い,核抽出液を調整したのち,FLAG抗体ビーズとHA抗体ビーズを順次用いて,二段階アフィニティー精製を行った。現在までのところ,Bach1に関しては再現性良く複合体候補を精製できている。予備的質量分析の結果,癌抑制因子など予想外な因子が含まれることが明らかになった。このことにより,当初は予定していなかった実験を追加することになった。また,クロマチン修飾酵素もいくつか含まれていることをウエスタン等の実験から見出している。一方,Bach2複合体に関しては、19年度に入ってはじめて精製に成功し、さらに、構成要素の質量分析もほぼ終えている。この複合体は、大きく二つの機能単位に分けられると考えている。一つは、ヒストンアセチル化酵素HDAC3および機能不明因子Rif1を含むコリプレッサー複合体、もう一つはユビキチン化E3リガーゼCullin3を含む、Bach2分解制御複合体と予想される。しかし、各因子のBach2機能制御における役割は不明であり、さらなる解析が必要である。特に転写制御という点で興味深いのは、Rif1と考えている。

Rif1はテロメア長の維持に関わることが酵母で示されているが、哺乳類ホモログの機能はほとんど知られていない。私たちはRif1とHDAC3が同じ複合体に含まれることを免疫沈降実験等で確認しており、このことから、Rif1はヒストン修飾制御に関わる新規コリプレッサーとも予想される。抗原で刺激されたB細胞は、抗体遺伝子定常領域のDNA組み換えをおこし(クラススイッチDNA組み換え、CSR)、抗体機能の多様性を拡張するとともに、VDJエクソンに体細胞突然変異が選択的に導入され、より抗原親和性の上昇した遺伝子クローンが選び出される。しかし、これら二つのイベントがどのような遺伝子ネットワークで既定されているのかについては不明な点が多い。代表者らは、Bach2ノックアウト(KO)マウスではCSRが著しく低下することを既に報告しており、今年度は、Bach2下流遺伝子ネットワークを解明することを一つの目標とした。前年度までの研究で、Bach2は形質細胞特異的転写因子Blimp-1を抑制することを見いだしたが、これがCSRに重要か否かを遺伝学的に検証した。具体的には、B細胞特異的Blimp-1 KOマウスとBach2 KOマウスを交配し、二重ノックアウトマウスを作出し、CSRのレベルを比較した。Bach2 KOではほとんどCSRは観察されないが、Blimp-1を同時に破壊することにより、CSRは効率よく回復した。このことから、Bach2によるBlimp-1の抑制が、CSRには必須であることを証明した。Bach2遺伝子を制御する転写因子Pax5はBlimp-1で抑制されることが報告されている。そこで、これら遺伝子群のネットワークについて、遺伝子抑制速度などのパラメーターを実験的に決定し、ネットワークを微分方程式でモデル化した。この力学系のふるまいからも、Bach2のCSRや形質細胞分化における意義が示された。Bach2複合体の質量分析から見いだしていた転写抑制コファクター群についてマウス脾臓Bリンパ球でのノックダウン実験を行い、これら因子もBlimp-1抑制に関与することを見いだしつつある。遺伝情報発現の理解を深めるためには、DECODEシステムを複数の遺伝子・蛋白質が形成するネットワークとして捉え、システムレベルでネットワークアーキテクチャーやダイナミクスを調べる必要がある。そこで本研究では、グロビン遺伝子や抗体遺伝子など細胞分化関連遺伝子制御に加え、ヘムオキシゲナーゼ1などストレス応答性遺伝子制御においても機能している転写因子Bach1およびBach2に注目し、そのDECODE複合体とDECODE回路の解析を、生化学と遺伝学を駆使して進めてきた。具体的には、以下の点を目標とした。(1)Bach1およびBach2を含む転写制御複合体を精製し、その構成因子を同定し、個々の機能および複合体としての機能を、ノックダウン法やノックアウトマウス等を用いて解明する。(2)Bach1およびBach2の生理的標的遺伝子を同定し、エンハンサー解析等を行う。
シナプス伝達抑圧とグルタミン酸受容体

小脳顆粒細胞・ブルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性興奮性シナプスは、顆粒細胞と下オリーブ核ニューロンの同時刺激によりその伝達効率が長期間低下する。この現象は長期抑圧と呼ばれ小脳の関与する運動学習の細胞レベルでの基礎過程と考えられている。本研究では、この長期抑圧に関与するグルタミン酸受容体を同定することを試みた。グルタミン酸受容体はイオンチャネル内在型のイオノトロピック受容体とGタンパク結合型のメタボトロピック受容体に大別されているが、イオノトロピック受容体のδ2サブユニットは、プロキンエ細胞のみで発現していることが報告されていた。そこで、培養プルキンエ細胞にδ2サブユニットmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、δ2サブユニット蛋白の合成を阻害したところ、脱分極とグルタミン酸投与により引き起こされるグルタミン酸感受性の低下、として検出される長期抑圧が起こらなくなった。さらにδ2サブユニットを欠損したミュータントマウスを作製したところ、このミュータントマウスは長期抑圧を発現せず、運動障害を示すことが明らかとなった。また、メタボトロピック受容体については、mGluR1が長期抑圧に関与することを、機能阻害抗体を用いて明らかにした。mGluR1の細胞外ドメインのグルタミン酸結合領域と推定される部位を抗原として抗体を作製したところ、mGluR1の機能を阻害するものが得られた。この抗体存在下では長期抑圧を引き起こせなかった。
新規遺伝子Fam64aを用いた心筋再生医療に向けた基礎的検討

我々は最近、哺乳類では胎生期の子宮内低酸素環境から出生後の肺呼吸開始による酸素濃度の増加が心筋分裂を停止させることを突き止め、この過程に関わる重要遺伝子としてFam64aを同定した。Fam64aは胎児心筋細胞の核に強く発現し、細胞周期を促進するが、出生後は発現が激減し、心筋分裂は停止する。また、胎生期の心筋分裂にはFam64aの十分な発現と細胞周期の特定時期におけるユビキチンリガーゼAPC/Cによる同分子の分解の両方が必須である、即ち、Fam64aの発現が細胞周期に合わせて周期的に増減することが重要であることも明らかにした。本年度は、Fam64aの発現が減少する出生後に心筋特異的に発現が増強する過剰発現マウス(昨年度に作製済み)を用い、統合的な表現型解析を行った。本マウスでは出生後もFam64a発現が維持され、期待通り新生児期、成体期での心筋分裂能の亢進が認められた(分裂マーカーの発現率増加、及び細胞周期促進遺伝子の発現増加)。しかし、加齢と共に心機能の悪化を来たし、心不全に移行した。遺伝子レベルでは、肥大マーカー(ANP)の発現増加、Caハンドリング蛋白の発現低下(L型Caチャネル、リアノジン受容体、筋小胞体Ca-ATPase)、甲状腺ホルモン受容体αの発現低下などが認められた。単離心筋細胞においては、収縮率の低下、及びCaトランジェントにおけるピーク振幅値の低下とピーク到達時間の遅延が認められ、Caハンドリング機構の障害が示唆された。組織レベルでは、サルコメア構造の崩壊が認められ、同時に、心筋細胞の核が巨大化し、いびつな形状に変化している像が一部で観察された。個体レベルでは、エコー解析において左室拡大と収縮率の顕著な低下を認めた。即ち、Fam64a過剰発現マウスでは、新生児期・成体期の心筋分裂能が亢進するにも関わらず、加齢と共に心機能悪化を来たすことが明らかとなった。我々は分裂が盛んな胎生期心筋細胞の分裂制御メカニズムを解明し、これを成体心筋へ適用することで心臓再生医療の実現を目指す研究を進めている。本年度は当初の計画通り、Fam64aの心筋特異的過剰発現マウスについて、遺伝子・分子から個体レベルにわたる統合的な表現型解析を行った。その結果、期待通り新生児期・成体期での心筋分裂能の亢進を認めたものの、一方で加齢と共に心機能が悪化した。これは、Fam64aの発現が細胞周期に合わせて周期的に増減することが心筋分裂において重要であるという原則に照らせば想定内の結果である。即ち、APC/Cによる分解系を無視したFam64aの過剰発現による同分子の過度な蓄積による何らかの作用と考えられる。本マウスの心臓悪化機序を明らかにする為、次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子解析を行った。その結果、概日リズムの制御下にある心筋刺激伝導系、特にカリウムチャネルの異常が示唆された。従って、来年度はそれら関連遺伝子の解析や心筋活動電位計測、心筋ペーシングによる心電図・不整脈計測、テレメトリー計測などを行い、Fam64aの過剰蓄積が何らかの機序で概日リズム制御下の心筋刺激伝導系異常をもたらす可能性を検討する予定である。その他の原因究明策については「今後の推進策」で述べる。また、当初の計画通り、自施設内でのFam64a心筋特異的KOマウスの作製も進めている。具体的には、ゲノム編集技術により、Fam64a遺伝子のエクソン3の上流、及びエクソン4の下流にloxP配列をノックインしたマウスを作製中である。これが完成すれば、心筋特異的Creマウス(Nkx2.5-Cre;胎生早期から活性がON)との交配により心筋特異的Fam64a KOマウスを得ることが出来る。本マウスでは、胎生期心筋の分裂能障害が想定され、Fam64aの機能を解析するのに理想的な動物モデルとなる。Fam64aの過度な蓄積による心機能悪化を改善するため、同分子の分解系であるAPC/Cを同時に活性化することを検討する。具体的には、APC/Cの主要活性化因子であるCdc20とFam64aの心筋特異的ダブル過剰発現マウスを作製する。両遺伝子をαmyosin heavy chainプロモーター(出生後に心筋特異的に活性がON)でドライブすることにより、本マウスではFam64a及びAPC/Cの内在発現・活性が低下する出生後に心筋特異的に過剰発現が開始される。即ち、胎生期心筋の細胞周期と同様の状況を成体期心筋で実現できるものと期待される。本マウスの表現型解析を詳細に行うと共に、心筋梗塞負荷(冠動脈前下行枝の閉塞)、及び心臓冷却傷害負荷(液体窒素プローブによる冷却傷害;技術確立済み)に対する本マウスの心筋分裂・再生能の向上(分裂マーカー、細胞周期遺伝子、分裂タイムラプス解析)、及び心機能の回復(心エコー、摘出心の圧-容積関係、Ca測光)を評価し、これを野生型マウス及びFam64a単独過剰発現マウスと比較する。これらの評価は心筋梗塞発症の急性期(24時間まで)から慢性期(3か月程度)までフォローし、改善効果を詳細に明らかにする。

また、これらの遺伝子改変マウスの表現型解析時には単離心筋細胞を用いた解析が必須となるが、その際に外来遺伝子を導入する系として我々は大サイズの遺伝子を安定的に導入可能なバキュロウイルス実験系の確立を目指している。基本の実験系は既に確立・論文報告済みであるが、現在、ウイルスの濃縮により発現効率を大幅に向上できる系を検討中である。また、上述したように、概日リズム関連遺伝子の解析や心筋活動電位計測、心筋ペーシングによる心電図・不整脈計測、テレメトリー計測などを行い、Fam64aの過剰蓄積が概日リズム制御下の心筋刺激伝導系異常をもたらす可能性を検討する予定である。哺乳類の心筋細胞は胎児期には活発に分裂して原始心臓を形成するが、出生後は分裂を停止する。従って、成体では虚血性心疾患等で失われた心筋細胞を再生することは出来ず、故に本疾患は致死的であり、治療戦略の開発が急務である。我々は最近、心筋分裂には低酸素環境が必須であり、哺乳類では胎児期の子宮内低酸素環境から、出生後の肺呼吸開始による酸素濃度の増加が心筋分裂を停めることを突き止めた。また、低酸素下の胎児心筋において分裂を促進する最重要遺伝子としてFam64aを同定した。Fam64aは胎児期心筋の核に強く発現して細胞周期を促進するが、出生後は発現が激減する。本年度は、Fam64aの発現が減少する出生後に心筋特異的に発現が増強する過剰発現マウスの作製を試みた。本マウスは出生後も心筋の細胞周期回転が維持され、成体期での心筋分裂・再生能の向上が期待される。心筋特異的プロモーターの下流にFam64a配列を繋いだ遺伝子をマウス受精卵にインジェクションすることにより過剰発現マウスを得た。本マウスは正常に発生し、心筋組織像や心体重比は野生型と相違なかった。しかし、成体期心筋では細胞分裂マーカーの発現率や細胞周期遺伝子の発現が増強しており、分裂能の向上が示唆された。一方、心エコー解析では加齢に伴い、逆に心機能が悪化しており、長期的且つ過剰な細胞周期活性による心機能悪化が示唆された。また、我々は心筋分裂にはFam64aの発現だけでなく、細胞周期のM期におけるユビキチンリガーゼAPC/CによるFam64aの分解が必須であることを突き止めた。そこで、我々が確立したバキュロウイルスを用いた遺伝子導入法により、成体期の単離心筋にFam64a及びAPC/Cを適切に発現させ、細胞周期に応じたFam64aの周期的増減を再現することで、慢性的な過剰発現を防止し、心筋分裂・再生能の更なる向上を目指して実験を行っている。我々は分裂が盛んな胎児期心筋細胞の分裂制御メカニズムを解明し、これを成体心筋へ適用することで再生医療の実現を目指す研究を進めている。その過程で、低酸素環境下の胎児心筋細胞において細胞分裂を促進する最重要遺伝子としてFam64aを同定した。本年度は、当初の計画通り、Fam64aの心筋特異的過剰発現マウスの作製を試み、予定通り作製することができた。本マウスについて個体から分子・遺伝子レベルに渡る網羅的な表現型解析を進めており、上記の実績で述べたように、成体期心筋の分裂能向上を示唆する結果を得ることが出来た。一方で、Fam64aの長期的な発現に伴う過剰な細胞周期活性が逆に心機能を悪化させる可能性についても重要な知見を得ることが出来た。これについては、Fam64aが細胞周期のM期においてユビキチンリガーゼAPC/Cによって分解される、即ち、細胞周期に応じてFam64aの発現が周期的に増減することが胎児心筋の分裂に必須であるという我々の知見から鑑みて妥当な結果であると考えられる。