hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老人の睡眠パターンの脳波による解析の試みー在宅老人ケア対策としてー

5人の老人を対象に、連続3夜の終夜睡眠ポリグラフィー検査、主観的睡眠調査、翌日の生活、行動調査を実施した。そして、老人の睡眠脳波パターンの分析を行なった。さらに、睡眠脳波パターンと翌日の生活、行動状態を対比させることにより、両者の因果関係の解明を試みた結果以下の成績を得た。1.睡眠障害を訴える老人の全睡眠時間および睡眠率は、睡眠障害を訴えない老人のそれに比べ低い値を示した。これに加えて、同じ睡眠障害を訴える老人でも、睡眠潜時が増加している症例とし、睡眠第4段階およびREM睡眠期の割合が減少している症例とが認められた。2.5人の老人全体の傾向として、中途覚醒回数の顕著な多さは認められなかった。しかし、睡眠段階移行数および中途覚醒時間は若年者を対象とした諸家の報告と比べると多く、不安定な睡眠であった。また、平均睡眠深度と睡眠時間の関係を回帰分析した結果、相関係数-0.629の有意な逆相関が認められた。つまり、平均睡眠深度が浅い者は相対的に睡眠時間が長く、逆に平均睡眠深度が深い者は相対的に睡眠時間が短くなる傾向が示唆された。3.主観的睡眠調査の結果では、睡眠障害を訴える老人と睡眠障害を訴えない老人との間で顕著な違いは認められなかった。4.覚醒中の生活、行動調査と前夜の睡眠脳波パターンとの対比では、熟眠障害または入眠障害を示した老人は日中「臥床」の状態が比較的長く続いたのに対し、他の老人は「談話・読書」や「外出行動」などの状態が多く、日中の活動度が高いことが示像された、今後、活動度の定量的評価をした上で症例数および検査実施回数を増やして検討していく必要があるものと思われる。予備調査として,老人性睡眠・覚醒障害の実態把握および老人の問題行動と睡眠の関連性についての実態調査を計画していたが,関係諸機関の協力体制が十分でなく, 62年度においては医用データ装置の信頼性およびデータ処理の準備作業が主で,脳波記録による終夜睡眠パターンの解析に関与する交絡因子の検討・把握にとどなった.つまり,成人学生24名,老人ホームの老人118名を対象に選び,老人の睡眠・覚醒リズム障害をとらえる付随指標として血圧,体温,脈拍を測定し, HalbargのCOSINOR法によりリズム性の有無を判定するとともに,平均(Messor),振幅(Amplitude),頂点位相(Acrophase)を算出し,統計処理により以下の成績を得た.1.血圧・体温・脈拍のリズム性は,ともに老化によって容易に消失しない.2.特に体温は,加齢の影響を受けにくく,理想的なコサインカーブに近いリズム変動を示し,再現性もあることからも,日内リズムの観察に最適といえる.3.老人の最高血圧は,成人に比し平均で25mmHg高く,伏幅は1.52倍,頂点位相は24時間のずれがある.4.脈拍についても,頂点位相は成人に比して老人は, 3時間のずれがある.5.血圧・体温・脈拍ともに運動・食事・精神的緊張などの影響を考慮し,常に安静を保った上で測定することが重要である.6.また,併せてリズム性の検討のため, HalbargのCOSINOR法に基づくデータ処理のためのプログラム開発を行った.5人の老人を対象に、連続3夜の終夜睡眠ポリグラフィー検査、主観的睡眠調査、翌日の生活、行動調査を実施した。さらに、睡眠脳波パターンと翌日の生活行動状態を対比させることにより、両者の因果関係の解明を試みた結果以下の成積を得た。

これに加えて、同じ睡眠障害を訴える老人でも、睡眠潜時が増加している症例と、睡眠第4段階およびREM睡眠期の割合が減少している症例とが認められた。2.5人の老人全体の傾向として、中途覚醒回数の顕著な多さは認められなかった。しかし、睡眠段階移行数および中途覚醒時間は若年者を対象とした諸家の報告と比べると多く、不安定な睡眠であった。また、平均睡眠深度と睡眠時間の関係を回帰分析した結果、相関係数ー0.629の有意な逆相関が認められた。つまり、平均睡眠深度が浅い者は相対的に睡眠時間が長く、逆に平均睡眠深度が深い者は相対的に睡眠時間が短くなる傾向が示唆された。3.主観的睡眠調査の結果では、睡眠障害を訴える老人と睡眠障害を訴えない老人との間で顕著な違いは認められなかった。4.覚醒中の生活、行動調査と前夜の睡眠脳波パターンとの対比では、熟睡障害または入眠障害を示した老人は日中「臥床」の状態が比較的長く続いたのに対し、他の老人は「談話・読書」や「外出行動」などの状態が多く、日中の活動度が高いことが示唆された。今後、活動度の定量的評価をした上で、症例数および検査実施回数を増やして検討していく必要があるものと思われる。
眼循環に影響を及ぼす血管平滑筋に対する生理薬理学的研究

正常眼圧緑内障のように眼圧上昇を伴わない視神経障害の発生因子として視神経乳頭の血流障害は長い間論議となってきた。近年レーザードプラー、レーザースペックルなど、生体で視神経近傍の循環動態を非浸襲的に測定できる方法が発達し、この問題の論議は新たな局面を迎えた。正常眼圧緑内障の治療において、既存の緑内障治療薬は眼圧下降という目的からは十分な効果は持っていない。このような薬剤の眼循環に対する効果はこの意味から臨床上重要と思われる。この問題は先の新しい眼循環測定法を駆使したin vivoの実験が多数行われているが、我々はin vitroでこれらの薬剤が血管平滑筋に対してどのような効果を持つかを検討した。ウサギ毛様動脈を摘出し、その摘出血管を等尺性収縮記録装置に懸垂し、様々な薬物がこの血管にどのように影響するかを調べた。この血管はα作動薬に対して濃度依存性の収縮を示したが、β作動薬には反応せず、β受容体はこの血管に関する限り重要な役割を果たしていないと考えられた。神経刺激を行うとこの血管の神経支配には収縮性の成分と弛緩性の成分があることがわかった。前者は交感神経α受容体を介するもので、後者は非アドレナリン非コリン性のNOを伝達物質とする神経によって起こっていると考えられた。ピロカルピンはこの血管の内皮細胞に存在するムスカリン受容体を介して内皮依存性のNOを放出させることによって濃度依存性の弛緩を起こすことが明らかとなった。β遮断薬はBetaxolol、Timolol、Carteololで検討を行った。Betaxolol、Timololは比較的高濃度でこの血管を弛緩させたが、その機序として、これらの薬剤の持つCa拮抗薬様作用が考えられた。Carteololの血管弛緩作用は確認できなかった。ウノプロストンはやはり濃度依存性の弛緩を起こしたが、弛緩は内皮非依存性で、Ca拮抗薬様作用とも異なり、内因性のCGRPやPGの関与もなく、作用機序に関しては不明であった。既存の緑内障治療薬のほとんどは血管弛緩作用を持つが、その作用機序は異なっていることが明らかとなった。この結果は臨床的にも非常に有意義である。正常眼圧緑内障の病態には視神経の循環が関与することが示唆され、眼循環がどのように制御されているかという研究は臨床的にも非常に重要と考えられるようになった。我々は先にウシの眼動態を用いた実験を開始し、血管を弛緩させる非アドレナリン非コリン作動性の神経支配があることを見いだした。今回我々はまずウサギ眼球より後毛様動脈を摘出、摘出した血管より実体顕微鏡下で血管平滑筋条片を作成し、等尺性収縮記録法を用いて張力を測定した。矩形波パルス通電を潅流槽中に一対の塩化銀電極を導入し、フィールド刺激とした。ウサギ毛様体筋は高K溶液によって収縮し、カルバコール投与によって弛緩した。カルバコールによる弛緩はNO合成酵素阻害剤L-NAMEによって抑制されたので、内皮依存性のNOによる弛緩だと考えられた。この血管はHistamineによっても収縮するが、これは他の血管平滑筋とは異なる性質である。収縮にはH1受容体が関与していると考えられた。Histamine存在下でフィールド刺激を行うと弛緩が出現した。この弛緩はテトロドトキシンによって消失するので神経原性のものと考えられた。弛緩反応はアトロピンやα、β受容体遮断薬では変化なく、ウシと同様、非アドレナリン非コリン作動性の血管弛緩神経支配と考えられた。この弛緩はL-NAMEを前処理することによって著明に抑制された。以上によりウサギにおいては後毛様動脈はNOを伝達物質とする神経支配の存在が示唆された。

β遮断薬はBetaxolol、Timolol、Carteololで検討を行った。Betaxolol、Timololは比較的高濃度でこの血管を弛緩させたが、その機序として、これらの薬剤の持つCa拮抗薬様作用が考えられた。Carteololの血管弛緩作用は確認できなかった。ウノプロストンはやはり濃度依存性の弛緩を起こしたが、弛緩は内皮非依存性で、Ca拮抗薬様作用とも異なり、内因性のCGRPやPGの関与もなく、作用機序に関しては不明であった。既存の緑内障治療薬のほとんどは血管弛緩作用を持つが、その作用機序は異なっていることが明らかとなった。この結果は臨床的にも非常に有意義である。視神経近傍の循環に影響があると思われる毛様動脈の生理学的性質について研究を行った。白色家兎より毛様動脈を摘出し、その電気生理学的性質を等尺性収縮記録法を用いてin vitroで検討するとともに様々な緑内障治療薬の影響もあわせて検討した。神経刺激によってこの血管は弱い収縮活動を発生した。この収縮はブナゾシンによって抑制されたので、α受容体を介した交感神経による反応と考えられた。イソプロテレノールはこの血管を高K溶液で収縮させた状態でもほとんど反応を示さず、β受容体はほとんど存在しないと思われた。また、ヒスタミンはこの血管を強く収縮させたが、このように収縮させた状態で神経刺激を加えると著明な弛緩反応が発生した。この弛緩反応は血管内皮を機械的に除去しても見られたが、NO合成阻害剤であるN-ニトロ-L-アルギニンメチルエステルによって抑制された。ピロカルピンは1mMという高濃度までまったく収縮を起こさなかった。高K溶液で収縮させた状態でこの薬剤を投与してみると、1μMから弛緩が発生した。この弛緩もNO合成阻害剤で抑制された。チモロール、ベタキソロールは両者とも1mMという高濃度までほとんど収縮をおこさなかったが、カルテオロールは濃度依存性の収縮を示した。高K溶液での収縮下でこれらの薬剤を投与すると、ベタキソロールは100μMから、チモロールでは1mMから弛緩が見られたが、カルテオロールでは弛緩は見られなかった。以上の結果より白色家兎毛様動脈は交感神経による収縮と非コリン非アドレナリンNO線維による弛緩という二重神経支配を受けていると思われた。また、ピロカルピンは内皮依存性のNO放出によってこの血管を弛緩させ、血流改善作用があることが予想された。また、チモロール、ベタキソロール高濃度で白色家兎後毛様動脈を弛緩させる作用があることがわかった。この弛緩にはβ受容体も、NOも関与していないことから弛緩の機序としてカルシウムチャネル阻害作用などが考えられ、少なくとも高濃度では若干の血流改善作用があることが予想された。しかしカルテオロールはこの2剤とは違い弛緩は見られず、NO活性作用も明らかにはならなかった。正常眼圧緑内障のように眼圧上昇を伴わない視神経障害の発生因子として視神経乳頭の血流障害は長い間論議となってきた。近年レーザードプラー、レーザースペックルなと、生体で視神経近傍の循環動態を非浸襲的に測定できる方法が発達し、この問題は新たな局面を迎えた。既存の緑内障治療薬は眼圧下降という目的からは十分な効果は持っていない。このような薬剤の眼循環に対する効果はこの意味から臨床上重要と思われる。この問題は先の新しい眼循環測定法を駆使したin vivoの実験が多数行われているが、我々はin vitroでこれらの薬剤が血管平滑筋に対してどのような効果を持つかを検討した。
輸血関連新規感染症の実態解明に向けたパイロット研究

輸血用血液製剤には日本赤十字社が献血採血時に検査用血液を同時に採取してHIV, HBV, HCVの核酸増幅検査を個別検体で行っている。最新の2017年報告では、HBV 1件、HEV 4件と最もHEV感染の報告が多い。HEV感染に対しては北海道以外で核酸増幅検査が献血血液に対して行われていないことが原因である。今回の研究課題を応募時にはHEV検査に対する日本赤十字社の方針が不明であったため、簡便で多くの施設で施行できるHEV検査を開発、輸血用血液製剤に応用できるようにしたいと考えていた。しかし、その後2020年の終わりまでにHEV核酸増幅検査を全国に展開することが明らかとなった。そのため、2018年はHEVの一過性感染がどの程度受血者において観られるのかを明らかにし、献血由来の血液による一過性HEV感染の可能性を統計的に処理する際の背景リスクとして活用する必要がある、と考えた。これまで血液疾患の患者から抗HEV IgA, IgG, IgM抗体検査、HEV RNA検査を行い、IgG単独陽性/ IgM+IgG抗体陽性/ RNA陽性者が2 / 2/ 0見出された。この内、1名のIgM抗体陽性者においては、直近の輸血が無かったことからHEVの輸血による感染を証明するためには、ウイルスゲノムの血液製剤との比較が必要であることが分かった。一方、HTLV-Iの抗体ウインドウ期感染者が献血ドナーとなった場合の輸血用血液製剤に含まれるウイルスの検出については、ウイルスがCD4リンパ球に感染した状態で感染が成立することから、リンパ球へ感染させた後に血液製剤にスパイクし検出限界を確認する必要がある。感染したリンパ球の定量が間に入るため測定系の確立が遅れている。当初は、HEVの簡便迅速な検体検査法の開発、HTLV-Iの輸血による感染のリスクを顕かにして、その対応を立案することが研究の主目的であったが、日赤の方針転換があり、研究計画を変更する必要が生じた。そのための倫理審査用計画を作製したが、臨床研究倫理審査に想定外の時間が必要になったためである。1)早急に現在のHEV感染調査を全国レベルに拡大する。2)さらに、現在輸血用血液製剤で最も問題が大きい細菌汚染の輸血前評価を迅速に行う客観的指標の確立を行う。現在エンドトキシン迅速検査と細菌を蛍光染色しサンプルを評価する方法の2つで試行を始めている。3)HTLV-Iウインドウ期感染者を想定した血液製剤中のHTLV-Iウイルスの定量系について開発を進める。ウイルスの感染したCD4リンパ球が必要なため開発に時間がかかるようであればリンパ球を破壊して総量を測定する方法に変更する。

当初予定していた計画が日本赤十字社の方針に合わせ変更が必要になった。その後新たに提出した臨床研究計画書の倫理審査承認が想定より遅れ研究開始が遅延した。このために予算の執行に遅延が生じてしまった。
RND型トランスポーターの結晶構造に基づく機能解析

院内感染などに見られる多剤耐性化の主要な原因の一つであるRND型多剤排出トランスポーターの作動メカニズムの本質的理解を目指し、立体構造情報の高解像度化を進めるとともに、得られた結晶構造に基づく機能解析を進めた。得られた結晶構造に基づく蛋白質工学的解析を行い、基質透過経路のなかほどに基質選択性に関わるフィルター様の働きを持つ部位を見いだした。また、これまで極めて困難であったRND型トランスポーターの直接的な生化学的解析を行う手法としてグラム陽性細菌由来のRNDトランスポーターホモログを用いる方法を考案した。グラム陽性細菌由来RND型トランスポーターにおける薬剤排出研究はこれまでほとんど行われてこなかったが、グラム陽性菌のRND型トランスポーターも実際に薬剤を排除することが実験的に示された。また、これらのターゲットとした膜蛋白質の大量発現に成功し、結晶化が可能な高純度のサンプルを得ることにも成功している。それらの結晶化に際し、フェムト秒レーザー照射や微量溶液撹拌のほか、新たに開発中の高濃度アガロースゲル中での結晶化など新たな結晶化技術の開発し特許申請を行うと共に、それらを適用して現在もトランスポーターの結晶化を行った。大腸菌AcrBについてはは分解能が2.5Å分解能にまで向上した。初年度となる本年度は世界で初めて基質結合型の結晶構造が明らかとなった大腸菌AcrBの高分解能結晶化を目指すとともに、グラム陽性細菌由来AcrBホモログのクローニングを行った。高分解能結晶化については、精製条件などを検討するとともに、新規結晶化方法を用いることで、最高で2.6A分解能までのデータを獲得することに成功した。これは、AcrBについてこれまで報告されているものの中で最も高い分解能であり、さらなる高分解能結晶化を来年度も目指して行く予定である。また、グラム陽性細菌由来ホモログについては、これまでAcrBなどRND型と呼ばれるトランスポーター群はグラム陰性細菌について調べられている歴史的背景をうけ、極めて限られた情報しか利用できないが、今年度の実験でクローニングした6種類のグラム陽性細菌由来ホモログは何らかのトランスポーターであることが分かった。これらは非常に興味深いことに、AcrBとほぼ同じ分子サイズを持ち、何故か外膜チャネルTolCと結合するドメインを有するものと、ペリプラズム空間に突き出たドメインを大きく欠きAcrBに比べ7割程度の分子サイズしか持たないものの2種類があることが判明した。今後はこれらを材料に生化学的研究を進めて行く予定である。また大腸菌AcrA-AcrB複合体における蛋白質工学的研究も進行中で、AcrA-AcrBの結合界面における重要残基の特定は来年度うちに決着させるべく研究を進めている。多剤排出トランスポーターの働きを本質的に理解することは、多剤耐性化問題を克服するための重要な手がかりとなるため、製薬企業からばかりでなく、社会的にも大きな注目を集めている。化学療法に立脚する現代医療現場での脅威の一つに薬剤耐性化問題が挙げられる。多くの抗生物質が効かなくなるこの現象の主因である多剤排出トランスポーターの立体構造決定、さらに基質結合型結晶構造の決定による多基質の認識および排出メカニズムである「機能的回転輸送機構」を解明した実績の上に立ち、多剤排出トランスポーター、とりわけグラム陰性細菌の持つRND型トランスポーターの結晶構造解析を進めると共に、蛋白質工学的、分子生物学的および生化学的手法を用いて、残る排出機構解明に残された問題を解決し、RND型トランスポーターの詳細な構造に基づく機能解析と構造多様性についての総合的解明を目的として研究を進めた。多剤排出トランスポーターの中で最も構造および、機能が明らかな大腸菌由来AcrBの構造に基づく機能解析を進める一方、本研究で扱うAcrBホモログの構造解析と生化学測定を照らし合わせて、トランスポーターの作動メカニズムと本来の生理的役割について研究を行った。また、これまで既に得られた大腸菌多剤排出トランスポーターAcrBの蛋白質工学的研究を進め、多基質認識の構造的基盤を明らかにする目的で変異体を構築し、薬剤排出活性を測定した。その結果これまで考えていた薬剤結合部位と、薬剤取り込み口の間周辺に基質特異性を決定する因子があることを見いだし、filter regionと名付け現在露文執筆へ向けて詰めの実験を行っている。

また、機能研究を進めるために共同している英国ケンブリッジ大学のヘンドリック・ヴァン・ビーン博士らと、ABCトランスポーターでは膜貫通部分に同様の基質特異性を決定づける部分が存在することを明らかにした初となる共著の論文を出版した。今後は、RND型トランスポーターについても、共同で排出機構の解明を進めてゆく予定である。化学療法に立脚する現代医療現場での脅威の一つに薬剤耐性化問題が挙げられる。多くの抗生物質が効かなくなるこの現象の主因である多剤排出トランスポーターの立体構造決定、さらに基質結合型構造の決定による多基質認識およびその排出機構を解明した実績の上に立ち、多剤排出トランスポーター、とりわけグラム陰性菌の持つRND型トランスポーターの構造学的、蛋白質工学的、および生化学的研究を行い、排出機構解明に残された問題を解決し、同トランスポーターの構造に基づく詳細な機能解析と構造多様性の総合的解明を目的として研究を進めた。多剤排出トランスポーターの中で最も構造と機能の解明が進んでいる大腸菌AcrBの構造に基づく機能解析を進め、本研究で扱うAcrBホモログの構造解析と生化学測定を照らし合わせて、トランスポーターの作動メカニズムと本来の生理的役割について研究を行った。これまでの研究で見いだした薬剤結合部位と、薬剤取り込み口の中間に存在する基質特異性を決定する領域"filter region"について詳細な解析を進めた結果、ホモログ(AcrD)とのキメラ解析に於いて、基質特性を改変させるにはFilter regionに存在する3残基のアミノ酸に対する部位特異的変位で十分であることが明らかとなった。この変位はいずれも荷電性に関わるもので、AcrBおよびAcrDそれぞれの荷電性基質認識を説明するのに矛盾がない。また、同様のメカニズムが動物細胞由来ABCG2蛋白にも見られ、薬剤排出トランスポーターの基質認識機構の一般的なドグマである可能性を示唆していた。また、これら基質特異性の異なるホモログの結晶解析も進行中である。また高濃度ゲル中での結晶化など新しい手法による膜タンパク質結晶化技術を開発し特許出願もした。今後これらの構造機能解析をさらに展開し、多剤耐性化の克服に資する情報として開示していきたい。
変形性関節症ならびに慢性関節リウマチにおける関節軟骨の破壊機構に関する研究

変形性関節症(OA)や慢性関節リウマチ(RA)における関節軟骨の破壊機構に関しては、不明な点が多い。本研究では、これらの破壊機構を解明することを目的に、OAならびにRAの病的関節軟骨を免疫組織学的に検討した。さらに、これらの病的関節軟骨より軟骨細胞を分離、培養し、その基質修復能についても検討した。先ず、ヒト関節軟骨より精製したII型コラーゲンからCBペプチドを精製し、これに対する抗体を作製(抗CBペプチド抗体)、本抗体は分解されたII型コラーゲンと特異的に反応することを確認した。そこで、本抗体や抗コラーゲン抗体、抗プロテオグリカン抗体、抗フィブロネクチン抗体などを用いた免疫染色を行った結果、OAにおける関節軟骨の破壊は浅層から始まり、しだいに深層へと進展してゆくことが判明した。また、破壊過程の初期では、健常な関節軟骨には存在しないI型コラーゲン、フィブロネクチン、デルマタン硫酸プロテオグリカンなども出現してくることが明らかにされた。一方、RAの関節軟骨では、OA軟骨とは逆に、深層からの軟骨破壊が生じてくることが判明した。OA関節軟骨から得られた軟骨細胞のコラーゲンならびにプロテオグリカン合成量は、変性が軽度であれば増加しており、変性が中等度になると減少してくることが観察された。これに対し、RAの関節軟骨から得られた軟骨細胞の基質合成量は、健常な軟骨細胞のそれより減少していた。これらのことから、OAとRA関節軟骨の破壊機構は異なることが明らかにされ、初期OAでは軟骨基質の修復も営まれていることが判明した。しかし、この修復機転としての形成される軟骨基質は硝子軟骨とは異なり、線維軟骨の様相を呈するものと考える。変形性関節症(OA)や慢性関節リウマチ(RA)における関節軟骨の破壊機構に関しては不明な点が多い。今回は、これらの病的軟骨基質に対する免疫組織学的検索を行い、マトリックスの破壊状況を比較検討した。まずラットに感作して作製した抗ヒトII型コラーゲン抗体の特異性をELISA法を用いて検討した結果、三本鎖構造を有するnative typeのII型コラーゲン分子とは全く反応せず、三本鎖構造が解体された変性II型コラーゲンと濃度依存性に結合することが確認された。また本抗体を一次抗体として免疫組織染色を行うと、健常な関節軟膏は染色されなかったが、所期のOA軟骨では、表層から浅層が染色され、OAの進行に伴い深層へと染色域が拡大されていくことが判明した。これに対し、抗II型コラーゲン抗体では、逆に浅層で著しく染色性が低下していた。このことよりOA初期の軟骨では先ず表層から浅層に存在するII型コラーゲン線維の分解が生じてくることがわかった。また抗プロテオグリカン抗体による染色でも、OA軟骨では、浅層において著しい染色性の低下がみられ、プロテオグリカン分子もII型コラーゲン線維と同様に、浅層から分解されてくることが示唆された。これに対し、RAの関節軟骨では、II型コラーゲン抗体による免疫組織染色では、深層の染色性の低下がみられ、抗II型コラーゲンCBペプチド抗体では、深層に染色性が認められ、OA軟骨とは逆に、深層からのコラーゲン線維の分解が、RAの関節軟骨破壊の基礎になっていることが推察された。今後は、OAならびにRAの病的な軟骨組織を分解、培養し、各軟骨層における基質合成能を蛋白レベルで検討する予定である。今回、これらの病的軟骨から軟骨細胞を分離、培養し、その基質合成能をたんぱく質レベルで検討した。すなわち、手術時にOAならびにRA関節軟骨を採取し、肉眼的にほぼ健常な部分と、軽度ならびに中等度の変性所見を呈する部分の軟骨片を採取した。

軟骨細胞は、それぞれの軟骨片を0.8%プロナーゼと0.4%コラゲナーゼで消化して分離し、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むDME培養液で培養した。プロテオグリカンの合成量の測定は、^<35>SO_4^<2->でラベルした培養液をSephadex G-50カラムを用いて行い、II型コラーゲンの合成量は、^<14>Cプロリンを用いてラベルした培養液からImmunoprecipitation法にて測定した。その結果、変性が軽度なOA関節軟骨から得られた軟骨細胞のコラーゲン合成量は、コントロールの115%であり、プロテオグリカン合成量はコントロールの120%と増加していた。一方、変性が中等度の部位の軟骨細胞のコラーゲン合成量はコントロールの71%であり、プロテオグリカン合成量はコントロールの78%といずれも低下していた。また、RA関節軟骨から得られた軟骨細胞のコラーゲンならびにプロテオグリカン合成量は、変性の程度にかかわらず、コントロールより低値を示した。これらのことから、OAでは、関節軟骨の変性が軽度であれば、軟骨細胞の基質合成能は増加してなんらかの軟骨基質の修復が営まれているものと推察された。しかし、変性が進行すると、この軟骨細胞の基質合成能も低下し、基質の分解が合成を大きく上回ることが判明した。一方、RAでは、OAの場合と異なり、変性が軽度の段階でもその基質修復能は低いことが明らかとなった。したがって、OAとRAでは、軟骨基質の破壊機構のみならず、その修復能も異なることが判明した。
認知症早期臨床検査診断薬の開発

我々は、アルツハイマー病患者の脳でタンパク質中のアルギニンがシトルリンに変換した異常なタンパク質(シトルリン化タンパク質と総称)が早期に出現し、病状の進行程度に応じてその量が増加することを明らかにした。アルギニンをシトルリンに変換する酵素は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)と呼ばれ、脳内の至る所に存在する。本研究では、シトルリン化タンパク質を指標とした認知症の早期臨床診断薬の開発を目的とし、シトルリン化タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに成功した。これらの抗体を組み合わせて、シトルリン化タンパク質を高感度に検出するELISAシステムを構築する。アルツハイマー型認知症の特徴的な病理所見としてアミロイドベータタンパク質(Aβ)が蓄積した老人斑やリン酸化タウタンパク質が蓄積した神経原線維変化は有名である。これらタンパク質は、本来、正常な機能を果たしていたものがやがて様々な修飾を受け、異常化し、神経細胞の内側や外側に蓄積したためと考えられる。異常タンパク質の蓄積は、アルツハイマー型認知症をはじめ他の型の認知症でも観察される。本研究では、シトルリン化タンパク質を指標とした認知症の早期臨床診断薬を開発する。即ち、シトルリン化タンパク質を高感度に検出するELISAシステム(酵素免疫測定法)を構築し、臨床試験を実施する。平成25年度、シトルリン化タンパク質を包括的に捉える特異的なモノクローナル抗体を作製するため、ヒトPAD2を用いてヒストンをシトルリン化し、シトルリン化部位を化学修飾して、化学修飾シトルリン化ヒストン抗原を作製した。そして、この抗原をマウスに免役して、化学修飾シトルリン化タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を9クローン得ることに成功した。現在、これらの抗体を組み合わせて、化学修飾シトルリン化タンパク質を高感度に検出するELISAシステムを構築している。平成24年度、シトルリン化タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を作製した。即ち、シトルリン化タンパク質を包括的に捉える特異的なモノクローナル抗体を作製するため、牛の胸腺由来ヒストンからH1ヒストンのみを除き、ヒトPAD2組換えタンパク質を用いて、ヒストンをシトルリン化した。ヒストンのシトルリン化を確認後、ジアセチルモノオキシムやアンチピリンなどの試薬を用いて、シトルリン化部位を化学修飾した。化学修飾シトルリン化ヒストンができたのを確認後、透析して免疫抗原とした。次に、化学修飾シトルリン化ヒストン抗原をマウスに免役して、抗体ができたのを確認した。常法に従い、化学修飾シトルリン化タンパク質に特異的クローンをスクリーニングした。現在、個々のモノクローナル抗体について、反応性や特異性をELISA法、ウエスタン法、免疫染色法により確認している。平成26年度、ヒトグリア線維性酸性タンパク質組換えタンパク質(rhGFAP)とヒト2型PAD(hPAD2)組換えタンパク質を用いて、シトルリン化ヒトGFAP(Cit-hGFAP)を作製した。また、プロテオーム解析により、シトルリン化部位を同定した。さらに、抗原としてCit-GFAPをマウスに免疫し、Cit-hGFAPに反応するモノクローナル抗体を得ることができた。免疫組織染色により、作製したモノクローナル抗体はAD脳の反応性アストロサイトを染色することがわかった。また、Cit-hGFAPを定量するサンドイッチELISAも開発した。神経変性疾患研究計画に記載した内容を順調に行うことができた。研究計画に記載した内容を順調に行うことができた。

また、非常に興味深い結果も得られた。現在、研究計画の変更や解決すべき課題等は特にない。研究はおおむね順調に進展している。研究進行上、翌年度の使用が必要になったため。翌年度に全て使用する予定である。予算の執行も研究計画に沿って、順調に行っている。次年度も引き続き、研究計画に沿った予算の執行を行う。
宗教改革期スイスにおける都市共同体の構造に関する社会史的研究

これまで研究代表者は、宗教改革期の社会思想と農村共同体に関する研究を行ってきたが、その成果を土台にして、今回は分析対象を16世紀の都市共同体へと拡大し、社会史的に都市と宗教改革の関係についての考察を開始した。2017年8月にスイスのシャフハウゼン市にある州立文書館と市立文書館を訪問し、中世末から16世紀初めにかけての同市の歴史にまつわる史料、特に宗教改革史全般や1525年のブドウ栽培者の反乱に関わる史料を精力的に収集した。さらに、キリスト教史学会・東日本部会から依頼されて、研究代表者は2017年12月9日(土)に「ドイツにおける宗教改革と農村社会ーペーター・ブリックレの「共同体宗教改革論」をめぐってー」という講演を、明治学院大学白金キャンパスで行い、宗教改革の社会史研究において都市と農村の関係を考察する意義について議論した。その研究成果は、『キリスト教史学』第72集で2018年7月に公刊された。2017年6月に開催された三田史学会大会総合部会シンポジウムの内容を、「ヨーロッパ宗教改革研究の今日的意義ー500周年に寄せてー」という題名で、2018年12月に『史学』第88巻第1号で公刊した。これまで蓄積した成果を、「近世スイス・シャフハウゼンにおける葡萄栽培者ツンフトの反乱(1525年)について」という題名で、2019年4月6日に「宗教改革史研究会・スイス史研究会合同部会」で予備報告を行う予定である。さらに研究代表者は、上述と同名の研究報告を2019年5月19日に、「第69回日本西洋史学会大会」の自由論題報告という形で、静岡大学静岡キャンパスに於いて行うことを予定している。それに加えて、研究代表者は、別の題名での研究報告を2019年10月に広島大学史学研究会で行うことを計画している。三田史学会大会において大規模なシンポジウムの開催を無事に実施し、スイスの二つの文書館を訪問して大量の史料を収集するなど順調に計画を進めることができた。また予定外ではあるが、依頼されて宗教改革に関連した二つの講演会(日本キリスト教文化協会とキリスト教史学会)を、2017年6月と12月にそれぞれ行った。そのことは、より幅広い視点で宗教改革史研究を総合的に考察するための重要な契機となり、本研究を進める上で、結果として有意義なものとなった。さらに多くの史料を収集して、より詳細な史料分析を行う必要があるが、「第69回日本西洋史学会大会」で2019年5月19日に、「近世スイス・シャフハウゼンにおける葡萄栽培者ツンフトの反乱(1525年)について」という題名での研究報告を行う予定にしているので、おおむね順調に進展していると考えられる。2017年夏に収集した大量の史料を詳細に分析して、どのような史料が不足し、今後どのような史料を収集すべきかについて検討する。その上で、まずシャフハウゼンにおける1525年のブドウ栽培者の反乱について分析し、それに関する学会報告を行い、その内容を研究成果として公刊する。史料分析の対象は、ブドウ栽培者ツンフト関連のものに加えて、その蜂起に共同で参加したシャフハウゼンの漁師ツンフトに関わるものにも拡大したい。さらにそれらの研究蓄積をもとにして、シャフハウゼンの宗教改革の特質について考察する。特にシャフハウゼンでは、中心的な宗教指導者が不在のままに、外交的な圧力を受けて、市参事会によって宗教改革が導入されたという学説があるが、その有効性について検証する。2019年の夏に再度スイスを訪問して、史料を収集する予定である。それに加えて、宗教改革史や近世スイス史全般に関する重要な史料、研究文献、事典、辞書などを収集する。基本的に予定していた計画からの大幅な変更は必要ないと思われる。まず、ドイツとスイスにおける都市の宗教改革研究に関する学説史を整理するために、「宗教改革と都市共同体:ベルント・メラー説をめぐって」(『思想』第1122号、2017年10月、2445頁)を公刊し、メラーの学説の有効性と問題点について議論した。同年6月21日にキリスト教文化協会に依頼されて、「ルターの戦争観と現代」と題する講演を、教文館9階ホールで行った。さらに研究代表者は、「ヨーロッパ宗教改革研究の今日的意義ー五百周年に寄せてー」と題するシンポジウムを慶應義塾大学三田キャンパスで開催することを企画し、ドイツ、フランス、イギリスの宗教改革を専門とする三人の講演者を招いて、2017年6月24日の三田史学会大会総合部会シンポジウムの総合司会をつとめた。その研究成果は、今年の夏頃に『史学』第88巻第1号に掲載される予定である。2017年8月にスイスのシャフハウゼン市にある州立文書館と市立文書館を訪問し、中世末から16世紀初めにかけての同市の史料、特に宗教改革史全般や1525年のブドウ栽培者の反乱に関わる史料を精力的に収集した。

その研究成果は、『キリスト教史学』第72集で今年の7月に公刊される予定である。予定されていたものとしては、学説史の整理を行って、研究をさらに進めるための重要な論点をまとめ、三田史学会大会において大規模なシンポジウムの開催を無事に実施し、スイスの二つの文書館を訪問して大量の史料を収集するなど順調に計画を進めることができた。また予定外ではあるが、依頼されて宗教改革に関連した二つの講演会を、2017年6月と12月に行った。そのことは、より幅広い視点で宗教改革史研究を総合的に考察するための重要な契機となり、本研究を進める上で、結果として有意義なものとなった。ただし、通信教育関係教科書の執筆や勤務校での多忙な業務におわれ、予定にないほどの多くの時間を、本研究以外の目的のために費やさざるをえなかったことは確かである。さらに詳細な史料分析を行う必要があるが、着実に研究成果を公刊することができているので、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。これまで研究代表者は、宗教改革期の社会思想と農村共同体に関する研究を行ってきたが、その成果を土台にして、今回は分析対象を16世紀の都市共同体へと拡大し、社会史的に都市と宗教改革の関係についての考察を開始した。2017年8月にスイスのシャフハウゼン市にある州立文書館と市立文書館を訪問し、中世末から16世紀初めにかけての同市の歴史にまつわる史料、特に宗教改革史全般や1525年のブドウ栽培者の反乱に関わる史料を精力的に収集した。さらに、キリスト教史学会・東日本部会から依頼されて、研究代表者は2017年12月9日(土)に「ドイツにおける宗教改革と農村社会ーペーター・ブリックレの「共同体宗教改革論」をめぐってー」という講演を、明治学院大学白金キャンパスで行い、宗教改革の社会史研究において都市と農村の関係を考察する意義について議論した。その研究成果は、『キリスト教史学』第72集で2018年7月に公刊された。2017年6月に開催された三田史学会大会総合部会シンポジウムの内容を、「ヨーロッパ宗教改革研究の今日的意義ー500周年に寄せてー」という題名で、2018年12月に『史学』第88巻第1号で公刊した。これまで蓄積した成果を、「近世スイス・シャフハウゼンにおける葡萄栽培者ツンフトの反乱(1525年)について」という題名で、2019年4月6日に「宗教改革史研究会・スイス史研究会合同部会」で予備報告を行う予定である。さらに研究代表者は、上述と同名の研究報告を2019年5月19日に、「第69回日本西洋史学会大会」の自由論題報告という形で、静岡大学静岡キャンパスに於いて行うことを予定している。それに加えて、研究代表者は、別の題名での研究報告を2019年10月に広島大学史学研究会で行うことを計画している。三田史学会大会において大規模なシンポジウムの開催を無事に実施し、スイスの二つの文書館を訪問して大量の史料を収集するなど順調に計画を進めることができた。また予定外ではあるが、依頼されて宗教改革に関連した二つの講演会(日本キリスト教文化協会とキリスト教史学会)を、2017年6月と12月にそれぞれ行った。
越境汚染大気中の有機過硝酸エステル類の測定とその光化学反応性への寄与率評価

有機硝酸エステル類は排ガス等に直接含まれているNOxから派生する2次汚染物質であり、長距離輸送されて人為活動が少ない遠隔地の大気汚染の原因となり得る。本研究では有機硝酸エステル類について自動連続で長期間にわたり日本海に面した遠隔地(能登半島珠洲)で観測し、飛来する気塊の由来地別および季節別の濃度変動特性を明らかにした。観測結果から、それら物質群は窒素酸化物から派生する反応性総窒素酸化物中で凡そ15-35%程度を占めること、冬季から春先にかけて大陸からの越境輸送により珠洲では高濃度となること、太陽光強度に依存し大気の光化学反応に直接関わっていることを、明らかにした。平成23年度ではまず、熱分解-キャビティ減衰位相シフト分光法(TD-CAPS法)を用いたTONs自動連続測定システムの構築を行った。TONsの構成成分である有機過硝酸エステル類(PANs)や有機硝酸エステル類(ANs)は加熱することにより熱分解し、NO_2を放出する。この性質を利用して、TONsを熱分解してNO_2に変換し、その後キャビティ減衰位相シフト分光法NO_2モニターでNO_2濃度を測定することによりTONsの濃度を観測する。また、温度の異なったラインを設けることにより、PANsとANsを分けて定量するシステムを構築する。PANsとしてはPAN,PPNを、ANsとしては、硝酸メチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチルについて、熱分解効率およびその温度依存性について調べた。その結果、PANsについては150°C,ANsについては360°Cで定量的に熱分解し、NO_2に変換されることが明らかとなった。この結果より、常温、150°C、360°Cと温度の異なるライン(それぞれNO_2,PANs,ANsラインとする)を設けることにより、NO_2,PANs,ANsの濃度を個々に定量することが可能であると考えられる。一方、硝酸ガスについても熱分解効率を測定したところ、NO_2,PANsラインでは分解効率は0%であったが、ANsラインでは有意に熱分解し、NO_2を放出することも明らかとなった。この結果をふまえて、ANsラインの前段にNaClを塗布した環状デニューダーを用いた硝酸ガスを除去するシステムを構築した。なお、ANsラインについては使用しているうちに劣化し、分解効率が低下する傾向が見られた。(坂東・定永)石川県珠洲市において、O3,CO,反応性窒素酸化物(NOy)とNOyの構成成分である、NOx、無機全硝酸、有機過硝酸エステル類(PANs)および有機硝酸エステル(ANs)の連続観測を行った。珠洲に到達する気塊を後方流跡線解析により飛来経路別に区分し、由来別・月別にPANs・ANs濃度の季節変動を調べた。その結果、中国・韓国由来の気塊のときにPANs、ANs濃度が高い傾向を示す月とそうでない月が存在した。具体的には、冬季春季に中国・韓国由来の気塊の場合、濃度が高くなる傾向が見られた。このような違いが見られた原因は、PANs・ANs濃度を支配する要因が季節によって異なる、具体的には、中国・韓国由来の濃度が高い月のPANs・ANs濃度は長距離輸送によって支配され、その他の月の濃度は近傍での生成反応によって支配されると考えられる。このような濃度支配の要因が変わることは汚染物質の日内変動からも見ることができる。珠洲で観測されたPANs, ANsについては、中国・韓国由来の濃度が高い月は、PANs・ANsともに規則的な日内変動を示さなかった。一方、その他の月は、PANs・ANsともに夜間は濃度が低く日中は濃度が高いという規則的な日内変動を示した。(坂東・定永)遠隔地である珠洲市,都市部である大阪市および京都市において連続測定を実施した。それぞれの測定地点においてPAN, PPN, PiBN, PnBN, APAN, MPANを測定することができ,都市部では複数の未同定ピークを検出した。都市部におけるPANsの濃度変動パターンはポテンシャルオゾン濃度とよく一致し,光化学生成が主要な変動要因であることが示唆された。都市部における夜間のPANs濃度は珠洲における濃度レベルよりも有意に高く,夜間の生成機構の存在が示唆された。(板野)H23年度に有機過硝酸エステル類(PANs)と有機硝酸エステル類(ANs)の分離観測に最適な熱分解温度に関する基礎検討を終えたことを受け、常温、150、および360°Cの熱分解ラインをもち、交互に3ラインを切り替えることによりNO2、PANs、ANsを自動的に測り分ける熱分解ーキャビティ減衰位相シフト分光法(TD-CAPS法)システムをH24年夏までに完成させた。

本システムを石川県能登半島突端の珠洲市にある金沢大学能登学舎内大気観測・能登スーパーサイト(NOTOGRO)に設置し、11月よりPANs、ANsの連続観測を開始した。同サイトで既に観測を継続しているNO、NO2、総反応性窒素酸化物(NOy)、全硝酸(T.NO3)の観測データに加え、測定原理の異なるTD-CAPS法によるPANsとANsのデータを加えて、NOyとΣ(NO+NO2+PANs+ ANs+T.NO3)を比較すると、約100±5%の範囲内で値が一致することを確認できた。これにより、これまでmissing-NOy成分として詳細が未解明のままにされていた部分のほとんどがPANsとANsで説明できること、またこれら両成分の合算量がT.NO3量と同程度、対NOy比で20-40%程度、を占めることも確認できた。H25年3月には同連続観測と並行してガスクロマトグラフー化学イオン化質量分析(GC-/NICI-MS)によるPANs、ANsの個別成分分析用大気試料の試験採取と成分別分析を行い、TD-CAPSデータと整合的な予備分析結果を得ることができた。最終年度であるH25年度はTD-CAPS法によるPANsおよびANsの連続観測を継続するとともに、GC-/NICI-MS試料の捕集・分析を春夏秋冬の4季毎に実施しできることから、PANs、ANsの主要構成成分の季節変動も明らかにできる見通しがついた。TONsの連続測定システムのコアとなる熱分解流通反応管部についてハード的に完成するとともに、PANsとANsの測り分けのための分解温度について精度の高い基礎データを得たことにより、PANsとANsを測り分ける連続測定技術を概ね完成することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、大気中での寿命が長く、かつ、分解するとNO2を放出するためNOxの長距離輸送担体として働く有機(過)硝酸エステル類の全量(PANs+ANs)の連続観測を我が国の代表的な清浄地域の一つである沖縄本島辺戸岬において行ない、長距離輸送中でも生き残り、越境大気汚染の原因となっているPANs+ANsの実態を定量的に把握し、加えて、越境汚染の代表的な時期である春季(35月)にPANs+ANsの個別成分分析用の大気試料を捕集し、GC-/NICI-MSにより各物質別に定量するとともに、個々の熱安定性、OH反応性について文献、実験室実験を通して得ることにより、日本および西太平洋縁辺域での越境汚染物質による光化学オキシダント生成への寄与を定量的に明らかにすることを当初の交付申請段階で目的とした。沖縄県辺戸岬の観測サイトはインフラ等の問題から、そこでの観測に替わって、同じく大陸に面しかつローカルな汚染源の少ない能登半島珠洲においてPANs+ANsの連続観測を行なうことに計画変更した。当初の予定ではH23年度中に同連続観測を開始する計画であったが、約半年程度の遅れで、H24年11月より連続観測を開始することができた。連続観測データの解析からほぼ予想通りの結果、即ちmissing-NOyのほとんどが今回連続観測を開始できたPANs+ANsで説明できること、が確認できた。また、GC-/NICI-MSによるPANsおよびANsの個別成分分析に関する予備試験結果により、今後1年間で、各季節の代表的な期間を選び、46回の試料採取と分析を行うことで、個別成分の季節変動に関する情報を得る目途もついた。現在大気試料の半自動
蛋白質チロシンリン酸化と癌細胞の増殖応答

チロシンキナーゼ(PTK)は癌細胞の増殖制御に深く関与する機能分子である。代表者らはその制御機構を解明する目的で、独自に単離したDok-1(p62^<dok>)とそのファミリー分子の造血器腫瘍における機能と作用機序の解析を進めている。昨年度の本研究の結果から、我々はDok-1とDok-2がサイトカインによる増殖及び生存シグナルを負に調節することで、白血病の抑制に機能していることを提唱してきた。そこで、本年度は、Dok-1/2による癌抑制機能の場を特定する為、骨髄細胞の移植実験を行った。その結果、Dok-1/2二重欠損マウスの骨髄細胞を移植した場合にのみ白血病の発症が確認され、また、その二重欠損マウスの骨髄細胞は増殖因子無添加条件下でのin vitroコロニー形成能を持つ事も確認された。この結果は、Dok-1/2の癌抑制機能が血球内での機能にあることを示すものである(J. EXP. Med.,2004)。他方、Dokファミリー分子による癌抑制の分子機構に関しては、エフェクター分子の結合領域と予想されるチロシン残基の重要性をDok-1について網羅的に検討した。その結果、従前から重要とされていたrasGAPとの会合部位(Tyr-295、Tyr-361)に加えてTyr-336とTyr-340の重要性が明らかになった。興味深いことに、両チロシン残基をファニルアラニンに置換したDok-1変異体はrasGAPとの会合能を維持しつつも、Rasの抑制能を喪失していた。これは、Dok-1にrasGAP以外のエフェクター分子を示唆する重要な知見と言える(Genes Cells,2004)。この他にも、発癌やその防御との関わりが深い免疫シグナルに対するDok-1/2の抑制機能の発見や、線虫のRas-Erkシグナル系を正に制御する新規アダプター分子の同定など、癌細胞の増殖応答に係るシグナル系の解析が進められた。チロシンキナーゼ(PTK)は多細胞生物の細胞増殖制御に必須の分子であり、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)等の多様な白血病や腫瘍の発症に深く関与している。従前の研究によって、申請者らはPTK関連白血病及び腫瘍由来の細胞中で顕著にチロシンリン酸化される蛋白質Dokを同定し、それが細胞増殖とMAPキナーゼに抑制性のシグナル分子であることを発見している。そこで、PTKが素因とされる白血病や腫瘍を主な対象とし、チロシンリン酸化蛋白質の増殖応答制御における機能を解明する目的で、独自に単離したDokとそのファミリー分子について血液細胞の癌化における役割を検討した。その結果、Dok、Dok-2二重欠損マウスに認められる造血異常がCMLに類似の病態であることが明らかになった。さらに、その病態が顆粒球・単球系幹細胞の増加を伴うことを解明した。また、Dok、Dok-2二重欠損マウス由来の血液系細胞を用いた実験からDok、Dok-2二重欠損は顆粒球・単球系幹細胞の分化、増殖誘導に重要なサイトカイン刺激に対する増殖応答を亢進することも明らかにしている。一方、CMLにおけるDokファミリー分子の機能を知る目的で、bcr-ablトランスジーンを持つCMLモデルマウスにDok、Dok-2二重欠損を導入する実験を行い、両者がCMLの増悪化を抑制していることを明らかにした。以上の結果から、少なくともマウスの系においては、Dok、Dok-2分子が顆粒球、単球系細胞の癌抑制因子であり、また、bcr-ablによるCML様病態においてはその増悪化の抑制因子であることが判明した。現在、この癌抑制の分子機構について会合蛋白質の探索とその機能解析を中心に検討すると共に、ヒト癌におけるDokファミリー分子の癌抑制能の解析を進めている。また、本年度の研究によって見い出されたPTB領域を持つ新規アダプター分子の機能解析にも着手している。申請者らはPTK関連白血病及び腫瘍由来の細胞中で顕著にチロシンリン酸化される蛋白質Dokを同定し、それが細胞増殖とErkに抑制性のシグナル分子であることを発見した。本特定領域研究ではPTKが素因とされる白血病や腫瘍を対象とし、チロシンリン酸化蛋白質の増殖応答制御における機能を知る目的で、まずDokファミリー蛋白質の造血器腫瘍における役割を検討している。昨年度までに、Dok、Dok-2二重欠損マウスが顆粒球・単球系幹細胞の増加を伴うCML様の病態を呈し、その欠損がCMLモデルマウスに早期の致死性を誘導することを明らかにしていた。そこで、本年度においては骨髄系細胞の増殖と分化に重要なサイトカインに対する応答を細胞レベルで検討し、Dok、Dok-2二重欠損マウス由来の細胞に増殖応答の亢進とアポトーシスの低下を認めた。その際、細胞内のErk、Aktの活性化も亢進したことから、Dok、Dok-2はサイトカイン刺激時の増殖、生存シグナルの適切な抑制と骨髄系細胞の恒常性の維持に必須の分子であることが判明した。一方、CMLモデルマウスにDok、Dok-2欠損を導入した実験では、未熟T細胞リンパ腫や腸管リンパ腫が高頻度に発症したことから、両蛋白質がCML様病態の増悪化を抑制していることが判明した。

実際、CMLの急性転化例に由来する骨髄系細胞株の半数にDokもしくはDok-2の著減を認めている。他方、その発癌機構とチロシンリン酸化の関係を検討していたEBウイルス(EBV)に関しては、CD40L遺伝子に変異をもつXHIM(X-linked hyper IgM syndrome)患者由来のB細胞がEBVによって殆どトランスフォーメーションされないことを発見した。この予想外の知見を糸口に、EBV感染が宿主B細胞上にCD40Lを異所性に誘導し、さらに、そのCD40Lの機能がEBV感染によるB細胞のトランスフォーメーションに極めて重要であることを明らかにした。チロシンキナーゼ(PTK)は癌細胞の増殖制御に深く関与する機能分子である。代表者らはその制御機構を解明する目的で、独自に単離したDok-1(p62^<dok>)とそのファミリー分子の造血器腫瘍における機能と作用機序の解析を進めている。昨年度の本研究の結果から、我々はDok-1とDok-2がサイトカインによる増殖及び生存シグナルを負に調節することで、白血病の抑制に機能していることを提唱してきた。そこで、本年度は、Dok-1/2による癌抑制機能の場を特定する為、骨髄細胞の移植実験を行った。その結果、Dok-1/2二重欠損マウスの骨髄細胞を移植した場合にのみ白血病の発症が確認され、また、その二重欠損マウスの骨髄細胞は増殖因子無添加条件下でのin vitroコロニー形成能を持つ事も確認された。この結果は、Dok-1/2の癌抑制機能が血球内での機能にあることを示すものである(J. EXP. Med.,2004)。他方、Dokファミリー分子による癌抑制の分子機構に関しては、エフェクター分子の結合領域と予想されるチロシン残基の重要性をDok-1について網羅的に検討した。その結果、従前から重要とされていたrasGAPとの会合部位(Tyr-295、Tyr-361)に加えてTyr-336とTyr-340の重要性が明らかになった。興味深いことに、両チロシン残基をファニルアラニンに置換したDok-1変異体はrasGAPとの会合能を維持しつつも、Rasの抑制能を喪失していた。これは、Dok-1にrasGAP以外のエフェクター分子を示唆する重要な知見と言える(Genes Cells,2004)。この他にも、発癌やその防御との関わりが深い免疫シグナルに対するDok-1/2の抑制機能の発見や、線虫のRas-Erkシグナル系を正に制御する新規アダプター分子の同定など、癌細胞の増殖応答に係るシグナル系の解析が進められた。