hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎ウイルス増殖抑制に関連するIFNシステムの検討

C型肝炎ウイルスは現在慢性肝炎・肝硬変・肝臓癌の主要な病原因子であると考えられている。臨床ではその治療法として、主にインターフェロンが用いられている。インターフェロンにより誘導される遺伝子、PKR、MxAなどが知られており、ウイルス増幅を抑制する重要な役割があると考えられている。本研究では「PKR stable knock down(PKR SKD)細胞株」を作成した。Feoレプリコン(複製をルシフェラーゼ活性で測定できるサブゲノムレプリコン)を導入し、レプリコシのstable colony」を作成した。PKR stable knockdown細胞では、インターフェロンの抗レプリコン活性がcontrol細胞株に比し、有意に減弱していた。しかし、臨床的なヒトでの治療濃度でPKR stable knockdown細胞においてもレプリコンの増殖はほとんど抑制された。以上より、インターフェロンにより誘導されるPKRは、生理的にC型肝炎ウイルス増殖抑制において重要な役割を担うことが示唆されたが、インターフェロン治療には必須ではない可能性があると考えられた。また「MxA stable knock down(MxA SKD)細胞株」を作成した。インターフェロン添加後のCore抗原の分泌についても検討した。MxA stable knockdown細胞では、最大治療濃度でインターフェロンの抗C型肝炎ウイルス活性がcontrol細胞株に比し、有意に減弱していた。以上より、インターフェロン誘導遺伝子の一つであるMxAは、生理的なにC型肝炎ウイルス増殖抑制においてもインターフェロン治療においても重要な役割を担うことが示唆された。本研究では、代表的なインターフェロン誘導遺伝子であるPKR、MxAが抗C型肝炎ウイルス効果を有することを認めた。またMxAをknockdownすることにより、より効率的なC型肝炎ウイルス複製と、インターフェロンによる抗C型肝炎ウイルス効果の減弱を認めた。宿主自然免疫系は、C型肝炎ウイルス(HCV)を認識し、内因性インターフェロンを誘導する。インターフェロンにより誘導される遺伝子(Interferon stimulated genes:ISG)産物にはウイルス増殖を抑制する重要な役割がある。代表的なISGであるPKR,MxA,2'、5'-ASがHCV増殖に及ぼす効果は明らかでない。一方、C型肝炎ウイルス感染者の多くが慢性化することより、C型肝炎ウイルスが内因性インターフェロン産生系を効率的に阻止するエスケープ機構を有していると考えられる。C型肝炎ウイルス感染における内因性インターフェロン産生系としては、今までのところ「TLR3を介する経路」と、「RIG-Iを介する経路」の2つが知られており、いずれも最終的に、インターフェロン誘導に重要な役割を果たしているIRF3,IRF7を介する。しかし、この経路を構成する分子の抗C型肝炎ウイルス効果に対する重要性も明らかにはされていない。そこで、われわれは、HCV増殖に対するPKR,MxA,2'、5'-AS,およびTLR3経路とRIG-I経路を構成する分子の働きをHCVサブゲノムレプリコンおよび全長HCVゲノムJFH1を用いて検討している。PKRについての研究を論文化した上、発表するようにしている。OASについての研究も論文化した上、発表するようにしている。MxA,については論文化しながら、さらにMxAのHCV増殖抑制メカニズムを検討している。また、各分子の抗HCV効果の相互作用を検討するために、PKR,OAS,MxAを同時にknockdownするsiRNA発現ベクターを作成した。TLR3,RIG-Iについて、各分子をknockdownするsiRNA発現ベクターの作成した。また、Huh7細胞株でのTLR3,RIG-I発現を続けて検討していた。IRF-7をknockdownするsiRNA発現ベクターの作成ができなかったため、続けて検討していた。Huh7細胞株でのIRF-3を確認済み、発現IRF-3がknockdownされたHuh7細胞株を樹立し、確認するために各細胞株の蛋白質を回収した。
T細胞初期分化における細胞間相互作用に関する研究

本研究は,胸腺微小環境形成のメカニズムについてオランダロッテルダムエラスムス大学van Ewijkのグループと共同研究を行ったものである.具体的にはマウス胎仔胸腺(FT)をデオキシグアノシン(dGuo)で処理したもの(dGuo-FT)へ前駆細胞を1個だけ移入する実験法によって、微小環境の形成にはT前駆細胞の存在が不可欠であり,B前駆細胞やミエロイド前駆細胞ではその機能を代行できないことを明らかにした.第1および第2年度ではT前駆細胞として正常マウスのものを用いていたので,T系列細胞のどの分化段階のものが微小環境形成に作用しているのかわからなかった.第3年度に至って,T細胞抗原レセプター(TCR)遺伝子の再構成ができずCD44^-CD25^+の段階で分化が停止するRag2^<-/->マウスのFT前駆細胞を用いて同様の研究を行った.その結果,Rag2^<-/->FT前駆細胞でも正常前駆細胞と同じく微小環境を形成する機能を有していることが明らかとなった.すなわち,微小環境の形成には成熟T細胞は必要でないことが示された.FT細胞を上皮/ストローマ細胞とT系列細胞に分画して,いくつかの遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した.Notch1,Notch2,Jagged1,Jagged2は上皮およびT系列の両方に発現されていた.VCAM1,FGFは上皮側に発現されていた.これらの遺伝子の発現において,上皮/ストローマ細胞とT系列細胞との相互作用がどのようにかかわっているかという点について検討を始めている.本研究は,胸腺微小環境形成のメカニズムについてオランダロッテルダムエラスムス大学van Ewijkのグループと共同研究を行ったものである.具体的にはマウス胎仔胸腺(FT)をデオキシグアノシン(dGuo)で処理したもの(dGuo-FT)へ前駆細胞を1個だけ移入する実験法によって、微小環境の形成にはT前駆細胞の存在が不可欠であり,B前駆細胞やミエロイド前駆細胞ではその機能を代行できないことを明らかにした.第1および第2年度ではT前駆細胞として正常マウスのものを用いていたので,T系列細胞のどの分化段階のものが微小環境形成に作用しているのかわからなかった.第3年度に至って,T細胞抗原レセプター(TCR)遺伝子の再構成ができずCD44^-CD25^+の段階で分化が停止するRag2^<-/->マウスのFT前駆細胞を用いて同様の研究を行った.その結果,Rag2^<-/->FT前駆細胞でも正常前駆細胞と同じく微小環境を形成する機能を有していることが明らかとなった.すなわち,微小環境の形成には成熟T細胞は必要でないことが示された.FT細胞を上皮/ストローマ細胞とT系列細胞に分画して,いくつかの遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した.Notch1,Notch2,Jagged1,Jagged2は上皮およびT系列の両方に発現されていた.VCAM1,FGFは上皮側に発現されていた.これらの遺伝子の発現において,上皮/ストローマ細胞とT系列細胞との相互作用がどのようにかかわっているかという点について検討を始めている.T細胞を作り出す胸腺内の部位または装置は「胸腺微小環境」と呼ばれる.この構造は,主に胸腺上皮細胞によって構成されているが,単に上皮細胞だけで構築されるのではなく,T前駆細胞と上皮細胞の相互作用によって成立すると考えられている.この考えを実証するための基礎的研究を行った.T細胞分化の場として最も単純化した実験システムは,マウス胎仔胸腺(FT)をデオキシグアノシン(dGuo)で処理したもの(dGuo-FT)である.dGuo-FTを培養液中に沈めて胎仔肝臓中の前駆細胞(c-kit^+Sca-1^+)と共に培養する時,70%O_2環境(HOS培養)ではT細胞分化が起こるが,20%O_2環境(LOS培養)ではほとんど起こらない.組織学的検索によって,HOS培養の系では胸腺上皮の構造が正しく再構築されており,T細胞分化のための微小環境が形成されていることが明らかであった.一方,前駆細胞を加えずに単にHOS培養を行っても微小環境は形成されない.さらに,LOS培養では前駆細胞を加えても微小環境は形成されず,単に前駆細胞が存在しているだけでも不十分であることが明らかとなった.すなわち,前駆細胞の分化増殖と微小環境の成立は常時相互作用しながら進行するものと考えられた.今年度の研究は,前駆細胞として複数の細胞を用いたが,その中にはいろいろの種類の細胞が含まれている.今後は,それぞれ異なる種類の前駆細胞が微小環境の形成にどのようにかかわるかを解明する必要がある.胸腺微小環境は,主に胸腺上皮細胞によって構成されているが,単に上皮細胞だけで構築されるのではなく,T前駆細胞と上皮細胞の相互作用によって成立すると考えられている.しかし,純粋にT細胞だけを分化させる実験はわれわれのsingle cell assay系を用いる以外にない.この考えを実証するための基礎的研究を以下のように行った.T細胞分化の場として最も単純化した実験システムは,マウス胎仔胸腺(FT)をデオキシグアノシン(dGuo)で処理したもの(dGuo-FT)と胎仔肝臓中の前駆細胞(c-kit^+Sca-1^+)との共培養である.

70%O_2環境(HOS培養)では胸腺上皮の構造が正しく再構築されており,T細胞分化のための微小環境が形成されていることが明らかであった.そこで今年度は前駆細胞を濃縮した画分の細胞を1個づつdGuo-FTと共に培養する実験を行い,胸腺中でのT細胞,B細胞,ミエロイド細胞の生成が,それぞれ胸腺構造の構築にどのように作用するかを検討した.その結果,T前駆細胞と共培養した時にのみ正常な胸腺構造が形成されることが示された.胸腺内のT細胞分化を誘導する微小環境は,胸腺上皮細胞とT前駆細胞の相互作用によって形成されるものと考えられていたが,必ずしも正確なデータに基づいた結論ではなかった.本研究ではマウス胎仔胸腺(FT)をデオキシグアノシン(dGuo)で処理したもの(dGuo-FT)へ前駆細胞を1個だけ移入する実験法によって,微小環境の形成にはT前駆細胞の存在が不可欠であり,B前駆細胞やミエロイド前駆細胞ではその機能を代行できないことを明らかにした.昨年度まではT前駆細胞として正常マウスのものを用いていたので,T系列細胞のどの分化段階のものが微小環境形成に作用しているのかわからなかった.今年度は,T細胞抗原レセプター(TCR)遺伝子の再構成ができずCD44^-CD25^+の段階で分化が停止するRag2^<-/->マウスのFT前駆細胞を用いて同様の研究を行った.その結果,Rag2^<-/->FT前駆細胞でも正常前駆細胞と同じく微小環境を形成する機能を有していることが明らかとなった.すなわち,微小環境の形成には成熟T細胞は必要でないことが示された.FT細胞を上皮/ストローマ細胞とT系列細胞に分画して,いくつかの遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した.Notch1,Notch2,Jagged1,Jagged2は上皮およびT系列の両方に発現されていた,VCAM1,FGFは上皮側に発現されていた.これらの遺伝子の発現において,上皮/ストローマ細胞とT系列細胞との相互作用がどのようにかかわっているかという点について検討を始めている.
急性肺障害に対する遺伝子修飾骨髄由来間葉系幹細胞の全身投与による治療法の確立

慢性閉塞性肺疾患はタバコ煙等の有害物質を長期間吸入暴露することで生じる肺の慢性炎症性疾患で、進行性の不可逆的閉塞性換気障害で定義される。RAGEは、糖尿病性血管傷害における最終糖化産物の細胞膜受容体として発見され、炎症を惹起・増幅する。今回、ヒト肺組織におけるRAGE蛋白の発現解析により、COPDの発症と進展における関与の解明を目指し、I型肺胞上皮細胞、細気管支粘膜上皮細胞、肺胞マクロファージにおける発現を半定量解析しI型肺胞上皮細胞、細気管支粘膜上皮細胞、肺胞マクロファージにおいてRAGEの発現が亢進していることが判明した。また、一秒率とは負の相関を示し、喫煙指数との関連は認めなかった。研究目的は骨髄由来間葉系組織幹細胞(BM-MSC)の傷害血管修復機能と血管内皮に高発現する細胞膜水分子チャネルaquaporin (AQP)1と高度糖化最終産物に対する受容体receptor foradvanced glycation end products (RAGE)の可溶性亜型sRAGEの2つの血管保護的な多機能分子に着目し、AQP1ならびにsRAGE遺伝子発現修飾BM-MSCの全身投与による急性肺傷害に対する新規治療法の確立とその機序の分子レベルでの検証を目指すことにある。そのため、対象となるsRAGEの研究の前段階として、受容体であるRAGEの発現に関し、ヒト肺による手術検体75症例を用いてその発現を調査した。即ち、正常肺・気腫化肺・喫煙肺・非喫煙肺に関し、I型肺胞上皮細胞・肺胞マクロファージ・細気管支粘膜上皮細胞についてRAGEの発現をImage Jソフトウェアを用いて半定量解析した。その結果、気腫化肺のI型肺胞上皮細胞および肺胞マクロファージについて、RAGEの発現が統計学的に有意に上昇しており、一秒率とI型肺胞上皮細胞および肺胞マクロファージの発現について、負の相関が認められた。細気管支粘膜上皮細胞については疾患の有無にかかわらず差が認められなかった。また、喫煙に関しては、喫煙指数に関わらず、全ての細胞群において喫煙群と非喫煙群の間に有意差を認めなかった。本研究は、多臓器不全の主な死因となる急性肺傷害に対し、骨髄由来間葉系組織幹細胞(BM-MSC)の傷害血管修復機能と血管内皮に高発現する細胞膜水分子チャネルaquaporin (AQP)1と高度糖化最終産物に対する受容体receptor for advanced glycation end products (RAGE)の可溶性亜型sRAGEの2つの血管保護的な多機能分子に着目し、AQP1ならびにsRAGE遺伝子発現修飾BM-MSCの全身投与による急性肺傷害に対する新規治療法の確立とその機序の分子レベルでの検証を目指すことが目的である。BM-MSCのみならず肺血管保護・修復促進に関わるキー遺伝子であるAQP1とsRAGE遺伝子発現修飾を加え治療効率の向上を目指すことが独創点である。その前段階として、一昨年は、ヒト肺において正常肺および気腫性肺におけるRAGE発現に関する研究を行い、ImageJを用いて半定量解析を行い、気腫性肺におけるI型肺胞上皮細胞および肺胞マクロファージにおいて発現が亢進しているが、細気管支上皮細胞においては発現は変わらないことを突き止めた。また、喫煙歴に関して同様にヒト正常肺と気腫性肺においてRAGE発現の解析を行ったが、喫煙歴とRAGE発現は無関係であることが証明された。本年は、RAGEのリガンドの一つである、AGEsについて一昨年同様ヒト肺において気腫性肺におけるAGEs発現に関する研究を行った。AGEsに関してはRAGEと異なる結果となり、正常肺と気腫性肺において、AGEsに差はなく、喫煙歴で解析を行ったが同様に差がない結果となった。本研究は、多臓器不全の主な死因となる急性肺障害に対し、骨髄由来間葉系組織幹細胞(BM-MSC)の血管障害修復機能と血管内皮の高発現する細胞膜水分子チャネルaquaporin (AQP)1と高度糖化最終産物に対する受容体receptor for advanced glycation end products (RAGE)の可溶性亜型sTAGEの2つの血管保護的な多機能分子に着目し、AQP1並びにsRAGE遺伝子発現修飾を加え治療効率の向上を目指すことが独創点である。これまでに、その前段階としてヒト肺において正常肺および気腫性肺におけるRAGE発現に関する研究を行い、Image Jを用いてRAGEの半定量解析を行いった。RAGEは正常肺においてI型肺胞上皮細胞・肺胞マクロファージ・細気管支上皮細胞において高発現するため、これらに対するRAGE発現の研究を行った。気腫性肺におけるI型肺胞上皮細胞および肺胞マクロファージについて発現が亢進し、細気管支上皮細胞において発現は変わらないことを突き止めた。また、喫煙歴においては正常肺と気腫性肺の間でRAGE発現に差がないことを証明した。BM-MSC細胞の分離・培養をウサギモデルで試みたが、目的とする細胞の十分な分離・培養ができなかった。BM-MSC細胞を購入し、遺伝子導入を図ったがこれも困難であった。そのため、RAGEおよびそのリガンドの正常肺および気腫性肺の発現を確認することとした。RAGEのリガンドであるAGEsおよびHMGB-1に対して正常肺と気腫性肺における発現の研究を行った。これら、RAGEリガンドに関しては、RAGEと異なり、正常肺と気腫性肺において発現に差がないことを証明した。喫煙歴に関しても、これらの発現に差がないことを示した。

RAGEは、糖尿病性血管傷害における最終糖化産物の細胞膜受容体として発見され、炎症を惹起・増幅する。今回、ヒト肺組織におけるRAGE蛋白の発現解析により、COPDの発症と進展における関与の解明を目指し、I型肺胞上皮細胞、細気管支粘膜上皮細胞、肺胞マクロファージにおける発現を半定量解析しI型肺胞上皮細胞、細気管支粘膜上皮細胞、肺胞マクロファージにおいてRAGEの発現が亢進していることが判明した。また、一秒率とは負の相関を示し、喫煙指数との関連は認めなかった。本来の目的であるBM-MSC細胞の分離・培養をウサギモデルで試みたが、目的とする細胞の十分な分離・培養ができておらず、したがって次のステップであるGFP遺伝子の導入およびAQP1遺伝子の導入に進めていない。呼吸器外科学今後に関しては、ウサギやラットの実モデルによるBM-MSC細胞の分離・培養が困難であるため、外部から購入し、これにGFP遺伝子の導入およびAQP1遺伝子の導入およびそれらの肺障害モデルに対する投与実験を試みる予定である。手術検体を用いたヒト肺におけるRAGE発現確認できたが、それにかなりの時間と労力を要してしまった。そのため、ALI/ARDSモデルマウスによるAQP1遺伝子導入治療効果の非導入群との比較検討をする予定であったが、まだその実験モデルの確立に至っておらず、比較検討できていない状況である。したがって、それ以降の実験段階に進めないのが現状となっている。実験モデルが確立し次第、まず当初の計画を進めることとする。
無細胞系を用いた色素性乾皮症C群蛋白質複合体(XPC-hHR23B)の機能解析

高発癌性遺伝病である色素性乾皮症(XP)は、AからGおよびバリアント(V)の8つの遺伝的相補性群に分類される。XP-AからG群では、ヌクレオチド除去修復機構が欠損しており、DNA損傷の修復が行なわれない。我々が単離したXPC-hHR23B複合体は、DNA損傷の認識に関与する。本研究により、XPC-hHR23B複合体は、主要な紫外線損傷のひとつである(6-4)光産物を認識して結合するが、最も主要な紫外線損傷であるシクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)に対する選択的な結合は観察されないこと、また、これらの損傷の修復効率はXPC複合体の結合しやすさと良い相関が見られることを示した。さらに、XPC複合体の損傷DNA結合により、XPBとXPDを含むTFIIHが損傷DNA上に導入されることを明らかにした。一方、XP-V群は、ヌクレオチド除去修復機構は正常であり、その欠損機構は明らかでなかった。XP患者における発がんの機構を総合的に理解するためには、XP-V群の欠損機構を明らかにし、XPV責任遺伝子を同定することが必須である。本研究では、試験管内DNA複製系を用いて、XP-V群の細胞抽出液では、CPDを含む鋳型DNAの複製反応に欠損があることを明らかにした。さらに、その欠損を相補する蛋白質を精製し、これがCPDを乗り越えてDNA合成を行なえる新規のDNAポリメラーゼηであることを明らかにした。
昆虫やヒトの自然免疫系の網羅的理解につながる簡易実験の開発

高等学校の基礎生物の免疫分野において、食作用だけでなく免疫を網羅的に理解してもらうために、昆虫の血リンパを使って、液性免疫反応であるメラニン化や細胞性免疫反応である包囲化作用やノジュール形成の観察と液性免疫と細胞性免疫が協調して働くことを理解することのできる簡易実験の開発を行った。教材としての適性を高等学校や大学、科学館や博物館などでアンケートを用いて検証したところ、材料の扱い易さ、実験のし易さ、内容の理解という点で多くの人が良好と答えた。平成27年度の目的に従い以下の13の実績を得た。1、食作用を観察する際の血球の凝集を阻害する方法の検討昆虫の血球の食作用の観察方法にはin vivo法とin vitro法があるが(澤と中松,2014)、いずれの方法を用いても血球が凝集し、食作用をしている個々の血球が観察し難くくなる。そこで身の回りにある凝集阻害剤を検討したところ、寄生蜂の毒液やパイナップルが高い凝集阻害効果を示した。2、異物としてのアクリル絵の具を用いることの検討これまで昆虫の血球の食作用を観察するのに、異物として墨汁を用いてきた。今年度はより短時間で見つけやすい異物およびその他のノジュール形成や包囲作用も観察できる異物の検討をおこなった。その結果、アクリル絵の具は色によって顔料の大きさに違いがあり、粒子の小さな青系統は食作用に適しており、粒子の大きい赤系統はノジュール形成や包囲化作用に適していることがわかった。3、異物のメラニン化のしくみとノジュール形成および包囲化作用との関係について(1)メラニン化に関わるHSCの働きについて異物のメラニン化にはHyperspread cell(HSC)という血球が関わっている(Kato, et al. 2014)。今回は数の少ないHSCが多量の異物にどのように対応しているか、また、メラニン化に関わる5種類のタンパク質のmRNA発現に関して検討を行い以下の結果を得た。HSCは分裂をせず、移動することによって対応する。メラニン化に関わるタンパク質のmRNAの発現はLPS2≧PPO1≧SPH>PPO2≧PPAEの順番ある。(2)寄生蜂が寄生するとなぜ異物はメラニン化しないかの検討アワヨトウ体腔中の異物は寄生蜂の毒液があるとメラニン化しない。これはハチの毒液に含まれるLV8というアワヨトウのレクチンに類似するタンパク質によって、阻害されることを明らかにした。平成27年度の研究計画は液性免疫であるメラニン化、細胞性免疫である包囲化作用とノジュール形成のin vitro実験法における簡易実験の開発を主眼に置き、実験方法、供試昆虫、異物の検討をおこない、以下の1および2の実績を得た。1食作用異物については墨汁もしくはアクリル絵の具(青系統)を用いる。培地については生理食塩水もしくはPBSを用いる。体液量と反応時間については、体液量は昆虫の腹脚から針もしくははさみを使って1滴滴下し、反応時間は15分待つ。供試昆虫についてはチョウ目昆虫の幼虫が体液量が多いので扱い易いが、他の昆虫でも代替可能。2ノジュール形成異物については墨汁もしくはアクリル絵の具(赤系統)を用いる。培地、体液量、反応時間については食作用と同様におこなう。しかし、供試昆虫についてはやはりチョウ目昆虫が優れているが、コオロギやハスモンヨトウのようにノジュール形成を起こしやすい種類と、アワヨトウやカイコのようにそうでない種類が存在する。血球の凝集が遅い昆虫については反応時間が15分くらい、早い昆虫については体液滴下後すぐに観察すればよい。しかし、包囲化作用については、in vivo法を使えば容易に観察できるが、in vitro法を使うと異物を包囲する血球の数が少なく完全な包囲化までは至らない。今後はあらかじめメラニン化された異物を使うか、スライドガラスに滴下する体液量を増やすなどの検討をおこない、in vitro法における血球の包囲化作用観察の教材化をおこなう予定である。平成28年度の目的に従い以下の13の実績を得た。1免疫の初期段階で働くアワヨトウのレクチンについての解析:アワヨトウの異物認識には、タバコスズメガのImmulectin-2と相同性の高いLPS2というC型レクチンが関与していることが明らかになり、分子生物学的手法を使ってその塩基配列を決定し、抗体を作成してその発現するタイミングや発現箇所を特定した。また、このレクチンは、包囲化作用よりも食作用やノジュール形成において遺伝子発現が早いことが明らかになった。このことは異物に対する包囲化作用よりも食作用やノジュール形成の方が早く対応することを裏付ける結果となった。2フェノール酸化酵素の働きを実感する酵素の簡易実験:スライドグラス上にアワヨトウの体液を滴下したものを2つ用意し、片方にはフェノール酸化酵素阻害剤であるフェニールチオ尿素(終濃度8%くらい)、もう片方にはPBS(pH7.4)を入れることにより、体液の黒化度を目視で比較すれば、フェノール酸化酵素の働きを容易に実感できる簡易実験になることがわかった。3in vitro法における血球の包囲化作用観察の教材化:エッペンチューブにアワヨトウ6齢の体液を入れて、終濃度8%になるようにフェニールチオ尿素を入れる。そこにセファデックスビーズG15を入れて一定時間振盪した。その後沈殿をスライドガラス上に移し顕微鏡で観察すると、約1時間で血球の包囲化作用が観察された。

平成27年度に引き続き28年度の研究計画は液性免疫であるメラニン化に続く細胞性免疫である包囲化作用のin vitro実験法における簡易実験の開発を主眼に置き、実験方法、供試昆虫、異物の検討をおこなった。27年度にすでに食作用やノジュール形成に関する簡易実験の開発は終わっているので、自然免疫を実感できる簡易実験の開発については包囲化作用に限定して行い開発することができた。また、アワヨトウの細胞性免疫に関わるLPS2というレクチンの同定やLPS2の遺伝子発現についても経時的に調べることができた。その他メラニン化に関わると考えられているタンパク質であるPPO1、SPH、PPO2、PPAEの遺伝子の経時的発現も考慮すると、メラニン化やその下流域で起こる血球の凝集による包囲化作用形成のメカニズムの一部を解明したことになり、これらの酵素タンパク質を用いる簡易教材開発も視野に入れることができた。1伊勢市内小学校への出前講座において、昆虫の免疫について開発した教材をもとに以下のように容易かつ身近に感じることのできる教材を開発した。小学校3年生理科の「昆虫を育てよう」という単元で、通常はモンシロチョウの成長・発育を取り上げるが、モンシロチョウを野外から採集してくると、寄生蜂が寄生していることが多い。今回はなぜアオムシコマユバチはモンシロチョウ体内で生活できるのかを問題点として取り上げ、昆虫の血球と免疫の話について小学生でも理解が得られるように配慮し授業を行った。アンケート調査の結果小学校児童でも理解できる教材として取り扱える可能性が示唆された。2三重県立総合博物館での昆虫実験ラボ2017において、アワヨトウの血球の観察や食作用の実験を行った。アンケート結果から最初は昆虫の免疫について知らなかったことが多いと回答があったが、実験後にはほとんどの参加者が昆虫の免疫のしくみを理解することが出来たという結果を得た。実験器具の扱いや方法についても良く理解し、実験を進めることができたという回答が多かった。また、名古屋市科学館で行われたサイエンスラボにおいても同様の実験を行い、アンケート調査の結果もほぼ同様の満足を得る結果となった。このことにより昆虫の免疫の実験は、自然科学に対して興味を持つ博物館や科学館などの来館者には有効な実験教材であることが示された。3皇學館大学の理科実験実習という科目において、アワヨトウの血球の観察と墨粒に対する血球の食作用の観察を開発した実験手順に従い行った。in vivoとin vitroの両方の実験を行い、実験や観察のしやすさについてアンケート調査を実施したところ、血球の顕微鏡像はin vivo実験、実験手法についてはin vitro実験の方がそれぞれ実験し易いという結果になったが、それ以外は上記同様かなり高い満足感を得る評価となった。高等学校の基礎生物の免疫分野において、食作用だけでなく免疫を網羅的に理解してもらうために、昆虫の血リンパを使って、液性免疫反応であるメラニン化や細胞性免疫反応である包囲化作用やノジュール形成の観察と液性免疫と細胞性免疫が協調して働くことを理解することのできる簡易実験の開発を行った。教材としての適性を高等学校や大学、科学館や博物館などでアンケートを用いて検証したところ、材料の扱い易さ、実験のし易さ、内容の理解という点で多くの人が良好と答えた。
化学剤、違法薬物の大気圧化学イオン化分析に基づく現場検知技術の高度化

違法薬物として、メタンフェタミン(MA)、アンフェタミン、MDA、MDMA、コカイン、o-メトキシ(MeO)-MA、m-MeO-MA、p-MeO-MA、o-ブロモ(Br)-MA、m-Br-MA、p-Br-MA、トリアゾラム、JWH-018、α-PVPを用い、スワブに塗布して急速加熱し、3種類の装置であるSmiths Detection製MMTDイオンモビリティースペクトロメトリー(IMS)装置(63Niイオン化)、IonScan 550T(63Niイオン化、ドーパントあり)、IonScan 600(コロナ放電(CD)イオン化、ドーパントあり)に導入してスペクトルを測定した。MMTDおよびIonScan 500DTでは、すべての薬物からモノマー由来と思慮される正イオンが主要ピークとして認められ、reduced ion mobility(K0)値は若干MMTDの場合が低かった。一方、IonScan 600においては、薬物種に応じて、モノマー、ダイマー、トリマー、分解物由来と思慮される正イオンが観察された。芳香環位置異性体間では、概ねo、m、pの順番で移動度が大きかった。理研計器(株)試作のドリフト式IMS装置にCD素子またはシャープ(株)製の大気中電子放出素子(AEE)を装着し、青酸ガス、塩化シアン、ホスゲン、塩素、マスタードガス(HD)、ルイサイト1(L1)について生成する負イオンを測定した。反応物イオンピーク(RIP)としてCDではK0値:2.142.52の複数のピークが認められ、NO2ー、NO3ー、HNO3・NO3ーと確認された。一方、AEEではK0値:2.18の単一ピークが認められ、O2ーと確認された。CDでは、ホスゲン、HD、L1を除いて化学剤由来のピークはRIPと重なったが、AEEでは、化学剤由来のピークはRIPとよく分離された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。違法薬物として、メタンフェタミン、アンフェタミン、MDA、MDMA、コカイン、o、m、p-メトキシメタンフェタミン、o、m、p-ブロモメタンフェタミン、トリアゾラム、JWH-018、α-PVPを、化学剤として、ソマン、タブン、シクロヘキシルサリン、VX、RVX、マスタードガス(HD)、ルイサイト1(L1)、窒素マスタード(HN)1、2、3、シアン化水素(AC)、塩化シアン、ホスゲン、塩素(CL)、クロルピクリンを用いた。化学剤蒸気を直接、薬物をスワブに塗布して急速加熱して、日立製作所製逆流型大気圧化学イオン化イオントラップ質量分析計(コロナ放電イオン化)に導入して質量スペクトルを測定した。また、化学剤蒸気を直接、薬物とVXおよびRVXをスワブに塗布して急速加熱して、Smiths Detection製MMTDイオンスペクトロメトリー(IMS)装置(63Niイオン化)に導入してイオンモビリティースペクトルを測定した。質量分析では、薬物8種のうち、プロトン付加イオンがベースピークまたは高強度イオンとして観察された。化学剤17種のうち、プロトン付加イオンがベースピークまたはマイナーイオンとして観察された。ACからは負の分子イオンが、L1からは負のフラグメントイオンと分子イオン化が、その他からはフラグメントイオンが観察された。IMS分析では、違法薬物から分子関連と示唆される正イオンが主要イオンとして観察された。神経ガスのG剤からはダイマーと思慮される正イオンが、VX、RVX、NH類からは分子関連と思慮される正イオンが観察された。HD、L1、血液剤、CLからは、分子関連と思慮される負イオンが、その他からは塩素イオンが観察された。Reduced ionmobility値の逆数と分子量の間に概ね正の相関が認められたが、一部ばらつきが顕著であり、位置異性体間でも差が認められた。実験計画予定のIMS装置のIonScan 550T、IonScan 600の導入が遅れており、測定ができていない。IMSに接続するTOF-MS装置が故障に付き、現在修理中である。IMS装置のGA2100、質量分析装置のIMPACT HDに関しては現在順次測定中である。対象化合物が多岐に渡っているために、今年度は逆流型大気圧化学イオン化イオントラップ質量分析計およびIMS装置MMDTの測定に集中した。化学剤として、エチルサリン、サリン、n-プロピルサリン(新たに製造)、i-ブチルサリン、ソマン、タブン、シクロヘキシルサリン、VX、RVX、マスタードガス(HD)、ルイサイト1(L1)、窒素マスタード(HN)1、2、3、シアン化水素(AC)、塩化シアン、ホスゲン、塩素(CL)、クロルピクリンを用い、化学剤蒸気を直接、または専用のスワブに塗布して急速加熱して、3種類の装置であるSmiths Detection製MMTDイオンモビリティースペクトロメトリー(IMS)装置(63Niイオン化、ドーパントなし)、IonScan 550T(63Niイオン化、ドーパントあり)、IonScan 600(コロナ放電イオン化、ドーパントあり)に導入して、イオンモビリティースペクトルを測定した。装置に応じて、化学剤のダイマー、モノマーのドーパントアダクト、モノマー、分解物と思慮される正イオンが観察された。

理研計器(株)試作のIMS装置(コロナ放電イオン化、ドーパントなし)に関して、神経ガスからは濃度に応じて分解物、モノマー、ダイマー由来の正イオンが観察され、びらん剤からは分解物、モノマー由来の負イオンまたはモノマー由来の正イオンが観察された。ガス性化学剤からは、複数の反応物イオンピーク(RIP)群に近接する位置に特有の負イオンが観察されたが、各々の識別は難しかった。一方、理研計器(株)試作のIMS装置にコロナ放電イオン化に代わり、シャープ(株)(平成29年度より共同研究開始)製の大気中電子放出素子(原理:トンネル電子)を装着しIMS測定をしたところ、RIPとしてKo値-2.23に1本のピークを与え、ガス性化学剤、HD、L1、HNからはRIPとは明確に異なる位置に負イオンピークが観察された。研究代表者の瀬戸康雄は、平成29年3月末より平成30年3月31日まで科学警察研究所の副所長の任についたことにより、所長を補佐した研究所業務全般の指示、兼務の法科学研修所長としての研修運営全般の指示など、行政的な業務が多忙となった。よって、研究へのエフォートが低下し、計画していた研究の遂行に大きな遅れを来した。違法薬物として、メタンフェタミン(MA)、アンフェタミン、MDA、MDMA、コカイン、o-メトキシ(MeO)-MA、m-MeO-MA、p-MeO-MA、o-ブロモ(Br)-MA、m-Br-MA、p-Br-MA、トリアゾラム、JWH-018、α-PVPを用い、スワブに塗布して急速加熱し、3種類の装置であるSmiths Detection製MMTDイオンモビリティースペクトロメトリー(IMS)装置(63Niイオン化)、IonScan 550T(63Niイオン化、ドーパントあり)、IonScan 600(コロナ放電(CD)イオン化、ドーパントあり)に導入してスペクトルを測定した。MMTDおよびIonScan 500DTでは、すべての薬物からモノマー由来と思慮される正イオンが主要ピークとして認められ、reduced ion mobility(K0)値は若干MMTDの場合が低かった。一方、IonScan 600においては、薬物種に応じて、モノマー、ダイマー、トリマー、分解物由来と思慮される正イオンが観察された。芳香環位置異性体間では、概ねo、m、pの順番で移動度が大きかった。理研計器(株)試作のドリフト式IMS装置にCD素子またはシャープ(株)製の大気中電子放出素子(AEE)を装着し、青酸ガス、塩化シアン、ホスゲン、塩素、マスタードガス(HD)、ルイサイト1(L1)について生成する負イオンを測定した。反応物イオンピーク(RIP)としてCDではK0値:2.142.52の複数のピークが認められ、NO2ー、NO3ー、HNO3・NO3ーと確認された。一方、AEEではK0値:2.18の単一ピークが認められ、O2ーと確認された。CDでは、ホスゲン、HD、L1を除いて化学剤由来のピークはRIPと重なったが、AEEでは、化学剤由来のピークはRIPとよく分離された。逆流型大気圧化学イオン化イオントラップ質量分析に関しては、違法薬物の一部を測定して、データをまとめる。IMS装置MMDTに関しては、化学剤のうち催涙剤やくしゃみ剤の分析を行う。IMS装置のIonScan 550T、IonScan 600を導入して、薬物、化学剤全般を測定する。IMS装置のGA2100、質量分析装置のIMPACT HDの測定を継続して、データをまとめる。
希土類添加アルミニウム系ペロブスカイト型酸化物の発光解析と応用

最終年度の平成27年度では、III-III系ペロブスカイト型酸化物母体のエネルギーバンドに対する希土類イオンのエネルギーレベル図をまとめること、及び希土類イオン添加III-III系ペロブスカイト型酸化物蛍光体薄膜を用いた紫外エレクトロルミネッセンス(UV-EL)デバイスの試作とUV-ELの発現の検証が目標であった。前者のエネルギーレベル図については、X線光電子分光法(XPS)を活用した希土類イオンのエネルギーの解析方法に関する論文と、その手法をYAlO3に適用して作成したエネルギーレベル図に関する論文にまとめ、いずれも国際学術雑誌上で公開された。本研究により、XPSによる希土類イオンのエネルギーの効率的な解析方法が実証され、また代表的な材料における希土類イオンのエネルギーレベルが明らかとなり、今後の新規蛍光体の開発や発光解析を進めるうえで有用な成果を得た。後者のUV-ELデバイスについては、Gd3+添加YAlO3薄膜を用いた薄膜型UV-ELデバイスを作製し、そのUV-ELの発現を調査した。デバイスは工業的に汎用なスパッタリング法により薄膜を積層させて作製した。デバイスに交流電圧を印加したところ、電界の集中のために発光は不均一であったが、Gd3+由来のUV-ELを観測した。本研究により、世界で初めてペロブスカイト型酸化物を用いた薄膜型デバイスからのUV-ELの発現を実証し、その成果は学会において報告した。現在、課題である均一な面発光の実現のための方策も決まり、研究は次の段階へ進みつつある。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、基礎研究として、III-III系(Al系)ベロブスカイト型酸化物のバンドギャップに対する希土類イオンのエネルギーレベルを明らかにすることを目的とする。平成25年度においては、III-III系ペロブスカイト型酸化物のYAIOを母体材料としてGd, Euなど一連の希土類イオンを添加した解析用サンプルを作製すること、および作製したサンプルに対して基礎的な光学測定や解析を行った。解析用YAlO_3粉末サンプルを固相反応法により作製した。得られたサンフルに対して蛍光/励起スペクトルや光吸収スペクトルを測定した。特に、Gd-Pr共添加YAlO_3は、Gdからの強い紫外発光を示すことが分かった。Eu添加YAlO_3の励起スペクトルには、CTSに帰属されるピークが観察された。CTSのエネルギー位置は、価電子帯上端とEu^<2+>基底状態間のエネルギー差を示し、酸化物母体中の希土類イオンのエネルギーレベルの決定にあたり基準となる重要な情報である。平成25年度の研究により、YAlO_3,中の希士類イオンの代表的なエネルギーレベルに関する基礎的な情報が得ることが出来た。本研究の応用研究は、基礎研究で得られた知見をもとに、デバイス化に有望なIII-III系(Al系)ペロブスカイト型酸化物蛍光体を探索・選択し、その蛍光体薄膜を用いた無機ELデバイスを試作することである。基礎研究においてGd-Pr共添加YAlO_3がGdからの強い紫外発光を示したため、Gd発光中心のYAlO_(3)を選択し、ELデバイス化の予備実験として薄膜の作製を試みた。所属研究室においてスパッタリング法よる製膜を行い、産業技術総合研究所においてPLD法での製膜を行っている。作製した薄膜サンプルの結晶相や発光を調査しており、デバイスの実現に向けて検討が進められている。本研究では、基礎研究として、III-III系(Al系)ペロブスカイト型酸化物母体材料の価電子帯や伝導帯に対する希土類イオンのエネルギーレベルを明らかにすることを目的としている。平成26年度は、希土類添加III-III系ペロブスカイト型酸化物YAlO3等のバンドギャップや希土類イオンのエネルギーレベルを解析した。解析用サンプルは、錯体重合法によって作製し、XRDによりほとんど目的物質の単一相であることを確認した。バンドギャップは、光吸収・励起スペクトルの測定値や文献値を参考にして求めた。母体の価電子帯上端の位置や希土類イオンの4f基底状態のエネルギーはX線光電子スペクトルの測定値を基に決定した。得られた情報から、母体の価電子帯上端の位置を基準とした希土類添加III-III系ペロブスカイト型酸化物の希土類イオンのエネルギーレベル図を作成した。本基礎研究により、希土類イオンのエネルギーレベルが代表的な酸化物を用いて系統的に明らかとなった。発光の解析や新規蛍光体の物質探索等に有用なデータを得ることができた。本研究の応用研究として、基礎研究の知見を基に、デバイス化に有望なIII-III系ペロブスカイト型酸化物蛍光体を探索・選択し、その蛍光体薄膜を用いた無機発光デバイスを試作することにしている。平成26年度は、Gd3+の強い発光が期待できるGd添加YAlO3とGd-Pr共添加YAlO3について薄膜を作製した。スパッタリング法やパルスレーザー堆積法による製膜を行い、高品質な薄膜が作製できた。フォトルミネッセンスの測定では、Gd添加、Gd-Pr共添加薄膜のいずれもGdの発光を示した。カソードルミネッセンス(CL)の測定においても、両薄膜はともにGd3+からの発光を示し、Gd添加薄膜がGd-Pr共添加薄膜より強いCLを示すことが分かった。今後、薄膜型発光デバイスの試作を進める予定である。

最終年度の平成27年度では、III-III系ペロブスカイト型酸化物母体のエネルギーバンドに対する希土類イオンのエネルギーレベル図をまとめること、及び希土類イオン添加III-III系ペロブスカイト型酸化物蛍光体薄膜を用いた紫外エレクトロルミネッセンス(UV-EL)デバイスの試作とUV-ELの発現の検証が目標であった。前者のエネルギーレベル図については、X線光電子分光法(XPS)を活用した希土類イオンのエネルギーの解析方法に関する論文と、その手法をYAlO3に適用して作成したエネルギーレベル図に関する論文にまとめ、いずれも国際学術雑誌上で公開された。本研究により、XPSによる希土類イオンのエネルギーの効率的な解析方法が実証され、また代表的な材料における希土類イオンのエネルギーレベルが明らかとなり、今後の新規蛍光体の開発や発光解析を進めるうえで有用な成果を得た。後者のUV-ELデバイスについては、Gd3+添加YAlO3薄膜を用いた薄膜型UV-ELデバイスを作製し、そのUV-ELの発現を調査した。デバイスは工業的に汎用なスパッタリング法により薄膜を積層させて作製した。デバイスに交流電圧を印加したところ、電界の集中のために発光は不均一であったが、Gd3+由来のUV-ELを観測した。本研究により、世界で初めてペロブスカイト型酸化物を用いた薄膜型デバイスからのUV-ELの発現を実証し、その成果は学会において報告した。現在、課題である均一な面発光の実現のための方策も決まり、研究は次の段階へ進みつつある。本研究の基礎研究について、III-III系ペロブスカイト型酸化物母体材料中の希土類イオンのエネルギーレベルの解析を行い、エネルギー図を作成することが出来た。また、応用研究についても、結晶性の高い高品質な薄膜の作製に成功し、基礎的な発光評価をすることが出来たため。27年度が最終年度であるため、記入しない。基礎研究については、追加調査として、希土類を添加した蛍光体サンプルの真空紫外領域の励起スペクトルをエネルギー図を用いて解析し、エネルギーレベルに関するより詳細な知見を得る。応用研究については、作製に成功した希土類添加蛍光体薄膜を用いたカソードルミネッセンス(CL)やエレクトロルミネッセンス(EL)の評価を進める。CLやELのデバイスへの応用を検討し、発光を示したデバイスに関して基礎的な発光の評価を行う。YAlO_(3)に関して、希上類イオンの基礎的なエネルギーレベルに関する情報を得ることが出来た。また、応用研究にも着手し、薄膜を得ることが出来たため。基礎研究に関しては、より正確なエネルギーレベルを求めるために、固相反応法と比較して欠陥が少なく、組成均一性や結晶性の高い液相法で解析川サンプルを作製し、その測定を進めながら解析する。応用研究に関しては、薄膜のCL、測定など、デバイス化に向けた測定を実施していく。
複合変異マウスを用いたがん化・転移シグナルの研究

Rbヘテロ型マウスは、甲状腺C細胞において、正常アレルの欠損により、腺腫を生じる。このマウスでN-ras遺伝子を追加欠損すると、Rb欠損C細胞腺腫が悪性転換する。RbN-ras二重ヘテロ型マウスに生じたC細胞腫では、Rb正常アレル欠損に続いて、N-ras遺伝子座のLOHと悪性化が観察される。N-ras野生型Rb欠損C細胞腺腫を詳細に解析したところ、多種のDNA損傷応答因子と、セネセンスマーカーの発現を観察した。N-rasホモ型マウスから生じた腫瘍において、これらはことごとく、発現消失した。RbN-ras両欠損C細胞株に野生型N-rasを導入すると、DNA損傷、セネセンスが誘導され、ヌードマウス皮下移植腫瘍は良性組織型を示した。この細胞では、導入野生型N-Rasが等分子数活性化型(V12)の約5分の1程度活性化され、p130がヒストンメチル転移酵素と結合していた。V12導入細胞では、セネセンスは誘導されず、このような結合も見いださなかった。次に、Rb欠損時のN-Ras活性の亢進の機構を調べるために、RbN-ras両欠損マウス由来C細胞株にRbを急速導入、細胞周期変化が誘導される前にmRNAを回収、マイクロアレイ解析を行った。その結果、Rasの活性調節に直接に関わるあるファミリーがRbによる発現抑制を受けることが判明した。これらのプロモーター領域に、E2F結合配列とともに、E2Fの影響を受ける転写因子の結合配列を多数見いだし、ChIP解析、ルシフェラーゼ解析により、これらが、発見した遺伝子群の転写制御に必須であることを確認した。さらに、Rbヘテロ欠損と同時に、p16Ink4a,p19ARF,ATM,Suv39h1のいずれかをホモ型欠損する二重ノックアウトマウスコホート群を作製し、腫瘍表現型を解析した。以上により、我々は、Rb失活細胞の癌化を阻止する重要な生体防御機構を見つけた。Rbを欠損した細胞でN-Rasの活性が亢進することの生物学的医学的レリバンスを探索するため、RbN-ras複合変異マウスの腫瘍表現型解析を行った。その結果、野生型N-ras遺伝子が、Rb欠損下垂体腫瘍では、癌遺伝子として、Rb欠損甲状腺髄様癌では、癌抑制遺伝子として作用する可能性が示唆された。本課題では、RbN-ras複合変異マウス甲状腺髄様癌由来細胞を用いて、癌抑制遺伝子としての野生型N-ras遺伝子の作用機構を明らかにすること、ヒト神経内分泌腫瘍におけるN-ras遺伝子の動態を解析することを目的とした。まず、Rbのみを欠損したマウス甲状腺に生じる良性腫瘍が種々のセネセンスマーカーを発現するのに対し、RbN-rasを同時に欠損したマウス甲状腺に生じる腫瘍(病理学的悪性腫瘍)はそれらを全く発現しないことが判った。RbN-ras同時欠損腫瘍に野生型N-rasを導入すると、病理学的良性の組織学的特徴と、種々のセネセンスマーカーの発現を観察した。この現象の分子機構を詳細に調べたところ、Rb非存在下の野生型N-rasの作用、同遺伝学的背景における野生型と発癌型(活性化型)N-rasの機能のおおきな違い、そして、RbとN-rasの遺伝学的関連のメカニズムが浮き彫りになった。特定の遺伝学的背景、特定の組織における発癌において、野生型のras遺伝子がいかなる貢献をなすかという問題に重要な洞察を与えたと考える。一方、マイクロサテライトマーカーを用いた予備的な解析は、散発性ヒト甲状腺髄様がんが、高頻度にN-ras遺伝子の欠損を有する可能性を示唆した。この知見の特異性を検討するため、また、甲状腺髄様がんを含有する神経内分泌腫瘍におけるN-ras遺伝子の動態を解析するため、東京女子医科大学内分泌外科学教室、東京大学との共同研究体制を確立した。免疫組織学的解析、RbとN-ras他関連遺伝子のアレル特異的PCR、セネセンス関連遺伝子発現とN-ras動態の関連解析等の作業が、現在進行中である.Rbヘテロ型マウスは、甲状腺C細胞において、正常アレルの欠損により、腺腫を生じる。

これらのプロモーター領域に、E2F結合配列とともに、E2Fの影響を受ける転写因子の結合配列を多数見いだし、ChIP解析、ルシフェラーゼ解析により、これらが、発見した遺伝子群の転写制御に必須であることを確認した。さらに、Rbヘテロ欠損と同時に、p16Ink4a,p19ARF,ATM,Suv39h1のいずれかをホモ型欠損する二重ノックアウトマウスコホート群を作製し、腫瘍表現型を解析した。以上により、我々は、Rb失活細胞の癌化を阻止する重要な生体防御機構を見つけた。
アルツハイマー病線維型アミロイドβペプチド分解酵素の検索

アミロイドβペプチド(Aβ)はアルツハイマー病(AD)患者脳で疾患特異的に観察される老人斑の主成分であり、Aβ蓄積はAD脳で観察される様々な病理変化の最上流に位置し、進行的な神経細胞の機能障害と脱落の引き金となる.従って、ADの根本的克服のためには脳内Aβレベルを低下させる必要がある.凝集・線維化により老人斑を形成したAβの分解過程には、分泌型Aβに作用して定常レベルを規定するネプリライシンとは異なる分解システムが存在すると考えられる.活性型マイクログリアの貪食作用はそれに相当するが、細胞外に存在する複数のプロテアーゼにも老人斑の分解能力が推定される。マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)や組織型プラスミノージェンアクチベーター(tPA)は細胞外でマトリックスを形成するタンパク質を分解することから、凝集・線維化Aβ分解酵素の有力な候補になる.本研究では、変異型アミロイド前駆体蛋白質(amyloid precursor protein ; APP)-トランスジェニックマウスとMMP2欠損マウスまたはtPA欠損マウスとの交配を行い、これらのプロテアーゼの欠損によって脳内Aβ蓄積が加速するか否かについて検討した.本年度は、これらの交配動物から経時的に(最長24ヶ月齢)脳摘出を行い、Aβに特異的な抗体を用いるELISAにて海馬におけるAβ量の変化を測定した.APP遺伝子が導入された遺伝的背景においてMMP2欠損(+/-)またはtPA(+/-)欠損のどちらにおいても、APPトランスジェニックマウスと比較し、有意なAβ量の変化は認められなかった.従って、現段階においては、線維型Aβクリアランスに対するこれらのプロテアーゼの関与は低いと考えられる.しかし、部位特異的な関与も考慮し、本研究助成終了後も大脳皮質等におけるAβ量の変化について解析する予定である.アミロイドβペプチド(Aβ)はアルツハイマー病(AD)患者脳で疾患特異的に観察される老人斑の主成分であり、Aβの蓄積はAD脳で観察される様々な病理変化の最上流に位置し、進行的な神経細胞の機能障害と脱落を引き起こす引き金になる.従って、AD克服のためには脳内Aβレベルを積極的に低下させる必要がある.凝集・線維化により既に老人斑を形成したAβの分解過程には、分泌型Aβに作用して定常レベルを規定するネプリライシンとは異なる分解システムが存在すると考えられる.実際、活性型マイクログリアの貪食作用はそれに相当するが、細胞外に存在する複数のプロテアーゼも老人斑の消去に関与することが推定され、特にマトリックスメタロプロテアーゼや組織型プラスミノージェンアクチベーター(tPA)は細胞外でマトリックスを形成するタンパク質に作用して分解する能力があることから凝集・線維化Aβ分解酵素の有力な候補になる.本研究では、変異型アミロイド前駆体蛋白質(amyloid precursor protein;APP)-トランスジェニックマウスとMMP2欠損マウスまたはtPA欠損マウスとの交配を行い、これらのプロテアーゼの欠損によって脳内における老人斑形成が加速するか否かについて検討し、線維型Aβクリアランスに対する関与について明らかにすることを目的としている.本年度は、上記の掛け合わせ動物から組織化学解析用および生化学解析用に経時的に(最長24ヶ月齢)脳摘出を行い、サンプルを採取した.組織化学解析用のサンプルは、パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作製した.現在、老人斑形成(Aβ蓄積)の加速化について組織化学的解析と合わせて生化学的解析を開始している.アミロイドβペプチド(Aβ)はアルツハイマー病(AD)患者脳で疾患特異的に観察される老人斑の主成分であり、Aβ蓄積はAD脳で観察される様々な病理変化の最上流に位置し、進行的な神経細胞の機能障害と脱落の引き金となる.従って、ADの根本的克服のためには脳内Aβレベルを低下させる必要がある.凝集・線維化により老人斑を形成したAβの分解過程には、分泌型Aβに作用して定常レベルを規定するネプリライシンとは異なる分解システムが存在すると考えられる.活性型マイクログリアの貪食作用はそれに相当するが、細胞外に存在する複数のプロテアーゼにも老人斑の分解能力が推定される。マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)や組織型プラスミノージェンアクチベーター(tPA)は細胞外でマトリックスを形成するタンパク質を分解することから、凝集・線維化Aβ分解酵素の有力な候補になる.本研究では、変異型アミロイド前駆体蛋白質(amyloid precursor protein ; APP)-トランスジェニックマウスとMMP2欠損マウスまたはtPA欠損マウスとの交配を行い、これらのプロテアーゼの欠損によって脳内Aβ蓄積が加速するか否かについて検討した.本年度は、これらの交配動物から経時的に(最長24ヶ月齢)脳摘出を行い、Aβに特異的な抗体を用いるELISAにて海馬におけるAβ量の変化を測定した.APP遺伝子が導入された遺伝的背景においてMMP2欠損(+/-)またはtPA(+/-)欠損のどちらにおいても、APPトランスジェニックマウスと比較し、有意なAβ量の変化は認められなかった.従って、現段階においては、線維型Aβクリアランスに対するこれらのプロテアーゼの関与は低いと考えられる.しかし、部位特異的な関与も考慮し、本研究助成終了後も大脳皮質等におけるAβ量の変化について解析する予定である.