hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レナリドミドと細胞障害性CSF1R抗体を併用した白血病幹細胞根絶療法の開発

平成27年度は実働研究ができていないため実績はない。AML幹細胞株MDS92D、MDS-Lに対して100nM lenalidomideを添加したところ、アポトーシスの増加とともに、12時間以内のCSF1RのmRNA発現亢進と、24時間以内の細胞表面への発現亢進が認められた。一方、同じくAML幹細胞で、コントロールとして用いたKG1aでは、同様の現象は認められなかった。フローサイトメトリー(FACS)を用いた細胞分化解析では、CD34およびHLA-DRの発現が減少し、軽度単球系細胞への分化傾向を認めたことから、単球への分化傾向を呈しながら細胞死誘導する機序が推定された。しかしlenalidomide添加後4日目(細胞表面CSF1R発現がピークとなる時期)の時点において、M-CSFを添加しても細胞増殖への影響は認められず、受容体のリン酸化も認められなかったため、シグナル伝達解析は中止した。次にFACSにて、MDS-L、MDS92Dの両細胞において、M-CSF添加後に細胞表面のCSF1Rが細胞内へ内在化することが分かったため、サポリン結合抗CSF1R抗体とlenalidomideの併用療法を行ったところ、lenalidomide単独、およびサポリン結合抗CSF1R抗体単独と比較して、併用療法群においてより強い細胞毒性が認められた。以上より、我々はlenalidomideがMDS92D、およびMDS-Lの細胞表面CSF1Rの発現を亢進させることと、lenalidomideとサポリン結合抗CSF1R抗体との併用療法の可能性を示した。H26年度は実働研究ができていない。H25年のin-vitro研究成果の論文化が遅れていること、そしてその後のprimary細胞を用いた研究も検体回収の困難さなどによりうまく進んでいない。今年度は、まずin-vitroのデータを論文化することから始める。その後随時ヒトprimary細胞を用いたAML幹細胞への効果発現に対しての研究を進める。lenalidomideの作用としては、おおむね予想通りであった。シグナル伝達解析については、予想に反して、受容体のリン酸化と、M-CSF刺激による反応性がなかったことからその施行に意味を見いだせなかったため、先送りとした。しかしサポリン結合抗CSF1R抗体とlenalidomide併用療法の結果が得られたことで、lenalidomide療法に対する一定の結果が得られたと考えている。H26年度は研究を一時中断したため、十分な研究ができなかった。まず、これまでの結果(in-vitro lenalidomideのCSF1R発現誘導作用と抗CSF1R抗体併用療法)について、論文化を進めている。今後はヒトAML幹細胞に対する同様の効果について解析予定である。ヒトAML幹細胞を用いた研究に対しての抗CSF1R、サポリン結合IgG、細胞培養、フローサイトメトリーに用いる抗体など諸薬品購入用に用いる。シグナル伝達に関わると予想されていた費用が不要となったこと、予想よりも少ない費用で賄われたことが主な理由。サポリン結合CSF1R抗体と、フローサイトメトリーに関わる抗体関連を中心に拠出する。
地域包括支援センターが行う住民主体の介護予防活動の創出支援システムの開発

地域包括支援センターは、介護予防の住民主体の自主活動支援が期待されている。しかし、地域包括支援センターが住民主体の介護予防活動に取り組むためのガイドラインは示されていない。本研究では1地域包括支援センターを対象とした住民主体の介護予防活動の取り組みの現状を調査し支援の課題を整理する。2自主活動の創出をテーマとして取り組んでいる研究者を対象に支援方法を調査し、その共通点を明らかにする。3さらに、12を整理して住民主体の介護予防活動を支援するガイドラインを作成することを最終目的とする。
大学の特色に適応可能な結核検診マトリックスの作成

大学における結核検診は、大学の第一学年もしくは学生全員に胸部X線検査を行う大学が大多数だったが、その検査で結核と診断された学生は受検学生のわずか0.0044%であった。結核と診断された大学生は、外国人留学生および海外渡航歴のある学生が多かった。結核菌感染の有無を検査するInterferon-Gamma Release Assay(IGRA)では、日本人学生と比して外国人留学生における陽性率が高かった。今後の大学結核検診では、既往歴・高まん延国への渡航歴・滞在歴、呼吸器症状の有無・患者接触可能性のある実習の有無・学部属性を問診し対象学生を選択することが可能と考えられた。1)千葉大学における過去の結核検診のデータ解析:学生一般定期健康診断における胸部X線検査を受診者全員に行っていた期間のうち、2001から2010年度までの結核検診(胸部X線検査)受診者101,879名と、「国立大学法人保健管理施設協議会胸部X線検査のあり方」に準拠して検査対象を絞った2011から2015年度の結核検診受診者52951名を比較検討した。結果、検査対象を絞った場合、学生全体の56.4%が結核検診を受検していた。結果、全員が結核検診をうけていた期間に比して約20%程度の胸部X検査が省略された。検査対象を絞ることで、要精検率は0.53%から0.89%へ上昇したが、患者発見率は0.022%から0.014%へ減少した。定期健診外で発見された結核患者は2011から2015年度では2名であった。結核と診断された学生の背景を調査すると「症状あり」「家族歴あり」「医療従事経験あり」「結核高まん延国への渡航歴あり」が重要であると考えられた。2)全国大学の結核検診実態調査:公益社団法人全国大学保健管理協会第1種会員校503校に郵送でアンケート調査を行った。347校から回答を得た(回答率69.0%)。3)外国人留学生検診におけるInterferon-Gamma Release Assays(IGRA)の実施:2015年度は、92名の外国人留学生に検査を行った。陽性率は6.5%で、1名の低感染性結核患者が発見された。2011年以降、累積で391名の検査が行われており、陽性率は約10%であった。1)過去の結核検診のデータ解析は終了し、結果を第53回全国大学保健管理研究集会(盛岡市)で発表した。2)全国大学の結核検診実態調査は終了し、調査の結果は、第54回全国大学保健管理研究集会(大阪市)にて公表予定である。平成27年度に行った全国大学の結核検診に関するアンケート調査結果を解析し、以下の結果を、第54回全国大学保健管理研究集会(大阪市;平成28年10月)で発表した。全国大学保健管理協会第1種会員大学503校に郵送で無記名アンケート調査を行い、348大学から回答を得た(回答率69.2%)。胸部X線検査方法は、デジタル撮影で検査を行っている大学が37.9%とアナログ撮影からデジタル撮影への移行が進んでいた。また、92.5%の大学で検査を外部委託で行っていた。検査対象は、学生全員としている大学が73.6%と多かった。定期健康診断胸部X線検査の要精検率は全体で0.27%、結核の発見率は0.0044%であった。学生結核患者の67.4%が定期健康診断で発見された。期間中に結核と診断された学生のうち、外国人留学生の占める割合は51.5%、2年以内に渡航歴のある学生は21.2%と高かった。定期健康診断の問診で、海外滞在歴・渡航歴を調査していると答えたのは、それぞれ9校、15校と少なかった。IGRA(Interferon-Gamma release assay)を新入生や医療系学部生などに行っている大学が52校あった。外国人留学生や海外滞在・渡航歴のある学生など結核罹患リスクが高いと思われる学生を抽出できる問診を実行できている大学は少ない。現況での大学生における結核リスクとして重要と考えられた海外渡航・滞在歴を含めた問診項目を改善し、その後、胸部X線検査およびIGRA検査を行うべきと考えられた。28年度までに予定していたアンケート調査を終了しその一部は解析して結果を学会発表できた。28年度内にアンケート調査に基づき構成した結核検診マトリックスを利用して、学生のIGRA検査を行った。平成28年度に行った、大学生におけるIFN-γRelease Assay (IGRA)を利用した結核検診の結果を解析し、以下の結果を、第55回全国大学保健管理研究集会(宜野湾市)で発表した。1)平成28年度C大学学生定期健康診断および外国人留学生健康診断にて、IGRA:クォンティフェロンTBゴールド(QFT)を行った。対象は、定期健康診断対象学生のうち本人が検査を希望した287名(一般健診群、男:女=209:78、平均年齢23.9±2.2歳)および外国人留学生健康診断対象学生107名(留学生群、男:女=58:49、平均年齢25.4±3.8歳)、計394名(男:女=267:127、平均年齢24.3±2.8歳)であった。2)研究対象学生の胸部レントゲン検査に異常は認めなかった。3)QFT結果:一般健診群;判定保留

3名・陽性3名(陽性率1.05%)、留学生群;判定保留1名・陽性7名(陽性率6.54%)、全体では、陽性10名、判定保留4名、陽性率2.5%であった。4)QFT陽性学生の背景:研究対象学生に自覚症状はなかった。一般健診群の陽性/判定保留学生はすべて日本人で、既往歴・家族歴、高蔓延国への渡航歴はなかった。陽性学生のうち1名に患者接触歴があり、LTBIとして治療を受けた。留学生群の陽性/判定保留学生では、既治療1名、他施設で1年前にIGRA陽性を指摘されていた学生1名であった。他の6名は明らかな患者接触歴はなく、2名を医療機関に紹介し1名がLTBI治療を受けた。4名は、経過観察となった。IGRAは、日本人学生では陽性であっても、暴露機会が不明で、問診等で検査対象を絞るべきと考えられた。外国人留学生では、日本人学生に比して陽性率が高い傾向にあったが、LTBI治療の説明が困難であった。大学における結核検診は、大学の第一学年もしくは学生全員に胸部X線検査を行う大学が大多数だったが、その検査で結核と診断された学生は受検学生のわずか0.0044%であった。結核と診断された大学生は、外国人留学生および海外渡航歴のある学生が多かった。結核菌感染の有無を検査するInterferon-Gamma Release Assay(IGRA)では、日本人学生と比して外国人留学生における陽性率が高かった。今後の大学結核検診では、既往歴・高まん延国への渡航歴・滞在歴、呼吸器症状の有無・患者接触可能性のある実習の有無・学部属性を問診し対象学生を選択することが可能と考えられた。2016年度は、前年度までの結果に基づき、外国人留学生および定期健診実施前の問診で1)呼吸器症状のあるもの、2)2年以内の結核高まん延国への渡航歴があるもの、3)同居家族に結核罹患歴があるもの、3)医療従事経験のあるものを抽出し、同意を得られた学生にIGRA検査を行う予定としている。また、他大学の結核検診実態調査については、アンケートの質問項目のみでは補足不可能なより詳細な情報を得るため、同意を得られた大学からヒアリング調査を追加で行うこととし、また、それら結果の解析について研究分担者に依頼する予定である。今年度中に、収集したデータを解析し、大学における結核検診マトリックスを完成させる。公衆衛生公益社団法人全国大学保健管理協会第1種会員校503校に郵送でアンケート調査を行った全国大学の結核検診実態調査の集計を業務委託したが、委託業者からの支払い請求が年度末を越えたため、支払いが次年度となったことが理由である。学会参加者の旅費として計上していたが、予定より参加者が減少したため、旅費が減少したため。すでに、28年度当初に上記支払請求があり、未使用金額は支払いを完了した。29年度は当初の予定より、学会開催地が遠隔地に変更されたため、29年度分旅費として使用する。
グラフェン膜の介在による電極特性の制御とその２次元評価

表面構造が安定しているグラフェン層を金属/半導体界面に挿入し電気的特性を制御することを本研究の目的としている。グラフェン層を大面積で均一に半導体表面に堆積することが困難なため、電極面内の2次元評価法として顕微光応答法を新たに立ち上げた。Ni/n-GaN構造ではグラフェン層が介在している部分ではショットキー障壁高さが低くなることが明らかになった。本電極構造を用いると、低抵抗なオーミック電極がn形GaNに対して形成される可能性が示唆される。本研究は表面に未結合手が無い安定した構造をもつグラフェン膜を半導体上に形成し、原子オーダーの表面保護膜を実現することに着目している。金属/グラフェン/半導体構造を形成し、その電気的特性の制御を行うことが本研究の目的である。H25年度は、GaN上にグラフェンを形成する際、密着性を高める要因を明らかにする検討を行った。本研究ではSiCを高真空中で熱処理し、表面に高品質なエピタキシャルグラフェンを大面積形成している。グラフェン上に金属膜を堆積し、SiC基板から剥離して、GaN表面に転写する手法を用いた。しかし、転写の最終段階である、金属膜/グラフェン/GaN構造から金属膜を酸により溶解する際に、グラフェン膜がGaN表面に吸着しない問題が発生した。この原因をグラフェンの構造から解析した。グラフェンの端面はジグザグ型、及びアームチェアー型の構造をもった場合に安定することが計算結果から明らかになった。我々は高品質大面積グラフェン膜転写に重きを置いたが、この考えはグラフェン表面がダングリングボンドをもたないことから疎水性であるGaN表面との密着性においては不利な条件であることが実験的に見出された。グラフェン端面は比較的規則的な原子配列をもち、密着性を高めると予想されるので、むしろ小面積グラフェンを貼り合わせる方針で研究を進めることとした。本研究のもう一つの軸である電極界面の2次元評価においては、GaN表面に存在する数原子オーダーの汚染層を敏感に像として検出できることを示した。更に、Au/Ni電極の熱劣化も、2次元像として捉え、電気的特性と相関を得ることに成功した。これらの結果は電極界面にグラフェンが介在した場合でも有効的に評価できることを示唆するものである。また、n形、p形GaNショットキー接触の基本特性の理解においても、いくつかの成果を得た。H24年度では半導体基板上への大面積グラフェン膜の形成技術の基礎を固める実験に着手した。グラフェン材料の作成として、自前でSiC上にグラフェンを形成する技術を検討した、この手法では高品質なエピタキシャルグラフェンを得ることができるが、一方、高真空で高温の成長条件が必要とされるため、これまでに九州大学・田中悟教授の研究室でしか良膜成長は成功していない。また、SiC上のグラフェンを引き剥がし、半導体表面に転写する技術、および電極形成、余分なグラフェン除去技術も合わせて検討した。グラフェン膜の膜厚、結晶性に不均一性が懸念されるため、本研究のもう一つのテーマである電極面内で集光ビームを走査する2次元評価法の新たな立ち上げも行った。本装置は非破壊で金属/半導体界面の電気的特性を評価出来るもので、今回のこの装置が立ち上がると世界で唯一の装置となる。H24年度は分解能1ミクロン以下を目指し、光学系、機械系の設計から着手し、既存光学部品の選定だけでなく、部品の一部は特注で加工してよりコンパクトな構造を目指した。信号系では低ノイズを実現するよう、電流入力プリアンプを用いたロックイン検出方式を採用して、設計を進めた。測定結果は従来用いられている分光器からの光を用いた測定結果と比較して妥当性を示した。最終年度はGaN表面上へのグラフェン形成に注力した。これまではSiC上に昇華法により堆積したグラフェンを、金属膜を蒸着して剥離し、GaN表面に転写する手法を取っていた。しかし、転写後に金属膜を溶液で除去する際に、GaN表面が疎水性のためグラフェン膜も溶液中に流れ出てしまうという問題点があった。今回はグラフェン塊を購入し、粉砕後、揮発性の高い溶液にグラフェンを分散し、GaN表面に塗布する手法を取った。グラフェン塊としてHOPG(高配向グラファイト)、及びキッシュグラファイトの使用を試みた。大まかにこれらのグラフェン塊を機械的に砕き、テトラヒドロフラン(THF)溶液中で超音波処理により更なる粉砕を行った。超音波処理は最長150時間以上行ったが、10時間程度で粉砕された粒子の細かさは飽和する傾向がみられた。

遠心分離により上澄み液を採取し、ラマン測定を行った結果、大多数は3層上のグラファイトであるが、ごく一部に3層以下のグラフェンが存在することが分かった。この上澄み液をGaN表面上に滴下し、THFを蒸発させ、Ni電極を蒸着した。このショットキー電極の2次元評価を行うと、界面に介在したグラファイト、およびグラフェンの形状を光電流の像として確認することができた。しかし、グラフェンの存在確率が小さいため、電気的特性との対応は明確に出来なかった。本研究のもう一つの軸である電極界面の2次元評価においては、Au/Ni/n-GaN構造の熱劣化過程を評価し、その結果がレター誌(Applied Physics Express)に採択された。また、この手法はSiC上に形成した電極にも有効であり、ワイドギャップ半導体一般の評価に有望であることを示した。金属/半導体界面の評価グラフェン形成においては、グラフェンとGaNとの密着性の悪さの原因を究明することができた。そして、大面積単一グラフェン膜ではなく、端面でGaNと密着性をもつ構造が本研究において有利であることを見出した。電極の2次元評価は予想以上に進んでおり、装置の構築においては2μm以下の空間分解能を実現し、光電流からショットキー障壁高さを算出するプログラムも完成した。その結果、約1時間半で200μm角を3μmの分解能で測定することが可能となった。信号強度の安定性、ノイズ対策等を強化することにより、電極界面の原子オーダーの汚染層を敏感に検出できるようにした。現状の性能で電極界面の単層グラフェンの有無が2次元評価できるものと思われる。グラフェン膜の形成:この項目は本学・橋本明弘准教授の指導下で行った。小片に切断したSiC基板を真空中で通電により高温加熱することで高真空を保ちながらSiを昇華させ表面にグラフェン膜を形成した。ラマン測定を行った結果、良好なエピタキシャルグラフェンが数ミリ角の大きさで形成されていることが明らかになった。転写、金属電極プロセス:グラフェン上に薄膜Ti、及び厚膜Alの二層構造を蒸着することにより、密着性が優れ、且つ塩酸により容易に除去出来る金属介在膜を実現した。その上にサファイア基板を接着し、SiC基板から数ミリ角の大面積グラフェン膜の剥離に成功した。GaN基板上への転写は現在のところ再現性が乏しく、来年度、表面処理を検討する。なお、グラフェン膜の除去は酸素プラズマにより容易に除去出来ることを確認した。電気的特性の2次元評価:2次元光応答法装置の新規構築は、光源として半導体レーザーからの光がシングルモードを介して出射されるものを購入しビーム形状を真円に整えた。GaNのエネルギーバンドギャップよりやや小さい光子エネルギーを持つ紫外、並びに青色光を用いた。機械系では従来までのステッピングモータではなく、ピエゾ素子駆動ステージを採用し高い空間分解能を実現出来る系とした。動作確認として、直径200ミクロンのNi/n-GaNショットキー接触を測定し、従来分光器を同じ大きさの電流収率が得られることを確認した。そして、2波長の電流収率から2次元像として障壁高さが得られることを確認した。最終年度はGaN表面へのグラフェン形成に注力し、グラフェン介在電極の二次元評価を達成する。
原子間力顕微鏡による活性な清浄表面の単原子観察条件の研究

1)現有の原子間力顕微鏡の超高感度化探針先端に働く非常に微弱な引力勾配を高感度に測定するため、超高感度な変位検出系と超高感度な周波数変調回路を実現した。2)清浄で先鋭な探針の実現活性な半導体清浄表面に対して安定な単原子観察を実現するため、原子レベルで先鋭で清浄な探針を実現した。3)活性な半導体清浄表面に対する単原子観察条件の理論的検討活性な半導体清浄表面を原子分解能で測定するために必要な引力勾配の大きさについて理論的に検討し、10N/m以上であることを見出した。4)表面に弱く結合した原子(アダトム)の原子分解能観察条件の解明加熱清浄化処理により得られるSiの活性な(111)再構成表面を、探針と試料表面間に働く引力勾配を変化させながら観察し、表面に弱く結合した原子(アダトム)を原子分解能で安定に観察できるための引力勾配の大きさを解明した。また、原子分解能観察に必要な引力勾配の大きさは、探針先端のダングリングボンドの有無により大きく変化することを見いだした。5)軌道混成による力の原子レベル測定に成功金属を吸着したSi表面とダングリングボンドを持ったSi探針との間の相互作用力が、Si清浄表面における場合と比較してどのように変化するのかを検討した。その結果、探針が試料から離れている時には、ファンデルワールス(vdW)力やクーロン力が画像化に寄与し、他方、接近している時には、Si-Ag原子間の共有結合軌道と探針先端のダングリングボンドとの軌道混成による力が画像化に寄与していることを解明した。6)金属単結晶表面の原子分解能観察に世界で初めて成功これまで、非接触AFMを用いて、金属単結晶表面を原子分解能で観察できたという報告はない。本研究では、金属単結晶表面であるAg(111)表面を世界で初めて原子分解能観察することに成功した。1)現有の原子間力顕微鏡の超高感度化探針先端に働く非常に微弱な引力勾配を高感度に測定するためには、探針の振動振幅を超安定に保持しながら、探針の共振周波数の変化を高感度に検出する必要がある。そこで、まず、変位検出感度0.2Åの現有の光干渉計を改良し、超高感度な変位検出を実現した。具体的には、ノイズ成分の極めて少ない光源と超安定な駆動回路を購入し、検出感度0.05Åの超高感度な光干渉計を実現した。また、現有の周波数変調回路(検出感度0.1Hz)を改良し、超高感度(検出感度0.01Hz)な周波数検出を実現した。2)探針の先鋭度や清浄度を評価する装置の付加活性な半導体清浄表面に対して安定な単原子観察を実現するには、原子レベルで先鋭で清浄な探針を使用することが必要不可欠である。そこで、現有の超高真空原子間力顕微鏡に探針の清浄度と先鋭度を評価する装置を付加した。なお、上記の探針評価には導電性が必要であるが、導電性シリコンから作られる探針を使用することにより解決する。3)活性な半導体清浄表面に対する単原子観察条件の理論的検討引力領域で原子分解能を実現するためには、探針先端を試料表面に原子間距離に相当する間隔(5Å以下)まで近づける必要があると予想される。しかし、このような距離では、探針先端の原子と試料表面のダングリングボンド(共有結合が切れている活性な不飽和結合手)とが相互作用し、引力勾配が急激に大きくなる。この引力勾配が板バネのバネ定数より大きくなると、探針が試料側に突然ジャンプし接触してしまう。

従って、探針先端を活性な試料の極近傍まで近づけるためには、ジャンプが起こらないように引力勾配よりも大きなバネ定数の板バネを選定する必要がある。そこで、活性な半導体清浄表面を原子分解能で測定するために必要な引力勾配の大きさについて理論的に検討し、10N/m以上であることを見いだした。平成9年度に改良した超高感度の原子間力顕微鏡を用いて、活性な半導体清浄表面を実際に観察し、表面に弱く吸着した原子(アダトム)を原子分解能で観察するための条件を実験的に検討した。1)表面に弱く結合した原子(アダトム)の原子分解能観察条件の解明加熱清浄化処理により得られるシリコンの活性な(111)再構成表面を、探針と試料表面間に働く引力勾配を変化させながら観察し、表面に弱く結合した原子(アダトム)を原子分解能で安定に観察できるための引力勾配の大きさを解明した。また、原子分解能観察に必要な引力勾配の大きさは、探針先端のダングリングボンドの有無により大きく変化することを見いだした。2)単原子観察条件のダングリングボンドの活性度依存性の実験的検討ダングリングボンドを原子状水素で終端することにより不活性化したシリコンの再構成表面を試料として取り上げ、この表面を原子分解能測定に必要な引力勾配の大きさを実験的に解明する。この測定により、ダングリングボンドの活性度の単原子観察条件への影響を解明した。3)単原子観察条件に対する静電気力やファンデル・ワールス力の影響の実験的検討酸素を吸着させた局所的にイオン化したシリコン表面に対しても引力勾配の大きさを解明し、単原子観察条件に対する静電気力力やファンデル・ワールスの影響を検討する。具体的には、バイアス電圧を印加しながら表面を観察し、表面極近傍では静電気力の影響が大きいことを見いだした。また、静電気力の影響を除去しながら、活性な清浄表面を観察するための方法を新たに考案した。
超臨界プラズマプロセシング

超臨界流体中あるいは常圧から超臨界領域の圧力でのガス・超臨界流体と液体界面での放電プラズマを利用した物質変換プロセスとして各種色素の反応、アラニン等のアミノ酸などの反応を検討したところ、プラズマにより重合反応を中心に化学反応が誘起されることを見出した。プラズマの発光強度の測定から、発光強度と反応の関係および反応機構を明らかにした。金属への超臨界流体中でのレーザーアブレーションにより生成するナノ粒子やクレーターの圧力依存性が極めて大きく、臨界圧力近傍で粒子生成が促進されることが分かり、プラズマの発光強度との関係を明らかにした。亜臨界水中、超臨界二酸化炭素中、および超臨界アルゴン中での放電プラズマを生成し、化学反応への応用を検討した。各種放電方式での高圧流体中でのプラズマの生成挙動を測定した。一方、亜臨界水中でのプラズマによるフェノールの反応においてはフェノールの7量体程度までの重合生成物の生成が確認できた。また、アニリンを原料とした場合も、2量体の生成が確認できた。超臨界アルゴン中でのプラズマによるフェノールの反応では、フェノールが超臨界アルゴンに溶解しにくいが、ヒドロキノンの生成が確認でき、フェノールからヒドロキシル基の引き抜きが生じている可能性が示唆された。また、放電電極上に生成した粒子状および膜状生成物はアモルファスカーボンであることが各種の測定から明らかになった。超臨界流体/液体界面での放電プラズマ生成挙動を調べるために、観察窓および可動型電極を有する高圧超臨界プラズマセルを設計製作した。超臨界アルゴン/液体水を用いて電極の位置による放電プラズマの生成挙動を観察した。パルスパワーにより電極近傍ではコロナ放電から始まりアーク放電に移行し、界面上にプラズマが生成することが確認できた。急峻な立ち上がりを有するナノ秒パルス放電による非熱平衡プラズマは,雰囲気流体を乱すことなく,放電による活性種を提供できる可能性がある。本年度は,同軸円筒状電極を有するナノパルス放電形成・化学反応装置を新たに設計・製作し、超臨界二酸化炭素中や超臨界アルゴン中におけるパルス放電特性の計測を行った。また本装置を用いて、アミノ酸のモデル化合物としてアラニンを選定し、パルス放電プラズマによるアラニンの重合化(オリゴペプチド合成)を目指した実験を通じて,超臨界流体中で形成されるナノパルス放電プラズマがアミノ酸と作用し、重合反応を生起する世界に前例のない新規な反応場の確立を目指した.同軸円筒対ワイヤー電極とすることにより,放電エリアが大幅に拡大し,反応効率の大幅向上が期待できる。また、コロナ状放電が確認できたまた,反応容器の構造・体積・電極が異なる小型プラズマ生成装置を用いたアラニン等のモデル化合物の超臨界流体なのパルス放電反応実験も行った。超臨界二酸化炭素中や超臨界アルゴン中におけるパルス放電プラズマによるアラニンの重合化(オリゴペプチド合成)を目指した実験を通じて,超臨界流体中で形成されるナノパルス放電プラズマがアミノ酸と作用し、重合反応を生起する世界に前例のない新規な反応場の確立を目指した.MALDI-TOF-MSのピロール処理後から、高分子量化合物(ピロールのオリゴマー:130440AMU)が形成された。水面システム中パルス放電プラズマは排水の有機汚染物質や染料(オレンジG、オレンジII、コンゴレッド、ナプトールブルー)を分解するのに有効であった。脱色率が増加し、電界エネルギーの増加によりピークパルス電圧およびパルス数とともに増加した。超臨界流体ナノバブルにおける超臨界流体/液体界面および超臨界流体中で形成したマイクロエマルション界面での放電プラズマを利用した材料プロセシングおよび物質変換手法の開発を目的とした。本年度は、超臨界流体ナノバブルを形成しうる装置製作、およびそれを利用した有機化合物の重合反応試験を主に行った。その結果、目的とする装置作製が完了し、超臨界アルゴン-アラニン系でのオリゴペプチド合成に成功した。同軸円筒状電極を有するナノパルス放電形成・化学反応装置を新たに設計・製作した。反応に関与する放電プラズマ領域を拡大した。高電圧パルス放電対応装置としては世界初である。同軸円筒対ワイヤー電極とすることにより,放電エリアが大幅に拡大し,反応効率の大幅向上が期待できる。また、コロナ状放電が確認できた。

脱色率が増加し、電界エネルギーの増加によりピークパルス電圧およびパルス数とともに増加した。亜臨界から超臨界中でのナノ界面でのプラズマを利用したプラズマプロセシング技術を創出することを目的とする。超臨界領域のみならず、密度ゆらぎによる局所的密度差界面、超臨界流体/液体界面等でのプラズマを利用した材料プロセシングおよび物質変換手法の構築を目指した。また、パルスレーザー照射により生成するプラズマを利用したナノ材料調製における超臨界流体の役割を検討した。(1)放電プラズマ特に常圧から超臨界領域の圧力でのガス・超臨界流体と液体界面での放電プラズマを利用した物質変換プロセスについて、研究を行った。メチルオレンジ等の色素の反応、アラニン等のアミノ酸の反応について反応機構を解明することを目的に詳細に検討した。生成物の分析の他に、プラズマの発光強度の測定を北海道大学(佐々木教授)と共同で実施し、化学反応へのプラズマの関与を考察した。色素の反応については電極材料と流体圧力の影響を受けること、結晶状固体が生成することが明らかになった。アミノ酸についてはアルカリ条件下でオリゴマー化が進行し、分解反応とオリゴマー化反応の関係、反応機構が明らかになってきた。また、無機物である酢酸アンモニウムからアミノ酸であるグリシンが生成した。(2)レーザーアブレーション金などの材料への超臨界流体中でのアブレーションにより生成するナノ粒子やクレーターの流体圧力依存性が極めて大きく、臨界点近傍で顕著な違いがみられることがわかった。その機構を解明するために北海道大学(佐々木教授)と共同でレーザーによるプラズマ発光強度の測定を行い、その圧力依存性を明らかにした。メチルオレンジの反応、アラニンの反応について反応機構を解明することを目的に詳細に検討した。メチルオレンジの反応については電極材料と流体圧力の影響を受けること、結晶状固体が生成することが明らかになった。アラニンについてはアルカリ条件下でオリゴマー化が進行し、分解反応とオリゴマー化反応の関係、反応機構が明らかになってきた。
抗菌ペプチドによる神経反発因子の発現促進機構とアトピー性皮膚炎治療薬への応用

アトピー性皮膚炎の病変部では、神経反発因子の発現減少に伴い表皮内神経線維の稠密化による起痒刺激の受容増加と、抗菌ペプチドの減少に伴う易感染性が認められる。本研究は、正常ヒト表皮角化細胞を用いて、抗菌ペプチドLL-37が神経反発因子セマフォリン3A(Sema3A)の発現に及ぼす影響ならびにそのシグナル伝達系を中心に検討した。その結果、抗菌ペプチドLL-37はSema3Aの発現を誘導すること、その誘導にはGiタンパク質共役型受容体ならびにMAPKの一種であるERK1/2を介することが判明した。アトピー性皮膚炎(AD)の痒みは抗ヒスタミン薬に抵抗性であり、難治性である。そのような難治性の痒みは不眠や就労障害の原因となり患者のQuality of Life(QOL)を著しく障害する。AD病変部では、神経反発因子(例:Semaphorin 3A [Sema3A] )の発現減少に伴う表皮内神経線維の稠密化による起痒刺激の受容増加と、抗菌ペプチドの減少に伴う易感染性が見られる。最近、我々は表皮角化細胞を抗菌ペプチドで刺激するとSema3A発現が増加することを見出した。そこで、平成26年度は、正常ヒト表皮角化細胞を用いて、抗菌ペプチド(human β-defencin 1-4及びLL-37)がSema3A発現に及ぼす影響ならびにシグナル伝達経路について解析した。正常ヒト表皮角化細胞に上記の抗菌ペプチドを添加し、一定時間培養後、total RNAならびに培養上清を回収した。その後、Real-time PCR及びELISA法により、Sema3Aの発現をmRNA及びタンパク質レベルで解析した。その結果、Sema3A発現を最も強く誘導したのはLL-37であった。次に、LL-37によるSema3A発現誘導の細胞内シグナル伝達経路を明らかにするため、既報を参考に、MAPK経路の阻害剤を用いた検討を行った。その結果、LL-37を介したSema3A発現誘導にはMAPK経路の一部が関与していることが明らかとなった。また、候補受容体の阻害剤を用いて同様の解析を行ったが、受容体を同定するに至らなかった。現在、LL-37によるSema3A発現誘導の詳細な分子機序に関して、解析を進めている。アトピー性皮膚炎(AD)の痒みは抗ヒスタミン薬に抵抗性であり難治性である。そのような難治性の痒みは不眠や就労障害の原因となり患者のQuality of Lifeを著しく障害する。AD病変部では、セマフォリン3A (Sema3A)等の神経反発因子の発現減少と神経成長因子(NGF)等の神経伸長因子の発現増加に伴う表皮内神経線維の稠密化による起痒刺激の受容増加と、抗菌ペプチドの減少に伴う易感染性が認められる。最近、我々は正常ヒト表皮角化細胞を抗菌ペプチドLL-37で刺激するとSema3Aの発現が増加することを見出した。そこで、平成27年度は、正常ヒト表皮角化細胞を用いて、1)様々な抗菌ペプチド(ヒトβ-ディフェンシン(hBD) 1-4及びLL-37)が神経反発因子及び神経伸長因子の発現に及ぼす影響、2) LL-37によるSema3Aの発現促進に関わるシグナル伝達系、3) ADモデルマウスへのLL-37配合軟膏の治療効果について検討した。表皮角化細胞に添加したLL-37はSema3Aの発現を促進し、NGFの発現を抑制することが明らかとなった。他の抗菌ペプチド(hBD1-4)はLL-37のような作用は認められなかった。また、阻害剤を用いた実験により、LL-37によるSema3A発現誘導の細胞内シグナル伝達はMAPK経路の一部であるERKを介していることが判明した。また、予備実験としてADモデルNC/NgaマウスにLL-37配合軟膏を塗布した結果、掻破行動の抑制が認められた。以上の結果は、LL-37が表皮角化細胞におけるSema3AとNGFの発現のバランスをSema3A側にシフトさせ、痒みの原因となる表皮内神経線維の増生を抑制することを示唆した。平成26年度の研究では、正常ヒト表皮角化細胞にLL-37を添加することでSema3Aが誘導されることと、そのシグナル伝達経路のメカニズムの一部を明らかにすることができた。これらの研究成果の一部は、2014年10月に東京で開催された国際痒みシンポジウムならびに12月に大阪で開催された日本研究皮膚科学会学術大会で発表を行った。また研究成果の一部を論文にまとめ、現在投稿中である。ほぼ予定通りに研究は進行している。皮膚科学平成26年度の研究成果を踏まえ、次年度はLL-37によるSema3Aの発現誘導メカニズムの詳細を明らかにし、他の軸索ガイダンス分子の発現誘導に関しても検討する予定である。また、ADモデルNC/Ngaマウスならびにドライスキンモデルマウスを用いて、抗菌ペプチドの外用による止痒効果を検討し、創薬を目指す。
社会集団における行動抑制とドーパミンシステムについての検討

本研究は「社会集団における行動抑制とドーパミンシステムとの関連の解明」を目的としている。(Morgan et al, 2007)によって社会順位との関連が示唆されており、行動の抑制にも深くかかわるDRD2受容体に焦点を当てた計画である。主な研究内容は1ニホンザルのDRD2遺伝子多型における個体の行動的・生理的評価、2ニホンザルのDRD2遺伝子における多型出現頻度の調査、3ニホンザルのDRD2遺伝子多型と集団環境における個体の行動・社会的行動の評価である。申請時の年次計画では、本年度は13についてそれぞれ準備を進める段階であった。本研究において実験対象にしている本年度遂行した研究に関する詳細は以下である。1.ドーパミンD2受容体の個体の社会行動・社会順位への影響(薬理行動観察・行動実験)高順位のオスでは拮抗薬の投与時、攻撃的ディスプレイが減少、順位テストにおいても順位が下落する傾向が見られ、低順位のオスでは作動薬の投与時において攻撃的ディスプレイが増加、順位テストにおいて投与前よりも衝動的な行動をとる傾向がみられた。これらは社会順位の構成においてDRD2受容体の結合能と、それに関わる行動が強く影響することを示唆する重要な結果である。2.マカクザルにおける神経伝達物質関連遺伝子(DRD1、5HTTLPR)の多型調査とグループ内個体の社会順位との関連どちらの遺伝子多型についても先行研究においてアカゲザルにはヒトと類似した多型があるとされており、本研究においても多型がみられたが、ニホンザルには同様の多型がアカゲザルに存在する頻度と同等の頻度では存在しなかった。本研究のテーマの視点をもって産地系統とその環境、それぞれの神経伝達物質および行動にかかわる遺伝子の多型について検討してゆくことでまたさらに社会と神経伝達物質関連遺伝子の関連、その進化について新たな知見が得られると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
神経細胞を用いたトキソプラズマのステージ転換を制御する分子機構の解明

トキソプラズマ原虫は、人を含めたほぼ全ての哺乳類に感染する人獣共通の病原体である。世界人口の約3割が感染しているとされ、妊婦が初感染すると流産や胎児の脳症等を引き起こす。本原虫にひとたび感染すると、宿主の脳や筋肉内で増殖型虫体から潜伏型虫体へとステージ転換し嚢胞を形成する。分厚い膜に守られた潜伏型虫体に有効な治療薬は存在せず、潜伏型虫体を完全に排除することはできない。さらに、患者が免疫抑制状態にある場合には、再活性化して死に至らしめる。我々は、潜伏型虫体へのステージ転換が神経細胞や筋細胞などの一部の細胞種で高頻度に生じることに着目し、神経細胞に感染した際に発現量の増加する原虫遺伝子群を他の細胞種と比較して特定した。本研究では、これら遺伝子の機能解析を通じて、治療の困難な慢性感染が起きる仕組みの解明を目指す。今年度は以下の4つの項目について研究を行なった。1)スクリーニングの結果選抜された6つの原虫遺伝子のノックアウト型原虫の作製。2)ステージ転換能を評価するin vitro実験系の構築。3)上記の2つを組み合わせ、原虫因子の欠損によるステージ転換能への影響の評価。4)親株とノックアウト型原虫株間でのマウスにおける病原性試験。これまでに、4つの遺伝子についてノックアウト型原虫の作製に成功した。また、間接蛍光抗体法を用いて、神経細胞に感染させた原虫のステージ転換効率の評価法を確立した。次に、それらを用いて遺伝子欠損によるステージ転換効率への影響の有無を解析したが、いずれの株においてもステージ転換能に変化はみられなかった。最後に、マウスにおける病原性を比較したところ、4つの内1つのノックアウト型原虫株で致死率が高くなっていることを見出した。ノックアウト型原虫の作出、表現型解析系の確立に成功し、当初の予定通りノックアウト型原虫の表現型の解析にも着手することができたため。おおむね順調に進展していると考える。ステージ転換能の解析結果から、今回着目した原虫遺伝子は少なくともステージ転換の必須遺伝子でないことが示された。その一方で、1つのノックアウト型原虫株で病原性が非常に増加していることが明らかとなった。このことから、本遺伝子は宿主の生存に必要な分子であることが考えられる。この遺伝子は、トキソプラズマのゲノムデータベース上で予測されたhypothetical proteinであり、その性質については全く知られていない。次年度は、病原性に違いを認めた原虫株の機能解析を進める。すなわち、遺伝子ノックアウトによる原虫増殖等の一般性状への影響を調べるととともに、本遺伝子の特異抗体を作製し、局在を明らかとする。さらに、感染マウスにおける病態を病理学的および分子生物学的に解析することで、病原性の違いを引き起こしたメカニズムを明らかとする。
各種排水に対する嫌気好気式生物脱リンプロセスの適用可能性の評価

嫌気好気法によるリン除去過程における有機物代謝機構を明らかにすることにより,各種排水に対する本法の適用可能性を評価するための考え方を示すことを目的として,実験的な研究を行った.得られた結果は以下のようにまとめられる.1.嫌気好気法で生成された.リン含有率の高い汚泥に酢酸を投与した場合,嫌気条件下で酢酸は汚泥に取り込まれ,同時に汚泥内炭水化物の消費とポリヒドロキシ酪酸の蓄積が認められた.ポリヒドロキシ酪酸生成に必要な還元力を炭水化物の代謝により得ているものと推定される.2.酢酸以外に,コトク酸,ピルビン酸,乳酸,プロピオン酸を嫌気的に汚泥に投与した場合にも,汚泥内炭水化物の消費が観察された.汚泥内炭水化物は,嫌気工程における細胞内の参加還元バランスを調整する機能を持つと予想され,このような機能は,リン蓄積を促進するような有機物代謝にとって必須と考えられる.酸化還元バランスの調整の必要無く還元性ポリマーを形成しうるような還元的物質や,蓄積炭水化物による調整機能では還元力を補いきれない酸化的物質を主成分とする排水には,嫌気好気法によるリン除去は適用できない可能性がある.3.汚泥の異化代謝により生成される全ATPのうち,ポリソン酸合成に使われるのは,ポリソン酸含有率が高い汚泥の場合でも1%以下であり,汚泥はポリソン酸蓄積により増殖のためのエネルギーをカットされることがほとんど無いことがわかった.従って,ポリソン酸蓄積汚泥でも,汚泥収率(除去炭素量あたりの生成汚泥量)を維持できる.今後,アノミ酸などの含窒素化合物に対する基礎的検討および上で得られた酢酸をはじめとする各種カルボン酸に関する結果を実プロセスに応用するための検討が必要である.嫌気好気法によるリン除去過程における有機物代謝機構を明らかにすることにより,各種排水に対する本法の適用可能性を評価するための考え方を示すことを目的として,実験的な研究を行った.得られた結果は以下のようにまとめられる.1.嫌気好気法で生成された.リン含有率の高い汚泥に酢酸を投与した場合,嫌気条件下で酢酸は汚泥に取り込まれ,同時に汚泥内炭水化物の消費とポリヒドロキシ酪酸の蓄積が認められた.ポリヒドロキシ酪酸生成に必要な還元力を炭水化物の代謝により得ているものと推定される.2.酢酸以外に,コトク酸,ピルビン酸,乳酸,プロピオン酸を嫌気的に汚泥に投与した場合にも,汚泥内炭水化物の消費が観察された.汚泥内炭水化物は,嫌気工程における細胞内の参加還元バランスを調整する機能を持つと予想され,このような機能は,リン蓄積を促進するような有機物代謝にとって必須と考えられる.酸化還元バランスの調整の必要無く還元性ポリマーを形成しうるような還元的物質や,蓄積炭水化物による調整機能では還元力を補いきれない酸化的物質を主成分とする排水には,嫌気好気法によるリン除去は適用できない可能性がある.3.汚泥の異化代謝により生成される全ATPのうち,ポリソン酸合成に使われるのは,ポリソン酸含有率が高い汚泥の場合でも1%以下であり,汚泥はポリソン酸蓄積により増殖のためのエネルギーをカットされることがほとんど無いことがわかった.従って,ポリソン酸蓄積汚泥でも,汚泥収率(除去炭素量あたりの生成汚泥量)を維持できる.今後,アノミ酸などの含窒素化合物に対する基礎的検討および上で得られた酢酸をはじめとする各種カルボン酸に関する結果を実プロセスに応用するための検討が必要である.本年度は、各種の有機物が嫌気好気式リン除去プロセス内でどのような経路により代謝されるかを調べた。実験室内に設置した2基の半連続式嫌気好気法モデルプラントより得た汚泥に対し、酢酸,グルコース,リンゴ酸,乳酸,グルタミン酸を投与した嫌気回分実験を行った。酢酸の嫌気代謝は次式で説明できることが明らかになった。【(C_6H_(10)O_5)n】+6n【CH_3】COOH +3nATP→汚泥内多糖類酢酸【(C_4H_6O_2)_n】+ 2n【CO_2】+ 3nADP +3nPiポリヒドロキシ酪酸オルトリン嫌気工程でこの反応が生じるためには、好気工程で汚泥内に多糖類が蓄積されている必要がある。この式はポリヒドロキシ酪酸(PHB)合成に必要な還元力を汚泥内に蓄積した多糖類の解糖により得ていることを意味している。以上のことからリン除去のメカニズムとして次のような考え方が導かれる。すなわち、リン除去を安定して維持するには、好気工程での糖蓄積と嫌気工程での還元性ポリマーの蓄積が相補的に生ずる必要があり、しかも嫌気工程においての糖から還元性ポリマーへの電子の移動が生ずることが必須である。このように考えると、還元性ポリマーであるポリヒドロキシ酪酸に転換しやすい酢酸を多く含む廃水ではリン除去能の高い汚泥ができるが、酢酸のみを有機物源とした場合、好気での糖蓄積が生じにくいため、リン除去は不安定になるという結果もよく説明される。酢酸以外の有機物の代謝過程は定量的に追うことができなかったが、ポリヒドロキシ酪酸以外の還元性ポリマー形成や、嫌気条件下におけるタンパク質合成の可能性を示唆する結果が得られている。これらの有機物代謝過程についてはさらに検討が必要である。
分子動力学シミュレーションで探るＤＮＡ配列探索中の蛋白質の分子動態

分子動力学計算により、DNA配列探索中の蛋白質のカイネティクスについて研究を行った。ABFの方法を使って様々な方向にバイアスフォースを加えることで蛋白質の運動を調べた。結合サイトと蛋白質重心間のベクトル方向に力を加えていくと、蛋白質がDNAの溝に沿ってらせん状に動いていく様子が見られた。これは、DNA配列探索中の蛋白質がらせん運動していることを示唆する結果である。自由エネルギー計算の結果からは、蛋白質がいったんDNAに結合すると、解離方向よりもスライド方向に移動しやすいことが分かった。自由エネルギー地形から遷移状態理論をもとに遷移レートを計算するための理論的背景について検証を行った。DNAに結合する蛋白質は、膨大なDNA塩基配列の中からターゲット配列を見つけ出す。配列探索の過程は、遺伝子発現の出発点となる重要な段階であり、これを分子レベルで捉えることができれば、生命現象の本質的理解につながる。しかし、その過程の蛋白質の様子については、はっきりと分かっておらず、議論が続いている。本研究課題では、全原子モデルの分子動力学シミュレーションにより、自由エネルギー地形を計算することで、配列探索中の蛋白質の様子を明らかにすることを目的に研究を進めている。平成26年度は、本研究課題で利用する自由エネルギー計算法のプログラムの改良作業を行った。プログラムのテストは、低分子の系とペプチドの系を用いて行った。開発したプログラムにより計算した自由エネルギーの結果が、長時間シミュレーションから求めた結果と対応することを確認することで、プログラムの正常動作を確認した。また、DNAと蛋白質の相互作用に対して自由エネルギー地形を計算し、DNA配列探索中の蛋白質のカイネティクスについて検討した。蛋白質がDNAから離れる場合の自由エネルギー障壁は、少なくとも16 kcal/mol程度あることがわかった。一方、DNAに沿ってスライド方向に移動する場合については、アンブレラサンプリングによる先行研究があり、自由エネルギーの障壁は、8.7 kcal/mol程度あることが示されている。両者の自由エネルギー障壁を比べると、スライドよりも解離の方が著しく大きい。そのため、蛋白質がいったんDNAに結合すると、解離方向よりも、スライド方向に移動しやすいことが分かった。本研究課題では、全原子モデルの分子動力学シミュレーションにより、自由エネルギー地形を計算することで、配列探索中の蛋白質のカイネティクスを明らかにすることを目的に研究を進めている。これまでAdaptive Biasing Force(ABF)法による自由エネルギー計算のプログラムを開発してきた。この方法は、自由エネルギーの勾配に応じて加えるバイアスフォースを調整することにより、通常の分子動力学シミュレーションではなかなか起こらないレアイベントを誘導し、自由エネルギー地形を効率的に計算することができる。平成27年度は、このプログラムの拡張作業を行い、2次元自由エネルギー地形を計算できるようにした。ABF計算から得られた2次元自由エネルギー地形が、長時間シミュレーションから求めたものと対応することを確認し、計算アルゴリズムの整合性を確認した。また、自由エネルギー地形から分子運動を議論するには、自由エネルギーとレートコンスタントの関係を捉えることが重要になる。そのため、自由エネルギー地形から遷移状態理論を使ってレートコンスタントを見積る手順について検証した。平成27年度は、2次元自由エネルギー地形の計算について、計算プログラムの拡張とアルゴリズムの検証を行った。これは、DNA配列探索中の蛋白質のカイネティクスを議論する上で重要な部分であり、平成27年度はこの部分を構築することができた。おおむね順調に進展しているといえる。また、学会において口頭発表を行うなど、研究成果発表についても予定通り進めることができた。本研究課題では、全原子モデルの分子動力学シミュレーションにより、自由エネルギー地形を計算し、配列探索中の蛋白質のカイネティクスを明らかにすることを目的に研究を進めている。今年度は、DNAと蛋白質の相対的な配置を表わす反応座標を中心に検討し、蛋白質の分子運動について検証した。DNAの長軸方向のみを反応座標とした場合は、蛋白質の配置変化に大きな負荷がかかり、蛋白質の運動を誘導するには適切ではないことが分かってきた。一方、重心間の距離を反応座標に設定し、バイアスフォースを加えて分子動力学計算を行うと、蛋白質が結合サイトから離れようとするが、このときDNAの溝に沿って螺旋状に動いていく様子が見られた。この結果は、DNA配列探索中の蛋白質が螺旋運動をしている可能性を示唆するものである。今後、自由エネルギー地形の観点から、より慎重な議論を進めていく。また、自由エネルギー地形をもとに分子ダイナミクスを議論するために、自由エネルギーと遷移レートコンスタントの関係について検証を行った。反応座標が1次元と2次元の場合でいくつかのケースについてテストし、遷移状態近似のもとで自由エネルギー地形からレートコンスタントを正しく求めることができることを確認した。他に、自由エネルギー地形解析を多次元反応座標へ拡張し、水和イオンの系を対象にテストを行った。平成28年度は、反応座標の検討を行い、DNA配列探索中の蛋白質の運動を検証した。

重心間の距離を反応座標に設定してバイアスフォースを加えた分子動力学計算から、蛋白質がDNA表面を螺旋状に回りながら動いていく過程を導くことができた。この結果は、DNA配列探索中の蛋白質が螺旋運動をしている可能性を示唆するものであり、今後解析を進めていく上で重要な手掛かりを得ることができたといえる。おおむね順調に進展しているといえる。また、学会において口頭発表、ポスター発表を行うなど、研究成果発表についても予定通り進めることができた。DNAに結合する蛋白質は、膨大なDNA塩基配列の中からターゲット配列を見つけ出す。この過程を分子レベルで捉えることができれば、生命現象の本質的理解につながる。本研究課題では、全原子分子動力学計算から自由エネルギー地形を計算することで、配列探索中の蛋白質のカイネティクスを明らかにすることを目的に研究を進めた。まず、計算プログラムの拡張作業を行い、水和イオンやペプチドの系を用いてテストした。2次元自由エネルギー地形が、長時間計算から求めたものと対応することから計算法の正しさを確認した。DNAと蛋白質の相互作用に対する自由エネルギー地形の計算から、DNA配列探索中の蛋白質のカイネティクスについて検討した。蛋白質がDNAから離れる場合の自由エネルギー障壁は、スライド方向に対する自由エネルギーの障壁と比べて、著しく大きい。そのため、蛋白質がいったんDNAに結合すると、解離方向よりも、スライド方向に移動しやすいことが分かった。また、導かれた自由エネルギー地形から蛋白質の分子運動を議論するために、自由エネルギー地形から遷移状態理論を使ってレートコンスタントを見積る手順について検証した。その結果、エネルギー障壁だけでなく、他の状態からの寄与を考慮することで、遷移レートをより正確に議論できることが分かった。反応座標の検討では、DNA長軸方向を反応座標とすると、蛋白質の配置変化に大きな負荷がかかり、蛋白質の運動を誘導できなかった。一方、重心間の距離を反応座標に設定し、外力を加えていくと、蛋白質がDNAの溝に沿って螺旋状に動いていく様子が見られた。DNA配列探索中の蛋白質が螺旋運動をしている可能性を示唆する結果が得られた。また、開発した自由エネルギー地形解析を蛋白質ー低分子相互作用の系に適用し、反応座標を適切に設定することで、様々な生体系の分子カイネティクス解析に応用できることを示した。分子動力学計算により、DNA配列探索中の蛋白質のカイネティクスについて研究を行った。ABFの方法を使って様々な方向にバイアスフォースを加えることで蛋白質の運動を調べた。