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介護資格制度の社会的意義と課題の検討－パーソナルアシスタンスの実現に向けて

研究目的は、障害者福祉から考える介護資格制度の意義と課題の検討である。研究方法は介護政策の変遷に関する文献研究と障害当事者団体へのインタビュー調査である。研究結果として、介護資格制度には「質の担保」、「介護技術の標準化」、「介護職の社会的評価」という意義があるが、一方で主体性や個別性を重視する障害者の自立生活から考えれば、介護資格制度の取得状況と実際の介護の質が必ずしも連動しないことが明らかになった。平成25年度は、介護資格について制度・実践・言説の変遷を追うために、文献を精読・整理し、資格制度史を明らかにするという計画を立てていた。現在、介護保険法や障害者総合支援法に基づいての訪問系介護の従事にあたり、それには資格要件が課されている。それがいかなる背景のもとで制度化され、現在に至るのかという点を研究課題として立てていた。それは、平成26年に正式に国内批准された障害者権利条約で定められる「パーソナルアシスタンス」の実現を目指すうえで、検討すべき課題の一つであり、それに取り組む意義があると考えている。本研究を行うにあたっての柱は大きく二つある。一つは、時系列に即し、介護資格制度に係る制度・実践・言説の変遷をまとめることである。訪問介護従事者の研修については家庭奉仕員制度時代から、現在の介護福祉士・介護職員初任者研修に至るまで、度々の要綱改定を経ている。そうした変遷について、文献精読を通しデータ化する作業を行いながら、その内容を把握することができている。もう一つの柱は、パーソナルアシスタンスの思想と実践の軌跡を、先に述べた介護資格制度の変遷に照合させまとめることである。パーソナルアシスタンスの思想と実践は、障害者の自立生活運動により培われている。障害者の自立生活理念は、障害者本人が生活の主体であるという点にあり、介護においても、誰に介護を依頼し、どのような方法で介護を受けるのかを、障害者本人を中心に、必要に応じてその支援者がサポートしながら行うことを意味する。そうした理念を重視してきた障害者自立生活運動にとって、介護従事要件として「障害者本人の推薦」に先だって資格要件が厳密に定められることへの違和が、これまで表明されてきた。介護資格制度の成り立ちと変遷及び障害者自立生活運動の理念とその運動軌跡に着目しながら、その動向を整理したことが、平成25年度の研究実績である。平成26年度は、障害者等の介護を必要としている人々及び介護従事者・介護派遣事業者が、介護資格制度をどのように意味づけてきたのか、また現在どのように意味づけているのかという点について、調査研究を行った。ここでいう介護従事者・介護派遣事業者について、2000年の介護保険制度開始以降、多様な供給主体が介護派遣事業を展開してきたが、そのなかでも1970年代からの障害当事者運動にルーツをおく従業者や事業者を対象にしている。調査地域については、特に障害者自立生活運動や、公的介護保障要求運動の全国動向を検討のうえ、先進地域である東京都・大阪府・大阪市・名古屋市における状況を調査した。調査方法はドキュメント分析とインタビュー調査の方法を採っている。以下は、調査に基づき得られた知見である。2003年度から、これまでいくつかの自治体独自で実施されてきた全身性障害者介護人派遣事業は法に基づく障害福祉サービスへと編成され、それによって介護従事には資格取得や研修受講が必須となった。こうした介護従事への資格要件化について、障害当事者運動は人材の確保への不安や資格教育の内容から、また、障害者と介護者との個と個の関係に重きをおくとともに障害者本人を自立生活の中心におくという志向から、否定的評価を下してきた。一方で、障害者の介護保障の基盤を作り、介護を「仕事」として成り立たせるために、介護の事業化の必要が主張され、それに付随して資格要件は一定受け入れざるをえないという認識が存在した。加えて、養成研修を行うからには、その内容が現場実践に資するものであり、かつ障害当事者が研修講師となるようにと検討されてきた。平成27年度は2つの面から研究を行った。1つは障害者総合支援法見直し議論の中でどのようにパーソナルアシスタンス(以下PA)が議論されてきたかを検討し、その要点を示すことである。これは平成28年度を目途とした障害者総合支援法施行3年後見直しの論点の一つに、PAが含まれたためだ。社会保障審議会等、各種の審議会の資料・議事録とともに、先行研究による文献研究の方法を採っている。結果として、PAは2011年の総合福祉部会による骨格提言や障害者権利条約を背景にした議題であったが、次の点からその実施が困難だと政策上考えられてきた。1PA制度「新規」創設への懸念、2ダイレクトペイメントへの懸念、3意思決定支援の必要な障害者への権利擁護、PAが適切か否か、4財源確保。これらの点について、これまでの施策・障害当事者運動の言及等と照合して検討し、重度訪問介護の発展的継承としてPAがあることやPAの提供形態は必ずしもDPのみではないことの明確化、PAの「実際」を起点に権利擁護について考える必要、財源確保のための試算の必要といった、PA実施に向けて検討すべき要点を明らかにした。もう1つは、障害当事者運動体がどういうプロセス(認識の変容を含む)を経て介護の事業化に至ったのかを明らかにするため、特に介護の事業化が企図された1980年代に焦点を当て研究を行った。明らかになった事柄は以下の通りである。

1980年代大阪での障害当事者運動の周辺で起きていた在宅障害者の介護に関する生活課題に対し、それ以前の運動体で行われていたように、その責任を障害者と健常者との「個の関係」の中におくのではなく、介護を「制度化」させていくべく行政に対し「公的」介護保障を要求する方向性にシフトしていく様相が明らかになった。そして、障害者運動として安定した介護派遣を行うための「事業化」にあたり、その財源と方法についても明らかにした。研究目的は、障害者福祉から考える介護資格制度の意義と課題の検討である。研究方法は介護政策の変遷に関する文献研究と障害当事者団体へのインタビュー調査である。研究結果として、介護資格制度には「質の担保」、「介護技術の標準化」、「介護職の社会的評価」という意義があるが、一方で主体性や個別性を重視する障害者の自立生活から考えれば、介護資格制度の取得状況と実際の介護の質が必ずしも連動しないことが明らかになった。達成度については「やや遅れている」と評価している。調査により一定の知見を見出すことができているのだが、その成果をもとに査読付き論文を出すことができなかった。本研究テーマについて、さらなる調査実践と分析を重ね、成果を発表する必要があると判断し、上記の評価とした。社会福祉学平成27年度が最終年度となるため、これまでの研究をさらに継続させつつ、とりまとめができるように進めていく。平成26年度に行った各自治体での調査研究は、平成27年度前期まで継続して行う。加えて、知的障害のある人々への介護と、その従事のための資格要件の在り方についても、調査研究を進めていく。そうした調査研究および文献研究の結果をふまえてとりまとめを行う。達成度については、「やや遅れている」と評価している。介護資格制度の変遷を追うという課題については、その始まりから現在までを一定追うことができており、そこでの知見を論文化することもできている。しかし、査読付き論文の採択がかなわなかったこととともに、変遷を追うという作業の中で、おりおりに、さらに重点的に調査研究する必要性が見出されたため、平成26年度に積み残しているものもあることから上記の評価を行った。研究計画と比較すると、平成26年度の調査研究の進捗状況が遅れているため、人件費やデータ文字おこしにかかる費用(その他)の支出が減じ、差が生じている。平成26年度は、障害者等の介護を必要としている人々及び介護従事者・介護派遣事業所が、介護資格制度をどのように意味づけてきたのか、また現在どのように意味づけているのかという点について、調査研究を行う。特に、全国の障害者の自立生活運動推進の動向を検討のうえ、先進地域における状況を調査する。平成25年度にその予備的調査を行っており、平成26年度に行う調査地域として、東京・大阪・名古屋を計画している。加えて、平成25年度の研究結果から、各地域における障害者介護保障運動の変遷と実態を、より詳細に探究する必要性を認識している。その点も十全に踏まえての調査研究を行う予定である。平成27年度は、平成26年度に引き続き調査研究を行い、年度後半からは研究のとりまとめを行う。研究計画立案当時、「その他」項目である文献複写代金に多くの予算を充てていたが、必要な文献を実際に集めると予算額に至らず、そこに誤差が生じたため。
びびり振動を自動回避する次世代工作機械の開発

高度な知識や作業を必要とせずにびびり振動の回避を実現する手法の提案と,これを実行する次世代工作機械の実現可能性について検討を行った.提案手法では,加工中に計測される信号を利用してびびり振動の種類を判別し,強制型/再生型が生じにくい条件の予測を行う.これを繰り返すことでシステマティックにびびり振動を回避する条件の推定と最適化を行う.さまざまな条件で検討を行った結果,提案手法により,従来の安定限界推定手法などと比較してより精度良く,かつ容易に安定な条件を予測/最適化し得ることを確認した.高度な知識や作業を必要とせずにびびり振動の回避を実現する手法の提案と,これを実行する次世代工作機械の実現可能性について検討を行った.提案手法では,加工中に計測される信号を利用してびびり振動の種類を判別し,強制型/再生型が生じにくい条件の予測を行う.これを繰り返すことでシステマティックにびびり振動を回避する条件の推定と最適化を行う.さまざまな条件で検討を行った結果,提案手法により,従来の安定限界推定手法などと比較してより精度良く,かつ容易に安定な条件を予測/最適化し得ることを確認した.本研究では,高価な設備や作業者の知識を必要とせずシステマティックにびびり振動の回避を実現する手法の提案と,これを実行する次世代工作機械の開発を目的としている.これを実現するためには,びびり振動における振動発生メカニズムとびびり振動周波数の特徴に着目し,加工中に計測されるびびり振動の測定信号を利用して,まず,びびり振動の種類を判別し,それに基づいて適切な加工条件を推定する必要がある.そこで,さまざまな実験条件において評価を行い,一部の加工条件を除くと,大まかに振動の測定信号からそのびびり振動の種類を判別することができ,適切な条件を推定し得ることを確認した.また,測定の手段として加速度センサやマイクロフォン,渦電流変位計などが有効であることを確認した.その一方で,自励型びびり振動の場合には,半径方向切込みや主軸回転数が小さい条件などでは判別が難しく,これに起因してびびり振動を回避する主軸回転数条件の推定精度が低下してしまう場合があることを確認した.このため,実験結果と安定限界解析の比較を詳細に行い,そのメカニズムについて検討を行った.また,自励型びびり振動に関するメカニズムの更なる深い理解と,応用的な高精度解析モデルが必要であると考え,伝達関数の高精度推定手法やボーリングプロセスなどに対応した解析モデルの検討,自励型びびり振動に対するモードカップリングと再生効果の影響の切り分けなどについて検討を行った.本研究では,高価な設備や作業者の知識を必要とせずシステマティックにびびり振動の回避を実現する手法の提案と,これを実行する次世代工作機械の開発を目的としている.昨年度までに,多くの条件で提案手法によってびびり振動の種類の判別と適切な条件の推定が実現できることを確認したが,半径方向切込みや回転数が小さい場合など一部の条件では,びびり振動の種類の判別が難しく,適切な条件の推定が困難となる場合があることを確認した.そこで,そのような例外的な条件(主に半径方向切込みや回転数が小さい条件)に関して,その理由/現象を明らかにするとともに,対応する新たな解析モデルの定式化について検討を行った.その結果,切削プロセスが深く関与していることを明らかにした.さらに,プロセスのモデル化を行って従来解析モデルを修正することにより現象の推定が可能となり,これをびびり振動回避のアルゴリズムへ実装することにより,提案手法の高精度化を実現し得ることを確認した.さらに,不等ピッチ工具や,ボーリング加工への応用として,それぞれのプロセスに対応する解析モデルの定式化を行った.その結果,定式化に基づいて安定限界推定が可能であることを確認した.また,ボーリング加工に対しては,開発したアルゴリズムによりびびり振動回避ができることを確認した.以上の検討により,応用的な加工条件に対しても適用が可能であり,総合的に判断しても提案手法の実用性が高いことを明らかにした.
非線形拡散方程式における界面ダイナミクスと進行波の大域的解構造の研究

非線形拡散方程式系の研究の基礎をなす線形の熱方程式についての研究を行って、KPP-フィッシャー方程式やある臨界指数以上の指数をもつ藤田型の半線形熱方程式で報告されているような不規則長時間挙動が、1次元の線形熱方程式についてはスケーリングされた変数で解を観察することにより、その詳細が明らかになるということを示した。さらに、線形方程式で明らかになった長時間挙動と同様な結果が非線形方程式で成立する条件について検討を行った。非線形の拡散現象を記述する放物型方程式に関して、その理解に重要な対象である界面と進行波のダイナミクスについて研究を行った。非線形系の拡散現象は、物理学、化学、生物学、さらに近年は金融工学上のモデル等、多くの分野で現れる。それらの中には、急激な状態変化が狭い領域に集中する界面と呼ばれる局在構造が現れて、この界面の示す振る舞いを理解することが非線形現象を解明する上での鍵になることが数多くある。単独、あるいは連立の非線形拡散方程式で記述される拡散現象では、界面の動力学を支配する方程式が、形式的な漸近展開によって、空間内の曲面の発展方程式として導かれている。これらの方程式は、微分幾何学的には広い意味で平均曲率流方程式と呼ばれるものとなる。拡散現象が単独の2階放物型方程式で記述されている場合には、導出の数学的正当化がすでに多くの研究者の努力の結果、ほぼ満足のいく形で成功している。本年度は特に、昨年度の研究結果を引き継いで、非線形拡散方程式系の研究の基礎をなす線形の熱方程式についての研究を行った。昨年度においては、KPP-フィッシャー方程式やある臨界指数以上の指数をもつ藤田型の半線形熱方程式で報告されているような不規則長時間挙動が、1次元の線形熱方程式についてはスケーリングされた変数で解を観察することにより、その詳細が明らかになるという予想を得たが、本年度はこの予想を証明すると同時に、多次元への拡張を検討した。23年度、24年度は非線形拡散方程式系の研究の基礎をなす線形の熱方程式についての研究を行って、KPP-フィッシャー方程式やある臨界指数以上の指数をもつ藤田型の半線形熱方程式で報告されているような不規則長時間挙動が、1次元の線形熱方程式についてはスケーリングされた変数で解を観察することにより、その詳細が明らかになるということを示したが、本年度は線形方程式で明らかになった長時間挙動と同様な結果が非線形方程式で成立する条件について検討を行った。その結果、極一部の非線形方程式については同様の長時間挙動を示すことが期待できることがほぼ確実であるとの観察を得ることができた。本年度は特に、4階以上の高階の放物型偏微分方程式に現れる界面のダイナミクスについて研究を行った。その結果、平面上で平行移動と回転、及び、反転に対して方程式が不変である場合、定常波を緩く歪めて構成される界面のダイナミクスは、曲線短縮流によって近似できることを形式的に示すことができた。この形式的導出を厳密に正当化することは、今後の課題である。また、非線形拡散方程式系の研究の基礎をなす線形の熱方程式についての研究を行った。その結果、KPP-フィッシャー方程式やある臨界指数以上の指数をもつ藤田型の半線形熱方程式で報告されているような不規則長時間挙動が、1次元の線形熱方程式についてはスケーリングされた変数で解を観察することにより、その詳細が明らかになるということが予想できた。非線形の拡散現象を記述する放物型方程式に関して、その理解のために重要な対象である界面と進行波のダイナミクスについて研究を行った。

界面のダイナミクスについては、比較定理や変分構造を有さない一般の連立系に対して、界面ダイナミクスの縮約系として平均曲率流が現れることを数学的に厳密に示すことを一つの目的としている。非線形系の拡散現象は、物理学、化学、生物学、さらに近年は金融工学上のモデル等、多くの分野で現れる。それらの中には、急激な状態変化が狭い領域に集中する界面と呼ばれる局在構造が現れて、この界面の示す振る舞いを理解することが非線形現象を解明する上での鍵になることが数多くあると認識されている。単独、あるいは連立の非線形拡散方程式で記述される拡散現象では、界面の動力学を支配する方程式が、形式的な摂動展開によって、空間内の曲面の発展方程式として導かれている。これらの方程式は、微分幾何学的には広い意味で平均曲率流方程式と呼ばれるものとなる。拡散現象が単独方程式で記述されている場合には、導出の数学的正当化がすでに多くの研究者の努力の結果、ほぼ満足のいく形で成功している。連立の方程式系の場合にも、その系が比較定理、ないしは変分構造を有するならば、単独方程式の場合と同様にして、導出の正当化を行なうことが可能である。一方、この種の`数学上の良い構造'を持たない一般の連立系に関しては、数学的正当化は得られていない。良い数理構造を必ずしも持たない一般の連立系に関して界面運動の支配方程式として、平均曲率流方程式を数学的に導出することを研究目的の一つとしている。当該年度は、その目的のための重要なステップになると思われる、楕円型線形偏微分作用素のスペクトルの研究を行った。非線形拡散現象を記述する種々の放物型方程式に関して、その大域的な解構造の理解において鍵となることの多い界面と進行波の動力学について研究を行った。界面のダイナミクスについては、一般の連立拡散方程式系に対して、界面の動力学を記述する縮約力学系として平均曲率流方程式が導かれることを数学的に厳密に示すことを、大きな目標の一つとしている。非線形の拡散現象は多くの分野において現れるが、それらの中では、さらに、急激な状態の変化がごく狭い部分に集中した界面と呼ばれる局在構造が現れることが多くある。非線形の拡散方程式系で記述される拡散現象では、形式的な摂動展開によって、この界面のダイナミクスを支配する方程式が、空間の中で時間変化する曲面の方程式として導かれるが、この曲面に関する方程式は広い意味で平均曲率方程式と呼ばれるものになる。これらの導出の数学的な正当性は、導出の元となる拡散方程式系が、比較定理ないしは変分構造を有する場合については、すでに満足のいく形で得られている。しかしながら、より一般の連立拡散方程式系については、十分な正当化は得られていない。本研究課題の研究代表者は、一般の連立系に対して正当化を得るための重要なステップとして、連立系の線形化作用素である楕円型方程式の固有値・固有関数などのようなスペクトルに関する情報を詳細に得ることが必要であると予想をしている。そのため、当該年度は、昨年度に引き続き、楕円型線形偏微分作用素のスペクトルの研究を深め、そのスペクトルの構造と曲率流方程式の間にある関連性を追及した。
マウス蝸牛組織における自然免疫応答の検討

NLRP3はマクロファージなどの自然免疫担当細胞に発現している蛋白質である。NLRP3の機能獲得型変異は、NLRP3インフラマソームを活性化しInterleukin-1βの分泌を促すために、全身性自己炎症性疾患を引き起こす。我々は、NLRP3の機能獲得型変異が非症候群性難聴も引き起こすことを明らかにし、その病態として、蝸牛局所でNLRP3インフラマソームが活性化されるためと仮定した。この仮説を証明するために野生型マウスを用いて実験を行い、マクロファージが蝸牛局所に存在すること、マクロファージにNLRP3インフラマソームを構成する蛋白質のmRNAが存在することを明らかにした。我々は非症候群性遺伝性難聴家系の原因遺伝子がNLRP3であることを明らかにした。現在までにNLRP3は全身性自己炎症性疾患であるクリオピリン関連周期熱症候群の原因遺伝子であることが同定されており、本疾患の患者では機能獲得型変異により自然免疫担当細胞から恒常的にInterleukin-1β(IL-1β)が分泌されるために全身性炎症が生じると考えられていた。本家系の患者では難聴以外に臨床症状がなかったため、NLRP3の機能獲得型変異により全身性炎症の一部症状として蝸牛のみに炎症が生じているとは考えにくい。そこで我々は、蝸牛内に組織マクロファージが存在し、それらの細胞でIL-1βが分泌されたために蝸牛局所に炎症が惹起され非症候群性難聴が生じたという仮説を立てた。本研究では、この仮説を証明することを目的とした。これまでに、マクロファージ特異的な抗体を用いて、マウス蝸牛内に組織マクロファージが存在することを明らかにした。また、マウス蝸牛内の組織マクロファージにNLRP3インフラマソームを構成する蛋白質(NLRP3, ASC, Pro-caspase-1, IL-1β)のmRNAが存在することをRT-PCR法にて明らかにした。またこれらの蛋白質のmRNAの経時的な変化をQuantitative-PCR法により評価した。平成27年度は、マウス蝸牛内に組織マクロファージが存在するか、マウス蝸牛内の組織マクロファージにNLRP3インフラマソームを構成する蛋白質(NLRP3, ASC, Pro-caspase-1, IL-1β)が発現しているか評価することを目的としていた。平成27年度中にこれらの項目について実験が終了しており、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。我々は非症候群性遺伝性難聴家系(DFNA34)の原因遺伝子がNLRP3であることを明らかにした。また、マウス蝸牛内の組織クロファージにNLRP3インフラマソームを構成する蛋白質(NLRP3,ASC,Pro-caspase-1,IL-1β)のmRNAが存在することをRT-PCR法にて明らかにした。これらの蛋白質のmRNAの蝸牛組織における経時的な変化をQuantitative-PCR法により評価するとともに、蝸牛内におけるこれらのmRNA発現量を、NLRP3インフラマソームが存在することが報告されている他の組織(脳、肺、肝臓)におけるmRNA発現量と、Quantitative-PCR法で比較した。平成28年度は、組織マクロファージにおいてNLRP3インフラマソームが活性化されるか、さらに蝸牛内においてIL-1βの下流の炎症性サイトカイン(IL-6、IL-8)が上昇するか評価する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。耳鼻咽喉科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
経済的状況におけるコミュニケーションの役割に関する実験、および理論研究

次の四種類の情報が独裁者ゲームにおける提案者の行動に及ぼす影響について経済学実験によって検証した。情報Oは、提案者の選択に対する受容者の評価、情報Pは提案者の選択に対する受容者の期待、情報Qは受容者が提案者となった場合の選択、そして情報Rは他の被験者たちが提案者となった場合の選択に関する情報である。各情報の間には、理論的な関係が想定可能であるため、すべての情報を同時に被験者に与えることで、他の情報の効果を取り除いた純粋な効果の有無を各情報について抽出した。分散分析の結果、情報O、Q、Rそれぞれの主効果に有意差が確認された。また、情報Pの主効果は有意でなかったものの、情報Qとの間に交互作用が確認された。この交互作用は、提案者は利己的な受容者の期待は無視するが、利他的な受容者の予想を裏切らないように行動することを示唆している。今年度はコミュニケーションに関する新しい理論モデルの構築に従事した。具体的には、Battigalli, p. and Dufwenberg, M. (2007)が提示した、他者の期待に反する行為をすることで罪の意識を感じるという人間モデルを改良することで、過去の実験結果を説明することを試みた。これまでに実施した実験結果の主な特徴は、「声」のオプションが付いた独裁者ゲームにおいて、(1)被独裁者が自分の取り分として等分以下を提案したときは独裁者はそれに従う傾向があるものの、(2)等分より多い貪欲な提案をした被独裁者に対しては一切の分け前を与えないというものである。Battigalli, P. and Dufwenberg, M. (2007)のモデルでは、他者の期待に対して何ら規範的制約を課していないため、そのままでは実験結果を説明するようなモデルに応用することはできない。そこで「他者が抱くあるプレイヤーへの期待」を、「そのプレイヤーが従うべきと他者が考える社会規範」と解釈することにより、「他者の期待」に関する妥当性を導入した。現在までに開発した理論モデルでは、被独裁者が取り分として等分以下を提案した場合の独裁者の行動、つまり(1)については説明することに成功したが、等分よりも多い貪欲な提案をされた場合の独裁者の行動、(2)については整合的な結果が得られていない。現在のバージョンでは貪欲な提案をした被独裁者に対しては常に等分を与えるという理論的結果となる。来年度はさらなる改良を行うことで、貪欲な被独裁者に対してある種の罰を与えるような独裁者の行動を説明する。本研究課題は、利害対立の状況においても人々がコミュニケーションによって互いの行動を調整することを実験的に明らかにし、その理論的根拠を提示することである。昨年度までの研究では、Battigalli, P.and Dufwenberg, M.(2007)が提示した罪回避の理論を修正することでこれまでの実験結果を説明することを試みた。罪回避の理論では、プレイヤーは相手プレイヤーの期待を裏切ることで罪の意識を感じるとされるが、罪の意識を感じるのは、その期待が妥当であった場合に限定するという修正を行ったのである。本年度は、独裁者ゲームを基にした次のような実験によって、期待の妥当性がどのようにして与えられるのかについて検証した。通常の独裁者ゲームと同様に、提案者がある一定金額のパイに関する配分を選択し、その選択がそのまま提案者と受容者の配分として確定するが、提案者は配分を選択する際に複数の情報を参照することができる。第一の情報は提案者の選択に対する受容者の期待、第二の情報は提案者の選択に対する受容者の評価、第三の情報は受容者が提案者となった場合の選択、そして第四の情報は他の提案者たちの選択に関する情報である。実験では、すべての情報を同時に被験者に与えることで、他の情報の効果を取り除いた各情報の純粋な効果と情報間の交互作用を抽出した。実験結果は、受容者の期待についてその主効果が検出されなかったものの、上記第三の情報との間に交互作用が検出された。また、他の情報との間には交互作用は検出されなかった。すなわち、提案者は利他的な行動を選択する受容者の期待を裏切らないように配分を選択するが、利己的な行動を選択する受容者の期待は無視したのである。この実験により、ある個人が他者の期待を裏切ることで罪の意識を感じるのはその期待が妥当であった場合に限ること、また、その妥当性は、期待の内容とそれを抱く他者の行動との整合性によって与えられることが明らかになった。
CALRが関わる造血シグナル伝達と、その破綻による骨髄増殖性腫瘍発症機序の解明

In vitro解析では、様々な変異CALR変異体を用いて、変異CALRの活性責任部位の同定を進めている。また、糖鎖欠損細胞株を用いた解析によりCALR変異の活性に与える糖鎖修飾の影響を明らかにした(解析中)。In vivo解析では、マウスCALR塩基配列の一部をCRIPR/Cas9を用いて欠失させ、ヒトと相同的な変異をノックイン(KI)したKIマウスの作成に成功し、KIマウスが血小板増多症を発症することを明らかにした(Blood Cancer J.2019)。更に、CALRのハプロ不全モデルとしてのhetero KOマウス、及び完全欠損モデルとしての血球特異的なconditional KOマウスの作成に成功した。そして、RNA発現は野生型とマウスと変わらないにも関わらず、CALRのシャペロン機能不全によりタンパク発現が欠損している分子の存在を見出した。また、CALR不全は造血幹細胞の機能に影響を与えることを世界で初めて見出した(米国血液学会2018)。「変異CALRのin vitro解析」、「変異CALR、及び正常CALRのin vivo解析」の2つのテーマについて一定の成果をあげることができた。前者のテーマでは、まずヒト血球系細胞株の中で、巨核球の形質を有する細胞株の中から、MPLを恒常的に発現している細胞株をスクリーニングした。次にそれらの細胞にCRISPR/Cas9システムを用いてCALR変異をノックインしたところ、細胞増殖の亢進やサイトカイン非依存性が獲得されることを明らかにした。更に詳細なメカニズムを明らかにすべく解析を進めている。後者のテーマでは、MHC classIプロモータの制御下に変異CALRを発現するトランスジェニック(TG)マウスを作成し、ヒトET様のMPNを発症することを示した。また、CRIPR/Cas9システムを用いて、ヒトと相同的な変異をノックインしたマウスの作成に成功し、解析を開始している。当初の計画どおりに、使用するDNAコンストラクト作成、ツールとなる技術の確立、細胞株、組み換えマウス樹立などを実施することができた。In vitro解析では、様々な変異CALR変異体を用いて、変異CALRの活性責任部位の同定を進めている(解析中)。また、糖鎖欠損細胞株を用いた解析によりCALR変異の活性に与える糖鎖修飾の影響を明らかにしつつある(解析中)。In vivo解析では、マウスCALR塩基配列の一部をCRIPR/Cas9を用いて欠失させ、ヒトと相同的な変異をノックイン(KI)したKIマウスの作成に成功し、KIマウスが血小板増多症を発症することを明らかにした(論文投稿中)。そして、RNA発現は野生型とマウスと変わらないにも関わらず、タンパク発現が欠損している分子の存在を見出した。これは、CALRのシャペロン機能不全によると考えている。現在、CALR不全は造血幹細胞の機能に影響を与えること、一定の条件化で白血病が高率に発症することよりCALRにはtumor suppressorの機能があることなども明らかにしつつあり、解析を進めている。また、MPNに対するTYK2蛋白を標的とした新規治療法の可能性や、同疾患におけるHMGA2遺伝子とJAK2の協調について解明した。当初の計画通りに使用するDNAコンストラクト作成、ツールとなる技術の確立、細胞株、組み換えマウスの樹立と解析などを実施することができた。今後は、「変異CALRのin vitro解析」テーマについては、変異CALR分子と、それにより活性化されるMPL分子の活性責任部位を同定する研究を進めて行く。「変異CALR、及び正常CALRのin vivo解析」テーマについては、作成に成功したノックインマウスの表現型解析を進めると共に、正常CALR欠損マウスについても、作成と解析を試みていく。in vivo解析では、CALRのハプロ不全マウス、及び血球特異的なconditional KOマウスの解析を進め、見出しつつある表現型のメカニズムについて、解析を加えていく。
網膜特異的蛋白の発現に関与する転写因子(RX,CRX)の転写調節機構について

ロドプシンやIRBP、アレスチンといった網膜特異的蛋白の遺伝子のプロモーター部位にはPCE-1領域(CAATTAA/G)とOTX領域(TGATTAA)というシスエレメントが存在しており、OTX領域にはCRXとよばれるホメオボックス型転写因子が結合することが知られていた。我々の一連の研究は、PCE-1領域に結合する転写因子を同定し、網膜特異的遺伝子の発現にそれらがいかに関わりあっているかを検討することにあった。我々はまずPCE-1領域をプローブにしてサウスウェスタン法にて、RXと呼ばれるホメオボックス遺伝子を同定した。次に抗RX抗体を用いて、ウェスタンブロット法と免疫染色法を行い、RXが網膜特異的に存在し、網膜視細胞層以外にも内顆粒層や神経節細胞層など網膜全体に存在することを示した。さらにEMSA法にてRXがPCE-1領域に結合するのを確認した。また変異をつけたプローブによるEMSA法にて、RXとCRXという似通った転写因子が結合領域のコア(ATTAA)の前の2塩基対(CAかTG)によって結合特異性が違ってくることを明らかにした。次いで我々はCATアッセイにてRX, CRXによる綱膜特異的遺伝子のプロモーターの転写調節活性を調べた。RXもCRXもアレスチンやIRBPプロモーター活性を量依存的に増加させた。それに対しアレスチンプロモーターのPCE-1領域のみに変異をつけるとRXによる活性のみが低下した。さらにRX, CRXの領域特異的なプロモーター活性をみるため、PCE-1とOTXをつないだCAT遺伝子を作成し、RX, CRXを導入して実験を行ったところ、PCE-1ではRXのみが、OTXではCRXのみが活性を増加させた。これらのことから、網膜特異的遺伝子の発現にはPCE-1とOTX領域が必要であり、それぞれRX、CRXという転写因子が領域特異的に結合し、活性化していることが明らかにされた。(方法)pGEX4T-1に組み込んだhumanRXを発現させ、GST-RX融合蛋白を作成した。この蛋白2mg/0.5mlをアジュバントとともにウサギに免役し、5週後に抗Rx抗体を得た。ウシ網膜、水晶体、虹彩、マウス脳、肝臓をRIPA bufferにてホモジナイズし、それぞれの組織蛋白を精製した。これら蛋白をSDS-PAGEにて電気泳動し、ブロッターにてニトロセルロース膜に蛋白をブロットしたものを1000倍希釈の抗RX抗体にてインキュベートした後、ペルオキシダーゼラベルされた抗ウサギIgG二次抗体に反応させ発色させた。(結果)網膜と虹彩のみで特異的に37kDaのbandが見られた。他の組織で見られたbandは抗原とincubateしたRX抗体でも見られ、非特異的なbandと思われる。ラット眼球をパラフィン固定し、前述の抗RX抗体を用いて免疫組織染色の実験を現在進行中である。レポータージーン(アレスチンプロモーター/CAT等)とエクスプレッションベクター(CMV-RXやCMV-CRX)をニワトリ胎児網膜プライマリカルチャーや網膜芽細胞、あるいはcos細胞などに導入しそれぞれの細胞内でのRXもしくはCRXのプロモーター活性を見る実験が進行中である。免疫組織染色(方法)ヒトRXcDNAをpGEX発現ベクターに組み込み、バクテリアでGST-RX融合蛋白を作成、精製し、ウサギにアジュバントとともに注射し、ポリクロナル抗体を作製した。ラット眼球をパラフィン固定し、Vector社のAEC kitにて免疫染色を行った。(結果)(方法)マウスアレスチンプロモーターおよびマウスIRBPプロモーターをpSVCATに組み込みレポータージーンを作成する。

RX、CRXをpCDNA3に組み込みこれを発現ジーンとし、293 cellにco-transfectし培養する。3日後に細胞をホモジナイズし得られた、蛋白を用いてCAT assayを行った。(結果)アレスチン、IRBPプロモーターともRX, CRXをtransfectすることによりdose dependentにプロモーター活性の上昇を見た。またRX, CRXを同時にtransfectするとsinergicにプロモーター活性を上昇させた。このことから、RX, CRXは協調的に網膜特異的なプロモーターを活性化していることがわかった。次年度はRX, CRXが本当にPCE1,OTX site特異的に結合し、プロモーター活性を上昇させているのか、新しいconstructやmutantを作成して、研究を行う予定である。CATassayによるRX, CRXの特異的シス領域の活性化目的:平成14年の実験でCAT assay法を用いてRX, CRXがアレスチンおよびIRBPのプロモーターを活性化することを明らかにした。アレスチンやIRBPのプロモーターにはRXが結合するPCE-1サイト(CAATTAG)とCRXが結合するOTXサイト(TGATTAA)が存在する。今年度の実験はRXとCRXが特異的にそれぞれの領域に結合して活性化することを明らかにすることにある。方法:プロモーターをCAT上流に組み込みレポータージーンを作成する。結果:まずマウスアレスチンプロモーターのPCE-1サイトCAATTAGをCAACCAGに変えたものをpsvCATに組み込みレポータージーンとしてCAT assayを行うとCRXで活性化するもののRXでプロモーターは活性化されなかった。さらにtkプロモーターを上流に持つCATジーン(pTKCAT5)にPCEサイトおよびOTXサイトを2個ずつtandemに組み込んでCAT assayを行った。PCE-1を組み込んだレポータージーンはRXが、OTXを組み込んだものはCRXがそれぞれ特異的に活性化することが示された。結論:このことにより我々が過去に行った結合実験と組み合わせて考えると、アレスチン、IRBPのプロモーターにあるPCE1,OTXというシス領域に転写因子RX, CRXがそれぞれの特異的に結合し活性化していることが明らかになった。
ミトコンドリア内への過剰なＣａ２＋流入を感知・抑制する蛋白質複合体の構造生物学

所属研究室で見出されたミトコンドリアへの過剰なカルシウム取り込みの制御HAX-1-UCP3複合体に着目し、構造生物学的手法(X線回折実験・NMR法)を駆使して、この複合体の構造機能相関研究を行った。これまでに、以下のことを明らかにしてきた。1HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれC末端側領域(HAX-1(211-280))とミトコンドリア内腔に存在するループ2領域(UCP3(165-175))であること及び両者の結合にはカルシウムの存在が必須であること。2HAX-1(211-280)に関しては、カルシウムと直接結合すること及びその結合により大きな構造変化(部分的なフォールディング)が誘起されること。3HAX-1は、カルシウムとの結合により膜結合性を獲得すること。4HAX-1のC末端側の膜結合に関わるαヘリックスを除去すると、UCP3ループ2との結合は維持されるが、カルシウムと直接結合できなくなること。これらの結果から以下の仮説を立てた。HAX-1のC末端側のαへリックス領域は、カルシウム非存在下ではアンフォールド状態をしており、UCP3のループ2領域が、HAX-1のUCP3のループ2領域との結合領域に接近するのを妨げる。一方、カルシウム存在下においてC末端側のαへリックス構造が誘起されると共に膜結合性を獲得し、UCP3ループ2領域との結合領域が露出することでUCP3との結合が可能になる。また、この複合体と相互作用する因子があるか否かをUCP3を強制発現させた筋芽細胞のミトコンドリア画分とリコンビナントHax-1(211-280)を用いて、免疫沈降実験を行った。因子の同定には至らなかったが、この複合体と結合しうる因子が存在することを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。所属研究室で見出したミトコンドリアへの過剰なCa2+取り込みの制御HAX-1-UCP3複合体に着目し、X線回折法を用いて、この複合体の構造機能相関研究を行った。これまでに、HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれ、C末端側領域(211-280)とミトコンドリア内腔に存在する膜間ループ2領域(165-175)であること及び両者の結合にはCa2+の存在が必須であること明らかにしている。また、HAX-1に関しては、Ca2+と直接結合すること及びその結合により大きな構造変化が誘起されることを明らかにした。これらの結果より、HAX-1(211-280)のCa2+結合を介した大きな立体構造変化がミトコンドリア内のCa2+濃度上昇の感知とUCP3との結合に関与している可能性が示唆された。そこで、この複合体が如何にしてCa2+の取り込みを制御しているかを明らかにすることを目的とし、初年度はX線回折法よるHAX-1(211-280)単体及びUCP3ペプチドとの共結晶構造解析を目指した。まず、HAX-1の大量発現・精製を行い、様々な結晶化スクリーニングキットを用いて、単独及びUCP3ループ2ペプチドとの共結晶化を行った。この過程で、蛋白質を安定化するために添加していた界面活性剤CHAPSが、結晶化ドロップ内で相分離を引き起こすことがわかった。そこで、他の界面活性剤DDMに変えて精製を行ったところ、1L当たりの精製蛋白量が約10倍に増え、結晶化ドロップ内の相分離問題も解決できた。興味深いことに、CHAPSとDDMでミセルサイズが異なることにより、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターンから、界面活性剤のミセルと直接結合することが明らかになった。また、幾つかの条件で結晶が得られ、そのうちの代表的な結晶に関しては、SDS電気泳動・銀染色の結果から、蛋白質由来のものであることを確認した。さらに、大型放射光施設SP-8で回折実験を行ったが、残念ながら構造解析可能な回折データは得られなかった。私は産後休暇による研究中断のため、当該年度の7/1から本研究を開始した。X線回折法によるHAX-1-UCP3複合体の構造研究を進めた。対象とするHAX-1は膜結合性を示すため、試料調製が難しい蛋白質であるが、結晶化のための大量発現・精製系の確立、様々な種類の結晶化条件の探索を網羅的に行った。複合体の構造決定まで至っていないが、三年計画の初年度であり、着実にゴールに向かって進めており、概ね計画どおりに進んでいると判断される。ミトコンドリアへの過剰なカルシウム取り込みの制御に関わるHAX-1-UCP3複合体に着目し、構造生物学的手法(X線回折実験)による構造機能相関研究を試みた。これまでに、HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれC末端側領域とミトコンドリア内腔に存在するループ2領域であること及び両者の結合にはカルシウムの存在が必須であること明らかにしている。また、HAX-1のC末端側領域に関しては、カルシウムと直接結合すること及びその結合により大きな構造変化(部分的なフォールディング)が誘起されることを明らかにした。これらの結果より、HAX-1のカルシウム結合を介した大きな立体構造変化がミトコンドリア内のカルシウム濃度上昇の感知とUCP3との結合に関与している可能性が示唆された。

さらに、この複合体が如何にしてカルシウムの取り込み制御をしているかを明らかにすることを目的とし、今年度も昨年度と同様に、X線回折法による複合体の構造解析を試みた。特に、HAX-1のC末端側領域の膜結合性を考慮して、膜タンパク質の変性を防ぐ脂質キュービック相(LCP)法等の膜タンパク質に適した結晶化方法を用いて、網羅的な結晶化を行った。その結果、いくつかの条件で結晶が得られた。得られた全ての結晶のX線回折実験を行った結果、ほとんどの結晶は塩由来のものであることが判明したが、一つ条件だけわずかな回折点が得られた。現在、この条件をベースとし、結晶化条件の最適化を行っている。今年度は、X線回折法によるHAX-1のC末端領域とUCP3のループ2領域の複合体の構造決定を試みた。対象とするHAX-1のC末端領域は膜結合性を示しており、界面活性剤存在下での結晶化や膜タンパク質の変性を防ぐ脂質キュービック相(LCP)法による結晶化を網羅的に行い、いくつかの結晶を得て、回折実験を行った。このうち多くの結晶は塩であることが判明したが、一つの条件のみ、わずかな回折点が得られた。今後、この結晶化条件をベースに、さらなる検討を行うことで構造解析が可能なデータが得られることが期待される。現在、研究期間の半期であり、残りの半期で目標に到達できると考え、「おおむね順調に進展している」と判断した。ミトコンドリアへの過剰なCa2+取り込みの制御に関わるHAX-1-UCP3複合体に着目し、この複合体の構造機能相関研究を行った。これまでに、HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれC末端側領域HAX-1(211-280)とミトコンドリア内腔に存在するループ2領域(UCP3(165-175))であること及び両者の結合にはCa2+の存在が必須であること明らかにした。また、HAX-1(211-280)に関しては、Ca2+と直接結合すること及びその結合により大きな構造変化が誘起されることから、HAX-1(211-280)のCa2+結合を介した大きな立体構造変化がミトコンドリア内のCa2+濃度上昇の感知とUCP3との結合に関与している可能性を示唆した。前年度までに、HAX-1のカルシウム結合・膜結合に関わる残基の一部を同定することにより、カルシウムとの結合により膜結合性を獲得するという興味深い知見を得た。そこで、今年度は、膜と結合するHAX-1のC末端のαへリックス領域を取り除いたHAX-1(211-247)/(211-266)の発現系・大量精製系を構築し、その試料を用いてNMR法による相互作用解析及びX線回折実験に用いるための共結晶化を行った。NMR法では、HAX-1(211-247)/(211-266)はUCP3ループ2ペプチドと結合可能であること及びCa2+と結合しないことを明らかにした。これより、Ca2+非存在下では、アンフォールド状態のC末端側のαヘリックス領域が、HAX-1のUCP3結合領域をマスクしている可能性が考えられた。一方、HAX-1(211-247)/HAX-1(211-266)の大量調製を行い、UCP3ループ2ペプチドとHAX-1(211-247)/(211-266)の共結晶化スクリーニングを行ったが、回折実験に供する結晶は得られなかった。本研究では、HAX-1-UCP3複合体形成機構の解明を目指し、NMR法による相互作用解析及び共結晶化を精力的に行っている。前年度までに、HAX-1のカルシウム結合・膜結合に関わる残基の一部を同定し、カルシウムとの結合により膜結合性を獲得するという興味深い知見も得ている。
病原性発現機序へのIgAプロテアーゼの関与の解明ー粘膜局所免疫の攻撃因子かー

腸分泌液中分泌型IgA(sIgA)は、9例の小腸還流液および10例のポリエチレングリコールによる腸管(大腸)洗液より、抗α鎖結合Sepharose-4Bにてtotal sIgAを、Jacalin lectin結合Sepharoseー4BにてsIgAl(IgAlサブクラス)を精製した。これらの精製腸管分泌液中sIgAについて、Bacteroides vulgatus、B.fragilisおよびClostridium ramosumに対する菌体凝集抗体活性を検討した。その結果、10例中1例の大腸液より精製したsIgAおよびsIgAlにB.vulgatusに対する菌体凝集抗体活性が、また9例中5例の小腸液より精製したsIgAlにC.ramosumに対する菌体凝集抗体活性が見出された。現在、これらの菌体凝集抗体活性のみられた腸管分泌液中sIgAを選択して、対応細菌に対する凝集抗体価に及ぼす精製Clostridial IgA proteaseの作用を検討中である。未だpreliminaryではあるが、IgA proteaseは抗体活性そのものは抑えないが、凝集抗体としての活性を抑制することを示唆する結果を得ている。この検討を進める上での問題点は、小腸還流液や大腸洗液中のsIgAの大半がdogradationを受けていて、高力価の凝集抗体価を有するsIgAを得難いことであり、今後、比較的にintactに保たれている腸管粘液からのsIgAの分離により結論を出したい。これまでに得た結果については、平成元年4月に開催の第36回体液蛋白会議(開催地ロンドン)で成果を公表の予定である。
マイオスタチン阻害ペプチドによる筋ジストロフィーとサルコペニア治療法の開発

マイオスタチンは骨格筋に特異的に発現し筋量を負に制御するユニークなTGF-beta分子である。本研究では、血中でマイオスタチンリガンドを生理的に阻害するプロドメインの阻害活性中心(IC)を絞り込んだ。ICに、これまで知られていなかった、リガンドとマイオスタチン筋細胞膜受容体との結合を特異的に阻害する作用を見出した。相当する合成オリゴペプチドの投与によって筋ジストロフィーモデルマウスの筋量を増加させることに成功した(Ohsawa, et al. PLoSOne 10:e0133713, 2015)。筋ジストロフィーは筋細胞の変性・壊死から筋萎縮を来す遺伝性疾患群で、有効な治療法は皆無である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)ではTGF-βシグナル分子LTBP4によって運動予後が規定される。一方、加齢性筋萎縮(サルコペニア)は骨格筋幹細胞のTGF-β活性上昇により筋再生が障害される。マイオスタチンは骨格筋に特異的に発現し筋量を負に制御するユニークなTGF-β分子である。われわれは、独自アッセイ系により、マイオスタチンリガンドを流血中で生理的に阻害するプロドメインから、その阻害活性中心を絞り込んだ。本研究は、この阻害活性中心ペプチドを、DMDおよびサルコペニアモデルへ投与しTGF-β是正筋萎縮治療の可否と機構解明を目指す。平成26年度は、ペプチドの用量を振って、野生型マウスへ投与し筋肥大効果と骨格筋マイオスタチン活性を検討し投与条件を設定した。この過程で、プロドメインが、筋細胞表面で、リガンド-受容体結合を阻害するという、新たな薬理機構を発見した。この成果から、このペプチド医薬のPCT出願(PCT/JP2014/52345)に成功し、併せて論文発表ができた(Takayama,Ohsawa, et al. J Med Chem 58;1544-1549,2015)。モデルマウスへのペプチド投与に取り組み、その筋萎縮治療効果とモデルマウス骨格筋のTGF-βシグナル是正機構の解明を目指す。われわれは、独自にアッセイ系を構築し、マイオスタチンを生理的に阻害するプロドメインの阻害活性中心を絞り込み、これに相当する合成オリゴペプチドの投与によって野生型マウスの筋量を増加させることに成功した(特許出願:2013-17540)。本研究は、このペプチドを希少難病デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび加齢性筋萎縮(サルコペニア)モデルマウスへ投与する。骨格筋解析によって、これらの共通病態と想定されるTGF-βシグナル亢進を是正する治療戦略の可否とその機構を探る。すなわち、TGF-βを標的とする新規低分子ペプチド薬の臨床応用を目指し、同時にTGF-βを介する筋萎縮の分子細胞機構の解明に挑む基礎研究である。平成27年度は、この阻害ペプチドを常染色体優性肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)1Cの疾患モデルマウスの前脛骨筋に投与し筋萎縮の改善に成功した。次いで、このペプチドによる筋萎縮改善の分子機構について詳細な解析を実施した。その結果、阻害活性中心が、予想された血中マイオスタチンリガンドの阻害機構の他に、筋細胞膜表面でのリガンド-膜受容体結合の特異的阻害という革新的な薬理機構を示すことを発見して論文発表をおこなった(Ohsawa Y, et al. PLoSOne 2015;10:e0133713)。さらに、このペプチドの最適化を実施して、最重症型デュシェンヌ型筋ジストロフィージストロフィーモデルDBA/2-mdxマウスとサルコペニアモデルKlothoマウスに局所および全身投与し、骨格筋病変が改善するのか、衛星細胞が増加するか、マウス寿命が延長するかについて検討している(未発表)。LGMD1Cモデルマウスの筋萎縮改善機構の解析から、阻害活性中心が、Random coil(RC), Alpha-helix (AH), Latento lasso (LL)の3つの領域に分割され、それぞれ、I型膜キナーゼ受容体、リガンド、II型膜キナーゼ受容体と結合し、筋細胞膜上でリガンド-受容体結合を特異的に阻害するという革新的な薬理機構を発見した。この結果は、現在が米国FDAが"break-through therapy"に指定しているマイオスタチンII型受容体抗体医薬(Bimagrumab)と比較して、より高い安全性と卓越した有効性が期待できる。そこでペプチド最適化により、最重症型デュシェンヌ型筋ジストロフィージストロフィーモデルとサルコペニアモデルモデルマウスへの全身投与による有効性を立証し、非臨床POCの獲得を目指している。マイオスタチン阻害ペプチドについて用量を振って、野生型マウスの投与し、ペプチド投与条件を設定した。

条件設定したペプチドを、最重症型DMDモデルマウス及びサルコペニアモデルマウスに投与を開始し、筋萎縮・筋力低下の改善効果の検討している。本年度、DMDモデルDBA/2-mdxマウスは、大阪大学から実験医学中央研究所へ寄託されクリーンアップを実施した。このため、このマウスの繁殖に時間が掛かっている。そこで、一期的投与でなく、複数回に分けてペプチド投与を開始して研究を進捗させている。経時的に生理学的解析(体重・握力・走力・血中CK値)を実施している。血中及び骨格筋マイオスタチン/TGF-βシグナルシグナルの変動(転写因子活性化p-Smad2/3蛋白質量、標的遺伝子p21, p16発現量)、骨格筋幹(衛星)細胞動態、及びKaplan-Meier法により寿命解析をおこない、ペプチド投与群で筋萎縮が改善して、TGF-βシグナルが是正されるか検討している。また副作用モニターのため血液生化学検査を並行している。骨格筋摘出後には直ちに電気刺激によって張力(相対力・絶対力)を測定し投与群で筋力低下が改善するか検討を予定する。摘出筋を組織学的に解析して、投与群で、筋線維(単一筋線維断面積)萎縮、ジストロフィー性変化(壊死線維数・再生線維数・線維化指数・脂肪化指数)の軽減が達成されるか、そのマイオスタチン活性との相関について解析を進める。平成28年度は、阻害ペプチド投与マウスの筋萎縮改善の分子機構について、網羅的遺伝子発現解析によって検討し病態の鍵となる新たなマイオスタチン下流分子をスクリーニングし筋分化解析を実施する。このアプローチからTGF-βシグナル亢進を起点とする筋ジストロフィーおよびサルコペニア発症の分子機構を解明し、併せて阻害ペプチドによる改善機構を探っていく。筋ジストロフィー平成27年度以降には、モデルマウスへのペプチド投与を継続するとともに、マイオスタチンシグナル下流で働く新たな骨格筋萎縮及び肥大遺伝子の同定に取り組む。まず骨格筋遺伝子発現プロファイリングによって、マイスタチン阻害ペプチド投与群と非投与群の発現に差異のある分子を登録する。次いで、候補遺伝子群をわれわれが既に習熟しているレトロウイルスベクターpMXs-IRES-GFP (Ohsawa Y, et al. Lab Inv, 92:1100-1114, 2012)にサブクローニングする。次いでパッケージング細胞へトランスフェクションしてウイルス抽出しC2C12マウス筋芽細胞に感染させ遺伝子を発現させる。この筋芽細胞の低濃度ウマ血清培地による筋管分化誘導アッセイを行う。筋管分化効率を比較し、マイオスタチンシグナル下流で働く骨格筋萎縮及び肥大遺伝子を絞り込む。さらにレンチウイルスベクターへ組み込んで、マウス骨格筋への局所投与し、新規筋萎縮及び肥大遺伝子を同定する。マイオスタチンを起点とするこれらの新規遺伝子を標的とした治療開発へ繋げたい。次年度研究費は、主として、マウス骨格筋解析と、骨格筋萎縮及び肥大遺伝子の同定のためのPCRなどの分子生物試薬、及び細胞培養を計上した。予算計上していたよりも安価になった為H26年度に発注した修理及び消耗品の支払いが、H27年度となったため次年度使用額が発生した。平成28年度も実験継続の為、前年度の差額と合わせて物品を購入予定