hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内送達を可能にする分子標的ペプチド（中分子化合物）の新しい設計法

進化分子工学(細胞表層ディスプレイ技術)とペプチド構造構築理論を組み合わせることにより,細胞内送達を可能にし,細胞内タンパク質をターゲットとする分子標的ペプチド(中分子化合物)の新しい設計法を開発する。すなわち,強固な立体構造(ヘリックス・ループ・ヘリックス構造: HLH)をもつペプチドの細胞表層提示ライブラリーを構築し,標的タンパク質に結合するペプチドをスクリーニングする。得られるペプチドは立体構造を持っているので,生体内の酵素分解に対しても安定であり,抗体と同等の高い特異性と強い結合活性をもつ。この分子標的HLHペプチドを「マイクロ抗体」と呼ぶ。そこで,このペプチドを利用して,特定の細胞を標的し細胞内に効率良く送達される分子標的中分子の開発を行う。本研究によって,標的タンパク質が細胞内タンパク質にまで一挙に及ぶことになり,ケミカルバイオロジーの進展に貢献するとともに,医薬品開発においても対応可能な疾患の範囲が大きく広がる。28年度にヘリックス・ループ・ヘリックス構造をもつ立体構造規制ペプチドを設計し,ヘリックス部分,ループ部分,ヘリックス部分+ループ部分の3種のライブラリーを構築した。さらに,そのファージ表層提示ライブラリーを作製した。これらのライブラリーを血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対してスクリーニングしたところ,安定なヘリックス構造をもつVEGF結合ペプチド(Kd = 0.7 nM)の獲得に成功した。29年度は,本VEGF結合ペプチドの生体内安定性を検討した。また,プロテイン・グラブティングによるマイクロ抗体の設計を検討し,細胞内のp53とMDM2とのタンパク質ータンパク質相互作用を阻害するペプチドの獲得に成功した。(1)マイクロ抗体の生体内安定性:マイクロ抗体の分子標的医薬としての潜在能力を評価した。マイクロ抗体は立体構造を持つことにより,抗体と同様に,高い特異性と親和性さらに生細胞内での安定性(酵素抵抗性)を獲得することができる。そこで,前年度に得られたVEGF結合性マイクロ抗体をペプチド合成し, CDおよびNMRにより立体構造を解析した。その結果,安定したhelix-loop-helix構造を持つことが明らかになった。また,酵素抵抗性を検討した。トリプシンと反応させ経時的の残存ペプチド量を測定したところ,強い酵素分解抵抗性を観測した(半減期:20時間)。さらに,チオレドキシン融合ペプチドを合成し,細胞増殖阻害活性を測定した。その結果,本ペプチドが,ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のVEGF添加による細胞増殖を阻害することが判明した(IC50: 200 nM)。(2)立体構造情報に基づくマイクロ抗体の開発:プロテイン・グラブティングによるマイクロ抗体の設計を検討した。X線構造から得られる立体構造情報をもとに,分子認識に必要なアミノ酸残基を土台ペプチドに移植し,目的のマイクロ抗体を設計する。本研究では,p53とMDM2とのタンパク質ータンパク質相互作用を分子標的とした。この相互作用では,p53のヘリックス部分がHDM2と結合しており,その結合に関与するp53ヘリックス上のアミノ酸を,マイクロ抗体のC末端ヘリックス上に移植した(エピトープ・グラフティング)。さらに,構造支持領域であるN末端ヘリックス上にポリアルギニンなどの細胞膜透過性ペプチド配列を移植した(アルギニン・グラフティング)。得られたペプチドは,MDM2と強く結合し,p53とMDM2との相互作用を阻害した。さらに,本ペプチドのがん細胞増殖阻害活性を検討したところ,ヒト結腸腺ガン細胞の増殖を完全に阻害した。(1)マイクロ抗体の細胞膜透過性の検討および膜透過性ペプチドの導入:巨大タンパク質である抗体は細胞膜透過性がないため,細胞内の重要なタンパク質を標的にすることができない。一方,マイクロ抗体の分子サイズは小さく,細胞膜透過性もつ可能性があり,抗体に比べ大きなメリットである。そこで,MDM2結合性マイクロ抗体を蛍光分子で化学修飾し,蛍光を指標にして細胞膜透過性を検討する。また,本マイクロ抗体が細胞膜を透過しない場合は,N末端に膜透過性ペプチドであるポリアルギニンを導入する。(2)マイクロ抗体ー薬物複合体の合成:VEGF結合するマイクロ抗体に,チューブリンの重合阻害剤である抗腫瘍性抗生物質を導入し,マイクロ抗体ー薬物複合体を合成する。この複合体は,エンドサイトーシスにより細胞内に移行し,細胞内でジスルフィド結合が開裂し,薬物を放出する。マイクロ抗体ー薬物複合体は,抗体ー薬物複合体に代わる新しい薬物送達法であり,これを,PDC(Peptide Drug Conjugate)と名付ける。(3)マイクロ抗体の抗原性試験:マイクロ抗体と担体タンパク質の縮合体を合成する。1)マイクロ抗体のみ,2)マイクロ抗体+アジュバント,3)マイクロ抗体-KLH縮合体の3種の抗原で免疫し,血中の抗体産生量をELISAで検証する。(4)細胞膜透過性マイクロ抗体およびマイクロ抗体ー薬物複合体の生物活性:細胞膜透過性マイクロ抗体およびマイクロ抗体ー薬物複合体について,細胞アッセイを行い,生物活性を評価する。抗VEGF分子標的化合物に関しては,ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いる。抗MDM2分子標的化合物に関しては,ヒト結腸腺ガン細胞を用いて,ガン細胞増殖阻害活性を検討するとともに,アポトーシスやセルアレストなど各種バイオマーカーを調べることにより作用機序を明らかにする。すなわち,強固な立体構造をもつペプチドの細胞表層提示ライブラリーを構築し,標的タンパク質に結合するペプチド(マイクロ抗体)をスクリーニングする。

得られるペプチドは立体構造を持っているので,生体内の酵素分解に対しても安定であり,抗体と同等の高い特異性と強い結合活性をもつ。そこで,この分子標的ペプチドを利用して,特定の細胞を標的し細胞内に効率良く送達される分子標的中分子の開発を行う。本研究によって,標的タンパク質が細胞内タンパク質にまで一挙に及ぶことになり,ケミカルバイオロジーの進展に貢献するとともに,医薬品開発においても対応可能な疾患の範囲が大きく広がる。28年度は,ヘリックス・ループ・ヘリックス構造をもつ立体構造規制ペプチドを設計し,ヘリックス部分,ループ部分,ヘリックス部分+ループ部分の3種のライブラリーを構築した。さらに,そのファージ表層提示ライブラリーを作製した。これらのライブラリーを血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対してスクリーニングしたところ,安定なヘリックス構造をもつVEGF結合ペプチド(Kd = 0.7 nM)の獲得に成功した。VEGF受容体が,エンドサイトーシスすることが知られているので,このペプチドがVEGFと複合体を形成し,VEGFとともに細胞内へ取り込まれることが期待される。(1)立体構造規制ペプチドライブラリーの構築:ヘリックス部分のペプチド・ライブラリー(α-helix)の作製には成功している。このα-ヘリックス部分ライブラリー以外に,さまざまなタンパク質ータンパク質相互作用のトポロジーを考慮し,ループ部分のライブラリー(Loop)およびヘリックス部分+ループ部分のライブラリー(α-helix+loop)の構築した。(2)立体構造規制ペプチドライブラリーのスクリーニング:上記のように構築したら3種のライブラリーをファージ表層に提示させ,各種標的タンパク質に対してスクリーニングを行った。細胞外タンパク質として血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を分子標的とした。VEGFの膜受容体であるKDRは,エンドサイトーシスを起こす。3種のファージ表層提示ライブラリーを標的タンパク質VEGFに対してバイオパンニングしたところ,α-helix+loopライブラリーより,結合活性をもつ立体構造規制ペプチド(マイクロ抗体)が獲得された。(3)立体構造規制ペプチド(マイクロ抗体)の安定性と結合活性:上記のスクリーニングから得られたペプチドを固相法により合成した。表面プラズモン共鳴スペクトル法(SPR)により,このペプチドが高い結合活性を持つことが判明した評価した(Kd 0.7 nM)。また,円二色性スペクトル法(CD)により,VEGF結合ペプチドが安定なヘリックス構造を持つことを確認した。進化分子工学(細胞表層ディスプレイ技術)とペプチド構造構築理論を組み合わせることにより,細胞内送達を可能にし,細胞内タンパク質をターゲットとする分子標的ペプチド(中分子化合物)の新しい設計法を開発する。
仮想現実の体験で実現する情報セキュリティの脅威と安全を教育するｅラーニングの開発

本研究は、情報セキュリティ教育に仮想現実の手法を取り入れ、ウイルスや攻撃を体験できるシステムを構築することで、通常は目に見えない情報の安全について理解させるシステムについて試作する。情報セキュリティ教育は一般的に、情報倫理教育との関係から、紙ベースやディジタルデータや利用しても演習方式(パワーポイントや実験など)を通して理解させる教材が多い。仮想現実と連動させた体験型のシステムについての開発例は無いようである本システムは従来の可視化技術の先にある仮想現実を導入することで、情報セキュリティの理解を深める教育システムの構築を目指し、e-learningへの導入を検討する。仮想現実の手法を取り入れ、ウイルスの危険度ごとに触れる感触の相違を実現する。さらに、組織内に感染したPCからの異常通信によるネットワーク内の通信量の多さ等の変化を、水の流れを触るように体験できるシステムを構築する。本年度の研究では、セキュリティ強度(ウイルスの脅威)に対して、コーディック解析や脅威分析を行い直感的に力覚装置への反力としての力の動きに対応するようにデータへの変換を行い、特性について明らかにした。ウイルス感度の高いパケットを可視データとして赤色とし、脅威なしを青で表現した。力覚反応と色の対応を同期して操作できるシステムを構築した。また、ウイルス付きの添付ファイルなどは、隠れファイルとして大きなファイルになる傾向があり、ファイルをドロップとして送信しようとするとファイルサイズにより、重さを感じるようにアプリケーションソフトウエアを作成した。1色彩とパケット量の関係付けた。2トラフィック量により時系列的に異常値を抽出して、色付けし、力覚の反応に対応付けた。力覚を操作するときの感覚量について特性を明らかにした。3特性をもとに、ネットワーク中で動作する異常なパケットを抽出して、力覚として感じることが出来るシステムを構築した。4パケットを箱型の立体として作成し、異常量に対応した色彩とパケット量を再現することができるように作成した。5パケットの異常量を抽出して、パケット部分を重さと感知して力覚に適応させた。30年度に得られた実験結果を基として、システム構築の特性解析を行う。また、力覚特性の感覚再現として削る感覚特性について検討する。これは、経験的な特性量の再現を明らかにするもので、システムの総合的な特性に役立てる。異なる複数の力覚装置を同一のプラットフォームで動作できるように、共通プラットホームの特性について分析する。これは、e-learningのプラットフォーム特性として、システム設計指針として利用できる。本研究は、情報セキュリティ教育に仮想現実の手法を取り入れ、ウイルスや攻撃を体験できるシステムを構築することで、通常目に見えない情報の安全について理解させるシステムについて試作する。情報セキュリティ教育は一般的に、情報倫理教育との関係から、紙ベースやディジタルデータを利用しても演習方式(パワーポイントや実験など)を通して理解させる教材が多い。仮想現実と連動させた体験型のシステムについての開発例は無いようである。本システムは従来の可視化技術の先にある仮想現実を導入することで、情報セキュリティの理解を深める教育システムの構築を目指し、e-learningへの導入を検討する。本年度の研究では、セキュリティ強度(ウイルスの脅威)に対して、コーディック解析や脅威分析を行い直感的に力覚装置への反力として力の動きに対応するようにデータへの変換を明らかにする。例えば、ウイルス強度が高いファイルでは、可視化データで脅威を赤で表現し、脅威無を青で表現するなどの対応関係とともに、赤であれば力覚が強く動作し、ポインティングデバイスの移動が出来ない。青であればポインティングデバイスの移動が容易い等の表現をするなどについて実験を行い明らかにした。1色彩と重要度の関係について、先行研究を参考に再分類し整理した。2トラフィック量について、openflowシステムを導入してシステム設計を行い、仮想クラウドを構築し、トラフィック量やパケットの種類について、疑似ネットワークシステムを構築した。当初の予定のopenflowシステムは、価格が10倍以上高価になることが分かり、購入可能なopenflowシステムを再度設計しなおした。その結果、導入機器が変更したものの当初予定していた機能を持たせることが出来た。3コンピュータへの入出力データのトラフィック量を自由に変化させるシステムを構築した。openflowスイッチを用いて、トラフィック量=水流量として考え、力覚量へのその変換について検討した。たとえば、可視化においては、トラフィック量を太く表示したりしているが、力覚では水の流れを手で受けるような反力として再現する。その力覚の流量と可視化の太さ等の感覚量の対応を実験から求めることが出来た。4購入した力覚装置が故障し、修理に出しているために装置を利用した開発が遅延している。

本年度の研究では、セキュリティ強度(ウイルスの脅威)に対して、コーディック解析や脅威分析を行い直感的に力覚装置への反力としての力の動きに対応するようにデータへの変換を行い、特性について明らかにした。ウイルス感度の高いパケットを可視データとして赤色とし、脅威なしを青で表現した。力覚反応と色の対応を同期して操作できるシステムを構築した。また、ウイルス付きの添付ファイルなどは、隠れファイルとして大きなファイルになる傾向があり、ファイルをドロップとして送信しようとするとファイルサイズにより、重さを感じるようにアプリケーションソフトウエアを作成した。1色彩とパケット量の関係付けた。2トラフィック量により時系列的に異常値を抽出して、色付けし、力覚の反応に対応付けた。力覚を操作するときの感覚量について特性を明らかにした。3特性をもとに、ネットワーク中で動作する異常なパケットを抽出して、力覚として感じることが出来るシステムを構築した。4パケットを箱型の立体として作成し、異常量に対応した色彩とパケット量を再現することができるように作成した。5パケットの異常量を抽出して、パケット部分を重さと感知して力覚に適応させた。29年度に作成されたシステムを利用し、ネットワークからの異常値すなわちウイルスが感染した場合の特徴量について検討する。試作した仮想クラウドシステム中のコンピュータにウイルスを発生させ、その挙動について可視化し、トラフィック量に変換するシステムを試作する。パケットを触るときの感覚について、PCの画面では平面での表示になり、立体表示しているときに奥行きについて操作性が悪いことが分かった。そこで、奥行きについての評価基準を設定して、システムに組み込み評価実験を行う。また、操作範囲の異なるものを使用する場合にも利用できるような共通したプラットォームについて検討をする。修理が完了したら、開発を再開する予定である。30年度に得られた実験結果を基として、システム構築の特性解析を行う。また、力覚特性の感覚再現として削る感覚特性について検討する。これは、経験的な特性量の再現を明らかにするもので、システムの総合的な特性に役立てる。異なる複数の力覚装置を同一のプラットフォームで動作できるように、共通プラットホームの特性について分析する。これは、e-learningのプラットフォーム特性として、システム設計指針として利用できる。実験に使用している装置が故障し、研究に支障が生じた。現在修理を依頼しており、修理費に使用する予定である。
温熱、放射線、免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせた新規な複合療法の開発

温熱療法は放射線や抗がん剤の効果増強効果があることが従前より知られえているが、最近、免疫賦活効果があることが明らかにされつつある。私たちは、近年注目されている、免疫チェックポイント阻害剤と温熱療法を併用することにより、両者の免疫の賦活効果が相まって、遠隔転移をも抑制できる可能性があると仮説を立てた。本研究は免疫チェックポイント阻害剤と温熱療法の併用効果を局所および遠隔転移に着目して研究する。また、放射線をさらに加えることによる局所及び遠隔巣に対する抗腫瘍効果をも研究し、そのメカニズムを解明する。
アンギノーサス群連鎖球菌由来ストレプトリジンSホモログに特徴的な分子特性の解析

本研究では、ヒト口腔内に常在するStreptococcus anginosus subsp. anginosus(SAA)が産生するペプチド性溶血毒素であるストレプトリジンS(SLS)のホモログによる細胞障害メカニズムを明らかにするために、そのツールとなるSLSホモログ組換え体の調製系について検討を行った。また、β溶血性SAAと共培養したヒト由来株化細胞のマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子発現解析の結果より、SLSホモログ依存的な細胞の遺伝子発現変動を明らかにし、β溶血性AGSが産生するSLSホモログによる細胞障害メカニズムの解明に向けた足がかりとなる結果を得た。ストレプトリジンS(SLS)は、ヒトに対して病原性を示す化膿性連鎖球菌(SPy)が産生するペプチド性溶血因子であるが、その分子特性や作用メカニズムには不明な点が多い。我々は近年、ヒトの口腔内に常在するアンギノーサス群連鎖球菌(AGS)の中でβ溶血性を示すサブグループ(β-AGS)において、SLSのホモログを産生していることを初めて明らかにすると共に、β-AGSの中でもβ溶血性Streptococcus anginosus subsp. anginosus(β-SAA)ではアミノ酸配列の異なる2分子のSLSホモログを産生するという興味深い知見を明らかにした。しかしながら、これらSLSホモログの分子特性の詳細もSPy由来SLSと同様に不明である。そこで本研究では、一般的には非・低病原性菌と認識されているAGSの新規病原因子として注目されるSLSホモログの分子特性や作用メカニズムの解明を目的とし、SLSホモログを組換え体として調製してその分子特性や作用メカニズムを明らかにするという計画で研究を進めている。本年度の研究では、β-SAAの基準株(NCTC 10713)由来の2分子のSLSホモログのin vitro調製を目指し、SLSホモログおよびそれらの機能型分子への変換に携わると考えられている各因子の組換え体発現系の構築と発現誘導を行った。また、比較対象として、SPy由来の各因子についても検討した。さらに、SLSの構造と作用特性について新たに報告された知見を参考にし、SLSホモログの検出とその機能解析の促進が期待される新たな改変SLSホモログのin vivo発現系も構築すると共に、その改変分子の機能について溶血活性を指標とした評価を行った。本年度に得られた以上の成果を基にして、次年度の計画であるβ-SAA由来SLSホモログの機能解析について引き続き検討を行っていく。本年度は、β-SAA由来SLSホモログおよびSPy由来SLSの機能型組換え体の調製に関する検討を進めたが、大腸菌発現系を用いたin vitro調製系の検討で、β-SAA由来のSLS前駆体およびその機能型への変換に携わる各因子(SagAsSagE)の中でSagBとSagDの可溶型発現が乏しく、またSPy由来因子では各因子の発現量が総じて少ない結果となった。よって、この系を用いた目的分子の調製には更に条件検討が必要で想定以上の時間を要すると考えられたので、年度計画の内容を考慮して別のin vivo発現系(Lactococcus lactis発現系)の利用について検討した。この発現系では、SagAsからSagEをコードする各遺伝子をオペロン構造のまま発現ベクターに挿入すると共に、目的分子の検出と精製を容易にすることが期待されるC末にペプチドタグを付加した改変分子発現系を考案した。この系により改変分子の誘導発現には成功したが、恐らく精製時に組換え体の失活が生じ、結果として溶血活性を示す機能型分子の調製には至らなかった。以上を踏まえ、効果的なSLSホモログ組換え体の調製法としてはβ-SAAに備わる本来の産生システムを利用することが得策であるという考えに至り、最終的にはβ-SAAにおいてin vivoでのペプチドタグ化SLSホモログ組換え体の発現系を構築し、さらに血液寒天培養にてβ溶血性を示したことから、改変分子が機能型として産生されていることが確認できた。以上より、本年度の研究は当初計画の内容だけでは十分な成果を得ることができず、それを受けて現在までの進捗状況を「(3)やや遅れている」としたが、研究過程で見出された問題点の克服が期待される新たな発現系が構築できており、引き続き次年度以降の計画を当初の予定に添って推進できると考えている。平成27年度には、β-SAA由来SLSホモログと、比較対象として化膿性連鎖球菌(SPy)由来SLSについて、組換え体の発現・調製システムの構築を行った。結果として、既存の発現系(大腸菌発現系など)ではなく、β-SAAに備わる本来の生産システムを利用し、検出と精製を容易にするためのHisタグを付加した組換え体(タグ化SLS)の発現系を構築した。続く平成28年度には、タグ化SLSの分子特性や細胞障害性などについて検討を行った。まず、タグ化SLSの精製法に関する検討を行い、ニッケル親和性を利用した一段階での精製系を確立した。精製したタグ化SLSは赤血球に対して溶血活性を示したが、培養細胞に対しては明確な細胞障害性は確認されなかった。そこで、細胞障害性についてはSLSホモログ産生株および非産生株を用いた共培養系で検討した。その検討の一つ、マイクロアレイ解析の結果より、ヒト由来株化細胞(HSC-2およびTHP-1)に対してSLSホモログ依存的な応答反応、具体的には転写調節因子の発現量がSLSホモログ依存的に増加していることなどを示唆する結果が得られた。

本研究によって、これまで不明であったβ-SAA由来SLSホモログに依存した細胞応答メカニズムの一端を明らかにすることができた。現在も引き続き検討を行っており、この一連の検討により、β-SAAの新たな細胞障害因子として注目されるSLSホモログの分子特性や細胞に対する作用特性について明らかにし、β-SAAの病原性との関連について検討していきたいと考えている。本研究では、ヒト口腔内に常在するStreptococcus anginosus subsp. anginosus(SAA)が産生するペプチド性溶血毒素であるストレプトリジンS(SLS)のホモログによる細胞障害メカニズムを明らかにするために、そのツールとなるSLSホモログ組換え体の調製系について検討を行った。また、β溶血性SAAと共培養したヒト由来株化細胞のマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子発現解析の結果より、SLSホモログ依存的な細胞の遺伝子発現変動を明らかにし、β溶血性AGSが産生するSLSホモログによる細胞障害メカニズムの解明に向けた足がかりとなる結果を得た。本研究課題の平成28年度の推進方策としては、まず平成27年度からの検討内容を継続し、in vivoにおけるSLSホモログ組換え体(ペプチドタグ化SLSホモログ)の機能型分子としての効果的な調製法および精製法を確立すると共に、調製した分子の安定保存条件についても情報を得て、平成28年度の研究計画を遂行するための被検分子の準備を優先的に進める。なお、平成27年度の検討においてペンディングとなっている大腸菌発現系を利用したSLSホモログ組換え体のin vitro調製に関する検討については、未だ不明点が多いβ-AGS由来SLSホモログの活性型分子への変換に関する分子メカニズムを明らかにするための新たな知見が得られることが期待されるので、平成28年度も引き続き検討を進めていきたいと考えている。SLSホモログ組換え体の準備が完了次第、平成28年度の当初計画に従って、β-SAA由来SLSホモログの細胞障害性に関する各検討、具体的には各動物種(ウマ、ウサギ、ヒツジなど)の赤血球に対する溶血特性の比較検討や、ヒト由来株化培養細胞(ヒト口腔由来細胞株HSC-2やヒト由来単球系細胞株)に対する細胞障害性について、SPy由来SLSと比較検討しながら検討を行う。さらに、ヒト由来株化細胞に対するSLSホモログの細胞障害メカニズムの詳細を明らかにするために、マイクロアレイ解析によるSLSホモログを作用させた細胞の遺伝子発現レベルでの検討や、その解析結果より推測される細胞の様々な応答反応について検討を行う。以上により、β-SAAの新たな細胞障害因子として注目されるSLSホモログに特徴的な分子特性や作用特性について明らかにすることを目指して検討を行う。連鎖球菌由来病原因子の機能および細胞応答反応の解析3月末に開催された学会出張費などの支払いが現時点で完了していないため。4月に支払いが完了する予定である。
明治期の文人ネットワークにおけるジャンル横断的な文化交流の総合的研究

幸田露伴たちが明治20年代に結成していた文人サークル、根岸党について、成立から解体までの活動の詳細を解明した。具体的には、不明だった成立・解消の時期をそれぞれ明治10年代後半・明治27年ころと特定し、またメンバーの詳細も明らかにした。そのうえで、根岸党を旧時代に殉じた逃避的享楽の場とする従来の捉えかたを訂正し、時代の中心で活躍する文化人たちも一方で他愛ない遊びに本気で興じるような、明治という時代の多様性のあらわれと捉えなおすことで、その文化史的意義を明らかにした。本年度中に発表した「幸田露伴「頼朝」論」および「根岸党の旅と文学」は、常勤研究職への採用によって中断した日本学術振興会特別研究員PDとしての研究課題「明治期の文人ネットワークに見る近世との文化的接続に関する研究-幸田露伴を中心に-」の成果である。本年度は特に、後者の研究によって得られた知見と課題を発展させた研究を行った。まず、明治中期に活躍した文人サークル、根岸党のメンバーであった高橋太華の日記の所在が、慶應義塾図書館において確認されたことを受け、同館および遺族の許諾のもとに翻刻と注釈を行った。明治25年の1月から3月まで記されたこの日記には、幸田露伴・岡倉天心・森鴎外ほか多数の文化人との交遊が記録されており、明治期の文人たちの交流を知る貴重な資料である。本年度は1月前半の翻刻・注釈作業を行い、彼らのネットワークの実体についての把握を進めた。なお、この内容は『東海大学紀要文学部』第94輯(近日発行予定)への採録が決定済であり、1月後半以降の日記についても、翻刻・注釈作業を引続き進めている。また、これまでその実体が正確に知られていなかった根岸党について、成立から解体までの活動を新聞・雑誌類に発表された作品によって詳細に明らかにし、あわせてそれらの内容と意義を具体的に解明した。これにより、江戸期の文化を身につけた文人たちがまだかなり残り、旧き感性と新時代の思潮や新しい文物とを自然に融和させていた明治期の文化状況の特徴と、そうした交遊の空気を作品に描き出した根岸党の文化的位置が明らかになった。この研究成果は、本年6月に教育評論社より単行本として刊行予定であり、現在その最終作業に入っている。本年度は、『幸田露伴と根岸党の文人たち-もうひとつの明治』および「高橋太華『雅俗日記』(明治二十五年)翻印と注釈」(一)(二)を発表し、本研究課題の仕上げと一般への成果公開を行うとともに、新たな課題の発見によって次なる研究課題への発展的接続を試みた。まず、幸田露伴らが明治二十年代に結成していた文人サークル、根岸党について、成立から解体までの活動の詳細を平成22年度中にほぼ解明し、その文化史的意義を明らかにしたのを受け、その内容を上記図書にまとめた。その内容は、従来ほぼ不明とされてきた根岸党の成立・解消の時期をそれぞれ明治十年代後半・明治二十七年ころと特定したうえで、構成メンバーや各人の関わりの濃淡、党の活動を描いた作品などを詳細に紹介したものである。そのうえで、作家・画家・新聞記者・思想家・裁判官・官僚など様々な人士が集まり、気ままな遊びを繰広げていた根岸党について、従来からの逃避的享楽の場とする捉え方に疑義を呈し、これはむしろ、真摯な言論や芸術の場などで活躍する人物も他愛ない遊びに本気で興じていた、明治という時代の多様性のあらわれと捉えるべきであるとした。これにより、江戸期の遊びの精神と感性を保ったまま新時代を迎えた人々が、新しい文物をどのように捉え、受入れたのかという、近世と近代の文化的接続の状況が明らかになり、従来は分断して捉えられることの多かった両時代の、緩やかな交代期における文化の実相を解明することができた。また、平成22年度中に所在を確認していた、根岸党の中心的メンバーの一人、高橋太華の日記について翻刻と注釈を行った。幸田露伴・岡倉天心・森鴎外ほか多数の文化人との交遊が記録されたこの日記は、明治中期の文人たちのネットワークの実態を明らかにするうえで貴重な資料であるため、単に翻刻を公開するのではなく、詳細な注釈を附して彼らの交友の様相を明らかにしようと試みている。この作業は現在も継続中であり、平成24年度中に公開が完了する予定である。
バイオメカニクス特性を応用した義歯支持組織の症型分類

目的:有床義歯補綴治療のための適切な診断を行う上で,義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性の客観的な評価は重要である.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を総合的に評価し,診断基準を確立するために,義歯床下粘膜における硬さと厚さの関係を検討した.方法:口蓋粘膜に異常の認めない有歯顎者10名の口蓋粘膜部における3箇所(第一大臼歯側方部・口蓋側方部・口蓋正中部)を計測部位とした.硬さ(ヤング率)は触覚センサー,厚さは超音波厚さ計を用いて計測した.結果:ヤング率は口蓋正中部が最も高く(2.4±0.8MPa),口蓋側方部で最も低かった(1.0±0.5MPa).粘膜の厚さは口蓋正中部で最も薄く(1.2±0.3mm),口蓋側方部で最も厚かった(2.8±0.7mm).ヤング率と厚さは,直線関係を示したが,粘膜の薄い部位ではヤング率の値が広く分布していることが示された.結論:ヤング率の値が広く分布する部位があり,一概に厚さからヤング率の推定はできないことが示された.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を客観的に評価し診断基準を確立するためには,硬さと厚さをそれぞれ評価する必要性が示唆された.目的:有床義歯補綴治療のための適切な診断を行う上で,義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性の客観的な評価は重要である.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を総合的に評価し,診断基準を確立するために,義歯床下粘膜における硬さと厚さの関係を検討した.方法:口蓋粘膜に異常の認めない有歯顎者10名の口蓋粘膜部における3箇所(第一大臼歯側方部・口蓋側方部・口蓋正中部)を計測部位とした.硬さ(ヤング率)は触覚センサー,厚さは超音波厚さ計を用いて計測した.結果:ヤング率は口蓋正中部が最も高く(2.4±0.8MPa),口蓋側方部で最も低かった(1.0±0.5MPa).粘膜の厚さは口蓋正中部で最も薄く(1.2±0.3mm),口蓋側方部で最も厚かった(2.8±0.7mm).ヤング率と厚さは,直線関係を示したが,粘膜の薄い部位ではヤング率の値が広く分布していることが示された.結論:ヤング率の値が広く分布する部位があり,一概に厚さからヤング率の推定はできないことが示された.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を客観的に評価し診断基準を確立するためには,硬さと厚さをそれぞれ評価する必要性が示唆された.目的:有床義歯補綴治療に際し,義歯支持組織のバイオメカニクス特性である「粘膜硬さ」は主に触診による術者の主観的感覚で診査され,再現性や普遍性に問題があるため客観的評価は極めて重要である.粘膜硬さの客観的評価法を確立するため,触覚センサープローブの固定方法と接触角度が計測値に及ぼす影響を明らかにし,その補正方法を検討した.方法:4種類の擬似粘膜を製作し,各種条件下で弾性率を計測した,触覚センサーの接触角度の規定とプローブ先端の滑り防止を目的としたプローブガイドを製作した.接触角度,固定方法,プローブガイドの装着による計測値への影響を分析した.また,同意の得られた有歯顎者1名の義歯支持軟組織の硬さを計測した.結果:触覚センサーシステムを口腔粘膜の硬さの計測に応用するため,口腔粘膜を想定した擬似粘膜の弾性率を計測し,30。傾斜と各設置条件とプローブガイドの装着による計測への影響を分析した.また,口腔粘膜の弾性率を計測し,触覚センサーシステムの口腔内応用の有用性を検討した.その結果,プローブガイドを装着した場合,4種類の擬似粘膜の全ての計測結果において大きなばらつきはなく,30°に傾けた時の弾性率は0°より大きな値を示した.0°と30°傾斜時の弾性率は直線関係を示した.その回帰式より30°に傾けた際の弾性率から触覚センサーを0°で接触した際の弾性率を16%以内の誤差で算出可能であることが示された.以上の結果より触覚センサーシステムを用いた口腔内計測時の30°傾斜と固定方法による影響が明らかになり,回帰式による補正を行い弾性率を算出することで,義歯支持軟組織のバイオメカニクス特性である口腔粘膜の硬さを客観的に評価できる可能性が示唆された.目的:有床義歯補綴治療のための適切な診断を行う上で,義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性の客観的な評価は重要である.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を総合的に評価し,診断基準を確立するために,義歯床下粘膜における硬さと厚さの関係を検討した.方法:口蓋粘膜に異常の認めない有歯顎者10名の口蓋粘膜部における3箇所(第一大臼歯側方部・口蓋側方部・口蓋正中部)を計測部位とした.硬さ(ヤング率)は触覚センサー,厚さは超音波厚さ計を用いて計測した.

結果:ヤング率は口蓋正中部が最も高く(2.4±0.8MPa),口蓋側方部で最も低かった(1.0±0.5MPa).粘膜の厚さは口蓋正中部で最も薄く(1.2±0.3mm),口蓋側方部で最も厚かった(2.8±0.7mm).ヤング率と厚さは,直線関係を示したが,粘膜の薄い部位ではヤング率の値が広く分布していることが示された.結論:ヤング率の値が広く分布する部位があり,一概に厚さからヤング率の推定はできないことが示された.義歯床下粘膜のバイオメカニクス特性を客観的に評価し診断基準を確立するためには,硬さと厚さをそれぞれ評価する必要性が示唆された.
組織再生医工学を応用した新規インプラント周囲炎治療法の確立

インプラント周囲炎の治療法を検討、開発するために、イヌ実験的インプラント周囲炎発症モデルを作製し、非外科的、外科的処置下で種々の除染を行った。その結果、外科的除染が非外科処置と比較し周囲骨再生量が多いことが分かったが、顕著なアタッチメントゲインや骨量増加は認めなかった。進行したインプラント周囲炎の治療には外科的対応が必要で、さらに新たな治療法の開発や予防が重要であることが分かった。組織再生医工学を応用した新規インプラント周囲炎治療法を確立することを最終的な目標とし、本研究ではその臨床応用直前までの基礎研究による新たなインプラント周囲炎の外科的治療法の開発を目的とする。この研究目的を達成させるために、実験的ビーグル犬に実験的インプラント周囲炎を発症後、われわれのクループで検討した除染法で除染後、周囲組織再生に組織工学に基づく手法を導入し、総合的に検討し、より安全・確実で効果的な治療方法の確立をめざす。インプラント周囲炎発症後の周囲組織の再生治療法を確立することを最終的な目標とし、本研究では周囲組織の再生効果が得られると考えられる様々な再生療法を実験的に作製したインプラント周囲炎モデルで比較検討し、より確実性の高いインプラント周囲炎の外科的治療法によって失われたインプラント周囲組織再生法を開発することを目的としている。平成20年度は、ハイブリット犬を用いたインプラント周囲炎モデルを作製し、各材料の移植を行うことにある。Youらの方法(Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,103,34-37,2007)を一部改変し実施する。すなわち、体重20kg以上のオス成犬の下顎第一,第二前臼歯および第一後臼歯を抜歯し、4か月間抜歯窩の治癒を待った後に直径3.7mm、長さ10mmのインプラント体(Screw-Vent^[○!R]implant Zimmer Dental社製、USA)を片側に3本ずつ埋入した。埋入後3か月のオッセオインテグレーション期間経過後、インプラント体周囲にワイヤーとガーゼを巻きつけ3か月間放置し、インプラント周囲炎を惹起させた。現在研究は順調に進行し、インプラント体周囲の骨吸収はフィクスチャー長の約40%に達したところで、絹糸を除去し、プラークコントロールを実施している。今後実験的インプラント周囲炎発症部位に対してさまざまな治療法を試みる予定である。インプラント周囲炎発症後の周囲組織の再生療法を確立することを最終的な目標とし、本研究では周囲組織の再生効果が得られる様々な再生療法を、実験的に作製したインプラント周囲炎モデルで比較検討し、より確実性の高いインプラント周囲炎の外科的治療法により、失われたインプラント周囲組織再生療法を開発することを目的としている。平成21年度は、平成20年度で作製した、イヌ実験的インプラント周囲炎発症モデルで、プラークコントロールだけでは周囲組織の再生は起こらないことを確認した後、下顎片側ずつ、それぞれ非外科的あるいは外科的処置を行い、インプラント体表面の各種除染を行った。観察期間中は経時的に臨床的パラメータを測定した。さらに、除染後1および3か月後に試料を回収し、マイクロCTを用いた、骨梁構造の解析、研磨切片の作製を鋭意行っている。臨床的パラメータの結果からは、インプラント体の除染を行うと、アタッチメントレベルはやや改善するものの、吸収した骨レベルに大きな変化は認められないことが分かってきた。さらに、マイクロCTによる解析の結果、周囲骨組織での骨梁構造にどのような影響が出ているのかを細かく解析している。現在までの検討結果から、中程度に進行したインプラント周囲炎の治療には外科的対応が必要で、今までに検討された除染方法では十分な治療結果を得られないことが分かりつつある。今後、最終年度に研磨切片によるさらに詳細な検討を加え、成果を公表したい。

現在までの検討結果から、中程度に進行したインプラント周囲炎の治療には外科的対応が必要で、今までに検討された除染方法では十分な治療結果を得られないことが分かりつつある。今後、最終年度に研磨切片による蛍光染色結果も併せ解析し,詳細な検討を加え、成果を公表したい。インプラント周囲炎発症後の周囲組織の再生療法を確立することを最終的な目標とし、本研究では周囲組織の再生効果が得られる様々な再生療法を、実験的に作製したインプラント周囲炎モデルで比較検討し、より確実性の高いインプラント周囲炎の外科的治療法により、失われたインプラント周囲組織再生療法を開発することを目的としている。まず、イヌ実験的インプラント周囲炎発症モデルを作製し、プラークコントロールだけでは周囲組織の再生は起こらないことを確認した後、下顎片側ずつ、それぞれ非外科的あるいは外科的処置を行い、インプラント体表面の各種除染を行った。観察期間中は経時的に臨床的パラメータを測定した。さらに、除染後1、3か月後に試料を回収し、研磨切片の作製を行った。臨床的パラメータの結果から、インプラント体の除染を行うとアタッチメントレベルはやや改善が、吸収した骨レベルに大きな変化は認められないことが分かった。さらに、研磨切片によるHE染色、蛍光染色による組織形態計測の結果、外科的除染直後の周囲骨再生量が多いことが分かったが、大きくアタッチメントゲインを起こすような骨量増加は認めなかった。以上の検討結果から、中程度に進行したインプラント周囲炎の治療には外科的対応が必要で、今までに検討された除染方法では十分な治療結果を得られないことが分かり、今後さらに新たな治療法の開発や、発症前診断の確立、あるいは予防が重要であることが分かった。
ニヒリズムの問題に対する日本の哲学の今日的意義

本年度は、先ず第一に、前年度の研究成果を踏まえて、引き続いてニヒリズムにおける意志の問題を取り上げ、西谷啓治の思想と、ニーチェ、ハイデガーの思想とを比較し、その異同を明らかにした。そのように西洋のニヒリズムをめぐる言説と対比することによって、日本の哲学者のニヒリズム理解の特徴を明らかにした。続いて、西田幾多郎と西谷啓治の思想を取り上げ、両者における西洋哲学、および禅をはじめとする東洋哲学の理解の違い、さらには当時のさまざまな歴史的、あるいは思想的な状況についての両者の理解の違いに注目し、両者におけるニヒリズムの問題に対する受けとめ方の違いが、どのようなところから生じてきているかを明らかにした。さらに、西谷啓治と阿部正雄の禅および東洋思想の理解の仕方に注目し、それがどのように西洋の世界において理解され、受けとめられたか、とくに阿部正雄の「ケノーシス的な神(自己を空ずる神)」と「動的な空」をめぐる思想が西洋世界においてどのような論争を巻き起こしたかを明らかにし、阿部の問題提起のもつ意義を、西洋世界におけるその受容ないし批判の特質を浮き彫りにするこによって、解明することに努めた。
看護における組織内合意形成に焦点をあてた研究成果活用の促進モデルの構築

本研究は合意を形成し研究成果の活用促進を図る看護組織の特徴を明らかにし実情に即した方策を構築していくことを目的とした。看護に関する研究成果活用の阻害要因についての半構成的インタビュー調査や看護管理者対象へのアンケート調査などから、合意形成を得ていくためには看護師の研究成果活用を推進する方策として、専門性の高い看護師をキーパーソンとして育成することと学位取得者の割合を高めること、そして、組織的にケア改善の手順の整備と会議の活性化と集団の意見をまとめるファシリテーション能力を向上させる研修強化といった組織的な取り組みなどの有効性が示唆された。二年目にあたる今年度は、看護組織における合意形成の成立状況と研究成果活用との関連性について、全国調査の前段階として対象を東北地方A県全域の病院に拡大し自記式質問紙調査を行った。施設の看護管理者を対象に、組織的な合意形成の実態、および、前年度調査で明らかになった施設内における看護職への研究能力向上の取り組みと関連する教育内容の実態を質問するとともに研究成果活用の阻害要因の認識との関連性について統計学的に検討した。その結果、合意形成の実態については、当該の課題の適応範囲に応じて権限を与えられた看護師長レベルもしくは委員会レベルで内容が決定され、「手順書」等で明文化し勉強会およびカンファレンス等で周知を図るといった多くに共通する決定と周知の方法をとる傾向が見られ、一部、医師や他職種からも意見をもらう、倫理面への配慮が必要な場合は施設外のメンバーを加えて検討するといった工夫を行っている施設があることが明らかになった。施設内教育と研究成果活用の阻害要因との関連では、研究能力向上の研修を多く開催している施設ほどケア方法の変更に関する決定権の自覚が無いと感じる看護師が少なく、責任者も研究成果の活用を認める傾向があること、そして、看護師へのモチベーション向上を目的とした研修を多く開催している傾向などが明らかになった。また、患者情報を分析する専門の担当者を配置している施設では研究成果を活用するための設備や環境の不十分さの認識が低いことから、情報を扱う看護もしくは専門職の存在が研究成果の臨床活用に有利に働くことが示唆された。看護師には、最新の研究成果を活用した看護の改善が求められる。そのためには組織レベルでの研究成果活用の意義や必要性が重要とされるが、多くの看護組織ではその認識が共有されていなかったり職場風土などに問題があるなど課題となっている。初年度である今年度は、看護組織における合意形成の成立状況と研究成果活用との関連要因を検討する前段階として、研究成果活用の関連要因の再検討を行った。東北地方の中規模病院に勤務する看護職を対象に、研究成果活用の阻害要因と日頃の実践内容の根拠に疑問を持つ経験とその対処法の関連を検討したところ、日頃の実践で疑問を持つ頻度が多い者ほど最新の研究成果の情報不足の認識が高く、疑問を自分で調べることをせず誰かに質問する者ほど研究への苦手意識やマイナスイメージが高い結果となった。一方、研究成果活用意識の職場内不統一や個人目標を考慮した人事との関連性は認められなかった。これらから、個々の看護師が抱いた疑問を組織で共有する意識や取り組み状況、および情報検索能力、読解能力といった研究能力の向上の取り組みが関連要因として考えられる。その他、今回の調査では意識の統一や個人のキャリア開発に関する要因との関連性は認められなかったものの、ファシリテーションやキャリアデザインは組織の在り方に関する重要な概念となっていることから、継続して検討する必要があると考えられた。看護師の組織的な研究成果活用を推進するため、すでに指摘されている研究成果活用の阻害要因以外の要因について看護スタッフを対象に因子探索を行った結果、新たな阻害要因が抽出された。すなわち(1)日本看護協会等が認定する専門看護師や認定看護師が所属していない、(2)ケアの改善を望んでいても他の看護師への遠慮や気軽に相談できない雰囲気がある、(3)組織的にケア改善に取り組む仕組みがない、(4)看護の基本姿勢やアカデミックスキルが身についていないであった。それを受け、東北地方の病院の看護管理者を対象に研究成果活用の阻害要因と組織構成員であるスタッフの学習歴、院内教育との関連について検証を行った。結果、病院の規模にかかわらず看護スタッフに占める看護大学卒業者の割合が高くなるにつれて有意に「組織環境」の関する阻害要因が軽減することが確認された。また、院内教育では阻害要因の強さを示す得点が最も高かった研究成果の入手プロセスに関連する「コミュニケーション」と、研究能力向上を目的とした研修の実施とに有意な相関関連が認められた。さらに、阻害要因が2番目に高かった「研究の質」は、会議の活性化とまとめる能力の向上を目的とした研修とに有意な相関関連が認められた。以上から、組織的な研究成果活用の推進には、看護や研究の基礎を修得し、さらに高い研究成果の活用能力を有する看護スタッフの育成と活用、スタッフ個人に依存したり職場の雰囲気に左右されないケア改善のシステムの整備を行うことが重要である。

そのためには大卒看護師の採用の推進、文献検索と研究成果の入手への手続き的、経済的支援、ならびに、ファシリテーションやコーチング等コミュニケーションスキルの向上と合意形成の促進を図る院内研修の充実が鍵となってくることが明らかになった。看護情報学当初、平成25年度は先駆的かつ効果的に合意形成している全国の看護組織の実践例を調査する予定であったが、先駆的かつ効果的な実践の定義に対する示唆を得るため先行研究を検討した結果、看護師へのモチベーション向上といった人材育成の観点も影響要因として加える必要があることがわかった。そのため、全国調査のプレテストとして再度調査方法の妥当性を確認する必要性が生じたため今年度は1県内の施設を対象とした調査を行った。平成24年度は初年度として看護組織における合意形成の成立状況と研究成果活用との関連要因の調査を全国の看護管理者を対象に実施する予定であったが、研究成果活用との関連要因の再検討が必要と判断されたため実施できず、やや遅れている。ただし、これまで指摘されていなかった新たな関連要因(看護師の疑問を組織的に情報化する取り組みなど)が発見できたことは評価できると考えている。平成25年度の調査で影響要因として示唆された人材育成の研修実施状況や患者情報(カルテ)の分析担当者の配置の有無ならびに必要性の認識を調査項目に加えた全国調査を進める。また、合意形成については、トップダウンの決定と普及の方法については例が多く収集されたので、次の調査では、現場の看護師からの発議といったボトムアップの例も収集されるように調査項目に反映させたい。そこで、平成26年度は、平成25年度の調査結果を詳細に分析するとともに全国の約1000病院の看護管理者を対象に郵送のアンケート調査を実施する。組織的な合意形成のあり方としてトップダウンおよびボトムアップの革新方法の実態と人材(担当者)の配置状況、院内教育の実態と研究成果の臨床活用状況ならびに阻害要因との関連性を検証していく。看護組織における合意形成の成立状況と研究成果活用との関連要因について検討を進めていく。研究成果活用上の阻害要因と本研究でねらいとしている看護組織における合意形成およびそれらとの関連性が予測される看護師の疑問を組織的に情報化する看護部の取り組みや、組織づくりの重要概念であるファシリテーション、キャリアデザインとの関連性について、全国の看護管理者を対象に統計学的に検討していく。また、先の調査から、先駆的・効果的に合意形成を推進する組織的取り組みを抽出しインタビュー調査を行い具体的に記述すること、そして、それらを参考に研究成果活用の促進モデル案を作り、全国の看護職を対象としたアンケート調査からモデルを検証していく。研究の概念化を見直すための情報収集、関連要因を検証するための全国調査と分析、発表を行うための費用が必要である。関連学会への参加費、資料購入費、ならびに研修費の他、全国調査にかかる通信費、謝礼、データ整理、分析にかかる人件費ならびに分析機器の充実、発表のための学会参加費として使用する。
羊膜と再生刺激を用いた肝再生医療

羊膜は免疫原性に乏しく間葉系幹細胞も多く含むため、再生医療への応用が期待されている。間葉系幹細胞を抽出して心筋細胞に分化させる研究をもとに、羊膜そのものを切除による再生刺激を加えた肝に貼付して肝細胞への分化誘導を試みたが、全く誘導されることはなかった。そこで発想を転換し羊膜を培養基質として用い肝細胞を培養したところ、通常の培養皿やマトリゲルと比較して長期にアルブミン産生能を維持できることが明らかとなり、羊膜の向き(緻密層または上皮層)でも産生能に差がみられることがわかった。肝細胞を培養により長期機能維持することは再生医療の課題のひとつであり、今後新たな肝細胞の培養基質としての開発が期待される。【羊膜採取】長崎大学病院では既に眼科・視覚科学教室が既に羊膜を冷凍保存し臨床試験に用いており、同科に羊膜採取のプロトコルを御教授していただいた。現在では当科単独で羊膜の採取・保存が可能である。【ヒト羊膜のラット肝への移植】採取したヒト羊膜を用いてラットへの移植を試みた。最終的には放射線照射を行い作成した急性肝不全モデルを用いる予定であるが、羊膜の移植手技を安定させるためまず通常の野生型ラットを用いた。凍結保存していた羊膜を解凍し下記の要領でラットに移植し、移植後1・2週間で犠牲死させ標本を作製した。標本はHE染色、及び抗パンサイトケラチン抗体・抗ビメンチン抗体(前者は上皮系、後者は間質系のマーカーであるが羊膜にはいずれも発現している)を用いて免疫組織化学的検討を行い、羊膜の生着の有無を評価した。140%肝切+残肝の割面に羊膜を貼付肝の中葉を切離し(40%肝切)、残った左葉に割を入れて羊膜を貼付、縫合固定した。標本では肝切離面の線維化が著明で羊膜細胞を確認できなかった。肝切離面では炎症反応の影響が強いため生着を得られないと判断し、以下のモデルを作製した。270%肝切+上腹部全体に羊膜を広げて留置370%肝切+羊膜を大網に包埋して固定2・3いずれの方法でも組織学的に羊膜の生着を確認することができなかった。【羊膜の採取・凍結保存】前年度に引き続き、長崎大学病院における予定帝王切開症例のうち事前にインフォームド・コンセントを得られた症例で羊膜の採取を行い、凍結保存を行った。【ヒト羊膜のラット肝への移植】前年度に引き続き、野生型ラットに70%肝切除を行い、一期的に肝を被覆するように羊膜移植を行った。前年度は凍結保存していた羊膜を用いたが生着が得られなかったため、羊膜を採取した同日にラット肝切除・羊膜移植を行った。しかし術後4日目に手術を施行したラットが全例死亡し、羊膜の生着は確認できなかった。ヒト羊膜をラットに移植しても生着を得られないため。当初の計画では羊膜に肝再生刺激を加えて肝組織への分化を誘導することが目的であったが思い通りの成果が得られず、羊膜を培養基質として用い、肝細胞を培養する研究を開始した。【目的】ヒト羊膜上でラット肝細胞を培養し、その機能が通常の培養より保たれるかを検討する。【方法】1羊膜の採取:当院でインフォームド・コンセントを得られた予定帝王切開症例に立ち会い、出産の際に摘出される羊膜を回収。清潔操作で胎盤を除去し小切して凍結保存した。2肝細胞の播種:7週齢のWistar雄性ラットから肝細胞を分離し、プラスチック製培養ディッシュ:TC、コラーゲンコートデッシュ:Co、羊膜を貼付したデッシュ(羊膜上皮側:E、緻密層側:C)にそれぞれ3.75 x105 cells /well(=5 x104 cells /cm2)を播種。肝細胞を播種しない羊膜のみのディッシュ:Aも準備(それぞれn=5)。【結果】TC・Coでは鏡検上7日目頃から大半の細胞が死滅し、rAlbも14日目にはほぼ測定不能となったのに対し、E・Cでは細胞の形態が28日目まで維持され、rAlbも当初の量を維持していた。hHGFはいずれのディッシュにおいても低下傾向であった。【考察】ヒト羊膜上でラット肝細胞を培養することによりアルブミン産生能を長期間維持することが可能であった。培養期間中hHGFは低下していることより、羊膜に豊富に含まれるコラーゲンが肝細胞培養の基質として有益である可能性が示唆された。当初の予定であった羊膜から肝組織を構築するという目的は達していないが、逆転の発想から羊膜を培養基質として肝細胞を培養する全く新しい試みを開始し、肝細胞が長期にわたり機能を維持できることを証明できた。肝細胞培養において長期機能を維持することは再生医療における重要なゴールのひとつであり、今後の展開が十分期待できる。また、ヒト羊膜上でのラット肝細胞培養の研究であるため、いわゆる異種移植の組み合わせであるが、それでも良好な結果を得られたことは、今後移植免疫に関する研究の足掛かりとなることが期待される。ヒト羊膜を用いた再生医療として、昨年度はヒト羊膜上での初代ラット肝細胞培養を行った。