hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNAポリメラーゼ・イータとTLS及びDNA修復タンパク質との相互作用の解析

染色体DNAは絶えず損傷し続けており、DNA損傷に対応するメカニズムの解明は染色体サイクルの全体像の理解に必須である。本研究では、色素性乾皮症バリアント群の責任遺伝子産物であるPolηとTLS因子REV1及びミスマッチ修復因子MLH1の相互作用の生理的意義の解析を行った。そして、ヒト細胞の内在性REV1のDNA損傷部位への集積が、Polηとの相互作用により制御されていることを明らかにし、複数のTLSポリメラーゼを制御する機構があることを明らかにした。また、REV1との相互作用能を失ったPolηを発現させたXP-V群細胞株を樹立し、それらの細胞株では、紫外線感受性や紫外線誘発突然変異は正常レベルに回復しているが、自然突然変異が有意に抑制されていないことを見出し、PolηとREV1との相互作用が、内在性DNA損傷による突然変異を抑制していることを初めて示唆した。ミスマッチ修復機構は、DNA複製の忠実度を保つ上で重要な機構であるが、加えて、細胞周期チェックポイント機構や細胞死経路及び体細胞超突然変異の生成においても重要な役割を担っている。本課題では、PolηがMSH2/MSH6に加えてMLH1/PMS2とヒト細胞中で相互作用することを新たに明らかにした。また、MSH2/MSH6は、PolηのC末部分と直接相互作用することが報告されているが、それだけではなく、MLH1/PMS2を介してPolηのN末領域とも相互作用することを見出した。さらに、Polηとこれらのミスマッチ修復タンパク質との相互作用は、細胞周期のS期にクロマチン上で亢進することを見出した。これらの成果により、TLSタンパク質とミスマッチ修復タンパク質問の相互作用の多様性が初めて明らかになり、様々な生理機構との関連解明研究への新たな道筋を示した。染色体DNAは絶えず損傷を受け続けており、DNA損傷に対応するメカニズムの解明は染色体サイクルの理解に必須である。DNAポリメラーゼ・イータ(Polη)は、色素性乾皮症バリアント群の責任遺伝子産物であり、損傷乗り越えDNA複製において重要な、役割を担っている。本申請者は、Polhと相互作用する因子として、損傷乗り越え複製因子の一つであるRevlやミスマッチ修復因子Mlhlなどを同定しておりく本課題ではこれらの相互作用の意義の解析を行っている。本年は、点変異を導入し、Revlとの相互作用能のみを失ったPolηを作出し、この変異体を安定に発現させたXP-V群細胞株を樹立した。この細胞株は、紫外線感受性及び紫外線誘発突然変異に関しては、野生型Polηを発現させた細胞株と同様に正常であった。しかし、自然突然変異の抑制に異常が認められたことから、PolηとRevlとの相互作用により、内在性のDNA損傷による突然変異を抑制する新規のメカニズムが存在することを明らかにした。一方で、これまでにPolηと相互作用することが報告されているタンパク質は、Revlを含めて全て、PolηのC末側領域と相互作用することが知られているが、MlhlはPolηのN末領域内の活性に必要なLittle finger領域と相互作用することを明らかにした。これらのタンパグ質間相互作用の意義をさらに追及することにより、Polηによる損傷乗り越え複製と他のDNA損傷応答機構とのクロストークの解明、そして、その染色体サイクルにおける役割の解明につながると期待できる。
複核金属錯体による新規合成反応の開発と分子理論的検討

硫黄架橋二核ルテニウム錯体を用いた新規触媒反応の開発とその新規触媒反応の反応機構について分子理論的な検討を加えることにより、その触媒反応の本質的な原理を明らかにすること及び得られた知見を基にしたさらなる新規分子変換反応の開発を行うことを目的に研究を行った。研究期間内の達成された代表的な研究成果をまとめた。研究代表者らのこれまでの研究成果を踏まえて、研究代表者らの研究グループが開発に成功した複核金属錯体を触媒として用いたカルベン錯体の一種であるアレニリデン錯体を鍵中間体とする新規触媒反応の開発を目的としている。研究期間内に、開発に成功した触媒反応の反応機構に関する実験化学的な知見を得ると共に、当特定領域の研究者との共同研究による理論研究から分子理論的検討を加えて詳細な反応機構や電子構造を明らかにすることに焦点を絞り研究を行う。さらに、本研究で得られた情報をフィードバックし、触媒をより精密に設計することで、より高度な分子変換反応開発につなげることを研究目的としている。複数の金属を同時に用いるとそれらの協同効果が期待でき、単一の金属を用いた時には見られない特異な反応性の発現が達成可能となる。この様な概念は古くからあるが、実際にこの概念を適用し特異な反応性を達成した例は非常に限られてきた。我々の研究グループでは、硫黄架橋二核ルテニウム錯体に着目し、この二核錯体存在下でのみ特異的に進行するプロパルギル位置換反応などに代表される触媒反応の開発に成功してきた。本研究課題では、上記で示した硫黄架橋二核ルテニウム錯体を用いた新規触媒反応の開発とその新規触媒反応の反応機構について分子理論的な検討を加えることにより、その本生成の本質的な原理を明らかにすることに重点を置いている。本年度は芳香族化合物の不斉プロパルギル化反応の開発に焦点を当て研究を推進した。既に見出しているプロパルギル位置換反応に有効であった光学活性チオラート配位子を有する二核ルテニウム錯体を用いて、芳香族化合物のエナンチオ選択的なプロパルギル化反応の検討を行った。N,N-dimethylanilineとプロパルギルアルコールとの反応では最高94%eeを達成した。また、2-methylfuranとの反応でも最高83%eeのエナンチオ選択性の発現が見られた。近年数多くの不斉Friedel-Craftsアルキル化反応が開発されているが、プロパルギルアルコールを親電子剤として用いた例は本触媒反応が初めてである。研究代表者らのこれまでの研究成果を踏まえて、申請者らの研究グループが開発に成功した複核金属錯体を触媒として用いたカルベン錯体の一種であるアレニリデン錯体を鍵中間体とする新規触媒反応の開発を目的としている。本年度は上記の研究目的に対して以下の検討を行った。さらに、昨年度に見出したシクロプロピル基をプロパルギル位に有するプロパルギルアルコールとアニリンとの炭素-炭素結合の開裂を伴う共役エンイン化合物の立体選択的新規触媒反応について適用範囲を精査すると共に、理論化学から分子論的検討を加えて反応機構に関する解明を行った。その結果、協奏的な反応経路で炭素-炭素結合の開裂が進行することが確認できた。この理論的な検討の結果得られた知見を基にして、プロパルギルアルコールとジエンとの反応の検討を行い、新規触媒反応が進行することを見出した。昨年度までの研究成果として、これまでに上記で述べた触媒的プロパルギル位置換反応の類似反応としてプロパルギルアルコールとオレフィン類のカップリング反応の開発に成功している。プロパルギルアルコールから系中で生成するアレニリデン錯体のβ, γ炭素-炭素二重結合間とオレフィンとの間でのアレニリデンーエン反応が進行し、炭素-炭素結合が新規に生成することで、1, 5-エンイン化合物が効率良くかつ高選択的に得られたと考えている。この新規触媒反応の反応機構を理論計算により検討したところ、当初推定していた協奏的にアレニリデンーエン反応が進行しているのではなく、段階的に炭素カチオン種の生成を伴い反応が進行していることを見出した。

この理論計算によって明らかとなった反応機構の検討結果を踏まえて、反応中間体として生成すると推定される炭素カチオン種を適切なカチオン捕捉剤で押さえることができれば、オレフィン類の新しい官能基化反応開発に繋がるのではないかと考えた。実際に実験を行ったところ、予想通りオレフィン類の触媒的オキシプロパルギル化反応が進行することを見出した。申請者らのこれまでの研究成果を踏まえて、申請者らの研究グループが開発に成功した複核金属錯体を触媒として用いたカルベン錯体の一種であるアレニリデン錯体を鍵中間体とする新規触媒反応の開発を目的としている。研究期間内に、開発に成功した触媒反応の反応機構に関する実験化学的な知見を得ると共に、当特定領域の研究者との共同研究による理論研究から分子理論的検討を加えて詳細な反応機構や電子構造を明らかにすることに焦点を絞り研究を行う。さらに、本研究で得られた情報をフィードバックし、触媒をより精密に設計することで、次世代の窒素固定法などのより高度な分子変換反応開発につなげる。我々の研究グループが検討を行ってきた「複数の金属を用いた特異な分子変換反応の開発」に関する研究で、シクロプロパン誘導体とアルデヒド及びイミンなどのカルボニル類縁体との[3+2]型環化付加反応の開発を行った。触媒量の硫黄架橋二核ルテニウム錯体及び化学量論量のルイス酸存在下、二つのエステ基を有するシクロプロパンとベンズアルデヒドとの反応で、対応するテトラヒドロフラン誘導体が、また、イミンとの反応で対応するピロール誘導体がそれぞれ良好な収率で得られた。その有機合成的な知見から本触媒反応の適用範囲を詳細に検討すると共に、反応機構に関する理論的な検討を加え、詳細な反応機構を明らかにすることに成功した。特に、理論計算に関しては、連携研究者である坂田健グループ(星薬科大学)と密接に連絡を取り合う共同研究を推進することに成功した。
日本仏教教育の戦前と戦後の連続性と非連続性―宗教教育の公共性に向けて―

平成30年度は、前年度に引き続いて資料収集と各研究分担の研究状況の検討会を中心に研究を進めた。資料収集については分担を決め、川村は浄土真宗関係を、笹田は臨済宗関係を、小池は曹洞宗関係を担当した。川村は、北海道の開教で大きな力を発揮した真宗大谷派の活躍に注目し、同派札幌別院で明治期から第二次大戦後までの仏教教育・仏教教化の資料調査を行った。また、国立国会図書館および真宗および浄土宗の宗門大学で資料調査を行った。笹田は、禅の修養と間宮英宗関連の資料、および教育雑誌『興亜教育』と宗教新聞『中外日報』に掲載された昭和10年代から終戦時までの宗教教育、仏教教育に関する論文と記事を収集調査した。小池は、戦後の曹洞宗教学部の教化資料として注目される布教講話集の収集を行った。特に今回は、ハワイの開教に注目し、川村と笹田が、ハワイにある浄土真宗、浄土宗、曹洞宗の別院、更にハワイ日本文化センターを訪問し、日系人に対する仏教教育・仏教教化に関する資料収集を行った。開教使が記した当時の日誌や別院発行の新聞や機関誌等の貴重な資料を閲覧し、コピーした。また種々の教化・教育のテクストを購入した。研究検討会は3回行った。第1回は、7月22日、第2回は10月28日に共に秋田大学東京サテライトで、第3回は平成31年1月30日・31日の両日に秋田大学中央図書館共同研究室で行った。当初計画した仏教教育を実践した元教師や宗教者の聞き取り調査は調査対象となる人選ができず、30年度は見合わした。また敗戦後の占領期のGHQの影響についても十分な分析はできなかった。しかし、今までの研究を背景にして近代日本における戦前期の仏教教化と仏教教育については十分な研究ができ学会発表等を行った。我々の研究はどこまでも仏教の教化や教育の果たした功罪を近代日本全体のなかで教育学的に捉えようとするものである。本研究は、戦前と戦後に見られる仏教教育に何が連続し、何が非連続の状態にあるのかを教育学的に明らかにし、現代日本で問題になっている宗教教育の公教育における可能性を探るものである。これについて戦前までの研究は順調に進み、現代への分析視座を獲得できる状態になっている。このため、我々は、以下のような学会発表を行った。まず、駒澤大学で10月27日に開催された日本仏教教育学会第27回学術大会で、今まで研究討議をした研究の一部を3名連名の形で共同発表を行った。発表タイトルは「戦前の日本仏教教育の原理と方法ー布教教化の原理と実践理論ー」である。更に大正大学で平成31年3月23日に開催された第5回日本仏教教育学会公開研究会のシンポジウム「建学の理念と大学教育ー仏教教育学の今日的課題ー」において小池はシンポジストとして「社会教育としての仏教教育と道徳教育」と題して発表した。笹田はシンポジウムのコメンテーターを務めた。川村は、酪農学園大学で5月20日に開催された第38回全国私立大学教職課程協会研究大会の第2分科会において「現代日本における道徳教育の根本問題ー佛教教育の必要性ー」と題して発表した。また、芦屋大学で10月20日に開催された現代教育研究会において「親鸞における『悪人正機』の教育学的意義」と題して発表した。更に中国南京で11月4日に開催された中国仏教文化研究所主催の第16回日中佛教学術交流会議で基調講演を行った。講演タイトルは、「現代の人間学と仏教教育ー仏教教育の現代性ー」である。以上のような発表を行うことで研究の進捗状況が確認できることから概ね順調に研究が進んでいると言うことができる。平成30年度の研究は、戦前期の仏教教育を中心に行い、学会発表も行ったが、これからも戦前期の仏教の民衆へ向けた教化と教育の資料の発掘を続けるとともに、戦後直後の仏教の教育資料や教化資料、さらにはGHQの占領政策による仏教の教化と教育への影響、さらに民衆への発言や言動に関する資料の収集を行うことで、戦後期の仏教の教化と教育の実態を明らかにする。仏教は宗教として民衆の人間形成に甚大な影響を与えるため、そうした資料の発掘によって仏教の功罪を明らかにすれば、仏教から宗教教育の公共性についての可能性を探ることができるのではないかと思われる。今後の研究は、こうした見通しのもとに進める。平成29年度の研究は、資料収集と研究分担者との研究状況の検討会を中心に進めた。資料収集については、川村は、浄土真宗関係、笹田と小池は禅宗関係を担当した。当初、笹田は禅宗の一宗である曹洞宗を担当することにしていたが、従来の研究方向から小池が曹洞宗を担当し、笹田は臨済宗を担当した。川村は、浄土真宗の本山である西本願寺の宗会の議事録の調査を行い、明治期と大正期に仏教教育について議論されている議事録を収集した。西本願寺の宗会は国会開設のロードマップになったと言われ、貴重な議事録の収集ができた。また、西本願寺の戦前の機関誌である『教海一瀾』に掲載されている仏教教育に関する記事の収集をおこなった。笹田は、花園大学情報センターで明治期から現代まで発行されている機関誌『正法輪』を調査し、戦前・戦後の臨済宗の教育制度・教育内容等の資料を収集した。小池は、主として明治期の曹洞宗の機関誌『曹洞宗報』と『曹洞宗布達全書』を調査した。

研究検討会は2回行った。第1回は、11月18日に東京の秋田大学東京サテライトで、第2回は、2月5日に秋田大学中央図書館共同研究室で行った。収集資料に基づく研究討議から浄土真宗と禅宗は明治期の近代化のなかで民衆の教育的啓蒙を強力に推し進めていたことが分り、明治期の公教育外での仏教教育の現実と実践の様相が明らかになった。特に、啓蒙する仏教者の教育的意識が、民衆を「愚人」と見る愚人開導にあることが、共同討議から見えてきたことは大きな収穫であった。公教育における近代的な国民教育の進展の背景に、民衆と深く関ってきた仏教の教育と教化があること、そしてその場が寺院であることが、明治期の特質と言えるが、これがどのように変容し、受け継がれていくのかが、これからの研究の課題となった。本研究の目的は、教育基本法の改正と道徳の教科化で公教育における宗教的教養教育の可能性が出てきたことに鑑み、宗教教育の公教育にける可能性を探るものであるが、特に日本人の意識形成に強い教育的影響力を歴史的に持ってきた仏教に注目し、仏教のそれを浄土真宗と禅宗の戦前と戦後に注目して教育学的に検証し、健全な宗教教育の構築を考えようとするものである。平成29年度は、主として明治期の資料収集をして、日本近代化のなかで仏教の教育的影響力を調べることができた。資料収集については、当初計画した各宗派の発行している新聞や民間の宗教新聞社については時間的制約からできなかったが、それ以外については概ね順調に調査ができ、浄土真宗と禅宗の明治期の教育的啓蒙の実態を生活のレベルで検証できる状況になった。平成30年度は、前年度に引き続いて資料収集と各研究分担の研究状況の検討会を中心に研究を進めた。資料収集については分担を決め、川村は浄土真宗関係を、笹田は臨済宗関係を、小池は曹洞宗関係を担当した。川村は、北海道の開教で大きな力を発揮した真宗大谷派の活躍に注目し、同派札幌別院で明治期から第二次大戦後までの仏教教育・仏教教化の資料調査を行った。また、国立国会図書館および真宗および浄土宗の宗門大学で資料調査を行った。笹田は、禅の修養と間宮英宗関連の資料、および教育雑誌『興亜教育』と宗教新聞『中外日報』に掲載された昭和10年代から終戦時までの宗教教育、仏教教育に関する論文と記事を収集調査した。小池は、戦後の曹洞宗教学部の教化資料として注目される布教講話集の収集を行った。特に今回は、ハワイの開教に注目し、川村と笹田が、ハワイにある浄土真宗、浄土宗、曹洞宗の別院、更にハワイ日本文化センターを訪問し、日系人に対する仏教教育・仏教教化に関する資料収集を行った。開教使が記した当時の日誌や別院発行の新聞や機関誌等の貴重な資料を閲覧し、コピーした。また種々の教化・教育のテクストを購入した。研究検討会は3回行った。第1回は、7月22日、第2回は10月28日に共に秋田大学東京サテライトで、第3回は平成31年1月30日・31日の両日に秋田大学中央図書館共同研究室で行った。当初計画した仏教教育を実践した元教師や宗教者の聞き取り調査は調査対象となる人選ができず、30年度は見合わした。また敗戦後の占領期のGHQの影響についても十分な分析はできなかった。しかし、今までの研究を背景にして近代日本における戦前期の仏教教化と仏教教育については十分な研究ができ学会発表等を行った。我々の研究はどこまでも仏教の教化や教育の果たした功罪を近代日本全体のなかで教育学的に捉えようとするものである。
日本の伝統舞踊における「わざ」の継承・習得・熟達過程の体系化

本研究は,日本の伝統舞踊において「わざ」がどのように継承・習得され,また時間とともに「わざ」がどのように熟達するかを理論的,科学的,総合的に解明することを目的とする.モーションキャプチャ(身体動作),アイマークレコーダ(視線計測)を用いて舞踊におけるわざの物理的側面の計測し,指導者から学習者へと伝えられる「わざ」の継承,習得,熟達過程について多面的なアプローチを試みた.また,初心者から熟練者まで,熟練度の異なる協力者を対象とし,熟達の過程の定量化を試みた.本研究は,日本の伝統舞踊において「わざ」がどのように継承・習得され,また時間とともに「わざ」がどのように熟達するかを理論的,科学的,総合的に解明することを目的とする.モーションキャプチャ(身体動作),アイマークレコーダ(視線計測)を用いて舞踊におけるわざの物理的側面の計測し,指導者から学習者へと伝えられる「わざ」の継承,習得,熟達過程について多面的なアプローチを試みた.また,初心者から熟練者まで,熟練度の異なる協力者を対象とし,熟達の過程の定量化を試みた.本研究では,日本の伝統舞踊において「わざ」がどのように継承・習得され,また時間とともに「わざ」がどのように熟達するかを理論的,科学的,総合的に解明することを目的としている.具体的には,動作分析,視線分析,言語分析,行動分析を行い,指導者から学習者へと伝えられる「わざ」の継承,習得,熟達過程を多面的にアプローチする.本年度は,舞楽『陵王』において舞人が登台後沙陀調音取から当曲音頭までのあいだをどのような「間」で舞うか,またその際龍笛主管奏者の有無や状況により舞人の「間」のとり方がどのように変化するかについて,動作解析と舞人によるアンケート調査により定量的に明らかにするための実験を行った.実験は,4名の舞人に(1)無音,(2)録音に合わせる,(3)龍笛奏者と背中合わせ,(4)龍笛奏者が舞人の背を見ながら同じ向き,(5)龍笛奏者と向かい合わせの計5条件で行い,各5試行ずつ計測を行った.実験の結果,舞人の「間」のとり方には個人差があるが,その個人差ははじめに習った師ではなくその後一緒に多く練習をした人と似通う傾向があること,龍笛奏者が視認でき,曲の一連の流れを感じることができる条件下の方が舞人は舞いやすく,ゆったりと舞えると感じていることが分かった.実際の舞台の本番中,舞人は面をつけるため龍笛奏者を視認することは難しいが,一元配置分散分析の結果,同じ向き条件と向かい合わせ条件には有意差がなかったため,龍笛奏者が舞人を視認できていれば,龍笛奏者から舞人の「間」をはかり合わせることができると推察される.本研究では,日本の伝統舞踊において「わざ」がどのように継承・習得され,また時間とともに「わざ」がどのように熟達するかを理論的,科学的,総合的に解明することを目的としている.具体的には,動作分析,視線分析,言語分析,行動分析を行い,指導者から学習者へと伝えられる「わざ」の継承,習得,熟達過程を多面的にアプローチする.23年度は主に,22年度に収録した舞楽『陵王』のデータの分析を進め,舞人の「間」のとり方についての詳細な検討を行った.その結果,舞人が主観的に感じている「間」の長さと,客観的に測定しうる物理的な「間」の長さは必ずしも一致しないことが示された.とりわけ,舞楽における「間」は,振りと振りのつなぎ目の「間」をどのように保つか,といったことと大きく関係しており,振りに費やす時間が短ければ短いほど,舞人自身は「ゆったりと舞えた」と感じていることがわかった.つまり,振りと振りをつなぐ「間」の長さをどのように保つか,ということと舞人の「間」の感覚に強い関連があることが示された.研究成果は国内,国外の会議にて発表し,伝統芸能において暗黙裡に受け継がれてきた秘伝のわざを実証的な方法によりアプローチする試みとして一定の評価を得た.今年度はさらに,日本の伝統芸能従事者として,花柳乃三氏(日本舞踊),笹岡隆甫氏(生け花)を招聘し,それぞれの分野における「伝統とわざ」についての情報提供をいただいた.24年度は最終年度であるため,これまでの研究の整理と統合を行い,本研究の最終目標であった「わざ継承の体系化」のための作業を行う予定である.本研究は,日本の伝統舞踊において「わざ」がどのように継承・習得され,また時間とともに「わざ」がどのように熟達するかを理論的,科学的,総合的に解明することを目的とするものであった.指導者から学習者へと伝えられる「わざ」の継承,習得,熟達過程について多面的なアプローチを試みた.モーションキャプチャ(身体動作),アイマークレコーダ(視線計測)を用いて舞踊におけるわざの物理的側面を計測を行った.また,初心者から熟練者まで,熟練度の異なる協力者を対象とし,熟達の過程の定量化を試みた.さらに,実際の稽古場面に立ち会い,稽古の風景をビデオ撮影し,映像コーディングにより行動分析を行った.

これらをもとに,実際に稽古の現場で使用されているわざ言語(指導言語)と動きの関係を明らかにするとともに,指導者と学習者のインタラクティブな関係性についての定量化を試みた.編成24年度は,特にこれまでに収録したモーションキャプチャデータの編集,分析,統合作業を行うとともに,日本舞踊に限らず,広く芸能におけるわざの継承,習得,熟達過程に関する検討や未熟練者,熟練者の比較を行った.また,観客の有無によって演者のパフォーマンスがどのように異なるかを調べるための実験を実施し,熟練者がいかにして「観客」を巻き込んで舞台空間を作り出しているかについて検討を行った.研究成果は国内外の会議において発表を行った.当初の予定通りデータ収録は順調に進んでいる.しかし,データの編集,集計作業に膨大な労力を費やしており,やや難航している.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度では,これまでに蓄積してきたあらゆるデータの統合を行い,「わざ」伝承の体系化を目指すべく,さまざまな分析手法を試みる予定である.特に学内に在籍している統計を専門とする研究者に知識提供を要請し,データの集約方法について検討を重ねたいと考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
動的密度汎関数理論に基づく分子性液体の非平衡特性に関する基礎研究

1)高分子の配座に対する溶媒効果高分子の配座は例えば蛋白質分子の折れ畳と関連して多くの研究者の興味を集めている。我々は動的な密度汎関数理論の立場から1つの高分子が単純液体(溶媒)に溶けている場合の高分子の配座を研究した。すなわち高分子の運動とそれに追随する溶媒の運動をカップルして解き、高分子の配座の時間的な変化を追跡し、それに伴う系の自由エネルギーの変化をも計算した。これにより親水性、疎水性溶媒での異なる振る舞いを説明した。これまで溶媒の効果を分子論的な立場から調べた例は少なく今後も密度汎関数理論は高分子の配座に対する溶媒効果の研究において重要な役割を果たすと期待される。2)エントロピーによる非平衡系の解析ガラス転移や擬似徐冷における非平衡状態を特徴づけるときに、系のエントロピーは重要な役割を果たす。我々は熱エントロピーと統計エントロピーの2種類のエントロピーを導入し、これらの間の不等式を簡単な確率モデルに対して導出し、これよりいくつかの系(2安定系、サイクル系)に対してこの不等式の意味を明らかにした。1)分子性液体に対する動的密度汎関数理論分子性液体の平衡特性に関するチャンドラ-等の密度汎関数理論を動的に拡張し、これを用いてまず2原子分子の粘性係数を定式化し実際に数値計算した。すなわちクエット流における2分子間の相関の、等方性からのずれをもとめこれより粘性係数を計算した。数値的に正しい値を与えるだけでなく分子自身がクエット流中においてある方向に揃うということを理論的に預言している。2)分子性液体の熱膨張と配座上に述べた定式化により分子性液体の熱膨張や異性化反応等も扱えることがわかり実際に液体窒素とモデル化したn-ブタンについて計算し計算機実験の結果と比較した。高密度液体においてはボンド長の大きなトランス状態よりボンド長の短いゴ-シュ状態ととりやすいということを定量的に示した。3)モンテカルロ法の開発と応用高分子液体におけるコラプス転移や蛋白質の折り畳みは我々の研究目標の一つであるがこれらの研究においては計算機実験が重要な役割を果たしモンテカルロ法の開発は重要なテーマである。我々は特にこの分野で最近興味を集めているエントロピーサンプリング法に注目しこれを適応(アダプテーション)モンテカルロ法と位置付け、新しい導出法を与え、さらにこれを1次相転移系に応用した。多くの2次元図形の処理、データ解析にはパソコンのMacが重要な役割を果たした。時々刻々の高分子の変形を調べたことにより、親水性、疎水性溶媒での異なる振る舞いを説明した。2)エントロピーによる非平衡系の解析ガラス転移や疑似徐冷における非平衡状態を特徴づけるときに、系のエントロピーは重要な役割を果たす。
トランス脂肪酸が天然の脂肪酸とは異なる機序で起こす細胞機能障害に関わる因子の解明

人工のトランス脂肪酸を多く摂取すると、立体構造が類似する天然の飽和脂肪酸を多く摂取した時のように疾患の発症リスクが高まることが報告されている。そこで本研究では、細胞膜でのリン脂質の変化に着目し、人工のトランス脂肪酸が起こす細胞機能の障害に関わる因子を明らかにする。この現象に関わる分子として、すでに特定したAktを中心に、(1)Aktが活性化する場である細胞膜の脂質ラフトのリン脂質に焦点を絞った解析と、(2)リピドミクス解析やマイクロアレイ解析による網羅的な解析を並行して進める。これにより、天然の物質と似た構造の人工の物質が細胞機能を障害し、生体機能を乱すメカニズムの一端が明らかになると考える。
HLA分子由来ペプチドと遺伝子導入樹状細胞を用いた寛容誘導の研究

研究課題:HLA分子由来ペプチドと遺伝子導入樹状細胞を用いた寛容誘導の研究。研究計画要旨及び実績概要:我々は以前、HLA抗原(HLA-B35及びHLA-B51)を移入したTransgenic mouse(TGM)2種類を作成し,HLAクラス1分子の免疫応答における役割を直接in vivo(異所性心移植モデル)で解析するシステムを開発した。このモデルにてドナー由来の合成ペプチドのレシピエント胸腺s内投与により移植心の生着延長を認めている(60日以上)。今回我々は、成人の退化した胸腺に変わり得るものとして、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(DC)に着目し、遺伝子レベルで操作したDCと、上記アロ由来ペプチドとの接触により、胸腺内投与と同様の末梢性免疫寛容を上記TGM移植モデルにて誘導するのを目的としている。HLA抗原を移入したTGM2系統(C3H. B35及びC3H. B51)の回復及び免疫応答の確認:凍結胚からの回復後、約半年間の交配過程を経てTGM2系統共にホモ接合性の繁殖可能な個体が得られた。当研究計画の要ともいえる2系統間の同種免疫応答をin vivo及びin vitroにて確認した。C3H. B35からC3H. B51への皮膚移植片は平均15日間で90%が拒絶され、異所性心移植片は平均24日間で拒絶された。これらは当研究計画の基礎となる安藤らの報告(Ando and Beck et al.,Transplantation 68,904-908,1999.)とほぼ合致する所見である。また、C3H. B35皮膚移植片にて感作されたC3H. B51脾細胞を応答細胞、ガンマ線照射処理C3H. B35脾細胞を刺激細胞とし、混合培養することにより、E:T比80:1で50%を超える%特異的細胞障害活性を持つ同種(この場合はC3H. B35に対する)特異的細胞障害性Tリンパ球を生成し得た。マウス樹状細胞(DC):骨髄由来細胞から付着細胞を除外しGM-CSFおよびIL4を作用させることにより、混合白血球反応にて確認しうる同種免疫応答を惹起するアロ樹上細胞を生成し得た。これらのDCを使用してTGMの心移植、皮膚移植を行い、寛容誘導が可能か否か検討する。研究計画要旨及び実績概要:我々は以前、HLA抗原(HLA-B35及びHLA-B51)を移入したTransgenic mouse(TGM)2種類を作成し,HLAクラスI分子の免疫応答における役割を直接in vivo(異所性心移植モデル)で解析するシステムを開発した。このモデルにおいてドナー由来の合成ペプチドをレシピエント胸腺内に投与することにより移植心の生着延長を認めている(60日以上)。今回我々は、成人の退化した胸腺に変わり得るものとして、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(DC)に着目し、遺伝子レベルで操作したDCと、上記アロ由来ペプチドとの接触により、胸腺内投与により得られたのと同様の末梢性免疫寛容を上記TGM移植モデルにおいて誘導することを目的としている。研究の進捗状況を以下に示す。

HLA抗原を移入したTransgenic mouse(TGM)2系統(HLA-B51TGM及びHLA-B35TGM)の胚移植による回復:HLA-B51TGMは雌雄共にホモ接合性の繁殖可能な個体が得られている。HLA-B35TGMはホモ接合性の雄の個体のみ得られているため、戻し交配及び人工授精により繁殖可能な雌雄の組み合わせを得るべく計画中である。遅くとも平成十三年3月下旬には心移植移植実験に用いる個体を確保できる予定である。マウス異所性心移植技術的安定:当研究室に於いて既に確立済みである。マウス樹状細胞(DC)採取技術の確立、形質及び機能評価:現在in vitroにて形質及び機能の評価を行なっている。遺伝子レベルでの樹状細胞(DC)操作:適切なウイルスベクター、導入遺伝子、パッケージング細胞系列は既に準備済みであり当研究室にてDCにおける有効性が確認されている。総括:研究計画の進行は概ね順調である。研究課題:HLA分子由来ペプチドと遺伝子導入樹状細胞を用いた寛容誘導の研究。研究計画要旨及び実績概要:我々は以前、HLA抗原(HLA-B35及びHLA-B51)を移入したTransgenic mouse(TGM)2種類を作成し、HLAクラスI分子の免疫応答における役割を直接in vivo(異所性心移植モデル)で解析するシステムを開発した。このモデルにてドナー由来の合成ペプチドのレシピエント胸腺内投与により移植心の生着延長を認めている(60日以上)。今回我々は、成人の退化した胸腺に変わり得るものとして、強力な抗原提示能を有する樹状細胞,(DC)に着目し、遺伝子レベルで操作したDCと、上記アロ由来ペプチドとの接触により、胸腺内投与と同様の末梢性免疫寛容を上記TGM移植モデルにて誘導するのを目的としている。HLA抗原を移入したTGM2系統(C3H.B35及びC3H.B51)の回復及び免疫応答の確認:棟結胚からの回復後、約半年間の交配過程を経てTGM2系統共にホモ接合性の繁殖可能な個体が得られた。当研究計画の要ともいえる2系統間の同種免疫応答をin vivo及びin vitroにて確認した。C3H.B35からC3H.B51への皮慮移植片は平均15日間で90%が拒絶され、異所性心移植片は平均24日間で拒絶された。これらは当研究計画の基礎となる安藤らの報告(Ando and Beck et al. Transplantation 68, 904-908, 1999)とほぼ合致する所見である。また、C3H.B35皮膚移植片にて感作されたC3H.B51脾細胞を応答細胞、ガンマ線照射処理C3H.B35脾細胞を刺激細胞とし、混合培養することにより、E:T比80:1で50%を超える%特異的細胞障害活性を持つ同種(この場合はC3H.B35に対する)特異的細胞障害性Tリンパ球を生成し得た。マウス樹状細胞(DC):骨髄由来細胞から付着細胞を除外しGM-CSFおよびIL4を作用させることにより、混合白血球反応にて確認しうる同種免疫応答を惹起するアロ樹上細胞を生成し得た。展望:今後、TGMより採取したDCを操作することによるTGM間の同種免疫応答の制御の可能性を検討する予定である。
飛行ビークルのための多脚型対地適応システム

飛行ビークルの対地適応性を向上させるために搭載可能な脚機構のコンセプトを提案した.理想的な速度特性を持ち衝撃吸収をしやすい脚機構を平行リンクを用いて構成し, 2脚モデル, 3脚モデルを製作し,不整地での衝撃吸収と地形適応の動作試験を行った.クワッドローターのヘリコプターに本機構を搭載し,飛行と地形適応が可能であることを示した.飛行ビークル自体の移動自由度を利用し,省自由度で着地点を任意に選び胴体部を水平に保つことができる機構を考案し,実験により有効性を確かめた.飛行ビークルの対地適応性を向上させるために搭載可能な脚機構のコンセプトを提案した.理想的な速度特性を持ち衝撃吸収をしやすい脚機構を平行リンクを用いて構成し, 2脚モデル, 3脚モデルを製作し,不整地での衝撃吸収と地形適応の動作試験を行った.クワッドローターのヘリコプターに本機構を搭載し,飛行と地形適応が可能であることを示した.飛行ビークル自体の移動自由度を利用し,省自由度で着地点を任意に選び胴体部を水平に保つことができる機構を考案し,実験により有効性を確かめた.対地適応システムに必要な機能として,街撃吸収と地形に適応した形状の実現に着目し,以下の研究を行った.(1)平行リンクを用いた衝撃吸収と地形適応平行リンクを用いた脚機構を二つ用いた着地システムを開発した.脚はそれぞれ鉛直方向の伸縮1自由度を持ち,DCモータとロータリーエンコーダ,PID制御で位置制御が可能なものとした.実験では高さは既知とし.リミットスイッチで落下の瞬間を検出し,あらかじめ決めたソフトランディング軌道を追従する制御を行い,落下衝撃を加速度センサで計測する形式とした.平面上での着地動作,段差のある面での着地動作実験を行い,衝撃吸収機能を確認した.(2)空圧アクチュエータを用いた衝撃吸収と地形適応空圧シリンダ3本を用いた着地機構を開発し,段差のある地形への着地動作について検証した.センサとしては.足裏のタッチセンサ,胴体部の姿勢センサを搭載した.空圧シリンダはバルブの制御により.シリンダ間の流体を共有し,パッシブな不整地適応(イコライザー)機能を実現した.また,落下実験により,バルブを制御して衝撃吸収と着地後の地形適応形状の実現が可能であることを確認した.(3)斜面に適応する脚機構の検討固定脚1本と1自由度可動脚2本,赤外線センサと姿勢センサを有する,斜面を想定した不整地適応機構を開発した.アクチュエータとしては小型のRCサーボモータを使用し,足裏が胴体部に対して常に同じ方向を維持するように,ワイヤープーリーを用いた平行リンク機構を搭載した.比較的低速な100mm/sec程度の落下速度において,斜面における対地適応形状の実現が可能であることを確認した.対地適応システムに必要な機能として,衝撃吸収と地形に適応した形状の実現に着目し.以下の研究を行った.(1).3本脚の機構モデルを利用した衝撃吸収動作の実験前年度までの成果を踏まえ,提案する平行リンク機構を3組搭載した機構を開発し.段差のある地形において,衝撃吸収能力と着地後の胴体支持機能を有することを加速度センサと画像解析により実験的に確認した.センサとしては可撓性のワイヤを用いたウィスカセンサ,加速度センサを用い,脚先の接触状況を検出し,その情報を制御に利用した.(2)飛行ビークルに搭載した脚機構による,空中での脚動作の確認と,不整地への適応動作の確認模型ヘリコプターを利用した飛行可能な機構を製作し,実際に限られたペイロード内で離着陸が可能であり,空中での動作が可能であることを確認した.さらに,この機能を利用して,段差のある不整地に適応して離着陸が可能であることを確認した.(3)自由度を削減した5自由度の機構を用いた不整地適応機構の考案と機構モデルによる動作検証歩行用多脚ロボットの脚の自由度としては,脚先端の位置を指定するため1脚当たり3自由度を有することが普通であったが,飛行ビークルの対地適応機構として使う場合,飛行ビークル自体の移動能力も利用できるため,必要な自由度が少なくて済むはずである.そこで5自由度からなり,脚先の3か所を相対的に駆動可能な機構を提案し,実機によりその実現可能性を提案した.
配糖体色素の精密構造認識によるキラル超分子の形成と発色

ヤグルマギクの青色花弁色素、プロトシアニンは、アントシアニンのサクシニルシアニン(Sucy)、フラボンのマロニルフラボン(Mafl)、金属イオン(Fe^<3+>,Mg^<2+>)から形成される分子集合型分子であった。直接、花弁から本色素を単離するのは解離、退色が容易に起こるため極めて困難であった。粗色素から構成成分を精製・単離し、それらの構成成分のあらゆる組み合わせを検討して、プロトシニアン色素の再構成実験を行った。SucyとFe^<3+>イオンの等量比がきわめて大切でその比が1:1/6のであることが必須であった。1/6以上の鉄イオンを用いるとプロトシアニン異なった色素を生成した。再構成によって天然の色素と全く同一の化学的性質をもつ再構築色素を純粋に得た。この色素の精密な分子量はイオンスプレイ質量分析によって8511であること、^<57>Fe(enriched)で置換されたプロトシアニンのメスバウワ-測定とESRから錯体中心の鉄イオンはFe^<3+>であることを突き止めた。以上の結果からプロトシアニンの分子組成を[Sucy_6Mafl_6Fe^<3+>Mg^<2+>]と決定することができた。中心金属のFe^<3+>とMg^2をそれぞれ他の金属イオンで置換すると、3価の金属イオンで置換すると青色から青紫色に変わったが、2価の金属を替えてもその色は変化しなかった。これらの磁気円二色性からプロトシアニンの青色は、リガンドのアントシアニジン母核からFe^3への電荷移動(LMCT)によって発現されることが分かった。
相変化マスクを用いた近赤外半導体ナノイメージング分光法と量子状態制御法の開発

光通信デバイス・材料の高分解能顕微分光法として、相変化マスクを用いたナノイメージング分光法の提案と実証を行った。相変化材料(GeSbTe)が有するアモルファス相・結晶相間の高い光学コントラストと近赤外域での高い透過率を最大限に活用し、100200nmの空間分解能と波長1500nm近傍での定損失な信号集光を実現した。また、GeSbTeのアモルファス化は大きな体積変化をともない、量子ドットへの応力印加源としても利用できることを実証した。応力印加位置や印加量の適切な制御により、量子ドットのエネルギー準位を精密に調整可能であることを示し、シミュレーションとも良く一致していることを確認した。GeSbTe薄膜を光学マスクとした近赤外ナノスケール分光のデモンストレーションを試みた。まず、薄膜構造の設計を、FDTDシミュレーションを用いておこなった。光学的コントラストと励起光減衰の大きさを考慮し、膜厚の最適値として50nmという値を見出した。この厚さの場合、発光信号の減衰はほとんどないことも明らかとなった。また、アモルファス領域(開口)の大きさを直径300nmとした場合、試料内での光照射領域は、200nmとなるという結果を得た。測定用試料として、MBE成長によるInAs/InP量子ドットを用意した(発光波長は11001500nm)。その表面にGeSbTe薄膜(組成比10:2:13)をスパッタ成膜し、アニーリングにより結晶化した。フェムト秒パルスレーザ(波長800nm)、あるいはピコ秒パルスレーザ(波長532nm)を使い、非熱的にアモルファス開口を形成した(開口の大きさは300nm以下である)。続いて、He-Neレーザを光源として、量子ドットのフォトルミネッセンス測定をおこなった。GeSbTeの光学マスクを施していない領域では、数10本の発光ラインが見られるのに対し、アモルファス開口領域では、数本のみとなっており、観察されている量子ドットの個数が大幅に限定されていることがわかった。アモルファス開口部に連続光をごく短時間照射し、アニーリングによる結晶化をおこなったところ、数本の発光ラインが消滅し、開口が閉じたことを確認した。以上のとおり、GeSbTeを光学マスクとした新しい顕微分光法の開発に成功した。近赤外領域で高空間分解能(200nm)と高集光効率を両立しており、光通信波長帯デバイス用材料・ナノ構造の評価ツールとしての意義は大きい。カルコゲナイド相変化材料薄膜を光学マスクとした高分解能近赤外ナノ分光法の開発に継続して取り組んだ。高光透過性を有するアモルファス化領域を開口として機能させ、空間分解分光をおこなう。観察対象としては1.31.5umにて発光するInAs/InP量子ドットを用意し、その上に相変化薄膜を成膜した。これまで相変化膜としてGeSbTeを使用してきたが、新たにGeTeを導入し、アモルファス化条件の最適化を行った。GeTeの方が結晶化、アモルファス化が容易であり、また相変化閾値が明瞭であるため、アモルファス化領域の微小化に有効であることが明らかとなった。また、さらなる開口の微小化のために、ドーナツ状スポットによる再結晶化法と組み合わせることを試みた。通常のアモルファス化の後に、フルエンスを抑えたアジマス偏光ビームを照射することにより、アモルファス化領域の外周部を結晶化し、開口径を半分以下にすることができた。相変化時の体積変化にともなう応力印加を利用した量子ドット発光エネルギー制御法の高度化に継続して取り組んだ。こちらの実験においてもGeTe膜を導入し、複数パルス照射によるアモルファス化・結晶化によって、段階的かつ可逆的な発光ピークシフトを確認した。相変化にともなう体積変化がGeSbTeよりも大きいため、各ドットのピークシフト量の平均値として大きな値が得られた。最大エネルギーシフト量は3meV程度であった。また、アモルファス化領域と量子ドットの相対位置とシフト方向・シフト量の関係を系統的に調査した。アモルファス化領域直下ではアモルファス化量に比例してレッドシフトを示し、アモルファス化領域周辺部ではブルーシフトを示すことを見出した。この結果は応力分布シミュレーションと良く一致している。カルコゲナイド相変化材料(GeSbTe)薄膜を光学マスクとした高分解能近赤外ナノ分光法の開発に前年度に引き続き取り組んだ。高光透過性を有するアモルファス化領域を開口として機能させ、空間分解分光を行った。観察対象としては1.31.5umにて発光するInAs/InP量子ドットを用意し、その上にGeSbTe薄膜を成膜した。GeSbTe

膜厚、ならびにアモルファス化条件(レーザフルエンス・照射回数)を最適化することにより、前年度より小さく、安定したアモルファス開口形成が実現した。さらに金属遮光膜を施さない近接場プローブを用いて光をサブ波長まで集光する技術と組み合わせることにより、より小さなアモルファス開口が形成でき、空間分解能が大幅に向上することを確認した。相変化時の体積変化にともなう応力印加を利用した量子ドット発光エネルギー制御法の高度化を推進した。GeSbTe膜上にSiO2を成膜し、応力が主に量子ドット側に印加されるよう工夫した。複数パルス照射によるアモルファス化・結晶化(フルエンスで調整)によって、段階的かつ可逆的な発光ピークシフトが確認され、精度良く所望の発光エネルギーを得ることを確認した。最大エネルギーシフト量としては2meVという値が得られた。また、相変化にともなう発光エネルギーのシフト方向がドットごとに異なることが見い出された。応力分布のシミュレーションにより、相変化箇所(応力印加箇所)とドット位置の相対的な関係に依存して、両方向のシフトが再現され、実験と整合する結果が得られた。初年度の計画である、光学マスクの設計、開口形成とその消去、ならびに分解能評価がすべて順調に遂行できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。光学マスクによる空間分解能(アモルファス開口サイズ)は当初の計画通りの値が達成されている。イメージングに関しても、開口の形成・消去を安定に行うことができており、予定していた予備実験を終えた。局所応力印加による発光ピークシフトについても、計画立案時に期待していた段階的、可逆的シフトを確認することができた。応力印加にともなってレッドシフト、ブルーシフトの両方向の変化が得られることは想定外であったが、応力シミュレーションによりこの振る舞いを説明することができた。研究計画通り、今後は相変化にともなう応力印加により、量子ドット発光の制御を進める。高分解能化・高コントラスト化に向けて、相変化材料の組成を検討する。特に、GeSbTeよりも相変化しきい値が明瞭だと予想されるGeTeを中心に検討する。また、ドーナツビーム照射加熱による結晶化と組み合わせることにより、さらに小さなアモルファス開口形成を目指す。これまでの予備実験をもとに、アモルファス開口の形成と結晶化による消去を繰り返すことによって開口を走査し、イメージング分光を実証する。近接場光学顕微鏡を用い、相変化箇所の周辺でスペクトルのマッピングを行い、応力分布シミュレーションから推測されるピークシフトと対比する。精密な応力印加により隣接する複数の量子ドットの量子準位を独立にチューニングし、ドット間の相互作用を制御することを試みる。超放射や準位反発などの現象の観測を視野に入れる。
ＵＰＦ１依存的な新規ＲＮＡ分解を介したｍＲＮＡの量的制御及びその生理機能の解明

近年の研究により、少なくともNMD経路においては、標的でないmRNAからのUPF1タンパク質の解離が速いことが、UPF1による基質認識に重要であると示唆されている。そこで、UPF1標的mRNAが選択的に分解されるメカニズムとして、標的RNAからのUPF1タンパク質の解離の違いに着目した。つまりは、標的RNA上でUPF1の解離が遅くなることで、RNA上にUPF1が滞留しているのではないかと仮説を立てた。もしこの仮設が正しければ、GC-richなモチーフ配列からのUPF1タンパク質の解離が遅くなるはずであるだと考えた。まず、32P標識したGADD45Bの3'UTR配列について、元のGADD45BのRNA配列(WT)とGC-richな配列をアデニンに置換したRNA配列(MUT)の2種類を用意した。それぞれのRNAをUPF1タンパク質とIn vitroで結合させ、その後、非標識RNAとATPを加えたときに、標識RNAからのUPF1の解離のされやすさを調べた。ゲルシフトアッセイの結果、それぞれのRNA(WTとMUT)はいずれもUPF1タンパク質と結合していることを確認した。一方で、非標識RNAを加えた後、MUTのRNAからのUPF1タンパク質の解離は、WTのRNAと比較して速いことがわかった。また、ATPをさらに添加した条件下では、MUTのRNAからのUPF1タンパク質の解離の程度が大きくなることがわかった。RNAヘリケースであるUPF1のRNA上の運動にはATPが要求されるという考えに合致する結果と解釈した。以上の結果から、UPF1はGC-richな配列をアデニンに置換したRNAと比較して、GC-richなモチーフ配列を含むRNA上から解離しにくいことが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、UPF1タンパク質をノックダウンしたときのRNAの分解速度の変動、及びUPF1とRNAの物理的な相互作用の有無を同時解析することにより、UPF1標的RNAとして246遺伝子を同定した。次に、リン酸化UPF1のゲノムワイドなRNAフットプリントデータを利用することにより、UPF1を介したRNA分解経路における基質認識部位の同定を試みた。まず、上記の次世代シーケンサーから得られたシークエンスリードは他の領域と比較してRNAの3'UTR領域に比較的多くマッピングされることから、リン酸化したUPF1タンパク質はRNAの3'UTR領域に主に結合していることがわかった。そこで、同定した246種のUPF1標的遺伝子の3'UTR領域に存在するリン酸化UPF1の結合部位のRNA配列からモチーフ配列をMEMEを用いて予測した。その結果、CUGを中心としたモチーフ配列がリン酸化されたUPF1の結合配列として予測された。さらに、上記で同定されたリン酸化UPF1結合配列を含むUPF1標的RNAの3'UTR配列がRNAを不安定化し、UPF1を介したRNA分解を誘導するかどうか検証した。UPF1標的遺伝子として同定されたGADD45B mRNAの(上述の結合配列を含む)3'UTR配列を組み込んだレポーターRNAをHeLa細胞中に発現させたところ、レポーターRNAの不安定化が確認された。このことから、3'UTR配列中にRNA分解促進配列が存在していることが確認された。また、UPF1をノックダウンしたHeLa細胞において、上記のレポーターRNAの不安定化はキャンセルされた。さらに、リン酸化UPF1の結合部位を欠いた3'UTR配列を組み込んだレポーターRNAでは上記で見られたRNAの不安定化が部分的にキャンセルされた。以上の結果から、リン酸化UPF1の結合配列を含むUPF1標的RNAの3'UTRが、UPF1を介したRNA分解経路における基質認識に関与していることが示唆された。昨年度では、UPF1を介したRNA分解機構の破綻がもたらす疾患について解析を行った。具体的には、DMPK mRNAの3'UTR配列中に見られるCUGリピートの過伸長によって引き起こされる1型筋ジストロフィー症に着目した。この疾患では、CUGリピートの過伸長を起こしたmRNAが核内で凝集することがわかっている。このことから、1型筋ジストロフィー症の患者では、CUGを含むGC-richな配列を標的とするUPF1が上記のCUGリピートにトラップされ、UPF1を介したRNA分解経路が抑制されているのではないかと仮説を立てた。まず、DMPK mRNAの3'UTR配列中でCUGリピートの過伸長を起こしている1型筋ジストロフィー症を発症している患者でUPF1の標的遺伝子の発現量が上昇しているかどうか確認を行った。その結果、罹患者では、他の遺伝子と比較してUPF1の標的mRNAの発現量が統計的に有意に上昇していることがわかった。このことから、1型筋ジストロフィー症の患者では、UPF1を介したRNA分解経路が抑制されることにより、UPF1の標的mRNA群の発現量が増加しているのではないかと考えた。次に、過伸長を起こしたCUGリピートを含むmRNAをHeLa細胞で強制発現させたとき、UPF1の標的mRNA群の発現量が増加するかどうか確認した。qPCR法によりUPF1の標的mRNAの発現量を調べた結果、CUGリピートを含むmRNAを強制発現させたときにUPF1の標的mRNA(ナンセンス変異を持つ異常なmRNAも含む)の発現量の増加は見られないことがわかった。このことから、本研究において、1型筋ジストロフィー症においてUPF1を介したRNA分解経路の破綻は起きていないと結論づけた。

本研究課題の当初研究目的の達成度については、期待した結果が得られなかった。昨年度では、これまでに明らかとしたUPF1を介したRNA分解経路が破綻した時に引き起こされる疾患について解析を試みた。しかしながら、UPF1を介したRNA分解経路と着目した疾患との関係を実証するに至らなかった。現在、昨年度までに得られた結果をもとに、論文を作成し、国際誌に投稿中である。上記の点から、研究の到達度として期待した結果が得られなかったと判断した。近年の研究により、少なくともNMD経路においては、標的でないmRNAからのUPF1タンパク質の解離が速いことが、UPF1による基質認識に重要であると示唆されている。そこで、UPF1標的mRNAが選択的に分解されるメカニズムとして、標的RNAからのUPF1タンパク質の解離の違いに着目した。つまりは、標的RNA上でUPF1の解離が遅くなることで、RNA上にUPF1が滞留しているのではないかと仮説を立てた。もしこの仮設が正しければ、GC-richなモチーフ配列からのUPF1タンパク質の解離が遅くなるはずであるだと考えた。まず、32P標識したGADD45Bの3'UTR配列について、元のGADD45BのRNA配列(WT)とGC-richな配列をアデニンに置換したRNA配列(MUT)の2種類を用意した。それぞれのRNAをUPF1タンパク質とIn vitroで結合させ、その後、非標識RNAとATPを加えたときに、標識RNAからのUPF1の解離のされやすさを調べた。ゲルシフトアッセイの結果、それぞれのRNA(WTとMUT)はいずれもUPF1タンパク質と結合していることを確認した。一方で、非標識RNAを加えた後、MUTのRNAからのUPF1タンパク質の解離は、WTのRNAと比較して速いことがわかった。また、ATPをさらに添加した条件下では、MUTのRNAからのUPF1タンパク質の解離の程度が大きくなることがわかった。RNAヘリケースであるUPF1のRNA上の運動にはATPが要求されるという考えに合致する結果と解釈した。以上の結果から、UPF1はGC-richな配列をアデニンに置換したRNAと比較して、GC-richなモチーフ配列を含むRNA上から解離しにくいことが示唆された。本研究課題の当初研究目的の達成度については、期待したほどではないがある程度の進展が見られたと判断している。ゲノムワイドな分解測定法であるBRIC-seq法とRNA結合タンパク質との相互作用を確認するRIP-seqを組み合わせることによりUPF1標的遺伝子を同定し、さらには、UPF1のフットプリントデータを活用することにより、UPF1標的mRNAの3'UTR配列中に存在するシス因子を予測することができた。