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クリーンエネルギーシステムの基盤となる高圧下における改質ガス乱流燃焼の基礎的研究

本研究は,環境・エネルギー技術の中核である燃焼技術において,パワープラントで高い熱効率が得られるクリーンエネルギーシステムとして将来重要な役割を果たすと期待される,石炭改質ガス複合サイクル(IGCC)におけるガスタービン燃焼に注目する.そのガスタービンの高温高圧環境を模擬した燃焼場における一酸化炭素および水素を主成分とする層流および乱流燃焼機構を解明し,純酸素燃焼によって二酸化炭素回収と貯蔵(CCS)への展開も見据えた基礎研究を実施する.本年度は,はじめに昨年度実施した層流燃焼速度に関する数値解析結果に基づいて高圧乱流燃焼実験の条件設定を行った.高圧乱流燃焼実験では圧力を0.5MPaおよび1.0MPaとし,石炭改質ガスを模擬してCO_2:65%,H_2:35%の混合燃料に純酸素を混合し当量比を1.0とした.さらに再循環ガスを模擬したCO_2で希釈して所定の層流燃焼速度となる予混合気を用いた.乱流燃焼実験の主な計測内容はOH-PLIF計測であって,取得した火炎断面画像から乱流燃焼速度,火炎面密度の空間分布などを求めた.その結果,石炭改質模擬ガスによる乱流予混合火炎の構造は,従来のメタン・空気乱流予混合火炎に比較して,局所火炎の凹凸の微細化が顕著であり,一方で乱流火炎領域の体積が小さいことがわかった.このことは,IGCCシステムの中核であるガスタービンが予混合燃焼モードで使用される場合,燃焼振動を起こしやすい特性をもつことを意味している.火炎領域の微細化は予混合ガスの熱物性特性や層流燃焼速度,およびWang氏が来日前に本国で行った層流燃焼の予備実験とも一致する結果であり,今後共同研究を進める共通のテーマとなる.研究計画当初は予混合気の高温化(予熱)を想定したが,使用するCOが毒性のあるガスであることや,混合成分ガスとして,H_2,CO_2,O_2と多成分の計量が必要であり,実験に複雑な手順を必要とした.そこで,研究期間内に高温実験まで行うことは困難であると判断したが,そのような複雑な実験を高精度で実施できたと考えている.本研究は,環境・エネルギー技術の中核である燃焼技術において,パワープラントで高い熱効率が得られるクリーンエネルギーシステムとして将来重要な役割を果たすと期待される,石炭改質ガス複合サイクル(IGCC)におけるガスタービン燃焼に注目する.そのガスタービンの高温高圧環境を模擬した燃焼場における一酸化炭素および水素を主成分とする層流および乱流燃焼機構を解明し,純酸素燃焼によって二酸化炭素回収と貯蔵(CCS)への展開も見据えた基礎研究を実施する.本年度は,高圧配管,バーナの設置など高圧乱流燃焼実験の準備作業を進めるのに平行して,石炭改質ガスを燃料とし二酸化炭素回収に適したCO/H2/CO2/O2混合気に対する酸素燃焼の基礎特性を明らかにすべく,幅広い濃度条件における層流燃焼速度の数値解析を行い,従来のCH4を主燃料とする天然ガス火炎との比較を実施した.この中で,希釈剤となる高濃度CO2による輻射損失の影響,CO/H2/O2系における素反応経路,素反応感度の特徴,CO/H2/CO2/O2予混合火炎は総じて火炎の固有不安定性が大きくなることなどの特徴を予測し,今後行う高圧乱流燃焼実験条件を確定する基礎資料とした.本研究は,環境・エネルギー技術の中核である燃焼技術において,パワープラントで高い熱効率が得られるクリーンエネルギーシステムとして将来重要な役割を果たすと期待される,石炭改質ガス複合サイクル(IGCC)におけるガスタービン燃焼に注目する.そのガスタービンの高温高圧環境を模擬した燃焼場における一酸化炭素および水素を主成分とする層流および乱流燃焼機構を解明し,純酸素燃焼によって二酸化炭素回収と貯蔵(CCS)への展開も見据えた基礎研究を実施する.本年度は,はじめに昨年度実施した層流燃焼速度に関する数値解析結果に基づいて高圧乱流燃焼実験の条件設定を行った.高圧乱流燃焼実験では圧力を0.5MPaおよび1.0MPaとし,石炭改質ガスを模擬してCO_2:65%,H_2:35%の混合燃料に純酸素を混合し当量比を1.0とした.さらに再循環ガスを模擬したCO_2で希釈して所定の層流燃焼速度となる予混合気を用いた.乱流燃焼実験の主な計測内容はOH-PLIF計測であって,取得した火炎断面画像から乱流燃焼速度,火炎面密度の空間分布などを求めた.その結果,石炭改質模擬ガスによる乱流予混合火炎の構造は,従来のメタン・空気乱流予混合火炎に比較して,局所火炎の凹凸の微細化が顕著であり,一方で乱流火炎領域の体積が小さいことがわかった.このことは,IGCCシステムの中核であるガスタービンが予混合燃焼モードで使用される場合,燃焼振動を起こしやすい特性をもつことを意味している.火炎領域の微細化は予混合ガスの熱物性特性や層流燃焼速度,およびWang氏が来日前に本国で行った層流燃焼の予備実験とも一致する結果であり,今後共同研究を進める共通のテーマとなる.研究計画当初は予混合気の高温化(予熱)を想定したが,使用するCOが毒性のあるガスであることや,混合成分ガスとして,H_2,CO_2,O_2と多成分の計量が必要であり,実験に複雑な手順を必要とした.そこで,研究期間内に高温実験まで行うことは困難であると判断したが,そのような複雑な実験を高精度で実施できたと考えている.
中性子解析によるATP結合タンパク質の水和構造とそのダイナミクス研究

(1)宿主である大腸菌の使用コドンに従い最適化したDAPKリン酸化領域をコードするDNAをプラスミドベクターpET-20b(+)のNdel-Xholサイトにサブクローニングし、BL21(DE3)大腸菌株に形質転換し、大量培養する事によってDAPKを得た。2.DAPKのATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)の結晶育成(1)PEG1000、硫酸アンモニウム、硫酸リチウムの三条件を重点的に最適化し単結晶を得る事が出来た。(2)ATPアナログ物質としてアデニリル-イミド二リン酸(AMP-PNP)、アデノシン二リン酸(ADP)、アデノシンγチオ三リン酸(ATP-γS)を使用した。3.DAPKのATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)での水和水構造の違い。(1)DAPKのX線結晶構造解析:DAPKに結合しているATPアナログ物質は10個以上の水分子と水和構造を形成している。これらの水分子は良くオーダーされており、はっきりと観測する事が出来たと言えるだろう。しかしAMP-PNP及びATP-γSのγ-リン酸基はディスオーダーしており、確実な原子位置を特定出来ているとは言い難い。(2)DAPKの中性子結晶構造解析:中性子回折法での見かけの水和水構造はその運動状態を反映して、ブーメラン状、棒状、ボール状にそれぞれ見える。ATP結合状態とApo状態での水和水配向の自由度(エントロピー)の差に寄与るると考えられる。ATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)、非ATP結合タンパク質の水分子の構造を求め、3状態での構造の違いを比較し、ATPと水分子との相互作用を解明する。引き続き中性子結晶構造解析のための大型結晶育成実施中。我々はこれまで生体高分子の中性子構造解析を行い、タンパク質やDNA分子を取り巻く水和構造を水素原子まで含め決定してきた。水分子の配向は双極子モーメントの方位を規定するので、水分子が作る双極子モーメント場を決定することが出来た。ATP結合タンパク質中でのATPのエネルギー変換の特性を水和水ネットワークのダイナミクス(構造揺らき)から理解することを目的にしている。1.ATP結合タンパク質として、腫瘍制止の制御やアポトーシスの仲介役を行うキナーゼの-種であるヒトのdeath-associated protein kinase(DAPK)を選び、プラスミドをProf.M.Egliから頂き、それの発現を行った。その結果プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養ま出来たがDAPKは得られなかった。現在、Prof.M.Egliへの問い合わせを含め、その原因を検討中である。2.血中タンパク質フィブリノーゲンの加水分解酵素トロンビンと阻害剤ビバリルジンとの複合体の中性子解析が進行している。阻害剤との界面に2個の水分子を水素原子まで含めてその構造を同定できた。そこで、AutoDockというタンパク質-基質結合エネルギー計算プログラムを用い、2個の水分子の複合体形成への寄与を以下のように考察した。水分子が全く無い場合、それぞれ1個のみが存在した場合、および2個の水分子が存在した場合のそれぞれについて、タンパク質-基質結合エネルギーと阻害定数を求めた結果、それぞれ、(-3.37kca/mol,3.40mM),(-3.91kcal/mol,1.37mM),(-4.18kca/mol,0.86mM)(-4.73kcal/mol,0.34mM)と水分子の寄与が大変重要であることが判明した。
動的赤外分光法による高分子材料の分子凝集構造解析に関する定量評価法の開発

動的赤外分光システム光学系の改良、ならびに、光学系の異方性に関する機器定数決定のための解析理論式の構築およびそれを用いた光学系各種光学異方性機器定数の厳密決定を行った。その後、セグメント化ポリウレタンウレア(以下SPUUと略称する)を用いて、静的延伸配向状態での赤外分光測定を行い、静的データより得られる各吸収バンドの最大吸収強度、吸収バンド位置、ならびに吸収バンド巾の延伸比依存性より動的測定データを計算機シミュレーションを行った。その結果、動的フィルム厚変化は体積一定変形で近似できることが確認された。次いで、赤外吸収スペクトルの動的変化を個々の吸収バンドの最大吸収強度、吸収バンド位置、吸収バンド巾、ならびにフィルム厚の動的変化の線形和と近似した分離定量評価解析理論式を構築し、データ解析プログラムを開発した。また、静的データからの動的データのシミュレーション結果との比較検討を行った。その結果、動的データの分離定量解析が妥当であることが確認された。SPUUの動的赤外分光学的解析結果における最大の成果は、動的分子配向に関係する動的二色差スペクトルのみならず、官能基の濃度変化に対応する動的平均吸光度スペクトルを用いることの重要性が結論付けられたことである。すなわち、ハードセグメントとソフトセグメント中の、各々、ウレアカルボニル基ならびウレタンカルボニル基に起因する吸収バンドを含む波数領域(18001550cm^<-1>)で測定された種々のスペクトルにおいて、セグメント配向に関係する二色差の動的スペクトルと静的スペクトルの両者の形状は相似的であるが、水素結合をしたカルボニル基の濃度に関係するウレアカルボニルならびウレタンカルボニル吸収バンドの動的および静的平均吸光度スペクトルには大きな相違があり、特に、ハードセグメント中の水素結合したウレアカルボニル基の動的変化量が大きく、動的歪みにより、ハードセグメントのウレアカルボニル基の水素結合が切断していることを見出した。すなわち、ハードセグメントドメインへの応力の伝達は、高分子鎖方向からではなく、高分子鎖に垂直な水素結合したウレアカルボニル基の結合方向からなされていることを意味している。これが、セグメント化ポリウレタンフィルムの静的変形により観察される変形軸に垂直なハードセグメント配向を示す要因である。平成11年度の研究計画に記載した下記の3項目について、ほぼ予定通りに実施できた。(1)動的赤外分光システム光学系の改良と各種機器定数の厳密決定システム光学径の改良後、光学系の異方性(光源の異方性、偏光子の偏光度、偏光変調器の吸収異方性、分光器の吸収異方性)に関する機器定数決定のための解析理論式を構築し、その解析理論に基づく光学測定を行い、光学系各種光学異方性機器定数の厳密決定を行った。(2)静的赤外分光測定と動的測定データの計算機シミュレーションセグメント化ポリウレタンウレアを用いて、静的延伸配向状態での赤外分光測定を行い、静的データより得られる各吸収バンドの最大吸収強度、吸収バンド位置、ならびに吸収バンド巾の延伸比依存性より動的測定データを計算機シミュレーションを行った。(3)吸収強度、吸収バンド位置、ならびに吸収バンド巾の動的変化などを分離定量評価するための解析評価技法の開発

赤外吸収スペクトルの動的変化を個々の吸収バンドの最大吸収強度、吸収バンド位置、吸収バンド巾、ならびにフィルム厚の動的変化の線形和と近似した分離定量評価解析理論式を構築し、データ解析プログラムの開発をほぼ完了した。前年度の研究結果を基にして、平成12年度以降の研究計画に記載された「セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光測定と各種動的寄与の分離定量評価」ならびに「セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光学的解析とその分子動力学的解釈」を行った。ここでの最大の成果は、セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光測定結果のデータ解析において、動的二色差スペクトルのみならず、動的平均吸光度スペクトルを用いることにより重要な結論が得たことである。ハードセグメントとソフトセグメント中の、各々、ウレアカルボニル基ならびウレタンカルボニル基に起因する吸収バンドを含む波数領域(18001550cm^<-1>)で測定された種々のスペクトルにおいて、セグメント配向を表す二色差の動的スペクトルと静的スペクトルの両者の形状は相似的であるが、水素結合をしたカルボニル基の濃度に関係するウレアならびウレタン吸収バンドの動的および静的平均吸光度スペクトルには大きな相違があり、特に、ハードセグメント中のウレアカルボニル基の動的変化量が大きく、動的歪みにより、ハードセグメントのウレアカルボニル基の水素結合が切断していることを意味している。すなわち、ハードセグメントドメインへの応力の伝達は、高分子鎖方向からではなく、高分子鎖に垂直な水素結合したカルボニル基の結合方向からなされていることを意味している。これが、セグメント化ポリウレタンフィルムの静的変形により観察される変形軸に垂直なハードセグメント配向を示す要因である。この研究結果に関しては、現在、投稿中である。前年度に引き続き、「セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光測定と各種動的寄与の分離定量評価」ならびに「セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光学的解析とその分子動力学的解釈」を行った。特に、前年度の成果として記載した、セグメント化ポリウレタンウレアの動的赤外分光測定結果のデータ解析において、動的二色差スペクトルのみならず、動的平均吸光度スペクトルを併用して解析することの重要性に基づき、データ解析を継続した。ハードセグメントとソフトセグメント中の、各々、ウレアカルボニル基ならびウレタンカルボニル基に起因する吸収バンドを含む波数領域(18001550cm^<-1>)で測定された種々のスペクトルにおいて、セグメント配向を表す二色差の動的スペクトルと静的スペクトルの両者の形状は相似的であるが、水素結合をしたカルボニル基の濃度に関係するウレアならびウレタン吸収バンドの動的および静的平均吸光度スペクトルには大きな相違があり、特に、ハードセグメント中のウレアカルボニル基の動的変化量が大きいことを見出している。さらに、この現象について、球晶構造を有するセグメント化ポリウレタンウレアと球晶構造を有しないものとの比較に重点を置いて検討した。その結果、球晶構造の有無に拘わらず、静的ならびに動的挙動に同様な結果が得られた。すなわち、本実験で用いたミクロ構造を異にするセグメント化
自然災害に関する人文社会系研究のデータベース化

本研究は、人文社会系の研究を広く収集・データベース化し、研究者が関連研究の利用を行いやすい環境を整備することを目的としている。昨年度に引き続き、地震災害、津波災害、火山災害、風水害、雪害、火災の6領域に関して研究の収集及びデータベース化を行った。データの追加については、学術論文の充実を中心とし、具体的には、文部省科学研究費の助成を受けた研究を「自然災害の予測と防災力研究報告集録」に基づき集録した。対象年度は昭和58年度以降である。また、静岡県で作成した「地震災害資料データファイリング」(静岡県、1983.3)との情報交換も行った。検索キーワードの改善については、利用者の関心の多様性及びフロッピー・ベースでのデータ提供に鑑み、各研究者が関連文献を抽出するのに役立つ目安となることを重視した。具体的には、以下の項目とした。(1)災害因災害因1地震、津波、火山、風水害、雪害、火災、その他、一般*ただし、複合も含む(e.g.地震/津波など)災害因2具体最災害名例)日本海中部地震、雲仙普賢岳噴火、長崎豪雨等*ただし、東海地震等想定災害も含む。発生年災害発生年(東海地震等想定の場合には「相定」)(2)キーワードキーワード1災害(災害記録、事例分析、防災計画、予測など)キーワード2研究領域(法・制度、経済的影響、人間行動、情報等)キーワード3研究領域細目(キーワード2の補足)本研究は、人文社会系の研究を広く収集・データベース化し、研究者が関連研究の利用を行いやすい環境を整備することを目的としている。発生年災害発生年(東海地震等想定の場合には「相定」)(2)キーワードキーワード1災害(災害記録、事例分析、防災計画、予測など)キーワード2研究領域(法・制度、経済的影響、人間行動、情報等)キーワード3研究領域細目(キーワード2の補足)
神経幹細胞分化を誘導する血小板由来増殖因子の機能解明

本年度は、下記の成果を得た。PDGFR-βconditional knockout mouseおよびコントロールマウスのそれぞれから新生仔の神経細胞を分離培養し、過酸化水素を用いた酸化ストレスを加え、生存能や生存に関するシグナルを検討した。PDGFR-βconditional knockout神経細胞は、酸化ストレスに対し、脆弱性を示し、そのシグナルにはPI3K/AKT, MAPKが重要であることが明らかとなった。次年度は、生体を用いた神経幹細胞の検討を中心とする予定である。本研究は、Nicheの制御機構解明に寄与し、中枢神経再生における新しい増殖因子の応用の可能性を提示するものと考えられる。1) PDGFR-ss conditional knockout mouse神経幹細胞は、コントロールと比較してSecondary Neurosphere形成能が低下し、細胞死が多く発生することが明らかとなった。次年度は細胞増殖、細胞死、分化に関連するシグナルについての検討を予定している。2) PDGFR-ss conditional knockout mouse神経細胞は、コントロールと比較して酸化ストレスに対し、脆弱性を示し、そのシグナルにはPI3K/AKT,MAPKが重要であることが明らかとなった。3)中大脳動脈閉塞による脳虚血後の病変は、コントロールと比較してPDGFR-ss conditional knockout mouseで優位に大きく、治癒遅延も観察された。次年度は、脳虚血により誘導される中枢神経ニッチェの活性化とPDGFの関係について、検討を進める予定である。本研究は、培養細胞および生体脳虚血モデルを用い、神経組織の修復に対するPDGFの役割を検討することにより、神経組織再生に向けた新しい増殖因子の応用に寄与するものである。本研究は、血小板増殖因子PDGFおよびその受容体が、中枢神経ニッチェ(Niche)の環境維持と神経幹細胞の分化、遊走、生存に重要な役割を果たすことを、独自に開発したCre-loxP systemを用いたPDGF β受容体(PDGFR-β)のconditional knockout mouseを用いて明らかにすることを目的とする。PDGFR-βconditional knockout神経幹細胞は、コントロール細胞と比較してSecondary Neurosphere形成能が低下することが明らかとなった。生後1日のSVZから分離したknockout神経幹細胞のSecondary Neurosphere形成能は、生後4週目のSVZから分離した細胞と同程度であった。分化誘導培養では、神経細胞へ分化する割合が減少した。幹細胞の性質としての増殖能と多分化能が低下するという老化形質が窺われると考えられた。RT-PCR arrayを用いた網羅的な遺伝子解析においては、BDNFおよびFGF2の減少、BMP4の増加が見られた。PDGF/PDGFR-βは、神経幹細胞の生存に重要とされるFGF2、神経細胞への分化と成熟に重要とされるBDNF、アストロサイトへの分化に関連するBMP4とのsynergisticな作用、あるいはこれらの因子の発現の制御に関わることにより、神経幹細胞の生存と分化に関与する可能性が考えられる。今後はこれらの因子に直結するシグナルへ研究を進めることにより、神経幹細胞制御機構におけるPDGF/PDGFR-βシグナルの役割について検討していきたいと考えている。
がん組織リンパ管を標的としたミサイル療法の開発

申請者らは最近、乳がん等を対象にプロテオーム解析による"がん関連蛋白質"の探索を推進すると共に、ファージ表面提示法を応用して、in vitroで抗体を迅速に創製できるナイーブ・ファージ抗体ライブラリ技術を改良・確立した。また、疾患サンプルのディファレンシャルプロテオーム解析によって同定される多数の蛋白質に対して、抗体ライブラリにより迅速かつ網羅的に抗体を創製し得る方法論(抗体プロテオミクス技術)を先駆けて確立している。そこで本研究では、この抗体プロテオミクスを有効活用し、がん組織リンパ管の基礎的情報の集積を図ると共に、がん組織リンパ管に特異的に発現する分子を探索し、"がん組織リンパ管を標的としたミサイル療法"を開発するための基盤情報等を得ようと試みた。本観点から昨年度は、がんのリンパ行性転移に密接に関わる創薬バイオマーカー蛋白質の候補を複数探索できた。また当該検討過程において、これら候補蛋白質が肺がんの診断マーカーともなり得ることを見出した。以上の成果をもとに平成22年度は、これら創薬バイオマーカー蛋白質候補の同定、組織内分布等を詳細に解析した。その結果、既存のリンパ管マーカーであるPodoplaninは、正常組織リンパ管内皮細胞およびがん組織内リンパ管内皮細胞の両方で発現している一方で、新たに見出したReticulocalbin1は、正常肺組織や正常リンパ管内皮細胞では発現しておらず、肺がん組織内のリンパ管内皮細胞およびがん細胞に選択的に高発現していることを認めた。またこのReticulocalbin 1は、がんなどの条件下では細胞膜上にも発現し得ることから、新たな抗体医薬や分子標的医薬の開発に資すること、新たな診断薬開発につながるものと期待された。申請者らは最近、乳がん等を対象にプロテオーム解析による"がん関連蛋白質"の探索を推進すると共に、ファージ表面提示法を応用して、in vitroで抗体を迅速に創製できるファージ抗体ライブラリ技術を確立した。また、疾患サンプルのディファレンシャルプロテオーム解析によって同定される多数の蛋白質に対して、抗体ライブラリにより迅速かつ網羅的に抗体を創製しうる方法論(抗体プロテオミクス)を先駆けて確立している。そこで本研究では、この抗体プロテオミクスを有効活用し、がん組織リンパ管の基礎的情報の集積を図ると共に、がん組織リンパ管に特異的に発現する分子を探索し、"がん組織リンパ管を標的としたミサイル療法"を開発しようとするものである。本観点から、平成20年度は、がん組織リンパ管内皮細胞と正常組織リンパ管内皮細胞、あるいは種々の血管内皮細胞等との特性比較を試みた。まず初めに、がん組織リンパ管内皮細胞等をプロテオーム解析したところ、がん組織リンパ管内皮細胞特異的な発現変動たんぱく質(創薬バイオマーカー候補たんぱく質)を多数探索することに成功した。そこで次に、これらのプロテオーム解析で見出された候補分子について、特異的モノクローナル抗体を作製し、正常組織およびがん組織といった臨床サンプルについて、免疫染色を行った。その結果、がんのリンパ行性転移に密接に関わる創薬バイオマーカーたんぱく質を複数同定できた。また当該検討過程において、肺がんの診断マーカーとなり得る興味深い発現変動たんぱく質(3種)を見出した。これらは、正常肺組織では全く発現しておらず、肺がん組織でのみ選択的に発現していた。次年度は、これら創薬バイオマーカーたんぱく質を用いた診断技術や治療技術の開発と共に、高リンパ行性転移仮性を示す肺がん細胞を用いた抗体プロテオミクスを実施することで、上記の目標を達成するものである。
近代日本の大縮尺都市図に関する基礎的研究

本研究の最大の自的であった近代日本の都市図の目録作成に関して,研究代表者および研究分担者は共同して,1)実物(ごく一部それに近いコピーや復刻版を含む)の閲覧に基づく詳細目録,2)近代日本の都市図を多数所蔵する諸機関の所蔵目録,の2種の目録を作成した(報告書所載)。対象は,敗戦時に市制を施行していた全国約200都市の図である。1)は約380点,2)は2,500余点の都市図(一部重複分を含む)を収録しているが,2)については採録対象機関以外の所蔵分としておよそ1,000点程度の存在が確認/推測される。いまだ完全な目録とは言いがたいが,従来この種の目録がまったく存在しなかったことを考えるならば,それなりの存在意義を主張しうるものと考える。これらの目録からは,1)近代日本の都市について作成された地図の種類としては,一般図(主題図に対する概念としての)が多いこと,2)主題図としては,a.商工案内図,b.地籍図系の図,c.住宅地図等が,全国の相当数の都市で作成されたこと,3)近代都市図の所蔵機関としては岐阜県図書館が圧倒的多数の所蔵点数を誇っていること,等が明らかとなった。これらの目録に基づく全国規模の解析(山田第1論文)に加えて,各地方ごとのやや詳しい考察として,北海道(山田第2論文)および島根県(天野論文)の事例を報告書に掲載した。本研究ではまた,日本近代の都市図を資料として用いることによってどのようなことが明らかになるのか,といった点についても,検討を始めた。報告書所載の金坂論文はその一例である。また日本近代都市図を加工することによって,その表現内容をより的確に示すことの可能性についても,報告書所載の小方論文は検討するところがあった。これらはいずれも,本研究関係者の今後の研究方向を示唆するものである。本年度は4カ年計画の研究の初年度であり,当初からの研究計画に従って,山田は北海道の,金坂は中部地方の,天野は中国・四国地方の諸都市の近代都市図のリスト作成と,各地方における近代都市図の特質の解明に当たった。また小方は戦前期の日本で撮影された空中写真についての研究に着手した。加えて金坂は,前近代の日本の都市図についての研究をも行い,それらから近代の図への連続・不連続の問題にもアプローチしつつある。山田の担当した北海道については,すでに本研究開始前から種々の機会に調査を行っていたこともあり,比較的順調に作業が進展した。北海道立図書館・北海道大学附属図書館・札幌市立中央図書館・市立函館図書館・旭川市立図書館・市立小樽図書館・釧路市立図書館・帯広市立図書館など,北海道内の主要図書館,それに国立国会図書館において,近代の北海道の大縮尺都市図の収蔵状況を調査済みである。この一連の作業の中で,北海道の複数の都市において,すでに192030年代から住宅地図が作成されていた事実が明らかとなった。住民の変動の激しい新開地都市における需要の多さを示すものであろうか。金坂の担当した中部,天野の担当した中四国については,対象都市数の多さもあって,近代都市図の所蔵状況に関する調査は未完了であるが,少なくとも地元の公共図書館での所蔵状況に関していうと,北海道の図書館ほどには多くの大縮尺都市図を所蔵していないケースが多いようである。しかし,そのことは,これらの地方においてあまり多くの地図が作成されなかったことを意味するのではなく,近代都市図のもつ資料価値の相対的差異(古い歴史をもつ都市では,近世以前の都市図と比べて近代以後の図は軽視されがちである)によるものと考えるべきであろう。

4カ年計画の研究の2年度日である本年度は,当初からの研究計画に従って,山田は九州地方の,金坂は東北地方の,天野は前年度に引き続き中国・四国地方の諸都市の近代都市図のリスト作成と,各地方における近代都市図の特質の解明に当たった。また小方も前年度に引き続き戦前期の日本で撮影された空中写真についての研究に従事した。山田の担当した九州地方については、長崎について非常に多数の近代都市図が作成され,また残存していることが明らかとなり,その中には全国的にみてもきわめて早い時期(大正中期)の住宅地図類も含まれている。金坂の担当した東北地方については,対象都市数の多さもあって、近代都市図の所蔵状況に関する調査は未完了であるが,天野の担当した中四国地方については,2年度にわたって調査を行った結果,所蔵状況に関する調査をおおむね終えることができた。他の地方についても,残された平成15・16年度において所蔵状況の調査を終え,かなり高いカバレッジをもつ地図目録が作成できる見通しが得られたが,当初予定していた都市図の表現内容を画像情報として取り込んだデータベースの構築は,主として著作者や所蔵者の権利の問題をクリヤーすることが困難であることにより,断念せざるをえない状況である。本年度、本研究の直接の成果といえる雑誌論文や図書がなかったことは遺憾であるが,山田は前年度行った研究の成果を人文地理学会大会において口頭発表しており,目下その内容をとりまとめて投稿すべく準備中である。本研究は全4年の計画期間の内すでに3年を終え,研究計画全体の基礎となる近代日本の大縮尺都市図の作成状況・保存状況の調査についても,その過半を終了した。とくに本年度は,国立国会図書館と並んで広域に及ぶ日本近代都市の大縮尺図の所蔵が予想された東京市政調査会付属市政専門図書館において,その所蔵状況に関する調査を行うことができた。その結果,同会の設立年次(1922年)の関係もあって,本国書館所蔵の大縮尺近代都市国のほとんどが昭和戦前期作成のものであり,それ以前に溯る図はわずかであることが明らかとなった。研究代表者(山田)は,本研究開始直前の2000年人文地理学会大会の特別研究発表「大縮尺地図と名簿資料にみる近代日本の都市」において,近代日本の大縮尺都市図が,(1)内務省作成の5000分の1都市図,(2)陸地測量部作成の大縮尺地形図,(3)商工案内図,(4)地籍図の系統に属する図,(5)都市計画図,(6)住宅地図,(7)火災保険図,(8)その他の市街地図,の8類型に区分されるのではないかとの見通しを提示したが,その後の本研究への取り組みの中で,この区分の妥当性についての確信を得つつある。ただし,以下のコメントも必要であろう。1)(3)の商工案内図は,明治初中期に多く作成された「実業家明細図」的なものと.大正末期以後長期にわたって作成された「商工地図」的なものとの間にかなりの異質性がみられる。2)日本固有のものとも言われる(6)住宅地図は,江戸期の切絵図以来の伝統を受け継ぐものかとも推測されるが,実際には明治期に作成された実例を見いだせず,その推測の当否は今後のさらなる検証に委ねられる。3)上記(1)(8)のいずれにも該当しないものとして,仙台市が上下水道整備事業に向けて市制施行直後の1893年に作成した『仙台市測量全図』(5000分の1)があり,作成時期を考えると技術的にも特筆に値する。
ノンコーディングＲＮＡによる発現統御ネットワークの解明に基づくがんの個性の描出

ヒト肺癌の分子病態の全貌に迫るべく、スーパーコンピュータを駆使したシステム生物学的アプローチを統合しつつ、とくにマイクロRNAやlncRNA等のノンコーディングRNA(ncRNA)に注目したがん研究を展開した。肺癌を遺伝子発現制御システムの異常と捉えて、発生・進展に重要な役割を担うncRNAを探索し、miR-375, miR-30c, miR-342-3p, MYMLR等の関与を同定し機能を明らかとした。128株の肺癌細胞株のmiRNAとmRNAのマイクロアレイデータをダウンロードして、発現量に顕著な差を認める364mRNAと42miRNAを抽出し、宮野研の玉田らとの共同研究によって非線形ベイジアンネットワーク解析ソフトウェアSiGNを用いたネットワーク推定を行った。我々がASH1によって発現誘導されて神経内分泌(NE)分化に重要な役割を担うマイクロRNAとして同定したmiR-375を、本ネットワーク推定はASH1下流に正しく推定できており、その高い確度が示唆された。また、124例のNSCLC症例について、mRNAとmiRNA双方の網羅的発現プロファイルデータの取得を完了しており、術後再発・予後など各種臨床病態と有意に関連するサブネットワークの抽出へと進む予定である。気道上皮のNE細胞の発生に必須な転写因子であり、また、我々が肺小細胞癌のNE分化と生存の鍵を握ることを示してきたASH1について、miRNAとlong intergenic non-coding RNA(lincRNA)に注目しつつ、その遺伝子制御ネットワークのシステム生物学的理解を目指した検討を開始した。肺腺癌細胞株A549にレンチウイルスベクターを用いたASH1の発現誘導系(Tet-On)を構築し、小細胞癌類似のNE分化の誘導を確認し、さらに時系列データを採取した。また、ASH1のmRNA量よりもその転写活性度をよく反映する遺伝子セットを、実験的にASH1による発現制御を確認した遺伝子群をもとに、宮野研の新井田らが開発したソフトウェア(EEM)を用いて抽出し、ASH1モジュールとして規定した。現在、ASH1モジュールの活性度と相関を示すmRNA,miRNA,lincRNAの探索・同定を進めつつある。今後さらにmRNAとマイクロRNAの双方を含むネットワークの綿密な解析を推進し、ヒト肺癌の分子病態の全貌に迫りたい。本年度は、124例の治癒切除された肺非小細胞癌の腫瘍組織から得たmRNA及びマイクロRNA発現プロファイルデータをもとに、がん患者の腫瘍組織で稼働している発現制御関係の推定を試み、再発・死亡と有意に関連する遺伝子が濃縮された14個のサブネットワークと、各々の中心となるハブ遺伝子を同定した。我々が肺腺癌のリネジ生存がん遺伝子として同定したTTF-1が、予後と有意に関連するハブ遺伝子の一つとして抽出された。また、TTF-1の生存シグナルを伝える分子として同定したROR1が、TTF-1をハブとするサブネットワーク内の直近にマップされ、両者の密接な発現制御関係が実際の肺癌患者において描出された。さらに、肺腺癌の予後に有意に関連するハブ遺伝子の一つとしてmiR-30を同定し、ネットワーク推定から示唆された標的遺伝子が、実際にその発現制御下にあることを実験的に検証した。一方、マイクロRNA発現プロファイルの階層的クラスタリング解析によって、肺腺癌が胎児期と成人期の肺が示す発現プロファイルに類似した2群に大別し得ることを示した。上述のネットワーク推定において、両クラスター間で発現差のあるサブネットワークに含まれるmRNAは、DNA複製、細胞周期或いは、増殖等に有意な関連を示した。我々が肺癌おける遺伝子増幅と過剰発現を見出したmiR-17-92は、胎児肺に最も高い類似性を示すサブクラスターにおいて、とくに高い発現と予後不良との有意な相関を示した。未分化で旺盛な増殖を示すmiR-17-92を高発現する肺腺癌の病態を反映するものと考えられる。今後は、マイクロRNA以外のノンコーディングRNAも取り込んでネットワーク推定を進め、システムとしてがんの分子病態を読み解いて、先端的な診断や個別化医療の実現へとつなげる基盤としたい。肺腺癌の多様性について、miRNAの階層的クラスタリング解析が示唆した、胎児期と成人期の肺への類似を示す二群の存在に特に着目して進めた。スーパーコンピュータ上のSiGN-BNプログラムを用い、ベイジアンネットワークによる推定を行ったところ、両者間で有意な発現差を示す遺伝子が濃縮された19個のサブネットワークのハブ遺伝子にmiR-30dとmiR-195が含まれていた。これらのマイクロRNAを肺癌細胞株に導入して検証したところ、患者腫瘍中で制御関係が推定された子ノードの遺伝子群の発現の殆どが予想された方向に変化した。逆に、miR-30dとmiR-195の導入で変化した遺伝子群について、ヒト肺癌腫瘍組織における影響度をスコア化して検討したところ、これらが高発現を示す成人期肺類似のマイクロRNA発現プロファイルを示す症例群では、低発現を示す胎児期肺に類似した症例群に比して、有意に強い影響度が観察された。

代表的癌遺伝子のc-mycをハブとする転写制御ネットワークについても検討を進めた。ドキシサイクリン添加によりc-mycを発現誘導可能な2株の肺癌細胞株を樹立し、実験的にc-mycによる転写活性化と抑制の程度を反映する遺伝子モジュールを規定した。同一の肺がん患者腫瘍組織から得たmRNAとマイクロRNA双方のマイクロアレイ解析データセットに適用して、c-mycの制御活性度と相関するマイクロRNA群を同定したところ、c-mycによる転写活性化を受ける或いは、逆にc-mycを標的遺伝子とするマイクロRNAが複数含まれていた。現在、c-myc誘導時に発現誘導されず、患者腫瘍組織中では相関を示すマイクロRNAに関し、c-mycの転写活性に関わるco-factor等を標的とする可能性について検討を進めている。ドキシサイクリンでMYCを発現誘導可能な肺癌細胞株を樹立し、MYCの影響下にある遺伝子群を抽出してMYCモジュールを規定した。同一の肺癌患者腫瘍組織のmRNAとmiRNAのマイクロアレイデータに適用して、MYCの制御活性と相関するmiRNAを探索したところ、MYCの標的遺伝子とする、或いは、MYCを標的遺伝子とする既報のmiRNAを複数含んでおり、探索戦略の堅牢性が確認された。さらに、MYCによって発現に影響を受けず、腫瘍組織中ではMYCモジュールに反映されるMYCの制御活性と相関を示すmiR-342を同定した。種々の検討を進めた結果、miR-342は、MYCをハブとする遺伝子発現調節ネットワークにおいて、MYCの結合部位と近傍のゲノムDNAに結合し協調的に働くE2F1遺伝子を標的とするという、これまでにない様式でMYCの転写活性を制御するmiRNAであることが明らかとなった。また、肺癌の神経内分泌分化を司るASH1に関して、76症例の肺腺癌において、EEM解析を通じて規定したASH1モジュールの発現量と、有意な相関を示す45個のlincRNAを抽出した。その階層的クラスタリング解析は、ASH1モジュールが高い活性を示すクラスターの症例は、有意に高浸潤性・高悪性度であり、またp53変異を多く含み、TRU型腺癌が少なかった。さらに、ASH1のDOX依存的な発現誘導可能な肺癌株を用いて、実験的にASH1の制御下にある345個のlincRNAを含む1677遺伝子を抽出し、階層的クラスタリング解析を肺腺癌76症例において行った。その結果、ASH1制御下にあるCDH1やCHGB1等とクラスターされる185個のlincRNAを抽出し、とくに強くASH1による発現制御を受けている11個のlncRNAの抽出に至った。200塩基程度以上の鎖長を持ちRNA分子として機能する、long non-coding RNA(lncRNA)のがんとの関わりは殆ど未解明である。マイクロアレイ解析の結果にもとづいて、肺がんの発生・進展に重要なMYC癌遺伝子産物の活性を反映する遺伝子群をMYCモジュールとして規定した。宮野班の島村らが開発し「京」に実装したGIMLETを用い、MYCの転写調節活性を制御するモジュレーター活性を持つlncRNAを探索し、MYMLR (MYC-modulating lncRNA)を同定した。
木造芝居小屋の歌舞伎の科白・衣装等に及ぼした影響の研究

研究課題名の「木造芝居小屋の歌舞伎の科白・衣裳等に及ぼした影響の研究」は平たく言えば、「江戸時代様式の芝居小屋の舞台・客席における視聴覚レベルの研究」ということである。建築物としては一本目通りの横梁木の長さに制約され、屋根に覆われた内装も木製である。全蓋屋根は外光を遮り終日小屋内を日影の状態に置き、木製内装は音響的効果を期し難い。場内の明かりは明かり窓から入れた。客席の左右高みに並んで設けたのは採光的に合理的だっただけでなく換気にも有効だったが、場内明かりは季節・時刻・天候による光状況に左右された。季節は日本の緯度に最も影響され、地勢状況から季節による気温湿度も変動も大きかった。今日までの歌舞伎学の史的研究では上記のような視点が議論されることが殆どと云ってよいほどなかった。即ち舞台や客席の明かり状況やその変化はどのようであったか、蝋燭照明はどの程度の効用だあったのか、台詞は場内にどのていど聞こえたか等である。遠山静雄著「舞台照明学」を別としてこれと云った古い文献にも研究書も乏しく、進歩したIT技術を援用して調査し研究した。次の5テーマに絞り成果を得た。1照度と場内:概ね10010ルクス。舞台より客席の方が明るい。役者から客が良く見える。2照度と衣裳:生地9種、各12色で実験。差はあるが、100ルックス以下では黒ずみ、原色が見えない。3音響と台詞:場内空間が今日の小劇場程度で聴覚上問題はない。プロ70db程度。狂言出自を思わせる術。4演技:旧来未解決の荒事「見得」に絞り、モーションキャプチャーにより「不動明王の種字」説を提言。5回舞台:上三河農村舞台(兵庫)調査により面自く見せるための機構と力学を解明。欧州と中国の古劇場を調査し場内照明や舞台機構あるいは演出等比較して旧来説を脱した。プロ70db程度。歌舞伎は初め見物は野天であったが、享保年間から舞台も見物席も屋根の掛かった全蓋式の芝居小屋となった。舞台も客席も屋根の日陰の内に閉じ込められその影の中で演じ見物するという状況になった。野天とは比較にならないほど薄暗い世界になった。小屋の左右は2階建ての芝居茶屋で占められたので採光窓は3階部分に設けられた。日照は季節・気象・時間によって著しく異なるが、今日唯一幕末の芝居小屋たる香川県琴平町の金丸座がこの様式で1階客席で外光の千分の一程度の照度しかない。舞台の照度は舞台縁で客席と似たレベルだろう。こうした状況の中で歌舞伎の演技・セリフ・化粧・衣裳・道具が成立したのである。これを実証すべく平成14年9月29日、岐阜県恵那郡福岡町の常盤座で同町歌舞伎保存会の協力を得て入射光だけに頼る歌舞伎上演を行った。舞台の上下手縁と奥・花道・客席中央・2階上手桟敷・同正面桟敷と野外に照度計を設置し5秒間隔で計測するとともに舞台と舞台側からみた客の明りの状態をハイビジョン撮影した。常盤座はほぼ西向きで上手桟敷は南面している。江戸期の小屋は採光

窓が舞台奥まで続いているので舞台も客席も照度的にはほぼ同一であったと思われる。つまり役者も客を見ながら演技していたことになる。こういう状態は双方からアンケートをとることによって証明された。時期は秋分の6日後で日照的に好都合だったが、曇天で、上演時刻の9時20分から10時32分の72分間の間に照度は16000ルックスから2090ルックスまでの激しい変化を見た。最後の10分ほど閉窓して蝋燭芝居を試みた。蝋燭芝居は禁制に近ったのであるが、人々は錯覚している。14年度研究を日照照明に特化し、映像記録をピツチャーインピクチャーのDVDに、各種データ・写真等をCDにして論文(400字詰55枚相当)を添えたセットとして照度編を完成した。平成15年度は前年度の常盤座(岐阜県福岡町)地芝居公演での検証『映像(DVD)・データ(CD)・論文』の報告(書)の後を受け次の調査を実施した。「科」;歌舞伎俳優中村又蔵の協力を得て九州大学大学院芸術工学院において"見得"のモーションキャプチャーを行った。これは歌舞伎の見得が不動尊の種字を演技化したものという仮説の検証のためである。このキャプチャーの映像化等纏めは九大で目下行っており、実証研究は16年度になる。「白」術;木造芝居小屋という環境下でやはり成立したとの見方であったが、14年度の予備的調査の結果有蓋式以前の無蓋露天客席時代に成立したものとの仮説に変わった。狂言師・歌舞伎俳優・新劇俳優に狂言・歌舞伎・新劇の三分野の台詞全体を己の分野の台詞術で言ってもらって波形・音圧を計測することとし15年度は歌舞伎を中村又蔵のそれを収録した。狂言・新劇は16年度に繰り延べる。「衣裳生地」;歌舞伎衣裳によく使われる生地と色彩の光学的物性即ち反射性能を調査し、低照度下における見え方を写真撮影した。生地は竜紋・精好・羽二重・縮緬・綸子・襦子・紬・木綿・ビロードの9種を黒・赤・紫・朱鷺・栗梅・柿・黄・卵・鰹(かつ)・萌黄・浅葱・白の12色に染め、300ルックス(明るい居間)を基準に200・100・90・80・70・60・50・45・40・35・30・25・20・15・10・5と照度を下げながら調査した。生地・色彩によって見え方の度合いが違うことや10ルックスが限度たることが確認された。「金欄の刺繍もの」も用意したが、時間的予算的事情で16年度に回る。「舞台機構」;凸版印刷による撮影の機会を捉え上三河農村歌舞伎舞台(兵庫県南光町)を調査した。天井に回舞台と迫下げ機構を持つユニークなものであるが、床の回舞台が片手で動くほどに負荷が小さい(数値化未了)。24輪の遊星滑車のためだが、幕末の工学力を物語るものである。凸版から映像提供を受けたが、分り易いようにCG化した。研究課題名に記された各調査研究テーマについて次の通りデータ取りと解析・情報処理を行った。1.【科】について;科とは身体表現つまり演技で、特に江戸歌舞伎の特徴とされる荒事の「見得」について従来の荒武者事説に対して不動明王の種字の身体による表象との仮説を俳優中村又蔵丈と九州大学大学院芸術工科研究院源田悦夫研究室の協力のもとモーションキャプチャー装置で検証した。高蓋然性で実証できたと思われる2.【白】について;白とはセリフ術で、先行する能狂言のそれと共通するのかしないのかを中村又蔵丈と狂言師善竹十郎師の協力のもと歌舞伎と能狂言を同じ台本で喋ってもらいスペクトログラフで記録した。能狂言は露天小屋時代のもので、現行歌舞伎は木造芝居小屋から引き継がれたものであるが、特に有蓋木造環境の影響の有無をデータ処理によって検証中である。両者間に余り変化がなければ有蓋木造環境以前からとの仮説が立つ。
オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と効果的な治療法の探索

現在、我が国においてがんは死亡率トップの病気であり、中でも胃がんは肺がんと並び、がんによる死因の多くを占めている。本研究課題においては、胃がん幹細胞の増殖性・可塑性・分化能を制御する機構を生体外で迅速かつ詳細に解析を行い、それらの知見を基盤にして生体内で胃がんを根絶する真に効果的な治療法を確立することを目的としている。(1)オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と特性の理解;本研究計画においては、胃特異的にがんを発症するマウスモデル(Ganマウス)と、胃の幹細胞特異的に緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するLgr5DTR-EGFPマウスを交配し、得られたマウスの胃よりオルガノイドを樹立することで胃がん幹細胞を可視化し、その存在を明らかにする。また、ヒト胃がん組織より樹立したオルガノイドにおいて、LGR5遺伝子座にEGFPを挿入することでヒト胃がん幹細胞を可視化する。これらの胃がん幹細胞を単離し、分子生物学的解析を通してその特性を理解する。(2)遺伝子編集技術を用いた胃がん幹細胞制御機構の解明;これまでに、Ganマウスおよびヒト胃がんより安定的にオルガノイドを樹立し、遺伝子編集を行うことに成功している。本研究では、悪性化胃がんにおいて高発現し、高頻度で変異が見られる遺伝子をマウス/ヒトオルガノイドで発現誘導もしくはノックアウトし、機能的な検証を通して胃がんの悪性化を導く機構を明らかにする。(3)マウス生体を用いた胃がんの効果的な治療法および抗がん剤の探索;幹細胞を可視化したヒト胃がんオルガノイドをマウスの生体内に移植し、(1)、(2)で明らかとなる知見を元に、悪性化を導く機構を標的として生体内においてがん幹細胞を攻撃する。がんの再発・転移を防ぐ新規治療法を開発し、既存の抗がん剤を組み合わせることで、胃がん全体を撲滅できる効果的な治療法の開発に貢献する。1.オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と特性の理解;FACSを用いて、胃がんオルガノイドよりLGR5-EGFP陽性細胞を回収し、RNA-sequencingによる包括的遺伝子発現解析を行い、LGR5陽性胃正常組織幹細胞および他組織のがん幹細胞の遺伝子発現パターンと比較することで、胃がん幹細胞で特異的に発現する遺伝子を抽出した。2.遺伝子編集技術を用いた胃がん幹細胞制御機構の解明;胃がんの悪性化を導く候補遺伝子を発現させた胃がんオルガノイドの生体内移植、および分子生物学的手法を用いて候補因子の下流調節機構の詳細な解析を行った。胃がん幹細胞の増殖・維持・分化を制御する分子機構の全容解明を試みる一方で、レンチウイルス発現系を用いたCRISPR/Cas9遺伝子欠損スクリーニングの立ち上げを行った。様々な遺伝子が欠損した胃がんオルガノイドを用いて、生体外浸潤アッセイおよびコロニー形成アッセイなどの生体外実験と免疫不全マウスへの移植などの生体内を組み合わせ、新規胃がん悪性化遺伝子の探索を行っている。3.マウス生体を用いた効果的な治療法および抗がん剤の探索;2.で明らかになった胃がん幹細胞の増殖能・転移能を制御する機構を標的として、悪性化がんに対する効果的な治療法をマウス生体内において検証する実験系を立ち上げた。具体的には、LGR5陽性細胞を可視化した胃がんオルガノイドで候補遺伝子に条件的欠損変異を導入し、免疫不全マウスの脾臓もしくは胃に接種する。がん組織の増殖と他臓器への転移頻度を指標に、候補因子の条件的欠損がマウス生体内においてがん幹細胞の増殖能・転移能を抑制することを確認する。1.オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と特性の理解;オルガノイドを用いた生体外実験およびマウスへの生体内移植実験を組み合わせ、網羅的な解析により明らかになった胃がん幹細胞の増殖・維持・分化に関わる候補因子の検証を行う。コロニー形成アッセイ、浸潤・遊走アッセイ、Real-time PCRや免疫染色などの実験を通して、LGR5陽性細胞が胃がん幹細胞である可能性を検証し、これまで知られていなかった胃がん幹細胞の特性を理解する。一方で、生体外培養を行ったがん幹細胞のプロファイルが生体内のものと一致するかどうかを確認するために、胃がんマウスモデルの生体内から直接回収したLGR5陽性細胞も含めて解析を行う。2.遺伝子編集技術を用いた胃がん幹細胞制御機構の解明;ゲノム編集を行った胃がんオルガノイドと分子生物学的手法を用いて候補因子の下流調節機構を詳細に解析することで、胃がん幹細胞の増殖・維持・分化を制御する分子機構の全容を解明する。一方で、レンチウイルス発現系を用いたCRISPR/Cas9遺伝子欠損スクリーニングと浸潤アッセイおよびコロニー形成アッセイなどの生体外実験と免疫不全マウスへの移植などの生体内を組み合わせ、胃がんの悪性化を導く責任遺伝子の網羅的な探索を行う。3.マウス生体を用いた効果的な治療法および抗がん剤の探索;前年度に作製した遺伝子改変胃がんオルガノイドの移植マウスを用いて、新規抗がん剤および既存の抗がん剤との効果的な組み合わせを探索する。がんの増殖・浸潤・転移を抑制しつつ、がん全体を攻撃する新規治療法の確立を目指す。

本研究課題においては、胃がん幹細胞の増殖性・可塑性・分化能を制御する機構を生体外で迅速かつ詳細に解析を行い、それらの知見を基盤にして生体内で胃がんを根絶する真に効果的な治療法を確立することを目的としている。(1)オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と特性の理解;本研究計画においては、胃特異的にがんを発症するマウスモデル(Ganマウス)と、胃の幹細胞特異的に緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するLgr5DTR-EGFPマウスを交配し、得られたマウスの胃よりオルガノイドを樹立することで胃がん幹細胞を可視化し、その存在を明らかにする。また、ヒト胃がん組織より樹立したオルガノイドにおいて、LGR5遺伝子座にEGFPを挿入することでヒト胃がん幹細胞を可視化する。これらの胃がん幹細胞を単離し、分子生物学的解析を通してその特性を理解する。(2)遺伝子編集技術を用いた胃がん幹細胞制御機構の解明;これまでに、Ganマウスおよびヒト胃がんより安定的にオルガノイドを樹立し、遺伝子編集を行うことに成功している。本研究では、悪性化胃がんにおいて高発現し、高頻度で変異が見られる遺伝子をマウス/ヒトオルガノイドで発現誘導もしくはノックアウトし、機能的な検証を通して胃がんの悪性化を導く機構を明らかにする。(3)マウス生体を用いた胃がんの効果的な治療法および抗がん剤の探索;幹細胞を可視化したヒト胃がんオルガノイドをマウスの生体内に移植し、(1)、(2)で明らかとなる知見をもとに、悪性化を導く機構を標的として生体内においてがん幹細胞を攻撃し、がんの再発・転移を防ぐ新規治療法の開発し、既存の抗がん剤を組み合わせることで、胃がん全体を撲滅できる効果的な治療法の開発に貢献する。1.オルガノイドを用いた胃がん幹細胞の可視化と特性の理解;胃がん幹細胞を可視化するために、胃特異的にCOX-2/PGE2遺伝子およびWnt-1遺伝子が発現し、炎症とWntパスウェイの亢進を引き起こす結果、胃がんを発症するGanマウスとLgr5遺伝子座にEGFP遺伝子が挿入された結果、胃幹細胞を可視化できるLgr5DTR-EGFPマウスを交配し、得られたマウスより胃正常および胃がんオルガノイドを樹立した。また、胃がん患者より摘出した胃がん組織と周囲の正常組織より、ヒト胃正常および胃がんオルガノイドを樹立した。続いて、CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いてLGR5遺伝子座の下流にEGFP遺伝子を挿入した。2.遺伝子編集技術を用いた胃がん幹細胞制御機構の解明;ヒト胃がんで高発現する遺伝子群および高頻度に変異が見られる遺伝子群を比較し、ヒト胃がん幹細胞の増殖・維持に重要な候補因子を抽出した。悪性化がんは未分化な細胞特性を獲得することが示唆されているため、特に細胞の未分化性維持に関連する遺伝子に着目して検証を進めている。具体的には、トランスポゾン由来の配列を持ち、転移因子の仲介によって効率良くゲノムに挿入されるPiggyBac発現誘導型ベクターおよびCRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、1.で樹立したマウス・ヒトの正常・胃がんオルガノイドで候補因子の時期特異的強制発現およびノックアウトを行い、オルガノイドにコロニー形成能・増殖能・形態の変化を引き起こす因子を選定した。