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ヨーロッパなどがん研究先進国との研究交流

1.研究背景がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。地理的に隔離されているわが国の研究者は、研究者との直接の討論、情報、資料交換に自ら制限があり、ともすると孤立しかねない。この問題点を克服するため、わが国の第一線の研究者を積極的にがん研究先進国に送る必要がある。本研究は、ヨーロッパのがん研究先進諸国との研究交流を目的に組織された。特に、日独、日仏がんワークショップはそれぞれ一年毎にヨーロッパ本国と日本と場所をかえて行われているが、本年度は両者ともヨーロッパで開催された。本年度は17名をヨーロッパ諸国に派遣した。2.日仏がんワークショップ1996年9月17日20日、フランス・リ-ル市、パスツール研究所において、「がん宿主相関の分子細胞生物的基盤」をテーマとしてワークショップが開催された。主催者はフランス側がDr.Stehelin、日本側が渋谷正史、豊島久真男であった。わが国からは岡田雅人(阪大・蛋白研)、平井久丸(東大・医)、松本邦弘(名大・理)、渋谷正史(東大・医科研)、宮坂昌之(阪大・医)、黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、西川伸一(京大・医)、辻本賀英(阪大・医)、餐場篤(東大・医科研)が本研究費で出席した。なお、若杉尋(国立がんセンター)、広橋説雄(国立ガンセンター・研)、吉倉廣(東大・医)、神田忠仁(国立予研)、豊島久真男(大阪成人病センター)が別途予算により参加した。プログラムは次の通りであった。Session1:シグナル伝達(日本側3名、フランス側3名発表)、Session2:腫瘍・宿主相関(日本側3名、フランス側3名)、Session3:発生・分化(日本側3名、フランス側3名)、Session4:細胞増殖と抑制(日本側3名、フランス側3名)。3.日独がんワークショップ1996年9月26日27日ドイツ・ハイデルベルグ市ドイツがんセンターにおいて「ウイルスによるヒトのがん」に関する日独がんワークショップを開催した。主催者はドイツ側がH.zur Hausen、S.Meuer、日本側は吉田光昭であった。わが国から高田賢蔵(北大・医)、永田恭介(東工大・生命理工)、石橋正英(愛知がんセンター・研)、菅村和夫(東北大・医)、園田俊郎(鹿児島大・医)が本研究費班員が研究を行った。さらに吉田光昭(東大・医科研)、伊藤嘉明(京大・ウイルス研)、豊島久真男(大阪成人病センター)、吉倉廣(東大・医)、神田忠仁(国立予研)が別途予算で参加した。発表テーマは次の通りであった。HTLV(日本側3名)、HIV(ドイツ側2名)、EBV(日本側1名、ドイツ側1名)、HPV(日本側2名、ドイツ側4名)、アデノウイルス(日本側1名)、SV40(日本側1名)、肝炎ウイルス(日本側1名、ドイツ側1名)、ヒト白血病(日本側1名)、がん免疫(日本側1名)4.その他の派遣者研究が急速に進展しつつある領域について、野田哲生(癌研)、安本茂(神奈川がんセンター)、富永明(高知医大)、村上義則(国立がんセンター)を派遣した。

主催者はドイツ側がH.zur Hausen、S.Meuer、日本側は吉田光昭であった。わが国から高田賢蔵(北大・医)、永田恭介(東工大・生命理工)、石橋正英(愛知がんセンター・研)、菅村和夫(東北大・医)、園田俊郎(鹿児島大・医)が本研究費班員が研究を行った。さらに吉田光昭(東大・医科研)、伊藤嘉明(京大・ウイルス研)、豊島久真男(大阪成人病センター)、吉倉廣(東大・医)、神田忠仁(国立予研)が別途予算で参加した。発表テーマは次の通りであった。HTLV(日本側3名)、HIV(ドイツ側2名)、EBV(日本側1名、ドイツ側1名)、HPV(日本側2名、ドイツ側4名)、アデノウイルス(日本側1名)、SV40(日本側1名)、肝炎ウイルス(日本側1名、ドイツ側1名)、ヒト白血病(日本側1名)、がん免疫(日本側1名)4.その他の派遣者研究が急速に進展しつつある領域について、野田哲生(癌研)、安本茂(神奈川がんセンター)、富永明(高知医大)、村上義則(国立がんセンター)を派遣した。1.研究背景がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進諸国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。地理的に隔離されているわが国の研究者は、研究者との直接の討論、情報、資料交換に自ら制限があり、ともすると孤立しかねない。この問題点を克服するため、わが国の第一線の研究者を積極的にがん研究先進国に送る必要がある。本研究は、ヨーロッパのがん研究先進諸国との研究交流を目的に組織された。特に、日独、日仏の2国間がん研究交流を中心に運営している。2.日仏がんワークショップ10月35日の3日間、フランス・ニ-ス市郊外において、がんの分子生物学をテーマにワークショップを開催した。日本側から、山本、清木、田中、秋山、西田、大野の7名を派遣した。3.日独がんワークショップ10月2629日、京都において細胞内輸送をテーマに日独ワークショップを開催した。ドイツ側から10名、日本側から14名の発表を行った。4.その他:急速に進展する研究に対応し、最新の情報を入手するため、12名の若手の第一線の研究者をヨーロッパの先端研究室に派遣した。派遣者名および研究テーマは次の通りである。前田浩(がんの化学療法)、斉藤隆(免疫学)、増井徹(細胞生物学)、千田和弘(細胞生物学)、野田哲生(分子生物学)、榎本克彦(病理学)、湯浅保仁(分子生物学)、安井弥(病理学)、伊庭英夫(ウイルス学)、野瀬清(生化学)、菅沼雅美(生化学)、中野明彦(細胞生物学)1.研究背景:がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進諸国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。2.日独がん共同研究連絡会議:平成7年7月1013日、Essen大学において「細胞・分子レベルにおける発がん研究」をテーマに日独がん共同研究連絡会議を行う。わが国から次の7名の研究者(黒木登志夫、関口睦夫、田中亀代次、野田哲生、辻本賀英、沖俊一、葛西宏)を派遣した。3.日仏がん共同研究連絡会議:平成7年7月57日沖縄においてがんウイルスをテーマに日仏がん共同研究連絡会議を行う。
アクチン重合端振動の細胞内可視化

細胞伸展縁に形成される扇状の葉状仮足(ラメリポディア)では,その先端のアクチン重合が細胞を伸展させる.ラメリポディアは約180ナノメーターと薄く,XTC線維芽細胞をポリリジンでコートしたガラスに強く接着させることで,単一焦点面内に捉え,アクチン結合分子の動態を正確に観察できる.以前の研究で,葉状仮足においてアクチン線維の約3分の1が,重合後10秒以内に脱重合することを見出し,2002年サイエンス誌に報告した。今回,我々はアクチン崩壊機構の解明を目標に,ラメリポディアのアクチン線維端に結合する主要な分子であるArp2/3複合体とキャッピングプロテイン(CP)に注目し,その単分子キネティクス解析を行った.驚くべきことに,インビトロではアクチン線維に高親和性で結合するCPが,細胞内では半減期1.2秒の速さでアクチンネットワークから解離していた.これはインビトロのCPの解離速度より3桁も速く,アクチン線維の崩壊速度よりも20倍以上速い.その原因を追究したところ,1)ストレス線維に会合するCPは寿命が長い,2)アクチン脱重合阻害剤であるジャスプラキノライドでCPの解離がすみやかに著明に延長,3)アクチン脱重合因子コフィリンをリン酸化,不活化するLimキナーゼの過剰発現でCPの解離が延長することが見出された.1)3)はアクチン線維崩壊を阻害する条件であるが,半減期が30秒のアクチン線維を安定化させることがより速い解離速度をもつCPの解離速度を遅延させるのは,非直感的な現象である.1つの説明として,CPの解離はコフィリンによる線維切断にトリガーされる一方,アクチン線維は再結合によって分解を免れていることが考えられる.これらに基づき,葉状仮足ではアクチン線維は高頻度に切断-再結合を繰り返し,線維端のCPは切断されたアクチンオリゴマーとともにネットワークから離脱する高頻度アクチン線維切断-再結合モデルを提唱した(J.Cell Biol.175:947,2006).本研究は、私が見出した手法で、細胞内アクチン線維の重合・脱重合動態を一分子ごとに可視化する蛍光単分子スペックル法(Science vol.295,1083-1086,2002)をアクチンの重合端に結合する主要な分子に応用し、その生化学的性質や制御シグナルの分子機序を細胞内で直接解明することを目的とする。当初の対象として、アクチン重合がその伸展の原動力となっていることが知られる細胞先端の葉状仮足におけるアクチン重合機構を解析した。現在までに、細胞先導端の主要なアクチン線維調節分子であるAr p2/3複合体とキャッピングプロテインを中心にその細胞内分子動態を解析するとともに、アクチン線維重合・脱重合の数理モデルをたてアクチン改変のメカニズムを検討した。特にキャッピングプロテインに関しては、半減期1.2秒程度の速い分子解離速度を生細胞内で示す予想外の結果を見出した。リコンビナントで作製したGFP標識ヘテロダイマーの生化学的性質と比較することで、その速い分子動態が生細胞内特有の性質であることを確認した。更に、他の反矢じり端結合分子が強くアクチン線維をキャップするか確認する目的で、現在知られている、Eps8,XAIP1,VASP,ゲルソリンについても、cDNAを採取、GFP融合体を細胞内に発現させ、それらの分子動態を観察したが、全てにおいてアクチン骨格系に長時間(数十秒の単位)で結合しているものはなかった。これらの結果は、細胞先端の葉状仮足にみられる樹状突起ネットワークでは、アクチン線維は速やかに脱キャップするメカニズムが存在することを示唆する。得られた分子キネティクスから数理モデルを構築し、アクチン線維切断が恒常的に細胞の葉状突起内で起きることを確認した。これは、上記の速い脱キャップとともに線維切断といった制御で、細胞伸展縁の動的な細胞骨格制御が可能になっていることが示唆される(投稿中)。その脱キャップ機構について、引き続き検証中である。今回,我々はアクチン崩壊機構の解明を目標に,ラメリポディアのアクチン線維端に結合する主要な分子であるArp2/3複合体とキャッピングプロテイン(CP)に注目し,その単分子キネティクス解析を行った.驚くべきことに,インビトロではアクチン線維に高親和性で結合するCPが,細胞内では半減期1.2秒の速さでアクチンネットワークから解離していた.これはインビトロのCPの解離速度より3桁も速く,アクチン線維の崩壊速度よりも20倍以上速い.その原因を追究したところ,1)ストレス線維に会合するCPは寿命が長い,2)アクチン脱重合阻害剤であるジャスプラキノライドでCPの解離がすみやかに著明に延長,

3)アクチン脱重合因子コフィリンをリン酸化,不活化するLimキナーゼの過剰発現でCPの解離が延長することが見出された.1)3)はアクチン線維崩壊を阻害する条件であるが,半減期が30秒のアクチン線維を安定化させることがより速い解離速度をもつCPの解離速度を遅延させるのは,非直感的な現象である.1つの説明として,CPの解離はコフィリンによる線維切断にトリガーされる一方,アクチン線維は再結合によって分解を免れていることが考えられる.これらに基づき,葉状仮足ではアクチン線維は高頻度に切断-再結合を繰り返し,線維端のCPは切断されたアクチンオリゴマーとともにネットワークから離脱する高頻度アクチン線維切断-再結合モデルを提唱した(J.Cell Biol.175:947,2006).
UV/光電子法による超微粒子測定のための荷電装置の試作と評価

1.光源一体型光電子/負イオン放出材の作成とその発生量の測定石英ガラスまたは254nmのUVランプ上に透明導電性膜ITO/Auを蒸着させた光電子/負イオン放出材を作成し、紫外ランプ点灯時の外部光電効果による光電子/負イオン発生量を求めた.その結果、反射型(放出材の金属蒸着表面への照射)<透過型(その裏側からの照射)<光源一体型の順序で、より多くの光電子/負イオンを発生させられることが分かった.2.交流型/直流型光源一体型荷電装置(光電子/負イオン発生装置)の試作254nmのUVランプの表面にITO/Auを蒸着させ、光源/光電子/負イオ放出材一体型の荷電装置を新たに作成した.本装置を直流型として用いた超微粒子の荷電効率から考えて、透過型荷電装置(負イオン濃度は約10^6個cm^3)に比較して、かなり多い負イオン濃度が得られていると推定された。3.交流型/直流型光源一体型荷電装置の評価交流型/直流型光源一体型荷電装置を試作し、直流では24nmと56nmの単分散NaCl超微粒子で荷電電圧、流速を変化させ、交流では56nmの単分散NaCl超微粒子で荷電電圧、流速、周波数を変化させ、装置の性能を荷電割合、通過割合、荷電通過割合により評価した.特に、超微粒子測定には、高い荷電割合とその高い通過割合、すなわち荷電された超微粒子の通過割合(荷電通過割合)が重要である。交流を用いた場合、56nmの超微粒子の荷電実験において、その荷電割合は減少したが、荷電通過割合は増加していた.よって、本装置の交流における有効性が確認された.1.光源一体型光電子/負イオン放出材の作成とその発生量の測定石英ガラスまたは254nmのUVランプ上に透明導電性膜ITO/Auを蒸着させた光電子/負イオン放出材を作成し、紫外ランプ点灯時の外部光電効果による光電子/負イオン発生量を求めた.その結果、反射型(放出材の金属蒸着表面への照射)<透過型(その裏側からの照射)<光源一体型の順序で、より多くの光電子/負イオンを発生させられることが分かった.2.交流型/直流型光源一体型荷電装置(光電子/負イオン発生装置)の試作254nmのUVランプの表面にITO/Auを蒸着させ、光源/光電子/負イオ放出材一体型の荷電装置を新たに作成した.本装置を直流型として用いた超微粒子の荷電効率から考えて、透過型荷電装置(負イオン濃度は約10^6個cm^3)に比較して、かなり多い負イオン濃度が得られていると推定された。交流を用いた場合、56nmの超微粒子の荷電実験において、その荷電割合は減少したが、荷電通過割合は増加していた.よって、本装置の交流における有効性が確認された.1.光電子/負イオン発生量の測定石英ガラス上に透明導電性膜ITO (50Å)/Au (50Å)を蒸着させた光電子/負イオン放出材に254nmの紫外線を照射し、放出材を陰極とし、陽極との距離を一定に保ち、印可電圧を変え、光照射により増加した電流値から、光電子/負イオン発生量を求めた。その結果、放出材の金属蒸着表面への照射より、その裏側からの照射において、より多くの光電子/負イオンを発生させられることが分かった。2.直流型荷電装置の試作石英ガラス/ITO (50Å)/Au (80Å)のうら側から、2本の紫外線ランプ(6W)を照射する直流透過型の荷電装置を試作した。本装置荷電部での負イオン濃度は約10^6個/cm^3であった。3.超微粒子の荷電効率の測定による荷電装置の評価電界強度100V/cmの平均帯電量は、粒径の増加とともに増加した。0.1μmの標準粒子の発生濃度を10^510^7個/lと変化させたが、その平均帯電数はほぼ一定となり、本装置の荷電装置としての有効性が明らかになった。しかし、電界強度をさらに上げると荷電装置内で、帯電した超微粒子の一部が捕獲されるため、適当な電界強度への調整、または交流電界への変更の必要性が示唆された。4.次年度の予定直流透過型荷電装置による印可電圧に関する最適電界強度の探索、ならびに交流透過型装置の試作とその性能評価について詳細に検討する。1.光源一体型光電子・負イオン放出材の作成とその発生量の測定石英ガラスまたは254nmのUVランプ上に透明導電性膜ITO/Auを蒸着させた光電子・負イオン放出材を作成し、紫外ランプ点灯時の外部光電効果による光電子・負イオン発生量を求めた。

その結果、反射型(放出材の金属蒸着表面への照射)<透過型(その裏側からの照射)<光源一体型の順序で、より多くの光電子/負イオンを発生させられることが分かった。2.交流型/直流型光源一体型荷電装置(光電子/負イオン発生装置)の試作254nmのUVランプの表面にITO/Auを蒸着させ、光源/光電子/負イオン放出材一体型の荷電装置を新たに作成した。本装置を直流型として用いた超微粒子の荷電効率から考えて、透過型荷電装置(負イオン濃度は約10^6個/cm^3)に比較して、かなり多い負イオン濃度が得られていると推定された。3.交流型/直流型光源一体型荷電装置の評価交流型/直流型光源一体型荷電装置を試作し、直流では24nmと56nmの単分散NaCl超微粒子で荷電電圧、流速を変化させ、交流では56nmの単分散NaCl超微粒子で荷電電圧、流速、周波数を変化させ、装置の性能を荷電割合、通過割合、荷電通過割合により評価した。特に、超微粒子測定には、高い荷電割合とその高い通過割合、すなわち荷電された超微粒子の通過割合(荷電通過割合)が重要である。交流を用いた場合、56nmの超微粒子の荷電実験において、その荷電割合は減少したが、荷電通過割合は増加していた。よって、本装置の交流における有効性が確認された。
オーファンG蛋白質共役型受容体が仲介する概日時計中枢神経系の光環境適応メカニズム

地球上の生物は体内時計機能を持ち、周囲の明暗環境に生理機能を同調させる。近年、昼夜交代労働や人工照明下での不規則な生活習慣による体内時計の乱れが不眠症や精神疾患、高血圧症などの疾病の発症につながることが指摘されている。私は、このような背景の中、生体内において細胞間情報伝達に重要な役割をもつGタンパク質共役受容体(GPCR)に着目し、機能未定のオーファンGPCRを対象とした探索研究を事前に行った結果、体内時計の中枢である視交叉上核(SCN)において光位相調節に関わる新規のオーファン受容体GPRLを同定した。そこで本研究では、SCNにおいてGPRLが仲介する光情報と時計遺伝子の情報統合プロセスを明らかにすることを計画し、次の成果を得た。まず、位相後退を引き起こす主観的夜の前半の光刺激をマウスに与えた際、GPRL欠損マウスは野生型マウスと比較して位相応答が極度に弱いこと、そして、同じく主観的夜の前半に光刺激をマウスに与えると、GPRL欠損SCN内では野生型と比較して光応答遺伝子c-Fosの発現誘導が弱まることを確認した。さらに、位相後退とは反対の位相前進を引き起こす主観的夜の後半の光刺激をマウスに与えた際の応答性を評価した結果、GPRL欠損マウスは野生型マウスと比較して位相応答が減弱せず、GPRL欠損SCN内におけるc-Fosの発現誘導も野生型と比較して低下は見られないことを明らかにした。このことから、GPRLが光刺激による位相変動機構の時刻依存性に寄与している可能性が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
酸化物系薄膜電極の湿式プロセッシングと高性能イオンセンシングデバイスへの応用

酸化物薄膜電極の合成法:(1)アセチルアセトナト錯体法、金属カルボン酸法により、ペロブスカイト型酸化物薄膜を500-600°Cの低温合成できることがわかった。(2)電析法によりNiO,NIOOH,IrOx酸化物等を合成できることがわかった。電流検出型リン酸イオンセンサ:(1)LaCoO_3薄膜電極を合成し、リン酸イオン(H_2PO_4^-,HPO_4^<2->)に対する電流検出型センサの検討を行ったところ、リン酸イオンを含む溶液中で高いアノード電極触媒活性を示し、しかもその電流値はリン酸イオン濃度に依存することがわかった。また、そのアノード電流変化を用いれば、電流検出型リン酸イオンセンサを構築できることがわかった。エレクトロクロミズム型イオンセンサ:遷移金属系酸化物(Co_3O_4,NiO等)をゾル-ゲル法や電析法を用いてITO付き基板上に作製した酸化物薄膜電極が、リン酸イオンを含む溶液中でエレクトロクロミズムを示し、しかもその透過率変化がリン酸イオン濃度の対数に比例して変化することを見出した。Co_3O_4系電極は、1.0×10^<-6>1.0×10^<-2>MのHPO_4^2に対して光学変化を示し、応答時間も約50秒と良好なリン酸イオン応答を示すことを見出した。また、本素子は、NO_<3->やCl^-などに対する選択性も高く、全く新しいタイプのオプティカルリン酸イオンセンサとなることを見出した。
導電性素材を用いた変形可能な柔らかい入出力デバイス

本研究では、デジタル情報を直感的に扱うために、身近なマテリアルを用いた入出力インタフェースの開発を進めている。例えば粘土や紙、あるいはハサミやペンなど普段慣れ親しんでいる素材や道具の特性に着目し、それらを入出力としたインタフェースとすることで、"書く"や"造る"、"切る"などの手作業の創作活動がデジタル技術により拡張できると考える。本年度は、これまで取り組んできた身近な素材を用いたツールの応用として、より実用的に使用可能にするべく、現在普及している3Dプリンタやバキュームフォームなどのファブリケーション技術に手作業の直感性を取り入れる試みを行った。また自然物などの身近な素材を体にしたロボットキットの開発や展示を行った。例えばバキュームフォーマーを用いた高速かつ試行錯誤可能な立体造形ファブリケーションツールや、空中像と3Dプリンタを用いたインタラクティブモデリング環境、オープンデザインを取り入れた"歩き方"について考える学習用ロボットキットなどである。幾つかのプロジェクトはすでに、採択率の低いUIST2014をはじめ国内外の学会などで展示を行っており、国際的な評価として認められている。また研究論文は情報処理学会論文誌の特選論文をはじめとして優れた研究や作品に贈られる賞なども受賞しているため、学術的にも社会的にも意義のある研究テーマであることが証明されている。これらの取り組みは、導電性・柔軟性などの素材の特性をもつ身近な素材をベースとした入出力インターフェースあるいはデジタルファブリケーションへの応用への可能性を示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、入出力に適しているマテリアル特性の調査やその特性を利用したプロトタイプの開発を行った。dePENdは通常のペンと紙を用いて手描きを支援するシステムである。これはボールペンのペン先の強磁性に着目しており、机内部の磁石の位置をXYステージとコンピュータで制御することで,筆記時のペンの動きを制御する。アプリケーションとして、図形や直線の自動的な描画や、アレンジの追加、通信機能やコピーアンドペーストなどの機能を実装した。enchanted scissorsは、身近な創作道具であるハサミに着目したインタフェースである。従来のハサミの素材に着目し、導電性インクで描かれた線に刃先が触れることで静電容量値が変化し、それに応じてハサミの開閉が動的に制御される仕組みを組み込んだ。紙に描かれた線をより正確に切る、ある範囲の中で自由に形状表現を行う、などの新たな体験が可能となる。また複数のマテリアル特性を組み合わせることで、複数の性質を持った新しい素材を簡易に開発できる試みを行った。熱可逆樹脂に導電性のあるカーボン、磁性のあるトナーを混ぜることで複数の性質を持った樹脂を開発した。これらの取り組みは、導電性などの素材の特性が、身近な素材をベースとした入出力インターフェースへの応用への可能性を示唆している。今後はこれらのプロトタイプを発展させて、よりアナログな素材とデジタル情報が結びつくことによって、創作活動支援や情報操作技術への発展に繋がるようにしていきたい。今年度は、昨年度から進めているプロジェクトの発展を行ったり、デジタルファブリケーションなど新たな視点からの新規プロジェクトの開発などを進めた。例えば振動モータの多方向牽引力を用いた描画支援のためのペン型デバイスや、タブレット型画板と導電性筆を用いた紙の上への描画促進ツール、導電性樹脂と3Dペンを用いた「歩く」3Dドローイングの基礎検討、空中像と3Dプリンタを用いたインタラクティブモデリング環境などである。これらの取り組みは、導電性・柔軟性などの素材の特性をもつ身近な素材をベースとした入出力インターフェースあるいはデジタルファブリケーションの応用への可能性を示唆している。今後はこれらのプロトタイプを発展させるとともに、これまでのプロトタイプ群をまとめ、創作活動支援や情報操作技術への発展に繋がるようにしていきたい。

例えばバキュームフォーマーを用いた高速かつ試行錯誤可能な立体造形ファブリケーションツールや、空中像と3Dプリンタを用いたインタラクティブモデリング環境、オープンデザインを取り入れた"歩き方"について考える学習用ロボットキットなどである。幾つかのプロジェクトはすでに、採択率の低いUIST2014をはじめ国内外の学会などで展示を行っており、国際的な評価として認められている。また研究論文は情報処理学会論文誌の特選論文をはじめとして優れた研究や作品に贈られる賞なども受賞しているため、学術的にも社会的にも意義のある研究テーマであることが証明されている。これらの取り組みは、導電性・柔軟性などの素材の特性をもつ身近な素材をベースとした入出力インターフェースあるいはデジタルファブリケーションへの応用への可能性を示唆している。本資金申請時の2年度の目的は、柔軟な素材を用いた直感的な操作デバイスの開発と直感的な操作デバイスを用いたアプリケーションの実装であった。これらは、3Dペンなどを用いた空間ドローイングツールや柔らかい素材を用いたMorphingCubeなどの表現、また造形物と空中像を組み合わせたファブリケーションツールなど、実際にプロトタイプを開発して、さらに評価、対外発表を行っているため、当初の研究目的を達成していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究方針は昨年度からの継続である柔軟な素材を用いた直感的な操作デバイスの開発を進め、展示活動やワークショップを積極的に行いユーザ体験から得られるフィードバックを評価したいと考える。それらについてまとめ、国内外で発表することを目的とする。また柔軟な素材を用いた直感的な創作環境やデジタルファブリケーションツールの研究開発に着手し、近年のパーソナルファブリケーション研究や産業へ貢献する。申請したテーマのもと、複数の新しいインタフェースのプロトタイプを開発しており、また幾つかのプロジェクトは国内外で発表し国際的な評価として認められた。また次期プロジェクトに向けて新素材の試作も行っているので、本年度の目標は達成している。本研究課題は申請時に、柔軟な入出力デバイスの素材として導電性粘土を用いると述べた。しかし柔軟な入出力デバイスを構成するマテリアルは、他にも検討することができる。多角的に研究テーマに取り組むために、様々な素材の開発や検討を行う。また身近な素材をインタフェースとして扱う際に、粘土以外にも紙やハサミなど様々なツールや素材が存在する。本研究ではそれらと新しいファブリケーションツール(3Dプリンタ、レーザーカッター)を用いながら、新しいインタラクティブファブリケーションツールを開発する予定である。
有機塩素化合物の化学的脱塩素法の開発

PCBに代表される有機塩素化合物は,その毒性から健康被害や環境汚染が問題とされている。PCBは試験的に燃焼処理されたことがあるが,ダイオキシンの副生の恐れがあるため,処理施設近くの住民の合意が得られず,日本においては今後とも実行できない現状にある。本研究では,化学的脱塩素処理であるアルカリ触媒分解法を発展し,PCBを水素供与体である油とアルカリおよび炭素系触媒を用い,常圧で290355°Cに加熱することによって99.999%以上の除去率を達成することが出来た。また,PCBのモデル物質として一塩化ビフェニルを用いて反応機構を解析した。反応速度の向上には苛性ソーダよりも苛性カリが有効であり,促進効果は数十倍に達することを明らかにした。アルカリの添加量はPCBの塩素量の4倍等量あれば十分であった。塩素収支から求めた脱塩素率は100%であった。さらに,本研究で開発したプロセスにおいては,不純物として含むダイオキシンをも同時に分解していて新たな環境汚染物質の生成は見られない。反応生成物から推定される反応機構は,従来言われていたラジカル反応のみではなく,イオン反応も並行して起きていることが強く示唆された。本研究の成果は,現在耐用年数が過ぎPCBを含有するため処理を必要とするトランス油等の処理に適用可能と考えれる。平成7年度の研究成果として以下の点が上げられる。1.C重油や工業用流動パラフィンなど安価なオイルを用いてPCBが99.999%分解できることを確認した。また、高濃度PCB(20000mg/l)の処理が可能である。2.モノクロルビフェニルおよび3塩化PCBを主成分とするKC-300、4塩化PCBを主成分とするKC-400の分解反応は見かけ上1次反応で表せることを明らかとした。また、その活性かエネルギーも算出した。3.アルカリの種類について検討を行い、苛性ソーダ及び苛性カリが有効であることを明らかにした。また、苛性カリは苛性ソーダに比べて反応速度の面で優意である。4.アルカリの添加量は多いほど反応が速く進行し、塩素量に対する化学量論比の10倍等量以上あれば十分である。5.アルケンを添加剤として用いることにより反応が促進される。添加量は反応媒体油の10%でよいことがわかった。6.塩素収支から求めた脱塩素率は100%であることを確認した。7.生成する塩類は触媒とともに固形分として分離できることがわかった。また、残渣の分離は遠心分離法で効率よく除去できる。8.油中にとけ込んだ塩類は水抽出法で除去することが可能であり、希硫酸を用いることで除去効率が上がることを確認した。9.3塩化PCBからビフェニルに至る反応経路を確認し、PCBは脱塩素化されて低塩素化する形でビフェニルに至ることを確認した。また、その経路の反応速度定数を推算した。

反応生成物から推定される反応機構は,従来言われていたラジカル反応のみではなく,イオン反応も並行して起きていることが強く示唆された。本研究の成果は,現在耐用年数が過ぎPCBを含有するため処理を必要とするトランス油等の処理に適用可能と考えれる。
ヘルペスウイルスの遺伝子発現スイッチ機構の解明

ガンマヘルペスウイルスの遺伝子発現制御について検討した。ウイルスの増殖に必須とされていたORF35タンパク質が遺伝子制御に関わるか検討したが、これまでの知見と異なり、ウイルス増殖の効率や潜伏感染からの再活性化に関与していることが分かった。ORF31タンパク質は、遺伝子発現の制御に関与し、機能部位を同定した。また、ORF31と結合し、ウイルス増殖に関与する細胞タンパク質の候補を探索し、候補タンパク質について検討を進めている。マウスガンマヘルペスウイルス(MHV)68が持つ5種類のスイッチ蛋白質(ORF18, ORF24, ORF30, ORF31, ORF34)を発現するプラスミド、また、それぞれを欠損するウイルスゲノムを持つ細菌人工染色体(BAC)を作成した。また、各蛋白質を安定発現する細胞の樹立を試み、ORF30とORF24以外の安定発現細胞を得た。作成した安定発現細胞株を用いて、ORF18、ORF31、ORF34をそれぞれ欠損するウイルスを回収した。組換えBACを用いた検討から、あるウイルス蛋白質(たとえばORF18)の欠損は同じ蛋白質でのみ増殖を補完でき、他の蛋白質ではできないことが分かった。感染細胞での各蛋白質の相互作用を検討するために、タグを付けた蛋白質を発現するウイルス、もしくは蛋白質特異的抗体を作成中である。ORF31と結合する蛋白質を免疫沈降法および質量解析で検討し、100種類以上の蛋白質を検出した。現在までに7つの蛋白質について、ORF31との結合性やshRNA導入による遺伝子ノックダウンのMHV68増殖に対する影響について検討を行った。うち、3種はノックダウンによる細胞障害が強く、検討を中止した。別の3種はノックダウンによってウイルス増殖が影響を受けなかったため検討を中止した。1種につき、ORF31との結合性は微弱もしくは認めないが、ノックダウンによりウイルス増殖が低下したため、現在、詳細な解析を進めている。今後、さらに検討するORF31結合蛋白質の数を増やす予定である。機能不明であり、ウイルス増殖に必須であるとされるORF35蛋白質がスイッチ蛋白質として機能するかを検討した。既報と異なり、ORF35蛋白質はウイルス増殖に必須ではなく、スイッチ蛋白質ではないことが明らかとなった。本件については論文修正原稿を準備中である。機能不明であり、ウイルス増殖に必須であると報告されていたマウスガンマヘルペスウイルス(MHV)68のORF35遺伝子は、実際はウイルスの増殖に必須ではなく、効率的なウイルス増殖に必要であることを明らかにした。また、ORF35遺伝子は潜伏感染からの再活性化にも関与することを明らかにし、論文発表した。MHV68が持つ、5つのスイッチ蛋白質のうちの1つであるORF31蛋白質の性状解析を行い、現在論文を投稿中である。また、ORF31蛋白質と結合する宿主蛋白質が、前年の研究で100以上見つかっており、その中のひとつにつき詳細を解析中である。この宿主蛋白質はORF31と結合し、ノックアウト細胞ではウイルスの増殖がおよそ10分の1に低下することが分かった。また、ORF31以外のスイッチ蛋白質についても組換えウイルス等を用いて検討を進めている。ORF35については論文発表を行っており、ORF31に関する論文も現在投稿中であるので、研究の進展を見ている。しかし、ORF24,ORF30のテトラサイクリン誘導発現細胞の樹立が不可能であった。一過性発現細胞を用いた場合、感染性ウイルスの産生量が少なく、実験に供することができなかった。さらに、両蛋白質にエピトープタグをつけた組換えウイルスの作成を試みたが、ORF30にタグをつけた組換えウイルスの回収は不可能であった。一方、ORF24にエピトープタグを付けた組換えウイルスは回収可能であったが、蛋白質の発現を確認することができなかった。同様にORF18、ORF31にエピトープタグを付けた組換えウイルスは回収が不可能であった。ORF18に対する抗血清を作成したものの、発現プラスミドを用いた場合にはORF18蛋白質の検出可能だが、ウイルス感染細胞ではできなかった。ORF31に対するモノクローナル抗体を作成したが、感染細胞中での蛋白質の発現が少なく検出が容易ではなかった。上記のように想定以上の実験上の困難に直面した。また、研究代表者が平成28年4月から琉球大学に移動することとなり、実験を中断しなくてはならなくなった。これらのことから、進捗状況としてはやや遅れ気味であると判断せざるを得ないと考える。ヘルペスウイルスの遺伝子発現は、細胞とウイルスのタンパク質の働きにより制御を受け、前初期、初期、後期タンパク質と大きく三つに分けられる。本研究ではマウスガンマヘルペスウイルスを用いて、後期タンパク質発現の"スイッチ"として働くウイルスタンパク質の探索・機能解析を行った。ORF35遺伝子はウイルス増殖に必須であると考えられていた遺伝子であるため、後期タンパク質の発現に関与するかについて、ORF35遺伝子を欠損させた組み換えウイルスを作成し遺伝子発現を確認した。既報と異なり、ORF35遺伝子は1ウイルスの増殖に必須ではない、2後期タンパク質の制御に関係しない、3ウイルス増殖効率に寄与する、4潜伏感染からの再活性化に関与している可能性があることを明らかにした。また、ORF35タンパク質の性状についても検討し、多量体を形成することや細胞質内に局在することを明らかにした。同様の方法を用いてORF31遺伝子についても検討を行った。

その結果、1ウイルスの増殖に必須であること、2後期タンパク質の発現に関わること、3ORF31タンパク質のN末端側に機能部位が存在することなどを明らかにした。ORF31タンパク質と結合し、ウイルスの増殖に関わる細胞タンパク質の探索も行った結果、100以上のタンパクを同定した。その後、3つについて詳細な検討を行った結果、ウイルスの増殖に影響を及ぼす可能性のある遺伝子が特定できたが、その詳細なメカニズムの解明は今後の検討課題として推進していく。ガンマヘルペスウイルスの遺伝子発現制御について検討した。ウイルスの増殖に必須とされていたORF35タンパク質が遺伝子制御に関わるか検討したが、これまでの知見と異なり、ウイルス増殖の効率や潜伏感染からの再活性化に関与していることが分かった。ORF31タンパク質は、遺伝子発現の制御に関与し、機能部位を同定した。また、ORF31と結合し、ウイルス増殖に関与する細胞タンパク質の候補を探索し、候補タンパク質について検討を進めている。ORF24,ORF30の発現細胞をテトラサイクリン誘導発現もしくは一過性発現によって解決することによって当初予定を充足させることが可能である。ORF31との結合がはっきりしないという問題はあるものの、ノックダウンによってMHV68の増殖が低下する新規宿主蛋白質を一つの候補として解析するに至っている。ウイルス増殖に必須であり、機能不明であるとされていたORF35蛋白質が、実際は必須ではなく・スイッチ蛋白質として機能しないということを明らかにすることができ、修正原稿の準備まで到達できた。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。琉球大学での遺伝子組み換え実験の申請・認可にかかる時間、タグ付き蛋白質を発現する組換えウイルスの解析の困難さから、これまで考えてきた5つのスイッチ蛋白質のうち、解析系が動かせるORF31とORF34を重点的に行う方針に切り替えることで研究の推進を図る。ウイルス学ORF24, ORF30の安定発現細胞株を定法で作成する代わりに、テトラサイクリン誘導発現細胞・一過性発現細胞を検討する。また、得られた蛋白質欠損ウイルスについては当初予定通りに検討を進めていく予定である。現在、ウイルスの増殖に影響を与える宿主因子はスイッチ蛋白質の機能に影響を与えているわけではないことから、当初予定とは異なる解析(ウイルス粒子形成・自然免疫応答など)を行う必要がある。また、同定された100種以上のORF31結合蛋白質の検討も並行して行い、当初予定の解析を進めていく予定である。平成27年度中に琉球大学への移動が決定した。九州大学に比べ設備状況がよくないため、琉球大学での設備の拡充を行う必要があり、同年度中の支出を抑える必要があった。想定よりBACの作成、安定発現細胞の樹立を問題なく行うことができた。その一方で、経費を抑えるためにORF24、ORF30の安定発現細胞の作成には定法に固執してしまった。同様に蛋白質の検出を容易にする目的で行った、蛋白質タグが挿入困難なORF30、ORF18についてもタグの挿入に固執してしまったことが理由であると考えられる。
複合ストレス後にみられる恐怖反応増強における視床下部ー下垂体ー副腎系の役割

ラットが強いストレスを受けると,その後の条件性恐怖反応が増強する現象は,心的外傷後ストレス障害(PTSD)の有用な動物モデルと考えられている。本研究では,強制水泳とフットショックによる複合ストレスを用いて,ラットの条件性恐怖反応のストレス誘発性増強における視床下部ー下垂体ー副腎皮質ストレス反応(HPA)系の関与について検討した。HPA系を操作する様々な薬物を複合ストレス前に投与し,その後の条件性恐怖反応を観察したところ,HPA系は,複合ストレス時にグルココルチコイド受容体とアドレナリンβ受容体の賦活が相補的に作用することで,ストレス誘発性恐怖反応増強の成立に関与していることが明らかになった。本年度は,HPA系ストレス反応の最初の反応であるCRHの中枢作用がストレス誘発性恐怖反応増強効果に関与しているのかどうかを検討した。Wistar-Imamichi系雄ラットを被験体として、昨年度の実験と同様に,フットショック(1.0 mA, 1s×4回)と強制水泳(20分間)を組み合わせた複合ストレスを与えた。この複合ストレス処置の15分前に,CRH受容体アンタゴニストであるα-helical CRHを脳室内に投与した。複合ストレス処置から2週間後に複合ストレスを与えた装置とは文脈の異なる装置で文脈恐怖条件づけ(0.1 mA, 2 s)を行い、その翌日、1週間後および2週間後に保持テストを行った。その結果、すべての群においてストレス誘発性恐怖反応増強がみられ、複合ストレス時に分泌されるCRHはその後の恐怖反応増強に関与していない可能性が示唆された。本年度は、ラットのストレス誘発性恐怖反応増強における視床下部ー下垂体ー副腎皮質ストレス反応(HPA)系の役割を検討するために,HPA系の最終反応であるグルココルチコイド分泌を抑制するmetyraponeおよびdexamethasone投与の効果を検討した。またグルココルチコイドの嫌悪性情動記憶促進効果にはストレス反応としてのノルアドレナリン分泌が関与しているという報告があることから,βノルアドレナリン受容体遮断薬であるpropranolol投与の効果も合わせて検討した。Wistar-Imamichi系雄ラットを被験体として、フットショック(1.0 mA, 1s×4回)と強制水泳(20分間)を組み合わせた複合ストレスを与えた。この複合ストレス処置の15分前に,metyropone(25, 50 mg/kg),dexamethasone(0.4 mg/kg),propranolol(10, 20 mg/kg)あるいは生理食塩水のいずれかを腹腔内投与した。その結果、いずれの薬物処置によってもストレス誘発性恐怖反応増強がみられ、複合ストレス時に分泌されるグルココルチコイドおよびアドレナリンは、その後の恐怖反応増強に関与していない可能性が示唆された。前年度までの結果より,フットショックと強制水泳を組み合わせた複合ストレスによる条件性恐怖反応の増強には,複合ストレス時に副腎皮質から放出されるグルココルチコイド,副腎髄質から放出されるアドレナリン,さらに視床下部から放出されるCRHは関与していないことが明らかになった。そこで本年度は,脳内のグルココルチコイド受容体の関与を検討するために,グルココルチコイド受容体遮断薬であるRU38486の脳室内投与の効果を検討した。その結果,RU38486脳室内投与は,条件性恐怖反応のストレス誘発性増強には影響しなかった。しかしながら,RU38486とアドレナリンβ受容体遮断薬のプロプラノロールの併用投与がストレス誘発性増強を減弱した。実験心理学・行動神経科学今年度については,交付申請書に記載した計画通り実験を遂行できた。しかしながら予想に反して,CRHの中枢作用もストレス誘発性恐怖反応増強に関与していない可能性が示唆された。今年度については、交付申請書に記載した計画通り実験を遂行できた。しかしながら予想に反して、トラウマストレス時に分泌されるグルココルチコイドあるいはアドレナリンが、ストレス誘発性恐怖反応増強に関与しているという証拠は得られなかった。これまでの結果から、HPAストレス反応系のうち、複合ストレス時に副腎皮質から放出されるグルココルチコイド,副腎髄質から放出されるアドレナリン,さらに視床下部から放出されるCRHは、恐怖反応増強に関与していない可能性が考えられた。26年度は,脳内のグルココルチコイド受容体(GR)がストレス誘発性恐怖反応増強に関与しているのかどうかを検討するため,GRアンタゴニストの脳内投与の効果を検証する。25年度以降は,CRHの中枢作用がストレス誘発性恐怖反応増強効果に関与しているのかどうかを検討する。

24年度の結果から、HPAストレス反応系のうち、複合ストレス時に副腎皮質から放出されるグルココルチコイドは、恐怖反応増強に関与していない可能性が考えられた。CRHはHPA系の活動を調節する主要なペプチドであるが,脳内,とりわけ扁桃体や海馬において中枢作用を持ち,不安や情動,嫌悪性情動記憶の調節に関与していることが示唆されている。そこで本研究では,複合ストレスによる恐怖反応増強効果にこのCRHの中枢作用が関与しているのかどうかを検討する。残額が端数のため使用できなかった。消耗品購入のために,次年度の助成金と合わせて使用する。ラットを用いた実験を行うため、消耗品として動物購入費用および飼育に要する費用が必要となる。また、薬物や実験器具(消耗品)も購入予定である。成果の一部を発表するために、海外および国内の学会への参加のための旅費が必要である。
硫黄酸化細菌のNAD依存型イソクエン酸脱水素の構造と機能の精密解析

インクエン酸脱水素酵素(ICDH)は多くの生物から単離されており,細菌由来のICDHのほとんどは補酵素としてNADP^+を要求する.これに対し,我々が見出した化学合成独立栄養細菌Acidithiobacillus thiooxidans由来のICDHはNAD^+依存型である.また本酵素はアミノ酸配列や反応機構など細菌由来の3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)と類似している.本酵素のX線結晶構造解析を行いNADP^+特異的ICDH,及びIPMDHとの比較検討を行うことにより,基質認識機構,NAD^+・NADP^+型補酵素認識機構の解明に役立つと考えられる.我々はまず本酵素遺伝子のクローニングを行い,大腸菌を用いた大量発現系を構築した。次に,ICDH大量発現プラスミドpKK-ICDHを用いて大量精製を行った.酵素精製は熱処理60°C,5minの後,DEAE-ToyopearlとSephacryl S-200HRの二つのカラムに供する事で行った.得られた精製酵素を用いて結晶化を行った結果,ICDH-NAD^+複合体の状態で四角両錐の結晶が得られ,1.9Åまでの解析データが得られた。本結晶ではニコチンアミドのリボースがC-dループのThr105の主鎖窒素に配位しており,ニコチンアミド環周辺の電子密度も高分解能で解析できた。ニコチンアミド基の窒素がC4炭素に対してcis側にあり23°の二面角で基質側に傾いていた。そこで,量子化学計算による水素の電荷を計算した結果,C4の2つの水素原子はアミド基のNH_2が近づくcis配座で負荷電を持ち,二面角23°で最も大きな負電荷を帯びると予測された。一方,アミド窒素がC4炭素に対してtransではC4位の水素が正荷電を持ち,ハイドライド形成に不利と示唆された。これらの結果は,補酵素だけではハイドライドが放出されない理由や酵素反応の立体選択性にも明確な説明を与える魅力的な仮説を提供した。現在,酵母由来のICDHが臨床検査薬として利用されている.At-ICDHは熱安定性,pH安定性や基質であるインクエン酸に対する高い親和性の点で酵母由来ICDHより優れていたため,臨床検査薬として実用化されることになった.インクエン酸脱水素酵素(ICDH)は多くの生物から単離されており,細菌由来のICDHのほとんどは補酵素としてNADP^+を要求する.これに対し,我々が見出した化学合成独立栄養細菌Acidithiobacillus thiooxidans由来のICDHはNAD^+依存型である.また本酵素はアミノ酸配列や反応機構など細菌由来の3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)と類似している.本酵素のX線結晶構造解析を行いNADP^+特異的ICDH,及びIPMDHとの比較検討を行うことにより,基質認識機構,NAD^+・NADP^+型補酵素認識機構の解明に役立つと考えられる.我々はまず本酵素遺伝子のクローニングを行い,大腸菌を用いた大量発現系を構築した。現在,酵母由来のICDHが臨床検査薬として利用されている.At-ICDHは熱安定性,pH安定性や基質であるインクエン酸に対する高い親和性の点で酵母由来ICDHより優れていたため,臨床検査薬として実用化されることになった.イソクエン酸脱水素酵素(ICDH)は,TCA回路中やグルタミン生合成経路において重要な役割を果たす酵素である。本酵素は細菌由来のものでは補酵素としてNADP^+を要求するものがほとんどであるが,我々が発見した化学合成独立栄養細菌である硫黄酸化細菌Acidithiobacillusthiooxidans中のICDHは補酵素としてNAD^+を要求する。NAD^+依存型ICDHのX線結晶構造解析の例はなく,今回本酵素の立体構造を明らかにするため,本酵素の大量発現・精製系を確立し,性質検討及び結晶化を行った。初めに大量発現系の構築を行った。すでに構築されていた発現プラスミド

pLWDlを鋳型とし,ICDH遺伝子部分をPCRで増幅させ,pKK223-3にライゲーションし大量発現用プラスミドpKKICDHを作成した・大腸菌JM109を形質転換させ本酵素を発現させt。次に酵素精製は,熱処理60°C5分間を行うことで大腸菌由来のICDHを取り除き,DEAE-ToyopearlとSephacryl、S-200HRを用いて行った。電気泳動的に均一に精製されていることが確認されたので,この酵素標品を用いて性質検討と結晶化を行った。大腸菌クローン株から精製した本酵素の性質は,元株A.thiooxidans由来の精製された酵素と比較して,至適pH・至適温度・基質特異性・補酵素特異性及ぴ金属要求性についてほぼ同じ性質を示した。結晶化の条件検討を行ったところ,ICDH-NAD^+複合体の状態で,沈殿剤にcitrateを用いたときに結晶が得られ,現在2.4Åまでの解析データが得られている。興味がもたれる炭酸固定反応については,現在検討中である。今後,今回確立した発現・精製系を用いて精製酵素を得,X線結晶構造解析及び炭酸固定反応の検討を進めていく予定である。イソクエン酸脱水素酵素(ICDH)は多くの生物から単離されており,細菌由来のICDHのほとんどは補酵素としてNADP^+を要求する.これに対し,我々が見出した化学合成独立栄養細菌Acidithiobatillusthiooxidans由来のICDHはNAD^+依存型である.また本酵素はアミノ酸配列や反応機構など細菌由来の3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)と類似している.本酵素の結晶構造解析を行いNADP^+依存型ICDH,及びIPMDHとの比較検討を行うことにより,基質認識機構,補酵素認識機構の解明に役立つと思われる.そこで今年度は本酵素の結晶構造解析を行った.まずICDH大量発現プラスミドpKKICDHを用いて大量精製を行った.酵素精製は熱処理60°C,5minの後,DEAE-ToyopearlとSephacryl S-200HRの二つのカラムに供する事で行った.電気泳動により単一に精製されていることが確認されたので,この精製酵素を用いて結晶化を行った.その結果,ICDH-NAD^+複合体の状態で,四角両錐の結晶が得られた.この結晶は,空間群P4_32_12,格子定数a=b=125.99Å,C=268.35Åのパラメーターを持つ。Os置換体を用いて位相を決定し、分解能1.9Åでの精密化を進めている。また,この解析により,ニコチンアミドのリボースの酸素がThr105の主鎖に配位,固定されており,このためC-dループの構造がNADP型ICDHと大きく異なっていることがわかった.一方,基質特異性の検討のため,活性中心のSerをGluに置き換える部位特異的変異を行い,変異酵素pKKICDH-S113Eを作成し,酵素精製及びイソクエン酸に対するKm値を求めた.その結果,野生型酵素と比べて比活性が0.8%に低下し,Km値は40倍に増加した。今後はさらに解析を進めて,補酵素及び基質の認識機構の全容を明らかにする予定である。イソクエン酸脱水素酵素(ICDH)は多くの生物から単離されており,細菌由来のICDHのほとんどは補酵素としてNADP^+を要求する.これに対し,我々が見出した硫黄酸化細菌Acidithiobatillusthiooxidans
口腔レンサ球菌のリポタイコ酸の免疫・生物学的活性

種々のグラム陽性菌の細胞表層に分布する両親媒性のリポタイコ酸(LTA)は,グラム陰性菌外膜を構成する内毒素性リポ多糖(LPS)に対応する構造物で,両者は共通の生物活性を示すとの説がある.そこで,我々は口腔レンサ球菌のLTA,特にデンタルプラークから最も高頻度に分離されるStreptococcus sanguis LTAに着目して,歯周組織のサイトカインネットワークに及ぼす作用を検討して,歯周病発症との係わりを探ろうとした.まず,Sigma社製の各種LTAを供試して,歯肉線維芽細胞培養に加えたところ,いずれのLTAも肝細胞増殖因子(HGF)/スキャッターファクター(SF)産生を増強した.特にS.sanguisLTAの活性は強かった.なお,対照とした各種LPSは全く活性を示さなかった.ちなみに,HGF/SFは上皮系細胞に多彩な作用を示すサイトカインとして注目を集めている.次に,歯肉上皮細胞にこれら標品を作用させて,HGF/SF誘導因子であるインターロイキン(IL)-1産生誘導作用を調べたところ,LPSは強い活性を示したが,LTAには活性は認められなかった.更に,リコンビナントヒト(rHu)IL-1αとS.sanguisLTAを併せて歯肉線維芽細胞に作用させると極めて強力にHGF/SFを誘導する事が明らかになった.この様な相乗作用は他のLTAでも認められた.なお,Sigma社製LTAは精製が不十分でLPS等の混入が認められた.従って,これまで報告のあるLTAによる各種サイトカイン誘導作用については再検討の必要があると考えられるが,本研究の成績は精製LTAでも確認されている.最後に,rHuHGFを歯肉上皮細胞に作用させると,期待通り,形態変化と増殖促進作用が認められた.以上の成績は口腔に最も多数生息する口腔レンサ球菌のLTAが歯周組織を構成する細胞を直接・間接に活性化して組織破壊と治癒の両面で作用する可能性を示唆している.種々のグラム陽性菌の細胞表層に分布する両親媒性のリポタイコ酸(LTA)は,グラム陰性菌外膜を構成する内毒素性リポ多糖(LPS)に対応する構造物で,両者は共通の生物活性を示すとの説がある.そこで,我々は口腔レンサ球菌のLTA,特にデンタルプラークから最も高頻度に分離されるStreptococcus sanguis LTAに着目して,歯周組織のサイトカインネットワークに及ぼす作用を検討して,歯周病発症との係わりを探ろうとした.まず,Sigma社製の各種LTAを供試して,歯肉線維芽細胞培養に加えたところ,いずれのLTAも肝細胞増殖因子(HGF)/スキャッターファクター(SF)産生を増強した.特にS.sanguisLTAの活性は強かった.なお,対照とした各種LPSは全く活性を示さなかった.ちなみに,HGF/SFは上皮系細胞に多彩な作用を示すサイトカインとして注目を集めている.次に,歯肉上皮細胞にこれら標品を作用させて,HGF/SF誘導因子であるインターロイキン(IL)-1産生誘導作用を調べたところ,LPSは強い活性を示したが,LTAには活性は認められなかった.更に,リコンビナントヒト(rHu)IL-1αとS.sanguisLTAを併せて歯肉線維芽細胞に作用させると極めて強力にHGF/SFを誘導する事が明らかになった.この様な相乗作用は他のLTAでも認められた.なお,Sigma社製LTAは精製が不十分でLPS等の混入が認められた.従って,これまで報告のあるLTAによる各種サイトカイン誘導作用については再検討の必要があると考えられるが,本研究の成績は精製LTAでも確認されている.最後に,rHuHGFを歯肉上皮細胞に作用させると,期待通り,形態変化と増殖促進作用が認められた.以上の成績は口腔に最も多数生息する口腔レンサ球菌のLTAが歯周組織を構成する細胞を直接・間接に活性化して組織破壊と治癒の両面で作用する可能性を示唆している.