hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄小脳失調症Ⅰ型における複合体タンパク質プロテオーム解析による分子病態の解明

脊髄小脳失調症I型(SCA1)の原因遺伝子はアタキシンー1(Atxn1)である。Atxn1複合体のプロテオーム解析は成功しなかったが、Atxn1の相互作用タンパク質と複合体の機能について報告する。(1) VCPはAtxn1と相互作用し、変異型はDNA損傷を増加させた。(2)ハエのin vivoスクリーニングをSCA1モデルハエで行い、RPA1が病態ネットワークのハブ遺伝子であり、実際に変異Atxn1との相互作用を認めた。(3)変異Atxn1と結合するHMGB1の補充療法は運動機能障害と寿命を回復させた。新規分子メカニズムとしてHMGB1によるミトコンドリアDNA損傷修復を示した。ポリグルタミン病である脊髄小脳失調症I型(SCA1)はアタキシン1(Atxn1)のポリグルタミン鎖の異常伸長を原因としているが、その分子病態は未だ不明な点が多い。我々はオミックス研究よりこの病態を抑制する標的タンパク質を同定し、ポリグルタミン病モデル系を用いてその病態の改善を報告してきた。本研究計画では、Atxn1を含む高分子複合体のプロテオーム解析を行い、神経変性に至る前のニューロンの機能障害に関わる複合体タンパク質を同定および定量し、SCA1病態への効果について疾患モデル系を用いて検証する。また、複合体を形成しているタンパク質のみを対象とする網羅的解析であることが本研究の特徴である。これまで定量的ショットガン・プロテオーム解析による結果が得られていないが、これに先立ち2つの知見が得られた。1.ポリグルタミン病において共通する分子病態機構を理解するために、ERA/VCP/p97に注目した。DNA損傷修復機能の阻害について報告した(Fujita K et al, Nature Communications 2013)。2.疾患モデルショウジョウバエを用いた遺伝学とシステム生物学を組み合わせ、SCA1のDNA損傷に重要な役割を持つタンパク質としてRpA1とChk1を報告した(Barclay SS et al, Human Molecular Genetics 2014)。これら2つ報告より、Atxn1と複合体を形成する可能性があるタンパク質として新たにVCPとRpA1がみいだされた。これらの知見を加え、Atxn1複合体を分画する条件の検討を進めることと並行し、リン酸化プロテオーム解析に着手すること、さらに新たにみいだしたVCPとRpA1の免疫沈降に続くプロテオーム解析で複合体の同定を行っていく。ポリグルタミン病である脊髄小脳失調症I型(SCA1)は原因遺伝子産物アタキシン1(Atxn1)におけるCAG/ポリグルタミンの異常伸長を原因とするが、その分子病態は未だ不明な点が多い。本研究計画では、Atxn1が形成する複合体を網羅的にプロテオーム解析を行い、神経変性に至る前のニューロンの機能障害に関わる複合体タンパク質を同定および定量し、SCA1病態への効果について疾患モデル系を用いて検証する。複合体を形成しているタンパク質のみを対象とする網羅的解析であることが本研究の特徴である。実施状況については、最初の標的であるAtxn1複合体タンパク質について、当初ゲルろ過クロマトグラフィーにより得られる高分子画分の定量的ショットガン・プロテオーム解析によりその候補分子を得る計画であったが、特定の画分に再現性よくAtxn1(あるいはその複合体)が分画できていない。実験条件の至適化を目指しているが現在まで達成できていない。他のクロマトグラフィーによる検討も始めているが、計画を一部修正し、細胞画分を全て解析する計画から核画分のAtxn1複合体タンパク質を得ることに集中する。更に、達成できない場合を想定し、計画修正案としてリン酸化タンパク質に標的を変更した定量的ショットガン・プロテオーム解析を平成25年度に行う。この解析法は、当研究室の別の課題で確立しており、技術的な問題点は少ないと考えている。本研究計画で得られる標的タンパク質の知見は、治療法開発において発症前あるいは発症初期の分子作用点となりうる可能性が高いと考えており、治療および予防法の開発に貢献することが最終的な目標である。ポリグルタミン病である脊髄小脳失調症I型(SCA1)は、原因遺伝子産物アタキシン1(Atxn1)におけるポリグルタミン鎖の異常伸長が原因であると考えられているが、その分子病態は未だ不明な点が多い。私たちのグループではオミックス研究より、SCA1病態に関与するタンパク質HMGB1, HPS70, Maxerなどを同定し報告してきた。本研究計画の目的は、Atxn1複合体をプロテオーム解析し、発症前の早期病態に関わる分子を同定および定量することである。

プロテオーム解析からシステムバイオロジー解析までの方法論は本年度に報告した別プロジェクトの論文で確立した(Hum Mol Genet 2015, 24, 540-558)。しかしながら、プロテーム解析を行う画分の調製としてAtxn1を含む複合体を安定的に分画する方法が確立できていない。一方で、平成25年度までにAtxn1と相互作用する分子VCP(Nat Commun 2013, 4, 1816)とRPA1(Hum Mol Genet 2014, 23, 1345-1364)についての知見が得られたので報告した。さらに最終年度には、SCA1モデルマウスを用いたHMGB1の治療効果が得られたため、HMGB1を含むatxn1複合体という観点で研究を進めたが明確な結論は得られなかったが、治療効果とその分子メカニズムを報告した(EMBO Mol Med 2015, 7, 78-101)。この中でSCA1の新な病態メカニズムとしてミトコンドリアDNA障害を報告しており、今後Atxn1複合体を検討していく上ではミトコンドリアに関わる視点を加えること必要がある。今後の計画として、発症前の早期病態に関わるリン酸化シグナルを同定することと、本計画の第一目標であった、核、細胞質、ミトコンドリアといった各細胞画分におけるAtxn1複合体タンパク質の同定と早期SCA1病態における変化について解析を進めていきたい。分子神経病理学Atxn1複合体の定量的ショットガン・プロテオーム解析と他の解析を組み合わせて複合体形成タンパク質を同定する計画であったが、現状この手法で結果が得られていないが、これに先立ち2つの知見が得られたので報告する。1.ポリグルタミン病において共通する分子病態機構を理解するために、ポリグルタミン鎖に結合するタンパク質として現在所属する研究グループが同定したTERA/VCP/p97(以下VCPと記述)に注目した。Atxn1、アタキシン-7(脊髄小脳失調症7型)、アンドロジェン受容体(球脊髄性筋萎縮症)、ハンチンチン(ハンチントン病)といった、4種類のポリグルタミン病タンパク質で検討したところ、正常型、ポリグルタミン鎖が異常伸長した変異型がともにVCPに結合した。VCPはER近傍、核、ミトコンドリアにおいて機能する多機能タンパク質で、今回の報告では主にVCPを介したDNA損傷修復機能を共通病態分子機構として明らかとした(Fujita K et al, Nature Communications 2013)。2.疾患モデルショウジョウバエを用いた遺伝学とシステム生物学を組み合わせ、SCA1のDNA損傷に重要な役割を持つタンパク質としてRpA1とChk1を報告した。SCA1モデルショウジョウバエとDNA修復関連遺伝子のショウジョウバエライブラリーを用いたスクリーニングより、パスウェイ解析し、病態ネットワークを構築し、RpA1とChk1が中心的な役割を果たしていることを推定した。さらに、免疫沈降法によりRpA1とAtxn1が直接的に結合することを示した(Barclay SS et al, Human Molecular Genetics 2014)。
バーミヤーン壁画の描き起こし図の作成とその美術史的研究

アフガニスタンのバーミヤーン遺跡群は、1979年以降の内戦の間に多大な被害を受けた。研究代表者は、破壊以前に現地調査を行って石窟の仏教壁画を研究し、現地でのスケッチに基づいて壁画の線図を作成した。これは現在も多くの研究者に利用されている。一方で、破壊後の調査を通して石窟の形態や壁画の年代に関する新たな基礎資料が得られ、さらに詳細な検討が可能となっている。本研究では、未整理・未公表のために活用されてこなかった遺跡破壊前の貴重かつ膨大な写真を活用してそれをトレースし、縮尺を入れた新たな描き起こし図を作成する。その過程で、他地域との文化交流と未だ不明な部分の多い制作年代を明らかにすることを目指す。
ヒストンリーダーの乳がん幹細胞における役割の解明と阻害剤による分化制御法の開発

ヒストン修飾を認識するタンパク質「リーダー」は、エピジェネティック情報を細胞の表現系へと変換する重要な因子である。申請者はこれまでに、ヒストンリジンメチル化のリーダー「Cdyl2」が、マウスES細胞で高発現しており、正常な分化の進行に重要であることを見いだした。また、ヒトCDYL2が、乳がんで高発現をしていること、過剰発現によって幹細胞分画が上昇するという予備的結果も得ている。本研究では、ヒトCDYL2の乳がん幹細胞における役割を明らかにすること及びその阻害によるがん幹細胞の分化制御の可能性を検討することを目的とする。当該年度では、【Aim 1:CDYL2の乳がん幹細胞における役割の解明】に関して、昨年度に明らかとしたCDYL2高発現大腸がん細胞株を用いて研究を行なった。まず、siRNAによる一過性のノックダウンと行なったところ、CD44CD133陽性がん幹細胞分画が若干減少した。そこで、CDYL2ノックアウト細胞の作製へと移行した。効率の良いノックアウトを行うために、誘導型Cas9の細胞株を作成し、CRISPR/Cas9システムを用いた。その結果、36クローン中9クローンにおいて、両アレルにおけるCDYL2遺伝子領域の欠損・CDYL2タンパクの完全な消失が観察された。それらのクローンにおいては、がん幹細胞分画が有意に減少した。また、一部のクローンに関して、外因性のCDYL2を発現させたレスキュー実験を行なったところ、がん幹細胞の分画の上昇が確認された。【Aim 3:乳がん検体を用いた発現解析と予後解析】に関しては、複数のデータベースを解析したところ、CDYL2高発現群では、全生存率が低いという結果が得られた。以上のように、乳がんおよび大腸がんにおいて、CDYL2はがん幹細胞の維持に関与していることを示された。本研究に関わる発表を、国内学会でポスター発表を行った。当該年度では、昨年度の明らかとした乳がんよりも適しているCDYL2高発現の大腸がん細胞株を用いた研究を行なった。siRNAによる一過性のノックダウンおよびCRISPR/Cas9システムを用いたノックアウト細胞株を作製し、CD44CD133陽性の幹細胞分画が有意に減少した。一部のクローンに関して、CDYL2を発現させたレスキュー実験も行い、がん幹細胞の分画の上昇を確認した。一方で、阻害剤の開発に関しては、投与濃度・細胞内への移行の解析が滞っている。以上の状況から、おおむね順調と判断した今後、当該年度の樹立されたノックアウト細胞株を用いて、がん幹細胞分画の割合への影響・薬剤感受性の変化・xenograftモデルを用いた腫瘍形成能・転移能の変化を解析する。CDYL2の標的遺伝子を同定するために、ノックアウト細胞株、過剰発現細胞株、親株を用い、CDYL2のChIP-seqによって標的領域を同定する。バルク細胞の結果から、がん幹細胞性に関わる遺伝子に着目し、FACSで単離したがん幹細胞を用いた少数細胞ChIP-qPCRを行う。がん幹細胞の維持の分子機構を明らかにするために、CDYL2過剰発現細胞株を用いて、IP-WBを行い、結合タンパクの同定も行うヒストン修飾を認識するタンパク質「リーダー」は、エピジェネティック情報を細胞の表現系へと変換する重要な因子である。当該年度では、【Aim 1:CDYL2の乳がん幹細胞における役割の解明】に関して、乳がん細胞株(MDA-MB-231およびMDA-MB-468)にCDYL2を過剰発現した細胞を用いて、発現アレイを行い、がんの浸潤や転移に関わる遺伝子群が上昇していることを明らかとした。また、CDYL2は大腸がん細胞において、乳がんに比較して10倍も高く発現しているという細胞株の結果を得た。そこで、大腸がん細胞株3株(DLD-1, HCT116, SW480)を用いて、過剰発現細胞を作製し、幹細胞分画が上昇していることを見いだした。【Aim 2:CDYL2を標的としたがん幹細胞休眠療法の検討】に関しては、Univ.of North CarolinaのDr. Jamesの開発したCDYL2の阻害剤を入手し、大腸がんへの投与を行った。以上のように、乳がんのみならず大腸がんでもCDYL2が重要であることを示すことができ、がん幹細胞への関与を一般化することが出来た。本研究に関わる発表を、国内学会でポスター発表、国際学会での口頭発表で行った。当該年度では、CDYL2の過剰発現乳がん細胞株の発現アレイを施行した。大腸がん細胞株においても、CDYL2が異常に発現していることが分かったため、大腸がんの3細胞株を用いて過剰発現細胞を作製し、幹細胞分画が上昇していることも見いだした。また、Univ.of North CarolinaのDr. Jamesの開発したCDYL2の阻害剤を入手し、大腸がんへの投与を行った。

一方で、CRISPR/Cas9システムを用いたCDYL2ノックアウト(KO)細胞株に関して、大腸がん細胞株SW620を用いてクローン化を行ったところ、クローン間での違いが検出された。そこで、バルク細胞での解析に移行する必要が生じたため、KO細胞を用いた解析は進んでいない。以上の状況から、おおむね順調と判断した。ヒストン修飾を認識するタンパク質「リーダー」は、エピジェネティック情報を細胞の表現系へと変換する重要な因子である。申請者はこれまでに、ヒストンリジンメチル化のリーダー「Cdyl2」が、マウスES細胞で高発現しており、正常な分化の進行に重要であることを見いだした。また、ヒトCDYL2が、乳がんで高発現をしていること、過剰発現によって幹細胞分画が上昇するという予備的結果も得ている。本研究では、ヒトCDYL2の乳がん幹細胞における役割を明らかにすること及びその阻害によるがん幹細胞の分化制御の可能性を検討することを目的とする。当該年度では、【Aim 1:CDYL2の乳がん幹細胞における役割の解明】に関して、昨年度に明らかとしたCDYL2高発現大腸がん細胞株を用いて研究を行なった。まず、siRNAによる一過性のノックダウンと行なったところ、CD44CD133陽性がん幹細胞分画が若干減少した。そこで、CDYL2ノックアウト細胞の作製へと移行した。効率の良いノックアウトを行うために、誘導型Cas9の細胞株を作成し、CRISPR/Cas9システムを用いた。その結果、36クローン中9クローンにおいて、両アレルにおけるCDYL2遺伝子領域の欠損・CDYL2タンパクの完全な消失が観察された。それらのクローンにおいては、がん幹細胞分画が有意に減少した。また、一部のクローンに関して、外因性のCDYL2を発現させたレスキュー実験を行なったところ、がん幹細胞の分画の上昇が確認された。【Aim 3:乳がん検体を用いた発現解析と予後解析】に関しては、複数のデータベースを解析したところ、CDYL2高発現群では、全生存率が低いという結果が得られた。以上のように、乳がんおよび大腸がんにおいて、CDYL2はがん幹細胞の維持に関与していることを示された。本研究に関わる発表を、国内学会でポスター発表を行った。当該年度では、昨年度の明らかとした乳がんよりも適しているCDYL2高発現の大腸がん細胞株を用いた研究を行なった。siRNAによる一過性のノックダウンおよびCRISPR/Cas9システムを用いたノックアウト細胞株を作製し、CD44CD133陽性の幹細胞分画が有意に減少した。一部のクローンに関して、CDYL2を発現させたレスキュー実験も行い、がん幹細胞の分画の上昇を確認した。一方で、阻害剤の開発に関しては、投与濃度・細胞内への移行の解析が滞っている。以上の状況から、おおむね順調と判断した今後、大腸がん細胞株を用いたCRISPR/Cas9システムを用いてCDYL2 KO細胞株の作製を行う。バルク細胞での解析を行う為には、KO細胞の選択が必要となるので、KOと同時に選択マーカー導入の系を確立する。樹立されたKO細胞株を用いて、がん幹細胞分画の割合への影響・薬剤感受性の変化・xenograftモデルを用いた腫瘍形成能・転移能の変化を解析する。
精密位置ぎめ装置の非線形制御に関する研究

位置決め装置の機械的機構内に存在するクーロン摩擦やバックラッシュなどの非線形特性、力や熱による寸法変化や変形などは、位置決めの精度に大きい影響をおよぼす。本研究ではこれらの要因を克服して超精密な位置決め精度を実現する制御方式の検討を以下の内容で行った。1。予備的検討ボールねじをサーボモータで駆動してテーブルを移動させる形式の既存の1軸位置決め装置を用いて、いくつかの方式の制御を試みた。その結果可変構造制御によるスライディングモード制御が有望であることが判明した。このほかフィードバック制御にパルス状操作入力を組み合わせた方式が、単純ではあるがかなり良好な成績をあげる実用的方式であることもわかった。これらはシミュレーションによっても確かめた。2。精密位置決め実験装置の計画と組み立て既存装置と構造は同一で、精度を高めた位置決め装置を組み立てた。テーブルの位置を分解能10nmの光学式リニアエンコーダで検出し、これを直接フィードバックする制御ループを構成した。3。制御方式の比較検討制御対象の数学モデルとして、3次、4次、5次の3種の状態方程式をとり、それぞれについて、状態フィードバック制御とスライディングモード制御による設計をおこない、シミュレーションと実験により制御性能を比較した。いずれの制御方式についても3次モデルでは無視した高次モードの影響、5次モデルではパラメータ推定の困難性から良好な結果が得られず、4次モデルが最良の結果を与えた。制御方式ではスライディングモード制御がより良好な制御成績を与えることが分かった。1。2。3。1.制御方式の検討(1)可変構造制御ボールネジ駆動の位置ぎめ機構の非線形特性をバックラッシュと静および動摩擦で表わしたモデル上で、シミュレーションにより種々の制御方式を比較した結果、可変構造制御のスライディングモード制御が注目すべきことが判明した。既設の実験装置による実験を加えた結果を論文にまとめた。(1993IFAC会議で発表決定)(2)パルス入力による位置ぎめ単純なフィードバック制御による位置ぎめ方式についても、その可能性の限界を追求する目的で実験的検討を行った。バックラッシュや摩擦による定常偏差、リミットサイクルの発生を取り除く方法として、パルス状操作入力による制御方式を試みた。その結果、パルスの高さおよび巾とテーブルの移動量の関係を同定し、これに従ってパルス入力を加えるコントローラを考案した。通常の線形フィードバック制御ループとの組合せにより、構造が簡単で有効な制御システムを構成できた。2.実験装置の計画と組立より精密な位置ぎめ制御方式の開発のため、新に決めた仕様に基づいた実験装置を計画した。メーカの製作作業遅延により本年度の使用に至らなかったが、既設装置にくらべ、位置ぎめ精度、計測精度、データ取り込みの容易さなどに格段の改善が得られるものと期待している。位置決め装置の機械的機構内に存在するクーロン摩擦やバックラッシュなどの非線形特性、力や熱による寸法変化や変形などは、位置決めの精度に大きな影響をおよぼす。1。2。3。いずれの制御方式にについても3次モデルでは無視した高次モードの影響、5次モデルではパラメータ推定の困難性から良好な結果が得られず、4次モデルが最良の結果を与えた。
白血病細胞の増殖における細胞増殖因子ー受容体ーシグナル伝達機構の解析

急性骨髄性白血病(AML)における白血病細胞の異常な増殖は、白血病性幹細胞によって支持されている。白血病細胞の増殖機構を解明することを目的として、白血病性幹細胞の増殖に必要な増殖因子とその作用機序を明らかにすることを研究の主眼とした。白血病性幹細胞は、メチルセルロ-ス培地あるいは液体培養系で増殖する。この増殖にはIL-3、GM-CSF、G-CSFなど顆粒球コロニ-刺激因子(CSF)が重要であることをまず明らかにした。しかし、CSFは正常の顆粒球系造血にも不可欠であり、白血病性幹細胞の増殖に決して特異的ではない。そこで次に、他の細胞増殖因子、たとえばIL-1について検討した。この結果、IL-1は白血病細胞を刺激してGM-CSFを産出させ、分泌された。GM-CSFが白血病性幹細胞の増殖を刺激する。いわゆる、autocrine growth mechanismの存在が確認された。このように、白血病性幹細胞の増殖には、多数の細胞増殖因子が直接にあるいは間接的に作用していることが明らかにされた。次に細胞増殖因子に対応する受容体を研究した。この結果、白血病細胞膜にはGM-CSF,G-CSF,IL-1に対する受容体が存在することが確認された。しかし、それらの受容体数・親和性と細胞増殖因子の刺激効果の間には必ずしも相関がみられなかった。この事実は、白血病性幹細胞の増殖が受容体レベルで統御されていないことを示唆する。しかし、この点については受容体の構造の解析を含めて今後の研究課題とした。第3に、G-CSFとGM-CSFが白血病細胞受容体と結合した後のシグナル伝達系の研究を行った。この目的にはProtein KinaseCの活性化の有無・程度を研究したが、これらCSFの作用にどのようにProtein KinaseCが関与しているかは詳細にされず、今後の研究課題とした。
初期書院造の空間構成に関する研究

日本を代表する住宅建築様式である「書院造」の初期(1617世紀)遺構の空間構成を、小壁や欄間の意匠と配置形式から分析し、併せて書院造の成立状況の仮説を提供した研究。本研究は、これまで主に平面的な情報に基づいて分析が行われていた書院造に関して、断面的な情報や室内照度などを用いて再検討を行おうとするもので、平成17年度から平成20年度にかけての4ケ年で実施する。初年度である平成17年度の研究実績は以下の通り。(1)平成17年度調査計画の策定事前に行っていた予備調査内容及びそれに基づく分析を再検討し、調査事業全体及び平成17年度の調査対象候補を決定し(京都府内に所在する36棟)、文化財修理工事報告書等を参照して事前に調査計画を具体的に策定した。(2)機器作成及び調整短時間(1室10分以内程度)に室内照度を測定するために、同時に4点(床面より100・800・1500・2200mmの高さ)の照度測定を行い、かつそのデータを瞬時に転送記録するための機器を作成した。(3)現地調査調査対象候補とした36棟のうち承諾を得た24棟に関して平成17年8月23日30日の日程で現地調査を実施し、a)書院造遺構の各部寸法計測(修理工事報告書に記載されていない分)・b)室内空間の照度計測・c)障壁画など全柱間装置の写真撮影等、を行った。(4)図面の作成現地調査の結果を用いて、a)照度分布状況を示す図の作成・b)障壁画などの柱間装置の状況がわかる展開図の作成、を行った。本研究は、これまで平面的な情報に基づいて行われてきた書院造の遺構に関して、断画的な情報や障壁画の画題あるいは室内照度などを用いて再検討を行おうとするもので、平成17年度から平成20年度の4ヶ年で実施する。第2年度にあたる平成18年度の研究実績は以下の通り。(1)平成18年度調査計画の策定調査対象を決定し、文化財建造物修理工事報告書等を参照して事前に調査計画を策定した。(2)調査調査日及び調査対象は以下の通り(全15棟)8月28日:正法寺(京都府)大方丈/8月29日:西本願寺(京都市)対面所・白書院・飛雲閣/8月30日:金地院(京都市)方丈、四天王寺(大阪市)本坊方丈/8月31日:岡寺(奈良県)書院、長岳寺(奈良県)庫裏/9月1日:当麻寺(奈良県)奥院・中ノ坊書院、観心寺(大阪府)書院、金剛寺(大阪府)摩尼院書院/2月14日:有楽苑(岐阜県)旧正伝院書院・如庵/2月15日:曼荼羅寺(岐阜県)書院(3)図面の作成現地調査の結果を用いて、照度分布状況を示す図面、及び障壁画などの柱間装置の詳細を示す図面、を作成した。成果の公表を見合わせる必要がある場合は、その理由及び差し控え期間等を記入した調書(A4判縦長横書1枚)を添付寸ること。本研究は、これまで平面的な情報に基づいて行われてきた書院造の遺構に関して、断面的な情報や障壁画の画題あるいは室内照度などを用いて再検討を行おうとするもので、平成17年度から平成20年度の4ケ年で実施する。第3年度にあたる平成19年度の研究実績は以下の通り。(1)平成19年度調査計画の策定調査対象を決定し、文化財建造物修理工事報告書等を参照して事前に調査計画を策定した。(2)調査調査日及び調査対象は以下の通り(全棟)8月20日:瑞龍寺法堂(富山県高岡市)・瑞龍寺大茶堂(登米県高岡市)/8月21日:勝興寺大広間(富山県高岡市)・勝興寺書院及び奥書院(富山県高岡市)/8月22日:妙成寺書院(石川県羽咋市)・妙成寺庫裏(石川県羽咋市)/8月24日:那谷寺書院・庫裏(石川県小松市)・江沼神社長流亭(石川県加賀市)/8月25日:大通寺広間(滋賀県長浜市)・大通寺客室(滋賀県長浜市)/2月14日:臨済寺本堂(静岡県静岡市)(3)調査結果の取りまとめ現地調査の結果を取りまとめ、平成20年度に必要な補足調査の方針を策定した。本研究は、これまで平面的な情報に基づいて行われてきた書院造の遺構に関して、欄間や小壁の意匠などの断面的な情報や障壁画の画題あるいは室内照度などを用いて再検討を行おうとするもので、平成17年度から平成20年度の4ヶ年で実施する。最終年度にあたる平成20年度の研究実績は以下の通り。(1)平成20年度調査計画の策定平成19年度以前に実施した調査を元に、補足調査の対象を決定し、文化財建造物修理工事報告書等を参照して事前に調査計画を策定した。(2)調査7月23日に宮城県松島町の瑞巌寺本堂の調査を実行した。(3)調査結果の分析

平成1720年度に現地調査を行った45棟の初期書院造遺構について、その空間構成を明示するための作図を行い、それを基に分析を行った。(4)研究成果報告書の作成調査内容及び分析結果をまとめた報告書を作成し、印刷製本の上、研究機関等に配布した。
複数無線チャネルを用いた車両間配信手法

本研究課題では,VANET(Vehicular Ad-hoc NETwork)における複数無線チャネルを用いたデータ配信手法を提案する.提案手法では,道路を無線電波の到達距離ごとの領域(以後,セルと呼ぶ)に分け,互いに干渉しない複数のチャネルを各セルに順番に割り当てる.各車両は所属するセルのチャネルを使用して通信し,ネットワーク全体では複数のチャネルを同時に並行して使用することで,パケットの衝突を軽減し,スループットの改善を図る.これにより,連続したメッセージの送受信を可能にし,大容量データの配信を実現する.応募計画に挙げた(a)-(c)三項目について研究を行い、概ね計画目標を達成しました。(a)道路の分割とチャネル割り当ての考案:4チャネルを用いた道路分割は応募段階でほぼ成功したが、4チャネルが利用可能なのは11bの一部古い仕様だけであり、3チャネルでの分割が必要である。そこで、4チャネル割り当て法を完成する上、往復車線に異なるチャネルを割り当てる際、一セルのサイズを上限の200mとし、左右のセルを半セル分ずらす方式を取った。この場合、高々3チャネルで全セルの色分けが可能になり、同じチャネルを利用するセルも100m離れるため、ほぼ干渉が起きないことが保証される。(b)道路分割自動化プログラムの作成: 4チャネルを利用した自動化プログラムの作成が成功しました。道路を有向グラフとして扱い、頂点(交差点)間のグラフに対し、100200mのサイズで数等分して順番にチャネルを割り当て、頂点にサイズ100mのセルを設け、隣接しないチャネルを割り当てればよい。道路分割自動化プログラムで地図を分割する上、手動でチャネル数を減らしたり、セルを修正するなどの工夫をする。(c)セル内送信権決定アルゴリズムの考案:セルの中一定距離おきに、バーチャルな線を引き、送信権獲得線と呼ぶ。GPS搭載車両はこの線に到達する瞬間、送信権を得たとし、同じチャネル内に他の送信電波を感知しなければ、送信(ブロードキャスト)を開始する。送信権の長さは、車両速度に比例する。送信権が尽きれば、次の送信権獲得線に到着するまで送信できない。車両密度が低ければ、車両の速度が速いと考えられる。この場合、車両は長い送信権を獲得し、データを連続的に送信できる。一方、車両密度が高ければ、車両の速度が遅いと考えられ、短い送信時間しか得られない。車両間通信技術の多くは無線LANを通信手段として利用するため、隠れ端末による混信問題や、対向車両間の通信スループットが極端に低い問題を抱えている。本応募課題で複数チャネルを用いた配信プロトコルを提案する。目標は(1)混信軽減、(2)対向車両間通信、(3)通信スループット向上、(4)送信権公平性保証、の四点とする。IEEE 802.11gは干渉しない3または4つのチャネルが利用可能であるため、単一チャネルのみを利用する場合と比べて混信の影響が軽減され、大容量の通信が期待できる。提案手法では、各交差点と交差点間をつなぐ道路を無線電波が到達可能な大きさの領域(セルと呼ぶ)に区切り、隣り合うセルとの電波干渉を考慮して各セルにチャネルを割り当てる。各車両はGPSにより自身の正確な位置情報を取得して、自身が所属するセルを把握し、それぞれのセルに割り当てられたチャネルを利用することで、チャネル競合に伴う輻輳の発生を抑えることができる。また、データ通信はブロードキャストを用いて行うことで、コネクションが不要となり、車両の高速移動に対応可能である一方、セルは無線電波到達範囲に収まるサイズであるため、隠れ端末問題が発生しにくい。さらに、各車両には帯域へのアクセス待機時間に比例した優先度が設定されるため、車両数が変動した場合においても公平に送信権が得られる。動画像広告用のビデオクリップを数種類生成し、車両ネットワークへ流布した場合の性能について評価した。提案手法は他の手法と比べて車両密度が高い混雑した状況下でも高いスループット能力を持つことを確認した。各車両が取得できたビデオクリップ数についても、提案手法は多くのビデオクリップを高い完成度で取得できていることを確認した。関連する研究業績として、スタートアップ期間中に、ジャーナル論文2本、国際会議論文1本を上げた。本研究課題では,VANET(Vehicular Ad-hoc NETwork)における複数無線チャネルを用いたデータ配信手法を提案する.提案手法では,道路を無線電波の到達距離ごとの領域(以後,セルと呼ぶ)に分け,互いに干渉しない複数のチャネルを各セルに順番に割り当てる.各車両は所属するセルのチャネルを使用して通信し,ネットワーク全体では複数のチャネルを同時に並行して使用することで,パケットの衝突を軽減し,スループットの改善を図る.これにより,連続したメッセージの送受信を可能にし,大容量データの配信を実現する.平成26年度の目標である3項目(a)道路の分割とチャネル割り当ての考案、(b)道路分割自動化プログラムの作成、(c)セル内送信権決定アルゴリズムの考案、応募時からすでにアルゴリズムを考慮し始めたため、サーベイ、考案と試行錯誤に十分な時間があった。また、手法開発する傍ら、計算機シミュレーションにも取り組み、送信権獲得線の位置決定など、初歩的な性能評価も行ってきた。27年度が最終年度であるため、記入しない。高度交通システム応募計画のとおり、以下の三項目について、取り組む方針である。(d)シミュレータ上でシミュレーション実験:前年度に設計したアルゴリズムを計算機シミュレーションで検証し、単一チャネルを利用して送信する場合と比較し、スループットの変化を測る。また、通常の無線LANと比較し、通信成功率を評価する。シミュレーションの結果を利用してアルゴリズムをチューニングする。

現在、すでに自作のシミュレータ上で初歩的な性能評価が行えるようになった。今後、Scenargieシミュレータへの実装を試みる。(e)疑似実機実験:提案手法を市販の無線LAN機器に実装する場合、一部ハードウエアを改造する必要の可能性があり、本応募課題の期間内に完了しない恐れがある。その代替案として、ZigBee通信方式を使うXBeeセンサーを通信部とし、iPadを演算部とするシステムを作り、車両を疑似して実機実験を行い、通信の効果を裏付ける。(f)研究総括と成果発表:シミュレーションから結果が得られた段階から、国内研究会で途中成果を報告する。実機実験の結果を持ち国際会議とジャーナル論文に投稿する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
新規脂質輸送タンパク質Sec14L3の機能解析

本研究は呼吸に必須の生理活性物質である肺サーファクタントの輸送、分泌、リサイクルのメカニズムを明らかにする事を目的として行った。我々は、肺に高発現し肺胞中に分泌される脂質輸送ドメインを有する機能未知のタンパク質であるSec14L3に着目しその機能を解析した。解析の結果Sec14L3は肺サーファクタント脂質の輸送に関与しないが、肺の炎症を制御する可能性が示唆された。肺サーファクタントはリン脂質を主成分とする、呼吸に必須の物質である。肺サーファクタントリン脂質は肺胞腔中に分泌された後、肺胞上皮細胞によりリサイクルされる事が知られているが、そのメカニズムは不明である。本研究は、肺サーファクタントリン脂質輸送およびリサイクルの分子機構の解明を目的とし、その候補分子であSec14L3の機能解析を行うものである。Sec14L3は肺および細気管支の上皮細胞に高発現し、肺胞腔中に分泌される機能未知タンパク質であり、酵母から保存されているリン脂質結合ドメインであるSec14ドメインを有している。平成26年度は以下の成果を得た。1、Sec14L3およびSec14L4二重欠損マウスの作出;Sec14L3欠損マウスの肺サーファクタントリン脂質量と組成を野生型マウスと比較したところ大きな差が認められなかった。本研究の解析により、Sec14L3と高い相同性を有するSec14L4もまた肺において高発現し、Sec14L3と同様に肺胞腔中に分泌される事が明らかになったため、Sec14L4がSec14L3の機能を代償している可能性が示唆された。そこで、Sec14L3/Sec14L4二重欠損マウスを作出した。2、Sec14L3の肺における発現解析;当研究室が保有しているSec14L3抗体を用いてマウス肺を用いた免疫組織染色を行ったところ、Sec14L3は気管支、細気管支の繊毛上皮細胞、肺胞1型および2型上皮細胞に発現が認められた。3、Sec14L3の急性肺障害における発現変動;グラム陰性菌の持つ内毒素であるリポ多糖をマウスの期間内に投与する事で、急性の肺障害を引き起こしたところ、Sec14L3の発現が抑制される事が明らかとなった。肺サーファクタントはリン脂質を主成分とする呼吸に必須の生理活性物質であり、肺を虚脱から守る他、免疫応答にも関与し宿主防御にも重要である事が知られている。しかしながらその輸送やリサイクリングの分子機構には不明な点が多い。そこで本研究では、肺に高発現し脂質結合ドメインを有する機能未知タンパク質であるSec14L3の肺サーファクタント脂質リモデリングにおける寄与を明らかにする事を目的とした。平成28年度は以下の結果を得た。Sec14L3/L4二重欠損マウスの気管支肺胞洗浄液中のリン脂質組成を解析したところ、野生型との間に肺サーファクタント脂質の量や組成の違いはみられなかった。また、Sec14L3/L4二重欠損マウスの呼吸機能は一見正常であったため、次にグラム陰性菌の持つ内毒素であるリポ多糖を気管内に投与することによる急性の肺障害モデルを行った。結果、二重欠損マウスにおいて、いくつかの炎症性のサイトカイン類が野生型よりも強く誘導されていた。これらの結果からSec14L3/L4は定常状態の肺においては必須ではないが、肺の炎症の制御等に関与している可能性が示唆された。また、精製Sec14L3やSec14L3安定発現細胞を用いて、Sec14L3のリガンドとなる脂質の同定を試みた。Sec14L3がリン脂質の中で特にPhosphatidylinositol phosphates(PIPs)と結合する事が明らかとなったが、実際に輸送するリガンド脂質については明らかにする事が出来なかった。PCRおよびウエスタンブロット解析の結果、Sec14L3と高い相同性(アミノ酸配列で約80%)を示すSec14L4もまた、肺に高発現し肺胞腔中に分泌される事が明らかとなった為、Sec14L3単独欠損マウスの解析を行う予定であったが、Sec14L3/Sec14L4の二重欠損マウスを作成し解析する事とした。そのため、マウスを用いた実験が計画よりやや遅れている。脂質生物学現在作成中である、Sec14L3/Sec14L4二重欠損マウスを用いた表現系解析により、Sec14L3およびSec14L4の肺における機能を解析する。Sec14L3/Sec14L4はどちらも肺胞腔中に分泌されるが、結合する脂質リガンドが不明のため、二重欠損マウスの気管支肺胞洗浄液中のリピドミクス解析を行う事により脂質リガンドの同定を行う。また、マウスのみではなく、リコンビナントSec14L3の精製タンパク質やCell lineでの過剰発現なども併せて用いる事により、脂質リガンドの同定を試みる。

また、Sec14L3およびSec14L4はインフルエンザ感染や喘息などにより、その発現が減少する事が報告されているため、二重欠損マウスでの感染実験や肺障害実験を行う事により、病態時におけるSec14L3およびSec14L4の機能を明らかにする。
歯周病原性細菌コンソーシア形成機構の解析

本研究では歯周病原性菌病原性解析を目的とし、細菌間の相互作用を解析した。慢性歯周炎病巣から分離されるP. gingivalisとT. denticola間では、Hgp44により共凝集することが明らかになった。増殖においては、F. nucleatumとPrevotella intermedia、C. ochracea, P. gingivalis等の間にバイオフィルム形成促進が認められた。さらにF. nucleatumとP. gingivalisの組み合わせにおいては、増殖のみならずヒト歯肉上皮細胞侵入性の上昇が認められた。これらの結果は、歯周病原性菌がコンソーシアを形成することによりデンタルプラーク中で優位となり、病原性を発揮していることが示唆された。歯周病原性菌のpolymicrobial infectionの解析を目的とし、根尖性歯周組織炎中から細菌を分離し、その成立に関わる細菌の組成を解析した。根尖部から分離された細菌の主要なものは、Fosobacterium nucleatum, Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidisであった。これらの菌の組み合わせによるバイオフィルム形成促進作用を解析すると、F.nucleatumとPorphyromonas gingivalisとの間にバイオフィルム形成促進作用が認められた。Two compartment systemを用いて解析すると、この作用は、P.gingivalis由来の可溶性mediatorによると考えられた。さらにこの2菌種を用い、ヒト歯肉上皮細胞への感染実験を行った。P.gingivalisのヒト歯肉上皮細胞への侵入性は、単独感染の場合に比べて、F.nucleatumとの混合感染の場合に著明な上昇が見られた。これらの菌種間の共凝集を阻害するgalactoseによってその侵入性が25%程度抑制を受けたことより、細菌間の共凝集がこの侵入性に一部関与していると考えられた。さらにF.nucleatumの侵入阻害性を有しP.gingivalis侵入を抑制しないcyclohexiamideが混合感染時のP.gingivalisの侵入が強く抑制したことから、P.gingivalisの侵入にF.nucleatumと細胞との間の相互作用が重要な役割を果たしていると考えられた。これらの結果は、polymicrobial infectionが歯周病原性菌の病原性発揮に重要な役割を果たすことを示唆している。Porphyromonas Treponema denticola、T.forsythiaの3菌種は慢性歯周炎歯周炎病巣から高頻度に分離されるためred complexと呼ばれている。これらの菌による歯肉溝内でのコンソーシア形成は歯局炎の発症に重要な役割を果たす。本研究では、このメカニズムを明らかにする目的でred complexのうちP. gingivlis、T.denticolaに焦点を当て解析を行った。P.gingivalisとT.dnticolaの共凝集のメカニズム解析では、P.gingivalisのタンパク分解酵素であるarg-gingipainA, arg-gingipainB, lys-gingipainを欠損させると共凝集反応が消失した。P.gingivalisの線毛の欠損株によっては共凝集は影響を受けなかった。さらにarg-gingipainA, lys-gingipain, hagAの欠損株によっても共凝集活性が認められなかった。この3つのタンパクに共通のドメインとして認められるHGP44に注目し、HGP44のcopy数と共凝集活性について欠損株を用いて比較すると、HGP44の数の減少とともに共凝集反応が弱くなっていた。これらの結果から、HGP44は、P.gingivalisとT.denticolaの共凝集の主要なligandとして機能し、歯周病原菌によるコンソーシア形成に重要な役割を果たすことが明らかになった。さらに歯肉溝内でのコンソーシア形成には病原体と宿主間のcross talkが重要な働きを果たす。P.gingivalisと宿主の間のcross talkについて歯肉溝滲出液中でストレスに伴って変動するnoradrenalineが、P.gingivalisの増殖に与える影響について解析した結果では、noradrenallneによって、P.gingivalisの増殖速度の低下と病原性因子であるarg-gingipain産生の上昇が認められ、宿主のストレスに対する応答が歯周病原細菌の病原性に影響を与えていること明らかにできた。背景:特定の嫌気性グラム陰性菌種からなるバイオフィルムは、歯周病の発症と進行に関与している。歯周病原性菌は歯周病原性バイオフィルムないでコンソーシアを形成し、その形成をコントロールしている考えられるため、本研究では歯周病原性菌における細菌間相互作用について解析を行った。研究成績:F. nucleatumは、P. intermedia, P. nigrescensおよびC. ochraceaとの間に共凝集性が認められた。F. nucleatumとP. intermedia及びP. nigrescensの共凝集は、P. intermediaとP. nigrescensの加熱により失われた。

これとは対照的にF. nucleatumとC. ochraceaの共凝集は、F. nucleatumの加熱により失われた。F. nucleatumとP. intermediaあるいはP. nigrescensとの共培養では、それぞれの単独培養に比べバイオフィルム形成が有意に上昇した。しかし、P. intermediaまたはP. nigrescensの培養上清を加えても、F. nucleatumのバイオフィルム形成促進は認められなかった。さらにAI-2産生は供試菌株全てに認められたが、バイオフィルム形成能とは関連しなかった。C. ochraceaとF. nucleatumの共培養ではそれぞれの単独培養に比べバイオフィルム形成が上昇した。さらにC. ochraceaの培養上清を加えてF. nucleatumを培養すると、バイオフィルム形成能の上昇が認められた。これらの結果から、バイオフィルム中のグラム陰性桿菌には、共凝集による物理的な定着手段に加え、バイオフィルム内での優位性を確保するために細菌間相互作用によりそのバイオフィルム形成能を増加させていると考えられる。
JVSマウスを用いたミトコンドリア数の増生に係わる新規蛋白質因子の解析

研究では,ミトコンドリア数が劇的に増加増殖(増生)している全身性カルニチン欠乏マウスであるJVSマウスの心筋細胞に着目し,ミトコンドリアの増生に係わる分裂と融合に関わる蛋白質複合体を解明することを研究目的として,以下の研究成果を得た.1)JVSマウス心筋ミトコンドリアの酸化的リン酸化系の異常性心筋ミトコンドリアのstate3の、呼吸活性は,JVSマウスは対照マウスと比べると,グルタミン酸系,コハク酸ともに減少していた.また,呼吸鎖複合体の各種シトクロム含量は,シトクロムa+a3,シトクロムb,シトクロムc+c1とも,に減少していた.ATP-Pi交換活性はJVSマウスでは対照マウスの約1/3に減少していたが,驚くことに,ATPase活性は逆に約2倍に増加していた.2)Differential Display法によるミトコンドリアが劇的に増生しているJVSマウスの心臓からのミトコンドリアのバイオジェネシスに関わる遺伝子の単離JVSマウスの心筋細胞で発現しているmRNAと正常マウスでのmRNAとの差をDifferentiai Display法を用いて調べたところ,JVSマウスの心筋細胞で特異的に発現している6種の未知遺伝子を発見した.これらの塩基配列について,Genomnetの最新のデータベースでサーチしたが,同一のものは見出されず,新規の遺伝子断片であることが判明した.3)Thymidine double block法によるHeLa細胞の細胞周期の同調培養とミトコンドリアの形態変化の観察ミトコンドリア移行シグナルを付加した蛍光蛋白ベクターpDsRed-Mitoを5070%の高効率で各種動物細胞にトランスフェクションさせる実験条件を確立させ,ついでThymidine double bloc法によるHeLa細胞の細胞周期の同調培養に成功,細胞周期によりミトコンドリアの形態がどのように変化しているかについて,FACSとCCD蛍光顕微鏡を用い,世界に先駆けて観察に成功した.研究では,ミトコンドリア数が劇的に増加増殖(増生)している全身性カルニチン欠乏マウスであるJVSマウスの心筋細胞に着目し,ミトコンドリアの増生に係わる分裂と融合に関わる蛋白質複合体を解明することを研究目的として,以下の研究成果を得た.1)JVSマウス心筋ミトコンドリアの酸化的リン酸化系の異常性心筋ミトコンドリアのstate3の、呼吸活性は,JVSマウスは対照マウスと比べると,グルタミン酸系,コハク酸ともに減少していた.また,呼吸鎖複合体の各種シトクロム含量は,シトクロムa+a3,シトクロムb,シトクロムc+c1とも,に減少していた.ATP-Pi交換活性はJVSマウスでは対照マウスの約1/3に減少していたが,驚くことに,ATPase活性は逆に約2倍に増加していた.2)Differential Display法によるミトコンドリアが劇的に増生しているJVSマウスの心臓からのミトコンドリアのバイオジェネシスに関わる遺伝子の単離JVSマウスの心筋細胞で発現しているmRNAと正常マウスでのmRNAとの差をDifferentiai Display法を用いて調べたところ,JVSマウスの心筋細胞で特異的に発現している6種の未知遺伝子を発見した.これらの塩基配列について,Genomnetの最新のデータベースでサーチしたが,同一のものは見出されず,新規の遺伝子断片であることが判明した.3)Thymidine double block法によるHeLa細胞の細胞周期の同調培養とミトコンドリアの形態変化の観察ミトコンドリア移行シグナルを付加した蛍光蛋白ベクターpDsRed-Mitoを5070%の高効率で各種動物細胞にトランスフェクションさせる実験条件を確立させ,ついでThymidine double bloc法によるHeLa細胞の細胞周期の同調培養に成功,細胞周期によりミトコンドリアの形態がどのように変化しているかについて,FACSとCCD蛍光顕微鏡を用い,世界に先駆けて観察に成功した.申請者らは、心筋細胞においてミトコンドリア数が劇的に増加しているJVSマウスを用いて,これまでにJVSマウス心筋ミトコンドリアでは,呼吸活性,各種チトクローム含量,ATP-Pi交換活性が正常マウスに比べ低下(3070%)していること,ATPase活性は逆に約2倍に増加していること,H^+-ATP合成酵素のサブユニットの発現量は(c(P1),c(P2),e,IF1,βについてはmRNAレベル,αサブユニットとcoupling factor6についてはタンパクレベル),JVSマウスと正常マウスとで差がないことを明らかにし,JVSマウスの心筋細胞では機能的に不完全なミトコンドリアが増生していることを明らかにしている.本研究では,ミトコンドリアの分裂・増殖機構を解明するために,蛍光Differential Display法によりミトコンドリア数の増生に関わる新規蛋白質因子の遺伝子の単離を試みた.その結果,ミトコンドリア数の増生に関与する可能性のある9種のcDNA断片を得ることに成功した.それらのcDNAの塩基配列を決定し,ホモロジーサーチを行なったところ,3つの遺伝子断片については既知の遺伝子であり,その他の6種については,新規の遺伝子であることが明らかになった.現在,6種の遺伝子の完全長cDNAクローニングを行なっているところである.また,今回単離した遺伝子産物の生理機能を調べるために,ミトコンドリア輸送シグナルペプチドを融合させた蛍光タンパク発現ベクターを培養細胞にトランスフェクションして,生細胞中におけるミトコンドリアの動的変化をタイムラプスデコンボリューションCCD蛍光顕微鏡下で直接観察できるシステムを開発した.

今後,このシステムを用いてミトコンドリア数の増生に関わる因子を明らかにしていきたい.本研究では,ミトコンドリア数が劇的に増加増殖(増生)している全身性カルニチン欠乏マウスであるJVSマウス(juvenile visceral steatosis mouse)の心筋細胞に着目し,ミトコンドリアの増生に係わる分裂と融合に関わる蛋白質複合体を解明することを研究目的として,以下の研究成果を得た.JVSマウスの心筋細胞で発現しているmRNAと正常マウスでのmRNAとの差をDifferential Display法を用いて調べたところ,JVSマウスの心筋細胞で特異的に発現している697,480,351,663,442,630bpsの6種の未知遺伝子(部分的なcDNA)を発見した.これらの塩基配列について,Genomnetの最新のデータベースでサーチしたが,同一のものは見出されず,新規の遺伝子断片であることが判明した.ミトコンドリア移行シグナルを付加した蛍光蛋白ベクターpDsRed-Mit oを5070%の高効率で各種動物細胞にトランスフェクションさせる実験条件を確立させ,ついでThymidine double block法によるHeLa細胞の細胞周期の同調培養に成功,細胞周期によりミトコンドリアの形態がどのように変化しているかについて,FACSとタイムラプスデコンボルーションCCD蛍光顕微鏡を用い,世界に先駆けて観察に成功した.
細胞外ATPによる容量性カルシウム流入抑制機構の解明

容量性Ca^<2+>流入は,アゴニストによるイノシトールリン脂質代謝の活性化によって遊離されたIP_3が小胞体からCa^<2+>を放出させた後,枯渇した小胞体を充填するために起こる細胞外からのCa^<2+>流入である.このCa^<2+>流入機構は現在多くの細胞で報告されており,特に非興奮性細胞における主要なCa^<2+>動員経路として知られている.本研究者は,今までにラット単離褐色脂肪細胞において細胞外ATPが小胞体膜のCa^<2+>ポンプ阻害剤であるタプシガルジンによって誘導される容量性Ca^<2+>流入を完全に抑制することを報告してきた.本研究では,この抑制機構についてに検討を行い,以下の結果を得た.2.P2受容体阻害剤であるスラミン及びPPADSはATPによる一過性の細胞内Ca^<2+>濃度上昇作用と容量性Ca^<2+>流入抑制を濃度依存的に阻害した.3.ATPを細胞に与えると,細胞骨格のアクチンフィラメントは細胞膜周囲に殻のように重合し,ところどころ厚く重合した部分が見られるため細胞の形状が変化しているのが観察された.4.タプシガルジン単独ではアクチンフィラメントの分布に変化はなかったが,タプシガルジンで処理した後にATPを与えるとアクチンの細胞膜周囲への再重合が観察された.5.P2受容体阻害剤は,ATPによるアクチンフィラメントの細胞周囲への再重合を抑制した.6.アクチンの脱重合剤であるサイトカラシンDで細胞を処理すると,ATPによるアクチンの再重合は見られなかった.またサイトカラシンD処理の細胞ではATPによる容量性Ca^<2+>流入阻害は見られなかった.以上のことより,細胞外ATPはP2受容体を介してアクチンフィラメントの細胞膜周囲への再重合を促進し,膜に厚く重合したアクチン蛋白がCa^<2+>流入を抑制する可能性があることが示唆された.容量性Ca^<2+>流入は,アゴニストによるイノシトールリン脂質代謝の活性化によって遊離されたIP_3が小胞体からCa^<2+>を放出させた後,枯渇した小胞体を充填するために起こる細胞外からのCa^<2+>流入である.このCa^<2+>流入機構は現在多くの細胞で報告されており,特に非興奮性細胞における主要なCa^<2+>動員経路として知られている.本研究者は,今までにラット単離褐色脂肪細胞において細胞外ATPが小胞体膜のCa^<2+>ポンプ阻害剤であるタプシガルジンによって誘導される容量性Ca^<2+>流入を完全に抑制することを報告してきた.本研究では,この抑制機構についてに検討を行い,以下の結果を得た.2.P2受容体阻害剤であるスラミン及びPPADSはATPによる一過性の細胞内Ca^<2+>濃度上昇作用と容量性Ca^<2+>流入抑制を濃度依存的に阻害した.3.ATPを細胞に与えると,細胞骨格のアクチンフィラメントは細胞膜周囲に殻のように重合し,ところどころ厚く重合した部分が見られるため細胞の形状が変化しているのが観察された.4.タプシガルジン単独ではアクチンフィラメントの分布に変化はなかったが,タプシガルジンで処理した後にATPを与えるとアクチンの細胞膜周囲への再重合が観察された.5.P2受容体阻害剤は,ATPによるアクチンフィラメントの細胞周囲への再重合を抑制した.6.アクチンの脱重合剤であるサイトカラシンDで細胞を処理すると,ATPによるアクチンの再重合は見られなかった.またサイトカラシンD処理の細胞ではATPによる容量性Ca^<2+>流入阻害は見られなかった.以上のことより,細胞外ATPはP2受容体を介してアクチンフィラメントの細胞膜周囲への再重合を促進し,膜に厚く重合したアクチン蛋白がCa^<2+>流入を抑制する可能性があることが示唆された.G蛋白連関型受容体やチロシンキナーゼ型受容体の活性化により惹起されるイノシトールリン脂質応答によってIP_3が遊離され,小胞体からCa^<2+>が放出される.この小胞体の枯渇によって細胞膜のCa^<2+>チャネルが開き,細胞外Ca^<2+>が流入(容量性Ca^<2+>流入)する現象は現在多くの細胞で報告されている.本研究者は,ラット単離褐色脂肪細胞において,細胞外ATPは小胞体膜のCa^<2+>ポンプ阻害剤であるタプシガルジンによって誘導される容量性Ca^<2+>流入を完全に抑制することを報告してきた.今年度,この抑制機構について検討を行い,以下の結果を得た.実験は,Ca^<2+>蛍光指示薬を取り込ませた細胞を用いて細胞内Ca^<2+>濃度変化を記録し,解析した.3)P2受容体の特異的阻害剤であるスラミンはATPによる一過性の細胞内Ca^<2+>濃度上昇作用と容量性Ca^<2+>流入抑制を濃度依存的に阻害した.4)もう一種類のP2受容体の特異的阻害剤であるPPADSはATPによる一過性の細胞内Ca^<2+>濃度上昇阻害と容量性Ca^<2+>