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日本における相互扶助の経済思想の現代史的意義に関する研究

次に、フィールドワークとして、秋田県仙北郡神代村柏林集落(現・仙北市田沢湖神代)に形成された「キリスト教村」(キリスト教信仰に基づく共同体)について、文献調査・資料収集及び現地における聞き取り調査を行った。ここは、賀川豊彦の農民福音運動に感化された人物をリーダーにして戦後満州からの引き揚げ者たちにより開拓されたところで、現在も住民のほぼ全員がキリスト教信仰を守っている地域である。この調査については、今後論文にまとめ、公表する予定である。また、第1年度の研究成果を踏まえ、賀川豊彦の農民福音運動に基づいて昭和初期に展開した岩手県の「三愛塾」の活動と宮澤賢治(1896-1933)の協同組合構想(作品「ポラーノの広場」)との繋がりを指摘した論文を公表した。日本における相互扶助の経済思想及び協同組合に関する文献・資料の読解・分析では、平成28年度に集中的に収集した岩手県を中心とする昭和前期の東北地方に関する文献・資料について精力的に取り組むことが出来た。そのなかで、従来、その思想的親近性が指摘されていた宮澤賢治の協同組合構想と賀川豊彦の協同組合構想との繋がりについて、岩手県の花巻教会、一関教会及び宮城県の塩釜教会に関わる人たちの密度の濃い交流のなかに位置付けて把握することが可能であることを、資料的裏付けをもってほぼ論証できることを明らかにした。このことについては、さしあたりまず、論文「賀川豊彦と宮澤賢治ー新しい人づくり・新しい村づくりー」(『愛媛経済論集』37/1、p.69-95)で発表した。この見解については十分に論証できていない部分もあるので、今後さらに補強を加えていくこととしている。また、フィールドワークでは、岩手県摺沢地区の農村更生運動に関する現地調査から得た情報に基づいて、秋田県田沢湖地区の農村調査を行った。戦後開拓期に入植が進んだ旧神代村柏林に住民全員がキリスト教信者であるという現代の日本においてはきわめて珍しい地区があり、現地で聞き取り調査を行った。ここでは戦前期に賀川豊彦の薫陶を受けて相互扶助思想にもとづく農村建設を目指した人物の働きがあったことがわかり、それに関する資料・文献等を収集した。この秋田県柏林地区でのフィールドワークの成果については、まだまとめられていないが、平成30年度中に口頭発表を行い、その後に論文化する計画で資料の読解、考察を進めた。以上のことから、現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると評価する。本研究は、近代日本における相互扶助の思想と、そこから具体的に構想された生活改善のための社会運動や事業活動に着目し、それらの歴史的経験が現代の思想状況の形成にいかに寄与しているかを解明することを目的として、平成28年度より5ヶ年計画で進めているものである。第3年度の平成30年度は、1まず、平成29年度に行った賀川豊彦(1888ー1960)の生活協同論の整理作業をまとめ、賀川豊彦記念松沢資料館の監修を受け、松野尾裕編『希望の経済ー賀川豊彦生活協同論集』(緑蔭書房、平成30年7月)を刊行した。また同書の刊行に関連して、『生活協同組合研究』平成30年11月号に論文「賀川豊彦ー希望の経済」を寄稿し、また『家の光』平成30年11月号にインタビュー記事「今こそ協同組合の底力」が掲載された。2次に、賀川豊彦が在野における厚生経済論者であったとすれば、アカデミズムにおける厚生経済論の開拓者であった福田徳三(1874ー1930)に関し、平成30年6月2日開催の経済学史学会第82回全国大会においてセッション「復活する福田徳三の経済思想」を行い、コメンテーターを務めた。福田
深海遠洋性チャ-トに含まれる遠洋粘土鉱物の堆積化学的研究

沖縄本島の本部帯、及び伊江島、伊是名島においてチャ-ト層のサンプリングを行い、また北海道においては、遠洋性と思われるチャ-トのサンプリングを行い、172個のチャ-ト及び関連堆積岩の分析を行なった。この結果、地球化学的に遠洋性と半遠洋性チャ-トの特徴が見い出され、ある程度の識別方法が確立出来た。遠洋性チャ-トはHyaloclastiteなどの基盤火成岩接触部などを除くと、FeとMgの間に強い正の相関関係が成立し、かつそのプロットは0点を通る連続的線上に分布する。FeとK間の相関も遠洋性チャ-トには見られるがMgとの相関はさらにそれよりも強いものである。これに対して半遠洋性チャ-トにおけるFeとMg間の相関は弱いものとなる特徴がある。Fe/Mg比は一般に現在の北太平洋表層付近の遠洋性粘土よりも23倍比高い値になり、主にジュラ紀から白亜紀にかけての遠洋性チャ-トのFe/Mg比は、現在の大西洋の中央海嶺付近の遠洋性粘土の比に近い値になる。遠洋性チャ-トは、層序的に、単一岩相で、厚く薄層の赤色チャ-トが堆積している事で特徴ずけられる。またCCD以浅の遠洋の海山上の遠洋炭酸塩中にノジュ-ルとして産出するフリントも陸上に露出しているのが発見された。沖縄本島周辺域では、遠洋性チャ-トと考えられるものは、伊江島のタッチュ-に露出している赤色チャ-トのみで、他のチャ-ト層はすべて半遠洋性起源である事が判明した。陸上に露出しているCCD以深、以浅を問わず、遠洋性チャ-トの層序は、現海洋の深海底における遠洋性チャ-トの層序に良く対比する事が出来、地質時代の過去にも現在のような深海底が存在し、日本列島下にもぐり込んだ遠洋性チャ-トの一部は、日本列島上まで露出してきた地史が解る。初年度はサンプリングに重点を置き、沖縄本島や北海道において調査を行った。沖縄本島の本部帯や伊江島を中心に、各タイプのチャート層、これに互層する負岩、赤土土壌試料122サンプルを採集した。北海道では、遠洋性や深海底相と考えられるチャート層、泥質岩相を中心にサンプリングを行い、82サンプルを採集した。これらのサンプルについて、肉眼観察に基づき岩相の記載を行い、これを細礫程度のチップにした後、ミキサーミルにより化学分析のための粉末試料を作成した。今回サンプリングされたもののうち、岩相、産状から遠洋性と考えられるものを選び出し化学分析を行った。その内訳は、層状の赤色チャート37サンプル、これに互層する赤色粘度岩12サンプル、及びミクライト質石灰岩24サンプルと、この中にノジュールとして産出するフリント22サンプルである。これらの粉末サンプルについて、有機物量と炭酸塩量を強熱法により求め処理したサンプルを、HFとHClにより溶解し、その沈澱物を稀塩酸に溶解したものを原子吸光法で、Al、Ti、Fe、Mg、Na、K、Ca、Mn、Sr、Zn、Cu、Ni、Co、Cr、Pbの15元素について全岩濃度を求めた。また、ミクライト質石灰岩やフリントサンプルについては炭酸塩量が高いため、酢酸アンモニウムアセラートにより抽出を行い、上記の15元素について炭酸塩結合部の濃度を求めた。

この結果、遠洋性と考えられるサンプル中には、遠洋粘度鉱物が多く含まれるためFe/Mg比が一定になるという結論が得られたため、1989年5月茨城大学で開催される日本地質学会で発表する予定である。またこれに引き続き、次年度は残された遠洋性と考えられないサンプルについてこの中でのFe/Mg比のばらつきを検討することが課題として残される。本年度は研究の二年目にあたり、伊江島を含め伊是名島においても、遠洋性チャ-トの産状を観察し、サンプリングを行なった。この結果、総数172個のサンプリングを行ない、これらのサンプル総てについて化学分析を終了した。その結果は「研究成果報告書」やSedimentologyへの論文としてまとめられているが、いくつかの興味深い知見を下に記す。(1)遠洋性チャ-トにはCCD以浅の海山上に堆積するフリントノジュ-ルとCCD以深の深海底に堆積する層状赤色チャ-トの二種類が含まれるが両者とも、遠洋粘土鉱物を含むことに由来するFeとMg間の強い正の相関関係が見られる特徴がある。(2)ジュラ紀から白亜紀後期にかけて堆積した遠洋性チャ-トにおけるFe/Mg比は、現在の太平洋の遠洋性堆積物のFe/Mg比とは異なり、むしろその比は大西洋の遠洋堆積物におけるものと似た値になる。これはジュラ紀から白亜紀後期における中央海嶺等の分布など現在の太平洋のものというよりは大西洋に似たような分布であったことを示唆させる。(3)半遠洋性の多色性層状チャ-トにおけるFe-Mg間の相関係数は遠洋性のものと比べた場合、若干低い値になる。(4)CCD以深、CCD以浅を問わず、遠洋性チャ-トを含む地層における化学層序の特徴から、その基盤は、玄武岩のような火成岩であることが解る。(5)CCD以深の深海底における遠洋性チャ-トの層序を見ると、下位から、基盤の玄武岩、チョ-クあるいはミクライト質石灰岩、層状赤色チャ-トと堆積するが、さらにこの上位に半遠洋性の多色性の層状チャ-トが堆積している可能性があるが、今回この層序を直接的に観察する事が出来なかったので、今後このような層序を直接陸上において観察する事が重要な課題となるであろう。
「新しい終末期」におけるがん患者の死にゆく過程の経験の解明

本研究課題は、がん患者本人が綴った闘病ブログの記述内容(テキスト)を収集し、計量的に分析することによって、自らの死を予見しつつ、目の前の日常を生きる「新しい終末期」におけるがん患者の経験の解明に取り組むものである。患者は病いや、それにともなう死をどのように受け止め、どうありたいと思っているのか。これらを明らかにすることにより、患者への理解、死にゆく過程の支援をめぐる課題に貢献することを目指す。
金属メッシュデバイスを用いたバイオセンシング

平成25年度は、細菌を対にして1.フィルターを用いた簡易総菌数検査、ならびに2.抗原抗体反応を利用した特異的な検出を行った。その中で、より微細な周期構造の利用が有用であることが明らかとなったものの、開口よりも大きいターゲットの定量可能性を評価する必要が生じたため、3.花粉を用いた定量可能性の評価を行った。1.フィルターを用いた簡易総菌数の定量細菌を捕集可能な精密濾過用のメンプレンフィルターはテラヘルツ帯で吸収ロスが非常に小さく、基材として適していることが確認された。また細菌を捕集したメンブレンフィルターを金属メッシュに密着させることで菌数に応じた透過スペクトルの系統的な変化が見られ、1.5×10^5/mm^2以上の菌数を検出することに成功した。また異なる寸法の金属周期構造体を用いて同様に検出を行い、寸法によって検出感度が異なることが確かめられた。また電磁界解析を用いて細菌のサイズ(1μm×23μm)を検出するのに最適な寸法の金属メッシュを検討した。2.抗原抗体反応を利用した特異的な検出食品中に含まれる細菌の簡易菌種同定検査をめざし、金属メッシュ表面に抗体を固定してターゲット選択性を付与し細菌の定量を行った。表面の選択性を持たせる分子プローブにはシラン、マレイミド等を介してターゲットと反応する抗体を固相化したものを用い、金属メッシュは周期が約30μmのものを用いた。その結果、10^5/mL以上の菌濃度を有意に検出できた。3.花粉の定量評価花粉を金属メッシュ表面に付着した状態で透過スペクトルを測定した。金属メッシュ本来の透過スペクトルに対し、花粉が付着するとその花粉数に応じて共鳴ピークに減衰が見られ、従来の変化(周波数シフト)とは違う傾向が見られた。またピークの減衰量から花粉数が定量できることが示された。(抄録なし)(1)動作メカニズムの解明および高感度化の検討金属メッシュに電磁波を入射すると表面に電場の局在・増強が生じ、その電場内の屈折率変化に応じて透過スペクトルが周波数シフトする。異なる周期構造の金属メッシュの電磁界解析により、細密な構造の場合は電場の局在領域もスケールダウンし狭域化することが明らかとなった。そこで異なるスケールの周期構造を有する金属メッシュを作製し、実験的に感度評価を行った結果、構造の周期を約1/10にしてβ-lactoglobulinの検出感度が約50倍に向上した。(2)ナノオーダー薄膜の検出構造を細密化した金属メッシュを用いてサブミクロン厚に成膜したSiO2薄膜の検出を行った。その結果、膜厚に応じて透過特性の系統的な周波数シフトが得られ、10THz(波長30μm)の電磁波で100nm厚以上を有意に検出することができた。これは金属メッシュに用いた動作波長の1/300の厚みに相当し、高感度とされている既存法であるSPR法と同等であった。(3)メンブレンフィルタを用いた微量物質センシングメンブレンフィルタは疎水性の多孔質構造をもつことからタンパク質の吸着性に優れており、固定基材として広く用いられているおり、テラヘルツ帯の電磁波を透過する性質をもつ。本研究では、メンブレンに固定したプローブ分子による選択的なターゲット検出を行った。ターゲットには皮膚や粘膜を正常に保つ効果を持つ機能性物質として知られているビオチンに着目し、通常の抗原抗体反応よりも親和性の強いアビジン-ビオチン反応を阻害測定法により測定した結果、ビオチン01μg/mLの定量評価に成功した。この濃度は、農作物中のビオチンの有無を判定出来るレベルであるが、金属メッシュの最適化により更なる微量検出が期待出来る。

またピークの減衰量から花粉数が定量できることが示された。電磁界シミュレーションにより得られた解析結果をもとに得られた知見からデバイスの高感度化を実証することができた。また実用段階には及ばないものの、センシング例もすでに実証されており、今後さらに機能向上が期待できることから、現在までの達成度としては順調といえる。金属メッシュの基板表面に抗体を固定することにより、ターゲット選択性をもたせ、同定と定量の両方を可能とするセンサの構築を目指す。まず抗体固定のプロトコルを確立するにあたり、夾雑物存在下でも非特異的吸着による影響を最小化するために、表面のブロッキングについても検討する。ターゲットには細菌やタンパク質を設定し、食品の検査に適用可能な濃度の検出を試みる。また、本研究において用いたフィルタを一体化した金属メッシュを作製することにより電場が強く局在される場所にターゲットを配置することが可能になるため、感度の向上が期待できる。本研究ではフィルター体型金属メッシュの試作ならびに評価を行う予定である。(抄録なし)
協働に対するネットワークのあり方について

簡素なモデルを用いて、協働を行うチーム生産に問題における協調的行動の発生がいかにして生まれるかについての理論的研究を行った。第1に、長期的な関係をもつチームでは、長期的関係の継続性に応じて最適な分配規則が異なることを示した。第2に、長期永続的チームにおける関係多様化による協調行動促進の効果は常に存在することが分かった。本年度は,簡素なモデルを用いて,チーム生産に問題における協力的行動の発生がいかにして生まれるかについての理論的研究を二つ行った。一つは繰り返しゲーム理論を用いて,いかなる分配ルールが協調促進的かについて調べた。この研究は京都大学の関口格氏と和歌山大学の太田勝憲氏の協力をもとに遂行された。この研究によって,メンバーが将来における成果を重視する場合は,対称的な分配ルールが協調促進的であるのに対し,そうでない場合は能力の高いメンバーを優遇するような非対称的な分配ルールがむしろチームの成果を上げることになることを示した。もう一つは,各メンバーが自発的に行動タイミングを決定できるチーム生産において,あるメンバーが他のメンバーに先んじて行動を起こすことがあるかについて調べた。これは,ある種のリーダーシップの発生にづいての理論的研究を意味,している。この研究において,メンハ-の物理的な特性が似かよっている場合に上記で述べた意味でのリーダーシップが発生することが証明された。この研究は神戸大学の末廣英生氏の協力によって遂行された。第1の研究において,情報が非常に制約されているチーム生産問題で,協調的行動が生み出されやすい環境が分かった。特に上記研究は,実証分析等で従来言われてきた,法律事務所等のパートナーシップ型組織における賃金の平等性についての理論的説明を与えている。第2の研究では,リーダ-が生まれると,チームの生産性が効率的な方向へと導かれることから,協働作業における生産性向上の仕組みとしてのりーダLシップめ機能が分かった。このことは,従来経済学において未開であづた組織におけるリーダーシップ研究の新たな展開を示唆している。現代はまさにコラボレーション(協働)の時代である。現代の経済環境では他者と上手く協調的関係を構築することで、両者が生み出す成果の価値を高めたり、ブランドイメージを向上させたりすることが重要になってきている。他方、経済学の研究では従来から、協働作業では、ある個人の労働投入は、当該個人の便益になるのみならず、他者にとっても便益をもたらすため、「ただ乗り」が起こり、パフォーマンスが低下する事が過去の研究成果として知られている。その解決策の一つとして、成員が長期的関係にコミットするという方策が挙げられる。そこで、本研究では、協働のネットワークのあり方と長期的関係における協調行動出現との関係性を次のように3つの観点から分析し、それぞれについて成果を得た。1.研究協力者の和歌山大学太田勝憲氏との共同研究により、従来離散時間で扱われていた長期の協働に対する関係多様化問題を、連続時間の枠組みで捉え直すことで、協働における関係多様化の効果は正の割引因子であれば大きさによらず存在することが分かった。この成果を査読付き英文雑誌Economics Lettersに投稿し、採択され、掲載された。2.研究協力者の京都大学の関口格氏と和歌山大学太田勝憲氏との共同研究により、長期の協働における最適賃金配分の特徴付けに成功した。この結果をEconometric SocietyのEuropean Meetingに投稿し、採択され、報告した。また、現地にて欧州の研究者と当該課題について議論をした。3.研究協力者の神戸大学末廣英生氏との共同研究により、協働におけるリーダーシップの出現についての十分条件を見いだした。この成果をGame Theory SocietyのWorld CongressとEconometric SocietyのEuropean Meetingに投稿し、採択され、報告した。
社会主義ユーゴスラヴィアにおける「記憶の政治」と犠牲者ナショナリズム

本研究は、現在の世界的課題でもある「犠牲者ナショナリズム」について、社会主義ユーゴスラヴィアにおけるクロアチア民族社会に焦点を当てて分析するものである。旧ユーゴの民族間対立は「国内問題」と捉えられ易いが、冷戦期には第二次大戦時の経験を踏まえたホロコースト批判や「全体主義/社会主義批判」の文脈から「犠牲者性」に基づく政治運動が国際的に隆盛となっており、東欧でも60年代末からソ連の抑圧を転機として市民層からの政治的主張が顕在化していた。本研究の目的はクロアチアにおける展開を取り上げながら、そうした国際的潮流の下での「犠牲者ナショナリズム」の構築過程と民族問題の要因を具体的に明らかにすることにある。
新生ペプチドによる翻訳アレストと連携したRNA制御機構

前年度にバイオインフォマティクス解析によって同定した植物間で保存されたアミノ酸配列を持つ14個のuORFの中から、uORFにコードされるペプチドが実際に翻訳制御に関与するものを同定する目的で、フレームシフト変異やアミノ酸置換によってアミノ酸配列を変化させ場合の下流のレポーター遺伝子の発現への影響を検討した。シロイヌナズナ培養細胞MM2dから調製したプロトプラストを用いた一過的発現解析の結果、アミノ酸配列依存的に下流ORFの発現に影響を与えるuORFを新たに5つ同定した。新たに同定したuORFについて、発現制御に重要な領域を同定するために、アミノ酸置換解析を行った。制御に重要な領域のアミノ酸配列に特に共通性はみられなかったが、C末端の15-20残基が発現制御に重要であるという傾向がみられた。昨年度の解析により、LONESOME HIGHWAY(LHW)遺伝子のuORFペプチドによる発現制御にはuORFの終止コドンが必要であるのに対し、ANAC082遺伝子のuORFペプチドによる発現制御は終止コドンに依存しないことが示された。今年度、新たに同定したuORFについても発現制御の終止コドン依存性を検討したところ、そのうちの一つのuORFでは発現制御が部分的に終止コドンに依存することが示された。これらの結果から、遺伝子によってuORFペプチドによる発現制御のメカニズムに違いがあることが示唆された。上流ORF(uORF)にコードされる新生ペプチドが自身を翻訳したリボソームに作用して翻訳アレストを引き起こし、それによって下流のORFからのタンパク質合成が抑制されると考えられるシロイヌナズナの3つの遺伝子について、翻訳アレスト機構の解析を行った。まず、シロイヌナズナの培養細胞の一過的発現系を用いたAlaスキャニング解析により、翻訳アレストに重要なuORFペプチド内のアミノ酸の同定を行った。その結果、いずれのuORFもC末端側の18アミノ酸以内の領域が重要であることが示された。また、これらのuORFにおける翻訳アレストに終止コドンが必要かどうかを解析したところ、終止コドン依存的に翻訳アレストが起こるuORFと、終止コドン非依存的に翻訳アレストが起こるuORFが見出された。この結果から、遺伝子によってuORFペプチドによる翻訳アレストのメカニズムに違いがあることが示唆された。uORFペプチドによって制御されるシロイヌナズナの遺伝子をさらに同定する目的で、アミノ酸配列が植物間で保存されているuORFの網羅的な探索を行った。その結果、アミノ酸配列が植物間で広く保存されているuORFを新たに13個同定した。その中に、5'非翻訳領域における選択的スプライシングによってuORFの存在や配列が変化する遺伝子が見出され、これらの遺伝子ではuORFによる翻訳制御と選択的スプライシングの連携によって遺伝子発現が制御される可能性が考えられた。
顕微ラマン分光法による機械構造材料の高温酸化誘起表面割れその場解析

本研究課題では、機械構造材の高温酸化誘起表面割れの機構解明と抑制指針の提言を目的とした。個別課題として、『Ni基耐熱超合金の応力加速粒界酸化(SAGBO)割れ』と『リサイクル含銅鋼のCu起因熱間表面割れ』を取り上げ、以下のような新しい知見を得た。(1)Ni基耐熱超合金のSAGBO割れ:小型パンチ(SP)クリープ試験法を用いたSAGBO割れ感受性評価法の開発を目的として、ガスタービンディスク用Ni基超合金Alloy 706のSPクリープ破壊挙動を調査するとともに、SABGO割れ感受性に及ぼすボロンの影響についても検討した。その結果、クリープ破断強度に及ぼすSABGO割れの影響をSPクリープ特性の変化として明瞭に捉えることが可能であり、本試験法が割れ感受性評価の有力なツールになることが明らかとなった。また、ボロンは耐粒界酸化特性にはあまり影響しないものの、き裂の発生あるいは成長を抑制する効果があり、割れ感受性低減の有効な添加元素であると考えられた。(2)リサイクル含銅鋼のCu起因熱間表面割れ:熱間表面割れの支配因子同定と割れ感受性の簡易評価法確立を目的として、高温無負荷条件下での銅の粒界濃化特性を調査し、高温引張試験より得られる割れ感受性指数E_p'との相関について検討した。その結果、銅濃化粒界の平均深さd_<ave>、最大深さd_<max>、数密度d_nが増加するとともにE_p'も増加することが明らかとなった。また、d_<ave>、d_n、ビッカース硬さH_vを説明変数として、E_p'を推定するための回帰式を多変量解析により求めることができた。この回帰式をE_p'の推定式として用いることによって、鋼種に依存することなく熱間表面割れ感受性を一義的に評価することが可能となった。本研究課題では以下のような研究実績を得た。1.高温その場観察用SP試験装置の作製高温、種々の環境中でその場表面割れ感受性試験が行える小型パンチ(SP)試験装置を作製した。2.1100°C-SPクリープ試験東大・柴田教授らが大型標準引張試験片によって赤熱脆性感受性を計測した種々の含銅鋼より微小試験片(10×10×0.5mm)を採取し、1100°Cで低真空および高真空の環境でSPクリープ試験を行い、クリープ曲線を計測し赤熱脆性感受性に及ぼす酸素ポテンシャルの影響について調査した。3.Cu粒界侵入深さの定量評価赤熱脆性感受性がキャラクタライズされている4種類の試料よりブロック試験片を切り出し、1100°Cの大気中で酸化試験を行った。試験後の試験片表面とその断面を光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡により詳細に観察した。加えて、X線マイクロアナライザーを用いた断面観察より、粒界へのCuの平均侵入深さ、最大深さを測定し、脆化感受性等との相関関係を調査した。その結果、Cuの侵入深さが増加するに従い脆化感受性も単調に増加していく傾向が認められた。本研究課題により、高温その場観察用SP試験装置を作製するとともに、SPクリープ試験法が表面割れ感受性評価手法として有用であるという目処を得た。14年度は、データ蓄積を通してマスターカーブを作成するとともに、顕微ラマン分光器とレーザー顕微鏡を用いた高温その場観察により、割れ発生の微視的メカニズムについて詳細な検討を行う予定である。また、14年度は、本試験法をNi基超合金のSAGBO割れ感受性評価に適用する予定である。
魚類白血球におけるGnRH

脊椎動物では最小のゲノムサイズをもち,全ゲノムがほぼ解明されたトラフグを材料に検討した結果,sbGnRH(タイ型),sGnRH(サケ型),cGnRH II(チキンII型)の3種類のGnRHと,3種類のGnRH-Rを持つことが明らかとなり,それらのcDNAクローニングを行なった.発現組織を検討したところ,sbGnRHとsGnRHは,免疫器官や白血球など広範な組織に分布していたが,cGnRH IIは脳以外には腎臓,頭腎,脾臓のみで発現が認められた.また,GnRH-Rも免疫器官や白血球を含むすべての組織に認められた.GnRH-RをCOS細胞に強制発現させ,GnRHに対する反応性を調べたところ,3種類のGnRH-RはすべてsGnRHとcGnRH-IIに対して,sbGnRHより強い反応性を示した.また,トラフグGnRH-Rは2グループに分けられ,互いに異なるリガンド選択性を示すことがわかった.これらの結果はGnRH-Rを介したGnRHの作用の多様性を示唆するものであった.免疫系における役割を検討するには,リンパ球の分類が不可欠であり,T細胞のCD3,ヘルパーT細胞のCD4,細胞障害性T細胞のCD8β,δ型T細胞のTCRγ鎖等の構造決定を行った.末梢血,あるいはリンパ組織から分離したリンパ球画分に,PHA, ConA, Poly I : C, LPS, PMAを加えて培養し,これら免疫系諸因子やGnRH等の遺伝子発現変動を調べている.これらに加えて,生殖内分泌系と白血球機能との関係,GnRHの細胞増殖調節におけるチロシンフォスファターゼとの関係などについても検討を加えた.脊椎動物では最小のゲノムサイズをもち,全ゲノムがほぼ解明されたトラフグを材料に検討した結果,sbGnRH(タイ型),sGnRH(サケ型),cGnRH II(チキンII型)の3種類のGnRHと,3種類のGnRH-Rを持つことが明らかとなり,それらのcDNAクローニングを行なった.発現組織を検討したところ,sbGnRHとsGnRHは,免疫器官や白血球など広範な組織に分布していたが,cGnRH IIは脳以外には腎臓,頭腎,脾臓のみで発現が認められた.また,GnRH-Rも免疫器官や白血球を含むすべての組織に認められた.GnRH-RをCOS細胞に強制発現させ,GnRHに対する反応性を調べたところ,3種類のGnRH-RはすべてsGnRHとcGnRH-IIに対して,sbGnRHより強い反応性を示した.また,トラフグGnRH-Rは2グループに分けられ,互いに異なるリガンド選択性を示すことがわかった.これらの結果はGnRH-Rを介したGnRHの作用の多様性を示唆するものであった.免疫系における役割を検討するには,リンパ球の分類が不可欠であり,T細胞のCD3,ヘルパーT細胞のCD4,細胞障害性T細胞のCD8β,δ型T細胞のTCRγ鎖等の構造決定を行った.末梢血,あるいはリンパ組織から分離したリンパ球画分に,PHA, ConA, Poly I : C, LPS, PMAを加えて培養し,これら免疫系諸因子やGnRH等の遺伝子発現変動を調べている.これらに加えて,生殖内分泌系と白血球機能との関係,GnRHの細胞増殖調節におけるチロシンフォスファターゼとの関係などについても検討を加えた.GnRHの存在はウナギ,ニジマス,コイにおいて確認されており,特に後2者を中心に検討してきたが,染色体の倍数化が起こっており,GnRHやリセプター(GnRH-R)にそれぞれ2つずつの遺伝子があり,組織ごとに発現パターンに変異があることが分かつた.そのため,機能解析には不適当と判断し,脊椎動物では最小のゲノムサイズをもち,全ゲノムの解明が近いトラフグを材料に研究を進めることとした.まず,トラフグのGnRHとそのリセプター(GnRH-R)について検討した結果,トラフグがsbGnRH(タイ型),sGnRH(サケ型), cGnRH II(チキンII型)の3種類のGnRHと,3種類のGnRH-Rを持つことが明らかとなり,それらのcDNAクローニングを行なった.RT-PCRにより発現組織を検討したところ,sbGnRHとsGnRHが,免疫器官や白血球を含むさまざまな組織に広く分布しているのに対して,cGnRH IIは脳以外には腎臓,頭腎,脾臓のみで発現が認められた.また,GnRH-Rも免疫器官や白血球を含むすべての組織に認められた.SbGnRHの局在を免疫組織化学的に調べたところ,好中球やマクロファージに陽性反応が認められた.また,胸腺細胞にも反応が見られた.これらのことは,GnRHが生体防御系においても何らかの役割を演じていることを示すものであり,皮膚や消化管局所といった感染経路での生体防御という視点も含めてその役割を検討している.ゲノムデータベースが使えることからトラフグを実験材料として選定し,GnRHの解析を行なうと共に,白血球が産生するGnRHの意義を分析するための白血球や免疫応答に関する基礎知見を蓄積をはかった.昨年度報告したトラフグのもつ3種類のGnRH分子種,sGnRH,cGnRH-II,sbGnRHが,GnRH受容体(GnRH-R)を介してどのようにはたらくかを明らかにするために,まずトラフグ下垂体から3種類のGnRH-R cDNAを単離した.

RACE法により,トラフグ下垂体からGnRH-RのcDNAを単離し,配列解析を行った.各GnRH-RはC末端の細胞内領域をもつ構造をとり,4エキソン3イントロン構造を有する別々の遺伝子にコードされていた.次に,トラフグおよび既知のGnRH-Rの演繹アミノ酸配列をもとに分子系統樹を作製した結果,3種類のフグGnRH-Rのうち2種が同一のグループに,もう1種は別グループに属することがわかった.次に,GnRH-RをCOS細胞に強制発現させ,トラフグの持つGnRH分子種に対する反応性を調べた.3種類のトラフグGnRH-RはすべてsGnRHとcGnRH-IIに対して,sbGnRHより強い反応性を示した.また,上述の2つのグループに属するトラフグGnRH-Rは互いに異なるリガンド選択性を示した.これらの結果はGnRH-Rを介したGnRHの作用の多様性を示唆するものであった.免疫応答,白血球に関する基礎知見として,トラフグのIgM,IgDの他,サイトカインとしてIL-8,IL-12,細胞マーカーとして,T細胞のCD3ε,ヘルパーT細胞のCD4,細胞障害性T細胞のCD8βの構造を決定し,GnRH研究の足がかりを得ることができた.トラフグにおいては,白血球におけるGnRHの存在が明らかになっている.しかし,免疫系における役割を詳細に検討していくためには,リンパ球の分類が不可欠である.そのために昨年度より,T細胞のCD3,ヘルパーT細胞のCD4,細胞障害性T細胞のCD8βの構造解析を進めてきたが,本年度はそれらに加えて,γδ型T細胞のTCRγ鎖についてもほぼ決定することができた.別途進行中のIgMのH鎖,L鎖,IgDのH鎖,すでに報告されているTCRα鎖を合わせて,単一魚種としては初めて代表的なリンパ球すべてを識別する手法を得たことになる.GnRHは性行動の促進や細胞増殖の調節など,多様な作用を持つ.染色体上でGnRH遺伝子の隣に位置し,細胞増殖調節作用を持つチロシンフォスファターゼ(PTPαとPTPε)に対する作用を調べたところ,GnRHはそれらの遺伝子発現を抑制するという結果が得られた.従って,GnRHがもつ性行動の促進と細胞増殖の調節という2つの作用が,GnRHのPTPα/PTPε抑制作用により引き起こされることが明らかとなった.
地方における文芸コミュニティの形成と変容に関する研究―暮鳥会寄託資料を軸として

暮鳥会寄託・寄贈資料について、群馬県立土屋文明記念文学館所蔵資料との関係を明らかにし、山村暮鳥自筆資料の総体について明らかにした。山村暮鳥の詩集について、草稿レベルからの検討により、成立過程を明らかにした。山村暮鳥初期の活動が、地方の文芸コミュニティにどのように影響を与えたか、秋田県での事例を初めとして解明し、没後の顕彰活動について、群馬県での事例を初めとして解明した。山村暮鳥の全集未収録・新資料を翻刻し、公開すると共に、それら資料の時代背景を考察し、地方における詩のコミュニティの中での山村暮鳥の位置を明らかにした。山村暮鳥デジタルアーカイブを作成し、山村暮鳥の自筆資料をウェブ上で公開した。本年度の研究は暮鳥会資料の全体を把握し、基礎的資料のデジタルデータ化を進めるため、資料撮影を行った。茨城県立図書館において資料の調査および撮影を行い、群馬県立土屋文明記念文学館において、資料調査を行った。以上の調査において、山村暮鳥の草稿、自筆資料、蔵書など一次資料の調査作業を進め、同時に撮影した資料の検討作業を開始した。また、茨城県水戸市、福島県いわき市において、地方文芸資料の収集を行った。本研究の目的である、地方における文芸コミュニティを解明するための基礎資料として、暮鳥会寄託資料のほか、群馬県立土屋文明記念文学館が所蔵している山村暮鳥資料の一部を調査することで、本研究の土台作りの第一段階を着実に進めることができた。また、暮鳥会資料の一部について、翻刻作業をすすめ、未発表資料についての検討を行った。本年度の成果物として、「暮鳥会資料が拓く可能性ー山村暮鳥生誕130年、新たな暮鳥研究へ向かって」(『雲』第19号2014年9月)、「山村暮鳥の自筆資料をめぐってー草稿、創作ノート、説教メモ」(『日本近代文学』第92集、印刷集)の2本の論考を発表したほか、口頭報告として「日本近代詩のなかでの山村暮鳥」(第86回企画展「生誕130年記念展山村暮鳥ーそして『雲』が生まれたー」記念講演会(招待講演),群馬県立土屋文明記念文学館2014年11月3日)、「暮鳥会資料の画像化、その成果と課題」(暮鳥会山村暮鳥生誕130年没後90年記念関連事業(招待講演),茨城中学・高等学校2014年12月13日)を行った。本年度の研究においては、群馬県立土屋文明記念文学館に所蔵されている資料の調査を行うとともに、昨年度撮影した資料の翻刻作業を進めた。以上の作業により、群馬、茨城に分散している山村暮鳥の原稿・草稿・メモの関係を整理した。本作業は本研究の目的の一つである、山村暮鳥の詩の生成の解明に必要な作業であり、その成果は「「榲めろの声」とは何かー山村暮鳥『雲』巻末詩をめぐってー」(群馬県立土屋文明記念文学館紀要「風」、第19号、2016.3、pp.1-18)として論文化した。また、本研究の成果を生かし、講演「朔太郎・暮鳥の詩的出発をめぐって」(前橋文学館開館記念月間記念講演会,前橋文学館2015.9.13)を行うとともに、講演録「朔太郎・暮鳥の詩的出発をめぐって」(『前橋文学館報』第43号2016年3月pp.48-69)を公開した。同時に、原稿類の翻刻作業を進め、「翻刻暮鳥会寄贈資料・山村暮鳥自筆詩草稿」(『雲』第20号2015.9)、「新資料山村暮鳥「小説『春』序文」(暮鳥会寄贈資料)翻刻と解説」(『鹿児島県立短期大学紀要(人文・社会科学篇)』第66号2015年12月pp.21-27)、「新資料山村暮鳥『虹とさくらんぼ』序文原稿および関連資料(暮鳥会寄贈資料)・翻刻と解説」(『人文』第39号2015年11月pp.1-7)と、着実に作業を進めている。これら資料の重要性については、「山村暮鳥の自筆資料をめぐってー草稿、創作ノート、説教メモー」(『日本近代文学』第92集2015.5)にて報告した。さらに、群馬県の文教団体の歴史と現状について調査を行い、「記憶の記録としての『遠望』」(『遠望』第48集2016.2)に報告を掲載した。本研究の目的の一つである、暮鳥資料の検討について、いくつかの新資料を翻刻して公開することができたことをはじめ、土屋文明記念文学館の協力のもと、山村暮鳥資料を有機的に関連づけた論考を発表することができた。本年度、研究論文1本、翻刻3本、研究ノート2本、講演1回、講演録1本を発表し、研究目的に従った研究業績をあげることができている。本年度の研究においては、暮鳥会寄贈資料、茨城県立図書館に保管されている暮鳥会寄託資料、及び群馬県立土屋文明記念文学館に所蔵されている資料を総合的に検討した。原稿類の翻刻作業を進め、「新資料山村暮鳥『雲』「序文」原稿及び関連資料(暮鳥会寄贈資料)・翻刻」(『雲』、第21号、2016.9、pp.36-45)を発表した。

本翻刻は、山村暮鳥の詩集『雲』の序文の生成過程を明らかにする資料である。同時に、暮鳥会の加倉井東氏、浅井敦氏と協力し、暮鳥会寄託・寄贈資料のデジタルアーカイブ化作業を行い、その成果をインターネット上で公開した。デジタルアーカイブは、単に画像データのみを公表するだけでなく、解題をつけて公開している。例えば、詩集『雲』の原稿については、公開した原稿の成立時期や、同作品の別稿の情報(所蔵情報、成立時期)などを記載し、資料の意義について個別に解説している。アーカイブは今後も整備し続けていく予定であるが、その最も基礎となる部分は構築できたと考える。本年度までの作業により、各地に分散された山村暮鳥の自筆資料及び関連資料の全貌が明らかになったことは重要な成果であり、今後、デジタルアーカイブにて資料を順次公開することで一般に利用しやすい環境を整備すると共に、資料を総合的に考察した論を公表する予定である。また、本年度までの研究の結果、山村暮鳥が伝導説教に使用した「説教メモ」の重要性が再確認されたこと、説教メモについても各地に分散されていることが判明したことは、続く研究の課題を提供するものとなった。暮鳥会寄託・寄贈資料について、群馬県立土屋文明記念文学館所蔵資料との関係を明らかにし、山村暮鳥自筆資料の総体について明らかにした。山村暮鳥の詩集について、草稿レベルからの検討により、成立過程を明らかにした。山村暮鳥初期の活動が、地方の文芸コミュニティにどのように影響を与えたか、秋田県での事例を初めとして解明し、没後の顕彰活動について、群馬県での事例を初めとして解明した。山村暮鳥の全集未収録・新資料を翻刻し、公開すると共に、それら資料の時代背景を考察し、地方における詩のコミュニティの中での山村暮鳥の位置を明らかにした。山村暮鳥デジタルアーカイブを作成し、山村暮鳥の自筆資料をウェブ上で公開した。本研究の目的の一つである、暮鳥資料のデジタル画像化について、撮影作業を着実に進展させたほか、調査の過程で新たに必要となった群馬県立土屋文明記念文学館での調査を行うことで、資料についての撮影作業・基礎的調査が着実に進展している。本年度の調査をもとに、研究論文2本、講演2回の発表することができ、研究目的に従った研究業績をあげることができている。収集した資料が原稿・草稿・メモだけでも想定以上にのぼり、また、その検討には多くの時間がかかるため、本年度は収集した資料の解読と検討が中心となる。文芸コミュニティの検討については、地域ごとの特性が想定以上に多様であるため、検討範囲を精選し、論理構築を行う。同時に、デジタルデータ自体の整理を引き続き行う。日本文学本年度、撮影した資料について、データ整理及び検討を進める。撮影資料は膨大であるため、個別の資料の丁寧な検討が本年度必要となる。また、群馬県立土屋文明記念文学館の暮鳥資料の重要性が調査過程により判明したため、群馬県立土屋文明記念文学館での調査を行う。研究の最終目標である地方文芸コミュニティの様態解明に向けて、地方雑誌資料などの探索と収集が一層必要となるため、ひきつづき、茨城県、福島県、群馬県をはじめとした資料調査が必要となる。また、研究の基礎となる文芸ネットワークについての理論構築を引き続き行う。ほぼ予定通りに執行しており、0円に合わせる目的での執行を行わなかったためである。少額のため、次年度計画に影響を与えるほどの使用残はないと考えている。
マイコライザに感染した植物を用いたヒ素の除去と健康被害のリスク評価

前年度までに、アーバスキュラーマイコライザが植物の生長、有害物質に対する耐性強化に果たす役割について研究を行ってきた。ところが、この際に用いてきた手法は、生長量を測定するというものであり、一つの要素の影響を調べるのにほぼ一年間を要することから、研究の進展に大きな支障を来してきた。そのため、今後のこうした研究も視野に入れて、本年度は、より素早い評価手法の開発に取り組んだ。植物は、ストレス環境下に置かれると細胞内組織内に活性酸素を発生される。その多くはスーパーオキシドであり、これはその後、スパーオキシドディスミュターゼによって過酸化水素に変換される。そうしたことから、この過酸化水素濃度と環境ストレスとの間の関係から、植物が置かれた環境下のストレス強度を評価することを考えた。研究では、これまで調査を行ってきた荒川河岸等において、これまで調べてきたイネ科大型植物を含む植物種を対象に、様々な条件下で生育する植物を採取、過酸化水素濃度を分析するとともに、日射及び、壌条件より環境ストレス強度を測定、比較検討した。その結果、環境ストレス強度と植物体中の過酸化水素濃度との間には、極めて良好な正の関係が存在する事が得られた。さらに、そうした関係は、類似する種では概ね一定の関係として得られ、種ごとの生育地のストレスの相対的な比較等に利用できることが明らかになった。これまで調べてきたイネ科の種については、土壌水分量の低下と共に過酸化水素濃度が増加、ストレスが増加していることが得られ、より乾燥した環境下に生えるオギの方がヨシよりも高いストレス下にあることが伺える結果となった。ただし、本課題の主課題であった、マイコライザの働きに関係する栄養塩吸収量がストレスに与える影響については、河岸のような貧栄養な場所においてさえも土壌水分量よりもはるかに影響が少ないという結果が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。バングラデシュは、土壌中のヒ素濃度が高く、住民の生活の上で極めて大きな問題を引き起こしている。ところが、国力、住民の生活レベル等、全ての点で、過大な投資を伴う土壌対策を行うことは難しい。そうした中、植物を利用してヒ素を取り除く手法であるファイトレメディエーションは、安価でかつ持続的な方法として、今後、大きな利用価値が認められる。ところが、ファイトレメディエーションに利用しようとする植物自体、ヒ素に対する耐性は必ずしも高くなく、十分な効果が期待できるか否かについては問題が残る。そのための一つの方法として、植物を、植物自体の活性化を高めるアーバスキュラーマイコライザに感染させることによって、ヒ素に対する耐性を高めることが考えられる。そうした背景の下、本共同研究では、比較的耐性が高いと考えられるイネ科の植物を用い、ヒ素の含まれる土壌中で、マイコライザの有無によるヒ素の吸収能を測定することを予定していた。ところが、土壌化学を長年にわたって研究し、共同で研究を進めることになっていたHarn Rashid助教が退職したこと、植物体中の過酸化水素濃度で、植物に掛かる環境ストレス強度の測定が可能であることが明らかになったこと、さらに、Animesh Sarkar氏の来日が遅れ、実際の野外の観測ができなくなってしまったこと等の理由から、当初の研究の方向を多少変化させ、土壌のヒ素濃度に焦点を当てるのではなく、ヒ素を吸収することで、植物自体がどのような強度のストレスを受けるかといったことを直接的に測定することを考えた。そのため、マイコライザへの感染がストレス強度に影響するかについての過去の研究の十分なレビューが必要である。平成29年度は主にそれに費やすことを行った。平成29年度は、まず、バングラデシュにおけるヒ素汚染の実態を把握した。そのため、Animesh Sarkar氏の来日が遅れ、当初、平成29年度に、温室においてマイコライザに感染させた植物と感染させていない植物との間で、ヒ素の吸収能に生ずる差を把握すること、野外で採取した植物に対するマイコライザへの感染の状況を把握することを予定していたものの、時期的にこうした作業が難しくなった。また、こうした研究の専門家で共同で作業を行うことを予定してたHarun Rashid助教が退職せざるを得なくなり、効率的にこうした作業を行うことが難しくなった。他方、重金属を含む、植物の環境から受けるストレス強度が、植物体内の過酸化水素濃度を測定することで、極めて精度よく評価できることが明らかになった。そのため、当初予定していた、土壌のヒ素濃度(全ヒ素量)を精度よく測定する必要がなくなり、植物体内の過酸化水素濃度の測定だけで、その時の植物の状態を定量的に把握することが可能になると考えられる。この方法を利用することで、植物のヒ素に対する耐性の簡単かつ定量的な評価が可能となり、ヒ素に対する耐性とマイコライザの感染度との関係も容易に評価することができる。こうしたことから、研究方針を変え、マイコライザの感染の有無と植物体内のヒ素濃度との関係を求めることにした。これまで、重金属の存在下で、過酸化水素を含む活性酸素量の増加に対する研究は多数存在する。しかし、過酸化水素濃度として、ストレス強度を見積もった研究はほとんど存在しないと考えられるが、現在、その背景にある研究のレビューを行っている。

そのため、今後のこうした研究も視野に入れて、本年度は、より素早い評価手法の開発に取り組んだ。植物は、ストレス環境下に置かれると細胞内組織内に活性酸素を発生される。その多くはスーパーオキシドであり、これはその後、スパーオキシドディスミュターゼによって過酸化水素に変換される。そうしたことから、この過酸化水素濃度と環境ストレスとの間の関係から、植物が置かれた環境下のストレス強度を評価することを考えた。研究では、これまで調査を行ってきた荒川河岸等において、これまで調べてきたイネ科大型植物を含む植物種を対象に、様々な条件下で生育する植物を採取、過酸化水素濃度を分析するとともに、日射及び、壌条件より環境ストレス強度を測定、比較検討した。その結果、環境ストレス強度と植物体中の過酸化水素濃度との間には、極めて良好な正の関係が存在する事が得られた。さらに、そうした関係は、類似する種では概ね一定の関係として得られ、種ごとの生育地のストレスの相対的な比較等に利用できることが明らかになった。これまで調べてきたイネ科の種については、土壌水分量の低下と共に過酸化水素濃度が増加、ストレスが増加していることが得られ、より乾燥した環境下に生えるオギの方がヨシよりも高いストレス下にあることが伺える結果となった。ただし、本課題の主課題であった、マイコライザの働きに関係する栄養塩吸収量がストレスに与える影響については、河岸のような貧栄養な場所においてさえも土壌水分量よりもはるかに影響が少ないという結果が得られた。本共同研究では、当初、土壌のヒ素濃度と植物体内のヒ素濃度、更に、植物の生長量との関係から、植物のヒ素に対する耐性を求めることを予定していた。しかし、これには、植物の生長量を測定しなければならないために、最低6か月程度の期間を使って生長実験を行う必要がある。そのため、条件を変えた実験を多数行うことは不可能であるという問題を抱えていた。しかし、今回開発した、植物体内の活性酸素濃度を測定することで、植物が環境から受けるストレスを定量的な評価するシステムでは、短期間で植物の状態の評価ができ、種々に条件を変えた実験も可能になり、さらに、現地における植物の状態の把握も可能である。こうした理由から、本共同研究では、今後、この方法を用いることとする。ただし、重金属ストレスによる活性酸素の増加の有無に関する研究はこれまで多数存在するものの、過酸化水素量のみで定量的に把握することを試みた研究はこれまで存在していないと考えられる。そのため、まず、このシステムによる基本特性を明らかにする必要がある。具体的には、多少時間をかけた生長実験を行い、生長量の他に、クロロフィル量や生長ホルモンの量を測定し、かつ、過酸化水素量の測定を同時に行うことで、過酸化水素量との相関の把握、更に、過酸化水素量を低減させるために植物体内で生ずる防御反応である、カタラーゼやアスコルビン酸ペルオキダーゼなどの酵素による活性との関係を測定する。更に、その後、ヒ素存在下で様々な条件での実験を行い、ストレス強度の増加について実験を進めることになる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
セメントイン(新発見内在性架橋接着分子)によるタンパク質の糊付け技術の確立

タンパク質の接着技術を確立する上で要となるセメントインを遺伝子工学的に大腸菌に作らせる系を構築し,セメントインの性質を明らかにした。同様に,本研究を通して新たに発見した同族分子についても,大腸菌を利用した発現系とアフィニティークロマトグラフィーによる精製系を確立した。すなわち,セメントインとその同族分子のcDNAを発現ベクターpMAL-pに組み込み,大腸菌に導入し,マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形でペリプラズムに分泌されるようにした。これをアミロース・レジンを担体とするアフィニティーカラムにかけ精製した。精製標品にFactor Xa(プロテ-ゼ)を作用させて,不要なマルトース結合タンパク質部分を切断除去し,ヒドロキシアパタイト・カラムに通すことにより簡便かつ効率よく目的物を得る方法を開発した。このようにして得た産物は,予想通り触媒量のトランスグルタミナーゼによって非常に効率よく架橋され,優れたタンパク質接着能力を有することが確かめられた。精製標品に対する抗体も作製し,ウエスタン分析や免疫組織化学やラジオイムノアッセイの開発に応用した。その結果,セメントイン及びセメントイン様接着分子は生体中では細胞外マトリックスタンパク質に架橋されて存在すること、気管や腸の上皮細胞に多く発現しており,血中にも存在することが明らかになった。組織分布に関しては、RNaseプロテクションアッセイによっても気管や腸に多いことを確かめた。さらにヒトのある種の病態(Psoriasis,乾癬)では,セメントインが異常に発現し,皮膚等の結合組織の病気になることが判明した。以上の結果は、本研究対象である接着因子が基礎及び応用の両面に置いて,極めて重要な因子であることをよく物語っている。1.タンパク質の接着技術を確立する上で要となる接着分子セメントインの大量発現系を構築し,セメントインの性質を詳細に調べた。まず,セメントイン及びセメントインを含む融合タンパク質のcDNAを発現ベクターpMAL-pに組み込み,大腸菌で大量発現させた。産物をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した後,トランスグルタミナーゼによって架橋されるか否かを調べたところ,セメントイン部分は,予想通り,非常にいいトランスグルタミナーゼの基質になることがわかった。すなわちセメントインは,トランスグルタミナーゼの作用によって,それ自身または他のタンパク質との間で容易に架橋接着し,重合することが明らかになった。タンパク質をくっつける糊として利用できることになる。2.セメントインが生体内で実際にこのような働きをしていることを確かめるために,セメントインに対する抗体を作製し,ウェスタンブロット解析を行った。セメントインが重合体ないしは,他のタンパク質とのヘテロマーとして存在すると,分子量は単量体のそれより大きくなると予測される。実際,電気泳動による分子量の見積りからこのことは確かめられた。3.セメントインの架橋接着反応の速さを光散乱法によって測定したところ,触媒量のトランスグルタミナーゼの存在下で,極めてすみやかに進行し,実用化に際し,有利な性質を有することが明らかになった。4.セメントインが生体のどのような組織に多く存在するかを,RNaseプロテクションアッセイ及び免疫組織化学的手法により明らかにした。このように,応用のみならず基礎の観点からも重要な知見を多く得た。セメントインと命名した内在性の架橋接着因子を利用してタンパク質の糊付け技術を開発し実用化に結びつけるために必要なセメントインの量産系を組み立て、その精製法を確立するとともに、新しく発見したセメントインの同族分子(Pro-SPAI)についても,同様に大腸菌を利用した発現系とアフィニティクロマトグラフィーによる精製系を確立した。ブタのPro-SPAI cDNAを発現ベクターpMAL-pに組み込み、大腸菌に導入し、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形でペリプラズムに分泌されるようにした。

これをアミロース・レジンを担体とするアフィニティーカラムにかけ精製した。精製標品にファクターXa(プロテアーゼ)を作用させて、不要なマルトース結合タンパク質部分を切断除去し、ヒドロキシアパタイト・カラムに通すことにより簡便かつ効率よく目的物を得る方法を開発した。このようにして得たPro-SPAIは、予想通りトランスグルタミナーゼによって非常に効率よく架橋され、優れたタンパク質接着能力を有することが確かめられた。精製標品に対する抗体も得た。またブタの遺伝子の詳細な解析から、同族分子が他にも3種類存在し、合わせて少なくとも5種類の架橋接着因子が存在することを明らかにした。これらはいずれも3個のエクソンからなり、イントロンの配列を含めてそっくりな遺伝子構造を有し共通の先祖遺伝子から進化してきたことが示唆された。最初に発見し本研究のきっかけを作ったセメントインに関しては、基礎の観点からも興味深い知見を得た。すなわちヒトのある種の病態(Psoriasis)では,セメントインが異常に発現し、皮膚等の結合組織の病気になることが判明した。本研究対象である接着因子の基礎および応用の両面における重要さをよく物語っている。生体内で起こっているタンパク質の架橋接着反応を応用して,バイオテクノロジー分野で必要とされているタンパク質の糊付け技術を開発するために,私たちが新しく見つけた接着分子とその同族分子群の性質と遺伝子構造等を解明し,基礎固めを行うとともに,それら有用分子の大量生産系を構築するという応用研究を行ってきた。本年度はこれらの研究を発展させるとともに,接着分子を共有結合でくつける反応を触媒する酵素トランスグルタミナーゼに関する研究も行った。すでにウシの血管内皮細胞からトランスグルタミナーゼをクローニングすることに成功していたが,あらたにヒトのクローンを得ることにも成功した。医療分野への応用を考えると必要なものである。また接着分子(セメントインまたはセメントイン様分子と命名)の定量法と存在部位の同定法の開発も必須であることから,モノクローナル抗体を用いてセメントインのラジオイムノアッセイ系を確立した。抗体染色による局在部位の同定法も完成に近づいている。ラジオイムノアッセイの応用で基礎的に興味深い結果が得られた。すなわち血液中にも接着分子が15μM程度存在することが明らかになった。この接着分子がどの組織のどの細胞に由来するのかを決定するためにノーザン分析とイン・スツ・ハイブリダイゼーションを行っている最中であるが,気管や小腸の上皮細胞にセメントイン及びセメントイン様分子のmRNAが多量に発現しているという予備的な結果を得ている。接着効率は接着分子中の糊代部分の長さに依存する面がある。この観点から,種々の動物の接着分子の長さをクローニングによって調べたところ,動物種によって,糊代部分の長さが異なることが判明した。現在,大腸菌の系を用いて遺伝子工学的にこれら長さの異なる接着分子を量産するための発現系を構築中である。