hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造解析

今後、GSTを切断したのち、結晶化を試みる予定である。PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造を明らかにする研究の一環として、本年度は以下の研究を行った。1.昨年度作製したMBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bをプロテアーゼ(Factor Xa)処置によりタグを切断した後、superoseを用いたゲルろ過に供した。しかし、目的のDGKγC1A及びDGKγC1Bペプチドが得られなかった。そこで、より微量なペプチドを検出するために、C末端にもFLAGタグを融合したMBP-DGKγC1A-FLAG及びMBP-DGKγC1B-FLAGを作製し、プロテアーゼ処置した後、ゲルろ過に供し、FLAG抗体を用いて目的ペプチドを追跡した。その結果、DGKγC1A-FLAGとDGKγC1B-FLAGは、ともにボイドボリュームに溶出され、aggregationを起こしている可能性が強く示唆された。この傾向は、同様に作製したMBP-DGKγC1-FLAG,MBP-εPKCC1-FLAG及びMBP-εPKCC1A-FLAGでも認められた。また、作製した各融合蛋白質の再フォールディング後、PDBu結合能を測定したが、有意な結合は認められなかった。以上のことから、MBP融合PKC及びDGKのC1ドメインを大腸菌を用いて発現させた場合には、正常な高次構造を保持していない可能性が示唆された。そこで今後、GSTタグや、バキュロウイルス発現系など対応策を講じていく必要があると思われる。2.PKCγ及びδサブタイプにおいてもC1ドメインが脂質性シグナルにおいて重要な働きをしていることを明らかにした。即ち、PKCγのC1ドメインは脂肪酸などのPLA2プロダクトによる膜局在において重要な働きをしており、この膜滞在時間の延長がPKCγの機能において重要な働きをしていることが示唆された。また、PKCδのC1ドメインはセラミドによるPKCδの活性化に必須であり、PKCδによるアポトーシスに重要であった。
銅-希土類複合触媒を用いたCO、CO_2からの新規アルコール合成プロセスの開発

硝酸銅の熱分解過程において希土類金属イオンを共存させることによって合成した新規な銅-希土類複合酸化物Cu_6O_8Ln(NO_3)(Ln:希土類金属)及びその水素還元によって得られた物質の吸着特性及び触媒特性について研究した。希土類金属としてイッテルビウムを選んだ。触媒能は、銅及びイッテルビウムの硝酸塩の混合物を酸素気流中下、673Kで焼成して得られた複合酸化物Cu_6O_8Yb(NO_3)を水素還元することによって発現した。水素還元処理により表面積及び細孔容積は増加した。触媒のメタノール生成活性は水素還元温度に依存して変化した。水素及び一酸化炭素を原料とした場合は、523Kにおいて活性は最大となり、従来の銅/亜鉛/クロム三元系メタノール合成触媒よりも大きかった。水素及び二酸化炭素の混合ガスを原料とした場合でもメタノールは生成したが活性は低かった。メタノール生成活性は、従来の三元系触媒では523K付近で最大となったが、銅-イッテルビウム酸化物ではそれより低温の473Kで最大活性を示した。より低温で高活性を示すことは、この物質が触媒として優れていることを示している。エチレンの水素化活性も水素還元温度に依存して変化するが、最大活性を示す温度は、メタノール合成反応の場合と異なり573Kであった。還元後の触媒のTEM観察、EDS測定、XRD測定及びBET測定の結果から、メタノール合成反応とエチレン水素化反応においては、触媒表面積、金属銅粒子径及び酸化イッテルビウム結晶粒子の分散状態が重要であることが示唆された。硝酸鋼の熱分解過程において希土類イオンを共存させると、新規な銅-希土類複合酸化物Cu_6O_8Ln(NO_3)(Ln:希土類金属)を生成するが、この触媒特性は殆ど報告されていない。本研究はこの複合化合物及びその還元された物質の触媒作用を調べるため行ったものである。触媒特性を調べるに先立ち吸着特性を調べた。この複合酸化物は、窒素吸着・脱離においてヒステリシスを示すことがわかった。銅及びイッテルビウムの硝酸塩の混合物を酸素気流中下、673Kで焼成して得られた複合酸化物Cu_6O_8Yb(NO_3)を水素還元して触媒とした。水素還元により表面積及び細孔孔容積は増加した。触媒活性は水素還元温度に依存して変化し、H_2及びCOを原料とするメタノール生成活性は523Kで最大となった。エチレンの水素化活性も水素還元温度に依存して変化するが、最大活性を示す温度は573Kであり、メタノール合成反応の場合とは幾分異なる。還元後の触媒のTEM観察、EDS測定、XRD測定及びBET測定の結果から、523Kにおいて触媒表面積は最大となり、また金属銅粒子径は最小になることがわかった。また金属銅上には酸化イッテルビウムが結晶化せず高分散していることも示唆された。さらに高温で水素還元すると、酸化イッテルビウムの結晶化が進行し、その酸化イッテルビウムと金属銅が混在した状態になることが示唆された。これらの結果を総合すると、メタノール合成反応とエチレン水素化反応とでは、最適な表面状態が異なるものと考えられる。硝酸銅の熱分解過程において希土類金属イオンを共存させると、新規な銅-希土類複合酸化物Cu_6O_8Ln(NO_3)(Ln:希土類金属)を生成する。この物質を水素還元すると、興味ある触媒能が発現することがこれまでのわれわれの研究でわかった。本研究ではさらにこの触媒能について調べるため行ったものである。

触媒は、銅及びイッテルビウムの硝酸塩の混合物を酸素気流中下、673Kで焼成して得られた複合酸化物Cu_6O_8Yb(NO_3)を水素還元して調製した。水素還元処理により表面積及び細孔容積は増加した。触媒のメタノール生成活性は水素還元温度に依存して変化した。水素及び一酸化窒素を原料とした場合は、523Kにおいて活性は最大となり、従来の銅/酸化亜鉛/酸化クロム三元系メタノール合成触媒よりも大きかった。水素及び二酸化炭素の混合ガスを原料とした場合でもメタノールは生成したが、活性は低かった。メタノール生成活性は合成温度に依存し、銅-イッテルビウム酸化物では473K、従来の三元系触媒では523K付近で最大となり、最大活性を示す温度が異なった。銅-イッテルビウム酸化物がより低温で高活性を示すことは、この物質が触媒として優れていることを示している。高圧下における実験も現在遂行中であるが、メタノール合成活性が認められている。エチレンの水素化活性も水素還元温度に依存して変化するが、最大活性を示す温度が573Kであり、メタノール合成反応の場合とは異なった。還元後の触媒のTEM観察、EDS測定、XRD測定及びBET測定の結果から、メタノール合成反応とエチレン水素化反応においては、触媒表面積、金属銅粒子径及び酸化イッテルビウム結晶粒子の分散状態が重要であることが示唆された。硝酸銅の熱分解過程において希土類金属イオンを共存させることによって合成した新規な銅-希土類複合酸化物Cu_6O_8Ln(NO_3)(Ln:希土類金属)及びその水素還元によって得られた物質の吸着特性及び触媒特性につて研究した。希土類金属としてイッテルビウムを選んだ。触媒能は、銅及びイッテルビウムの硝酸塩の混合物を酸素気流中下、673Kで焼成して得られた複合酸化物Cu_6O_8Yb(NO_3)を水素還元することによって発現した。水素及び一酸化炭素を原料とした場合は、523Kにおいて活性は最大となり、従来の銅/亜鉛/クロム三元系メタノール合成触媒よりも大きかった。水素及び二酸化炭素の混合ガスを原料とした場合でもメタノールは生成したが活性は低かった。メタノール生成活性は、従来の三元系触媒では523K付近で最大となったが、銅-イッテルビウム酸化物ではそれより低温の473Kで最大活性を示した。より低温で高活性を示すことは、この物質が触媒として優れていることを示している。エチレンの水素化活性も水素還元温度に依存して変化するが、最大活性を示す温度は、メタノール合成反応の場合と異なり573Kであった。
真核細胞の信号伝達系まるごとシミュレーションのためのグリーン関数反応動力学法開発

真核生物のシグナル伝達経路は、発生、分化やがんなど人の営みに深くかかわる様々な細胞現象の根幹をなしている。その原理を解明しようとする計算生物学の分野でも研究が続けられてきたが、細胞膜や核、染色体などの複雑な構造を含む細胞内でほんの数個の分子のふるまいが決定的な意味を持つシグナル伝達経路を分子一つ一つのふるまいから計算することはこれまで非常に困難であった。我々はこの困難を解決すべくグリーン関数動力学法と呼ばれる新規技法を開発し、厳密かつ高速な反応拡散シミュレーションを実現した。本研究ではこれをさらに並列化することでひとつの細胞をまるごと含めたシグナル伝達経路の1分子粒度での計算を可能にした。本研究課題は真核細胞シグナル伝達系の1分子粒度反応拡散シミュレーションを可能にする新規並列計算技術の開発を目的とする。本年度の実施計画では1、プロトタイプコードの完成、2、反応アルゴリズムの決定と実装、3、境界条件処理を研究対象としていた。1については、計画通りMPIを用いた分散メモリ並列計算のプロトタイプコードを完成させており、次年度にむけて予備的なプロファイリングを始めている段階である。現時点でも実問題を対象とした条件で並列計算による高速化が実現されており、次年度以降のチューニングで高い並列性能の実現が期待できる。2についても、1次及び2次反応について試験的な実装を行い、正しく計算が行われていることを確認した。1次反応については計画時の設計に加え、プロセス間同期直前に予め反応の可否を決定しておくことでより高速な計算が可能である事を確認した。次年度以降、2次反応についても同様の方法による拡張を検討する。3については、2次元平面や1次元物体等の構造体の実装を行った。これら構造体上の反応拡散、構造体への結合・かい離・反射はブラウン動力学法上の反応として実装された。プロトタイプコード上でこれらの動作を確認しており、複雑な形状の細胞膜やフィラメント・DNA等の表現が可能となった。より高速な計算を可能とするグリーン関数の導出・評価コードの開発については、今年度は基本的な拡散のみに留め、次年度以降で詳細プロファイルの結果と照らし合わせボトルネックとなっているものから優先的に導入する計画である。以上、本年度の主たる目的であるプロトタイプコードの開発は計画通り完成できた。次年度以降このコードを基盤として性能検証とチューニングを行い、実問題(シグナル伝達経路)の計算を行っていく。本年度の実施計画では、1、昨年度までに開発したプロトタイプコードの性能評価と詳細プロファイリングの実施、2、OpenMPによるスレッド並列化などのプロトタイプコードの改良を研究対象としていた。1については、計画通り本研究室の有する400コア程度のクラスタマシン上において真核細胞シグナル伝達系の典型的な分子濃度・拡散速度と並列計算の同期時間幅のいくつかの組み合わせについて計算を行い、並列計算のスケーリングの確認およびボトルネックの洗い出しを行った。プロトタイプコードはいずれ場合も確認した400並列までは80%以上の弱スケーリングを示した。これによりプロトタイプでも適切な並列計算が行われていることが示せた。またボトルネック解析の結果、並列計算上の通信プロセスはいずれもボトルネックとはならなかった。主たるボトルネックは想定通り分子の拡散計算であったが、一部の場合では各コアの計算する分子の拡散状況のばらつきによってロードインバランスが発生し、これが全体の計算速度を大きく損なっていた。2については、ボトルネック解析の結果を反映して、スレッド並列化は行わず、代わりにペアグリーン関数の実装を行った。ペアグリーン関数はロードインバランスの原因と考えられた二つの分子が至近距離にある場合に利用される局所解析解であり、非並列型の改良グリーン関数動力学法では既に導入されていた。その結果、コードの高速化が確認され、より適切なグリーン関数の切り替え法について現在検討中である。以上、本年度の主たる目的であるプロトタイプコードの性能解析は完了し、チューニングは順調に進展している。次年度以降このコードを用いて実際の真核細胞シグナル伝達系を計算し、性能評価とチューニングを継続していく。本研究の目的は、真核細胞スケールの信号伝達系を対象とする厳密な1分子粒度シミュレーションを実現するために、1000コア規模の大規模並列計算が可能な新規並列化手法「並列グリーン関数動力学法」を開発することである。これまでに分散・共有メモリで基本的な実装を終えた。続いて細胞膜やDNAなどの構造体との衝突・反応や構造体上での拡散を実現し、前年度は3次元で2粒子を含むグリーン関数を本並列化手法に取り入れて厳密・高速化を試みた。また、216コア並列までの性能評価により弱スケーリングを確認している。本年度はまず次年度の本格的な運用に向けて、コードの見直しと性能評価に基づく実装の効率化を行った。また、構造体に関する計算を厳密に行うため、グリーン関数ライブラリの作成とポリゴン上での拡散反応に必要となる新たなグリーン関数の実装を行った。これまで、構造体との衝突・反応や構造体上での拡散には3次元と同じグリーン関数を利用するか、反応ブラウン動力学法による非効率的な計算を用いてきた。その結果、計算の厳密性と効率が失われていた。計算の厳密性はグリーン関数動力学法が持つ稀有な特性であり、非常に重要である。

これを解決するため、非並列のグリーン関数動力学法で利用している複数のグリーン関数実装をライブラリとして独立させ、我々の並列化法に取り入れ、一般の研究者もグリーン関数を単独で利用できるように整備を行った。また、従来、構造体を表現するポリゴン上の拡散に用いられるグリーン関数は頂点を含むことができず、分子が頂点に近づくたびに低速な反応ブラウン動力学法を用いていた。そこで頂点を中心としたグリーン関数として、反射境界と吸収境界条件を持つくさび形上の解が利用できることを新たに考案、実装し、実際に利用可能であることを確認した。これにより、ポリゴン上でも頂点に妨げられず、効率的な拡散計算が可能となった。本研究は新規並列計算技法の開発を行い、真核細胞のシグナル伝達系規模の問題に応用可能なものとすることである。今年度までに基本的なコードを実装するとともに、性能評価、応用に際し特別に必要となる種々の個別実装を済ませている。次年度はこれを具体的な問題に適用することで最終結果の評価を行う予定である。これは当初の進捗見込みに照らして順当であると考える。研究課題の最終年度である本年度では、これまで開発してきた並列版グリーン関数動力学法のコードをまとめるとともに、それにあたって必要とされた各種のグリーン関数に関する実装部分を、従来の非並列版グリーン関数動力学法のコードと共通して利用できるよう切り離し、独立したグリーン関数計算ライブラリとして公開した。これにより、これまで並列版・非並列版で別々に開発・保守されてきたグリーン関数ライブラリをまとめて管理できるようになるとともに、共同研究先と共に利用することで並列化以外にも様々に拡張されてきた変更を横断的に取り入れることが可能になった。加えて本年度では、昨年度から引き続き特に問題となっていた平面上での反応拡散に関する開発を推し進めた。並列版では細胞全体を扱うために一次元および二次元の細胞構造の表現を可能にすることも目的にしていた。非並列版ではこれらについて部分的に開発されていたが、単一二次元平面上での反応拡散については既に開発されていたものの、ポリゴンによって表現される複雑な平面上での反応拡散については十分でなかった。特に、ポリゴンの頂点周りの拡散はこれまでブラウン動力学法を使うなど厳密でない方法に頼らざるを得ず、細胞構造の形状から生じる効果についてはグリーン関数動力学法が持ち味とする正確かつ厳密な結果を示すことができないでいた。そこで新たに頂点周りの反応拡散方程式を特殊な境界条件を与えることで解き、前述のライブラリへと実装することで分子が頂点に近づいた場合に高速かつ厳密な拡散を再現することを可能にした。以上により、一次元・二次元の細胞構造を有する複雑かつ厳密な1分子粒度反応拡散シミュレーションを可能とするグリーン関数動力学法の並列化を世界ではじめて実現した。真核生物のシグナル伝達経路は、発生、分化やがんなど人の営みに深くかかわる様々な細胞現象の根幹をなしている。
細胞接着因子の操作による慢性期脊髄損傷治療法の開発

慢性期脊髄損傷ラットに対して、脊髄損傷部をコラーゲンフィラメントで置換を行った。また細胞接着因子に作用して、Cell cycleを上げることにより、組織修復を促進するCompound Aを添加した。In vitroにおいては神経系細胞に対するCompound Aの分化・誘導作用を認めた。しかし、In vivoでは、主に周囲のFibroblastsに作用することで、瘢痕組織の増性を招き、十分な脊髄機能の再建にはつながらなかった。神経系細胞へ特異的に作用するような遺伝子改変などの工夫が必要と考えている。(1)慢性期脊髄損傷環境にどの程度の侵襲を加えることで、急性期環境が構築できるのか?下位胸髄損傷ラットモデルでの慢性期における組織学的検証と併せて、ヒト脊髄患者でのMRI評価で検証をおこなった。組織学的には脊髄障害部は高度障害を生じた場合でも、12髄節以内にその障害範囲は限局したままであった。ヒト脊髄損傷患者におけるMRI変化でも同様の結果が得られた。すなわち、慢性期においても限局した脊髄に対してのみ再生医学的手法を用いた治療を加えれば良いと判断され、将来的には実際の治療範囲同定のための理論的根拠となりうる。(2)脊髄損傷ラットにコラーゲンフィラメント移植を行い、組織学的再生過程が発生するか?下位胸髄切離ラットにコラーゲンフィラメント(以下CF)移植を行った。移植後数日後には神経栄養因子の発現が確認されるとともに、アストロサイトなどの補助細胞のCF内への進入が確認される。これに後押しされるように軸索もCF内へと進入してくる。移植後8週程度にて再生軸索の髄鞘化と神経生理学的な機能回復が確認された。Long tractの再構築も一部確認され。最終的には脊髄の局所再生が生じることが確認された。実際には再生効率は、若年ラットにおいてでも約10%未満と推測している。今後は、十分な機能回復のために、再生効率をさらに上昇させる必要性が問題点として残存した。CF内にて枯渇している神経栄養因子補充と併せて、薬剤投与を併用した集学的治療を開始している。(1)脊髄損傷ラットにコラーゲンフィラメント移植を行い、組織学的再生過程が発生するか?下位胸髄切離ラットにコラーゲンフィラメント(以下CF)移植を行った。Long tractの再構築も一部確認される。CF内にて枯渇している神経栄養因子補充と併せて、薬剤投与を併用した集学的治療を開始した。In vitroにおいてニューロン、グリア系細胞、脊髄組織のスライス培養を行い、Compound Aの神経組織に対する効果を確認した。各種免疫染色(各神経系組織抗体を用いた免疫染色、細胞増殖マーカーを用いた組織評価)、RT-PCR等を用いた各種遺伝子発現の量的、時間的変化について解析した。In vitro下で神経突起伸長、細胞活性に最も適した,至適濃度を同定し、実際のIn vivo脊髄損傷モデルに使用するための、最適な投与時期や投与間隔についての理論的基盤を明らかにした。濃度依存性にニューロンにおいては細胞死の抑制と生存率がわずかに上昇した。またグリア系細胞の細胞活性と併せて、新生血管の増性を認めることが確認された。(研究の方法)基礎データの収集として、in vitroにて神経系細胞の培養を行い、濃度調整を行ったCompound Aを添加した培養液中で培養を行う。神経系細胞の動態を把握し、最適な投与濃度を把握する。次にこれまでと同様の手法にて、脊髄損傷ラットを作成し、コラーゲンフィラメント移植と並行して腹腔内に留置した浸透圧ポンプに充填されたCompound Aの持続投与を行った。最終的に組織学的、電気生理学的、行動学的な評価を行った。(研究成果)In vitroでの検証では、神経前駆細胞はCompound Aの濃度依存性にグリア系細胞への分化・誘導が促進された。また濃度依存性に神経突起の伸長促進を認めた。またグリア系細胞のうち、アストログリアへと分化する傾向を認めた。

神経系細胞への毒性などは示さなかった。Vivoの移植・投与実験結果は、こうしたvitroでの結果を反映したものとなると予想していたが、結果としては修復をおこなった脊髄部分に対し、旺盛なfibroblastsの進入が周囲組織から生じる結果をCompound A投与が招く結果となっていた。神経系組織の軸索伸展作用には大きく貢献していたものの、脊髄を横断するような形での瘢痕組織の進入も併せて生じていたため、結果としては不十分な機能回復、組織学的な回復しか得られなかった。今後は、周囲瘢痕の進入防止のために、修復脊髄部の周囲を被覆したり、遺伝子操作による、神経系組織特異的に作用するような薬剤操作が必要となると考えて、現在さらなる研究を推し進めている。
生体吸収性Mg合金のための欠陥修復型ポリマー修飾リン酸カルシウム被膜の開発

H29年度に、アニオン性ポリマーのポリアクリル酸(SPA)を水酸アパタイト(HAp)被覆Mg合金に修飾したところ、Hanks液中低歪み速度引張り(SSRT)試験での破断寿命がHApのみ被覆Mg合金よりも約50%増加した。一方、SPA-HAp被覆Mg合金表面での骨芽細胞の接着性はHApのみ被覆Mg合金よりも抑制されていた。そこでH30年度は生体適合性に優れたポリエチレングリコール(PEG)を、PEG水溶液へのディップコーティングによりHAp被覆Mg合金に修飾し、Hanks液中でのSSRT試験を行った。PEG修飾時の温度を室温と60°Cとした。PEG-HAp被覆Mg合金のSSRT破断寿命はSPA-HAp被覆Mg合金よりも短かったが、HApのみ被覆Mg合金よりも約40%長かった。PEG修飾温度が室温の方が60°Cの場合よりもSSRT破断寿命が長い傾向がみられた。PEGは非イオン性であるがその水溶液は酸性を示す。PEG修飾時の温度を60°Cにすると、PEG水溶液中でMg合金の腐食が起こり、SSRT破断寿命に影響を及ぼしたと考えられる。一方、非イオン性PEG修飾でもHAp被覆Mg合金の破断寿命を増加できたことから、SPAとPEGに共通するリン酸カルシウム析出の核になり得る性質と、SPAとPEG水溶液の粘性が、基材Mg合金の変形で生じるHAp被膜のき裂修復に重要な役割を果たしていると考えられる。H30年度は、PEG修飾したMg合金の細胞接着性を検討した。PEG修飾により、HAp被覆表面に比べて細胞接着・増殖が抑制されることが明らかになった。以上の結果より、PEG-HAp被覆は、ステントのように抗血栓性が求められるMg合金の被覆に適していることが示唆された。一方、PEG-HAp被覆Mg合金のHAp被膜修復メカニズムや、長期間の耐食性や細胞接着性は、今後の検討が必要である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。リン酸カルシウム(Ca-P)被覆Mg合金のCa-P被膜の欠陥やMg合金の局部腐食箇所の修復を促進するポリマーの探索を行った。アニオン性ポリマーであるポリアクリル酸ナトリウム(SPA)はCa-P析出の核になる可能性があることから、Ca-P被覆AZ31合金に修飾し、表面にカッターで基材合金に達する傷を付けた後、Hanks液に浸漬した。SPA複合化により傷中に顆粒状のCa-Pの析出が促進された。断面観察では、Ca-P被膜のみでは傷の内側は10 um程度の比較的厚いCa-P層に覆われ、傷の修復が起こったことが示されたが、傷の底部から孔食の発生がみられた。SPAを複合化した場合、傷の内側のCa-P層は数um程度に薄く均一になり、傷内部からの孔食発生はみられなかった。これらの結果より、アニオン性ポリマーはCa-P被覆Mg合金の表面の傷の修復に効果を発揮することがわかった。生体適合性に優れた中性ポリマーと前述のアニオン性ポリマーがCa-P修復に及ぼす影響を比較したところ、アニオン性ポリマーの方が高い修復促進能を示した。そこで、細胞適合性に優れた中性ポリマーの末端官能基をアニオン性官能基に置換し、Ca-P被膜との複合化を目指した。しかし、当該ポリマーの末端基をアニオン性官能基に置換したポリマーの市販品はなく、ポリマー合成が専門の共同研究者に合成を依頼したため、非常に少量のアニオン性ポリマーしか得られなかった。予備実験として、合成したアニオン性ポリマーをMg合金表面に直接修飾し、細胞培養液中に浸漬したところ、未被覆Mg合金よりもMgイオン溶出が抑制された。アニオン性ポリマーはCa-PやMg合金との結合力が中性ポリマーよりも高いことから、修飾ポリマーの表面での安定性が向上したことがポリマーによる培養液中からのCa-P析出を促進したと考えられる。本研究で開発した表面は特許出願準備中である。H28年度に、当初候補としていた中性ポリマーではなくアニオン性ポリマーの方が本研究の目的に即していることがわかったため、中性ポリマーの末端官能基置換によりアニオン性ポリマーに切り替えていくことにした。アニオン性ポリマーの合成に時間が掛かったこと、ポリマー複合化前のリン酸カルシウムのみ被覆したMg合金の被膜と細胞の相互作用の検討に時間が掛かったことにより、当初の予定より全体の進捗は遅れている。一方、市販のアニオン性ポリマーを修飾したリン酸カルシウム被覆AZ31において、アニオン性ポリマーが被膜の傷修復促進に有効であったことから、ポリマー複合化によるリン酸カルシウム被膜の自己修復能向上は順調に進捗していると考えられる。このため、全体ではやや遅れているとした。H28年度に、ポリアクリル酸ナトリウム(SPA)を複合化したリン酸カルシウム(Ca-P)被覆AZ31合金に大気中で付けた傷は、Hanks液中でSPAによるCa-P析出の促進で修復されることを明らかにした。H29年度にはSPA複合化Ca-P被覆AZ31のHanks液中での低歪み速度引張り試験を行った。SPA複合化試料ではCa-P被覆のみに比べて、破断までの時間が約1.45倍に大幅に増加した。き裂発生点付近は、Ca-P被覆のみでは脆性であったのに対し、SPA複合化表面では延性を示した。

SPA複合化試料でも、き裂発生点より数十um深い領域では脆性を示し、さらに深い領域は延性を示していた。AZ31は疑似体液中での水素脆化の可能性が指摘されている。これより、SPA複合化により引張りで発生したCa-P被膜のき裂が早期に修復されるため、き裂先端での水素発生もしくは水素吸収が抑制されたと考えられる。水酸アパタイト(HAp)およびリン酸八カルシウム(OCP)被覆AZ31表面で骨芽細胞を培養した。HAp被膜では直径数十umのロッド状の結晶が内層から約0.25 umの間隔で成長しており、OCP被膜では厚さ数十umの板状の結晶が端面を上に約1 umの間隔で成長している。HAp被覆表面では細胞はよく接着、伸展して増殖できたが、OCP被覆表面では細胞の伸展が阻害され、増殖も抑制された。SPA複合Ca-P被覆AZ31表面での骨芽細胞の細胞接着形態を観察した。SPA複合Ca-P被覆AZ31ではCa-P被覆のみに比べて細胞の伸展が若干抑制されていたが、未被覆AZ31に比べて細胞密度が高く、細胞の伸展がみられた。SPA修飾量を調整することで、Ca-P被覆Mg合金表面の欠陥修復能を向上するとともに、細胞接着を妨げない表面の実現の可能性が示された。H29年度に疑似体液中での低歪み速度引張り(SSRT)試験より、リン酸カルシウム(Ca-P)被膜に溶液中でin-situに形成されるき裂の修復にはアニオン性ポリマーが有効であることを明らかにした。修復メカニズムにおけるアニオン性ポリマーの役割の詳細については今後の検討が必要であるが、本課題の研究目的である「親水性ポリマーの複合化によるCa-P被膜の欠陥修復能の向上」に対して十分な指針を与えたと考えられる。一方、SSRT試験に用いたアニオン性ポリマーのポリアクリル酸の生体適合性は必ずしも高くなかった。ポリアクリル酸よりも生体適合性に優れたアニオン性ポリマーへの切り替えが必要である。そこで、細胞適合性が良好な中性ポリマーの末端をアニオン性の官能基で置換することで、ポリアクリル酸と同様の効果を期待した。H29年度は共同研究者に合成してもらったアニオン性官能基で置換したポリマーを用い、予備実験としてMg合金に直接ポリマーを修飾し、細胞培養液中での腐食試験を行った。末端基置換ポリマーの方が元のポリマーよりもMg合金の耐食性を向上させた。この結果は、本研究課題当初の予想範囲を超える結果である。上記の結果を鑑みて、全体的にはおおむね順調に研究が進捗していると考える。H29年度に、アニオン性ポリマーのポリアクリル酸(SPA)を水酸アパタイト(HAp)被覆Mg合金に修飾したところ、Hanks液中低歪み速度引張り(SSRT)試験での破断寿命がHApのみ被覆Mg合金よりも約50%増加した。一方、SPA-HAp被覆Mg合金表面での骨芽細胞の接着性はHApのみ被覆Mg合金よりも抑制されていた。そこでH30年度は生体適合性に優れたポリエチレングリコール(PEG)を、PEG水溶液へのディップコーティングによりHAp被覆Mg合金に修飾し、Hanks液中でのSSRT試験を行った。PEG修飾時の温度を室温と60°Cとした。PEG-HAp被覆Mg合金のSSRT破断寿命はSPA-HAp被覆
蝸牛において予想されるTRPM4チャンネルの特異的機能の解明

我々は抗TRPM4ラビットIgG抗体を使用してTRPM4がアダルトマウスにおいて内有毛細胞側底部、血管条辺縁細胞頂側部に特異的に発現していること、およびそれぞれの部位で聴覚確立期においてTRPM4 mRNAの発現が著しく上昇していることを解明した。さらにTRPM4ノックアウトマウスの聴覚を聴性脳幹反応(ABR)によって評価し、17週齢以降における野生型と比較しての閾値上昇を認めた。以上の結果よりTRPM4は内有毛細胞の再分極と辺縁細胞頂側における内リンパ腔へのK+の移送への部分的な寄与が予想され、TRPM4遺伝子のヒトにおける進行性感音難聴との関連性も示唆された。高度難聴児は新生児1,000人に1人の割合で生まれそのうち50%は遺伝子の関与が推測され、一方加齢に伴う難聴にも大きな個人差があり、遺伝的背景が関与していると考えられている。哺乳類聴覚器の蝸牛では、高K+低Na+濃度の特異的な組成をもつ内リンパが、endocohlear potential (EP)と呼ばれる80 mVの高電位を有し、聴覚受容において重要な役割を有する。内リンパとEPは蝸牛側壁の血管条により形成され、血管条辺縁細胞頂側の電位依存性K+チャンネルKCNE1/KCNQ1がK+の内リンパ腔への最終的な移動で主な役割を果たしている。一方で1990年代はじめに同部位における非選択型陽イオンチャンネルの存在がパッチクランプ法によって確認された。この非選択型陽イオンチャンネルの特性がTRPチャンネルのひとつのTRPM4と極似していたため、我々はTRPM4に対してのカスタム抗体による免疫染色を行い、TRPM4の血管条辺縁細胞頂側と内有毛細胞体部での特異的発現を明らかにした。TRPM4の発現量についてもmRNAレベルで検討し、聴覚開始時期の生後1週齢から2週齢の間での急激な発現量上昇を確認した。以上の結果より我々はTRPM4が内リンパ液の高K+組成の維持と内有毛細胞の再分極において重要な役割を有すると考察した。方法:発生各段階の野生型(WT)マウスを対象とし、側頭骨凍結切片を作製し、抗TRPM4ラビットIgG抗体(Teruyama R et al., 2011)を用いて蛍光抗体法で免疫染色を行った。同じ発生段階で蝸牛上皮を基底板上のコルチ器を含む部分と血管条を含む側壁とに分けて解剖後mRNAを抽出し、TRPM4の発現を半定量的RT-PCR法にて測定した。TRPM4 KOマウスはハイデルベルグ大学より分与を受けて継代を開始し、WT、ヘテロ、KOマウス(各N=3)の聴覚評価を生後4週齢から36週齢までの各段階で聴性脳幹反応(ABR)によって施行した。結果:TRPM4の特異的免疫反応が4Wマウスにおいて内有毛細胞側底部、血管条辺縁細胞頂側部、および一部の蝸牛神経節細胞と神経軸索で観察された。半定量的RT-PCRでは、コルチ器・蝸牛外側壁の双方において聴覚の確立するP7から2Wにかけて著しい発現上昇が認められた。TRPM4 KOマウスABR測定結果については、主に生後17週齢以降においてKOマウスではWTに比べて閾値上昇が観察された。考察:ABR測定結果よりTRPM4遺伝子のヒトにおける進行性感音難聴との関連性も示唆された。ハイデルベルグ大学の研究者のご厚意によりTRPM4 KOマウスを導入し得たことにより、当初計画していた通りにTRPM4 KOマウスの聴覚を生理学的に解析する実験を開始することができた。しかし平成27年度初めには研究代表者(村田)が順天堂大学より慶応大学に移籍し、さらに年度末には慶応大学より大阪大学への移籍が必要であったため、その都度遺伝子改変マウスの移動など実験環境の整備を要した。主に以上のような理由により、研究の進捗は現時点ではやや遅れている。1.研究の背景と目的TRPM4は興奮性細胞での活動電位形成と、非興奮性細胞では主に上皮細胞での発現が報告されている。我々は今回科研費の補助を受けることでマウス内耳発生の各段階におけるTRPM4の発現について検討し(Sakuraba M et al., 2014)、さらにTRPM4 KOマウスをハイデルベルグ大学より導入し聴力評価を開始した。得られた解析し哺乳類内耳におけるTRPM4の役割を解明することを目的とした。2.研究の具体的内容方法:発生各段階(胎生15.5日齢から4週齢)の野生型(WT)マウスから側頭骨凍結切片を作製し、抗TRPM4ラビットIgG抗体(Teruyama R et al., 2011)を用いて蛍光抗体法で免疫染色を行った。一方で各発生段階でマウス蝸牛をコルチ器と外側壁とに分けて解剖した後mRNAを抽出し、TRPM4の発現を半定量的RT-PCR法にて測定した。聴覚機能評価についてはTRPM4 KOマウス、ヘテロ、WT(各N=3)のABR(聴性脳幹反応)測定を生後4W(4週齢)から36Wにおいて施行した。結果:TRPM4の特異的免疫反応が4Wマウスの内有毛細胞側底部、血管条辺縁細胞頂側部、および一部の蝸牛神経節細胞で観察された。

半定量的RT-PCRでは、コルチ器・蝸牛外側壁の双方において聴覚完成期(生後7日齢から2W)での発現上昇が認められた。ABR測定結果については17W以降においてKOマウスではWTに比べて閾値上昇が見られた。3.研究の意義と重要性発現解析よりTRPM4は内有毛細胞における脱分極後にK+を流出させ再分極へ導く機能を有し、辺縁細胞頂側では内リンパ腔へのK+の移送にKCNQ1/KCNE1と共に寄与している可能性が示された。ABR測定結果よりTRPM4遺伝子のヒトにおける進行性感音難聴との関連性も示唆された。我々は抗TRPM4ラビットIgG抗体を使用してTRPM4がアダルトマウスにおいて内有毛細胞側底部、血管条辺縁細胞頂側部に特異的に発現していること、およびそれぞれの部位で聴覚確立期においてTRPM4 mRNAの発現が著しく上昇していることを解明した。さらにTRPM4ノックアウトマウスの聴覚を聴性脳幹反応(ABR)によって評価し、17週齢以降における野生型と比較しての閾値上昇を認めた。以上の結果よりTRPM4は内有毛細胞の再分極と辺縁細胞頂側における内リンパ腔へのK+の移送への部分的な寄与が予想され、TRPM4遺伝子のヒトにおける進行性感音難聴との関連性も示唆された。哺乳類聴覚器の蝸牛では、高K+低Na+濃度の特異的な組成をもつ内リンパが、EPと呼ばれる80 mVの高電位を有し、聴覚受容において重要な役割を果たしている。内リンパとEPは蝸牛側壁の血管条により形成され、血管条辺縁細胞頂側の電位依存性K+チャンネルKCNE1/KCNQ1がK+の内リンパ腔への最終的な移動において主要な役割を果たしていることが既に明らかにされているが、一方で1990年代はじめに同部位における非選択型陽イオンチャンネルの存在がパッチクランプ法によって確認された。このチャンネルの特性が実はTRPM4と極似していたため、我々はTRPM4に対してのカスタム抗体による免疫染色を行い、TRPM4の血管条辺縁細胞頂側と内有毛細胞体部下方での特異的発現を明らかにした。TRPM4の発現量についてもmRNAレベルでも検討し、聴覚開始時期にあたる生後1週齢から2週齢の間での急激な発現量上昇を確認した。我々は以上の結果を英文論文として報告し、TRPM4が内リンパ液の高K+組成の維持と内有毛細胞の再分極において重要な役割を有すると考えた(Sakuraba M, Murata J, et al., J Neurosci Res. 2014)。今後の研究の推進方策としては、TRPM4 KOでは加齢による難聴の進行が野生型より促進されている可能性が考えられることも踏まえて、以下のように内耳形態、機能を解析することを予定している。1. TRPM4 KOマウスとコントロールマウスの内耳形態を比較解析し、KOマウス内耳に形態異常がみられるかを解明する。パラフィン切片にて、有毛細胞、血管条、蝸牛神経節で細胞消失や形態異常の有無を観察する。必要に応じて凍結切片で血管条辺縁細胞、内有毛細胞、外有毛細胞などの細胞マーカーとなる抗原の免疫染色を併用することで、特異的な細胞の消失や変性(degeneration)の有無を検討する。特に8週齢と48週齢においてTRPM4 KOマウスとコントロールマウスの比較を行い、加齢よる内耳の形態的変化に差異が見られるかを検討する予定である。2.加齢による内耳機能・形態変化は音響外傷の積み重ねであるとも考えられている。従って今年度の結果よりTRPM4 KOマウスは強大音刺激による内耳障害程度が、コントロールマウスよりも大きい可能性が考えられる。
近世日本における自然資源の利用と管理に関する歴史学的研究

本研究の目的は、日本の近世社会を主な事例として、自然資源の利用と管理に関する歴史学的研究を、主に漁業(水産資源)を事例として行うことである。このような目的意識のもと、本研究では、1豆州内浦などを分析対象拠点として、資源変動とそれに対する地域の生業・社会の対応を、事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、2全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する行政・調査資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業を進めた。これらの研究をまとめ、最終年度に『近世・近代の水産資源と生業ー保全と繁殖の時代ー』を吉川弘文館から刊行した。本研究の目的は、日本の近世社会を主な事例として、自然資源の利用と管理に関する歴史学的研究を行うことである。このような目的にアプローチするため、1特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、2全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する調査資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業を進めることを計画した。本年度は、以下のような作業を行った。1、1に関わる作業として、前年度の作業を継承しつつ、伊豆国君佐波郡内浦地域の史料群を素材とした史料集である『豆州内浦漁民史料』(全三冊)のデータベース化をひとたび終え、その分析・論点整理の作業に入ることができた。2、2に関わる作業として、平成24年7月1721日に宮崎県文書センター所蔵宮崎県庁文書、平成25年3月59日に島根県庁所蔵島根県庁文書の調査を行った。宮崎県庁文書については公開に強い限定が付されており、残念ながら十分な資料調査を行うことができなかったが、島根県庁文書については相応の史料の残存していることが判明した。3、平成24年12月22日に東北大学災害科学国際研究所にて研究会に参加した。この研究会に関わって、「一九世紀仙台藩における流域とサケ資源保全政策ーサケからカワ・ヤマへー」と題した論文を年度末に脱稿・提出した(刊行年月日未定)。4、昨年度脱稿した論文は出版計画が止まってしまったが、それとは別に、本年度は「一九世紀末二〇世紀初・魚油を通してみた日本と世界ー石巻周辺地域における魚油変動を出発点としてー」と「問題提起漁業史研究からみる環境史研究への展望」を公表することができた。また、近世・近代の水産資源繁殖に関わるこれまでの論考を著書にとりまとめる作業を行った。このような目的にアプローチするため、1特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、2全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業を進めることを計画した。1、本年度は、本科研の最終年度に当たることから、これまでの研究の総括を進め、2013年11月にそれを単著『近世・近代の水産資源と生業ー保全と繁殖の時代ー』(吉川弘文館、全297頁)にまとめ刊行した。2、「近世日本における自然資源の利用と管理に関する歴史学的研究」という本科研の題目を意識し、分析対象を水産資源以外に広げ、農業史に関して「近代日本農業史研究と環境史研究」(鳥越皓之編『環境の日本史5自然利用と破壊ー近現代と民俗ー』吉川弘文館、2013年6月)を、また森林資源と水産資源との関わりを意識して「近世の水揚帳とサケの漁況変動」(『歴史評論』764、2013年12月)を執筆・発表した。3、調査としては、とくに2に関わる調査として、6月2627日に奈良県庁文書(奈良県立図書情報館所蔵)の閲覧・撮影を、また12月2122日には滋賀県庁文書調査の追加作業として同県内で刊行された自治体史のチェックを同県立図書館にて行った。4、分析対象を森林資源に広げることを意図して、11月2324日に一関市大東町に残る山林・山村資料の調査を行い、翌3月1112日にはその一部について目録化作業も行った。具体的には、(1)特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、(2)全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する調査資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業を進めることを計画した。

本年度の作業概要は以下のようなものである。1、(1)に関わる作業としては、伊豆国君澤郡内浦地域の史料群を素材として活字化された『豆州内浦漁民史料』(全三冊)のデータベース化を進め、おおむね終えることができた。2、(2)に関わる作業としては、8月811日および3月1518日に愛媛県庁文書(愛媛県立図書館所蔵)、12月2627日および3月2224日に滋賀県庁文書(滋賀県庁県政資料室蔵)、3月710日に山口県庁文書(山口県文書館所蔵)の史料撮影を行った。いずれも撮影を終えることができた史料の量は、当初予定していたものの68割程度となっている。3、これとは別に、東北地方で発掘が進んでいる山林・海川関連資料の閲覧および撮影を、11月2224日に阿仁町で(こちらは史料閲覧のみ)、3月2930日に東北大学防災科学研究拠点にて行った。4、本科研に関わる論文として、「漁業史研究と水産資源変動ー資源保全史の再考から環境史研究へー」を論集論文として執筆した(刊行は2012年度内予定)。1特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、2全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する調査資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業課題について、1については豆州内浦を事例とした史料分析データの収集を終え、分析作業に着手することができ、また2については、漁業に関わる史料に限定はされているものの、新たに宮崎県・島根県を対象として一定量の画像データを収集することができたため。また、論文として「一九世紀末二〇世紀初・魚油を通してみた日本と世界ー石巻周辺地域における魚油変動を出発点としてー」(菊池勇夫・斎藤善之編『講座東北の歴史第四巻交流と環境』清文堂出版・285309頁)のほか、問題提起文「漁業史研究からみる環境史研究への展望」(『地方史研究』358〈第62巻第4号〉・5861頁)を発表することもできた。(1)特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、(2)全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する調査資料の概要調査とデータ収集、という二つの作業課題について、(1)については豆州内浦を事例とした史料分析データの収集に一定の目処をつけ、また(2)については、漁業に関わる史料に限定はされているものの、愛媛県・滋賀県・山口県を対象として一定量の画像データを収集することができたため。また、残念ながら論文の発表に至らなかったが、論文原稿自体は提出済みの成果が一本あり、2012年度内に公表予定となっている。次年度は、20万円という限られた予算のなかでではあるが、本年度に引きつづき、1特定フィールドを設定して資源変動と地域の生業・社会の対応を事例に則して掘り下げる地域史研究の作業と、2全国各地に明治期の行政文書として残されている、伝統的生業の技術や技能・慣行などに関する調査資料の概要調査とデータ収集、3「近世・近代の水産資源の利用と管理に関する歴史学的研究」という本科研テーマに合わせた論文集の作成を進めたい。1については、豆州内浦を拠点とした史料分析データを用いた分析的検討や立論の作業を進めたい、と考えている。2については、過去二年間に調査を行った愛媛県・滋賀県・山口県・島根県・宮崎県のうち、とくに史料的に興味を感じている愛媛県か山口県の追加調査を一度でも実施できたら、と考えている。また、3については、原稿を完成させ、出版に向けて業者との交渉を進めたい。
中世ヴェネツィアにおける市民の家産管理と都市国家の財政

今年度はまず、昨年度収集した約50通の遺言書史料を分析し、データベース化した。それによると13世紀初は遺言書自体の数が少ないということもあるが、やはりサン・マルコ財務官は初期は不動産管理などの仕事はほとんど請け負っていないこと、13世紀前半は市民の遺言書に不動産を代々子孫に残そうと言う意図はあまり見られないということがはっきりした。また同時に、13世紀前半において家産の流れを規制していた法史料を綿密に検討したところ、ヴェネツィアでは相続や嫁資に対する女性の権利が比較的強いこと、不動産売買に関して独自の手続きを採用しているがわかった。そこでサン・マルコ財務官の発展と市民の家産管理の変化の関係を13世紀を通して考察する前段階として、まず13世紀前半のヴェネツィア社会と家産の流れを規制する法との関連について考察した。その結果、女性の法的地位の高さや財産権の大きさ、親族の権利を保護しながらも不動産市場の迅速化をめざしたヴェネツィア独自の不動産売買の諸手続、といったヴェネツィア都市法の特徴は、13世紀前半の海外発展やそれにともなう商人層の台頭・経済活動の活発化と重要な関係にある、ということが明らかになった。この内容は論文にまとめ『西洋史学』に投稿して採用決定、年末に入稿し現在印刷中である。当初の目的であるサン・マルコ財務官の発展と家産の関係についても来年度中に活字にする予定。13世紀のヴェネツィアは都市の公的機能が発達する時代であるが、特に市民生活との関わりで興味深いのはサン・マルコ財務官という役職である。遺言執行人としての機能を発達させたこの役所は、市民の遺産(不動産収入を含む)を預かり、それを国の財政を支える重要な基金に投資するなどして、市民の家産運営と都市国家の財政の間に一種の共生関係を確立させることになった。今年度は1260年代以前の遺言書を網羅的に調査した。未だ資料は分析途中であるが、おおよその結論を述べると、次のようになろう。すなわち、サン・マルコ財務官は初期は不動産管理などの仕事はほとんど請け負っていないこと、13世紀前半は市民の遺言書に不動産を代々子孫に残そうと言う意図はあまり見られないということである。また、最近刊行されたヴェネツィア史の大部の概説書の「コム-ネ(自治都市)時代」の巻によると、13世紀は干拓などによって都市空間が拡大する時期であった。それに伴い、13世紀後半には都市当局による公共の広場の管理というのが顕著に見られるようになっていく。13世紀後半から、市民の間の不動産を代々子孫に伝えようという試みが増えてくることと、このような都市空間の拡大・当局による管理にはどのような関係があるのか。興味深い問題であるので、今後はこのようなことも念頭において遺言書の検討とサン・マルコ財務官の機能の調査を進めていきたい。
親の介護に直面する労働者の課題の明確化と包括的支援モデルの構築

本研究は、近年の高齢化に伴い今後ますます増えることが予測される親介護に直面する労働者に焦点をあて、介護の実態、就労との関連、および労働者の親介護に関する課題の明確化を行い、職域および地域における支援方策を検討することを目的としている。平成30年度は以下(1)(3)を行い、成果を得た。(1)国内外における家族介護に関する基礎資料、仕事と介護の両立や介護離職といった家族介護が仕事に及ぼす影響について文献を検索・収集し、職場、地域における家族介護労働者への支援制度および活動の背景について整理を行い、家族介護を行う労働者の現状に関する既知見をまとめた。その結果、我が国における介護休業制度を主体とした支援体制について確認でき今後休業以外の支援も含めた体制整備の必要性が示唆された。また、北欧諸国などとの比較では、社会保障制度、福祉と保健医療の連携、被介護者としての高齢者の自立や家族的責任のあり方が大きく異なっており、これらの要素も親介護労働者のニーズに大きく影響することが推察された。(2)国内外における家族介護労働者の特性や支援に関する文献を検索・収集し、家族介護労働者の課題、支援内容についての整理を行い、既知見をまとめた。研究者が先行して収集していた労働者の家族に関連した課題への取り組みに関する文献の再整理を行い、家族の健康課題の労働者への影響として、労働への影響、労働者の精神・身体的な健康度への影響等が確認できた(3)(1)、(2)の結果を踏まえ、研究者・研究協力者と研究の概念枠組について協議を行い、本研究における調査のアプローチ、着目すべき項目などの整理を行い、本研究の具体的な実施計画の再策定および次年度以降の実施に向けての調査内容の吟味を行った。また、いくつかの企業の産業保健担当者、自治体高齢者担当保健師らと研究テーマに関する協議を行い、研究体制の構築を進めた。当該年度に親介護経験を有する労働者へのインタビュー調査開始を予定していたが、介護を行う労働者の実態、支援制度などの情報収集や、新たに開始した文献検討に時間を要した。今後は、予定していた親介護経験を有する労働者などへのインタビュー調査を実施し、労働者の親介護実態および支援ニーズや課題の明確化を進める。当初、インタビュー調査を当該年度内に開始する予定としていたが、研究計画を再検討し、次年度に実施することとしたため、調査遂行のための物品、旅費および調査補助等にかかる人件費などの支出については次年度に使用することになった。
がんにおけるスプライシング制御機構の解析

近年、がん特異的なスプライシングががんの悪性化に関わっていることが明らかとなってきている。本研究により、明細胞型腎細胞がんにおいて、E3リガーゼArkadiaがスプライシング制御因子ESRP2をユビキチン化しスプライシング能を増強することを生化学的に見出し、その結果、がん細胞の増殖が抑制されていることが明らかとなった。さらに、データベースのデータ解析により、明細胞型腎細胞がんにおいてArkadiaは予後良好因子であることを見出した。今年度は、The Cancer Genome Atlas (TCGA)のオープンリソースのがん患者のがん部と非がん部のRNAシーケンスによる網羅的な発現データの解析を複数種のがんにおいて行い、その結果、スプライシング制御因子であるESRP1の発現が顕著に低下しているものの、ESRP2の発現は保たれている明細胞型腎細胞がん(ccRCC)に着目して、ESRP2に関する詳細な検討を行った。本検討の予備実験から、ESRP1およびESRP2がE3リガーゼArkadiaおよびWWP1と相互作用していることが示唆されるデータを得ていたが、本年度はまず、Arkadiaに着目して検討を行った。TCGAから取得したccRCCの患者データの解析から、ESRP2が機能的に制御されていることが示唆される結果を得た。さらに、生化学的な検討を詳細に進め、ArkadiaがESRP2のどのリジン残基をユビキチン化しているか同定し、さらに、ArkadiaによるESRP2のユビキチン化の結果、ESRP2のスプライシング機能が調節されていることを見出した。Arkadiaは、TGF-betaシグナルに作用するE3リガーゼであるが、ccRCCの細胞株であるOS-RC-2細胞、および腎臓細胞であるHEK293T細胞で、TGF-beta刺激を行うと、ArkaidaおよびESRP2の発現が低下することを見出した。このことから、ArkadiaによるESRP2のスプライシング機能調節はTGF-betaシグナル非依存的であることが示唆された。OS-RC-2細胞でRNAシーケンスを行い、ESRP2とArkadiaの作用を網羅的に調べたところ、ESRP2またはArkadiaのノックダウンにより細胞増殖因子の発現上昇が認められ、ccRCCにおいては、ESRP2およびArkadiaが、がん抑制的に働いていることが示唆された。Epithelial splicing regulatory protein(ESRP)は、がんの予後良好因子とも予後不良因子とも報告があり、より詳細な検討が必要である。ESRPの制御については、転写レベルでの報告しかなく、今回研究代表者がESRP結合分子としてE3リガーゼring finger protein 111(RNF111/Arkadia)を見出したことから、ESRPがタンパク質レベルでの制御を受けている可能性があり、機能制御に着目しながら、ESRPが、がんでどのような役割をしているのかについて明らかにすることを目的とした。初年度は、The Cancer Genome Atlas (TCGA)のがん患者のがん部と非がん部のRNAシーケンスによる網羅的な発現データの解析を行い、その結果、ESRP1の発現が顕著に低下しているものの、ESRP2の発現は保たれている明細胞型腎細胞がん(ccRCC)に着目して、ESRP2に関する詳細な検討を行った。本検討の予備実験から、ESRPに結合するArkadiaに着目して検討を行った。さらに、生化学的な検討を詳細に進め、ArkadiaによるESRP2のユビキチン化の結果、ESRP2のスプライシング機能が調節されていることを見出した。ESRPとArkadiaの作用を網羅的に調べるためにOS-RC-2細胞でRNAシーケンスを行った。今年度は、初年度に得られたOS-RC-2細胞でのRNAシーケンスの解析を詳細に行うとともに、RNAシーケンスのバリデーションを行い、フェノタイプに関するアッセイを行った。本検討から、ccRCCにおいてArkadiaはESRP2を調節することでがん抑制的に働くことを明らかにし、成果について論文を発表した。当初、ArkadiaとWWP1の2分子について、ESRP1およびESRP2との相互作用が認められたが、今年度は、Arkadiaについてのみ、詳細な検討を行った。The Cancer Genome Atlasからのデータ解析により、明細胞型腎細胞がんに絞っての検討となった。ArkadiaとWWP1による、スプライシング制御因子ESRP1およびESRP2の制御の可能性については、当初の計画では、さまざまながん種で検討を幅広く行う予定だった。しかしながら、今年度は、明細胞型腎細胞がんについて、ArkadiaによるESRP2の機能制御に関してのみの検討となった。当初の計画より、フォーカスは絞られたものの、TCGAのccRCCの患者データの解析から、ArkadiaによるESRP2のスプライシング機能調節を示唆するデータが得られ、また、生化学的、分子生物学的な詳細なArkadiaによるESRP2の制御機構を明らかにすることができ、さらにccRCCの細胞株を使ったRNAシーケンスによる網羅的な解析が進み、ESRP