hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
御産・御悩の御祈にみる中世成立期の政治と宗教

2.御産・御悩の御祈に関するデータベースの入力作業:中世成立期真言密教の百科事典的書物と評される『覚禅鈔』は、仏教史だけでなく政治史・外交史など当該期の多彩な研究分野から注目されている史料である。本年度は『覚禅鈔』の年号・書名索引の入力作業を完成させ、本研究課題の基礎的データを蒐集した。また関係諸分野に広く貢献する『覚禅鈔』年号・書名索引の公表にむけて校正作業にも着手した。3.研究成果の発表:1(1)『覚禅鈔』諸本の調査で得られた結果を東大共同研究の研究会にて口頭発表し、1(2)の結果を論文としてまとめ、奈良女子大学古代学学術研究センターの雑誌『古代学』に投稿し採用された。また、これらの史料調査・蒐集の中で、御産・御悩の御祈の一つの転機は12世紀後半にあることが明らかになり、当該期に成立した平氏政権による福原遷都を政治・宗教政策の一環としてとらえなおし口頭発表するなど、御産・御悩の御祈の研究を契機に中世成立期の政治と宗教の関係性を多面的にとらえる研究成果を導き出すことができた。本研究の目的は王家の御産・御悩の御祈を分析することで日本中世成立期の宗教の政治的機能の特色と変遷を明らかにすることにある。最終年度である平成24年度は2年目までのデータベース作成・史料調査を継続し(下記1)、その成果を研究報告や論文の形で発表し(下記2)、本研究課題の解明をめざした。1.データベース作成・史料調査:本研究課題の中心史料『覚禅鈔』の年号・書名索引は、前年度に入力作業が終了したため、本年度は校正作業を行い、精度を高めた。その過程で不明確な箇所は東京大学史料編纂所の写真帳・高野山大学図書館の原本などで追加調査を行い『大正新脩大蔵経』の底本である勧修寺本よりも情報量が多い諸本を確認した。これにより仏教史・政治史・外交史など多分野から注目されている『覚禅鈔』の情報を補填することができた。また御悩の御祈の対象ともなる内侍所神鏡について聖教類・日記史料の蒐集・調査を行った。2.調査結果の考察・発表:『覚禅鈔』データベースをもとに考察を進めた結果、『覚禅鈔』には真言宗・天台宗・大陸・神道関係の教義が反映されていること、その情報収集の方法には独特の傾向があることが判明し、論文執筆を進めた。また、1での史料蒐集・調査から、12世紀後半に政治と宗教の関係が変化する可能性があると考え、奈良女子大学古代学学術研究センター研究会「福原の時代」で「福原遷都と伊勢」と題して発表した。この研究発表の一部を論文「中世成立期の平安京と内侍所神鏡」と題して執筆し雑誌『奈良歴史研究』への掲載が許可された。拙稿では、アマテラスを正体とする内侍所神鏡・平安京・天皇との関係性の変化を整理して福原遷都を機に内侍所神鏡=アマテラスが平安京と空間的に結びつくことで「万代の都」平安京の言説化が進展することを明らかにし、中世成立期の宗教の政治的機能を都市史・政治史と関連させて説明することができた。全130巻に及ぶ入力作業に膨大な労力を要する『覚禅鈔』の書名・年号索引の入力作業を終了させ、本研究課題達成のための基礎的データの整理が終了しているため。また、査読付論文を執筆し、本研究課題の基本的方向性を明らかにすることができ、本研究課題の目的達成のための研究計画が着実にすすめられているため。今年度は、昨年度までに調査・蒐集した史料をもとに、本研究課題の考察を深め発表することをめざす。本研究課題の基礎データとなる『覚禅鈔』の書名・年号索引は1200頁に及ぶことが明らかになった。このため、今年度は書名・年号の全件データベースの公開ではなく、真言密教僧の覚禅が主要参考文献とした書のうち、他宗派との関係性が明確になるデータ(天台僧安然著『諸阿閣梨真言密教部類惣録』・天台僧静念著『行林抄』など)などの整理及び考察結果の発表をめざし、御産・御悩の御祈を宗教界の構図全体と関係させながら考察する。また、御産・御悩の御祈が大きく変化した事が明らかになった後白河院政期の政治と宗教の関係性についての考察を深めるため、当該期の帝都観と宗教の関係性について考察し、発表する予定である。
生物時計再構成系の動的秩序探究

シアノバクテリアの生物時計は3つの時計タンパク質KaiA,KaiB,KaiCによって構成されている。3つのタンパク質が離合集散し、KaiCのリン酸化状態が約24時間周期で変動する。KaiAとKaiBはKaiCとの結合を周期的に変動させており,Kaiタンパク質これらとの複合体の形成は概日リズム形成に重要である。中心振動体として働くKaiCは、CIドメインとCIIドメインとよばれる2つのドメイン構造からなる。今回、六量体KaiCを構成する2つのリング構造を個別に精製し、それぞれのドメインの機能解析を実施した。精製タンパク質を用いて、リン酸化状態の解析およびゲル濾過クロマトグラフィーにより多量体構造変化を解析した。その結果、CIIリングがリン酸化修飾されることで、六量体から単量体に解離することを見出した。さらに、リン酸化されるアミノ酸残基を質量分析により同定したところ、KaiCの432番目に相当するスレオニン残基がCIIドメインでリン酸化されていることが明らかになった。一方、CIリングは常に安定な六量体を形成していることが確認できた。さらに、温度変化によるKaiCのリン酸化変動を詳細に解析した。KaiCは4°Cにおいては、リン酸化状態は上昇し、30°Cにおいては低下することが知られている。そこで、4°Cから30°Cにおける温度範囲でのリン酸化の変動を解析した。リン酸化状態は10°Cを境に、それ以下の温度では上昇し、それ以上の温度では低下した。一方、CIIリングでは、温度が高くなるほど、リン酸化状態は大きく変動することが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。シアノバクテリアの生物時計は3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCとATPによってin vitroで再構成可能である。中心振動体であるKaiCのリン酸化状態が概日周期をもって変動する。本研究では、KaiCにCBB依存的に分離する2つの構造状態(gs-KaiCとcs-KaiC)があることを見出した。BN-PAGEを用いて時計タンパク質の高次構造の動態を解析した。BN-PAGEでKaiCは主に2つのバンドとして検出された。ところが、KaiCをゲル濾過クロマトグラフィーで分離すると、見かけの分子量で六量体にあたる位置に単一のピークで溶出され、BN-PAGEの結果と一致しなかった。これらの挙動の違いは、BN-PAGEで添加するCBBによって引き起こされたのではないかと推測し、KaiCにCBBを添加してNative PAGE解析に供した。その結果、CBBを添加したときに限り、KaiC単量体と思われるバンドが検出された。このことから、KaiC六量体には、CBB存在下でも六量体を維持する構造状態(gs-KaiC)とCBB存在下で解離する構造状態(cs-KaiC)が存在することが明らかになった。また、野生型KaiCおよびリン酸化模倣の変異型KaiCの構造状態をBN-PAGEで解析した。両残基ともにリン酸化された状態(pS/pT)を模倣したKaiC-DEと初期脱リン酸化状態(pS/T)を模倣した変異型KaiC-DTでは共にgs-KaiCの割合が極めて低く、ほぼすべての分子がcs-KaiCの状態にあった。これらの変異型KaiCのKaiBとの結合を調べたところ、KaiC-DEおよびKaiC-DTのみがKaiBと結合した。KaiCがcs-KaiCになることで複合体が形成されることが明らかになった。本年度は、主に中心振動体KaiCの挙動変化を解析した。BN-PAGEでの実験結果を基に、新たな構造変化を見出すことができた。今回見出した構造変化が生じる分子的な要因を明らかにするため、KaiCのCIおよびCIIドメインに着目する。
グルタミン酸輸送蛋白を介する神経変性疾患治療薬の開発

アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は神経細胞の脱落によって生じる。神経細胞の死滅を引き起こす一つの要因としてグルタミン酸によるカルシウム流入が挙げられている。グルタミン酸の起源として神経終末からのグルタミン酸放出が想定されていた。われわれの研究によって、細胞外ナトリウムなどの細胞外の電解質濃度を変化させるとグルタミン酸輸送蛋白を介してグルタミン酸を細胞外に放出されることが明らかにされた。すなわち、脳虚血や頭部外傷が生じると脳の細胞が損傷を受けて、細胞内外のイオン濃度が異常になり、細胞外のナトリウム濃度が低下し、カリウム濃度が上昇する。このようなイオン濃度の変化によりグルタミン酸輸送蛋白が逆回転して正常状態ではグルタミン酸を取り込むはずのところが、グルタミン酸を放出するようになる。このようなグルタミン酸輸送蛋白の逆回転によってグルタミン酸が細胞外に放出されて、神経細胞死を招く可能性がある。そこで、グルタミン酸輸送蛋白によるグルタミン酸の放出を抑制する薬物を検索した。その結果、グルタミン酸類縁物質であるL-2-(carboxycyclopropyl)-glycineのアイソフォームのうちIII型とIV型がグルタミン酸放出に対して阻害することが明らかとなった。これらの薬物が神経変性疾患における神経細胞死を阻止するのに役立つ可能性があると考えられた。今後、さらに類似の構造を持つ薬物がグルタミン酸の放出を阻害するかを検索してゆく予定である。神経細胞が過剰のグルタミシ酸により傷害されて、神経変性疾患を起こすことはよく知られている。一般に、シナプスにおけるグルタミン酸濃度はグルタミン酸輸送蛋白によって調節されている。したがって、グルタミン酸輸送蛋白を介する神経変性疾患の治療について検討した。グルタミン酸輸送蛋白をアミノ酸エルゴット・アルカロイドとともに10分間プレインキュベーションすることによって、グルタミン酸に対する親和性を増すことを明らかにした。ブロモクリプチンなどのアミノ酸エルゴット・アルカロイドによるグルタミン酸輸送蛋白の機能増強作用はリスリドなどのアミン・エルゴット・アルカロイドでは認められない。また、アミノ酸エルゴット・アルカロイドの作用はドーパミンD1,D2受容体アゴニストやアンタゴニストの添加による影響は受けなかった。さらに、ブロモクリプチンには抗酸化作用があるところから、同様の抗酸化作用を持つビタミンEやdithiothreitolを添加したが影響はみられなかった。おそらく、アロステリック・サイトに作用して、蛋白代謝に影響するものと考えられる。一方、アルツハイマー病患者の剖検脳では海馬や前頭葉でグルタミン酸輸送蛋白のうち、グリアに存在するGLT1やGluT1の発現が低下していることを明らかにした。これらのグルタミン酸輸送蛋白の発現は小脳では対照群と差がみられなかった。アルツハイマー病では神経細胞は減少するが、アストログリアなどのグリア細胞は増加するので、GLT1やGluT1といったグルタミン酸輸送蛋白は増加することが予想される。しかるに、それらグルタミン酸輸送蛋白の発現が減少していたのはグルタミン酸の放出低下によるグルタミン酸輸送蛋白の発現低下を反映しているものと考えられる。それにより、神経の変性が加速されるものと考えられる。神経変性疾患の代表的な疾患としてアルツハイマー病患者剖検脳の諸部位におけるグルタミン酸輸送蛋白の多型性を対照群剖検脳と比較・検索したその結果,グルタミン酸輸送蛋白の一種であるGLT1のアルツハイマー病脳における。mRNAの発現が前頭葉皮質表層,深部,海馬CA1領域,歯状核にて正常対照剖検脳より有意に低下していた。ヒト・グルタミン酸輸送蛋白(GluT1)のcDNAをHeLa細胞に発現させ,グルタミン酸の取り込みのアッセイ系を確立した。その系ではグルタミン酸の取り込みは細胞外のナトリウム・イオンを必要としたが,クロライド・イオンは必要としなかった。この取り込みはL-アスパラギン酸,D-アスパラギン酸,DL-threo-β-hydroxyaspartate,L-cysteine sulfinateなどの薬物によって阻害される。また,L-2-(carboxy cyclopropyl)

glycine(L-CCG)の種々のアイソフォームのグルタミン酸取り込みへの影響を調べた。その結果,L-CCG-IIIおよびIVがグルタミン酸の取り込みを著明に阻害した。その結果,グルタミン酸がfolded formにて取り込まれることが明らかになった。グルタミン酸取り込みを促進させる物質として,エルゴット・アルカロイドがあることを明らかにした。エルゴット・アルカロイドの中でも,ergotamine,bromocriptine,dihydroergotamineなどのアミノ酸エルゴット・アルカロイドがグルタミン酸の取り込みを促進した。しかし,ergonovine,lisurideなどのアミン・アルカロイドにはグルタミン酸取り込み促進作用はみられなかった。アミノ酸エルゴット・アルカロイドなどの薬物はアルツハイマー病脳などで低下したグルタミン酸取り込み能を活性化し,細胞死を防御すると考えられる。アルツハイマー病やパーキンソシ病などの神経変性疾患は神経細胞の脱落によって生じる。神経細胞の死滅を引き起こす一つの要因としてグルタミン酸によるカルシウム流入が挙げられている。グルタミン酸の起源として神経終末からのグルタミン酸放出が想定されていた。われわれの研究によって、細胞外ナトリウムなどの細胞外の電解質濃度を変化させるとグルタミン酸輸送蛋白を介してグルタミン酸を細胞外に放出されることが明らかにされた。すなわち、脳虚血や頭部外傷が生じると脳の細胞が損傷を受けて、細胞内外のイオン濃度が異常になり、細胞外のナトリウム濃度が低下し、カリウム濃度が上昇する。このようなイオン濃度の変化によりグルタミン酸輸送蛋白が逆回転して正常状態ではグルタミン酸を取り込むはずのところが、グルタミン酸を放出するようになる。このようなグルタミン酸輸送蛋白の逆回転によってグルタミン酸が細胞外に放出されて、神経細胞死を招く可能性がある。そこで、グルタミン酸輸送蛋白によるグルタミン酸の放出を抑制する薬物を検索した。その結果、グルタミン酸類縁物質であるL-2-(carboxycyclopropyl)-glycineのアイソフォームのうちIII型とIV型がグルタミン酸放出に対して阻害することが明らかとなった。これらの薬物が神経変性疾患における神経細胞死を阻止するのに役立つ可能性があると考えられた。今後、さらに類似の構造を持つ薬物がグルタミン酸の放出を阻害するかを検索してゆく予定である。
IgA腎症における免疫複合体形成機序の解明と新規治療法の開発

TLR9の発現増強や、サイトカインの刺激により、糖鎖構造・糖鎖修飾酵素の活性化が誘導され、糖鎖異常IgA1や糖鎖異常IgA1特異的IgGの産生が亢進することが示され、扁桃を主とした異常な粘膜免疫応答により、IgA腎症の病態において重要な免疫複合体が形成されることが示された。血中バイオマーカー(糖鎖異常IgA1、糖鎖異常IgA1特異的IgG、およびIgG-IgA免疫複合体)を測定することで、扁桃摘出術の適応と治療効果判定に応用できると考えられた。IgA腎症の病態における糖鎖異常IgA1産生と免疫複合体形成機序を解明するために、今年度では、まずIgA腎症患者の末梢血および摘出された扁桃よりB細胞を抽出し、EBウイルスで不死化し、IgA1-およびIgG産生細胞株を樹立することに成功した(n=5ずつ)。引き続き、CpGを用いたTLR9の発現増強やIL-6などのサイトカインでの刺激によるIgA1の糖鎖構造・糖鎖修飾酵素の活性化やIgG産生細胞株での糖鎖異常IgA1特異的IgGの産生が亢進するかを検証しているところである。本症の診断および活動性を評価する非侵襲的な方法を生み出すために、血中糖鎖異常IgA1・糖鎖異常IgA1特異的IgG抗体価およびIgA抗体価、IgG-IgA免疫複合体、および尿中糖鎖異常IgA1などのバイオマーカーの測定系を樹立した。これらを用いて、IgA腎症患者、IgA腎症以外の腎症患者、健常人の血清および尿サンプルを収集し、上述したバイオマーカーを測定している。IgA腎症は、多因子疾患であり、その成因と病態が複雑であるがために、ひとつのバイオマーカーよりも複数のバイオマーカーを組み合わせることで、診断・疾患活動性の評価に有用であることが基礎データとして示された。本症における扁桃B細胞の役割を解明するため、扁摘後の血中バイオマーカーの推移と治療反応性との関連を解析した。IgA腎症に対して扁桃摘出(扁摘)治療を行い、治療経過をフォローできた患者(15症例)の血液サンプル(扁摘前後、治療1年後)を用いて、バイオマーカー(血中糖鎖異常IgA1、糖鎖異常IgA1特異的IgGおよびIgA1-IgG免疫複合体)を測定し、扁摘が有効であった症例では、各バイオマーカーが優位に低下しており、扁桃B細胞がIgA腎症の病態に深く関与していることが示された。来年度は、さらに長期的な経過を解析する予定である。IgA腎症の病態における糖鎖異常IgA1産生と免疫複合体形成機序を解明するために、今年度では、まずIgA腎症患者の末梢血および摘出された扁桃よりB細胞を抽出し、EBウイルスで不死化し、IgA1-およびIgG産生細胞株を樹立することに成功した(各n=10)。CpGを用いてTLR9の発現を増強させると、また、IL-6での刺激によって、IgA1の糖鎖構造・糖鎖修飾酵素の活性化やIgG産生細胞株での糖鎖異常IgA1特異的IgGの産生が亢進することが示され、粘膜での感染によって、これら免疫複合体を形成するIgA,IgGが産生されることが示された。実際に、これらの糖鎖異常IgA1と糖鎖異常IgA1特異的IgGが免疫複合体を形成することが確認され、ヌードマウスに連続投与したところ、血尿・蛋白尿が認められた。さらに電子顕微鏡所見では、糸球体上皮・内皮細胞障害が確認された本症における扁桃B細胞の役割を解明するため、2005年から2009年までに当院にて扁摘およびステロイドパルス療法が施行されIgA腎症患者25名を対象とした。扁摘前・扁摘後・ステロイドパルス終了後の血中および尿中のバイオマーカー(糖鎖異常IgA1、糖鎖異常IgA1特異的IgG、およびIgG-IgA免疫複合体を測定した。また、摘出された扁桃細胞を24時間培養し、培養上清中の糖鎖異常IgA1および糖鎖異常IgA1特異的IgGの産生量を測定した。尿所見異常の改善に伴い、血中糖鎖異常IgA1・糖鎖異常IgA1特異的IgG・IgA1-IgGICおよび尿中糖鎖異常IgA1値の有意な低下が認められ、扁摘パルス療法の治療効果が高い患者軍での扁桃細胞では、糖鎖異常IgA1特異的IgGの産生量が有意に高値であった。以上より、IgA腎症の病態において重要な役劃を担う糖鎖異常IgA1や糖鎖異常IgA1特異的抗体の一部は、口蓋扁桃由来であることが示唆された。
会計不正防止のための知識の集積とスピルオーバーによる市場モニタリング制度の構築

会計不正(財務諸表等の不正表示)は、投資家、規制当局、監査法人その他ステークホルダーにとって重大な問題である。本研究は、組織に集積された知識がアクター(監査人)の強制的交代などにより市場全体にスピルオーバーするメカニズムを解明し、最適モニタリング構築の政策要件を明らかにする。
複合化ナノ空間セラミックスの創製

前駆体溶液を用いて代表的な多孔性材料であるミクロポーラスシリカと金属酸化物微粒子の複合体の合成手法を検討した。出発前駆体、溶媒、反応温度を精密に制御して調製し得られた前駆体の熱分解挙動、分子構造変化を解析した。この結果に基づいて焼成して得られた複合化ナノ空間セラミックス試料について、結晶構造解析、微細構造解析、ガス吸着特性評価を行い、吸着サイトの特定化について考察した。さらに、金属粒子分散シリカを用いてカーボンマイクロコイルの作製に成功し、カーボンマイクロコイルの成長機構について考察した。前駆体溶液によるその場形成法を用い,ミクロポーラスアモルファスシリカと金属酸化物微粒子の複合体の合成手法を検討した。出発前駆体,溶媒,pH,反応温度を精密に制御して調製し、得られた前駆体の熱分解挙動をTG-DTAで解析した。この結果に基いて焼成して得られた複合化ナノ空間セラミックス試料について、結晶構造解析、微細構造解析、およびガス吸着特性評価を行った。多段階の圧力制御による定容法ガス吸着測定装置を用いて,各温度での二酸化炭素の可逆吸着量の圧力依存性を調べた結果、導入金属種により、二酸化炭素吸着能に差があることが判明した。また、複合化ナノ空間セラミックス試料として合成に成功したニッケル粒子分散シリカを用いてCVD法で作製したカーボンマイクロコイルの微構造解析を進めた。CMCの成長先端部分を樹脂に包埋し、集束イオンビーム(FIB)法を用いて、触媒粒子の断面形状を特定化するために、三次元解析を行い、また、FIB法で切り出した触媒粒子の断面試料について、透過電子顕微鏡観察(TEM)を行った。コイル先端部分にNi元素が分析され、これが触媒粒子であり、Tip-growth型の成長先端が観測された。この触媒粒子は、fcc-Niから、R-3C構造をもつNi3Cへ構造変化していること、また、ファセット構造を有していることが明らかとなった。複合化ナノ空間セラミックスを合成し、評価解析することで、新規なガス吸着特性や、CMC合成触媒としての展開の可能性が明らかになった。前駆体溶液によるその場形成法を用いてミクロポーラスシリカと金属酸化物微粒子の複合体の合成手法を検討した。出発前駆体、溶媒、反応温度を精密に制御して調製し得られた前駆体の熱分解挙動を、分子構造変化を解析した。この結果に基いて焼成して得られた複合化ナノ空間セラミックス試料について、結晶構造解析、微細構造解析、二酸化炭素の吸着特性評価を行い、可逆吸着サイトの特定化について考察した。また、シリカにナノ金属微粒子を析出した材料系における走査透過電子顕微鏡解析手法を確立した。複合化ナノ空間セラミックスとして合成に成功したニッケル粒子分散シリカを用いてカーボンマイクロコイルの作製を試み、微細構造解析を行った。さらに、ニッケル微粒子を触媒粒子としてCVD法で作製したカーボンマイクロコイルについて透過型電子顕微鏡で微細構造解析を行い、カーボンマイクロコイルの形成メカニズムについて検討した。CMC繊維先端は、成長先端であり、触媒は、CMCの成長面に対して3回対称の構造を有するNi3Cであり、さらに、CMC断面組織についても3回対称のドメインを有していることから、Ni3C触媒がCMCの優先方位成長に大きく関わっていることが判明した。本研究では、化学的溶液法を用いて、複合化ナノ空間セラミックスの合成および解析手法の確立を目的とした。平成23年度は、(1)ミクロポーラス材料に、金属酸化物ナノ粒子が高密度に分散した複合化ナノ空間セラミックス材料、(2)ナノ粒子分散複合微粒子の作製を進め、これらの生成挙動解析および微細構造解析を進めた。(1)においては、金属(M)ナノ粒子分散シリカの生成挙動について詳細な解析を行った。化学溶液法で合成した前駆体粉末について、各温度における分子構造、熱分解挙動、化学結合について解析した。また、合成試料の透過電子顕微鏡、走査透過型電子顕微鏡による微細構造解析を行い、複合化組織の解析手法についても検討を行った。また、金属粒子分散シリカを用いて作製したカーボンマイクロコイルの構造解析を進める上で必要となる透過型電子顕微鏡による観察手法の確立を進めた。(2)においては、化学溶液法で作製したIn2O3ナノ粒子膜表面に数nmのAu、Pd、Ptナノ結晶を製膜した試料を、走査透過型電子顕微鏡により微細組織を観察した。In2O3ナノ粒子膜に分散したAuナノ粒子では安定面である(111)のファセット構造が観察できた。また、各種ガスセンサー特性を評価した結果、水素には、Pd添加系、COには、Pt系、H2Sには、Au系を添加した試料がそれぞれ特性が向上した。以上のように、化学合成法を駆使することにより、複合化微細組織制御を行うことで、特徴的な構造と機能発現の相関性の構築が期待できる。微構造制御複合化

セラミックス材料の作製法、構造解析法、ガス吸着特性評価について、H24年度の研究目的をおおむね達成している。微構造制御複合化セラミックス材料の作製法、構造解析法について、初年度の研究目的をおおむね達成している。当初の計画通りに研究を推進する。合成した試料について、微構造解析等の構造解析を行うとともに、特徴的な構造と機能特性との相関性について議論する。合成した試料について、微構造解析等の構造解析を遂行すると共に、特徴的な構造と機能特性との相関性についても検討を進める。当初の計画通りに研究費を使用する予定である。23年度導入計画を進めていた装置については、24年度に導入予定である。
東アジアの中における日本先史文化の位置づけ

日本の旧石器時代、縄文時代、弥生時代、以後の北海道の文化について、石器、土器、骨角器その他の遺物、住居、墓制などをとりあげ、各時代における文化領域の広がりを明らかにし、その変化を追跡した。また各時代について、どの程度日本列島に独特で固有の文化領域があるのか、東アジア全体の視野で考察した。1.佐藤は後期旧石器時代について、環日本海地域という広く弱いまとまりの中に日本列島諸地域のまとまりがあり、時間の進行とともに小地域差を顕在化させていく過程が明らかにした。2.今村を中心とする縄文時代については、各種文化要素の比較から、列島内における地域差よりもはっきりとした差が北は宗谷海峡、西は朝鮮海峡、南は沖縄本島の南側に引かれることが明らかにされた。九州は縄文時代をほぼ通じて独自の地域色を示すが、奄美諸島、沖縄諸島と南下するにつれてその文化要素が順次減少していく。このことは沖縄諸島の文化が縄文文化の延長上の位置することを示す。3.後藤を中心とする弥生時代には朝鮮と北部九州の間での文化要素の共有がかつてなく高まるが、基本的な地域差も継続する。北部九州から東に北に移動するにしたがって文化要素が漸次脱落する傾向が著しい。4.宇田川・熊木による北海道は、縄文時代以降近世まで、独自性と本州との交流が交錯しながら推移する。さらに北方の樺太千島地域との関係を示す証拠は、縄文期には少なく、続縄文期にやや高まる。特異な位置を占める石刃鏃やオホーツク文化を除くと北方との関係が主流になることはないようである。本課題の成果については、報告の原稿量が大きいこと、広く一般への還元を行なう価値があるので、研究成果公開促進費を申請し、学術図書として出版する予定である。今年度はまず全体の打ち合わせでこのテーマにかかわる研究上の問題点を洗い出し、そのうえでの研究方針について再確認と細部の設定をおこなったうえで、本年度の課題である石器による日本先史文化の位置づけに必要なデータの収集を行った。この作業は、東京大学考古学研究室所蔵の発掘調査報告書から縄文時代の石器の組成をデータとして収集することが中心になった。報告書名と遺跡名のデ一タは機械的に入力することができたが、石器組成のデータに関しては、所属する時期、石器の分類など、アルバイトの人たちだけでは機械的に行えない問題が続出し、作業は難航した。旧石器時代については日本列島における石器の種類と分布状況が相当に詳しく知られており、その知識が研究者の間で共有されているといってよいので、新たにロ-データの収集は行わず、むしろ日本の周辺地域の石器の種類と分布の研究が主要な課題となった。また全体での研究会を4回開催し、大陸の土器の大きな把握と、大陸と比較したときの日本の土器の特徴(大貫)、日本文化の北(宇田川・熊木)と南(今村)の限界、旧石器時代における大陸と日本の関係(佐藤)、朝鮮文化と日本文化はどう異なるか(後藤)などの問題について発表、討論が行なわれた。これは今回の研究成果というわけではなく、これまで研究代表者と研究分担者がこの問題をどうとらえていたのかを出し合い、重ね合わせることにより「日本文化」の姿をとらえようとする試みであり、多くの新しい見方が得られた。「日本文化」の範囲はたとえば対馬、樺太という定点を見ると変化していることがよくわかる。また基本的資科の収集と現地調査が、沖縄(今村)、鹿児島(佐藤)、北海道(安斉)九州(後藤)などでおこなわれた。本年は昨年度の石器についての基礎データ収集に加えて土器を研究の中心とした。土器については数量化が難しく、記述的方法で各自の分担を決めて進行した。今村は主に南西諸島の土器をもって縄文土器の限界と先島諸島、台湾の土器について研究したが、沖縄の土器について文様帯の系統という観点から本土との関係を探った。

宇田川、熊木は北海道の土器についてとくに続縄文・オホーツク・擦文土器の研究を行った。これらはいずれも歴史的日本文化の範囲を考えるのに重要な土器群である。また後藤直は朝鮮無文土器が日本に進出し拡散消滅していく過程を中心に研究した。このように今年はとくに日本の縁辺部をその周囲の地域と土器によって比較することとなった。一方大貫は日本先史文化の東北アジアでの位置付けという広い観点からの研究を続け、その成果は『東北アジアの考古学』(同成社)に盛り込まれた。また佐藤宏之は専門が旧石器時代であるため、南西諸島の旧石器文化について現地調査を中心に研究をおこない、旧石器時代における日本列島的文化の南限という問題にとりくんだ。なお今村が編集した季刊考古学66号(特集:日本と南海の考古学)は東南アジアとの比較において日本の先史文化の理解を進めようという意図のもとに編集されたもので、本研究課題の成果が随所に,組み込まれている。本年度も3回の研究連絡と発表討論の会をもったが、個々の研究成果の発表のほか、文化圏とは何か、それはどのようにしてとらえられるのか、民族や国家とどのような関係にあるのかという根本的な問題について白熱した議論が展開された。この問題には安斉正人が専門とする考古学の方法論的研究が大きなかかわりを持つ。本年度は石器、土器以外の遺物および遺構を中心に研究を進めた。しかしそのすべてを扱うことは困難であり、骨角器のうち銛頭、宗教的遺物のうち土偶と石棒、遺構については住居址のデータ収集と分析が中心になった。とくに北方の銛頭を宇田川が、土偶を今村が、住居址を大貫がとりあげた。また後藤は日本と朝鮮の農耕を中心とする生業の差を検出することに努め、熊木はオホーツク文化の位置付けを検討した。どの分野についても相当な数の先行研究があり、その把握が最初の課題となった。また先行研究の成果を総合し、日本全体の位置付けを求めることが意識的に進められた。銛頭についてはこれまでとりあげた土器や石器に見る地域差と違って、日本列島内での地域差が非常に大きく、北海道の銛頭は独白の伝統を保持して展開する。この種の遺物が縄文文化の範囲よりもむしろ環境に大きく関係する性質のものであることが示された。土偶についても同様に日本列島内における変異が大きく、日本の中央部ではこれが早くからあるが,縄文文化の分布圏ほぼ全体に広がるのは後期のことである。住居址については、竪穴住居という型式が資源的状況に原因する生業形態と定住性に強く関連すること、そのアジアにおける広がりの過程が暖房施設の発達と密接な関係をもつことが大貫によって明らかにされた。そのほか今村は沖縄の八重山地域と台湾の現地調査を行ない、多くの情報を得るとともに日本的文化の南限の問題に取り組んだ。本年は10月と1月に調査の報告会と討論会をもち、これまでの成果を振り返るとともに、残すところ1年となったこの課題の調査報告書のまとめ方について意見が交換された。基本的には研究成果公開促進費による出版助成費を申請し、単行本の形での出版を目指すことになった。本年度はまとめとして平成9年度の土器、10年度の石器、11年度の遺構等によって得られたデータの重ね合わせと全体像の把握を中心的課題とした。
培養不能微生物のゲノム解析

地球上の99%以上の微生物種は培養法が不明であり、その生理・生態はほとんど未知である。本研究では、シロアリ腸内に共生する培養不能細菌の1種の少数細胞から、DNA合成酵素を使用することで全遺伝子情報を1千万倍に増幅して完全解読する手法の確立を試み、世界で初めて成功した。これにより、これまで詳細が不明であったシロアリと腸内原生生物、腸内細菌の複雑な3者共生機構を世界で初めて明らかにした。シロアリ腸内には大量かつ多様な細菌が存在し、餌である枯死植物の分解発酵や空中窒素固定など、宿主シロアリに必要不可欠な役割を担っている。これらの細菌の99%は現時点で培養不能であり、報告者(本郷)らは培養を介さない方法によって群集構造と腸内局在解明を試みてきた。しかし、これら未培養細菌の機能解明には新たな手法の確立が必要であり、それが本研究課題の中心である。近年、培養不能細菌のメタゲノム解析法が普及し、昆虫共生細菌を含むいくつかの培養不能細菌種のゲノム全長と、推定される機能が報告されてきた。しかしシロアリ腸内は多くの自然環境同様に細菌種が極めて多様であり(腸あたり推定700-1200種)、単一あるいは単純な構成の細菌群の大量回収は不可能で、こうしたアプローチはとれない。そこで報告者は、ある種の酵素を用いて少ない細胞数からゲノムを増幅し、特定のシロアリ共生細菌種の、ゲノム配列解析による機能解明を目指した。報告者が標的としたのは、分類学的新規性が極めて高い"Termite Group 1(TG1)"門細菌である。報告者らのグループが発見したこの新門細菌群は未培養だが、ある種のシロアリ腸内原生生物の細胞内絶対共生細菌であることを明らかにした。そこで、その宿主原生生物を分離し、ゲノムの増幅を行った。得られたサンプルを理研ゲノムセンターでショットガン及びパイロシーケンス法によって配列解析し、ゲノム全長のほぼ完全な再構築に成功した。現在アノテーション(遺伝子同定)中であるが、TG1細菌のエネルギー、炭素、窒素代謝など基本的な代謝経路を解明しつつある。培養株の存在しない細菌門のゲノム全長配列解析はほとんど例がなく、微少量細胞を出発点とするゲノム解析系を確立したという点でも大きな意義があった。得られたサンプルを理研ゲノムセンターでショットガン及びパイロシーケンス法によって配列解析し、ゲノム完全長配列取得に成功した。得られたゲノムは通常の細菌ゲノムに比べ縮小しており、原生生物と相利共生するように特異的な進化を遂げてきたものであることが示唆された。しかし、これら米培養細菌の機能解明には新たな手法の確立が必要であり、それが本研究課題のテーマであった。報告者は、ファージ由来のPhi29 DNA合成酵素を用いてわずか数百個の細菌細胞からゲノムを全増幅して、未培養細菌ゲノム完全長の取得を試みた。報告者が標的としたのは、ヤマトシロアリ腸に共生するセルロース分解性原生生物Trichohymha agilis(トリコニンファ・アギリス)の、さらにその細胞内に共生するRS-D17細菌(未培養審問Termite Group1に属する細菌の1種)である。上記手法によりDNAサンプルを調製して配列解析したところ、1.1メガ塩基対の同細菌の環状ゲノム完全長取得に成功した。

ゲノム配列から、この細菌は細胞壁合成系・防御系、自己複製調節機構など多くの遺伝子群を失っている一方で、アミノ酸合成系など窒素代謝系遺伝子を豊富に維持していることが明らかとなった。これにより、この細菌が、シロアリの餌である木材に欠乏する必須アミノ酸などを合成して宿主原生生物とシロアリに供給するという、相利共生を行っている事が強く示唆された。この成果は米国科学アカデミー紀要に掲載され、理化学研究所からプレスリリースされた。現在、報告者が確立した同手法を用いて、数種類の難培養性細菌ゲノムを解読済みあるいは解読中であり、順次学会・論文発表していく。
シャペロン介在性オートファジーの神経変性疾患・精神疾患発症への関与解明

本研究はリソソーム系タンパク質分解の中で研究の進んでいないシャペロン介在性オートファジー(CMA)とミクロオートファジー(mA)の活性を別々に評価する実験方法を開発し、神経疾患への関与解明を行うこととした。申請者が過去に報告したGAPDH-HTをレポータータンパク質として用いる方法にCMA及びmAにそれぞれ関与する分子のノックダウンを組み合わせることで、CMAとmA活性をそれぞれ評価する方法の開発に成功した。さらには薬物誘発パーキンソン病モデルにおいて、CMA/mA活性が低下することやCMA活性化薬により細胞死が抑制されることを示し、パーキンソン病発症におけるCMA/mAの関与が示唆される。シャペロン介在性オートファジー(CMA)活性を簡便に評価するために、そのマーカータンパク質であるGAPDH-HaloTag (GAPDH-HT)を安定的に発現する細胞をFlp-Inシステムを用いて作製した。GAPDHはHsc70により認識されるCMA基質として知られており、本研究で用いる活性評価法はGAPDH-HTのリソソームへの移行を指標としている。最近、哺乳細胞ににおいてHsc70を介して後期エンドソームに基質が取り込まれるとの報告がなされ、これが哺乳細胞におけるミクロオートファジー(mA)ではないかと提唱された。よって、GAPDH-HTによる活性評価はCMAだけでなくmAの活性も反映している可能性がある。そこで、GAPDH-HT発現細胞において、siRNAによりCMA関連タンパク質LAMP2A及びmA関連タンパク質Rab7のノックダウンを行うことで、GAPDH-HTのリソソーム集積が影響を受けるかを検討しところ、GAPDH-HTのリソソーム集積はそれぞれ有意に抑制されたが、いずれも単独では完全に抑制することはできなかった。Rab7ノックダウン時のGAPDH-HTリソソーム移行はCMAを、LAMP2Aノックダウン時の移行はmAを反映していると考えられ、この系を用いることで、CMAとmAの両者の活性を評価することが可能であることが示唆された。遺伝性パーキンソン病PARK7はタンパク質DJ1の機能低下が原因で発症するが、その詳細な分子メカニズムは不明である。この発症メカニズムにCMAあるいはmAが関与するかを検討するため、GAPDH-HT発現細胞にDJ1のノックダウンを行い、GAPDH-HTのリソソーム移行を検討したところ、GAPDH-HTのリソソーム移行が亢進していた。よって、DJ1機能低下によりCMAもしくはmAの活性異常が引き起こされることが示唆された。申請者は前年度までにリソソームタンパク質分解系の一つであるシャペロン介在性オートファジー(CMA)の活性を評価するマーカータンパク質であるGAPDH-HaloTag (GAPDH-HT)を安定的に発現する細胞株を確立し、GAPDH-HTの細胞内へのドット状集積によりCMAだけでなくリソソームタンパク質分解系の別経路であるミクロオートファジー(mA)の活性評価も可能であることを解明した。この新規評価系を用いて、これまでにCMAを活性化すると報告されているミコフェノール酸(MPA)とレチノイン酸受容体アンタゴニストの一つであるLE540がCMAだけを活性化しているのか、それともmAの両方に影響しているのかを検討した。CMA及びmAの活性評価はmA関連タンパク質であるRab7及びCMA関連タンパク質であるLAMP2Aをそれぞれノックダウン下状況でのGAPDH-HTのドット状集積により評価した。その結果、MPAは主にCMAの活性化を引き起こす一方で、LE540はCMA, mAの両者の活性化を惹起する、ということが示唆された。これまでのCMAに関する研究はCMAとmAを混在させた評価系で行っていることが多く、CMAとmAを別々に評価する実験系を用いることで、これまでにCMAに影響すると報告された薬物がmAに関しては異なるプロファイルを示す、ということが明らかとなった。また、神経変性疾患の一つであり、最近原因遺伝子の同定された脊髄小脳失調症21型(SCA21)の発症にCMA/mAの活性変化が関与する可能性を検討するため、SCA21患者で発見された変異型TMEM240をGAPDH-HT発現細胞に過剰発現させた。その結果、野生型TMEM240を発現させるだけで、CMA/mA活性の減弱による基質タンパク質(GAPDH-HT, MEF2D)の増大が観察され、CMA/mA活性が低下していたが、変異型TMEM240を発現させるとその活性低下が増悪することが明らかとなり、CMA/mA活性の低下がSCA21の発症原因の一つである可能性も考えられる。前年度までに、培養細胞株にマーカータンパク質GAPDH-HTの発現及びsiRNAを用いた関連タンパク質のノックダウンの併用により、シャペロン介在性オートファジー(CMA)とミクロオートファジー(mA)の活性をそれぞれ評価できる実験系を確立した。本年度はこの実験系が初代培養神経細胞でも適用可能かを検討した。初代培養神経細胞への遺伝子導入は培養細胞で用いたカチオン性リポソームを用いたプラスミドのトランスフェクションでは困難であったため、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いることにした。神経細胞に特異的に遺伝子発現させるsynapsin I promoterの下流にGAPDH-HT cDNAを導入したAAVベクターを作製し、ラット胎児大脳皮質由来の初代培養神経細胞に感染させることで、神経細胞にGAPDH-HTを高発現させることに成功した。

また、siRNAは従来通りのカチオン性リポソーム試薬で導入可能であり、CMA関連タンパク質であるLAMP2A及びmA関連タンパク質であるTSG101をそれぞれ有意にノックダウンすることができた。これらのsiRNAをトランスフェクションした神経細胞において、GAPDH-HTのリソソーム/後期エンドソームへの移行をdot状の集積として観察した。それぞれのノックダウンにより、GAPDH-HTのdot状集積は部分的ながら有意に抑制されていた。さらには、CMAを活性化することが知られているmycophenolic acidを処置すると、コントロールsiRNA及びTSG101 siRNAを導入した細胞ではdot状集積は有意に増大したが、LAMP2A siRNAを導入した細胞では有意な増大は観察されれず、LAMP2AノックダウンによりmA活性が、TSG101ノックダウンによりCMA活性が神経細胞でもそれぞれ評価可能であることが明らかとなった。本研究はリソソーム系タンパク質分解の中で研究の進んでいないシャペロン介在性オートファジー(CMA)とミクロオートファジー(mA)の活性を別々に評価する実験方法を開発し、神経疾患への関与解明を行うこととした。申請者が過去に報告したGAPDH-HTをレポータータンパク質として用いる方法にCMA及びmAにそれぞれ関与する分子のノックダウンを組み合わせることで、CMAとmA活性をそれぞれ評価する方法の開発に成功した。さらには薬物誘発パーキンソン病モデルにおいて、CMA/mA活性が低下することやCMA活性化薬により細胞死が抑制されることを示し、パーキンソン病発症におけるCMA/mAの関与が示唆される。CMAだけでなくmAの解析も行えている部分は当初の予定よりも進んでいる部分であるが、マウスを用いた解析が進んでいない点でやや遅れている。神経薬理学引き続きパーキンソン病や脊髄小脳失調症を中心とした神経変性疾患におけるCMA及びmAの関与を培養細胞モデルを使って解析することを進めていく。マウスを用いたin vivoの解析については、トランスジェニックマウスの作製はどうしても時間がかかるため、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入により神経変性疾患や精神疾患モデルにおける解析を行っていく予定である。本来の目的であるCMAだけでなくmAの活性評価も可能な点を明らかにしたところは当初の予定より進んでいるが、トランスジェニックマウスの作製が進んでいないため、予定全体から考えるとやや遅れていると判断考えている。まずはGAPDH-HT発現細胞株を用いて、DJ1ノックダウン時にCMAとmAのどちらが影響しているのかを検討する。また、これ以外の様々なパーキンソン病関連タンパク質や薬物誘発パーキンソン病モデルを用いて、CMA及びmAのパーキンソン病における関与を検討していく。さらにはパーキンソン病以外の神経変性疾患モデルや精神疾患モデルについても同様の検討を行っていく。また、トランスジェニックマウスの作製を再度試みて、CMA及びmAの生理機能や疾患発症における関与をin vivoでも明らかにしていく。また、トランスジェニックマウスの代わりに、ウイルスベクターによるin vivoでの遺伝子導入によるin vivoでの解析や初代培養細胞への遺伝子導入によるin vitroでの解析を並行して行っていく。
年輪中の炭素14と同位体元素からの環境因子探索による弥生期考古学への新たな展開

弥生前期に生育していた鳥海神代杉を用い、炭素14濃度と炭素・酸素安定同位体(δ^<13>C・δ^<18>O)の測定を行い、日本地域の特性や太陽活動及び環境変動について調べた。鳥海神代杉350年輪のうち756-462 BCの173単年輪について炭素14濃度データを確定した。鳥海神代杉と欧州産樹木との比較から、鳥海神代杉の炭素14濃度は欧州産樹木より約0.3%低い値を示すと分かった。これは年輪形成時期に発生する東アジアモンスーンの発達により、北半球よりも濃度が低い南半球大気の日本への流入が原因と考えられる。しかし両方の変動パターンは同様であり、日本産樹木の炭素14濃度は地球規模での変動を示すと分かった。これらは、日本産樹木による較正曲線作製の上で重要な知見である。また、単年輪データの周期解析では、662-488 BCの175年間に太陽活動11年周期変動を反映すると考えられる、周期7.7-11.1年の有意性の高い周期成分が抽出された。安定同位体測定では、748-475 BCの147単年輪についてδ^<18>Oを、740-464BCの122単年輪についてδ^<13>Cを測定した。δ^<18>O変動には0.2-0.3%の増減や安定を示す期間があった。年輪のδ^<18>Oは相対湿度を示すとされ、弥生期前期に相対湿度が大きく変化した期間や安定した期間があったと考えられる。また、δ^<13>Cでは10-60年の時間幅で0.2%の増減を示す変動がみられた。δ^<18>Oとδ^<13>Cとでは変動の様相が異なる。これはδ^<13>Cが様々な気象現象に影響されδ^<18>Oよりも複雑であるためと考えられる。また、考古学試料測定の試験実験として、鎌倉時代のものとされている木片の炭素14年代を測定した。間隔をとり剥離された2単年輪を測定した結果、木片はAD 982-1038の平安時代のものと分かった。本研究の単年輪による手法が歴史関連試料の年代測定に有効であるといえる。本研究では、弥生期前期に位置する鳥海神代杉約350年輪の1年輪ごとに対し、炭素14濃度測定及び、酸素、炭素の安定同位体比の測定を行ない、それらのデータ時系列作成を目指している。本年度、次の実験が終了した。1、276単年輪についての年輪剥離。2、157単年輪のα-セルロースを作成。3、225年間について1年間隔で136単年輪の炭素14濃度測定。ほぼ350年をカバーしている。4、96単年輪の炭素安定同位体比(δ^<13>C)測定。5、1950年からの気象データと酸素安定同位体(δ^<18>O)との比較測定結果から求めた炭素14年代と較正曲線IntCal04との比較より、136単年輪はIntCal04のまわりに分布しており、変動のパターンは同じであった。また、周期解析により太陽11年、22年周期活動に相当する周期成分がみられた。炭素14濃度が極大を示すB.C.700年付近と、炭素14濃度が一定を示すB.C.580年付近の特徴的な時期でのδ^<13>Cを調べた。2つの期間のδ^<13>Cの平均値は、B.C.700年付近で-22.31‰、B.C.580年付近で-21.60‰であり、差は1σの測定誤差より大きい。年輪中酸素安定同位体(δ^<18>O)と気象データとの関係を調べるため、山形県鶴岡市から採取した杉を単年輪で1950年からの40年間に対し8点のδ^<18>O測定を行ない、山形県酒田市の1950年からの年平均の相対湿度と比較した。結果、2つのデータには良い相関がみられ、現代と弥生期の気象比較にとって重要な指標が得られると期待できる。弥生前期に生育していた鳥海神代杉年輪を用いて、炭素14濃度と酸素同位体の測定を行い太陽活動および気候変動について研究を進めている。2年度目は約70単年輪試料のα-セルロースの作成とAMS測定を実施した。測定は東京大学タンデム加速器研究施設で行なった。これまでの測定を合わせ、全350年輪のうち280年輪をカバーする163単年輪のデータを確定した。日本産樹木である鳥海神代杉データと、他研究機関のヨーロッパ産樹木データについて炭素14年代による比較を行なった。その結果、鳥海神代杉の炭素14年代はヨーロッパ産樹木より約20年古い値を示した。このことから、ヨーロッパと日本とで炭素14年代に地域的な差かおることが考えられる。この時期の単年輪炭素14年代データは世界に先駆けたもので重要な研究成果である。安定同位体比濃度の測定では、酸素同位体の基礎特性について調べた。酸素同位体比は山形大で試料を作成し、北海道大で測定を行っている。

今年度は、実験室の違いによる測定値への影響について調べるため、標準試料を複数個測定した。その結果、山形大での作製試料の酸素同位体比の平均値と標準偏差は33.08‰、0.57‰であり、北海道大での作製試料は32.75,‰、0.33‰であった。山形大と北海道大のそれぞれのδ^<18>O平均値は、標準偏差の2σの範囲であっており、異なる実験室の影響はないことがわかった。これらの研究成果の一部は2008年9月に日本物理学会およびAMS国際会議に発表しており、学術誌(Radiocarbon)へ論文投稿を準備中である。弥生前期に生育していた鳥海神代杉を用い、炭素14濃度と炭素・酸素安定同位体(δ^<13>C・δ^<18>O)の測定を行い、日本地域の特性や太陽活動及び環境変動について調べた。鳥海神代杉350年輪のうち756-462 BCの173単年輪について炭素14濃度データを確定した。鳥海神代杉と欧州産樹木との比較から、鳥海神代杉の炭素14濃度は欧州産樹木より約0.3%低い値を示すと分かった。これは年輪形成時期に発生する東アジアモンスーンの発達により、北半球よりも濃度が低い南半球大気の日本への流入が原因と考えられる。しかし両方の変動パターンは同様であり、日本産樹木の炭素14濃度は地球規模での変動を示すと分かった。これらは、日本産樹木による較正曲線作製の上で重要な知見である。また、単年輪データの周期解析では、662-488 BCの175年間に太陽活動11年周期変動を反映すると考えられる、周期7.7-11.1年の有意性の高い周期成分が抽出された。安定同位体測定では、748-475 BCの147単年輪についてδ^<18>Oを、740-464BCの122単年輪についてδ^<13>Cを測定した。δ^<18>O変動には0.2-0.3%の増減や安定を示す期間があった。年輪のδ^<18>Oは相対湿度を示すとされ、弥生期前期に相対湿度が大きく変化した期間や安定した期間があったと考えられる。また、δ^<13>Cでは10-60年の時間幅で0.2%の増減を示す変動がみられた。δ^<18>Oとδ^<13>Cとでは変動の様相が異なる。これはδ^<13>Cが様々な気象現象に影響されδ^<18>Oよりも複雑であるためと考えられる。また、考古学試料測定の試験実験として、鎌倉時代のものとされている木片の炭素14年代を測定した。間隔をとり剥離された2単年輪を測定した結果、木片はAD 982-1038の平安時代のものと分かった。本研究の単年輪による手法が歴史関連試料の年代測定に有効であるといえる。
グリア細胞株由来神経栄養因子を用いた『薬物依存』モデル細胞の確立

メタンフェタミンは我が国において最も乱用されている依存性薬物である。しかし、メタンフェタミンが薬物依存を引き起こす機構については、ほとんど分かっていなかった。我々は、薬物依存関連遺伝子としてtumor necrosis factor-α(TNF-α)およびtissne plasminogen activatorを見出した。しかし、それらの遺伝子を見つけるためには、依存モデル動物を用いて、脳内での発現変化や行動薬理学的な検討を行わなければならず、多くの薬物依存関連遺伝子候補タンパクをスクリーニングすることは、時間的にも費用面においても不可能に近い。当萌芽研究ではその問題を解決するため、培養細胞を用いて簡易に薬物依存関連遺伝子候補タンパクをスクリーニングできる薬物依存モデルの確立を目指した。16および17年度は、ドパミン様の細胞株や神経細胞初代培養細胞に対してメタンフェタミンを添加した際のドパミン遊離の反応性を検討していたが、マウスなどにメタンフェタミンを投与した時のようなシャープな増加は観察されなかった。そこで、ドパミン合成酵素および受容体を発現している細胞株であるPC12細胞にドパミントランスポーター遺伝子を導入し、発現した細胞についてクローニングを行った。その結果、恒常的にドパミントランスポーターを過剰に発現する細胞の確立に成功した。この細胞では、メタンフェタミンを添加後30から60分後に著しいドパミンの遊離量の増大が観察された。我々が、動物実験において、メタンフェタミンによるドパミン遊離を調整することをすでに確認している遺伝子のいくつかについて、本確立細胞でも結果を再現することが出来た。今後、このモデル細胞を用いて、薬物依存関連遺伝子のクローニングやメカニズムの解明を行いたいと考えている。我々は、平成12年度から5年間の予定で文科省科学技術振興調整費『依存性薬物により誘発される精神障害の機構の解明の研究』を得て、薬物依存の研究者10名を統括している。今までに本研究班から、いくつかの薬物依存関連遺伝子を見出してきた。それらの遺伝子を見つけるためには、依存動物を用い、脳内での発現変化や行動薬理学的な検討を1つ1つ行っていかなければならない。多くの依存関連遺伝子候補タンパクをスクリーニングするためには、時間、費用および人手が必要であり、現状では、不可能に近い。そこで、多くの種類の薬物依存関連遺伝子をスクリーニングする方法の確立を目的として、培養細胞を用いた薬物依存モデルの確立を試みることが、本萌芽研究の目標であった。そこで、わが国で、最も、乱用されているメタンフェタミンを対象として、モデル動物の確立を試みた。メタンフェタミンの作用の1つに、細胞間隙でのドパミン遊離量の増大がある。ドパミン遊離量が増大することによって、さまざまな精神毒性が引き起こされていると考えられている。メタンフェタミン添加によってドパミン遊離の増大が観察される細胞系を確立することができれば、薬物依存関連遺伝子のスクリーニングに活用することが出来ると考えられる。そこで、本年度は、メタンフェタミン刺激でドパミン遊離が増大する細胞の確立を目指した。そこで、モデル細胞として、PC12細胞を用いた。この細胞は、ドパミン産生能を有し、ドパミン受容体やトランスポーターも発現している。この細胞にメタンフェタミンを作用させ、培養上清中のドパミン遊離量について、用量依存性や時間依存性を確認したところ、メタンフェタミンを作用させて12時間後に、ドパミンの遊離が観察された。来年度移以降は、このモデル細胞を用いて、我々が今までに、見出してきた薬物依存関連遺伝子について、検討したいと考えている。メタンフェタミンが薬物依存を引き起こす作用機序として、細胞間隙でのドパミン遊離量が増大し、精神毒性が引き起こされることが報告されていることから、メタンフェタミン添加によってドパミン遊離の増大が観察される細胞系を確立することができれば、薬物依存関連遺伝子のスクリーニングに活用することが出来ると考えられる。本研究課題が開始された平成16年度より培養細胞を用いて簡易に薬物依存関連遺伝子候補タンパクをスクリーニングできる薬物依存モデルの確立を目指し、17年度も継続して実験を行った。薬物依存が形成される原因に多くのことが考えられるが、上記したように、細胞間隙でのドパミン遊離量が増大を再現させるためには、ドパミンの遊離量を増加させるか、再取り込みを減少させるかのいずれかの方法がある。本年度は、特にドパミンの取り込みを減少させることによるモデル細胞の確立を試みた。神経様の形態を示し、神経初代培養細胞よりも遺伝子導が容易であるPC12細胞にドパミントランスポーター遺伝子を導入し、発現した細胞についてクローニングを行った。その結果恒常的にドパミントランスポーターを過剰に発現する細胞の確立に成功した。最終年度となる次年度は、この細胞にグリア細胞由来神経栄養因子を導入してメタンフェタミンへの作用を検討したいと考えている。