hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食物アレルギー発症機序に関する免疫組織化学的、超微形態学的研究

食物アレルギー発症機序における初期的段階を詳しく解明する目的で本研究を行なった。平成8年度はラットの乳飲期、離乳期、の小腸を用い、高分子物質、種々のレクチンおよび食物性抗原が管腔側から粘膜上皮を通過し、粘膜固有層内へ侵入するか否かを免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。その結果は、平成8年度研究実績報告書に記載してある通りである。平成9年度は、平成8年度の実験を踏まえて乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラットの小腸、成熟期ラットの胃、小腸を用い高分子物質、種々のトレーサーおよび食物性抗原が管腔側から粘膜上皮を通過し、粘膜固有層内へ侵入するか否かを免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラット(生後14日目)の小腸管腔へ高分子物質および食物性抗原を投与し、免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。その結果、乳飲期(母乳飼育群)ラットの空腸では、吸収上皮細胞内および細胞間隙、さらに粘膜固有層内に反応産物が認められた。乳飲期(人工乳飼育群)ラットの空腸においては、管腔内および吸収上皮細胞の細胞頂部に僅かな反応産物が見られたが、細胞間隙および粘膜固有層内には認められなかった。成熟期ラットにおいて、アルコール(25%,50%,)を投与すると、25%アルコール投与群では、胃と小腸(空腸)の上皮細胞に僅かながら障害が見られた。50%アルコール投与群では、同じ部位に強い障害がおこり、その部位から種々のトレーサーおよび食物性抗原が粘膜固有層内に侵入することが観察された。以上の結果より、乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラットにおいて、母体のアレルゲンが母乳中の抗体と共に空腸の吸収上皮細胞に取り込まれ、細胞内を通過し、粘膜固有層内へ侵入することが示唆された。また、離乳期成熟期ラットにおいては、胃、小腸(空腸・回腸)の上皮層に障害が起った部位より、アレルゲンが細胞内を通過し粘膜固有層内へ侵入ことが示唆された。食物アレルギー発症機序における初期的段階を詳しく解明する目的で、本研究を行っている。平成8年度はラットの乳飲期、離乳期、成熟期の小腸を用い、高分子物質、種々のレクチンおよび食物性抗原が管腔側から粘膜上皮層を通過し、粘膜固有層内へ侵入するか否かを免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行った。乳飲期ラット(生後14日目)の小腸管腔内へHRP、colloidal gold、cationized gold、ferritin、cationized ferritin等の高分子物質、種々の植物性レクチン、またはovalbumin、ovomucoid等の食物性抗原を投与し、細胞化学的、超微形態学的検索を行った。その結果、空腸では前記のトレーサーは母乳中の抗体と共に、エンドサイトーシスによって吸収上皮細胞内へ取り込まれ、ライソゾーム内で細胞内消化を受けずに細胞側壁へ移動し、細胞間隙から粘膜固有層内へ侵入することが示唆された。同時期の回腸では、細胞内へ高分子物質が大量に吸収されるが、巨大ライソゾーム内に運ばれ、細胞内消化を受けるため高分子の形での粘膜固有層への侵入は認められなかった。

離乳期(生後23日目)および成熟期ラット小腸において管腔内に投与した種々のトレーサーの上皮細胞内への侵入は認められなかった。しかしながら、パイエル板上皮細胞においては細胞内を通過することが分かった。離乳期において、オレンジ果汁(100%)を投与すると、小腸の上皮層に障害が起こり、その部位から種々のトレーサーおよび食物性抗原が粘膜固有層内に侵入することが観察された。授乳期ラット(出産後14日目)の血管内に高分子物質を投与した結果、血管側、乳腺の腺細胞内、乳汁内に観察された。このことから、母体のアレルゲンは母乳中の抗体と共に乳飲期哺乳動物の空腸上皮細胞内に取り込まれ、細胞内を通過し、粘膜固有層へ侵入することが示唆された。食物アレルギー発症機序における初期的段階を詳しく解明する目的で本研究を行なった。平成8年度はラットの乳飲期、離乳期、の小腸を用い、高分子物質、種々のレクチンおよび食物性抗原が管腔側から粘膜上皮を通過し、粘膜固有層内へ侵入するか否かを免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。その結果は、平成8年度研究実績報告書に記載してある通りである。平成9年度は、平成8年度の実験を踏まえて乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラットの小腸、成熟期ラットの胃、小腸を用い高分子物質、種々のトレーサーおよび食物性抗原が管腔側から粘膜上皮を通過し、粘膜固有層内へ侵入するか否かを免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラット(生後14日目)の小腸管腔へ高分子物質および食物性抗原を投与し、免疫組織化学的、超微形態学的に検索を行なった。その結果、乳飲期(母乳飼育群)ラットの空腸では、吸収上皮細胞内および細胞間隙、さらに粘膜固有層内に反応産物が認められた。乳飲期(人工乳飼育群)ラットの空腸においては、管腔内および吸収上皮細胞の細胞頂部に僅かな反応産物が見られたが、細胞間隙および粘膜固有層内には認められなかった。成熟期ラットにおいて、アルコール(25%,50%,)を投与すると、25%アルコール投与群では、胃と小腸(空腸)の上皮細胞に僅かながら障害が見られた。50%アルコール投与群では、同じ部位に強い障害がおこり、その部位から種々のトレーサーおよび食物性抗原が粘膜固有層内に侵入することが観察された。以上の結果より、乳飲期(母乳飼育群、人工乳飼育群)ラットにおいて、母体のアレルゲンが母乳中の抗体と共に空腸の吸収上皮細胞に取り込まれ、細胞内を通過し、粘膜固有層内へ侵入するこが示唆された。また、離乳期成熟期ラットにおいては、胃、小腸(空腸・回腸)の上皮層に障害が起った部位より、アレルゲンが細胞内を通過し粘膜固有層内へ侵入ことが示唆された。
階層ナノカーボンを用いたレドックスキャパシタ電極の創製と機能発現メカニズムの解明

本研究では、カーボンナノファイバー、グラフェンナノリボン(GNR)など比表面積が大きく、電気伝導性に優れた一次元ナノカーボン材料を利用して、電気化学キャパシタのエネルギー密度と出力密度の向上を目指す。電気化学キャパシタの高エネルギー密度と高出力密度を達成するためには、電極内部に適切な電子伝導パスとイオン拡散パスを導入することが重要である。ここでは、一次元ナノカーボンによって形成される多孔性電極の内部構造(ナノカーボンによって形成される骨格構造と細孔構造)と物性の関係、さらにこの電極を用いて作製したキャパシタの性能を体系的に調査することによって、高性能電極の設計指針を示す。本年度は、一次元性(ネットワーク構造の構築)と二次元性(大きな比表面積)とを併せ持つリボン形状のGNRを用いた電極構造の制御について検討を行った。多層カーボンナノチューブの酸化開裂処理により得られた酸化型のGNRを化学的に還元することでGNRを作製した。さらに、得られたGNRの分散液中の凝集状態を制御することで、GNR積層シートの細孔構造の制御が可能であることを見出し、厚み方向に対して屈曲度の低い多孔性電極の作製が可能であることを明らかにした。厚み方向に屈曲度の低い細孔構造を有するGNR電極を用いたキャパシタでは、電極内での効率的なイオン拡散パスの形成によって内部抵抗が低減され、エネルギー密度と出力密度が同時に向上することを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ネットワーク状のカーボンナノファイバー(CNF)の表面に二酸化マンガンナノワイヤ(MnO2NW)を階層的に導入することで、MnO2NW/CNF複合電極を作製し、電極内部に形成される導電体のネットワーク構造と活物質/導電体の接触部位の構造が電極特性に与える影響を体系的に調査し、高性能電極の設計指針を確立することを目的としている。本年度は、CNFとMnO2NWの複合構造が電極特性に与える影響を調査するために、電界紡糸法により作製した繊維径の異なるCNFの表面に異なる担持量のMnO2NWを電解析出させることで、種々の複合電極を作製し、その電気化学的性質を評価した。評価の結果、複合電極の高機能化には、特に電極内でのMnO2NW/CNF接触点形成の最適化とMnO2NW自体の構造安定化が必要であることが明らかになった。CNF/MnO2NW複合電極の作製と評価については概ね計画通りに進捗している。キャパシタ性能の向上には複合電極内でのCNF/MnO2NW接触点形成の最適化とMnO2NW自体の構造安定化が必要であることが明らかになった。複合電極の高機能化について次年度以降も引き続き検討を進める。本研究では電気伝導性に優れたカーボンナノファイバー(CNF)、カーボンナノチューブ(CNT)、グラフェンナノリボン(GNR)などの一次元状のナノカーボン材料より構成される三次元ネットワークシートを用いて、高エネルギー密度、高出力密度を有するフレキシブル且つバインダーフリーな電気化学キャパシタの電極作製を目指す。三次元ネットワークシートの構造、物性さらには電気化学特性を体系的に調査することで、高性能電極の設計指針を確立することを目的としている。本年度は、昨年度に引き続きCNFの表面に針状の二酸化マンガンナノワイヤ(MnO2NW)を析出させたCNF/MnO2NW複合電極を作製し、高容量化の検討を進めた。電極の高容量化には電極活物質であるMnO2の表面積を増大させると同時に集電材であるカーボンとの電気的接触点を形成することが重要である。具体的には、CNF間の距離とMnO2NWの担持量が異なる複合電極を作製し、複合電極の構造と電気化学的性質の相関を調べた。検討の結果、CNF間においてMnO2NWが橋架け構造を形成するような場合に、活物質表面積の増大と、CNFとMnO2NW間での接触点形成の両立が実現し、高容量化が達成されることを見出した。また本年度からは新たに、多層カーボンナノチューブの酸化開裂処理により作製される擬一次元ナノカーボンであるGNRを用いた電気化学キャパシタ電極の作製及び検討を行っている。これまでの検討からGNR電極の電気化学特性は、湿潤状態での集合状態に依存することを明らかにしている。GNRを電極に用いた電気化学キャパシタの検討においても概ね計画通りに進捗している。これまでにGNR電極の電気化学特性は、湿潤状態での集合状態に依存することを明らかにしている。

さらに、得られたGNRの分散液中の凝集状態を制御することで、GNR積層シートの細孔構造の制御が可能であることを見出し、厚み方向に対して屈曲度の低い多孔性電極の作製が可能であることを明らかにした。厚み方向に屈曲度の低い細孔構造を有するGNR電極を用いたキャパシタでは、電極内での効率的なイオン拡散パスの形成によって内部抵抗が低減され、エネルギー密度と出力密度が同時に向上することを明らかにした。本年度の検討により、CNF/MnO2NW複合電極の作製法および評価法は確立された。次年度はMnO2の結晶構造制御と従来のCNFに加えて1次元形状の高結晶性ナノカーボンの電極基材利用についても検討を進め、電極構造と電気化学特性との関係を明らかにしていく。GNR電極の電極作製方法の更なる検討、及び電極内部構造の解析を通じて、大容量・高速充放電に適した電極の設計指針を明らかにしていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
膵星細胞はビタミンA欠乏で活性化し，膵がんで線維化を引き起こし悪性化にかかわる

膵がんでは線維化が豊富におこっており,がんの発生に関わっている.一方膵星細胞はビタミンAが欠乏することで活性化し,線維化に関与すると考えられているが,詳細な分子機構は不明である.私たちはこれまでに,レチノイン酸代謝酵素CYP26の異常発現が星細胞でのビタミンA欠乏を引き起こし,さまざまな病態と関わることを解明した.この成果から,膵星細胞の活性化機構は,CYP26の異常発現によるものと推察した.これらを踏まえ本研究では,1) CYP26の異常発現を原因としてレチノイン酸が欠乏し,膵星細胞が活性化すること,2)活性化した膵星細胞が間質の線維化や膵がんの悪性形質を促進する詳細な機構を明らかにする.膵がんでは線維化が豊富におこっており,がんの発生に関わっている.一方膵星細胞はビタミンAが欠乏することで活性化し,線維化に関与すると考えられているが,詳細な分子機構は不明である.私たちはこれまでに,レチノイン酸代謝酵素CYP26の異常発現が星細胞でのビタミンA欠乏を引き起こし,さまざまな病態と関わることを解明した.この成果から,膵星細胞の活性化機構は,CYP26の異常発現によるものと推察した.これらを踏まえ本研究では,1) CYP26の異常発現を原因としてレチノイン酸が欠乏し,膵星細胞が活性化すること,2)活性化した膵星細胞が間質の線維化や膵がんの悪性形質を促進する詳細な機構を明らかにする.
簡約代数群のエルパケットの研究

(1)エンドスコピ-、エルパラメ-タ-の理論は、簡約代数群の表現の理論において、重要な役割を果たすと思われるが、この研究の第一の目標は、エンドスコピ-、エルパラメ-タの理論と、局所体、大局体上の簡約代数群の保型表現の関係を探ることである。(2)もう一つの目標は、簡約代数群のエルパケット、ア-サ-パケットの決定、特に表現の制限即の記述による、特殊線形群、特殊ユニタリ群のinner formのエルパケット、ア-サ-パケットの決定である。齋藤、平賀の共同研究において、特殊線型群のinner formに関する結果を、temmperedな場合から、genericな場合に拡張した。ユニタリ群、特殊ユニタリ群については、そのエルパラメータの分類を行い、それぞれのパラメータについての、そのS群を決定した。これから、Moeglinによるユニタリ群のLパケットの決定を用いて、特殊ユニタリ群のエルパケットの決定ができる場合があることが分かったが、まだ一般にはまだ困難がある。齋藤は、ユニタリ群のもっとも簡単なdual pairに関する、Moen-Rogawskiの定理と、Prasadによる二次一般線型群の誘導表現の分解に関する定理が、同値であることを示し、さらにこれから、Prasadの二次体の指標に対応する二次一般線型群の表現の制限に関する結果が、これから導かれることを示した。これには、テータ対応を、シーソー原理を用いる。平賀、市野、池田は、P進体離散系列表現の形式的次数が、その表現から決まるあるガンマ因子によって表されるという予想を提出し、幾つかの例についてこれを示した。また3次ユニタリ群の場合にもtwisted endoscopyを用いてこれを示した。今野拓也は、今野和子との共同研究で、doubling methodによる、実ユニタリ群の対のテータ対応を具体的に記述した。これは、保型表現への応用上重要である。今年度は、2007年6月11日から15日まで、フランスのルミニー数学研究所において、日仏研究集会「Automorphic Endoscopy」を、J.-P. Labesse氏、Ngo Bao-Chau氏と共催で行った。日本とフランスを中心にして、50名程の参加者を得た。Ngo氏によるfundamental lemma予想の解決、藤原一宏氏のLeopoldt予想の解決を始めとして、多くの若手研究者による優れた結果の発表が行われた。これは、今後のこの分野における日仏の共同研究の出発点となることが期待される。平賀は、特殊線型群のinner formのエルパケットの決定について、これまでは、temperedなものに限られていたのを、一般のアーサーパケットに拡張することに成功した。これは、BadulescuによるJacquet-Langlands対応に関する優れた結果とこれまでのアイデアを組み合わせることにより成功した。これは我々の、考えるS群が、エルパケットを記述することを示す新たな結果である。齋藤は、保型形式の制限に関して、これまでとは違ったタイプのもについて研究した。一つは、central isogenyで、もう一つは、非連結な代数群の場合である。これらの制限を明快に記述することに成功した。これには有限アーベル群のガロアコホモロジーに関する一つの定理に基づく。これは、周期とエル関数の特殊値の研究に応用があると思われる。これら一連の表現の制限に関する結果を纏めた。池田と市野は、スロスープラサド予想の精密化を行い、これらの特殊値に現れる2のべきが、アーサーパラメーターに対するS群の位数と密接に関係することを確かめ、これらを一般的な予想として定式化した。池田と市野は、直行群上の保型形式の制限に関する、Gross-Prasad予想の精密化を与えたが、これらの結果に現れる定数は、保型表現のエンドスコピーと深い関係のあることが予想されていた。市野は、Wee Teck Ganとの共同研究で、この予想が、0(5)から0(4)への制限に関しては正しいことを示した。これはテータ対応の理論を駆使することよって示された。この結果は、予想が一般に正しいことを強く指示するものと思われる。この研究の進展は、エルパケット、エンドスコピーをより深く理解する上で重要であると思われる齋藤と平賀は、保型形式の制限について研究し、central isogenyの場合には、対応する保型形式の間の関係を、S群を用いて表すことができた。これには、有限群のガロアコホモロジーについての新たな結果が基礎になっている。また連結でない、代数群上の保型形式を連結成分に制限したときの様子を考察し、類似の結果を得たが、前者の場合ほど、明確な結果を得られなかった。これは、非連結群についての表現に対して、L-parameterの研究が進んでいないためであり、非連結な代数群の表現論の構築の必要性を示している。平賀と市野は、保型誘導の跡の関係に現れる定数について考察し、intertwining作用素を適当に選ぶことにより、この定数が1で或ることを示した。

これにはtransfer factorに関する精密な考察が必要になる。これにより、保型誘導について、より精密な結果が得られると期待される。西山は、エルミート対称対とコンパクト対称対からなる、シーソー対について、カペリ恒等式を示した。また、今野は、U(2)の局所Gross-Prasad予想を示した。
原子層制御蒸着法および局所磁性測定法を用いた高スピン分極合金の探索

スピントロニクスの分野では,伝導電子が100%スピン分極した物質である「ハーフメタル」の候補として,ホイスラー合金薄膜が精力的に研究されている.当研究グループでは,薄膜成長を原子層レベルで制御することによって合金規則度や界面原子種・界面構造が制御されたL2_1型ホイスラー合金やそれと類似構造をもつ新規合金の薄膜を作製し,原子核をプローブとした局所的な磁性測定手段であるメスバウアー分光法や放射光核共鳴散乱法を用いて規則度の乱れや界面の影響を精密に評価することによって,他の研究グループとは違った視点から高スピン分極合金の探索にブレイクスルーをもたらすことを目指している.平成20年度は, L2_1型Co_2MnSnホイスラー合金を中心に,原子層制御交互蒸着法よって作製した合金薄膜および強磁性トンネル接合における局所磁性・界面磁性および磁気抵抗効果について調べた. Co_2MnSn強磁性層とMgOバリア層からなる磁気トンネル接合においては,大きなトンネル磁気抵抗効果が得られるには至らなかったが,局所磁性と磁気抵抗効果の相関を示すデータが得られた.一方,界面における局所磁性を調べるために作製したCo_2MnSnとAgの多層膜においては,構成元素原子層の蒸着順にかかわらず,Co_2MnSn界面がCo原子で終端していることを示唆するデータが得られた.また, Co_2MnSnとCrの多層膜においては,強磁性の発現に最低限Co/MnSn/Co/MnSn/Coの原子積層ユニットが必要であることがわかった.以上のように,ホイスラー合金薄膜やそれを用いた磁気トンネル接合の局所磁性に関するユニークな情報が得られ,ホイスラー合金系磁気トンネル接合で問題とされている磁気抵抗変化率の大きな温度依存性の原因解明になどに向けて,今後の研究の足がかりが得られた.スピントロニクスの分野では,伝導電子が100%スピン分極した物質である「ハーフメタル」の候補として,ホイスラー合金薄膜が精力的に研究されている.当研究グループでは,薄膜成長を原子層レベルで制御することによって合金規則度や界面原子種・界面構造が制御されたL2_1型ホイスラー合金やそれと類似構造をもつ新規合金の薄膜を作製し,原子核をプローブとした局所的な磁性測定手段であるメスバウアー分光法や放射光核共鳴散乱法を用いて規則度の乱れや界面の影響を精密に評価することによって,他の研究グループとは違った視点から高スピン分極合金の探索にブレイクスルーをもたらすことを目指している.平成20年度は, L2_1型Co_2MnSnホイスラー合金を中心に,原子層制御交互蒸着法よって作製した合金薄膜および強磁性トンネル接合における局所磁性・界面磁性および磁気抵抗効果について調べた. Co_2MnSn強磁性層とMgOバリア層からなる磁気トンネル接合においては,大きなトンネル磁気抵抗効果が得られるには至らなかったが,局所磁性と磁気抵抗効果の相関を示すデータが得られた.一方,界面における局所磁性を調べるために作製したCo_2MnSnとAgの多層膜においては,構成元素原子層の蒸着順にかかわらず,Co_2MnSn界面がCo原子で終端していることを示唆するデータが得られた.また, Co_2MnSnとCrの多層膜においては,強磁性の発現に最低限Co/MnSn/Co/MnSn/Coの原子積層ユニットが必要であることがわかった.以上のように,ホイスラー合金薄膜やそれを用いた磁気トンネル接合の局所磁性に関するユニークな情報が得られ,ホイスラー合金系磁気トンネル接合で問題とされている磁気抵抗変化率の大きな温度依存性の原因解明になどに向けて,今後の研究の足がかりが得られた.
癌幹細胞の可塑性が誘起する腫瘍転移の分子機構解明

研究代表者がDNA損傷によって惹起される細胞死誘導リン酸化酵素として同定したDYRK2は、これまでの内外の研究から癌に抑制的に働くことが、乳癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、肝臓癌などで報告されている。本研究ではDYRK2の癌抑制機構について、その幹細胞性と転移における役割に注目しながら引き続き検証を進めている。2018年度は乳癌におけるDYRK2の役割について、幹細胞性の制御をふまえた動物実験モデルで検証した。ホルモン受容体陽性乳癌細胞株であるMCF-7において、DYRK2の発現を抑制した細胞株を作成し網羅的発現解析を行って野生株と比較したところ、最も発現が増加した遺伝子としてCDK14を同定した。実際にMCF-7細胞においてDYRK2の発現を抑制するとCDK14の発現が上昇し、増殖能が顕著に増加した。DYRK2とCDK14の発現を抑制すると、in vitro、in vivoにおいてDYRK2単独抑制細胞よりも腫瘍増殖や浸潤能が減少した。実際の乳癌組織内においても、DYRK2が低発現の組織ではCDK14の発現は高かった。この分子機構として、DYRK2は転写因子ARを介してKLF4を転写制御することでCDK14の発現を調節して乳癌の幹細胞性を抑制することを見出した。DYRK2低発現細胞ではAR阻害剤であるMDV3100の添加でCDK14の発現が低下した。近年、ARを標的とした乳癌治療が効果的であるとの報告もあり、これまで悪性度が高いとされていたDYRK2低発現乳癌に対して、AR阻害剤が治療標的となる可能性がある。この結果をふまえて、他の癌種でも同様の制御機構が存在するのかについて検証を開始することとした。DYRK2による発癌制御や癌幹細胞性の維持について分子機構の解明に取り組んでおり、その一端を動物実験モデルで示すことが出来た。これは本研究の根幹をなすものであり、提示した仮説の方向性が概ね正しいことを意味する。DYRK2の発現制御についても、さらに幾つかの機構を想定して研究が進んでおり、来年度以降の成果が期待される。DYRK2の転移と幹細胞化との関わりについて様々な癌種で示すことが今後の課題であり、引き続き幹細胞性維持におけるDYRK2の役割について、研究を進めていきたい。in vitroのみならず、すでに遺伝子改変マウスを用いたin vivo実験を開始しており、実験系の妥当性を評価している。我々が細胞死誘導性リン酸化酵素として同定したDYRK2は、これまでの内外の研究から癌に抑制的に働くことが、乳癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌などで報告されている。本研究ではDYRK2の癌抑制機構について、その肝細胞性と転移に焦点を当てて調べている。まず、大腸癌の肝転移におけるDYRK2の役割について、動物実験モデルで検証した。大腸癌細胞株HCT-116にE2-Crimsonを導入し、蛍光標識による追跡を可能にした。ヌードマウスの脾臓に癌細胞を注入し経門脈による肝転移を誘導し、転移巣から腫瘤を回収した。E2-Crimson陽性細胞をセルソーターで分離しDYRK2の発現を調べたところ、有意にその発現が低下していることを見出した。そこでHCT-116にDYRK2を安定的に発現する細胞株を樹立し、マウス肝転移モデルで検証したところ、野生型DYRK2を発現した細胞株では有意に転移能が減少したが、リン酸化酵素活性のないDYRK2発現細胞では、コントロール細胞と同等の転移能を示した。以上の結果から、DYRK2の発現抑制が大腸癌の転移を促進すること、翻ってDYRK2の強制発現によって酵素活性依存的に転移を抑制できることが示唆された。さらに手術検体を用いてDYRK2の発現レベルと予後について検証を行った。DYRK2の発現が高い症例では低い症例に比べて、全生存率、無病生存率それぞれについて有意に高いことが判明した。この結果をふまえて、他の癌種でも同様の結果が得られるかについて検証を開始した。癌転移にDYRK2が関与していることを、動物実験モデルで示すことが出来た。DYRK2の発現制御についても、幾つかの機構を想定して研究が進んでおり、来年度以降の成果が期待される。

この分子機構として、DYRK2は転写因子ARを介してKLF4を転写制御することでCDK14の発現を調節して乳癌の幹細胞性を抑制することを見出した。DYRK2低発現細胞ではAR阻害剤であるMDV3100の添加でCDK14の発現が低下した。近年、ARを標的とした乳癌治療が効果的であるとの報告もあり、これまで悪性度が高いとされていたDYRK2低発現乳癌に対して、AR阻害剤が治療標的となる可能性がある。この結果をふまえて、他の癌種でも同様の制御機構が存在するのかについて検証を開始することとした。DYRK2による発癌制御や癌幹細胞性の維持について分子機構の解明に取り組んでおり、その一端を動物実験モデルで示すことが出来た。これは本研究の根幹をなすものであり、提示した仮説の方向性が概ね正しいことを意味する。DYRK2の発現制御についても、さらに幾つかの機構を想定して研究が進んでおり、来年度以降の成果が期待される。DYRK2の転移と幹細胞化との関わりを示すことが最大の課題であり、特に幹細胞性維持におけるDYRK2の役割について、研究を進めていきたい。in vitroのみならず、in vivo実験を準備しており、実験系の妥当性を評価している。DYRK2の転移と幹細胞化との関わりについて様々な癌種で示すことが今後の課題であり、引き続き幹細胞性維持におけるDYRK2の役割について、研究を進めていきたい。in vitroのみならず、すでに遺伝子改変マウスを用いたin vivo実験を開始しており、実験系の妥当性を評価している。
初期投射パターンによる皮質興奮性ニューロンの分類とその産生過程の解析

大脳皮質興奮性ニューロンは、皮質内外の領域を結ぶ投射性ニューロンである。これらニューロンは皮質脳室帯(VZ)から生じたのち表層に向かって移動し6層構造(I-VI層)を形成する。この時、後から生まれた細胞は先に生まれた細胞よりも表層に配置することが知られている。これらニューロンの投射先は、皮質下(subcortical)と皮質内(交連性callosal)に大きく2つに分けられるが、皮質下投射ニューロンが深層(V, VI層)のみに分布するのに対し、皮質内投射ニューロンは第I層を除くすべての層に分布する。これら興奮性ニューロンの投射タイプがどのように発生するかを明らかにする目的で、初期軸索形成過程を解析した。すると、ほぼすべてのニューロンは中間帯(IZ)を移動する過程で軸索形成を開始することがわかった。軸索の向きは外側(lateral)か内側(medial)のいずれかであり、外側投射が先に、内側投射は後から現れる時期依存性があることがわかった。起始細胞のマーカー発現ならびにその後の層分布から、これら投射は皮質下・皮質内投射にそれぞれ発達すると考えられた。この考えに一致して、同じ深層であっても皮質下投射ニューロンの方が皮質内投射ニューロンよりも先に誕生のピークを迎えることがわかった。以上の結果より、皮質興奮性ニューロンは初期投射から2つのタイプに分類されること、また、これらのニューロンは異なる時間枠で順次産生されることが明らかとなった。また、これまで知られているニューロン層配置と誕生日の相関よりも、ニューロン投射タイプと誕生日により強い相関があることが示され、皮質ニューロンの発生の理解に新しい視点をもたらした。27年度が最終年度であるため、記入しない。大脳皮質興奮性ニューロンは皮質内外の領域を結ぶ投射性ニューロンである。これらニューロンは層構造を形成し、一般的に深層には皮質外投射、浅層には皮質内投射ニューロンが分布するとされるが、詳しくみると深層では両者が混在している。これらニューロンはそれぞれさらに投射の多様性を示すが、その産生過程は不明な点が多い。これまでの研究で、深層興奮性ニューロンは、移動過程において中間帯で軸索を形成することを明らかにした。本年度は深層浅層全体を含めたこれらニューロンの軸索形成をさらに詳しく調べ、初期の軸索投射について系統的に解析した。その結果、皮質興奮性ニューロンはその初期投射パターンから外側投射するものと内側投射するものの2つに分類できることがわかった。外側投射は内側投射よりも先に現れた。それぞれの起始細胞の分子発現から、外側、内側投射はそれぞれ将来の皮質下投射と交連性ニューロンに対応すると考えられた。また、これらニューロンの層分布から、2タイプのニューロンの切換えは深層ニューロンの産生時期におこると予想された。そこで実際に同じ深層(V層)内の皮質下投射ニューロンと交連性ニューロンの最終分裂日を比較したところ、皮質下投射ニューロンの方が全体として先に分化していることがわかった。以上の結果より、皮質興奮性ニューロンはその初期投射から異なる性質を持つ2つのタイプに分類されることが明確になった。また、これまで各層に分布するニューロンと最終分裂日にはinside-outの相関があることが知られていたが、ニューロンの投射タイプと最終分裂日はより強い相関があることが示唆された。研究課題として掲げた3つの項目のうち、(1)興奮性ニューロンはその初期投射パターンから2つに分類できることを明確にすること、

(2)同じ深層(V層)に存在する2つのニューロンタイプの発生時期(最終分裂日)を明らかにすることはほぼ達成した。さらに(3)2つのニューロンタイプの切換えが起こる場を明らかにすることについても解析準備が整ってきているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。誕生時期の差が層の枠組みを超え外側、内側投射ニューロンで2分されるということをより一般化するため、VI層内のニューロンの誕生時期についても解析する。研究課題(3)として挙げた、外側、内側投射をするニューロンタイプの切換えの場を解析するため、平成25年度までに用意した誘導型Creをもつプラスミドや、レポーターマウス、スライス培養を組み合わせて、時期特異的あるは細胞特異的な標識を行い、個体脳ならびにタイムラプス解析によってそれぞれのニューロンタイプが生じる過程な解析を進める。得られた結果をまとめ論文として発表する予定である。
p21rasシグナル伝達経路活性化阻害による炎症性腸疾患の治療 -炎症の抑制と発癌予防を目的として-

本研究においてはp21ras活性化阻害剤の腫瘍発生阻害効果および炎症性抑制効果について,消化管由来腫瘍細胞および炎症腸疾患モデルを用いて検討し,これらの薬剤を炎症性腸疾患の治療,炎症性腸疾患における発癌のchemopriventionに応用することを目的とした。これまでin vitroの研究を行ってきた。その結果,Ki-rasを遺伝子導入したfibroblast(NIH/3T3)cell,およびKi-rasのmutationが明らかとなっているcell lineを用いて下記の結果を得た。(2)FA,OAがKi-rasでtransformされた上記細胞に対してcytotoxicに作用するのに対し,正常細胞はこの薬剤に対して抵抗性であること(3)これらの細胞に対するcytotxicityは,DNAのfragmentationを伴うapoptosis誘導するであること(4)細胞内シグナル伝達系の解析により,これらがMAPK、JNKのキナーゼを介したシグナル伝達系を介してapoptosisを誘導していることを見出した。これらのことから,FTPase阻害剤であるFA,OAは,rasのmutationを伴う腫瘍のapoptosisを誘導し,しかも正常細胞に影響を及ぼさないchemoprevention reagentとして有望である可能性を見出した。現在,動物実験および,炎症性腸疾患発癌を想定した大腸癌由来細胞における検討を行っている。本年度は,Trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)惹起性ラット腸炎モデルを作成し,その腸管局所の経時的な免疫学的解析を行った。炎症発生以後経時的に腸管組織を摘出し,これより分離したRNAを用いて,Tリンパ球由来サイトカイン(IL-2,IL-4,IL-10,INF-g)mRNA量をRT-PCR法を用いて測定した。その結果,このモデルの慢性期において,Th-1タイプのcytokine(IL-2,IL-4)が持続的に産生されていることを明らかにした。この結果によって,本研究の課題である「炎症性腸疾患動物実験モデル腸管局所におけるリンパ球由来サイトカイン産生に及ぼすp21ras活性化阻害剤の影響」についての解析に当たってTh-1タイプの動態に特に注目すべきであることが明らかになった。さらに本年度は,患者由来の材料を用いて,「ヒトの免疫担当細胞と腸管内血管内皮細胞の接着をin vitroで再現する実験系の開発とその解析」についての研究を進め,患者大腸・小腸由来の血管内皮細胞培養を行っている。今後,ratのTNBS腸炎モデルを用い,このモデルに対して当研究施設で新規に開発した薬物を含むp21ras活性化阻害剤であるprotein pharnesyl transferase inhibitorを種々の投与量で全身・局所投与し,影響を検討を行う。研究目的:p21 ras活性化阻害剤の腫瘍発生阻害効果および炎症抑制効果について,消化管由来腫瘍細胞および炎症性腸疾患モデルを用いて検討し,これらの薬剤を炎症性腸疾患の治療,炎症性腸疾患における発癌のchemopriventionに応用することを目的とする。平成10年度の研究実績(2) falnesylamineがKi-rasでtransformされた上記細胞に対してcytotoxicに作用するのに対し,正常細胞はこの薬剤に対して抵抗性であること(3)これらの細胞に対するcytotxicityは,DNAのfragmentationを伴うapoptosis誘導するであることを見出した。これらのことからFTPase阻害剤であるfalnesylamineは,rasのmutationを伴う腫瘍のapoptosisを誘導し,しかも正常細胞に影響を及ぼさないchemoprivention reagentとして有望である可能性を見出した。
光反応性連続構造高分子を用いた光メカニカルシステムの構築

光合成微生物が持つ光感知タンパク質の光反応中心として利用されているフォトクロミック分子であるクマル酸類を縮合重合して得られる主鎖型フォトポリマーの重合方法論を開発した。これらの高分子は全繰り返し単位主鎖中に連続的に光反応性基を有し、かつ剛直であるために光反応はそのまま物質の密度変化に影響を及ぼすと考えられる。そこで、平成20年度はクマル酸に特異的なE-Z異性化や[2+2]付加環化反応を、分子鎖間配列形態でコントロールし、連続的に起こる光反応を利用して光メカニカルシステムを確立することを目的として研究をすすめた。まずメタヒドロキシ桂皮酸およびカフェ酸を重合し、光反応性連続構造を持つ高分子を得た。分子量は25000程度であった。しかし、ポリカフェ酸に関しては分子量が5000000を超える超高分子量体が含まれることが分かった。これらは何れもトリフルオロ酢酸に溶解することが分かったので、キャスト法によりフィルムを作成した結果、透明なフィルムが得られた。そこで光変形挙動を調べた。ポリ(m-クマル酸)フィルムは高圧水銀灯照射により照射方向に対して反対側に屈曲した。これは、非晶性のフィルムであり、分子鎖間におけるπ電子の重なりが無く、E-Z異性化がフィルム表面で効率的に起こったことに依ると考えられる。一方、ポリカフェ酸のフィルムは照射方向に屈曲した。これは高分岐構造のために分子鎖同士が接する機会が増加し、二量化が起こる割合が増加したことに依ると考えられる。光変形により生じた力は10μN程度であり、プラスチックフィルムにおいて光を力学エネルギーへと直接変換するシステムを初めて開発したことになる。
はばたき飛行を制御する神経機構の分析

これまでに特定しているはばたき飛行を制御する脳下行性ニューロンについて,分子遺伝学的な手法を用いて形態学的な分析を行い,ニューロンの入出力を特定した.下行性ニューロンへの入力細胞として,視覚系・平衡感覚系のニューロンを特定した.飛翔神経叢およびハルテア神経叢への投射に加え,脳内の深部領域にもシナプス出力部をもつことが分かった.また,脳下行性ニューロンを選択的に標識する遺伝子組み換え系統の作出を継続し,この過程で,はばたき制御に重要な役割をもつことが推察される新たな脳下行性ニューロンを発見した.下行性ニューロンに関わる3件の実験結果,飛行回路を含む神経系についての神経解剖地図をプレプリントサーバbioRxivにアップし,作成した遺伝学的リソースについて,コミュニティに公開した.GAL4系統データベースを用い,運動系である飛行回路を構成する飛翔神経叢,ハルテア神経叢のニューロンの分析を行い,運動ニューロン・介在ニューロンについて,新たな細胞種を同定した.神経支配領域を分析することにより,飛行回路の内部構造を分析した.神経突起分布のプロファイルをもとにした多変量解析により,背腹軸にかけて層状の機能的構造の存在を示した.またSplit-GAL4交差法を用いて,これらのニューロンタイプを選択的に標識する遺伝子組み換え系統を作出した.作出した系統について,今後活性化および不活性化実験を行い,どのようにはばたき飛行へ貢献しているかを検証する.飛行制御ニューロンの分析:これまでに同定されたはばたきをコントロールする脳下降性ニューロンDNa02のシナプス領域の解析を行った.分子遺伝学的な手法を用い,経シナプストレーサーによって,DNa02のシナプス前細胞の探索を行い,視覚系・平衡感覚系の細胞を特定した.またシナプトタグミンによる分析を行い,胸部神経節の神経終末はシナプス前末端であること,さらに脳内においても,インフェリア・ブリッジという領域にシナプス前末端が存在することを明らかにした.また研究の過程で,全体的にDNa02に類似の形状を示すが,飛翔神経叢の異なる領域へ投射をもつ下行性ニューロンDNa03の分析を行った.DNa02と同様,それぞれ類似する小型のニューロンの集団であり,DNa03との機能的な差異が推察される.飛行回路の解析:GAL4系統データベースにより,飛翔神経叢を構成する運動ニューロン,介在ニューロンの同定を行い,ニューロンタイプ別のリストを作成した.このリストを元に,Split-GAL4交差法を用いて,ニューロンタイプを選択的に標識する遺伝子組み換え系統を作出した.同定したニューロンの三次元再構築を行い,飛行神経回路の内部構造を分析したところ,2つレイヤーに分かれていることを発見した.背側のレイヤーは,脳とよく接続し,またパワー筋運動ニューロンがより多くの神経支配をもっていた.腹側のレイヤーは,制御筋運動ニューロンがより多くの神経支配をもっていた.またジャイロスコープ様のセンサであるハルテアからの感覚信号を処理するハルテア神経叢についても同様に分析を行い,各ニューロンタイプを同定し,これらを選択的に標識する系統を作出した.飛翔神経叢と同様,背側と腹側の2層に機能的に分化していることが推察される.飛行制御ニューロンの分析:はばたきをコントロールするニューロンDNa02の飛行中の神経活動を計測する.立体的に分布する45番の樹状突起分枝について,最適な計測プレーンを検討する.DNa02は脳内におよそ15対存在するニューロン集団であり,(1)DNa02のニューロンが方向,速度,加速度など,飛行のパラメータをどのように表現しているか,(2)集団のそれぞれのニューロンの応答の個性を調査する.また,DNa03について,これを標識する遺伝子組み換え系統を作出し,シナプス接続解析を行う.飛行回路の解析:昨年度に同定した飛翔神経叢,ハルテア神経叢のニューロンデータをアフィン変換によって標準座標系に登録し,各ニューロン同士の接続関係を推測する.とくに,2つの神経叢間同士の連絡と,機能未知の領域であるテクチュリムへの投射に注目する.これまでに特定しているはばたき飛行を制御する脳下行性ニューロンについて,分子遺伝学的な手法を用いて形態学的な分析を行い,ニューロンの入出力を特定した.下行性ニューロンへの入力細胞として,視覚系・平衡感覚系のニューロンを特定した.飛翔神経叢およびハルテア神経叢への投射に加え,脳内の深部領域にもシナプス出力部をもつことが分かった.また,脳下行性ニューロンを選択的に標識する遺伝子組み換え系統の作出を継続し,この過程で,はばたき制御に重要な役割をもつことが推察される新たな脳下行性ニューロンを発見した.下行性ニューロンに関わる3件の実験結果,飛行回路を含む神経系についての神経解剖地図をプレプリントサーバbioRxivにアップし,作成した遺伝学的リソースについて,コミュニティに公開した.GAL4系統データベースを用い,運動系である飛行回路を構成する飛翔神経叢,ハルテア神経叢のニューロンの分析を行い,運動ニューロン・介在ニューロンについて,新たな細胞種を同定した.神経支配領域を分析することにより,飛行回路の内部構造を分析した.神経突起分布のプロファイルをもとにした多変量解析により,背腹軸にかけて層状の機能的構造の存在を示した.またSplit-GAL4交差法を用いて,これらのニューロンタイプを選択的に標識する遺伝子組み換え系統を作出した.作出した系統について,今後活性化および不活性化実験を行い,どのようにはばたき飛行へ貢献しているかを検証する.飛行制御ニューロンの分析:これまでに同定されたはばたきをコントロールする脳下降性ニューロンDNa02のシナプス領域の解析を行った.

分子遺伝学的な手法を用い,経シナプストレーサーによって,DNa02のシナプス前細胞の探索を行い,視覚系・平衡感覚系の細胞を特定した.またシナプトタグミンによる分析を行い,胸部神経節の神経終末はシナプス前末端であること,さらに脳内においても,インフェリア・ブリッジという領域にシナプス前末端が存在することを明らかにした.また研究の過程で,全体的にDNa02に類似の形状を示すが,飛翔神経叢の異なる領域へ投射をもつ下行性ニューロンDNa03の分析を行った.DNa02と同様,それぞれ類似する小型のニューロンの集団であり,DNa03との機能的な差異が推察される.飛行回路の解析:GAL4系統データベースにより,飛翔神経叢を構成する運動ニューロン,介在ニューロンの同定を行い,ニューロンタイプ別のリストを作成した.このリストを元に,Split-GAL4交差法を用いて,ニューロンタイプを選択的に標識する遺伝子組み換え系統を作出した.同定したニューロンの三次元再構築を行い,飛行神経回路の内部構造を分析したところ,2つレイヤーに分かれていることを発見した.背側のレイヤーは,脳とよく接続し,またパワー筋運動ニューロンがより多くの神経支配をもっていた.腹側のレイヤーは,制御筋運動ニューロンがより多くの神経支配をもっていた.またジャイロスコープ様のセンサであるハルテアからの感覚信号を処理するハルテア神経叢についても同様に分析を行い,各ニューロンタイプを同定し,これらを選択的に標識する系統を作出した.飛翔神経叢と同様,背側と腹側の2層に機能的に分化していることが推察される.飛行制御ニューロンの分析:はばたきをコントロールするニューロンDNa02の飛行中の神経活動を計測する.立体的に分布する45番の樹状突起分枝について,最適な計測プレーンを検討する.DNa02は脳内におよそ15対存在するニューロン集団であり,(1)DNa02のニューロンが方向,速度,加速度など,飛行のパラメータをどのように表現しているか,(2)集団のそれぞれのニューロンの応答の個性を調査する.また,DNa03について,これを標識する遺伝子組み換え系統を作出し,シナプス接続解析を行う.飛行回路の解析:昨年度に同定した飛翔神経叢,ハルテア神経叢のニューロンデータをアフィン変換によって標準座標系に登録し,各ニューロン同士の接続関係を推測する.とくに,2つの神経叢間同士の連絡と,機能未知の領域であるテクチュリムへの投射に注目する.
種々のDNA動態における早老症原因遺伝子産物RecQL4の機能とその連携の解析

本研究では、早老症原因遺伝子産物RecQL4の高等真核細胞内での機能と動態を理解することを目的とし、生化学的手法や培養細胞を利用した解析をおこなった。その結果、1) RecQL4がDNA損傷部位へ速やかに移行すること、2) DNA損傷応答関連タンパク質のほか、種々のタンパク質翻訳後修飾酵素がRecQL4と相互作用すること、3) RecQL4に高等真核細胞の生存に必須な領域とDNA損傷に対応するための領域が共存していること、が示された。本研究では、DNA複製をはじめとした細胞周期の諸段階と遺伝子構造安定性維持機構の分子的な連携に焦点を絞り、その中でのRothmund-Thomson症候群原因遺伝子産物RecQL4の機能について、分子レベルより解明することを目標とする。RecQL4のDNA修復に対する役割についての知見を得るため、GFP融合RecQL4を発現させた細胞株を作製し、その細胞核にレーザーを照射して特定の領域にDNA二本鎖切断損傷を与えたところ、照射部位へのRecQL4の集積が観察された。このRecQL4のDNA損傷部位への集積にはN末側の領域が重要な役割を果たすことが示唆された。次に、質量分析を用いてRecQL4と相互作用するタンパク質の同定を試みたところ、紫外線損傷修復因子であるDDB1などのDNA損傷応答関連タンパク質、タンパク質脱アセチル化酵素SIRT1の他、様々なユビキチンリガーゼ(E3)やSUMO E3リガーゼがRecQL4と相互作用することが見出された。これらについて、免疫沈降法とimmuno blottingを組み合わせて確認もおこない、確かにRecQL4とこれらのタンパク質に相互作用があることが示された。したがって、ユビキチン化やSUMO化などの修飾がRecQL4の機能を制御している可能性が考えられた。さらに、細胞生物学的解析の手段としてRecQL4を破壊したニワトリDT40細胞株を樹立した。この細胞株の生存にはヒトRecQL4に発現させる必要があり、ヒトRecQL4の発現を停止させると細胞は致死となった。本実験の成果により、RecQL4が確かに生存に必須なタンパク質であることを高等真核生物り細胞レベルで明確に示すことに成功した。昨年度、GFP融合RecQL4を発現させた細胞株を作製し、その細胞核にレーザーを照射して照射部位へのRecQL4の集積を観察した。レーザー照射により様々な種類のDNA損傷が発生すると考えられるが、BrdUを添加した場合にとくにDNA二本鎖切断の頻度が増すことが知られている。そこで、この条件で同様の実験をおこなったところ、GFP-RecQL4の損傷部位への集積が顕著に増加した。したがって、RecQL4はDNA二本鎖切断修復において機能することが強く示唆された。このようなRecQL4のDNA損傷部位への集積は、損傷発生後2-3分で強くなるものの、すぐに解離が始まり、DNA損傷の発生から10分後にはほとんど見られなくなったことより、RecQL4のDNA二本鎖切断修復における機能は極めて一過的なものであると考えられた。また、このようなRecQL4のDNA損傷部位への集積は非相同末端結合修復の初期段階から主要な役割を果たすKu80や相同組み換え修復に機能するNBS1、BRCA1などの欠損細胞を用いて同様の検討をおこなったが、RecQL4の損傷部位への集積に影響を与えなかった。一方、ParP-1の欠損やParP-1の阻害剤であるDIQを処理したときにRecQL4の損傷部位への集積が顕著に抑制された。以上より、RecQL4がDNA二本鎖切断に応じたポリADPリボシル化に呼応して損傷部位に集積し一過的な機能を果たすことが推測された。ロスモンド・トムソン症候群(RTS)原因遺伝子産物(RecQL4)のDNA複製・修復に対する役割についての知見を得るため、細胞生物学的解析の手段としてRecQL4を破壊したニワトリDT40細胞株を樹立した。この細胞株の樹立に際し、遺伝子組換えにより細胞内でヒトRecQL4タンパク質を発現するよう操作したが、このヒトRecQL4の発現を停止すると同細胞株は致死となった。この致死性は、ヒトRecQL4のN末端側496アミノ酸のみで抑えることが可能であった。RecQL4のN末端側領域は出芽酵母のDNA複製に必須なタンパク質であるSld2に相同性を有することが知られており、同領域がDNA複製に必須な役割を果たすことが推測されている。本結果は、RecQL4のN末端側領域が高等真核細胞においても生存に必須な作用を持つことをはじめて提示したものである。

一方、同細胞株の生育をヒトRecQL4の全長で維持した場合に比べて、N末端側のみで生育を維持した細胞ではDNA二本鎖切断やDNA架橋剤に対する感受性が高まることが示された。このことから、RecQL4の中央領域およびC末端側領域が、DNA傷害に対する応答・修復反応に寄与を果たすことが示唆された。RTSではRecQL4の中央領域以降に変異がある場合が多いことから、RTSの原因となるRecQL4の変異ではN末端側の細胞生存に必須な機能が影響を受けることなく中央部以降の機能に欠損を持つと考えられる。すなわち、ヒトRecQL4のN末端側のみで生育を維持したRecQL4欠損細胞株は、RTS患者細胞を模した樹立細胞株として、他の遺伝的背景を同一とする細胞株との比較による詳細なRecQL4の細胞生物学的解析を可能にするものであると期待できる。
先天代謝異常症の病因遺伝子の同定-特にムコ多糖症、β-ケトチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム病

1.ムコ多糖症:IVA型欠損酵素GALNSのcDNAクローニング、染色体座位の決定につづき、全長ゲノム構造解析に成功した。またI,II.IVA,VII型の数10例の遺伝子変異を同定した。なかでもIVA型約100例の患者にて45種類の変異を確認しているが、日本人患者のdouble gene deletionによるcommon rearrangementや欧米人のcommon missense mutationの同定は注目を得ている。今後、日本、欧米(イギリス、アイルランド、ドイツ、イタリア、フランス、カナダ、アメリカ)、アジア(中国、パキスタン、インド)、南アメリカ(コロンビア、ブラジル)の各人種で遺伝子解析を行い、人種間での変異や収束性や多様性について検討する予定である。2.β-ケトチオラーゼ欠損症:合計21症例の本症の遺伝子解析を行っているが、これまでに明らかとなった13例の17の異なった遺伝子変異について、Mutation Updateの依頼原稿にまとめた。この疾患の解析からエクソン内の1塩基置換で、そのエクソンがスキップするという現象を発見した。またアメリカの本症家系について、蛋白質遺伝子両面から出生前診断をおこなった。関連する細胞質チオラーゼ(CT)についてもヒトCT抗体を用いてヒトCTcDNAをクローニングすることに成功し、その全塩基配列を決定することができた。3.ペルオキシソーム病:ペルオキシソームβ酸化系酵素の一つであるアシルCoAオキシダーゼのヒトcDNAをクローニングし、本酵素欠損症兄妹例において病因と考えられる点突然変異を見い出した。また、副腎白質ジストロフィー症の遺伝子解析を行った。Zellweger症候群F群の病因遺伝子変異を同定した。更に最近、C群の候補病因遺伝子を単離したので、現在解析を進めている。1.cDNAの単離・細胞質アセトアセチル-CoAチオラーゼ抗体を調製し、それをプローブとしてヒト肝λgt11cDNAライブラリーをスクリーニングし陽性クローンを得た。さらにヒト胎盤λgt11cDNAライブラリーから完全長のcDNAをクローニングした。・ヒトアシルCoAオキシダーゼcDNAはラットcDNAをプローブとして不完全長cDNAが単離されていたが5'末端を含む完全長cDNAの単離に成功した。2.ゲノム遺伝子の単離全長cDNAをプローブとしてヒトλEMBL3ゲノミックDNAライブラリーをスクリーニングしてヒトperoxisome assemblyfactor-1(ヒトPAF1)とヒトN-acetylgalactosamine-6-sulfatase(ヒトGALNS)の全長を含む互いにオーバーラップするクローンを得た。3.遺伝子染色体上座位の決定4.病因遺伝子変異の同定MPSI型(5例)、MPSII型(11例)、MPSIV型(17例)、MPSVII型(5例)、ケトチオラーゼ欠損症の変異部位を決定し、1部臨床表現型と遺伝子変異型との相関性を示唆する結果を得た。<研究目的>先天代謝異常症(特にムコ多糖症、β-ケトチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム病)の病因病態の解明、早期診断、保因者診断、出生前診断への応用、治療法の開発を目的として遺伝子解析を行い、以下の結果を得た。<平成6年度研究結果>1.ムコ多糖症:I型、II型、IVA型、VII型の数10例について新しい変異を同定した。なかでもIVA型約100例の患者にて45種類の変異を確認しているが、日本人患者のdouble gene deletionによるcommon rearrangementや欧米人のcommom missense mutationの同定は注目を得ている。2.β-ケトチオラーゼ欠損症:13例の17の異なった遺伝子変異を同定し、Hum.Mutat.のMutation Updateという依頼原稿にまとめた。そしてこれらの疾患の解析からエクソン内の1塩基置換でそのエクソンがスキップするという現象を発見した。

3.ペルオキシソーム病:アシルDoAオキシダーゼ欠損症兄妹例において病因と考えられる点突然変異を見い出した。また、副腎白質ジストロフィー症の遺伝子解析を行った。さらにZellweger症候群F群3例において遺伝子変異を同定した。