hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
介護労働の市場化と外国人化を誘起する移民・福祉政策の相互作用性に関する国際比較

→2017年の現地調査で明らかになった2010年中頃からの付属労働制度におけるバウチャー利用の急速な普及により、イタリアにおけるケア労働の非正規性の顕著な普及や抑制傾向に点kンすると考えられた。しかしながら、これが十分な調査結果やデータ蓄積・公開により実証される前に急遽2017年度をもって当該制度は廃止になった。また、2018年から後続制度にあたる制度が実施されており、さらなる継続的な中止が必要となった。(2)地方政策において展開される当該労働者への専門職業化と就労の適正化に向けた支援策の実態と政策効果と問題点について実証分析を通じて明らかにする。→下記の「研究の進捗状況」ニ明記した理由により、当該目的に対する現地調査は平成30年度に実施予定である。(3)日本とイタリアの「介護労働の市場化と外国人化」に係る、理論枠組みの構築と両政策並びに現状の受入れ実態に関する比較分析指標を作成し、両国の政策展開と実態の実証的に解明に着手する。→これに関しては、イタリアが2000年代以降、介護労働の市場化と外国人化が決定的になったのに対して、日本については、2010年代後半から、外国人化を誘起する制度変更が行われている。また市場に関しては日本では介護労働の完全な市場化は進められていないが、高齢化により介護保険制度の給付水準が抑制傾向が見られる中で、市場化は不可避的に進んでいるといえる。ただし、外国人介護労働者による完全な市場労働は解禁されていない。外国人ケア労働者の就労形態については、2017年の現地調査でバウチャーを用いる付属労働制度についての指摘があったため、これについての調査を新たに開始した。又この制度が突如2017年12月31日に廃止され、2018年からは後続の新制度が施行されるようになり、これまでの分析の見直しが必要となった。加えて、学内業務(入試委員長2016-7年)や家族の介護によって、研究遂行のための時間が大幅に短縮した。2000年代以降のイタリアでは、民間市場の家事領域で介護労働に従事する外国人労働者が劇的に増加した。この事態はとくに受入れ国であるイタリアの移民政策と社会政策双方の直接ー間接的な相互作用性によって誘起されてきた。他方、日本では2014年前後「介護労働の市場化と外国人化」について大々的な議論や特区での適用が急激な展開をみせている。そこで本研究では日本とイタリアの事例について、外国人介護労働者に対する移民政策と介護政策の相互作用、介護労働の市場化をめぐる政策動向、外国人介護労働者の技能評価の解明を目的とした。研究の結果、日本とイタリアが介護政策においては介護の現物給付(日本)と現金給付(イタリア)主流の政策をとり、また外国人介護労働者については、厳格な入国前の技能・学歴要件と入国後の職業教育(日本)と入国前の技能・学歴要件が不在で、入国後に事後的に滞在就労を承認する制度利用の普及(イタリア)といった点で、入国前後に少なくとも二重の審査や技能習得を要する日本と、事後承認型のイタリアという点で対照的であることが明らかになった。また、こうした介護をめぐる政策様相の対象性は、世界的にみて最高比率の水準にある、高齢化、財政収支の赤字(対GDP)、社会保障支出における非現役(高齢者)への支出といった高い共通性があるにもかかわらず、対照的であることも明らかにし、これらをAsian Europe Journal (Springer)で論文発表した。
母細胞壁の開裂と脱ぎ捨ての有無から解くトレボキシア藻の細胞連結と偽柔組織化

本研究は、トレボキシア藻の分裂様式の変化が細胞同士の連結を生み出し、単細胞藻が糸状体化していく過程を明らかにすることを目的とした。二分裂型のスチココッカスは、糸状体をしばしば形成する株と全く形成しない株が存在する。糸状体形成の要因を明らかにするために、母細胞壁開裂の有無と分裂面の細胞壁成分の差異に着目した。糸状体形成株と非形成株はどちらも母細胞壁の開裂が観察された。一方、糸状体形成株では、細胞質分裂後の分裂面にマンノース特異的ConAの蛍光が観察された。細胞質分裂面のマンノース局在の有無が糸状体形成に影響を及ぼしている可能性が示唆された。マンノシダーゼとセルラーゼで処理すると、糸状体は断片化し、プロトプラスト化する様子が観察された。トレボキシア藻の多くは、内生胞子形成で増殖し、母細胞壁開裂後に娘細胞が放出される。一方、細胞質分裂後に母細胞壁が脱ぎ捨てられずに残存する種も存在する。本研究では、母細胞壁の残存による分裂様式の変化が、細胞同士の連結を引き起こし、単細胞状態から糸状体化、細胞塊化、偽柔組織化を経て葉状体へと発達していく過程を明らかにすることを目的としている。初年度は、糸状体を形成するStichococcusbacillarisと細胞塊を形成するDiplosphaerachodatiiの分裂溝とトライアンギュラースペースに電子密度の高い細胞外分泌物が生じることに着目した。2種の培養細胞を加圧凍結後、凍結置換し、透過型電子顕微鏡で観察した。分裂溝陥入後、トライアンギュラースペースに面する娘細胞膜から電子密度の高い内容物をもつ基質小胞が複数分泌されると、小胞の周囲から徐々に細胞外分泌物の電子密度が低下し、やがてトライアンギュラースペース全体の細胞外分泌物が消失する様子が観察された。母細胞壁はこの後に開裂するが、娘細胞壁上に残存する。分泌物が分解されて娘細胞同士のつながりがなくなると、母細胞壁開裂後に単細胞状態になるものと考えられる。このような細胞外分泌物や基質小胞は、単細胞性のChlorella、Nannocohloris、Marvaniaなどでは観察されないことから、娘細胞解離の遅れを引き起こす要因になっていると予想される。トレボキシア藻綱のStichococcusbacillarisには一時的に糸状体を形成する株がある。本種が含まれるカワノリ科では、細胞塊を形成するDiplosphaeraや柔組織のような塊になるPrasiolopsis、葉状体を形成するPrasiolaが存在することから、Stichococcusの糸状体形成は多細胞化の初期の段階と位置づけられる可能性がある。昨年度は、S.bacillarisやDiplosphaera chodattiの分裂溝とトライアンギュラースペースに生じる基質小胞と細胞外分泌物の消長を透過電顕で調べた。今年度はS.bacillarisの糸状体形成株と非形成株の差異に着目した。S.bacillaxis Handa-1755-a株は、対数増殖期から定常期を通じて細胞は単細胞状態のままだった。一方、786-x株は対数増殖期に数数十個の娘細胞同士が連なった糸状体を形成するが、定常期には娘細胞が分離し単細胞状態に戻る。このことから786-x株の糸状体形成は娘細胞解離の遅れに起因すると予想された。そこで、1755-a株と786-x株の分裂を透過型電顕で観察したところ、細胞質分裂と母細胞壁の開裂はどちらの株でも同じように起こっていた。娘細胞解離の遅れは母細胞壁開裂後に娘細胞壁の接着面が分離する過程に原因があるのではないかと考えられた。マンノース特異的ConA染色を試みたところ、786-x株の糸状体の両末端と、接着したままになっている娘細胞同士の境目で特異的な蛍光が観察された。同じマンノース特異的PSA染色では、糸状体の片方の末端のみに蛍光が観察された。一方、糸状体を形成しない1755-a株では、これらのレクチン染色の蛍光は観察されなかった。昨年度と今年度の成果をもとに、来年度は新規分裂面での細胞壁成分の違いが娘細胞の解離の遅れへ及ぼす影響について調べる。トレボキシア藻綱のStichococcusbacillarisには一時的に糸状体を形成する株と形成しない株がある。

S. bacillarisの属するカワノリクレードは柔組織様細胞塊や葉状体などの多細胞化を果たしたクレードである。S. bacillarisの糸状体形成機構を明らかにすることは、トレボキシア藻綱における細胞連結のしくみを知るための鍵になると期待される。昨年度は、糸状体形成株と非形成株ではどちらも同様に細胞質分裂と母細胞壁の開裂が起こることを確認した。そこで、本年度は母細胞壁開裂後の娘細胞解離に着目し、糸状体形成株と非形成株の細胞壁成分の差異を調べた。糸状体形成株は分裂予定面にFluostain Iの蛍光が観察された。細胞質分裂後の分裂面にはマンノース特異的ConAの蛍光が観察された。一方、非形成株ではFluostain Iの蛍光は糸状体形成株と同様に観察されたが、ConAの特異的蛍光は観察されなかった。このことから、細胞質分裂面のマンノース局在の有無が糸状体形成に影響を及ぼしている可能性が示唆された。そこで、糸状体形成株をマンノシダーゼ処理したところ、ConAの特異的蛍光は消失したが、糸状体に変化はなかった。セルラーゼ処理の場合には、Fluostain Iの特異的蛍光は消失せず、糸状体に変化はなかった。しかし、マンノシダーゼとセルラーゼで同時に処理すると、ConAとFluostain Iの蛍光が消失し、糸状体の断片化と細胞のプロトプラスト化が観察された。母細胞壁の開裂とそれに続く娘細胞解離の過程を超微細構造学的に解析することにより、カワノリ科の多様な細胞体制の発達の初期段階としての糸状体形成機構が見いだされつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に基づき、Diplosphaeara属やPrasiolopsis属の種を研究対象に含め、新規分裂面の細胞壁成分の差異を明らかにすることにより、カワノリ科の細胞体制の発達過程の一端を明らかにすることを目指す。
脳活動の同期と社会的相互作用の関連の検討

超小型近赤外分光測定装置(NIRS)を用いて、背内側前頭前野の活動の同期現象をリアルタイムでモニター可能なシステムを作成し、個体間の社会的相互関係を実社会環境下で定量計測することが本研究の目的である。グループ・ディスカッション時、リズム集団歩行時の脳活動同調を計測した結果、集団インタラクションのあり方の違いに応じた脳活動同調の変化を捉えることに成功した。個人内の脳機能同定を主とする従来研究を越えた個人間の脳活動同調の評価が、共感やコミュニケーションの質などの集団における創発的状態の指標を与える可能性を示唆している。超小型近赤外分光測定装置を用いて、背内側前頭前野の活動の同期現象をリアルタイムでモニターするシステムの開発と、集団の脳活動、集団の作業効率、集団を形成する個人間のコミュニケーションの質と量を定量化するためのログを記録する環境の開発を行った。脳活動の相関の計算は、当初、distance correlationを用いることを予定していたが、呼吸や心拍、体動にともなう生理的信号のゆらぎ成分を排除するために、Wavelet transform coherence (WTC)を用いることにした。パイロット実験として、若年健常被験者25名が、同時に半径2mのコースを歩くときの脳活動の同調を、歩行がスムースになるようリズムを提示した場合と、何も指示をせず自然に歩行させた場合とで比較した。リズム提示したで、歩行がスムースかつ、歩行速度が速くなっただけではなく、脳活動を反映する、周期5秒から10秒の帯域で、前後して歩行している被験者の背内側前頭前野の活動が同期することを検証した。また、大学生48名を対象として、4名でしりとり課題を行わせ、背内側前頭前野の活動の同期を計測した。その結果、周期15秒から30秒の帯域で、平均WTCの値が対話密度と正相関すること、各個人の他メンバとの平均WTCも,その人の発言数と正相関することが示された。この結果は、コミュニケーションが密なほど,この時間スケールの脳同調が強いことを示しており、このシステムを用いて、本研究の目的である、個体間の社会的相互関係を実社会環境下で脳機能計測を用いて定量可能であることが示された。超小型近赤外分光測定装置を用いて、背内側前頭前野の活動の同期現象をリアルタイムでモニターするシステムの開発と、集団の脳活動、集団の作業効率、集団を形成する個人間のコミュニケーションの質と量を定量化し、社会的相互関係を実社会環境下で計測することが研究の目標であった。平成26年度は、実際に、中学校の英語の授業を行っている最中に、教師と生徒の間での、背内側前頭前野の脳活動の同期の計測を行った。50分間の授業を、最初の15分間は、生徒間、生徒教師間でポジティブかつ友好的な関係性を築くウォーミングアップ活動を行い、そののちに通常の英文法の授業を行った場合と、それを逆の順番で授業を行った場合で、教師1名とランダムに選んだ生徒9名の脳活動の同期をWavelet transform coherence(WTC)を用いて解析した。その結果、最初にウォーミングアップ活動を行った群のほうが、授業中の脳活動の同期頻度が多いことがわかった。現実の授業中の教師-生徒間のコミュニケーションの質を、こうした脳活動の同期現象によって定量化できる可能性が示唆された。また、超小型NIRSで計測する脳活動揺らぎと、個人特性との結び付きの可能性を調べる目的で、時間スケール毎の脳活動揺らぎと、性質や性格などの個人特性との関連を検討した。その結果、神経症傾向が、負の感情刺激受容時の緩やかな時間スケールの揺らぎパワー低下に相関することや、開放性の低さは、感情価に依らず課題がもたらすより短い時間スケールでの活動揺らぎ減少に相関することなどを発見した。脳科学本研究の目的である、個体間の社会的相互関係を実社会環境下で脳機能計測を用いて定量可能であることをパイロット実験で示すことができた。次年度はより本格的な検証実験を行う。当初の計画通り研究を進め成果を対外発表する。
ヒゲクジラ類と漁業の競合問題を解決するためのカツオクジラの採餌行動の解明

本研究ではナガスクジラ科の動物が必要とする資源量を推定するためにタイ湾でカツオクジラの摂餌量を実測することを目的とした。2016年9月に野外調査準備として、動物装着型記録計(データロガー)、VHF発信器、浮力材と吸盤がセットになったタグを作製した。また既存のデータロガーは水中での抵抗が大きく、クジラへのタグ装着後すぐに外れてしまうという問題があったため、2016年8月に新規開発された小型のデータロガーを購入した。2016年の10月29日から11月11日の期間、タイのサムットソンクラームに滞在しタイ湾で野外調査を実施した。例年では10-11月をピークとして、多くのカツオクジラがタイ湾に来遊するのだが、本調査ではクジラをほとんど見ることができなかった。例年よりも気温が低く、それが間接的にクジラの来遊状況に影響を与えていた可能性が考えられるが、はっきりとした理由はわからなかった。クジラにほとんど遭遇できなかったため、本調査ではクジラへのタグ装着はできなかった。野外調査においてタグ装着はできなかったが、滞在期間中にタイの共同研究者スラサク・トンサクディー研究員(Department of Marine and Coastal Resource)と本研究課題について多くの議論を交わすことができた。また今後の調査計画についての打ち合わせを実施した。調査終了後はこれまで集めたデータおよび、今年度の調査で得られた目視観測のデータを合わせ解析を進め、現在国際学会誌への投稿準備中である。
胎児胎盤循環調節における一酸化窒素の意見に関する研究

「目的」胎児胎盤循環が障害される各種病態において胎盤でのNO合成酵素(NOS)の局在ならびに発現の差異の検討を目的とした。「成績」家兎に免疫して作製したヒト内皮型NOSに対するポリクローナル抗体を用いて、妊娠初期、及び末期の正常胎盤組織の免疫組織化学的検討を行った。ヒト内皮型NOSの局在は胎盤を構成する組織のうち、胎児側では臍帯血管の終末である絨毛内の毛細血管内皮細胞、ならびに絨毛の合胞体細胞に認められた。この免疫組織染色性は妊娠初期絨毛組織と妊娠末期絨毛組織との比較では、絨毛において合胞体細胞の構成比の高い妊娠末期胎盤において高い傾向が窺われた。妊娠中毒症例の胎盤を用いた検討では、NOSの発現は低下する傾向が示唆された。インビトロにおける胎盤絨毛細胞のNOSの発現の免疫組織化学的検討を行う目的で、Percoll gradient法を用いてヒト胎盤よりcytotrophoblastを調整し、10%ウシ胎仔血清を添加したDulbecco's Modified Eagle's Medium中で培養し、同抗体を用いた検討を行った。ヒト内皮型NOSはcytotrophoblastには染色されなかったが、培養72時間後にこれらcytotrophoblastが合胞体細胞への分化を終了した時点では強く染色された。以上の成績より、ヒト胎盤絨毛においても血管内皮細胞と同様に内皮型NOSが発現することが明らかとなった。今後、絨毛細胞培養系を用いてNOSの発現に影響を与える可能性のある物質を負荷することにより、NOS発現の調節機構の詳細な検討を行う予定である。
近代的書記言語の形成過程の解明－ベトナム語の虚詞と文法史的変化を通して－

ベトナム語の文法を表す語の用法の変化を通して、言語の「近代化」の根本的な要因と普遍的な特徴を解明する。世界の有力諸言語は書き言葉として用いられるにあたって、総じて「近代化」という過程を辿ったと言われているが、その普遍性についてはあまり明らかになっていない。ベトナム語は特に短期間で急激に近代化がなされたため、言語の近代化過程の根本的要因・普遍的な特徴の解明のために、ベトナム語の近代化の過程の研究が必要となる。当分野における新たな試みである人文情報学的な手法を導入する。本研究を行うことにより、これまでになかった「近代化」の観点から、あらゆる言語の教育・研究に新たな方向性を与えることができる。
自己免疫性神経疾患の発症機序:病原体・ガングリオシドとの分子相同性

軸索型ギラン・バレー症侯群モデル動物の樹立ウシ脳ガングリオシド注射後軸索型GBSのモデル動物の樹立を試みた.(1)ウサギ13羽に実際に使用されていたウシ脳ガングリオシド2.5mgもしくはFreund完全アジュバントを3週に1回の割合で感作を繰り返した.初回感作後5-11週で13羽全例に運動麻痺が生じた.発症からピークに達するまでの期間は4日から13日であり,GBS同様急性発症の様式をとった.末梢神経の大径有髄線維は著しく脱落し,ワーラー様の変性を呈していた.リンパ球の浸潤や脱髄像は見られなかった.これに対して,アジュバント対照群10羽では発症しなかった.(2)ウシ脳ガングリオシド感作ウサギでは,初回感作後2週ないし3週でIgMクラスの抗GM1抗体が誘導され,3週ないし4週でIgGへクラススイッチした.クラススイッチ後3週程度でIgG抗GM1抗体はピークに達し,その後1週以内に運動麻痺が発症する傾向がみられた.(3)ウサギ末梢神経よりガングリオシド画分を精製した.簿層クロマトグラム免疫染色にて,発症ウサギの血漿IgGが認識するバンドはモノシアロガングリオシド画分に存在し,標準GM1と同様の移動度を示した.さらに,発症ウサギの血漿IgGが認識するバンドを薄層クロマトグラム-blotting後に質量分析を行い,GM1に由来するシグナルが検出された.発症ウサギの血漿IgGが認識する分子がウサギ末梢神経に発現するGM1であることを確認した.正常ウサギの坐骨神経の軸索にコレラ毒素が結合し,GM1が末梢神経の軸索に発現していることを支持した.本研究により軸索型GBSの動物モデルが樹立されたことから,その病態の解明と治療法の開発は飛躍的に進むであろう.ギラン・バレー症候群患者血清が反応する新しいウシ脳微量ガングリオシド分子の構造決定ウシの脳から抽出したガングリオシドが,西ヨーロッパや南アメリカでは各種神経疾患に対して広く使用されていた.その後,ウシ脳ガングリオシド注射後に発症したギラン・バレー症候群患者が,少なくとも数10例にのぼることが明らかにされた.ギラン・バレー症候群の発症機序を明らかにするために,患者血清が認識するウシ脳ガングリオシド分子をひとつひとつ同定していく作業を開始した.ウシ脳ガングリオシドをQ-Sepharoseカラムクロマトグラフイーで分画した.ギラン・バレー症候群患者血清を用いて薄層クロマトグラフム免疫染色を行い,反応したバンドのひとつがN-グリコリルノイラミン酸を有するGM1[GM1(NeuGc)]であることを突き止めた.抗GM1(NeuGc)抗体は,GM1(NeuAc)と交叉反応を示し,GM1(NeuGc)が免疫原となった可能性が考えられた.GM1(NeuGc)を含むウシ脳ガングリオシド注射後に,GM1(NeuAc)にも交差反応する抗GM1(NeuGc)抗体が産生され,ギラン・バレー症候群発症に至ることが推測された.GM1(NeuGc)は,ギラン・バレー症候群患者血清が認識する新しいウシ脳ガングリオシド分子である.他にも未同定とされるバンドが数多く存在しており,患者血清が反応する微量ガングリオシドの同定中である.また,構造決定された分子が,ヒト末梢神経にも存在するかを確認していく予定である.軸索型ギラン・バレー症侯群モデル動物の樹立ウシ脳ガングリオシド注射後軸索型GBSのモデル動物の樹立を試みた.(1)ウサギ13羽に実際に使用されていたウシ脳ガングリオシド2.5mgもしくはFreund完全アジュバントを3週に1回の割合で感作を繰り返した.初回感作後5-11週で13羽全例に運動麻痺が生じた.発症からピークに達するまでの期間は4日から13日であり,GBS同様急性発症の様式をとった.末梢神経の大径有髄線維は著しく脱落し,ワーラー様の変性を呈していた.リンパ球の浸潤や脱髄像は見られなかった.これに対して,アジュバント対照群10羽では発症しなかった.(2)ウシ脳ガングリオシド感作ウサギでは,初回感作後2週ないし3週でIgMクラスの抗GM1抗体が誘導され,3週ないし4週でIgGへクラススイッチした.クラススイッチ後3週程度でIgG抗GM1抗体はピークに達し,その後1週以内に運動麻痺が発症する傾向がみられた.(3)ウサギ末梢神経よりガングリオシド画分を精製した.簿層クロマトグラム免疫染色にて,発症ウサギの血漿IgGが認識するバンドはモノシアロガングリオシド画分に存在し,標準GM1と同様の移動度を示した.さらに,発症ウサギの血漿IgGが認識するバンドを薄層クロマトグラム-blotting後に質量分析を行い,GM1に由来するシグナルが検出された.発症ウサギの血漿IgGが認識する分子がウサギ末梢神経に発現するGM1であることを確認した.正常ウサギの坐骨神経の軸索にコレラ毒素が結合し,GM1が末梢神経の軸索に発現していることを支持した.本研究により軸索型GBSの動物モデルが樹立されたことから,その病態の解明と治療法の開発は飛躍的に進むであろう.
Xenopus卵細胞に於ける内因性Mチャネル

本研究の主たる目的はXenopusの卵細胞に内因性Mチャネルが存在するか否かについて回答を得るためにM電流の存在を電気生理学的に証明することであった。研究計画に従い成熟卵細胞を用いた膜電位固定実験を行いイオン電流を記録した。実験には助成金により購入したデータ取得・解析装置を用いた。【実験結果】〔1〕保持電圧(-70mV)から脱分極側で活性化される外向きカリウム電流には潅流液中に投与したバリウム(0.1-2mM)により容量依存性に抑制される成分が存在した。〔2〕バリウム感受性カリウム電流は、時間依存性成分と非依存性成分から構成されていた。〔3〕時間依存性成分の膜電位依存性はいわゆるM電流の膜電位依存性と等価であった。〔4〕バリウム感受性、時間依存性成分の薬理学的な性質に関してはテトラエチルアンモニウムや4-アミノピリジンに非感受性であることを証明した。以上の実験結果によりXenopusの卵細胞がMチャネルを内因性に有している事が確定したので、学会等に報告した。内因性クロライド電流の性質に関してもいままで報告されていなかった実験結果が得られたので併せて報告した。本研究は脳細胞のMチャネルに対するプローブとしてのDNAを卵細胞から大量に入手する事に対する理論的背景を与えた。尚、研究発表の欄にはウシ蛙交感神経節細胞のM電流に関する研究成果、購入したデータ取得・解析装置を用いて行ったウサギ副交感神経節細胞での研究成果なども記載した。
大腸癌間質に着目した再発リスクに関わるバイオマーカーの探索

大腸癌間質組織に存在する癌関連線維芽細胞は、癌の進展に重要な役割をすると考えられている。大腸癌細胞株と線維芽細胞株の共培養によって、線維芽細胞のMMP-2が誘導され、癌細胞の浸潤能が亢進することが観察された。線維芽細胞のMMP-2発現を誘導する因子としてEMMPRINが考えられる。大腸癌の臨床検体を用いた免疫組織学的検討では、EMMPRIN、MMP-2ともに約半数の症例で発現していた。両者の発現には有意な関連を認め、EMMPRINによるMMP-2誘導を示唆する結果であった。予後因子の解析では、有意な因子を見出すことはできなかったが、EMMPRINとMMP-2の同時発現が有意な傾向を示していた。昨年度の研究では、in vitroにおける大腸癌細胞株と線維芽細胞の共培養の系で、大腸癌細胞はEMMPRINを産生し線維芽細胞のMMP-2発現を誘導していること、線維芽細胞は液性因子を産生し大腸癌細胞のEMMPRIN発現を誘導していることが考えられていた。本年度は、細胞株を増やし検討したところ7種の細胞株中5株でこの現象が確認され、invasion assayにおいても浸潤能の亢進が確認された。これらは、共培養液にEMMPRIN抗体を加えることによって抑制される傾向が示され、EMMPRINは両細胞を媒介する重要な因子であることが確認された。さらにこれらの細胞株では同時にFGFRの発現を認めており、文献的(Henriksson ML et al. Am J Pathol. 2011)に報告されているFGF1/FGFR3による線維芽細胞から癌細胞へのシグナル経路の存在が伺われた。Invasion assayで認められた浸潤能亢進は、fibroblast growth factor receptor inhibitorによって抑制されることが確認された。さらに発現レベルが低く再現性に乏しいものの、癌細胞と線維芽細胞の共培養の系においてEMTのマーカーであるSnailの発現を認めており、線維芽細胞はEMT誘導に重要な役割を担っているものと考えられる。臨床検体を使用した解析では、Stage2および3大腸癌手術症例37例の免疫組織学的解析を行った。MMP-2の発現は間質において43.2%、EMMPRINの発現は癌細胞において51.4%において認めた。両者の発現は、相関(P=0.0025)を認め、in vitroの実験結果を裏付けるものであった。MMP-2およびEMMPRINは病理学的因子との関連を認めなかったが、MMP-2、EMMPRINともに発現を認める症例は、予後不良の傾向(P=0.0771)を示しており、今後の症例数の追加、観察期間の延長などによりMMP-2とEMPPRINは有意な予後因子となりうるものと考えている。大腸癌細胞株からRNAを抽出しcDNAの合成を行ったところ、EMMPRINの発現解析を行ったところ発現量は、細胞株によって異なっていた。しかし、線維芽細胞との共培養の系では、大腸癌細胞株もEMMPRINの発現亢進し、さらに共培養した線維芽細胞のMMP-2の発現が誘導されていた。この結果から、in vitroにおいて大腸癌細胞と線維芽細胞との間に相互関係が存在することになり、その相互関係に関連する分子としてEMMPRINとMMP-2が想定された。大腸癌細胞株と線維芽細胞の共培養の系でマトリゲルを用いたinvasion assayを行った。するといずれの大腸癌細胞株においてもその浸潤能が亢進していることが確認され、大腸癌細胞と線維芽細胞の相互関係は、癌の浸潤に関わる可能性が示唆された。手術にて摘出されたStageII大腸癌組織145例を用い、MMP-2の発現を検討した。間質部にMMP-2発現を認める症例は78例(53.8%)、腫瘍部にMMP-2の発現を認める症例は45例(31.0%)であった。MMP-2の発現による予後解析を行ったところ、間質部にMMP-2の発現群は、非発現に比べ有意に予後不良であった。腫瘍部のMMP-2発現に関しては、発現群と非発現群の予後はほぼ同等であり差を認めなかった。したがって、腫瘍部で発現するMMP-2は予後因子とはならないが、間質部で発現するMMP-2は予後因子となるもものと考えられた。次に、間質部でMMP-2を発現している症例を選択し、EMMPRINの発現解析を行った。現在まで32例の解析が終了しており、EMMPRINの発現は29例(90.6%)に認めており、高い相関性が考えられる。

本年度はさらに実際の生体現象に近い環境下での実験を試みるために、大腸癌切除標本から線維芽細胞を分離し、大腸癌細胞株と共培養する系を確立した。腫瘍関連線維芽細胞(CAF)のマーカーとしてFibroblast activation protein(FAP)の発現を確認した。大腸癌細胞株とCAFの共培養系では、癌細胞株においてEMMPRIN・VEGF-Aの発現上昇、浸潤能・血管新生能の亢進、CAFにおいてMMP-2の発現が上昇していた。癌細胞におけるEMT関連因子であるSnailなどの発現も誘導されている可能性が高い。しかしながら、現段階では再現性が十分とはいえない段階であり、CAFの分離にさらなる精度が必要と考えられ、FAPの他のマーカーの探索も必要と考えられる。臨床検体を用いた研究では、Stage2および3大腸癌手術症例37例においてSnailおよびe-cadherinの免疫組織学的検討を行った。Snailの発現は、Stage2(28.6%)、Stage3(73.9%)であり、リンパ節転移との間に相関(p=0.0069)を認めた。E-cadherin陽性、陰性症例におけるSnailの発現は、21.4%、78.3であり、逆相関(p=0.001)を認めた。これらの結果よりin vitroにおいて大腸癌とその周囲に存在する線維芽細胞との相互関係によって、癌細胞は上皮間葉転換、血管新生能・浸潤能が亢進していることが示唆され、臨床検体における免疫組織学的検討においては、Snailはリンパ節転移と相関を認めていることから、in vitroにおける実験系から得られた結果を示唆するものと考えられる。消化器外科学昨年度に確立した大腸癌細胞株と線維芽細胞株の実験系によって、より多くの細胞株を使用し、EMMPRINとMMP-2の関連を証明できた。さらに、昨年度に検討できなかったEMTのマーカーであるSnailの発現を確認できたことも今後の研究に向けてあらたな知見と考えている。そして、癌細胞株と間質細胞のサロゲートとして使用した線維芽細胞株とのクロストークの媒体としてFGF/FGFRのシグナルの存在を伺わせる結果を得たことも今後の研究計画を立案する上でも重要な成果と考えている。臨床検体を使った検討では、EMMPRINの免疫染色の条件設定にやや時間をようしたものの安定した結果を得ることができるようになり、今後は症例数を重ねていくのみ問う言う檀家まで達したものと考えている。しかしながら、EMT関連マーカーのSnailやE-cadherinの免疫染色は終了しておらず、in vitroの結果を臨床検体で確認できていない。大腸癌細胞株と線維芽細胞株の共培養の系を確立することができ、今後、この系を利用して腫瘍関連線維芽細胞に関わる研究が実施可能となった。今年度に得られた知見としては、相互関係が存在することが明らかになり、そのキーとなる分子はMMP-2とEMMPRINであることが確認された。大腸癌細胞株と線維芽細胞株との相互関係によって、大腸癌細胞株は浸潤能を得ることが確認された。さらに、大腸癌細胞株の性格の変化について、特に上皮間葉転換(EMT)についても検討予定としていたが、本年度はそこまでは達成できなかった。臨床検体における検討は、Stage2大腸癌組織145例を使用してMMP-2の免疫組織学的検討を行った。以前得られた知見通り、間質部に発現するMMP-2は予後因子となることが症例数を増加しても確認された。
モデルペプチドを用いたアポリポタンパク質脂質膜結合機構に関する研究

前年度に引き続き、アポA-I及びアポEペプチドの脂質膜結合の分子論について、超遠心分離法、蛍光分光法、NMR測定、超高感度熱量測定などを併用して検討した。アポA-Iペプチドの脂質膜結合様式について、トリプトファン蛍光異方性測定による運動性の評価並びに励起エネルギー移動法による結合部位の同定を行った。その結果、アポA-Iペプチドの両親媒性α-ヘリックスは、膜中心位から約1nmの距離に結合し運動性が束縛された状態にあるが、膜中にコレステロールが存在すると、さらに約1nm水相側に押し出され、運動性が高い状態で結合することが明らかとなった。つまり、細胞膜中のコレステロール含量の増加によって、アポA-Iの膜結合様式がより可逆的で水相への細胞脂質の引き抜きに有利な結合へと変化すると考えられ、アポA-Iの細胞膜コレステロール搬出機構に重要な示唆を与えた。さらにアポEペプチド(2.8-kDa)についても検討を進めた。まず、リポタンパク質様脂質粒子に対する結合性を大腸菌発現系で作製したアポE脂質結合ドメイン(10-kDa)と比較したところ、結合親和性、結合量とも同程度の値が得られ、ペプチドがアポEの脂質膜結合様式を反映していることが確認された。次に、超高感度熱量測定を用いてアポEペプチドと脂質膜との相互作用を検討したところ、膜中のコレステロールは結合パラメータに影響を与えず、アポA-Iペプチドとは対照的な結果となった。今後、大腸菌発現系で作製したアポEを用いて、脂質結合のメカニズムをさらに検討していく予定である。善玉コレステロールとして知られるHDLの主要タンパク質であるアポリポタンパク質A-I(アポA-I)及びそのモデルペプチドの脂質膜結合機構を、主に蛍光法及びNMRにより検討した。アポA-IはHDL様の非常に小さなリポソーム、あるいはカイロミクロン様のエマルションに結合性が高く、それらの結合には表面膜リン脂質の極性部位の構造が重要であることが蛍光プローブを用いた蛍光異方性及び重水同位体効果の測定から示唆された。そこで、アポA-I及びそのモデルペプチドの脂質膜結合部位の原子レベルでの同定を、高分解能1H-、13C-NMRを測定することにより行った。その結果、アポA-Iのα-ヘリックスは、リン脂質グリセロール骨格部分からカルボニル炭素及び隣接するアルキル鎖のα、β-メチレン基付近にかけての界面部位に強く結合し、疎水部深くには結合していないことが示された。この、比較的"浅い"アポA-Iα-ヘリックスの脂質膜結合様式は、ペプチドのトリプトファン残基と蛍光消光剤間の励起エネルギー移動を利用した蛍光測定の結果からも支持された。さらに、コレステロールや中性脂質によるアポA-Iの脂質膜結合性の変化の原因を13C-NMRによる脂質膜構造の詳細な比較から検討したところ、リン脂質カルボニル炭素の化学シフト値がアポA-Iの最大結合量と非常によく相関することを見出し、リン脂質カルボニル炭素付近の水和状態(構造性)、すなわち脂質-タンパク質問相互作用に供される脂質膜界面部位のスペースによってアポA-Iの結合性が制御されていることを初めて明らかにした。
Tリンパ球のアポトーシス誘導を介する肺胞上皮細胞の肺防御機構

27例のARDS剖検肺について、Fas/FasL蛋白およびmRNAの検出と発現細胞の同定を行った。新鮮凍結ARDS肺組織切片にFas陽性Jurkat T細胞を加え、同細胞に対するアポトーシス誘導頻度をDapi蛍光染色により測定した。また、抗FasL抗体を前処置することにより抑制実験を行い、アポトーシス誘導の特異性を確認した。FasはARDSの全期に検出された。FasLは急性期の肺胞上皮細胞に強く発現していたが、硝子膜形成期と器質化期では減弱する傾向が見られた。ARDS肺組織はJurkat細胞のアポトーシスを誘導したが、その頻度は急性期が最も多く、硝子膜形成期と器質化期には減少した。このJurkat細胞のアポトーシス誘導は抗FasL抗体でほぼ完全に抑制された。急性期のARDS肺胞上皮細胞におけるFasLの発現は、リンパ球など炎症細胞に対するアポトーシス誘導に関与しており、肺胞上皮の保護防御機能を担っている可能性が示唆された。2.ラット単離II型肺胞上皮細胞のFas/Fas Iigand発現とTリンパ球に対するアポトーシス誘導ラットからII型細胞を単離し、Fas/FasL蛋白およびmRNAの発現を検討した。II型細胞にFas陽性のJurkat T細胞を加え6時間co-cultureし、Dapi染色によりアポトーシスの頻度を計測した。II型細胞にあらかじめLPS,TNF-α, IL-1β, IL-8を加え刺激した時、および、抗FasL中和抗体(NOK-1)で前処置した時にも同様に検討した。非刺激II型細胞はFas/FasL蛋白およびmRNAを発現し、あらかじめサイトカインで刺激しておくとFas/FasLの発現は増強した(LPS<TNF-α<IL-8<IL-1β)。非刺激II型細胞とco-cultureしたJurkat T細胞の約5%にアポトーシスが誘導され、サイトカインで刺激しておくとアポトーシスの頻度は有意に増加した(LPS 8%, TNF-α17.5%, IL-1β20%, IL-8 22%)。NOK-1はJurkat T細胞へのアポトーシス誘導の約80%を抑制した。サイトカイン刺激ラット単離II型細胞はFas陽性Jurkat T細胞にアポトーシスを誘導したが、この反応にはFas/FasL系が特異的に関与していることを示した。ヒト急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および正常肺について、Fas/Fas ligand(FasL)の発現を検討し、発現したFas/FasL系がアポトーシス誘導機能を有するかを検討した。【方法】27例のARDS剖検肺について、DNA電気泳動とTUNEL法によりアポトーシスを検出し頻度を測定した。Western blottingと免疫組織染色にりFas/FasL蛋白の検出と発現細胞の同定を行った。Fas/FasLのmRNAはRT-PCRで検出した。

次に、新鮮凍結肺組織切片にFas陽性Jurkat T細胞を加え、同細胞に対するアポトーシス誘導頻度をin situでDapi蛍光染色により測定した。また、抗FasL抗体を前処置することにより抑制実験を行い、アポトーシス誘導の特異性を確認した。【結果】硝子膜形成期と器質化期早期のARDS肺では高頻度に肺胞上皮細胞のアポトーシスが見られたが、急性期におけるアポトーシスは少なかった。対象健常肺ではアポトーシスはほとんど見られなかった。FasはARDSの全期に検出された。FasLは急性期の肺胞上皮細胞に強く発現していたが、硝子膜形成期と器質化期では減弱する傾向が見られた。ARDS肺組織はJurkat細胞のアポトーシス誘導は抗FasL抗体でほぼ完全に抑制された。【考案】急性期のARDS肺胞上皮細胞におけるFasLの発現は、肺胞上皮自身のアポトーシス誘導だけでなく、マクロファージ、リンパ球など炎症細胞に対するアポトーシス誘導に関与しており、肺胞上皮の保護防御機能を担っている可能性が示唆された。II型肺胞上皮細胞(II型細胞)がFas/Fas ligand(FasL)を発現するか、するとすればサイトカイン刺激でその発現が変化するかを検討した。さらに、発現したFasLがアポトーシスを誘導する機能があるかどうかを検討した。【方法】Dobbsらの方法に従いラットからII型細胞を単離し、1日培養後培養槽に付着した生存細胞を計数した。このII型細胞から蛋白を抽出し、Fas/FasLの発現をWestern blotおよび免疫細胞染色で検討した。また、抽出したRNAについてFas/FasL mRNAの発現をRT-PCRで検討した。II型細胞に発現したFasLの機能を見るために、Fas陽性のJurkat細胞を加え6時間co-cultureし、Jurkat細胞を回収し、Dapi染色によりアポトーシスの頻度を計測した。次に、II型細胞にLPS,TNF-α,IL-1β,IL-8を加え刺激し、同様にFas/FasL、同mRNAの発現を検討し、Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導を計測した。アポトーシス誘導がFas/FasL系を介することを確認するために、抗FasL中和抗体(NOK-1)で前処置したときのアポトーシス抑制についても検討した。【結果】1)非刺激II型細胞から抽出した蛋白のWestern blotでFasおよびFasLが検出され、免疫細胞染色でもFas/FasLの発現が確認された。同細胞から抽出したRNAのRT-PCRではFas/FasL mRNAが検出された。3)非刺激II型細胞とco-cultureしたJurkat細胞の約5%にDapi染色により核の断片化が見られ、アポトーシスが誘導されていることがわかった。II型細胞をあらかじめ上記サイトカインで刺激しておくと、Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導の頻度は有意に増加した。(LPS8%,TNF-α17.5%,IL-1β20%,IL-8 22%)4)培養液中に抗FasL中和抗体であるNOK-1をあらかじめ加えておくと、サイトカイン刺激II型細胞とのco-cultureによるJurkat細胞へのアポトーシス誘導増加の約80%は有意に抑制された。【まとめ】ラットII型細胞は非刺激状態でもFas/FasLを発現しているが、各種サイトカインの刺激により発現が増強した。このII型細胞はFas陽性
ゲノム情報のRNAによる発現制御であるRNAiの分子機構

RNAi (RNA interference)とは真核生物の細胞に2本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、線虫C. elegansにおける実験系で最初に発見された。ゲノム情報の発現制御の新しい手法として、基礎研究のみならず将来の医療や植物育種等へのRNAiの応用が期待されている。我々の研究グループは線虫をモデル生物として用い、遺伝学と生化学の両方を組み合わせた手法でRNAiの分子機構について解析を行った。まず、RNAiに関与する遺伝子群を徹底的に同定することを目的として、RNAi活性を欠損した線虫変異体の大規模なスクリーニングを行い、51系統の変異体(fj1fj51)を新たに単離した。そのスクリーニングにおいては、高頻度に出現する傾向のあるV番染色体由来の既知変異を避けて実験を進めることができるように我々のグループ独自の工夫を織り込んだ。引き続いた解析の結果、新しく単離したfji4,fji45変異は未知のRNAi関与遺伝子を反映している可能性が高いと判断するにいたっており、原因遺伝子のクローニングに向けて詳細なマッピングを進めているところである。ところで、既知のRNAi因子の中では、筆者が以前に発見したRDE-1がRNAi現象の鍵であると考えている。RDE-1がどのような因子と相互作用して機能しているのか明らかにするために、エピトープタグを付加したRDE-1蛋白を線虫体内で発現させ、タグに対するアフィニティー樹脂を用いてRDE-1複合体の精製を行った。その結果、RDE-1が複数のRNAi関与因子と相互作用していることが判明した。
VEGFに結合するマトリックス成分とその分解による活性調節機構

軟骨組織は無血管性の特殊に分化した組織である。本研究では、本来血管のない関節軟骨組織において、強力な血管新生因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を検討するとともに、VEGFに結合することでその生理活性を調節する分子のクローニングを目指す。また、VEGFと未知の結合分子との複合体をマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)で分解することでVEGF活性の変化を調べる。得られた成果は以下の通りである。(1).慢性関節リウマチと変形性関節症の関節軟骨組織においてVEGF_<121>とVEGF_<165>のmRNA発現が認められ、in situ hybridizationで軟骨破壊の進んだ部位の軟骨細胞が標識された。また、VEGF受容体はKDRとflt-1は陰性であったが、neuropilin-1が検出された。軟骨組織器官培養上清中にVEGF蛋白が検出され、その産生は培養軟骨細胞でも確認された。免疫染色による軟骨細胞のVEGF染色陽性率は、Mankin scoreと有意な相関を示し(n=32,r=0.827,p<0.0001)、軟骨破壊の程度と関連が見られた。(2).VEGFに結合する分子をクローニングするために、VEGF_<165>をbaitとしてGAL4based yeast two hybridsystemにより軟骨細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。陽性を示した162クローンのうち128クローンを部分シークエンスしたところ、既知の分子としてフィブロネクチン、コラーゲン、テネシンなどの細胞外マトリックス分子の他、膜タンパクや種々のサイトカインなどが含まれていた。これらの分子とVEGF_<121>とVEGF_<165>との結合能をプレートアッセイとBlACOREを用いて検討中である。また、VBGF_<165>との複合体での血管内皮細胞の増殖活性、複合体のMMPでの分解と活性変化を検討予定である。本研究では、本来血管のない関節軟骨組織において、強力な血管新生因子である内皮細胞増殖因子(VEGF)の発現を検討するとともに、VEGFに結合することでその生理活性を阻害する分子のクローニングを目指す。また、VEGFと未知の結合分子との複合体をマトリックスメタロプ口テアーゼ(MMP)で分解することでVEGF活性の変化を調べる。本年度得られた成果は以下の通りである。(1)正常、慢性関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)関節軟骨から得られた軟骨細胞におけるVEGF遺伝子発現をRT-PCRにより検討したところ、いずれのサンプルにおいてもVEGFの発現が認められた。VEGF_<121>の発現をin situ hybridizationで検討したところ、軟骨破壊が進行した部位のRA関節軟骨細胞が標識され、免疫組織化学的にもRAとOAにおいて同様な局在を認めた。(2) VEGFに結合する分子をクローニングするために、VEGFをbaitとしてGAL4 basedyeast two hybrid systemにより軟骨細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。今後、全てのクローンをシークエンスするとともに、重要な分子について全長シークエンスの決定、VEGFとの結合性の検討および活性の変化を調べる予定である。
べん毛モータの機械的強度と出力特性

バクテリアが泳ぐのは、より良い環境に到達するためである。その推進機関であるべん毛モータが簡単に壊れるようでは、彼らの生存に関わる事態となる。したがって、べん毛モータは十分な強度を持つ必要があるが、それを定量的に確かめた実験は無かった。本研究では、べん毛モータの機械的強度を定量的に測る手法を開発し、サルモネラ菌の野生型モータと強度が低下した突然変異体モータの強度を求めることができた。得られたデータから、バクテリアの生育環境下において、野生型のモータが過不足のない適度な強度を有することが分かった。複数の構造タンパク質が強固な構造を形成する典型例であるバクテリアのべん毛モータについて、その機械的強度を実験的に評価してきた。強度が低下した突然変異型のモータと、野生型のモータを比較することにより、構造タンパク質間の相互作用の大きさと、それを変化させる要因を明らかにする。また、機械的強度が低下したモータの出力特性が、野生型と異なっているかどうかについても調べることで、モータの強度維持に関わる構成部品が、モータのトルク発生にも影響を与えるかどうかを明らかにすることを目指してきた。初年度には、べん毛モータに流体力を印加することで、1個ずつのモータの機械的強度を定量的に測定する系を開発した。それにより、機械的強度が低下した変異型サルモネラ菌べん毛モータの強度が、2.0 ±1.0 pNであるとのデータが得られた。これを受けて、2年目には、モータの強度測定に加えて、モータの出力特性の測定を行った。結果として、モータ特性に関しては、機械的強度が低下した突然変異体と野生型のモータの間に、有意の差は見られなかった。このことは、べん毛モータの機械的強度を維持するための構造形成部位と、トルク発生部位の間に、機能的な相関はほとんど無く、互いに独立した機能部位として働いていることを示している。一方、突然変異体モータの機械的強度測定に関しては、実験系の改良によって、初年度に得られたデータの約2倍に当たる3.7 ±1.6 pNという値が得られた。具体的な改良点は、モータに流体力を加える際にべん毛をスライドグラスに固定する方法として、初年度は抗べん毛抗体を用いたのに対し、次年度は遺伝子操作によりべん毛繊維の表面を改質したstickyfilamentを用いたことである。最終年度である3年目は、以上のデータの妥当性を検証し、構造データとの比較などを行い、全体をまとめる作業に当たる予定である。したがって、べん毛モータの基本構造は十分な強度を持つ必要があり、構造タンパク質同士が強固に結びついて構造を形成する典型例となっている。本研究では、べん毛モータの機械的強度が低下した突然変異体を手がかりに、構造形成に寄与するタンパク質間相互作用の大きさと特徴を明らかにすることを目指している。また、これらの変異体モータの出力特性を測定することで、変異に伴う構成部品の構造変化がモータの内部抵抗に与える影響を評価し、その起源について変異部位に着目して調べていくことも目指している。強度維持機構の解明を目指す研究の出発点として、1個ずつのべん毛モータの機械的強度を定量的に測定する系を開発した。すなわち、光学顕微鏡に一軸電動ステージと高速度カメラを搭載したべん毛モータの強度測定システムを構築した。これを用いて、野生型サルモネラ菌べん毛モータと、回転子タンパク質FliFの突然変異によって機械的強度が低下した変異型サルモネラ菌べん毛モータの強度測定を行った。その結果、変異型べん毛モータの強度は2.0 ±1.0 pNであることが分かった。遊泳中にはべん毛が抜けず、高粘度なゼラチン溶液中ではべん毛が抜けてラージバンドルを形成する、というこれまでの報告と比較して、本研究で得られた値は妥当なものであると考えられる。一方、野生型モータの強度については、計測値の分布が変異型モータと明らかに異なることは示されたが、強度を決定することはできなかった。測定方法に改良を加えながら計測データをさらに蓄積することで、野生型モータについても定量的な強度測定が可能になると考えている。モータの出力特性に関しては、計画通り2年目から本格的に取り組む予定である。複数の構造タンパク質が強固な構造を形成する典型例であるバクテリアのべん毛モータについて、強度が低下した突然変異型のモータと、野生型のモータを比較することにより、構造タンパク質間の相互作用の大きさと、それを変化させる要因を明らかにすることを目指して研究を行った。遺伝的解析により突然変異部位を特定するとともに、変異型モータの機械的強度を実験的に評価した。また、機械的強度が低下したモータの出力特性が、野生型と異なっているかどうかについても調べることで、モータの強度維持に関わる構成部品が、モータのトルク発生にも影響を与えるかどうかを調べた。べん毛モータに流体力を印加することで、1個ずつのモータの機械的強度を定量的に測定する系を開発した。突然変異体モータの機械的強度として、3.7 ±1.6 pNという値が得られた。野生型モータの強度は20 pN以上であることが示唆された。モータ特性に関しては、機械的強度が低下した突然変異体と野生型のモータの間に、有意な差は見られなかった。

このことは、べん毛モータの機械的強度を維持するための構造形成部位と、トルク発生部位の間に、機能的な相関はほとんど無く、互いに独立した機能部位として働いていることを示している。遺伝的解析によって、復帰変異体においてはロッドと呼ばれる部品に変異が入ってモータ強度が低下したもの他に、Motと呼ばれる部品に変異が入ったものが多数あることが明らかになった。このことは、べん毛の抜けやすさが回復したように見える復帰変異体の多くにおいて、モータ出力低下によりべん毛が抜けなかったことを示唆している。モータ強度の測定に関しては、国際学会で発表した。遺伝的解析に関しては、論文としてまとめて投稿中である。バクテリアのべん毛モータについて、強度が低下した突然変異型のモータと、別の変異が加わることで強度がある程度回復した復帰変異型モータを用いて、構造タンパク質間の相互作用の大きさと、それを変化させる要因を明らかにすることを目指して、モータの機械的強度とモータ特性の測定、ならびに遺伝子解析を行った。べん毛モータの機械的強度を調べるために、外部から粘性力を加える実験系を構築した。べん毛がスライドグラスに付着した状態で菌体が回転するテザードセルを作製し、カバーグラスを移動させて周辺の水溶液を流動させ、テザードセルが離脱するまで流速を増大させた。セルが離脱したときの流速から粘性力(べん毛モータに加わった力)を求めた。得られたモータ強度は、強度が低下した変異体で約4pNだった。野生型のテザードセルは離脱する確率が小さく、我々の実験系で印加できる粘性力の上限、約20 pNよりも大きな強度を有する可能性が高いことが分かった。復帰変異体のうちロッドに第2の変異があるものの強度は、両者の中間の値を示した。これらのモータの回転数-トルク特性は、互いに有意差を示さなかった。単離・解析した復帰突然変異体は400種で、その70%について2番目の変異箇所を同定できた。そのうち、元の変異体でモータが壊れる箇所であるロッドに第2の変異が入ったものは2つあった。残りのうち、111種はMotと呼ばれる部分に、71種はCリングと呼ばれる部分に変異が入っていた。これは、べん毛の抜けやすさが回復したように見える復帰変異体の多くで、モータの出力低下によりべん毛が抜けなかったことを示唆する結果である。なお、復帰突然変異体の遺伝的解析に関する部分の論文投稿が予定より遅れたため、研究期間を1年間延長した。延長期間中に追加実験を行い、以上の結果をまとめた論文のジャーナル掲載に至り、一連の研究を終了させることができた。バクテリアが泳ぐのは、より良い環境に到達するためである。その推進機関であるべん毛モータが簡単に壊れるようでは、彼らの生存に関わる事態となる。したがって、べん毛モータは十分な強度を持つ必要があるが、それを定量的に確かめた実験は無かった。本研究では、べん毛モータの機械的強度を定量的に測る手法を開発し、サルモネラ菌の野生型モータと強度が低下した突然変異体モータの強度を求めることができた。得られたデータから、バクテリアの生育環境下において、野生型のモータが過不足のない適度な強度を有することが分かった。
PETによる高次視覚機能に対する主観的注意の機能解剖研究

我々はさまざまな奥行き情報を統合して三次元的な形態や空間を認識していることが心理学的に証明されている。しかし、脳内でのこのような視覚情報処理機構に関してはほとんど解明されていない。そこで本研究では、ポジトロンCTを用いて、三次元的な視覚情報処理に関与して活動を示す巨視的な神経回路の特定を行った。正常右利き若年男子6名を対象とした。被験者はポジトロンCT撮像中に次の2つの形態の識別課題を行った。1)三次元形態の識別課題(3D):被験者にコンピュータグラフィクスで作成した三次元図形(六角錐)を視覚刺激としてHMDを使って立体視させた。刺激は見た目は変わらないが凹凸の程度が違っていて、見本と同じ凹凸の刺激が提示された時に右手でボタンを押して合図をさせた。2)面の傾き識別課題(3DS):被験者にコンピュータグラフィクスで作成した平面を視覚刺激としてHMDを使って立体視させた。被験者は面の三次元的な傾きに注目して、見本と同じ傾きの刺激が提示された時に右手でボタンを押して合図をさせた。それぞれのコントロール課題として、同じ視覚刺激セットをもちいて、見本刺激提示直前に提示される手掛かり刺激がでたときに右手でボタンを押して合図をさせた。3DS課題・3D課題ともに大脳右半球頭頂間溝皮質に有意な血流増加を認めた。左半球では有意な血流増加は認められなかった。3DS課題で賦活された領域は、3D課題で賦活された領域よりも前方側に位置していた。本研究結果は、三次元構造認識のためのニューロン機構が頭頂間溝領域にあることを示した。さらに我々の最近の研究より、二次元の線分の角度の弁別を同様な遅延見本合わせ課題を行わせた場合でも、大脳右半球の頭頂間溝皮質に賦活が認められることが明らかにされており、右半球の視覚的な物体の立体的構造の情報処理における特異性の存在が示唆される。