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美文論書『バッティカーヴィア』における文法規則例証の様態とその文法学的側面の解明

本年度の研究成果は以下の5点にまとめられる。(1)バッティがA 3.1.91をパーニニ文法の核心をなすものと見なしていると考えられる点、動詞語根からの派生形規則を中心に例証規則を選んでいる点、そして主題の部をパーニニ文典の最終部に位置し語形派生の最終段階で適用されるtripAdI規則の例証により締め括る点から、『バッティカーヴィア』の構成がパーニニ文法の派生組織とパーニニ文典の構成に立脚したものであることは明らかである。(2)バッティはBhK 6.71-86において、A 3.1.146を例証した後A 3.1.147の例証を省略する。彼は、同一条件下で同一動詞語根の後に異なる接辞の導入を規定する両規則を一対のものと見なし、前者を例証すれば事足りると考えたのである。バッティの規則例証法の特徴の一つとして新たに指摘できる。(3)バッティはBhK 8.91-92において規則例証に傾注するのではなく、A 1.4.96の例証箇所という舞台と詩節の文脈を生かし、詩的技巧を規則例証の中に織り交ぜる。彼は規則例証という自らはめた足枷を、美文としての完成度を高めているのに役立てている。(4)〈残余〉としての〈関係〉(zeSasambandha)ではない〈拠り所と依拠者の関係〉(AdhArAdheyabhAva)は、第七格接辞固有の適用領域であり、第六格接辞がそれを表示することはない。所有接辞matUPは〈残余〉としての〈関係〉と〈拠り所と依拠者の関係〉を表示するために導入される。(5)詩人カーリダーサにとっては、文法学に加え、先代の詩人の言語運用(pUrvakaviprayoga)もまた言葉の文法性の基準である。以上の画期的な研究成果は、新たな文法学研究と美文学研究、さらには広い意味でのサンスクリット研究の礎となるべきものであり、その価値少なからぬものがある。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、(1)宮廷詩人バッティが著した『バッティカーヴィア』(以下BhK)における文法規則例証の様態、(2)バッティが有するパーニニ文法学の知識と文法学の伝統に対する彼の態度、(3) BhKがパーニニ文法家達に与えた影響、ここれら三点の解明を目標に掲げて研究を実施した。(1)については、主題の部に属するBhK6.87-93を考察し、主題の部の他の箇所と同様、当該箇所でも規則が定式化されている順序とそれを例証する語の順序の一致が見られることを明示した。さらに、BhK雑多の部と定動詞の部における規則例証にも考察を加え、雑多の部における規則例証は主題の部のそれを補助する役割を担うこと、定動詞の部には規則例証に加えて多様な定動詞形それ自体を教示する役割があることを指摘した。(2)については、BhK6.87-93で規則例証のために使用される表現を分析することで、バッティがパーニニの規則に加えてカーティアーヤナのvantikaを例証する場合があることを明らかにした。次に、BhK8.99でAStadhyayT2.3.17を例証するために使用される表現troOyamatvatahを考察し、バッティは文法学の伝統に精通しながらもパタンジャリの規則解釈に常に従うわけではなく、詩人達の言語慣習を考慮に入れて規則例証を行う場合があることを明らかにした。(3)については、文法学文献『シッダーンタカウムディー』中で問題視されるバッティの非文法的表現subhruに対する文法家達の解釈を一つずつ検討し、彼らにとってBhKが規則解釈を行う上で決して無視することのできない作品であったことを指摘した。本年度に実施した研究は、サンスクリット文学史において独自の地位を占めるBhK文法学部門の世界初の本格的研究であり、インド文学研究と文法学研究さらにはサンスクリット文化研究にも大きく資するものである。

彼は規則例証という自らはめた足枷を、美文としての完成度を高めているのに役立てている。(4)〈残余〉としての〈関係〉(zeSasambandha)ではない〈拠り所と依拠者の関係〉(AdhArAdheyabhAva)は、第七格接辞固有の適用領域であり、第六格接辞がそれを表示することはない。所有接辞matUPは〈残余〉としての〈関係〉と〈拠り所と依拠者の関係〉を表示するために導入される。(5)詩人カーリダーサにとっては、文法学に加え、先代の詩人の言語運用(pUrvakaviprayoga)もまた言葉の文法性の基準である。以上の画期的な研究成果は、新たな文法学研究と美文学研究、さらには広い意味でのサンスクリット研究の礎となるべきものであり、その価値少なからぬものがある。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は『バッティカーヴィア』主題の部(第5章第97詩節-第9章)を中心とした考察を予定していたが、同作品の雑多の部(第1章-第5章第96詩節)と定動詞の部(第14章-第22章第23詩節)の研究にも着手することにより、同書の規則例証の様態をより包括的に考察することができたからである。本年度の研究により、『バッティカーヴィア』文法学部門を構成する雑多の部、主題の部、定動詞の部の基本的な様相は明らかになったと言ってよい。しかし、本年度に扱えたのはそれら三部中の詩節のほんの一部に過ぎず、各部におけるバッティの規則例証の方法や特徴及び同作品に反映されたパーニニ文法学の伝統を解明するには、文法学部門中の詩節を文法学的観点から丹念に分析した資料をさらに積み上げていく必要があるだろう。また、『バッティカーヴィア』がパーニニ文法学に与えた影響とその文法学史上の位置づけをより広い視点から考察するために、本年度の研究で扱った派生教本文献『シッダーンタカウムディー』(16世紀後半から17世紀初頭)に加え、次年度はそれ以前に著された文法学文献も考察対象とする予定である。
アルキルグリセロ脂質の緑藻種間分布調査－タテヤママリモ発、脂質生化学の新展開

本研究の目的は、タテヤママリモAegagropilopsis moravicaから発見した植物初のアルキルグリセロ脂質が、他の緑藻種でも見られるのか、またどのような種間分布を示すのか、調査することである。シオグサ目を中心に、大型海藻も含む緑藻類を収集し、それらを化学的手法により分析していく。今年度は、以下の2点を実施した。1)緑藻類の収集今年度は5月半ばから9月下旬にかけて、国内6ケ所にて緑藻の採集を試みた。採集時期や環境変動の問題もあり、2か所では緑藻が生育していないために採集できなかったものの、シオグサ目を中心に、ハネモ目、カサノリ目、ミドリゲ目、イワヅタ目を含む淡水種2種、海洋種15種よりなる計19試料を集めることが出来た。2)アルキルグリセロール標品の合成一方、標品となるキラルなアルキルグリセロール合成経路の確立に向けて検討を行った。リノール酸とソルケタールよりモノアシルグリセロールのアセトナイド保護体を得て、これを坂井教郎らの開発した臭化インジウム(III)とトリエチルシランを用いた脱酸素的還元化でエーテル化を試みたが、少なくとも4種の生成物を得た。現在生成物の構造同定を進めるとともに、反応条件を検討している。緑藻の採集を担当する分担者は4月付けで移籍したため、一般的な海洋性緑藻の最盛期が研究拠点のセットアップのタイミングと重なり、確保できた試料数が伸び悩んだ。一方でアオミソウ科(Pithophoraceae)内よりタテヤママリモの最近縁種に当たるアオミソウ(Pithophora sp.)やミゾジュズモ(Basicladia okamurae)が入手できたことは特筆すべき成果である。一方、代表者は人的リソースの不足のために、合成ルートの確立および予定していた分析システムの立ち上げまでには至っていない。この点を考慮し、進捗は「やや遅れている」と判断した。1)緑藻の収集引き続き、淡水性および海洋性シオグサ目緑藻の採集を進めていく。2)アルキルグリセロール標品の合成藻類試料からのアルキルグリセロール同定のために必要なキラル標品の合成ルートを確立する。現在、反応の追跡を容易にするためにオレフィン鎖を有する原料を用いて条件検討を行っているが、不飽和結合そのものが反応している可能性がある。そこで、まずは飽和モノアシルグリセロールを出発原料に反応経路の確立を目指す。3)アルキルグリセロール分析システムの立ち上げおよび藻類試料の分析板橋豊らの開発したアルキルグリセロール分析システムを導入する。さらに今年度より、藻類試料の分析を開始する。すなわち、Bligh & Dyerの方法により得た脂質画分を鹸化し、不鹸化脂溶性画分を、3,5-dinitrophenylisocyanateで誘導体化後、キラルHPLCカラムSumichiral OA-4600を使用したLC-MS分析系で分析し、アルキル鎖長および立体化学も含めて組成分析を行う。

3)アルキルグリセロール分析システムの立ち上げおよび藻類試料の分析板橋豊らの開発したアルキルグリセロール分析システムを導入する。さらに今年度より、藻類試料の分析を開始する。すなわち、Bligh & Dyerの方法により得た脂質画分を鹸化し、不鹸化脂溶性画分を、3,5-dinitrophenylisocyanateで誘導体化後、キラルHPLCカラムSumichiral OA-4600を使用したLC-MS分析系で分析し、アルキル鎖長および立体化学も含めて組成分析を行う。分析システムの立ち上げが進まなかったため、キラルカラムの購入分が差額として生じた。次年度に購入するため、使用について特に問題はない。
粘菌の細胞集団の確率的遺伝子発現と閾値ダイナミクスの解析

細胞が環境を感知する際には、膜上の受容体とリガンドの、分子ゆらぎに由来する物理的拘束が避けられない。その際、物理的な検出限界において生物系が動作している可能性が、1977年にBergとPurcellによって理論的に予想されている。細胞性粘菌Dictyosteliumdiscoideumの初期発生ダイナミクスを例にとり、細胞の飢餓後の分化と細胞間サイクリックAMPシグナリングの関係性を、顕微鏡下、細胞レベルで可視化し定量化することを目的とした。また、これが細胞集団密度によってどのように変化するかを解析し、細胞が集まったことで出現する環境応答への鋭敏性を特徴づけることで、多細胞化が時空間的な動力学の不安定性によって出現せざるを得ないからくりを浮かび上がらせたい。平成19年度は主に、細胞内サイクリックAMPの変動について細胞外の刺激との関係を解析した。細胞集団を顕微鏡下で長時間にわたって追跡するためのプログラムの作成を行った。また還流系を構築し、応答の刺激濃度依存性や、周期性への依存性を解析した。その結果、cAMPにたいする閾値的なダイナミクスによって集団的な振動が引き起こされている様子が明らかになった。平成20年度は、細胞外のサイクリックAMPが細胞集団でのサブnM程度まで蓄積され、そのようにノイズが支配する環境の中から、細胞内に固有の周期的フィルターを用いて共鳴的な現象を介して、集団レベルの振動と波の現象が発生することを明らかにした。一分子レベルの高い感度と周波数帯の選択性を巧みに利用することで、マクロレベルの秩序形成が出現し、これが遺伝子発現の調節のタイミングを決定していると考えられる。このように階層をまたいで展開するマルチスケールの動力学的な構造は、他の生命系のマクロ秩序の形成においても期待される。本研究課題では、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumの初期発生ダイナミクスを例にとり、そのような側面が細胞の飢餓応答と一連の遺伝子発現の振る舞いにいかに影響を与えているかを解明する。こうした目的のため、細胞性粘菌の初期発生を比較的少数の細胞で観察する系に必要な培養系と測定システムの構築した。顕微鏡下、細胞レベルで可視化し定量化し、また、これが細胞集団密度によってどのように変化するかの解析に着手した。細胞性粘菌Dictyosteliumdiscoideumの初期発生ダイナミクスを例にとり、細胞の飢餓後の分化と細胞間cAMPシグナリングの関係性を、顕微鏡下、細胞レベルで可視化し定量化することを目的とした。また、これが細胞集団密度によってどのように変化するかを解析し、細胞が集まったことで出現する環境応答への鋭敏性を特徴づけることで、多細胞化が時空間的な動力学の不安定性によって出現せざるを得ないからくりを浮かび上がらせる。平成19年度は主に、細胞内cAMPの変動について細胞外の刺激との関係を解析した。その結果、いくつかの異なるタイムスケールからなる適応現象と、細胞の運動と関係した振動不安定性、さらにそれらが生じる分岐付近に系が分化によって導かれている様子が明らかになった。
発癌に関与する腸内クロストリジウムの分離・分類および代謝に関する研究

昭和61年度より昭和63年度の3年間の本研究より以下の成果が得られた。1)ヒトの腸内よりClostridiumの分離のためにこれまで用いられている80°C、10分間の熱処理、エタノールおよびクロロホルムなどの薬物処理の他に、新たに3種類の選択培地の考案を行ない、ヒトの腸管由来Clostridiumの分離に適していることが明らかにされた。2)これらの選択培地を用いてヒトの腸内より分離されたClostridium spp.の糖分解性状、生化学的性状、代謝産物、薬剤感受性およびDNAのG+Cモル%などによって、蛋白分解性および醗酵性の強いグループ、蛋白分解性の強いグループ、醗酵性の強いグループおよび両性質が弱いグループの4群に分類されることが明らかにされた。さらにこれらの分類体系により、食餌成分および老化と腸内Clostridiumの関係を解明する研究の一環として、健康成人8名の高肉食摂取時におけるClostridium spp.の変動を検索したところ、分離株108菌株の内、醗酵性が強いC.paraputrificum,C.innocuumおよび蛋白分解性の強いC.perfringensの菌数が高肉食によって増加し、また、日本人(農村)とカナダ人(都市)の腸内Clostridium spp.の構成を比較すると、カナダ人において醗酵発の強いC.coccoidesおよびC.tertiumの菌数,C.innocuumの検出率が有意に高いことが認められた。一方、年齢差(特に、2030歳代、15名と60歳以上の15名の2グループ)による腸内Clostridium spp.の構成を検索すると、208菌株が分離され、そのうち、60歳以上の老人で蛋白分解性および醗酵性の強いC.paraputrificum,C.innocuumおよびC.perfringensの菌数が高いようであった。このように発癌、特に結腸癌との関係が深い高肉食・高脂肪食の摂取や老化によってClostridiumの菌種構成が変動することが明らかにされた。しかしながら、既存の菌種として同定できない菌株が予想以上に多く、それらの分類学的研究の重要性がますます示唆された。そのうち、醗酵性の強いClostridium spp.が8グループ、蛋白分解性の強いClostridium spp.が5グループ、さらに醗酵性および蛋白分解性のないClostridium spp.が11グループ認められ、今後、既存の菌種との分類学的研究の必要性が明らかにされた。3)このようにして分離・同定・分類されたC.innocuum98株、C.paraputrificum88株、C.clostridiiforme58株、C.cocoides34株、C.perfringens45株、C.tertium23株およびClostridium spp.〔未分類株、35種のグループ〕65株、計411株を用いて、発癌に関与する腸内酵素、特にβーグルクロニダーゼおよび7αーデハイドロキシラーゼやアンモニア、インドールおよび硫化水素などの産生能、硝酸塩の還元能を検索して、どのような分離株がこれらの機能を保有するのかを検索した。β-グルクロニダーゼ産生株は既存の菌種に強い反応は認められないが、Clostridium spp.のうち8種に陽性反応が認められ、とりわけClostridium spp.の4種に強い反応を示し、いずれも高脂肪食摂取時に分離された菌株であった。7αーデハイドロキシラーゼ産生株は強い陽性反応をしめす菌種・菌株は認められなかった。アンモニア産生株はC.clostridiiforme,C.perfringensおよびClostridium spp.のうち、7種に陽性反応が認められ、ヒトの老化に伴って高頻度に出現す菌株が多いようであった。さらにインドール(6種のグループ)および硫化水素(3種)の産生株、硝酸塩の還元株(3菌種および5種)など分離されたが、その分離源に特徴は認められなかった。

一方、年齢差(特に、2030歳代、15名と60歳以上の15名の2グループ)による腸内Clostridium spp.の構成を検索すると、208菌株が分離され、そのうち、60歳以上の老人で蛋白分解性および醗酵性の強いC.paraputrificum,C.innocuumおよびC.perfringensの菌数が高いようであった。このように発癌、特に結腸癌との関係が深い高肉食・高脂肪食の摂取や老化によってClostridiumの菌種構成が変動することが明らかにされた。しかしながら、既存の菌種として同定できない菌株が予想以上に多く、それらの分類学的研究の重要性がますます示唆された。そのうち、醗酵性の強いClostridium spp.が8グループ、蛋白分解性の強いClostridium spp.が5グループ、さらに醗酵性および蛋白分解性のないClostridium spp.が11グループ認められ、今後、既存の菌種との分類学的研究の必要性が明らかにされた。3)このようにして分離・同定・分類されたC.innocuum98株、C.paraputrificum88株、C.clostridiiforme58株、C.cocoides34株、C.perfringens45株、C.tertium23株およびClostridium spp.〔未分類株、35種のグループ〕65株、計411株を用いて、発癌に関与する腸内酵素、特にβーグルクロニダーゼおよび7αーデハイドロキシラーゼやアンモニア、インドールおよび硫化水素などの産生能、硝酸塩の還元能を検索して、どのような分離株がこれらの機能を保有するのかを検索した。β-グルクロニダーゼ産生株は既存の菌種に強い反応は認められないが、Clostridium spp.のうち8種に陽性反応が認められ、とりわけClostridium spp.の4種に強い反応を示し、いずれも高脂肪食摂取時に分離された菌株であった。7αーデハイドロキシラーゼ産生株は強い陽性反応をしめす菌種・菌株は認められなかった。アンモニア産生株はC.clostridiiforme,C.perfringensおよびClostridium spp.のうち、7種に陽性反応が認められ、ヒトの老化に伴って高頻度に出現す菌株が多いようであった。さらにインドール(6種のグループ)および硫化水素(3種)の産生株、硝酸塩の還元株(3菌種および5種)など分離されたが、その分離源に特徴は認められなかった。ヒトの新鮮排泄便を用いて、これを従来行われている80°C,10分間の熱処理、エタノール処理、クロロホルム処理などによってクロストリジウムの分離率を検討したところ、エタノールおよびクロロホルムによる処理と熱処理の間に大きな差は認められなかった。一方、ヒトの腸内に優勢に常在しているClostridium innocuum,C.ramosum,C.paraputrificumおよびC.clostridiiformeなどのレシチナーゼ陰性のクロストリジウムの選抗培地の考案を試みたところ、Eggerth-Gagnon寒天にプロピオン酸塩,Tween80,ノボビオシン,コリマイシン添加およびオレアンドマイシン添加した各培地さらにTween80,リファンピシン,コリマイシン,ネオマイシンを添加した培地がC.innocuum,C.ramosumおよびC.clostridiiformeの検出に適しているようであった。しかしながら熱および薬物各処理により分離されるクロストリジウムの各菌種に選択性のある培地の検討が望まれた。
抗菌剤耐性サルモネラの感染様式と耐性因子伝達機構の解明

南日本のブロイラーから分離されたサルモネラのうちアンピシリン、セフォタキシムの両剤に耐性を示したのは33株(35.5%)でblaTEM52、blaTEM20型ESBL産生株がそれぞれ22株、1株認められ、以前の報告と比較して著しく増加していた。IncP型のプラスミドはtetA、aadA1、sul1の3つの耐性遺伝子を保有し、3つの血清型から検出されたため、多剤耐性の拡大と大きく関わっていることが示された。調査したサルモネラにはプラスミドが広く存在し、異なる血清型間に共通のプラスミドが存在したことから、CTX耐性及び多剤耐性サルモネラの増加とプラスミドは大きく関わっていることが判明した。S. Infantisは我が国のブロイラー由来サルモネラの優勢な血清型であり、人のサルモネラ食中毒を引き起こす血清型の上位を占めている。近年本菌のβラクタム薬耐性が報告され、その拡大が危惧されている。そこで本研究では南日本におけるブロイラー由来S. Infantisの薬剤感受性を調べ、βラクタマーゼ遺伝子の検討を行った。92鶏群1472の鶏盲腸検体から分離されたS. Infantisを用い薬剤感受性試験、ダブルディスク試験、耐性遺伝子のPCRによる検出とシークエンス、プラスミドプロファイルの解析を行った。分離された93株のうちアンピシリン、セフォタキシムの両剤に耐性を示したのは33株(35.5%)でblaTEM52、blaTEM20型ESBL産生株がそれぞれ22株、1株認められ、以前の報告と比較して著しく増加していた。blaTEM52保有株1株はblaCTX-M25にも同時に陽性を示した。AmpC産生を示した株は8株すべてでblaCMY2陽性であった。ESBL産生株では約50kb、180kbの、AmpC産生株では約180kbのプラスミドが検出され、両者の間で保有するプラスミドの相違が認められた。blaCTX-M25は約125kbのプラスミドが関連していた。ブロイラーにおけるblaTEM52型ESBL産生S. Infantisの広範囲な拡大が認められた。さらにblaCMY2、blaCTX-M25保有S. Infantis株も新たに出現した。これらのβラクタマーゼ遺伝子はプラスミドと関連していると考えられた。薬剤耐性菌問題が久しく続いており、多くの学会でも大きく取り上げられ、鹿児島県のブロイラーからも多剤耐性やセフォタキシム(Ctx)耐性のサルモネラが分離されている。本研究ではブロイラー由来サルモネラの薬剤耐性と保有プラスミドの調査及び解析を行い、サルモネラの薬剤耐性の獲得・拡大とプラスミドの関連について調べた。ブロイラー盲腸検体由来サルモネラ計149株(Infantis 128株、Manhattan 17株、Typhimrium 4株)を材料とし、9薬剤を用いた感受性試験、PCRとシークエンスによる耐性遺伝子の検出、プラスミドの抽出・レプリコンタイピング・伝達試験を行った。その結果、137株(92%)がストレプトマイシン、スルファメソキサゾール、テトラサイクリンの3剤に、60株(40%)がCtxに耐性を示した。また4種のプラスミド泳動パターンと5サイズのプラスミドが得られた。IncP型の140kbプラスミド(p140)はtetA、aadA1、sul1の3つの耐性遺伝子を保有し、3つの血清型147株から検出されたため、多剤耐性の拡大と大きく関わっていることが示された。IncX1型のp38は、ESBLと関わるblaTEM52遺伝子を保有し、このプラスミドが検出されたInfantisとManhattan計44株は全てCtxに耐性を示した。これよりp38がCtx耐性の拡大と大きく関わっていることが示された。今回1株あるいは2株のみが保有していたプラスミドにおいても、IncA/C型のp120からblaTEM52、blaCTX-M-25遺伝子、IncI1型のp100からCMY-2、tetA遺伝子が検出され、これまでと異なるプラスミドの出現も認められた。調査したサルモネラにはプラスミドが広く存在し、異なる血清型間に共通のプラスミドが存在したことから、Ctx耐性及び多剤耐性サルモネラの増加とプラスミドは大きく関わっていることが判明した。今後も継続的なモニタリングが必要であると考えられる。Salmonella Infantisは我が国の主要な食中毒原因菌であり、本菌の抗菌剤耐性化、とくに基質特異性拡張型βラクタマーゼ(ESBL)産生菌の出現および伝播は公衆衛生上大きな問題である。

本研究ではブロイラー由来S.Infantisの薬剤耐性、保有プラスミド、耐性遺伝子を調査し、さらに分離株をドナーとしてプラスミド伝達試験を行い、個々のプラスミドの耐性遺伝子を調べた。2009年9月から2010年1月にかけて1農場から分離された鶏由来S.Infantis全17株を用いた。薬剤感受性試験は、簡易法としてKB-DISCによりDISC拡散法で12薬剤について調べた。さらに最少発育阻止濃度(MIC)は寒天平板希釈法を用いて、アンピシリン(AMP)、セフォタキシム(CTX)、ストレプトマイシン(SM)、カナマイシン(KM)、テトラサイクリン(TET)、スルファメトキサゾール(SUL)の6薬剤を測定した。耐性遺伝子の検出にはPCR法、プラスミドの抽出には関崎の変法、プラスミド伝達試験にはE.coli DH5αを用いた接合法を行った。さらに菌株間の近似性を求めるためPFGEを行った。全17株のうち4株がセフォタキシム(CTX)耐性のESBL産生菌であった。CTX耐性S.Infantisの含む約95kbpプラスミドにはAMP・CTX耐性を担うCTX-M-14耐性遺伝子があり、約140kbpプラスミドにはSUL・SM・TET・KM耐性をそれぞれ担うsul1・aadA1・tetA・aphA1耐性遺伝子があった。日本のブロイラーに対して第三世代セフェム系薬が使用されていないにも関わらずこのようなCTX耐性S.Infantisが分離されたことは、耐性伝播にプラスミドが関係していると考えられた。鹿児島県下のロイラーからの薬剤耐性サルモネラ菌株の収集は当初予定したとおり順調に進行している。薬剤感受性試験、耐性遺伝子の検索およびそれらのシークエンスも計画通り達成できた。その結果、予想されたβラクタマーゼ耐性遺伝子以外の新規な薬剤耐性遺伝子も検出でき、それを過去にさかのぼって検索する研究も加わり予想以上に成果が上がっている。鹿児島県下のブロイラーからの薬剤耐性サルモネラ菌株の収集も当初予定していたとおり順調に進行している。加えて、他の機関との情報交換により、当初の予定以上の薬剤耐性サルモネラ菌株を入手することができ、この菌株を解析に用いたところ、我が国のブロイラーにおける新規な薬剤耐性遺伝子をプラスミド上に検出することができたことが大きな収穫となった。初年度からのサルモネラ菌株の収集を継続し、さらなるデータの蓄積を目指す。鹿児島県下の農場から職長処理場に持ち込まれるブロイラーの盲腸を収集(年間約50鶏群各16羽、合計総数約800サンプルを予定)、増菌培地および選択培地を用いてコロニーを分離し、生化学的性状検査により菌種を同定後、特異抗血清を用いて血清型別を実施する。多検体処理に対応した寒天平板希釈法を用いて、サルモネラの薬剤感受性試験を実施する。各々の薬剤耐性に関与する様々な遺伝子を、特異的なプライマーを用いたPCR法によって検索する。耐性遺伝子内の塩基配列の変異を特定するためダイレクトPCRシークエンスを行う。さらにプラスミドの抽出を行い、薬剤耐性との関連を調べる。試験管内接合法により細菌から細菌へのプラスミドの移動による薬剤耐性の伝達を調べる。また、エレクトロポレーション法により薬剤耐性に関与する遺伝子を特定する。初年度の方法を継続し、菌株の収集を続けデータを蓄積する。
鳥類AHRアイソフォームを指標とした化学物質のリスク評価

本申請は有機ハロゲン化合物・芳香族炭化水素の鳥類に対する潜在的な感受性およびリスクを評価するため、鳥類AHRアイソフォーム(AHR1・AHR2)について発現レベルや機能について理解することを目的とした。具体的には、以下のような結果が得られた。リアルタイムRT-PCR法を用いて、カワウのAHRアイソフォームmRNA量を組織別に解析したところ、AHR1は多くの組織でほぼ同程度に、AHR2は主に肝臓で発現していた。また肝臓中AHRmRNA量の個体別比較から、AHR1とAHR2の発現量の間に有意な関係は認められなかった。以上の結果から、各AHRアイソフォームはそれぞれ異なる発現制御を受け、特異的な機能を有していることが示唆された。また、鳥類AHRの転写活性化能を評価するため、レポーター遺伝子発現系を構築し、AHRアイソフォームを介した各化学物質の転写活性化能の測定・比較をおこなった。まず、ニワトリやハシブトガラスAHR1・AHR2を対象に、代表的なダイオキシン類化合物であるTCDD; TCDF; PeCDD; PeCDFの4異性体とPCB3異性体(PCB126;169;118)の濃度依存的な応答性を確認した。その後、用量応答性が認められた異性体に関しては、各AHRのEC_<50>値を算出した。その結果、すべての鳥類AHR1でダイオキシン類濃度依存的な応答がみられ、ニワトリAHR1(EC_<50>0.0086-0.024nM)の方がハシブトガラスAHR1(EC_<50>0.095-0.87nM)よりも敏感にダイオキシン類に応答していることがわかった。一方、AHR2に関しては、ニワトリAHR2はすべての化合物に対して応答性がなかったものの、ハシブトガラスAHR2では用量応答性がみられ、種によってAHR2の機能が大きく異なることが示唆された。本研究の結果より、鳥類AHRのリガンド選択性や応答性には明確な種差およびアイソフォーム特異性があり、AHRの機能特性の解明がダイオキシン類や芳香族炭化水素に対する生物種固有のリスクや影響を評価するために重要であると考えられた。リアルタイムRT-PCR法を用いて、カワウのAHRアイソフォームmRNA量を組織別に解析したところ、AHR1は多くの組織(肝臓・腎臓・心臓・肺・脾臓・精巣/卵巣・脳・小腸)でほぼ同程度に、AHR2は主に肝臓で発現していた。また肝臓中AHR mRNA量の個体別比較から、AHR1とAHR2の発現量の間に有意な関係は認められなかった。また、AHR1 mRNA発現量とTEQ値の間にも有意な関係は認められなかったが、AHR2はTEQ値の上昇に伴い減少した。さらに、AHR2はダイオキシン類の曝露により転写レベルで何らかの負の制御を受けていることが推察された。鳥類AhRが転写活性化能を有するか評価するため、luciferase reporter gene assayをおこなった。14nM TCDD処理によって、AhR1をトランスフェクトした細胞ではluciferase発現量がニワトリAhRと同様に上昇した。一方でAhR2をトランスフェクトした細胞では全く/

わずかに上昇した(アホウドリAhR2:8-fold,カワウAhR2:5.0-fold,empty:4.0-fold)。そのluciferase unitsはAhR1よりもはるかに低く、特にカワウAhR2においてはAhRを介した反応の結果かどうか、確認が必要である。しかしながら、鳥類AhR2の転写活性化能はAhR1よりも低いと推察される。本申請は有機ハロゲン化合物・芳香族炭化水素の鳥類に対する潜在的な感受性およびリスクを評価するため、鳥類AHRアイソフォーム(AHR1・AHE2)について機能解析することを目的とした。今年度は前年度構築したレポーター遺伝子発現系を用い、AHRアイソフォームを介した各化学物質の転写活性化能の測定・比較を行った。まず、ニワトリやハシブトガラスAHR1・AHR2を用いて、代表的なダイオキシン類化合物であるTCDD、TCDF、PeCDD、PeCDFの4異性体と3種のPCB異性体(PCB126、169、118)の濃度依存的な応答性を確認した。その後、用量応答性が見られた異性体に関しては各AHRのEC_<50>値を算出した。その結果、すべでの鳥類AHR1でダイオキシン類濃度依存的な応答が見られ、さらに、ニワトリAHR1(EC_<50>0.0086-0.024nM)の方がハシブトガラスAHR1(EC_<50>0.095-0.87nM)よりも敏感に応答していることが分かった。一方、AHR2に関しては、ニワトリAHR2はすべての化合物に対して応答性が見られなかったものの、ハシブトガラスAHR2では用量応答性がみられ、種によってAHR2の機能性が大きく異なっていることが示唆された。また、ハシブトガラスAHR2のリガンドプロフヤイルはAHR1とは異なり、TCDD、TCDFよりもPeCDD、PeCDFに敏感に応答することが分かった。PCB異性体については、ニワトリやハシブトガラスAHR1・AHR2のすべてのアイソフォームでダイオキシン類化合物よりも低い応答性がみられた。本研究の結果より、鳥類AHRのリガンド選択性や応答性には明確な種差やアイソフォーム特異性があり、AHRの機能特性の解明が有機塩素化合物や芳香族炭化水素に対する生物種固有のリスクや影響を評価するために重要であると考えられた。
直接シミュレーションによる超新星爆発メカニズムの解明

本研究は重力崩壊型超新星爆発のニュートリノ加熱メカニズムを調べるために、球座標一般相対論的ボルツマン輻射流体コードを開発し、超新星シミュレーションに応用することを目的としたものである。平成29年度においては重力パートを開発して真空でそれが正しく動くことを確認したほか、開発中の一般相対論的コードが将来生み出す結果と比較するために、現行の特殊相対論的ボルツマン輻射流体コードでのシミュレーションを行った。本年度ではまず昨年度に行った回転する親星の超新星シミュレーションを詳細に解析した。その結果、超新星におけるニュートリノの運動量分布は中心から放射された成分と近傍から放射された成分の2つが存在することを見出し、これによって従来のニュートリノ輸送近似法の精度が制限されることを見出した。これらの結果は論文誌に投稿、多くの研究会等で発表したほか、博士論文の一部にもなっている。それに加えて、再度計画を一部変更し、核物質状態方程式が異なる2つの超新星シミュレーションの結果を解析・比較するということも本年度には行った。核物質状態方程式は一般相対論的重力とともに原子中性子星の構造を決定し、放射されるニュートリノの性質に影響するため、現行のニュートン重力のシミュレーションを行っておいて、将来的に一般相対論的シミュレーションと比較することは相対論的強重力の効果を調べる上で重要となるからである。この解析により、超新星ダイナミクスとニュートリノ放射は核物質状態方程式に強く影響を受けることを見出した。加えて、この解析により状態方程式の扱いにバグが混入していたことが判明した。このバグを取り除くことにより、将来的な一般相対論的シミュレーションの信頼性を担保できるようになった。当初計画していた一般相対論的コードの完成までは至らなかったが、その開発・応用のために必要な準備を本課題で着実に整えられたと言える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は重力崩壊型超新星爆発のニュートリノ加熱メカニズム仮説を調べるために、球座標一般相対論的ボルツマン輻射流体コードを開発し、超新星シミュレーションに応用することを目的としている。初年度では、球座標数値相対論コードの開発とそれをボルツマン輻射流体コードに結合することを計画しており、実際に球座標数値相対論コードの開発には成功した。このコードは、少なくとも真空解は精度良く解けることを確かめてある。これは最終目的であるコードの中核をなす重要なパーツとなる。また、アインシュタイン方程式は拘束系であるため数値相対論コードの初期条件生成は非自明な問題であり、超新星爆発シミュレーションの初期条件を拘束条件を満たすように構成する初期条件生成コードも開発した。これによって、コードを一般相対論化する準備は整ったと言える。また、コード開発と並行して、一般相対論効果を浮き彫りにするためにニュートン的重力のもとでのボルツマン輻射流体コードによる超新星爆発シミュレーションも行う計画であった。この目的のため、比較的速い自転速度を持つ星の重力崩壊、およびそのコアバウンス後の進化までのシミュレーションを行った。このシミュレーションでは爆発は起こらなかったが、特に自転によるビーミング効果がニュートリノ分布に与える影響を定量的に見積もり、また、先行研究で用いられていたニュートリノ輸送の近似法ではニュートリノ分布の四重極変形を最大で20%程度過大評価することを指摘した。これはニュートリノ輸送を近似なしに行う本研究でのみ可能な評価であり、将来的に精度を高めた新しい近似法の提案に利用できる可能性がある重要な指摘である。さらに、こうして一般相対論的シミュレーションと比較するための対照実験にあたるシミュレーションが準備できたことになる。一般相対論的ボルツマン輻射流体シミュレーションを行い、超新星爆発メカニズムに迫るという観点からは概ね順調に進展していると言える。計画の一つであった、一般相対論的シミュレーションと比較するためのニュートン的シミュレーションを実行するという部分に関しては、予定通りに問題なく進められている。コード開発の部分に関しては当初の研究計画通りに進んでいるとは言い切れないが、計画の最重要部分である数値相対論コードの開発は問題なく完了した。コード全体を統合する部分は完了してはいないが、これは初期条件の生成に当初よりも時間をかける必要が出てきたためであり、この部分を飛ばしては数値計算を行うこと自体ができなくなってしまう。それゆえ、必要なコードを着実に開発していっているという意味では、概ね順調に進展していると言えよう。

この解析により、超新星ダイナミクスとニュートリノ放射は核物質状態方程式に強く影響を受けることを見出した。加えて、この解析により状態方程式の扱いにバグが混入していたことが判明した。このバグを取り除くことにより、将来的な一般相対論的シミュレーションの信頼性を担保できるようになった。当初計画していた一般相対論的コードの完成までは至らなかったが、その開発・応用のために必要な準備を本課題で着実に整えられたと言える。平成29年度に引き続き、一般相対論的ボルツマン輻射流体コードの開発を進める。開発した数値相対論コードと、既にニュートン的シミュレーションにも利用したボルツマン輻射流体コードとを統合することで、目的のコードを開発する予定である。この部分を性急に進めてバグの多いコードになってしまっては意味がないので、問題の生じやすい部分に関しては共同研究者と議論を重ねつつ、慎重に開発していく予定である。コードが完成次第、超新星爆発シミュレーションを実行し結果を論文にまとめる。その一方で、平成29年度に行ったニュートン的シミュレーションにおいては多くの興味深い現象が見つかっており、さらに詳細な解析をおこなえばその物理的な起源、および超新星爆発に与える影響を調べることができると考えられる。ここで詳しく調べておくことは、将来的に一般相対論的シミュレーションと比較する際にも重要な知見を多く与えてくれるため、早い内に解析を遂行する必要性がある。ゆえに、平成30年度もある程度はコード開発及びシミュレーションと並行して、この解析にも時間を割く予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
啖助・趙匡・陸淳を中心とする唐代春秋学の基礎的研究

これまで三年間かけて研究してきた「啖助・趙匡・陸淳を中心とする唐代春秋学の基礎的研究」の総まとめとして『啖助・趙匡・陸淳を中心とする唐代春秋学の基礎的研究(第一分冊)』及び『啖助・趙匡・陸淳を中心とする唐代春秋学の基礎的研究(第二分冊)』を刊行した。第一分冊の方には「唐代の儒教と啖助・趙匡・陸淳の春秋学-序説-」・「春秋微旨(上・中・下)訓解」を収載,第ニ分冊の方には「春秋集伝弁疑訓解」を収載する。陸淳の『春秋集伝弁疑』の翻訳を進め、現在全十巻中第九巻まで終了している。そのうち第六巻までを『春秋集伝弁疑訓解(全二冊)上編-巻一至巻六-』として刊行した。残りの四巻も次年度中には刊行できる運びである。これで陸淳の著書のうち『春秋啖趙集伝箕例』全十巻の翻訳と併せて彼の著述の大半を訳し終えたことになる。また、『春秋啖趙集伝箕例』の中の巻八の「姓・氏・名・字・爵・諡例」、及び巻十地名譜中に見える第三者の意見の混入は版本の追跡調査によってはそれが誰かは確認できず、北宋の朱臨の文章(『春秋集伝弁疑』の序文)に『春秋集伝箕例』は既に北宋の初年に完本がなかったことが見えているから、おそらく陸淳の弟子柳宗元あたりの意見が混入している可能性が高くなった(これについては別に証拠があるが今はふれない)。さらに『春秋集伝微旨』の翻訳を準備中。また柳宋元の春秋学との比較も進めている。こうした作業を通じなぜ唐末に春秋学が盛んとなりそしてそれが韓愈・柳宋元らの儒教復興運動、北宋の春秋学の盛行を促し、朱子学の誕生につらなるのかをある程度明確にできることが予想される。前年度中に発刊した『春秋弁疑訓解(全二冊)上編』に引き続き、『春秋弁疑訓解(全二冊)下編』の原稿を完成させ、これを刊行させた。体裁は、B5版、全129頁、末尾に「唐代儒教関係研究文献目録」を収載した。これで唐の陸淳の『春秋』関係著述三作のうち『春秋啖趙集伝纂例』と併せ二作までの訳注製作の作業が完了したことになる。残る『春秋微旨』についても訳注の作業に入っており、次年度中にもその刊行が実現できる状態になりつつある。また、前年来未解決であった現行本『春秋啖趙集伝纂例』の中に後人の手が加わっていることについてはこの本が出来てまもない時期にそれがなされていることは確認できたが、それが誰なのかはまだ特定できていない。啖助らの『春秋』学の特質の分析についても伝例の整理を通じて概ねその特徴が当時の李王朝の政治形態や社会的な諸般の事情と密接にからんでいることはおおよそ検討をつけることができるまでに至っているが、その具体的な状況の提示は現段階では困難である。すべて訳注完成後の詳説を期すつもりである。なお、この作業を続けている過程で、このタイトルとはいささかずれるが儒教そのものの定義に関しても私なりに気づくところがあって、それを原稿に起こすことができた。今年度の報告の中に含めておく。第一分冊の方には「唐代の儒教と啖助・趙匡・陸淳の春秋学ー序説ー」・「春秋微旨(上・中・下巻)訓解」(いずれも書き下ろし)を収載。第二分冊の方には「春秋集伝弁疑(全十巻)訓解」を収載する。いずれも、これまでほとんど顧みられることのなかった唐代の春秋学の展開を解明する上では最も基礎的な研究成果となったと思う。
発生工学的手法を用いた炎症性肺疾患治療法の展開(副題)エイコサノイド、PAFを標的に

<研究結果>(A)気管支喘息・気道過敏性:(1)PAF受容体遺伝子:コントロール群に比べ、PAFR-Tgマウスにおいて気道過敏性を認めた。この気道過敏性が、アトロピン感受性のメカニズムに依存することを明らかにし、論文発表した(Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002)。(2)cPLA_2遺伝子:ovalbumin感作マウスに抗原投与した場合、cPLA_2-KOマウスでは野性型群に比べ、気道収縮が著明に軽減していた。また野性型群で認められた気道過敏性が、cPLA_2-KOマウスでは認められなかった。(B)ARDS:(1)PAF受容体遺伝子:ARDSモデルとして、塩酸気管内投与を行なった。呼吸不全・肺水腫は、PAFR-Tgにおいて他群に比べ有意に著明であった。一方、PAFR-KOでは他群に比べ有意に軽度であった。(2)cPLA_2遺伝子:ARDSモデルとして、塩酸気管内投与またはエンドトキシン投与を行なった。cPLA_2-KOマウスでは野性型群に比べ、肺水腫、低酸素血症、好中球浸潤がいずれも有意に軽減していた。<本研究成の実用化への見通し・実用化後の社会的貢献度>炎症性肺疾患は、社会的に極めて重大な疾患となっている。ARDSは、難治性、致死性において他に類をみない程、重篤な疾患であり、治療薬の開発が切実に待たれている。気管支喘息は、世界的にも発症頻度、死亡率が増大しつつあり、画期的な喘息治療薬の開発が期待されている。本研究の成果により、cPLA_2をはじめ炎症抑制治療の標的が明確になりつつあり、今後、有効な治療法・治療薬の開発および実用化は近いと思われる。ARDSや難治性気管支喘息に対する治療薬の開発実現化は、社会医学的にも医療福祉・医療経済的にも莫大な貢献をなすものである。本研究の成果は科学誌に公表され、国内・国外を問わず、注目を受けつつある。本研究では、発生工学的手法を応用し、脂質性メディエーターの炎症性肺疾患発症機序における重要性について検討する。特に、ARDS、特発性間質性肺炎、気管支喘息などにおける、PAFおよびエイコサノイド関連遺伝子の意義を明らかにすることにより治療の標的を明確にし、有効な治療法、治療薬の開発および実用化を目的とする。本研究では、発生工学的技術を用いて作成した遺伝子ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスを使用する。平成11年度:<炎症性肺疾患におけるPAFR、cPLA_2遺伝子発現の関与>炎症性肺疾患モデルとして、ARDS、特発性間質性肺炎、気管支喘息の動物モデルを用いた。マウス各群に、塩酸気管内投与(ARDS)、ブレオマイシン気管内投与(特発性間質性肺炎)、抗原感作(気管支喘息)などの処置を行い、生理学的、生化学的、免疫組織化学的、分子生物学的検討により、PAF受容体遺伝子発現およびcPLA_2遺伝子発現と炎症性肺疾患の関係について評価・検討を加えた。

特に、ARDS、特発性間質性肺炎、気管支喘息などにおける、PAFおよびエイコサノイド関連遺伝子の意義を明らかにすることにより治療の標的を明確にし、有効な治療法、治療薬の開発および実用化を目的とする。本研究では、発生工学的技術を用いて作成した遺伝子ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスを使用する。平成12年度:PAFR-Tgマウス系、PAFR-KOマウス系、cPLA_2-KOマウス系各々について、遺伝的背景を均一にするため、C57BL/6マウスへのバッククロスを10代以上に進めた(99.9%に純化)。<炎症性肺疾患におけるPAFR、cPLA_2遺伝子発現の関与>炎症性肺疾患モデルとして、ARDS、特発性間質性肺炎、気管支喘息の動物モデルを用いた。マウス各群に、塩酸気管内投与またはLPS投与(ARDS)、ブレオマイシン気管内投与(特発性間質性肺炎)、抗原感作(気管支喘息)などの処置を行い、生理学的、生化学的、免疫組織化学的、分子生物学的検討により、PAF受容体遺伝子発現およびcPLA_2遺伝子発現と炎症性肺疾患の関係について評価・検討を加えた。特に、ARDSに関しては、PAF受容体遺伝子発現およびcPLA_2遺伝子発現が極めて重要であることが明らかになり、治療薬開発の標的となりうる可能性が呈示された(2000年7月、Nature Immunology誌に論文掲載)。<研究結果>(A)気管支喘息・気道過敏性:(1)PAF受容体遺伝子:コントロール群に比べ、PAFR-Tgマウスにおいて気道過敏性を認めた。この気道過敏性が、アトロピン感受性のメカニズムに依存することを明らかにし、論文発表した(Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002)。(2)cPLA_2:ovalbumin感作マウスに抗原投与した場合、cPLA_2-KOマウスでは野性型群に比べ、気道収縮が著明に軽減していた。また野性型群で認められた気道過敏性が、cPLA_2-KOマウスでは認められなかった。(B)ARDS:(1)PAF受容体遺伝子:ARDSモデルとして、塩酸気管内投与を行なった。呼吸不全・肺水腫は、PAFR-Tgにおいて他群に比べ有意に著明であった。一方、PAFR-KOでは他群に比べ有意に軽度であった。(2)cPLA_2遺伝子:ARDSモデルとして、塩酸気管内投与またはエンドトキシン投与を行なった。cPLA_2-KOマウスでは野性型群に比べ、肺水腫、低酸素血症、好中球浸潤がいずれも有意に軽減していた。<本研究成果の実用化への見通し・実用化後の社会的貢献度>炎症性肺疾患は、社会的に極めて重要な疾患となっている。ARDSは、難治性、致死性において他に類をみない程、重篤な疾患であり、治療薬の開発が切実に待たれている。気管支喘息は、世界的にも発症頻度、死亡率が増大しつつあり、画期的な喘息治療薬の開発が期待されている。本研究の成果により、cPLA_2をはじめ炎症抑制治療の標的が明確になりつつあり、今後、有効な治療法・治療薬の開発および実用化は近いと思われる。ARDSや難治性気管支喘息に対する治療薬の開発実現化は、社会医学的にも医療福祉・医療経済的にも莫大な貢献をなすものである。本研究の成果は科学誌に公表され、国内・国外を問わず、注目を受けつつある。
脳高次機能におけるグルタミン酸受容体チャネルの役割

本研究の目的は、NMDA受容体チャネルが記憶、学習といった脳高次機能にはたす役割を受容体を構成するサブユニットと形成される受容体の機能という面から明らかにすることである。そのために、NMDA受容体チャネルを構成するe各サブユニットを欠失したマウスを標的遺伝子組換えにより作成し解析をおこなうことを計画した。本年度は、発現が発生初期からから認められ、生後その発現が前脳に限定されてくるε2サブユニットのノックアウトマウスの作成に成功した。この変異マウスは、哺乳反射が消失しており生後すぐに死亡した。しかし、強制栄養による飼育を試みた結果、生後3日以上生存し身体的にも発育するることが明らかになった。ε2サブユニットの欠失により、形態学的に大きな変化は認められなかったが、脳幹三叉神経核に存在するバレレッテ構造が消失していた。さらにこの変異マウス海馬CA1錐体細胞では、生後3日目までNMDA受容体チャネルを介する電流成分が検出されなっかた。また、この領域で生後2-3日頃から低頻度刺激でおこる長期抑圧(LTD)も認められなかった。これらのことから、ε2サブユニットは、生存に必須な分子であること。さらに、幼若期海馬でのNMDA受容体チャネルの構成成分であり、シナプスの可塑性に関係する分子であることが明らかになった。また、ある種の神経細胞終末のシナプス形成に関与することが示唆された。
腰椎部脊柱管外病変に係る難治性疼痛のメカニズム解明と治療法開発

腰椎部外側病変の神経障害性疼痛の形成には交感神経系が痛覚伝達に対して修飾している可能性がパッチクランプ法により示唆された。また脊髄内メカニズムとして、ミクログリアの活性化と脊髄膠様質細胞の興奮性との間にインターフェロンγ(IFNγ)が関連している可能性がある。IFNγは興奮性伝達物質グルタミン酸の受容体であるNMDA受容体の作動薬を流した際に観察される脊髄後角細胞の一過性の緩徐な内向き電流を有意に増強する。この作用はIFNγが脊髄後角内のミクログリアにあるIFNγ受容体に結合し、CCL2シグナリングを介して後角細胞のNMDA受容体を活性化していることが判明した。腰椎部脊柱管外病変(いわゆる外側病変)における疼痛は術後アロディニアも残りやすく、難治性であるがそのメカニズムには不明な点が多い。本研究は外側病変の疼痛にはその解剖学的な位置関係から交感神経節が関与していて、脊髄後角のミクログリアの活性化に影響を与えているという仮説のもとに解析をすすめた。本年度は交感神経節がどの程度、神経障害性疼痛の形成に関与しているのか検討した。まず、神経根圧迫モデルとしてL5腰神経を後根神経節遠位で結紮したモデル(SNLモデル)ラットを作成し、結紮後1週でin vivoパッチクランプ法にて脊髄膠様質ニューロンの自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)を解析した。SNLモデルラットにおける脊髄膠様質ニューロンのsEPSCはshamモデルやnormal ratと比較して、頻度・振幅共に亢進していることがわかった。次にSNLモデル作成時に同時に交感神経幹を切除したモデルを作成し、同様に術後1週後に脊髄膠様質ニューロンのsEPSCを解析した。その結果、SNL+交感神経幹切除モデル群においてはSNL単独群よりもsEPSCの頻度が平均で有意に低いことが判明した。以上の結果から、腰部神経根の圧迫によって生じる神経障害性疼痛の形成初期には交感神経系による何らかの痛覚伝達に対する修飾が関与し、それによって脊髄膠様質における興奮性神経伝達物質のグルタミン酸の放出が定常的に亢進する神経可塑的な変化が起こる可能性が考えられた。この機序は腰椎部脊柱管外病変における難治性疼痛のメカニズムの一つである可能性が示唆された。研究計画に従い、本年度は腰椎部脊柱管外病変(外側病変)における神経障害性疼痛の形成機序に交感神経系が関与している可能性について電気生理学的に検証することができた。これまでに腰部脊柱外病変における神経根の絞扼部位の違いは、疼痛強度の差と脊髄内ミクログリアの活性化の差をもたらすことを報告してきたが、ミクログリアの活性化と脊髄膠様質細胞の興奮性との関係は未だ明らかになっていない。そこで本年度は炎症性サイトカインの1つインターフェロンγ(IFNγ)に着目し、脊髄内ミクログリアと脊髄膠様質細胞との相互作用についてパッチクランプ法を用いて検討を行った。興奮性伝達物質グルタミン酸の受容体であるAMPA受容体、NMDA受容体にそれぞれの作動薬を流した際に観察される脊髄後角細胞の一過性の緩徐な内向き電流(それぞれAMPA電流、NMDA電流とする)に対するIFNγの作用を解析した。IFNγ灌流投与によりAMPA電流ではなくNMDA電流が有意に増強した。このNMDA電流増強作用はIFNγ受容体拮抗薬と、ミクログリアインヒビターであるミノサイクリンにより抑制された。以上より、ミクログリア上のIFNγ受容体にIFNγが作用し、脊髄膠様質細胞に何らかの興奮性シグナル伝達を行っていると考えられた。腰部脊柱外病変は神経障害性疼痛の一形態であるが、この神経障害性疼痛の形成にインターフェロンγによる脊髄内ミクログリア活性化が脊髄膠様質細胞の興奮性の増強に関与していることを示すことができた。これまでの本研究での結果において、腰部神経根の圧迫によって生じる神経障害性疼痛の形成初期には交感神経系による何らかの痛覚伝達に対する修飾が関与し、それによって脊髄膠様質における興奮性神経伝達物質のグルタミン酸の放出が定常的に亢進する神経可塑的な変化が起こる可能性が考えられることを報告してきた。また、腰部脊柱外病変における神経根の絞扼部位の違いは、疼痛強度の差と脊髄内ミクログリアの活性化の差をもたらすことを報告してきた。このミクログリアの活性化と脊髄膠様質細胞の興奮性との間には炎症性サイトカインの1つインターフェロンγ(IFNγ)が関連している可能性を指摘した。IFNγは興奮性伝達物質グルタミン酸の受容体であるNMDA受容体の作動薬を流した際に観察される脊髄膠様質細胞の一過性の緩徐な内向き電流(NMDA電流)を有意に増強する。さらに電極内にIFNγの細胞内シグナル伝達経路であるJAK-STAT経路の阻害剤を混入してNMDA電流を観察したところ、増強作用は認めなかった。従って、IFNγはミクログリアにあるIFNγ受容体を介して作用していることが判明した。さらにニューロン-グリア間のクロストークを担っていると報告されている代表的なケモカインであるCCL2のアンタゴニストを共に灌流投与したところ、IFNγによるNMDA電流増強作用はブロックされた。