hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血小板生理活性ペプチド定量測定による骨髄環境予測と横断的病態検査への応用展開

本申請による最も顕著な実績として、肝細胞癌による肝切除後の肝再生過程における血小板VEGF-Aの動態と役割について明らかにして論文発表したことである(Aryal B, et al. ASwitch in the Dynamics of Intra-PlateletVEGF-Afrom Cancer to the Later Phase of Liver Regeneration after Partial Hepatectomy in Humans. PLoSONE 11(3):e0150446)。創傷治癒の骨髄へのシグナルは骨髄巨核球における血小板産生において血小板VEGF-Aの産生を調節して組織再生に寄与していることを明らかにすることにより本申請の目的を果たした。末梢組織のイベントは骨髄へのシグナル応答を介してお互いにポジティブあるいはネガティブにフィードバック調節されているものと予測される。従って止血栓の大きさと質は部分的には骨髄機能によって制御されていると考える。本研究による最も顕著な実績として、肝細胞癌による肝切除後の肝再生過程における血小板VEGF-Aの動態について明らかにして論文発表した(Aryal B, et al.PLoSONE 11(3):e0150446)。創傷治癒の骨髄へのシグナルは骨髄巨核球における血小板産生において血小板VEGF-Aの産生を調節して組織再生に寄与していることを明らかにすることにより本研究の目的を果たした。今年度、肝切除患者の肝再生における血小板VEGFの関与を証明したことより、肝再生の骨髄へのシグナルが骨髄巨核球に伝わること、すなわち、血小板VEGFの抗原量の評価が骨髄機能の評価につながることの当初の仮説を裏付けることができた。肝再生のシグナルが血小板の形質を変化させて、肝産生・組織修復に適した血小板への形質転換を促すことの発見は意義深いと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。止血凝固・血小板・血管代謝ヒトの病態における血小板検体からのアプローチは順調に進捗し、血小板生理活性ペプチド定量測定による骨髄環境予測と横断的病態検査への応用展開に相応しい展開がなされたと考える。今後は、基礎研究からのアプローチとして、ヒトにおける血小板VEGF-Aの病態関与への考察を深めるために血小板特異的VEGF-A発現マウスの作出と解析を検討する。既にCAG-loxP-EGFP/CAT-loxP-human VEGF-Aの遺伝子を導入したマウス(hVEGF-Afl)を作出済みであり血小板特異的なプロモーターによるCre発現マウスとの交配により血小板特異的VEGF-Aの発現は可能である。hVEGF-AflがCre発現マウスとの交配により組織特異的にVEGF-Aを発現することは既にJ Immunol.2010に報告しており実証済みである。計画通りに進捗しており、かつ新知見も得られている。肝切除症例数を更に増やして今年度に得られた知見への信頼性の向上を図るとともにin vitroの実験において、研究実績の概要に述べた血小板VEGF-AとHGFの肝再生における分子相互作用について明らかにしていく予定である。
遺伝子発現プロファイルによる神経細胞分化過程にかかわる遺伝子の抽出

遺伝子発現は一般的に機能に直接関連しているものと、2次的に変化するものがあり、前者だけを同定するための方法論が必要である。これまでの研究で、NGF,eIF4A1,Nnat,Rb1,Rnf13,TREK1の各遺伝子をPC12細胞へ導入し発現を誘導すると神経伸長を起こすことがわかっている。これらの遺伝子による神経伸長過程の遺伝子発現プロファイル解析をおこない、共通する遺伝子発現変化を同定する。これらは神経伸長現象に直結した変化である、と推察される。サンプリングする細胞は、導入遺伝子の発現誘導前と発現誘導後0,1,2,6,12,24,48,96,164,336時間の計11ポイントである。計2304遺伝子(いずれもPC12での発現が確認されているもの)の発現量をアダプター付加競合PCR法で測定した。5つの導入遺伝子で共通する変化について、分化後の164,336時間のサンプルと発現誘導前のサンプルで発現量に変化のある遺伝子を同定した。False discoveryrate50%の選択基準で40個の遺伝子が同定された。この基準では半数の遺伝子は疑陽性だが半数の20個は陽性である。神経伸長を行って分化した細胞では、Rb1,insulin-like growth factor receptorやmicrofibrillar associated proteinの発現が高く、また、volatge-dependent anion channel2,cdc27の発現が高い。これらの遺伝子は5つのPC12細胞株に共通した発現をとっているという点から、神経伸長に深く携わっている可能性が強く、実際の活性についてはこれからの研究に期待できる。
ヒト表皮のテロメア長と日光老化・癌の発生

皮膚の日光曝露による老化と癌の発生に関する研究を行った。曝露の有無にかかわらず1検体中の表皮内の構成細胞のテロメア長に差は乏しかった。曝露部表皮ではテロメアが有意に短かった。日光角化症(AK)の背景表皮では、テロメア短縮が証明された。つまり、AKはテロメアの短い表皮から発生した。同一個体の曝露部表皮と(頸部)と非曝露部(腹部)のテロメア長は、日光曝露部のテロメア長が短縮している傾向にあった。また、線維芽細胞ではAK周囲で短かった。AKの発生母地ではAKのない曝露部線維芽細胞よりも有意にテロメアが短く、前癌病変であるAKの発生に紫外線UV-BとともにUV-Aの影響があることが想像できた。日光老化と癌の発生の関係を知るために染色体の不安定性を引き起こすテロメア短縮を表皮細胞で解析した。FISH法により表皮の構成細胞である基底細胞、傍基底細胞、棘細胞と真皮の線維芽細胞のテロメア長を測定した。パイロット研究として、日光非曝露部、日光曝露部、日光角化症の背景皮膚、日光角化症(Actinic keratosis、前癌病変)の4群のサンプルを測定した。パイロット研究により、1.日光角化症以外の皮膚で、基底細胞のテロメア最長ではなかった(食道や口腔上皮と異なる結果)。2.日光曝露部や日光角化症の背景皮膚の基底細胞のテロメアは非曝露部よりも短い。しかし、全ての細胞種が非曝露部よりテロメアは短くなかった(対象症例数の増加が必要か)。さらに、東京都健康長寿医療センターの剖検例(同一個体)の日光被曝の有無(頚部と腹部)と、皮膚各細胞のテロメア長を比較解析する。25年度に引き続き日光老化と癌の発生の関係を知るために染色体の不安定性を引き起こすテロメア短縮を表皮細胞で解析した。FISH法により表皮の構成細胞である基底細胞、傍基底細胞、棘細胞のテロメア長を測定した。25年度に日光非曝露部、日光曝露部、日光角化症の背景皮膚、日光角化症(Actinic keratosis(AK)、前癌病変)の4群のサンプルをパイロット研究として実施した結果をHuman Pathologyに投稿しアクセプトとなった。結果の概略として1.日光非曝露群、日光曝露群のおよびAK背景の、基底細胞のNTCR値は3種類の細胞種の中で最も高い値は示さなかった(研究グループの他の結果では基底細胞のNTCR値が最も高かった)。2.日光非曝露群における基底細胞のNTCR値は、日光曝露群と比較して有意に高かった。日光非曝露群の基底細胞、傍基底細胞、および基底上細胞のNTCR値は、AK背景の対応する細胞と比較して、いずれも有意に高い値を示した。3.日光曝露群の基底細胞、傍基底細胞および基底上細胞のNTCR値は、AK背景の対応する細胞と比較して、いずれも有意差は認められなかった。4. AK病変部位の基底細胞のNTCR値は、AK背景の基底細胞と比較して低値を示した。以上からテロメアの短縮を示すAKの浸潤のない表皮およびAK自体において、テロメアの短縮と染色体の不安定性を示す組織学的に正常な上皮から癌が発生することを確認した。このことから前癌状態または組織学的に正常な状態からの発癌において、テロメア機能不全と染色体の不安定性が極めて重要な役割を果たしていることが示唆される。引き続き東京都健康長寿医療センターの剖検例(同一個体)の日光被曝の有無(頚部と腹部)と、皮膚各細胞のテロメア長を比較解析する。26年27年度前半までの結果として1.日光非曝露群、日光曝露群のおよびAK背景の、基底細胞のNTCR値(テロメア長を反映)は、3種類(基底、傍基底、および基底上細胞)の細胞種の中で最も大きな値は示さなかった。2.日光非曝露群における基底細胞のNTCR値は、日光曝露群と比較して有意に大であった。日光非曝露群の3種の細胞のNTCR値は、日光角化症(前癌病変、AK)背景の対応する細胞と比較して、いずれも有意に大であった。3.日光曝露群の3種の細胞のNTCR値は、AK背景の対応する細胞と比較して、いずれも有意差は認められなかった。4. AK病変部位の基底細胞のNTCR値は、AK背景の基底細胞と比較して小さな値を示した。以上からAKの背景およびAK自体において、テロメアの短縮が証明された。つまり、前癌病変はテロメアの短い皮膚から発生するすことを確認した。27年度後半はこれまでの検討では考慮されなかった皮膚疾患をもたない同一個体の日光曝露部表皮(頸部)と非曝露部表皮(腹部)を用いて、日光曝露による正常皮膚テロメア長の基底細胞と真皮線維芽細胞ついて検討した。基底細胞と真皮線維芽細胞の年齢との相関について回帰分析を行ったが、いずれも有意差は認めなかった。基底細胞と真皮線維芽細胞のどちらにおいても、日光曝露部と非曝露部テロメア長の間に有意差は認められなかったが、わずかに日光曝露部表皮のテロメア長の方が短縮している傾向にあった。日光曝露部と非曝露部どちらにおいても、すべての症例で基底細胞のテロメア長の方が、真皮線維芽細胞のテロメア長よりも有意に短かった。

老化関連のβーGal染色は良好な結果が得られていない。理由前癌病変はテロメアの短い皮膚から発生するすことを確認し、仮説を支持する結果を得た。27年度後半からのパイロット的研究により、日光被曝の有無による基底細胞のテロメア長に日光曝露の有無により同一個体内でも差のあることが示唆された。症例を増やして、有意差のあることを証明できれば、日光老化によりテロメア短縮を引き起こし、AKの発生母地となることを裏付ける原著論文の作成を開始できる。老化関連βーGal染色は良好な結果が得られていないが、テロメア検索症例数が十分となれば、論文中では結果は不要と考える26年28年度までの結果として、1.日光非曝露群、日光曝露群および日光角化症(前癌病変、AK)背景の基底細胞のNTCR(テロメア長を反映)は、表皮を構成する3細胞種(基底、傍基底、傍基底上細胞)の中で最も大きな値ではなかった(基底層に表皮幹細胞が所在しない)。2.日光非曝露群における基底細胞のNTCR値は、日光曝露群と比較して有意に大であった(日光によるテロメア短縮)。3.日光曝露群の3種の細胞のNTCR値は、AK背景の対応する細胞と比較して、いずれも有意差はなかった(真皮では有意差あり)。4.AK病変の基底細胞のNTCR値は、AK背景の基底細胞と比較して小さな値を示した(AKが最短)。以上からAKの背景およびAKにおいて、テロメアの短縮が証明された。つまり、前癌病変(AK)はテロメアの短い表皮から発生した。27年度後半からこれまでの検討では考慮されなかった皮膚疾患をもたない同一個体の日光曝露部表皮(頸部)と非曝露部表皮(腹部)を用いて、日光曝露による皮膚テロメア長の基底細胞と真皮線維芽細胞について検討した。基底細胞と真皮線維芽細胞の年齢との相関について回帰分析を行ったが、いずれも有意差は認めなかった。基底細胞と真皮線維芽細胞のどちらにおいても、日光曝露部と非曝露部テロメア長の間に有意差は認めなかったが、わずかに日光曝露部表皮のテロメア長の方が短縮している傾向にあった(症例数の問題と考察)。日光曝露部と非曝露部どちらにおいても、すべての症例で基底細胞のテロメア長の方が、真皮線維芽細胞のテロメア長よりも有意に短かった。AKの発生母地領域における老化関連のβ-Gal染色が陽性結果を示せばテロメア短縮→老化細胞の発生→AK→癌の発生母地化の細胞動態が示せたことになると考えている。以上の結果と考察を原著とし執筆中である。今後は表皮培養細胞を使った研究を展開する。皮膚の日光曝露による老化と癌の発生に関する研究を行った。曝露の有無にかかわらず1検体中の表皮内の構成細胞のテロメア長に差は乏しかった。曝露部表皮ではテロメアが有意に短かった。日光角化症(AK)の背景表皮では、テロメア短縮が証明された。つまり、AKはテロメアの短い表皮から発生した。同一個体の曝露部表皮と(頸部)と非曝露部(腹部)のテロメア長は、日光曝露部のテロメア長が短縮している傾向にあった。また、線維芽細胞ではAK周囲で短かった。AKの発生母地ではAKのない曝露部線維芽細胞よりも有意にテロメアが短く、前癌病変であるAKの発生に紫外線UV-BとともにUV-Aの影響があることが想像できた。パイロット研究により、日光被曝の有無による表皮基底細胞のテロメア長に差のあることがわかり、これらの結果を論文にすることができ一応の成果を今年度は残せた。
硫酸カリウム結晶の成長に対する不純物作用の錯体化学的影響

硫酸カリウム結晶の成長速度に対するクロム不純物の影響を実験的に調べ、錯体化学的な検討を加えた。先ず、塩化クロムを不純物として添加した場合の成長速度をpHを変えて測定した。特徴的な結果としては、不純物効果がpHの履歴に大きく依存したことである。たとえば、クロムを1ppm添加しpH=5で、温度38°C過冷却度6°Cの条件下で硫酸カリウム結晶を成長させた場合、pH=5に長時間保持した後の溶液の場合は、成長は完全に抑制されたが、pH=5に調整直後の溶液の場合は、抑制効果は全く見られず、結晶は純粋系と同じ速度で成長した。これは、ある特定の化学的形態をとったとき始めて不純物効果を示すクロム錯体が、その形態をとるのにある時間が必要であることを示唆している。もう一つの興味ある結果は、クロム不純物の成長抑制作用において数10分の時間にわたる非定常性が見られたことである。すなわち、まず純粋系で結晶成長させておきそこにクロム不純物を添加すると、その成長抑制効果は始めは全く現れなかったが、数10分後には速度は徐々に減少し始めやがて完全に成長が止まってしまった。この現象もやはり、先に述べた特定の化学的形態をもった錯体が形成されるのにある一定の時間が必要であることを示唆している。以上のように、結晶成長に対するクロムの不純物作用をpH条件を変えて実験的に検討し、それを錯体化学的立場から考察した研究は、今まで見られない。その意味で、本研究は(従来メカニズムが明確に説明されて来なかった)結晶成長に対する不純物効果の説明に、一つの解明の糸口を与えるものと考えられる。現在、本研究の一部を国際的な学術雑誌に投稿すべく準備中である。
神経損傷後の中枢神経回路の改編を制御する神経活動依存的機構の解析

我々は、視床の触覚核であるVPm核の中継細胞への上行性線維が神経損傷後5日以降に一本支配から多重支配になることを明らかにした。しかし、抑制性入力の変化に不明であった。そこで、本課題では、末梢神経損傷後経日的にVPm中継細胞から抑制性GABA電流を調べた。その結果、手術1日目からシナプスGABA電流は減弱し、一方でシナプス外GABA電流は増加していた。lこの増加は手術後7日目では多重支配した細胞のみに観られら。さらに、正常動物でVPmにシナプス外GABA受容体のアドニストを投与したところ、多重支配が生じた。したがって、損傷後のシナプス外GABA電流の増加が上行性線維改編を誘導する可能性がある。感覚性求心経路の遮断・切断によって、その投射先である視床・体性感覚野などの上位中枢神経系では神経回路の配線と機能が可塑的に変化する。この変化の誘導には、神経活動依存的な要因が示唆されているが、改編する神経回路のシナプスレベルでの厳密な規則性は十分に解明されていない。神経活動は抑制性と興奮性のバランスで規定されている。本研究は、申請者が発見した、眼窩下神経の切断によって誘導される内側毛帯線維-視床VPm核投射細胞シナプスの多重支配化現象をモデルに、シナプス後細胞への興奮・抑制のバランスと神経回路改編の関係を調べてきた。視床VPM細胞へのphasicな抑制性入力(eIPSC)は視床網様体核を最小刺激することによって誘発される。このeIPSCおよびmIPSCsは、眼窩下神経切断後1日目には大きく減弱し、その後も内側毛帯線維のリモデリングが生じる7日目まで減弱していた。即ちphasic inhibitionは神経損傷により術後1日目よりVPm細胞で低下した。興味深い事に、eIPSCと反対にGABAによるtonic inihibitionは手術後1日目から増強しており、多重支配を示した手術後7日目の細胞で特異的に増強していた。内側毛帯線維の多重支配は術後5日目から出現することから、それよりも早期に抑制性入力が劇的に変化していることになる。電荷量を計算すると、eIPSCの減弱よりもtonic inihibitionの増強による電荷量が大きいため、切断後の視床の細胞は過分極方向にシフトしていることが想定された。さらに、損傷後一週間目ではtonic inhibitionの増強は内側毛帯線維が多重支配を起こしている細胞で特異的にみられた。このことから、tonic inhibitionと多重支配の間には何らかの関係性があることが推測された。通常、体性感覚視床(VPM核)のVPM細胞は、生後初期に複数の求心性内側毛体線維によって支配されるが、生後21日目では生後発達に伴って1つのVPM細胞が1本の内側毛帯線維に支配されるようになる。申請者は、生後21日目において、マウスのひげからの体性感覚情報を伝達する眼窩下神経を切断すると、VPM細胞へ新たな内側毛帯線維が動員される再改編現象が起こることを明らかにしてきた。このような再改編現象の一方で、VPM細胞へ入力する抑制性GABAシナプスでは、神経切断後早期からシナプス部電流(phasic電流)の減少とシナプス外部電流(tonic電流)の増加が、興奮性内側毛帯線維の再改編に先立って誘導されることを見出した。さらに、シナプス外GABAA受容体作動薬のVPM核内持続処置では、新たに内側毛体線維が動員されることも明らかにした。これらの結果から、眼窩下神経の切断によるVPM細胞でのtonic電流の増強は、内側毛帯線維の再改編現象の引き金になる可能性が示唆される。現在、Cre-GFP発現レンチウイルスベクターを用いてVPM細胞上のシナプス外GABAA受容体を時期特異的にノックダウンさせ、眼窩下神経切断による内側毛帯線維の再改編への影響を解析している。本解析では、シナプス外GABAA受容体の必須構成サブユニットであるアルファ4サブユニットの遺伝子座にloxP配列を組み込んだトランスジェニックマウスを用い、生後14日目にVPM核へCre-GFP発現レンチウイルスベクターを処置して、シナプス外GABAA受容体を時期特異的にノックダウンさせてから、生後21日目での眼窩下神経切断を行っている。この解析において、我々は、眼窩下神経の切断前にシナプス外GABAA受容体のノックダウンを行うと、神経切断による内側毛帯線維の再改編現象が一部抑制される可能性を見出している。四肢切断、脊髄損傷などの求心性経路が遮断されると、その投射先である視床や体性感覚

野などの上位中枢において受容野の大きさが変化し、神経軸索走行が変化することから、上位中枢においても大規模な神経回路の書き換え(再編成)が生じると考えられている。こうした神経回路の再編成は、脳障害後の代償機能や、幻肢痛などの異常感覚にも深く関与すると考えられ、その機構の解明は、脳機能回復に向けた新たな治療・リハビリ法の開発に極めて重要である。これら求心性入力遮断後の急性期では上位中枢神経細胞自身の神経活動が変化することが示唆されている。例えば、末梢感覚神経損傷後に視床や大脳皮質で、GABA濃度が数分以内に減弱する事や、感覚神経損傷後の視床において、胎児型ナトリウムチャネル(Nav1.3)が発現し、視床の神経活動が亢進することが報告されている。このような急性期での活動性の変化は、受容野のUnmasking現象に関与すると考えられている。しかしながら、神経損傷による中枢神経系の活動性の変化が、その後に引き起こされるであろう神経回路自身の改編にどのような影響を与えているかについては明らかになっていない。この問題に対し、神経切断後の中枢神経系での抑制性・興奮性入力のバランス変化を明らかにし、最終的には神経活動性を操作することで、神経損傷後の中枢神経回路の改編における神経活動依存的な機構を調べる。具体的には、電気生理学的に求心線維のシナプス解析と入力様式の解析が可能な内側毛帯線維ー視床VPm核投射細胞シナプスを対象に、申請者がこれまでに明らかにした末梢感覚神経損傷による多重支配化現象に着目して研究を行う。神経損傷後、VPm細胞へのphasic inhibitionは損傷後1日目から低下していた。予想に反して、同じ時間経過でtonic inhibitionの増強現象を見いだした。また興味深いことに、この増強が神経損傷後の多重支配を示す細胞に特異的に観られることも観察されており、神経損傷によって先ずは抑制系が変化し、それにより内側毛帯線維が改編されることも示唆された。最終年度はウイルスベクターによる遺伝子導入法によって、抑制性(tonicとphasic inhibition)に外乱をかけることにより、内側毛帯線維の改編にどのような影響を与えるかを明らかにする予定である。これまでに申請者は、成獣マウスの眼窩下神経を切断すると、術後56日目から、記録したVPm細胞の約70%の細胞で、新規内側毛帯線維がシナプスを形成し、支配本数が24本に有意に増えることを電気生理学的に発見し(多重支配化現象)、J.Neurosci.2012に報告した。今年度は、多重支配線維が切断後56日目で出現することを受けて、多重化の誘導過程が切断後56日目の間で生じると推論し、この間のVPm細胞への興奮性と抑制性入力のシナプス解析を行った。その結果、抑制性入力(IPSC)は網様体核の最小刺激により得られるeIPSPも、自発のIPSC (sIPSC)も切断後1日目で減弱し7日目まで減弱は続く傾向にあった一方、興奮性入力は内側毛帯線維一本あたりのEPSCも自発のEPSCも多重支配が生じる手術後7日目前後ではじめて減弱していた。即ち、抑制性入力の減弱が興奮性入力の減弱より先行する傾向にあった。即ち、切断直後は抑制性の減弱により、視床細胞の興奮性が上昇すると考えられる。これらの興奮性の亢進が、多重支配の誘導にどのように関わるかを調べてゆきたい。
ミジンコの低酸素応答機構の解析

1オオミジンコにおけるHIF-1β機能解析と発現組織の特定オオミジンコHIF-1βの機能のを調べるために、オオミジンコHIF-1β(Dap HIF-1β)がHIF-1βを欠損した培養細胞の低酸素応答を相補できるか否かを調べた。DapHIF-1β発現プラスミドをマウス培養細胞Hepa c4に導入し、prolyl 4-hydroxylase(PH) α(I)の低酸素応答エレメントをエンハンサーとしてもつルシフェラーゼレポーター遺伝子の低酸素に応答した発現を調べた。その結果、低酸素に応答したルシフェラーゼ活性の増加が認められた。そのレポーター活性の増加は遺伝子上流の低酸素応答エレメントの配列(HRE)に依存しているか否かを調べるためにHRE内に変異を導入したルシフェラーゼレポーター遺伝子の低酸素に応答した発現を調べた。その結果、レポーター活性の上昇は認められず、低酸素応答エレメントの配列(HRE)に依存していることが示された。ミジンコHIF-1βに対する特異抗体を用いて、成体と胚の抗体染色を行った。成体については低酸素状態で飼育したものと通常酸素状態で飼育したものとを調べた。その結果、ミジンコ胚では、大額、小額、甲皮、殻腺、5つの胸脚、第2触角、正中線などの核に特異的な染色が認められた。この染色された組織のいくつかは、ショウジョウバエのHIF-1βhomologであるTgoと同様に、HIF-1βとヘテロ二量体をつくるbasic helix-loop helix(bHLH)因子が発現していると考えられる組織の核に特異的に存在していると考えられた。また、成体についても免疫染色を行い、鰓脚の一部であるエピポッドと呼ばれるヘモグロビンを生産している組織の核に局在することを明らかにした。しかし、このエピポッドの核染色は十分な酸素条件下および低酸素条件下で飼育したミジンコにおいて観察された。2ミジンコにおけるHIF-1αhomologの単離HIF-1のサブユニットであるHIF-1αについて、two-hybrid法を用いて、HIF-1αをコードするcDNAの単離を行なうため、ミジンコより調製したRNAを用いてtwo-hybrid用のライブラリーの作製をい、GAL4 binding domainnとHIF-1βのbHLHの融合遺伝子により、スクリーニングを行った。その結果、他の生物のHIF-1αと高い相同性を示すクローンを単離することに成功した。(オオミジンコHIF-1βに対する特異抗体の作製)大腸菌のpET発現ベクターを用いて、オオミジンコHIF-1βと他の生物のHIF-1βとの相同性の少ないC末端側部分231残基をHisタグをもち、チオレドキシンと融合したタンパクとして生産させ、Hisタグに対するアフィニティーカラムにより精製した。Hisタグとチオレドキシンをエンテロキナーゼにより除いたHIF-1βのc末部分を用いてラットを免疫し、オオミジンコHIF-1βに対する特異抗体を作製した。今後、酸素濃度の変化に依存したHIF-1β遺伝子の発現量についての解析やミジンコ胚及びミジンコ成体における発現部位の同定等を行っていく予定である。(新規ヘモグロビン鎖遺伝子の単離)新規ヘモグロビン鎖遺伝子の単離を行うために、ミジンコより染色体DNA断片を分離し、λファージベクターを用いて、染色体DNAライブラリーを作製した。このライブラリーを用いて、これまでにクローン化した3つのヘモグロビン鎖遺伝子の遺伝子間配列をDNAプローブとして、まだ得られていない遺伝子を含む染色体DNA断片を複数単離した。その全塩基配列を決定し、クラスター構成を明らかにした。その結果、既知のクラスターの3'側には新たな遺伝子は確認できなかったが、5'側には3個の新規ヘモグロビン鎖遺伝子の存在が明らかとなった。これより、ミジンコ染色体上には、約20kbに渡り6個のヘモグロビン遺伝子が同一方向に並んで存在することが明らかとなり、いずれのヘモグロビン遺伝子の上流にも、HIF-1の結合配列と相同な配列が複数存在した。しかしながら、ヘモグロビン中には今回得られた以外にもサブユニット鎖が存在することから、さらに大きなクラスター構造をとっている可能性が考えられることから、現在も染色体歩行を行っている。

成体については低酸素状態で飼育したものと通常酸素状態で飼育したものとを調べた。その結果、ミジンコ胚では、大額、小額、甲皮、殻腺、5つの胸脚、第2触角、正中線などの核に特異的な染色が認められた。この染色された組織のいくつかは、ショウジョウバエのHIF-1βhomologであるTgoと同様に、HIF-1βとヘテロ二量体をつくるbasic helix-loop helix(bHLH)因子が発現していると考えられる組織の核に特異的に存在していると考えられた。また、成体についても免疫染色を行い、鰓脚の一部であるエピポッドと呼ばれるヘモグロビンを生産している組織の核に局在することを明らかにした。しかし、このエピポッドの核染色は十分な酸素条件下および低酸素条件下で飼育したミジンコにおいて観察された。2ミジンコにおけるHIF-1αhomologの単離HIF-1のサブユニットであるHIF-1αについて、two-hybrid法を用いて、HIF-1αをコードするcDNAの単離を行なうため、ミジンコより調製したRNAを用いてtwo-hybrid用のライブラリーの作製をい、GAL4 binding domainnとHIF-1βのbHLHの融合遺伝子により、スクリーニングを行った。その結果、他の生物のHIF-1αと高い相同性を示すクローンを単離することに成功した。
アポトーシスにおけるスプライシング制御

アポトーシスと選択的スプライシング制御機構との関連を検索するために、アポトーシス誘導に応じたアポトーシス関連遺伝子のアイソフォーム発現パターンの変化、及びそれに附随したスプライシング制御システムの変化、とりわけRNAポリメラーゼII(PolII)最大サブユニットC-末端領域(CTD)のリン酸化状態の変化を解析した。HeLa及び293Tヒト培養細胞に、アポトーシス誘導刺激としてエトポシド添加またはUV照射処理を行い、それに附随した複数のスプライシングバリアントを持つことが知られているアポトーシス関連遺伝子(Bcl-x、Caspase 2、Caspase 9、Mcl-1、Apaf-1)のアイソフォーム発現パターンの変化をRT-PCRにより経時的に解析した。同時に、CTDのリン酸化状態の変動を、部位特異的なリン酸化を認識するモノクローナル抗体を用いウエスタンブロットによって検出した。更にスプライシング因子及びCTDをリン酸化することが報告されているMAPKの発現の変化をウエスタンブロットによって検討した。調べたアポトーシス関連遺伝子のアイソフォーム発現パターンは、今回検討したアポトーシス誘導刺激によっては大きな変動を示さなかった。一方ある線量以上の紫外線照射によってCTDリン酸化の量的・質的変動が観察され、更にPolII最大サブユニットの選択的な分解が観察された。一方エトポシド処理によってはPolIIの特異的分解は観察されなかった。現在、アポトーシス誘導時にApaf-1遺伝子のプロモーター近傍及び選択的スプライシングを受けるエクソン近傍で転写/プロセシングに関与している因子及びCTDのリン酸化状態の変化を、クロマチン免疫沈降法(ChIP)によって検索している。
時系列とその関連領域における推測理論の研究

昭和61年度においては,上記研究課題名のもとに研究分担者が中心になって分担課題に関連した10の研究会(シンポジウム)を開催し,日本数学会の統計数学分科会や他の関連分科会の多くの会員および広く他の分野の研究者の参加も得て,活発で実り多い研究を進めることができた.昭和62年度においては,これらの研究会で発表された研究成課にその後に得られた研究成果も加えて,各分担課題ごとに分担者を中心にとりまとめを行い,研究成果報告書を作成した.報告書の各章の題目と分担した分担者名は次のとおりである.1章:ノンスタンダードアナリシスの応用(釜江哲朗)2章:中心極限定理(伊藤俊次・高橋陽一郎)3章:情報理論とその周辺(井原俊輔)4章:Diophantos近似とGeodesic flow(伊藤俊次・高橋陽一郎)5章:数理物理学における確率論の問題(志賀徳造)6章:工学データにおける推定法の研究(岩瀬晃盛・間瀬茂)7章:パラメトリックモデルの推定と検定(赤平昌文・稲垣宣生)8章:推定量を中心に統計量の諸性質の研究(平安名常儀)9章:相関構造をもつデータのモデル分析(小西貞則)10章:動的システムの数理とその応用(岩本誠一)時系列の確率論的研究や数理統計学的研究,およびこれらと深いかかわりを持つ関連領域において10のサブテーマを定め,各サブテーマについて研究分担者を中心にして日本数学学会統計数学分科会会員およびその周辺領域の研究者の協力を得て研究グループをつくり,研究集会を開催し,そこで発表された研究成果をまとめたものである.いくつかの共通の問題について異なった分野の研究者が意見を交換し,研究を発展させたのが特徴である.各章の題名(サブテーマ)と内容は次のとおりである.1.ノンスタンダードアナリシスの応用:フーリエ解析や特異摂動等の結果を示す.2.中心極限定理:混合型中心極限定理や力学系の中心極限定理等に関するいくつかの結果を示す. 3.情報理論とその周辺:エントロピーとlarge deviation,時系列の情報と微分幾何等に関する結果を示す.4.Diophanyos近似とGeodesic flow:エルゴード理論から見たDiophantos近似,測地流に関する結果等を示す.5.数理物理学における確率論の問題:パーコレーション理論やIsing理論等に関するいくつかの結果等を示す. 6.工学データにおける推定法の研究:交通流の問題等において必要となる推定問題の提起等. 7.パラメトリックモデルの推定と検定:高次の漸近理論等に関するいくつかの結果を示す. 8.推定量を中心に統計量の書性質の研究:標本変動係数や極値統計量の分布等に関するいくつかの結果を示す. 9.相関構造をもつデータのモデル分析:因子分析におけるベイズ的接近法の有効性等いくつかの結果を示す.10.動的システムの数理とその応用:順序配分過程の逆理論やマルコフ決定過程に関するいくつかの結果等を示す.昭和61年度においては,上記研究課題名のもとに研究分担者が中心になって分担課題に関連した10の研究会(シンポジウム)を開催し,日本数学会の統計数学分科会や他の関連分科会の多くの会員および広く他の分野の研究者の参加も得て,活発で実り多い研究を進めることができた.昭和62年度においては,これらの研究会で発表された研究成課にその後に得られた研究成果も加えて,各分担課題ごとに分担者を中心にとりまとめを行い,研究成果報告書を作成した.報告書の各章の題目と分担した分担者名は次のとおりである.1章:ノンスタンダードアナリシスの応用(釜江哲朗)2章:中心極限定理(伊藤俊次・高橋陽一郎)3章:情報理論とその周辺(井原俊輔)4章:Diophantos近似とGeodesic flow(伊藤俊次・高橋陽一郎)5章:数理物理学における確率論の問題(志賀徳造)6章:工学データにおける推定法の研究(岩瀬晃盛・間瀬茂)7章:パラメトリックモデルの推定と検定(赤平昌文・稲垣宣生)8章:推定量を中心に統計量の諸性質の研究(平安名常儀)9章:相関構造をもつデータのモデル分析(小西貞則)10章:動的システムの数理とその応用(岩本誠一)上記研究課題名のもとに、研究分担者が中心になって分担課題に関連した10の研究会(シンポジウム)を開催し、日本数学会の統計数学分科会やその他の関連分科会の会員でその課題に関連したテーマについて現在研究を進めている研究者を広く招き、活発で実り多い研究を進めることが出来た。その中の代表的なものを記すと次のようである。赤平を中心とした「パラメトリックモデルの推定と検定」研究会では、現在注目されている推定や検定の方法の良さを標本数との関係でより精密に論ずることなどが議論され、今後の方向の意見交換等を行った。平安名は「推定量を中心に統計量の諸性質」研究会を開催し、時系列解析で問題になる統計量の分布や、今まで末解決であった情報量基準に関する分布等を調べる試み、混合分布に関するより一般的な推定法の提案等が行われた。小西は「相関構造をもつデータのモデル分析」研究会を開催し、因子分析に関する新しい観点に立った解析法の提案や、種々の統計量の確率分布を求めるために標本数が大きいときに漸近展開で近似することが用いられるが、その近似誤差の評価等の新しい結果が示された。井原の「情報理論とその周辺」

研究会においては、時系列における種々の解析の情報理論的接近の試みや、確率論や数理統計学における種々の概念の情報理論的取扱い方法の提案がなされ、異なった立場や分野の研究者間の意見交換を行い、より広い立場での研究の推進をはかることが出来た。釜江は確率論や数理統計学において、その理論展開の道具として最近注目されている「ノンスタンダードアナリシス」の応用の研究会を開催し、その応用の可能性を関数方程式や代数等種々の立場から検討を行い、意見交換を行って今後の研究に役立てるための材料とすることが出来た。その他にも多くの研究会が開催され、総括や今後の研究活動の打合わせも行われた。次年度にこれらの研究の報告書を作成する予定である。
アルミニウムイオンそのものの植物根の細胞機能に及ぼす影響 蛍光プローブを用いた細胞の生理状態のin situ解析

アルミニウムストレスは酸性土壌における作物生育阻害の第一要因であるとされていて、水耕栽培系におけるアルミニウムイオンストレスの再現実験が多く行われてきた。しかし、その大部分においては、アルミニウムイオンの形態を毒性の強いAl^<3+>に保つためにpH4付近の低pH領域で行われている。しかしこのような条件で植物根の生育は低pHのみによっても阻害をうけることが確かめられており、必ずしもアルミニウムイオンそのものの影響を正しく評価できていなかった。そこで、本研究では、低pHの影響を排することのできるpH5.0においてアルミニウムイオンストレスをアルファルファ根に与え、伸長阻害および根の細胞の生理的機能に与える影響をin situで観察した。根の細胞のviabilityを蛍光色素FDA(fluorescein diacetate)の分解活性として検出し、蛍光顕微鏡による観察を行ったところ、低pHでは数時間で消失したのに対し、アルミニウムイオンストレスの場合は、短時間で伸長阻害が起こっても、長時間にわたって保持されていることがわかった。また細胞内カルシウムイオン濃度のFura-2を用いたin situ検出を試みたが、アルミニウムイオンストレスにともなう顕著な変化は認められなかった。これらの結果より、アルミニウムストレスによる根の伸長阻害は、細胞全体の構造的破壊や機能の喪失によってではなく、細胞のとくに伸長にかかわる部分、たとえば細胞壁のゆるみや組み替え、de novo合成の過程に生じた障害によって起こる可能性が示された。
対話型CG映像メディア提示システムと映像コンテンツの制作技法の研究

操作者と対話が可能なリアルタイム3D-CGアニメーションを再生する新たな映像メディア提示システムと、その映像コンテンツを制作するためのシナリオ型記述言語を開発した。この技術を利用した2種類の教育システムを開発した。ひとつは、小中学校における理科の対話型映像教材の開発である。規模が大きすぎて目に見えない題材(宇宙や気象)や本質的に見えない題材(電気と磁気や化学反応)を3D-CG技術で可視化して提示する映像教材コンテンツの開発に成功した。実際に小中学校で実験授業を3回行い成果を確認した。また映像をシナリオ記述言語で簡単に制作できる利点を生かして、非専門家でも短時間で3D-CGアニメーションを用いたプレゼンテーション映像を制作できる映像制作キットの開発も行った。実際に、高等学校の1年生を対象に3年間(3回)の映像創作実験授業を行い、その成果を確認した。これらの成果は、IEEE主催の国際会議等で精力的に報告した。
血液脳関門における薬剤排出輸送系の生理的意義

薬物の脳への移行性は血液脳関門の働きによって制御されているが、その機構については不明な点が多い。特に、近年発見されたP-糖蛋白などの排出輸送系が血液脳関門(BBB)で生理的にどのような働きをしているかほとんど解明されていない。そこで、本研究はBBBの排出輸送系の多様性とその生理的意義を特に機能の観点から解明することを目的とした。以下の点を解明した。1.血液脳関門(BBB)には胆汁酸を排出する輸送系が働き、血液中のタウロコール酸やコール酸などの胆汁酸の脳への移行性を顕著に制限していること。その輸送系は、既に報告したBBBのパラアミノ馬尿酸(PAH)排出輸送系とは異なること。2.胆汁分泌されるアニオン型環状へプチド性薬剤BQ-123は、BBBから担体輸送系で排出されること。この輸送系は胆汁酸輸送系とは異なること。3.脳内ステロイドであるデヒドロエビアンドロステロンの硫酸抱合体(DHEAS)は、BBBから未変化体として担体輸送系で排出されること。4. L-cystineを取り込みL-glutamic acidを排出するsystem Xc-がdiethylmaleateによってBBBに誘導されること。以下の点を解明した。
メタルダスティングを利用した新製錬法の開発

メタルダスティングを利用した炭化鉄(セメンタイト)からの微細な還元鉄粉末の製造のための基礎研究として、高温域(750°C以上)での分解挙動および低温域(750°C以下)での分解実験を行い、天然鉱石への応用、流動層の利用について調べた結果、以下の知見を得た。(1)試薬ヘマタイトから、750°C、H_2-30vol%CH_4で作成したセメンタイト粉末を550°C650°C、900°CにてH_2-30vol%CH_4混合ガス中で保持する実験結果から、低温域では650°Cが最も分解速度が大きく、900°Cとほぼ同じであることが分かった。さらに、650°Cでは、分解までに析出する過剰炭素量が900°Cの約1/5倍と少なく、鉄粉と炭素の除去に適していた。(2)250600μmの天然鉱石粒を用いて(1)と同様の実験を行った結果、試薬ヘマタイトと同様の結果が得られた。したがって、天然鉱石を用いてもメタルダスティングが可能であることが分かった。(3)(2)で得られた試料を900°C、CO-20vol%CO_2で保持して炭素をガス化除去した。650°Cで分解させた試料は過剰炭素が少ないため除去にかかる時間が短く、さらに実験後のSEM観察でも、900°Cで分解させた試料に比べて焼結していないことが分かった。(4)(2)、(3)と同様の実験を、分解段階及び炭素除去について流動層を用いて行った結果、分解段階に流動層を用いると試料のスティッキングが発生し焼結が進んでいた。炭素除去段階にのみ流動層を用いると、650°Cで分解させた試料はかなり焼結を防ぐことができた。また、分解後試料を物理粉砕することで、特に650°Cで分解させた試料ではさらに炭素除去時の焼結を防ぐことができることが分かった。炭化鉄の分解過程を利用した高純度で微細な鉄粉を効率的に回収するための基礎実験として、酸化鉄ペレットを用いて炭化鉄の生成と分解過程に及ぼす温度の影響について調べた。反応ガスはH_2/CH_4(70/30)系ガスを用い,温度範囲は700-1000°Cである。700-750°Cでは、還元及び炭化はペレットの外側からトポケミカルに進行し、生成した炭化鉄も約3時間は分解せず比較的安定に存在した。800°Cでは還元はトポケミカルに進行するが,炭化鉄はペレット表面と内部の2ヵ所から生成し共に内部に広がって行き,最終的にはペレット全体が炭化鉄となる。分解はペレット内部から外側に進み、それにつれてペレットも膨張する。900-1000°Cでの炭化鉄の生成はペレット内部から生じるが生成量は少なく,分解は内部から外側に進行する。特に900°Cで炭化鉄の分解と粉化が顕著で、最終的にはペレット全体が崩壊する。以上のように炭化鉄の生成と分解過程は反応温度によって大きく異なっている。8001000°Cの場合にみられる炭化鉄がペレット内部から生成するという特異な現象もペレット半径方向の炭素濃度分布の測定とペレット構成粒子のSEM観察から説明することができた。これまでのところ本研究の目的にかなう反応温度は炭化鉄の生成と分解が比較的速やかに進行する900°C前後の反応温度が適していると推定された。

今後の課題としては、より効果的に微細鉄粉を回収するために分解速度を損なうことなく過剰の炭素析出を抑制する方法を見つけることにある。メタルダスティングを利用した炭化鉄(セメンタイト)からの微細な還元鉄粉末の製造のための基礎研究として、セメンタイト分解の最適条件を調べ、さらに、セメンタイト分解で生成する鉄粉と炭素の分離条件を調べた結果、以下のことが分かった。(1)セメンタイト化の段階とセメンタイトの分解の段階を同じ温度およびガス組成で一貫して行った実験結果から、メタルダスティングには900°C、H_2/CH_4=70/30あるいはH_2/CH_4=80/20で120分反応させる条件が最適であることが分かった。(2)セメンタイトの安定生成条件である750°C、H_2/CH_4=70/30でセメンタイトを生成させたのち、種々の組成のH_2-CH_4気流中で900°Cまで昇温させ、セメンタイトの分解に及ぼすガス組成の影響を調査した結果、メタルダスティングにはH_2/CH_4=70/30あるいはH_2/CH_4=80/20で120分反応させる条件が最適であることが分かった。(3)(1)の条件で、天然鉱石を用いてセメンタイトの生成・分解実験を行った結果、緻密質で粒径の大きい(250300μm)天然鉱石ほどセメンタイトの分解が起こりやすいことが分かった。(4)炭素除去法として、磁力選鉱法、液中分離法(エタノール、オレイン酸-n-ブチル)、CO-CO_2雰囲気における炭素のガス化除去法の3通りの方法を検討した結果、CO-CO_2雰囲気における炭素のガス化除去が最適であり、90%以上の炭素除去が可能であった。また、この方法ではセメンタイト分解で生成した鉄粉の焼結を避けるために、短時間で反応の終わる高温(900°C)の条件で行なう必要がある。メタルダスティングを利用した炭化鉄(セメンタイト)からの微細な還元鉄粉末の製造のための基礎研究として、昨年度は主に高温域(750°C以上)での分解挙動を調査した。本年度は低温域(750°C以下)での分解実験を行い、天然鉱石への応用、流動層の利用について調べた結果、以下の知見を得た。(1)試薬ヘマタイトから、750°C、H_2-30vol%CH_4で作成したセメンタイト粉末を550°C650°C、900°CにてH_2-30vol%CH_4混合ガス中で保持する実験結果から、低温域では650°Cが最も分解速度が大きく、900°Cとほぼ同じであることが分かった。さらに、650°Cでは、分解までに析出する過剰炭素量が900°Cの約1/5倍と少なく、鉄粉と炭素の除去に適していた。(2)250600μmの天然鉱石粒を用いて(1)と同様の実験を行った結果、試薬ヘマタイトと同様の結果が得られた。したがって、天然鉱石を用いてもメタルダスティングが可能であることが分かった。(3)(2)で得られた試料を900°C、CO-20vol%CO_2で保持して炭素をガス化除去した。650°Cで分解させた試料は過剰炭素が少ないため除去にかかる時間が短く、さらに実験後のSEM観察でも、900°Cで分解させた試料に比べて焼結していないことが分かった。(4)(2)、(3)と同様の実験を、分解段階及び炭素除去について流動層を用いて行った結果、分解段階に流動層を用いると試料のスティッキングが発生し焼結が進んでいた。炭素除去段階にのみ流動層を用いると、650°Cで分解させた試料はかなり焼結を防ぐことができた。また、分解後試料を物理粉砕することで、特に650°Cで分解させた試料ではさらに炭素除去時の焼結を防ぐことができることが分かった。
免疫抑制剤による白質脳症発症に関わるビリルビン・サイトカインの影響に関する研究

無処置ラットではタクロリムス投与により濃度依存性のTACの脳内移行性を認めることが示唆された。また、タクロリムスの神経症状発症の脳内タクロリムス濃度の閾値は870ng/gと推察された。血中タクロリムス血中濃度と脳内濃度は有意に相関関係を示した(p<0.001)。神経症状を発症するタクロリムス血中濃度は28.6ng/mLと推察された。急性/劇症型肝炎ラットモデルを用いて高ビリルビン血症モデルラットを作成した。血清ビリルビン値、タクロリムス投与量、および脳内濃度、血中濃度を測定した。血清ビリルビン値の上昇に伴い、血液脳関門が破綻し、低濃度のタクロリムスが脳内移行することが明らかになった。肝移植後、免疫抑制剤であるCalcineurin-inhibitor (CNI)に関連した中枢神経障害を発症した症例を臨床検討した結果、移植後早期の遷延する高ビリルビン血症が危険因子として考えられた。これらの臨床結果を動物実験モデルで確証するために、高ビリルビン血症と血中CNI濃度の関係について動物実験で確証することが本研究の主題である。実験初年度はCNIとしてタクロリムス(Tac)を使用した。無処置ラットにおけるTacが脳内に移行開始する血中TAC濃度を検討し、脳内移行するまでのTAC総投与量を算出した。初年度は、ラットに中心静脈ルート確保する予備実験が必要であったが以下の知見を得た。Tacをラットに以下の用量群(N=5)で持続静注し、0.10mg/kg/day、0.25mg/kg/day群、0.5mg/kg/day、1.0mg/kg/day、1.5mg/kg/dayでは静注後7日目の血中濃度と脳内血中濃度はそれぞれ、血中濃度は7.2±0.5、11.2±1.2、15.5±1.5、30.1±4.2、41.1±7.2 ng/mL、脳内血中濃度は20.2±6.5、43.2±7.9、85.5±14.5、187.16±34.2、221.1±47.5ng/gであった。剖検までの神経症状の有無、程度についてスコア化(2回/日)し検討する。症状なし(0点)振戦(1-2点)、自傷行為(3-4点)、痙攣(5-6点)、呼吸抑制(7点)として平均値を算出した。0.10mg/kg/day群、0.25mg/kg/day群、0.5mg/kg/day、1.0mg/kg/day、1.5mg/kg/dayでそれぞれ、0点、0点、3.6点、3.9点、5.7点であった。免疫抑制剤であるカルシニューリン阻害剤(Calcineurin-inhibitor,CNI)による中枢神経障害を認めた肝移植症例について臨床検討した結果、移植後早期の遷延する高ビリルビン血症、CNI投与量、移植時年齢が危険因子として考えられた。この結果より、CNIによる中枢神経障害発症の機序のひとつとして、高ビリルビン血症あるいはビリルビン上昇に随伴する高サイトカイン血症に伴う血液脳関門機能障害によるCNIの脳内移行が示唆された。動物実験・培養細胞モデルにて、高ビリルビン血症あるいは高サイトカイン血症に伴う血液脳関門の破綻に伴うCNIの脳内移行性について生物学的研究をおこない、実際の臨床結果を検証することが本研究の主題である。CNIによる中枢神経障害はCNIの血中濃度に関わらず発症する。その機序はCNIの脳内移行による中枢神経細胞障害と考えられているが、CNIは通常の治療域の血中濃度では脳内に移行しない。本研究では臨床結果より血清ビリルビン値に着目し、CNIによる中枢神経障害の機序のひとつとして、動物実験モデルで血清ビリルビン値の上昇に伴った高サイトカイン血症の状態では低濃度CNIが脳内に移行しやすくなることを生物学的に明らかにする点で独創的であると考えられる。本研究にてCNIの中枢神経障害の機序のひとつを明らかにすることにより、肝移植をふくめた臓器移植後、高ビリルビン血症を伴う高サイトカイン血症が遷延する場合、学童期症例ではCNI投与を一時休薬し、代替免疫抑制剤(抗CD25抗体、mTOR阻害剤等)を用いて免疫抑制療法をおこなうことにより、CNIによる白質脳症による中枢神経障害の発症を回避できる可能性が期待され、移植後のQOLを高めることが可能になる。4ー5週齢Winsterラットをもちいて以下の実験を行った。吸入麻酔下にて内頸静脈よりシリコンチューブを留置しハーネスで固定し静注ラインとして使用し飼育する。実験動物に痙攣を伴う呼吸抑制を認めた場合、エンドポイントとして安楽死させた。実験1)正常ビリルビン群では無処置ラットにおいてタクロリムス(TAC)が脳内に移行開始する血中TAC濃度、投与量についてTAC総投与量を算出した。実験2)混合型高ビリルビン群ではガラクトサミンを腹腔内に投与した急性肝不全モデルラットを用いてTACが脳内に移行開始する血中TAC濃度、投与量についてTAC総投与量を算出した。ガラクトサミンは投与量を1500mg/kg、1000mg/kg、500mg/kgとした3群間を設定した。

実験3)間接型高ビリルビン群ではビリルビン溶解液(3.2 mg/mL)を持続静注したラットを用いてTACが脳内に移行開始する血中TAC濃度、投与量についてTAC総投与量を算出した。ビリルビン溶解液は投与量を30mg/kg、20mg/kg、10mg/kgとした3群間を設定した。免疫抑制剤のひとつであるカルシニューリン阻害剤(CNI)の登場により、移植成績は飛躍的に向上した。しかし、免疫抑制療法の中心的な役割を担うCNI製剤による副作用、とりわけ中枢神経毒性は移植患者の生活と質を著しく低下させる。臨床症状は、手指の振戦から白質脳症に伴う痙攣や視野障害、意識障害を呈し、移植後1ヶ月以内の早期に発症する。1991年より当科において肝臓移植後、CNIによる白質脳症と診断された症例は、CNIで導入した160例中11例(6.9%)であった。白質脳症と診断された11例は、移植時年齢が8歳より15歳に集中していた。18歳未満の症例(N=79)中、白質脳症と診断された患児では、移植後3週以内に発症し、移植後早期の血清総ビリルビン値が高く遷延し、TAC血中濃度は同等あるいは低いにもかかわらず、体重で換算したTAC総投与量が少ないことが明らかになった。多変量解析では、年齢が8ー15歳、移植後平均血清ビリルビン値が7 mg/dL以上であることが危険因子と考えられた。他施設では、CNIによる中枢神経障害の発症が移植臓器別では肝臓が最も多く、心臓、腎臓あるいは膵臓では少なく、肺移植では重症感染等による敗血症を合併した子供の発症率が高いと報告されている。幼児・小児は脳の大部分において血液脳関門が未発達であり、その機能が不十分である。これらの報告を考慮し、肝移植後早期のサイトカイン血症あるいは肝機能低下に伴う高ビリルビン血症がCNIの脳内移行に何らかの影響を及ぼし、低濃度のCNIが脳内に移行し中枢神経障害(白質脳症)が発症している可能性が示唆された。以上より、学童期の肝移植においては、移植後遷延する高ビリルビン血症あるいは随伴する高サイトカイン血症がCNIによる中枢神経障害の発症の初期過程に関与していることが示唆され本研究の発想に至った。無処置ラットではタクロリムス投与により濃度依存性のTACの脳内移行性を認めることが示唆された。また、タクロリムスの神経症状発症の脳内タクロリムス濃度の閾値は870ng/gと推察された。血中タクロリムス血中濃度と脳内濃度は有意に相関関係を示した(p<0.001)。神経症状を発症するタクロリムス血中濃度は28.6ng/mLと推察された。急性/劇症型肝炎ラットモデルを用いて高ビリルビン血症モデルラットを作成した。血清ビリルビン値、タクロリムス投与量、および脳内濃度、血中濃度を測定した。血清ビリルビン値の上昇に伴い、血液脳関門が破綻し、低濃度のタクロリムスが脳内移行することが明らかになった。ラットに対する中心静脈ルートの確保するための外科的技術を確立することができ、タクロリムス血中濃度と脳内移行が濃度依存性にあることが明らかになったため、今後の実験結果を明らかにするうえで有用な結果であったと考えられた。ガラクトサミン誘発性急性肝不全モデルラットにおいてタクロリムスの脳内移行性と血中直接ビリルビン値との関連が認められたことから、さらに例数を多く検証することより相互関係について検討する。Cecchelliらの方法(Advanced Drug Delivery Reviews,36:165,1999)を参照し、セルカルチャーインサートのメンブレン上に脳微小血管内皮細胞(Human cerebromicrovascular endothelial cell)の単層膜を形成し、in vitro血液脳関門実験モデルを構築する方法を用いる。