hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GFPを用いたFRETによる神経系細胞内における転写因子間相互作用の追跡

ステロイドホルモンが神経系細胞の発生、分化、機能発現に際して様々な影響を及ぼすことが知られている。こうした作用の大部分は、転写制御因子であるステロイドホルモンレセプターを介した遺伝子発現制御に基づく。リガンド結合したステロイドホルモンレセブターは通常ホモダイマーを形成して基本転写装置とともに巨大な複合体を染色体上に構築するが、この際ステロイドホルモンレセプターと基本転写装置との間を介在するいわゆる転写共役因子(cofactor)の存在が必須であることがわかってきた。神経系におけるステロイドホルモン作用の解明にはステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子の相互作用の機構ならび゙に異なるステロイドホルモンレセプター間のヘテロダイマー形成の可能性を検索するとともに、その作用発現の場を調節する機構を細胞種特異的にダイナミックに検索していく必要がある。こうした蛋白-蛋白相互作用の解析に、近年two hybrid systemが用いられているが、疑陽性例が非常に多いなど未だ課題が山積している。本研究は、ステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子、あるいは異なるステロイドホルモンレセプター同士がリガンドの添加や様々な細胞外環境の変化に対して細胞内でどのような相互作用を示すのかを、蛍光のエネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer;FRET)を利用して生細胞内でリアルタイムにイメージングして解析する系の確立を目的とした。Estrogen receptor(ER)αをCFPで、転写共役因子のSBC-1(steroid receptor coactivator1)をYFPでそれぞれ標識し、あるいはERαおよびEBβをそれぞれCFPおよびYFPで標識し、COS細胞に共発現させ、種々の薬剤を投与してその相互作用をFRETにて解析した。FRET用あるいはdonor用の蛍光フィルターセットを用いて画像を取り込み、background処理を行った後、下記の式に従って蛍光強度の比をを求め、さらにGordonらの方法(Biophys J.74:2702-13(1998))により補正してFRET値を求めた。その結果、ERα-CFPとSBC-1-YFPとを共発現させた場合およびERα-CFPとERβ-YFPとを共発現させた場合、アゴニストの17-β-estradiolを投与後15-30分後において、対照のcorticosteroneの場合と比較してFRET値の上昇を認めた。今後は、その他のステロイドレセプターとSRC-1との相互作用なども含めて、初代培養神経細胞を用いて観察を進める予定である。さらに、FRETのみならず、FCCS(fluorescence cross correlation spectrography)のような新しい技術も取り入れてsingle cellかつreal timeで神経系における転写因子相互作用を解析していきたいと考える。こうした作用の大部分は、zinc-fingerモチーフを有する転写因子であるステロイドホルモンレセプターを介した遺伝子発現制御に基づく。リガンド結合したステロイドホルモンレセプターは、通常ホモダイマーを形成して基本転写装置とともに巨大な複合体を染色体上に構築するが、この際、ステロイドホルモンレセプターと基本転写装置との間を介在するいわゆる共役転写因子(cofactor)の存在が必須であることがわかってきた。初年度は、ステロイドレセプターと共役転写因子との相互作用ならびに異なるステロイドレセプター間のへテロダイマー形成の可能性を蛍光のエネルギー移動(fluorescent energy transfer(FRET))により解析するための基礎的検討を行った。グルココルチコイドレセプター(GR)およびミネラルコルチコイトドセプター(MR)と各々異なる色の蛍光を発する改変型GFPのcyan fluorescent protein(CFP)およびyellow fluorescent protein(YFP)との融合蛋白を培養細胞に共発現させ、共通のリガンドであるコルチコステロン(CORT)のレセプターの核_細胞質間輸送に対する影響をみた。核内移行速度は内因性のレセプターをもたないCOS細胞ではCORTに対する親和性の差を反映していたが、内因性のGRおよびMRが共発現する海馬の培養神経細胞ではCORTに対する親和性を反映した核移行速度の差は認められず、異なる核輸送の機構が存在する可能性が示唆された。また、GRとCFPおよび共役転写因子のsteroid receptor cofactor-1(SRC-1)とYFPの融合蛋白を同一細胞に共発現させ、その動態をリアルタイムに解析した。SRC-1はリガンドの存在の有無にかかわらず核内に局在するが、その存在様式はリガンドの添加によりGRが核内に移行する前後で、ドット状の分布から網状の分布へと変化することが観察され、核内においてGRと挙動を共にするように分布状態が変化することが示唆された。

本研究は、ステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子、あるいは異なるステロイドホルモンレセプター同士がリガンドの添加や様々な細胞外環境の変化に対して細胞内でどのような相互作用を示すのかを、蛍光のエネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer;FRET)を利用して生細胞内でリアルタイムにイメージングして解析する系の確立を目的とした。Estrogen receptor(ER)αをCFPで、転写共役因子のSBC-1(steroid receptor coactivator1)をYFPでそれぞれ標識し、あるいはERαおよびEBβをそれぞれCFPおよびYFPで標識し、COS細胞に共発現させ、種々の薬剤を投与してその相互作用をFRETにて解析した。FRET用あるいはdonor用の蛍光フィルターセットを用いて画像を取り込み、background処理を行った後、下記の式に従って蛍光強度の比をを求め、さらにGordonらの方法(Biophys J.74:2702-13(1998))により補正してFRET値を求めた。その結果、ERα-CFPとSBC-1-YFPとを共発現させた場合およびERα-CFPとERβ-YFPとを共発現させた場合、アゴニストの17-β-estradiolを投与後15-30分後において、対照のcorticosteroneの場合と比較してFRET値の上昇を認めた。今後は、その他のステロイドレセプターとSRC-1との相互作用なども含めて、初代培養神経細胞を用いて観察を進める予定である。さらに、FRETのみならず、FCCS(fluorescence cross correlation spectrography)のような新しい技術も取り入れてsingle cellかつreal timeで神経系における転写因子相互作用を解析していきたいと考える。
低酸素（高地）トレーニングの効果を高める至適条件に関する研究

本研究は低酸素(高地)トレーニングの効果を高める至適条件を検討するために運動時の酸素飽和度に着目して幾つかのトレーニング実験を行った。高度や運動強度に関わらず運動中の酸素飽和度を90%以下になるように負荷強度を設定し、1回30分間、一定期間(週2回、4週間)の自転車駆動トレーニング実施によって、有意な持久能力の向上が認められた。したがって低酸素環境における持久能力のトレーニング効果を高める条件としては酸素飽和度が90%以下の水準になるような負荷強度を選択することが重要であるといえよう。常酸素と低酸素環境3条件における各環境下で運動を行った際の酸素飽和度等から、環境(酸素濃度%)と運動負荷と生理的指標の相互関係について明らかにし、酸素飽和度85%とした時の運動強度を求め、この方法で求めた運動強度の妥当性を検証することを目的とした。対象者は健常な男子学生10名とした。常圧低酸素環境(標高1500m、2500m、3200m相当)となる低酸素テントを用いて、自転車エルゴメーターを用いた運動を常酸素環境含めた4条件下で多段階漸増負荷試験を行い、各生理学的指標を測定した。運動継続時間の平均値は、常酸素、標高1500m、2500m、3200m相当の低酸素環境下4条件の順に9.7(±0.9)分、9.5(±0.8)分、9.2(±0.9)分、8.9(±1.0)分であり、標高3200m相当の環境下の方が常酸素環境下よりも有意(p<0.01)に短い値を示した。最大酸素摂取量(VO2max)及びオールアウト時のSpO2の平均値は常酸素>1500m>2500m>3200m相当の環境下の順で大きく、4条件間でそれぞれ有意(p<0.001)な差が認められた。以上の結果をもとに、対象者の標高2500m、3200m相当の低酸素環境下2条件におけるSpO2の値が85%に達する運動負荷(watt)を求め、上限30分の自転車駆動を行わせたところ、両条件ともに10名中8名がSpO2を85%75%に保ちトレーニングを遂行することができたが、2名は途中で中止した。トレーニング中の%VO2maxの平均値は、標高3200m相当の低酸素環境下の値(43.1±3.9%)の方が標高2500m相当の値(74.5±10.1%)よりも有意(p<0.001)に低い値を示した。今後は目標とするSpO2の水準を複数設定してトレーニングをある一定期間実施した際の効果を比較検討していく予定である。同一低酸素環境下(酸素濃度15.4%:標高2500m相当)における運動時の酸素飽和度が90%、85%となるような運動強度でそれぞれ一定期間トレーニングを行い、その効果に差異や特異性が認められるのかについて、検討を行った。対象者は健常な男性16名とした。トレーニングにおける運動負荷は、自転車駆動による多段階負荷試験において、SpO2が90%に達した負荷、85%に達した負荷を求め、8名ずつ2群に分けて設定し、30分間の自転車駆動トレーニングを、それぞれ週2回の頻度で4週間行った。トレーニング前後に常酸素環境下、低酸素環境下において多段階負荷試験を行い、両群におけるトレーニング効果を比較、検討した。多段階負荷試験における運動継続時間は、両群ともに、各条件でトレーニング後の方がトレーニング前よりも有意に高い値を示したが、両群の変化率の間に有意な差は認められなかった。VO2maxについては、90%群において常酸素環境下では有意な変化は認められず、低酸素環境下ではトレーニング後の方がトレーニング前よりも有意に高い値を示した。以上より、30分間の自転車駆動を週2回、4週間という短時間かつ短期間の低酸素トレーニングにおいて、持久的能力の改善といったトレーニング効果が現れることが明らかとなった。これらは、90%群と85%群のトレーニング時の負荷や生理的運動強度には、両群で差がなかったことから、トレーニング効果に差が認められなかったと解釈することができるが、低酸素環境下における生理応答に個人差があるために生じた可能性も否定できない。【目的】本年度は、動脈血酸素飽和度(SpO2)の値を88%をトレーニング設定運動強度とし、異なる二つの低酸素濃度レベルの環境下でのトレーニング実験の効果について比較することとした。【方法】対象者は健常な男子学生16名(年齢20.6(±1.2)歳、身長172.4(±6.3)cm、体重67.8(±7.2)kgであった。対象者を酸素濃度15.4%環境下(標高2500m相当)でトレーニングを行う群8名(15.4%群)と、酸素濃度13.6%(標高3500m相当)8名でトレーニングを行う群8名(13.6%群)に分け、自転車エルゴメーター(COMBI社製AEROBIKE75XLII)を用いた30分間の自転車駆動トレーニングを、週2回の頻度で4週間行った。【結果】8回のトレーニングのSpO2の平均値は両群ともに目標の範囲内でトレーニングを遂行することができた。8回のトレーニングの運動負荷の平均値は15.4%群で115.1(±25.9)Wであり、13.6%群で49.5(±31.3)

Wとなり、両群には有意な差(p<0.001)が認められた。常酸素環境下での多段階負荷試験におけるオールアウトまでの運動時間は、両群共に有意な増加(p<0.01)が認められた。常酸素環境下での多段階負荷試験における最大酸素摂取量(VO2max)は、13.6%群のVO2maxのみ有意な増加(p<0.01)が認められたが、変化率は15.4%群で1.5(±3.5)%であり、13.6%群で4.6(±3.8)%であり、両群の運動時間とVO2maxの変化率には有意な差は認められなかった。【結論】同一水準のSpO2をトレーニング時の設定運動強度として異なる低酸素環境下でトレーニングを行った場合、両群ともに運動能力の向上が認められた。しかし、両群間には運動負荷の平均値には65.6Wの差があるにも関わらず同等のトレーニング効果が得られたことは大変興味深い。可能な範囲内で酸素濃度を下げた環境で低強度であるがトレーニングを行うことは意義があることが明らかとなった。本研究は低酸素(高地)トレーニングの効果を高める至適条件を検討するために運動時の酸素飽和度に着目して幾つかのトレーニング実験を行った。高度や運動強度に関わらず運動中の酸素飽和度を90%以下になるように負荷強度を設定し、1回30分間、一定期間(週2回、4週間)の自転車駆動トレーニング実施によって、有意な持久能力の向上が認められた。したがって低酸素環境における持久能力のトレーニング効果を高める条件としては酸素飽和度が90%以下の水準になるような負荷強度を選択することが重要であるといえよう。同一低酸素環境下(酸素濃度15.4%:標高2500m相当)における2つの運動時の酸素飽和度が90%、85%となるような運動強度において一定期間トレーニングを行い、その効果を比較し、効果に差異や特異性が認められるのかについて、検討を行った。その結果、30分間の自転車駆動を週2回、4週間という短時間かつ短期間の低酸素トレーニングでも、持久的能力の改善といったトレーニング効果が現れることが明らかとなった。これらは、90%群と85%群のトレーニング時の負荷や生理的運動強度には、両群で差がなかったことから、トレーニング効果に酸素飽和度が90%、85%となるような2つの運動強度で差が認められなかったのかもしれないし、あるいは低酸素環境下における生理応答に個人差があるために生じた可能性も考えられる等の結論を得ることができたため。運動生理学今後は、低酸素環境をたとえば標高を3000mと2000m相当の2条件に分け、それぞれの環境下において、運動中のSpO2を85%程度になるよう負荷強度を設定、調整し、ある一定期間(週2回、4週間)トレーニングを実施した際の効果を比較し、異なる低酸素環境下において、酸素飽和度を同一にした際のトレーニング効果に差異が生じるかどうかについて検討する予定である。このことを明らかにすることによって、酸素飽和度を基準とした効果的な低酸素トレーニング方法の確立につながることが期待される。常酸素と低酸素環境3条件における各環境下での環境(酸素濃度%)と運動負荷と生理的指標の相互関係について予定通り明らかにすることができた。当初は低酸素環境3条件で行う予定であったが、標高2500m、3200m相当の低酸素環境下2条件における酸素飽和度ー運動負荷から酸素飽和度85%とした時の運動強度を求め、この強度でトレーニングを行わせた。この方法で求めた運動強度の妥当性を検証することができた。設定した酸素飽和度85%は、標高が2000m以上でないと設定強度が高く現実的でないため2条件とした。この辺りは引き続きの課題であるといえる。今後は目標とするSpO2の水準を複数(例えば90%、85%、80%など)設定してトレーニングをある一定期間実施した際の効果を比較検討していく必要性がある。
肺小細胞癌におけるNF1遺伝子発現様式に関連した分化誘導シグナル伝達系の解析

NF1遺伝子発現におけるtypel/ll比を人為的に変化させて分化誘導刺激との関連をみることでNF1遺伝子の発現様式が原因的に働いているかどうかを知る実験を行った。typel-mRNAあるいはtypell-mRNAのみを選択的に発現するプラスミドベクターを作成し、トランスフェクションで細胞形態の変化を含む表現系を変化を検討した。ラミニンによっておこるフラスコ壁接着性、神経様突起形成、typel/ll比の逆転などは、数時間から比較的急速に起こる変化であるので、それに対応した可発現誘導性プロモーターをもつプラスミドが必須となる。温度感受性あるいはテトラサイクリン誘導性のプロモーターでの発現調節は比較的これに適した結果を得た段階まで実験は進んだ。分化誘導前後の細胞の転写産物の差し引き(サブトラクション)からRB遺伝子発現の有無によって左右される標的遺伝子をクローニングすることを試みた。細胞表面からラミニン受容体を介して核内にシグナルが行くことになるが、核内でRB遺伝子を巻き込む経路を我々は推定している。核内での調節が統合され、再び細胞質のシグナル伝達系を遡って表現型に到達する段階の遺伝子群を目標にdifferential RT-PCR法によってクローニングした。クローンについては既知の遺伝子はなく、2クローンについて追跡解析が必要である。臨床材料におけるalternative splicingのパターンは培養細胞ほど明確な結果は出なかったが、再発例などでは明らかに分化度の低下とともに、typel/ll比の変動が見られる場合が11例中2例にみられた。腫瘍内での微少環境での評価が必要とも考えられる。肺小細胞癌の培養細胞は形態学的にclassic typeとvariant typeに分類される。前者ではAPUD系細胞に特徴的なAADC活性が高く、後者ではその活性が低い。またclassic typeの肺小細胞癌は予後が比較的良好であり、NSE濃度の高い例は予後が不良であるなどの特徴を有する。肺小細胞癌はその神経内分泌分化能によっても特徴づけられていて、発生母地は、神経分泌顆粒の存在するもののあること、L-dopa decarboxylase活性の高いものがあること、ADH、ACTH等の神経ホルモン分泌能を有するもののあることなどを根拠としてneuroectodermal originの範疇に加える考え方があるが、数多くの研究結果から、神経内分泌分化能を有する気管支上皮を起源とする意見が支配的となってきている。今回我々が解析に用いたNF1遺伝子は17番染色体長腕上に存在し、その構造中にG-protein related domain(GRD)があり、この領域内でのaltemative splicingにより二つの異なる転写産物typelとtypellができることは佐谷らにより報告されている。RT-PCRによって両転写産物の発現比を細胞株間で比較し、肺小細胞癌の形態学的分類との相関を解析した。classic typeの細胞株ではtypel/ll比が高く、variant typeでは低い傾向が明らかであった。スプライシングの生じるこの領域が活性型ras遺伝子の不活化に関与する領域、すなわちGRD中にあるので、肺小細胞癌の分化度と深く関連していることは興味深い。本研究では、肺小細胞癌において分化度と密接に関連するマーカーとしてNF1遺伝子のalternative splicingのパターンの有用性を示した。NF1遺伝子発現におけるtypeI/II比を人為的に変化させて分化誘導刺激との関連をみることでNF1遺伝子の発現様式が原因的に働いているかどうかを知る実験を行った。typeI-mRNAあるいはtypeII-mRNAのみを選択的に発現するプラスミドベクターを作成し、トランスフェクションで細胞形態の変化を含む表現系の変化を検討した。ラミニンによっておこるフラスコ壁接着性、神経様突起形成、typeI/II比の逆転などは、数時間から比較的急速に起こる変化であるので、それに対応した可発現誘導性プロモーターをもつプラスミドが必須となる。

分化誘導前後の細胞の転写産物の差し引き(サブトラクション)からRB遺伝子発現の有無によって左右される標的遺伝子をクローニングすることを試みた。細胞表面からラミニン受容体を介して核内にシグナルが行くことになるが、核内でRB遺伝子を巻き込む経路を我々は推定している。核内での調節が統合され、再び細胞質のシグナル伝達系を遡って表現型に到達する段階の遺伝子群を目標にdifferential RT-PCR法によってクローニングした。クローンについては既知の遺伝子はなく、2クローンについて追跡解析が必要である。臨床材料におけるalternative splicingのパターンは培養細胞ほど明確な結果は出なかったが、再発例などでは明らかに分化度の低下とともに、typeI/II比の変動が見られる場合が11例中2例にみられた。腫瘍内での微小環境での評価が必要とも考えられる。
超並列型MRマイクロスコープの開発とヒト胚子三次元構造データベースの構築

静磁場強度2.34T(テスラ),室温開口径40cm,均一静磁場領域16cm球の水平開口型超伝導磁石と,本研究で新たに開発した、4チャンネルアレイ型勾配コイル,100MHz4チャンネル超並列MR送受信システムを用いて,同時に4体のヒト胚子撮像を可能とする超並列MRマイクロスコープシステムを構築した.4チャンネルのプローブのRFコイルは,交換可能となっており,10mm,12mm,15mm,20mmと,それぞれ試験官の外径に対して最適化したRFコイルが使用できるものとした.このシステムを用い,京都大学において,1960年代に組織的に収集され,化学固定されたカーネギーステージが1923のヒト胚子約600体を,保存液(10%ホルマリン溶液)に浸した状態で,TR(繰り返し時間)100ms,TE(エコー時間)8msのT1強調三次元スピンエコー法を使用して三次元撮像を行った.画素のマトリクスサイズは128×128×256,画素サイズ(空間分解能)は100160ミクロン立方,計測時間は約8時間であった.画像の信号対雑音比は良好であり,神経系,内臓などの解剖学的構造の描出に成功した.また,これらの画像を,256×256×512画素にフーリエ内挿し,三次元回転することにより正中断面に平行な断層面の画像マトリクスに変換し,解剖学的構造評価が可能なデータベースの基礎データとした.このように,正中断面を検索画面とする,胚子の高分解能三次元画像の集積に成功した.静磁場強度2.34T(テスラ),室温開口径40cm,均一静磁場領域16cm球の水平開口型超伝導磁石と,本研究で新たに開発した、4チャンネルアレイ型勾配コイル,100MHz4チャンネル超並列MR送受信システムを用いて,同時に4体のヒト胚子撮像を可能とする超並列MRマイクロスコープシステムを構築した.4チャンネルのプローブのRFコイルは,交換可能となっており,10mm,12mm,15mm,20mmと,それぞれ試験官の外径に対して最適化したRFコイルが使用できるものとした.このシステムを用い,京都大学において,1960年代に組織的に収集され,化学固定されたカーネギーステージが1923のヒト胚子約600体を,保存液(10%ホルマリン溶液)に浸した状態で,TR(繰り返し時間)100ms,TE(エコー時間)8msのT1強調三次元スピンエコー法を使用して三次元撮像を行った.画素のマトリクスサイズは128×128×256,画素サイズ(空間分解能)は100160ミクロン立方,計測時間は約8時間であった.画像の信号対雑音比は良好であり,神経系,内臓などの解剖学的構造の描出に成功した.また,これらの画像を,256×256×512画素にフーリエ内挿し,三次元回転することにより正中断面に平行な断層面の画像マトリクスに変換し,解剖学的構造評価が可能なデータベースの基礎データとした.このように,正中断面を検索画面とする,胚子の高分解能三次元画像の集積に成功した.静磁場強度2.34T(テスラ),室温開口径40cm,均一静磁場領域16cm球の水平開口型超伝導磁石と,本研究で開発した,100MHz4チャンネル超並列MRマイクロスコープを用いて,同時に4体のヒト胚子を撮像するシステムを構築した.超並列MRマイクロスコープは,4チャンネルの勾配磁場プローブと,4チャンネルの100MHz並列MRIコンソールから構成されている.4チャンネルのプローブのRFコイルは,交換可能となっており,最大内径20mmまで使用できるようになっている.化学固定されたヒト胚子を,保存液(10%ホルマリン溶液)に浸した状態で撮像するために,TR(繰り返し時間)100ms, TE(エコー時間)8msのT1強調3Dスピン・エコー法を用い,カーネギーステージ21の胚子を中心に撮像実験を行った.その結果,128×128×256画素のマトリクスサイズ,120ミクロン立方の画素サイズ,約8時問の計測時間で,明瞭な解剖学的構造を得ることに成功した.この結果により,2年間で約4,000体の胚子の三次元撮像に十分な性能を有する超並列MRマイクロスコープの構築ができたと結論した.静磁場強度2.34T(テスラ),室温開口径40cm,均一静磁場領域16cm球の水平開口型超伝導磁石と,本研究で新たに開発した,4チャンネルアレイ型勾配コイル,100MHz4チャンネル超並列MR送受信システムを用いて,同時に4体のヒト胚子撮像を可能とする超並列MRマイクロスコープシステムを構築した.4チャンネルのプローブのRFコイルは,交換可能となっており,10mm,12mm,15mm,20mmと,それぞれ試験官の外径に対して最適化したRFコイルが使用できるものとした.このシステムを用い,京都大学において,1960年代に組織的に収集され,化学固定されたカーネギーステージが1923のヒト胚子約600体を,保存液(10%ホルマリン溶液)に浸した状態で,TR(繰り返し時間)100ms, TE(エコー時間)8msのT1強調

三次元スピンエコー法を使用して三次元撮像を行った.画素のマトリクスサイズは128×128×256,画素サイズ(空間分解能)は100160ミクロン立方,計測時間は約8時間であった.画像の信号対雑音比は良好であり,神経系,内臓などの解剖学的構造の描出に成功した.また,これらの画像を,256×1256×512画素にフーリエ内挿し,三次元回転することにより正中断面に平行な断層面の画像マトリクスに変換し,解剖学的構造評価が可能なデータベースの基礎データとした.このように,正中断面を検索画面とする,胚子の高分解能三次元画像の集積に成功した.
歯科用有機材料の経時的な細胞傷害性評価法の開発

歯科用有機材料(メチルメタクリレート系材料)は、細胞内で酸化ストレスとして作用し、遺伝子上の抗酸化剤応答配列(Anti-Oxidant Responsive element:ARE)を活性化する。この事実を利用し、これまでにARE遺伝子の下部にホタルルシフェラーゼを組み込み、AREの活性化量を発光量の測定により定量化する(レポーターアッセイ法)方法を確立してきた。しかし、本方法は発光量を測定する直前に、細胞膜を溶解させ、細胞質溶液を作製する必要がある。すなわち、細胞を死滅させてしまうために時系列的な評価が困難であった。そこで、本研究では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、高発光性分泌型タンパク質であるガウシアルシフェラーゼ遺伝子に組み変えることによって、上記問題を解決することとした。ARE遺伝子をタンデムに乗せた後、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を下部に組み込んだ遺伝子を構築した(pARE-pGL)。解毒に関与する組織細胞であるヒト肝がん細胞(HepG2細胞)を主株とし、遺伝子導入し、歯科有機材料として頻用されるヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)に対する発光量を比較したところ、細胞質内の発光量で261倍、培養上澄液の発光量で643倍もの発光量を示した。そこで、構築したpARE-pGL遺伝子に薬剤耐性遺伝子を組み込み、ステーブルクローンを樹立した。コントロールに対するHEMA刺激時の発光量が高い細胞を選択した。ステーブルクローン細胞の名前はHepG2-AG11細胞とした。このHepG2-AG11細胞を利用し、歯科用有機材料の経時的な反応、および他の材料に対する応答性の評価を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに使用していたレポーター遺伝子(ホタルルシフェラーゼ遺伝子:luc)と、コドンユーセージが高いもので構成された高発光型分泌発光遺伝子(ガウシアルシフェラーゼ遺伝子:pGluc)の発光活性比較を基本ベクターのpGLベクターにそれぞれ組み換え、HepG2細胞に一過性導入して検証した。この時、3種類のトランスフェクション試薬および細胞播種密度での導入効率の条件検討を行なった。また、分泌型発光タンパク質の特徴として、発光基質と混和させた瞬間が最も発光活性が高く、急激に活性が低下してくる。そこで、発光活性のピーク値および積算値での発光活性比較を行なった。発光タンパク質の試料はそれぞれpGL-lucは細胞溶解液、pGL-pGlucは培養上澄液を用いた。その結果、pGL-lucと比較して、pGL-pGlucで得られた発光タンパク質はピーク値で24倍、10秒間積算値で374倍の活性が出ることが判明した。このpGlucレポーター遺伝子をこれまでに構築したARE2-lucのレポーター遺伝子領域に組み込んだベクター(ARE2-pGluc)を構築した。この2種類の遺伝子を用い、HepG2細胞に一過性導入して発光活性測定を検討した。一過性遺伝子導入後、24時間培養した。その後、新鮮な培養液(control)に交換して、6時間後にそれぞれの発光タンパク質の活性を比較した。その結果、controlでの活性は、ARE2-pGlucは従来のARE2-lucと比較して約14倍の活性が得られた。また、歯科有機材料のHEMA5mMを刺激した時、controlと比較して12倍のARE活性倍率が得られることを確認した。これまでの結果により、従来の方法と比較して細胞を溶解することなく、培養上澄液でARE活性率の測定が可能であることが判明した。計画的に進めている。現在のところ、基礎的な条件検討などの実験が多いが、堅牢な細胞毒性試験システム構築には必須過程であり、事象をひとつずつ検証している。新規に構築している細胞毒性試験方法は、発光タンパク質を分泌する過程が存在する。そのため、様々な歯科用有機材料の分泌能への影響を検証する必要がある。

具体的には、本実験で使用した分泌型発光遺伝子のみを単純ベクターに組み込み、歯科用有機材料の有無による発光能の差異がないかを検証する。さらに、細胞外へ分泌された発光タンパク質の発光強度が歯科材料による影響を及ぼさないかどうかの検証も必要となる。この実験には、先に実験で用いた単純分泌型発光遺伝子導入ベクターにより得られた発光タンパク質含有の培養上澄液を用い、歯科用有機材料の有無による発光強度への影響を検証する。これらの詳細な条件検討ののち、薬剤耐性遺伝子を組み込み、ステーブルクローン細胞の樹立を行う。発光量が高く、さらに歯科有機材料に対する反応率の高い細胞を選択することにより、高感度かつ安定した細胞毒性試験法の確立を目指す。また、現在のところ、細胞刺激後6時間後の時点での計測のみであるため、最終的な目的である経時的変化の検証を行う。具体的には、これまでに検証してきた実験結果との相関があるかを検証したのち、このステーブルクローン細胞を用いて細胞刺激後、1、2、4、6、8、10、24時間の経時的変化を連続的に観察する。このとき、発光タンパク質が培養上澄液に飽和状態になり、分泌能の低下を起こさないよう、各計測段階で培養液の交換をすべきかどうかの検証も追加する。この時、細胞播種濃度の検証も必要となる。各段階ごとに随時検証を行い、堅牢かつ精度の高い、簡便な細胞毒性試験の構築を目指す。論文は各段階で随時発表予定であり、新規の細胞毒性試験法として、国際規格への提案を視野にいれているため、海外への発表を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子異常と血管新生を指標とした肺癌の新病期分類の確立と治療指針の開発

血管新生抑制因子の解析血管新生抑制作用を有するとされるThrombospondin(TSP-1)の腫瘍間質における蛋白発現と腫瘍内微小血管(Microvessel Count:MVC)との関連を非小細胞肺癌230例に対し免疫組織化学的に解析し、臨床的意義を検討した。TSP-1発現減弱は154例(67.0%)に認められ、減弱群に進行例が有意に多く認められた。非減弱群に対し、減弱群では有意に予後不良であった。MVCの低値群、高値群の2群間で、高値群が有意に予後不良であった。TSP-1の発現の程度とMVC値に有意な相関は認められなかった。MVC高値群に関してTSP-1の発現別に予後を検討すると、TSP-1非減弱群で有意に予後良好であった。非小細胞肺癌の腫瘍間質におけるTSP-1の発現低下は予後不良因子であった。TSP-1発現とMVCとの関係および悪性度との関連については、TSP-1の発現減弱によって血管新生を促進し悪性度を増す系と、血管新生に関わらずTSP-1の発現によって悪性度を抑制する系が存在することが示唆された。多重遺伝子変異解析による悪性度診断現在の病理組織学的診断によるTNM分類に加えて、遺伝子変異や発現異常などの生物学的特性に基づいた予後因子を解析し、臨床的に補助療法を必要とする患者の層別化を試みた。肺腺癌の切除症例を対象とし、がん遺伝子(K-ras)、がん抑制遺伝子および細胞周期調節遺伝子(p53,p27,p16),細胞接着因子(E-cadherin,β-catenin)、血管新生因子(TSP-1,MVC)についてDNA変異あるいは蛋白発現異常の有無を解析した。単変量解析による有意な予後不良因子は、p53変異,p27,E-cadherin,β-catenin,TSP-1の発現異常であった。各症例でこれらの因子の異常数を算定し多重変異として予後を解析すると、異常数の増大とともに有意に予後不良であった。すなわち、分子生物学的特性を考慮することで、肺腺癌における悪性度の危険因子がより明確になり、集学的治療、補助療法を必要とする患者の層別化が可能になると考えられる。
メタロジエン-鉄錯体を利用する有機合成反応の開発

リチオジエン-Fe(CO)_3に対し、反応性の高いsp^3炭素を有するアリルハライド、又はベンジルハライドを作用させたところ、予期していたアルキル化生成物は得られず、3位とアルキル基間に鉄錯体由来と考えられるCO配位子が挿入された化合物が得られることを見出した。このときの反応機構はリチオジエン-Fe(CO)_3のFe上のCO配位子が3位に挿入することで生成するアシルアニオン中間体に相当する化学種を経由し、得られたと考えられる。このアシルアニオン中間体はこれまでに報告例がなく、有機合成化学上、非常に興味深い化学種である。上記のCO配位子挿入反応において、リチオジエン-Fe(CO)_3のFe上のCO配位子が分子内、または分子間で移動することでアシルアニオン中間体が得られるため、Feが配位不飽和であることが示唆される。そこで、アシルアニオン中間体に対し適当な配位子を作用させることでCOが鉄錯体の3位に挿入し、かつ配位子交換反応が進行した化合物が合成できるのではないかと考えた。その結果、配位子としてPMe_3を作用させたところ、COが挿入しかつ鉄上の配位子を高収率で得ることに成功した。また、PMe_3以外のリン配位子を作用させても同様の反応が進行している。リチオジエン-Fe(CO)_3の反応性を制御する目的で、Fe上の配位子を変換することを考えた。すなわち、FeのCO配位子をリン配位子に換えた錯体に対して塩基を作用させてみた。その結果、^nBuLiを作用させることで、比較的安定なリチオジエン-Fe(CO)_2PR_3が調製でき、合成反応に利用できることを見出した。この中間体に種々の求電子剤を作用させた結果、アルデヒドとも反応し、付加体が得られることを見出した。ジエン-鉄錯体はジエン部位の保護、ジエン隣接部位での反応などの利用例が報告されているが、ジエン部位を直接反応に利用した例は数少ない。本研究では,ジエン-鉄錯体より生成できるメタロジエン-鉄錯体を利用する新規有機合成反応の開発を行っている。本年度は、ジエニルホスフェート-鉄錯体の3位アニオンを利用した置換基導入反応において、反応の適用範囲を拡張する目的で、ヘテロ元素求電子剤との反応を行った。様々なヘテロ元素求電子剤と反応させた結果、ジエニルホスフェート-鉄錯体の3位にヘテロ元素求電子剤由来の置換基を導入することに成功した。ここでの検討から、ヘテロ元素-炭素間の結合距離が長くなるような求電子剤との反応性が良いということが示唆される。また,リチオジエン-鉄錯体と金属化合物とのトランスメタル化を試みた。その結果、Cu, Zn, B化合物を用いたトランスメタル化の場合、メタロジエン-鉄錯体が室温まで昇温しても比較的安定であるということがわかった。トランスメタル化に利用する金属化合物として、Cu, Zn, B化合物を選択し、ジエニルホスフェート-鉄錯体に対してPd触媒を利用し、プロモベンゼンとのクロスカップリング反応を試みたところ,CuCNを用いた場合比較的良好な収率で,カップリング反応が進行することを見いだした。ジエニルホスフェート-鉄錯体にLDAを作用させることで3位のリチオ化が進行することが明らかとなっているが,このリチオ化中間体は低温でのみ安定に存在するため、取り扱いが困難であること、さらに炭素求電子剤との反応性が低いことがわかっている。そこで本年度は,リチオ化中間体をホウ素化合物に交換することで空気や熱に対して安定なメタロジエン-鉄錯体としてボラジエン-鉄錯体合成を試みた。その結果,リチオ化中間体にトリメトキシボランを作用させ,さらにピナコールを作用させることで,目的とする安定なボラジェン-鉄錯体を56%の収率で得ることに成功した。得られたボラジエン-鉄錯体を加水分解することでボロン酸とし,りん酸三カリウム、塩化銅、Pd触媒存在下ブロモベンゼンを作用させ,クロスカップリング反応(Suzuki反応)を試みたところ、3位にフェニル基が導入されたジエン-鉄錯体を68%の収率で得ることに成功した。また,用いるハロアリールのハロゲンの種類及び,銅塩の種類によって反応収率が大きく異なることが分かっており,今後検討を加える予定である。

上記のCO配位子挿入反応において、リチオジエン-Fe(CO)_3のFe上のCO配位子が分子内、または分子間で移動することでアシルアニオン中間体が得られるため、Feが配位不飽和であることが示唆される。そこで、アシルアニオン中間体に対し適当な配位子を作用させることでCOが鉄錯体の3位に挿入し、かつ配位子交換反応が進行した化合物が合成できるのではないかと考えた。その結果、配位子としてPMe_3を作用させたところ、COが挿入しかつ鉄上の配位子を高収率で得ることに成功した。また、PMe_3以外のリン配位子を作用させても同様の反応が進行している。リチオジエン-Fe(CO)_3の反応性を制御する目的で、Fe上の配位子を変換することを考えた。すなわち、FeのCO配位子をリン配位子に換えた錯体に対して塩基を作用させてみた。その結果、^nBuLiを作用させることで、比較的安定なリチオジエン-Fe(CO)_2PR_3が調製でき、合成反応に利用できることを見出した。この中間体に種々の求電子剤を作用させた結果、アルデヒドとも反応し、付加体が得られることを見出した。
ショウジョウバエにおける細胞及び器官分化の分子機構

本年度の特筆すべき成果としては、segment polarity遺伝子、hedgehogを単離、構造解析し、そのハネでのectopicな発現を利用し、hedgehogが前部後部区画の前部側境界を誘発し、それにより遠近軸が重複し、鏡像対称に前部区画が重複することが分かったことである。embryoと同様、成虫原基においても、hedgehogは、その予想レセプターptcの自分自身に対する転写抑制を抑制すると思われる。実際、ectopicなhedgehogの効果は、backgroundのptcの量により著しい影響をうけ、ptcのdoseの減少により、表現型は、より厳しいタイプに変化した。ectopicにhedgehogが、前部区画で発現するトランスジェニックラインでは、hedgehog発現領域のまわりに、ptcのみならずdppも発現し、野生型の前部後部区画境界と類似の発現パターンを示した。これらの結果は、hh-ptcシグナル系の下流にdppが位置し、ある種のmorphogenとして機能している事を強く示唆している。hedgehogについては、培養細胞での発現も調べており、二段かいでプロセスされる分泌蛋白である事が分かった。
本態性高血圧症および心不全発症機構に関する包括的ゲノム解析

本態性高血圧症は遺伝的素因の関与が示唆される代表的な生活習慣病であるが、本疾患が具体的にどの様な遺伝子異常を背景としているかは今なお殆ど不明なままである。また本態性高血圧などによる長期にわたる圧負荷はやがて心筋の収縮力低下および細胞死を導き、うっ血性心不全に至る。我々は本研究計画において本態性高血圧症および心不全の発症・進展機構を明らかにする目的で、疾患モデル動物あるいは患者心筋サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析によりうっ血性心不全の病態解明を目指した。Dahl ratは遺伝性食塩感受性ラットであり、高食塩負荷摂取により全身性高血圧・心肥大を発症する。高食塩負荷の持続により比較的短期間のうちに重症心不全へと移行するため、ヒトの心不全発症機構の良いモデル動物といえる。そこで各病期のDahl rat心筋を用いてDNAマイクロアレイ解析(約8800種類の遺伝子)を行い、病期特異的に発現変化する遺伝子の同定を試みた。その結果「心肥大発症に伴って発現亢進する遺伝子群」、「健常期および心肥大期では発現が高いが心不全への移行に伴って発現が低下する遺伝子群」など様々な疾患関連遺伝子を同定することに成功した。興味深いことに後者の中には細胞のアポトーシスを制御する転写因子が含まれていた。本遺伝子産物のdominant negative変異体を発現する組換えアデノウィルスを作成し培養ラット心筋に導入したところ、アンギオテンシンII添加による細胞内カルシウム濃度の上昇がブロックされることが示された。一方、自治医科大学の卒業生ネットワークを介したDNAサンプル収集を行い、本態性高血圧症に寄与する遺伝子多型の解明を目指した・新生仔ラット培養心筋細胞にエンドセリン-1、ノルエピネフリン、カルジオトロフィン-1、アンギオテンシンIIなどの心肥大誘導因子を添加し、各因子が具体的にどの様な細胞内変化を介して心肥大をもたらすかをDNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果各因子が、部分的にオーバーラップするもののそれぞれ固有の細胞内シグナルを惹起することが判った。・遺伝的に食塩感受性であるDahlラットは、高食塩含有食摂取によって速やかに高血圧→心肥大→うっ血性心不全へと移行する。我々はこれら各病期のDahlラット心室筋よりRNAを抽出しDNAマイクロアレイを用いて解析することで、「心肥大の発症」および「心肥大から心不全への移行」にどの様な遺伝子発現の変化があるかを検討した。6週令のDahlラットに食塩負荷を開始したところ、翌週には高血圧が発症し、11週令まで高血圧・心肥大が進行した。しかし13週令の時点で心機能の低下、心拡大が生じ、うっ血性心不全への移行が確認された。食塩負荷プラス群とマイナスのコントロール群それぞれから、各週令のラット2匹より心筋を取り出し、DNAマイクロアレイにて解析した。得られたデータのうち食塩負荷早期に発現誘導が生じる遺伝子は心肥大発症に関与すると予想され、また11週令から13週令の間に大きく発現量が変化するものは心不全への移行に関与する遺伝子群である可能性が高い。約8800種類のラット遺伝子を配置したAffymetrix社のGeneChipを用いて発現解析を行った結果、8週令の時点で食塩負荷群においてのみ発現が誘導される遺伝子が計5個同定された。さらに本解析を通して発現がいったん誘導された後心不全への移行に伴って低下する遺伝子や、負荷前から発現が活性化されているが心不全発症期に低下する遺伝子など、興味深い動態を示す遺伝子群が複数同定された。・心臓弁膜症あるいは原発性肺高血圧症の患者心筋よりRNAを抽出し、GeneChipシステムにて解析を行った。その結果ユビキチン依存性蛋白分解系路に属するプロテアゾーム複合体の遺伝子が、心内圧依存性に誘導されることが明らかになった。一方、自治医科大学の卒業生ネットワークを介したDNAサンプル収集を行い、本態性高血圧症に寄与する遺伝子多型の解明を目指した。

本態性高血圧症は遺伝的素因の関与が示唆される代表的な生活習慣病であるが、本疾患が具体的にどの様な遺伝子異常を背景としているかは今なお殆ど不明なままである。また本態性高血圧などによる長期にわたる圧負荷はやがて心筋の収縮力低下および細胞死を導き、うっ血性心不全に至る。我々は本研究計画において本態性高血圧症および心不全の発症・進展機構を明らかにする目的で、疾患モデル動物あるいは患者心筋サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析によりうっ血性心不全の病態解明を目指した。Dahl ratは遺伝性食塩感受性ラットであり、高食塩負荷摂取により全身性高血圧・心肥大を発症する。高食塩負荷の持続により比較的短期間のうちに重症心不全へと移行するため、ヒトの心不全発症機構の良いモデル動物といえる。そこで各病期のDahl rat心筋を用いてDNAマイクロアレイ解析(約8800種類の遺伝子)を行い、病期特異的に発現変化する遺伝子の同定を試みた。その結果「心肥大発症に伴って発現亢進する遺伝子群」、「健常期および心肥大期では発現が高いが心不全への移行に伴って発現が低下する遺伝子群」など様々な疾患関連遺伝子を同定することに成功した。興味深いことに後者の中には細胞のアポトーシスを制御する転写因子が含まれていた。本遺伝子産物のdominant negative変異体を発現する組換えアデノウイルスを作成し培養ラット心筋に導入したところ、アンギオテンシンII添加による細胞内カルシウム濃度の上昇がブロックされることが示された。一方、自治医科大学の卒業生ネットワークを介したDNAサンプル収集を行い、本態性高血圧症に寄与する遺伝子多型の解明を目指した本態性高血圧症は遺伝的素因の関与が示唆される代表的な生活習慣病であるが、本疾患が具体的にどの様な遺伝子異常を背景としているかは今なお殆ど不明なままである。本遺伝子産物のdominant negative変異体を発現する組換えアデノウィルスを作成し培養ラット心筋に導入したところ、アンギオテンシンII添加による細胞内カルシウム濃度の上昇がブロックされることが示された。
災害時の迅速な避難行動の鍵「自主防災組織の避難訓練」の参加・不参加住民の要因分析

本研究では、長崎市の自主防災組織を事例に、1990年7月の扇町、1991年6月の侍石、7月も平山町、本河内1丁目の避難訓練を選び、住民の参加・不参加にはいかなる要因があるのかを,過去の災害経験、地域社会への関心、災害に関する認識、自主防災組織に関する認仕などに関するアンケ-ト調査を行ない明らかにした。取り上げた4防災組織は、「都市化の程度」と「1982年長崎豪雨災害時の被災程度」によって扇町:市街地・軽微な被害、本河内1丁目:市街地・比較的大きな被害、平山町:郊外部・軽微な被害、侍石:郊外部・比較的大かな被害、という4つの類型に分けられる。扇町自主防災組織については、1990年に465世帯を対象に留置法によるアンケ-ト調査を行ない(回収率35.5%)、本年度要因分析を行なった。3地域については、今年度アンケ-ト調査を実施し(配布数・回収率:本河内1丁目・、平山町475・29.1%、侍石121・39.6%)、予察的な要因分析も終了した。本格的な要因分析を行なった扇町自主防災組織について結果を述べる。林の数量化II類分析法によって、参加・不参加に影響したアンケ-ト調査項目を把握した。その結果、最も参加・不参加に影響している項目は、「避難訓練実施の情報入手手段」であり、回覧板のみの場合には不参加に、自治会役員または近所の人に誘われた場合には参加に作用している。以下家族構成、自主防災組織の必要性の認識、自主防災組織結成時期の認知、自治会役員経験の有無の順であった。このことから、地域社会の人間的関係が住民の避難訓練への参加を促す重要な要因であり、この点を踏まえて対策を立てる必要があることが明らかになった。
MYB3R転写因子をゲノム編集で機能破壊することで果実を大型化できる可能性の検討

トマトで細胞分裂の制御に関わるMYB3Rのゲノムワイド解析を行ったところ,4種類(SlMYB3R14)のMYB3Rの存在が明らかになった.分子系統樹からの機能推定と遺伝子の発現解析の結果から,SlMYB3R1およびSlMYB3R2は細胞分裂期の果実における細胞分裂の促進に,SlMYB3R3は細胞分裂停止期の果実における細胞分裂の停止に,SlMYB3R4は果実成熟期のエンドリデュプリケーション(核内倍加)の誘導に関わる可能性が示唆された.果実サイズの改変を目指してSlMYB3R3のゲノム編集を試みたが,形質転換体は多数得られたもののゲノム編集個体が得られなかったため,その作出を継続中である.トマトで細胞分裂の制御に関わるMYB3Rのゲノムワイド解析を行ったところ,4種類(SlMYB3R14)のMYB3Rの存在が明らかになった.分子系統樹からの機能推定と遺伝子の発現解析の結果から,SlMYB3R1およびSlMYB3R2は細胞分裂期の果実における細胞分裂の促進に,SlMYB3R3は細胞分裂停止期の果実における細胞分裂の停止に,SlMYB3R4は果実成熟期のエンドリデュプリケーション(核内倍加)の誘導に関わる可能性が示唆された.果実サイズの改変を目指してSlMYB3R3のゲノム編集を試みたが,形質転換体は多数得られたもののゲノム編集個体が得られなかったため,その作出を継続中である.園芸生理・生化学
放射線によるポリシランの機能化とその秩序構造の構築

本研究は、ポリシランの放射線グラフト重合による化学修飾、および得られたグラフトポリマーを用いた秩序構造の構築を目的として行ったものである。前年度の研究においてポリシランが放射線グラフト重合に耐えうるだけの放射線耐性を有することが明らかとなったので、本年度は実際にポリシランに対するグラフト重合を試みた。試料として用いたポリシランは、側鎖がアルキル基のみからなるpoly(methylpropylsilane)(PMPrS)であり、これに対し両親媒性を有するmethyl methacrylate(MMA)のグラフト重合を試みた。トルエン溶液を真空下室温でガンマ線照射することによりグラフトポリマーを得た。GPC、UV、IR、^1H-NMR等の分析結果から、このポリマーがPMPrS主鎖にMMAがグラフト重合したものであることが確認された。ケイ素原子一個当たりのMMAユニットの導入率で定義されるグラフト率を^1H-NMRスペクトルから求めたところ、総吸収線量、およびMMA濃度の増加とともにグラフト率は増加した。これに対し、線量率が増加した場合にはグラフト率は減少した。今回の一連の実験において到達した最大のグラフト率は0.73であった。得られたグラフトポリマーの気水界面における挙動を調べるために表面圧-面積等温線の測定を行った。PMPrSホモポリマーでは、高圧縮まで表面圧の上昇が見られず、水面上で3次元的に凝集した糸まり状になっていることが示唆された。一方、グラフトポリマーでは大面積から表面圧が上昇し、MMAユニットの分率に対して極限占有面積を求めたところ、その値はほぼ直線的に変化した。このことから、グラフトポリマーは、PMMA側鎖が気水界面に接して広がり、PMPrSが糸まり状に丸まった形態をとっていることが考えられる。この場合、各ポリマー鎖は凝集せず各々分離して水面上に広がっており、一種の単分子膜を形成していると言うことができる。以上述べたように、本研究によって、放射線グラフト重合を用いてポリシランに対して有効に化学修飾を行うことができることが明らかとなった。また、放射線グラフト重合により両親媒性を付与したポリシランが単分子膜を形成することが見出された。気水界面単分子膜は人工的な分子集積体として知られるLB膜の前段階であることから、種々のポリシランを用いて人為的な秩序構造の構築を行うための可能性が本研究により示された。本研究課題における初年度として以下のような成果を得た。側鎖にフェニル基を有するpoly(methylphenylsilane)(PMPS)および側鎖がアルキル基のみからなるpoly(di-n-hexysilane)(PDHS)を合成し、γ線照射に対する分子量の変化を調べた。その結果、PMPSについては分子量の大きな変化は見られなかったものの、PDHSでは分子量が顕著に減少することが見出された。PDHSの分子量低下の度合いは、吸収線量の増加に伴って大きくなっており、照射によって高分子鎖の切断が生じていることがわかった。試料の違いに基づく分子量変化の相違は、主鎖が炭素のみからなるポリマーについて従来より知られているように、フェニル基の保護効果に基づくものであり、耐放射線性を有するポリシランの選択の指針としては、炭素系ポリマーと同様の基準を適用できることがわかる。γ線照射によるポリシランの分解は照射雰囲気によっても影響を受けた。すなわち、真空中で照射した場合と比較して空気中で照射した場合はより大きく分子量が減少した。このことより、空気中の酸素がポリシランの分解に重要な役割を果たしていることがわかった。従って、放射線機能化に際しては、真空中で反応を行うことが必要となる。γ線照射に対するPMPSおよびPDHS吸収スペクトルの変化を調べたところ、切断に伴ってケイ素主鎖のσ共役に基づく吸収帯の吸光度の現象が認められた。この結果、ケイ素主鎖の切断を示すものであり、上に述べた分子量低下の結果と一致するものである。以上のように、γ線照射による化学修飾において、主鎖の分解を抑制するためには側鎖にフェニル基を有するPMPSを用いることが効果的であることがわかったので、次年度はこの結果に基づき、ポリシランへのグラフト重合についての研究を継続していく予定である。

PMPrSホモポリマーでは、高圧縮まで表面圧の上昇が見られず、水面上で3次元的に凝集した糸まり状になっていることが示唆された。一方、グラフトポリマーでは大面積から表面圧が上昇し、MMAユニットの分率に対して極限占有面積を求めたところ、その値はほぼ直線的に変化した。このことから、グラフトポリマーは、PMMA側鎖が気水界面に接して広がり、PMPrSが糸まり状に丸まった形態をとっていることが考えられる。この場合、各ポリマー鎖は凝集せず各々分離して水面上に広がっており、一種の単分子膜を形成していると言うことができる。以上述べたように、本研究によって、放射線グラフト重合を用いてポリシランに対して有効に化学修飾を行うことができることが明らかとなった。また、放射線グラフト重合により両親媒性を付与したポリシランが単分子膜を形成することが見出された。気水界面単分子膜は人工的な分子集積体として知られるLB膜の前段階であることから、種々のポリシランを用いて人為的な秩序構造の構築を行うための可能性が本研究により示された。