hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
継続治療を受けている肺がん患者のセルフケア促進に関する基礎的研究

がんに対する死のイメージは過去のものになりつつあるが、年々増加の一途をたどっている肺がんは難治性であり、患者・家族にとって大きな脅威や苦痛となっている。このような肺がん体験者が治療効果や生存率を越えたところで、治療の初期段階から自らの健康問題に主体的に取り組めるよう支援していくことががん看護の大切な役割であると考える。そこで、本研究では継続治療を受けている肺がん患者のセルフケア状況とその要因を記述することを目的とした。肺切除術後と終末期で痛みのある患者を対象にデータ収集した結果以下のことが明らかとなった。1.術後肺がん患者のセルフケア状況として《セルフケアの動機づけ》《セルフケアの方向付け》《セルフケアの実現》および《セルフケアの寄与因子》の4つのカテゴリーが導き出された。《動機づけ》には、<楽観視できない将来予測><自分と家族の人生を変える出来事>などのサブカテゴリーが含まれており、この状況評価が意図的行為を発動させる理由になっていると捉えられた。《実行》には、<呼吸機能を鍛える><身体の変化に注意を払う><再発の不安をコントロール><生活環境から再発のリスク要因の排除>などが導き出された。《寄与因子》には<医療者との信頼関係><ソーシャルサポート><身体的苦痛の程度>が考えられた。2.終末期肺がん患者の痛みに対するセルフケアでは、上記の4つのカテゴリーに加えて《セルフケア能力低下の自覚》のカテゴリーが導き出された。これには<息切れしやすくなった自分>や<判断力が低下した自分>があり、徐々に健康状態が悪化する終末期患者特有のカテゴリーであると捉えられた。《セルフケアの実行》には、<医療者と一緒に鎮痛計画の作成><自分のやり方で痛みを緩和>など、低下するセルフケア能力との兼ね合いの中で痛みの緩和に自助能力を働かせている状況が明らかとなった。がんの病名告知状況とその結果に対する遺族の納得に関する調査では、患者の曖昧な情報提供と患者が病名に漠然と気づいていることが遺族の納得に影響していることが明らかとなった。本年度は、肺がん患者のセルフケア状況とセルフケア遂行に関わる要因を明らかにすることを目的に、化学療法を受けながら入退院を繰り返している患者を対象に調査している。面接法を中心にして、1.自分の健康状態の認識、2.健康や幸福の回復・維持のための意志決定、3.健康のために実施している行動などについてインタビューを行っている。データ収集の途中であり、最終的な分析結果が得られていないが、11名の患者(1名の面接回数1-5回)から得られたデータから、患者のセルフケアのカテゴリーとして以下の7つの傾向が示されている。1.<体力の維持>であり、「残っている肺は使わないと余計ダメになる」との認識によって呼吸回数を見ながら運動したり、食事内容への注意、無理をしないなどがあった。2.<状態悪化の徴候の監視>対象者は全員自分が肺がんであることを認識していた。ちょっとした痛みや体重減少に敏感に反応し、受診したり医師に相談していた。CTや血液検査の結果も現在の状態把握の指標にしていた。また、痰が詰まって呼吸ができなくなったときの対処方法を考えている人もいた。3.<苦痛症状のコントロール

>鎮痛剤を指示通りに内服したり、痛みを記録し、受診時に医師に示して鎮痛剤の増量を求めていた人もいた。4.<治癒・状態改善への取り組み>癌の縮小を期待して化学療法を積極的に受けたり、様々な民間療法を取り入れていた。5.<日常生活の常態化>化学療法に伴う不快感や倦怠感があっても、孫の世話や家事、趣味の継続をすることで、いつもの自分を取り戻そうとしていた。6.<外観の調整>カツラやできるだけおしゃれをすることで脱毛や病気を持っていることの心理的負担を軽減しようとしていた。7.<気分のコントロール>人との接触で生きる充実感を高めたり、気功や書物で自らを鼓舞し、死の不安やイライラの軽減をしていた。なお、患者のセルフケアには家族の存在が重要な意味を持っており、目下アンケートにより家族がセルフケアにどのような影響を持っているかについても調査中である。肺がんに対する治療は、非小細胞かんでIIIA期までは外科的手術が第一選択となることが多い。しかし、術後は肺容量や肺血管床が減少することで、活動量の制限をきたしたり、がんであることによる不安や恐怖のために、心身両面から継続した健康管理が重要となる。そこで今年度は、手術療法を受ける肺がん患者を対象に、肺切除術を受けた患者のセルフケア状況とセルフケア行動に関与している要因を明らかにすることを目的に調査している。参加観察と面接法により、1)自分自身の健康に対する関心、2)健康管理に示している患者の意志決定、3)患者がとっているセルフケア行動、4)セルフケア行動に関与している要因などについて、術前から退院後半年までに2・3回インタビューを行い、質的帰納的分析方法により分析する。現在対象になっている患者は18名で、平均年齢は64±10.7才、男性9名女性9名、開胸による肺切除術8名、胸腔鏡下による肺切除術10名である。18名中1名がIIIA期で、術後放射線療法と化学療法を行っているが、他はI期あるいはII期で補助療法は行われていない。術前は、全例ががん告知を希望し、"自・分の健康の異変と向き合う"ことをしていた。全例に病名、がんの進行状況、手術による治療効果、手術リスク、術後の身体機能の変化等が伝えられ、ほとんどの患者は「手術は先生を信頼して任せるしかないけど、自分でできるところは精一杯努力しておきたい」と、呼吸練習や体力維持のための階段昇降を実施し、"専門家の治療力を受け入れる""手術に向けて体調を整える"ことをしていた。術後は術式による相違があるが、術後FVCl147±173.3ml、%VC41・7±6.6%の減少が見られ歩行時の息切れや疲労感、筋肉痛などを自覚していた。医師からの手術で変化した身体機能に関する情報と自覚症状を重ね合わせて、“手術による身体機能の変化を認識"し、ネアライザーや呼吸練習などの“処方された治療を遂行"し、階段昇降や買い物など"身体と相談しながら活動量の拡大"を図っていた。また、同じ病気体験の患者と意識的に交流し、"健康状態を監視する情報の獲得"をしていた。現在は症例を増やすと共に、退院後のセルフケア状況に関するデータ収集を進めている。
アルファ核種標識RGDを用いた難治性膵癌に対するペプチド受容体放射性核種療法

近年、ペプチド受容体放射性核種療法(PRRT)が、新たながん治療法として注目されている。中でも、アルファ線核種(アクチニウムー225)で標識した225Ac-PSMA617は前立腺癌に対して劇的な治療効果を示した。本研究では、RGDペプチドを利用したTargeted Alpha Therapyの可能性について検討を行う。本年度は、DOTA-E[c(RGDfK)]2へ225Ac標識を行った。東北大学金属材料研究所アルファ放射体実験室で233Uから225Acをイオン交換樹脂カラム法で分離した。この225Ac溶液からFe担体を化学分離した。その後、溶離液を蒸発乾固させ、国立がん研究センターに移送し、実験に用いた。酸性条件下(pH6)又は、アルカリ条件下(pH9)、95°C、反応時間1560分にて標識を行った。標識の確認には薄層クロマトグラフィー又はHPLCにより行った。その結果、標識率約50%程度で225Acの標識に成功した。しかし、インジウムで標識した際には、標識率が90%以上であることから、今後さらなる標識条件の改善が求められる。また、フローサイトメトリーにより、膵癌のがん幹細胞マーカーの一つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の同定を行った。その結果、BxPC-3やCapan-1で高発現が認められた。今後は、225Ac-DOTA-E[c(RGDfK)]2を用いた治療実験や副作用評価を行っていく予定である。計画通り、225Acの標識に成功し、膵がん細胞株(5種)におけるALDHの同定を行うことができた。昨年度に引き続き、225Ac標識率の向上に向けた取り組みを続ける。また、225Acに代わり、111In-DOTA-E-[(cRGDfK)]2を用いて、膵癌移植マウスにおける体内動態や腫瘍集積性の検討を行うことにより、DOTA-E-[(cRGDfK)]2の体内動態を把握する。計画的に実験が進み、効率よく試薬を使用することができたため。実験動物(ヌードマウスなど)や細胞培養に必要な試薬や血清などの購入に使用する。
特殊透過現象を用いたサブ波長構造光学デバイスの研究

本研究の目的は、金属サブ波長構造配列を用いた、光学デバイスを試作評価することである。前年度に引き続き、(1)サブ波長構造デバイスの性能評価(2)新しいサブ波長構造デバイスの設計と試作評価(3)光学デバイスの集積化に関する検討を平成23年度に行った。(1)サブ波長構造デバイスの性能評価金属材料としてパラジウムを選択し、パラジウムの水素化について誘電率の分散性を考慮しLorentz-Drudeモデルのパラメータフィットを行った。構造形状については、電波領域におけるアンテナの考え方を応用し、Frequency-Selective-Surfaceと呼ばれる構造配列を用いることとした。光学パラメータの変化に対して、サブ波長構造が形成する伝搬定数のTransparent-Windowが作用することを示した。(2)新しいサブ波長構造デバイスの設計と試作評価近年の論文で提案された新しい構造試作法(高アスペクト比ナノフィン構造)について、サブ波長構造デバイスへの応用を検討した。具体的には、光を増強した際の電場の増強効果について注目し、Poyinting-Vectorを用いた構造形状と波長の関係性について明らかにした。また、試作評価については、紫外-近赤外分光計を用いて、高アスペクト比ナノフィン構造の反射スペクトルを計測した。結果として、光学解析結果と実験結果がよく一致することを示した。(3)光学デバイスの集積化に関する検討光学デバイスの集積化に関する検討を行った。これまでに試作したサブ波長開口配列は赤外領域の光を用いるため、光源やディテクタの小型化が困難である。しかし、高アスペクト比ナノフィン構造は、紫外-近赤外領域において動作するため、比較的、光源やディテクタの小型化、集積化が容易である。サブ波長構造デバイスのうち、サブ波長ホールアレイにおける異常な透過現象について、子細な検討を行い、伝搬定数と透過波長の関係を実験とともに示した。また、新規の構造体として、ナノアンテナやナノフィン構造について、実験および解析が順調に遂行できたため。本研究課題については、種々の構造の検討を行った。今後は電場の増強効果を用いて、光化学分野へ展開したいと考えている。

サブ波長構造デバイスのうち、サブ波長ホールアレイにおける異常な透過現象について、子細な検討を行い、伝搬定数と透過波長の関係を実験とともに示した。また、新規の構造体として、ナノアンテナやナノフィン構造について、実験および解析が順調に遂行できたため。本研究課題については、種々の構造の検討を行った。今後は電場の増強効果を用いて、光化学分野へ展開したいと考えている。
局所麻酔薬センサーの開発

1.局所麻酔薬電極:膜組成は局麻薬とのイオンペア-、可塑剤、基剤、溶媒を混合、銅線に被覆し作成した。参照電極は銀/塩化銀電極で、ダブルジャンクション型にして等張食塩水を液絡部とした。直径50μmの微小センサーも開発した。2.電極感度:5x10^<-7>10^<-2>Mの濃度範囲で約57mV/decadeを示し、検出限界は10^<-8>Mであった。pHの影響はブピバカイン以外はHenderson-Hasselbalchの式に従うカチオン型濃度変化に対応した。温度変化はネルンスト勾配に影響するが、安定性は変わらなかった。3.電極電位への各種因子の影響:イオン強度の影響はなかった。疎水性局麻薬の電極は、試料溶液中の他種の局麻薬の影響を受けにくく、逆に溶液中の局麻薬の疎水性が高いものほど電極電位に影響するという理論に忠実な結果が得られた。筋弛緩薬に対して電極が反応した。センサーに対する筋弛緩薬の選択係数は検討中である。4.アルブミンとの相互作用:電極電位への影響はなく、局麻薬との結合による遊離局麻薬濃度の減少に伴う電極電位変化から、結合定数を簡単に求めることができる。局麻薬の代謝産物の影響:リドカインの生体内代謝産物は約1/10の電位を示した。MEGXや水酸化リドカインの選択係数は1x10^<-0.6-0.8>であった。局所麻酔薬電極のイオン選択膜の適性組成と電極電位応答の反応性、耐久性及び血液構成成分と生体での電極電位応答を検討した。1.局所麻酔薬電極のイオン選択膜組成:局麻薬の塩酸塩とテトラフェニル硼酸とのイオンペア-、可塑剤としてのフタル酸ジオクチル、基剤であるポリ塩化ビニルおよび共通溶媒テトラヒドロフランを5mg,100mg,110mg,1.5mlとするのが最適であった。この溶液を銅線に被覆し電極を作成した。生体内留置用電極(0.4mm^φ)においても電位応答の反応性、耐久性に問題はなかった。2.参照電極作製:銀/塩化銀電極で、生体条件下での測定に備えダブルジャンクション型にして等張食塩水を液絡部となるようにし、安定した電位が得られた。反応性は、5x10^<-5>10^<-2>Mの濃度範囲で約57mV/concentration decadeに示し、検出限界は10^<-6>Mであった。pHの影響はブピバカイン以外はHenderson-Hasselbalchの式に従うカチオン型濃度の変化に対応した。温度変化は室温37°C付近で調べたところネルンスト勾配のみに影響し、安定性は変わらなかった。3.電極電位応答に及ぼす各種因子の影響:試料溶液のイオン強度は影響しなかった。術中に用いられる薬物も、局麻薬間相互の影響以外は問題なかった。電極を構成する局麻薬が疎水性が高いものほど、試料溶液中の他種の局麻薬の影響を受けにくく、逆に溶液中の局麻薬の疎水性が高いものほど電極電位に影響するという理論に忠実な結果が得られた。4.アルブミンとの相互作用:アルブミンそのものは電極電位にほとんど影響せず、局麻薬とアルブミンの結合による遊離局麻薬濃度の減少に伴う電極電位変化から、結合定数を簡単に求めることができ、この方面での新たな応用が考えられた。局所麻酔薬イオン選択性膜の被覆電極を開発し、家兎血管内に留置した電極によるリドカイン(Lid)の血中濃度の連続測定が可能となった。本年度では電極法で得られた結果を高速液体クロマトグラフ法と比較し、さらにリドカインの代謝産物の電極電位に及ぼす影響を検討した。日本白色家兎を用いウレタン麻酔人工呼吸下に実験を行なった。電極を大腿動脈より挿入し、センサー部を腹部大動脈内に留置いた。参照電極は腹部皮下に置いた。

電極間電位はポテンシオメーターにより測定し、連続記録した。リドカインは耳静脈より投与した。リドカイン濃度は使用家兎の血清を使用して検量線を作成し、測定された電位差を血清リドカイン濃度に換算した。電極法によるリドカイン血中濃度は投与後約15秒で最高濃度を示し、以後指数関数的に減少した。リドカイン投与5,10,30分後の電極法とHPLC法の濃度はほぼ同一の値を示した。原理的に電極法ではイオン化したリドカインのみに反応する。しかし、検量線を家兎血清において作成しているため、結合型をも含めて換算されているので結果的にはHPLC法と同様の結果が得られたものと考えられる。リドカインは生体内代謝により、脱エチル化されたり(MEGX)水酸基が添加されたりする(水酸化リドカイン)。電極でそれぞれの溶解液の電位を測定すると約1/10の電位を示し、1×10^<-0.6-0.8>という選択係数が得られた。この結果は本電極によりLid濃度を過大評価する可能性が示唆された。以上の結果から、さらに本電極法とHPLC法間に高い一致をみるには、本電極のイオン選択性、検量線作成方法などに課題を残すことがわかった。・生体応用臨床実験グループは実験動物への生体応用を行なった。血中濃度の高速液体クロマトグラフとの比較検討の結果、電極電位からの濃度計算は従来家兎血漿にて行なっていたが生食における検量線で得られた結果と次元が一致することが判明した。このことは、測定対象の血液採取後電極の電位-濃度検量線をその都度作成する必要性がないことを意味し、測定がより簡潔になろう。一方、以下の問題点が生じた。すなわち、生体内に存在する主なイオンに対する電極のイオン選択性には問題がなかったが、実験動物において生体内応用の際に並行して投与した筋弛緩薬に対して電極が反応した。4級アミンと3級アミンの差異があるものの、イオン化物質を感知するという測定原理から首肯できる結果であった。このため、臨床応用に際して、併用薬剤との電極電位への影響を除外するため、電極組成の再検討が必要であることが判明し、現在継続して検討中である。・高感度電極の開発リドカインの臨床有効濃度は10^<-5>Mのオーダーである。従来の電極では測定下限であったため、電極組成の改良により10^<-7>Mまでネルンスト応答が得られた。家兎動静脈内留置により、同時に血中濃度が測定され、5mg/kgのリドカイン静脈内投与により、10^<-5>Mのオーダーを示した後60分後には10^<-7>Mに減少するまで連続測定が出来た。・微小電極開発局所麻酔薬の作用機序解明のため、イカ巨大神経を使用して細胞内外のリドカイン測定の計画がある。そこで、神経軸索内に留置する微小電極を試作した。直径50mmのセンサーを試作し、10^<-7>M10^<-2>Mの濃度範囲でネルンスト応答を示した。
肝再生能力を有するヒトｉＰＳ細胞由来胆管上皮細胞を用いたヒト化肝臓マウスの作製

マウス肝臓細胞をヒト肝臓細胞へと置換させたヒト化肝臓マウスの作製には良質な細胞源の確保が必要となる。本研究ではヒト化肝臓マウスを作製するための細胞源として胆管上皮細胞に着目した。まずマウス肝蔵より単離した胆管上皮細胞を肝傷害モデルマウスに移植することで、その肝再生能力を検証した。更に、ヒトiPS細胞より誘導した胆管上皮細胞を用いてヒト化肝臓マウスの作製を試みた。その結果、正常時の胆管上皮細胞に肝再生能力は認められず、ヒトiPS細胞より誘導した胆管上皮細胞についても同様の結果となった。これらの結果より、胆管上皮細胞はヒト化肝臓マウス作製のための細胞源としてふさわしくないことが示唆された。初年度の研究において当初ヒト化肝臓マウスを作製するための細胞源として想定していたヒトiPS細胞由来胆管上皮細胞が、生体内における肝再生能力を持たないことを確認した。これを受けて研究内容の大幅な軌道修正を行い、ヒトiPS細胞に限らず、肝再生能力を有する培養細胞のスクリーニングを行った。検討の結果、ヒト肝癌細胞株の一種であるHepaRG細胞に肝再生能力があることを見出し、これを報告した(Higuchi et al., Xenobiotica, 2013)。HepaRG細胞を肝傷害モデルマウス、TK-NOGマウスに移植し、その生着性を検討したところ、移植したHepaRG細胞は生体内において肝実質細胞、もしくは胆管上皮細胞からなるコロニーを形成した。HepaRG細胞由来肝実質細胞では薬物代謝関連因子(CYP3A4、MRP2)の発現も確認され、生着率の高い個体では血中へのヒトアルブミン放出も観察された。これらの結果はHepaRG細胞がヒト化肝臓マウス作製のための細胞源として有用であることを示している。HepaRG細胞はライン化された培養細胞株であり、試験管内で容易に増やすことが出来る。これを用いて均質なヒト化肝臓マウスを安定生産することが出来れば、ヒト肝臓疾患や薬物代謝に対する非常に再現性の高いin vivo評価モデルを提唱することが出来る。今後の課題としてマウス肝臓中に移植したHepaRG細胞の生着率向上が挙げられる。細胞移植の方法や肝傷害モデルマウスの改善を行うことで、より置換率の高いHepaRG細胞由来ヒト化肝臓マウスモデルを作成する技術を確立したい。本研究は肝再生能力を有する胆管上皮細胞をヒトiPS細胞より誘導し、これを用いてヒト化肝臓マウスを作成することを目的とする。平成24年度の研究計画として1ヒト化肝臓マウスからのヒト胆管上皮細胞単離と肝再生能力の確認、2ヒトiPS細胞より胆管上皮細胞を分化誘導する培養系の確立を行った。1の前検討としてマウスの肝臓より、胆管上皮細胞を単離する技術を確立した。胆管上皮細胞のマーカーであるEpCAM分子を指標として磁気ソーティングを行ったところ、胆管上皮細胞を効率よく単離することに成功した。この技術を既存のヒト化肝臓マウスに応用し、摘出したヒト化肝臓マウス肝臓よりヒトEpCAM陽性の胆管上皮細胞を単離した。これを肝傷害マウスにシリアル移植して肝再生能力を検討したところ、コントロール(未濃縮細胞群)に対して著しい生着率の上昇は見られず、当初の研究仮説とは異なる結果となった。2については既報の無血清分化誘導法(Nakamura et al., Cellular Reprograming 14 171-185, 2012)をもとに、0.5M EDTA処理によって効率よく胆管系譜への分化を誘導する方法を確立した。胆管系譜への誘導を行った群では細胞の形態が繊維状に変化し、既知の胆管マーカー遺伝子を発現していた。これらの細胞について肝傷害マウスへの移植を試みたところ、肝臓への生着は見られたが正常な肝実質、胆管様の構造は形成されず、期待された肝臓再生能力は確認できなかった。研究計画自体は当初の予定通りに進捗している。しかし得られた結果が全てネガティブであるため、当初の作業仮説をもとに作成した研究計画に沿って研究を行っても、最終目標であるヒトiPS細胞からのヒト化肝臓マウス作成を達成することは非常に困難であると思われる。したがって、本年度の研究方針については大幅な変更を行い、改めて目標達成を目指す。昨年度中に肝再生能力を示さないヒトiPS細胞由来肝臓細胞と、肝再生能力を示すヒト肝臓細胞においてマイクロアレイ解析を行い、その遺伝子発現パターンを比較した。結果、ヒトiPS細胞より誘導した肝臓細胞の遺伝子発現パターンは胎児期の肝臓細胞に近く、成人の肝細胞と比較しても未熟な段階にあることが推測された。

この結果をもとに、ヒトiPS細胞由来肝細胞において発現量の少ない遺伝子をスクリーニングし、それらを強制発現することで肝細胞の成熟化が誘導されるか、また肝傷害マウス生体内における肝再生能力の獲得が見られるかを検討する。また別検討として、ある種の肝臓癌細胞に、生体内における肝再生能力があることを見出した。同細胞を肝傷害マウスに移植すると肝実質、胆管様の構造を形成し、肝実質様細胞では代謝酵素等の発現も確認された。現在のところ生着率の低い点が問題となっているが、上記マイクロアレイ解析等の結果も参考に、同細胞を遺伝子改変することで生着率の向上が見られるかを検討する。後述した肝臓癌細胞については当初の研究計画中には記載のない細胞であるが、ライン化され試験管内での維持培養が可能であるという点で、ヒト化肝臓マウス作成のための細胞源として非常に魅力的である。この細胞の特性を明らかに出来れば、その情報はヒトiPS細胞を細胞源とするヒト化肝臓マウスの作成研究にもフィードバックすることが出来る。本年度はこれらの解析、検討を進めることで、研究目標の達成を目指す。本年度の研究内容は各細胞における遺伝子の強制発現、およびノックダウンが主となる。したがって、それに伴うベクターの購入や、分子生物学実験の消耗品、細胞培養実験の消耗品等購入に研究費を使用する。
経穴刺激前後の自律神経活動の変化を指標としたつわり症状に有効な経穴の探索

妊娠初期のつわり症状は妊婦のQOLを低下させる要因であるが、有効な対策は明らかではない。つわりの重い妊婦は副交感神経活動が亢進していることや経穴刺激が自律神経活動を変化させることから、妊娠初期の妊婦に対して経穴刺激を行い自律神経活動の変化を観察する。その結果つわり症状に効果的な経穴を特定することができれば、つわり症状軽減に向けた対策に繋がると考えた。本研究の目的は、1つわり症状の経時的変化と自律神経活動との関係を明らかにすること、2経穴刺激前後の自律神経活動の変化からつわり症状に効果がある経穴を特定すること、3特定した経穴刺激の効果を明らかにすることである。
IPMN併存膵癌の分子生物学解析に基づく膵癌早期診断法の開発

IPMN併存膵癌の切除標本を用いて、MUC染色による亜型分類とGNAS変異に注目した分子生物学的解析を行ったところ、併存膵癌はMUC2陰性の胃型、GNAS野生型のIPMNに高頻度に合併していた。また十二指腸液を用いた解析ではIPMNのGNAS変異を90%以上の感度で同定することができた。GNAS野生型のIPMNを膵癌高危険群として重点的な経過観察を行うことで膵癌を早期に診断できる可能性が示唆された。また病変のGNAS/KRAS変異解析はIPMN併存膵癌とIPMN由来浸潤癌の鑑別にも有用であることが示された。IPMN併存膵癌20例(26病変)を含む179例のIPMN切除標本を用いて、MUC染色による組織亜型分類とGNAS変異に注目した分子生物学的解析を行ったところ、併存膵癌の90%はMUC2陰性の胃型IPMNに合併していた。また6例でIPMN(胃型5例、腸型1例)と併存膵癌のGNAS変異を調べたところ、併存膵癌6病変と胃型IPMN5病変にGNAS変異は認めず、腸型IPMNの1例のみにGNAS変異を認めた(Ann Surg 2013)。また併存膵癌は分枝型IPMNに合併することが圧倒的に多いと報告されていたが、3例の主膵管型IPMNに併存膵癌を認め、これらはいずれもMUC2陰性・胃型で、GNAS変異を認めなかった(Ann Surg 2014)。すなわちMUC2陰性・胃型でGNAS変異を認めないIPMNが分枝型、主膵管型を問わず併存膵癌合併の高危険群の可能性が高いと考えられた。さらに症例数を110例に増やして、併存膵癌を合併しないIPMNとのGNAS変異の頻度について比較したところ、併存膵癌はGNAS野生型のIPMNに高率に合併することが分かった。多変量解析でも胃型、GNAS野生型のIPMNに併存膵癌が有意に合併することから、この2つの因子も持つIPMNが併存膵癌発生の危険因子であるといえる(submitted data)。胃型、GNAS野生型を術前に診断し、膵癌発生高危険群に対して重点的に検査を行えば膵癌を早期に診断できる可能性がある。術前にERCP下に採取した膵液サンプルと切除IPMNのGNAS変異の一致率を調べたが、一致率は50%未満であった。従って膵液サンプルでの膵癌合併予測は困難であると思われた。GNAS遺伝子変異は膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas, IPMN)に特異的であるが,通常型膵癌合併IPMNにおけるGNAS変異の意義は明らかではない。そこで当該科で切除を行った110例のIPMN(通常型膵癌合併16例を含む)を対象に,マクロダイセクションで採取したIPMN腫瘍細胞のGNAS codon 201における変異をSanger法,High-resolution-melt-curve解析,competitive allele specific TaqMan PCR (castPCR)法で解析し,臨床病理学的因子との比較を行った.また術前ERCPの際に採取した23例の十二指腸液(通常型膵癌合併4例を含む)のGNAS遺伝子変異解析をcastPCR法で行った。通常型膵癌合併IPMNでは非合併IPMNと比較してGNAS遺伝子変異率が有意に低かった(4/16, 25% vs 61/94, 65%, P=0.0047).多変量解析ではGNAS遺伝子変異なし(P=0.0007)と胃型IPMN(0.049)が通常型膵癌合併の独立危険因子であった。十二指腸液では23例中11例でGNAS変異が検出され,切除組織とは21例(91%)でGNASの状態が一致した。4例の通常型膵癌合併例のうち3例で十二指腸液と切除組織の両方でGNAS遺伝子変異を認めなかった。以上の結果から、通常型膵癌はGNAS変異のないIPMNに合併する頻度が高く,十二指腸液のGNAS遺伝子変異解析はIPMN患者の中から通常型膵癌を合併する高危険群を検出するのに有用である可能性が示唆された。十二指腸液を用いることでIPMNのGNAS変異の状態を高い感度で同定できることができたため、膵液を用いた解析は必ずしも必要ではなくなった。さらに本研究で行うべきことは十二指腸液を用いたGNAS変異検出キットの開発と、網羅的遺伝子解析(マイクロアレイ)による併存膵癌の発癌過程の解明である。特に網羅的解析についてはすでにサンプルを抽出して解析を始めている段階であるので、概ね順調に進んでいる。

27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学GNAS変異の解析は蛋白質マーカーの解析とは異なり、キット化しにくい。従ってGNAS変異により異常発現をきたす蛋白質マーカー、あるいは別のマーカーの解析を行い、キット化に適したマーカーの検索を行っていく。これまでIPMN、IPMN併存膵癌を含む200例以上の十二指腸液の保存検体があるので、これを利用する。測定の多くはELISA法を用いることになる。網羅的解析についてはClonal Evolutionの概念を用いてIPMNのheterogeneityのそれぞれの部位からサンプルを抽出し、同一膵に発生した併存膵癌からもサンプルを抽出し、同じ細胞を起源としているのか、別の細胞から個別に発生してくるものなのかを検証する。マイクロ・マクロダイセクション法で組織を抽出し、total RNAを抽出しmRNAの網羅的発現解析を行い、候補遺伝子マーカーを絞り込んでいく。候補マーカーのvalidationは、免疫染色法, ELISA法あるいはWestern blot法による蛋白の発現解析により行う。平成25年度に行う予定の実験は1 .同一膵内に発生したIPMNと併存膵癌の分子生物学的マーカー解析、2.膵癌非合併IPMN、IPMN非合併膵癌の分子生物学的マーカー解析、3.網羅的遺伝子解析(マクロアレイ)による併存膵癌の発癌過程の解明の3項目であった。1と2は上記の研究実績の概要部分で述べた通り一定の成果が得られた。その流れから3.は行わずに、平成26年度以降に予定していた膵液中の分子生物学的マーカー解析と切除標本の対比を先に行うこととした。現在、その解析途中であり、研究の進行が若干遅れている。研究計画はおおむね順調に進展しており、資金を有効に使用できたため。GNAS変異の検索が膵液サンプルで十分に行えない可能性が高いため、十二指腸液サンプルで代用することを検討する。米国Johns Hopkins大学では十二指腸液内のGNAS変異を検出する方法を開発しており、それに準じた方法を用いて解析を行う。また膵液による解析においてもMUC2発現の有無の解析は可能であると思われるため、GNAS変異とともに併存膵癌発生高危険群のもう一つの因子であるMUC2陰性・胃型の検出において膵液採取の意義を見出せるように研究を進める。具体的には膵液中RNAを抽出してRT-PCR法でMUC2 mRNAの発現解析を行う。また同一膵内のIPMNと併存膵癌の網羅的遺伝子発現解析(マイクロアレイ)を行うことで、併存膵癌の発癌過程の解明を目指す。マーカーとしての安定性やアレイに必要なサンプル抽出量の問題から、凍結切片よりtotal RNAを抽出し、mRNAの網羅的発現解析を行う。また比較対象として正常膵管、膵癌非合併IPMN、IPMN非合併膵癌の網羅的解析も併せて行い、候補遺伝子マーカーを絞り込んでいく。候補マーカーのvalidationは、免疫染色法あるいはWestern blot法による蛋白の発現解析により行う。さらにどの段階で遺伝子異常が併存膵癌とIPMNの違いを惹き起こすかを調べるために、同一膵内の正常膵管、PanIN-IIIIの多段階病変を病理組織学的に検索して、validationで発現に違いの見られたマーカーの発現解析を行う。この研究過程の中で膵癌発症高危険群の同定に有用な新たな診断マーカーの候補が見つかることも期待できる。
笑い話に注目した日本語ナラティブの「型」と「技」の地域比較

今年度はこれまでに収録したデータをもとに、ナラティブにおける談話構造について分析を行った。語りの構成要素はMaynard(1989)によると導入・背景説明・出来事語り・結末・評価・結句というようになっており、関西地方の話者による語りでは、出来事語りの内部に出来事の「説明」・場面の展開での「遭遇」・それに対する話し手の心理的「反応」という構造が繰り返し現れていた。しかし、東北地方(山形)の話者による語りでは、Maynardのいう構造は形成されており、その内部構造については場面の展開での「遭遇」についても数は少ないが現れていたが、関西地方の話者のものとは異なり、一つ一つの場面での遭遇したことへの「反応」に関する言及が見られなかった。また、「説明」「遭遇」(「反応」)の繰り返しが出来事語りの内部構造として繰り返されるということも見られず、「説明」が続くか、一度だけその中で「遭遇」が登場するというパターンが見られた。東北地方では関西地方での語りのパターン(型)が異なっているということが確認できた。中国地方(広島)の話者による語りでは、もちろんMaynardのいう構造は見られたが、その内部構造については、「説明」「遭遇」のパターンをとり、数多くないものの「反応」についての言及は部分的に見られた。また、「説明」「遭遇」(「反応」)を繰り返すパターンも、「反応」が常に現れるわけではないが、わずかではあるが出現することが確認された。これにより、中国地方では関西地方での語りのパターン(型)が部分的にも現れることがわかった。まず、既存の笑い話資料に基づく分析を実施した。これは研究を進めるうえで今後の分析項目を洗い出すために行うもので、しばしば体験談の中の会話の引用部分において、声の高さを変えたり、声質を変えたりすることで、想定される発話者の人物像の表現が行われていることが明らかになった。また、その時の人物像の表現は実際の話者の声そのものをまねているのではなく、話者の属性(例えばお年寄り)の人物像に基づく声の特徴(例えばゆっくり弱い声で話す)や役割語の使用(例えば、終助詞に「のう」を使用する)が見られた。この研究成果については、日本語文法学会第16回大会パネルセッションにおいて口頭発表を行った。次に、会話データの収録については東北地方において実施することができ、2名分約1時間のデータが収録できた。データについて会話構造を分析したところ、Maynard(1989)が挙げるような6つの構成要素(Prefacing, Setting, NarrativeEvent, Resolution, Evaluation, Conclusion)が見られたが、既存の笑い話資料のうち関西の女性によるものと比較すると、Narrative Eventの部分に見られる階層構造(説明・遭遇・反応)が希薄であり、起きた事象を時系列に基づいて語るということが見られた。まだ、2人分のデータだけでありこれを東北地方の語りの特徴として挙げるのは早計であるが、今後の調査を行ううえで注目すべきポイントを得ることができた。平成27年度開始直後に病気で倒れ、1か月間入院を余儀なくされた。また、退院後の体調が不良気味であったため、夏に向けての準備が遅れ、データ収録のためのインフォーマントの確保や収録の機会を十分にとることができなかった。そのため、データの収録は東北地方1件2名のみとなり、当初予定していた6名分の収録には至らなかった。また、関東地方での収録計画も立てることができず、データ収録が実施できていない。以上のことから、当初の計画通りのデータの収録が実施できておらず、また談話資料のコーパス化も代表者の手作業による一部のほかは実施できてない。以上のことから、本研究課題の進捗は遅れていると言わざるを得ない。東北地方において、本調査として会話データの収録を行った。2日間で4名分のデータを収録することができた。また、それて並行して補助調査として、広島でも会話データの収録を行った。こちらでは、2名分のデータを収録することができた。収録データの分析は現在もなお実施中であるが、現時点で判明したこととして、まず、擬音語・擬声語・擬態語や「わたし、『どうしようか』と思って」のような直接引用の出現が、関西地方の話者に比べて少なかったことが挙げられる。巷間では、関西地方では擬音・擬態語をよく使うといわれているが、「だーっ」「ばーっ」というような表現を用いることが少ないことが、東北、広島で言えることであった。また、「たら」「なら」といった表現の出現が比較的少ないことも分かった。これらの表現は出来事を語る場合、新たに遭遇した事態や出来事を導くものとされているが、これらを使った表現が関西地方の話者に比べて用いられる傾向が低いことが分かった。また、東北の事例では「たら」「なら」の出現が少ないわけではなかったが、後に現れる事態としては、予想外のことや驚くべき事態が登場することは少なく、おおかた予想できる事態の方が多かった。このことから、「たら」「なら」の談話的用法として、予想外のことや驚くべきこととの遭遇を導くという動機づけが少なく、出来事の展開として次の事態を導きという動機づけで使用されているのではないかという結論に至った。このことから、同じ形式の表現を用いるものの、談話的な動機づけとしては同じではない、つまり、東北地方では「たら」「なら」を使った表現が発話の型としては十分に確立されていないのではないかという意見を導くことができた。

研究の遂行、とくに実地調査を行うための時間が十分になく、年度末に急遽実施する形となってしまった。現状として、研究職員ではないので、非常勤講師としての責務を果たすことに追われていた。研究に対し十分な時間が取れなったことは誠に恥ずべきことではあるが、現実的に正規の研究職員でない状況では、最大限時間が確保できるよう努力しつつも、それに十分叶うことができないという状況があることは否めない。今後は、何とか時間を確保して研究、特に実地調査を行えるよう配慮していく方針である。今年度の研究は、昨年度までに得られた映像・音声データからの観察を中心に行った。その結果わかったこととして、東北地方では体験談を語るときにジェスチャーを交えて表現することが少なく、口頭で説明する傾向が強いことがわかった。これは関西地方の話者との比較によるものである。さらに、広島でのジェスチャーの出現度合いは、東北と関西の中間に当たるものであり、身体全身を使って話すという行為は西日本を中心に見られる傾向があることが予想される。逆に東日本では身体全身を使うというよりも、口頭で語ろうとする傾向があることが言えるであろう。もちろん、ジェスチャーの出現度合いは話者の個人差によるものもあると思われるが、少なくとも今回得られたデータではこのような結果になった。また、事態の展開を表現するような「そしたら」「そんなら」「(動詞)たら」という形式の出現について調査すると、東北地方の体験談ではその出現が少ないが、まったくないわけではないということが一昨年度に続いてわかった。さらに、「...たの」「...たんだよ」といた「のだ」形式が現れた場合、その次に「そしたら」等が現れることがいくつか見られた。そこから、東北地方では関西地方に比べて「そしたら」等の形式を使うことは少ないが、全くないわけではなく、「のだ」形式の文の後にこれらを使うことが見られるということがわかった。また、広島での「そしたら」等の出現は東北地方よりは多かったが、関西地方ほど多く現れないということもわかった。研究の遂行、とくに実地調査を実施するための時間が十分になく、年度末に1件実施するのが精一杯になってしまった。企業勤務および非常勤講師等において業務に追われることになり、ますます研究を十分に執行できない状況になってしまっていた。今年度はこれまでに収録したデータをもとに、ナラティブにおける談話構造について分析を行った。語りの構成要素はMaynard(1989)によると導入・背景説明・出来事語り・結末・評価・結句というようになっており、関西地方の話者による語りでは、出来事語りの内部に出来事の「説明」・場面の展開での「遭遇」・それに対する話し手の心理的「反応」という構造が繰り返し現れていた。しかし、東北地方(山形)の話者による語りでは、Maynardのいう構造は形成されており、その内部構造については場面の展開での「遭遇」についても数は少ないが現れていたが、関西地方の話者のものとは異なり、一つ一つの場面での遭遇したことへの「反応」に関する言及が見られなかった。
自家半月板砕片移植が半月板欠損部におけるin situ半月再生に関する研究

(目的)研究者らは、砕片化した家兎自家半月板移植が半月板大欠損部に線維軟骨組織を再生させることを発見した。しかしその機序は明らかではない。本研究では、家兎を用い、凍結解凍処理によって内在性細胞を死滅させた自家半月板マトリクス砕片移植と、自家半月板(内在性細胞+マトリクス)砕片移植の効果を比較することにより、内在性細胞移植とマトリクス移植の効果を分離して再生機序の解明を行うことである。(方法)日本白色家兎75羽を用い、右膝内側半月板前節に3x5mmの欠損を作製し、以下の3群に分けた。I群は、欠損部を筋膜で被覆しその中に砕片化した自家半月板を移植した。II群は、筋膜内に凍結解凍処理した自家半月板砕片を移植した。III群は何も処置を加えなかった。各群は3、6、12週で5羽ずつ屠殺し、肉眼的および組織学的定量評価を、各群6、12週で5羽ずつ屠殺し、引張試験による力学的評価を行った。統計解析には分散分析を用いた。(結果)1)肉眼的評価:いずれの時期においてもIおよびII群がIII群より有意に高値(p<0.01)であった。2)組織学的評価:6および12週でI群がIIおよびIII群より有意に高値(p=0.04)であり、II群はIII群より有意に高値(p<0.01)であった。3)力学的評価:12週におけるI群の最大破断荷重および線形剛性はII群のそれより有意に高値(p<0.01、p=0.02)であった。III群はIおよびII群より有意に低値であった。(考察)本研究では凍結解凍処理した自家半月板砕片移植による、半月板欠損部への効果は、自家半月板砕片移植に比べて組織学的にSafranin-Oの低染色性を示し、最大破断荷重および線形剛性においても有意に低値を示した。自家半月板砕片移植による半月板再生効果は、移植された半月板内在性細胞と細胞外マトリクスの両者の複合効果である可能性を強く示唆した。
免疫グロブリン様受容体PIR-Bによる好塩基球のサイトカイン産生制御機構の解析

好塩基球のTh2免疫応答サイトカイン産生における抑制型免疫グロブリン様受容体PIR-Bの関与について検討するため,PIR-B欠損マウス由来骨髄細胞より誘導したPIR-B欠損好塩基球を用いて解析を行った.その結果レトロウィルスベクターによる遺伝子再構成の実験系からPIR-BがIL-3誘導性IL-4産生を制御していることを見いだした.また,種々の変異型PIR-Bを用いた解析から好塩基球のIL-3誘導性IL-4産生機構にはこれまでに報告されていないPIR-Bの新たな免疫制御機構の関与が示唆された.好塩基球のTh2免疫応答サイトカイン産生における抑制型免疫グロブリン様受容体PIR-Bの関与について検討するため,PIR-B欠損マウス由来骨髄細胞より誘導したPIR-B欠損好塩基球を用いて解析を行った.その結果レトロウィルスベクターによる遺伝子再構成の実験系からPIR-BがIL-3誘導性IL-4産生を制御していることを見いだした.また,種々の変異型PIR-Bを用いた解析から好塩基球のIL-3誘導性IL-4産生機構にはこれまでに報告されていないPIR-Bの新たな免疫制御機構の関与が示唆された.本研究では好塩基球のTh2免疫応答サイトカイン産生における抑制型免疫グロブリン様受容体PIR-Bの関与について検討することを目的とした.これまでに好塩基球は,(1)休止期にはIL-3刺激にのみIL-4を産生するが,活性化時にはIL-3刺激には応答せずIgEクロスリンク刺激にのみIL-4を産生する.(2)活性化によりPIR-Bの細胞表面発現が上昇する.(3)PIR-B発現欠損好塩基球は野生型とは異なり活性化時にもIL-3刺激に応答してIL-4を産生するという結果を得ている.これら結果からPIR-BはIL-3依存的なIL-4産生経路への関与が示唆される.そこでレトロウィルスベクターによる遺伝子再構成の実験系を用い,PIR-B欠損好塩基球はPIR-Bの発現回復によりIL-3刺激によるIL-4産生が野生型と同様のパターンに回復することを確認した.さらに好塩基球のシグナル解析を行いPIR-B欠損好塩基球では野生型と比べてIL-3刺激によるSykのリン酸化が亢進することから,IL-3刺激により動員されるSykの活性化をPIR-Bが抑制することでIL-4産生シグナルを制御している可能性が示唆された.一方,PIR-Bの活性化制御機構は,その細胞内領域のITIMチロシンリン酸化部位へ動員される抑制性フォスファターゼSHP-1により活性化シグナルを抑制すると考えられているが,今回このITIMのチロシン残基を欠失させた変異型PIR-Bを発現させIL-4産生を検討したところ,野生型PIR-Bを発現させた好塩基球と同様のIL-4産生パターンであった.またPIR-BリガンドであるMHC-Iを欠損する好塩基球では野生型と同様のIL-4産生パターンであることから,好塩基球のIL-3刺激によるIL-4産生機構にはこれまでに報告されていないPIR-Bの新たな免疫制御機構が関与するものと考えられる.本研究では好塩基球のTh2免疫応答サイトカイン産生における抑制型免疫グロブリン様受容体PIR-Bの関与について検討することを目的とした.これまでに好塩基球は,(1)休止期にはIL-3刺激にのみIL-4を産生するが,活性化時にはIL-3刺激には応答せずIgEクロスリンク刺激にのみIL-4を産生する.(2)活性化によりPIR-Bの細胞表面発現が上昇する.(3)PIR-B発現欠損好塩基球は野生型とは異なり活性化時にもIL-3刺激に応答してIL-4を産生するという結果を得ている.これら結果からPIR-BはIL-3依存的なIL-4産生経路への関与が示唆される.そこで本年度は昨年度の結果をもとにさらに詳細な解析を行うため,レトロウィルスベクターによる遺伝子再構成の実験系を用い様々な変異型PIR-Bを発現させIL-4産生を検討したところ,細胞内領域を完全に欠失させた変異型PIR-BでPIR-B欠損好塩基球と同様にIL-4産生抑制作用が消失した.またPIR-Bの細胞外領域をCD4に置換した変異型PIR-Bを発現させるとIL-4産生抑制作用が低下した.よって好塩基球におけるPIR-BのIL-3誘導性IL-4産生はこれまで考えられていたPIR-Bの免疫抑制機構に依らない新たな機構が関与することを強く示唆している.一方,好塩基球におけるIL-3シグナルについてはIL-3刺激によりSykのリン酸化がPIR-B欠損細胞で亢進するもののSTAT5,ERK,JNK,P38など他のIL-3刺激の下流シグナル分子のリン酸化は野生型と同様の状態であった.よってPIR-BはIL-3誘導性IL-4産生特異的に作用していることが示唆された.
篩部伴細胞での遺伝子発現制御が植物体内の物質長距離移行に及ぼす影響の解析

本研究では,篩管内あるいは伴細胞内に存在するタンパク質の同定を進め,これらの伴細胞-篩管間移行および篩管内移行過程を明らかにすること、また,伴細胞特異的にこれらの発現レベルを変化させた形質転換植物を作成し,篩管内における目的タンパク質量の変化を明らかにし,このことに伴っておこる篩管転流の量的質的変化を追跡することを目的としている。1.伴細胞で発現させたタンパク質の篩管への移行過程の追跡----成熟葉で篩部伴細胞で強い発現を示すプロモーターであるイネチオレドキシンhプロモーターの下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子を連結し、これをイネに導入した。形質転換イネより、インセクトレーザー法により、純粋な篩管液を採取し、発現した外来タンパク質がどのくらいの濃度で篩管内に存在しているかを測定した。また、同じ植物の葉の可溶性タンパク質を抽出し、同様に導入遺伝子産物含量を求めた。あるタンパク質の篩管内濃度をそのタンパク質の葉での存在量で割った値は、このタンパク質が伴細胞から篩管への移行の程度を表す指標となると考えた(対象としているタンパク質は伴細胞に多く存在しているので)。この値を、内在性篩管タンパク質と比べると、外来タンパク質は有為に小さな値を持つことが分かった。このことは、内在性の篩管液タンパク質は、積極的に篩管内へ放出されていくことを示唆している。2.篩管タンパク質の同定と機能--篩管内に存在するタンパク質の同定は,インセクトレーザー法により得られた純粋な篩管液を大量に(1ml程度)採取し,そのタンパク質を2次元電気泳動で分離した後,それぞれのタンパク質のN端アミノ酸配列を明らかにする手法を用いた。これまで同定された篩管液タンパク質のうち、31kDaのタンパク質は、地上部の伴細胞と篩管に局在することが明らかになった。また、篩管内の方が、伴細胞よりも高濃度に存在していることが分かった。このことも1の結果と同様に、内在性の篩管タンパク質が積極的に篩管へ放出されていることを示唆している。以上の様に、伴細胞から篩管へのタンパク質の移行は、単なるリークではなく、より積極的な理由が存在していると考えている。また、GS, GOGATなどの窒素代謝関連酵素、アンモニウムトランスポーター遺伝子の維管束での発現解析も終了した。本申請研究では,篩管内あるいは伴細胞内に存在するタンパク質の同定を進め,これらの伴細胞-篩管間移行および篩管内移行過程を明らかにすること、また,伴細胞特異的にこれらの発現レベルを変化させた形質転換植物を作成し,篩管内における目的タンパク質量の変化を明らかにし,このことに伴っておこる篩管転流の量的質的変化を追跡することを目的としている。

1.伴細胞および篩管内タンパク質の同定-篩管内に存在するタンパク質の同定は,インセクトレーザー法により得られた純粋な篩管液を大量に(1ml程度)採取し,そのタンパク質を2次元電気泳動で分離した後,それぞれのタンパク質のN端アミノ酸配列を明らかにする手法を用いた。このことにより、分子質量10000Da,21000Da付近、31000Daの篩管液タンパク質のN末端アミノ酸配列を分析することができた。これらの成果に関しては、現在、その篩管内での活性の測定、発現部位の特定を行い、論文としてまとめる予定である。2.篩管液タンパク質cDNAおよび特異抗体の取得-得られたアミノ酸配列をもとにイネESTクローンを農林水産省より提供を受け、その遺伝子配列を決定し、遺伝子の構造を明らかにした。大腸菌内で得られたcDNAより組み換えタンパク質を作成しこれを用いて特異抗体を得ることに成功した.また,10000Daタンパク質に対する抗体を用いてこのタンパク質の局在性を調べたところ、まだ、シンクとして機能していると思われる葉の伴細胞に局在することが明らかになった。これらの研究成果をもとに、論文を製作中である。3.伴細胞特異的遺伝子発現制御-すでに,伴細胞特異的発現を示すプロモーターを取得しており,これを用いたイネ形質転換用バイナリーベクターも開発済みである.このプロモーターに,これまで取得されてきた伴細胞あるいは篩管タンパク質のcDNAをアンチセンス(あるいはセンス)方向に連結し,これをもちいてイネを形質転換した.これまでに認められていないような大きなタンパク質でも、伴細胞に発現させると篩管へ導入されることが明らかになった(論文作成中)。本申請研究では,篩管内あるいは伴細胞内に存在するタンパク質の同定を進め,これらの伴細胞-篩管間移行および篩管内移行過程を明らかにすること、また,伴細胞特異的にこれらの発現レベルを変化させた形質転換植物を作成し,篩管内における目的タンパク質量の変化を明らかにし,このことに伴っておこる篩管転流の量的質的変化を追跡することを目的としている。1.伴細胞で発現させたタンパク質の篩管への移行過程の追跡----成熟葉で篩部伴細胞で強い発現を示すプロモーターであるイネチオレドキシンhプロモーターの下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子を連結し、これをイネに導入した。形質転換イネより、インセクトレーザー法により、純粋な篩管液を採取し、発現した外来タンパク質がどのくらいの濃度で篩管内に存在しているかを測定した。また、同じ植物の葉の可溶性タンパク質を抽出し、同様に導入遺伝子産物含量を求めた。あるタンパク質の篩管内濃度をそのタンパク質の葉での存在量で割った値は、このタンパク質が伴細胞から篩管への移行の程度を表す指標となると考えた(対象としているタンパク質は伴細胞に多く存在しているので)。この値を、内在性筋管タンパク質と比べると、外来タンパク質は有為に小さな値を持つことが分かった。このことは、内在性の篩管液タンパク質は、積極的に篩管内へ放出されていくことを示唆している(一部論文作成中)2.篩管タンパク質の同定と機能篩管内に存在するタンパク質の同定は,インセクトレーザー法により得られた純粋な篩管液を大量に(1ml程度)採取し,そのタンパク質を2次元電気泳動で分離した後,それぞれのタンパク質のN端アミノ酸配列を明らかにする手法を用いた。これまで同定された篩管液タンパク質のうち、31kDaのタンパク質は、地上部の伴細胞と篩管に局在することが明らかになった。また、篩管内の方が、伴細胞よりも高濃度に存在していることが分かった。