hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
霊長類のゲノムデータを用いた近縁種間・種内多様性解析と保全生物学への応用

霊長類の保全生物学と種内の多様性研究のために、ヒトとアカゲザルのゲノム配列の比較から、変異性の高いイントロン領域をはさんだエクソンが両種で完全に一致している領域を抽出し、未解読の霊長類のDNA断片を増幅できる2303ペアのプライマーデータベース"Prim-Prim"を作成し公開した。これらのプライマーを用いて、主としてテナガザル6種の塩基配列決定を行い、これらプライマーの有用性を確かめた。霊長類の保全生物学と種内の多様性研究というふたつの目的のために、"Prim-Prim"というデータベースの設立を計画した。このデータベースは既知の霊長類ゲノム配列の比較から、未解読の霊長類のDNA断片を分子マーカーとして増幅させることのできる「霊長類ユニバーサルプライマー」を収める事を目標としている。研究代表者の斎藤の研究室に,16本キャピラリーの塩基配列自動決定装置を導入した。研究分担者の石田がシロテテナガザルとフクロテナガザル各10個体のDNAサンプルを提供し,それらを実験に用いた。なでにゲノム配列の解読が終了しているヒト(Homo sapiens)とアカゲザル(Macaca mulatta)のゲノム配列を比較し、変異性の高いイントロン領域をはさんだエクソンが両種で完全に一致している領域を抽出した。この中からPCRプライマーとしてのよい化学的性質を持つ部分配列を"Primer3"により同定し、これら2303組を「狭鼻猿類ユニバーサルプライマー」の候補配列として予測した。プライマー予測の妥当性を検証するためにこれらのうち10組を用いてヒト、チンパンジー(Pan troglodytes)、シロテテナガザル(Hylobates lar)、フクロテナガザル(Symphalangus Syndactylus)ゲノムDNAの増幅を試みた。その結果いずれのサンプルにおいても期待される塩基配列をもつDNA断片が得られたことが確かめられた。斎藤:昨年に続いてテナガザル2種(アジールテナガザルとフクロテナガザル)についてイントロン領域の配列決定を進めた。データベースPrim-Primで公開している2000箇所以上の候補領域のうち,すでに100種類の領域について,どちらの種でも塩基配列決定ができることを確認している。ただし,領域・個体によってはうまくDNAが増幅されない場合が若干存在する。ヒトゲノムとアカゲザルゲノムの比較から取り出されたイントロン配列,およびエクソン末端のPCRプライマー領域であるが,テナガザルはアカゲザルよりもヒトに系統的に近いとはいえ,分岐時間が1500万年以上なので,独自の塩基置換を蓄積したために,狭鼻猿ユニバーサルPCRプライマーとして設計したものが働かなかったものと思われる。塩基配列が決定できたものについては,これらを多重整列し,系統樹を作成したが,現在のところこれら2種間での過去の交雑を示唆するパターンはまだ発見されていない。石田:アジア産類人猿としてテナガザルに焦点を当て、その系統分類・社会構造解明のため、ゲノム解析を進めた。テナガザル4属のうち3属4種についてミトコンドリアDNA全長の塩基配列を決定し系統解析に用いると共に、種判別に有用な領域の探索をおこない、ND3-4部分を抽出した。これらの情報をもとに、日動水テナガザル国内血統登録台帳と対照しながら、国内保有のテナガザルの種判別を逐次おこなった。一方、新たな試料の創成については、非霊長類哺乳類を中心に20種の細胞・DNAを保存した。霊長類の保全生物学と種内の多様性研究というふたつの目的のために、"Prim-Prim"というデータベースを作成した。このデータベースは既知の霊長類ゲノム配列の比較から、未解読の霊長類のDNA断片を分子マーカーとして増幅させることのできる「霊長類ユニバーサルプライマー」2303ペアを収めている。すでにゲノム配列の解読が終了しているヒトとアカゲザルのゲノム配列を比較し、変異性の高いイントロン領域をはさんだエクソンが両種で完全に一致している領域を抽出した。この中からPCRプライマーとしてのよい化学的性質を持つ部分配列を同定し、これらを「狭鼻猿類ユニバーサルプライマー」の候補配列として予測した。これらのプライマー58対を用いて、主として石田が収集したテナガザル6種の36個体のDNAサンプルを用い、塩基配列決定を行った。配列決定は斎藤の研究室で実施した。現在これらの配列データを解析中である。結果を2010年9月に京都で開催される国際霊長類学会で発表する予定である。研究資材の開発・拡充については、各種霊長類のDNA・細胞に加え、広く哺乳類全般から試料を収集し、60生物種のリソースが作成できた。小型類人猿の系統分岐に関しては、属レベル、種レベル、亜種レベルで良い解像度を得られるよう、解析領域の選定をした。分子生態学・保全学への応用を念頭に、排泄物からのDNAを常染色体STRの解析に使えるよう条件設定をおこなった。以上は石田が担当した。
一般均衡における資産価格に不動産と人的資本が与える影響

本研究は、土地供給弾力性および消費選択特性が資産クラスの価格相関、資産選択、およびリスク・プレミアムにおよぼす影響について研究を進めることを目的としている.当該年度は、当初は研究計画に沿った研究実施を予定していたが,本研究のこれまでの成果等に基づき米ペンシルベニア州立大学より招聘をうけ,7月末で現行所属機関(東京大学)を退職する運びとなった。今後も研究自体は遂行する予定であるが,科研費の残額を返還する必要があるため,平成21年7月までの実績を報告するものである。7月までの短い期間ではあったが,精力的に研究を推進し,8件の雑誌論文公表と5件の学会発表を行った.また、論文一編を国際学術誌へ投稿した。特に、"International Conference on the US Economy, Policy Research Institute of the Ministry of Finance, Japan"では資産価格特性に関する研究に基づく発表を,住宅経済研究会では住宅を考慮した効用関数の推計結果に関する発表を,資産評価政策学会ではJ-REITデータに基づく家計の資産選択問題に関する発表を,東京都不動産鑑定士協会研研究研修委員会では取引価格データを利用した資産選択の研究についての発表を,日本ファイナンス学会においては不動産を本格的に組み込んだ金融研究についてのレビューを,それぞれ行った.また理論研究及び実証研究をさらに深化させており、そのために必要なコンピュータソフトウェア(Mathematica)、参考図書(和書および洋書)、データベース(TOREIT Property Database)等を購入した。理論的には、非対称の資本調整費用の導入、投資家の社会的責任投資選好の導入,数値解析及びカリブレーションによる定量分析を、実証的には先進国の株価及び住宅価格データの精査、J-REITの投資口価格及び投資不動産の詳細データの精査,家計の資産保有・住宅賃料・賃金・土地利用規制等のデータ収集である。本研究は、土地供給弾力性および消費選択特性が資産クラスの価格相関、資産選択、およびリスク・プレミアムにおよぼす影響について研究を進めることを目的としている。さらに、査読付論文を2編、査読なし論文を3編公表し、書籍の一章執筆を担当した。うち、国際学術誌であるInternational Real Estate Reviewに掲載された論文では、商業用不動産の価格及び供給量のマクロ特性を実証的に明らかにした。季刊住宅土地経済では、住宅価格の特性の基礎条件を理論的に検討した。書籍においては、不動産の価格と収益率に関して、環境や社会的責任に着目した場合の特性について、理論的及び実証的な研究を行った。また、論文一編を国際学術誌へ投稿した。また、理論研究及び実証研究をさらに深化させており、そのために必要なコンピュータ、ソフトウェア、記憶装置、参考図書、データベース等を購入した。具体的には、非対称の資本調整費用の導入、数値解析及びカリブレーションによる定量分析、先進国の株価及び住宅価格データの精査、家計の資産保有・住宅賃料・賃金・土地利用規制等のデータ収集のための作業である。
「とびはね音調」の実態とその機能の解明

首都圏において近年広まった新しい音調である「とびはね音調」の実態とその機能の一端を明かにした。従来、文末音調はアクセントに干渉しないとされてきたが、本音調はアクセントに干渉し、その下降を無効化することによって「同意求め」機能を獲得している。伝統的な上昇調の衰退に伴い、本音調は「問いかけ」機能も併せ持つようになりつつある。さらには、首都圏若年層を中心に、文末上昇を伴わないアクセント下降無効化のみによる「同意求め」機能をもつタイプが新たに広まりつつあることも確認した。全国でも本音調は、若年層に広く受容されつつあるが、地域的由来が「東京」であることによって、近畿では受容に否定的であることもわかった。2013年度は、調査データに基づく「とびはね音調」の受容にかんする分析ならびに研究成果の公開をした。これと並行して、文法的観点を導入した調査票の作成と音響的分析の指標にかんする検討を行った。調査データに基づく分析と研究成果は、大きくふたつある。いずれも2012年に実施した調査データである。成果のひとつは、「とびはね音調」が全国でどの程度・どのように受容されているのかについて全国聞き取りアンケート調査データに基づくもの、もうひとつは首都圏周辺部の埼玉県秩父市における「とびはね音調」の受容程度を面接調査で実施した調査によるもの。前者からは、全国平均値としては、1990年代の首都圏若年層並の6割程度に「とびはね音調」は受容されており、その用法もほぼ「同意要求」ととして受容されているというものであった。同音調が喚起する主要なイメージとしては、若者・都会で、これも1990年代の若年層調査結果と重なる。以上より、「とびはね音調」は1990年代首都圏若年層における単なる一時的流行ではなく、全国に広がりをもつものであるものであることが確認された。一方、地域・年代・性などによる属性差が観察され、全国一律に受容が進んでいるわけではないこともわかった。首都圏周辺部で実施した実際に発音をしてもらう調査による後者からも、若年層では「とびはね音調」を首都圏中心部同様の音調・用法にて広く受容しているいることが確認された。本研究の課題のひとつである文法的観点を導入した調査票の作成については、次のようなことを行った。まず、同意要求ならびに否定疑問文にかんする文献の収集を行い、それらを踏まえ、調査デザインならびに調査票文言等を検討した。次年度に対面調査が実施できるところまで準備を進めたことになる。これとは別に、音響的観点からの分析のための指標についても、専門家からのアドバイスなどを受け、分析準備を進めている。《研究実績の概要》研究第1年度となる2012(H24)年度においては、研究基盤の形成と全国における「とびはね音調」の受容状況を把握するための調査を企画・実施した。具体的内容は、次の(1)-(3)の通り。意義・重要性についてはそれぞれに示す。(1)PC、録音機器類、記録メディア等を購入し、研究基盤を形成した。同時に、関連する先行研究の精査とその収集を行った。【意義・重要性】企画・調査・データ収集・連絡に必要な機器類の購入をしたことにより研究基盤が形成された。また、音声・文法という異なる分野の関連文献リストを作成・収集することによって、共同研究者間の相互理解が深まった。(2)研究メンバーによる対面打ち合わせを春・秋の学会シーズンに行い、研究計画の確認とプレ調査計画ならびに調査票等の作成を行った。【意義・重要性】直接対面でやりとりをすることによって、打ち合わせが活性化した。とくに調査企画・調査票作成においては、この方法が効果的であった。その結果、(a)文法的観点を導入した自記式アンケート、(b)自然談話に近いやりとりにおける出現実態を調査する目的のロールプレイイング調査のふたつの調査の企画とそこで用いる具体的な調査票案が作成できた。(3)「とびはね音調」が全国においてどのように受容されているのかを把握するために、聞き取りアンケート調査の手法を用いた調査を実施し、調査結果についての中間報告を行った。【意義・重要性】従来、「とびはね音調」の全国における受容状況は、具体的データとしては把握されていなかった。そのため、概略的とはいえ全国における受容状況が本調査によって把握できたことは、ひとつの成果といえそうだ。また、この全国調査の分析を通じて、「とびはね音調」の採用意識には地域差が大きいことも分かった。このことは次年度以降に予定している実地調査候補地の選定根拠となった。

最終年度は、本研究課題である「とびはね音調」の実態と意識に特化した調査サイトを構築し、動作テストを兼ねた首都圏大学生調査を実施した。動作テストを兼ねたことによって、スマホのキャリアや機種などの多様性にかなりの程度対応できるような実用的な調査サイトとなった。「ことばの発音調査サイト」URLは次の通り。http://maki.e-secure.co.jp/tobihane/この調査の特色は、従来の対面式調査と聞き取りアンケート調査をスマホ対応に発展させたもので、スマホユーザーであれば、全国どこからでもいつでも好きなときに参加できるような調査方法である。調査協力者をまず調査許諾画面において登録制とすることによって、セキュリティーにも配慮している。また、調査謝礼も調査サイト経由で渡すことが可能となった。データの管理については別にIDとパスワード付きの管理画面を用意しており、何重にもセキュリティーに配慮した。「ことばの発音調査サイト」は、「言う調査」「聞く調査」「言語意識調査」の大きく3パートで構成されており、申請者が本研究課題も含め、これまでに蓄積してきた方法と知見をコンパクトにスマホ調査としてカスタマイズしたものである。「言う調査」は、文法研究と音調研究の融合に基づくシミュレーション法を採用し、非対面でも適切な画像と指示文を提示することによってコンテクスト依存の強い音調調査の非対面調査を可能とした。この他、全国聞き取りアンケート調査や対面調査などに基づく「とびはね音調」にかんする報告をプロジェクトメンバーそれぞれが研究期間中に公開し、「とびはね音調」の実態と意識にかんする新しい知見を付け加えた。総合的にみて、「とびはね音調」にかんする新しい知見を得たこと、音調にかんする現代に見合う新しい調査方法を開発したことなどが、本研究課題の成果といえるだろう。「とびはね音調」の実態と意識にかんするスマホ専用調査サイト(要登録)日本語学2種類のタイプの異なる調査データに基づく分析を行い、それらの公開を新規分担者とともに行ったところは、順調であるといえる。一方、文法的観点を導入した調査票の作成とそれを用いた実地調査は、分担者の都合によりやや進行が遅れた。連動して、文法的観点を導入した調査票に基づく調査データの音響的指標に基づく分析も遅れている。これらを最終年度への課題として残している。ただし、分担者都合による部分は専門家からのアドバイスを積極的に得るなどしてある程度リカバーしたと考えている。おおむね順調と判断した理由は次の通り。(1)先行研究の収集と読み込みを行い、並行して準備調査の企画・調査票案が作成できたこと(2)全国聞き取りアンケート調査を実施、その中間報告を行えたこと。このデータが準備調査・実地調査の調査地選定根拠ともなったこと一方、文法的観点を導入した自記式アンケートが未完成であること、準備調査の実施には及ばなかったことは、反省点である。今後の課題は、文法的観点を導入した調査票の完成と、それに基づく調査の実施。加えて、調査によって得た音声データの音響分析を進める。当初の計画では、全国複数地点における調査を予定していたが、調査票作成の遅れに伴い、首都圏域調査に留まる可能性が高い。次年度は、最終年度となるため、調査の実施・分析と並行して、本研究課題の積み残したことなどの整理もしていく予定。第2年度においては、次のような研究目標を立てている。(1)全国聞き取り
適応放散的種分化の進化ゲノム遺伝学的研究:小笠原固有植物の進化解析

本研究では、適応放散的種分化がおきている小笠原固有植物を最新ゲノム解析技術を使用することにより、従来の研究手法では困難であった適応放散的種分化をもたらした遺伝的変異の特定を試みた。ヘラナレン、コヘナラレン、アゼトウナ、ヤクシソウについてRNAseq法により解析を行った。その結果得られた遺伝子配列を対象にして、ヘラナレンとコヘラナレンで有意に発現量の異なる遺伝子の相互比較を行った結果、1つのフラボノイド合成系の遺伝子候補に挙がった。また、1年生草本のヤクシソウと比較して、発現が有意に異なる遺伝子を探索した結果、2個が維管束形成に関与する遺伝子であった。適応放散的種分化とは1つの祖先種から複数の異なる生態的特性を持つ種に種分化する現象であり、昔から生物学者の興味を引き多くの研究が行われてきた。しかし、ほとんどは現象や遺伝的特性、系統関係などの記述的研究で、進化メカニズムまで踏み込んだ研究はほとんどない。本研究では最近急速に発展してきた遺伝子/ゲノム解析技術を用いて、実際に適応放散を引き起こした遺伝的変化の特定、自然選択あるいは遺伝的浮動の役割の解析をゲノム全体で行い、適応放散的種分化が生じる進化メカニズムの総合的解明を試みる。そのため、すでに系統関係や各種内の遺伝的変異などの研究が進んでいる小筆原諸島の固有種3種を含むアゼトウナ属(キク科)を対象にしている。平成22年度は、小笠原固有種のヘラナレン、コヘナラレンおよび、アゼトウナ属の小笠原固有種の姉妹群にあたるアゼトウナについて、花のつぼみから全RNAを抽出し、mRNA分離後、cDNAライブラリーを作成し、次世代シークエンサーにより、配列決定を行った。また、ヘラナレンについては葉からの抽出RNAからの解析も行った。それぞれについて塩基を読んだ結果、ヘラナレン、コヘナラレン、アゼトウナについて、それぞれ約3600万、4200万、5400万の100bpのリードができ、アライメントの結果、14,532、15,325、16,687の配列が得られた。また、ヘラナレンの葉については、約2530万のリードで、12,423の配列を得た。それぞれの配列について、BLASTプログラムを用いて既知配列との相同性を検索し、それぞれの種についてそれらをデータベース化した。詳細な比較解析は23年度で行う予定である。そのため、すでに系統関係や各種内の遺伝的変異などの研究が進んでいる小笠原諸島の固有種3種を含むアゼトウナ属(キク科)を対象にしている。平成23年度は、小笠原固有種のヘラナレン、コヘナラレンおよび、アゼトウナ属の小笠原固有種の姉妹群にあたるアゼトウナについて、22年度に取得した次世代シークエンサーの遺伝子発現配列決定をの比較解析を行った。各14,532、15,325、16,687の独自配列から、類似配列を検出し、種により発現が有意に異なる配列を抽出した。2段階のスクリーニングの結果、ヘラナレンvsコヘナラレンで5個、ヘラナレンvsアゼトウナで32個、コヘナラレンvsアゼトウナで23個の候補遺伝子を得た。これらの詳細な発現比較解析は24年度に行う予定である。また、上記3種の姉妹群に当たる1年草のヤクシソウについて、他の種と同様に次世代シークエンサーによる遺伝子発現配列決定を行い、14,547個の有意に異なる配列を得た。ヤクシソウと他種の比較解析は24年度に行う予定である。

平成24年度は、小笠原固有種の外群にあたり、分子系統解析結果からアゼトウナ属で最も基部で分化したと考えられるヤクシソウとの比較を行った。ヤクシソウの次世代シークエンサーによるRNA-seqで得られた14,547個の有意に異なる配列をヘラナレン、コヘナラレンと比較した結果、ヤクシソウvsコヘナラレンで35個、ヤクシソウvsヘナラレンで38個の候補遺伝子を検出した。また、両者で共通していた遺伝子は28個であった。これらをBlast検索した結果、この内の2個が維管束形成に関与する遺伝子であった。また、昨年度得られたヘラナレンとコヘラナレンで有意に異なる遺伝子の同定を行った結果、1つのフラボノイド合成系の遺伝子候補に挙がった。これらの遺伝子の発現の変化により、アゼトウナ属小笠原固有種の形質変化が引き起こされている可能性が示唆された。次世代シークエンサーの技術的発展と、ランニングコストの廉価化により、データの取得は順調にいっている。最終年度にこれらを解析することにより、十分な成果が得られると思う。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、データ解析を重点的に行う予定である。大量のデータの比較作業が必要であるが、高速処理用の計算機を使用して、効率よくデータ解析を行いたい。
硬組織からの薬物検出方法の開発と血中濃度との相関に関する研究

昨年まで、一部の事例について骨から抽出した試料の分析を行い、一定の種類の薬物については抽出可能であることが確認できた。しかしながら、それら各薬物の抽出効率にはばらつきがあり、骨に含まれる薬物がすべて抽出できていなことも推測された。一方で、分析後に分析機器であるLCーMS/SMの不具合が起こることがあった。抽出試料に多量の塩または脂質などが含まれているものと推定され、不具合の原因物質の特定と抽出方法の検討を行った。【原因物質の特定】骨抽出試料においてナトリウム、カリウム、クロール、リン、マグネシウム及びカルシウムの各イオンを分析の分析を行ったところ、高濃度で含まれているものは確認できなかった。一方、分析前に使用するフィルターから溶出する物質について検討したところ、PTFEフィルターでは余分な溶出物は確認できなかったが、ナイロンフィルターではナイロンの溶出が確認され、これらLCの流路などで吸着し不具合を起こしている可能性が示唆された。【抽出方法の検討】アセトニトリルとNaClを用いた抽出法の他に、アセトニトリル+MgCl2とアセトニトリル+QuEChERS法を試み、抽出効率などを検討した結果、従来のアセトニトリル+NaCl抽出法が適当であること、最終溶解液はアセトニトリルよりも初期移動相がより良いこと、QuEChERS法の脂質除去効果はあまりよくないこと、PTFEフィルターが良いことが明らかとなった。分析機器や人員等の研究環境整備が遅れているため。分析機器に負荷をかけないより良い抽出方法を継続して検討する。現在まで、主として精神神経用薬及び覚醒剤がこの方法で抽出可能であることは確認した。その他の薬物についても検討する。覚醒剤については血中濃度との比較も行う。今年度は現在までに分析した骨試料の結果を一部収集し解析を行った。死後変化の少ない事例、または死後変化が進行していたとしても血液が採取できた事例で血液から多種類の薬物が検出された事例(多剤検出事例)において、血液と骨からの検出薬物が一致しているか否か調べた。さらに白骨事例や高度腐敗、ミイラ化事例で液体試料や軟部組織試料では検査が困難であった事例ににおいて、その骨試料を用いて薬物検査を行っていた事例を抽出し、その検査結果を調べた。対象となった多剤検出事例は4事例あり、4から15種の精神神経用剤が血液または尿から検出されていた。白骨事例等で骨試料で検査を行った事例は46事例あった。【結果及び考察】多剤検出事例ではいずれの事例においても血中で検出された薬物の一部を検出することができた。また、白骨事例等の骨試料では46例中4例で薬物が検出された。血中から検出された薬物は骨試料からでも検出は可能であったが、検出できない薬物もあった。骨から検出された薬物は、その血管内血液に存在する薬物を検出していると推測されるため、検出されなかった薬物については、第一には血中濃度が低いことが挙げられるが、血中濃度が比較的高めでも検出されなかった薬物もあり、これらは抽出方法が適切でない可能性や骨血管への分布が少ない特徴を有する可能性がある。抽出方法については塩基性薬物、酸性薬物ともに抽出されていることから適切であると推定はされるが、検出できなかった薬物があることを考慮すると何等かの検討が必要である。白骨事例等の薬物スクリーニングでは、今回はじめて約1割弱の事例で何等かの薬物が検出されることが明らかとなった。死因判断や身元推定の一助となる可能性が示唆された。職場の異動があり、分析機器や人員等の研究環境が整っていないため。抽出方法については他の方法も試みてより良い方法の探求を行う。今回は精神神経用薬について、骨から検出可能か否か調べたが、その他の薬物についても順次検討していく。覚醒剤事例については通常、血中濃度が測定されているので、骨試料を用いてその含有量を分析し血中濃度との比較を行っていきたい。研究環境の不整備については、他機関との協力体制を築き、補っていきたい。

分析機器に負荷をかけないより良い抽出方法を継続して検討する。現在まで、主として精神神経用薬及び覚醒剤がこの方法で抽出可能であることは確認した。その他の薬物についても検討する。覚醒剤については血中濃度との比較も行う。年度途中での職場の異動で、その後の研究環境が不明のため物品購入を控えた。新しい研究環境の整備状況に合わせて必要機材や物品等の選定を行う。研究環境が一部未整備であり、必要物品の把握が困難であったため、購入を控えた。研究環境の整備状況に合わせて必要物品などの選定・購入を行う。
シソ科植物の成分に基づく新規アミロイドβ凝集阻害物質の開発とその分子機構

脳内でのアミロイドβ(Aβ)の凝集体の生成は,アルツハイマー病の原因の一つとされる.本研究では,Aβ凝集を抑制する機能を持った物質をシソ科植物からの探索と誘導体化により開発し,これらをツールとした凝集阻害機構の解明を目的とした.これまでの研究から,ロスマリン酸誘導体には,Aβ凝集の凝集の初期に作用する比較的水溶性の高い物質群と, α-へリックス構造を安定化,または小さな凝集体同士の結合を阻害している比較的脂溶性の物質群の阻害機構が異なる2群に分類されることが示唆されていた.そこで,本年度はこの凝集阻害機構が異なると考えられる2つの化合物群のより詳細な凝集機構を明らかにする目的で,Aβモノマーとロスマリン酸誘導間との結合をSTD-およびSOFAST-HMQC NMR法により検討した.その結果,いずれのタイプの誘導体もAβと結合することが示唆されたが,モノマーとの結合を観測することができなかった.そこで,これらの誘導体がどのくらいの大きさのAβ凝集体に結合・凝集阻害をしているのかをAβと誘導体が含まれる溶液をPICUP法処理後,ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて観察した.その結果,水溶性の高い誘導体は,非存在下と比べて4量体までAβオリゴマーの凝集を阻害剤促進し,その後を阻害することが示唆された.また,脂溶性の高い誘導体群は,阻害剤非存在下や水溶性誘導体と比較してモノマーのバンドが濃かったことから, Aβモノマーと結合して凝集を阻害する可能性が示唆された.これらの結果は,複雑な工程を経て凝集するAβの凝集過程やその毒性を整理・評価するために,ロスマリン酸誘導体を有用なツールとして利用できる可能性を提示した.認知症の半数以上を占めるアルツハイマー病の患者の脳内では,アミロイドβ(Aβ)が凝集し老人斑が形成されるが,このAβ凝集体が神経細胞やシナプスの脱落などの神経毒性を示し、アルツハイマー病の病因となると言われている。従って、Aβ&凝集阻害物質がアルツハイマー病の予防・治療に繋がることが期待されている。ところが、Aβ凝集の詳細な凝集機構は未だに明らかになっていない。一方、我々は以前、シソ科ハーブ系の香辛料が高い凝集阻害活性を示し、主活性成分はロスマリン酸であることを明らかにし、同じシソ科のアオジソは、これまで最も活性の高かったスペアミントの約40倍もの活性を示した。そこで本研究ではアルツハイマー病の予防・治療薬の開発に寄与するために,ロスマリン酸誘導体やアオジソの活性成分をツールとして化学構造とAβ凝集阻害機構の関係を解明することを目的としている。はじめに、ロスマリン酸の種々のの部分構造に着目した種々の誘導体を化学合成し、これらのAβ凝集阻害活性を一般的な評価法であるチオフラビンT(ThT)法および我々の研究グループ独自の方法である微量ハイスループットスクリーニング(MSHTS)法の二法により凝集体量が半分になる阻害物質の濃度(EC50値)を求め、これらの値を比較検討した。その結果、誘導体の化学構造によりAβ凝集阻害活性の程度は異なるうえに、活性の評価法によっても阻害強度が異なる傾向が示された。次にロスマリン酸誘導体存在下での凝集体形成過程をこのMSHTS法により経時的に観察した。その結果、凝集体形成速度は添加するロスマリン酸誘導体の化学構造により異なりることが明らかとなった。そこで、ロスマリン酸誘導体とAβペプチドの結合位置をAutoDockを用いてドッキングシミュレーションしたところ、試験管内で得られた結果と計算で得られた結果は相関性を示した。研究計画では、本年度は1)シソ科植物に含まれるAβ凝集阻害物質の化学構造に基づく誘導体の合成と、2)合成した誘導体のMSHTS法およびThT法による活性評価とそれに基づくAβ凝集阻害段階の特定をすることとなっている。シソ科植物のAβ凝集阻害物質の誘導体合成については、ロスマリン酸とその周辺化合物50種類を化学合成し、計画通りに進行した。一方、アオジソの阻害物質については阻害物質の特定に時間がかかっており、この点については進捗が遅れている。合成したロスマリン酸誘導体の活性評価は合成した全ての化合物についてMSHTS法およびThT法により活性評価し、それらのEC50値を算出したうえに、凝集体形成過程の経時的観察により化学構造と凝集過程の関係を考察しており、この点についても計画通りに進捗している。さらに、ロスマリン酸誘導体に関しては平成29年度以降の実施計画にあるAβペプチド上の結合位置をAutoDocを用いたドッキングシミュレーションを既に進めており、この点に関しては計画以上に進展している。以上の結果は複数の学会で発表され、また現在査読付き原著論文に投稿中である。このことから総合的に判断し、本年度の研究目的は概ね順調に進展していると自己点検した。脳内でのアミロイドβ(Aβ)の凝集体(オリゴマー)の生成は,アルツハイマー病の原因の一つとされる.本研究では,このオリゴマー生成を抑制する機能を持った物質をシソ科植物からの探索と誘導体化により開発し,これらをツールとした凝集メカニズムの解明を目的とした.

我々はこれまで,シソ科植物に多く含まれるロスマリン酸誘導体の化学構造により凝集体形成速度が異なり,ドッキングシミュレーションではこれら誘導体のAβペプチドへの結合位置も凝集阻害活性と相関性を示すことを明らかにした.本研究では,はじめにシソの活性物質の探索を行ったところ,シソには複数のAβ凝集阻害物質が含まれることが示唆された.誘導体間での活性の違いをより詳細に検討するために,凝集体形成速度のより詳細な解析を行った.その結果,誘導体の構造により凝集体形成の阻害段階が異なることが示唆された.円二色性スペクトル測定によるAβオリゴマーの二次構造の経時的変化を観察からは,オリゴマー生成に重要なβシート構造形成速度や形成量に誘導体の構造が影響していることを明らかにした.また,電子顕微鏡観察では,生成する凝集体の形態は添加する阻害剤により異なることが示唆された.さらに,核磁気共鳴スペクトルにより誘導体はAβ上で相互作用することで凝集を阻害していることが示唆された.このような多面的分析により,ロスマリン酸型阻害剤の微妙な化学構造の違いがAβ凝集阻害機構に影響していることが示唆された.これらの結果は,複雑な工程を経て凝集するAβの凝集過程を整理・評価するために,ロスマリン酸誘導体を有用なツールとして利用できる可能性を示唆している.本年度の目標である核磁気共鳴(NMR)スペクトルによるAβとロスマリン酸誘導体との相互作用の観察の基本的条件は確立され,さらなる解析を進めている.本研究目的を達成するために,Aβ凝集阻害活性の評価において円二色性スペクトルや電子顕微鏡での凝集体の形態観察にも着手することができ,来年度以降の研究推進に当初より幅広いアプローチをすることができた.現在、研究成果を論文にとりまとめて、国際誌に投稿している。脳内でのアミロイドβ(Aβ)の凝集体の生成は,アルツハイマー病の原因の一つとされる.本研究では,Aβ凝集を抑制する機能を持った物質をシソ科植物からの探索と誘導体化により開発し,これらをツールとした凝集阻害機構の解明を目的とした.これまでの研究から,ロスマリン酸誘導体には,Aβ凝集の凝集の初期に作用する比較的水溶性の高い物質群と, α-へリックス構造を安定化,または小さな凝集体同士の結合を阻害している比較的脂溶性の物質群の阻害機構が異なる2群に分類されることが示唆されていた.そこで,本年度はこの凝集阻害機構が異なると考えられる2つの化合物群のより詳細な凝集機構を明らかにする目的で,Aβモノマーとロスマリン酸誘導間との結合をSTD-およびSOFAST-HMQC NMR法により検討した.その結果,いずれのタイプの誘導体もAβと結合することが示唆されたが,モノマーとの結合を観測することができなかった.そこで,これらの誘導体がどのくらいの大きさのAβ凝集体に結合・凝集阻害をしているのかをAβと誘導体が含まれる溶液をPICUP法処理後,ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて観察した.その結果,水溶性の高い誘導体は,非存在下と比べて4量体までAβオリゴマーの凝集を阻害剤促進し,その後を阻害することが示唆された.また,脂溶性の高い誘導体群は,阻害剤非存在下や水溶性誘導体と比較してモノマーのバンドが濃かったことから, Aβモノマーと結合して凝集を阻害する可能性が示唆された.これらの結果は,複雑な工程を経て凝集するAβの凝集過程やその毒性を整理・評価するために,ロスマリン酸誘導体を有用なツールとして利用できる可能性を提示した.これまでの成果により、ロスマリン酸誘導体はその化学構造によりAβ凝集阻害活性が異なり、活性の評価法によっても阻害傾向が異なることが示された。
パイエル板の分化発生過程における高次構造構築メカニズムの解析

二次リンパ器官であるパイエル板は、効率よく迅速な抗原特異的な免疫応答を行うため、組織内部は明確な高次構造が形成されている。B/T細胞領域は胎児期には存在せず、生後形成されると考えられたが、そのメカニズムは解明されていない。本研究では胎児期パイエル板の形成に働くinducer細胞が、出生後にCXCR4依存的にパイエル板内で局在を変えることで、B細胞領域/T細胞領域の形成を制御していることを明らかにした。外来抗原に対する免疫応答を担う場である二次リンパ器官のパイエル板は、胎児期に原基が形成された後、出生直後の新生児期に組織内部の高次構造が構築される。本研究はそのメカニズムを解明することを目的としている。免疫染色による解析から、胎児期には原基全体に均一に分布していたLymphoidtissue inducer(LTi)細胞は生後B細胞予定域に斑状に集結した後、B細胞領域の外側に移動しT細胞領域との境界部に分布していた。これに伴いB細胞およびT細胞の各細胞領域への集積が始まることから、LTi細胞の再分布は細胞領域形成過程に重要な役割を果たすことが予想された。さらにリンホトキシン阻害剤を用いたFACSおよび免疫染色の解析の結果、この特徴的なLTi細胞の分布変化は、LTi細胞表面に発現するリンホトキシン依存的にケモカインレセプターがCXCR5からCXCR4にスイッチすることで、CXCL13陽性のB細胞領域からCXCL12陽性のT細胞領域へ細胞が移動するというメカニズムによるものである可能性が示唆された。そこで、LTi細胞特異的ケモカインレセプター発現を欠損させたマウスを解析したところ、LTi細胞のB細胞領域からT細胞領域への移動が阻害され、T細胞領域形成不全が認められた。この結果より、新生児LTi細胞でのCXCR4の発現はLTi細胞のT細胞領域境界部へ分布制御に必須であり、さらにこの分布変化はT細胞領域形成に重要な役割を果たすことが明らかとなった。これまでLTi細胞の研究は主としてリンパ器官の原基形成の機能解析の報告が中心であったが、本研究は器官内部の高次構造の構築にもLTi細胞が関与することを示す初めての報告である。生体内で複雑に制御されている免疫応答反応は、各リンパ器官の高次構造に依存したリンパ球の分布および動態の上に成立するものであることから、本研究による高次構造構築メカニズムの解明はリンパ器官の秩序形成を理解する上で重要な位置をしめるものと考えられる。小腸の腸管壁に点在する二次リンパ器官であるパイエル板は、胎児発生後期に原基が出現し、出生後一週間で細胞領域決定など組織内部の高次構造が構築される。本研究はこの高次構造構築メカニズムの解明を目的としている。昨年度までに、原基形成に働くLymphoid tissue inducer(LTi)が出生直後はB細胞予定域に集積した後、数日後にはB/T細胞領域境界部に移動することを明らかにした。さらにこの現象は、LTi表面のケモカインレセプターが、リンホトキシン依存的にCXCR5からCXCR4陽性にスイッチすることで制御されていることを示した。しかし、リンホトキシンレセプターLTβRはLTiにはなくストローマ細胞Lymphoid tissueorganizer(LTo)側に発現し、スイッチを直接制御するメカニズムが不明であった。そこで、我々はLTo細胞からLTβRシグナル依存的に分泌される液性因子がケモカインレセプタースイッチを誘発すると仮定し、胎児LTiをセルソーターで分取し、in vitro培養系でこれまでにCXCR4発現誘導作用が報告されている種々のサイトカイン類の効果を検証したところ、TGFβ1にその効果が認められた。TGFβは様々な発生過程に重要な役割を果たすだけでなく、腸管免疫系細胞の分化や活性に作用することが多数報告されており、パイエル板分化に何らかの役割を果たしても不思議ではないと考えられる。現在in vivoにおいて、本当にTGFβ1がパイエル板発生過程に関与しているのかどうか、中和抗体や阻害剤を用いた系で検討を行っている。LTiはリンパ器官形成だけでなく、NK様細胞への分化など免疫機能をもつ細胞として近年大きく注目されている。本研究は、そのLTiの新たな役割を示すものであり、多様なLTiの機能を理解する上で重要な位置を占めるものである。
ゴルジ阻害による抗がん効果を規定する細胞表面・分泌タンパク質の発現調節機構の解明

ゴルジ機能阻害剤による三次元培養下の細胞表面タンパク質発現抑制を介した抗がん機構の解析ゴルジ機能阻害剤M-COPAは、細胞表面への小胞輸送阻害を介して全ての表面分子の発現を抑制すると予測していたが、昨年までの単層培養系における網羅的解析によって、一部の細胞表面分子のみを顕著に発現抑制することが明らかになった。またin vivoでM-COPA感受性を示すヒト胃がん細胞株の三次元培養系において、細胞増殖抑制を起こす濃度より低濃度のM-COPA曝露によりスフェロイドが崩壊すること、その現象は代表的な胃がん治療に用いられる他の抗がん剤では認められず、M-COPAに特徴的であること、スフェロイドの崩壊濃度域で特定のインテグリンの表面発現が顕著に抑制されることを見出した。本年度はM-COPA曝露後のスフェロイド崩壊と上記インテグリンの表面発現低下の因果関係を検討するために、siRNAを用いて当該インテグリンを含む様々なインテグリン分子の発現をノックダウンした時のスフェロイド形成能を評価した。その結果、当該の2種類のインテグリンでのみスフェロイド形成能が喪失し、M-COPA曝露時と同様の表現型が認められた。また、この2種類のインテグリンの中和抗体を3次元培養細胞に添加して分子の機能を阻害したところ、siRNA処理時と同様にスフェロイドの形成を認めなかった。以上の結果から、M-COPAによるインテグリンの表面発現抑制を介し、スフェロイド崩壊によって増殖が抑制されたことが示唆された。in vivoでM-COPAが奏功する胃がんの抗がん機構を解析するため、細胞株の三次元培養モデルを用い増殖阻害を評価した。大変興味深いことに、増殖阻害を示すよりも低濃度のM-COPA曝露によりスフェロイドが崩壊した。この現象は他の代表的な抗がん剤曝露では観察されなかったことから、M-COPAの抗がん効果の特徴と考えられた。細胞表面タンパク質の中で、この濃度域で表面発現が低減する細胞接着分子は複数存在した。それらのタンパク質のうちスフェロイドの形状維持に機能的に寄与している分子を見出すため、siRNAを用い発現を抑制するか、或いは中和抗体を用い機能を阻害し、スフェロイドの形成が認められなくなる接着分子を探索した。その結果、2種類のインテグリンが同定された。これらのインテグリンはヘテロ2量体を形成すること、増殖シグナルに関わることが知られている。以上の結果から、ある種の胃がんにおいては、インテグリンの表面発現の低減が抗がん効果に重要であると考えられた。以上のように、研究はおおむね順調に進展している。昨年度に単層培養で観察された事象と同様に、スフェロイド培養下においても、一部接着分子の表面発現がM-COPA曝露によって低減される一方で、全く表面発現に影響をうけない接着分子が存在した。どのようなメカニズムでこの差異が生ずるのか、M-COPA標的分子の上流・下流に位置する分子や、相互作用する分子の関わりについて、siRNA等の手法を用い、分子レベルでの解明を試みる。またM-COPAによるスフェロイド培養がん細胞に対する増殖阻害に関わるタンパク質として同定されたインテグリンはヘテロ2量体を形成し、細胞外マトリクス(ECM)をリガンドとする。そこで当該インテグリンに対するリガンド分子を含む代表的ECM分子の発現をsiRNAでノックダウンした場合のスフェロイド形成能と増殖への影響を検討し、抗がん効果における機能を解析する。以上の研究から、M-COPAによる抗がん機構を解明と効果予測バイオマーカーの同定を目指す。1.ゴルジ機能阻害剤により発現変動する細胞表面タンパク質の探索とその発現調節機構の解明ヒト細胞表面分子アレイ(BD Bioscience社)を用い、5種類のヒトがん細胞株におけるゴルジ機能阻害剤M-COPA暴露前後の細胞表面分子の発現変動をフローサイトメトリー(FCM)により解析した。細胞表面に発現するタンパク質は、ゴルジ体を介して輸送小胞により細胞表面まで運搬されると考えられ、ゴルジ機能を阻害することにより、すべての表面分子の発現低下を期待した。ところが、意外なことに、細胞表面発現が顕著に抑制されたのは一部のタンパク質に限られ、残りの分子は発現低下が認められなかった。一例として、受容体チロシンキナーゼ(RTK)のうちMETやFGFRなどは細胞表面発現が顕著に抑制された一方、まったく抑制されないRTKも見出された。このことは、de novoに生産されたタンパク質が細胞表面まで運搬され、発現するまでの分子機構が、タンパク質ごとに異なることを反映しているものと考えられた。2.三次元培養系を用いた細胞表面タンパク質発現と抗がん効果の関連分析JFCR39細胞株でスフェロイドを形成する細胞を選別し、M-COPA曝露後の変化を観察した。興味深いことに、in vivoでM-COPA感受性を示すヒト胃がん細胞株で、細胞増殖抑制を起こす濃度より低濃度のM-COPA曝露によりスフェロイドが崩壊することを見出した。この性質はM-COPAに特徴的で、5-FUやシスプラチンといった代表的な抗がん剤では認められなかった。また、M-COPAによるスフェロイド崩壊時の細胞表面分子の発現阻害をFCMにより解析したところ、スフェロイド崩壊に伴い発現が顕著に抑制される細胞接着分子を見出した。見出した細胞接着分子の発現低下の、スフェロイド崩壊への機能的関与が注目された。in vivoゼノグラフトモデルでM-COPAが抗腫瘍性を示した5種類のヒト

がん細胞株を用いて、ヒト細胞表面分子アレイ(BD Bioscience社)に含まれる242種類の細胞表面分子について、単層培養時M-COPA処理前後の発現変化をフローサイトメトリー(FCM)により網羅的に解析した。その結果、すべての細胞表面分子の発現が抑制されることはなく、顕著な発現抑制を来した分子は一部に留まった。そこで、M-COPA曝露により特定の細胞表面分子の発現が低下することがM-COPAの抗がん効果に機能的に関与しているとの仮説を立て、顕著な発現抑制が認められた分子について、M-COPA非存在下においてsiRNAにより発現抑制させ、がん細胞の生存・増殖に対する影響を順次検討した結果、発現ノックダウンにより細胞増殖を顕著に抑制する受容体チロシンキナーゼを同定した。一方、in vivoの微小環境を模倣するためのスフェロイド培養系を構築するために、JFCR39に含まれるがん細胞株について低吸着U底プレートにてスフェア形成する細胞のスクリーニングを行い、23細胞株を同定した。そのうち、in vivoでM-COPAが奏功する胃がん細胞株をモデルとし、スフェロイド培養下でM-COPA曝露後の形態変化を観察したところ、増殖抑制をきたす薬剤濃度より低濃度のM-COPA曝露によりスフェロイドが崩壊することを見出した。M-COPA以外の3種の化学療法剤について同様なアッセイを行った結果、低濃度の薬剤曝露でスフェロイド崩壊を起こすのはM-COPA特異的な現象であった。そこで、計画を前倒しして、スフェロイド培養系においてM-COPAが細胞表面発現を阻害する表面分子のスクリーニングを進めたところ、スフェロイド崩壊に関与しうる細胞接着分子の顕著な発現抑制を見出した。以上のように、研究はおおむね順調に進展している。ゴルジ機能阻害剤による三次元培養下の細胞表面タンパク質発現抑制を介した抗がん機構の解析ゴルジ機能阻害剤M-COPAは、細胞表面への小胞輸送阻害を介して全ての表面分子の発現を抑制すると予測していたが、昨年までの単層培養系における網羅的解析によって、一部の細胞表面分子のみを顕著に発現抑制することが明らかになった。またin vivoでM-COPA感受性を示すヒト胃がん細胞株の三次元培養系において、細胞増殖抑制を起こす濃度より低濃度のM-COPA曝露によりスフェロイドが崩壊すること、その現象は代表的な胃がん治療に用いられる他の抗がん剤では認められず、M-COPAに特徴的であること、スフェロイドの崩壊濃度域で特定のインテグリンの表面発現が顕著に抑制されることを見出した。本年度はM-COPA曝露後のスフェロイド崩壊と上記インテグリンの表面発現低下の因果関係を検討するために、siRNAを用いて当該インテグリンを含む様々なインテグリン分子の発現をノックダウンした時のスフェロイド形成能を評価した。その結果、当該の2種類のインテグリンでのみスフェロイド形成能が喪失し、M-COPA曝露時と同様の表現型が認められた。また、この2種類のインテグリンの中和抗体を3次元培養細胞に添加して分子の機能を阻害したところ、siRNA処理時と同様にスフェロイドの形成を認めなかった。
マラリアの重症化に関与する宿主因子の分子制御

脳マラリアの発症には、熱帯魚マラリア原虫が感染した赤血球の脳内微小血管内皮細胞への付着、その結果生じる閉塞とそれに伴う組織傷害が関与する。ヘムオキシゲナーゼ1はヘム分解系の律速酵素であり、ヘムをビリベルジン、鉄、一酸化炭素(CO)に変換する。ビリベルジンは直ちにラジカル消去作用のあるビリルビンに還元される.我々は、鉄の再利用に重要なヘムオキシゲナーゼ1の発現の程度が、マラリア感染の重症化に関与すると推定している。培養ヒト臍帯静脈内皮細胞を低酸素(1%)に曝露すると、ヘムオキシゲナーゼ1の発現量(mRNAと蛋白レベル)が正常酸素圧(19%)の発現量の10%にまで低下した。この際、ヘムオキシゲナーゼ1mRNAの安定性には変化がない。さらに、鉄キレート剤であるdesferrioxamineが低酸素と同程度にヘムオキシゲナーゼ1の発現を低下させた。ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子の転写開始点の197bp上流に位置する(GT)配列の反復回数には遺伝的多型が見られる。そこで、代表的な多型(16、20、29、38回の反復)を持つ融合遺伝子を構築し、レポーター遺伝子の一時的発現の差を検討した。(GT)の反復回数16、20の各プロモーター活性が高めであり、さらにそれぞれの活性が過酸化水素処理により誘導された。東北大学医学部老人科との共同研究として、各100人の男性喫煙者肺気腫群、喫煙者非肺気腫群のゲノムDNAを解析し、30回以上の(GT)の反復配列を持つ喫煙者では有意に肺気腫になりやすいことを明らかにした。以上により、(GT)の反復回数が長いほど、すなわちヘムオキシゲナーゼ1が誘導されにくいほどマラリアに対して抵抗性があると予想している。
グレリンが環境変化適応性覚醒反応を起こす脳内メカニズムの解明

脳-腸ペプチドであるグレリンの中枢投与は覚醒作用を示し、一方その受容体欠損は環境変化適応性覚醒反応を選択的に消失させる。環境変化に対する適応反応や注意、認知反応には適切な覚醒レベルの維持が必須であり、上記の先行報告は覚醒反応におけるグレリンシグナリングの重要性を示唆する。昨年度は環境変化適応性覚醒反応の脳内調節機構におけるグレリンの役割を解明することを目的として、覚醒中枢のニューロンに対するグレリンの作用機序についてラット脳スライスを対象としたパッチクランプ法で検証を行い、グレリンが覚醒中枢の一部である結節乳頭核ヒスタミン含有ニューロンに対して後シナプス性の脱分極作用を示し、その作用機序の詳細を明らかにした。今年度は細胞内カルシウムイメージング法を用いた検証により、同じく覚醒中枢の一部である青斑核領域の細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させること、そのグレリン誘導性細胞内カルシウム濃度上昇には細胞内ストアおよび細胞外から細胞質への流入出によるものであることを明らかにした。今年度は、本学の組織改組により生じた担当委員業務の激増により、本研究エフォートを大幅に削減するとなった。グレリンの覚醒中枢ニューロンに対する作用の検討を一部実施したが、予定していた行動実験に着手するに至らなかった。したがって、進捗状況としては、やや遅れている、と判断した。1年間の期間延長により研究計画を実施する。次年度はグレリンまたはグレリン受容体拮抗薬の脳局所投与および睡眠・覚醒状態判別を用いたin vivo実験による検証を行い、グレリンが覚醒中枢ニューロンに及ぼす作用が動物の睡眠・覚醒行動にどのような影響を与えるのかを検証することで、グレリンの生理的役割を解明していく。そこで本研究では環境変化適応性覚醒反応の脳内調節機構におけるグレリンの役割を解明することを目的として、覚醒中枢のニューロンに対するグレリンの作用機序についてラット脳スライスを対象としたパッチクランプ法で検証を行った。覚醒中枢の一部である結節乳頭核ニューロンに対して、グレリンは後シナプス性の脱分極作用を示した。そのイオン機序を解明するために、グレリンにより誘発される内向き電流の逆転電位を検証したところ、カリウムイオンの平衡電位とほぼ一致した。また、同脱分極反応がナトリウム/カルシウム交換体の阻害剤であるKB-R7943または細胞内カルシウムキレータであるBAPTAの存在によって消失する事が認められた。すなわちカリウムイオンチャネルの閉口により脱分極反応が生じるが、その細胞内伝達経路にはナトリウム/カルシウム交換体による細胞内カルシウム濃度変化が関与していることが示唆された。電気生理計測が行われたニューロンの組織学的特性を免疫染色によって検証したところ、グレリンによって脱分極が起こるニューロンの半数以上がヒスタミンニューロンであったことが示唆された。今年度は、グレリンの覚醒中枢ニューロンに対する作用を検討した。グレリンが覚醒中枢の一つとして知られる結節乳頭核のヒスタミンニューロンに対してグレリンが興奮性の作用を示すこと、およびそのイオン機序が判明した。中枢性グレリンによる環境変化適応性覚醒反応のメカニズム解明が、睡眠障害の診断や治療法開発の基盤的根拠となる睡眠・覚醒制御機構の包括的な理解へつながる。したがって、進捗状況としては、おおむね順調に進展、と判断した。これまで、グレリンが覚醒中枢のニューロンに対して興奮性の作用を示すことがin vitro実験による知見から明らかとなってきたが、次年度はグレリンまたはグレリン受容体拮抗薬の脳局所投与および睡眠・覚醒状態判別を用いたin vivo実験による検証を行い、グレリンが覚醒中枢ニューロンに及ぼす作用が動物の睡眠・覚醒行動にどのような影響を与えるのかを検証することで、グレリンの生理的役割を解明していく。

今年度は、本学の組織改組により生じた担当委員業務の激増により、本研究エフォートを大幅に削減するとなった。グレリンの覚醒中枢ニューロンに対する作用の検討を一部実施したが、予定していた行動実験に着手するに至らなかった。したがって、進捗状況に遅延が生じたため、1年間の期間延長により研究計画を実施する。次年度はグレリンまたはグレリン受容体拮抗薬の脳局所投与および睡眠・覚醒状態判別を用いたin vivo実験による検証を行い、グレリンが覚醒中枢ニューロンに及ぼす作用が動物の睡眠・覚醒行動にどのような影響を与えるのかを検証することで、グレリンの生理的役割を解明していく。