hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ディスク型ミクロゲルの合成とその凝集構造形成に関する研究

分子量分布の狭いポリ(スチレン-b-4-ビニルピリジン)[P(S-b-VP)]をリビングアニオン重合法で合成し、3,N-ペンタデシルフェノール[PDP]とのブレンド膜を作成し、PVP/PDPLamella in cylinder(LC)構造を発現させ、PVPコアーPSシェル型ディスク状ミクロゲルを合成した。ブロック共重合体の分子量が3万以上では、橋かけ時に膜がゲル化し、ミクロゲルが得らなかったため、PDPではなく、末端フェノール化ポリエチレンオキザイドを合成し、用いたが、LC構造は発現しなかった。これは、ポリエチレンオキサイド部分の結晶化が相分離構造形成に不適切なためである。このため、高分子量ブロック共重合体においてもPDPを用い、膜を、長時間アニールし、20°C以下で橋かけした。なおアニール時のPDPの蒸発を、FT-IR測定により検討した結果、PDPの蒸発はないことが明らかとなった。また、LC構造はSAXSによっても確認した。ミクロゲルの形状はシャドウイング法を用い、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果、ミクロゲルの厚みは、ブロック共重合体の分子量に依存せず、いずれも、3-7nmであり、文献値、SAXSの値ともよく一致し、高分子量ポリマーにおいてもディスク状ミクロゲルの合成に成功したた。PDPはクロロホルム/ヘキサン系で再沈殿することで除去した。誘電率の異なるクロロホルム、テトラヒドロフランおよび、ジメチルホルムアミドを溶媒として、ミクロゲルの凝集挙動を検討した。その結果、低誘電率のクロロホルムを溶媒とした場合、ミクロゲルのPVPコアは凝集しなかったが、誘電率を上昇するにつれ、ミクロゲルは、PVPコアの凝集のため、棒状の凝集体を形成した。この際、溶媒の誘電率のみならず、凝集の遮蔽となるPSシェル鎖の分子量が増大するにつれ、凝集をおこす溶媒の誘電率は増加するとの知見を得た。本研究では、始めにポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン)ブロック共重合体1種類、及び、ポリ(スチレン-b-4-ビニルピリジン)ブロック共重合体5種類(TI:PS84%,Mn=1.69X10^5,T2:PS76.5%,3.99X10^5,T3:PS70.6%,Mn=5.38X10^4,T4:PS84.4%,Mn=2.01X10^4,T5:PS65.6%,7.16X10^3)を合成し、GPC(新規購入パーツ:デュアルポンプ、示差屈折計、カラムオーブン)を用い、その特性を求めた。これらのポリマーとポリエチレンオキシド(PEO)を混合し、ポリスチレンマトリックス中でポリピリジンーPEOが棒を形成し、その棒の中でポリピリジンとPEOがラメラを形成するというミクロ相分離構造の発現を試みた。その際、溶媒としてトルエン、クロロホルム、テトラヒドロフランを用い、また、アニーリングの有無を因子として発現される相分離構造を検討した。分子量15000のPEOを用いたが、マクロ相分離を発現した。そのため、より分子量の小さな化合物として3N-ペンタデシルフェノール(3NPDP)を用いた。各膜の超薄切片の透過型電子顕微鏡観察の結果、T1,T4に関し、3NPDP混合比14%、トルエンでキャストしアニーリングを加えなかった膜において、意図したミクロ相分離構造を得る事ができた。更に、これらの相分離構造中のポリピリジン部分を、1,4-ジヨードブタンガスを用い、橋かけを行った。

その結果、分子量の低いT4では、棒状ミクロドメイン中、ポリピリジンドメインは3NPDPドメインでディスク状に隔てられていたにも関わらず、ディスク状ドメイン間の橋かけが起こり、その結果、内部に3NPDP球形ドメインを持つ棒状のミクロゲルが得られた。分子量の高いT1では、ディスク状のミクロゲルが得られたが、その収率は約30%であり、副生成物として棒状のミクロゲルが生成した。これは、3NPDPの分子量の低さが原因と考えられ、3NPDPに代わり末端にフェノール基を持つ分子量1万以下のPEOを合成した。前年に引き続きポリ(スチレン-b-4-ビニルピリジン)[P(S-b-VP)]と3,N-ペンタデシルフェノール[PDP]のブレンド膜より、PVP/PDPLamella in cylinder(LC)構造を発現させ、PVPコアーPSシェル型ディスク状ミクロゲルを合成した。前年の研究では、ブロック共重合体の分子量が3万以上では、橋かけ時に膜がゲル化し、ミクロゲルが得らなかったため、PDPではなく、末端フェノール化ポリエチレンオキザイドを合成し、用いたが、LC構造は発現しなかった。これは、ポリエチレンオキサイド部分の結晶化が相分離構造形成に不適切なためである。このため、高分子量ブロック共重合体においてもPDPを用い、膜を、長時間アニールし、20°C以下で橋かけした。なおアニール時のPDPの蒸発を、FT-IR測定により検討した結果、PDPの蒸発はないことが明らかとなった。また、LC構造はSAXSによっても確認した。ミクロゲルの形状はシャドウイング法を用い、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果、ミクロゲルの厚みは、ブロック共重合体の分子量に依存せず、いずれも、3-7nmであり、文献値、SAXSの値ともよく一致し、高分子量ポリマーにおいてもディスク状ミクロゲルの合成に成功したた。PDPはクロロホルム/ヘキサン系で再沈殿することで除去した。誘電率の異なるクロロホルム、テトラヒドロフランおよび、ジメチルホルムアミドを溶媒として、ミクロゲルの凝集挙動を検討した。その結果、低誘電率のクロロホルムを溶媒とした場合、ミクロゲルのPVPコアは凝集しなかったが、誘電率を上昇するにつれ、ミクロゲルは、PVPコアの凝集のため、棒状の凝集体を形成した。この際、溶媒の誘電率のみならず、凝集の遮蔽となるPSシェル鎖の分子量が増大するにつれ、凝集をおこす溶媒の誘電率は増加するとの知見を得た。
代謝性組織リモデリングとその変容によるメタボリックシンドロームの分子機構の解明

本研究では、肥満の脂肪組織と非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の肝臓において、CLS(crown-like structure)を起点として組織リモデリングが生じていることを証明し、細胞間相互作用による代謝性組織リモデリングの分子機構と病態生理的意義の解明を目指している。本年度は、肝臓CLSに特異的な分子メカニズムと、抗糖尿病薬のDPP-4阻害剤が代謝性組織リモデリングに及ぼす効果の解明に取り組んだ。DPP-4阻害剤は現在最も広く使用されている抗糖尿病薬で、血糖低下作用に加えて、肝臓における抗脂肪肝効果など多面的な作用が報告されている。我々は既に、遺伝性肥満を呈するメラノコルチン4型受容体(MC4R)欠損マウスに高脂肪食を負荷することにより、肥満やインスリン抵抗性を背景として、脂肪肝、NASH、肝細胞癌を経時的に発症するNASH・肝細胞癌モデルを確立した。そこで、DPP-4阻害剤をMC4R欠損マウスに投与したところ、予想に反して血糖値や脂肪肝の改善効果が認められなかった。この時、血中GLP-1活性やインスリン値は上昇したが、MC4R欠損マウスの強いインスリン抵抗性のためと考えられる。一方、肝臓CLSは同程度に形成されたものの、炎症や線維化は顕著に抑制された。この機序として、死細胞に応答するマクロファージの活性をGLP-1が抑制した可能性を考えている。さらに1年間の長期投与により、肝癌の発症が有意に抑制されることを見出した。さらに、肝臓CLSに特異的な分子メカニズムとして、死細胞センサーXや貪食制御分子Yに着目して検討を行っている。具体的には、これらの遺伝子欠損マウスの骨髄をMC4R欠損マウスに移植し、NASH発症に及ぼす影響を検討している。CLSにおける死細胞認識機構や死細胞クリアランスの重要性が示唆されるデータを予備的に得ており、詳細なメカニズム解明に繋げたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、肥満の脂肪組織と非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の肝臓において、CLS(crown-like structure)を起点として組織リモデリングが生じていることを明らかにした。本研究では、臓器局所の実質細胞と間質細胞の相互作用の場としてCLSに焦点を当てて、細胞間相互作用による代謝性組織リモデリングの分子機構と病態生理的意義の解明を目指している。本年度は、FXRアゴニストの代謝性組織リモデリングに対する作用を検討した。最近、臨床試験にてFXRアゴニストのNASHに対する有効性が示唆されているが、その作用機序はよく分かっていない。基礎研究では、肝星細胞やマクロファージにFXRが発現し、FXR活性化により抗炎症、抗線維化作用がもたらされると報告されているが、FXRは肝細胞に最も豊富に発現している。我々は既に、遺伝性肥満を呈するメラノコルチン4型受容体(MC4R)欠損マウスに高脂肪食を負荷することにより、肥満やインスリン抵抗性を背景として、脂肪肝、NASH、肝細胞癌を経時的に発症するNASH・肝細胞癌モデルを確立している。FXRアゴニストをMC4R欠損マウスに投与したところ、糖代謝には明らかな影響を及ぼさない一方、強力な抗NASH作用を認めた。組織学的には、脂肪肝改善作用に比して、肝細胞障害(風船様変性)や炎症、線維化が顕著に抑制された。FXRアゴニストの効果は、我々が確立した誘導性NASHモデルにおいても同様に認められた。この誘導性NASHモデルを用いた検討により、FXRアゴニストの効果は脂質代謝作用とは独立している可能性が考えられた。実際、FXRアゴニストを投与した肝臓において、肝細胞死の抑制が観察され、単離肝細胞において細胞死シグナルの抑制が認められた。本研究により、肝細胞を標的とするFXRアゴニストの新たな抗NASH作用が示唆された。CLSに注目することにより、NASHの病態解明や抗NASH治療戦略の作用標的に関する新たな視点が順調に得られている。本年度は、SGLT2阻害剤の代謝性組織リモデリングに対する作用を検討した。新しい糖尿病治療薬のSGLT2阻害剤は、血糖低下作用に加えて、肝臓における抗脂肪肝効果など多面的な作用を有している。そこで、SGLT2阻害剤をMC4R欠損マウスに投与したところ、血糖値の低下、体重増加の抑制、脂肪肝の改善など既知の効果に加えて、CLS形成や間質線維化が強力に抑制されることを見出した。この機序として、SGLT2阻害剤がGSH産生を介して抗酸化作用を発揮することが明らかになった。さらに、約1年間投与を継続すると、MC4R欠損マウスにおける肝腫瘍の発生が顕著に抑制されることを見出した。この機序は未だ明らかでないが、非腫瘍部における線維化抑制され、MycやAFP発現が低下することを観察している。さらに詳細な機序を明らかにするためには、より短期間で肝腫瘍を発症する新たな動物モデルが必要である。

そこで、MC4R欠損マウスに肝癌誘発化学物質であるジエチルニトロソアミン(DEN)を投与することにより、肝腫瘍形成を従来の1年から3-4ヶ月程度に短縮する新しいメタボ肝癌モデルを開発した。このような種々の動物モデルを組み合わせることにより、代謝性組織リモデリングの病態解明や新規治療標的の同定、薬効評価系としての利用などが促進すると期待できる。薬効評価や病態解明に関する研究が順調に進捗しており、さらに研究を加速させる新しい動物モデルの開発にも成功した。本研究では、肥満の脂肪組織と非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の肝臓において、CLS(crown-like structure)を起点として組織リモデリングが生じていることを証明し、細胞間相互作用による代謝性組織リモデリングの分子機構と病態生理的意義の解明を目指している。本年度は、肝臓CLSに特異的な分子メカニズムと、抗糖尿病薬のDPP-4阻害剤が代謝性組織リモデリングに及ぼす効果の解明に取り組んだ。DPP-4阻害剤は現在最も広く使用されている抗糖尿病薬で、血糖低下作用に加えて、肝臓における抗脂肪肝効果など多面的な作用が報告されている。我々は既に、遺伝性肥満を呈するメラノコルチン4型受容体(MC4R)欠損マウスに高脂肪食を負荷することにより、肥満やインスリン抵抗性を背景として、脂肪肝、NASH、肝細胞癌を経時的に発症するNASH・肝細胞癌モデルを確立した。そこで、DPP-4阻害剤をMC4R欠損マウスに投与したところ、予想に反して血糖値や脂肪肝の改善効果が認められなかった。この時、血中GLP-1活性やインスリン値は上昇したが、MC4R欠損マウスの強いインスリン抵抗性のためと考えられる。一方、肝臓CLSは同程度に形成されたものの、炎症や線維化は顕著に抑制された。この機序として、死細胞に応答するマクロファージの活性をGLP-1が抑制した可能性を考えている。さらに1年間の長期投与により、肝癌の発症が有意に抑制されることを見出した。さらに、肝臓CLSに特異的な分子メカニズムとして、死細胞センサーXや貪食制御分子Yに着目して検討を行っている。具体的には、これらの遺伝子欠損マウスの骨髄をMC4R欠損マウスに移植し、NASH発症に及ぼす影響を検討している。CLSにおける死細胞認識機構や死細胞クリアランスの重要性が示唆されるデータを予備的に得ており、詳細なメカニズム解明に繋げたい。誘導性NASHモデルを用いて、抗NASH治療戦略の評価を効率よく進めるとともに、マクロファージや線維芽細胞に注目して、新たな病態メカニズムの解明や創薬標的の同定に関する研究を推進する。新たなメタボ肝癌モデルを用いて、発癌に及ぼす代謝制組織リモデリングの意義を検討するとともに、マクロファージや線維芽細胞に注目して、代謝制組織リモデリングの分子メカニズムの解明を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Adiposity亢進に伴う腫瘍免疫微少環境変化と泌尿器癌進展の分子機構解明

●本研究の目的は、腫瘍微小環境における脂質、液性免疫因子、局所免疫細胞の包括的解析を行い、Adiposity亢進による腫瘍進展に関与する免疫微少環境関連標的分子を同定することであるが、2018年度には2016年継続して以下の結果を出し、知見を示すことができた。●我々は以前、MIC-1が高脂肪食下での前立腺進展に関わることを報告したが、2017年にMIC-1の受容体がGFRAL(GDNF family receptor α-like)であることが報告された(Nature 2017)。2018年には、このGFRAL/MIC-1システムと前立腺癌進展と癌免疫微小環境の解析を行い、高脂肪によって、前立腺癌細胞からのMIC-1の発現亢進がおこり、MIC-1が間質細胞を刺激し、IL-6やIL-8の発言を促進、結果として、前立腺癌の進展を促すことを見出した(投稿準備中)、現在さらに高脂肪食下でのGFRAL/MIC-1システム亢進の分子機構を解析している。●脂肪酸結合分子4(FABP4)は脂質シャペロン分子で脂質代謝に重要な働きをするが、前立腺癌細胞と前立腺癌組織におけるFABP4の発現と前立腺癌細胞の増殖、浸潤能における機能解析を行い前立腺癌細胞によるFABP4の産生と分泌は前立腺癌の進展を促進する可能性があることを示した(2016-2018年度、Oncotarget 2017)。●腎癌におけるAdipokineやインスリン受容体の解析により、腎癌発症の肥満パラドックス(肥満は腎癌のリスクファクターであるが、進展に対しては、予防的に働く)を説明できる結果を示した(2016-2018年度、PLoSOne 2017、Oncol Rep 2017)。本研究の目的は、腫瘍微小環境における脂質、液性免疫因子、局所免疫細胞の包括的解析を行い、Adiposity亢進による腫瘍進展に関与する免疫微少環境関連標的分子を同定することであるが、以下の結果、知見を示すことができた。●我々は、MIC-1が高脂肪食下での前立腺進展に関わることを報告したが、2017年にMIC-1の受容体がGFRALであることが報告された(Nature 2017)。2018年には、このGFRAL/MIC-1システムと前立腺癌進展と癌免疫微小環境の解析を行い、高脂肪によって、前立腺癌細胞からのMIC-1の発現亢進がおこり、MIC-1が間質細胞を刺激し、IL-6やIL-8の発言を促進、結果として、前立腺癌の進展を促すことを見出した。●脂肪酸結合分子4(FABP4)は脂質シャペロン分子で脂質代謝に重要な働きをするが、前立腺癌細胞と前立腺癌組織におけるFABP4の発現と前立腺癌細胞の増殖、浸潤能における機能解析を行い前立腺癌細胞によるFABP4の産生と分泌は進展を促進する可能性があることを示した(Oncotarget 2017)。●高脂肪食によるmicroRNAの発現異常による前立腺癌進展を示した(Carcinogenesis 2016)。腎癌におけるAdipokineやインスリン受容体の解析により、腎癌発症の肥満パラドックス(肥満は腎癌のリスクファクターであるが、進展に対しては、予防的に働く)を説明できる結果を示した(PLoS One 2017、Oncol Rep 2017)。以上より、本研究はおおむね順調に進んでいると言える。今後、高脂肪食・肥満下の前立腺癌増殖・進展における腸内細菌叢異常と全身性免疫応答(サイトカイン誘導)が関連するかを明らかにし、腸内細菌叢の制御により前立腺癌や腎癌の進展を阻止できるかも検討する。1)我々は高脂肪職の中でもラード食摂取により遺伝子改変マウスが白色脂肪増加を引き起こし、前立腺癌発症比率が増加し、増殖能が亢進していることを見出した。一方、対象群と比較し、ラード食摂取マウスの腸内細菌叢変化を認め、癌増殖、癌微小免疫環境の関連が興味深い新たなテーマとして見出された。2019年以降は現在の研究に加えて、高脂肪食・肥満下の前立腺癌増殖・進展における腸内細菌叢異常と全身性免疫応答(サイトカイン誘導)が関連するかを明らかにする。さらに腸内細菌叢の制御により前立腺癌進展を阻止できるかも検討する。2)さらにMIC-1/GFRALシステム亢進とAdiposity亢進にともなう前立腺癌進展機構の解析をすすめる。とくに腫瘍免疫微小環境の異常に注目し、IL-6やIL-8の関与を分子レベルで示す。3)泌尿器癌腫瘍周囲の脂肪細胞の培養系を用いて、in vitroでのサイトカイン産生プロフィールを正常者(腎移植の腎提供者)の脂肪培養と比較し、腫瘍免疫微小環境に影響を与える分子を同定。4)分子疫学的手法によって候補分子の遺伝子多型・泌尿器癌進展や生活習慣との背景、臨床情報、臨床経過、治療効果(特に新規免疫療法)との関連を検証、臨床応用に繋げる。●近年の泌尿器癌の増加は著しい。疫学的には『食事の西欧化』による高カロリー・高脂肪食の影響が示唆される。私どもの研究も含めて、この進展機序に、腫瘍微少環境における局所免疫が深く関与していることが示されている。本研究は、腫瘍微小環境における脂質、液性免疫因子、局所免疫細胞の包括的解析を行い、Adiposity亢進による腫瘍進展に関与する免疫微少環境関連標的分子を同定する。

●脂肪酸結合分子4(FABP4)は脂質シャペロン分子で脂質代謝に重要な働きをするが、前立腺癌細胞と前立腺癌組織におけるFABP4の発現と前立腺癌細胞の増殖、浸潤能における機能解析を行った。FABP4はホルモン不応性前立腺癌細胞PC-3、DU145とその培養液において高発現、ホルモン感受性細胞LNCaPでは低発現であった。血清FABP4値は前立腺癌患者では健常者に比べて有意に高く、患者血清中のFABP4値はGleason score値と正相関がみられた。FABP4は前立腺癌組織にも高発現し、また前立腺癌と脂肪組織の境界面にも高発現していた。In vitroの検討では、PC-3、DU145細胞の浸潤能はリコンビナントFABP4の添加により有意に亢進し、FABP4 siRNA処理によって有意な低下が見られた。また、リコンビナントFABP4の処理によって、PC-3、DU145細胞でAKTとERKのリン酸化の亢進がみられた。よって前立腺癌細胞によるFABP4の産生と分泌は前立腺癌の進展を促進する可能性がある。●その他の研究として、高脂肪食によるmicroRNAの発現異常による前立腺癌進展を示した(論文業績参照)。また腎癌におけるAdipokine、インスリンパラドックスを説明できる結果を示した(論文業績参照)。また、前立腺癌に対する内分泌療法に伴う骨粗鬆が骨転移を促進することを示した(論文業績参照)。●本研究の目的は、腫瘍微小環境における脂質、液性免疫因子、局所免疫細胞の包括的解析を行い、Adiposity亢進による腫瘍進展に関与する免疫微少環境関連標的分子を同定することであるが、初年度に以下を示すことができた。●脂肪酸結合分子4(FABP4)は脂質シャペロン分子で脂質代謝に重要な働きをするが、前立腺癌細胞と前立腺癌組織におけるFABP4の発現と前立腺癌細胞の増殖、浸潤能における機能解析を行い前立腺癌細胞によるFABP4の産生と分泌は前立腺癌の進展を促進する可能性があることを示した(論文作成中)。●高脂肪食によるmicroRNAの発現異常による前立腺癌進展を示した(論文業績参照)。●腎癌におけるAdipokineやインスリン受容体の解析により、腎癌発症の肥満パラドックス(肥満は腎癌のリスクファクターであるが、進展に対しては、予防的に働く)を説明できる結果を示した(論文業績参照)。●前立腺癌に対する内分泌療法に伴う骨粗鬆が骨転移を促進することを示した(論文業績参照)。●近年の泌尿器癌の増加は著しい。疫学的には『食事の西欧化』による高カロリー・高脂肪食の影響が示唆される。私どもの研究も含めて、この進展機序に、腫瘍微少環境における局所免疫が深く関与していることが示されている。本研究では、腫瘍微小環境における脂質、液性免疫因子、局所免疫細胞の包括的解析を行い、Adiposity亢進による腫瘍進展に関与する免疫微少環境関連標的分子を同定する。●脂肪酸結合分子4(FABP4)は長鎖脂肪酸に結合する分子で細胞内脂質代謝に深く関わっている脂質シャペロン分子である。
マイクロ電解セルの創出による電解反応機構解明とデバイス応用

本萌芽研究では、液中透過力の強い200keV走査透過電子顕微鏡を用いた局在場検出法を採用し、SiNメンブレン電解セルの開発、ならびにoffset型HARDF検出法による局在場検出技術の創出を推進した。内径が3mmのHARDF検出器中心に対して、電子ビーム軸に約1.3mmオフセットを与え、投影レンズ系を調整してカメラ長を2.23mに調整した。電解セルを透過した電子に対して、透過電子線は0.3mRadの偏向角で、50%のHARDF検出強度を与え、液中に形成される局在場で散乱された散乱電子情報を画像化できることを実証した。本研究では、透過電子顕微鏡中視野下で機能する極薄のマイクロ電解セルを開発し、既開発の局在場可視化技術と組み合わせて、電解液中での炭素系電極の構造変化や局在電荷分布をナノスケールで可視化解析する技術の創出を目的としている。電解液中でのグラファイト担持体の熱拡散過程とグラフェン面の破断とカーリング、さらにエッジ端の再結合過程を調べ、電解液中における担持体の劣化過程を解明して、高機能高耐久性電池電極構造への開発指針を得るとともに、電解液中での担持体や触媒微粒子上での動的な局在電荷形成・電位分布を可視化計測し、局在電荷(特異点)に強く依存する酸化還元触媒反応機構を解明する計画である。H27年度は、研究代表者が同時期から実施している基盤研究Aの局在電場可視化の研究によって得られる、高分解能電子線偏向検出機構を利用し、本研究課題での電解液中セルを組み合わせて、電解液中での電荷・電場分布の可視化を実現する予定であった。実際にH27年度末の段階で、4分割Siダイオード検出器を開発によって電線偏向検出機構が稼働開始し、局在場検出度として2000V/mを実現し、電解液中での局在場可視化は実現できる見通がたった。しかし、水溶液を電解液とした超薄型のメンブレン電解液マイクロセルでの液漏れ、真空リーク事故によって、電解液中マイクロセルの開発に苦慮している。そこで、水溶液系電解液による液中セルを一端見合わせ、耐真空性が良好なイオン液体を用いた電解液マイクロセルによる液中局在場分布の可視化を優先して実施することとした。本研究の推進には、(1)透過電子顕微鏡による電子線偏向・干渉計測系の整備と、(2)マイクロ電解セルの実現、という2つの独立した技術の平行進行が必要となる。(1)に挙げた電子線偏向干渉計測系は、本研究代表者が同一時期に開始した基盤研究Aの主テーマとして開発を推進している技術である。こちらは、専用の4分割Siダイオード検出器を開発し、現時点で、おおよそ100個の局在電子集団を計測できるレベル、すなわち2000V/mの局在電場強度の計測を年度末に実証したところである。このレベルの局在電場であれば、電解液中での局在場の変化を観測できると予測される。一方で、苦戦しているのは、極薄のメンブレンによって作り出される電解液セルの開発である。特に水溶液を電解液とした密封型の極薄メンブレンセルの形成に対して、内部電極の設置とともに、ガス発生に対応したリザーバの形成と多機能・高機能を盛り込んだために、真空中での気密保持に多くの課題を見いだした。この状況を受けて、研究方法の一部変更を検討している。まず、水溶液による電解液封入を一旦見合わせ、イオン液体を電解液とした耐真空性に優れる電解液中セルを用いる手法を検討する。この場合、イオン液体の電位窓約±1V程度に印可電圧が抑制されてしまうが、電極間距離をミクロンスケールで制御し、微少電解領域を形成することで電界強度を維持できるはずである。イオン液体自体の蒸気圧の低さ、耐真空性を最大限に利用してSTEM環境内での電解セルの動作を実証できるように推進方向の修正を行う。イオン液体は電子線照射によって重合し固体化するが、実験系の改良と操作手法を改善して電子線照射時間を極力短縮することで、その場の可視化が実現できると予測している。本研究では、透過電子顕微鏡視野下で機能する極薄のマイクロ電解セルを開発し、既開発の局在場可視化技術と組み合わせて、電解液中での炭素系電極の構造変化や局在電荷分布をナノスケールで可視化解析する技術の創出を目的としている。電解液中でのグラファイト担持体の熱拡散過程、グラフェン表面の破断とカーリング、さらにエッジ端の再結合過程を調べ、電解液中における担持体の劣化過程を解明して、高機能耐久性電池電極構形成に向けた開発指針を得るとともに、電解液中での担持体や触媒微粒子上での動的な局在電荷形成・電位分布を可視化計測し、局在電荷に強く依存する酸化還元反触媒応表機構を解明する計画である。本研究を遂行するためには、透過走査電子顕微鏡を用いた局在場検出技術の開発と、電解液を電子顕微鏡中に保持しながらら電解電位印加を行うためのマイクロ電解セルの開発が重要な開発項目である。しかしながらH27年度の初年度から、SiNメンブレンへの金属電極の加工ならびに、電子線照射下での真空鏡筒カラム内でのセルの安定性、つまり水の漏洩や、電子線照射に伴うメンブレン歪みと破裂など、その安定性の確保に多くの課題が見出された。

本萌芽研究では200keV電子顕微鏡を走査型に改造し、透過力の強い200keV電子線によるSiNメンブレン電解セルの透過と、HARDF検出器による局在場検出技術への方針変更を行った。HARDF検出中心に対して電子ビーム軸にオフセットを与え、投影レンズ系を調整することで、局在場による散乱電子情報を画像化することができる事を実証した。イミダゾリウム系イオン液体が高真空環境で安定に液状を保ち、走査透過電子顕微鏡の鏡筒内で電解液として利用できる事は判明した。しかし、有機高分子であるがために、電子線照射による重合反応が起こる。しかも、細く絞ったSTEM電子線、つまり非常に高い電子線ドーズに晒されることで、イオン液体の重合反応が極めて速く進行してしまうことも判明した。一方で水溶液ベースの電解液を用いた場合には、水のリークと、局所的な電解液変性に伴うメンブレン膜の膨張が生じ、メンブレン膜が破裂する。この事象が多発して問題となり、電子顕微鏡鏡筒内での電解液の保持に苦労している。SiNメンブレンの厚さは100nmであり、表面にpt電極を配置してある。このメンブレン膜2枚を重ね合わせて、電解液をメンブレン間の隙間に浸透させ、メンブレン基板周囲をエポキシ樹脂で張り合わせる構造を用いている。実効的な電解液の厚さは約1ミクロンであるが、この中でのガスの発生と局所的なメンブレンの歪みをどう解消するか、様々な方面から検討を進めている。一方で、200keV電子線を用いた、HARDF検出器による局在場検出系はほぼ完成している。また200keV電子線による張り合わせメンブレンの透過像と電解液の無い状態での突起物周囲でに形成される局在場による電子線散乱可視化も実現している。固体材料や真空雰囲気に対して、流動性の液体を用いる事の難しさが如実に現れている。本研究では、透過型電子顕微鏡視野下で機能する極薄のマイクロ電解セルを開発し、既開発の局在場可視化技術と組み合わせて、電解液中での炭素系電極の構造変化や局在電荷分布をナノスケールで可視化解析する技術の創出を目的とした。本萌芽研究では、200keV電子顕微鏡を走査型に改造し、透過力の強い200keV電子線によるSiNメンブレン電解セルの透過と、HARDF検出器による局在場検出技術への方針変更を行った。内径が3mmのHARDF検出器中心に対して、電子ビーム軸に約1.3mmオフセットを設定した。投影レンズ系を調整し、カメラ長を2.23mに調整すると、電子線は0.3mRadの偏向角を与え、これは50%のHARDF検出強度に相当する。この電子光学系で局在場による散乱電子情報を画像化できることを実証した。厚さ100nmで0.5mm角のウィンドウを持つSiNメンブレンにPt/Tiのマイクロ金属電極を加工し、これを液中局在場計測の電解計測の基部試料とした。ここにイオン液体を塗布し、もう一枚のSiNメンブレンで挟み込み電解セル構造を形成した。AgClを溶解したクロライド系イミダゾリウム塩電解液に対して、電位を与えると陽極電極にはAgデンドライトが樹状成長する。このデンドライト成長過程で樹状成長した銀針状結晶の先端に明確な局在場形成を検出する事ができた。樹状結晶に対して-10Vの電圧を印加すると、STEM画像中には先鋭部に明領域が形成された。針状結晶先端から0.4μmの同心円領域には90V/umの局在場が形成され、結晶先端には約10000個の局在電荷が形成されたことに対応する。また、極性分子電解液による局在場増強も観測された。本研究を通して、200keVの透過走査型電子顕微鏡を用い、SiNメンブレンで挟み込んだ極薄電解液セル中での局在場可視化が可能であることが実証された。本萌芽研究では、液中透過力の強い200keV
B細胞分化活性化制御における分化抑制因子Idの役割

分化抑制因子Idは哺乳類では4種類(Id1, Id2, Id3, Id4)知られている。Idの種類によって、機能が異なる可能性を示唆するデータが蓄積してきている。実際、Id2欠損B細胞と, Id3欠損B細胞は、B細胞活性化状況が異なることを見いだし、それに起因すると思われる免疫反応の異常が認められる。それぞれのIdの作用機構を明らかにする目的にてB細胞を解析する。Id2-/-B細胞、Id3-/-B細胞と、コントロールB細胞をin vitroにて分化誘導し、遺伝子発現のプロファイリングを行った。その結果、Id2, Id3欠損により発現量に変化の見られる多数の遺伝子群が明らかになった。これらの遺伝子群はId2欠損とId3欠損では大きく異なることから、Idの機能的相違を反映する結果である可能性が考えられた。次に、Idの過剰発現によって変化する遺伝子群を調べることによって、直接転写を制御している対象遺伝子を絞り込むことを行った。このため、種々分化段階のB細胞株をもちいてinducible lineを樹立した。Id遺伝子の発現誘導によって、細胞の活性化状態等の変化を認めたが、Id2, Id3間で、発現に差のある遺伝子はあまり見つからず、差を認めた遺伝子もノックアウトB細胞から得られたデータと比較すると、直接のターゲットとは考えられなかった。この細胞株を用い、Id2, Id3それぞれの複合体を分離しその構成成分を調べたが、ここでも二つの複合体間に大きな違いを見いだす事は出来なかった。しかし、これらの解析を進める過程で、形質細胞分化とクラススイッチ組換えを制御する新しいメカニズムが明らかになったため、これを投稿中である。しかし、Id2、Id3の過剰発現における遺伝子発現の変化を比較しても、それほど大きく差のある遺伝子は見つからなかった。それ以外の研究も、ほぼ予定通りに進んでいる。しかし、データは想定外であり、結論には至らなかった。しかし、この研究を行う過程で新しい知見が得られたため、現在それをまとめているところである。Id2, Id3の機能的相違を明らかにするには、それぞれのターゲット候補遺伝子(Id2-/-B細胞とId3-/-B細胞とで発現の異なる遺伝子)をさらに絞り込む必要がある。過剰発現の系では正しいターゲット遺伝子を絞り込むことが出来なかったため、B細胞以外細胞系列における、Id2-/-とId3-/-の遺伝子発現を比較することによって候補遺伝子を抽出する。B細胞とそれ以外の細胞で共通に制御されている遺伝子をターゲット遺伝子として次の解析を進める予定である。Id2遺伝子欠損マウス,Id3欠損マウスにおいて、B細胞活性化状況が異なることに起因すると思われる免疫反応の異常を、それぞれのマウスにおいて見いだしている。このB細胞活性化の差異を生み出す分子基盤を明らかにする目的にて、Id2-/-B細胞、Id3-/-B細胞と、コントロールB細胞をin vitroにて分化誘導し、cDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルのスクリーニングを行った。その結果、Id2,Id3欠損により発現量に変化の見られる多数の遺伝子群が明らかになった。B細胞活性化にはB細胞受容体からのシグナルが重要である。野生型およびId2遺伝子欠損、Id3遺伝子欠損マウスのB細胞シグナリングの変化を解析した結果、一部のシグナリング経路に有為な差を見いだした。さらに解析をすすめるため、野生型Id2、Id3及び、各種ドメイン欠損型Idをtetracycline依存的に過剰発現できる細胞株をA20細胞株を用いて作製し、各種Idによる遺伝子発現制御機構と、BCRシグナル制御過程における役割の違いを検索した。その一方でId2,Id3が様々なB細胞分化状態の維持にどのように関与しているのかを再度詳細に検証する目的にて、種々分化段階のB細胞株をもちいたinducible lineを樹立した。しかし、これらの細胞株を用いた実験からはId2とId3の機能的相違を見いだすことは出来なかった。そこで、Id2欠損マウス、Id3欠損マウスに加えて、Id2,Id3をinducibleに発現誘導出来るマウスの作成に着手した。

Id遺伝子の発現誘導によって、細胞の活性化状態等の変化を認めたが、Id2, Id3間で、発現に差のある遺伝子はあまり見つからず、差を認めた遺伝子もノックアウトB細胞から得られたデータと比較すると、直接のターゲットとは考えられなかった。この細胞株を用い、Id2, Id3それぞれの複合体を分離しその構成成分を調べたが、ここでも二つの複合体間に大きな違いを見いだす事は出来なかった。しかし、これらの解析を進める過程で、形質細胞分化とクラススイッチ組換えを制御する新しいメカニズムが明らかになったため、これを投稿中である。In vitroの実験から、期待出来る実験結果は得られなかったが、一通りの実験を行ったことから、今後の実験を進めるのに適した系が明確になった。Id2-/-B細胞、Id3-/-B細胞と、コントロールB細胞をin vitroにて分化誘導し、遺伝子発現のプロファイリングを行った。その結果、Id2, Id3欠損により発現量に変化の見られる多数の遺伝子群が明らかになった。しかし、Id2、Id3の過剰発現における遺伝子発現の変化を比較しても、それほど大きく差のある遺伝子は見つからなかった。それ以外の研究も、ほぼ予定通りに進んでいる。しかし、データは想定外であり、結論には至らなかった。しかし、この研究を行う過程で新しい知見が得られたため、現在それをまとめているところである。マウスで表現系の明らかであるB細胞を用いて今後の解析をすすめる。すでに表現系が確認出来ているId2欠損マウス、Id3欠損マウスに、様々なIdやIdの変異体を過剰発現することによって、それぞれの欠損によって見られた表現系に与える影響を調べる。Id2, Id3の機能的相違を明らかにするには、それぞれのターゲット候補遺伝子(Id2-/-B細胞とId3-/-B細胞とで発現の異なる遺伝子)をさらに絞り込む必要がある。過剰発現の系では正しいターゲット遺伝子を絞り込むことが出来なかったため、B細胞以外細胞系列における、Id2-/-とId3-/-の遺伝子発現を比較することによって候補遺伝子を抽出する。B細胞とそれ以外の細胞で共通に制御されている遺伝子をターゲット遺伝子として次の解析を進める予定である。
遺伝子発現解析によるマウス胎仔低酸素バイオマーカーの探索

本研究の目的は、低酸素ストレスによる胎児脳出血の発症機序を解明するため、発症前から発症過程におけるマウス胎仔低酸素バイオマーカーを発見することである。その手段として、正常モデルマウス群(N群)、脳出血モデルマウス群(J群)、および慢性低酸素負荷群(H群)の網羅的遺伝子発現解析と、それによる母体血中の胎仔由来cell-freeDNAの同定を行う予定である。平成27年度は、胎仔由来cell-freeDNA採取のため、先行研究に倣い、正常胎盤、妊娠マウス母獣血液、産褥マウス母獣血液を採取した。採取方法、採取時期については研究代表者と協力者間で協議の上、決定した。また、段階的低酸素負荷による胎仔由来cell-freeDNAの発現変化(と胎仔の状態)から虚血低酸素のバイオマーカーを発見するための準備として、低酸素に対する急性反応と慢性反応を区別して評価するためのシステムを構築した。他方、システム生物学関連の研究会に参加し情報収集を行うことで、遺伝子発現解析のための理論構築にも取り掛かった。しかし、27年度の前半、研究代表者の人事異動があったため、研究の実務的な着手が遅れた点も報告する。平成28年度前半は、N、J、H群の遺伝子発現ライブラリ作成のため、胎仔脳および母獣血を採取し、組織由来RNAおよび母獣血中cell-free DNAを抽出する段階まで実施した。しかし、年度の後半、再び研究代表者の人事異動があったため、研究時間の確保が極めて困難となった。そこで、28年度後半は、27年度に作成した遺伝子発現解析のための理論構築をさらに進め、発現量のばらつき、および細胞数を考慮した新規数理モデルを構築した。このモデルにより、従来の回帰分析などの統計学的手法に加え、分散の程度から遺伝子発現ネットワークを推定するアイディアを得ることができた。今後は実験との比較を行いたいと考えている。平成27年度は正常胎盤・妊娠マウス母獣血液・産褥マウス母獣血液の遺伝子発現ライブラリ作成を目的に以下の実験を行った。C57BL/6Nマウスに妊娠に十分な栄養であることが保証されているAIN-93Gを給餌したN群を作成し,妊娠させた。妊娠19.5日目に正常分娩したマウスを分娩翌日に麻酔下で開胸し,心臓より採血を行った。この血液から血漿を分離し,産褥マウス母獣血液サンプルとした。同様に妊娠17.5日に麻酔下で母獣を開胸し,心臓より採血を行った。この血液から血漿を分離し,妊娠マウス母獣血液サンプルとした。正常胎盤サンプルは別の妊娠17.5日のマウスから麻酔下で採取した。これは採取時の出血の影響で母獣が低酸素状態となる事を避けるためである。平成29年度に実施予定の段階的急性低酸素負荷条件に慢性低酸素負荷を追加することにし,その条件検討を行った。計画書に記載した急性低酸素では胎盤への血流を完全に遮断した後,5分間だけ血流を開放している。この5分間で母獣血中へ胎仔由来のCell-freeDNAが十分に移行しない可能性および,低酸素に対する急性反応と慢性反応を区別して評価できる様に改善するためである。検討はN群で実施した。妊娠15.5日目の母獣を麻酔下で開腹し,両側の子宮動脈に0.5mm径のテグスを併走させた状態で絹糸で結紮する。結紮後,テグスを抜去することで子宮動脈径を0.5mmに制限することができた。この動脈系の制限により子宮動脈血流を約50%抑制することを超音波画像診断によって確認した。閉腹後,正常に覚醒し,48時間の生存に成功し,胎仔成長が約70%に抑制されること,胎盤の酸素分圧が約60%に抑制されることを確認した。平成27年度に代表者の所属が変わり,共同実験者との打合せ時間が不足したため,予定していたアノテーションを実施することが出来なかった。その分,平成29年度実施予定の低酸素負荷に関する条件検討を先行して実施し,次年度以降に遅れを挽回出来る態勢を整えることができた。

平成28年度前半は、N、J、H群の遺伝子発現ライブラリ作成のため、胎仔脳および母獣血を採取し、組織由来RNAおよび母獣血中cell-free DNAを抽出する段階まで実施した。しかし、年度の後半、再び研究代表者の人事異動があったため、研究時間の確保が極めて困難となった。そこで、28年度後半は、27年度に作成した遺伝子発現解析のための理論構築をさらに進め、発現量のばらつき、および細胞数を考慮した新規数理モデルを構築した。このモデルにより、従来の回帰分析などの統計学的手法に加え、分散の程度から遺伝子発現ネットワークを推定するアイディアを得ることができた。今後は実験との比較を行いたいと考えている。平成28年度は予定通り,脳出血モデルマウス群(J群)の遺伝子発現ライブラリを作成する。平成27年度に実施出来なかったアノテーションに関してはN群,J群のサンプルを同時に実施し,遅れを挽回する。平成29年度に実施予定の段階的低酸素負荷に関しては,計画書に記載した急性低酸素負荷だけでなく,平成27年度に実施した慢性低酸素負荷も併せて実施する。これによって,より多くの低酸素バイオマーカーが検出されることが期待できる。平成27年度に代表者の所属が変わり,共同実験者との打合せ時間が不足したため,予定していたアノテーションを実施することが出来なかった。平成27年度に実施できなかった遺伝子発現ライブラリのアノテーションを行う。また,平成28年度は予定通り,脳出血モデルマウス群(J群)の遺伝子発現ライブラリを作成する。
ばらつきや欠陥を克服する集積回路ハードウェア設計技術

製造容易性を向上させるとともにばらつきに強靭な構造を持つ論理回路の構造法と、ばらつきや欠陥の影響を救済する方法について検討した。ばらつき耐性と製造性を強化する方法としてレイアウトパターンの単純化と規則性向上に着目し、その定量的効果をシミュレーションと実測により明らかにした。フリップフロップがチップ内ばらつきに脆弱である事を解明し、ばらつきに強靭なフリップフロップを開発した。ばらつき量を測定するオンチップモニタ回路を開発した。本研究の目標は、ナノメートル寸法となった集積回路を対象として、製造容易性を高めるとともにばらつきに対して強靭な回路構成法をを明らかにすることと、ばらつきや欠陥の影響を救済するための集積回路構成法を示すことである。今年度は、スタンダードセルを対象として、その製造容易性を高める方法を検討した。また、テスト回路を試作し、実回路におけるばらつき量を評価した。これらの概要は、次の通りである。まず、スタンダードセルの製造容易性を高める方法として、レイアウトに規則性を導入することによりレイアウトパターンの複雑度を下げた。これにより、露光工程におけるパターン転写の忠実度が向上するとともに、焦点ずれなどのプロセス変動への耐性も向上すると期待できる。一方、規則性の導入により設計自由度が下がるため、レイアウト面積や動作特性にも影響を及ぼすと懸念される。そこで、Dフリップフロップを対象として、ポリシリコンパターンへの規則性導入効果を露光シミュレーションにより評価した。導入する規則性の程度を2段階に分けてチップ内のポリシリコン幅のばらつき量を評価した結果、規則性導入によりばらつき量が大きく低減することが明らかになった(6.8%から、2.7%と1.3%に減少)。一方、チップ面積は増加する(12%と29%)。今後、動作特性に及ぼす影響について精査する必要がある。次に、実回路における特性ばらつき量を評価するために、90nmプロセスにおいてリングオシレータアレイを作成し、発振周波数ばらつきを評価した。ばらつき成分を、チップ上でなだらかに変化する量とランダムに変化する量に分離したところ、後者は前者の約5倍であり、ランダム成分が支配的であった。今後、ばらつきの詳細なモデル化や、より広いチップ領域でのばらつき特性の評価が必要である。本年度はスタンダードセルを対象として、製造性の強化を目的としたレイアウトの単純化や規則性の導入が、特性のばらつきや動作特性に及ぼす影響を、シミュレーションとともにテスト回路(180nm, 90nm, 65nm)の実測から評価した。90nmプロセスのテスト回路では、ダミー挿入によるポリシリコンピッチの単一化により、動作速度のばらつき量は16%程度低減する一方、動作速度自身は4%低下した。一方、45nmプロセスを想定した場合、ポリピッチの統一は適切な露光耐性確保の観点から不可欠であることも判明した。プロセスノードごとに適切なレベルの規則性導入が重要である。なお、180nmプロセスでは、製造性に考慮したスタンダードセルライブラリを新たに開発した。このライブラリは、VDECを通じて日本全国に公開している。特性ばらつきの評価技術については、実シリコン上で発生するばらつきを分析し、その成分分離を行った。90nmプロセスでは、チップ内でランダムに発生する成分が最も多く、その標準偏差はゲート1段あたり4.2%であった。また、ばらつきがランダムに変動する場合のゲート遅延分布を正規分布として求める手法を開発した。再構成回路におけるばらつき活用技術についても検討した。特性変動量やNBTIによる特性劣化量の測定方法についても検討し、65nmプロセスでテスト回路を設計した。今後、ばらつきや劣化の補償技術に検討を進めていく。本研究の目標は、製造容易性を向上させるとともにばらつきに強靭な構造を持つ要素論理回路(これをロバスト論理ブロックと呼ぶ)の構成法を明らかにすることと、ロバスト論理ブロックを構成要素とし、ばらつきや欠陥の影響を救済可能なチップレベルのハードウェア実現法を明らかにすることである。具体的な達成目標は以下の通り。(1)ロバスト論理ブロックの回路ならびにレイアウト構成法を明らかにする。(2)回路特性のばらつきや特性劣化の定量的な評価・解析技術を開発する。(3)ばらつきや欠陥を救済可能な集積回路ハードウェア構成法を示す。今年度は、達成目標の(1)を実現する技術として、ばらつき耐性と製造性を強化するためのレイアウトガイドラインとして、ポリシリコンのパターン形状を単純化し、密に規則的に配置する方法が有効であることを明らかにした。上記目標の(2)については、リングオシレータを基本とする特性ばらつきの評価回路を作成し、周波数ばらつきから製造ばらつき量を求める方法を開発した。また、リーク電流の変動を高速に測定する回路を開発し、NBTIによる特性劣化を正確に評価する方法を示した。達成目標の(3)に関しては、製造ばらつきを評価するオンチップモニタ回路を開発し、測定したばらつきに応じて基板バイアス電圧を調節し、製造ばらつきの影響を補償する回路技術を開発した。
抗体医薬開発への応用をめざしたニワトリモノクローナル抗体作製系の開発

近年,抗体は研究用試薬や抗体医薬としての利用価値が高まっている。そのため,抗体作製に関する研究は重要な分野である。そこで,本研究ではニワトリを利用する新規なモノクローナル抗体作製システムの開発することを目的とした。そのために,ニワトリB細胞株DT40を親株とし,抗体遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子をノックアウトする事により,ハイブリドーマ作製に必要な新規ニワトリ細胞融合株を樹立した。近年、モノクローナル抗体は抗原認識の厳密性のみならず、その生理活性の高さから、様々な領域で使用されており、それに伴い有効なモノクローナル抗体作製系の構築および研究が必要とされている。本研究課題ではニワトリハイブリドーマの作製法を確立する事による、新規なモノクローナル抗体作製系の構築することを目的としている。本年は、ハイブリドーマ作製系の構築のために必要な薬剤感受性を示すニワトリ細胞融合株の作製を試みた。ニワトリB細胞株DT40を用いて以下の研究成果を得た。DT40は、動物細胞では例外的に高頻度に標的相同組み換えが起こるため、特定の遺伝子ノックアウトを容易に行う事が可能である。1)DT40の内在性の抗体遺伝子軽鎖と重鎖をノックアウトするためのベクターを作製し、DT40に導入した。その結果、抗体分子を発現しないDT40株の作製に成功した。2)ハイブリドーマ選択のために必要なマーカーを導入するため、DT40のチミジンキナーゼ遺伝子のノックアウトを試みた。チミジンキナーゼ遺伝子をノックアウトするためのベクターを構築し、抗体遺伝子を欠損したDT40に導入した。その結果、チミジンキナーゼ遺伝子を欠損したクローンの取得に成功した。3)作製した細胞株のHAT培地に対する感受性を検討した。HAT培地中での増殖能力を比較した結果、チミジンキナーゼ遺伝子を欠損した細胞株のみで細胞死が誘導された。その一方で、チミジンアナログを含む培地中では生育が見られた。以上の結果より、今回作製した細胞株が細胞融合株としての性質をもつと考えられる。本研究課題は,抗体医薬開発の基盤となる技術の開発のために新規なモノクローナル抗体作製システムの構築を目指し,ニワトリハイブリドーマ作製系の構築を目的とした。初年度には,細胞融合に必要な細胞融合株を遺伝子工学的手法を用いてニワトリB細胞株DT40を改変することにより樹立した。樹立した細胞株では,ヒポキサンチン,アミノプテリン,チミジンを含むHAT培地中で速やかに細胞死が誘導された事より,細胞融合株としての利用できる可能性を持つ。そこで,本年度では,初年度に樹立した細胞融合株を用い,実際にニワトリリンパ球との細胞融合を行った。まず,TNP-KLHをニワトリに反復免疫し,血清中の抗TNP IgG抗体価の上昇をELISA法により確認した後,脾臓を摘出し脾臓B細胞を調整した。その後,脾臓B細胞と新規に樹立したDT40由来細胞融合株との細胞融合をポリエチレングリコール法と電気融合法を用いて行った。その際,細胞融合効率を最適化するため,ニワトリの免疫条件や融合方法の最適化について検討した。細胞融合後,ハイブリドーマのみを選択するため,HAT培地中で培養した結果,ポリエチレングリコール4000を用いる条件においてHAT耐性のコロニー形成が確認できた。更に,取得したコロニーのフローサイトメーターによる解析の結果,取得したクローンの中にはDNA量の増加しているクローンが存在した。これは,ニワトリ由来の細胞と樹立した細胞融合株が細胞融合した事によりHAT培地に対し耐性を獲得した事を意味する。以上の結果は,HAT培地中で選択可能な細胞融合株の樹立及びハイブリドーマの取得に成功した事を示す。
犯罪・暴力行動への情報環境の関与についての精神生理学的研究

家庭内・学校内暴力あるいは駅や列車内をはじめとする公共空間での衝動的な犯罪や暴力が著しく増加している。私たちは情報環墳学の立場から、すでに人工性の高いある種の構造をもった音が衝動的行動やうつ状態に関係する脳の基幹部(視床、視床下部、脳幹)の血流を低下させることや、その反対に、自然性の高い環境音やそうした環境音と音構造の近似した楽器音などが、人間を生理的に快適な状態に導くことをいくつかの生理指標で発見している。従来の家庭環境、教育環境、病的負因といった特別な背景を原因とする犯罪・暴力でなく、広く一般的に人々がきれやすく、犯罪・暴力に関わる現象について、個人的な要因だけでなく、現代人一般の精神的なベースラインすなわち緊張や不安状態の水準が高まっている可能性を無視すべきではない。本研究では、犯罪・暴力行動と人間にとって時間空間的にもっとも大きな情報環境要因のひとつである音環境との関係について検討を試みた。いくつかの音環境を高性能の収録装置を開発して、その構造を分析手法についても独自に開発しながら解析した。例えば東京の繁華街・住宅地域の環境音はほとんどすべて人工音であり、周波数構造は、10kHz程度まででそれ以上の高周波成分は皆無であり、しかも定常的で音響振動構造の複雑な変化は見られなかった。一方、音環境としてもっとも自然性が高く安全性が高い人類の遺伝子が育まれた熱帯雨林の環境音は、150kHz以上に及ぶ超高周波成分を豊富に含み、非定常で周波数構造の形状が微小時間内で多様に変化し、複雑・変容性の大きい音響振動構造をもっていた。人工音のみの環境音と熱帯雨林の環境音との中に被験者を一定時間おくと、人工音環境に比べて、熱帯雨林の音環境では、脳波α波が増加し、血中、尿中のアドレナリン、コルチゾールの濃度が減少した。音環境の違いは、潜在的な緊張レベル、不安レベルに影響を及ぼし、人間の精神生理的ベースラインに影響を与えていることが見出された。安全・安心な音環境の検討と造成が犯罪・暴力の抑止にも貢献できる可能性が示唆された。今日、無差別かつ衝動的な暴力が増加している。また、犯罪にまでは健在化しないが、家庭内暴力あるいは駅や列車内などの公共の場での暴力も著しく増加している。こうした現象は、現代人の心理的なストレスと無縁でないことは言うまでもないが、現代人はきれやすい体質、きれやすい傾向に生理的におかれているかもしれない可能性も検討して見ることは無意味ではないだろう。私たちは、ある種の構造をもった音が人間のストレスを軽減して癒しの方向に導くことをいくつかの生理的指標ですでに発見している。聴覚は、人間にとって常に受信状態にあり、意識、無意識を問わず音は環境化しており24時間有無をいわさず享受している。私たちは、人間をきれやすくする音環境と安静化する音環境を客観的な指標として示すことができないかを検討することとした。今年度は、まず人間が不快感を生じるであろう都市の音環境と人間が快適性を感じる田園の音環境とを精密に比較検討した。そのためその典型例として東京の駅前商店・住宅密集地域とインドネシア・バリ島の田園農村地域ならびにボルネオの熱帯雨林の音環境を、150kHz以上の超高周波帯域まで優れた応答特性を有する超広帯域環境音収録システムによって録音した。これを、150kHz以上の超高周波帯域まで計測可能なFFT分析システムを用いて周波数分析するとともに、私たちがオリジナルに開発した最大エントロピースペクトルアレイ法を用いて、微小時間領域における音響振動構造の変化を精密に分析した。この結果、FFTスペクトルの周波数分布を調べると、東京の環境音は、10kHz程度までの周波数成分に集中しており、高周波成分は皆無であるのに対して、インドネシア・バリ島の田園農村の環境音では、50kHz以上までのびる高周波成分を豊富に含んでいた。さらに熱帯雨林の環境音では、100kHzをも上回る高周波成分を含んでいた。次に、最大エントロピースペクトルアレイを調べると、東京の環境音は、ときおり突発的な電車や車の音が入る以外ほとんど変化がなく定常的であった。これにくらべて、インドネシア・バリ島の田園農村やボルネオの熱帯雨林の環境音は、スペクトルの形状が微小時間の中で複雑に変化し、非定常で複雑・変容性の大きい音響振動構造をもっていた。これらの音が人間に与える生理的影響を調べるために、次年度に実験モデルを構築して実験を行う予定である。家庭内暴力、学校内暴力あるいは駅や列車内などの公共の場での衝動的な犯罪や暴力が著しく増加している。一方私たちは、情報環境学の立場から、情報環境が人間に与える生理的影響について研究を続けている。私たちは、人工性の高いある種の構造をもった音が衝動的行動やうつ状態に関係する脳の基幹部の血流を低下させることや、あるいは自然性の高い環境音やそうした環境音と音構造の近似した楽器音などが、人間を生理的に快適な状態に導くことをいくつかの生理指標で発見している。犯罪・暴力の一般的増加現象は、人間ひとりひとりの個別的なストレス要因とともに、現代人の情報環境における一般的なストレス要因の増加の可能性について検討する必要があろう。私たちは、現代人の情報環境の中で、空気振動としての音が人間にとって常に受容され環境化している要因のひとつであることから、きれやすい傾向を生理的に導く要因のひとつとして音環境に注目することとした。昨年度、いくつかの音環境を収録しその構造を検討した。