hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白金ナノコロイドを応用した低細胞ストレス修復法の確立

う蝕治療で多く用いられている光重合型コンポジットレジンはラジカルを利用して重合硬化する歯科材料である。しかしながら、過剰なラジカルは細胞にとってストレスとなり、細胞障害の原因となることがある。本研究では抗酸化作用をもちラジカル捕捉能があると言われている白金ナノコロイドを利用して光重合型コンポジットレジンの重合に用いられているラジカルによる細胞ストレスを低減させる方法について検討を加えた。光重合型コンポジットレジンの重合にはラジカル重合が利用されている.多くは感光材のカンファーキノン(CQ)と3級アミン(DMAEM)によりラジカルを発生させている.そして,これらによって発生するラジカルが細胞内の代謝に影響を与えることが申請者らの研究で示唆された.そこで、本年度は白金ナノコロイドによってラジカルが除去できるかを検討してみた.ヒト単球系細胞THP-1細胞に0.5mMのDMAEMと0.4mMのCQを添加し光照射40秒によりラジカルを発生させた.ラジカル発生時に白金ナノコロイドを0-20ppmで存在させ.細胞の代謝活性に与える影響を細胞内ミトコンドリア活性,細胞内GSH濃度を0,6,24時間後に測定することで評価した.白金のコロイド単独では細胞内代謝に大きな影響を与えることはなかった.ラジカル発生条件下では,細胞内代謝は顕著に低下した事から、ラジカルは細胞内に侵入し細胞内の代謝経路を阻害していることが示唆された.白金ナノコロイドとラジカルの両方が存在する条件では,細胞内代謝およびGSH濃度が低下する傾向が認められ,ラジカルに対し白金ナノコロイドが何らかの影響を与えていることが示唆されたが,直接的にラジカルを補足しているという結論は得られなかった.しかしながら,白金コロイドが存在するとラジカルの細胞内代謝抑制効果が低減される傾向が認められたことから,CQとDMAEMEMにより発生するラジカルの細胞酸化ストレスの緩和に利用できる可能性が示唆された.白金ナノコロイド自体の細胞内ミトコンドリア活性、細胞防御機構の一つである細胞内グルタチオン濃度への影響について明らかとなった。実際に光重合型コンポジットレジンの重合には、3級アミン(ジメメチルアミノエチルメタクリレート)と感光材(カンファーキノン)を利用してラジカルを発生させていることから、これらの物質を用いて細胞培地内でラジカルを発生させて細胞への影響を調べた。ラジカル発生条件下では細胞内ミトコンドリア活性は劇的に低下し、細胞内グルタチオン濃度も低下の傾向が認められた。このことから、発生したラジカルは細胞内に侵入して細胞内代謝に対して非常に強く抑制的に作用していることが示唆された。ラジカル発生条件に白金ナノコロイドを添加して細胞活性を測定したが、若干のミトコンドリア活性への抑制作用を弱める効果を認めたものの有意な差はなかった。このことから、白金ナノコロイドが細胞外で発生したラジカルを捕捉することでのラジカル除去効果については低いと思われた。一方、ラジカルが細胞代謝系に強く影響することが明らかとなった。光重合型コンポジットレジンにつては、構成成分(モノマー、重合開始材、重合促進剤他)のそれぞれの細胞代謝への影響は検討されているものの、複合作用や発生したラジカルの影響に関しては検討がなされていない。そこで、発生したラジカルが細胞防御機構やアポトーシスに誘導に関与しているかに検討を加えた。その結果、細胞内代謝を抑制することでグルタチオンの合成経路に何らかの作用を及ぼしていることが明らかとなるとともに、アポトーシス誘導に重要な役割を持つカスパーゼ3/7活性の有意な上昇を認めた。従って、生じたラジカルがアポトーシスの誘導に関与することが示唆された。光硬化型重合型コンポジットレジンの細胞内シグナル系への影響を低減することで、より生体に刺激のない修復方法を開発することを目的とした。これまでの研究で溶出するモノマーや光硬化型重合の開始剤として使用されているカンファーキノンや3級アミンが細胞の防御システムであるグルタチオンの合成を阻害していることが判明した。また、重合の際に利用されるラジカルが細胞内の代謝活性を著明に抑制していることが明らかとなった。このことから、ラジカルの補足作用があるとされる白金ナノコロイドを重合系に添加することで、ラジカルの細胞内への移行を抑制して細胞への影響を低減させることが可能かどうかについて検討をしてきた。その結果、ラジカル重合系に白金ナノコロイドを添加しても、ラジカルによる細胞の代謝活性の抑制効果に影響を及ぼすことは認められなかったことから、細胞外での白金ナノコロイドによるラジカルの補足効果は期待できないとの結論に至った。そこで、ラジカルが細胞内の代謝系にどのように影響しているかを詳細に検討することでラジカルの影響を最小限に抑えることができないかを調べた。ラジカルに暴露されたTHP-1細胞(ヒト由来単球細胞)において、Caspase3、Caspase7を誘導したことから、ラジカルが細胞のアポトーシスを誘導していることが示唆された。

しかしながら、Caspase8およびCaspase9の活性上昇が認められなかったことから、従来報告されている細胞膜上のデスリガンドレセプターを介した経路(Caspase9)や細胞内ストレスによりミトコンドリアを介して誘導される経路(Caspase8)とは異なる経路によりアポトーシスを誘導していることが示唆された。このことから小胞体ストレスによる誘導経路(Caspase12)が示唆されたが、ヒト由来細胞においては報告のない経路であることからさらに検討が必要と思われた。一般的に言われている白金ナノコロイドが細胞内でのラジカルの捕捉能が細胞外ではほぼ期待できないことが明らかとなったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。白金ナノコロイドを添加しての細胞外ラジカルの除去は困難である,一方、コンポジットレジンの重合に利用されているラジカルがアポトーシス誘導に関与していることは新知見である。従って、ラジカルが細胞内代謝経路にどのように影響するかについて検討を加えていく予定である。
シイタケ子実体形成関連遺伝子の同定手法の開発とその機能解析

本研究では、シイタケ子実体形成メカニズム解明にむけて、特定遺伝子のノックダウンによる逆遺伝学的アプローチを可能にするための形質転換手法の確立と、RNAiを用いた遺伝子ノックダウンを試みた。既報のシイタケ光受容体タンパク質をコードしているphrA遺伝子のクローニングを行い、全長cDNAおよびゲノムDNAを得たうえで、コード領域約600 bpを対象にGUS部分配列をリンカーとしたRNAiコンストラクトを構築した。構築したベクターをシイタケプロトプラストに導入し、形質転換を行った。その結果、一部の形質転換体で菌糸伸長速度の低下や着色が観察された。シイタケ子実体形成関連遺伝子の同定手法の開発については、形質転換手法の確立が必須である。本研究ではプロトプラストーPEG法による遺伝子導入法を検討することとした。本年度シイタケ菌糸体からのプロトプラスト調製法について検討するため、他の白色腐朽菌で確立した方法をそのまま適用したところ目標数値である0.5×10の8乗/菌糸体に達することが出来なかった。これはセルラーゼ処理に用いた菌糸体量が少なかったことが大きな要因であると考えられ、菌糸の培養条件を検討することで今後改善可能であると考えられる。一方で、子実体形成に関する知見を他の角度からも検討するために、液体培地中での子実体形成過程における培地成分の検討を行った。本実験は、遺伝子発現の結果生ずる代謝産物の変化から、子実体関連遺伝子の推定を試みることを目的とした。子実体形成期における培地pHを測定したところ、子実体原基形成期に急激なpHの低下が観察された。また、培養ろ液のクロロホルム/メタノール抽出液および酢酸エチル抽出液を誘導体化後GC/MS分析に供したところ、主要な脂肪酸としてパルミチン酸とステアリン酸が検出されたが、子実体形条件および子実体非形成条件において差はなかった。従って代謝物の網羅的解析からの子実体形成関連物質同定および関連遺伝子の推定は困難であることが分かった。一方、形質転換に用いる発現ベクターについては、ゲノム情報の欠如から有用なプロモーターおよびターミネーター取得が困難であったことから、ゲノム配列が公開されているPhlebia brevispora由来のPDC遺伝子とその周辺領域を取得し、薬剤耐性遺伝子およびGFPを連結した形質転換ベクターを構築した。(1)形質転換系の確立シイタケの子実体形成メカニズムを解明するために、特定遺伝子ノックダウンと、評価としての液体培地上での子実体形成率を組み合わせた逆遺伝学的なアプローチを可能とするために形質転換手法を確立した。プロトプラスト-PEG法におけるプロトプラスト調製条件を検討したところ、形質転換に十分と考えられるプロトプラスト数を得ることが出来た。また、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gpd)遺伝子プロモーターおよびターミネーターを含み、クローニングサイトとしてAsc Iサイトを持つ発現ベクターを構築した。選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子(hpt)を導入し、形質転換を行ったところ、ハイグロマイシン耐性を持つ形質転換体を複数得ることが出来た。また、それらにはクランプ結合を持つものと持たないものが存在した。すなわち、本形質転換法により、子実体形成評価可能な形質転換体を得られることが示唆された。(2)光受容体遺伝子ノックダウンコンストラクトの構築シイタケ子実体形成へは光照射が必須であることが分かっている。そこで既報の光受容体タンパク質がシイタケ子実体形成にどのように関わっているかを明らかにするために、シイタケ光受容体タンパク質をコードしているLe.phrA遺伝子のクローニングを行い、全長cDNAおよびゲノムDNAを得た。コード領域約600 bpを対象に、GUS部分配列をリンカーとしたRNAiコンストラクトを構築した。担子菌の生活環の中でも、子実体の形態形成は他の過程と比べて、形態的に著しい変化を示し、食料資源としての経済的価値のみならず、分子細胞生物学的にも興味深い現象である。シイタケについては、子実体形成期に特異的発現を示す複数の遺伝子について報告がある。しかし、逆遺伝学的解析が進んでおらず、子実体形成の主要な分子機構の解明には至っていないのが現状である。本研究ではシイタケの子実体形成メカニズムを解明するために、特定遺伝子のノックダウンと、評価としての液体培地上での子実体形成率を組み合わせた逆遺伝学的なアプローチを可能とするために形質転換手法の確立とRNAiを用いた遺伝子ノックダウンを試みた。これまでの研究で、シイタケ子実体形成へは光照射が必須であることが分かっており、光受容体と考えられるタンパク質遺伝子も報告されている。そこで既報の光受容体タンパク質がシイタケ子実体形成にどのように関わっているかを明らかにするために、シイタケ光受容体タンパク質をコードしているLe.phrA遺伝子のクローニングを行い、全長cDNAおよびゲノムDNAを得たうえで、コード領域約600 bpを対象に、GUS部分配列をリンカーとしたRNAiコンストラクトを構築した。構築したベクターをプロトプラスト-PEG法により、薬剤耐性マーカーと共に導入し形質転換株を得たところ、形質転換体を得ることができ、そのうちいくつかは表現型として菌糸伸長速度の低下や着色が見られた。子実体形成能に対する影響については現在実験を継続中である。

既報のシイタケ光受容体タンパク質をコードしているphrA遺伝子のクローニングを行い、全長cDNAおよびゲノムDNAを得たうえで、コード領域約600 bpを対象にGUS部分配列をリンカーとしたRNAiコンストラクトを構築した。構築したベクターをシイタケプロトプラストに導入し、形質転換を行った。その結果、一部の形質転換体で菌糸伸長速度の低下や着色が観察された。プロトプラスト再生株に単核菌糸体が多く含まれるため、子実体形成実験可能な複核菌糸体を得るプロトプラスト調製条件の検討に時間を要した。森林化学技術的ベースは整えることが出来た。今後は研究計画通りに複数のシイタケ子実体形成関連遺伝子のノックダウンコンストラクトを構築し、順次形質転換を進めていき、子実体形成関連遺伝子の機能を表現型レベルで詳細に明らかにする。研究を遂行する上での課題は、致死遺伝子に対する対応が予想されるが、作成するコンストラクトの対象配列を変えることでコントロールできないか検討する。本研究においては、シイタケ菌糸体の生育が遅いことから、高濃度のプロトプラスト溶液取得が現在最大の難関であり、目標値に達していないため、やや遅れていると判断できる。しかしながら、培地条件および培養条件を検討することで改善可能であり、次年度以降に達成可能であると考えられる。プロトプラストを調製し、構築したPhlebia brevispora由来の発現カセットを保持する発現ベクターを導入し、形質転換効率を算出する。プロモーターは十分機能すると予想されるが、万が一機能しない場合は、他の担子菌ゲノム配列から複数のPDC遺伝子領域をクローニングし、発現ベクターとする。同時に、既報にある子実体形成関連遺伝子のクローニングを進め、順次高発現させることで、子実体形成への関与を検討する。
トラスツズマブ獲得耐性の機序:TGF-β/SMAD経路と上皮間葉転換の関与

目的:TGFβ及びその下流のSMAD経路が抗HER2薬に対する耐性化に関与しているかを明らかにする。結果:TGFβ-SMAD3経路の持続的な活性化は、HER2陽性乳癌細胞において抗HER2薬耐性化及び癌幹細胞形質を誘導した。SMAD3の活性化はトラスツズマブ(Tz)耐性に関わる複数の遺伝子の転写調節に関わっていた。乳癌組織における核内SMAD3の発現とTzを含む化学療法の病理学的奏功の間には負の相関が認められた。SMAD3を阻害すると、TGFβによる薬剤耐性化が阻止され、Tz耐性細胞におけるTz感受性が回復した。結論:TGFβ-SMAD3経路は抗HER2薬に対する耐性化とその維持に関与する。本研究は、HER2陽性乳癌に対する標準治療薬である抗HER2抗体trastuzumab (Tzm)の耐性獲得機序にTGF-β/SMAD経路が関与するかどうかを解明することを目的としている。初めに、HER2陽性乳癌細胞株SKBR-3をTGF-βで14日間刺激しTGF-β/SMAD経路を持続的に活性化させることで、TzmおよびHER2 kinase阻害剤であるlapatinib (Lap)に対する耐性化が生じることを見出した。また、TGF-βの下流にあるSMAD3がリン酸化され核内移行することを確認した。そこで、SMAD3の特異的阻害剤であるSIS3を添加したところ、Tzm/Lapへの耐性化が完全に解除された。なお、PI3K阻害剤でTGF-β/PI3K/AKT経路を阻害してもTzm/Lapの耐性化は解除されなかった。以上より、TGF-β/SMAD経路の持続的活性化がTzm/Lapの耐性化を誘導することがわかった。TGF-β/SMAD経路は上皮間葉移行(EMT)と幹細胞の誘導の主たるdriverである。そこで、これらのphenotypeの出現とTzm/Lap耐性化の関係について検討した。すると、EMTで誘導されるべきSNAI1/2やTWIST1などの転写因子およびEMTのマーカーはほとんど動かないにもかかわらず、乳癌幹細胞を多く含むCD44(+)CD24(lo)細胞分画の割合が劇的に増加し、mammosphere形成能も上昇していた。この細胞分画はSIS3で減少することもわかった。さらに他のHER2陽性乳癌細胞株を用いて同様の検討を行い、CD44(+)CD24(lo)分画が増加しないものはTzm/Lap耐性獲得が生じないことを見出した。以上より、TGF-β/SMAD経路によるTzm/Lap耐性化にはEMTの誘導よりも幹細胞化が深く関わっており、CD24の発現抑制が指標になることが判明した。また、時間経過を追って検討することで、ある複数の転写因子の発現がTzm/Lap耐性獲得と同じタイミングで変動することを突き止めることができた。TGFβ-SMADシグナルは上皮間葉移行(EMT)や癌幹細胞化をはじめとして癌細胞により高い悪性度を付与する。また、このシグナルは薬剤耐性化にも関与している。しかし、TGFβ-SMADシグナルがtrastuzumabやlapatinibに対する耐性を誘導するかどうかは未だ不明である。HER2陽性乳癌細胞株をTGFβで持続的に刺激したところ、ある種の細胞株のみが抗HER2薬に対する耐性を獲得した。耐性を獲得しなかった細胞株と比較して、耐性を獲得した細胞株ではSMAD3のリン酸化が強く促進され、幹細胞マーカーであるCD44+CD24-細胞分画の割合が増加していた。さらに、その細胞株ではTGFβ刺激によりmammosphereの形成能も増強していた。上記より、SMAD3が抗HER2薬の耐性化に関与することが示唆されたため、SMAD3の特異的阻害薬であるSIS3でSMAD3の活性化を阻害したところ、CD44+CD24-分画の増加が抑制され、抗HER2薬に対する耐性化も完全に阻止された。この時点でCD24の発現低下が抗HER2薬の耐性化に伴っていることが示されたため、術前にpaclitaxelおよびtrastuzumabを投与された症例において、その治療反応性と腫瘍におけるCD24の発現を検討したところ、CD24の高発現と良好な治療反応性が相関することが示唆された。さらに、trastuzumab存在下で長期培養することにより得られたtrastuzumab耐性乳癌細胞株をSIS3で処理すると、trastuzumabへの感受性が回復することが明らかとなった。以上より、TGFβ/SMAD3経路が乳癌細胞の抗HER2薬に対する耐性化を誘導しうることが示された。さらにtrastuzumab耐性細胞の実験から、trastuzumab耐性の維持にもこの経路が関与していることが示唆された。当該年度の5月に実験を担当していた大学院生が海外に転居(研究目的ではない)したため、フルタイムで実験を行うことのできる者がいなくなってしまった。この時点で論文化するのに必要なデータの半分程度を取得していた。そこで、申請者が実験を引き継ぎ、残る半分のデータを取得した。具体的には、(1) TGFβがSMAD3を活性化することで抗HER2薬の耐性化を誘導するが、その耐性化には細胞の幹細胞化が伴っていたこと、

(2)臨床検体を用いて乳癌における幹細胞マーカーであるCD24の発現とtrastuzumabの感受性に相関があったこと、(3) trastuzumabに耐性を示す細胞でもSMAD3の阻害によりtrastuzumab感受性が回復することを見出した。ここまでの成果は12月の国際学会で発表した。現在、論文投稿の準備を進めているところである。もう一つの課題であるTGFβシグネチャーによる抗HER2薬感受性予測モデルの作成は次年度の課題として行うことにする(今後の研究の推進方策についても参照のこと)。TGFβ-SMADシグナルは上皮間葉移行(EMT)や癌幹細胞化をはじめとして癌細胞により高い悪性度を付与する。また、このシグナルは薬剤耐性化にも関与している。しかし、TGFβ-SMADシグナルがtrastuzumabやlapatinibに対する耐性を誘導するかどうかは未だ不明である。HER2陽性乳癌細胞株をTGFβで持続的に刺激したところ、ある種の細胞株のみが抗HER2薬に対する耐性を獲得した。耐性を獲得しなかった細胞株と比較して、耐性を獲得した細胞株ではSMAD3のリン酸化が強く促進され、幹細胞マーカーであるCD44+CD24-細胞分画の割合が増加していた。さらに、その細胞株ではTGFβ刺激によりmammosphereの形成能も増強していた。上記より、SMAD3が抗HER2薬の耐性化に関与することが示唆されたため、SMAD3の特異的阻害薬であるSIS3でSMAD3の活性化を阻害したところ、CD44+CD24-分画の増加が抑制され、抗HER2薬に対する耐性化も完全に阻止された。術前にpaclitaxelおよびtrastuzumabを投与された症例において、その治療反応性と腫瘍におけるSMAD3の発現を検討したところ、活性化されたSMAD3と治療抵抗性の相関が示された。Trastuzumab耐性の乳癌細胞株において、SIS3によるtrastuzumab感受性の回復を検討した。すると、SMAD3が活性化された細胞株において、SIS3によってtrastuzumab感受性の回復が認められた。以上より、TGFβ/SMAD3経路は乳癌細胞の抗HER2薬に対する耐性化を誘導することを示した。SMAD3はtrastuzumab耐性化に対する標的分子の候補となりうる。目的:TGFβ及びその下流のSMAD経路が抗HER2薬に対する耐性化に関与しているかを明らかにする。結果:TGFβ-SMAD3経路の持続的な活性化は、HER2陽性乳癌細胞において抗HER2薬耐性化及び癌幹細胞形質を誘導した。SMAD3の活性化はトラスツズマブ(Tz)耐性に関わる複数の遺伝子の転写調節に関わっていた。乳癌組織における核内SMAD3の発現とTzを含む化学療法の病理学的奏功の間には負の相関が認められた。SMAD3を阻害すると、TGFβによる薬剤耐性化が阻止され、Tz耐性細胞におけるTz感受性が回復した。結論:TGFβ-SMAD3経路は抗HER2薬に対する耐性化とその維持に関与する。実験、解析等順調に進展している。平成26年度に行うとした研究内容は(1) TGF-β刺激によってTzmへの耐性を獲得する系の確立(2) TGF-β刺激によるTGF-β/SMAD経路の活性化およびEMTの誘導の検出
生殖系列サイクルの遺伝的安定性の発生制御メカニズム

生物の遺伝情報は常に損傷と修復を繰り返して変化する。多細胞生物では受精を起点に個々の細胞の増殖分化プロセスで遺伝情報は変異を蓄積して癌や老化等の原因になるものと考えられる。しかし各細胞系譜の遺伝的安定性は均一ではなく、特に生殖系列サイクルでは遺伝情報の恒常性が高いものと考えられる。遺伝的安定性がどの様に発生プログラムと連携して機能調節を受けるのか、また何故生殖系列サイクルの遺伝的安定性は高いのか、その制御基盤の理解は殆ど進んでいない。本研究では哺乳類の初期発生過程と生殖系列サイクルの遺伝的安定性の発生制御メカニズムの解明を目的とし、(1)初期発生過程と生殖系列サイクルの遺伝的安定性の発生制御の全体像、(2)遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構、(3)遺伝的安定性の人為制御が細胞・個体に与える影響、の解明を目指す。遺伝的安定性の発生制御は生物学上の重要課題であると共に、その制御技術は幹細胞リソースの応用等に広く重要である。本年度は、上記(1)の詳細な解析を進めると共に、(2)、(3)について実験系の立ち上げ等の準備を行った。生殖系列サイクルを中心とする遺伝情報制御の全体的な特性をより体系的に理解する事を目的に、多能性幹細胞株、生殖幹細胞株、体細胞株等のモデル細胞を用いて遺伝的安定性に関わる様々な指標の包括的な解析に取り組んだ結果、生殖幹細胞株は、多能性幹細胞株や体細胞と比べて、遺伝的安定性の幾つかの指標が明瞭に高い事、生殖幹細胞株と多能性幹細胞株は遺伝的安定性に関わる機能遺伝子群の特徴的な発現相違を示す事、等を示す結果を得た。これら観察に関わる遺伝子/経路の機能を明らかにする為に、レンチウイルスベクターを介して転写活性化型dCas9遺伝子をマウスES細胞に組み込んだ後に、解析対象とする遺伝子(本年度はチェックポイントキナーゼ等)のプロモーター配列をターゲットとする複数のgRNA発現レンチウイルスを導入した。qRT-PCRにより目的遺伝子の発現上昇を比較解析し、ゲノムに組み込まれたレンチウイルス/トランスジーンのコピー数の検定を行った。更に目的遺伝子の発現上昇が明瞭に観察されたマウスES細胞株(プール)について、染色体分配の安定性等の指標を詳細に調べた。またヒトiPS細胞についても同様の実験系の作出を進めた。生殖系列サイクルの遺伝的安定性の制御遺伝子群のマルチオミクス解析:多能性幹細胞、生殖幹細胞、体細胞の各細胞系譜の発生段階による遺伝的安定性の相違は、その制御遺伝子群(DNA修復、DNA複製、染色体制御、細胞周期制御、抗酸化制御など)の遺伝子発現調節や機能調節に基づくものと考えられ、その実体にアプローチするためにマルチオミクス解析を行う。マウス多能性幹細胞、生殖幹細胞、繊維芽細胞のRNAseq発現データは既に得ており、各分化誘導モデルのデータを追加すると共に、public domainのデータセットを利用する。ゲノム損傷応答では修復蛋白質の安定性や翻訳制御が大きな役割を担う事から、包括的プロテオーム解析を行う。遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構の解明:多能性幹細胞と生殖幹細胞ではそれぞれ遺伝的安定性の制御に関わる特定の遺伝子サブセットが協調して発現制御される。これら遺伝子発現制御の相違のメカニズムを明らかにする為にゲノムワイドスクリーニングを行う。Loss of functionスクリーニングは、マウスのほぼ全遺伝子のエクソン領域をターゲットとするゲノムワイドgRNAプールとCRISPR/Cas9システム、およびgain of functionスクリーニングはマウスのほぼ全遺伝子のプロモーター領域をターゲットとするgRNAプールとDNA切断活性を持たずに転写活性化能を持つ変異型CRISPR/Cas9システムを用いる。機能候補遺伝子はcDNA過剰発現、ノックアウト実験等を行い、遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構を解明する。

これら観察に関わる遺伝子/経路の機能を明らかにする為に、レンチウイルスベクターを介して転写活性化型dCas9遺伝子をマウスES細胞に組み込んだ後に、解析対象とする遺伝子(本年度はチェックポイントキナーゼ等)のプロモーター配列をターゲットとする複数のgRNA発現レンチウイルスを導入した。qRT-PCRにより目的遺伝子の発現上昇を比較解析し、ゲノムに組み込まれたレンチウイルス/トランスジーンのコピー数の検定を行った。更に目的遺伝子の発現上昇が明瞭に観察されたマウスES細胞株(プール)について、染色体分配の安定性等の指標を詳細に調べた。またヒトiPS細胞についても同様の実験系の作出を進めた。生殖系列サイクルの遺伝的安定性の制御遺伝子群のマルチオミクス解析:多能性幹細胞、生殖幹細胞、体細胞の各細胞系譜の発生段階による遺伝的安定性の相違は、その制御遺伝子群(DNA修復、DNA複製、染色体制御、細胞周期制御、抗酸化制御など)の遺伝子発現調節や機能調節に基づくものと考えられ、その実体にアプローチするためにマルチオミクス解析を行う。マウス多能性幹細胞、生殖幹細胞、繊維芽細胞のRNAseq発現データは既に得ており、各分化誘導モデルのデータを追加すると共に、public domainのデータセットを利用する。ゲノム損傷応答では修復蛋白質の安定性や翻訳制御が大きな役割を担う事から、包括的プロテオーム解析を行う。遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構の解明:多能性幹細胞と生殖幹細胞ではそれぞれ遺伝的安定性の制御に関わる特定の遺伝子サブセットが協調して発現制御される。これら遺伝子発現制御の相違のメカニズムを明らかにする為にゲノムワイドスクリーニングを行う。Loss of functionスクリーニングは、マウスのほぼ全遺伝子のエクソン領域をターゲットとするゲノムワイドgRNAプールとCRISPR/Cas9システム、およびgain of functionスクリーニングはマウスのほぼ全遺伝子のプロモーター領域をターゲットとするgRNAプールとDNA切断活性を持たずに転写活性化能を持つ変異型CRISPR/Cas9システムを用いる。機能候補遺伝子はcDNA過剰発現、ノックアウト実験等を行い、遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構を解明する。
主権なき国家論は可能か？：フーゴー・プロイスの思想と行動

本研究は、フーゴ・プロイスの主権なき国家論の理論上および実践上の有効性を究明しようとするものである。プロイスは、主権に代えて、「領域高権」概念を導入し、政治主体が重層的に併存する当時のドイツの政治状況において、あえて権力主体を特定するために強引な擬制を行うことを回避しえたという点で、その優位性が認められることを明らかにした。しかし同時に彼は、「責任の拡散」という有機的国家論に特有の難問に直面し、ワイマール憲法48条の大統領の非常権限の評価をめぐり、逡巡する結果ともなった。本年度は、フーゴー・プロイス(1860-1925)の重層的な政治秩序構想の分析を行った。プロイスの師であるオットー・ギールケ(1841-1921)が、国家の概念規定に主権概念を導入したために、水平的な仲間団体論(ゲノッセンシャフト理論)の貫徹が阻まれる結果となったのに対して、プロイスは「領域高権」という概念を利用して国家と自治体の原理的区別に成功し、論理的にほぼ完璧に近い形でゲノッセンシャフト理論を貫徹することに成功したことを究明した。その上で、ワイマール憲法の起草者であるプロイスの憲法草案について、その直接公選大統領制構想に焦点をしぼり、憲法制定過程におけるプロイスの役割を究明しようと試みた。つまり、プロイスの大統領制構想は、プロイスがドイツ革命以前に構想していたビスマルク憲法改正草案におけるライヒ機関としての皇帝という構想にその淵源を辿ることができ、紆余曲折を経たワイマール憲法の制定過程においても、例外的にプロイスの当初の構想がほぼそのままの形で維持された部分であったこと、そして、行政府の権限と立法部の権限の不均衡という問題も、もともとのプロイスの構想に存在していたことを究明した。以上の研究成果は、『政治思想研究』における査読付論文の形で公刊するとともに、戦時法研究会(上智大学)における研究報告という形で公表した。なお、上記査読付論文は、政治思想学会研究奨励賞を受賞した。その他、書評論文1本、海外における研究報告1本、国内における招待講演2本という形で、研究成果の社会還元に努めた。本年度は、フーゴー・プロイス(1860-1925)の「領域高権」概念の理論的優位性について、検討した。主権概念を拒否したプロイスによって導入された「領域高権」概念について、彼独特の「領域」概念との連関に注目しつつ、主権概念に対する理論的優位性を吟味した。その結果、政治主体が重層的に併存する当時のドイツの政治状況において、あえて権力主体を特定するために強引な擬制を行うことを回避できるという点で、理論上および実践上の優位性が認められること、しかし、その反面、「責任主体の拡散」という有機的国家論特有の問題が顕在化したことを確認した。「責任主体の拡散」という問題点については、理論的に一義的な対応は困難であり、ベルリン市議会における議員としての政治活動の分析を進め、プロイスが実際に当事者として関わることとなった、具体的な政治問題に照らして検討する必要性がある。この点についての詳細な分析は、次年度の課題の一つである。本年度の当初の計画では、昨年冬に、ベルリンの連邦公文書館、ベルリン中央州立図書館における未公刊の書簡史料や内務省関係文書の調査・収集を予定していたが、昨年11月に発生したパリ同時多発テロ事件の影響で、渡航を順延せざるを得ず、調査を実施できなかった。体制を整え直して、次年度の秋以降に調査が実施できるように、調整を行いたい。ただし、フーゴー・プロイス協会会長のクリストフ・ミュラー教授との密接なコンタクトは維持しており、次年度の秋に講演会を企画し、目下、日本への招聘手続きを進めている。パリ同時多発テロ事件の影響で、計画していた昨年冬のドイツにおける調査・史料収集は順延せざるを得なかったが、それ以外の部分では研究の進展に大きな滞りはない。本年度は、刊行予告が出されたまま、長らく未公刊となっていたフーゴー・プロイス協会によるプロイス全集第三巻が刊行され、本研究の進展にとり最も重要なワイマール憲法の制定過程をめぐる一次史料にまとまった形でアクセスできる状況となった。この史料状況の大幅な改善をうけて、プロイスがワイマール憲法の起草者として関与した憲法制定の審議過程を跡付ける作業を進めた。とりわけ、ワイマール憲法48条の大統領緊急権導入をめぐる審議過程に注目し、当初のプロイス草案では言及されていなかった、基本権の停止条項が導入された経緯を究明するため、関連文献および一次史料の分析を進めた。その結果、当該条項の導入は、1919年1月20日から2月17日の間になされたと考えられることが明らかとなった。その具体的な経緯について、議事録のさらなる分析をすすめたい。フーゴー・プロイス協会を主催するクリストフ・ミュラー教授とは、密接なコンタクトを保っており、ミュラー教授の依頼で、ギールケの連邦国家論についての独語論文を執筆した。当該論文は、デトレフ・レーネルト教授が編集する論文集に収録され、2017年度中にドイツで公刊される予定である。また、プロイス全集完結を受けたミュラー教授の来日講演についても、ミュラー教授の健康上の問題をクリアする必要があるものの、前向きな調整を進めている。さらに、社会思想史学会創立40周年を記念して、学会の総力を挙げた社会思想史事典の編纂が進められており、学会からの依頼でギールケやプロイスを中心的に取り上げた「社会有機体論」の項目を執筆し、原稿を提出した。

長らく刊行が待ち望まれていたプロイス全集第三巻(ワイマール憲法制定過程)が刊行され、史料状況が大幅に改善されたため、研究の進展は順調に推移している。本研究は、フーゴ・プロイスの主権なき国家論の理論上および実践上の有効性を究明しようとするものである。プロイスは、主権に代えて、「領域高権」概念を導入し、政治主体が重層的に併存する当時のドイツの政治状況において、あえて権力主体を特定するために強引な擬制を行うことを回避しえたという点で、その優位性が認められることを明らかにした。しかし同時に彼は、「責任の拡散」という有機的国家論に特有の難問に直面し、ワイマール憲法48条の大統領の非常権限の評価をめぐり、逡巡する結果ともなった。本年度は、ワイマール憲法48条の大統領緊急権の導入をめぐる、憲法制定ドイツ国民議会の議事録の分析を進めた。その結果、以下の3点が明らかとなった。第一に、48条は、制定当時の政治的危機状況の中で、起草者および制憲議会のメンバーにとり、共和国を護るための合憲的独裁として構想され、制定されたことが明らかとなった。しかし第二に、憲法発効後の厳しい政治情勢の中で、条文からの逸脱が恒常化し、特に48条4項については、制定趣旨に全く反する運用がなされるようになったことが判明した。さらに第三に、当初、合憲的独裁の条項として、シュミットの委任独裁論も援用しながら、48条を擁護していたプロイスが、シュミットの影響およびエーベルト大統領の死去に伴うヒンデンブルク大統領選出という政治状況の変化の中で、48条の濫用の懸念を強調し、48条に対する制限の必要性を説くに至ったことが明らかとなった。これら研究の成果と、前年度までに明らかとなった研究成果を総括し、北大政治研究会において研究報告を行ったほか、これら成果を総括する論文の執筆準備を進めた。また、「デモクラシーはなぜ崩壊したのかードイツ・ワイマール共和国の経験に学ぶー」と題して、市民向けの講座を2回に分けて開催したほか、その内容を論文にまとめたり、『現代日本の立憲主義をめぐる学際的研究ー憲法学、行政法学、政治学の観点からー』と題する共著を出版するなど、一般社会向けの研究還元にも力を入れた。論文の公刊や国内外における研究会や講演会における発表という形で、研究成果の公表に努めると共に、2014年9月には約3週間の日程で、ドイツ・フランクフルトのマックス・プランク研究所における在外研究に従事し、ミヒャエル・シュトライス教授をはじめとする研究所メンバーと意見交換を行った他、必要な資料の収集も順調に進めることができたため。次年度は、順延したドイツにおける調査・史料収集を実施し、プロイスのベルリン市議会における政治活動など、彼の実践面での活動について分析をすすめるとともに、論文や研究報告、講演という形で、研究成果の社会還元に努めたい。刊行された一次史料をはじめ、関連文献の分析を確実に進めて、研究の総括を行う。ドイツ政治思想史次年度は、本年度に収集した資料の分析を進め、直接公選大統領制の他、ライヒ再編構想や大統領の国家緊急権(ワイマール憲法48条)といった他の重要論点についても、ワイマール憲法制定過程におけるプロイスの役割を究明し、論文や研究報告という形で研究成果の社会還元に努めていきたい。昨年11月に発生したフランス同時多発テロ事件の影響で、昨年12月に予定していたドイツでの調査を順延したため。物品購入の端数が出たため。
主観視点体験型複合現実感技術の応用システム開発基盤研究

本研究では、高い没入感と臨場感を特長とするビデオシースルー型頭部装着型表示装置(HMD)を用いた主観視点体験型の複合現実感応用システムに着目し、総合的な視点から複合現実感応用システムの実利用面での普及に資することを目的とした。その特徴を踏まえたコンテンツのデザイン・制作とシステム開発の知見を方法論として整理し、体系化を行った。また、それと併せて、当該システム形態に適するユーザインタフェースの研究を進め、コンテンツ制作・開発のためのソフトウェア・ツールの開発を行った。Laval Virtual 2013にて2013年3月末から4月初旬にかけてデモ展示を行ったMRエンタテインメントHyak-Ki Men(百鬼面)について制作・展示過程を検証し、日本バーチャルリアリティ学会大会での口頭発表およびSIGGRAPH ASIA 2013にてポスター発表を行った。『百鬼面』のほかにも、本フレームワークに沿って開発したMRエンタテインメントMR CyborgSoldiersのデモ発表を実施し、MRシステムの制作開発の方法論「MRワークブック」の改訂を進めた。実験用ベースシステムについて、オープンソースベースのフレームワークの開発を行った。併せて、システム構成上の改善として、大幅なコンパクト化を実現した。これにより、プログラム上もプレイヤを2名にしたり、主観視点映像と客観視点映像とを同時に実現したりすることが容易となった。さらに、2013年年度に開発したMRシステム「MR Coral Sea」に関して、2014年4月に開催されたLaval Virtual 2014のデモ展示では機材輸送・運用が低いコストで簡便に実現できた。なお、本研究テーマに係る作品がLaval Virtualのデモ展示コンペティションReVolutionに3年連続の入賞を果たし、当該制作開発の方法論が有効に機能する証左として示しうると考える。また、研究を進める中で、本研究ではHMD装着型を基本とするがゆえにHMDを装着しないオーディエンス(一般観衆)とHMDユーザとの体験をいかに整合させるかが大きな研究課題として認識されることとなった。本研究では、MRエンタテインメントのフレームワークの中で、これをMR Physical Displayという名称で位置づけ、バーチャル空間を現実空間へと多感覚的に媒介するメディアとして今後の研究の中で重視していくこととした。MR Coral SeaはMR Physical Displayに重点をおいた事例として開発を行った。本研究計画に沿って、事例調査の実施、実験用ベースシステムの構築、HMD装着型の複合現実感体験の分析と制作・開発の方法論について第一次の指針をまとめた。本指針のまとめを実践的にすすめるため、学部生に制作・開発過程を指導しつつ、複合現実型エンタテインメント・システムなどの事例開発を実施した。一つは、立命館大学が運営する国際平和ミュージアムでの企画展「放射能と人類の未来」に展示アドバイザーとして参画し、実験的な取り組みとして制作・展示した『バーチャル原発ジオラマ』である。また二つ目は、エンタテインメント・システム『百鬼面』である。前者は、2013年5月から7月まで、同ミュージアムに実際に展示運営され、従来にない展示として、高い評価を得た。後者に関して、本取り組みの成果を検証すること目的として、バーチャルリアリティに関する国際的なカンファレンス・展示会として世界最大級であるLaval Virtual 2013のコンペティションReVolutionプログラムに本プロジェクトを投稿し入賞を果たした。72投稿中15作品が採択された厳しい中でも特に、他が工学系大学研究室の大学院生を含む技術的に高度なプロジェクトが多いところ、本作品は学部3年生が学習しつつ主な作業主体として制作した作品であり、当該制作開発指針が有効に機能するものであることの証左と考えられる。先行して実施している昨年度から二年連続での入賞であり、その確度は高い。実際に、当該作品をフランスのラヴァル市にてデモ展示し、評価テストを行った。専門家だけでなく、家族連れを含む多くの見学者がプレイを楽しみ、実用性の高いシステムを開発し得たことが示された。Laval Virtual 2013でのデモ展示での評価を元に協力会社と研究会を実施した。また、多感覚的ユーザインタフェースに関する試験的取組をインタラクション2013にてデモ展示した。本研究では、複合現実感技術に関して特に、高い没入感と臨場感を特長とするビデオシースルー型頭部装着型表示装置(HMD)を用いた主観視点体験型の複合現実感応用システムに着目し、総合的な視点から複合現実感応用システムの実利用面での普及に資することを目的とした。当該装置構成を前提とした体験の特質を改めて分析し、その特徴を踏まえたコンテンツのデザイン・制作とシステム開発の知見を方法論として整理し、体系化を行うものであった。また、それと併せて、当該システム形態に適するユーザインタフェースの研究を進め、コンテンツ制作・開発のためのソフトウェア・ツールの開発も行うとした。研究期間を通じてシステム開発の事例を重ね、知見を制作教育のカリキュラムの形で体系化を進めた。国内外でのデモ展示実験を実施し、コンテンツの実利用性向上の観点に基づいた評価・考察を行った。

システムの技術的な改良を行うだけでなく、事例としてはエンタテインメントの枠組みに絞りつつコンテンツの特質に沿った運用・演出方法などの知見を蓄積した。最終年度では、成果のまとめに取り組み、期間全体のほぼ半数の成果発表を実施した。2件の国際カンファレンスと6件の国内カンファレンスでの成果発表・デモ展示を実施した。本研究計画初年度にまたがる年度以降器も含めれば計4回の国際会議での展示実験を実施した。バーチャルリアリティに関する国際展示会・カンファレンスLaval VirtualのデモコンペティションReVolutionに3回、SIGGRAPH ASIAの体験型技術展示セッションEmerging Technologiesに1回採択されており、これらが一定の厳格な審査基準によることと、本件が学部生を主体とした実証的制作プロジェクトであることから、技術的にもコンテンツ的にも本取組みの制作・開発知見の体系化が寄与するところと判断できる。バーチャルリアリティ(VR;人工現実感)・ミクストリアリティ(MR;複合現実感)協力企業2社の1社が複合現実感事業から撤退し、また他1社が研究の要となる設備ビデオシースルーHMDについて、貸与の継続を打ち切るという事象も発生したため、研究環境と企業連携体制に見直しを要する状況となった。しかしながら、研究環境に関しては、ビデオシースルーHMDに関する要求仕様を段階的に切り分け、本研究段階に必要な要件を精査することで、当該年度の研究遂行に最低限必要なソフトウェア開発環境および既存品を改造したHMDを準備することができた。企業連携体制については、関連する他企業との連携を新たに開拓しつつある。本年度の主要な研究実績として、1『百鬼面』と『MR Cyborg Soldiers』の試行開発と展示実験、およびそれらを踏まえたMRコンテンツ開発制作指針の精緻化を実施し、2新たな事例開発の実施とLaval Virtual 2014ReVolutionへの応募と採択を実現した。本研究テーマに係る作品がLaval Virtualのデモ展示コンペティションReVolutionに3年連続の入賞を果たした状況は、当該制作開発の方法論が有効に機能する証左として示しうると考える。また、研究を進める中で、本研究ではHMD装着型を基本とするがゆえにHMDを装着しないオーディエンス(一般観衆)とHMDユーザとの体験をいかに整合させるかが大きな研究課題として認識されることとなった。本研究では、MRエンタテインメントのフレームワークの中で、これをMR Physical Displayという名称で位置づけ、バーチャル空間を現実空間へと多感覚的に媒介するメディアとして今後の研究の中で重視していくこととした。MR Coral SeaはMR Physical Displayに重点をおいた事例として開発を行った。
ストレス環境下における植物メリステムの細胞分裂活性維持機構の解明

ストレス環境下におかれた植物が成長し、生存し続けるためには成長点の活性や機能を維持する必要がある。本研究では、イネを対象として、塩ストレス環境下での細胞分裂活性の維持および根の伸長制御にそれぞれ関わるRSS1因子とRSS3因子について、その特性や機能を解析した。RSS1が熱変性を受けにくいタンパク質であること、RSS3がDNA結合性bHLH因子およびジャスモン酸シグナリングの制御因子JAZと結合し、ジャスモン酸に対する過剰応答の抑制に寄与することを明らかにした。また、ジャスモン酸シグナルの不活性化に関わる酵素遺伝子の過剰発現によりイネの耐塩性が向上することを示した。本研究では、メリステムでの細胞分裂活性や細胞分裂と分化との調和がストレス環境下でどのように維持されるのかについて、その機構を分子レベルで理解することを目指して研究を進めている。これまでにストレス環境下での細胞分裂活性に必要な因子としてRSS1を報告しているが、この因子の欠損変異体では細胞周期のG1-S期移行がストレスに依存して強い阻害を受ける。本年度はG1-S期移行制御に関わる因子と考えられているRbのイネホモログに関する研究や、塩ストレス存在下での根の成長に関わるRSS3因子の解析を進め、主に以下の成果を得た。1.Rbのイネホモログの1つであるOsRBR1の変異体は、生育が顕著に阻害され、不稔性を示すが、とくに花粉形成が全く起きないことを見出した。このことはOsRBR1が花粉形成の初期段階に必要であることを示した。2.OsRBR1およびOsRBR2に結合するRepAタンパク質をコードする遺伝子をデキサメタゾン(DEX)誘導性プロモーター下流に連結させたコンストラクトを作成し、これを導入したイネについて解析を進めた。このイネの幼苗にDEX処理を施したところ、RepA遺伝子の発現誘導とともに、地上部および根の顕著な生育阻害がみられた。これらの個体の根端について詳細な解析を行ったところ、分裂領域については短く、伸長領域については長くなっていた。また、分裂領域の細胞数は減少し、伸長領域の細胞数は増大していた。一方、Rbへの結合に必要なアミノ酸を欠失させた変異RepAを同様に誘導した場合には、生育阻害は観察されなかった。これらのことから、RepAの発現が細胞の分裂から分化への移行を促進させる可能性が示唆された。3.RSS3がジャスモン酸シグナリングに関わるJAZ因子およびbHLH型転写因子と複合体を形成すること、rss3変異体ではジャスモン酸応答が起こりやすいこと等を見出した。ストレス環境下において植物の細胞分裂活性を維持することは、ストレスに適応した持続的な成長と個体の生存の両方に重要である。植物の組織は、メリステムの細胞が分裂し、さらに分化することによって形成される。また、メリステムの機能維持のためには、細胞分裂が細胞分化と協調されておこなわれる必要がある。本研究では、メリステムでのこのような分化と調和した細胞分裂の活性がストレス環境下でどのような制御によって維持されるのか、その機構を分子レベルで解明することを目的として研究を進め、これまでに以下の成果を得た。ストレス環境下での細胞周期の制御に関わるイネ因子RSS1はタンパク質脱リン酸化酵素PP1と結合することが示されているが、イネの複数のPP1の中でもOsPP1が高いRSS1親和性をもつことを新たに示した。またOsPP1が、RSS1の安定性に寄与するN末端側のドメインではなく、C-末端側の機能領域に結合すること、RSS1タンパク質が熱処理による変性を受けにくく、熱処理後もPP1への特異的な結合活性を有することを示した。RSS1の機能欠損変異体では、メリステムの分裂細胞において、細胞分裂周期のG1期からS期への移行がストレス依存的に強く阻害される。このことから、G1-S期移行の抑制因子Rbの機能調節にRSS1が関わる可能性が示唆されている。イネゲノムには2種類のRbホモログがコードされているが、その1つであるOsRBR1の変異体を同定した。この変異体を圃場で生育させたところ、顕著な生育遅延や不稔性が確認された。また、Rbの活性を人為的に制御することを目指し、Rbの機能を阻害するRepAタンパク質をコードする遺伝子をデキサメタゾン誘導性プロモーターの下流に連結させたコンストラクトを作出した。さらに、この融合遺伝子を導入したイネカルスおよび再分化イネ個体を得た。本研究では植物メリステムの機能が環境ストレス下においてどのように維持されるのかを、イネを用いて調べている。本年度においては、以下のような進展がみられた。1.ジャスモン酸を不活性化するCYP94C2b酵素遺伝子を過剰発現させたイネの解析から、ジャスモン酸シグナリングの抑制が、塩ストレス下でのイネの成長や生存を高めること、ならびに塩ストレス誘導性の葉の老化を抑制することを見出した。また同時に、ジャスモン酸シグナリングの抑制が、メリステムや葉原基の活性の保持にも寄与すると推定した。これらの効果には、サイトカイニンの作用が関与する可能性が考えられたため、サイトカイニン応答性マーカー遺伝子の発現解析を行った。その結果、少なくとも葉の老化抑制についてはサイトカイニンの作用を介さないことが判明した。2.ジャスモン酸シグナリングに関わる因子に変異を導入したイネを作出したところ、小穂の発達異常が見出された。

この異常は頴の繰返し形成、小花様器官の繰返し形成(貫生化)等を伴うことから、このイネではメリステムでの細胞分裂や分化の異常のみならず、メリステムの転換の異常や有限性の欠如が起きているものと推定された。これらの結果は、ジャスモン酸シグナルに関わる因子がイネの小穂メリステムの維持や転換のプログラムに関わることを示唆している。3. RSS1相互作用因子であるPP1を構成的に発現させるイネの代わりに、デキサメタゾン(DEX)誘導によりPP1を発現させるイネの作出を試みたところ、形質転換イネカルスが得られた。これを用いて、今後さらなる解析を行う予定である。ストレス環境下におかれた植物が成長し、生存し続けるためには、メリステムやその周縁部での細胞の分裂能や分化能を維持する必要がある。しかしながら、その維持機構については、これまでに殆ど理解されていない。本研究では、こうした機構に関する知見を得ることを目的として、関連するイネ因子の解析を進め、主として以下の成果を得た。(1)ストレス環境下での細胞分裂活性の維持に必要とされるRSS1が、熱処理による変性を受けにくいこと、また熱処理後もタンパク質脱リン酸化酵素PP1への結合能を保持することを明らかにした。このことは、塩ストレスや高温ストレスによってタンパク質が変性しやすい条件となってもRSS1が機能できることを示唆する。(2)塩ストレス環境下での根の伸長に必要とされるRSS3が、ジャスモン酸(JA)シグナリングの負の制御因子であるJAZおよびDNA結合性のbHLH因子と結合し、JAに対する過剰応答の抑制に関わることを示した。このことは、過剰なJA応答の抑制が、塩ストレス環境下での根の伸長成長に必要であることを示唆する。(3)JAは植物体内で活性型のJA-Ileに変換されるが、JA-Ileの不活性化に関わるCYP94C2bを過剰発現させたイネでは、JA応答性が低下し、また塩ストレス環境下での生存能が向上した。後者では、葉の老化遅延やシュートの成長点の機能保持を伴っていた。これらより、イネにおいては、JAに対する応答性が塩ストレス耐性に強く影響すると推察される。(4)[最終年度に実施した研究の成果]Nona BokraやPokkaliを含むいくつかの耐塩性イネ品種において、CYP94C2bの発現レベルが標準品種である日本晴よりも高いことを見出した。このことは、CYP94C2bの発現量の改変による耐塩性の強化が、遺伝子組換え操作によらずとも、実現可能であることを意味する。ストレス環境下におかれた植物が成長し、生存し続けるためには成長点の活性や機能を維持する必要がある。本研究では、イネを対象として、塩ストレス環境下での細胞分裂活性の維持および根の伸長制御にそれぞれ関わるRSS1因子とRSS3因子について、その特性や機能を解析した。RSS1が熱変性を受けにくいタンパク質であること、RSS3がDNA結合性bHLH因子およびジャスモン酸シグナリングの制御因子JAZと結合し、ジャスモン酸に対する過剰応答の抑制に寄与することを明らかにした。また、ジャスモン酸シグナルの不活性化に関わる酵素遺伝子の過剰発現によりイネの耐塩性が向上することを示した。