hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゼニゴケにおける性決定遺伝子の探索

ドラフト・雌ゲノム・データからX染色体に連鎖する配列を抽出した。雄ゲノムとの比較によりX染色体由来候補配列を選抜し、F1世代での連鎖解析を行ったところ、X染色体に由来する5配列を同定した。次に、様々な組織に由来するRNA-seqデータを用いてX染色体遺伝子の発現パターンの比較を行い、雌生殖器特異的発現パターンを示す遺伝子を選抜した。それらの遺伝子についてRT-PCRを行って発現特異性を評価したところ、これまでに1個の遺伝子が雌生殖器特異的に発現していることが確認された。類似性検索により、当該遺伝子はDNAメチル化の制御に関わるタンパク質をコードしていることが示唆された。平成25年度も前年度に引き続き,X染色体配列の探索を行った。まず,X染色体遺伝子の一部は雌生殖器官特異的に発現していると考えられるので,造卵器あるいは雌器床特異的に発現している遺伝子を探索した。RNA-seqデータの解析により,雌生殖器特異的遺伝子を23個見いだした。これらの遺伝子を含むゲノム配列を米国Joint Genome Instituteの未公開ゲノムデータ(JGI ver 0.6)より取得し,それぞれの配列に対するPCR用プライマーを作成した。しかし,いずれのプライマーも雄株および雌株で増幅が見られたため,今回評価した雌生殖器官特異的遺伝子は常染色体に存在すると結論づけた。次に,雌ゲノム(BC4;標準雌株Takaragaike-2を4回戻し交配して得られた株)情報から雄ゲノム(標準雄株Takaragaike-1)情報を差し引いて,X染色体の配列を探索したところ,8 kb以上の配列が12本得られた。それぞれについて,雌雄特異性を雌雄標準株およびそれらのF1個体を用いたゲノミックPCRにより判定を行い,5配列が雌特異であることが判明した。これまでに得られたX染色体配列について,類似性検索およびRNA-seqデータのマッピングにより遺伝子コード領域を探索している。見いだされた遺伝子についてRNA-seqおよびRT-PCR法による発現解析を行い,雌特異的遺伝子を絞り込んでいる。さらに,これらの遺伝子のプロモーターを単離し,レポーター遺伝子による発現解析も進行中である。平成24年度はX染色体配列の獲得を実施した。まず、XおよびY染色体に共通する遺伝子に基づく方法でX染色体に由来する配列を探索した。具体的には、先行研究で得られているY染色体遺伝子の配列情報を用い、JGIより提供された雌のゲノム配列中にY染色体遺伝子のホモログを探索した。その結果、10個ずつのホモログがscaffold00017(約1.9 Mb)およびscaffold 22(1.8 Mb)に見いだされた。それぞれのscaffoldの塩基配列を用いて遺伝解析を実施し、両者ともX染色体に連鎖していることを明らかにした。今回XおよびY染色体に共通することが明らかとなった遺伝子20個について、性染色体間のシンテニーを調べたところ、保存されている部分はわずかであった。これは、XおよびY染色体が分岐したあと、それぞれにおいて染色体レベルの再編が起こったことを示唆している。次にRepresentational Difference Analysis(RDA)法を用いてX染色体連鎖マーカーの単離を試みた。ゲノムを切断するHindIIIを用いて解析を行ったところ、X染色体に連鎖し、かつ前述のscaffoldに含まれない配列が1つ見つかった。この配列は、約75 kbのscaffold00225に含まれていた。従って、X染色体について全部で4 Mb近い配列情報が得られたことになる。Scaffold00017および00022に対して、EST情報および類似性に基づく遺伝子探索を行ったところ、前者で20個、後者で19個の遺伝子を見いだした。これより、X染色体の遺伝子密度は100 kb当たり約1遺伝子となる。これはY染色体とほぼ同じであり、両者が類似した進化の過程を経てきたことを示唆している。本研究の目的は、半数体生物ゼニゴケの性染色体に存在すると予想される性決定遺伝子の同定である。これまでに、研究代表者らはゼニゴケY染色体の構造を半数体生物としては初めて明らかにし(PNAS 104:6472-6477, 2007)、さらにX染色体特異的マーカーを単離してX染色体の部分構造を明らかにしている。これらの成果に基づいて上記の課題に取り組むため、本研究では、まずX染色体に由来する塩基配列を収集し、Y染色体遺伝子情報およびRNA-seq情報を用いてX染色体遺伝子を探索した。ゼニゴケX染色体のサイズは約20 Mbであるが、その約60%はX染色体特異的rDNAクラスターで占められる(Chromosome Res. 11:694-703, 2003; PNAS 104:6472-6477, 2007)。

本研究では、X染色体のうち、rDNAクラスター以外の部分約8 Mbのみを対象とした。米国Joint Genome Instituteから提供されたドラフト・ゲノム・データには、常染色体とX染色体の配列情報が混在しているため(雌株を用いたため)、まずこれらのデータからX染色体に連鎖する配列を抽出した。雄ゲノムとの比較および遺伝子発現パターンの比較によりX染色体由来候補配列を選抜し、F1世代での連鎖解析を行ったところ、X染色体に由来する5配列を新たに同定した。次に、様々な組織に由来するRNA-seqデータを用いてX染色体遺伝子の発現パターンの比較を行い、雌生殖器特異的発現パターンを示す遺伝子を選抜した。それらの遺伝子についてRT-PCRを行って発現特異性を評価したところ、これまでに1個の遺伝子が雌生殖器特異的に発現していることが確認された。類似性検索により、当該遺伝子はDNAメチル化の制御に関わるタンパク質をコードしていることが示唆された。ゲノム科学X染色体配列の選抜に想定以上の時間を費やした。また,機能解析用コンストラクトの作成にも時間を要しており,全体に当初計画よりも遅れている。計画した2種類のアプローチの両方で良好な結果が得られた。新たなRNA-seqデータも利用できるようになったため,発現特異性に基づく候補遺伝子の絞り込みをさらに進める。これらの遺伝子について機能解析用コンストラクトを作成して植物に導入し,表現型を観察する。平成24年度に4 Mb近いX染色体の情報が得られたが、実際にはさらに数Mb残されていると見積もっている。新たなX染色体の領域を探索するため、雌雄のゲノムデータ(新たにJGIより雄ゲノムのデータが供給された)を比較し、雌特異的な配列を網羅的に単離する。遺伝子探索については、平成24年度末までに得られた総計10億本を超えるRNA配列情報を活用する。TophatなどのRNAマッピングツールを用い、発現領域の探索および雌雄・組織間における発現量の差を網羅的に解析する。候補遺伝子については、RT-PCRによる発現の組織特異性の確認を行ったうえで逐次解析用コンストラクトを作成し、形質転換による機能解析を実施する。当該年度の計画において,多数の形質転換体を作成する予定であったが,X染色体の候補配列の選抜が遅れ,ほとんど実施できなかったため。遺伝子機能解析のための形質転換体作成および評価に使用する。平成25年度は、X染色体連鎖解析用のPCR、発現解析用のRT-PCR、コンストラクトの作成、形質転換体の作成および培養維持に必要な消耗品が必要である。また、初年度に得られた研究成果を学会報告するための旅費も必要である。
昆虫脳における神経ペプチドの放出に関する細胞生物学的研究

昆虫の変態調節の中心的存在である脳および中枢神経系におけるペプチドニューロンの構造と機能を分子レベルで解析することを目標に、カイコ幼虫を材料に神経ペプチドであるボンビキシンを産生するニューロンについて免疫電顕レベルで同定し、その微細構造を明らかにした。また神経分泌の上位調節機構を明らかにするため、ボンビキシンニューロンに西洋ワサビペルオキシダーゼを注入標識し、樹状突起および入力線維を電顕によって観察した結果、樹状突起が左右の両半球のニューロパイルに伸び、入力繊維は部位によって形態が異なることが明らかになった。次にペプチド以外のアミノ酸や一酸化窒素などの低分子伝達物質との共存性を免疫組織化学および酵素組織化学的に検討し、神経分泌ニューロンにおけるNADPH diaphoraseおよびグルタミン酸脱炭酸酵素の局在を明らかにした。免疫電顕の結果、樹状突起内にもボンビキシンの抗体と反応する分泌顆粒が含まれていることが明らかとなった。それらの顆粒が脳内で放出されるか否かについて、摘出した脳を高密度(60mM)のカリウム液で脱分極刺激し、タンニン酸固定を施したあと電顕的に放出像を検討した結果、脳のニューロパイル内で神経分泌顆粒の放出がおこることが明らかとなった。放出は典型的な開口放出であるが、所謂シナプス部位ではなく、その機能は単なる神経伝達ではないことを示している。以上の結果より、昆虫の神経分泌ニューロンが脳内の部位によって異なる神経回路からなる複雑な調節機構を受けていること、ボンビキシンのような神経ペプチドが血液中に放出されて神経分泌ホルモンとしての機能をはたしているだけでなく、脳内のニューロパイルの中で放出されて、別の何らかの神経機能を果たしていることが示された。
がん胎児性中性アミノ酸トランスポーター(LAT1)の発現と細胞のがん化機構と制御

腫瘍細胞型アミノ酸トランスポーターLAT1を抑制し、正常細胞型LAT2には作用しない抑制薬の創製を目的に、LAT1に選択的な高親和性新規抑制薬の開発を試みた。トリヨードサイロニンをシード化合物として化合物デザインを行い、250物質の合成、検討を行い、KYT0193、KYT0206、KYT0213と命名した3種の高親和性化合物を得た。3者ともに既存のLAT抑制物質BCHに比し約1000倍、トリヨードサイロニンに比し約1020倍程度の高い親和性を示した。KYT0206はLAT1選択的、KYT0213はLAT2選択的であり、KYT0193はLAT1及びLAT2の両者に親和性を示した。これにより、当初の目的であるLAT1選択的高親和性抑制物質が創製された。次に、これら高親和性新規アミノ酸トランスポーター抑制薬の腫瘍増殖抑制効果のin vitro及びin vivoによる検討を行った。すでにBCHに関して行ったのと同様に、in vitroではT24細胞を、in vivoではヌードマウスにT24細胞接種腫瘍に対するKYT0193及びKYT0206の効果を検討した。その結果、KYT0193及びKYT0206は、in vitroにおいてBCHの約1/1000の濃度でT24細胞の増殖を抑制することが明らかになった。BCHによる細胞増殖抑制はcytostaticなものであるが、KYT0193及びKYT0206は、高濃度側では細胞死が生じた。さらに、KYT0193に関しては、ヌードマウスにT24細胞を接種した腫瘍に対する増殖抑制効果をBCHの場合と同様の投与プロトコールで検討した。その結果、BCHの1/1000投与量で腫瘍増大抑制効果が得られた。
日本近世社会における時間認識に関する研究

まず近世都市に設置された時の鐘について江戸の事例を中心に検討を行い、以下の知見を得た。特質のひとつは、時の鐘の維持費用は、幕閣の認可のもと、町人のみならず武家屋敷からも徴収されていること、かつ徴収の主体が時の鐘の請負人自身であることである。身分を越えた公共的負担区分として扱われたことによるものと思われるが、町人が武家屋敷へ徴収にまわることも含め、極めて異例な体制である。だが長期滞納を続ける武家屋敷が多いことが早くから問題となっていた。他都市では基本的に領主の達しに基づき町人が負担している事例が多い。このほか、時の鐘自体が時刻を知る仕組みについて、機械時計のみならず香時計を用いていること、また各地の時の鐘に伝達する体制についても一定度解明した。次に時の鐘が知らせる時間が民衆生活に与える影響について、領主法令、民衆共同体の申し合わせ類から検討した。その結果、民衆世界で共有していた、時の鐘が知らせる不定時法の時制とは別に、武家領主や天皇家らの生死や礼儀礼に関しては定時法の時制が用いられたこと、両者の時制のずれが近世中期以降に問題となりだし、その統一化が試みられたことが判明した。さて、不定時法に基づくと昼間の時間が季節により大きく変動する。近世中期以降には、この時間の長さの違いという点が意識されるようになる。具体的には商家などの奉公人規定に昼寝や夜なべの規定が季節を区切って設けられたり、大坂では建築関係の職人について、町奉公所が勤務時間を季節に分けて定めている。村落社会では都市社会に比しこうした動きは遅いが、しかし番水をめぐる村同士の水論のなかで、定時法の論理が持ち出されるようにもなった。このように民衆社会における時間認識の、近世中期段階での転換・進化について明らかにしたことが、本研究の第三の成果である。以上の成果をもとに、成稿を進めている。
カルシウムシグナルを介した内皮機能・血管形成制御機構の研究

血管形成は、胎生期の臓器形成や生後の創傷治癒などに不可欠の過程であり、その異常は胎生致死や癌などの原因となることから制御機構の解明は必須である。血管形成機構に関しては、これまで転写因子活性化シグナルの解明に焦点が絞られてきたが、近年、様々なシグナル伝達のキー因子であるである細胞内カルシウム(Ca2+)の重要性が示唆されている。例えば、増殖因子刺激により細胞内Ca2+濃度の増減が生じ、生じた細胞のみ血管新生が亢進すること、また血流(shear stress)によりメカノセンサーが活性化され細胞内Ca2+濃度が上昇することが報告されており、これらは胎児期心臓拍動開始により血管新生が爆発的に進む機構の1つである可能性を示唆している。しかし、(1)血管新生を導く経路にどのメカノセンサーや関連因子が関与しCa2+シグナルが惹起されるのか、その分子実体およびシグナル経路は明らかでない。一方、申請者らの研究グループは心血管形成に必須の膜タンパク質としてTmem100を同定し、その機能にCa2+シグナルが関与することを見出したが、どのようなシグナル経路にTmem100が関与して血管形成に寄与しているのか分子機構は不明である。本研究ではTmem100とカルシウムシグナルの関連性に着目し、新規血管形成シグナルを明らかにすることを目的とする。これらが明らかになれば、薬物開発の新たなターゲット探索にも結びつき、ヒト疾患の病因解明・治療法の開発に向けた基礎研究として現代社会に大いに役立つことが期待できる。申請者らの研究グループは、これまで、欠損すると心血管形成異常を起こし胎生死させる機能不明の膜タンパク質としてTrans membrane Protein100(Tmem100)を同定し、その機能発現に細胞内Ca2+シグナルが関与することを見出している。一方、血管形成にはメカノセンサー等を介したカルシウムシグナルの重要性が示唆されているが、その候補としてCa2+透過チャネルであるTRPチャネルが示唆されている。近年、TRPV1/TRPA1とTmem100が結合することが報告されたことから、内皮機能に重要な役割を担うTRPV4とTmem100に関連を調べた結果、両者が物理的に結合することを明らかにした。今後、TRPV4のイオンチャネル活性やタンパク発現にTmem100が必要か否かを確認する予定であるが、現在それらに向けて、TRPV4発現細胞にてイオンチャネル活性をパッチクランプ法にて、また細胞内Ca2+レベルを蛍光イメージング法にて測定できるようになっている。TRPV4のみならず様々なTRPチャネルとTmem100との物理的相互作用を免疫沈降法・免疫蛍光法にて確認。確認後は両者の結合領域を決定し、類似配列を持つチャネルを標的因子の候補とする。物理的相互作用が確認されたTRPチャネルに関し、Tmem100の有無がチャネル活性に影響するかイオン電流並びに細胞内Ca2+レベルを測定して、Tmem100がTRPチャネルの機能発現に重要かを明らかにする。

確認後は両者の結合領域を決定し、類似配列を持つチャネルを標的因子の候補とする。物理的相互作用が確認されたTRPチャネルに関し、Tmem100の有無がチャネル活性に影響するかイオン電流並びに細胞内Ca2+レベルを測定して、Tmem100がTRPチャネルの機能発現に重要かを明らかにする。2019年4月より別の部署への移籍が決定したため、実験よりデータ解析に時間を使ったため物品費が予定より少なくなった。
実質臓器透析用ファイバー型プローブの開発

市販の微小透析用プローブを直ちに肝臓、腎臓等の実質臓器に用いるには多くの問題点がある。そこで、1)組織損傷を抑えるために、プローブの直径を市販のプローブの1/3以下にする。2)透析潅流液の流速を高め、速い反応を観察する。3)拍動や呼吸性移動による組織障害をへらす。以上の目的に合致したファイバー型プローブを試作し、ファイバー型プローブの透析効率をin vitro、in vivoの系で検討を行った。1)in vitroの実験:透析膜は、外径220μm、内径190μmのキュプロファンファイバー(分子量cut off point 5,500:Aファイバー)および血漿交換用に開発された限外濾過膜(Bファイバー)を選び、有効透析長を15mmとなるよう接続チューブを両端に挿入した。Aファイバーでは、10μ1/minの流速においても、アデノシン、クレアチニンの回収率は20%以上と良好であった。しかし、アンジオテンI、II(AI、II)の回収率は、5or10μl/minで、8.7%or4.4%と低い回収率しか得られなかった。Bファイバーを用いてもAI、IIの回収率は大きく上昇せず、5μl/minで10%程度であった。そこで、高い効率の得られたアデノシンに焦点を絞り、in vivoの実験系で腎間質液中のアデノシン動態の検討を行った。2)in vivo実験:ペントバルビタール麻酔イヌの腎皮膜除去後、Aファイバープローブを腎の長軸方向に刺入し、10μl/minの流速で潅流した。腎虚血時には、アデノシン濃度は2倍の増加を示した。一方、イノシンはその10倍、ヒポキサンチンは、100倍以上の増加を示した。そこで、アデノシンの動態をより正確につかむため、adenosine deaminase阻害剤(EHMA)およびadenosine kinase阻害剤(iodotubercidin)の注入実験を行った。EHMAでは100倍以上、一方、iodotubercidinで数倍の増加が観察された。これらの結果は、細胞から遊離されたアデノシンの大部分はadenosine deaminaseにより分解されるが、adenosine kinaseによる再利用は数%にとどまることが明らかになった。本プローブは、市販のプローブに比べ外径が200μと細く、組織損傷を低く抑えることが可能で、また透析効果率が510倍高いため、生体の速い反応をとらえることができる。腎でのアデノシン動態結果から解かるように、本法の有用性が明らかになり、今後多くの実質臓器に応用されるものと期待する。

そこで、1)組織損傷を抑えるため、プローブの直径を市販のプローブの1/3以下にする。2)透析潅流液の流速を高め、組織との平衡状態に早く達する。3)拍動や呼吸性移動による組織障害を減らす。以上の目的に合致したファイバー型プローブを試作し、ファイバー型プローブの透析効率をin vitro、in vivoの系で検討を行なった。1)in vitroの実験:透析膜は、外径220μm、内径190μmのキュプロファンファイバー(分子量cut off point5,500:Aファイバー)および血漿交換用に開発された限外濾過膜(Bファイバー)を選び、有効透析長を15mmとなるよう接続チューブを両端に挿入した。Aファイバーでは、10μl/minの流速においても、アデノシン、クレアチニンの回収率は20%以上と良好であった。しかし、アンジオテンシンI、II(AI、II)の回収率は、5or10μl/minで、8,7%or4,4%と低い回収率しか得られなかった。Bファイバーを用いてもAI、IIの回収率は、大きく上昇せず、5μl/minで10%程度であった。また、アルブミンおよびレニンの回収率も、35%と低値であった。しかし、低回収率であったが、数時間の透析期間中その回収率は非常に安定していたのので、in vivoへの応用を試みた。2)in vitroの実験:ペントバルビタール麻酔イヌの腎臓の皮膜除去後、プローブを腎の長軸方向に刺入し、5μl/minおよび10μl/minの流速で潅流した。腎動脈圧低下等レニン分泌刺激を加えると、透析液中のレニンおよびAI濃度は、血漿中濃度のそれぞれ50倍以上の高値を示した。これらの結果は、組織間隙に遊離した生体内活性物質の測定が、これら物質の生理機能を解明する上で重要であることを示している。このように、本ファイバー型プローブの有効性を示す結果を得ている。実質臓器用に前年度開発したファイバー型微少透析用プローブを用い、腎臓でのアデノシン、イノシン、ヒポキサンチンの動きを虚血時、虚血潅流時で測定し、腎機能調節におけるアデノシンの役割を検討するための基礎とした。しかしながら、腎間質液中のアデノシン濃度は、後述するように、腎虚血時でも2倍程度の増加にとどまった。対照時のアデノシン濃度は100nM前後で、虚血時には200300nMへ増加するが、生理作用を発揮する濃度に近いと考えられるが、十分とはいえない。そこで、腎組織中でのアデノシン動態を明らかにするため、アデノシン分解酵素阻害薬erythro-(2-hydroxy-3-nonyl)adenosine hydrochloride(EHNA)、adenosine kinasee阻害薬;indotubercidineおよび両者を同時に与えた時の腎間質液中のアデノシン量の比較検討を行った。ペントバルビタール麻酔イヌの腎皮膜除去後、プローブを腎の長軸方向に刺入し、10μl/minの流速で潅流した。なお、透析プローブへのフィブリン等の付着防止のため、透析液中に10U/mlのヘパリンを混入させた。1)生理的食塩水注入時は、前述したように虚血時には2倍の増加が認められた。再潅流30分目には、ほぼ対照値に戻っていた。2)EHNA(100μM)潅流時:50400倍増加した。3)Indotubercidine(10μM):34倍の増加。
高地・低酸素環境下での運動トレーニングによる身体の適応過程の性差を探る

これまでの研究により新たな検討課題として上げられた、睡眠中の酸素飽和度の高低や急激な変化の発生頻度との関係について追加検討を行った。すなわち、低酸素環境下での睡眠中に繰り返し生じる動脈血の酸素飽和度の低下が、高地暴露中の睡眠の質や疲労感に与える影響を検討した。対象者は、非常に鍛練されスポーツ競技者14名(男子2名、女子12名)であった。対象者は標高1,000mにおいて5泊6日の高地滞在を行った。滞在1泊目の就床時から起床時まで、パルスオキシメーターを用いて連続的に心拍数(HR)と動脈血酸素飽和度(SpO2)を測定し、酸素飽和度低下指数(Oxygen desaturation index,ODI)を算出した。また高地暴露期間中は、毎朝起床直後にVisual Analog Scaleを用いて睡眠の質と疲労感を評価した。3%ODI(ベースラインのSpO2値から3%以上の急激な低下が生じた頻度)が5dip/h以上かつ4%ODIが4dip/h以上の対象者をOD高頻度群(6名)、それ以外の対象者を低頻度群(8名)とし群間比較を行った。睡眠中のSpO2およびHRの平均値に両群間で有意な差はなかった。両群とも高地暴露が進むにつれ疲労感は増大したが、両群間による差はなかった。睡眠の質は、両群とも高地滞在1泊目が最も悪く、2泊目以降は改善し、その後はその水準を推移した。なお、両群間でその推移に有意な差は認められなかった。標高1,000mという、それほど標高が高くはない低圧低酸素環境(準高地)においても、睡眠中においては動脈血の急激な酸素飽和度低下が繰り返し生じる。一方、疲労感の強弱、睡眠の質の良悪に及ぼす影響は、準高地環境においては小さいと考えられる。生体が高地環境に暴露されると、酸素分圧の低下に対する代償作用として造血が促進される。造血に至る過程では性ホルモンが関与することが報告されていることから、高地暴露による赤血球性状の変化にも男女による差異が生じるかもしれない。研究の初年度は、高地滞在が赤血球性状に与える影響の性差を検討した。対象者は16歳から18歳の男子7名、女子8名であった。対象者は標高2,200mの自然の高地に15日間滞在した。高地滞在の前後に海面レベルにて、ヘマトクリット値(Hct値)とヘモグロビン濃度(Hb濃度)を測定し、これら測定結果から平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)と血漿量の変化(ΔPV)を算出した。また、高地滞在中は、3日目、8日目、12日目にHb濃度を測定した。高地滞在中、男子のHb濃度は3日目に有意に高い値を示し、8日目は3日目と比べて低下、12日目は再び有意に高い値を示した。高地環境への急性適応として血液濃縮が生じ、その後、血液濃縮の緩和を経て造血が亢進していたことが推察される。女子のHb濃度は、男子と同様に3日目に有意に高い値を示したが、8日目、12日目は高地滞在前の水準と同程度であった。女子においては、血液濃縮が緩和された後の造血応答の個人差が大きいことが推察される。高地トレーニング前後で比較すると、男子はHct値、Hb濃度、MCHCは有意な変化は示さなかったが、ΔPVは増加した。赤血球の質的変化を伴わない血液の量的増加がもたらされた可能性が考えられる。一方、女子のHb濃度は低下する傾向を示し、MCHCにおいては有意な低下を示した。Hct値は有意な変化を示さなかったが、ΔPVは増加した。男子と同様に、血液の量的増大がもたらされた可能性が考えられるが、女子においては赤血球の質的変化が生じていたかもしれない。総ヘモグロビン量及び低酸素に対する化学感受性を測定する為のシステムの作成は、当初の計画通り完了した。当初、予備実験として行う予定だった3日程度の常圧低酸素暴露は、自然の高地を利用した15日間の低圧低酸素暴露に変更となったが、確認すべきデータを取得することはできた。生体が高地環境に暴露されると,酸素分圧の低下に対する代償作用として造血が促進される.造血に至る過程では性ホルモンの関与が報告されていることから,高地暴露による赤血球性状の変化にも差が生じる可能性が考えられる.昨年度は連続的な高地暴露の影響を検討したが,本年度は間欠的な高地暴露による影響を検討した.対象者は16歳から19歳の男子8名,女子4名であった.対象者は11日間,1日の中で標高1,300mの準高地と標高340mを往復して滞在する間欠的な高地(低酸素)暴露(Intermittent altitude exposure: IAE)を行った.高地滞在の前と滞在4日目,7日目,11日目にヘモグロビン濃度(Hb)とヘマトクリット値(Hct)を測定した.男子のIAE中のHbは,IAE前の値と同程度を推移し,大きな変化は示さなかった.HctはIAEが進むにつれ次第に増加した.男子においては,赤血球の量的変化(増加)が生じていた可能性が高い.一方女子のIAE中のHbは,滞在4日目にはIAE前の値と比べて高値を示し,その後は4日目の値を維持した.

HctはIAEが進むにつれ次第に増加したが,7日目をピークにその後は同程度の値を推移した.女子も男子と同様に赤血球の量的変化(増加)がもたらされるが,顕著な造血が得られるまでの期間に関して,男子よりもより多くの期間を費やす必要があるかもしない.連続的な高地・低酸素暴露と間欠的な高地・低酸素暴露は,何れも造血に至るがその過程に違いが観察された.また,それぞれの暴露方法において,造血過程には性差が生じる可能性も示唆された.所属研究機関が変更となったため,高地(低酸素)環境を作り出すシミュレーターの再作成が必要となった.再構築にかかる費用や施設の運用に関わるルール作り等の問題解決に時間を要し,本実験(人工低酸素環境を使用した間欠的高地暴露)の実施に至らなかった.昨年度の段階で自然環境を利用した研究手法に切り替えることを視野に入れていたため,試験的に自然環境を利用した間欠的高地暴露を行い,研究データを取得した.研究論文の投稿には至ったがアクセプトされなかったため,再投稿の準備を進めている.昨年度と一昨年度の研究において、連続的な高地暴露と間欠的な高地暴露は、何れも造血に至る過程で性差が生じる可能性が示唆された。今年度の研究においては、性差が生じる原因の一端を探るべく、睡眠中の酸素飽和度低下の影響を検討した。検討理由として、低酸素性肺血管攣縮が男性よりも女性の方が弱いこと、女性の方が咽頭の気道抵抗が低いこと、睡眠中の化学感受性が保たれることなど、これら性別による違いが動脈血の酸素飽和度の維持に関与している可能性が考えられた為である。なお、睡眠中の血中酸素分圧の高低は、造血の程度に大きな影響を及ぼしている。対象者は16歳から19歳の男子5名女子5名であった。対象者は11日間、1日の中で標高1,300mの準高地と標高340mを往復して滞在する間欠的な高地暴露(Intermittent altitude exposure: IAE)を行った(=前年度実施研究と同様の手順)。高地滞在の前日と滞在3日目、6日目、11日目の起床直後に、ヘモグロビン濃度(Hb)とヘマトクリット値(Hct)を測定した。これら血液分析実施日の前夜就寝時から翌朝に起床するまで、パルスオキシメーターを用いて睡眠中の動脈血酸素飽和度を測定し、Oxygen desaturation index(ODI、睡眠中に生じる急激な酸素飽和度低下の単位時間当たりの発生回数)を算出した。男子のIAE中のHbは、IAE前と同程度を推移し、有意な変化は示さなかった。HctはIAEが進むにつれ次第に増加した。女子のIAE中のHbは、滞在3日目にはIAE前の値と比べ高値を示し、その後は3日目の値を維持した。これら結果は前年度実施の研究結果と概ね同様の結果であった。睡眠中の酸素飽和度の高低やOD発生頻度との関係について詳細な検討を現在行っている。研究論文を投稿後、査読過程において追加検証が必要であるとの結論を得た。その為、実施計画の見直しを図り、追加検証を行った。これら一連の作業に時間を要することとなり、研究に遅れが生じた。これまでの研究により新たな検討課題として上げられた、睡眠中の酸素飽和度の高低や急激な変化の発生頻度との関係について追加検討を行った。すなわち、低酸素環境下での睡眠中に繰り返し生じる動脈血の酸素飽和度の低下が、高地暴露中の睡眠の質や疲労感に与える影響を検討した。対象者は、非常に鍛練されスポーツ競技者14名(男子2名、女子12名)であった。対象者は標高1,000mにおいて5泊6日の高地滞在を行った。
脳卒中後の歩行障害に対する体幹・下肢近位部トレーニングの効果：ランダム化比較試験

脳卒中患者の歩行改善には歩行量をはじめとした下肢の運動量が必須であることが知られているが、短時間で行うことのできる麻痺側体幹・下肢の選択的な高強度トレーニングも一定の効果を有している可能性がある。本研究では健常者を対象とした計測により、「膝歩き・いざり歩行」について、その運動特性を明らかにし、介入課題としての適正を調べた。続いてそれらの課題について脳卒中患者を含めた要介護高齢者を対象として介入効果について予備的検討を行った。結果、課題の実施状況が良好で運動量が十分確保できた患者においては歩行機能の改善が認められた。ただし患者と課題の適合性についてばらつきが大きいことが問題として挙げられた。脳卒中患者の歩行再建には、歩行量をはじめとした下肢の運動量が必須であることが知られているが、短時間で行うことのできる麻痺側体幹・下肢の選択的な高強度トレーニングも一定の効果を有している可能性がある。本研究ではそのような選択的集中トレーニングの効果について検証する予定である。特に片麻痺患者の体幹・近位部の残存能力に着目し、現在までにkneeling-gait(膝歩き), scooting(長坐位いざり)など、歩行様のリズミックな律動的動作で且つ、体幹・下肢近位部の筋活動を効率的に、安全に動員できるような動作について健常者・麻痺患者を対象に解析を実施中である。本年度は昨年度に引き続き、脳卒中患者の歩行改善に有効な体幹トレーニング、および体幹機能評価についての探索を実施した。これまでに体幹トレーニングとして膝立ち姿勢を用いたトレーニングの有用性について、脳卒中片麻痺患者を対象に筋電図および動作解析にて検討した。結果、膝立ち姿勢を用いた歩行様訓練は片麻痺患者の両側脊柱起立筋の筋活動を通常歩行のそれと比べて有意に活性化することを見出した。しかしながら麻痺患者では健常者で見られた腹筋群、大殿筋、中臀筋などの筋活動の上昇は認められず、要因として片麻痺患者では膝立ち姿勢の難易度が高く、健常者に比べて著しく速度が低下すること、また麻痺側の利用を避け、健側につよく依存する動作となることなどが挙げられた。このため、麻痺側の機能を自然に引き出せるような運動方法の工夫が必要であると考えられた。またもう一つの体幹筋機能訓練として、長坐位いざり動作を利用したトレーニングの効果について現在継続して検討している。途中集計(12名)の結果、健常者における長坐位いざり運動は、体幹筋の高い筋活動を示しており、脳卒中患者におけるトレーニングとして有用である可能性が確認された。また脳卒中患者における体幹筋の評価(介入前後の効果検討)として、予測的姿勢制御(APA)に伴う筋活動変化を計測することの有用性について健常者を対象に検討した。片麻痺患者では麻痺した手を使わずにAPAを評価する必要があり、そのため片手のみを用いた両側体幹筋のAPA評価を、健常者を対象として試みた。結果、健常者では片手のみを用いる方法によっても両側のAPAに伴う筋活動を評価できることが分かった。これより片側上肢しか随意性の無いような片麻痺患者においても、APAに伴う筋活動を利用すれば、介入後の体幹機能の変化を評価できる可能性が示唆された。これまで前年度、前々年度において、健常者を対象とした検討によりkneeling-gait(膝歩き), scooting(長坐位いざり)について、体幹・下肢近位部の筋活動を効率的に、安全に動員できる運動課題であることを明らかにした。そこで本年度は、scootingを介入課題として選定し、脳卒中患者を含めた要介護高齢者を対象として予備的検討を行った。対象は通所リハビリテーション施設に通う要介護高齢者46名(介入群23名、コントロール群23名)とし、歩行機能評価としてTUGを介入一週間前、介入前、介入後で実施した。介入期間は2週間とした。結果、最終評価まで可能であった40名(介入群23名、コントロール群20名)について、介入前後でのTUGに有意差は認められなかった。しかし課題の実施状況が良好な患者においては改善が認められた症例も散見された。本研究の実施過程において患者の身体機能のみならず、意欲などの精神的状態、集中力、円背などの変形の問題から統一的な課題実施が困難であり、これを改善する必要性が明らかとなった。一方、いざり移動課題とのマッチングが良く、積極的に運動量を確保することができた症例は、TUG成績の改善が改善する可能性が示されており、今後はどのような患者がいざり移動の課題に適応しやすいのか検討の意義があると考えられた。

ただし患者と課題の適合性についてばらつきが大きいことが問題として挙げられた。介入に用いる運動課題の選定が遅れているため。現在複数の運動課題について介入高価の可能性について検討している。人間医工学これまで検討してきた運動課題のうち効果の期待されるものを選定し、介入試験を行う予定である。リクルートする患者の運動機能レベルが今後の課題となる。トレーニング課題の妥当性について、事前検討に時間を要しているため。当初予定していた運動介入課題について、再検討する必要性が生じ、研究の進行が遅れているため。年度内に介入課題の選定を終了する。未使用額は、次年度における成果公表、介入試験の実施に充てることとしたい。翌年度使用分を加味したため研究上必要な書籍の購入
グローバル化時代の地域主義と境界線の意味変容ー南東欧と東アジアの比較的研究

南東欧の新しい地域主義については、これまでEUおよびNATOの東方拡大によって促された地域主義と国家の加盟競争などにあらわれる権力政治的側面が強く認識されている。こうした南東欧での研究と比べ東アジアの地域主義はASEAN諸国が牽引力を発揮し、地域の大国である日本、中国、韓国が連携するかたちをとっている。そこでは「ASEANの流儀」という、あらたな国際秩序観と国際政治の手法が有用であり、境界線は分断や対立ではなく、歴史的なアジア的国際秩序観にもとづく友好の架け橋といった意味が定着していることが鮮明となっている点が確認された。以上が本研究における成果である。当該25年度においては、南東欧の境界線問題について、ブルガリア、ルーマニア、クロアチアのEU加盟にともなって、自らの国境線とその中に包摂されたEU境界線、さらに隣接する非加盟国との境界線に対する各国の政治的、経済的、安全保障上の意味と国民のそれぞれの境界線に対する文化的認識の変化について考察した。EU加盟の実現の裏面で、政治的一体性、経済活動の競争化の進展にともなう、国民の日常生活における経済生活の実態などにも研究の主眼点をおいた。また、今年度はセルビアの政治研究所のストヤノヴィッチ上級研究員との共同研究の機会も得て、旧ユーゴスラヴィアにおける境界線問題について理論的な視角から研究を進めた。社会主義時代の時代の多民族国家における各共和国のバランス・オブ・パワー関係を重視したリアリスト的アプローチからの境界線の設定、また解体後における、国際社会の関与による新たな境界線画定構想や、解体後の新たなる「内なる境界線」の創出などにおいては「コンストラクティヴィズム」的理解の有用性を再認識することができた。さらに南東欧諸国の加盟にともない、「新しい地域主義」との関連で、南東欧概念と諸国間協力の実態の変化を、1999年以後の「南東欧安定化」の実質的という観点から、政府、国民が「新しい地域主義」どのように認識していったかについての研究もすすめた。東アジアについての境界線については、2015年のASEAN共同体設立との関連で、ラオス、インドネシア、ミャンマーを訪れる機会があり、「多様性の中の統一」を実践してきたこれら地域の「新しい地域主義」実現への可能性を、いわゆるASEANーWay(ASEANの流儀)の政治哲学、政治実践の分析視角から検討した。東ヨーロッパの社会主義政権の崩壊による中東欧とバルカンへのアイデンティティの分断とヨーロッパ連合への加盟と非加盟の差異化、また旧ユーゴスラヴィア紛争を経験した後のバルカン地域のさらなる分断状況は、ヨーロッパにおける不安定材料となってきた。南東欧はそうした地域として1999年以降のヨーロッパ安定化協定の対象国となり、またEU加盟の条件の整わない地域は西バルカンとして、さらなる差別化を経験してきた。西バルカンは周知のように旧ユーゴスラヴィアを構成した共和国の独立後の6カ国(後のコソヴォ独立によって7カ国)からスロヴェニアを除き、またアルバニアを加えた地域である。この地域は冷戦後、それまでとは異なる多くの線引きによって一体性を確保することが困難になってきたところである。しかし、EU加盟条件としてはこうした分断線を乗り越えて新たな地域的協力を目指すことが求められている。24年度は、こうした分断と協力のせめぎ合いのなかで、南東欧諸国、とりわけ西バルカン諸国がどのような形で、あらたな地域主義を構想し始めているのかを研究した。本年7月のクロアチアのEU加盟に他の諸国が続くことができるのか、また、EUの「拡大疲れ」が言われるなかで、その拡大の意味の変容を捉えようとした。また、東アジア地域に目を転じれば、韓国、日本、中国の間には、南東欧とは異なる形で、古典的な領域紛争が尖閣諸島、竹島(独島)をめぐって顕在化しており、あたらな地域主義に逆行する現象がみられた。南東欧の状況と東アジアの状況の対照性を、考えることが本年度の課題として新たに浮かび上がったことが重要である。本研究は境界線の意味についてのヨーロッパとアジアにおける意味の異同について、今日進行するグローバル化のなかでの新たな地域主義の文脈のなかで比較しようとするものである。この点から、当該26年度においては、「ヨーロッパとアジア」あるいは「東と西」という観点から、種々の文献を読む作業をおこなってきた。そのひとつは、文明論的視点としてのキリスト教文明、イスラム文明、さらに仏教文明などの視角から境界の持つ意味をとらえるアプローチである。そのなかで、鈴木大拙の論考を幅広く検討して、仏教文明の視角からする境界認識、そのヨーロッパ文明批判は、本研究を進める上で重要な枠組みとなりうるものであった。さらに、文明論的視点とは別に近代ヨーロッパ政治および政治思想における境界概念、その二分法的視点である「内と外」「自己と他者」「包摂と排除」「先進性と後進性」「優越と劣等」といった枠組みに対して、アジアでは二分法を乗り越える「全体論的」「全一的」認識に特徴が見られることが明らかになった。こうした認識論的差異から学ぶことで、今後、本研究では「ヨーロッパとアジア」の二分法的視点を超え、「ヨーロッパとアジア」双方を包み込む視点から分析をすすめる観点を獲得したことは有益であった。今後は、境界内の民族および人間の存在、境界外の民族および人間の存在、加えて境界を越える、あるいは跨る民族と人間の存在について、これらを新たな地域主義との関連でとらえることになろう。また、26年度はクロアチアにおいて地域主義と境界線の研究および資料収集を行うことができたことは有益であった。

本年度は最終年度にて、冷戦後のグローバル時代の経済、社会、政治、安全保障の領域での国際的、国家的、地域的な相互依存、相互浸透の急速な進展と従来の境界線の意味の変容について総合的な考察を行った。本研究の対象地域は南東欧と東アジアである。南東欧は冷戦期には東西対立の分断線が走り、南東欧諸国は東西に分かれて対立した。冷戦後になると「旧東欧」は「中東欧」と「バルカン」への文化的、社会的分断線が顕在化し、再度分断線が引かれ、そのなかで南東欧地域は「バルカン」の一体性の再構築と地域主義の新たな活性化が期待された。しかし、90年代を通じた旧ユーゴスラヴィア紛争は、この新たな地域主義の機会を喪失する過程ともなり、南東欧は、EU加盟の実現から遠のく「西バルカン」なる地域を作りだすに至る。今日、南東欧においては、あらたな地域協力の必要性、地域的統合の枠組みの創出が必須かつ唯一の地域発展の選択肢として提示されているのだが、グローバル時代の競争経済の進展と各国がおかれた独自の安全保障、国際政治環境のなかで実質的な統合力をもつ地域へと脱皮できないままの状況が続いている。他方、東アジアに目を転じると、日中韓の三国間では、協力と友好、冷戦期の分断と対立の枠組みは依然として十分に克服されたとは言い難いが、ASEAN地域では各国は経済発展のレベルでの格差や文化などの多様性は残るものの、それらを乗り越えて、経済、政治、社会での共同体形成への実質的形成を具体化しつつある。ミャンマーの民主政体への移管、メコン川流域を中心とした経済協力を動因として、東アジアは現在世界の経済、政治で最も躍動的な地域へと変貌し、冷戦期の境界線を乗り越えた新たな地域主義への形成が進展している。今後も両地域の比較を通じた研究の発展が期待されるところである。南東欧の新しい地域主義については、これまでEUおよびNATOの東方拡大によって促された地域主義と国家の加盟競争などにあらわれる権力政治的側面が強く認識されている。こうした南東欧での研究と比べ東アジアの地域主義はASEAN諸国が牽引力を発揮し、地域の大国である日本、中国、韓国が連携するかたちをとっている。そこでは「ASEANの流儀」という、あらたな国際秩序観と国際政治の手法が有用であり、境界線は分断や対立ではなく、歴史的なアジア的国際秩序観にもとづく友好の架け橋といった意味が定着していることが鮮明となっている点が確認された。以上が本研究における成果である。今年度は、南東欧と東アジアの地域主義と境界線問題を、これまでの二分法的な「ヨーロッパとアジア」「東と西」といった比較の枠組みを越えて、全体のなかでの双方の比較、今日の国際状況のなかでより具体的に表現するなら、グローバル化という事象を全体的に捉え、そこにおける南東欧と東アジアの新たな地域主義を理解するとともに、境界線を固定的にではなく、「動くもの」「構築されるもの」「架橋および融合するもの」といった観点から捉える視点をより明確にすることができ、今後の本研究への大きな足がかりとなったことは評価できると考えている。国際関係論今年度は、研究のまとめに入るがアジアについての実態調が不十分であるので、できるだけ早い時期に東南アジアの境界線について、各地の研究機関を訪問していきたいと考えている。
無尾両生類の正逆雑種にもとづくMating callの遺伝と生殖的隔離機構

1.ヨーロッパ産トノサマガエル群のカエル、イタリア産とルクセンブルグ産のRana lessonaeおよびトルコ産Rana ridibundaの間で作成した3組の正逆雑種、ならびに各対照区の雄から、それぞれ同一条件でMating callを採録し、分析した。その結果、雑種のMating callは、正逆の組み合わせにより大部分の音声成分が異なり、全音声成分のうち多くは雌親種のものに近い値を示したが、雑種特有のものも見られた。しかし、雄親種の音声成分に近いものは皆無であった。そのため、雑種のMating callは雌親種のものに似る傾向を示した。2.ダルマガエル典型種族3集団、トウキョウダルマガエル7集団および分布域がその両亜種に挟まれているダルマガエルの名古屋種族7集団の各Mating callを比較した結果、典型種族は全てよく似た1音節構造を示し、トウキョウダルマガエルは全集団が類似した多音節構造を示したが、名古屋種族の鳴き声は、方向性を伴って変異し、分布が近い亜種のものにそれぞれ似る傾向が見られ、名古屋種族の亜種間雑種起源が示唆された。3.鹿児島から青森に至る17集団のツチガエルのMating callを比較した結果、一鳴きの継続時間と構成パルス数に本州の長軸に沿った明瞭なクラインがみられ、両者とも南西から東北にいくほど値を増し、その両端に近い集団間ではそれぞれ5倍と4倍もの差があった。その差は、雌による識別テストから有効な隔離機構となり得ることなどがわかった。1.日本産のトノサマガエル(N_JN_J),ダルマガエルの典型種族(BB)と名古屋種族(B_NB_N),トウキョウダルマガエル(TT),韓国産のチョウセンプランシーガエル(CC),中国産のトノサマガエル(N_CN_C),台湾産のフッケンプランシーガエル(FF)の各Mating callは,音声構造上それぞれに特殊化が進んでいる(申請者,1987).これらのカエルの間で作成した8組の正逆雑種,N_JB(N_JN_J♀×BB♂)とBN_J(BB♀×N_JN_J♂),N_JCとCN_J,N_CCとCN_C,N_JFとFN_J,BCとCB,BTとTB,FCとCF,N_JN_CとN_CN_J,ならびに各対照区の雄から,それぞれ同一条件でMating callを採録し,分析した.その結果,雑種のMating callは,正逆の組み合わせにより大部分の音声成分が異なり,全音声成分のうち17%が雑種独特であり,83%が雌親類のものに近い値を示した.しかし,雄親類の音声成分に近いものは皆無であった.そのため,雑種のMating callは雌親種のものに似る傾向を示した.2.ヨーロッパ産トノサマガエル群のカエル,イタリア産とルクセンブルグ産のRana lessonaeおよびトルコ産Rana ridibundaの間で作成した3組の正逆雑種についても,上記の極東産トノサマガエル群と同様に,雑種のMating callの音声成分は雌親種のものに近い値を示すものが多いことがわかった.3.ダルマガエルの典型種族3集団,トウキョウダルマガエル6集団および分布域がその両亜種に挟まれているダルマガエルの名古屋種族5集団の各Matingcallを比較した結果,典型種族は全てよく似た1音節構造を示しトウキョウダルマガエルは全集団が類似した音声節構造を示したが,名古屋種族の鳴き声は,方向性を伴って変異し,分布が近い亜種のものにそれぞれ似る傾向がみられ,名古屋種族の亜種間雑種起源が示唆された.4.広島から青森に至る16集団のツチガエルのMating callを比較した結果,一鳴きの継続時間と構成パルス数に本州の長軸に沿った明瞭なクラインがみられ,その両端の集団間ではそれぞれ5倍と4倍もの差があり,その差は,雌による識別テストから有効な生殖前隔離機構となり得ることがわかった.1.ヨーロッパ産トノサマガエル群のカエル、イタリア産とルクセンブルグ産のRana lessonaeおよびトルコ産Rana ridibundaの間で作成した3組の正逆雑種、ならびに各対照区の雄から、それぞれ同一条件でMating callを採録し、分析した。
S1Pによる骨形成-血管新生制御機構の解明と硬組織再生治療への臨床的展開

2018年度は、ヒト歯根膜幹細胞(HPLSCs)を用いて、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)によりHPLSCsから放出されるパラクライン因子が細胞間相互作用し、骨形成・血管新生作用を促進するという仮説に関して、分子レベルで解析した。計画当初は、HPLSCsの通常培養を行い、S1Pの影響を検討する予定であったが、臨床応用を鑑み、生体内環境に近く、高い骨形成能が得られる三次元培養を行った歯根膜幹細胞スフェロイドを用いるよう変更した。具体的には、歯根膜幹細胞スフェロイドにおけるS1Pの作用と血管形成関連シグナルのパラクライン因子の検出をqRT-PCR法、ELISA法により検討した。HPLSCsには、スフェロイド形成・骨芽細胞分化誘導の24時間前にS1Pを添加し、スフェロイド形成後、3日後、7日後にmRNA抽出と上清の回収を行った。その結果、S1Pにより骨芽細胞分化マーカー遺伝子であるRunx2、ALP、OCNのmRNA発現が有意に増加した。とりわけS1PによりRunx2発現は分化誘導3日後に著明に増加した。また、骨芽細胞分化誘導におけるS1Pによる血管形成マーカー因子分泌量について、通常培養細胞とスフェロイド形成細胞において比較検討した。通常培養細胞では、S1Pにより血管形成マーカー因子のうち、培養7日目で、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管成長関連因子(DLL4)分泌量が有意に増加した。一方、スフェロイド形成細胞では、分化誘導3日目、S1Pにより、VEGF分泌量が著明に増加した。すなわち、通常培養細胞と比較してスフェロイド形成細胞では、分化の早期にVEGFが有意に多く分泌されることが明らかとなった。当初、骨芽細胞、歯根膜幹細胞、血管内皮細胞の上清を使用して、細胞間相互作用を検討する予定であったが、歯根膜幹細胞スフェロイドと血管内皮細胞の共培養を行うことにより、より臨床に近い状況でS1Pの作用を検討することに変更し、そのモデルを確立しているところであるが、抽出mRNAの量が少ないため、培養条件を検討中である。また、今回はこれまでに行った骨芽細胞分化マーカー発現における実験の結果を基に歯根膜幹細胞スフェロイドサンプルの採取を分化誘導3日、7日として検討したが、スフェロイド形成細胞におけるELISAの結果から、マーカー因子分泌のピークは3日目よりも早期にある可能性が考えられた。そのため、サンプル採取時期について慎重に検討する必要性がある。一方、in vivoの検討として、ラット歯根尖切除/歯槽骨欠損モデルを確立することができたが、このモデル作成に時間を費やしたため、現在の全体的な進捗状況としてはやや遅れている。in vivoの検討として、ラット歯根尖切除/歯槽骨欠損モデルを確立することができた。そこで、前年度の実験から、骨芽細胞分化マーカー遺伝子発現増加作用が大きいと考えられたS1PR2作動薬とS1P徐放性スキャホールドとの混合材を用いて、根尖周囲におけるS1Pの骨新生作用の検討を行っている。これまでに、術後3週までのサンプルからは、S1PR2作動薬による骨量、骨梁数の増加が認められ、消失した骨組織は回復傾向を示しているが、骨窩洞の修復状態、根尖部周囲のS1P受容体発現について、免疫組織染色等を行い、さらなる解析を行う必要性がある。また、歯髄組織における硬組織形成作用については、同様に実験を行い、ラット実験的露髄面を形成してS1Pの作用について検討を行う必要性がある。骨芽細胞-血管内皮細胞相互作用の解析に先立ち、S1PR1およびS1PR2受容体作動薬を投与したマウス脛骨からmRNA、血液から血清を抽出し、骨芽細胞分化マーカーならびに血管新生関連シグナルのパラクライン因子の検出をqRT-PCR法、ELISA法により行った。S1PR1作動薬により、アルカリホスファターゼ(ALP)、オステオポンチン(OPN)、骨シアロタンパク質(BSP)の発現は有意に増加した。S1PR2作動薬により、ALP、OPN、BSPに加えてオステオカルシンの発現が有意に増加した。とりわけ、S1PR2作動薬により、後期の分化マーカーや骨基質形成に関与する遺伝子発現が著明に増加した。骨芽細胞分化に重要なRunx2に関しては、両作動薬により発現が増加傾向にあった。加えて、S1PRおよびS1PR2受容体阻害薬を用いた同様の実験では、S1PR1経路はBSP、S1PR2経路はALP、OPN、BSPの発現に関与することがわかった。次年度以降、in vivoの根尖部歯周組織における骨組織形成作用を解析するうえで、これらの遺伝子に着目して実験を行う。また、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF-2)、血管成長関連因子(DLL4)発現に関して、現在解析中である。一方、骨芽細胞-血管内皮細胞相互作用の解析について、それぞれの細胞と培養上清を培養し、S1P存在下ならびに非存在下での骨分化促進・血管新生作用亢進について濃度依存性による影響を検討中であり、引き続き解析を進めていく。次年度以降のin vivoにおける実験をスムーズに進めるため、骨芽細胞-血管内皮細胞相互作用の解析に先立ち、S1PR1およびS1PR2受容体作動薬存在下、非存在下のマウス脛骨から抽出したmRNA、血清を用いて、両シグナルが関与する因子について比較検討を行った。これまでに明らかにしたin vitroの結果とは異なる因子にも関連することが明らかとなった。