hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラーレンを用いた非侵襲性ナノDDS医薬の創製と炎症性腸疾患治療への応用

本研究は、安全かつ有効な「経口投与型ナノDDS医薬」の開発を最終目標に、DDS化C60フラーレンを新規合成・創製し、炎症性腸疾患に対する有効性・安全性を精査しようとするものである。当該年度は、初年度に創製したPVPフラーレンとともに、新たに創製した水酸化フラーレンの経口投与型ナノDDS医薬としての有効性・安全性をin vivo、in vitroで評価した。まず、腸管上皮細胞を用いてin vitroで各種フラーレンの抗酸化作用・炎症性サイトカイン産生抑制作用を評価した。その結果、水酸化フラーレンは細胞傷害性を示さない濃度においても、抗酸化剤であるN-アセチルシステインと同程度の抗酸化作用を示すと共に、腫瘍壊死因子(TNF-α)刺激によって誘導される炎症性サイトカイン(1L-8)産生を顕著に抑制し、抗炎症作用を有することを明らかとした。さらに、細胞傷害性を指標に各種水酸化フラーレンの安全性を評価したところ、in vitroで抗酸化作用・抗炎症作用が認められた濃度においても、細胞傷害性は全く認められず、水酸化フラーレンは極めて安全性に優れていることが示唆された。次に、DSS誘発大腸炎モデルマウスに水酸化フラーレン(C60[OH]36、C60[OH]44)を1週間経口投与し、体重変化を観察すると共に、投与開始から1週間後に解剖し、血便率、大腸長を測定した。その結果、C60[OH]36を投与した群では、DSSによる体重減少、及び大腸の短縮が有意に抑制された。また、これまでに我々の研究室で確立した方法により水酸化フラーレン(C60[OH]36)の安全性(一般毒性・免疫毒性・遺伝毒性・生殖発生毒性)をin vivo、in vitroで評価した。その結果、C60[OH]36は、DSSモデルに対して治療効果を示す投与量においても顕著な毒性を示さず、極めて安全性が高いことを明らかとした。以上の結果より、水酸化フラーレン(C60[OH]36)は炎症性腸疾患に対する安全かつ有効な治療薬となる可能性が示された。当該年度はin vitroで有効性、安全性が見出されたPVPフラーレンの経口投与型ナノDDS医薬としての安全性・有効性を、炎症性腸疾患モデルを用いて評価した。また、新たに多数の水酸基をフラーレン骨格に導入した水酸化フラーレンを創製し、経口投与型ナノDDS医薬としての有効性・安全性をin vivo、in vitroで評価した。その結果、水酸化フラーレン、特にC_60[OH]_36はIn vitroで強力な抗酸化作用・抗炎症作用を示すと共に、炎症性腸疾患モデルマウスに対して治療効果を示し、かつ安全性にも優れていることを明らかとした。医薬品化に必須であるADMEに関する情報の収集が今後必要とされるものの、ある程度の進展はあったと評価する。当該年度は、研究計画に従い、C60フラーレンの化学修飾法を駆使し、水溶性高分子で化学修飾したDDS化C60フラーレンを創製した後、物性とともに、抗酸化作用・炎症性サイトカイン産生抑制作用などの炎症性腸疾患治療薬としての基本特性をin vitroで評価・比較した。さらに、in vitroで有効性、安全性が見出された各種DDS化C60フラーレンの経口投与型医薬としての有効性を、炎症性腸疾患モデルを用いてin vivoでの検討を進めた。具体的には、ポリエチレングリコール(PEG)やポリビニルピロリドン(PVP)などの水溶性高分子による化学修飾により、C60フラーレンの水溶性・分散性を向上させたDDS化C60フラーレン(PEGフラーレン、PVPフラーレンなど)を新規創製した。これらDDS化C60フラーレンの炎症性腸疾患治療薬としての基本特性をin vitroで評価した結果、C60フラーレンをPVPで包接したPVPフラーレンが、強い抗酸化作用を示すことを明らかとした。そこで、in vitroにおける炎症性サイトカイン産生の抑制作用を指標として、PVPフラーレンの抗炎症作用を評価した。その結果、PVPフラーレンは、抗炎症作用を有するとともに、in vitroで抗酸化作用・抗炎症作用が認められた濃度においても、細胞傷害性は全く認められず、極めて安全性に優れていることが示唆された。次に、代表的な炎症性腸疾患モデルであるデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎モデルマウスを作成し、体重推移・血便率・生存率・病理所見・生化学検査などを指標にin vivoでPVPフラーレンの治療効果を評価した。その結果、PVPフラーレンは、既に炎症性腸疾患治療薬として臨床で応用されている5-アミノサリチル酸製剤よりも顕著な治療効果を示した。さらに、in vivoにおける一般毒性を精査したところ、各種水酸化フラーレンは、治療効果が認められた投与濃度においても顕著な毒性は認められず、安全かつ有効な炎症性腸疾患治療薬となる可能性が示された。

その結果、水酸化フラーレンは細胞傷害性を示さない濃度においても、抗酸化剤であるN-アセチルシステインと同程度の抗酸化作用を示すと共に、腫瘍壊死因子(TNF-α)刺激によって誘導される炎症性サイトカイン(1L-8)産生を顕著に抑制し、抗炎症作用を有することを明らかとした。さらに、細胞傷害性を指標に各種水酸化フラーレンの安全性を評価したところ、in vitroで抗酸化作用・抗炎症作用が認められた濃度においても、細胞傷害性は全く認められず、水酸化フラーレンは極めて安全性に優れていることが示唆された。次に、DSS誘発大腸炎モデルマウスに水酸化フラーレン(C60[OH]36、C60[OH]44)を1週間経口投与し、体重変化を観察すると共に、投与開始から1週間後に解剖し、血便率、大腸長を測定した。その結果、C60[OH]36を投与した群では、DSSによる体重減少、及び大腸の短縮が有意に抑制された。また、これまでに我々の研究室で確立した方法により水酸化フラーレン(C60[OH]36)の安全性(一般毒性・免疫毒性・遺伝毒性・生殖発生毒性)をin vivo、in vitroで評価した。その結果、C60[OH]36は、DSSモデルに対して治療効果を示す投与量においても顕著な毒性を示さず、極めて安全性が高いことを明らかとした。以上の結果より、水酸化フラーレン(C60[OH]36)は炎症性腸疾患に対する安全かつ有効な治療薬となる可能性が示された。当該年度は、C60フラーレンの分散性・水溶性・抗酸化活性の改善を図り、DDS化C60フラーレン(PEGフラーレン、PVPフラーレンなど)を新規創製した。これらの炎症性腸疾患に対する有効性・安全性をin vitro、in vivoで検討した結果、特に、PVPフラーレンが、強力な抗酸化作用、抗炎症作用を併せ持ち、かつ安全性にも優れた炎症性腸疾患治療薬となる可能性を見出した。本研究成果から、本研究課題は順調に進展していると評価する。当該年度はin vitroで有効性、安全性が見出されたPVPフラーレンの経口投与型ナノDDS医薬としての安全性・有効性を、炎症性腸疾患モデルを用いて評価した。また、新たに多数の水酸基をフラーレン骨格に導入した水酸化フラーレンを創製し、経口投与型ナノDDS医薬としての有効性・安全性をin vivo、in vitroで評価した。その結果、水酸化フラーレン、特にC_60[OH]_36はIn vitroで強力な抗酸化作用・抗炎症作用を示すと共に、炎症性腸疾患モデルマウスに対して治療効果を示し、かつ安全性にも優れていることを明らかとした。医薬品化に必須であるADMEに関する情報の収集が今後必要とされるものの、ある程度の進展はあったと評価する。本年度は、より優れた炎症性腸疾患治療薬となるDDS化C60フラーレンを創製・探索するとともに、CD4+CD45RBhighT細胞移入モデル(クローン病モデルマウス)などの炎症性腸疾患モデルマウスを作成し、昨年度の検討で安全かつ有効な炎症性腸疾患治療薬となる可能性が示されたPVPフラーレンの炎症性腸疾患治療薬としての有効性・安全性評価をさらに進める予定である。さらに、医薬品化に必須であるADMEに関する情報を収集するため、腸管吸収性、細胞内・体内動態などを、透過型電子顕微鏡やICP-MSなどを用いて検討する。
心臓移植における犠牲神経最小化のための臨床解剖学的評価と提案

腹部や骨盤外科領域(消火器外科、泌尿器外科、婦人科外科)においては、術後の患者QOL向上のために、可能な限り自律神経温存術を施行してきたが、心臓外科領域においては、術式の困難さや他の優先事項などから未だに自律神経温存術は採用されていない。特に、心臓移植は絶対的に貴重なものであることから、その機会を最大限に利用したい。今後、その術式が見直されるときには、心臓自律神経系の温存術が施行されることが予想される。その際に、解剖学的基礎資料が必要になることはいうまでもなく、そのための解剖学的評価と提案を行うことが、研究の目的である。今年度は、特にヒトの心臓周囲の大血管が変異するする際に、心臓自律神経系がどのように変化するか、について詳細に解析した。その結果、従来の定説(大血管の発生学的な上下の変動に合わせ、心臓自律神経系も上下にシフトする)とは異なり、新知見(上下にシフトするのではなく、通常の心臓自律神経系の配置に加え、新たに形成や新生された血管に伴行する心臓神経路が形成される)を得て、論文としてまとめることができた(Auton. Neurol., 2007)。また、これまでヒトの機能的評価をする目的で、実験動物を利用した実験医学的研究報告が多数認めらる。しかし、実際にはこれらの実験動物からヒトへいたる過程には解剖学的な大きな差があり、これちの結果をそのままヒトへと当てはまることは難しい。そこで、本年度後半からは、これらの差を埋めるために、心臓自律神経系の進化比較解剖学的解析に着手した。その一部を論文としてまとめた(J. Morphol., 2007)。この進化比較解剖学的解析は、来年度も行っていく予定である。
ヒストン複合体から迫るクロマチン構造制御の分子基盤

申請者はヒト培養細胞において世界で初めてクロマチン形成装置をヒストン複合体として精製することに成功した(Cell,2004)。17年度においては、クロマチン形成の分子基盤と、その戦略のバリエーションについて解析する目的で、酵母をモデル系としてヒストン複合体を精製し、以下の解析を行った。出芽酵母、分裂酵母において、FLAG/HAエピトープタグを付加したヒストン遺伝子株を構築し、各種ヒストン複合体を精製することに成功した。驚いたことに、出芽酵母、分裂酵母、ヒトでヒストンH3/H4複合体の構成因子が異なることを見いだし、現在、これらの違いからクロマチン形成の共通の分子基盤と戦略のバリエーションについて、細胞周期制御やタンパク量制御に焦点を当てて機能解析を進めているところである。また、タンパク質総量としてはほとんど同じにもかかわらず、細胞抽出液から精製されるヒストンH2A-H2B量は、H3-H4に比較して10倍以上多いことが明らかとなった。さらに、出芽酵母H2A-H2B複合体にはヒストンシャペロンNap1以外にFACT(Spt16、Pob3)が含まれることが明らかとなった。FACTはもともとクロマチン転写伸長を促進する因子として同定されたが、最近ヒストンH2A-H2Bをヌクレオソームから除くことが示唆されている。抽出されるH2A-H2B量の多さとFACTとの結合は、出芽酵母における遺伝子発現量とヒストンダイナミクスの関連性を示唆するものと思われ、現在in vitro系の構築を含めて解析を進行中である。
抗胎盤性アルカリフォスファターゼ抗体を用いた転移性精巣腫瘍の診断および治療

ヒトセミノーマ移植腫瘍におけるPLAP濃度はHeLa細胞移植腫瘍より高いにもかかわらずAnti-PLAP MAbの集積性は低く腫瘍イメージングは不可能であった。そこでこれまでにCEAなどにおいて報告されているIFN投与による細胞膜抗原の発現増強効果がヒトセミノーマ移植腫瘍のPLAPにおいて誘導されうるか否かを検討した。IFN投与により腫瘍組織内PLAP濃度は約50%増加した。抗体の腫瘍集積性は増強し抗体投与11日後において腫瘍イメージの改善をみた。しかしこの際の腫瘍/血流比は1.0以下で抗体投与後早期から腫瘍イメージを捕えることは困難であり、INF投与量や投与方法に検討の余地を残した。ついでSCIDマウス精巣にHeLa細胞をinjectionすることにより精巣腫瘍およびそのリンパ節転移モデルを作製し、Anti-PLAP MAbの血行性およびリンパ行性投与における腫瘍集積性について検討した。この精巣腫瘍転移モデルでは肝、肺にヒトベータグロビンのPCR産物として検出されるmicrometastasisの存在が示された。そこでMacro-and micrometastasisに対するI-131labeledAnti-PLAP MAbを用いたRadioimmunotherapyによる抗腫瘍効果を検討した。抗体の腫瘍集積性は精巣腫瘍よりもリンパ節転移巣に高く、これは病巣の大きさおよび抗原量の相違によるものと考えられた。また抗体の腫瘍集積の絶対量は血行性投与の方が勝っていた。リンパ行性投与によるニンパ節に対する優位な抗体の集積は認められずこの転移モデルにおいては腫瘍局在診断および標的治療に際し、抗体の血行性投与の有用性が示唆された。精巣腫瘍およびリンパ節転移巣に対しては腫瘍重量においてそれぞれ57%、95%の抑制率を認めたが、組織学的に残存腫瘍が確認された。またこのモデルにおいては腫瘍細胞注入後1週目より肝、肺にPCRによって検出可能であるmicrometastaisが認められたことより、これらの病巣に対する抑制率を検討したところ、それぞれ97%、81%であった。以上の結果よりPI標識抗体を用いたRadioimmunotherapyの抗腫瘍効果が確認されたが、PCRでのみ検出されるmicrometastasisに対しても同療法の治療限界が示唆された。ヒト精巣腫瘍における胎盤性アルカリフォスファターゼ(PLAP)レベルはセミノーマ3.76±2.98IU/g(n=38)、非セミノーマ0.44±0.62IU/g(n=21)であった。一方ヌードマウス移植腫瘍内PLAP3.63±2.17IU/g(n=19),同LAP(肝性アルカリフォスファターゼ)0.24±0.15IU/g(n=19)であり、それぞれセミノーマと非セミノーマにおけるPLAPの組織内濃度に近似していることが示された。そこでI-125標識抗PLAPあるいは抗LAPモノクローナル抗体を用いて、転移性精巣腫瘍の局在診断の可能性を探る目的にそれぞれの抗体のマウス移植腫瘍に対する腫瘍集積性について検討を加えた。腫瘍組織における抗PLAP抗体の%ID/g tissueは投与後216時間まで約8%を維持したのに対し、抗LAP抗体の場合は時間とともに他の臓器と同様に減少していった。抗LAP抗体では腫瘍/血液が1を越えなかったのに対し、抗PLAP抗体においては投与48時間後より1を越え、216時間後には3.75に達した。

体外イメージングにおいては抗PLAP抗体投与後48時間より明らかな腫瘍組織への集積を認め216時間後にはほぼ腫瘍組織のみが描出された。つぎにヒトセミノーマ細胞の継代培養の試みとして血清PLAP陽性を示したセミノーマ症例のリンパ節転移巣をSCIDマウス背部に移植したところ約80%の生着率が得られた。約1カ月で1gまで増殖し2-3gまでは壊死をきたすことなく均一な腫瘍組織を得ることが可能であった。移植セミノーマ組織内PLAP,LAP濃度はそれぞれ3.74IU/g,19.2IU/gであり5代継代後においても同等の組織内濃度を維持していることが示された。I-125標識抗PLAP,抗LAPモノクローナル抗体を用いて腫瘍集積性を検討すると腫瘍組織における%ID/g tissueは抗PLAP抗体の場合は投与後216時間まで1-2%を推移するに留まった.また抗LAP抗体においては投与後24時間の6.9%より漸減し216時間後は3.5%であった.腫瘍/血液は両者とも1を越えることはなかった.体外イメージングにおいては抗LAP抗体投与後72-168時間においては腫瘍の存在が確認されたが、抗PLAP抗体による腫瘍イメージは得られなかった。マウス血清アルカリフォスファターゼ(PLAP,LAP)レベルは移殖腫瘍重量と正の相関をもって上昇し、病期の進行に伴って血清レベルの上昇をみる臨床データに相応していた。またSCIDにおける血清レベルはPLAP,LAPともヌードマウスの約5-7倍の活性を示し、循環抗原量に差があることが示された。(方法)ヒトセミノーマとHeLaあるいはヒト膀胱癌:KK-47をSCIDマウス背部に同時に移植し、Anti-PLAP MAbの集積性について検討した。またタリウムの体内分布よりこれら3腫瘍における血流の相違について検討した。Anti-PLAP MAbのF(ab′)2 fragmentのヒトセミノーマに対する集積性を検討した。SCIDマウス精巣にHela細胞をinjectionすることにより精巣腫瘍およびそのリンパ節転移モデルを作製し、Anti-PLAP MAbの血行性およびリンパ行性投与における腫瘍集積性について検討した。(結果)3腫瘍におけるPLAP濃度(IU/g)はヒトセミノーマ:14.2、HeLa:7.6、KK-47:0.7であった。抗体投与9日後のTumor/Blood Ratioはヒトセミノーマ:0.36、HeLa:2.79、KK-47:0.83であり、HeLaでは抗体投与2日目より、KK-47では抗体投与9日目で腫瘍イメージを捕えることが可能であった。腫瘍の血流比はHeLa/セミノーマ=3.7、KK-47/セミノーマ=2.2であった。ヒトセミノーマは最も高いPLAP濃度を有するにもかかわらず、Anti-PLAP MAbの集積性は最も低く、この一因として他の腫瘍に比べて血流が少ないことが示唆された。
初期地球における核酸塩基の新たな起源の解明

本研究では生命誕生前の地球で頻繁に起こっていたと考えられる隕石の海洋衝突を実験室で模擬して、その現象で生成する生命に必須の有機物、特に核酸塩基の生成を検証した。核酸塩基は生命の遺伝情報の文字となる分子で生命の誕生に不可欠であるが、その生成過程は非常に限定されていた。本研究では、一段式火薬銃を用いて隕石衝突によって引き起こされる化学反応を模擬し、生命誕生前の地球への隕石の衝突によって地球上に存在した大量の二酸化炭素を炭素源として、海洋中のアンモニアを窒素源として数種類の核酸塩基と多種のアミノ酸が生成することを示した。本研究費は生命誕生前の地球の海洋に隕石が衝突する際に起こると考えられる化学反応によってどのような有機物(特に核酸塩基)が生成するのかを明らかにする研究に使用した。隕石衝突による核酸塩基の生成を示す実験結果はこれまで報告されていないが、本研究では、隕石衝突を模擬した衝突回収実験生成物の分析を行い、シトシンとウラシルという核酸塩基の生成を世界で初めて明らかにした。これらの核酸塩基はDNAとRNAを構成しており、生命の遺伝システムには不可欠な物質である。この研究は地球惑星科学分野における主要な国際誌であるEarth and Planetary ScienceLettersに公表し、その成果は国内の主要新聞(読売、日経、朝日、毎日など)や海外のニュースサイトなどのメディアで大きく取り上げられた。さらに、本年度行った実験では主に塩化鉄、サーペンティンの影響を明らかにするための衝突回収実験を行った。この結果、塩化鉄は有機物の生成に有意な影響を及ぼさず、サーペンティンはアミノ酸やアミンの収率を大きく向上させることを示すデータを得た。サーペンティンは炭素質コンドライトに多く含まれる鉱物であり、この鉱物が衝突の際に有機物生成に貢献するということが確かめられれば、生命誕生前の地球における生命前駆物質の誕生に関して大きな影響を及ぼすと考えられる。この成果はさらに検証が必要であるので、次年度はこの検証も継続して行う。実験生成物の分析により、核酸塩基のうちの一部の生成を確認した。このことは初期地球における核酸塩基の新たな供給源を示すという本研究申請時の最も主要な目的を概ね達成したことなる。生命誕生前の地球における遺伝物質の起源は明らかになっていない。本研究では当時の地球で頻繁に起こっていた隕石や小惑星の海洋への衝突によって核酸塩基が生成するのかどうか、その場合は、どのような要素が核酸塩基の収率や生成種に影響を与えるのかを明らかにすることを目的としている。現在までの研究において、最大の目的である隕石衝突による核酸塩基(シトシン、ウラシル)の生成に関して実証し、Earth and Planetary Science Letters誌に論文を公表した。この成果は主要新聞などに取り上げられるなど、多くの反響を得た。また、研究代表者は本研究の成果を含む一連の成果により文部科学大臣若手科学者賞を受賞した。昨年度はどのような条件で核酸塩基の生成量が変化し、多種多量の核酸塩基が生成するのかを明らかにするための実験を行ない、海洋がある程度のアンモニアを含む場合は、最大3種類のDNAとRNAを構成する核酸塩基、1種類の含窒素塩基が生成し得ることが明らかした。今年度は、隕石模擬物質の組成を変えて実験を行い、鉱物組み合わせが生成物の量と種類に及ぼす影響を定量的に明らかにする。また、平行して進めているガラスラインを用いたガス循環型の衝突蒸気雲模擬実験においても、アンモニアを含まない出発試料からアミノ酸の生成を確認している。これまでの成果について、国際学会で発表を行う。7月にアメリカのサンディエゴで行われる生命の起源に関する国際学会において招待講演を行うことになっており、本研究成果を発表する。さらに、研究成果を論文にまとめ、国際誌に投稿する。現在までに本研究テーマの中で最大の目的である隕石衝突による核酸塩基の生成に関して実証し、論文を公表した。また、核酸塩基と同時に分析している生成物中のアミノ酸に関しては、アンモニアのような還元的な窒素源を全く含まなく窒素ガスを窒素源とする実験で、アミノ酸の生成を確認した。これらの成果は初期地球における生命構成物質の起源を大きく広げるもので、今後、さらに実験を重ねて国際誌に公表すると共に、一般にも情報発信を行う。最終年度の今年度はこれまでの実験条件の追試とデータの補強を行うために、衝突実験と固相気相熱反応実験を行い、生成物中のアミノ酸、核酸塩基、アミン、糖などの分析を行った。これまでの実験によって、初期地球の海洋中のアンモニア濃度が非常に高い場合に大気や海洋中の二酸化炭素を炭素源として多種のアミノ酸や核酸塩基が生成することが明らかになった。中には、生命に使われないアミノ酸や核酸塩基様物質の生成も明らかになった。海洋中のアンモニア濃度が冥王代の海洋で期待される程度に低い場合でも、最低でも生命を構成するアミノ酸のうち最も単純なグリシンが生成することを明らかにした。この場合、核酸塩基の生成が起こる可能性はあるが、その収率は低いことも判明した。さらに、生成物の中には糖の原料となるホルムアルデヒドが含まれることも明らかになった。

このことは初期地球における糖の原材料の新たな生成源をしめす結果となった。リボースなどの糖は核酸塩基と結合して核酸を生成する原料となり、生命の起源において非常に重要な物質であるが、これまでは主に光化学反応で生成するものと考えられていた。以上の様なこれまでに得られた成果について国際生命の起源学会、NASAアストロバイオロジー会議や生命の起源に関するゴードン会議で招待講演を行った。さらに、国内の学会での招待講演や市民講演会における講演で研究成果の発信を行った。研究成果は2本目の論文としてまとめ、投稿予定である。本研究では生命誕生前の地球で頻繁に起こっていたと考えられる隕石の海洋衝突を実験室で模擬して、その現象で生成する生命に必須の有機物、特に核酸塩基の生成を検証した。核酸塩基は生命の遺伝情報の文字となる分子で生命の誕生に不可欠であるが、その生成過程は非常に限定されていた。本研究では、一段式火薬銃を用いて隕石衝突によって引き起こされる化学反応を模擬し、生命誕生前の地球への隕石の衝突によって地球上に存在した大量の二酸化炭素を炭素源として、海洋中のアンモニアを窒素源として数種類の核酸塩基と多種のアミノ酸が生成することを示した。今後の研究では、今年度に取得したデータでその影響が示唆されたサーペンティンの影響を明らかにする実験、およびその他の隕石構成鉱物や初期地球に存在する鉱物の影響について衝突回収実験を行って評価する。これにより核酸塩基の生成に影響を及ぼす鉱物や条件を明らかにすることを目指す。現在までの研究で、海洋中のアンモニア濃度が高い場合、これまでにない量と種類の核酸塩基が生成することを明らかにし、逆に、海洋中のアンモニア濃度が低い場合でも、単純なアミノ酸が生成することを明らかにした。今年度は、隕石模擬物質の組成を変えて実験を行い、鉱物組み合わせが生成物に及ぼす影響を定量的に明らかにする。具体的には還元的な隕鉄を模擬した組成はこれまでの実験で行ってきたので、より現実的で隕鉄より酸化的な普通コンドライト組成の出発試料(珪酸塩を含む試料)、さらに酸化的な炭素質コンドライト組成の出発試料について実験を行う。また、平行して進めているガス循環ラインを用いた衝突蒸気雲模擬実験においても、アンモニアを含まない出発試料からアミノ酸の生成を確認している。これまでの成果について、国際学会で発表を行う。7月にアメリカのサンディエゴで行われる生命の起源に関する国際学会において招待講演を行うことになっており、本研究成果を発表する。さらに、研究成果を論文にまとめ、国際誌に投稿する。29年度が最終年度であるため、記入しない。地球化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
食道・胃接合部の内腔で発生する一酸化窒素による周囲組織細胞間結合装置の障害

食道・胃接合部で発生する癌は、欧米を中心に急速に増加しており、食生活の欧米化などに伴い、今後、本邦でもその増加が危惧されている。私は、これまでヒトの食道・胃接合部で限局性に発生する一酸化窒素(NO)が同部の炎症・発がんと関連しているという仮説をたて研究を進めてきた。今回のラットの動物モデルを用いた研究で、NOが食道・胃接合部の粘膜表面に傷害を及ぼすことを明らかにされ、今後、発がんとの関連に関しての検討が期待される。今年度はまずex vivoのUssing chamberを用いたモデルによる実験を行い、酸性条件下、亜硝酸塩より発生させた活性酸化窒素種(RNOS)により、ラット胃粘膜がどのような傷害を受けるか検討し、実際のヒト食道胃接合部の粘膜傷害に関連付けことを目的とした。食道胃接合部内腔およびその周囲粘膜の微小環境を再現するため、ラットの胃粘膜のみを摘出し、管腔側と基底側で別々の溶液を還流させるUssing chamberモデルを用いた。管腔側の溶液には、pH2.5の酸性条件下で生理的範囲内の濃度の亜硝酸ナトリウム(NaNO_2)を加えRNOSを発生させて曝露した。粘膜のバリア機構の評価に関しては、電気生理学的な粘膜抵抗の測定、^3Hで標識したマンニトールの管腔側から基底側への透過速度の測定、さらに粘膜表層上皮細胞間でバリア機構を形成するtight junctionの傷害をみるため、tight junction関連蛋白であるoccludinの免疫染色およびWestern blotを行った。実際に粘膜内にNOをはじめとしたRNOSが拡散しているか確認するために、RNOSと組織中蛋白との反応生成物であるDNIC(Dinitrosyl dithiolato iron complex)を低温下でEPR法(electron paramagnetic resonance spectroscopy)を用いて測定することで検討した。Ussing chamberにて粘膜側にRNOSを曝露した結果、粘膜抵抗の低下および粘膜透過性の亢進、さらに免疫染色とWestern blotでtight junction関連蛋白であるoccludinの発現低下を認めた。また発生したRNOSの粘膜内への拡散を組織中DNICを低温EPR法で検出することにより確認した。ヒト食道胃接合部内腔およびその周囲粘膜の微小環境を再現したこのラットにおける検討において、食道胃接合部内腔で発生したRNOSがその周囲粘膜のtight junctionを傷害し、それによって粘膜防御機構を低下させることが示された。RNOSの化学修飾作用によるストレスが、ヒト食道胃接合部における重要な傷害因子となることが示唆された。前年までのラットの胃を用いたex vivoの実験結果から食道・胃接合部内腔で発生した一酸化窒素(NO)は周囲組織に拡散し、粘膜上皮の細胞間結合装置を障害することが示された。さらに、in vivoでの効果を確認するために、ラットの胃内に生理的濃度の亜硝酸塩を投与し、胃酸とアスコルビン酸の存在で化学的に胃内にNOを発生させるモデルを作成し、このモデルにおいても、NO暴露によって周囲組織細胞間結合装置の障害されることが明らかなった。通常、食道・胃接合部内腔で発生するNOは、胃酸が食道内に逆流する状態(胃・食道逆流症)では、その発生部位が下部食道に移動する。よって、NO暴露による食道扁平上皮に対する影響も検討する必要がある。そこで逆流性食道炎の食道障害に対する外因性NO持続暴露による影響をラット逆流性食道炎モデルを用いて検討した。確立されたラット逆流性食道塩モデルに対して、0.1%の亜硝酸ナトリウム、1%アスコルビン酸の同時投与を行う。このモデルでは胃酸逆流の有る状態で、同時投与した亜硝酸ナトリウム、アスコルビン酸が下部食道内腔の酸性条件下で速やかに反応し高濃度のNOを生じることになる。両剤の同時投与によって食道障害は非投与時と比較し4、5倍に増加した。この食道の障害はスーパーオキサイド消去剤の投与により抑制され、外因性NO暴露による食道障害の増悪にはスーパーオキサイドが関与していることが示唆された。よって、食道内腔で発生したNOはスーパーオキサイドが豊富に存在する食道の炎症組織に拡散することにより、細胞毒性の強いパーオキシナイトライトを生成し、食道障害を増悪させる可能性が考えられた。
無機的環境下における真菌類の単体硫黄酸化と化学合成によるエネルギー生成

真菌類は有機物を利用する従属栄養性の微生物と考えられてきたが、独立栄養的な生育も数多くの真菌株に見つかっている。これらは有機物の存在しない条件においても硫黄を酸化し、大気微量成分であるCOSを加水分解することができる。内生細菌を除去したをFusarium solani THIF01株およびF. solaniNBRC9425について、硫黄を含む無機塩培地での生育を確認した。土壌環境が大気中のCOSの主要な消失源であることから、土壌に広く生息する真菌としてTrichoderma sp. THIF08を用いてCOS分解酵素の精製を行った。以上の結果、真菌の新たな硫黄代謝の重要性が明らかとなった。真菌類において、硫黄をエネルギー源とする無機環境での生育を明らかにすることを目的に、分与を受けた7株の真菌類の中から、内生細菌が確認されず、しかも最も高い硫黄酸化活性を示したFusarium solani p.sf. pisiNBRC9425を供試菌として研究を行った。本菌を硫黄をエネルギー源とする条件下で培養し、糸状細胞の増殖を中心とする生理学的特性の解明、硫黄酸化反応に関連する酵素系の探索に用いる菌体を調製するための培養条件などを検討した結果貴重な情報が得られた。本菌は硫黄を唯一のエネルギー源とする無機栄養培地(WS-5培地)において、培養開始30日目では0.1 mMの硫酸イオンが、また菌体量の指標としたエルゴステロール量は14 mg/Lにまで増加することを確認した。DAPI染色後の培養液を蛍光顕微鏡で観察すると、単体硫黄の粒子表面は菌糸によって覆われており、従属栄養条件に比較するとその生育は格段に低いが、無機栄養性細菌での生育にほぼ匹敵する増殖が得られることが確認された。チオ硫酸塩を単体硫黄と共に添加することで生育は約3倍に、硫酸イオンの生成量は約2.3倍に増加し、チオ硫酸塩には生育促進効果のあることが明らかとなった。菌体量の増加を目的に有機物を添加した結果、酵母エキスは40 mg/Lの濃度であれば菌体量の増加とチオ硫酸イオンおよび硫酸イオンの増加が見られ、グルコース、マルトース、ポテトエキスではチオ硫酸イオンの生成は大きく低下した。Trichoderma属の真菌には単体硫黄を代謝することが知られており、無機硫黄化合物である硫化カルボニルも分解することから、硫化カルボニル代謝と単体硫黄代謝の関連が期待される。そこで、並行して分解機構を調べるために保存菌株の中から高い分解活性を示すTHIF20株を選抜した。使用菌株の硫黄培地での生育については順調に成果を得ることができている。しかし、培養に用いてきた単体硫黄を新たに同一の試薬会社から購入したところ、バッチの違いが真菌の生育に微妙に影響を及ぼす可能性が明らかとなり、現在複数の試薬メーカに問い合わせ中である。必要な種類の試薬が整い次第、菌株に対する単体硫黄の試薬ごとの影響について確認の調査を行った上で、今後安定的に入手可能な硫黄を確定し培養計画を立てる。万一これまでと同等レベルの単体硫黄が入手不可となった場合は、他の菌株の使用も視野に入れた実験ができるように準備をすることにする。硫黄酸化に関わる酵素の同定に関しては、本菌の細胞破砕液からイオン交換や疎水性カラムなどを用いた分画を試みたが、これまでのところ充分な活性画分を得ることに繋がっていない。そこで硫黄の有無によって調製した培養菌体について、出現するタンパク質の違いをもとに硫黄酸化反応に関与する酵素タンパク質を得ることを目指して、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ないその泳動パターンを比較している。2次元電気泳動についてはこれまで2回試みたが、共存する物質の影響で高品質の画像が得られていない。当研究室ではこれまで細菌を中心とした研究がほとんであったために、真菌細胞を用いた生化学的研究の経験が少ない。今後情報を広く収集し電気泳動にかける試料調製法にさらに工夫を加えることで、スポット解析の可能なまでの結果が得られるようにしたいと考えている。ターゲットとなるタンパク質の確定後は、常法に則りクローニング、組み換えタンパク質の大量発現、その後の生化学的解析などの作業を進める計画である。従来、真菌類は従属栄養性とされていたが、単体硫黄を基質とする化学合成的な生育やC1- S化合物である硫化カルボニル(COS)の分解を複数の真菌株において我々は明らかにしてきた。昨年度に引き続き、単体硫黄存在下での生育の詳細はFusarium solani NBRC 9425株を用いた。培養は通常の化学合成独立栄養細菌の培地調製法に則り行っているが、オートクレーブなどの操作により懸念される夾雑物の影響を排除する場合は別のガラス容器内に培養容器を密閉後、滅菌を行った。単体硫黄の種類により硫黄酸化に差が見られたため、培養には硫黄(和光純薬)を使用した。共存する有機化合物の硫黄酸化活性への影響を確認するために、昨年度は酵母エキスを用いて最大の活性を得られる濃度を調べたところ15 mg/Lが最大であり、40 mg/Lまではその8386%の活性を維持していた。

一方、下限濃度に関しては、0.01及び0.1 mg/Lの濃度では対照と同程度の硫酸イオン生成が、1及び10 mg/Lでは促進が見られ、極めて低濃度の有機物によって硫黄酸化に対する促進効果があるものの、全く添加していない場合でも硫酸イオン生成が見られ、有機物を含まない培養条件において完全な硫黄酸化系が進行していることを確認することができた。硫黄あるいは有機物を生育基質とする細胞のタンパク質について二次元電気泳動を行い、分子量50-90 kDaの範囲のタンパク質に硫黄によって誘導される複数の顕著なスポットを確認した。今後これらのタンパク質について解析を実施する。COSの分解についてはTrichoderma sp. THIF20株について酵素精製を進め、10残基のN末端アミノ酸を決定した。今後はこの情報をもとに遺伝子のクローニング、大腸菌での発現を試みると共に、単体硫黄酸化系との関連について検討を進める。真菌類は有機物を利用する従属栄養性の微生物と考えられてきたが、独立栄養的な生育も数多くの真菌株に見つかっている。これらは有機物の存在しない条件においても硫黄を酸化し、大気微量成分であるCOSを加水分解することができる。内生細菌を除去したをFusarium solani THIF01株およびF. solaniNBRC9425について、硫黄を含む無機塩培地での生育を確認した。土壌環境が大気中のCOSの主要な消失源であることから、土壌に広く生息する真菌としてTrichoderma sp. THIF08を用いてCOS分解酵素の精製を行った。以上の結果、真菌の新たな硫黄代謝の重要性が明らかとなった。Fusarium solani p.sf. pisiNBRC9425による硫黄の初発酸化反応については、ATP生成が実際に進行しているのかどうかを発光法によって明らかにする計画である。関連する酵素タンパク質の同定については、現在までのところ、真菌細胞からの夾雑物の除去が不十分なためPDQusetに耐える品質の2次元電気泳動の結果がまだ得られていない。今後もその作業を継続して前処理の工夫を引き続き行い、関与が予想されるタンパク質の決定にまで結びつけたいと考えている。その後、切り出したタンパク質については質量分析計による構造解析などの解析を進め、クローニングまで行うことが出来たものについては大量発現酵素を用いた酵素学的性状についても調査する。組換えタンパク質の大量発現には申請書の段階ではEscherichia coliを予定していたが、DNAの起源が真核生物であることを考慮してSaccharomyces cerevisiaeに変更する可能性もある。Trichoderma属の真菌にはFusarium solaniと同様に硫黄を利用するものがあることが知られ、更に硫化カルボニルも分解することから、両硫黄化合物の代謝におけるネットワークの存在の可能性が出てきた。そこで、両者の分解機構を並行して調査するために、当研究室で保存している分離菌株の中から高い分解活性を示すTHIF20株を選び、硫黄代謝についても調べることとする。これらを総合しつつ、真菌類における硫黄酸化、特に単体硫黄の酸化とその周辺反応について解析を進める計画である。環境微生物学
種々の網膜疾患およびぶどう膜疾患におけるSlope ERGの有用性

近畿大学医学部眼科外来を受診した糖尿病網膜症を発症していない糖尿病患者6例6腹に対し、インフォームド・コンセントを得たうえでslope ERGを記録した。また他のあらゆる眼底病変のない症例に限定して検討を行った。ERG電極は白色LEDを内蔵した双極型電極を使用し、slope光刺激を作成する光刺激装置は今まで使用したものを用いた。披検眼はミドリン^【○!R】P点眼液にて瞳孔径を7mm以上に散瞳し、ベノキシール^【○!R】点眼液にて角膜表面麻酔を行った。角膜保護のため、スコピゾル^【○!R】を電極の角膜面に滴下してから披検眼に装着した。接地電極として脳波記録用皿電極を検眼側の耳朶に装着した。背景光輝度は17cd・m^<-2>に、刺激光の最大強度は1.9cd・m^<-2>・secに設定し、ERGの増幅および加算にはNeuropack Σ(日本光電社製)を使用した。記録したERG波形はlow-cut filter 0.5Hz、high-cut filter1kHzで処理し、数回加算平均した。Slope光刺激の点灯に要する時間(up-slope時間)を短いものから順次変化させ、それにより得られるERGのON応答について検討した。ERGのON応答の波形に含まれるa波および律動様小波O1、O2について頂点潜時の計測を行った。結果は6症例のうち、2例においてup slope時間を68.1msecに設定したときに,頂点潜時が正常群の平均値±標準偏差の範囲を上回る値を得た。この2例で矩形波光で記録したERGを記録した場合、頂点潜時は正常群の平均値±標準偏差の範囲内であった。以上の結果は、slope ERGが、検眼鏡的には明らかでない微細な糖尿病性変化を検出しうる可能性があることを示す所見であると思われる。ひいてはslope ERGの記録が、網膜病変を詳細に解析する上で新しい方法であると言うことが出来ると考える。
天敵の利用を中心としたわが国と東南アジアにおける蔬菜害虫の総合的害虫管理

わが国の蔬菜害虫防除は世界で最も化学農薬に依存しており、化学農薬による環境汚染や食品への残留、野生生物の減少などが大きな問題となっている。化学農薬の使用量を減らし、環境に優しい持続可能な農業を目指すことが、日本農業における大きな課題である。一方、経済成長が著しい東南アジア諸国では、大規模蔬菜栽培地帯での化学農薬多用に拍車がかかっており、その弊害は日本以上に悲惨な状態にある。このような現状を改善するためには、生物的防除を基盤にした総合的害虫管理(IPM)技術の確立が重要である。そこで、日本と東南アジアで共通に問題となっているアザミウマ類やハモグリバエ類、コナガなどを対象害虫として選び研究を行った。まず日本では、ナスのIPMを対象として、土着天敵の保護利用法と天敵の放飼増強法に関する研究を行い、さらに、天敵の大量増殖に関する研究も行った。一方、東南アジアにおいては、まず、蔬菜害虫防除の現況について予備調査を行い、日本では使用禁止になっている農薬も含め、雑多な農薬が無秩序に散布されている現状を明らかにした。しかし、農薬散布がほとんど行われてない小規模な家庭菜園では各種の天敵が活発に活動しており、これらの天敵活用を中心にしたIPMが重要であると考えられた。また、日本に比べ蔬菜害虫の天敵相は質・量ともに勝っていた。しかし、土着天敵に関する情報については、そのインベントリー作成さえも不十分であった。そこで、ベトナムにおけるハモグリバエ類の寄生蜂を対象として選び、作物と害虫と天敵との相互関係に関する調査を行った。これらの研究成果は、わが国と東南アジアにおける蔬菜害虫IPM技術確立に大きく寄与するものと思われる。また、今回の研究を通じて、生物的防除を基礎とした、日本および東南アジアにおけるIPM研究国際共同体制の構築が重要であることが明らかになった。東南アジアにおける蔬菜の総合的害虫管理に関する研究として、今年度は、タイとベトナムで予備調査を行った。ベトナムではまず、ホーチミン市近郊の野菜栽培地帯で、ハモグリバエ類の天敵昆虫を採集した。また、ベトナムの高原野菜産地ダラットでは、キャベツ畑で大量の化学農薬が散布されており、リサージェンスでコナガやキスジノミハムシが多発しているのを確認した。さらに、ハノイ近郊で天敵微生物の採集を行った。一方タイでは、バンコク近郊の野菜栽培地帯で大量の化学農薬が散布されているのを確認した。また、リサージエンスでハモグリバエが多発しているのも確認した。また、カセサート大学のカンパンサンキャンパス周辺の農薬無散布ナス圃場でナスに特異的に生息するヒメジンガサハナカメムシがアザミウマだけでなくアブラムシやコナジラミの天敵としても活躍しているのを観察した。また、チェンマイ郊外のマエジョウ大学の農場にある無農薬野菜圃場で、ハモグリバエ類の天敵昆虫を多数採集した。さらに、チェンマイ近郊のキャベツ畑を巡回し、コナガの天敵昆虫も採集した。これらの天敵類の同定は現在進行中である。なお、両国で使われている農薬の種類としては、日本では未登録であったり、登録が取り消されたものも含まれることも確認した。これらの情報を元に、平成16年度に予定している本調査の研究計画を立てた。一方、わが国における蔬菜の総合的害虫管理に関する研究としては、福岡の施設ナスでタイリクヒメハナカメムシを用いたアザミウマの生物的防除を中心にした総合的害虫管理システムを確立し、その実証試験を行った。

また、エンドウに発生するナモグリバエを利用した土着寄生蜂自然増殖システムを確立し、それを用いたハモグリバエの生物的防除の実用化試験を宮崎の施設ナスで行った。さらに、化学農薬の天敵昆虫に対する非致死的影響に関する研究も開始した。東南アジアにおける蔬菜の総合的害虫管理に関する研究として、今年度は、ベトナムでハモグリバエ類とその天敵に関する調査を行った。特に、中部ベトナムのフエ近郊での調査に重点を置き、ネギハモグリバエとその寄生蜂の野外調査を行い、露地ネギを通年栽培している農家において、化学農薬多用によるリサーゼンスの現状を明らかにした。これと同時に、ハノイ農業大学(北部)とフエ大学(中部)、ノンラム大学(南部)の研究補助者を組織化し、蔬菜加害性ハモグリバエ類とその天敵類をベトナム全土から収集する体制を構築し、それによって得られた標本の同定作業を開始した。また、タイのカセサート大学カンパンサンキャンパス周辺の農薬無散布ナス圃場で、ナスに特異的に生息するヒメジンガサハナカメムシの分布が、アザミウマでなくむしろハダニの密度に依存しているのを明らかにし、多食性捕食者が複数種の害虫の密度抑制に寄与している実態を明らかにした。一方、わが国における蔬菜の総合的害虫管理に関する研究としては、昨年に引き続き、福岡の施設ナスでタイリクヒメハナカメムシを用いたアザミウマの生物的防除防除を中心にした総合的害虫管理システムを確立し、その実証試験を行った。今年度は特に、害虫と天敵の空間分布構造明らかにした。また、宮崎県では、エンドウに発生するナモグリバエを利用した土着寄生蜂自然増殖システムを確立し、それを用いたハモグリバエの生物的防除の実用化試験を行った。さらに、高知県において、土着天敵を利用した蔬菜害虫の総合的害虫管理に関する研究を行った。これらの野外研究とは別に、数種化学農薬がタイリクヒメハナカメムシとハモグリミドリヒメコバチに及ぼす非致死的影響に関する研究を行い、天敵に優しいとされている化学農薬でも、天敵に対して、色々、異なった形で、何らかの影響を与えることを明らかにした。東南アジアにおける蔬菜の総合的害虫管理に関する研究として、昨年度に引き続き、ベトナムで蔬菜加害性ハモグリバエ類とその天敵に関する調査を行った。その結果、同じ中部ベトナムでもハイバイ峠の北側のフエと南側のカンナンでは気候が異なり、害虫の発生パターンも異なることを明らかにした。また、昨年組織化した、ハノイ農業大学(北部)とフエ大学(中部)、ノンラム大学(南部)の研究補助者に依頼して採集してもらったハモグリバエ類とその天敵の標本を整理して、蔬菜加害性ハモグリバエ類とその寄生蜂のインベントリーを作成した。また、タイのカセサート大学カンパンサンキャンパス周辺の農薬無散布ナス圃場で、ナスに特異的に生息するヒメジンガサハナカメムシが、アザミウマでなくむしろハダニを好んで捕食することを実験的に明らかにした。なお、ベトナムとタイでの現地調査の際に、蔬菜栽培地帯で実際に使用されている化学農薬の種類について情報を収集し、欧米や日本、さらには中国から輸入された雑多な化学農薬が無秩序に散布されている実態を明らかにした。次に、わが国における蔬菜の総合的害虫管理に関する研究としては、九州大学では、コナガの寄生蜂の大量増殖システムを確立するために、高品質のコナガを容易に大量増殖できる人工飼料の作成に成功した。
Crkを介する癌遺伝子産物と癌抑制遺伝子産物のクロストーク

昨年度、Crk癌遺伝子産物の活性化をモニターするために、Crkのリン酸化を生細胞でみるためのプローブを作成し、Crk蛋白の上皮細胞増殖因子依存性のリン酸化を解析した。その結果、上皮細胞増殖因子の細胞膜での刺激が、リン酸化されたCrkにより速やかに細胞内を伝播していく様子を画像化できた。しかし、このプローブにおいてはプローブの細胞内での拡散が非常に早いために、細胞内のどこでCrkのリン酸化が始まっているかが解析できなかった。そこで、このプローブにK-Ras蛋白のCAAXドメインを融合させ、このプローブが細胞膜のみに局在するようにした。この改良型プローブを用いることにより、上皮細胞増殖因子の刺激が、辺縁部の細胞膜においてCrkのリン酸化を誘導する様子を画像化することができた。さらに、このプローブを用いてCrk癌遺伝子産物の活性化状態をより、広範囲の細胞で画像化するために、このプローブの遺伝子をコードする組替えアデノウイルスを作成した。このウイルスを用いることにより、ヒト、サル、げっ歯類のさまざまな培養細胞を用いてCrkのリン酸化を可視化することに成功した。また、HeCdレーザーを装備したEvanescent field顕微鏡を用いることにより、細胞の接着斑においてCrkがリン酸化する様子も可視化できた。以上の結果は、Crkのリン酸化が細胞の増殖や細胞運動において時間的、空間的に制御されていることを示すものである。今後、この系をもちいて、さまざまな細胞事象におけるCrk癌遺伝子産物の役割が明らかにされていくものと期待される。本年度は、Crk癌遺伝子産物に結合するもっとも量的に多い分子であるC3Gが、Crkによりどのように活性化されるかについて検討を加えた。C3Gは癌化を抑制する低分子量GTP結合蛋白Rap1の活性化因子である。Crkを加えるとC3GのRap1活性化能が著しく亢進することを見出した。CrkにはSH2およびSH3ドメインがあるが、この両方のドメインが機能することがC3Gの活性化には必要であった。SH2ドメインの機能を欠損させた変異体に細胞膜移行シグナルを付加したところ、CrkによるC3Gの活性化能が一部復活した。SH3はCrkがC3Gに結合するために必要なので、CrkがC3Gを活性化するのはC3Gを細胞膜近傍に移行させるためであるという結論を得た。しかし、膜移行シグナルをつけたC3Gも、Crkと共発現するとさらに活性化されることを見出した。そこで、C3Gが細胞膜において何らかの修飾を受けるのではないかと考え、解析したところ、C3Gがチロシンリン酸化を受けていることを見出した。そこで、さまざまなC3Gの欠失変異体を作ったところ、C3Gのほぼ中央の領域にC3Gのチロシンリン酸化部位を見出した。さらに、C3Gのアミノ末端側を欠失したところC3GのRap1活性化能が著名に亢進した。これは、C3Gのアミノ末端側に活性を負に制御する領域があり、これがチロシンのリン酸化により解除されるというモデルを提供するものである。RasファミリーG蛋白の活性化機構を探るために、Rap1近縁の蛋白であるRap2の機能解析を行った。1.Rap2は、これまでに知られているRasファミリーG蛋白とは異なり、定常状態でもGTP型が50%を超えていることがわかった。2.Rap2のGTP型が50%を超えている機構を解析するために、グアニンヌクレオチド交換因子およびGTP水解促進酵素との感受性を解析した。Rap2はほとんどすべてのRap1グアニンヌクレオチド交換因子により活性化され、その程度に大きな差は認められない。3.Rap2はRap1のGTP水解促進酵素により活性化されるが、その程度は著しく低い。すなわち、GTP水解促進酵素に対する感受性の低さがRap2の高いGTP/GDP比をもたらしている。

4.Rap2のGTP/GDPが減少する条件を調べた。その結果、Src、Crk、Rasなどで癌化した3Y1細胞ではGTP結合型のRap2が著しく減少していることがわかった。この細胞にRap2を過剰発現すると、癌化を抑制することがわかった。5.Rap2による癌化抑制機構を調べた。Rap2はRap1同様に、Ras依存性のMAPキナーゼ活性化を抑制していた。しかし、Raf依存性のMAPキナーゼ活性化は抑制しなかった。すなわち、Rap2はRas依存性のMAPキナーゼ活性化を抑制することにより癌化を抑制するらしい。6.Rap2の細胞内局在を調べた。免疫電子顕微鏡法ならびに免疫組織染色法によりRap2の細胞内局在を解析した。その結果、Rap2は約半分が細胞膜に、残りが、細胞内の膜画分に存在することがわかった。Crk癌遺伝子産物の活性化をモニターするために、Crkのリン酸化を生細胞でみるためのプローブを作成した。これは、Crk蛋白の両側にGreen fluorescent proteinの変異体であるEYFPとECFPとを結合させたもので、この蛋白では、Crkのリン酸化に応じてECFPからEYFPへのfluorescent resonance energy transfer(FRET)がおきて、430nmの波長で励起した際の530nmの励起光の変化が捉えられるものである。このプローブを用いて、Crk蛋白の上皮細胞増殖因子依存性のリン酸化を解析した。その結果、Crkは上皮細胞増殖因子による刺激で速やかにリン酸化をうけることがわかった。しかし、細胞内でほぼ均一にリン酸化が入るので、その原因を探った。そのために、EYFPに結合したCrk蛋白を細胞で発現させ、530nmの強い励起光を照射し、細胞質内の一部のCrk蛋白のみを褪色させた。しかし、励起光照射後、数秒以内に褪色したスポットが見えなくなってしまうことから、Crkは非常に速やかに細胞質内を動いており、上皮細胞増殖因子の刺激が局在化した活性化を見せないのはCrkの拡散によるものであることがわかった。以上のことより、上皮細胞増殖因子の細胞膜での刺激は、リン酸化されたCrkにより速やかに細胞内を伝播していく可能性が示唆された。また、このような単一蛋白の構造を生細胞でモニターする系ははじめてであり、今後の発展が期待される。昨年度、Crk癌遺伝子産物の活性化をモニターするために、Crkのリン酸化を生細胞でみるためのプローブを作成し、Crk蛋白の上皮細胞増殖因子依存性のリン酸化を解析した。その結果、上皮細胞増殖因子の細胞膜での刺激が、リン酸化されたCrkにより速やかに細胞内を伝播していく様子を画像化できた。しかし、このプローブにおいてはプローブの細胞内での拡散が非常に早いために、細胞内のどこでCrkのリン酸化が始まっているかが解析できなかった。そこで、このプローブにK-Ras蛋白のCAAXドメインを融合させ、このプローブが細胞膜のみに局在するようにした。この改良型プローブを用いることにより、上皮細胞増殖因子の刺激が、辺縁部の細胞膜においてCrkのリン酸化を誘導する様子を画像化することができた。さらに、このプローブを用いてCrk癌遺伝子産物の活性化状態をより、広範囲の細胞で画像化するために、このプローブの遺伝子をコードする