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国際レジストリ連携(iCRN)の臨床的意義と医療機関における課題に関する研究

本研究課題は、人間医工学におけるレギュラトリーサイエンスとして、アンメット・メディカル・ニーズに対するリアル・ワールド・エビデンス(RWE)という新概念への対応の中で、最重要項目の1つである国際レジストリ連携の臨床的意義に着目し、医療機関における課題について検討するものである。初年度は現状調査、次年度はProof of Concept計画、3年目以降は具体的なレジストリ連携を予定している。初年度の研究実績の概要は、先行研究(基盤研究C#25350585)で構築された国際医療機器レジストリ連携の応用として、国内外の現状調査を行った。まず国際規制調和と戦略的レジストリ連携の定義・方法論について、Art Sedrakyan博士(米国コーネル大学、1月に来日)、Danica Marinac-Dabic博士(米国FDA、10月にMDEpiNet年次集会で会合)と研究打ち合わせを行い、Proof-of-conceptの計画について貴重な助言を得ることができた。次にアンメット・メディカル・ニーズの現状とレジストリへの期待について、米国臨床腫瘍学会(ASCO2018)および国際腫瘍循環器サミット(GCOS2018)においてBonny Ky博士(米国ペンシルベニア大学)、Thomas Suter博士(スイス・ベルン大学、日本心不全学会で来日)、Ana Barac博士(米国心臓病学会、日本腫瘍循環器学会で来日)、Javid Moslehi博士(米国バンダービルト大学、日本循環器学会で来日)らと研究打ち合わせを実施し、日本臨床腫瘍学会、日本心臓病学会、レギュラトリーサイエンス学会、日本薬理学会、安全性薬理研究会を含む国内のシンポジウム等において国内のオピニオンリーダーと意見交換を行った。今後、医療機関における課題を検討し、具体的なレジストリ連携へと研究を発展させる予定である。本研究計画では、初年度は現状調査、次年度はProof of Concept計画、3年目以降は具体的なレジストリ連携を予定している。初年度の研究実績の概要は、先行研究(基盤研究C#25350585)で構築された国際医療機器レジストリ連携の応用として国内外の現状調査を行ったが、海外のキーパーソンが相次いで来日されたことを生かして国内のオピニオンリーダーとの情報共有が進み、2年目のProof of Concept計画を一部前倒しで進めることができた。まず国際規制調和と戦略的レジストリ連携の定義・方法論についてはArt Sedrakyan博士(米国コーネル大学)が2019年1月に来日されたことを契機に医療機器レジストリの連携(MDEpiNet-J)および並立する概念である患者レジストリ/手技レジストリの連携(IDEAL-J)について、2年目以降更に発展させる方向で意見交換ができた。また、アンメット・メディカル・ニーズの現状とレジストリへの期待について、Thomas Suter博士(スイス・ベルン大学)が日本心不全学会で来日、Ana Barac博士(米国心臓病学会)が日本腫瘍循環器学会で来日、Javid Moslehi博士(米国バンダービルト大学)が日本循環器学会で来日されたことを契機に、腫瘍循環器(Cardio-Oncology/Onco-Cardiology)という学際領域における医療の進歩とエビデンスの不足について意見交換を実施し、上記各学会に加え、日本臨床腫瘍学会、日本心臓病学会、レギュラトリーサイエンス学会、日本薬理学会、安全性薬理研究会を含む国内のシンポジウム等において、国内のオピニオンリーダーと情報を共有することができた。今後、医療機関における課題を検討し、Proof of Conceptの計画および具体的なレジストリ連携へと研究を発展させる予定である。本研究課題では、国際規制調和の観点から国際レジストリ連携の意義とその方法論を確認し、アンメット・メディカル・ニーズの具体例として腫瘍循環器領域を例に取り、Proof of Conceptの計画と具体的なレジストリ連携へと研究を推進する予定である。人間医工学におけるレギュラトリーサイエンスでは、医学の進歩は最終的には人を対象とする試験に一部依存せざるを得ない研究に基づく(世界医師会ヘルシンキ宣言)ことから、臨床研究の科学性・倫理性・信頼性を担保するための方法論、すなわちGCPが大きな役割を果たしている。国際規制調和の観点からは、GCP刷新としてICH-E6(R2)に加えICH-E8の改訂でアンメット・メディカル・ニーズへの対応に必要な「データソースの多様化」「方法論の多様化」が進みつつあり、特に米国FDAでは「リアル・ワールド・データ」を活用した「リアル・ワールド・エビデンス」について、MDEpiNet-PPPやNESTといった産官学連携を通じて理論構築とその実践が進んでいる。一方、わが国では、まず薬事法(現・薬機法)において医薬品の承認申請を目的とした「治験」においてGCP(ICH-E6(R1))への対応が始まり、最近では臨床研究法の施行によりその対象が「特定臨床研究」へと拡大されたものの、GCP刷新への対応は遅れている(大津ほか、臨床評価;46(2):303-320, 2018)。本研究課題では、まず先行研究(基盤研究C#25350585)で構築された国際医療機器レジストリ連携のノウハウおよび人的ネットワークを発展させる(MDEpiNet-J, IDEAL-J)。更に、これを初年度の現状調査で得られたアンメット・メディカル・ニーズである腫瘍循環器学という学際領域に応用し、エビデンス作りにも貢献したい(信濃ほか、腫瘍内科;23(4):352-363,2019)。

初年度は現状調査、次年度はProof of Concept計画、3年目以降は具体的なレジストリ連携を予定している。初年度の研究実績の概要は、先行研究(基盤研究C#25350585)で構築された国際医療機器レジストリ連携の応用として、国内外の現状調査を行った。まず国際規制調和と戦略的レジストリ連携の定義・方法論について、Art Sedrakyan博士(米国コーネル大学、1月に来日)、Danica Marinac-Dabic博士(米国FDA、10月にMDEpiNet年次集会で会合)と研究打ち合わせを行い、Proof-of-conceptの計画について貴重な助言を得ることができた。次にアンメット・メディカル・ニーズの現状とレジストリへの期待について、米国臨床腫瘍学会(ASCO2018)および国際腫瘍循環器サミット(GCOS2018)においてBonny Ky博士(米国ペンシルベニア大学)、Thomas Suter博士(スイス・ベルン大学、日本心不全学会で来日)、Ana Barac博士(米国心臓病学会、日本腫瘍循環器学会で来日)、Javid Moslehi博士(米国バンダービルト大学、日本循環器学会で来日)らと研究打ち合わせを実施し、日本臨床腫瘍学会、日本心臓病学会、レギュラトリーサイエンス学会、日本薬理学会、安全性薬理研究会を含む国内のシンポジウム等において国内のオピニオンリーダーと意見交換を行った。今後、医療機関における課題を検討し、具体的なレジストリ連携へと研究を発展させる予定である。本研究計画では、初年度は現状調査、次年度はProof of Concept計画、3年目以降は具体的なレジストリ連携を予定している。初年度の研究実績の概要は、先行研究(基盤研究C#25350585)で構築された国際医療機器レジストリ連携の応用として国内外の現状調査を行ったが、海外のキーパーソンが相次いで来日されたことを生かして国内のオピニオンリーダーとの情報共有が進み、2年目のProof of Concept計画を一部前倒しで進めることができた。まず国際規制調和と戦略的レジストリ連携の定義・方法論についてはArt Sedrakyan博士(米国コーネル大学)が2019年1月に来日されたことを契機に医療機器レジストリの連携(MDEpiNet-J)および並立する概念である患者レジストリ/手技レジストリの連携(IDEAL-J)について、2年目以降更に発展させる方向で意見交換ができた。
女性労働者の権利規定をめぐる交渉過程分析――日本・シンガポール比較研究――

本研究は、日本およびシンガポールにおける女性労働者の雇用の実情、女性労働者を取り巻く法律・社会保障制度とそれらの経済階層別の負担と受益の格差、および両国の女性労働運動について調査・分析を試みたものである。今年度上半期は、日本の女性労働運動団体の掲げる課題(同一価値労働同一賃金)に関する先行研究の整理・分析を行った。続いて下半期には、シンガポールに関連する先行研究・資料の収集および現地調査時の研究視点・方法を整理したうえで、2009年10月から2010年3月までシンガポール現地調査(所属機関:シンガポール国立大学人文社会科学部日本研究学科、受入教員:Thang Leng Leng准教授)を実施した。この期間に、シンガポールにおける女性労働政策および女性に関わる税・社会保障制度に関する資料の検討および中国系シンガポール人女性労働者に対する聞き取り調査を実施した。今年度の研究活動を通して、とりわけシンガポールにおける女性労働者の、経済階層によって異なる転職経験、出産・子育ての経験および貧困化のパターンについて明らかにすることができた。このことは、経済階層および男女によって社会保障制度のインパクトが異なって作用し、かつどの階層に対して有利・不利に作用しているのかを知るうえで重要な研究となる。本研究の目的は、女性労働運動がいかなる政治的機会構造に規定されているのか、またそのなかで運動体がいかにしてみずからを制約する政治構造の変容を試みているのかを検証する日本・シンガポール比較研究である。研究にあたっては、女性労働者の権利規定について利害関係を有する女性労働者団体、労働組合、経営者団体および行政をとりまく政治的機会構造を検証する。1年目にあたる平成20年度は、主として日本における女性労働者団体の活動経緯と、それに影響を与えたアクターおよび国外の政治構造の分析をおこなった。また、女性労働者団体の活動戦略の基盤となっている理論的方向性の分析を、先行研究のレビューをつうじておこなった。この作業は、女性労働運動およびその成果の射程をとらえるうえで重要な作業として位置づけ、実施したものである。女性労働運動に焦点を置いたうえで、現在の日本における労働運動をみていくことによって、女性労働者と男性労働者のあいだに横たわる類似性と差異を明確化する作業が可能となってきている。運動体およびその成果のジェンダー格差を概観可能とするためのこのような作業は、来年度の研究の基礎となる部分として位置づけている。加えて、女性労働者の置かれた現状を理解するために、労働相談事業の対応および分析作業をおこなった。これによって、異なった側面からの現在の女性労働者の置かれた状況やその問題点について確認することが可能となった。
線虫を用いた次世代膵癌診断法の有効性についての検討

膵癌の予後は極めて不良であり、新規診断・治療法の開発が急務となっている。本研究では野生型線虫の嗅覚を応用したN-NOSE法を用いることで癌の匂いを科学的に検討し線虫が膵腫瘍発生を組織学的に確認された膵腫瘍自然発生モデルマウスの尿に対してもヒト同様の誘引行動を呈することを示した。線虫の行動をげっ歯類で再現できたことの重要性は、これまではヒトの臨床検体を用いていたため、サンプルの多様性も影響し、原因物質の同定までは至らなかった可能性も示唆されるが、このマウスモデルを利用することで、走行性を惹起する物質の同定が可能となることが期待され、N-NOSE法が膵癌の早期診断の一助になる可能性も示唆された。膵癌は消化器癌の中で最も予後不良で、初診時には多くが進行癌であり、その5年生存率は5%前後である。しかし、Stage I症例では5年生存率は80%であり、膵癌の早期発見の重要性は強調してもし過ぎることはない。本計画では、挑戦的萌芽研究として「匂い」を科学する斬新な技術により早期膵癌を簡便に診断する方法を開発研究する。匂いの技術は、寄生虫の一種である線虫の嗅覚を応用した方法を用いる。膵癌の予後が悪い原因の1つとして、膵癌は早期診断が困難である点が挙げられる。歴史的にCEA、CA19-9といった糖鎖抗原に対する腫瘍マーカーが汎用されているものの、その感度並びに特異度は決して満足出来るものではなく、またStage I膵癌における感度は非常に低いのが現状である。従って、早期膵癌の診断を可能とする新規バイオマーカーの樹立が世界的に求められている。さらには、既存のマーカーと比較してより安価であれば、糖鎖マーカーに代わる次世代型のマーカーとなりうることが想定される。これまでの内外での研究によって、麻薬犬の嗅覚を応用することで、様々な種類の癌を探知可能であることが報告されている。確かに、イヌの嗅覚はヒトの100万1億倍と言われており、実際、訓練により麻薬犬は癌の微妙な臭いを感じとるようである。しかし、麻薬犬の訓練に手間暇コストが掛かるために、現時点では広く日常診療まで応用されていないのが実情である。一方、協働して研究している広津らの報告によると、線虫も近年の探索的研究により癌を診断可能(N-NOSE法)であることが示されている。N-NOSEは初めからヒトの尿検体を用いてアッセイされたため、マウスモデルにおいても同様の走行性を呈するか否かについてはこれまで報告されていない。本研究では、この新規診断方法がマウスにおける膵腫瘍自然発生モデルマウスにおいて再現可能か検討することを目的としている。本研究では大阪大学消化器外科が中心となって収集を進めている膵癌症例の体液(唾液、尿、血清)を線虫の匂いのシステムに乗せてその有効性を科学的に検討するのが目的となる。現在までに膵腫瘍自然発生モデルマウスとして知られるKRASG12D変異マウスの実験群において、実際に腫瘍形成を認める事を肉眼的並びにヘマトキシリン-エオジン染色を用いて組織学的に確認した。一方、コントロールマウスでは腫瘍形成を認めなかった。このことより、自然発生モデルマウスで実際に腫瘍形成を認める事を確認した。また、このマウス尿を希釈し、N-NOSEのマウスモデルにおける再現性を解析した。その結果、マウス尿に対しても走行性を示す傾向が得られた(協働研究者広津らによる解析)。また、c-Metノックアウトマウスの尿においても同様の解析を施行したが、線虫に対する走行性に有意差を認めなかった。これは癌遺伝子に変異がある場合に線虫がこの遺伝子変異を感知可能であることを示唆する。マウスモデルにおいての有効性を再現可能であることを示したので、下記の通り区分を選択した。消化器癌の中で最も予後不良な膵癌に対する挑戦的萌芽研究として、「匂い」を科学する斬新な技術により早期膵癌を廉価かつ簡便に診断する方法を開発研究する。協働研究者の広津らの報告によると、線虫も近年の探索的研究により癌を診断可能(N-NOSE法)であることが示されている(PlosOne 2015)。N-NOSEはヒトの尿検体を用いてアッセイされたため、マウスモデルにおいても同様の走行性を呈するか否かについてはこれまで報告されていないのが現状である。現在までに膵腫瘍自然発生モデルマウスとして知られるKRASG12D変異マウスの実験群の尿を希釈し、N-NOSEのマウスモデルにおける再現性を解析した。本年度は、膵腫瘍自然発生モデルマウスの尿を用いても、N-NOSE法による再現性を確認するために追加の走行性アッセイを施行し、再現性を確認した。ここまでの知見を英文論文化し、現在論文投稿準備中である。

さらに、マウスモデルでも解析可能であれば、様々な病期の膵癌の臨床検体を用いて病期別での感度および特異度を解析する。膵癌における正確度がある一定以上のレベルであれば、最終的に早期膵癌に対する感度と特異度を確認し、既存のマーカーと廉価性について検討する。また、本研究により、マウスモデルでも癌の臭いに対し走行性を呈することが確認されたので、将来的には、嗅覚物質の同定も可能であることが示唆される。膵癌の予後は極めて不良であり、新規診断・治療法の開発が急務となっている。本研究では野生型線虫の嗅覚を応用したN-NOSE法を用いることで癌の匂いを科学的に検討し線虫が膵腫瘍発生を組織学的に確認された膵腫瘍自然発生モデルマウスの尿に対してもヒト同様の誘引行動を呈することを示した。線虫の行動をげっ歯類で再現できたことの重要性は、これまではヒトの臨床検体を用いていたため、サンプルの多様性も影響し、原因物質の同定までは至らなかった可能性も示唆されるが、このマウスモデルを利用することで、走行性を惹起する物質の同定が可能となることが期待され、N-NOSE法が膵癌の早期診断の一助になる可能性も示唆された。作年度は、膵腫瘍自然発生モデルマウスの尿を用いても、N-NOSE法による再現性を確認した。これらの知見により、異種移植モデルを用いても同様の走行性を示す事が期待される。また、マウスモデルでも癌の臭いに対し走行性を呈した場合は、ヒトと同様にマウスモデルでもN-NOSEが有効であれば、将来的にマウスモデルを手始めに、嗅覚物質の同定を進めていく。本方法の先鞭的な基礎研究は、発生生物学的な線虫の嗅覚臓器研究としてRas-MAPK経路の関与が既に明らかとなっている。また、既存のマーカーとコストパフォーマンスについても検討する。本方法では、大きな意義を有するスクリーニングを簡便かつ廉価に実施することが可能となることが見込まれる。消化器外科
魚類・底生動物群集の生息場所を介した相互作用

捕食者が、摂食によって直接的に餌動物群集に影響するだけではなく、社会行動・採餌・繁殖の過程で生息場所の量や質を変えることによって間接的に下位群集に作用することは多くの群集に起こりうる。本研究は、タンガニイカ湖と琵琶湖の魚類・底生動物群集を対象に、1)生息場所条件を介した下位動物群集への影響を量的に評価し、2)魚類の社会構造や摂餌生態と餌動物群集との相互作用の機構を探究するものである。今年度は、琵琶湖北湖の大浦と菅浦の水深125mに調査区を設け、底生動物の分布・生息密度調査、ディマ-ジェンストラップ調査、人工基盤移入実験、ライトトラップ調査、魚類センサスなどを実施した。従来、琵琶湖において、潜水による採集・観察はほとんど行なわれていなかったが、本研究では新しく開発した器具や方法により以下の成果が上がっている。石表面の底生動物は石単位定量採集で、砂泥中に生息する種類はコアサンプラ-で毎月採集した。両サンプルを深度別・底質別に集め、底生動物の分布・生息密度・微生息場所などの資料を得た。菅浦では、底質・水草・海綿類・藻類の分布が岸際から深場にかけて帯状に変化しており、これに対応した底生動物のゾ-ネ-ションがみられた。夏期には、水深15m前後の水温躍層に沿って軟質の淡水海綿が底質を覆っており、この海綿中にはクロスジヒゲナガトビケラとトゲモチヒゲナガトビケラの幼虫蛹が多数発見された。また、水深5m以浅の大きな石の裏ではコエグリトビケラ(琵琶湖固有の未記載種)が集合して前蛹で越夏していた。1月になると、淡水海綿帯の規模は縮小した。また、この時期には、沿岸帯の全域にわたり多数のヨコエビJesogammarus(Annanogammarus)spp.が出現した。これらの資料は、底生動物の分布・生活史情報としてのみならず、魚類との相互関系を調査する際の基礎資料として利用する予定である。
高速原子間力顕微鏡による脚の短いプロセッシブミオシンの運動メカニズムの解明

ミオシン6とミオシン10は、アクチンフィラメント上を移動する2つの脚をもつモータータンパク質である。興味深いことに、脚の長さが短いにもかかわらず、大きな歩幅で運動することが分かっている。しかしながら、それらが運動する最中の構造的な情報は一切得られていないため、その運動メカニズムは未解明であった。本研究では、高速原子間力顕微鏡を用いて、運動中のミオシン6とミオシン10の構造形態を高い時間・時間分解能で直接観察することを行った。その結果、各ミオシンが大きな歩幅と小さな歩幅をとりながら、ふらふらと一方向に進む運動を直接観察することに成功し、各ミオシンの運動メカニズムの理解を深めることができた。ミオシン6とミオシン10は、細胞内で小胞輸送や、特定の構造を保持するためのアンカーとして機能しているモータータンパク質である。これら2つのミオシンは脚が短いにも関わらず、アクチンフィラメント上を大きな歩幅でプロセッシブ運動できることが報告されている。しかしながら、それらがアクチンフィラメントと相互作用しているときの明瞭な構造的証拠はいままで得られていない。そこで、本研究では高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて、運動中のミオシン6とミオシン10の構造形態変化を直接観察することで、その構造的証拠を提出し、それぞれのミオシンの機能メカニズムを詳細に解明することに取り組んでいる。当該年度は、前年度までに観察に成功している各ミオシンの歩行運動の高空間分解能観察と観察例を増やすことに取り組んだ。特に、ミオシン10においては、得られた観察像の詳細解析に取り組み、運動様式の詳細を次のように明らかにすることができた。(1)大きな歩幅は、ミオシンの軽鎖結合部位よりも高さが低いドメインによって実現されていること。その高さが低いドメインは、これまで報告されているSAH(single alpha helixの略)ドメインと矛盾しない形状で、歩行運動中のミオシン10において直接的な構造証拠を提出できたことを意味する。(2)低濃度ATP存在下で、ミオシン10はミオシン5よりも頻繁に前足が解離し、イレギュラーな運動を起こしやすいことが分かった。これは、ミオシン10の2つの足が柔らかいSAHドメインでつなげられているために、分子内張力による2つの足のキネティクスの非対称性の度合いを低くしているためだと考察された。また、ミオシン10においては、ファシンでバンドル化したアクチンフィラメント上(生体内で機能している環境に近い)を運動する様子も観察することにも成功した。各ミオシンの脚(レバーアーム部)の長さは、細胞内で同じく小胞輸送を担うミオシン5のものと比べて、ミオシン10の場合は半分、ミオシン6にいたっては3分の1しかない。近年、これらの脚の短いミオシンでも、アクチンフィラメント上を大きな歩幅でプロセッシブ運動できることが報告され、注目を集めているが、それらの構造的証拠はほとんど得られていない。当該年度は、運動中のミオシン10の構造形態変化を詳細に観察することに主に取り組んだ。その結果、昨年までにミオシン6の運動観察で観察されたような(1)2つのモーター部を大きく広げた構造形態をとることで大きな歩幅で前進運動すること、(2)2つのモーター部が隣り合うアクチンのサブユニット上に寄り添うような形で結合する様子が直接的に観察された。以上の観察結果は、ミオシン10の運動様式を直接観察した画期的な成果である。また、AFMの画像撮影中に狙った場所にだけに力を及ぼすことができる走査モード(インタラクティブモード)を開発した。その性能を評価するために、ATP非存在下のミオシン5の後ろ足にだけ力を及ぼすことを試み、ミオシン5に人工的な一方向運動を誘起することに成功した。この結果は、ミオシン5の前進運動にATPの加水分解サイクル中の中間状態ADP.Pi状態は必要ないという極めて重要なことを示唆している。このモードは、ミオシン6やミオシン10の運動メカニズムを解明するに当たっても非常に有効である。ミオシン6とミオシン10は、細胞内で小胞輸送や、特定の構造を保持するためのアンカーとして機能しているミオシンである。これらのミオシンは脚が短いにも関わらず、アクチン繊維上を大きな歩幅でプロセッシブ運動できることが報告されている。しかし、それらがアクチン繊維と相互作用しているときの明瞭な構造証拠は得られていない。

そこで、本研究では高速原子間力顕微鏡を用いて、運動中のミオシン6と10の構造形態変化を直接観察することで、その構造的証拠を提出し、それぞれのミオシンの機能メカニズムを詳細に解明する課題に取り組んだ。結果、どちらのミオシンにおいてもアクチン繊維に沿って、大きな歩幅で動いたり、小さな歩幅で動いたりする様子をビデオ撮影することに成功した。ここで、大きな歩幅は、これまで報告されているSAH(single alpha helixの略)ドメインと矛盾しない形状を持った部位で実現されていることを直接可視化した。この成果は、当該分野において、アクチン繊維と結合しているこれらのミオシンの姿が詳細に得られていない中で、画期的な成果といえる。また、どちらのミオシンも、脚の長いプロセッシブなミオシン5よりも頻繁に前足が解離し、イレギュラーな運動を起こしやすかった。これは、ミオシン6や10では、2つの足が柔らかいSAHドメインでつなげられているために、分子内張力による2つの足のキネティクスの非対称性の度合いが低くなっているためだと考察された。このことは、従来の生物物理学的手法で予想されていたが、ここではそれを説明する構造証拠を得ることができた。また、ミオシン10においては、ファシンでバンドル化したアクチン繊維上(生体内で機能している環境に近い)を運動する様子も観察することにも成功した。現在これらの内容をまとめた論文を執筆中である。生物物理学高速原子間力顕微鏡を用いて、ミオシン6とミオシン10の歩行観察を直接観察することによって、それぞれのミオシンが大股を広げて歩行している様子の構造的証拠を得ることができており、徐々にその運動様式の詳細に迫るデータを得ることができている。しかしながら、それぞれのミオシンは、これまでに観察に成功しているミオシン5の運動と比べてレギュラーな運動を行わないことが分かってきた。それゆえ、その運動様式を定量するためにはたくさんの観察例を集めなければならないが、先鋭で安定なAFM探針を作成する歩留りが悪く、さらに先鋭なAFM探針を作成できても摩耗が激しいために、当初計画していたほどに高い空間分解能の観察例が集まらないという状況である。これには、本課題研究で観察しているミオシン6と10は、ミオシン5にくらべ足が短いということも強く影響している。ミオシン6の歩行運動様式に関しては、大股を広げるときの構造モデルとして、現在2つのモデルが提案され、論争中であるが、それを決定的にする映像は得られていない状況である。本研究課題を実施することができたために、ミオシン6とミオシン10がアクチンフィラメント上を大きな歩幅で歩行運動するための構造基盤をリアルタイムに撮影できたことは特筆に値する。また、2つのミオシンがアクチンフィラメントに2つの頭部で結合しているときの前足にわずかながら回転運動が見られることに気が付いている。この回転運動はレバーアーム部位が硬いと考えられるミオシン5のときは見られないので、レバーアーム部位のフレキシビリティーが、この運動の有無を決めているということが示唆される。このような観察結果は、従来の手法では取得することができないために、これらのミオシンの運動メカニズムを別の視点からより詳細に理解することに繋がると考える。
葉老化時おける葉緑体タンパク質分解メカニズムの解明

植物の葉では老化時に下位葉のタンパク質を分解して上位葉へ転流させて“生かす"という生存戦略をとっている。しかしながら、そのタンパク質分解機構には不明な点が多い。本課題では、植物の総タンパク質の80%を含有する葉緑体において、主な膜タンパク質である光化学系IIのアンテナタンパク質の分解機構について研究を行った。その結果、光化学系IIの構造の変化がアンテナタンパク質分解酵素の活性を制御していることが明らかになった。本研究の目的は植物の葉老化時に誘導されるシステマティックな葉緑体タンパク質の分解機構の解明である。特に、光化学系II (PSII)のマイナーサブユニットの変異体(thf1)およびATP合成酵素の変異体(gamera)が伴に暗黒老化時に高い光合成能力を保持することに着目し、両変異体を用いることで葉老化時のタンパク質分解メカニズムを目指した。イネのthf1は老化時に長期間緑色を保つステイグリーンの表現型を示すことから、昨年度はシロイヌナズナthf1変異体がステイグリーンの表現型を示すことを確認し、光合成活性の変化を測定することを試みた。しかしながら、シロイヌナズナのthf1はイネのようなステイグリーン表現型を示さず、光合成活性も低かった。thf1が本研究の目的達成に適さないことが示唆されたため、PSII関連の他の変異体でステイグリーン表現型をもつダイズを用いて研究を進めていくことにした。PSIIのサブユニットであるPsbMが欠損したダイズのpsbmは暗黒老化時においてクロロフィルbが分解せず緑色を保つことが知られている。また同時にPSIIのアンテナタンパク質であるLHCIIが分解しないことも報告されている。そこで葉老化においてタンパク質分解に異常をきたしたpsbmのPSII複合体分解の時間経過を追い、分解途中のPSII複合体がどのような構成をとるのか視覚的に明らかにすることを目指した。その結果、PSIIの複合体の一部がPSIIコアから欠落することよりステイグリーン表現型を誘導していることが明らかなった。言い換えれば、PSII複合体の分解には複合体が会合していることが重要であることが示された。本研究課題の目的は、植物の葉老化において大きなイベントの1つである総タンパク質の80%を含有する葉緑体たんぱく質の分解メカニズムの解明である。葉緑体タンパク質の分解メカニズムは不明な点が多い。本課題では、特に地球上でもっとも存在量が多い膜たんぱく質であると言われている葉緑体チラコイド膜に局在するPSIIのアンテナタンパク質に注目し、それが分解しないダイズの突然変異体を解析した。その結果、PsbMの欠損がアンテナタンパク質分解酵素の活性を低下させることによって、アンテナタンパク質および、それが含有するクロロフィルbが長期間保持され、ステイグリーンを保つことが明らかになった。また、タバコを用いてアンテナタンパク質の特異的な分解酵素であるNYC1のRNAi系統において老化誘導時にPSIIのアンテナタンパク質および、クロロフィルbが分解されないことも確認した。同時に、タバコのPsbM欠損系統も作製した。その結果、ダイズと同様の表現型を持つことが確認できた。ダイズのPsbM突然変異体は自然発生的な品種であるのに対し、タバコの系統はバックグラウンドが同一であることから、2つの欠損系統を比較することができ、それらが酷似した表現型を持つことを観察することができた。計画時においては、PSIIのPsb29に注目したが、シロイヌナズナの突然変異体ではイネのような明らかなステイグリーン表現型が観察されなかったことから、他のPSII変異体で且つステイグリーンを示すPsbMに焦点を移した。しかしながら、本課題を遂行する過程で、アンテナタンパク質を含むPSIIの分解には、サブユニットの1つであるPsbMが必須であることが明らかになり、PsbMの欠損がアンテナタンパク質を特異的に分解するプロテアーゼの活性低下に寄与していることを発見した。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子・生理科学26年度が最終年度であるため、記入しない。シロイヌナズナのthf1がイネと大きく違う表現型を示したことから、当初計画していた変異体解析は断念せざるを得なくなった。しかしながら、研究目的は葉老化時におけるPSIIの分解メカニズムの解明であることから、別のPSII変異体を用いた研究に切り替えた。昨年度は変異体の基礎的な生理解析を行うことを計画に掲げていた。その計画通り、ダイズのPSII変異体psbmの通常生育条件下での光合成生理活性の測定、暗黒老化時の生理活性および光合成タンパク質の蓄積量解析をはじめ、クロロフィル量安定性の有無など基礎データを収集した。さらに、変異体のPSIIのアンテナタンパク質であるLHCIIが非常に安定であることから、PSIIの複合体解析も行った。その結果、変異体では老化時に5つのサブユニットの集合体が複合体から解離することが観察された。さらに変異体におけるクロロフィル分解酵素の活性が低下することも突き止めた。これらのことからクロロフィル分解酵素の働きと複合体形成に関連がある可能性が示唆された。昨年度は目標としていた変異体の生理解析と伴に分子メカニズム解明の足がかりとなるなる結果を得ることができた。

本研究では「PSII老化分解開始シグナルの解明」を目指している昨年度の研究から葉老化時におけるタンパク質複合体の構成がクロロフィル分解酵素などの他の膜タンパク質とのインタラクトに関与していることが示唆された。今後はこのクロロフィル分解酵素の挙動を中心に、PSII複合体およびアンテナタンパク質の安定性に注目する。そのためにクロロフィルb分解酵素であるNYC1遺伝子のRNAi植物の解析も併せて行う。psbmの変異体はダイズの研究から始まったものであるが、ダイズは形質転換技術の実績が乏しいことから、今後の変異体を用いた解析はすべてタバコを用いて行うことにする。まずはタバコのpsbmでもダイズと同じようにステイグリーンを示し、PSII複合体の分解の様子が酷似していることを確認する。さらに、上述したようにNYC1遺伝子のRNAi植物を用いて老化時におけるPSII複合体の構成を追跡することでクロロフィル分解に複合体形成が必須であるかどうかを検証する。また、最終的な目標として葉老化時にPSIIを分解するプロテアーゼとの関わりも明らかにしていきたいことから、暗黒誘導されるプロテアーゼ様タンパク質をデータベースなどから収集し、本研究の暗黒条件下でそれらの遺伝子発現がどのように変化するか検証を試みる。これらの試みから、PSII複合体形成と分解、ひいては老化時においてほとんど知られていないプロテアーゼの挙動を総合して葉緑体の老化分解メカニズムを明らかにする。
中間エネルギー核子入射核反応における前平衡直接反応過程の研究

本研究の目標は、中間エネルギー領域の核子入射核反応で特徴的に観測される前平衡反応過程に核内核子の短距離相関がどのような影響を与えるかを解析し、明らかにすることである。まず、前平衡反応過程の中で、入射核子が核内核子と少数回の2体散乱を繰り返し放出される多段階直接(MSB)反応に与える短距離相関の効果を調べることにした。研究代表者等が開発してきた半古典歪曲波(SCDW)模型に必要な標的核のWigner分布関数の導出に、Gaydarov氏らのグループによって開発された短距離相関を考慮した計算手法を組み込み、MSDで放出される核子の角度分布、特に後方角放出を解析した。まず、Jastrowタイプの短距離相関を導入したNatural Orbitの手法で求めた一体密度行列から標的核のWigner分布関数を計算した。入射エネルギー150,160,186,392MeVの^<40>Ca(p, p'x)反応を解析対象とした。短距離相関を考慮したWigner分布関数を用いたSCDW断面積は、以前のWoods-Saxson型の平均場に対するWigner分布関数を用いた結果に比べ、後方角での断面積が増加し、実験値との一致が改善することがわかった。前方角への放出には殆ど効果がないことも明らかになった。Wigner分布関数を用いて算出される核子運動量分布を両者で比較すると、短距離相関を考慮した場合は、2fm^<-1>以上の高運動量成分が増加し、その結果、入射核子と高運動量核内核子との2体散乱で後方角への放出割合が増加することが分かった。その後、他の計算模型や手法を使い、Wigner分布関数を導出して、SCDW計算に組み込み、実験データの解析を行った。Coherent density fluctuation model (CDFM)による結果が^<12>C,^<40>Ca,^<90>Zrに対する(p, p'x)反応の実験データを最も良好に再現できることがわかった。このことは、核内短距離相関より長距離相関の方がより影響をもつことを示唆しており、Generating coordinate法に基づいてSCDW模型の再定式化を行った。本研究の本年度の目標は、中間エネルギー領域の核子入射核反応で特徴的に観測される前平衡反応過程に核内核子の短距離相関がどのような影響を与えるかを解析し、明らかにすることである。まず、前平衡反応過程の中で、入射核子が核内核子と少数回の2体散乱を繰り返し放出される多段階直接(MSD)反応に与える短距離相関の効果を調べることにした。研究代表者等が開発してきた半古典歪曲波(SCDW)模型に必要な標的核のWigner分布関数の導出に、Gaidrov氏らのグループによって開発された短距離相関を考慮した計算手法を組み込み、MSDで放出される核子の角度分布、特に後方角放出を解析した。Jastrowタイプの短距離相関を導入したNatural Orbitの手法で求めた一体密度行列から標的核のWigner分布関数を計算した。入射エネルギー150,160,186,392MeVの^<40>Ca(p,p'x)反応を解析対象とした。より詳細な議論を展開するために、現在、各模型パラメータの感度解析を進めている。

その後、他の計算模型や手法を使い、Wigner分布関数を導出して、SCDW計算に組み込み、実験データの解析を行った。Coherent density fluctuation model (CDFM)による結果が^<12>C,^<40>Ca,^<90>Zrに対する(p, p'x)反応の実験データを最も良好に再現できることがわかった。このことは、核内短距離相関より長距離相関の方がより影響をもつことを示唆しており、Generating coordinate法に基づいてSCDW模型の再定式化を行った。
研究開発が労働生産性、雇用に与える効果分析〜企業パネルデータを使って〜

平成10年度の研究として、通産省『企某活動基本調査』のパネル化した18708企業のデータを用いて企業の海外活動が国内雇用に与える影響を実証分析した。その結果、以下の結論を得た。1.各企業の付加価値額の伸びは、国内雇用を有意に増加させている。2.その企業が製造業であることは、非製造業であることに比して国内雇用を有意に減少させている。これは、これまでの結果を整合的である。.3.その企業が海外進出していることは、進出していないことに比して有息に親企業の国内雇用を減少させている。これもこれまでの分析結果と整合約である。また、この効果2時間を経て逓減している。4.海外子会社における従業者数の増加も親企業の国内雇用を有意に減少させる方向に働いている。しかし、時間を経ると、有意に国内雇用を増加させる報告に転じている。5.海外子会社の売上げの増加は、親企業の国内雇用を有意に増加させる。6.海外子会社の対日輸出シェアの増加は、親企業の当期の国内雇用を有意に場加させるが、時間を経るとその効果は有意でなくなる。7.進出地域がどこであるかは、親企業の当期の国内雇用に有意な影響を及ぼさないが、時間を経ると、北米・欧州およびアジアに主として選出している企業の国内雇用は、他の地域に主として進出している企業に比して有意に減少している。
協働的アクション・リサーチによる，中1入門期の英語教育に関する総合的研究

佐賀県吉野ヶ里町立三田川中学校1年生の入門期(最初の1学期)の「ゆるやかな移行」と「適度な段差」を意識した英語指導方法を,福岡県福岡市の中学校教員が各自の教育現場で試みた。その結果,実施した教員が,(1)できるだけ,その通りにやってみようとするタイプと,(2)あまりオリジナルにはこだわらず,自分なりにアレンジしてみようとするタイプ,の大きく二つに分かれることが明らかになった。この結果は,Teacher Training式の教師研修に対する現職教員の反応の分類に関する示唆を与えると考えられる。「どのような形の小中連携をめざすべきか」に関する具体的提案や、「それをどう実現し、その結果どうなったか」についての実践報告を行うために、小中連携ですでに成功しているS県のM中学校の授業を参考にしながら、F県F市の中学校教員と研究代表者による協働的アクション・リサーチを実施することとした。平成26年4月からの実施のために、平成25年度は、以下のことを行った。(1)4月12月M中学校での中1入門期英語授業実践の追跡調査、小中連携の英語教育についての情報収集、協働的アクション・リサーチ実施に向けての準備、(2)1月13日M中学校英語教員による第1回目の研修、(3)2月11日M中学校英語教員による第2回目の研修、(4)2月上旬3月上旬26年度の協働的アクション・リサーチ参加者の決定(5)3月6日協働的アクション・リサーチ参加者と研究代表者によるミーティング26年度4月からの協働的アクション・リサーチに参加する中学校教員は、最終的に7名(5校から1名ずつ、1校から2名)となった。3月11日にこのグループのメーリング・リストを立ち上げ、情報の共有・意見の交換を開始した。26年度は、(a)中学校教員間の話し合い、(b)英語授業の実施、(c)中学校教員へのインタビューを継続的に行う予定である。「(a)中学校教員間の話し合い」及び「(b)英語授業の実施」に関しては、ビデオ録画および参与観察によるデータ収集を行う予定である。また,中学校教員と研究代表者とで構成するメーリングリストでのメールのやり取りも、データとして取り扱う。「(c)中学校教員へのインタビュー」は、録音によってデータを収集する。録音及び録画によって得られたデータは、文字起こしし、分析対象とする。「どのような形の小中連携をめざすべきか」に関する具体的提案や、「それをどう実現し、その結果どうなったか」についての実践報告を行うために、小中連携ですでに成功しているS県のM中学校の授業を参考にしながら、F県F市の中学校教員と研究代表者による協働的アクション・リサーチを行った。中学校教員(2名)が中1入門期(4月7月)の間,M中学校での中1入門期の英語授業実践にもとづく英語の授業を行った。毎回の授業が終了した後,各自の気づきをジャーナルとして記録しておいた。また,中学校教員と調査代表者とで構成するメーリングリストでのメールのやり取り,そして中学校教員に対するインタビューの内容もデータとして取り扱うことにした。このようにして得られたデータを総合的に分析した。平成25年度(1)4月12月M中学校での中1入門期英語授業実践の追跡調査,小中連携の英語教育についての情報収集,協働的アクション・リサーチ実施に向けての準備、(2)1月13日M中学校教員による第1回目の研修、(3)2月11日M中学校教員による第2回目の研修、(4)2月上旬3月上旬26年度の協働的アクション・リサーチ参加者(7名)の決定、(5)3月6日協働的アクション・リサーチ参加者と研究代表者とのミーティング平成26年度(1)4月7月協働的アクション・リサーチの実施、(2)8月アクション・リサーチ実施者2名からのインタビュー・データの収集、これまでに得られたデータの総合的分析、(3)10月12日日本教育アクション・リサーチ・ネットワーク大会での発表、(4)1月10日M中学校教員による第3回目の研修、(5)1月25日M中学校教員による第4回目の研修、(6)2月上旬3月上旬27年度の協働的アクション・リサーチ参加者(18名)の決定、(7)3月3日協働的アクション・リサーチ参加者と研究代表者とのミーティング「どのような形の小中連携をめざすべきか」に関する具体的提案や、「それをどう実現し、その結果どうなったか」についての実践報告を行うために、小中連携ですでに成功しているS県のM中学校の「『ゆるやかな移行』と『適度な段差』という教育理念に基づく授業」を参考にしながら、F県F市の中学校教員と研究代表者による協働的アクション・リサーチを行った。27年度(最終年度)は、中学校教員(5名)が中1入門期(4月7月)の間、M中学校での中1入門期の英語授業実践にもとづく英語の授業を、それぞれの教育現場で行った。毎回の授業が終了した後、各自の気づきをジャーナルとして記録しておいた。また、中学校教員と調査代表者とで構成するメーリングリストでのメールのやり取り、そして中学校教員に対するインタビューの内容もデータとして取り扱うことにした。このようにして得られたデータを総合的に分析した結果、「優れた実践の教育理念に基づいて、自身の教育実践の工夫を試みる教員」は、(1)できるだけ、その通りにやってみようとするタイプと、(2)あまりオリジナルにはこだわらず、自分なりにアレンジしてみようとするタイプと、大きく二つに分かれることが明らかになった。

サンプル数が少ないため一般化することは困難であり、二つに分かれる理由も未だ不明確ではあるが、Teacher Training式の教師研修に対する現職教員の反応のタイプが明らかになった点は、本研究の成果として評価できると考えられる。佐賀県吉野ヶ里町立三田川中学校1年生の入門期(最初の1学期)の「ゆるやかな移行」と「適度な段差」を意識した英語指導方法を,福岡県福岡市の中学校教員が各自の教育現場で試みた。その結果,実施した教員が,(1)できるだけ,その通りにやってみようとするタイプと,(2)あまりオリジナルにはこだわらず,自分なりにアレンジしてみようとするタイプ,の大きく二つに分かれることが明らかになった。この結果は,Teacher Training式の教師研修に対する現職教員の反応の分類に関する示唆を与えると考えられる。26年度に行う予定であったスケジュールはほぼ全て行うことができた。ただ、協働的アクション・リサーチ参加者7名のうち、中学1年生の授業を担当できる教員が2名しかいなかったため、2名の実践についての調査までしか行うことができなかった。しかしながら、2名から収集したデータを分析した結果、「ある教え方に基づき自身の教育現場での改善を図るためには、具体的方法の模倣だけでは不十分であり、その方法を支えている教育理念に立ち返り、自分の現場の状況と照らし合わせながら、調整をし続けること」が必要不可欠である、という結論に至ることができた。それ故、「おおむね順調」と判断した。教師教育学27年度については、中学1年生担当の教員を十分に確保するために、協働的アクション・リサーチ参加者を18名に増員することとした。「M中学校の小中連携の基本理念である『ゆるやかな移行』と『適度な段差』という教育理念に基づき、中1担当教員が自身の現場の状況の中で、小中連携のあるべき姿について模索し続けること」を最終年度のテーマとした。データ収集は、(a)中学校教師間の話し合い、(b)英語授業の実施、(c)中学校教員へのインタビューを、継続的に行う予定である。「(a)中学校教師間の話し合い」及び「(b)英語授業の実施」に関しては、ビデオ録画及び参与観察によるデータ収集を行う予定である。「(c)中学校教員へのインタビュー」は、録音によってデータを収集する。録音及び録画によって得られたデータは、文字起こしし、分析対象とする。25年度に行う予定であったスケジュールはほぼ全て行うことができた。ただ、M中学校英語教員による研修が、協働的アクション・リサーチ参加者の招集に予想以上に時間がかかったため、2週間程度の間隔を空けながら5回行うべきところが、2回の集中研修(810時間)の形になってしまった。26年度は、(a)中学校教員間の話し合い、(b)英語授業の実施、(c)中学校教員へのインタビューを継続的に行う予定である。「(a)中学校教員間の話し合い」及び「(b)英語授業の実施」に関しては、ビデオ録画および参与観察によるデータ収集を行う予定である。また,中学校教員と研究代表者とで構成するメーリングリストでのメールのやり取りも、データとして取り扱う。
リン酸化シグナルをターゲットにした非遺伝毒性発がん物質スクリーニング法の開発

タンパク質リン酸化は、最もポピュラーな翻訳後修飾で、生命現象や病態に大きな影響を持つことが知られている。近年の質量分析技術の向上は、リン酸化プロテオミクスを発展させ、大規模なリン酸化サイトの同定と、膨大な量のタンパク質リン酸化部位のデータベース化につながった。しかし、これらの膨大なリン酸化サイトの多くは生理的意義が判明しておらず、逆にその数が生理的に意義のあるリン酸化サイトの決定を困難なものにしている。我々は、ヒトゲノム上のリン酸化サイトを周辺配列の構造から、178のリン酸化モチーフに分類したデータを使い、リン酸化モチーフの進化的保存性(Conservation index:CI)がその生理機能への重要性と関係があること見出した。がんにおけるドライバー遺伝子の多くはタンパク質リン酸化に関係する遺伝子であり、その基質であるリン酸化サイトに入る変異はがん化への影響を持つことが期待された。そこでリン酸化モチーフ情報が、疾患シグナルの探索に有効か検証もかねてリン酸化モチーフ情報と、International Cancer Genome Consortium (ICGC)(https://icgc.org/)に登録されたがん特異的変異データを組み合わせてその関係を調べた。がん組織では、生理的重要性の高いリン酸化モチーフに変異が蓄積しやすい傾向がみられ、この結果は、がん組織のリン酸化モチーフ上の変異が、ゲノム不安定性によるランダムな変異の挿入でなく自然選択的に挿入されていることを示唆した。さらにリン酸化モチーフ上のがん突然変異に組織特異性がみられるか確認したところ、皮膚がんで特徴的な変異が観察された。その変異がどのようなタンパク質に導入されているか検証すると、高い機能特異性が分かったことから、その機能における変異の役割を今後明らかにする。非遺伝毒性発がん物質の発がん性試験は、その発生機序の多様さから、動物実験以外では困難であるとされている。しかし悪性度の高いがん細胞は1足場非依存的な自立増殖、2分化の消失、3高い解糖性、4増殖因子やプロテアーゼの分泌という共通した性質を獲得しており、それぞれの性質によって、関連した蛋白質のリン酸化ががん細胞間で共通して観察される。近年、原ガン遺伝子の変異以外に、意味のないと考えられていたサテライト変異の集団も腫瘍の悪性化に関係するという結果が、腫瘍SNPの大規模解析から明らかにされつつある。そこで、膨大なリン酸化サイトの中から発がんに影響のあるリン酸化サイトを抽出する方法の開発として、本課題では、まずヒトにおいてリン酸化サイト上のがん特異的変異が細胞がん化にどうかかわるのか包括的に理解するために、このリン酸化モチーフ上の腫瘍組織特異的な変異から、細胞がん化に影響を持つ変異を抽出する方法の開発を試みた。まずヒトゲノム上1,003,756サイトのセリン、スレオニン、チロシン残基を中心とするモチーフ構造、進化的保存性、キナーゼ予測のためのキナーゼー基質情報をアサインしたデータベースを使い、International Cancer Genome Consortium (ICGC)(https://icgc.org/)に登録されている16,164,044のがん特異的変異から、アミノ酸置換のあるリン酸化モチーフ上の114,262変異をピックアップし、がん組織でのモチーフ上の変異の偏りから、リン酸化モチーフと細胞がん化との関係を調べた。当初予定通り、ヒトがんSNPデータベースを用いたリン酸化モチーフ上のがん変異データベースの構築および、リン酸化シグナル伝達経路地図の作製が進んでいる。申請者は、これまでの研究から178のリン酸化モチーフを同定しリン酸化モチーフの生理的重要性のパラメーターとして進化的保存性を利用し、リン酸化シグナルの解析を行ってきた(Yoshizaki H Gigascience 2015)。本課題ではこれらのデータを利用し、がん特異的な変異とリン酸化モチーフとの間に関連性を見出せるか調べた。International Cancer Genome Consortium (ICGC)(https://icgc.org/)に登録されている16,164,044のがん特異的変異から、アミノ酸置換のあるリン酸化モチーフ上の114,262変異をピックアップし、がん組織でのモチーフへの変異の偏りと各リン酸化モチーフの進化的保存性との間で相関を調べた。この結果、リン酸化モチーフ上のがん特異的変異導入頻度は、リン酸化モチーフの進化的保存性と正の相関を持つことを明らかにした。しかも、この相関は健常者SNPデータで確認されなかった。これはがん組織では、生理的重要性の高いリン酸化モチーフに変異が蓄積しやすいことを意味し、がん組織のリン酸化モチーフ上の変異は、ゲノム不安定性によるランダムな変異の挿入でなく自然選択的に挿入されていることを示唆した。これらの結果から、リン酸化モチーフ解析に着目した発がんシグナル伝達経路予測が可能であることが期待される。申請通りのペースで研究が進んでいる。がん組織における遺伝子変異は、がん遺伝子やがん抑制遺伝子に代表されるがんの発生、進化に直接重要な役割を持つドライバー変異と、がん組織のゲノム不安定性によりランダムに入ると考えられるパッセンジャー変異に分類される。既知ドライバー遺伝子の多くはタンパク質リン酸化に関係する遺伝子である。しかし、その基質であるリン酸化サイトに入る変異はがん化への影響を持つことが予想されるものの、その細胞がん化への影響は、多くがパッセンジャー変異と考えられており、いまだ明らかにされていない。本研究で我々は、リン酸化モチーフに注目し、ヒトがん組織におけるリン酸化サイト上のがん特異的変異を分類することで、リン酸化モチーフ上の遺伝子変異の持つ細胞がん化への影響予測を試みた。

我々は、膨大なリン酸化サイトを簡便に特徴づけるために、リン酸化サイトの周辺アミノ酸配列の特徴からモチーフ構造を抽出し178のリン酸化モチーフに分類した。決定したモチーフは、比較進化解析から進化的保存性を算出した。International Cancer Genome Consortium (ICGC)に登録されている16,164,044のがん特異的変異から、アミノ酸置換のあるリン酸化モチーフ上の114,262変異をピックアップし、がん組織でのモチーフへの変異の偏りと各リン酸化モチーフの進化的保存性との間で相関を調べた。この結果、リン酸化モチーフ上のがん特異的変異導入頻度は、リン酸化モチーフの進化的保存性と正の相関を持つことが明らかになった。これはがん組織では、生理的重要性の高いリン酸化モチーフに変異が蓄積しやすいことを意味し、がん組織のリン酸化モチーフ上の変異は、ゲノム不安定性によるランダムな変異の挿入でなく自然選択的に挿入されていることを示唆した。さらに腫瘍組織の違いによって、変異が導入されるリン酸化モチーフにも偏りが観察された。リン酸化プロテオミクス解析の精度が本課題の進行に必要な基準に達しなかったため、トキシコゲノミクス研究の変異データで代用することになった為。計画の修正とその検証で遅延している。タンパク質リン酸化は、最もポピュラーな翻訳後修飾で、生命現象や病態に大きな影響を持つことが知られている。近年の質量分析技術の向上は、リン酸化プロテオミクスを発展させ、大規模なリン酸化サイトの同定と、膨大な量のタンパク質リン酸化部位のデータベース化につながった。しかし、これらの膨大なリン酸化サイトの多くは生理的意義が判明しておらず、逆にその数が生理的に意義のあるリン酸化サイトの決定を困難なものにしている。我々は、ヒトゲノム上のリン酸化サイトを周辺配列の構造から、178のリン酸化モチーフに分類したデータを使い、リン酸化モチーフの進化的保存性(Conservation index:CI)がその生理機能への重要性と関係があること見出した。がんにおけるドライバー遺伝子の多くはタンパク質リン酸化に関係する遺伝子であり、その基質であるリン酸化サイトに入る変異はがん化への影響を持つことが期待された。そこでリン酸化モチーフ情報が、疾患シグナルの探索に有効か検証もかねてリン酸化モチーフ情報と、International Cancer Genome Consortium (ICGC)(https://icgc.org/)に登録されたがん特異的変異データを組み合わせてその関係を調べた。がん組織では、生理的重要性の高いリン酸化モチーフに変異が蓄積しやすい傾向がみられ、この結果は、がん組織のリン酸化モチーフ上の変異が、ゲノム不安定性によるランダムな変異の挿入でなく自然選択的に挿入されていることを示唆した。さらにリン酸化モチーフ上のがん突然変異に組織特異性がみられるか確認したところ、皮膚がんで特徴的な変異が観察された。