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実時間その場電子スピン共鳴分析によるプラズマの生体に及ぼす作用に関する研究

細菌の殺滅を目的とした放電プラズマ滅菌は,薬品不要で電源のみで稼働するために,いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られることから,有望な技術である.しかしながら,これまでにも生体内での活性酸素の細胞壊死に与える影響は多く調べられてきているのであるが,生体外から故意の酸化作用による細胞寿命の決定機構は解明されていない.本研究では,この実時間その場ESR観察技術を進展させ,プラズマと生体との相互作用の一端が解明され,バイオプラズマ技術の実用化が促進されたと考える.プラズマ滅菌の生化学的な作用の解明に物理化学的観察手法から切り込む研究が今後も期待される.実時間その場電子スピン共鳴分析によるプラズマの生体に及ぼす作用に関する研究を進めてきた。特に、細菌の殺滅を目的とした放電プラズマ滅菌は,薬品不要で電源のみで稼働するために,いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られることから,盛んに研究されつつある.このバイオプラズマ応用において,プラズマと生体との相互作用は未知であり,その解析が強く求められている.本研究ではこの要求に対し,プラズマ滅菌過程の生体内フリーラジカルの挙動の解析に着目し,プラズマ生成するイオン,ラジカル,光といった個々の反応種の滅菌作用の発現機構をその場で実時間に観察可能な方法により詳細解明することを目的として進めた.本研究では,モデル生物としてミドリカビ胞子の生体ラジカル観察を行い,世界に先駆けて胞子内の生体フリーラジカルの検出を基軸として,このカビ胞子のプラズマ不活化挙動との関連を生体用実解析装置を導入して詳細に評価することができた。まだ、プラズマ滅菌・不活化の機構全体の解明に至ってはいないが、その足がかりを構築することができた.細菌の殺滅を目的とした放電プラズマ滅菌は,薬品不要で電源のみで稼働するために,いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られることから,有望な技術である.しかしながら,これまでにも生体内での活性酸素の細胞壊死に与える影響は多く調べられてきているのであるが,生体外から故意の酸化作用による細胞寿命の決定機構は解明されていない.本研究では,この実時間その場ESR観察技術を進展させ,プラズマと生体との相互作用の一端が解明され,バイオプラズマ技術の実用化が促進されたと考える.プラズマ滅菌の生化学的な作用の解明に物理化学的観察手法から切り込む研究が今後も期待される.細菌の殺滅を目的とした放電プラズマ滅菌は,薬品不要で電源のみで稼働するために,いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られることから,盛んに研究されつつある.このバイオプラズマ応用において,プラズマと生体との相互作用は未知であり,その解析が強く求められている.本研究ではこの要求に対し,プラズマ滅菌過程の生体内フリーラジカルの挙動の解析に着目し,プラズマ生成するイオン,ラジカル,光といった個々の反応種の滅菌作用の発現機構をその場で実時間に観察可能な方法により詳細解明することを目的として進めている.申請者は,世界に先駆けてユニークな実時間その場で表面生成するラジカル検出可能な電子スピン共鳴観察手法を確立しており,この解析を応用してバイオプラズマ技術の実用化について研究を進めている.本年度は,モデル生物としてミドリカビ胞子の生体ラジカル観察に行い,世界に先駆けて胞子内の生体フリーラジカルの検出を基軸として,このカビ胞子のプラズマ不活性化挙動との関連を詳細に評価して,プラズマ滅菌・不活性化の機構解明を図ることができた.平成24年度は,モデル生物のフリーラジカル観察とそのプラズマ相互作用による挙動の詳細解析を行う計画としていたが,そのための生体計測用の装置を開発するを済ませており,また生化学反応の解明を進めるためにフリーラジカルの同定とその検証作業を行うことができた.平成25年度は,引き続きモデル生物のフリーラジカル観察とそのプラズマ相互作用による挙動の詳細解析を行う.フリーラジカルの同定とその検証作業は詳細に進めており,さらに,放電プラズマの化学種の個々の作用とそれらの相乗効果について,ラジカルの反応速度の方程式を立てて解析する予定である.24年度で得られた結果を発展させ,モデル生物の種類を広げることで,この解析手法の課題と将来性を議論する.測定にはESR用の合成石英ガラス管を利用する.このガラス管が放電プラズマの発生によって劣化していくため消耗品として計上している.その他,測定で使用する化学薬品などの購入にあてる.成果発表を研究代表者が年に2回国内発表し,研究代表者が海外の国際会議において発表する経費計上を計画している.
心理主義・物理主義の融合による街路空間の様相の解明

現在、雰囲気や地域らしさといった都市の質的な側面に対する関心が高まっている。しかしその全体性や複雑性ゆえに、測定や分析の方法論は確立されていない。本研究では、都市の全体的な在り方を「様相」という概念で捉え、街路空間の様相を、心理的側面と物理的側面の両方から、かつ定量的・定性的に解明する。具体的には国内10都市における代表的ルートの全方位映像を被験者に示し、印象を話してもらうことで心理的様相に関するデータを取得し、そのルート周辺の建物や交通量を測定することで物理的様相を知る。そしてこれらを分析することで、都市の様相を総合的に明らかにする。
SAGE法によるヒト血液細胞の遺伝子発現解析

我々は、生体防御機構(免疫)、特に炎症、免疫疾患をターゲットにした遺伝的要因の同定と分子レベルでの解明の為、生体防御機構に中心的な役割を担う血液細胞(特に樹状細胞)に焦点を絞りSerial analysis of gene expression(SAGE)を用い包括的な遺伝子発現解析を行うことを目的とする。我々は現在まで、単球からの樹状細胞の分化に伴う遺伝子発現をSAGE法により検討を進めてきた。これらの結果から、樹状細胞が発現している遺伝子及び分化に伴って発現してくる遺伝子を同定し、癌ワクチンへの応用が期待される樹状細胞の機能を明らかにする。一方、樹状細胞たけでなく免疫系全体として考えるとT細胞、B細胞など他の血液細胞の発現遺伝子を調べることがそれぞれの血液細胞特有の遺伝子を検索する上で重要である。そこで他の血液細胞(B、NK, T細胞など)の包括的遺伝子解析を行いデータベース化し、それを基にして炎症、免疫疾患の遺伝的要因の同定、また、分子レベルでの機能を明らかにする。b)他の血液細胞の発現遺伝子を調べることによりそれぞれの血液細胞特有の遺伝子を検索する目的で、今回、ヒトCD8陽性T細胞とNK細胞について85,848個のtagを解析した。NK細胞ではCTLに関与している遺伝子granulysin, perforin, granzyme B, and defensin-α1,などが多く発現していた。
糸状菌の生産する抗酸化物質の構造と活性

1.AspergillussojaeKをCzapek培地に接種し、30°Cで約20日間振盪培養して得られた培養液上清の抗酸化活性はおよそ10,000units/mlであった。この培養液をロ-タリ-エバボレ-タ-で10倍に濃縮し、DEAEーセルロファインカラムに供し、NaClグラジエントで溶出させた。この時の使用バッファ-は50mM酢酸バッファ-(pH4.5)で、活性は0.4M付近で溶出された。この活性画分をセファデックスGー15カラムにかけ、蒸留水で溶出させた。抗酸化活性とニンヒドリン陽性画分は完全に一致した。この画分を凍結乾燥した。2.この抗酸化物質はエタノ-ルー水(67:33)の溶媒系でTLCを行っても原点から移動せず、その加水分解物はグリシンとアスパラギン酸のRfにスポットが検出された。Nー末端アミノ酸を決定するためDNP化して加水分解し、TLCを行ったところ、グリシンが検出され、Nー末端アミノ酸はグリシンであることが明かとなった。Nー末端アミノ酸を除いた加水分解物をアミノ酸アナライザ-で分析したところ、グリシンとアスパラギン酸のモル比は1:1から1:2へ変化した。このことは抗酸化物質のペプチドはグリシンとアスパラギン酸が2分子づつからなっていると考えられた。抗酸化物質をペプチドシ-クエンサ-で分析したところ、GlyーGlyーAspーAspではないかと考えられる結果を得た。3.この抗酸化物質に種々のプロテア-ゼ(プロテア-ゼE、プロナ-ゼK)やペプチダ-ゼ(カルボキシペプチダ-ゼY、カルボキシダ-ゼW、アミノペプチダ-ゼ)を作用させが活性は全く減少しなかった。この結果、この抗酸化物質は通常のペプチド結合ではない、あるいは前記の酵素の作用を妨げる物質が結合しているのではないかと考えられた。4.既存の抗酸化物質や抗酸化剤とA.sojaeKから分離した抗酸化物質の抗酸化活性を魚油の酸化抑制効果などで比較検討した。1.抗酸化物質生産菌として、研究室保存のAspergillus属5株と市販の醤油麹菌から分離した3株を用いた。基本的な倍地としてはCzapek倍地を使用し、30°Cで振盪培養後培養上清の抗酸化活性をMishraらのアスコルビン酸の自動酸化を利用する方法で測定した。使用した8株の中ではA.sojaeUが最も活性が高く、A.oryaeは活性は低かった。A.sojaeUを用いて倍地の炭素源や窒素源の種類と濃度を変えて培養したところ、炭素源の抗酸化物質生産への影響はほとんどなく、窒素源の影響が大であった。すなわち、窒素源として硝酸ナトリウムや尿素を0.3%加えた時に活性が高く、同量のポリペプトンや硫酸アンモニウムでは菌体の増殖に差はないが活性は10分の1以下であった。A.sojaeUをツアペック倍地で、30°C、28日間振盪培養することで約10000units/mlの抗酸化活性を持つ培養液上清が得られた。2.抗酸化物質の精製方法について検討した。抗酸化物質はニンヒドリン陽性で、紫外部吸収が低く、透析膜を通過する分子量1万以下の物質であることからアミノ酸を含む物質であると考えられた。そこでDEAE-セルロファインカラムに培養液上清の濃縮液をかけ、抗酸化物質をNaclの濃度勾配で溶出させた。活性画分をセファデックスG15カラムでゲルろ過し、濃縮後マイクロアシライザ-で脱塩したものを凍結乾燥した。3.上記の部分精製標品についてその組成と若干の性質を検討した。この抗酸化物質には糖やりんなどは含まれておらず、アミノ酸アナライザ-にかけると酸性領域に一つのピ-クとして検出された。6NHClで加水分解するとアスパラギン酸とグリシンが等モル検出され、前記のピ-クは消失しており、活性も失なわれていたことから抗酸化物質はアスパラギン酸とグリシン等モルからなるペプチドであろうと推察された。この抗酸化物質は各種タンパク分解酵素による影響をうけなかった。

Nー末端アミノ酸を除いた加水分解物をアミノ酸アナライザ-で分析したところ、グリシンとアスパラギン酸のモル比は1:1から1:2へ変化した。このことは抗酸化物質のペプチドはグリシンとアスパラギン酸が2分子づつからなっていると考えられた。抗酸化物質をペプチドシ-クエンサ-で分析したところ、GlyーGlyーAspーAspではないかと考えられる結果を得た。3.この抗酸化物質に種々のプロテア-ゼ(プロテア-ゼE、プロナ-ゼK)やペプチダ-ゼ(カルボキシペプチダ-ゼY、カルボキシダ-ゼW、アミノペプチダ-ゼ)を作用させが活性は全く減少しなかった。この結果、この抗酸化物質は通常のペプチド結合ではない、あるいは前記の酵素の作用を妨げる物質が結合しているのではないかと考えられた。4.既存の抗酸化物質や抗酸化剤とA.sojaeKから分離した抗酸化物質の抗酸化活性を魚油の酸化抑制効果などで比較検討した。
計算機的手法及びNMRによる超臨界水溶液の解析

最終年度にあたる16年度は、まず、亜臨界・超臨界水中におけるフェノールのH-D交換のNMRによる反応速度論的解析について、J. Chem. Phys.に発表した。亜臨界・超臨界水、及び超臨界水・ベンゼン混合溶液を用い、水の密度制御を行うことによって、H-D交換の完全な位置制御に成功した。オルト・メタ・パラの全ての組み合わせの置換体について、位置選択的に重水素化したフェノールを合成する手法を確立した。更に、中性のフェノールと比較したフェノレートイオンの高温高圧水中の反応速度についても解析を行った。フェノレートの場合、各置換位置の反応性はフェノールと比較して増大し、異なる選択性を示した。これらの結果について10月の高圧力学会で発表する。また8月の国際学会において、ラマン分光法による水素結合性超臨界流体の構造の解析について発表した。水などの水素結合の状態を測定するにあたり、ラマンを含む振動分光はNMR等と比較して、その平均値だけでなく分布に関する情報も提供する点において有益な測定法である。NMRによる超臨界水および水溶液の解析を補完する目的で、当研究室とJEOLと共同で新しい高温高圧流体の高感度ラマン測定装置を開発し、今まで測定が不可能であった低密度の超臨界水の測定を可能にした。今回は特に水素結合状態の密度依存性に着目し、3×10^<-4>g/cm^3以下まで至る孤立分子模様の超低密度から広範囲に渡って測定することに成功した。また、超臨界水との比較のため、同じく水素結合性流体である超臨界メタノールの実験も同様に行った。メタノールの臨界温度は水よりも低く、臨界温度から更に温度を上げていったときの変化をより容易に観察できた。NMRやシミュレーションの結果との比較から、超臨界水における水素結合の密度依存性は局所密度一元論では説明できないことを示した。この結果について論文を準備中である。水などの水素結合の状態を測定するにあたり、振動分光はNMR等と比較して、その平均値だけでなく分布に関する情報も提供する点において有益な測定法である。従って、今まで進めてきたNMRによる超臨界水および水溶液のNMRによる解析を補完する目的で、当研究室とJEOLと共同により、特殊薄型ダイヤモンド窓を使用した高温高圧流体の高感度ラマン測定装置を開発した。それによって今まで測定が不可能であった低密度の超臨界水の測定が可能になり、NMRの実験と平行してラマンよる超臨界水の構造を調べた。特に水素結合状態の密度依存性に着目し、3×10^<-4>g/cm^3以下まで至る孤立分子模様の超低密度から広範囲に渡って測定した。メタノールの臨界温度は水よりも低く、臨界温度から更に温度を上げていったときの変化をより容易に観察できる。NMRや計算機シミュレーションの結果との比較から、超臨界水における水素結合の密度依存性は局所密度一元論では説明できないことを示した。これらの結果について学会発表を行い、特に今まで報告されていなかった超低密度における超臨界水のラマン測定を可能にした点において反響を得た。今までの結果については論文として執筆し、現在議論を深めるために軽水・重水混合溶液を使った更に詳細な実験を行っている。NMR測定については、ビスフェノールAとその関連物質の超臨界および亜臨界水中における無触媒分解反応の解析が既に当研究室で行われていたが、それを更に発展させ、その密度と分解速度、および分解過程の関連について更に詳細な測定が続行中である。今までの結果について論文としてまとめ、最新の測定結果を含めて近々投稿することが可能な状態である。15年度は主に亜臨界・超臨界水中における反応機構の解明を目標に、幾つかの化学反応についてNMRを用いて解析した。まず、フェノールにおけるH-D交換の反応速度論的解析を行った。210-240°Cの亜臨界域では、オルト、パラ位の両方で数時間の単位でH-D交換が進行することが判った。孤立分子の電子密度計算より、両者の反応性はパラがやや高いかほぼ同じであることが判っているが、それに反し、この反応条件ではオルトの反応が50%程度早く、水和の効果が現れている。反面、350°Cまでの温度域ではメタ位に全く反応が進行しない。超臨界域ではオルト・パラは瞬時に置換し、反応性の低いメタ位でも、水密度0.4g/cm^3において十時間のオーダーで置換が進行した。水密度を下げていくと次第に反応速度は減少し、また、パラに対するオルトの選択性も上昇した。水分子の局在化による反応選択性をより上げるため、疎水性のベンゼンに少量の水を添加した超臨界混合溶液中で反応させ、オルトだけを選択的に重水素化することに成功した。またこの水熱反応は可逆であることも利用し、重水素化の自在なトポロジカル制御を完成させた。この亜臨界・超臨界水、およびベンゼン・水混合溶液を用いた斬新な位置選択的重水素化法について、特許出願に向けて準備中である。また上記の結果について日本化学会年会で発表し、好評を博した。同時に論文にもまとめ、Journal of Chemical Physicsに投稿して受理され(AIPID number:009424JCP)、間もなく掲載予定である。これ以外に、亜臨界・超臨界水中における4級炭素におけるC-C結合切断の研究も進行中である。

4級炭素にメチル基2つとフェノール基とフェニル基の付いた4-クミルフェノールから出発し、フェニル基のパラ位に水酸基を付加したビスフェノールAと、フェノール基から水酸基を除いた2,2-ジフェニルプロパンについて反応速度を求め、フェノールの場合と同様に、超臨界水の密度変化およびベンゼン・水混合溶液を用いて水和効果を解明しつつある。最終年度にあたる16年度は、まず、亜臨界・超臨界水中におけるフェノールのH-D交換のNMRによる反応速度論的解析について、J. Chem. Phys.に発表した。亜臨界・超臨界水、及び超臨界水・ベンゼン混合溶液を用い、水の密度制御を行うことによって、H-D交換の完全な位置制御に成功した。オルト・メタ・パラの全ての組み合わせの置換体について、位置選択的に重水素化したフェノールを合成する手法を確立した。更に、中性のフェノールと比較したフェノレートイオンの高温高圧水中の反応速度についても解析を行った。フェノレートの場合、各置換位置の反応性はフェノールと比較して増大し、異なる選択性を示した。これらの結果について10月の高圧力学会で発表する。また8月の国際学会において、ラマン分光法による水素結合性超臨界流体の構造の解析について発表した。水などの水素結合の状態を測定するにあたり、ラマンを含む振動分光はNMR等と比較して、その平均値だけでなく分布に関する情報も提供する点において有益な測定法である。NMRによる超臨界水および水溶液の解析を補完する目的で、当研究室とJEOLと共同で新しい高温高圧流体の高感度ラマン測定装置を開発し、今まで測定が不可能であった低密度の超臨界水の測定を可能にした。今回は特に水素結合状態の密度依存性に着目し、3×10^<-4>g/cm^3以下まで至る孤立分子模様の超低密度から広範囲に渡って測定することに成功した。また、超臨界水との比較のため、同じく水素結合性流体である超臨界メタノールの実験も同様に行った。メタノールの臨界温度は水よりも低く、臨界温度から更に温度を上げていったときの変化をより容易に観察できた。NMRやシミュレーションの結果との比較から、超臨界水における水素結合の密度依存性は局所密度一元論では説明できないことを示した。この結果について論文を準備中である。
クローン病腸管線維化治療を目的としたHSP47の線維化機構の解明

我々は、Crohn's disease(CD)の腸管線維化についてコラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(HSP)47が炎症性サイトカインであるIL-17Aを介して亢進している事を報告してきた。しかしながら、HSP47を介した腸管線維化の詳細な機序解明については十分ではなく、線維化治療の検討も今後の課題である。本年度は複数のサイトカインがHSP47発現に与える影響および機序解明について検討した。昨年度までにヒト筋線維芽細胞株(CCD-18Co)ではIL-17AおよびIL-1β刺激によるHSP47発現亢進を確認したが、本年には他の炎症性サイトカインであるTNF-αがIl-1βとの共刺激にてHSP47発現を亢進させる事を確認した。また、IL-1βがインフラマゾームと呼ばれる蛋白複合体を介して誘導される事を複数のCD患者peripheral blood mononuclearcell(PBMC)で確認したが、その誘導がMediterranean fever(MEFV)遺伝子の変異を有しているCD群が変異の無いCD群に比較して有意に亢進している事を確認した。CDではIL-17AおよびTNF-αが病態形成に重要とされており、CD腸管狭窄症例ではこのインフラマゾームを介したIL-1βが、他の炎症性サイトカインと合わせてHSP47発現に寄与し、CD腸管線維化を伴う腸管狭窄形成に関与している可能性が示唆された。実際、MEFV遺伝子変異を有するCD患者では、変異のないCD患者と比較して有意に腸管狭窄を有している割合が高かった。IL-1βと複数のサイトカインの共刺激によるHSP47発現亢進はマウスの線維芽細胞における検討でも同様の結果が得られており、今後のIL-1βを介した経路およびHSP47そのものの制御によるCD腸管線維化治療の可能性が示唆された。我々は、クローン病(以下CD)の腸管線維化について、コラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(以下HSP)47が炎症性サイトカインであるIL-17Aを介して亢進していることを報告してきた。しかしながら、HSP47を介した腸管線維化には他のサイトカインなども関与しているとされ、その詳細な機序解明については十分ではない。また、線維化治療を目指すためのHSP47制御についての検討も今後の課題である。この為、IL-17A以外にもHSP47に関与するサイトカイン及び経路について検討し、さらにマウスHSP47shRNAを作成し、その線維化の制御を試みた。結果、マウス線維芽細胞株(NIH3T3)に炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-17A)、抗炎症性サイトカイン(TGF-β1、IL-10)による刺激を行ったところIL-17A以外にTGF-β1刺激にてHSP47及びコラーゲンの発現亢進を遺伝子(mRNA)、蛋白にて確認した。また、炎症性腸疾患(以下IBD)モデルマウスにおけるTGF-β1の関与を明らかにするためIL-10ノックアウト(以下KO)マウスの腸管組織でTGF-β1の発現を遺伝子(mRNA)にて確認したところ、炎症部位におけるTGF-β1が非炎症部位に比して発現が亢進していることを確認した。さらにNIH3T3においてIL-17A刺激ではその発現経路にJNK経路が関与し、TGF-β1刺激ではJNK以外にもsmad 2/3経路がHSP47、コラーゲン発現に関与していた。加えてNIH3T3にHSP47shRNA投与を行った状態でIL-17AおよびTGF-β1による刺激を加えた検討では、いずれもコラーゲンの発現が抑えられた。このことから、HSP47そのものの制御による腸管線維化治療の可能性が示唆された。IBDモデルマウスであるIL-10KOマウスにおける検討にて12週頃より自然腸炎を発症し、その腸管組織における免疫染色(Azan染色)にて線維化を確認し、同部位の遺伝子(mRNA)解析にてHSP47の発現亢進を認めた。また、NIH3T3にてIL-17AおよびTGF-β1刺激におけるHSP47、コラーゲンの発現亢進を認め、それぞれJNK、smad2/3経路が関与していることも確認した。さらに同細胞株においてHSP47shRNAによるコラーゲン発現抑制についても確認し、マウスにおけるHSP47の線維化の関与およびその制御の可能性についてある程度明らかにすることが可能であった。しかしながら、IL-10KOマウスの腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞の初代培養系における検討では、検体によるHSP47、コラーゲンの発現量の変化が大きく異なり、腸炎の程度を考慮して培養細胞の調整を行うのに時間を要したため、現時点でTGF-β1のみでしか解析ができなかった。また、HSP47のプロモーター領域にGFPを組み込んだレポーターアッセイ系についてもNIH3T3、腸管筋線維芽細胞の初代培養系いずれでも樹立しているが、腸管筋線維芽細胞の検討ではマウス間での培養状態の差が大きく、現在NIH3T3中心に解析を行っている。我々は、クローン病(CD)の腸管線維化についてコラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(HSP)47が炎症性サイトカインであるIL-17Aを介して亢進していることを報告してきた。

しかしながら、HSP47を介した腸管線維化の詳細な機序解明については十分ではなく、線維化治療におけるHSP47制御の検討も今後の課題である。本年度はHSP47に関与するサイトカインおよび経路について検討し、さらにヒトHSP47shRNAによる線維化の制御を試みた。結果、ヒト筋線維芽細胞株(CCD-18Co)ではIL-17A以外にIl-1β刺激によりHSP47およびコラーゲンの発現上昇を認め、さらにIL-17AとIL-1βの共刺激ではより発現が増強された。この為、Il-1βとCDとの関連について追加検討したところ、CD腸管狭窄症例においてMediterranean fever(MEFV)遺伝子の変異を有している症例が有意に多かった。同変異はインフラマゾームと呼ばれる蛋白複合体を介してIL-1βの発現が誘導されるとされ、実際に同変異を有するCD患者のperipheral-blood mononuclear cell(PBMC)の検討ではインフラマゾームの活性化およびIL-1βの誘導が確認された。また、同変異を有するCD患者と変異のないCD患者の血清中IL-1β濃度を計測したところ、変異を有する症例では有意にIl-1βの発現上昇を認めた。ヒトHSP47shRNAによる検討ではヒト腸管組織より単離した筋線維芽細胞の初代培養系(human intestinal subepithelial myofibroblasts: ISEMFs)におけるコラーゲンの発現抑制が確認された。この事から、IL-1βを介した経路およびHSP47そのものの制御による腸管線維化治療の可能性が示唆された。IBDモデルマウスであるIL-10KOマウスにおける検討では腸炎発症の時期が安定しないことがあり、腸炎の程度に差が生じた。結果として、マウスの検討において各種蛋白の発現に差異が生じ、解析に困難が生じることがあった。この為、本年度はヒト血清、細胞株(CCD-18Co)およびヒト腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞の初代培養系(human intestinal subepithelial myofibroblasts: ISEMFs)における検討を行った。培養細胞における検討では昨年度マウス細胞株の同様にCCD-18CoおよびISEMFsにおいてIl-17AおよびTGFーβ1刺激でのHSP47、コラーゲン発現亢進に加えてIl-1βにおける発現亢進を確認した。また、ヒトHSP47shRNAによるHSP47のノックダウンによりコラーゲンの発現抑制も認めたことから、ヒトにおけるHSP47の線維化の関与およびその制御の可能性についてある程度明らかにすることが可能であった。この為、ヒト解析が行えたことやHSP47/Il-1βの経路の確認やその背景の患者群においてMEFV遺伝子変異を有する新たな可能性の発見など将来的な腸管線維化制御の目標としては概ね順調な研究が可能であったと判断された。しかしながら、IBDモデルマウスにおいて予定していた腸炎部位に直接HSP47shRNAを投与する検討が困難であったことから、今後はIL-10KOマウスの腸炎発現状態の再検討や他のIBDモデルマウスであるTCR-αKOマウスでの解析も検討中である。我々は、Crohn's disease(CD)の腸管線維化についてコラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(HSP)47が炎症性サイトカインであるIL-17Aを介して亢進している事を報告してきた。
肝動脈塞栓療法後の腫瘍新生/進展効果の評価および抑制方法の探索

前年度に引き続き、ラット肝細胞癌モデルでの解析を行った。N1S1細胞をラット肝臓に移植し、1週間後に軽カテーテル的動脈塞栓術を施行した。塞栓術施行48時間後にサクリファイスを行い、癌病変部を含めた肝検体を摘出し、RT-PCRにてTGF-β1およびHIF-1α、αSMA,CollagenのmRNA発現量を測定した。これら4項目すべてで、Sham群と比較し塞栓術施行群にて有意にmRNA発現上昇が見られた。前年度に評価した免疫染色やELISAによるTGF-β1タンパク質発現亢進を示した結果と同様であり、これらを後押しする結果であった。これらの結果が。1)肝動脈塞栓術による低酸素が影響しているのか、あるいはマクロファージ等の炎症細胞が関与しているのかを調べるため、さらに2)TGF-β1およびHIF-1αそれぞれの発現の関係を調べるために、In vitro studyを行った。ラット肝細胞癌(N1S1)を48時間低酸素培養し、HIF-1aブロッカーを用いて低酸素培養下でのHIF-1a発現を抑えた上で、TGF-β1の発現量を検討した。この条件下では、TGF-b1の発現が有意に抑制された。また、外因性にTGF-β1を加えることで、HIF-1αの上昇が得られることがわかった。これらの結果より、TGF-β1およびHIF-1αの発現は低酸素によるものと思われるが、それぞれが共依存性に作用し合っている可能性が推察された。当初の予定では、VX2腫瘍担癌ウサギを使用する予定であったが、より臨床に近い条件にするため、ラット肝細胞癌を用いて研究を行うこととした。In vitroにて、ラット肝細胞癌細胞(N1S1)を低酸素培養し、48時間後のHGFおよびTGF-b1の産生・放出能を調べた。常酸素培養群と比べ、HGFの放出には差異はみられなかったが、TGF-b1の放出は有意に増加した。また、HIF-1aブロッカーを用いて、低酸素培養下でのHIF-1a発現を抑えた上で、TGF-b1の発現を検討した。同結果より、TGF-b1の発現上昇は、低酸素刺激によるHIF-1a上昇による影響を受けている可能性が示唆された。施行後48時間でサクリファイスを行い、採血および癌病変部を含めた肝検体を摘出した。これらの検体を用いて、免疫染色、ELISA、Western blottingおよびPCRにて、各検討項目の解析を行っている。免疫染色では、治療後病変の周囲に免疫細胞浸潤が見られると共に、TGF-b1およびHIF-1aの強発現が見られた。周囲肝実質および治療された病変の内部には、これらの発現は乏しかった。次いで、ELISAにてTGF-b1濃度を測定したが、in vitroのデータとは異なり、in vivoでは全身末梢血中のサイトカイン濃度には変化は見られなかった。これらの結果より、動脈塞栓術によるTGF-b1の発現は局所で強く生じ、全身への影響は少ない可能性が示唆された。その他の項目に関しては、現在解析中である。研究計画書では、in vivoからの実験を予定していたが、in vitroでの癌細胞の低酸素応答の確認を行った。これにより数ヶ月程度の遅れが生じたが、より良い結果を得るため、また動物愛護の点からも賢明な判断であったと考えれる。以後の研究進捗は順調と考えられる。これらの結果が。In vivo実験で得られた検体の解析をすすめる。解析結果を踏まえ、次いで治療後のlong termstudyを行い、肝細胞癌の再発、survivalについて検討を行う。

最終的には、TGF-b1阻害薬あるいはHIF-1a阻害薬を用いて、再発の抑制および生存期間の延長に寄与するか判断する予定である。In vitro実験を行ったことにより当初よりもin vivo実験の開始が遅れている。前年度に行えなかったin vivo実験用の経費として165,899円を次年度に繰越して使用する。
砂質土壌地帯のブラッキッシュ・ウォータ利用によるかんがい

熱帯には雨期と乾期が半年ずつあり、乾期には農業用水が非常に不足する。熱帯であるので、温度と日射量は十分にあるので、良質の水さえ十分に得られれば、農業生産が可能になる条件はそろっている。タイ国内陸部には砂質の塩類土壌地帯が数百万haの広範囲に存在し、乾期には地表に塩類が集積し農地に適さなくなる典型である。このような農業に不適な乾期にも地下水位は12mと浅く、量は豊富である。しかし、多くの場合、その地下水の中には重量濃度で1%前後の高濃度で塩類(主にNaCl)が含まれるブラキッシュウォータであって、そのままでは、高塩類濃度のゆえにかんがいには適さない。一方、熱帯であるので乾期晴天下では日射量は多く、夜も冷却が起きる。その熱エネルギーあるいは温度差を利用して悪水を蒸留すれば良水を得られる可能性がある。しかし、高価な装置でなく農業に向く簡易なものである必要がある。蒸留には現地に簡単な小型ビニールハウスを作り、採水を試みた。その結果、熱帯晴天の条件下で、塩濃度1%、深さ1.5mの地下水から、水平面積1【m^2】あたり1日に1l2lの良質水(濃度10ppm=0.001%)が得られた。従って、この方法は熱帯でブラキッシュウォータから良質水を得るのに適した方法である。土壌と地下水との間に水平に空隙を設け、日夜の温度較差により水蒸気の一方向移動を促す案が唱えられていたので、実験装置を作って試験した。その結果、現地条件に近い、水温30°C、地温20°Cの条件で1日に約0.3mmの蒸発・凝縮が認められた。この値は理論値を若干下回るが諸々の条件を考えれば矛盾しない。従って、この方法では塩類集積を回避し、良質水を下層土に得ることはできるが、量的にはやや劣ると考えざるを得ない。良質水の効率的かんがい方法として「圧入式地下かんがい」が発案され、圧力と注水量の関係を数値計算し、今後の展開に資した。
正常ヒトおよび筋萎縮性側索硬化症脊髄におけるグルタミン酸受容体の検討

筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動ニューロンの選択的脆弱性とグルタミン酸による興奮毒性の関係を,脊髄神経細胞におけるグルタミン酸受容体発現の違いの観点から検討した.グルタミン酸受容体は代謝型受容体とイオンチャネル型受容体に大別されるが,代謝型受容体の1-5型(mGluR1-5)mRNAの発現ををヒト正常脊髄で,イオンチャネル型受容体のうちAMPA型受容体サブユニット(GluR1-4)mRNAの発現を正常者とALS患者の脊髄で,in situ hybridization法を用いて検討した.代謝型受容体の正常脊髄での検討では,mGluR1とmGluR5 mRNAの発現が脊髄後角に豊富で,運動ニューロンでは低いことが示された.mGluR1とmGluR5に選択性のある作動薬は脊髄運動ニューロンに対し保護作用があることが示されている.従って,運動ニューロンにおけるmGluR1とmGluR5 mRNAの発現が相対的に低いことは,運動ニューロンは他の脊髄神経細胞に比べmGluR1とmGluR5を介した神経保護作用が少ない可能性を示しており,運動ニューロンの選択的脆弱性と関係しているかもしれない.一方,正常者とALS患者の脊髄でAMPA受容体サブユニットmRNAの発現をflip型,flop型を別個に検討した.Flip型は遅い再分極を,flop型は速い再分極を有するAMPA受容体を形成することが知られている.Flip型は後角に優位に分布し,flop型は灰白質にびまん性に分布していた.ALSの前角では正常者に比べ,flop型のmRNAの減少が著明に認められ,Flip型のmRNAは保たれていた.この結果はALSの前角においてはFlip型AMPA受容体が相対的に増加している可能性を示し,ALSの運動ニューロンは正常者の運動ニューロンに比べ再分極の遅いAMPA受容体をより多く有していることを示唆している.再分極の遅いAMPA受容体は作動薬に対してより強い毒性を介するとされている.従って,今回の研究の結果は,AMPA受容体刺激に対して,ALSの運動ニューロンは正常者の運動ニューロンよりも脆弱であることを示している.代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)のmRNAの分布をin situ hybridization法を用いてヒト脊髄で検討した.HmGluR1,HmGluR2,HmGluR3,HmGluR4,HmGluR5,とGroup I mGluR(mGluR1とmGluR5)のスプライスヴァリアントであるHmGluR1a,HmGluR1bとHmGluR1bおよびHmGluR5aとHmGluR5bに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを作成し,ヒト脊髄にてそれらのmRNAの分布,細胞局所を明らかにした.ヒト脊髄ではmGluR1,mGluR4とmGluR5のmRNAの発現が認められたが,mGluR3とmGluR4のmRNAは発現していなかった.mGluR1 mRNAは脊髄灰蛋白質に広範に分布していた.mGluR1a mRNAの発現は認められず,mGluR1b mRNAは前角細胞に強く,後角にも発現していた.一方,mGluR1d mRNAは前角細胞にのみ認められた.mGluR4の信号は前角細胞に中程度,後角にも軽度認めた.mGluR5 mRNAは後角に強く,他の灰白質に弱く発現していた.mGluR5aの発現はmGluR5と同様であったが,mGluR5bの発現は後角に限局していた.これらの脊髄でのmGluR mRNAの発現パターンの違いは脊髄神経細胞間における生理的役割の違いを示したものと考えられる.筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動ニューロンの選択的脆弱性とグルタミン酸による興奮毒性の関係を,脊髄神経細胞におけるグルタミン酸受容体発現の違いの観点から検討した.グルタミン酸受容体は代謝型受容体とイオンチャネル型受容体に大別されるが,代謝型受容体の1-5型(mGluR1-5)mRNAの発現ををヒト正常脊髄で,イオンチャネル型受容体のうちAMPA型受容体サブユニット(GluR1-4)mRNAの発現を正常者とALS患者の脊髄で,in situ hybridization法を用いて検討した.代謝型受容体の正常脊髄での検討では,mGluR1とmGluR5 mRNAの発現が脊髄後角に豊富で,運動ニューロンでは低いことが示された.mGluR1とmGluR5に選択性のある作動薬は脊髄運動ニューロンに対し保護作用があることが示されている.従って,運動ニューロンにおけるmGluR1とmGluR5 mRNAの発現が相対的に低いことは,運動ニューロンは他の脊髄神経細胞に比べmGluR1とmGluR5を介した神経保護作用が少ない可能性を示しており,運動ニューロンの選択的脆弱性と関係しているかもしれない.一方,正常者とALS患者の脊髄でAMPA受容体サブユニットmRNAの発現をflip型,flop型を別個に検討した.Flip型は遅い再分極を,flop型は速い再分極を有するAMPA受容体を形成することが知られている.Flip型は後角に優位に分布し,flop型は灰白質にびまん性に分布していた.ALSの前角では正常者に比べ,flop型のmRNAの減少が著明に認められ,Flip型のmRNAは保たれていた.

この結果はALSの前角においてはFlip型AMPA受容体が相対的に増加している可能性を示し,ALSの運動ニューロンは正常者の運動ニューロンに比べ再分極の遅いAMPA受容体をより多く有していることを示唆している.再分極の遅いAMPA受容体は作動薬に対してより強い毒性を介するとされている.従って,今回の研究の結果は,AMPA受容体刺激に対して,ALSの運動ニューロンは正常者の運動ニューロンよりも脆弱であることを示している.
ヌクレオソーム表面におけるDNAの回転の転写制御への関与

1.以前に、高等真核細胞内の各遺伝子上でヌクレオソームがどの領域を占めているか(並進上の位置)を詳細に決定する方法を開発したので、今回、これを補うものとして、細胞内の各ヌクレオソーム上でDNA2重螺旋のどの部位がヒストンに面しており、どの部位が溶液に露出しているか(回転上の位相)を正確に決定する方法を開発した。この方法は、細胞のX線照射およびDNA1本鎖切断のligation-mediated PCR法による解析からなる。また、上記2方法を用いて、転写活性とヌクレオソーム配置との関係を検討した。とくに、定位置に局在するヌクレオソームをプロモーター内に持つような遺伝子をとりあげ、局在ヌクレオソームのふるまいについて以下のような解析を行った。2.細胞を血清で刺激すると、c-FOS遺伝子の急速な活性化がみられるが、これにはc-FOS領域のヒストンのアセチル化、リン酸化の変化が伴っている。ヒト2倍体培養細胞を血清刺激したとき、c-FOSプロモーター内に局在するヌクレオソームに関して位置関係の変化が生じているかを検討したが、全く変化が認められなかった。このヌクレオソームは、遺伝子活性化に際して化学修飾を受けるにもかかわらず、一切の位置変化を起こさないようである。3.細胞周期のM期においては、ほとんどの遺伝子で転写は完全に停止する。M期のHeLa細胞のc-FOS遺伝子およびRNU6遺伝子のプロモーター内におけるヌクレオソームの分布を解析したところほぼランダムとなっており、間期における局在は全く失われていることが判明した。このことから、M期における転写の停止には、転写活性に対応したヌクレオソーム配置・クロマチン構造の喪失が関係していると推測している。生きている高等真核細胞内の各ヌクレオソームの表面で、DNA二重螺旋のどの部位がヒストンに面しており、どの部位が溶液側に露出しているか(回転上の位相)を決定する方法を開発した。この方法の概要は、次のようなものである。培養細胞を氷上でX線照射(600Gy)し、細胞内の水分子からOHラジカルを発生させる。その後、直ちにゲノムDNAを抽出する。ヌクレオソーム存在部位では、ラジカルの発生源となる水分子がヒストンによりかなり排除されていること、および、蛋白質がラジカルを捕捉・吸収することから、ラジカル濃度が低くなる。結果的に、DNAが溶液側に露出している部分では、ラジカルの攻撃により切断されるが、ヒストンに面している部分では防護される。コントロールとして、精製した裸のDNAをX線照射したものを準備するが、この場合は、局所的な防護は起こらない。ゲノムDNAをligation-mediated PCR法で増幅し、特定遺伝子配列上に生じたDNA一本鎖切断の正確な位置と量を、最終的にシークエンスゲル上に強弱のバンドとして塩基配列レベルで表示する。もし、特定DNA配列のヌクレオソーム表面における回転上の位相が細胞集団内で同調している場合、細胞をIn vivo照射したサンプルにのみ、DNA螺旋の周期に対応した約10塩基ごとの切断パターンがあらわれるが、このことをヒト細胞のc-FOS、HPRT、RNU6各遺伝子上で確認した。前年度までに、高等真核細胞内の各遺伝子上でヌクレオソームがどの領域を占めているかを決定する方法、および各ヌクレオソーム上でDNA二重螺旋のどの部位がヒストンに面しているかあるいは溶液側に露出しているかを決定する方法を開発した。本年度はこれらの方法を用いて、転写活性とヌクレオソーム配置との関係を検討した。ヒト細胞のc-FOS遺伝子のプロモーター内には通常ヌクレオソームが定位置に存在している。ここでは、c-FOS遺伝子の発現レベルが大きく変化する二つの例をとりあげ、その状況下におけるこの局在ヌクレオソームのふるまいを詳しく検討した。

ヒト細胞を血清で刺激すると、c-FOS遺伝子の急速な活性化がみられるが、これにはヒストンのアセチル化、リン酸化の変化が伴っている。このときプロモーター内に局在するヌクレオソームに関して位置関係の変化が生じているかを検討したが、全く変化が認められなかった。このヌクレオソームは、遺伝子活性化に際して化学修飾を受けるにもかかわらず、一切の位置変化を起こさないようである。細胞周期のM期においては、ほとんどの遺伝子で転写は完全に停止する。このときのc-FOSプロモーター内におけるヌクレオソームの分布を解析したところほぼランダムとなっており、間期における局在は全く失われていることが判明した。このことから、M期における転写の停止には、転写活性に対応したヌクレオソーム配置・クロマチン構造の喪失が関係していると推測している。
膠原病合併肺動脈性肺高血圧症における血管内皮前駆細胞の役割の解明

肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、肺血管壁が厚くなり、血管内が狭くなる病態である。膠原病における生命予後不良の病態だが、未だ原因不明である。そこで、血液中の単球に着目し、その関与を追究した。強皮症PAH例と非PAH例の血液から単球を分離し、PCRアレイ法による網羅的な遺伝子解析を行った。その結果、PAH症例では4遺伝子(CCL5、CCR6、LTBP1、OCLN)の発現上昇が認められた。これらは病変部への細胞遊走、接着、線維化に関わるため、膠原病患者における肺動脈病変の治療標的になると考えられた。MCTDや強皮症といった膠原病の難治性病態の一つである肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、肺動脈の内腔狭窄で、血管平滑筋および内皮細胞の増殖と線維化からなるリモデリングによって形成される。近年、循環血中の単球が局所にリクルートされ、血管新生や線維化病態に関わることを示す知見が集積されている。申請者の所属する研究グループは、ヒト末梢血単球のサブセット(単球由来多能性細胞)が間葉系細胞や血管内皮への分化能を獲得することを発見し、強皮症の末梢血管内腔狭窄病変の病態形成における中心的役割を果たす可能性を見出した。PAHにおける肺動脈病変の病理像も類似していることから、末梢血単球の多分化能や組織修復に関する成果を、PAH-CTDの病態解析に応用することとした。そこで、今回は末梢血単球の遺伝子発現を網羅的に検討することで、膠原病に伴うPAH病態における単球の役割を追究することを目的とした。背景因子を一致させたPAHを有する強皮症3例とPAHのない強皮症3例から末梢血CD14+単球を分離し、PCRアレイ法を用いてケモカイン、細胞外マトリックス、TGFβ/BMPシグナル、血管内皮に関わる計318遺伝子の発現を比較した。その結果、PAH症例で発現の高い17遺伝子と発現の低い17遺伝子が抽出された。発現が亢進した遺伝子の中ではケモカインとその受容体や細胞接着分子が、発現が低下した遺伝子の中では、TGFβ/BMPシグナル分子や細胞外マトリックス分解酵素関連の遺伝子が主に見出された。以上から、本研究では、末梢循環障害をもつ強皮症症例の末梢血単球を用いたが、PAHの有無により末梢血単球の遺伝子発現が異なることが示された。また、これら遺伝子の既知の機能から、末梢血単球が遊走や、接着能の亢進を介して肺動脈のリモデリングに関わる可能性が示唆された。前年度は、背景因子を一致させたPAHを有する強皮症3例とPAHのない強皮症3例から末梢血CD14+単球を分離し、PCRアレイ法を用いてケモカイン、細胞外マトリックス、TGFβ/BMPシグナル、血管内皮に関わる計318遺伝子の発現を比較した。今年度は、各遺伝子について、PAHを有する患者検体、PAHのない患者検体、および健常人検体で半定量的PCRによる2次スクリーニングを行い、PAH症例ではCCL5、CCR6、LTBP-1、OCLNの発現亢進とTGFB2の発現低下が見出された。これらの遺伝子の既知の機能から、循環血液中の細胞動員や細胞接着の亢進、抑制性TGFβ/BMPシグナル分子の低下が示唆された。以上から、本研究では、強皮症患者において、末梢血単球が遊走や、接着能の亢進を介して肺動脈のリモデリングに関わる可能性が示唆された。今後、多数例の患者検体を用いて、3次スクリーニングによる候補遺伝子の絞り込みを行う。.
体育の教授過程に関する研究(特に現象学的解析を中心として)

本研究の目的は、体育の授業過程における教師および児童の意識の変容を把握する方法を見いだそうとするものであった。過年度までの検討の結果、体育の授業における児童の意識の変容を把握する方法として、逐語記録法、カテゴリ-法、態度測定法、達成度調査法等が実施されており、これらは各研究目的と結びついて、より有効で簡便な方法が追究されている。また、これらは教師の行為の検討にも有効であることが確認されている。しかし、これらの中には児童自身にその変容の程度を聞く方法は含まれているが、教師自身により意識の変容をとらえる試みはほとんど無いことがわかった。しかも、この教師自身(すなわち授業者自身)からえられる資料に基づく研究の推進はより良い授業を目指す一助になることも確認された。したがって、本研究の目的は授業者の意識の簡便な把握方法の作成ともなる。この作成へ向けての研究授業の分析の結果得られた知見は、次の通りである。1.抽出された授業者の意識の類型は、(1)予想(2)観察、発見(3)感心、とまどい、不安、失望、怒り(4)評価、確認、判断(5)反省、対策、修正、計画(6)願い、要望であった。2.これらの類型とこれに対応する行為の類型は授業者に固有のパタ-ンが見られる。このパタ-ンの蓄積は教授過程の研究の重要な資料となりうる。3.願い、要望は授業者の教育観を明らかにする手がかりとなる。4.願い、要望が出現するのは、児童の運動技能、態度、感受性などから想起され、それぞれの向上を期待してである。5.評価、確認、判断に授業者のいわゆるこどもを見る眼があらわれるのではあるまいか。評価、確認、判断には、学習者に関するもの以外として、授業者自身、学習内容、学習環境があげられる。1.本研究の目的は,体育の教授過程を教師と児童・生徒の人間学的ひろがりとして捉え,そこでの両者の意識を把握することであった.したがって,ある意味で方法論の探究さも言うことができる.しかし,本年度,各研究機関等への訪問も含めた先行研究の検討によると,現在実施・研究されている大多数の体育の授業分析法は,あまりにも方法論が先行し,その規定要因たる目標がないがしろにされ,方法のための方法という現象が生じているように思える.この結果を踏まえ,本研究において,最初になされた事は,研究対象授業での明確な目標の設定であり,その目標に向かっての教師と児童・生徒の自己認識の把握方法の試行であった.現象学的見地より設定された目標は, 1)世界内存在としての自己の身体の知覚の発達2)自己と意識の.識の獲得3)運動の意味の把握4)他者との出会いと他者の行動に対する感受性の育成であった.2.研究授業は,本年度4回実施した.これらは,ビデオによって授業全体の流れ,教師の行動,抽出児の行動が記録された.また,授業終了時に(1)学習者全員の自己認識に関しての自由記述(2)教師の自己認識の自由記述授業終了後,ビデオ再生による(3)教師の自己認識の変化と抽出児への他者認識の変化の記述を実施してもらった.3.2の(1), (2), (3)によって得られた資料は,現象学的見地により設定された4つの目標に沿って分類され,それぞれの因子を分析・抽出中である.

4.今後は, (1) 3で得られた因子による,本年度実施の研究授業の再整理と検討, (2)(1)に基づく新たな研究授業の実施, (3)教師,抽出児,研究観察者(教師あるいは抽出児の自己認識を,先に得た因子にもとづいて外部より他者観察),による自己あるいは他者認識の記述等によって,体育の教授過程の児童の意識把握の方法を探る.1.すでに昭和62年度の研究実績の概要においても報告した通り、体育の授業を研究するにあたっては、当該の授業の目標が明確に設定されていなければならない。本年度も、体育の授業分析に関する先行研究の検討と現象学的見地より設定した授業の目標へり到達過程を教師の自己認識と他者認識、および児童の自己認識の点から追求した。2.本年度検討された体育の授業分析に関する先行研究は、カテゴリー法によるもの、態度測定法によるもの、ALT-PEシステムによるもの、の三種に分類できる。検討の結果は、批判的には次のようにまとめられよう。(1)カテゴリー法による授業分析は、その簡便さを計るうえでも、できるだけ少ないカテゴリーで、できるだけ質の高い内容を分析しうることが課題となる。(2)態度測定法による授業分析は、授業を学習者側からのみ把握することになり、教授-学習過程として成り立っている授業を明確に把らえきれるかという疑問が生じる。(3)ALT-PEスタイルによる授業分析は、ALT-PE値の意味するものが問われなければならない。いずれにしても、本年度検討された授業分析法においては、授業の目標は設定されていても、従来からのものであったり、あるいは、授業の目標設定はなされず、授業の型を検討するものであった。3.本研究において設定された現象学的見地よりの目標に沿って実施された昭和62年度および63年度の研究授業より分析・抽出された因子は次の6因子である。自己の意識、自己の身体、自己の運動、他者の意識、他者の身体、他者の運動。これらは、教師、抽出児、観察者の自己認識と他者認識の記述より導き出された。4.今後は、これら6因子に基づいた授業分析表の作成がなされ、その妥当性が、各学年および多種の教材にわたって検討される。前年度までの検討の結果、体育の授業研究において、特に授業過程の研究において、授業者自身の意識より得られた資料にもとづくものはほとんど無いことがわかった。しかも、この資料にもとづいた研究の推進は、より良い授業を目指している事の一助になることも確認された。しかし、授業者自身による現実の授業における意識の変容を簡便に得る方法は当然確立されてはいない。今年度の研究の目的はしたがってより簡便なこの研究法の作成に向けられることになる。この為の授業研究の分析の結果得られた知見は、次の通りである。・抽出された授業者の意識の類型は、(1)予想、(2)観察・発見(3)関心・とまどい・不安・失望・怒り(4)評価・確認・判断(5)反省・対策・修正・計画(6)ねがい・要望であった。・これらの類型とこれに対応する行為の類型は授業者に固有のパタ-ンが見られる。このパタ-ンの蓄積は、教授過程の研究の重要な資料となりうる。・ねがい、要望は授業者の教育観を明らかにする手がかりとなる。・ねがい、要望が出現するのは、児童個人の運動技能、態度、感受性などから想起され、それぞれの向上を期待して出てくる。・評価、確認、判断の差はつけがたい部分もある。(今回は研究者の主観によった)が、学習者に関してのこれらの差は、いわゆる教師の子どもを見る目にあたるのではあるまいか。
多変数を扱った統計教材に関する考察と授業実践による検証

ビックデータ時代といわれる今日,データから傾向を読み取り,それに基づいて課題を設定することや意思決定することは,これからの社会生活の中で必要な資質・能力である。しかしながら現在の高等学校での統計教育は,まだまだ統計の知識や技能を獲得することに偏重しており,これらの力を育成するような学習活動までは行えていない。そこで本研究では,「テクノロジーを使って分析し,グループで学習する多変数の教材が,現代人に必要な資質・能力である『多変量データから課題設定できる力』の育成に有効である」との仮説をもとに,教材を開発し,実践した。これらを学習した生徒の様相は, PPDAC探究プロセスに沿って分析し,学会等(日本科学教育学会,全附連高等学校教育部会,統計教育の方法論ワークショップ)で発表した。研究の成果は以下の3点である。(1)多変数の教材では,解決すべき問題やデータが与えられても,自らPPDACサイクルを循環させ,発展的な学習ができることが明らかになった。(2)本教材の特性を生かし,シミュレーションゲームによって生徒の学習の成果をフィードバックした。活動の様相や授業後の感想から,生徒にとって,ゲームシミュレーションによる学習の終結がよい「落としどころ」であると考察された。(3)統計先進国ニュージーランドにて,学校視察やインタビュー調査を行い,問題解決学習の評価基準について情報を収集し,検討した。次年度は,評価の在り方を再検討し,作成したルーブリックによって,生徒のレポートや発表を実際に評価し,還元したいと考えている。