hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨・軟骨系におけるNO合成酵素とサーカディアンリズム関連遺伝子の作用解明

合成ステロイド剤を末梢臓器の初代培養系や細胞株に用いるとリズム発振が誘導されることや,生体への連続投与で行動リズムが撹乱されることが知られており,GCがリズム調節を末梢臓器に伝えるメッセンジャーとしての作用があることが明らかにされた.時計遺伝子mPeriod (Per)1プロモーターにはGC応答領域があり,このサイトを介してmPer1の転写が制御されている(Koyanagiら2006).一方,FuらはPer遺伝子KOマウスで骨量が増大することを報告し,時計遺伝子perの作用として,細胞周期蛋白cyclinD1の抑制を介した骨芽細胞増殖の抑制を,さらにRANKL発現を誘導することで破骨細胞活性を上げることなどを明らかにしたが(Fuら2005),本研究ではこれらの知見を踏まえ,GCの骨量減少が時計遺伝子制御を介して行われていることを確認するため,MC3T3-E1,C2C12,10T1/2,C7,RAW264.1などのマウス由来細胞株を用いて時計遺伝子発現を検討した.すなわち,GCが時計遺伝子を誘導し細胞周期蛋白制御を調節することで骨の増殖分化に作用するかmRNAレベルで解析した.各細胞をデキサメタゾン(Dex)1-1000nMで処理し,Per1,2,3,Cry1,2,Bmal1,Clockについて定量RT-PCR解析し,特にPer1以外にもDex依存性の発現を確認できた.さらにDex処理で経時的に一過性に誘導することが確認できた.最近,造血幹細胞の骨髓からの放出やホーミングがサーカディアンリズムによる調節を受けていることが明らかにされた(Frenetteら2008).このことは骨芽細胞ニッチの時計遺伝子調節機構の存在を示唆するものであるが,われわれはPer2ノックアウトマウスを用いて,プレドニゾロン徐放性ペレットによる骨髓細胞,骨芽細胞の時計遺伝子の発現を確認した.当科で現有の実験設備は本研究を遂行するうえで困難を帰するため、本年度は実験室のセットアップから行い、細胞培養設備、生化学実験設備の整備を行った。これらに要する基本試薬などを準備したうえで、まず骨・軟骨系細胞株であるMC3T3-E1、ATDC5、C3H1OT1/2および対照株として293、HepG2、HT-1080、C2C12を入手し、まずNOSの発現レベルの検討から行った。発現の確認にはRT-PCR法を用いて行った。すでにMC3T3-E1を用いて確立したiNOS発現条件は炎症性サイトカインの処理によって誘導されるため通常の培養下での発現は認められないが、他の細胞株も同様であった。現在eNOS、nNOS、時計遺伝子群Per1、Per2、Dec1、Clockの発現検討に着手しているところであるが、条件検討中である。さらにタンパク質の発現検討を行うためにウェスタンブロット法、免疫染色法による検討を行うための設備を整え骨分化マーカー因子の抗体を入手した。時計遺伝子群の抗体はその多くが市販されていないため、入手法について模索している。さらに、組織学的解析を行えるよう硬組織標本作製の設備を整えた。本年度は実験室改装から行う必要があり、その整備に時間を費やされたが生化学的基本操作が可能となった。その間、本学ゲノム医学研究センター副センター長:須田立雄博士、病態生理部門:片桐岳信博士両氏にご指導をいただき、先端研究の情報収集に努めた。昨年Per、Cry遺伝子改変マウスの解析による報告があり、その欠損マウスで骨量が増大することが確認されている(Fu et al.Cell 2005)。単離した骨芽細胞の増殖能増大に影響していることから、時計遺伝子群が骨リモデリングの調節に関与していることが明らかとなった。今後これらの知見をもとに新たな視点での解析を進めたい。骨組織へのグルココルチコイド(GC)の作用は,in vivoにおいて骨芽細胞のRunx2.I型コラーゲンなどの発現を抑制しアポトーシスを誘導する一方で,骨髄マクロファージの増殖がGC受容体を介して抑制されるごとが報告された.(Kimら2006).さらにその抑制効果は破骨細胞前駆細胞に作用して増殖を抑制し,細胞骨格制御を介して成熟破骨細胞の骨吸収活性も抑制することが示された.ところで,合成ステロイド剤を末梢臓器の初代培養系や細胞株に用いるとリズム発振が誘導されることや,生体への連続投与で行動リズムが撹乱されることが知られており,GCが糖代謝や抗炎症作用とともにリズム調節を末梢臓器に伝えるメッセンジャーとしての作用があることが明らかとなってきている.最近では,時計遺伝子mPeriod(Per)1プロモーターにGC応答領域があり,このサイトを介してmPer1の転写が制御されていることが明らかにされた(Koyanagiら2006).FuらはPer遺伝子KOマウスで骨量が増大することを報告し,時計遺伝子perの作用として,細胞周期蛋白cyclinD1の抑制を介した骨芽細胞増殖の抑制を,さらにRANKL発現を誘導することで破骨細胞活性を上げることなどを明らかにしたが(Fuら2005),本研究ではこれらの知見を踏まえ.GCの骨量減少が時計遺伝子制御を介して行われていることを確認するため,骨芽細胞株および間葉系幹細胞株を用いて時計遺伝子発現を検討している.

現在,GCが時計遺伝子を誘導し細胞周期蛋白制御を調節することで骨・軟骨の増殖分化に作用するかなどを解析中である.また,NOがリズム発振を調節することやNOS活性にリズムがあることも報告があることから(Dingら1994,1997;Tunctanら2002),NOドナーや阻害剤を用いて時計遺伝子に影響するかなども検討予定である.合成ステロイド剤を末梢臓器の初代培養系や細胞株に用いるとリズム発振が誘導されることや,生体への連続投与で行動リズムが撹乱されることが知られており,GCがリズム調節を末梢臓器に伝えるメッセンジャーとしての作用があることが明らかにされた.時計遺伝子mPeriod (Per)1プロモーターにはGC応答領域があり,このサイトを介してmPer1の転写が制御されている(Koyanagiら2006).一方,FuらはPer遺伝子KOマウスで骨量が増大することを報告し,時計遺伝子perの作用として,細胞周期蛋白cyclinD1の抑制を介した骨芽細胞増殖の抑制を,さらにRANKL発現を誘導することで破骨細胞活性を上げることなどを明らかにしたが(Fuら2005),本研究ではこれらの知見を踏まえ,GCの骨量減少が時計遺伝子制御を介して行われていることを確認するため,MC3T3-E1,C2C12,10T1/2,C7,RAW264.1などのマウス由来細胞株を用いて時計遺伝子発現を検討した.すなわち,GCが時計遺伝子を誘導し細胞周期蛋白制御を調節することで骨の増殖分化に作用するかmRNAレベルで解析した.各細胞をデキサメタゾン(Dex)1-1000nMで処理し,Per1,2,3,Cry1,2,Bmal1,Clockについて定量RT-PCR解析し,特にPer1以外にもDex依存性の発現を確認できた.さらにDex処理で経時的に一過性に誘導することが確認できた.最近,造血幹細胞の骨髓からの放出やホーミングがサーカディアンリズムによる調節を受けていることが明らかにされた(Frenetteら2008).このことは骨芽細胞ニッチの時計遺伝子調節機構の存在を示唆するものであるが,われわれはPer2ノックアウトマウスを用いて,プレドニゾロン徐放性ペレットによる骨髓細胞,骨芽細胞の時計遺伝子の発現を確認した.
循環器系病変における歯周病原性細菌が及ぼす機構についての解析

(1)歯周病原性細菌の循環器系疾患部位からの検出近年、歯周病の循環器系疾患への関与が注目されている。本研究の目的は、循環器系疾患、特に難病の一つであるバージャー病の病変組織から歯周病原性細菌の検出を調べることであった。92.9%(13/14)の病変部位及び全員の患者の口腔からPCR法で歯周病原性細菌が検出された。特にT.denticolaは85.7%(12/14)の閉塞動脈から検出された。コントロールの7例は前例歯周病菌陰性であった。14名のバージャー病患者は全員中度から重度の歯周病を診断された。今回調べたバージャー病患者は高い頻度で歯周病を診断され、病変部位の閉塞動脈より高い割合で歯周病原性細菌が検出されたことにより、今まで病因不明の難病であったバージャー病は口腔内細菌特に歯周病菌の慢性感染に関わると(2)歯周病原性細菌の静注による動脈血栓発症に関する研究血管組織に於ける歯周病原性細菌の影響を解明するために、動物感染モデルの作成を行った。生後(9)10週齢の雄性Wistarラット12匹を用って、代表的な歯周病原性細菌P.gingivalisを2週間にわたり皮下ポンプから持続的にラット頚静脈に注入した。注入開始2週間後及び4週間後に動脈を採取し、病理検査及びPCR検査を行った。病理的所見ではすべての動脈の壁構造はよく保たれていたが、動脈内腔に器質か初期の血栓を認めた。PCR法ではラットの動脈検体からP.gingivalisを検出された。この動物実験の結果より、歯周病細菌は動脈血栓の発症に関与することを示唆された。近年の研究によると歯周病などの慢性感染症はアテローム性動脈硬化症や、その他の血管疾患に関与することが示唆されてきた。歯周炎の血管疾患への関与を調べるために,1.血管疾患を有する患者において,歯周病の有無と程度を調べる。2.血管疾患罹患部組織及び唾液・歯肉縁下プラークから歯周病原性細菌を検出する。結果:PCR法で71.9%(161/224)の血管疾患部位,97%(130/134)の口腔内より歯周病原性細菌が検出された。血管疾患部位及び口腔内から検出された各歯周病原性細菌の割合は、P. gingivalis :53.1%(119/224)と86.6%(116/134); T. denticola :51.3%(115/224)と76.1%(102/134)。T. denticolaの口腔内からの検出率と血管疾患部位の検出率が有意に相関する(P=0.002,Spearman test)。2.血管疾患患者の77.6%が4mm以上の歯周ポケットを,91.8%が3mm以上の臨床的アタッチメントロスを示した。3.血管疾患の1つであるバージャー病を有する14名の患者は中度から重度の歯周炎を示した。その中に12人の疾患部位からT. denticolaを検出された。考察:今回調べた血管疾患患者において、殆どの歯周組織の状態は悪かった。血管疾患部位及び口腔内より高い割合で歯周病原性細菌遺伝子が検出された(特にP. gingivalisとT. denticola)。細菌性酵素であるP. gingivalisのジンジパインなどは赤血球の凝集を促し血栓の形成を促進する可能性が知られ、これらを含めた菌体成分は、アテローム性動脈硬化症の病因や大動脈瘤の形成過程に関るかもしれない。可動性細菌の1つであるT. denticolaはバージャー病に関与するかもしれない(1)歯周病原性細菌の循環器系疾患部位からの検出近年、歯周病の循環器系疾患への関与が注目されている。
大腸菌O157におけるプロファージとプロファージ様エレメントの誘発と水平伝達

腸管出血性大腸菌O157Sakai株が保有する18種類のプロファージに関して、以下の解析を行った。1)大腸菌O157堺株が保有する18種類のプロファージのゲノム配列の詳細な再解析2)誘発可能なファージ検出のためのマイクロアレイ解析3)染色体から切り出されたファージゲノムのPCRによる検出4)リアルタイム定量PCRによる細胞内及びファージ粒子内に存在するファージゲノムDNAの定量5)染色体から切り出されてファージ粒子内にパッケージされると考えられたプロファージへのCp耐性遺伝子の挿入6)Cp耐性遺伝子を付加したプロファージの大腸菌K-12株への伝達能の解析以上の解析の結果、明らかな構造的欠陥を有する複数のプロファージが、ゲノムからの切り出し、複製、ファージ粒子内へのパッケージング能を有することが明らかとなった。さらに、少なくとも3種類のプロファージがK-12株に伝達されることも明らかになった。この予想外の結果は、細菌のゲノム上にしばしば存在するdefectiveなプロファージがただの残骸でなく、潜在的な水平伝達能力を持つことを初めて示したものである。同時に、この結果はゲノム上に複数存在するdefectiveなプロファージ間で、遺伝子産物のin transでの供給など、様々な相互作用があることを示すものである。さらに、これらの解析の中で、O157のStx1ファージであるSp15とStx2ファージであるSp5との間で、高頻度の組換えが生じ、新しいStx2ファージが生じることを明らかにし、その組換え部を特定した。また、大腸菌O157の病原性発現を制御すると予想される新規の調節遺伝子や、これまで報告されていない全く新しいタイプのファージの複製タンパク質と発現調節タンパク質を発見した。今後、さらに詳細な解析を行う必要があるが、いずれも重要な発見である。当初の計画どおり、以下の解析作業を終えた。1)大腸菌O157堺株が保有する18種類のプロファージのゲノム配列の詳細な再解析2)誘発可能なファージ検出のためのマイクロアレイ解析3)染色体から切り出されたファージゲノムのPCRによる検出4)リアルタイム定量PCRによる細胞内及びファージ粒子内に存在するファージゲノムDNAの定量5)Sp5欠失体の作成6)Sp5欠失体を用いたプロファージ誘発能の解析その結果、明らかな構造的欠陥を有する複数のプロファージが、ゲノムからの切り出し、複製、ファージ粒子内へのパッケージング能を有することが明らかとなった。また、この結果はゲノム上に複数存在するdefectiveなプロファージ間で様々な相互作用があることを示すものである。いずれもきわめて重要で画期的な研究成果である。現在論文作成中であり、レベルの高い雑誌に掲載される可能性が非常に高いと思われる。さらに、上記の解析系を確立したことで、今後、もう一つの主要な実験計画である「種々の抗生剤暴露時のファージ誘発能の系統的解析」を行う体制も整った。また、以上の解析の過程で、大腸菌O157の病原性発現を制御する新規の調節遺伝子や、これまで報告されていない新しいタイプのファージの複製タンパク質と発現調節タンパク質を発見した。今後、さらに詳細な解析を行う必要があるが、いずれも重要な発見であり、論文発表が期待できる。
大腸菌secY変異の生化学的解析を通じた蛋白質膜透過の分子メカニズムの研究

大腸菌における蛋白質膜透過反応の研究において、遺伝学的に解析されてきた種々のSec変異蛋白質を精製し、in vitroにおいて生化学的に分析することは、最も待たれていることの一つである。本研究では、変異SecYとそれらを含む蛋白質膜透過装置複合体の精製と、その生化学的諸性質の比較が目的であった。現在、His_6タグ法を用い、野生型とSecY39など6種の変異SecY膜透過複合体を、90%以上の純度まで精製し、また、野生型SecE単量体の精製にも成功した。精製した野生型SecY複合体については、その膜透過活性が再構成プロテオリポソームを用いて確かめられた。今後は、各々の変異体について、各種変異体の基質に対する親和性、SecA ATPaseに対する親和性、SecAの膜をはさんだダイナミズムへの各変異の影響、後述のHis_6-OmpA前駆体のNi^<2+>_-感受性膜透過を用いた膜透過初期過程における各変異の影響等を比較してゆきたい。一方、本研究では、in vitroにおける膜透過反応の基質として、His_6ダク法により大腸菌外膜蛋白質OmpAの分泌前駆体を精製したが、このHis_6タグは、OmpA成熟体のN_-末端付近に挿入したときだけ、pro-OmpAのin vitroでの反転膜小胞への膜透過にNi^<2+>感受性をあたえることが明らかとなった。阻害効果はヒスチジンの添加で解除され、膜透過のごく初期の分泌前駆体の内膜へのターゲティング以降で、かつシグナル配列切断以前に起こっていることが明らかとなった。Ni^<2+>はSecYとHis_6-OmpAとの化学的架橋を妨げる一方、基質認識を甘くする考えられているsecY遺伝子上のprlA3変異より調製した膜小胞中では、Ni^<2+>の効果は部分的に抑圧された。以上の結果は、SecYEG複合体による膜上での基質認識を、in vitroで示めした点で重要であると考えられる。本年度は次年度の準備段階としての性格が強く、めざましい結果はまだ得られていないが、研究はほぼ予定通りに進行している。現在のところ、可溶性因子としてのSecAとSecB、基質としてのc-mycおよびHis_6タグを持つ数種のOmpA前駆体、そして、SecE単量体について精製が終了している。変異体SecYとしては、SecY24(ts)、SecY39(cs)、SecY104(cs)、SecY122(cs)、SecY125(cs)、SecY205(cs)、SecY^<-d>1の7種類を解析の対象として選んだ。SecE/SecY/(SecG)複合体は、SecY24を含むもの以外His_6-SecE/SecY過剰生産株からNi-NTA-agaroseにより部分的に精製された。野生型複合体について、混在蛋白質を除くためQ-Sepharoseカラムが次の精製ステップとして有効であることが明らかとなり、これによって、野生型および変異型の分泌装置が精製できると考えている。secY24変異については、当研究室の馬場らがin vivoで複合体形成に問題があるというデータを出しており、これと良い一致を示す。

SecY単量体については当初のGST融合遺伝子を用いた精製法を変更し、SecEと同様に、N′末端にHis_6タグを付加してNi-NTA-agaroseを用いて精製中である。この融合遺伝子の融合部位にはFactor Xaの認識部位を導入してあり、His_6タグを除去することができる。こうした実験に付随して、精製したSecAなどの可溶性因子の活性や基質(pro-OmpA)の膜透過能確認のため、反転膜小胞を用いたin vitro膜透過反応解析も行っている。この解析の中、pro-OmpAの膜透過がHis_6タグの導入位置がシグナル配列のごく近傍(シグナル配列切断位置より20残基ぐらいまでの成熟体領域)にあるときに100μM程度のNi^<2+>に感受性となることが明らかとなった。Ni^<2+>の影響はin vitro translocation反応のごく初期にのみ見られることから、His^6タグへNi^<2+>が配位する結果、成熟体部分のシグナル配列近傍に正電化が導入され、シグナル配列活性が弱められえためと考えられる。事実、Ni^<2+>の存在下では分泌装置のpro-His_6-OmpAに対する親和性は低下しており、また、secYのもう一つのタイプの変異であるprl変異、つまりシグナル配列認識が甘くなる変異は、この阻害をin vitroにおいて抑えることができる(本年度分子生物学会にて発表)。こうしたことから、成熟体のN-末端領域にHis_6タグをもつpro-OmpAは分泌装置が基質を認識する過程を解析する上で、生化学的な新しい手段を提供するものとして期待し、この方面の解析にも視点を向けようと計画している。大腸菌における蛋白質膜透過反応の研究において、遺伝学的に解析されてきた種々のSec変異蛋白質を精製し、in vitroにおいて生化学的に分析することは、最も待たれていることの一つである。本研究では、変異SecYとそれらを含む蛋白質膜透過装置複合体の精製と、その生化学的諸性質の比較が目的であった。現在、His_6タグ法を用い、野生型とSecY39など6種の変異SecY膜透過複合体を、90%以上の純度まで精製し、また、野生型SecE単量体の精製にも成功した。精製した野生型SecY複合体については、その膜透過活性が最構成プロテオリポソームを用いて確かめられた。今後は、各々の変異体について、各種変異体の基質に対する親和性、SecA ATPaseに対する親和性、SecAの膜をはさんだダイナミズムへの各変異の影響、後述のHis_6-OmpA前駆体のHi^<2+>-感受性膜透過を用いた膜透過初期過程における各変異の影響等を比較してゆきたい。一方、本研究では、in vitroにおける膜透過反応の基質として、His_6タグ法により大腸菌外膜蛋白質OmpAの分泌前駆体を精製したが、このHis_6タグは、OmpA成熟体のN-末端付近に挿入したときだけ、pro-OmpAのin vitroでの反転膜小胞への膜透過にNi^<2+>感受性をあたえることが明らかとなった。阻害効果はヒスチジンの添加で解除され、膜透過のごく初期の分泌前駆体の内膜へのターゲティング以降で、かつシグナル配列切断以前に起こっていることが明らかとなった。Ni^<2+>はSecYとHis_6-OmpAとの化学的架橋を妨げる一方、基質認識を甘くする考えられているsecY遺伝子上のprlA3変異より調製した膜小胞中では、Ni^<2+>の効果は部分的に抑圧された。以上の結果は、SecYEG複合体による膜上での基質認識を、in vitroで示めした点で重要であると考えられる。
潰瘍性大腸炎は潰瘍性小腸大腸炎である(DSS誘導小腸大腸炎モデルの作製)

本研究の目的は、潰瘍性大腸炎が大腸に限局する疾患であるとの認識をあらため、小腸にも病変を生じうる疾患であると捉えなおすことにより病因・病態を解明しようとするものである。その手段として、Dextran sulfatesodium(DSS)誘導小腸大腸炎モデルを作成しようというものである。今年度は以下の項目につき検討を行った。1.DSS経口投与による上皮細胞の遺伝子発現2.当初、ラットによりモデルを作成し検討する予定であったカミ、単なる回腸瘻モデルであればマウスでも耐術可能ではないか、という点、および将来各種遺伝子改変マウスを用いることができるという利点から、マウスにモデル作成を試みた。しかし、エーテル麻酔深度の調節および術後の回復が十分でなく、検討に耐えうるモデルの作製はできなかった。3.回腸嚢炎臨床像の検討術後の臨床経過について詳細に検討を行った。その結果、現時点では術後症例の約50%に回腸嚢炎が発症すること、一部の症例では再燃を繰り返し抗生剤依存性、抗生剤抵抗性の症例が出現することが明らかとなった。1.粘膜炎症評価のための組織学的炎症グレードの確立:まず、通常の3%DSS自由飲水1週間投与により、DSS誘導大腸炎を型どおり作成し粘膜炎症評価のための組織学的炎症グレードの確立を行った。実験腸炎の組織学的評価基準はいろいろあるが、今回Okayasuらの基準に準拠し0.正常、1.多核白血球を含む炎症細胞の局所的浸潤、2.炎症性細胞浸潤、腺上皮の脱落と陰窩膿瘍、3.潰瘍形成により点数化を行うこととした。2. DSS至適投与量、投与期間の検討:通常のDSS誘導大腸炎モデルにより、投与濃度、投与期間を検討した。3%自由飲水では5日間投与で上記の炎症の点数化により0.7前後、10日間で1.7から2.0前後の高度の炎症を認めた。一方、5%の自由飲水では炎症が強く7日間で半数以上が死亡した。したがって、今後の一連の実験は3%DSS投与を中心に行うこととした。3.ラットを用いた大腸全摘術モデルの確立:当初、直腸の全切除により手術死亡が多数見られたため、残存直腸の長さを変えざるを得なかった。その結果、残存直腸5-10mm程度で30-40%の死亡であった。そこで、本術式後にさらにDSS投与は難しい可能性が高いと判断された。そこで、まず大腸空置モデルにDSS投与を行うこととした。
コンピュータによる日本人大学生の英語読解語彙力の調査研究

この研究では、日本人大学生英語学習者を対象にして、リーディングを通じてそれぞれの学習者の語彙力のプロフィールを作成し、学習者の不足している語彙をコンピュータと携帯電話などのモバイル・デバイスでのタスクで提供して、語彙力を向上していくことを目的とした。今までは、学習者はリーディング中にどのように単語を調べるのかがほとんど知られていなかったため、学習者はどの単語を見るかを具体的に記録を残すためのシステムが開発され、調査を行った。(1)6月から9月まで、システム作成に取り組んだ。基本デザインができてから、語彙の選択1データベースへの入力を行った。(2)研究代表者の一年生向けの早稲田大学のGateという英語の2クラス(46人)の学習者で調査を行った。リーディング教材は選択した500語彙の入った自作のものとなった。語彙の上達はこの500語粟を中心とした独自のテストで10月の事前調査と1月の事後調査によって調べた。事前調査と事後調査の間の期間の学習者のタスク中のログ記録によって、学生がどのように知らない単語を調べたかを調べた。(3)10月11月の学習者の行動を分析し始めて、11月末にJALT学会大会で中間発表を12月にさらに分析したデータをタイで開催されたGloCALL学会で中間発表を行った。(3)1月末に事後調査終了後、授業中に学習者の感想をアンケートで聴取した。(4)2月3月に事前調査と事後調査の結果と共に、ログ記録とアンケートの分析を行った。(5)「語彙力の上達」と「学習者の注釈の使用行動」と「ソフトの適正の調査」の3つのテーマに沿って、分析を行った。平成22年度に向けてのデータ入力を始めた。(a)「語彙力の上達」は、事前と事後の調査を元にして、学習者プロフィールのソフトの効果を分析した。(b)学習者の注釈の使用行動」は、記録ログの分析のよって、学習者はどのときに注釈を使用し、学習者の注釈形式の好みを調査した。(c)「ソフトの適正」は、具体的にソフトの長所・短所を調べて、学生のアンケートと研究者の観察に基づいて、ソフトそのものを調査した。(6)平成21年度は、国内学会であるJALT学会大会で、予定通り途中経過発表をした。JACET大学英語教育学会と米国のTESOL学会で発表を予定していたが、役職の仕事の都合により出席できなかった。その代わりに、同等レベルのGloCALL学会で発表をすることができた。今までは、学習者はリーディング中にどのように単語を調べるのかがほとんど知られていなかったため、学習者はどの単語を見るかを具体的に記録を残すためのシステムが開発された。学習者用のインターネット上のインターフェイスと語彙コーパスのデータベースを構造して、英単語、英語の意味、和訳、音声、意味を表す例文、定義のコーパスを作成した上でリーディングの文章の選択・作成を行った。このシステムで英文を読むと、データベースにある単語は自動的に注釈がつき、学習者が自由にクリックして、上記の情報を閲覧することができる仕組みとなった。システムを通じてクリックされた単語の全てがそれぞれの学習者のプロフィールとなり、クリックされた単語を元に自動的に語彙のタスクが作成されるため、終了後にパソコン又は携帯電話でそのタスクをすることができる。このシステムを利用し、学習者のプロフィールを作成し、学習者は実際にどのような単語を知り、どのような単語を調べることを調査した。研究者の一年生向けのクラス(合わせて79名)の学習者で2ヶ月の期間で調査を行った。語彙の上達は事前・事後調査によって調べた。リーディングは研究者によって作成したものと、学生が自由にインターネットから取り出したものの組み合わせとなった。学習者は2ヶ月の間ライティングのタスクを4回行い、リーディングで調べた単語と、ライティングで使用した単語の比較を行った。終了後は、学習者のシステム、携帯又はパソコンで行ったタスクなどについての感想をアンケートで聴取し、実際のパターンも細かく分析した。
地域自立支援協議会における障害者の居住支援活動と福祉コミュニティの形成

本研究の目的は、地域主体の協働に基づく居住支援のありかたを実証的に明らかにすると共に、地域自立支援協議会の活動を通じて、福祉コミュニティが形成される側面を考察することである。全国の地域自立支援協議会の取り組みを調べたところ、居住に関するテーマを扱う協議会は限られているが、実際に活動している協議会は主に4つの活動に分類でき、行政機構や運営の脆弱性といった共通課題が明らかになった。また、協議会参加団体の居住支援活動実態と課題把握を行ったところ、多層的な活動内容と主体間の連携の必要性が明らかになり、居住問題解決にむけて福祉コミュニティの形成されはじめていることが考察された。本年度は、地域自立支援協議会において、居住関連部会を設置している自治体に対して、ヒアリング調査を実施した。昨年度の全体的な状況把握において、居住関連の事業化や部会設置の進捗がすすんでいない状況が明らかになったため、本年度は先進的な取り組みを実施している自治体へヒアリング調査を実施した。対象とした自治体は、居住サポート部会や、住まいワーキンググループ等、地域の居住の場の確保や、居住支援に関して組織的に取り組んでいる、もしくは取り組もうとしている5か所であった。自治体担当者、協議会メンバーや事務局にヒアリングを実施した結果、以下のような課題点と、部会設置にむけた意向が明らかになった。まず、課題点としては地域自立支援協議会自体の運営が、自治体および地域組織にとって大きな負担となっている点である。障害者に関連する地域課題は、多種多様にわたっており、自立支援協議会はすべてに取り組まねばならないため、住まいの課題解決までには至っていない。その理由として、事務作業の負担の増大、地域福祉団体の協力や参加の形骸化が指摘された。現段階では協議会自体の運営方針や位置づけをきちんと地域に浸透させる点に労力を払っている状況である。一方、居住関連部会を設置している協議会では、課題解決にむけて活発な取り組みがみられるものの、関連主体の協力参加についての課題を抱えていた。自治体の住宅部局については情報交換にとどまっており、協議の場への参加はみられなかった。地域の不動産事業者についても、情報提供への協力を仰いでいるものの協議会への参加を促すまでには至っていなかった。しかしながら、協議会では、居住関連の課題の重要性は認識しており、今後とも取り組むべき課題であるとの共通認識がみられた。研究開始初年度において、まず全国の地域自立支援協議会の取り組みを調べたところ、居住に関連する部会設置が一部に限られていることがわかり、その原因として協議会の運営体制の脆弱性や、課題の優先順位が低いこと、福祉部局と住宅部局の連携の困難さが挙げられた。次いで、居住部会を設置している協議会にヒアリング調査を実施し、部会の活動内容をまとめたところ、大きくは、圏域内の居住関連の地域資源の整理、研修会の開催、居住ニーズ調査、居住支援関連制度の設置に分類できた。一方で、居住のテーマの絞りづらさや、成果の見えにくさ、事業者や家主との連携不足が課題として挙げられており、部会設置にいたったものの、単年度の取り組みにとどまる協議会もみられた。最終年度は地域自立支援協議会の居住関連の部会において、協議会参加団体の居住に関連する地域の活動実態と居住に関する課題把握を行い、居住問題解決にむけた福祉コミュニティのありかたを検討した。具体的には、札幌市厚別区地域自立支援協議会の地域部会に実際に参画し、参加団体から地域の居住課題を抽出し、その解決にむけて主体間の連携の可能性や部会活動の方向性を議論した。その結果、現状では障害者の住まいについての地域理解や公民連携は進んではいないが事業者、利用者、支援団体、行政とも、居住の問題解決のプロセスにおちて福祉コミュニティの形成が不可欠であるとの意識があることがみてとれた。本年度は、地域自立支援協議会における住居確保への取り組みの実態把握として、まず既存の調査資料や、各都道府県の行政資料を中心として、協議会の実態の把握を行った。制度化以降、協議会の組織化はすすんでおり、制度の主旨どおり協議会によって様々な組織運営形態や、活動内容などがみられた。また全体をみると、住居に関する課題に対して部会を設置して専門的に取り組む協議会の数は少なく、多くの協議会では、くらし部会や地域移行部会のなかで一つのテーマとして取り上げられていることが明らかになった。しかしながら、その一方で、居住部会を設置して、居住サポート事業者と連携しながら取り組んでいる協議会や、住宅セーフティーネット法に基づく居住支援協議会と密接に連携しながら活動をしている協議会もあり、障害者の居住に関する取組に対して地域間の格差がみられた。その原因として、そもそもの障害者の地域居住ニーズの少なさや、空き物件の状況、居住問題への関心の少なさ、協議会活動が初期段階にあるいことなど複合的な要因が考えられ、これらを整理していくことが、今後の本研究の目的からしても重要な点である。

また、居住に関して取り組んでいる協議会では、居住サポート事業に取り組んでいる相談支援事業者が協議会のメンバーとなっている場合は、不動産系団体との連携はスムースにはかられるが、それ以外の場合は、居住ニーズの調査から開始し、現段階では具体的な支援事業までは至っていない協議会がみられ、活動内容についてもばらつきがみられた。本年度は3年間の研究期間のうち2年目であり、1年目の文献調査および予備調査を終えて、地域自立支援協議会で積極的に居住支援に取り組んでいる団体に対して、先行的にヒアリング調査を実施した。全国的なアンケート調査の実施にむけて、調査票の作成をすでに終えており、配布と回収の手筈を整えるだけの段階であり、当初の目的よりもすこし遅れているが、全体としては研究は順調に進捗している。本年度は、居住支援部会を設置している協議会にアンケートを試むことを試みようとしたが、都道府県レベルでは、市町村もしくは圏域ごとの協議会設置の有無は把握しているものの、協議会の活動内容まで把握しているケースが少なく、部会を設置しているかどうかの判断が困難であったため、調査対象の絞り込みが困難であった。そのため、無作為抽出でのアンケートも検討したが、居住部会の設置自体がすすんでいないことをふまえ、有効な回答を得づらいと想定されたため、アンケート調査は見送った。また、協議会の運営団体や連絡先も、市町村内の保健福祉関連課や相談支援事業者など様々であることも、情報の把握に手間取った理由である。今後の研究の推進の方向性として、最終年度にあたる平成25年度には研究結果のとりまとめを行う。具体的には、全国の地域自立支援協議会へのアンケート調査の結果を整理分析したうえで、先進的な事例調査をあわせて、自立支援協議会における居住関連の課題と、住居確保にむけた有効な方策を明らかにする。また、協議会へ参加する住居確保に関連する事業者についての調査も可能な限り実施したい。さらに、これまでの調査に協力していただいた協議会での住まい部会の立ち上げに参加し、居住支援活動の実践にもかかわる予定である。今後の研究の推進方策として、まず居住支援に積極的に取り組む団体に対して、個別のヒアリング調査を実施して、その実態の把握や連携に関する課題を明らかにすることに努めたい。協議会への個別調査によって、協議会に参加している福祉系の団体や、不動産系の団体が具体的に明らかになり、協議会との協力のもと、参加団体に対するアンケート調査が可能であると思われる。また、地域自立支援協議会の居住支援に対する全体的な傾向を把握するため、すでに先行的な調査を行っている北海道や、勤務先に近い近畿2府4県に対して協力を求める予定である。本年度は、札幌市厚別区の地域自立支援協議会への定期的な参加を予定しており、旅費が発生する。また、全国アンケート調査の入力作業のために謝金も必要である。次年度は、居住に関する部会を設置している協議会への個別ヒアリング調査が基本となるため、国内旅費の支出が多くなる予定である。上記のような協議会は全国的に散らばっており、また具体的な活動内容や、参加団体への調査協力を求めるために、現地を訪問しての聞き取りが中心となる。
東アジア沿海地域における民俗文化再生過程の人類学的研究

本研究では、中国文明圏に属してきた広義の東アジア沿海部における最近の社会変動に関し、文化人類学的な現地調査により、以下の諸点について分析を行った。1)近代化、経済のグローバリゼーションの中での地方民俗文化の再創造過程及びその特徴。2)再活性化した民俗文化と中華文明及び文化のグローバリゼーションとの相互関係。即ち、文化の中心-周縁関係の変容又は文化の個別化と画一化の間の相互作用の分析。尚、各分担者は、それぞれ調査の成果を論文や口頭発表などによってそれぞれ明らかにしているが、このほか、平成12年12月には、本研究と密接に関わってきた海外の研究者を招聘し、ワークショップを行い、分担者全員によって研究成果のとりまとめを行った。その結果、解明された事柄の中で重要な点を、以下に3点とりあげる。1.長期にわたって民族が錯綜して混在してきた地域では、ある一群の人々のもつ慣習は、様々な民族の慣習が入り乱れた様相を見せる。即ち、民族をある特定の慣習や伝統と言う枠組みから規定することには限界がある。2.ベトナムや中国のように急激な経済の改革開放が進みつつある地域では、国家に対する周縁の関係に変容がみられる。地方は、従来のように中心を志向するのではなく、むしろ中心と一定の距離を保つことにより、地方としての文化の独自性を主張し、新たな文化の中心となることを志向している。3.東アジアのように、かつて中華文明という求心的な文明が存在していた地域では、儒教のような宗教性も併せ持つ強固なイデオロギーによって抑圧あるいは疎外されてきた「民俗文化」が自己主張を始める際には、民間信仰がそれを代表する傾向がある。本年度は、初年度でもあるので、基礎研究を心がけた。年度の初めにあたって、まず研究連絡会議を開き、本研究の趣旨、目的を分担者の間で再確認した後、実施計画の細部について意見の交換をし、また次年度以降を踏まえた全体を見渡す長期的な見通しを話し合った。実地調査については、末成、Chu、中西、李がベトナムを、三尾が台湾、三尾、伊藤、本田が中国、田村が韓国へ渡航した。末成はベトナムで、これまでの研究成果を元にしてハノイ近郊のベトナム人村落についての基礎調査を範囲を拡大して行い、またChuとともに周辺の少数民族村落にも足をのばし、比較研究のための基礎的データを収集した。中西は、南部においてベトナム人村落で改革・開放の波の中で復活著しい民間信仰の実態について調査を行った。李は、これまでの韓国、沖縄での調査経験を生かし、ベトナムという新たなフィールドで韓国系企業をターゲットにそこではたらくベトナム人と経営者との民族間関係にかかわる基礎的調査を行った。伊藤と本田は、やはり韓国や中国東北部の朝鮮族の調査経験を生かし、北京近郊の朝鮮族の企業を中心としたネットワークについての基礎調査を行った。三尾は、従来から行っている中国と台湾の漢民族の民俗文化、特に民間信仰の比較研究を続行した。中国側での調査は〓でも共同で調査を行った。田村は、中国とその周辺の諸国に見られる民間信仰において、中華文化の影響と地域の独自性との関係を探るために、今年度は韓国で調査を行った。なお、清水、瀬川、馬は今年度はそれぞれの国内において民間信仰とエスニシティについて文献の渉猟などの基礎研究を行った。本年度は、第2年度であるので、昨年度の基礎研究にもとづいて各自研究の方針を絞り込んで、より深い実地究研ーフィールドワークーを実施した。末成は、Chuとともに、ベトナムにおいてこれまでのハノイ近郊のベトナム人村落についての基礎調査及び、少数民族村落の調査を続行した。中西は、ベトナム南部の地域における民間信仰の復興の実態に関して村落における定点観測を行うとともに、広域にわたるサーベイも実施し、より広い視野からの研究に心がけた。田村は、中西と同様の視点で主に、ベトナム北部村落に重点を置いて調査を行った。

李は、前年から開始したベトナムにおける韓国系企業における韓国人経営者とベトナム人との関係についてより深い調査を行った。そこにおいては、同じ中華文明圏に属してきたという類似性と、異なる国の植民地となり、異なる政治体制を経験してきたという相違性が、民族間関係にどのような影響を及ぼしてきたが研究の重点となった。三尾は、本プロジェクトで重点がおかれているベトナムにおいて、中国研究の専門家としてベトナムの文化に与えた中華文明の影響と、近代化の波の中でのベトナム文化の変容について研究した。ベトナム北部では、ベトナム人の村落における文化に対する中華文明の影響を、中南部では、主に華僑・華人社会のベトナムにおける変容を調査した。清水は、台湾において先住民文化の変容に関して資料収集を行った。伊藤は、前年度から開始した北京近郊の朝鮮族の企業を中心としたネットワークについての調査を行い、長年フィールドとしてきた韓国における企業のネットワークとの比較研究を推進した。瀬川は、今年度も国内において民間信仰とエスニシティについての文献による基礎研究を深めた。本年度は、最終年度であるので、昨年度までの基礎研究や実地研究を更に深め、研究の成果をまとめていくことを最重点とした。末成は、田村、李、三尾は、ベトナムにおいて、地域による文化の相違、近代化の流れの中での主に宗教を中心とした民俗文化の復興の様相、中華文明に対して周縁的な位置を占めてきた韓国とベトナムにおける人間関係のネットワークのあり方などについて調査を行った。清水は、台湾において先住民文化の変容とエスニシティに関して資料収集を行った。伊藤は、韓国における企業のネットワークの研究を行い、昨年度北京近郊で行った朝鮮族の企業ネットワークとの比較研究を推進した。瀬川は、馬とともに中国の海南島を中心として、経済開放政策の中での中国の地方文化の海外との繋がりの強化、民俗文化の再創造について研究を行った。尚、12月に本研究と密接に関わってきた海外の研究者を招聘し、ワークショップを行い、研究成果のとりまとめを行った。その結果、以下のようなことが解明された。1.長期にわたって民族が錯綜して混在してきた地域では、ある一群の人々のもつ慣習は、様々な民族の慣習が入り乱れた様相を見せる。即ち、民族をある特定の慣習や伝統と言う枠組みから規定することには限界がある。2.ベトナムや中国のように急激な経済の改革開放が進みつつある地域では、国家に対する周縁の関係に変容がみられる。地方は、従来のように中心を志向するのではなく、むしろ中心と一定の距離を保つことにより、地方としての文化の独自性を主張し、新たな文化の中心となることを志向している。3.東アジアのように、かつて中華文明という求心的な文明が存在していた地域では、儒教のような宗教性も併せ持つ強固なイデオロギーによって抑圧あるいは疎外されてきた「民俗文化」が自己主張を始める際には、民間信仰がそれを代表する傾向がある、
解像度に依存しない分布表現を用いた材料内部の物性値分布の推定手法の開発とその応用

非破壊検査や物理探査において推定対象とする領域は,多くの場合,材料物性値の急激な変化と緩やかな変化が混在している.従来の推定手法では,材料物性値の分布を離散的に取り扱っており,この様な特徴の異なる変化が混在する分布を,高精度かつ効率的に表現することは困難であった.本研究では,離散的な取扱いを行わずに領域内部の材料物性値の分布を表現する方法を提案し,それを用いた材料物性値の分布の推定手法の開発を行う.また,開発を行う推定手法の新たな展開として,推定手法の数値シミュレーション手法への適用可能性について検討する.非破壊検査や物理探査において推定対象とする領域は,多くの場合,材料物性値の急激な変化と緩やかな変化が混在している.従来の推定手法では,材料物性値の分布を離散的に取り扱っており,この様な特徴の異なる変化が混在する分布を,高精度かつ効率的に表現することは困難であった.本研究では,離散的な取扱いを行わずに領域内部の材料物性値の分布を表現する方法を提案し,それを用いた材料物性値の分布の推定手法の開発を行う.また,開発を行う推定手法の新たな展開として,推定手法の数値シミュレーション手法への適用可能性について検討する.
クオラムセンシングを誘導するペプチドフェロモンに見られる翻訳後修飾の機能解明研究

枯草菌から発見した、翻訳後修飾によるトリプトファン残基のイソプレニル化の普遍性の解明を目的として、まず、修飾酵素に着目し、活性に必要なアミノ酸残基を特定した。次に、その情報を元に、門の異なる細菌からファルネシルトリプトファンを有する新規ペプチドを発見した。さらに、その修飾酵素のX線結晶構造解析を行い、その結果を元に探索した結果、翻訳後修飾によるトリプトファン残基のイソプレニル化は様々な門の細菌に広く存在することが判明した。また、納豆菌由来の納豆のネバネバを誘導するファルネシルトリプトファンを有する新規ペプチドを発見した。さらに、この翻訳後修飾は幅広い基質許容性を示すことが判明した。トリプトファンのイソプレニル化が普遍的に存在する機能発現に必須な翻訳後修飾であることを証明するために、まず、これまでの研究によって明らかとなったComXとComQのコンセンサス配列をコードする両遺伝子を有し、両遺伝子がクラスターを形成している細菌をゲノム配列のデータベースから検索し、属の異なる候補細菌を5種類ほど選別した。修飾ペプチドが常分泌型でない可能性や、分泌量が少ない可能性を考慮し、選別した遺伝子クラスターを有するプラスミドを候補細菌のDNAを鋳型に市販のベクターを用いて作製し、大腸菌に導入して過剰発現を試みたが、残念ながら両候補とも発現しなかった。そこで、ベクターの種類、配列などを検討し、新たに別途ベクターを作製した。次に、作製した新規ベクターを用いて、分子生物学的手法によりcomQX候補ではなく、comQ候補のみ、および、comX候補の過剰発現大腸菌を作製することにした。選別したco調候補を有するプラスミドを候補細菌のDNAを鋳型に作成し、大腸菌に導入して過剰発現を試みた結果、comQ候補過剰発現大腸菌を作製することに成功した。同様にして、選別したcomX候補を有するプラスミドを候補細菌のDNAを鋳型に作成し、大腸菌に導入して過剰発現を試みた結果、comX候補過剰発現大腸菌を作製することに成功した。なお、今後はベクターの種類、配列などを再検討し、他の候補細菌についてはcomQX候補過剰発現大腸菌も作製する予定である。平成24年度に行った研究において、ComXフェロモンやその前駆体であるComXを指標にした相同性検索は困難であることが判明したため、平成25年度は、ComXのトリプトファンをイソプレニル化し、ComXフェロモンを生合成する修飾酵素であるComQを指標とした相同性検索によって、トリプトファンのイソプレニル化が普遍的に存在する機能発現に必須な翻訳後修飾であることを証明することにした。修飾酵素ComQは、テルペン類の生合成前駆体であるイソプレニル二リン酸の生合成酵素と相同性があるため、単にComQを指標に相同性検索を行っても、イソプレニル二リン酸生合成酵素であるかトリプトファンイソプレニル化酵素であるか区別がつかない。そこでComQが、ComXのトリプトファンを認識し、イソプレニル化するために必要なアミノ酸残基を決定した。具体的には、イソプレニル二リン酸生合成酵素において酵素活性に必須なSARMと呼ばれるモチーフに相当するComQのアミノ酸配列、およびその近傍のアミノ酸を変異させたComQ変異体をcomQ遺伝子を導入した大腸菌を用いてそれぞれ作成し、GPPまたはFPP存在下、別途、固相合成したComXペプチドとのin vitro酵素反応によってComQにおけるComX認識に必要なアミノ酸配列を解明した。その結果、トリプトファンイソプレニル化酵素とイソプレニル二リン酸生合成酵素の違いを生み出すアミノ酸残基を見いだすことが出来た。さらに、決定したアミノ酸残基をコードする遺伝子を有する生物種をゲノム配列のデータベースから検索し、候補を選別した。その内の一つについては、遺伝子クラスターを有するプラスミドを候補細菌のDNAを鋳型に作成し、大腸菌に導入して過剰発現させた。クオラムセンシングを誘導する新規クオラムセンシングフェロモンを探索するために、生合成酵素に着目したゲノムマイニングを行った。ただし、通常の相同性検索を行った場合は既知のタンパク質が数多く検出されてしまったが、申請者らが平成25年度に決定した生合成酵素ComQのモチーフ配列をフィルタリングしたところ、既知のIPPSを含まない、様々な細菌由来の300種類程度のタンパク質が検出できた。そこで次にComXフェロモンを生産する枯草菌とは別の網に属する生産細菌を候補として選定し、そのDNAを鋳型に候補タンパク質の異種発現を行った。また、選出した候補タンパク質のすぐ隣にコードされた基質ペプチド候補も同様にして異種発現を行った。これらを用いて、ファルネシル二リン酸と、Mgイオン存在下、in vitro酵素反応を行い、イソプレニル化された修飾ペプチドを合成させた。得られた反応液をファルネシル基由来のフラグメントイオンに着目したLC-MS分析を行ったところ検出に成功し、さらにMS/MS分析の結果から、C末端側から2番目のトリプトファンがファルネシル化された修飾ノナペプチドであることが判明した。そこで、決定したアミノ酸配列および推定修飾構造を有する修飾ペプチドを化学的に合成することにした。以前の研究や、平成24年度に行った、液相合成法によるイソプレニルトリプトファンの合成を基盤に、固相ペプチド合成法を組み合わせた目的の修飾ノナペプチドの立体選択的合成を行った。

本研究課題がおおむね順調に進展していると判断した理由は、これまで発見された、トリプトファンが翻訳後修飾によりイソプレニル化された修飾ペプチドは、申請者らが発見した枯草菌由来のComXフェロモンのみであったが、今回の研究により、枯草菌以外にも同種の修飾酵素が存在し、修飾ノナペプチドが生産されることが判明したためである。さらに、修飾ノナペプチドの化学合成を行うことが出来たためである。昨年度に引き続き、目的の修飾ノナペプチドの立体選択的合成を行った。LC-MS分析により、各種データが修飾ノナペプチドの合成品と天然物において一致したことから、修飾ノナペプチドの立体化学も含めた化学構造を決定することが出来た。また、修飾ノナペプチドの生物的役割については、関連遺伝子の発現解析を行うための条件検討を行っている。さらに、昨年に行ったゲノムマイニングの結果から得られた候補タンパク質のうち、ComXフェロモンを生産する枯草菌とは別の門に属する生産細菌を候補として選定し、そのDNAを鋳型に候補タンパク質の異種発現を行った。また、選出した候補タンパク質のすぐ隣にコードされた基質ペプチド候補も同様にして異種発現を行った。これらを用いて、ファルネシル二リン酸と、Mgイオン存在下、in vitro酵素反応を行い、イソプレニル化された修飾ペプチドを合成させた。得られた反応液をファルネシル基由来のフラグメントイオンに着目したLC-MS分析を行ったところ検出に成功し、さらにMS/MS分析の結果から、C末端側から2番目のトリプトファンがファルネシル化された修飾デカペプチドであることが判明した。液相合成法によるイソプレニルトリプトファンの合成を基盤に、固相ペプチド合成法を組み合わせた目的の修飾デカペプチドの立体選択的合成を行った。LC-MS分析により、各種データが修飾デカペプチドの合成品と天然物において一致したことから、修飾デカペプチドの立体化学も含めた化学構造を決定することが出来た。本研究課題がおおむね順調に進展していると判断した理由は、これまで発見された、トリプトファンが翻訳後修飾によりイソプレニル化された修飾ペプチドは、申請者らが発見した枯草菌由来のComXフェロモンのみであったが、一昨年の発見により、枯草菌以外にも同種の修飾酵素が別の属にも存在し、今年度の発見により、別の門にも修飾デカペプチドが生産されることが判明し、当初の目的であった普遍性の解明へと大きく前進したためである。クオラムセンシングを誘導する新規クオラムセンシングフェロモンを探索するために、生合成酵素に着目したゲノムマイニングを行った。得られた様々な細菌由来の300種類程度のタンパク質のうちから放線菌門の細菌由来の機能未知タンパク質について、まず生産細菌を購入し、そのDNAを鋳型に候補タンパク質であるSboQの異種発現を行った。また、候補の遺伝子クラスターにコードされている短鎖ペプチドSboXが修飾ペプチドフェロモンの基質であると推測されたため、同様にして基質ペプチドの異種発現を行った。これらを用いて、Mg2+イオンとファルネシル二リン酸(FPP)存在下、in vitro酵素反応を行ったが、目的の修飾ペプチドが得られなかった。
免疫システムを利用したテーラーメイド人工酵素の開発

天然酵素は,「遷移状態の安定化」に加え,「補酵素」などの触媒因子を組み合わせることによって高い活性を示す.すなわち,このような触媒因子の組み合わせを抗体タンパク質に導入することが高活性発現の鍵となる.そこで,種々の官能基をもつ非天然コファクターを収納するための結合サイトと基質分子の結合サイトの両方を併せ持つ抗体酵素の作製を検討した。その結果,コファクター分子を入れ替えることにより,触媒反応の種類や触媒機構をコントロールできる抗体-補酵素ハイブリッド型抗体酵素の創出に成功した。1.抗体酵素の作製抗原結合部位にコファクター結合部位と基質結合部位を構築するために,ハプテン(1)を設計した。合成したハプテンを担体タンパク質(KLHおよびBSA)と縮合させ抗原としたのち、Balb/cマウスと免疫した。一連の細胞工学的手法により、ハプテンを特異的に認識する50種類のモノクローナル抗体が得た。2.触媒活性測定アシル基転移反応:50種の抗体に関して活性スクリーニングを行った。エステル化合物と求核触媒として機能すると期待されるアルコール性のコファクター分子とのエステル交換反応を検討した結果,触媒活性のある22種の抗体を得た。また,その触媒反応は,ハプテンの添加により濃度依存的に阻害された。そこで,最も活性の高かった2種の抗体(25E2,27C1)について,詳細な反応速度論的解析を行った。コファクター分子としてアルコール、アミン、チオールのどれを用いた場合も高い触媒活性を示した。2種に関して動力学的パラメータK_m, V_<max>,k_<cat>の決定した。その結果、非触媒反応に比べて,アルコールを用いた場合198(25E2)倍,109(27C1)倍、アミンを用いた場合1.4×10^4(25E2)倍,5.5×10^4(27C1)倍、チオールを用いた場合4.2×10^3(25E2)倍,2.9×10^3(27C1)倍の速度加速を観測した。また、アミドを基質として用いた場合も触媒活性を持つことが判明した。脱離反応:コファクター分子としてフェニル酢酸誘導体を用い,塩基触媒により脱離反応を検討した。その結果,抗体25E2がβ-ハロケトンからエノンへの脱離反応を触媒することを見いだした。従来の触媒抗体の多くは,単一の触媒因子(遷移状態の安定化)で反応を触媒するため,活性が低い.一方,天然酵素は,「遷移状態の安定化」に加え,「補酵素」や「一般酸-塩基触媒」などの触媒因子を組み合わせることによって高い活性を示す.すなわち,このような触媒因子の組み合わせを抗体タンパク質に導入することが高活性発現の鍵となる.