hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
藍藻毒ミクロキスティンの生成機構へ紫外線照射が及ぼす影響の解明

<主な成果>紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値の変化を評価することを目的として、昨年度は、毒性物質の量の変化をより正確に測定できる手法を開発した。今年度は、開発した手法を用い、死滅する藍藻細胞数と増殖する藍藻細胞数をより正確に測定し、その挙動を記述するモデルを作成した。作成したモデルによって、紫外線処理後に死滅する細胞数の変化、増殖する細胞数の変化、さらには死滅する細胞から放出されるミクロキスティンの3点を適切に記述することができた。モデルによって、細胞内藍藻毒の紫外線による分解を確認した。<研究実施状況>(1)さまざまな処理条件における死滅細胞と増殖細胞の分離計数紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値の変化を評価するために、死滅する藍藻細胞数と、増殖する藍藻細胞数を分けて計数する必要があった。異なる種類の紫外線ランプ、光回復を考察できる異なる培養光源、異なる紫外線照射量など、複数の条件において、この計数を行った。同時に、藍藻毒を測定し、紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値を評価した。(2)藍藻毒毒性値の変化を記述するモデルの作成(1)死滅する細胞数と増殖する細胞数の記述紫外線処理後の藍藻毒毒性値の変化を記述するには、その元となる藍藻細胞数の変化を記述することが、まず必要である。昨年度開発したセファロスポリン手法を用い、(1)の段階では、さまざまな処理条件において死滅細胞と増殖細胞を分離計数した。この結果に当てはまるようなモデルを選択し、死滅細胞数、増殖細胞数の変化をそれぞれ記述した。死滅細胞数は、時間が経過するとともに徐々に死滅速度が速くなる、マルチヒット型モデルを採用して記述した。増殖細胞数は、単純な増殖曲線によって記述した。この2つの細胞数モデルを合わせて、紫外線処理後の全体の藍藻細胞数の変化を記述した。(2)細胞1個当たりの藍藻毒毒性値の変化紫外線処理後の細胞数の変化モデルを作成した後、藍藻毒毒性値の変化を記述するモデルを作成した。水中の藍藻毒濃度を記述するため、死滅細胞数の挙動と、死滅細胞数1個当たりの藍藻毒毒性値を設定する必要があった。このうち、死滅細胞数1個当たりの藍藻毒毒性値は、紫外線照射量が600mJ/cm2以上の場合に、低く設定する必要があることが分かった。昨年度の成果の一つとして、紫外線による細胞内の藍藻毒の分解現象の発見が挙げられるが、その結果をモデルでも確認できた。〈主な成果〉紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値の変化を評価することを目的として、研究を遂行し、毒性物質の量の変化をより正確に測定できる手法を開発した。開発した手法を用い、紫外線処理によって死滅する藍藻細胞1個当たり放出される藍藻毒を定量した。これまでの手法では、紫外線処理が有する特性ゆえに、死滅する藍藻細胞数を正確に計測できなかったが、本研究ではより正確に定量できる手法を開発し、より正確な毒性物質の量を測定することに成功した。その結果、紫外線によって細胞内に存在する毒性物質を分解できることが明らかになった。〈研究実施状況〉1.実験に用いる藍藻類の選定研究遂行に必要な情報を収集した上で、対象とする藍藻類を選定した。検討の結果、Microcystisの研究において世界的に広く用いられ、またその遺伝子情報も豊富であるMicrocystis aeruginosa PCC7806株を用いることとした。2.毒性値の変化を評価するための新たな手法の確立紫外線による藍藻毒毒性値の変化を評価するため、毒性物質レベルと遺伝子レベルで解析を行う。このうち、毒性物質の分析に関して手法を確立することを試みた。研究を進めていく過程で、細胞1個当たりの毒性物質量を定量することが困難であることが分かり、これを解決するためには、実験中に死滅していく細胞の数を正確に算出する必要があることが分かった。死滅していく細胞の数を正確に算出するため、セファロスポリンを用いた新たな培養方法を本研究にて確立した。このことによって、実験中に死滅する細胞の数を以前よりも正確に算出できるようになった。3.本研究で確立した手法を用いた毒性値の変化の算出確立した手法を用いて、毒性値の変化を算出した。毒性値は、セファロスポリンを用いた手法によって、毒性物質の量として算出した。算出した結果、紫外線によって細胞の中に存在する毒性物質の量が減少することが明らかになった。また、毒性物質の細胞外の濃度は変わらないことから、水系への影響を最小限に留めたまま、毒性値を減少させられることが明らかになった。この点は、紫外線処理を行う上での利点であり、今後さらに深く研究していくことが期待される点である。<研究実施状況

>(1)さまざまな処理条件における死滅細胞と増殖細胞の分離計数紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値の変化を評価するために、死滅する藍藻細胞数と、増殖する藍藻細胞数を分けて計数する必要があった。異なる種類の紫外線ランプ、光回復を考察できる異なる培養光源、異なる紫外線照射量など、複数の条件において、この計数を行った。同時に、藍藻毒を測定し、紫外線処理に伴う藍藻毒の毒性値を評価した。(2)藍藻毒毒性値の変化を記述するモデルの作成(1)死滅する細胞数と増殖する細胞数の記述紫外線処理後の藍藻毒毒性値の変化を記述するには、その元となる藍藻細胞数の変化を記述することが、まず必要である。昨年度開発したセファロスポリン手法を用い、(1)の段階では、さまざまな処理条件において死滅細胞と増殖細胞を分離計数した。この結果に当てはまるようなモデルを選択し、死滅細胞数、増殖細胞数の変化をそれぞれ記述した。死滅細胞数は、時間が経過するとともに徐々に死滅速度が速くなる、マルチヒット型モデルを採用して記述した。増殖細胞数は、単純な増殖曲線によって記述した。この2つの細胞数モデルを合わせて、紫外線処理後の全体の藍藻細胞数の変化を記述した。(2)細胞1個当たりの藍藻毒毒性値の変化紫外線処理後の細胞数の変化モデルを作成した後、藍藻毒毒性値の変化を記述するモデルを作成した。水中の藍藻毒濃度を記述するため、死滅細胞数の挙動と、死滅細胞数1個当たりの藍藻毒毒性値を設定する必要があった。このうち、死滅細胞数1個当たりの藍藻毒毒性値は、紫外線照射量が600mJ/cm2以上の場合に、低く設定する必要があることが分かった。昨年度の成果の一つとして、紫外線による細胞内の藍藻毒の分解現象の発見が挙げられるが、その結果をモデルでも確認できた。
氷河・氷床コアにおける固体直流電気伝導度を用いた年代決定と古気候・古環境の解明

過去、数百年における気候・環境因子の年々変動を南極氷床で掘削された浅層コアから求め、産業革命以降の人間活動の影響を地球規模影で評価することが本研究の目的である。本研究に用いた浅層コアは、南極・東ドローニング・モードランド域の昭和基地とドームふじを結ぶルート上で、表面質量収支や積雪堆積課程の異なる場所S25、H15、H72、YM85、H231、MD364、DFS地点で掘削されたコアである。本年度の研究活動は、これらのコアの年代を決定する作業を行った。具体的な活動内容はH231とMD364コアの酸素同位体の測定と主要イオン種の測定(イオンクロマトグラフ)を行った。また、日本南極地域観測第42次隊によって掘削されたYM85地点で掘削された雪氷コアの基本解析を行った。MD364地点で掘削された雪氷コアの研究結果は、ECM(固体直流電気伝導度)と化学主成分(nssSO_4^<2->とpH、MSA)を統計的に解析を行い、6つの有意な火山シグナルが推定できた。これらの結果はMD364コアの年代を推定する上で重要な役割を果たす。火山シグナル年代よりもモデル年代の方が古く出ており、堆積中断の影響やMD364地点付近の表面流動の影響が現れていることが考えられる。H231地点で掘削された雪氷コアに関しては、ECMと化学主成分の結果より、過去200年間のうち最大規模の噴火記録をもつ1815年に噴火したTambora火山シグナルを検知することが出来た。また、雪氷コアの基本解析のひとつであるECM測定を行う際の問題点のひとつに、氷の密度変化に伴うECMのバックグラウンド値の変化がある。同じ水素イオン濃度の部分でも、雪氷コアの密度が小さいとECMのバックグラウンド値は小さくなる。そこで、本研究ではECMの密度補正を行う経験式を求めることを目的とする実験を行った。その結果、雪氷コアの密度変化に伴うECM値のバックグラウンド変化の原因は、ECM値が氷の層位構造に対して依存性があることを定量的に明らかにし、ECM値と氷の層位構造の関係を求め、経験式を求めることが出来た。この経験式はECM値の密度補正を行う際に使用することが出来る。これらの結果は、多点地域で掘削された雪氷コアから火山活動に起因するECMシグナルを比較する場合に役立つことが期待される。
新しい実験的エイズ感染in vitroおよびin vivoモデルの作製

エイズの予防、治療法にとり、最も大きな障害となっているのは、適切な感染実験モデルが開発されていないことである。現在まで、ヒトCD4遺伝子導入マウスや、チンパンジ-において感染実験が試みられているものの、エイズ発症に至るような動物モデルは得られていない。近年、Kindtらが、ウサギはHIV感受性をもっていると報告している。事実、ウサギは、他の動物種と異なり、ヒトHILV-1ウイルスを含む、ヒトレトロウイルスに対して感受性が高いようである。われわれは、HIV受容体であるヒトCD4抗原をコ-ドする遺伝子の導入をウサギ培養細胞株、あるいはウサギ個体へ行い、効率のよい実験的HIV感染モデルを作製することを目的に研究を行った。まず、BPV 69%フラグメントを含むKarasuyamaベクタ-BCMGSNeoにサイトメガロウイルス・エンハンサ-、ヒトCD4cDNAを挿入し、これをウサギ培養株(滋賀医大瀬戸博士より供与をうけたHTLV-1感染T細胞株)2種に、電気穿孔法により遺伝子導入を試みた。その結果、現在までにヒトCD4を安定にかつ高率に発現する遺伝子導入株が数種得られ、さらにこれらから限界希釈法により6つのクロ-ンを得ることに成功した。これらのものにつき、現在HIV感染実験を山口大学山本直樹教授に依頼し、行っている。予備的な結果では、遺伝子導入前の親株では、HIV感染はみられないものの、ヒトCD4発現クロ-ンのあるものに感染がおきるようである。これが事実であるとすれば、霊長類以外の細胞で初めてHIV感染をおこすことに成功したということになる。また、個体への遺伝子導入は受精卵へのマイクロインジェクションを用い、移植を受けた仮親から数匹の仔が得られている。現在、ヒトCD4の発現の有無につき検索中である。
コンドリュール・CAIの微小部酸素同位体比解析による原始太陽系の形成過程の研究

隕石は太陽系の形成過程を知る上で最も直接的かつ物質科学的な情報を提供する。コンドライト隕石に含まれるCAIやコンドリュールを構成する鉱物の特徴的な酸素同位体比異常の成因は、惑星物質科学における最重要課題の一つである。本研究では、コンドリュールやCAIの酸素同位体組成を高精度に測定するために、紫外線レーザー掘削型連続フロー同位体比質量分析計(UVLA-CF-IRMS)を自作する。そして酸素同位体組成と岩石学的特性とを関連づけて考察し、各種物質の形成過程を解明する。これにより初期太陽系の物理化学的環境、物質進化史に関する全く新しい情報を得る事を目的とする。平成十七年度は、実際の岩石鉱物試料の酸素同位体比を測定するための最適な条件を決定するための実験を主に行った。高純度酸素ガスを使った酸素同位体比測定の実験では、質量分析装置が最も精度良く(δO値のばらつきが±0.5‰未満)測定できる試料酸素ガスの量は、45-80ナノモルである事が判明した。この量は、主要な造岩鉱物を直径、深さともに110-130ミクロン掘削した時に得られる酸素量である。この実験結果を踏まえて、実際の岩石鉱物試料のレーザー掘削・分析試験を行った。この実験により、酸素抽出反応はレーザーのエネルギーのみならず、反応時のフッ素の圧力にも左右され、しかもフッ化の最適条件は鉱物種ごとに異なる事が判明した。フッ素雰囲気化でのレーザー掘削によって造岩鉱物から酸素を抽出する事には成功したものの、その量は当初の見込みより大幅に少なかった。この実験から、本手法では試料反応容器の容積と導入すべきフッ素量、そしてレーザーのエネルギー密度が特に重要であり、本手法においてはむしろ試料前処理ラインを反応容器に合わせた構造にすべきである事が明らかになった。平成十五年度は主にUVLA-CF-IRMSの試料前処理ラインの開発を行った。前処理ラインの構造は当初、Young et al.(1998)の方式、すなわち2つのヘリウムの流れをキャピラリーチューブと3つのON/OFFバルブの開閉によって制御する方式に倣っていた。しかしこれまでの試行から、この方式はヘリウム流の制御が非常に難しく、ヘリウム流を逆転させる際にベースラインが激しく乱れるという問題も発生した。これらの問題を解決するため、六方バルブによってヘリウム流の向きを逆転させる方法に、前処理ラインを改良した。この改良によって配管は非常に単純になり、ヘリウム流の逆転によるベースラインの乱れも、ほぼ無視できる大きさにまで減らす事ができた。本装置では、レーザー掘削によって得られた試料の酸素を、ヘリウムで前処理ラインへ強制的に押し出す方式を採用する予定である。反応容器からフッ素除去管までの容積はブランクの量に密接に関係する。現在の配管による試験では多量のブランクが付加される事が判明したので、今後はこの部分の容積を減らすための改良を行う予定である。平成十六年度は、昨年度に全面的な改良を行った試料前処理ラインの動作試験とさらなる改良、フッ素精製装置の改良を行った。前処理ラインはブランクを軽減するために、低温トラップと反応容器周辺の配管をできる限り容積が少なくなるように改良した。反応容器のOリング周辺から僅かな大気漏れ込みがブランクを増やす大きな原因の一つである事が確認されたので、漏れ込みを減らすための改良(Oリングを納める溝の拡張など)を施した。また、質量分析装置はベースラインおよび同位体比の安定性を向上させるために、検出器とイオンソースの電子部品を交換して機器の安定性を改善させ、機器の冷却対策を講じるなどの改修作業を行った。また、試料分解物質であるフッ素ガスは、ボンベに詰められた高圧フッ素を試薬によって精製してから再度発生させる方式をやめ、市販のフッ素吸蔵物質を少量加熱して低圧のフッ素を得るという、より簡便かつ安全で経済的な方法によって得るように装置を改良した。

本研究では、コンドリュールやCAIの酸素同位体組成を高精度に測定するために、紫外線レーザー掘削型連続フロー同位体比質量分析計(UVLA-CF-IRMS)を自作する。そして酸素同位体組成と岩石学的特性とを関連づけて考察し、各種物質の形成過程を解明する。これにより初期太陽系の物理化学的環境、物質進化史に関する全く新しい情報を得る事を目的とする。平成十七年度は、実際の岩石鉱物試料の酸素同位体比を測定するための最適な条件を決定するための実験を主に行った。高純度酸素ガスを使った酸素同位体比測定の実験では、質量分析装置が最も精度良く(δO値のばらつきが±0.5‰未満)測定できる試料酸素ガスの量は、45-80ナノモルである事が判明した。この量は、主要な造岩鉱物を直径、深さともに110-130ミクロン掘削した時に得られる酸素量である。この実験結果を踏まえて、実際の岩石鉱物試料のレーザー掘削・分析試験を行った。この実験により、酸素抽出反応はレーザーのエネルギーのみならず、反応時のフッ素の圧力にも左右され、しかもフッ化の最適条件は鉱物種ごとに異なる事が判明した。フッ素雰囲気化でのレーザー掘削によって造岩鉱物から酸素を抽出する事には成功したものの、その量は当初の見込みより大幅に少なかった。この実験から、本手法では試料反応容器の容積と導入すべきフッ素量、そしてレーザーのエネルギー密度が特に重要であり、本手法においてはむしろ試料前処理ラインを反応容器に合わせた構造にすべきである事が明らかになった。
ルイス酸／カルベン協奏機能型触媒の開発

昨年度に引き続き、チオアミドのダイレクト型触媒的不斉アルドール反応におけるレトロ反応の問題解決に傾倒した。レトロ反応の進行は生成物の光学純度低下に直結するため、ダイレクト型反応における不斉反応では重大な問題となる。基質として立体障害の大きい分岐状構造を有するアルデヒドとの反応において、その生成物の相対的な熱力学的不安定性に起因してレトロ反応が顕著に見られることがわかり、本基質を用いてレトロ反応抑制法を探った。生成物と同様の部分構造を有する化合物を添加することで、触媒との錯形成過程で生成物と競合してレトロ反応サイクルへの導入を大幅に遅延させることができることを見出した。本手法により、種々の分岐状構造を有するアルデヒドにおいてもチオアミドをエノラート前駆体とするダイレクト型アルドール反応が時間依存性のない立体選択性で目的生成物を与える信頼性の高い触媒反応条件を同定することに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の主眼は、ハードLewis酸/水素結合/N-ヘテロサイクリックカルベン(NHC)の3機能発現型新規不斉触媒の開発である。適用反応としては、NHCにより求核的に活性化可能なアルデヒドと不活性なケトンの触媒的不斉ベンゾイン縮合反応を想定した。水素結合形成ユニットとしてキラルビスアミド配位子をデザインし、ハードLewis酸配位部位とNHC部位を賦与することで3機能発現型不斉触媒の創製を目指した。アミノ酸残基部位へのNHC導入を考えチアゾリルアラニンからビスアミド配位子を合成し不斉ベンゾイン縮合反応を検討した。しかしながら、報告例のない不活性ケトンとの反応は非常に困難で、新規触媒系の有意な評価ができないことから、比較的進行しやすい分子内触媒的不斉Stetter反応に置き換えて検討することとした。本反応においてもこの新規触媒系による反応促進能は乏しく、包括的な検討の結果カリウムをLewis酸として用いる反応系で中程度のエナンチオ選択性を発現するに留まった。NHCと多くの金属種がお互いの触媒能を削減する相互作用をする傾向が見られたため、本方法論による協奏機能型触媒は困難と判断して得られた反応特性を国際学術誌に投稿して終了させ、次年度は異なる協奏機能型触媒の創製を目指すこととした。3機能発現型新規不斉触媒の開発は多くの困難を伴ったが、その後に開始した協奏機能型不斉触媒によるダイレクトアルドール反応において、レトロ反応を抑制する効果的な添加剤を同定した。次年度の研究展開に大きく貢献する成果である。触媒的不斉ダイレクトアルドール反応におけるレトロ反応問題の解決に取り組む。ダイレクトアルドール反応は活性求核剤であるエラノート種を系中発生させるタイプのアルドール反応で、原子効率100%で進行する優位性があるが、反応と原系と生成系は平衡状態にある。多くのダイレクトアルドール反応では平衡は生成物側に偏っているため特に問題とはならないが、反応時間依存的に立体選択性が低下していく問題点があった。レトロ反応を左右する部分構造を系統的に精査するとともに、レトロ反応を抑える新たな触媒反応条件を同定し、ダイレクトアルドール反応を実践的不斉合成技術として定着させることを目指す。
アミノ酸輸送蛋白の反応中心に関する分子遺伝学的研究

研究代表者は、大腸菌のプロリンおよびグルタミン酸輸送が二次性能動輸送機構によって駆動されることを解明し、それぞれの反応がプロリン輸送蛋白(putP)およびグルタミン酸輸送蛋白(gltSおよびgltP)によって触媒されることを検証してきた。本研究は上記の輸送蛋白の反応機構を確定すること、および、反応中心の分子構築を解明することを目的とし、以下に述べる成果を得た。1)プロリン/Na^+ーシンポ-ト機構:Δμ_<Na>+に依存し、pHによって調節されるプロリン輸送反応を詳細に解析し、プロリンとNa^+の等方共役輸送に関する速度諭モデルを提案し、検証した。2)プロリン輸送蛋白の反応中心の分子構築:等方共役輸送過程に変異を生じた変異輸送蛋白の変異部位の決定、ならびに、NEM感受性Cys残基をSerに置換した変異輸送蛋白の反応特性を解析し、反応中心の分子構築をおおむね以下のように推定した。(i)Cysー281(ヘリックスVII)およびCysー344(ヘリックスVIII)はプロリン/Na^+の結合に関与している。(ii)Glyー22およびCysー141(それぞれヘリックスIおよびIVに存在)、Argー257(ル-プVIVIIに存在)はNa^+の結合/共役輸送に関与している。(iii)gltSの塩基配列の決定とputPの相同性検索の結果、基質/Na^+ーシンポ-タ-におけるNa^+ー結合モチ-フの存在が示唆された。このモチ-フはGlyー328(ヘリックスIX)、Alaー366(ヘリックスVIIIIX)、Leuー371、Glyー375、Argー376(ヘリックスIX)より構成され、Cysー344をとりまくクラスタ-を形成している。このことは、上記5本の膜貫通ヘリックスが特異的なヘリックス相互作用を介して、活性中心の空間構造を構築していることを示唆する。3)基質/Na^+ーシンポ-タ-の生理機能と普遍的分布:上記の新知見および従来の諸研究の成果を取りまとめ、標記に関する総説を書き下ろし、出版した。1)プロリン輸送系の解析:大腸菌プロリン輸送蛋白(<putP>___ー)による能動輸送反応と基質結合反応を詳細に解析し、共役イオンの結合によって基質に対する親和性が上昇するというNa^+/プロリン共輸送反応の速度論モデルを提出した。カチオン共役の分子機構を検討するため、プロリン取込み活性が高濃度Na^+依存性となる変異株を選択し、その解析を行った。Gly_<22>→GluまたはCys_<141>→Tyr置換変異によって輸送反応および基質結合反応におけるNa^+親和性とカチオン特異性が低下し、SH阻害剤NEMに対する感受性や基質結合反応のpH依存性が変化する事を明らかにした。我々の成果を総括し、Gly_<22>とCys_<141>、部位特異的変異法を用いてNEM感受性とNa_+結合親和性に関与する残基として同定されたCys_<281>とCys_<344>、カチオン結合モチ-フをそれぞれ含む5本の膜貫通へリックスI、III、VII、VIII、IXが、本輸送蛋白で共役イオン結合部位および輸送経路を形成している可能性を指摘した。

2)グルタミン酸輸送系の解析:大腸菌B株より2種類のグルタミン酸輸送蛋白(<gltS>___ーと<gltP>___ー)の構造遺伝子をクロ-ニングし、<gltS>___ー輸送蛋白はNa^+/グルタミン酸共輸送反応を、一方、<gltP>___ー輸送蛋白はH^+/グルタミン酸(またはアスパラギン酸)共輸送反応を触媒することを明らかにしてきた。今回、<gltS>___ー遺伝子の全塩基配列を決定し、<gltS>___ー輸送蛋白は12本の膜貫通領域を持つ疎水性蛋白(分子量42.5K)であることを明らかにした。また、<gltS>___ー輸送蛋白は他のNa^+/有機溶質共輸送蛋白(大腸菌Na^+/プロリン共輸送蛋白、ウサギおよびヒトのNa^+/グルコ-ス共輸送蛋白)とイオン共役に関与すると思われる構造モチ-フ[GlyーAlaーXーXーXーXーLeuーXーXーXーGlyーArg]を共有する事を見出した。研究代表者は,大腸菌のプロリンおよびグルタミン酸輸送が二次性能動輸送機構によって駆動されることを解明し,それぞれの反応がプロリン輸送蛋白(putP)およびグルタミン輸送蛋白(gltSおよびgltP)によって触媒されることを検証してきた。本研究は上記の輸送蛋白の反応機構を確定すること,および,反応中心の分子構築を解明することを目的とし,以下に述べる成果を得た。1)プロリン/Na^+-シンポ-ト機構:ΔμNa^+に依存し,pHによって調節されるプロリン輸送反応を詳細に解析し,プロリンとNa^+の等方共役輸送に関する速度論モデルを提案し,検証した。2)プロリン輸送蛋白の反応中心の分子構築:等方共役輸送過程に変異を生じた変異輸送蛋白の変異部分の決定,ならびに,NEM感受性CysをSer置換した変異輸送蛋白の反応特性を解析し,反応中心の分子構築をおおむね以下のように推定した。(i)Cysー281(ヘリクスVII)およびCysー344(ヘリクスVIII)はプロリン/Na^+の結合に関与している。(ii)Glyー22およびCysー141(それぞれヘリクスIおよびIIIに存在),Argー257(ル-プVIVIIに存在)はNa^+の結合/共役輸送に関与している。(iii)gltSの塩基配列の決定とputPとの相同性検索の結果,基質/Na^+シンポ-タ-におけるNa^+-結合モチ-フの存在が示唆された。このモチ-フはGlyー328(ヘリクスIX),Alaー366(ル-プVIIIIX),Leuー371,Glyー375,Argー376(ヘリクスIX)より構成され,Cysー344をとりまくクラスタ-を形成している。このことは上記5本の膜貫通ヘリクスが特異的なヘリクス相互作用を介して,活性中心の空間構造を構築していることを示唆する。3)基質Na^+シンポ-タ-の生理機能と普遍的分布:上記の新知見および従来の諸研究の成果をとりまとめ,標記に関する総説を書き下ろし,出版した。
レセプトデータ分析による22世紀への橋渡しとなる革新的な医療圏創出に関する研究

わが国は、世界に類例のない高齢化社会への移行期にあって新たな健康長寿社会への創成に向けた制度設計に関心が高まってきている。とりわけ、北海道は、過疎地域が多く地域社会の構造的な変貌に対し、社会インフラとしての医療サービス提供に係る柔軟で持続的な体制整備の必要性が指摘されている。研究期間の前半においては、二次医療圏内の中心都市である市町村からのレセプトデータを活用して地域住民の医療圏を越えた受療行動や医療圏域内の医療サービスの需給関係の実態について居住地と医療機関との距離、冬季と夏季、年齢階級と疾病との関連性について主として中分類区分を用いた分析をおこなった。現行医療圏の原型は、約50年前に遡るが、医療サービスの受療行動に着目した場合は、人口減少と超高齢化社会への変化に対する医療資源の効率的な配分への要請に即応するためには現行体制の再検討の必要性が示唆された。研究期間後半においては、対象地域を全道179市町村に拡大し2011年度から5か年分に係るNDBを活用して医療サービスの需給関係を前期に準じて比較し実態の把握を行った。最終年度においては、医療従事者や物的医療資源の地域的な偏在が、受療者の医療機関の選好性に及ぼす影響について、人工透析患者約2,000人を対象としたアンケート調査を行った。医療機関へのアクセシビリティの良否に影響されつつも人口密度が希薄地域においては、受診環境は厳しさを増してきており、医師との信頼関係を基礎に合理的と思われる医療機関を選好する傾向が強いことが推量された。また、透析専門医の存在や施設整備の充実度が、医療圏の範囲の広狭を左右する傾向がみられた。今後、将来の人口構造や疾病構造の変化に即応した医療圏設定の検討に際しては、柔軟な医療圏制度の基本的な在り方として、医療の高度化と合いまって医療機能の連携と分化が、機能し易い仕組みの再構築の必要性が示唆された。地域における経済社会の構造的な変貌に柔軟に対応可能な社会インフラとしての医療供給体制の創出に向けた課題の適格な把握と、その過程における医療サービスの需要面からのアプローチに焦点を充て調査研究作業を行った。北海道は、人口密度の希薄に象徴されるように、医療、福祉等人々の活動基盤となる社会基盤の脆弱性が指摘されている上に、人口減少・高齢化・産業経済発展基盤の立ち遅れ等の複合的な要因の相互作用から、医療サービスの地域格差の広がりが懸念されている。これまでに、市町村別の人口動態を基礎に医療情報についてレセプトデータを用いて、誰が、何時、どこで、どのような医療サービスを受け、その投入医療費の程度と傷病名はどのようなものであったかを把握し、二次医療圏単位の比較検討ができるよう、分析システムの構築、その活用を図った。二次医療圏の機能については、医療人や施設整備面の充実度と地域間における果たす役割が、地域的バラツキの発生要因として推し量ることができ、医療資源の賦存状況が、医療需要の活発化に影響を及ぼすと同時に、医療機関へのアクセスの良否は、医療需要面と医療機能面の効率性に影響を与えるという、因果関係の存在が示唆された。変貌する地域社会の特性を踏まえた社会インフラとしての医療機能の維持増進を図るための医療資源の効率的な配分のあり方を明確化するための一助として道路交通ネットワークや、医療機能の良否が受診医療機関の選好性にどのような影響を及ぼすかを考察するため道内に居住し人工透析医療を受けている患者を対象にアンケート調査の実施の体制を整えた。更に、基本的情報として、2次医療圏毎の実態把握のため、厚生労働省からのレセプト情報等の提供の承諾を受け(NDB)、医療サービスの実態把握の環境整備を整えた。基本情報として位置づけられる、レセプトデータ(国保と後期高齢者医療)につき、4市3町から、平成2327年度の5年分の提供を受けた。この他、三次医療圏の中心都市の市部の3市についても、同様に、匿名化処理後のレセプトデータの、提供を受けられる様に、関係機関と折衝中にあり、29年夏頃を目指して、二次と三次医療圏の比較を、医療資源と、医療機能の両面に働きかける、医療サービスの需給動向に着目した分析に必要な枠組みの構築ができた。レセプト情報等(NDB)の提供に関する承諾により、5年分のうち2か年分の医科・歯科・調剤に係る、北海道分の全データーを入手分析システムの開発に着手し、GISソフトの購入と、収集した既存の4市3町のレセプトデータ(匿名化処理後のもの)を活用し、医療圏を拡大した、受診(療)者行動の視覚的表示を試みた。地域社会の人口構造が、急速に変貌し、社会インフラとしての医療サービス提供に係る柔軟で持続的な体制整備の必要性が指摘されている。とりわけ、北海道は、過疎法による過疎地域が多く、人口密度が希薄のため医療サービスの需要と供給の安定性や効率性確保について、多角的な視点からの課題の的確な把握が重要となる。人口減少、高齢化は、地域の産業経済社会の発展基盤をゆるがしかねなく、医療サービスの地域格差の発生と拡大が懸念されている。これまで、北海道内の4市3町の、レセプトデータと、人口動態に係る各種公表資料から地域のマクロ的な視点による分析とともに、地域住民が何時、どこで、どのような医療サービスを受け、支払った医療費や傷病名等を把握し二次医療圏単位、農山漁村等、地域の特性に応じた比較検討ができるような分析システム構築しその活用を図った。

更に、調査対象地域を拡大し、特に、三次医療圏単位の分析を確かなものにするための地方中核都市2市を加えた三次医療圏単位の医療の需要供給面の実態につき、実態把握ができつつある。また、医療費増高の疾病として、上位を占めるる人工透析医療受診者を一例として、医療サービスの需要者側の主観的要因を含めたアンケート調査により現況把握を行った。人口集積の高い首都札幌市のレセプトデータは、厚生労働省からNDBの提供を受け、これらの情報を活用し、地域格差の要因の把握と是正ための方向性と長期的観点に立った施策展開のための基本的事項のとりまとめを進めている。医療供給面では、北海道の21二次医療圏単位の病院・診療所毎に医療資源(物的・人的)の賦存状況を把握し、利活用するための環境整備を図った。レセプト情報は、北海道内179市区町村毎に区分し、国保・後期・社保分の保険者について、NDBを活用し、データー分析ができるよう環境を整えた。また、NDBの入手以前において、医療圏単位に医療の地域格差の分析、検討に主眼に置いた調査を行うため、6市3町から入手した匿名化処理後のレセプトデータをも併用活用し、医療資源の偏り、自然的、社会的、経済的な諸条件から、受領者の医療機関の選択行動に影響及ぼす、傾向を分析し、地域社会の構造的な変化が医療サービスの需要供給面に、及ぼす影響や居住地の違いが、医療の地域格差を引き起こす要因となる実態の把握を行った。また、格差是正の必要性は、将来人口の推移を踏まえなければならないが、医療資源の有限性と効率的な配分、並びに医療技術の進歩発展とその期待性や医療需要を見極めつつ、地域医療サービスの長期的な観点に立った今後の在りかたを検討する上での情報の入手とともに解析するための、システム開発も概ね順調に進行しており、研究課題に沿った、研究成果を得るために、追求し得る環境が整備され、おおむね当初の計画のとおり順調に進展している。わが国は、世界に類例のない高齢化社会への移行期にあって新たな健康長寿社会への創成に向けた制度設計に関心が高まってきている。とりわけ、北海道は、過疎地域が多く地域社会の構造的な変貌に対し、社会インフラとしての医療サービス提供に係る柔軟で持続的な体制整備の必要性が指摘されている。研究期間の前半においては、二次医療圏内の中心都市である市町村からのレセプトデータを活用して地域住民の医療圏を越えた受療行動や医療圏域内の医療サービスの需給関係の実態について居住地と医療機関との距離、冬季と夏季、年齢階級と疾病との関連性について主として中分類区分を用いた分析をおこなった。現行医療圏の原型は、約50年前に遡るが、医療サービスの受療行動に着目した場合は、人口減少と超高齢化社会への変化に対する医療資源の効率的な配分への要請に即応するためには現行体制の再検討の必要性が示唆された。研究期間後半においては、対象地域を全道179市町村に拡大し2011年度から5か年分に係るNDBを活用して医療サービスの需給関係を前期に準じて比較し実態の把握を行った。最終年度においては、医療従事者や物的医療資源の地域的な偏在が、受療者の医療機関の選好性に及ぼす影響について、人工透析患者約2,000人を対象としたアンケート調査を行った。医療機関へのアクセシビリティの良否に影響されつつも人口密度が希薄地域においては、受診環境は厳しさを増してきており、医師との信頼関係を基礎に合理的と思われる医療機関を選好する傾向が強いことが推量された。また、透析専門医の存在や施設整備の充実度が、医療圏の範囲の広狭を左右する傾向がみられた。
非線形な大変形を伴う宇宙用柔軟展開構造の定式化と実験的検証

宇宙用柔軟展開構造物の基本的構成要素の一つとして柔軟2次元梁に着目して絶対節点座標法(ANCF)に基づいて定式化を行った.定式化では内部粘性抵抗と柔軟展開構造物が地上で実験する際に受ける空気抵抗による摩擦についても考慮して、数学モデルを構築した。展開時に要求される大回転および大変形を受ける運動の一つである動的スティフニングをANCFによって表現できることを示し、既存の内部粘性抵抗モデルおよび提案する空気抵抗モデルについて実験との比較検証を行い、定性的かつ定量的に良い一致が得られた。2次元変形を伴う非常に柔軟な要素を持つ展開機構(EFDM)について絶対接点座標法(ANCF)を用いて定式化を行った。20年度の予定であった塑性変形と拘束条件変化に関する影響の効果を考慮するための準備として、大変形を伴う弾性変形のみを考慮して定式化を行った。また、対象として非常に薄い梁を選び、宇宙用柔軟展開構造物に必要とされる挙動として、大変形とオーバーオール運動としての動的スティフニング効果に着目した。一般的にANCFで定式化したモデルは数値解析時に計算誤差の影響が大きく発生し、本研究で構築したモデルについても同様の影響が発生したために、いくつかの数値計算法を試行錯誤的に実施し、数値計算法に関して比較的安定して結果の得られる知見を得ることができた。また、ANCFで定式化されたモデルに関して、オーバーオール運動に関する定量的な実験検証はほとんど見当たらないが、本研究において定式化したモデルと、それに対応した実験を行うことで、定量的な実験検証を実施し、定式化の有効性を示すことができた。また、実験では落下塔による微小重力実験を当初予定していたが、実験時間が短くやり直しが困難ということと、20年度の検討でオーバーオール運動の検証には比較的長い実験時間が必要という結論が解析より得られたため、地上での検証方法を検討し、2次元変形に関しては落下塔を用いずとも、重力の影響を取り除いて検証が可能となるような実験装置を開発した。また、オーバーオール運動の地上での実験検証では空気抵抗の影響が非常に大きく影響することが判明したが、実験装置の改善によりそれらの影響を大きく低減している。人工衛星等に搭載される非常に柔軟な構造を有するような展開構造物の検証の手法として,大変形を表現できる方法として近年注目されている絶対接点座標法(以下ANCF)によるモデル化を利用した方法の検討を行った.本研究では,地上における検証実験データとANCFでの数値解析結果の両者を活用することで宇宙での挙動を検証する方法の構築を目指しており,基礎検討として弾性変形のみ仮定した柔軟梁の回転運動による動的スティフニングに注目して研究を行った.地上と宇宙空間での大きな違いは重力と大気の有無であり,地上での検証実験のデータに極めて近い数値解析モデルが構築できれば,そのモデルから重力と大気の影響を差し引いた解析から宇宙での挙動が予測できる.しかし,ANCFに基づくモデルでは実験的な検証に関する研究は不十分であり,また大気の影響等を考慮した研究も少ない.そこで,本研究ではこれらの影響を考慮したモデルの提案と実験的検証を以下のように行った.1.真空容器内での柔軟梁の回転による動的スティフニングに着目し,大気の影響を取り除いた状況での解析モデルの構築と実験検証を行い,定性的かつ定量的に良い一致を示すモデルを構築した.2.空気抵抗を考慮したモデル構築を行い,大気中で柔軟梁の回転による動的スティフニングの実験結果との比較を行い,定量的かつ定性的に良い一致が見られた.これらの結果より,簡単な梁などの展開挙動については地上での検証実験から宇宙での挙動も予測できるものと考えられる.当初の予定で検証方法自体の検証のために落下塔による比較も検討していたが,装置の工夫により無重力環境での実験との比較がなくとも,十分な検証を達成することができ,今後も同様な進め方でせん断変形,塑性変形,粘弾性による影響等の各種要素を考慮した,より実際のものに近いモデルを用いた検証方法の構築へと発展させることできると期待される.
二言語辞書のための語場理論に基づく基礎語彙の体系的記述-日独両語の場合-

1.日独両語の基礎語彙を選定し,それぞれの語彙素ごとの記述を,統語論的に共起関係にある要素のカテゴリーの差を中心に,以下のやり方で両語の対照記述を試みた.対応語の決定には,翻訳対応,動詞のAktionsartなど多面的観点によった.品詞がまたがる場合もそれぞれ統一的に扱った.(1)対象は三大品詞に限定したが,動詞についての記述を中核とし,形容詞はドイツ語についても用言として動詞と同じ扱いとした.名詞は用言の名詞化として処理できるものはそこから導き出し同一カテゴリーにより修飾連体成分(Att rihut)を示した.それ以外の名詞も,これに準ずる方式によった.(2)用例の収集,分類,組み換え操作に(大型電算機を含めて)電算機を利用した.用例を基礎語〓に限ったので,組み換え操作によって,特定語彙素ごとに用例を集め,名詞については,動詞共起成分としてどのカテゴリーの頻度が高いかを統計的に調べることで,名詞の下位区分に別個の方式が可能なことが明らかになった.2.基礎語彙の選定については,種々の従来の資料を検討した.基礎語彙の範囲内だけの用例は,インフォーマントに頼るが,データベースの大型電算機による処理によるかの二方式がある.後者を前者で補う方式が実際的であろうが,データベースをどこに求めるべきかが今後の課題として残った.3.二言語対照記述に有効な各品詞の下位区分を,動詞については,ある程度行ったが,名詞,形容詞についても完成して,それが自すと語野理論に基づく分類と関連づけられることが期待される.1.日独両語の基礎語彙を選定し,それぞれの語彙素ごとの記述を,統語論的に共起関係にある要素のカテゴリーの差を中心に,以下のやり方で両語の対照記述を試みた.対応語の決定には,翻訳対応,動詞のAktionsartなど多面的観点によった.品詞がまたがる場合もそれぞれ統一的に扱った.(1)対象は三大品詞に限定したが,動詞についての記述を中核とし,形容詞はドイツ語についても用言として動詞と同じ扱いとした.名詞は用言の名詞化として処理できるものはそこから導き出し同一カテゴリーにより修飾連体成分(Att rihut)を示した.それ以外の名詞も,これに準ずる方式によった.(2)用例の収集,分類,組み換え操作に(大型電算機を含めて)電算機を利用した.用例を基礎語〓に限ったので,組み換え操作によって,特定語彙素ごとに用例を集め,名詞については,動詞共起成分としてどのカテゴリーの頻度が高いかを統計的に調べることで,名詞の下位区分に別個の方式が可能なことが明らかになった.2.基礎語彙の選定については,種々の従来の資料を検討した.基礎語彙の範囲内だけの用例は,インフォーマントに頼るが,データベースの大型電算機による処理によるかの二方式がある.後者を前者で補う方式が実際的であろうが,データベースをどこに求めるべきかが今後の課題として残った.3.二言語対照記述に有効な各品詞の下位区分を,動詞については,ある程度行ったが,名詞,形容詞についても完成して,それが自すと語野理論に基づく分類と関連づけられることが期待される.1語彙の意味記述および意味的分類に関する文献の収集は、文献が予想ほど多くなかったがほぼ終わり、理論的検討が進められている。2語彙素別日独対照記述のモデルについては、動詞語彙を中心に、ヴァレンツ理論に基づいて共起関係(いわゆる連語関係)にある名詞,形容詞を頻度および意味論的観点から選び出すという形で、名詞,形容詞も併せ記述する方式をほぼ確定し、電算機処理を開始した。この方式は、一定量のデータを蓄積した後で、名詞を例にあげると、逆にそれぞれの名詞語彙素について格理論に基づく統語的役割を明らかにする記述をある程度自動的に行うことを可能にするものである。3広義の語形成手段に基づいて品詞内部の意味構造および品詞にまたがる派生関係の構成をこの言語について対照的に扱う方式も、文献的検討をほぼ終わって、モデル的に示す見通しができた。4上記の作業の言語資料としては、九州大学計算機センターのデータベースに収められている。西独ドイツ語研究所の現代ドイツ語コーパスおよび九州大学のトーマス・マンテキストデータを東京大学の大型計算機センターを通して利用できる態勢を整えた。
東洋における時間論の総合的研究ーインド思想と仏教を中心としてー

本研究は,次の諸点を目的として遂行された。(1)インド思想,仏教思想の各分野の研究者が,それぞれの領域における時間論の特質を哲学一般の地平において明らかにするための確乎たる足場を築くこと。(2)上記の各分野の研究者の間の交流を図り、学際的領域の開拓に努めること。(3)インド思想,仏教思想における時間の捉え方の基本的な枠組みを探り出し、その現代的意義に関し一定の見通しを立てること。である。結論的には,これらの所期の目的は,研究分担者等の協力を得て,ほぼ達成されたといえる。以下に,本研究の遂行に当たって各研究分担者が主にどのような問題の解明を試みたかを簡略に記せば,次の通りである(一部省略)。土田は『マハ-バ-ラタ』中に現れる二説話の運命論的思想について検討した。宮元はヒンドゥ-教文献に見られる宇宙論を理解する上で不可欠の『マヌ法典』における時間の単位について調査するとともに,「宇宙は無限である」というインド思想の一根幹をなす考え方を哲学的に考察した。谷沢は言語哲学者バルトリハリが説く行為者としての時間などについて論究した。加藤は一般に煩悩の別称とされる「隨眠」を手掛りとして,説一切有部の三世実有説とそれに対する経量部の反論を詳細に解明した。木村は華厳教学の大成者法蔵の時間論を究明し,その意気を探った。竹村は現代の諸哲学ともしばしば比較される道元の時間論を追究し,彼の思惟構造の重要な一面を明らかにした。蜂屋は広く諸資料を探って,中国における「時」の思想を跡づけ,それを踏まえて中国仏教者僧肇の時間論の特徴を浮き彫りにした。坂部はベルグソンにおける「多様性」の概念を詳細に検討し,そこから,東西の時間観念の比較研究を行うに際しての一般的な時空モデルないし時間モデルを構成するための多くの手掛かりを得た。である。本年度,研究代表者および各研究分担者は,当初の研究実施計画にもとづき,真摯に研究を進めた。すなわち,第一に,各研究者は,それぞれの分担領域において,多くの大学院生等の協力を得ながら,鋭意,基本資料並びに内外の関連文献の調査・収集に努め,着実に成果を挙げつつある。例えば,研究代表者木村は,仏教思想の哲学的精華といわれる華厳教学の時間論の中に,時間の直線的経過の否定や瞬間の永遠性の追求といった現代的意義をもつ,示唆に富む内容が含まれていることを明確にし,研究分担者・加藤は,説一切有部における三世実有説(過去・現在・未来の実在性を主張する説)の論証の成立過程を解明し,また,同じく上村は,9世紀の詩論家ラ-ジャシェ-カラの「時間の区分」の仕方を検討し,それがあくまでも詩的な約束ごとと関わることを明らかにした。分野によって研究の水準や遂行の難易度に差があるため,成果そのものには若干の相違が出ているが,この点については,次年度は協力体制をより強めることによって調整を図り,研究の全般的な進展を期したい。第二に,予定通り,研究集会を2回開催し(平成2年10月,平成3年2月),互いに研究の意義と目的に関して認識を深めるとともに,研究上の問題点等を披瀝しあい,意見の交換を行った。このことは,相互に極めて有益であり,次年度の成果のとりまとめの際には,諸研究の充実と関連性の濃密化という形で現れてくることが期待される。

本研究は,次の諸点を目的として遂行された。(1)インド思想,仏教思想の各分野の研究者が,それぞれの領域における時間論の特質を哲学一般の地平において明らかにするための確乎たる足場を築くこと。(2)上記の各分野の研究者の間の交流を図り,学際的領域の開拓に努めること。(3)インド思想,仏教思想における時間の捉え方の基本的な枠組みを探り出し,その現代的意義に関し一定の見通しを立てること。である。結論的には,これら所期の目的は,研究分担者等の協力を得て,ほぼ達成されたといえる。以下に,本研究の遂行に当たって各研究分担者が主にどのような問題の解明を試みたかを簡略に記せば,次の通りである(一部省略)。土田は『マハ-バ-ラタ』中に現れる二説話の運命論的思想について検討した。宮元はヒンドゥ-教文献に見られる宇宙論を理解する上で不可欠の『マヌ法典』における時間の単位について調査するとともに,「宇宙は無限である」というインド思想の一根幹をなす考え方を哲学的に考察した。谷沢は言語哲学者バルトリハリが説く行為者としての時間なでについて論究した。加藤は一般に煩悩の別称とされる「隨眠」を手掛りとして,説一切有部の三世実在説とそれに対する経量部の反論を詳細に解明した。木村は華厳教学の大成者法蔵の時間論を究明し,その意義を探った。竹村は現代の諸哲学ともしばしば比較される道元の時間論を追究し,彼の思惟構造の重要な一面を明らかにした。蜂屋は広く諸資料を探って,中国における「時」の思想を跡づけ,それを踏まえて中国仏教者僧肇の時間論の特徴を浮き彫りにした。坂部はベルグソンにおける「多様性」の概念を詳細に検討し,そこから,東西の時間観念の比較研究を行うに際しての一般的な時空モデルないし時間モデルを構成するための多くの手掛かりを得た。
歯の移動時のＣＯ２レーザーにおける疼痛軽減効果の作用機序の解明とその臨床応用

アストロサイトとグリア細胞の歯の移動時の変化の分析結果として、ラット三叉神経脊髄路核において、3日後より増加、5日後に最も著しい増加を認め、14日後に元の状態に戻った。次に、痛みマーカーであるc-fos蛋白とこれらの細胞との共存を認めた細胞は、5日後に尾側亜核および吻側亜核に増加した。以上より歯の移動時の遅発性の痛みの伝達、調節にこれらの細胞の関与が示唆された。次に、CO2レーザー照射を行うと、歯の移動13日後に増加したc-fos蛋白は抑制したが、アストロサイトとグリア細胞の減少は認めなかった。以上より、レーザー照射による鎮痛効果は主に即効性の痛みに関与することが示唆された。平成25年度は、培養神経細胞および骨髄細胞におけるCO2レーザー照射の影響について検討する前に、CO2レーザーによる組織傷害、末梢神経傷害が無いことを確認する実験を行なった。実験後のラット上顎骨を採取し、10% EDTAにて脱灰後、凍結式ミクロトームにて50μmの厚さで矢状方向に切断した。4°Cで、rabbit anti-CGRP抗体(×500)に72時間浸し、PAP法にて免疫染色を行い、DABと0.015% H2O2で視覚化した。顕微鏡にて歯根膜部や歯髄内を観察し、神経ペプチドであるCGRPの含有神経線維を観察し、歯の移動やCO2レーザー照射などの侵害刺激により、神経線維の萎縮などの傷害が生じていないか評価した。また、H-E染色を行い、CO2レーザー照射による組織為害性について評価した。その結果、全ての群の左右の根尖部付近の歯根膜と歯髄ににおいて、CGRPに反応を示した神経線維が観察された。また、H-E染色から、全ての群の組織切片において、組織傷害は観察されなかった。このことから、今回使用したCO2レーザーの出力、照射時間の範囲では、歯根膜や歯髄における神経線維に対して為害作用はないことが推測された。平成24年度の研究実績として、ラットの上顎第一と第二臼歯の実験的矯正移動を行ない、歯の移動開始後1,3,5,7,14,28日目にラットの灌流固定を行なった。上顎を取り出し後固定を行い、EDTAにて脱灰したのち凍結させ、中脳路核や三叉神経節も凍結させ、ミクロトームにて20μmの連続凍結切片を作成した。作成した切片の免疫染色ならびに蛍光免疫染色を行ない、反応部位におけるマイクログリア、アストロサイト及びそれぞれの神経ペプチドやc-fos蛋白の局在を落射蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡から得られる蛍光像から断層像を再構築し、三次元距離計測ソフトおよび体積・表面積測定ソフトを用い、神経組織の三次元構築を行い、定量化した。その結果、実験的歯の移動後3,5,7,14日では、尾側亜核の実験側においてマイクログリアならびにアストロサイトの集積や突起の伸展が認められた。吻側亜核においては、マイクログリアは3,5,7,14日後に、アストロサイトは7,14日後に実験側において増加ならびに伸展がみられた。また、実験的歯の移動後3、5、7日に歯の移動側ではc-Fos陽性の神経線維周囲にマイクログリア、アストロサイトの集積が認められた。14日後においては、マイクログリアならびにアストロサイトの集積は認められなかった。これらの結果は、グリア細胞が痛みの発達、維持に関与していることを示唆している。末梢神経の侵害受容により、中枢では神経の活性化が起こり、神経伝達物質を放出し、周囲のマイクログリアの活性化を引き起こす。この早期のマイクログリアの活性化は、アストロサイトの活性化を導き、痛みを維持させると考えられる。本研究の目的は矯正歯科治療に伴う痛みに対する中枢神経系の役割およびCO2レーザーの軽減効果のメカニズムを解明することである。本申請者らはすでに歯の移動時に認める痛みマーカーの発現の分析を末梢及び中枢で行い、CO2レーザー照射による影響を基礎的(Journal of Dental Research, 89: 537-42, 2010)または臨床的(Angle Orthod. 78: 299-303, 2008)に報告した。今回、我々は即発性の痛みのみならず、矯正歯科治療に特徴的な遅発性の痛みにおける効果に着目した。そこで、まず新たに遅発性の痛みの指標となりえるアストロサイトおよびグリア細胞の歯の移動時の変化の分析を行った。その結果、実験的歯の移動後、ラット中枢神経(三叉神経主知覚核、尾側亜核、吻側亜核)領域において、アストロサイトおよびグリア細胞の増加を認めた。

アストロサイトおよびグリア細胞は尾側亜核において3日後より増加、5日後に最も著しい増加を認め、14日後にコントロールの状態に戻った。さらに、痛みマーカーであるc-fos蛋白とアストロサイトおよびグリア細胞の共存性の検証を行った。c-fos蛋白が歯の移動後35日後において増加を認めた。マイクログリアおよびアストロサイトにおいてc-fos蛋白と共存を認めた細胞は、5日後に尾側亜核および吻側亜核に最も著しい増加を認めた。以上の結果より歯の移動時に特徴的に起きる遅発性の痛みにアストロサイトおよびグリア細胞が関与し、痛みの伝達および調節に深く関わることが示唆された。次に、ラット臼歯の実験的歯の移動後、CO2レーザー照射を行ったが、13日後に著しく増加したc-fos蛋白の抑制を認めたが、アストロサイトおよびグリア細胞の有意な減少は認められなかった。以上より、CO2レーザー照射による鎮痛効果は主に即効性の痛みに関与することが示唆された。歯科矯正学平成25年度は、培養神経細胞および骨髄細胞におけるCO2レーザー照射の影響について検討する前に、CO2レーザーによる組織傷害、末梢神経傷害が無いことを確認する実験を行なったために、やや遅れている。平成24年度は、実験的歯の移動時におけるCO2レーザー照射の影響について検討する予定であったが、CO2レーザーの照射条件を決定するのに時間を要し、実験がやや遅れている。CO2レーザー照射時のラット組織内の温度変化等の結果を参考にし、レーザーの照射条件は1.0W、30秒間行うこととし、歯の移動のための矯正用ゴムを挿入した部位の歯周組織にCO2レーザーを照射する方法で、現在進行中である。平成26年度は、培養神経細胞および骨髄細胞におけるCO2レーザー照射の影響について検討する予定である。今後、平成25,26年度に、実験的歯の移動後の三叉神経脊髄路核尾側亜核、吻側亜核において、モノアミン、プレプロエンケファリンmRNAの発現の検討を行い、CO2レーザー照射が、痛みの下行抑制系に及ぼす影響について評価する。また、CO2レーザー照射が歯周組織に与える傷害について評価するために、培養神経細胞に直接CO2レーザーを照射し、神経細胞の構造、神経ペプチドの放出の変化およびそれらが回復するまでの過程を評価する。さらに、培養骨髄細胞を用い、CO2レーザー照射による骨分可能の評価を行う予定である。平成25年度は、培養神経細胞および骨髄細胞におけるCO2レーザー照射の影響について検討する前に、CO2レーザーによる組織傷害、末梢神経傷害が無いことを確認する実験を行なったために、細胞培養費およびそれに関連する消耗品、機器の使用がなかったために、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額と合わせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。