hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞死を制御するマイクロRNAの同定とその癌化における役割

がん細胞で高発現し抗アポトーシス機能を果たしているWT1遺伝子が,抗癌剤ドキソルビシン処理によるアポトーシス誘導時に、その濃度依存的に発現抑制をうけることを見出した。次に、抗癌剤誘導性アポトーシス時に発現が亢進し、WT1の発現を抑制することによりアポトーシス経路を活性化しうるmicroRNA(miRNA)の同定を試みた。低分子RNAクローニング法により、抗癌剤処理により発現誘導をうける低分子RNAを22種同定し、それらのなかからmiR-A(仮称)がWT1を標的としアポトーシスを制御しうることを明らかにした。さらにmiR-Aは肺癌患者の予後マーカーになりうることを明らかにした。がん細胞で高発現し抗アポトーシス機能を果たしているWT1遺伝子は,抗癌剤処理によるアポトーシス誘導時に、その濃度依存的に発現抑制をうけることを見出した。本研究では、抗癌剤誘導性アポトーシス時にWT1の発現抑制因子として働き、アポトーシス経路を活性化しうるmiRNAの同定を試みた。まず、未処理の胃癌細胞株と抗癌剤処理した胃癌細胞株からそれぞれ15nt-30ntの低分子RNAをクローニングし、それらのクローン頻度を比較することによって抗癌剤処理により発現誘導をうける低分子RNAを同定した。これら低分子RNAのなかから既知のmiRNAに焦点をあて、reporter assayによりWT1 mRNAを直接的に標的とするmiRNAの決定を試みた。その結果、3種のmiRNAがWT1を直接の標的としうることが明らかになった。これら3種のmiRNAはWT1を発現する固形癌細胞株において、WT1の発現を抑制しアポトーシスを誘導した。特に、あるmiRNA(miR-A:仮称)は最も効率よくWT1の発現を抑制し、それに相関して最も強いアポトーシス誘導能を示した。一方で、内在性miR-Aを阻害すると、抗癌剤誘導性アポトーシスが抑制されると同時に、WT1の発現抑制効果が軽減された。これらの結果は、miR-Aがアポトーシス実行過程においてWT1の発現抑制因子として働いていることを示している。さらに定量的real-time PCRにより、WT1を高発現している肺癌患者癌部においては非癌部に比べてmiR-Aの発現が低下していることを明らかにした。現在このmiRNAのノックアウトマウスの作成に着手しており、次年度では生体機能に及ぼす役割や、がん化において果たす役割を検討していきたい。がん細胞で高発現し抗アポトーシス機能を果たしているWT1遺伝子は,抗癌剤ドキソルビシン処理によるアポトーシス誘導時に、その濃度依存的に発現抑制をうけることを見出した。本研究ではまず、未処理およびドキソルビシン処理後の胃癌細胞株からそれぞれ低分子RNAクローニングをおこない、クローニング頻度をすることにより、抗癌剤処理によって発現誘導をうける低分子RNAを明らかにした。そして、それらのなかから既知のmiRNAに焦点をあて、抗癌剤誘導性アポトーシス時にWT1を直接の標的としその発現を抑制するmiRNA(miR-A;仮称)を同定した。そこで本年は、miR-Aノックアウトマウスを作成し、miR-AによるWT1を含む標的遺伝子群の調節機構の破綻が生体に及ぼす影響、さらにがんの発症や進展において果たす役割を明らかにすることを目的とした。まずmiR-A前駆体をコードする領域をloxP配列で挟まれたNeo遺伝子に置換したマウスを作成した。このマウスとCAG-Creマウスの交配により、Neoを除去し、miR-A前駆体領域がloxP配列に置換したマウスを得た。miR-A(+/-)ヘテロ欠損マウス同士の交配によりmiR-A(-/-)ホモ欠損マウスを得た。miR-A欠損マウスの成体期における血液学的・病理組織学的解析による表現型スクリーニングから、miR-A欠損マウスは血液学的異常(骨髄増殖性疾患)および泌尿生殖器系の異常(水腎症、腎奇形)を呈していることが明らかになり、miR-Aが造血システムや腎発生に重要であることを示した。
ナノ秒蛍光を指標とした非侵襲生体糖化検出法の開発と糖尿病スクリーニングへの応用

蛋白質による糖化反応は複雑で未解明の部分も多いが、最終的に非常に安定なAGE架橋がコラーゲン線維間に生成される.AGEs架橋が過度に形成されるとコラーゲン線維の色調や物性が変化する。同時にコラーゲンの自家蛍光の蛍光寿命がAGEsの産生に伴い短くなるという報告もある。AGEsの局在や組織への蓄積を光学的に分析することで組織の糖化レベルを評価ことができ、糖化現象が生体にあたえる影響を解明できそれらを応用することで生体老化の指標を策定できるのではないかと考えた。本研究で人及びラット組織のAGEs沈着状況と蛍光寿命の変化を詳細に測定し生体の糖化が蛍光寿命を基準として評価できる可能性が示唆された。コラーゲン分子にパルス紫外光を照射すると、コラーゲン自身の青白い自己蛍光が発生し、さらに非線形光学現象によってSHG光も発生する。そこで、本研究では蛍光性AGEに着目し、光を指標にして組織老化や糖化を評価する診断法を開発する。糖尿病患者の皮膚や血管にはAGEsが通常より多く蓄積されており、歯髄内においても異所性の石灰化が起こるとされている、さらに歯髄においてもAGEs沈着が石灰化現象と密接な関連があるという報告や、蛍光性AGEsの一種であるpentosidineの沈着が齲蝕罹患部位に認められるという報告がされている。我々はこれらの糖化において二次的に起こる現象を利用することで、蛍光寿命測定の原理を応用した生体における糖化コラーゲンの蓄積を検出することを目的とした。本研究で提案する手法はナノ秒蛍光特性を簡便に測定し、蛍光減衰波形をもとに糖化度をチェックすることで老化状態を指標化するものである。このような手法を生かした装置の開発自体が医用光学の分野で大きな意味を持つだけでなく、提案手法は皮膚からの情報取得を目標とし、非侵襲であるため診断に対する制約が無く、糖尿病の簡易スクリーニングに利用でき、QOL向上につながる。また、直ちに発展可能な応用では、カテーテルによる、血管内部からの血管壁糖化チェックが考えられる。さらにSHGと組み合わせてマルチモダール化すれば、光老化、しわ発現、再生医療、皮膚移植・角膜移植を初めとする臓器移植、火傷評価など、コラーゲンが関与するさまざまな医科学研究ならびに医療に寄与できると考えている。本年度においては予定していた細胞培養用コラーゲンゲルおよび象牙質コラーゲンを糖化させ、液体クロマトグラフィーにより、蛍光性AGEであるペントシジンを抽出することが可能となった。対照ペントシジンには化学合成した試薬を用い、生体より得たものと蛍光比較を行った。ペントシジンの蛍光寿命値はまだ報告されていないので、一連の実験結果を報文としてまとめることができた。形態学的アプローチとして、象牙質や軟組織内の架橋構造の超微形態学的観察をするための透過型電子顕微鏡用観察試料作成を行った。コラーゲン内の架橋構造の局在には、超薄切片加工とコラーゲン染色技術および超高圧電子線トモグラフィーによる撮影を用いる。また、架橋領域の染色方法としてコラーゲン分子間架橋構造に対してはカテキンを用いたポジティブ染色を用いる予定であったが、カテキンによるコントラストが十分得られなかったため免疫電子顕微鏡法に切り替え、十分な観察が可能となった。コラーゲン線維内でのAGEsの局在を特定するが出来た。人の歯では緩慢な変化が起こっており、加齢に伴い石灰化が亢進する一方、象牙質コラーゲン線維においては糖化反応が起こり、Advanced GlycationEnd-products(AGEs)と総称される糖化物質の沈着が進むことで、歯の変色や物性の変化に与える影響を与えることが分かってきた。糖化反応は加齢変化の一つとして考えられ、一連の反応はメイラード反応とよばれ、酵素が関与せずに不可逆的に反応が進行する。象牙質は糖化ストレスに常に受ける環境にあり、ほとんど代謝しないため老化物質が蓄積しやすい環境と考えられる。最近では、血液中のヘモグロビンや血管、歯を構成する象牙質やその歯における疾患である齲蝕の中にもAGEsが蓄積することが分かり、蓄積した蛍光性AGEsに対して光学的な手法を応用することで様々な疾患の診断や治療への応用も視野に入れて研究を進めている。本研究では超微形態学的手法、免疫組織学的手法、western blot法などの生化学的手法、さらに象牙質コラーゲンの蛍光寿命測定などの光学的手法を用いて分析を行った。コラーゲン基質におけるAGEsの中には自己蛍光を持っているものもあり、本研究においてコラーゲン線維の自己蛍光に比べて蛍光の減衰時間である蛍光寿命が短いという結果が出た。その違いを光学的に測定し利用することで従来の蛍光量を指標とした蛍光強度ではなく蛍光の質をみた蛍光寿命による感度の高い測定を行うことが可能となった。クロマトグラフィーやNMRのデータから蛍光性架橋の原因物質はペントシジンであると考えられる。これらの物質は、生体内の様々な期間において蓄積することから、ヘモグロビンの蛍光寿命の減衰や血管の力学的強度の低下や、象牙質の齲蝕進行特性の変化にも相関しており、今後様々な臨床領域への応用が可能であると考えている。

AGEsの局在や組織への蓄積を光学的に分析することで組織の糖化レベルを評価ことができ、糖化現象が生体にあたえる影響を解明できそれらを応用することで生体老化の指標を策定できるのではないかと考えた。本研究で人及びラット組織のAGEs沈着状況と蛍光寿命の変化を詳細に測定し生体の糖化が蛍光寿命を基準として評価できる可能性が示唆された。29年度は観察手法の汎用性を考え、小型かつ安価な小出力の半導体紫外レーザーを使い、検出は高感度なフォトンカウント方式を採る。そこでは蛍光に限定して、糖尿病スクリーニングの可能性を探る。(1)励起パルス光源として小型半導体レーザーを、試料照射部に光ファイバーを用い可動プローブ型AGEチェック装置を試作する。生体への安全性に関しては十分に考慮する。(2)蛍光情報と生理学的所見との整合性を議論し、糖尿病ラットで血液を用いた実用性の評価を行う。ヒト測定部位は口腔粘膜や歯肉から始める。理由は、口腔粘膜において表層に血管が走行しており光が浸透しやすい点にある。最終的には腕などの皮膚なども対象とする。(3)バイオメカニクス的考察を含め、糖化が関与する生体変化の総括的な検討を進める生体工学2016年度においてラットを用いた動物実験の開始時期が1ヶ月ずれ込んだ(ラットを飼育する期間を血糖値の状態から1ヶ月ほど延長したため)ため、その額が次年度使用額として計上されることとなった。実験自体は順調に経緯しており当初の計画には問題ない。現在飼育しているラットを用いた実験の追実験として、糖尿病に罹患したラットを購入する(34万円/匹)予定である。
昆虫の寿命延長処理に伴う記憶障害の分子基盤の解明

代表者はコオロギの長期記憶形成能力が加齢に伴い低下することを報告している。本研究ではコオロギを使って、寿命延長処理が記憶能力に及ぼす影響を調べた。低温環境で飼育したコオロギでは長期記憶形成能を維持したまま寿命が延長した。交尾制限したコオロギでは寿命が延長したが成虫脱皮の早い段階から記憶形成能が低下した。抗酸化物質のメラトニンを長期投与したコオロギでは、寿命の延長なしで長期記憶形成能を長く維持できた。また加齢コオロギにメラトニンを単回投与すると長期記憶が形成され、メラトニンが長期記憶の形成過程に重要であることが示唆された。動物では加齢に伴い体の老化と脳の老化が進んでいく。その一方で低温環境、食餌制限、交尾制限など特定の飼育環境下において寿命が延長することが報告されている。しかし、これらの飼育条件が脳の老化に与える影響を調べた研究は少ない。本研究の目的は、交尾制御などの寿命延長処理に伴う脳の老化の分子機構を、特に記憶分子として知られている一酸化窒素(NO)の動態と絡めて明らかにすることである。具体的には、記憶の研究において優れた研究材料として知られているフタホシコオロギを用い、(1)低温環境、食餌制限、交尾制限などの飼育環境下における寿命と脳老化の関係を調べ、(2)それらのコオロギについてNOを含む様々な記憶関連分子の脳内発現量を調べ、脳老化の分子機構を推察する。また(3)抗酸化物質が寿命や脳老化にどのような影響を及ぼすのかも調べる。初年度は主に、飼育環境や抗酸化物質が寿命と脳老化に与える影響について調べ、以下の結果が得られた。(1)交尾制限した雄コオロギの成虫脱皮後の寿命と記憶障害の発症時期を調べたところ、平均寿命は雄雌一緒で飼育した対照群と比べて約1.5倍に延長したが、記憶障害は逆に数日早く出現した。すなわち交尾制限雄では寿命が延びる反面、脳の老化が早く起こるといえる。ただし、この雄を雌と2日間ペアにしたところ、記憶障害が完全に回復した。(2)低温条件下(21度)で飼育したコオロギは通常の飼育温度(27°C)で飼育した対照群と比べて平均寿命が約1.4倍延長し、記憶障害の出現時期も1.5倍以上遅れた。すなわち低温条件下では寿命が延び、かつ脳の老化時期も遅くなった。(3)抗酸化物質であるメラトニンを飲料水に混ぜて飼育したコオロギでは、通常のコオロギで記憶障害がみられる成虫脱皮20日目においても記憶障害が全く観察されなかった。すなわちメラトニンには脳の老化を予防する効果があることが示唆された。その一方で、低温環境、食餌制限、交尾制限など特定の飼育環境下において寿命が延長することが報告されている。本研究の目的は、交尾制御などの寿命延長処理に伴う脳の老化の分子機構を、記憶分子として知られている一酸化窒素(NO)の動態と絡めて明らかにすることである。本研究では、記憶の研究において優れた研究材料として知られているフタホシコオロギを用い、初年度では、低温環境、交尾制限などの飼育環境下における寿命と脳老化の関係を調べた。2年目は主に、抗酸化物質であるメラトニンが寿命と脳老化に与える影響について調べ、以下の結果が得られた。(1)抗酸化物質であるメラトニンを飲料水に混ぜて飼育したコオロギでは、通常のコオロギと比べて平均寿命に有意な差はみられなかった(成虫脱皮後の平均寿命が約14日)。ただし、これらのメラトニン水飼育コオロギでは、通常は成虫脱皮3週目の加齢コオロギにおいてみられる長期記憶形成不全(加齢性記憶障害)が全く観察されなかった。(2)加齢コオロギの脳にコオロギの生理食塩水に溶かしたメラトニンを単回投与したところ、若いコオロギ同様に長期記憶が形成された。(3)抗酸化物質として知られているグルタチオンやアスコルビン酸を投与した加齢コオロギでは、加齢性記憶障害を改善する効果はみられなかった。以上の結果から、メラトニンには寿命を延長する効果がみられなかったが、抗酸化作用とは違う作用により脳の老化を予防及び回復させる効果があることが示唆された。また、(4)交尾制限により脳の老化が進んだコオロギにメラトニンを単回投与したところ、記憶形成能が改善した。すなわちメラトニンには、環境の変化に起因する脳機能の低下も改善できることがわかった。加齢に伴い脳が老化するという現象(加齢性記憶障害)は、ヒトを含む哺乳類だけでなく昆虫などの無脊椎動物でも知られている。一方で、抗酸化物質の投与、低温環境、食餌制限、交尾制限などの処置により寿命が延長することも報告されている。ただし、これらの処置が脳の老化に与える影響を調べた研究は少ない。本研究の目的は、抗酸化物質の投与や交尾制御に伴う脳の老化の分子機構を、一酸化窒素(NO)などの既知の記憶分子と絡めて明らかにすることである。本研究では、学習・記憶の研究において優れた研究材料として知られているフタホシコオロギを材料として用いている。

本研究ではこれまでに、(1)交尾制限したコオロギでは、寿命が延長されるが記憶障害が早く起こること、(2)低温条件で飼育したコオロギでは、寿命が延び、脳の老化時期も遅くなること、(3)抗酸化物質であるメラトニンが加齢コオロギ(成虫脱皮3週目のコオロギ)でみられる長期記憶の記憶障害(加齢性記憶障害)を予防および回復させることを見出した。最終年である平成27年度では、若齢コオロギ(成虫脱皮1週目のコオロギ)に対するメラトニンの効果について調べた。まず、若齢コオロギの脳にメラトニンを訓練直前または訓練直後に単回投与したところ、本来長期記憶を形成できない1回の学習訓練でも長期記憶が形成された(長期記憶の誘導効果)。一方、抗酸化物質として知られているグルタチオンやアスコルビン酸には長期記憶の誘導効果がみられなかった。また、メラトニンとNO合成酵素阻害剤の共投与実験から、メラトニンは長期記憶形成機構においてNO系より下流で働くことが示唆された。さらに、メラトニンの代謝産物もメラトニン同様に長期記憶の誘導効果がみられた。以上の結果は、メラトニンが従来考えられていた抗酸化作用とは別の機構により脳の老化を抑制することを支持するものである。代表者はコオロギの長期記憶形成能力が加齢に伴い低下することを報告している。本研究ではコオロギを使って、寿命延長処理が記憶能力に及ぼす影響を調べた。低温環境で飼育したコオロギでは長期記憶形成能を維持したまま寿命が延長した。交尾制限したコオロギでは寿命が延長したが成虫脱皮の早い段階から記憶形成能が低下した。抗酸化物質のメラトニンを長期投与したコオロギでは、寿命の延長なしで長期記憶形成能を長く維持できた。また加齢コオロギにメラトニンを単回投与すると長期記憶が形成され、メラトニンが長期記憶の形成過程に重要であることが示唆された。2年目の研究実施計画では「抗酸化物質による寿命延長と脳老化の関係」「交尾制限による寿命延長コオロギの加齢性記憶障害改善実験」を、行動薬理学的手法を用いて調べることを目的としており、いずれも示唆に富んだ結果が得られた。特に、メラトニンには加齢性記憶障害に対して予防だけでなく改善効果もあることがわかり、今後NO系との関連を調べていきたい。以上のことから、本年度の達成度を「(2)おおむね順調に進展している」とした。生物学まず、食事制限やインスリンシグナル伝達系の阻害などが寿命と脳老化に及ぼす影響を行動薬理実験やRNAiを用いて調べる。さらに、通常の環境で飼育した若齢コオロギと加齢コオロギだけでなく、交尾制限、低温環境で寿命延長したコオロギやメラトニン投与コオロギの脳を取り出し、NOSのmRNAの定量実験を行う。そしてこれらの飼育環境を変える実験や薬物投与実験でそれぞれ得られた寿命、記憶力、脳内NOS量のデータを比較解析してこれら3つのパラメータの相関を調べ、申請者が立てた「体の老化(寿命)と脳の老化の間にはNOを介したトレードオフの関係がある」という作業仮説を検証する。初年度の研究実施計画では交尾制限コオロギの寿命、記憶力、脳内NO量を、主に行動実験と分子生物学的手法を用いて調べることを目的としていた。ただし初年度の春に申請者が北海道大学から東京医科歯科大学に移動することになり、申請者の実験環境や実験動物の飼育環境が大きく変化してしまい、コオロギの大量飼育・大量使用が難しくなった。そこで、大量のコオロギが必要である初年度の行動実験の一部を2年目以降に移動し、その代わりにコオロギの数が少なくても結果を出すことができる2年目以降遂行予定の実験を初年度に行った。
熱水噴出孔周辺の原始的な蔓脚類の系流進化学的研究

北フィ-ジ-海盆の水深1990mの熱水噴出孔から無柄目フジツボ亜目フジツボが採集された。ハワイ沖の浅海に生息するChionelasmus darwiniiに近縁であるが,形態的に異なり,そのギャップの大きさから新属新種(Eochionelasmus ohtai Yamaguchi)と判断された。周殻基底部に多層の付随小殻板を持つことや蓋板の筋痕などの特徴から,最も原始的なフジツボ亜目だったC.darwiniiよりも原始的,つまり最も原始的なフジツボ亜目であった。深海熱水噴出孔からは東太平洋海嶺で有柄目エボシガイ亜目のNeolepas zevinaeが,マリアナ背孤海盆で無柄目ハナカゴ亜目のNeoverruca brachylepadoformisが発見され,それらは各分類群で最も原始的であった。これらの原始的なものは互いに外部形態が異なる。上唇,大顎,小顎,蔓脚などの軟体部の形態は極めてよく類似し(収れん現象),深海熱水噴出孔周辺のかすかな流れで運ばれる極めて細かな浮遊物体をとらえて食べるのに適した軟体部を持ち,浅海や潮間帯に棲む原始的なフジツボ類と著しく異なる。Eochionelasmusの個体発生は筋肉の柄を持った(有柄目)段階を経て,最終的にそれを失い,その一部に系統発生を含んでいる。中生代後期から新生代初めの適応放散で,浅海にいた原始的な分類群が,より進化した分類群によってニッチェを奪われ,浅海域に住んでいた祖先の絶滅後も,熱水噴出孔に用意された避難場所に逃げ込んで原始的な特徴を持ったまま特殊化したと考えられる。以上をまとめてPasific Science(1990).vol.44,no.2,pp.135ー155に掲載した。またエボシガイ亜目はNeolepas zevinaeの他に,沖縄トラフに2新種および北フィ-ジ-およびラウ海盆にそれぞれ1新種が,ハナカゴ亜目はNeoverruca bracylepadomorphaの他に,沖縄トラフに2新種,海形海山に1新種,北フィ-ジ-・ラウ海盆に1新種が生息することが判った。
外来通院がん患者の主体性を活かして行う実践のための外来看護師育成プログラムの洗練

平成28年度に引き続き研究協力施設の確保につとめた結果、4施設を確保できた。各施設内の倫理審査委員会に審査の申請をし、承認を得た。平成29年7月、当初から協力の意思のある施設を研究協力施設として確保できる予定であったが、当初の予想に反し、多忙な外来のため再度協力を検討したいと連絡があり、研究協力施設の確保に時間を要した。最終的には4施設から同意が得られ、各施設内の倫理審査委員会に審査を申請し、承認を得た。施設ごとに運用方法を検討し、プログラムを実施する。プログラム実施後は、評価のためのインタビュー調査を実施し、分析を通してプログラムの洗練を行う。【目的・方法】外来がん看護分野及び看護人材育成分野の有識者5名程度からなる専門家会議を2回開催し、グループインタビュー内容の質的分析を通して、開発した「外来通院がん患者の主体性を活かして行う実践のための外来看護師育成プログラム」(以下プログラム)の妥当性・実現性を高めるための課題を明らかにした。【結果】1.プログラムの目的・学修者:「学修者の条件は経験年数ではなく実践力のレベルで表記する」等3課題が明らかになった。2.構成と活用方法:「運用のイメージがわかない」「プログラム内容が主体性を育み活かすこととどのように結びつくのかをわかりやすく記述する」「サブプログラム(以下SP)の前に自宅療養中の患者の特徴や外来看護の役割について学べる内容を加える」「SPの前に外来看護のための時間と場所を捻出する工夫を学べる内容を加える」「指導者が適切に指導できるようマニュアルが必要」等21課題が明らかになった。3.サブプログラム:SP1患者の考えの把握と理解;6課題、SP2問題解決方法獲得への支援と療養姿勢の後押し/SP3がん治療に伴う副作用と対処方法の説明;6課題、SP4医師からの情報獲得支援;2課題、SP5外来における他職種連携;「他職種任せにせず看護師の役割を果たすことを強調」等7課題、がそれぞれ明らかになった。【考察】加えるべき内容、強調すべき内容、表記方法、運用上の工夫等プログラムの妥当性・実現性を高めるための課題が明らかになった。外来看護師に特化した教育プログラムは少ないため、プログラム運用方法はわかりやすく記述する必要があり、また、プログラム内容と主体性の育成・活用との関係を明確に記述する必要があるといえる。さらに外来通院がん患者の特徴や外来看護の特徴をプログラムの基礎として位置づけることや目的にそった指導ができるよう指導者マニュアルの作成が必要であることが明らかになった。研究協力依頼を行った6施設すべてから協力が得られたため、計画通り専門家会議を開催することができた。外来がん看護分野及び看護人材育成分野の有識者からなる専門家会議(平成27年度実施)の結果をふまえて、開発した育成プログラムの修正を行った。これまでの研究協力施設(がん診療連携拠点病院)に修正した育成プログラムの試行について研究協力を依頼し、研究協力施設の確保を行った。一方、育成プログラムを円滑に運用できるよう講義教材(教育テキストとスライド)を作成した。平成28年7月よりこれまでの研究協力施設に協力依頼を開始し、11月には同意を得、平成29年3月までには施設ごとのプログラム運用方法の検討を終了する予定であったが、当初の予想に反し、多くの病院から、平成28年度診療報酬改定における入院基本料算定要件見直し等の影響が大きく研究協力の余裕がないと連絡があり、研究協力施設の確保に時間を要した。平成28年度は以下のように研究をすすめる。1.専門家会議の結果をふまえて育成プログラムを修正し、プログラムの妥当性・実現性を高める。2.がん診療連携拠点病院に対しプログラム試行についての研究協力を依頼する。3.協力の得られた施設に研究者が出向き、平成29年度のプログラム実施に向けて、外来看護師の教育担当者とともに運用方法の検討・準備を行う。研究協力を依頼している施設のうち、4施設からは、状況が落ち着けば協力を検討したいといわれているので、協力依頼をすすめる。協力が得られた施設から、外来看護師の教育担当者(教育担当の副看護部長や看護師長など)と育成プログラムの具体的な運用方法について検討を開始する。
TiS2系2D超格子材料の化学創製

本研究では、我々は無機層状TiS2単結晶のファンデルワールスギャップに有機分子(ルイス塩基)を挿入した無機/有機ハイブリッド超格子を新規熱電変換材料として研究していた。まず、CVT方法によって、TiS2単結晶を育成した。次は電気化学反応と使って、有機分子をTiS2単結晶のファンデルワールスギャップに挿入した。さらに、溶媒交換によって、無機/有機ハイブリッド超格子の構造と特性を制御した。結果として、TiS2(Hexylamine)x(H2O)yを合成し、NMR分析によって、組成を確認した。また、XRD、HAADF-STEMと偏光FT-IR分析を使って、有機無機ハイブリッドの層状構造及び有機分子のTiS2層間での傾きを明らかにした。自家製装置を使って、熱電特性を測定した。室温で、TiS2(Hexylamine)x(H2O)yので導電率は784S/cmになり、元のTiS2単結晶(300S/cm)より、大きく上がった。ホール測定により、有機分子(ルイス塩基)の挿入のため、キャリア濃度を大幅に上がった。その結果、ゼーベック係数は-75.4uv/k低い値を示した。TiS2(Hexylamine)x(H2O)yの熱伝導率は0.69W/mKになり、元のTiS2単結晶4.45W/mKより、大幅に低減させることが成功した。最後はTiS2単結晶を超える熱電特性を得られました。室温でZT=0.2, 100度で0.28を達成した。さらに、異なる誘電率を持つ有機分子を系統的にインターカレーションした。試料のキャリア濃度、ゼーベック係数はほぼ同程度であったが、極性有機分子の誘電率の増加とともにキャリア移動度が増加するため導電率も向上した。これは、極性有機分子の誘電遮蔽効果によってTiS2層内の伝導電子が有機カチオンから受けるクーロン引力が減少するためと解釈される。
DRPLAモデルマウスにおける神経細胞機能障害の生理学的解析

歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)の病因は患者のDRPLA遺伝子のCAGリピート(ポリグルタミンをコード)の異常伸長が異常蛋白の核内集積、転写障害を引き起こし、機能異常をもたらすと考えられている。我々は伸長した変異DRPLA遺伝子(129リピート)を導入したトランスジェニックマウス(Q129)から得られた脳切片を用いてDRPLAの病態生理を電気生理学的に検討した。Q129は脳全体が萎縮してんかんの重積発作を示すため、まず12-14週齢の海馬のシナプス伝達機能を調べた。その結果、興奮性シナプス後電流(EPSC)の減弱とNMDA/AMPA比やpaired pulse ratioの増大、AMPA受容体、GABA受容体の減少、spineの減少が観察された。シナプス伝達の長期増強現象には強い刺激条件下では有意差は認められなかったが、サンプル数が足りないので結論に至らなかった。次に、症状出現以前の4週齢の淡蒼球を調べた。ここではpaired pulse ratioの著明な低下が見られた。他の所見には異常は認められなかった。一見矛盾する結果であるが、逆に、以上の結果はシナプス前における細胞内カルシウムのhomeostasisの異常を示すもので、このことがDRPLA症状発現の原因のひとつと考えられた。
真核細胞に二重鎖DNAひねり/巻き戻し因子(DUF)の構造と機能に関する研究

DUFは、二重鎖DNAに結合して二重鎖に負にひねりを加え、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された因子である。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRPl(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのへテロ二両体である。S期のXenopus卵無細胞抽出液に、精子クロマチンあるいはプラスミドDNAを添加すると、これらを鋳型としてDNA複製が起こる。この系を用いて、DNA複製におけるDUFの機能を解析した。抗-DUF抗体を用いて、卵抽出液からDUFを除くと、精子クロマチンを鋳型としたDNA複製活性が著しく減少した。これに精製DUFを加えると、複製能の回復が見られた。このことからDUFが卵抽出液におけるDNA複製に必須であるがわかる。精子クロマチンを卵抽出液に加えると、クロマチンが膨潤し、次いで、核形成が起き、DNA複製が行われる。卵抽出液中のDUFは核形成時またはそれ以後、かつ、DNA複製開始以前に核に取り込まれ、クロマチンと結合することがわかった。抗-DUF抗体を用いた沈降実験により、p97ATPaseがDUFと相互作用するということがわかった。p97ATPaseもDUFとほぼ同じ時期に、再構成された核に取り込まれた。p97ATPaseは細胞質において膜の融合に関与するとされてきたが、核内でDNA複製にも関与することが示唆される。DUFを含む卵抽出液中で再構成されたクロマチンDNAは、抗-DUF抗体をもちいてDUFを除いた卵抽出液中で再構成されたクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことが判明した。さらに、DUFはヒストンに対して強い親和性を示した。DUFはDNAおよびコアヒストンと相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。DNA Untwisting/Unwinding Factor(DUF)は、二重鎖DNAに負のひねりを加え、かつ二重鎖を巻き戻すことによって、in vitroでDNA複製を開始させる因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から単離された。DUFは、87kDaと140kDaとの2種のサブユニットから成り、前者はマウスT160(V(D)J組換えのシグナル配列に結合する因子)およびヒトSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)と高い類似性を有し、後者は、出芽酵母のG1期における遺伝子発現制御に関わるCdc68pと約30%の相同性を持つことを明らかにした。本研究では、Xenopus卵抽出液中でDUFが精子核に取り込まれる時期とDNA複製との時期の関係について調べた。さらに、Xenopus卵抽出液中に、DUFと相互作用する因子を探索した。(1)Xenopus卵抽出液に除膜した精子核を加えて、核形成、DUFおよびライセンシング因子であるMCMタンパク質の核への取り込み、また核におけるDNA複製の時期について検討した。その結果、MCMタンパク質が核形成直後に核に取り込まれるのに対し、DUFはDNA複製直前に核に取り込まれることがわかった。(2)抗-DUF140抗体を用いて、Xenopus卵抽出液中にDUFと結合する因子を探索したところ、分子量97kDaの因子が見いだされた。マイクロシークエンシングの結果、この因子はp97ATPアーゼであることがわかった。このATPアーゼは細胞質および核に存在し、細胞質では膜融合に関与することがわかっていたが、核内での機能は不明であった。

DUFとp97ATPアーゼが相互作用することから、このATPアーゼがDUFとともにDNA複製に必要なDNAの構造変化に関与する可能性が示唆された。DUFは、二重鎖DNAに結合して二重鎖に負にひねりを加え、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された因子である。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのヘテロ二両体である。S期のXenopus卵無細胞抽出液に、精子クロマチンあるいはプラスミドDNAを添加すると、これらを鋳型としてDNA複製が起こる。この系を用いて、DNA複製におけるDUFの機能を解析した。抗-DUF抗体を用いて、卵抽出液からDUFを除くと、精子クロマチンを鋳型としたDNA複製活性が著しく減少した。これに精製DUFを加えると、複製能の回復が見られた。このことからDUFが卵抽出液におけるDNA複製に必須であるがわかる。精子クロマチンを卵抽出液に加えると、クロマチンが膨潤し、次いで、核形成が起き、DNA複製が行われる。卵抽出液中のDUFは核形成時またはそれ以後、かつ、DNA複製開始以前に核に取り込まれ、クロマチンと結合することがわかった。抗-DUF抗体を用いた沈降実験により、p97ATPaseがDUFと相互作用するということがわかった。p97ATPaseもDUFとほぼ同じ時期に、再構成された核に取り込まれた。p97ATPaseは細胞質において膜の融合に関与するとされてきたが、核内でDNA複製にも関与することが示唆される。DUFを含む卵抽出液中で再構成されたクロマチンDNAは、抗-DUF抗体をもちいてDUFを除いた卵抽出液中で再構成されたクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことが判明した。さらに、DUFはヒストンに対して強い親和性を示した。DUFはDNAおよびコアヒストンと相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。
英国人植民地官僚の中国農村観と威海衛統治

本研究では中国の山東省に位置する威海衛に着目し、中国農村内部の社会結合をめぐる英国人植民地官僚の認識が、東アジアの英領植民地・租借地の統治政策にいかなる影響を与えたのかを分析しようと試みた。現時点では、当初設定した作業仮説は検証の途上にあるが、資料の調査を通じて、威海衛関連史料の概要を把握することができたほか、さらに検討すべき史料群の存在も明らかとなった。こうした史料群の収集、および本研究を踏まえた上での研究成果の公表は、最終年度前年度申請の結果、2017年度から新たに採択された基盤研究Cにおいて継続して取り組んでいる。本研究の目的は、中国農村内部の社会結合をめぐる英国人植民地官僚の認識が、東アジアの英領植民地・租借地の統治政策にいかなる影響を与えたのかを分析することにある。より具体的には、イギリスの租借地であった威海衛、とりわけその都市周縁に広がる後背地の農村に焦点を当てる。1年目となる本年度は、日本国内に所蔵されている威海衛関係の所蔵状況を把握し、これらを収集することを主な目標とした。この方針に従い財団法人東洋文庫等において、同文庫が所蔵するモリソン・パンフレットに収められている威海衛関連の文書や、イギリス人植民地官僚として香港および威海衛の統治政策に深く関与したジョンストン(R. F. Johnston)による著作等の関連資料を調査・収集したほか、先行研究の整理を行なった。その結果、ジョンストンや彼の先輩にあたるスチュアート・ロックハート(J. Stewart Lockhart)など、威海衛の統治政策に足跡を残した植民地官僚による同地の村落社会をめぐる認識は、威海衛同様にイギリスの植民地であり、彼らが勤務した経験を持つ香港での自らの経験からも様々な影響を受けている可能性があり、彼らが執筆した史料を読解する上でこの点に留意する必要があることが明らかとなった。そこで威海衛をめぐる作業と平行して、イギリスによる香港、とりわけ新界における農村社会の統治についても再検討を開始した。この目的のため、10月下旬から11月上旬には香港およびその周辺地域(澳門、広州)を訪問し、関連資料を調査・収集した。本年度は昨年度の国内外における調査を踏まえ、イギリスの文書館に所蔵されている史料を調査・収集することを主な目標とした。より具体的には、8月17日から9月8日にかけて香港およびイギリスを訪問し、各地で史料の調査・収集を行った。まず、イギリス国立公文書館に所蔵されている威海衛関係の公文書を調査・収集することにより、同文書館に所蔵されている威海衛関係史料の現況を知ることができた。また、スコットランド国立図書館に所蔵されているスチュアート・ロックハートの個人文書を閲覧・収集したことで、公文書には現れてこない現地の事情を知ることができた。このため、概ね順調に進んでいると考えられる。より具体的には、イギリスの租借地であった威海衛、とりわけその都市周辺に広がる後背地の農村に焦点を当てる。3年目となる本年度は、前年度に引き続きイギリスをはじめとする、各地に所蔵されている関連史料の収集・読解に焦点を置いた。2015年度に実施したイギリスでの史料調査の結果、まず当該研究の目的を達成するためには、イギリスの国立公文書館に所蔵されている史料を体系的に収集し、これらを詳細に分析する必要があることが判明した。このため本年度は昨年度に引き続き、8月に2週間ほどイギリス(ロンドン)に滞在し、史料の調査・収集に取り組んだ。より具体的には、国立公文書館では1威海衛をその管轄下に置いた植民地省の関連文書、2威海衛同様に東アジアに所在した、香港に関する植民地省の関連文書、3威海衛の統治に関する内閣関係文書、を中心に収集した。またロンドン滞在中には、英国図書館およびロンドン大学東洋・アフリカ研究学院の図書室も訪問し、関連する文献や史料を調査・収集した。こうしたイギリスにおける史料の調査・収集に加えて、東京大学総合図書館を複数回訪問し、同館に所蔵されているイギリス外交文書の中から、威海衛に関連するものを調査・収集した。さらに本年度には10月に武漢を訪問し、中国の農村社会研究をめぐる華中師範大学との学術交流に参加した。まず、日本国内に当初の想定を超える威海衛関連資料が所蔵されている可能性が高いことが判明した。さらに、香港とその周辺地域における調査もまた予想以上に充実したものとなった。このため、概ね順調に進展していると考えられる。

来年度以降は今年度の調査結果を踏まえて、主に同公文書館に所蔵されている史料を中心に、必要に応じて日本国内および東アジア各地に所蔵されている史料を調査・収集し、これらを読解・分析する予定である。中国近現代史・イギリス帝国史来年度以降については、引き続き日本国内に所蔵されている威海衛関連資料の調査・収集に努めるほか、イギリスおよび東アジア各地に所蔵されている資料もまた順次調査・収集し、それらを読解・分析する予定である。来年度もイギリスでの調査を予定しているため、その分今年度の支出を抑制した。来年度に重要な支出を予定しているので、その分今年度の支出を抑制した。現地調査のための旅費や史料の複写費などに充てる。現地調査のための旅費や資料の複写費等に充てる。
イネ科作物の根における傾斜重力屈性の発現機構に関する研究

イネ科作物の種子根は傾斜重力屈性をしめすことが知られている.本研究では,トウモロコシとコムギの種子根を対象に,傾斜重力屈性の発現の様相を調査するとともにし,それに及ぼす数種の環境要因と内的要因を見い出すことによって,発現のメカニズムを明らかにすることを試みた.1.種子根は,圃場においてもまた実験室条件下においても,傾斜重力屈性をしめし,鉛直とは異なる方向に伸長する.とくに,出根直後には負の重力屈性反応をしめし,その後正の重力屈性反応をしめすが,この生長運動は傾斜重力屈性の成立に果たす役割は小さくないと考えた.2.トウモロコシの種子根を用いて,主要な環境要因である土壌の温度と水ポテンシャルの影響を調査した.負の重力屈性反応は,高温条件下で抑制された.また,水ポテンシャルは出根時の根の方向に影響し,低水ポテンシャルの下で根はより下向きに出現した.数値モデルのあてはめによって,高温や低い水ポテンシャルは,根の生長初期の負の重力屈性反応の消失を早めることが示唆された.3.コムギの種子根においても,乾燥条件は根の重力屈性反応に影響をあたえ,下方向への根の伸長を誘導した.初生種子根の切除を行ったところ,第一側生種子根の負の重力屈性反応が抑制された.また,その際には第一側生種子根の根端の肥大がみられたことから,同化産物の分配といった内的要因が,種子根相互の重力反応性に関与していることが示唆された.イネ科作物の種子根は傾斜重力屈性をしめすことが知られている.本研究では,トウモロコシとコムギの種子根を対象に,傾斜重力屈性の発現の様相を調査するとともにし,それに及ぼす数種の環境要因と内的要因を見い出すことによって,発現のメカニズムを明らかにすることを試みた.1.種子根は,圃場においてもまた実験室条件下においても,傾斜重力屈性をしめし,鉛直とは異なる方向に伸長する.とくに,出根直後には負の重力屈性反応をしめし,その後正の重力屈性反応をしめすが,この生長運動は傾斜重力屈性の成立に果たす役割は小さくないと考えた.2.トウモロコシの種子根を用いて,主要な環境要因である土壌の温度と水ポテンシャルの影響を調査した.負の重力屈性反応は,高温条件下で抑制された.また,水ポテンシャルは出根時の根の方向に影響し,低水ポテンシャルの下で根はより下向きに出現した.数値モデルのあてはめによって,高温や低い水ポテンシャルは,根の生長初期の負の重力屈性反応の消失を早めることが示唆された.3.コムギの種子根においても,乾燥条件は根の重力屈性反応に影響をあたえ,下方向への根の伸長を誘導した.初生種子根の切除を行ったところ,第一側生種子根の負の重力屈性反応が抑制された.また,その際には第一側生種子根の根端の肥大がみられたことから,同化産物の分配といった内的要因が,種子根相互の重力反応性に関与していることが示唆された.トウモロコシの種子根は,出根直後には負の重力屈性反応を示し,その後正の重力屈性反応を示す.この特異な生長運動が,傾斜重力屈性の発現に果たす役割は小さくなく,そのメカニズムの解明を試みた.土壌温度と水ポテンシャルの影響を調べるために,土壌温度32,25,18°Cおよび土壌水ポテンシャル-5,-38,-67kPaの条件下にトウモロコシを栽培し,土壌中の種子根の軌跡から伸長方向の変化を調査した.負の重力屈性反応は,出根直後から根が約10cmに達するまでみられたが,高温条件下で抑制された.水ポテンシャルは出根時に影響を与え,種子根は低ポテンシャルの下でより下向きに出現した.種子根の伸長方向の変化を,時間とともに減少する負の重力屈性反応と根が最終的にとる伸長角度(liminal angle)へむけての正の重力屈性反応の和と仮定したところ,モデルはデータによく適合した.負の重力屈性に係わるパラメータを検討することにより,高温や低い水ポテンシャルによって初期の負の重力屈性の消失が早まることが明らかになった。以上により,トウモロコシ種子根の初期生長には,生理的に異なった2種の生長運動が関与していることが明らかになった.すなわち,正の重力屈性反応は現在の伸長角度とliminal angleとのずれを感受する過程を含む反応であるのに対して,負の重力屈性反応はこの感受機構をともなわず,主として発生の段階あるいは時間経過によって規定されるものであることが示唆された.イネ科作物の根とくにコムギの種子根を対象に,初期生長における負の重力屈性反応やリミナルアングルと呼ばれる根が最終的にとる伸長方向が,内外の諸要因にどのように応答するかを明らかにすることによって,傾斜重力屈性の発現と制御機構の解明を試みた.また,これらの重力に対する反応が,根の形態特性とどのように関連しているかについても調査した.1.実験室では,大気中に根を伸長させ,その幾何学的な形状から,1mmごとの根の伸長角度やその他の形態的なパラメータを抽出する必要があった.ホルダーにはさんだ発芽から伸長した根の形態を,カメラ,ディジタイザおよびパーソナルコンピュータからなる測定系を作成した.2.上記の測定系を用いて,次の結果をえた.(1)乾燥条件は,根の重力屈性反応に影響をあたえ,下方向への根の伸長を誘導した.これは,経験的に知られている乾燥土壌中での根の反応と類似したものである.

(2)初生種子根の切除を行ったところ,第一側生種子根の負の重力屈性反応が抑制され,その結果第一側生種子根はより鉛直に近い方向に伸長した.また,その際には第一側生種子根の根端の肥大がみられたことから,同化産物の分配といった内的要因が,種子根相互の重力反応性に関与していることが示唆された.すなわち,一種の補償作用が機能していると考えられる.
プレート内部における起震応力場の生成要因と地震断層の発達過程に関する研究

1)横ずれ断層の発達とその周辺での変形との関連について:トルコ・マルマラ海の場合横ずれ断層の発達に伴ってどのような断層群が周辺に発達し内部変形を起こすのかを明らかにするため、ケーススタディとしてトルコ・マルマラ海のサイスモテクトニクスを詳細に調べた。マルマラ海の周りに展開されている広帯域地震計の波形記録を用いて、マルマラ海下に発生する多くの小・中規模の地震のメカニズム解を決定した。その結果、次のことが明らかになった。(1)マルマラ海には全体として北西-南東方向の主圧縮応力が働き、東部の応力場が空間的に均質であるのに対して、西部は複雑なようすを呈する。(2)横ずれの主断層は、マルマラ海の中央部付近において、南北にステップオーバーを起こし、その周辺では補助断層で起こっていると思われる小中地震の集中した活動がみえる。(3)これら小中地震のメカニズムは系統的で、構造地質学的に横ずれ断層の発達に伴って周辺に発生すると考えられる変形と調和的である。本研究は、これまでわかっていなかったマルマラ海下のサイスモテクトニクスを明らかにするとともに、実例をもとに横ずれ断層の発達と小中断層の系統的な特徴を関連付けた点で新しい成果をあげた。本成果は、Geophys. J. Inter.に投稿中である。2)不連続な断層群を広がる地震のずれ伝播の数値実験からの調査3次元数値計算から、不連続な断層での動的な破壊伝播が、断層の幾何配置に強く依存することを導き、その成果をGeophys. J. Inter.に公表した。1)花折断層断層不連続部分における地震観測本年度、花折断層不連続部分近くで地震観測を実施。その結果、花折断層で起こった数個のM3から4の地震を直上で観測することに成功。現在、データの解析を行っている。2)不連続な断層群を広がる地震のずれ伝播の数値実験からの調査不連続な断層での破壊伝播の推定:波形インバージョン法で仮定する破壊フロント伝播の影響地震の波形を用いて不連続な断層での破壊過程を決定する際、推定される破壊過程のようすは波形インバージョン法の中で仮定される破壊フロント伝播に依存することが、数値実験で明らかになった。誤った破壊フロント伝播を仮定すると、特に、次の断層に破壊が飛んだあとの破壊の伝播や震源時間関数に違いが現れる。一方で、インバージョンでの波形の復元度を破壊フロントの正否で比較しても、その差は小さい。動的破壊過程パラメータの推定を用いた不連続な断層モデルの推定不連続な断層での動的な破壊伝播は、断層の幾何配置に強く依存することがこれまでの3次元数値計算からわかっている。このことを逆に利用し、動的破壊パラメータを運動学的破壊パラメータから推定する際のすべり量や破壊時刻の残差を比較することにより、不連続な断層の詳細な幾何配置が決定できる可能性を新たに示した。ランダース地震や鹿児島県北西部地震を想定した、平行あるいは直角な2つの横ずれ断層の場合で、数値実験から、問題点などを含めた調査を行った。
メカノトランスダクションと幹細胞体内移動メカニズムを応用した組織再生法の開発

実験の初年度として、in vitroで歯根膜細胞、骨髄由来間葉系幹細胞に間欠的な伸展刺激を与え、細胞からどのような成長因子が分泌されるかを遺伝子レベル、タンパクレベルで解析した。伸展刺激は培養細胞伸展装置(STREX社製)を用いて行った。その結果、伸展刺激により間葉系幹細胞の集積に間接的に働く血管新生因子や骨形成を促進する液性因子の発現が遺伝子レベルでも、タンパクレベルでも上昇することがわかった。以上の結果から、間欠的な伸展刺激により、細胞から出される液性因子の構成、発現量が変わることが明らかとなった。それらの因子を、ヒト臍帯静脈内皮細胞に適用すると、血管形成促進が認められ、ヒト骨芽細胞様細胞に適用すると石灰化を亢進させることが明らかとなった。以上の結果から、細胞から分泌された液性因子により、幹細胞遊走に重要な血管形成能が上昇する可能性が示唆された。in vivoではマウスの頭蓋骨欠損モデルに上記の因子をコラーゲンスポンジとともに移植する実験をした。その結果、対照群と比較すると、実験群では欠損部の骨再生が促進していることが組織学的、放射線学的に明らかになった。in vitroでの実験結果が動物実験でも裏付けられた。現在、骨形成促進効果、血管新生促進効果と幹細胞の遊走、集積の関係性を解析中である。特に、血管新生との関連性について免疫組織学的に検討している。同時に、伸展刺激の条件検討を行ない、幹細胞の集積を直接的に促す因子を探索する予定である。細胞に伸展刺激を与えることで、間接的にではあるが、幹細胞遊走に不可欠である因子の発現上昇が認められた。また、副次的に血管新生因子や骨形成を促進する液性因子の発現が遺伝子レベルでも、タンパクレベルでも上昇することがわかった。現在、動物実験でその効果を検証している。動物実験で示された結果と幹細胞集積の関係性を明らかにする。また、伸展刺激の条件検討を続けることで、より効果的な条件を明らかにする。研究が順調に進み、実験に使用する物品が節約できたため。次年度の物品費にあてる。
難治性掻痒症の神経機構解明に向けての新規アプローチ

我々が経験する強い『痒み』は非常に耐え難く、生活の質(QOL)を著しく低下させる。一方、最近、神経ペプチドホルモンのガストリン放出ペプチド(GRP)、およびその受容体(GRPR)が介在し、脳延髄および脊髄レベルで痛覚とは乖離した神経機構により、痒覚を特異的に伝達することが報告された。そこで本研究では、げっ歯類の掻痒症モデルを用いてGRP系に着目し、難治性掻痒症の神経機構とその病態生理の解明に迫る。さらに、『痒み』の鍵因子としてのGRP系を、ニホンザルの解析を通じて霊長類において普遍化し、臨床応用(痒み制圧)への『橋渡し』を目指す。一方、最近、神経ペプチドホルモンのgastrin-releasing peptide(GRP)、およびその受容体(GRPR)が介在し、延髄・脊髄レベルで痛覚とは乖離した神経機構により、痒覚を特異的に伝達することが報告された。これまでヒトを含む霊長類の脊髄におけるGRP関連の報告は乏しいため、本研究では、霊長類の脊髄や脳幹におけるGRP発現とその生理機能を明らかにする目的でニホンザル(Macaca fuscata)を用いた解析を行った。バイオインフォマティクス解析および遺伝子クローニングによりGRP/GRPR遺伝子の同定を試みた結果、ニホンザルとヒトのGRPの一次構造は完全一致しており、GRP/GRPR遺伝子は霊長類間で高い相同性を示した。次に、本研究室で作出したGRPR遺伝子改変ラット[ GRPR発現細胞に赤色蛍光タンパク質RFPとヒトジフテリア毒素受容体を同時に発現するトランスジェニック(Tg)ラット]のキャラクタリゼーションを進めた。GRPRTgラットの脳と脊髄におけるGRPR発現ニューロンの局在についてRFPシグナルを指標に解析した。その結果、GRPR発現が報告されている脳・脊髄の各領域においてRFP陽性ニューロンを多数観察した。今年度は霊長類のニホンザルにおける脊髄GRP系の確認を目標としており、本研究により、ニホンザルの知覚神経系においてGRP/GRPR系の遺伝子・ペプチド発現の同定が完了し、GRP/GRP受容体系がヒトを含む霊長類においても普遍的に痒みの伝達に関与することが示唆された。さらに今回の解析から、本研究室で作出したGRPR Tgラットは、個体・行動レベルでGRPRの機能を解析する上で優れたモデルであると言える。以上の成果から、研究はおおむね順調に進展しているものと自己評価する。我々が経験する強い痒みは非常に耐え難く、生活の質を著しく低下させる。一方、最近、神経ペプチドホルモンのガストリン放出ペプチド(GRP)、およびその受容体(GRPR)が介在し、延髄・脊髄レベルで痛覚とは乖離した神経機構により、痒覚を特異的に伝達することが報告された。これまでヒトを含む霊長類の脊髄におけるGRP関連の報告は乏しいため、本研究では、霊長類の脊髄や脳幹におけるGRP発現とその生理機能を明らかにする目的でマカクザルを用いて解析した。バイオインフォマティクス解析および遺伝子クローニングによりGRP/GRPR遺伝子の同定を試みた結果、マカクザルとヒトのGRPの一次構造は完全一致しており、GRP/GRPR遺伝子は霊長類間で高い相同性を示した。さらに、ニホンザル脊髄や脳幹を用いてGRP免疫染色を行い、GRPの発現分布を解析した。その結果、解析したすべての脊髄レベル(頚髄、胸髄、腰髄、仙髄)で共通して、脊髄後角に強いGRP免疫陽性反応を示す線維が観察された。さらに、それに対応して、比較的小型の後根神経節ニューロンの一部にGRP陽性反応を認めた。以上の結果、霊長類の脊髄においてもGRP系が存在することが強く示唆された。次に、本研究室で作出したGRPR遺伝子改変ラット[ GRPR発現細胞に赤色蛍光タンパク質RFPとヒトジフテリア毒素受容体を同時に発現するトランスジェニック(Tg)ラット]に対してジフテリア毒素の微量投与を行った。投与後、本Tgラットの脳と脊髄におけるGRPR発現ニューロンについてRFPシグナルを指標に解析した。その結果、ジフテリア毒素を投与した脳・脊髄領域においてRFP陽性ニューロンの著しい減少を認めた。

われわれヒトを含む霊長類の脊髄におけるGRP/GRPR系の機能を明らかにしていくことは急務であるが、本研究の発展により、難治性掻痒症などの臨床研究へ発展する、「橋渡し」となることが期待できる。今後は、ホルマリン固定したニホンザル組織を用いて凍結切片(延髄、三叉神経節、脊髄、後根神経節)を作製し、GRPに対する免疫組織化学、およびGRP-Rに対するin situハイブリダイゼーション解析を実施して行く予定である。さらに、モデル動物としてげっ歯類のラットを用いた解析も平行して推進していく。即ち、本研究室で作出した遺伝子改変モデル(GRPR Tg)ラットに対して、ジフテリア毒素を局所投与することによりGRPR発現ニューロンを時・空間特異的に破壊することができる展望がある。このことから、今後、痒み神経機構におけるGRPRの作用メカニズムを解明できることが期待できる。神経内分泌学・神経解剖学ニホンザルのサンプル確保に予想以上に時間を要したため、27年度はバイオインフォマティクス解析を優先させた解析を進めた。また、遺伝子改変ラットの繁殖に計画以上の時間を要したため、27年度は実験を遂行するための十分な個体数を確保できなかった。ニホンザルの解析に関しては、27年度中に一定のサンプル確保には成功したため、28年度は免疫組織化学、生化学、および分子生物学的解析を行っていく予定である。また、引き続きサンプル収集も進める。遺伝子改変ラットの繁殖も続けており、28年度は個体数が確保でき次第、本遺伝子改変ラットを用いて難治性掻痒症モデルを作製していく予定である。