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津波被災地の地域農業・漁業復興における在来知と災害リスク軽減研究

東日本大震災後の宮城県地域社会の農業漁業の復興過程を民族誌の手法によって明らかにすると共に、住民の在来知が、復興期の災害リスク軽減(減災)研究においてどのような役割を発揮するか探求するものである。今年度は、仙台市七ヶ浜・名取市閖上・山元町等で現地調査をおこないながら、(1)生業技術や社会組織、経営イノベーション(2)宗教・慰霊施設と社会的記憶などに関する民族誌資料を収集を本格的に進めることで、地域社会の在来知がどのようにレジリアンス構築に貢献しているのかを判断するための調査資料を収集するとともに、一部はそれについての考察を行い論文として刊行した。また中間成果発表として、9月17-18日にデンマークのコペンハーゲン大学・コペンハーゲン災害研究センターでワークショップ「災害と沿岸コミュニティ:アジアとヨーロッパの視点」を開催し、本事業に関する国際的ネットワークを構築した。特に(1)については漁業の実態を把握するために乗船調査を行い、漁業過程や漁業経営、護岸工事、資源配分、生産と販売、さらに在来知についての現場での参与観察・聞き取り調査を行い、漁業復興のにおけるイノベーションを深く理解することが出来た。その一部は動画として収集され、民族誌映画を制作する見通しを立てることが出来た。また防潮堤と漁業活動についても今後調査をする必要があることがわかった。(2)については、災害イベントや災害死が地域社会にどのように記憶されているのか歴史民俗的な側面と同時に、祈念建造物や慰霊活動に関する聞き取り調査を行った。また地元の漁業の歴史と集団的記憶についての民族誌資料を収集することが出来た。これらをもとに稲作農業復興における在来知、小規模漁業と政策について比較研究、災害死者の慰霊碑の役割等について論文を発表した。昨年度調査体制を整えたそれぞれのメンバーが、農業漁業復興に係わる実質的な人類学調査を行い、関連する民族誌資料の収集をおこなうとともに、一部は成果を研究発表および論文刊行ということで発信することが出来た。特に昨年度は広域にわたる調査を行ったが、今回は調査地を絞り込むことでより集約的な調査を実現した。代表者と分担者は同じ大学に勤務しており日常的に研究打ち合わせができた。またデンマーク在住の研究協力者は、2018年4月から東北大学に勤務する体制になり、充実した研究組織となった。また本研究事業に関連して7本の学術論文、4本の学会・研究会発表、1冊の学術図書の刊行を行ったことも大きい。活発な研究活動を展開できた。次年度は、災害リスク軽減における在来知の役割について、自然科学的な検証が可能な領域を明確にすることで震災復興政策にどのような貢献が可能か検討する。逆に、在来知のなかには文化的価値として社会が継承するべきものもあり、それを政策がどのように支援できるのかも考えていく必要がある。国際的ネットワークについてはヨーロッパ人類学者との連携を中心にさらに発展させるつもりである。東日本大震災後の宮城県地域社会の農業漁業の復興過程を民族誌の手法によって明らかにすると共に、住民の在来知が、復興期の災害リスク軽減(減災)研究においてどのような役割を発揮するか探求する。今年度はこの事業に必要な調査方法・視座を確立するとともに被災地での農業漁業の調査体制を確立し、それぞれの現場における課題を見つけることが目的であった。在来知と減災の調査方法については、メンバーでの議論を通して防潮堤建設や土地区画整理等の復興政策を踏まえながら、農業漁業の経営形態、生産物の種類と生産手段、社会規範についての民族誌情報を解明し、それを政策適用可能な知とする必要性が確認された。今年度の大きな成果は、それぞれ調査地域を選び、主要インフォーマントとの関係を確立するなど、今後の調査体制を確立したことである。具体的には北から牡鹿半島・東松島・塩竃市桂島・仙台市七ヶ浜・名取市閖上、岩沼市、山元町磯浜の漁業集落である。農業については山元町となっている。このなかでそれぞれの漁業活動や経営タイプに応じた調査を行ったほか、漁業復興政策についての資料収集も行った。特に漁業復興政策が漁業者あるいは漁業経営組織にどのような影響を及ぼしているのか、防潮堤建設、漁場と資源配分、水揚げ量と販売などについて予備的な社会資料を収集した。一方で、漁業集落における神社や慰霊碑についても調査を行い、漁業者の社会組織と信仰について民族誌資料を収集した。これらは荒削りだが、漁業復興過程についての一次資料を収集したことである。これらを踏まえ次年度以降の本格調査の見通しを得たことは大きい。なお、農業調査についてはこれまでの蓄積を踏まえて論文を執筆し、復興行政のなかでの在来知の役割を解明することができた。本事業のテーマで初めて研究を開始したメンバーが着実に現地調査体制を構築したこと。また漁業復興に係わる具体的な調査項目を提示できたことで、今後の調査研究活動の見通しが構築できた。特に日本の漁業人類学の専門家と面談し、研究方法についての助言を得る機会を設けたことは有用であった。宮城県のほぼ全域を調査することができたことも、様々な属性に係わる資料をえる観点から有用だった。デンマーク在住の研究協力者も予定通り、日本を訪問し調査を実施できた。また本研究事業に関連して5本の学術論文、6本の学会・研究会発表、1冊の学術図書の刊行を行ったことも大きい。

なお、農業復興については、国際学術雑誌に論考を投稿し、査読をへて2018年度に掲載されることが決まった。このなかで被災地で進行する大規模化経営農家にとって労働力を効率的配分が必要であり、この点において在来知のある部分を地域社会で共有する行政からの働きかけが必要であるとの結論に達した。東日本大震災後の宮城県地域社会の農業漁業の復興過程を民族誌の手法によって明らかにすると共に、住民の在来知が、復興期の災害リスク軽減(減災)研究においてどのような役割を発揮するか探求するものである。今年度は、仙台市七ヶ浜・名取市閖上・山元町等で現地調査をおこないながら、(1)生業技術や社会組織、経営イノベーション(2)宗教・慰霊施設と社会的記憶などに関する民族誌資料を収集を本格的に進めることで、地域社会の在来知がどのようにレジリアンス構築に貢献しているのかを判断するための調査資料を収集するとともに、一部はそれについての考察を行い論文として刊行した。また中間成果発表として、9月17-18日にデンマークのコペンハーゲン大学・コペンハーゲン災害研究センターでワークショップ「災害と沿岸コミュニティ:アジアとヨーロッパの視点」を開催し、本事業に関する国際的ネットワークを構築した。特に(1)については漁業の実態を把握するために乗船調査を行い、漁業過程や漁業経営、護岸工事、資源配分、生産と販売、さらに在来知についての現場での参与観察・聞き取り調査を行い、漁業復興のにおけるイノベーションを深く理解することが出来た。その一部は動画として収集され、民族誌映画を制作する見通しを立てることが出来た。また防潮堤と漁業活動についても今後調査をする必要があることがわかった。(2)については、災害イベントや災害死が地域社会にどのように記憶されているのか歴史民俗的な側面と同時に、祈念建造物や慰霊活動に関する聞き取り調査を行った。また地元の漁業の歴史と集団的記憶についての民族誌資料を収集することが出来た。これらをもとに稲作農業復興における在来知、小規模漁業と政策について比較研究、災害死者の慰霊碑の役割等について論文を発表した。昨年度調査体制を整えたそれぞれのメンバーが、農業漁業復興に係わる実質的な人類学調査を行い、関連する民族誌資料の収集をおこなうとともに、一部は成果を研究発表および論文刊行ということで発信することが出来た。特に昨年度は広域にわたる調査を行ったが、今回は調査地を絞り込むことでより集約的な調査を実現した。代表者と分担者は同じ大学に勤務しており日常的に研究打ち合わせができた。またデンマーク在住の研究協力者は、2018年4月から東北大学に勤務する体制になり、充実した研究組織となった。また本研究事業に関連して7本の学術論文、4本の学会・研究会発表、1冊の学術図書の刊行を行ったことも大きい。活発な研究活動を展開できた。次年度は、今年度分担者、研究協力者とともに調査成果を共有するとともに、相互の調査の関係を化クリルさせることが必要である。そのことでそれぞれの立場からの漁業復興における在来知の役割が解明できるだろう。
渦干渉モデルによるせん断乱流の構造解明

1.3次元離散渦法を用いて,基本的な渦の3次元相互干渉を調べ,この方法の有用性,問題点を検討した。まず,正方形渦輪の角度を円弧でおきかえ,円弧部分の曲率を系統的に変化させることによって,辺の転換が生ずること;転換周期は渦核半径とともに増加することを示した。運動エネルギ-,運動量,ヘソシティなどの保存量は,渦度の発散が生ずるまでは比較的よい精度で一定に保たれることがわかった。2.長方形の短辺を半円で置換した渦輪(擬楕円渦輪)のアスペクト比ARを広範囲に変化させて,その変形過程を調べた。この結果,ARの値に対応して4つの基本的な変形パタ-ンのあることがわかった。この結果は,渦輪の断面を多数の渦要素に分割して,粘性効果を取り入れた計算によって確認された。また実験によっても確認された。以上の結果は,非円形噴流の発達,混合速度,乱流構造を理解するために有用である。3.等元性乱流はさまざまな強さと大きさをもつ渦の相互作用の結果であるとされている。この概念の妥当性を検討するために,48個の円形渦輪を,対応する正多面体上に配列したときの相互作用を3次元離散渦法によって計算し,Kolmogorovスペクトルが実現されることが確認された。同時に散逸スペクトルもk^<1/3>(k:波数)に比例する波数範囲をもつことがわかった。k^<ー5/3>スペクトルが現われるのは,相互作用によって生ずる高渦度領域がほぼ等方的に分布するときであり,この領域が非等方的であるときはk^<ー5/3>領域は実現しがたいようである。4.主流の中におかれた円板の非定常はく離流れを,3次元離散渦法によって計算する方法を示した。この結果を用いて,実際に非定常はく離流れが解析しうることを示すとともに,後流中の3次元渦構造の形成過程を明らかにすることができた。後流の中心軸が下流方向に位置を変えることから判断して,スパイラル型の構造の存在が示唆された。1.3次元離散渦法を用いて、基本的な渦の3次元相互干渉を調べた。正方形渦輪の四つの角部を四分の一円弧におきかえ、この部分の曲率半径と渦核半径の比を系統的に変化させることによって、正方形渦輪には辺の回転が生じること、回転周期は渦核半径の増加とともに増加することなどを明らかにした。同時に、運動エネルギ-、運動量、角運動量、全渦度およびヘリシティの時間発展を求め、これらの力学的保存量の保存性を評価する上で、運動エネルギ-が最適であることを示した。運動エネルギ-の時間変化にもとづいて、3次元離散渦法が精度よく適用できる最大時間を与える限界時間の概念を導入し、これが計算の時間間隔角部の曲率半径および渦核半径によってどのように変化するかを系統的に明らかにした。2.長方形の短辺を半円によって置きかえた渦輪(卵形渦輪)について長径と短径の比Rを広い範囲に変化させて、その変形とこれに伴う力学的特性量の時間的変化を解析した。この結果、卵形渦輪にはRの値に対応して次の4つの変形モ-ドがあることがわかった:

(1)長辺と短辺が入れかわるモ-ド(R=24);(2)辺の入れかわりのあとで二つの渦輪に分裂するモ-ド(R=58);(3)辺の入れかわりが発生することなく二つの渦輪に分裂するモ-ド(R=910);(4)辺の入れかわりが発生せず三個の渦輪に分裂するモ-ド(R=1120)これらの結果は非円形ノズルから噴出する憤流の構造を解明するための重要な知識である。3.CCDカメラから取りこんだ流れの中の微粒子の運動軌跡にもとづいて、瞬時における3次元速度ベクトル場を求めるシステムの構成およびソフトウェアの開発を行った。このシステムにはいまだ改善すべき点があるが、基本的な部分は完成しているので、今後この装置を用いて、渦の相互作用に関する計測を行ない、計算結果と比較する予定である。1.乱流はさまざまな強さおよび空間的な大きさをもつ渦の変形と相互作用の結果であると考えた。等方性乱流は慣性領域においてKolmogorovのー5/3乗スペクトルを示すことが知られている.3次元離散渦法を用いて48正多面体の表面上に配置された円形渦輪の相互干渉を計算し,-5/3乗スペクトルが実現されることを確認した。エネルギ-散逸は非粘性流体を対象とする本計算には含まれていないが,渦輪の核半径に相対する構造関数を導入しているために,擬似的な高波数領域でのエネルギ-減衰が生ずる.この結果,Kolmogorovの長さスケ-ルを求めることが可能であった.また,エネルギ-スペクトルの低波数領域における極大値に対応する波数の逆数として,エネルギ-を含む渦のスケ-ルを求めることもできた.この計算からえられた重要な知見の一つは,-5/3乗スペクトルを得るためには,多数の渦管の相互作用は必ずしも必要ではなく,数個の渦の相互作用で十分であることである.この結果は,等方性乱流を考える上で新しい概念を導く可能性をもっている.2.平行部と半田部から構成される擬似楕円渦輪の変形に関する3次元離散渦法による数値解析を行った.渦輪の断面を25個の渦要素の分布によって近似し,さらに周方向にこのような断面を多数配置した.渦輪のアスペクト比ARを412の範囲で変化させたところ,軸の転換;軸の転換後2個の渦輪に分裂;軸の転換なしに2個の渦輪に分裂し,そのあとさらに合体と軸の転換をくり返す;3個の渦輪に分裂したあと再結合と軸の転換を行う,の四つの変形モ-ドがあることがわかった.この結果は非円形ノズルからの噴流の挙動を調べる上で有用な知識を与える。3.主流中に迎角をもっておかれた円板からの非定常到離流れを渦法によって計算し,後流の中の渦輪がしだいに3次元構造に移行する過程を明らかにした.これによって,後流中にスパイラル構造が示唆された.
水産物由来の脂溶性成分による脂肪細胞のライフサイクル制御機能の解明

本研究では、水産物に特徴的なカロテノイドや高度不飽和脂肪酸に着目し、肥満形成と密接な関わりを持つ脂肪細胞のライフサイクル制御機能に焦点を絞り検討した。マウス由来の前駆脂肪細胞3T3-L1を用いて、脂肪細胞への分化を抑制する物質の探索を行った結果、食用海藻であるワカメやコンブなどに含まれるフコキサンチンが、分化過程で誘導されるグリセロール-3-リン酸脱水素酵素(GPDH)活性や細胞内の脂肪蓄積を顕著に抑制することを見出した。更に、フコキサンチンを経口投与したマウスの白色脂肪組織で検出されたフコキサンチノールにおいても、同様の分化抑制能を示すことを明らかにした。その際、フコキサンチン及びフコキサンチノールは、脂肪細胞への分化の過程でマスターレギュレーターとして働くPPARγの発現を抑制することを見出した。また、フコキサンチンは、肥大化した脂肪細胞で過剰に発現しインスリン抵抗性を引き起こすTNFαの遺伝子発現を顕著に抑制するとともに、糖尿病肥満マウスの血糖値の改善効果を示した。これらの結果は、フコキサンチンが脂肪細胞のライフサイクルを制御することによって、白色脂肪組織の機能を改善することを示唆するものである。一方、水産脂質に特徴的なドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)も、3T3-L1細胞やラットより分離した初代脂肪細胞の分化をPPARγやC/EBPαの発現抑制を介して抑制することを見出した。また、有効性を明らかにしたDHAやEPAを含有する魚油とフコキサンチンを併用することで、糖尿病肥満マウスの内臓脂肪の増大をより効果的に抑制できることを見出した。以上の結果は、フコキサンチンやDHA、EPAが脂肪細胞のライフサイクル制御能を有し、肥満予防への利用が期待できる新たな水産成分であることを示唆するものである。本研究では、様々な生活習慣病のリスクファクターとなる肥満に対して予防効果を示す機能性成分を水産物中に見い出すため、肥満形成と密接な関わりをもつ脂肪細胞の分化制御機能に焦点を絞り検討した。その結果、下記の結果を得た。1.食用海藻であるワカメやヒジキ、コンブなどに含まれるカロテノイドの一種であるフコキサンチン(FC)、および水産脂質に特徴的なドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)が前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の過程で特徴的に誘導される細胞内脂質の蓄積とグリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性を顕著に抑制することを見い出した。2.FC、DHA、EPAのそれぞれが分化過程において様々な遺伝子発現を調節する核内受容体PPARγのmRNA発現を抑制することを見い出した。更に、PPARγに制御されるリポプロテインリパーゼや脂肪酸結合タンパク質aP2のmRNA発現も抑制されることを明らかにした。3.FCおよびFCを約10%含むワカメ油を糖尿病-肥満モデルマウスであるKKAyに経口投与した結果、体重増加の抑制や生体内の白色脂肪組織重量の低下が認められた。4.FCを投与したマウスの白色脂肪組織において、脂肪酸から熱への変換を司る脱共役化タンパク質1(UCP1)の発現が亢進されていることを見出した。UCP1は通常白色脂肪組織には発現していないタンパク質であることから、FCの脂肪細胞に対する新規な分化制御機能が示唆された。以上の結果は、海洋生物に特徴的なFCやDHA、EPAが前駆脂肪細胞から脂肪細胞の分化に対し抑制効果を示すこと、更にFCが白色脂肪組織においてUCP1タンパク質を介して脂質代謝を亢進させるユニークな作用を有することを細胞、動物実験にて明らかにした。

これらの結果は、水産物に特徴的なFC、DHAおよびEPAによる脂肪細胞の分化に対する制御機能を示すものである。本研究では、様々な生活習慣病のリスクファクターとなる肥満に対して予防効果が期待される機能性成分を水産物中に見出すため、肥満形成と密接な関わりをもつ脂肪細胞の分化制御機能に焦点を絞り検討している。昨年度の研究により、ワカメなどの食用海藻に含まれるフコキサンチン(FC)や魚油の主要な構成脂肪酸であるドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)が3T3-L1前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することを見出した。本年度の研究により、下記の知見が得られた。1.マウスに経口投与したFCの一部がフコキサンチノール(FCOH)に変換され、白色脂肪組織に蓄積することが明らかとなった。2. FCOHは、10μM以下の濃度において前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化過程で誘導される油滴の蓄積やGPDH活性の発現を抑制し、更に分化の制御因子であるPPARγのmRNA発現量を低下させた。3. FCOHの3T3-L1に対する分化抑制効果はFCによる抑制効果と比較して顕著であることを明らかにした。4. DHAは25-100μMの濃度において3T3-L1細胞に加え、ラットより分離した初代脂肪細胞の分化を抑制することが明らかとなった。5. 3T3-L1細胞および初代脂肪細胞の培養上清中に分泌されるレプチン濃度がDHAやEPA処理により顕著に低下した。6.上記で分化抑制効果が見られたFCOH(10μM以下)及びDHA、EPA(100μM以下)の添加濃度では3T3-L1細胞の増殖はほとんど抑制されなかった。以上の結果より、水産物に特徴的なFCの生体内代謝物であるFCOHが脂肪細胞の分化抑制作用を示す活性物質の一つであることが明らかとなった。また、DHAやEPAは初代脂肪細胞に対しても分化抑制効果を示したことからその有用性が示唆された。本研究では、様々な生活習慣病のリスクファクターとなる肥満に対して予防効果が期待される機能性成分を水産物中に見出すため、肥満形成と密接な関わりをもつ脂肪細胞の分化抑制能について検討している。平成19年度は、細胞系による分化抑制効果のみならず、マウスを使ったin vivo実験により、脂肪組織の機能改善効果を有する物質についても調べた。1.昨年度の研究により、ドコサヘキサエン酸(DHA)は3T3-L1細胞に加えラット初代脂肪細胞に対しても分化抑制効果を示すことを見出したが、その作用機構の一つとして核内転写因子PPARγの遺伝子発現抑制作用を明らかにした。また、エイコサペンタエン酸(EPA)にも同様の発現抑制傾向が見られた。2.ワカメより単離したフコキサンチン(FC)を糖尿病/肥満マウスに投与した結果、これまで報告した白色脂肪組織(WAT)の増大抑制効果に加え、肥大化したWATで過剰に発現するtumor necrosis factor α(TNFα)遺伝子の発現抑制効果を見出した。3.これまでに有効性を明らかにしたフコキサンチン(FC)とEPAやDHAを含む魚油を肥満/糖尿病マウスに併用投与した結果、WATの増大が相加的に抑制されることを明らかにした。4.その際、生体内の脂肪組織量と相関する血中レプチン濃度の低下が見られ、これは脂肪細胞を用いた結果と同様であった。
プロテインキナーゼの活性調節の異常による神経細胞に関する研究

神経細胞の分化、成長の過程に一致して神経細胞内にでは蛋白質リン酸化活性が急速に高まり、シナプス形成が終ると高い活性を侍ちつづける。蛋白質リン酸化反応はシナプスにおける神経情報伝達機構を密接に関係している。一方カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(キナーゼII)は脳神経系で非常に高い活性をもち、神経機能調節に重要な役割を果すと考えられている。キナーゼIIの生理的役割を明らかにするために、培養神経細胞にキナーゼIICDNA,および、その変異CDNA導入し酵素を強制発理させ解析を試みている。キナーゼIICDNAを導入した神経茅細胞では神経実起形成が促進され、グロースコーンの運動性が高くなることが明らかとなり、キナーゼIIが神経細胞の分化や形態形成、シナプス形成に関与すると考えられた。しかし、キナーゼIIの変異CDNAのうちCa^<2+>カルモデュリンによる調節能を失った常に活性の酵素を発理する場合には、細胞の増殖が抑制され、神経細胞化が起ることが明らかとなった。この変異酵素は、正常酵素が主として細胞質に存在し、一部核周辺にも点在するに対し、細胞内に広く分在し、核内にも入ることが主疫化学的に示された。従って核内での転写調節に対して何らかの影響を与えることにより細胞機能調節が異常になる可能性が考えられる。このことは、C-fos遺伝子発理においてキナーゼIIがCa^<2+>依存性に転写活性を高めるのに対し、変異酵素はCa^2非依存性=転写を高めることを明らかにしたことにより支持される。このようにキナーゼIIの変異酵素を用いて解析することにより、神経細胞化とプロテインキナーゼの調節異常の関係を明らかにできるであろう。
IP3レセプターによる未熟心筋機能評価法の開発

新生児手術では、心臓の未熟さの度合いの把握や、未熟心筋細胞としての能力を見極めることが重要である。心筋の興奮収縮連関に関与するイノシトール三燐酸(IP3)のレセプター(筋小胞体の膜上に存在する)の遺伝子が、マウス未熟心筋においてどのような発現様式をとり、心筋細胞自体の未熟度との関連を明らかにすることを目的とした。IP3レセプター遺伝子の発現に関しては、心筋において発現することが93年にM.C.Moschellaらにより報告。同年、刺激伝導系に、より多く発現されている事をL.Gorzaらが報告した。我々はまず、心筋の発達段階におけるIP3レセプター遺伝子の発現様式の検討のため、Type IのIP3 ReceptorのcDNAを鋳型としたRNAプローブの作製を行った。さらに、日令ごとの胎生期のマウス組織と、日令ごとの新生児マウスを材料とし、その心臓と小脳(ポジティブコントロール)を摘出し、4%パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋を行い、5μmの厚さの切片を作製した。これらに対し、免疫組織化学、RNAに対してのIn situ hybridizationを行い、12日令16日令の胎児マウスと生後07日までの新生児マウスの標本における結果で、ポジティブコントロールの小脳では、成長とともに陽性率が上昇した。これに対し、心筋では胎児期のより若い心筋細胞での陽性率が高くなる傾向が認められた。作製したRNAプローブによるIn situ hybridizationをヒト組織に応用するための固定や反応時間等の条件設定の検討実験を行った。マウス組織とほぼ同様の条件設定でその陽性細胞の検出が確認された。現段階で、ヒト組織の症例数はn=2であり、その両者において心筋での陽性細胞は確認された。現在、症例数の上積みと発現量の定量化の検討を進めている。新生児心臓手術では、心臓の未熟さの度合いの把握や、未熟な細胞の持つ心筋細胞としての能力を見極めることが重要である。ここで、心筋の興奮収縮連関に関与するイノシトール三燐酸(IP_3)のレセプターが、筋小胞体の膜上に存在するが、このIP_3レセプター遺伝子のマウス未熟心筋細胞における発現様式を探り、心筋細胞自体の未熟度との関連を明らかにすることを目的する。IP_3のレセプター遺伝子の発現に関しては、心筋細胞でのType I geneの発現が、M.C.Moschellaらにより1993年に報告され、更に心筋の刺激伝導系細胞により多く認められるということが、L.Gorzaらにより同年に報告されている。しかし、発達段階における研究発表はまだなされていない。平成12年度は、心筋細胞の発達段階における遺伝子の発現様式を検討を開始した。まず、Type IのIP_3 ReceptorのcDNAを鋳型としたジゴキシゲニンラベルのRNAプローブの作製を行った。さらに、作製したRNAプローブによるIn situ hybridizationでの固定や反応時間等の条件設定の検討実験を行った。その後、日令ごとの胎生期のマウスを取りだし、加えて日令ごとの新生児マウスを材料として、その心臓と脳組織(ポジティブコントロール)を摘出し、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行い、5μmの厚さの切片を作製した。これらに対し、免疫組織化学、RNAに対してのIn situ hybridizationを行った。12日令16日令の胎児マウスと生後07日までの新生児マウスの標本における結果では、ポジティブコントロールの脳組織では、成長とともに陽性率が上昇した。これに対し、心筋では幼弱細胞での陽性率が高いと考えられる結果であったが、現在その発現量の定量化について検討中である。
シャペロン様AAA-ATPase(VCP,NVL)による細胞機能制御

VCPはAAAファミリーに属するATPaseであり、小胞体における異常タンパク質の分解(ERAD)やオルガネラ形成において重要な役割を果たす。VCP結合タンパク質として同定されたSVIPを過剰発現させると、小胞体が肥大化して細胞内に空胞が形成される。本研究では、SVIPによる空胞形成機構を解明し、SVIPの細胞内における役割を明らかにするために、このタンパク質のERADにおける役割を解析した。その結果、in vivoおよびin vitroのアッセイ系において、過剰量のSVIPがERADを阻害することが示され、空胞形成との関連が示唆された。また、SVIP-VCP複合体に含まれる他のサブユニットを同定するために、SVIPの全領域をベイトとして、酵母two-hybrid法スクリーニングを行った。その結果、VCPの他に複数のタンパク質が、SVIP結合タンパク質の候補として同定された。また、NVL2はVCPとアミノ酸配列がよく類似したタンパク質であるが、VCPが主に細胞質に分布するのに対して、NVL2は核小体に局在する。従って、NVL2は核小体の機能において独自の役割を担っている可能性が考えられた。本研究では、NVL2が核小体においてRNAヘリカーゼの一種と相互作用し、60Sリボソームの生合成に関与することを明らかにした。NVL2のドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞において、rRNA前駆体のプロセシングに影響は見られなかったが、このRNAヘリカーゼがリボソーム生合成中間体中に蓄積している可能性が示された。また、種々の変異体を用いてNVL2の核小体局在に必要なアミノ酸配列を同定したところ、この配列にリボソームタンパク質であるL5が結合することが示された。NVL2はL5と結合することにより、核小体に局在化する可能性が考えられた。1.小胞体関連分解(ERAD)におけるVCP結合タンパク質SVIPの機能解析-VCPは小胞体関連分解(ERAD)において重要な役割を果たすAAA ATPaseである。VCPの新規結合タンパク質として我々が同定したSVIPがERADにおいて果たす役割を調べるために以下の実験を行った。(1)セミインタクト細胞を用いたin vitro実験系-ヒトサイトメガロウイルスUS11遺伝子産物は、宿主細胞の主要組織適合複合体クラスI重鎖をERADにより分解へ導く作用を持つ。US11を発現させた細胞を界面活性剤で処理して細胞膜に選択的に穴を開け、そこにSVIPタンパク質を添加すると、クラスI抗原の細胞質への放出が阻害された。(2)トランスフェクション法によるin vivo実験系-ERADの基質であるCFTR変異体(CFTRΔF508)をGFPとの融合タンパク質として安定発現させた細胞株を樹立し、これらのタンパク質の分解をウエスタンブロッティングにより解析した。これらの細胞に、SVIPをトランスフェクションにより発現させると、ERADによるCFTRの分解が顕著に抑制された。以上の結果から、SVIPが細胞内に過剰に存在するとERADが阻害されることが明らかになった。2.NVLによるリボソーム生合成制御機構の解析-NVLは核には局在するVCPホモログである。私たちは、NVLがリボソーム60Sサブユニットの生合成過程に関与し、またRNAヘリカーゼの1種であるDob1p(Mtr4p)と相互作用することを明らかにした。Dob1pは酵母においてrRNA前駆体のプロセシングに関与することが知られている。そこで、NVLのドミナントネガティブ変異体を細胞に発現させたところ、rRNA前駆体プロセシングヘの影響は認められなかったが、DOB1がリボソーム生合成中間体中に蓄積している可能性が示された。

VCPは、小胞体における異常タンパク質の分解やオルガネラ形成などにおいて重要な役割を果たすAAA ATPaseである。VCP結合タンパク質として同定されたSVIPは、過剰発現により、ポリグルタミン病などの神経変性疾患においても見られる小胞体の空胞化を誘導する。本研究では、SVIPによる空胞形成機構を解明し、SVIPの細胞内における役割を明らかにするために、SVIP-VCP複合体に含まれる他のサブユニットの同定を試みた。また核内に存在するVCP類似タンパク質であるNVLが、VCPと異なる細胞内局在を示す機構を解析した。VCP-SVIP複合体が小胞体の機能において果たす役割をさらに明らかにするために、SVIPの全領域をベイトとして、酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行った。その結果、VCPの他に複数のタンパク質が、SVIP結合タンパク質の候補として得られた。2.NVLの核および核小体局在機構の解析NVLには2種類のアイソフォームが存在する。これらは異なる核内分布を示し、NVL1は核質に、NVL2は核小体に各々局在する。NVLの核および核小体への局在化機構を解明することは、その細胞内における役割や制御機構を解明するにあたり重要である。本研究では、種々の欠失変異体や部位特異変異体を用いて、NVL1およびNVL2が核および核小体に局在するために必要なアミノ酸配列を同定した。さらに、リボソームタンパク質であるL5が、NVL2の核小体局在シグナルを認識し、これを核小体へと導くことを示した。
T細胞の免疫寛容誘導とその情報伝達機構の解析

本年度の解析によりT-APC interactionにおいてはCD28-B7 costimulatory経路とは別に、APC由来のIL-12がT細胞に活性化シグナルを導入しうることが明らかとなった。(1)Ag/APCでの刺激培養中にCD28-B7 costimulatory経路を阻止するreagentを添加しても増殖性が全く影響されないいくつかのTh1クローンが見い出された。(2)これらTh1クローンとAg/APCの培養中に抗IL-2mAbを添加しても増殖が全く影響されず、これらTh1クローンはIL-2非依存性の増殖を示すことがわかった。(3)この培養上清中にIL-2は全く検出されず、一方強いIL-12産生が認められた。(4)抗IL-12mAbによりこれらTh1クローンの増殖はほぼ完全に阻止され、IL-12依存性の増殖機構が作動していることが明かとなった。(5)更に増殖に伴い著明なレベルのIFN-γ産生が誘導されることが確認された。このようにCD28-B7が作動せずとも、IL-12によりT細胞増殖及びIFN-γ産生を含むT細胞活性化経路が作動することが示された。(6)T-APC interactionにおけるIL-12産生はCD40-CD40 ligand(CD40L)の分子間相互作用を介することが認められた。即ち、T細胞レセプター(TCR)刺激後のT細胞はCD40Lを発現し、このCD40LによりAPC上に発現しているCD40が刺激されることにより、APCからIL-12が産生されることが証明された。
近接したアルキン部位をもつ非平面環状　π電子系の機能開拓

近接したアルキン部位をもつ分子の機能開拓を目的として、これまでにチオフェン縮環ビスデドロ[12]アヌレン1の反応性の検討をし、還元反応においてテトラチエノ縮環ヘプタレン2が得られることを見出している。さらに、この還元反応に対する縮環部位の効果を検証したところ、テトラベンゾ縮環ビスデドロ[12]アヌレン3からもヘプタレン誘導体4が得られることを明らかにしてきた。今回、ヘプタレン骨格の電子構造および芳香族性に対して縮環部位の立体効果や電子構造がどの程度影響するのか検証するべく、4の化学還元および、その還元種の単離を試みた。その結果、THF中室温で、カリウムを作用させた後、[2.2.2]クリプタンド共存下で再結晶を行ったところ、テトラベンヘプタレンラジカルアニオンが生成した。一方で、DME中で過剰量のカリウムを作用させた後、-30°Cで再結晶したところ、対応するジアニオンの単結晶を得ることができた。X線結晶構造解析の結果、ラジカルアニオンとジアニオンのいずれにおいても、ヘプタレン骨格に大きな結合交替が確認できた。これは、チオフェン縮環体2のジアニオンが結合交替の小さい構造であったこととは対照的な結果である。加えて、NMR測的および理論計算より、2のジアニオンが芳香族である一方、ベンゼン縮環ヘプタレンのジアニオンが非芳香族であることを明らかにした。この理論、実験の結果は、芳香環縮環部位がヘプタレンジアニオンの電子構造に大きく寄与することを示している。28年度が最終年度であるため、記入しない。外部刺激応答性分子の創製を目的として,チオフェン縮環ビスデヒドロ[12]アヌレン1の反応性を検討した.これまでに,1が加熱や紫外光照射により[2+2]型の環化体へと異性化することを明らかにしている.一方で,今回,1の還元反応を検討したところ,これまでとは異なる様式で渡環環化が進行し,テトラチエノヘプタレン2が得られることを見出した.さらに,2の中性種が非芳香族であるのに対し,ジアニオン[(K・[2.2.2]cryptand)+]2・[22-]が芳香族であることを磁気特性および結晶構造から明らかにした.これはヘプタレン誘導体の中性種とジアニオン,両方の結晶構造解析に成功した初めての例である.以上の結果は速報として,Angew. Chem. Int. Ed.誌に受理された.その他に,縮合多環ペンタレンの迅速な合成法の開発に取り組んだ.目的のフェナントレンおよびジチエノベンゼン縮環ペンタンは,1,4-ビス(ブロモアリール)-1,3-ジアセチレンのホモカップリングおよびデヒドロアヌレンの渡環環化を含む計四段階で構築することができた.理論計算により,目的物がベンゼン縮環ペンタレンよりも大きなNICS(1)値をもつことを見出した.さらに吸収スペクトルおよび電気化学測定により,目的物が狭いHOMO-LUMOギャップをもつことを明らかにした.以上の結果については今年度末,日本化学会春季年会にて発表予定である.近接したアルキン部位をもつ分子の機能開拓を目的として,これまでにチオフェン縮環ビスデヒドロ[12]アヌレン1の反応性を検討し,還元条件でテトラチエノ縮環ヘプタレン2が構築できることを見出している.加えて,2のさらなる還元により二電子還元体が得られ,理論,実験両面からヘプタレン中性種が非芳香族,ジアニオンが芳香族であることを明らかにしてきた.今回,ヘプタレン骨格の電子構造に対して縮環部位の環のサイズや電子構造がどのような影響を与えるのかを検証すべく,テトラベンゾヘプタレン3を設計,合成した.テトラベンゾヘプタレン3は,ジフェニルアセチレンのジブロモ体を出発原料に,酸化的ホモカップリングによりベンゼン縮環ビスデヒドロ[12]アヌレン4を得た後,還元的渡環環化により収率45%で得た.X線結晶構造解析の結果,3は,2と比較して大きく捻れた構造をもつことがわかった.続いて,縮環部位の違いがヘプタレンジアニオンの芳香族性に与える影響を検証すべく,3の化学還元を試みた.THF中室温で,3に金属カリウムを作用させたところ,溶液の色が無色から茶色へと変化した.1H NMRスペクトルを測定したところ,ヘプタレン骨格のオレフィン水素の化学シフトが,還元に伴い大幅に高磁場シフトしていた.これは,2が還元に伴い低磁場シフトしたこととは対照的な結果である.この大きな違いには環電流効果が関与していると考えられるため,理論計算により,中性種およびジアニオンの構造最適化とNICS値を見積もった.その結果,2および3の中性種ではいずれも非芳香族であった.ジアニオンは,2が芳香族であった一方,3では反芳香族性の発現が示唆された.この計算結果は,芳香環縮環部位がヘプタレンジアニオンの電子構造に大きく寄与することおを示している.縮合多環π電子系の簡便な合成法の確立と芳香環縮環部位の種類が電子構造に与える影響を明らかにするべく,昨年度はこれまでのチオフェン縮環体とは異なるベンゼン縮環ビスデヒロ[12]アヌレンを設計,合成し,その反応性を検討した.さらに,そこから得られるヘプタレンという骨格に着目し,芳香環縮環部位とヘプタレンの電子構造の相関を徹底的に調べ上げた.

具体的には,テトラベンゾヘプタレンを設計,合成しただけでなく,その還元種の同定まで至った.さらに,理論計算を用いて,電子構造を明らかにした.チオフェン縮環ヘプタレンの中性種が非芳香族性を,二電子還元体が芳香族性を示した一方,ベンゼン縮環体は中性種で非芳香族性を,二電子還元体で反芳香族性を示した.この結果は,非交互炭化水素の化学に対して新たな知見を与えるものであり,順調に成果が得られていると評価できる.近接したアルキン部位をもつ分子の機能開拓を目的として、これまでにチオフェン縮環ビスデドロ[12]アヌレン1の反応性の検討をし、還元反応においてテトラチエノ縮環ヘプタレン2が得られることを見出している。さらに、この還元反応に対する縮環部位の効果を検証したところ、テトラベンゾ縮環ビスデドロ[12]アヌレン3からもヘプタレン誘導体4が得られることを明らかにしてきた。今回、ヘプタレン骨格の電子構造および芳香族性に対して縮環部位の立体効果や電子構造がどの程度影響するのか検証するべく、4の化学還元および、その還元種の単離を試みた。その結果、THF中室温で、カリウムを作用させた後、[2.2.2]クリプタンド共存下で再結晶を行ったところ、テトラベンヘプタレンラジカルアニオンが生成した。一方で、DME中で過剰量のカリウムを作用させた後、-30°Cで再結晶したところ、対応するジアニオンの単結晶を得ることができた。X線結晶構造解析の結果、ラジカルアニオンとジアニオンのいずれにおいても、ヘプタレン骨格に大きな結合交替が確認できた。これは、チオフェン縮環体2のジアニオンが結合交替の小さい構造であったこととは対照的な結果である。加えて、NMR測的および理論計算より、2のジアニオンが芳香族である一方、ベンゼン縮環ヘプタレンのジアニオンが非芳香族であることを明らかにした。この理論、実験の結果は、芳香環縮環部位がヘプタレンジアニオンの電子構造に大きく寄与することを示している。外部刺激応答性分子の創製を目的として,チオフェン縮環ビスデヒドロ[12]アヌレンの一連の反応性を明らかにした.さらに,それに関した論文を3報,報告できたことは研究が概ね順調に進展していることを示していると考えられる.近接したアルキン部位をもつ環状分子の一連の反応により,様々な縮合多環π電子系分子を得るに至っているが,今後はこの中でも,縮合多環ペンタレンの凝集状態の制御に取り組む.具体的には,ジチエノベンゼン縮環ペンタレンの末端に非対称にかさ高い置換基を導入し,二分子の凝集を誘起,制御する.高い反芳香族性をもつペンタレンをface-to-faceで凝集させることができれば,単分子とは異なる芳香族性を発現するだけでなく,反芳香族分子のJ会合やH会合により特異な物性の発現が期待できる.さらにこれらの知見を踏まえ,凝集状態の構造特性と半導体特性の相関についても検討したい.また,昨年度に得られたテトラベンゾヘプタレンの還元種の電子構造および分子構造を実験的に追究し,チオフェン縮環体との相違を明らかにする.具体的には,X線結晶構造解析に適した単結晶を得るため,還元種を生成する際の還元剤の種類,再結晶条件を検討する.28年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度末に1,4-ビス(ブロモアリール)-1,3-ジアセチレンから縮合多環ペンタレンが迅速に合成でき,さらに,得られた化合物の性質が特異であることがわかった.この化合物群の電子状態や凝集状態のファインチューニングをし,機能性材料や有機エレクトロニクス材料への応用へとつなげる予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。
液-液、固-液界面反応場の構築と生体関連イオンの一斉分析

互いに交じり合わない2相の境界面である液-液界面は、バルクとは異なる物理化学的性質を有している。従ってバルク、2相分配系では発現し得ない新たなイオン認識機能の発現の探索を目的として、液-液界面におけるアニオン認識機能を、動的界面張力測定法により速度論的、熱力学的に解析し、水素結合によるアニオン認識反応に与える液-液界面の効果を検討した。種々のホスト分子について測定を行った結果、中性アニオン認識ホスト分子であるチオ尿素型ホスト分子に対しては界面張力の減少が見られなかったが、電荷を有するアニオン認識部位であるイソチオ尿素(チオウロニウム)を導入したホスト分子MT-C_1、及びイソチオ尿素基に、チオ尿素基を導入したチオ尿素-イソチオ尿素型ホストBT-C_1に対して界面張力の減少が見られた。速度論的解析の結果、界面錯形成反応の反応機構はホスト濃度により変化することが明らかとなった。界面張力の減少量はイソチオ尿素型ホストMT-C_1に比べてBT-C1は大きく増加した。更に熱力学的解析を行った結果、界面でのホスト-アニオン錯体の安定度の目安である吸着定数K及び飽和界面濃度もBT-C_1の方が大きかった。この結果は水分子が多く存在する液-液界面において中性官能基であるチオ尿素による水素結合が効果的に働いたためであると考えられる。吸着定数Kから見たアニオン選択性についてはMT-C_1ではBr^-(K=56,000±11,000)>H_2PO_4^-(K=30,000±6,600)≒Cl^-(K=25,000±18,000)、BT-C_1についてはH_2PO_4^-(K=170,000±6,000)>Br^-(K=81,000±23,000)>Cl^-(K=63,000±22,000)となりBT-C_1にリン酸選択性が発現した。以上の結果は液-液界面が親水性アニオンに対する選択性発現のための特異的な認識反応場として有用であることを強く示唆するものである。
鉛フリーなリラクサー強誘電体および巨大圧電物質の開発と物性解明

本研究では、鉛系に変わる材料として、一つには、Ba-Ti系酸化物をベースにリラクサーの開発を試みた。急冷法で育成したBaTi_2O_5針状結晶が700-750K付近で強誘電相転移を起こし、その時誘電率が30,000にも達することを見出した。しかも、誘電損失は高温でも0.1以下と小さく、高温用コンデンサ材料などとして応用が期待される。この新規強誘電体材料に関する特許を出願した。酸素欠損の微妙な違いで、シャープな転移からリラクサー状のブロードな転移に代わるなど興味深い振る舞いが見出された。誘電率、誘電損失、自発分極の値を広い温度範囲で測定し、強誘電体の代表物質であるBaTiO_3と物性の違いを比較した。更に、X線回折実験から、強誘電性相転移における結晶対称性の変化や、格子変位の大きさ等を明らかにした。これらの結果を、2005年8月の日韓強誘電体会議にて、招待講演として発表した。また、FZ法によって、大きさ2×2×5mm^3の単結晶の育成に成功した。その単結晶を用いて、光吸収スペクトルやAC法による比熱の測定を行った。バンドギャップが約3.4eVと可視域で透明であること、転移点での転移エントロピーが0.136 J/molKときわめて小さいことなど明らかにした。さらに、ゾル・ゲル法にてBaTi_2O_5ナノ粒子を作製し、それをエマルジョンにしてスピンコートすることで透明薄膜の作製に成功した。薄膜材料などとしての応用の可能性が広がった。二つめは、層状スラブ構造をもつSr_2Nb_2O_7をベースに材料開発を試みた。Sr_2Nb_2O_7の強誘電性相転移温度は1615Kと非常に高い。SrをBaで50%ほど置き換えると、その転移温度は室温付近まで低下する。FZ炉を用いて、Ba添加のSr_2Nb_2O_7単結晶の育成を行い、32%まで置換した単結晶を9種類育成し、10-900Kの温度域で誘電特性を詳細に調べた。不整合相転移や低温強誘電転移がBa添加で消失し、新たに別のブロード転移が出現することを明らかにした。ラマン散乱実験やX線回折実験の結果をふまえ、この系の相図の概略を明らかにした。2004年9月の日本物理学会(青森)や2005年1月の中国地区化学会講演会で招待され、これらのトピックスを話題に講演した。三つ目の鉛フリ強誘電体材料として、K-Nb系酸化物に注目し、物質探索を試みた。KNbO_3は代表的強誘電体である。今回、K_5Nb_9O_<25>において、100K以下の低温ではあるが、新規強誘電相を見出した。Partial filled Tetragonal Tungsten Bronze構造での強誘電性は始めてであり、今後の研究の発展が期待される。

2004年9月の日本物理学会(青森)や2005年1月の中国地区化学会講演会で招待され、これらのトピックスを話題に講演した。三つ目の鉛フリ強誘電体材料として、K-Nb系酸化物に注目し、物質探索を試みた。KNbO_3は代表的強誘電体である。今回、K_5Nb_9O_<25>において、100K以下の低温ではあるが、新規強誘電相を見出した。Partial filled Tetragonal Tungsten Bronze構造での強誘電性は始めてであり、今後の研究の発展が期待される。不揮発性メモリーとして強誘電体薄膜(FeRAM)が製品化された。今のところ、ICメモリーカードなどの低容量製品であるが、いくつかの応用上の問題が解決されれば、大容量のDRAMなども、FeRAMに凌駕されるだろう。強誘電体は21世紀のキーマテリアルである。しかし、巨大誘電率をもつリラクサーや、すでに広く使われている圧電素子などの材料は、Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>)O_3、PbZr_<1-x>Ti_xO_3(PZTと呼ばれる)のような、鉛を含む強誘電体である。鉛の環境への悪影響を考えるとき、鉛フリーな材料の開発が急務になっている。本研究では、鉛系に変わる材料として、一つには、チタン-バリウム酸化物をベースにリラクサーの開発を試みた。TiO_2リッチ組成からの単結晶育成を試み、従来BaTi_2O_5と呼ばれていた針状結晶が430-480°C付近で強誘電相転移を起こし、その時誘電率が40,000にも達することを見出した。非鉛系の新しい強誘電体材料として、特許出願を行った。EPMAでの化学分析からTiリッチなBaTiO_3であること、X線構造解析より単斜晶系で空間群C_2であることなど明らかとなった。酸素欠損の微妙な違いで、シャープな転移からリラクサー状のブロードな転移に代わるなど興味深い振る舞いがあり、これから解明すべき点が数多く残っている。二つめは、層状スラブ構造をもつSr_2Nb_2O_7をベースに、材料開発を試みた。Sr_2Nb_2O_7の強誘電性相転移温度は1342°Cと非常に高い。SrをBaで50%ほど置き換えると、その転移温度は室温付近まで低下する。我々は、この混晶系に、PZTと同じような濃度相境界が存在することを見出し、2002年8月の日韓強誘電体会議で招待講演を行なった。また、本研究費で購入したFZ炉を用いて、Ba添加のSr_2Nb_2O_7単結晶の育成に挑戦し、現在32%まで置換した単結晶を育成できるようになった。結晶の更なる大型化向け、育成条件の検討を行なっている。誘電率の温度依存については基礎的データ揃ってきた。結晶構造や圧電率の大きさなど未解明であり、これからの課題である。今のところ、ICメモリーカードなどの低容量製品での製品化であるが、いくつかの応用上の問題が解決されれば大容量のDRAMなどもFeRAMに凌駕されるだろう。TiO_2
殺虫性毒素産生細菌(BT菌)におけるプラスミド依存性ファ-ジを用いた分子育種

殺虫性毒素産生細菌Bacillus thuringiensisの分子育種法の開発を目的として毒素遺伝子の発現と制御および安定性を検討するため、AF101株を用いて本菌が保有する殺虫性毒素遺伝子を含む単一のプラスミドpAF101の解析を行った。これまでの研究の結果、pAF101には申請者が本菌で見いだした2種の弱毒ファ-ジのうち、J7Wー1プロファ-ジが組み込まれていることが判明していたが、今回あらたにKKー88ファ-ジゲノムの制限地図を作製し、その遺伝子解析の結果、この遺伝子の一部もpAF101上に存在することが明かとなった。このことから、pAF101の80%が2種のファ-ジゲノムによって構成されていることが確認された。一方、前年度から継続した毒素遺伝子のクロ-ニングは、毒素遺伝子がプラスミド上のファ-ジゲノム領域以外に存在する可能性が高くなったため、pAF101全体からショットガン法によって行った。その結果、pAF101の6.5kb PstI DNA断片を有するE.coli組換え体において70kdalの新たな蛋白の発現が認められた。この蛋白は抗毒素血清と特異的に反応することから、毒素遺伝子は6.5kb PstI DNA断片に存在することが判明した。そらにこのクロ-ニングされた毒素遺伝子は2種弱毒ファ-ジゲノムと相補性を有せず、プラスミド上のファ-ジゲノム領域以外に位置することが認められ、AF101株が保有するプラスミドpAF101は大きく分別してJ7Wー1の全ファ-ジゲノム、KKー88ファ-ジゲノムの一部および毒素遺伝子の3種の独立した遺伝学的な領域から構成されていることが判明した。本研究において、AF101株における2種のファ-ジゲノムは毒素遺伝子と独立して存在することが判ったが、今後、これらファ-ジの有する選択誘発性を本菌の分子育種における新規ベクタ-構築に利用するため、両ファ-ジの誘発制御機構を検討してゆく予定である。殺虫性毒素産生細菌のプラスミド依存性ファ-ジを用いた分子育種に関する研究において、殺虫性毒素遺伝子を含むプラスミドとそれに組込まれたプロファ-ジの関係を分子生物学的に検討し、以下に述べる研究成果が得られた。1)Bacillus thuringiensis AF101株の毒素遺伝子を含み、プロファ-ジJ7Wー1を組込んだプラスミドpAF101のHindIIIおよびXbaI消化DNA断片をクロ-ニングすることにより、J7Wー1ファ-ジゲノムのほぼ全領域とpAF101の約80%のDNAライブラリ-が作製された。これらDNA断片のうち、HindIII DNA断片においては形質転換株においてタンパク質の発現は認められなかったが、XbaI DNAを組込んだキメラプラスミドのうち9.2kb DNA断片をもつpXB9ー4において62kdalのペプタイドの発現を形質転換株において認めたほか、5.3kb DNA断片をもつpXB5ー14、6.8kb DNA断片をもつpXB7ー12でそれぞれ、78kdalおよび48kdalのペプタイドの発現が認められた。また、pXB9ー4に組込まれた9.2kb XbaIDNA断片には62kdalのペプタイドをコ-ドする遺伝子がプロモタ-領域を含んでクロ-ニングされていることが判明した。

2)プラスミドpAF101の生物学的機能を検討する上で必要不可欠な要因となる制限地図の作製を上記したDNAライブラリ-を用いて行った。この結果、pAF101におけるJ7Wー1ファ-ジゲノムの領域が明らかになったほか、AF101株が保有するJ7Wー1とは別種の紫外線誘発性ファ-ジKKー88のファ-ジゲノムの一部と相同性のある領域がpAF101に存在することを見いだした。3)KKー88ファ-ジゲノムにおいて、これまでプラスミドに組込まれていると考えられていたが、KKー88のゲノム解析の結果、KKー88ファ-ジゲノムのすべて、もしくは大部分は染色体上に存在するが、その一部の領域はプラスミド上の領域と重複しているという結果が得られた。殺虫性毒素産生細菌Bacillus thuringiensisの分子育種法の開発を目的として毒素遣伝子の発現と制御および安定性を検討するため、AF101株を用いて本菌が保有する殺虫性毒素遺伝子を含む単一のプラスミドpAF101の解析を行った。これまでの研究の結果、pAF101には申請者が本菌で見いだした2種の弱毒ファ-ジのうち、J7Wー1プロファ-ジが組み込まれていることが判明していたが、今回あらたにKKー88ファ-ジゲノムの制限地図を作製し、その遺伝子解析の結果、この遺伝子の一部もpAF101上に存在することが明かとなった。このことから、pAF101の80%が2種のファ-ジゲノムによって構成されていることが確認された。一方、前年度から継続した毒素遺伝子のクロ-ニングは、毒素遺伝子がプラスミド上のファ-ジゲノム領域以外に存在する可能性が高くなったため、pAF101全体からショットガン法によって行った。その結果、pAF101の6.5kb PstI DNA断片を有するE.coli組換え体において70kdalの新たな蛋白の発現が認められた。この蛋白は抗毒素血清と特異的に反応することから、毒素遺伝子は6.5kb PstIDNA断片に存在することが判明した。さらにこのクロ-ニングされた毒素遺伝子は2種弱毒ファ-ジゲノムと相補性を有せず、プラスミド上のファ-ジゲノム領域以外に位置することが認められ、AF101株が保有するプラスミドpAF101は大きく分別してJ7Wー1の全ファ-ジゲノム、KKー88ファ-ジゲノムの一部および毒素遺伝子の3種の独立した遺伝学的な領域から構成されていることが判明した。本研究において、AF101株における2種のファ-ジゲノムは毒素遺伝子と独立して存在することが判ったが、今後、これらファ-ジの有する選択誘発性を本菌の分子育種における新規ベクタ-構築に利用するため、両ファ-ジの誘発制御機構を検討してゆく予定である。