hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
耐酸化性に優れた超耐熱高強度IrAl系金属間化合物の開発

(1)NiAlにIrを5mol%程度添加することで、クリープ強度が2桁上昇する。(2)Ni_<0.9>Ir_<0.1>Alの高温クリープ特性は温度及び応力依存性を示す。低温側1273K以下では、内部応力≒クリープ変形応力、であり応力指数は約4以上になり内部応力支配のクリープ機構となる。一方1273K以上では、低応力側では、変形応力にしめる有効応力成分と内部応力成分ほぼ等しくなるが、高応力になるほど内部応力成分が増す。(3)以上の結果は、NiAlのNi原子サイトを占有するIrの原子半径がNiのそれに比して著しく大きく、原子サイズの違いにより形成されるIrの弾性応力場と、NiAl中に形成され易い刃状転位の応力場との相互作用(Cottrel-Jaswon)に起因する転位の溶質元素引きずり抵抗(τd)の大きさの変化によって説明される。(4)従来τdはAl-Mg系のようなfcc合金では有効応力成分に寄与すると考えられているが、NiAlの様な金属間化合物においては内部応力成分に寄与することが本研究によって明らかにされた。本研究によって得られた知見は、IrNiAl系金属間化合物の実用化にとって有用である。我々はNiAlの圧縮強度およびクリープ強度を改善するのにIr添加が極めて有効であることを発見した。Ir添加したNiAlは1273KにおいてNiAlの3倍の圧縮強度を示し、クリープ速度はNiAlに比べて3桁ほど低下する。今回、クリープ試験条件(負荷応力および試験温度)をより広範囲で行うことによってクリープ速度の応力依存性を詳細に調べ、転位観察によって(Ir,Ni)Al合金のクリープ機構および高温強度改善の機構を検討した。アーク溶解にて作製したNiAlおよびNiAlにIrを5mol%添加した(Ir,Ni)Alボタン合金を1473K×14daysの溶体化処理後、ワイヤーカット放電加工機を用いて2×2×5mm3の角柱に切り出し試験片とした。インストロン型試験機を用いて負荷応力10150MPa、12731373Kの温度領域で定荷重圧縮クリープ試験を行った。実験の結果は以下のようにまとめられる。(Ir,Ni)Al合金の応力指数n値が負荷応力の増加によって約3から5以上に変化することが分かった。また、試験温度が上昇するとn値は低下する。NiAlの転位組織は発達したサブグレインが形成され、グレイン内部にはほとんど転位が見られない。一方、(Ni,Ir)Al合金はn値が3の領域では均一に分布した転位が見られ、n値が5以上の領域ではサブグレインが形成され、グレイン内部にも均一に分布した転位が観察される。以上まとめると以下のように記述される。転位観察の結果、(Ir,Ni)Al合金のサブグレインは2つの異なるバーガースペクトルからなる転位のネットワークであることが分かった。これは刃状転位の上昇によって形成されるNiAlのサブグレインと異なる。おそらく(Ir,Ni)Al合金では多重すべりによる転位反応で不動転位が形成され、その安定化配列によって転位のネットワークが形成されると考えられる。Ir添加による強化機構は不動転位の形成による内部応力の増加であると考えられる。
脳波を用いたメンタルトレーニング評価法の開発

本研究の目的は、脳波のCNVという成分を用いて、メンタルトレーニングの効果がどのように発揮されるかを「目に見える形」で評価することを目的とした。そのため、被験者が運動イメージを描いているときのCNVと実際に運動を行っているときのCNV、何もしないで安静を保っているときのCNVを比較した。その結果、運動をイメージしているときのCNV後期成分の方が、何もしないで安静を保っているときにCNV後期成分に比べ振幅が大きくなる傾向にあった。また、その傾向は、トレーニングによって大きくなる可能性があることも示唆された。しかしながら、CNV後期成分には運動準備電位(RP)とそれ以外の成分の少なくとも2つの成分からなることが示されており(Tecce&Cattanach,1987)、得られた実験結果がイメージトレーニングによるものではなく、何らかの筋緊張による運動準備電位の混入によって生じた結果である可能性が指摘された。そこで本研究では、さらに、CNV後期成分から運動成分(movement-preceding negativity;MPN)を取り除くために、Damen&Brunia(1994)が用いたdelayed feedback paradigmを応用して運動と関連する成分を取り除くことを試みた。その結果、運動とは関連のない成分(stimulus-preceding negativity;SPN)を得ることができ、その成分が心理的な(affectvi-motivational)刺激と関連があることが示された。今後は、このSPNを用いてメンタルトレーニングの効果を評価する必要性が指摘された。
ケイ化物を用いた無毒性高効率熱電変換材料の開発

熱電発電とは、温度差のあるところから電気エネルギーを直接取り出す発電方式であり、環境にやさしい発電方法として関心が高まっている。これに必要な材料が熱電変換材料であるが、その中で金属ケイ化物は、原料が天然に多く存在し、毒性がなく、高い熱電変換効率を持つ材料として注目されている。本研究の初年度では希土類金属元素のケイ化物や三元系のケイ化物について合成と測定を行い、その熱電特性について調査した。本年度では、ケイ化物の中で高い電気伝導度を持つことが知られている二ケイ化コバルトに着目し、特に、ゼーベック係数の絶対値が低いことを改善する目的で、CoSi_2にSiを添加して複合体とする方法と、Siの一部をBで置換する方法の二通りを試み、電気的性質の変化について検討した。具体的にはまず、真空封管したコバルトおよびケイ素粉末を1050°Cで2h加熱することにより、二ケイ化コバルトの単一層の粉末を合成し、これを、900°C-125MPa、という温度および圧力下で、2h、HIP焼結することにより相対密度96%を持つ緻密化した焼結体バルク試料を作製することに成功した。次に、この方法でCoSi_2とSiとの複合体バルク試料を作製し、その電気的性質を評価した。その結果、CoとSiのモル比が1:2から1:4.7までは添加量の増加に伴って電気伝導度が低下、ゼーベック係数の絶対値が増加する傾向を示し、モル比が1:4.8を超えると、電気伝導度は急激に上昇、ゼーベック係数の絶対値が低下するという現象を見出した。この結果は、電気伝導を支配している物質がCoSi_2からドープされたSiへ交替するというパーコレーションの観点から説明することができた。一方、Siの一部をBで置換して得られたバルク試料の電気伝導度は半導体的となり、その値は置換量と共に低下した。また、そのゼーベック係数はほとんど変化しなかった。この結果から、ホウ素の置換がCoSi_2の電子移動度を低下させるものの、電子状態にはあまり影響を及ぼさないことがわかった。その中でも、金属ケイ化物は、原料が天然に多く存在し、毒性がなく、高い熱電変換効率を持つ材料として注目されている。しかし、現在までに行われている研究は主に、遷移金属のケイ化物が中心である。本研究では、新たに希土類金属のケイ化物と希土類-遷移金属の三元系複合ケイ化物に着目し、これらを真空封管によって合成し、緻密な焼結体を作製することを目指した。また、得られた試料の電気伝導度とゼーベック係数を測定し、これらのケイ化物が熱電変換材料として利用できる可能性を、電気特性に加えて高温における耐酸化性を含めて評価した。これらに加えて4価のTiやZrのケイ化物についても焼結と電気的性質の評価を行った。その結果、MSi_2(M=Y,La,Gd)の粉末では真空中10501300°Cの加熱で、MYSi_2(M=Co,Ni,Cu)の粉末では真空中800900°Cの加熱で単一相を得、HIP焼結法を用いることにより、2元系では74-84%、三元系では8694%の密度を持つ焼結体を得ルことに成功した。また、これらのケイ化物試料が10^5Sm^<-1>以上の非常に高い電気伝導度を持ち、二元系より三元系のほうがより高いことがわかった。温度の上昇に伴ってゼーベック係数の絶対値が増加することから、これらのケイ化物の電子構造が金属と同様であることを明らかにし、電子状態密度計算によってもこのことを確認することができた。一方、大気中高温における安定性を測定したところ、TiSi_2が非常に高い耐酸化性を持つことがわかった。以上の結果は、日本セラミックス協会第20回秋季シンポジウムにて講演発表を行った。

その結果、CoとSiのモル比が1:2から1:4.7までは添加量の増加に伴って電気伝導度が低下、ゼーベック係数の絶対値が増加する傾向を示し、モル比が1:4.8を超えると、電気伝導度は急激に上昇、ゼーベック係数の絶対値が低下するという現象を見出した。この結果は、電気伝導を支配している物質がCoSi_2からドープされたSiへ交替するというパーコレーションの観点から説明することができた。一方、Siの一部をBで置換して得られたバルク試料の電気伝導度は半導体的となり、その値は置換量と共に低下した。また、そのゼーベック係数はほとんど変化しなかった。この結果から、ホウ素の置換がCoSi_2の電子移動度を低下させるものの、電子状態にはあまり影響を及ぼさないことがわかった。
嚥下障害の発生学的発症機序の解明:CHARGE症候群をプロトタイプとして

胎児期よりマウスに抗甲状腺薬(methimazole)の投与を行ったところ、非投与群と比べてmethimazole (MMI)投与群で体重増加率が悪かった。また、CHD7遺伝子のm RNA発現量をMMI投与群と非投与群とで定量PCR法を用いて比較したところ、MMI投与群でCHD7遺伝子の発現の低下が認められた。胎児期のマウス(E13.5)のpalliumでは、脳室帯に特異的にCHD7遺伝子の発現が認められた。嚥下機能は大脳皮質から脳幹部への投射によっても支配されていると考えられている。抗甲状腺薬の投与による体重増加不良のひとつの原因として哺乳不良が考えられ、本研究によって、そのメカニズムの一端としてCHD7遺伝子発現の低下が関与している可能性が示唆された。新生児医療の急激な進歩により、未熟児・早期産児や多発奇形症候群の患者の生存率が著しく向上してきている。その一方で、脳神経障害を始めとする合併症の対策が急務となっている。特に、脳神経障害を合併する多発奇形症候群や早期産児の嚥下機能障害は生命予後に関わる因子として重要である。CHARGE症候群の主要な臨床症状のひとつに脳神経の異常がある。新生児期にCHARGE症候群と診断された全ての患者において、嚥下機能障害が認められている。申請者は、CHARGE症候群の原因遺伝子CHD7のニワトリ相同遺伝子(Chd7)を同定しており、ニワトリ胚とRNA干渉法を組み合わせた実験系を用いて嚥下機能とChd7遺伝子の関係を発生学的見地から解明しようと試みた。RNA干渋によりChd7遺伝子発現を低下させると予測される塩基配裂を持つプラスミドベクターを、脳神経の形成に関わる神経堤細胞の出現領域にエレイクトロポレーション法を用いて遺伝子導入した。その結果、遺伝子導入されたニワトリ胚では、胚の奇形や成育不良が数多く確認された。それらの異常は、RNA干渉を起こさないプラスミドを遺伝子導入したコントロール郡でも同様に認められた。両群間で差を認めなかった原因として、エレクトロポリーションによる遺伝子導入法の条件検討が不十分であることが考えられた。また、RNA干渉を起こすプラスミドベクターの遺伝子発現抑制の評価も詳しく行う必要があると考えられた。今後、1)エレクトロポレーション法の条件検討を更に細かく行うこと、2)Chd7遺伝子の発現が既に確認されている眼原基、耳原基、脳原基からprimary cultureを作製し、それらを用いてRNA干渉による遺伝子発現の低下を詳細に評価することが重要となる。本研究課題で確立される実験系は、多発奇形症候群を始めとする様々な疾患の病態を解明する貴重な手段となり得る。CHARGE症候群の患児では誤嚥や嚥下障害が予後にも関わる重要な臨床症状である。これらの臨床症状は第IX・第X脳神経の異常と関係があると考えられており、しばしば後鼻孔閉鎖や口蓋裂の存在によって症状が増悪する。我々を含めた複数の報告者が、胎児期の抗甲状腺薬の投与によってCHARGE症候群様の奇形症状(コロボーマ、後鼻孔閉鎖)が誘発される可能性を指摘している。そこで本年度は、抗甲状腺薬の投与とCHARGE症候群様症状の出現、CHD7遺伝子の発現パターンの変化など、以下の点についてニワトリ胚およびマウス胎仔を用いて検討した。(1)ニワトリ胚およびマウス胎仔へ抗甲状腺薬(methimazole)の投与を行い、コロボーマ、後鼻孔閉鎖の出現の有無を調べたが何れの症状も確認されなかった。(2)マウス胎仔にmethimazole (MMI)の投与を行い、CHD7遺伝子のmRNA発現量をMMI投与群と非投与群とで定量PCR法を用いて比較したところ、MMI投与群でCHD7遺伝子の発現の低下が認められた。(3) MMI投与群と非投与群とで、嚥下機能を担う脳神経(第IX・第X脳神経)の細胞体におけるCHD7遺伝子の発現量の変化を、抗体染色法とlipophilic tracerを組み合わせた手法で検討した。しかし、明確な結論を得ることはできず、実験手技を含めた更なる検討が必要と考えられた。CHD7遺伝子の発現は大脳にも認められており、嚥下機能は大脳皮質から脳幹部への投射によっても支配されていると予想されている。マウスでは胎仔期からの抗甲状腺薬の投与によって出生直後から体重増加不良が認められることが知られている。体重増加不良のひとつの原因として哺乳不良が考えられ、本研究によって、そのメカニズムの一端としてCHD7遺伝子発現の低下が関与している可能性が示唆された。
モノクロナール抗体を利用したインフルエンザの迅速診断

インフルエンザ流行に備え、ウイルス感染細胞上で、迅速にインフルエンザウイルス型、亜型を同時に検出する方法を展開するため、A型インフルエンザウイルスのAH1N1(ソ連)型とAH3N2(香港)型それぞれに特異的に反応するモノクロナール抗体:C179、F49を一次血清として用い、ウイルス感染細胞に発現するインフルエンザウイルス抗原をペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ(PAP)法により染色し、検出する方法を試みた。まず、過去に分離され、赤血球凝集阻止(HI)試験により型別された160株のインフルエンザウイルスについてPAP法で型別し、両者の精度を確認した。2株だけは、PAP法によってのみH1N1とH3N2の混合感染であることが明らかにされたが、それ以外の株は両者の結果は完全に一致し、流行期に導入応用できることが明らかになった。次に、患者うがい液を細胞に接種、40時間後に固定、これらのモノクロナール抗体を一次血清に用いPAP法によりウイルス感染の有無(検出)及び型別を試みた。同時に細胞変性(CPE)を指標にした培養によるウイルス検出も行なった。1993/94、1994/95インフルエンザ流行期において、72、80検体について検討した結果、25のH3N2、27のH1N1ウイルスを検出、CPEによるウイルス検出それぞれ33、34に比べ、PAP法は若干検出率が劣るが検体中のウイルス量の影響と考えられた。しかし、PAP法は迅速性に優れ、ウイルス検出と同時に型(亜型)別が行なえる点で有用な方法であった。我々は、インフルエンザウイルス感染細胞を酵素抗体法の一種、PAP法による免疫学的染色法で可視化することにより、感染後24時間以内にウイルスの存在を証明することを既に開発している。PAP法での一次血清に型特異血清を使用することにより、感染ウイルスの型鑑別も可能である。本研究は、我々が既に作製したインフルエンザウイルスAH1、H2型共通な抗原決定基(エピトープ)に反応するモノクロナール抗体、AH3型共通に反応するモノクロナール抗体、及びB型ポリクロナール抗体をPAP法一次血清として使用することにより、患者由来検体を感染させた細胞上で迅速に感染及び感染型鑑別を試み、従来のウイルス分離法との感度検定を行なうことを目的とした。まず、インフルエンザウイルス標準株20株を用い、これらのモノクロナール抗体をPAP法一次血清として使用した場合、感染細胞上での型鑑別が可能である事を確認した。次いで、1970年来大阪府下でインフルエンザ流行因子として分離同定されたウイルス80株について、本法による型鑑別を行こないHA、HI反応により同定された型と一致する成績を得た。又、複数型による流行が確認されている年に分離同定された株について、PAP染色により同一検体中に複数のウイルス亜型の存在が推察される例を2件認め、混合感染例の検出も可能と考えられる。さらに、本流行時、72件の患者由来検体を感染させた細胞について、従来の分離同定と同時に、PAP染色による迅速診断法を併用し、反応条件の設定及び感度検定を行こなったところ、PAP染色には感染培養後40時間が適当であり、従来のウイルス分離33/72、その内40時間(検体感染後2日以内)に迅速型鑑別診断されたのは25/33の成績を得、感度では劣るが、迅速に感染及び型鑑定の情報獲得に有用である成績を得た。我々は、インフルエンザウイルス感染細胞を酵素抗体法の一種、PAP法による免疫学的染色法で可視化することにより、感染後24時間以内にウイルスの存在を証明することを既に開発したいる。

前年度、既に作製したインフルエンザウイルスAH1、H2型共通な抗原決定基に反応するモノクロナール抗体、AH3型共通に反応するモノクロナール抗体、及びB型ポリクロナール抗体をPAP法一次血清として使用することにより、インフルエンザ標準株、及び患者由来検体を感染させた細胞上で反応条件を設定、感染及び感染型鑑別を試み、迅速に感染細胞上での型鑑別が可能である事を確認した。同時に、従来のウイルス分離法と感度検定を行なったところ、従来のウイルス分離に比べ70%程度の感度で検出可能であり、感度は劣るが、迅速に感染及び型鑑定の情報獲得に有用である成績を得た。この感度が劣る原因の一つとして、検体中のウイルス量が一定量でないため、細胞に接種されるウイルス量のバラツキが考えられる。この点を考慮し、本年は、従来の分離法に従い検体を細胞に接種、24時間一段増殖させた後に培養上清をプール、このサンプルを更にマイクロプレート上に接種20時間後に固定、PAP染色し、感染及び型鑑別を行こなうことにより感度上昇を試みた。68検体について検討した結果、従来のウイルス分離(二代継代の結果)陽性29件、迅速診断陽性21件と感度は前年度と大差が認められなかった。しかし、分離一代陽性の結果と比較すると、21/22であり、感度差は認められない。従って、ウイルス分離等には、検体中のウイルス量のバラツキはさけられない点であり、特に、インフルエンザ感染のように流行全体像を早期に把握する必要がある場合、前年度に得られた反応条件による迅速診断法により、単に患者診断だけでなく、早期に情報を得るに適した方法である。
バイオミネラリゼーションに倣う新材料創成－石灰鱗の制御への挑戦－

貝類や甲殻類などのバイオミネラリゼーションに倣った構造材料に適用可能な炭酸カルシウム生成を目的として,貝や蟹などバイオミネラリゼーションで生成された材料の機械的特性を調べ,水垢などの石灰鱗に着想を得て,レーザによる炭酸カルシウムの生成を試みた。その結果,多くの貝殻はアラゴナイトであり,貝殻外部やホタテはカルサイトであり,アラゴナイトの降伏応力は1GPa程度,カルサイトの降伏応力は約400MPaであることを,微小押込み試験を用いた逆問題解析により明らかにした。また,炭酸水素カルシウム水溶液中に設置した試験片にレーザを照射して炭酸カルシウムを生成できることを実証した。1.カニなどの甲殻類,およびホタテ,シジミ,ハマグリ,アサリなどの貝類などのバイオミネラリゼーションで生成された炭酸カルシウム製材料の高強度の機構を解明するために,その階層的組織構造に着目して,既存設備の走査型電子顕微鏡SEMを用いてミクロ・ナノ構造を外表面および内表面ならびに断面の各面における階層的組織構造の異方性に着目してSEM観察し,外側と内側で空孔などの組織構造が異なることなどを明らかにした。2.微小押込み試験から得られた荷重ー変位曲線を用いて逆問題解析を行い,アサリおよびハマグリの貝殻の内面の降伏応力が1GPa程度,アサリの貝殻の外面の降伏応力が400MPa程度であることを明らかにした。また,ビッカース硬さ試験の結果から,貝殻の種類および面に関係なく,ビッカース硬さが2.5GPa程度であること,微小圧子押込み試験の結果より,今回調査した貝殻の縦弾性係数はおおよそ2550GPaの範囲であることを明らかにした。3.水垢(石灰鱗)に着目して,炭酸カルシウム膜を,水酸化カルシウム水溶液中に設置した銅板やステンレス鋼板などの基板に人工的に生成できることを明らかにした。また,基板の設置方法や温度などを制御することにより,生成効率が高まる可能性を明らかにした。4.設備備品費で購入したレーザを用いて,水酸化カルシウム水溶液中に設置したステンレス表面に,レーザを走査し,制御性のよい炭酸カルシウム層の生成が可能であることを実験的に明らかにした。交付申請書の研究実施計画に記した項目について,順調に実施し,着実な成果を得ている。1.生体鉱物の硬さ,縦弾性係数および降伏応力を評価するためにアサリ,ウバガイ,ヤマトシジミ,ハマグリ,ホタテの貝殻,カニの爪およびシカの角に対してビッカース硬さ試験および微小圧子押込み試験を行った結果,貝殻の硬さはHV=2.40GPa程度,カニの爪,シカの角はHV=0.30GPa,縦弾性係数は20GPaの範囲,貝殻の降伏応力は400MPaまたは1000MPa程度,カニの爪およびシカの角は50 MPa程度であることを明らかにした。2.金属表面で炭酸カルシウム膜を形成する際の基板温度の影響を評価するために,ヒータ加熱で温度を調整してステンレス鋼の試験片表面に炭酸カルシウムを生成させ,炭酸カルシウムの膜厚を測定した結果,炭酸カルシウムがより生成しやすい温度が存在することを明らかにした。3.レーザ照射による金属表面での炭酸カルシウム膜の作製における,レーザ出力,集光レンズと試験片との距離,試験片の移動速度,液温および照射時間の影響の評価を行った.その結果,(1)波長532nmの連続発振Nd:YAGレーザを用いた局所的な加熱により金属表面に炭酸カルシウムを生成できること,(2)レーザの照射時間が短い領域においてはレーザ出力の増大に伴い炭酸カルシウムの膜厚が増大する一方,レーザ出力1.5Wにおいて照射時間が長くなると炭酸カルシウムの生成後にレーザキャビテーションで発生した衝撃波の衝撃力およびレーザアブレーションにより試験片表面が削られ炭酸カルシウムの生成が不可能になること,(3)集光レンズと試験片との距離は炭酸カルシウムの生成に大きく影響し,集光レンズを移動させるだけでエネルギーを増大させることなく膜厚および幅を調整できること,(4)液温の増大に伴い炭酸カルシウム膜の幅が増大する一方,炭酸カルシウムの膜厚は減少する傾向を示しことなどを明らかにした。交付申請書の研究実施計画に記した項目について,平成27年度は順調に実施できたので,平成28年度は,引き続き,交付申請書の研究実施計画に記した項目について研究を推進する。知的計測評価学
中枢免疫寛容を維持する自己抗原の発現制御機構の解明

生体が生命活動を獲得し挙動を示すのには、細胞から産生されるタンパク質が中心的な役割を担っている。タンパク質の発現は、転写制御因子や転写因子によってさまざまな遺伝子がダイナミックに制御されている。これらの一連の制御機構を理解することは、われわれがどのように生命体として出来上がり、生命活動を行っているかの理解に繋がる。今回我々は、胸腺の髄質上皮細胞に選択的に発現している転写因子Fezf2に着目し、質量分析解析を活用することで、Fezf2の共役因子を網羅的に同定した。それらの分子に着目することで、Fezf2を中心としてどのような遺伝子が下流で発現制御されているかを明らかにすることを試みた。一方で、最新のシーケンス技術を取り入れ、RNAシーケンス解析やクロマチン免疫沈降ーシーケンス解析を用いていることで、胸腺髄質上皮細胞におけるFezf2の分子挙動を明らかとした。また、質量分析解析の結果から、新規Fezf2相互作用因子FIPを同定し、FIPを胸腺上皮細胞で選択的に除去するコンディショナルノックアウトマウスを用意し、免疫学的な解析を行った。このマウスは胸腺細胞の分化(特に正の選択)は正常であったが、CD4陽性T細胞やCD8陽性T細胞のT細胞抗原受容体のレパトアが大きく変化しており、負の選択に異常がある可能性が見いだされた。一方で、制御性T細胞などアゴニスト選択によって出来上がるT細胞の集団の割合は、野生型マウスと比べて大きな変化はなかった。そして、コンディショナルノックアウトは加齢に伴い、全身の臓器にT細胞の組織浸潤が見られるといった自己免疫疾患様の症状を示すことが明らかとなった。以上の結果から、胸腺上皮細胞で選択的に発現するFIPは、Fezf2と協調して自己抗原の発現を制御することで、T細胞の負の選択に関わる遺伝子であるとともに、中枢性免疫寛容に関わる重要な分子であることが明らかとなった。当初に想定していたFIPの分子メカニズムより相当複雑な機構により、FIPが遺伝子発現を制御していることが明らかとなり、新たな視点と解析手法の確立に迫られた。現在、FIPが分子レベルでどのようにFezf2と相互作用するかや、クロマチン制御領域をより明らかとし、詳細な分子基盤の解明に挑戦している。また、FIPに反応する自己応答性T細胞が胸腺内でどのように選別されているかを可視化し、選択的に分取する実験系を確立している。当初の予定より論文の作成など遅延し目的の経費を使用する機会が無かった。
細胞内の空間配置を制御する力学要素としてのオルガネラの役割の理解

本研究では、「細胞核の細胞中央への移動」と「細胞質流動の発生」におけるオルガネラの力学的な役割を定量的に明らかにすることを通じて、『真核生物の細胞内小器官(オルガネラ)が細胞内の大規模な空間再配置に必要な力学的要素として働いている』とするコンセプトを確立することを目指す。2018年度の主な進展は以下の通りである。「細胞核の細胞中央への移動」に関しては、関与が疑われるオルガネラ(エンドソーム、リソソームなど)を細胞全体にわたって高速で3次元的に撮影する方法の確立に成功した。また、オルガネラを力学的要素として構築した数理モデルで、細胞核の移動の原動力となる中心体の配置を説明できることを示し、発表を行った(Kondo & Kimura, 2019)。遠心顕微鏡を用いた細胞内力測定については、米国にある遠心顕微鏡を2019年度に利用して測定するための準備を進めた。「細胞質流動の発生」においては、細胞内への磁気ビーズの導入方法について検討を行っている。まだ再現性良く導入するには至っていないが、可能性の高い方法を見出した。磁気ビーズの導入方法を確立できれば、磁気ピンセット技術を用いて、オルガネラの物性や発生する力を測定したり制御したりすることが可能となる。また、細胞質流動においても、その原動力の力学的要素として重要な小胞体(ER)を、高速で3次元的にイメージングすることが重要であり、その撮影方法の確立にも成功している。以上のように研究課題は着実に前進している。研究計画として掲げた、(i)遠心顕微鏡を用いた細胞内力測定、(ii)磁気ピンセットを用いた細胞内力測定、(iii)細胞内オルガネラの挙動の高速3次元イメージング、(iv)数理モデルの構築、のいずれについても着実な進展が認められ、計画通りに進んでいるため。2019年度には、遠心顕微鏡を用いた細胞内力測定を実施し、細胞核を動かすのに必要な力の大きさを定量化する。さらに、高速3次元イメージングを通じて、細胞全体でオルガネラがどのタイミングで、どれくらいの数動いているかを定量化する。これらを通じて、「本当にオルガネラの移動で核の移動に十分な力をまかなえるのか?」という問いに答える。ERの粘弾性を測定のために、磁気ビーズの細胞内への導入と、その磁気ピンセットによる操作技術を確立する。さらには、ERのイメージングを通じて、「ERが動くことによって微小管の方向が変わるか?」また「ERは微小管上をどれくらいの頻度で動くか?」という問いに答える。これらの実験を踏まえて、2020年度には、核の配置と細胞質流動に関する数理モデルを構築し、オルガネラが果たす役割を定量的に理解する。
海洋における植物プランクトンの光環境適応の分子基盤とメカニズムの解明

珪藻は、海洋全域に生息している主要植物プランクトンで、海洋の炭素固定の約40%を担う水圏の炭素循環系において最も重要な光合成生物である。珪藻は遊泳能力を持たないため、海洋の有光層内における様々な水深で光適応しなければならない。特に、沿岸域に多く生息することから、海水の鉛直混合(海面と深層の混合)による影響を受け易い。しかし、珪藻が様々な水深間を輸送される際、どのように光適応するかを示した報告は無い。これらの点を明らかにするために、本研究では、海洋性植物プランクトンの中ゲノム解析済みのモデル中心目珪藻Thalassiosira pseudonana及び羽状目珪藻Phaeodactylum tricornutumを用いて研究を行った。本年度は、昨年度の研究で確立した珪藻からの光化学系タンパク質複合体の単離法を利用し、2種の珪藻間における光化学系の違いを見出した。結果として、2種の珪藻間では、集光アンテナタンパク質であるFCPの種類・量および特性が大きく異なる事が判明した。さらに、光化学系1における周辺集光アンテナの大きさにも差を見出す事ができた。これらの結果は、これまで珪藻研究では報告されておらず、複数の珪藻間で全く異なる光化学系システムを構築している可能性を示す初めての生化学的知見である。また、近年、緑藻を用いた研究で明らかとなった、強光適応タンパク質であるLHCSRについて調べたところ、珪藻においてもLHCSRの発現が確認でき、その局在は光化学系と結合していることが明らかとなった。これらの結果をもとに、2種の異なる珪藻間における光環境適応メカニズムの差異を、生息域(環境条件)の違いと関連づけた研究成果をまとめている。本研究では、今後の植物プランクトンの生理・生化・生態学的研究の基盤整備としての、重要な役割を担う事が出来たと考える。このため、この藻類における光・海洋環境変動に伴う光合成効率(基礎生産量)の変化は、海洋生態系及び気候変動に大きく影響を及ぼすと考えられる。また、珪藻は遊泳能力を持たないため、海洋の有光層内における様々な水深で光適応しなければならない。これらの点を明らかにするために、本研究では、海洋性植物プランクトンの中でも優占的に生息し、環境的に寄与が大きく、ゲノム解析済みのモデル中心目珪藻Thalassiosira pseudonanaを用いて研究を行った。本年度は、未だに確立されていない珪藻種の培養条件の確立、細胞の破砕条件の確立及び光化学系タンパク質の精製条件を検討した。これまで通常、珪藻の培養には組成が不安定な天然海水が用いられていたが、本研究では人工海水を用いた培養条件を確立した。また、得られた珪藻細胞をグラスビーズ法、BioNeb法、凍結融解法を用いて破砕を試みた。その結果、BioNeb法による細胞破砕が最もチラコイド膜の単離に適している事が明らかとなった。また、得られたチラコイド膜を、ドデシルマルトシドを用いて可溶化することで、珪藻の光化学系タンパク質の精製を行った。現在、精製された光化学系タンパク質超複合体について、質量分析及び色素分析による詳細な解析を行っている。
アジアにおける原人と新人の共存:更新世アジア人類遺跡の河川性及び火山性石英のESR年代測定による研究

インドネシアのジャワ島では、世界で最も新しい原人(Homo Erectus)の頭骨が発見され、原人が旧人だけでなく、新人とさえ共存していたの議論がなされており、人類の進化を議論する上できわめて重要な場所となっている。しかし、その根拠となる年代測定については不確定な部分が多く、共存を証明するまでには至っていない。本研究では、原人の頭骨が発見された、Ngandong遺跡について、その層序と関連する堆積物の石英を用いてESR(電子スピン共鳴)年代測定、また、火山噴出物を用いて、この遺跡のESR及びK-Ar, Ar-Ar年代測定を試みた。本研究における、最も重要な技術的側面は、石英を用いた堆積物のESR年代測定であるが、これは世界的にも一部のグループにおいて行われているにすぎない。日本及びフランスのいくつかの年代既知の堆積物を用いた研究により、その実験的方法を確立した上で、Ngandong遺跡の堆積物試料に年代測定法を適用する。ジャワ島Ngandong遺跡周辺で採取したテフラから、斜長石、ホルンブレンドを抽出し、K-Ar, Ar-Ar年代測定を試みた。残念ながら、大気の成分が多く、十数万年と思われる範囲の年代を得ることができなかった。ジャワ島Ngandong遺跡周辺で採取したテフラ及び河川性、風成堆積物から石英を抽出し、堆積物のESR年代測定の方法論に基づいて年代測定を試みた。光によって消滅する複数の信号の成分を用いて求めた年代は一致せず、消滅が不十分だった可能性があることがわかった。現地において再度試料を採取して、年代測定を行う予定であったが、現地は2005年末の大地震の混乱が続いており、現地調査を行うことができなかった。今後、現地調査を含め、さらに研究を進め、Ngandong遺跡の確かな年代を得ることにより、東南アジアにおける原人、旧人、新人の進化の過程、アフリカからの移動を明らかにすることができる。本研究では、原人の頭骨が発見された、Ngandong遺跡について、その層序と関連する堆積物の石英を用いてESR(電子スピン共鳴)年代測定、また、火山噴出物を用いて、ESR及びK-Ar, Ar-Ar年代測定を行い、この遺跡の年代を確立することを目的とする。インドネシア・ジャワ島で、このための年代測定に必要な河川堆積物および火山性堆積物の採取を行った。河川堆積物のESR年代測定のための基礎実験は終了したので、この結果を基に、年代測定を行っている途中である。また、火山性堆積物については、非常に粒径がこまかく、K-Ar年代測定に用いるカリウム長石を抽出するのに時間を要したが、これも終了しており、近く年代測定を行う予定である。
活性型血小板を介した糖尿病性細小血管症の進展抑制効果を有する生薬の探索

糖尿病性細小血管症発症・進展抑制効果を有する生薬を探索することを目的に、その発症・進展の過程で鍵となる活性型血小板及びマイクロパーティクル(PDMP)に対する駆オ血薬の効果を検討した。Streptozotocin誘発糖尿病ラットに牛膝・丹参・紅花エキスを連日7日間胃内に強制投与し、FACS及びELISAにより活性型血小板・PDMPを測定した。活性型血小板に対する効果は認めなかったが、糖尿病誘発により増加した活PDMPは牛膝、紅花及び丹参エキスにより有意に低下した。このことから、牛膝、紅花及び丹参はPDMP抑制を介し、糖尿病性細小血管症発症を抑制する可能性が示唆された。生活習慣の欧米化により糖尿病患者は増加の一途を辿り、その合併症である糖尿病性腎症・網膜症・神経障害などの一因である動脈硬化の進展に伴う細小血管症の進展を抑制する治療法の開発が求められている。今回、糖尿病性細小血管症の発症・進展の過程で鍵となる活性型血小板及びマイクロパーティクル(PDMP)に対する生薬の効果を基礎的に研究し、糖尿病性細小血管症発症・進展抑制効果を有する生薬を探索することを目的とした。牛膝・丹参・紅花の各生薬エキス末は、各生薬100gに対し500mlの蒸留水からエキスを抽出、凍結乾燥させて作製した。7週齢のWistar/ST雄性ラットにStreptozotocin (STZ、60mg/kg)を腹腔内単回投与して糖尿病を誘発した後、無作為に6群(Sham群、糖尿病Control群、牛膝・丹参・紅花の生薬エキス群、Sarpogrelate群)に分類し、薬剤あるいは水道水を連日7日間胃内に強制投与した。薬剤投与後にペントバルビタール麻酔下に門脈血を採取し、多血小板血漿・乏血小板血漿に分離して血小板数を調整した上で、抗CD62、抗CD61抗体を用いてフローサイトメトリー(FACS)により活性型血小板マーカーを測定した。さらに、血小板由来マイクロパーティクル測定キットPDMP ELISA Kitを用いてPDMP濃度を測定した。FACSによる検討では、糖尿病群はSham群に比較して活性型血小板及びPDMPの検出率がともに増加し、活性型血小板は薬剤投与による有意な変化を認めなかったが、PDMP検出率は牛膝及び丹参エキスにより有意に低下した。また、ELISAによるPDMP濃度測定では、糖尿病群で増加し、丹参及び紅花エキス、Sarpogrelateの投与により有意に低下した。生活習慣の欧米化により糖尿病患者は増加の一途を辿り,合併症である糖尿病性腎症・網膜症・神経障害などの一因として動脈硬化の進展に伴う細小血管症の進展を抑制する治療法の開発が求められている。今回,糖尿病性細小血管症の発症・進展の過程で鍵となる活性型血小板及びマイクロパーティクル(PDMP)に対する生薬の効果を基礎的に研究し,糖尿病性細小血管症発症・進展抑制効果を有する生薬を探索することを目的とした。7週齢Wistar系ラットにStreptozotocin (STZ, 60mg/kg)を腹腔内単回投与して糖尿病を誘発し,血糖値が300mg/dlで安定するSTZ投与1週間後に血糖値を測定して糖尿病の発症を確認した。漢方医学的に駆オ血効果を有する生薬の抽出エキスは常法に従い,生薬(牡丹皮,牛膝,益母草,紅花,丹参) 100gに水500mlを加えて30分間煎出し,濾過後に凍結乾燥法により生薬エキスを作製し,糖尿病モデルラットに経口強制投与した。STZ投与5週間後においてペントバルビタールを腹腔内投与して麻酔し,開腹した後に下大静脈より静脈血を採取した。採取した血液は遠心分離して多血小板血漿・乏血小板血漿に分離し,乏血小板血漿を用いて多血小板血漿の血小板数を調整した上で,抗Pセレクチン,抗CD62,抗PDMP抗体を用いてフローサイトメトリー(FACS)により活性型血小板マーカーを測定した。糖尿病群はSham群に比較して活性型血小板,及びPDMPが増加していた。生薬エキスの効果の検討では,紅花エキスの投与により活性型血小板数が低下する傾向を示し,牡丹皮,牛膝,益母草,丹参の各エキスでは変化がみられなかった。一方,PDMPにおいては,牛膝エキスと紅花エキスによりPDMPは減少したが,その効果は有意ではなく,他の生薬エキスでは変化がみられなかった。牛膝・丹参・紅花の各生薬エキス末は定法に従い、各生薬100gに対し500mlの蒸留水からエキスを抽出、凍結乾燥させて作製した。

7週齢のWistar/ST雄性ラットにStreptozotocin (STZ、60mg/kg)を腹腔内単回投与して糖尿病を誘発した後、無作為に6群(Sham群、Control群、牛膝・丹参・紅花の生薬エキス群、Sarpogrelate群)に分類し、薬剤あるいは水道水を連日7日間胃内に強制投与した。薬剤投与後にペントバルビタール麻酔下に大動脈を採取し、eNOS及びiNOSのモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析による検討では、糖尿病群はSham群に比較してeNOS及びiNOSがともに増加した。一方、糖尿病誘発により増加したeNOS及びiNOSは、牛膝・丹参・紅花のすべての生薬エキス、及びSarpogrelate投与による有意な変化を認めなかった。漢方医学STZ誘発糖尿病モデルラットは予定通りに作製している。各生薬エキスは常法の通りに作製し、その投与についても計画通りに実施している。活性型血小板及び血小板パーティクルも計画通りに測定できており、生薬エキスの効果を検討し、糖尿病誘発により惹起された血小板パーティクルの増加が丹参及び紅花により有意に低下することが明らかとなった。以上の結果より、達成度は概ね順調に進展していると判断した。STZ誘発糖尿病モデルラットは予定通り作製できた。生薬エキスについても常法の通りに施行し,生薬100gに水500mlを加えて30分間煎出した後に,濾過後に凍結乾燥法により生薬エキスを得た。また,その投与についても計画通りに経口強制投与が行われた。生薬エキスの活性型血小板、および血小板パーティクルに対する効果については、FACSによる計測値の変動が大きいこともあり,有意な差が得られていない。この点については,一群のラット数を増やすことにより確認する必要がある。平成25年度と同様に、STZ誘発糖尿病モデルラットに各種生薬エキスを投与した上で、活性型血小板、及び血小板マイクロパーティクルをFACSにより測定するとともに、ELISAにより血小板マイクロパーティクルを測定し、活性型血小板、あるいは血小板マイクロパーティクル抑制効果を有する生薬を探索する。平成25年度に血小板マイクロパーティクル抑制効果抑制効果が認められた丹参及び紅花エキスについて、投与量による活性型血小板抑制効果および糖尿病性細小血管症抑制効果の相違を検討する。さらに、腎機能マーカー、腎組織学的検討により糖尿病性細小血管症を評価するとともに、大動脈のeNOS及びiNOSをウェスタンブロット法により定量する。本研究にはSTZ誘発糖尿病モデルラットが必要であり、その作製の為に6週齢Wisterラット(80匹、1匹2,000円、160,000円)を購入する。また、STZ誘発糖尿病モデルラットより血液、大動脈、腎臓を採取する際に用いる麻酔薬(pentobarbital、15,000円)、及び実験に用いる生薬(31,000円)、活性型血小板マーカーを測定するために抗CD62、抗CD61抗体、及びPDMP ELISA Kitの購入が必要である(387,000円)。さらに、動脈硬化進展の判定には組織学的検討が不可欠であり、大動脈及び腎臓のパラフィン固定、染色を外部に委託する必要があり、その経費を計上した(368,000円)。平成24年度と同様に,STZ誘発糖尿病モデルラットに各種生薬エキスを経口投与し,活性型血小板,および血小板マイクロパーティクルをFACSを用いて測定し,活性型血小板,あるいは血小板マイクロパーティクル抑制効果を有する生薬を探索する。
太陽系外での地球型惑星形成

いろいろな原始惑星系円盤において形成された原始惑星を対象に,木星型惑星の摂動のもとでガス円盤が散逸する場合に,どのような地球型惑星が形成されるかを数値計算した.また,太陽系外で多く見つかっている短周期の惑星は,惑星散乱が起きる場合に生じる古在機構と中心星との潮汐相互作用によって説明できることを示した.いろいろな原始惑星系円盤において形成された原始惑星を対象に,木星型惑星の摂動のもとでガス円盤が散逸する場合に,どのような地球型惑星が形成されるかを数値計算した.また,太陽系外で多く見つかっている短周期の惑星は,惑星散乱が起きる場合に生じる古在機構と中心星との潮汐相互作用によって説明できることを示した.散逸する原始惑星系円盤と木星型惑星の重力を含めた場合の地球型惑星の最終形成について研究を行った.これまで,ガス円盤と木星型惑星の効果を含まない研究では,形成される地球型惑星の離心率は大きく,太陽系と異なってしまうことが知られていた.そこで,ガス円盤のポテンシャルと木星型惑星の重力を含めて,原始惑星衝突合体の進化過程を調べた.数値計算の結果,潮汐抵抗と円盤散逸の効果によって,太陽系類似の地球型惑星系が形成されることが示された.太陽系外の惑星系でこの効果を調べるためには,太陽系外における木星型惑星の配置の起源を知る必要がある.そこで,惑星同士の散乱と中心星による潮汐相互作用で,起源のはっきりしていない短周期の木星型系外惑星がどの程度説明できるかを調べた.太陽系外では,1週間以下の公転周期をもつ惑星が数多く見つかっている.この起源を説明するモデルのひとつに,複数の惑星同士の散乱によって短周期の軌道に飛ばされる,ジャンピング・ジュピターモデルがある.しかし,惑星同士の散乱だけでは,短周期の惑星はほとんど形成されない.そこで,ジャンピング・ジュピターモデルに中心星の潮汐的抵抗を含めた軌道計算を行った.5-10AUに3つの木星型惑星を置いた計算から,軌道不安定によって1つの天体が内側の軌道に散乱され,そのうち2から3割の天体に古在機構1が働いて惑星離心率が一時的に大きくなる現象が起きることがわかった.惑星の離心率が大きくなると,近日点が中心星に近づき,そこで強い潮汐抵抗を受ける.このため,古在機構に入った惑星のすべてが短周期の木星型惑星になることがわかった.地球型惑星は,火星サイズ程度に成長した原始惑星が衝突することによって,最終的な大きさの惑星へと進化する.過去の研究では,この大衝突のために,形成される地球型惑星軌道が円軌道から大きくゆがみ,太陽系の形状と異なってしまうことが知られていた.昨年度までの研究で,木星型惑星,原始惑星系円盤の重力および,円盤の重力抵抗と散逸の効果を考慮することで,太陽系類似の地球型惑星系を形成できることが示された.そこで,円盤の散逸時間,重力抵抗の強さを変化させながら,原始惑星衝突合体の進化過程を調べ,太陽系以外の条件で,どのような地球型惑星が形成されるかを調べた.数値計算の結果,円盤散逸が速い場合,あるいは,重力抵抗が強く効く系では,木星の効果が十分に働かずに,円軌道からずれた惑星系が形成されることがわかった.太陽系外では,太陽系とかなり異なった木星型惑星が発見されている.太陽系外での地球型惑星形成を調べるためには,それらの木星型惑星の配置の起源を知る必要がある.そこで,短周期の木星型惑星形成の起源を調べるために,惑星散乱過程に中心星からの潮汐力を含めた数値計算を行った.その結果,惑星散乱が起きた場合の3割程度で,観測されるような短周期木星型惑星が形成されることがわかった.これは,惑星系が不安定にある間に,古在機構と呼ばれる,離心率と軌道傾斜角の交換現象が生じるためである.このために,惑星散乱を通じて短周期の軌道に移動する惑星は,軌道の傾きが幅広く分布する特徴を持っていることが判明した.地球型惑星は,原始惑星が衝突して最終的な大きさの惑星へと進化する.この過程においては,系に存在する木星型惑星の重力が重要な影響を及ぼす.太陽系外では,太陽系であれば地球型惑星が存在しているような中心星の近傍の領域に木星型惑星が発見されている.これらの木星型惑星は,質量や離心率がともに大きく,太陽系外での地球型惑星形成は,これらの木星型惑星の配置の起源と合わせて議論しなければならない。また,観測技術の向上によって,中心星の近傍であれば,地球サイズの惑星の検出が可能となってきている.これらのことから,中心星近傍への惑星の軌道進化を,惑星散乱過程と潮汐かに着目して調べた.潮汐力を入れた直接軌道計算の結果,複数の木星型惑星が形成されて軌道が不安定になった場合の3割程度で, 1つの惑星が地球型惑星領域を侵犯しながら短周期惑星となった.この確率はあまり潮汐力の強さに依存していない.これは進化パスが潮汐力の強さには寄らず,散乱によって決まる軌道要素によって決まっているためと判明した.潮汐相互作用が働くためには,近日点が中心星のごく近くに入る必要がある.直接の軌道散乱で最終的に潮汐力の働く領域に入る確率はわずか2%ほどであった.しかし,散乱によって軌道傾斜角が大きくなると,残りの惑星との長期摂動が働いて,軌道傾斜が離心率へと変換されるため,長時間の間に短周期化が起こる.このような惑星は1割程度あった.

また,軌道が不安定な時代に,一時的に離心率が大きくなって短周期化される惑星は全体の2割あった.残りの7割の系では,木星型惑星は火星軌道以遠に存在する.つまりこのような系であれば,太陽系類似の方法で地球型惑星形成の行われる可能性がある.
CYP2D6 geneの変異が抗うつ薬の薬物動態と臨床反応に与える影響

上記の17例を含めて合計54例のtrazodone 150mgを服用中でうつ病患者でtrazodoneとmCPPの血漿濃度測定とCYP2D6遺伝型決定を行った。その結果、正常遺伝子のホモ接合体が17例、酵素活性低下を来すCYP2D6Chと正常遺伝子のヘテロ接合体が23例、活性欠損を来すCYP2D6と正常遺伝子のヘテロ接合体が4例、CYP2D6CHのホモ接合体がが6例、CYP2D6ChとCYP2D6のヘテロ接合体が3例、活性欠損を来すCYP2D6BとCYP2D6Chのヘテロ接合体が1例であった。Trazodoneの血漿濃度の平均(範囲)は630(251-1251)ng/mlであり、mCPPのそれは64(32-138)ng/mlであった。対象を変異遺伝子なし(17例)、変異遺伝子1つ(27例)、変異遺伝子2つ(10例)の3群に分け、trazodoneとmCPPの血漿濃度を比較した。その結果、いずれの薬物についても3群間で有意差は見られなかった。従って、trazodoneとmCPPの代謝にはCYP2D6以外の酸素も関与しているものと考えられる。現在、これらの結果を論文にまとめ投稿中である。
長鎖非翻訳RNAによるがん細胞内エピゲノム情報の制御

がん細胞が環境に応じて変化する際に、細胞を制御する機構としてエピジェネティクスの関与は疑いがないが、どのようにエピゲノムが調節されるのかについては必ずしも理解が進んでいない。近年エピゲノム調節分子として長鎖非翻訳RNA(lncRNA)が注目されている。我々はこれまで細胞外シグナルで誘導されるlncRNA(TUG1)と、TUG1によるエピゲノム制御について明らかにしてきた。本研究では研究結果をさらに発展させ、1TUG1と相互作用するタンパク質によるエピゲノム調節、2RNAメチル化修飾(m6A)に関わるタンパク質、3TUG1のm6Aメチル化修飾およびその生物学的意義、について解析することを目的とする。lncRNAによるエピゲノムネットワーク調節およびその分子機序を明らかにすることは、がん細胞の動態制御の解明のみならず新たな治療標的の探索につながる。今年度はがん細胞のみならず正常細胞におけるTUG1の機能を明らかにするためTUG1ノックアウトマウス(TUG1 KO)を樹立した。TUG1 KOマウスの発生過程を解析した結果、TUG1はDNA複製過程においてその調節に重要な働きをしており、特に組織幹細胞の維持に必要である可能性を見出した。これまでの解析からTUG1のがん幹細胞での重要性を報告してきたが、正常細胞でも幹細胞性の維持に必要であると考えられた。一方、TUG1 KOマウスは約70%が胎生致死をきたすが、胎生致死に至らず出生したマウスは、成体では明らかな表現型を示さなかった。さらにがん細胞においてTUG1の合成・分解、TUG1の細胞内局在、TUG1結合タンパク質との相互作用、がん細胞のみならず正常細胞に与える影響について明らかにすることができた。本研究の目的は、がん細胞が環境に応じて変化する際に、どのようにエピゲノムを調節するのかについてlncRNAのひとつであるTUG1に注目し、TUG1と相互作用するタンパク質によるエピゲノム調節、TUG1におけるm6Aメチル化修飾の制御法およびその生物学的意義、について解析することである。今年度はm6Aメチル化修飾について、一分子での検出を目指しナノポア技術を用いた解析法の確立のための準備を行った。またTUG1 KOマウスの樹立に成功し、予測外の機能を発見した。そのため研究計画とは若干異なる方向に進めているが、きわめて新規性の高いlncRNAの機能を発見した点から十分な成果が得られていると考える。研究の目的に従いTUG1の新規機能について重要な所見を得つつある。樹立したTUG1 KOマウスの解析を引き続き行う。特に胎生致死のメカニズムについて明らかにする。またTUG1の細胞内での機能解析と相互作用するタンパク質によるエピゲノム調節およびそのがん細胞の影響について解析を引き続き行う。またTUG1のm6Aメチル化修飾およびその生物学的意義についてもてナノポア技術を用いた解析法を引き続き試みる。同定したTUG1のm6A修飾RNA領域を合成し(100140 nt、m6A修飾したもの)、m6Aの有無が今年度までに同定したタンパク質群との相互作用に及ぼす影響を解析する。がん幹細胞を用いてTUG1のm6A修飾RNA領域をCRISPR/Cas9システムを利用して取り除き、腫瘍形成能等の細胞に対する影響や、TUG1ーEZH2の相互作用に与える影響について解析する。さらにヒストンH3K27メチル化状態についてもゲノムワイドに解析する。また細胞内のTUG1の安定性や半減期への影響を解析する。がん細胞が環境に応じて変化する際には、細胞を制御する機構としてエピジェネティクスが関与するが、どのようにエピゲノムが調節されるのかについては必ずしも理解が進んでいない。その詳細をさらに明らかにするため、今年度は【Aim 1】のTUG1と相互作用するタンパク質によるエピゲノム調節を中心に解析を行った。特にTUG1の合成・分解、TUG1の細胞内局在、TUG1結合タンパク質との相互作用への影響、細胞に与える影響等について解析した。質量分析からTUG1はin vitroで8種類のタンパク質と結合すること見出している。本年度はこれらのタンパク質のうち新規タンパク質(RBP1、仮名称)に着目して解析を行った。RBP1とTUG1のどの領域が相互作用するか検討するために、Flagでタグ付けしたTUG1の領域ごとの欠失変異体を作成して、免疫沈降実験からTUG1と各タンパク質の結合部位を決定した。RBP1の阻害はTUG1の発現低下をきたした。興味深いことにTUG1の阻害はRBP1の細胞内局在を変動させた。またTUG1-RBP1はエピゲノムネットワーク調節機序に加えて、さらに一部の腫瘍細胞において細胞周期の重要な調節因子として働いていることを見出した。これらの結果をvivoで検証するためのコンベンショナルTUG1ノックアウトマウスの作製を行ってきたがほぼ終了し、またTUG1-Ex2のコンディショナルノックアウトマウスについては作製進行中である。今年度は研究予定計画のうち【Aim 1】TUG1と相互作用するタンパク質によるエピゲノム調節を中心に行い、TUG1と相互作用することが予測されたタンパク質のうち、特にRBP1について詳細に検討した。