hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナトリウムイオン駆動型膜内回転モーターの力発生機構の解明

細菌べん毛モーター回転のエネルギー源は、電気化学的ポテンシャル差によるイオンの流入である。海洋性ビブリオ菌Vibrioalginolyticusは、ナトリウムイオンで動く極べん毛を持つ。これまでに固定子内のイオン透過経路については、ほとんど研究が進んでいなかったが、ATR-FTIRを用いた測定によりNa^+結合部位をはじめて実験的に明らかにした。また、固定子タンパク質膜貫通部位への変異導入により、イオン透過経路を推測した。固定子構成タンパク質にGFPを融合させて、それらの局在の条件を調べたところ、Na^+依存的な局在を明らかにした。固定子のダイナミックな集合解離の重要性を示唆した。固定子タンパク質のペリプラズム側断片の結晶構造を解明しすることにより、大きな構造変化がイオンチャネルの活性化に必要であることを示唆することができた。イオン流入を動力源として回転する、超小型ナノマシンであるATPaseとバクテリアべん毛モーターにおいて、イオン流入がどのようなメカニズムによって回転運動に変換されるかを解明することを大きな目標とする。本研究計画では、これまでに多くの研究が行われてきたプロトン型のモーターに対してナトリウムイオン駆動型のモーターについて研究を進める。イオン共役と回転の仕組みを分子レベルで明らかにすることを目的に、モータータンパク質によるイオン流入を直接検出する方法を確立し、イオン流入とモータータンパク質の構造変換と回転を同時計測することを目指す。べん毛モーターの回転力のエネルギー源は電気化学的ポテンシャル差によるイオンの流入である。しかし、どのようにして電気化学的ポテンシャル差がべん毛の機械的回転力に変換されているのかは不明のままである。その原因として、べん毛超分子複合体での固定子-回転子間相互作用の詳細が十分に明らかにされていないこと、in vitroでのべん毛モーター再構成系が確立されていないため、モーター一回転のために必要なイオンの流入量を定量的に測定できていないことなどが挙げられる。in vitroべん毛モーターの再構成系の構築のためには、まずリポソームに再構成したPomAB複合体にNa^+チャネル活性が存在し、取り込んだNa^+の定量的測定系の確立が必要である。これまでに大腸菌由来の転写翻訳再構成系PURESYSTEM(ポストゲノム研究所)、大腸菌抽出液系RTS(ロシュ)、小麦胚抽出液系ENDEXTテタノロジー(セルフリーサイエンス)を使用した固定子タンパク質(PomAB)の合成を試みている。その結果、PURESYSTEMを使った系において、界面活性剤存在下でタンパク質合成を行い、PomABの合成と可溶化両分からの回収に成功した。そこでホスファチジルコリンで作成したリポソーム存在下でPomABの合成を行った。しかし、界面活性剤、リポソームどちらの存在下でもPomBは推定分子量より約2kDaくらい小さいポリペプチド鎖として合成されていた。この原因を解明するとともに、PomA/PomBが正しい配向でモータータンパク質が膜挿入されているかを確認する必要があるが、合成が確認されたことは大きな成果であり、今後のチャネル活性の測定系の構築に大きく前進した。さらに、固定子構成タンパク質PomBにGFPを融合させたGFP-PomBの局在の条件を調べたところ、培地にNa^+が存在するときは極局在がみられるが、培地を交換してNa^+をK^+に置換すると極局在がみられず蛍光は菌全体に拡散し、更に蛍光ドットの局在と拡散は可逆的であることが分かった。固定子と回転子の相互作用に対するイオンの影響を明らかにできると期待される。しかしながら、どのようにして電気化学的ポテンシャル差がべん毛の機械的回転力に変換されているのかは不明のままである。べん毛超分子複合体での固定子-回転子間相互作用の詳細を明らかにすることを目標にしている。モータータンパク質が膜タンパク質であることから、解析に十分な量を得ることが難しい。そこで、無細胞タンパク合成系を用いて、研究を進めることにした。PURESYSTEMを使った系において、界面活性剤存在下でタンパク質合成を行い、ポリソーム存在下でPomABの合成に昨年度成功した。しかし、PomBは推定分子量より約2kDaくらい小さいポリペプチド鎖として合成されていた。その原因を調べた結果、N末端側に何らかの異常があると考えられた。PomB Pro-12に変異を導入すると、正常な分子量を持っていた。また、N末端にGFPが融合したPomBは、分子量が正常であった。このことから、PomBのN末端領域の構造が変化することで切断が抑圧されたのではないかと思われた。

PomB Pro-12変異タンパク質を発現した菌体が、野生型と同程度の運動能を示した。これらの合成PomABを用いて、プロテオリポソームへの再構を行い、Na^+取り込み活性の測定する準備ができた。固定子構成タンパク質PomBにGFPを融合させたGFP-PomBの局在の条件を調べたところ、培地にNa^+が存在するときは極局在がみられるが、K^+に置換すると極局在が見られなくなった。このイオン依存的な蛍光ドットの局在と拡散は可逆的であることを昨年示した。本年度は、PomBの推定イオン結合部位を含む、種々の変異体を作成してモーターの局在化を調べ、モーター機能と局在の関連をさらに明らかにできた。また、イオノフォアを用いた実験で、局在には、おそらく膜電位は必要ではないことが示された。べん毛モーターの回転力のエネルギー源は電気化学的ポテンシャル差によるイオンの流入である。大腸菌ではMotA/MotBのH^+チャネル機能、ビブリオ菌ではPomA/PomBのNa^+チャネル機能に伴う電気化学ポテンシャル差により回転力が生み出される。しかしながら、どのようにして電気化学的ポテンシャル差がべん毛の機械的回転力に変換されているのかは不明のままである。本研究課題では、べん毛超分子複合体での固定子-回転子間相互作用の詳細を明らかにすることを目標にしている。本年度はモーター膜タンパク質のイオン透過経路について新しい知見を得ることができた。べん毛モーター固定子中を透過するイオンは、固定子複合体中の膜貫通部位に唯一存在するカルボン酸、Asp24-PomB(Asp32-MotB)がイオン結合部位と推定されている。全反射型赤外分光法(ATR-FTIR)を用い、Asp残基とイオンの相互作用を確かめることに成功した。PomA/PomBをビブリオ菌で発現させ、精製を行い、大腸菌Polar lipidに再構成した。この試料を用い塩存在下・非存在下での測定を行った。その結果、Na^+存在下で、COOH型からCOO^-型へ変化するカルボン酸を見出した。D24N変異体での信号消失から、Asp24とNa^+の結合による変化であることを確かめるとともに、2つの信号が残ることから、Asp24以外のNa^+結合部位を明らかにすることができた。さらに、Asp24に至る透過経路について検討した。Asp24(Asp32-MotB)のヘリックス2ターン分、イオン取り込み側に位置し、H^+駆動型でAla、Na^+駆動型でCysに保存されている残基に着目し、側鎖の大きさを変える種々の変異体を作成した。その結果、MotA-M206がMotB-A39と向かい合いイオン透過経路を形成していることが推定された。
腎線維化で塩分負荷が腎内アンジオテンシン活性と受容体随伴プロレニン系に及ぼす影響

腎線維化にはレニン・アンジオテンシン系(RAS)の亢進が関与するが、循環RASを抑制する塩分負荷による腎線維化の機序は不明である。本研究は、高塩分摂取の慢性抗胸腺細胞血清腎炎ラットにおいて集合管、結合尿細管での(プロ)レニン受容体の尿腔側細胞膜面への移動が、レニンmRNA発現増加を伴わないプロレニン、レニン蛋白の結合とプロレニンの非酵素的活性化を惹起し、アンジオテンシンII産生亢進、腎線維化に関与することを明かにした。血中renin angiotensin system (RAS)を抑制する塩分負荷が、腎線維化を進行させる機序を検討するため、片腎摘(uninephrectomy; U)後に抗胸腺細胞抗体(anti-thymocyte serum; ATS)の2回投与で作成した慢性進行性ATS腎炎ラットを正常塩分摂取(UAN群)と1%食塩水の飲水による高塩分摂取(UAH群)に分け、正常塩分摂取でshamオペをした(SN群)と血中・腎内RAS関連因子を検討し、以下の知見を得た。1.血中レニン、angiotensin II (AII)はSN群に比してUAN群は低く、UAH群ではより低値であった。2.SN群に比してUAN、UAH群では腎内のangiotensinogen (AGT)、AII、プロレニン、レニン、プロレニン受容体が増加し、尿中AGT排泄が増えていた。3. UAH群は、3群のうちで血中レニン、AIIは最も低値で傍糸球体装置のプロレニン、レニンの発現が抑制されているにもかかわらず、UAN群よりも腎線維化進行、尿蛋白増加、血圧上昇がみられ、尿細管におけるプロレニン、レニンの著明な発現亢進が認められた。4.プロレニン受容体の細胞内信号伝達因子PLZFは、SN群の腎にはほとんど認められないが、UAH群の間質単核浸潤細胞に認められた。以上より、高塩分負荷は血中RAS、傍糸球体装置のプロレニン、レニンの発現を抑制するが、慢性進行性ATS腎炎においては尿細管のプロレニン、レニンの発現促進を惹起して腎線維化の進行に関与する可能性が示唆された。今後は高塩分負荷が尿細管レニンの発現や分泌に及ぼす機序を検討する。1.UAH群ではUA群よりも蛋白尿が高度で腎線維化病変が進行した。2.血中レニン、アンジオテンシンII(AII)はSN群に比してUA群では低く、UAH群ではより低下した。傍糸球体装置のプロレニン、レニンの発現も同様にUA群で低下し、UAH群では著明に抑制された。3.腎組織のAII、プロレニン、レニンはSN群に比してUA群で増え、UAH群ではより増加し、特に尿細管でのプロレニン、レニンの著明な増加が認められた。4.腎組織の(プロ)レニン受容体の総蛋白量は、SN、UA、UAH群間でほとんど差が認められないが、UA群ではSN群に比して膜結合型の(プロ)レニン受容体が増加し、UAH群ではその増加がより高度であった。以上より、高塩分負荷は血中RASと傍糸球体装置のプロレニン、レニンの発現を抑制するが、慢性進行性ATS腎炎において腎組織の膜結合型の(プロ)レニン受容体が増加し、腎へのプロレニン、レニンの結合と腎組織におけるプロレニンの非酵素的活性化が増加することが、腎組織AIIを増加させて腎線維化の進行に関与する可能性が示唆された。昨年までの検討で高塩分負荷は、傍糸球体細胞のプロレニン、レニンの発現を抑制するが、慢性抗胸腺細胞血清(anti-thymocyte serum ; ATS)腎炎の腎組織において膜結合型の(プロ)レニン受容体(PRR)の増加とそれへの結合を介したプロレニンの非酵素的活性化が腎内アンジオテンシンII(AngII)を増加させ、腎線維化の進行に関与することが明かとなった。そこで、塩分負荷による膜結合型PRRの増加がAngII依存性かを調べるため、0.5%食塩水飲水の高塩分摂取慢性ATS腎炎ラットにオルメサルタン10mg/kg/日(UAH+O群)あるいはヒドララジン5mg/kg/日(UAH+H群)を投与し、非投与の高塩分摂取慢性ATS腎炎(UAH群)、シャム手術後に水道水飲水のコントロール(SN群)において腎組織RAS関連因子を検討した。その結果、UAH+O群ではUAH群よりも1)蛋白尿、腎線維化病変が軽度で、2)尿細管のプロレニン、レニン蛋白が減少し、3)腎皮質のレニンmRNA発現量やPRRの蛋白、mRNA

発現量はUAH群と同程度であるが、4)腎組織の膜結合型PRR、非酵素的活性化プロレニン、AngIIが減少し、さらに5)免疫染色にてPRRは、SN群では集合管細胞の細胞質内に塊顆粒状に認められるのに対し、UAH群ではPRRは管腔側細胞膜面に移動しており、UHA+H群ではこのPRRの管腔側細胞膜面への移動が抑制されていた。一方、UHA+O群ではUAH群に比して上記1)5)のような変化は認められなかった。以上より、高塩分摂取の慢性ATS腎炎ラット集合管でのPRRの管腔側細胞膜面への移動とそれへの結合を介したプロレニンの非酵素的活性化は、AngII依存性であることが示唆された。
コラーゲン遺伝子多型に着目した骨盤臓器脱高リスク発生群の選別化と早期リハビリ介入

骨盤臓器脱患者の発生要因として肥満や多経産、慢性的な腹圧動作などの環境因子があるが、それだけでなく未経産婦の発生や家族歴を有する患者存在から遺伝的背景の関与が示唆されているが日本人の骨盤臓器脱と遺伝的背景に関する報告は殆どない。我々は、TaqMan SNP Genotyping Assayを用いて骨盤臓器脱患者の末梢血白血球由来DNAを抽出し、コラーゲンtype3遺伝子多型を健常者と比較した。コラーゲンtype3遺伝子のゲノタイプとしてrs1800255、rs1801184の2つを検討したが、骨盤臓器脱患者群と非患者群の差を認めなかった。コラーゲンtype1やエラスチン遺伝子など他のゲノタイプについても検討する予定である。また、骨盤臓器脱患者のQOL調査を過活動膀胱症状質問票やP-QOL(骨盤臓器脱に関連するQOL質問票)を用いて行った。骨盤臓器脱手術後には頻尿・尿意切迫感などの蓄尿症状や尿勢低下・排尿困難感などの排尿症状が有意に改善を認めたが腹圧性尿失禁や夜間頻尿に関しては術前後で改善を認めなかった。また、それらの基礎的裏付けを得るため、骨盤底脆弱性に起因する腹圧性尿失禁モデルとして出産擬似ラット(腟急性拡張)にくしゃみを誘発することで腹圧を上昇させ、トラマドールを用いてその際の尿道機能評価を行った。骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆された。骨盤臓器脱の遺伝的発生要因として人を対象とした研究に関して、当初の予定の通りゲノタイプで研究を実施した。さらにゲノタイプを追加して、また被験者を追加し実験をする予定である。骨盤底・排尿機能評価の基礎的裏付けとして腹圧性尿失禁モデルラットを用いて実験を行い、骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆されさらに実証のための実験を継続している。骨盤臓器脱の遺伝的背景について、コラーゲンtype3遺伝子に関して被験者を追加し、またtype1やエラスチンに関する遺伝子についても検討が必要と思われた。今後倫理審査委員会の追加承認を得て、研究を遂行する予定である。遺伝子多型の更なる追加検討と人でのシネMRIやウロダイナミクス検査を用いた骨盤底評価として膀胱尿道機能検査を行う予定である。骨盤臓器脱患者の発生要因として肥満や多経産などの環境因子があるが、未経産婦の発生や家族歴を有する患者がいるなど遺伝的背景も示唆されている。TaqMan SNP Genotyping Assayを用いて骨盤臓器脱患者の末梢血DNAを抽出し、コラーゲンtype3遺伝子多型を健常者と比較した。今回コラーゲンtype3遺伝子のゲノタイプ2種類の検討をしたが、被験者の数が少なく骨盤臓器脱患者群と非患者群の差を見出すに至っていない。今後さらにサンプル数を増やして検討していく。骨盤臓器脱手術後には頻尿・尿意切迫感などの蓄尿症状や尿勢低下・排尿困難感などの排尿症状が有意に改善を認めたが腹圧性尿失禁に関しては改善を認めなかった。結果は2017年11月17日第31回日本泌尿器内視鏡学会、2018年4月21日第106回日本泌尿器科学会総会にて報告した。また、それらの基礎的裏付けを得るため、骨盤底脆弱性に起因する腹圧性尿失禁モデルとして出産擬似ラット(腟急性拡張)を用いて尿道機能評価を行った。1)ラットにくしゃみを誘発して尿道マイクロチップ法で尿禁制反射を測定するモデル、2)尿が漏れるリークポイント圧を測定するモデルを用いて、トラマドール(オピオイドu受容体作動薬)、またはシプロダイム(オピオイドu受容体遮断薬)の投与実験を行った。結果、トラマドールの静脈内投与は1)2)のモデルとも尿禁制反射を増強し、その効果はシプロダイムの脊髄内投与で遮断された。よって、尿禁制反射の増強効果は脊髄オピオイドu受容体の作用を介するものであることが示唆された。以上より、骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆された。骨盤臓器脱の遺伝的発生要因として人を対象とした研究と、その骨盤底・排尿機能評価の基礎的裏付けとして腹圧性尿失禁モデルラットを用いて実験を行っている。動物実験において、脊髄内オピオイドu受容体を刺激することによって尿禁制反射の増強効果が得られた。このことは、骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆された。骨盤臓器脱遺伝子多型に関しては、患者群・非患者群ともにサンプル数の収集とゲノタイプの種類を検討する必要がある。

我々は、TaqMan SNP Genotyping Assayを用いて骨盤臓器脱患者の末梢血白血球由来DNAを抽出し、コラーゲンtype3遺伝子多型を健常者と比較した。コラーゲンtype3遺伝子のゲノタイプとしてrs1800255、rs1801184の2つを検討したが、骨盤臓器脱患者群と非患者群の差を認めなかった。コラーゲンtype1やエラスチン遺伝子など他のゲノタイプについても検討する予定である。また、骨盤臓器脱患者のQOL調査を過活動膀胱症状質問票やP-QOL(骨盤臓器脱に関連するQOL質問票)を用いて行った。骨盤臓器脱手術後には頻尿・尿意切迫感などの蓄尿症状や尿勢低下・排尿困難感などの排尿症状が有意に改善を認めたが腹圧性尿失禁や夜間頻尿に関しては術前後で改善を認めなかった。また、それらの基礎的裏付けを得るため、骨盤底脆弱性に起因する腹圧性尿失禁モデルとして出産擬似ラット(腟急性拡張)にくしゃみを誘発することで腹圧を上昇させ、トラマドールを用いてその際の尿道機能評価を行った。骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆された。骨盤臓器脱の遺伝的発生要因として人を対象とした研究に関して、当初の予定の通りゲノタイプで研究を実施した。さらにゲノタイプを追加して、また被験者を追加し実験をする予定である。骨盤底・排尿機能評価の基礎的裏付けとして腹圧性尿失禁モデルラットを用いて実験を行い、骨盤臓器脱患者の尿道機能の障害機序として、骨盤底の形態学変化のみでなく神経学的変化(内因性尿道括約筋不全)の可能性が示唆されさらに実証のための実験を継続している。骨盤臓器脱における骨盤底機能、特に腹圧性尿失禁の発生機序に関して基礎的な裏付けが得られた。今後人を対象とした遺伝子多型の更なる追加検討と人でのシネMRIやウロダイナミクス検査を用いた骨盤底評価として膀胱尿道機能検査を行う予定である。骨盤臓器脱の遺伝的背景について、コラーゲンtype3遺伝子に関して被験者を追加し、またtype1やエラスチンに関する遺伝子についても検討が必要と思われた。今後倫理審査委員会の追加承認を得て、研究を遂行する予定である。遺伝子多型の更なる追加検討と人でのシネMRIやウロダイナミクス検査を用いた骨盤底評価として膀胱尿道機能検査を行う予定である。現在の研究の成果発表における国際・国内学会への参加、及び研究成果に関しての論文発表の費用に充てる計画である。その他、次年度に持ち越した研究に関する実験試薬、器具、周辺機器・実験動物の購入に充てる計画である。倫理審査委員会への追加申請後に追加実験(追加ゲノタイプ)予定で、その開始が遅れているため。また、次年度の海外学会における成果発表に備えて予算を残している。
非破壊CT-XRD連成法の開発とセメント硬化体研究への応用

X線CT法は、幾何学的空間分布を可視化する手法であり、XRDは結晶性物質を同定する分析手法である。これらCTとXRDを連成させた「非破壊CTーXRD連成法」を開発して、セメント硬化体への適用性を研究した。装置は、大型放射光施設(SPring 8)のビームライン28B2で開発した。白色X線を用いることで、低エネルギー領域の物質同定も可能であり、短時間測定により有効な手法であることを明らかにした。セメント硬化体内部のひび割れ状況、骨材分布と骨材種、セメント水和物の溶脱を微小領域で調べることができることを明らかにした。大型放射光施設SPring-8の成果公開利用優先課題として利用申請を行い、ビームラインの利用が認められた。これまで試行してきたBL28B2において「非破壊CT-XRD連成法」の開発を引き続き実施した。CT画像のコントラストの向上およびセメント硬化体における関心領域の最小化を達成するために、その改良を引き続き研究した。また、関心領域からの回折信号の取得においては、X線照射の設定時間内での十分な結晶情報を確保することが重要であり、引き続き操作方法の改良を行った。供試体は、直径5mm、長さ15mm程度の有姿セメント硬化体を準備した。標準的な試料として普通ポルトランドセメントと水を化学反応させて硬化した試料を作製した。水セメント比は0.3および0.5として、硬化セメントペーストに割裂でひび割れを導入した。実現象で想定される劣化を実験室内で模擬するために、先ずひび割れ内部へCO2ガスを注入して強制炭酸化を試みた。その後、通水を行い水和物の変質をひび割れ近傍と硬化体内部について「非破壊CT-XRD連成法」を用いて測定した。また、セメントペーストと岩盤への相互作用を調べるために、現場から採取したコアを準備して測定した。取得したX線回折について、角度変換の妥当性を検討するとともに、ICSDのデータベースの適用について調べた。また、ひび割れの立体画像を作製することで、物理的な観点からも変質状況を調べる手法を研究した。マイクロメートルオーダーでの水和物の変質状況を明らかするとともに、測定条件における供試体サイズおよび測定結果をエネルギー分散型の回折で整理することの有意性について課題を抽出した。成果発表のための論文執筆を行った。非破壊CT-XRD連成法の開発では、測定精度をより向上するための測定条件を見直し、最適な条件で測定を実施することが必要である。そこで、今回は特に供試体の直径を約3mmと小さくすることの影響を調べることとした。CT撮影におけるエネルギー、ステップ角度、露光時間、画素寸法、全体視野はこれまでと同一とした。また、回折におけるビームの大きさ、回折角度、照射時間、上流、下流に設置したスリットから供試体までの距離、供試体の回転も同様である。一方、今回の測定からX線の透過率を計測して、今後のデータ解析の参考とした。その結果、供試体を小さくすることで、X線の吸収が抑制できて強度が比較的改善することができた。研究期間を通じて、非破壊CT-XRD連成法がセメント系材料やベントナイト材料の材料開発、変質挙動機構の解明に役立つことを示すことができた。特に、ひび割れ近傍やコンクリートとベントナイトや岩との境界領域は、従来法では非破壊試験が困難であった。本研究課題で研究開発した非破壊CTーXRD連成法を用いることで、微小領域での物理損傷の程度や鉱物同定が可能であることを明らかにした。今後はエネルギー吸収による低エネルギー域での鉱物同定精度の向上が課題であることを示すとともに、産業利用における市販品の開発、普及に繋がる研究であると言える。また、鉄筋コンクリートなど密度差が極端に大きい材料の境界域の相互作用の研究にも一部着手できた。これにより本手法の適用性を拡大できるものと考えられる。大型放射光施設の利用申請が順調に認められ、ビームラインの利用が可能になり、セメント硬化体のひび割れ、水和物変質について研究することができた。非破壊CT-XRD連成法は、条件設定や取得データの処理法について課題を抽出することもできた。コンクリート工学H27年度前期の利用申請を行い、利用が既に認められた。平成26年度に得られた結果を基にして、「非破壊CT-XRD連成法」の改良を繰り返し、高度化を目指した研究を継続する。ひび割れ硬化体中での通水による溶出現象を引き続き調べ、セメント硬化体と岩盤との相互作用についても境界部の変質現象の解明を目指す。測定から得られるデータは、CT画像および関心領域のX線回折情報である。これらの数値演算処理技術を深度化する研究を行う。すなわち、内部空間情報として、水和物、未水和物、微細空隙、マイクロクラック、骨材の空間分布を抽出するための再構成演算処理技術を高度化する。

取得した回折スペクトルの情報から結晶同定までの解析手法を詳細に研究する。すなわち、水酸化カルシウム(Portlandite)の同定精度を向上すると同時に、エトリンガイト、炭酸カルシウム(カルサイト他)などの主要結晶性物質の同定精度を向上させることを目的に、データの解析技術をさらに研究する。その一環として、高低混在するエネルギー領域のデータ収集と2θと関連を付ける研究を踏まえて、結晶同定の解析技術を開発しながら評価手法の充実をはかる。セメント系硬化体の新しい評価手法として発展させる。本手法の新規性と独創性に鑑みて、研究成果を順次とりまとめ、国内外で成果発表を行う。
重力波検出用超高安定モード同期レーザーの開発とパルス・スクイーズト光の発生

重力波振幅をh=10^<-21>とするとき、ショットノイズによる検出限界を拡大するために、1kwcwのパワーレベルが高い強度ならびに周波数安定度とともに要求されている。このような大出力を要求される安定度で連続的に発生し得るレーザーは現存しない。このような荷酷な要求を緩和する方策の一つとして、本研究ではスクイージングをとりあげ、そのパルス化によって、重力波検出の感度向上をはかろうとするものである。そこで、以下の事項を検討することとした(1)パルス・スクイージングによる検出感度の改善(2)パルス化の具体的方法(1)については、干渉計のフレーポートに注入する真空スクイーズド光のポンビングを、干渉計入力メインビームからどの程度の比率で分割するかを検討し、その最適比率について検討した。(2)については、パルス化に適常用しられるモード同期法ならびに、新たに、コヒーレンド重畳蓄積法を提案し、その実現可能性と有効性について検討した。実現可能性については、最近の高反射率ミラーの入手可能化によってはじめて検討段階となる新しい方法であり、99.9%の高反射率ミラーによってパルスピークパワーを数千倍向上できると結論される。以上の計画に対して、今年度においては、高安定レーザーを試作することからはじめた。反対安定性を実測するため、同一レーザーを2台製作中である。当初予定のNd:YAGでは十分な結果が得られなかったため、現在より高い安定性の期待できるNd:ファイバーレーザーについて実験を進めている。さらに、コヒーレント重畳蓄積に関しては、反射率99.9%のミラーを用いた基礎的実験を開始した。現在のところ、すべて本格的実験の準備段階にある。具体的な成果については、来年度に報告できる予定である。
癌細胞特異的な分子生物学的差異を標的とした抗癌剤の合成研究

癌細胞と正常細胞の分子生物学的差異を標的とした2種類の選択的抗腫瘍物質(Tyroscherin及びLaurenditerpenol)に関して合成研究を行った。1.増殖因子IGF-1受容体を介したシグナル伝達系の阻害剤であるTyroscherinの合成研究:類縁体合成による構造活性相関研究にも応用可能な合成経路の確立を目的に全合成研究を行った。高いE-選択性のJuliaカップリングを鍵反応として、提出構造の合成に成功した。しかし合成品と天然物とのスペクトルデータが一致しなかったため、立体異性体の合成による真の構造の決定を目指した。提出構造合成と類似の手法で異性体の合成を行った結果、2種の立体異性体の混合物としての合成に成功した。このうち一方が天然物と良い一致を示したことから、真の構造を推定することができた。現在単一異性体としての合成を継続中であり、立体の確定と構造活性相関を検討予定である。2.転写因子HIF-1の阻害剤であるLaurenditerpenolの合成研究:天然物の立体配置のうち現在確定しているのは、左側部分の水酸基の絶対立体配置と右側部分に相当するビシクロ環の相対立体配置のみであるため、まずは立体化学の決定を目的として合成研究を行った。昨年度は左側部分の合成を検討したが、今年度は主に右側部分の合成を行った。当初当初のDiels-Alder反応による合成を計画したが困難であったため、不斉補助基を利用し、ヨードエーテル化を鍵反応とした経路を検討し、骨格の構築に成功した。今後は左右のカップリングと立体選択性の向上を検討予定である。癌細胞と正常細胞の分子生物学的差異を標的とした2種類の選択的抗腫瘍物質に関して合成研究を行った。将来的に左右の構造を変換した類縁体を容易に合成できるよう、Juliaカップリングを用いた収束的な合成経路の確率に成功した。不斉点に関して、左側部分は光学活性原料であるチロシンより誘導されるケトンのsyn選択的な還元を経て、右側部分はプロピオニルオキサゾリジノンの不斉アルキル化を経て構築した。左右両部分のJuliaカップリングはKHMDSを塩基として用いた場合に高いE-選択性を示し、目的のTyroscherinの全合成を達成した。本化合物は最終精製の手法によりNMRの化学シフトが変化するため、まだ天然物との完全な一致を示していないが、誘導化などによる確実な同定を目指しているところである。左側部分は効率的に立体配置を決定出来、将来的に立体配置による構造活性相関も検討可能となるよう、Robinson成環反応を鍵反応として非立体選択的な合成を達成したが、立体配置の決定には至っていない。右側部分の架橋環は当初のDiels-Alder反応による構築を断念し、シクロヘキサンジオンよりヨードエーテル化を鍵反応としてラセミ体での合成を達成した。現在は不斉補助基を用いた右側部分の光学活性体合成と、左右両部分のカップリングに関して検討中である。
琵琶湖における細菌群集と溶存有機物の相互作用による両者の質的変遷

本研究では、以下を解明した。琵琶湖では、夏季に表水層で植物プランクトンがタンパク質様の溶存有機物(DOM)を生産し、タンパク質様DOMは細菌により難分解な腐植様DOMへと変換される。腐植様DOMは、冬季に深水層へと輸送される。夏季の成層期の琵琶湖深水層では、クロロフレクサス門に属するCL500-11細菌一種が優占し、さらに細菌食者である原生動物のキネトプラスチド鞭毛虫も優占する。すなわち、成層期の琵琶湖の深水層では、腐植様DOMがCL500-11細菌に消費され、CL500-11細菌はキネトプラスチド鞭毛虫始めとする原生生物に摂食される、深水層特有の生態系が駆動しているのかもしれない。本研究では、溶存有機物の変性過程と細菌群集組成の変化とを対応させて研究し、細菌群集と溶存有機物の相互作用による両者の質的変遷の多様性を解明することを目的としている。琵琶湖北湖定点の細菌群集構造解析には、キノンプロファイル法を用いた。細菌バイオマスの指標である全呼吸鎖キノン量は、成層期の5mでは7月調査時をピークに経時的に減少した。70mのキノン量は5mに比べて低い値で推移する傾向にあり、明確な季節変動は見られなかった。成層期の5mではActinobacteria(メナキノン(MK)-9, 10, 11および水素飽和型MK)が、70mではBetaproteobacteria(ユビキノン(UQ)-8)が優占した。また、琵琶湖の深水層において、CL500-11クラスター(クロロフレクサス門)の細菌が優占分類群であることを解明した。成層期には、深水層においてCL500-11クラスターが優占し、季節周期的な変動を示した。CL500-11クラスターは、成層期を通じて深水層で増加し続け、最大で全細菌現存量の10%に達した。琵琶湖における蛍光溶存有機物の生物地球化学的解析では、蛍光溶存有機物(FDOM)をタンパク質様のFDOM (FDOMT)と腐植物様のFDOM (FDOMM)に分類した。FDOMTの季節動態は、準易分解性有機物と有意な相関があった。FDOMMの季節動態は、微生物(主に細菌)による酸素消費、窒素・リンの栄養塩類濃度の季節パターンと有意な相関があり、FDOMMは深水層における有機物分解過程で生ずるものと推測された。湖水中の細菌類による溶存有機物の変質を検討するために、湖水中に有機物を添加して細菌を培養・増殖させ、増殖後の溶存有機物の化学組成を調べて細菌類の関与を調べた。細菌の増殖により生成する有機物は、分子量5,000以下の低分子量の有機物が全体の8割を占めた。窒素添加系では、コントロールに比べ、培養後にアミノ酸が多いことが示唆された。細菌群集組成解析では、コントロールと窒素添加系では細菌群集に大きな違いが見られなかった。本研究では、以下が解明された。琵琶湖では、夏季に表水層で溶存有機物(DOM)濃度が上昇する。これは、表水層で植物プランクトンが溶存有機物(タンパク質様DOM)を生産するが、表水層の窒素・リンが枯渇しているために細菌による分解が促進されず、DOMが蓄積するからである。細菌による分解は窒素・リンが比較的多く供給される水温躍層に限定され、タンパク質様DOMは難分解な腐植様DOMへと変換される。琵琶湖におけるCODの上昇は、この腐植様DOMの蓄積かもしれない。ここで生成した腐植様DOMは、冬季にかけて湖水が鉛直循環するために深水層へと輸送される。一方、夏季の水温成層している琵琶湖北湖全域の深水層では、クロロフレクサス門に属するCL500-11細菌一種のみが優占することが明らかとなった。深水層は、元々溶存有機物濃度が高くないため、この細菌は難分解な腐植様DOMを利用せざるを得ないであろう。さらに、主に細菌食者であるキネトプラスチド鞭毛虫に特異的な遺伝子プローブを用いたFluorescently in situ Hybridization (FISH)を行ったところ、夏季の琵琶湖深水層では、キネトプラスチド鞭毛虫が全鞭毛虫の45%も占めていることが明らかとなった。

すなわち、琵琶湖の深水層では、表水層で植物プランクトンにより生産されたタンパク質様DOMが細菌により腐植様DOMへと変換され、腐植様DOMは湖水循環によって深水層へと輸送され、次の年の夏季・成層期にCL500-11細菌に利用され、増殖したCL500-11細菌はキネトプラスチド鞭毛虫に摂食されるという、表水層での一次生産に端を発する深水層特有の微生物ループが駆動しているのかもしれない。本研究では、溶存有機物の変性過程と細菌群集組成の変化とを対応させて研究し、細菌群集と溶存有機物の相互作用による両者の質的変遷の多様性を解明する。研究は、琵琶湖北湖において、月に1回の頻度で調査・サンプル採取を行った。鉛直プロファイラーを用いた物理化学環境項目の鉛直プロファイルの測定を行い、また表層、水温躍層上部、水温躍層下部、深層から試水を採取し、栄養塩類濃度、植物プランクトン現存量、細菌現存量、細菌群集解析、原生生物群集解析、溶存有機物濃度・化学組成、光合成・呼吸速度の測定を行った。琵琶湖北湖では、夏季の成層期の表層において窒素とリンが枯渇したのに対し、溶存有機物、特にタンパク質様溶存有機物(PDOM)の蓄積が見られた。これに対して、腐植物質様溶存有機物(HDOM)の蓄積は、PDOMの分布の直下に見られた。PDOMの濃度は主に細菌による酸素消費量と正の相関があったことから、PDOMは細菌による分解を受けていると示唆された。また、HDOMは、表層で植物プランクトンにより生産されたPDOMが湖水混合等で深層に輸送される際に細菌の文かいを受けたことにより生成されると示唆された。細菌の群集解析は、細菌の遺伝系統をある程度反映し、かつ生理特性をも反映する呼吸鎖キノンを用いた分類方法を開発し、これを琵琶湖北湖に適用した。その結果、琵琶湖の表層、深層の両方において、どの季節においてもユビキノン8保有タイプとユビキノン10保有タイプの細菌が優占した。これらの細菌は、PDOMの分解によるHDOMの生成に関与していると示唆された。当初計画にあった植物プランクトン現存量・組成、細菌群集解析、原生生物群集解析、溶存有機物濃度・化学組成、光合成・呼吸速度測定のいずれについても、測定や分析を終えているだけでなく、これらについての学会発表や論文執筆・投稿まで済ませている。また、平成24年度に予定していた原生生物の単離が終わっており、平成24年度には単離した生物の遺伝子のシークエンスをすでに進めている。藻類の単離や室内実験での分析の再検討もあるが、研究全体としては順調に動いている。25年度が最終年度であるため、記入しない。琵琶湖北湖の溶存有機物の濃度、鉛直分布、化学組成の季節変化と、分解に伴う化学組成の変化および有機物の鉛直輸送まで評価できたのは、大きな進展である。細菌の群集組成を、Fluorescent in situ Hybridization法で行う予定であったが、この方法は遺伝子配列のみに着目した分類であり、有機物分解特性等の生理特性は全く反映されない。このため、呼吸鎖キノンに基づいた分類方法を開発し、琵琶湖北湖に適用した。この方法により、有機物変遷に関係した細菌の群集解析を進めることができた。鞭毛虫の群集解析は、夏季のサンプルのみ解析が終わっており、平成25年4月中にはその他の季節の解析も終了する。藻類の単離を行っていないが、この作業は元々溶存有機物の採取とその分解実験を行うためのものであり、琵琶湖観測に基づいた上記の結果が得られているので、藻類単離は特に必要が無くなった。以上の研究の進捗状況から、本研究はおおむね順調に進んでいる。本研究では、琵琶湖の植物プランクトンを室内で培養することにより、藻類が生産する溶存有機物を収集することができるため、本研究にとって藻類の単離がそれほど重要でないことが分かってきた。平成24年度は、琵琶湖の植物プランクトンを用いて、生産された溶存有機物の動態研究に専念する。琵琶湖の原生
舌癒着症と乳幼児突然死症候群(SIDS)との関係についての基礎的研究

舌癒着症矯正術を希望する乳児433名に対し睡眠状態、哺乳状態、泣き方、抱き癖、向き癖、無呼吸の有無などを術前後に質問調査した。結果、72.998.3%の症状改善がみられ、95.1%の母親は本矯正術を受けたことに満足していた。簡易型終夜睡眠モニターを術前後に貸し出し、睡眠時の動脈血酸素飽和度(SpO_2)、脈拍、口鼻呼吸を測定した。結果、術後SpO_2平均値、SpO_2最低値、SpO_295%以上の割合は有意に上昇し脈拍数は減少する傾向がみられた。慢性的な低酸素症の改善に有効と思われた。舌癒着症児20名に全身麻酔下にて矯正術中、レーザー組織血液酸素モニターを用い頭部と下腿の組織血液酸素飽和度(StO_2)を経時的に測定した。平均StO_2値は、術後いずれも高度な有意差で増加した。舌小帯およびオトガイ舌筋切離と同時に呼吸が改善されることが示唆された。SIDSと診断された26例に対し全身所見、口腔内所見、解剖所見を調べ、また保護者へ生前のSIDS児の状態について質問調査を行なった。SIDS児の発症月齢は平均4.4±2.3ヶ月であった。舌癒着度は確認できた23例中21例が重度、1例が中度、1例が軽度であった。生前の状態を保護者から聴取できた16例について舌癒着症状を分析した結果、寝つきが悪いが12例(75.0%)に(一般では21.4%)、抱き癖および向き癖がともに10例(62.5%)に(一般ではそれぞれ48.2%、36.1%)見られた。発見時体位はうつ伏せが16例、仰向けが10例であった。発見時体位がうつ伏せの16例中11例(不明3例を除く)は、生前の最終確認時体位が仰向けで、つまり寝返りを打った後に死亡していた。その11例中6例は、初めて寝返りをした日から2週間以内に死亡していた。また寝返り後死亡した11例中5例は、一般的な寝返り開始時期である生後5ヶ月より前に死亡していた。今回の調査から、重度の舌癒着症児で、寝つきが悪く、向き癖の症状があり、寝返りを早期に開始する児で寝返りを開始した直後はSIDSの危険性が高いことが示唆された。舌癒着症矯正術を希望する乳児433名に対し舌癒着度、顔色、手足の冷え、腹部膨満、などを観察し、睡眠状態、哺乳状態、泣き方、抱き癖、向き癖、無呼吸の有無などを術前後に母親にアンケート調査した。結果、72.998.3%の症状改善がみられた。

眠りが浅い、いびきをかくなど睡眠状態は96.1%の患児に改善がみられ、84.7%の母親は母乳の飲み方がよくなったことを実感し、95.1%の母親は本矯正術を受けたことに満足していることがわかった。また母乳育児向上のためにも本矯正術は有効であると思われた。簡易型終夜睡眠モニターを術前後に貸し出し、睡眠時の動脈血酸素飽和度(SpO_2)、脈拍、口鼻呼吸、気管音を測定した。結果、術後SpO_2平均値、SpO_2最低値、SpO_295%以上の割合は有意に上昇し脈拍数は減少する傾向がみられた。慢性的な低酸素症の改善に有効と思われた。乳児に鼻カニューラの装着は困難であったため無呼吸、イビキの測定はできなかった。近隣の解剖を行なっている大学法医学教室に出向き、乳児突然死の解剖に立会い、舌癒着症の観点から観察したところ、SIDSと診断された全例に高度の舌癒着がみられた。遺族に対して生前の症状や生活状態について聞き取り調査したところ、反り返ってよく泣く、睡眠が浅くいびきをかくなどの症状が多いことがわかった。以上の結果より、SIDSと診断された中に高度舌癒着症児が存在すること、舌癒着症矯正術により低酸素の症状が改善されSpO_2も上昇することなどから、SIDSの予防的処置としての可能性が考えられた。今後、さらに症例数を増やし、矯正術の効果について多角的に検討していく予定である。SIDSと診断された26例に対し全身所見、口腔内所見、解剖所見を調べ、また保護者へ生前のSIDS児の状態について質問調査を行なった。SIDS児の発症月齢は平均4.4±2.3ヶ月、男児13名女児13名同数であった。舌癒着度は確認できた23例中21例が重度、1例が中度、1例が軽度であった。生前の状態を保護者から聴取できた16例について舌癒着症状を分析した結果、寝つきが悪いが12例(75.0%)に(一般では21.4%)、抱き癖および向き癖がともに10例(62.5%)に(一般ではそれぞれ48.2%、36.1%)見られた。発見時体位はうつ伏せが16例(61.5%)、仰向けが10例(38.5%)であった。発見時体位がうつ伏せの16例中11例(不明3例を除く)(84.6%)は、生前の最終確認時体位が仰向けで、つまり寝返りを打った後に死亡していた。その11例中6例(54.5%)は、初めて寝返りをした日から2週間以内に死亡していた。また寝返り後死亡した11例中5例(45.5%)は、一般的な寝返り開始時期である生後5ヶ月より前に死亡していた。今回の調査から、重度の舌癒着症児で、寝つきが悪く、向き癖の症状があり、寝返りを早期に開始する児で寝返りを開始した直後はSIDSの危険性が高いことが示唆された。舌癒着症児20名に全身麻酔下にて矯正術中、レーザー組織血液酸素モニターを用い頭部と下腿の組織血液酸素飽和度(StO_2)を経時的に測定し解析した(t検定対応あり)。下腿部の平均StO_2値(%)は各々、術前66.3±8.0、術中68.0±7.9、術後69.2±7.6で、術前-術中、術中-術後、術前-術後いずれも高度な有意差でStO_2は増加した。頭部の測定でも同様の結果となり、舌小帯およびオトガイ舌筋前腹切離と同時に呼吸が改善されることが示唆された。
線虫(Caenorhabditis elegans)の寿命変異体の解析

酸素は生命活動に必須であるが、、様々なストレスを引き起こす危険因子でもある。酸素は生体内で反応性の高い活性酸素(O_2-、H_2O_2、・OH等)を生成し、それらが生体分子を攻撃する。現在、活性酸素は老化の促進を引き起こす主要因子の一つと考えられている、本研究は、活性酸素と老化の関係を遺伝学的に明らかにするため、遺伝的解析の可能な線虫(Caenorhabditis elegans)を用いて、酸化ストレス・老化に関わる遺伝子を同定することを目標とする。戦略として、既に得られている長寿命/活性酸素耐性変異体(mev-4)、短寿命/活性酸素高感受性変異体(oxy-4)の原因遺伝子を期間内にクローン化する。変異体の原因遺伝子のマッピング、及び、同定mev-4の原因遺伝子は染色体Vにマッピングされた。様々な三因子交雑を繰り返し、詳細なマッピングを行った結果、mev-4はsma-1とlon-3の間にマッピングされた。その中に含まれる遺伝子を調べ、そのうちの一つに、変異が起きていることを見いだした。oxy-4の原因遺伝子についても、同様の手法を用いて、染色体IIIのdpy-17とlon-1の間にマップした。oxy-4の場合も、その領域に含まれる遺伝子に変異を起こしている遺伝子を見いだした。現在これらの遺伝子がmev-4、及び、oxy-4にこれら遺伝子を導入し、その表現型を相補するかどうか調べている。酸素は生命活動に必須であるが、様々なストレスを引き起こす危険因子でもある。酸素は生体内で反応性の高い活性酸素(O_<2->、H_2O_2、・OH等)を生成し、それらが生体分子を攻撃する。現在活性酸素は老化の促進を引き起こす主要因子の一つと考えられている。本研究は、活性酸素と老化の関係を遺伝学的に明らかにするため、遺伝的解析の可能な線虫(Caenorhabditis elegans)を用いて、酸化ストレス・老化に関わる遺伝子を同定することを目標とする。1.変異体の原因遺伝子のマツピングこれまでの解析により、mev-4の原因遺伝子は染色体Vのunc-23とrol-4を含む領域に、oxy-4の原因遺伝子は染色体IIIのdpy-17のごく近傍に存在することが判明していた。さらに詳細な原因遺伝子のマッピングを行った結果、mev-4の原因遺伝子の存在箇所をsma-1とlon-3の間にマッピングした。同様に、oxy-4はdpy-17とlon-1の間にマップされた。2.変異体の原因遺伝子の同定現在、この領域に含まれる遺伝子をリストアップし、塩基配列の決定を行い、変異した遺伝子を探している。現在のところ、mev-4、oxy-4ともに、ある遺伝子に変異を見いだしているので、それらの遺伝子が表現型を相補するかどうか調べている。
ヒト細胞白血病ウィルスによる自己免疫症機構の解析

CD4とc-fmsのプロモーターを用いて、T細胞特異的あるいはマクロファージ特異的にtaxを発現するトランスジェニックマウス(Tg)を作製したところ、どちらのマウスも関節炎を発症し、自己抗体も産生されていたので自己免疫になっていた。しかしCD4-tax-Tgでは発症前から自己抗体の産生が認められ、自己抗体の産生にTaxがT細胞で発現することが重要であることが示唆された。またCD4-tax-Tgでは、T細胞がマイトジェンに対して不応答になっており、抹消にメモリー型のT細胞が増加しており、慢性関節炎だけではなく大腸炎や自己溶血性貧血などの自己免疫疾患も発症していることがわかった。またHTLV-I-TgマウスのT細胞レパートリーの解析からII型コラーゲン反応性のT細胞が関節で増加していることがわかり、免疫寛容が破綻している可能性が示唆された。一方、HTLV-I-Tgでの関節炎発症に関与するサイトカインを同定するために、IL-1α,IL-1β,IFN-γ,TNF-α,IL-4,IL-6のそれぞれの遺伝子ノックアウトマウス(KO)とHTLV-I-Tgとを交配して関節炎の発症率を比較したところ、IL-1 α/βダブルKOとIL-6KOマウスでは発症が抑制されることがわかり、この二つのサイトカインが関節炎の発症に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。またコラーゲン誘導関節炎においてもKOマウスを用いた同様の解析を行い、やはりIL-1とIL-6が発症に重要であることがわかった。最近、IL-1レセプターアンタゴニストKOマウスが関節炎を自然発症することが明らかとなり、関節炎発症におけるIL-1の重要性が明らかとなってきており、今後発症機構を明らかにしていく予定である。
マウス二次口蓋発生における正中上皮索消失について

マウス二次口蓋におけるMEE細胞の細胞動態をメインテーマとしている。胎齢14日19時間のICRマウス胎仔を用い臼歯相当部において口蓋板接触期から癒合後期にあたる(すなわち正中部に索状にMEE細胞が観察される時期)の前後の標本を観察対象としている。軟口蓋先端部から前方に向かい、5μmの連続切片を作製し10μm毎にHE染色を行った後、三次元構築ソフトTRI/3D-SURを用い上皮と間葉の輪郭をコンピュータ上にトレース。同時に×400倍像にて光顕的に観察されたアポトーシス小体を抽出し3D構築を行い、細胞移動の観察を行っている。2003年2005年マウス顎関節発生に関する実験的研究(学内共同研究)ICRマウスの顎関節発生を経時的に観察した。その過程において上関節腔分離の時期にみられる細胞消失(排除)に着目しアポトーシスの観点からを観察を行う。口蓋にみられたものと異なり、時期や部位も散見されていた。また関節形成にHGF/c-metの関わりが示唆された。(論文投稿中)1999年2003年1)器官培養法によるマウス口蓋発生に関する実験的研究(学内共同研究)塩田らの報告した無血清液体培地を用いた口蓋器官単体の培養下にマウス二次口蓋組織の形態的観察を行った。in vivoと同様にMEE細胞の移動とFas/FasL経路のアポトーシスが再現されていた。(2005年4月論文掲載)2)in vivoと器官培養の手法を応用し、Caspase8阻害剤添加による口蓋発生への影響ならびにFasレセプターの先天的機能欠損である1pr/1prマウスによる二次口蓋発生の観察を行った。しかしいずれも二次口蓋形成は遂行され口蓋の発生に関わるMEE細胞の消失にアポトーシスの系以外にも複数路があることが考えられた。2000年マウス二次口蓋発生におけるアポトーシスに関する実験的研究ICRマウス二次口蓋発生における正中上皮索消失に、形態学的にアポトーシスの現象が観察されアポトーシス関連タンパクのFas、Fasligandの関与が示唆された。(2000年論文掲載)マウス二次口蓋におけるMEE細胞の細胞動態をメインテーマとしている。(2000年論文掲載)
分子発生生物学的アプローチによる網膜変性疾患の病態解明

ラット網膜発生にともなうTGF-βスーパーファミリー受容体の発現について検討した。TGF-β受容体は出生前後から網膜細胞に蛋白質レベルで発現され、出生前よりTGF-βの作用が発揮されている。アクチビンの作用のうちアクチビンI/アクチビンII型受容体を通しての作用は生後9日頃から発揮され、アクチビンIB/アクチビンII型受容体を通しての作用は出生前後から発揮される。BMPについてはBMP R-IA/BMP R-IIを介するシグナルは出生前後から、BMP R-IB/BMP R-IIを介するシグナルは生後9日頃から発揮される。それぞれの機能の差が示唆された。培養網膜未分化組胞の分化の分子制御を、網膜芽細胞腫細胞株をもちいて検討した。TGF-βによる細胞増殖作用を喪失しており、TGF-βII型受容体のmRNAレベルでの発現抑制によるのものであることが判明したTGF-βII型受容体遺伝子の変異はみられず、発現を制御している領域の変異が示唆された。これら細胞株にはTGF-βの細胞内シグナル伝達分子(Smad2,Smad3.Smad4)のmRNAは正常に発現しており、TGF-β受容体遺伝子導入を行うとTGF-βのシグナル伝達の回復がみられた。網膜細胞は未分化な状態からTGF-βスーパーファミリーに対する感受性は発現されており、分化にTGF-βスーパーファミリーが重要な働きをしていることが明らかになった。網膜色素変性モデルラットでの検討を網膜色素変性モデルラットであるRCSラットにおける網膜変性前のアポトーシスシグナル伝達分子を検討した。神経細胞のアポトーシスを制御しているApotosis Signak-regulating Kinase-1(ASK-1)とその下流に位置するJNK,p38について検討したところ、RCSラットでは網膜変性発症直前の段階でASK-1の機能不全が起こっていることが示唆された。RCSラットの網膜変性はASK-1に関与するアポトーシスの制御メカニズム障害の可能性が考えられた。ラット網膜の形態学的な発生過程を観察した。生直後には、網膜細胞層は2層(神経節細胞と内外顆粒層の未分離層である。内外顆粒層の未分離層が生後6日までの間に分離して、視細胞層も形成されてきた。網膜の分化に関連する因子を検出する目的で、TGF-βスーパーファミリーの受容体の発現のタイミングについて組織化学的に観察した。TGF-βI型受容体、II型受容体、骨形成因子(BMP)IA型受容体、II型受容体、アクチビンIB、II型受容体は生直後生後3日の間に発現が確認された。しかし、BMP IB型受容体、アクチビンI型受容体の発現はおくれて、生後36日にみられた。このことからTGF-βスーパーファミリーの因子の作用のうち、TGF-βの作用は生直後より網膜に及んでいるが、BMP、アクチビンの作用の一部は網膜の成熟とともに網膜に及ぶようになる可能性が示唆された。網膜の細胞の成熟にTGF-βスーパーファミリーがどのように作用するかを検討するためTGF-βの網膜芽細胞腫細胞(Y79)対する作用様式を分子生物学的に検討した。網膜芽細胞腫は未分化な網膜細胞で、sodium butylate,cAMPなどで刺激すると、分化が開始される。TGF-βI型受容体、II型受容体の双方の発現していないためTGF-βにY79は反応しない。I型受容体mRNAレベルでは発現していたが、II型受容体は発現が見られなかった。cAMP刺激でTGF-βII型受容体mRNA発現が見られるようになった。

TGF-βII型受容体の遺伝子の蛋白質に翻訳される領域には変異が見られなかった。このことから網膜芽細胞のTGF-βに対する不応性は受容体レベルでの異常が関与しうることがわかった。さらに、TGF-βI型受容体、II型受容体遺伝子をY79細胞に導入すると、TGF-βに対する反応性が回復した。網膜未分化細胞の機能におけるTGF-βの重要性を示唆するとともに、その網膜分化の分子メカニズムを検討するモデルとして網膜芽細胞腫細胞Y79が有用であることが分かった。ラット網膜発生にともなうTGF-βスーパーファミリー受容体の発現について検討した。TGF-β受容体は出生前後から網膜細胞に蛋白質レベルで発現され、出生前よりTGF-βの作用が発揮されている。アクチビンの作用のうちアクチビンI/アクチビンII型受容体を通しての作用は生後9日頃から発揮され、アクチビンIB/アクチビンII型受容体を通しての作用は出生前後から発揮される。BMPについてはBMP R-IA/BMP R-IIを介するシグナルは出生前後から、BMP R-IB/BMP R-IIを介するシグナルは生後9日頃から発揮される。それぞれの機能の差が示唆された。培養網膜未分化細胞の分化の分子制御を、網膜芽細胞腫細胞株をもちいて検討した。TGF-βによる細胞増殖作用を喪失しており、TGF-βII型受容体のmRNAレベルでの発現抑制によるのものであることが判明したTGF-βII型受容体遺伝子の変異はみられず、発現を制御している領域の変異が示唆された。これら細胞株にはTGF-βの細胞内シグナル伝達分子(Smad2,Smad3,Smad4)のmRNAは正常に発現しており、TGF-β受容体遺伝子導入を行うとTGF-βのシグナル伝達の回復がみられた。網膜細胞は未分化な状態からTGF-βスーパーファミリーに対する感受性は発現されており、分化にTGF-βスーパーファミリーが重要な働きをしていることが明らかになった。網膜色素変性モデルラットでの検討を網膜色素変性モデルラットであるRCSラットにおける網膜変性前のアポトーシスシグナル伝達分子を検討した。神経細胞のアポトーシスを制御しているAPotosis Signak-regulating Kinase-1(ASK-1)とその下流に位置するJNK,p38について検討したところ、RCSラットでは網膜変性発症直前の段階でASK-1の機能不全が起こっていることが示唆された。RCSラットの網膜変性ASK-1の関与するアポトーシスの制御メカニズム障害の可能性が考えられた。