hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
川崎病の発症に係る細菌同定およびheat-shock蛋白の産生動態に関する検討

川崎病の原因を確定するため、過去に申請者が患者の上部消化管から検出した「病原体の遺伝子」および川崎病の主要な合併症である冠動脈瘤形成の発端となる「病原体特異的なheat-shock protein(HSP)」を川崎病患者の臨床検体から検出しうるツールの開発を試み、臨床検体への応用を試みた。川崎病の発症に関わる可能性の高いNeisseria属、Acinetobacter属Enterobacteriaceae属、Enterococcus属、Staphylococcus属、Streptococcus属の特異的プライマーを用いて、これまで川崎病患者急性期血液検体38検体、咽頭拭い液検体24検体を用いて、RT-qPCRによる菌数定量解析を施行した。その結果、N. sicca subgroup、N.cinerea subgroup、N. flav subgroup、N. weaveriの遺伝子は、それぞれ95%、79%、68%、63%と高率に川崎病患児の咽頭粘膜より検出されたが、2例の疾患対象患者からは検出されなかった。同様に、Acinetobacter属も川崎病患者検体からのみ42%検出されていた。なお、Staphylococcus属、Streptocossus属は、上記のNeisseria、Acinetobacter属の菌株が検出された患者咽頭粘膜全例から同時に検出された。なお急性期血液検体からは、上述の菌遺伝子のうち、Enterobacteriaceae属、Staphylococcus属、Streptocossus属が31検体中2検体(検出率7%)認められるにとどまった。2.病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体による定量川崎病急性期血清のAcinetobacter HSP60(Acinetobacter 125-138)およびNeisseria HSP60 (Neisseria 419-432)のサンドイッチELISA(間接法)によるHSP60定量系の開発に成功した。この検討により得られたポリクローナル抗体を用いて、川崎病急性期血清31検体を解析したところ、1検体のみ高抗体価(640倍)のNeisseriaHSP60を検出するに至った。本来なら、疾患対照検体からの細菌遺伝子および細菌特異的HSP60タンパクの検出まで着手する予定であったが、新種のNeisseria株のプライマーおよびその産生物であるHSP60を検出する抗体の開発に時間がかかったため、数検体の解析にとどまった。かなりの高精度のツールを完成させることができたことから、次年度は、疾患対照検体にも焦点をおいて臨床検体の解析に集中できることが最も大きな意義、重要性と考えられた。新種のNeisseria菌株特異的HSP60タンパクの検出用の抗体による定量がわずか1検体でのみ高値であったのは予想外であったので、その原因を考察したところ、これらの検出用サンプルを川崎病回復期(冠動脈病変の出現頻度の高いとされる11-13病日)の患者血液検体に求めていたことがわかった。実際の病原菌特異的HSP産生時期は、ごく病初期でありこれが免疫グロブリン製剤により中和され冠動脈病変を抑制する機序を考えると、ごく病初期の患者血液検体における同タンパク産生量を測定する必要性があると考え、今年度は、同解析により重点を置く予定である。川崎病の原因を確定するため、過去に申請者が患者の上部消化管から検出した「病原体の遺伝子」および川崎病の主要な合併症である冠動脈瘤形成の発端となる「病原体特異的なheat-shock protein(HSP)」を川崎病患者の臨床検体から検出しうるツールの開発を試みた。まず、病原体の遺伝子を分子生物学的に検出するプライマーの完成を目指した。その結果、目的菌の一つであるAcinetobacter属細菌株は16S rRNA遺伝子の塩基配列を解読したところA. radioresistensであったので、これに対する特異的プライマーを作成した。目的とするNeisseria属菌株は、新種の細菌であったため、分子系統樹上、subgroupとして認識するプライマーの開発を行った。更に、病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体作製を検討した。これまでに既報の配列より、A. radioresistensおよびNeisseria属HSP60遺伝子の全長を増幅可能なプライマーを設計し、このプライマーを用いて当該株におけるHSP60遺伝子配列を決定した。これらの遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列について近縁菌種とのアライメントを行い、種あるいは株特異的アミノ酸の特定およびエピトープの推定を試みた。その結果、各菌のHSP60を対象とした特異抗原を決定することができた(Neisseria 419-432; Acinetobacter 449-462; Enterobacter 426-439)。各抗HSPペプチド抗血清を用い、各HSP60 1/2,000希釈を一次抗体として、Western blotting法により、目的とするバンドが60 kDa付近に得られることを確認した。これより、ELISA系の構築に進み、標的菌種とそれ以外の菌種間で、定量的に閾値設定が可能であることを確認した。本来なら、患者検体からの細菌遺伝子および細菌特異的HSP60タンパクの検出まで着手する予定であったが、ほとんどの川崎病患者検体から抽出されたNeisseria株が新種であったことから、この遺伝子をPCRで検出するプライマーおよびその産生物であるHSP60を検出する抗体の開発に時間がかかった。

しかし、かなりの高精度のものを完成させることができたことから、次年度以降は、臨床検体の解析に集中できることが最も大きな意義、重要性と考えられた。川崎病の原因を確定するため、過去に申請者が患者の上部消化管から検出した「病原体の遺伝子」および川崎病の主要な合併症である冠動脈瘤形成の発端となる「病原体特異的なheat-shock protein(HSP)」を川崎病患者の臨床検体から検出しうるツールの開発を試みた。1.病原体の遺伝子の分子生物学的検出法2.病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体による定量本来なら、疾患対照検体からの細菌遺伝子および細菌特異的HSP60タンパクの検出まで着手する予定であったが、新種のNeisseria株のプライマーおよびその産生物であるHSP60を検出する抗体の開発に時間がかかった。しかし、かなりの高精度のものを完成させることができたことから、次年度以降は、疾患対照検体を中心とした臨床検体の解析に集中できることが最も大きな意義、重要性と考えられた。川崎病の原因を確定するため、過去に申請者が患者の上部消化管から検出した「病原体の遺伝子」および川崎病の主要な合併症である冠動脈瘤形成の発端となる「病原体特異的なheat-shock protein(HSP)」を川崎病患者の臨床検体から検出しうるツールの開発を試み、臨床検体への応用を試みた。川崎病の発症に関わる可能性の高いNeisseria属、Acinetobacter属Enterobacteriaceae属、Enterococcus属、Staphylococcus属、Streptococcus属の特異的プライマーを用いて、これまで川崎病患者急性期血液検体38検体、咽頭拭い液検体24検体を用いて、RT-qPCRによる菌数定量解析を施行した。その結果、N. sicca subgroup、N.cinerea subgroup、N. flav subgroup、N. weaveriの遺伝子は、それぞれ95%、79%、68%、63%と高率に川崎病患児の咽頭粘膜より検出されたが、2例の疾患対象患者からは検出されなかった。同様に、Acinetobacter属も川崎病患者検体からのみ42%検出されていた。なお、Staphylococcus属、Streptocossus属は、上記のNeisseria、Acinetobacter属の菌株が検出された患者咽頭粘膜全例から同時に検出された。なお急性期血液検体からは、上述の菌遺伝子のうち、Enterobacteriaceae属、Staphylococcus属、Streptocossus属が31検体中2検体(検出率7%)認められるにとどまった。2.病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体による定量川崎病急性期血清のAcinetobacter HSP60(Acinetobacter 125-138)およびNeisseria HSP60 (Neisseria 419-432)のサンドイッチELISA(間接法)によるHSP60定量系の開発に成功した。この検討により得られたポリクローナル抗体を用いて、川崎病急性期血清31検体を解析したところ、1検体のみ高抗体価(640倍)のNeisseriaHSP60を検出するに至った。
Liquid biopsyを用いたHCC術後再発予測に有用なバイオマーカーの開発

末梢血内の腫瘍細胞(circulating tumor cell: CTC)と腫瘍細部由来のcirculating cell freeDNA (ccfDNA)の両者を用い、肝細胞癌術後再発高危険群を同定する方法と、術後再発を早期に同定する方法を開発する。これまではCTCの検出感度が低かったため、我々はccfDNAを用いて大腸癌肝転移症例の発高危険群を同定する方法と、術後再発を早期に同定する方法を開発してきた。CTCはがん特異的であるため、ccfDNAと併用することにより更に精度の高い方法を開発できる可能性がある。1)術前のCTCおよびccfDNA、手術切除標本、術後1ヶ月目のCTCとccfDNAを用いて早期再発危険群を同定する方法を開発する。2)術後1ヶ月目、以降2ヶ月毎のCTC、ccfDNAを用いて術後再発を早期に同定する方法を開発する。HCC術後にLBRが減少しなかった症例、術前に30個/ml以上のCTCが検出された症例、手術1ヶ月後にCTCが検出された症例を早期再発高リスク群とする。高リスク症例では毎月、通常リスク症例では2ヶ月毎に採血を行い、ccfDNA、CTCを用いて画像診断より先に再発を同定できるか検証する。高リスク症例では3ヶ月毎、通常リスク症例では6ヶ月毎に画像診断を行う。理由HCVに対する抗ウイルス治療が効果を上げ、ここ数年数々の治療法が確立された。その有効率は90%を超えるようになっている。そのためHCV由来のHCC症例は全国的に減少しており、そのため手術件数もどの施設においても減少している。当施設においても過去5年間、年間50例近い症例に対して肝切除を行っていたが、ここ2年は2030例に留まっている。そのため、サンプル数が減少しているため、研究進行がやや遅れている。現在、2年間でサンプル数は50例となっている。高リスク症例では毎月、通常リスク症例では2か月ごとに採血を行い、CCfDNA, CTCを用いた画像診断より先に再発を同定可能かを検証を開始している。サンプル収集をする一方で、結果の解析を同時進行させ、進行の遅れを回復する予定である。ccfDNAががん特異的ではなく、強い侵襲が加わると偽陰性が生じやすい。術前のCTCおよびccfDNA、手術切除標本、術後1ヶ月目のCTCとccfDNAを用いて早期再発危険群を同定する方法を開発する。術後1ヶ月目、以降2ヶ月毎のCTC、ccfDNAを用いて術後再発を早期に同定する方法を開発する。昨年手術を行った20例のHCC症例の検体を用いてLBRを測定する。術後にLBRが減少しなかった症例、術前に30個/ml以上のCTCが検出された症例、手術1ヶ月後にCTCが検出された症例を早期再発高リスク群とし、高リスク症例、通常リスク症例ともにcfDNA、CTCを用いて画像診断より先に再発を同定できるか検証する。HCVに対する抗ウイルス治療が効果を上げている。そのため、全国的にHCC症例が減少し、それに伴い手術件数もどの施設においても減少をしている。当施設においても例年50例以上のHCC肝切除症例がいたが、昨年は30例にとどまっている。そのため、サンプル数が減少し、研究進行がやや遅れいている。

当施設においても過去5年間、年間50例近い症例に対して肝切除を行っていたが、ここ2年は2030例に留まっている。そのため、サンプル数が減少しているため、研究進行がやや遅れている。更にサンプル収集を続ける。1年間に約30例のHCC手術を行っているため、2年間で更に60例の集積を予定している。術後にLBRが減少しなかった症例、術前に30個/ml以上のCTCが検出された症例、手術1ヶ月後にCTCが検出された症例を早期再発高リスク群とする。高リスク症例では毎月、通常リスク症例では2ヶ月毎に採血を行い、ccfDNA、CTCを用いて画像診断より先に再発を同定できるか検証する。高リスク症例では3ヶ月毎、通常リスク症例では6ヶ月毎に画像診断を行う。現在、2年間でサンプル数は50例となっている。高リスク症例では毎月、通常リスク症例では2か月ごとに採血を行い、CCfDNA, CTCを用いた画像診断より先に再発を同定可能かを検証を開始している。サンプル収集をする一方で、結果の解析を同時進行させ、進行の遅れを回復する予定である。症例数が予想よりも少なかったことから、試薬の使用量が少なく、残高が生じた。次年度は症例数を増やす予定になっており、それに伴い試薬の使用量の増加が見込まれている。
DNA複製時におけるゲノム安定化維持機構の解析

DNA複製の阻害は、細胞にとって致死となるため、障害を取り除いて複製を再開するメカニズムは、すべての生物にとって普遍的な問題であるだけでなく、ヒトにおいて、これらのシステムに異常が生じた場合、突然変異頻度の上昇、重複、転座等のゲノム不安定化が引き起こされ発がんの原因になることがわかっている。我々は、大腸菌からヒトまで高度に保存されたMgs1蛋白質の機能解析を通じてDNA複製時のゲノム安定化維持における、DNA複製、修復、組換え機構の全体的な理解を深めたいと考えて研究を行っている。今回、Two-Hybrid法による出芽酵母Mgs1蛋白質と相互作用する因子の同定を試みた結果、ヒトのユビキチン様蛋白質SUMO-1のホモログであるSmt3を同定した。また、細胞粗抽出液中にも、Smt3により修飾を受けた複合体が存在し、Mgs1蛋白質の機能に影響を与えていることが考えられた。次に、mgs1変異株を用いた結果から、Mgs1は、DNA複製フォーク進行阻害に応答して働く複製後修復や相同組換え機構とは別の経路で、フォーク進行阻害の回避に関与していることが示唆された。さらに、mgs1変異はDNAポリメラーゼδ(Polδ)をコードするPOL3遺伝子の温度感受性変異株の高温感受性を抑制する一方で、ゲノム不安定化を伴っていることを明かにした。また、このような関係は、酵母だけでなく、原核生物の大腸菌においても観察された。このことから、Mgs1蛋白質の機能は、原核生物から真核生物まで保存されており、複製フォークが損傷や障害等によって阻害された場合、Polδを含む複製装置と相互作用することで複製フォークの進行を制御し、ゲノム安定性維持に働いていると考えられる。
エアーブリジ構造を用いたフリースタンデイング3C-SiCの結晶成長

SiCは増大する商業上の重要性にかかわらず,SiC基板は今だ比較的高価である.このため低価格化に向けてSi基板上に成長させようとする様々な報告がされている.しかしながらこのヘテロエピタキシャル成長を用いた方法でSiC基板を製品として実用化している例は少ない.学術研究としての課題は更なる欠陥低減方法の追求である.例えば他の材料で用いられている方法をSiCに応用することなども考えられる.そこで注目したのはマイクロチャネルエピタキシーという方法である.今まで報告されてきたマイクロチャネルエピタキシーを用いたSi上3C-SiC成長に関しては、欠陥の低減が可能であると見出されつつある段階に来ている.しかしながらこの方法を利用して実用しようとする動きは全くない.これはこの方法を利用した報告では,まだまだ評価に関して不十分である.そしてこの方法に関する実用に向けた問題点を議論した報告がそれまで無かった.そこで本実験ではもう一度成長に注目してこの方法が欠陥の低減につながる方法であるか否かを,電子顕微鏡を用いて評価を行った.最初に他のグループが提案したアイデアを利用したコラム構造を用いたSiCエピタキシャル成長と,新しく提案するT型構造を用いたSiCエピタキシャル成長について議論した.そしてこれまでは横方向に欠陥の低減した領域を形成させることを考えていたが,縦型マイクロチャネルエピタキシーの方法を用いることで成長上部に欠陥の低減した領域を作ることを目的とし新しい成長方法を提案した.これらの成長方法を総括して,マイクロ加工付き基板上へのSiCエピタキシャル成長と名付けることにして,報告した.そして最後に本成長の実用に向けた問題点について議論した.SiCは増大する商業上の重要性にかかわらず,SiC基板は今だ比較的高価である.このため低価格化に向けてSi基板上に成長させようとする様々な報告がされている.しかしながらこのヘテロエピタキシャル成長を用いた方法でSiC基板を製品として実用化している例は少ない.学術研究としての課題は更なる欠陥低減方法の追求である.例えば他の材料で用いられている方法をSiCに応用することなども考えられる.そこで注目したのはマイクロチャネルエピタキシーという方法である.今まで報告されてきたマイクロチャネルエピタキシーを用いたSi上3C-SiC成長に関しては、欠陥の低減が可能であると見出されつつある段階に来ている.しかしながらこの方法を利用して実用しようとする動きは全くない.これはこの方法を利用した報告では,まだまだ評価に関して不十分である.そしてこの方法に関する実用に向けた問題点を議論した報告がそれまで無かった.そこで本実験ではもう一度成長に注目してこの方法が欠陥の低減につながる方法であるか否かを,電子顕微鏡を用いて評価を行った.最初に他のグループが提案したアイデアを利用したコラム構造を用いたSiCエピタキシャル成長と,新しく提案するT型構造を用いたSiCエピタキシャル成長について議論した.そしてこれまでは横方向に欠陥の低減した領域を形成させることを考えていたが,縦型マイクロチャネルエピタキシーの方法を用いることで成長上部に欠陥の低減した領域を作ることを目的とし新しい成長方法を提案した.これらの成長方法を総括して,マイクロ加工付き基板上へのSiCエピタキシャル成長と名付けることにして,報告した.そして最後に本成長の実用に向けた問題点について議論した.我々はチャネルエピタキシャル成長法により横方向成長を積極的に利用した新しい成長方法を見い出した。シリコンの露出部に1000Å程度のSiC層を堆積させる(種成長と呼ぶ)。この段階で酸化膜の上にも少量のSiCが成長するが、HClを同時に添加することにより粒状のSiCになる。次にこの試料をHF溶液の中にし酸化膜を除去し、薄いSiC膜で覆われた部分を周期的に形成する。これをCVD用の基板とする。この基板をCVD装置にて、1000°Cで水素+塩化水素の雰囲気に置くとシリコン露出部がエッチングされ溝ができる。次に最適の温度プロファイルでSiCを成長(再成長)すると、最上部の薄いSiCを種結晶として横方向成長が優先しておこり、隣の柱から延びてきた面と合体して1枚の結晶面が形成される。このようにしてSi基板上にエアブリッジ構造の3C-SiCが形成される。横方向成長領域の下にエアギャップが形成され、Siと3C-SiCが分離した。隣接する種領域との間隔が10μm以下のパターン部分ではエアブリッジ構造が再成長中に形成される。種成長時の成長温度および再成長中のキャリア水素の流量は成長後の3C-SiCの状態に大きな影響を与える。種成長時の成長温度1350°Cのとき、成長温度1250°Cに比べ、再成長後に得られる3C-SiCの表面モフォロジーが改善した。一方、再成長中のキャリア水素流量を増加させていくと、成膜表面が平坦になるが、<111>方向の成長速度が減少する。成長中の水素流量を増加させるにつれ、シリコンの柱がエッチングされていき、ついには消失しまう。結果として、3C-SiCがSi基板から離れてしまい、成長中にフリースタンディングとなる。この方法を用いることで降温時の熱膨張係数差による歪みの効果を低減できる。このフリースタンディング構造、エアーギャップの形成メカニズムは今後の課題として残っている。SiCは増大する商業上の重要性にかかわらず,SiC基板は今だ比較的高価である.このため低価格化に向けてSi基板上に成長させようとする様々な報告がされている.しかしながらこのヘテロエピタキシャル成長を用いた方法でSiC基板を製品として実用化している例は少ない

.学術研究としての課題は更なる欠陥低減方法の追求である.例えば他の材料で用いられている方法をSiCに応用することなども考えられる.そこで注目したのはマイクロチャネルエピタキシーという方法である.今まで報告されてきたマイクロチャネルエピタキシーを用いたSi上3C-SiC成長に関しては、欠陥の低減が可能であると見出されつつある段階に来ている.しかしながらこの方法を利用して実用しようとする動きは全くない.これはこの方法を利用した報告では,まだまだ評価に関して不十分である.そしてこの方法に関する実用に向けた問題点を議論した報告がそれまで無かった.そこで本実験ではもう一度成長に注目してこの方法が欠陥の低減につながる方法であるか否かを,電子顕微鏡を用いて評価を行った.最初に他のグループが提案したアイデアを利用したコラム構造を用いたSiCエピタキシャル成長と,新しく提案するT型構造を用いたSiCエピタキシャル成長について議論した.そしてこれまでは横方向に欠陥の低減した領域を形成させることを考えていたが,縦型マイクロチャネルエピタキシーの方法を用いることで成長上部に欠陥の低減した領域を作ることを目的とし新しい成長方法を提案した.これらの成長方法を総括して,マイクロ加工付き基板上へのSiCエピタキシャル成長と名付けることにして,報告した.そして最後に本成長の実用に向けた問題点について議論した.
発生期大脳皮質神経細胞の多段階的移動を制御する分子機構

本研究課題では、マウス大脳皮質発生過程において、側脳室に面する脳室帯(VZ)から移動を開始する2つの集団に関して移動様式を検討した。一方はVZ内で最終分裂を終了するもので、約10時間VZ内に留まったのち、分裂を伴わずに多極性細胞へと形態変化し、VZのすぐ表層側に集積する。一方、VZを出発してもまだ分裂能を持つ細胞集団は脳表面側へと伸びる長い突起を有し、前者よりもより表層側へ早く移動し分裂する。我々はこれまで、脳室帯で誕生した皮質神経細胞の大部分は脳室下帯(SVZ)に一過性に留まり多極性細胞になること、多極性細胞はさらに皮質板(CP)に入る前に放射状線維を足場として移動するロコモーション細胞へと形態変化することを観察してきた。しかし、移動過程で多極性細胞を経る必然性は不明であった。多極性細胞で機能する分子を探索するため、SVZに発現する受容体タンパク質のスクリーニングを行った。その結果、18種類の候補分子が得られ、この中にはRobo2などの複数の軸索ガイダンス分子が含まれていた。本年度は主にRobo2による移動制御、及び軸索伸展への役割を解析した。発現パターンの解析から、Robo2の役割として、多極性細胞の時期におけるCPへの侵入の阻止が考えられた。この仮説を検点を検討した。1)Robo2は多極性細胞において機能できる形で発現しているか?-ベクターを子宮内電気穿孔法により導入し、多極性細胞がGFPにより可視化された切片に対して、蛍光を用いた分解能の高いin situ hybridiationを行った。その結果、実際に多極性細胞にRobo2が発現していることが確認された。2)Robo2を阻害した場合にCPへの進入が早まるか?-上記の仮説が正しければ、Robo2を強制発現させた場合にはCPへの侵入が遅れ、阻害した場合には早まることが期待された。強制発現させた場合に、CPへの進入が遅れることはすでに確認されている。Robo2を阻害した場合の効果を検討するため、short hairpin RNA (shRNA)発現ベクターを子宮内電気穿孔法により導入し、Robo2のノックダウンを試みた。7種類の配列を試みた結果、予想に反して4種類のベクターで移動の遅れが確認された。この結果は、Robo2が実際に移動過程で移動神経細胞に内在的に働いていることを示唆している。我々は子宮内電気穿孔法により大脳皮質脳室帯組織へ蛍光タンパク質発現プラスミドを導入することで、移動神経細胞の動態を観察し、その大部分が脳室下帯(SVZ)に一過性に留まり多極性細胞になること、その後多極性細胞はロコモーション細胞へと変化することを報告した。しかし、多極性細胞を経ることの意義は明らかではない。多極性細胞の時期には、移動方向と直行する接線方向に軸索を伸ばし始めることが観察されるので、正しい軸索走行の形成に必要である可能性が推測された。そこで、SVZに発現する受容体タンパク質のスクリーニングを行い、その一つとしてRobo2を同定した。8種類のノックダウンベクターを子宮内電気穿孔法により導入し、その内のいくつかで移動の遅れを観察したものの、いずれも軽度であった。また、ドミナントネガティブを導入した場合や、Robo2 K0の組織学的解析においても、またRobo2のリガンドとして知られるSlitlを多極性細胞の近傍に発現させた場合にも影響は見いだせなかった。これらのことから、Robo2は多極性細胞の移動や軸索伸展への役割は低いことが示唆された。一方我々は、脳室帯から移動を開始する神経細胞に2つの集団があることに気付いた。1つは脳室帯で分裂を終了し、しばらく脳室帯に留まった後、典型的な多極性細胞となって脳室帯の直上、すなわち組織学的意味でのSVZに留まり、やがて放射方向への極性を獲得し、ロコモーションとなる集団。もう1つは、前者よりも早期に組織学的SVZを通過し、中間帯内へと分散し、分裂する集団である。後者はいわゆる非脳室帯前駆細胞であり、その存在する組織学的SVZを含めて中間帯内の比較的広い部分が機能的SVZに対応する。本研究課題では、組織学的SVZと機能的SVZが区別されるべきもので、後者は前者の上(脳表面側)に広がることを明確に示した。
H_∞制御理論適用のための前提条件の体係化

現代制御理論の反省の上にたって構築されたロバスト制御理論の中核としてH_∞制御が近年盛んに応用されている。しかし、H_∞制御理論適用のための前提条件はしばしば満たされず、応用時に大きな障害となっている。これは1. G_<12>(s)、G_<21>(s)の零点条件が満たされない2. D_<12>、D_<21>のランク条件が満たされないでまとめられる。第1項が問題になる典型例としてサーボ問題があり、第1、2項が問題になる場合として実プラントの入出力点の配置の不揃い等がある。本研究はまず不安定重みを導入してロバストサーボ系を構成する問題を取りあげ、色々な角度から検討した。すなわち、a.実閉ループ系が安定である場合を実質安定と定義し、実質安定を確保し、かつ、制御器が内部モデルを持つための十分条件を与え、これらの条件下でH_∞制御器を導出した。b.次に制御器が必ずしも内部モデルを持たない場合にもH_∞制御問題が解けることを示し、その解を導いた。c.実質安定で、且つ、評価伝達関数が安定である場合を改めて総合安定と定義し、総合安定が達成される系の構造を調べた。また、第2、3項の問題に対応して以下の結果を得た。すなわち、d. D_<12>、D_<21>がフルランクではあるが、冗長度を持つ場合のH_∞制御、H_2制御に解を与えた。e.これらがフルランクでない場合について、デスクリプタ形式を導入し、スペルトル分解問題を解いた後、H_2制御とH_∞制御問題に対する解を与えた。a.c.の成果はH_∞サーボ理論をさらに展開していくため、d.e.は、一般の非標準H_∞制御、H_2制御を展開していくため基礎となるとともに、産業応用の場面でも有効に利用されつつある。このことに対応してf.前提条件が絡みあった複雑な問題として、電力系統のロバスト周波数制御を取り上げ、そのH_∞制御器の構成手順を示した。ロバスト制御の中核として,H∞制御が近年盛んに応用されるに至っている。しかし,適応可能なための前提条件はしばしば満たされず,応用時に大きな問題となっている。これは,以下のようにまとめられる。1.D_<12>,D_<21>のランク条件が満たされない2.G_<12>(S),G_<21>(S)の零点条件が満たされない第1項が問題になる場合としてプラントの入出力配置の不揃いがある。また、第2項が問題になる場合として,サーボ問題がある。現状ではこのような問題に対して対処療法的な扱いしか知られておらず,技術者を悩ませている。申請者はこれまでに、これらの問題の中の一部を解いてきたが、なお未解決の問題が多く残っていた。本研究の目的はこれらの問題を解き、その有効性を実験にて確認し、もって、産業界に寄与することであった。本年の結果としてこの研究の第1の目的がほぼ達成された。すなわち、第1項の問題に対してはデスクリプター形式を持込んで問題が解かれ,結果は2編の論文(1編は掲載予定、他は投稿中)にまとめられた。

また,第2項の問題の内、制御対象が虚軸上の極を持つ問題が解かれ、2編の論文(2編とも投稿中)にまとめられた。投稿中の論文は必ず掲載と確信するが、次ページの論文はこれらの研究の副産物として書かれた3編、および、基礎となる著書を含んでいる。現代制御理論の反省の上にたって構築されたロバスト制御理論の中核としてH_∞制御が近年盛んに応用れている。しかし、H_∞制御理論適用のための前提条件はしばしば満たされず、応用時に大きな障害となっている。これは1.G_<12>(s)、G_<21>(s)の零点条件が満たされない2.D_<12>、D_<21>のランク条件が満たされないでまとめられる。第1項が問題になる典型例としてサーボ問題があり、第1、2項が問題になる場合としてプラントの入出力点の配置の不揃い等がある。本研究はまず不安定重みを導入してロバストサーボ系を構成する問題を取りあげ、色々な角度から検討た。すなわち、a.実閉ループ系が安定である場合を実質安定と定義し、実質安定を確保し、かつ、制御器が内部モデを持つための十分条件を与え、これらの条件下でH_∞制御器を導出した。b.次に制御器が必ずしも内部モデルを持たない場合にもH_∞制御問題が解けることを示し、その解をいた。c.実質安定で、且つ、評価伝達関数が安定である場合を改めて総合安定と定義し、総合安定が達成さる系の構造を調べた。また、第2、3項の問題に対応して以下の結果を得た。すなわち、d.D_<12>、D_<21>がフルランクではあるが、冗長度を持つ場合のH_∞制御、H_2制御に解を与えた。e.これらがフルランクでない場合について、デスクリプタ形式を導入し、スペルトル分解問題を解い後、H_2制御とH_∞制御問題に対する解を与えた。a.c.の成果はH_∞サーボ理論をさらに展開していくため、d.e.は、一般の非標準H_∞制御、H_2制御展開していくため基礎となるとともに、産業応用の場面でも有効に利用されつつある。
加齢に伴う骨格筋機能低下予防における酢酸の作用及びその機序に関する研究

本研究は、酢酸が骨格筋に及ぼす生理機能について明らかし、加齢による骨格筋機能低下予防における酢酸の作用を明らかにすることを目的とした。筋管細胞を用いて解析したところ、酢酸は細胞に速やかに取り込まれた後、糖・脂質代謝などの調節に関与するAMPKの活性化をもたらした。さらに、ミオグロビンの転写制御を担う転写因子MEF2Aの発現を増加させ、その核内局在を促進させると共に、ミオグロビンおよびGLUT4の発現を増加させて脂質代謝やグルコースの取り込みを増加させることを明らかにした。加えてPGC1aの発現についても増加させたことから、酢酸はミトコンドリア増幅にも関与すると示唆された。高齢動物骨格筋における酢酸の作用に焦点を絞り、酢酸が筋線維組成およびミトコンドリア生合成においてどのように作用するか、また酢酸が骨格筋委縮を予防できるかについて検討を行うと共に、骨格筋における酢酸の作用機序を明らかにすることを目的とした。32週齢のSD系雄性ラットを使用し、5週間の予備飼育後、37週齢から56週齢まで週5日間、1%酢酸投与群(Ace群)、水投与群(Water群)をそれぞれ0.5ml/100g(体重)を胃ゾンデにより胃腔内に投与した。飼育期間中に体重、摂餌量の測定、また小動物代謝計測システムによる代謝測定を行った。55週齢Water群では投与前の36週齢と比較して酸素消費量が有意に低下していたのに対しAce群では投与前と変化がなく、加齢に伴うエネルギー消費量の低下が抑制されていた。56週齢のWater群と比較してAce群においてヒラメ筋の筋線維数が有意に増加しており、特に遅筋線維数の増加がみられたことから、酢酸により遅筋線維数の減少が抑制されると示唆された。遅筋化に関わる遺伝子であるmef2aのヒラメ筋における遺伝子発現レベルを調べたところ加齢により発現が減少しており、56週齢のWater群とAce群を比較したところmef2a発現レベルが有意にAce群で上昇していた。これらの結果から酢酸が遅筋線維現象の抑制に影響を与えていると考えられた。本研究では、高齢動物骨格筋における酢酸の作用に焦点を絞り、酢酸が筋線維組成およびミトコンドリア生合成においてどのように作用するか、また骨格筋委縮を予防できるかについて検討を行うと共に、骨格筋における酢酸の作用機序を明らかにすることを目的としており、以下の項目(1)高齢動物における酢酸摂取による代謝動態の解析、(2)酢酸摂取が高齢動物の運動耐久力に及ぼす影響、(3)酢酸摂取による高齢動物骨格筋の筋線維組成に及ぼす影響、(4)骨格筋ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能に関する検討、(5)筋委縮関連遺伝子の発現動態の解析、および(6)培養細胞を用いた酢酸の作用機序の解明、について計画している。平成27年度には、このうち(1)(3)について検討を行ったことから、研究課題についておおむね順調に進展していると考える。高齢動物における酢酸摂取が骨格筋萎縮に対してどのような作用を示すか検討する目的で、筋委縮関連遺伝子の解析および組織化学的な解析を行った。加齢によりIGF-1が減少すると、それらの活性が低下し、FoxOの脱リン酸化、次いでAtrogin-1などの筋委縮関連遺伝子の活性化が引き起こされると考えられる。そこで酢酸投与した動物の骨格筋抽出液を用いてリン酸化FoxO、Akt、およびmTORをウェスタンブロット法により解析した。またAtrogin-1およびMuRF1などの発現レベルをRT-PCR法により解析した。その結果、筋萎縮と老化に関連する遺伝子であるfbxo32 (Atrogin-1)、trim63 (MuRF1)およびtgfb1 (TGF-β)の遺伝子発現レベルはAce群で低下していた。加齢に伴い筋線維横断面積が拡大することの原因の一つとして、脂肪蓄積が考えられ、筋線維内における脂肪滴の蓄積は、肥満や2型糖尿病、老化骨格筋等において認められる。オイルレッド染色とHE染色を行い骨格筋の脂肪滴蓄積および筋線維化について解析した。ヒラメ筋では、Water群で筋線維内に多数の脂肪滴および筋線維化および壊死がみられた。腓腹筋はAce群と比較しWater群で筋線維内に少数の脂肪滴がみられたが、顕著な筋線維化は認められなかった。以上の結果から、中高齢のラットに継続的に酢酸を摂取させることにより、加齢に伴う脂肪蓄積や筋繊維化などが抑制されることが示唆された。本研究では、高齢動物骨格筋における酢酸の作用に焦点を絞り、酢酸が筋線維組成およびミトコンドリア生合成においてどのように作用するか、また骨格筋萎縮を予防できるかについて検討を行うと共に、骨格筋における酢酸の作用機序を明らかに擦ることを目的としており、以下の項目(1)高齢動物における酢酸摂取による代謝動態の解析、(2)酢酸摂取が高齢動物の運動耐久力に及ぼす影響、(3)酢酸摂取による高齢動物骨格筋の筋線維組成に及ぼす影響、(4)筋委縮関連遺伝子の発現動態の解析、(5)骨格筋ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能に関する検討および(6)培養細胞を用いた酢酸の作用機序の解明、について計画している。平成27年度にはこのうち(1)(3)、また平成28年度には(4)について検討を行ったことから、研究課題についておおむね順調に進展していると考える。酢酸の継続的な摂取が高齢動物の骨格筋の萎縮抑制に対してどのような影響を与えるかを明らかにするために、本年度はミトコンドリアの機能解析を行った。

骨格筋組織(ヒラメ筋および腓腹筋)のSDH染色の結果、酢酸を摂取させた動物において、ヒラメ筋におけるSDHの陽性反応が高く、ミトコンドリアDNA量も有意に高かった。腓腹筋においても同様な傾向が見られた。腓腹筋ではミオグロビンおよびトロポニンIが増加し、核内におけるPGC1aが有意に増加していた。これより、酢酸を継続的に摂取することにより腓腹筋およびヒラメ筋でも遅筋化に進む傾向が示唆された。次に、L6筋管細胞を用いて、培養液に0.5mM-10mM酢酸を添加後の細胞におけるAMPKのリン酸化およびPGC1aのリン酸化をウェスタンブロット法により測定した結果、酢酸の濃度依存的にAMPKのリン酸化が増加し、AMPKの阻害剤により抑制された。骨格筋特異的転写因子MEF2Aの発現増加およびMEF2Aの核内への局在変化を観察した結果、酢酸処理後にMEF2Aの核内移行レベルが増加し、AMPKの阻害剤により抑制された。一方、腸管や脂肪組織には酢酸をリガンドとして活性化するGPR43が存在するが、骨格筋における酢酸の作用機序を明らかにする目的で、L6筋管細胞においても酢酸をリガンドとして活性化するGPR43が存在するかを、分化程度の異なるL6筋管細胞を用いて解析した。その結果、筋管細胞に分化が進むにつれてGPR43遺伝子の発現が増加することが示された。筋管細胞におけるGPR43が酢酸により活性化されるかどうかを解析するために、細胞内カルシウムレベルを解析する測定系を検討し、蛍光標識を用いて蛍光プレートリーダーによる解析法を確立した。酢酸で処理することにより、時間経過とともに細胞内カルシウムが増加する傾向が見られた。本研究は、酢酸が骨格筋に及ぼす生理機能について明らかし、加齢による骨格筋機能低下予防における酢酸の作用を明らかにすることを目的とした。筋管細胞を用いて解析したところ、酢酸は細胞に速やかに取り込まれた後、糖・脂質代謝などの調節に関与するAMPKの活性化をもたらした。さらに、ミオグロビンの転写制御を担う転写因子MEF2Aの発現を増加させ、その核内局在を促進させると共に、ミオグロビンおよびGLUT4の発現を増加させて脂質代謝やグルコースの取り込みを増加させることを明らかにした。加えてPGC1aの発現についても増加させたことから、酢酸はミトコンドリア増幅にも関与すると示唆された。本年度は、(1)骨格筋ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能に関する検討、(2)筋委縮関連遺伝子の発現動態の解析について検討を進める。この遂行ために、培養細胞及び実験動物を用いて遺伝子レベルおよびタンパク質レベルでの解析を進める。ミトコンドリアおよび骨格筋萎縮に関わる因子の動態を解析するために各種抗体、mRNA解析のための各種プローブおよび関連試薬等を購入して進める。本年度は、(1)骨格筋ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能に関する検討および(6)培養細胞を用いた酢酸の作用機序の解明、について検討を進める。この遂行のために、実験動物および培養細胞を用いて遺伝子レベルおよびタンパク質レベルで解析を進める。そのために必要な各種mRNA解析のためのプローブ、ミトコンドリア関連タンパク質の抗体等の試薬を購入して進める。
CD28ファミリー分子によるT細胞活性化調節の分子機構

CD28 signalの特徴の一つとして、IL-2の産生増強があげられる。IL-2の転写は様々な転写因子がそのpromoter領域に結合することで調節されているが、なかでもNFκBはCD28のco-stimulationに対する依存性が高いことが知られている。近年、長らく謎であったTCR signalによるNFκB活性化のpathwayの解析が進み、PKC_θ,CARMA1,Bcl10といった分子が重要であることが明らかになってきた。しかし、CD28がこれらの分子にどのような影響をあたえるのか、またTCR signalとは違うCD28特有のシグナルが存在するのかといった疑問に対しての解答はまだほとんど出ていない。そこでBcl10がCD28 signalによるNFκBの活性化にどのような役割をはたしているのかを解析することにした。Jurkat細胞にBcl10を過剰発現させ、CD28刺激によるIL-2 promoterおよびNFAT, CD28RE, NFκB siteの活性化を測定した。Bcl10を過剰発現させるとCD28刺激によるCD28REおよびNFκB siteの活性化が著しく増強された。一方、NFAT siteの活性化にはほとんど影響がなかった。また、Bcl10による増強効果はPKCθの阻害剤の添加、またはPKCθのドミナントネガティブ体により強く阻害された。CD28 signalがBcl10分子に与える影響を調べるために、CD28 signalがBcl10のリン酸化及び細胞膜への移行を誘導するかを検討したところ、Bcl10分子はCD28刺激に伴い、リン酸化と細胞膜への移行が観察された。さらに、CARMA1を過剰発現させるとBcl10同様にCD28シグナルによるNF-κBの活性化を増強し、CARMA1のドミナントネガティブ体はBcl10によるNF-κBの活性化増強を阻害した。以上の結果は、PKCθ-CARMA1-Bcl10 pathwayがCD28依存性のNFκB活性化に非常に重要な役割を担っていることを示唆している。IL-2の転写は様々な転写因子がそのpromoter領域に結合することで調節されているが、なかでもNFκBはCD28のcostimulationに対する依存性が高いことが知られている。近年、長らく謎であったTCR signalによるNFκB活性化のpathwayの解析が進み、PKCθ,CARMA1,Bcl10といった分子が重要であることが明らかになってきた。Jurkat細胞にBcl10を過剰発現させ、CD28刺激によるIL-2 promoterおよびNFAT,CD28RE,NFκB siteの活性化を測定した。以上の結果は、PKCθ-Bcl10 pathwayがCD28依存性のNFκB活性化に非常に重要な役割を担っていることを示唆している。

さらに、CARMA1を過剰発現させるとBcl10同様にCD28シグナルによるNF-κBの活性化を増強し、CARMA1のドミナントネガティブ体はBcl10によるNF-κBの活性化増強を阻害した。以上の結果は、PKCθ-CARMA1-Bcl10 pathwayがCD28依存性のNFκB活性化に非常に重要な役割を担っていることを示唆している。
プロテアソーム機能不全単球からのIFN誘導ケモカインIP-10の産生機序の解明

プロテアソーム機能不全である中條-西村症候群患者において、末梢血単球をIFNγで刺激後、IP-10の産生が増加していることがわかっている。しかしIFNシグナル伝達のどこに異常があるかは不明であり、今回検討した。不死化B細胞をIFNγで刺激し、リン酸化STAT1、リン酸化JAK1のレベルをウェスタンブロットで検討した。中條-西村症候群患者において健常者に比べ、リン酸化JAK1レベルが上昇しており、リン酸化STAT1レベルには変化を認めなった。これらの結果は、中條-西村症候群患者において、リン酸化JAK1がプロテアソームにおいて分解される事がIFNシグナル伝達にとって重要であることを示唆している。中條ー西村症候群(NNS)患者と健常者の末梢血からCD14+単球を単離して検討する前に、まず、各人の末梢血にEBウイルスを感染させて作成した不死化B細胞を用いて各種条件設定を行うことを試みた。各人の同意を得て作成し凍結保存していた不死化B細胞を融解して培養し、10 IU/mlのリコンビナントヒトIFNγを添加して24時間後に細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定後抗リン酸化STAT1-PE抗体で染色してFACSCaliburで解析したが、患者2名と健常者ともに同程度に軽度陽性に染まり、明らかな差は認めなかった。そこで、IFNγ添加0時間、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間後に細胞を回収し、M-Perにて溶解しSDS-PAGEに展開して抗リン酸化STAT1抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、患者2名と健常者ともにIFNγ添加3 - 6時間後をピークに陽性バンドを検出し、バンドの濃さには明らかな差異を認めなかった。そこで、患者末梢血からpositive selectionでCD14+単球を単離して同様の実験を行うことを試みたが、得られる細胞数が少ないためか、IFNγ添加1時間、3時間、6時間後に明らかな陽性バンドを検出できなかった。そのため、まず健常者ボランティアの末梢血からpositive selectionとnegative selectionの両方の方法で十分な数のCD14+あるいは他細胞マーカー陰性の単球を得、IFNγ添加12時間後まで処理した細胞を回収して同様の実験を行い、陽性バンドを得ることを試みている。交付申請時の、「NNS患者と健常者の末梢血からpositive selectionにてCD14+単球を単離し、24時間後に培養上清中にIP-10の産生が確認された10 IU/mlのIFNγを添加して、1時間から24時間後まで経時的に細胞を回収する。細胞膜、細胞質と核成分に分けて抽出し、可溶画分中の蛋白質が等量になるように分注して凍結保存し、適宜SDS-PAGEに流してメンブレンに転写し、冷蔵庫で保管する。これらのメンブレンを用いて、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, STAT1, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、それらの発現量の変化を網羅的・定量的に検討する。患者単球と健常者単球の結果を比較することで、プロテアソームがIFNγ-JAK/STAT経路のどの部分に作用しているかを明らかにする」という研究計画に対して、キーとなるリン酸化STAT1の発現解析に手間取り、予定通り計画を遂行できなかった。類症であるCANDLE症候群にて、IFNγ刺激後の細胞内STAT1のリン酸化の亢進がFACSで認められると報告されていることから、細胞分画に分けて種々の抗体でウェスタンブロットを繰り返す前に、まずリン酸化STAT1について予想通りの結果を得ることが重要であるが、細胞の処理方法、生細胞数、IFNγ添加後の時間、分画の有無などの問題から、末梢血単球を用いたウェスタンブロットで有意なバンドが見られないものと考えられる。トラブルシューティングの方向は明確であり、早期にクリアして計画に追いつくことを目指している。既報のCANDLE症候群との相違を明らかにするため、前年度に滞った「健常者末梢血から単離したCD14+単球にIFNγを添加して12時間後まで経時的に細胞を回収してM-Perにて溶解しSDS-PAGEに展開して抗リン酸化STAT1抗体を用いてウェスタンブロットを行い、陽性バンドを得る」ことから実験を開始したが、患者の通院に合わせた採血に依存するため実験が思うように進まず、また予想される大きさのバンドは遂に見られなかった。そこで各人の末梢血にEBウイルスを感染させて作成した不死化B細胞を用いて再度抗リン酸化STAT1抗体を用いたウェスタンブロットを行ったところ、やはり前回と同様に患者2名と健常者ともにIFNγ添加24時間後をピークに陽性バンドを検出し、その間に明らかな差異を認めなかった。そこで、コントロールとして抗β-actin抗体を用いたウェスタンブロットを行い、全タンパク量に差異がないことを確認した。一方、リン酸化のコントロールとして抗STAT1抗体を用いたウェスタンブロットを行ったが、有意なバンドは見られず、リン酸化の割合を正確に評価することはできなかった。次いで、STAT1の上流にあるJAK1のリン酸化について検討するため、抗リン酸化JAK1抗体を用いたウェスタンブロットを行ったところ、患者2名でIFNγ添加12時間後をピークに陽性バンドを検出したのに対し、健常者では明らかな陽性バンドを認めなかった。

そこで、リン酸化JAK1のユビキチン化を確認するため、抗ユビキチン抗体を用いたウェスタンブロットを行ったが、リン酸化JAK1と同じ位置にはバンドは見られなかった。現在、抗リン酸化JAK1抗体を用いたウェスタンブロットの再現性の確認と、抗JAK1抗体を用いたコントロール実験を進めている。交付申請時の、「NNS患者と健常者の末梢血からpositive selectionにてCD14+単球を単離し、24時間後に培養上清中にIP-10の産生が確認された10IU/mlのIFNγを添加して、15分から24時間後まで経時的に細胞を回収する。細胞膜、細胞質と核成分に分けて抽出し、可溶画分中の蛋白質が等量になるように分注して凍結保存し、適宜SDS-PAGEに流してメンブレンに転写し、冷蔵庫で保管する。これらのメンブレンを用いて、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, STAT1, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、それらの発現量の変化を網羅的・定量的に検討する。患者単球と健常者単球の結果を比較することで、プロテアソームがIFNγ-JAK/STAT経路のどの部分に作用しているかを明らかにする」という研究計画に対して、キーとなる患者末梢血由来単球の解析が十分にできず、予定通り計画を遂行できていない。代わりに不死化B細胞を用いたウェスタンブロットを行い、予想に反してリン酸化STAT1には差がなく、むしろリン酸化JAK1に差があるという結果を得た。この結果は、CANDLE症候群とは異なるIFNシグナル異常の存在を示唆するが、転写に依存したIP-10の発現亢進があるならSTATのリン酸化に差があるはずで、再現性の確認を含め、更なる検討が必要である。これらの結果を日本研究皮膚科学会第41回年次学術大会総会と76th Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatologyにて報告し、研究遂行に対して助言を得た。「中條ー西村症候群患者と健常者末梢血から単離したCD14+単球にIFNγを添加して経時的に細胞を回収してM-Perにて溶解しSDS-PAGEに展開して抗リン酸化STAT1抗体を用いてウェスタンブロットを行い、陽性バンドを得る」ことから実験を開始したが、患者の通院に合わせた採血に依存するため実験が思うように進まず、また予想される大きさのバンドは見られなかった。そこで末梢血にEBウイルスを感染させた不死化B細胞を用いて抗リン酸化STAT1抗体を用いたウェスタンブロットを行った。患者2名と健常者ともにIFNγ添加24時間後をピークに陽性バンドを検出し、両者に明らかな差異を認めなかった。コントロールとして抗β-actin抗体を用いたウェスタンブロットを行い、全タンパク量に差異がないことを確認した。一方、リン酸化のコントロールとして抗STAT1抗体を用いたウェスタンブロットを行ったが、有意なバンドは見られず、リン酸化の評価はできなかった。次いで、STAT1の上流にあるJAK1のリン酸化について検討するため、抗リン酸化JAK1抗体を用いたウェスタンブロットを行った。