hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロセスモデルの運動学的検討

ヒトは咀嚼することで,食物の硬さや凝集性,付着性を変化させている.それによって食べ物を飲み込み(嚥下)やすい状態にしている.嚥下しやすい状態になった食物は,舌の運動によって咽頭に送り込まれて嚥下の準備がおこる.舌の運動を誘発する因子を検討するため,咀嚼による食物性状の変化と嚥下の関係を検討した.嚥下する前の食物の状態は,硬さや凝集性,付着性にて一定の傾向がある事が知られた.ヒトは咀嚼することで,食物の硬さや凝集性,付着性を変化させている.それによって食べ物を飲み込み(嚥下)やすい状態にしている.嚥下しやすい状態になった食物は,舌の運動によって咽頭に送り込まれて嚥下の準備がおこる.舌の運動を誘発する因子を検討するため,咀嚼による食物性状の変化と嚥下の関係を検討した.嚥下する前の食物の状態は,硬さや凝集性,付着性にて一定の傾向がある事が知られた.ヒトは咀嚼を行いつつ咽頭へ次々と食物を送り込み(stage II transport;以下STII),咽頭に貯留させた後,嚥下している.摂食嚥下機構や摂食嚥下障害の病態,特に喉頭に通じる咽頭へ,次々に食物を送り込む運動であり,嚥下障害をもつ患者では,誤嚥のリスクを高める可能性のあるSTIIに関しては,未だ不明な点が多い.その機構の解明や疾患による違いを明らかにすることで,誤嚥のリスクなどを軽減できる可能性がある.またRebecca J.Leonardらは,健常成人を対象にして,嚥下造影検査(Videofluorography;以下VF)を用い,咽頭に貯留した食物の断面積を測定して,咽頭収縮力を計測している.しかし,疾患による変化は未だ明らかにされていない.平成20年度は(1)健常人10名を対象にしてVFを行い,その画像を画像解析ソフトIMAGE-Jを用いて,STIIにより咽頭に送り込まれた食物の面積を計測した.一口量とその面積の関係をみることで,結果としてVFという2次元の画像からSTIIにより咽頭に送り込まれた食物の体積を予測できることが分かった.(2)(1)で得られた結果を元に,筋強直性ジストロフィー患者10名を対象にして,安静時咽頭腔の計測を行ない,健常人と比較した.筋強直性ジストロフィー患者では,咽頭腔が健常人に比して広くなる傾向が認められた.筋強直性ジストロフィー患者では,咽頭を構成する筋の筋力低下や弛緩が原因ではないかと考察した.ヒトは咀嚼を行いつつ、次々と咽頭へ食物を送り込み(stage II transport;以下STII),咽頭に貯留させた後,嚥下している.摂食・嚥下の機構や障害の病態に関しては未知の部分が多い。特に喉頭に通じる咽頭へ,次々に食物を送り込む運動であり,接触・嚥下障害をもつ患者では,誤嚥のリスクを高めるSTIIの生理学的・運動学的機構に関しては不明な点が多い.その機構の解明することや、疾患による違いを明らかにすることによって,摂食・嚥下障害を持つ患者の誤嚥や窒息のリスクを軽減させることができる可能性がある。ヒトは食物を咀嚼し、唾液と混ぜ合わせることで食物の物性(texture)を変化させている。これは、咀嚼により食物を嚥下しやすい物性(STIIを引き起こすであろうtexture)に変化させる運動であると考えられる。平成21年度の研究仮説は、「ヒトは咀嚼によって、食物物性(具体的には食物の付着性・凝集性・硬さ)を嚥下しやすい物性に変化させている。すなわち咀嚼後の食物の物性は一定の値に近づく。」とした。健常人を対象に、咀嚼した食物を、飲み込みたいと感じた時に吐き出させ、その物性(texture)を計測し、嚥下前の物性と比較検討した。結果として、様々なtextureの食物を咀嚼した場合でも、咀嚼後のtexture(特に凝集性や硬さ)はおおむね一定となることが知られた。これによって仮説が正しいことが証明された。ただし、STIIにより咽頭へ送り込まれる食物と吐き出した食物の物性に違いがある可能性があるため、嚥下前の咀嚼の条件を詳細に検討する必要があると考えた。ヒトは食物を摂取する際、口腔内での咀嚼と咽頭への送り込みを同時に行っている。プロセスモデルとは、この摂食・嚥下に関連した一連の運動を示すモデルの事である。この時にみられる舌の送り込み運動はstage II transport(STII)と呼ばれている。しかしSTIIの運動学・生理学的な働きについては未だ不明な点が多い。また、臨床的には摂食時に咀嚼とともに食物が咽頭へ送り込まれること(すなわちSTIIが咀嚼とともに起こる事)が、誤嚥の一つの因子になっていることもよく経験される。このためSTIIという運動の解明は誤嚥の予防にも役立つ。我々は、STIIを起こす口腔内への刺激因子(STIIのトリガー)として、食物物性(食物のtexture)が関与しているという仮説を立てた。

それを証明するべく、咀嚼前後での様々な食材の食物textureの変化を測定した。更には、咀嚼後に食物が咽頭を通過するのにかかる時間に関して嚥下造影検査を用いて調査した。その結果、咀嚼後にはどのような食物を摂取しても、無意識下では食物物性は特徴的な変化をすることが知られた。また、咽頭通過時間もほぼ一定になる事が知られた。ただ、今回研究に用いた食物に関しては、嚥下しやすいゼリー状のものが主体であり、今後は固形物や水分含有量の少ない物および咀嚼をしても性質を変える事が困難なものを含めて検討していく必要があると考えられた。多発筋炎や皮膚筋炎の患者の嚥下時の咽頭収縮力をNIHが作成したIMGEと呼ばれる、画像計測ソフトを用いて測定した。この結果から、これらの患者では、四肢筋力に相関して嚥下に関連する筋群の筋力低下も進むことが示唆された。
波長ルーテイングを用いた短距離高速光通信の研究

アクセス網の個々の加入者に波長を割り当て、下り10Gbps,上り2.5Gbpsの高速な信号をWDM-PONで提供する検討を行い、パターン効果を抑圧した半導体光アンプの利得圧縮を利用して注入同期したFP-LDを用いて下り10Gbps,上り2.5Gbps伝送実験を実現させた。さらなる次世代のアクセス網として各加入者に1Tbpsを提供可能な空間多重・波長多重並列光伝送の両方を組み合わせたSDM-WDM並列光伝送を提案した。空間多重の並列光伝送と個々のノードに波長を割り当て、波長をアドレスとした波長ルーテイングを用いたフォトニックLAN(パラウエーブネットワーク)を提案・検討し、波長切り替えの基礎実験を行った。本研究は、ノードや光端末に波長を割り付けて、波長をアドレスとした波長ルーテイングを用いた短距離高速光通信により、将来の高速短距離光通信技術を開拓することを目的としている。具体的には光LAN(ここではフォトニックLANと呼ぶことにする)と光アクセス網の構築形態のひとつであるWDM-PONを対象に、波長をアドレスとした波長ルーテイングを用いた高速光通信を研究する。空間分割(SDM)である並列光伝送と波長ルーテイングを併用したフォトニックLANは申請者の独自提案でユニークであり、他に検討している例がない。また、注入同期技術を光アクセス網に適用する検討では、申請者と独立に他の国でも勢力的に検討されている。今年度は上記の研究内容のうちで、(1)注入同期技術の欠点である厳密なLD温度制御の課題、特にWDM-PONでのLD温度制御の緩和について、今までに検討してきた注入する波長数1波長をさらにもう一波長追加して2波長に増加することで注入同期の同期はずれを防止する案を提案し、これを実験で実証した。この結果を論文として公表した。(2)フォトニックLANのネットワーク構成方法について検討した。LANを階層的にとらえ、上位のネットワーク、下位のネットワークとし、各々のネットワークについて構成方法を網のシンプルさとスループットに主力をおいて検討を進めている。一部の結果を電子情報通信学会総合全国大会にて発表した。空間分割も(SDM)である並列光伝送と波長ルーテイングを併用したフォトニックLANは申請者の独自提案でユニークであり、他に検討している例がない。また、注入同期技術を光クセス網に適用する検討では、申請者と独立に他の国でも勢力的に検討されでいる。今年度は上記の研究内容のうちで、以下の検討をした。(1)光アクセス網のWDM-PONでの検討において、下り信号光波長を用いてFP-LDに注入同期する事で上りの伝送にも波長を再利用する方式がある。この方式では下り信号の消光比を小さくしないと安定な注入同期が実現しない。しかし、消光比を小さくすると下り信号の受光特性が劣化する。これを半導体光アンプの利得飽和特性を利用する事で解決する方法を提案し、検討した結果を論文(IEEE)として公表した。(2)光アクセス網のWDM-PONの次の高速システム(各加入者に100Gbpsや1Tbps)構成案として、昨年度IEICEの研究会(OFT)にてSDM-WDM並列伝送の提案を行った。これの検討を深め、研究会(OFT)にて発表すると共に論文(JOC)としても公表した。本研究は、ノードや光端末に波長を割り付けて、波長をアドレスとした波長ルーティングを用いた短距離高速光通信により、将来の高速短距離光通信技術を開拓することを目的としている。具体的には光LAN(ここではフォトニックLANと呼ぶことにする)と光アクセス網の構築形態のひとつであるWDM-PONを対象に、波長をアドレスとした波長ルーティングを用いた高速光通信を研究する。空間分割(SDM)である並列光伝送と波長ルーティングを併用したフォトニックLANは申請者の独自提案でユニークであり、他に検討している例がない。(1)光アクセス網のWDM-PONでの検討において、目標の上り2.5Gbps下り10Gbpsの双方向伝送系を構築し技術課題の克服や課題の抽出を行い、その結果を論文として公表した。

(2)光高速LAN(フォトニックLAN Para-Wave NET)の検討を深めアレーLDを用いるのでそのLDに対する要求条件や課題につき検討しその結果を論文として公表した。(3)光高速LAN(フォトニックLAN Para-Wave NET)のネットワーク構成法について検討しその結果を論文として公表した。
糸状菌由来ポリケタイド合成酵素を標的とする生物活性天然物の探索

Aspergillus fumigatusは、ヒトアスペルギルス症の主たる原因菌であり、ヒトへの感染にはDHN-メラニンの生成が重要な要因となっている。ポリケタイド合成酵素(PKS)Alblpは、A.fumigatusにおけるDHN-メラニン生合成の最初の反応を触媒する鍵酵素であり、その阻害剤をスクリーニングするため、初年度は異種糸状菌での発現系を用いたアッセイ系を検討したが、菌体が集塊し、生育にバラツキが生じる、また、時間がかかる、などの問題点があった。そこで、単細胞で生育し、発現制御もしやすい酵母発現系を用いるin vivoアッセイ系の確立を試みた。まず、alb1 cDNAを酵母の発現ベクターpYES-DEST52に組み込み、発現プラスミドpYES-albYを構築した。これをphosphopantetheinyl transferase発現プラスミドpKOS12-128aとともに酵母INVSc1に導入した。この形質転換酵母にガラクトースとエタノールによる誘導をかけると、Alblpの発現と活性型への修飾によりAlblp反応の生成物であり、DHN-メラニンの前駆体であるYWA1を生産した。これは、糸状菌由来PKSの酵母での機能発現として初の例である。YWA1は406nmに極大吸収をもつことから、406nmの吸収をAlblp PKS活性の指標として、前培養した形質転換酵母を一晩誘導培養後、培養液を酢酸エチルで抽出し、その406nm吸光度を測定するアッセイ系を構築した。まず、Alblp阻害のコントロールとして、既知のPKS阻害剤であるセルレニンの阻害活性を本アッセイ系で確認した。次いで、このアッセイ系を用いて、糸状菌培養抽出液240サンプルをスクリーニングし、5検体に阻害活性を見出した。その中で強い阻害活性を示した2検体にっいて、活性本体を同定すべく培養条件、分離条件などを検討したが、単一活性物質の単離には至っていない。1新規ポリケタイド合成酵素遺伝子のクローニング糸状菌還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子として既にクローニングされているロバスタチンおよびT-トキシン生合成のPKSの配列をもとに、縮重入りプライマーをデザインし、ソラナピロン生産株Altanaria solaniのゲノムDNAを鋳型にPCRを行い、約900bpの断片を得た。その配列は既知の還元型PKSと高い相同性を示したことから、Alt. solaniのゲノムDNAコスミドライブラリーを構築し、このPCR断片をプローブとしたスクリーニングを行い陽性クローンを取得した。陽性クローンインサートの塩基配列を決定し、1個のPKS、1個の酸化酵素、および2個のCytochrome P-450からなる生合成遺伝子クラスターの存在を明らかにした。このPKSにはKeto Reductase, Enoyl Reductase, Dehydrataseといった還元型ポリケタイド合成酵素に特徴的なドメインが存在し、またMethyl Transferaseドメインも存在することから、このクラスターがソラナピロン生合成に関わるものと推測され、現在、親株の遺伝子破壊および異種糸状菌におけるPKSの発現によりその機能同定を行っている。2ポリケタイド合成酵素阻害活性評価系の開発新規に得られたポリケタイド合成酵素および、すでにクローン化したAtx, wA, PKS1, alb1各遺伝子を、異種糸状菌発現用プラスミドベクターに組み込み、A. oryzaeを形質転換し、各遺伝子の発現を誘導しポリケタイドの生産性を検討した。

このうち生産性の高かったナフトピロン合成酵素alb1による形質転換菌体を培養し、誘導培地に移植すると同時にテストサンプルを添加し、その後7日まで培地上清中に遊離してくるナフトピロンの量を410nmの吸光度にて経時的にモニターした。その結果、陽性対照薬として用いたセルレニン添加群では菌体重量に若干差がみられるものの410nmの吸光度増加は10mg/mlの濃度で完全に阻害され、天然物を対照とした一次スクリーニング系として利用可能なことが判明した。一方in vitroで高活性を示した形質転換体抽出タンパクについては各ポリケタイド合成酵素の精製を行い、放射性基質を用いる二次スクリーニング用のアッセイ条件を確立した。また、各種薬用植物・生薬を含水エタノールにて熱時抽出し、阻害活性の一次スクリーニング用のサンプルを調整した。Aspergillus fumigatusは、ヒトアスペルギルス症の主たる原因菌であり、ヒトへの感染にはDHN-メラニンの生成が重要な要因となつている。ポリケタイド合成酵素(PKS)Alb1pは、A. fumigatusにおけるDHN-メラニン生合成の最初の反応を触媒する鍵酵素であり、その阻害剤をスクリーニングするため、昨年度は異種糸状菌での発現系を用いたアッセイ系を検討したが、菌体が集塊し、生育にバラツキが生じる、また、時間がかかる、などの問題点があった。そこで、単細胞で生育し、発現制御もしやすい酵母発現系を用いるin vivoアッセイ系の確立を試みた。まず、alb1 cDNAを酵母の発現ベクターpYES-DEST52に組み込み、発現プラスミドpYES-albYを構築した。これをphosphopantetheinyl transferase発現プラスミドpKOS12-128aとともに酵母INVSclに導入した。この形質転換酵母にガラクトースとエタノールによる誘導をかけると、Alb1pの発現と活性型への修飾によりAlb1p反応の生成物であり、DHN-メラニンの前駆体であるYWA1を生産した。これは、糸状菌由来PKSの酵母での機能発現として初の例である。YWA1は406nmに極大吸収をもつことから、406nmの吸収をAlb1p PKS活性の指標として、前培養した形質転換酵母を一晩誘導培養後、培養液を酢酸エチルで抽出し、その406nm吸光度を測定するアッセイ系を構築した。まず、Alb1p阻害のコントロールとして、既知のPKS阻害剤であるセルレニンの阻害活性を本アッセイ系で確認した。次いで、このアッセイ系を用いて、糸状菌培養抽出液240サンプルをスクリーニングし、5検体に阻害活性を見出した。その中で強い阻害活性を示した2検体について、活性本体を同定すべく培養条件、分離条件などを検討したが、単一活性物質の単離には至っていない。
準定常分布を用いた増殖過程の過度的挙動に関する研究

本研究では,定められた敷居値を境に出生率が異なる増殖過程の過渡的な挙動を調べるために,まず数値計算実験を行い,観測されたいくつかの性質に対して理論的な解析を試みた.得られた主な結果は以下の通りである.1.増殖過程が準定常状態に達する場合には,その途中において固体数は直線的に増加することが観測された.また,サンプルパスに対する大偏差理論を用いると,敷居値と出生率に関するある条件の下では,この現象が理論的に説明できることを示した.準定常状態から死滅に至る過程についても同様である.2.線形増殖過程では,一般に準定常状態を保つ時間の長さは,そこに至るまでの時間やそこから死滅するまでの時間の長さに比べてかなり長くなることが実験から判明した.これに対して,擬出生死滅過程においては,準定常分布を保つ時間の分布が指数的に減少することが理論的に証明された.また,そのときの減少率は,個体数自体の増減に関連して定まる減少率と,環境の影響を表すマイクロ状態の推移に関連して定まる減少率との大きい方に一致することが示された.線形増殖過程の準定常状態の分布は厚い裾を持つことが予想されており,この点で2つの過程の性質には大きな差があると考えられる.今回の数値実験では、準定常状態に達する過程が少なく、そのようなデータの採集に時間を要した.加重サンプリングなどのシミュレーション技法を応用して精度良いデータを効率よく集める工夫も今後必要であろう.本研究では,定められた敷居値を境に出生率が異なる増殖過程の過渡的な挙動を調べるために,まず数値計算実験を行い,観測されたいくつかの性質に対して理論的な解析を試みた.得られた主な結果は以下の通りである.1.増殖過程が準定常状態に達する場合には,その途中において固体数は直線的に増加することが観測された.また,サンプルパスに対する大偏差理論を用いると,敷居値と出生率に関するある条件の下では,この現象が理論的に説明できることを示した.準定常状態から死滅に至る過程についても同様である.2.線形増殖過程では,一般に準定常状態を保つ時間の長さは,そこに至るまでの時間やそこから死滅するまでの時間の長さに比べてかなり長くなることが実験から判明した.これに対して,擬出生死滅過程においては,準定常分布を保つ時間の分布が指数的に減少することが理論的に証明された.また,そのときの減少率は,個体数自体の増減に関連して定まる減少率と,環境の影響を表すマイクロ状態の推移に関連して定まる減少率との大きい方に一致することが示された.線形増殖過程の準定常状態の分布は厚い裾を持つことが予想されており,この点で2つの過程の性質には大きな差があると考えられる.今回の数値実験では、準定常状態に達する過程が少なく、そのようなデータの採集に時間を要した.加重サンプリングなどのシミュレーション技法を応用して精度良いデータを効率よく集める工夫も今後必要であろう.
蛋白質をブロットさせた膜上での細胞培養による蛋白質研究法の確立

1.二次元セルブロット法(II-D Cell Blot法)の確立。トリプシンで部分消化したフィブロネクチンを、二次元電気泳動後、PVDF膜に転写した。その膜上でフィブロネクチン細胞結合ドメインの存在するスポットを、抗体を用いて確認した。また、蛋白質を転写したPVDF膜上にbaby hamster kidney(BHK-21)細胞を培養し、一日後の細胞接着と細胞形態を肉眼的にあるいは、顕微鏡を用いて観察した。その結果、フィブロネクチン細胞結合ドメインの存在するスポットの位置と、細胞が膜に強く接着したスポットの位置とが一致した。PVDF膜上に転写された蛋白質の一次構造解析法は、アミノ酸シークエンサーを用いて確立している。すなわち、本法を用いて、細胞の接着、分化、死に関連する蛋白質を二次元電気泳動上のスポットとして確認し、そのスポットを切り出してアミノ酸配列を解析することにより、蛋白質の解析は、容易になった。2.二次元セルブロット法を用いて、肺小細胞癌培養細胞を神経様細胞に分化誘導させる分子を、肺腺癌培養細胞株培養上清中から、二次元電気泳動上のスポットとして確認した。蛋白質のアミノ酸配列解析から、本蛋白質が、新しい細胞分化誘導因子であることを明らかにした。3.我々の確立した、二次元セルブロット法を用いて、細胞の接着、分化、死に関連する蛋白質の解析をさらに進める計画である。本研究の目的は、細胞に形態変化を起こす蛋白質の活性を簡便に調べる方法を確立すること、及び、その方法を用いて、肺小細胞癌培養細胞を神経様細胞へ分化させる分子を同定し、肺小細胞癌細胞の分化機構を解明することである。今年度に行なった研究によって得られた新たな知見は、1、蛋白質をドットした膜(ウェスターンブロッティング用)上で細胞を培養し、その細胞の形態を観察することから、蛋白質の持つ機能を解析する方法を確立した。2、蛋白質を電気泳動(SDS-PAGE)後、ウェスターンブロットした膜上に細胞を培養し、その細胞形態を観察することから、活性を持つ蛋白質のバンドを同定する方法を確立した。3、上記研究法を用いて、肺小細胞癌培養細胞を神経様細胞へ分化させる分子を、肺腺癌培養細胞の培養上清中から見いだした。すなわち、肺腺癌(PC-9)の培養上清をSDS-PAGEした後、その蛋白質を膜にブロットし、その膜上に肺小細胞癌培養細胞(Lu-134A)を培養し、一日後、細胞を固定、染色し、細胞の形態を観察した。その結果、分子量約95kDa近辺のバンド上の細胞が、神経細胞様突起を伸展していることを認めた。このバンド上の蛋白質は、既知の細胞分化因子(ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、IVコラーゲン等)に対する抗体とは反応しなかった。この結果を、1996年の癌学会において報告した。また、肺小細胞癌培養細胞株(Lu-134A)が、ポリエチレンイミンや、肺腺癌培養細胞培養上清によって、著しく長い神経細胞様突起を伸展し、神経様細胞に分化することをJapanese Journal of Cancer Research(Vol.88,No.2,P.176-183,1997)に発表した。新しく見いだした細胞分化因子の解析を今後進める計画である。本研究の目的は、細胞に形態変化を起こす蛋白質を簡便に解析する方法を確立すること、及び、その方法を用いて、肺小細胞癌培養細胞を神経様細胞へ分化させる分子を同定し、肺小細胞癌細胞の分化機構を解明することである。今年度に行なった研究によって得られた新たな知見は、1、蛋白質を二次元電気泳動後、ウェスターンブロットした膜上に細胞を培養し、その細胞形態を観察することから、細胞形態変化誘導活性を持つ蛋白質を、二次元電気泳動上のスポットとして確認する方法を確立した。すなわち、細胞外基質の一種であるフィブロネクチンをトリプシンで部分消化したものを、二次元電気泳動した後、膜にブロットし、その膜上にBHK-21(baby hamster kidney)

細胞を培養し、細胞形態を顕微鏡を用いて観察した。その結果、フィブロネクチン細胞結合ドメインに対する抗体に反応する二次元電気泳動スポットの上に乗った細胞が、形態変化を起こし膜に強く伸展しているのを観察した。膜にブロットされた蛋白質の一次構造を決定する技術は確立している。すなわち、細胞に形態変化を誘導する蛋白質の精製、同定に役立つ有力な方法(二次元電気泳動-セルブロット法)を新たに確立した。2、上記研究法を用いて、肺小細胞癌培養細胞を神経様細胞へ分化誘導する分子を、肺腺癌培養細胞培養上清中から、二次元電気泳動のスポットとして見いだした。この結果を、1997年の癌学会において報告した。また、肺小細胞癌培養細胞株(Lu-134A)が、ポリエチレンイミンや、肺腺癌培養細胞培養上清によって、著しく長い突起を伸展し、神経様細胞に分化することをJapanese Journal of Cancer Research(Vol.88,No.2,P.176-183,1997)に発表した。3、肺小細胞癌細胞を神経様細胞へ分化誘導する分子の一次構造解析を、二次元電気泳動-セルブロット法を用いて進める計画である。さらに、未知の細胞形態変化誘導物質の解析を、本方法を用いて進める計画である。
道徳的および価値的判断における不完全情報への対処に関する比較文化研究

本研究は道徳的、対人的価値判断の場面で必要とする情報の一部が欠損している場合、その欠損にどのように対処するかを、文化との関係において研究することを目的とする。研究方法として、TAT及び文章完成法をモデルとして独自のシナリオ完成法を考案した。これは人間関係を述べた簡単な一文を与え、その前後に文を補って、一つのまとまった話にすることを求める方法である。被験者は文章を作成した後、それにしたがって、いくつかの質問項目に答える。この反応の分析により、不確定場面における道徳的判断及び意図の判断が同時に測定されるようになっている。6つのテーマについて、日本及び米国の男女学生60名に面接調査を行い、その反応を記録し、予備コーディングをおこなった。その結果にもとづき、コーディングの手引きを作成した。米国のデータの大部分と、日本の20ケースほどのコーディングを完了した。コーディング手法の日米間の調整をおこない、日米間の比較をおこなった。道徳的挿話の6つのストーリーについての判断では、日本では共生関係の侵害行為についての判断のほうが、個人への侵害行為に関しての判断よりも厳しく、アメリカではその反対の傾向が見られた。また、作成したストーリーの内容については、日本では関係性志向の内容が多く、それに対してアメリカでは、個人志向性の話が多く作成されていた。またコーディングによる分析では、感情的内容が明示されているもの、暗示されているもの共に日本の方が多かった。並行して行われた「尊敬できる人」に関する質問項目への反応では、日本では、対人的な配慮ができる人が上位の項目になることに較べて、アメリカでは"一般的能力の高い人"が上位の項目とされた。1.道徳的判断をめぐっての研究情報が不完全な場合にポジティブな情報を代置して判断する傾向に関し、更にこまかい分析をおこない理論的に考察をすすめた。2.知的能力の判断をめぐっての研究人の知的能力判断に関してさまざまな行動特性が手がかりとして用いられる場合、その用い方、重みづけの仕方について文化、年齢、世代の影響がどのようにあるかを見るために、知的能力の判断と各種行動特性との相関関係の発達的変化を検した。3.意図の判断をめぐっての研究例えば、電話で誘って、曖昧な判断で断られたような場合、相手の意図をどう推測するかについて、性差および文化差を検するため、日本人青年男女100人、米国人15人について4項目の調査を行った。性差は明瞭でなかったが、文化差としては日本人のほうが豊富な推論を行う傾向があった。4.社会的判断をめぐっての研究上と同じ被験者群に対し、文章完成法テストの方法を用いて、自己・家族・他人・社会関係等について反応を求めた。結果については、目下分析中であるが、自分に関する判断について、女子の方が外見的な記述を補いやすいという点で性差が認められた。5.行動の異常性の判断をめぐっての研究米国ミシガン大学において作成した仮想ストーリーに準拠して、日本の事情に適合するように再編し、日本人高校生30名、小学生30名について、面接調査を行った。その結果にもとづき、コーディングの手引きを作成し、平成6年3月1日現在、米国のデータの大部分と、日本の20ケースほどのコーディングを完了した。年度内にコーディング手法の日米間の調整をおこない、日米間の比較をおこなう。

現在までの結果では、感情的内容が明示されているもの、暗示されているもの共に日本の方が多かった。これと平行して、「尊敬できる人の条件」20項目を作成し、これをどのくらい重要と考えるかを4段階で評定させた。この結果についても、現在分析を進めている。なお、唐澤の担当する行動の異常性の概念をめぐっての調査はすでにデータ集めを終わり、日米比較をおこなっている。平成5年度までについては既に報告したので、平成6年度について述べる。1:シナリオ完成法のコーディングマニュアル作成研究方法として、TAT及び文章完成法をモデルとして独自のシナリオ完成法として作成されたデータを分析した。6つのテーマについて、米国の男女学生60名に面接調査を行い、さらに、これに対応する日本の大学生の反応を同じく面接調査により昨年度求められたデータにより、米国と共通するカテゴリーによるコーディングを行った。このコーディングマニュアル作成には、予想以上に時間と労力を必要とした。日米のコーディング者同士に言語概念としての相違が既にあり、そのあいだの調整が必要であったためである。こうした詳細な検討を通して、日米の道徳性に関する比較研究の上でも重要なものとなりうるコーディングマニュアルが作成された。2.コーディングマニュアルによるデータの分析道徳的挿話の6つのストーリーについての判断では、日本では共生関係の侵害行為についての判断のほうが、個人への侵害行為に関しての判断よりも厳しく、アメリカではその反対の傾向が見られた。また、作成したストーリーの内容については、日本では関係性志向の内容が多く、それに対してアメリカでは、個人志向性の話が多く作成されていた。3.「尊敬できる人」に関する質問項目への反応を分析した。日本では、対人的な配慮のできる人が上位の項目になることに較べて、アメリカでは"一般的能力の高い人"が上位の項目とされた。4.さらに上記の事柄を踏まえた実績報告書の作成をおこなった。
新規前がん病変とアポトーシスを指標とする大腸がん予防因子検出のための研究

大腸がん予防因子検出のためのbeta-catenin accumulated crypt(BCAC)発現を指標とした新規短期試験の有用性を検討するため,食用ゴマ中の抗酸化物質セサミノール配糖体,緑茶に含まれる新規抽出物ミリシトリン,樹皮に含まれるポリフェノールであるバチカノールCを被験物質としてBCAC発現への修飾効果を検索した。その結果,いずれの物質の混餌投与群においても化学発癌物質誘発BCAC及びaberrant crypt foci(ACF)の発現が基礎食投与群に比して優位に低下した。したがってセサミノール,ミリシトリン,バチカノールCは有望な大腸発がん予防物質である可能性が示唆された(いずれも投稿準備中)。今回検討したBCACモデルは,従来のACFと併用することで化学予防物質のスクリーニング法としてより詳細かつ正確な予知情報を提供するものと期待される。また大腸がん予防物質の可能性があるAuraptene(AUR)を大腸がん細胞(Caco-2,DLD-1,SW480,HCT116)に添加し,添加後2日目に起こる細胞動態の変化を検索した。その結果,すべての細胞においてAUR添加によって細胞増殖は低下し,同時に細胞周期はいずれの細胞においてもS-G2/M期へ集積していた。しかしながらアポトーシスに関しては,HCT116では添加濃度75μMまでにてアポトーシスが誘導されたが,それ以外の細胞ではアポトーシスは誘導されなかった(投稿準備中,2004年米国癌学会示説発表予定)。以上からAURの大腸がんに対するアポトーシス誘導性は細胞依存性が存在することが示唆された。このことは,アポトーシス誘導性を指標とした化学予防物質のスクリーニングを考えた場合,スクリーニング系としては未知部分が多いためprematureであることを示唆する。その一方で,細胞増殖能への影響というパラメーターが化学予防物質スクリーニングにより有用であることが示唆された。
活性化破骨細胞が産生する骨代謝調節因子の探索

骨組織の腫瘍において反応性骨増生がよく認められるが、本研究はその分子機構について明らかにすることを目的とする。今年度も骨軟部腫瘍の症例を通して幅広く反応性骨増生の観察を続けた結果、巨細胞腫瘍に頻繁に認められる反応性骨増生の場合と同様に破骨細胞の関与が強く示唆された。また、破骨細胞と反応性骨増生部位とは直接接していないことが普通であり、何らかの液性因子が反応性骨増生に係わっていることが考えられた。昨年度までに、吸収性セラミック上の破骨細胞の培養上清には破骨細胞形成を抑制する作用があること、吸収性、非吸収性骨代替材料上で形成された破骨細胞の培養上清には、ともにC2C12細胞の骨芽細胞への分化を促進する作用があることを明らかにしている。今年度は細胞の遺伝子発現解析をするため、本実験用に加圧成形法を用いて直径25mmのハイドロキシアパタイト(非吸収性セラミック)ディスク及びβ-TCP(吸収性セラミック)ディスクを作成した。これらのディスクの気孔率、表面形状及び成分を解析し、いずれも問題がないことを確認した上で、まずこのディスク上で従来からの打ち抜き法で作成したディスク同様、支障なく破骨細胞が形成され得ることを酒石酸抵抗性酸性ボスファターゼ染色及びDAPI染色で確認した。次に、RANKLタンパク存在下でそれぞれのディスク上にマウス大腿骨及び脛骨由来マクロファージを破骨細胞に分化させ、これらの破骨細胞からtotalRNAを抽出し、吸収性セラミック上の破骨細胞と、非吸収性セラミック上の破骨細胞が発現する遺伝子の差を、マイクロアレイを用いて網羅的に解析した。アレイ解析は、それぞれ2回行った実験試料を用いて行った。現在、吸収性セラミック上の破骨細胞と非吸収性セラミック上の破骨細胞の発現遺伝子を比較し、両者間で有意な差があると判断される遺伝子を検索している最中である。この結果に基づき、次の新たな研究プロジェクトを開始する予定である。骨組織の腫瘍において反応性骨増生がよく認められるが、本研究はその分子機構について明らかにすることを目的としている。まず、骨軟部腫瘍の症例を通して幅広く反応性骨増生の観察を行った結果、いずれも巨細胞腫瘍に頻繁に認められる反応性骨増生の場合と同様に、破骨細胞の関与が強く示唆された。次に、吸収性骨代替材料であるβ-TCP、非吸収性骨代替材料であるハイドロキシアパタイト、さらには、現在開発中である、弱い吸収性を有するハイドロキシアパタイトのディスクを作成し、その上でRANKL発現細胞とマウス骨髄マクロフアージを共存培養させ、破骨細胞を形成させた。この時の培養上清を採取、保管し、これを40%新鮮培養液に混合した培養液を用いでまず破骨細胞形成に及ぼす影響を確認したが、吸収性を有するセラミックの培養上清を含む培養液での破骨細胞形成は非吸収性のセラミックの培養上清を含む培養液での場合に比べて破骨細胞形成が弱まる傾向があった。一方、骨芽細胞分化に及ぼす影響を確かめるために、骨形性因子BMP-2で刺激して骨芽細胞への分化を誘導したC2C12細胞への影響を確認した。吸収性、非吸収性骨代替材料上で形成された破骨細胞の培養上清は、ともにC2C12細胞の骨芽細胞への分化を促進した。また、我々が開発したハイドロキシアパタイトディスク上ではBMP-2によるC2C12細胞の分化誘導が著しく遅延することを見いだしたが、この細胞に上記の培養上清を添加すると、同様に骨芽細胞への分化促進が確認された。平成19年度はこれらの実験系を用いて遺伝子発現解析を行う予定である。

アレイ解析は、それぞれ2回行った実験試料を用いて行った。現在、吸収性セラミック上の破骨細胞と非吸収性セラミック上の破骨細胞の発現遺伝子を比較し、両者間で有意な差があると判断される遺伝子を検索している最中である。この結果に基づき、次の新たな研究プロジェクトを開始する予定である。
近位尿細管アシドーシスに対する新規薬物療法の開発

NBCe1変異による遺伝性近位尿細管アシドーシスは重症の酸血症や眼症状、成長障害など多彩な臨床症状を呈する難病である。新規NBCe1変異として早期停止型W516X変異が同定されたため、この変異を組み込んだノックインマウスを作成した。W516Xホモマウスはノンセンス変異依存mRNA分解機構によるNBCe1機能低下のために重度の酸血症、成長障害、眼症状などを呈し、ヒトの近位尿細管アシドーシスのよい動物モデルであり、分子治療法の評価に有用であると考えられた。一方、他の家系における解析から細胞膜発現を欠如するNBCe1変異が片頭痛を生じることも明らかにした。本研究は重症の酸血症、成長障害、失明などを伴う難病である遺伝性近位尿細管性アシドーシスに対する有効な治療法を開発するために立案された。今年度はナトリウム重炭酸共輸送体(NBC1)の新規に同定された変異W516Xを遺伝子工学的手法を用いて組み込んだノックインマウスの樹立とその解析を行った。W516Xホモマウスは低体重・発育不良・貧血・脾腫・高尿素窒素血症ならびに著明な代謝性アシドーシスを呈し、未治療では生後20日前後で全例死亡した。またホモマウスではNBC1のmRNAおよび蛋白発現を認めず、変異mRNAの分解機転が働いていることが示された。一方、ヘテロマウスは野生型に比べごく軽度の代謝性アシドーシスを示したが、ほぼ野生型と同等の発育を示した。単離した近位尿細管を微小潅流し細胞内pH測定法によりNBC1活性を比較したところ、ヘテロマウスでは中程度の活性低下(野生型の約60%の活性に相当)を認め、ホモマウスでは著明な低下(野生型の約15%程度の活性)を認めた。Stop-flow法により測定した近位尿細管重炭酸再吸収量についてもほぼ同様であった。ホモマウスに対して重炭酸投与を行ったところ、アシドーシス・貧血・脾腫・高尿素窒素血症などの改善に伴い、著明な寿命延長が見られた。このようにして得られた生後30日以上生存したホモマウスでは角膜浮腫による角膜混濁を認めた。以上より、W516Xノックインマウスはヒトの近位尿細管性アシドーシスの表現型を再現する適切な動物モデルであることが示された。今後、PTC124およびアミノグリコシドなどの治療判定を行う予定である。重症の酸血症、成長障害、失明などを伴う難病である遺伝性近位尿細管性アシドーシスに対する有効な治療法を開発するためにナトリウム重炭酸共輸送体(NBCe1)の変異W516Xを組み込んだノックインマウスの樹立とその解析を行った。生後30日以上生存したホモマウスでは角膜浮腫による角膜混濁を認めた。以上より、W516Xノックインマウスはヒトの近位尿細管性アシドーシスの表現型を再現する適切な動物モデルであることを報告した(Kideny Int 2011)。PTC124による分子治療を試みているが、現在までin vivoでは十分な効果が得られていない。眼症状を伴う遺伝性近位尿細管アシドーシス(OMIM60428)は重症の酸血症による成長障害に加え、失明に至る重度の視力障害、片麻痺を伴う片頭痛、精神発達遅延など多彩な臨床症状を呈する難病であり、有効な治療法は未だ確立していない。現在までに12種類のナトリウム重炭酸共輸送体NBCe1変異が同定・解析され、NBCe1機能低下の原因として異なる分子機序が働いていることが明らかになっている。

本研究はまずNBCe1の早期停止型変異W516Xノックインマウスの表現系を明らかにした後、この変異に対する低分子化合物PTC124によるread-through効果をin vivoの系で確認するとともに、in vitroの系での解析も合わせ、作用機序の詳細や至的条件を同定する目的で立案された。作成されたW516Xノックインホモマウスは予想通り近位尿細管におけるNBCe1発現が著明に減少しており、血中重炭酸濃度4mM耐程度の重度の酸血症と生長障害を呈していた。ホモマウスから単離した近位尿細管におけるNBCe1活性と重炭酸再吸収量は共に野生型の20%以下と著明に低下しており、NBCe1の近位尿細管重炭酸再吸収における重要性が再確認された。未治療のホモマウスは酸血症のため生後20日程度で全例死亡してしまうが、アルカリ治療によって生後2ヶ月程度まで延命が可能となった。そうしたホモマウスの眼を観察すると角膜浮腫による角膜混濁を呈していた。以上よりヒトの眼症状を伴う近位尿細管アシドーシスをよく再現できる動物モデルが作成されたため、現在invivoおよびinvitroの系でPTC124の効果を検討している。
マウス遺伝学的手法を用いた栄養素の脳機能に対する役割の解明と障害改善への応用

脳機能に対する栄養素の役割を明らかにして、栄養素を脳機能障害改善に役立てることを目標として、レチノイン酸とトリプトファンに着目して研究を進めた。(1)レチノイン酸受容体RARコンディショナル変異マウスの作製と解析テトラサイクリンシステムによる制御下で野生型あるいはドミナントネガティブ型RARを発現制御可能なコンディショナル変異マウスの作製及び解析を進めた。同時に野生型RARを前脳領域特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスの作製及び解析も進めた。外来遺伝子の高発現が観察されたトランスジェニックラインを用いた行動学的解析から、成体のマウスにおいて野生型RARが高発現した場合には、空間記憶・恐怖記憶及び社会認知記憶形成能力が顕著に向上することが示された。これら変異マウスではRARの標的遺伝子であるRARβの高発現が観察されたことから、レチノイン酸情報伝達経路が学習・記憶能力を正に制御することが示唆された。また、ドミナントネガティブ型RAR変異体過剰発現マウスの作製にも成功し、今後解析を続ける予定である。(2)脳機能に影響を及ぼす栄養素の検索とその脳機能に対する役割の解析;神経伝達物質セロトニンの前駆体である必須アミノ酸トリプトファンの制限食をマウスに給餌することで、トリプトファン長期摂取制限の学習・記憶能力に対する影響を解析した結果、トリプトファン摂取制限は扁桃体依存性の学習・記憶能力には影響を与えなかったが、海馬依存性の恐怖条件付け文脈学習能力の減退が観察された。一方、トリプトファンの制限量を制限すると情動行動に変化が観察されることから、申請者らが開発した不安障害モデルマウスであるCaMKII過剰発現マウスにトリプトファン制限食を給餌した。その結果、トリプトファン摂取制限により、変異型マウスの示す不安行動亢進が緩和されることが明らかとなり、トリプトファンの摂取調節によって精神障害が改善されることが強く示唆された。今後のトリプトファン摂取調節による不安障害緩和への応用が期待された。本年度は、脳機能に対する栄養素の役割を明らかにして、栄養素を脳機能障害改善に役立てることを目標として、レチノイン酸とトリプトファンに着目して研究を進めた。(1)レチノイン酸受容体RARコンディショナル変異マウスの作製と解析テトラサイクリン応答領域制御下で野生型あるいはドミナントネガティブ型RARを発現するコンディショナル変異マウスを作製し、さらに、前脳特異的にテトラサイクリン依存性転写因子を発現させたトランスジェニックマウスと交配させて、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。また、同時に野生型RARを前脳領域特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスの作製も進めた。外来遺伝子の高発現が観察されたトランスジェニックラインを用いた行動学的解析から、成体のマウスにおいて野生型RARが高発現した場合には、空間記憶及び恐怖記憶形成能力が向上することが示された。また、これら変異マウスではRARの標的遺伝子であるRARβの高発現が観察され、RARの活性化が学習・記憶能力を正に制御することが示唆された。一方、この過剰発現は不安行動を亢進することも示唆された。2)脳機能に影響を及ぼす栄養素の検索とその脳機能に対する役割の解析;神経伝達物質セロトニンの前駆体である必須アミノ酸トリプトファンの制限食をマウスに給餌することで、トリプトファン長期摂取制限の学習・記憶能力に対する影響を解析した。その結果、トリプトファン摂取制限は扁桃体依存性の学習・記憶能力には影響を与えなかったが、海馬依存性の恐怖条件付け文脈学習能力の減退が観察された。

脳機能に対する栄養素の役割を明らかにして、栄養素を脳機能障害改善に役立てることを目標として、レチノイン酸とトリプトファンに着目して研究を進めた。(1)レチノイン酸受容体RARコンディショナル変異マウスの作製と解析テトラサイクリンシステムによる制御下で野生型あるいはドミナントネガティブ型RARを発現制御可能なコンディショナル変異マウスの作製及び解析を進めた。同時に野生型RARを前脳領域特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスの作製及び解析も進めた。外来遺伝子の高発現が観察されたトランスジェニックラインを用いた行動学的解析から、成体のマウスにおいて野生型RARが高発現した場合には、空間記憶・恐怖記憶及び社会認知記憶形成能力が顕著に向上することが示された。これら変異マウスではRARの標的遺伝子であるRARβの高発現が観察されたことから、レチノイン酸受容体の活性化が学習・記憶能力を向上させること、レチノイン酸情報伝達経路が学習・記億能力を正に制御することが示唆された。また、ドミナントネガティブ型RAR変異体過剰発現マウスの作製にも成功し、今後解析を続ける予定である。2)脳機能に影響を及ぼす栄養素の検索とその脳機能に対する役割の解析;神経伝達物質セロトニンの前駆体である必須アミノ酸トリプトファンの制限量を制限すると情動行動に変化が観察されることから、申請者らが開発した不安障害モデルマウスであるCaMKII過剰発現マウスにトリプトファン制限食を給餌した。その結果、トリプトファン摂取制限により、変異型マウスの示す不安行動亢進が緩和されることが明らかとなり、トリプトファンの摂取調節によって精神障害が改善されることが強く示唆された。今後のトリプトファン摂取調節による不安障害緩和への応用が期待された。
アイオネン交互共重合体の合成および機能

2.IIIの合成を検討している際に,I(m=2,3)とII(p=1)の1:1付加による新規なアイオネン・オリゴマ-(IV)の合成に成功した。IVはアイオネン・ポリマ-の生成における最初の中間体であり,I(m=2),II(Z=Br)の場合には70%以上の収率で得られた。二官能性単量体同志の反応の最初の中間体が高収率で得られた例はないので,この結果は注目に値する。また,IVは分子端に-N(CH_3)_2と-CH_2Zの両方の基を持つ鎖状アイオネン・オリゴマ-の最初の例でもあり,その溶液を加熱することにより通常の型のアイオネン・ポリマ-が得られた。(以上論文印刷中)3.III(Z=Br)と種々のα,ωージブロミドとの反応によりアイオネン交互共重合体(V)の合成を試みたが,両者の溶解性,吸湿性が大きく異なるために高重合体は得られなかった。4.3の結果から高重合度のVを得るためには,IIIの親水性を弱くすることが必要であると考え,Iの代りに4,4'ージピリジル等のより疎水性のジアミンとPーキシリレンジブロミド等のα,ωージブロミドと反応させて,2:1付加により鎖状アイオネン・オリゴマ-(VI)を合成した。これと種々のジブロミドとの反応によりVの合成を試み,生成物の構造を検討中である。また,VIの対アニオンをPF^-_6に変えることにより,VIとジブロミドとの反応を,アセトニトリル等の有機溶媒中で均一反応で行うことができるので,高重合度のVを合成できる可能性がある。そこでこの点についても検討中である。5.Vの合成が予想以上に困難であったために,その機能を測定するに至らなかったが,4の重合体の構造を確立後にこれを行う予定である。1.アイオネン交互共重合体2__を合成するための出発原料となるα,ωージアミン型オリゴマ-1__の合成が可能であることは以前に報告した。本年度は合成,構造決定の面から更に詳細な研究を行い,以前には構造に関して不明確な点のあった1__の構造を4DOMHz ^1HNMRの研究により正しいことを明確に示した。R=CH_3,R^1=ー(CH_2)_lー,R^2=ー(CH_2)_mー,ーCH_2CH_2(OCH_2CH_2)_pー,l=2,3,m24,Z=Cl,Brの場合に1__を純度よく合成することができた。2.現在,オリゴマ-1__の精製を行い,交互共重合体2__を合成するための準備を行っている。1__とα,coーシハロゲン化物(ZーR^3ーZ)を反応させる予定であるが,反応が均一に進行するような系を探索している。3.オリゴマ-1__の合成の研究を行っている際に,(CH_3)_2N(CH_2)_lN(CH_3)_2とZCH_2CH_2(OCH_2CH_2)_pZとの1:1付加により,新規なアイオネン・オリゴマ-3__を合成することに成功した(R=CH_3,l=2,3,P=1,Z=Cl,Br)。これはアイオネン・ポリマ-の生成における最初の中間体であり,このようなオリゴマ-が単離された最初の例である。3__を合成するためには,3__が析出し易いような媒体を希釈剤として用いることが必要であった。また,3__の溶液を加熱すると,通常の型のアイオネン・ポリマ-が得られた。4.アイオネン・ポリマ-の性質に関しては,湿度センサ-への応用について既に報告している。2__の型の交互重合体についても同様な研究を行う予定であるが,その準備として,従来の諸報告を整理して総説を書き上げた(Chemtechに投稿予定)。5.3の重要な発見に伴い,他の研究計画は次年度に行うことに変更した。(Z:ハロゲン)2.IIIの合成を検討している際に,I(m=2,3)とII(p=1)の1:1付加による新規なアイオネン・オリゴマ-(IV)の合成に成功した。

4.3の結果から高重合度のVを得るためには,IIIの親水性を弱くすることが必要であると考え,Iの代りに4,4'ージピリジル等のより疎水性のジアミンとPーキシリレンジブロミド等のα,ωージブロミドと反応させて,2:1付加により鎖状アイオネン・オリゴマ-(VI)を合成した。これと種々のジブロミドとの反応によりVの合成を試み,生成物の構造を検討中である。また,VIの対アニオンをPF^-_6に変えることにより,VIとジブロミドとの反応を,アセトニトリル等の有機溶媒中で均一反応で行うことができるので,高重合度のVを合成できる可能性がある。そこでこの点についても検討中である。5.Vの合成が予想以上に困難であったために,その機能を測定するに至らなかったが,4の重合体の構造を確立後にこれを行う予定である。
認知症疾患の原因となる異常蛋白質蓄積の伝播仮説に基づく実験的な病態の解析

認知症疾患の多くは大脳における異常な凝集蛋白の蓄積が原因で生じる.この異常蛋白蓄積は疾患の進行に伴い神経解剖学的に整然とした拡がり方をすることから,病変の拡がりと神経回路との関連が指摘されている.本研究では剖検脳組織の解析により,アルツハイマー病とその関連疾患である神経原線維優位型認知症の側坐核におけるタウ蛋白の異常凝集・蓄積が,側坐核に神経線維を送る主要な部位である海馬CA1と海馬支脚におけるタウ蓄積の程度と密接に関係することを明らかにした.この結果は,タウ蓄積病変の拡大が神経回路を介して生じることを示唆している.まず,研究基盤上の課題であった(20112012年の)研究所および都立松沢病院の移転,それに伴う両施設の超低温槽・保冷庫の更新等の結果生じた剖検脳試料の収納の混乱について,本年度,集中的に資源を投入したことにより整理が完了した.その間に,前年度に見出した神経原線維変化優位型認知症(tangle predominant dementia: TPD)における側坐核のtau異常蓄積に関してさらなる解析を進め,Alzheimer病: ADとの比較を行ったところ,tau伝播仮説と良く合致する知見を得ることができた.すなわち,側坐核および尾状核のtau蓄積の出現におけるTPDとADとの差異は,両疾患の海馬および大脳新皮質におけるtau蓄積分布の違い(大脳新皮質:AD>>>TPD,嗅内皮質:AD>TPD,CA1・支脚:AD<TPD)と,これらの部位と側坐核/尾状核との神経線維連絡とから説明が可能である.また線条体内部にはstriosome/matrixと呼ばれる神経化学的にヘテロな部位が存在し,それぞれへの大脳皮質,海馬からの投射に量的な差があるが,TPDにおける側坐核のtau異常蓄積もまだらに出現し,それがstriosome/matrixの構造に一致していることがわかった.これもTPDの側坐核におけるtau異常蓄積が,同疾患においてCA1・支脚のtau蓄積がADよりも高度であることに由来することを示唆する所見と考えられる.なお,この側坐核の研究の過程で,従来考えていたよりも(tau病変検出を目的としてルーチンで行っていた)Gallyas-Braak染色では十分検出できていないtau異常蓄積が存在する可能性が出てきたため,解析済みとしていた過去の症例についてAT8抗体を用いた再評価を開始した.本年度は,まず当研究室が所蔵している変性型認知症疾患症例について,異常蛋白質蓄積病変を免疫組織化学染色により確認する作業から開始した.これは従来,剖検脳病理診断における異常tau蓄積検出の大半を,長期間のホルマリン固定の影響を受けにくいGallyas-Braak染色(神経原線維変化,嗜銀顆粒,neuropil threadsやastrocytic plaques),Bodian染色によるPick球の検出により行っていたためである.その過程で,神経原線維変化型老年期認知症(SD-NFT)の側坐核に,従来知られていなかった異常リン酸化tau陽性神経細胞の出現を認めた.これはADの側坐核よりもはるかに高頻度であった.この側坐核のtau陽性細胞は,近接切片のGallyas-Braak染色標本ではほとんど観察されず,そのために今日まで気づかれていなかったものと推測される.リン酸化tau特異抗体である,AT8,AP422,PHF-1に加え,リン酸化非特異的なA0024,構造変化特異的なMC-1などにより非特異反応でないことを確認した.SD-NFT側坐核の凍結脳からsarkosyl不溶画分を調製し,脱リン酸化の後immunoblotを行ったところ,SD-NFTの側頭葉やADと同様,6バンドパターンを確認した.したがって,異常蓄積tauのアイソフォームが3R+4RパターンであることはSD-NFTの他の部位と同様である.ただ,免疫電顕では明確なfibrilを形成している部位は稀で,免疫反応は構造が不明瞭なライソゾーム様の部位に多く見られた.Gallyas-Braak染色がtauのどのような分子構造の変化を認識して陽性となるのかはいまだにわかっていないが,異常リン酸化と凝集・不溶化はその変化に先行して生じていると推測される.前年度の研究で課題となった点(試行ごと,ウェルごとのー本来生じるべきではないーばらつき)について,その克服に向けた実験を行った.しかし,結論としては本年度も,ヒト脳由来のシードを(1)安定して,かつ(2)十分な濃度・量で調製するところまで到達できなかった.さらに,ばらつきの要因が,recipient側の培養細胞にタウ遺伝子の過剰発現をさせる段階にも存在すると推測された.既報の文献で採用されている,Sarkosyl不溶画分をシードとして使う場合には,雑多な蛋白が,それも大量に含まれることになる.そして,その割合が(疾患によって異なるのはもちろんのこと)症例ごとに異なるた.immunoblotでは抗体による選択的ラベリングを行うのであたかも不溶性の凝集タウが大きな割合を占めているように見えるが,LC/MS/MSで解析を行うとタウの断片の検出頻度は決して高くないことがわかった.