hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正孔と電子を同時にドープした強相関電子系NiSの金属-非金属転移に関する研究

強相関電子系のNiAs型NiSはT_t=263K以下で電荷移動ギャップが0.1eV程度開くことにより、n型金属からp型非金属へ相転移する。NiSのNiを原子空孔で置換することはホールドープに相当し、Ti、V、Crで置換することは電子ドープに相当する。たとえば、電子ドープ型Ni_<1-x>Cr_xSのT_t以下の非金属相(低温相)の熱電能(S)の符号はx_c=0.015以上で正から負へ反転してしまう。そこで、本研究では、ホールと電子を同時にドープした(Ni_<1-x>Cr_xS)_<1-y>Sを注意深く作成し、Sを系統的に測定することにより、ホールと電子を同時にドープした強相関電子系について以下のような新しい知見を得た。(1)(Ni_<1-x>Cr_x)_<1-y>SのCrの固溶限界x_Lは、y=0のx_L=0.04に比べて、y=0.02ではx_L=0.20、y=0.04ではx_L=0.075であった。(2)y=0.02の試料では、低温相のSの符号はx=0.04までは正のままであるが、x_c=0.05以上で負に反転した。一方、y=0.04の試料では、低温相のSの符号はx_L=0.075においても正のままであり、y=0やy=0.02の試料のように負に反転することはなかった。(3)(Ni_<1-x>Cr_x)_<1-y>Sの低温相の磁化率の温度依存性において、キュリーワイス成分の重なりがみられた。さらに、低温相のSの温度依存性の解析から、y=0.02やy=0.04の試料においても、y=0同様、Crドープによりバリアブルレンジホッピングが起きていることがわかった。以上の結果(1)(3)から次のような物理的描像が浮かび上がってくる。yが大きい系ほど低温相のSの符号の反転濃度x_cが大きくなる傾向は、電荷移動ギャップ中のフェルミ準位近傍にアンダーソン局在による不純物準位が形成し始めるのに必要なCr濃度がyが大きいほど大きくなることを示唆している。すなわち、反転濃度x_cまでは、ドープされた電子は、原子空孔を導入することによって生じているpホールを補償しているのである。
少子高齢化社会に対応した子育て支援住環境システムの構築と実装に関する研究

本研究では、1住宅・施設計画の視点、2団地再生・リノベーション、3既存都市環境、4住情報の4つの領域を設定し、研究を進めている。各領域のこれまでの研究成果の概要は以下の通りである。1子育て支援を企図して建設された公営住宅団地の住環境の実態を捉えるため2018年10月に全戸対象としたアンケート調査を実施した。子育て支援住環境としての団地の共用空間のあり方、住戸内の和室と続き間の活用の可能性について分析を行った。2樫原団地(京都市)を対象として、子育て支援住環境の具体的デザインを検討した。和の空間が子育てにおいて有効ではないかと考え、和の空間要素を持つ住戸改修を提案した。この提案では、住戸内外の繋がりや子どもの成長に伴なう可変性に配慮している。さらに、この提案に対するアンケート調査を実施し、評価と問題点を把握した。3歴史的市街地に多く存在する細街路は、子育て世帯にとって生活空間としての可能性や交通安全性に利点があると考え、細街路に居住する子育て世帯のケーススタディを行った。子育て世帯による路地空間利用の実態および、利用を可能とする条件を把握した。また、地域コミュニティのケーススタディとして地蔵盆の調査を実施した。4大阪府内及び京都市内の子育て世帯を中心に、アンケート調査、ヒアリング調査、住み方調査などを行い、子育て世帯の住宅選択行動と住み替え時の住環境選好、住情報ニーズ、居住移動の特徴を明らかにし、行政や不動産業者による子育て世帯向けの住情報支援の現状と課題を明らかにした。各領域ごとのワーキングによって研究をすすめ、全体会議における情報交換および協議により調整を行っている。一部、予定していた住戸改修プロジェクトの実施が困難になっているが、代替の方法の検討により研究を推進している。今後も、設定した4つの領域ごとに研究を推進する。各領域における推進方策は以下の通りである。12018年に実施したアンケート調査の詳細な分析を進める。団地に併設される福祉施設が果たす役割、団地内の共用空間の領域意識などの分析を加えて、現住宅の評価を行い、公営住宅における子育て支援として組み込むべき整備について議論する。2当初計画では、2019年度に樫原団地における子育て住戸改修を実現・検証する予定であったが、所有者である京都市住宅供給公社の方針変更に伴い、実現が困難となっている。そのため、建築士が参加する設計実験WS等の代替の研究方法を行うことで、子育て支援住環境において有効なデザインを明らかにする予定である。3細街路に居住する子育て世帯を対象とする調査を継続するとともに、細街路に位置する長屋を子育て世帯向けに改修する実例を通じて、課題について実践的な検討を行う。また、地域コミュニティ運営の具体的な事例として、地蔵盆を対象とした調査を実施する。4実際に、子育て世帯に役に立つ住情報支援の体制づくりを目標に、子育て世帯を取り巻く社会の情勢やニーズを踏まえた、多様な住情報支援主体による情報提供の可能性について検討していく。

また、地域コミュニティ運営の具体的な事例として、地蔵盆を対象とした調査を実施する。4実際に、子育て世帯に役に立つ住情報支援の体制づくりを目標に、子育て世帯を取り巻く社会の情勢やニーズを踏まえた、多様な住情報支援主体による情報提供の可能性について検討していく。
疎プロトン性溶媒中でのイオン多重体生成-イオンの酸塩基性および容媒効果-

従来、1:1電解質からの対称的な三重イオン生成反応は、低誘電率(εγ<10)溶媒中でのみ起こり得るものであるとされてきた。本研究は、電気伝導度法および吸光光度法により、中程度ないし高い誘電率(25<εγ<65)を有する溶媒中で、水素結合や配位結合力によって三重イオンなどのイオン多重体が生成することを明らかにすることを目的とした。同時に、三重イオン生成とイオンの酸塩基性および溶媒との関連性を明らかにした。塩基性の異なる種々のアミン類とハロゲン化水素酸との間の塩BH^+X^- (B=N-メチルジオクチルアミン、1,3-ジフェニルグアニジン、N,N-ジエチルアニリンなど、X=Cl,Br)からの三重イオン生成反応を確認した。このとき、塩を構成する塩基Bの塩基度が小さい方が、三重イオンを生成しやすいことが明らかとなった。一方、アニオンについては、ハロゲン化物イオンの他、酸性度の異なる酸からの共役イオンについて検討し、アニオンの塩基性が強い程、三重イオン生成が起こりやすいことを明らかにした。三重イオン等のイオン多重体生成は、溶媒和力の小さい溶媒、すなわち、溶媒のドナー数およびアクセプター数が小さい溶媒中で起こりやすい。
新規脳保護法を導く脳内トランスポーターコントロールの解明

脳内にはmdr1aという物質があり、これにより多くの薬剤の脳内浸入が阻まれる。Mdr1aは内因性物質の移動にも影響する。今回、我々はmdr1aノックアウトマウスを使用して局所脳虚血モデルを作成し、血中のサイトカインやBcl-2などアポトーシス関連物質を測定した。結果、mdr1が存在することで虚血後のIL-6,Bcl-2やBaxの変化に影響し、脳へのダメージが助長されることが推察された。本年度は、脳内輸送担体であるP-gpが脳虚血後にアポトーシス関連物質やサイトカインにいかに影響するかを、mdrlaノックアウトマウスの一過性局所脳虚血実験により調査した。(実験方法)1)Mdrlaノックアウトマウスとワイルドタイプマウスによる一過性局所脳虚血モデルの作成:局所脳虚血はシリコンコーティングした6-0モノフィラメントを外頚動脈から挿入し、中大脳動脈起始部に留置、30分間虚血後、モノフィラメントを抜去し再灌流する。モデル作製中はレーザードップラー・フローメトリーを頭部に装着して中大脳動脈領域血流の変化を確認する。2)脳虚血後脳内領域別及び経時的な免疫化学的測定:再灌流後30分、3時間、6時間、12時間、24時間、48時間に麻酔下にて脳を取り出し、領域別に分けて冷凍保存。それをホモジネートしてから遠心分離等により分画ごとに抽出。それらのサンプルを使ってP-gp、Bclファミリー、ウェスタン・プロッティング法により検出。また虚血後3時間・6時間に経心臓的に採血して血漿成分を抽出、そのサンプルからIL-1beta、IL-6などをELISA法により測定。(結果) Mdrlaノックアウトマウスでは正常マウスと比較して時間経過とともにBaxは低下Bcl-2は増加を示した。またIL-6はmdrlaノックアウトマウスでは正常マウスの約3分の1であった。以上の結果及び以前に報告したp-gpの存在が脳虚血後ダメージの大きさに影響するという結果を考慮すると、P-gpの存在が一部のアポトーシス経路を助長しまた、サイトカインの放出にも影響を及ぼし結果的に虚血後の組織障害の増加に繋がる可能性が示唆された。P-gpなどの脳内輸送担体は、アポトーシス関連物質やサイトカインなどとも密接に相互作用を及ぼしており、P-gp自体の脳組織内の局在的な特徴や働きから神経障害に影響していることが示唆されている。今回はP-gpの作用に関してmdrlaノックアウトマウスを使って一過性局所脳虚血モデルを作成し、再灌流後のサイトカイン(IL-1beta, IL-6, TGF-beta1)を測定、また組織内でのサイトカインの局在状況も確認追加した。実験方法:対象はmdrlaノックアウトマウス群とFVB正常マウス群。一過性局所脳虚血はシリコンコーティングした6-0モノフィラメントを外頚動脈から挿入し、中大脳動脈起始部に留置、30分間虚血後、モノフィラメントを抜去し、再灌流する。再灌流後、各設定時間に採血し、ELISA法にて各サイトカインの定量的測定を行なう。また、虚血後の脳組織切片を作成し、各サイトカインの局在を確認した。結果:現在のところIL-6は虚血再灌流後6時間時にmdrlaノックアウトにおいて正常マウスと比較して有意に低下を示した。IL-1beta, TGF-beta1に関しては両マウス間に明らかな違いはないが、更なる検討が必要と思われた。また組織標本による各サイトカイン局在は、両マウス間での明らかな相違は認めなかった。今回の結果より、以前局所脳虚血によるダメージが、mdrlaノックアウトマウスの方が正常マウスより有意に少なかったを報告しており、その結果に今回の結果を加えることで、脳虚血時のP-gpの働きがより具体的に解明されることが予想される。脳虚血におけるサイトカインの活性状況に対する、脳内トランスポーターP-gpの影響を検討1)Mdr1aノックアウトマウスとワイルドタイプマウスによる一過性局所脳虚血モデルの作成:局所脳虚血は6-0モノフィラメントを外頚動脈から挿入し、中大脳動脈起始部に留置、30分間虚血後、モノフィラメントを抜去し再灌流する。2)脳虚血後血液内サイトカインの測定:虚血前、再灌流後に採血し、IL-1beta、IL-6,TGF-beta1などをELISA法により測定。結果、IL-6はノックアウトマウスにて有意に減少していたことが判明。IL-1betaやTGF-beta1には有意な違いが見られなかった。3)脳虚血後脳内領域別及び経時的な組織化学的確認法:再灌流後での脳組織にサイトカインの集積像を観察。今回の結果では陽性像の判別が困難であったため、正常マウスとノックアウトマウスにおける違いは結論に達しなかった。

本年度よりLaser Speckle Imagingによる脳血流測定を開始、これにより虚血後の反復血流測定が可能となった。ここまでの結果ではノックアウトマウスと正常マウスにおける血流回復変化に違いが認められたが、今後はより詳細な検索が必要。Mdr1a由来P-glycoproteinは薬物の脳組織内への浸透をコントロールしているが、虚血に対する影響やサイトカインなどの内因性物質への影響も報告されている。我々はこれまでノックアウトマウスを使用して、P-gpの存在が脳虚血のダメージに影響することを報告してきた。本年度の実験結果より、IL-6に対するP-gpの影響が大きく、このことが結果的に虚血脳においてP-gpが組織ダメージに影響を及ぼす一因と示唆された。これまでの脳虚血でのP-gpの影響に関する実験結果を加えて考察すると、虚血での脳内トランスポーター対策は脳保護に繋がる戦略と考える。
哺乳類中枢神経系の発生におけるPOU転写因子の機能

本研究では、Class III POU転写調節因子群(Brn-1,Brn-2,Brn-4)の哺乳類の神経発生、特に中枢神経系の神経系譜の決定と制御における機能の解明を目的として、これらの遺伝子が欠損したマウスを樹立し、その解析を行っている。Brn-1欠損マウスの解析からは中枢神経系の組織学的解析から海馬の層構造に異常があることが判明し、Brn-1が海馬の形成に重要な機能を有することが明らかとなったが、中枢神経系他の多くの領域では異常は明らかでなかった。また、生後48時間以内に死亡する原因が腎不全であることを突き止めた。腎臓でも、Brn-1が機能していることは興味深く、現在免疫組織化学等によりこれらの詳細な解析を行っている。Brn-4欠損マウスは高度難聴となることが、生理学的解析(ABR,AP等)から明らかとなった。現在、聴覚系を中心に組織学的解析を行っている。我々はさらにBrn-1欠損マウスとBrn-2欠損マウスの交配により両遺伝子を欠損したマウスを作成した。Brn-1,2二重欠損マウスは生直後に死亡し、中枢神経系の組織学的解析から、各遺伝子の単独欠損マウスでは認められない新たな異常を発見した。これはBrn-1,Brn-2遺伝子の機能的代償性を示すものでありその詳細な組織学的解析により、その詳細な機構が解明されることが期待される。今後はBrn-1,Brn-2,Brn-4遺伝子の二重、三重欠損マウスを作製し解析することにより、これらの遺伝子の機能の全貌が明らかになるであろう。また、これらの各変異マウスから抽出したRNAを用いたDifferntial Display法により、クラスIII POU転写調節因子群の標的遺伝子の同定を試みる予定である。
新古典輸送効果を含むMHD平衡安定性解析

MHD平衡を決定するためには、磁気面関数としての圧力分布と電流分布が必要となる。そこで、この両者が新古典拡散によって決まると仮定してどのような平衡が達成されるかを調べた。本研究では、圧力分布は実験で得られるものに近いものに仮定し、電流分布が新古典拡散理論から導かれるブートストラップ電流を用いることにした。この電流分布を決定するためにはMHD平衡が必要であるので、平衡計算コードとブートストラップ電流計算コードを交互に計算し、電流分布と矛盾のない平衡解に収束するまて繰り返した。ここではヘリカル配位を取り上げ、核融合科学研究所で建設中のLHD装置のパラメタを用いて計算を行った。この配位では、もっとも不安定なMHD不安定性は交換型不安定性である。そこで得られた平衡に対して、理想交換型モードに対する安定性条件であるメルシエ条件に注目し、これが圧力分布が異なる場合にどのように変化するかについて調べてみた。まず、最初にP=P_0(1-PHI)^2の比較的ピ-キングしたプロファイルの場合について調べてみると、ブートストラップ電流を考慮に入れない場合には弱い不安定領域がプラズマ中に存在するだけであるが、ブートストラップ電流を考慮すると得られた平衡は非常に不安定なものとなった。これは、ブートストラップ電流が圧力勾配の大きい磁気軸近傍で多く流れ、またこの配位では回転変換を上昇させる向きに流れるため、シャフラノフシフトが小さく磁気井戸の安定か効果が弱くなったためである。一方、P=P_0(1-PHI^2)^2の比較的平坦なプロファイルの場合には、ブートストラップ電流が流れてもピ-キングした場合ほど不安定にはならず、ベータ値が低いときには安定であることが得られた。児の場合、ブートストラップ電流がプラズマ周辺部で多く流れるため、磁気軸近傍の回転変換は余り上昇せず、磁気井戸の安定化がある程度利いているためであると考えられる。
NMRによるCD44‐プロテオグリカン複合体の相互作用解析

細胞の遊走機構を理解する上で、細胞外マトリックスの主要成分であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(PG)と主要な細胞接着分子であるCD44との相互作用を構造生物学的に解明することは重要である。今年度は、CD44のヒアルロン酸(Hyaluronic acid ; HA)結合ドメイン(HA-binding domain ; HABD)とコンドロイチン硫酸(ChS)の基本骨格であるコンドロイチン(CH)との相互作用解析をNMR法により行った。まず、当研究室で開発された、分子間相互作用界面を正確に決定する手法である交差飽和法を適用した。その結果、CD44 HABD上のCH結合界面を同定することに成功した。次に、CHの結合に伴うCD44 HABDの化学環境の変化を検知する、化学シフト摂動実験を行った。その結果、顕著な化学シフト変化が、結合界面と異なる領域において観測された。これらの結果は、CH結合によってHABDに大きな構造変化が誘起されることを示す。昨年度報告したHA複合体形成における結合界面および化学シフト変化と比較すると、結合界面はほぼ一致しているが、構造変化に起因すると思われる化学シフト差が観測された。この結果は、HABDが異なる構造のリガンドに対して柔軟にフィットする可能性を示す。現在、コンドロイチン硫酸AおよびCについても解析を進めている。生体内において、ChS鎖はコアタンパク質に結合したPGとして存在している。遊離状態のChSとコアタンパク質結合状態のChSとの間でCD44による認識に差があるか否かは興味深い問題である。CD44とPGとの相互作用様式を解明する方法に、交差飽和法を速い交換系に適用する転移交差飽和法がある。測定条件を確立するため、SPR法による検討を進めている。HA結合状態でのCD44HABDの立体構造決定を進めており、最終的な構造精密化を行っている。CD44は、ヒアルロン酸(HA)やプロテオグリカン(PG)に結合する一回膜貫通型タンパク質であり、細胞接着・シグナル伝達への関与が示唆されている。CD44は、HAやPGに含まれるコンドロイチン硫酸(ChS)を、細胞外N末端側のドメイン(HABD : HA-bidding domain)を介して認識する。CD44HABDは、HA結合性相同領域であるリンクモジュール(LM)を含む。しかし、CD44はLMのみではHA結合活性を持たず、LM両端の付加配列も必要とする。CD44HABDは、単体、HA複合体とも立体構造は未解明であり、HA認識における構造生物学的知見は得られていない。当研究室の開発したNMRを用いた交差飽和法によるタンパク質複合体相互作用界面決定法を、CD44-HA間相互作用解析に適用した。まず、CD44に関する構造情報を得るため、CD44 HABDの二次構造を決定した。その結果、CD44 HABDは、他のHA結合タンパク質とのアミノ酸相同性が高いLMの立体構造を保持していること、さらに付加配列領域においてβシートを形成して広いHA結合面を形成していることが明らかになった。次に、HA結合界面を同定するため、交差飽和法を適用した。HAへのラジオ波照射により、LM内の11残基が選択的にシグナル減衰率20-60%の交差飽和の影響を受けたが、付加配列領域のG152にも同様な交差飽和現象が見られた。この結果は、付加配列領域にもHAと直接結合する領域が存在することを示す。さらに、化学シフト摂動実験を行った結果、顕著な化学シフト変化がLM内の7残基で観測されたが、付加配列においては実に18残基に観測された。これらの結果から、CD44 HABDのリンク・モジュール領域に加え、付加配列のG152近傍もHAと接触し、さらに付加配列全体に構造変化が誘起されることが強く示唆された。今後、HAからChS、さらにPGへと対象分子を展開する予定である。

CD44とPGとの相互作用様式を解明する方法に、交差飽和法を速い交換系に適用する転移交差飽和法がある。測定条件を確立するため、SPR法による検討を進めている。HA結合状態でのCD44HABDの立体構造決定を進めており、最終的な構造精密化を行っている。
基本転写因子TFIIEとTFIIHによる核内シグナル伝達と転写のカップリング機構

1.ヒトTFIIEαのZnフィンガー領域の構造解析ヒトTFIIEは、αとβの2サブユニットがα2β2の4量体を形成し、転写開始と伸長への移行に機能する。αは中央のコア領域にznフィンガーモチーフを有しており、この欠失変異体は試験管内転写系においてドミナントネガティブとして機能することから、転写において重要な機能を担っていると考えられる。さらに原核生物である古細菌類にも最近、ヒトTFIIEαのZnフィンガー領域を含むN末端領域だけがホモログとして存在することが示され、その種を越えた機能の重要性が考えられている。そこで我々は、この領域をNMRにより構造解析した。その結果、亜鉛依存に構造を形づくる、Znフィンガーモチーフであることが実証された。その機能について、現在解析中である。2.RNAポリメラーゼII(Pol II)の転写開始から伸長への移行段階の解析昨年度、線虫TFIIEβホモログを用いて、Pol II最大サブユニットC末端の7アミノ酸繰り返しCTD配列の2番目と5番目のセリンのTFIIHによるリン酸化のうち、5番目のセリンリン酸化が転写伸長への移行活性と密接な関連性があることを示してきた。そこで、今年度はさらにβサブユニットのC末端にTFIIEのこの転写伸長への移行活性に関与する領域があることを見い出した。この領域内のアミノ酸残基を点突然変異により置換してやると移行活性のみならず、Pol IIのリン酸化活性も大きく低下することを明らかにした。3.ヌクレオチド除去修復因子XPCの修復反応におけるTFIIHとの相互作用XPCは紫外線等によるDNAの損傷修復反応において損傷部位を認識して修復反応の引き金を引く因子であることを我々は明らかにしているが、今回このXPCがそのC末端でTFIIHと結合することが修復活性においても大変重要であることを示した。
腹膜線維症改善を目指したHGF & BMP-7遺伝子導入積層型中皮細胞シートの開発

腹膜透析患者の腹膜傷害は、中皮細胞の脱落が起因し、腹膜の線維化が生じる。よって、傷害を改善するアプローチとして、1.中皮細胞シートによる補充、2.肝細胞増殖因子(HGF)、3.骨形成因子7(BMP-7)による再生効果としてシートの積層化を用いた。結果、HGFならびにBMP-7遺伝子導入中皮細胞シートの積層型細胞シートの開発に成功した。本手法は、線維化改善に期待される。腎不全患者の代替療法の腹膜透析は、長期使用により腹膜の線維化や肥厚の合併症が懸念される。この改善効果をもつ因子の一つと考えられるBMP-7遺伝子をヒト中皮細胞株に遺伝子導入するため、BMP-7遺伝子をpEF-DESTベクターに組み込み、大腸菌により大量生成を行なった。バンドサイズを確認した結果、pEF-DESTベクターに目的のBMP-7遺伝子が組み込まれているのが確認された。pEF-DESTベクターには、Blasticidin耐性遺伝子が組み込まれている。仮にBMP-7遺伝子が細胞に導入されると、その細胞は薬剤であるBlasticidinを加えても死することはない。そのため、今回の研究で用いるヒト中皮細胞株のBlasticidin耐性を培養培地にBlasticidinを0から10□g/mlの範囲で添加して測定した。その結果、ヒト中皮細胞株25%コンフルエントの状態では、Blasticidin濃度が4□g/ml以上で培養5日目ではほとんど全ての細胞が死していた。これに対し、2□g/mlでは細胞が2%ほど生存していた。一方、100%コンフルエントの状態では、培養5日目で4、6、8、10□g/mlでそれぞれ95、98、99、100%の細胞死が観察されたが、2□g/mlでは50%程度残っていた。播種濃度に依存するが、培養10日目で全ての細胞が死する濃度は、2□g/mlであった。今回の結果より、今後ヒト中皮細胞株にBlasticidinを用いてBMP-7遺伝子を導入できることが示された。今回、BMP-7遺伝子をpEF-DESTベクターに組み込んだことで、どの細胞にもBMP-7遺伝子が導入される可能性が示され、今後線維化疾患に対するBMP-7を用いた新規治療法として非常に重要な知見を得た。また、BMP-7遺伝子導入細胞を用いた腹膜肥厚の軽減が示されれば、腹膜透析の普及と医療保険の軽減にさらに効果的である。ヒト中皮細胞株(Met)にHGF遺伝子あるいはBMP-7遺伝子を導入した細胞をリポフェクタミンを用いて作成した。HGFならびにBMP-7遺伝子のGAPDHに対する発現量は、導入無しでは0%に対して、HGFでは267.5±8.0%、BMP-7では7.9±0.2%であり、P<0.01であり、優位な遺伝子発現がみられた。その細胞と温度感受性培養皿を用いて培養を行い、温度を37°Cから20°Cに下げる操作のみで細胞のみが培養皿から剥離する手法を用いて、細胞のみから構成されるHGF徐放中皮細胞シート(HMCS+HGF)ならびBMP-7徐放中皮細胞シート(HMCS+BMP-7)の作成に成功した。HGF遺伝子あるいはBMP-7遺伝子無の細胞シート(HMCS)のHGFならびにBMP-7の発現量は0pg/mlであるのに対して、HMCS+HGFでは約240pg/ml、HMCS+BMP-7では約80pg/mlであり、有意に高い放出量を示し、遺伝子の発現量を反映していた。さらに、温度感受性培養皿を用いて、HMCS+HGFにHMCS+BMP-7を重ねたHGF&BMP-7遺伝子導入積層型中皮細胞シートの作製に成功した。よって、本手法はin vitroで安全に目的の遺伝子を導入した細胞を用いてシート作製が可能であり、更に積層化させることで、強度が向上し、異なる遺伝子発現をもつ組織の構築ができ、線維化疾患の改善の強力なツールとなることが期待される。
ダウン症を持つ子どものいる家族のレジリエンスを高めるライフサイクルに即した支援

家族支援にあたり個々の成員の思いを明らかにすべく、今回、日本ダウン症協会山梨県支部の会員の協力を得て、父親及びきょうだいの思いについて検討した。9名の父親のフォーカス・グループ・インタビューの分析から、7つのカテゴリー:【命の危機】【心の揺れ】【障がいの構え】【父親としての責任】【父親の自覚】【母親と父親の相違】【周囲の人との関わり】が抽出された。7名のきょうだいの作文を分析したところ、6つのカテゴリー:【同胞の存在を否定的にとらえる】【同胞の存在を肯定的にとらえる】【同胞の良さを認める】【大人になる過程】【ダウン症は一つの特性】【社会に対する憤り】対象はいずれも日本ダウン症協会山梨県支部の会員の協力を得て依頼した。父親および母親を対象にグループインタビューを実施し、きょうだいにはダウン症をもつきょうだいに対する思いについて作文を書いてもらった。子どもが6歳35歳までの父親10名にインタビューした結果を示す。1)生まれた当初のショックは大きい;2)就学に当たり、子どもに適した学校が選択できるよう、親の会でホームページを作りサポートすることの提案;3)子どもが高校生以上の6名中2名が退行を起こしており、どのようにしたら通常の生活に復帰できるかが問題であり、まだ高校生以下の子どもの親は退行を起こすか否かを心配し、起こさない工夫に関心を持っていた;4)2次性徴に付随する事柄を自分で対処できるようにするための工夫。男子については自分で対処。女子の場合は、母親が対処していたのでは、自立しないのできょうだいの力を借りるなどであった。きょうだいの有無が確認できないため、きょうだいの総数については不明であるが、今回協力の得られたきょうだいは、10代から20代の7名(男4名、女3名)であった。書かれた作文から、きょうだいに対する思いの言葉を切り出し、意味づけを行った。その結果、7名中6名は、「ダウン症をもつきょうだいのやさしさ」が自分にとって良い影響を与えてくれたと、プラスにとらえていた。アメリカ、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のMarcia Van Riper博士に、全米での親の会とMarcia博士との関わり、および彼女の研究についての結果について確認した。その結果、1)親の会を通じての相談等、メールや電話でコンタクトをとり続けサポートしている、2)全米にダウン症を専門とするクリニックが約50存在しており、出生前から、また出生後は育児から始まりライフサイクルに沿い医療のみならず生活全般の相談に応じているなど明らかになった。対象は、いずれも日本ダウン症協会山梨県支部の会員の協力を得て依頼した。1.急激退行を示すダウン症を持つ青年期の親を対象としたインタビュー調査:平成26年度に父親及び母親を対象としてインタビューした結果から、ダウン症をもつ者では青年期・成人期において急激退行が問題となっていることから、その事を不安に思う父親・母親も少なくない。また、インタビュー対象者の中にも引きこもり、あるいは退行を示すk子どもを持つ親もいることから、急激退行を起こしている子どもを持つ親、及び調査時点では問題なく過ごせている親を対象としてグループインタビューを実施した。父親のみ,及び母親のみの2グループで実施したが、いずれも、家に引きこもってしまった子どもに何もできず、対処に苦慮しているのが実情であった。相談しようにも適切な場所あるいは人がおらず、家族で抱え込んでいた。母親は、自分の育て方が悪かったのではと、自分を責めている者もいた。2. 10代から30代までのきょうだいを対象にグループインタビューを実施した。ダウン症を持つきょうだいの違いについては、親には時に説明されていなくとも、幼稚園の頃には小さいなどの特徴から気づいていくようである。特に3人きょうだいの真ん中で、上がダウン症をもつきょうだいだと、小学生くらいまでは何となく親に放っておかれる感じが強いようである。思春期に入る頃には、むしろ放っておいてほしい気持ちが強くなる。これは、ダウン症を持つきょうだいに対する親の態度を見ていても感じるようで、いつまでも小さい子どものように扱う親の態度を批判している。また、ダウン症を持つきょうだいとの年齢差、きょうだいの順位、親の考え方等それぞれの家族により異なることをきょうだい同士話し合うことで実感できていた。青年期・成人期のダウン症候群では、急激退行を示すことがあり、実際に経験している親は、適切な支援を受けられることもなく、そうした子どもを抱え込み苦慮している。このような親の状況を少ない対象ではあるが、父親、母親の立場から明らかにすることができた。また、きょうだいに関しては、出生順位、家族に支援者がいるか否かなど、きょうだいの置かれた状況により本院が変える問題も異なっていること、発達段階によってもきょうだいの抱える問題は異なること、親とダウン症をもつきょうだいとの関係を客観的にみて適切な判断をしていること、など明らかにすることができた。対象はいずれも日本ダウン症協会山梨県支部の会員の協力を得て実施した。1.父親をインタビューした結果をまとめ、Archives of Psychiatric Nursingに投稿し、掲載された。2.きょうだいのエッセイの分析に、新たに2名のエッセイを加え分析をしなおした。また、インタビュー結果をあわせた上で論文としてまとめている。近日中に英訳を依頼し、Archives of Psychiatric Nursingに投稿する予定である。

3.ダウン症を持つ子どもの親の気持ち、また高校までの成長の様子を冊子としてまとめ、公表するために、日本ダウン症協会山梨県支部会長を含む4名の母親とミーティングを重ね、内容について検討している。当初、きょうだいの作文を通してダウン症持つ同胞に対するきょうだいの思いを分析し、まとめる予定であったが、より状況を明らかにするべく、きょうだいのインタビュー追加することとした。しかし、中心となるきょうだいの結婚、大学受験、就職等により、日程調整が難しく、予定通りの進行とはいかなかった。ダウン症をもつ子どもの父親・母親にインタビューをしその思いをまとめた上で、新しく親になる人々、及びダウン症を持つ子どもやその家族にかかわりを持つであろう人々に、ダウン症をもつ子どものことや家族の思いについて理解を深めてもらうことを目的とし、「ダウン症を持つ子どものいる生活」と題する冊子を作成した。冊子の内容は、1)ダウン症ってなあに?、2)子どもの誕生から学校生活までお子さんの誕生・乳幼児期・小学校入学と学校生活、3)子どもたちの成長、さらに山梨県内における社会資源の紹介となっている。なお、冊子は、関連病院、及び市町村保健師等に配布、また日本ダウン症協会の山梨県支部を通して必要とする家族に配布した。家族支援にあたり個々の成員の思いを明らかにすべく、今回、日本ダウン症協会山梨県支部の会員の協力を得て、父親及びきょうだいの思いについて検討した。9名の父親のフォーカス・グループ・インタビューの分析から、7つのカテゴリー:【命の危機】【心の揺れ】【障がいの構え】【父親としての責任】【父親の自覚】【母親と父親の相違】【周囲の人との関わり】が抽出された。7名のきょうだいの作文を分析したところ、6つのカテゴリー:【同胞の存在を否定的にとらえる】【同胞の存在を肯定的にとらえる】【同胞の良さを認める】【大人になる過程】【ダウン症は一つの特性】【社会に対する憤り】ダウン症児の親を対象としたグループインタビューからは、父親の障がいを持つ家族に対する思いと変容、障がいを持つ家族と暮らすことで工夫している点、役に立った支援や必要とする支援などは一部明らかになってきた。また、きょうだいについても人数は多くはないが、障がいをもつ家族に対して成長過程では、なぜそのような行動をするのだろうかなど戸惑ったり、いらいらしたりなどの気持ちは持ちつつも、ダウン症をもつ家族の優しさによい影響を受けていた。ただし、年齢に応じて身近で相談できる人がそばにいることが重要であることも示唆された。そういったサポートがないと、きょうだい自身が自分の気持ちを整理できず、ダウン症をもつ家族に対する否定的な感情を抱いたまま成長していく可能性も示唆された。ダウン症児の親(父親・母親)及び兄弟を対象としたインタビューから個々の特徴を明らかにしたい。ことにきょうだいに関しては、一度試みたが、それを踏まえた上で、きょうだいの会の意義、きょうだいの会を実施していくに当たっての方向性、運営などについて検討していきたい。
脳腫瘍における腫瘍壊死因子動注療法による循環代謝の変動と治療効果に関する研究

Sprague-Dawleyラットの右大脳基底核に定位的にC6ラットグリオーマ細胞を注入接種して脳腫瘍モデルを作成した.移植後10日目にネンブタール麻酔下に右内頚動脈から腫瘍壊死因子(10,000単位)を注入し,4,8,24,72時間目に脳血流量を定量して無治療群と比較し,病理学的検討も併せて行った.脳血流量の測定は吸入麻酔下で大腿動静脈にカテーテルを挿入し,完全覚醒させた後に^<14>C-iodoantipyrineを30秒間で静脈内投与し,経時的に動脈採血を行い,RI注入終了時に断頭して摘出脳を凍結し,クライオスタットで冠状断切片を作成した.^<14>C-標準線源とともにX線フィルムに密着させ,オートラジオグラムを作成し,デンシトメーターで計測した黒化度から局所アイソトープ濃度を求め,^<14>C血中濃度と局所アイソトープ濃度から局所脳血流量を算出した.無治療群(n=5)では腫瘍中心部の血流量は60.6±13.9ml/100ml/min(mean±SD),辺縁部が72.5±10.2ml/100ml/minで,いずれも患側(122.7±18.7ml/100ml/min)および健側灰白質(135.7±20.2ml/100ml/min)と比較して低値であった(p<0.01).腫瘍中心部では血流量が動注4および8時間後に27.4±12.8ml/100ml/min(n=4),30.7±8.2ml/100ml/min(n=4)と有意に低下した(p<0.01).24時間後には組織学的に壊死が確認され,72時間後に血流量は15.7±11.1ml/100ml/min(n=3)まで低下して壊死域が拡大した.辺縁部でも血流量は動注4時間後に58.5±5.0ml/100ml/minと有意に減少し(p<0.05),8,24時間後にしだいに低下して72時間後には45.0±11.0ml/100ml/minまで減少した.一方,患側および健側灰白質では血流量に有意な変化はなく,腫瘍組織における選択的な血流低下が明らかとなり,腫瘍および正常組織の腫瘍壊死因子に対する感受性の差異が示された.Sprague-Dawleyラットの右大脳基底核に定位的にC6ラットグリオーマ細胞を注入接種して脳腫瘍モデルを作成した.移植後10日目にネンブタール麻酔下に右内頚動脈から腫瘍壊死因子(10,000単位)を注入し,4,8,24,72時間目に脳血流量を定量して無治療群と比較し,病理学的検討も併せて行った.脳血流量の測定は吸入麻酔下で大腿動静脈にカテーテルを挿入し,完全覚醒させた後に^<14>C-iodoantipyrineを30秒間で静脈内投与し,経時的に動脈採血を行い,RI注入終了時に断頭して摘出脳を凍結し,クライオスタットで冠状断切片を作成した.^<14>C-標準線源とともにX線フィルムに密着させ,オートラジオグラムを作成し,デンシトメーターで計測した黒化度から局所アイソトープ濃度を求め,^<14>C血中濃度と局所アイソトープ濃度から局所脳血流量を算出した.無治療群(n=5)では腫瘍中心部の血流量は60.6±13.9ml/100ml/min(mean±SD),辺縁部が72.5±10.2ml/100ml/minで,いずれも患側(122.7±18.7ml/100ml/min)および健側灰白質(135.7±20.2ml/100ml/min)と比較して低値であった(p<0.01).腫瘍中心部では血流量が動注4および8時間後に27.4±12.8ml/100ml/min(n=4),30.7±8.2ml/100ml/min(n=4)と有意に低下した(p<0.01).24時間後には組織学的に壊死が確認され,72時間後に血流量は15.7±11.1ml/100ml/min(n=3)まで低下して壊死域が拡大した.辺縁部でも血流量は動注4時間後に58.5±5.0ml/100ml/minと有意に減少し(p<0.05),8,24時間後にしだいに低下して72時間後には45.0±11.0ml/100ml/minまで減少した.一方,患側および健側灰白質では血流量に有意な変化はなく,腫瘍組織における選択的な血流低下が明らかとなり,腫瘍および正常組織の腫瘍壊死因子に対する感受性の差異が示された.
人工心臓ポンプ用材料の耐久性予測に関する基礎的研究

人工心臓ポンプへの応用を考えて、東洋紡績社の3種類のセブメント化ポリエーテルポリウレタン、及びエチコン社のバイオマー,アブコ社のアブコサン51について、引張試験,疲労試験,並びにX線光電子解析装置による表面層の組成分析を行った。その結果、バイオマーと、ソフトセグメントのPTMGの分子量が2000の東洋紡績社TM5が、ポンプ膜材料として必要な柔軟性,強度,靭性に優れることが明らかになった。また、PTMGが850のTMIは硬くて強度が高く、延性が低いのでカニューラやポンプハウジングなどの構造部材に適し、PTMGが1350のTM3は、血液適合性に優れる表面組成を有するので、血液接触面に有用であることがわかった。次いで、TM5とバイオマーを用い、耐久性を評価し、疲労寿命を予測するための加速試験法を開発するための基礎データを得る目的で、疲労挙動に及ぼす試験温度と繰り返し速度の影響を調べた。その結果、材料の弾性を表す応力振幅/ひずみ振幅比は0.8Hzから5Hzの間で周波数にほとんど依存せず、また24°Cと37°Cでは温度の影響を受けないが、50°Cでは変化が生ずることが明らかになった。これらの実験結果は、温度50°Cで周波数として5Hzの加速疲労試験が、これらの材料の耐久性の評価に利用できることを示している。最後に、TM5を用いて37°Cに保持した生理食塩水中で、50%の平均ひずみに、15%のひずみ振幅を5Hzの周波数で重疊させる耐久試験を行ったところ、毎分100回の心拍数に換算して約3.8年の間材料が破損しない結果が得られた。しかしながら、この間の平均応力の低下は破断時まで続き、これより人工心臓ポンプの長期間利用にあたっては、リラクセーションの問題が大きいことが指摘された。
地域在宅超高齢者における精神機能低下予防を目的とした訪問型介入プログラムの開発

高齢者の中でも特に後期高齢者(75歳84歳)および超高齢者(85歳以上)は,今後虚弱者の割合が増加することが知られており,高齢者のサクセスフルエイジング達成を支援する積極的な地域介入活動(介護予防事業)の推進が,今後の高齢者保健領域の重要課題となっている。本研究では,「回想法」を応用した訪問型介入プログラム(「自分史くらぶ」)に対する高齢者のニーズを調査した。65歳から89歳の都市部在宅高齢者2271名に対して面接聞き取り調査の勧誘を行い,1171名から有効回答を得た(調査参加率51.6%)。本介入プログラム参加に積極的な者は,65歳79歳では27%,80歳以上の高齢者では23%であった。次いで参加態度の関連要因を探索した。65歳79歳の高齢者では,心身の健康状態が優れる者,とくに高次生活機能,主観的幸福感,握力が高い者における参加態度が良好であることが明らかになった。一方80歳以上の高齢者では,慢性疾患罹患者が多い,身体的痛みの保有者が多い,日常生活に対する自己効力感の高い者において参加態度が良好であることが示された。65歳から79歳の比較的年齢が低い高齢者では,従来の知見と一致し,より心身の健康状態が優れる者が介入プログラムへの参加態度が良好であるという「自己選択バイアス」の傾向が認められた。一方で,80歳以上の比較的年齢が高い高齢者では,心身の健康状態が低下傾向に有る者のほうが介入プログラムへの参加態度が良好である傾向が認められた。上記知見から,本プログラムはより年齢が高く,心身の虚弱性が高い高齢者を介入対象とすることにより介入効果が認められやすい可能性が示唆された。
エチレンにより誘導されるダッチアイリスりん茎の花熟に伴う遺伝子発現

ダッチアイリス'ブルー・マジック'りん茎の茎頂よりRNAを抽出し,Poly Tプライマーを用いてcDNAを合成,PCRにより増幅して,DD法により遺伝子発現の解析を行った.これまで,低温感応性が認められず幼若期にあると考えられるエチレン処理を行っていない小球(9g球)の茎頂のみに発現していた遺伝子の特異的PCR産物(CG-01)に関して,りん茎の花熟との関連を明らかにした.まず,1999年産の高温経過前のりん茎の茎頂では,CG-01の発現量は大であり,大球(17g)でもわずかに発現が確認された.しかし,エチレン処理を行った直後の茎頂では,大球,小球ともCG-01の発現はみられなくなった.低温処理後に開花率を確認したところ,小球では0%,大球でも33%と低く,CG-01が発現していたりん茎茎頂は幼若期にあったことがうかがえた.そこで,夏を経過した後の小球を用いて,3'RACE法によりCG-01の3'末端側塩基配列を決定しようとした.その結果,400bp付近にCG-01の塩基配列から合成したプライマーとアダプターぷライマーの両者で増幅されたPCR産物が検出された.しかし,この塩基配列をCG-01の塩基配列と比較したところ,別の遺伝子のものであった.夏を経過すると,幼若期にある小球でもCG-01の発現が消失することが予想された.ダッチアイリス'ブルー・マジック'りん茎の茎頂よりRNAを抽出し,Poly Tプライマーを用いてcDNAを合成,PCRにより増幅して,DD法により遺伝子発現の解析を行った.これまで,低温感応性が認められず幼若期にあると考えられるエチレン処理を行っていない小球(9g球)の茎頂のみに発現していた遺伝子の特異的PCR産物(CG-01)に関して,りん茎の花熟との関連を明らかにした.まず,1999年産の高温経過前のりん茎の茎頂では,CG-01の発現量は大であり,大球(17g)でもわずかに発現が確認された.しかし,エチレン処理を行った直後の茎頂では,大球,小球ともCG-01の発現はみられなくなった.低温処理後に開花率を確認したところ,小球では0%,大球でも33%と低く,CG-01が発現していたりん茎茎頂は幼若期にあったことがうかがえた.そこで,夏を経過した後の小球を用いて,3'RACE法によりCG-01の3'末端側塩基配列を決定しようとした.その結果,400bp付近にCG-01の塩基配列から合成したプライマーとアダプターぷライマーの両者で増幅されたPCR産物が検出された.しかし,この塩基配列をCG-01の塩基配列と比較したところ,別の遺伝子のものであった.夏を経過すると,幼若期にある小球でもCG-01の発現が消失することが予想された.ダッチアイリス`ブルーマジック'のりん茎は,夏の高温を経過することによって幼若期から花熟状態に移行して,花芽分化のための低温に感応するようになる.しかし,高温経過前の掘り上げ直後のりん茎であっても,50100ppmのエチレンに数時間曝露するだけで,即時的に花熟状態となり,低温感応が可能となる.また,高温を経過しても花熟状態が成立しない小球(球重89g)においてもエチレン処理により花熟状態への移行が起こる.この特性を利用して,幼若期あるいは花熟状態にあるりん茎茎頂部に特異的に発現あるいは消失している遺伝子をRT-PCR法を利用したディファレンシャルディスプレイ法により解析した.その結果,cDNAの合成に11(T)CGを,その後のPCR反応にOP-26-01をプライマーとした場合に,幼若期の茎頂に特異的に発現している遺伝子の断片(300400bp)を増幅することに成功し,この遺伝子の発現は3年間を通じて高い再現性を示した.そこで,この遺伝子の341bpにわたる塩基配列を決定し,CG-01と命名した.塩基配列から,この遺伝子断片には比較的長いオープンリーデングフレームが存在し,タンパク質のアミノ酸配列をコードしている部分であることが予想されたが,既知の遺伝子との相同性は低かった.また,さらに詳しくCG-01の発現様相を検討した結果,CG-01は高温を経過する前のりん茎には発現しているが,高温を経過すると開花能力のない小球でも発現しなくなることが明らかになった.現在,CG-01の3'および5'の末端側の塩基配列を解析中である.ダッチアイリス'ブルー・マジック'りん茎の茎頂よりRNAを抽出し,Poly Tプライマーを用いてcDNAを合成,PCRにより増幅して,DD法により遺伝子発現の解析を行った.これまで,低温感応性が認められず幼若期にあると考えられるエチレン処理を行っていない小球(9g球)の茎頂のみに発現していた遺伝子の特異的PCR産物(CG-01)に関して,りん茎の花熟との関連を明らかにした.まず,1999年産の高温経過前のりん茎の茎頂では,CG-01の発現量は大であり,大球(17g)でもわずかに発現が確認された.しかし,エチレン処理を行った直後の茎頂では,大球,小球ともCG-01の発現はみられなくなった.低温処理後に開花率を確認したところ,小球では0%,大球でも33%と低く,CG-01が発現していたりん茎茎頂は幼若期にあったことがうかがえた.

そこで,夏を経過した後の小球を用いて,3'RACE法によりCG-01の3'末端側塩基配列を決定しようとした.その結果,400bp付近にCG-01の塩基配列から合成したプライマーとアダプタープライマーの両者で増幅されたPCR産物が検出された.しかし,この塩基配列をCG-01の塩基配列と比較したところ,別の遺伝子のものであった.夏を経過すると,幼若期にある小球でもCG-01の発現が消失することが予想された.
低分子化合物による巨大DNAの折り畳みの立体制御

荷電高分子鎖の折り畳み構造の制御方法の確立を目指して研究を行った。本年度は荷電高分子としては長鎖DNA分子に注目し、コイル-グロビュール転移との関連で、その高次構造変化について系統的に研究を進めた。得られた主要な成果は次の通りである。(1)側鎖にアミノ基を有するポリエチレングリコール(PEG-A)を加えることによるDNA分子の高次構造変化を、蛍光顕微鏡による単一分子観察法を活用することにより調べた。その結果、PEG-Aを添加すると、DNAの一分子内にグロビュール構造とコイル構造が共存する、分子内相分離構造が形成されることを見い出した。それに対して、中性の水溶性高分子であるPEGを用いたときには、DNA分子鎖はコイルからグロビュールへ不連続に変化した。透過電子顕微鏡による観察から、実際に分子内相分離しているDNA鎖の形態を計測することにも成功した。同様の分子内相分離構造は、中性の高分子である、ポリビニルピロリドンを凝縮剤として用いたときも生成することがわかった。(2)数μMの微量の鉄(III)イオンにより、DNA鎖は不連続な高次構造変化を行い、コイルからグロビュール状態へと移行することを、単分子計測により明らかにした。この状態の溶液に、アスコルビン酸を加え、鉄イオンを還元すると、DNA鎖はグロビュール状態からコイル状態に転移することを、蛍光顕微鏡観察から確認した。単一高分子の高次構造が、溶媒の酸化還元電位によって大きく変化することを見い出したものとして、この研究成果は意義深いと思われる。また、蛍光顕微鏡上のブラウン運動の計測から求めた流体力学的半径は、電子顕微鏡によって得られる凝縮体(グロビュール)のサイズとよく対応することも明らかとなった。
菌体内と宿主核内で別機能をもつデュアルエフェクターBspR

百日咳菌とその類縁菌である気管支敗血症菌は,BspRによって多くの遺伝子が制御されている。本研究にて,BspRはN末端領域の配列を介してIII型分泌装置依存的に宿主細胞内に移行後,さらに細胞の核内に移行することを明らかにした。本研究にてBspRは菌体内で転写調節因子として機能するだけではなく,細胞の核内でエフェクターとして機能することが強く示唆された。宿主内での機能を明らかにすることで,BspRのデュアルエフェクターとしての性質を提唱していきたい。申請者らはボルデテラ属細菌において,新たな転写調節因子を発見しBspRと命名した。BspRは菌体内で制御因子として機能する一方で,III型分泌装置によって菌体外に分泌される。BspRが菌体外に分泌されることで,フィードバック制御による転写調節が,おこなわれているのだろうか?これを検証するために,BspRのN末端側にFLAGタグを付加して,非分泌型のBspRを作製した。その結果,非分泌型のBspRにおいても野生型BspRと同様な転写調節の機能を有していたので,BspRの分泌能は菌体内での機能(制御因子としての機能)には関与しないことが明らかとなった。一方,エフェクターの多くは,III型分泌装置を介して宿主内に移行し,宿主細胞機能を撹乱することで感染維持に寄与している。そこで,BspRがIII型分泌装置依存的に宿主細胞内に移行するのかについて,CyaAレポーター系にて評価した。CyaAは宿主細胞内のカルモデュリンによって活性化型となり,細胞内cAMPの濃度を増加させる。BspR-CyaA融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し,気管支敗血症菌のcyaA欠損株に導入後,感染細胞のcAMP量を測定することで,融合タンパク質の宿主移行能を判定した。その結果,BspRはN末端の150アミノ酸残基を介して,III型分泌装置依存的に宿主内に移行することが明らかとなった。以上の結果をまとめると,1) BspRの転写調節因子としての機能には,菌体外分泌は必要ではないこと,さらに,2) III型分泌装置を介し宿主細胞内に移行することを明らかにした。BspRは菌体内で機能するのとは独立して,宿主内でエフェクターとして機能する可能性が示唆された。ヒト百日咳の起因菌である百日咳菌は,多様な毒素とIII型分泌装置依存性のエフェクターを発現している。これらの病原因子が時空間的に機能することで,本菌の感染が成立していると考えられているが,その詳細なメカニズムについては不明である。百日咳菌を含むボルデテラ属細菌の病原遺伝子の多くは二成分制御系であるBvgASに制御されている。申請者は,BvgAS制御をファインチューニングする因子としてBspRを発見した。BspRは菌体内で様々な遺伝子の転写制御に関わる一方で,N末端側の配列を介してIII型分泌装置依存的に宿主細胞内に移行することを今回の研究で明らかにした。BspRの宿主内での機能を明らかにするために,bspR遺伝子を培養細胞用の発現ベクターに組み込みHeLa細胞に導入した。その結果,BspRはN末端側の配列を介し細胞の核内に移行することを明らかにした。核移行性のタンパク質は,塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニン残基が連なった核移行シグナル(NLS)を有しているが,BspRは典型的なNLSを有していなかった。本研究にてBspRが宿主細胞の核内でエフェクターとして機能することが強く示唆された。BspRの宿主内での機能については解析が進行中であり,今後の研究の展開で,原核・真核細胞の両者で機能する新たな概念の病原因子として提唱していきたい。BspRの核移行シグナルの解析と並行してBspRと相互作用する宿主側因子の同定をおこなう予定である。医歯薬学これまでの研究成果により,BspRが菌体内で機能するのとは別に,III型分泌装置を介して宿主細胞内に移行することを明らかにした。この発見によってBspRは,原核ー真核生物の両者で働く機能性タンパク質であることが強く示唆された。今後は,宿主細胞内の機能についてより詳細に解析をおこなうことで,BspRの二面性が明らかになると考えられる。当初の予定通り,研究計画は順調に進展している。BspRは菌体内だけではなく,III型分泌装置を介して宿主内に移行することが明らかになったので,宿主内での機能についてより詳細な解析をおこなう予定である。これまで,BspRの発現ベクターを培養細胞に導入していたが,トランスフェクション効率にばらつきがあるために,定量解析に問題が生じていた。そこで,bspR遺伝子を培養細胞の染色体に安定に導入し,Tet On Offシステムによる遺伝子誘導で,bspRの発現を制御する培養細胞株の樹立をおこなっている。

発現誘導が可能な均一クローンを作製することで,細胞内におけるBspRの局在,BspRと相互作用する宿主側因子の同定,BspR存在下における宿主側因子の発現解析が容易になる。これによって,BspRの宿主内での機能をより詳細に解析する予定である。一方,FHAやパータクチンなどの百日咳ワクチン抗原も,このBspRに正の調節をうけている。現在,BspRによって正の調節を受けている未知タンパク質について大腸菌での精製をおこなっている段階である。in vivoの感染実験にて,ワクチン抗原として利用可能であるかを評価したい。BspRは菌体内での転写制御因子としての機能とは別に,宿主細胞内に移行することを明らかにした。BspRの機能をさらに精査するために,細胞内での発現解析を展開しているが,現在,培養細胞の染色体上にbspR遺伝子を組み込んだ均一クローン株を作成している段階である。研究計画はおおむね順調に推移しているが,均一クローン作製後に計画していた実験がずれ込んだので,次年度使用額が生じた結果となった。BspRの宿主細胞内での機能を明らかにするために,培養細胞の染色体上にbspR遺伝子を安定に組み込んだ株を樹立しているところである。この樹立株の最大の特長は,Tet On/OffシステムにてBspRの発現を厳密に制御可能なことである。この樹立株をもちいて,BspRの発現誘導をかけたときに,宿主細胞の遺伝子発現・タンパク質発現が,どのように変わるのかを網羅的に解析する予定である。また,BspRの局在とこれと相互作用する宿主側因子の解析をおこなうことで,宿主内でのBspRの機能を調べる予定である。一方,BspRは菌体内で転写調節因子として機能しており,ワクチン抗原も正の調節を受けているを明らかにしている。BspRによって正の調節を受ける未知タンパク質の洗い出しをおこない,ワクチン抗原として利用可能かについて,マウスを用いた感染防御試験をおこなう予定である。