hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NOGマウスを用いた小児白血病幹細胞の同定とその特性・体内動態に関する研究

NOGマウスを用い、マウス内にヒト白血病細胞を非常に良く生着させ、髄外病変を含めたヒト白血病環境を極めて忠実に再現する系を確立した。この系の詳細な解析により、骨髄に加え肝臓、特に門脈周囲領域が重要なヒト白血病幹細胞ニッチであることを示した。門脈周囲領域に存在する白血病細胞が骨髄に存在する白血病細胞と異なった特性をもっていること、更には胆管上皮細胞と白血病細胞がSDF-1/CXCR4 axisを介して微小環境を構成していることを示した。これらの結果は、白血病髄外病変をターゲットとする新規治療法の開発に有用であると考えられる。これまで我々が確立してきたヒトーマウス異種移植の系を用いることによって、近年基礎、臨床両面で着目されている「がん幹細胞」のうち特に「ヒト小児白血病幹細胞」に焦点を当て、その特性・体内動態を解明することが本研究の目的である。当該年度の研究により、まずヒト急性リンパ球性白血病細胞をNOGマウスの尾静脈に注射することにより、ヒト白血病細胞を効率よくマウス個体内に生着させる系を確立することが出来た。マウス個体内において経時的にヒト白血病細胞の割合が増し、骨髄をはじめ肝臓、脾臓、リンパ節、生殖器においても白血病細胞が増殖し、移植後数ヶ月にて9割以上のキメリズムを達成できていることを免疫学的評価、組織学的評価にて確認することが出来た。更に、我々は骨髄以外の臓器として肝臓に注目し、移植後早期より肝臓内の特に胆管周囲にヒト急性リンパ球性白血病細胞が出現していること、分裂増殖を繰り返していること、高キメリズムマウスに化学療法を行ってもやはり胆管周囲に白血病細胞が残存し、化学療法の終了と共に再増殖を認めること等を発見した。臨床において一般に急性骨髄球性白血病細胞は肝臓内で門脈域類洞中心静脈域と比較的均一に分布する一方、急性リンパ球性白血病細胞は門脈周囲に集簇して分布すると言われており、上記の現象は臨床症例を極めて模倣していると考えられる。近年骨髄において正常造血幹細胞や白血病幹細胞のニッチェの候補として、骨内膜の骨芽細胞ニッチェと血管周囲組織を中心とした血管ニッチェが挙げられているのを参考に、我々は急性リンパ球性白血病幹細胞のニッチェが骨髄以外に肝臓においても存在し、しかも胆管周囲にあるのではないかと仮説を立てた。次年度の研究にてこれらの真偽と関連する因子の同定を進めていく予定である。昨年度の研究に基づき、肝臓内門脈周囲領域における白血病幹細胞ニッチ構成に関わる重要な因子を同定すべくNOGマウス肝臓内のヒト白血病細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、肝臓内の白血病細胞が、他臓器内の白血病細胞に比べより高頻度でCXCR4を発現していることを見いだした。更に胆管上皮細胞がCXCR4のリガンドであるSDF-1を発現しており、組織学的に両者が密着し存在していることを確認した。加えて肝臓内の白血病細胞の遊走能、コロニー形成能、二次移植による生着効率が他臓器内の白血病細胞に比べ増加していることを確認した。更にヒト白血病細胞の生着したマウスに、SDF-1/CXCR4 AxisをブロックするAMD3100とAraCを同時投与することにより、AraC単独群に比べ肝臓内の白血病細胞の再増殖を抑制できた。以上の結果より、肝臓に存在する白血病細胞が骨髄に存在する白血病細胞と異なった特性をもっていること、肝臓において胆管上皮細胞と白血病細胞がSDF-1/CXCR4 Axisを介して微小環境を構成していることが明らかとなった。急性リンパ性白血病のみならず他の白血病についても、これまで骨髄以外の臓器における白血病幹細胞の動態につきその詳細は明らかでない。異種であるとはいえ移植前処置を必要とせず、ヒト環境を極めて模倣していると思われる今回のNOGマウスを用いた系により、肝臓の微小環境の詳細とSDF-1/CXCR4 axisの重要性が明らかとなった。これらの知見は、白血病髄外病変をターゲットとする新規治療法の開発に役立つと考えられる。
最高エネルギー宇宙線観測における地表検出器特性による系統誤差の研究

日本のAGASA実験グループは、エネルギースペクトルは1020eVを超えて延びているという観測結果を得ているのに対し、アメリカのHiResグループは10^<20>eV付近でスペクトルが落ち込んでいるという結果を発表している。両実験ともに10^<20>eVを超えるイベントの期待値は多くなく、さらに高統計で議論する必要があるため、Auger Project (Auger)、Telescope Array Project (TA)といったさらに大規模な実験が進められている。Augerでは水チェレンコフ検出器、TAではシンチレーター検出器をそれぞれメイン検出器として用いているため、検出器特性の違いのために異なる結果を出す可能性がある。AGASAのサイトで行ったAugerプロトタイプ検出器の性能実験結果とシミュレーションを用いて検出器特性による系統誤差の評価を行った。宇宙線空気シャワーシミュレーションとしては、多くの実験グループにより用いられているCORSIKA6.5を用い、GEANT48.0により、AGASAシンチレーター検出器、Augerプロトタイプ検出器の特性を考慮した。空気シャワーの発達において高エネルギーでの相互作用モデルはQGSJET-II、SIBYLL2.1を用い、一次宇宙線種として陽子、鉄核について比較を行った。シャワー粒子数のシャワー軸からの距離に対する分布はシンチレーター、水タンクともにどのモデル、粒子種の組み合わせでも実験データがほぼ再現されたが、陽子を用いた方が再現性が良かった。AGASA、Augerではエネルギー決定のパラメーターとしてシャワー軸から、それぞれ600m、1000mでの粒子数密度を用いている。この値から推定エネルギーへの影響を見積もると、最大±6%(天頂方向)±14%(45度)、水タンクでは±18%(天頂方向)±12%(45度)の違いが生じることが分かった。日本のAGASA、アメリカのHiResなどにより10^<20>eVを越える宇宙線が観測されているがまだその起源は解明されていない。近年発表されたAGASAとHiResの10^<20>eVを越える宇宙線のフラックスについて多少の差異があり、議論になっている。現在10^<20>eVを越える宇宙線の起源を解明するためにアメリカユタ州でテレスコープアレイ実験(TA)が、アルゼンチンでAuger projectが進んでいる。TAではAGASAと同様、空気シャワー中の電磁成分に感度の高いシンチレーター検出器を主な検出器としているのに対し、Auger projectではミューオン成分に感度の高い水チェレンコフ検出器を主として用いている。AGASAのサイトで開発したAuger projectプロトタイプ検出器の実験データとシミュレーションデータを用いて両検出器の違いによる、超高エネルギー宇宙線のエネルギー決定の系統誤差について評価することを目的としている。本年度はシャワーシミュレーションプログラムAIRESを用いてイベントを生成し、GEANTを用いたAGASAの検出器シミュレーション、Auger prototype検出器のシミュレーションを作成して組み合わせ、観測粒子数の計算を行った。Auger projectではシャワー軸から1kmの場所での粒子数密度をエネルギー決定のパラメーターとして用いており、10^<20>eVの鉄と陽子で1020%の違いが生じた。一方、AGASAは600mでの粒子数密度を用いており、鉄と陽子で812%の差となった。特に水チェレンコフ検出器において、エネルギーを精度よく求めるためには宇宙線粒子種を押さえることが重要である。次年度に、生成したシャワーシミュレーションデータと実験データとの比較を行い、地表検出器の種類によるエネルギー決定誤差について議論する。
飲酒によって引き起こされる肝疾患を予防する食品成分の検索とその応用

食品成分によるアルコール性肝疾患の予防効果とそのメカニズムについての総括的な研究を行った。申請者が開発したin vitroアルコール性肝炎および肝硬変モデル、実験動物を用いたin vivoアルコール性肝疾患モデルを用いて検討したところ、Ecklonia cava抽出物、玉造黒門越瓜抽出物、ごまリグナン、マテ茶抽出物などの食品成分は、細胞レベルのみならず動物レベルでもアルコール性肝疾患の予防効果を示した。食品成分によるアルコール性肝疾患の予防効果とそのメカニズムについての総括的な研究を行い、近年、罹患者数が急増しているアルコール性肝疾患に着目して、日常の食生活を改善することによって健康長寿を目指すことができるように提言するための基礎研究を行うことを目的として、以下の2点について解析した。1)肝線維化さらには肝硬変の直接的な原因となる分離肝星細胞を用いたin vitroアルコール性肝硬変モデルを用いて、アルコール性肝硬変の予防効果を有する食品成分を探索したところ、Ecklonia cava抽出物、玉造黒門越瓜抽出物、セサミノール、緑茶抽出物がエタノールによって誘導された肝星細胞の活性化の抑制効果を有することを明らかにした。これらの食品成分は、細胞内グルタチオン量を増加させることによって、エタノールによって亢進した活性酸素種量産生量を減少させ、肝星細胞のコラーゲン合成能を抑制する作用を有することを見出した。Ecklonia cava抽出物、緑茶抽出物の効果については、日本栄養・食糧学会、日本病態栄養学会、ヨーロッパ肝臓学会において発表した。2)分離肝細胞によるin vitroアルコール性肝炎モデルを用いて、アルコール性肝炎の予防効果を有する食品成分を探索したところ、Ecklonia cava抽出物および玉造黒門越瓜抽出物が有効であることを明らかにした。これらの食品成分は、エタノールによって誘導された酸化ストレスを軽減させることによって、肝細胞障害を抑制する作用を有することを見出した。これらの効果については、日本栄養・食糧学会、茶学術研究会シンポジウム(お茶の健康と科学)において発表した。食品成分によるアルコール性肝疾患の予防効果とそのメカニズムについての総括的な研究を行い、近年、罹患者数が急増しているアルコール性肝疾患に着目して、日常の食生活を改善することによって健康長寿を目指すことができるように提言するための基礎研究を行うことを目的として、申請者が開発したin vitroアルコール性肝硬変モデルおよびin vitroアルコール性肝炎モデルをもちいて、アルコール性肝疾患(肝炎および肝硬変)を予防する食品成分を検索し、さらに、実験動物を用いたin vivoアルコール性肝疾患モデルを用いて、in vitroの研究で予防効果の認められた食品成分を食事に取り入れることによって効果が認められるかを検討することを目的として、以下の成果を得た。In vitroアルコール性肝硬変および肝炎モデルを用いて、アルコール性肝疾患の予防効果を有する食品成分(Ecklonia cava抽出物、玉造黒門越瓜抽出物、ごまリグナン、マテ茶抽出物)を見出し、そのメカニズムについて解析した。すなわち、エタノールによって細胞内の活性酸素種産生量が亢進し、このことが引き金となってアルコール性肝炎や肝線維化さらには肝硬変が形成されること、また、本研究で見出した上記の食品成分には、抗酸化作用を有することを明らかにした。さらに、実験動物を用いたin vivoアルコール性肝疾患モデルを作製した。すなわち、アルコールを飲用させ、単独投与では障害を誘導しない低濃度の肝障害剤(四塩化炭素)を同時投与することによってアルコール性肝疾患を発症させるモデルを確立した。本モデルでは、飼育期間が1週間を経過した頃から肝障害の指標となる血中の逸脱酵素(AST、ALT、LDH)活性値が上昇し、3週間の飼育期間でアルコール性肝疾患に特徴的な肝障害が観察されることから、in vivoアルコール性肝疾患モデルとして有用あることを明らかにした。平成22年度に申請者が確立したin vivoアルコール性肝疾患モデルを用いて、アルコール性肝疾患の予防効果を有する食品成分(Ecklonia cava抽出物、玉造黒門越瓜抽出物、ごまリグナン、マテ茶抽出物)によるアルコール性肝疾患の予防効果について検討したところ、これらの食品成分は、肝障害の指標となる血中の逸脱酵素(AST、ALT、LDH)活性値を顕著に低下させること、肝臓中の過酸化脂質産生量を低下させること、病理組織学的解析結果から肝障害(肝細胞変性や肝線維化)をコントロールレベルにまで抑制させることが明らかとなった。これらの食品成分は、細胞レベルのみならず動物レベルでもアルコール性肝疾患の予防効果を示したことから、健康長寿を目指すことができる食生活に積極的に取り入れることができることが示唆された。

さらに、健康食品の開発などにも応用することができる可能性が見出された。これらの研究成果について2報の学術論文を作成した(1報は掲載済み、1報は印刷中)。さらに現在、2報の学術論文を作成中である。
地下水中の固有微生物を利用したヒ素除去に関する研究

研究の目的地下水中の固有微生物が鉄やマンガンを酸化させるという能力を持っていることは古くから知られている。これらの微生物をろ材に捕捉し、繁殖させて鉄やマンガンを除去する生物接触酸化法(鉄バクテリア法)が開発されており、現在、一部の自治体が浄水処理として採用している。本法は従来の凝集沈殿を伴う浄水処理法と比較すれば経済的であるばかりでなく、環境を配慮した新しい水処理技術である。一方、地下水には水道基準を超える砒素が含まれていることがあることから、従来の地下水中の固有微生物を利用した生物接触酸化法を精査し、鉄やマンガンとともに砒素の除去特性を明らかにして、基礎的な実験データを蓄積することが本研究の目的である。平成16年度の成果京都府向日市水道部の協力を得て、砒素濃度が他の井戸よりも比較的高い井戸を原水として実験を開始した。実験装置は小型実験装置(ろ過筒やポンプなどから構成)に加え、対象井戸を常時稼動できないことから、貯水槽3m^3を2基設置して実験を開始した。しかしながら、地下水が一時的に貯水槽に蓄えられることにより、空気中の酸素による酸化が促進され、地下水中の微生物が量質ともに変化したことにより、小型実験装置では、鉄やマンガンの除去を確認することができたが、砒素の除去を確認するまでに至らなかった。平成17年度の成果平成16年度の反省から、実験場所を京都府向日市の向日市物集女西浄水場の実験井戸を原水として行うことにした。10月13日の結果では、原水の砒素濃度が59.1ppb、処理水が7.3ppbと90%に近い除去率を得ることができた。また、SPring-8 BL19B2ビームラインにおいてX線吸収微細構造測定も実施し、その結果、微生物による砒素の酸化(III価からV価)が行われていることが判明した。現在も向日市での実験を継続している。本研究を実施するためには、ヒ素濃度が比較的高い地下水が入手する現場において実験する必要があった。このようなことから、京都府向日市上下水道部の協力を得て、現在給水を停止している浄水用井戸を利用して実験することとした。また、研究実施についても向日市上下水道部だけでなく、株式会社地域環境システム研究所、東洋濾水機株式会社といった企業、非営利特定法人地下水利用技術センター、神戸大学大学院の協力を得て、産官学連携の研究組織によって遂行した。京都府向日市が管理している14号井戸に実験装置を設置した。微生物が繁殖しやすい環境をつくるために、多孔質でプロピレン製のろ材を用いた。地下水揚水ポンプの能力が実験装置に必要な水量より大幅に大きいため、一時的にタンクに汲み上げてから実験装置に導入した。流量は150m/日、逆洗は23日に1回、地下水補給は34日に1回の割合で行った。試験水・ろ過塔上下・処理水の4箇所から採水した。除去の傾向として、鉄濃度が高い場合にはヒ素が若干除去されることを確認した。今回の実験で鉄濃度が一定でないのは、地下水をタンクに一時貯留して、しばらくしてから実験装置に導入したため、タンク内で鉄酸化が発生し、鉄分が沈降しため、導入する水の鉄濃度は低くなったと考えられる。鉄はろ過塔上部、アンモニア性窒素はろ過塔上中部、マンガンはろ過塔全体で除去されている。マンガンはろ過塔全体、アンモニア性窒素はろ過塔上部から中部、鉄はろ過塔上部で除去されている。このような結果から、各物質を酸化・硝化には複数の細菌が関わっており、過塔内で住み分けが行われていると考えられる。ヒ素除去については、鉄濃度が大きく影響し、鉄濃度が高いほどヒ素除去率は高くなる傾向を確認した。

10月13日の結果では、原水の砒素濃度が59.1ppb、処理水が7.3ppbと90%に近い除去率を得ることができた。また、SPring-8 BL19B2ビームラインにおいてX線吸収微細構造測定も実施し、その結果、微生物による砒素の酸化(III価からV価)が行われていることが判明した。現在も向日市での実験を継続している。
生体分子導入による液晶の高機能化 －“生物“と”液晶“の密接な関係性の具現化－

本年度は、DNA添加効果が顕著に現れると期待される水系のリオトロピックネマティク(LNe)液晶の作製を試みた。結果、二成分系では不可であったが、三成分系にすることでLNe液晶の作製が実現できた。また、興味深いことに、室温で等方相を示すLNe液晶にDNAを少量添加するだけでネマテリック相が発現した。油系のネマテリック液晶では観られなかった現象であり、やはり、生体に近い水系液晶への添加効果の方がより大きく現れることが分かった。一方で、イオン密度測定による電気的性質については、油系液晶中ではDNA分子がイオン的に振る舞うことが分かっているが、水系LNe液晶中では、顕著なイオン的振る舞いは観測されなかった。これは、互いに水溶性のDNA分子とLNe液晶を構成する界面活性剤分子が水素結合等の強い結合を生じているためと考えられる。また、ブルー相液晶については、光重合性モノマー液晶を用いたブルー相の発現に成功し、さらにラビング法による配向処理によってある程度均一な配向構造を得ることができた。結果、モノマーおよびカイラル剤濃度を詳細に調査することによって、他の等方性液体相やコレステリィク相で重合したものよりも機械的強度の高いブルー相固化試料を得ることができた。本課題では、“生物"と“液晶"の密接な関係性に着目し、生体分子としてDNAの液晶への添加効果および生体類似構造を有するブルー相液晶について調査を行った。液晶材料としては油系および水系の液晶を作製した。油系と水系の液晶へのDNA添加効果を考察すると、総じてDNA分子は生体に近い水系液晶に強い効果を示すことが分かった。ブルー相液晶については、光重合性モノマーを用いたブルー相の発現に成功し、さらに配向処理による一様配向化、また、それに基づく高機械強度試料を得ることができた。液晶研究における標準試料的な5CBに一本鎖のDNAを添加し、液晶特性に及ぼすDNA添加効果の定量的評価を試みた。評価項目として、偏光顕微鏡を用いたテクスチャー観察および相転移温度測定・相同定、円偏光二色性測定、電気光学効果観測を主に実施した。その結果、相転移温度に変化が見られない添加濃度においてもテクスチャーには変化が現れ微細化することが分かった。円偏光二色性の結果からは、DNA添加が液晶場の配向捩れを誘起しうることが確認された。また、テクスチャーの微細化や配向捩れの度合いは、塩基数よりも濃度に強く依存することが明らかとなった。したがって、DNA添加による高機能性や高次構造の発現に対して、可溶添加質量において少塩基数で高濃度とするのが有効と考えられる。電気光学効果の観測結果からは、液晶分子の応答時間に塩基種依存性が観られた。特にアデニン・グアニンとチミン・シトシンの間で比較的大きな差が見られ、塩基のサイズが関与していると考えられる。他方、5CB以外の液晶試料についても検討を行ったが、液晶相の温度範囲が広い試料では、液晶分子自身の配向構造が安定なため、DNA添加効果が現れにくいことが判明した。水系液晶として、両親媒性化合物(C16E8およびC12E8)を用いてリオトロピック液晶を作製した。広い温度範囲で安定的に現れるミドル相に着眼し、DNA添加効果を調査した。テクスチャー観察においては、ミドル相特有の扇模様が乱雑化する様子が観られた。DNA分子の振る舞いを調査するためイオン密度測定を行った結果、DNA分子が電場に追随してイオン的に移動することが判明した。なお、5CBのような油系液晶媒質中では、そのような振る舞いは観測されなかった。したがって、生体内同様の水環境下でDNAの添加効果がより顕著に現れることが分かった。当初の予定通り、5CB液晶へのDNA添加効果の定量的評価を行い、液晶の静的な分子配向構造や動的な応答特性へのDNA塩基数や添加濃度依存性を調査できた。一方、塩基種依存性については、電気光学特性の一部に塩基種による差異が認められたが、結果の解釈に不明な部分もあり、他の液晶試料を用いるなどして、より詳細な解析・検討が必要と考えている。水系液晶についても、予定通り、両親媒性分子を用いての作製に成功し、DNA添加効果を調査できた。しかし、塩基種による差異が不明瞭であり、より大きな添加効果を発現させるためにも、より低粘性で、ラメラ相のような比較的単純な分子配向構造を有する水系液晶の作製が必要と考えている。また、生体類似の構造を有するブルー相液晶についても検討を行っており、多角的な調査を実施できていると考えている。本年度も主に液晶媒質へのDNA添加効果について調査を行った。油系液晶においては、従来の5CBに加えて新たに数種類の液晶試料についても検討した。また、配向処理が特性に及ぼす影響についても調査した。評価項目としては、偏光顕微鏡観察、相転移温度測定、円二色性(CD)測定、電気光学効果測定を行い、多角的に調査を進めた。結果、偏光顕微鏡観察にてDNAの凝集体が観測されテクスチャーの微細化が確認されるケースもあったが、相転移温度の変化は認められなかった。また、円二色性測定においては、配向処理の有無による差異が観られ、一様配向セルにおいてのみCDピークが観測された。無配向セルのように元から配向が乱れている場合にはDNA添加による構造変化が現れにくいことが判明した。さらに、電気光学効果においては、使用した全ての液晶試料においてDNA添加による立ち下がり応答の遅延が観測された。

しかし、液晶種に対するDNA添加(塩基種、添加濃度、塩基数)依存性は同一傾向にはなく、液晶試料とDNAの相性が特性に強く影響するという興味深い結果を得た。一方、水系液晶については、昨年度の結果を踏まえて、より低粘度のリオトロピック液晶を作製するため、より分子量の小さい両親媒性化合物C12E5に着眼した。さらに、従来のミドル相よりもシンプルな構造を有するラメラ相についてDNA添加効果を調査した。調査項目は主として電場に対するイオン的振る舞いに注目し、イオン密度、抵抗、容量の測定を行った。結果、従来同様にDNA分子がイオン的に振る舞うことが確認されたが、イオン密度は比較的小さな値となった。ラメラ相の構造はミドル相よりもシンプルではあるが、液晶分子が層状に配列した構造となるため、DNA分子が媒質中を移動しにくかったと考えられる。しかし、ミドル相に対する結果に比べて、塩基種による差異が大きく現れる傾向が得られた点が注目される。本申請課題では、液晶への生体分子添加効果を解明することを第一の目的とし、生体分子としては先ずDNAに着目している。本年度は、液晶場におけるDNA分子の振る舞いをより詳細に解析するために、予定通り、液晶試料および液晶相に着目し検討を行った。油系液晶では、数種類の液晶試料を用いてDNA添加による特性変化を調査したが、液晶試料による差異が観られた。DNA分子との相溶性が基本的に高くない油系液晶では、両者の相性に強く依存することが明らかとなった。また、配向処理が及ぼす影響も明らかとなり、次年度に向けての貴重な情報が得られた。水系液晶では、より低分子の両親媒性化合物を用いたラメラ相の調製に成功し、DNA添加効果の調査・解析を行うことができた。さらには、生体類似の構造を有するブルー相液晶についても検討を進めており、その発現条件や構造の解析、均一配向試料の作製ならびにナノ構造材料への応用的展開を目指した成果が得られた。本年度も引き続き液晶媒質へのDNA添加効果について調査を行った。特にこれまで作製できなかった水系のリオトロピックネマティック液晶相を三成分混合系とすることよって実現することができた。このリオトロピックネマティック液晶試料にDNAを添加すると、偏光顕微鏡観察ではDNAの凝集体などは見られず、一様に分散していると考えられる。また、相転移温度の変化も見られなかった。一方、イオン密度測定においては、先行研究のミドル相やラメラ相で見られたDNA分子のイオン的振る舞いとは異なり、また添加と無添加で全く異なる挙動を示した。リオトロピックネマティック液晶において、より顕著なDNA添加効果が見られたことは期待通りであったが、その一方で、それぞれ液晶相で何がどう違うのか、ネマティック液晶媒質中でDNA分子はどのような振る舞いをしているのかが未だはっきりとしておらず、更なる調査が必要である。また、生体類似の構造を有するブルー相液晶については、光重合性液晶モノマーを用いて、その発現条件(モノマーの混合比等)を調査した。また、円二色性測定によって構造解析を行い、約450nmの周期構造を有することが分かった。さらにラビング法による均一配向試料を作製することができ、紫外線照射による光重合後も構造が維持された。
会計検査制度の比較研究

本研究は、国(連邦制の国にあっては、連邦と州)及び地方公共団体の会計検査制度をいくつかの主要国を取りあげて比較研究を行なったものである。研究成果報告においては、主として英国、アメリカ合衆国、ドイツ、フランス、カナダ及びオーストラリアを取りあげている。第1部においては、「会計検査制度の諸潮流」をまとめている。国の会計検査機関の組織に関して、権力分立制度との関係において、いくつかの類型が認められること、合議制機関方式と独任制機関方式とがあること、外部監査機関のほかに内部監査機関を設けている国が多いことを指摘している。また「会計」の検査以外に持続可能な環境についての監査権限を付与されている国があること、告発者保護法の制定により、会計検査院も、その告発を受けとめる機関としての権限を与えられていることを指摘し、かつ、諸外国の会計検査機関自体が外部の監査を受けていることなどから、会計検査機関の「責任」が今後の重要な課題となることを導いている。さらに複数のレベルの政府の会計検査機関相互の間において検査(監査)そのものについての協力関係等があるほか、技術上の協力関係も重要となることを指摘している。第2部においては、自治体の監査制度の比較研究を詳細に展開している。自治体監査を実施する機関を特別に国(州)に設けている国、国(州)の会計検査機関が実施する国、組合方式、会計士監査の義務づけによる場合などの多様な方式がみられる。これらの研究成果は、今後の日本における自治体監査制度の構築に資するものと考える。なお、日本の外部監査制度に関して実態調査を実施したが、創設直後であることもあり、とりまとめの研究は今後の課題として残すこととなった。1.外国法制に関する資料の収集と分析本年度は、アメリカ、イギリス、ドイツについて会計検査制度に関する資料を収集し、分析を開始した。また、法制度のみならず、会計検査のための「監査基準」、さらに、その前提となる公会計の基準に関する資料も入手し分析しつつある。資源会計(例、イギリス)の導入が会計検査にいかなる影響を及ぼすか、成果監査(performance audit)などの流動状況についても研究を継続している。2.自治体監査の動向の調査平成11年度より導入された外部監査の運用状況と、それが監査委員監査に与える影響について6道県5市についてヒアリング調査を実施した。その結果、外部監査人の選任状況、外部監査人に対する自治体のバック・アップ体制等について知見を得ることができた。平成11年度分の報告書は、本年3月までに出されるので、平成12年度には、それらを分析する予定である。1.本年度の研究実績本年度は昨年度に続き,外国の制度の研究と日本の自治体監査制度の研究に重点を置いて進めた。前者に関し,私費によりオーストラリアおよびアメリカ合衆国を訪問したのをきっかけとして,両国の州の監査制度および自治体監査制度について相当の知見を得ることができたことは大きな収穫である。これらの国において,州が自治体に対する監査機関をもち,又は州の会計検査院が自治体の監査している場合が多いこと,いわゆる内部監査も重視されていること,などを知ることができた。後者,すなわち日本の自治体監査については,いくつかの自治体を訪問し,行政監査の充実の傾向を知ると同時に,それが包括外部監査人の監査と視点において重なり合うことが多く,今後,制度の再検討が必要であるという感触を得た。なお,『住民訴訟と自治体財務』という書物を著し,住民監査請求について考察した。今回の関連で,アメリカのFalse Claims Actや若干の国のWhistleblower Proteotionについても研究した。2.今後の研究への展望今回の研究を通して,監査制度に国民・住民がいかに係り合うかが大きな課題であることを痛感した。この点が今後の研究の一つの軸となると考える。
地盤の耐液状化性能設計法の構築とその実用化-設計地震動を超える外力への対応-

当該研究に関連して、雑誌論文への研究発表2件、学会発表27件を行った。特に、第15回日本地震工学シンポジウムにおいては「設計想定と異なる事象に対する基礎地盤の耐震性能評価戦略について」を発表し、液状化に関する性能設計の資する戦略を示した「SPATIAL VARIABILITY OF LIQUEFACTION AND POST-LIQUEFACTION PROPERTIES OF HYDRAULIC FILL SAMPLED FROM A RECLAIMEDSITE(埋立地から採取した浚渫圧送土の液状化および液状化後の特性に関する信頼性評価)」では、科研費を使用した小名浜港埋立地での隣接したボアホール試料の液状化試験結果のバラツキを論じた。この研究では、深度方向に細粒分含有率が大きく異なること、その結果として力学特性い違いが生じることを明らかにした。「密な砂質土の液状化後の変形特性について」は液状化対象とならない密度を検討した。「液状化後の残留せん断ひずみと再圧密体積ひずみの関係」では,これらは本研究の実施計画である1液状化検討の対象外の土質・地盤条件の明確化2液状化後の地盤要素の終局的な残留変形量(沈下量,水平変形量)と靭性能の評価3液状化に関する性能設計の枠組みを構築する.内容に沿ったものである。また、2019年3月には、地盤工学会エネルギーに基づく液状化予測手法に関する研究シンポジウムにおいて、現状の予測手法の課題をレビューするとともに、新たな枠組みでの液状化予測判定手法のケーススタディ結果を報告した。また、同シンポジウムでは、繰返し三軸試験を基準化累積損失エネルギーにより整理し,砂やしらすの飽和・不飽和状態での比較,定量的評価を行った結果も報告した。さらに、液状化数値解析における信頼性を担保するために、どのようなことが必要となるかも検討した。2018年度においては、設計の枠組みで必要となる、原位置から採取した試料を用いた液状化試験結果のバラツキを検討し、細粒分の多少によってそれが大きく左右されることが明らかとなった。また、地震動のバラツキとしても、表層部の盛土切土の違いによって、地震動の最大値指標が5割ほど違うこともしめし、一般的な耐震設計条件を超える場合(危機耐性)として、外力の増加をどこまで考えるか、地盤物性の低下をどこまで考えるべきかの指針を示すことができた。また、種々の土質を対象とした繰返しせん断試験としては、熊本地震における火山灰質粘性土、北海道胆振東部地震における破砕性のある火山灰質砂質土も対象として検討し、粘性土でも地震動により過剰間隙水圧が上昇し、その結果剛性が低下することなどを明らかにした。また、火山灰質土では、単調載荷じより繰返しせん断時の方が粒子破砕が生じやすく、せん断初期の剛性低下や残留せん断強度の低下につながることを示した。数値解析としては、Geo=Asiaを用いた解析や、3次元DEMを用いた解析によって、実験ではできない条件で、解析を行い、性能設計に向けた検討うを始めることができている。本年度は最終年度として、研究開始当初の目標を達成すべく、研究をまとめて行きます。具体的には、(1)土の一次的性質(土質分類、粒度組成、細粒分の性質)と土の二次的性質(密度、粘着力、透水性)に基づいて、液状化の検討対象外の土を示す方法論を明らかにします。(2)従来の方法に代わる新たな耐液状化性能を評価できる室内試験法を提示し、それに基づいて、液状化判定チャートを示します。(3)数値解析による残留変形を求める場合、結果の確からしさを評価する方法を示します。以上は、これまでの各研究分担者の結果を持ち寄り、集中的に討議する機会を作り、推進します。本研究の目的は,現状の液状化発生予測判定法を脱皮し,土質材料の流動性,液状化した後の変形特性や間隙水の移動を考慮した,レベル2地震動あるいはそれを超えるような外力にも対応できる地盤の耐液状化性能設計法の枠組みを構築し,実用化を目指してそれを実証することにある.本年度は、その初年度として、本研究に関わる課題整理と、実験研究に取組むための試験装置製作を行った。研究に関わる課題整理としては、東日本大震災にみる液状化研究の課題をとりまとめ、日本地震工学会の論文集に投稿した。試験装置製作としては、宇都宮大学に中空ねじり試験装置を、東北大学に非排水中型せん断試験装置を導入した。中空ねじり試験機を用いた実験では,本研究代表者らが先に提案している応力振幅一定の非排水繰返しせん断→ひずみ振幅一定の非排水繰返しせん断→単調せん断試験→排水試験を主に砂質土に対して実施した。また、非排水中型せん断試験装置を用いた噴砂実験では、継続的に噴砂を発生させるための実験方法を検討して、再現性のある実験方法を確立した。さらに、その土槽に拘束圧を掛けた状態でコーン試験を実施できるように改良を施し、土質の種類や密度に応じたコーンの貫入時の抵抗の発生機構を実験的に検討できるようになった。間隙水の出入りを考慮したせん断試験では,液状化後の体積ひずみとの関係で試験結果を整理し、浸透に対する抵抗性能を定量的に検討中である。研究に関わる課題等を整理するとともに、研究実施に必要な実験装置など開発し、稼動し始めた。また、要素試験については、細粒分を含む側の土質のシリーズ研究、排水を考慮した試験のシリーズ研究に着手している。

また、その際の供試体の密度の評価について、統一的な評価が出来る指標を実験的に検討した。1.JGS規準を細粒分(FC)を多く含む土に拡大適用した相対密度(DR)の評価に課題があることを明らかにし,FCの多少に拘わらず非常に密な状態にすれば,液状化抵抗が確実に大きくなることを確認した.また,中空ねじり試験よりシルト粒径の石炭灰フライアッシュ(FA)と粗砂・礫粒径の石炭灰クリンカアッシュ(CA)の液状化後の体積収縮特性を把握した.その結果,FA,CAとも砂同様に繰返しせん断履歴によって液状化し,その後の排水による体積ひずみは,最大15%を越える供試体も存在した.2.薬剤(AE剤)を用いて土中の水分状態を強制変化させた不飽和砂質土の繰返しせん断変形挙動を検討した.同一飽和度であっても,薬剤によって拘束水を自由水化させた場合,液状化抵抗が低下すること,より低い飽和度でも液状化することがわかった.また,火山灰質砂のしらすを用いた,飽和液状化強度試験も行った.3.原位置サウンディング試験(コーン貫入,標準貫入,スウェーデン式サウンディング試験(SWS))を溶融石英と流動パラフィンを用いた透明地盤で検討した.その結果,コーン貫入と標準貫入試験は土のせん断強度に対応しているのに対し,SWS試験は先端ビットのエッジによる土の掻き取り抵抗を計測していることが示唆された.また,東北大が導入した貫入抵抗試験装置が稼動できるようになった.4.細粒分を含む砂質土および細粒分を含まない礫質土を対象として,間隙水流入による体積膨張を伴う繰返しせん断試験を実施した.体積膨張に伴う液状化強度は非排水強度と比較して56割程度になることを確認した.また,この傾向は砂の違いによらないこともわかった.5.宅地の液状化被害の簡易判定にはが用いられている.液状化地盤上の住宅に対して有効応力解析を行い,FL法と非液状化層厚による簡易判定結果と有効応力解析による住宅の変形量は必ずしも対応しないことがわかった.当初の予定のとおり,平成27ー28年度には,研究の遂行に必要な大型試験装置の導入が終わり,順調に稼動し始めている.今後は,導入装置を用いた実験により精緻なデータを積み重ねる段階にある.耐液状化に関する性能設計のための大きな枠組みは,研究代表者の風間が整理し,国内学会誌に掲載された.また,2017年7月に開催される地盤地震工学における性能設計に関する国際学会にて発表予定である.まず、性能設計に関する国際会議に4編の研究論文を発表した。液状化検討対象外の土質・地盤条件の明確化については、不飽和土の飽和度を変化させた試料,細粒分の質や量の違う試料,密な砂試料を用いて、主に靭性の観点から整理をすすめた。また、火山灰質砂のしらすを用いた飽和液状化強度試験,入念に突き固めたDr:90-95%の試料土やセメント固化土も対象に検討した。液状化後の地盤要素の終局的な残留変形量と靭性能評価については、従来法である非排水繰返しせん断強度と累積損失エネルギー量の関係を吟味し、後者の方が前者よりも4倍ほど感度のよい靭性指標であることを示した。流動性の評価として、粒径の異なるガラスビーズとケイ砂を用いて,乾燥と飽和,試料の凹凸,粒径の大小をパラメータにして流動性を評価する実験を行った。試料の凹凸があるほど,流動量は減少すること、水の有無,粒子形状(凹凸),粒径が流動量に影響を与えていることを示した。
わが国における予算の管理機能の拡大に関する研究

予算の管理機能と標準原価計算の管理機能について文献研究を行った結果、予算編成の実態を知る必要があること、およびわが国の企業の全体的な傾向についてアンケート調査を行う必要があることの二つの点か明らかになった。従って、予算編成の実態、特に中期長期計画と予算の関係・予算期間・予算審議機関・予算のローリングについての調査質問に、予算管理の領域で従来より問題とされている参加予算の機能の本質に関する質問、および予算担当者の役割知覚に関する質問を加えて、わが国の東証一部上場企業のうちの363社に対して郵送質問票によるアンケート調査を行った。調査に先立って質問項目に関するパイロット・テストを行っている。郵便質問調査の回収率は約38%であった。回収された質問票を集計した結果の概要として、わが国の企業が広く総合予算制度を使用していること、3年程度の中期計画を利用している企業が多いこと、部長・課長クラスの組織階層からの予算原案の提示とその上位の階層との間でのすりあわせと修正が実際に行わられていること、参加予算に情報収集機能と共に多面的な行動的機能が期待されていること、予算編成では予算と中期計画の合致が重要視されていると同時に組織目標と整合的な行動を導くことが重視されていること、といった点を挙げることができる。この調査結果からより明確な結論を導くべく、結果に対して統計的な処理を施して仮設の検定を行ってゆく予定である。またいくつかの企業に対してインタビュー調査を行ったが、当初に仮設として設定されたような意見を収集するにいたらなかった。今後は、この調査結果を踏まえる形でインタビュー調査を行い、予算管理の実態をさらに検討することを予定している。
前駆体マイクロRNAへのポリウリジル化反応の構造基盤

マイクロRNAは、特定のmRNAと相補的に結合し、mRNAの分解と翻訳抑制を誘導することによって、細胞分化やガン化などに関連する多くの遺伝子の発現制御を担っている。RNA結合タンパク質Lin28は、ウリジル化酵素TUT4をプレマイクロRNAにリクルートし、RNAをポリウリジル化することで分解経路に誘導し生合成を調節する。本研究では、ウリジル化酵素の立体構造を解明し、反応機構を明らかにすることを目的とした。ヒトポリウリジル化酵素の活性部位を結晶化し、現在分解能の向上のため、結晶化条件の精密化と測定条件の最適化を行っている。低分解能のX線回折データを使った分子置換法の解析を進めている。マイクロRNAは、特定のmRNAと相補的に結合し、mRNAの分解と翻訳抑制を誘導することによって、多くの遺伝子の発現制御を担っている。ポリウリジル化酵素TUT4は、RNA結合タンパク質Lin28によってプレマイクロRNAへリクルートされ、プレマイクロRNAをポリウリジル化することで分解経路に誘導し生合成を調節している。本研究では、TUT4・Lin28によるプレマイクロRNAのポリウリジル化機構を解明することを目的としている。HISタグ付加したヒトポリウリジル化酵素のコンストラクトを作製し、大腸菌を用いて発現した。全長、および全ドメインを含むコンストラクトを作製し、大腸菌で大量発現した後、Niカラム、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを使って精製を行った。安定した状態で精製と濃縮が可能であり、結晶化スクリーニング実験を行った。しかしながら現在まで、結晶を得るところまで至っていない。精製後のサンプルで少量の分解物が見られ、結晶化を妨げていると考えられる。また、RNA合成活性部位を含むC末端領域を大腸菌で大量発現し、Niカラム、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを使って精製を行った。高純度で精製した後、結晶化スクリーニング実験を行った。しかしながら、この領域のタンパク質においても現在まで結晶を得るところまで至っていない。今後、さらにコンストラクトの検討を行い、結晶化を試みる予定である。また、RNAを加えタンパク質を安定化させ、結晶化実験に供していく予定である。ポリウリジル化酵素の組換えタンパク質を調製した。HISタグ付加したポリウリジル化酵素のコンストラクトを作製し、大腸菌を用いて発現した。濃縮を行って、結晶化スクリーニング実験を行った。高純度に精製した後、結晶化スクリーニング実験を行った。その結果、ポリウリジル化酵素C末端領域については結晶を得ることができた。今後、さらに結晶化条件などの検討を行い、良質な結晶を作製する予定である。また、タンパク質RNA複合体を調製し、結晶化実験に供していく予定である。プレマイクロRNAのウリジル化を触媒するポリウリジル化酵素は、ヒトではTUT4およびTUT7の二つが見つかっている。共にN末端から、ジンクフィンガードメイン、ポリメラーゼドメイン、ジンクフィンガードメイン、ポリメラーゼドメイン、タンデムなジンクフィンガードメインで構成されている。TUT4とTUT7はそれぞれ1644残基、1495残基であり、分子量が大きなタンパク質である。結晶化に最適な領域を見出すため、N末端とC末端領域を削った組換えタンパク質を調製した。その結果、N末端のジンクフィンガードメインからC末端の一つのジンクフィンガードメインを含む領域のタンパク質が、Lin28依存的なポリウリジル化活性に必要であることがわかった。続いて、TUT・Lin28・プレマイクロRNA三者複合体の調製は行った。三者複合体の調製のため、以下の試料を調製した。TUTは、TUT4のN末端とC末端領域を削ったタンパク質の発現コンストラクトを調製し、大腸菌で大量発現させた。数種のカラムを用いて、ほぼ単一バンドになるまで精製を行った。Lin28についても同様に、N末端とC末端領域を削ったタンパク質の発現コンストラクトを調製し、大腸菌で大量発現した。数種のカラムによって精製し、純度が高いタンパク質を調製した。プレマイクロRNAとしては、合成RNAと転写したRNAなどさまざまな長さ、配列のものを調製した。TUT・Lin28・プレマイクロRNAを混合し、ゲルろ過カラムによって複合体を確認した。精製した複合体を用いて結晶化スクリーニングを行ったが、結晶を得ることはできなかった。

続いて、TUTの触媒部位に着目し、発現コンストラクトの作製とタンパク質発現精製を行った。その結果、一つのコンストラクトで結晶を得ることができ、現在5Å程度の分解能のX線回折データを収集している。マイクロRNAは、特定のmRNAと相補的に結合し、mRNAの分解と翻訳抑制を誘導することによって、細胞分化やガン化などに関連する多くの遺伝子の発現制御を担っている。RNA結合タンパク質Lin28は、ウリジル化酵素TUT4をプレマイクロRNAにリクルートし、RNAをポリウリジル化することで分解経路に誘導し生合成を調節する。本研究では、ウリジル化酵素の立体構造を解明し、反応機構を明らかにすることを目的とした。ヒトポリウリジル化酵素の活性部位を結晶化し、現在分解能の向上のため、結晶化条件の精密化と測定条件の最適化を行っている。低分解能のX線回折データを使った分子置換法の解析を進めている。ポリウリジル化酵素について、様々なコンストラクトを作製し、精製と結晶化を試みてきた。全ドメインを含むタンパク質は、分子量が非常に大きく不安定であるため、結晶を得ることは難しかった。活性部位周辺のC末端領域に関しては、高純度に精製することができた。複数のタンパク質を調製して結晶化実験を行った結果、1つのコンストラクトについては結晶化が可能となった。スクリーニングで2条件で結晶化が可能となっており、それぞれの条件の改良を進めている。今後、セレノメチオニン導入したタンパク質結晶を使った位相決定、またはホモログの立体構造を利用した分子置換法による位相決定、および構造決定を目指す。ヒトポリウリジル化酵素特有のアミノ酸配列を含んでおり、新規的な反応機構が解明されると期待される。構造生物化学結晶を得ることができたポリウリジル化酵素のC末端領域の構造決定を行う。また、RNAを混合して結晶化し、RNAの認識機構、ポリウリジル化機構を解明する。明らかとなった立体構造を基にした、生化学的解析、および生物物理学的な解析を行い、基質となるRNAの認識機構の解明と触媒反応機構の解明を行う。補助因子Lin28およびプレマイクロRNAの調製も既に行っており、生化学的解析を行う準備が整っている。Lin28、プレマイクロRNAを使って、全ドメインを含むポリウリジル化酵素の詳細な生化学的解析を行い、構造に基づいた反応機構の解明を行う。ヒトポリウリジル化酵素について、様々なコンストラクトを作製し、精製と結晶化を試みているが、現在まで結晶を得るところまで至っていない。ポリウリジル化酵素のドメイン領域のタンパク質については、安定して高純度で精製できているにも関わらず結晶が得られないのが予想外であった。遺伝子の種を変更するなど、さらにコンストラクトの検討を行い、結晶化と立体構造の解明を目指す。遺伝子の種の変更を含めて発現コンストラクトの再検討を行い、結晶化が可能であるタンパク質の調製を行う。また、RNAを混合してタンパク質の安定化を試み、結晶化を行う。
オルガネラ膜接触によるゴルジ体機能調節

私たちは以前、小胞体とゴルジ体の膜接触部位におけるコレステロール及びセラミドの輸送が、トランスゴルジネットワーク(TGN)からのCARTS輸送小胞の形成に必要であることを報告した。これら脂質の輸送は、CARTSが担うTGNから細胞膜への小胞輸送と協調して厳密に制御される必要があるが、その分子メカニズムはこれまで明らかになっていない。私たちは、小胞体にコレステロールが十分存在する時、小胞体膜に局在するSCAPというタンパク質がゴルジ体との膜接触部位において、Sac1脂質ホスファターゼを介し、VAP/OSBPからなるコレステロール/ホスファチジルイノシトール4-リン酸(PI4P)交換輸送複合体と相互作用することを見出した。小胞体膜のコレステロールセンサーであるSCAPは、コレステロール欠乏時に膜結合型転写因子であるSREBPを小胞体からゴルジ体へと輸送し活性化することにより、コレステロールの合成・取り込みに関わる遺伝子の転写を促進することが明らかになっている。SCAPの発現抑制は、PI4Pのターンオーバーを阻害し、VAP/OSBP複合体の分布を変化させたことから、小胞体-ゴルジ体接触部位での脂質輸送を阻害している可能性が示唆された。この結果と一致して、SCAPの発現抑制は小胞体-ゴルジ体接触部位の脂質輸送を阻害した時と同様にTGNからのCARTS形成を阻害した。このフェノタイプは、野生型SCAPの発現によりレスキューされたが、コレステロールとの結合によるコンフォメーション変化が誘導されないSCAP変異体ではレスキューされなかった。これらの結果は、小胞体にコレステロールが十分存在する時、SCAPが小胞体-ゴルジ体接触部位でのコレステロール/PI4P交換輸送を介してTGNからの輸送小胞形成を制御することを示唆しており、SCAPの全く新しい機能を示している。APEXタグ法で見出された小胞体-ゴルジ体接触部位の新規構成タンパク質、ATP6V0A2の機能解析を進めるため、抗ATP6V0A2ポリクローナル抗体を作製した。また、ATP6V0A2の安定発現抑制細胞を樹立した。SCAPの機能解析については以下の進展があった:(1)SCAP安定発現抑制細胞を樹立し、この細胞をもとに各種SCAP変異体安定発現細胞を樹立した。(2)BiFC法を利用したVAP-OSBP複合体可視化細胞を樹立した。(3)上記(1)、(2)の細胞を用いて、PI4Pターンオーバーおよび、VAP-OSBP複合体分布、CARTS形成へのSCAPの関与を明らかにした。(4)精製タンパク質を用いてSac1のPI4Pホスファターゼ活性測定実験系を構築した。(5)ショ糖密度勾配遠心分画法によりゴルジ体膜を単離し、コレステロール含有量を測定した。・コントロール細胞およびSCAP安定発現抑制細胞からショ糖密度勾配遠心分画法によりゴルジ体膜を単離し、コレステロール含有量を測定したが、有意な差を検出することができなかった。現時点で得られたサンプルには、小胞体膜やエンドソーム膜の混入が多く、これが原因となっている可能性がある。さらにゴルジ体の精製度の高いサンプルを調製してコレステロールの測定を再度行う。・精製タンパク質を用いることでSac1のPI4Pホスファターゼ活性を測定することには成功したが、この実験系ではSCAP(およびSCAPとコレステロールの結合)がSac1活性に及ぼす影響については十分に評価できないため、ミクロソームを用いた実験系の構築を行う。・小胞体にコレステロールが十分存在する時、SCAPはSREBPおよびInsigと複合体を形成することから、SCAPがこれらタンパク質との複合体として小胞体-ゴルジ体接触部位で機能しているかどうかを検証する。・VAP-OSBP複合体可視化細胞を利用し、CARTS形成時のVAP-OSBP複合体の挙動(つまり、小胞体-ゴルジ体接触部位のダイナミクス)を観察し、この膜接触部位によるCARTS形成の時間的・空間的制御のメカニズムを解明する。・樹立したATP6V0A2発現抑制細胞を用い、小胞体-ゴルジ体接触部位における機能解析を行う。私たちは以前、トランスゴルジネットワーク(TGN)から細胞膜への輸送を仲介する輸送小胞であるCARTSの形成に、小胞体-ゴルジ体膜接触を介したセラミド・コレステロール輸送が必要であることを報告した。しかし、CARTS形成の過程において、積み荷タンパク質の選別やプロセシングを膜接触がどのような仕組みで制御しているのかは不明である。また、膜接触部位における脂質輸送の制御機構についてもこれまでほとんど明らかになっていない。今回私たちが取り組んだ課題は以下の3点である。(1) TGNにおけるCa2+依存性積み荷選別に小胞体-ゴルジ体膜接触は関与するか?:FRETに基づくCa2+センサーを利用してTGN内腔Ca2+の測定系を構築することができたが、膜接触がTGNのCa2+ホメオスタシスに関与することを示すのに十分な検出感度が得られなかった。(2) SCAPの小胞体-ゴルジ体接触部位における生理的役割の解明:SCAPは、コレステロール欠乏時に転写因子であるSREBPをゴルジ体へ輸送し活性化するコレステロールセンサーである。私たちは、小胞体膜に局在するSCAPがコレステロール輸送複合体との相互作用を介して、CARTS輸送小胞形成に働くことを明らかにした。この研究成果は、SCAPの新規機能ならびにコレステロール輸送制御機構の解明につながることが期待される。(3) APEXタグ法に基づく小胞体-ゴルジ体接触部位新規構成タンパク質の探索:

今回私たちは、新規構成タンパク質の候補としてV型H+-ATPase構成因子であるATP6V0A2を見出した。複数の膜接触部位構成因子の発現抑制によりTGN内腔pHの上昇が認められたことから、小胞体-ゴルジ体膜接触がV-ATPase活性の制御を介してCARTS形成時の積み荷タンパク質の選別およびプロセシングに関与する可能性が考えられた。Ca2+依存性積み荷選別への小胞体-ゴルジ体膜接触の関与の解析については、期待した成果が得られなかったものの、SCAPの解析や膜接触部位新規構成タンパク質の探索については、大きな進展があった。脂質ラフトに局在するglycosylphosphatidylinositol (GPI)アンカー型膜タンパク質の輸送に対するSCAP発現抑制の影響を調べた結果、ゴルジ体から細胞膜への輸送に遅延が見られた。Reverse Dimerization Systemを利用した誘導型のCARTS形成実験系を今回新たに構築し解析を行った結果、SCAP発現抑制細胞ではコントロール細胞に比べCARTS形成量が約80%低下していることがわかった。また、Bimolecular Fluorescence Complementation(BiFC)に基づく解析の結果、小胞体膜のSCAPが膜接触部位でVAP-A-OSBP-Sac1コレステロール輸送複合体と相互作用することが示唆された。APEXタグ法による小胞体-ゴルジ体接触部位新規構成タンパク質の探索においては、当初計画していたOSBP PH-FFAT変異体のAPEX融合タンパク質だけでなく、VAP-AのAPEX融合タンパク質も利用し、小胞体-ゴルジ体接触部位構成タンパク質のビオチン標識を行った。精製タンパク質を質量分析した結果、ゴルジ体に局在することが報告されている複数のOSBP-related protein (ORP)ファミリータンパク質に加えて、V型H+-ATPase構成因子であるATP6V0A2(TGNに局在)が見出された。この結果に基づき、小胞体-ゴルジ体膜接触とTGN内腔pHホメオスタシスの間に関連があるのではないかと考え、TGN内腔pHを測定するための実験系を構築した。結果として仮説を支持するデータを得ることができた。私たちは以前、小胞体とゴルジ体の膜接触部位におけるコレステロール及びセラミドの輸送が、トランスゴルジネットワーク(TGN)からのCARTS輸送小胞の形成に必要であることを報告した。これら脂質の輸送は、CARTSが担うTGNから細胞膜への小胞輸送と協調して厳密に制御される必要があるが、その分子メカニズムはこれまで明らかになっていない。私たちは、小胞体にコレステロールが十分存在する時、小胞体膜に局在するSCAPというタンパク質がゴルジ体との膜接触部位において、Sac1脂質ホスファターゼを介し、VAP/OSBPからなるコレステロール/ホスファチジルイノシトール4-リン酸(PI4P)交換輸送複合体と相互作用することを見出した。