hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス口蓋裂の表現型におけるpolymorphismとその発症機構の解明

TGFβ3遺伝子欠損マウスを戻し交配(8世代以上)により、C57BL/6J, 129/Sv, FVB/N, SJL/J, ICRの各系統で樹立し、ホモ胎児の口蓋裂表現型の系統差を調べた。その結果、C57BL/6Jでは100%の頻度で完全口蓋裂のみがみられるのに対して、ICRでは口蓋前方部分のみ癒合した不完全口蓋裂が100%の頻度でみられた。また、129/Sv, FVB/N, SJL/Jの各系統ホモ胎児では、完全口蓋裂と不完全口蓋裂の両表現型が種々の頻度で混在していた。さらに、各系統野生型胎児のMEE細胞の最終分化能力を我々が開発した単一口蓋突起回転浮遊培養法を用いて調べた結果、in vitroにおけるMEE細胞の最終分化能力とTGFβ3遺伝子欠損マウスの口蓋裂表現型との間に相関性があることが示唆された。また、対にして培養した口蓋突起を組織学的に解析した結果、同じTGFβ3-/-マウス胎児口蓋でも、C57BL/6J系統と異なり、ICR系統では口蓋前方部分のMEE細胞は間葉細胞ヘトランスフォームする能力を保持していることが明らかとなった。以上の実験結果から、口蓋形成遺伝子の異常と遺伝学的背景に隠されている修飾因子(変更遺伝子)との複合が口蓋裂表現型の多様性を生み出していることが示唆された。さらに、C57BL/6J系統のTGFβ3遺伝子欠損マウス胎児の口蓋突起は脱メチル化剤(5-アザデオキシシチジン)添加培地で培養することにより、ICR系統とほぼ同じ不完全口蓋裂にまで回復できることから、口蓋裂表現型の修飾因子はインプリンティング遺伝子である可能性が示唆された。しかしながら、口蓋裂表現型の修飾因子として、複数の候補遺伝子についてRT-PCRとWestern blot法で解析したが、現在までに実験群と対照群で有意な差を示す因子は検出されていない。本年度は非近交系マウス(ICR)と近交系マウス(C57BL/6J,129/Sv,FVB/N,SJL/J)の野生型胎児口蓋組織を材料に用いて、新規DNAメチル化酵素であるDnmt3b発現の差異をwestern blottingおよびRT-PCRで調べたが、有意な差を見出すことはできなかった。一方、我々の開発した単一口蓋突起回転浮遊培養法の培養条件を設定し直して、口蓋突起内側縁上皮細胞の最終分化能力を調べたところ、非近交系マウスと近交系マウスの野生型でさらに著しい相違を認めた。同様の条件でTGFβ3遺伝子欠損マウス(ICR系統とC57BL/6J系統)の対になった口蓋突起を培養したところ、ICR系統では口蓋前方部分の口蓋突起内側縁上皮細胞は上皮性縫合を形成すれば、TGFβ3に依存しないで間葉細胞にトランスフォーメーションできることが明らかになった。また、本来、in vivoでもin vitroでも上皮性縫合を形成する能力を持たなかったC57BL/6J系統のTGFβ3遺伝子欠損マウスでさえ、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することによって、上皮性縫合が形成されるようになることが判明した。しかし、上皮性縫合を形成してもトランスフォーメーションすることはなく、脱メチル化剤(5-アザデオキシシチジン)を併用しても効果は認められなかった。

マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害しない場合は、脱メチル化剤は内側縁上皮細胞の最終分化を促進し、C57BL/6J系統のTGFβ3遺伝子欠損マウスにみられる完全口蓋裂のみの表現型がICR系統とほぼ同じ表現型(不完全口蓋裂)にまで有意に回復した。これらの実験結果から、マトリックスメタロプロテアーゼ活性の抑制が上皮性縫合の形成時には必要であり、その直後から起こる最終分化にはマトリックスメタロプロテアーゼ活性化が必要であることが示唆された。100%の頻度で完全口蓋裂のみを発症するTGFβ3遺伝子欠損マウス(C57BL/6J系統)のホモ胎児口蓋を脱メチル化剤(5-アザデオキシシチジン)添加培地で培養して、ICR系統での不完全口蓋裂と同等の表現型にまで約80%の確立でレスキューし得た実験結果から、C57BL/6J系統TGFβ3ホモ胎児の完全口蓋裂表現型はTGFβ3遺伝子単独の異常によるものではなく、C57BL/6Jの遺伝学的背景に隠されている劣性遺伝的修飾因子との複合により生じることか示唆された。この実験に用いた5-アザデオキシシチジンの効果を遺伝子レベルで確認するため、培養後の実験群と対照群の口蓋組織からそれぞれゲノム・DNAを抽出し、代表的なインプリンティング遺伝子であるIgf-2rのアンチセンスRNAプロモーター領域(DMR2)およびセンスRNAプロモーター領域(DMR1)のメチル化状態の差異を解析した。その結果、5-アザデオキシシチジンは培養開始前までにメチル化されたDNAの脱メチル化は起こさないものの、培養中に起こる新規メチル化を効果的に抑制すること、およびその新規メチル化抑制効果はDMR2に対するよりもDMR1に対してより強く作用することが判明した。また、5-アザデオキシシチジンを用いて、in vivoで同様のレスキュー実験を試みたが、口蓋裂表現型の変化は観察されなかった。さらに、in vitroとin vivoでの脱メチル化剤の効果の差異の一つに子宮内環境因子である羊水が関与している可能性が示唆されたため、マウス羊水およびインフォームドコンセントにより承諾を得て採取されたヒト羊水の成分解析を行うとともに、マウス胎児の実験的破裂口蓋モデルを作製し、その破裂創の治癒を指標として種々の培養実験により、in vitroで子宮内環境を再現し得る人工羊水の開発に成功した(現在、特許出願準備中)。
食細胞によるアポトーシス細胞の貪食機構の生理的・病理的意義

1.食細胞による死細胞の貧食に関与ずるMFG-E8分子の変異体(D89E)はin vitroにおいて、多くの種類の食細胞による死細胞貧食を障害する作用を有するが、この変異蛋白を経静脈的にマウスに投与したところ、用量依存的に抗リン脂質抗体や抗核抗体が産生された。このD89Eタンパク投与による自己抗体の産生は、ex-vivoでアポトーシスを誘導した死細胞を同時に投与することによりその抗体価が上昇することから、変異タンパクの投与が食細胞による死細胞の処理を遅延させ、その結果、自己抗体産生が誘導されることが分かった。これらの結果により、死細胞貧食が自己に対する免疫寛容の維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。2.生体における食細胞による死細胞貧食の生理的意義を明らかにする目的で、一時的にマクロファージを誘導的に欠損することができる遺伝子改変マウスの作製を行った。lysozyme M遺伝子のプロモーターのコントロール下にhHB-EGF cDNAを挿入したノックインマウス(LysM-DTRマウス)を作製したところ、このマウスにジフテリア毒素(DT)を投与すると、脾臓、胸腺、肝臓に存在する食細胞の欠損を誘導できるが、高濃度のDT投与により96時間以内に個体死が起こることが分かった。死因を詳細に検討したところ、組織学的に肺に著明なうっ血と肺胞腔の減少が見られた。免疫組織学的検討により、肺胞マクロファージとともに二型肺胞上皮の欠損が見られ、それに伴って、肺胞洗浄液中のサーファクタントタンパクの著明な減少が見られた。このことからLysM-DTRマウスではマクロファージだけでなく、二型肺胞上皮にもhHB-EGFが発現し、DT投与による同細胞の消失により、ARDS様の呼吸不全が誘発されることが明らかとなった。食細胞による死細胞の貪食に関与する分子として同定した、MFG-E8の食細胞結合領域であるRGD配列をRGEに変換したMFG-E8変異蛋白(D89E)を作製し、その機能を解析した。D89E蛋白はin vitroにおいて、多くの種類の食細胞による死細胞貪食を濃度依存的に阻害した。さらにD89Eの死細胞貪食に伴う抗炎症作用に対する影響を検討したところ、死細胞負食に伴うLPS刺激腹腔マクロファージによるIL-10産生が、D89E添加により濃度依存的に抑制されることが分かった。生体内における食細胞による死細胞処理の生理的、病理的意義を検討する目的で、この変異蛋白を経静脈的にC57BL/6マウスに投与したところ、用量依存的に抗リン脂質抗体や抗核抗体が産生されたが、死細胞の貪食を阻害する作用を持たないE1E2PT変異蛋白を投与しても全く自己抗体が産生されなかった。またD89E投与により産生が誘導された自己抗体の血清抗体価は投与終了後も持続的に高値を示し、腎臓の糸球体に免疫グロブリンの沈着が起こることも確認された。これらのことより、死細胞貪食が自己に対する免疫寛容の維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。生体における食細胞による死細胞貧食の生理的意義を明らかにする目的で、一時的にマクロファージを誘導的に欠損することができる遺伝子改変マウスを作製した。ジフテリア毒素(DT)はヒトHB-EGFに結合して細胞内に取り込まれるが、マウスHB-EGFには結合しない。ヒト

HB-EGF cDNAを細胞特異的なプロモーターのコントロール下で発現させた遺伝子改変マウスにDTを投与するとヒトHB-EGFを発現した細胞にのみDTが取り込まれ、その毒性により細胞が死に至る。我々は、このシステムを用いて各種マクロファージのtransient inducible ablationの系の確立を試みた。最初に生体内のマクロファージにおけるこのシステムの有効性を確認することも兼ねて、マクロファージ全般に発現しているlysozyme M遺伝子のプロモーターのコントロール下にhHB-EGF cDNAを挿入したノックインマウス(LysM-DTRマウス)を作製した。このマウスにDTを投与すると、脾臓、胸腺、肝臓に存在する食細胞の欠損を誘導できるが、高濃度のDT投与により96時間以内に個体死が起こることが分かった。死因を詳細に検討したところ、組織学的に肺に著明なうっ血と肺胞腔の減少が見られた。免疫組織学的検討により、肺胞マクロファージとともに二型肺胞上皮の欠損が見られ、それに伴って、肺胞洗浄液中のサーファクタントタンパクの著明な減少が見られた。このことからLysM-DTRマウスではマクロファージだけでなく、二型肺胞上皮にもhHB-EGFが発現し、DT投与による同細胞の消失により、ARDS様の呼吸不全が誘発されることが明らかとなった。
リボソームRNAの機能ドメインとそのタンパク質認識・高次構造

I.動物Pタンパク質複合体のGTPase RNAドメインへの結合ラット肝リボソームより精製したリボソームPタンパク質,P0,P1,P2はin vitroで複合体を形成し、28S rRNAのGTPaseドメインに強い結合性を示した。また、Footfrint法による解析によって、その結合部位と考えられる一つのinternal loopをドメイン中に同定した。Pタンパク質複合体はラットGTPaseRNAドメインばかりでなく、大腸菌の相同ドメインにも強く結合した。この結合によって、真核生物型GTPase RNAドメインの高次構造を認識する抗28S抗体の結合性が増強することが判明し、Pタンパク質の結合がRNAの機能構造形成に影響を与えることが示唆された。同様な手法で、大腸菌の相同体L8複合体もドメイン構造に影響を与えることが示された。II.動物Pタンパク質複合体の大腸菌リボソームへの結合とその効果大腸菌リボソームからL7/L12タンパク質(またはL7/L12/L10)を特異的に除いたコア粒子とP0/P1/P2複合体を混合させることにより、Pタンパク質複合体と大腸菌リボソームとから成るハイブリッド(70S-P粒子)が得られた。Pタンパク質の役割を明確にするため、大腸菌intact 70Sリボソームとは作用しない動物細胞の伸長因子EF-2に対する70S-P粒子の受容性を解析した。70S-P粒子はもはや大腸菌の伸長因子EF-G依存のGTPase活性を保持せず、かわりに高い動物EF-2依存のGTPase活性を示した。また、70S-P粒子は動物細胞のEF-1α/EF-2因子依存のポリフェニルアラニン合成活性も示した。これらの活性はGTPase RNAドメインのリガンドである抗生物質チオストレプトンによって阻害された。さらに、GTPaseドメインのRNA断片をCompetitorとして加え、70S-P粒子形成を妨げた場合も活性が抑制された。以上の結果より、酸性タンパク質複合体がGTPase RNAドメインの一定部位に結合し、RNA構造調整と機能発現に関わることが示された。
琉球列島の石筍の高分解能解析とサンゴデータを組合わせた完新世の大気海洋変動復元

地質試料を用いた古気候解析は,地球環境変動を理解するうえで重要な手法の一つである.近年では,中国を中心に,石筍を用いた第四紀の気候変動解析(例えば,アジアモンスーンなど)に関する知見が蓄積されつつあるが,琉球列島においては更新世後期完新世の環境変動を代表する石筍データは得られていない.そこで,本研究では,琉球列島の複数の石筍について化学分析を実施し,サンゴの海洋プロキシデータとの解析から大気ー海洋間の変動史を復元することを目的としている.2018年度は,本研究課題事業の最終年度(1年延長申請済み)にあたり,石筍の追加分析ならびにデータ解析,成果発表,学術論文の執筆を行った.琉球列島(石垣島,沖縄島,沖永良部島)の複数の鍾乳洞において観測モニタリングした洞内環境データ(気温,湿度,二酸化炭素濃度,環境水など)の解析,複数の石筍試料の分析から得た安定酸素炭素同位体組成の高時間解像度時系列データの解析と石筍包有水の追加分析を行い,更新世後期完新世における琉球列島の陸域環境(気温,降水量)の長期変動を復元することに成功した.サンゴの海洋プロキシデータとの解析では,完新世における大気ー海洋の数年数十年変動の類似性と相違性を見出すことができた.以上の成果は,国内外の学会で発表した(計15件).また,本研究事業期間(2014ー2018年度)の研究成果は,2019年度のJpGU Meeting(日本地球惑星科学連合大会,2019年5月)などでも発信し,学術論文としてまとめて国際学術雑誌に発表する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。地質試料を用いた古気候復元解析は,地球環境変動を理解する上で重要な手法の一つである.近年では,中国を中心に,石筍を用いた第四紀の気候変動解析(例えば,アジアモンスーンなど)に関する知見が蓄積されつつあるが,琉球列島においては完新世の環境変動を代表する石筍データは得られていない.そこで,本研究では,琉球列島の複数の石筍について化学分析を実施し,完新世における琉球列島の陸域環境(気温,降水量)の長期時系列データを抽出し,サンゴの海洋プロキシデータとの解析から大気ー海洋間の変動史を復元することを目的としている.2014年度は,琉球列島の鍾乳洞(石垣島,沖縄島,沖永良部島の3島9鍾乳洞)において定期現場調査を開始した.ロガーによる洞内環境(気温,湿度など)の連続観測,二酸化炭素濃度計測,環境水の採取などを行った.鍾乳洞管理者の許可を得て採取した複数の石筍試料について,切断,整形,研磨を行い,化学分析用の粉末サンプルを採取した.安定酸素炭素同位体比分析の結果,石筍試料の形成年代は完新世であると推定され,明瞭なハイエイタス(形成中断)もみられないことから,本研究の目的に合致する最適な石筍試料を選別することができた.2014年度に導入したX線画像読取装置システムのセットアップと予備的な実験を行った結果,石筍試料の縞構造の撮影と画像解析が可能であることを確認した.2014年度はレーザーアブレーションシステムに不具合が生じ,微量元素組成の高解像度分析を当初の計画通り実施することができなかったため,安定酸素炭素同位体比分析を精力的に実施した.野外調査の結果と化学分析の結果を解析し,本年度に得られた成果を2015年度の国内外の学会など(例えば,国際第四紀学連合第19回大会などを予定)で発表する.地質試料を用いた古気候解析は,地球環境変動を理解するうえで重要な手法の一つである.近年では,中国を中心に,石筍を用いた第四紀の気候変動解析(例えば,アジアモンスーンなど)に関する知見が蓄積されつつあるが,琉球列島においては完新世の環境変動を代表する石筍データは得られていない.そこで,本研究では,琉球列島の複数の石筍について化学分析を実施し,完新世における琉球列島の陸域環境(気温,降水量)の長期時系列データを抽出し,サンゴの海洋プロキシデータとの解析から大気ー海洋間の変動史を復元することを目的としている.2015年度は,2014年度に引き続き,琉球列島の鍾乳洞(石垣島,沖縄島,沖永良部島の3島9鍾乳洞)において洞窟管理者の許可を得て定期現場調査を実施し,ロガーによる洞内環境(気温,湿度など)の連続観測,二酸化炭素濃度計測,環境水・石筍試料の採取などを行った.複数の石筍試料について,切断・整形・研磨を行い,X線画像の縞構造解析,化学分析,年代測定を行った.その結果,石筍試料の形成年代は最終氷期完新世現在のタイムレンジにあり,本研究の目的に適することを確認した.また,安定酸素同位体組成の分析から過去の陸域環境の推定を試みた.野外調査ならびに化学分析の解析結果は,一部を国内外の学会で発表し,国際学術雑誌に発表した(Uemura et al., 2016. GCA).また,2014ー2015年度の研究成果をとりまとめ,2016年度の国内外の学会など(例えば,ゴールドシュミット国際会議第26回大会など)で発表し,国際学術雑誌に投稿する予定である.本研究は,概ね2015年度研究実施計画どおりに進められた.

具体的な理由は,1)琉球列島における異なる3地点(石垣島,沖縄島,沖永良部島)の複数の鍾乳洞において,現場観測を2014年度より継続的に実施できたこと,2)鍾乳洞管理者の許可を得て,多数の石筍試料を採取することができたこと,3)試料の各種実験と化学分析を順調に推進することができ,本研究目的に合致する多くの基礎データが得られたこと,4)比較対象とするサンゴ年輪データの蓄積と解析が進展したこと,5)成果の一部を国内外の学会や国際学術雑誌で発表したことや,次年度に開かれるゴールドシュミット国際会議第26回大会への発表投稿が受理されたこと,である.なお,レーザーアブレーションシステムに不具合が生じたため,微量元素分析を当初の計画通り実施できなかった.この点では進捗状況に遅れがあるものの,それ以外の研究項目で膨大な基礎データが蓄積されたことや,成果を定期的に発信できていることから,本研究は概ね順調に進展していると判断される.地質試料を用いた古気候解析は,地球環境変動を理解するうえで重要な手法の一つである.近年では,中国を中心に,石筍を用いた第四紀の気候変動解析(例えば,アジアモンスーンなど)に関する知見が蓄積されつつあるが,琉球列島においては完新世の環境変動を代表する石筍データは得られていない.そこで,本研究では,琉球列島の複数の石筍について化学分析を実施し,完新世における琉球列島の陸域環境(気温,降水量)の長期時系列データを抽出し,サンゴなどの海洋プロキシデータとの解析から大気ー海洋間の変動史を復元することを目的としている.2016年度は,2015年度に引き続き,琉球列島の鍾乳洞(沖縄島,沖永良部島の2島7鍾乳洞)において洞窟管理者の許可を得て定期現場調査を実施し,ロガーによる洞内環境(気温,湿度など)の連続観測,二酸化炭素濃度計測,環境水・石筍試料の採取などを行った.複数の石筍試料について,切断・整形・研磨を行い,X線画像の縞構造解析,化学分析,年代測定を行った.その結果,石筍試料の形成年代は最終氷期完新世現在のタイムレンジにあり,本研究の目的に適することを確認した.また,安定酸素同位体組成ならびにレーザーアブレーションICPなどの化学分析から過去の陸域環境の推定を試みた.以上の野外調査ならびに化学分析の解析結果,ならびに比較対象とするサンゴなどの海洋プロキシの解析結果は,一部を国内外の学会や学術雑誌で発表した.また,2014ー2016年度の研究成果をとりまとめ,2017年度の国内外の学会など(例えば,JpGU-AGU Joint Meeting 2017など)で発表し,国際学術雑誌に投稿する予定である.本研究は,概ね2016年度研究実施計画どおりに進められた.具体的な理由は,1)琉球列島における異なる2地点(沖縄島,沖永良部島)の複数の鍾乳洞において,現場観測を2014年度より継続的に実施できたこと,2)鍾乳洞管理者の許可を得て,多数の石筍試料を採取することができたこと,3)試料の各種実験と化学分析(安定同位体組成分析,レーザーアブレーション微量元素分析,ウラン系列年代測定など)を順調に推進することができ,本研究目的に合致する多くの基礎データが得られたこと,4)比較対象とするサンゴ年輪データの蓄積と解析が進展したこと,5)成果の一部を国内外の学会や国際学術雑誌で発表したことや,2017年度に開かれるJpGU-AGU Joint Meeting 2017で成果を発表する予定であること,である.以上のように,各種研究項目で膨大な実験データが蓄積されたことや,成果を定期的に発信できていることから,本研究は概ね順調に進展していると判断される.地質試料を用いた古気候解析は,地球環境変動を理解するうえで重要な手法の一つである.近年では,中国を中心に,石筍を用いた第四紀の気候変動解析(例えば,アジアモンスーンなど)に関する知見が蓄積されつつあるが,琉球列島においては完新世の環境変動を代表する石筍データは得られていない.
顔面骨の仮骨延長部位におけるLRP5遺伝子導入による骨形成能促進効果に関する研究

われわれはメカニカルストレス存在下の骨分化調節因子として、LRP5/Wntシグナルを活性化するために、仮骨形成する際に、非ウイルスベクターによるWnt3a遺伝子を局所注射により導入し、その後通常通り仮骨延長を行うことを発案した。従来行われていなかった遺伝子導入法を、非ウイルスベクターを用いて安全に行い、細胞分化とメカニカルセンシングを促進することで分化調節と細胞動員が意図的になされれば、効率の良い仮骨延長が実現可能であろう。効果判定として、従来より行っている低出力超音波パルス照射群、rhGDF5群に対して仮骨延長を行い、比較検討を行う予定で実験系を開始した。しかし本研究の期間内では、マウス骨折モデルの仮骨部分に対して、遺伝子導入した後の骨形成効果について、比較検討するにとどまった。その結果、LRP5/Wntシグナルは、Wnt3a遺伝子を導入することによって、βカテニン経路を持続的に活性化し、未分化な仮骨の細胞を軟骨細胞に分化増殖させることがわかった。一方、COX2-PGE2生成系は、その刺激が破骨細胞を誘導しない範囲で軟骨の架橋を促進後、骨化させることも判明した。すなわち、軟骨形成によるボリュウムの増加とメカニカルストレスによる骨化の促進が、多骨化を生む要因になっていることが予想される。これを臨床応用すれば、仮骨延長後にはシャフトの太い、再建骨が得られることが予想される。しかし、本目的を完結させるためには、COX2-PGE2生成系とLRP5/Wntシグナルのクロストーク、Wnt3a遺伝子以外のWntファミリーの仮骨に対する効果、LRP5の変異型によるシグナルの相違、Wntはcbfal/Smadシグナルを活性化するか、などの追求をおこなう必要があり、今後の研究展開としたい。従来のin vitroでの実験では、骨延長での主役は未分化な間質細胞とそれらが分化した骨芽細胞であることが判明している(Ishigame M.et al.J.B.M.R 2002)。そして、超音波刺激のような、低出力でHSP72を上げることなく、細胞に刺激を与える系では、骨芽細胞がその刺激に対してアナボリックな反応を起こすことが観察された。さらに細胞へのメカニカルストレス付与時のCOX-2 mRNAの上昇が必ず観察されることである。NS398のようなCOX-2のブロッカーを用いた場合、骨細胞の超音波刺激に対するアナボリックな反応が消失したことから(J.B.M.R 2003)、COX-2PGE産成の系が、骨芽細胞の骨形成(増殖または分化)効果に大きな影響を与えていることが推測された。骨延長においても、緩徐に仮骨を延長していく過程が、COX-2の上昇をみることからPGE2合成系の影響と、各種成長因子との関係を調べることが重要と考え、平成15年のin vitroの実験計画にはこれをふまえて、予備実験的をおこなった。それによると、高齢COX-2ノックアウトマウスの培養骨芽細胞に対して機械的刺激を与え、アナボリックな反応の消失を観察した。すなわち、各種成長因子の枯渇した高齢マウスはCOX-2PGE2合成系によっての骨形成にバックアップされるのみで、さらにCOX-2PGE2合成系は機械的刺激の骨形成効果としてのシグナルを伝達する重要な役割を果たすことが示唆された。未分化間葉細胞、骨芽細胞培養下での遺伝子導入の準備は、鶴見大学歯学部で整い、帝京大学薬学部におけるTat-PNAの合成と予備的実験の終了を待つところである。Tat-PNA合成は可能であるが、導入した細胞での発現に現在苦慮しており、さらなる改良を行っている。平成16年度には実現が可能であると考えられる。Wntファミリーは、成長因子の一つである。近年の解析結果からLRP5/Wnt/β-

cateninシグナルの骨軟骨形成及び骨代謝における重要性が示唆されている。それゆえ仮骨形成過程におけるβ-cateninシグナル経路を活性化することは、骨軟骨形成の促進に繋がるものと推測される。そこで本研究では、Wntファミリーの中でもβ-cateninシグナルを活性化するWnt3a遺伝子発現ベクターを導入遺伝子として用い、エレクトロポレーション法を用いて、骨折近傍組織への遺伝子導入を行い、それによって仮骨延長時の仮骨形成に対する影響について検討を行った。平成16年度は、以下(1)(4)にしめす実験を行った。(1)エレクトロポレーション法による遺伝子導入効率の検討(2)骨折モデルマウスへの遺伝子導入の検討(3)Wnt3aによる骨折治癒・修復過程の影響((1)仮骨の性状の解析,(2)骨質の評価,(3)骨軟骨関連分化マーカーの発現変動の解析,(4)組織染色)(4)Wnt3aの作用機構の解析。その結果、骨折近傍組織にWnt3a発現ベクターを導入したところ、仮骨・筋肉組織由来のWnt3a発現が確認され、オートクライン・パラクライン的に骨折局所において作用する可能性が示された。また、μCTによる解析から仮骨幅および仮骨量が増加することが明らかとなった。組織染色により軟骨基質の増大が確認された。また、仮骨内におけるヘキソサミン含量およびALPase活性はWnt3aの導入により増加し、Ca含量には影響を及ぼさなかった。仮骨における骨軟骨関連分化マーカーの発現レベルは、特に軟骨分化マーカーにおける発現の増強が認められた。仮骨延長部にWnt3aを導入することが、軟骨仮骨量を増加させ、延長後の骨径を太くする可能性が示唆された。
民法解釈論における正当化概念としての法典外部的要素と法典内部的要素

本研究は、バブル経済の崩壊のもたらした金融危機の中で、思わぬ対象を得た。すなわち、抵当権の物上代位や短期賃貸借、さらには将来債権の譲渡に関する最高裁判決が、これまでの判決を実質的に変更し、金融機関側に有利に動き始めたのである。これは、明らかに法典外部的要素を法解釈に取り込んだ作業にほかならない。とりわけ、短期賃貸借における判例は、これまで形式論理のみによっていたにもかかわらず、抵当権者の権利を強める、という至上命題のもとで変動したのである。我妻テーゼは、このようにして再生した。しかし、このことによって失われた法典外部的要素もある。歴史、沿革、比較法-これらの考慮はかえって少なくなってきた。これをフランス・ドイツにおける解釈論と比較してみると、その特殊性はあらわになる。両国における解釈論を一言でいえば、約束事が多いことである。約束事から逸脱することはできない。この約束事は、歴史、沿革、さらには確立した学説法理によって形成されている。イングランドにおいてもしかりである。一見、プラグマティックに実用性を重んじているように思われるイングランド法は、アティアとサマーズの指摘に待つまでもなく、多くの約束事からなる形式的な基礎付けをともなうのである。「約束事」も経済事情も、いずれも法典外部的要素である。したがって、法典内部的な要素のみで自己完結的な解釈論は、ドウォーキンの指摘にもかかわらず、決してとられてはいない。しかし、そうだからといって、「約束事」の多い解釈と少ない解釈との違いは重要である。まず、代表的な教科書類における解釈論の理由付けの検討から始めた。ここにおいて、最も注目されるのは、我妻栄『近代法における債権の優越的地位』の影響力である。とりわけ、担保物権法の分野においては、「抵当権者に有利である」ということが、解釈論の唯一の根拠となっている例すら多々見られる。同様に、債権譲渡等の分野でも、「債権の流通性を高める」ということが、解釈論の論拠として用いられている。以上の点をいかに考えるかが問題であり、それが利益考量論をいかに位置づけるかにもかかわってくる。現時点での試論を述べれば、利益考量論は、実は「利益を考量する」というところにその真価があったわけではなく、「考慮すべき要素を多様化する」ということに貢献したものと見られる。現時点では、一方の価値のみを強調して、解釈論の論拠とするのははばかられる状況であろうと思われるのである。しかし、我妻の論拠提示が、まさに近代法の進むべき方向に関する我妻テ-ゼに基礎づけられている点も重要である。つまり、方向性のテ-ゼを経由して初めて、上記のような理由付けが可能になったのである。そうであるならば、問題は、はたして方向性を認識することができるか、また、認識することができるとしても、それを解釈論の根拠とできるか、が検討されるべきことになる。とりわけ、前者については、マルクス主義的な方向性提示が強い批判を受けたにもかかわらず、なぜ我妻テ-ゼは生き残ったのか、が問題とされなければならない。
プリオン様伝播モデルによるレビー小体型認知症病原蛋白質の本体解明と創薬基盤の構築

レビー小体型認知症(DLB)の脳内における異常型αSynの広がり方は、プリオン病の感染性蛋白質であるプリオンの伝播性に類似しており、異常型αSynのプリオン様伝播機構を解明することはDLB克服にとって重要な課題である。本研究では、様々な条件下で人工的に作製した異常型αSynの伝播性について、プリオン様伝播性試験管反応系(RT-QuIC)、実験マウス、培養細胞を用いて評価することで、伝播性を有する異常型αSynに関与する因子を解明する。またその異常型αSynの分子サイズ、形態、立体構造を解析することで異常型αSynの本体を解明する。さらに因子に基づくDLB治療薬の探索と、異常型αSynの構造情報に基づく創薬基盤の構築を行う。
透析導入防止・腎臓機能障害進行防止をめざした腎臓リハビリテーション物理療法の確立

我が国の身体障害者に占める腎臓機能障害者の増加が著しい.また,腎臓機能の低下とともに運動耐容能の低下もたらされている.一方,運動はCKD患者においても運動耐容能,QOL,糖や脂質代謝改善などのメリットをもたらすと考えられるが,運動中には腎血流量や糸球体濾過量の減少,尿蛋白の増加などが生じる危険性も指摘されてきた.運動の代替としての電気刺激療法の有効性も不明であった.本研究では,従来,安静が治療の一部とされていたCKD患者へ腎リハの効果を科学的に解明し,本研究代表者が会長を務める日本腎臓リハビリテーション学会において診療ガイドライン策定に至ることができた.平成28年は、末期腎不全患者30名(男性60%,70.6±10.6歳,diabetes 67%)を自転車運動群10名、下肢電器刺激群10名、対照群10名に無作為に振り分け、HD中に週2回の自転車運動または下肢低周波電気刺激療法(イトーESPURGE)による下肢電気刺激(両側大腿四頭筋と下腿三頭筋への電極貼付)を12週間継続し,対照群には通常のHD治療を行った。12週間の介入前後の各種生化学検査、透析効率、透析日の早朝血圧、身体運動機能の身体機能に与える影響を比較検討した。その結果、介入12週後に自転車運動群は、早朝血圧、透析効率、LDL-C、下肢筋力、運動耐容能に変化が認められた。電気刺激群では各種生化学検査値が変化し、下肢筋力は維持されていた。対照群に変化は認められなかった。次に、自宅で自主トレとして、非監視下で電機刺激を実施できるかどうか可能性を検討した。対象は、本研究について説明に対し書面で同意が得られた、72歳の膜性腎症、男性、stage3のCKD患者、糖尿病を合併していた。本対象は、介入前にスクワットや散歩等の定期的な運動は行っていたが、握力および下肢筋力は同年代平均の50%以下であり、適正な運動はできていなかった。自宅で自主トレとして、両側下肢筋に低周波電気刺激を自宅で毎日60分間、12週間連続して実施したところ(刺激の強さは疼痛閾値より下に設定した)、介入前後で体組成は変わらずに、各種生化学検査、血管内皮機能、運動耐容能、筋力、心臓自律神経機能、身体活動量測定に変化が生じた。これらの結果から、慢性腎臓病のどの段階にも有効であるが、それぞれ異なる影響を与えることが示唆された。特に、保存期CKDに対しての下肢微弱電気刺激は、透析導入防止・腎臓機能障害進行防止に影響があることが示唆された。次年度以降は、さらに対象者を増やし検討していく予定である。概ね計画通りに進行しているため。本年度は腎臓リハビリテーションのエビデンス確立のため,1.腎臓リハビリテーションガイドライン策定実現と2.保存期在宅CKD患者における運動療法が身体運動機能と蛋白尿に与える影響を検討した.1. 2016年度から進行した糖尿病性腎症に対する運動指導の評価として「糖尿病透析予防指導管理料腎不全期患者指導加算」が診療報酬として新たに認められた.海外から出されたいくつかのCKDに対するガイドラインでは,透析患者や保存的CKD患者における運動療法の定期的施行が推奨されているが,そのエビデンスレベルは高いものではない.このような流れのなかで,医療としての腎臓リハビリテーションの位置づけを明確にし,患者予後,QOL,満足度を最大化する医療を提供するための診療ガイドラインの作成をし,南江堂から出版予定になるに至った.ガイドラインの目的は腎臓リハビリテーション医療の質,安全性と有効性,およびその提供を最適化することとし,対象は,糸球体腎炎・ネフローゼ症候群者,保存期CKD患者,血液透析患者,腎移植患者とした.特に運動療法は,包括的なプログラムの根幹となるものであり,実施するにあたり具体的なマニュアルの作成が強く求められてきた.また,腎臓リハビリテーションのプログラムは,患者の医学的,栄養学的,心理社会学的,教育的,職業上のすべての側面を評価することから始まることから,各種評価の方法や標準的な運動療法プロトコールについて加え,病期別の対応と留意点等についても紹介した.さらには,英語版を海外の医学雑誌に投稿する予定である.2.糖尿病を合併する膜性腎症CKDstageIIIb患者に対し,3か月間の運動療法を行った結果,運動期間中は蛋白尿の減少を認めたが,運動終了後に蛋白尿が増悪した.これらのことから,保存期CKDへの運動療法は有害事象の発生無しに身体機能を向上させる可能性が示唆された.我が国の身体障害者に占める腎臓機能障害者の増加が著しい.また,腎臓機能の低下とともに運動耐容能の低下もたらされている.一方,運動はCKD患者においても運動耐容能,QOL,糖や脂質代謝改善などのメリットをもたらすと考えられるが,運動中には腎血流量や糸球体濾過量の減少,尿蛋白の増加などが生じる危険性も指摘されてきた.運動の代替としての電気刺激療法の有効性も不明であった.本研究では,従来,安静が治療の一部とされていたCKD患者へ腎リハの効果を科学的に解明し,本研究代表者が会長を務める日本腎臓リハビリテーション学会において診療ガイドライン策定に至ることができた.今後は対象者数を増やし、さらに検討を重ねていきたい。内科学,リハビリテーション医学
光スイッチング機能を有する膜結合性酵素の化学変換法による合成

本研究では、非天然芳香族アミノ酸を、タンパク質の一次シ-ケンスの特定部位に導入して、光により酵素機能を制御できる分子システムを開発することを目的とした。具体的には、リン脂質の2位のアシル鎖を選択的に切断する酵素であるホスホリパ-ゼA_2(PLA2)を選び、化学変換法により改質して、変異酵素を合成した。合成の概要は以下の通りである。i)PLA2のリシン残基の側鎖アミノ基の選択的アミジン化、ii)エドマン分解を3サイクル行うことによる、PLA2のN端側の3残基の切断(DES3)、iii)非天然芳香族アミノ酸を含むトリペプチドの液相法による合成、iv)トリペプチドの活性エステルとDES3との反応、v)N端保護基の除去と変異酵素の精製。酵素活性は、放射性同位元素でラベルした脂質を用いてリポソ-ムを調製し、酵素との反応で遊離するアシル鎖を定量して行った。得られた変異酵素は、Trp^3をナフチルアラニン、アントリルアラニン及びフェニルアゾフェニルアラニン(azoF)で置換した3種類である。Trp^3は、基質集合体の界面認識部位を構成しているアミノ酸残基である。前2者の変異酵素では、UV光照射により酵素活性が減少した。これは、導入した非天然芳香族アミノ酸の光励起により、空間的に近接して存在するTyr^<69>との間で電荷移動錯体が形成され、変異酵素の脂質膜への分配が抑制されるためと考えられる。一方、トランス型azoFを導入した変異酵素では活性が失われたのに対し、UV光照射によりシス型にすると僅かながら酵素活性が認められた。シス型azoFを結合した変異酵素では、αヘリックス含率がトランス型よりも増大しており、トランス/シス異性化によるコンホメ-ション変化が、酵素活性の光応答性の原因と考えられる。本研究は、光感応性非天然アミノ酸を、タンパク質の一次シ-ケンスの特定部位に導入して、光により酵素機能を制御できるようなシステムを開発することを目的とする。ここでは、天然に存在する酵素を改質して変異酵素を得るセミシンセシス法により、変異ホスホリパ-ゼA_2を合成する。初年度においては、i)ホスホリパ-ゼA_2に存在する9個のリシン残基の側鎖アミノ基の選択的アミジン化、ii)エドマン分解による、ホスホリパ-ゼA_2のN端側の3残基の切断、iii)非天然アミノ酸を含むトリペプチドの合成、を行った。以下に、その概要を説明する。i)Trp^3を光感応性非天然アミノ酸であるアントリルアラニン(ant-Ala)で置換した変異酵素は、導入したアントリルアラニンの光励起によりTyr^<69>との間で電荷移動錯体を形成し、変異酵素の脂質膜への分配が変化すると考えられる。アントリルアラニンの導入のため、ホスホリパ-ゼA_2のN端側からAla,Leu,Trpの3残基をエドマン分解により切断するが、あらかじめLys残基の側鎖アミノ基をアミジノ基で選択的に保護した。この選択的アミジン化は、pH10.5でホスホリパ-ゼA_2とメチルアセチミデ-トとを40分反応させる操作を、数回繰り返して行った。これにより、従来行われていた7個のアミノ酸をN端側に有する酵素前駆体を用いる必要がなくなった。反応後、ODSカラムを用いたHPLC法により精製した。ii)エドマン分解を繰り返して、N端側の3残基を切断した。生成する各アミノ酸のPTC誘導体をTLCで検出して反応の進行を確認した。

iii)アントリルアラニンを合成し、Boc-Leu-OSu(OSu:コハク酸イミドエステル)およびBoc-Ala-OSuと順次反応させ、Boc-Ala-Leu-antAla-OHを合成した。次年度においては、切断した酵素と合成したトリペプチドの縮合反応を行い、目的の変異酵素を得て、その特性解析を行う。本研究では、非天然芳香族アミノ酸を、タンパク質の一次シ-ケンスの特定部位に導入して、光により酵素機能を制御できる分子システムを開発することを目的とした。具体的には、リン脂質の2位のアシル鎖を選択的に切断する酵素であるホスホリパ-ゼA_2(PLA2)を選び、化学変還法により改質して、変異酵素を合成した。合成の概要は以下の通りである。i)PLA2のリシン残基の側鎖アミノ基の選択的アミジン化、ii)エドマン分解を3サイクル行うことによる、PLA2のN端側の3残基の切断(DES3)、iii)非天然芳香族アミノ酸を含むトリペプチドの液相法による合成、iv)トリペプチドの活性エステルとDES3との反応、v)N端保護基の除去と変異酵素の精製。酸素活性は、放射性同位元素でラベルした脂質を用いてリポソ-ムを調整し、酵素との反応で遊離するアシル鎖を定量して行った。得られた変異酵素は、Trp^3をナフチルアラニン、アントリルアラニン及びフェニルアゾフェニルアラニン(azoF)で置換した3種類である。Trp^3は、基質集合体の界面認識部位を構成しているアミノ酸残基である。前2者の変異酵素では、UV光照射により酵素活性が減少した。これは、導入した非天然芳香族アミノ酸の光励起により、空間的に近接して存在するTyr^<69>との間で電荷移動錯体が形成され、変異酵素の脂質膜への分配が抑制させるためと考えられる。一方、トランス型azoFを導入した変異酵素では活性が失われたのに対し、UV光照射によりシス型にすると僅かながら酵素活性が認められた。シス型azoFを結合した変異酵素では、αヘリックス含率がトランス型よりも増大しており、トランス/シス異性化によるコンホメ-ション変化が、酵素活性の光応答性の原因と考えられる。
江戸時代後期・明治時代における地域市場の歴史学的分析-屎尿流通を中心に-

本研究課題を完成させるため、(1)関係史料の収集・整理、(2)本研究の総括と成果発表、(3)研究成果の出版準備、の3点を中心に進めてきた。(1)は、昨年度より調査を開始した信濃国松代(現・長野県)の大名・真田家の関係史料を収集した。また、屎尿流通に関する大阪地域の史料を引き続き収集したほか、地域市場分析の深化が期待される近江国(現・滋賀県)一帯の流通関係史料について調査をおこなった。(2)は、研究課題についての成果と課題を総括したほか、真田家関係史料の調査・収集で得た内容の一部については、江戸時代後期における地域市場と中央市場の関係を論じた「松代真田家の大坂交易と御用場」(渡辺尚志・小関悠一郎編『藩地域の政策主体と藩政』所収、岩田書院、2008年7月刊行)としてすでに発表済みである。さらに、各地域における農業肥料の特質を明らかにするため、市場史研究会において大会報告の機会を得て、「一九世紀近江における魚肥流通」をテーマに研究を進めている。(3)は、本研究における3ヵ年間の成果をもとに、著書『屎尿からみた近世社会(仮題)』(清文堂出版、2010年刊行予定)の準備を進めている。今年度、集中して調査をおこなった真田家関係史料については、渡辺尚志・荒武賢一朗編『藩地域の政治活動と社会(仮題)』(岩田書院、2010年刊行予定)で論文集の「総論」と、個別テーマ「松代真田家の大坂進出と明治維新」を執筆する予定である。また、「近世史から現代社会を考える研究会」(代表・荒武)の活動成果として、荒武賢一朗編『歴史と現代のつながり(仮題)』(2010年刊行予定)の準備をおこなっており、同書の「序章」と個別テーマ「食品流通構造と小売商・消費者の存在」を執筆予定である。今年度は、(1)自己の成果を含む研究史の再検討、(2)関係史料の収集・整理・公表、(3)学会報告での成果発表、の3点を中心に研究活動をおこなった。(1)は日本経済史全体のほか、主たる研究対象である大阪の都市史、および周辺農村史に関する先行研究の成果と、今後自身が取り組むべき課題の抽出に努めた。また平成15年度関西大学大学院に提出した博士論文「江戸後期・明治前期大坂地域における流通構造-青物・屎尿流通を中心に-」で展開した学説の内容点検、および今後取り組むべき課題の確認作業を行った。(2)は研究課題に掲げる地域市場に関する史料調査を行った。近隣の所蔵機関では関西大学文学部、大阪大学経済学部、大阪市史編纂所、尼崎市立地域研究史料館など、また遠隔地においては福島県文化センター歴史資料館、学習院大学史料館、一橋大学付属図書館、国立公文書館などで史料閲覧の機会を得た。それぞれ大阪・江戸(東京)・京都に関する江戸時代、明治時代の古文書を整理・複写・解読・データ化の諸作業を行った。その成果の一部として、「大阪宗旨役所触扣」、「浅野隼人家関係文書」を公表している。これらを含め、次年度以降に向けて史料収集活動の基礎を固める活動に終始した。(3)は平成18年7月に開催された第45回近世史サマーセミナーにて「屎尿問題からみた近世社会-流通・環境をめぐる秩序と実態-」と題した口頭報告を行い、日本近世社会においての屎尿取引の実情を流通や環境の側面から論じた。また19年2月には名古屋近世史研究会・同近現代史研究会の合同例会において「近世・近代移行期大坂における商人の動向-『商都』の実像-」と題した口頭報告の機会を得た。ここでは「天下の台所」と称される近世大坂のイメージの再検討、明治維新直後の商人の動向を検討し、新たな都市像の構築を試みた。いずれについても今後雑誌論文として公表する予定である。今年度は、(1)隣接諸科学による成果の検討、(2)関係史料の収集・整理(デジタルカメラによる写真撮影・パソコンによるデータ処理・収集史料のデータベース化)、(3)学会・学術雑誌での成果発表、の三点を中心に活動をおこなった。(1)は文献史学の研究成果だけでなく、経済学・考古学・地理学など本研究と関わりの深い隣接諸科学の有益な議論を幅広く吸収し、その意義や課題を確認することに努めた。また本研究の主要テーマである屎尿流通以外の地域市場論の吸収も意識的におこなった。(2)は研究課題に沿って地域市場についての史料収集・整理をおこなった。近隣では関西大学文学部、大阪市史編纂所、愛知川町史編さん室など各所蔵機関のほか、遠隔地の国文学研究資料館、国立公文書館、東京都江戸東京博物館、埼玉県立文書館、一橋大学、佐賀大学、熊本大学などで史料閲覧の機会を得た。それぞれ整理・複写・解読・データベース化の作業を実施し、今後の研究に活用できるよう整備している。(3)は地域市場分析の一環から、近世畿内における米穀の問題を論文として執筆した。また(1)と関連して、これまでの先行研究の成果を整理し、近世大坂や畿内・近国にかかわる書籍の書評2本を学術雑誌で発表した。口頭報告は、平成19年5月15日に松代真田家文書研究会で「松代真田家大坂御用場の設置と商品流通」と題した報告をおこない、続けて同年11月10日に明治維新史学会秋期大会で「幕末維新期の大坂御用場-大名・旗本におけるもうひとつの大坂拠点-」を発表した。

両報告はともに従来述べられてきた近世大坂蔵屋敷の経済的意義を検証し、本研究のなかでも重要視する地域市場の内実を詳細に検討したもので、今後論文として公表する準備を進めている。本研究課題を完成させるため、(1)関係史料の収集・整理、(2)本研究の総括と成果発表、(3)研究成果の出版準備、の3点を中心に進めてきた。(1)は、昨年度より調査を開始した信濃国松代(現・長野県)の大名・真田家の関係史料を収集した。また、屎尿流通に関する大阪地域の史料を引き続き収集したほか、地域市場分析の深化が期待される近江国(現・滋賀県)一帯の流通関係史料について調査をおこなった。(2)は、研究課題についての成果と課題を総括したほか、真田家関係史料の調査・収集で得た内容の一部については、江戸時代後期における地域市場と中央市場の関係を論じた「松代真田家の大坂交易と御用場」(渡辺尚志・小関悠一郎編『藩地域の政策主体と藩政』所収、岩田書院、2008年7月刊行)としてすでに発表済みである。さらに、各地域における農業肥料の特質を明らかにするため、市場史研究会において大会報告の機会を得て、「一九世紀近江における魚肥流通」をテーマに研究を進めている。(3)は、本研究における3ヵ年間の成果をもとに、著書『屎尿からみた近世社会(仮題)』(清文堂出版、2010年刊行予定)の準備を進めている。今年度、集中して調査をおこなった真田家関係史料については、渡辺尚志・荒武賢一朗編『藩地域の政治活動と社会(仮題)』(岩田書院、2010年刊行予定)で論文集の「総論」と、個別テーマ「松代真田家の大坂進出と明治維新」を執筆する予定である。また、「近世史から現代社会を考える研究会」(代表・荒武)の活動成果として、荒武賢一朗編『歴史と現代のつながり(仮題)』(2010年刊行予定)の準備をおこなっており、同書の「序章」と個別テーマ「食品流通構造と小売商・消費者の存在」を執筆予定である。
ソフトマテリアル表面を探査する自律走査型マルチアクティブプローブ法の開発（国際共同研究強化）

基課題では、自走する多数のアクティブマター(微小管)を用いて、ゲルなどに代表される軟らかい材料(ソフトマテリアル)表面の力学特性変化(歪・応力変化)を探針する『マルチアクティブプローブ』法を開発することを目的としてきた。これまでに、1)独自開発した顕微鏡上力学試験機の作動精度を確認するとともに弾性基盤上で微小管アクティブプローブを長時間駆動させる条件の最適化を終えている。さらに、2)本装置を用いて弾性基盤上の力学的な環境変化が微小管アクティブプローブの動的挙動に及ぼす影響を評価してきた。これらを通して、(1)アクティブプローブである微小管は応力方向や荷重モード(引張や圧縮など)に依存して垂直方向、対角方向あるいは環状に進行方向を変化(偏向運動)させる、(2)微小管の移動速度はソフトマテリアル基盤の伸張歪を増加させると高くなる、さらに、(3)コンピュータシミュレーション実験により微小管の偏向運動は微小管にかかる曲げエネルギーに依存するという知見を見出している。これらの研究成果は、微小管がソフトマテリアル表面の力学特性を評価するアクティブローブとして有用であることを強く支持するものである。本課題では、これまでの工学的な視点を生命科学分野や医学分野にまで広げることで基課題の飛躍的な発展を目的としている。29年度はアクティブプローブとして利用してきた微小管の力学刺激に対する動的挙動を分子レベルで評価することにより、細胞骨格としての役割を担う微小管の力学知覚機構の解明を目指した。具体的には力学刺激に対する微小管の動的持続長および先導端の揺らぎの1分子ナノメトリーおよび高分解能な顕微鏡を用い微小管の力学物性の変調評価を行った。提案書に掲げた研究計画通りに進んでいるため。微小管は、神経細胞活動に必要な信号伝達の導線であるとともに、機能維持に必要な物質輸送にも係っている。30年度は力学刺激に対する微小管の生化学的特性変調機構を明らかにすることで、近年、力学ストレスの影響が指摘されている神経疾患等の病理解明につながる知見を得ることを目的とする。具体的には、顕微鏡上力学試験機を用いて微小管に引張あるいは圧縮応力を印加することで神経細胞疾患に特有の座屈現象や断片化現象を再現するとともに、共同研究先が保有する先進的な解析技術を用いて再構成系の細胞内物質輸送を評価することで、力学的ストレスが生理機能そのものに与える影響を明らかにする予定である。内定年度:2016本研究では、自走する多数のアクティブマター(微小管)を用いて、ゲルなどに代表される軟らかい材料(ソフトマテリアル)表面の力学特性変化(歪・応力変化)を探針する『マルチアクティブプローブ』法を開発することを目的としている。これらを通して、(1)アクティブプローブである微小管は応力方向や荷重モード(引張や圧縮など)に依存して垂直方向、対角方向あるいは環状に進行方向を変化(偏向運動)させる、(2)微小管の移動速度はソフトマテリアル基盤の伸張歪を増加させると高くなる、さらに、(3)コンピュータシミュレーション実験により微小管の偏向運動は微小管にかかる曲げエネルギーに依存するという知見を見出した。これらの知見をもとに共同研究者(Henry Hess:コロンビア大学)と本国際共同研究を通してどのように生命科学分野および医学分野へと広げるかについて打ち合わせを行った。具体的には共同研究先が開発してきた1分子ナノメトリー技術および超高感度蛍光微分干渉顕微鏡と、申請者らが開発してきた顕微鏡上伸展装置などを融合しながら微小管の先進的なメカノバイオロジー研究を行うことなどについて議論を交わした。計画通り研究が進展しているため。

微小管がソフトマテリアル表面の力学特性を評価するアクティブローブとして有用であることを実証するため、ソフトマテリアルであるポリジメチルシロキサン表面の力学特性を、微小管の動的挙動をイメージングすることで、さらに詳細に評価していく。また、これまのプローブとしての検証だけでなく、生命科学分野および医学分野へと広げることで、基課題の飛躍的な発展を目指す。具体的には1分子ナノメトリー技術や原子間力顕微鏡などの装置を有効活用しながら、微小管の先進的なメカノバイオロジー研究を行う予定である。微小管は、神経細胞活動に必要な信号伝達の導線であるとともに、機能維持に必要な物質輸送にも係っている。30年度は力学刺激に対する微小管の生化学的特性変調機構を明らかにすることで、近年、力学ストレスの影響が指摘されている神経疾患等の病理解明につながる知見を得ることを目的とする。具体的には、顕微鏡上力学試験機を用いて微小管に引張あるいは圧縮応力を印加することで神経細胞疾患に特有の座屈現象や断片化現象を再現するとともに、共同研究先が保有する先進的な解析技術を用いて再構成系の細胞内物質輸送を評価することで、力学的ストレスが生理機能そのものに与える影響を明らかにする予定である。