hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時間分割ラウエ法利用研究

A1)ヘム蛋白質についての、時間分割ラウエ法及びNMR分光法による研究(森島)Leu29置換ヒトミオグロビンに関しては、新たにLeu29Ser置換体を調製した。Wild typeに比べて、k(on)が1/15に減少した。親水性になったことにより、水分子が進入したためと考えられる。A2)リン酸化合物を結合する酵素についての、時間分割ラウエ法、酵素化学による研究(小田、西野、倉光)グルタチオン合成酵素:caged-ATP:遷移状態アナログ(TSA)の三元複合体について、ラウエ法測定を行った。フラッシュ前と直後(45秒)について測定した。その結果、ATPのγリン酸がTSAに移ることを確認出来た。(小田)複合金属フラビン酵素であるキサンチン酸化酵素につき、結晶化は温度に依存し、21°Cが最適であることがわかった。(西野)アミノ基転移酵素の基質となるフェニルピルビン酸と2-ケトグルタル酸のcaged化合物を合成した。(A03公募、古田との共同)酸性条件で十分遅い反応を見るために、高度好熱菌Thermus thermophilus由来のアスパラギン酸アミノ基転移酵素の大量発現系を確立した。(倉光)A3)加水分解酵素についての時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(三井、上杉、田之倉)RNaseA結晶へのcaged化合物の溶解度が低い問題に悩まされていたが、今回、コハク酸アンモニュウムを使用することにより、良好な結晶を得た。硫酸アンモニュウム結晶とコハク酸アンモニュウム結晶とでは、格子定数に数%の差があるだけであるが、後者のほうが、はるかに白色X線に耐性であることを発見した。分子間相互作用の様相の違いとの関連を追求中である。(三井)2',3'-サイクリックヌクレオチドに対応するcaged化合物の合成は極めて難航している。(上杉)ペプシノゲンの結晶をハンギングドロップ法で作製しラウエ法による測定を行った。アルミニュウムのフィルタを入れることによって、かなり良好なスポットが観測されるようになった。(田之倉)A4)蛋白質構造のダイナミックスを追求するための新しいNMR法の開発(楯)緩和時間分データから、psec領域での蛋白質の主鎖の局所運動性に相違があることを示した。カルボニル炭素の緩和パラメーターから、水素結合状態など、数msec程度での時間域での構造安定性に直接かかわる量を抽出する手法を開発した。A5)計算機実験に基づく蛋白質の動的構造解析(北尾)ピコ秒より遅い時間オーダーで起こっている運動が、時間分割ラウエ法で観測されるようなミリ秒かそれより遅い運動とどのように関係しているのか、今後更に解明していく。以下、交付申請書の『本年度の研究実施計画』欄の1)5)に対応させて述べる。1)ヘム蛋白質(森島):アミノ酸残基Leu29を置換して配位子結合能を制御した数種のミオグロビン、及びジスルフィド結合を新たに導入したミオグロビンの作成に成功し、配位子結合反応の追跡、NMR測定ならびに結晶化を進めている。2)ヌクレオチド結合酵素(勝部、小田):グルタチオン合成酵素のラウエ法による時間分割解析のために、放射光実験施設のBL18及び英国ダレスベリーの放射光実験施設を利用して、X線ダメージの程度及びその対策、回折データの分解能、フローセルを用いた基質導入法等に関し、基礎データを収集した。また、反応速度を極端に低下させた変異型酵素の作成及び結晶化を行い、結晶中での酵素反応速度論的解析を行った。3)リボヌクレアーゼ(三井、上杉):リボヌクレアーゼAの高対称性(三方晶系)結晶のラウエ法による静的X線結晶解析(2.5A分解能)に成功した。またcaged CpUのアナログとしてのdCPTとの複合体結晶を通常の方法で解析し、2.5A分解能の構造を明らかにした。一方、caged CpUの合成に成功し、近紫外光の照射により、活性なCpUが得られることを確認した。4)NMR分光法の開発(楯、三井):チオールプロテアーゼ阻害蛋白質シスタチンAのNMRシグナルの完全帰属を完了した。次にN(15)の緩和時間測定から主鎖の内部運動の解析を行った。また、現在まで報告例のない側鎖の内部運動の解析に向けて、C(13)ラベル化率の低い蛋白質を調製し、側鎖の緩和解析の予備的な実験を行った。5)キサンチン酸化酵素(西野):キサンチン酸化酵素(分子量30万)の結晶化条件を吟味し、3A分解能のデータを収集した。また、ニワトリの酵素の全一次構造を決定し、哺乳類でおこる脱水素酵素/酸化酵素の相互変換がニワトリ酵素では起こらない理由を解析した。以下、交付申請書の『本年度の研究実施計画』欄のA1)A4)に対応させて述べる。A1)ヘム蛋白質についての、時間分割ラウエ法及びNMR分光法による研究(森島)新たに、Leu 29をPheに置換したミオグロビンを調製し、静的構造が天然のものと殆ど違わないのに、COを再結合する速度が著しく異なることを見出した。また、E-ヘリックスとF-ヘリックスの間にジスルフィド結合を導入した変異体を調製した。

A2)ヌクレオチドを結合する酵素についての、時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(勝部、小田、西野)グルタチオン合成酵素について、caged-ATPとの複合体の結晶化に成功し、この結晶中におけるcaged-ATPの光分解条件をも確立した。また、反応生成物の一つであるADPの定量法を確立し、ATP→ADP交換の速度を測定したところ、結晶中では、溶液中の150倍の時間を要することが判明した。キサンチン脱水素酵素については、3Aを越える分解能の結晶の作成に成功した。A3)加水分解酵素についての時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(三井、上杉、田之倉)caged-CpUを合成し、約2分の光照射で50%分解されることを確かめた。ニトロベンジル基と塩基との相互作用は非常に弱い。しかし、caged-CpUの三方晶系リボヌクレアーゼA結晶への導入には失敗した。溶解度を上げるためのDMSOが元凶である。一方、PEG存在下でのリボヌクレアーゼSの単斜晶を新たに発見した。この溶媒系では溶解度の問題は無いものと期待される。クロコウジカビ由来の酸性プロテアーゼAについては、ラウエ法による結晶の劣化過程について多様な経験を深めた。A4)蛋白質構造のダイナミックスを追及するための新しいNMR分光法の開発(楯、三井)シスタチンAの溶液構造を精密化することに成功した。次に、アミドプロトンの交換現象からミリ秒域の構造揺らぎの様相について観測した。この結果、同じ二次構造内でも、中央と端では揺らぎの大きさが異なる等の画期的な定量的データが得られた。以下、交付申請書の『本年度の研究実施計画』欄のA1)A5)に対応させて述べる。A1)ヘム蛋白質についての、時間分割ラウエ法及びNMR分光法による研究(森島)。Leu 29置換ヒトミオグロビンに関しては、一酸化炭素の結合に対して、ヘムポケット内の水分子が大きく関与していることが分かった。結晶化の容易なマッコウ鯨のミオグロビンについても同様な変異体を作った。A2)リン酸化合物を結合する酵素についての、時間分割ラウエ法、酵素化学による研究(小田、西野、倉光)グルタチオン合成酵素:caged-ATP:遷移状態アナログ(TSA)の三元複合体の構造を解析した。また、フラッシュフォトリシスで反応開始直後の構造を-10°Cで解析した。その結果、活性中心に結合したcaged-ATPとTSAの構造を捉えることに成功した(小田)。複合金属フランジ酵素であるキサンチン酸化酵素につき、結晶化は温度に依存し、21°Cが最適であることが分かった(西野)。レーザー光によるcaged化合物の光分解を検討した結果に基ずいて、1μ秒まで測定可能な酵素反応追跡装置を作製した。40μlのサンプルを、基質濃度が高い条件下で、測定することが可能となった(倉光)。A3)加水分解酵素についての時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(三井、上杉、田之倉)RNaseへのcaged-CpUの導入は成功していない。ウシガエル由来のRNaseA/Lectin(三方晶系)からは、シングルショットのラウエ法によっても、結合したシアル酸を明瞭に確認することが出来た。7αヒドロキシステロイド脱水素酵素については、A03公募の古田氏が溶解度の高いcagedコール酸を合成中である(三井)。ペプシノーゲンの結晶にラウエ法を適用してみたが、ストリークがひどい。結晶化条件から根本的に検討しなおしている。
低質量暗黒物質直接探索のための低閾値有機半導体検出器の基礎開発

現在世界的に注目を集めている低質量暗黒物質の直接探索実験は、比較的原子量の小さい物質で低閾値の検出器を製作することで感度の高い探索実験を行うことができる。本研究は有機半導体を放射線検出器として動作させ、暗黒物質探索実験に必要とされる要素技術を開発することを目的とした。有機半導体を用いて検出器構造を製作、半導体トランジスタとしての性能を評価、漏れ電流が一般的な検出器よりも大きいもののトランジスタとしての基礎測定を示すことを確認した。その後、α線、重粒子線を照射する試験を行い、放射線検出器としての動作するためには数倍のシグナル/ノイズ(S/N)比の改善が必要であることが判明した。暗黒物質直接探索実験は、イタリアのDAMAグループ等の「検出の主張」と米国のXENON100グループ等の「排除の主張」が対立しているが、10GeV以下の質量では許容される領域がある。低質量暗黒物質は、比較的原子量の小さい物質で低閾値の検出器を製作することで感度の高い探索実験を行うことができる。米国のDAMIC実験は40eVのCCDを用いて、わず1gの検出器で100kg以上の質量の検出器に匹敵する感度を得た。本研究は、i)有機半導体を放射線検出器として動作させ、閾値0.5keVを達成、ii)暗黒物質探索実験に必要とされる長期安定性や大質量化への要素技術を開発することを目的とする。これまでに有機半導体を用いたFET構造を製作、検出器としての基本性能である空乏層形成と電荷収集に寄与するドレイン-ソース電流について、ゲート、ソース電圧依存を詳細に測定した。製作したサンプルが以前ん製作したものよりもリーク電流が大きかったため、この対策を予定している。封止による対策は、そのまま暗黒物質検出器として必要とされる長期安定化へも有効であると考えられる。今後、放射線検出器として動作確認の後に、材料選択によって低閾値化を実現、暗黒物質検出器としての有用性を評価する。米国のDAMIC実験は40eVのCCDを用いて、わずか1gの検出器で100kg以上の質量の検出器に匹敵する感度を得た。平成26年度の研究では、放射線検出器としての動作確認実験を行った。α線、重粒子線を照射する試験を行い、放射線検出器としての動作するためには数倍のシグナル/ノイズ(S/N)比の改善が必要であることが判明した。S/Nの改善のためには、素子の厚膜化(現在は0.5μm)、ノイズの低減(現在は、アンプまでケーブルによる接続)、正孔の長寿命化(現在の寿命は不明)が有効である。それぞれで数倍の改善をおこうなうことで、粒子線検出器としての動作を確認することが有機半導体を暗黒物質探索実験へと応用するための重要な開発要素であることが判明した。宇宙線実験平成25年度は、○有機半導体測定システムの確立及び○有機半導体検出器を製作、閾値を低下させるための材料・構造パラメータ探索。を予定、以下に記す通り予定通り順調に進展した。(H25-1)実積のある材料による、有機半導体検出器の製作:これまでに実績のある低分子有機材料を用いて、トランジスタ構造を製作、半導体としての基礎性質の測定を行った。低閾値達成のために必要である移動度(移動速度×寿命)の速い材料を用いて、100nmの半導体厚で20種類のセルサイズのFETトランジスタを製作した。(熊木)(H25-2)材料パラメータの測定および放射線検出器としての性能評価:(H25-1)で作製した材料自体の半導体の基礎的な特性を測定した。FETトランジスタ構造を形成、電流の電圧依存を測定した。まず、半導体測定専用の機器を保有するKEKで測定を行い、素子の特性を詳細に測定した。その後、神戸大学の簡単な測定器を組み合わせたシステムを構築、同様の測定を可能とした。有機半導体を放射線検出器として応用するために、特性を測定するためのシステム確立は順調な進捗である。製作したFETトランジスタの電気的性質、特に空乏層形成と電荷収集に寄与するゲート、ソース電圧依存を詳細に測定、放射線検出器として動作させるための最適な電圧の組み合わせを検討した。(身内)

この結果、以前作成したサンプルよりもリーク電流が大きいことが判明、封止による対策を行う予定とした。半導体検出器としての評価はリーク電流を減少させた後に行うこととした。(H25-3)材料・構造パラメータの順位づけ半導体検出器として使用するためには、バンドギャップの小さな材料が有利と考えられる。上記(H25-2)のリーク電流を解決の後、各種材料で検出器構造を試作、材料の判断を行うこととした。平成25年度に製作した有機半導体トランジスタは、以前作成したサンプルよりもリーク電流が大きいことが判明した。平成26年度はこの対策を再優先で行い、解決の後に検出器としての性能向上の研究を行う。(H26-1)リーク電流対策:リーク電流が大きいと、雑音源となり低閾値検出器製作の支障となる。平成25年度に製作したサンプルは、製作後の封止を行わなかった。このため、空気中の水分によってリーク電流が発生していた可能性がある。平成26年度には、製作直後に封止を行い、空気中の水分による影響のないサンプルを製作する。(熊木)(H26-2)放射線検出器としての動作確認:(H26-1)でリーク電流の減少が確認されたのちに、放射線検出器としての動作確認を行う。まずは、放射線検出器として動作することを第一の目標とする。その後、本検出器の最大の目標である検出器の閾値測定を中心に測定する。これらの測定は、α線やX線を検出器に照射することで行う。(身内)(H26-3)暗黒物質探索実験への応用評価:低閾値を達成したのち、暗黒物質探索実験へ応用するための種々の要請について検討する。長期安定化に対しては封止技術による対策、大質量化のためには積層化、低バックグラウンド測定の要請には、材料中の放射性不純物測定などによって対策を行う。(身内)半導体試作の結果、リーク電流が観測された。リーク電流対策を確認した後に多種材料での製作を次年度に行う。半導体材料、測定用回路部品を購入する。
酸性域で触媒活性をもつ新奇セリンエンドペプチダーゼの構造と機能の特徴

酸性pH領域で触媒活性を有するセリンエンドペプチダーゼについてはその触媒機構を探る上で興味深い対象である。本年度、著者はIpomoea batatas塊根より微量含まれるそのタイプのセリンエンドペプチダーゼを、塊根抽出液の硫安沈殿透析液よりDEAE-cellulose→Con A-Sepharose→Butyl-Toyopearl 650M→Hydorxyl-apatite HPLCによる精製手順により初めて単離することに成功した。酸性域でDFPにより阻害される酵素は少なくとも2種類(A,B)あり、両者はButyl-Toyopearl 650Mで分離できた。今回は酵素Aについて研究をおこなった。本酵素はSDS-PAGE上で単一バンド(分子量6万7千、銀染色による)を示した。精製酵素のSDS-PAGEゲ-ル上での活性染色では67kDa付近にゼラチン分解活性がみられた。プロテインシーケンサーでN末端一次構造解析を行ったところ、N末端は何らかの修飾のためにブロックされている可能性が高いことがわかった。現在BrCN分解法による断片化で内部配列の解析し、cDNA解析用オリゴヌクレオチドプローブを作成し、mRNAからの構造の推定作業を進めている。代表的な植物由来セリンエンドペプチダーゼcucumisinを抗原とする抗体と本酵素との間でウエスタンブロットを行ったところ反応がみられず、さらに各種プロテアーゼインヒビターによる酵素活性への影響を調べたが、従来の動植物由来プロテアーゼと類似した阻害傾向は見いだせないことからcucumisionとは異なるタイプの植物セリンエンドペプチダーゼである可能性が高い。活性残基周辺配列の同定を活性部位指向性試薬であるBiotion-Ala-Ala-Pro-Phe-CKを使用した新手法により進め、本酵素がこの化合物により酵素活性が抑えられることが判明し、本酵素の触媒活性にHis残基が関与することを示唆している。
構音障害音声の聴覚判定における信頼性についての調査研究

本研究は構音障害の評価及び訓練の質的向上に寄与することを目的に計画・実施された.構音障害に対する訓練では,訓練計画の立案時点で構音の異常を正確かつ詳細に聴取すること(聴覚判定)が重要である.しかしながら聴覚判定は主観的な評価であるため,評価者による不一致があることが長らく問題とされてきた.そこで,本研究では,評価者間および評価者内の判定結果の一致度を測ることで,聴覚判定の信頼性の向上に必要な事項を提案しようと試みた.合計で9名の協力者(評価者)を得て,同一のスピーチサンプルの聴取を行うことでデータを収集した.データ収集は迅速かつ安全に行えるよう,大阪大学に設置されているREDCap(Research Electronic Data Capture)システムを用いた.本研究では,予備調査として行った文献的考察に基づき,「口蓋化構音」と「構音点の後方化」と称される構音の誤りに注目し検討を行うこととした.口蓋化構音とは福迫ら(1974),岡崎ら(1982)により報告された,口蓋裂術後の構音障害で頻発する異常な構音操作の一種である.歯茎を構音点,舌先を構音体として産生されるべき子音([t, d, s, ts, dz, n, r]など)が,硬口蓋を構音点に,また舌背を構音体として産生され,そのため音に歪が生じる.一方「構音点の後方化」は軟口蓋を構音点,奥舌を構音体とする誤り音である.文献的考察では臨床現場においてこの二つが混同されやすい状況があることが示唆された.そこで,口蓋化構音あるいは構音点の後方化を含むスピーチサンプルを作成し, 9名の評価者の結果の一致/不一致を検討したところ,「口蓋化構音」と判定しながらも,構音点を「軟口蓋」とした判定が全体の10%を占めていた.また,構音点が軟口蓋に後退している誤り音を「後方化」ではなく「置換」する判定が全体の59%を占めていた.つまり,誤り音の定義の解釈が評価者によって異なっていることと,構音点の後方化に関しては概念が定着していない可能性が強く疑われる結果であった.本研究の結果から,構音障害の聴覚判定の信頼性の向上に必要な事項として「口蓋化構音と構音点の後方化の概念の再検討」があることが示唆された.本研究は構音障害の評価及び訓練の質的向上に寄与することを目的に計画・実施された.構音障害に対する訓練では,訓練計画の立案時点で構音の異常を正確かつ詳細に聴取すること(聴覚判定)が重要である.しかしながら聴覚判定は主観的な評価であるため,評価者による不一致があることが長らく問題とされてきた.そこで,本研究では,評価者間および評価者内の判定結果の一致度を測ることで,聴覚判定の信頼性の向上に必要な事項を提案しようと試みた.合計で9名の協力者(評価者)を得て,同一のスピーチサンプルの聴取を行うことでデータを収集した.データ収集は迅速かつ安全に行えるよう,大阪大学に設置されているREDCap(Research Electronic Data Capture)システムを用いた.本研究では,予備調査として行った文献的考察に基づき,「口蓋化構音」と「構音点の後方化」と称される構音の誤りに注目し検討を行うこととした.口蓋化構音とは福迫ら(1974),岡崎ら(1982)により報告された,口蓋裂術後の構音障害で頻発する異常な構音操作の一種である.歯茎を構音点,舌先を構音体として産生されるべき子音([t, d, s, ts, dz, n, r]など)が,硬口蓋を構音点に,また舌背を構音体として産生され,そのため音に歪が生じる.一方「構音点の後方化」は軟口蓋を構音点,奥舌を構音体とする誤り音である.文献的考察では臨床現場においてこの二つが混同されやすい状況があることが示唆された.そこで,口蓋化構音あるいは構音点の後方化を含むスピーチサンプルを作成し, 9名の評価者の結果の一致/不一致を検討したところ,「口蓋化構音」と判定しながらも,構音点を「軟口蓋」とした判定が全体の10%を占めていた.また,構音点が軟口蓋に後退している誤り音を「後方化」ではなく「置換」する判定が全体の59%を占めていた.つまり,誤り音の定義の解釈が評価者によって異なっていることと,構音点の後方化に関しては概念が定着していない可能性が強く疑われる結果であった.本研究の結果から,構音障害の聴覚判定の信頼性の向上に必要な事項として「口蓋化構音と構音点の後方化の概念の再検討」があることが示唆された.
カブトガニ血球細胞内大・小顆粒に含まれる生体防御物質群の構造解明と作用機作の研究

カブトガニ(Tachypleus tridentatus)の血球および血漿より、細菌表層成分を認織する新規のレクチン類を精製し、それらの構造と機能解析を行った。タキレクチン-1は、221アミノ酸残基からなり、約40残基の繰り返し配列が6回存在した。タキレクチン-1は、各種細菌を凝集するとともに、リポ多糖(LPS)を表層に持つグラム陰性菌に対して抗菌活性を示した。一方、。タキレクチン-2は236アミノ酸残基からなり、47残基の5回繰り返し配列が存在した。タキレクチン-2は、N-Acetyl基をもういくつかの糖に対して特異性を示し、グラム陽性菌の表層成分であるリポテイコ酸と結合し、かつグラム陽性菌の一種を特異的に凝集したタキレクチン-3およびタキレクチン-4は、ともに大腸菌O111:B4のO抗原多糖に高い親和性があって、リピドAとKDOのみからなるLPSにはまったく反応しなかった。したがって、大腸菌O抗原の特異的糖であるコリトースを認織している可能性が高い。123アミノ酸残基からなるタキレクチン-3はRinderpest virusの血球凝集素の一部と配列類似性を示し、一方、タキレクチン-4は、Xenopus laevisの機能不明の蛋白質であるXL-PXN1のアミノ末端側領域と配列類似性を示した。また、カブトガニ血漿中には、哺乳類の補体系に相当する感染防御系の存在が示唆されていたが、今回、哺乳類のC-reactive proteinと配列相同性のある溶血因子やN-acetyl基に特異性を有するTachylectin-5を精製し、現在、解析中である。また、マックスプランク研究所との共同研究により、タキレクチン-1およびタキレクチン-2のX線結晶解析が完了した。一方、。今回、新規にカブトガニ血球細胞内に見い出したレクチンは、Ca^<2+>依存的にヒトA型赤血球を凝集することでTachylectin-2とは大きく異なっている(Tachylectin-4と命名)。Tachylectin-4は、Dextran Sulfate-セファロースCL-6B、セファロースCL-6B、Fuc-アガロースを用いて精製され、50gの血球から約0.5mg得られた。Tachylectin-4のヒトA型赤血球凝集活性はキレート剤や高濃度のFucやN-Acetylneuraminic acidで阻害されるが、LPSで強く阻害された。LPSによる阻害は、O抗原多糖をもつLPSによってのみ観察され、リピドAとKDOのみからなる変異体のLPSによってはまったく阻害が見られない。従って、Tachylectin-4は、LPSのO-chainあるいはOuter coreに存在する糖鎖を認識している可能性が高い。Superdexによるゲル濾過では、Tachylectin-4は、分子量470,000の位置に溶出されたが、SDS-PAGEでは分子量30,000と31,000の2種のサブユニットから成り、多量体を形成していると思われる。逆相HPLCで分離した両サブユニットを、リジルエンドペプチダーゼによるペプチドマップで比較したところ、両者は非常によく似たisoproteinであることが示唆された。そこで、Tachylectin-4をGlycosidase Fで処理した後SDS-PAGEしたところ、分子量30,000のバンドのみが観察されたことから両サブユニットの差は、N-結合型糖鎖の差であることが予想される。次に、Tachylectin-4の部分アミノ酸配列の情報をもとにのcDNAクローニングを行い、全塩基配列を決定した。

Tachylectin-4の前駆体は23アミノ酸残基のシグナル配列と232アミノ酸残基の成熟蛋白質からなり、一箇所のN-結合型糖鎖の付加部位が存在することが判明した。この配列をもとにホモロジーを検索したところ、Xenopus laevisの機能不明の蛋白質であるXL-PXN1のアミノ末端側領域と25%の配列相同性を持つことが判明した。カブトガニ(Tachypleus tridentatus)の血球および血漿より、細菌表層成分を認識する新規のレクチン類を精製し、それらの構造と機能解析を行った。タキレクチン-1は、221アミノ酸残基からなり、約40残基の繰り返し配列が6回存在した。タキレクチン-1は、各種細菌を凝集するとともに、リポ多糖(LPS)を表層に持つグラム陰性菌に対して抗菌活性を示した。一方、タキレクチン-2は236アミノ酸残基からなり、47残基の5回繰り返し配列が存在した。タキレクチン-2は、N-Acetyl基をもついくつかの糖に対して特異性を示し、グラム陽性菌の表層成分であるリポテイコ酸と結合し、かつグラム陽性菌の一種を特異的に凝集した。タキレクチン-3およびタキレクチン-4は、ともに大腸菌O111:B4のO抗原多糖に高い親和性があって、リピドAとKDOのみからなるLPSにはまったく反応しなかった。したがって、大腸菌O抗原の特異的糖であるコリトースを認識している可能性が高い。123アミノ酸残基からなるタキレクチン-3はRinderpest virusの血球凝集素の一部と配列類似性を示し、一方、タキレクチン-4は、Xenopus laevisの機能不明の蛋白質であるXL-PXN1のアミノ末端側領域と配列類似性を示した。また、カブトガニ血漿中には、哺乳類の補体系に相当する感染防御系の存在が示唆されたが、今回、哺乳類のC-reactive proteinと配列相同性のある溶血因子やN-acetyl基に特異性を有する新しいレクチン(Tachylectin-5と命名)の精製に成功した。
アリル型ホウ素反応剤の合成とその反応

アリル型ホウ素化合物の調整とカルボニル化合物との有機合成反応について研究した。1-アルキンの三臭化ホウ素でのハロボレーション反応により得られる、2-ブロモ-1-アルケニボランから、有機亜鉛試薬とのクロスカップリング反応によるアルキル化、ジブロモメタンによるホモロゲーション反応を経て3,3-二置換のアリル型ボランを誘導できた。1-アルキンとしてはブチン、ヘキシン、フェニルアセチレン等が使用でき、高いジアステレオ選択性で対応する2-ブロモ-1-アルケニルボランを与えた。しかし、プロピンを用いた場合、他の1-アルキンと比べて選択性が低下することがわかった。有機亜鉛試薬としては、Me、Et、Phなど種々利用できることが明らかとなった。不斉合成を目的として得られた3,3-二置換のアリル型ボランのホウ素上のアルコキシ基を酒石酸エステル誘導体として、種々アルデヒドと反応させることにより光学活性な四級炭素を持ったホモアリルアルコールを合成した。最初に使う、アルキンと有機亜鉛試薬を選択することにより生成物の水酸基のシン-アンチの位置に自由に置換基を導入できることを見いだした。反応のジアステレオ選択性は9895%、エナンチオ選択性は8070%である。また、アリル型ホウ素化合物の新規合成法として遷移金属触媒による異性化反応を用いる方法を調査した。3-アルコキシアルキンをハイドロボレーションすることで立体選択的に3-アルコキシビニル型ホウ素化合物が合成できる。得られた3-アルコキシビニル型ホウ素化合物をイリジウム触媒により異性化すると穏和な条件でアリル型ホウ素化合物に異性化することを見いだした。ルテニウム、ニッケル、ロジウム等では反応はうまく進行しなかった。立体選択性はホウ素上のアルコキシ基によって異なるが、ピナコールエステルではE体選択的に、イソプロポキシ基でZ体選択的に異性化することを見いだした。
関節リウマチ滑膜血管新生におけるADAMファミリーの役割

ADAM (a disintegrin and metalloproteinase)は近年注目されているMMP近縁遺伝子ファミリーで、metalloproteinaseおよびdisintegrinドメインを有することから、プロテアーゼであると同時に接着因子としての機能を併せ持つと考えられている.研究代表者はこれまで30種類以上の分子種からなるADAMのうち,プロテアーゼ活性を有すると考えられる10種類のADAMに注目し,関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)滑膜組織における発現スクリーニングをmRNAレべルで行った.RAおよびOA滑膜組織で発現が認められたのはADAM9,10,12,15,17であった.このうちADAM12と15はOAに比しRA滑膜組織で選択的に発現しており,なおかつADAM15についてはRA全例で発現が認められた.ADAM15に注目し免疫組織学的解析を行うと,RA滑膜組織の血管密度とReal-Time PCR法で得られたADAM15 mRNAの発現量との間には相関関係が認められた.また,血管内皮細胞(HUVEC)を用いたスクリーニングではADAM9,10,12,15,17,19,20の発現が認められた.これらのデータからADAM15はRA滑膜組織における血管新生に重要な役割を果たすADAMであると考えた.HUVECでsiRNAによりADAM15 mRNAのノックダウンを行ったinvasion assayでは,ノックダウン群で浸潤能の低下が認められた.ADAM (a disintegrin and metalloproteinase)は近年注目されているMMP近縁遺伝子ファミリーで、metalloproteinaseおよびdisintegrinドメインを有することから、プロテアーゼであると同時に接着因子としての機能を併せ持つと考えられている。研究代表者はこれまで30種類以上の分子種からなるADAMのうち,プロテアーゼ活性を有すると考えられる10種類のADAMに注目し,関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)滑膜組織における発現スクリーニングをmRNAレベルで行った.RAおよびOA滑膜組織で発現が認められたのはADAM9,10,12,15,17であった.このうちADAM12と15はOAに比しRA滑膜組織で選択的に発現しており,なおかつADAM15についてはRA全例で発現が認められた.そこでADAM15に注目し免疫組織学的解析を行うと,RA滑膜組織の血管密度とReal-Time PCR法で得られたADAM15 mRNAの発現量との間には相関関係が認められた.また,血管内皮細胞(HUVEC)を用いたスクリーニングではADAM9,10,12,15,17,19,20の発現が認められた.これらのデータからRA滑膜組織における血管新生にはADAM15が重要な役割を果たしていることが示唆される.しかしながら血管内皮細胞のスクリーニング結果が示すように,他のADAMの発現も認められる.今後,これらのADAMが基底膜分解,内皮細胞増殖,遊走,管腔の形成・維持という複数の過程からなる血管新生のどの過程で関わるのか,その役割分担について検討を行う予定である.ADAM (a disintegrin and metalloproteinase)は近年注目されているMMP近縁遺伝子ファミリーで、metalloproteinaseおよびdisintegrinドメインを有することから、プロテアーゼであると同時に接着因子としての機能を併せ持つと考えられている.研究代表者はこれまで30種類以上の分子種からなるADAMのうち,プロテアーゼ活性を有すると考えられる10種類のADAMに注目し,関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)滑膜組織における発現スクリーニングをmRNAレべルで行った.RAおよびOA滑膜組織で発現が認められたのはADAM9,10,12,15,17であった.このうちADAM12と15はOAに比しRA滑膜組織で選択的に発現しており,なおかつADAM15についてはRA全例で発現が認められた.ADAM15に注目し免疫組織学的解析を行うと,RA滑膜組織の血管密度とReal-Time PCR法で得られたADAM15 mRNAの発現量との間には相関関係が認められた.また,血管内皮細胞(HUVEC)を用いたスクリーニングではADAM9,10,12,15,17,19,20の発現が認められた.これらのデータからADAM15はRA滑膜組織における血管新生に重要な役割を果たすADAMであると考えた.HUVECでsiRNAによりADAM15 mRNAのノックダウンを行ったinvasion assayでは,ノックダウン群で浸潤能の低下が認められた.
特別支援学校以外の学校における医療的ケア必要児童生徒への支援システムモデルの構築

本研究は,医療的ケアを必要とする児童生徒の支援に携わっている学校関係者や保護者等に実態調査を行い,支援内容とシステムの現状や教育保障推進上の課題を明らかにし,校内体制および支援システムモデルを検討することが目的である。平成30年度は研究計画を見直し,インタビュー調査対象者を医療的ケアを必要とする児童生徒の支援に携わった経験がある養護教諭と現在医療的ケアを行っている看護師とした。そこで,平成27年実施の実態調査時に研究協力の同意が得られた特別支援学校の看護師に調査協力を依頼した。その際,岩手県教育委員会にも,調査に関する説明をした。インタビュー調査に賛同し同意が得られた看護師を対象に,インタビューガイドを基に半構成的面接を実施した。実施対象者は,6名であった。なお,本研究は,著者が所属する大学で研究計画書の倫理審査を受け,実施の承認を得た。また,収集した面接データの逐語録作成を行った。さらに,テキストマイニングソフトウェアを購入し支払い手続きを行った。研究計画では,医療的ケアを必要とする児童生徒の支援に携わっている学校関係者の語りを音声データとして記録し,その後文字データに変換し,質的研究法の分析手法を用いて分析するとしていた。計画通り,研究協力の同意が得られた学校の養護教諭8名と支援員1名,特別支援学校の看護師にインタビュー調査を実施し,データ入力も終えていて,ほぼ予定通りである。しかし,質的研究法の分析手法を用いて分析するまでには至らなかったことから,遅れている状況である。今後は,得られたデータを質的研究法の分析手法を用いて分析し,千葉県における組織的体制を参考にしながら医療的ケアへの支援システムを検討していく。また,研究成果刊行物を発行し,研究協力校,岩手県教育委員会および各市町村教育委員会に送付する。さらに,研究成果を関連学会で発表し,参加者からの意見を得て今後の示唆とする。平成29年度は,医療的ケアに関する資料等を広く集め,内容を分析した。また,平成27年に実施した「医療的ケアを必要とする児童生徒の実態調査」結果から,岩手県内の小中学校及び特別支援学校や特別支援学校における医療的ケアを必要とする児童生徒の実態と支援を行う上での課題を明らかにした。これらの検討から得られた知見を参考にして,「インタビューガイド」を作成した。平成27年実施の実態調査時に研究協力の同意が得られた学校で,医療的ケアを必要とする児童生徒の支援に携わった養護教諭と支援員に調査協力を依頼した。インタビュー調査に賛同し同意が得られた養護教諭と支援員を対象に,インタビューガイドを基に半構成的面接を実施した。実施対象者は,小学校養護教諭2名,中学校養護教諭(当時)2名,特別支援学校養護教諭4名,中学校支援員1名であった。さらに、特別支援学校における医療的ケアについて,組織的に実施している千葉県の施設見学を行った。千葉県千葉リハビリテーションセンターと千葉県袖ヶ浦特別支援学校を訪問し,千葉県の組織的体制整備の在り方を学んだ。研究計画では,インタビュー調査対象者を,医療的ケアを必要とする児童生徒の支援に携わっている学校関係者や保護者等としていた。計画通り,研究協力の同意が得られた学校の養護教諭8名と支援員1名に,インタビュー調査を実施し,データ入力も終えていて,ほぼ予定通りである。しかし,看護師や保護者へのインタビュー調査実施には至らなかったことから,やや遅れている状況である。今後は,研究協力看護師や保護者を募りデータ収集を継続実施しながらも,研究計画の見直しを行っていく。

また,得られたデータを質的研究法の分析手法を用いて分析し,千葉県における組織的体制を参考にしながら医療的ケアへの支援システムを検討していく。今後は,得られたデータを質的研究法の分析手法を用いて分析し,千葉県における組織的体制を参考にしながら医療的ケアへの支援システムを検討していく。また,研究成果刊行物を発行し,研究協力校,岩手県教育委員会および各市町村教育委員会に送付する。さらに,研究成果を関連学会で発表し,参加者からの意見を得て今後の示唆とする。平成29年予定の看護師や保護者へのインタビュー調査実施には至らなかったため,研究協力者に対する謝金や調査に関連した残金がある。また,計画していた文献管理ソフトウエアの購入が遅れている。平成30年度は,特別支援学校看護師や保護者のインタビューを実施し,データ収集を継続して面接データの逐語録作成の支払いを行う。また,購入が遅れている文献管理ソフトウエアに加えて,テキストマイニングソフトウェアを購入し支払い手続きを行う。購入が遅れている文献管理ソフトウエアを購入し支払い手続きを行う。また,研究成果還元用冊子印刷費と,研究協力校,岩手県教育委員会および各市町村教育委員会に送料に充てる。さらに,関連学会で研究成果を発表する際の参加費,旅費等に充てる。
欧州逆統合の政治学

昨年の単著『統合の終焉』(岩波書店)の刊行に引き続き、今年度は『ヨーロッパ統合史』の増補版を公刊し、統合とは逆向きの解体の研究を加味した形で近年の憲法・ユーロ危機をあとづけ、その意味を思想、政策的に探る作業を別途論文の形で公刊した。とりわけユーロ危機の実証研究を進めるに当たり、不信ゆえに各国分断と統合が同時に進むさまを明らかにしたことは、研究の大きな進展を意味する。ユーゴやソ連などの連邦解体の議論への比較参照がなかなか進まなかったものの、ユーロ危機に沿った形で逆統合を考察する体系的な著書・論考の執筆を優先したことになった。今後につながる多くの着想を得た。本研究は、欧州逆統合(European Disintegration)をテーマとし、政治体としての欧州の解体メカニズムを探求するものである。その際、欧州連合(EU)に焦点を当て、12005年の憲法的危機から現在進行形のユーロ危機までの過程を経験的に跡づけながら、2ユーゴやソ連などの連邦解体の政治過程との比較の視座から比較政治史的な考察を交錯させ、3申請者が取り組んできた『ヨーロッパ統合史』を発展的に書き換えたいと考えている。本研究ではさらにそこから、2つの点で含意を汲み取れるのか見極めたい。一つは4思想的なもので、主権と逆統合との関わりを検討すること、もう一つは5政策的に、地域主義やグローバル化などの相互依存ガバナンスのあり方への含意を探ることである。上記のうち1、4、5は本年度も引き続き深めることができた。すなわち、まず本年度は、近年の憲法・ユーロ危機をあとづけ、その意味を思想的および政策的に探った単著『統合の終焉ーEUの実像と論理』(岩波書店、2013年、508頁)を出版し、全面的に欧州「統合」像の転換を世に問うたのである。同時に3を試みた。ユーロ危機を通じて明らかになったヨーロッパ社会の内部における断層・断絶に着目し、社会・民主・機能的な正統性の三重苦として『ヨーロッパ統合史』の最現代史を描きなおす作業を終え、その増補版を刊行するにいたった(発売は次年度)。これらにより、十分な成果であったと考えられる。これまでのところ着手できたのは、上記の1、4、5である。すなわち、まず、近年の憲法・ユーロ危機をあとづけ、その意味を思想的および政策的に探った単著『統合の終焉ーEUの実像と論理』(岩波書店、2013年、530頁)の脱稿に力を注いだ。刊行直前にまでこぎつけたこの本の発刊が次年度最初の仕事となる。それは同時に3にもつながる作業であった。つまり、ユーロ危機を通じて明らかになったヨーロッパ社会の内部における断層・断絶に着目し、社会・民主・機能的な正統性の三重苦として『ヨーロッパ統合史』の最現代史を描きなおす作業でもあったのである。これにより、1345に初年度から着手できたことは、十分な成果であったと考えられる。その際、欧州連合(EU)に焦点を当わせ、12005年の憲法的危機から現在進行形のユーロ危機までの過程を経験的にあとづけながら、2ユーゴやソ連などの連邦解体の政治過程との比較の視座から比較政治史的な考察を交錯させ、3研究代表者が取り組んできた『ヨーロッパ統合史』を発展的に書き換えたいと考えている。本研究ではさらにそこから、2つの点で含意を汲み取れるのか見極めたいと考えてきた。一つは、4思想的なもので、主権と逆統合との関わりを検討すること、もう一つは、5政策的に、地域主義やグローバル化などの相互依存ガバナンスのあり方への含意を探ることである。最終年度の本年度も15の各面において、引き続き深めることができた。

とりわけ、近年のユーロ危機をあとづけ、その意味を歴史・政治・経済政策的に探った論考「統合と分断の同時深化こそ欧州の「新常態」」(『中央公論』2015年4月号、144-151頁)を公刊し、「EUの歴史的軌跡と将来」(『国際問題』2015年5月号)を脱稿した。さらに、このユーロ危機を通じて明らかになったヨーロッパ社会の内部における断層・断絶に着目し、社会・民主・機能的な正統性の三重苦として『ヨーロッパ統合史』の最現代史を描きなおす作業を終え、その増補版を刊行するにいたった。これらにより、十分な成果であったと考えられる。今後は、その成果を、新版の『ヨーロッパ統合史』に向け、全面的な刷新を試みる。そのための大型科研申請を準備しているところである。社会科学見方によっては、計画以上に進展したといえる。というのも、単著『統合の終焉』を岩波書店から刊行し、さらに『ヨーロッパ統合史』の増補版の公刊にめどをつけ、近年の憲法・ユーロ危機をあとづけ、その意味を思想、政策的に探る作業にすでにめどをつけてしまったからである。「おおむね順調」に留めたのは、相変わらず、ユーゴやソ連などの連邦解体の議論への参照が進まず、それとの関連で欧州逆統合をいまだ捉えられていないことによる。くわえて、論点整理した萌芽的なポジションペーパーの執筆が、体系的な著書の執筆を優先したことにより、遅れていることによる。しかし、強調しておくべきは、ユーロや憲法危機について、本や論文をまとめたことである。これは研究の進展を意味する。見方によっては、計画以上に進展したといえる。というのも、初年度において、単著『統合の終焉』を岩波書店から上程寸前までこぎつけ、近年の憲法・ユーロ危機をあとづけ、その意味を思想、政策的に探る作業にすでにめどをつけてしまったからである。しかしながら、おおむね順調に留めたのは、以下の理由からによる。つまり、ユーゴやソ連などの連邦解体の議論への参照がいまだ進まず、それとの関連で欧州逆統合をいまだ捉えられていないことによる。くわえて、論点整理した萌芽的なポジションペーパーの執筆が、体系的な著書の執筆を優先したことにより、やや遅れていることによる。研究計画の大幅な変更は必要ない。欧州統合が逆統合と同時に進行するメカニズムを、他の事例との比較の中で明らかにしていきたい。次年度は、海外における類似の研究との接点をさらに厚くし、東アジアにも射程を広げる予定である。次年度は、海外における類似の研究との接点を厚くしていく所存である。今年度の経費に108,457円の残額が生じたのは、研究費の節減・効率的使用を図ったためである。次年度はこの研究の最終年度であることから、研究射程の拡張に向けての資源としてこれを投入する。今年度の経費に残額が生じたのはその節減・効率的使用を図り、次年度において海外調査に集中的に回す予定であるためである。
外科的侵襲におけるプロテアーゼ活性化受容体の機能解析

セリンプロテアーゼ及びその受容体(プロテアーゼ活性化型受容体)の生体調節機能が、DICの病態形成に強く関与するとの発見を受け、外科的領域における同受容体の機能解析を企てた。まず、同受容体の発現細胞を用いてプロテアーゼによる受容体の切断を行い、N末端残基をアフィニティ・カラムにて抽出、精製。この精製ペプチドでウサギを免疫し、抗ペブチドポリクローナル抗体を作製した。これを用いて、ELISA法による切断ペプチドの定量実験を行った。活性化トロンビン量を間接的に定量する同法は、DIC並びに多臓器不全の早川診断法として活用できる可能性が示唆された。さらに、腫瘍細胞株各種を用い、周術期に分泌亢進する各種プロテアーゼが、同受容体を介して腫瘍病変そのものに与える影響について基礎的実験を進めた。ヒトグリオブラストーマでは、PAR-1を介しトロンビンのシグナルが細胞内に流れ、細胞の増殖及び形態変化を促進させること、ヒト大腸がんでは、PAR-2を介しトリプシンのシグナルが流れ、細胞の増殖が促進されることなどが明らかになった。また、シグナル伝達系については、細胞内カルシウム経路、PKCアイソザイム経路、MAPkinaso経路等の関与が明らかになった。今後は外科領域の各種病態における同受容体の関与についてさらに研究を進め、ELISA法による同受容体切断の定量的測定、既存のプロテアーゼインヒビターの新たな応用法の確立、並びに新規プロテアーゼインヒビターのドラッグデザイン等、診断・治療の新しい指針の確立に着手していく予定である。DIC早期診断のための検査としてはFDP、Fibrinogenなどの定量が現在主として用いられている。これらは正常値からの増減で判定されるため、直接活性化トロンビンを測定する場合に比べ感度は低い。活性化トロンビン量をトロンビン受容体(プロテアーゼ活性化受容体:Protease activated receptor-1,2:PAR-1,-2)の切断ペプチドのELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法による定量によって知ることが、本研究の目指すところである。RabitをPAR-1,-2細胞外ドメインペプチドのMAP抗原で感作し、抗血清を作成した。ELISA法にて各々x2000-x5000の抗体価を確認したので、全採血を行い、血清を分離した。IgGの硫酸アンモニウムによる塩析分画による粗精製を施行、抗原結合affinity columnを作成し、抗原特異的抗体(Anti-human PAR-1,-2 antibody)を精製した。本抗体を用い、臨床血液検体のELISA法に対する応用のみならず、臨床組織標本の免疫組織染色が可能となった。今後は、Informed consentを得た後、患者と正常の血清を用いて、上記切断ペプチドの定量を施行し、既知の検査値との相関性についても解析するとともに、早期診断法としての有効性についても評価する予定である。トロンビンは血液凝固反応において不可欠の因子であり、そのプロテアーゼ活性によりフイブリノーゲンからフイブリンを形成する。この他にも、血管内皮細胞の活性化や単球の遊走刺激、血管平滑筋や線維芽細胞の増殖作用など多彩な作用がある。トロンビンの細胞に対する作用は、そのプロテアーゼ活性により、形質膜上の7回膜貫通型のトロンビン受容体(Protease-activated receptor-1:PAR-1)によって担われる。最近、PAR-1とホモロジーの高いcDNAがクローニングされ、PAR-2と命名された。PARが活性化される際には、細胞外アミノ末端領域が切断され、新しい断端のアミノ酸残基が内在性リガンドとして反応することが判明している。

DICなどの外科的侵襲の際、PAR-1,-2の切断ペプチドの血中レベルを測定することによって、活性化トロンビン量を定量的に査定することが本研究の元来の目的であったが、更にPARの機能解析を進めるために、新しい断端のアミノ酸6残基を人工的に合成し、ヒトglioblastoma細胞を用い、PAR-1,-2受容体シグナル伝達、細胞形態及び増殖に対する作用、Protein kinase C(PKC)のトランスロケーションについて検討した。合成ペプチドによってPAR-1,-2を刺激すると細胞内カルシウムシグナルが発生したが、PAR-1アゴニストペプチド刺激後、PAR-2アゴニストペプチドで刺激してもカルシウムシグナルは発生せず、cross desensitizationが認められ、PAR-1,-2の間に密接な機能的関係があると考えられた。PAR-1,-2刺激で、ともに細胞形態の変化が認められ、またPKCのトランスロケーションにおいても共通もしくは特異的に活性化されるものがあり、PAR-1,-2は密接な関係はあるが、それぞれに特異的な細胞応答を惹起することが示唆された。セリンプロテアーゼ及びその受容休(プロテアーゼ活性化型受容体)の生体調節機能が、DICの病態形成に強く関与するとの発見を受け、外科的領域における同受容体の機能解析を企てた。まず、同受容体の発現細胞を用いてプロテアーゼによる受容体の切断を行い、N末端残基をアフィニティ・カラムにて抽出、精製。この精製ペプチドでウサギを免疫し、抗ペプチドポリクローナル抗体を作製した。これを用いて、ELISA法による切断ペプチドの定量実験を行った。活性化トロンビン量を間接的に定量する同法は、DIC並びに多臓器不全の早期診断法として活用できる可能性が示唆された。さらに、腫瘍細胞株各種を用い、周術期に分泌亢進する各種プロテアーゼが、同受容体を介して腫瘍病変そのものに与える影響について基礎的実験を進めた。ヒトグリオブラストーマでは、PAR-1を介しトロンビンのシグナルが細胞内に流れ、細胞の増殖及び形態変化を促進させること、ヒト大腸がんでは、PAR-2を介しトリプシンのシグナルが流れ、細胞の増殖が促進されることなどが明らかになった。また、シグナル伝達系については、細胞内カルシウム経路、PKCアイソザイム経路、MAPkinase経路等の関与が明らかになった。今後は外科領域の各種病態における同受容体の関与についてさらに研究を進め、ELISA法による同受容体切断の定量的測定、既存のプロテアーゼインヒビターの新たな応用法の確立、並びに新規プロテアーゼインヒビターのドラッグデザイン等、診断・治療の新しい指針の確立に着手していく予定である。
受容体型チロシンキナーゼの半合成と構造機能解析

細胞の増殖や分化に関わる受容体型チロシンキナーゼの機能不全はがん等の重篤な疾患の原因となる。本研究では、当該受容体の構造機能解析において困難な部分であった膜貫通ー膜近傍部位に関して詳細な解析を行い、さらに細胞を用いて調製したタンパク質断片と合成化学的に調製したタンパク質断片を縮合する半合成という技術の開発を行うこととした。各種分光学的構造解析実験から、受容体の活性化における膜貫通ー膜近傍部位の構造変化に関しては新た知見を得ることに成功し、細胞外領域から膜貫通ー細胞質内膜近傍部位に至る受容体断片の半合成にも成功した。平成24年度は繊維細胞増殖因子受容体3(FGFR3)の細胞外領域から膜貫通一細胞質内膜近傍領域に至るタンパク質断片に関して、リガンドの結合に伴った膜貫通一細胞質内膜近傍部位の構造変化を捉えるべく、試料の調製法を確立することを第一の目標とした。すなわち、膜貫通一細胞質内膜近傍領域に部位特異的標識を導入した試料の調製を想定し、当該部位は合成化学的手法によって調製を行い、一方、細胞外領域は大腸菌での発現、精製によって調製する。それらを合成ブロックとして、ライゲーションによって縮合し、目的物を得る予定であった。界面活性存在下での反応であるが、目的物の生成をSDS PAGEゲル上においては確認した。しかし、膜貫通一膜近傍配列ペプチドの化学合成に多くの時間がかかるという問題に直面し、単離するだけの量を獲得するための反応条件の最適化には至らなかった。そこで、この反応条件の検討を効率的に進めていくために膜貫通一膜近傍配列も大腸菌発現系を用いて獲得すべく、その調製法の検討を行った。現時点においては、目的としている配列を獲得するに至っている。半合成受容体を用いた構造解析実験の前段階として、膜貫通一膜近傍配列ペプチドの脂質二重膜中における構造解析は多くの重要な知見を与える。この実験なしに半合成受容体の標識戦略を決めることは困難である。24年度は、野生型配列と膜貫通部位に常時活性型の変異を導入したものに関して、それらの構造比較解析も行った。その結果、細胞質内膜近傍部位は野生型配列では、膜に結合しているのに対し、変異型では膜から解離することがわかった。膜貫通部位への常時活性型の変異の導入によって膜貫通部位の二量体構造に変化が生じたこと(活性型構造の形成)によって、細胞質内膜近傍部位の挙動に変化が生じた解釈しており、今後の構造解析実験に方向性を与える結果であると考えている。計画を立案した当時の平成25年度の目標はFGFR3細胞外領域から膜貫通、細胞質内膜近傍部位に至る蛋白質断片を半合成し、膜貫通-膜近傍部位の構造機能解析を開始することであった。平成24年度の半合成実験において、目的物の生成が確認でき、25年度はその半合成の最適化、上記構造解析を行う予定であった。実際に実験を開始すると、ライゲーションによる半合成条件のスクリーニングを行う際、材料となる細胞外領域断片の大量調製が問題となることが分かった。現在は、半合成反応条件の最適化とともに細胞外領域の大量調製条件の検討も行っている。なお、平成24年度末において問題点となっていた膜貫通-膜近傍領域の大腸菌による大量調製に関しては、収量の増加に成功しており、当該部位の調製に関しては問題はなくなった。FGFR3膜貫通-細胞質内膜近傍配列ペプチドの脂質二重膜中における構造解析:半合成受容体を用いた構造解析実験の前段階となる膜貫通-膜近傍配列ペプチドの脂質二重膜中における構造解析は多くの重要な知見を与える。これまで、野生型配列と膜貫通部位に常時活性型の変異を導入したものに関して、それらの構造比較解析を行ったところ、細胞質内膜近傍部位は野生型配列では、膜に結合しているのに対し、変異型では膜から解離することがわかっていた。平成25年度はさらに、この細胞質内膜近傍部位の膜からの解離は、膜貫通部位の脂質二重膜に対する配向に依存することが分かった。すなわち、野生型配列に関しても膜貫通部位が脂質二重膜に対して「立つ」ことによって、細胞質内膜近傍部位は膜から解離することがわかった。膜貫通部位の膜これらの結果に関しては論文としてまとめた。現在、この論文は投稿中であり、査読結果待ちという状態にあるH25年度は大腸菌発現系によって調製した細胞外領域合成ブロックの大量調製に向けた条件検討を行い、膜貫通ー膜近傍領域を含んだ合成ブロックとの縮合を行うことを第一としていた。各種条件検討を行ったが、収量の改善に至らなかった。大腸菌によって細胞外領域合成ブロックを調製した場合、タンパク質は沈殿画分に存在するため、機能解析実験には当該部位のフォールディングが必要となる。この過程においても、試料のロスは避けられない。従って、H26年度は当該部位の調製ストラテジーを見直し、動物細胞を用いて調製を行うこととした。その結果、HEK293細胞を用い、ライゲーションの合成ブロック、すなわちC末端にチオエステルを有する細胞外領域タンパク質断片の調製に成功した。さらに、その合成ブロックと膜貫通ー膜近傍部位を含んだペプチドの縮合にも成功した。これまでの研究では野生型、常時活性変異型配列に関して膜貫通ー細胞質内膜近傍部位に相当するペプチドを化学合成し、脂質二重膜中における構造比較解析を分光学的手法によって行った。