hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腋芽の成長を制御する分子機構の解明

分枝パターンはメリステム(植物の幹細胞)の性質に大きく依存する。メリステムが活性を持ち続ける場合は枝分かれが作られ続ける。一方、メリステムが花としての性質を獲得すると、メリステムは花を作って活性を失う。本研究では、イネの穂をモデルとして枝分かれの研究を行った。その結果、PAP2とTAW1の二つの遺伝子が花メリステムへと性質が変化するタイミングの決定に関わることを明らかにした。葉の腋につくられる「腋芽」は、形成された後にさまざまな要因により伸長するか休眠するかが決まる。本研究では、腋芽がどのように休眠するのかを分子レベルで理解するために、休眠と伸長の移行段階にある腋芽の状態を、メリステム活性や遺伝子発現を指標に比較する。また、新規植物ホルモンであるストリゴラクトンの腋芽伸長抑制作用について、作用部位や作用メカニズムを明らかにし、腋芽の成長相の遷移にともなってメリステムにどのような現象が起こるのかを明らかにする。まず、イネを用いて、腋芽がどの段階で休眠するかを決定した。その結果、腋芽がついている葉の成長ステージがP7の段階に腋芽が休眠に向かい、細胞分裂がほぼ完全に停止することが明らかになった。ストリゴラクトンを合成できないd10変異体では、P7に達しても細胞分裂頻度が低下しない。したがって、この時期が休眠開始時期であることが分かった。そこで、腋芽での遺伝子発現について、P7時期の野生型とd10変異体の腋芽の比較、野生型植物の腋芽のP6.5とP7時期の比較を行い、腋芽休眠にかかわる遺伝子の網羅的解析を行うことにした。今年度は、解析のための材料を集めた。ストリゴラクトンの受容体候補であるD14の局在を解析した。その結果、D14はP6時期以降に腋芽に局在することが分かった。また、細胞間を移行する可能性が示唆された。植物の器官は茎頂分裂組織(メリステム)のはたらきにより作られる。植物の成長に伴い、メリステムは次々に形成される。これらのメリステムがどのような器官を分化させるか(メリステムの性質)は、植物の成長にしたがって移り変わる。メリステムの性質が変化することはすなわち分化プログラムが切り換わるということであり、植物の形態を決定するもっとも重要な要因である。本研究では、イネの花序を研究対象として、メリステムの成長相の転換を解析している。PANICLE PHYTOMER2 (PAP2)はイネ科植物に独特のMADSボックス遺伝子である。pap2変異体とPAP2過剰発現体の解析から、PAP2がメリステムの小穂(イネ科に特有の花をつける枝)アイデンティティーを決定する遺伝子であることを示した。さらに、それだけではなく、、PAP2が、1メリステムの生殖成長相への転換、2メリステムの小穂アイデンティティの獲得、3花器官形成プログラムへの転換、の3つの段階において成長相の進行を促進することを明らかにした。これらの結果から、PAP2がイネ科植物の進化において重要な役割を担ったことが示唆された。TAWAWA1(TAW1)遺伝子はメリステムの成長相の転換に対してブレーキとして働く。イネ穂が形成される際には、まず枝が作られ、その後、メリステムの性質が枝メリステムから小穂メリステムに転換することにより花がつく。TAW1遺伝子のはたらきが強まると、小穂メリステムの転換が遅れるため枝分かれが増える。その結果、枝に着く花の数も増える。一方、TAW1のはたらきが弱くなると、すべての成長相の転換が早まることが明らかになった。TAW1遺伝子の分子機能を明らかにすることを目的とした。また、TAW1のイネ収量増加への貢献について調査した。TAW1タンパク質は細胞核に局在することがわかっており、タンパク質構造のコンピューター解析により核内でDNAに結合することが予想されている。この予想を確かめるために、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)法でTAW1タンパク質の結合配列を探索し、5塩基からなる結合配列が得られた。この5塩基の配列が存在するプロモーターを使い、大腸菌で発現させたTAW1タンパク質が結合することを確認した。また、結合には5塩基のすべてが必要であることを確認した。次に、TAW1タンパク質が相互作用するタンパク質を酵母ツーハイブリッド法で探索した。TAW1と結合する、核に局在する、穂形成時に発現するという条件を満たす遺伝子としてシロイヌナズナBlade on Petiole1 (BOP1)のイネ相同遺伝子が単離された。イネゲノムにはBOP1相同遺伝子が3つある。これらタンパク質のすべてがTAW1と相互作用することがわかった。また、TAW1とBOPが植物体内で結合することをBiFC法により確認した。BOP1相同遺伝子の機能を明らかにするために過剰発現とRNAiによるノックダウンを行っている。

植物では、メリステムとよばれる幹細胞で未分化細胞が維持されている。未分化細胞が維持されることは、枝分かれを作り続けるというTAW1の機能にも必須であると考えられる。一方、BOP1は、これとは逆に、細胞を分化した状態に保つはたらきがあるとされている。このことから、BOP1をおさえることがTAW1の機能であるという仮説が成り立つ。今後はこの仮説を検証し、枝分かれをつくるメカニズムを明らかにする予定である。イネ穂の形成においては、まず、枝分かれが作られ、そのそれぞれに花(小穂)が形成される。ひとつの小穂にひとつの種子(コメ)が形成される。したがって、小穂形成の前にどれだけ枝わかれが形成されたかがひとつの穂につくコメの数を決定する。TAWAWA1(TAW1)遺伝子は、穂の枝分かれ形成をコントロールする遺伝子である。本研究では、TAW1遺伝子の分子機能を明らかにすることを目的としている。また、TAW1のイネ収量増加への貢献についても研究をすすめている。TAW1タンパク質は細胞核に局在することがわかっており、他の遺伝子の転写を調節する機能があると考えられているがその詳細は明らかではない。そこで、TAW1タンパク質が相互作用するタンパク質を酵母ツーハイブリッド法で探索した。TAW1と結合する、核に局在する、穂形成時に発現するという条件を満たす遺伝子としてシロイヌナズナBlade on Petiole1 (BOP1)のイネ相同遺伝子が単離された。イネゲノムにはBOP1相同遺伝子が3つある。これらタンパク質のすべてがTAW1と相互作用することがわかった。また、TAW1とBOPが植物体内で結合することをBiFC法により確認した。BOP1相同遺伝子の機能を明らかにするために過剰発現とRNAiによるノックダウンを行っている。ひとつの穂にできるコメの数は収量を決定する重要な要因である。また、植物の繁殖における最重要事項である。植物の生育環境の情報の繁殖へのインプットを明らかにするために栽培密度を変えてtaw1-D変異体を育成したところ、栽培密度とTAW1の働きが密接に関連することが示唆された。イネの穂の形態は、穂分化時に形成されるメリステムの成長相の転換の結果として決定される。これまでの解析から、メリステムの成長相の転換に重要な役割を果たす二つの新規遺伝子を単離した。さらに、いずれも、単一のステップだけではなく複数の異なる相転換において機能することを明らかにした。したがって、これらの遺伝子は個々の段階ではなくメリステムの相転換にとって根本的な機能を果たす可能性がある。今後、これら遺伝子の機能を解析することにより、メリステムの相転換の本質に迫ることができると期待される。これらの理由から、研究は順調に進展していると判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。TAWAWA1タンパク質と相互作用する遺伝子を単離できた。また、環境条件がTAW1遺伝子にインプットされているという興味深い知見を得た。メリステムの相転換は、植物の形態を決定する重要な要因である。
軟骨内骨化における血管侵入と基質分解の制御機構の解明

トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)は頭蓋の形態形成における重要な制御因子の一つであるが、TGF-βシグナリングがどのように頭部神経堤細胞(CNC細胞)由来の間葉細胞の運命を決定するかという機能的意義は未だ明らかにされていない。この問題を解明するため我々は、Tgfbr2^<fl/fl>;Wnt1-Creコンディショナルノックアウトマウスを作成した。これらのマウスは100%が前頭骨を含めいくつかの頭蓋骨が欠損するという表現形を示す。TGF-βシグナリングの欠如はCNC由来間葉細胞から頭蓋骨を形成する骨芽細胞への増殖分化の過程において何らかの重要な働きを持つと考えられたため、in situ hybridizationを用いて前頭骨原器における骨芽細胞めマーカー遺伝子の発現の検出を試みた。骨芽細胞の早期の分化マーカーであるRunx2、オステオネクチン、type I collagenの発現に大きな差は認められなかったが、より後期のマーカーであるOsterix、オステオポンチン、BSP、オステオカルシンの発現はノックアウト群において抑制されていた。次に遺伝子アレイ解析によって、ワイルドタイプとノックアウトマウスでの発現に大きな差が認められたいくつかの遺伝子をTGF-βシグナリングの下流遺伝子の候補としin situ hybridizationによって解析したところ、Fgfr 2の発現が抑制されていることが明らかになった。(GRC, Craniofacial morphogenesis & Tissue Regeneration. 2004にて発表)2、歯胚形成におけるLEF-1の必要性LEF-1はβカテニンによって制御されるWntシグナリングの細胞特異的な転写因子である。Two-component transgenicsystemを用いてLef-1ノックアウトマウスにおける早期頭顔面形態形成期のCNC細胞の遊走パターンを解析したところ、Lef-1はCNC細胞の遊走には関与しないことがわかった。Lef-1ノックアウトマウスでは蕾期以降歯胚の成長が進行しないが、CNC細胞由来の間葉細胞の凝集に異常はみられない。このことからLef-1がCNC細胞のCell cycleには影響を与えていないことがわかった。ところがLef-1ノックアウトマウスでは歯胚上皮のアポトーシス活性が著しく上昇していた。このことがLef-1ノックアウトマウスの歯胚の成長を妨げている要因と考えられた。(IADR. 2004にて発表)1,腫瘍骨転移モデルマウスの解析防衛医大との共同研究で乳癌腫瘍細胞を注射し骨転移をおこしたマウスを作成し、組織学的解析を行った。頸骨の腫瘍転移巣において、CD31陽性の血管内皮細胞、TRAP陽性細胞による骨基質の吸収、および各種マーカーを用いた免疫系細胞の観察を行い、マクロファージとリンパ球の局在等を明らかにするとともに、電子顕微鏡による腫瘍転移巣の観察を行い腫瘍境界部における細胞群の詳細な組織像を明らかにした。これらの成果を、第22回日本骨形態計測学会、第20回日本骨代謝学会および第24回アメリカ骨代謝学会において発表した。2,骨芽細胞におけるMsx1の働きについて骨芽細胞様細胞株であるMC3T3-E1に、ノックアウトにより骨形成の抑制が報告されている転写抑制因子Msx1と蛍光タンパクGFPの遺伝子を組み込んだアデノウイルスを感染させ、Msx1を強制発現させこれらの細胞を蛍光により識別して観察することに成功した。また、これらの細胞をアスコルビン酸の投与により骨芽細胞への分化に導くとともに、その課程におけるオステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク、Runx2、アルカリホスファターゼ等の骨芽細胞マーカーの発現の変化を、RT-PCR, Western blotting, Northern blotting、酵素組織化学、免疫組織化学等の手法を用いて明らかにし、Msx1の骨芽細胞における増殖、分化に及ぼす影響について新たな知見を得た。

Lef-1ノックアウトマウスでは蕾期以降歯胚の成長が進行しないが、CNC細胞由来の間葉細胞の凝集に異常はみられない。このことからLef-1がCNC細胞のCell cycleには影響を与えていないことがわかった。ところがLef-1ノックアウトマウスでは歯胚上皮のアポトーシス活性が著しく上昇していた。このことがLef-1ノックアウトマウスの歯胚の成長を妨げている要因と考えられた。(IADR. 2004にて発表)
聴覚系シナプスのスクラップ＆ビルドによる回路機能制御

本年度は以下の3つの研究をおこなった。(1)下丘の入力シナプスの発達に伴う変化:ラット下丘神経細胞からパッチクランプを行い、下位神経核からの上行性線維と、対側下丘からの入力を比較した。聴覚開始前では、上行性線維からの入力は連発刺激で短期シナプス抑圧をするのに対し、開始後では抑圧が減少し、高頻度刺激に対して応答が追随するようになった。一方で、対側下丘からの入力は連発刺激に対して短期シナプス促通するのに対し、開始後では促通が減少し、高頻度に対してより安定な応答を示した。また、シナプス後部の受容体脱感作の影響が発達に伴って減少し、シナプス前性のメカニズムによって伝達が媒介される可能性が示唆された(Kitagawa and Sakaba in revision)。(2)小脳プルキンエ細胞出力シナプスのシナプス形成に関するBral2の役割:小脳プルキンエ細胞出力シナプスに関して、細胞外マトリックスを構成するBral2が欠失すると、シナプス形成が棄損ないし遅れることが示唆され、結果としてシナプス伝達効率が下がることがノックアウトマウスを用いた研究から示唆された(Edamatsu et al., 2018, J Neurochem)。シナプス形成が恒常的に異常なのか、発達の遅れであるかは今後の詳細な解析が必要であろう。(3)また、これらの研究とは別に精神神経疾患のモデルマウスの供与を受け、シナプス前終末の機能がどのように損なわれるかを調べる研究に着手した。海馬シナプスをモデルとして、現在、機能異常を詳細に調べている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は聴覚系の研究とそれ以外の研究で当該領域と関連する研究成果があった。(1)ラット下丘は脳幹からの入力と対側の下丘からの2つの入力がある。聴覚入力開始以前(P9-11)では前者は連発刺激に対してシナプス応答の短期抑圧、後者は短期促通をした。聴覚入力開始以後(P15-18)では、両者の短期シナプス可塑性はほぼ消失し、連発刺激に対して比較的一定の応答を示すようになった。また、シナプス後部NMDA受容体が発達に伴ってより早い応答を示したが、応答の振幅自体は変化がなかった。一方でAMPA受容体の応答には変化がなかった(論文投稿中)。これらの変化は聴覚系脳幹とは共通性があるもの(短期可塑性の消失)、異なるもの(受容体の応答特性の変化)があった。下丘や聴覚系脳幹で聴覚入力自身が応答の変化を決定するかそうでないかは今後決定しなければならない。(2)海馬苔状線維シナプス前終末においてパッチクランプ直接記録による膜容量測定と全反射蛍光顕微鏡におけるシナプス小胞動態観察を組み合わせてCaー伝達物質放出連関を測定する実験系を構築した。長期シナプス増強などに関与することが示唆されるcAMP/PKAの活性化によって、Caチャネルとシナプス小胞の距離が短縮する可能性が間接的に示唆された。これはシナプス可塑性誘導に伴って、シナプス前終末内の伝達物質放出部位において分子構造の組み換え(スクラップ&ビルド)が行われる可能性があることを意味する。今後、これをより直接的な方法で証明することが課題となる。聴覚系の研究に関しては当初計画の予想範囲内で進捗している。一方で、計画以外で海馬苔状線維シナプス前終末に関して、当初想定していなかった可塑性誘導時の伝達物質放出部位内での分子構造の組み換えの可能性が示唆されたため、予定以上と判断した。聴覚系の研究に関しては当初の計画通り下丘と聴覚系脳幹calyx of Heldとの比較を進めるとともに、電気生理だけでなく、イメージングを用いた研究を進める。また、海馬苔状線維の研究でもCaチャネルの伝達物質放出部位内での分布の変化、放出部位の数の増減などをイメージングで直接可視化する研究を進める。
バクテロイデスがもつ滑走・分泌装置の3次元ダイナミクス

バクテロイデテス門に属する細菌Flavobacterium johnsoniaeは固形物表面上を滑走する.この動きにはべん毛線毛といった既知の運動装置とは全く異なる.興味深いことに,歯周病原細菌などの病原因子の分泌システムとも深く結びついており,これらの細菌によって引き起こされる感染症の予防や治療につながる可能性を秘めている.本研究では1.表面タンパク質が左巻きらせんのループに沿って外膜上を動き回ること,2.表面タンパク質が固形物表面との接着力を変えること,を明らかにし,これは戦車の走行装置である『無限軌道』とよく似た運動の仕組みをもつことを明らかにした.バクテロイデテス門に属する細菌Flavobacterium johnsoniaeは固形物表面上を滑走する.この動きにはべん毛線毛といった既知の運動装置とは全く異なる.興味深いことに,歯周病原細菌などの病原因子の分泌システムとも深く結びついており,これらの細菌によって引き起こされる感染症の予防や治療につながる可能性を秘めている.本研究では1.表面タンパク質が左巻きらせんのループに沿って外膜上を動き回ること,2.表面タンパク質が固形物表面との接着力を変えること,を明らかにし,これは戦車の走行装置である『無限軌道』とよく似た運動の仕組みをもつことを明らかにした.私たちは、バクテロイデスがもつ滑走・分泌装置の全容解明を目指して研究している。バクテリアの1グループであるBacteroidetes属は、海中・土壌・体内、様々な環境に広く分布している。これらの多くは、滑走運動と呼ばれる、表面上を動く能力があるが、そのメカニズムは、既知の生体運動とは根本的に異なっており、全く新しい装置の存在が示唆されている。本年度は、滑走装置の構造や挙動を『可視化』することで、このメカニズムを新しいアプローチで明らかにした。最も速く滑走するBacteroidetesであるFlavobacterium johnsoniaeにおいて、SprBという外膜タンパク質に注目して研究を進め、以下の結果を得た。1.SprBは固形物表面への接着をになうアドヘジンとしての機能をもつ。2.このタンパク質を蛍光標識すると、菌体の膜表面上を高速で動いているのを可視化できた。これは、菌体の極から極へと、約3ミクロンのピッチをもつ、左巻きらせんに沿った動きだった。3.このらせんの流れは、プロトン駆動力の阻害剤によって可逆的に停止し、同時に菌体の滑走運動も停止した。4.このらせん流をもちいて、菌体が表面上を滑走運動するとき、左に曲がる傾向があった。5.らせん状に流れているSprBは、細くて硬い150 nmの繊維状の分子形状をとっており、膜から固形物表面に向かって、突き出していた。6.繊維状のタンパク質が左巻きのらせんに流れるとき、左に曲がる滑走運動が生じることを数学的に検証し、評価した。これらの成果により、未知の生体運動であったバクテロイデスの滑走運動は、左巻きのらせん流によって生じるユニークなメカニズムであることを示した。運動装置は、バクテロイデスの病原毒素分泌装置と類似性があるので、そのメカニズムを解明する上でも、重要な知見といえる。私たちは、バクテリアのもつ滑走・分泌装置の全容解明を目指して研究している。Bacteroidetesに属するバクテリアは海中・土壌・体内、様々な環境に広く分布している。これらの多くは滑走運動と呼ばれる表面上を動く能力があるが、そのメカニズムは既知の生体運動とは根本的に異なっており、全く新しい装置の存在が示唆されている。本年度は、滑走運動の構造や挙動を「可視化」することで、このメカニズムを新しいアプローチで明らかにした。滑走運動の遺伝学的な解析が進んでいるFlavobacterium johnsoniaeを対象として研究を進めた。前年度までに、膜表面の巨大タンパク質であるSprBの動きを解析し、論文として報告したので、本年度では運動・分泌にかかわる他のタンパク質にも注目した。従来の抗体による標識方法では、細胞外のタンパク質にのみ適用できなかったため、sfGFPを融合させた発現株を用いた実験系を構築することでこの問題を解決した。滑走関連遺伝子としてすでに同定されているSpr遺伝子や、分泌関連タンパク質として同定されているGld遺伝子にsfGFPを融合させ発現させ、その挙動を観察した。分泌装置を構成することが期待されるGld遺伝子の場合、タンパク質の末端に蛍光タンパク質を融合させると、その機能も失われるため、構築したいずれの株も良好な結果を得ることができなかった。しかし、Spr遺伝子の中には、前年度に報告したSprBと同じように外膜表面を高速で移動するタンパク質を複数見つけることができた。これらのSprタンパク質はSprBと複合体をつくり、運動時の力伝達や接着に関する役割を果たしていると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。基礎細菌学26年度が最終年度であるため、記入しない。滑走運動のメカニズムが解明されつつある。これは、顕微鏡による可視化技術の発展、分子生物学的な変異体・抗体リソースの充実、数学的な運動モデル構築、それぞれが融合することで、学際的な研究が展開したことによる。当初の研究目的を達成しており、今後の研究目的であるタンパク質分泌メカニズムを明らかにする上でも、有用な成果が得られている。当該年度には,米国科学アカデミー紀要誌に,筆頭著者となる論文を掲載することができ,バクテリアの生体運動メカニズムと,その多様性という観点から,インパクトを与えることが出来たのではないかと考えている.

また,運動のモデルに関する論文も,物理学の専門誌としてはもっとも権威のあるPhysical Reviews Letter誌に共著で論文を掲載することができ,細菌学にとどまらず,多角的なアプローチで研究を展開することが出来ている.今後は、滑走装置だけでなく、進化的に同じ起源であると予測されている、分泌装置にも注目して、タンパク質輸送の過程を可視化する顕微鏡の開発に着手する。滑走装置のふるまいについては、今回の我々の行った研究で、ある程度の答えを見つけられたが、一方で、装置の全体像について、ナノオーダー以上の構造学的知見が得られていないことが、更なる研究の進展を妨げているようにも思える。滑走・分泌装置の複合体としての構造を電子顕微鏡や原子間力顕微鏡をもちいて可視化するというアプローチでも研究を展開させる。これらと光学顕微鏡による計測技術を上手く組み合わせた形で、研究を発展するような、長期的な視点を持って、同時に研究を進めてゆく。
レセプトデータを利用した医薬品の規格適正化による医療費削減効果の検証

本研究では、処方される医薬品の規格をより安価な組み合わせへ変更することによる経済的メリットを明らかにし、今後の国民医療費の削減につなげることを目的としている。2016年度は、主に健康保険組合から提供を受けたレセプトデータ等を集めたJMDCデータベースを用いて調査を行った。調査期間はデータ提供が可能であった2005年1月1日から2014年8月までの間とし、対象医薬品はアンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)に分類されている全ての品目とした。日本で上市されていたARBはカンデサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベサルタン、アジルサルタンの7成分であった。調査期間中、ARBが処方されていたレコードは2,403,022件であり、このうち規格適正化の可否判定の際に必要な情報(医薬品の規格、用法用量、処方日数)が欠損している862,837件を除外した1,539,727件を解析対象とした。規格適正化により、削減が可能であった金額は30,921,510.3円であった。これは、平均すると薬剤費全体の約0.74%に相当した。今回の調査において、規格適正化可能な処方錠数の割合は、すべてのARBで経時的に漸減し、5%付近で一定となっていた。したがって、実臨床では経時的により安価な組み合わせによって処方される割合が高まるが、全体の5%程度は規格が適正化されないまま処方が継続されていると考えられた。この理由として、特に薬剤服用中に問題がなければDo処方が継続されている可能性、あるいはアドヒアランスや服用錠数の自己調節などによる可能性が考えられた。また、新たな規格が上市された際、速やかに適切な規格への切り替えを行うことで効率よく医療費を削減できる可能性が示唆された。今回の結果の解釈には、より高齢者の多い国民保険のデータを含まない点に注意が必要である。本研究では、処方される経口医薬品の規格をより安価な組み合わせへと変更することによる経済的メリットを明らかにし、今後の国民医療費の削減につなげることを目的としている。初年度である平成27年度は、まず岡山大学病院での処方実績に基づいた調査を行った。期間は2009年8月から2014年7月までの5年間とした。小さい規格の製剤を同一タイミングで複数個内服している患者の処方について、より大きい規格をより少ない数で内服するよう処方変更することにより、2014年時点での公定薬価ベースでどの程度金額に差があるのかを比較した。対象とする医薬品は、中枢神経系用薬、循環器官用薬、消化器官用薬、血液・体液用薬、その他の代謝性医薬品の5領域に該当する経口剤のうち、規格の変更が可能なものとした。5年間、5領域の医薬品において、規格を変更することにより109,630,350.5円の薬剤費削減につながることが明らかとなった。内訳として、中枢神経系用薬が44.0%、その他の代謝性医薬品43.2%、循環器官用薬8.2%、消化器官用薬3.2%、血液・体液用薬1.4%であった。個別の医薬品では、5年間で500万円以上の薬剤費削減が可能であるものもあり、規格変更により効率よく薬剤費を削減できる品目が存在する可能性が示唆された。次に単施設のデータでは採用医薬品、処方傾向などの影響を受けやすく、結果から示唆できる内容に限界があることから、健康保険組合のレセプトデータベースを利用し、同様の解析を行うこととした。対象品目として、高血圧治療薬の1つであるアンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARBs)を選択した。入手可能な健康保険組合のレセプトデータベースより、日本で市販されているARBsの2005年以降のレセプトデータを抽出した。次年度以降はこのデータを利用し、同様に各種解析を進めていく予定である。本年度の計画では、岡山大学病院単施設において中枢神経系用薬、循環器官用薬、消化器官用薬、血液・体液用薬、その他の代謝性医薬品の5領域における医薬品の規格変更による経済効果を検証することを目指していた。これらについてはすでに解析が完了している。また、次年度以降に使用予定のアンギオテンシン受容体II拮抗薬のレセプトデータをすでに入手し、解析を進めている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。

規格適正化により、削減が可能であった金額は30,921,510.3円であった。これは、平均すると薬剤費全体の約0.74%に相当した。今回の調査において、規格適正化可能な処方錠数の割合は、すべてのARBで経時的に漸減し、5%付近で一定となっていた。したがって、実臨床では経時的により安価な組み合わせによって処方される割合が高まるが、全体の5%程度は規格が適正化されないまま処方が継続されていると考えられた。この理由として、特に薬剤服用中に問題がなければDo処方が継続されている可能性、あるいはアドヒアランスや服用錠数の自己調節などによる可能性が考えられた。また、新たな規格が上市された際、速やかに適切な規格への切り替えを行うことで効率よく医療費を削減できる可能性が示唆された。今回の結果の解釈には、より高齢者の多い国民保険のデータを含まない点に注意が必要である。これまで、解析には2014年時点での公定薬価を利用していたが、より正確なデータを求めるために、処方時点での薬価を利用して再計算を行う必要があると考えている。また、現在入手しているレセプトデータベースにおいて、特に病院の院内処方に関するデータには医薬品の用法用量が正確に記載されていない、あるいは無記載のものが散見される。そのため、当初想定していた計画と比較し、院外処方に焦点を当てた解析となることが予想される。これらの背景を十分考慮した上で、データの解釈を行う予定である。当初、解析ソフト購入分としての予算を申請していたが、別途解析用に利用可能なソフトを無料で使用することができたため、支出額を抑えることが可能となった。当初の申請では、研究結果を公表するための論文投稿に必要な予算を計上していなかったため、次年度使用額は文献の更正、投稿費用として利用する予定である。
精細管の三次元構造と精子形成能の空間的「偏り」の解明

カップルの15%が不妊であり、半数は男性側に原因があるとされている。原因の多くは精子形成障害であるが、機序が解明されたものは少なく、その解明と治療のために精子を作る精巣の研究が多数報告されてきた。しかし、精巣内の大部分を占める精細管の構造と機能に関しては、今もなお未解明な点が多く、研究段階にある。本研究は蛍光3重染色を用いた半自動の三次元再構築法により、生後発達を含めた精細管の構造解析と精子形成の定量的解析を三次元で行うことを目的とした。さらに、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子を同定し、その遺伝子がコードする分子の機能を解明することを目指す。また、ヒトでは精細管の三次元再構築例がなく、詳細な構造の解明を目指す。平成28-29年度は、生後発達におけるマウス精細管の本数・分岐・長さ・走行・相互関係を明らかにするために、0日齢、21日齢、70日齢の精細管の三次元再構築を各3例行った。また、精子形成に関わる空間的な偏りを検討するため、精子形成が開始した場所を三次元で明らかにした。また、70日齢の再構築した精細管を精子形成のステージごとに3つに分け、周期的変化を三次元で解析した[Reproduction 154: 569 (2017)]。平成30年度は空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子の同定とヒト精細管の三次元再構築をを試みたが、現時点では共にうまくいっていないため、続き上記の研究を進める。カップルの15%が不妊であり、半数は男性側に原因があるとされている(Fisher & Hammarberg, 2012)。本研究は蛍光3重染色を用いた半自動の三次元再構築法により、生後発達を含めた精細管の構造解析と精子形成の定量的解析を三次元で行うことを目的とした(平成28年度の目的)。さらに、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子を同定し、その遺伝子がコードする分子の機能を解明することを目指す(平成29年度以降の目的)。また、ヒトでは精細管の三次元再構築例がなく、詳細な構造の解明を目指す(平成29年度以降の目的)。平成28年度では、生後発達におけるマウス精細管の本数・分岐・長さ・走行・相互関係を明らかにするために、0日齢、21日齢、70日齢の精細管の三次元再構築を各3例行った。70日齢において、蛍光染色を用いた半自動の三次元再構築は技術的に困難であり、PAS染色を使った半自動の再構築方法を考案し、実行した。また、精子形成に関わる空間的な偏りを検討するため、精子形成が開始した場所を三次元で明らかにした(論文執筆中)。精巣の形態の詳細な情報は研究の基盤として不可欠である。0日齢、21日齢、70日齢の精細管の三次元再構築を各3例完了した。精子形成の定量解析として、精子形成が開始した場所を三次元で明らかにした。平成28年度は、生後発達におけるマウス精細管の本数・分岐・長さ・走行・相互関係を明らかにするために、0日齢、21日齢、70日齢の精細管の三次元再構築を各3例行った。平成29年度、70日齢の再構築した精細管を精子形成のステージごとに3つに分け、周期的変化を三次元で解析した。平成28年度の成果と合わせ、1つの論文にまとめることができた[Reproduction 154: 569 (2017)]。また、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子の同定とヒト精細管の三次元再構築をを試みたが、現時点では共にうまくいっていないため、平成30年度も引き続き上記の研究を進める。精巣の形態の詳細な情報は研究の基盤として不可欠であり、男性不妊症をはじめ、精巣の様々な疾患の原因解明と治療の開発をすすめる多くの研究に寄与する。空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子の同定を試みたが、現時点でははっきりとしたデータが出ていない。

また、ヒト精細管の三次元再構築を行なっているが、サンプル数が少ないことで、試料の固定条件の検討ができず、現時点ではうまくいっていない。カップルの15%が不妊であり、半数は男性側に原因があるとされている。原因の多くは精子形成障害であるが、機序が解明されたものは少なく、その解明と治療のために精子を作る精巣の研究が多数報告されてきた。しかし、精巣内の大部分を占める精細管の構造と機能に関しては、今もなお未解明な点が多く、研究段階にある。本研究は蛍光3重染色を用いた半自動の三次元再構築法により、生後発達を含めた精細管の構造解析と精子形成の定量的解析を三次元で行うことを目的とした。さらに、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子を同定し、その遺伝子がコードする分子の機能を解明することを目指す。また、ヒトでは精細管の三次元再構築例がなく、詳細な構造の解明を目指す。平成28-29年度は、生後発達におけるマウス精細管の本数・分岐・長さ・走行・相互関係を明らかにするために、0日齢、21日齢、70日齢の精細管の三次元再構築を各3例行った。また、精子形成に関わる空間的な偏りを検討するため、精子形成が開始した場所を三次元で明らかにした。また、70日齢の再構築した精細管を精子形成のステージごとに3つに分け、周期的変化を三次元で解析した[Reproduction 154: 569 (2017)]。平成30年度は空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子の同定とヒト精細管の三次元再構築をを試みたが、現時点では共にうまくいっていないため、続き上記の研究を進める。70日齢の再構築した精細管を精子形成のステージごとに3つに分け、周期的変化を三次元で解析する。また、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子を同定し、その遺伝子がコードする分子の機能を解明することを目指す。この目的のために、DNAマイクロアレイや二次元蛋白質電気泳動を用いた解析を検討する。また、ヒト精細管の三次元再構築を行い、詳細な構造の解明を目指す。引き続き、空間的に偏る精子形成に関連した遺伝子の同定とヒト精細管の三次元再構築を試みる。
卵母細胞ゲノムの発生支持能に不可欠なエピジェネティクス修飾の調節

本研究では、マウスおよびブタの卵母細胞を対象とし、卵母細胞の成長過程で行われるゲノム修飾の過程を明らかにすることを目的に体外培養による卵母細胞の生産と関連付けて実施した。得られた成果は、以下の通りである。1)マウス新生仔および妊娠12.5日目胎仔から卵巣を採取し、体外培養に供試して、卵母細胞の体外培養による生産システムを開発した。胎仔卵巣は中腎とともに8日間器官培養し、ついで中腎を除去してさらに10日間器官培養した。その後、卵巣より機械的に発育した卵胞を摘出して、さらに11日間培養することにより直径60pm以上に達した卵母細胞を生産することができた。新生仔卵巣も同様に、器官培養・卵胞培養によりさらに効率に卵母細胞の生産が可能であった。2)体外生産された卵母細胞におけるインプリント遺伝子、Igf2r,Zac1、Lit1およびH19の発現調節領域におけるDNAメチル化解析を実施したところ、いずれの遺伝子も正常にメチル化を受けている卵母細胞の存在が多数を占めていることを確認した。DNAメチル化抗体、ヒストンメチル化およびアセチル化抗体を用いた解析からも確認した。さらに、核移植により卵子を再構築した後、体外受精することにより産子の生産に成功した。3)ブタにおいては、成体卵巣を薄切して、内部の卵胞を採取し、これを体外培養することにより成長した卵細胞の生産が可能であった。しかし、体外成長可能な卵母細胞は、体外培養開始時点ですでにその直径が80μm以上に発育していることが要件であった。4)卵母細胞成長過程でインプリントを受ける遺伝子の特定を進め、現在までに、27遺伝子が母方で(卵母細胞)制御を受けていることを明らかにした。卵母細胞形成過程におけるゲノムインプリンティングの重要性の一端を明らかにすることができた。本研究では、マウスおよびブタの卵母細胞を対象とし、卵母細胞の成長過程で行われるゲノム修飾の過程を明らかにすることを目的に、体外培養による卵母細胞の生産と関連付けて実施した。初年度に得られた成果は以下の通りである。マウス新生仔および妊娠12.5日目胎仔から卵巣を採取し、体外培養に供試して、卵母細胞の体外培養による生産システムを開発した。その後、卵巣より機械的に発育した卵胞を摘出して、さらに11日間培養することにより直径60μm以上に達した卵母細胞を生産することができた。新生仔卵巣も同様に器官培養・卵胞培養によりさらに効率に卵母細胞の生産が可能であった。しかしながら、これらの卵母細胞の体外成熟能は低く、第二減数分裂中期に進行するものはごく限られていた。現在、体外生産された卵母細胞におけるインプリント遺伝子、Igf2r, Zac1およびH19の発現調節領域におけるDNAメチル化解析を実施中である。一方、ブタにおいては、成体卵巣を薄切して、内部の卵胞を採取し、これを体外培養することにより成長した卵細胞の生産が可能であった。しかし、体外成長可能な卵母細胞のサイズは80μm以上であった。今後さらに小型の卵母細胞からの卵子の生産を試みるとともに、メチル化シトシンに対する抗体を用いたメチル化解析を現在実施中である。

1)マウス新生仔および妊娠12.5日目胎仔から卵巣を採取し、体外培養に供試して、卵母細胞の体外培養による生産システムを開発した。胎仔卵巣は中腎とともに8日間器官培養し、ついで中腎を除去してさらに10日間器官培養した。その後、卵巣より機械的に発育した卵胞を摘出して、さらに11日間培養することにより直径60μm以上に達した卵母細胞を生産することができた。新生仔卵巣も同様に器官培養・卵胞培養によりさらに効率に卵母細胞の生産が可能であった。2)体外生産された卵母細胞におけるインプリント遺伝子、Igf2r, Zac1、Lit1およびH19の発現調節領域におけるDNAメチル化解析を実施したところ、いずれの遺伝子も正常にメチル化を受けている卵母細胞の存在が多数を占めていることを確認した。DNAメチル化抗体、ヒストンメチル化およびアセチル化抗体を用いた解析からも確認した。さらに、核移植により卵子を再構築した後、体外受精することにより産子の生産に成功した。3)ブタにおいては、成体卵巣を薄切して、内部の卵胞を採取し、これを体外培養することにより成長した卵細胞の生産が可能であった。しかし、体外成長可能な卵母細胞は、体外培養開始時点ですでにその直径が80μm以上に発育していることが要件であった。4)卵母細胞成長過程でインプリントを受ける遺伝子の特定を進め、現在までに27遺伝子が母方で(卵母細胞)制御を受けていることを明らかにした。卵母細胞形成過程におけるゲノムインプリンティングの重要性の一端を明らかにすることができた。
放射線によるミトコンドリア形態機能応答とそれらを標的とした新規がん治療法開発

これまでに我々は、ミトコンドリア分裂制御タンパク質Drp1が放射線によるミトコンドリア断片化ならびに細胞死に寄与することを明らかにしてきた。そこで、申請者は、形態変化を通じて制御されるミトコンドリア機能の変化が放射線感受性を修飾しているのではないかという仮説を立てた。本研究では、in vitroおよびin vivoにおいて、Drp1をはじめとした複数の制御因子を通じ調節されるミトコンドリア形態がどのように放射線感受性を修飾するのかを解明することを目的とし、ミトコンドリア機能変化を中心に解析する。これにより、放射線増感の新たな標的としてミトコンドリアがその候補となりうるのか評価する。
Airinterface培養細胞の血小板活性化因子による粘液線毛調節機構

PAFの気道上皮細胞粘液線毛輸送系に対する影響とその作用機序について、高分化上皮細胞培養系であるair interface法を用いて検討した。Ussing chamber法によるイオントランスポートの検討ではPAFの添加によりshort circuit currentおよびconductanceの増加をもたらした。この反応はClchannel blockerであるDPACで抑制されたことよりPAFによる電気的特性の変化はClイオントランスポートの亢進によることがわかった。またこの反応はPAF受容体拮抗剤や、Caのキレート剤であるBAPTA-AMにより抑制され、またindomethacinの前処置により抑制された。以上よりPAF受容体を介し、Ca依存性でかつprostaglandinを介する反応と推測された。そこでPAFによる気道上皮細胞内情報伝達機構を明らかにするためsecond messengerの測定を行った。fura2法を用いて培養細胞内遊離カルシウムの動態を検討した。PAF添加後、細胞内カルシウムは有意に上昇し、その反応は一過性のスパイク反応と持続性の反応の2相性示した。EGTAの前処置にて前者は抑制されず、後者の持続性の反応は完全に抑制された。またイノシトール3リン酸(IP3)を3H-D-myoinositolを用いてcompetitive inositol binding assayを用いてIP3を経時的に測定したところ、IP3の一過性の上昇を認めた。以上のことから、PAFは細胞内および細胞外からのカルシウムの流入を引き起こすことがわかった。またprostaglandinの遊離の有無をRIAで測定したそころPGE2,PGF2αの有意な増加を認めた。従ってPAFによる気道上皮細胞機能の発現にprostaglandinの関与が推測された。血小板活性化因子(以下PAF)は強力な炎症性メデイエーターで炎症細胞の活性化、気道収縮、血管透過性の亢進などの作用を有し、気管支喘息の病態に重要な役割を果していると考えられている。気管支喘息では粘液線毛輸送系の障害が観察されているが、この方面のPAFの関与はまだ十分検討がなされていない。本年度はAirinterface法により培養した気道上皮細胞を用いて、PAFの電気的特性に与える影響およびPAF添加後の細胞内カルシウムの動態を明らかにした。1電気的特性の評価:Airinterface法で培養された牛気道上皮細胞をUssingchamberに固定しvoltageclamp法により電気的特性の変化を測定した。PAFの投与により濃度依存性にshort-circuitcurrentが増加した。またCl channelblockerで抑制されたことによりPAFにより電気的特性の変化はClイオンの分泌亢進によることがわかった。またこの反応はPAF受容体拮抗剤、Ca除去、indomethacinの前処置により抑制されることから、PAF受容体を介し、Ca依存性でかつprostaglandinを介する反応と推測された。2細胞内遊離カルシウムの測定:培養細胞にfura2-AMを負荷し蛍光比の変化により細胞内カルシウムを測定した。PAF添加後、細胞内カルシウムは上昇し、その反応は一過性の反応と持続性の反応の2相性を示した。EGTAの前処置にて後者の持続性の反応は完全に抑制され、またPAF受容体拮抗剤により両方の反応とも抑制された。よってPAFはPAF受容体を介し、細胞内カルシウム貯蔵部位からの一過性の遊離および細胞外からのカルシウムの流入を引き起こすことが推測された。本年度はPAFの気道上皮細胞の粘液線毛輸送系に対する細胞内作用機序を明らかにするため、その受容体情報伝達機構について検討した。

昨年度の結果よりPAFが気道上皮細胞の細胞内カルシウムの一過性の増加とそれに続く持続性の増加の二相性の反応をひきおこすことが明らかとなったため、細胞内カルシウムの遊離を促すイノシトール3燐酸(IP3)レベルを測定した。方法は[3H]-IP3によるcompetitive protein binding assayを用いた。その結果、PAFはIP3の一過性の上昇をもたらし細胞内カルシウムの一過性の増加とtime-courseが一致した。このことよりPAFはIP3の上昇を介して細胞内貯蔵部位からのカルシウムの遊離をもたらすことがわかった。また細胞内カルシウムの上昇はphospholipase A2の活性化を促しprostaglandinの産生に影響すると考えられたため、PAF刺激後のprostaglandinE2,F2αのレベルをRIAを用いて測定した。その結果、PAFは有意のProstaglandin E2,F2αの上昇をもたらした。以上よりPAFはPAF受容体を介し、phospholipase Cの活性化によりIP3を産生し細胞内貯蔵部位からのカルシウム遊離をもたらし、さらにphospholipase A2の活性化を介してprostaglandinの産生を引き起こし、これがイオントランスポートなどの気道上皮細胞機能に影響を与えることがわかった。
後期中等教育段階における数学と物理の双方向性の構築と双方向性指向教材の開発研究

本研究は,後期中等教育段階の学習者(高校生や高等専門学校の低学年生)が,日常的に数学と物理を関連させて学習するために,数学と物理の学びにおける双方向性を構築することを目的とし,次の4項目を実施する.項目1数学と物理の教科書における単元ごとの関連を調べ,表面的な双方向性を構築する.項目2数学と物理の学習事項において,それぞれの科目間で身につけるべき力の関連を導出し,身につける力の双方向性を構築する.項目3数学と物理の双方向性を体感しながら学ぶ,双方向性指向教材を開発する.項目4開発した教材を実際に高等専門学校1,2年の授業で活用,改善したのち,公開する.本研究は,後期中等教育段階の学習者(高校生や高等専門学校の低学年生)が,日常的に数学と物理を関連させて学習するために,数学と物理の学びにおける双方向性を構築することを目的とし,次の4項目を実施する.項目1数学と物理の教科書における単元ごとの関連を調べ,表面的な双方向性を構築する.項目2数学と物理の学習事項において,それぞれの科目間で身につけるべき力の関連を導出し,身につける力の双方向性を構築する.項目3数学と物理の双方向性を体感しながら学ぶ,双方向性指向教材を開発する.項目4開発した教材を実際に高等専門学校1,2年の授業で活用,改善したのち,公開する.
中世ヨーロッパにおける権力構造とアイデンティティー複合

本研究では前近代、とりわけ中世ヨーロッパにおける支配権力の編成の実態とメカニズムを各地域におけるアイデンティティー(一体性)の形成との関係で捉えることを課題とした。全体的な権力の構造(国家)のレヴェルでこの問題を考える場合には、社会を構成する各レヴェル、階層毎に検討しなければならない。本プロジェクトでは権力の最上層部分(王権、諸侯権)に限定し、集団的な「統合と調整」に論点を絞り、各地域間の差異とヨーロッパ中世的な特徴を把握することができた。本プロジェクトの"中世における権力構造のヨーロッパ的特質を明らかする"という課題はその推進母体である「ヨーロッパ中世史研究会」の本来の課題でもある。今回の科研プロジェクト(2006-2008年度)はメンバーの面でも上記の研究会とも重なっており、具体的な研究も順調に遂行されている。課題の具体化の面では2006年度初めに、各自の構想と全体的な目標の明確化のための準備会を開催した。その結果「統合と調整」という共通課題を設定し、その枠組みの中で、各分担者が自己の研究対象を十分考慮して具体的なテーマを決めることができた。各自の研究成果は「論集」として刊行する予定である。「統合と調整」というテーマは(1)紛争解決のメカニズム、(2)議会における合意形成のメカニズム、(3)王権の地域統治と統合のメカニズム、の三つに分けて3年間に順次検討していくこととなった。初年度は(1)のテーマに力点をおくこととし、2006年度当初以降、隔月の割合で例会を開き、研究会以外からも報告者、参加者を得て、問題点の明確化と共有、新たな視点の導入と深化を図ることができた。その結果は中間報告集の形で蓄積する予定である。2007年度は(1)の課題を更に深めるべく、a)外国人研究者の招聘による公開の講演会の開催、b)全国的なシンポジウムの開催を予定している。即ち、a)については(1)の課題において国際的に高い評価を得ているCl.ゴヴァール教授(パリ第一大学)を招き4月初旬に東京と京都で講演会を開き、b)については11月下旬に西洋史研究会と共催で(1)の課題でシンポジウムを東京で開くことになっている。なお、2006年度には科研予算を有効に活用し、活発に文献・史料の収集が行われた。特に3名は海外で自己のテーマに直結した史料の現地での収集を行い、成果を挙げることができた。本プロジェクトの、"中世における権力構造のヨーロッパ的特質を明らかする"という課題の具体的な追求は、その推進母体である「ヨーロッパ中世史研究会」の活動と相侯って、2007年度も順調に遂行された。初年度(2006年度)当初に「統合と調整」という共通課題を設定し、分担者毎の具体的なテーマを決め、それらのテーマを(1)紛争解決のメカニズム、(2)議会における合意形成のメカニズム、(3)王権の地域統治と統合のメカニズム、の三つに統括して、順次、共同で取り組むことした。2007年度は昨年度に引き続き、(1)のテーマに力点をおくこととし、年度当初以降、隔月の割合で例会を開き、研究会以外からも報告者、参加者を得て、問題点の明確化と共有、新たな視点の導入と深化を図ることができた。特に2007年度には(1)の課題を更に深めるべく、a)外国人研究者の招聘による公開の講演会の開催、b)全国的なシンポジウムを開催した。即ち、a)について国際的に高い評価を得ているC1.ゴヴァール教授(パリ第一大学)を招き4月初旬に東京と京都で講演会を開き、b)については11月下旬に「西洋史研究会」と共催で、(1)の課題でシンポジウムを東京で開いた。いずれも盛会で、内容的にも所期の目標を達成することができた。2007年12月以降は定例の研究会をベースに、2009年、2010年に予定されているシンポジウムと論集の刊行に向けて(2)、(3)のテーマに取り組んでところである。なお、2007年度も科研予算を有効に活用し、活発に文献・史料の収集が行われた。海外での史料収集においても所期の成果を挙げることができた。本プロジェクトは平成20年度が最終年度にあたる。その意味でも本年度は3年間の研究の集約という観点で研究活動が推進された。具体的には、初年度の初頭に策定された(1)紛争解決のメカニズム、(2)議会における合意形成のメカニズム、(3)王権にによる地域統治のメカニズム、という三つの課題のうち、本年度は(2)と(3)に力点が置かれた.全体としては例年通り、メンバー以外の研究者も報告者に加え、合計4回の研究集会を開催することができ、各回とも、多くの参加者を得て活発な質疑・応答がなされ、問題点をより明確にすることができた。この成果はプロジェクトのメンバーを中心とする全国レヴェルの学会でのシンポジウムに反映させることになっている。

具体的には、(2)のテーについては、2009年4月に『法制史学会』において「西欧中世-近世における政策決定をめぐる合意形成」という論題の下でシンポジウムが開催されることになっており、(3)のテーマについては2010年5月のシンポジウム開催を計画である。また、年度末には3年間の研究成果を総括した報告書を刊行し、全国の研究者に配布し意見交換の素材としている。さらに、2009年3月には合宿を行い、メンバー間での成果と課題に関する率直な意見交換の場を設けることができた。そこでは同時にこのプロジェクトの成果を論文集の形で公表することが決められた。各自が自己のテーマに従って2009年11月までに論文を執筆し、科研費での出版助成を申請することとなった。なお、今年度は個人レヴェルでの成果の公表も活発に行われ、多くの研究論文・研究書が多様な形で公刊されたことを付記しておきたい。