hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体環境の制御による虚血性神経細胞死の抑止

1)虚血性神経細胞死ORP150が小胞体に局在するストレス蛋白として、神経細胞を虚血ストレスから守りうるメカニズムを明らかにするため、スナネズミの遅発性神経細胞死モデルを用いて、ORP150と虚血性神経細胞死の関連について検索した。一過性脳虚血後のスナネズミ海馬CA1領域では虚血負荷後にORP150の発現上昇を認めた。虚血耐性条件ではORP150の上昇は蛋白レベルでも明らかになり、アデノウイルスベクターによるORP150の強制発現によって、神経細胞死が抑止された。以上から、より緩やかに神経細胞死が進む遅発性神経細胞死においても小胞体ストレスの重要性が示された。2)マウスにおける小脳発生での検討。ORP150は、生後4-8日にかけて小脳、特にプルキンエ細胞に強い発現パターンを示した。ORP150を過剰発現させたトランスジェニックマウス(TG)では、プルキンエ細胞に強いORP150の発現を認めるとともに、ORP150ノックアウトヘテロ接合体(KO)では、その発現は明らかに減弱していた。ORP150の強制発現によってこの時期における細胞死が抑制され、逆にORP150ノックアウトマウスでは、神経細胞死が加速された。ORP150は海馬神経においてグルタミン酸による細胞内Ca++上昇を抑え、細胞死を抑制することから小脳発生過程における神経細胞死にも小胞体を介する神経細胞死の関与が示唆される。Megsinは東海大学の宮田らによって見いだされた新規serine proteinaseinhibitorであり、Meg Tgのヘテロ接合体は、生後4-6ヶ月をピークに、海馬および黒質(SNpc)においてPAS陽性の細胞内沈着を伴って胞死が進む。このMeg Tgの黒質における病変が小胞体依存性の神経細胞死であることを示した。ORP150(150 kDa Oxygen Regulated Protein)はアストログリアの初代培養系より精製・クローニングされた新規ストレス蛋白である。砂ネズミの一過性総頚動脈結紮によって海馬CA1領域に遅発性神経細胞死(DND)がおこり、この細胞死は虚血耐性を獲得させた個体では起こらない。ORP150は虚血耐性を獲得した砂ネズミCA1領域に極めて強く発現し、また、あらかじめCA1領域にアデノウイルスベクターを用いてORP150を遺伝子導入することにより、神経細胞死を救済することができることを示した。DNDでは1-2週間で神経細胞死が完成する「慢性虚血性神経細胞死モデル」である。このパラダイムにおいてもORP150は神経細胞死を抑制することが示された。小胞体における小胞体ストレス応答は虚血や変性に伴う神経細胞死に関わることが明らかになっている。マウスにおける小脳発生では神経細胞死がおこることが知られているが、新規小胞体ストレス蛋白であるORP150は、生後4-8日にかけて小脳、特にプルキンエ細胞に強く発現、GRP78、GRP94、HSP70などとは異なった発現パターンを示した。ORP150ノックアウトマウスの発生初期の小脳プルキンエ細胞を観察すると、出生後4-6日にかけて、TUNEL法および活性化caspase-3による免疫染色で胞死が検出される。この細胞死は、野生型、ORP150トランスジェニックマウス(Tg ORP150)の順に、すなわち、ORP150の発現が強くなるほど抑制される傾向にあった。

さらに、Tg ORP150では、プルキンエ細胞の密度も、明らかに増加していた。ところが、行動テストで評価された小脳の機能は、逆にTg ORP150で、傷害されており、発生段階における小胞体ストレスが、ホストのプルキンエ細胞の至適密度を決めると考えられる。また、グルタミン酸拮抗薬であるMK-801の投与により、TGと同様の傾向が再現された。ORP150は海馬神経においてグルタミン酸による細胞内Ca++上昇を抑え、細胞死を抑制することから小脳発生過程における神経細胞死にも小胞体を介する神経細胞死の関与が示唆される。マウスにおける小脳発生では神経細胞死がおこることが知られているが、新規小胞体ストレス蛋白であるORP150は、生後4-8日にかけて小脳、特にプルキンエ細胞に強く発現、GRP78、GRP94、HSP70などとは異なった発現パターンを示した。ORP150を過剰発現させたトランスジェニックマウス(TG)では、プルキンエ細胞に強いORP150の発現を認めるとともに、ORP150ノックアウトヘテロ接合体(KO)では、その発現は明らかに減弱していた。ORP150ノックアウトマウスの発生初期の小脳プルキンエ細胞を観察すると、出生後4-6日にかけて、TUNEL法および活性化caspase-3による免疫染色で胞死が検出される。この細胞死は、野生型、ORP150トランスジェニックマウ(Tg ORP150)の順に、すなわち、ORP150の発現が強くなるほど抑制される傾向にあった。さらに、Tg-ORP150では、プルキンエ細胞の密度も、明らかに増加していた。ところが、行動テストで評価せれた小脳の機能は、逆にTg ORP150で傷害されており、発生段階における小胞体ストレスが、ホストのプルキンエ細胞の至敵密度を決めると考えられる。コンフォーメーショナル病モデルとしてmegsin transgenic rat(Meg Tg)の解析をおこなった。Megsinは東海大学の宮田らによって見いだされ新規serine proteinase inhibitorであり、Meg Tgのヘテロ接合体は、生後4-6ヶ月をピークに、海馬およ黒質(SNpc)において神経細胞死が進む。このMeg Tgの黒質における病変が小胞体依存性の神経細胞死であることを示した。1)アデノウイルスベクターによる逆行性感染系の確立(北尾が担当)Pael受容体(理化学研究所・高橋良輔チームリーダより供与)された発現ベクター(Ad/PaelR)を線条体に注入し、逆行性に感染させ、黒質緻密層(SNpc)におけるPael受容体遺伝子発現系を確立した。また、マーカー遺伝子として蛍光蛋白(EGFP)アデノウイルスベクター(Ad/GFP)も作成した。コントロールベクターとしてはGFAP(glial fibrary acidic protein)を発現するアデノウイルスベクター(Ad/GFAP)を用いた。これらのアデノウイルスベクターを用いて以下の実験を行った。・Ad/EGFP+Ad/PaelRを線状体に注入し、黒質でのGFP遺伝子の発現を確認する。
水電解と燃料電池を組み合わせた省エネ型トリチウム分離回収技術の研究

福島原子力発電所の汚染水問題で、トリチウムの分離・回収技術の確立が急務とされている。本研究では、水電解と燃料電池を組み合わせた省エネルギ-型水素同位体分離法を研究した。実際に、固体高分子形燃料電池では生成水側に水素同位体が濃縮される同位体効果を発見し、水電解と併用することで、高効率かつ少ない電力消費量で水素同位体が分離・濃縮できることを実験的に証明した。福島原子力発電所の汚染水問題では、トリチウムの分離・回収技術の確立が急務とされている。水素同位体分離法は色々と提案されており、中でも水電解法は分離係数が極めて高い利点が知られている。しかしその電力消費量は膨大であり、電解法のみによる分離方法では依然として多くの課題がある。そこで本研究では、水電解と燃料電池を組み合わせた新しい省エネ型分離方法を提案している。しかし、燃料電池での同位体分離の報告例はなく、水素同位体の酸化電極反応に関する基礎的知見も少ない。今年度は重水素電極反応に関する速度論的パラメーターと同位体効果の関係について調べた。電気化学測定は、水素雰囲気下で白金回転ディスク電極を用いて行った。電解液は軽水素硫酸溶液(0.05 M H2SO4 + H2O)と重水素硫酸溶液(0.05 M D2SO4 + D2O)を使用した。測定は開回路電位(OCP)から±300 mVの範囲、掃引速度±10 mV s-1にてリニアスイープボルタメトリーを行い、軽水素または重水素の酸化反応(HOR or DOR)及び還元反応(HER or DER)による電流値を記録した。ずれの溶液でも酸化反応では拡散限界電流が観察され、その値は回転数の1/2乗と比例関係を示した。平衡電位から±50 mV付近のターフェル勾配を解析すると、還元反応のターフェル勾配はHERの方が小さく、一方、酸化反応に関してはDORの方が小さかった。今回得られた結果から、重水素電極反応ではその酸化反応速度の方が速く、燃料電池でも水素同位体は重水として分離濃縮できる可能性が発見できた。福島原子力発電所の汚染水問題で、トリチウムの分離・回収技術の確立が急務とされており、水素同位体分離は非常に重要な技術である。種々の水素同位体分離法がある中で、水電解法は分離係数が極めて高いが、電力消費量は大きく、電解法のみによる分離方法では依然として多くの課題がある。本研究では、水電解と燃料電池を組み合わせた新しい省エネルギ-型水電解方を研究した。このプロセスでは、燃料電池を活用し電気エネルギーのリサイクル設計、および燃料電池での同位体分離効果を加えた分離工程の高効率化を目指した。まず本研究では燃料電池における同位体分離の可能性を検討するため、実際に水素同位体の電極反応に関する電気化学的メカニズムを検討した。そこでは、白金ディスク電極を用いた回転電極を使い、交換電流密度やターフェル勾配を測定した。その結果、燃料電池反応(水素酸化反応)でも同位体効果により水素同位体分離が行える基礎的知見が得られた。次に、実際に固体高分子形燃料電池(PEFC)を使い、発電状態における重水素同位体分離係数を測定した。その結果、本実験では重水素濃度が10 atomic %の時、重水素同位体分離係数は最大約6.0となり、PEFCでは未利用の生成中に重水素が濃縮されることが分かった。また重水素濃度と分離係数の関係を調べると、重水素濃度が低濃度側にいくにつれて分離係数は2から4前後の値で収束することが分かった。平成26年度の研究計画では、アルカリ溶液を使った水電解や燃料電池反応における、水素同位体の速度論的考察を提案していた。今年度は当初の予定通り実験が順調に遂行し、水素同位体の酸化反応や還元反応に関わる交換電流密度やターフェル勾配を測定測定することに成功し、2件の学会発表ならび1件の学術論文への投稿ができた。電気化学分野平成27年度は、本研究で提案しているカスケードモデルの実証実験を行う。そこでは、以下の3点について検証する計画である。a)一段当たりの消費電力量と分離係数の評価b)複数段での消費電力量と分離係数の評価c)パイロットプラント設計の知見を得る
量子ハミルトニアンのスペクトルに対する確率論的および統計学的アプローチ

1.各成分が、独立かつ同一の正規分布に従う確率変数からなるn次の実対称行列を考える。行列X^<(n)>の固有値の数直線上での配列から得られる経験分布は、適当なスケーリングの下でn→∞とするときWignerの半円則に収束することがよく知られている。近年になってT.Chan,L.Rogers,Z.Shi,Y.Takahashiは、F.Dyson(1962)のアイディアに基づいてX^<(n)>の仮想的な時間発展X^<(n)>(t)を考えることにより、このことに別証明を与えた。彼らはX^<(n)>(t)の固有値たちから成るn次元の拡散過程が満たす確率微分方程式を研究し、それを通じて固有値の経験分布のなす確率過程のn→∞における極限を調べている。しかしながらその確率微分方程式の係数に特異性があることから、彼らは解の存在を確かめるために必要以上に難しい解析を行なっているように思われる。これに対し我々は、半円則の導出に話を絞る限り、固有値そのものの満たす上記確率微分方程式ではなく、固有値の経験分布のStieltjes変換が満たす、より易しい方程式を調べるだけで十分であることに注目し、従来の議論を簡単な見とおしのよいものにした。さらにその方程式は、行列X^<(n)>(t)のレゾルベントを考えることによりたやすく導かれることを示した。なお、この成果は大学院生の平塚剛氏との共同研究によるものである。2.物性理論、特に不規則系、ランダム行列、および量子力オスの理論に共通して現れる、「準位統計」の現象論的な側面を数学的に基礎づけた。これは、スペクトルまたはその一部を定常な点過程のサンプルと見なすことによってのみ可能であるが、物理学者による従来の研究ではそのことが十分明確に意識されていたとはいいがたい。そこで本研究では、定常点過程の一般論の立場から「準位統計とは何か」ということを考察し、次のようなことを明らかにした。(1)準位統計に現れる様々な平均量の間に成り立つ関係式の多くは、点過程論でよく知られたPalm-Khinchinの等式から導かれる。(2)定常点過程が定義された確率空間の上には、Palm測度と呼ばれるものが自然に構成されるが、準位の間隔分布などを観測することは実は、ハミルトニアンのスペクトルを点過程と見なしたときの、そのPalm測度を観測することに相当する。各成分が、同一の正規分布に従う確率変数からなるn次の実対称行列を考える。但し対称性による制約を除いては各成分は独立とする。行列X^<(n)>の固有値の数直線上での配列から得られる経験分布は、n→∞とするときWignerの半円則と呼ばれる確率分布に収束することが知られている。

一方ランダム行列の固有値分布に対するこの種の極限定理を導く方法として、行列を値とする確率過程X^<(n)>(t)で、各時刻tにおける過程の分布が、はじめに与えたランダム行列の分布に一致するものを調べてはどうかというアイディアがF.Dysonによって提起されていた。近年になってT.Chan,L.Rogers,Z.Shi,Y.Takahashi等によりこのアイディアは確率解析の手法により厳密化された。彼らはX^<(n)>(t)の固有値(λ^<(n)>_l(t),...,λ^<(n)>_n(t))から成るn次元の拡散過程が満たす確率微分方程式を研究し、それを通じて固有値の経験分布のなす確率過程のn→∞における極限挙動を調べている。しかしながら彼らの議論はWignerの半円則の導出という形では最終的にはまとめられていないし、確率微分方程式の係数に特異性があることから、その解の存在を確かめるために必要以上に難しい解析を行っているように思われた。これに対し我々は、半円則の導出に話を絞る限り、(λ^<(n)>_l(t),...,λ^<(n)>_n(t))の満たす上記の確率微分方程式ではなく、経験分布のStieltjes変換が満たす、より易しい確率微分方程式を調べるだけで十分であることに注目し、従来の議論を簡単な見とおしのよいものにした。さらにその方程式は、行列X^<(n)>(t)のレゾルベントを考えることによりたやすく導かれることを示した。なお、この成果は大学院生の平塚剛氏との共同研究によるものである。本年度は、物性理論、特に不規則系、ランダム行列、および量子カオスの垣論に共通して現れる、「準位統計」の現象論的な側面を数学的に基礎づけることに努力を向けた。ここで準位統計とは、量子系のハミルトニアン(数学的には自己共役作用素)が離散スペクトルを持つとき、それを統計的な面から特徴づけようとする研究である。(離散スペクトルを構成する個々の固有値をエネルギー準位、または単に準位と呼ぶ。)これは、スペクトルまたはその一部を定常な点過程のサンプルと見なすことによってのみ可能であるが、物理学者による従来の研究ではそのことが十分明確に意識されていたとはいいがたい。そこで本研究では、定常点過程の一般論の立場から「準位統計とは何か」ということを考察し、次のようなことを明らかにした。1)準位統計に現れる様々な平均量(その多くはM.L.Mehtaの書“Random Matrices“および長谷川洋氏の書「量子系の準位統計」(物理学最前線28、共立出版)において論じられている)の間に成り立つ関係式の多くは、点過程論でよく知られたPalm-Khinchinの等式から導かれる。2)定常点過程が定義された確率空間の上には、Palm測度と呼ばれるものが自然に構成されるが、準位の間隔分布などを観測することは実は、ハミルトニアンのスペクトルを点過程と見なしたときに、そのPalm測度を観測することに相当する。3)可積分なハミルトン力学系を量子化して得られるスペクトルはregular spectrumと呼ばれている。regular spectrumに対しては準位集積が見られるということを、1977年にBerryとTaborが論じ、その後Sinaiがその理論を、より数学的に定式化した。しかしSinaiの議論はBerry-Taborのアイディアとは微妙に異なっている。実はBerry-Taborの考えを忠実に整理し直すことで、数学的にはもっとすっきりした問題が立てられる。
映画学と認知心理学を融合した映像表現と視覚的注意に関する研究

本年度は映画学および認知心理学におけるアイトラッキングを活用した先行研究文献を収集し、その課題や問題点を確認するとともに、共同研究者の松本氏が現在保有しているアイトラッカー機材を活用して、試行的な実験を実施した。また愛媛大で眼球運動の専門家と意見交換し、本プロジェクトにもっとも適したアイトラッカーやソフトウェアについて検討することができた。次年度は適切なアイトラッカーおよびソフトウェアを購入し、映画作品の場面を使ったアイトラッキングの実験を開始する予定である。具体的には映画監督の演出(フレームの中のすべての要素をコントロールすること)が、実際の映画観客の視線移動とどのようにかかわっているのかを実証的に解明する実験である。これまで研究代表者は小津安二郎監督作品『彼岸花』(1958)のある場面において、実際に観客が背景に意図的に配置されている3人の通行人を見るのか(あるいは通行人を認識していたか)を実験したことがあるが、次年度はさらに実験対象とする場面を増やすとともに、比較対象として同じ映像で異なる条件の映像を作成し、実験の精度を高めたい。当初はアイトラッカーを購入して実験の計画を具体的に進める予定であったが、予想以上に事前の調査が必要で、本プロジェクトに適切なトラッカーを選定することに時間がかかってしまった。A社の担当者からカタログなどを取り寄せ、比較検討し、アイトラッキングの専門家に、アイトラッカー選定の際の判断基準などをお聞きした。ただ拙速に判断して使えない本プロジェクトの研究目的に合わない機材を購入するよりは、しっかり時間をかけて納得したうえで購入したほうがよいと判断し、当初予定していた今年度のアイトラッカー購入を延期する判断を行った。本年度末までに十分な情報収集を行ったので、次年度すぐにアイトラッカーを購入し、実験を開始する予定である。そのため、最終年度である次年度には、当初の研究計画通りに進めることができる。初年度にアイトラッカーを選定して購入する予定であったが、しっかりと選定するための資料調査や聞き取り調査を実施し、予想以上に時間がかかってしまったため、次年度にアイトラッカー購入を延期することになったのが理由である。
農水産物中のダイオキシン類の生物学的測定法の開発とその適用

申請者らはこれまで、活性化したダイオキシン受容体(アリール炭化水素受容体、AhR)をダイオキシン応答配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて定量的に検出できる簡易測定法ELISAを開発している。本研究では、これをさらに改良してより簡便に農水産物中のダイオキシン類を測定することを試みた。残念ながら、研究期間中に公定法と改良ELISA法の比較検討に至らなかったが、エビのダイオキシン類を公定法により測定した結果、外国産エビの1検体で他の2検体と比較しておよそ10倍の高濃度のダイオキシン類が検出されたことから、市場や加工段階での簡易測定法の開発が望ましいと考えられる。ダイオキシン類の簡易測定法ELISAの改良法として、従来の材料であるラット肝臓細胞質画分に加えて、モルモット肝臓細胞質画分およびマウス肝臓細胞質画分を調製し、それぞれの2,3,7,8-四塩化ジベンゾ-p-ジオキシンを用いてダイオキシン応答性を確認した。まず、従来法である32PラベルしたDREを用いたゲルシフトアッセイにより活性化したアリール炭化水素受容体(AhR)を検出した結果、モルモット肝臓細胞質画分ではラット肝臓細胞質画分での検出限界と同等あるいはそれ以上のダイオキシン応答性が見られたのに対して、マウス肝臓細胞質画分ではほとんど応答性が見られなかった。また、モルモット、マウス、並びにラット肝臓細胞質画分中のARNT(AhRパートナータンパク質)の発現量をウェスタンブロッティング法により検出した結果、マウスおよびラット肝臓細胞質画分からは検出できたものの、モルモット肝臓細胞質画分からは検出できなかった。ゲルシフトアッセイではモルモット肝臓細胞質画分を用いて活性化AhRを検出できたことから、ウェスタンブロッティングで使用した抗体の交差性がなかった可能性が考えられる。改良SW-ELISAを構築については、使用する抗体も含めて条件の検討中である。ダイオキシン類を検出する従来法であるゲルシフトアッセイにより、32Pラベルしたダイオキシン応答配列(DRE)を用いて動物の肝臓より調製した細胞質画分のアリール炭化水素受容体(AhR)活性化を検出した結果、C57BL/6マウス由来細胞質画分ではダイオキシン応答が見られなかったのに対して、SDラット由来細胞質画分では濃度依存的なAhR活性化を検出できた。C57BL/6マウスAhRは、過去の文献よりダイオキシン応答性が高いことが報告されているため、夾雑物が多い肝臓細胞質画分ではなくタンパク質発現系由来であればダイオキシン応答性が高まることが期待できる。ダイオキシン類の簡易測定法ELISAの改良法として、AhRとそのパートナータンパク質であるARNTをラット肝臓細胞質画分由来ではなく、昆虫細胞を用いて発現させたマウスAhRおよびARNTに変更するため、これらのタンパク質のクローニングを行った。これまでの予備試験結果から、AhRはNiに非特異的に吸着することが示唆されたため、AhRおよびARNTへの標識は標識として汎用性が高いHisではなくFLAGが有効ではないかと考え、最終ベクターをpPolh-FLAG&#8482;-2 Transfer Vector (Sigma)と決定し、インサート部分の構築を行った。現在、マウスAhRおよびマウスARNTの両端に制限酵素を付した目的インサートをTAクローニングベクターに挿入し、シークエンス解析を行う段階にあり、未だ昆虫細胞発現系は構築できていない。また、改良ELISA法に使用する抗体については、ゲルシフトアッセイでダイオキシン応答性が確認できたラット肝臓細胞質画分を用いて検討中である。研究環境の変化に伴い研究協力が得られなかったことが大きな要因であるが、今年度行う予定だった公定法との比較については、水産物中のダイオキシン類を公定法で測定する機関候補が少なく、予算と分析時間の調整ができなかったことが挙げられる。本研究では、高分解能GC-MSを用いたダイオキシン類の公定法と、簡易測定法であるレポータージーンアッセイ、並びに申請者らが開発したELISA法を用いて食品中に含まれるダイオキシン類を定量・比較検討することを目的とする。これまでの研究から、大腸菌で発現させたアリール炭化水素受容体(AhR)は、DNA結合能をもたず、申請者らが開発したSW-ELISA法には適さないことが分かっている。申請者らが開発したELISA法であるSW-ELIA法を改良するため(改良SW-ELISA法)、これに資するAhR源として、従来のラット肝臓細胞質画分に加えて、ダイオキシン類への応答が確認されている系統マウスのAhRおよびそのパートナータンパク質であるARNTを昆虫細胞発現系で発現させて使用することとした。これらの受容体タンパク質の昆虫細胞発現系の構築に向けて、本年度は、昆虫細胞発現系で使用するベクターに適したcDNAインサートの設計とクローニングを行った。具体的には、最終ベクターに導入するインサートのTAベクターへの導入を行った。AhRおよびARNTのインサートが導入されたTAベクターを大腸菌にトランスフォームして得られたコロニーを各24個選抜し、ミニスケールで培養後、抽出・精製したDNAを制限酵素切断により目的インサートが導入されているか、アガロースゲル電気泳動による確認を行った。このうち、候補となるインサートのシークエンス解析を行っている。また、昨年度に引き続き、改良SW-ELISA法に使用する抗体の検討を行っている。平成28年度は、産前産後の休暇および育児休業の取得のために研究を一時中断したため、進捗状況に遅れが生じている。

環境汚染物質であるダイオキシン類の我が国での排出量および食品への汚染量は減少傾向にあるものの、我が国の食品の6割程度を輸入に依存していること等から、ダイオキシン類による健康影響への懸念は未だ払拭されていない。そこで本研究では、高分解能GC-MSを用いた公定法と、市場で従来使用される簡易測定法であるレポータージーンアッセイ、並びに申請者らが開発した簡易測定法ELISAの改良法を用いて輸入および国産食品中に含まれるダイオキシン類を定量して比較するとともに、方法の違いによるデータの相関性およびELISAの改良法の適用について検討することを目的とした。まず、申請者らが開発した簡易測定法ELISAの改良を目指して、ダイオキシン受容体の資材としてモルモット、ラット、並びにマウス肝臓より細胞質画分を調製し、その応答性について確認した。その結果、マウス肝臓細胞質画分では応答性が低かったため、生体試料としてはラットおよびモルモット肝臓細胞質画分が適していることが示唆された。また、生体試料に限らず、昆虫細胞を用いたダイオキシン受容体およびパートナータンパク質の発現系構築を目指したが、研究期間中には構築に至らなかった。一方、市販のエビ3検体(外国産2検体および国内産1検体)を購入し、公定法によるダイオキシン類の分析を行ったところ、外国産2検体のうち1つは総ダイオキシン類が0.0066pg-TEQ/g、もう1つは0.00030 pg-TEQ/g、国内産は0.00011 pg-TEQ/gであった。外国産のうち1検体は、他の2検体と比較しておよそ10倍の総ダイオキシン類が検出された。今後の研究展開としては実験室ではなく、マーケットや加工段階での簡易測定法の開発が望ましいと考えられる。申請者らはこれまで、活性化したダイオキシン受容体(アリール炭化水素受容体、AhR)をダイオキシン応答配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて定量的に検出できる簡易測定法ELISAを開発している。本研究では、これをさらに改良してより簡便に農水産物中のダイオキシン類を測定することを試みた。残念ながら、研究期間中に公定法と改良ELISA法の比較検討に至らなかったが、エビのダイオキシン類を公定法により測定した結果、外国産エビの1検体で他の2検体と比較しておよそ10倍の高濃度のダイオキシン類が検出されたことから、市場や加工段階での簡易測定法の開発が望ましいと考えられる。実質的な異動に伴い研究環境が変化したこと、また研究協力が得られなかったことが大きな原因であるが、加えて、昆虫細胞発現系の構築に使用するベクター等実験材料の選抜・入手に時間がかかったことが挙げられる。平成28年度は11月に育児休業より復職予定であるので、復職後は研究期間を半年から一年間延長し、本研究課題の遂行に努める。特に、喫緊の課題であるマウスAhRおよびARNTのクローニングと、公定法での分析を同時期に進めることで、研究遂行の効率化を図る。従来予定していた研究期間を一年間延長して研究を遂行する。また、昨年度に予定した昆虫細胞発現系の構築ができていないため、昆虫細胞発現系にこだわらず、ウサギ網状赤血球翻訳システムの使用に切り替えることも検討する。食品科学
光受容の分子機構

光生物学の目標は,光捕獲の量子過程から最終的な生物学的反応が現れるまでの長いtransduction鎖を,一連の素過程に分けて解析し,生命現象に対する光の作用を統合的に理解することである.本重点領域研究では,光受容関連タンパク質,光受容膜,さらには光受容細胞などの各階層的構造で起こる素過程について,分子生物学や細胞生物学で開発された遺伝子操作や免疫化学的手法などの新技術を導入することにより,光受容関連分子の構造のみならず,光受容膜の高次構造形成過程やその機能まで解析することを目的として,研究を進めている.本総括班は,本重点領域研究の進展状況を常に正確に把握し,その成果の評価を厳正且つ的確に行い,計画研究および公募採択による研究が所期の目標に向って効率よく展開するために,必要に応じて然なるべき助言や指導を与え,且つ計画班間の連絡を緊密にして互いに新しい研究成果を得るように協力する道を拓くことを目的としている.総括班は,研究代表者および各計画研究班の代表者などから成る5名の班間研究連絡調整委員と,研究成果を評価する9名の成果評価委員とから構成されている.本年度は総括班会議を62年5月と10月, 63年2月の三回開催し,第一回会議では本年度の事業計画を検討・決定した.第三回会議では, 22名の計画研究分担者および9名の公募採択者が行った研究報告を二日間にわたって受け,各班員について個別に厳正な採点を行い,次年度の研究計画に対して助言を与えた. 10月には京都で公開シンポジウムを開催し,三計画班班長および班友が本研究の目指す研究内容について講演を行い,百余名が参加した. 5月および2月にはニュースレターLUMINIS1号および2号を発刊し,また2月には昭和62年度研究成果報告書を発刊し,本重点領域研究関係者および関連分野の研究者に配布し,本研究の進展を計った.光生物学の目標は,光捕獲の量子過程から最終的な生物学的反応が現れるまでの長いtransduction鎖を,一連の素過程に分けて解析し,生命現象に対する光の作用を統合的に理解することである.本重点領域研究では,光受容関連タンパク質,光受容膜,さらには光受容細胞などの各階層的構造で起こる素過程について,分子生物学や細胞生物学で開発された遺伝子操作や免疫化学的手法などの新技術を導入することにより,光受容関連分子の構造のみならず,光受容膜の高次構造形成過程やその機能まで解析することを目的として,研究を進めている.本総括班は,本重点領域研究の進展状況を常に正確に把握し,その成果の評価を厳正且つ的確に行い,計画研究および公募採択による研究が所期の目標に向って効率よく展開するために,必要に応じて然なるべき助言や指導を与え,且つ計画班間の連絡を緊密にして互いに新しい研究成果を得るように協力する道を拓くことを目的としている.総括班は,研究代表者および各計画研究班の代表者などから成る5名の班間研究連絡調整委員と,研究成果を評価する9名の成果評価委員とから構成されている.本年度は総括班会議を62年5月と10月, 63年2月の三回開催し,第一回会議では本年度の事業計画を検討・決定した.第三回会議では, 22名の計画研究分担者および9名の公募採択者が行った研究報告を二日間にわたって受け,各班員について個別に厳正な採点を行い,次年度の研究計画に対して助言を与えた. 10月には京都で公開シンポジウムを開催し,三計画班班長および班友が本研究の目指す研究内容について講演を行い,百余名が参加した. 5月および2月にはニュースレターLUMINIS1号および2号を発刊し,また2月には昭和62年度研究成果報告書を発刊し,本重点領域研究関係者および関連分野の研究者に配布し,本研究の進展を計った.
バーチャルリアリティを適用した農業ロボットの知能化手法の開発

本研究は人間の農作業に関わる知を構造化・一般化してロボットの知能として活用できる方法論を探求する。マルチスペクトルビジョンセンサをベースにしたステレオビジョンを構成してロボットに装備し,作業と同時に農地環境情報を収集する。バーチャルリアリティ(VR)を介して圃場内の様子を高い臨場感のもとで再生できるシステムを開発し,知識のインタープリタとして機能させる。1)ハイパースペクトルカメラによる有用情報の抽出ハイパースペクトルビジョンセンサによって植物の生育情報や雑草の繁茂状態など有用情報を自動抽出できる方法論を開発した。分光情報についてPLS回帰分析を行い,情報抽出に有効な光波長を同定して回帰モデルを構築した。今年度はオレンジ熟度,農薬残存量,雑草識別などについて高い精度で認識できる方法論を確立した。2)VRによる空間情報記述法の開発取得した画像情報をRTK-GPS,姿勢角センサ(IMU)による位置データの属性として取り扱い,世界測位系WGS84で表現される3次元画像空間が表現できるソフトウェアを開発した。また,共同研究者岡本がValparaiso University電子工学科に勤務する協力研究者Will博士を訪問して,VRの空間情報記述法について情報交換して計算負荷が小さいアルゴリズムを考案した。3)データベースによる知の蓄積と自動整理人間の意志決定が生育状態,土壌状態など様々なデータを融合して行われることに基づき,ロボットが周辺画像を取得・解析して有用情報に変換した後で,データベースに自動的に蓄積できるシステム開発を行った。本年度は以下の2項目について実施し,成果の一部を国際シンポジウムにおいて講演した。また論文としても投稿し現在印刷中である。1)画像処理による有用情報の抽出R-G-B-NIRの4チャンネルのマルチスペクトルビジョンセンサ(640×480)をロボットビジョンに採用した。ロボットの取得した情報を実空間に正確に表現する方法論の確立が本質であるが,生育情報や雑草の繁茂状態など人間の関心のある情報だけを抽出して仮想空間に表現することも意思決定支援の観点から重要である。このようなことから土壌,植生に関してビジョンによって推定できる有用情報を画像処理によって自動抽出できる方法を考案した。2)ローカル座標系からグローバル座標系への変換法の確立画像情報はカメラ座標系におけるローカル座標で出力される。そのセンサ座標系からロボットのロール角,ピッチ角などの姿勢角,雲台回転角, GPS座標を使用して座標変換を行うソフトウェア開発を行った。すなわち, VRで3Dを再構成する上で必要となるビジョンデータをすべてグローバル空間に変換できる方法を確立した。
人の生理活動レベルに基づく「時間」の定義とその利用法

人が単位時間あたりにこなすことのできる仕事量を計測し、その関係の逆、すなわち単位仕事量当たりの時間を新たに定義することを目的とした研究を進めた。仕事としては、多くの人が行うものの一つとして、自動車運転を取り上げた。人の生理的活動を基準にして、運転操作時の疲労と運転操作の確実性の間に相関を見出し、それが個人を超えて年齢、性別を問わずに多くの人を対象に共通の尺度で評価できる可能性を見出した。この尺度は、日常的に比較的手軽に計測できる心拍、血流量、体表面温度から計算できる定量的なものであり、1時間以上の連続測定が可能であれば、単位仕事量当たりの時間と強い相関を持つ量として算出できる(以下「生理時間尺度」と呼ぶ)。6名の実験協力者を得て、実車による運転操作実験に基づいて、上記の生理時間尺度を個人ごとに求め、本研究で提案する方法の日常生活での有効性を検証した。検証結果では、実験室レベルの評価とほとんど同じものが得られており、日常生活での尺度として利用できることが明らかとなった。人が感じている「時間の流れ」と生理時間尺度の関連を主観評価に基づいて調べたが、これについて個人差が大きく総合的に理解することはできなかった。1)単位時間当たりのタスク処理置から、生理的時間を定義することを目的として、クレペリンテストと画像からのアイコン探索課題実験を行った。単位時間当たりのタスク処理量と生理的時間を決めるために必要なタスク処理効率と生理指標(血圧、心拍など)や眼精疲労の指標であるフリッカーテスト値との関係を解析した。生理指標はタスク処理中に15%までの変動を示し、タスク処理量の変動より大きいことを見出した。2)新たに定義する生理的時間が、人が感じる時間の流れとどのような場面や状況で、同じ傾向にあるのかを調べる必要がある。この傾向の一致は、新たに定義した生理的時間が人々の「生き方計画」の指標として受け入れられるかどうかに大きな影響を与える。したがって、できるだけ傾向が一致(できるだけ線形的な関係になる)することが望まれる。これを調べるために、先に述べたクレペリンテストと画像からのアイコン探索課題の実行前後、実行の中間時点で主観評価を実施した。タスク時間が40分程度と短かったために主観評価における変動が小さく、明確な関係を見出すことができなかった。この問題点は、23年度の研究において課題と主観評価の見直しを行って解決するつもりである。3)実験結果を整理することにより、タスク処理量に基づく新たに定義した生理的時間が、生理指標を補助指標として定量的に計測可能であることがわかったので、次年度では、人が感じている時間の流れとの関係を明らかにする研究を進める。本研究の結果に基づいて提案する生理時間尺度は、筋運動、神経活動に依存して変化するものであることは一般的理解であるが、生理時間尺度が変動するメカニズムは現時点では不明である。したがって、この尺度の生理学的な理解が今後の課題である。

さらに、この尺度を日常生活で手軽に算出できるデバイズが開発できれば、本研究の内容を反映して、日常生活における行動量を決定する指標として利用することが可能となる。このデバイス開発も今後の課題である。人が感じる「時間の流れ」と生理的時間尺度との関連を明らかにする研究も今後必要である。
固相担持法による高活性遷移金属錯体触媒の創製

ポリスチレン担持型ホスフィンは、不均一系遷移金属錯体触媒の配位子として古くから研究されてきた。しかし、柔軟な高分子鎖が立体障害として働くため、触媒活性の低下がしばしば問題となる。本研究者のグループは金属配位点を空間的に孤立化させて高活性金属種を生成するポリスチレン架橋モノホスフィンPSTPPを開発している。さらに、この触媒設計概念を2座キレートホスフィンへと拡張したポリスチレン架橋ビスホスフィンPS-DPPBzを開発し、これがニッケル触媒による塩化アリールのアミノ化反応およびフェノールエステルとアゾール類のC-O/C-Hカップリング反応、銅またはコバルト触媒によるアルケンのヒドロホウ素化反応において既存の均一系配位子よりも圧倒的に優れた配位子性能を示すことを見出した。本年度は、昨年度から引き続きPS-DPPBzーニッケル触媒による塩化アリールと有機リチウム反応剤のクロスカップリングについて研究し、その成果を取りまとめ論文発表した。空気中安定な[NiCl2(PS-DPPBz)]を触媒前駆体に用いることができ、これまでに報告されているニッケル触媒系よりも高活性を示した。グラムスケールの反応にも適用でき、触媒回転数は1880回に達した。不均一系触媒の特性を活かして、触媒の回収再利用も可能である。また、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋モノホスフィンPS-TCPの適用性に関する研究では、塩化アリールのアミノ化反応やアリールボロン酸とのクロスカップリングにおいて、高性能な配位子として知られるBachwald型配位子と比べて同等かそれを上回る高性能を示した。本研究についても実験結果をとりまとめ論文発表した。ポリスチレン担持型ホスフィンPS-DPPBzの用途をニッケル触媒によるアルキルリチウム反応剤のクロスカップリングに拡張することができた。さらに、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋ホスフィンの配位子の合成に成功し、塩化アリールのアミノ化反応や鈴木・宮浦クロスカップリングなど、いくつかのPd触媒反応における有効性が確認できた。さらにPS-DPPBzを用いた新規反応の開発に成功するなど、今後の展開に繋がる新しい成果も出ている。これまでに合成したポリスチレン架橋ホスフィンの用途拡張を継続しつつ、キラルホスフィンを架橋剤とする新規ポリスチレン架橋ホスフィンを合成し、不斉合成に展開する。またシリカ担持ホスフィン遷移金属触媒をキラル添加剤と組み合わせて用いる不斉合成法の開発も展開する。2座キレートホスフィンであるDPPBzを架橋点とする新しい高分子-ホスフィンハイブリッドPS-DPPBzを設計・開発し、これがいくつかのNi触媒反応系において顕著な高分子効果を示し、優れた配位子となることを見出した。Ni触媒による塩化アリールのアルキル置換第一級アミンによるアミノ化反応にBINAP配位子が有効であり、NiとBINAPの1:1型キレート錯体が活性種であることがHartwigらにより報告されている。しかし、電子豊富な塩化アリールの反応性は低く、その利用に大きな制限があった。本反応にPS-DPPBzを適用したところ、電子豊富な塩化アリールに対しても優れた配位子性能を示し、高収率でアミノ化生成物を与えた。一方、2点架橋配位子やDPPBz,BINAPは効果的ではなく、PS-DPPBzにおける高分子4点架橋が高い触媒活性の発現に重要である。アゾール類とナフチルエステル類のNi触媒C-H/C-Oカップリング反応が伊丹らにより報告されている。立体的に嵩高く、高電子供与性を特徴とするDCYPEが特異的に有効な配位子であることが示されている。一方PS-DPPBzは、立体的嵩高さと電子供与能のどちらにおいてもDCYPEと比べて著しく低下するDPPBz骨格を持つ配位子であるにも関わらず、この反応に有効であった。高分子効果によって高活性種が生成したことは明白である。また、既存の均一系触媒ではほとんど反応性を示さない単環式フェノールエステルの反応も、PS-DPPBzを用いることで効率よく進行し、C-H/C-Oカップリング生成物が良好な収率で得られ、PS-DPPBzの有用性が示された。2座キレートホスフィンであるDPPBzを架橋点とする新しい高分子-ホスフィンハイブリッドPS-DPPBzがニッケル触媒による塩化アリールのアミノ化やアゾールとアリールエステルのクロスカップリングにおいて、期待どおりの性能をしますことを確認できた。本研究者のグループは金属配位点を空間的に孤立化させて高活性金属種を生成するポリスチレン架橋モノホスフィンPS-TPPを開発している。本年度は、PS-DPPBzの適用性についての研究を進め、ニッケル触媒による塩化アリールと有機リチウム反応剤のクロスカップリングの優れた配位子となることを明らかにした。これまでにニッケル触媒村橋カップリングに有効であると報告されている1,2-ビス(ジエチルホスフィノ)エタンや対応する可溶性配位子であるDPPBzでは、同条件下、反応はほとんど進行しないことから、ポリマー架橋の効果は顕著である。

また、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋モノホスフィンPS-TCPを新たに合成し、塩化アリールのアミノ化反応など、いくつかのPd触媒反応の優れた配位子となることを見出した。たとえば、PS-TCPは、塩化アリールのPd触媒クロスカップリングにおいて、PS-TPPや均一系のトリシクロへキシルホスフィンよりも優れた配位子性能を示した。ポリスチレン担持型ホスフィンPS-DPPBzの用途をニッケル触媒によるアルキルリチウム反応剤のクロスカップリングに拡張することができた。さらに、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋ホスフィンの配位子の合成に成功し、塩化アリールのアミノ化反応など、いくつかのPd触媒反応における有効性が確認できた。ポリスチレン担持型ホスフィンは、不均一系遷移金属錯体触媒の配位子として古くから研究されてきた。しかし、柔軟な高分子鎖が立体障害として働くため、触媒活性の低下がしばしば問題となる。本研究者のグループは金属配位点を空間的に孤立化させて高活性金属種を生成するポリスチレン架橋モノホスフィンPSTPPを開発している。さらに、この触媒設計概念を2座キレートホスフィンへと拡張したポリスチレン架橋ビスホスフィンPS-DPPBzを開発し、これがニッケル触媒による塩化アリールのアミノ化反応およびフェノールエステルとアゾール類のC-O/C-Hカップリング反応、銅またはコバルト触媒によるアルケンのヒドロホウ素化反応において既存の均一系配位子よりも圧倒的に優れた配位子性能を示すことを見出した。本年度は、昨年度から引き続きPS-DPPBzーニッケル触媒による塩化アリールと有機リチウム反応剤のクロスカップリングについて研究し、その成果を取りまとめ論文発表した。空気中安定な[NiCl2(PS-DPPBz)]を触媒前駆体に用いることができ、これまでに報告されているニッケル触媒系よりも高活性を示した。グラムスケールの反応にも適用でき、触媒回転数は1880回に達した。不均一系触媒の特性を活かして、触媒の回収再利用も可能である。また、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋モノホスフィンPS-TCPの適用性に関する研究では、塩化アリールのアミノ化反応やアリールボロン酸とのクロスカップリングにおいて、高性能な配位子として知られるBachwald型配位子と比べて同等かそれを上回る高性能を示した。本研究についても実験結果をとりまとめ論文発表した。さらに、トリシクロヘキシルホスフィン誘導体を3点架橋剤とするポリスチレン架橋ホスフィンの配位子の合成に成功し、塩化アリールのアミノ化反応や鈴木・宮浦クロスカップリングなど、いくつかのPd触媒反応における有効性が確認できた。
環状ホスホニウムイリドを用いる多官能中員環誘導体の立体選択的合成法の開発

五員環状ホスホニウムイリドとエノンの反応は、従来の反応様式には無い連続的なイリドのエノンへのMichael付加及び分子内Witting反応の進行により、シクロヘプテニルジフェニルホスフィンオキシドを生成する。本研究は、本反応の汎用性を検討するため、六、七員環ホスホニウムイリドを用いる八、九員炭素中員環合成への応用、またエンエステルとの反応による中員環エノールエーテル合成について検討した。六員環イリドと種々の不飽和カルボニル化合物の反応を行ったところ、エナ-ル、β、β-二置換エノンからはWitting生成物が得られたが、カルコン、ベンザルアセトン、4-ヘキセン-3-オンの反応からは、シクロオクテン誘導体が3847%の収率で生成した。また七員環イリドの反応は、β-n-アルキル置換エノンからは同様な反応が進行し、シクロノネン誘導体を生成したが、β位にフェニル、あるいはイソプロピル基といった嵩高い置換基を有するエノンからは、環化体が得られず七員環イリドの共役付加反応性の低下が観察された。また五員環イリドとエンエステルを用いた同様な反応を検討したところ、上記と同様なイリドの共役付加及び分子内Witting反応が進行し、対応するシクロヘプタノンのエノールエーテル誘導体が一段階で生成することを見い出した。本反応においては、エンエステルの置換基の種類によらず6073%の収率で環化体を与え、エノンでは進行しなかったβ、β-二置換エンエステルからも37%の収率で環化体が生成することが明かとなった。以上のように本研究は、環状リンイリドを出発物質とする連続的Michael-分子内Witting反応が、シクロオクテン骨格の構築また官能基として有用なエノールエーテルを含むシクロヘプテン誘導体合成において有用な新規方法論であることを明らかとした。
犬の免疫介在性疾患における末梢リンパ球でのP糖蛋白質の発現に関する研究

本研究の目的は、免疫介在性疾患を有する犬の末梢血リンパ球におけるP糖蛋白質(P-gp)の発現を経時的に評価し、その発現レベルと疾患活動性や治療経過の相関性について検討することである。犬の免疫介在性疾患の中でも一般的な免疫介在性多発性関節炎(IMPA)と診断した症例の初発時(n=7)における末梢血および末梢血単核球を採取し、P-gpの遺伝子転写量とタンパク発現量をそれぞれリアルタイムRT-PCRおよびフローサイトメーターを用いて定量した。寛解(n=5)後についてはP-gpの転写量を定量した。また、P-gpの転写量とIMPAにおける治療経過や、疾患活動性(CRP濃度)との相関性を解析した。末梢血におけるP-gpの転写量に関しては、初発群において健常群(n=7)よりも有意に低値を示したが(P=0.03)、寛解群におけるP-gpの転写量は、初発群と比較して有意差を認めなかった。末梢血リンパ球におけるP-gpのタンパク発現量に関しては、初発群において健常群よりも有意に低値を示した(P=0.03)。初発時のCRP濃度は7例全てにおいて高値を示したが、寛解後は腫瘍を併発した2例を除く5例において基準値範囲内に低下した。初発群においてP-gpの転写量およびタンパク発現量の低下を認めたことから、IMPAにおいては薬剤排泄能が健常犬と異なっている可能性が示された。薬剤排泄能は治療反応性に関与している可能性が高く、それらを示唆するように治療抵抗性を示す症例は認めなかった。また、寛解群におけるP-gpの転写量は初発群と比較して有意差は認めなかったが、5例中4例で上昇しており、もともとP-gpの発現が低い状況でIMPAが発症し治療により発現が増加した、もしくはIMPAの発症を機にP-gpの発現が低くなり、治療により発現が増加した可能性が示され、P-gpがIMPAの病態に関与している可能性が示された。
肺移植後移植片慢性機能不全に対する新規細胞治療の基礎的研究

肺移植は終末期呼吸器疾患に対する有効な治療法として確立しているが、術後5年生存率は5060%と未だ十分に満足できるものではない。肺移植後慢性期の死因で最も頻度は高いものは、慢性拒絶反応によって生ずる閉塞性細気管支炎症候群である。本研究においては、マウス慢性拒絶反応モデルを用いて、抗炎症作用ならびに組織修復作用をもつ多能性幹細胞であるMuse細胞の投与が、肺移植後の閉塞性気道病変の形成を抑制するかどうかについて検討した。BALB/cマウスをドナー、C57BL/6マウスをレシピエントとするマウス肺内気管移植モデルを作成した。マウス肺内気管移植モデルは肺移植後の慢性拒絶反応モデルとして確立しており、移植した気管支内腔に線維性肉芽腫による閉塞性気道病変を形成、その病理像はヒト肺移植後の閉塞性細気管支炎に類似する。移植後3日にMuse細胞、MSC、PBSを投与する3群を作成し、移植後28日でグラフトを採取し気管内腔の閉塞率を検索したところ、Muse群では、MSC群、PBS群に比較して有意に閉塞率が低下していた。また、Muse細胞投与の閉塞性気道病変形成抑制効果は、投与する細胞数が多いほど大きくなる傾向にあった。Muse細胞は、抗炎症、抗アポトーシス、組織修復などに関与する様々な因子を分泌することが先行研究により明らかになっているが、本研究におけるMuse細胞の効果にどのような因子が関与するのかについては現在検討中である。本研究の成果は、難治性合併症である肺移植閉塞性細気管支炎症候群に対する新たな治療法の開発につながる可能性がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。肺移植後移植片慢性機能不全(CLAD)の多くは閉塞性細気管支炎(BO)の形で発症し、主として慢性拒絶反応が原因と考えられている。BOは、病理学的に細気管支上皮細胞傷害と内腔へ肉芽形成を特徴とする病態であることから、同種免疫反応による上皮細胞傷害を抑制するとともに、上皮細胞の積極的な再生を促すことが肉芽細胞の増生を防止し、BOの発生を抑制する可能がある。本研究の目的は,免疫・炎症抑制作用を有する間葉系幹細胞(Mesechymal Stem Cell; MSC)ならびに生体の間葉系組織に存在する多能性幹細胞:Multilineage-differentiating Stress Enduring (Muse)細胞による細胞治療が、BOの発症予防ならびに治療に有効であるかどうかを、近年開発されたマウス肺移植BOモデルを用いて検討することである。まず、閉塞性細気管支炎(BO)を発症するマウス同所性左片肺移植モデルで、報告通りにBOが発現するかどうかを病理学的に検討した。この結果、再現性にやや問題はあるものの、移植肺にはボ病変がみられることが明らかになった。次に、同モデルを用い、移植直後から7日毎にヒトMSC、Muse細胞、PBS(コントロール)を静脈内投与した。移植後42日目にグラフトを採取して、BO発症の程度を形態学的に評価した。MSCならびにMuse細胞投与群においては、コントール群と比較し、BOの発生頻度が低い傾向が見られたが、まだ実験数が少なく、統計学的な処理を行うに至っていない。今後は、マウス肺移植の成功率の向上と実験数の増加に努め、さらに研究を進める予定である。マウス肺移植は手技的に高度な技術を要する手術である。また、マウス肺移植モデルにおける閉塞性細気管支炎発症の再現性も、もとより完全なものではないため、実験数の確保が予定よりやや遅れている。この結果、病変形成の再現性に問題があることがわかった。このため、2017年度は、上記の仮説を検証するためにBOモデルとして広く認知されているマウス気管皮下移植モデルならびにマウス気管肺内移植モデルを用いた検討を開始した。同モデルを用い、移植直後から7日毎にヒトMSC、Muse細胞、PBS(コントロール)を静脈内投与した。移植後28日目にグラフトを採取して、BO発症の程度を形態学的に評価した。MSCならびにMuse細胞投与群においては、コントール群と比較し、閉塞気道病変の発生頻度が低い傾向が見られたが、さらに実験数を増やしていくことが必要である。また、結果の背景にある免疫学的な機序についても検討を進めていく。

マウス肺移植モデルにおける閉塞性細気管支炎発症の再現性も、もとより完全なものではないことが報告されていたが、実際に行ってみると、研究を進める上でやや不安な結果であった。肺移植は終末期呼吸器疾患に対する有効な治療法として確立しているが、術後5年生存率は5060%と未だ十分に満足できるものではない。肺移植後慢性期の死因で最も頻度は高いものは、慢性拒絶反応によって生ずる閉塞性細気管支炎症候群である。本研究においては、マウス慢性拒絶反応モデルを用いて、抗炎症作用ならびに組織修復作用をもつ多能性幹細胞であるMuse細胞の投与が、肺移植後の閉塞性気道病変の形成を抑制するかどうかについて検討した。BALB/cマウスをドナー、C57BL/6マウスをレシピエントとするマウス肺内気管移植モデルを作成した。マウス肺内気管移植モデルは肺移植後の慢性拒絶反応モデルとして確立しており、移植した気管支内腔に線維性肉芽腫による閉塞性気道病変を形成、その病理像はヒト肺移植後の閉塞性細気管支炎に類似する。移植後3日にMuse細胞、MSC、PBSを投与する3群を作成し、移植後28日でグラフトを採取し気管内腔の閉塞率を検索したところ、Muse群では、MSC群、PBS群に比較して有意に閉塞率が低下していた。また、Muse細胞投与の閉塞性気道病変形成抑制効果は、投与する細胞数が多いほど大きくなる傾向にあった。Muse細胞は、抗炎症、抗アポトーシス、組織修復などに関与する様々な因子を分泌することが先行研究により明らかになっているが、本研究におけるMuse細胞の効果にどのような因子が関与するのかについては現在検討中である。本研究の成果は、難治性合併症である肺移植閉塞性細気管支炎症候群に対する新たな治療法の開発につながる可能性がある。マウス肺移植の成功率は次第に向上してきており、実験数の確保に努める。また、当初予定したマウス同所性移植モデルに加え、動物BOモデルとして広く認知されているものの手技的にやや容易なマウス肺内気管移植モデルを用いた研究も進めていく予定である。当初予定したマウス同所性移植モデルに加え、マウスBOモデルとして広く認知されている皮下気管移植モデルならびに肺内気管移植モデルを用いた研究を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。