hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経ペプチドCGRPによる免疫系を介した癌微小環境制御軸の提唱

CGRPは37アミノ酸からなり、αCGRPとβCGRPの2つのアイソフォームが存在する神経ペプチドである。その受容体はRAMP1とCLRのヘテロ2量体で構成される。CGRP受容体はマクロファージなど免疫細胞にも発現していることが明らかになっている。そこで本研究では、CGRPを介した神経系による免疫系の制御が腫瘍形成にかかわる機能を解析することとした。その結果、CGRPがマクロファージの遊走やIL-12産生を制御し、腫瘍形成にかかわっていることを明らかとした。これらの結果は、CGRPを介した神経ー免疫ー腫瘍微小環境制御軸の存在を提唱するものである。CGRP受容体特異的サブユニットであるreceptor activity-modifying protein-1 (RAMP1)のコンディショナルノックアウトマウス)とCAG-Creトランスジェニック(TG)マウスとの交配により全身性にCGRP受容体を欠損させたマウスにLewis肺癌細胞株あるいはメラノーマ細胞株を移植し、腫瘍形成を評価した。その結果、腫瘍体積の増加抑制傾向が認められた。このことは、CGRPー免疫系ー癌微小環境制御軸の存在を支持するものとなった。一方、作用機構を解明する目的で、骨髄細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とともに培養し樹状細胞への分化誘導に対するCGRPの作用を検討した。その結果、CGRPの2つのアイソフォーム(αCGRP、βCGRP)ともに分化の抑制作用があり、またよりβCGRPの効果が顕著であることを突き止めた。さらにこのCGRPの効果はRAMP1欠損マウス由来BMDCの分化誘導系では全く認められなかった。これらの結果から樹状細胞の分化においてCGRP受容体を介したシグナル伝達系の必要性が示された。CGRP受容体はGαタンパク質共役型受容体である。そこでcAMP-PKA経路の活性化がこの樹状細胞分化制御にかかわることが推測された。そこで野生型マウス骨髄細胞由来樹状細胞においてCGRP刺激によるcAMPレベルを測定した結果、上昇が確認された。よって樹状細胞免疫系に対してCGRPが重要な役割を演じていることが示唆された。このCGRPを介した樹状細胞免疫系の制御とRAMP1欠損マウスにおける腫瘍増殖抑制作用との関係をさらに検討することにより、神経系ー免疫系ー癌微小環境制御軸の存在とその制御分子メカニズムを明確にすることができると期待できる。遺伝子改変動物を用いたIn vivo, in vitro評価は順調に進み、CGRPー免疫系ー癌微小環境制御軸の存在評価の一歩を進めることができた。In vivoではRAMP1ノックアウトマウスの表現型が弱いものの、作用が認められたことの意義は大と考える。またCGRPの2つのアイソフォーム(α、β)において骨髄由来樹状細胞分化において作用の相違を認めた研究意義も大きいと考える。癌はわが国における死亡者数のトップを占める疾患である。この癌の発症や悪性化機序の解明、さらには癌治療戦略において、免疫担当細胞の機能や活性の制御機構解明が重要である。一方、免疫系は神経系と巧妙にクロストークしている証拠が蓄積されてきた。よって、癌の発症や悪性化機序の解明、さらには癌治療戦略において、神経系ー免疫系を介した癌微小環境の統合的解析研究を進めることが必須と考えた。そこで本研究は、申請者がこれまで蓄積してきた、1神経ペプチドであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)による免疫系制御、2癌臨床検体を用いた遺伝子の発現とその機能の解析、3CGRP受容体であるreceptor activity-modifying protein-1 (RAMP1)欠損マウスの作製、の成果と技術を統合させることにより、CGRPー免疫系ー癌微小環境制御軸の存在を示すことを目的とした。その結果、マウス肺がん細胞3LLを皮下移植するモデルにおいて、RAMP1欠損マウスは野生型マウスに比べ有意な腫瘍形成能抑制が見られた。またこのマウス腫瘍を用いて解析した結果、担癌RAMP1 KOマウスではマクロファージのバランスがM1型に偏倚し、腫瘍へのマクロファージの浸潤が亢進している傾向が見出された。またin vitroの実験から、CGRPが骨髄由来マクロマージのCCL2による遊走を有意に抑制すること、またIL-12の産生をも有意に抑制することを認めた。以上の結果より、CGRPはM1マクロファージの腫瘍への遊走や炎症性サイトカイン産生を抑制して、腫瘍形成促進に関わっていることが示された。よって本研究により、CGRPを介した免疫系特にマクロファージ機能を介した癌微小環境制御軸の存在を明らかにすることができた。前立腺癌、膵癌発症遺伝子改変マウスとCGRP欠損マウスを用いた腫瘍形成解析:膵癌と前立腺癌を自然発症する遺伝子改変マウスを用いてそれらの癌発症におけるCGRPシグナルの意義を、病理組織学的解析、生化学的解析により明示する。癌細胞に発現するRAMP

1を介したCGRPの機能解析:癌細胞におけるCGRP受容体遺伝子の発現解析、CGRP受容体を介したCGRPシグナルの解析とその機能を解明する。癌細胞に発現するCGRP受容体のin vivo機能解析:CGRP受容体発現癌細胞のRAMP1遺伝子の発現を抑制し、ヌードマウスの背部皮下に移植するxenograftモデルにより腫瘍形成等の評価を行う。転移能はルシフェラーゼ発現癌細胞を用い、発光を検出することにより確認する。上記検討によりCGRPー免疫系ー癌微小環境制御軸に関して萌芽的知見を得る。生物系薬学
蛍光基質を用いた微量核酸検出法の開発

組換えDNA技術を用いた遺伝子構造および機能の研究はラジオアイソト-プの使用量を飛躍的に増加させ,RI施設の狹隘化,汚染廃棄物の蓄積など様々な問題をひき起している。本研究の目的はRIを用いずに遺伝子の研究が行えるような方法の開発にある。既に非RI法としていくつかの方法が欧米で開発され実用段階に入ってはいるが,我々は既存の方法とは異る蛍光法を採用し全く別の角度よりこの問題に取組んでいる。採用した方法はデイゴキシゲニンで標識したDNAに,アルカリ性フォスファタ-ゼをつけた抗体を結合させ,酵素活性を蛍光基質を用いて可視化するという方法である。そのためには酵素と反応して不溶性となり蛍光を発する基質を新たに合成する必要がある。現在までにクマリン誘導体26種,ペリレン誘導体7種,フルオレシン誘導体5種,ナフト-ル誘導体46種,その他2種,合計86種の蛍光物質を合成し,(1)480500nm以上の長波長域に蛍光を示し,(2)反応後フィルタ-に沈着し,(3)比蛍光強度が高い,という三点に関してスクリ-ニングを行った。その結果,3ーHydroxyーNー2ーbiphenylylー2ーnaphthalenecarboxamide(HNPP)が最良の蛍光基質であることが判った。これを用いるとスポットテストで10fg(既存法の最高感度),サザンハイブリダイゼ-ションにより70fgのDNAを検出出来る。また,解像度,所要時間,反応のモニタ-,デ-タ-の保存,リプロ-ブの容易さ,試薬の安定性など要求される全ての点で他の非RI法より優れていることが実証された。平成2年度に行われた全国国立大学遺伝子実験施設長会議の席上,遺伝子操作技術の普及に伴い,アイソト-プ使用量の飛躍的増加が報告された。RI使用に伴う諸問題(バイオハザ-ド,汚染廃棄物処理など)を解決するためには,RIによらない核酸検出法が開発されなくてはならない。このために現在世界中でこの研究が行われており,既にかなりの成果があがっているが,未だRIと同等もしくはそれ以上の感度を誇る方法は開発されていない。我々の目的はRI法以上の高感度を有する代替法を開発することにある。今年度は標的DNAにdigoxigeninで標識したプロ-ブをハイブリさせた後,アルカリ性フォスファタ-ゼ標識した抗体と反応させ,ついで酵素活性を蛍光基質を用いて検出するという系を用い,そのための蛍光基質の合成を行った。合成した基質は合計35種(クマリン誘導体4種,ナフト-ル誘導体26種,その他5種)。感度検定にはラムダDNAを用いたドットブロット法を,また結果の良かったものはさらにサザンブロット法による確認を行った。その結果,検出感度が1pg以上と低いものおよび転写膜に反応産物が吸着しなかったもの,酵素の基質となりえなかったもの計27種,0.1pg1.0pgの感度をもつもの7種,30fgの高感度をもつもの1種であった。この高感度をもつナフト-ル誘導体の構造式については最終年度の報告書に記載する。30fgの感度は既存のものの中最高であったが,研究の性質上1fgのものがえられるまでは成果の公表はしない方針である。前年度の研究によってナイロンメンブレン上での微量核酸の検出にはナフト-ル誘導体が有用であることが示された。そこで本年度はナフト-ル誘導体の合成を重点的に行ない最終的に46種の化合物について検討を加えた。また,ナフタレン環が2つ連結した構造をもち,比蛍光強度がFITCより十倍以上高いことで知られるペリレンの誘導体についても7種合成し核酸検出に用いたが,主として標識に用いた酵素との反応性の問題から微量核酸の検出には適さないことが分かった。

しかしペリレン誘導体については今後,酵素反応性を向上させる様な化学修飾を行なうことにより適用可能と考えられる。ナフト-ル誘導体46種の中では,3-Hydroxy-N-2-b:phenylyl-2-naphthalenecarboxamide(HNPP)が最も高い検出能を示した。このHNPPについて検出条件の最適化を目的としてナイロンメンブレン上での蛍光特性を調べたところ,蛍光波長と蛍光強度はpHの影響を強く受けることが分かった。ナイロンメンブレン上では高いpH域(pH13以上)で蛍光強度が約2倍となり,蛍光ピ-クは長波長側(490nm)に現われる。そのために短波長域に存在するUV励起光源の反射光・散乱光やナイロンメンブレンそれ自体による蛍光ノイズの影響が少なく,高いSIN比を得ることができた。これらのデ-タをふまえ,検出における光学系を最適化したところスポットテストで10fgを検出できた(この感度は既存法の最高感度である)。また,サザンハイブリダイゼ-ションでは70fgのバンドが検出できた。さらに高等真核生物のDNAを用いたゲノミックサザン法においても1μg以下という微量核酸中で単一コピ-遺伝子を検出することに成功し,リプロ-ブも可能であった。
先端医療分野における欧米の生命倫理政策に関する原理・法・文献の批判的研究

先端医療分野における欧米の生命倫理政策に関する研究ということで、いくつもの国の多様な分野に関して14名の研究者が同時進行で研究を進めている。今年度特に重点的に研究を進めたのは、新しい技術であるゲノム編集技術についてである。フランス、ドイツをはじめとするヨーロッパにおけるゲノム編集技術に関する倫理的考察について、国レベルの倫理委員会や各種研究機関の倫理委員会などによる議論や勧告、研究者による研究論文、胚保護法等の各国の法律、ヨーロッパ人権条約、生物医学の適用に関する人権と人間の尊厳の保護のための条約等、入手可能な限りの文献を用いて、分析、解明し、その成果を日本生命倫理学会において発表した。さらに、英国のナフィールド生命倫理評議会の倫理的考察や、第2回国際サミットにおける議論と声明、世界における遺伝情報の取り扱いなどについても、研究、分析を進めている。次に大きな研究テーマとしたのは、人体や人体の一部あるいは産物を医療資源として使用することの法的規制・倫理的是非の問題である。具体的には、ヒト受精胚やヒト胚性幹細胞の研究利用と人間の尊厳の問題や、ヒトiPS細胞研究、ドイツにおける再生医療、スペインにおける臓器移植等に関する倫理的課題について、研究分担者以外の国内の研究者も含めて研究発表と議論を重ね、年度末にその成果を『生命倫理・生命法研究資料集』としてまとめ、国内の300名ほどの研究者に配布した。安楽死、終末期医療に関する研究は、以前から継続して続けている。今年度は、オランダとベルギーにおける安楽死に関する研究報告の続報と、それらを含めて世界各国の安楽死の状況を概観する研究を行った。さらに、現在、ユネスコ政府間生命倫理委員会のフランス代表であり委員長であるクリスティアン・ビック氏に講演を依頼し、グローバル世界における生命倫理はどうあるべきかについて議論した。先端医療分野は多岐にわたるので、すべての分野についてすぐに成果を出せるというわけではない。各研究分担者がそれぞれに、自分の専門とする国における自分の研究領域について研究を進めている。今年度は、欧米各国のゲノム編集技術や遺伝情報の取り扱いについての法学的、倫理学的分析、また、研究や再生医療における、ヒト受精胚、胚性幹細胞、iPS細胞の利用の哲学的、倫理学的、法学的考察を中心に研究を進め、成果を公表してきた。今後はそれらの研究を継続する一方で、さらに、欧米各国における生殖医療、出生前診断、妊娠中絶、臓器移植等の分野の法規制や倫理的考察についても研究成果を出していく。秋に、第1回研究会を開催し、研究分担者による研究成果の発表と議論により、研究成果を共有し、欧米各国の法規制や倫理的考察について比較・検討・考察する。その時に、オランダから、安楽死員会の委員でもある教授の先生を招聘し、安楽死先進国であるオランダにおける安楽死の思想と現状と問題点について講演してもらい、日本における誤解を解くとともに、今後のわが国における終末期医療の方向性はどうあるべきかを考える。暮れには第2回研究会を開催し、研究分担者だけでなく、先端医療技術の法規制や倫理問題を専門に研究している国内の研究者も研究発表や議論に加わってもらい、さらに研究の幅を広げる。折しもフランスでは生命倫理法の改正作業が進んでいる。フランスにおける生命倫理政策は、世界中に影響を及ぼすので、新たな法規制やその根底にある生命倫理思想の変遷について分析をする。またフランスの関係者にも面談し、理解を深める。必要に応じて、研究分担者を欧米に派遣して、欧米各国における法と倫理の現状について、資料と情報の収集に当たってもらう。年度末には、1年間の成果を集約し、『生命倫理・生命法研究資料集』を刊行する。

今年度は、欧米各国のゲノム編集技術や遺伝情報の取り扱いについての法学的、倫理学的分析、また、研究や再生医療における、ヒト受精胚、胚性幹細胞、iPS細胞の利用の哲学的、倫理学的、法学的考察を中心に研究を進め、成果を公表してきた。今後はそれらの研究を継続する一方で、さらに、欧米各国における生殖医療、出生前診断、妊娠中絶、臓器移植等の分野の法規制や倫理的考察についても研究成果を出していく。秋に、第1回研究会を開催し、研究分担者による研究成果の発表と議論により、研究成果を共有し、欧米各国の法規制や倫理的考察について比較・検討・考察する。その時に、オランダから、安楽死員会の委員でもある教授の先生を招聘し、安楽死先進国であるオランダにおける安楽死の思想と現状と問題点について講演してもらい、日本における誤解を解くとともに、今後のわが国における終末期医療の方向性はどうあるべきかを考える。暮れには第2回研究会を開催し、研究分担者だけでなく、先端医療技術の法規制や倫理問題を専門に研究している国内の研究者も研究発表や議論に加わってもらい、さらに研究の幅を広げる。折しもフランスでは生命倫理法の改正作業が進んでいる。フランスにおける生命倫理政策は、世界中に影響を及ぼすので、新たな法規制やその根底にある生命倫理思想の変遷について分析をする。またフランスの関係者にも面談し、理解を深める。必要に応じて、研究分担者を欧米に派遣して、欧米各国における法と倫理の現状について、資料と情報の収集に当たってもらう。年度末には、1年間の成果を集約し、『生命倫理・生命法研究資料集』を刊行する。
リング構造を持つ分子シャペロンCLpBによる凝集タンパク質の再生

分子シャペロンClpBは、他の分子シャペロンDnaKとその補助因子と協力して、変性、凝集したタンパク質を活性のある状態にまで再生することができる。ClpBの結晶構造をもとに変異体解析を行い、ClpBがどのように凝集タンパク質を再生するのかを調べた。ClpBはNドメイン、AAA1、ミドルドメイン、AAA2、の4つのドメインからなり、リング状の6量体を形成して働く。ClpBは、凝集したタンパク質をほぐす際、そのリングの中央の孔にタンパク質を通す(糸通し)といわれている。まずこの糸通し活性を、脱凝集活性とは区別して検出できる実験系を構築した。また、4つのドメインのうちNドメインはαへリックスに富んだ球状のドメインであるが、ClpBによる変性タンパク質の結合を助けるとともに、それ自身大きく構造変化することによって、脱凝集過程を促進することを見出した。ミドルドメインは棒状のコイルドコイル構造をしており、これがさらに2つの羽のような構造(wing-1,wing-2)に分かれている。今回、ミドルドメインのwing-1、wing-2はそれぞれ脱凝集過程に必須の役割を持っていることを示唆する結果を得た。さらに、Wing-2の動きを蛍光エネルギー移動法(FRET)で検出することに成功した。分子シャペロンClpBは、他の分子シャペロンDnaKとその補助因子であるDnaJ、GrpEと協力して、凝集タンパク質を再生することができる特異な分子シャペロンである。結晶構造解析の結果から、相対的配向が大きく変化すると考えられるドメイン同士を、ジスルフィド結合によって固定する変異体を複数作成し、そのシャペロン活性や、ATP加水分解活性に対する影響を解析した。現在、これらの変異体について、更に様々な角度から解析を進めている。ミドルドメインは4本のαヘリックスからなる棒状のコイルドコイル構造からなり、ちょうど2つの羽を持つプロペラのような形をしている。これら2つの羽構造について、それぞれ変異導入の影響を調べ、それぞれが固有の役割を担っていることを示唆する結果を得た。また、これまでの研究で、ミドルドメインはAAA1へのヌクレオチドの結合によりその向きを変えることを示している。このミドルドメインの構造変化について、特にwing2と呼ばれる羽の構造変化を、蛍光エネルギー移動法を用いて、詳細に解析する系の構築を試みた。構造変化の検出は可能となったが、詳細な解析を行うためには更なる系の改善が必要である。更に、個々のドメインの構造変化がClpB六量体リングの中でどのような役割を果たすかを解析するため、6量体の中で変異導入サブユニットを特定する系を構築中である。分子シャペロンClpBは、他の分子シャペロンDnaKとその補助因子であるDnaJ、GrpEと協力して、凝集タンパク質を再生すること(脱凝集)ができる特異な分子シャペロンである。結晶構造解析の結果から、Nドメインとミドルドメインは、他のドメインに対する相対的配向が大きく変化すると考えられている。今回、変異導入したしステイン残基のジスルフィド結合によって、Nドメインをさまざまな向きで、AAA1ドメインに固定し、その影響を解析した。その結果、Nドメインは、ドメインの向きに関わらず、基質タンパク質の結合を促進するが、脱凝集活性の促進には、さらにNドメインの向きの変化が重要であることがわかった。また、大腸菌のClpBに変異を導入して、ClpPというプロテアーゼを結合させることによって、ClpBの脱凝集活性の部分活性を、基質タンパク質の分解という形で検出する方法が、他のグループから報告されているが、好熱菌のClpBにおいても同様の検出系を作成することに成功した。ClpBはNドメイン、AAA1、ミドルドメイン、AAA2、の4つのドメインからなる。このうちミドルドメインは、4本のαヘリックスからなる

棒状のコイルドコイル構造からなり、ちょうど2つの羽(wing-1, wing-2)を持つプロペラのような形をしている。また、ClpBはリング状の6量体を形成して働くが、凝集したタンパク質をそのリングの中央の孔に通すようにしてほぐす活性(糸通し活性)を持つといわれている。これまでの研究で、ミドルドメインの2つの羽構造はそれぞれ独自の働きを持つことが示唆されているが、その詳細は分かっていなかった。今回、昨年度作製した、ClpBの糸通し活性の検出系を用いて変異体解析を行ったところ、これら2つの羽構造は糸通し過程以外の脱凝集過程に働くということが明らかになった。さらに、wing-2の働きに重要なアミノ酸残基を特定することができた。また、ClpBとともに働く分子シャペロンDnaKとその補助因子DnaJについて、DafAとよばれる温度依存性の調節因子が知られている。DafAによる活性調節の様子を詳細に解析したところ、DafAは従来考えられていたよりも幅広い温度範囲でDnaKとDnaJの活性を制御していることが明らかになった。
イヌのグルタミン酸輸送体の機能と構造およびその遺伝的変異に関する研究

昨年までに申請者らはイヌ脳グルタミン酸(Glu)輸送体のcDNAクローニングからイヌ赤血球型輸送体サブタイプがGLAST型であることを明らかにした.この結果に基づき,遺伝的にグルタミン酸輸送活性が低い赤血球(低Glu酸輸送;LGT)および完全に活性を欠損した赤血球(Glu輸送活性欠損;D)を有する日本犬の家系についてGLAST遺伝子および蛋白質の解析を行った.各形質のイヌ個体について骨髄細胞由来GLAST cDNAの塩基配列の決定を行ったところ,LGTおよびD型の両方にGLAST蛋白質の492番目のアミノ酸残基GlyのSerへの置換をもたらす変異(G492S)の存在が確認された.しかしながらG492SGLASTはXenopus oocyte発現系において正常と同様な輸送活性を示すことから,この変異自体はsilent polymorphismであるものと考えられた.一方,イムノブロット法によるGLAST蛋白質の検出を試みたところ,イヌ赤血球においてGLAST蛋白質は66kDaのポリペプチドとして検出され可溶化の条件により二量体(130 kDa)を形成することが明らかになった.これらの蛋白質量を比較することにより各形質のイヌ赤血球におけるGLAST蛋白質の発現状況について検討したところ,LGT赤血球ではGLAST蛋白質量の減少,またD型赤血球では完全な消失が認められた.このことからGlu輸送活性の異常(低下あるいは欠損)はGLAST蛋白質の質的な変化よりはむしろ量的な減少によって生じていることが明らかになった.また,RT-PCR法により各形質のイヌ骨髄細胞よりGLAST mRNAの検出が十分可能であることから,この変化はposttranscriptionalな異常によるものと考えられた.さらに,G492S変異を利用したPCR-RFLPから転写活性の低下したGLAST遺伝子の存在も示唆されており,これらのイヌにおいて多様なGLAST遺伝子の変異が複雑に関与し形質を決定しているものと考えられた.PCR法により増幅したイヌ脳由来グルタミン酸トランスポーターの部分cDNA塩基配列を基にイヌ脳グルタミン酸トランスポーター遺伝子特異的プライマーを作製し,3-Rapid amplification of cDNA ends(RACE)および5'-RACEを行い特異的産物を得た.つぎにこれらを結合し全長クローンを作製し,その全塩基配列を決定した.得られたクローンは全長3811bpで120bpの5'-非翻訳領域と542アミノ酸をコードするOpen readingframeおよび約2kbの3'非翻訳領域を含んでいた.塩基配列から予想されるアミノ酸配列レベルでヒト,ウシおよびラットのGLASTサブタイプのホモログにそれぞれ97%,97%および95%と非常に高い相同性を示した.このことから単離されたクローンはイヌのGLASTホモログであることが確認された.さらに,このクローンのcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に一過性に発現させたところ,ナトリウム依存性のグルタミン酸の取り込みが確認された.また,動力学的および薬理学的特徴はイヌ赤血球の特徴に一致した.また,RT-PCRにより骨髄および網状赤血球にGLASTのmRNAの存在が確認されたことから赤血球型のGLASTサブタイプであることが確認された.以上のことから,本クローンはイヌ脳のナトリウム依存性グルタミン酸トランスポーターの一つであり,赤血球に発現しているサブタイプであるものと考えられた.このクローンは今後,イヌの中枢神経の神経変性疾患におけるグルタミン酸トランスポーターの役割を解明するために非常に有用であるものと考えられ,さらにイヌ赤血球に見られるグルタミン酸輸送体の活性節機構の遺伝的変異の解明に大きく寄与するものと考えられる.昨年までに申請者らはイヌ脳グルタミン酸(Glu)輸送体のcDNAクローニングからイヌ赤血球型輸送体サブタイプがGLAST型であることを明らかにした.この結果に基づき,遺伝的にグルタミン酸輸送活性が低い赤血球(低Glu酸輸送;LGT)および完全に活性を欠損した赤血球(Glu輸送活性欠損;D)を有する日本犬の家系についてGLAST遺伝子および蛋白質の解析を行った.各形質のイヌ個体について骨髄細胞由来GLAST cDNAの塩基配列の決定を行ったところ,LGTおよびD型の両方にGLAST蛋白質の492番目のアミノ酸残基GlyのSerへの置換をもたらす変異(G492S)の存在が確認された.しかしながらG492SGLASTはXenopus oocyte発現系において正常と同様な輸送活性を示すことから,この変異自体はsilent polymorphismであるものと考えられた.一方,イムノブロット法によるGLAST蛋白質の検出を試みたところ,イヌ赤血球においてGLAST蛋白質は66kDaのポリペプチドとして検出され可溶化の条件により二量体(130 kDa)を形成することが明らかになった.これらの蛋白質量を比較することにより各形質のイヌ赤血球におけるGLAST蛋白質の発現状況について検討したところ,LGT赤血球ではGLAST蛋白質量の減少,またD型赤血球では完全な消失が認められた.このことからGlu輸送活性の異常(低下あるいは欠損)はGLAST蛋白質の質的な変化よりはむしろ量的な減少によって生じていることが明らかになった.また,RT-PCR法により各形質のイヌ骨髄細胞よりGLAST mRNAの検出が十分可能であることから,この変化はposttranscriptionalな異常によるものと考えられた.さらに,G492S変異を利用したPCR-RFLPから転写活性の低下したGLAST遺伝子の存在も示唆されており,これらのイヌにおいて多様なGLAST遺伝子の変異が複雑に関与し形質を決定しているものと考えられた.
レーザーを用いた結晶核発生技術による有機・蛋白質結晶の創製

有機非線形光学結晶DASTの育成において、ナノ秒YAGレーザーを用いた時の結晶析出確率は約10%と低かったが、フェムト秒チタンサファイアレーザーを用いた場合、結晶析出確率は約25%に向上した。さらに、DAST溶液を過飽和状態にして1時間静置した後にレーザー照射したところ、結晶析出確率は約60%であり、飛躍的に向上することが分かった。溶液状態(分子クラスターサイズ)とレーザー照射は密接に関連していることを実証した。一方、蛋白質の結晶化においては、ナノ秒レーザーの照射に対して効果が見られず、フェムト秒レーザーの照射が有効であることが分かった。数マイクロリットルの微量蛋白質溶液にレーザーを照射する必要があるため、顕微鏡下でレーザー照射できる光学系を構築した。本システムは、蛋白質の主な結晶化手法であるハンギングドロップ蒸気拡散法やシッティングドロップ蒸気拡散法に適応した。従来は結晶化に至らない低過飽和度の溶液において、フェムト秒レーザーの照射により結晶化を実現した場合、結晶の品質が向上した。特に、結晶化が困難である膜タンパク質AcrBトランスポーターはX線回折分解能が3.5Å(従来)が2.3Åとなり、大幅に結晶品質が向上した。
分子設計されたNO合成酵素の機能発現及び生体内NOのダイナミックス

一酸化窒素(NO)は血管拡張、血小板凝縮、免疫、細菌感染など生体にとって極めて重要な多くの作用を行なう。このNOはアルギニンからNO合成酵素によって合成される。NO合成酵素の活性部位にはシトクロムP450と同じくチオールが配位したヘム鉄が存在しており、NO合成はP450反応と同じ機構で進むと推定される。本研究では、肝臓P450のヘム活性部位がNO合成酵素の活性部位のモデルとして利用できるのではないかと考えて、NOとP450活性部位変異体との相互作用を詳細に検討した。NO-鉄3価ミオグロビン錯体や極性溶媒中のNO-ヘム鉄3価錯体の鉄は容易に還元されて鉄2価になる。一方、NO-P450鉄3価錯体やNO-NO合成酵素鉄3価錯体は安定に存在する。このP450やNO合成酵素における鉄の還元が、その生理作用と重要な関係があるのではないかと考えて、P450の活性部位変異体とNOとの相互作用を調べた。P450の推定遠位に存在するGlu318をアラニンへ変換するとNO-P450錯体の鉄は容易に還元された。この還元速度はジベンゾアントラセンやフェナントレンのような堅く且つ平面性のある基質を添加すると著しく減少した。レーザーフラッシュ照射による、NOの脱離-再結合速度やレーザー光受理能力もこれらの基質により大きく影響された。これらの結果から、P450の場合と同様にNO合成酵素の場合も、NOはヘム遠位のカルボキシル基と相互作用して安定化しており、各種の基質の導入により、その活性部位内の動きは大きく影響されることが示唆された。又、NO錯体の還元性は周辺の水や水酸イオンによって大きく影響されることが示唆された。2種類のNO合成酵素、bNOS及びiNOS、のcDNAを米国の研究者より恵与された。これらのcDNAを用いて、2種類のNO合成酵素を昆虫細胞、大腸菌及びパン酵母に発現させることを試みた。昆虫細胞においてはヘムを外部から添加することによりNO合成酵素の発現が効率良くなることが確かめられた。大腸菌については市販の発現ベクターでは成功しなく、より効率の良い発現ベクターを米国より取り寄せている。酵母での発現については、外部より補酵母を添加する必要があることが推定され、添加の効果について現在実験中である。NO合成酵素と相互作用するグアニルシクラーゼのクローニングに成功し、その昆虫細胞、大腸菌、パン酵母における大量発現についても現在検討中である。NO合成酵素はその活性部位にP450と同じ構造を持つヘム鉄を有している。故にP450はNO合成酵素の良いモデルにもなりうると考え、NOとP450との相互作用を調べた。その結果、P450の遠位に存在するカルボキシル基がNOと直接相互作用していることが各種分光学的方法で確かめられた。このことからNO合成酵素においてもまったく同様な相互作用が存在し、この酵素の活性発現に重要な寄与をしていることが示唆された。

NO-鉄3価ミオグロビン錯体や極性溶媒中のNO-ヘム鉄3価錯体の鉄は容易に還元されて鉄2価になる。一方、NO-P450鉄3価錯体やNO-NO合成酵素鉄3価錯体は安定に存在する。このP450やNO合成酵素における鉄の還元が、その生理作用と重要な関係があるのではないかと考えて、P450の活性部位変異体とNOとの相互作用を調べた。P450の推定遠位に存在するGlu318をアラニンへ変換するとNO-P450錯体の鉄は容易に還元された。この還元速度はジベンゾアントラセンやフェナントレンのような堅く且つ平面性のある基質を添加すると著しく減少した。レーザーフラッシュ照射による、NOの脱離-再結合速度やレーザー光受理能力もこれらの基質により大きく影響された。これらの結果から、P450の場合と同様にNO合成酵素の場合も、NOはヘム遠位のカルボキシル基と相互作用して安定化しており、各種の基質の導入により、その活性部位内の動きは大きく影響されることが示唆された。又、NO錯体の還元性は周辺の水や水酸イオンによって大きく影響されることが示唆された。
複合金属クラスター錯体におけるredox軌道の局在化vs非局在化の配位制御

1、1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン、dppfeを含んだMnカルボニル錯体およびRCCo_3(CO)_9を単位ユニットとし、これを2個以上組み込んだ複合金属クラスターをいくつか合成し、その電気化学的挙動をBAS製electrochemical analyzerで解析した。(1)Mn-dppfe系の化合物として新たにHMn(CO)_3dppfe,ClMn(CO)_3dppfeを合成し、単結晶X線解析を行った。これらの化合物とこれまでに報告した(MeCp)Mn(CO)_2dppfe,(MeCp)Mn(CO)dppfe,{ClMn(CO)_4}_2(μ-dppfe)のcv,ディファレンスパルスポーラロ、対流ボルタンメトリーの測定を行い、redox過程とredoxサイトを確定した。各化合物中のMnのE_<pa>値とA対称のν(CO)値の間に良い相関があることが判明した。(2){-CCo_3(CO)_x}_n.SP系の化合物としてp-{(CO)_9Co_3C}_2-R(R=-C_6H_4(1),-C_6H_4-C_6H_4-(2)),{RCCo_3(CO)_8}_2(μ-dppfe)(R=Cl(3),Me(4),{ClCCo_3(CO)_8}_2(μ-dppe)(5)(dppe=1、1'-ビスジフェニルホスフィノエタン)の合成とcv測定および化合物1、4、5の単結晶X線解析を行った。化合物1は2-5と異なり、その還元過程で二つのCo_3クラスターユニット間の強い相互作用を示した。この事実は1ではredox軌道が非局在化している事を示している。つまり本研究テーマで言うごとく、redox軌道の局在化、非局在化が二つのクラスターユニットを結合するスペーサー分子の種類などによって制御出来ることが実証できた。
数値処理と数式処理の融合による計算機援用解析学の可能性に関する基礎的研究

研究分担者がそれぞれの分担課題に関して恒常的に検討を続け、以下のような研究実績を得た。1.中尾は、前年度に引き続き非線形楕円型境界値問題および定常Navier-Stokes方程式の解に対する数値的検証法の改良・拡張について検討し、特に本年度は、以下の成果を得た。(1)楕円型方程式の検証に関して、double turning pointの検証法を定式化し具体例を与えた。(2)非凸領域上の定常Navier-Stokes方程式で記述されるStep-flow問題に対してその解の精度保証付きで計算することに成功した。(3)特異随伴作用素をもつ楕円型問題に対する有限要素解の構成的なL-2誤差評価について、Aubin-Nitscheの技巧を用いない計算機援用的方法により数値的に評価する知見を得た。(4)空間3次元熱対流問題の精度保証に関して、新たな分岐解の検証定式化とその実例を与えた。2.吉川は、ソボレフ空間の計算可能構造について、数値解析における有限要素法との関連を見込むために、ソボレフ関数の近似と近似の評価の管理を帰納的関数により行う手法について知見を得た。3.横山は、制御におけるパラメータ値の決定の最適化問題に対して、記号的代数的手法を適用し、大域的最適値を正確に求めることに成功した。数学研究応用では、逆ガロア問題において数値計算による証明を行い、さらに分解体計算では代数的近似を利用した高速化を実現した。1.中尾は、楕円型境界値問題および定常Navier-Stokes方程式の解に対する精度保証付き計算法を、より実用度の高いものに改良・拡張することを試みるとともに、実際問題に適用しその有効性を実証するとともに、その記号処理による実現法について検討した。具体的には、(1)無限次元Newton法にもとづく数値的検証法の実際問題への適用例として2次元Driven-Cavity問題の解を取り上げ、有限要素法とその構成的誤差評価を用いた場合の検証を実現した。(2)空間2次元熱対流問題の解の検証のためにスペクトル法をもとにした精度保証方式により、理論的解明が困難な分岐点自体の数値的存在検証方式を与え、数学的に厳密な数値的検証を行った。(3)2次元重調和方程式の有限要素解に対するアプリオリ誤差評価定数を、実用的な値で精度保証付きで算定する方法を定式化し、その実例を与えた。2.吉川は、Hilbert空間の双1次形式に関するRieszの定理とLax-Milgramの定理の計算可能解析学における定式化を行い,さらに,楕円型変分問題への応用条件をこの立場で検証した。成果の一部は,8月京都大学で開催された関連国際学会CCA2005の併設テュートリアル講演として発表した。残部は,11月にCape Town大学Vasco Brattka準教授との共同研究で完成させた。3.横山は、本研究の工学への応用事例として、制御における、多項式の根の配置問題について、従来の数値シュミレーションとは異なる、記号・代数的手法により、保障された正確な計算法を与え、それを国際会議で発表した。さらに、代数制約(連立代数方程式)に関して、パラメータを指数部に持つ場合の解(affine variety)の構造の安定性について、Gr" obner基底の形の安定性に基づき、いくつかの基本的な結果を得た。概要について、国際会議で発表した。研究分担者がそれぞれの分担課題に関して恒常的に検討を続けた。今年度の主な研究実績は以下の通りである。1.中尾は、楕円型境界値問題および定常Navier-Stokes方程式の解に対する精度保証付き計算法を、より実用度の高いものに改良・拡張することを試みた。具体的成果は以下の通り。(1)重調和方程式の解に対する有限要素解の構成的誤差評価を与え、その応用として2次元Driven-Cavity問題の解の数値的検証を実現した。(2)空間3次元熱対流問題の解の検証のためにスペクトル法をもとにした数値的存在検証手順を定式化し、自明解からの分岐直後の解の数値的存在証明に成功した。(3)強圧的でない楕円型作用素の有限要素解に対する構成的a priori誤差評価定数を与えた。(4)本質的スペクトルを持つ無限領域上の作用素のスペクトルギャップを数値的に検証する方法の定式化を与えた。2.横山は、記号・代数処理と数値処理の効果的融合研究として、実現の可能性の高い、多項式の分解体計算の効率化とパラメータで記述されるイデアル(代数多様体)の安定性の解析を行なった。特に、分解体では、ガロア群計算を元に計算を線形代数計算に落とすことができ、この部分に根の近似を効果的に使うことが可能になる。3.吉川は、解析学の立場からの計算可能性について次の検討を行った。a.八杉満利子教授(京都産業大学理学部)主催の計算可能解析関連のセミナーに出席し,発表および討論を行った.また,林晋教授(京都大学人文学研究科)主催のヒルベルト計画をめぐる研究会に出席し,討論に参加した.b.Ning Zhong教授(シンシナティ大学)とソボレフ空間を計算可能解析学の立場から,特に,近似理論との関係を明らかにすることを目的とする研究を行った.これについては,成果発表のための準備をしている.研究分担者がそれぞれの分担課題に関して恒常的に検討を続け、以下のような研究実績を得た。

(1)楕円型方程式の検証に関して、double turning pointの検証法を定式化し具体例を与えた。(2)非凸領域上の定常Navier-Stokes方程式で記述されるStep-flow問題に対してその解の精度保証付きで計算することに成功した。(3)特異随伴作用素をもつ楕円型問題に対する有限要素解の構成的なL-2誤差評価について、Aubin-Nitscheの技巧を用いない計算機援用的方法により数値的に評価する知見を得た。(4)空間3次元熱対流問題の精度保証に関して、新たな分岐解の検証定式化とその実例を与えた。2.吉川は、ソボレフ空間の計算可能構造について、数値解析における有限要素法との関連を見込むために、ソボレフ関数の近似と近似の評価の管理を帰納的関数により行う手法について知見を得た。3.横山は、制御におけるパラメータ値の決定の最適化問題に対して、記号的代数的手法を適用し、大域的最適値を正確に求めることに成功した。数学研究応用では、逆ガロア問題において数値計算による証明を行い、さらに分解体計算では代数的近似を利用した高速化を実現した。
『共産党宣言』の起草者名の普及史

1848年2月に共産主義者同盟の綱領として無署名で発表された文書である『共産党宣言』が、カール・マルクスの起草文書として広く認知されるようになる経緯を、同盟内部、知人等彼の周囲の人々、及び一般の人々それぞれの周知の進展する過程として、周知の最初期である1850年代について、この時期に刊行された諸再版・再録を軸に、マルクスとその同時代人の手紙類、新聞雑誌等の検討を通して明らかにする中で、種々の成果を生み出した。『共産党宣言』は、現在、『資本論』と並びカール・マルクスの主著の一つとして広く知られている。しかし『宣言』は本来、1848年2月に手工業職人・労働者を主とする秘密結社「共産主義者同盟」の1年間限りの綱領として無署名で刊行された。かかる性格の文書がいかなる経緯で現在のように周知されるに至ったのか。この過程を、1864年の国際労働者協会創立以前、特に1850年代を対象に解明するのが本研究の課題である。初年度は、1)対象とすべき期間を明確にし、2)その時期について下記の成果を得た。1)イギリスの労働者たちは1854年3月にマンチェスターにおいて労働者議会を開催する。マルクスは名誉議員の一人としてその議決文書に連署するよう要請される。この時点ですでに彼が英労働者間に一定の地歩を占めており、それには、彼が『宣言』の起草者である事実の普及が幾可かの重みをもっていたことが窺われる。以上から、対象期間を1854年3月以前に限定できることが分かった。その論拠の一つとして労働者議会について簡潔に述べたヴォルフガング・マイザー「1850年代半ばの労働運動における社会綱領」を翻訳した。2-1)起草者を明示した最初の刊行物は1850年11月発行の『レッド・リパブリカン』と『新ライン新聞。政治経済評論』であることを追試確認し、社会史国際研究所(アムステルダム)で関係資料を調査収集した。また、明示の契機が同年9月の共産主義者同盟の分裂にあることを追試確認した。2-2)明示に先立ち、同年7月4日付『新ドイツ新聞』掲載のマルクス「声明」において自ら『宣言』に言及していたことを見出し、その経緯を学会発表した。2-3)マルクスらは知識人にも大きな影響力があったため、『宣言』刊行直後からプロイセン当局に注視され、「ケルン共産党裁判」に至り、その過程で起草者名が普及した可能性の高いことが分かった。『共産党宣言』は、本来、1848年2月に手工業職人・労働者を主とする秘密結社「共産主義者同盟」の1年間限りの綱領として無署名で刊行された。かかる性格の文書がいかなる経緯で現在のようにマルクスおよびエンゲルスの起草したものとして周知されるに至ったのか。第2年度は下記の成果を得た。1)前年度行った1850年代半ばのイギリス労働運動における労働者議会におけるマルクスの位置づけの検討から、研究対象期間を1854年3月以前に限定できる点について一層確実に証拠立てるため、1860年秋に出版されたマルクスによる論争書『フォークト氏』以降は、『宣言』の起草者名がかなり普及していることを、ベルンハルト・ベッカー著『1848年および現在のドイツの運動』(1864年刊)における「この『宣言』はマルクスを信奉する党が出した」(S.45)とする文言等によって確認した。2)起草者名明示の契機となった1850年9月の同盟分裂後、中央指導部はケルンに移転するが、この移転により大陸における同盟の活動性が高まり、プロイセン当局に注視されて、「ケルン共産党裁判」に至ることとなる。この経緯を確認し、中央指導部移転についての基本文献であるカール・オーベルマン著『共産主義者同盟史1849年1852年』(1955年刊)第3章を邦訳した。3)「ケルン共産党裁判」の審理においては、『宣言』がマルクスとエンゲルス2名によって起草されたというより、マルクスによって起草されたとされており、裁判についての新聞報道においても同様であることを追試確認した。本年度は『レッド・リパブリカン』掲載の英訳および『新ライン新聞。政治経済評論』掲載の部分再刊についての検討を続行するとともに、特に下記2点に関する資料紹介と論文をとりまとめ、公表した。1.『共産党宣言』は共産主義者同盟の綱領として起草された。我が国では同盟の組織の性格について種々の議論があり、一致した見解が定まっていない憾みがある。規約の観点から同盟を検討する研究が不十分なためと思われる。このため、旧東独において最も学術的良心的な研究として定評あるマルティン・フントの論文「共産主義者同盟の時期におけるマルクスおよびエンゲルスによる党把握の発展について」を試訳し、公表した。

今後の学界における上記検討のための基礎資料の一つを用意するものとしての紹介である。2.『宣言』の起草者名の普及については、マルクス自身による後年の回顧等の文言を検討する必要がある。それらのなかで、マルクスが自身とは政治的立場も見解も異なるイギリス在住の聖職者モーリッツ・カウフマンに対して、その著作のうち自身の略伝・理論および運動について述べた二つの章の校正を行い、訂正等の助言を与えていることに着目し、この助言に関する事実関係とその検討の結果をまとめ、論文として公表した。本論文によって、次の4点が初めて明らかにされた。すなわち、1)マルクスの助言はすべて受容されたこと、2)マルクスが資料として送付した彼の論文「ジョージ・ハウエル君の国際労働者協会の歴史」の記述がカウフマンによって利用され、その著作の叙述がより正確化されたこと、3)著作での利用箇所のうち上記論文からの直接引用はマルクスの「協会の歴史」論文の異文である可能性があること、4)『宣言』からの一部引用が興味深い英訳であること、以上。1.『レッド・リパブリカン』掲載の『共産党宣言』最初の英訳の訳者がヘレン・マクファーレンであることをその「序言」で初めて明らかにした『宣言』1872年ドイツ語版と密接に関連する『ライプツィヒ大逆罪裁判』(1872年刊)について研究発表した。2.一昨年度成果オーベルマン論文翻訳の続編の内容をもつI.フントの論文を翻訳した。3.本年度は上記最初の英訳について論文を発表予定であったが、マクファーレンについて、米・英・南阿の国際協力による新調査の結果、1818年にクロスミルで更紗捺染工場主の裕福な家庭に生まれ、家族がその先端技術を学ぶ関係で独語に習熟したが、1842年の父の歿後破産し、ガヴァネスとしてウィーンに赴き1848年革命を実見、1851年以降、革命亡命者F.プルーストと結婚、コンスエラを出産、南阿に移民しようとするも夫と娘に先立たれ、帰国後、教区司祭ジョン・W.エドワーズと再婚、ハーバートとウォルターの2男児に恵まれるも、1860年バディリーで41歳で歿等の伝記的事実が昨年11月末に初めて公表された。その確認と検討のため、論文とりまとめが年度を越えたが、H25年度中に公表予定。4.『宣言』起草者を初めて公表した誌紙が1850年発行の『新ドイツ新聞』、『レッド・リパブリカン』及び『新ライン新聞。政治経済評論』のどれかを、基準を明瞭にして確定した。5.『レッド・リパブリカン』編集者ハーニーがロンドンのドイツ人労働者教育協会に入会した日付を、アムステルダム社会史国際研究所蔵のM.ネットラウによる議事録抜粋を調査し1846年2月24日と初めて確定した。6.『宣言』を再録した警察資料ヴェルムート/シュティーバー著『19世紀の共産主義者陰謀』(1853年刊)の発行部数がわずか100部であったことを、1862年刊のファンデルモイレンによる政治諜報活動に関する著作32頁の叙述から確認した。交付申請書記載時の研究目的を遂行するなかで、関連して生じた問題群の研究とそれらの解決を優先しているところであるが、それら問題群が見出されたこと自体当初計画を遂行したことによる発展でありまたより重要な課題の設定であったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。1850年代に限定して研究を開始したが、成果報告書における詳論は、特に『レッド・リパブリカン』掲載の英訳および『新ライン新聞。政治経済評論』掲載の部分再刊についての検討に限定したい。19世紀後半全体に及ぶ課題設定は、単独での研究はいささか困難であることが分かってきた。
始原菌の藍色細菌生物時計遺伝子KaiCホモローグの機能

我々は、藍色細菌(シアノバクテリア)の生物時計の中核を担う時計遺伝子クラスターkaiABCのクローニングに成功し、kaiBとkaiCのホモログが始原菌archaeaのゲノムに広く存在することを明らかにしている(Ishiura et al.,1998.Science281:1519-1523)。始原菌の生息する自然環境は塩湖や深海底の熱水の吹き出し口などの通常の生物が生存できない極端な条件が多く、生物時計の存在意義は考えにくい。はたして、これらの鳥ホモログが時計遺伝子として機能しているのか、あるいは時計とは直接関係のない生理機能を担っているのかは非常に興味深い問題である。今後は、他の始原菌のKaiCタンパク質でも同様の解析を行うとともに、藍色細菌のKaiCで見つかっている他の活性に関しても検討したい。
新規な溶液内化学反応速度解析法としての拡張型キャピラリー電気泳動反応器の開発

種々の分野における“錯体システム"の有用なキネティクス(反応速度論)解析法に対する喫緊のニーズに応えるべく,キャピラリー電気泳動分離プロセスを“錯体システム"の「反応容器」として用いるというコンセプトに基づき“拡張型"キャピラリー電気泳動反応器(CER)の開発を行った.金属錯体の生成反応速度解析の新たな手法として,zone-passing mode CER(ZP-CER)を開発し,さらにその適用範囲を非金属錯体の生成反応系,および色素の加水分解反応系へと拡張した.さらに,温度可変型ZP-CERを開発し,これを用いて非金属錯体の生成反応における活性化パラメータを取得することに成功した.今年度は,Fe(II)-1,10-フェナントロリン(phen)錯体をモデル化合物として,本研究において提案する"錯体"の生成反応速度度解析のための拡張型CER「zone-passing mode (ZP-) CER」のコンセプトを確立する事を試みた.配位子であるphenを含む泳動緩衝溶液で満たしたキャピラリーにFe(II)溶液のプラグを注入し,電圧を印可して電気泳動を行った.Fe(II)のプラグを注入した後,さらに落差法により泳動緩衝溶液を注入した.このときの泳動緩衝溶液の注入時間を変えることによって,Fe(II)溶液プラグのスタート位置を種々に変化させ,泳動時間を制御した複数の電気泳動図を得た.またこのとき,phenを含まない泳動緩衝溶液をFe(II)のプラグの前後に注入した.それぞれの電気泳動図を解析し,泳動時間の増加に伴うFe(II)-phen錯体ピークの相対ピーク面積の変化から,Fe(II)-phen錯体の生成率の時間プロファイルを得た.これを,擬一次反応として解析し,その生成速度反応速度定数を算出することに成功した.一方,フルボ酸ーFe(III)錯体ーEDTA間の配位子交換反応をモデル反応系として,ZP-CERの“錯体"の置換反応速度度解析への拡張を試み,フルボ酸ーFe(III)錯体ーEDTAの配位子置換反応速度定数を算出することに成功した.今年度は,フタレイン系色素の一つであるテトラブロモフェノールフタレインエチルエステル(TBPE)をモデル化合物として,本研究において提案する"錯体"の生成反応速度解析のためのzone-passing mode (ZP-CER)を,そのコンセプトはそのままに,一般的な化合物の反応のキネティクス解析へ拡張することを試みた.酸性泳動緩衝溶液で満たしたキャピラリーにTBPE溶液のプラグを注入し,電圧を印可して電気泳動を行った.TBPEのプラグを注入した後,さらに泳動緩衝溶液を注入した.このときの泳動緩衝溶液の注入時間を変えることによって,TBPE溶液プラグのスタート位置を種々に変化させ,泳動時間を制御した複数の電気泳動図を得た.またこのとき,中性泳動緩衝溶液をTBPEのプラグの前後に注入した.それぞれの電気泳動図を解析し,泳動時間の増加に伴うTBPEピークの相対ピーク面積の変化から,キャピラリー内で進行したTBPEの酸加水分解反応の残存率の時間プロファイルを得た.これを,擬一次反応として解析し,その酸加水分解反応速度定数を算出することに成功した.一方,ZP-CERを非金属錯体である1-(2,4-ジヒドロキシ-1-フェニルアゾ)-8-ヒドロキシナフタレン-3,6-ジスルホン酸(Hーレソルシノール)-ホウ酸錯体生成反応系へ応用することを試み,その生成反応速度定数を算出することに成功した.上述のように,本年度の研究計画項目,「zone-passing mode CERの種々の反応系への拡張」を達成することができている.また,上述のzone-passing mode CERのHーレソルシノール-ホウ酸錯体への応用は,本年度の研究計画項目「“錯体"の活性化パラメータ測定のための拡張型CERとしての温度可変型CERの創出」のための導入ステップとして取り組んでいる.前年度,ZP-CERによりホウ酸ー1-(2,4-ジヒドロキシ-1-フェニルアゾ)-8-ヒドロキシナフタレン-3,6-ジスルホン酸(Hres)錯体生成反応系の生成反応速度定数(kf)を算出することに成功した.これを受け,今年度は,ホウ酸-Hres錯体の生成反応系をモデル反応系として,“錯体"の活性化パラメータ測定のための拡張型CERとしての温度可変型ZP-CERの創出に取り組んだ.活性化パラメータの測定には,精密なkfの測定が必須になる.これを達成するための手段として,印可電圧を変化させずに泳動時間を制御する方法をとった.通常,ホウ酸泳動緩衝溶液で満たしたキャピラリーにHres溶液のプラグを注入し,電圧を印可して電気泳動を行うが,ここではHresのプラグを注入した後,さらに泳動緩衝溶液を注入した.このときの泳動緩衝溶液の注入時間を変えることによって,キャピラリー内でのHres溶液プラグのスタート位置を種々に変化させ,電気泳動時の印可電圧を変えること無く泳動時間を制御することが出来た.また,ホウ酸を含まない泳動緩衝溶液の短いプラグをHres溶液プラグの前後に注入し,ホウ酸緩衝溶液とHresとの接触により電気泳動開始前に錯形成反応が進行することを防止した.各々の電気泳動図から得た泳動時間の増加に伴うホウ酸-Hres錯体ピークの相対ピーク面積の変化を擬一次反応として解析し,そのkfを算出した.ZP-CERによるkfの測定温度を15-25°Cの間で変化させて,各測定温度におけるkfを測定した.