hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルドケト還元酵素の薬物耐性への関与と抗癌薬の標的としての可能性の検討

アルドゲト還売酵素(AKR)ファミリーの一つであるAKR1B10はヒト非小細胞肺癌組織において大量に誘導されることが報告されている。そこで、basalでのAKR1B10の発現がほとんど認められない非小細胞肺癌細胞株H23に種々の刺激を与え、RT-PCRによって解析したところ、過酸化水素および親電子性物質のEthoxyquinによりAKR1B10のmRNA量の増加が認められた。次に転写調節機構を解析するためAKR1B10遺伝子の5'-上流領域を単離したところ、一部塩基配列の異なる2種類のalleleが存在することが明らかとなった。本位電子にはCT-rich領域が存在し、両allele間には本領域でのCCTTリピートのマイクロサテライトが存在した。そこで、本領域が転写調節に関わっているかを検証するため、AKR1B10が恒常的に発現している非小細胞肺癌細胞株A549をもちいてレポーターアッセイをおこなった。その結果、本マイクロサテライトは転写活性には関与しないことが明らかとなった。また、5'-上流領域を順次欠失させて検討した結果、-3.0kb-2.2kb領域においてbasalの転写調節に関わる配列が存在することが示された。一方、AKR1B10がEthoxyquinによって発現上昇することから,本物質が活性化すると考えられている転写因子Nrf_2の関与について検討した。上記のレポーターアッセイの系にNrf_2タンパク質の発現プラスミドを導入した結果、有意なプロモーター活性の上昇が認められた。このようにAKR1B10は発癌を誘導するような酸化的ストレスや、その制御に関与する転写因子Nrf2により転写調節されることが明らかとなった。
脊椎動物未受精卵の分裂停止因子Emi2の活性制御機構の解析

Emi2は、自身のC末端に存在するRL tailを介してAPC/Cと結合する。本研究は、Emi2の活性化および安定化の分子メカニズムの解明も目的としており、Emi2が結合するAPC/Cサブユニットの特定が非常に重要であると考えられた。その結合の際に、Emi2がAPC/Cの活性化に必要な因子を排除するのではないかと仮定し、前年度の研究を進めた。その結果、RL tai1とアミノ酸配列が非常に酷似したC末端をもつUbe2S (E2ユビキチン結合酵素)がその候補として浮上した。そこで私は、Emi2がAPC/Cと結合する際に、APC/Cの同一サブユニット上でUbe2Sと競合することでMeta-II停止を引き起こしているのではないかと仮説を立て、本年度の研究を行った。まず、Meta-II停止時のツメガエル卵抽出液を用いて、APC/Cの免疫沈降を行った。すると、受精刺激後にEmi2が分解される際に、Ube2SとAPC/Cとの結合がMeta-II停止時に比べ45倍に上昇すること、その結合上昇にはEmi2の分解(APC/CからのEmi2の解離)が必須であることが分かった。次に、Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL)で発現させたAPC/Cサブユニットを用いた実験から、Emi2およびUbe2SはAPC/CのコアサブユニットであるAPC10と結合することが分かった。以上の結果から、Meta-II停止時において、Emi2はRL tailを介してAPC10と結合しUbe2Sと競合していることが強く示唆された。また、この結果は国際的にも高い評価を受け、平成26年3月17日付けでNature Communications誌に受理され、現在印刷中である。(抄録なし)(抄録なし)脊椎動物の未受精卵は、受精のために第二減数分裂中期(Meta-II)で細胞周期を一時停止する。Early mitotic inhibitor 2(Emi2)は、この分裂停止に必須の因子である。1、Emi2はMos-MAPK経路の下流因子p90Rskからリン酸化を受け、3量体の脱リン酸化酵素であるPP2Aがそのリン酸化部位に結合することで活性化、および安定化することが知られている。このPP2Aは、A、B、Cサブユニットからなり、複数種存在するBサブユニットがその基質特異性を決定していることが知られているが、Emi2特異的に結合するPP2AのBサブユニットは同定されておらず、その詳細な分子機構も明らかになっていなかった。そこで本研究員は、本年度の研究においてツメガエル卵を用いたPP2ABサブユニットの同定に着手し、B56β/εサブユニットがEmi2に結合したPP2Aの構成因子であることを見出した。2、Emi2内には不活性化に関与するCdk1リン酸化部位が存在することが知られているが、その詳細な分子機構は明らかになっていなかった。本年度の研究によって、Emi2のN末側の8カ所のCdk1リン酸化部位にCdk1自身、CK1、およびPlk1が結合し、Emi2の不活性化、および不安定化にはそれらの結合が必要であることが明らかとなった。また、リン酸化抗体などを用いた実験から、結合したこれらのキナーゼがEmi2へのさらなるリン酸化を行っている可能性が示唆され、それらのリン酸化が直接Emi2の活性化や安定化に寄与している可能性が高いことも明らかとなった。脊椎動物の未受精卵は、受精のために第二減数分裂中期(Meta-II)で細胞周期を一時停止する。1、前年度の研究から、Emi2のN末側のCdk1リン酸化部位にCdk1自身、CK1、およびPlk1が結合し、その結合したキナーゼによるEmi2へのさらなるリン酸化が、Emi2の不活性化や不安定化に直接寄与している可能性が高いことが分かっていた。本年度の研究結果から、このリン酸化部位は、Emi2の結合対象であるApc/cとの結合部位(c末端)に存在すること、また、Emi2の活性化および安定化に必要であるとされる脱リン酸化酵素のPP2Aが、このリン酸化を優先的に脱リン酸化する可能性が高いことも示唆された。2、Emi2がAPC/Cを不活性化する際には、その結合が不可欠であるが、実際にAPC/Cを構成するどの因子に結合するのかは分かっていなかった。本研究の目的である、Emi2の活性化および安定化の機構の解明には、その因子の特定も非常に重要であると考えられたため、本年度は、Emi2のAPC/C結合部位の特定も行うことにした。その際に、Emi2がAPC/Cの活性化に必要な因子を結合によって排除することで、APC/Cが不活性化される可能性を考え、Emi2のC末端のアミノ酸配列に着目し、APC/Cを構成する因子の中で同様の配列が見られる因子を探索した。その結果、E2(ユビキチン結合酵素)であるUbe2SのC末端がEmi2のC末端と非常に酷似したアミノ酸配列をしていることが判明し、Ube2SとEmi2がAPC/Cと結合する際に競合する可能性が高いことが分かった。

本研究は、Emi2の活性化および安定化の分子メカニズムの解明も目的としており、Emi2が結合するAPC/Cサブユニットの特定が非常に重要であると考えられた。その結合の際に、Emi2がAPC/Cの活性化に必要な因子を排除するのではないかと仮定し、前年度の研究を進めた。その結果、RL tai1とアミノ酸配列が非常に酷似したC末端をもつUbe2S (E2ユビキチン結合酵素)がその候補として浮上した。そこで私は、Emi2がAPC/Cと結合する際に、APC/Cの同一サブユニット上でUbe2Sと競合することでMeta-II停止を引き起こしているのではないかと仮説を立て、本年度の研究を行った。まず、Meta-II停止時のツメガエル卵抽出液を用いて、APC/Cの免疫沈降を行った。すると、受精刺激後にEmi2が分解される際に、Ube2SとAPC/Cとの結合がMeta-II停止時に比べ45倍に上昇すること、その結合上昇にはEmi2の分解(APC/CからのEmi2の解離)が必須であることが分かった。次に、Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL)で発現させたAPC/Cサブユニットを用いた実験から、Emi2およびUbe2SはAPC/CのコアサブユニットであるAPC10と結合することが分かった。以上の結果から、Meta-II停止時において、Emi2はRL tailを介してAPC10と結合しUbe2Sと競合していることが強く示唆された。また、この結果は国際的にも高い評価を受け、平成26年3月17日付けでNature Communications誌に受理され、現在印刷中である。研究を遂行するにあたって、本研究員の所属する研究室の博士研究員や他のメンバーに協力して頂くことで様々な情報を得ることができ、研究結果を計画の早期の段階で国際誌に発表することができた。このため、現在は当初の研究計画のうち2年目の1/2程度(および3年目の研究計画の一部)が終了した状態である。昨年度から、本研究が当初の計画以上に推移していたため、本研究を内包しつつ発展した研究内容を模索していた。その研究を遂行するにあたって、本研究員の所属する研究室の博士研究員や他のメンバーに協力して頂いたことで、非常に有用な情報を多数得られた。このため、現在は当初の研究目的からさらに発展した内容を含む研究を遂行している状態にある。(抄録なし)本研究課題は今後も当初の研究計画通り遂行する予定であるが、現在の状況を踏まえると来年度も当初の計画以上に進むことが予想される。その場合を想定し、この研究課題から派生した研究内容を模索する予定である。本研究は、研究計画の最終年度に入った。当初の予定以上に研究が推移していたため、発展した研究も盛り込みつつ、研究を遂行する予定である。(抄録なし)
ナミビア半乾燥地域における「地生態系」と人間活動の関係に関する研究

環境変動の影響を受けやすいナミビアの半乾燥地域では、近年の急激な社会システムの変化にともない、自然と人間の関係性も大きく変容している。本研究では、地形や植生、土壌といった多層的な自然環境の要素を「地生態系」として総合的に捉え、「地生態系」と人間活動の関係を長期間のフィールドワークを通して明らかにすることを目的としている。これまでは、主に地生態系の調査と人々の生業である放牧活動の研究を実施し、植生が地形や土壌に強く規定されて分布している状況や、それにともなって変化する家畜の放牧ルートの季節性などについて具体的に明らかにしてきた。最終年度にあたる今年度は、社会・経済変化の調査を行い、住民の放牧地利用の社会的な背景に関して検討した。2010年6月に実施した現地調査から、調査地域の家畜数は、2002年度から2006年度までは増加傾向にあったが、2006年度以降は一定もしくは減少するという傾向が明らかになった。この理由について検討すると、降水量の増減等とは関わりなく、家畜の販売機会の増加と大きく関わっていることが明らかとなった。調査地域では、2006年から家畜オークションが近郊都市で実施されるようになり、それにともなって家畜をオークションで積極的に売却する世帯が増加してきている。すなわち、オークションの普及に伴って、調査地域で放牧される家畜数が大きく増加することはなく、植生環境に家畜の放牧圧が与える影響は近年あまり変化していないと考えられる.このように本研究では、半乾燥地の自然環境の脆弱性を規定する諸要因を、地形や植生だけでなく、社会経済的な要因も含め検討し、「地生態系」と人間活動の関わりの複雑さを明らかにした。環境変動の影響を受けやすいナミビアの半乾燥地域では、近年社会システムが大きく変容し、自然と人間の関係性も大きく変化している。本研究では、そのような状況の中で環境変動が地域にどのような影響を与えるのかを検討するため、地形や植生、土壌といった多層的な自然環境の要素を「地生態系」として総合的に捉え、「地生態系」と人間活動の関係を長期間のフィールドワークを通して明らかにすることを目的としている。本年度は、平成20年8月から平成21年1月の期間に、ナミビア中部の村に滞在して現地調査を実施した。今回の調査では、人々の活動の中で最も重要な生業であるヤギ放牧に着目し、放牧と植生との関係について双方の調査を行って検討した。植生調査の結果、植生構造や樹木の樹形は地形条件等の影響を受け場所によって大きく異なっていた。環境の厳しい地形面上では樹木は樹高が2m以下の潅木状になる一方で、水分条件がよい地形面では同種の樹木が10mを越える高木となっていることが明らかとなった。ヤギ放牧に関してはヤギの採食行動の追跡調査から、本地域では潅木状の樹木が重要な採食物となっていることがわかった。したがって、地形環境が異なる場所が存在することによって植生に差異が生じており、その植生の違いが結果的にヤギ放牧のルートと深く関わっていることが示された。またヤギ放牧にとっては、樹木の生育環境が厳しい地形面上の潅木が、有用な採食資源となっていることが示唆された。先行研究において、半乾燥地域における潅木の増加は草本の減少をもたらすために家畜の採食資源の減少につながるものと問題視されてきたが、本研究では潅木が有用な家畜の採食資源になりうる場合もあるということを示すことができた。本年度は、平成21年6月から9月の期間に、ナミビア中部の村に滞在して現地調査を実施した。今回の調査では、人々の活動の中で最も重要な生業であるヤギ放牧に着目し、放牧と植生との関係について調査を行って検討した。調査では、現地滞在期間中に小型のGPSをヤギに取り付けることにより、放牧ルートの長期間にわたる定量データを取得することができた。アフリカ乾燥地域における先行研究では、このような定量データは短期間しか取得されていないため、このデータは大変貴重であるといえる。このGPSデータと採食物のデータ、および植生調査結果から、ヤギの放牧ルートに関して、乾季は採食可能かつ存在量の多い木本種の分布が重要であること、そして雨季は、存在量は少ないが採食時間か長いヤギの嗜好種とも言える木本種の分布が放牧場所決定の大きな要因となっていることが明らかとなった。植生分布は地形やその他の環境因子の影響を受けて分布が偏っているため、その環境要因の場所ごとの違いが、人々の重要な生業活動であるヤギ放牧と大きく関わっているといえる。したがって、その場所の地生態的な特性によって、放牧適地が規定されていることが示唆された。

これまでは、主に地生態系の調査と人々の生業である放牧活動の研究を実施し、植生が地形や土壌に強く規定されて分布している状況や、それにともなって変化する家畜の放牧ルートの季節性などについて具体的に明らかにしてきた。最終年度にあたる今年度は、社会・経済変化の調査を行い、住民の放牧地利用の社会的な背景に関して検討した。2010年6月に実施した現地調査から、調査地域の家畜数は、2002年度から2006年度までは増加傾向にあったが、2006年度以降は一定もしくは減少するという傾向が明らかになった。この理由について検討すると、降水量の増減等とは関わりなく、家畜の販売機会の増加と大きく関わっていることが明らかとなった。調査地域では、2006年から家畜オークションが近郊都市で実施されるようになり、それにともなって家畜をオークションで積極的に売却する世帯が増加してきている。すなわち、オークションの普及に伴って、調査地域で放牧される家畜数が大きく増加することはなく、植生環境に家畜の放牧圧が与える影響は近年あまり変化していないと考えられる.このように本研究では、半乾燥地の自然環境の脆弱性を規定する諸要因を、地形や植生だけでなく、社会経済的な要因も含め検討し、「地生態系」と人間活動の関わりの複雑さを明らかにした。
多様化したソニックヘッジホッグカスケードによる神経管の発生制御(2)

shhの下流である転写調節因子Gliの多様化に着目して、Gli2とGli3のどちらが神経管の正中構造の決定(腹側化)に必要なのかを解析した。そしてShhシグナルのマウス神経管正中決定過程でのGli2とGli3の機能の分担状況を遺伝学的に明らかにした。実験のため細胞内シグナルがShh非依存的に活性化しているPtc1変異胚を用いた。Ptc1は正常な細胞でSmoの機能を抑制する。その結果、Shh非存在化では腹側化シグナル伝達は抑制される。Ptc1の変異体ではPtc1の機能が失われSmoは抑制されず、Shh非依存的にGliが活性化する。よってPtc1変異体では神経管の背腹軸の全てのレベルで過剰な腹側化がみられると考えるれる。その腹側化(floor plate, motor neuron, interneuronそれぞれについて)を抑制できるGliの変異を調べた。その結果、floor plateとV3 inter neuronの分化についてはGli2が心臓レベルより後方の神経管で分化活性化シグナルの伝達を行うこと、またこの範囲にある細胞ではGli1,Cli3ともに発現するがそのGli2の機能は代替できないことを明らかにした。心臓レベルより前方では、Gli3はGli2非存在化でfioor plateとV3 inter neuronの分化シグナル伝達機能を代替できることがわかった。Motor neuronの分化誘導はそれとは異なり、体軸のどのレベルでもGli2非存在下ではGli3がmotor neuron分化の活性化シグナル伝達を担っていることが分かった。すなわち神経管の相異なる部位の間で、機能するGliの種類に差がある事がわかった。Gli3;Shh,二重欠損胚の解析によるGli3の前脳発生における機能我々はGli2;Gli3;Ptc1三重変異体の解析によってSmoの腹側化シグナルがGli2やGli3を介して正中を決定することを示唆した。しかし遺伝子発現のパターンとGli3単独変異胚の解析から、Gli3がShhのシグナル伝達に直接関与するよりは、逆にShhシグナルに対し抑制的に働き背側領域の決定に関与することが示唆されていた。この事実を検証するために我々はShhとGli3を同時に失った二重変異胚を作成しその頭部形成を解析した。もしShhシグナルに対しGli3が抑制的に関与していればGli3の変異はShh単独変異胚に対しレスキュー効果を示す可能性がある。興味深い事に予想どうりGli3;Shh二重変異胚は単眼症を示すShh単独変異胚に比べ顕著に正常に近い形態を維持していた。眼は両眼が分離し前脳、間脳の形成も正中構造がかけている事を除けば正常に近い、もしくはGli3変異胚に似た脳構造を示した。前脳の背腹軸の形成がShh無しでもほとんど正常に形成されていた事は興味深い。要約すると、発生過程にある神経管においてGli3は間接的にShhシグナルを抑制している。またGli3,Shhを共に失っても部分的な背腹軸が成立することから、正中から拡散したShhの勾配に非依存的に背腹軸は成立する事がわかった。更に、成果1で観察されたGli3の腹側化活性化の機能と成果2で観察された腹側化を抑制するという観察結果は矛盾する事から、Shhの有無、或いはGli2の有無によってGli3の機能がShhシグナルの伝達に対し活性化、抑制化に転換しうる可能性を示唆している。Gliの相同遺伝子産物であるショウジョウバエのCiはヘッジホッグの有無により機能の変換が起こる事が知られており、我々の結果はGli3がCiと同じ機能を持つ可能性を示唆している。
共培養系を用いた鋤鼻-副嗅球再構築系の確立とニューロン間シナプス形成機構の解析

フェロモンの情報処理を担う鋤鼻神経系をシナプス形成機構解析のモデルとして、in vitroの実験を行うため、ラット由来の副嗅球と鋤鼻器の分散培養細胞からなる共培養系を開発し、以下の点を明らかにした。1.共培養下で鋤鼻-副嗅球ニューロン間にシナプスが形成されていることを、鋤鼻ニューロンへの電気刺激とカルシウムイメージング法を組み合わせ、薬理学的に検討することによって証明した。2.鋤鼻系を構成する各ニューロンの細胞分化・成熟過程において、鋤鼻-副嗅球間の相互作用が重要な働きを果たしていることを明らかにした。(1)鋤鼻ニューロンは、単独培養では決して成熟しない。副嗅球細胞との共存により、細胞内情報伝達系に関わる分子の発現や形態的な成熟を示すようになることが判明した。(2)フェロモン受容体(候補)ファミリーのうちV2Rファミリーに属する2種類の受容体が副嗅球細胞との共培養によって発現誘導されることを見いだした。(3)齧歯類では尿中に多種類のフェロモン活性物質が含まれる。共培養下の鋤鼻ニューロンに希釈尿成分を電気泳動的に投与すると、応答して興奮を示すものがあることをカルシウムイメージング法で観察した。この場合も、単独培養では応答性は認められなかった。項目2のような共培養による変化は、分子形態的にも機能的にも時間経過がよく一致しており、項目1のシナプス形成の時間経過ともよく一致していた。また、共培養下では副嗅球ニューロン側にも変化が認められ、経シナプス的な情報の授受が細胞の変化に重要ではないかと考えた。今後この可能性について検討していきたい。また、受容体の発現誘導現象を見いだしたことから、鋤鼻系の関わる個体識別や交配相手選択の際の嗜好性の発達などに、特定フェロモン受容体の発現調節などが関わっているのではないかと考え、今後この方面に研究を発展させていきたい。フェロモンの情報処理に関わる鋤鼻神経系の役割を探究するために、ラットから切り出した副嗅球および鋤鼻器に由来するそれぞれのニューロンの共培養系をin vitroの実験モデル系として開発した。本年度は、共培養条件下で副嗅球-鋤鼻ニューロン間に機能的なシナプスが形成されているかどうかについて検討し、以下のような成果を得た。1.培養下の鋤鼻ニューロンは、生体の鋤鼻器類似の構造をもつ細胞塊を形成する(鋤鼻細胞塊)。共培養開始後21日目に、双極電極を用いて鋤鼻細胞塊に対して電気刺激を加えた。同時に、カルシウム蛍光指示薬fluo-4を付加した培養副嗅球ニューロンをイメージング法により観察したところ、複数のニューロンで時間的に刺激とよく一致した一過性の細胞内Ca^<2+>上昇が観察された。2.鋤鼻細胞塊からの軸索束の伸展は共培養7日目で既に観察されるが、上述のCa^<2+>の変化は21日目前後でないと観察されなかった。3.刺激に対する応答は、グルタミン酸受容体拮抗薬であるCNQXの添加により可逆的に阻害されたが、APVの添加ではほとんど影響を受けなかった。一方、培養副嗅球ニューロンでは、複数のニューロン間で同期して生じる自発的なCa^<2+>振動現象が観察されるが、この振動現象に対しては、CNQX、APVの両者とも抑制効果を示した。

4.以上の結果は、副嗅球ニューロン同士に形成される(自発的Ca^<2+>振動現象を担う)シナプスとは薬理学的に異なるシナプスの存在を示唆し、共培養下において、副嗅球ニューロン同士以外のシナプス要素、すなわち鋤鼻細胞塊から副嗅球ニューロンへの投射が形成されたと考えられた。鋤鼻副嗅球ニューロン間の機能的シナプス結合は、形成に共培養開始から21日目前後必要であることも示唆された。5.このような共培養系に、フェロモン物質を含有するとされる尿を微小電極から電気泳動的に添加したところ、鋤鼻ニューロン単独の培養では変化は見られなかったが、共培養下では尿への応答と考えられる一過性のCa^<2+>上昇が観察された。この点については次年度さらに検討していく。フェロモンの情報処理に関わる鋤鼻神経系の役割を検討するために、ラット由来の鋤鼻器および副嗅球ニューロンの共培養系をin vitroの実験モデル系として開発した。本年度は、共培養下での鋤鼻・副嗅球ニューロン間の相互作用により、両部位のニューロンの分化や成熟への影響、回路の形成や修飾などへの影響について検討し、以下のような成果を得た。1.共培養下の鋤鼻細胞塊に、フェロモン物質を含有している尿を微小電極から電気泳動的に添加したところ、添加した尿への応答と考えられる一過性のCa^<2+>上昇を示す鋤鼻ニューロンが観察された。この応答を示す鋤鼻ニューロンは培養鋤鼻細胞塊中の一部に局在しており、全ての鋤鼻ニューロンが均一に応答を示すわけではなかった。2.鋤鼻ニューロンの尿に対する応答は、共培養下でのみ観察され、鋤鼻単独の培養下では全く見られなかった。このことは、共培養による副嗅球からの影響により、鋤鼻ニューロンが成熟することにより、尿内のフェロモン物質に対する応答性を獲得するようになったことを示唆している。3.培養鋤鼻ニューロンの尿に対する応答性の獲得は、共培養開始から23週間頃から観察でき、これより以前には見られない。共培養下での鋤鼻・副嗅球ニューロン間のシナプス形成もほぼ同じ期間を要するという前年度の成果とも一致する結果である。4.フェロモン物質への応答性の基礎となるフェロモン受容体の発現に関して、フェロモン受容体V2Rファミリーに属するVR1およびVR4について抗体を用いたウエスタンブロッティング法で調べたところ、フェロモン受容体の発現が副嗅球と共培養することによって誘導されるということ、経時的に共培養12週後に発現量は急激に増加し、3週目にプラトーに達することなどが判明した。この発現量の経時変化は応答性の獲得ともよく一致している。5.鋤鼻ニューロンの変化に並行して、共培養による副嗅球ニューロンの変化に関しても共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫染色標本の観察により解析した。副嗅球ニューロンでは、共培養により1ニューロン当たりのスパイン数が減少した。しかし、シナプス前終末と明白に対向しているスパインの割合は高くなっていた。また、スパイン頭部の体積は共培養下では有意な増加が見られた。これらの変化は、Conditioned Mediumや両者をディッシュ内で完全に分離した培養条件では観察されず、両者の直接的な接触が必要であることも判明した。以上のことは、鋤鼻ニューロンからの接触および入力がが副嗅球ニューロンで構成される中枢内回路の形成に修飾作用を及ぼしていることを示唆している。
モノソミー系統樹立と生存要因の解明～モノソミーカイコはなぜ生存できるのか？～

本研究では、ゲノムDNAシークエンスとゲノムreal-time qPCRにより、限性系統カイコの後代で認められる成長不良の矮小個体の中に第2染色体モノソミー個体が1)存在すること、2)遺伝性があり系統樹立できた、3)両性共に存在すること、4)その系統では正常系統と形質により区別できること明らかにした。また、RNAseqによりF2における正常に対するモノソミーのmRNA発現頻度比較は、第2染色体が0.59、他の26常染色体の平均発現比は約1であった。このことから常染色体の遺伝子発現には、遺伝子量補償が存在しないと考えられた。当該年度は、形態的特徴と母親の減数分裂異常から生ずることが予測される、カイコ第2染色体モノソミー個体を得ることを第一目的とし、W転座系統雌と第2染色体正常雄の子供に現れる成長遅延と矮小化をメルクマールに選抜を行った。その結果、49個体の第2染色体モノソミー候補雄を得た。これらのうち、27個体において次世代の受精卵が得られた。第2染色体正常雄は幼虫形質マーカーを異にする2系統を使用しており、上記受精卵の一部から孵化させた次世代を検討したところ、想定通り幼虫形質がほぼ1:1に分離した。これらの一方が、モノソミー候補である。正常とモノソミー候補の双方から染色体標本作製を行い、FISHしたところ、用いたChr2-BACのシグナルが2と1となり、モノソミーの可能性が示唆された。17個体の第2染色体モノソミー候補雄について、カイコゲノム情報をもとに設計した第2染色体上を網羅的に増幅するSTSプライマーセットを用いて、ゲノム定量PCRを行った。このうち成長遅延が認められたものの体サイズの矮小化の著しくなかった1個体は、第2染色体を2本持つと判断された。15個体は、第2染色体の一部が2本分、残りが1本分の定量性を示す欠失個体であり、残る1個体が第2染色体モノソミーと判定された。モノソミーと正常個体について、第2染色体の一部遺伝子のmRNA発現をreal time PCRにて調査したところ、発現量の大きいハウスキーピングな遺伝子に関しては、モノソミーで正常の半分程度であったが、発現量の小さい遺伝子は個体差が大きかった。なお、欠失個体の染色体に関して親世代に戻って特定をすすめたところ、第2染色体断片と第24染色体断片の相互転座により生じた異常染色体を有することが推定された。成長遅延・矮小個体の大部分が、出発点のW転座系統雌由来の未同定異常染色体を含み、この一部は第2染色体断片により構成されていた。これは、当初想定した「成長遅延・矮小個体」=「モノソミー個体」に反していたにも関わらず、ゲノム定量PCRの結果、この異常染色体をも含まないカイコ第2染色体モノソミー個体の獲得が実現できたことは大きな進捗であった。現在、この個体に形質マーカーによる区別が可能なカイコ系統を交配し孵化を待つ状態にある。また、親世代の雄成虫のmRNA発現も調査できた。次年度の孵化個体での系統樹立が可能となったことで本研究の本筋は達成できたと考えられる。ただし、当初予定していたよりも、モノソミー個体の出現率は低く、再調査が必要なFISHが残ったことは未達と認識している。一方で、想定外に定性できた、大きな第2染色体欠失を持つ個体でのゲノム定量PCRデータ取得、それらのデータに基づいたカイコChr2-BAC選抜ならびにFISHから、親世代における正確な性染色体構成の把握が可能となった。これは、放射線照射による突然変異系統作製から今日まで、多くのチャレンジをはねのけてきた親系統の第2、第24、W染色体の相互転座の顛末を知らしめる成果に至った。この結果から派生して、カイコW染色体の性決定因子であるFem piRNAの局在性を示すデータを提示できた。以上より本研究は概ね順調に進捗していると判断する。カイコ第2染色体(8.4Mb: 2018.4.16現在のSilkbaseデータ)上に設定した、27マーカーにより、モノソミーと推定された個体から、大きな欠失をもつ第2染色体部位が絞り込まれた。これにより完全モノソミーと部分ヘミ個体をreal-time定量PCR(qPCR)により簡便診断したところ、遅れ小蚕57個体中3個体がモノソミーと診断された。昨年度調査結果も併せ、27マーカーによる判定で2個体はモノソミーと判断した。昨年度、選抜したモノソミー個体と標準系統p50のゲノムDNAシークエンスを行い、リード50kbウインドー毎に頻度解析を行ったところ、第2染色体のみが大部分で標準系統の配列の出現頻度が1/2程度であった。この結果は、PCRによるモノソミー判定結果を強く支持するものである。これらモノソミー雄とマーカーとなる形質遺伝子座を有する正常雌との交配越年卵から孵化させた個体(F1)形質により判別したモノソミー候補に対し、上記27マーカーによるqPCRを行ったところ、雌雄共にモノソミーと判定された。さらに、次世代(F2)を形質判別し、モノソミー候補と正常候補の染色体をBAC-FISH比較した。正常候補の2n=56(正常な染色体数)に対し、前者は第2染色体を1本欠く2n=55で、減数分裂時には第2染色体ユニバレントが観察された。

これら判定に基づき、RNAseqによりF2におけるモノソミーに対する正常のmRNA発現頻度比較を行ったところ、第2染色体は0.59と低い値を示す一方、他の26常染色体の平均発現比は約1であった。このことからモノソミー個体の遺伝子発現は、総じて遺伝子数に比例すると推定された。脱皮ホルモンに応答して発現が誘導される遺伝子と変態のタイミングに関連する幼若ホルモン関連遺伝子については、2つのNGSを行った結果、資金的に不可能となった。本研究では、ゲノムDNAシークエンスとゲノムreal-time qPCRにより、限性系統カイコの後代で認められる成長不良の矮小個体の中に第2染色体モノソミー個体が1)存在すること、2)遺伝性があり系統樹立できた、3)両性共に存在すること、4)その系統では正常系統と形質により区別できること明らかにした。また、RNAseqによりF2における正常に対するモノソミーのmRNA発現頻度比較は、第2染色体が0.59、他の26常染色体の平均発現比は約1であった。このことから常染色体の遺伝子発現には、遺伝子量補償が存在しないと考えられた。越年卵から孵化したモノソミー個体を飼育するとともに、2種類のマーカー遺伝子座を有する系統との相互交配することで、系統維持可能なモノソミー系統を樹立する。この交配によって、生ずる正常個体とモノソミー個体はマーカー形質による区別が可能となるように設計されているため、モノソミー個体と正常個体のRNAseqを行い、第2染色体遺伝子の網羅的なmRNA発現解析比較を行う。上述の系統維持には、2種類の正常系統が必要となるため、モノソミー個体相互の交配へも挑戦する。この交配が実現できれば、第2染色体完全欠失個体が得られる。これらは、生存できない可能性が十分に予測されるため、どの時期まで胚発生が進行するのかを明らかにする。もちろん、孵化、成長することがあれば、高等生物の遺伝子進化に関わる重大発見となる。本年度中に十分な個体数が確保できるのであれば、脱皮ホルモンに応答して発現が誘導されるecdysis triggering hormone、BHR3、変態のタイミングに関連する幼若ホルモン関連遺伝子(HMGR)については、発育に沿って詳細に解析し、正常個体と比較することにより、モノソミー個体において幼虫発育に異常をきたす原因に迫りたい。昆虫細胞遺伝学
17世紀イギリスにおけるピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教研究

本研究は17世紀イギリスにおけるピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教に関わる研究である。事件は1605年11月5日、カトリック教徒過激派ジェズイットによるジェームズ一世殺害未遂事件である。事件直後から英国国教会説教家によって事件を糾弾する説教事件日に行われたが、それは事件の残酷性を指摘し、併せてジェームズ一世の神の慈悲による奇跡的救出を賞賛するものであった。この研究中に私はピューリタン説教家も火薬陰謀事件説教を行っていることを知り、新たにピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教研究を行う事にした。扱う期間をピューリタン革命前後から王政復古に至るまでとし、ピューリタン説教家の事件に関する説教を取り上げることにした。英国国教会説教の火薬陰謀事件説教とピューリタン説教家の火薬陰謀事件説教の大きな違いは前者においては説教はジェームズ一世体制維持のためであり、後者においては説教は進行中のピューリタン革命成就のためであることである。それゆえ、ピューリタンの説教にはジェームズ一世賞賛は見られず、火薬陰謀事件よりもチャールズ一世打倒を目的とした説教となっている。最終年度においてはMatthew Newcomen,Wlliam Strong, William Bridgeを研究対象としたが、いずれの説教においてもジェームズ一世は登場せず、事件そのものも論じられない。Newcomenではジェズイットの「狡猾」と「残虐性」が強調され、Strongではむしろ王党派との戦いへの勝利が扱われ、Bridgeではイギリス社会改革の必要性が説かれている。王政復古までのピューリタンの火薬陰謀事件説教をほぼ網羅した本研究は英国国教会説教の火薬陰謀事件説教研究の続編とも言うべく研究であるが、ピューリタン説教による火薬陰謀事件説教が何を意図していたかが明らかにされた。平成27年度の研究は,最初に英国国教会派の説教家達ーWilliam Barlow, Lancelot Andrewes, John Donne, Jeremy Taylorーの火薬陰謀事件説教を取り上げ、それらの説教の特徴を明らかにした。英国国教会派の説教家たちの説教は当然のことながらジェームズ一世擁護が彼らの義務なので、火薬陰謀事件に対する彼らの態度は徹底した反ローマ・カトリック教会である。事件の首謀者達及びその背後で彼らに影響を与えたローマ・カトリック教会への批判は敵意・憎悪で満ちた説教となっている。英国国教会派の説教家達は事件を引き起こしたローマ・カトリック教徒への批判を通してジェームズ一世王朝ひいては英国社会の安定を強く訴えている。彼らと比べるとピューリタン説教家達ーCornelius Burges, Matthew Newcomen, John Strickland, Anthony Burgesーの火薬陰謀事件説教はローマ・カトリック教会・教徒への批判は見られるが事件への批判は型どおりの批判となっている。彼らのローマ・カトリック教会批判は1641年のアイルランド反乱が契機となっているが、彼らは反乱農民を援護しているのはローマ・カトリック教会であると言い、ローマ・カトリック教会への批判を始める。ピューリタン説教家達は火薬陰謀事件日の11月5日に記念説教を行うのであるが、その説教は徐々に反チャールズ一世へと移り、革命が本格化してくると今度は彼らの説教は革命成功のためのアジ的な説教となってくる。当該年度の研究対象のピューリタン説教の火薬陰謀事件説教は説教を通しての革命遂行とその成功の確約を聴衆に訴える説教となっており、英国国教会派説教家の説教内容とは大きな違いを見せている。当該年度における研究は予定通り進展している。研究方法は研究対象の説教の精読であるのでほぼ予定通りであった。当該年度の研究では英国国教会派の説教家達とピューリタン説教家達による火薬陰謀事件説教の比較検討により、両派説教家達の説教内容に違いが見られることが解明された。火薬陰謀事件説教を通して一方は体制維持、他方は革命成就を強調する。次年度はピューリタン説教家達の火薬陰謀事件説教を研究対象とするが、彼らの説教の真意が明らかにされ、彼らが目指す革命は真の神の国建設のためであるという主張が一層強調されることが予想される。彼らの火薬陰謀事件日説教はその本来の目的から遊離し、ピューリタンという一部英国人のためだけの説教となっている。それがまた彼らの革命政権が長く続かなかった理由でもある。平成28年度の研究対象は平成27年度の英国国教会派説教を踏まえてピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教である。17世紀に入り1642年に本格的に内乱が勃発し、体制側のチャールズ一世派説教家は徐々に守勢に追いやられ、逆にピューリタンが政治の主導権を握る。それと同時に説教もピューリタン説教家が大勢を占め、彼らが事件日の11月5日にほぼ毎年記念説教を行うことになった。火薬陰謀事件は元々ローマ・カトリック教の過激派ジェズイットがジェームズ一世を国会議事堂爆破によって殺害しようとした事件であった。火薬陰謀事件説教の目的は事件の風化を防ぎ、あわせて事件の残虐性とカトリック教会がいかに危険な宗教組織体であるかを国民に訴え、奇跡的に難を逃れたジェームズ一世を賞賛し、神への感謝をささげることである。平成27年度で扱った英国国教会派説教家はすべてこの目的に沿って説教を行い、ジェームズ一世体制維持に尽力する。これに対してピューリタン説教家による火薬陰謀事件は英国国教会派説教による火薬陰謀事件と大きな違いを見せる。それはピューリタン説教家はもはやジェームズ一世賞賛、体制維持に説教を向けることはしていないということである。彼らの説教の真の目的はいかにしてチャールズ一世体制を打倒し、共和制を樹立することにある。

本来の火薬陰謀事件日における記念説教は火薬陰謀事件を扱うことになっているのであるが、ピューリタン説教家は本格的に火薬陰謀事件を扱うことはせず、逆に体制打破を叫ぶのである。平成28年度に扱ったWilliam Spurstowe, Charles Herle, Matthew Newcomen, William Strong, Stephen Marshallはすべて火薬陰謀事件説教において事件よりもチャールズ一世体制打倒を聴衆に訴えている。火薬陰謀事件説教が内乱時においてはジェームズ一世、チャールズ一世時代と大きく異なっていることを平成28年度において解明できた。本研究の研究方法は、内乱時におけるピューリタン説教家が火薬陰謀事件説教において何を訴えようとしていたのかを各説教の精読によって解明しようとするものである。研究対象の一次資料がほぼ完備しているので、研究は概して順調に進んでおり、予定通り各説教の精読により、ピューリタン説教家による火薬陰謀事件の真意を解明することができる。本研究は17世紀英国におけるピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教である。火薬陰謀事件は1605年11月5日国会開会中にカトリック教の過激派ジェズイットによるジェームズ一世暗殺未遂事件である。従来火薬陰謀事件説教は英国国教会派の説教家によって事件後毎年11月5日に行われていた。英国国教会派説教家による火薬陰謀事件説教については科研費による研究として行ったがその研究過程で私はピューリタン説教家も火薬陰謀事件説教を行っていることを知った。1640年代にピューリタン説教家も11月5日に記念説教を行うことになった。しかし、ピューリタン説教家は英国国教会派説教家とは著しい違いを見せる。英国国教会派説教はジェームズ一世体制擁護のために王賞賛、カトリック教批判に集中する。これに対してピューリタン説教家は新しい社会建設が彼らの目的であるためジェームズ一世及び息子チャールズ一世を批判する。彼らにはもはや王賞賛、体制維持の姿勢は見られない。彼らにとって時の王チャールズ一世打倒による共和国樹立が急務となるが父ジェームズ一世を賞賛することはない。ピューリタン説教家の事件日における説教は事件よりもチャールズ一世体制打破を直接論ずるのである。たとえば彼らは王党派との各地での戦いでの勝利を聴衆に確約し、また勝利をおさめればその記念に戦勝記念説教をも行う。平成27年から始めた本研究は平成28年度と平成29年度はピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教研究を行った。平成27年度ではピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教との相違を論ずるため英国国教会説教家による火薬陰謀事件説教を一部論じた。その後平成28年度、平成29年度ではピューリタン説教家による火薬陰謀事件説教の精読によってその解明にあたった。最終年度の平成29年ではPeter Sterry: England's Delivery from northernPresbyteryを中心にしてピューリタン説教家の火薬陰謀事件説教の解明にあたった。
ナノ・ミクロ組織ハイエントロピー合金の優れた高温特性を制御するメカニズム解明

本研究では、ナノ・ミクロ組織ハイエントロピー合金の高温特性を制御する根本的なメカニズムを高温変形・加工中のその場中性子回折実験で明らかにしようとする。新学術領域A03班から提供された加工熱処理で創製した数種類のナノ・ミクロ組織のハイエントロピー合金を対象として、高温変形・加工中のその場中性子回折実験を行い、結晶学的ミクロ組織情報を試験片バルク状態で獲得し、機械特性との比較を行うなどして、研究を計画している。今回の研究計画を遂行するために必要な研究環境を十分に整えており、速やかに研究を実行することができる。本研究において優れた成果が得られた場合には、速やかに情報を公開する。
発情行動発現の中枢分子機構:シバヤギを用いた多元的解析

雌動物の発情行動、すなわち雄に対する誘引・許容の行動は、種の存続に必須の性行動である。本来的にプログラムされ通常は抑制されている一連の中枢神経活動が、受胎の機会が最大となる特定の時期(発情期)にだけ解発される。発情行動の様式は動物種により多様であるが、その内分泌学的背景は哺乳類を通じて共通であり、卵胞から分泌される発情ホルモン(エストロジェン)の血中濃度上昇に依存して発現する。エストロジェンと発情発現との因果関係は明瞭かつ定型的であり、これまで行動解析の代表的な実験モデルの一つとして多用されてきた。しかし発情行動を制御する中枢メカニズムについては依然として不明な点が多い。本研究では、実験動物としてシバヤギを供試し、多元的情報の連続採取が可能な大型動物の利点を活用して、発情発現に関与する中枢機構を統合的に解析することを試みた。具体的には、GnRHニュ-ロンについて、電気生理学的、形態学的および生化学的手法による検討を行った。視床下部ホルモンであるGnRHは、下垂体からの性腺刺激ホルモン分泌を司るばかりでなく、性行動との密接な関連についても古くより指摘されているからである。研究の概要は、以下の各項目に示す通りである。(1)シバヤギ用脳定位手術法の確立(2)多ニュ-ロン発射活動(MUA)記録解析システムによるGnRHパルスジェネレ-タ-の電気生理学的検討(3)GnRHニュ-ロンの脳内局在に関する免疫組織学的検討(4)脳内微小透析法によるGnRH神経分泌活動の検討これらの検討を通じて、覚醒無拘束状態のシバヤギにおけるGnRHニュ-ロンの神経内分泌活動を、リアルタイムに解析しうるシステムが確立された。本実験モデルを基礎に、卵巣摘除雌にエストロジェンを投与してLHサ-ジを誘起した際におけるGnRHニュ-ロンの神経内分泌活動を調べ、LHサ-ジはGnRHの大量分泌により誘起されること、このGnRHサ-ジはGnRHパルスジェネレ-タ-とは異なる神経機構の支配下にあることなど、いくつかの新たな知見を得ることができた。本研究は、雌シバヤギの発情行動発現を司る中枢神経機構を、電気生理学的、生化学的および免疫組織化学的手法を用いて統合的に解析しようとするものである。本年度は、各研究手段の確立と基礎的実験モデルの開発を目指し、以下の研究を実施した。1.視床下部多ニュ-ロン発射活動(MUA)の記録解析システムの開発弓状核を中心とする視床下部内側底部に白金イリジウム製の記録電極を脳定位的に埋め込みMUAを記録した。電極及び記録装置の改良を重ね、また脳定位手術法に習熟した結果、覚醒・無拘束状態のシバヤギからLHのパルス状分泌と同期するMUA(GnRHパルスジェネレ-タ-の活動状態を反映すると考えられる)を長期間にわたって捉えることに成功した。このシステムの開発により、視床下部ー下垂体軸に対する性腺ステロイドホルモンや神経活性物質の影響をリアルタイム解析することが可能となった。第3脳室中に放出されるGnRHおよびカテコラミンの濃度を経時的に追跡するための基礎検討として、ポリカ-ボネ-ト製の透析プロ-ブを用いた<in vitro>___ー回収試験を行い、<in vivo>___ー試験用の条件設定を行った。3.GnRHニュ-ロンの局在に関する検討視床下部及び周辺領域の前額断および矢状断連続切片について、モノクロ-ナルおよびポリクロ-ナル抗体を用いた免疫組織化学的検討を行いGnRH陽性細胞体の局在および線維の走行を同定した。本実験モデルを基礎に、卵巣摘除雌にエストロジェンを投与してLHサ-ジを誘起した際におけるGnRH

ニュ-ロンの神経内分泌活動を調べ、LHサ-ジはGnRHの大量分泌により誘起されること、このGnRHサ-ジはGnRHパルスジェネレ-タ-とは異なる神経機構の支配下にあることなど、いくつかの新たな知見を得ることができた。本年度は平成2年度の継続として、卵巣摘除シバヤギにエストロジェンを投与しLHサ-ジを誘起した際における視床下部GnRHニュ-ロンの神経内分泌活動の変化について検討を行った。1)多ニュ-ロン発射活動(MUA)記録解析システムによる電気生理学的解析覚醒・無拘束状態の動物から、下垂体LHのパルス状分泌と同期する視床下部内側底部MUAの特異的上昇をリアルタイム記録しながら以下の実験を行った。(a)LHサ-ジとGnRHパルス分泌調節機構の関連LHサ-ジ期間中にもMUAの定期的上昇は継続し、その頻度はサ-ジ成立後に有意に低下した。すなわち、LHサ-ジの成立はGnRHパルス頻度の上昇によるとする従来の仮説は否定され、パルスジェネレ-タ-とは異なる神経機構の関与が示唆された。(b)内因性オピオイドペプチド(EOP)の役割卵巣ステロイドホルモンの存在下および非存在下で、EOPの受容体拮抗薬であるナロキソンを投与し、MUAに与える影響を検討した。いずれの条件下でもMUA上昇の頻度は増加し、GnRHパルス分泌調節機構におけるEOPの抑制的関与が示された。2)脳内微小透析法によるGnRH神経分泌活動の解析覚醒無拘束状態で視床下部GnRHニュ-ロンの神経分泌活動を解析する方法の確立を目的として以下の実験を行った。(a)微小透析法の基礎検討in vitro実験によりGnRHの回収条件を検討したのち、透析プロ-ブをシバヤギ正中隆起部に脳定位手術的に留置しin vivoでの灌流試験を行った。その結果、LHパルスと相関するGnRHの律動的分泌パタ-ンが観察され、本法を脳内GnRH分泌動態の解析に応用することが可能となった。(b)LHサ-ジ時におけるGnRH分泌パタ-ン上記の実験モデルを用いてエストラジオ-ル投与時のGnRH分泌パタ-ンを調べたところLHサ-ジの開始と一致する明暸なGnRH分泌の上昇が観察され、LHサ-ジはGnRHサ-ジによって引き起こされることが明かとなった。
メチオニン生合成の個体統御と種子への蓄積制御の包括的解明

植物においてメチオニン生合成の鍵段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は,アロステリック酵素ではなく,遺伝子発現の段階でフィードバック制御される。すでに,CGSをコードするCGS1遺伝子の発現が,メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニンに応答した特異的な翻訳停止と,これと共役したCGS1 mRNA分解による発現抑制によるフィードバック制御機構を報告している。しかしながら,もし,合成されたCGSタンパク質の安定性が高ければ,翻訳停止とmRNA分解による制御は重要ではないということが考えられる。CGS1遺伝子は核にコードされるが,葉緑体に移行して機能する。CGSタンパク質の分解がもともと早く,不安定であれば,翻訳停止とmRNA分解による制御が意味を持つが,生物学的には効率が悪い。そこで,葉緑体移行後のCGSタンパク質の分解によるフィードバック制御の可能性を考えた。上記の遺伝子発現段階でのフィードバック制御では,S-アデノシルメチオニンがエフェクターとなるが,細胞にメチオニンを投与すると,速やかにS-アデノシルメチオニン濃度が高まると考えられていることから,メチオニン投与実験を行うことで,メチオニンとS-アデノシルメチオニンのいずれがエフェクターであっても,投与の効果を検出できると期待される。CGSタンパク質の分解産物と思われるバンドが多数検出されたが,メチオニン投与によるシグナル強度の違いはみられず,また,栽培条件およびタンパク質の抽出条件により異なることから,非特異的な分解が生じているものと考えられた。一方,葉緑体移行後の全長CGSタンパク質と考えられるシグナルは,メチオニン投与によって減少することを見出した。また,このメチオニン応答は,明暗条件で異なることが見出された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。メチオニンの非天然アナログ化合物であるエチオニンは,δ位のS-メチル基の代わりにS-エチル基を持つ。エチオニンは,様々な酵素反応において,メチオニンと間違えて使われることにより毒性を示し,植物では発芽直後に生育が阻害される。一方,遊離メチオニンを過剰に蓄積する変異株では,外から与えたエチオニンを“薄める"ことで,その毒性を弱めるため,エチオニンに耐性を示す。酵母やシロイヌナズナにおいて,エチオニン耐性変異株を分離することで,遊離メチオニンを過剰に蓄積する突然変異株が得られており,シロイヌナズナにおいてはmto (methionine over-accumulation)変異と呼んでいる。エチルメタンスルフォン酸(EMS)で突然変異誘起処理を施したミヤコグサの2世代目種子をエチオニンを含む培地で発芽させ,初期の成長を観察することで,エチオニン耐性変異株の分離を行なった。約8,000粒のM2種子を播種し,五十数株のエチオニン耐性変異株候補を得た。得られた変異候補株の地上部から調製した細胞抽出液について,液体クロマトグラフ(リチウム法)を用いて遊離アミノ酸含量を測定し,野生型株の値と比較した。野生型株との比較を行なう上で,遊離アミノ酸濃度の絶対値の測定には多大の手間がかかるため,スクリーニング段階としては,複数のアミノ酸(グリシン,バリン,およびイソロイシン)とメチオニンの比を比較することとした。その結果,野生型株の数倍から十数倍の遊離メチオニン含量を示すと考えられるmto変異株候補が3株得られた。いずれの株も,メチオニン以外の遊離アミノ酸については,野生型株と大きな違いは見られず,メチオニンの生合成に特異的な変異を持つと期待される。H29年度は,これらの株についての詳細な解析を行なう。既にシロイヌナズナにおいては,mto変異として,mto1変異(シスタチオニンγ-シンターゼ遺伝子),mto2変異(スレオニン合成酵素遺伝子),および,mto3変異(S-アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子)の各変異を報告している。ミヤコグサを用いてmto変異を分離することの意義は,ミヤコグサがマメ科植物であることにある。タンパク質の合成には炭素,窒素およびイオウが必要であり,これらの栄養がバランス良く供給される必要がある。とりわけ,炭素と窒素栄養の比(C/N比)と,イオウ栄養と窒素栄養の比(S/N比)が重要であると考えられているが,含硫アミノ酸であるメチオニンの蓄積に関わる変異株はS/N比に対する応答を考える上で興味深い。我々も,シロイヌナズナの種子貯蔵タンパク質の蓄積において,S/N比が重要であることを報告している。シロイヌナズナでは窒素栄養とイオウ栄養は、ともに土壌から吸収せねばならないが,マメ科植物では,根粒菌を着生させた条件では,言わば窒素栄養の供給が約束されている。したがって,タンパク質合成におけるS/N比に応答した制御が,シロイヌナズナとミヤコグサで異なっている可能性がある。本研究で,ミヤコグサのmto変異株が分離されたことは,こうした研究を行なうための実験材料を初めて提供することとなった。加えて,エチオニン耐性による遊離メチオニン過剰蓄積変異株の分離方法が,広く植物一般に適用可能であることを示唆している。シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は,植物においてメチオニン生合成の鍵段階を触媒し,1980年代に行われた研究により,主要なフィードバック段階であることが報告されているが,その制御機構は未知であった。