hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家畜卵巣内卵母細胞の発育開始制御と体外発育法の開発

家畜の卵巣内には,卵子のもととなる小さな卵母細胞が莫大な数存在している。成体の家畜の卵巣には,これらの卵母細胞の発育開始を抑制する機構が働いており,これによって哺乳類の長い生殖可能期間が保証さていると考えられる。家畜の卵母細胞の発育開始は, FOXO3Aと呼ばれる転写因子によって抑制的に制御されており, FOXO3Aの発現を一時的に抑制すると,卵母細胞は発育を開始することが明らかとなった。また,卵巣内の発育途上の卵母細胞を1ヶ月以上の長期間にわたって体外で培養することが可能となった。研究材料として,と畜場で採取したブタおよびウシの卵巣,10日齢の仔ブタの卵巣を使用し,以下の3課題を中心に研究を実施した。1)ウシ二次卵胞の長期培養法の開発:卵巣の表層から切り出したウシ二次卵胞をコラーゲンゲルに包埋し,ウシ血清,血漿,血清アルブミンのいずれかとFSHを含む培養液中で4週間に渡って培養した。その結果,卵胞および卵母細胞の生存性は血漿を含む培養液で最も高く,卵母細胞の一部は直径約50μmから90μmへと発育した。2)成体卵巣由来原始卵胞の異種移植試験:と畜場で採取した成体のウシおよびブタの卵巣の表層から原始卵胞を多数含む組織片を切り出し,雄,雌,卵巣摘出雌の3種類のSCID(重症複合免疫不全症)マウスに6ヶ月間に渡って異種移植した。移植2ヶ月後には原始卵胞の発達は認められなかったが,移植6ヶ月後に原始卵胞の一部は胞状卵胞へと発達し,内部の卵母細胞もほぼ発育完了の直径へと発育した。対照として用いた新生仔の卵巣から採取したブタ原始卵胞は移植2ヶ月後には胞状卵胞へと発達しており,新生仔と成体の原始卵胞における発育開始の機構が異なることが示唆された。3)成体および新生児卵巣内の原始卵胞におけるFOXO3aの発現解析:ブタFOXO3aの卵母細胞における発現を明らかにした後,成体および新生仔原始卵胞における発現を免疫蛍光抗体法によって比較した。成体の原始卵胞内の卵母細胞の核にはいずれもFOXO3aの強いシグナルが観察されたが,新生仔卵巣内の原始卵胞では,卵母細胞の核で発現の見られるものと見られないものが混在していた。研究材料として,と畜揚で採取したブタおよびウシの卵巣,1020日齢の仔ブタの卵巣を使用し,以下の3課題について研究した。1)ウシ二次卵胞の長期培養法の開発:卵巣の表層から切り出したウシ二次卵胞をコラーゲンゲルに包埋し,ウシ血清,ウシ血漿,ウシ卵胞液,ウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかとFSH(0,25,50ng/ml)を含む培養液中で6週間に渡って培養した。その結果,卵胞および卵母細胞の生存性は血漿あるいはBSAを含む培養液で高く,卵母細胞の一部は直径約50μmから約100μmへと発育した。2)ブタ原始卵胞におけるKITの発現解析と異種移植:成体のブタ卵巣の表層から原始卵胞を多数含む組織片を切り出し,SCID(重症複合免疫不全症)マウスに2ヶ月間移植しても原始卵胞の発達は認められないが,1020日齢の仔ブタの卵巣から採取した原始卵胞の一部は異種移植後,胞状卵胞へと発達し,内部の卵母細胞もほぼ発育完了の直径へと発育した。両原始卵胞では,卵母細胞の発育開始に関わると考えられているKITは同様に発現していた。成体の卵巣から採取した原始卵胞を種々の条件でKITリガンド(stem cell factor)で処理後にSCIDマウスに移植したが,2ヶ月後,原始卵胞の発達は全く認められなかった。ブタFOXO3A mRNAの部分配列を決定し,siRNAを作成した。ブタLLC-PK1細胞を用いてsiRNAによるFOXO3Aの発現を低下させる条件を検討した後,成体卵巣より採取した原始卵胞を含む組織を用いてsiRNAiによる原始卵胞内の卵母細胞のFOXO3Aノックダウンを試みたところ,卵母細胞のFOXO3Aの発現が低下することが明らかとなった。家畜卵巣内の発育開始前あるいは発育途上の卵母細胞から成熟卵を生産する技術を作出するとともに,原始卵胞の発育開始機構を明らかにすることを目的として,本年度は以下の3課題について研究を進めた。研究材料としては,と畜場で採取したブタおよびウシの卵巣,1020日齢の仔ブタの卵巣を使用した。1.ブタ原始卵胞の発達開始におけるKITの役割成体のブタ卵巣の表層から原始卵胞を多数含む組織片を切り出し,KITリガンド(KL: stem cell factor)で処理後にSCID(重症複合免疫不全症)マウスに2ケ月間異種移植した。

対照として移植した仔ブタの卵巣から採取した原始卵胞の一部は移植後,胞状卵胞へと発達し,内部の卵母細胞は発育完了の直径へと発育した。一方,成体の卵巣から採取した原始卵胞の発達は全く認められなかったが,KL処理によって卵母細胞の生存性は維持された。2.原始卵胞のFOXO3AのsiRNAによるノックダウンによる発育開始制御ブタFOXO3Aに対するsiRNAを作成し,成体卵巣より採取した原始卵胞を含む組織を用いてsiRNAiによる原始卵胞内の卵母細胞のFOXO3Aノックダウンを試みたところ,卵母細胞のFOXO3Aの発現は低下した。siRNA処理後の原始卵胞を含む卵巣組織片をSCIDマウスに2ケ月間移植したところ,対照siRNAで処理した原始卵胞は発達しなかったが,FOXO3Aをノックダウンした原始卵胞の一部は二次卵胞へと発達し,FOXO3Aが原始卵胞の発達開始を抑制的に制御していることが示唆された。FOXO3Aノックダウン法の基礎的条件検討はマウスを用いて行った。また,ウシのFOXO3A mRNAの部分配列を決定し,同様な実験を開始した。3.ブタ原始卵胞の体外培養法の開発ブタ卵巣の原始卵胞を多数含む組織片を器官培養用ディッシュを用いて1週間培養し,培養液中に各種ステロイドホルモンを添加し,その作用を検討した。培養後,半数以上の原始卵胞は退行したが,エストロジェンおよびテストステロン添加により退行は抑制された。家畜卵巣内の発育開始前あるいは発育途上の卵母細胞から成熟卵を生産する技術を作出するとともに,原始卵胞内卵母細胞の発育開始機構を明らかにすることを目的として,以下の課題について研究を進めた。研究材料としては,と畜場で採取したブタおよびウシの卵巣と10-20日齢の仔ブタの卵巣を使用した。1.成体卵巣由来原始卵胞内卵母細胞のFoxo3A蛋白質のsiRNAによるノックダウン法の確立成体のブタおよびウシの卵巣の表層から切り出した原始卵胞を多数含む組織片を用いて,siRNAが卵母細胞中へ導入されることを蛍光色素で標識したFOXO3A siRNAiを用いて確認した。ブタFOXO3Aに対する2種のsiRNAを用いて,原始卵胞内の卵母細胞のFOXO3Aノックダウンを試みたところ,どちらのsiRNAによっても卵母細胞のFOXO3Aの発現は低下した。また,ウシFOXO3A mRNA配列から作成したsiRNAによって,成体のウシ卵巣の原始卵胞中の卵母細胞のFOXO3Aノックダウンを試み,卵母細胞のFOXO3Aの発現が同様に低下することを明らかにした。2.siRNAによる原始卵胞内卵母細胞の発育開始制御siRNA処理後のブタおよびウシ原始卵胞を含む卵巣組織片をSCIDマウスに移植したところ,対照siRNAで処理した原始卵胞は発達しなかったが,FOXO3Aをノックダウンした原始卵胞の一部は二次卵胞以降へと発達した。この結果は,FOXO3Aが成体の卵巣における原始卵胞の卵母細胞の発育開始を抑制的に制御していること,またFOXO3Aの発現を一時的に抑制すれば,卵母細胞に発育開始を誘導できることを示唆している。3.ウシ二次卵胞の長期培養法の開発卵巣の表層から切り出したウシ二次卵胞をコラーゲンゲルに包埋し,血漿を添加した培養液中で6-8週間培養した。培養開始時約60μmであった卵母細胞は,培養6週間後には直径約100μmへと発育したが,この実験系ではその後培養期間を延長しても卵母細胞はさらには発育しなかった。
敗血症性誘発性循環機能不全機構の細胞・分子薬理学的解明

敗血症性ショックにおけるβ受容体を介した陽性変力作用減弱が、同受容体細胞内情報伝達系のどの部位においていかなる機序により生じているかを薬理学的および分子生物学的手法を用いることにより体系的に解明する事を目的とした。NewZealand白色家兎にエンドトキシンを静注し敗血症性ショックを作成し、静注後3および6時間後の摘出右室乳頭筋を使用した。薬物はIsoproterenol(Isp),colforsin daropate(CD),dBcAMP,NOS合成阻害薬(N^G-nitoro-L-aginin:L-NNA)を使用した。薬物刺激による陽性変力作用・Adnylate cyclase(AC)活性測定、β受容体結合飽和実験、GS,Gi蛋自のWestern,Northern blot解析を施行した。これらの検討により敗血症性ショックにおいて、L-NNA前処置の影響を受けないIspによる陽性変力作用・AC活性の低下、CD,dBcAMP陽性変力作用・AC活性の保持、β受容体数・親和性の保持、Gi蛋白に著変を認めないGS蛋白量およびmRNAの減少を認めた。この結果は敗血症性ショックにおいてはNOの直接作用によらないβ受容体を介した陽性変力作用の低下があり、この機序としてGs蛋白質の転写段階からの減少によることが註明された。臨床的には、抗ショック療法としてAC刺激薬、PDE阻害薬、Ca^<2+>感受性増強薬等の有効性が示唆された。今後の研究の展望として、敗血症性ショックにおけるこのβ受容体細胞内情報伝達系の変化を惹起する、NO以外の物質の同定を行う必要があると考えられた。敗血症に見られる心筋β受容体を介した陽性変力作用減弱機構の解明を家兎を使用して検討した。Lipopolysaccharide(LPS)100μg/kgを投与してβ受容体刺激薬であるisoproterenolによる敗血症家兎乳頭筋心収縮力濃度反応曲線を得た。対照群には溶媒のみを投与した。乳頭筋標本の基礎収縮力に対照群と敗血症群の間で差を認めなかったが、LPS投与3時間後に敗血症群反応曲線が右方移動し、さらに6時間後にはその最大反応も対照群に比較して有意に低下することを確認した。この陽性変力作用減弱機序の解明のためにNitricoxide(N0)合成酵素阻害薬であるNG-nitro-L-arginine(L-NNA)前処置による濃度反応曲線の変化を検討したが両群間に差を認めなかった。受容体結合飽和実験により求めたβ受容体数および親和性も両群間で差を認めなかった。以上より敗血症では早期よりβ受容体を介した陽性変力作用が低下しており、その機序としてβ受容体数の変化、NOの関与は否定的であり、受容体とその情報伝達系の連関状態が障害されている可能性が強く示唆された。この結果に基づきG蛋白質の変化、アデニレートシクラーゼ活性の変化に関して検討中である。New Zealand白色家兎にエンドトキシンを静注し敗血症性ショックを作成し、静注後3および6時間後の摘出右室乳頭筋を使用した。薬物はIsoproterenol(Isp),colforsin daropate(CD),dBcAMP、NOS合成阻害薬(N^G-nitro-L-argi nin:L-NNA)を使用した。薬物刺激による陽性変力作用、Adnylate cyclase(AC)活性測定、β受容体結合飽和実験、Gs,Gi蛋白のWestern,Northern blot解析を施行した。

これらの検討により敗血症性ショックにおいて、L-NNA前処置の影響を受けないIspによる陽性変力作用・AC活性の低下、CD,dBcAMP陽性変力作用・AC活性の保持、β受容体数・親和性の保持、Gi蛋白に著変を認めないGs蛋白量およびmRNAの減少を認めた。この結果は敗血症性ショックにおいてはNOの直接作用によらないβ受容体を介した陽性変力作用の低下があり、この機序としてGs蛋白質の転写段階からの減少によることが証明された。臨床的には、抗ショック療法としてAC刺激薬、PDE阻害薬、Ca^<2+>感受性増強薬等の有効性が示唆された。今後の研究の展望として、敗血症性ショックにおけるこのβ受容体細胞内情報伝達系の変化を惹起する、NO以外の物質の同定を行う必要があると考えられた。
小児1型糖尿病におけるインプリント遺伝子の意義に関する研究

1型糖尿病の病因をHLA抗原遺伝子に代表される素因と環境因子の両面より検討している。(1)1型糖尿病の発症感受性遺伝子解析:HLA-DRβ鎖遺伝子、DQα鎖遺伝子、DQβ鎖遺伝子、CTLA-4遺伝子、NeuroD/BETA2遺伝子、内因性レトロウイルスIDDMK1,2-22遺伝子多型について検討した。(2)我々は日本人の多数例の解析の結果、SPIDDM群において母親が糖尿病である頻度が高く多くは2型糖尿病であることを明らかにした。これに対して発症率の高い欧米では、特に父親に糖尿病を有する頻度が高く、多くは1型糖尿病である。これ等の事実を背景にして(3)発症感受性遺伝子の両親からの伝搬について検討した。現在までに20家系について、両親、兄弟の血液か採取され、HLA遺伝子の発症感受性遺伝子がどちらの親から来ているか解析したが、家系の絶対数が不十分であった。1)DQα鎖遺伝子:感受性遺伝子である0301は19人全員に認められ、内8例はホモ接合体であった。ヘテロ接合で0301が父由来は8例、母由来は2例、不明が2例であった。2)DQβ鎖遺伝子:感受性遺伝子0401,3032は17/20例に認めた。3032/3032が2例、3032/401が2例、その他はどちらかのヘテロであった。3032は父から4例、母から1例、401は父から3例、母から5例であった。3)DRβ鎖遺伝子:405、901、802が感受性遺伝子で19/20で陽性であった。この内901/901が2例、405/901が1例、405/802が2例であった。405の父由来は4例、母由来は5例、802は父由来が3例、母由来が2例、901は父由来5例、母由来2例であった。4)CTLA-4:5歳未満発症E群では対照に比しA/Aの頻度が有意に低く、G/Gが有意に高かったが、E群が少なく。解決することは出来なかった。5)NeuroD/BETA2遺伝子:対照に比しA/Aが低く、G/Gが多い傾向が見られたが、有意ではなかった。内因性レトロウイルスIDDMK1,2-22、ENV蛋白N末端から339,510番目のアミノ酸配列の変化を伴うA→G変異についても検討したが、有意な差が見られなかった。6)今回の検討ではHLA抗原では発症感受性遺伝子が父由来は27例、母由来は17例で父親が多かった。特にE群では3032,901は父親9例、母親3例で父親が多く白人に一致した。内因性レトロウイルスIDDMK

1,2-22、ENV蛋白N末端から339,510番目のアミノ酸配列の変化を伴うA→G変異についても検討したが、有意な差が見られなかった。6)今回の検討ではHLA抗原では発症感受性遺伝子が父由来は27例、母由来は17例で父親が多かった。特にE群では3032,901は父親9例、母親3例で父親が多く白人に一致した。小児期発症1型糖尿病患者におけるIDDMK1,2-22遺伝子多型の関連についての検討1型糖尿病発症と関連が報告された、内在性レトロウイルスIDDMK1,2-22遺伝子に多型を同定し、1型糖尿病との関係を検討した。【対象】小児期発症IDDM患者を急性発症IDDM(A)(n=50)と、緩徐発症IDDM(S)(n=20)に分類し、IDDM(A)のうち発症年令が5歳未満をIDDM(E)(n=24)、正常対照(n=52)とした。【結果と考案】1)ENV領域610bp中5'末端より339および510番目の塩基にA/Gの多型を認めた。A→G変異によりスーパー抗原活性を示すENV蛋白はそれぞれTyrがCysおよびstopがTrpに変化した。2)小児期発症IDDM患者94例のうち339番目の遺伝子頻度はAが90(96)%Gが10(4)の頻度であり、510番目はA70(79)%,G 30(21)%(();正常)であり、対象と比較してGの多型の増加傾向が認められた。3)IDDM(S)では339番目のGが18%(p=0.0057)、IDDM(E)では510番目のGが38%(p=0.033)と対象と比較して有意なGの多型の増加が認められた。4)IDDMK1,2-22の2ケ所の多型とHLA DRB(0405、0901)、GAD抗体価の強い相関は認められなかった。内在性レトロウイルスIDDMK1,2-22の多型と小児発症1型糖尿病の関連を検討した結果、ENV領域610bp中5'末端より339および510番目の塩基にA/Gの多型があり、アミノ酸置換を伴っていた。この多型のGアリルと1型糖尿病の関連が認められた。中でもIDDM(S)において339番目のG、IDDM(E)において510番目のGの頻度が高い傾向が認められた。今後これらの多型がスーパー抗原活性におよぼす影響を解析すると共に、IDDM(E),およびIDDM(S)の例数を増やし、IDDMK1,2-22の1型糖尿病の感受性遺伝子としての可能性を検討する。更に、家族検索を行いこの遺伝子の遺伝様式と発症の関係について検討する。小児期発症1型糖尿病患者の発症に関わるIDDMK1,2-22遺伝子多型の関連の意義昨年までの研究で(1)活性のあるHERV-K遺伝子を単離し、IDDMK1,2-22遺伝子を特異的に増幅し、FNV領域に610bpをクローニングしてその塩基配列を決定。(2)5'末端(最初のメチオニン(Met)codon)から339(290)および510(461)番目の塩基(nt)に各々(A/G)(A/G)のアミノ酸置換を伴った塩基置換を見いだした。平成13年度はこの2つの多型の意義について検討した。1.IDDMK1,2-22のENV蛋白N末端で見いだされた2つの多型と1型糖尿病の相関。小児期発症1型糖尿病患者を次の3群に分けて検討した。(1)乳幼児発症1型糖尿病(5歳未満急性発症)(E群)、(2)5歳以上の急性発症1型糖尿病(A群)、(3)ゆっくり準行する1型糖尿病(S群)。上記A/G, A/G多型が患者群、対照群で有意な差を認めるかどうかについて検討した。この結果、E群において510番目のG/Gホモの頻度が対照に比し有意に高いことを明らかにした(J Hum Genet 46:712,2001)。その意義をさらに確実にするため、E群の症例を増やし、現在解析中である。
ブラシカ作物の種子春化・緑体春化機構の解明と緑体春化型ハクサイの育成

セイヨウナタネの49系統の春化特性を調査し,イスズナタネ(春化要求性,低い)×合成ナプス(春化要求性,強)のF2集団育成した。また,ハクサイの第2染色体の上端にキャベツ由来の開花抑制遺伝子BoFLC2領域を導入した系統(以降,育成ハクサイ系統という)を育成したほか,キャベツ,ハクサイにおける, BrFLC1/2/3の発現量の多様性が春化要求量の多様性と関連性がある可能性を示した。また,RNA-seq解析では,BoFLC2座において低温処理によってlncRNAの発現が誘導されることを示した。育成ハクサイ系統は元品種のハクサイ品種比べ高い晩抽性を示し,育種母本として利用できることが示された。1.緑体春化型ハクサイのゲノムde novoシークセンスデータからキャベツ由来の導入染色体部分(置換)を明らかにするためのコンピューターソフトを構築した。それを用いてハクサイのAゲノムバックグラウンドへ導入されたキャベツ由来染色体部分を同定できた。2.発現解析では,ハクサイ,キャベツ,緑体春化型ハクサイ,3系統の13葉展開個体を用いて,低温処理前,後,低温処理後室温で2週間育てた区の3つの処理区から,本葉由来のmRNAを用いてFLCなど開花関連遺伝子の発現解析をq-PCRで実施した。その結果,ハクサイのBrFLC2は低温処理によって低下調節され,その後,発現は低下したままであったが,キャベツのBoFLC2および緑体春化型ハクサイにキャベツから導入されたBoFLC2は低下調節されなかった。いくつかあるFLCホモログのうち,キャベツではBoFLC2が花芽抑制遺伝子と考えられているので,緑体春化型ハクサイの開花習性に導入されたBoFLC2の発現が関係していることが示唆された。3.キャベツDH系統・MP-22を用いて9葉齢、11葉齢,13葉齢、14葉齢の4ステージの植物体について,非低温処理下でのBoFLC1,BoFLC2,BoFLC4の発現レベルを,RNAseqにより分析したが,3つのFLCホモログの発現レベルには4ステージで変化がなかった。今後,低温処理後の発現解析を行う。4.エピゲノム解析では,ハクサイの低温処理前後において、BrFLC領域のH3K27me3の状態についてクロマチン免疫沈降法により調べた。その結果、BrFLC1、2、3については、全て春化処理により発現が抑制され、かつ、H3K27me3の蓄積が見られた。以上の結果から,ハクサイではシロイヌナズナ同様、春化処理により、H3K27me3が蓄積することでFLCの転写が活性型から抑制型へと変化することが示された。初年度に予定していた遺伝解析材料の準備,緑体春化型ハクサイのde noveシークエンス解析,q-PCRによる開花関連遺伝子の発現解析の一部,エピゲノム解析の一部を実施できたので,所期の目的を達成していると判断した。28年度には,1)種子春化型×緑体春化型ハクサイの交雑ならびに種子春化型自然ナプス×緑体春化型合成ナプスの交雑から育成したそれぞれのF2集団を用い,春化特性を決定している遺伝機構についてQTL解析を行う。2)ハクサイのAゲノムバックグラウンドへ導入されたCゲノム染色体断片(A2染色体に導入されているのは確認済み)の領域サイズを異にする種々の緑体春化型ハクサイ系統を用い,導入されたCゲノム染色体断片上に位置する遺伝子の効果を見る。3)キャベツ,緑体春化型ハクサイについて,低温処理前と処理期間中にわけて,LEY,FLC,FTオルソログならびにBoFLCをターゲットにするsRNAやnon-coding RNAの発現を,q-PCRあるいはRNA-seqで解析する。4)エピゲノム解析では,種子春化型ハクサイと緑体春化型ハクサイを用いて,春化前のクロマチン修飾状態と春化後のクロマチン修飾状態をヒストンのリジン残基(H3K4me2、H3K9me2、H3K27me3、H3K36me3)について調査する。植物育種学
鳥の道具使用における視覚機能の解明に向けた眼球運動の非侵襲計測法の開発

本研究では、カラスの道具使用の運動要素である頭部到達運動の感覚運動メカニズムの解明を3つの点で行った。1頭部到達運動の高速撮影画像から眼球運動の計測を試みた。到達運動中の眼球運動は示唆されたが、高精度計測には至らなかった。2整形樹脂でクチバシを人工延長し、ついばみ運動をカラスとハトで比較した。カラスは直ちについばみ運動を調整したが、ハトはできなかった。3プリズムを用いて視野をずらし、ついばみ運動をカラスとハトで比較した。ついばみ運動軌道の誤差相関は、カラスでは、ごく微小時点間でのみ生じたが、ハトではほぼ全時点で相関した。以上から、カラスは頭部運動中に視覚による運動調整を行うことが示唆された。カレドニアカラスは、小枝や葉をクチバシで咥えて操作し採餌する。ここには鳥固有の身体形態に由来する感覚-運動上の問題がある。眼とクチバシが共に頭部にあるゆえ、道具を操作するために頭部が動くと視界が乱れ、標的を安定して視野内に捉える補償作用を要するという問題である。カラスがどのようなメカニズムでこの問題を解決しているのか不明である。本研究は、カラスの道具使用における感覚-運動協調について、その計測技術の開発とともにそのメカニズム解明を目指す。平成29年度は、道具使用を構成する基盤的運動として、餌のついばみ到達運動をモデルとした行動課題の立ち上げと運動学的解析法を確立し、その感覚-運動協調メカニズムをハトとカラスで比較検討した。道具使用が延長された身体の操作であることに着目し、歯科用セメントで着脱式の人工クチバシを作り、ハトとカラスに装着することでクチバシを約30%延長するという操作を行った。装着前、装着中、離脱直後、離脱1週間後の計20日間にわたり、床の餌をついばむときの頭部とクチバシの運動を高速ビデオ撮影し、運動解析を行った。結果、カラスは、延長クチバシ装着直後のみ、餌取得成功率が下がったが、それ以外の期間は影響が生じないクチバシ延長への早い順応が確認された。一方、ハトは、装着中一貫して、餌取得成功率の顕著な低下がみられ、離脱直後も回復が遅かった。詳細な運動学的解析によって、カラスはクチバシ延長によって早く餌に到達する影響を、クチバシ開口を早めることで補償する柔軟性が見られ、離脱後は直ちに元の運動に回復した。一方ハトは、クチバシを早く開ける補償作用が十分に機能していないように見えたものの、離脱後にはクチバシを早く開けすぎる運動の残効が確認された。これらの結果から、身体延長に対する順応性はハト、カラスともに備わっているが、両者のメカニズムは異なる可能性が示唆された。眼球運動測定技術の開発に想定以上の時間を要しているものの、有効な行動課題の立ち上げと運動学的解析の方法を確立できた点は計画通りに進めることができている。さらに、確立した行動課題を用いてハトと比較することでカラスの感覚運動協調のメカニズムの一端を明らかにできた点は当初計画より進んだ点である。したがって、研究全体としては順調に進んでいる。カレドニアカラスは、小枝や葉をクチバシで咥えて操作する道具使用採餌を行う。この行動には鳥固有の身体形態に由来する感覚-運動上の制約がある。眼とクチバシが共に頭部にあるため、道具操作に伴って頭部が常に動き,視界外乱を避けられない。カラスの採餌は,標的を安定して視野内に捉え操作するための補償機構を備えているはずである。本研究は、カラスの道具使用における感覚-運動協調機構の解明を目指す。前年度に実施したクチバシ延長に対するついばみ運動調整メカニズムの検討を土台に,2017年度は、道具使用を構成するもう1つの基盤的運動である視覚性制御機構の検討を試みた。視野を約40度右へずらすプリズム眼鏡をカラスとハト用に作成し、ついばみ到達運動に対する視野偏移の影響を行動レベルで調べた。カラスおよびハトを対象に、前方に提示された餌小片をついばむ行動を高速ビデオで撮像し、プリズムの装着前、装着直後、装着中、脱着後について、その運動軌道を比較検討した。その結果、ハトのついばみ運動軌道は、プリズムによる視野偏移の方向にずれ、運動開始から終了までの逐次偏移は一貫して相関していた。このことは、ハトのついばみ運動軌道は、運動開始時点の視覚情報に規定され、運動中の視覚情報は殆ど寄与しない、フィードフォーワード制御であることを示唆する。一方、カラスのついばみ運動軌道は、プリズムによる視野偏移の方向にずれる傾向が観察されたものの、その程度は非常に小さく、開始時から終了時までの逐次偏移の相関は弱かった。このことは、カラスのついばみ運動軌道は、運動開始時点の視覚情報に依拠せず、運動中の視覚情報を用いて調整されるオンラインフィードバック制御であることを示唆する。これらの結果から、カラスの道具使用に伴う頭部運動と連動した視界外乱の問題は、視覚性のオンラインフィードバック制御による補償機構が関与していることが示唆された。

3プリズムを用いて視野をずらし、ついばみ運動をカラスとハトで比較した。ついばみ運動軌道の誤差相関は、カラスでは、ごく微小時点間でのみ生じたが、ハトではほぼ全時点で相関した。以上から、カラスは頭部運動中に視覚による運動調整を行うことが示唆された。平成28年度に開発した頭部・クチバシの到達運動課題を土台に、引き続き高速ビデオ撮影データをもちいた眼球画像処理による眼球運動の追跡・再構築の技術を立ち上げながら、それと並行する形で、プリズムを用いた視野変動技術を導入し、延長された身体マップ(クチバシ)とどのように補償・統合されるかを明らかにすることで、感覚-運動の協調メカニズムをさらなる解明を進める。比較認知心理学高速ビデオカメラのコントラスト向上のための赤外線照射器および高速ビデオカメラの追加購入を予定していたが、実験装置の光条件および壁・床の色と素材の改変などの消耗品レベルでの工夫によって、当該器の導入が不要になったことで、計画していた運動解析に耐えうる精度の頭部運動データの取得が可能になったため、当初予定していた物品費の購入が不要になった。計画していた以上の早さで行動課題の立ち上げと感覚-運動協調メカニズムの解明が進んだため、当初は予定していなかった視覚および運動場の外乱を操作できる段階にまで大きく実験条件とその理解を進めることができた。これをベースに、H29年度には視覚順応操作のためのプリズム装置作成、および、運動場操作のための磁場発生装置の導入に相当額の使用を計画している。
正浸透(FO)膜処理プロセスにおける膜ファウリング物質の特性解析

本研究では、都市下水及び海水を膜ろ過原水とする正浸透(FO)膜ろ過プロセスにおける膜ファウリング原因物質の特性をした。いずれの場合においても、微生物由来の高分子有機物(いわゆるバイオポリマー類)が主要な膜ファウリング原因物質であった。下水処理プロセスの検討においては、下水中に含まれるバイオポリマー類が模擬物質(アルギン酸ナトリウムなど)と比較して膜ファウリング発生ポテンシャルが高いことが明らかとなった。また、海水淡水化プロセスの検討では、膜ファウリング発生ポテンシャルは有機物の総量からでは説明できないことを見出した。本年度は、正浸透(FO)膜の活性層をドローソリューション(DS)側へ接触させた場合(AL-DS)における膜ファウリングについて、膜内部における膜ファウリング物質分布に着目しながら検討を行った。膜ろ過試験は、市販のFO膜(CTA-NW及びCTA-ES、ともにHydration Technology Innovation社製)を使用し、代替膜ファウリング物質であるアルドリッチフミン酸(AHA)を溶解させた溶液を原水として実施した。AHAは、当初想定していた代替膜ファウリング物質(アルギン酸ナトリウム及びウシ血清アルブミン)と比較して、膜ファウリングを引き起こしやすい特徴を有していることが、予備検討にて判明したため、本検討においてはAHAに焦点を絞って検討を実施した。また、カルシウムの共存が膜ファウリングに及ぼす影響を検討するため、カルシウム存在下及び非存在下における膜ファウリング試験を実施した。同時に、膜ファウリング試験終了時に膜洗浄試験を実施し、膜表面洗浄による膜透過性能回復度も評価した。カルシウムイオンの有無が膜ファウリングに及ぼす影響に関しては、用いたFO膜はいずれもカルシウムイオンの存在下において、膜ファウリングがより速やかに進行することが明らかとなった。閉塞膜の断面を観察したところ、カルシウム非存在下においてはAHAはFO膜の支持層全体に広く分布していたのに対し、カルシウム共存下においては、AHAは支持層表面に集中して分布していた。これらの結果は、支持層内部に侵入したAHAは大きな膜ろ過抵抗となっていなかったのに対し、膜表面に蓄積したAHAは膜透過性能の低下に大きく寄与していたことを示唆するものである。本研究課題では、正浸透(FO)膜ろ過プロセスにおいて実際に膜の閉塞(膜ファウリング)に関与する有機物群を特定することを目的としているが、研究開始当初想定していた膜分離活性汚泥法(MBR)処理水のFO膜処理はシステム全体としての競争力に乏しいことから、最終年度においては、より現実性が高いと考えられる都市下水の直接FO膜ろ過及びFO膜を用いた海水淡水化過程における膜ファウリング原因物質の特性解析を実施した。実都市下水及び実海水を原水とする連続膜ろ過試験を実施し、試験終了後の閉塞膜より回収した膜ファウリング原因物質の特性解析を実施したところ、膜ろ過原水中においては必ずしも支配的ではなかった微生物由来の有機高分子(いわゆるバイオポリマー類)が膜ファウリング原因物質中においては主要な構成成分となっていたことを明らかにすることができた。また、実下水を用いた膜ろ過試験においては、従来FO膜ろ過プロセスではほとんど発生しないと指摘されていた、物理洗浄で解消することのできない物理的に不可逆的な膜ファウリングが発生することも明らかとなった。このような知見は、従前より精力的に実施されてきた代替物質(ウシ血清アルブミン、Aldrich社製のフミン酸、アルギン酸ナトリウムなど)を用いた実験では解明することができなかったことであり、新規性の高い有用な知見であると考えている。本研究の最終目的は実際にFO膜ろ過プロセスが適用される可能性のある場面を想定し、そこで膜ファウリングに関与し得る有機物の特性に関する情報を取得することである。実下水への直接FO膜ろ過の適用に関しては、実用化に向けた検討を視野に入れることができるような性能も得られていることから、研究期間全体を俯瞰した場合、現実性のある膜ファウリング原因物質の特性解析を実施することができたという観点で、当初の目標を達成することができたと判断している。水処理工学本年度は、代替膜ファウリング物質を使用した検討を実施した。当初計画においては、実河川水を始めとする実液系との比較を実施する予定であったが、代替膜ファウリング物質を用いた膜ファウリング現象について、当初予定していたよりもさらに踏み込んだ解析を実施することができる見込みが立ったため、AHAを用いた検討を継続した。結果として、実液系との比較検討は実施できなかったが、AHAを用いた際の膜ファウリング現象に関して、より詳細な知見を得ることができたことから、研究の進捗状況としては概ね順調であると判断される。また、本年度確立した、膜断面観察技術等については、次年度実施する実液系の実験においても適用することが可能であることからも、本年度の検討が有益であったことが明らかである。

今年度、代替膜ファウリング物質を使用した実験を概ね完了させることができたことから、今後は、実河川水や実下水処理水等、FO膜の適用が実際に想定される原水を用いた試験に取り掛かる予定である。実河川水としては、神戸市内の浄水場より、実際の水道原水を採水することを予定している。浄水場担当者とはすでにコンタクトを確立しており、詳細な採水方法やスケジュール等の調整を開始している。実下水処理水としては、実際の下水を処理するMBR処理水を想定している。本年度、神戸市内の実際の下水処理場内にベンチスケールのMBRを立ち上げており、本装置より処理水を採水する予定である。立ち上げたベンチスケールMBRはすでに安定した連続運転ができる状況となっており、採水の準備は整っていると判断される。今後は、これらの実原水を用いた実験を実施し、今年度得られた知見と比較することによって、FO膜における膜ファウリング現象の解明や代替膜ファウリング物質を用いた実験を実施することの意義について、検討を進めていく予定である。FO膜ろ過装置については、当研究室で所有している物品の中で遊休品が生じたことから、当該研究に流用することが可能であった。また、原水送水用のポンプについても、当研究室の遊休品で代替することができるものであった。さらに、当初想定していた実液系の実験についても、次年度に実施することとしたことから、実液系における実験において必要となる予定だった有機物分析装置についても現段階では費用発生はしていない。これらの装置購入費が減額となった分、次年度使用額が生じた。次年度においては、実液系を用いた実験に取り掛かる予定であることから、実液系での実験にて必要となる有機物分析装置は当初の予定通り購入する予定である。また、当初想定していなかった水質分析装置(COD測定装置)も購入する必要性が生じた。さらに、次年度実施する予定である実液系の実験においては、複数の実験を並行して実施する必要が生じることから、実験設備の追加購入が必要となる可能性も高い。今年度、研究室内遊休品を流用することで生じた減額分は上記機器の購入分にて執行される予定である。
エネルギースペクトル可変中性子照射場の開発に関する研究

本研究は、炭素線治療を受けた患者の医療被ばくの原因となる二次中性子に着目したものである。特に、2次がんリスクモデル構築に不可欠な生物実験を実現するためにエネルギースペクトル可変中性子照射場の概念設計と実験的検証を行う。平成30年度においては、29年度に構築したモンテカルロシミュレーション計算システムを用いて、量子科学技術研究開発機構、放射線医学総合研究所(放医研)重粒子線がん治療装置(HIMAC)治療室内、患者位置の中性子エネルギースペクトルを再現する中性子生成ターゲット及び減速フィルターの設計を行うとともに、モンテカルロシミュレーションの実験的検証に必要な照射場の整備を行った。モンテカルロシミュレーションの結果より、研究課題提案時に想定していた体系に比べ、より簡便にHIMAC治療室内の中性子エネルギースペクトルを再現可能なことを明らかにした。また、これまで実施したモンテカルロシミュレーションの実験的検証によって、シミュレーション計算で示唆された中性子エネルギースペクトルの可変性が確認できたが、平成31年度においても継続し検証を進め、当初の予定通り、シミュレーション計算にフィードバックした設計の実施を行う。当初の予定通り、放医研HIMAC治療室内にシミュレーション計算の実験的検証を行う照射場を構築し、中性子エネルギースペクトル測定、線量測定、線質測定を実施した。平成30年度に開始した測定を継続し進めるとともに、それらの結果をシミュレーション計算にフィードバックした設計を実施する。また、これまで炭素線治療場に対して検討を行ってきたが、本方法により汎用性を与えるための検討を行う予定である。放射線治療では潜在的に治療部位以外にも放射線が照射されるため、治療後の晩発影響リスク(特に二次がんリスク)が存在する。X戦地領については治療患者の疫学研究を基に線量と二次がんリスクの関係を示唆する研究結果が報告されている。近年普及が進んでいる陽子線や炭素線を用いた粒子線治療についても患者の被ばく線量評価が行われているが、X線治療では存在しない高エネルギー中性子や高LET荷電粒子の影響などにより、線量リスクモデルを用いた定量的評価は実現できていない。本研究では、炭素線治療場で生成される中性子に着目し、2次がんリスクモデル構築に不可欠な生物実験を実現するためのエネルギースペクトル可変中性子照射場の概念設計及び実験的検証を行う。平成29年度においては、モンテカルロシミュレーションのための計算システムの構築を行い、中性子エネルギースペクトルのターゲット依存性、角度依存性をモンテカルロシミュレーションを用いて取得した。また、炭素線治療室で評価された中性子エネルギースペクトルが持つ3つのピークの中で、熱中性子を除いた数MeV, 100 MeV付近のピークに着目して、それらのピークの比率を変更させる方法をモンテカルロシミュレーションを用いて明らかにした。次年度において、シミュレーション計算の実験的検証のためにターゲット及び減速フィルターの設計を行う予定である。実際の照射場において、中性子エネルギースペクトルをより簡易的に可変させるための工学的検討をモンテカルロシミュレーションとともに進め、実験的検証も開始する予定である。提案した方法が実現可能であることをモンテカルロシミュレーションにおいて実証した。計画時にはより複雑なターゲット、減速フィルターの組み合わせを検討することで、より精密な模擬照射場を構築可能と考えたが、ターゲット、減速フィルターの加工の複雑さや実験的検証における不確かさを考慮し、より単純なターゲット、減速フィルターの組み合わせを検討することを優先したため、計画した最適解を求める手法の確立は行っていない。中性子エネルギースペクトルをより簡易的に可変させるための工学的検討をモンテカルロシミュレーションとともに進める。設計したターゲット及び減速フィルターの設計、加工を行い、それらを用いた実験的検証を重粒子線加速器を用いて開始する予定である。今年度の計画通り、ワークステーション1台の購入のみの使用である。生じた次年度使用額は購入金額の端数と考えており、特段の理由はない。次年度、計画している物品購入時に使用予定である。本年度までに実験的検証のための中性子照射場の整備を行い実験的検証を開始したところであるが、そららの実験的検証結果を基に、中性子生成ターゲットや減速フィルターの追加工等や必要となる実験装置の整備を進めることが必要であると判断した。そのため、次年度においては今年度同様、実験的検証に必要な物品の購入及び研究成果の発表のために助成金を使用する予定である。
歯痛が口腔粘膜(口唇・舌・頬粘膜・歯肉)の血流に及ぼす影響

歯髄は感覚神経の豊富な組織で、痛みが強烈なことから臨床において歯髄の痛みを主訴として来院する患者は多い。近年、感覚神経は求心性に興奮を中枢に投射する第一義的な機能の他に、神経終末でサブスタンスPなどの神経伝達物質を放出することにより支配領域の血管拡張を引き起こすことが明らかにされている。しかしながら歯髄の痛みが口腔の他の組織にどのような影響を及ぼすかについてはこれまで明らかにされていない。そこで、今回は感覚神経の密度が高い歯髄を刺激することにより口唇、舌、頬粘膜、歯槽歯肉および口蓋歯肉などの口腔諸組織に及ぼす影響を血流を指標として検討した。その結果、1.上顎犬歯の電気刺激により刺激側と同側の口蓋粘膜、上下顎歯肉、頬粘膜、舌、および下唇などの遠隔部の口腔粘膜に血管拡張反応が観察された。口蓋粘膜では刺激側と同側のみならず反対側においても血管拡張反応が得られた。2.歯髄刺激によって生じる口腔粘膜の血管拡張反応は、自律神経節遮断剤であるヘキサメソニウムの静脈投与により投与前と比較して有意に抑制されたことから、その血管拡張反射に副交感神経が関与することが示唆された。3.同一条件での歯髄刺激によって生じる血流増加量(%)は組織間で有意差がみられ、刺激と同側の口蓋粘膜および下唇では上下顎歯肉、頬粘膜および舌と比較して有意に大きな反応が得られた。今後、この反射の遠心路として解剖学的に考えられる顔面および舌咽神経を延髄レベルで切断等することにより反射ルートについて詳細に検討したいと考えている。
システム制御化された多機能性リポソームの構築：放出機能と運動機能

リポソーム1固体の制御から複数リポソーム(多数コンパートメント)の制御へと研究を発展させるため、膜の融合システムを完成させた。光応答性界面活性剤を用いて膜のstretch状態を光でコントロールする実験系を設計し、光で膜張力を増加させることで、膜の融合現象(FusionおよびHemifusion状態)を創り出した。膜内のコレステロール濃度および温度をパラメータとする相図を構築し、FusionおよびHemifusionに必要な条件を明らかにした。さらに、顕微鏡実験により膜張力の増加量を見積り、物理化学的メカニズムを膜の弾性エネルギーにより説明した。また、分子要素の膜への装着・システム制御化の基本メカニズムを理解するため、膜界面に粒子を吸着させ、膜面上における粒子の拡散および透過現象のダイナミクスを解析した。顕微鏡像の画像解析から、粒子運動の平均二乗変位を測定した。拡散係数の粒子サイズ依存性を明らかにし、理論モデルとの比較を行った。実験結果をフィッティングすることで得られた膜粘性の値は、過去の測定値と良く一致した。そして、粒子と膜の吸着力をコントロールして膜による包装状態を変化させると、膜に包まれた高吸着状態の粒子は小さい拡散係数を示すことを発見した。さらに、膜が出芽変形したくびれ部位に粒子が局在化し、異常拡散性を示すことも分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。DNA等の分子部品をリポソームに実装したアメーバー型分子ロボットを自在に制御するため、リポソーム構造ダイナミクスの操作技術およびリポソーム膜面への分子装着に関する研究を行った。リポソーム操作技術として、光による膜融合コントロール系の開発を推進させた。光応答性界面活性剤を用いて膜張力の増減をコントロールすることで、融合システムを構築し、膜の自由エネルギー計算により融合の中間体(融合ポア)の安定性について説明した。そして、膜組成や光照射強度をパラメータとする相図を構築し、最適な制御条件の探索を行った。また、リポソーム膜への分子吸着に関しては、膜小胞のサイズに依存して内部のDNA分子が膜への吸着・脱吸着やfolding・unfolding状態を変化させる分子システムを設計した。また、膜面に吸着したナノ粒子の運動解析を行い、膜変形と粒子運動の協同的効果が異常拡散現象を誘起させることを発見した。さらに、膜面への分子モーターの装着を行い、流動性のある膜上における細胞骨格分子・微小管の運動解析を行った。膜面の組成(流動性)を変化させることで、運動スピードおよび直進性を制御することに成功した。また、運動する2つの微小管が衝突すると、運動方向が揃う現象が観察された。今後、これらの微小管の集団運動を膜面へフィードバックさせ、アメーバ機能を備える分子ロボットを設計する。リポソーム融合の操作技術開発および、DNA、ナノ粒子、分子モーター等のゲスト分子群のリポソーム膜面への装着実験が着実に進展している。先ず、膜融合・ポア形成の光制御系を確立する。制御パラメータの確定および数理モデル化により技術基盤を整える。そして、分子ロボットの感覚・知能を担う核酸分子との相互作用実験に移行する。また、分子要素の膜への装着・システム化として、分子モーター・ナノ粒子の膜上運動のパターン解析を進め、システムを制御する物理原理を明らかにする。
ヒト成体由来細胞を用いた歯周組織の組織工学的再生

歯周疾患により失われた歯肉および歯槽骨を成体由来細胞、増殖因子、マトリックスの三者を用いて組織工学的に再生させることを目的とした。とりわけ、細胞供給については少量の組織片から培養操作を経てシート状の大きさに拡大することにより初めて臨床応用が可能となった。具体的には歯肉組織片から上皮細胞と線維芽細胞に分離・培養して培養上皮シートと培養線維芽細胞シートを完成させた。また骨膜組織片から培養骨膜シートを完成させて、すでに報告済みの多血小板血漿(PRP)とハイドロキシアパタイト(HAp)顆粒混合物に被覆する形で歯槽骨欠損部に臨床応用を行った。基礎的研究成果として、培養上皮シートの細胞挙動、動物製剤を含まない培地で歯肉スポンジを培養する方法、骨芽細胞・歯根膜細胞における肝細胞増殖因子(HGF)の作用、細胞外ATPおよびATPγSの歯根膜細胞増殖に対する作用について検討した。臨床的研究成果として、培養線維芽細胞シートを従来の結合組織移植片の代替物として用い露出根面の歯肉被覆に成功した。培養骨膜シートを多血小板血漿(PRP)とハイドロキシアパタイト(HAp)顆粒混合物と用いることで、骨再生が飛躍的に向上した。今後、臨床研究については細胞プロセシングセンターでの培養を規格化し培養骨膜シートの症例数を増やしてかつ長期的予後を観察することで先進医療として申請したい。基礎的研究に関しては、さまざまな足場材料を検討するとともに細胞の播種方法に多血小板血漿やヒアルロン酸を応用することで細胞の更なる高密度の培養を図る予定である。1.培養骨膜シートについては、患者の下顎大臼歯頬側部の付着歯肉直下の骨表面より、5mmx5mmの骨膜小片を採取後、直ちにウシ胎児血清(10%)、抗生物質(1%)、アスコルビン酸(25μg/ml)を含むMedium199にて培養シャーレ上で6週間培養してシート状構造物を作成することに成功した。PRP+HA複合体の調整については、これまでに確立した方法に従って調整をした。すなわち、患者末梢血8.5mlから2回の遠心分離により0.6mlのPRPを調整し、このうちPRP 0.3mlにつき、0.1gのアルギン酸ナトリウムを添加して活性化し、0.5mgのHAと混和させた。現在、ヒトの骨内欠損に対して、培養骨膜シート+PRP+HAを移植し、その臨床的有効性について検討中である。2.培養骨の作成については、in vitroで以下の実験を行った。気孔率70%のハイドロキシアパタイト(HA)多孔体ブロック試料(20x10x3mm)を使用し、細胞はヒト骨芽細胞様細胞株MG63を用いた。培養は、10%FCSを含むDMEMあるいはαMEMを培養液としてCO_2インキュベータと回転培養器を併用した。気孔中での細胞の増殖は、試料断面をCrystal Violet染色後、画像解析により評価した。HA多孔体を酸処理した場合、細胞の深部気孔への到達とそこでの増殖が顕著に促進された。フラスコ中での静地培養に比較して、閉鎖系での回転培養は多孔体深部での細胞生存率を向上させた。また、画像解析をする際、多孔体を薄切するよりは、ある程度の暑さをもたせたまま、焦点深度の深い画像を得るほうが有用であった。今後の展開として、1はさらに臨床症例数を増やして臨床比較研究まで発展させて有効性を明らかにしたい。2については実験動物(ヌードマウス)の背部に移植し、経時的に移植骨の正着および石灰化の状況を観察していきたい。1.培養骨膜シートについては、患者の下顎大臼歯の付着歯肉直下より、5mm x 5mmの骨膜小片を採取後、直ちにウシ胎児血清、抗生物質、アスコルビン酸を含む

Medium199にて6週間培養してシート状構造物を作成することに成功した。歯周病骨内欠損を有する患者27症例に対して、多血小板血漿+ハイドロキシアパタイト複合体とともに培養骨膜シートを移植して臨床効果を検討した。6か月予後において、培養骨膜シートを用いない多血小板血漿+ハイドロキシアパタイト複合体投与群と比較して有意に歯槽骨の再生と付着の獲得が認められた。2.培養骨の作成については、in vitroで以下の実験を行った。これまで表面を酸処理した気孔率70%のハイドロキシアパタイト多孔体ブロック試料に、ヒト骨芽細胞様細胞株MG63を播種してCO_2環境下で回転培養したところ、細胞の深部気孔への到達とそこでの増殖が顕著に促進された。新たな担体として、ポリ乳酸ニットを用いて歯根膜細胞の3次元培養を試みた。ポリ乳酸ニットにアテロコラーゲンゲルを塗布することにより細胞数が飛躍的に増加した。これよりポリ乳酸ニットも培養骨の担体として有望であることが示された。今後の展開として、1はさらに臨床症例数を増やしてかつ長期的予後を観察することで臨床比較研究として発展させてこの治療法の有効性を明らかにしたい。2に関して、ハイドロキシアパタイト多孔体ブロック試料については実験動物の背部に移植し、経時的に移植骨の正着および石灰化の状況を観察していく予定である。ポリ乳酸ニットについては細胞の播種方法に多血小板血漿やヒアルロン酸を応用をすることで細胞のさらなる高密度の培養を図る予定である。1.培養骨膜シートについては、患者の下顎大臼歯の付着歯肉直下より、5mmx5mmの骨膜小片を採取後、直ちにウシ胎児血清、抗生物質、アスコルビン酸を含むMedium199にて6週間培養してシート状構造物を作成することに成功した。歯周病骨内欠損を有する患者30症例に対して、多血小板血漿+ハイドロキシアパタイト複合体とともに培養骨膜シートを移植して臨床比較研究を行った。12か月予後において、培養骨膜シートを用いない多血小板血漿+ハイドロキシアパタイト複合体投与群と比較して有意に歯槽骨の再生と付着の獲得が認められた。2.培養骨の作成については、これまで表面を酸処理した気孔率70%のハイドロキシアパタイト多孔体ブロック試料に、ヒト骨芽細胞様細胞株MG63を播種してCO_2環境下で回転培養したところ、細胞の深部気孔への到達とそこでの増殖が顕著に促進された。細胞の進入したハイドロキシアパタイト多孔体ブロックとポリ乳酸ニッ下試料を実験動物の背部に移植し、経時的に移植骨の正着および異所性石灰化の状況を組織学的に観察したところ類骨を思わせる石灰化様構造物が認められた。今後、1については症例数を増やしてかつ長期的予後を観察することで先進医療として申請したい。2に関して、細胞の播種方法に多血小板血漿やヒアルロン駿を応用することで細胞のさらなる高密度の培養を図る予定である。
皮膚アレルギー疾患における神経とマスト細胞の相互作用とその制御

皮膚アレルギー性疾患における神経の役割の役割を明らかにするため、サブスタンスP刺激により皮膚マスト細胞から放出されるヒスタミン、LTB4およびTNFαの動態とマスト細胞の分化・増殖機序について研究した。手術材料より得られたヒト皮膚組織をサブスタンスPで刺激すると、すべてのドナー由来の皮膚組織からヒスタミンが遊離されたが、LTB4およびTNFα遊離については各々36.4%および80%の皮膚ドナー組織からのみ明らかな遊離が誘導された。また皮膚組織をステロイドまたはMAPキナーゼ(ERK)阻害剤により前処理すると、ヒスタミン遊離は影響を受けることなくTNFα遊離が抑制された。さらに運動、発汗、緊張などにより誘導される蕁麻疹において、皮疹出現とともに脳波異常が現われる症例を見出し、脳幹レベルでの中枢神経活動が皮膚アレルギー様症状と連動し得ることを明らかにした。次にヒト皮膚マスト細胞を刺激した際に見られる活性物質遊離パターンの多様性を解析するため、マウス骨髄由来培養マスト細胞をSCF、あるいはNIH3T3線維芽細胞存在下に培養し、サブスタンスPに対する応答獲得機序、および細胞増殖機序について研究した。マウス骨髄由来マスト細胞は、SCF存在下に培養するとサブスタンスP刺激に反応してヒスタミン遊離を起こすことなくLTB4を遊離し、SCF受容体(c-kit)に変異を持つマスト細胞を線維芽細胞と共に培養すると、逆にLTB4遊離を起こすことなくヒスタミン遊離を起こすようになった。このLTB4遊離は抗アレルギー薬およびMAPキナーゼ(ERK)により抑制されたが、細胞内Ca^<2+>濃度の上昇とは明らかな相関は認められなかった。またマスト細胞/線維芽細胞共生培養系において、IL-6ファミリーは線維芽細胞上の非SCF因子を介してマスト細胞の増殖を促すことが明らかになった。まずNlH3T3線維芽細胞と共生培養したマウス骨髄由来培養マスト細胞(BMMC)を、PD098059またはSB203580の2種類のMAPキナーゼ阻害剤の各々で前処理後、抗原またはサブスタンスPで刺激し、その結果誘導されるヒスタミンおよびLTB4遊離への影響を検討した。その結果、ヒスタミンおよびLTB4遊離はいずれもPD098059により選択的に抑制され、BMMCをサブスタンスP刺激して誘導されるこれらのメディエーター遊離には、抗原刺激の場合と同様にERK-MAPKinase経路が必須の伝達系として活性化されることが明らかになった。次にBMMCを抗原およびサブスタンスPで刺激した際の細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]i)の変化を解析した。BMMCを、100ng/mlのSCF添加による単独培養、または線維芽細胞との共生培養の条件下で2週間培養すると、いずれの場合にもサブスタンスP刺激による[Ca^<2+>]iの上昇が誘導された。しかしながら共生培養3週後には、ヒスタミン遊離の程度はさらに増加したにも関わらず、([Ca^<2+>]i)の上昇はむしろ減弱し、興味あることに抗原刺激による([Ca^<2+>]i)の上昇もBMMC単独培養時に比べて減弱していることが判明した。このような変化は100ng/mlSCF存在下の単独培養では認められず、また一部の抗アレルギー薬は、抗原刺激による反応には影響を与えることなくサブスタンスP刺激によるヒスタミンおよびLTB4遊離を抑制することが判明した。以上の結果から、線維芽細胞との共生培養によりBMMCが受ける影響は、SCFを介したものだけにとどまらず、またサブスタンスP刺激によるヒスタミン遊離反応には、[Ca^<2+>]