hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Akt持続活性による重症未熟児網網膜症の進展機構

Akt活性を誘導したマウス網膜では、血管の拡張・血管透過性の亢進・血管瘤形成がみられる。平成29年度は、Akt活性化マウス網膜における異常血管形態が細胞増殖に依存するかを確認する目的で増殖抑制剤および、Akt阻害剤を投与した。その結果、細胞増殖抑制によりAkt活性による異常血管拡張は解消されるものの血管瘤は残存することが明らかになった。Akt阻害により血管瘤の形成も減少することから、増殖以外の要素も血管異常の原因となることが予想された。また、Akt持続活性を誘導する遺伝子発現を網羅的に解析し、Akt活性の時期特異的に発現上昇する遺伝子を抽出した。これらの遺伝子の発現とその局在、およびAktとの相互作用について解析を試みた。目的とする遺伝子の発現解析が困難であったため、遺伝子改変マウスの計画を先に進めた。平成30年度は、培養細胞から抽出したAkt時期特異的に変化する複数の遺伝子についての解析を実施する。分子生物学的な手法を用いて、Aktとの結合および活性調節について解析をすすめる。必要物品の額に達したので、次年度に繰り越す予定とした。次年度は、遺伝子ータンパク質相互作用を解析するための予算に充てる。
中胚葉誘導における予定外胚葉細胞の応答性の分子機構の解析

中胚葉誘導は脊椎動物の発生過程において最初に見られる誘導現象であり、その後の形態形成に必須である。中胚葉誘導は時空間的に特異的に起こることが知られているが、その分子機構についてはまだ十分には理解されていない。そこで、我々が単離した中胚葉特異的遺伝子であるnt1遺伝子が神経胚期に予定中脳・後脳境界部で異所的に発現するゼブラフィッシュ突然変異体の表現型解析を行うことで、その分子機構の一端を理解することを目指している。単離されているnt1遺伝子を異所的に発現する変異体のうちkt541とkt658の2つの系統は、温度感受性と優性の母性効果を示したことから、その原因遺伝子の同定は比較的に困難になった。現在、変異部位と密接に連鎖するDNAマーカーを同定するために、kt541変異体に対して多くの多型を持つ別系統の野生型ゼブラフィッシュを数世代にわたって交配することで、変異部位近傍以外が別系統に組み変わった集団を確立し、変異部位の遺伝学的マッピングを試みている。さらにnt1遺伝子の異所的発現が見られる他の5つの変異体系統について、表現型の解析を行ったところ、1系統は色素を作るメラノサイトの減少が観察され、4系統は頭部の中枢神経系での細胞死が見られ、いずれも胚性致死を示した。これら5系統では、前述の2系統と比べてnt1遺伝子の異所的発現が非常に弱く解析が難しい。このことはヘテロの母親由来の正常な遺伝子産物が卵に供給されていることによる可能性があると考えられたので、現在、変異をホモに持つ胚の始原生殖細胞を別個体に移植する実験を行っている。これによってホモ個体の致死性が回避され、正常な遺伝子産物を持たない卵を得られることが期待される。このような卵が得られた後は、それに由来する胚の表現型を解析する予定である。そこで、中胚葉特異的遺伝子であるntlの発現パターンに異常を示すゼブラフィッシュ突然変異体を用いて、この問題に取り組んでいる。筆者らが既に単離しているkt541とkt658は、神経胚期に予定中脳・後脳境界部で異所的にntl遺伝子を発現する。同時に胚盤が卵黄を包み込むエピボリー現象が完了しないという異常を示すが、この表現型の強さと頻度に大きなばらつきが見られたことから、母性効果と発生温度が表現型に与える影響について検討した。その結果、kt541とkt658のどちらの変異も個体によって浸透度にばらつきはあるが、メスがヘテロの場合はオスの遺伝子型に関わらず異常が出ることから優性の母性効果を持つことが明らかになった。さらに、23.5°Cと31.5°Cでは異常を示す胚が多いのに対して、27.5°Cでは少ないことから、温度感受性を示すことも明らかになった。kt541変異体の温度感受性を利用して、この原因遺伝子が胚発生過程のどの時期に働いているかを検討したところ、中期胞胚変移が起こるとされている512細胞期から1024細胞期にかけて機能していることが明らかになった。以上の表現型解析に加えて、変異体の原因遺伝子を同定するための準備を行った。変異部位と密接に連鎖するDNAマーカーを同定するために、kt541変異体と多くの多型を持つ別系統のゼブラフィッシュとを数世代にわたって交配し、変異部位近傍以外が別系統に組み変わった集団を確立した。この集団を用いて変異部位の遺伝学的マッピングを行なう。
胃がん抑制遺伝子Runx3の作用機構の解析

胃がん抑制遺伝子RUNX3の作用機構を追究するために、Runx3ノックアウト(Runx3-/-)マウス胃上皮から細胞株を樹立し、その形質を調べたところ、以下の結果を得た。1.細胞株をヌードマウス皮下へ移植したところ、Runx3+/+細胞は全く腫瘍を造らなかったが、Runx3-/-細胞は、ヌードマウス皮下に分化型腺癌からなる大きな腫瘍を形成した。2.Runx3-/-細胞にRUNX3遺伝子を発現させると、試験管内での細胞増殖速度はほぼ半減した。この細胞をヌードマウス皮下へ移植すると、腫瘍形成率は低下し、形成された腫瘍の大きさも顕著に減少した。組織学的に検索したところ、RUNX3遺伝子発現細胞が形成する腫瘍では、細胞の増殖が低下し、アポトーシスを起こす細胞数が増加していた。3.胃上皮細胞株をコラーゲンゲル上で器官培養したところ、Runx3+/+細胞は正常細胞と同様に、細胞同士が密着し、基底側-表層側という極性を保持し、腺管様構造を形成したが、Runx3-/-細胞は相互の接着が疎で、細胞極性は失われ、腺管形成は見られなかった。これらの結果は、(a)Runx3欠失によって胃がんが出来ること、(b)Runx3が生体内でも胃上皮細胞の増殖とアポトーシスの調節に重要な役割を果たしていること、(c)Runx3は胃上皮細胞の増殖やアポトーシスの調節だけでなく、細胞接着や形態形成の制御に関係した別の機能を果たしていること、を示している。
ｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトを用いたアレキサンダー病の病態解明

アレキサンダー病は、アストロサイト特異的に発現するGFAPをコードする遺伝子の変異を認める神経変性疾患である。本病患者の皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、さらにアストロサイトに分化誘導することを目的としたが、最近の技術進歩を受けて、まずは予備実験として非アレキサンダー病患者の末梢血リンパ球からのiPS細胞樹立を試みた。今後、iPS細胞からアストロサイトへの分化誘導を試みる予定である。また、細胞モデルにおけるGFAP異常凝集体の同定法が確立されていないことから、種々の免疫染色法を試して有用性を検討した。結果、従来からのGFAP染色が最も凝集体の同定に有用であることを示した。アレキサンダー病は臨床的には乳児期発症で大脳白質病変を主体とする重症な型から成人期発症で延髄・頚髄病変を主体とする比較的緩徐な進行を示す型まで多様な臨床病型を示す。これまでの申請者らの成果も含めて細胞実験やマウスモデル実験により、変異GFAPを主体とする異常凝集体がアストロサイトの機能、さらにはニューロン-アストロサイトの相互作用に影響を及ぼすアストロサイト病であることが明らかにされつつあるが、本病の多様な臨床病態を説明しうる研究はなされていない。本研究では近年改良・向上がみられているiPSCの技術を用いて、アレキサンダー病患者から得られた試料よりiPSCを樹立し、さらにアストロサイトに分化誘導することにより、臨床病型に応じたアストロサイトとアストロサイト-ニューロン相互作用を解析することを目的とした。平成25年度は予備実験として、アストロサイトに分化した際に有用となる培養細胞レベルにおける変異GFAPの異常凝集体を同定評価する染色法を検討した。具体的には野生型ヒトGFAP,ヒト変異GFAP(R239C)遺伝子をそれぞれ導入した副腎皮質細胞腫瘍由来の細胞に対して、もっとも一般的な染色法であるGFAPとin vivoで報告のあるFluoro Jade B,本病では報告はないが凝集体を染色するthioflavin, congo redを比較した。結果、従来のGFAP染色が最も凝集体の同定に有用であることが示された。本研究では近年改良・向上がみられているiPSCの技術を用いて、アレキサンダー病患者の皮膚線維芽細胞からiPSCを樹立し、さらにアストロサイトに分化誘導することにより、臨床病型に応じたアストロサイトとアストロサイト-ニューロン相互作用を解析することを目的とした。また、アストロサイトは中枢神経領域により形態学的、生理学的にも多様性をもつことが明らかにされてきており、iPSCから種々のアストロサイトサブタイプへの分化も試みる。本年度は申請者らの施設および関連施設に通院しているアレキサンダー病患者から同意を得られた場合に皮膚生検を施行し、線維芽細胞を樹立した。1型から3型まで各病型の患者からiPSCを樹立することを目的としたが、本年度は3型1例にとどまっている。また、研究の推進については当初連携を予定していた独立行政法人医薬基盤研究所「難病研究資源バンク」がiPS細胞関連から撤退せざるを得なくなったこと、単独施設での研究の推進は困難で本年度設定された再生医療実現拠点ネットワークプログラム「iPS細胞研究中核拠点」との連携が望ましいことから試料収集やiPS細胞樹立に対して新たな連携を模索する必要が生じたことから現在までの到達度としては当初計画よりもやや遅れている状況である。細胞モデルやマウスモデル研究により、本病は変異GFAPを主体とする異常凝集体がアストロサイトの機能、さらにはニューロン-アストロサイトの相互作用に影響を及ぼすアストロサイト病であることが明らかにされつつあるが、多様な臨床病態を説明しうる研究はなされていない。本研究ではアレキサンダー病患者の皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、さらにアストロサイトに分化誘導することにより、臨床病型に応じたアストロサイトとアストロサイト-ニューロン相互作用を解析することを目的とした。当初は大脳優位型、延髄・脊髄優位型、中間型すべての型において線維芽細胞を樹立することを目標としていた。しかし、実際に同意が得られたのは中間型アレキサンダー病患者1名のみであった。

一方で、近年のiPS細胞技術の向上により末梢血リンパ球からのiPS細胞樹立が可能になり、侵襲性の面も考慮して、アレキサンダー病患者においても末梢血から樹立したiPS細胞を用いてアストロサイトへの分化誘導を目指すことにした。今年度は予備実験として、非アレキサンダー病患者から得た末梢血リンパ球(CD34陽性細胞)にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、LIN28、mp53DD,とEBNA1をepisomal vectorを用いてエレクトロポレーション法で遺伝子導入して、iPS細胞を樹立した。報告書作成時点ではiPS細胞からアストロサイトへの分化誘導には至っていないが、今後、形態学的・生理学的に多様性をもつ種々のサブタイプについての検討も行いながらアストロサイトへの分化を試みる予定である。臨床神経学独立行政法人医薬基盤研究所「難病研究資源バンク」とMTAを締結し、試料の提供手続きを可能とした。しかし、平成25年度より同研究所に関してはiPS細胞関連から撤退せざるを得なくなったこと、単独施設での研究の推進は困難で「iPS細胞研究中核拠点」との連携に関してiPS細胞樹立に対して新たな連携を模索する必要とアストロサイトへの分化誘導の効率化(現在でも誘導に約半年が必要)から現在までの到達度としては当初計画よりもやや遅れている。本年度は試料の収集が主な目標であったが、当初連携を予定していた独立行政法人医薬基盤研究所「難病研究資源バンク」がiPS細胞関連から撤退せざるを得なくなった。iPS細胞研究に関しては単独施設での研究の推進は困難であり、新たに選定された再生医療実現拠点ネットワークプログラム「iPS細胞研究中核拠点」との連携を模索する必要性が生じたため、現在までの到達度はやや遅れている状況である。iPS細胞樹立に対して新たな連携施設を模索するとともに、ヒトiPS細胞からアストロサイトへの分化誘導が非常に困難である原因を比較的誘導が容易であるマウスモデルを用いて検討する。再生医療実現拠点ネットワークプログラム「iPS細胞研究中核拠点」との連携を確立して、試料の収集とアレキサンダー病のiPS細胞樹立を図る。試料については申請時には皮膚組織を予定していたが、近年の技術の発展により血液からのiPS細胞樹立が可能となっており、侵襲性の観点からも血液試料の収集に改める予定である。収集後はiPS細胞からアストロサイトへの分化誘導および誘導したアストロサイトの機能解析(アストロサイト細胞質内凝集体の形成時期および凝集過程の検討、アストロサイト-ニューロン相互作用の解析)、薬物スクリーニングを行う。iPS細胞樹立が、当初予定より遅れが生じている。来年度、ips細胞の樹立及び分化誘導、機能解析の為の物品費及び人件費、情報収集のための学会や研究会参加の為の旅費に使用する予定。iPS細胞の樹立および分化誘導、機能解析ための物品費および人件費、日進月歩の領域でもあり情報収集のための学会や研究会参加のための旅費に使用する予定である。
一般化されたボランティアのジレンマの理論的・実験的研究

本研究の目的は,一般化されたボランティアのジレンマ・ゲームと呼ばれるゲームの理論的・実験的研究である.これは各人が貢献するかどうかを同時かつ独立に決定し,一定数の貢献がなされたときにのみ,公共財が供給されるというタイプのゲームである.2018年度は,プレーヤーの間で貢献コストが異なる「非対称的」なケースについての論文をまとめてきた.具体的には,貢献コストが低い「強いタイプ」と貢献コストが高い「弱いタイプ」の2つのタイプが混在するとし,各タイプの内部では貢献コストが等しい状況を分析してきた.このケースでの実験はすでに行われている.当初は,極限QREがリスク・ドミナンスを一般化した均衡概念と一致するのではないかと思わせるシミュレーション結果が得られた.これは極めて強く興味深い結果であるため,その定理を証明するための努力が行われた.しかし,より精細な分析を行ったところ,少なくとも強いタイプが複数存在する場合には,主枝が分岐しており,強いタイプの一人だけが貢献する均衡(これがリスク・ドミナンスに近い均衡)だけでなく,完全混合戦略の均衡へも枝が伸びていることが確認された.まとめとなる論文においては,むしろこれまでの論文では十分な解析がなされてこなかった均衡に関する一般的命題をまとめるとともに,すでに行った実験結果に基づき,不平等回避モデル,QREモデル,Level-kモデルのそれぞれについて推計を行い,比較することとなった.現在,英文校正を行っているところである.本研究の目的は,一般化されたボランティアのジレンマ・ゲームの理論的・実験的研究である.2016度は,すべてのプレーヤーの貢献のコストが同じである「対称的ケース」について,実験および理論的研究を行った.この論文は出版に向けて投稿を行ったところだが,現在,改訂バージョンを再投稿したところである.さらに,プレーヤーたちの間に,貢献コストが低い「強いタイプ」と貢献コストが高い「弱いタイプ」が存在する状況についても実験を起こなった.具体的には,2016年11月24日と25日の2日間にわたって,計147名の学生被験者に参加してもらい,中央大学の経済実験室で実験を行った.1グループの規模を2人にした場合と3人にした場合に分け,3人のグループの場合には,強いタイプが1人の場合と2人の場合に分けた.また,利得は3種類用意した.すなわち,2人のケースで3種類,3人のケースで6種類について実験を行った.理論的予測では,弱いタイプはあまり貢献しないという結果になるが,実際の実験では予測よりも貢献するという結果が得られた.これについては,QREモデルとLevel-kモデルを用いて,どちらのモデルの予測力が高いかを推計しているところである.また,理論的な研究としては,非対称なケースにおけるQREの解析を行った.新たに取り入れたのは,ホモトピー・アプローチというQREの計算方法である.これにより,主枝を基本的に常微分方程式の数値的解法で辿れるようになった.この方法を用いることで,これまで以上に高い精度で,極限QREを計算できるようになった.現在は,その一般的性質に関して議論しているところである.具体的には,極限QREが一般化されたリスク・ドミナンスの概念と一致することの証明を行おうとしている.当初の研究計画の通り,2016年度は対称なケースを扱って,論文を執筆した.すでに論文を学会発表したうえで,ワーキング・ペーパーにし,専門雑誌に投稿したところである.こちらについては,改訂を要求されたため,改訂を行い,すでに再投稿したところである.2017年度は非対称なケースを扱う年度である.研究実績で述べたように,すでに非対称なケースについても実験を行ってデータを収集した.これを2つのモデルで推計を行っているところである.また極限QREの一般的な特徴づけの議論を行っているところであり,論文も細かいところを除いてほぼ執筆が終わっている.本研究の目的は、一般化されたボランティアのジレンマ・ゲームと呼ばれるゲームの理論的・実験的研究である。これは各人が貢献するかどうかを独立に決定し、一定数の貢献がなされたときにのみ、公共財が供給されるというタイプのゲームである。2017年度は、(1)2016年度の研究内容、すべてのプレーヤー貢献のコストが対称で、同一タイプであると見なせるケースについての論文を投稿し出版することができた(後に報告するKawagoe, T., T. Matsubae, and H. Takizawa 2017がそれである)。そのうえで、当初の研究計画通り、(2)プレーヤーたちの間に、公共財供給する際の貢献コストが低い「強いタイプ」と貢献コストが高い「弱いタイプ」という2つのタイプが混在している「非対称のケース」に考察を向け、これについての研究を行った。すでに実験は行っており、データは一部を除き、揃っている。ただし、はこだて未来大学で行う予定だった実験は、被験者が思うように集まらず、これについては中止した。現在はこのケースの論文執筆にとりかかっている。この非対称のケースにおける極限QREをホモトピー・アプローチを用いて解析した結果から得られた「推測」について、研究分担者間でコミュニケーションをとりながら、証明をチェックをしている。すなわち、ホモトピー・アプローチによって計算して特定した主枝から極限QREを特定したところ、これまでの同分野の研究で報告されてきた混合戦略とは異なるナッシュ均衡になることがわかると同時に、それがリスク・ドミナンスの概念と近いものであることがわかったので、その事実を証明しているところである。

当初の研究計画において、ボランティアのジレンマ・ゲームの構造の複雑性にしたがって、2016年度がプレーヤーのすべてで公共財貢献コストが等しい「対称的ケース」を扱い、2017年度が公共財貢献コストが低いプレーヤーと高いプレーヤーが混在する「非対称なケース」を扱うことになっていたが、概ねその通りに推移している。すでに「対称的ケース」についての論文は、実験と理論的結果の両方を含む論文を執筆したうえで、学会発表を経て、ワーキングペーパー化を行い、最終的に出版することができた(後述のKawagoe, T., T. Matsubae and H. Takizawa 2017)。2017年度の対象である「非対称なケース」については、すでに実験を行ってデータは収集したところである。また、このケースの極限QREの性質について得られた「推測(conjecture)」を証明しようとしているところであり、論文作成に向けて、着々と作業が行われている。本研究の目的は,一般化されたボランティアのジレンマ・ゲームと呼ばれるゲームの理論的・実験的研究である.これは各人が貢献するかどうかを同時かつ独立に決定し,一定数の貢献がなされたときにのみ,公共財が供給されるというタイプのゲームである.2018年度は,プレーヤーの間で貢献コストが異なる「非対称的」なケースについての論文をまとめてきた.具体的には,貢献コストが低い「強いタイプ」と貢献コストが高い「弱いタイプ」の2つのタイプが混在するとし,各タイプの内部では貢献コストが等しい状況を分析してきた.このケースでの実験はすでに行われている.当初は,極限QREがリスク・ドミナンスを一般化した均衡概念と一致するのではないかと思わせるシミュレーション結果が得られた.これは極めて強く興味深い結果であるため,その定理を証明するための努力が行われた.しかし,より精細な分析を行ったところ,少なくとも強いタイプが複数存在する場合には,主枝が分岐しており,強いタイプの一人だけが貢献する均衡(これがリスク・ドミナンスに近い均衡)だけでなく,完全混合戦略の均衡へも枝が伸びていることが確認された.まとめとなる論文においては,むしろこれまでの論文では十分な解析がなされてこなかった均衡に関する一般的命題をまとめるとともに,すでに行った実験結果に基づき,不平等回避モデル,QREモデル,Level-kモデルのそれぞれについて推計を行い,比較することとなった.現在,英文校正を行っているところである.研究計画においては,今年度,コストが非対称的なケースの研究を行う予定になっている.これについては,すでに実験も行い,ある程度データが存在している.とりあえずは,非対称のケースについての論文を早急にしあげて,さまざまな学会で発表していくことが必要となる.それとともに追加実験も必要に応じて行う.また,理論研究も並行して行う.今後は、これまでも主に理論研究の方面で当該研究に参加していただいていた松八重泰輔氏を正式に研究分担者として迎え、「非対称のケース」についての理論的分析を早急に終え、実験データを用いて、QREとLevel-kの両方のモデルについて統計的推計を行い、論文を仕上げることである。
新規脂質変換反応の探索と機能性脂質生産プロセスの開発

微生物油脂をつくることのできるカビMortierella alpinaの油脂生産性を向上させるための研究を行った。まず、遺伝子の組み換え系を構築し、代謝改変を行うことで油脂の生産性を強化した。またこの菌は、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸などの有用脂肪酸だけでなるユニークなステロール類も生産する。そこで、ステロール生合成に関わる酵素遺伝子の機能を評価し、ステロール生産を向上させることができた。1.アラキドン酸生産性糸状菌Mortierella alpina 1S-4は、天然で希少なデスモステロールを蓄積することが知られている。しかしながら、その生合成経路については不明な点が多い。我々は、デスモステロールを含む微生物ステロールの生産を目指した分子育種を試みた。小胞体膜貫通タンパク質であるERG28pは4, 4-DimethylzymosterolをZymosterolへ変換するC4脱メチル化酵素複合体を小胞体膜につなぎとめる働きをすると考えられている。そこで、M.alpina 1S-4からerg28遺伝子を単離し、過剰発現させることでステロール生産性向上を試みた。その結果、コントロール株が単位培地当たり13.0mg/lであったのに対し、erg28発現株では20.0mg/lとなったことから、ステロール生産量を約1.5倍高めることに成功した。2.糸状菌の形質転換では、相同組換えの頻度は一般的に非常に低い。M.alpina 1S-4においても外来遺伝子は非相同組換えによりゲノム上へ挿入される。そこで、非相同組換えに関わると考えられるDNAリガーゼ(Lig4)注目し、lig4遺伝子の転写量をRNAiあるいは、アンチセンスで抑制した転写抑制株をまず作製することとした。転写後2本鎖RNAが形成されるコンストラクトとアンチセンス鎖が転写されるコンストラクトを構築し、形質転換に用いた。形質転換体のlig4遺伝子の転写量をリアルタイムPCRで測定し、転写量が4分の1に低下した転写抑制株を得ることに成功した。現在、この株を用いてΔ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子破壊を試みている。得られた形質転換体の脂肪酸組成を分析することで遺伝子破壊の可能性を評価している。1.糸状菌Mortierella alpina 1S-4はアラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸(PUFA)を蓄積する油糧微生物である。本菌での脂質代謝経路の解明及びより厳密な代謝制御によるPUFAの高生産を行うために、遺伝子ターゲッティング技術の開発を目指した。非相同組換えに関わるKU80をコードするku80遺伝子を相同組み換えにより破壊した株を用いて、PUFA生合成に関わるΔ5不飽和化酵素遺伝子の破壊を試みた。約40株の形質転換株の脂肪酸組成を分析したところ、Δ5不飽和化酵素活性の低下によるアラキドン酸蓄積量の減少が確認された。また、サザン解析の結果、本形質転換株におけるΔ5不飽和化酵素遺伝子への破壊用ベクターの挿入が示唆された。今後、本結果を参考に、ターゲッティング頻度の向上を目指す。2.M.alpina 1S-4は培養温度が低くなるとエイコサペンタエン酸を蓄積する。これは、ω3脂肪酸不飽和化酵素が低温域で活性化されるためと考えられてきた。酵母発現系を用いた本酵素遺伝子の機能解析を行ったところ、2つの新たな未知脂肪酸を見いだした。同定の結果、2つの未知脂肪酸はhexadecatrienoic acid (9cis, 12cis, 15-16:3)とhexadecadienoic acid(9cis, 12cis-16:2)であることがわかった。このことから本酵素はω3位だけでなくΔ12位にも二重結合を導入することがわかった。さらに、様々な脂肪酸の変換効率を調べたところ、低温ではなく通常の培養温度でも本酵素活性による産物を検出することができた。基質・酵素複合体の温度変化による構造特異性に興味がもたれる。3.M.alpina 1S-4はPUFAだけでなく、デスモステロールなどの希少ステロールを蓄積する。sterolacyltransferase(SAT)は遊離ステロールとアシルCoAからステロールエステルを合成する反応を触媒する。これまでに酵母において内在性SATの過剰発現や欠損により菌体内ステロールとステロールエステルの存在比が変化することが報告された。そこで、M.alpina 1S-4のSATホモログ遺伝子(msat1)を本菌株よりクローニングし、msat1過剰発現株でのステロール生産性を評価した。総ステロール量を分析したところ過剰発現株はホスト株にくらべ約1.6倍のステロールを生産することが分かった。次に、酵母発現系を用いたmsat1の機能解析を行ったところ、MASAT1はエルゴステロールを基質とすることや、添加したPUFAをステロールエステルへ変換することがわかった。糸状菌Mortierella alpina 1S-4はアラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸(PUFA)を蓄積する油糧微生物である。

本菌での脂質代謝経路の解明及びより厳密な代謝制御によるPUFAの高生産を行うために、遺伝子ターゲッティング技術の開発を目指した。そこで、相同組換えに関わるLIG4(DNAリガーゼ)の破壊株の作製を試みた。2回交叉によるlig4遺伝子の置換によりlig4破壊株を構築した。現在このlig4破壊株を宿主としたPUFA生合成に関わる酵素の遺伝子破壊株構築を試みている。細胞内の脂質貯蔵体である油滴小胞の外膜上にはcaleosinなどの油滴小胞特有のタンパク質が存在する。caleosinは油滴小胞の構造安定化に寄与すると推測される。これまでにシロイヌナズナのcaleosinが油滴小胞の肥大化を促進することが報告されている。そこで、アラキドン酸生産性糸状菌M. alpina 1S-4株からcaleosinをコードする2つ遺伝子を単離し、過剰発現させることで脂質蓄積への影響を評価した。これら2つのcaleosinのアミノ酸配列は互いに61%の相同性を示した。2種のcaleosin過剰発現株はコントロール株と比べて特に培養初期から中期において脂質蓄積が速やかに進行することが観察された。新たな微生物油脂の探索研究において、総脂肪酸当たり20%以上のエイコセン酸(C20:1Δ11)を蓄積するMortierella chlamydosporaを見いだした。エイコセン酸は植物油脂に比較的多く存在し、保湿効果があることから化粧品などへ応用される有用脂肪酸である。各脂質画分中の脂肪酸の定性・定量分析を行ったところ、エイコセン酸は25%がトリアシルグリセロールに、24%が遊離脂肪酸画分に存在していることが確認された。1.油糧微生物M.alpina 1S-4の相同組み換え系を開発することに成功した。2.PUFA生合成に関わる酵素遺伝子の新たな機能性を見い出した。3.PUFA生合成に関わる酵素遺伝子の過剰発現により、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸などの生産性を向上させることに成功した。4.デスモステロールなどの希少ステロールの生合成経路を明らかにし、個々の遺伝子過剰発現と遺伝子転写抑制を行うことによりデスモステロールをはじめとする希少ステロールの生産性を向上させることに成功した。以上の研究成果は研究計画に沿ったものであり、「研究目的」の達成度は順調であるといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。基本的には、研究計画の通り進めていく。特に、相同組み換え系の効率をさらに向上させ、より厳密な代謝制御による選択的なPUFA生産菌の育種を目指す。そのために、非相同組み換えに関わる酵素遺伝子を網羅的に破壊し、より高頻度で相同組み換えが起こる宿主株の開発を目指す。得られた脂質高生産株の培養条件の至適化により、生理活性評価実験に供せられる量の生産を実現し、得られたサンプルの機能性評価研究を展開し、新規機能性脂質の創製を図る。
ゲノム伝達の中核にある染色体動原体の方向性を決める分子機構

動原体の一方向性の決定がセントロメア中央領域の接着によって決まっていることを証明した。相同染色体間の減数分裂の組み換えが、動原体の一方向性結合を保証していることを示した。シュゴシン・PP2A(脱リン酸化酵素)複合体が、コヒーシン保護において拮抗するキナーゼを同定した。さらに、染色体分配の要となるICS(インナーセントロメア・シュゴシン)ネットワーク、染色体を形づくるための普遍的な制御機構を発見した。体細胞が増殖分裂する過程で、複製された染色体のコピーが娘細胞へ均等に分配されるためには、染色体の中心部分にある動原体が反対方向からのスピンドル微小管によって捕らえられる。一方、生殖細胞で精子や卵子を形成するときに見られる染色体を半分に減らす分裂は減数分裂と呼ばれ、体細胞の分裂と明確に区別され、複製された染色体の動原体は、一旦は同じ方向からのスピンドル微小管によって捕らえられ、同じ方向へ分配される。今回、酵母を用いた研究で、減数分裂のときは2つの染色体の動原体の中に埋もれたDNAを染色体の「糊」のタンパク質コヒーシンが接着することにより、その結果、動原体が同じ方向に向くように規定されていることを証明した。さらに体細胞分裂では、動原体部分のコヒーシンを積極的に不活性化し、その代わりに側近領域でコヒーシンが染色体DNAの接着を維持することにより、動原体が反対方向へ向くように仕向けられていることも明らかにした(Nature 2009)。全ての真核生物に保存されたCENP-Cは動原体の機能に本質的な役割をもつが、実際の分子機能については不明であった。我々は分裂酵母の研究より、動原体と微小管の正しい結合に必要なFtalやPcslといったタンパク質が、CENP-Cを足場として動原体に局在することを明らかにした。さらに減数分裂では、CENP-Cは一方向性の動原体構築に必要とされるMoalを特異的に動原体へリクルートし、減数第一分裂の還元分配を制御していることを明らかにした。今回の発見により、CENP-Cの本質的な機能が明らかになっただけでなく、体細胞分裂と減数分裂の動原体の違いを生み出すメカニズムの一端が明らかになった(Dev Cell2009)。細胞の染色体は遺伝情報を担うことで知られている。体細胞の染色体分配のときに、複製された染色体のコピーが2つの娘細胞へ均等に分配されるためには、染色体の中心部分にある動原体が反対方向からのスピンドル微小管によって捕らえられることが重要である。オーロラキナーゼ複合体は動原体の商のセントロメアという場所に局在し、微小管と動原体の結合部位をリン酸化することにより、間違った結合を修正する働きがある。このように、セントロメアは染色体が正しく分配されるために必須の機能を果たしている染色体上の場所として古くから知られていたが、その形成機構は今まで分かっていなかった。今回の研究により、セントロメアは染色体上に広く存在するヒストン複合体のリン酸化によって決まることが明らかになった。すなわち、オーロラキナーゼ複合体が、シュゴシンというタンパク質と協調して、ヒストン複合体の構成因子であるH2AとH3の特異的なアミノ酸のリン酸化を直接認識してセントロメアに局在することを突き止めた。また、この2つのピストンのリン酸化は、動原体に局在するBub1キナーゼと、染色体ペアの接着部位に局在するHaspinキナーゼによって担われており、これらのリン酸化が空間的に交わった部位にセントロメアが形成されることを意味する。また、分裂期特異的にオーロラキナーゼ複合体がCDK1キナーゼにリン酸化されることによりシュゴシンと結合できることも示した。酵母とヒトの細胞の解析から、これらの機構は保存された機構であることを証明した。本研究は、染色体のセントロメアという場が時空間的にどのように規定されるかという生物学の根本的な問題を解いた(Science 2010.Nature 2010)。生殖細胞の染色体分配は、減数分裂という特殊な様式によって染色体ゲノムを半分にする。とくに減数第一分裂で、相同染色体の間で組み換えが起きることが、染色体が正しく分かれるために必須の役割をもつが、その分子メカニズムについては解明されていなかった。セントロメアに局在するオーロラキナーゼは、動原体と微小管の間違った結合を不安定化することにより正しい結合を促進する働きがあり、相同染色体の間の組み換えによる物理的結合(キアズマ)は、動原体とスピンドル微小管の結合に応じて相同染色体の間の張力を生み出す。本研究では、この張力の発生によって相同染色体のセントロメアのオーロラキナーゼの局在が変化し、その結果、動原体と微小管の正しい結合が安定化されることを見出した。これにより、長い間謎であった減数分裂組み換えのもつ染色体分配における意義が、分子レベルで解明された(Dev Cell 2011)。

コンデンシンは、染色体を凝縮させる働きをするタンパク質である。本研究では、コンデンシンが染色体中央部の動原体に局在することによってコンパクトな動原体の構造を構築し、スピンドル微小管が正しく染色体を捕らえることを保証していることを明らかにした。また、コンデンシンが染色体DNA上に均一に存在するヒストン複合体の一つのタンパク質H2Aを足場に局在することを発見し、オーロラキナーゼによるコンデンシンのリン酸化によってH2Aとの結合が促進されることを明らかにした。さらに、染色体の分離が起きるときには、オーロラキナーゼが動原体の近くから染色体腕部近傍に移動することにより、コンデンシンによる適時的な染色体凝縮、それにともなう染色体の分離を実現していることを明らかにした(Nature 2011)。本研究により、染色体の形と分離の動的制御について根本的な理解が得られた。最近我々は、マウスの生殖細胞で特異的に発現するテロメア結合タンパク質を同定し、酵母から動物細胞まで保存された相同染色体のペアリング機構があることを示唆する結果を得た(Morimoto et al. J Cell Biol 2012)。さらに新規の減数分裂特異的な染色体動態制御因子を同定するために、減数分裂期特異的な染色体因子のスクリーニング法(Meiosis-specific localization screening: MSLS)を開発した。実際この方法で、減数分裂特異的な新規のテロメア制御因子を複数取得することに成功した。我々が見出したシュゴシンは、脱リン酸化酵素PP2Aを呼び込むことによって、染色体の接着を守るとともに、染色体の二方向性を規定するオーロラキナーゼと複合体を形成して、染色体のセントロメアに局在する。この制御ネットワークをICS(インナーセントロメア・シュゴシン)ネットワークと命名した(Watanabe Nat Rev Mol Cell Biol, 2012)。ICSネットワークは、染色体の接着と動原体の二方向性結合をリンクさせる、染色体分配の中心的な制御機構であると考えられる。本年度の研究より、ICSネットワークの最上流に働くBub1キナーゼの局在の分子機構を解析した。その結果、動原体タンパク質Spc7がM期チェックポイントタンパク質Mph1キナーゼによりリン酸化されると、それをBub1が認識して局在するという機構が明らかになった(Yamagishi et al. Nat Cell Biol, 2012)。これによりICSネットワークの全貌が明らかになった。25年度が最終年度であるため、記入しない。いくつかの研究は計画以上に進展したが、分裂酵母の減数分裂過程のPlo1の基質の決定は遅れている。昨年度は、セントロメアに局在したPlo1キナーゼが、セントロメアのRec8をリン酸化することを明らかにしたので、次年度はその生理学的な意義をより明確にする。マウス精巣からCENP-Cと結合するタンパク質を検索した結果、生殖細胞特異的な発現を示すタンパク質MEICENPを同定できている。昨年度に作製したノックアウトマウス(不完全であるが部分的な表現型を示す)の解析を詳細に行う。さらに、新たに作製している完全破壊マウスの解析も、作製でき次第進める。
神経細胞におけるCaチャンネルの調節機構に関する研究

申請者のこれまでの研究から、電位依存性N型Ca^<2+>チャンネルは、1)チャンネルα1BサブユニットC末端とG蛋白質αサブユニット(Gα)との、2)α1BサブユニットのリピートI-II間の細胞内ループ(loop-1)とG蛋白質βγサブユニット(Gβγ)との、双方の直接的な相互作用により抑制を受けることが示唆された。この結果を踏まえて、N型チャンネル側はその活性を温存したまま、α1BC末端あるいはloop-1に、Green Fluorescent Protein(GFP)変異種のEYFPあるいは新規のRed Fluorescent ProteinであるDsRedを組み込んだEYFP/DsRed-α1Bを作製した。一方、G蛋白質側は、GoαのN端(lipid修飾部位の後方)とGβ1のN端に、GFP変異種のECFPまたはDsRedを組み込んだECFP/DsRed-GoαあるいはECFP/DsRed-Gβ1を作製した。これらEYFP/DsRed-α1B、ECFP/DsRed-G蛋白質を、予め外来性のCa^<2+>チャンネルα2、β1サブユニットが安定に発現しているBHK細胞(BHK6細胞)に発現させたところ、α1Bサブユニットは、EYFP/DsRedの融合部位に関わらず、細胞膜と細胞内小胞にパッチ状に発現し、Goα、Gβ1は細胞膜と核を除く細胞質で均一な発現パターンを示した。さらに、両者を共発現させると、これら2つの発現パターンが重層した。BHK6細胞に、δオピオイド受容体、G蛋白質、N型チャンネルの3者を共発現させ、ECFP(donor)-EYFP(acceptor)間のFluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)解析を行ったところ、α1BサブユニットC末端にEYFPを組み込んだEYFP-α1BとECFP-Goαの組み合わせで、ECFPの蛍光強度に対するEYFPの蛍光強度の比(EYFP/ECFPの比)が、受容体刺激により経時的に変化した。以上により、実際に生細胞の中で、GαがN型チャンネルα1BサブユニットC末端と直接的な相互作用をすることが明かとなった。この内容の論文原稿を現在作成中である。N型Caチャンネルは、そのI-II loopでG蛋白質βγサブユニット(Gβγ)と、そのC末端でG蛋白質αサブユニット(Gα)と、相互作用をすることを従来の研究で示すことができた(J.Biol.Chem.273,17585-17594,17595-17603,1998)。この情報を元に、G蛋白質とN型Caチャンネルの相互作用の可視化を試みるため、GoαおよびGβ1にシアン蛍光蛋白質ECFPを組み込んだ融合タンパク質と、N型CaチャンネルのI-II loopおよびC末端にイエロー蛍光蛋白質EYFPを組み込んだ融合タンパク質を、培養細胞BHK細胞に発現させた。このBHK細胞には、既にCaチャンネルα2サブユニットとβ1サブユニットを導入し、恒常的に発現させている。蛍光顕微鏡下で蛍光のパターンを観察したところ、Goαはdiffuseな蛍光が見られ、Gβ1は島状に限局した蛍光が見られた。両者を共発現させると、Gβ1単独と同様のパターンを示した。一方、N型CaチャンネルはI-II loopおよびC末端のいずれにEYFPを組み込んでもその発現パターンは変わらず、Gβ1より以上に限局した蛍光を示した。

さらに、GoαあるいはGβ1サブユニットとN型Caチャンネルを共発現させると蛍光パターンはN型Caチャンネル単独と同様のパターンを呈した。以上の結果から、1)外来性のGαおよびGβサブユニットが相互作用をすること、2)外来性のN型Caチャンネルと外来性のGαあるいはGβサブユニットが相互作用をすること、が示唆された。本年度は、ECFPとEYFP間のfluorescence resonance energy transfer(FRET)の有無を検討し、G蛋白質とイオンチャンネル分子間の相互作用の可視化を試みる。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、各種蛋白質の細胞内局在を詳細に検討する。申請者のこれまでの研究から、電位依存性N型Ca^<2+>チャンネルは、1)チャンネルC末端とG蛋白質αサブユニット(Gα)との、2)チャンネルのリピートI-II間の細胞内ループとG蛋白質βγサブユニット(Gβγ)との、双方の直接的な相互作用により抑制を受けることが明らかとなった。この結果を踏まえて、N型チャンネル(α1B)側は、C末端とリピート1-II間の細胞内ループにGreen Fluorescent Protein(GFP)変異種のYFPを組み込んだYFP-N型チャンネルを作製した。一方、G蛋白質側は、GoαのN端(lipid修飾部位の後方)とGβ1のN端にGFP変異種のCFPを組み込んだCFP-G蛋白質を作製した。これらYFP-N型チャンネル、CFP-G蛋白質を、予め外来性のCa^<2+>チャンネルα2、β1サブユニットが安定に発現している動物培養細胞(BHK細胞)に単独で発現させ、共焦点レーザー顕微鏡でその細胞内局在を観察したところ、N型チャンネルは細胞膜や小胞体にパッチ状に発現し、G蛋白質は核を除く細胞膜、細胞質で均一な発現パターンを示した。さらに、両者を共発現させると、これら2つの発現パターンが重層する像が得られた。この細胞でCFP(donor)-YFP(acceptor)間のFluorescencce Resonance Energy Transfer(FRET)の観察を行ったところ、チャンネルC末端にYFPを組み込んだYFP-N型チャンネルとGoαにCFPを組み込んだCFP-Goαを共発現させた組み合わせで、CFPの蛍光強度に対するYFPの蛍光強度の比(YFP/CFPの比)が、受容体刺激により経時的に変化した。このことは、N型チャンネルとGαがチャンネルのC末端を介して、実際に生細胞の中で相互作用していることを示唆する。以上の内容の論文原稿を現在作成中である。
高圧下において発揮される生体高分子機能の解析

本研究では、圧力の「効果」を積極的に「利用」する試みを行い、高圧による生体高分子構造の変化が、物性変化を通じて機能の変化として現われる過程を、「新奇な機能を利用すること」に目標を定め、酵素・膜タンパク質機能、核酸ータンパク質相互作用などを対象に検討した。一年目は主なプロテア-ゼ、ペプチタ-ゼの作用について検討を加えたが、二年目はその成果にのっとり、ヌクレア-ゼ、エステラ-ゼを取り上げた。その結果,圧力の二つの作用のうち、Morlifier作用については、プロテア-ゼの逆触媒によるペプチド縮合反応の基質特異性・触媒性能の変化を解析し、常圧下とは異なる触媒機能を得た。また、エンドヌクレア-ゼでは基質である核酸の塩基配列に対する特異性の変化および結合特異性の変化に重点を置いて解析した。RNAの分解では、天然の酵素だけでなく、そのモデル触媒系も対象とし、圧力が反応の速度を飛躍的に高める反面、特異性は低下させること、その原因は酵素モデルと基質との複合体形成に伴う正の体積にあること等が明らかにされた。一方Denaturant作用については、血清タンパク質、膜タンパク質を対象とし、その選択的遊離およびペプチタ-ゼによる限定的加水分解における圧力の効果を検討し、特にこれらの基質および触媒高分子が高圧力下でとる高次構造の変化と機能の変化との関係を明らかにした。さらに、圧力による可逆的変性作用を利用して、タンパク質の内部の所定の官能基(フェロセンなど)を導入するという新しい手法を提案するに至った。タンパク質は、高い圧力により変性や相互作用の変化をきたすことが知られている。本研究では、より基礎的な側面での酵素・タンパク質における圧力の利用を考えた。圧力を変性剤として利用することには、通常用いられる化学的変性剤とは異なり、処理後に変性剤の除去操作が要らないという大きな利点がある。本年度は、変性状態でタンパク質をプロテア-ゼによって限定分解すること、および化学修飾することを試みた。対象タンパク質には一次構造などいくつかの性質がわかっており、良質純品が入手しやすいという理由からまずBSAを取り上げた。BSAにサ-モライシンを数千気圧で作用させると、分子量48000あたりに分解生成物が得られる。われわれは既に加圧下においてサ-モライシンの低分子基質に対する活性が10倍以上になることを報告しているが、高分子性の基質(熱変性BSA)での作用ではむしろ(加圧下で)活性低下が見られることから、上記の結果は加圧により、BSAのコンフォメ-ションが崩れたことが主要な原因であると考えられる。この限定分解の部位を、C末端、アミノ酸分析によって特定した。一方、高分子化電子メディエ-タ-として知られる、フェロセン誘導化BSAの調製を、圧力変性下で行なった。得られたFc-BSAの鉄原子吸光分析から、BSAI分子に結合しているFcの個数を計算したところ、圧力変性で調製したFc-BSAには6M尿素変性や、コントロ-ルよりも多くのフェロセンが含有されていることがわかった。一年目は主にプロテア-ゼ、ペプチダ-ゼの作用について検討を加えたが、二年目はその成果にのっとり、ヌクレア-ゼ、エステラ-ゼを取り上げた。その結果、圧力の二つの作用のうち、Modifier作用については、プロテア-ゼの逆触媒によるペプチド縮合反応の基質特異性・触媒性能の変化を解析し、常圧下とは異なる触媒機能を得た。

RNAの分解では、天然の酵素だけでなく、そのモデル触媒系も対象とし、圧力が反応の速度を飛躍的に高める反面、特異性は低下させること、その原因は酵素モデルと基質との複合体形成に伴う正の体積にあること等が明らかにされた。一方Denaturant作用については、血清タンパク質、膜タンパク質を対象とし、その選択的遊離およびペプチダ-ゼによる限定的加水分解における圧力の効果を検討し、特にこれらの基質および触媒高分子が高圧力下でとる高次構造の変化と機能の変化との関係を明らかにした。さらに、圧力による可逆的変性作用を利用して、タンパク質の内部に所定の官能基(フェロセンなど)を導入するという新しい手法を提案するに至った。
痛覚刺激による注意干渉の回路メカニズム：マウス皮質イメージングを用いた解析

1、皮質イメージングによる注意干渉関連領域の同定を行った。頭頂連合野を賦活させると一次視覚野が抑制されることから、注意干渉関連領域として頭頂連合野を候補にあげられた。対照実験として、一次視覚野の腹側に位置する高次領野を賦活し、その効果をフラビンイメージングにより解析した。賦活には、側頭部位に注入したMNI-ケージド-L-グルタミン酸からUVフラッシュ光を照射してグルタミン酸を放出させた。同領野から一次視覚野への若干の興奮性伝播が見られたことから連合野賦活との差異が明白になり、一次視覚野抑制に対する頭頂連合野の特異性を明らかにすることができた。2、感覚野抑制に働く神経経路の同定を行った。頭頂連合野から一次視覚野への皮質内経路の切断したマウスの頭頂連合野にMNI-ケージド-L-グルタミン酸を注入し、UVフラッシュ光照射によるグルタミン酸放出で同領域を賦活させた。その効果をフラビンイメージングにより解析したところ、一次視覚野の抑制応答が消失することを見出し、頭頂連合野から一次視覚野への皮質内経路が抑制応答に必要であることを明らかにした。3、注意干渉関連領域の賦活と感覚野抑制の程度との関係を調べた。強弱2種の電流強度により頭頂連合野を電気刺激し、各々について一次視覚野の神経活動が抑制される様をフラビンイメージングによって測定した。その結果、電気刺激の強度の強ければ、頭頂連合野の興奮は大きくなるとともに、一次視覚野がより強く抑制されることが観測され、両領野間の定量的な関係を明らかにした。研究代表者が所属する研究室の教授が定年退職を迎えるにあたり、退職記念行事の準備と実施、ならびに教授退職に伴う種々の事務手続き、研究室の備品・薬品等の整理業務に膨大な時間がかかった。1、皮質イメージングによる注意干渉関連領域の同定をさらに進める。視覚野の視覚応答を抑制する注意干渉関連領域として頭頂連合野を既に同定したが、この他の脳領域についても検討する。特に、聴覚野と体性感覚野の応答抑制を指標にして探索を行う。2、痛覚刺激により賦活され、感覚野抑制に働く神経経路の同定を試みる。麻酔マウスの後肢をサイン波電気刺激した後、灌流固定・免疫染色を行う。c-fos蛋白質の発現を調べ、賦活した脳部位を同定する。さらには、痛覚刺激で賦活する皮質領域にトレーサーを注入し、神経結合を明らかにする。(理由)研究代表者が所属する研究室の教授が定年退職を迎えるにあたり、退職記念行事の準備と実施、ならびに教授退職に伴う種々の事務手続き、研究室の備品・薬品等の整理業務に膨大な時間がかかった。そのため、研究の進展を遅らさざるを得なくなり、使用する予定であった研究費が未使用となったから。(使用計画)皮質イメージングによる注意干渉関連領域の同定で使用するマウスや、感覚野抑制に働く神経経路の同定に使用するマウスや試薬の購入に使用する。
数サイクル高強度中赤外電界下の固体の極限応答探索

平成29年度に開発した中赤外光源を用いて、実際の固体高調波に関する知見を得た。固体に印加している最中の、過渡的なタイミングで、可視光のプローブを入れ、固体の透過、反射スペクトルを測定した。バンド構造を調べるための、中赤外の波長で決まる振動時間(6000 nmで20フェムト秒)より短いプローブ光の同期システムを開発した。固体バンド構造決定と高調波計測装置開発として、赤外光源でワイドギャップ半導体を励起して、非線形光学応答を誘起した際の可視、紫外スペクトル領域での計測を行った。試料としては2次元系のセレン化ガリウムや、典型的な半導体であるガリウムひ素を用いて、紫外線に至る高次高調波発生に成功している。この高次高調波発生に際し、高調波の光子エネルギーが典型的なブリルアンゾーン内の電子波数に台頭しており、バンド構造の再構築に必要な曲率の決定を行った。これは高次高調波の偏光測定によって得られたものである。高次高調波のスペクトルは透過並びに反射の両配置で計測して、固体内を伝搬する効果を明らかにした。紫外線は化学反応追跡、光電子分光等の応用範囲が大きいスペクトル領域ではあるが,物質の屈折率が低く、透過率が低いために、光学素子を作成することが非常に困難かつ、高額であるが、極限的非線形光学効果を用いることによって、赤外光源の制御と固体高調波発生媒質の人工構造成型を通して、紫外高調波の偏光制御を行った。光電子分光では一パルスあたりの放出される電子数が、スペースチャージにより分解能をリミットする。固体高調波発生では、発生に必要な強度が気体よりも低く抑えられており、高調波発生に必要なエネルギーが低く、高繰り返し化可能であり、適合性が良い知見を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。固体からの高調波発生用の高強度中赤外光源の開発を無事に終了した。中赤外光源開発では既存のシステムに励起レーザーを導入して、高強度化を行っている。当初の予定では高強度化は新たなレーザーを購入予定であったが、所属研究室の既存のレーザーが使用可能であったため、これを流用した。現在の出力は中赤外の3.5マイクロメートルで、約120マイクロジュールであり、高次高調波発生実験のために十分な強度がある。この中赤外の光源についてはさらなる高度化を合わせて、現在Optics Lettersに投稿中である。この光源を用いて、高調波発生実験を行った。GaSeからの奇数次の高調波の偏光が曲がることを見出し、理論の研究室との共同研究により、GaSeの最低伝導帯のバンドの逆有効質量と関連付けられることを世界で初めて実証し、また理論的な式を演繹した。この結果はPRLに投稿し、受理されて、すぐに論文になる予定である。また年度途中での実験結果より、理論的に予言されていたが、実証されていない、円偏光中赤外励起の高調波発生における選択則を実験的に実証した。この結果はOpticaに掲載済みである。またGaAsからの高調波発生を世界で初めて反射配置で行い、バンドギャップを越える高次高調波発生に成功した。高次高調波発生の透過配置と反射配置では発生した高次高調波のスペクトル形状が全く異なり、反射配置における高調波のスペクトルが固体の応答を正しく再現していることが分かった。より高次の高調波発生を反射配置で行うことはこれまで世界で例がなく、またこの配置が固体の非線形応答を正しく予測できることから、これからの主流な実験手法となることが予想され、他の研究室にさきがけて、行っていく予定である。またこの結果自体はNature Photonicsに投稿予定である。年度当初に計画していた励起のためのチタンサファイアレーザーの高強度化、並びに、中赤外光源の高強度化が完全に完了した。さらに中赤外光源の短パルス化を行い、中赤外でのスペクトル領域での1.8サイクルの電場発生に成功した。これは当初の計画になかったことであるが、研究遂行のために重要な役割を果たすと思われる。中赤外光源で、GaSeからの高調波発生を行い、その偏光回転とバンドの形状について実験・理論両方の側面からアプローチして、高調波発生とバンドの波数依存する逆有効質量の関係性を明らかにした。この結果は年度初めの予定以上の成果である。さらには開発下中赤外光源で、円偏光励起高次高調波発生に成功して、さらに長年未解決であった、選択則の観測に成功している。これもやはり当初の目的にはなかったが、現在最先端の研究において重要な貢献である。最後に、固体からの高次高調波発生の長年の懸案であった位相整合条件について考察を行い、世界で初めて、反射配置での固体からの高調波発生に成功した。反射配置では透過配置に比べ、中赤外光パルスの伝搬効果が最小限に抑えられ、物質固有の非線形応答を抜き出すことに成功した。この反射配置での固体高調波発生はこれからの主流となる実験手法になると思われる。