hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サブミリ波帯直交偏波共用広帯域周波数選択板に関する研究

惑星探査機搭載サブミリ波分光放射計のアンテナ給電系に用いる直交偏波共用周波数分離板(FSS)として,Jerusalem Cross Slot型とそれを改良したMaltese Cross Slot型FSSを設計し,その設計に基づいてフォトリソグラフィの手法により試作した.試作したFSSについてサブミリ波帯で反射透過特性を測定することにより所望の反射透過特性が得られることを確認した.さらに2層化により透過帯域の広帯域化を実現できることを確認した.1.惑星探査機搭載サブミリ波分光放射計受信機用FSSの仕様検討:地球をはじめとする惑星大気のための惑星探査機搭載用サブミリ波分光放射計において,複数の周波数帯の受信機で単一のアンテナを共用して受信するための分波器として用いるために,650 GHz帯付近の周波数帯を選択的に透過し,600 GHz帯以下の周波数帯を反射する周波数選択板(Frequency Selective Sureface)について計算機シミュレーションにより理論的検討を行った.FSSの方式としては,サブミリ波帯での損失の大きな原因となる誘電体基板を用いないスロットアレー方式とし,スロットの形状として,Jerusalem-cross型(JCSA)と,より広帯域化の可能性のあるMaltese-cross型(MCSA)について比較検討することとした.2.単層FSSの設計: JCSA型およびMCSA型のFSSについて,400750 GHzの周波数範囲で入射角45度の場合について反射透過特性の周波数および偏波依存性について,モーメント法により解析を行った.特に,それぞれのタイプのFSSについて,FSSの比帯域の,各種スロット形状パラメータに対する依存性について検討し,比帯域の広帯域化を図った.3.単層FSSの試作:モーメント法によるFSSの広帯域設計が完了しなかったため,単層FSSの試作には至らなかった.モーメント法によるFSSの広帯域設計が完了しなかったため,単層FSSの試作には至らなかったため.1.単層FSSの設計:昨年度に引き続き,JCSA型およびMCSA型のFSSについて400750 GHzの周波数範囲で入射角45度の場合について反射透過特性の周波数および偏波依存性について,モーメント法による解析を行った,その結果,MCSA型FSSの形状パラメータを最適化することにより, JCSA型に比べて比帯域の大きい単層型FSSが得られることを明らかにした.また,JCSAやMCSAのような限定され形状ではなく,自由度の高い任意のスロット形状を用いることによる単層FSSの広帯域化について,FSSの単位セルを格子状の要素に分割してそれそれの要素における導体の有無を01の離散値配列で表現し,遺伝的アルゴリズム(Genetic Algorithm)による最適化手法を適用することにより,FSSの広帯域化ができることを示した.2.単層FSSの試作,特性評価試験とその結果の評価検討:上記の1で設計された単層MCSA型を試作した.当初は,誘電体膜を用いない単純な中空スロットを想定していたが,MCSA形の金属導体の鋭角部分が金属内部応力により変形することが危惧されたため,2μm厚の誘電体(SiN)薄膜上に蒸着した200nm厚の金にphotolithographyによりスロットを形成することとし,このために形状を若干修正した.試作品は年度末に完成したが,今年度は特性評価試験には至ることが出来なかった.3. FSSを2層化することによる広帯域化設計:上記の1で得られた中空型単層MCSA型FSSを2層化することによる透過帯域の広帯域化について検討した.その結果上記の1で得られたMCSA型FSSの場合,2層の間隔を213μmとすることにより,透過率99%の帯域幅を約70 GHz(比帯域約11%)が実現できることを明らかにした.これにより,従来のJCSA型FSSを2層化して得られる帯域幅に比べて約1.8倍の広帯域化が実現できる.単層型FSSの試作に年度末までかかったため,今年度は特性評価試験には至ることが出来なかった.前年度に試作した,単層Maltese-Cross Slotアレイ(MCSA)型周波数選択板(FSS)について,入射角45度における複素反射係数と複素透過係数を400 GHz750 GHzのサブミリ波帯でベクトルネットワークアナライザにより測定した.反射・透過係数の測定結果をモーメント法による数値計算と比較した結果,実測値は計算値と非常によく一致していることが確認でき,モーメント法による設計およびそれに基づくFSSの試作が十分な精度でなされていることが確認できた.さらに,本設計によるMCSA型FSSを2層スタックにした場合の反射・透過特性をモーメント法により計算した結果,2層化により500 GHz600 GHzの120 GHzの帯域でほぼフラットな透過特性を直交両偏波に対して実現できることを確認した.以上の結果をまとめると,JCSA型のFSSは2層化により透過帯域幅(@-1dB)は約60 GHzになるのに対し,MCSA型の場合は2層化により約120 GHzとなることから,MCSA型の方がJCSA型に比べて約2倍の広帯域が直交両偏波で実現できることが明らかとなった.このようなサブミリ波帯の広帯域な直交偏波共用FSSは惑星探査機搭載用サブミリ波分光放射計のみならず,ミリ波・サブミリ波帯大型電波望遠鏡での多周波数帯同時観測の準光学的周波数分波器としての利用が期待されており,国立天文台野辺山電波観測所の45m電波望遠鏡に同様の直交偏波共用FSSの利用に向けての検討を進めている.惑星探査機搭載

サブミリ波分光放射計のアンテナ給電系に用いる直交偏波共用周波数分離板(FSS)として,Jerusalem Cross Slot型とそれを改良したMaltese Cross Slot型FSSを設計し,その設計に基づいてフォトリソグラフィの手法により試作した.試作したFSSについてサブミリ波帯で反射透過特性を測定することにより所望の反射透過特性が得られることを確認した.さらに2層化により透過帯域の広帯域化を実現できることを確認した.1.単層FSSの特性評価試験とその結果の評価検討:前年度設計した単層FSSを試作し,反射・透過係数の周波数特性およびその偏波依存性を400 GHz750 GHzのサブミリ波帯で測定し,その結果について評価検討する.2.FSSを2層化することによる広帯域化設計前項の特性評価試験とその結果の評価検討結果に基づき,上記の製造手法によりサブミリ波帯において十分な精度のFSSを作成することができていることが確認できた場合.同様の単層FSSを一定の間隔で平衡に2枚配置した2層構造とすることに,透過帯域幅を広帯域化することを試みる.1.単層FSSの特性評価試験とその結果の評価検討:前年度に試作した単層FSSについて,反射・透過係数の周波数特性およびその偏波依存性を400 GHz750 GHzのサブミリ波帯で測定し,その結果について測定実験により評価検討する.2. FSSを2層化することによる広帯域化設計:前項の特性評価試験とその結果の評価検討結果に基づき,同様の単層FSSを一定の間隔で平行に2枚配置した2層構造とすることにより,透過の広帯域化の可能性についてシミュレーションにより検討する.2層化FSSの試作については,最終年度までの予算では困難であることが判明したため,試作は断念する.電波工学モーメント法によるFSSの広帯域設計が完了しなかったため,単層FSSの試作を今年度に行うことが出来なかった.単層FSSの試作に年度末までかかり,単層FSSの測定評価実験に取り掛かることができなかったため.今年度生じた次年度使用額は,今年度試作できなかった単層FSSの試作に充てる.今年度生じた次年度使用額は,今年度実施出来なかった測定評価実験および成果の学会発表などに充てる.
パイ共役炭化水素における炭素-炭素共有結合とイオン結合のスイッチングの精密制御

π共役炭化水素のイオン的なC-C結合解離によるカルボカチオン、カルボアニオン生成の熱力学的および速度論的挙動を検討し、以下の新しい知見を得た。1.溶媒とカルボカチオンとのルイス酸塩基的相互作用によるイオン解離の促進t-BuC_<60>^-と置換シクロプロペニリウムイオンから、フラーレンC_<60>の1,4-付加体を定量的かつ位置選択的に合成した。この炭化水素は、THFではイオン解離しないが、DMSOを添加すると部分的に解離して、t-BuC_<60>^-に特有の近赤外吸収を示した。解離自由エネルギーはDMSO含有量の増加にともなって低下したが、この効果はDMSOのモル分率が5%以下の領域で特に顕著であった。DMSOが大きなドナー数をもつことから判断して、カチオンに対するルイス塩基的な溶媒和がイオン解離促進の主な原因であると結論した。2.イオン解離の速度論パラメーター炭化水素のC-C結合解離によるπ共役イオン対発生の精密な反応速度測定は、これまで報告例がなかった。本研究では、最近我々が合成したイオン解離性炭化水素を用いて、DMSO-THF混合溶媒中におけるC-C結合のイオン解離速度を測定した。この解離は数kcal/molの低い解離自由エネルギーを示すことから、活性化自由エネルギーも小さく、解離は極めて迅速に起こると推測された。しかし反応速度測定の結果この反応は意外に遅く(室温で半減期10秒程度)、活性化自由エネルギーは約19kcal/molと、かなり大きいことが判明した。この結果から、検討した分子のイオン解離はは、炭素ー炭素結合が最初ラジカル解離的に伸長し、結合がかなり伸びた時点で初めてイオン的な電子配置に移行することが示唆された。
内耳機能における内向き整流K^+チャネルの分子生物学的・生理的解析

聴覚は人や動物にとって不可欠な感覚である。音情報を受容するため高度に分化した器官が内耳蝸牛である。蝸牛は内リンパ液という特殊な液体で満たされている。それは細胞外液であるにも関わらず、約150mMのK^+イオンを含んでおり、電位は約+80mVと非常に高い(内耳高電位)。内リンパ液には、聴覚一次受容器である有毛細胞の感覚毛が触れている。音刺激により内リンパ液のK^+イオンは有毛細胞へ流入し、細胞を興奮させるが、内耳高電位はK^+イオン流入のdriving forceを増大し、音に対する高感受性を形成している。よって、内耳高電位は、聴覚機能にとって必須である。以前より内リンパ液の高K^+・高電位の成立には、蝸牛側壁の、螺旋靱帯と呼ばれる線維芽細胞群や血管状と呼ばれる上皮細胞群に分布する、K^+チャネルを介したK^+イオン動態が深く関わっているとされてきたが、その役割や分子実体は、未だ大部分が不明である。本研究では、K^+チャネルの分子レベルでの同定と生理的機能の解明を目的にした。我々は以前に、内向き整流性K^+チャネルKir4.1が血管状に発現し、側壁を介したK^+イオンの循環を促進させ、高電位の成立に必須であることを報告していた。更に昨年度、別のK^+チャネルKir5.1が、螺旋靱帯の特殊な線維芽細胞に局在していることを明らかにし、K^+イオンの循環を負に制御している可能性を見出した。本年度は、Kir5.1の蝸牛における生理機能を解析する目的で、ノックアウトマウスの作成を開始し、ヘテロマウスを得ることができた。また、新たにK^+イオン循環を制御するトランスポーター分子も見出しつつある。内耳蝸牛のK^+イオンの循環は、Kir4.1、Kir5.1、トランスポーター等のイオン輸送体によって、精密に制御されており、それにより内リンパ液の高K^+・高電位が恒常的に保たれているということが明らかとなった。聴覚は人や動物にとって不可欠な感覚機能である。以前より内リンパ液の高K^+・高電位の成立には、蝸牛側壁の、螺旋靭帯と呼ばれる線維芽細胞群や血管状と呼ばれる上皮細胞群に分布する、K^+チャネルを介したK^+イオン動態が深く関わっているとされてきた。しかし、そのK^+チャネルの具体的な役割や分子実体は、未だ大部分が不明である。本研究では、そのK^+チャネルの分子レベルでの同定と生理的機能の解析を目的にしている。我々は以前に、内向き整流K^+チャネルであるKir4.1が血管状に発現し、側壁を介したK^+イオンの循環を促進させ、高電位の成立に重要な役割を果たしていることを報告した。今回、別の内向き整流K^+チャネルKir5.1が、螺旋靱帯の特殊な線維芽細胞に特異的に分布していることを明らかにし、K+イオンの循環を負に制御している可能性を見出した。よって、内耳蝸牛のK^+イオンの循環は、Kir4.1、Kir5.1という異なった2つのチャネルによって、精密に制御されており、それにより内リンパ液の高K^+・高電位が恒常的に保たれていると推察することができた。今後さらに、ノックアウト動物等を作成することにより、Kir5.1の内耳における機能を詳細に検討していく予定にしている。

我々は以前に、内向き整流性K^+チャネルKir4.1が血管状に発現し、側壁を介したK^+イオンの循環を促進させ、高電位の成立に必須であることを報告していた。更に昨年度、別のK^+チャネルKir5.1が、螺旋靱帯の特殊な線維芽細胞に局在していることを明らかにし、K^+イオンの循環を負に制御している可能性を見出した。本年度は、Kir5.1の蝸牛における生理機能を解析する目的で、ノックアウトマウスの作成を開始し、ヘテロマウスを得ることができた。また、新たにK^+イオン循環を制御するトランスポーター分子も見出しつつある。内耳蝸牛のK^+イオンの循環は、Kir4.1、Kir5.1、トランスポーター等のイオン輸送体によって、精密に制御されており、それにより内リンパ液の高K^+・高電位が恒常的に保たれているということが明らかとなった。
Dicer-floxマウスを用いたiPS細胞におけるmicroRNAの役割の解析

内容:Dicerを欠損可能なiPS細胞の樹立のために、Dicer-floxマウスの尻尾の線維芽細胞を培養し、そこにOxt3/4,Sox2,Klf4,c-mycをレトロウイルスにて発現させ、iPS株を樹立した。一方、Dicer-floxがホモでRosaCreERT2をヘテロでもつマウスを準備し、ここからも同様の方法でiPS細胞を樹立した。これらのiPS細胞について、未分化マーカーを免療染色やRT-PCRで、増殖をBrdUの取り込みなどで検討し、通常のiPS細胞と未分化状態における性状がかわらないことを確認した。さらにDicerを欠失させるため、Creをトランスフェクション、あるいはタモキシフェンの投与にて発現させ、Dicerが欠失することを確認している。次にこれらの細胞にmiRNAを発現させるため、様々な異なるタイプのmiRNA発現プラスミドを作成し、iPSへのトランスフェクションあるいはレトロウイルスの形にしてインフェクションを行い、培養し、miRNAが過剰発現がされるかどうかqRT-PCRを用いて検討を加えた。ウイルス、トランスフェクションいずれもあまり効率の良い過剰発現には至らず、また結果も不安定で、miRNAの過剰発現の安定した系の開発が技術的な課題として残った。意義、重要性:しかしながら、本研究で樹立したこれらのiPS細胞は、Dicerの必要性の検討のみならず、miRNAのiPSの未分化性維持、分化過程における役割を検討するためにきわめて有用なツールとなることが期待される。
ハニカムコアを持つ保温壁の熱伝達率測定

六角形ハニカムサンドイッチ構造の保温壁の内部に生じるふく射および対流伝熱について,その熱伝達率を測定し,多孔質材による伝熱抑止の効果について検討した.すなわち,内部が多孔質で充たされているハニカムサンドイッチパネルが鉛直に置かれた場合について伝熱実験を行った.実験は,ハニカムコアの形状比をH/L=11固定とし,平板直接法(JIS A1413)に基づいて伝熱量を測定し,その結果を数値解析結果と比較検討した.〈伝熱実験〉本研究費補助金を受けて,縦横300mmの大きさの試験体(保温パネル)の熱伝導率(熱伝達率)を平板比較法で自動計測する装置を完成させた.この装置を用いて,厚さL=30mmの六角形ハニカムサンドイッチパネル(セルのサイズH=30mm)の内部に多孔質材を充填して鉛直に置いた場合について,伝熱量を測定した.なお,実験に用いたハニカムコアは上質紙で作られ,内部に充填する多孔質材には目の粗い発泡プラスチックを用いた.〈数値解析〉ハニカムサンドイッチパネルは多数の六角形断面のセルが連なっているので,それらの一つを考え,内部のふく射と自然対流について,ふく射の伝播をRosselandの近似で,流れをDarcyの法則で扱い,実験と同条件での数値解析を行なった.その結果,実験結果と解析結果は良く一致した.六角形ハニカムサンドイッチ構造の保温壁の内部に生じるふく射および対流伝熱について,その熱伝達率を測定し,多孔質材による伝熱抑止の効果について検討した.すなわち,内部が多孔質で充たされているハニカムサンドイッチパネルが鉛直に置かれた場合について伝熱実験を行った.実験は,ハニカムコアの形状比をH/L=11固定とし,平板直接法(JIS A1413)に基づいて伝熱量を測定し,その結果を数値解析結果と比較検討した.〈伝熱実験〉本研究費補助金を受けて,縦横300mmの大きさの試験体(保温パネル)の熱伝導率(熱伝達率)を平板比較法で自動計測する装置を完成させた.この装置を用いて,厚さL=30mmの六角形ハニカムサンドイッチパネル(セルのサイズH=30mm)の内部に多孔質材を充填して鉛直に置いた場合について,伝熱量を測定した.なお,実験に用いたハニカムコアは上質紙で作られ,内部に充填する多孔質材には目の粗い発泡プラスチックを用いた.〈数値解析〉ハニカムサンドイッチパネルは多数の六角形断面のセルが連なっているので,それらの一つを考え,内部のふく射と自然対流について,ふく射の伝播をRosselandの近似で,流れをDarcyの法則で扱い,実験と同条件での数値解析を行なった.その結果,実験結果と解析結果は良く一致した.
高エンタルピー流における非平衡原子・分子過程計算コードの開発

地球大気組成種の非平衡原子・分子過程と高エンタルピー流の結合計算コードの開発を行った。本計算コードは、プラズマ内部の原子・分子励起状態間の遷移過程を直接解き、非平衡状態分布を計算する。考慮した遷移過程は、電子・原子・分子間衝突による励起、電離、解離過程、重粒子間衝突による化学反応、輻射の放出・吸収過程である。真空紫外から近赤外までの主要な発光スペクトルを解析できるように、各化学種の電子励起状態を選定してある。得られた状態分布から、比熱比や化学組成、輻射放出・吸収率などの巨視的物理量を計算し、流れ場の保存量にフィードバックさせる。従来の熱化学非平衡流体解析では評価することが出来なかった、励起種による流れ場への影響を正確に見積もることができる。対流や拡散流束も変化し得るが、特に化学反応生成率と輻射熱輸送量は数10%以上もの増減を示す場合もある。また、時々刻々変化するプラズマ流れ場の大域的な変動を追跡しながら、任意の時空間における発光スペクトルを数値データとして記録できる。分光装置により測定された発光スペクトルとの直接的な比較が可能となる。そのため、プラズマ内部状態をより精緻に解析することができ、高エンタルピー流実験との非常に密な連携を実現する。プラズマ内部の状態を特定することのできなかった高エンタルピー流研究において、今までになかった新たな視点を与えることとなる。原子・分子過程と流れ場を結合した非定常解析は世界的にも未だ行われておらず、基礎的な物理過程と工学応用とを結びつける研究成果である。非常に詳細なプラズマ流れ場解析手法の確立は、近未来の宇宙開発において重要な意味を持つと確信する。このような研究成果をもとに、国内外の学術会議にて計6件の口頭発表を行った。また現在、学術雑誌への投稿準備も進めている。地球大気における各化学種の非平衡原子・分子過程と高エンタルピー流の結合計算コードの開発のための第一段階として、原子・分子構造データベースの構築を行った。空気を窒素・酸素分子の混合気体と考えて、それらの生成物であるN_2、O_2、NO、N、O、N_2^+、O_2^+、NO^+、N^+、O^+、N^<2+>、O^<2+>、O_2^-、O^-、e^-の15化学種を考慮した。原子化学種の量子状態は、全てNISTのデータベースを参照した。また、分子化学種の量子状態を記述するために分光定数の実験データを収集した。次に、励起状態間の遷移反応速度定数の理論的・実験的な経験式を調べた。原子化学種の自然放射係数は、NISTのデータベースを参照し、総数は8,000遷移程度を収集してデータベース化した。分子のバンド放射係数の計算に必要となる電気双極モーメントには、最新の実験データ掲載論文を調査し参照した。また、電子衝突による励起、電離、解離過程には、Drawinの反応断面積を用い、重粒子間衝突反応にはParkの反応モデルを用いた。地球大気の構成化学種に対して構築した衝突輻射モデルを基に、非定常遷移レート方程式計算コードの開発を行った。現在、ここまでの内容を基に投稿論文の執筆中である。今後は、非定常遷移レート方程式と輻射流れ場の支配方程式の統合計算コード構築を目指す。このような計算手法は、局所的に非平衡な原子・分子過程を伴う非定常高エンタルピー流動現象の数値解析を実現するため、実験とのより密な連携を可能にする。プラズマ内部の状態を特定することのできなかった高エンタルピー流研究において、今までになかった新たな視点を与えるになり、一種のブレイク・スルーとも言える。
肥満におけるマクロファージスカベンジャー受容体 CD163の機能解明

マクロファージに発現するHbスカベンジャー受容体であるCD163を欠損するCD163KOマウスは、高脂肪食による肥満に抵抗性を示し、WTマウスと比べ体重・肝重量・内臓脂肪量が有意に少なく、腸内細菌叢に変化が生じていた。肥満化WTマウスの肝や精巣上体ではCD163陽性細胞が著減しており、組織炎症によってCD163を全く発現しない単球由来マクロファージが浸潤していることが分かった。以上から、CD163が初期の肥満形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、新たな系統・個体発生学的解析のテーマとしてCD163は組織在住マクロファージのマーカーである可能性が示唆された。CD163 WT/KOマウスを用いて、高脂肪食投与による肥満・II型糖尿病モデルを作成し、WTマウスは肥満と共に脂肪肝・内臓脂肪肥大と耐糖能異常を示すが、肥満抵抗性を示したKOマウスでは認められないことが分かった。これらの差異を脂肪組織中のマクロファージの機能的差異(慢性炎症への進展しやすさ等)に基づくと仮定し、3T3-L1脂肪細胞とマクロファージの共培養系によるin vitro実験を行ったが、WT/KOマクロファージ間にin vivoの現象を説明し得るような差を認めなかった。しかし、興味深いことに、肥満化することで肝臓や内臓脂肪(精巣上体脂肪組織)中のマクロファージの総数は増加するにも関わらず、WTマウスにおいてもCD163陽性マクロファージ数は著減していることが分かった。つまり、脂肪蓄積した脂肪細胞や肝細胞と直接接触しているマクロファージの大部分はCD163陰性であるということが分かった。従って、in vivoの実験結果をもたらすWT/KOマウスの機能的差異は脂肪蓄積臓器では無く、吸収臓器内で起こっている可能性が示唆された。そこで、実験計画通り、糞中腸内細菌の抽出と腸内細菌叢の次世代シークエンスを行うこととした。また、脂肪蓄積した臓器で増加しているCD163陰性マクロファージが単球由来であることは、これまでにも報告がなされている。がんの腫瘍中に浸潤し単球由来マクロファージが大部分を占めるとされる腫瘍随伴マクロファージ(TAMs)も、申請者所属教室の解析では大部分がCD163陰性であることが分かっていた。これらを踏まえると、マウスにおいて「単球由来マクロファージはCD163を発現しない」という新たな仮説が考えられる。研究計画段階で予期しなかった発見であり、こちらに関してもin vitroの解析を開始した。「研究実績の概要」で記述した通り、マクロファージと脂肪細胞の共培養系では、マクロファージのCD163の有無による脂肪蓄積や炎症惹起性の差が顕著では無く、予期せぬ陰性データであったが、脂肪吸収と腸内細菌叢への解析へ移行することができている。尚、共培養系の実験計画は当初H29年度を予定していたが、前倒しで解析に入ることが出来ている。また、所属教室で以前に行われたCD163と腫瘍の解析で判明していた「腫瘍随伴マクロファージ(TAM)の多くがCD163陰性である」という結果と共に、マウスの単球由来マクロファージがCD163を発現せず、CD163が組織在住マクロファージのマーカーとして有用である可能性を強く示唆する洞察を得たと言える。このことは、未だに結論の出ていない「マクロファージの起源とその体内動態」を研究する上でCD163が非常に強力な道具となる可能性を示しており、新たな研究テーマを開拓したと言える。従って、当初の研究計画以上に進展していると言える。高脂肪食による肥満モデルマウスにおいてマクロファージのCD163(ヘモグロビンスカベンジャー受容体)を欠損しているCD163KOマウスは肥満抵抗性を示した。脂質代謝関連臓器の解析でも、肝や精巣上体脂肪組織において、CD163WTマウスは有意な重量増と脂肪蓄積を示したが、KOマウスでは同様の変化が見られなかった。ところが、興味深いことにWTマウスの臓器内ではCC163陽性マクロファージが著減しており、炎症性サイトカインの上昇とCCL2(単球遊走に寄与)の発現が上昇していた。一方で腫瘍に浸潤する腫瘍関連マクロファージ、およびin vitroで樹立した骨髄由来マクロファージはCD163を全く発現しないことが分かった。そこで、高脂肪食投与下のWTマウスにおいて、脂肪肝内のマクロファージのCD163発現が著減した理由は、慢性炎症によるCCL2依存的な単球由来マクロファージの増加によるものと仮定し実験を行なった。クロドロネートリポソームの腹腔投与によってマクロファージを一時的に除去したところ、マクロファージ数が回復した後もCD163の発現は著減したままであることが分かった。同様の現象は、脾臓でも認められたが、高脂肪食投与による肥満モデルマウスでは、脾臓内のC163発現は変化していなかった。以上から、マウスにおいて、CD163は組織在住マクロファージにのみ発現するとの新たな仮定を設定し、組織在住マクロファージの由来とされる卵黄嚢マクロファージのCD163発現をマウス胎児を用いた免疫染色で確認したところ、胎齢12日前後の造血の見られる肝臓にはCD163陽性マクロファージが殆ど存在せず、卵黄嚢内にCD163陽性マクロファージが局在していることが分かった。以上から、当初の肥満とCD163との関連性の解析から、CC163がマウスにおける組織在住マクロファージのマーカーとなり得ることが判明した。

マクロファージに発現するHbスカベンジャー受容体であるCD163を欠損するCD163KOマウスは、高脂肪食による肥満に抵抗性を示し、WTマウスと比べ体重・肝重量・内臓脂肪量が有意に少なく、腸内細菌叢に変化が生じていた。肥満化WTマウスの肝や精巣上体ではCD163陽性細胞が著減しており、組織炎症によってCD163を全く発現しない単球由来マクロファージが浸潤していることが分かった。以上から、CD163が初期の肥満形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、新たな系統・個体発生学的解析のテーマとしてCD163は組織在住マクロファージのマーカーである可能性が示唆された。高脂肪食投与下のCD163 WT/KOマウスの腸内細菌叢の変化を次世代シークエンスで捉え、変化した細菌群の解析を行う。可能であれば、その細菌群とマクロファージの相互作用についての解析まで行いたい。また、「現在までの進捗状況」で記述したCD163の組織在住マクロファージマーカーとしての有用性についても、別の新たなテーマとして平行して解析を進めていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。基礎病理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
メリクロンロボットによる植物組織培養の自動化に関する研究

組織培養により得られた長さ2mm程度の幼苗やカルス細胞塊を培養器間で移植するマイクロロボット(メリクロンロボットと呼称)を開発,試作した。本ロボットハンドはアクチュエータに形状記憶合金を使用しており,苗やカルスを傷めることなく把握して寒天培地から植出し,別の寒天培地に植付けることができる。苗の位置検出は培地に微弱なハルス電流を流すと,苗が一種のアンテナとなり電波を発振する現象を利用している。この検出精度に及ぼす受信アンテナ形状の影響を詳しく調べるとともに,受信アンテナをハンド部と一体化し小型化を図った。苗の性状判定はカラーセンサにより行う。以上の装置を統合した移植システムをユニツト化し,2ユニツトからなる全自動苗移植システムを試作,完成した。本システムでは分散型の制御方式を取り入れており,各ユニットは単体でも使用できる。また,室内を無菌維持するため電話回線による遠隔操作とした。システムの性能試験を行った結果,1本の苗を約20Sで移植でき,実用化の目処を得た。さらに,カルスを対象として,環境制御が可能な試作インキュベータにロボットを内蔵したカプセル構造型の移植システムを開発した。また,上記植物アンテナセンサ方式の応用として,植物器官やカルス細胞塊の電波像を得る装置を新たに試作した。その結果,電波像が形状認識や生理状態計測用センサとして利用できる可能性を見出した。さらに,遠心分離器を使用しない簡単な構造からなるプロトプラスト自動製造装置を試作した。これにより均一な大きさのプロトプラストが得られる。また,Dielectrophoresis現象を適用した溶液チャンバ内におけるプロトプラストの運動制御装置を試作し,1対1細胞融合の自動化についても検討した。以上の結果を基に,植物組織培養の自動化システム開発における設計理念について考察し,既存技術との整合性など現状における実用上の問題点を明らかにした。培養した幼苗(茎径1mm前後、長さ25mm前後)を新しい寒天培地に移植するロボット(メリクロンロボット呼称)を開発した。本試作ロボットハンドは動作機構として平行リンク方式を適用し、アクチュエータに形状記憶合金(線径0.4mm)を用いているのが特徴である。これにより幼苗を傷付けずソフトに把握し、寒天培地から植え出し、新しい寒天培地へ植え付けることが可能となった。また、苗把握や、植え付け、植え出し時における動作量あるいは力の制御は形状記憶合金の通電量をパルス幅変調方式で変化させることにより幅広く対応できることを実験により確認した。また、苗移植の高速化を図るため、ハンドを取り付ける直交座標型のアーム移動をベルト駆動とした。苗の位置検出は、寒天培地に微弱パルス電流を流すことにより、苗から発信される電波をハンドに取り付けたアンテナにより受信して行われる。アンテナ形状は、指向性の最も良い形状を実験により決定した。また、この銅箔アンテナを多チャンネル化することにより、植物の形態を電波像として捕らえるとともに、生体内部情報の検出の可能性について調べた。苗の成育状態(長さ、色)の判定には、RGB出力タイプのカラーセンサ素子を縦に6個配列し光源、スリットを組合わせたコリメータ的な装置を試作した。以上のそれぞれの試作装置を統合し、かつユニット化することにより、多段に搭載できる実用レベルの全自動苗移植システムを実現した。制御システムはホストコンピュータに補助金で購入したパーソナルコンピュータを用いた。また、ユニット単体に自律性を持たせた。また、パソコン通信による遠隔地からのシステム操作を試み成功した。

一方、上記とは別に、カルス細胞塊の植え継ぎに形状記憶合金アクチュエータを適用したペンシル型構造の4本指ハンドを試作しその性能を調べた。いずれの場合も、無菌維持のため購入した卓上クリーンベンチ内で移植実験を行った。組織培養により得られた観賞用植物の幼苗を古い培地から新しい寒天培地に移植するメリクロンロボットを開発した。本ロボットはアクチュエ-タに形状記憶合金を使用しており、苗を傷めることなく植え出し、植え付けることができる。また、苗の位置検出は培地に微弱なパルス電流を流し、苗からの電波を検出することにより行われる。この植物アンテナセンサの精度に及ぼす検出側のアンテナ形状の影響を明らかにするとともに、苗移植ハンドにアンテナをプリントし小型化を図った。苗の性状判定はカラ-センサにより行う。以上の装置を統合した移植システムをユニット化し、多段ユニット構造からなる全自動苗移植システムを試作、完成した。本システムでは分散型の制御方式を取り入れており、各ユニットは単体でも使用できる。また、室内を無菌維持するため、電話回線による遠隔走査とした。システムの性能試験を行った結果、1本の苗を約20sで移植でき、実用化の目処を得た。さらに、上記の植物アンテナセンサの応用として、植物器官やカルス細胞塊の電波像を得る装置を新たに試作した。その結果、電波像が形状認識や生理状態計測用センサとして利用できる可能性を見出した。一方、カルスを対象としてクリ-ンベンチとロボットを一体化したカプセル型の移植ロボットも試作した。これは培養器としても利用できるよう環境制御装置を備えている。さらに、組織培養の支援技術として、遠心分離器を使用しない簡単な構造からなるプロトプラスト自動製造装置を試作した。これにより均一な大きさのプロトプラストが得られる。また、Dielectrophoresis現象を適用した溶液のチャンバ内におけるプロトプラストの運動制御装置を試作し、1対1細胞融合の自動化の可能性を示した。以上の結果を基に、植物組織培養の自動化システム開発における設計理念について考察し、既存技術との整合性など現状における実用化の問題点を明らかにした。
DNA複製関連遺伝子と発がん

本年度我々は、DNA複製関連のヒト遺伝子のほとんどを網羅したDNAチップを企業と共同で開発した。このDNAチップは、複製開始反応に関与する遺伝子(ORC,Cdc6pをコードする遺伝子など)、複製フォークの進行に関与する遺伝子(DNAポリメラーゼをコードする遺伝子など)、複製チェックポイントに関与する遺伝子(RAD53をコードする遺伝子など)など、約200遺伝子からなる世界で初めての複製関連遺伝子チップである(特許申請準備中)。さらに我々はこのDNAチップを用いて、脳、肺、胃、腸、膵臓、肝臓、卵巣、子宮など様々な組織由来の株化されたがん細胞において、複製関連遺伝子の発現を網羅的に解析した。その結果、既に報告のあるMCM(DNAヘリカーゼ)関連遺伝子以外にも、正常細胞に比べ多くのがん細胞で発現が上昇している複製関連遺伝子を複数同定した(Cdt1など)。我々はこれらの遺伝子の発現上昇が、細胞のがん化に寄与しているのではないかと考えている。また本研究提案では、細胞のがん化に関与する複製関連遺伝子変異を同定することも目標としている。本年度我々は、株化されたがん細胞における複製関連遺伝子変異の有無を調べた。その結果、複数の遺伝子(ORC1遺伝子など)中に変異を発見したが、複数のがん細胞で共通する変異は同定されなかった。平成16年度はこのような解析を(臨床分離されたがん組織を含め)続けると共に、同定された変異遺伝子を正常細胞内で発現し、細胞のがん化への関与を調べる。
中等症・軽症血友病Ａにおける第Ⅷ因子の凝血学的特性に基づく新規治療戦略の開発

中等症・軽症血友病A患者の有する異常FVIIIの原因となるFVIII遺伝子変異については、ダイレクトシーケンス法による全エクソン領域における遺伝子解析に加えて、MLPA法及びLong-PCR法を駆使して、検索を進めた。結果、中等症血友病Aの兄弟2例において、エクソン領域には変異がみられず、重複・欠失もみられなかったが、Long-PCR法によって、一般には重症型を呈すると考えられる遺伝子構造変異の存在が示唆された。一方、FVIIaを用いた中等症・軽症血友病Aの異常FVIII特性に基づく新規個別化治療戦略として、FVIIaによるTF依存的FVIII活性化反応機序に関する検討を行った。全長型FVIIIとBドメイン除去型FVIIIとで比較検討し、また、トロンビンによるFVIIIの活性化(・不活化)に重要なアミノ酸残基である、Arg372及びArg336を他のアミノ酸残基に置換したFVIII変異体を発現し、FVIIaによるTF依存的FVIII活性化反応における影響を検討した。それらの成果を第40回日本血栓止血学会学術集会及び第61回米国血液学会にて公表した。本年度は主に、FVIIaを用いた中等症・軽症血友病Aの異常FVIII特性に基づく新規個別化治療戦略について実験を進めた。Bドメイン除去型FVIIIにおいても、全長型FVIIIと同様にFVIIa/TFにより活性化が生じるが、Bドメイン除去型FVIIIでは、全長型FVIIIに比べて、不活化反応が抑制され、より長時間、凝固活性が保持されることがわかった。また、全長型FVIIIにおけるFVIIa/TFによる活性化反応では、Arg372→Arg336の順に開裂が起こるのに対し、Bドメイン除去型FVIIIでは、Arg336が先に開裂することで活性化がおこることを、凝固一段法及びWestern blot法により証明した。さらに、発現実験により得たBドメイン除去型FVIII変異体であるArg372AlaとArg336Alaを比較すると、いずれの変異体も、FVIIa/TFにより野生型FVIIIと同様に活性化され、Arg336でもFVIII活性化反応が生じ得ることを証明した。一方、FVIIa/TFによる活性化後の不活化反応は、Bドメイン存在時には、A2解離が主たる機序であるが、Bドメイン除去型FVIIIでは、Arg372開裂よりもArg336開裂が先行するためにA2解離が起こりにくく、結果として不活化抑制が起こると考えられた。当初計画した実験計画に沿って、血友病Aにおける新規治療戦略のための基礎的研究は順調に研究が進行している。引き続き、年次計画に従って研究を遂行する。当初計画よりも消耗品がわずかに少ない量で研究遂行できたためであると思われる。翌年度の助成金と合わせて、当初計画での消耗品購入のための使用を引き続き行なっていく予定である。
肝癌発生過程におけるグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子活性化の分子機構

グルタチオントランスフェラーゼP(GST-P)遺伝子の発現は、ラット肝化学発癌において顕著に上昇する。その機構を解明するため、5'上流領域を解析し強力なエンハンサーGPE1を-2.5kbに、サイレンサーを-300bpにみいだした。本研究においてこれらの機能に関して以下のことを明らかにした。1。トランスジェニックラットを用いた化学発癌実験により、GST-P遺伝子の5'制御領域は染色体の位置に無関係に癌化に伴い活性化されることを明らかにした。さらに詳細な変異体を導入したキメララットを作製し、検討したところ、GPE1のみでGST-P遺伝子を活性化しうることを明らかにした。2。サイレンサー内には数種のエレメントがあるが、その中でも重要なGPS4に結合する転写因子を精製し、アミノ酸配列を決定した。興味あることにNF1(Nuclear Factor1)様の蛋白質であることが明らかとなった。NF1は複製にも働く活性化因子として知られているが、その機能の詳細は不明であり今後の課題である。3。サイレンサー内の他のエレメントGPS1はC/EBPβによって制御されていることをすでに明らかにしている。C/EBPはファミリーを形成していることから、これらの癌化における変動について検討した。その結果、C/EBPαとC/EBPβの微妙なバランスがGST-P遺伝子のサイレンサーに重要であることを明らかにした。4。サイレンサー結合蛋白質の一つであるLIPはこれまで転写活性化ドメインを欠き転写活性化因子と競合するだけと考えられてきたが、より積極的な作用すなわち、直接的に転写を抑制することを明らかにした。またDNA結合ドメインを持たなくても転写を阻害した。これは塩基配列特異的転写因子が、条件によっては非特異的因子として働く可能性を示唆している。1。2。3。4。その機構を解明するため、5'上流領域を解析し強力なエンハンサーGPE1を-2.5Kbに、サイレンサーを-300bpにみいだした。本年度はこれらの機能について以下のことを明らかにした。1。GST-P遺伝子の発現様式にはつぎの2つの可能性が考えられる。一つは、ある癌関連遺伝子のそばにGST-P遺伝子があり、この癌関連遺伝子の活性化に伴いGST-P遺伝子もいっしょに活性化される可能性、もう一つは、染色体上の位置には全く関係なく共通の転写因子によって活性化されるというものである。これらの可能性を検討するためにトランスジェニックラットを作製し化学発癌実験を行った。その結果、GST-P遺伝子の5'制御領域は染色体の位置に無関係に癌化に伴い活性化されることが明らかになった。また各種変異体を導入したトランスジェニックラットの実験より、この活性化には-2.5KbのエンハンサーGPE1が重要であることが明らかとなった。2。サイレンサー内には数種のエレメントがあるが、その中でも重要なGPS4に結合する転写因子を精製した。これについては現在クローニング中である。3。この点については、各種発現ベクターを用いたトランスフェクションの実験においても確認した。

その機構を解明するため、5'上流領域を解析し強力なエンハンサーGPE1を-2.5Kbに、サイレンサーを-300bpにみいだした。本年度はこれらの機能について以下のことを明らかにした。1。トランスジェニックラットを用いた化学発癌実験により、GST-P遺伝子の5'制御領域は染色体の位置に無関係に癌化に伴い活性化されることを前年までに明らかにしたが、さらに詳細な変異体を導入したキメララットを作製し、検討したところ、GPE1のみでGST-P遺伝子を活性化しうることを明らかにした。2。サイレンサー内には数種のエレメントがあるが、その中でも重要なGPS4に結合する転写因子を精製し、アミノ酸配列を決定した。興味あることにNF1(Nuclear Factor 1)様の蛋白質であることが明らかとなった。NF1は複製にも働く活性化因子として知られているが、その機能の詳細は不明であり今後の課題である。3。サイレンサー結合蛋白質の一つであるSF-Bは、転写活性化遺伝子であるC/EBPβ(=NF-IL6=LAP/LIP)と同一と思われた。LIPはこれまで転写活性化ドメインを欠き転写活性化因子と競合するだけと考えられてきたが、より積極的な作用をしていると推察された。すなわち、直接的に転写を抑制することを明らかにした。さらに興味あることに、エフェクターの濃度によっては、DNA結合ドメインを持たなくても転写を阻害した。これは塩基配列特異的転写因子が、条件によっては非特異的因子として働く可能性を示唆している。
マグネシウム合金の精密鍛造プロセス開発のための延性破壊条件式の確立

Mg合金の精密鍛造の実用化を目指して,鍛造加工中に生じるMg合金の割れ発生について調べた.Mg合金の鍛造加工に適した割れ発生予測式を考案し,いくつかの加工条件下で鍛造実験を行い,考案した割れ発生予測式の有効性を検証した.鍛造中のスライド速度を任意に制御可能なサーボプレスを利用して,スライドモーションとMg合金の割れ発生の関係について調べ,スライド減速制御がMg合金の割れ発生の抑制に有効なスライドモーションであることが分かった.Mg合金の精密鍛造の実用化を目指して,鍛造加工中に生じるMg合金の割れ発生について調べた.Mg合金の鍛造加工に適した割れ発生予測式を考案し,いくつかの加工条件下で鍛造実験を行い,考案した割れ発生予測式の有効性を検証した.鍛造中のスライド速度を任意に制御可能なサーボプレスを利用して,スライドモーションとMg合金の割れ発生の関係について調べ,スライド減速制御がMg合金の割れ発生の抑制に有効なスライドモーションであることが分かった.Mg合金の精密鍛造の実用化を目指して,鍛造加工中に生じるMg合金の割れ発生について,塑性力学,金属学の両観点から詳細に調べた.これまで取り組んだMg合金の鍛造実験の結果より,鍛造条件(鍛造形状,温度,速度)と割れ発生条件をデータベース化して,幅広い鍛造条件下でのMg合金の割れ発生について考察した. Mg合金の塑性加工では引張り特性と圧縮特性が大きく異なることに着目して,両条件での応力-ひずみ曲線を取り込んだ有限要素解析コードを作成し,鍛造中のMg合金の応力,ひずみ,温度分布を算出した.その結果,引張り特性,圧縮特性のいずれかのみの応力-ひずみ曲線を利用した従来の有限要素解析よりも高精度に鍛造中のMg合金の塑性変形を解析することが可能となった.また作成した有限要素解析を使った従来の延性破壊条件式によるMg合金の鍛造加工中の割れ発生の予測は従来の有限要素解析による結果と比較して予測精度は向上したが,十分な予測精度は得られなかった.したがって,引張り,圧縮両条件の応力-ひずみ曲線を考慮することに加えて, Mg合金用の新延性破壊条件式を考案する等,今後,さらなる改良すべき点が多く残されている.一方,金属学の観点からは鍛造条件と金属組織変化,結晶粒径等の関係を調べた.特に鍛造前のMg合金の熱処理が鍛造特性に及ぼす影響について詳細に調べ,高温で熱処理を施すことで結晶粒が粗大化するにもかかわらず,異方性が緩和されるため,鍛造限界が向上することが分かった.前年度に引き続き,マグネシウム合金(以下,Mg合金)の精密鍛造の実用化を目指して,鍛造加工中に生じるMg合金の割れ発生について,塑性力学,金属学の両観点から調べた.前年度に提案したMg合金の引張り,圧縮の両条件での応力-ひずみ曲線を取り込んだ有限要素解析により,曲げ加工や後方押出し鍛造加工でのMg合金の割れ発生予測を適用し,その有効性を検討した.従来手法による結果と比較して予測精度は向上したが,十分な予測精度は得られず,Mg合金の異方性や集合組織の影響を考慮する等,実加工への適用に対して,今後,取り組むべき課題も多いことが分かった.一方,プレススライド制御が可能なACサーボプレスを用いて,鍛造加工中のプレススライド速度の加減速等の加工モーション制御がMg合金の鍛造加工性に及ぼす影響を調べ,Mg合金の精密鍛造プロセスのための鍛造加工手法を考案した.鍛造加工実験により,Mg合金の変形抵抗がピーク値をとる相当ひずみ0.2程度までは高速で鍛造加工し,加工軟化のふるまいを示す相当ひずみ0.2以上のひずみ域では低速で鍛造することで,鍛造加工限界が向上することが分かった.この減速スライドモーションでの鍛造加工では,金属組織観察によりMg合金の結晶粒径分布のバラツキが小さく,また有限要素解析によりMg合金のひずみ,温度分布のバラツキが小さく,鍛造加工中のひずみ集中を避けられることを明らかにした.さらに有限要素解析により,延性破壊パラメータ値も低く抑えられることも確認できた.
南イタリア・プーリア州における農家建築と田園地域の空間構成に関する研究

本研究は、イタリア南部のプーリア州を対象に、田園地域に建つ建物の機能や空間構成、さらに農場内での配置場所の特徴を、現地での実測調査や聞き取り調査によるフィールドサーベイと文献史料の両面から明らかにすることを目的とする。イタリア南部は農民の都市居住が支配的な地域でありながらも、田園地域には様々な規模や機能を持った建物が点在していた。しかし、戦後高度成長期に市街地拡大や土地利用変化が起こっただけでなく、農業の機械化やモータリゼーションによって田園部の農家が不要となり、破壊されている。そこで、農家建築をはじめとする田園部の建物と農場の実態を記録し、建築史学の視点から価値付けを行うことは急務である。
ヒメミカヅキモのホモタリック株における「性」の実体解明

ヒメミカヅキモのホモタリック株(以下、ホモ株)は、一つの細胞が有性分裂を行うことで生じた、二つの姉妹配偶子嚢細胞同士で接合子を作りやすく、近縁なヘテロ株と掛け合わせると低頻度でハイブリッド接合子を作る。まず、ヘテロタリック株と安定してハイブリッド接合子を形成するホモタリック株(naga37)の確立に成功した。さらに、このハイブリッド接合子から、子孫株の確立を目指したが、成功しなかった。新型シークエンサーを用いたRNAseq解析を行い、アイソフォームを含む132329のtranscriptを取得した。ヒメミカヅキモには、+型とー型の遺伝的に決定された性を持つヘテロタリック株(以下、ヘテロ株)と、1細胞由来の同一クローン同士で接合子をつくるホモタリック株(以下、ホモ株)が存在する。ホモ株では、一つの細胞が有性分裂を行うことで生じた、二つの姉妹配偶子嚢細胞同士で接合子を作りやすく、近縁なヘテロ株との交配でハイブリッド接合子を作ることから、有性分裂によって、姉妹にヘテロタリック株に相当する性分化が生じていると考えられた。今年度は、ヘテロ株、ホモ株、それぞれの生活環を網羅するtranscriptome解析を行うこととした。昨年度確立したホモ株(naga37s)について、栄養増殖期、接合誘起前期、接合誘起中期、接合誘起後期、発芽期の細胞を、それぞれ誘起時間を変えて回収し、これらからRNAを抽出した。また、ヘテロ株についても、栄養増殖期(+型、ー型)、窒素源欠乏条件(+型、ー型)、接合誘起期、発芽期など22条件から細胞を回収し、それぞれRNAを抽出した。現在、次世代シークエンサー(Illumina HiSeq2000)を用いたtranscriptome解析に供しており、データを待っている。さらに、ヘテロ株とホモ株との混合によりハイブリッド接合子が生じるが、このハイブリッド接合子からの子孫発芽について、接合子の成熟、乾燥処理条件などを検討した。タイムラプスビデオ解析などを多用し、緻密な観察を続けているが、接合子から接合子嚢として放出された後、予測されたように子孫細胞の形成が観られていない。今年度は、2011年度に確立したホモ株(naga37s)について、次世代シークエンサー(Illumina HiSeq2000)を用いたtranscriptomeデータをもとに、de novo assembleを行った。132329のcontig配列の中から、ヘテロ株のー型細胞特異的に存在するCpMinus1遺伝子のオルソログと思われるcontig配列を見いだした。このcontigは、ヘテロ株と同様に、窒素源欠乏条件下で発現レベルが高まることが示唆された。現在、cDNA libraryからの全長クローニングを進めている。また、ヘテロ株の性フェロモン遺伝子のオルソログも見いだしており、生殖様式の進化と生殖関連遺伝子群の解析をするための基盤がようやく整った。一方、ヘテロ株とホモ株との混合によりハイブリッド接合子が生じるが、このハイブリッド接合子からの子孫発芽については、接合子嚢として放出された後、子孫細胞の形成が起こらず、最終的に成功しなかった。この点は、最も困難であると当初から考えられていた点である。今年度は、ホモ株の性分化の実態を、生理学的な掛け合わせ実験を通して解析することとした。1.ヘテロタリック株と安定してハイブリッド接合子を形成するホモタリック株の確立これまでに予備的な解析を重ねてきたホモ株(kodama20; NIES-2666)は、+型のヘテロ株とはハイブリッド接合子を形成するが、ー型とは形成しなかった。そこで、新たにフィールドから単離したいくつかのホモ株を用いてヘテロ株との掛け合わせを行ったところ、両性のヘテロ株ともハイブリッド接合子を形成しうる2種のホモ株(hana1, naga37)を見出すことに成功した。

これにより、ホモ株の有性分裂後に生じる姉妹配偶子嚢細胞は、ヘテロ株の+型、ー型の両性に相等する性を持った細胞である可能性が高まった。2.有性分裂後の姉妹配偶子嚢細胞の単離培養と生理学的特性解析有性分裂直後の複数の姉妹配偶子嚢細胞をキャピラリーにより分離し、あらたにクローン株を作出した。これらのクローン株は自家接合子形成率が低下するものが多かったが、その場合ヘテロ株との混合でもハイブリッド接合子形成が見られなかった。さらに、これらの株ではPR-IP Inducer遺伝子の発現量の低下も見られた。RNA抽出には苦労したものの、目標とする量を得ることに成功している。現在までに解析結果が得られていないが、これは時間の問題である。また、ハイブリッド接合子からの発芽については、非常に困難であると当初から考えていたため、研究が遅れているとは判断していない。性フェロモンPR-IP Inducerのオーソログ分子をコードするcDNAは単離し、新規に確立したクローン株における遺伝子発現を調べることには成功したが、PR-IP Inducer遺伝子を含むゲノムDNAの単離に成功しておらず、プロモーター領域を利用したレポーター試験にまで至らなかった。引き続き、ハイブリッド接合子からの発芽を試み、生殖機構を決定づける原因遺伝子が、1つあるいは複数であるのかを、吟味する。また、Transcriptome解析により見いだされるであろう遺伝子群の内、性フェロモン遺伝子を中心に、特に性分化に影響を与えそうな遺伝子に着目して、恒常的に発現を誘導する内生プロモーターの下流に連結して、元のホモ株への遺伝子導入を行う。内生プロモーターとして、ヘテロ株では、HSP70遺伝子のプロモーターが有用であると判明しており、ホモ株にも適用する予定である。ホモ株が、ヘテロ株と同様の性を示すように変化した場合、ヘテロ株との掛け合わせを行い、生じた子孫の示す接合型との連鎖関係を検討する。ホモ株のゲノムからPR-IP Inducer遺伝子単離を、条件を変えて試みる。単離したプロモーター領域を利用して、レポーター遺伝子を連結して、有性生殖誘導した際、どのタイミングで発現が誘導されるのかを検討する。一方で、ヘテロ株における+型細胞特異的な受容体型キナーゼであるCpRLK1のオーソログ分子を特異抗体により検出することで、有性分裂後の性分化の様子を解析する。また、ハイブリッド接合子を安定的に生じさせるための、生理条件についても検討する。また遅れ気味であるヘテロ株の概要ゲノム計画の進展によっては、それをreferenceとして、新型シークエンサーによるtranscriptome解析にも取り組む予定である。2012年度内では、Transcriptome解析により見いだされるであろう遺伝子群のrealtime PCRによる解析などに着手出来ていないため、予算を解析に必要な遺伝子工学的試薬の購入に充てる予定である。また、Transcriptome解析の信頼度を高めるため、再度ホモ株からのRNA単離も進める予定である。2011年度に完了しなかったPCRによるゲノムDNA増幅、コンストラクト作製、形質転換を行うため、繰り越した研究費より遺伝子工学的な試薬の購入を予定している。