hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シダ植物配偶体におけるAM菌共生関係の多様性と進化

今後は、土壌粒子を模した固体としてシリカゲル等を寒天に混ぜて培地を作ることを試みる。4.5億年前、陸上に進出した植物は、「乾燥」と「土壌からの栄養吸収」という大きな問題に、菌類と共生関係を結ぶことによって対処したと考えられている。現生のコケ植物、シダ植物、種子植物は、体内(シダ植物以上は根)にアーバスキュラー菌(AM菌)を感染させ、菌から水分やリン酸をもらい、そのかわり菌に光合成産物を供給している。シダ植物は、配偶体を胞子体内に内蔵する種子植物とは異なり、配偶体(前葉体)が胞子体とは独立に生活するという特徴をもつ。シダ配偶体の大半は、サイズが数ミリと小形の心臓形で、単細胞性の仮根しかもたないため、これまで菌感染は無いと考えられてきた。しかし、最近の我々の研究から、遺伝子を用いて種同定されたシダ野生配偶体の大半が、配偶体の中肋部(中央の多層部)にAM菌を感染させていることがわかった。さらに菌感染率は、配偶体のハビタットと関係し、地表(地上)に生育するものの菌感染率は50100%であるが、岩上や樹上着生の配偶体は菌感染率が低く、多くが0%である事が示された。我々は、シダ配偶体とAM菌との共生関係の詳細を知るため、土壌(黒ボク土)を充填したシャーレ中でAM菌とシダ配偶体の共培養実験を行った。その結果、(1)AM菌存在区と非存在区の間で、生育した配偶体に明らかなサイズ差(10倍以上)がみられる種、(2)菌感染は行うが、菌非存在区との間に有意なサイズ差が見られない種、(3)菌存在下においても菌が全く感染しない種、の3グループに区別され、シダ配偶体とAM菌との共生関係が多様であることが示唆された。本研究では、「シダ配偶体とAM菌の共生関係」の多様性解析をめざし、野生配偶体の菌感染について調査研究をさらに進めるとともに、栄養条件(リン酸濃度)や配偶体の生育密度の調整が可能となる寒天培地等を用いた、より厳密な共培養実験系の開発をめざし、研究を進めている。シダ類の野生配偶体のAM菌感染率のデータを補完するため、これまでデータが不足していた岩上着生や樹上着生の野生配偶体の採集を進め、これらの種の分子同定、菌感染率、菌感染領域の観察を進めた。またFileMaker Proを購入し、種ごとに、配偶体の形、ハビタット、菌感染率、菌感染部位などについてのデータベース作成を開始した。黒ボク土を用いた配偶体とAM菌との共培養実験については、これまでデータが少なかった着生種について、ノキシノブを用いた実験を行った。その結果、他の着生種と同様、菌接種区においても菌感染率が0%であることが示された。これまでの結果と合わせ、着生種2科4種では皆同様に、菌接種区においても菌感染が全くみられなかったことから、着生種の配偶体は、菌感染を積極的に防ぐ何らかのシステムをもつという我々の仮説をより強くするものとなった。寒天培地を用いた共培養実験については、まず、菌接種区と非接種区で10倍以上のサイズ差を示して菌感染の効果が明瞭なゼンマイを用いて、リン濃度をふって実験を行った。黒ボク土がもつリン濃度3.35ppmを基準として、濃度を1/10, 1/100と下げていった。いずれも菌接種区と非接種区の間に、黒ボク土を使った共培養実験で得られたほどのサイズ差がみられず、場合によっては、菌接種区と非接種区間で有意な差がみられないこともあった。寒天共培養でサイズ差が出ない理由について、培地、添加する無機塩類、シャーレ内での配偶体密度、菌胞子の接種位置などの検討を重ねてきた。新しい実験系の確立にむけて順調に実験を進めている。野生配偶体のAM菌感染率とハビタットとの関係については、ほぼデータが揃ったと考え、今後はデータベース完成をめざすとともに、論文作成を始める。
海藻中のカロテノイドの生理活性と機能性素材への利用

本研究では、各種海藻に含まれるカロテノイドとポリフェノールについて分析した。その結果、エタノール、アセトン、水-エタノール、水などの食品に適用できる溶剤を用いてカロテノイドとポリフェノール画分を濃縮できることが分かった。また、フォトダイオードアレイ検出器を装備したHPLCによるカロテノイドやポリフェノールの定量法も確立し、各種海藻中に含まれる抗肥満作用や抗腫瘍活性が明らかにされているフコキサンチンなどの海藻脂溶性成分の定量を行った。こうした検討により、各種海藻中のフコキサンチンとポリフェノールの含有量を明らかにした。一方、海藻カロテノイドと海藻ポリフェノールの機能性については、特に抗酸化作用に着目し、ラジカル消去作用、活性酸素消去作用、脂質に対する抗酸化作用を評価した。その結果、海藻由来のカロテノイド(フコキサンチン)が、陸上植物由来のカロテノイド類より高い作用を示すことを明らかにした。また、海藻ポリフェノールも強い抗酸化作用を有することを見出した。これらの知見に基づき、生体内での海藻脂溶性成分の抗酸化作用について培養細胞を用いて明らかにした。本研究では、各種海藻に含まれるカロテノイドについて分析した。インド産も含め、海藻や海藻加工品製造時に排出される残滓から、有用カロテノイドの分別方法について、溶剤抽出、カラムクロマトグラフィー、HPLCなどを用いて検討した。その結果、エタノール、アセトン、水-エタノール、水などの食品に適用できる溶剤を用いてカロテノイド画分を濃縮できることが分かった。また、フォトダイオードアレイ検出器を装備したHPLCによるカロテノイドの定量法も確立し、各種海藻中に含まれる抗肥満作用や抗腫瘍活性が明らかにされているフコキサンチンなどの海藻カロテノイドの定量を行った。こうした検討により、インド産も含めた褐藻中にフコキサンチンが多く含まれていること、紅藻などに未知のカロテノイドの含まれている可能性も示した。海藻カロテノイドの資源としては、有用多糖類などを分別した未利用部分についても着目し、これらの資源からもカロテノイドを分別できることを明らかにした。一方、海藻カロテノイドの機能性については、HPLCにより分別した褐藻由来のフコキサンチンの抗肥満作用について動物実験により検証した。この検討により、フコキサンチン投与により、マウス内臓脂肪の顕著な減少が起こることを確認した。以上の成果を基に、アジア地域の各種海藻資源からの有用カロテノイドの探索とその機能性について現在検討中である。
組紐技術を応用した内部隔壁を有する中空材ＦＲＰプリフォームの創成

当該研究課題スタート時に既にマルチブレイダーを用いて連続炭素繊維糸条による「外殻+隔壁」構造FRPプリフォームを作成する技術はできていたが、H30年内にスピンドル(ブレイダー内で糸を解じょしつつ運搬し、組糸の経路を形成するための部品)に改良を加え、プリフォーム内での組糸の角度を様々に変化させられるようになったため、プリフォーム形成をするための糸経路の範囲が広がり、「隔壁」を形成する組糸の数(すなわちFRPの厚み)を増すことができた。この結果、単純な円筒状パイプの約2倍の強度を有する外殻+隔壁構造CFRPの作成に成功し、曲げ試験によりそれを実証した。上記構造プリフォームに加え、連続する組紐の途中で組紐が分岐・合流することのできるプリフォーム形成技術を開発し、実際にマルチブレイダーによって、プリフォームを試作することに成功した。このようにマルチブレイダー上で複雑な経路に対してスピンドルを運動させる場合、スピンドル同士の衝突が起こり、装置破損の恐れがあったが、複雑なスピンドルの運動をパソコン上でシミュレーションできるソフトウェアを自作し、スピンドル経路を考案する効率が向上した。当該研究課題スタート時点では「立体的に複雑な形状をした」プリフォーム作成に主眼をおいていたため、実際にFRPを成形する手法としては、(含浸時に粘度の低い)熱硬化性樹脂を用いたVaRTM(真空含浸工法)成形法等を想定していたが、熱可塑性樹脂フィルムの上に薄く開繊した炭素繊維を埋め込んだ中間基材(以後Cスリットヤーン)を入手することができ、Cスリットヤーンを用いた中空パイププリフォームの作成に成功し、さらにこのプリフォームを熱間プレスすることによって短時間でCFRP成形品を得ることができるようになった。炭素繊維連続糸条プリフォームによる熱可塑性樹脂母材のCFRPは工業的応用価値が非常に大きい。当該研究課題スタート時に既にマルチブレイダーを用いて連続炭素繊維糸条による「外殻+隔壁」構造FRPプリフォームを作成する技術はできていたが、H30年内にスピンドルに改良を加え、プリフォーム内での組糸の角度を様々に変化させられるようになったため、プリフォームを形成するための糸経路の範囲が広がり、「隔壁」を形成する組糸の数(すなわちFRPの厚み)を増すことができた。この結果、単純な円筒状パイプの約2倍の強度を有する外殻+隔壁構造CFRPの作成に成功した。このようにマルチブレイダー上で複雑な経路に対してスピンドルを運動させる場合、スピンドル同士の衝突が起こり、装置破損の恐れがあったが、複雑なスピンドルの運動をパソコン上でシミュレーションできるソフトウェアを自作し、スピンドル経路を考案する効率が劇的に向上した。当該研究課題スタート時点では「立体的に複雑な形状をした」プリフォーム作成に主眼をおいていたため、実際にFRPを成形する手法としては、(含浸時に粘度の低い)熱硬化性樹脂を用いたVaRTM(真空含浸工法)成形法等を想定していたが、熱可塑性樹脂フィルムの上に薄く開繊した炭素繊維を埋め込んだ中間基材(以後Cスリットヤーン)を入手することができ、Cスリットヤーンを用いた中空パイププリフォームの作成に成功し、さらにこのプリフォームを熱間プレスすることによって短時間でCFRP成形品を得ることができた。また、この熱可塑性樹脂母材のCFRP中空パイプはVaRTMによる熱硬化性樹脂母材のFRPとほぼ同じ機械的強度を示すことを曲げ試験により確認した。成形時間が短縮可能(すなわちコスト低減の可能性が大きい)。リサイクルが容易になる。炭素繊維連続糸条による複合材であるため、VaRTM成形品と同等以上の機械的性質が期待できる。等々、炭素繊維連続糸条プリフォームによる熱可塑性樹脂母材の熱間プレスCFRPは工業的応用価値が非常に大きいため、熱可塑性樹脂フィルムスリットヤーンを用いて「外殻+隔壁」構造FRPプリフォームを作成し、それを熱間プレス成形する技術開発を優先する。当該研究課題スタート時点では「立体的に複雑な形状をした」プリフォーム作成に主眼をおいていたため、実際にFRPを成形する手法としては熱硬化性樹脂を用いたVaRTM成形法等を想定していたが、本研究グループには樹脂成形の技術がないため、樹脂成形を外注に頼らざるを得ず、委託加工による樹脂成形外注は数ヶ月単位の納期を要するため、研究進捗の大きな妨げとなっていた。また、熱可塑性樹脂母材のCFRPは自動車の構造材としての使用も期待されるため、工業的応用範囲が飛躍的に増大する。上記Cスリットヤーンによるプリフォーム形成+熱間プレス技術の開発に加え、立体的に複雑な形状を有するプリフォーム形成技術の開発と、その機械的性質を向上させるプリフォーム形成条件の探索についても平行して進めて行く。この結果、単純な円筒状パイプの約2倍の強度を有する外殻+隔壁構造

CFRPの作成に成功し、曲げ試験によりそれを実証した。上記構造プリフォームに加え、連続する組紐の途中で組紐が分岐・合流することのできるプリフォーム形成技術を開発し、実際にマルチブレイダーによって、プリフォームを試作することに成功した。このようにマルチブレイダー上で複雑な経路に対してスピンドルを運動させる場合、スピンドル同士の衝突が起こり、装置破損の恐れがあったが、複雑なスピンドルの運動をパソコン上でシミュレーションできるソフトウェアを自作し、スピンドル経路を考案する効率が向上した。当該研究課題スタート時点では「立体的に複雑な形状をした」プリフォーム作成に主眼をおいていたため、実際にFRPを成形する手法としては、(含浸時に粘度の低い)熱硬化性樹脂を用いたVaRTM(真空含浸工法)成形法等を想定していたが、熱可塑性樹脂フィルムの上に薄く開繊した炭素繊維を埋め込んだ中間基材(以後Cスリットヤーン)を入手することができ、Cスリットヤーンを用いた中空パイププリフォームの作成に成功し、さらにこのプリフォームを熱間プレスすることによって短時間でCFRP成形品を得ることができるようになった。炭素繊維連続糸条プリフォームによる熱可塑性樹脂母材のCFRPは工業的応用価値が非常に大きい。当該研究課題スタート時に既にマルチブレイダーを用いて連続炭素繊維糸条による「外殻+隔壁」構造FRPプリフォームを作成する技術はできていたが、H30年内にスピンドルに改良を加え、プリフォーム内での組糸の角度を様々に変化させられるようになったため、プリフォームを形成するための糸経路の範囲が広がり、「隔壁」を形成する組糸の数(すなわちFRPの厚み)を増すことができた。この結果、単純な円筒状パイプの約2倍の強度を有する外殻+隔壁構造CFRPの作成に成功した。このようにマルチブレイダー上で複雑な経路に対してスピンドルを運動させる場合、スピンドル同士の衝突が起こり、装置破損の恐れがあったが、複雑なスピンドルの運動をパソコン上でシミュレーションできるソフトウェアを自作し、スピンドル経路を考案する効率が劇的に向上した。当該研究課題スタート時点では「立体的に複雑な形状をした」プリフォーム作成に主眼をおいていたため、実際にFRPを成形する手法としては、(含浸時に粘度の低い)熱硬化性樹脂を用いたVaRTM(真空含浸工法)成形法等を想定していたが、熱可塑性樹脂フィルムの上に薄く開繊した炭素繊維を埋め込んだ中間基材(以後Cスリットヤーン)を入手することができ、Cスリットヤーンを用いた中空パイププリフォームの作成に成功し、さらにこのプリフォームを熱間プレスすることによって短時間でCFRP成形品を得ることができた。また、この熱可塑性樹脂母材のCFRP中空パイプはVaRTMによる熱硬化性樹脂母材のFRPとほぼ同じ機械的強度を示すことを曲げ試験により確認した。成形時間が短縮可能(すなわちコスト低減の可能性が大きい)。リサイクルが容易になる。
英語習熟度の低い日本人大学生の中間言語に見られる借用を分析するためのコーパス構築

大学英語教育が取り組むべき課題のうち習熟度の低い学習者に対象を絞り,整った英語の文章を書くことができるようになるために何が問題となっているのかを明らかにすることを主たる研究目的とした.そのために,まず,中間言語資料(大学生の書いた英文)を継続的に収集し,自前の学習者コーパスとして利用できる手順を確立した.作成した資料の分析から,日本語の文法に引きずられたと考えられる誤用(母語の干渉)を幅広い範囲で確認した.これらの特徴はいずれも対照言語学的に見ても意味深いものであり,英語と日本語のように言語間距離が大きい場合においては特に,言語学の知見に基づいた指導が有効であることを示しているといえる.大学英語教育が取り組むべき課題のうち習熟度の低い学習者に対象を絞り,整った英語の文章を書くことができるようになるために何が問題となっているのかを明らかにすることを主たる研究目的とした.そのために,まず,中間言語資料(大学生の書いた英文)を継続的に収集し,自前の学習者コーパスとして利用できる手順を確立した.作成した資料の分析から,日本語の文法に引きずられたと考えられる誤用(母語の干渉)を幅広い範囲で確認した.これらの特徴はいずれも対照言語学的に見ても意味深いものであり,英語と日本語のように言語間距離が大きい場合においては特に,言語学の知見に基づいた指導が有効であることを示しているといえる.本研究の主たる目的のひとつは,英語習熟度の高くない日本人大学生の英語作文能力を育てるために,克服されるべき問題点を整理し,取り組みの優先順位を明らかにすることである.特に,文法面に着目し,母語である日本語からの影響と考えられる現象のうち,緊急に手当の必要な事項について,効果的な指導方法を提案していく.初年度の研究では,限られた量の資料を詳細に観察することによって,次の3点を取り組むべき課題として明らかにした.(1)日本語に見られる話題化の「は」と統語的主語との混同(2)既知情報省略の誤用(3)述語の項構造の流用による混乱もうひとつの主たる目的は,上に挙げた第一の目的達成のために必要な,学習者の生成物(作文)を資料として蓄積していくための仕組みの創成である.今年度は問題点の調査のために必要なデータを電子的に蓄積する方法について,大阪府立大学と千葉商科大学においていくつかの試行を行った.インターネット上のブログなどを利用した方法とともに,学習支援システムMoodleのモジュール複数を使用して,主に授業外の学習活動からの資料収集の方法を模索した.初年度の実践と分析からは,教師(観察者)にとって利用・管理しやすいものであることと同時に,学習者にとって参画しやすい活動と環境を提供することの重要性が示唆された.この成果をMoodle Moot 2001で発表し(山内),論文としてまとめ(内田・山内2011),刊行した.今年度は,初年度の研究成果として収集した学習者の中間言語資料についての手作業による分析をさらに進行させた.初年度の研究の中で,克服されるべき問題点として浮上していた次の3点について,どのような状況でどのようなエラーとして現れる傾向があるのかを明らかにした.(1)日本語に見られる話題化の「は」と統語的主語との混同(2)既知情報省略の誤用(3)述語の項構造の流用による混乱(1)については,英語の動詞beの過剰使用に結びついていること,(2)については,接続詞を伴う重文・複文において後置された節に脱落現象が多く見られること,(3)については,心的状態を表す動詞などに特にエラーが多いこと,などである.本研究のもうひとつの柱となる課題は,学習者の生成物(作文)を資料として蓄積していくための仕組みづくりである.今年度は,連携研究者である小島篤博氏の専門的知識と技術の提供により,授業支援システム(Moodle)上で行う学習活動のバックアップデータから中間言語資料を効率的に抽出するプログラムを完成させた.また,資料を得るための学習活動が,学習者間の人間関係の形成にも貢献し,学習の動機づけになるという予測外の効果があることが示唆された.以上の研究成果を国内外の学会で発表し,論文にまとめ,公刊した.大学英語教育に課された使命のひとつである英語作文能力育成のための指導を,比較的習熟度の低い学習者を対象に,より効率的に行うため,本研究では,問題点の整理に傾注をしてきた.研究期間に行った授業内外の学習活動を通して学習者の中間言語のデータ(作文)を蓄積してきた.そこに見られるさまざまな誤用について,学習者の母語である日本語の文法構造が借用されていると考えることで,一貫性のある説明が可能であることを示した.とりわけ,日本語の(1)「XはY(だ)」構造(2)既知情報の省略(3)述語の項構造の不適切な拡張借用が.指導上早急な手当を要する点であることを明らかにした.今年度は,学習管理システムから作文データを取り出す際に単文単位で処理できるよう,さらにGUIで簡便に使えるようにツールを改良した.それによって,誤用の生起を,文の数を基準とした数値でとらえることが可能になった.

たとえば,あるグループの資料中では,上記(3)の要因による誤用が全体の27%にあたる文に見られたが,その中には,(1)の要因(6%)も(2)の要因(8%)も同時に観察される,というふうに,複数の要因が同時に関わっている状況を明確に示すことができる.また,別の例として,be動詞文の誤用において主語の選択にどういう傾向があるのかといった分析も可能になった.上述の3点の日本語文法の特徴は,当初,本課題の主たる研究対象とした「習熟度の低い」学生だけでなく,さらに広範囲の,英語習熟度のより高い,日本語を母語とする大学生の誤用にも根強く影響を与えていることがわかった.ただしその生起頻度は,習熟度が高いほど低くなる.これらの現象に的を絞った指導が,大学英語教育において有効に働くであろうことを示す事実であるといえよう.本年度は,以上に概観した研究成果について,国内外で学会報告を行い,成果報告論文を発表した.大学英語教育に課された使命のひとつである、英語作文能力育成のための指導をより効率的に行うために、本研究では、従来の英作文指導の方法では効果を上げることが難しい、習熟度の低い学習者の場合に的を絞って、克服すべき問題点を整理することに注意を傾けてきた。授業内外の活動を通して、学習者の中間言語データ(作文)を収集し、独自の学習者コーパスを構築してきた。大阪府立大学の人文社会学系と千葉商科大学の商経学系の学生の作文を分析した結果、母語である日本語の統語的特徴が学習者の中間言語に影響し、その結果として、さまざまなエラーが引き起こされていることを明らかにした。日本語と英語の統語構造の違いのうち、特に影響が大きいと考えるのは次の3点である:(1)「主語」の概念の違い(2)既知情報を省略できる条件の違い(3)述語(動詞、形容詞)がとる項構造の違い。こういった対照言語学的知見に基づく分析結果を実際の指導に役立てるためには、学習者へのフィードバック方法はどうあるべきかを探るため、当年度は上記の2大学において授業を通した実践を行ってきた。その結果、学習者が求める指導方法について、アンケートなどを通して、一定の傾向をつかむことができた。当研究のもうひとつの柱である、コーパス構築については、ブログや学習支援システムのバックアップデータから、効率的に資料を取り出すツール(Moox, Bloox)が完成した。より使いやすいGUIに発展させることが今後の課題である。本年度は、上記の統語的分析、授業実践、ツール開発の研究成果について、学会報告を行った。研究過程で新たに浮上してきた課題は、指導の効果を測定するための基準の策定である。これは、本研究の当初からの課題である、母語話者をモデルとするのではない、共通語としての英語教育の目標点をどこにおくかという問題とも深く関わるものである。およそ当初の計画どおりに進行している.25年度が最終年度であるため、記入しない。上記のように、新たな課題が出現してはいるが、おおむね、当初の予定どおり進行している。データの収集と分析をこれまで順調に行ってきた.次年度より研究分担者として上述の小島氏を迎え,データ抽出ツールの完成と公開を目指す.学習者の中間言語に見られる統語的借用の分析の面では,これまでに得た観察結果を,言語類型論/対照言語学の知見を援用することにより,より一般的な言語学的議論に発展させる可能性をも探る.同時に,日々の授業実践を通して,効果的な指導の方策を探るべく,授業支援システム(Moodle)やブログなどを用いた学習者へのフィードバック方法を試行していく.指導効果をどう測定/評価するのかについても検討を始める.国内外での学会で成果を発表する.25年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度となる2013年度には、次の3点について、今年度と同様の研究チーム構成(内田、山内、小島)で、推進していく。
室傍核におけるノルアドレナリン神経系－CRF連関はストレス反応持続に関与するか？

脳内ノルアドレナリン含有神経系はストレス時に脳内アラーム系として活性化し、一過性のストレス反応を引き起こすと考えられている。このストレス反応が持続するとストレス関連疾患を発症すると推測されるが、その機序は解明されていない。そこで、本研究は、ラット急性拘束ストレスモデルを用いて、ストレス反応中枢の一つである視床下部室傍核(PVN)に投射する脳内ノルアドレナリン含有神経系およびCRFに着目し、両者の関連およびその下流で産生されるプロスタノイドが、ストレス反応を持続させる可能性を検証することを目的とする。昨年度は拘束ストレス負荷したラットのPVNにおいてPGE2およびTxA2量が増加することを明らかにした。そこで本年度は、拘束ストレス負荷したラットPVNにおけるPGE2およびTxA2量に及ぼすα/βアドレナリン受容体遮断薬、CRF-1受容体遮断薬、COX阻害薬、およびTxA2合成酵素阻害薬の影響を薬理学的に解析した。その結果、これらの薬物で脳室内前処置した急性拘束ストレス負荷ラットの視床下部室傍核におけるPGE2およびTxA2量の増加は抑制され、さらに血中カテコールアミン増加も抑制されることを明らかにした。これらの実験成績から、拘束ストレス負荷したラットのPVNにおけるPGE2およびTxA2量が、当該動物の血中カテコールアミン増加に関与することが示唆された。また透析液中のCRF含量については、微小透析液中へのCRFの回収条件検討が終わったので、ELISAによる解析を始めるところである。平成30年度は、当初の計画通りにすべての動物実験群を作成し、各種受容体遮断薬および酵素阻害薬の拘束ストレス負荷ラットにおける血中カテコールアミン量およびPVNの微小透析液中PGE2およびTxA2量に及ぼす影響を解析した。透析液中のCRF含量については、微小透析液中へのCRFの回収条件の検討に時間がかかったため、遅れが生じたが、次年度に早急に実施する。平成31年度は、当初の計画に従って、ストレス関連メディエーターとして微量生体物質の合成酵素(COX1,COX2,トロンボキサン合成酵素)およびその発現に関与すると予想される転写因子(NFκB, PPARγ)のタンパク質発現レベルおよびmRNAレベルをウェスタンブロッティングおよび定量PCRによって調べる。。さらに、これらの発現動態に及ぼす各種受容体遮断薬もしくは酵素阻害薬の影響を調べる。実験群(拘束ストレス負荷+薬物処置)および対照群(拘束ストレス負荷+薬物無処置、拘束ストレス負荷なし+薬物無処置)を作成する。実験には、1)実験群拘束ストレス負荷+薬物処置および2)対照群(拘束ストレス負荷+薬物無処置、拘束ストレス負荷なし+薬物無処置)の視床下部室傍核を含む500 &#181;mのスライスから両側の室傍核をパンチアウトした試料を用い7)、ウェスタンブロッティングにはタンパク質抽出液(T-PER)を、定量PCRには核抽出液(Trizol)を調製する。そこで本研究は、ラット急性拘束ストレスモデルを用いて、ストレス反応中枢の一つである視床下部室傍核に投射する脳内ノルアドレナリン含有神経系およびCRFに着目し、両者の関連および脳内プロスタノイドの関与を明らかにすることを目的とした。本年度は、急性拘束ストレス負荷ラットの血中カテコールアミンレベルの解析および視床下部室傍核における微量生体物質の脳マイクロダイアリシス法による解析を行った。120分間の急性拘束ストレス負荷により、血中カテコールアミンレベルはノルアドレナリンおよびアドレナリンともに有意に上昇した。さらに、急性拘束ストレスを負荷したラットの視床下部室傍核から経時的に透析液を採取し、質量分析法により透析液中の微量生体物質の同時一斉定量を行った。その結果、急性拘束ストレス負荷により室傍核における各種プロスタノイド含量が有意に増加することを明らかにした。また、上記とは別にペプチドサンプリング用のストレス負荷実験群を作製し、視床下部室傍核から経時的に透析液を採取した。これらの透析液中のCRF含量については、次年度にELISA実験を行い、急性ストレス負荷による変化を分析する予定である。平成29年度は、当初の計画通りに全ての実験群を作製し、ストレス負荷実験を行った。計画していたカテコールアミン分析および透析液中微量生体物質の分析は全て終了している。透析液を用いたELISA実験に遅れが生じたが、次年度に早急に実施する予定である。

その結果、これらの薬物で脳室内前処置した急性拘束ストレス負荷ラットの視床下部室傍核におけるPGE2およびTxA2量の増加は抑制され、さらに血中カテコールアミン増加も抑制されることを明らかにした。これらの実験成績から、拘束ストレス負荷したラットのPVNにおけるPGE2およびTxA2量が、当該動物の血中カテコールアミン増加に関与することが示唆された。また透析液中のCRF含量については、微小透析液中へのCRFの回収条件検討が終わったので、ELISAによる解析を始めるところである。平成30年度は、当初の計画通りにすべての動物実験群を作成し、各種受容体遮断薬および酵素阻害薬の拘束ストレス負荷ラットにおける血中カテコールアミン量およびPVNの微小透析液中PGE2およびTxA2量に及ぼす影響を解析した。透析液中のCRF含量については、微小透析液中へのCRFの回収条件の検討に時間がかかったため、遅れが生じたが、次年度に早急に実施する。平成30年度は、当初の計画に従って、急性拘束ストレスを負荷したラットのPVNにおける微量生体物質の薬理学的解析を行う。平成29年度に得られた実験成績に基づいて、視床下部室傍核において、拘束ストレス負荷による血中カテコラミン増加に関与するシグナル伝達経路を明らかにするために、各種受容体遮断薬および酵素阻害薬を用いて薬理学的に解析する。実験群(拘束ストレス負荷+薬物処置)および対照群(拘束ストレス負荷+薬物無処置、拘束ストレス負荷なし+薬物無処置)を作製する。実験群にはダイアリシスプローブを介して、各種受容体遮断薬もしくは酵素阻害薬をそれぞれPVNに局所投与する。視床下部室傍核透析液中のノルアドレナリン遊離、CRF遊離、プロスタノイド産生に及ぼす影響を検討する。なお、薬物の脂溶性によって直接プローブを介して投与できない場合は、脳室内前投与を行う予定である。平成31年度は、当初の計画に従って、ストレス関連メディエーターとして微量生体物質の合成酵素(COX1,COX2,トロンボキサン合成酵素)およびその発現に関与すると予想される転写因子(NFκB, PPARγ)のタンパク質発現レベルおよびmRNAレベルをウェスタンブロッティングおよび定量PCRによって調べる。。さらに、これらの発現動態に及ぼす各種受容体遮断薬もしくは酵素阻害薬の影響を調べる。実験群(拘束ストレス負荷+薬物処置)および対照群(拘束ストレス負荷+薬物無処置、拘束ストレス負荷なし+薬物無処置)を作成する。実験には、1)実験群拘束ストレス負荷+薬物処置および2)対照群(拘束ストレス負荷+薬物無処置、拘束ストレス負荷なし+薬物無処置)の視床下部室傍核を含む500 &#181;mのスライスから両側の室傍核をパンチアウトした試料を用い7)、ウェスタンブロッティングにはタンパク質抽出液(T-PER)を、定量PCRには核抽出液(Trizol)を調製する。透析液を用いたELISA実験に遅れが生じ、当該実験に用いる試薬や消耗品の購入予算が残り、次年度使用額が生じた。
タイ国農村における近代的農業基盤システムの受容過程に関する研究

戦後に建設されたタイ中央平原における近代的灌漑システムの現状を末端農村レベルまで調査し、独立的といわれるタイ農民の協同的水管理行動について検討した。チャオブラヤ川流域における乾期の絶対的水不足環境の下で、政府の努力に関わらず、Water Users′Group(WUG)が十分に機能せず、とくに乾期の水配分が政府の意図通り計画的に実施できていないことを明らかにした。末端レベルでは、圃場条件に応じた水管理が行われ、用水配分は一般に上流有利になっていて、水条件のよい農民だけが3期作を実現できる。用水確保のため、必要な限りではあるが協同で水路維持事業を実施している。圃場整備実施に対しても、村としての事業参加が見られ、大半の農民が参加している。しかし道水路密度,換地方法,不賛同者地区除外の仕方などに日本との違いがあることが指摘された。補助金等の政策技術によって、WUG活動へのインセンティブを高めることが必要である。中央平原稲作地帯における大型トラクタ走行の阻害要因であるBangkok clayeysoilに対する動力学的試験を行い、繰り返しねじりせん断試験における繰返し回数の増加につれて、ねじりせん断ひずみと間隙水圧が増加することを見いだした。乾燥密度と載加周波数がねじりせん断応力に及ぼす影響も明確になった。流域保全に関しては,メクロン川流域における土壌侵食および浮遊土砂流出と流域特性を解明するため、(1)流域および降雨特性、(2)タイの他諸河川との比較によるメクロン川の浮遊土砂流出特性、(3)浮遊土砂流出量推定式、(4)支流のクワイ・ヤイ川、クワイ・ノイ川およびランパチ川の浮遊土砂流出特性,の検討を行い、流域上流部に対して下流部の方が浮遊土砂のより大きな供給源になっていることを明らかにした。流域の長期的・持続的利用にとって、開発農地における土壌流亡対策の実施が重要であることを指摘した。本研究の基礎的背景をなす気象・水文および土壌流出に関する事項については,チャオプラヤ河流域およびメクロン河流域における観測体制の現状を把握するとともに,王立灌漑極(RID)を中心とする観測網の中から,本研究の目的に合致した観測地点の選定と観測記録の入手を行った。これは,RIDの協力により,電子記録の形態で供給された。タイでは観測体制が比較的整備されており,省庁間の連絡体制,データの公開性が極めて良好であることが確認でき,今後の研究の推進にめどをつけることができた。農地の形態および用水管理に関しては,タイ中央平原の北部チャイナ-ト市近郊ボロマタ灌漑地区内に4個所の調査地区を設定し,詳細な地図を入手するとともに,タイ側分担者の協力を得て,乾季水田作を対象に,用水の配分状況および耕作進行状況の観測と,農家に対する農業労働力および農業機械所有状況の聞き取り調査を実施した。これは,農地の形態すなわち,圃場整備済み地区,エクシテンシヴ地区(水田間掛け流しシステム)と支線用水路の上流部,下流部に分けて実施しており,これによって今後,各要因の影響度を分離して検討することができる。このような末端圃場レベルでの観測はこれまでになされたことがなく,タイ側にとっても極めて貴重なデータとなった。より上位の用水管理体制および用水管理に関する農民組織の設立,活動状況については,用水管理事務所での聞き取りを行い,ボロマタ地区全体の状況を把握した。

制度としては,Water Master(4人),Zone Man(42人),Ditch Tender(250人)によって,幹線レベル,支線レベルの用水配分が管理されることになっているが,実際には農家による自由な取水が定着しており、乾季に用水配分を受けることができる地区が指定されているにもかかわらず,現実にはそれが守られていない。末端農民組織もそのほとんどが壊滅状態であることを把握するとともに,少数の良好に運用されている農民組織については,聞き取り調査によって,その特徴を把握した。農業機械・器具および農作業システムの基礎的資料を収集するとともに,機械の走行基盤である水田土壌の力学的挙動に関する特性を解明するために,10地点において土壌のサンプリングを行い,圧縮,ねじり試験等を実施した。農地の形態および用水管理に関して,タイ中央平原北部,チャイナ-ト市ボロマタ灌漑地区において,4つの集落を選び,圃場形態別の農地および用水管理・使用状況を聞き取り調査するとともに,住民に対するアンケート調査を実施した。圃場整備の実施に関しては非常に高い評価をしており,実施段階で,集落全体として不同意者に対する説得が行われたことが判った。一方,圃場整備実施後の用水管理段階では,集落としてのまとまりはなくなり,水路を通した物理的な関係を持つ者だけが必要に応じて話し合いを行い,水路の維持管理を実施している。ただし,上流部ワンパイ地区では,強力な指導者の下に協同的維持管理を実施しており,その背景に関する分析が必要である。水文,土壌保全に関しては,メクロン河流域を対象に,長期の水文・土砂流出観測記録の分析を実施し,流域内の降水量の分布,長期変動状況,カオレム・スリナカリンの2ダム流域における河川流出,浮遊土砂流出の特性を明らかにした。また,衛星写真データの入手・分析を行い,山地流域における森林保全状況の解析を行った。山地は,熱帯原生林と竹林が地域的に錯綜し,比較的平坦な谷筋を中心に開発が進んでいることが把握できた。農業機械および営農システムに関しては,圃場機械の走行基盤としての土壌の力学的特性を試験するとともに,コントラクター農業浸透の可能性を検討するためデルタ下流部での現地踏査を実施し,水稲作を中心とする営農を展開する集落でのコントラクター農業が,跛行的に進行していることが把握された。タイの伝統的灌漑システムにおける農民参加型水管理の,近代的灌漑システムへの適用性を検討するため,北タイ・ムアンファイについての資料収集を行い,ムアンファイでは,農民の共同作業が計画的になされているが,受益面積は一般に小さいこと,RIDの水源増強を契機に,水利調整が進展している例があること等を明らかにした。圃場条件に関しては,中央平原北部バンクッド地区を調査した結果,タイと日本で,農民の圃場整備に対する動機,区画の大きさ,道水路密度,換地方法,地区除外の仕方などに違いがあり,農民の動機としては道水路の建設以外に2期作の実現があげられ,また,畦畔や道水路の密度を小さくし,事業費と減歩率を抑えている。トラクタ導入に関して,その水田内旋回時等に発生する土の破壊現象を解明することを目的とし,Bangkok clayey soilを供試して,繰返しねじりせん断試験を行った。土の破壊を強度限界と限界状態理論の観点から考察し,締固め現象の改善につながる実用的な結果を得た。流域保全に関しては,メクロン川流域における土壌侵食および浮遊土砂流出と流域特性を解明するため、(1)流域および降雨特性、
多因子性精神神経障害の分子遺伝学的アプローチ

我々はVPS13A遺伝子改変ChAcモデルマウスの作成に成功した。ChAcモデルマウスはストレイン129系とC57Bl/6系の雑種で作成したが、ヒト疾患における病理と一致した線条体を中心とした神経変性と有棘赤血球症を発症した。しかし、変性の程度や運動や行動の評価および神経化学的分析結果は個体差が大きく、環境因の差の少なさから背景遺伝子の差による影響がこのような結果をまねいたと考えた。これらの事実は、ChAcの発症に対して影響を与えるmodifier遺伝子(群)の存在を推測させた。続いて、背景遺伝子を揃えるべく、DBA/2J、BALB/cbyJ、C57BL/6Jの三種のストレインに戻し交配を行い、N11世代以降をもって実験に供したところ、DBA/2JにおいてVPS13A欠失型のホモ接合体では生直後からの発育は正常なものの生後三ヶ月を過ぎた頃から体重の増加が悪くなった。ヘテロ接合体では、野生型とホモ接合体のちょうど中間を示し、遺伝子の量的効果がみられた。すなわち、VPS13A遺伝子の欠失はDBA/2Jストレインの背景遺伝子を持った場合、成育における体重の増加傾向に対して優性遺伝形式の効果をみせた。C57BL/6Jストレインでは上記のような変化は全くみられず、BALB/cbyJではホモ接合体でのみ生後半年を過ぎた頃から体重の増加が悪くなった。BALB/cbyJでのVPS13A遺伝子の欠失の効果は、一見劣性遺伝形式のように考えられた。これらの結果は、VPS13A遺伝子の欠失がC57BL/6Jではみられない効果を優性もしくは劣性の効果いずれにしてもDBA/2JあるいはBALB/cbyJを背景遺伝子として持つ場合に体重減少が引き起こされた。このような事実は、ChAcの発症に対して強力な影響を与えるmodifying遺伝子(群)の存在を示唆する。すなわち、有棘赤血球舞踏病の原因を考える場合、VPS13A遺伝子の障害を考えるとともに他のmodifying遺伝子(群)の影響も大きいと考えられた。また、これらの結果とは別個に、DBA/2J、BALB/cbyJ、c57BL/6Jの三種のストレインともVPS13A欠失型のホモ接合体の雄性マウスでは生殖能力がなかったが、雌性マウスでは生殖能力が普通に存在していた。有棘赤血球舞踏病(chorea-acanthocytosis : CHAC)は常染色体劣性遺伝性神経変性疾患で、線条体の選択的変性から生じる神経精神症状と末梢血の有棘赤血球症を示す。最近、我々はCHACの病因となる新規遺伝子CHACを同定し、疾患変異を見い出した。本研究では、マウスのCHACcDNA配列を同定し、エクソン-イントロン構造を確認し、ヒトで疾患を引き起こすエクソン60-61の欠失変異を導入したモデルマウスを作成し、その表現型を解析した。CHAC変異ホモ接合体マウスは、87週齢時に野生型マウスに比し生存率と体重変化に有意差を認めず、不随意運動も示さなかった。

しかし、foot print testで歩幅の減少、rotarod testで落下までの時間の短縮など運動能力障害を認め、有棘赤血球症が出現し、赤血球脆弱化試験ではホモ接合体マウスが野生型マウスより有意に浸透圧負荷に脆弱であった。行動解析ではopenfield解析で自発運動量は有意に減少し、social interaction testではホモ接合体はケージの端の方で過ごす時間が有意に長く個体同士の接触時間は有意に短かった。脳のモノアミン解析では、モノアミンおよびその代謝産物の解析では中脳視床視床下部でドパミンの代謝産物であるHVAのみCHAC変異ホモ接合体マウスで有意な低下を認め、ドパミンは低下傾向にあるものの有意差を認めなかった。組織学的には、線条体にアポトーシスとグリオーシスの所見が認められた。有棘赤血球舞踏病は、ヒトにおいてもまれな疾患であり、その病態解析は困難であった。本研究で得られたモデルマウスでは、ヒトの疾患病態と極めて類似し、老齢期に至って軽症の臨床表現型を示し、病理学的にも神経化学的にも線条体を中心とする神経変性が確認され、今回作成したマウスはヒトの疾患を研究する上でよいモデルとなると考えられた。従来、有棘赤血球舞踏病(chorea acanthocytosis : ChAc)の臨床遺伝型に関しては、「メンデル遺伝にのっとる単一遺伝子疾患で常染色体劣性遺伝形式」とされてきたものの、同一家系内でさえも発症年齢や症状は多彩で、優性を示す家系例さえ報告されている。このような現象は、メンデル遺伝学では説明がつきにくいものであり、まさに上記の「多因子性の複雑な疾患」の中の疾患感受性遺伝子の効果が大きいものと考えられる。ChAcには精神症状の強い例も多く、私達も統合失調症の診断を受けた症例を報告した(in Neuroacanthocytosis Syndromes, pp.39-44,2004)。また、最近我々が経験した家系症例では、VPS13A遺伝子の病因変異をヘテロ接合性に持つ家系構成員にChAcの部分症状を示す例を多数認めた。このように、病因遺伝子VPS14Aを中心とした総合的解析は、多因子性、特に多遺伝子性の解明には比較的単純化された良いモデルとなると考えられる。ヒトChAc症例数は少ないため臨床研究は限界があり、私達は今回世界に先駆けて遺伝子改変モデルマウスの作成に成功した(J.Neurochem.92,759-766,2005)。ChAcモデルマウスはストレイン129系とC57Bl/6系の雑種で作成されたが、変異のホモ接合体においてヒト疾患における病理と一致した線条体を中心とした神経変性と有棘赤血球症を発症した。しかし、変性の程度や運動や行動の評価および神経化学的分析結果は個体差が大きく、環境因の差の少なさから背景遺伝子の差による影響がこのような結果を生み出したと考えている。すなわち、これら事実から、ChAcの発症に対して影響を与えるmodifier遺伝子(群)の存在の可能性が示唆された。
メトトレキサートによる腎障害発現に及ぼす利尿剤併用の影響

急性白血病やリンパ腫などの悪性腫瘍の治療に用いられる高用量メトトレキサート(MTX)療法では、血中MTX濃度の遷延や腎障害の発症によってその継続が困難になることがある。ハイドレーションを必要とする高用量MTX療法では、しばしば利尿剤が併用されるが、フロセミドやサイアザイド系利尿薬は尿を酸性化してMTXの排泄を遅延させるため、その併用を避けることが添付文書に記載されている。一方で、治療上の必要性により併用することがあるが、併用時の尿pHの変動や腎機能障害の発現頻度などの実態は明らかでない。これらの実態および腎機能障害の発現リスクを明らかにすることは同薬による副作用を未然に防ぐことに応用できると考えられる。本研究は、高用量MTXと利尿剤の併用時に腎障害発現に影響する因子を明らかにすることを目的として行った。筑波大学附属病院血液内科において、2002年2008年に1g/m^2以上のMTXとフロセミド(FS)またはアセタゾラミド(AZ)を併用し、48時間以内に採血を行った患者を対象にレトロスペクティブ調査を行った。腎障害の判定はAKIN分類を用いた。FS群(22名、31cycle)とAZ群(65名、113cycle)で、年齢、体表面積、MTX投与量、投与前の腎機能、肝機能、腹水・胸水の有無、および尿pH低下によるアルカリ化の回数に差はなかった。血中濃度の遷延はFS群ではAZ群と比較して高頻度に見られた(32.3%vs. 12.4%、p<0.01)。腎障害もFS群ではAZ群と比較して発症率が高い傾向が見られた(12.9%vs. 7.9%)。以上のことよりFSの併用が血中MTX濃度を遷延させ、腎障害の発症率を高めることが示唆された。
極超高感度電子打込型撮像素子の開発

EB-AMIの基礎特性を実験的に測定しEB利得、過剰雑音、解像度、最適膜厚の理論解析を行った。(1)実験特性:電子衝撃electron bombardment(EB)によるZnCdTe増倍センサを積層した新イメージ・インテンシファイア(II)を発展させた。電子衝撃利得(EB利益)は加速電圧10kvにおいて1500であった。従来のIIのように蛍光性のスクリーンと撮像素子を繋ぐファイバー・プレートがないので、増倍プロセスの解像度は高かった、画像品質は解像度、騒音特性がよく、白斑点、残像、焼付がない。エックス線照射による素子の疲労特性はなく、垂直ストライプがコントラストとして検知できない。5000時間の劣化寿命特性はa-Siと異なり極めてよく劣化は認知できなかった。素子の増倍層の焼付はCCDと異なり少い。(2)理論特性:EB-AMI型IIの増倍特性を2-10kVの範囲でMCシミュレーションにより計算し、実験によく合致した。閾値2kVはAl, Si_xN_<1-x>層の貫通損失で説明できた。最適厚は加速電圧10kVでは0.83μであった。膜内電子の横方向の広がりは0.83μで理論過剰雑音は7-1,3kVで1.2であった。以上の実験値との一致は大変よい。初年度は固体撮像素子を使わず既設の撮像管デマウンタブルで評価することを考えた。これまでの科研費の援助を得て製作した撮像・電子回折一体型蒸着装置があるのでこれを電子打込(EBIC)撮像可能な構造に改造した。ターゲットに近接して金蒸着膜の撮像パターンを設け紫外線照射して光電子像を発生させ電界加速してターゲットに射突させた。ターゲットはメッシュ等で保持したAl膜にCdTe,GaAsターゲット等を形成して評価撮像実験を行った。固体撮像素子AMIは蓄積電荷が正負両極性のターゲットの動作が可能であるので,正極性動作には通常の低速走査法を用い,負極性動作には高速走査方式を使った。測定は利得と増倍時の付加雑音を測定した。CdTe,GaAsターゲットの増倍利得はそれぞれ10KVで2500,3000倍の利得が得られた。1.撮像評価実験:非晶質薄膜材料は材料が結晶化しないように入射電子ビームエネルギーを制限しながら電子回折を行うのがよい。前年度に開発したCdTe,GaAS-EBIC現象を上記の微弱な電子回折ビームの検出に用いた。CdTe,GaAsターゲットを通常の蛍光スクリーン部に設置した。この後、低速電子型撮像用電子銃でターゲットを走査し信号を取り出した。電子回折の加速電圧は20kVなのでCdTe,GaAsターゲットの増倍利得はそれぞれ3000,4000倍であった。過剰雑音は1.15でほぼ無雑音増倍が達成できた。2.電子ミクロホトメトリ:さらに、デバイ環に沿って加算平均し空間周波数のFFTにより雑音軽減軽減処理をおこなうと入射電子線自身のショット雑音の軽減処理が効果的に達成できることを発見し学会報告した。3.膜形成時の新構造の発見:a-Se,a-Te膜蒸着時のその場観察を行い膜形成時にランダムチェインがまず形成発生し、その後よりエネルギの安定な連続ネットワークCRN構造に変わる現象を世界で初めて発見し報告した。4.画像特性:解像度,残像,ハイライト焼付等を測定した。解像度は1000TVL,残像は第3フィールドで0%,ハイライト焼付は無であった。また,当初予想したように寿命の劣化は全く見とめられない。5.シミュレーション:既開発のコンピュータシミュレーションプログラムを改良拡充した。ラザフォード散乱とベーテの損失能の公式を改良組合わせ増倍利得がより正確に予測可能になった。これを基に不可雑音を計算した。不可雑音の理論と実験の一致は極めて良かった。更に解析を上記実験と平行して進める。

得られた知見は随時製作にフィードバックさせる。EB-AMIの基礎特性を実験的に測定しEB利得、過剰雑音、解像度、最適膜厚の理論解析を行った。膜組成の決定:焼付がなく超寿命名材料としてCdTe,ZnTeが適合していることが判明し、低暗電流、残像特性からこれらの固溶体Zn_xCd_<1-x>Te(x=30%以下ZnCdTeと略記する)が最適であることが判明した。この組成膜のEB利得は10kVで1500であった。画像品質は解像度、騒音特性がよく、白斑点、残像、焼付がない。エックス線照射による素子の疲労特性はなく、垂直ストライプがコントラストとして検知できない。5000時間の劣化寿命特性はa-Siと異なり極めてよく劣化は認知できなかった。素子の増倍層の焼付はCCDと異なり少い。EB-AMI型IIの増倍特性を2-10kVの範囲でMCシミュレーションにより計算し、実験によく合致した。閾値2kVはAl,Si_xN_<1-x>層の貫通損失で説明できた。最適厚は加速電圧10kVでは0.83μであった。膜内電子の横方向の広がりは0.83μで理論過剰雑音は7-1.3kVで1.2であった。以上の実験値との一致は大変よい。
筋形成・維持におけるフクチン依存ジストログリカン糖鎖の役割と筋ジストロフィー病態

福山型筋ジストロフィーは、フクチン遺伝子の変異によって生じる重篤な小児期筋ジストロフィーであるが、分子病態に不明な点は多く、治療法も存在しない。本研究では、骨格筋選択的にフクチン遺伝子を欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作出した。本マウスは福山型筋ジストロフィー様の病態を呈し、分子病態の解明や遺伝子治療などの治療研究に有効なモデルとなる。福山型筋ジストロフィー(FCMD)は、フクチンを責任遺伝子とする重篤な小児期筋ジストロフィーである。フクチンの変異によって、筋細胞膜タンパク質のジストログリカンに糖鎖異常が生じることから、ジストログリカン糖鎖が病態に関与することは示唆されているが、糖鎖異常によって引き起こされる細胞・分子病態は、ほとんど明らかにされていない。また、ジストログリカン糖鎖の筋形成・維持における生理的役割も不明である。本計画では、これらの問題を解決する新たなモデルとして、筋選択的フクチン欠損マウスを創出する。フクチン欠損マウスの表現型や細胞・分子病態を解析することで、筋形成におけるフクチン依存ジストログリカン糖鎖の生理的意義を明らかにし、発症・病態に関わる分子を同定する。更に、モデルマウスを用いて、フクチン遺伝子治療の有効性も検討する。独創的なモデル系や独特な手法を用いることで、筋形成における糖タンパク質の意義といった基礎学術的な知見の獲得のみならず、新たな視点からの、FCMD発症機序の解明も期待される。今年度は、筋芽細胞からフクチンを欠損するマウス(cKOマウス)を創出し、その表現型の解析を行った。cKOマウスでは、フクチンタンパクの低下、ジストログリカンの糖鎖異常が観察され、また、離乳前から進行性の筋ジストロフィーが発症した。今後は、このモデルマウスを用いて、FCMDの発症機序の解明や遺伝子治療などを検討していく予定である。本年度は、成熟筋管でフクチンを欠損するマウスを作出した。昨年度作出した筋衛星細胞でフクチンを欠損するマウスと表現型を比較することで、筋形成・再生過程におけるフクチンの細胞生物学的・組織病態的な重要性が明らかになった。本研究によって、FCMDの発症機序の解明や遺伝子治療などの治療戦略の構築にむけて、有効な学術的知見と疾患モデル系が得られた。
ESR・MRI磁気共鳴法による移植細胞動態の新規追跡システム

近年の神経科学の発展と分子イメージング技術の発展とにより、再生医療や細胞移植に関する研究が推し進められ、臨床応用まで始められるに至っている。しかしながら、移植細胞の生体内における動態を確認し評価するシステムは未だ確立されていないという現状である。様々な手法を用いた移植細胞の生体内動態の確認・評価システム構築の動きが見られるが、本研究では、高感度であり、また、移植細胞組織の生理的状態や機能の評価も可能である、"新規磁気共鳴画像化法による、移植細胞の生体外追跡システムの開発"を提案した。平成18年度は以下の2つのテーマについて検討を行った。検討項目1:常磁性磁気標識剤の開発と細胞標識の基礎実験ESR・MRI両システムで画像化が可能な常磁性剤である、鉄・マンガン・安定ラジカル物質(第3級炭素化合物やナイトロオキシド類)を用いて、免疫系細胞および神経系細胞への取り込み実験を行った。免疫系細胞への取り込みと細胞毒性についてリンパ球、好中球を用いて検討を行った。マンガン、クロム、鉄という重金属イオンについて検討を行い、磁気標識能と毒性との関係を調べ、至適濃度を見いだした。検討項目2:ESR・MRI磁気画像化システムによる、移植細胞の非侵襲追跡実験検討項目1でマンガン、クロムについて至適濃度を決めることが出来たリンパ球を用いて実験を進めた。マンガンやクロムで磁気標識をしたリンパ球をマウスの体内へ投与し、リンパ球細胞の状態をMRI装置を用いて追跡した。我々の開発した0.5TMRIシステムにおいても、体内に戻した磁気標識リンパ球群を画像として確認することが可能であった。さらにリンパ球細胞を第3級炭素化合物で標識し、同様の実験を進め、体内での酸素消費を測定している。この測定が定量的に進めば、移植細胞の状態をよりよく観測することが可能である。近年の神経科学の発展により再生医療や細胞治療の研究が急速に推し進められ、臨床応用まで始められるに至っている。しかしながら、移植細胞の生体内動態を確認し評価するシステムは未だ確立されていないという現状である。平成17年度は以下の2つのテーマについて検討を行った。検討項目1:I磁気共鳴画像化システムの高解像度化への整備研究代表者の研究グループでは、2003年度から製作を開始したESR・MRI磁気共鳴画像化ステムを保有している。本研究に適した高解像度の画像を撮像するには画像の高解像度化が必要で、より高い磁場勾配を利用できるように、装置の改良を行った。現有装置での磁場勾配より10倍程度増強することが可能であった。検討項目2:常磁性の磁気標識剤の開発と細胞標識の基礎検討ESR、MRI両システムで画像化が可能な常磁性剤である、鉄・マンガン・安定ラジカル物質(ナイトロオキシドや第3級炭素化合物など)を用い、神経細胞や免疫細胞を磁気標識し、細胞内への常磁性物質の取り込み、細胞毒性等を検討中である。また、磁気標識した細胞が常磁性物質の造影効果により、ESR・MRI画像化システムで画像として位置的に確認できるか定性的な検討を終え、定量的検討に入ったところである。