hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
矯正力負荷による歯根膜機械受容器の神経生理学的,組織学的変化に関する研究

このことは中枢で侵害刺激に対する順応が起こったためと考えられる。免疫組織学的実験では、矯正力負荷によりネコの歯根膜神経終末が圧迫側変性組織内で消失することを確認した。また、変性組織周囲には、正常歯根膜内にはみられない顆粒状を呈した神経終末を認めた。このことから、神経生理学的実験で得られた応答閾値の上昇の原因が、歯根膜組織内特定領域の神経終末の量の減少、あるいは形態変化である可能性で示唆された。ヒトによる臨床実験では、前年よりさらに被験者数を増やして行った。その結果、圧覚の閾値上昇が矯正力負荷2日目をピークにあらわれてくること、また触覚についても矯正力負荷1日目をピークに上昇すること該確認された。矯正力負荷による歯根膜機械受容器の変化に関して、神経生理学的・免疫組織学的研究を行った。平成8年度までの研究から、ネコの下顎犬歯に100gの矯正力を1日間(以下1日間実験群)および4日間(以下4日間実験群)負荷すると、歯根膜機械受容器の応答閾値、潜時、順応性の種類の割合に変化が見られ、これが免疫組織学的観察から歯根膜内神経の消失や形態学的変化によるものであることが示唆された。本年度は矯正力負荷による生理学的変化の中で「順応性の割合の変化」について着目し、詳細な検討を加えた。電気生理学的実験で神経活動のうち、刺激に対し接続的な応答を続けるユニットを対照として解析を行った。パーソナルコンピューターを用い、各ユニットのインパルス間の時間を測定し、その逆数を「瞬間周波数」として求めた。その結果、矯正力を負荷していない群(以下、対照群)では、力刺激に対する瞬間周波数の変動が大きく、ばらつきが少なかった。一方、4日間実験群では、対照群と同じ力刺激に対して瞬間周波数の変動が小さく、ばらつきも大きかった。1日間実験群では、力刺激に対する瞬間周波数の変動が対照群と4日間実験群の中間を示し、ばらつきは大きく対照群と4日間実験群のばらつきの傾向を示していた。これらのことから、矯正力負荷により1日間実験群、4日間実験群と徐々に歯根膜内神経組織を取り巻く環境に変化を来たし、力刺激に対して適切な応答ができないユニットが増加していったことが示唆された。このことは平成8年度までに得られた応答閾の上昇、潜時の延長といった生理学的変化の裏付けとなると考えられる。
GFPを利用した分子スパイの開発と、細胞機能動態の可視化

プレート上の、GFP,RFPを発現する多数のコロニーの蛍光の特性を一度に解析するシステムを作製した。モノクロメーターで励起光を選択し、光ファイバーを使ってブレートを均一に照射する。プレートの蛍光像を様々な干渉フィルターを経てCCDカメラで撮り画像化する構成になっている。一度にプラスミド上のあらゆる箇所でランダム変異を含めた変異導入ができる遺伝子工学的手法を開発した(Nncleic Acid Researcb,2000)。この方法は、応用範囲が広く、迅速で低コストという利点を併せ持つ。この手法を利用してGFPの試験管内進化を試みたところ、新しい色の蛍光蛋白質(CGFP)の遺伝子が得られた(Nncleic Acid Research,2000)。CGFPは著しくpHに対して抵抗性を示すことがわかったプレート上の、GFP,RFPを発現する多数のコロニーの蛍光の特性を一度に解析するシステムを作製した。CGFPは著しくpHに対して抵抗性を示すことがわかったCameleonによるCa^<2+>イメージングの革命以前、申請者は低pHに耐性のyellow cameleon (長波長シフトのcameleon)を作製したため、小胞体の中でフォールディング効率が低下するという欠点を持つことが判明した。今回pHに耐性かつフォールディング効率の高いYFPを開発し、それを用いることでyellow cameleonを更に改善した。特に小胞体中の遊離カルシウムの濃度を測定する際に威力を発揮するものと期待している。細胞質yellow cameleonを用いて光学系の至適化を検討した。その結果、一光子レーザー走査顕微鏡(日立金属、固体レーザー、430nm)を使えば満足のゆくCa^<2+>濃度の断層像が得られることがわかった。1999年秋に、イソギンチャクよりRed Fluorescent Protein(RFP)がクローニングされた。申請者は、RFPに基つく蛍光指示薬を開発するため、RFPの蛍光特性の解析、および改変RFPの作製に着手している。改変RFPをプレート上のコロニー毎に調べるプレートイメージアナライザーを、購入したSencys CCDカメラを使って構築した。蛋白質のリガンド結合、蛋白質間の相互作用を指示薬の創製に応用するべく、GFP(RFP)融合蛋白質を、購入したBeacon(蛍光偏光度測定器)で解析するシステムをセットアップした。モノクロメーターで励起光を選択し、光ファイバーを使ってプレートを均一に照射する。一度にプラスミド上のあらゆる箇所でランダム変異を含めた変異導入ができる遺伝子工学的手法を開発した(Nucleic Acid Research,2000)。この手法を利用してGFPの試験管内進化を試みたところ、新しい色の蛍光蛋白質(CGFP)の遺伝子が得られた(Nucleic Acid Research,2000)。CGFPは著しくpHに対して抵抗性を示すことがわかった
電気けいれん療法はなぜ効果があるのかー細胞内カルシウムシグナル系との関係ー

ストレス誘導のマウスうつモデルを用いて、電気刺激(ECS)による改善効果の作用機序を、海馬のCa2+シグナル系に焦点を当て、調べた。CaMキナーゼIIとIVは有意な変化は見られなかったが、IP3Rやリアノジン受容体(RyR)はストレス負荷後に増え、ECSはこの増加を抑制した。しかし、いずれもメッセンジャーレベルに変化はなかった。さらに、RyRのアンタゴニストであるダントロレン投与によりECSの行動改善効果が抑制された。IP3RやRyRの分解を抑制することによって細胞内Ca2+濃度の維持を図る機序が生じたことが考えられ、ECSは細胞内Ca2+の低下を防ぐことでうつ状態を改善させた可能性がある。当初の計画では本研究のモデル動物としてラットを予定していたが、うつ病モデル作製法がより簡便であり、本研究分野での使用実績も多いマウスを使用することとした。また、初年度では正常動物での検討を予定していたが、電気けいれん療法(ECT)の効果確認のために初年度よりうつ病モデルを作製して解析することにした。1. ECTの条件の確立:正常マウスの両耳に電極を当て、60100Hz、1030mA、刺激時間1秒2秒の範囲で電気刺激を行い、けいれんが10秒以上でかつ明らかな障害が残らない条件を求めた。その結果、80Hz、30mA、刺激時間1.2秒をECTの条件とした。ECT時の麻酔はイソフルラン+ペントバルビタール(65mg/kg)とした。2.神経伝達物質の測定:単発ECT群と5日間の連続ECT群に分けて、脳内神経伝達物質をマイクロダイアリス法にて測定した。うつ病と関連が深いと考えられているドーパミンとセロトニンについてはECTによる有意な変化は見られなかった。3.うつ病モデルマウスの作製:C57BL/6Jマウスに対してICRマウスを10分/日x10日間同居させてストレスをかけたモデルを用いた(social defeat model)。このモデルに対して上記で決めた刺激条件で2日に1回のECTを7回行い、interaction、tale suspension、force swimming、sucrose preferenceなどのうつ病判定の行動テストを行った。うつ病モデルマウスでは正常マウスに比べてこれらのテストで有意な差が計測され、さらに、上記1で確立した刺激条件でECTを行いうつ状態の改善効果を確認した。カルシウム関連タンパク質の解析に関して当教室ではこれまでラットを用いていたため、当初は本研究のモデル動物としてラットを予定していた。しかしながら、うつ病モデル作製の容易性や当分野での蓄積データの多さからマウスに変更した。このため、モデル動物の作製やECT刺激条件の確立等に時間を要した。マウス(C57BL/6)をストレス群、電気けいれん刺激(ECS)群、ストレス+ECS群、正常コントロール群の4群に分けた。ストレスとして1日37時間の拘束・水浸負荷を15日間与え、これをうつ様モデルとした。ECS群についてはストレス2週間後に1日1回の電気刺激を2週間行った。ECSの条件は刺激後510秒以上のけいれんが起こる強さ(80Hz x 30mA x 1.2sec)とし、ストレス状態は、行動学的(オープンフィールド試験、強制水泳試験、尾懸垂試験など)および組織学的(海馬歯状回における新生神経細胞数およびBDNF陽性細胞数)に評価した。さらに、生化学的検討では、海馬内のBDNF、CaMキナーゼIIのリン酸化比率(pCaMKII/CaMKII)、リアノジン受容体(RyRs)、イノシトール三リン酸受容体1 (IP3R1)のタンパク発現量の変化をウェスタンブロッティング法でそれぞれ調べた。うつ様モデルでは強制水泳試験や尾懸垂試験における潜時の増加および、海馬歯状回における新生神経細胞数の減少が見られ、これらはECSを与えることで正常コントロールの値に戻った。一方、生化学検討においてはうつ様モデルマウスの海馬においてpCaMKII/CaMKIIの変化は見られなかったが、RyRsはRyR1,RyR2, RyR3のいずれのサブタイプも増大し、この増大は(特にRyR2において)ECSによって減弱された。一方、IP3R1はRyRs同様ストレスによって増大したが、ECSの効果は見られなかった。以上のことから、うつ様病態時にはRyRsを介したCa2+シグナル経路に何らかの変化が起こり、ECSがその変化を是正していることが示唆された。うつ様モデルマウスの作製条件およびECTの条件設定が修了した。現在、カルシウム関連の細胞内情報伝達系の検索を進めている。マウスを、ストレス群、電気けいれん(ECS)群、ストレス+ECS群、正常群の4群に分けた。ストレス群は拘束・水浸処置を15日間行いうつ様モデルとした。ECS群についてはストレスモデル完成後、1日1回の電気刺激(80Hzx30mAx1.2s)を2週間行った。ストレス群は強制水泳試験や新奇環境摂食抑制試験(NST)で潜時が有意にながくなったがECSによって正常レベルに戻った。また、ストレスによって減少した海馬歯状回の新生神経細胞数もECSによって回復した。このECS効果の機序の検討を行った。マイクロダイアリシス解析では、いずれの群も側坐核のドーパミンとセロトニンに有意な差は見られなかった。次に、海馬のCa2+シグナル系に焦点を当て検討を行った。まず、細胞内Ca2+濃度の調節因子である小胞体イノシトール三リン酸受容体(IP3R)およびリアノジン受容体(RyR)の変化について検討した。

蛋白レベルでは、IP3Rはストレスモデル完成直後に有意に増え、その後元のレベルに戻り、ECSはこの回復を促進した。RyR1とRyR3はモデル完成後に徐々に増え、2週間で正常群の2倍量になり、ECSはこのRyRの増加を抑制した。しかし、いずれもメッセンジャーレベルに変化はなかった。さらに、RyRのアンタゴニストであるダントロレン投与によりECSのうつ様行動改善効果が減弱した。一方、Ca2+依存性酵素であるCaMキナーゼIIとIVは各実験群において有意な差は見られなかった。以上の結果より、ストレスによって細胞内Ca2+濃度の低下が生じ、IP3RやRyRの分解を抑制することによってCa2+濃度の維持を図る機序が働いたことが示唆された。また、ECSは細胞内Ca2+濃度を上昇させ神経細胞の活性を回復させることでうつ様行動を改善させた可能性が考えられた。ストレス誘導のマウスうつモデルを用いて、電気刺激(ECS)による改善効果の作用機序を、海馬のCa2+シグナル系に焦点を当て、調べた。CaMキナーゼIIとIVは有意な変化は見られなかったが、IP3Rやリアノジン受容体(RyR)はストレス負荷後に増え、ECSはこの増加を抑制した。さらに、RyRのアンタゴニストであるダントロレン投与によりECSの行動改善効果が抑制された。IP3RやRyRの分解を抑制することによって細胞内Ca2+濃度の維持を図る機序が生じたことが考えられ、ECSは細胞内Ca2+の低下を防ぐことでうつ状態を改善させた可能性がある。うつ病モデルおよび行動学的評価方法やECTの刺激条件は確立できたので、今後、うつ病モデル動物にたいしてECTを行い、以下の項目について検討する。1.組織学的検討:海馬顆粒細胞層における神経細胞新生やシナプス形成の変化2.生化学的検討:カルモジュリンキナーゼやカルシニューリンなどのカルシウム関連たんぱく質の変動、およびカルシウムチャネルであるリアノジン受容体やIP3受容体の動態ECSの治療効果にRyRが関与することを明らかにするために、RyRのメッセンジャーレベルでの変化やRyRのアンタゴニストであるダントロレンを投与してECSの効果がどのように変化するかなどについて行動学的、組織学的に検討する。神経生理学当初の計画よりも遅れており、本年度予定の生化学的および組織学的検討がほとんど実施できなかったため。ほぼ計画通りの予算執行であったが、参加予定の学会旅費が計画より少なかったため。平成28年度の請求額と合わせて各種抗体の購入等に充てる予定である。次年度の物品費に組み込む予定である。
ペプチド-金属の自己集合に基づく絡まりを伴う機能性球殻構造の構築

ペプチド・金属の自己集合系において、ペプチド鎖同士の絡まりを伴う自己集合挙動を利用してウイルスのような巨大球殻状構造を構築し、分子の閉じ込め効果や酵素のような活性中心を有する球殻状構造の化学的構築へ発展させる。ペプチド鎖の絡まりを誘起するループ配列と、ペプチド鎖の屈曲を誘起するターン配列の組み合わせからなる配位子を設計し、金属イオンとの自己集合を検証することで、およそ30000Åにおよぶ巨大な空間を創出し、従来のカプセル状集合体には不可能な前人未踏の大きさの分子の閉じ込めへ展開させる。
屋外暑熱環境下の運動時における車いす生活者の深部体温の変化

車いす使用者の身体活動・運動を考える場合,健常者を対象とした運動指針がそのまま適応できないという指摘がある.車いす使用者は主な筋活動群が上肢であることと,障害が運動時の生理的応答に影響を及ぼすことが要因である。同様に,麻痺部が存在する場合,麻痺部の発汗作用が失われ,熱放散が機能しない.このことは,損傷部位の違いによって体温調節機構が異なることを示唆し,環境省や厚生労働省および日本体育協会が提言している熱中症予防指針に必ずしも当てはまらないことを示している.したがって,本研究の目的は暑熱環境における車いす使用者の体温の変動を明らかにし,車いす使用者に対する熱中症予防のための指針を立案することであった.車いす使用者のうち,特に体温調節が困難である脊髄損傷者を対象とし,暑熱環境下での運動負荷試験を実施し,発汗量、水分補給率および鼓膜温の変化を測定し,最高酸素摂取量の60%強度における上肢運動においては,おおよそ20分間の運動で,健常者に比して発汗量および水分補給率に有意差は観察されなかったものの,鼓膜温の変動においては,麻痺部における熱放散が小さいために健常者に比して有意に高値を示した.脊髄損傷者は,血管運動の欠落のみならず,麻痺部における発汗作用が減少している.また,損傷レベルによってその影響は広範囲に及んでいることから,熱放散ができず貯熱しやすい.脊髄損傷者は,屋内における暑熱環境においても熱中症などの暑熱障害に留意する必要があるが,その方略は一貫したものは散見されない.パラスポーツ実施時に用いられているのは,冷却水の経口摂取や,送風などが一般的であるが,身体冷却用のベストやアイススラリーの摂取が有用であると考えられる.また運動前の控え室などの室温が低い場合には,筋量が少なくなっていることから,バッファルームなどの体温を下げすぎないように留意する必要がある.車椅子生活者は、多くの場面において、自律神経系の障害を伴う場合が多く、熱産生と熱放散のバランスを取ることが困難である。したがって、暑熱環境下における運動や長時間の運動時には、貯熱量が増大し熱中症の発症のリスクが高まることが予測される。本研究は、暑熱環境下における運動時の車椅子生活者の深部体温の変化および発汗量をモニターすることによって、車椅子生活者の熱中症に関する指針を作成することを目的とする。平成28年度は、我々が開発したハンドエルゴメーターの補助機器を用いて、運動習慣を有する健康な若年成人男性10名(以下、コントロール群)および車椅子スポーツを実施している下肢肢体不自由者3名(以下、SCI群)を対象に最大下運動負荷試験を実施した。最大下運動負荷試験時の測定項目は、心拍数、最高酸素摂取量、血圧、主観的運動強度であった。心拍数の測定はPOLAR V800(POLAR社製)、血圧の測定はアネロイド式血圧計、主観的運動強度はボルグスケールを使用した。最高酸素摂取量はブレスバイブレス法を用いて、安静5分の後、3分毎に負荷を増加させる多段改漸増負荷試験を採用し、1分毎にモニターを行った。全ての被験者はオールアウトまで試験を実施した。コントロール群の最高酸素摂取量は、26±3 ml/min/kgであり、我々が実施したパイロットスタディとほぼ同水準の結果であった。心拍数は、150±8 bpmであり、先行研究における上肢運動の最高心拍数を支持する結果であった。SCI群の最高酸素摂取量は、コントロール群と比較して、高値を示した(31±5 ml/min/kg)。日常的に上肢を用いた運動を実施しており、筋持久力に優れていることが好影響を及ぼしたことが示唆される。これは主観的運動強度の水位にも顕著に現れており、コントロール群の上昇が早かったものの、SCI群においては、緩やかな上昇であった。平成28年度に所属が変わったことから、現在の所属における倫理委員会による審査と、以前より依頼していた被験者の実施が困難となり、新たに被験者の募集をすることとなった。しかしながら、コントロール群においては、計画していた10名の測定を終えることができ、車椅子生活者においても3名の協力を得ることができた。研究の内容においては、胸部の双極誘導による心拍数のモニターを予定していたが、新たな所属ではそれらの機器が無かったこと、高額で購入ができないことから、POLAR社製の心拍計を代用した。この機器は、他の先行研究においても使用され、正確な数値を導出するものである。被験者の確保を除いては、各種測定の遂行に問題はなく、今年度の測定にも支障はない。平成28年6月に開催されたヨーロッパアダプテッドスポーツ学会において、ハンドエルゴメーターの補助装置を用いた最高酸素摂取量の測定方法に関する発表を行った。なお、車椅子生活者における深部体温の変化および運動時の身体冷却に関わる論文を共同で執筆中である。平成28年度は、基礎的データである上肢最大運動時の酸素摂取量の測定および体温の変動を明らかにした。脊髄損傷者の体温の変動は、健常者に比して高値で推移し、回復期においても低下は緩やかであった。平成29年度は、これらの最大運動時の最高酸素摂取量から研究対象者の個々の運動強度を算出し、最大酸素摂取量の60%強度で30分間の上肢クランキング運動を実施した。研究対象者は、健常者と脊髄損傷者計8名であった。測定項目には、発汗量と深部体温を採用した。

上肢クランキング運動は、脊髄損傷者の自覚的な運動強度および心拍数が低値を示した。これは、脊髄損傷者の主たる運動肢が上肢であり、上肢の筋持久力が優れていることが要因である。しかしながら、深部体温は安静時から脊髄損傷者がやや高値を示し、運動時間の延長に伴い健常者と脊髄損傷者の深部体温の差は有意に拡大した。脊髄損傷者の体温調節は、T(胸椎)1011番より高位の損傷であると体温調節機能が欠如することが明らかになっている。今回の研究に協力を得られた脊髄損傷者は、T(胸椎)12番の損傷があり、体温調節の失調は小さいと考えられたものの、健常者と比較して深部体温が高値を示した。これは、麻痺部である下肢の発汗作用の低下と血管運動による熱の放散の困難さが引き起こしたものと考えられた。これらの結果は国際学会にて発表を行った。また、これまで我々が得た知見と、これまで報告されてきたことから、国立スポーツ科学センターの内藤貴司氏と日本体育学研究に脊髄損傷者の体温調節機能と身体冷却に関する総説を共同で執筆し、平成30年度の6月に掲載がなされる。現在は英文の校正を行なっており、来年度に英文で発表を行う予定である。これまで2年間に渡り、健常者における研究計画は完遂したものの、本研究の主たる研究の一つである脊髄損傷者のデータについては、基礎データは得られているものの、応用的研究の結果は揃っていない。これらは、応用実験に至るまでの研究協力の中止の申し出や、研究の継続によって脊髄損傷者の症状の憎悪が予見されるなど、研究対象者の安全性の確保のために中止を余儀なくされた者が出てきたためである。脊髄損傷者のうち、特にT1011より高位の損傷においては、自律神経機能の失調がみられ、体温調節が機能しない。高位損傷者においては、暑熱環境における最大強度の60%での運動を危険であると判断し、安全性の確保のために研究協力者から除外した。したがって、屋外の暑熱環境下における研究は完遂できなかったため、延長を申請し平成29年度に実験協力者の基礎データの習得から応用の研究に至るすべての研究計画を遂行することとしている。車いす使用者の身体活動・運動を考える場合,健常者を対象とした運動指針がそのまま適応できないという指摘がある.車いす使用者は主な筋活動群が上肢であることと,障害が運動時の生理的応答に影響を及ぼすことが要因である。同様に,麻痺部が存在する場合,麻痺部の発汗作用が失われ,熱放散が機能しない.このことは,損傷部位の違いによって体温調節機構が異なることを示唆し,環境省や厚生労働省および日本体育協会が提言している熱中症予防指針に必ずしも当てはまらないことを示している.
細胞間接着構造の極性形成を開始させる新規タンパク質相互作用の構造生物学的研究

前年度までに、α-catenin/merlin複合体の研究において、それらの相互作用領域を特定した。また、相互作用が確認できたタンパク質領域において結晶化スクリーニングを行い、いくつかの複合体結晶を得ることができたが、分解能の改善に難航していた。本年度は相互作用が確認できた領域のうち、これまで結晶化を試みていなかった領域について結晶化初期スクリーニングを行い、いくつかの結晶を得ることができた。結晶化に用いた溶液で得られた結晶を洗浄し、SDS-PAGEによって複合体であるかを確認した結果、αE-catenin/merlin複合体の結晶である可能性が示唆された。そのため、放射光施設でのX線回折実験を行い、分解能2.5 angstromの回折データを取得した。分子置換法による位相決定、初期モデルの構築を行い、Rwork/Rfree=20.0/24.1まで構造精密化を行った。その結果、結晶の非対称単位中に、2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインが存在していた。2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインに対して、2分子のαE-catenin由来の電子密度が確認できた。決定した結晶構造から、merlin FERM (19-314)ドメインのサブドメインCに位置するα1Cとβ5Cの間に形成される疎水性の溝に、αE-cateninがβシートを形成して相互作用していた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、α-cateninのD1ドメイン単独での結晶化スクリーニングを実施した。その結果、α-cateninの単体結晶を得ることができ、結晶化条件の精密化とクライオ条件の検討を行い、X線回折実験による分解能2.5Åでの回折データを取得した。分子置換法による位相決定を行い、α-cateninのD1ドメイン単独での三次元構造をX線結晶構造解析法で決定した。結晶構造の決定により、三次元構造に基づいて調製した変異体を用いてin vitroならびにin vivoにおける機能解析を行うことができるようになった。これまでに、α-cateninにはモノマーとダイマーの会合状態が存在することが知られており、それぞれの会合状態で機能が異なることが示唆されている。モノマー状態のα-cateninはβ-catenin-cadherinと相互作用して、リンカータンパク質(vinculin、EPLIN、α-actinin、l-afadin、ZO-1等)を介してアクチンと相互作用すると考えられている。ダイマー状態のα-cateninはアクチンと直接相互作用して、アクチンのバンドル化を促進するとともにArp2/3やWASpを介したアクチンの枝分かれや重合を阻害すると考えられている。このように、会合状態での役割の違いが示唆されているにも関わらず、会合状態の平衡を制御する分子機構は詳細に理解されていなかった。結晶構造に基づいて調製した変異体による生化学的・生物物理学的な実験により,我々はα-cateninの会合状態に重量なアミノ酸残基を特定して、どのような構造変化を伴ってα-cateninがホモ二量体またはβ-cateninとのヘテロ二量体を形成するのかについても議論できるデータを得ている。現在は、そのデータをProtein Data Bankに登録して、論文として発表する準備をしている。H26年度は、H25年度に報告したαN-catenin D1ドメインの単体構造に関する成果を論文として発表する準備を進め、FEBS lettersに現在投稿中である。H25年度までに、α-catenin/Merlin複合体における研究で、調製した目的タンパク質を用いたin vitro pulldown assayにより、α-cateninとMerlinの相互作用領域の特定を試みた。その結果、α-cateninとMerlinの相互作用には、α-catenin 1-56とMerlin 19-218が重要であることが示唆された。また、αE-cateninのサブタイプであるαN-cateninとαT-cateninにおいても、Merlinと相互作用することが確認できた。そして、相互作用が確認できた領域において、複合体の結晶も得られており、分解能6.0 angstromの回折データが得られていた。H26年度は、H25年度に報告したα-catenin/Merlin複合体の結晶の分解能を改善するために、結晶化条件の精密化とクライオ条件の検討を行った。しかし、分解能の改善が難航しており、相互作用が確認できている異なる領域において、複合体の結晶化スクリーニング(各領域の組み合わせに対して約1000条件ずつ)を実施した。その結果、H25年度に報告した条件とは別の条件で、いくつかの結晶が得られた。結晶化に用いた溶液で得られた結晶を洗浄し、SDS-PAGEによって複合体であるかを確認した結果、α-catenin/Merlin複合体の結晶である可能性が示唆された。そのため、結晶化条件の精密化を行い、放射光施設でのX線回折実験を行った。現在までに、分解能7.0 angstromの回折データを取得している。

結晶化に用いた溶液で得られた結晶を洗浄し、SDS-PAGEによって複合体であるかを確認した結果、αE-catenin/merlin複合体の結晶である可能性が示唆された。そのため、放射光施設でのX線回折実験を行い、分解能2.5 angstromの回折データを取得した。分子置換法による位相決定、初期モデルの構築を行い、Rwork/Rfree=20.0/24.1まで構造精密化を行った。その結果、結晶の非対称単位中に、2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインが存在していた。2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインに対して、2分子のαE-catenin由来の電子密度が確認できた。決定した結晶構造から、merlin FERM (19-314)ドメインのサブドメインCに位置するα1Cとβ5Cの間に形成される疎水性の溝に、αE-cateninがβシートを形成して相互作用していた。H26年度において、αN-cateninのD1ドメインに関する成果を論文として発表するために準備を進め、FEBS lettersに投稿中である。H25年度に報告したα-catenin/Merlin二者複合体の結晶について、分解能の改善に取り組んでいたが、大きな改善には至らなかった。しかし、H26年度に目的タンパク質の異なる領域の結晶化スクリーニングを実施し、別の結晶化条件を探索した結果、これまでとは異なる複合体の結晶を得ることができた。現在、この得られた複合体結晶の分解能改善し、良質なX線回折データを得るために研究を進めている。これらのことから、二者複合体の立体構造を明らかにしてその相互作用機構を明らかにするという目的に向かって進展していると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在、FEBS lettersに提出中であるαN-catenin D1ドメインの単体構造に関する成果を発表するため、今後も研究を進めていく予定である。H26年度に得られた新たなα-catenin/Merlin複合体の結晶の分解能を改善するために、今後も結晶化条件の精密化とクライオ条件の検討を行う。分解能の改善が難航する場合、相互作用が確認できている異なる領域について、引き続いて結晶化スクリーニングを試みる予定である。目的とするタンパク質の1つであるα-cateninの単体構造を原子レベルで解明した。変異体を用いた生化学的・生物物理学的実験からも、構造機能相関における興味深いデータを取得している。また、目的とするタンパク質複合体についても結晶を得ることができており、現在は良質なX線回折データを得るために研究を進めている。α-cateninの単体構造はタンパク質や核酸の立体構造を管理・保存している国際的なデータベースであるProteir Data Bankに登録を行い、これまでに収集したデータは論文として発表するために準備を進めている。
神経可塑性関連プロテアーゼのリアルタイムin situ活性測定法の開発

ニューロプシンは神経活動依存的に神経細胞外に政出される可塑性マーカーであり、また皮膚病理、妊娠などのマーカーである。この活性化を測定することができれば神経可塑性、病理、妊娠などをリアルタイムに測定することが可能となる。この特異的基質として我々は細胞接着分子L1を同定し、切断部位の配列から蛍光ペプチド基質を作成することを目標とした。平成14年度にニューロプシンによるL1切断部位の同定とそれを利用したニューロプシン特異的ペプチド基質の作成を行ったが、いずれも合成基質としてこれまで使用していたVal-Pro-Arg-MCAやPro-Phe-Arg-MCAよりも特異性、親和性に関して劣った。さらに平成15年度には、リコンビナント蛋白としてすでに調整したL1蛋白質について競合阻害をするかどうかを検討し、新合成基質として使用可能かどうかを検討した結果、最適の新合成基質となり得るペプチド合成基質を作成するに至らなかった。様々な残基数の合成ペプチド基質に対するニューロプシンの活性を測定し、基質特異性が高いものを作成することができなかったことから、今後はL1の部分配列を考慮することなくより幅広い範囲で合成基質を作成する必要がある。引き続き、合成基質の中でニューロプシンによる分解活性が高く、且つ他のプロテアーゼによる切断を殆ど受けないものをニューロプシン特異的ペプチド基質として作成する努力を続けなければならない。ニューロプシンの特異的基質として我々が同定したL1の切断部位の配列から蛍光ペプチド基質を作成することを目標としている。ニューロプシンによるL1切断部位の同定(宮井担当)とそれを利用したニューロプシン特異的ペプチド基質の作成(塩坂担当)を行うLlの全長cDNA(既に取得済)をバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞High5に強制発現させた。L1特異抗体を用いて検討したところ、200kdのfull length L1蛋白の発現を確認した。さらに、強制発現させた昆虫細胞に活性型のリコンビナントニューロプシンを作用させて細胞膜上のL1を切断したところ、180kdへの分解を観察した。しかし、現在のところ収量が悪く、TOFMSによりシークエンスを解析することが困難であった。さらに大量の蛋白産物を得るべく、試料の調整、精製法の詳細な検討をおこなっている。一方、ニューロプシンの合成基質切断特性、L1の既知のシークエンス情報および上記の結果から、切断サイトとして3カ所の配列を想定している。L1の配列にpoint mutationをいれることにより配列を変え、その結果ニューロプシンによるL1切断能が変化するかどうかを検討するため、L1ミュータントの作成を行っている。これを上記と同様に、昆虫細胞によりミュータント蛋白を作成し、ニューロプシンによる分解が行われるかどうかウェスターン法により検討することを計画中である。以上の検討により、ニューロプシンによる切断サイトを決定し目的の蛍光基質の作成にとりかかる。
学校組織間における知識移転―ミドルリーダーの人事異動に着目して―

これまでの研究期間に継続して実施した事例対象校における知識移転プロセスを分析し、分析結果を報告・出版した。具体的には、「高校文化活動の創造・発展・波及」及び「授業改革の創造・発展・波及」に取り組むある公立高校において、当該実践の草創期の改革を主導した前校長、前校長に見出され授業改革のキーパーソン(ミドルリーダー)となった3名の教諭、前校長とともに授業改革に当たった2名の教頭、前校長の授業改革を引き継ぎ発展させた現校長を対象としたインタビュー調査をもとに分析し、知識移転の実態を描き出した。対象事例の一つ目である「高校文化活動の創造・発展・波及」については、前校長のこれまでの教育実践や人事異動を契機としてつむぎだしたネットワークが活用され、学校間・都道府県間のつながりのなかで知識が移転し、さらにその知識が組織構成員(ミドルリーダー、その他教職員)へと伝播する過程を描き出した。また、当該過程の中で新たな高校文化活動(知識)が生み出され、発展し、現在では再び県下全域へと伝播している。対象事例の二つ目である「授業改革の創造・発展・波及」については、「高校文化活動の創造・発展・波及」と同じく授業改革の主導者であった前校長が、それまでの教育実践で作り上げた教育観や具体的教育実践を修正させながら移転し、それらを反映させる形でビジョンを形成している。そして当該ビジョンを組織構成員が共有し、ビジョン実現へと向かい実践が展開されるという知識移転の様相を描いた。上述した分析結果は、教育研究者・実践者によって構成される全国研究大会において共同発表するとともに、当該分析結果を「ミドル・アップダウン・マネジメント」の観点から再構成し書籍として刊行した。教員年齢構成の急激な変化や自律的学校経営のさらなる進展などを背景とし、学校改善に関する「知識」の継承・発展(知識移転)は喫緊の課題となっているが、その実際は明らかになっていない。そこで今年度は「学校組織における知識移転」の仮説生成を行うべく、二つの事例(小学校・高等学校)に関する調査研究を行った。具体的には、調査協力者である二名の教員のライフヒストリーを作成するとともに、その関係者へのインタビューも併せて行い、知識移転の様相について多角的視点から検討した。調査の結果、教師が新たな実践、学校改善を展開するうえでは、それまでの教職経験で獲得した「知識」が強く影響していることが確認された。また学校改善を果たすうえでは、当該教師(ミドルリーダー)が獲得した「知識」を、勤務校や時代状況に合わせ修正・発展させ適用させる様子も示された。さらに、「知識」の継承・発展は、当該知識を産み出した教師だけでなく、周囲の教師へも影響を与え、拡散する可能性も示唆された。このメカニズムを明らかにすることができれば、教師の異動と学校改善、そして人材育成を含めたトータルな支援方策を探ることが可能である。ただし、上記可能性を示すためには、知見の一般化が必要である。今年度調査を行った2事例を比較検討し、そこに共通する知識移転のメカニズムを描き出す必要がある(仮説の生成)。また生成した仮説を視座として、その他事例を収集・分析することで、より多くの知識移転事例を説明できるモデル生成を行う必要もある。当初の予定としては、ライフヒストリーの作成、知識移転に関する仮説生成とともに、その知見を活用したインタビュー調査の実施・分析を行う予定であった。しかし今年度はライフヒストリーの作成にとどまり、その他調査・分析が不十分である。今年度は昨年度に引き続き、「学校組織間における知識移転」に関する事例調査を行った。具体的には、昨年度も対象としたある高等学校において行われる文化的活動の波及と、同高校におけるアクティブ・ラーニングに関する教育実践の実施及びその波及に焦点をあて、当該実践関係者へのインタビュー調査及び資料収集、参与観察を行った。上記実践(文化的活動、アクティブ・ラーニング)は、一事例校での実践を越え、地域の他学校や県域にわたり実践が波及する状況にある。当該実践の調査からは、知識移転を促すミドルリーダーは、それまでの多様な教職経験等で獲得した「知識」を深化させながら、その「知識」を移転可能な内容へと変容させ、また、その「知識」に触れた関係する諸教員の職能成長をも引き起こすというプロセスが明らかになりつつある。この点については、同じく昨年度から継続調査を行っている小学校教員による教育実践の波及プロセスからも言及可能である。今年度は上記二つの事例調査に加え、他事例の収集にも着手した。具体的には、ある中規模自治体における小学校のミドルリーダー(教務主任、指導教諭等)複数名に対し、これまでの教職経験における知識移転経験の有無及びその内実に関してインタビュー調査を実施した。当該インタビュー調査を行った結果、昨年度から継続して実施している事例調査で生成しつつある上述の仮説の検証可能性を実感している。今後はこれまでの調査結果を踏まえ、また対象事例を拡大させながら分析作業を進める予定である。申請者の所属機関変更により、予定していた調査スケジュールが大幅に変更し、研究に遅れが生じている。一昨年・昨年度に引き続き、事例対象とする高等学校において「高校文化活動の創造・発展・波及」及び「授業改革の創造・発展・波及」に関する継続調査を行った。また、当該事例に関するキーパーソン(ミドルリーダー)を対象としたインタビュー調査を複数回継続的に実施し、知識移転の実態を描き出した。対象事例の一つ目である「高校文化活動の創造・発展・波及」については、人事異動や学校間・都道府県間をつなぐ組織(高校文化連盟)の影響を受けながら、新たに生み出された高校文化活動や組織構築のノウハウが継承され、かかる知識が再び他校へと広がる様相を明らかにした。

対象事例の二つ目である「授業改革の創造・発展・波及」については、人事異動により管理職をはじめとする組織構成員が変更する中、改革初期に構築された組織やキーパーソンを中心とし、授業改革が継続する過程を把握した。また、対象校の実態に合わせ、実践が変更・発展する様相や、その実践や知識が他校へと伝播するとともに、学校間をつなぐ新たな組織が構築される様子を記録することができた。また今年度は、上述した事例調査に加え、ミドルリーダーを対象としたインタビュー調査を多数実施し、事例校を通じて創出しつつある知見の検証に着手した。具体的には、校務分掌組織改革や若手教員育成システムの改善に取り組むミドルリーダーへインタビューを行い、その具体的プロセスや実現要因の記録に取り組んだ。事例校における教育実践プロセスの記録やミドルリーダーを対象としたインタビュー調査は現在も継続中であり、生成した仮説とその検証、一般化へ向けた分析などを継続して実施していく。事例校の継続調査やインタビュー調査を多数行うことにより、「学校組織間における知識移転」の具体的プロセスの把握はできつつある。しかし、知識移転に関する多角的・継続的なデータ収集が実現し、かつ、その分析へ着手はしているものの、分析結果を論文化・公表するには至っていない。これまでの研究期間に継続して実施した事例対象校における知識移転プロセスを分析し、分析結果を報告・出版した。具体的には、「高校文化活動の創造・発展・波及」及び「授業改革の創造・発展・波及」に取り組むある公立高校において、当該実践の草創期の改革を主導した前校長、前校長に見出され授業改革のキーパーソン(ミドルリーダー)となった3名の教諭、前校長とともに授業改革に当たった2名の教頭、前校長の授業改革を引き継ぎ発展させた現校長を対象としたインタビュー調査をもとに分析し、知識移転の実態を描き出した。対象事例の一つ目である「高校文化活動の創造・発展・波及」については、前校長のこれまでの教育実践や人事異動を契機としてつむぎだしたネットワークが活用され、学校間・都道府県間のつながりのなかで知識が移転し、さらにその知識が組織構成員(ミドルリーダー、その他教職員)へと伝播する過程を描き出した。また、当該過程の中で新たな高校文化活動(知識)が生み出され、発展し、現在では再び県下全域へと伝播している。対象事例の二つ目である「授業改革の創造・発展・波及」については、「高校文化活動の創造・発展・波及」と同じく授業改革の主導者であった前校長が、それまでの教育実践で作り上げた教育観や具体的教育実践を修正させながら移転し、それらを反映させる形でビジョンを形成している。そして当該ビジョンを組織構成員が共有し、ビジョン実現へと向かい実践が展開されるという知識移転の様相を描いた。上述した分析結果は、教育研究者・実践者によって構成される全国研究大会において共同発表するとともに、当該分析結果を「ミドル・アップダウン・マネジメント」の観点から再構成し書籍として刊行した。次年度は、より広範な知識移転に関する情報収集を行う必要がある。そして、収集したデータの比較検討・分析に着手する。
温度感応性高分子による大気、環境水中の多環芳香族炭化水素の分離濃縮と蛍光光度定量

申請者は、温度感応性高分子を“相転移する固相溶媒"として用いる微量環境汚染物質の分離濃縮法の構築を意図している。本研究では、温度変化を感受して、固-液の相転移する温度感応性高分子:ポリビニールメチルエーテル(以下PVME)あるいはポリ(N-イソプロLルアクリルアミド)を抽出媒体として、大気、環境水中の多環芳香族炭化水素(以下PAHs)を簡易迅速に捕集・濃縮し、高感度に蛍光光度定量する方法を確立した。またPVMEによる捕集機構を探り、高性能な温度感応性高分子のデザインをも試みた。以下にその詳細を述べる。1.定量方法の確立:大気試料の場合には、PVME(0.035%)水溶液を吸収液として通気・捕集し、また水試料では、PVME水溶液を加えた。これに硫酸(1mM)を添加後、53°Cに加温し振とうすると、PVMEは、PAHsを取り込んで凝集し器壁に付着した。傾斜して液を除去し、付着物を極少量のアセトニトリルに溶解し,蛍光検出-HPLC(Inertsil ODS-2カラム)に注入し,各々に適した波長においてPAHsの蛍光強度を測定した。2.定量結果:ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(b)フルオランテン、ピレン、など米国環境保護局及びWHOによって提示された16種類のPAHsが0.6pmo1/testまで測定出来た。水溶液として300倍まで簡易迅速な分離・濃縮が可能である。喫煙室の空気、自動車排気ガス、水中などのpptオーダーのPAHsを、簡易迅速に定量できた。3.捕集機構の解明と高性能温度感応性高分子のデザイン:NMR測定の知見から、PAHsはPVMEに疎水性相互作用によって捕集されていると推測された。さらに分離・濃縮の場として優れた機能を有する温度感応性高分子をデザインするために、官能基シクロデキストリンの導入などを検討した。以上、環境汚染の恐れのある有機溶媒抽出を用いずに、pptレベルの環境汚染物質を簡易迅速に分離・濃縮し、測定できる本法は、さらに広い範囲における応用性が期待される。新素材の温度感応性高分子を用いる微量環境汚染物質のモニター法を開発することを意図している。本研究では、温度感応性高分子の一つであるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(以下PNIPAAmと記す)を用いて大気、環境水中の多環芳香族炭化水素を簡易迅速に捕集濃縮し、高感度に蛍光光度定量する方法を確立した。1.方法:大気試料の場合には、PNIPAAm水溶液を吸収液として通気・捕集し、また水試料では、PNIPAAm水溶液を加えた後、約55°Cに加温すると、PNIPAAmは、多環芳香族炭化水素を取り込んで凝集し、器壁に付着した。傾斜して液を除去した後、付着物を極少量のアセトニトリルに溶解し、蛍光検出-HPLCに注入し,多環芳香族炭化水素の蛍光強度を測定した。2.定量法の確立:以下の様に最適な条件を定め、上記の定量法を確立した。(1)多環芳香族炭化水素として、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(b)フルオランテン、ピレン、など米国環境保護局及びWHOによって提示されている16種類の多環芳香族炭化水素について検討した。

(2)分離・濃縮の条件をPNIPAAm濃度0.2%、析出時の温度を55°C、液性を0.08M硫酸と定めた。(3)HPLCは、ODSカラムと、移動相アセトニトリル/水で分離し、検出には蛍光光度を測定した。本法によって、300倍までの迅速な濃縮が可能であり、0.6pmol/testまで測定できた。3.本法により喫煙室の空気、自動車排気ガス中の多環芳香族炭化水素の簡易迅速かつ高感度な定量に成功した。PNIPAAm以外の温度感応性高分子、ポリ(ビニルメチルエーテル)についても検討を始めた。以上、温度変化により固-液の相転移をする温度感応性高分子を抽出媒体とする分離・濃縮法の構築に成功した。本研究では、温度変化を感受して、固-液の相転移をする温度感応性高分子を抽出媒体として、大気、環境水中の多環芳香族炭化水素(以下PAHsと記す)を簡易迅速に捕集・濃縮し、高感度に蛍光光度定量する方法の確立を意図した。本年度においては、平成5年度に得たポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)に関する成果に基づいて、他の温度感応性高分子ポリビニールメチルエーテル(PVME)について検討し、ポリマーの特長を生かしたPAHsの定量法を確立した。さらにNMR測定による知見に基づいてその捕集機構の解明に端緒をつけた。又高い選択性を有する温度感応性高分子のデザインを試みた。以下にその詳細を述べる。1.定量方法の確立:大気試料の場合には、PVME(0.035%)水溶液を吸収液として通気・捕集し、また水試料では、PVME水溶液、硫酸(1mM)を加えた後、53°Cに加温し振とうすると、PVMEは、PAHsを取り込んで凝集し器壁に付着した。傾斜して液を除去し、付着物を極少量のアセトニトリルに溶解し,蛍光検出-HPLC(Inertsil ODS-2カラム)に注入し,各々に適した波長においてPAHsの蛍光強度を測定した。2.定量結果:ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(b)フルオランテン、ピレン、など米国環境保護局及びWHOによって提示された11種類のPAHsについて検討した。300倍までの迅速な濃縮が可能であり、0.6pomol/testまで測定出来た。喫煙室の空気、自動車排気ガス中のPAHsを簡易迅速かつ高感度に定量できた。3.捕集機構の解明:NMR測定の知見から、PAHsはPVMEに疎水性相互作用によって捕集されていると推測された。この知見に基づいて、ポリマーへの官能基シクロデキストリンの導入を検討した。
振動インテンシティの制御の高速化に関する研究

本研究の期間内に行った研究の結果以下の結果が得られた.2.アルゴリズムによりフィルタ係数を更新する際に用いるステップサイズパラメタの設定に置いて,周波数によらず一定値にするよりも,周波数の2乗あるいは3乗に比例するように設定すると,フィルタ係数の収束が早く行われる傾向があることが分かった.この理由については,なお解析的な研究を進めていく必要がある.3.振動インテンシティを観測する手法として直接差分法の2点,3点,4点を混在して組み合わせる方法を検討した.その結果,帯域ごとの制御量が向上し,より少ない計算量で次回のフィルタ係数を決定できることを明らかにした.4.Filtered-X LMS法における畳み込み参照信号を単純遅延に置き換えたDelayed-X LMS法を適用する試みを行ったが,モデリングエラーが大きいために制御効果が得られなかった.以上,アルゴリズムの改善,設定パラメタの検討,各種手法を取り入れた効率化を図り,振動インテンシティ制御に関する高速化を実現することができたといえる.一次元振動インテンシティの能動制御の高速化を目的としてコンピュータシミュレーションを中心に以下の点を検討した.まずは,第1は,ステップサイズパラメータに関する振動インテンシティ能動制御の高速化に関する検討である.いくつかのステップサイズパラメータを設定し,計算機シミュレータにより検討したところ,周波数の3乗に比例するようにステップサイズパラメータを設定すると,全帯域で適応フィルタが安定して収束することが示された.第2は,評価関数である振動インテンシティの観測に関する高速化についての検討である.検討の結果,振動場に応じて,各制御手法を選択して観測手法として用いれば,高い制御効果を得られることが示された.第3に,適応アルゴリズムで用いるfiltered-X参照信号を得るのに要する演算量に関する検討について,次の2つの点から検討を行なった.1つは,畳み込み演算を間領域ではなく,周波数領域で行なうことによる演算量削減の検討である.その結果,参照信号を得るのに要する演算量を大幅に削減することができた.この方法はDSPへのアルゴリズム実装時に非常に有用であると言える.もう1つは,参照信号をFiltered-x参照信号ではなく,Delayed-x参照信号を用いることによる演算量削減の検討である.Delayed-xアルゴリズムを用いると畳み込み演算を時間遅延に置き換えることが可能であり,演算量の削減は期待できる.しかし,実システムの伝達関数は特性が異なるので制御効果は悪くなる.これらの検討結果より,一次元振動インテンシティ能動制御システムの実装に関して,高速化という観点から実装の十分な見通しがついたということができる.本研究の期間内に行った研究の結果以下の結果が得られた.2.アルゴリズムによりフィルタ係数を更新する際に用いるステップサイズパラメタの設定に置いて,周波数によらず一定値にするよりも,周波数の2乗あるいは3乗に比例するように設定すると,フィルタ係数の収束が早く行われる傾向があることが分かった.この理由については,なお解析的な研究を進めていく必要がある.3.振動インテンシティを観測する手法として直接差分法の2点,3点,4点を混在して組み合わせる方法を検討した.その結果,帯域ごとの制御量が向上し,より少ない計算量で次回のフィルタ係数を決定できることを明らかにした.4.Filtered-X LMS法における畳み込み参照信号を単純遅延に置き換えたDelayed-X LMS法を適用する試みを行ったが,モデリングエラーが大きいために制御効果が得られなかった.以上,アルゴリズムの改善,設定パラメタの検討,各種手法を取り入れた効率化を図り,振動インテンシティ制御に関する高速化を実現することができたといえる.
造血幹細胞移植後の骨髄再構築過程と生着不全における責任細胞の分子病理学的解明

造血幹細胞移植における致命的合併症の一つにドナー由来の造血が失敗する生着不全がある。その病態については未知の部分が多く、移植片を攻撃する免疫細胞の由来や造血支持する間質細胞が病態に関与する可能性についてはほとんど調べられていない。本研究では、ヒト骨髄の病理組織標本を用いて、まず、正常の生着過程における造血様式の経時的変化を明らかにし、次に、正常生着例を比較対象として、生着不全症例における責任細胞の由来および臨床病理学的特徴を明らかにする。これにより、実臨床では現在ある治療法の適切な選択が可能となり、また、新たな治療法の開発にも寄与するものと考える。