hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
収量に関与する果皮の裂開機構の生理的解析

植物の種子の拡散や維持に深く関わっている組織の一つは、子房壁が発達した果皮である。作物にとって、植物が本来持つ種子を拡散させる能力は、収量や品質を著しく低下させ、輪作の栽培体系に於いては次年度の雑草発生の要因となる。ダイズのように、近年の栽培体系の変化により今まで問題にならなかった裂莢性が新たに大きな問題となっている作物もある。ダイズの裂莢は乾燥にともなう莢の捻れ、ならびに、縫合線部分の細胞壁構造が主原因であると予想され、これらには主に莢のリグニン構造が大きく関与していると考えられる。裂莢性が異なるNILの莢ならびに形質転換体から、裂莢の難易に対し特異的に変化を示す物質の単離・精製を行い、得られた結果を基にPdh1遺伝子産物の代謝経路の特定を試みている。また新たにダイズ莢の乾燥時に捻れる部分と捻れない部分の形態観察から柔組織の厚さに違いが生じていることが判明した。柔組織の厚さは捻れに対し拮抗的に働くものと考えられ、柔組織の成分も解析が必要である。ダッタンソバにおいては、果皮の裂開に差が生じる「満天きらり」と「ライスタイプ固定系統」の組織的観察では開花後8日目の「満天きらり」の果皮では、将来厚壁組織になる数層の柔組織が観察された。表皮下の数層の柔組織は、登熟に従い厚壁細胞へ発達しリグニンの蓄積が観察された。しかしながら「ライスタイプ」においては厚壁細胞への発達は見られなかった。開花時の子房において将来厚壁組織となる細胞層の分裂がみられないことからダッタンソバの果皮の発達はシロイヌナズナのものとは異なることが予想された。本研究では果皮の裂莢・裂開機構を生理的に解析するため、ダイズでは裂莢性関連遺伝子Pdh1に関するNILを圃場・培養器にて栽培した。未熟な莢より重合が進んでいないリグニン関連物質などを抽出し、NIL間で比較したところ前年までにみられたクロマトグラフと異なり両者間で差がみられなかった。圃場での採取時期の違いや保存方法に問題があったものと考えられる。またPdh1を過剰発現させたタバコ培養細胞BY-2の形質転換体から粗酵素分画を抽出し、モノリグノールを基質として同一の代謝産物が検出されるか確認を行っている。莢のリグニンの関与を調べるため、リグニン合成の初期段階に関与するPAL遺伝子の発現抑制を試みた。莢で特異的に発現するPdh1遺伝子プロモーターの下流にRNA干渉を起こすべくPAL遺伝子を配置したベクターを製作しているが予想外に時間がかかり、形質転換体の作成が遅れている。ダイズ莢において、捻じれる部位と捻じれない部位が存在しその部分の形態を比較した。厚壁組織には有意な違いが見られなかったが、捻じれない部分の柔組織は捻じれる部分のそれより厚いことが判明した。柔組織は乾燥後硬化することにより捻じれる力に対し拮抗的に働くことが予想される。「満天きらり」と「ライスタイプ固定系統」よりDNAの抽出を行い、全ゲノム解析を行った。また裂皮の要因となる厚壁組織の細胞層は開花時にすでに両系統間で差があることが確認されたため、開花時の両系統の花器からRNAを抽出しRNAseqを行った。現在シロイヌナズナの裂鞘に関与する遺伝子のオーソログについて発現解析を行っている。ダイズの裂莢性の難易は乾燥にともなう莢の捻れならびに縫合線部分の細胞壁構造が主原因であると予想され、これには主に莢のリグニン構造が大きく関与していると考えられる。裂莢性が異なるNILの莢ならびに形質転換体から、裂莢の難易に対し特異的に変化を示す物質の単離・精製を行い、得られた結果を基にPdh1遺伝子産物の代謝経路を特定する。この推定される代謝経路をin vitroにおいて再現しPdh1の機能を解析する。現在継代中の35Sプロモーターの下流にPdh1遺伝子を組込んだタバコ培養細胞BY2よりPdh1の単離精製を行い、リグノールの酸化経路に対しPdh1を供試して、この代謝物(フェニルプロパノイド代謝物)をHPLC、GC/MS等を用いて確認する。これによりPdh1の生理機能の実体とダイズから得られた代謝産物の解析をまじえて、莢におけるフェニルプロパノイド代謝経路を明らかにする。リグニン合成経路の初期段階に関与する遺伝子、ペクチン合成・分解に関与する遺伝子のノックダウンを行うよう、Pdh1のプロモーター領域の発現下においたRNAi用のベクターを構築し、形質転換体の作成を行う。またダッタンソバにおいては、ライスタイプとそうでないものの開花時の花器官より総RNAを抽出し行ったRNAseqについて解析を行う。系統間で特異的に発現する遺伝子について、果皮形成時のより精細な遺伝子発現解析を行い、候補遺伝子の絞込みを行う。両系統の交配により作成したF1、F2後代に対し、得られた候補遺伝子についての遺伝解析を行い、得られた情報を基に最終的に遺伝子マーカーの作成を目指す。

ダイズのように、近年の栽培体系の変化により今まで問題にならなかった裂莢性が新たに大きな問題となっている作物もある。ダイズの裂莢は乾燥にともなう莢の捻れならびに縫合線部分の細胞壁構造が主原因であると予想され、これには主に莢のリグニン構造が大きく関与していると考えられる。裂莢性が異なるNILの莢ならびに形質転換体から、裂莢の難易に対し特異的に変化を示す物質の単離・精製を行い、得られた結果を基にPdh1遺伝子産物の代謝経路を特定を試みている。ダッタンソバにおいては、果皮の裂開に差が生じる「満天きらり」と「ライスタイプ固定系統」の開花後の7日目の果皮よりRNAを抽出し、シロイヌナズナの角果形成に関与する遺伝子のオーソログの発現解析を行った。INDEHISCENT, FRUITFULLに関して「ライスタイプ」での発現が確認できなかった。組織的観察では開花後8日目の「満天きらり」の果皮では、将来厚壁組織になる数層の柔組織が観察された。表皮に近い2-3層の柔組織は、開花後14日目において厚壁細胞へ発達し、開花後43日目にはリグニンの蓄積が観察された。「ライスタイプ」においても同様に層状の柔組織が観察されたが、「満天きらり」と比較すると厚みが薄く、開花後14日目において厚壁細胞への発達は見られず、成熟後もリグニン化が確認されなかった。最終的に二次細胞壁が発達する細胞層は開花時に両系統間ですでに形態的に差があることが確認された。これらのことからダッタンソバの果皮の発達はシロイヌナズナのものとは異なることが予想された。本研究では果皮の裂莢・裂開機構を生理的に解析するため、ダイズでは裂莢性関連遺伝子Pdh1に関するNILを圃場・培養庫にて栽培した。未熟な莢より重合が進んでいないリグニン関連物質などを抽出し、NIL間で相違のあるピークの採取を行っている。またPdh1を過剰発現させたタバコ培養細胞BY-2の形質転換体から粗酵素分画を抽出し、モノリグノールを基質として同一の代謝産物が検出されるか確認を行っている。莢のリグニンの関与を調べるため、リグニン合成の初期段階に関与するPAL遺伝子の発現抑制を試みた。莢で特異的に発現するPdh1遺伝子プロモーターの下流にRNA干渉を起こすべくPAL遺伝子を配置したベクターを製作しているが予想外に時間がかかり、形質転換体の作成が遅れている。「満天きらり」と「ライスタイプ固定系統」の蕾よりDNAの抽出を行い、全ゲノム解析を行った。また開花後7日目の両系統の果皮からRNAを抽出し、シロイヌナズナの角果形成に関与する遺伝子のオーソログの半定量RT-PCRを行った。その結果、INDEHISCENT, FRUITFULLに関して「ライスタイプ」での発現が確認できなかった。開花後8日目の「満天きらり」の果皮では、将来二次細胞壁が発達し厚壁組織になる数層の細胞で構成された柔組織が観察された。開花後14日目において厚壁細胞へ発達し、開花後43日目にはリグニンの蓄積が観察された。「ライスタイプ」においても同様に層状の柔組織が観察されたが、「満天きらり」と比較すると層が薄く、開花後14日目において厚壁細胞への発達は見られず、開花後43日目においてリグニン化が確認されなかった。最終的に二次細胞壁が発達し厚壁組織になる細胞層は開花時にすでに両系統間で差があることが確認された。植物の種子の拡散や維持に深く関わっている組織の一つは、子房壁が発達した果皮である。作物にとって、植物が本来持つ種子を拡散させる能力は、収量や品質を著しく低下させ、輪作の栽培体系に於いては次年度の雑草発生の要因となる。
生物発光-蛍光2重エネルギー移動によるカスパーゼ3活性指示薬の開発

本研究では生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を利用した発光量増強技術と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づく指示薬作成技術を結びつけ発光性Ca^<2+>指示薬BRACの開発とその性質の解析およびBRACを利用し生きた細胞内(HeLa細胞)および植物(シロイヌナズナ)内のCa^<2+>イメージングを行った。その後生物発光-蛍光2重エネルギー移動についての研究を行い蛍光タンパク質Venusと橙色・赤色系蛍光タンパク質との相性の良いFRETペアを探索しいくつか該当する蛍光タンパク質を見つけた。しかしながら両者のFRET効率は低く満足の行く結果が得られていないため赤色系タンパク質に改良を加えたり新規に開発する事が今後の新たな研究課題になると考えている。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を利用した指示薬として細胞内カルシウム指示薬を開発した。この指示薬は生物発光タンパク質(Rluc8)と黄色蛍光タンパク質(Venus)の間にカルシウム結合により構造が変化するタンパク質(カルモジュリン)およびその結合タンパク質(ミオシン軽鎖ペプチド、M13)を挟んだ構造をしている。リンカーおよびVenusの円順列変異体を試し、カルシウムの有無で最もBRET効率の変化が大きくなるコンストラクトをスクリーニングした。これを培養細胞内に発現させ、細胞内のカルシウム濃度を発光でイメージングする事を可能とした。観察光学系として、Nikon 40倍油浸対物レンズを用い検出は浜松ホトニクスEM-CCDカメラImagEMを用いた。また、W-View光学系によるRluc8、Venus由来発光の同時観察を行った。また、この指示薬を安定的に発現する植物を作成した。これを用いて発光による植物個体のカルシウムイメージングを試みた。結果として、植物個体内のカルシウム濃度は平常時において培養細胞よりも高い事がわかった。植物個体でのカルシウム濃度上昇を検出するために、カルシウムの至適濃度に合わせたアフィニティを持つ指示薬の開発が必要とわかった。これを達成するため、カルシウムが結合するカルモジュリンタンパク質のアミノ酸にカルシウムとのアフィニティが低くなる変異を2箇所導入した。このカルモジュリンを用いてカルシウムとの指示薬を開発しているところである。また、今回作成できたカルシウム指示薬を用い蛍光タンパク質-発光タンパク質2重共鳴エネルギー移動指示薬を開発する。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を利用したカルシウム指示楽(BKAC)を開発した。これはカルシウムの有無によってRluc8に由来するスペクトルピークとVenusに由来するスペクトルピークの比が約60%変化する発光性のカルシウム指示薬である。このカルシウム指示薬をHela細胞に発現させて、1Hzでの観察を行う事ができた。これにより、ヒスタミン刺激に伴なう細胞内のカルシウム振動を観察することができた。また、シロイヌナズナに遺伝子改変を行い、安定的にBRACを発現させ、植物の病気を起こす遺伝子(Pseudomonas syringae pv. Tomato(Pst)DC3000)を持つ菌体Pst DC3000/avrRpm1をシロイヌナズナに感染し、約80分後に抵抗性を示す際に一過的にカルシウム上昇を示す事を可視化した。ここまでで、当初の目的であった、1)発光をもちいた機能性指示薬開発、2)個体レベルでの機能イメージングまでを達成することができた。詳細な解析として、BRACのKineticsをストップドフロー装置を用いて解析した。また、同様にカルシウムを感受する発光性タンパク質であるAequorinとの比較をHela細胞に発現させて行った。これらの結果をまとめて、PloS ONEに投稿し受理された。最終的な目標である、生物発光-蛍光2重エネルギー移動についても現在、研究を進めている。これまでに生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を利用したカルシウム指示薬(BRAC)を開発を行なってきた。また、シロイヌナズナに遺伝子改変を行い、安定的にBRACを発現させ、植物の病気を起こす遺伝子(Pst DC3000)を持つ菌体Pst DC3000/avrRpm1をシロイヌナズナに感染し、約80分後に抵抗性を示す際に一過的にカルシウム上昇を示す事を可視化した。当該年度はこれらの結果をまとめてPloS ONE誌に投稿し受理された。また、最終的な目標である、生物発光-蛍光2重エネルギー移動についての研究を行った。Venusと橙色・赤色系蛍光タンパク質との相性の良いFRETペアを探索し、いくつか該当する蛍光タンパク質を見つけたものの、FRET効率は非常に低く、満足の行く結果が得られなかった。
ウイルス感染における皮膚マスト細胞の役割の解明

我々はマウス胎児皮膚由来マスト細胞(FSMC)を用いて,HSVがFSMCに感染するかを検討した。HSV2(186株)をMOI 100でFSMCに接触させ24時間後に,蛍光抗体法により26%のFSMCにHSV感染を認めた。HSV感染におけるマスト細胞の役割さらに,HSV感染により,FSMCのTNF-α,IL-6,MIP-1α,MIP-2の産生が抑制され,LPS刺激を加えることにより,さらに顕著に抑制された。一方,熱処理したHSVでは,これらの産生に影響を及ぼさなかった。Annexin V bindingassayとTUNEL assayを用いた検討では,HSVはMOI依存性にFSMCのアポトーシスを誘導した。一方で熱処理したHSVでは,アポトーシスは誘導されなかった。さらに,ウイルスの複製を阻害するphosphonoacetic acid(PAA)で処理するとアポトーシスが阻害され,HSVによるFSMCのアポトーシスにウイルスの複製が関与していることが示唆された。以上より,HSV感染によりFSMCのアポトーシスが誘導され,サイトカインやケモカインの産生が抑制されることがわかった。マスト細胞は,局所の炎症反応を減弱させ,ウイルスに対する獲得免疫の誘導を抑制し,感染を遷延化させている可能性がある。マスト細胞に対するオステオポンチン(OPN)の役割また我々はFSMCにおいて,OPNの発現が認められることを発見した。また,OPNによりFSMCの遊走を促進し,IgEを介する脱顆粒を増強することを明らかにした。またin vivoにおいても,OPNノックアウトマウスではIgEを介する脱顆粒が抑制されていることが分かった。このことは生体内の皮膚マスト細胞においても,OPNがアレルギー反応や自然免疫を促進させている可能性を示唆している。
正常妊婦と妊娠中毒症妊婦における胎盤および母体血でのサイトカインと接着分子の濃度

M-CSFの胎盤組織内および血中での濃度を測定し,妊娠中毒症の病態生理を検討した。総蛋白(TP)濃度で較正した胎盤組織中M-CSF/TPは正常妊娠群96.3±21.6(U/mg Protein, M±SD) (n=19),中毒症群115.6±29.0(n=18)であり,血中M-CSFは正常群1289±464(U/ml),中毒症群1720±502であった。胎盤・血液中ともに妊娠中毒症妊婦の方が有意に局い濃度を示したことから,M-CSFが妊娠中毒症の病態へ関与していることが示唆された.また末梢血のM-CSF濃度を測定することにより,子宮内胎児発育不全(IUGR)の病態生理を検討した。M-CSF濃度はIUGR群1322(U/ml, Median) (n=20),正常群1118(n=27)であり,IUGR群の方が有意に高値であった。したがってIUGR妊娠(低体重新生児)の分娩にM-CSFの関与が想定された。帝王切開術を施行した正常妊婦15人と妊娠中毒症妊婦12人から手術前,術後1日,10日の3回にわたって末梢血を採取し,M-CSF濃度を測定した。両群ともM-CSF濃度は術後1日に有意に上昇し,術後10日には有意に低下した。このM-CSF濃度の上昇の程度が両群間で差を認めなかったため,その上昇機序は両群間で同様であると考えられた。この他,正常非妊婦,正常妊婦および妊娠中毒症妊婦から採尿し,6種の尿中パラメーターを測定して比較することにより,正常妊娠での腎臓の生理と妊娠中毒症での腎臓の病態生理を解明した。また正常非妊婦および正常妊娠20,30,36週の妊婦から採血および採尿をして,流血中の止血機転に関与する6種のパラメーターを測定し,妊娠経過によって発現する特有な変化を解明した。妊娠20週と30週の正常妊婦のそれぞれ36人,53人から末梢血を採取し,血清を-40°Cにて凍結保存した。解凍後ELISAにてM-CSF濃度を測定した。対象を分娩まで追跡し,妊娠中毒症を発現した群(中毒症群,20週13人,30週14人)と正常妊娠を維持した群(正常群,20週23人,30週39人)の2群に分けた。妊娠20週と30週の妊婦のそれぞれについて年齢と妊娠週数は両群間に有意差を認めなかった。M-CSF濃度は妊娠20週で中毒症群1401±420(U/ml,M±SD),正常群897±162であり,妊娠30週で中毒症群1391±325,正常群1043±190であった。妊娠20週でも30週でも中毒症群の方が正常群に比して有意(p<0.001)に高値であった。したがって妊娠中毒症の症状が発現する以前の妊娠20週および30週の時点で,妊婦の体内で将来妊娠中毒症を発症する変化が進行していることが確認された。この結果を英語論文にまとめ,現在投稿中である。

年齢と妊娠週数に有意差のない妊娠38週の正常妊婦19人と中毒症妊婦18人を対象として,その分娩直後に胎盤組織を切離し急速凍結した。凍結胎盤約1gを溶解液10mlに添加後均質化した。その溶液2mlを遠沈後,上清を凍結保存した。解凍後M-CSF,IL-2,総蛋白(TP)濃度を測定し,総蛋白濃度で較正した胎盤中cytokine濃度を算定した。M-CSF/TPは正常群が96.3±21.6(U/mg protein),中毒症群は115.6±29.0で中毒症群の方が正常群に比して有意(p<0.05)に高濃度であった。この結果を英語論文にまとめ,現在投稿中である。IL-2/TPは正常群が4624±2328(pg/g protein),中毒症群は3269±1669で正常群の方が中毒症に比して有意(p<0.05)に高濃度であった。この結果をもとにして現在英語論文を執筆中であるM-CSFの胎盤組織内および血中での濃度を測定し,妊娠中毒症の病態生理を検討した。総蛋白(TP)濃度で較正した胎盤組織中M-CSF/TPは正常妊娠群96.3±21.6(U/mg protein, M±SD),中毒症群115.6±29.0であり,血中M-CSFは正常群1289±464(U/ml)(n=19),中毒症群1720±502(n=18)であった。胎盤・血液中ともに妊娠中毒症妊婦の方が有意に高い濃度を示したことから,M-CSFが妊娠中毒症の病態へ関与していることが示唆された。また末梢血のM-CSF濃度を測定することにより,子宮内胎児発育不全(IUGR)の病態生理を検討した。M-CSF濃度はIUGR群1322(U/ml, Median)(n=20),正常群1118(n=27)であり,IUGR群の方が有意に高値であった。したがってIUGR妊娠(低体重新生児)の分娩にM-CSFの関与が想定された。帝王切開術を施行した正常妊婦15人と妊娠中毒症妊婦12人から手術前,術後1日,10日の3回にわたって末梢血を採取し,M-CSF濃度を測定した。両群ともM-CSF濃度は術後1日に有意に上昇し,術後10日には有意に低下した。このM-CSF濃度の上昇の程度が両群間で差を認めなかったため,その上昇機序は両群間で同様であると考えられた。この他,正常非妊婦,正常妊婦および妊娠中毒症妊婦から採尿し,6種の尿中パラメーターを測定して比較することにより,正常妊娠での腎臓の生理と妊娠中毒症での腎臓の病態生理を解明した。また正常非妊婦および正常妊娠20, 30, 36週の妊婦から採血および採尿をして,流血中の止血機転に関与する6種のパラメーターを測定し,妊娠経過によって発現する特有な変化を解明した。
持続的な後退運動の神経基盤

後退運動の制御および前進・後退の切り替え機構には未知の点が多い。本研究では後退運動制御機構の解明を目指して、線虫C. elegansにおいてチャネルロドプシンによる特定の神経細胞群の活性化が持続的な後退運動を誘発することを手掛かりに、この運動に関わる細胞の同定を試みた。1チャネルロドプシン発現細胞種と持続的後退との相関を解析し、AVA、AVD、RIMに加えてSMDあるいはRMDを持続的後退に必要な細胞の候補として絞り込んだ。2チラミンには持続的後退を抑制する効果があり、その作用の一部は塩化物チャネルLGC-55を介すことを見出した。前進・後退は動物の基本的な移動運動であり、その切り替えを司る神経機構の解明は神経科学の重要なテーマである。本研究では線虫C. elegansの後退運動の中で、持続的な後退運動現象に着目する。光遺伝学的手法を用いて特定の神経細胞群を人工的活性化することで持続的な後退運動が誘発されることを手掛かりとして、この現象に関わる神経細胞の絞り込み・同定を行う。glr-1遺伝子発現神経細胞群活性化により多くの個体が持続的後退を行った。また、nmr-1発現細胞群(AVA, AVD, AVE, AVG, DVA, PVC, RIM)の活性化でも実験を繰り返した結果、低頻度ながら長期間の持続的後退が誘発されることがあることを見出した。さらにnmr-1発現のモザイク性による個体間の差異と、後退運動との関連を検討した。その結果、RIMを含む複数の神経細胞でのChR2発現と持続的後退に相関があるが分かった。しかし、glr-1, nmr-1いずれのプロモーターでも特定の1種の神経細胞が持続的後退のカギをなるという可能性は否定された。また、nmr-1発現細胞群活性化による持続的後退が、チラミン産生欠損変異の背景で顕著に促進されることを見出した。当初予定した方針では特定の神経細胞を突き詰めることは難しいことがわかった。ただ、チラミン産生欠損変異での持続的後退促進という予想外の現象が見つかった。線虫C. elegansにおいてglr-1遺伝子発現神経細胞群をチャネルロドプシン(ChR2::yfp)を用いて光遺伝学的に人工的に活性化すると持続的後退運動が誘発されることが知られ、後退運動制御機構の点から興味深い。本研究ではこの現象に関わる神経細胞の同定を目指す。nmr-1遺伝子発現神経細胞群の活性化では強い持続的後退が誘発されないことから、glr-1(+)nmr-1(-)細胞群に含まれる12種類の神経細胞(AIB, AVB, AVJ, DVC, PVQ, RIA, RIG, RIS, RMD, RME, SMD, URY)の中から持続的後退に関わる神経細胞の候補を絞る予定である。昨年度からYFP発現を目安として、glr-1p::ChR2::yfpの発現細胞の同定を試みてきた。ところが、私たちの観察ではこの系統でnmr-1::mRFPと同じ細胞でしかYFPシグナルが検出できなかった。このためglr-1p::ChR2::yfp系統とnmr-1p::ChR2::yfp系統とで後退運動の違いが生じたのは、前者が後者より強い遺伝子発現を引き起こすことが原因ではないかと考え、発現細胞ごとの発現強度について検討した。しかし行動解析の結果と発現強度に明確な相関がみられなかった。今年度になって細胞標識法に問題があるのではないかと考え、詳細にYFP発現を観察した結果、細胞質全体でなく細胞内の一部でのみにYFPが存在することが多く、発現細胞が正確に標識できないことが明らかになってきた。このためglr-1p::GFPを細胞質全体にマーカーを発現する系統を新たに作成し直し、この系統を用いて実験を行った。この結果、nmr-1::mRFP以外の細胞でGFPが検出され、AIB,SMD, RMDを候補として今後さらに解析することになった。上述のように、これまでの細胞標識法に問題があったため発現細胞が正確に標識できないことが明らかになった。そこで新たな標識をほどこした系統を作成しなおし、実験をやり直すこととなった。このため1年間の期間延長を申請した。多くの動物において移動運動の大半は前進であり、後退は頻度が低い。前進・後退の切り替え、後退運動の調節には、種を超えて保存された機構が存在する可能性があると考え、本研究を着想した。本研究では線虫C. elegansが特殊な状況下で長期的かつ持続的な後退を行うことを手掛かりに、この持続的後退運動を制御する神経機構解明を目指した。具体的には、1glr-1遺伝子発現神経細胞群のチャネルロドプシンによる人工的活性化が持続的後退運動を誘発することに注目し、形質転換個体でのチャネルロドプシン発現のモザイク性を利用して、glr-1発現かつnmr-1非発現の11種の非コマンド介在神経細胞に対して、持続的後退と発現細胞の相関を解析した。2培地への高濃度チラミン添加が持続的な後退運動を引き起こすという先行研究の結果から、神経細胞活性化による持続的後退運動への内因性チラミンの関与を考え、チラミン合成能を欠損したtdc-

1変異体、および3種類のチラミン受容体遺伝子変異体に対して、上記の光遺伝学的活性化実験を行った。その結果、1glr-1遺伝子発現細胞群の光遺伝学的活性化によって引き起こされる長期的・持続的後退に必要な神経細胞としてAVA、AVD、RIMに加えてSMDまたはRMDが候補として絞られた。最終年度は、単一神経細胞でのチャネルロドプシン発現実験を試みたが、適当な形質転換系統が樹立できず、持続的後退に必要・十分な神経細胞の特定には至らなかった。2従来の報告から後退促進効果を持つと予想されたチラミンには、glr-1遺伝子発現細胞群活性化による持続的後退を抑制する効果があり、その作用の一部はアミン作動性塩化物チャネルLGC-55を介すことが明らかになった。興味深いことにLGC-55発現細胞には上述のSMD、RMDが含まれており、今後SMD、RMD各細胞の解析が必要であると考えている。後退運動の制御および前進・後退の切り替え機構には未知の点が多い。本研究では後退運動制御機構の解明を目指して、線虫C. elegansにおいてチャネルロドプシンによる特定の神経細胞群の活性化が持続的な後退運動を誘発することを手掛かりに、この運動に関わる細胞の同定を試みた。1チャネルロドプシン発現細胞種と持続的後退との相関を解析し、AVA、AVD、RIMに加えてSMDあるいはRMDを持続的後退に必要な細胞の候補として絞り込んだ。2チラミンには持続的後退を抑制する効果があり、その作用の一部は塩化物チャネルLGC-55を介すことを見出した。チラミンとチラミン産生細胞の役割を中心に研究を進めたい。発生生物学・神経科学nmr-1プロモーターを用いた実験で予想外の結果がでた。このため、当初予定していた各種神経細胞特異的なプロモーターの作成の内容ををもう一度見直す必要が生じ、一部のプロモーターは作成に着手しなかった。これまでの細胞標識法に問題があり、発現細胞が正確に標識できないことが明らかになった。そこで新たな標識をほどこした系統を作成しなおし、実験をやり直すこととなった。このため1年、研究期間を延長する。当初、作成予定プロモーター種のリストを一部変更し、新たなリスト基づいてプロモーターを作成する。物品費(消耗品)700,000円
哺乳動物における新規薬物排出輸送体MATEの構造と機能及び相互作用

肝臓及び腎臓における薬物排出を司るtransepithelial輸送に関与するトランスポーター分子は数種類存在している。これらのトランスポーター分子群は協奏的に機能して薬物排出機能を発揮していると考えられている。このことから、腎臓の糸球体における薬物の排出は厳密に制御された機構により調節されていると予想される。すなわちMATEが何らかの活性調節を受けている可能性が示唆された。また、MATEのC末端付近には比較的長大な可溶性の部分が存在している。この仮定に基づきMATEの親水性領域等に相互作用する制御分子を探索した。その結果数種の機能性タンパク質が同定出来た。申請者は現在までにMATEのプロトタイプのVibrioParahaemolyticus由来のNorMに関して機能性アミノ酸残基を同定している(J Bacteriol,2005)。NorMの薬物輸送に関与する機能性アミノ酸残基は、膜貫通領域に存在している酸性アミノ酸残基であった。バクテリア由来のMATEトランスポーターのNorMは、ヒトMATE1とタンパク質レベルで23.6%の相同性しかないが、これらの酸性アミノ酸残基のうちの2つはヒト及びマウスのMATE1及びMATE2で保存されていた。以上のことから、哺乳類のMATEにおいてもこれらの酸性アミノ酸残基を含む極性アミノ酸残基が、MATEの基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構に直接関係していることが予想される。これらの予想を基にMATE1の点変異体を複数作製した。(MATEの極性残基部分:E278A,E319A,H386A,E389A等)。そして、TEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込み活性に与える影響をRIトレーサー実験により調べた。この結果より機能性アミノ酸残基を決定した。また、MATE1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を解明した。ヒトMATE1の膜貫通領域にある極性アミノ酸のうち、E273Qの点変異体を作成しHEK293細胞に発現させたところ、TEAの輸送活性は完全に消失した(PNAS2005,)。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームへの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いた。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を構築した。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用した。そして輸送測定で基質とH+の化学平衡を測定した。生体内に存在する様々な有機化合物は高度に発達した器官である腎臓や肝臓により体外に排出される。この排出を担うのは種々の有機化合物トランスポーターである。ここ10年で、これらのトランスポーターの大部分の分子実体は同定されてきた。しかし,排泄の最終段階を担うOC (organic cation)/H+交換輸送系に関しては20年程前からその存在は知られていたが、いまだにその実体は解明されていなかった。最近申請者はこのトランスポーターのヒト及びマウスにおける分子実体を明らかにすることに成功した(PNAS,2005,)。そのトランスポーターはバクテリアでは多剤耐性に寄与しているMATE (multidrug and toxin extrusion)ファミリーの輸送体のorthologueであり、このトランスポーターをMATE1と名付けた。申請者の研究目的はMATE1トランスポーターの機能と構造の決定及びその輸送メカニズムの解明である。また、MATE1と相互作用し、その輸送活性を調節するような機能タンパク質を探索した。その結果、NATE1と相互作用する2種類のタンパク質を発見した。現在その機能について詳細に解析中である。腎臓や肝臓の細胞膜上に発現するトランスポーター群は、その多様な分子認識・輸送機構と発現分布によって代謝物や薬物の排泄過程に対して重要な役割を担っている。この排出は上皮細胞のbasolateral側とapical側の2つの細胞膜を介したtransepithelial輸送であり、複数のトランスポーターが関与している。血液中の有機カチオン性代謝老廃物はOCT(organic cation transporter)によりbasolateral側から取り込まれ、比較的高分子の化合物はapical側に存在するMDR(mutidrug resisitance factor)によって排泄されている.しかし、低分子の有機カチオンはH+との交換翰送で排泄されることは知られていたが、いまだにその実体は解明されていなかった).細菌のMATE(multidrug and toxinextrusion)はもっとも最近になって同定された多剤排出トランスポーターであり、動物・植物にも疑似の蛋白質が存在していることがデータベース解析により示唆されていた.しかしその機能は全く分かっていなかった.私は、MATEファミリーの輸送体の哺乳類におけるorthologueがOCの最終段階の排出を担っていると推定した.

私は、このヒト及びマウスのMATE orthologue2種をそれぞれ同定し、MATE1及び、MATE2と名付けた.そしてそれらが肝臓及び腎臓において排泄の最終段階を担うOC/H+トランスポーターの分子実体そのものであることを証明した(Otsuka M.et.al.:Ahumantransporter protein that mediates the final excretionstep for toxic organic cation Proc.Natl.Acad,sci.USA.2005.).私が明らかにしたMATEタンパク分子群は、肝臓・腎臓以外にも性ホルモン等の分泌臓器に発現しており、生体内において多様で重要な役割を果たしていると考えられる.MATEトランスポーターの機能についての研究は生体内における有機薬物輸送・排泄の全貌解明のみならず、脂溶性ホルモン分泌機構なども含めた有機物の輪送メカニズムの全貌解明に直結していると思われる.本研究において私は、1.MATE1及びMATE2の構造と機能の決定及びその輪送メカニズムを解明した.これまでのデータベース解析により、哺乳類におけるMATE orthologueはMATE1, 2以外にさらにもう1種類存在していることが示唆されている.申請者は既にその遺伝子断片をヒト組織より単離している。そこで、2.第3のMATE orthologueとなるMATE3のcDNA全長クローニングを行い、機能を解析した。また、肝臓及び腎臓における薬物排出を司るtransepithelial輪送に関与するトランスポーター分子は数種類存在しているので、これらのトランスポーター分子群は協奏的に機能して薬物排出機能を発揮していると考えられる。このことから、腎臓の糸球体における薬物の排出は厳密に制御された機構により調節されていると予想される。すなわちMATEが何らかの活性調節を受けている可能性が示唆される。また、MATEのC末端付近には比較的長大な可溶性の部分が存在している。この仮定に基づき3.MATEの親水性領域等に相互作用する制御分子を探索した。その結果数種の相互作用するタンパク質を発見した(論文投稿中)。
内因性光学的計測法を用いた脳神経手術支援技術の創出

脳腫瘍などの摘出脳外科手術において、術中に患部と正常組織の境目を把握する必要がある。本提案は、脳組織そのものの内因的光学特性を利用して開発された皮質機能マッピング技術を術中の患部組織の特定と周辺正常組織機能のモニタリングに応用することを目的としている。その目的を達成するために、まずは計測システムの構築を行った。我々は、これまでに内因性光計測法を用いて、実験動物を対象とした調査を行ってきた。脳外科手術に用いるために、手術室に適した計測システム構築は、最初に解決しないといけない問題の一つである。本研究では、使用するパソコンやカメラを更新したシステムを構築した。計測と刺激の呈示にそれぞれ1台のパソコンを用いた。また、計測にはディジタルCCDカメラを使用することにした。光源はLEDタイプの照明を用いた。刺激の呈示には、OpenGLを用いたパソコン単体での波形の呈示を行い、クロスケーブルを用いたTCP/IP通信を用いて計測との同期を行った。また、研究計画に基づいて、患部境界の画定法について研究を行った。研究室従来開発した内因性光学的信号の抽出法は主に実験動物を対象としたものであり、それに比べ人を対象とした脳外科手術の計測対象面積が遥かに広い。呼吸などによる脳組織表面の動きに生じる位置のずれが結果に大きい影響を及ぼす。初年度に、まずは内因性光計測法で得られた画像に対し構築した自動補正システムを構築した。まず計測開始時の画像から4点の座標を取得し、得られた4点の座標を全計測画像で追跡した。その後追跡した特徴点座標を用いて計測画像を補正した。補正は拡大縮小、回転、せん断、平行移動に加え、台形状の変換を用いて行い、特徴追跡は、計測画像の隣り合うフレームの間でオプティカルフローを計算し、指定した画素の移動を推定した。実験を立ち会うために、実験参加者の予防接種が求められている。半年を空けて数回の接種が必要な項目もあり、やや遅れている。特に実験計画の大きい変更が必要ない。遅れを取り戻すように進める。実験参加に必要な予防接種に時間が取られ、計画よりやや遅れているため、システムの構築が遅れている。効率的に進むため、計測システムが確定してから最終システムの計測機を構築することになったため、当初計画より一部の機器の購入が遅れた。次年度使用に生じた額はシステム構築に使用する光源装置、カメラ及び消耗品の購入に使用する予定である。
衛星追跡で解明する生得的なさえずりを持つ鳥類アカショウビンの生態的種分化

鳥類には、地理的障壁による物理的な隔離だけで種分化したとは考えられないほど多くの近縁種や亜種の分布域が隣接する。あるものは側所的種分化によると推察される。これは局所適応による移動分散制限の結果と推察されるが、局所適応の様相は実証されていない。本研究は、さえずりを生得的な特性とする種では、その音響特性が環境騒音に対する局所適応であり、それが移動分散を制限することを示す。移動能力に長けた鳥の移動分散が制限される生態的種分化の一例である。鳥類の音響研究は主にさえずりを後天的に獲得する鳴禽類が研究対象にされてきた。後天的なさえずりの獲得は分散を制限せず、音響特性の局所適応は移動分散を制約しない。本研究のようなアイディアは生まれ得なかった。アカショウビンの鳴き声を録音し、最高周波数を比較した。低緯度地域ほど鳥の声の周波数が低い音域に制限されるという傾向に一致した。鳴き声の録音を行った島の集団間で、鳴き声音声の再生実験を行った。同じ島の声に強く反応し、他の島の声への反応が弱い傾向があった。鳴き声周波数が異なる島の集団の声への反応が弱いことから、さえずり周波数の違いが生殖隔離の原因になっている可能性が示唆された。各島に録音機材を設置し、環境騒音の録音を行い、鳴き声周波数の上限である2327Hzでの環境騒音の大きさを比較した。現在のところ環境騒音の島による違い検出されていない。本種は渡り性であり、繁殖地への定着過程を解明することは鳴き声の局所環境適応を考える上で重要である。そこで成鳥つがいにGPSデータロガーを装着し、越冬地と繁殖地への帰還の際にどのような場所を通過するかの解明を試みた。宮古島で繁殖する個体はフィリピンの小島嶼で越冬していた。アカショウビンでは、南西諸島の狭い範囲でも局所適応と配偶者選択による同所生まれ同類交配により、個体群が隔離される様相の実証に近づきつつある。野外での調査実験は順調に進んでいるが、遺伝解析の進捗が遅れている。集団間に遺伝的な違いの度合いを明らかにするために、マイクロサテライトマーカーを用いて遺伝解析を行なっている。多型の多いマイクロサテライトマーカーが現在のところ見つからないの遅延の原因である。まずはGhaniya et.al (2016)、Adcock et.al (2006)、Bardeleben and Gray (2005)などを元に、ショウビン属に比較的近縁のハチクイ科、カワセミ科で開発されたマーカーを用いて解析を行ってきた。しかし、まだ解析可能な数のマーカーを得られていない。今後は他の鳥類で開発され、比較的汎用性が高いと考えられているマーカーも数多く試用し解析を行う。宮古島・伊平屋島・奄美大島における野外調査および3つの野外実験異なる声への反応強度の違い:鳴き声の録音を行ったそれぞれの集団間で、鳴き声の違いによって生殖隔離が起きているかどうかを調べるために鳴き声音声の再生実験を行う。再生した音声への鳴き返しの頻度を調べる。環境騒音の計測:各島に録音機材を設置し、環境騒音の録音を行い、アカショウビンの鳴き声周波数の上限である2327Hzでの環境騒音の大きさを比較する。アカショウビンの繁殖期間中に環境騒音の主役となると考えられるセミの声の状況をモニターする。音の減衰実験:島間の植生などの違いが、アカショウビンの鳴き声周波数への選択圧の違いとなりうるかを調べるために、各島で音の減衰実験を行う。個体識別録音と親子での鳴き声の特徴比較アカショウビンは鳴き声を学習せず、鳴き声の特徴が遺伝的に決まると考えられる分類群の種である。鳴き声の特徴が遺伝的に決まるとすると、鳴き声周波数は、親子間での鳴き声の類似はランダムに比較した場合とくらべ、より近い値になると予想される。宮古島では、2012年からアカショウビンを捕獲し足環を付し個体識別し、さらに採血しDNAから血縁関係の解明も行なっている。そのような長期間の調査での親子関係に加え、2018年には個体識別下での録音を増やし比較する。マイクロサテライト解析集中的に多くのマイクロサテライトマーカーの有効性を試し、集団の遺伝構造解析を進める。鳥類には、地理的障壁による物理的な隔離だけで種分化したとは考えられないほど多くの近縁種や亜種の分布域が隣接することが知られている。これらのあるものは側所的種分化によるものと推察されるものがある。このような例は局所適応が移動分散を制限した結果と推察されるが、局所適応の様相が実証された例はない。本研究は、南西諸島のアカショウビンのさえずりの音響特性が環境騒音に対する局所適応であり、その局所適応が移動分散を制限することを実証することを目的とする。本研究は、局所適応が移動能力に長けた鳥の移動分散を制限することを示す初めての研究であり、生態的種分化の一例を提供するものである。本研究で、最も重要であり独創的である点はアカショウビンを材料にすることである。アカショウビンのさえずりは、学習によって獲得されず、生得的である。これまでの鳥類の音響研究は主にさえずりを後天的に獲得する鳴禽類が研究対象にされた。後天的なさえずりの獲得は分散を制限しない。つまり、これまでの研究は音響特性の局所適応が移動分散を制約しない鳴禽類を対象としたため、本研究のようなアイディアは生まれ得なかった。

多良間島、宮古島、久米島、沖縄島、伊平屋島、奄美大島でアカショウビンの鳴き声を録音し、声紋解析をした結果、鳴き声の特徴には緯度に沿った勾配があった。これは島ごとに植生や他の生物の音などの違うことが音響環境に反映され、鳴き声の特徴が形成されたものと推察された。宮古島における音声再生実験により、鳴き声の違いは個体群毎に認識され、同じ特徴のさえずりにのみ強く反応することがわかった。鳴き声への反応の違いは、同類交配による生殖前隔離の存在を示唆する。鳴き声を学習しないアカショウビンでは、南西諸島の狭い範囲でも生息地による音響環境の違いに適応することで、個体群の隔離がおきている可能性が示された。本研究では、リュウキュウアカショウビンの巣立ちに雛に衛星追跡GPSを装着し、移動分散と配偶者選択の過程を解明する予定であった。しかし使用を予定していたアルゴスシステムを用いた最新超小型追跡用のデバイスが、日本の電波法の基準をクリアーできず使用不可能となった。このためGPSデータロガーを用いることになった。衛星追跡GPSを使用すれば、研究室に居ながらにして測位データが得られたのであるが、GPSデータロガーの場合、再捕獲をしデバイスを取り外した上でコンピュータを用い位置データを得なければならない。そのため再捕獲の可能性が極めて低い雛に、再捕獲が必要なGPSデータロガーを装着することはできない。つまり雛の分散過程の追跡、および配偶者の解明は諦めざるを得なかった。そこで、繁殖個体の土地執着性や配偶者執着性を足輪を用いて確認し、同類交配、異系交配による配偶成功を経年的に比較する現実的な方法を採用することとした。アルゴスシステムを使うデバイスよりも、GPSデータロガーは安価であるため、より多くの個体に装着が可能になる。そのほかの点に関しては順調に進展している。鳥類には、地理的障壁による物理的な隔離だけで種分化したとは考えられないほど多くの近縁種や亜種の分布域が隣接する。あるものは側所的種分化によると推察される。これは局所適応による移動分散制限の結果と推察されるが、局所適応の様相は実証されていない。本研究は、さえずりを生得的な特性とする種では、その音響特性が環境騒音に対する局所適応であり、それが移動分散を制限することを示す。移動能力に長けた鳥の移動分散が制限される生態的種分化の一例である。鳥類の音響研究は主にさえずりを後天的に獲得する鳴禽類が研究対象にされてきた。後天的なさえずりの獲得は分散を制限せず、音響特性の局所適応は移動分散を制約しない。本研究のようなアイディアは生まれ得なかった。アカショウビンの鳴き声を録音し、最高周波数を比較した。低緯度地域ほど鳥の声の周波数が低い音域に制限されるという傾向に一致した。鳴き声の録音を行った島の集団間で、鳴き声音声の再生実験を行った。同じ島の声に強く反応し、他の島の声への反応が弱い傾向があった。鳴き声周波数が異なる島の集団の声への反応が弱いことから、さえずり周波数の違いが生殖隔離の原因になっている可能性が示唆された。各島に録音機材を設置し、環境騒音の録音を行い、鳴き声周波数の上限である2327Hzでの環境騒音の大きさを比較した。現在のところ環境騒音の島による違い検出されていない。
日本語文処理の脳内メカニズム

1980年代には、日本語の「かき混ぜ文」が英語に見られる疑問詞の文頭への移動(WH移動)や話題化などのように、名詞句が意味役割上の解釈を受ける位置と異なる位置で発音される現象と同様に移動の一種であるかどうかが理論上の争点となった。1980年代末までには、理論言語学的には「かき混ぜ」もWH移動などと同様に統語的な「移動」の一種であるという結論が得られた(Saito 1985など)。1990年代に入って失語症の研究から「かき混ぜ」が移動の一種であるとする分析を支持する証拠が見つかった。このように、「かき混ぜ」が移動の一種であるとする分析は、理論言語学と神経言語学(失語症研究)双方の観点から支持されている。これらのことから、「かき混ぜ」がWH移動など他の移動と同様の脳内処理基盤を持つであろうことが推測される。この推測の妥当性を検証するために、Kim et.al. (2009)は、日本語母語話者を対象に脳機能画像法(fMRI)による日本語他動詞文の文理解(処理)時の脳活動を計測した。その結果、「基本語順文」と「かき混ぜ文」の文理解時に、左脳の下前頭回(ブローカ野)やウェルニッケ野など主に言語処理に固有に関与する言語中枢領域に賦活が観察され、このことから2つの語順の理解(処理)時に関わる認知処理はかなりの程度共通していることが示唆された。また、「かき混ぜ文」の文理解時に有意に働く賦活領域を特定するために行った「基本語順文」との直接比較では、左脳の下前頭回(BA44/45)に脳活動の上昇が観察された。この結果は、移動操作による統語構造の複雑さと下前頭回を含むブローカ野活動の上昇は、英語やドイツ語などの個別言語特有のものではなく、移動の統語現象を持つ言語において普遍的なものであることを示唆するものである。この推測の妥当性を検証するために、Kim et al.(2009)は、日本語母語話者を対象に脳機能画像法(fMRI)による日本語他動詞文の文理解(処理)時の脳活動を計測した。
ヒト間葉系幹細胞の心筋誘導因子の同定と誘導効率の改善―新しい免疫細胞の関与－

我々はこれまで、羊膜由来間葉系細胞が高い免疫寛容能及び心筋分化能を持つことを示してきた。本研究では、ヒト脂肪組織及び骨髄由来間葉系細胞と羊膜由来細胞の遺伝子発現解析を行い、それを比較して羊膜由来細胞の特性を示す遺伝子の抽出を試みた。羊膜由来細胞は、主として上皮系細胞と間葉系細胞のヘテロな集団であり、それらを分離した上で検討を行った。その結果、羊膜由来細胞特異的に発現の高い複数の遺伝子を見出した。何れの遺伝子も心筋分化に直接的な関与しているものではなく、免疫系及び炎症の調節に関係する遺伝子が含まれていた。この結果は、羊膜由来細胞は免疫寛容能が高いとの我々のこれまでの報告を支持するものであった。検討細胞として用いるヒト羊膜由来間葉系細胞の心筋誘導因子を同定するため、羊膜組織を構成している細胞を上皮系と間葉系の細胞に分離して採取する条件を検討した。採取した細胞を上皮特異的に発現しているCD326タンパク(EpCAM)抗体を用いたFACSにより評価した結果、90%以上の精度で上皮細胞と間葉系細胞を分離することができた。これまでの独自に開発したin vitro心筋誘導アッセイシステムを用いた実験において、マウス胎児初代心筋培養細胞との共培養48時間前に、羊膜由来間葉系細胞に免疫学的寛容に重要な働きをしていると考えられているIL10を加えることで、心筋誘導率を著しく改善できることを明らかにしている。そこで、上皮系と間葉系に分離した羊膜由来培養細胞それぞれをIL10を添加した群、しない群で培養し、48時間後に回収した後抽出したRNAのMicroArray解析を行った。クラスター解析により、IL10を添加した間葉系細胞群特異的に発現が上昇している3遺伝子、IL10を添加した上皮系細胞群特異的に発現が下降している2遺伝子を同定した。共培養の時間的・空間的・物理的条件とともに、これらの遺伝子が心筋誘導因子であるかを共培養の条件に反映し、リアルタイムPCR及び免疫染色にて検討中である。羊膜由来細胞の心筋誘導易化条件を検討すると同時に、IL10を主軸にし、心筋誘導と免疫寛容の関係についても調査中である。我々は羊膜由来間葉系幹細胞における心筋再生医療への応用を目指した基盤的な研究を進めている。その中で羊膜組織を構成する上皮系と間葉系の細胞の特性を明らかにすることを考えた。昨年度に引き続き、酵素処理にて単離し、上皮系と間葉系の細胞に分離したヒト羊膜由来細胞の特性及び心筋分化能を評価した。分離した上皮系および間葉系細胞に対して、羊膜細胞の高い免疫寛容能や心筋分化能に関与するとして報告した免疫抑制サイトカインであるインターロイキン-10 (IL-10)刺激し、その後の細胞動態を明らかにするため遺伝子発現解析を行った。その結果、上皮系と間葉系でそれぞれ特徴をもった発現パターンを有していることがわかった。これらの中では、組織内での相互作用が想定される発現パターンも認められており、現在より詳細な解析作業を進行中である。移植ツールからのアプローチと同時に、心筋誘導刺激のFeederとして用いているマウス培養心筋細胞の細胞成分をMACS法で分離し、心筋誘導に関わる細胞の探索を試みた。これまでの様々な組織由来の間葉系幹細胞における心筋誘導実験から誘導は、Feederの細胞成分条件と拍動力の両方が揃わないと実現されない。しかしながら抗体反応で低温下におく必要があるMACS法によるFeeder細胞成分の分離を行うと従来法と比べ分化誘導効果が劣る為、細胞成分の差異に伴う心筋誘導率の判定基準に見直しを検討中である。同時に共培養アッセイシステムを用いて、アレイ解析と同条件で処理をした細胞の心筋誘導実験も進行中である。帝王切開時に得られたヒト羊膜組織より酵素処理にて細胞を単離した。単離直後の細胞をCD326(Epithelial cell adhesion Molecule)抗体で標識し、上皮系の細胞分画(Positive)と間葉系の細胞分画(Negative)に分類し、これまでに心筋分化が確認されている、ヒト脂肪及び骨髄由来の間葉系細胞(Mesenchymal Stem Cells: MSCs)と、遺伝子発現レベルをアレイ解析にて比較した。羊膜由来細胞で特異的に発現が高かった遺伝子は、上皮系細胞で2種類、間葉系細胞で4種類存在したが、何れの遺伝子も心筋分化に直接的な関与が報告されていない遺伝子であった。間葉系の細胞で発現が高かった遺伝子は、免疫系及び炎症の調節に関係する遺伝子であり、この結果は、羊膜由来のMSCsが同じMSCsの中でも、HLA-ABC, HLA-D, HLA-DR陰性であり、MHCを介したT細胞系の免疫反応に最も抵抗性があるとした我々の報告を支持していた。続いて、心筋誘導因子同定のため、継代1世代目の培養羊膜細胞に、免疫抑制サイトカインのインターロイキン-10(IL-10),既に心筋分化を誘導するとの報告がある下垂体後葉ホルモンのオキシトシンそして発生時に重要で、成体においては免疫、炎症あるいは細胞の増殖や分化に関係しているとされている低分子量タンパク質のミッドカインを10ng/mlでそれぞれ48時間添加した群と何も添加しない群(FACS後に直ちにRNAを抽出した非培養群と添加した群と同様に培養した群の2群)に分け、それぞれの遺伝子発現レベルをアレイ解析にて比較した。

クラスター解析から遺伝子の発現パターンは、検体の個体間よりも、上皮と間葉間の差が大きくまた、添加した試薬によっても発現パターンは異なった。我々はこれまで、羊膜由来間葉系細胞が高い免疫寛容能及び心筋分化能を持つことを示してきた。本研究では、ヒト脂肪組織及び骨髄由来間葉系細胞と羊膜由来細胞の遺伝子発現解析を行い、それを比較して羊膜由来細胞の特性を示す遺伝子の抽出を試みた。羊膜由来細胞は、主として上皮系細胞と間葉系細胞のヘテロな集団であり、それらを分離した上で検討を行った。その結果、羊膜由来細胞特異的に発現の高い複数の遺伝子を見出した。何れの遺伝子も心筋分化に直接的な関与しているものではなく、免疫系及び炎症の調節に関係する遺伝子が含まれていた。この結果は、羊膜由来細胞は免疫寛容能が高いとの我々のこれまでの報告を支持するものであった。研究目的を達成するための研究計画に沿って実験を遂行できているため。幹細胞工学当初の研究計画にのっとり、引き続き心筋誘導刺激因子の同定と心筋誘導に関わる細胞成分の探索の2方向から心筋分化のメカニズムを検証する。来年度に継続される検体採取から評価までの一連の実験系の骨格はほぼ構築できたため。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。MicroArrayから得られるデータは膨大であり、その内容を精査しながら実験系に反映し、ヒト羊膜由来細胞の心筋分化誘導因子もしくは条件の同定を進める次年度の研究費と併せて消耗品購入に充てる予定である。検体数が予定よりも少なかったため、組織からの細胞抽出に関わる費用が減額となった。MicroArrayの膨大なデーターより心筋分化誘導に関連している因子を抽出することを集中的に行い、共培養実験に用いる試薬の購入数が予定より少なかったため。検体数が十分に揃って来たため、共培養実験を推進し、心筋誘導に関係していると思われる因子の同定に必要な試薬の購入に用いる。