hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳がん細胞の抗がん剤耐性化に関与する薬物代謝酵素の役割

本研究では、乳がん治療薬タモキシフェン(TAM)に対して耐性を示す乳がん細胞の発生機構を明らかにし、耐性化克服の端緒とすることを目的とした。乳がん細胞中においてTAMを不活性化する薬物代謝酵素UGT1A4が過剰発現した場合、TAMが代謝により不活性体のグルクロニドとなり薬物トランスポーターMRP-1を介して速やかに細胞外に排泄され細胞内濃度が減少していることが明らかになった。さらにはUGT1A4発現株におけるTAM耐性化はこれまでに報告されている機構とは異なり、薬物代謝酵素の過剰発現もTAM耐性化機構の一つとなりうることが示唆され、耐性化克服の標的となりうると考えられた。本研究計画の第一の目的である、乳癌細胞中におけるUGT1A4の過剰発現によって生じたタモキシフェン(TAM)耐性化の機構を明らかにするため、UGT1A4発現MCF7細胞(MCF-7-UGT1A4)におけるTAM代謝ならびにその動態を検討した。昨年度構築したUGT1A4を発現させたMCF-7-UGT1A4はTAMに対して耐性を示し、野生型に比べて細胞内TAM濃度は低下し、代謝物TAM N+-glucuronideはすみやかに細胞外へ排泄されていた。そこで、本年度はTAN N+-glucuronideの細胞外への排泄に係わるトランスポーターの検索を行った。その結果、MCF-7に発現していることが知られているMRP-1が主に関与していることが示唆された。一方、TAM耐性化したMCF7-1A4は、人為的にUGT1A4を発現させたものであるが、実際にTAM耐性化した乳癌細胞で、その耐性化がUGT1A4発現によるものが存在するかを明らかにする必要がある。そこで本研究計画の第二の目的として、MCF7細胞を死滅しない程度の濃度のTAM存在下で長期間培養し、生じるTAM耐性MCF-7細胞を作成した。現在作成開始より1年半程度が経過し、ほぼ耐性細胞が構築されたと考えられる。すなわち、TAMのN-グルクロン酸抱合反応の促進そして排泄によるTAMの細胞内濃度減少について検討した。その結果、TAM存在下において培養したMCF-7-UGT1A4細胞では、wild type MCF-7細胞と比較し、細胞内TAM濃度は低下していた。そして、同条件下においてTAM代謝物の同定を行ったところ、MCF-7-UGT1A4細胞においてTAM N+-glucuronideが生成していた。また、このTAM N+-glucuronideはすみやかに細胞外へ排泄されていた。さらには細胞中TAM蓄積量の測定を行ったところ、MCF-7-UGT1A4細胞ではwild type MCF-7細胞に比べて、細胞中TAM蓄積量は有意に減少していた。これらのことから、UGT1A4によるTAMのN-グルクロン酸抱合がTAM耐性を発現するメカニズムの一つであることが明らかになった。現在作成開始より10ヶ月程度が経過し、耐性細胞が構築されつつある段階である。当初の研究計画の通りTAM耐性MCF-7細胞株が2株樹立された(TAMR-MCF-7Aおよび-7B)。これらの耐性株についてエストロゲンに対する感受性を維持しているかを検討したところ、いずれもエストロゲン依存性の増殖を示した。そこでTAM耐性MCF7株における各種細胞増殖に関与する遺伝子群について、野生株との発現様式の比較を行った。すなわち、エストロゲン受容体(ERα, ERβ)、タンパク質リン酸化酵素(PKC)、HER-2、プロゲステロン受容体、アポトーシス制御関連遺伝子群(API5, BNIP3)などの発現変動をreal-time PCR法により測定した。一方、UGT1A4発現により耐性化させたMCF-7-UGT1A4株においても同様に各種制御因子の変動を測定し、耐性化の要因について検討した。その結果、MCF-7-UGT1A4細胞では、UGT1A4 mRNAはMCF-7-wild細胞に比較して約150016,900倍増加していた。

次いで、各種耐性化因子の変動をMCF-7-wild細胞と比較すると、MCF-7-UGT1A4細胞においてPRαβおよびPRβが約2.55倍の高発現を示したものの、その他細胞増殖調節因子においては著しい増加は認められなかった。一方、TAMR-MCF-7A及び7Bでは、MCF-7-wild細胞と比較して両細胞においてUGT1A4の著しい発現増加は認められず、PRαβ、PRβの発現においては著しく低下していた。一方、TAMR-MCF-7AではHER-2、PKCδなどの増殖因子が増加しており、細胞増殖能が保たれるようになっていると推定された。これらのことから、UGT1A4発現株におけるTAM耐性化はこれまでに報告されている機構とは異なる機構によるものであることが明らかになった。すなわち、TAM耐性化には、細胞増殖調節因子の変動のみならずUGT1A4のような薬物代謝酵素の過剰発現も乳癌のTAM耐性化機構の一つとなりうることが示唆された。薬物代謝・毒性学第一の目的としたUGT1A4発現MCF-7細胞において、UGT1A4発現によって促進されたN-グルクロン酸抱合反応がTAMの細胞外排泄につながることが明らかになった。第二の目的であるTAM耐性MCF-7細胞の作成は、概ね1年半の培養により耐性細胞がほぼ作成されたと考えられる。第一の目的としたUGT1A4発現MCF-7細胞において、予想されたメカニズムの通りにTAMの細胞内濃度の減少に伴い細胞外TAM N+-glucuronideが上昇しており、UGT1A4によるN-グルクロン酸抱合反応がTAM耐性化機構の一つであることが実証された。TAM耐性MCF-7細胞の作成は、概ね1年以上かかることが報告されており、第二の目的である耐性細胞は順調に作成されつつあると考えられる。当初の研究計画の通り樹立されたと考えられるTAM耐性MCF-7細胞株についてエストロゲンに対する感受性を維持しているかを検討する。さらに、細胞のミクロソームを調製し、TAMに対するN-グルクロン酸抱合活性の測定ならびにウェスタンブロット分析によりUGT1A4の発現を検討する。さらにTAM耐性MCF7株における各種遺伝子群について、野生株との発現様式の比較を行う。すなわち、エストロゲン受容体(ERα, ERβ)、タンパク質リン酸化酵素(PKC)、HER-2、プロゲステロン受容体、アポトーシス制御関連遺伝子群(API5, BNIP3)などの発現変動をreal-time PCR法により測定する。また、UGT1A4発現により耐性化させたMCF-7-UGT1A4株においても同様に各種制御因子の変動を測定し、耐性化の要因について検討する。当初の研究計画の通りTAM耐性MCF7細胞の樹立を継続して行う。耐性細胞株の樹立は過去に報告があり、現状でTAMにより死滅しない細胞が生育しているので、TAM耐性細胞株を得る可能性は高いと考えられる。耐性株が樹立、クローン化された場合には、拡大培養を行い、各クローン株についてTAMの代謝能を検討する。得られたTAM耐性MCF7細胞株の各種遺伝子群について、野生株との発現様式の比較を行う。
オーラルヒストリーの手法によるフィリピン開発主義体制の研究

2007年4月から2010年3月の3年間に及ぶ海外学術調査であり、フィリピンにおいてマルコス政権の独裁体制に参加したテクノクラートへの聴き取り調査と、当時の資料を発掘・データベース化を行った。インタビューは、合計16名を対象に、延べ36回にわたって実施された。インタビューは映像・音声・文書の形で、デジタル化された発掘資料(シックスト・ロハス文書、アーマンド・ファベリア文書)とともにフィリピン大学付属図書館で保管され、しかるべき時期に一般に公開される。初年度に当たる平成19年度は、プロジェクトを実施するための体制づくり、ベースライン調査、そして実際の聴き取りの、主な3つを実施した。(1)体制づくり;フィリピン大学経済学部教授(元国家開発庁長官)パデランガ氏、フィリピン大学第三世界研究所所長テサ・タデム氏の全面的な協力を得て、プロジェクト実施のためのロジスティック体制を構築した。打ち合わせなどの会議は経済学部で行い、2名のR.A.は第三世界研究所でデスクをもらい作業することになった。(2)べースライン調査;2名のR.A.を中心にマルコスの戒厳令体制を中心に既存研究を整理しデータベースをつくり、さらに政治史的なクロノロジーを作成した。(3)インタビュー;初年度は、被調査者の健康状態などを考慮し、優先順位の高いテクノクラートに焦点を絞った。その結果、実際の聴き取りを行ったのは4名である。まず、元財務長官(大臣)首相のセサール・ビラタ氏に5回に亘り、計15時間聴き取りを行った。同氏は比較的率直に質問に答えてくれきわめて協力的である。あと数回聴き取りを行い、同氏についてのものだけでも単著として出版することを現在計画している。その外には、マカパガル期の重要経済閣僚シクスト・ロハス氏に3時間の聞き取りを1回、マルコス期のシンクタンク「フィリピン高等研究所(PCAS)」副所長で、ラモス政権の経済情報長官ホセ・アルモンテ氏には2回、5時間、マルコス期の教育大臣兼フィリピン大学総長、フィリピン開発アカデミー総裁のO.D.コルプス氏に1回3時間、最後にラファエル・サラス元官房長官の側近であったリャグノ氏に1回3時間の聴き取りを行った。その他:フィリピン大学中央図書館との連携;われわれがこれから実施するインタビューについてのすべての記録はまずフィリピン大学図書館に整理された上で所蔵されることが決まり、そのための話し合いがなされた。同図書館はデータベース構築においても全面的に協力することを約束した。第2年度にあたる平成20年度、プロジェクトは軌道に乗り順調に進展した。初年度、テクノクラートの中でも最も著名で現在においても同僚の間に強い影響力をもっているセサール・ビラタ元首相に5回インタビューし、信頼を勝ち得たことにより評判がビラタ氏の同僚でもあった他のテクノクラートに及びインタビュー実施が容易になった。20年度の成果はこうしたインタビューに加えて、マカパガル期の代表的テクノクラートであるシックスト・ロハス氏から、同氏が保有している大統領や他の閣僚との往復書簡、公文書、その他重要文書の寄贈を受け、フィリピン大学中央図書館にJSPSテクノクラシー文書として保管、カタログを作成し、併せて文書そのものをデジタル化する作業を行った。(1)インタビューの対象者セサール・ビラタ元首相兼財務大臣へ(追加分7回)、シックスト・ロハス元国家経済評議会議長(2回)、アーマンド・ファベリア元大統領行政改革委員会委員長(1回)、プラシド・マパ元予算管理大臣(2回)、ハイメ・ラヤ元予算管理大臣(1回)、マニー・アルバ元予算管理大臣・教育大臣(2回)、ビンセント・パテルノ産業貿易大臣(1回)、国家経済評議会議長(1回)、ワシントン・シーシップSGV監査法人名誉会長(3回)(2)シックスト・ロハス氏から寄贈された文書は500箱、1箱に平均20のフォルダーが入っており、1フォルダーには平均50-70頁の文書が含まれている。この文書すべてについてデジタル化を実施し、カタログも作成した。そのすべてがフィリピン大学中央図書館に保存され、近い将来一般に公開される。(3)アーマンド・ファベリ氏は私どものインタビューに応じて半年後に逝去されたが遺族から、同氏が保管していた文書をデジタル化してもよいとの許可を得た。ロハス文書とは異なりオリジナルはご遺族に返却されるがデジタル化されたものはフィリピン大学中央図書館で保存される予定である。(4)ビラタ元首相への聞き取りが完成し、テープ起こしも終了したので、編集作業に入った。平成21年度中にフィリピンで出版する予定である。最終年度の本年は、インタビューのフォローアップだけでなく、トランスクリプトの編集作業、二人のテクノクラートから寄贈を受けた個人文書のデジタル化作業の完成、そして各種データベースの仕上げを行い、成果を関係者に報告するためのシンポジウムをフィリピン大学で開催した。

本年度のインタビュー:Virata元首相(迫加、1回)、元財務大臣Manuel Alba氏(2回)、元中央銀行総裁、予算大臣Jaime Laya氏(2回)、元大統領経済特別顧問Placido Mapa氏、元居住環境相副大臣Conrado "Jolly" Benitez氏、元フィリピン開発アカデミー副総裁Horacio "Boy" Morales Jr.氏、元情報大臣Francisco "Kit" Tatad氏、ジャーナリストAmando Doronila氏(各1回)。編集作業はフィリピン大学ディリマン校社会学科のラウラ・サムソン教授が中心となって行い、被インタビュー者に送付しレビューを受けた。Virata元首相からマルコス大統領夫妻について言及した部分等を削除するか長期間「封印」したいとの申し出があった。他の被インタビュー者から今のところ同様の申し出はない。Sixto Roxas氏から寄贈を受けた個人文書は、フィリピン大学中央図書館主席司書のサリー・アルランテ氏のチームによって全てデジタル化とインデックス作成が終了し、既にフィリピン大学のコンピュータにUploadされており、一般公開(アクセス許可)は近々実施する予定である。これと同時にArmando Fabella氏の遺族から許可の出た膨大な個人文書のデジタル化もアルランテ氏のチームによって完成した。この二つの文書はマカパガル期からラモス期に至るフィリピンの経済政策研究にとって必読資料になるとの評価を既に専門家から受けている。2月に開催したシンポジウムにおける本プロジェクトへの評価は思いがけないほど高く、フィリピン大学政治学科名誉教授のフェリペ・ミランダ教授は「画期的なプロジェクトであり、本来ならフィリピン側のイニシャティブ、資金でなされるべきであった。長らく望みながら実施できなかったがJSPSのプロジェクトはそれを実現してくれた、心から感謝したい」と冒頭発言した。
知能ロボットの視線制御による視覚機能の高度化に関する研究

本研究の成果として(1)人間の視覚機能を規範とし、その顕著な種々な特長をロボットへ導入するため,知能ロボットの視覚機能の高度化を目指し,人間の視線機能を考慮して作業環境の注目領域の濃淡画像および距離画像をセンサフュージョン的処理を行うことにより作業目標を効率よく達成できる認識システムを構成した。(2)プロトタイプとして,2台のCCDカメラ,レーザスキャンニング装置,高速画像処理装置及びUNIXワークステーションによるロボットビジョン装置を構成した。(3)この装置において,ロボットの作業環境を画像入力し,リアルタイム処理によって濃淡画像によるエッジ情報およびレーザスポット光の3次元情報を得ることが可能となった。(4)人間が指示する様々な作業目標に対して,ロボットが持つ数種の認識手法を最適に選択し,組み合わせるトップダウン的認識方式の開発を行った。(5)ロボットがコップの取っ手を掴もうとする状態を想定し、CCDカメラから取り込んだ画像から作業目標を抽出し、その視覚情報を得る実験を試みた。(6)具体的な成果として、(a)対象物体の注目領域を抽出し、作業目標を注目領域に限定することによる処理の効率化を図った。(b)個数計数機能により、複数物体の個数計数ができた。(c)レーザビジョンによる3次元情報取得機能を開発した。(d)センサフュージョン機能を有する画像処理システムの構築を行い、複数センサの情報のセンサフュージョン的な統合を行う基礎実験を行い良好な結果を得た。(7)本研究を基礎として目標とする知能ロボットの視線制御による視覚機能の高度化へ向けて研究を行う予定である。知能ロボットの視線制御による視覚機能の高度化を目指し,人間の視線機能を規範としてレーザ光線で指示された作業環境の注目領域の濃淡画像,距離画像などを高速処理する3次元視覚センサを開発し,作業目標を効率よく達成できるトップダウン的認識システムを構成することを目的とする。注目領域における濃淡画像,距離画像などの高速処理を行ない,これらの多種な視覚センサ情報のセンサフュージョン的に統合処理する方式の研究開発を行う。まず,本研究費で購入した2台のCCDカメラおよび現在保有する画像処理装置を用いてロボットの作業環境を画像入力し,濃淡画像によるエッジ情報とカメラキャリブレーションを行いステレオビジョン方式による距離情報を得ることができた。開発中の3次元視覚センサは,ロボット手先部に搭載され,作業対象物体をつかみにいく際にロボットの指先などが物体に衝突することなく安定把握することができることを目標とする。このため,スポット光を投射するための3個のレーザを使用し,対象物体の3次元位置と姿勢を求めるためレーザ3個を正3角形になるように配置して投射し距離を求める方法を採用する。本システムの特徴は,3個のレーザを一定距離で収束するように設置し,その前後での対象面での3点の位置変動などを物体接近時に利用できることである。本研究で得られた成果を基にして,オブジェクト指向型ロボットプログラミング言語EusLisp上で,来年度購入予定のミラースキャンナでレーザ光を自由に制御し、より高度な視覚センサシステムを有するハンドアイロボットを構成していく予定である。まず,本研究費で購入した2台のCCDカメラおよび保有する画像処理装置を用いてロボットの作業環境を画像入力し、リアルタイム処理によって濃淡画像によるエッジ情報とレーザビジョン方式による距離情報を得ることができた。また、レーザトラッカシステムを本システムに加えることにより視線制御機能が実現できる。これらの多種多様な視覚センサ情報のセンサフュージョン的統合処理方式の研究開発を行い,作業目的によるトップダウン的認識方式の諸機能についての検討を行った。

本研究で得られた成果を基にして,オブジェクト指向型ロボットプログラミング言語EusLisp上で,作業目的によるトップダウン的認識方式を付加して効率的及び高速な作業が可能な知能ロボットシステムを構築し、本方式の有効性を実証する。
中間エネルギ-精密核物理学

共同利用研究所である大阪大学核物理研究センタ-の新しい加速器計画として「サイクロトロン・カスケ-ド計画」が進められつつある。この計画では6セクタ-のリング・サイクロトロンを建設し、中間エネルギ-領域での精密核物理学を開拓・発展させることを目的としている。この事業の具体的建設を全国的視野のもとで進め、かつ新施設で明らかにされるべき核物理学の目標を検討するのが本研究の課題であった。現在すでにサイクロトロン本体の搬入・据え付けが行われており、初めての粒子加速に向けて準備が着実に進行している。この加速器によって、陽子で最高エネルギ-400MeV、Ar原子核程度までの軽重イオンで核子当り100MeV程度の加速が考えられており、高いエネルギ-分解能を持つ高性能のビ-ムが得られると期待される。また、測定器の検討も具体的につめられており、運動量分解能40000を現実のものとする高分解能スペクトログラフ(大ライデン)、飛行時間法による中性子測定装置、入射核破砕反応を用いた不安定核測定コ-スの建設が進行しつつある。これらの装置を用いて、全方向偏極測定を可能とする測定器系なども既に設計を終えており、実験活動の開始を期して待つ状況にある。特筆しておくべき事はビ-ム冷却や高輝度実験を含む次世代の原子核実験の開始を目指して、その第一段階としてのビ-ムサ-キュレ-ションリングが建設されていることであろう。このような測定系を用いた実験による新しい研究課題の検討も進められている。とりわけ、偏極測定による相対論的核模型の検証、原子核内のパイ中間子のふるまい、原子核中心部における核子および核力の様子、高励起領域における新しい型の集団運動の研究、中性子・陽子数が大きく異なる不安定原子核の構造等について、興味深い課題が出されてきている。世界に先がけπー中間エネルギー精密核物理学の樹立に向けて昭和62年度より発足した核物理研究センター増設計画(サイクロトロン・カスケード計画あるいはリングサイクロトロン事業と呼ばれている. )のいくつかの研究課題の実施上,建設上の詳細の検討をめぐって核物理研究連絡会メンバーの定例の会合が持たれた.この定例の会合ではリングサイクロトロン事業が東京大学原子核研究所を中心に計画立案がなされている.いわゆる大型ハドロン計画と相補的関係にある所から両計画の整合性をさらに高めるべく重点的に議論がなされている.さらに広域の専門領域の研究者間の意見交流,技術交流もはかるねらいで大型ハドロン検討作業部会と合同で全国規模の大型研究会も開催した.本報告書の研究発表欄の冒頭の業績は狭い専門にこだわらない,このような交流から生れた国際的成果の一つの代表例である.大阪大学核物理研究センターは全国共同利用研究センターの第1号として創設され、以来12年有余、本邦初のAVFサイクロトロンならびに世界最高分解能記録を保持する核反応粒子スペクトログラフ「雷電」等の設備による成果で国際的注目を浴びている。年間稼動時間は6000時間以上に達し他の研究機関の2倍にもなる。それでも国内外の利用者の希望の半分以下しか満たし得ない現状である。この実績をふまえ中間エネルギー精密核物理学樹立を目指してリングサイクロトロン建設事業が昭和62年度より進められている。本事業による新しい学問分野開拓の具体化を世界的研究動向を堪案しつつ、全国的規模でつめて行くのが本研究課題の目的である。そのため全国から選出された核物理研究連絡会メンバーによる検討と平行してリングサイクロトロン事業のうち特に測定器系建設ならびに開発プロジェクトの検討を毎月2回定例の作業部会でおこなって来ている。

この結果、核物理研究センター外の作業部会メンバーの何名かはセンター職員と同様の建設要員となってリングサイクロトロン施設の設計建造に従事するまでになった。一方、これ等の国内の動向と呼応するように国外の研究機関たとえばウプサラ大学放射線科学部ならびにスヴェドベルグ研究所との研究協力事業もすすめられており一昨年から今年にかけて国内外で大きな反響を呼んでいる超高エネルギー放射光の発生法や高エネルギー粒子ビームの高輝度化の新原理発見の成果が出ている。共同利用研究所である大阪大学核物理研究センタ-の新しい加速器計画として「サイクロトロン・カスケ-ド計画」が進められつつある。この計画では6セクタ-のリング・サイクロトロンを建設し、中間エネルギ-領域での精密核物理学を開拓・発展させることを目的にしている。この事業の具体的建設を全国的視野のもとで進め、かつ新施設で明らかにされるべき核物理学の目標を検討するのが本研究の課題であった。現在すでにサイクロトロン本体の搬入・据え付けが行われてあり、初めての粒子加速に向けて準備が着実に進行している。この加速器によって、陽子で最高エネルギ-400MeV、Ar原子核程度までの軽重イオンで核子当り100MeV程度の加速が考えられており、高いエネルギ-分解能を持つ高性能のビ-ムが得られると期待される。また、測定器の検討も具体的につめられており、運動分解能40000を現実のものとする高分解能スペクトログラフ(大ライデン)、飛行時間法による中性子測定装置、入射核破砕反応を用いた不安定核測定コ-スの建設が進行しつつある。これらの装置を用いて、全方向偏極測定を可能とする測定器系なども既に設計を終えており、実験活動の開始を期して待つ状況にある。特筆しておくべき事はビ-ム冷却や高輝度実験を含む次世代の原子核実験の開始を目指して、その第一段階としてのビ-ムサ-キュレ-ションリングが建設されていることであろう。このような測定系を用いた実験による新しい研究課題の検討も進められている。とりわけ、偏極測定による相対論的核模型の検証、原子核内のパイ中間子のふるまい、原子核中心部における核子および核力の様子、高励起領域における新しい型の集団運動の研究、中性子・陽子数が大きく異なる不安定原子核の構造等について、興味深い課題が提出されてきている。
医療・介護現場での職場改善を段階的に支援するツール開発

医療介護現場で働く人の安全・健康向上を目的に、物理化学的環境から作業方法等の改善まで包括的な視点で現場の労使が主体的に取り組む「職場改善活動」が広まっている。本研究では以下の2点を明らかにすることを研究目的とした。1医療・介護現場を中心に日本の職場で実施されてきた、労使主体の「職場改善活動」の共通点を文献やヒアリング調査から抽出し、現場に根付く職場改善活動の必須要素を明らかにする21の成果を基に、医療・介護分野での職場改善の導入や継続を支援するためのツールとして、職場改善活動の導入や継続に課題を抱える現場の労使が活用できるチェックリストを開発する平成29年度はヒアリング調査と現場訪問により、現場の良好事例を収集すると共に労使主体の「職場環境改善」の共通点を整理し、現場に根付く職場環境改善の必須要素を明らかにした。「活動を補助するシンプルなツールの使用」や「各現場の状況に合わせたフレキシブルな改善方法」等が必須要素として抽出された。また、健康・安全・働きやすさと共に「働きがい」「自身のスキルアップ」に現場の関心が強く置かれていることがわかった。平成30年度は平成29年度の調査と合わせて、医療・介護現場で実際に職場環境改善を進めていくツールを作成し中小規模の医療介護事業場を中心に約60名の参加者に向けてワークショップ形式の現場応用を実施した。現場からは、短い時間の中で包括的に職場のリスクアセスメントを進めることのできるツールの有用性や、実際の現場での事例から簡単に改善のアイデイアを得れること等の評価を得た。一方で、シフト制で全員集まることのできない職場での進め方や導入に関して職員の理解を得ることの難しさ等が課題として挙げられた。令和元年は、現場応用の結果を基にツールを完成させるとともに、導入・継続を行いやすい仕組みの検討を行う予定である。平成29年度に培ったネットワークを利用してヒアリング先の確保はスムーズに調整をすることができた。「参加型職場環境改善」および産業保健研究家・実務家の協力を得て職場環境改善のツールとしてアクションチェックリストおよび良好事例集を予定通り作成し現場応用まで進められた。現場応用での意見等をもとに職場環境改善のツールを完成させるとともに、研究成果の公表として、論文等での報告を予定している。平成29年度は、医療・介護現場を中心に日本の職場で実施されてきた、労使主体の「職場改善活動」の共通点を主にヒアリング調査から抽出するとともに、他の第三次産業においても実施し、現場に根付く職場改善活動の必須要素を明らかにした。その結果、職場改善活動を推進する必須要素に関して、医療介護現場を中心とする良好事例が収集できた。活動そのものに関する調査からはこれまでの研究結果と併せて、「活動を補助するシンプルなツールの使用」、「現場の全ての労使の参加」、「情報共有」、「現場の労使をエンパワメントする効果」、「各現場の状況に合わせたフレキシブルな改善方法」、「現場を統括する立場のスタッフの協力」、「シフト制に対応できる情報共有ツール」、「既存のシステムに組み込める簡易さ」の8項目が必須要素として抽出された。一方、現場の良好事例からは「相談しやすいレイアウト配置」、「整理整頓」、「ラベルの工夫」等の他の職場改善と共通している取り組みに加え、「共有カルテによるケアの視点の標準化」、「看護ケース勉強会」等の自身や職場全体の専門家としてのスキルアップにつながるような項目が必須要素として抽出された。このように医療・介護職の職場改善には、職場の働きやすさと共に、「働きがい」を追求することが必須要素として挙げられることが示唆された。これは医療職以外の第三次産業での職場改善における良好事例にも認められた。平成30年度は引き続き現場ヒアリング・良好事例収集および文献レビューを実施するとともに、導入・維持に必要な要素を整理し、チェックリストの概要作成を実施するとともに、医療・介護現場での職場改善の導入や継続を支援するためのツールとして、現場の労使が活用できるチェックリスト開発に資する情報を収集する予定である。当初の研究実施計画では平成29年度は医療・介護現場でのヒアリングを中心に実施予定であったが、特に介護現場でのヒアリング先への調整が確定できなかった。平成30年度は今年度培ったネットワークを利用してヒアリング先の確保に努める。

現場からは、短い時間の中で包括的に職場のリスクアセスメントを進めることのできるツールの有用性や、実際の現場での事例から簡単に改善のアイデイアを得れること等の評価を得た。一方で、シフト制で全員集まることのできない職場での進め方や導入に関して職員の理解を得ることの難しさ等が課題として挙げられた。令和元年は、現場応用の結果を基にツールを完成させるとともに、導入・継続を行いやすい仕組みの検討を行う予定である。平成29年度に培ったネットワークを利用してヒアリング先の確保はスムーズに調整をすることができた。「参加型職場環境改善」および産業保健研究家・実務家の協力を得て職場環境改善のツールとしてアクションチェックリストおよび良好事例集を予定通り作成し現場応用まで進められた。平成30年度は引き続き現場ヒアリング・良好事例収集・文献収集にて職場改善活動の導入・継続に関する必須要素の統合と良好事例の整理を行い、必須要素を対策志向型アクションチェックリスト形式に作成する。現場応用での意見等をもとに職場環境改善のツールを完成させるとともに、研究成果の公表として、論文等での報告を予定している。文具等、現場応用の際に使用予定の物品が訪問先で用意されていたため。使用計画としては、ツールの印刷費用等を予定している。
可視高分散分光観測による炭素星の炭素同位体比の研究

恒星進化末期の漸近巨星枝(AGB)にある炭素星の形成とその進化シナリオを検討するため、炭素星の可視高分散分光観測を行い、炭素の同位体比^<12>C/^<13>Cを測定する。ぐんま天文台のGAOES分光器を用いることによって、高い波長分解能でありながら、かつ広い波長領域を網羅した高精度の可視分光データを大量のサンプルに対して取得した。この様な大型サンプルに対する高精度の炭素同位体比の測定はこれまでに類をみないものである。県立ぐんま天文台の1.5m望遠鏡に設置された可視高分散分光器GAOESを用いて、多数の炭素星に対する可視域での高分散分光観測を行い、炭素の同位体比12C/13Cを測定し、HR図上の漸近巨星枝(AGB)における炭素星の形成とその進化のシナリオを詳細に検討することが本研究の目的である。2007年度には、GAOESのCCD検出器をサイエンスグレードと呼ばれる最高精度のものに換装するとともに波長設定精度や安定度を決定するクロスディスパーザ制御システムの調整を行った。詳細な性能の評価を行った結果、分光器として感度や精度が著しく向上したことが確認され、結果は日本天文学会等で報告されている。分光器本体以外にも制御計算機や望遠鏡の周辺装置の改良を行い、高い波長分解能で広い波長域のスペクトルを取得することができるGAOESの本来の特長を最大限に活かしながら本課題のための観測を効率よく遂行できる体制が確立された。このような状況の下、ぐんま天文台の柔軟な観測プログラムの運用も活用し、炭素星の分光観測が実行された。これまでのところ、最終目標の約15%にあたる十数個の天体に対して高精度の観測データが取得され、現在も観測が継続されている。取得された観測データは、新しく導入した記憶装置が組み込まれた計算機システムに保存され、そこに於いてさらなる処理、解析がなされるようになっている。最終的な測定結果を出すためには詳細な理論モデルの適切な利用が不可欠であるが、これらについても、この計算機システムの上で整備を進めており、今後の観測データの増加とともに、高精度の解析結果が得られるようになる見込みである。県立ぐんま天文台の1.5m望遠鏡に設置された可視高分散分光器GAOESを用いて、多数の炭素星の可視域での高分散分光観測を行い、炭素の同位体比^<12>C/^<13>Cを測定し、HR図上の漸近巨星枝(AGB)における炭素星の形成とその進化のシナリオを詳細に検討することが目的である。前年度より引き続き観測を継続し、目標のほぼ半数にあたる約30個の炭素製の高品質の分光データを取得した。観測データは前年度に導入した大容量の記憶装置と計算機を用いて整約処理が行われ、処理されたデータは統一された形式のファイルとして保存され、データベースが構築されている。観測に加え、2008年度にはGAOESの検出器周辺の温度制御や光学系に対する細部の改良を行い、分光器の安定性と測定精度の向上を図っている。また、制御ソフトウェアにも改良を加え、さらに優れた観測効率を達成するとともに、観測後のデータ処理との連携に関わる作業効率も向上している。実際の観測においては、ぐんま天文台の独立で柔軟な観測プログラムの運用上の特長も極めて有効に機能し、高い波長分解能で広い波長域のスペクトルを取得することができるGAOESの本来の特長が最大限に活かされた研究課題となっている。これまでの観測結果について、日本天文学会や研究会などでその途中経過の状況を報告している。また、最終的な測定結果を出すための解析に必要な理論モデルについても、計算機システム上でのソフトウェアの整備を行っている。各部を整備することによって観測の精度と効率が向上した望遠鏡とGAOESからなる観測システムを用いて、観測を継続し、ほぼ目標に達する約50個の炭素星の高品質な分光データを取得した。これは所期の研究目的を達成するために十分な数のサンプルである。観測されたデータはこれまでに導入してきた大容量の記憶装置と計算機を用いて整約処理が行われ、較正され一次元に処理された分光データは統一された形式のファイルとして保存され、直ちに解析に用いることのできるデータベースを構成している。

また、炭素同位体比を測定するために必要な炭素を含む分子に関する吸収線のデータの収集・整理と、辻による低温度星大気の数値モデル(Tsuji 1965, PASJ17, 152, Tsuji 1976, PASJ 28, 543)の整備を行い、これらを用いて観測データの解析を進めている。観測から実際に得られた分光スペクトルは、極めて広範な波長範囲とそこに含まる膨大な吸収線を持ち、また高い波長分可能による深く鋭い吸収線の輪郭を示し、解析には当初の想定を遥かに上回る細心の取り扱いが必要なことが明らかになってきた。このため、今年度は主に解析方法の吟味を行っている。基本的な組成解析が比較的容易な炭素星以外の天体についても、観測と分光データの分析を並行して行い、整備した分光器の能力や処理手法の妥当性を確認している。観測システムの整備の状況や、これを用いた観測結果、あるいは計画の進捗状況などは、論文や学会、研究会などで適宜報告されている。
シクロファンを分子基盤とした糖クラスターの設計と機能

(1)糖クラスターの会合挙動水中におけるTetrakis-typeおよびOctakis-type糖クラスターの会合挙動を表面張力法により検討したところ、グルコース及びガラクトース残基を導入したTetrakis-typeの糖クラスターでは明確な臨界会合体形成濃度を示さず、比較的に低濃度から会合が進行していることがわかった。一方、長鎖アルキル基を有するOctakis-typeの糖クラスターの場合にはCACが約40mMと判断された。(2)糖クラスターのコンホメーション水中でのCDスペクトルの測定から、Tetrakis-typeの糖クラスターは剛直な分子骨格を有しており、糖部位が単糖、二糖、三糖となるに従って糖残基の不斉性に応じたキラリティーが増すことがわかった。また、比較的に柔軟な分子構造をとりうるOctakis-typeの糖クラスターは導入したアルキル鎖の長さにより安定なコンホメーションが異なり、長鎖アルキル基を有する糖クラスターではConeコンフォーメーションをとり、長鎖アルキル基を持たない場合には1,3-alternateコンフォメーションをとることがコンピュータ解析から示唆された。(3)分子内空洞の微視的環境低温恒温水槽中で、ANSを糖クラスターに取り込ませ、分子内ミクロ環境を評価した。Tetrakis-typeの糖クラスターでは糖部位が単糖、二糖、三糖となるに従って分子内空洞の疎水性が増すことがわかった。(4)疎水性表面への固定化と分子間相互作用表面がアルキル基で覆われた疎水性のセンサーチップに両親媒性のOctakis-(Galb1-4GlcA)HostC11及びOctakis(Glca1-4GlcA)HostC11を固定化することで、バルク側に糖残基を配向・集積させた糖修飾表面を構築した。固定化挙動は表面プラズモン共鳴法により評価し、得られたDRU値から、1分子当たりの占有面積が約4.6nm2であることがわかった。これは直径2123Åの円に相当し、かつ糖クラスター分子の直径にほぼ等しいことから、いずれも密に充填した単分子層が形成されているものと判断された。
静注用インドメサシンの薬物血中動態と脳血流に関する検討

動脈管開存症の未熟児に対して、添付文書の用量でインドメサシンの投与方法をランダムに2群に分け超音波ドプラー法による脳血流速度(中大脳動脈、MCA;前大脳動脈、ACA)と血中濃度の経時的測定を試みた。投与方法は10分間での静注群(A)17例、2時間での持続点滴群(B)7例であった。A,B群の在胎は28.9±4.5週、31.2±4.5週、出生体重は1122±335g、1365±521g、投与日齢3±2.2、3.7±5.1で有意差はなかった。また、治療効果については両群の閉鎖率はA群、B群ともに100%であった。脳血流速度の最大減少について、A群では収縮期および拡張期ともにMCAでは投与後30分、ACAでは15分に認められた。B群ではMCAもACAも投与後90分に認められた。最大減少時の脳血流速度を前値を1とした収縮期の減少率で比較すると、MCAにおいてA群0.675±0.141、B群0.876±0.105であり、ACAにおいてA群0.671±0.120、B群0.796±0.130、であった。両部位ともA群で有意に低下した。血中濃度については、高速液体クロマトグラフィーでの検討を種々試みた。以前報告した方法(日本新生児学会雑誌19:410-414,1983)で検討したが、微量で高感度測定が必要なため夾雑物の影響により測定が困難であることが判明した。そのため、文献検索によりカラムで分離後に紫外線照射することでインドメサシンが蛍光物質に変化する方法(J Chromatogr 491:389-396,1989)が見出されたので検討を行った。現有の蛍光検出器で最高の感度をもつRF-5000で測定を試みた。励起波長を358nmとして発光波長を462nmとし、mobile phaseに過酸化水素を加えることでインドメサシンに対する特異性や定量性および夾雑物からの分離は証明できた。しかし現有機器での測定感度は血清1mlで100ng/ml程度であり、実際の測定には血清量を20μl以下にしたいため、さらに感度をあげる必要があることが判明した。今年度はインドメサシンの血中濃度測定はまだ測定条件検討中であるため出来ておらず、まず次年度で予定していた脳血流速に対するインドメサシンの影響について検討し、同時に血液sampleの収集をした。未熟児動脈管開存症のためインドメサシンによる治療が必要であった未熟児で両親の承諾の得られたものを対象とし、インドメサシン投与前より前大脳動脈脳血流速度および中大脳動脈血流速度を経時的に測定し、同時に薬物動態を検討できるように採血を行った。静脈内投与の方法を10分間で投与する群(10分投与群)と2時間かけてゆっくり投与する群(2時間投与群)にわけて検討した。脳血流速の検討は10分投与群では15分間隔で投与後2時間まで、2時間投与群では30分間隔で投与後3時間まで測定した。両群間に在胎週数および出生体重、投与日令に有意な差は認めなかった。治療効果については、両群とも良好で両群間に差はなかった。10分投与群では、前大脳動脈および中大脳動脈いずれも脳血流速度は投与15分後にはすでに前値に対し有意に減少し、平均すると前値の約65%まで低下した。脳血流速度を検討した2時間までには前値までには回復しなかった。一方2時間投与群では、脳血流速度は検討した3時間までは有意な低下は認めなかった。しかし2時間投与群にも1例10分投与群と同様に60%まで低下した症例もあり注意が必要であると思われた。脳血流速と血中濃度の推移、および在胎週数とや薬物血中動態との関係についての検討を次年度行う予定である。

以前報告した方法(日本新生児学会雑誌19:410-414,1983)で検討したが、微量で高感度測定が必要なため夾雑物の影響により測定が困難であることが判明した。そのため、文献検索によりカラムで分離後に紫外線照射することでインドメサシンが蛍光物質に変化する方法(J Chromatogr 491:389-396,1989)が見出されたので検討を行った。現有の蛍光検出器で最高の感度をもつRF-5000で測定を試みた。励起波長を358nmとして発光波長を462nmとし、mobile phaseに過酸化水素を加えることでインドメサシンに対する特異性や定量性および夾雑物からの分離は証明できた。しかし現有機器での測定感度は血清1mlで100ng/ml程度であり、実際の測定には血清量を20μl以下にしたいため、さらに感度をあげる必要があることが判明した。
MTGプロセスのための長寿命選択性ゼオライト触媒の開発

昨年度までに得られた成果に基づき、今年度は脱アルミニウム法、バリウムイオン交換法、CVD法の三つを組み合わせることによって当初の目的である長寿命高選択性ゼオライト触媒を得ることを目的とする研究を行った。バリウムをイオン交換すると、活性は、Baイオン交換率が増加するにつれて低下したが、寿命には大差がみられなかった。しかし、これにともない触媒の色が黒から灰色に変わった。そこで、流通反応中に析出したコ-クの量を熱重量測定装置によって定量したところ、Baイオン交換率が増加するにつれてコ-ク析出量が減少することがわかった。また、酸性質の変化をアンモニアの昇温脱離法によって検討したところ、Baイオンは強酸点を除き、中程度の強度をもつ酸点を発現させることがわかった。BaDM上での生成物には、ガソリンに適さない炭素数が11以上の芳香族が4.2(mol%生成した。そこではこの触媒の細孔入口径をCVDによって制御することによって、炭素数が以上の芳香族の生成を制御することを試みた。この結果。SiO_2蒸着量が1.4wt%で炭素数が11以上の芳香族の生成が制御された。この場合。酸素数10のテトラメチルベンゼンの生成はほとんど制御されず、また、寿命はSiO_2蒸着量によらずほとんど変わらないことがわかった。以上のことから、脱アルミニウムとBaイオン交換によってモルデナイトの酸性質を、ケイ酸アルコキシドのCVD法によってその細孔入口径を制御することによって、長寿命・高選択性MTG反応触媒を開発できることが可能となった。この結果。この場合。
ヒト型モノクローナル抗体による乳癌、肺癌のカクテル療法及び各種癌の糖鎖の分析

我々は主に乳癌及び肺癌の再発患者を用いて、非修飾型のヒト型モノクローナル抗体を投与してきた。用いた抗体は、はじめの予定と異なりGalβ1-4GlcNAcβ1-Rの末端2糖を認識しているSI-1は、白血球減少等の副作用が強いため、実際に投与を行ったのは、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-Rを認識しているSI-5及びGalβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Rを認識しているMH21-134の2抗体であった。informed consentの問題もあり、対象とした患者は再発症例でしか不可能であったため、奏功率は20%(3/15)にすぎなかった。非修飾抗体だけで好成績をあげるためには、Koprowskiらの作成した17-1A抗体の大腸癌患者に見られるように、既に対象腫瘍が肉眼的に切除された症例であることが望ましいと考えられる。つまり初発患者の治癒切除後に投与群と非投与群の無作為比較試験を行うべきであった。また、研究以前に予測したのと異なり、切除標本から抽出した糖脂質を調べると、主な糖鎖抗原の変化としてはCDH・CTHなどが増加してくる不全現象は最初の数例にすぎず、その後の症例ではaberrant glycosilationの方が優位を示した。特にシアル酸の付加された酸性糖鎖への変化が著明であった。このことはより悪性度の高い腫瘍細胞が、Sialyl Le^xやSialyl Le^aなどのセレクチンファミリーのリガンドを有している可能性とも結びつき、非常に興味深い現象といえる。これからの研究の展開としては、このようなgangliosideに対するカクテル療法が望まれる。また、外科切除後の症例でない限り多種類の抗体を用いたカクテル療法とはいえ、あまり有効ではなく、抗癌剤などの修飾による抗体療法が望ましい。癌細胞に対するヒト型モノクローナル抗体を用いて、ミサイル療法を行う為、癌患者の所属リンパ節から得たリンパ球とマウスミエローマSP2/0の改良株を用い作成したヒト型モノクローナル抗体MH21-134及びSCIDマウスを用いて得たヒト型モノクローナル抗体SI-1,SI-5を準備した。これらのエピトープは順に、Galbeta1→4GlcNAcbeta1→3Galbeta1→4GlcNAcbeta1→3Galbeta1→4Glcbeta1→R,Galbeta1→4GlcNAcbeta1→R,Galbeta1→4GlcNAcbeta1→3Galbeta1→4GlcNAcbeta1→Rであり、いずれもtype 2chainの糖鎖を認識する抗体で、強いADCC活性を有するlgG3 typeのヒト型モノクローナル抗体である。現在までこれを進行肺癌で術前にその栄養動脈である気管支動脈より注入し、その後切除を行ってきた。その切除標本より、直接イソプロピルアルコール・ヘキサン・水の系により糖脂質の抽出を行ったところ、糖鎖の伸長現象によるエスケープ現象は観察されず、これまでのところ不全現象が主であると考えられる。又再発転移性肺癌でも気管支動脈よりの注入を近日中に行う予定である。一方乳癌では胸壁再発例に対し周囲の外表面より注入した後摘出した。現在切除標本を用い免疫組織染色を行い用いた抗体の分布集積状態を検討している。

同時に、切除標本より糖脂質の抽出を行い、糖鎖の伸長、不全現象などの抗原性の変化を、TLC immunostainingを行い、検討中である。なお、SI-1,SI-5,MH21-134のうち末端二糖しか認識していないSI-1は全身投与では副作用として白血球減少症をまねくことが多く、これからは、局所投与にのみ使用する予定である。我々は主に乳癌及び肺癌の再発患者を用いて,非修飾型のヒト型モノクローナル抗体を投与してきた.用いた抗体は,はじめの予定と異なりGalβ1-4GlcNAcβ1-Rの末端2糖を認識しているSI-1は,白血球減少等の副作用が強いため,投与を途中で断念し,Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-Rを認識しているSI-5及びGalβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Rを認識しているMH21-134の2抗体を用いた.informed consentの問題もあり,再発または遠隔転移を持つ症例でしか行えなかったので,奏効率は20%(3/15)にすぎなかった.非修飾抗体だで好成績をあげるためには,Koprowskiらの作成した17-1A抗体の大腸癌患者にみられるように,対象腫瘍が既に肉眼的に切除された症例であることが望ましいと考えられる.また,研究以前に予測したのと異なり,主な糖鎖抗原の変化としては,DCH・DTHなどが増加してくる不全現象はほとんどみられず,むしろ糖鎖を延長させる方向であるaberrant glycosylationの方が優位を示した.特にシアル酸の付加されら酸性糖鎖への変化が著明であった.このことは,より悪性度の高い腫瘍細胞が,Sialy Le^xやSialy Le^aなどのセレクチンファミリーのリガンドを有しているとの多数の報告とも結びつき,非常に興味深い現象といえる.そこでこれからの研究の展開としては,このようなgangliosideに対する抗体をも含んだカクテル療法が望まれる.また,外科切除後の症例でない限り,多種類の抗体を用いたカクテル療法とはいえ,あまり有効ではなく,抗癌剤などの修飾を行った抗体療法が望ましい.
メダカ背腹構造突然変異Da遺伝子のマッピングとクローニング

脊椎動物における背腹構造の形成機構は発生学上の焦点の一つである。メダカDa(double analfin)変異体は、胴部、尾部において背側が腹側化している表現型を示す突然変異体である。本研究ではDa変異体原因遺伝子のポジショナルクローニング単離を行った。1)メダカ遺伝的連鎖地図の作成とDa遺伝子のマッピング:メダカ遺伝的連鎖地図を作成したところDa遺伝子は連鎖群VIIIにマップされた。Da遺伝子を挟む形で両側に存在するもっとも近いマーカーとDa遺伝子との物理的距離は144kb、及び360kbであった。これは染色体歩行を開始するにあたり十分近い距離であると考えられた。2)整列化コスミドライブラリーの作成:Da遺伝子近傍のマーカーから染色体歩行を開始し、物理的地図を作成するために、HNI系統を利用してメダカコスミドライブラリーを作成した。平均インサート長40.2kbのものが約12万クローン(メダカハプロイド6ゲノム分に相当)384穴マイクロタイタープレート上に整列化した。これらをスクリーニングしてDa遺伝子近傍の2個のマーカーを含むコスミドクローンを得ることに成功した。3)Da遺伝子近傍の物理的地図の作成:このコスミドクローンをプローブとして、メダカ間期核に対してFISHを行い、これらのマーカーが物理的にも近接して存在していることを顕微鏡下で明らかにした。そこで、これら2個のマーカーから染色体歩行を開始し、BACクローンとコスミドクローンを用いて、Da遺伝子を完全にカバーするコンティングマップを完成させ、Da変異を含む最小領域の決定を行った。その結果、70250kbの範囲内にDa変異が含まれていることが明らかになった。これによってDa遺伝子は、1個のBACクローンでカバーされることが期待された。1. Da遺伝子近傍の高密度遺伝子地図の作製計625個体のバッククロス個体を用いて、Da遺伝子近傍のマーカーの分離パターンを調べた。その結果、これまでに組換え体が得られていなかった3個のマーカー(stsM02-5,stsB07-3,k00l)について、Da遺伝子との間の組換え体を得た。最も近いマーカー(stsM02-5)とDa遺伝子との距離は0.32cMであり、物理的には約150kbに相当すると考えられた。これは染色体歩行を開始するにあたり十分近い距離である。得られた組換え体は、染色体歩行時の方向やDa遺伝子を含む最小領域を決定するために利用できる2.既知遺伝子のマッピング形態形成遺伝子を含む15種類の既知遺伝子の断片をメダカから単離し、塩基配列上の多型を利用して染色体地図上にマッピングした。その結果、shhとeng-2がDa遺伝子から約3cMの位置にマップされた。ゼブラフィッシュやヒトの遺伝子地図との比較から、Da遺伝子近傍の染色体領域が種を越えて保存されている可能性が示唆された。ゼブラフィッシュとのシンテニーを基に、背腹に関して発現パターンに差が見られるtbx-6やvn-cadなどがDa遺伝子の候補として考えられた。またこの過程で、他生物種とメダカとの間で保存されている染色体領域を他に3カ所見出した。3.コスミドライブラリーの作成遺伝子地図作製に使用した純系のHNI系統を用いて、ベクターを除く平均DNA長40kbで、10ハプ口イドゲノムをカバーするメダカコスミドライブラリーを作成した。stsM02-5のマーカーを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、このマーカーを含むコスミドクローンを1個単離できた。染色体歩行を行うために、このクローンの末端の塩基配列を決定し、STSマーカーを設定した。

脊椎動物における背腹構造の形成機構は発生学上の焦点の一つである。メダカDa(double and fin)変異体は胴部、尾部において背側が腹側化している表現型を示す突然変異体である。本研究ではDa変異体原因遺伝子のポジショナルクローニング単離を試みた。1)メダカ遺伝子連鎖地図を作成とDa遺伝子のマッピング:メダカ遺伝子的連鎖地図を作成したところDa遺伝子は連鎖群VIIIにマップされた。Da遺伝子を挟む形で両側に存在する最も近いマーカーとDa遺伝子との物理的距離は144kb、及び360kbであった。これは染色体歩行を開始するにあたり十分近い距離であると考えられた。2)整列化コスミドライブラリーの作成:Da遺伝子近傍のマーカーから染色体歩行を開始し、物理的地図を作成するために、HNI系統を利用してメダカコスミドライブラリーを作成した。平均インサート長40.2kbのものが約12万クローン(メダカハブロイド6ゲノム分に相当)384穴マイクロタイタープレート上に整列化した。これらをスクリーニングしてDa遺伝子近傍の2個のマーカーを含むコスミドクローンを得ることに成功した。3)Da遺伝子近傍の物理的地図の作成:このコスミドクローンをプローグとして、メダカ間期核に対してFISHを行い、これらのマーカーが物理的にも近接して存在していることを顕微鏡下で明らかにした。そこで、これら2個のマーカーから染色体歩行を開始し、BACクローンとコスミドクローンを用いて、Da遺伝子を完全にカバーするコンティグマップを完成させ、Da変異を含む最小領域の決定を行った。その結果、70250kbの範囲内にDa変異が含まれていることが明らかになった。これによってDa遺伝子は、1個のBACクローンでカバーされることが期待された。