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水の酸化と二酸化炭素還元反応を目指した再生可能な２電子酸化剤と２電子還元剤の開発

自然エネルギーを貯蔵可能な化学エネルギーに変換させる反応系の構築は、現代社会にとって極めて重要な研究課題である。化学結合生成・開裂には、少なくとも分子間で2電子の授受が必要であるが、光及び電気化学的反応での電子移動は1電子過程であり不安定ラジカル中間種が形成され易く選択的分子変換が困難になっている。本研究では、光1電子還元体へのプロトン化で中性ラジカル配位子を持つ金属錯体を形成させ、分子間不均化反応で2電子還元体を形成させCO2を行った。また、アクアー及びアミノ金属錯体からのプロトン解離で生成する負電荷を配位子に収容させることで、オキシル及びアミノラジカル錯体を形成させて、酸化反応を開発した。再生可能社会実現のための一つのアプローチとして光および電気化学的二酸化炭素還元には大きな期待がかけられているが、生成物が2電子還元の一酸化炭素とギ酸に限定されている。二酸化炭素を炭素資源として活用するためには、より有用な還元生成物を与える触媒反応の開発が必要不可欠である。二酸化炭素から一酸化炭素への骨格変換は触媒上での酸塩基反応で容易に起こるのに対して、生成したM-CO錯体への電子注入(酸化還元反応)は結合の還元的開裂を引き起こしCOが発生する。申請者は、ジメチルアミンがRu-CO基のカルボニ炭素に急速に付加することから、ジメチルアミンを求核試薬、その塩酸塩をプロトン源としてRu錯体を触媒とする光化学的二酸化炭素還元を行うと、選択的かつ触媒的にジメチルホルムアミドが生成することを明らかにした。本反応は二酸化炭素の還元的活性化を経て一段階の反応で有用物質を触媒的に与えた最初の反応である。補酵素NADH同様に、再生可能な有機ーヒドリドとして機能する触媒の開発を目的として、申請者はRu-pbn(2ーピリジルベンゾー1、5ーナフチリジン)錯体と2電子還元体Ru-pbnHH(ジヒドロー2ーピリジルベンゾー1、5ーナフチリジン)錯体を合成し、塩基存在下ではRu-pbnHH錯体は二酸化炭素としてHCOOHを与え、Ru-pbnを再生することを明らかにしていた。平成26年度は数種類のカルボン酸アニオンを塩基として用い、Ru-pbnHHからの二酸化炭素へのヒドリド輸送の詳細を検討した。ヒドリド輸送速度は相当するカルボン酸のpKaの値と強い相関関係を示した。さらに、酢酸アニオンを塩基とした系でのRu-pbnHHから二酸化炭素へのヒドリド輸送の速度論的アイソトープ効果kH/kdは8.3であり、NADH同様にRu-pbnHHは再生可能なヒドリド供給試薬として機能することを明らかにした。水中で[Ru(bpy)2(CO)2]2+(bpy = 2,2'-ジピリジル)のRu-CO基は水と可逆的かつ急速に反応してRu-COOHとRu-CO2基となり、3種の錯体は平衡系で存在している。これらの錯体の内、熱的にはRu-COOH錯体が最も不安定で100°C以上に加熱するとCO2を放出してRu-H結合を有するヒドリド錯体を生成し、水と反応してH2とRu-OH2基を持つアクア錯体を与える。Ru-アクア錯体はCO加圧下では[Ru(bpy)2(CO)2]2+を再生することから、これらの錯体は水性ガス移動反応を高効率で触媒する。水中では[Ru(pbn)2(CO)2]2+(pbn = 2-(2-ピリジル)ベンゾ[b]-1,5ナフチリジン)もRu-COOH錯体とRu-CO2錯体との平衡系で存在する。Ru-bpy錯体と異なり、Ru-pbn錯体の平衡混合物をCO加圧下、加熱してもH2は発生せず、pbn配位子が2電子還元を受けた[Ru(pbnHH)2(CO)2]2+(pbnHH = 5,10-ジヒドロ-2-(2-ピリジル)ベンゾ[b]-1,5-ナフチリジン)とCO2が生成した。以上の結果は, Ru-pbn錯体の平衡混合物の熱反応によるCO2の放出はRu-COOH錯体ではなく、Ru-CO2錯体からのCO2放出はpbn配位子の2電子還元反応と協奏的に起こり、[Ru(pbn)(pbnHH)(CO)(H2O)]2+と[Ru(pbn)(pbnHH)(CO)2]2+を経由して[Ru(pbnHH)2(CO)2]2+が生成することで説明される。したがって、Ru-pbn錯体は光及び電気化学的還元のみならず、Ru-COの化学酸化と共役して2電子還元を受けてRu-pbnHHを生成することが明らかとなった。光および電気化学的還元反応では、1電子移動によるラジカル中間体が形成され易い。特に、有機基の1電子還元や酸化は反応性の大きなラジカル種が形成され易く、選択分子変換の障害となっている、Ru-pbn錯体は可視光照射あるいは電気化学的還元反応で、副反応を伴うことなく、その配位子の2電子還元体を持つRu-pbnHH錯体が生成する。

平成27年度の研究でRu(pbn)(CO)錯体では、加熱が必要であるが、水との反応でカルボニル基の2電子酸化によるCO2発生とpbn配位子の2電子還元(pbnHH生成)が協奏的に起こることが明らかとなった。この事実は、pbnは光、電気エネルギーとともに、無機化合物の酸化と共役させて、選択的な2電子還元反応を起こさせることが可能になったことを示している。pbnと類似の構造を有する1,10-フェナントロリン型の配位子bpp(benzo[b]pyrido[3,2-f][1,7]-phenanthroline)を有するRu-bpp錯体はRu-pbn錯体に比べて、より大きなπ電子系を有し、リン光の量子収率は0.086で、犠牲試薬存在下では効率よく光2電子還元反応を受けてRu-bppHH錯体を与える。同一の配位子を有するRu-pbnに比べてRu-bppの還元電位は0.5V程度マイナスの電位にシフトするが、二つの2電子還元体Ru-pbnHHとRu-bppHHの酸化電位はほぼ同一である。Ru-bppHHはH-供与能が小さくCO2の還元能は示さなかったが、Ru-bppHHの光励起状態から酸素分子のエネルギー移動により、ほぼ定量的にHOOHを与えた。分子間電子移動は1電子過程であるのに対して,化学結合の生成・開裂には分子間で2電子の授受が必要である。そのため、有機化合物への(orからの)電子移動は必然的に反応性の大きなアニオンラジカルあるいはカチオンラジカルが形成する。その結果、電子移動を経由して反応が開始される光および電気化学的酸化還元反応では特定の反応を除いて、有機化合物の選択的分子変換が困難となっている。生体系の有機化合物の酸化還元反応では、補酵素NAD/NADHが一つのプロトン移動を伴った2電子の授受を触媒することで、ラジカル中間体による副反応を抑制し、選択的分子変換をおこなっている。現在、無機ヒドリド試薬が合成反応で使用されているが、その合成には、非常に大きなエネルギーを使用して合成され、再生不可能の試薬である。したがって、合成化学において再生可能で2電子の酸化還元を可能にする試薬の開発は、省エネルギーでの物質変換にとって極めて重要な研究課題である。これまで申請者等が開発したRu-pbn錯体とその2電子還元体Ru-pbnHH錯体のN-H結合は、無水溶媒中で強い塩基で処理するとプロトンを解離させると、H-供与剤として機能することを明らかにしてきたが、化学量論の反応でしか還元反応が進行しなかった。H28年度は、Ru中心に特定の置換基を導入すると、形式的にはRu-pbnHH錯体を、さらに1または、2電子還元させることが可能であることを明らかにした。その結果、電気化学的にはRu-pbnHHの2電子還元体の生成が可能となり、CO2飽和アセトニトリル/水混合溶媒中での定電位電解条件下、Ru-pbnHH骨格からCO2にヒドリドイオンが供給されて、始めて再生可能有機ヒドリド配位子から二酸化炭素へのヒドリド移動反応を触媒的に引き起こすことに成功した。自然エネルギーを貯蔵可能な化学エネルギーに変換させる反応系の構築は、現代社会にとって極めて重要な研究課題である。化学結合生成・開裂には、少なくとも分子間で2電子の授受が必要であるが、光及び電気化学的反応での電子移動は1電子過程であり不安定ラジカル中間種が形成され易く選択的分子変換が困難になっている。本研究では、光1電子還元体へのプロトン化で中性ラジカル配位子を持つ金属錯体を形成させ、分子間不均化反応で2電子還元体を形成させCO2を行った。また、アクアー及びアミノ金属錯体からのプロトン解離で生成する負電荷を配位子に収容させることで、オキシル及びアミノラジカル錯体を形成させて、酸化反応を開発した。金属錯体では複数個の電子の授受が可能であるが、分子間電子移動は1電子過程である。
種々の過圧履密歴を受けた砂地盤の液状化強度特性とそれに与える時間効果に関する研究

筆者らは以前より、過圧密を利用した液状化対策工法として載荷盛土工法および地下水位低下工法を想定し、繰返し中空ねじり試験を行って、それらによる過圧密効果に関する研究を行ってきた。その結果、(1)載荷盛土工法による方が地下水位低下工法によるよりも過圧密効果が大きい可能性があること、(2)両工法による液状化強度の増加は、過圧密比とKo値を用いて定式化できること等が明らかになっている。このような結果を踏まえ、本研究では、(1)両工法が併用された場合、(2)過圧密履歴を長時間受けた場合を想定し、それぞれの条件下での砂地盤におけるKo値の挙動および液状化強度の増加傾向を明確にすることを目的とした。この3年間において、(1)については、両工法を併用した場合、過圧密後のKo値は適用順序に影響を受けるが、液状化強度はKo値と過圧密比によって決まってくることが明らかになっている。また、(2)については、等方応力条件下で長期圧密を受けた場合、圧密時間とともに液状化強度は増加するが、その増加率は過圧密比2での増加率よりも若干小さいこと、また、過圧密比2の場合、最大鉛直有効応力により長期圧密されても、その長期圧密による液状化強度の増加は見られないこと、等が明らかになっている。さらに、(2)について、Ko応力条件下において過圧密履歴を受けた砂の液状化強度に与える長期圧密の影響を明らかにするため、過圧密過程での長期圧密効果および長期圧密過程での過圧密効果について実験を行った結果、過圧密過程において、最大鉛直有効応力により長期圧密を受けた場合には、その効果は見られないが、長期圧密過程において、過圧密履歴を受けた場合には、圧密時間が長くなるほど液状化強度は増加し、その長期圧密効果は圧密時間の関数で表されることが明らかになっている。地盤が過圧密履歴を受けると、液状化強度が増加する、いわゆる過圧密効果が得られることはよく知られている。また地盤は堆積してから長時間経過すると、次第に過圧密的な性質を有するようになる。このような過圧密の性質を利用した砂地盤の液状化対策工法があるが、その効果は十分に把握されているとは言えない。そこで筆者らは、過圧密を利用した液状化対策工法として載荷盛土工法および地下水位低下工法を想定し、それらによる過圧密効果に関する研究を行った。その結果、(1)載荷盛土工法による方が地下水位低下工法によるよりも過圧密効果が大きい可能性があること、(2)両工法による液状化強度の増加は、過圧密比とK_0値を用いて定式化できること等が明らかになっている。このような結果を踏まえ、本研究では、(1)両工法が併用された場合、(2)過圧密履歴を長時間受けた場合を想定し、それぞれの条件下での砂地盤におけるK_0値の挙動および液状化強度の増加傾向を明らかにすることを目的とした。(1)については、工法適用の順序やそれぞれの工法による過圧密比の値を変化させる等の条件で実験することとした。また、(2)については、過圧密履歴時の中で、鉛直有効応力が最大となる時点での長期圧密の影響について実験を実施した。その結果、以下のことが明らかになっている。(1)両工法を組み合わせた場合のKo値は工法の適用順序に影響を受ける。(2)(1)の条件における液状化強度は両工法の適用順序に影響を受けず、過圧密比と適用後のKo値によって決まるため、提案している式の値とよく一致する。

(3)等方応力条件下で長時間の圧密履歴を受けた場合は、液状化強度は増加するが、その増加率は過圧密比=2のときの増加率よりも多少小さい。(4)等方応力条件下で過圧密比=2の長期圧密を受けた場合は、液状化強度の増加がほとんど見られない。(5)Ko圧密で長期圧密した場合は、液状化強度の増加がほとんど見られない。過圧密を利用した液状化対策工法の効果は十分に把握されているとは言えない。そこで筆者らは以前より、この種の液状化対策工法として載荷盛土工法および地下水位低下工法を想定し、それらによる過圧密効果に関する研究を行ってきた。その結果、(1)載荷盛土工法による方が地下水位低下工法によるよりも過圧密効果が大きい可能性があること、(2)両工法による液状化強度の増加は、過圧密比とK_0値を用いて定式化できること等が明らかになっている。このような結果を踏まえ、本研究では、(1)両工法が併用された場合、(2)過圧密履歴を長時間受けた場合を想定し、それぞれの条件下での砂地盤におけるK_0値の挙動および液状化強度の増加傾向を明確にすることを目的としている。今年度においては、(1)については、想定される二つの工法の適用順序をすべて変える、6通りの条件で実験を行った。また、(2)については、過圧密履歴を与える前の鉛直有効応力で長期圧密された場合の過圧密効果、すなわち、例えば埋め立てられて時間が経過した後の地盤に対して過圧密効果が発揮されるかどうかについて実験を実施した。その結果、以下のことが明らかになっている。ただし、今回は長期圧密時間を160時間までとした。(1)両工法を組み合わせた場合のKo値は工法の適用順序に影響を受け、載荷盛土工法における盛土除去過程を地盤内の有効応力が小さくなってから実施する方が過圧密後のKo値はより大きくなる。また、地下水位低下工法における水位上昇過程を最後に行うと、過圧密後のKo値は小さくなる場合がある。(2)過圧密による液状化強度の増加、すなわち過圧密効果は、過圧密後のKo値と過圧密比の値で決まってくる。(3)長期圧密履歴を受けてからの過圧密効果は圧密時間が長いほど大きくなるが、長期圧密による過圧密効果の増加量は圧密時間が長くなるほど小さくなる。筆者らは以前より、過圧密を利用した液状化対策工法として載荷盛土工法および地下水位低下工法を想定し、それらによる過圧密効果に関する研究を行ってきた。この2年間において、(1)については、両工法を併用した場合、過圧密後のK_o値は適用順序に影響を受けるが、液状化強度はK_o値と過圧密比によって決まってくること、(2)については、等方応力条件下で長期圧密を受けた場合、圧密時間とともに液状化強度は増加するが、その増加率は過圧密比2での増加率よりも若干小さいこと、また、過圧密比2の場合、最大鉛直有効応力により長期圧密されても、その長期圧密による液状化強度の増加は見られないこと、等が明らかになっている。そこで、今年度においては、K_o応力条件下において過圧密履歴を受けた砂の液状化強度に与える長期圧密の影響を明らかにするため、過圧密過程での長期圧密効果および長期圧密過程での過圧密効果について実験を行った。
ストレスに応答する脳内新規遺伝子群の免疫修飾における役割の解析

生体に心理的、肉体的なストレスが負荷されると、下垂体-副腎皮質系、交感神経系を介して免疫機能が変化することは広く知られている。そこで研究者は、平成12年度までに、これら反応に関わる新規脳内分子を探索する目的で、大腸菌菌体内毒素(LPS)投与による炎症ストレスをマウスに負荷した後に発現量が増加する遺伝子をスクリーニングし、MAILとSSeCKSを同定した。本年度はこの二つの分子について発現・機能解析を進めた。1、SSeCKSの発現・機能解析平成12年度の検討より、LPS処置により、SSeCKSが脳血管で誘導されることを見出した。そこでマウス脳血管内皮細胞株IBECにSSeCKS cDNAを導入したところ、顕著なF-アクチン骨格の変化と仮足構造の伸展を認めた(J Histochem Cytochem)。仮足構造は貧食能の旺盛な細胞に典型的な構造であることから、SSeCKSと貧食の関係について調べたところ、SSeCKS導入内皮細胞ではデキストラン取り込み能の顕著な上昇がみられ、取り込まれたデキストランはSSeCKSと共在した。また免疫電顕法によりSSeCKSが取り込み小胞と共在することも見出した。以上のことからSSeCKSは物質取り込みに関わる分子であることが判明した。末梢臓器から脳実質に運ばれた液性情報伝達分子がニューロンを刺激することが、ストレス時の脳-免疫連関の賦活化に必須であると言われている。この際、脳血管内皮細胞は血流からの物質の取り込みと実質への放出を担うが、SSeCKSはこのうち、取り込みに関与していると思われる。2、MAILの発現・機能解析平成12年度の検討により、MAILが海馬の顆粒細胞で誘導されることを見出した。平成13年度は培養神経細胞株にMAIL cDNAの導入を試みたが導入効率が低く解析できなかった。そこで、神経細胞への導入効率が優れているアデノウイルスベクターにMAIL cDNAを組み込む作業を行った。また、MAILのゲノム構造を明らかにし(Immunogenetics)、これを基にMAILノックアウトマウス作製に着手した。これらの解析は今後の課題である。一方、全身臓器でのMAILの発現をin situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学的手法で調べ、Bリンパ球やマクロファージ、肝細胞など生体防御に深く関わる細胞で誘導されることを見出した。したがって、この分子は神経系における役割以外に、免疫系においても重要な役割を果たしていると思われる。生体に心理的、肉体的なストレスが負荷されると、下垂体-副腎皮質系及び交感神経系を介して免疫機能が変化することはよく知られている。そこで研究者はこれらの反応に関わる脳内の分子機構を明らかにするために、大腸菌菌体内毒素投与(LPS)などのストレスをマウスに負荷した後に発現量が変化する脳内遺伝子を検索し、45個の候補遺伝子を見出した。本年度はこの中でも顕著に増加したクローン131.5と142.5について、以下の検討を行った。1、131.5及び142.5の塩基配列決定と抗体、発現ベクターの作製。cDNAライブラリーを用いて131.5及び142.5のmRNA配列を決定した。131.5はラットでクローニングされているSSeCKSの異種ホモローグであった。また、142.5は新規のIkB様のアンキリンリピートタンパク質であり、Molecule possessing Ankyrin-repeatsInduced by LPS(MAIL)と名付けた(FEBS Lett)。それぞれの組み換えタンパク質をウサギに免疫し、抗体を作製した。また、これらやこれらの変異体やアンチセンス鎖を発現するベクターを構築した。2、SSeCKSおよびMAILの脳内発現パターンの解析。1で明らかとなったcDNA配列を元にオリゴヌクレオチドプローブを作製し、in situハイブリダイゼーション法で脳内での発現部位を調べた。SSeCKSは脳軟膜、微小血管に加えて、コルチコトロピン放出ホルモンニューロンの豊富な視床下部室傍核付近に強いシグナルが見られた。また、142.5は脳軟膜に強いシグナルが、海馬の顆粒細胞に弱いシグナルがそれぞれ見出された。3、MAILの機能解析。MAILの細胞内局在を蛍光タグ付き発現ベクターを用いて調べたところ核に局在することが明らかとなった。またこの遺伝子を導入した細胞では、種々の中枢作用を有するインターロイキン6の産生能が高まることが明らかになった(FEBS Lett)。

仮足構造は貧食能の旺盛な細胞に典型的な構造であることから、SSeCKSと貧食の関係について調べたところ、SSeCKS導入内皮細胞ではデキストラン取り込み能の顕著な上昇がみられ、取り込まれたデキストランはSSeCKSと共在した。また免疫電顕法によりSSeCKSが取り込み小胞と共在することも見出した。以上のことからSSeCKSは物質取り込みに関わる分子であることが判明した。末梢臓器から脳実質に運ばれた液性情報伝達分子がニューロンを刺激することが、ストレス時の脳-免疫連関の賦活化に必須であると言われている。この際、脳血管内皮細胞は血流からの物質の取り込みと実質への放出を担うが、SSeCKSはこのうち、取り込みに関与していると思われる。2、MAILの発現・機能解析平成12年度の検討により、MAILが海馬の顆粒細胞で誘導されることを見出した。平成13年度は培養神経細胞株にMAIL cDNAの導入を試みたが導入効率が低く解析できなかった。そこで、神経細胞への導入効率が優れているアデノウイルスベクターにMAIL cDNAを組み込む作業を行った。また、MAILのゲノム構造を明らかにし(Immunogenetics)、これを基にMAILノックアウトマウス作製に着手した。これらの解析は今後の課題である。一方、全身臓器でのMAILの発現をin situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学的手法で調べ、Bリンパ球やマクロファージ、肝細胞など生体防御に深く関わる細胞で誘導されることを見出した。したがって、この分子は神経系における役割以外に、免疫系においても重要な役割を果たしていると思われる。
集合住宅における住戸集合形態と居住性評価に関する研究

本研究は,(1)住戸集合形態の分析,および(2)居住性評価からなる。(1)住戸集合形態の分析では,建築関係の雑誌等から配置図や緒元を収集し,各部の長さ・面積を計測する予定であったが,適切な縮尺の図面を入手できた事例数が少なく,形態によるグル-ピングを行うまでには至らなかった。入手した事例については,密度別に緒元や立地などの整理を行った。(2)居住性評価としては,新しい集合住宅9事例,竣工後10年以上経過した2事例について観察調査を実施した。近年供給された集合住宅の空間構成の特徴としては,回廊,デッキ,住棟内プレイスペース,中庭といった半公的空間を多くとる事例が目立った。半公的空間に私的空間が直接面するような事例では,居住者がバリアを設ける(半公的空間である中庭に直接面する居間の窓の外側に目隠しとしてヨシズなどを立て掛ける等)事例が観察され,適切な段階構成を行う必要性が示唆された。屋内プレイスペースでは子どもの遊びはほとんど観察されなかった。また,屋外共有空間では駐車スペースの処理の仕方として,平面的な駐車場以外にも2段式機械駐車場,地下駐車場が採用されることが多いこと,舗装されたドライな仕上げが目立つ等の特徴がみられた。
英語でのスピーキングにおいてWTCの伸長を図る指導の効果

英語で話すことに対する抵抗感を授業での取組で軽減できるのかどうかという点について検証するために,SPM(Sentences Per Minute)と呼ばれる指導方法を用いて実際に授業を行い,抵抗感を軽減できるのかどうか検証した。大学生を対象にした授業においてSPMを取り入れ,3週間にわたる指導を行った。その前後での抵抗感のデータを比較した結果,多くの学習者で抵抗感が軽減されており,指導の効果があったことが示された。本研究は、英語でのスピーキングにおいてWTC(コミュニケーションを図る意思)の伸長を目的とした授業実践を行い、その効果を検証することを目的とした2年間の研究である。1年目である平成19年度は、そのパイロットスタディーとして、効果測定に用いるための尺度作成が目的であった。そのために、英語で話すことに対する抵抗感を測定するための質問紙尺度を作成した。抵抗感はWTC研究に基づき、英語で話すことに対する能力認知が低いこと、英語で話すことに対する不安が高いこと、発話の回避、といった3つの要因からなるとし、それらを測定する項目(15項目、各要因5項目ずつ)を作成した。これを、次年度の本調査の対象と同じ授業において実施し、165名からデータを得た。項目の選択においては、本調査が実際の授業内で行われるため、授業の妨害を少なくするために項目をできるだけ少なくすることが望ましい。そのため本分析では、確認的因子分析を用いて適合度を基に項目の選択を行った。その結果、各要因を3項目により測定するモデルが採択され、計9項目による尺度が作成された。各要因のクロンバックαの値は内的整合性が十分に高いと解釈できる範囲にあり、また項目の内容から妥当性も問題ないと判断された。次年度は、この尺度を用いて授業の効果を測定する。また、尺度が研究対象となる学生よりも広い範囲に適用可能かどうかという点についても検証し、作成された尺度の応用範囲を広げる予定である本研究は,英語でのスピーキングにおけるWillingness to Communicate(積極的に英語で話そうとする態度)を育成することを目的とした指導の効果を検証した。特に,不安などのスピーキングに対する抵抗感を軽減することをねらいとし,実際の授業でSPMと呼ばれる指導法を実践し,その前後で抵抗感に変化があるのかどうか分析した。対象となる授業は,大学1年生を対象としたスピーキングの授業で,必修の授業であった。さまざまな専攻の学生が履修するが,英語を専門とする学生はいなかった。この授業でSPMという,制限時間内に発する文の数を伸ばす活動を取り入れた指導を行い,指導の前後で抵抗感の変化を,平均値の水準での分析(t検定)と学習者個人の水準で分析(クラスター分析)を行った。抵抗感の測定は,否定的な能力認知,不安,話すことの回避の3つの因子からなる質問紙を用いた。その結果, 3つの因子すべてにおいて,平均値の水準で統計的な有意差が見られ,全体的な傾向として抵抗感が軽減されたことが示された。また学習者個人の水準の分析では, 3つの因子のパターンにより学習者を群分けし,当初どのような抵抗感を持っていた学習者が,指導後にどのような変化をしたか分析を行った。その結果,当初抵抗感が強いと判断された学習者が多数いたが,その群でも抵抗感の軽減が起こっていたことが示された。また,その他の群でも,当初の抵抗感が強くなくても,軽減が起こっていたことが示された。
エステル化に基づいたＭＣＰＤおよびグリシドールの同時定量法の開発

本研究は油脂加工品中の健康懸念物質であるモノクロロプロパンジオール類(2-MCPDと3-MCPD)とグリシドールの定量法を開発することを目的としている。本研究では、2-MCPDの合成法を開発し、これを用いて公定法中の化合物変換をNMRにより直接観測することで3-MCPD、2-MCPD、およびグリシドールのDGF公定法中の化合物変換を明らかとした。さらに、実際の油脂に既知量のグリシジル脂肪酸エステルを添加することにより、公定法処理で2-MCPDおよび3-MCPDに変換する量を定量した。その結果、グリシジルエステルを多く含む油脂はMCPDを多量に生成するため誤定量の原因となることがわかった。このためにはそれぞれの純物質を標品として必要とするが、研究開始当初、2-MCPDは市販されておらず、その合成法も確立されていなかった。本研究ではエピクロロヒドリンを出発原料として1,3-ベンジルエーテル化、2-クロロ化、1,3-脱ベンジルエーテルの3ステップで10グラムスケールの2-MCPDを合成する手法を開発した。これまで油脂中の3-MCPD量はドイツ公定法(DGF standard methods C-VI 18(10))のassay Aによって、グリシドール量はassay Bによって定量することができるとされていたが、我々は公定法中の化合物変換をNMRにより直接観測することで3-MCPDとグリシドールから5%程度の2-MCPDが生成することを明らかとし、この定量法が2-MCPDの生成を無視しているという問題点を明らかとした。さらに油脂中には初めから微量ながら2-MCPDが存在することを明らかとし、さらにこの2-MCPDも公定法処理中に一部が3-MCPDに変換されることを明らかとした。ただし、これらの変換は実際の定量に影響を及ぼさない程度である。さらに、本研究では実際の油脂に既知量のグリシジル脂肪酸エステルを添加することにより、公定法処理で2-MCPDおよび3-MCPDに変換する量を定量した。その結果、油脂の脂肪酸種にかかわらず95%程度の3-MCPDと5%程度の2-MCPDに変換されることが明らかとなった。すなわちグリシジルエステルを多く含む油脂はMCPDを多量に生成するため誤定量の原因となりやすいことがわかった。本研究は2-MCPDを含む油脂リスク物質の標品を合成し、その同時定量を行うことを目的としている。平成24年度では2-MCPDの合成法を確立し、2-MCPD、3-MCPD、およびグリシドールのエステル化標品を合成することを計画していた。2-MCPDの合成について、従来まったく合成できていなかったが、本研究では3ステップで効率よく合成する手法を開発した。特に最終ステップでは研究費で購入した高圧反応装置を用いることにより、2-MCPDジベンジルエーテルから高温高圧条件でパラジウム触媒と水素を作用させることにより2-MCPDが生成することを見出した。この手法によりこれまで合成されていなかったリスク懸念物質である2-MCPDのグラムオーダーでの合成を達成した。2-MCPD、3-MCPD、グリシドールのエステル体標品合成について、2-MCPDおよび3-MCPDのエステル体の合成は塩基性溶媒中酸クロリドとの反応で合成することができるが、グリシドールを原料に合成を行うと予期しない3-MCPDエステルが一部得られることがわかった。そのため、縮合剤としてEDCを用いた反応により合成実験を行ったところ、良好な収率でグリシジルエステルを得ることができた。また、酸無水物との反応でもそれぞれのエステル体を合成可能であることがわかった。この手法により、単純な前処理で2-MCPD、3-MCPD、およびグリシドールのエステル化処理を達成することができた。これらの研究成果を学会等で発表し、論文にまとめた。研究実績の概要にも示したように、平成24年度の前半で2-MCPDの合成法を確立し、後半で2-MCPD、3-MCPD、およびグリシドールのエステル体の標品を合成することができた。よって、当初予定していた目標は完全に達成されており、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。

最終年度となる平成25年度では、合成した標品のクロマトグラフィーによる分離の確認と、実際の油脂中からの抽出、エステル化、検出の一連の分析法の確立を目指す。本研究では比較的分子量の低いエステル体に誘導していることから、ガスクロマトグラフィーとFID検出器による定量を行う予定である。また、実際の油脂からの2-MCPD、3-MCPD、およびグリシドールの抽出はエクストリルート珪藻土カラムによる固相抽出を行う予定である。抽出やエステル化に用いる試薬、溶剤、消耗品を購入する予定である。また、クロマトグラフィーに関連する消耗品を購入する予定である。研究で得られた成果を学会発表するための旅費や論文投稿するための投稿費等に研究費を使用する予定である。その他の研究必需品にも研究費を使用する予定である。
SEMA4Aを介した神経・免疫クロストークによる好酸球性副鼻腔炎病態解明

好酸球性副鼻腔炎患者では他副鼻腔疾患患者と比較して血清SEMA4A濃度が有高い結果であったが、臨床病勢との相関は認められなかった。先行実験からSEMA4Aが欠損すると好酸球の寿命が短縮することがわかっており、同系統マウス(SEMA4A欠損マウスおよびWTマウス)より採取した骨髄由来好酸球に対して脱顆粒能および遊走能について評価を行ったが差は認められなかった。また骨髄由来好酸球に対して網羅的解析を行った結果、SEMA4A欠損マウス由来の好酸球においてCXCL12の遺伝子発現レベル亢進を認めた。鼻腔上皮細胞に対するSEMA4A刺激実験によってMMP-1蛋白の産生亢進が認められた。副鼻腔疾患患者において血清SEMA4A濃度を引き続き測定することによって、好酸球性副鼻腔炎患者においては他副鼻腔疾患患者と比較してより高い数値が検出される結果をえた。好酸球性副鼻腔炎患者における血清SEMA4A濃度はポリープスコアや血中の好酸球数、好酸球(%)との相関は認められなかった。また好酸球においてIL-5刺激が引き起こす細胞内シグナルの変動についてSEMA4Aが与える影響を評価するため野生型マウスとSEMA4Aノックアウトマウスより採取した骨髄由来好酸球に対するIL-5刺激実験を行った。以前の実験では刺激に用いたIL-5の濃度依存的にSTAT5のリン酸化の増強が野生型では認められており、SEMA4Aノックアウトマウスにおいては同反応の減弱化を認めていた。今回IL-5の濃度を固定し刺激時間に変化をつけ両系統の比較を行ったところ、野生型マウスと比較してSEMA4Aノックアウトマウスにおいては刺激15分の時点で特にSTAT5のリン酸化が減弱するという結果が得られた。骨髄由来好酸球を用いたその他の実験としてO-フェニレンジアミンを用いた脱顆粒アッセイについて両系統間の差を評価した。その結果、野生型・SEMA4Aノックアウトマウスいずれから誘導した骨髄由来好酸球においてもLPS刺激によって脱顆粒は誘導されたが、両系統間に差は認められなかった。またSEMA4Aの好酸球遊走能への影響を評価するため、両系統マウスに対してキチンをマウス腹腔内に注射し腹水を回収した後、腹水中細胞をフローサイトメトリー法を用いて評価する系で好酸球の郵送能について評価を行ったが差は認められなかった。当初患者血液および組織より好酸球を単離しmRNAを作成し、PCRによる遺伝子発現レベルの評価を行う予定であった。しかし好酸球内に多量に含まれるRnaseの影響およびもともと含有のmRNA量が少ないという理由から必要量のmRNAを確保する手法の確立に時間を要した。前年度に引き続き野生型マウスおよびSEMA4Aノックアウトマウス両系統より誘導した骨髄由来好酸球に対するIL-5刺激実験を行った。前年度の実験からSTAT5のリン酸化反応においてSEMA4Aが不可欠であるという結果が得られたが、その他の経路としてErkおよびAktのリン酸化について同様の評価を行ったところ両経路において明確な差は認められなかった。ECRS患者血中好酸球および組織中好酸球よりmRNAを採取し、両群の比較をPCR法を用いて行ったがSEMA4Aの発現レベルに差は認めらなかった。ヒト血液中好酸球におけるSEMA4A受容体の検索に関してPCRの結果可能性が考えられたPlexinB2、PlexinD1、NRP1についてフローサイトメトリー法を用いて検討を行ったがいずれの受容体も蛋白レベルでの明確な発現が認められなかった。このため鼻茸構成細胞中の他細胞でSEMA4Aの受容体を発現する細胞を検索したところ、鼻腔上皮細胞においてPlexinB1、PlexinB2、Nrp1の発現が認められることが免疫染色上確認された。鼻腔上皮細胞に対するSEMA4A刺激実験を行いRNA-sequenceを用いた網羅的解析を行ったところ基本遺伝子発現量1以上かつSEMA4A刺激によってMatrix metalloproteinase (MMP)-1、およびMMP-10が有意に遺伝子レベルの発現増加を認めた。今回の研究からSEMA4Aが好酸球性副鼻腔炎において鼻腔上皮に作用しMMPの産生を誘導、上皮リモデリングを促進することによって難治性鼻茸形成に寄与している可能性が示唆された。好酸球から安定したmRNAの確保を行う手法について上記のとおり確立したため、今後患者検体を用いて組織および血液中好酸球よりmRNAを確保しSEMA4Aの発現について比較を行う。また計画書に記載した好酸球におけるSEMA4Aの受容体に関して蛋白レベルでの発現を評価し、SEMA4A自体が好酸球に与える作用について今後検討していく。

また好酸球に対して与える作用が明確に確認できなければ周囲細胞において候補となる受容体を発現している上皮細胞についての作用を検討していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。耳鼻咽喉科・頭頸部外科29年度が最終年度であるため、記入しない。
ゼロエミッション化フリーデルクラフツ反応のための触媒設計

燃料の環境負荷低減のためガソリン等からの脱芳香族化が法制化されている。これに伴い大量の芳香族化合物が余剰となる。本研究はこの余剰芳香族化合物をファインケミカルズ業界において資源として有効利用する事で、業種間のゼロエミッションシステムを確立する事目的とし、そのキープロセスであるフリーデルクラフツ反応の改良をはかるため行なった。同反応は塩化アルミニウムを触媒とし、酸塩化物を反応試剤として用いる。これらは最終的に加水分解を経て廃棄されるため、環境負荷の非常に大きなプロセスである。本研究では塩素を使わないプロセスへの転換を目指し、酸無水物を反応試剤とした系を実現する新しい触媒の設計を試みた。昨年度までにトルエン及びベンゼンと無水安息香酸の反応を検討し、セシウムで部分的にイオン交換したタングスト燐酸を用い、高温で反応を行うことにより、塩素を使用しないフリーデルクラフツプロセスが可能であることを示した。本年度は、1)触媒の繰り返し使用についての検討と2)ベンゼンと様々なアシル化剤の反応を検討した。1)ベンゼンと無水安息香酸の系において、見かけ上、反応が停止した時点で反応物を追加すると反応が再開することから、触媒活性は持続すると考えた。そこで触媒を分離して、再度反応に用いたところ、活性は低下した。各種添加物の影響を調べ、生成物と触媒が錯体を形成し反応を阻害している可能性が示唆されたため、触媒の洗浄を行ったところ活性はかなり回復した。現在T.N=60程度まで、高選択性を維持した繰り返し利用が可能となった。2)無水酢酸と無水プロピオン酸をアシル化剤としたベンゼンの反応を試みた。触媒のスクリーニングの結果は、無水安息香酸の系と異なり、ナトリウム部分イオン交換体が高い活性を示した。装置上の制約から反応温度の上限が、150°Cであり、このため収率はいずれの反応物についても10-20%であった。高温での高収率が期待される。このように、反応物に応じた触媒と反応条件の選択を適切に行えば、塩素フリープロセスの実現も可能である。
ユニタリ表現の分岐則における重複度1定理と余随伴軌道の幾何

リーマン多様体における不連続群の場合と異なり、アファイン変換群の離散部分群を微小変形としたとき作用の不連続性が崩れることがある。一般の(不変なリーマン構造をもたない)等質空間における不連続性の変形の局所構造を解明するために、群論的な観点を用いて不連続群に関する「局所剛性」(非自明な微小変形が可能か)「安定性」(微小変形が不連続性を保つか?)「変形空間」(離散部分群の変形で、しかも不連続性を保つものの同値類)といった概念を導入し、その基礎的な性質を調べた。さて、半単純リーマン対称空間においては、高次元であっても「剛性定理」が成り立たない余コンパクトな不連続群の例が研究代表者の小林俊行によって発見されているが、「安定性」については多くの場合成り立つ(例えばGoldmanの予想)。一方、冪零等質空間における不連続群の変形については、「安定性」がどの程度崩れうるのかといった基本的な問題が解明されていなかった。そこで、新しい現象を探る目的で、不連続群が階数kの自由可換群と同型であり、k+1次元のユークリッド空間に冪零なアファイン変換として作用しているという状況に絞って、不連続群の変形の詳しい研究を行った。まず、冪零等質空間における不連続性の判定条件(Lipsman予想)を用いて、不連続群の変形空間を完全に決定し、特に「安定性」の崩れる点の局所構造を記述し、もとの空間の次元が奇数か偶数かによって変形空間の次元が不規則に変化する理由を明らかにした。分担者のNASRIN, Salmaは2005年7月に開かれた数理解析研究所研究集会「群の表現と調和解析の広がり(研究代表者:慶応大学河添健氏)」において主結果についての1時間講演を行い、証明のアイディアをプロシーディングスとして数理解析講究録[第1論文]に著した。さらに、完全な証明を書いた本論文を学術誌[第2論文]に著した。ユークリッド空間にアファイン変換として作用する不連続群の変形空間を研究した。まず、アファイン変換群の部分群となる2ステップ冪零リー群の中に含まれる離散部分群を変形し、ユークリッド空間に固有不連続に作用するパラメータ空間を完全に決定した。特に、この不連続群は局所剛性をもたず、従って、内部自己同型群による無駄を省いた変形空間(リーマン面のタイヒミラー空間に相当する概念)は正の次元をもつ。その次元は、もとの空間の次元が奇数か偶数かによって公式が異なることを発見した。さらに、微小な変形で固有不連続性が保たれないという現象が見出された。この現象は、3次元のローレンツ空間形の基本群に関するGoldmanによる予想(小林,Saleinにより証明)と対極にある。以上の結果は研究代表者の小林俊行と研究分担者のNasrin, Salmaの共著論文[1]で発表した。その証明には、Nasrin, Salmaが以前に証明した「2ステップ冪零リー群におけるLipsman予想の証明」を用いる。さて、表現の分岐則(部分群に制限したときの既約分解)が最も理想的に振舞うのは各規約表現の重複度が1になる場合である。研究代表者の小林俊行は、表現が無限次元および有限次元の場合に、分岐則が重複度1になるための複素幾何的な条件を発見し、それを証明した。さらに、複素多様体におけるvisible actionが、リーマン多様体におけるpolar actionやシンプレクティック多様体におけるcoistropicな作用の相互の関係を発見し論文[3]で報告した。研究分担者のNasrin, SalmaはHermite対称空間に関する最高ウェイト表現の重複度1定理の古典的極限としてCorwin-Greenleaf関数が0か1しか値を取らないことを証明し、日本数学会の年会で講演を行い、その報告を[2]に著した。

分担者のNASRIN, Salmaは2005年7月に開かれた数理解析研究所研究集会「群の表現と調和解析の広がり(研究代表者:慶応大学河添健氏)」において主結果についての1時間講演を行い、証明のアイディアをプロシーディングスとして数理解析講究録[第1論文]に著した。さらに、完全な証明を書いた本論文を学術誌[第2論文]に著した。
希釈された2次元ISING三角格子反強磁性体のスピングラス的挙動の研究

我々はデラフォサイト構造を持つ三角格子反強磁性体CuFeO_2におけるFe^<3+>のsiteを非磁性のAl^<3+>で置き換え、スピンフラストレーションを制御することによって、その役割を明らかにしようと試み、これまでCuFe_<1-x>Al_xO_2粉末試料の中性子回折実験を行なってきた。本研究はその延長として、(1)単結晶中性子回折実験による非希釈系の中間相および希釈系の低温相の再検証、(2)規則格子上に内在するスピンフラストレーションに加えて希釈操作におけるランダムネスの注入によるスピングラス相の出現を調べるという2つの目標を持って行われた。(1)についてはフラックス法により10^*10^*0.8mm^3程度の良質単結晶試料を得ることに成功し、これまで非希釈系の中間相および希釈系の低温相では、磁性イオンである軌道一重項Fe^<3+>のハイゼンベルグ自由度を生かして部分的にフラストレーションを解消し、ヘリカル構造に秩序化すると考えてきたが、むしろスピン密度波構造を取ることを単結晶試料を用いて逆格子空間上でその構造を直接見ることにより見出し、第三近接までの反強磁性交換相互作用が三角格子の幾何学のうえで相互に競合するためにスピン密度波構造が妥当であることを分子場の計算により定性的に示し、以前のメスバウアー効果で求められた中間相における内部磁場の広い分布も説明できることも示した。また(2)については、DC-SQUID磁化測定により得られた0.00【less thanor equal】x【less than or equal】0.85の範囲のデータをもとに粉末試料中性子回折実験を全濃度領域で行い、最低温(T=1.5K)におけるDiffuse ScatteringおよびZFC、FC磁化の差から混晶系でのスピングラス相の出現を確認し、規則系において既にフラストレーションが存在する系にランダムネスを注入する事情を反映した希釈型スピングラスと比較して容易にスピングラス相が出現する新たな磁気相図を得た。
物理的刺激が骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響―情報伝達系に対する分子生物学的検討―

重力と電磁場は両者ともに強度依存的にALPase活性を上昇させたことから、mechanical stressはヒト由来骨芽細胞様細胞の分化を促進することが示唆された。さらに、パルス電磁場負荷が、confluent以前のALPase活性を抑制したことから、増殖期にある細胞に対して増殖促進効果がある可能性が示唆された。F6-1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D3は、重力や電磁場に対するヒト由来骨芽細胞様細胞の反応に、有意な影響を与えることも明らかとなった。また、通常、細胞表面に結合しているALPase活性と、非コラーゲン性の基質蛋白質であるBGP産生能は互いに相関するが、病態によっては時に相違が見られる。今回、重力負荷とパルス電磁場負荷で、BGP産生能が異る反応性を示したことは興味深い。Mechanical stressは、細胞レベルでヒト由来骨芽細胞様細胞の分化・増殖を制御していることが確認された。また、RANKLおよびTNF-αによる破骨細胞誘導時に遠心力をかけた群とかけない群では、優位な差はなかったことから破骨細胞誘導には遠心による重力の影響はないと考えられる。これらのことからMechanical stressは骨芽細胞様細胞には分化・増殖促進に働き、破骨細胞には影響がないことから骨形成に有用であることが示唆された。1)骨芽細胞はヒト正常皮質骨より初代培養法にて採取した。破骨細胞はマウス由来骨髄細胞に1,25(OH)2D3を添加して採取した。2)力学的刺激として500から1500回転の遠心力を20分間、12時間ごとに負荷した。電気的刺激として0から7ガウスのパルス電磁場を連続的に負荷した。3)各種細胞内情報伝達経路の特異的阻害剤を添加して培養し、物理的刺激に対する反応性の変化を検討した。また物理的刺激によって骨芽細胞が産生するprostaglandinの同定を試みた。4)ALPase活性、BGP産生能を測定し、骨芽細胞の分化過程を評価した。さらにVon Kossa染色を行い画像解析で石灰化能を評価するための解析プログラムの開発を試みた。TRACP染色を行い破骨細胞の形成能を評価した。さらにdentine slice上で培養しその吸収窩を染色して画像解析で吸収能を評価するための解析プログラムの開発を試みた。5)結果ならびに考察:遠心力負荷により骨芽細胞のALPase活性、BGP産生能は強度依存的に上昇した。破骨細胞の形成能に著名な変化は認められなかった。一方、パルス電磁場負荷により骨芽細胞のALPase活性は強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。破骨細胞の形成能はわずかに上昇する傾向が認められた。パルス電磁場を負荷した骨芽細胞にindomethacinを添加すると、濃度依存的に反応が減少した。しかしCalphostin Cには反応しなかった。以上より、物理的刺激は骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。prostaglandin産生が関与していたことは骨芽細胞を介して破骨細胞に作用している可能性が示唆された。両刺激に対する細胞応答が違ったことから、物理的刺激の種類によって、反応経路が異なる可能性も示唆された。今回、骨芽細胞の石灰化能ならびに破骨細胞の吸収能を画像解析するプログラムの開発を試みたが確立には至らなかった。破骨細胞はマウス由来骨髄細胞に1α,25(OH)_2D_3を添加して採取した。

さらにVon Kossa染色を行い画像解析で石灰化能を評価するための解析プログラムの開発を試みた。TRACP染色を行い破骨細胞の形成能を評価した。さらにdentine slice上で培養しその吸収窩を染色して画像解析で吸収能を評価するための解析プログラムの開発を試みた。5)結果ならびに考察:遠心力負荷により骨芽細胞のALPase活性、BGP産生能は強度依存的に上昇した。破骨細胞の形成能に著名な変化は認められなかった。一方、パルス電磁場負荷により骨芽細胞のALPase活性は強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。パルス電磁場を負荷した骨芽細胞にindomethacinを添加すると、濃度依存的に反応が減少した。しかしCalphostin Cには反応しなかった。以上より、物理的刺激は骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。しかしながら、RANKLおよびTNF-αによる破骨細胞誘導時に遠心力をかけた群とかけない群では、有意な差はなかったことから破骨細胞誘導には遠心による重力の影響はないと考えられる。骨髄細胞培養系にM-CSFとRANKLを添加し、破骨細胞形成系を確立した。この破骨細胞形成に力学的刺激として遠心機をもちいて遠心力を加え、また電気的刺激としてパルス電磁場による刺激を加え、破骨細胞形成への影響を検討した。(1)5週令雄のddYマウスの大腿骨および頸骨から骨髄細胞を採取した。全骨髄細胞をM-CSFおよびRANKLまたはTNF-α存在下で48穴ウェル細胞培養用ディッシュにて15日間培養した。培地は10%FBSを含むα-MEMを使用した。力学的刺激として遠心機を用いて細胞に1500回転(1000G)の遠心力を24時間ごとに1時間負荷した。5日間培養した後、TRAP染色を行いその形成を観察した。(2)同様にこの破骨細胞形成系に電気的刺激としてパルス電磁場による刺激を加えるためそのパルス電磁場の強さ、負荷の時間および間隔等を検討した。(3)結果ならびに考察・RANKLによる破骨細胞誘導:ddYマウスから採取した全骨髄細胞からのRANKL存在下での培養において、TRAP陽性細胞数は3日目急激に増加した。細胞数のピークは単核では3日目、多核では4日目でありその後減少した。単核細胞数の減少は融合して多核細胞になるためであり、多核細胞数の減少は多核細胞の融合で、多核細胞1個あたりが占める面積が増すためと考えている。・TNF-αによる破骨細胞誘導:全骨髄細胞をM-CSF存在下でTNF-α単独で作用させた場合、破骨細胞様細胞が形成され、用量依存的にその数は増加した。24時間ごとに破骨細胞分化を観察したところ、72時間後から分化が認められるようになった。・RANKLおよびTNF-αによる破骨細胞誘導時の遠心力の影響:RANKLおよびTNF-αによる破骨細胞誘導時に遠心力をかけた群とかけない群では、優位な差はなかったことから破骨細胞誘導には遠心による重力の影響はないと考えられる。
リボ核タンパク質複合体酵素の構造活性相関と耐熱性

超好熱性古細菌(Pyrococcus horikoshii)由来リボ核タンパク質酵素・RNase Pの構成タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動法による解析から、RNAアニーリング促進活性とRNAシャペロン活性を有している事が明らかになり、これら両活性がRNase Pの触媒活性の活性化に関与していることを示唆した。さらに、PhoRpp38とPhopRNAの相互作用を熱力学的に解析した。その結果、それらの結合定数は1.56 x 107 M-1で、PhoRpp38は2つのステムループ構造に同等の親和性により結合することが分かった。以上の結果より、PhopRpp38のPhopRNAへの結合が、CドメインとSドメインの適切な配置をもたらし、さらにPhopRNAの塩基スタッキングを増加していることを示唆した超好熱性古細菌(Pyrococcus horikoshii)由来リボ核タンパク質酵素・RNase Pの構成タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動法による解析から、RNAアニーリング促進活性とRNAシャペロン活性を有している事が明らかになり、これら両活性がRNase Pの触媒活性の活性化に関与していることを示唆した。以上の結果より、PhopRpp38のPhopRNAへの結合が、CドメインとSドメインの適切な配置をもたらし、さらにPhopRNAの塩基スタッキングを増加していることを示唆した超好熱古細菌(Pyrococcus horikoshii)リボヌクレアーゼP (RNase P)は、触媒活性をもつRNA(PhopRNA)と5種のタンパク質から構成されている。本研究では、PhopRNAの高次構造を塩基配列比較と既知の細菌RNase P RNAの構造情報に基づき推定し、そのモデル構造をX線小角散乱により検討した。まず、既知のRNase P RNAの塩基配列の比較からPhopRNAの二次構造を再検討した。その結果、31%のヌクレオチドが塩基対を形成し16本のステム構造(P1P16)を形成していること、さらにステム構造P12.2にK-turnモチーフが推定された。続いて、既知の真正細菌RNase P RNAの結晶構造情報とRNA構造作成プログラム(ERNA-3D)を用いてPhopRNAの高次構造モデルを作製した。PhopRNAは各ステム内やステム間の塩基対とスタッキング相互作用により、分子サイズ110Ax95Ax21Aの高次構造を形成していることが推定された。次に、PhopRNAの構造モデルを検証するために、PhopRNAの構造をX線小角散乱により解析した。その結果、PhopRNAのX線小角散乱曲線(ギニエプロット)はモデル構造のそれとよく一致し、X線小角散乱法により得られた構造と良く重なることが分かった。研究目的リボヌクレアーゼP (Rnase P)は、前駆体tRNAの5'末端余剰配列のプロセシングを触媒するRNA酵素(リボザイム)である。申請者は、超好熱古細菌(Pyrococcus horikwshii OT3)のRnase P(PhoRNase P)が、触媒活性を持つRNAサブユニットと5種のタンパク質から構成されていることを明らかにした。平成23年度の研究では、以下のことを明らかにした。1)4種のタンパク質は2種のタンパク質複合体(PhoPop5-PhoRpp30とPhoRop21-PhoRpp29)を形成し、PhoRNAの分子シャペロンとして機能している。2)5番目のタンパク質乃PhopRpp38は2つのステムループに結合し、PhopRNAの耐熱性を上昇していることを熱力学的解析により明らかにした。3)PhopRNAの5種のステムループ構造の活性への寄与を検討することにより、いずれも触媒活性には直接寄与していないものの、各ステムループはPhopRNAの構造形成に重要であることを明らかにした。4)PhopRNAの高次構造モデルを作成するとともに、その溶液構造をX線小角散乱により解析し、PhopRNAの高次構造モデルを検証した。我々は超好熱アーキア(Pyrococcus horikoshii)RNase Pが、触媒活性を持つRNA(PhopRNA)と5種のタンパク質(PhoPop5, PhoRpp21, PhoRpp29, PhoRpp30, PhoRpp38)から構成され、PhoRpp38を除く4種のタンパク質とPhopRNAからなる再構成酵素(R-4P)が55°Cで最大酵素活性を示すのに対し、5種のタンパク質とPhopRNAを含む再構成酵素(R-5P)は70°Cで最大酵素活性を示すことを明らかにした。また、蛍光標識した相補的塩基配列を持つ2本のRNA鎖(21 nt)(Cy3-オリゴ-1とCy5-オリゴ-2)を用いた実験より、PhoPop5とPhoRpp30がRNAの会合と解離をともに促進することを見出し、これらの活性がPhopRNAの活性化に関与していることを示唆した。さらに、PhopRNAのヘリックスP3とP8を含む2本のステムループ構造の変異体(ΔP3とΔP8)を作成し、触媒活性への関与について検討したところ、変異体ΔP8では、kcatは変化しなかったがKMは49.2 μMに増加し、ΔP3ではKMは変化しなかったがkcatが0.89 min-1に減少した。