hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高選択的不斉触媒反応の開発

新しい効率的な不斉触媒の開発について検討した結果、酒石酸より誘導されるキラルな1,4-ジオ-ルを導入したチタン化合物が、キラルなルイス酸として、以下に示す各種反応に有効に利用できることが明らかになった。1.アクリル酸誘導体およびフマル酸誘導体と各種ジエンとの不斉Diels-Alder反応が、上記触媒とモレキュラ-シ-ブ4Aを組合わせ用いることにより、高い不斉収率で進行する。また分子内不斉Diels-Alder反応にも適用した結果、各種二環性化合物がほぼ光学的に純粋に合成できることが分った。2.キラルなチタン触媒は、アクリル酸誘導体とケテンジチオアセタ-ル、ビニルスフィド、アルキニルチオエ-テルとの[2+2]付加環化反応を促進し、各種シクロブタン、シクロブテンが極めて高い光学純粋で得られる。3.分子内エン反応が、キラルなチタン触媒により高エナンチオ選択的に進行する。シクロペンタノン、シクロヘキサノン誘導体が、簡便に、しかも高い不斉収率で合成できる。4.キラルなチタンは、アルデヒドの不斉ヒドロシアノ化の反応促進剤となり、各種アルデヒドより対応する光学活性ヒドロシアンが高選択的に生成する。5.ラセミカルボン酸、エポキシドの速度論的光学分割を、キラルなチタンを用いて検討した結果、触媒的にしかも高い選択性で分割が行なえることを見出した。上述した不斉反応を利用し、オキセタノシンの炭素類縁体、グランジソ-ル、ε-カジネンなどの生理活性物質を、光学的に純粋に合成することもできた。すでに我々は酒石酸から容易に誘導することのできるキラルなレチ-ジオールとジクロロジイソプロポキシチタンを混合することにより容易に調製することのできるキラルな環状チタンアルコキシドが、不斉Diels-Alder反応の有効な不斉触媒として働くことを見い出している。本年度はまず、このキラルなチタンアルコキシドが分子内不斉Diels-Alder反応にも有効であり、触媒量のチタンアルコキシドを用いるだけで種々の有用な合成中間体を高エナンチオ選択的に合成できることを見い出した。また、このキラルなチタン触媒は、Diels Alder反応にみられず、分子内不斉エン反応にも有効なルイス酸として働き、シクロヘキサン誘導体、シクロペンタン誘導体をそれぞれ90%ee前後の高い光学収率で合成することができた。さらにこのキラルなチタン触媒は、シアノトリメチルシランをシアノ化剤として用いるアルデヒドの不斉ヒドロシアノ化反応にも有効であり、反応条件を変えることにより、脂肪族・芳香族アルデヒドいずれの場合にも対応する光学活性シアノヒドリンが高い光学収率で得られることを見い出した。又、テトライソプロポキシチタンとキラルなレチ-ジオールを混合して調製したキラルなチタンイソプロポキシドは、ラセミのカルホン酸2-ピリジンチオールエステルの不斉エステル化剤として有効であり、カルボン酸の速度論的光学分割が高エナンチオ選択的に進行することを見い出した。しかもイソプロパノール存在下、触媒量のキラルなチタンイソプロポキシドを用いるだけで、エステル化が進行し、ラセミカルボン酸の触媒光学分割が当量反応の場合と同様に高い光学収率で行えることがわかった。酒石酸より誘導されるキラルな1,4-ジオ-ルを導入したチタン化合物を不斉触媒として用いることにより、不斉Diels-Alder反応、不斉分子内Diels-Alder反応が、高いエナンチオ選択性で進行することが明らかになった。また、本触媒はアクリル酸誘導体とケテンジチオアセタ-ル、ビニルスルフィド、アルキニルチオエ-テルとの〔2+2〕環化付加反応を促進し、対応するシクロブタン、シクロブテンがほぼ光学的に純粋に得られる。ここで得られるシクロブタンより、強い抗ウィルス活性をもつ、オキセタノシンの炭素同族体を不斉合成することができた。

キラルなチタン化合物は、フェニル酢酸誘導体のラセミ体の不斉エステル化にも有効である。触媒量のキラルなチタンを利用するだけで、光学分割を効率的に行うことができる。さらにラセミエポキシドの光学分割にも応用できることが分った。上述した反応の開発と同時に、キラルなチタン化合物の溶液中での状態について検討を行い、触媒反応の選択性にチタンの会合状態が大きな影響をもつことを明らかにした。また分子内不斉エン反応において、ジェミナルジ置換基効果が配座異性体の存在比に起因することを、分子力場計算を行い示した。不斉エン反応、〔2+2〕環化付加反応の生成物を利用し、ε-カジネングランジソ-ルを光学的に純粋に不斉合成した。また、分子内Diels-Alder生成物より、トランスデカリンを簡便に不斉合成し、これをコンパクチンを基本骨格に誘導することができた。
光学活性チタン触媒を用いたジケテンのアルデヒド類へのエナンチオ選択的付加反応

本研究者は1994年に、光学活性シッフ塩基とチタンアルコキシドから調製しキラルなチタン化合物存在下にアルデヒドとジケテンを反応させると光学活性5-ヒドロキシ-3-ケトエステルが高い不斉収率で得られることを見い出した(J. Chem. Soc., Chem. Commun, 1994, 341 ; Tetrahedron, 1994, 50, 4385)。この時点での不斉収率は最高84%eeであった。その後、より高い不斉収率の達成をめざして新たな不斉金属触媒の設計と合成を行った。具体的にはサリチルアルデヒドのフェノール性水酸基のオルト位にかさ高いtert-ブチル基を導入した3-tert-ブチル-2-ヒドロキシベンズアルデヒドと(S)-バリノールから合成したシッフ塩基の誘導体と触媒存在下にアルデヒドとジケテンを反応させると5-ヒドロキシ-3-ケトエステルが84%の光学純度で得られたのを、さらに、反応温度などの条件や触媒構造に改良を加えることにより光学純度を92%にまで向上させることに成功した。この5-ヒドロキシ-3-ケトエステルは二段階で容易に光学活性な6置換-4-ヒドロキシラクトンに導くことができるが、このキラルラクトンはコレステロール生合成阻害剤として注目されるコンパクチンやメビノリン類縁体に共通な生理活性発現に必須のキラル部分である。また触媒の構造に関してはチタンイソプロポキシド-シッフ塩基(モル比1:1)化合物が単量体として存在し触媒前駆体としてはたらいていることを明らかにした。本研究目的はアルデヒドとジケテンの反応により5-ヒドロキシ-3-ケトエステル類を高い化学収率かつ高い不斉収率で得ることである。本研究目的達成のためには高い触媒活性と不斉識別能をもつ不斉触媒の開発が最重要課題となる。本研究者はこれまでにサリチルアルデヒドのフェノール性水酸基のオルト位にかさ高いtert-ブチル基を導入した3-tert-ブチル-2-ヒドロキシベンズアルデヒドと(S)-バリノールから合成したシッフ塩基とチタンアルコキシドから調製したキラルなチタン化合物がアルデヒドの不斉シリルシアノ化反応の有効な触媒となることを見い出している。今年度はこのキラルなシッフ塩基-チタンアルコキシド触媒存在下にアルデヒドとジケテンを反応させると5-ヒドロキシ-3-ケトエステルが84%の光学純度で得られることを明らかにした。さらに最近、反応温度などの条件や触媒構造に改良を加えることにより光学純度を91%にまで向上させることに成功した。また触媒の構造に関してはすでにチタンイソプロポキシド-シッフ塩基(モル比1:1)化合物が単量体として存在し触媒前駆体としてはたらいていることを明らかにしているが、このジケテンとの反応ではチタンエノラートを経由したアルドールタイプの機構で進行している可能性もあると考え、現在、核磁気共鳴スペクトルなどを用いて反応メカニズム解明のための研究も行っている。本研究者は1994年に、光学活性シッフ塩基とチタンアルコキシドから調製したキラルなチタン化合物存在下にアルデヒドとジケテンを反応させると光学活性5-ヒドロキシ-3-ケトエステルが高い不斉収率で得られることを見い出した(J.Chem.Soc.,Chem.Commun,1994,341;Tetrahedron,1994,50,4385)。

具体的にはサリチルアルデヒドのフェノール性水酸基のオルト位にかさ高いtert-ブチル基を導入した3-tert-ブチル-2-ヒドロキシベンズアルデヒドと(S)-バリノールから合成したシッフ塩基の誘導体と触媒存在下にアルデヒドとジケテンを反応させると5-ヒドロキシ-3-ケトエステルが84%の光学純度で得られたのを、さらに、反応温度などの条件や触媒構造に改良を加えることにより光学純度を92%にまで向上させることに成功した。この5-ヒドロキシ-3-ケトエステルは二段階で容易に光学活性な6置換-4-ヒドロキシラクトンに導くことができるが、このキラルラクトンはコレステロール生合成阻害剤として注目されるコンパクチンやメビノリン類縁体に共通な生理活性発現に必須のキラル部分である。また触媒の構造に関してチタンイソプロポキシド-シッフ塩基(モル比1:1)化合物が単量体として存在し触媒前駆体としてはたらいていることを明らかにした。
光物性によるワイドギャップIIーVI族化合物のエピタキシャル成長の研究

(1)高温分子線を用いたZnSe/GaAsのMBE成長:Se分子とZn原子の試料表面拡散長の増大による成長温度の低温化を狙って、高温加熱した各分子線を用いたMBE成長を試みた。分子線の高温化には、加熱部を内蔵したセルを試作した。実験は加熱部温度を一定で(600°C)行なった。その結果基板温度100°Cでも良好なエピ膜の成長を確認した。成長温度100ー200°Cのエピ膜は、強いl_2束縛励起子発光線の他は、Y,DAPおよび深い準位からの発光は非常に弱いか全く観測されず、良好な低温でのPLを示した。また表面モフォロジ-も比較的良好であった。一方、Se分子のみを高温加熱した場合には、成長温度は200°Cまでしか低下し得なかったことから判定するに、Se,Znともに高温加熱し、つまり高速分子線を用いることで、両原子の表面拡散が促進され、その結果低温成長が可能になったものと結論できる。分子線加熱温度、Vl/ll比、分子線強度等の最適化によりさらに低温成長が可能と思われる。(2)(NH_4)_2S_x溶液で硫黄処理したGaAs基板上にZnSeをMBE法で成長し、その結晶性の評価をした。その結果、通常の硫黄系溶液で処理した基板上に成長したZnSe膜に比べ、硫黄処理した基板上に成長したZnSe膜のX線ロッキング曲線の半値幅は一般に大きく、特に薄い膜で顕著である。また、GaAs基板の半値幅もZnSe膜厚依存性を持つが、硫酸系処理を施した基板の方が大きい。これらの結果は、基板とエピ膜の界面に存在していると考えられる硫黄が、膜の結晶性をむしろ低下させていることを示唆しており、MOMBE成長の時とは逆の結果となっていることが判明した。膜成長時の水素ガスの有無が関与している可能性がある。基板とエピ膜界面の性質については、GaAsバファ-層成長による本質的な解決を目論み、計画中である。
藍藻に特化させた人工ｓｍａｌｌ　ＲＮＡの開発と物質生産プロセス最適化への応用

藍藻における有用物質生産量向上を目指して、有用物質合成系に関わる遺伝子の過剰発現や欠損、代謝系全体を制御すると考えられるグローバルレギュレーターの制御などの試みが行われている。本研究計画では、藍藻におけるバイオプロセス最適化のためのツールとして、人工small RNAに着目している。人工small RNAは、任意に選択した遺伝子の発現を制御できる。しかし、これまでに藍藻内で人工small RNAを用いた内在性遺伝子を制御した報告はない。そこで平成27年度の本研究では、人工small RNAを開発し、藍藻が有する内在性遺伝子の制御を目的とした。制御する内在性遺伝子として、藍藻が有するグローバルレギュレーターであるrpaBを選択した。RpaBは光合成に関与する光化学系遺伝子群を制御すると考えられている。はじめにrpaBを標的とする人工small RNAの開発を行った。rpaBの発現を抑制する人工small RNAを開発するために、人工small RNAの探索を実施した。その結果、RpaB-GFPの発現を90%以上抑制する人工small RNAを計6本獲得することに成功した。この人工small RNAは、藍藻の培養温度である30°Cの培養条件においても標的遺伝子の発現を80%以上抑制できると示された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
進化過程における新規機能遺伝子の誕生～真骨魚類孵化酵素をモデルとして

真骨魚類の孵化酵素遺伝子は、遺伝子の重複・多様化進化過程で、重複遺伝子の一方が新規機能を獲得して、効率の良い卵膜の分解系が生じたことが分かっている。メダカの機能維持遺伝子(HCE)に変異を入れた変異リコンビナントタンパク質を大腸菌の系を用いて作成し、新規機能活性を持つ酵素(LCE)の作成を試みた。HCEのアミノ酸のうち5残基をLCE様に変化させた孵化酵素を作成したところ、LCEの特異的な切断点のペプチドを分解する活性が得られることができた。本研究は、進化過程でのどのようなアミノ酸変異が、新規機能獲得遺伝子を生じるかを解明する手がかりとなる。進化過程において、真骨魚類の孵化は、単一酵素による分解系から2種の酵素による効率の良い分解系へと進化している。真骨魚類の中で初期に分岐したカライワシ類は単一種の孵化酵素を持ち、卵膜を膨潤させることによって孵化を行う。これが祖先型の卵膜分解メカニズムであると考えられる。一方カライワシ類より後期に分岐した正真骨類の魚種は2種類の孵化酵素clade I, clade II酵素をもち孵化時には2種の酵素により卵膜が可溶化される。卵膜分解作用から、2種の酵素による分解系は、単一種の酵素と同様の機能を持つ酵素(祖先型酵素)と新規機能酵素(膨潤卵膜可溶化酵素)よりなることが明らかとなっている。2種類の酵素による分解系では各酵素が卵膜タンパク質(ZPタンパク質)の別々の部位を切断することが分かっており、2種の酵素は特異性がはっきりと分かれている。しかし、正真骨類と側系統的に分岐したもう一方のグループ、ニシン・骨鰾類の魚種はclade I, clade IIの2種類の酵素を持つにもかかわらず、卵膜は膨潤するが可溶化することなく孵化が行われる。またこのグループ内で後期に誕生した魚種はclade Iのみをもち、clade II酵素を失っていることが知られている。そこで、25年度はニシン・骨鰾類に属し、2種の孵化酵素をもつミルクフィッシュにおいて、孵化酵素による卵膜分解メカニズムを明らかとした。(論文審査中)その結果、ニシン・骨鰾類のclade II酵素は、正真骨類のclade II酵素が特異的に切断し、膨潤卵膜を可溶化するキーとなる切断部位に対する活性がないことが分かった。つまり、ニシン・骨鰾類のclade II酵素は卵膜可溶化には不完全な活性を持つ酵素であるということが分かった。卵膜分解作用から、2種の酵素による分解系は、本来の酵素と同様の機能を持つ酵素(祖先型酵素)と新規機能酵素よりなることが明らかとなった。しかし、正真骨類と側系統的に分岐したもう一方のグループ、ニシン・骨鰾類の魚種はclade I, clade IIの2種類の酵素を持つにもかかわらず、卵膜を可溶化することなく膨潤により孵化が行われる。このことから、孵化酵素の進化のみではなく、ZPタンパク質の進化にも着目して研究を行った。2種類の孵化酵素をもつニシン・骨鰾類の魚種のZPタンパク質は未だクローニングされておらず、卵膜側の進化過程における変化を比較できなかったので、ニシン・骨鰾類に属する3魚種(ニシン、カタクチイワシ、ミルクフィッシュ)からzp遺伝子をクローニングし、特徴づけを行った(Sano et al, 2013)。これは孵化酵素の機能進化の研究をするうえで基質側の配列情報を得るという重要性だけでなく、これらの魚種は真骨魚類のzp遺伝子の系統関係を網羅的に知るために欠けていたグループの魚種であることから、卵膜の進化の研究にも貢献できたと考えている。卵膜分解作用から、2種の酵素による分解系は、単一種の酵素と同様の機能を持つ酵素(祖先型酵素)と新規機能酵素よりなることが明らかとなった。

真骨魚類の中で初期に分岐したカライワシ類は単一種の孵化酵素を持ち、卵膜を膨潤させることによって孵化を行う。これが祖先型の卵膜分解メカニズムであると考えられる。一方カライワシ類より後期に分岐した正真骨類の魚種は2種類の孵化酵素clade I, clade II酵素をもち孵化時には2種の酵素により卵膜が可溶化される。2種類の酵素による分解系では各酵素が卵膜タンパク質(ZPタンパク質)の別々の部位を切断することが分かっており、2種の酵素は特異性がはっきりと分かれている。しかし、正真骨類と側系統的に分岐したもう一方のグループ、ニシン・骨鰾類の魚種はclade I, clade IIの2種類の酵素を持つにもかかわらず、卵膜は膨潤するが可溶化することなく孵化が行われる。このことからclade II酵素は正真骨類に至る進化の過程で卵膜可溶化という新規機能を獲得したといえる。27年度は正真骨類に属するメダカの2種類の孵化酵素を用いて研究を行った。すでにクローニングされている正真骨類の様々な魚種の孵化酵素のアミノ酸配列の比較からclade Iとclade II特異的に置換が見られるアミノ酸を見つけた。メダカclade I酵素のアミノ酸のうち5残基をclade II様に変化させた孵化酵素を、大腸菌を用いた発現系で作成したところ、メダカのwild clade Iとは異なるペプチド分解特異性を示し、clade IIの特異的な切断点のペプチドを分解する活性が得られることがわかった。しかし卵膜は可溶化できなかった。今後は一次構造に対する特異性に加えて高次構造の認識機構を明らかとすることを目指す。機能進化学孵化酵素遺伝子の新規機能獲得の分子機構の解明を目指している。つまり、進化の過程で孵化酵素遺伝子のどこに変異が入ったことにより、それぞれの酵素の特異性の変化したのかを明らかにすることを目指している。最終的には、祖先型酵素に変異を入れ、新規機能得酵素の活性を持つ変異酵素の作成を目指す。明らかとなっている孵化酵素の立体構造を基に、孵化酵素遺伝子の様々な領域に変異を入れたリコンビナント孵化酵素を作製し、その活性の変化を比較している。大腸菌を用いたリコンビナント孵化酵素は、当研究室ですでに複数種の孵化酵素を作製して実験に用いており、作製のノウハウは確立している。孵化酵素によってリフォールディングの効率の良し悪しは様々であり、また変異を入れることでその効率が低下することも見られる。そこで、どの魚種の孵化酵素を用いて変異入りのリコンビナント酵素を作製するのを検討した。その結果、clade I, clade IIをもつ正真骨類の魚種から、メダカ、イトヨの孵化酵素遺伝子を用いることとした。現在、いくつかの変異入りリコンビナント孵化酵素が得られており、その活性を比較している。魚類の卵膜分解メカニズムの変化は孵化酵素の機能の変化に加えて卵膜も酵素に対応した変化が必要なように見受けられた。ZPタンパク質はZP domainと呼ばれる保存領域と保存性の低いN末端領域で構成されている。祖先型の分解系のカライワシ類の孵化酵素はN末端領域を切断して卵膜を膨潤させ、2種類の孵化酵素(clade I, clade II)を持つ正真骨類はcladeI酵素がN末端領域を切断するのに加えて、clade II酵素がZP domain内(mid-ZPd site)とZP domainの上流(N-ZPd site)を切断することで卵膜を可溶化させる。
高度吸収顎堤再生のための注入可能な間葉系幹細胞/担体複合体の開発

間葉系幹細胞(MSC)の骨分化に対する各種の担体(ヒアルロン酸,ハイドロキシアパタイト,βTCP)の影響を検討したところ,培養系においてはβTCPがMSCの石灰化を促進させることが判明した。これは特異的骨分化マーカーのプライマーを用いたRT-PCRを用いた解析から明らかとなった。一方,焼結ハイドロキシアパタイトには石灰化促進能は認められなかった。ヒアルロン酸にはMSCの石灰化促進能は認められないが,プロテオグリカンと組み合わせることで著しく弾性が高まることが判明した(Biorheology,2004)。また担体と細胞を生体内へ移植する際にはMSCが確実に担体に接着していることが必要となるが,それには植物レクチンの一種であるコンカナバリンA (ConA)とインゲンマメレクチン(PHA-E)の処理が有効であることが判明した(Exp.Cell.Res.,2004)。またMSCを大量に増殖させるためにはフィーダー細胞につくらせた細胞外マトリックス上にてMSCを培養することが有効であることも判明した(Biochem.Biophys.Res.Com.,2004)。さらにMSCのソースとしてはヒトの顎骨骨髄から採取した細胞には高い骨分化能があるが,軟骨や脂肪には分化しづらいことから顎骨由来のMSCも骨再生のための細胞として有効であることも判明した(J.Bone Mineral Res.,2005)。臨床研究のモデルとして,ラットの大腿骨から採取したMSCをβTCPに付着させ,頭頂骨にシリンジを用いて注入したところ,約4週間で新生骨形成が認められ,9週間では移植された頭頂骨の骨と見分け難い程の成熟した骨が形成されていた(第112回日本補綴学会発表,2004年10月)。この侵襲性の低い骨増生法は例えば高齢者の高度吸収顎堤の骨を増生させる方法として有効と成り得ることが示された。骨分化能を持つ細胞を探索するために、口腔領域から歯根膜、歯肉、骨髄、骨の各細胞を採取し検討した。骨からの細胞はインプラント埋入時にドリルに付着した骨片をコラゲナーゼ処理して培養を続けることで骨由来細胞のコロニーを得た。これらの細胞を骨誘導倍地にて培養した結果、最終的に骨分化能を持つものは骨髄と骨からの細胞であった。しかし骨からの細胞は非常に量が少なく、歯槽骨骨髄からのほうが大量に細胞を得ることが出来た。次に担体の種類の選択として、ハイドロキシアパタイト、βTCP、チタンそしてPLGAの上に間葉系幹細胞を播種し接着状態を検討した。その結果、この4種のいずれの担体上にも幹細胞は付着・伸展した。その後の増殖能を検討したところ、表面の滑沢なハイドロキシアパタイトやチタン上では細胞は順調に増殖したが、表面性状の粗いPLGA上での細胞増殖率は低かった。比較的注入が容易で生体吸収性の材料は顆粒状のβTCPであったので、次にこれら顆粒状担体にも間葉系幹細胞が付着しうるかを検討した。超低接着のプレート上に担体を播種し、この上に間葉系幹細胞を1x10^5150x10^5/40mg担体の割合で培地とともに添加した。90分後、非付着系細胞を洗浄除去し、核染色剤にて付着した細胞を蛍光染色し、落射型蛍光顕微鏡で付着状態を観察した。その結果、50x10^5/40mg担体以上の細胞ではほぼ付着状態はプラトーに達していた。さらに立体的な細胞付着状態を観察するために、共焦点レーザー顕微鏡にて細胞/担体の断層撮影を行い、3D画像を構築した。その結果、幹細胞は担体の上面から側面にかけて付着していたが、底面にはほとんど付着していなかった。したがって、担体全面に幹細胞を付着させるためには20分おきに担体と細胞を攪拌して、非付着面にも均質に細胞を付着させる必要があることが示された。

臨床研究のモデルとして,ラットの大腿骨から採取したMSCをβTCPに付着させ,頭頂骨にシリンジを用いて注入したところ,約4週間で新生骨形成が認められ,9週間では移植された頭頂骨の骨と見分け難い程の成熟した骨が形成されていた(第112回日本補綴学会発表,2004年10月)。この侵襲性の低い骨増生法は例えば高齢者の高度吸収顎堤の骨を増生させる方法として有効と成り得ることが示された。
予測的符号化に基づく計算論的心身医学ー過敏性腸症候群を対象とした基礎的検討ー

脳は身体状態のモデルを構成して身体からの感覚信号を予測し、それにより身体内部の知覚である内受容感覚を創発していると考えられている。本研究は、脳と身体の機能疾患である心身症はこのメカニズムの不全であるとの仮説を設定する。本研究では、代表的な心身症である過敏性腸症候群を対象とし、この疾患について豊富な研究経験と患者のデータ・ベースを持つクロアチアのリエカ大学と共同して、この仮説を実証的に検討する。特に、患者の内受容感覚に関する計算論的モデルを開発し、実験データとの適合性を検討することにより、計算論的心身医学ともいうべき研究と臨床実践の新しい領域を拓くことを目指す。
Deep learningを用いた肥大心筋の識別系の確立と新規心不全治療薬の同定

Deep learningを用いた心筋細胞に対する負荷の有無の視覚的特徴抽出の為、ラット新生仔初代心筋細胞の無血清培養群と血清培養群の蛍光免疫染色を用いてモデルの学習およびDeep leaningの条件検討を行った。無血清培養群と血清培養群の蛍光免疫染色を用いた学習モデルの作製にあたり、条件検討によりDeep leaningによる視覚的特徴抽出に適する最も鮮明な画像が得られる抗体として細胞骨格ではα-Actinin、核に対してはNkx2-5を同定した。得られた免疫染色条件を用い、無血清培養下の細胞と血清添加培養下の細胞を90%の精度で識別するモデルを開発した。次に、心筋細胞に対する肥大刺激の有無の視覚的特徴抽出の為、生体内に近い至適条件である低血清(0.1%)培養下およびインスリン/トランスフェリン添加下で、アンジオテンシンIIおよびエンドセリン-1による肥大刺激群と無刺激群の位相差顕微鏡画像を撮影し分類モデルの作製を行った。撮影した画像から心筋細胞画像を自動プログラムで切り出し、学習したモデルの分類性能を評価した。インスリン/トランスフェリン添加下でアンジオテンシンIIまたはエンドセリン-1の刺激の有無によって得られた位相差顕微鏡画像を用いた学習モデルの作製を試みたが、60-70%程度の精度でしか心筋肥大を判別できなかったため、アンジオテンシンII及びエンドセリン-1の両方を刺激として加え、刺激の有無によって得られた位相差顕微鏡画像を用いた学習モデルで行った。その結果、90%の精度で心筋細胞に対する肥大シグナルの有無の自動識別を達成した。
脳神経病変を標的とした成体リソゾーム病の新規遺伝子治療法の開発

リソゾーム酵素欠損症では、一般的に酵素補充療法の有効性が期待できるが神経変性を伴う疾患に対しては血液脳関門(BBB)の存在が大きな障害となり、有効な治療戦略が立てられていない。本研究では脳全体の広範な神経変性を伴う、異染性白質ジストロフィー(MLD)をモデルとして、臨床応用を目的とし非侵襲的かつ安全で脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法の開発を目的とする。今まで我々はsingle-strand Adeno-associated-virus (ssAAV)ベクターを使用していたが、治療用AAVベクターの改良として、よりBBBを通過可能な血清型9型のASA発現self-complementary AAV(scAAV9/ASA)ベクターを作製し、成体MLDモデルマウスにssAAV9/ASAもしくはscAAV9/ASAを静脈注射することで治療蛋白がBBBを通過し、治療効果があるか比較検討を行った。ssAAV9を静脈注射したものでは、脳内での治療蛋白の発現は確認することが出来なかったが、scAAV9を静脈注射したものでは、BBBを通過し脳内での治療蛋白の発現を確認することが出来た。また、行動実験、Alcian Blue染色によるスルファチドの蓄積の確認、Thin-layerchromatography assayによるスルファチドの定量を行ったところ、scAAV9/ASAを使用することで、長期に治療蛋白が脳内で発現する事を確認し、脳内での蓄積物質も優位に抑制されていた。行動実験においても優位に改善が認められ、成体マウスで神経症状を抑えることに成功した。これらの結果よりscAAV、血清型9を用いることで、成体での脳組織の治療法が可能になり、リソゾーム病のみならず、ALS、アルツハイマー病などの様々な脳神経病変を伴う疾患に応用が可能なると示唆された。異染性白質ジストロフィー(MLD)の遺伝子治療法を確立し、早期の臨床応用を目指す。MLDは広範な脱髄と神経変性を特徴とし、最も多い後期乳児型では歩行障害で発症し、精神運動発達遅滞・退行、痙性四肢麻痺が加わり最後は除脳硬直状態となる重篤な疾患である。欠損酵素はライソゾーム酵素であるが、血液脳関門(BBB)のため酵素補充療法による神経症状の改善は期待できない。よって神経変性疾患を治療するためにはBBBの壁を越える新しいアプローチが必要である。本研究では脳全体の広範囲な神経変性を伴うMLDモデルマウスをもちいて、非侵襲的かつ安全で、脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法の開発を目的とする。具体的には我々のこれまでの研究成果を踏まえ、BBBを効率よく通過するための画期的な方法による、成体の神経症状の新規治療法の確立をおこなう。当該年度に実施した内容は、脳神経組織に親和性の高いAdeno-associated-virus (AAV)ベクターの改良として、1今までsingle-strand AAVベクターを使用していたが、よりBBBを通過可能な、self-complementary AAV (scAAV)ベクターを作製した。2さらに、AAVには1-12までの血清型があるが、成体マウスに静脈注射しどの血清型がよりBBBを通過出来るかの検討を行った。3また長期に治療蛋白が発現出来るようプロモーターの改変を行った。4治療蛋白の改変としてASA-Tatキメラ蛋白質の作製(細胞膜通過活性をもつTat配列を組み込んだキメラ蛋白質が細胞膜を通過して、広い範囲の組織に移動できることが知られているためASA活性を保持したままで、BBBを通過できる分子)の作製を行った。改良を行ったAAVベクターを成体マウスへ投与を行った。本研究では脳全体の広範な神経変性を伴う、異染性白質ジストロフィー(MLD)モデルとして、脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法を検討している。本年度はBBBを通過可能な、self-complementary AAV (scAAV)ベクターによりMLD欠損酵素であるASAを発現させ、MLDのモデルマウスに投与を行い治療効果の検討を行った。scAAVベクター投与したモデルマウスでは脳内にADAの発現が認められ、行動実験においても改善を認めている。今後、長期にわたり経過観察を行い、行動の改善、安全性の検討を行っていく。MLDモ出るマウスにASA発現self-complementary AAVベクターの投与を行い、脳内にADAの発現が認められ、行動実験においても改善を認めている。本研究では脳全体の広範な神経変性を伴う、異染性白質ジストロフィー(MLD)病をモデルとして、臨床応用を目的とし、非侵襲的かつ安全で、脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法の開発を目的とする。前年度にBBBを通過可能なself-complementary AAV (scAAV)ベクターに治療蛋白を搭載したウイルスをMLDモデルマウスに静脈注射し、BBBを通過し脳内での発現を確認した。今年度はMLDモデルマウスの長期治療効果判定を行った。具体的には、血中の治療蛋白をELISAにより測定、Balance Beamテストによる行動実験、Alcian Blue染色によるスルファチドの蓄積の確認、Thin-layer

chromatography assayによるスルファチドの定量、各臓器での治療蛋白発現の定量、抗体染色による神経細胞での治療蛋白の発現を確認した。scAAVベクターを使用することで、長期(1年3ヶ月)に治療蛋白が脳内で発現する事を確認し、脳内での蓄積物質も優位に抑制されていた。行動実験においても優位に改善が認められ、成体マウスで神経症状を抑えることに成功した。このことより、scAAVベクターを用いることで成体マウスにおける、神経症状を伴う疾患の治療に有用であると示唆された。成体MLDモデルマウスに治療用ベクターを投与した。scAAVベクターに我々が使用しているCAGプロモーターを使用することで、BBBを通過し長期(1年3ヶ月)に治療蛋白が脳内で発現する事を確認し、脳内での蓄積物質も優位に抑制されていた。しかしながら最終的な安全性までの確認をすることが出来なかった。安全性の確認は当初の目的でもあり、解析必須と考える。今後、すでに採取している血清等の解析をすすめたい。リソゾーム酵素欠損症では、一般的に酵素補充療法の有効性が期待できるが神経変性を伴う疾患に対しては血液脳関門(BBB)の存在が大きな障害となり、有効な治療戦略が立てられていない。本研究では脳全体の広範な神経変性を伴う、異染性白質ジストロフィー(MLD)をモデルとして、臨床応用を目的とし非侵襲的かつ安全で脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法の開発を目的とする。今まで我々はsingle-strand Adeno-associated-virus (ssAAV)ベクターを使用していたが、治療用AAVベクターの改良として、よりBBBを通過可能な血清型9型のASA発現self-complementary AAV(scAAV9/ASA)ベクターを作製し、成体MLDモデルマウスにssAAV9/ASAもしくはscAAV9/ASAを静脈注射することで治療蛋白がBBBを通過し、治療効果があるか比較検討を行った。ssAAV9を静脈注射したものでは、脳内での治療蛋白の発現は確認することが出来なかったが、scAAV9を静脈注射したものでは、BBBを通過し脳内での治療蛋白の発現を確認することが出来た。また、行動実験、Alcian Blue染色によるスルファチドの蓄積の確認、Thin-layerchromatography assayによるスルファチドの定量を行ったところ、scAAV9/ASAを使用することで、長期に治療蛋白が脳内で発現する事を確認し、脳内での蓄積物質も優位に抑制されていた。これらの結果よりscAAV、血清型9を用いることで、成体での脳組織の治療法が可能になり、リソゾーム病のみならず、ALS、アルツハイマー病などの様々な脳神経病変を伴う疾患に応用が可能なると示唆された。
ゲーム理論におけるチープトークの役割に関する実験研究、およびその理論的考察

1.平成16年度後半に実施した、ゲーム理論におけるチープトークの役割に関する実験の結果を論文としてまとめた。これまでに実施した独裁者ゲームの実験とは異なり、この実験は、チャットシステムを利用することで、独裁者ゲームにおける独裁者と服従者間、もしくは独裁者と仲裁者間の自由な議論を可能にしている点が特徴的である。論文では、彼らが自由な議論によってどのような配分に合意するか、また、その合意額が実際の配分にどのように影響を及ぼすかを検討している。実験データを精査することで、独裁者と服従者ではより公平な配分に合意し、仲裁者と独裁者では、より独裁者に有利な配分に合意していることが分かった。また、統計的処理を施すことで、独裁者の決定する配分は議論の中で合意された額にしたがっていることが分かった。2.平成17年度に開催された学会、学外セミナー等に精力的に参加し、上でまとめた論文を報告した。具体的には、慶応大学の公共経済学セミナー、大阪大学主催のデザインサイエンスセミナー、信州大学で行われた第1回ESA-Japan-Branchにて研究発表をおこなった。3.これまでの実験結果を説明するコミュニケーションの理論研究に着手した。既存のゲーム理論が想定している、自らの利得関数最大化を目的としたプレイヤーとは異なり、コミュニケーションによって互いの了解を志向し、合意に基づいて自らの行動を調整すると言うプレイヤーを仮定することで、これまでの実験結果と部分的に整合的な理論結果を得ることができた。平成16年度は、ゲーム理論におけるチープトークの役割に関する実験を二度実施した。一方は、利害対立が顕著な状況における仲裁者の役割に関する実験である。具体的には、独裁者ゲームにおける当事者(服従者)の「声」と仲裁者の「声」の効果を比較している。この実験により、仲裁者と当事者ではその「声」の効果に大きな違いがあることが確認された。特に、仲裁者の「声」の方が服従者の「声」に比べ、より独裁者の行動に影響を与えることがわかった。これらの結果は、統計的処理を施し、「当事者の声と第三者の声」という論文にまとめた。これは東京大学の「経済学論集」に掲載される予定である。他方は、ゲームの構造に関してはこれまでに行ったチープトークに関する実験と同様であるが、チャットシステムを利用することにより、当事者間の自由な議論を可能にした実験である。これにより、当事者の行動調整がどのような議論によって行われているのかを明確にすることができた。平成16年度は,学会、セミナー等にも精力的に参加し、これまでに実施したゲーム理論におけるチープトークの役割に関する実験結果を発表した。具体的には、東京大学、チューリッヒ大学でのセミナー、岡山大学で行われた日本経済学会秋季大会、アムステル大学で行われたESAミーティングで研究報告をいった。また、東京大学で発表した論文、「Voice Matters in a Dictator Game」はCIRJEのディスカッションペーパーに掲載された。
ゲル網目内固-液反応によるメゾ多孔材料の開発

ケイ素アルコキシドを出発物質とする相分離を伴うゾル-ゲル法によって、尿素共存および酢酸酸性条件下、共連続マクロ孔構造を持つバルク状に調製した湿潤ゲルを、密閉条件下で加熱することにより尿素を熱分解してアンモニアを生成させ、尿素を含まない同様組成の湿潤ゲルを外部からアンモニア水溶液で溶媒置換した場合と比較して、メゾ細孔の形成挙動を調べた。反応系内の水に対して、完全熱分解で1モル濃度相当量以上の尿素を共存させた場合のpHは、出発組成中の濃度に関わらず約10まで上昇した。常圧下でのメゾ細孔の形成挙動は、同程度のpHで比較すると、水酸化アンモニウム溶液で段階的に置換した場合と同等であり、乾燥時の収縮挙動にも両者の差異は認められなかった。さらに、アンモニア水溶液の代わりに湿潤ゲルを尿素を含む水溶液で溶媒置換して熱分解を行った遍合にも、pHおよび温度のみに依存したメゾ細孔形成が観察された。次に尿素を出発組成に含むゲルを用いて、100°C以上の水熱条件下での熟成を行った。温度の上昇と共にメゾ細孔の形成は加速された。200°C程度の熟成においては、細孔径は50nmに達し、マクロ孔の領域にまで及んだが、細孔径の増加に伴って細孔容積は減少した。さらに200°C以上では、円筒形の共連続ゲル骨格内部からの溶出成分の顕著な拡散と同表面への析出により、ゲル骨格の空洞化が観察された。しかしマイクロメートル領域に及ぶこのような顕著な構造変化にもかかわらず、水熱条件でしばしば観察されるクリストバライト等への結晶化は観察されなかった。他方、非晶質チタニアゲルおよび酸化マンガン化合物の水熱条件下での処理により、比較的低温でのアナタース微結晶の析出、およびトンネル型化合物の生成が観察された。ケイ素アルコキシドの加水分解・重縮合反応において、ゾル-ゲル転移時に相分離を同時に誘起することのできる条件を選び、マイクロメートル領域の共連続ドメイン(ゲル相および溶媒相)を持つゲルを作製し、さらに密閉条件下で種々のpHおよび温度で熟成することにより、乾燥・熱処理後に形成されるメゾ細孔構造を解析した。小角X線散乱測定によれば、ほとんどのメゾ細孔領域の構造変化は湿潤状態で完了しており、乾燥・熱処理による構造変化の寄与は少ないことが明らかになった。また細孔構造形成は320日程度の長時間に渡って徐々に進行し、200°Cまででは温度を上げるほど最終的に到達する細孔サイズが大きくなるために、構造変化が長時間続く傾向が見られた。さらに熟成温度を300°Cまで上げることにより、メゾ細孔がマクロ細孔の領域まで粗大化し、ついには共連続構造のゲル領域が空洞化する現象が確認された。また同様のゲルを用いて、2μmのシリカ骨格と3μmのマクロ細孔および直径12nmのメゾ細孔を併せ持つ二重細孔ゲルを毛細管中で作製し、シランカップリング処理によって表面を疎水化した後に、液体クロマトグラフィーカラムとしての分離性能を評価した。電気クロマトグラフィーに対する適用では、シリカゲル中の金属不純物が極めて少ないために、市販カラムよりも低い電気浸透流の値しか得られなかった。他方HPLCポンプによる駆動で試料を流した場合には、市販カラムの半分程度の流動抵抗しか示さず、バルク状ゲル試料によるカラムと同様、アルキルベンゼン混合物の分離は市販カラムの2倍以上高速にできることが明らかになった。ケイ素

アルコキシドを出発物質とする相分離を伴うゾル-ケル法によって、尿素共存および酢酸酸性条件下、共連続マクロ孔構造を持つバルク状に調製した湿潤ゲルを、密閉条件下で加熱することにより尿素を熱分解してアンキニアを生成させ、メゾ細孔の形成挙動を調べた。反応系内の水に対して、完全熱分解で1モル濃度相当量以上の尿素を共存させた場合のpHは、出発組成中の濃度に関わらず約1.0まで上昇した。常圧下でのメゾ細孔の形成挙動は、同程度のpHで比較すると、水酸化アンモニウム溶液で置換した場合と同等であり、乾燥時の収縮挙動にも差異は認められなかった。さらに、湿潤ゲルを尿素を含む水溶液で溶媒置換して熱分解を行った場合にも、pHおよび温度のみに依存した、メゾ細孔形成が観察された。次に尿素を出発組成に含むグルを用いて、1000°C以上の水熱条件下での熟成を行った。温度の上昇と共にメゾ細孔の形成は加速された。200°C程度の熟成においては、細孔径は50nmに達し、マクロ孔の領域にまで及んだが、細孔径の増加に伴って細孔容積は減少した。さらに200°C以上では溶出成分の顕著な拡散と、共連続ゲル骨格の表面への析出により、ゲル骨格の空洞化が観察された。しかしマイクロメートル領域に及ぶこのような顕著な構造変化にもかかわらず、ゲルの結晶化は観察されなかった。他方、非晶質チタニアゲルおよび酸化マンガン化合物の水熱条件下での処理により、低温でのアナタース微結晶の析出、およびトンネル型化合物の生成が観察された。
経粘膜的ガス交換による中耳腔換気機構に関する基礎的研究

ヒト正常例および滲出性中耳炎例において、各種ガスにて中耳腔を置換し、嚥下を禁止した状態で中耳腔圧、中耳腔内の酸素分圧を測定した。その結果、1)正常例で、置換する各種ガスの組成により、中耳腔と中耳腔周囲組織の間にガスの吸収、拡散が生じた。ガスの移動方向、移動量は、置換後の中耳腔内ガス組成と周囲組織、すなわち中耳腔周囲の粘膜下毛細血管内のガス組成の圧勾配と、ガスを構成する各気体の拡散能により規定されていることがわかった。2)95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスで中耳腔を置換したとき、正常例と滲出性中耳炎例では、測定結果に差がみられた。症例数がまだ集まっていないが、滲出性中耳炎の治癒過程で測定結果も変化し、正常例の測定結果に近づく傾向がみとめられた。以上のことより、中耳腔において経耳管的ガス交換の他に経粘膜的ガス交換が存在していること。中耳腔粘膜の炎症によって、中耳腔と中耳腔周囲組織の間には、正常例と異なるガスの平衡様式が存在することを確認した。今後、このように滲出性中耳炎にとどまらず、様々な中耳疾患を検討し、臨床検査に応用したいと考えている。今回、中動物(ネコ)をもちいて、これまで人において我々が報告してきた、中耳腔粘膜を介した酸素の拡散吸収の存在、また、これらの拡散吸収が中耳腔酸素分圧と周囲組織の酸素分圧の差に依存していることを中耳腔内に各種酸素分圧を有するガスで置換し、その後の中耳腔酸素分圧の変化を測定することで証明した。さらに、全身麻酔下のネコの呼吸状態を変化させこのときの静脈血酸素分圧をモニターしつつ中耳腔酸素分圧を測定したところ静脈血酸素分圧の変化と同期して中耳腔酸素分圧の変化を認めた。今回の検討により中耳腔ガスは周囲組織との分圧差により拡散吸収が行われ、またさらに呼吸状態など生理的状態の変化によってその分圧にも変化を来したことが明らかになった。この事実から中耳腔ガス分圧、さらに中耳腔圧は呼吸状態など生理的状態に強く影響を受けているものと思われた。今後中動物(ネコ)で口蓋帆張筋を切断、能動的耳管開大能を廃絶し経耳管的換気がなされないモデルを作成し、中耳腔圧の経時的変化を観察する。従来の吸収説では陰圧形成から滲出性中耳炎に移行すると考えられているが、経粘膜的ガス交換による圧調節のための中耳腔は経耳管的換気がなくても中耳腔圧は大気圧付近に維持されると予想される。またこのような耳管機能廃絶モデルで気密室を利用して相対的中耳腔陽圧、陰圧を負荷し、中耳腔圧の変化をチンパノグラムにて測定することにより、経粘膜的ガス換気で中耳腔圧調節が行われるという点がさらに明らかになる。今回、経粘膜的換気障害がその発症機転に関与していると推測されている浸出性中耳炎をネコにおいて作成し、正常治で行ったように各種ガス分圧を有するガスにて中耳腔を置換し、その後のガス交換にて生じる中耳腔圧変化及び酸素センサーによる酸素分圧の変化を測定しようと試みた。しかしながら浸出性中耳炎発症時ネコの耳管が高度に狭窄状態を生じたため各種ガスにて中耳腔を置換することができず、動物モデルにおける実験は不可能であった。このため浸出性中耳炎患者症例で鼓膜チューブを挿入した症例に対し上述の実験を試み、中耳粘膜が正常と思われる外傷性鼓膜穿孔例との比較を行った。置換したガスは純窒素、空気、95%O_25%CO_2の混合ガス、純O_2の4種類であった。外傷性鼓膜穿孔例では酸素濃度に比例して酸素の吸収拡散が認められた。すなわちN_2を負荷したときは中耳粘膜からのO_2の強い拡散が認められ、また空気、混合ガス、純O_2と0_2がより高濃度になるに従ってO_2のより急峻な吸収が認められた。この結果はガスが粘膜を介して中耳腔から粘膜へまた粘膜から中耳腔へと双方向に移動しうること、またその移動量がガス分圧差に比例することを示している。

さらに上述のガス置換を浸出性中耳炎例に対して行ったところ、空気、混合ガス、純O_2置換時に外傷性鼓膜穿孔例と比較してより急激な酸素吸収が認められた。この結果は浸出性中耳炎発症時、中耳粘膜が低酸素状態になる可能性を示唆するものであり、また浸出性中耳炎発症時の中耳腔内陰圧形成にこの中耳粘膜の低酸素状態が関与していることが想像される。中耳腔の圧を大気圧に近い状態に保つことは、正常な聴覚の保持にとって重要である。中耳腔圧調節には、経耳管的換気に加えて経粘膜的換気もその役割の一端を担っていると考える。今回の対象は中動物(ネコ)、ヒト正常例及びヒト滲出性中耳炎例とした。測定方法は、外耳道を密閉し、各種の酸素分圧を有するガスで鼓膜穿孔を通して中耳腔を置換した。その後,中耳腔内の全圧の変化及び酸素分圧の変化を測定した。結果及び考察は、1.ネコについて;どのガスを負荷しても中耳腔内の全圧及び酸素分圧は、変化しなかった。このことより、ネコがヒトとは異なる圧調節機構が存在している可能性が高いと考えた。2.ヒト正常例について;各種ガスの酸素分圧を高くするにしたがって、中耳腔粘膜への酸素吸収量が増加した。また、95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスを中耳腔に負荷したときには、中耳腔内の全圧はほとんど変化しなかった。これらのことより、中耳腔の経粘膜的ガス交換は、置換するガスと中耳腔に存在する窒素、酸素、二酸化炭素の各分圧差とその拡散能によって規定されると考えた。3.ヒト滲出性中耳炎例について;95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスを中耳腔に負荷したとき、正常例と比較して、中耳腔内の全圧は陰圧化した。さらに、酸素分圧を測定することにより、中耳腔粘膜への酸素吸収量も正常例より増加していた。すなわち、滲出性中耳炎例の中耳腔では、酸素吸収の亢進が起こっていることが推測された。これらの結果は論文投稿が予定されている。
幼少期の養育環境の違いによる脳内自己/他者モデルの個体差および性差に関する研究

幼児期に養育者との相互作用を通じて内在化される自己と他者に関するモデルは、その後の対人関係を築く基盤となり、友人やパートナーとの関係性、さらには将来自分自身の子どもと築く関係性に影響することが示されているが、神経科学的な解明は不十分である。本研究では、健常な前成人期の男女を対象に、自己および他者評価課題に対する脳活動を機能的磁気共鳴画像法(fMRI)で計測し、幼少期に形成された内的ワーキングモデルの個体差(自己/他者モデルの肯定/否定的な程度)や集団(男性/女性)間の共通/差異について検討する。さらに幼少期の養育環境(父親/母親の養育スタイル)との関連性を検討し、自己/他者モデルに関する脳機能を発達・神経科学的に解明する。当該年度は実験システムの構築を中心に以下の計画を実施した。1.実験課題の決定:幼少期の被養育体験が成人期の対人機能および自己評価に及ぼす影響を的確に脳活動として示すための課題について、関連する先行研究を再調査し、議論を重ねた結果、自己、一般他者、父親、母親に対する反応を調査することとした。2.実験刺激の作成:本研究の目的に沿った実験刺激として用いる用語を選定した。3.個人特性の評価方法の決定:養育環境、内的ワーキングモデル、不安特性という個人特性の評価方法について、質問紙を決定した。4.研究倫理委員会での審査:本研究は人を対象とし、個人情報を伴う資料を提供してもらうため、厚生労働省の研究倫理指針およびヘルシンキ宣言の指針に則る倫理的配慮に基づく対策と措置を万全に講じ、首都大学東京研究安全倫理委員会の承認を得た。5.被験者のリクルート:健常で右手利きの20歳代前半の男女を対象とし、リクルートを行った。すべての対象者は、精神・神経疾患および意識消失を伴う頭部外傷の既往が無いことが確認され、インフォームド・コンセントが得られたものとした。研究協力者の協力も得られ、被験者のリクルートも順調に遂行している。本研究課題の目的に沿った計画について議論を深める中で、実験課題について具体化させ、より明確な課題作成を行うことが可能となった。以上より、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。実験課題について、関連する先行研究を再調査し、議論を重ねた結果、幼少期の被養育体験が成人期の対人機能および自己評価に及ぼす影響を的確に脳活動として示すために、自己、一般他者、父親、母親に対する反応を調査することとした。それに従い、解析方法の変更も生じるここになるため、さらに国内外での調査および議論を深め、的確な方法を決定し、推進する計画である。
頑健かつ柔軟な概日時計が可能とする限界日長適応

動かない植物にとって、適切な季節に花を咲かせ、種子を残すことは最重要課題である。季節を読む機構として概日時計による日長測定を基盤とした光周性が知られている。季節変化は生息地により変化するため、概日時計は頑健な日周変動と柔軟な季節変動の両方に適応する必要がある。本研究では日本産のアオウキクサを用いて、日長応答の限界日長と概日時計の周期に負の相関があることを見出した。このことは、概日時計の柔軟な周期変化が限界日長の地域適応を可能とすることを示唆している。本研究ではアオウキクサの限界日長と概日リズム周期との関連に注目している。同一水田から採取したアオウキクサにおいても限界日長の多様性が認められた。このことから、限界日長適応が単純な緯度依存性を示さないことが示唆され、様々な地域から複数の植物個体を採集する必要が生じた。そのため、アオウキクサにおける限界日長適応の詳細な解析も本研究の目的に加えることとした。また、アオウキクサは栄養成長で増殖するため、採集時に遺伝的別系統の個体を採取することが困難であるが、水はり直後の水田においては、発芽直後のアオウキクサが多数存在することが明らかとなった。そのため、採集時期をうまく選べば、遺伝的別系統を効率よく採集できると考えられる。ゲノムが公開されているウキクサ(Spirodela polyrhiza)のゲノム情報を用いて、ウキクサ植物の時計遺伝子プロモーターを同定、クローニングし、異なる位相でリズムを示す発光レポーターを作成した。その結果、朝発現型のSpLHY、昼発現型のSpPRR5、夕発現型のSpGI、夜発現型のSpELF3の4種類の発光レポーターの作成に成功した。これらのレポーターを多数のアオウキクサ系統に導入して発光リズムを測定することで、概日周期の変化が、どの位相で生じているかを明らかとすることができ、概日時計の多様性解析が大いに進展すると考えられる。本研究に必要な、生物発光測定装置と遺伝子導入装置は所属研究機関のものを利用していたが、ともに入手するめどがたった。そのため研究機関を異動をしても、研究は問題なく継続できる。限界日長の地域適応については、同一緯度・地点における多様性など新たな課題が見つかったが研究期間内で対処できる。逆にアオウキクサの短期間での限界日長が決定できるという長所を利用することで、限界日長適応に関して新たな研究を展開できると考えている。また、アオウキクサにおいて位相が異なる概日リズムを示す発光レポーターの作成にも成功したことから、時計周期の多様性についての解析も計画通りに進めることができる。発光リズムの測定は計画に比べ遅れてはいるが、生物発光測定装置と遺伝子導入装置を入手するめどがたち、次年度から専有的に使用できるため研究期間中に一定の成果が出せると考えている。以上のことから、計画に比べ変更点はあるものの、研究は順調に進展していると判断している。本研究ではアオウキクサの花成時期を決定する限界日長の地域適応と、それにともなう概日リズム周期の変化に注目している。昨年度までに、同一水田から採取したアオウキクサにおいても限界日長の多様性が認められるなど、限界日長適応の複雑さが明らかとなったことから、年度の前半では3箇所の地点から同一地域から各12系統のアオウキクサを採取し、限界日長の解析を進めている。生物リズムの測定については、発光レポーター導入装置・生物発光自動測定装置の作成を進めてきたが未だ調整の段階であり、計画通りには進展しなかった。一方で、先進ゲノム支援のゲノムDNAのde novoアセンブルに採択され、年度の後半ではアオウキクサのゲノム配列の決定を行うことができた。アオウキクサからの高分子量ゲノムDNAの抽出法、葉緑体ゲノムの排除法を最適化した結果、N50=23.8kbpと解析に十分なゲノム配列を得た。解析の結果、ゲノム上に複数の時計遺伝子を検出しており、配列情報を基に新規発光レポーターの作成を進めている。さらに、ゲノム情報をもとに次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析を計画しており、限界日長を挟む2つの日長条件で全遺伝子の日内転写変動を測定することで、限界日長決定に関わる遺伝子を効率的に探索できると考えている。そこで、この探索をもとに発光レポーター解析を進めるように計画を変更し、準備を進めている。上記のように発光リズムの測定が遅れているために、研究は計画通りには進展していないが、ゲノム配列の決定という計画以上の成果もあり、申請時の計画よりも「限界日長と概日リズム周期の関係」の核心にせまる研究が可能となっている。それを踏まえて論文を準備中であり、年度内に研究成果を論文としてまとめることは残念ながらできなかった。年度の前半では、サンプリング地点を吟味した計画的なアオウキクサの採集を行い、限界日長適応の実像を明らかとすることを目指す。新たに採集されたアオウキクサに対し、限界日長と概日周期が示す負の相関がみられるかを確認する。

さらに、アオウキクサに対し、次世代シーケンサーを用いたゲノム解析を行い、限界日長適応と概日時計変異との関連について、分子レベルでの知見を取得することを目指す。研究機関を異動したが、発光測定装置を設置するめどはついている。さらに、異なる位相でリズムを示す発光レポーターの作成に成功しているため、周期変化が顕著なアオウキクサに対し発光リズム測定を行い、概日周期の変化が、どの位相の遺伝子の挙動変化で生じているかを明らかとする。この解析で同定された位相特異的な変化と限界日長の変化について考察を進めていく。以上の知見に加えて、各サンプリング地点のアオウキクサのゲノム情報を比較することで、日本におけるアオウキクサの系統地理学を行い、限界日長の地域適応が時計の周期変化とどのように関連し進化してきたかを明らかとすることを、本研究の最終目標としたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物時間生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。