hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホモダイマー型光合成反応中心に存在するキノンの物理化学的性質と機能の解析

ホモダイマー型の緑色硫黄細菌反応中心を、人工的にヘテロダイマー型へ改変するための分子基盤を確立した。変異体" StrepA-△recA ::(HisAB-P)"を作製し、Ni-NTAカラムとStrep-tactinカラムに連続して通すtandemクロマトグラフィーを行うことにより、Strep-PscA/ His-PscA型反応中心を分取することができた。一方、遺伝子操作による解析を簡便化するために、広宿主域プラスミドをもちいた外来遺伝子発現系の構築にも成功した。今後、プラスミドを用いた外来遺伝子発現系が非常に有効なツールとなることが期待される。光合成細菌のタイプ1反応中心はホモダイマー構造をとり、2方向の電子移動経路は等価に機能していると考えられている。しかしながらどのように2方向の電子移動が制御されているかは不明である。また我々のこれまでの先行研究により、電子移動経路上には二次電子受容体としてキノン分子が存在することが示唆されてきたが、その詳細な反応特性は明らかとなっていない。そこで本研究では、ホモダイマー型反応中心の物理化学的特性と機能を解明する目的で、互いに補完的な2つのプロジェクト(Progect A:二次電子受容体・キノンの物理化学的性質および立体構想の解析、Project B:反応中心のヘテロダイマー化と部位特異的変異の導入)を企画・立案した。本年度は目的達成のための実験系を確立するために、Project Bを中心に推し進めた。具体的には、精製用タグ(His-tag)を付加したpscA'遺伝子と薬剤マーカー(Gm')を相同組み換えに必須なrecA遺伝子領域に挿入し、recA-株を作成した。これにより、ヘテロダイマー化のために導入した第2のpscA'遺伝子が、相同組み換え機構によって修復されることを防ぐことができる。次にNi-NTAカラムによるアフィニティー精製を行ったところ、His-tagを付加した第2のコアタンパク(His-PscA')の発現を確認することができた。閃光照射による過渡吸収変化測定およびESR測定から、安定な電荷分離に必要とされる電子伝達成分がすべて揃った反応中心標品であることが分かった。今回開発したアフィニティー精製は、従来の調製法よりも極めで簡便な方法であり、生化学的・分光学的解析のみならず、今後、結晶化を目指す上で、標品を大量に調製することが可能になった。緑色硫黄細菌やヘリオバクテリアの反応中心は、植物の光化学系1反応中心と同じタイプ1反応中心に分類される。しかしながら構成する反応中心コアタンパクはホモダイマー構造をとり、2方向の電子移動経路は等価に機能している。本研究は反応中心の2方向の電子移動の制御機構に着目し、緑色硫黄細菌の反応中心の物理化学的特性と機能を解明することを目的としている。互いに補完的な2つのプロジェクト(ProgectA:二次電子受容体・キノンの物理化学的性質および立体構想の解析、Project B:反応中心のヘテロダィマー化と部位特異的変異の導入)を立案し、研究を進めている。本年度は昨年度に引き続き、目的達成のための実験系を確立するためにProject Bを中心に推し進めた。昨年度は精製用タグ(His-tag)を付加したpscA'遺伝子と薬剤マーカー(Gm^r)をrecA遺伝子領域に挿入し、His-tagを付加した第2のコアタンパク(His-PscA')の発現を確認するとともに分光学的測定を行った。本年度は、さらにマススペクトルによる解析から、反応中心標品中にHis-PscA/HislPscA'型の標品が含まれていることを確認し、人工的ヘテロダイマー創出の足がかりを確立することに成功した。また一方において、遺伝子操作による解析を簡便化するために、広宿主域プラスミドをもちいた外来遺伝子発現系の構築を試みたところ、良好な結果が得られている。現在、プラスミドの安定的保持の確認を進めているとともに、緑色細菌Choloroflexus aurantiacus由来の反応中心タンパクの発現を試みている。さらにNi-NTAカラムによるアフィニティー精製により調製した反応中心標品の結晶化にも取り組み始めた。緑色硫黄細菌やヘリオバクテリアの反応中心はホモダイマー構造をとり、2方向の電子移動経路は等価に機能している。本研究は反応中心の2方向の電子移動の制御機構に着目し、緑色硫黄細菌の反応中心の物理化学的特性と機能を解明することを最終目標としてスタートした。互いに補完的な2つのプロジェクト(A:物理化学的特性の詳細な解析と、B:反応中心改変の実験系確立)を立案して3年間の研究を推進してきた。今後も引き続きホモダイマー型反応中心の反応特性を詳細に解析していくためには、人工的ヘテロダイマーに改変する実験系確立が急務である。

全体の計画がやや遅れているため、最終年度である本年は、昨年度に引き続きプロジェクトBに専念することにした。これまでの研究により、反応中心標品中にはnon-PscA/His-PscA型の反応中心が含まれていることが明らかとなり、人工的ヘテロダイマー創出の足がかりが得られていた。本年はさらに異なる精製用タグを導入し、non-PscA/His-PscA型反応中心を実際に単離する方法を開発することに成功した。具体的には、authenticなPscA遺伝子の5'末端にStrep-tagを付加したあと、His-tagを付加したPscA遺伝子をrecA遺伝子領域に挿入した変異体"StrepA-△recA::(HisAB-P)"を作製した。変異体をフレンチプレスにより破砕後、膜画分を回収し、界面活性剤により可溶化した試料をNi-NTAカラムとStrep-tactinカラムに連続して通すtandemクロマトグラフィーを行った。M-NTAカラムから溶出した反応中心画分のバッファーを置換した後、Strep-tactinカラムに通すことにより、Strep-PscA/His-PscA型反応中心を分取することができた。しかしながらStrep-tactinとの親和性が極端に低いようで、ウエスタンブロッティングの結果からは大半が吸着していないことが判明した。そこで通常のプロトコールよりも低い塩濃度のバッファーを試みることにより回収率の改善がみられた。次年度以降は、もう少し溶出条件を検討することによって回収率を向上させるとともに、PscA遺伝子の改変に取り組む予定である。
海底トンネルの力学的健全性評価法に関する研究

海底トンネル周辺の水圧分布がトンネルの健全性に及ぼす影響を調べるため,掘削から供用開始後までの諸条件をモデル化した有限要素法の開発を行った.それに基づいて解析を行った結果,間隙水圧上昇によって,覆工と地盤の間に剥離が発生しうることを確認した.また,トンネルの周辺地盤の透水性が低下すると,水圧や塑性域などは変化するが,覆工の健全性には大きな影響を与えないという結論を得た.海底トンネル周辺の水圧分布がトンネルの健全性に及ぼす影響を調べるため,掘削から供用開始後までの諸条件をモデル化した有限要素法の開発を行った.それに基づいて解析を行った結果,間隙水圧上昇によって,覆工と地盤の間に剥離が発生しうることを確認した.また,トンネルの周辺地盤の透水性が低下すると,水圧や塑性域などは変化するが,覆工の健全性には大きな影響を与えないという結論を得た.青函トンネルに代表される海底トンネルでは,施工時および供用時にかかわらず,地下水の浸対策が最大の課題である.そのため,青函トンネルの貫通に最大限貢献した技術は「注入」であった.ところが注入工注が,完成した海底トンネルの力学的安定性に関して大きな課題を残すことはあまり知られていない.それは、透水係数の小さい領域をトンネル周辺に配置すると,海面からの深さに対応する静水圧に近い大きな水圧がトンネルの近くにまで押し寄せることである.注入域の存在しないほぼ一様な透水係数の地盤内に海底トンネルを掘削した場合,トンネル覆工裏側での水圧を0と仮定すると,遠方の静水圧から覆工背面までなめらかな曲線として水圧分布が得られる.そしてトンネル覆工背面に流れ込む湧水は,この地点における水圧(全水頭)の勾配と透水係数の積の大きさで確定する.勾配は小さいが,透水係数が大きいため湧水は多量となる.一方,トンネル周辺に透水係数の小さい注入域を設けると,注入域の外径のところまで海面からの深さに匹敵する静水圧が到達する.極端な場合として,注入域の透水係数を0とすると,ここでは完全な静水圧となる.トンネル背後の領域での動水勾配は大きくなるが透水係数が十分に小さいので湧水は少なくなる.しかしいずれにしても、大きな水圧の領域がトンネルに近づくため,注入は力学的な観点から,覆工の健全性を阻害するおそれがあるのである.本研究では,注入,トンネル掘削,覆工構築そして完成時から現状までの各ステージにおいて,海底トンネル周辺地盤に生じている現象の解明し,併せて数値解析(数値実験)による現象のモデル化を行う.これらの検討を通じ,海底トンネルの健全度の評価法の確立および健全度に対する対策方法の提案を目指す.平成21年度は,海底トンネルの力学モデルの確立を行うとともに浸透力の影響を考慮する簡便な模型実験の設計を行った.青函トンネルに代表される海底トンネルでは,施工時および供用時にかかわらず,地下水の浸透対策が最大の課題である.そのため,青函トンネルの貫通に最大限貢献した技術は「注入」であった.ところが注入工法が,完成した海底トンネルの力学的安定性に関して大きな課題を残すことはあまり知られていない.それは、透水係数の小さい領域をトンネル周辺に配置すると,海面からの深さに対応する静水圧に近い大きな水圧がトンネルの近くにまで押し寄せることである.注入域の存在しないほぼ一様な透水係数の地盤内に海底トンネルを掘削した場合,トンネル覆工裏側での水圧を0と仮定すると,遠方の静水圧から覆工背面までなめらかな曲線として水圧分布が得られる.そしてトンネル覆工背面に流れ込む湧水は,この地点における水圧(全水頭)の勾配と透水係数の積の大きさで確定する.勾配は小さいが,透水係数が大きいため湧水は多量となる.一方,トンネル周辺に透水係数の小さい注入域を設けると,注入域の外径のところまで海面からの深さに匹敵する静水圧が到達する.極端な場合として,注入域の透水係数を0とすると,ここでは完全な静水圧となる.トンネル背後の領域での動水勾配は大きくなるが透水係数が十分に小さいので湧水は少なくなる.しかしいずれにしても、大きな水圧の領域がトンネルに近づくため,注入は力学的な観点から,覆工の健全性を阻害するおそれがあるのである.平成22年度は,透水性の異なる2種類の地盤で構成される模型地盤を用いた変状実験を実施した.また,青函トンネルの湧水データに基づいたトンネルの安定性解析(水-土連成)を行い,湧水量の変化がトンネルの安定性に及ぼす影響についてケーススタディーを実施した.青函トンネルに代表される海底トンネルでは,施工時および供用時にかかわらず,地下水の浸透対策が最大の課題である.そのため,青函トンネルの貫通に最大限貢献した技術は「注入」であった.ところが注入工法が,完成した海底トンネルの力学的安定性に関して大きな課題を残すことはあまり知られていない.それは、透水係数の小さい領域をトンネル周辺に配置すると,海面からの深さに対応する静水圧に近い大きな水圧がトンネルの近くにまで押し寄せることである.注入域の存在しないほぼ一様な透水係数の地盤内に海底トンネルを掘削した場合,トンネル覆工裏側での水圧を0と仮定すると,遠方の静水圧から覆工背面までなめらかな曲線として水圧分布が得られる.そしてトンネル覆工背面に流れ込む湧水は,この地点における水圧(全水頭)の勾配と透水係数の積の大きさで確定する.

勾配は小さいが,透水係数が大きいため湧水は多量となる.一方,トンネル周辺に透水係数の小さい注入域を設けると,注入域の外径のところまで海面からの深さに匹敵する静水圧が到達する.極端な場合として,注入域の透水係数を0とすると,ここでは完全な静水圧となる.トンネル背後の領域での動水勾配は大きくなるが透水係数が十分に小さいので湧水は少なくなる.しかしいずれにしても、大きな水圧の領域がトンネルに近づくため,注入は力学的な観点から,覆工の健全性を阻害するおそれがあるのである.平成23年度は,透水性の異なる2種類の地盤で構成される模型地盤を用いた変状実験の成果を取りまとめた。また,青函トンネルの湧水データに基づいたトンネルの安定性解析(水-土連成)を行い、トンネル周辺の透水係数の分布や導水機能の低下がトンネルの安定性に及ぼす影響について調べた。また、水圧を考慮した剛塑性解析により安定性の解析を行った。
非線形引き込みを使った海中可視光通信装置の開発

海域での可視光通信として、RC回路とスイッチのモデルを使い、可視光による非線形同期手法を調査した。非線形同期は水圧による電子回路の特性が変化する場合において発生すると考えられる。また、可視光による同期が可能なマイコンホタルを作成した。本システムはマイクロプロセッサと青・緑のLEDとフォトダイオードで構成される。青が非線形同期を行い、通信のクロックとなる。緑は4PPM信号のデータである。回路特性の時定数を変化させ同期が発生する範囲と通信可能な範囲を調査した。非線形同期により幅広い範囲で同期と通信が可能となった。ATCを導入することにより最大600mmの距離においての通信が可能となった。非線形同期通信のクロックを作成する元となる非線形同期回路についての試験及び作成を行った。フォトトランジスタとLEDオペアンプの選定に時間がかかったが、陸上での非線形同期を確認した。今回は、同時点灯回路にせず、オシロスコープで確認のしやすい非同時点灯回路とした。また、時定数を2[S]とした。これにより、1対1の関係で、点灯時間と非点灯時間が等分に分割されることが確認できた。また、時定数をそれぞれ、規定値の20%程度変化させたが、同様な成果を得られた。1対nの初期試験として、3個で試験を行った。その結果、初期状態において不安定な状態を示したが、その後安定した同期回路を発生することを確認した。さらに、色フィルタ型のフォトトランジスタの試験回路の作成も行った。その際、分光器による波長による感度を調査したが、青LEDと緑LED回路において回路同期が不安定になることが確認された。このことにより、色フィルタ型のフォトトランジスタのみではなく、もう一段のフィルタが必要であることが分かった。通信シミュレーションをMatlab上で数値シミュレーションを行い4PPMでの信号処理とチェックサムで通信が可能であることが理解できた。実験においては、海域において耐圧容器を使った、水深1,000mでの発光テストには成功している。ただし、均等圧型・モールド型の試験及び同期試験は今後の課題といえる。よって、今後の見通しも明るいといえる。ホタルの非線形同期を行うための回路作成と解析を行った。特に本年度はアナログ回路(以下、アナログホタル回路)からマイクロプロセッサを用いたマイコン回路(以下、マイコンホタル回路)への移行を目指して開発を行った。マイコンホタル回路には、水中での減衰率が低い青色を非線形同期のクロックとした、データ送信部を緑色とした。なお、光源としてLEDとセンサーとして感度の良いフォトダイオードを使用した。その結果、非線形同期試験としては3台を同期させることが可能となった。また2台のペアでは非線形同期を使い、10bps程度のデータ転送が可能になった。しかし、アナログホタル回路では6個程度の回路では同期が素早く起こるのに対して、マイコンホタル回路では、同期が発生するのは、3つが限度であった。この点についての考察を行ったところ、マイコンホタル回路ではサンプリングタイムが100mS程度である点が問題であることが理解できた。現在、サンプリングタイムとその影響について調査中である。本問題の解析のため、高速な信号処理が可能なDSPシステムを応用すべくMatlabとSimulinkにて計測システムの構築に着手している。また、プリント基板加工機・3Dプリンターの改造を行いホタル同期試験回路の作成がスムーズに行える体制を確立した。また、海域試験については本学所有の汐路丸での実施の為の予備調査を終えた。本年度は、大学のポンド、船舶、ブイ等での海域試験を行う予定である。マイコンホタル回路を作成し、同期試験が成功した。データ通信も可能となった。また回路作成のツール群・測定システムの開発が上げられる。しかし、デジタルホタル回路ではアナログホタル回路に比べ同期がスムーズに行かない点や複数台での同期が困難であることが上げられる。しかしシミュレーション等では位相差を上手く使えば良い点が理解出来ため、今後の発展も期待できると考えられる。非線形同期回路としてRC回路とスイッチの特性を用いた神経振動子をベースとした非線形引き込みを使い同期を行った。今回は水中での透過率のよい青色を同期のクロック、緑色をデータとした通信とする。また非線形同期の演算にはマイクロプロセッサを用いた。また受光素子には青・緑のフィルター付きのフォトダイオードを用いた。本システムにより、速やかに非線形同期が発生する事をシミュレーション及び実験で確認した。本研究では深海の圧力により回路特性が変化し通信に必要な青色LEDによるクロックの周期が変化した場合の問題に相当する問題として、この回路方程式の時定数τに注目した。この個体差として時定数τを変化させて行き同期や通信が可能な範囲を調査した。問題を簡単にするために3台の回路で構成された3リングオシレータを用いて調査した。その結果、τが異なっていても同期が出来る範囲が有ることが調査の結果理解出来た。次に、緑LEDを用いて通信を可能にするため青色による非線形同期の周期Tを1/4分割し4PPM通信を行うこととした。その結果、τを変化させても通信を行う事が可能となった。さらに、屋外や水中において通信を行う為には光の強度を自動調整する必要がある。そのためATC(Auto Threshold Control)を導入し受光信号のノイズと受信パルス除去するようにした。ATCの計算については受光信号・発光信号ともにパルスであるため移動平均から算出する形とした。特にデータ通信部は4PPM信号であるため送信信号数n回の移動平均を取る事にした。

上記により気中での通信距離の増加や屋外での通信の確立等が確認できた。現在水中用に防水容器に入れ水中での通信試験を行っており、今後はポンドや汐路丸での水中試験等を行う予定である。海域での可視光通信として、RC回路とスイッチのモデルを使い、可視光による非線形同期手法を調査した。非線形同期は水圧による電子回路の特性が変化する場合において発生すると考えられる。また、可視光による同期が可能なマイコンホタルを作成した。本システムはマイクロプロセッサと青・緑のLEDとフォトダイオードで構成される。青が非線形同期を行い、通信のクロックとなる。緑は4PPM信号のデータである。回路特性の時定数を変化させ同期が発生する範囲と通信可能な範囲を調査した。非線形同期により幅広い範囲で同期と通信が可能となった。ATCを導入することにより最大600mmの距離においての通信が可能となった。青色LED・フォトトランジスタ・非線形同期回路が作成できた点があげられる。そして、シミュレーションにより通信においては、4PPM信号変換とチェックサムを使うことにより、エラー訂正をした通信が可能であることが示された。よって、基本部分の構築が達成できた。これは、本研究の基本的な考え方に基づけば水中において通信が可能であることを示している。実験においては、水中での同期試験として1月に海中において1,000mの水深で試験を行った。現在そのデータについては解析中である。しかし、青LEDと緑LEDを使った実際の通信まではフィルタ設計までは実装できていない点、均等圧状態・モールド構造による素子の圧力によるパラメータ変動等は考慮できていない点があげられる。今後の課題はこの点になると考えられる。しかし、電子回路及び通信の理論部分については、ほぼ終了したといえる。今後は実装面での設計が課題となろう。よって、今後の見通しも明るいといえる。今後はマイコンホタル回路を4個以上で可能にすること。通信速度の向上を目指す。海域試験において同期試験・通信試験を行う。Matlab Simulinkで加配初した試験装置を使い、複数台のホタル同期試験時における位相差を計測する。本条件をマイクロプロセッサにインプリメントし,複数台での同期と通信を可能にする。また、海域試験を行い同期・通信の条件を調査する。水中における防水技術は紫外線硬化型のエポキシ樹脂を使うことにより水密が可能であると考えられるため、今後は水中への適応を考える。船舶海洋工学,ロボット工学今後は、非線形同期回路を用いて、光通信装置を作成する。特に問題となるのは、青LEDと緑LED用のフォトトランジスタを用いて光信号の分離とフィルタの設計が大きなカギとなると考えられる。
アキラルな鎖状結晶環境下における光反応解析と絶対不斉合成

アキラルな基質の形成する不斉結晶のキラリティーのみを不斉源として利用する反応も絶対不斉反応に属し、近年,分子間,分子内光反応を用いた成功例が報告されている。我々は,含窒素カルボニル化合物であるアミド,イミド,チオアミド,チオイミドが高い確率でキラルな空間群の結晶を与えることも見いだし,その側鎖に官能基を導入することで光反応に活性な分子を構築し,以下のような絶対不斉合成反応を達成した。(1)N,N-ジアルキル-α,β-不飽和チオアミドの固相光反応非対称なN-ベンジル-N-イソプロピル-α,β-不飽和チオアミドは光照射により,分子内アルケンの水素引き抜き環化反応によるβ-チオラクタムを与えるが,液相ではベンジル基が,固相ではイソプロピル基が反応部位となり,β-チオラクタムが得られる。相の違いによる生成物の選択性を見いだした。さらに,N,N-ジベンジルシクロヘキセンカルボチオアミドが不斉結晶(空間群P2_1)を形成することを見い出し,その光照射で光学活性なβ-チオラクタムが収率96%,97%eeで得られた。こ反応はcrystal-to-crystalで進行し,転化率が増加しても高い不斉選択性が保持された。(2)S-アリールo-ベンゾイル安息香酸チオエステルの固相光反応種々のs-アリールo-ベンゾイル安息香酸チオエステルについてX線結晶構造解析と光反応を検討した。全て固相光反応により対応するフタリドを高収率で与えた.6種類のチオエステルの中で3つの化合物が不斉結晶を形成した。その固相光反応生成物は光学活性体として得られた。フタリド生成の反応機構としては,原料と生成物について異常分散法を用いて絶対構造を決定したところ,ラジカル対を経由する反応機構ではなく,アリール基の移動を伴って環化し生成することが明らかとなった。
汎用有機金属反応剤を用いる触媒的不斉付加反応の開発

3位にかさ高いアリール置換基を有するH8-BINOL誘導体から調製されるチタン触媒により、有機リチウム、ハロゲン化有機亜鉛、有機ホウ素、並びに有機アルミニウム反応剤などの汎用有機金属反応剤を用いてアルデヒドへの不斉付加反応を高効率かつ高選択的に実現できることを見いだした。いずれの有機金属反応剤も入手容易で安価な前駆体から簡便かつ効率的に調製できることから、本反応により多種多様な光学活性体第二級アルコールの一段階合成が可能となった。優れた官能基耐性を持つ有機亜鉛や有機ホウ素反応剤の不斉付加により、医薬品の合成中間体としての需要が高い多官能性第二級アルコールの実用的不斉合成法が確立できた。官能基化アルキルホウ素反応剤の触媒的不斉付加:安価で入手容易な末端アルケンとアルデヒドを原料に用いる光学活性体第二級アリルアルコールの触媒的不斉合成法の開発に成功した。末端アルケンとボランジメチルスルフィド錯体との反応により調製したトリアルキルボランを過剰量のテトライソプロポキシチタン存在下、DPP-H8-BINOL-チタン触媒によるアルデヒドへの不斉付加に用いることにより、多様な光学活性体アルコールを高エナンチオ選択的に合成することができた。本反応には、ハロゲン原子、エーテル、エステル並びにシアノ基など様々な官能基を持つホウ素反応剤が使用でき、対応する多官能性アルコールの不斉合成に利用できることも明らかにした。アルケニルアルミニウム反応剤の触媒的不斉付加:末端アルキンのニッケル触媒ヒドロアルミ化により調製したα置換-アルケニルアルミニウム反応剤がDPP-H8-BINOL-チタン触媒存在下でアルデヒドに不斉付加反応を起こし、対応するアリルアルコールを高エナンチオ選択的に与えることを見いだした。ヒドロアルミ化に使用するジメチルアランはクロロジメチルアルミニウムと水素化ナトリウムの反応により容易に合成できることも明らかにした。一般に、末端アルキンのヒドロメタル化反応ではβ置換アルケニル金属反応剤が位置選択的に生成するため、不斉付加により生成するアリルアルコールは、β置換体に限られてきた。本反応は、末端アルキン原料にα置換アリルアルコールを不斉合成する始めての例である。アリールリチウム反応剤の触媒的不斉付加:有機リチウム反応剤をテトライソプロポキシチタンと処理してリチウムチタナートに変換して反応に用いても、高いエナンチオ選択性は得られなかったが、クロロトリイソプロポキシチタンと処理して有機チタン反応剤に変換することでこの問題が解決できることが解った。この知見に基づき、安価で入手容易な臭化アリールとアルデヒドを原料とする第二級アルコールの触媒的不斉合成法の開発に成功した。BuLiによるBr/Li交換、クロロトリイソプロポキシチタンによるアリールチタン反応剤の調製及びDPP-H8-BINOL-チタン触媒によるアルデヒドへの不斉付加を連続的に実施することにより、1 mol%以下の触媒量で、多様な光学活性体ジアリールメタノールを高エナンチオ選択的に合成することができた。ハロゲン化有機亜鉛反応剤の触媒的不斉付加:対応する臭化物をLiCl共存下で亜鉛末と処理することで、様々な反応性官能基を分子内に持つハロゲン化アルキル亜鉛反応剤が簡便かつ効率的に調製できる。これをテトライソプロポキシチタンと混合してアルデヒドへの不斉付加反応に用いたが良好な結果は得られなかった。各種の金属塩の添加効果を検討した結果、ハロゲン化アルキル亜鉛反応剤にテトライソプロポキシチタン及び臭化マグネシウムを添加した混合有機金属反応剤が、DPP-H8-BINOL-チタン触媒(5 mol %)共存下で芳香族アルデヒド及び不飽和アルデヒドに高エナンチオ選択的に付加し、対応する多官能性工学活性体第二級アルコールを高収率で与えることを見いだした。三置換アルケニルアルミニウム反応剤の触媒的不斉付加反応:末端アルキンをジルコニウム触媒共存下でトリメチルアルミニウムと処理することで立体選択的に調製した三置換アルケニルアルミニウム反応剤の芳香族アルデヒドへの触媒的不斉付加反応を開発した。本反応は、5 mol%の3-(3,5-ジフェニルフェニル)-H8-BINOLと3当量のテトライソプロポキシチタンの共存下でエナンチオ選択的に進行し、対応する光学活性体の三置換アリルアルコールを高収率で与える。アルケニルリチウム反応剤の触媒的不斉付加反応:入手容易な臭化ビニル誘導体のリチオ化により調整したアルケニルリチウム反応剤を用いるアルデヒドの触媒的不斉アルケニル化反応を開発した。アルケニルリチウム反応剤をBuZnClと処理することで亜鉛反応剤に変換したのちに触媒量の3-(3,5-ジフェニルフェニル)-H8-BINOL及び過剰量のテトライソプロポキシチタンの共存下でアルデヒドとの反応を行うことにより、多様な光学活性アリルアルコールがエナンチオ選択的に合成できることが明らかとなった。高活性3-置換H8-BINOL配位子の開発: 3-位によりかさ高い3,5-ジ-t-ブチルフェニル基

及び3,5-ジ-9-アントラセニル基が置換したH8-BINOLのチタン錯体が極めて高い触媒活性を有することを見いだした。例えば、1-ナフトアルデヒドへのフェニルトリイソプロポキシチタンの付加反応にこれらの配位子を用いると、わずか0.125 mol%の低触媒量でも90% eeを超える高いエナンチオ選択性が得られることがわかった。有機合成化学有機ホウ素反応剤の触媒的不斉付加に関しては当初の研究計画が概ね達成され、研究成果を論文発表することができた。また、有機アルミニウム反応剤の不斉付加にも本触媒系が適用できることも明らかにし、研究成果を論文発表した。さらに、アルキンのカルボアルミ化により調製した三置換アルケニルアルミニウム反応剤の不斉付加に関しても一定の成果が得られたが、エナンチオ選択性の一層の向上のために反応条件の探査が必要である。アリールリチウム反応剤の触媒的不斉付加及びハロゲン化有機亜鉛反応剤の触媒的不斉付加に関しては、当初の研究計画が概ね達成され、それぞれの研究成果を論文発表することができた。官能基化アルケニルホウ素反応剤の触媒的不斉付加に関しては、反応効率の面で改善の余地はあるものの多様な官能基に適用可能な不斉付加の反応条件がほぼ確立でき、近々に論文発表の予定であるが、反応効率の改善を目指し更に反応条件の探査が必要である。三置換アルケニルアルミニウム反応剤の触媒的不斉付加に関しては、エナンチオ選択性の改善を目指し反応条件の探査が継続する予定である。臭化アルケンのリチオ化で調製したアルケニルリチウム反応剤のアルデヒドへの触媒的不斉付加は、アルケニルチタン中間体が不安定で分解する問題がある。この課題を克服すべく、亜鉛反応剤へのトランスメタル化を検討する予定である。官能基化アルケニルホウ素反応剤の触媒的不斉付加に関しては、反応効率の改善を目指し反応条件の探査が継続する予定である。リチオ化で調製したリチオジチアン、フェニルチオメチルリチウム、リチオアセト二トリルなどの準安定有機リチウム反応剤のアルデヒドへの触媒的不斉付加を実現するためには、これまで良好な結果を与えたDPP-H8-BINOL配位子の改良が必要と考えられる。この課題を克服すべく、不斉配位子の徹底的なスクリーニングを検討する予定である。研究計画実施のために、薬品及びガラス器具の購入に使用する。また研究成果公表のための出張旅費及び論文投稿料としても使用する計画である。
初期2型糖尿病ラットでの拡張期末の心筋収縮タンパク質分子動態異常の放射光解析

独自の放射光X線心筋回折法の2型前糖尿病モデルGoto-Kakizaki(GK)ラットの拍動左心室への応用で心内膜下層に限局性の心筋収縮タンパク質動態異常を認め、同時に心臓拡張機能異常も認めた。GK心筋タンパク質のリン酸化は、myofilament proteinsには異常なく、タイチンに有意な減少を認めた。心筋組織のsoluble guanylate cyclase(sGC)発現とPKG活性の低下を認め、リン酸化減少にsGC-PKGシグナル低下の関与が推定された。放射光での冠動脈可視化から、GKの内皮依存性拡張機能に異常なく、従来説の内皮由来一酸化窒素低下によるシグナル低下は否定的あった。糖尿病は、Heart Failure with preserved Ejection Fraction(HFpEF)の重要な誘因であるが、その根本病態は未解明である。我々はこれまで、独自に開発した放射光X線心筋回折法を、1型糖尿病モデルラットのin vivo拍動左心室に応用して、拡張期末におけるミオシン頭部のアクチンからの解離数は、対照と比較して、増大していること(心内膜下層側でより顕著)を見出し、この解離増大の程度と心臓拡張能(dP/dtmin)の低下は相関することを明らかにした。本研究の28年度では、糖尿病によるHFpEFへの進展病態の解明を目指し、マクロ的な機能異常がないごく初期の2型糖尿病ラット(Goto-Kakizakiラット、10週齢)で、1型糖尿病ラットで見出した心筋収縮タンパク質の機能異常が早期発見できるかを放射光X線回折法で調べた。その結果、心内膜下層心筋を中心に、1型糖尿病ラットと同様の拡張期のクロスブリッジ数の減少(ミオシン頭部のアクチンからの解離数の増大)が検出された。この心筋収縮タンパク質機能異常は、心外膜下層では検出されなかった。また、Goto-Kakizakiラットの摘出心筋の免疫組織化学検査並びにWestern blotting解析からRho-kinaseの発現増大が見いだされ、この酵素の阻害薬(fasudil)をラットに慢性投与すると、検出した心筋収縮タンパク質機能異常は大きく改善することも判明した。昨年度、初期の2型糖尿病モデルラット(10週齢GKラット)の心臓で、拡張期末のミオシン頭部のアクチンからの解離数増大が生じており、さらに、Rho-kinase阻害薬(ファスジル)がこの分子動態異常を改善することを明らかにした。そこで、本年度は、このファスジルの改善効果が、進行した糖尿病+高血圧モデルラット(8週齢GKラットに2か月間の高食塩食を負荷)で有効かどうかを、確立した心不全治療薬であるアンギオテンシンIIタイプ1受容体遮断薬、ロサルタンの効果と比較することで調べた。その結果、ファスジルは拡張期末の解離数増大を改善するが、ロサルタンは改善しないことが分かり、ファスジルは心臓拡張機能障害の改善薬の候補となり得ると考えられた。また、ミオシンとアクチンの結合・解離を調節するmyofilament proteins (myosin-binding protein C, troponin I, myosin regulatory light chain )のリン酸化状態をWestern解析したが、GKラットとWistarラット(対照)間で有意差が見いだせなかった。そこで、心筋細胞の構造タンパク質であるタイチン(ミオシンの位置の安定性や弾力性・伸展性を調節する)のリン酸化状態を調べた結果、GKでは有意に減少していた。また、心筋のsoluble guanylate cyclase(sGC)発現とPKG活性の低下を同時に認めたことから、タイチンリン酸化減少にsGCーPKGシグナリング障害が関与すると推定された。以上から、心臓拡張機能障害の根本的機序にタイチンリン酸化障害を介した拡張期末の心筋収縮タンパク質機能異常の関与が示唆され、その分子基盤としてRho-kinase活性化によるROS発生増大とそれに伴うNO-sGC-PKGシグナリングの障害の可能性が示唆された。28年度のpreliminary studiesから、β1受容体遮断, Atenolol(10 mg/kg/day)およびAT1受容体遮断, Losartan(10mg/kg/day)、PKCβ遮断, LY333531(1mg/kg/day)が効果を有する可能性が示唆された。これらの薬剤の効果を比較することで、初期の糖尿病での心筋収縮タンパク質機能異常を起こすシグナル伝達機構を明らかにしたい。同時に分子生物学的検査を進め、分子病態の解明を目指す。循環生理学
社会的スキルの観点による在日中国人留学生の日本文化適応に関する社会心理学的研究

本研究の目的は,在日中国人留学生の日本文化適応を「日本人との対人関係の形成」という視点から切り込み,適応の段階に沿って問題を検討し,最終的に,適応を促進する手段(社会的スキル・アプローチ)を講じることである。研究では,中国人留学生の日本文化適応についての特有なニーズについて,中長期滞在の留学生,そして留学生を世話・指導している日本人を対象に調査した。また,中長期の留学生を調査した結果を短期滞在の者の結果と比較した。さらに,留学生の日本文化適応の尺度の作成を試みた。その上で,「体験学習」の方法論に則って,適応を促進する訓練のプログラムを開発・実践を通して,プログラムの効果を検証した。平成24年度には,研究計画書および平成23年度の実施報告書にあった「12.今後の研究の推進方策」で言及した内容に基づけば,1中国人留学生の日本社会における「日本人との対人関係の形成」に関する階層ごとの適応上の問題およびプロセスを総合的に明らかにする。2中国人留学生の各適応段階において,中国文化と対照的に捉える日本文化における対人関係に必要とする社会的スキルの種類とレベルを確認するために,質問紙調査および実験室実験を行う,という2つの研究を推進すると計画した。しかし,2012年9月ごろより,日本と中国の政治情勢の変化が激しくなり,本研究の研究対象者(在日中国人留学生)および研究テーマ(日本文化の適応)の性質上,この時期に計画を実行しても,得られたデータにバイアスがかかる可能性があることが予想される。このような政治的・社会的状況を鑑みて,平成24年度に,データ収集をせず,学会発表および学会参加を中心に研究活動を展開した。学会発表については,これまでに蓄積したデータを活用し,日本心理学会のポスター発表を行った。来聴者との議論を通じて,これまでの研究の問題点を知り,今後における研究を展開する方向性などの有益なヒントを得た。学会の参加については,日本グループ・ダイナミックス学会にて,異文化や社会的スキルに関連する発表を聴講した。この領域の最新動向の把握につなげた。平成25年度には,申請書に記載された研究1と研究2の完成に目指して,研究を展開した。研究1の目的,すなわち,「中国人留学生の日本社会における『日本人との対人関係の形成』に関する特有の問題点を抽出する」ことに照らし合わせて,自由記述調査を展開した。自由記述調査は,実施計画に沿って,既存研究の成果を取り入れながら,来日してから異なる滞在期間の留学生(短期滞在と長期滞在),そして留学生を指導・世話する日本人を対象に実施した。上記の各々の対象者群から得られた記述がまとめられた。また,短期滞在と長期滞在の留学生の結果の比較,そして,留学生自身と日本人側の意見の比較も行った。異なる観点から留学生の日本人との対人関係の問題点が明らかとなった。これら一連の結果を2014年度の日本社会心理学会,日本グループ・ダイナミックス学会にて発表する予定をしている。研究2の目的は,「留学生の各適応段階において,中国文化と対照的に捉える日本文化における対人関係に必要とする社会的スキルの種類とレベルを確認し,日本文化適応のプロセスを社会的スキルの側面から明らかにする」ことである。この目的を実現するために,留学生の日本人との対人関係の適応次元を明らかにした。具体的に,研究1で明らかにした留学生の適応上の問題点をもとに,候補項目を作成し,中国文化的社会的スキル尺度,日本文化的社会的スキル尺度,さらに文化共通的社会的スキル尺度を取り入れて,質問紙調査を行った。留学生における日本的対人関係適応尺度の開発を試みた。また,この尺度の他の文化的社会的スキルとの関係が検討された。研究2の結果を,2014年度の日本心理学会にて発表する予定をしている。近年,日本で勉強する外国人留学生が飛躍的に多くなり,在日留学生の日本文化適応を促す必要性が高まっている。本研究は,先行研究で指摘された在日留学生の適応に最大の課題点としての「対人関係の形成」に注目し,在日留学生,とりわけ中国人留学生の対人関係を円滑に運ぶ「社会的スキル」の研究を取り組もうとしている。社会的スキルの分類や異文化適応のプロセスに関する先行研究を踏まえ,本研究では,(1)来日期間ごとに,中国人留学生の日本文化適応には,どのような対人的問題を抱えているか,そしてどのような適応プロセスを踏むかについて明らかにする。さらに,(2)期間ごとの問題点に対応し,社会的スキル・トレーニングという方法を講じて,中国人留学生の「対人関係の形成」を向上させることを目的としている。3年計画の本研究は,当初,平成23年度には,上記の(1)に従い,「中国人留学生の日本社会における『日本人との対人関係の形成』に関する階層ごとの適応上の問題およびプロセスを総合的に明らかにする」と研究計画を立案した。

しかし,より先行研究を対象とする文献リサーチを行って,自らのこれまでの研究をまとめ,しっかりとした理論的なベースを構築することが,本研究の推進に大事と考えた。そのため,平成23年度には,まず,(1)書籍の購入および学術論文のレビューを行った。そして,(2)精力的に国内外の学会で発表・聴講を行った。(1)の実行により,異文化適応領域における社会的スキルに関する研究の方法論,とりわけ研究に重要とされる変数やトレーニングの方法など,一層明確になった。(2)の実行により,本研究の推進に役立つ自らのこれまでの研究成果を発表することができ,他の研究者と意見交換し,新たな知見を得ることができた。また,同じ領域の研究者の研究を聴講することにより,自らの研究の新しいヒントを得ることもできた。平成25年度までに,本研究は,研究1と研究2を実行しました。研究1では,「中国人留学生の日本社会における『日本人との対人関係の形成』に関する特有の問題点」を抽出した。研究2では,「中国文化と対照的に捉える日本文化における対人関係に必要とする社会的スキルの種類とレベルを確認」した。研究の最終年度の平成26年度には,本研究3の目的,つまり,「中国人留学生の日本文化適応を促すトレーニングのプログラムの開発および効果の検証」を取り組み,研究を展開した。日本文化適応に中国人留学生に特有なニーズをもとに,Gudykunst & Hammer(1983)が指摘した異文化のコミュニケーションに関する体験学習による異文化適応の社会的スキル・トレーニング(SST)の考え方を活用して,トレーニングのプログラムを編成した。また,このプログラムの編成には,etic-emicアプローチ,つまり,文化共通性-文化独自性の考え方を導入した。6回から構成されたプログラムの前半3回は,文化に関係なく,他者とコミュニケーションをとるときに必要な社会的スキルをトレーニングするものである。後半3回は,異文化環境下において必要となる社会的スキルをトレーニングする内容となっている。そして,これらのプログラムを短期滞在の日本語学校の中国人留学生を対象に,SSTの実践を行った。また,トレーニングの効果を検証するために,SSTの前後に,既存の中国文化に必要な社会的スキル尺度や日本文化に必要な社会的スキル尺度,文化一般の社会的スキル尺度,さらに研究2で開発した「日本的対人関係適応尺度」をはじめとする自己報告の質問紙調査を行った。さらに,SSTの前後に,参加者を日本人学生との会話実験を設けて,行動の面からSSTの効果を確かめた。社会心理学2012年9月ごろより,日本と中国の政治関係は,1972年の日中国交正常化以来,未曾有の危機状態に陥った。このような政治情勢により,日中両国の国民同士の交流や相手の国(国民)に対する考え方など,負の影響を与える可能性が十分に考えられる。本研究の研究対象者(在日中国人留学生)および研究テーマ(日本文化の適応)の性質上,2012年度においては,計画を実行しても,得られたデータにバイアスがかかる可能性があることが予想される。よって,研究の進行が遅れている状態となっている。
CdTeアレーを用いた高速・高分解能クアッドエネルギーⅩ線CT

●CdTeアレーを使った1.5倍拡大撮影:空間分解能の向上を目指して,0.1 mmフォーカスX線管により1.5倍拡大撮影を行い,約0.07 mmの空間分解能を実現した。●エネルギーサブトラクションプログラムの構築:スレッショルドエネルギーが異なる2つのRawファイル画像を差し引き,エネルギーサブトラクション画像を構成するプログラムを構築した。●CdTeアレーによるデュアルエネルギー(DE)CT撮影: 2値のスレッショルドエネルギーを設定して平均エネルギーの異なる2ファイルの断層像を撮影し,エネルギーサブトラクションにより準単色撮影を行った。よって,ヨウ素(I)とガドリニウム(Gd)のKエッジCTでは,それぞれ3350 keVと50100 keVのフォトンを用いることになる。これら2種のKエッジ撮影法を用いて造影剤入りファントムを撮影し,画像コントラストの変化を確かめた。●高速エネルギー弁別検出器の基礎研究: CdTe,LSO-PMT,YAP(Ce)-μPMTなどの検出器に用いる複数の小型の高速増幅器を試作した。次に,Am 241から発生するγ線を用いてエネルギー分解能を測定し,カウントレートの向上をはかった。一般に,マルチチャンネルアナライザー(MCA)は1 μs以上のパルス幅を有するイベントパルスの波高分析に利用されるので,MCAでの測定値は実際の波高値よりも小さい値になる。よってパルス幅拡張器を作製し,エネルギー補正無しで,X線スペクトルを測定した。●CdTeアレーを使った1.5倍拡大撮影:当初は2倍拡大撮影を予定したが,まずは1.5倍拡大撮影を行った。0.1mmフォーカスX線管を用いていることから,2019年度は2倍拡大を目指す。●エネルギーサブトラクションプログラムの構築:当初はフォトンカウンティングのエネルギーサブトラクションを目指したが,アレーの詳細が明かされていないため,Rawファイルでのサブトラクションを行った。●CdTeアレーによるDE-CT:研究テーマのクアッドエネルギー(QE)CT撮影は第一世代ではすでに成功している。アレーを用いてQE-CTを実現するにはDE-CTをスレッショルドエネルギーを変えて2度行えば可能である。しかし,実用的にはサブトラクションを含めてトリプル(TE)CTで十分であり,TE-CTの画質を向上し,撮影時間を短縮することが重要であると判断した。●高速エネルギー弁別検出器: CdTe検出器を用いた場合にはイベントパルス幅が1 μs以上となるため,最大カウントレートは100 kcps程度である。一方,YAP(Ce)-PMT検出器などから発生するイベントパルスの幅は100 ns程度まで縮めることができることから,1 Mcpsのカウントレートを比較的容易に達成できる。よって,コンパレーター回路の時間分解能を改善することにより,カウントレートが増し,画質が改善されると思われる。加えて第一世代CTの実験では4個の鉛製ピンホールを用い,散乱線を除去し,空間分解能を改善することができた。総じて当初の計画はほぼ予定通りに遂行され,研究成果に関する複数の論文もすでにアクセプトされている。●CdTeアレーを用いたTE-CTの画質改善: DEのCdTeアレーを用いた場合にはエネルギーサブトラクションも含めてTEとなる。本研究ではX線管を固定し,X線スペクトル,検出器の位置,ターンテーブルの位置などを調整して,特にリングアーチファクトを低減することを目指す。●CdTeおよびYAP(Ce)-PMTを用いたエネルギー弁別X線CT画像の画質改善:カウントレートを増し,空間分解能を向上させ,トランスレーションステップを0.1 mmに設定し,さらに散乱線を低減することにより,第一世代CT画像の画質を改善する。●CdTeを用いた新しいエネルギー弁別X線CTの開発:一般にX線スペクトルの実効エネルギーは被写体を透過することにより高まる。よって検出器に取り付けられた増幅器の最大出力電圧を固定し,検出器モジュール中の増幅器の増幅率を高めた際のプロジェクション出力を計算して画像再構成すれば,断層像の平均エネルギーは高まる。●YAP(Ce)-PMTを用いたビームハードニングX線CTの開発: X線フォトンのカウントによりPMTから発生される負のパルスを反転増幅する。次いで,前述のようにビームハードニングによりフォトンエネルギーの高い断層像を再構成する。●フォトンカウンティング・ビームハードニングX線CTの開発:一般に,検出器の感度はフォトンエネルギーに比例する。このエネルギー依存を是正するため,すべてのフォトンをカウントしてビームハードニングを用いることにより,エネルギー弁別CTを試みる。●XCounter社製のActaeonというCdTeアレーを購入し,ヨウ素(I)やガドリニウム(Gd)の造影剤を使ったKエッジ撮影を試みた。フォーカスサイズが直径0.1mmのX線管を用い,X線源とCdTeアレーとの距離を1.0mに調整した。X線フォトンのカウントレートを増し,平均化された画像を用いることにより,画質の向上をはかった。●I-Kエッジ撮影では管電圧を60kVに設定し,スレッショルドエネルギーを10と33keVに設定した。よって撮影に用いたエネルギーレンジは10-60そして33-60keVであった。犬の心臓の撮影ではエネルギーレンジを33-60keVに高めることにより,心筋のグレイ値濃度が増加し,冠動脈が高コントラストで撮影できた。空間分解能はピクセルサイズと同等で,0.1×0.1mmであった。

●Gd-Kエッジ撮影では管電圧を80kVに調整し,スレッショルドエネルギーを30と50keVに設定した。よって撮影に用いたエネルギーレンジは30-80そして50-80keVであった。ウサギ頭部の撮影ではエネルギーレンジを50-80keVに高めることにより,筋肉の濃度が増加し,鼻の微小血管が高コントラストで撮影できた。また200フレームの画像を平均化することにより,画像の粒状性が著しく改善された。●CdTeアレーとX線源の間にターンテーブルを取り付けて,デュアルエネルギーX線CT(DE-CT)スキャナーを構築した。一般撮影と比較して,KエッジCT撮影では,濃度の最大と最小の値は逆転するが,一般撮影と同等の結果が得られた。3D画像の構築も容易で,空間分解能は0.1×0.1×0.1mm程度であった。●29年度における上記研究成果に加えて,CdTeアレーを使った高速撮影を行った。シングル撮影モードではX線フォトンをカウントできないが,高線量率のX線を用いて高速撮影が可能である。ここでは撮影距離が1.0m程度で,最大1kfpsの高速連続X線撮影を行った。●購入したActaeonというCdTeアレーにはスレッショルドエネルギーを1keVのステップで選択できるプログラムが添付されており,あらためてDE撮影のためのプログラムを作成する必要はなかった。Actaeonにおける個々のピクセルには電荷有感増幅器とDEカウンターがついているが,電子回路が不明であるため,CdTeアレーとしてのエネルギー分解能を測定することは難しかった。●IやGdの造影剤を使ったKエッジ撮影ではスレッショルドエネルギーを変化させることにより,画像のコントラストは変化を確認した。しかし,最大エネルギーが一定であるため,大きなコントラスト変化は得られなかった。また,添付されているエネルギーサブトラクションプログラムは低エネルギー画像から高エネルギー画像を単純に差し引く方式であるため,画像に粒状性が現れ,改良が必要であった。●CdTeアレーを使ったDE-CT撮影では,0.1×0.1×0.1mm程度の空間分解能が得られ,3次元表示は容易であったが,高コントラストのKエッジCT画像を得るにはフォトンカウント・エネルギーサブトラクションが必要であった。総じて当初の計画は,ほぼ予定通りに遂行され,研究成果に関する複数の論文もすでにアクセプトされている。●CdTeアレーを使った1.5倍拡大撮影:空間分解能の向上を目指して,0.1 mmフォーカスX線管により1.5倍拡大撮影を行い,約0.07 mmの空間分解能を実現した。●エネルギーサブトラクションプログラムの構築:スレッショルドエネルギーが異なる2つのRawファイル画像を差し引き,エネルギーサブトラクション画像を構成するプログラムを構築した。●CdTeアレーによるデュアルエネルギー(DE)CT撮影: 2値のスレッショルドエネルギーを設定して平均エネルギーの異なる2ファイルの断層像を撮影し,エネルギーサブトラクションにより準単色撮影を行った。
幹前駆細胞の分化制御からみた肝線維化と再生・発癌の病態連繋

硬変肝では生理的な再生が損なわれると同時に、肝細胞癌が好発する。本研究では、線維肝における肝前駆細胞の誘導と再生、さらに発癌に対するNotchシグナルの作用を解明することを目的とした。Notch受容体のリガンドであるJagged1の欠失マウスを用いて解析を行ったところ、肝線維化の進展に伴って活性化した星細胞のJagged1発現が、近接する肝細胞のNotch2受容体を介して肝前駆細胞への脱分化を促し、これが線維肝の再生に寄与する可能性が示された。また、Jagged1/Notchシグナルはdemethylnitrosamine誘導性の肝発癌に対して抑制的にはたらくことが明らかになった。肝線維化が進行して肝硬変に至ると、生理的再生が損なわれる一方で、肝細胞癌が高率に合併する。たとえ早期に肝細胞癌を発見できても、手術後の肝再生不全の恐れのために切除できない症例も経験されるなど、その対策は急務となっている。本研究では、この肝線維化と再生・発癌の病態連繋を制御する細胞間の相互作用因子として、Notch/Jagged-1シグナルに着目した。同シグナルは、胎生期の肝発生段階においては胆管細胞への分化に重要な役割を担っていることが知られているが、生後の生理的あるいは病的条件下における肝再生にどのように関わるかは不明である。研究初年度は、野生型マウスから肝実質細胞と星細胞を分離して、Jagged-1の発現を検討した。その結果、Jagged-1の発現は肝実質細胞や静止期の星細胞ではわずかに認められるのみであるが、培養に伴って活性化した星細胞において発現増加が認められた。次に、Jagged-1遺伝子を欠失させたノックアウトマウスと野生型マウスに四塩化炭素を反復投与して、肝線維症を作製した。この際の肝線維化の度合いや肝星細胞の活性化をSirius red染色およびαSMA染色により組織学的に検討したが、Jagged-1の欠損は肝線維化の進展や星細胞活性化に直接的な影響を及ぼさなかった。そこで、線維肝を部分切除した際の再生にNotch/Jagged-1シグナルがいかなる影響を与えるかを明らかにするため、野生型マウスを用いて肝線維化の程度と再生との相関を見る予備実験に着手するなど、次年度以降の研究に向けた準備を進めている。肝線維化が進行して肝硬変に至ると、肝臓が持つ本来の再生能力が損なわれるとともに、高頻度に癌(肝細胞癌)を合併する。たとえ早期に肝細胞癌を発見できても、手術後の肝再生不全の恐れのために切除手術ができない症例も経験されるなど、その対策は急務となっている。本研究では、この肝線維化と再生・発癌の病態連繋を制御する細胞間の相互作用因子として、細胞表面に発現するNotch受容体と、これを活性化するリガンドであるJagged-1のシグナル伝達に着目した。Notch/Jagged-1シグナルは胎生期の肝発生において胆管細胞への分化に重要な役割を担っているが、生後の生理的あるいは病的条件下における肝再生や発癌にどのように関わるかについては充分に解明されていない。今年度までの研究により、コラーゲン産生細胞として肝線維化の進展において中心的役割を担っている肝星細胞の活性化に伴ってJagged-1発現が増加すること、Jagged-1遺伝子の欠失マウスと対照の野生型マウスに肝臓毒である四塩化炭素を反復投与して誘導される肝線維化の程度や星細胞の活性化状態には両群間で差がないもかかわらず、肝線維症マウスに対して70%の部分肝切除を行った後の生存率がJagged-1欠損マウスで著しく低下していた。このことから、肝線維化の進行に伴って活性化星細胞での発現が増加したJagged-1が、肝細胞のNotch受容体を介して病的条件下の肝再生を促進させる可能性が示された。また、生後3週を経過したJagged-1欠損マウスと対照の野生型マウスに対して、肝細胞癌の誘発物質であるDiethylnitrosamine (DEN)を腹腔内に単回投与し、Notch/Jagged-1シグナルが肝発癌に及ぼす影響に関する検討に着手した。さらに、受容体側であるNotch-1およびNotch-2の遺伝子欠失マウスを継代・繁殖させ、次年度以降の研究に向けた準備を開始した。硬変肝では生理的な再生が損なわれる一方で、肝細胞癌が好発する。肝線維化の進展を抑制しつつ傷害肝の再生を促すという肝硬変に対する基本治療戦略にもかかわらず、線維肝の再生を司る幹前駆細胞の分化制御機構の研究は大きく立ち遅れている。また、がん幹細胞の分化の観点から肝線維化と発癌との関連を解明しようとする研究も皆無である。本研究では、線維肝における幹前駆細胞の動員と分化、さらに発癌を制御する細胞間の相互作用(cell-cell contact)を司る機序として、Notch/Jagged-1シグナルに着目した。Jagged-1遺伝子欠失マウスを用いて、肝の線維化と再生、発癌の病態連繋を包括的に解析し、その制御機構の解明を通じて線維肝の再生促進と発癌抑止を図ることを目的とした。昨年度までの研究により、肝星細胞の初代培養に伴う活性化によりJagged-1発現が増加すること、Jagged-1遺伝子欠失マウスと対照の野生型マウスに四塩化炭素の反復投与を行って作製した線維肝の部分切除を行うと、Jagged-1遺伝子欠失マウスにおいて生存率の著しい低下が認められることが明らかになった。