hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
突然変異と細胞がん化の原因となる放射線誘発長寿命ラジカルの性質

我々は、これまでにX線あるいはγ線照射された哺乳類細胞に室温で20時間程度の寿命を持つ超寿命ラジカル(LLR ; Long Lived Radical)が生ずることをESRによるラジカル解析によって発見した。さらに、LLRは、放射線被曝後数十分から数十時間後に5mM程度のビタミンCで2時間処理することによって完全に消失することがわかった。活性の高いOHやO_2^-ラジカルの革命は200ナノ秒以下であるので、ビタミンC処理で捕捉されるラジカルは、LLRであると考えられる。LLRの消失に伴って細胞突然変異や細胞がん化誘導は抑制されるが、染色体異常や細胞死誘導を抑制することは出来ない。システアミンやDMSO処理でOHやO_2^-ラジカルを消去することで細胞死や染色体異常誘導を抑制することができるが、細胞突然変異や細胞がん化誘導を抑制することはできない。これらのことから、我々は、LLRこそが放射線による細胞の突然変異と細胞がん化の主因であると結論している。さらに、電子スピン共鳴解析法による解析から、LLRは、細胞内の疎水性のバイオポリマー部位で、恐らくDNAや脂質でなく、システインなどのスルフィニル基に年じていることなどが明らかになった。これら一連の結果は、これまで放射線生物学的に信じられてきた"放射線突然変異や発がんの原因は活性が高い酸素ラジカル種(ROS)がDNAや染色体を破壊することである"という予想を覆すものであり、ヒトにおける突然変異や発がんがタンパク質に生じた変異を起源とするという極めて新しく放射線の遺伝影響の本体を知るために極めて重要な知見である。我々は、これまでにX線あるいはγ線照射された哺乳類細胞に室温で20時間程度の寿命を持つ超寿命ラジカル(LLR)が生ずることをESRによるラジカル解析によって発見した。さらに、LLRは、放射線被曝後数十分から数十時間後にビタミンC処理することによって完全に消失するが、それに伴って細胞突然変異や細胞癌化が抑制されることがわかった。しかし、染色体異常や細胞死を抑制することは出来ない。これまで放射線突然変異や発癌の原因は、活性が高い酸素ラジカル種(ROS)がDNAや染色体を破壊することが原因と信じられていたが、そのような活性ラジカルは、放射線照射後ナノ秒単位で消失しているので、放射線被曝後数十分から数十時間後におこなうビタミンC処理で捕捉されない。これらのことから、LLRこそが放射線による細胞の突然変異と癌化の主因であると結論した。さらに、電子スピン共鳴解析法による解析から、LLRは、疎水性のバイオポリマーに誘導されていること、恐らくDNAや脂質でなくシステインなどのスルフィニル基に生じていることなどを明らかにした。さらに、LLRは、放射線被曝後数十分から数十時間後に5mM程度のピタミンCで2時間処理することによって完全に消失することがわかった。活性の高いOHやO_2ラジカルの寿命は200ナノ秒以下であるので、ピタミンC処理で捕捉されるラジカルは、LLRであると考えられる。システアミンやDMSO処理でOHやO_2ラジカルを消去することで細胞死や染色体異常誘導を抑制することができるが、細胞突然変異や細胞がん化誘導を抑制することはできない。さらに、電子スピン共鳴解析法による解析から、LLRは、細胞内の疎水性のバイオポリマー部位で、恐らくDNAや脂質でなく、システインなどのスルフィニル基に生じていることなどが明らかになった。これら一連の結果は、これまで放射線生物学的に信じられてきた

"放射線突然変異や発がんの原因は活性が高い酸素ラジカル種(ROS)がDNAや染色体を破壊することである"という予想を覆すものであり、ヒトにおける突然変異や発がんがタンパク質に生じた変異を起源とするという極めて新しく放射線の遺伝影響の本体を知るために極めて重要な知見である。我々は、X線あるいはγ線照射された哺乳類細胞に室温で20時間程度の寿命を持つ超寿命ラジカル(LLR ; Long Lived Radical)が生ずることをESRによるラジカル解析によって発見した。さらに、このLLRは、細胞内の疎水性のバイオポリマー部位のシステインなどのスルフィニル基を持つタンパク質に生じていることなどがわかった。このLLRは、放射線被曝後数十分から数十時間後にビタミンCやエピガロカテキンあるいは没食子酸など植物ポリフェノール類で処理することによって完全に消失することができる。活性の高いOHやO_2^-ラジカルの寿命は200ナノ秒以下であるので、ビタミンCなどの処理で捕捉されるラジカルは、LLRであると考えられる。また、LLRの消失に伴って細胞突然変異や細胞がん化誘導は抑制できるが、染色体異常や細胞死誘導を抑制できない。システアミンやDMSO処理でOHやO_2^-ラジカルを消去すると細胞死や染色体異常誘導は抑えられるが、細胞突然変異や細胞がん化誘導を抑制することはできない。ビタミンCを細胞の一生涯に渡って処理すると、デロメアの短縮が抑制されるとともに細胞の寿命の延長および遺伝的不安定化の低減化ができる事がわかった。これらのことから、我々は、LLRこそが放射線による細胞の突然変異と細胞がん化の主因であると結論している。これら一連の結果は、これまで放射線生物学的に信じられてきた"放射線突然変異や発がんの原因は活性が高い酸素ラジカル種(ROS)がDNAや染色体を破壊することである"という予想を覆すものである。加えて、ヒトにおける突然変異や発がんがタンパク質に生じた変異を起源とするという極めて新規性が高く、放射線の遺伝影響の本体を理解し、放射線被曝による発癌や突然変異誘発の危険度を軽減する方法の開発に資する極めて重要な知見である。
ヒト・マウス間の高次運動機能の比較解析のための生体力学モデル相互マッピング

解剖学的なランドマーク情報に基づき、既存のヒト神経筋骨格モデルのトポロジーを実験用マウスの骨格にマップすることで、実験用マウス神経筋骨格モデルのプロトタイプを作成した。さらに遺伝子発現データに基づき、その筋肉付着部位の検証及び修正を行った。マッピングの方法を定式化するとともに、現実的な労力でデフォメーションを行うための方法論を確立した。ここで開発した実験用マウス神経筋骨格モデルを用いて、ミュータントマウスの運動機能を解析するための逆運動学解析と逆動力学解析を行った。この成果を神経科学の分野に応用するために、国際的な共同研究を前提としたワークショップにオーガナイザとして参加した。相同性マッピングに重要なモーターニューロンの走行パターン(もしくは局在)を調べるため、モーターニューロンのマーカー遺伝子を持つマウスを作成した。これらのマウスも含め、マウスの歩行パターン計測に用いるミュータントマウスのラインを施設内に準備し、いつでも実験が出来るような体制を整えた。このミュータントマウス歩行パターンの計測については、インハウスの生体力学解析パイプラインに加え、オープンソフトウェアを用いたより可搬性の高いパイプラインを構築した。またこのパイプラインに合ったデータを生成するための各種ソフトウェアを作成した。マウスの動力学解析のための床反力計測装置を試作し、上記ミュータントマウスを用いた実証試験を行った。ミュータントマウスの該当遺伝子の中枢神経系における発現パターンを調べるため、ミュータントマウスの脳切片を作成した。神経科学分野の研究者との連携を前提として、外部機関でセミナーや打ち合わせを行った。海外の研究者と国際的な連携を視野に入れた話し合いを始めた。【生体力学的解析】新しい実験用マウスの運動データを計測するとともに、生体力学的解析に必要な床反力データを、複数の実験用マウスについて計測した。今までの床や平均台の上を歩かせる運動計測に加え、Running wheelを用いた粗粒度の歩行データを取得するためのプロトコルを考案し、定位置での歩行データ取得した。これは運動計測における死角を減らすことと空間解像度を上げることにより、少ない台数のカメラでのデータ取得を目指したものである。さらに、効率的な運動機能の計測のために、実験プロトコルの一部を改良した。【相互マッピング】ヒト筋腱組織の骨格系における起始点及び付着点の詳細な情報を取得し、骨格形状の相似性に基づきマウスの筋腱組織の起始点及び付着点の推定を行うためのソフトウェアを準備した。このソフトウェアは、本来比較(進化)形態学のツールとして開発されたものであるが、われわれはこのソフトウェアの特徴である形態変形の頑健なアルゴリズムを用いて、骨表面上にはない筋肉の経由点も含め、筋腱組織の起始点及び付着点の異なった空間での相互マッピングを行った。また、骨格形状の相似性を関係づけるために必要な解剖学的特徴点(ランドマーク)を、進化形態学的な観点から選定した(ただし、ここで言うランドマークは、比較形態学の流儀に則り、幾何学的な線や面のような概念も含む)。【モデリング】相互マッピングにより推定した筋骨格モデルの検証にあたり、新しいデータ(詳細な筋骨格の機能解剖学的な構造)が必要となっため、3個体程度のマウス全身に対する、ヨウ素造影剤を使ったX線CTスキャンを準備中。【運動機能の計測法の改良と逆運動学解析】従来よりも数の多い光学反射マーカーを実験用マウスの皮膚に装着し、高性能な汎用モーションキャプチャシステムを用いて、神経運動学的データを取得することに成功した。マウス全身の骨格モデルとインハウスの逆運動学解析環境を用いて、マウスの歩行における関節角度を推定した。マウスに装着できる光学反射マーカーの数を増やすため、小型光学反射マーカーの開発に着手した。【実験用マウスの骨格モデルの開発】マウスの行動異常を調べるためには、前提知識なしに各個体の骨格を軟骨の形状も含め正確にモデルに反映する必要がある。つまり、ある標準的なテンプレートを一般的なセグメンテーションに用いることは、適切ではない。テンプレートなしの正確なセグメンテーションを実現するため、X線CTスキャンで取得したマウス骨格のボリュームデータの構造解析を行うことで、半自動的にセグメンテーションを行う技術を開発した。【相互マッピングに向けての準備】ヒト筋骨格モデルから骨格・腱・筋肉の相互関係(トポロジー)を抽出し表示するするソフトウェアを開発した。相互マッピングを実現するため、ヒト下肢の代表的な筋肉に投射する抹消神経と、筋骨格の関係を文献より調べた。ヒト神経筋骨格モデルのデータをもとに推定した筋腱パスを、マウス全身の骨格モデルにマッピングすることで実装した。この粗粒度モデルと上記の方法で推定した関節角度を使って、いくつかの筋腱パス長の変化を推定した。ヒト・マウス間の高次運動機能の比較解析のための生体力学モデル相互マッピングの定式化を行い、ソフトウェアとして実装した。

この際、マッピングのための数理モデルを、コンピュータグラフィックスの分野で用いられる手法を用いて詳細化するとともに、必要な解剖学的ランドマークについても再検討を加えた。ヒトーマウス間に約200カ所に解剖学的ランドマークを設定するるとともに、4種類のランドマークを用いることで、ヒト骨格からマウス骨格へのデフォメーションを生物学的に整合性を保ちつつ行うことに成功した。デフォメーションにおいて想定外の事象(マッピングの綻び等)が生じた場合は、既存の進化解剖学的な知見に基づき慎重に修正を行った。結合組織特異的に発現する遺伝子の全身レベルでの3次元発現データをもとに、解剖学的な情報(特に筋肉の付着部位)を半自動的に推定するためのアルゴリズムを考案・実装し、特にマウス後肢の複数の筋肉の付着部位を推定した。ヒト疾患モデルマウスを用いた運動機能計測のための追加実験を行い、マウスの運動表現型とともに運動時の力計測を自主開発した3種類の計測装置を用いて行った。その際、運動計測法の効率化について再検討を行い、いくつかの工夫により上記改良したマウス神経筋骨格モデルを用いて、逆運動学解析及び逆動力学解析を行った。これらの成果を踏まえ、将来の国際共同研究を前提とした国際ワークショップにオーガナイザの1人として参加し、今後の方針(特にマウス神経骨格モデルの脳神経科学における活用)について関係者と協議を行った。ワークショップのウェブサイトに発表内容の概要等を記載した。また、本研究に関連して、生体力学モデルと進化遺伝学の重要性を主題とした学部から大学院生向けの教科書の執筆を行い、2014年に出版した。生物情報学信頼性の高い相同性マッピングの実施には、詳細な解剖学的情報の取得に加え、機能的な情報の取得が必須である。この実施には、必要なマウスの作成やラインの維持等当初困難が予想されたが、現有の施設の特徴を生かし、短期間で完了することが出来た。さらに計算生体力学的な解析においては、構築済みのインハウスの解析パイプラインに加え、生体力学の分野で国際的な存在感を増しつつあるオープンソースの解析パイプラインを組み合わせて使うことにより、より柔軟で相乗効果も期待出来る体制を構築出来た。これらの機能的な情報の取得に向けた体制は、当初の予想よりもすみやかに進展しており、本研究のテーマである相同性マッピングの効率化に貢献することが期待出来る。計画の効果的な実施のためには、実験用マウスの詳細な機能解剖学的データの取得が必要であることがわかったため。【運動機能の計測法の改良と逆運動学解析】本研究ではヒトとの生体力学的比較解析を目指している。運動データの粒度はヒトに近い程望ましいと言える。従来においては、マーカーの大きさや重さの制限の他に、カメラの解像度の制約からあまりマーカーの数を増やすことができなかった。例えば全身のデータでは肘・膝下の運動データを得ることはできなかった。
皮膚形態形成に関わる遺伝子の単離とそのヒト皮膚疾病における意義

皮膚悪性腫瘍、表皮分化異常、脱毛など皮膚科領域の主要な疾患の病因を理解し根元的な治療戦略を構築するためには、発症にいたる過程の細胞学的・分子生物学的機構の解明が必須である。本研究計画は、胎児皮膚の基本的な形態形成過程で発現が変化することを指標にして新たな遺伝子を同定・クローニングし、その機能を多様な培養系で検討して、ヒトのがんや表皮分化異常に起因する皮膚疾病における意義を明らかにしようというものである。皮膚の形態形成過程が集約的におこる胎生13-16日のマウス皮膚で発現レベルの変化する遺伝子をRNA differential display法によってスクリーニングし、7個の新規遺伝子断片を同定した。それらの遺伝子を順次解析しているが、そのうち幾つかを以下に述べる。発生の進行と共に発現が亢進する遺伝子の一つである4C32についてcDNA全長を単離し塩基配列を決定したところ、これまで毛のう特異的とされていたkeratin-associated proteinとホモロジーがあることが明らかになった。この遺伝子は、胎児皮膚の最外層、胎児および成体の舌糸状乳頭、成体尾の表皮に発現がみられた。4A40(仮称)は>10Kbの大きな転写物で、分化した表皮に特異的に発現すること、N末のCa結合性EF handドメイン、中央部の反復アミノ酸配列等から、フィラグリン様の構造と機能をもつ新規遺伝子であると推定された。4A50(仮称)も表皮の分化と共に発現が誘導される新規の遺伝子で、既知の機能ドメインは見出せなかった。塩基配列上はヒトのinfertility-related 75 KDa proteinとホモロジーがあり、実際この遺伝子はマウスの精巣でも発現していた。この他にも、幾つか興味深い発現パターンを示す遺伝子を単離し、現在その構造と機能を解析中である。本研究計画の実行によって、表皮の増殖と分化に関わる遺伝子を単離しうることが明らかとなった。今後、この研究を継続することによって、ヒト疾患との関連を明らかにしたい。本研究計画は、胎児皮膚の基本的な形態形成過程で発現が変化することを指標にして新たな遺伝子を同定・クローニングし、その機能を形態形成を起こすことのできるマウス皮膚の器官培養系、およびヒト表皮角化細胞の単層培養と三次元培養系で検討し、さらにヒト扁平上皮がんや表皮細胞の分化異常に起因すると思われる皮膚疾病組織で、それらの遺伝子がどのような異常を示すかを明らかにしようというものである。今年度はまず、皮膚の形態形成過程が集約的におこる胎生13-16日のマウス皮膚で発現レベルの変化する遺伝子をRNA differential display法によってスクリーニングし、7個の新規遺伝子断片を同定した。そのうち、発生の進行と共に発現が亢進する遺伝子の一つである4C32についてcDNA全長を単離し塩基配列を決定したところ、これまで毛のう特異的とされていたkeratin-associated proteinとホモロジーがあることが明らかになった。このcDNAをプローブにしてヒトgenomic DNA libraryをスクリーニングし、いくつかの類似した遺伝子クローンを得ることができた。これは、ヒトに4C32のホモローグが存在すること、しかもそれはいくつかの独立したメンバーからなるファミリーを形成していることを示すものである。

現在、そのヒト遺伝子クローンについて、構造解析、発現パターン、疾病との関連を検討している。皮膚悪性腫瘍、表皮分化異常、脱毛など皮膚科領域の主要な疾患の病因を理解し根元的な治療戦略を構築するためには、発症にいたる過程の細胞学的・分子生物学的機構の解明が必須である。本研究計画は、胎児皮膚の基本的な形態形成過程で発現が変化することを指標にして新たな遺伝子を同定・クローニングし、その機能を多様な培養系で検討し、さらにヒト扁平上皮がんや表皮細胞の分化異常に起因すると思われる皮膚疾病組織で、それらの遺伝子がどのような異常を示すかを明らかにしようというものである。今年度は昨年度に引き続き、皮膚の形態形成が集約的におこる胎生13-16日のマウス皮膚で発現レベルの変化することを指標にクローニングした遺伝子を順次解析した。4A40(仮称)は>10Kbの大きな転写物で、分化した表皮に特異的に発現すること、N末のCa結合性EF handドメイン、中央部の反復アミノ酸配列等から、フィラグリン様の構造と機能をもつ新規遺伝子であると推定された。4A50(仮称)も表皮の分化と共に発現が誘導される新規の遺伝子で、既知の機能ドメインは見出せなかった。塩基配列上はヒトのinfertility-related 75 KDa proteinとホモロジーがあり、実際この遺伝子はマウスの精巣でも発現していた。この他にも、幾つか興味深い発現パターンを示す遺伝子を単離し、現在その構造と機能を解析中である。本研究計画の実行によって、表皮の増殖と分化に関わる遺伝子を単離しうることが明らかとなった。今後、この研究を継続することによって、ヒト疾患との関連を明らかにしたい。
微小管を介して誘導される炎症応答の分子機序解明と統御法開発

自然免疫機構は、炎症応答の誘導に深く関わっている。自然免疫機構は、パターン認識受容体により病原体成分を認識し、炎症性サイトカインの産生を誘導する。また、自然免疫機構は自己由来の刺激性成分や栄養成分にも反応することがあり、しばしば炎症性の疾患の発症を惹起する。我々は、自然免疫の活性化制御に関する解析を行い、微小管が炎症応答の誘導において重要な役割を担うことを明らかにした。自然免疫関連受容体であるNLRP3は、リソソーム・ファゴソームの損傷に応じて情報伝達因子ASCおよびプロテアーゼCaspase-1と共にNLRP3インフラマソームを形成し、炎症性サイトカインIL-1ベータの産生を介して炎症を惹起する。尿酸塩結晶などの刺激性粒子によるNLRP3インフラマソームの過剰な活性化は痛風などの炎症性疾患の発症要因となるため、NLRP3インフラマソーム活性化を阻害する化合物の同定は重要な研究課題である。我々は、化合物ライブラリーを用いたスクリーニングを行い、痛風治療薬であるコルヒチンがNLRP3インフラマソームの活性化を抑制することを見出した。微小管は尿酸塩結晶などの刺激に応じてミトコンドリアを微小管形成中心方向へと輸送することにより、小胞体上のNLRP3とミトコンドリア上のASCの近接を誘導し、NLRP3インフラマソームの活性化を促進する。コルヒチンなどのチューブリン重合阻害剤は、微小管依存的に誘導される小胞体とミトコンドリアの近接を介したNLRP3インフラマソームの活性化を抑制する。尿酸塩結晶などの刺激性粒子は、ミトコンドリアの損傷を惹起するため、細胞内NADが減少してNAD依存性のアルファチューブリン脱アセチル化酵素であるSIRT2の活性が低下する。SIRT2の活性低下はアセチル化アルファチューブリンを増加させるため、ダイニン依存的なミトコンドリアの輸送を介したNLRP3とASCの近接が誘導される。損傷ミトコンドリア由来の活性酸素種は、NLRP3インフラマソームの直接的な活性化を誘導するが、NLRP3とASCの近接には影響を与えない。これらの解析結果は、NLRP3を活性酸素種が直接的に活性化する経路に加えて、NLRP3からASCへの情報伝達を行うための場を整える微小管依存的な経路がNLRP3インフラマソームの活性化に関わることを示している。自然免疫関連受容体であるNLRP3は、リソソームの損傷に応じて情報伝達因子ASCおよびプロテアーゼCaspase-1と共にNLRP3インフラマソームを形成し、サイトカインIL-1betaやIL-18の産生を介して炎症を惹起する。尿酸塩結晶やシリカナノ粒子などの刺激物によるNLRP3インフラマソームの過度の活性化は痛風や塵肺などの炎症性疾患の発症要因となるため、NLRP3インフラマソームの活性化を阻害する化合物の同定は重要な研究課題である。微小管は尿酸塩結晶などの刺激に応じて小胞体とミトコンドリアの近接を促進することにより、小胞体上のNLRP3とミトコンドリア上のASCの会合を誘導する。尿酸塩結晶などの刺激は、ミトコンドリアの損傷を惹起するため、細胞内NADが減少してNAD依存性のアルファチューブリン脱アセチル化酵素であるSIRT2の活性が低下する。SIRT2の活性低下はアセチル化微小管を蓄積させる。アセチル化微小管は小胞体とミトコンドリアの近接頻度を高めるため、NLRP3インフラマソームの会合が促進される。コルヒチンなどのチューブリン重合阻害剤は、微小管依存的なNLRP3インフラマソームの会合を抑制する。また、フィトケミカルであるレスベラトロールは、詳細なメカニズムは現段階では不明であるが、アセチル化微小管の増加を抑制することにより、NLRP3インフラマソームの会合を抑制する。これらの解析結果は、微小管がNLRP3インフラマソームの阻害剤を開発する上での有力な創薬標的であることを示している。生物系薬学本研究目的に関連する原著論文をコレスポンディングオーサーとして発表し、また新たに投稿した原著論文がリビジョンの状態にある。また、これらの研究成果について、多くの学術集会において招待講演を行った。さらに、これまでの業績が評価され、平成26年度日本薬学会奨励賞を受賞した。微小管に着目した解析を行い、オルガネラの空間配置を制御する因子を同定し、NLRP3インフラマソームの活性化機序を明らかにする。さらに、同定した因子が生活習慣病の発症に絡んでいるかどうかについて解析する。スクリーニングが順調に進んだため、実験費用が当初の見積もりよりも下回った。一方で、制御因子候補が多数同定されたため、H26年度の実験費用は増加する見込みである。

また、論文の出版を見越してリプリント費用をH25年度に計上したが、当該論文は投稿中の段階であり、リプリント費用はH26年度に必要となる見込みである。H25年度に同定した制御因子候補が、真の制御因子であることを確認する。これまでの研究成果を国際学術雑誌に原著論文として発表する。
SPA法を用いた新世代トランスポーター輸送活性測定システム

トランスポーターによる物質輸送は栄養素の取り込み、薬物の体内濃度調節、神経伝達など生命を維持するために不可欠な働きを担っている。このため、トランスポーター機能の解析は基礎生物学、医学、薬学上重要な課題となっている。これまで輸送活性の測定はトランスポーターのcDNAを導入した培養細胞が多く用いられてきたが、夾雑する他のトランスポーターによる影響など多くの問題を抱えている。このような背景をもとに、これまでの問題を解決する新しいトランスポーター活性測定法を着想した(SPA法)。本研究ではSPA法を用いた新しい輸送活性測定システムを開発する事を目的とした。この研究では、SPA法をトランスポーターに応用する。SPAビーズはビーズ近傍の放射性物質からでた放射線のみを検出するため、リポソーム内に取り込まれた基質の放射能のみを測定できる。これにより反応液を混ぜるだけで輸送活性の測定が可能である。本年度はSPAビーズと再構成リポソームの結合条件を中心に解析した。SPAビーズとしてプラスチック製のPVAビーズおよび、シリカ素材のYsiビーズを選択した。また、これらの樹脂ビーズはそれぞれ、銅イオンキレートタイプとストレプトアビジンコーティングタイプを用いた。銅イオンキレートタイプはタンパク質のHis-tagを介して、ストレプトアビジンタイプはビオチン化タンパク質を介してビーズに結合させた。tag付きタンパク質としてHis-tagを付加したVNUT(小胞型ヌクレオチドトランスポーター)、MATE(Multidrug And Toxic compound Extrusion)をビオチン化タンパク質として、大腸菌FoF1-ATPaseのβサブユニットのN末端領域にビオチン化配列を組み込んだものを大量発現、精製した。その結果、0.2 mgの銅イオンキレートビーズに約1μgのMATEまたはVNUT再構成リポソームが結合した。また、ストレプトアビジンビーズでは、ビオチン化FoF1-ATPaseとともにMATE1をリポソームに再構成し、MATEに対する抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。その結果、0.3mgのビーズに約3μgのリポソームが結合した。【背景】トランスポーターによる物質輸送は栄養素の取り込み、薬物の体内濃度調節、神経伝達など生命を維持するために不可欠な働きを担っている。また、精製タンパク質による方法も最近では用いられるようになってきた。この方法では、昆虫細胞に大量発現させたトランスポーターを精製・リポソームに再構成し、これにRI標識した基質を取り込ませ、ゲル濾過でリポソームを分離する。しかし、この方法はゲル濾過で分離するため、煩雑で熟練を要する問題を抱えていた。【目的】この様な背景をもとに、これまでの問題を解決する新しいトランスポーター活性測定法を着想した(SPA法)。この方法はシンチレーターを内包したビーズに精製トランスポーターを埋め込んだリポソームを吸着させる事で、リポソームを分離する事なく測定できる画期的なものである。本研究ではSPA法を用いた新しい、輸送活性測定システムを開発する事を目的とした。【結果】ビオチン化タグ付き膜タンパク質を介してストレプトアビジンSPAビーズに結合したリポソームを作製する事ができた。バックグラウンドが高いものの、このリポソームへのATPの結合や基質の輸送が見られた。生化学各種タグ付きタンパク質の発現系を構築し、大量発現、精製した。これらのタンパク質をリポソームに再構成し、SPAビーズヘの結合条件を検討した。これらは企画段階の予定どおりである。1.ビーズへのリポソーム結合条件の最適化をはかる。2.再構成リポソームを結合したビーズを用いて、輸送活性を測定。3.再構成リポソームを結合したビーズを用いて、リガンド結合活性を測定。4. PEG等を用いて、リポソームの安定化条件を検討する。研究費はトランスポータータンパク質発現のための培地、タンパク質精製用の界面活性剤および、輸送・リガンド結合測定用のアイソトープの購入に用いる。試薬の使用量が予想より少なかった。トランスポータータンパク質発現のための培地購入に用いる。
偏光イメージングを利用した高分子粘弾塑性体の二軸伸長特性の精密解析

二軸伸長は,高分子の成形方法として工業的に広く利用されている.この理由は,伸長によって物性が向上するためであり,幅広い高分子材料で利用されている.ガラス転移温度近傍や不均質系では,高分子は粘塑性応答を示す.こうした高分子について複屈折測定を組み合わせた二軸伸長実験を行って,その現象論的な記述を試みた.塑性的挙動を表す散逸項を新たに加えたひずみエネルギー理論は,粘塑性的挙動を示すガラス転移温度近傍の非晶性高分子や熱可塑性エラストマーの挙動をうまく記述した.このモデルの妥当性は,複屈折測定から確認することができた.二軸伸長は,高分子の成形方法として工業的に広く利用されている.この理由は,伸長によって物性が向上するためであり,幅広い高分子材料で利用されている.ガラス転移温度近傍や不均質系では,高分子は粘塑性応答を示す.こうした高分子について複屈折測定を組み合わせた二軸伸長実験を行って,その現象論的な記述を試みた.塑性的挙動を表す散逸項を新たに加えたひずみエネルギー理論は,粘塑性的挙動を示すガラス転移温度近傍の非晶性高分子や熱可塑性エラストマーの挙動をうまく記述した.このモデルの妥当性は,複屈折測定から確認することができた.1二軸伸長装置の改造と校正市販の二軸伸長装置では,応力レベルがあまりたくなく,延伸比も3倍程度である.このため,下記のスペックを有する二軸伸長装置の改造,開発を行った.a)低ひずみ速度伸長モード付b)荷重計:50kg,c)延伸比:5倍,d)温度範囲:-50200度この改造は,カトーテック社の村田と協力して行った.2偏光イメージングカメラによる二軸伸長装置.二軸伸長実験で課題となるのは,変形の均質性である.従来の方法では,格子状の線を試料に書き込み,この格子の変化から変形の様子をモニターしている.本研究では,経費により導入した偏光イメージングカメラを用いて,試料全体の複屈折の二次元分布を測定した.この方法により,試料全体の変形の様子が簡便にかつ高精度に評価することができた.3偏光イメージングカメラによる屈折率テンソルの全測定現行,あるいは上記の偏光イメージングカメラの使用方法は,材料中での複屈折,消光角の分布を二次元的にとらえるものである.本研究では,コノスコピーを用いて,材料中の一点について,屈折率テンソルの全測定を行った.すなわち,屈折率テンソルの3つ主値の差と3つのオイラー角を同時に測定した4ポバックス樹脂をモデル材料とし、上記に記述した装置をもちいて二軸伸長特性の測定を行った.平成25年度は,平成24年度に開発した装置を用いて,ガラス転移点近傍での無定形高分子について調べた.この系の物性は,一軸伸長特性等は比較的よく研究されている系である.本研究では,方法及び解析法の有用性を立証する目的で,ポリメタクリス酸メチル,ポリスチレン,ポリカーボネート等をモデルシステムとして,測定を行った.得られた二軸伸長下での,応力と屈折率テンソル測定データを,応力光学則を用いて,高分子セグメントの配向由来の成分とガラス成分に分離した.それぞれの成分に対して,弾性エネルギー解析を行い,配向由来のr成分に対しては,通常のゴムと同様の扱いが可能であった.一方,ガラス成分については,BKZ方程式等の解析を試みた.特に,一軸伸長実験では明らかにされていない,Finger項とCauchy項の寄与について明確にすることを目的としたが,ガラス成分ではCauchy項の寄与が大きいことが判明した.また,不均質系高分子を対象として研究を行った.前年度に開発した装置を用いて,医療用バルーンカテーテルに使用されているポリエステル等のエラストマーについて,その二軸伸長特性の精密解析を行った.バルーンカテーテルは,先端が風船状となっており,血管などの内部で膨らませることにより,治療や処置に用いられる.こうした用途では,高分子は数倍程度延伸され,また圧力を保持する必要があり,また圧力によるサイズの変化が小さい方が安定性がよく,良好な操作性につながる.こうした使用目的では,材料の二軸伸長特性が,製品の性能を支配する.二軸伸長特性を解析した結果,構造由来による塑性的な応答に対しても,形式的に弾性エネルギーが散逸すると考えることで,解析が可能であることわかった.二軸伸長は,高分子の成形方法として工業的に広く利用されている.この理由は,伸長によって物性が向上するためであり,幅広い高分子材料で利用されている.学術的には,二軸伸長実験は,ひずみテンソルの普遍量を幅広く変えることができ,非線形性の解析にきわめて有用な方法である.しかしながら,高分子材料の二軸伸長特性の研究は,ゴム等の弾性網目が中心で,粘弾体や粘塑性体に関する研究が乏しい.本研究では,メゾ相等,微視的不均質構造を有する高分子の二軸伸長特性について,レオオプティクスを駆使して現象論的に解明する.続いて,この解析で得られた現象論的パラメーターと分子構造・微視的構造との関係を明らかにし,高分子精密加工方法,高性能高分子材料の開発への指針を与えることを目指した.ポリエーテルブロックアミド共重合体(以下PEBAX)を190 °Cに熱した油圧式プレス機により加圧し、十分に緩和させた後、氷水により急冷を行った。以上の操作により得られたフィルムを70×70 mmにカットし、室温(17 °C)二軸引張試験機を用いて伸長を加え、ひずみー応力測定ならびに複屈折測定を行った。

測定から得られた伸長比と応力値からWの関数形をモデル的に決定し、妥当性を確かめた。塑性的挙動を表すため、ひずみテンソルの普遍量に依存する散逸項を導入した。この結果、導入したWは、ひずみー応力曲線をうまく記述した。これは、PEBAXフィルムのひずみ結晶化が変形様式による影響を受けにくく、結果的に応力が今回提案したモデルで記述できたためと考えられた。以上の結果について、第62回レオロジー討論会で発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。高分子物理化学26年度が最終年度であるため、記入しない。二軸伸長装置の開発・改造に時間を要した.測定は順調である.二軸伸長実験では,大面積の試料の作成が必要であり,均質な試料の作成に少し手間どった.また,均質へ変形させるためにも経験を要したが,解決した.26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り進める.引き続き,当初の計画にしたがって,研究を遂行する.二軸伸長変形は,企業においてフィルム延伸等で重要であり,企業研究者との連携も視野に入れて進めたい.26年度が最終年度であるため、記入しない。
シェーグレン症候群の発症機構における抗原提示細胞としての唾液腺細胞の役割について

自己免疫疾患モデルマウスMRL/lprマウス(5ヵ月齢)7匹と同齢の対照マウスMRL/+マウス10匹を用い、シェーグレン症候群の発症機構における唾液腺細胞の抗原提示細胞としての役割について免疫組織化学的に調べた。MRL/lprマウスから摘出した顎下腺をパラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋し、薄切組織切片を作製した。この組織切片に酵素抗体法(SAB法)により免疫組織染色を行い、costimulatory factorであるCD80、CD86、4-1BB ligand (4-1BBL)、OX40 ligand (OX40L)、GITR ligand (GITRL)の発現について調べた。その結果、CD80とCD86の発現は顎下腺導管細胞に認められ、MRL/lprマウスでは両者とも7匹全てに発現していたが、対照マウスではそれぞれ10匹中3匹、10匹中1匹の顎下腺にのみ発現を認めた。CD80とCD86の発現頻度に関してMRL/lprマウスと対照マウス間に有意差を認めた。また、4-1BBL、OX40L、GITRLの発現も顎下腺導管細胞に認められ、MRL/lprマウスではそれぞれ7匹中6匹、7匹全て、7匹中4匹に発現していた。一方、対照マウスではOX40Lの発現を7匹中4匹に認めたが、4-1BBLとGITRLの発現は認められなかった。4-1BBL、OX40L、GITRLの発現頻度に関してMRL/lprマウスと対照マウス間に有意差を認めた。唾液腺導管細胞にはMHC class II抗原が発現しており、non-professional抗原提示細胞としての性質があるということは既に報告されている。今回の研究結果から、抗原提示細胞としての機能を持つ唾液腺導管細胞に発現している5つのcostimulatory factorが自己免疫唾液腺炎の発症に関係していると考えられた。シェーグレン症候群の発症機構には自己免疫反応が関係しており、これまで樹状細胞やマクロファージ等のprofessional抗原提示細胞によって自己反応性T細胞が活性化され、唾液腺の組織破壊が惹起されると考えられていた。今回の研究で、professional抗原提示細胞に特徴的に発現するCD40とCD86が導管上皮細胞にも発現していることが明らかとなり、professional抗原提示細胞ばかりではなく導管上皮細胞もT細胞とのcostimulation反応によって自己免疫反応に関与している可能性が考えられた。また、CD26とcaveoloin-1間のシグナル伝達によってIRAK1そしてNF-κBが活性化され、CD86の発現が誘導されることが報告されており、導管上皮細胞に発現しているCD26とcaveoloin-1がCD86の発現促進に関連することが示唆された。さらに、プラズマ細胞様樹状細胞に発現して、自己免疫疾患の原因となるTNFαやIFNαの産生に関係するTLR 9ならびにTLR 9のシグナル伝達のcomponentであるMyD88が導管上皮細胞に発現していた。我々は、前回の研究でMRL/1prマウスの導管上皮細胞にTNFαとTNF receptor 1が発現しており、オートクリンなTNFα産生が顎下腺組織におけるアポトーシス誘導に関係していることを示した。今回の研究で、導管上皮細胞にTLR 9とMyD88が発現していたことから、これらの分子が導管上皮細胞によるTNFα産生に関連することが考えられた。また、これらの所見は、シェーグレン症候群の発症機構には獲得免疫ばかりではなく自然免疫も関係するということを示唆していると考えた。

シェーグレン症候群の発症機構には自己免疫反応が関係しており、これまで樹状細胞やマクロファージ等のprofessional抗原提示細胞によって自己反応性T細胞が活性化され、唾液腺の組織破壊が惹起されると考えられていた。今回の研究で、professional抗原提示細胞に特徴的に発現するCD80とCD86が導管上皮細胞にも発現していることが明らかとなり、professional抗原提示細胞ばかりではなく導管上皮細胞もT細胞とのcostimulation反応によって自己免疫反応に関与している可能性が考えられた。また、CD26とcaveoloin-1間のシグナル伝達によってIRAK1そしてNF-κBが活性化され、CD86の発現が誘導されることが報告されており、導管上皮細胞に発現しているCD26とcaveoloin-1がCD86の発現促進に関連することが示唆された。さらに、Foxp3はregulatory T cell (T reg)に特徴的に発現するマーカーであり、MRL/1prマウスにもT regがコントロールマウスと同様に存在することが明らかとなった。CD80にはT regの活性化作用のあることが分かっており、CD80が双方のマウスにおいてT regの活性化に関与していることが推察された。加えて、プラズマ細胞様樹状細胞に発現して、自己免疫疾患の原因となるTNFαやIFNαの産生に関係するTLR9とTLR7、ならびにそのシグナル伝達のcomponentであるMyD88が導管上皮細胞に発現していたことから、この2つの分子が前回の研究で明らかとなった導管上皮細胞によるTNFαの産生に関連することが考えられた。また、これらの所見は、シェーグレン症候群の発症機構には獲得免疫ばかりではなく自然免疫も関係するということを示唆していると考えた。昨年に引き続き、自己免疫疾患モデルマウスMRL/lprマウス(5ヵ月齢)7匹と同齢の対照マウスMRL/+マウス10匹を用い、シェーグレン症候群の発症機構における唾液腺細胞の抗原提示細胞としての役割について免疫組織化学的に調べた。MRL/lprマウスから摘出した顎下腺をパラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋し、薄切組織切片を作製した。この組織切片に酵素抗体法(SAB法)により免疫組織染色を行い、costimulatory factorであるCD80、CD86、4-1BB ligand(4-1BBL)、OX40 ligand(OX40L)、GITR ligand(GITRL)の発現について調べた。その結果、CD80とCD86の発現は顎下腺導管細胞に認められ、MRL/lprマウスでは両者とも7匹全てに発現していたが、対照マウスではそれぞれ10匹中3匹、10匹中1匹の顎下腺にのみ発現を認めた。CD80とCD86の発現頻度に関してMRL/lprマウスと対照マウス間に有意差を認めた。また、4-1BBL、OX40L、GITRLの発現も顎下腺導管細胞に認められ、MRL/lprマウスではそれぞれ7匹中6匹、7匹全て、7匹中4匹に発現していた。一方、対照マウスではOX40Lの発現を7匹中4匹に認めたが、4-1BBLとGITRLの発現は認められなかった。4-1BBL、OX40L、GITRLの発現頻度に関してMRL/lprマウスと対照マウス間に有意差を認めた。
多孔質固体の容量効果を利用した流動層燃焼装置からの未然ガスとN_2Oの排出低減

本研究はダイオキシン前駆体である未燃炭化水素ならびに温暖化ガスであるN_2Oの流動層石炭燃焼からの排出低減を目的としている。無機多孔質粒子には比較的高温で炭化水素を細孔内に保持する、いわゆる「容量効果」があること、ならびにN_2O分解の触媒作用があることを本研究で明らかにした。このような粒子を流動媒体としてプラスチック、石炭等を流動層燃焼した時に、ダイオキシン・未燃炭素・炭化水素、N_2OならびにNOx生成に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。揮発分の挙動を模擬するためにプラスチックを燃料として1種類の無機多孔質流動媒体を用いて燃焼し、緻密質である砂粒子の場合と未燃分の発生を比較した。多孔質粒子は炉内で揮発分を保持すること、その結果多孔質粒子は未燃分ならびにダイオキシン排出を低減することを明らかにした。2種類の無機多孔質流動媒体を用いて石炭を燃焼し、N_2O分解効果およびNOxの生成を従来のものを用いた場合および不活性な石英砂を用いた場合と比較した。その結果、前年度に用いたものと同程度のN_2O低減効果があったが、前年度の試料ではNOxを低減したのに対して本年度用いたものはNOxを増加させた。この窒素酸化物の生成の違いの原因を明らかにするために、固定層実験装置を用いて、これらの多孔質流動媒体が燃料から放出される揮発分中の窒素化合物の反応に及ぼす触媒効果を調べた。また、未燃ガスを低減するための容量効果について、固定層反応装置を用いて揮発分の捕集速度および捕集された炭素分の燃焼速度を幅広い温度範囲で評価した。この実験により、流動媒体によって炭素捕集の温度依存性が異なること、捕集された炭素の燃焼速度および燃焼反応の酸素濃度依存性が異なることを明らかにした。また、燃焼速度の定式化を行った。本研究は未燃炭化水素ならびに温暖化ガスであるN_2Oの流動層石炭燃焼からの排出低減を目的としている。このような粒子を流動媒体として流動層燃焼した時に実際に未燃炭化水素が減少するかどうかを明らかにするとともに、N_2OならびにNOx生成に及ぼす影響を明らかにすることを目的として実験を行った。実験室規模の小型流動層燃焼装置内に多孔質粒子を充填して、電気炉で所定の温度に加熱しつつ装置下部から空気を供給して流動化させ、その中にプラスチックを投入して燃焼を行い、排ガスを分析することで多孔質による未燃焼分低減効果とN_2O、NOx排出に及ぼす影響を定量的に評価した。対照実験として、緻密な砂を流動媒体に用いた実験を行った。その結果、多孔質粒子未燃分低減効果があることが流動層燃焼でも見られた。また炉内水平方向濃度分布も均一化した。この結果は多孔質粒子の容量効果による炭化水素の炉内保持時間の増加と、保持された炭化水素の粒子移動に伴う水平方向の混合促進作用によって説明できた。また、多孔質粒子は流動層燃焼装置からのNOx排出を減少させたが、N_2Oは増加させた。しかしこれは、多孔質粒子の触媒作用から期待される結果とは逆の結果であり、この現象を説明することが次の検討結果である。

無機多孔質粒子には比較的高温で炭化水素を細孔内に保持する、いわゆる「容量効果」があること、ならびにN_2O分解の触媒作用があることを本研究で明らかにした。このような粒子を流動媒体として流動層燃焼した時に実際に未燃炭化水素が減少するかどうかを明らかにするとともに、N_2OならびにNOx生成に及ぼす影響を明らかにすることを目的として実験を行った。小型流動層燃焼装置で各種の燃料を燃焼し、N_2O、NOx排出に及ぼす流動媒体粒子種類の影響を定量的に評価した。NOx、N_2O生成メカニズムを明らかにするために、炉内における火炎形成状況を目視観察するとともに、吸引ガス温度計を用いて火炎近傍のガス温度を測定した。また供給するガスをアルゴン希釈酸素にすることで空気中N_2からのNOx生成がおきない条件での実験を行った。その結果、従来の流動媒体である石英砂を用いた場合では揮発分のフリーボードでの火炎燃焼が顕著におき、その結果高温場が形成されて空気中N_2に由来するいわゆるサーマルNOxが生成すること、流動媒体粒子を揮発分保持効果のある多孔質粒子にすることで揮発分のフリーボード燃焼を抑制できてサーマルNOx生成を抑制できることを明らかにした。燃料中に含まれるNの酸化挙動を明らかにするために、炉内に揮発分中Nを模擬したNH_3を吹き込みNOx生成を観察した。石英砂流動媒体ではNOx生成が多かったが、多孔質流動媒体ではNOx生成が少ないことがわかった。これにより含窒素燃料を燃焼した場合のNOx生成特性が一部説明できた。本研究は未燃炭化水素ならびに温暖化ガスであるN_2Oの流動層石炭燃焼からの排出低減を目的としている。このような粒子を流動媒体として石炭等を流動層燃焼した時に、未燃炭素・炭化水素、N_2OならびにNOx生成に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。小型気泡流動層燃焼装置で各種の石炭を燃焼し、N_2O、NOx排出に及ぼす流動媒体粒子種類の影響を定量的に評価した。その結果アルミナ多孔質粒子を用いた場合は石英砂を用いた場合と比較してN_2O生成が1/3に減少した。一方、NOx生成には粒子の影響がほとんど見られなかった。炉内脱硫のために石灰石を供給した。従来型気泡流動層燃焼用脱硫剤として、空塔速度より終端速度が大きくなるような粗粉石灰石を石英砂流動媒体時に用いた。一方、空塔速度より終端速度が小さくなるような微粉石灰石を用いること提案した。実験は石英砂流動媒体で行った。従来型脱硫(粗粉石灰石)では、石灰石を供給でSO_2濃度を低下させると顕著にNOxが増加し、N_2Oはわずかに低減した。これに対して、微粉石灰石を脱硫剤に用いたときには、脱硫時のNOx増加を抑制できた。これにより、脱硫しながらNOxを増加させず、なおかつ、使用済み石灰石を円滑に装置から排出できる燃焼方法を見出した。含塩素燃料として塩化ビニルを燃焼し、ダイオキシン濃度を測定した。多孔質アルミナを用いることで未燃分排出を大幅に低減できるので、同時にダイオキシン排出も砂層に比べて1/10と大幅に低減できた。上記の研究は常圧の流動層燃焼を対象としていたが、これを加圧流動層燃焼装置に適用するための基礎的検討として、炉内粒子が代替流動媒体で置き換わったときの脱硫特性について理論的検討を行った。大型加圧流動層の脱硫モデルを提案し、実測値と比較した。
ヒト汗に含まれる薬物の連続的定量法による非侵襲ドラッグモニタリングの実現

汗はヒトの代謝経路の一つであり、直接的な生体情報を含んでいる。汗中の成分分析によるヒト体内情報の収得は、非侵襲・非観血で行うことが可能であるため、臨床的に有効が極めて高い。本研究により特別な生理的負荷なく日常的に採集できる条件下での汗のサンプリングにより、ドラッグモニタリングが可能であることを実証できた。1.薬の摂取によりその薬物がヒト汗中へ代謝されることを確定した。咳止め薬、酔い止め薬の成分であるテオフェリン、コデイン、カフェインを汗中に見いだし、これら薬物の濃度経時変化を調べ、0.55時間にわたり汗中へ代謝することがわかった。カフェインは同時にその代謝物(検知できた。2.テオフェリンは喘息患者に使用され、コントロールの必要な薬であるので、ベッドサイドモニタリングと非常に重要である。喘息患者へのテオフェリンのモニタリングに使用できる基礎的なデーターを確立した。来年度からの実施を計画している。3.ヒト汗の非常に簡便なサンプリング法を確立した。サンプリング時間は0.5分から5分間を用いた。この短いサンプリング時感により化学物質の体内での動的把握が可能になった。3.汗中に拍出される揮発性成分の迅速なトラップ法を確立し、この際の制御方法(捕集、温度など)に独自の工夫を行い、国有特許として出願した。4.汗中への代謝成分として有機カルボン酸類、グルコースなどを確認し、これらの摂取に伴う汗中への代謝の確認ができ、糖尿病への適用の基礎ができた。5.スポーツ医学への適用をおこない、運動しながら30秒間のサンプリングにより運動中の乳酸の動態が把握できた。6.汗中のアルカリイオンにより、汗腺下部でのナトリュムーカリウムチャンネルが作動していることが確認できた。7.これらの研究をヒントとして、皮膚からアセトン、水素が発生していることを発見した。1.汗はヒトの代謝経路の一つであり、直接的な生体情報を含んでいる。汗中の成分分析によるヒト体内情報の収得は、非侵襲・非観血で行うことが可能であるため、臨床的に有効が極めて高いと考えられる。本研究は特に運動負荷など特別な生理的負荷なく日常的に採集できる条件下での汗のサンプリングを行い、この汗中の成分分析を試みた。すなわち汗としては精神性発汗と不感性発汗を用い、皮膚からの直接的なサンプリングを行った。2.ヒト汗中の成分についてはこれまで本研究室でアルコールについて確立できているが、カフェインと咳止め薬について検討した。成分分析はGC/MSで行った。3.結果:(1)カフェインのテオブロミンへの体内代謝が迅速に行われることを汗の成分より測定できた。(2)咳止め薬服用後の汗中薬物濃度の経時変化を調べたところ、薬物服用前にはほとんど検出されなかった成分が時間経過とともに濃度が上昇するのが明らかに出来た。本研究により様々な薬物が汗から代謝されてくるものと考えられる。今年度の成果がかなり得られたので今後さらに検討を加えれば、発汗を用いたドラッグモニタリングが在宅医療や臨床の現場において、有効な手法となるであろう。本研究は特別な生理的負荷なく日常的に採集できる条件下での汗のサンプリングを行い、この汗中の成分によるドラッグモニタリングを目指している。

咳止め薬、酔い止め薬の成分であるテオフェリン、コデイン、カフェインを汗中に見いだし、これら薬物の濃度経時変化を調べ、0.55時間にわたり汗中へ代謝することがわかった。カフェインは同時にその代謝物(テオフェリン、テオブロミン、1,7-ジメチルキサンチン)も検知できた。テオフェリンは喘息患者に使用され、コントロールの必要な薬であるので、ベッドサイドモニタリングとして適用できよう。2.ヒト汗の非常に簡便なサンプリング法を確立した。サンプリング時間は0.5分から5分間を用いた。この短いサンプリング時感により化学物質の体内での動的把握が可能になった。3.汗中に拍出される揮発性成分の迅速なトラップ法を確立し、この際の制御方法(捕集、温度など)に独自の工夫を行い、国有特許として出願した。4.汗中への代謝成分として有機カルボン酸類(乳酸、3-ヒドロキシ酢酸、ピルビン酸、酢酸)、グルコースなどを確認し、これらの摂取に伴う汗中への代謝の確認ができた。5.簡便なサンプリング方法により、スポーツ医学への本方法の適用をおこない、運動しながら30秒間のサンプリングを多数回行い運動中の乳酸の動態が把握できた。汗はヒトの代謝経路の一つであり、直接的な生体情報を含んでいる。汗中の成分分析によるヒト体内情報の収得は、非侵襲・非観血で行うことが可能であるため、臨床的に有効が極めて高い。本研究により特別な生理的負荷なく日常的に採集できる条件下での汗のサンプリングにより、ドラッグモニタリングが可能であることを実証できた。1.薬の摂取によりその薬物がヒト汗中へ代謝されることを確定した。カフェインは同時にその代謝物(検知できた。2.テオフェリンは喘息患者に使用され、コントロールの必要な薬であるので、ベッドサイドモニタリングと非常に重要である。喘息患者へのテオフェリンのモニタリングに使用できる基礎的なデーターを確立した。来年度からの実施を計画している。3.ヒト汗の非常に簡便なサンプリング法を確立した。4.汗中への代謝成分として有機カルボン酸類、グルコースなどを確認し、これらの摂取に伴う汗中への代謝の確認ができ、糖尿病への適用の基礎ができた。5.スポーツ医学への適用をおこない、運動しながら30秒間のサンプリングにより運動中の乳酸の動態が把握できた。6.汗中のアルカリイオンにより、汗腺下部でのナとリュム-カリウムチャンネルが作動していることが確認できた。7.これらの研究をヒントとして、皮膚からアセトン、水素が発生していることを発見した。