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自殖種子による新しい栽培ギク育種法の確立

自家不和合性の栽培ギクはF2世代以降の子孫を大量に残すことが困難で、自殖系統を利用した近代的な遺伝育種が非常に遅れてきた。この問題を解決するために、我々は二倍体キクタニギクの野生集団から発見された自家和合性を栽培ギクに導入し、自家和合性で多様な形質の新栽培ギク115ラインを分離した。交配親の長管さじ弁が候補形質として選ばれ、四倍体のF1,BC1F1,BC2F1BC2F3子孫の遺伝的分離が調べられた。理論的に推定されたとおり、BC2F3世代で、自家和合性をもった種子で繁殖し、完全に管弁をもつ劣性ホモ系統が得られた。ここに自殖種子による遺伝学に基づいた遺伝形質の「デザイン」が可能になった。栽培ギク品種は基本的に自家不和合で、ヘテロ接合体である。私が発見した自殖野生系統の遺伝子を栽培ギク品種に取り込み、自殖種子によりホモ接合体を作成できるシステムを構築し、遺伝学に基づき候補形質を計画的に「デザイン」し、育種効率を大幅に短縮することを目的として、二つの方法で実験を進めた。1)栽培ギクと自殖二倍体キクタニギクのF1雑種からの自殖四倍体品種作成(3世代目で自殖系統が選抜される);F1雑種に、自殖四倍体キクタニギクを戻し交配し、2回の戻し交雑を行い、BC2子孫の自殖試験を行った。その結果、推定された1/6の自殖系統が分離したことが確かめられた。2)栽培ギクと自殖六倍体キクタニギクのF1雑種からの自殖四倍体品種作成(2世代目で自殖系統が選抜される);六倍体F1雑種に、自殖二倍体を交配し2世代目に自殖四倍体を作成する方法を実施する予定であったが、人為的に自殖六倍体を得ることが出来なかったので、この効率的な方法がまだ実施できなかった。その代わりに野生ノジギクの自殖六倍体を発見したので、今年このキクと栽培ギクのF1雑種作成を行う予定である。本年度の実績通り二つの方法による研究が進められた。一つ目の方法による、栽培ギクゲノムをもつ自殖四倍体が予定通り作成され、4000種子を得た。二つ目の方法は人為的に六倍体自殖キクタニギクを作成する予定であったが、作成に失敗した。コルヒチン処理は二倍体から四倍体作成の場合と同様に三倍体及び四倍体へのコルヒチン処理によるダメージから本葉の回復が二倍体に処理する場合と比べ大幅に遅れ、以後の成長過程で枯死してしまった。この方法を繰り返すことには限界があり、培養系で作成する必要がでてきた。しかし自殖六倍体を野生系統から探すことも同時的に勧めており、ノジギクで自殖系統を発見することが出来た。当面、自殖六倍体キクタニギクの代わりに使用していくことが可能となったので、2世代後に栽培ギクゲノムをもつ自殖系統を作成することが可能となるので予定通り実験を進めることが可能となった。キクの新品種の作成には,交配、芽条突然変異、放射線突然変異が利用され、クローン増殖技術(挿し芽)を利用して大量苗が生産されている。しかし、これら栽培ギク品種は自家不和合性であるために、F1世代以降の子孫を得ることが困難で、しかもヘテロ接合体である。私は自殖性を示す二倍体野生ギク、キクタニギクを発見し、この自殖遺伝子を栽培ギクに導入し、純系化した自殖栽培ギクの作成を試みた。昨年度作成したBC2F1子孫2ライン6個体のBC2F2子孫と別途作成したBC1F2子孫の双方について自殖性と有用な育種形質の遺伝的特性解析を行った。BC2F2子孫264個体の自殖性(APC(完熟種子数/頭花、achenes per capitulum)≦8)を示すと判断した系統は各ラインで55%、38%、BC1F2子孫1ライン31個体の自殖性個体は45%であった。得られた全ての後代子孫では交配親の栽培ギクに見られた管弁、八重、頭状花サイズなどの形質の分離が見られた。しかしまだほとんどがキクタニギクと親栽培ギクの中間的な形質としての発現であった。特徴的な栽培ギク親の管弁に関してはBC2F1世代で初めて管弁が見られた。しかし舌状弁の1数小花と限られた発現であった。理論的には四倍体染色体がランダムに分配していると仮定した場合、1/256の確率で完全な管状花よりなる頭状花が出現することが期待されるが、286個体の開花個体では見られなかった。四倍体新栽培ギク自殖系統の作成とこれらの系統の遺伝的特性解析に関しては順調に進んでいるが、昨年度問題となった自殖人為六倍体利用による新品種育成は、新たに発見した野生ノジギクの自殖六倍体に置き換えて、栽培ギクの交配を行う。最短で候補形質のホモ化系統の作出は1年遅れとなり最終的な品種固定には至らないが、候補形質の自殖化の確認は出来るので、本課題としては大きな問題ではない。

この問題を解決するために、我々は二倍体キクタニギクの野生集団から発見された自家和合性を栽培ギクに導入し、自家和合性で多様な形質の新栽培ギク115ラインを分離した。交配親の長管さじ弁が候補形質として選ばれ、四倍体のF1,BC1F1,BC2F1BC2F3子孫の遺伝的分離が調べられた。理論的に推定されたとおり、BC2F3世代で、自家和合性をもった種子で繁殖し、完全に管弁をもつ劣性ホモ系統が得られた。ここに自殖種子による遺伝学に基づいた遺伝形質の「デザイン」が可能になった。予定通り実験を進める。最も効率のよい方法で自殖四倍体ラインを新たに作成するとともに、本年度に確立できた3世代目自殖四倍体ラインからの栽培ギクの形質のホモ化系統を作成していく。さらに、これらの自殖四倍体ラインの遺伝的特性解析を行っていく。そして最後に、得られた有用育種形質のホモ化ラインから、標準的なスプレーギクの形質を示す組み合わせをデザインして、自殖性四倍体栽培ギク母本としての標準的スプレーギク型のシリーズを作成する。本年度に確立できたBC2F2世代(栽培ギク交配から3世代目に選抜された自殖四倍体ライン)の候補形質のホモ化が期待されることから、これらのラインの遺伝的特性解析を行い、有用候補形質として選抜された自殖性四倍体の後代子孫を栽培ギク母本とする。植物遺伝学3月分謝金と次年度謝金による予定作業が増加するので本年度作業を押さえた。雇用予定の変更のため本年度押さえた謝金を次年度増加する謝金のために繰り越した。植栽植物が予定より増加したために、圃場関連消耗品の補充
レーザー放射圧と自己組織化現象を用いる3次元フォトニック結晶創成法の開発と応用

期間内に異なる3つの方法による微粒子規則構造生成法を理論、計算機シミュレーション、および実験によって調べ、それぞれ以下のことがわかった。1.単光束レーザー光照射で勾配力と散乱力を利用して溶液セル底面に規則構造を生成する方法(1)簡便に微粒子の規則構造を生成できるが、形成される構造の大きさは照射レーザー光のスポット径で制限され、大きな微粒子規則構造を一度に形成することはできない。(2)スポット内であれば、3次元の積層構造を形成できる可能性がある。2.多光束レーザー光によって形成される3次元規則分布干渉縞の勾配力を用いて生成する方法(1)理論解析の結果、3次元空間で規則的な干渉光強度分布を形成するには、少なくとも4本の光ビームによる干渉を用いなければならない。(2)結晶学における14種類の結晶格子構造と同じ干渉強度分布を実現するための4本の光ビームの照射関係を理論的に明らかにした。3.単光束レーザー光の空問光強度分布を動的に変調して多数粒子を規則的に配置する方法(1)トラップ用の光ビームの空間分布を液晶空間光変調器を用いることで制御し、所望のパターン構造に微粒子を配置できるようになった。(2)所望のパターン構造の光強度分布を実現する空間光変調器での光波変調位相分布の算出に、Gerchberg-Saxtonの位相回復法を使用したが、アルゴリズムとして単純であるため、ビデオレートでの照射光パターンの更新となった。すなわち、微粒子配列パターンを動的に変えることができるようになった。いずれの方法でも、まだフォトニック結晶と呼べるようなサイズ・積層数の規則構造は実現できておらず、今後の課題として残されている。本年度は、単光束レーザー光照明によるフォトニック結晶創成法を中心として,効率的に微粒子凝集規則構造を得るための条件明らかにするため,より現実に近い状況に基づく数理モデルを開発して,計算機シミュレーションにより調べた.具体的には3次元的に浮遊する微粒子のレーザー放射圧による捕捉・加速・凝集構造生成現象を再現する数理モデルを開発するとともに,形成される微粒子凝集構造の3次元空間フーリエ解析を行なって,その形成速度および規則性におよぼす微粒子径,レーザーパワー,凝集構造生成位置のレーザービームに対する相対位置の関係を調べた.以下,明らかとなった点をまとめる.1.微粒子凝集規則構造の生成速度・用いる微粒子径が大きい程,規則構造を高速に生成できる.・照射レーザー光のパワーが大きい程,規則構造を高速に生成できる.・微粒子凝集構造を生成する位置を,照射レーザービームのビームウェスト部より手前とする方が速く生成できる.2.微粒子凝集構造の規則性・用いる微粒子径が大きい程,ブラウン運動の影響が少なく,規則性の高い構造となる.・照射レーザー光のパワーが大きい程,ブラウン運動の影響が少なく,規則性の高い構造となる.・微粒子凝集構造を生成する位置を,照射レーザービームのビームウェスト部とすることにより,もっとも安定で規則性の高い凝集構造を生成できる.なお,単光束レーザー光照射において,いかなる微粒子濃度・レーザーパワーで積層構造が形成できるか,フォトニック結晶として効力を発揮し得る可視光波長以下の粒径の微粒子を対象とした際にその下限サイズと条件はいかなるものか,金属微粒子を対象とした凝集化が可能かどうかが今後の課題である.本年度も,昨年度に引き続き単光束レーザー光照明によるフォトニック結晶創成法を中心として,効率的に微粒子凝集規則構造を得るための条件明らかにするために,計算機シミュレーションと実験の両面から研究を進めた.シミュレーションでは昨年度の数理モデルに加えて微粒子濃度が高い場合に起こる微粒子同士の衝突と積層を再現するモデルヘと修正を加え,本年度新たに導入した高性能のサーバマシン上で実施し,もっとも効率的に微粒子凝集規則構造が実現できる条件を調べた.

実験では,既存の落射蛍光顕微鏡とアルゴンレーザー,ならびに昨年度本研究費補助金により導入した顕微鏡用自動微動ステージを組み合わせて,生成される微粒子規則構造の特性について調べた.その結果,以下の点が明らかとなった.1.計算機シミュレーションのよる知見・形成される微粒子凝集構造の大きさは,照射レーザー光のスポット径で制限され,それ以上のサイズでは構造が不安定となる.・小さなスポット径でレーザー光を照射した場合,そのスポット径と同程度の大きさで微粒子の多層構造,すなわち3次元規則構造が生成できる可能性を確認した.2.実験による知見・計算機シミュレーションで予想された微粒子凝集構造の大きさのスポット径による制限を,実験により確認した.このことから,大きいサイズの微粒子規則構造を生成するためには,単光束照射では限界があることが分かった.・対象とする微粒子懸濁液を保持するセルの形状として,軸対称性のある円筒形状が適していることが分かった.なお,単光束照明で形成される微粒子凝集構造の大きさの限界から,並行して当初の目的である多光束照明による規則的な干渉光強度分布による微粒子トラップでの実現も進めている.理論解析の結果を基に,形成過程のシミュレーションプログラムの開発と倒立蛍光顕微鏡による試作装置の開発を進めているところである.本年度は,昨年度から引き続く単光束レーザー光照明によるフォトニック結晶創成法に加えて,空間光変調器を用いた任意光強度分布形成とその強度分布に沿った微粒子のトラップ法について研究を進めた.前者では主に計算機シミュレーションによる研究を進め,数理モデルの改良とそれに基づく最適パラメータの解明を行なった.後者では任意光強度分布を動的に形成するための位相回復アルゴリズムの開発と実験を進めた.その結果,以下の成果が得られた.1.単光束レーザー照明に関する計算機シミュレーション・微粒子凝集時の粒子間相互作用を考慮した数理モデルに改良することで,より忠実に実際の現象を反映したシミュレーション解析を実施できるようになった.・改良アルゴリズムで再度解析を行なった場合でも,前年度までに得られた微粒子凝集構造の大きさが照射レーザー光のスポット径で制限される点は同様であり,本手法による形成構造の大きさの制限の問題があることがわかった.2.空間光変調器を用いた任意形状での複数微粒子のトラップ・微粒子トラップ部でのレーザー光の光強度分布を所望のそれとする空間光変調器の位相透過率分布の計算にGerchberg-Saxtonアルゴリズムを採用することで,十分な速度で光強度分布を変え,複数微粒子を所望の分布に配置できるようになった.・ビーム中心点の0次回折光成分の存在が消去できず,そこに微粒子が捕捉されてしまう問題点が未だ解決できていない.
分子性導体の外場誘起非線形現象における階層間結合効果の理論

分子性導体に強い光を照射した後の電子物性変化の仕組みを、異なる階層における電子とフォノンの絡み合いを通して、理論的に明らかにした。二量化の強い分子性導体が二量体間の電荷不均化による秩序をもつ場合、励起光が二量体内の電子遷移を引き起こしたあと、二量体内で格子を変位させ、元々異なる価数の二量体の構造が近づいてから、一気に二量体間の電荷移動を起こして相転移する。連続波照射では二量体間の電荷移動を抑制できるが、パルス光照射では二量体内の電子遷移を抑制できることがわかった。より一般の遍歴電子モデルでは、負温度状態の生成や相互作用の反転が、対称的単一サイクル・パルスによってさえも起きることがわかった。光誘起相転移の前駆となる過渡状態は平衡状態から大きく離れている。したがって、過渡的な分子の価数を予測するときに、分子の価数に敏感な電子励起を観測するのと、分子振動の振動数を測定するのとでは、平衡状態で得られた経験則を使う限り、異なる結果を導いてしまう。超高速変化の初期過程では、一般に断熱ポテンシャルに沿って運動は起こらず、電子状態と振動状態の個別の情報と相関の解析が重要である。この観点からEt2Me2Sb[Pd(dmit)2]2の電荷分離相とモット・ハバード相における、振動状態とその光誘起時間変化を調べた。平衡状態における電子相を説明するには、分子を単位とすれば十分である。しかし、電子相によって異なる分子振動の振動数を説明するには、分子内の軌道自由度に由来した分子振動のソフト化を、平衡状態においてさえ考える必要がある。様々な分子振動がそれぞれ異なる分子内電子正孔励起と結合し、異なった強さでソフト化することを導いた。ここまでは断熱近似の範囲内で得られる。光誘起過渡状態において、断熱描像で予想されるソフト化とは異なった振動数で分子振動が起こる。これは、光励起密度が高いとき、および分子振動の振動数が高いときであることを明らかにした。また光励起エネルギーがダイマー間トランスファー・エネルギーより大きいとき、電荷秩序の融解は光励起密度の単調増加関数とならない。強励起では逆に電荷秩序の融解が抑制されるが、これには動的局在の寄与と、軌道励起の寄与があると予想される。光誘起相転移の多くは、もともと温度や圧力の変化で相転移が実現する物質および環境の近傍で、光照射をすることにより実現している。もし、物質中で競合する相互作用が、光照射で直接変調できれば、光誘起相転移を実現する可能性が広がり、そのダイナミクスの制御に向けて大きく前進する。この可能性を探る観点から、電荷分離相にあるEt2Me2Sb[Pd(dmit)2]2を小さい電場振幅で光励起して、これまで観測された電子状態の変化を再現する電子模型を使って、研究を行った。まだ実現していない、大きい電場振幅で光励起したときの、電子状態の変化を理論的に計算した。一般に、電場振幅が大きいと、移動前後の電子の居場所である二つの軌道の準位差が大きくなって、電子が動けない時間帯が長くなり、電子が局在しうることが知られている。この現象は動的局在と呼ばれる。ところで、Et2Me2Sb[Pd(dmit)2]2は強く二量化した系であり、電荷分離は二量体の間で起こる。これに関わるパラメタは複数の二量体間のトランスファー積分である。光誘起融解を実現するのに使われたレーザー光の中心エネルギーは、二量体内の電子遷移にほぼ共鳴している。これに関わるパラメタは二量体内のトランスファー積分である。これら二種類のパラメタを、光照射のしかた次第で独立に変調できることがわかった。連続波励起の場合、二量体間の有効トランスファー積分を減少することにより、動的局在が起こり、光誘起融解を抑制できる。これは、これまでに知られている事実からの自然な拡張である。しかし、パルス励起の場合、パルス光があたる短い時間で、二量体間の小さいトランスファー積分を変調することができない。しかし、二量体内の有効トランスファー積分を減少させ、光誘起融解を抑制できることがわかった。これは、二量体内の電子遷移を制御して実現できることを、解析的な計算とともに示した。三角格子を持つ擬2次元有機導体では、フェルミ準位付近の状態密度を大きく減らして安定化に寄与する二倍周期の電荷秩序と、三角格子に由来する三倍周期の電荷秩序が共存することがある。これらの起源は異なり、外場に対して一般に異なる応答をする。θ型有機塩でのサイリスタ現象の発見以来、非線形伝導に対する電荷秩序の効果が興味を持たれている。有限バイアス下の電子格子状態を、非平衡グリーン関数を使って求めた。θ型塩は高温金属相では対称性の高い結晶構造をもつために、電荷がフラストレートした状態にある。低温でストライプ型2倍周期の電荷秩序を安定化する際、正孔密度の増減に対応して異なる向きに分子面が回転する。この格子変位が維持される限り、2倍周期の電荷秩序が残り、電流は流れにくい。十分に大きなバイアスの下で2倍周期由来の構造因子が消えると、この格子変位も消える。しかし三倍周期由来の構造因子は電流が大きく流れても生き残り、実験で観測された状況を再現することが分かった。

光誘起相転移は非平衡環境で進むので、過渡的な電子状態と振動状態の関係は平衡におけるものと異なっている。平衡状態において、分子内のC=C伸縮振動の周波数は、分子の価数によって変化する。その関係と過渡的な周波数から期待される価数と、実際の分子の価数は一般にずれる。このずれ具合を解析すれば、光照射により吸収されたエネルギーの伝達経路について知見を得られる。そのため、分子内の軌道自由度、分子間の電荷移動自由度、分子振動および格子振動を取り入れた遍歴電子模型を採用する。電子格子相互作用が効いて電荷分離相になるEt2Me2Sb[Pd(dmit)2]2を考える。ハートリー・フォック近似の範囲内で、電荷秩序および分子振動と格子振動の周波数を再現した。分子および二量体がもつ対称性のために、それぞれの振動は分子内電子励起と選択的に結合している。最近の実験技術の発展により、より強い光をより短い時間で照射することができるようになり、強い光により電子状態がどう変化するか、これまでに観測されたことがない電子状態が現れうるか、などに興味が持たれている。そこで、振幅の大きい振動電場を照射した後の電子状態について、一般的な視点から理論的に研究した。もともと大振幅の振動電場では負温度状態が形成されうることが議論されてきた。連続的な光照射の場合は、古くから知られているが、最近はパルス光照射でも、可能なことが示唆されていた。ただし、パルス光はハーフ・サイクルなど、電場の時間積分が有限になるか、電場の時間変化が非対称なことが必要だと考えられていた。それは、トランスファー積分の符号が有効的に変わること、つまり動的位相シフトが大きいことが、必須と思われたからで、実験では達成が困難な条件だった。そこで、対称的なモノサイクルの振動電場により、負温度状態が形成されないか、それに付随して相互作用が反転しないか、調べた。強く二量化した分子性物質において、二量体の中と外で有効トランスファー積分の変調が、それぞれパルス光と連続波光で起きることがわかっていたので、それを簡単化した模型を考えた。1次元3/4フィルドで強く二量化した拡張ハバード模型に電子フォノン相互作用を加え、バンド絶縁相になる系を扱った。厳密対角化に基づき数値的に系の時間発展を計算した。すると負温度状態がモノサイクルの振動電場によっても形成され、オンサイト、サイト間の電子間相互作用も、電荷密度変調型、ボンド密度変調型の電子フォノン相互作用も有効的に反転することがわかった。つまり、有効トランスファー積分が全く変化しなくとも負温度状態が形成できること、エントロピーをあまり大きくせずに、全エネルギーを極大化することが必須であることを、明らかにした。光励起による負温度状態の生成と有効相互作用の反転については、オンサイト斥力だけをもつハバード・モデルに対して、オンサイト引力に変換することによる超伝導生成の可能性が知られていた。しかし現実の物質にはサイト間にも斥力があり、これを反転させてサイト間引力に変換すると、超伝導よりも相分離のほうが生成されやすいことが予想される。そこで1次元格子と2次元正方格子における1/2フィルドの拡張ハバード・モデルに対して、小さい系に対しては厳密対角化、大きい系に対しては時空間依存ハートレー・フォック近似を用いて、時間発展を計算した。負温度状態が古くから知られている二準位系から遠く離れた、二量化のない規則格子上においても、負温度状態の生成と斥力引力変換を示した。
リーマン・ヒルベルト問題の研究

一般研究(C)研究題名「リーマン・ヒルベルト問題の研究」(No.09640229)の科学研究費の費用により、平成9年平成11年度の間、上記の問題について研究を行った。この間論文を16編作成し、このうち9編はすでに印刷された。残りの7編は現在、印刷中となっている。研究は次のような5つのステップで進めた。(4)Putnamの不等式をn-tupleに拡張する。(5)Riemann-Hilbert問題をp-hyponormal作用素に拡張する。このうち(1)(3)については、(4)と(5)の研究のために行わなければならない研究であるが、これらについては、ほぼ理想的な形の結果を得ることができた。このため本研究の重要なテーマであった(5)の問題については、研究期間内に研究成果を得ることができた。(4)の問題については、研究の足がかりを得ることができ、研究成果を2編の論文としてまとめた。本研究は新潟大学教育人間科学部の古谷正教授には全面的な協力を得た。研究は古谷教授との共同研究が主である。また、平成10年度にはバナッハ研究所のW.Zelazko教授に来日していただき、平成11年度にはアイオワ大学のR.Curto教授に来日していただいた。両教授とは主として(4)に提示した問題について共同研究を行った。この(4)の問題、Putnamの不等式をn-tupleに拡張することについてはまだ完了できてはいないが、幸い2つの結果を得ることができた。ヒルベルト空間上の有界線形作用素でp-hyponormalと呼ばれる作用素に対してRiemann-Hilbert問題の解を得ることを目的として研究を進めている.まずWeyl's Theorem holds for p-hyponormal operators.の論文ではp-hyponormal作用素はWeylの定理が成り立つことをしめした.また論文Putnam's inequality for p-hyponormal n-tupleではp-hyponormal作用素に対してXia spectrumを構成することができ,これによりPutnamの不等式をn-tupleに拡張することができ,論文はGlasgow Math.J.に受理され出版されることになった.さらにsingular integral modelをp-hyponormal作用素にも作ることができ,このことからRiemann-Hilbert問題の解をこの作用素に与えることができた.この結果は論文Singular Integral Models for p-hyponormaloperators and Riemann-Hilbert problemとしてまとめた.論文はStudia Math.に受理され,出版されることになった.
感覚レベルと高次レベルの相互作用に関する論理・カオスダイナミックス

脳神経系における二つのレベルである感覚情報処理レベルと高次の推論過程のレベルの動的関係性と、それに伴う記憶の動的過程を明らかにするための理論的枠組を構築し、典型的なモデルにおいて数値シミュレーションを行なった。推論過程を前提→結論と結論の前提への置き換えの二つの過程に分離し、力学系へと変換した。これにより、従来型の神経回路網方程式とともに、新型の神経回路網方程式を得、それらがそれぞれ、レート・コーディング,コインシデンス・ディテクターを表現する可能性があることを数値的に明らかにした。興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの相互作用系に関する簡単な命題の真理値の推論過程を力学系へと変換することで、カオス的力学系を得、これが情報のコーディングと動的な記憶過程に深く関係する可能性を考察した。
薬剤耐性アスペルギルスの耐性機序解明と病原因子制御による新治療戦略の開発

予後不良なアスペルギルス症は患者数の増加、薬剤耐性の獲得などが問題となっている。一方で、新しい治療薬が存在しないという問題も抱えている。本研究は、本症の予後改善のために、アゾール系抗真菌薬に耐性を示すアスペルギルス感染症について、薬剤耐性獲得の機序の解明、アゾール系抗真菌薬の高用量吸入が有効であること、さらには人のアスペルギルスに対する過剰な免疫応答をアスペルギルスに活性のないマクロライド系抗菌薬でコントロールするといった新しい治療の可能性について実験的に証明した。本研究は、アスペルギルスの薬剤耐性機序の解明と耐性獲得阻止法の開発、ならびに病原因子の制御による新治療戦略の開発を行うことを目的としている。1臨床分離アスペルギルス株(アゾール系抗真菌薬感受性株、耐性株)の病原性確認とアゾール系抗真菌薬に対するin vivoでの感受性検討、2in vivo、in vitroにおける耐性化誘導能に関する検討、3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討を行った。1同一患者より分離された遺伝子学的に同一なアゾール系抗真菌薬の耐性株、感受性株を用いて、侵襲性肺アスペルギルス感染マウスモデルに感染させ、病原性の違いについて確認したところ、マウスに対して同様の病原性を示した。さらに、イトラコナゾール内服による治療実験を行ったところ、感受性株で耐性株に比較して、マウスの生存率が向上し、反対に耐性株では生存率が低下した。23慢性肺アスペルギルス症マウスモデルについて、COPDを作成したマウスに、免疫抑制をかけアスペルギルスを感染させると一定の期間、気道にアスペルギルスが存在することは確認できたが、よりよいモデルを目指して改良を行っている。一方、in vitroにおいて、低濃度のアゾール系抗真菌薬をアスペルギルスに暴露し続けると薬剤に対する感受性が低下することは確認できた。メカニズムの解析のために、アゾール系抗真菌薬の標的部位であるCYP51Aの変異を確認し、薬剤排出ポンプの発現について解析を行っている。また、上記に加えて、アスペルギルスが気道に感染した場合に、宿主の免疫応答としてMUC5ACなどのムチンを産生することが報告されており、過剰なムチン産生はアスペルギルスの感染を増強させるため、ムチン産生誘導は重要な病原因子の一つとして考えられる。in vitroで気管支上皮細胞であるH292細胞を用いて、アスペルギルスのムチン産生能とマクロライド系薬による産生抑制の可能性(病原性コントロール)について実験を開始した。1同一患者より分離された遺伝子学的に同一なアゾール系抗真菌薬の耐性株、感受性株を用いて、侵襲性肺アスペルギルス感染マウスモデルに感染させた。イトラコナゾールを種々の濃度で吸入させて治療した場合、低濃度では感受性株で耐性株に比較して、マウスの生存率が向上したが、高濃度の吸入では、耐性株も感受性株と同様に、マウスの生存率が向上し、イトリゾールへの感受性次第では、吸入治療も効果があることを確認できた。23慢性肺アスペルギルス症マウスモデルについて、非結核性抗酸菌を先行感染させ、その後にアスペルギルスを感染させる共感染モデルを作成し、非結核性抗酸菌症が先行すると、アスペルギルスがより長期間感染することが確認された。メカニズムの解析のために、アゾール系抗真菌薬の標的部位であるCYP51Aの変異を確認しところ、遺伝子変異は認められず、薬剤排出ポンプの発現について解析を行っている。また、in vitroで気管支上皮細胞であるH292細胞を用いて、アスペルギルスのムチンMUC5AC産生能とマクロライド系薬による産生抑制の可能性(病原性コントロール)について実験を行い、マクロライド系薬がムチン産生を抑制することをELISA法で確認した。1アゾール系抗真菌薬感受性株、耐性株の病原性確認とアゾール系抗真菌薬に対するin vivoでの感受性検討、2in vivo、in vitroにおける耐性化誘導能に関する検討、3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討、4マクロライド系薬による病原因子制御の可能性について研究を行った。1アゾール系抗真菌薬耐性株、感受性株を用いて、侵襲性肺アスペルギルス感染マウスモデルに感染させ、イトラコナゾール(ITCZ)を種々の濃度で吸入させて治療した場合、低濃度では感受性株で耐性株に比較してマウスの生存率が向上したが、高濃度の吸入では、耐性株も感受性株と同様に、マウスの生存率が向上した。マウス肺内でのITCZの濃度を測定した結果、高濃度吸入した場合にITCZの最小発育阻止濃度を上回る濃度に到達することが確認できた。アゾール系抗真菌薬の吸入療法の有用性を証明した。

23慢性肺アスペルギルス症マウスモデルについて、非結核性抗酸菌を先行感染させ、その後にアスペルギルスを感染させる共感染モデルを作成した。非結核性抗酸菌症が先行すると、アスペルギルスがより長期間感染することが確認された。in vitroにおいて、低濃度のアゾール系抗真菌薬をアスペルギルスに暴露し続けると薬剤に対する感受性が低下した。アゾール系抗真菌薬の標的部位であるCYP51Aの変異は認められず、他の耐性機序の存在が明らかとなった。4in vitroで気管支上皮細胞であるH292細胞を用いて、アスペルギルスのムチンMUC5AC産生能とマクロライド系薬による産生抑制について検討した。本薬がムチン産生を抑制することをELISA法で確認し、アスペルギルス症の治療の選択肢の一つになることを証明しえた。予後不良なアスペルギルス症は患者数の増加、薬剤耐性の獲得などが問題となっている。一方で、新しい治療薬が存在しないという問題も抱えている。本研究は、本症の予後改善のために、アゾール系抗真菌薬に耐性を示すアスペルギルス感染症について、薬剤耐性獲得の機序の解明、アゾール系抗真菌薬の高用量吸入が有効であること、さらには人のアスペルギルスに対する過剰な免疫応答をアスペルギルスに活性のないマクロライド系抗菌薬でコントロールするといった新しい治療の可能性について実験的に証明した。1臨床分離アスペルギルス株(アゾール系抗真菌薬感受性株、耐性株)の病原性確認とアゾール系抗真菌薬に対するin vivoでの感受性検討については、概ね順調に進展している。3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討についてはやや遅れているが、MUC5ACの病原性についての研究は進展している。上記から、総合的に、概ね順調に進展している。感染症1臨床分離アスペルギルス株(アゾール系抗真菌薬感受性株、耐性株)の病原性確認とアゾール系抗真菌薬に対するin vivoでの感受性検討は他剤の検討も開始する3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討また、カルシュニューリンの解析についても開始する。一方で、2in vivo、in vitroにおける耐性化誘導能に関する検討、3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討についてはやや遅れているが、MUC5ACの病原性についての研究も開始しており、総合的に、概ね順調に進展している。(今後の推進方策)1臨床分離アスペルギルス株(アゾール系抗真菌薬感受性株、耐性株)の病原性確認とアゾール系抗真菌薬に対するin vivoでの感受性検討、2in vivo、in vitroにおける耐性化誘導能に関する検討、3耐性化の機序解明と耐性化抑制に関する検討、4MUC5ACの解析をさらに進める。また、カルシュニューリンの解析についても開始する。(次年度の研究費の使用計画)前年度の研究内容に準じた追加実験のために、滅菌チューブ、シャーレなどのプラスチック製品、一般試薬、各種薬剤、培地、動物実験用マウスなどを引き続き購入、使用する。さらに、遺伝子欠損株作成のために、遺伝子解析用の試薬、キットなどを新たに購入し、使用する予定であり、前年度より多くの費用を要することとなる。
唾液腺における末梢型ベンゾジアゼピン受容体の薬理学的・分子生物学的特徴の検索

唾液腺における末梢型ベンゾジアゼピン受容体の薬理学的、分子生物学的特徴について以下の知見が得られた。1.RT-PCRによる末梢型ベンゾジアゼピン受容体mRNAの検出:ラットの耳下腺、顎下腺、舌下腺からtotal RNAを調製した。さらにこれからmRNAを調製した。ラットの末梢型ベンゾジアゼピン受容体の塩基配列から、特異的なプライマーをデザインした。この末梢型ベンゾジアゼピン受容体の特異的プライマーを用いてcDNAを増幅し、RT-PCRを行い、電気泳動した結果、ラットの耳下腺、顎下腺および舌下腺に特異的なバンドが検出された。2.1で使用したプライマーを用いて、スライドグラス上の組織(耳下腺、顎下腺、舌下腺)に対して、in situ RT-PCRを行った結果、腺房細胞および導管部に特異的な染色が認められ、末梢型ベンゾジアゼピン受容体のmRNAが検出された。3.Green fluorescent protein(GFP)ベクターと末梢型ベンゾジアゼピン受容体cDNAを組み合わせて、融合タンパク産生ベクターを作製した。作製したベクターを唾液腺培養細胞にトランスフェクションした。現在、細胞内における末梢型ベンゾジアゼピン受容体の局在の検索を蛍光顕微鏡を用いて行っている。以上の結果から、末梢型ベンゾジアゼピン受容体mRNAは、ラットの耳下腺、顎下腺および舌下腺の腺房細胞および導管部に存在することが明らかになった。唾液腺における末梢型ベンゾジアゼピン受容体の薬理学的特徴について、末梢型ベンゾジアゼピン受容体に結合するイソキノリン誘導体のPK11195の類似薬物である[^3H]PK14105でphotoaffinity labelingを行った結果以下の知見が得られた。1.[^3H]PK14105によって標識された膜タンパクは、ラット耳下腺、顎下腺、舌下腺、マウス顎下腺、ウサギ顎下腺およびヒト顎下腺においてすべて18kDaであった。2.動物間で受容体量を比較した結果、すべての動物でKd値がnanomolarレベルの高親和性であり、受容体数は、ヒト>ラット>マウス>ウサギの順に多かった。3.この膜タンパクのラベリングは、末梢型リガンドであるRo5-4864およびPK11195によって完全に阻害されたが、中枢型リガンドであるRo15-1788、clonazepamおよびODNでは阻害されなかった。4.ジヒドロピリジン系カルシウムチャネルのリガンドであるnitrendipine、BAY K8644、およびアニオン/カチオン共役輸送阻害剤であるbumetanide、furosemideによっても阻害された。5.この受容体の特異的結合は、nitrendipineおよびBAY K8644の存在下で有意な親和性の低下が認められた。以上の結果から、末梢型ベンゾジアゼピン受容体は、ラット、マウス、ウサギ、ヒトの唾液腺において[3H]PK14105で光標識される18kDaのタンパクを有することが明らかになった。
北海道南部の縄文時代における木材利用に関する研究

北海道南部地域の縄文時代及び続縄文時代における木材の利用状況について、10遺跡より採取した木質遺物を住居の構造材料、道具や什器などの材料、土木工事用の資料、燃料とに分けて分析研究した。また、比較のために道央・道東・道北、更に東北北部の若干の遺跡についても分析した。その結果、次の事柄が明らかになった1.住居の構造材料-ヤチダモと推定されるトネリコ属材は、時代を限らず、全道的にの使用頻度は高い。縄文時代中期から後・晩期にかけての道南地方では、クリ材が多用されている。今回比較のために分析検討した東北地方北部の遺跡では、分析数が少ないので結論的に述べることはできないが、縄文時代後・晩期まではクリ材が多用されるが、古墳時代以降では使用される例は少ない。なお、道央地域でクリ材が用材(後述する道具・什器の材料)として縄文時代後・晩期以降である。2.道具や什器の材料-調査資料数が極めて少ないので、道具や什器の種類ごとに材料の樹種を明らかにするには至っていない。3.土木工事用の資料-検討を加えた続縄文時代の河川の漁撈施設では、河畔に生育するヤナギ属やトネリコ属の樹木が多用されている。4.燃料-コナラ属材を中心に生活圏内及びその周辺に生育する樹木を特に選択することなく用いているようである。なお、道南地域では、縄文時代の早い時期からクリ材が燃料に用いられている。今回の分析は道南地域が中心であるので、今後は、道央あるいは道東・道北地域の遺跡についての分析を実施し、全道的な縄文時代の木材利用の傾向と東北地方との差異について明らかにして行きたいと考えている。
失われた抗菌活性を復活させる抗菌活性増強薬の開発

Compound K (6, 6'-dihydroxythiobinupharidine)による抗菌活性機構及び既存抗菌薬との併用効果機構について解析を行った。Compound KはDNA複製に重要なtopoisomerase IVを阻害し、その阻害様式はシプロフロキサシンやノボビオシンとは異なる新しい様式であることが示唆された。またバンコマイシンとの併用効果は、バンコマイシン耐性遺伝子群の発現抑制ではなく、結合標的であるD-alanyl-D-alanineの存在量を復活させることによることもわかった。最初にバンコマイシン耐性に関わる遺伝子群の発現解析を行った。バンコマイシンは細胞壁ペプチドグリカンの生合成過程や架橋反応を阻害する。このバンコマイシン耐性は、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)が保有する薬剤耐性プラスミド上に存在するVanA遺伝子群またはVanB遺伝子群によりもたらされる。感受性腸球菌(VSE)では併用効果は見られないことからこれら遺伝子群の発現あるいは種々の酵素の機能を抑制することによって、併用効果が発現していると考えられる。そこで、これら遺伝子群の発現をRT-PCR法により確認した。その結果、発現は減少しておらず、発現量減少による感受性化ではないことが分かった。またペプチドグリカンの組成解析を進めるべく、LC-MSにおける内部標準となる化合物(DAla-DLac)の化学合成を行った。しかし共同機器であるLC-MSの修理が必要となり、この実験は後回しにした。その代替として、バンコマイシンの蛍光標識体を用い、ペプチドグリカンのペプチド末端のDAla-DAlaの存在量を、蛍光顕微鏡を用いて評価することとした。バンコマイシンが結合できるDAla-DAlaの量が多ければ、菌はバンコマイシンに感受性を示すからである。濃度検討などを行い、評価をする準備が整った段階である。これらの実験から、VanA遺伝子群に含まれるいくつかの酵素の活性が阻害されている可能性が高くなった。そこで、DAla-DAlaをDAla-DLacに置換するために必要なVanA遺伝子群に含まれる複数の酵素について、大腸菌を用いて大量発現し、タンパク質精製を行って、その活性を測定することとした。現在、大量発現プラスミドを構築中である。本年度計画していたバンコマイシンとの併用効果のメカニズムについては、一定の進展が見られた。LC-MSが使用不可能となるなど不測の事態も起こったが、蛍光顕微鏡を用いた解析や、28年度に予定していたタンパク質の精製に向けた実験を行うことができた。論文も受理されたことから、予想以上に進んでいると判断される。一方で、アミノグリコシド系抗菌薬との併用効果の方は、バンコマイシンの作用機序の解析に時間をかけたため、あまり進んでいない。また実験代表者の異動に伴い、27年度末は研究をあまり進められなかった。よって総合的に見て「おおむね順調に進展している」とした。昨年度の解析結果から、バンコマイシン耐性遺伝子群の発現量は減少していなかったことが分かった。そこで細胞壁に存在しバンコマイシンが結合する標的であるDAla-DAlaの量を、DAla-DAlaに結合できる蛍光標識したバンコマイシンを用いて蛍光顕微鏡で観察した。当研究室で用いているバンコマイシン耐性腸球菌はバンコマイシンを培地中に添加すると発現誘導が起こる。その結果DAla-DAlaが減少し、蛍光標識したバンコマイシンが結合できなくなり、蛍光強度は減少した。一方、バンコマイシンに加えCompound Kを添加した場合においては、バンコマイシンが存在していても蛍光強度は消失しなかった。このことは、Compound KによりDAla-DAlaの存在量が回復していることを意味する。以上のことから、Compound KはDAla-DAlaをDAla-DLacに変換するいずれかの過程の酵素活性を阻害することが強く示唆された。これまでバンコマイシン耐性に関わる酵素に対する創薬は一部論文が報告されているが、その阻害効果は微弱であり、Compound Kの効果はそれをはるかに上回るものである。この結果を受けて、さらに標的を絞ることにした。バンコマイシン耐性に関与するVanA遺伝子群に含まれるいくつかの酵素遺伝子を大量発現プラスミドにクローニングした。現在これら酵素の精製を行うとともに、アッセイ系の構築を行っている。研究代表者の異動に伴い、今年度は行うことができる実験が限られていた。しかし必要最低限の研究は進んだと考えている。特に大量発現プラスミドの構築が終了していることは大きい。一方で、Compound Kの残量が少なくなってきたため、完全になくなる前に再度生薬からの単離を進めている。生薬のロットが変わると、含有量が変わることが予想されるため、慎重に作業を進めている。また国際学会での発表も受理され、2017年7月に行う予定である。平成29年度は、前年度に構築したバンコマイシン耐性遺伝子群に含まれる酵素の大量発現を行った。そしていくつかの酵素はアフィニティークロマトグラフィーにより精製を進めた。発現条件を丁寧に検討した結果、十分量のタンパク質を得ることができたが、ある酵素については大量発現により大腸菌の溶菌が起こっているようであったため、培養量を増加させることで十分量を得ることができた。またこれらの酵素活性を評価するためのアッセイ系を構築した。現在、この系の妥当性を評価するとともに、Compound Kの阻害効果を検討している。これまでの解析で、Compound Kには細菌のtopoisomeraseを阻害する効果があることを見出している。

抗菌薬のシーズとしての有用性を調べるために、ヒトのtopoisomeraseに対しての効果を解析した。現時点では目立った阻害効果は見られておらず、細菌に対する選択毒性が高いことが示唆された。今後この点は注意深く評価をしていく予定である。以上のことから、Compound Kとバンコマイシンの併用効果に関する研究成果として、(1)Compound Kはバンコマイシンが結合できるD-alanyl-D-alanineの存在量をVREにおいて増加させていること、(2)バンコマイシン耐性遺伝子群(VanA遺伝子群)の発現低下を引き起こしているわけではないこと、が明らかにされた。この結果からバンコマイシン耐性に関与する酵素活性そのものを阻害していることが予想されたため、(3)VanA遺伝子群に含まれるいくつかの酵素の精製を行った。さらに(4)ヒトtopoisomeraseに対する効果はあまり見られず、抗菌薬のシーズとして有用であることが示唆された。Compound K (6, 6'-dihydroxythiobinupharidine)による抗菌活性機構及び既存抗菌薬との併用効果機構について解析を行った。Compound KはDNA複製に重要なtopoisomerase IVを阻害し、その阻害様式はシプロフロキサシンやノボビオシンとは異なる新しい様式であることが示唆された。またバンコマイシンとの併用効果は、バンコマイシン耐性遺伝子群の発現抑制ではなく、結合標的であるD-alanyl-D-alanineの存在量を復活させることによることもわかった。まずは異動に伴う研究の遅れを取り戻す必要がある。病原体の使用や組換えDNA実験の承認を迅速に得て、実験の体制を整える。また共同機器の使用についても状況を調査し、使用可能となるよう手続きを早く終わらせる。一方で、タンパク質の精製に向けた実験は当初計画よりも進んでいることから、こちらを先に進める。また放射性同位元素使用の手続きも速やかに行い、アミノグリコシドとの併用効果についても解析を進める。まずはバンコマイシン耐性遺伝子群の産物であり、DAla-DAlaからDAla-DLacへの変換に関与する複数の酵素の精製を進める。現在、発現条件の検討を行っているところである。また評価系の構築も急ぐ。28年度よりも研究環境は改善されていることから、十分に標的の特定まではできると考えている。微生物学LC-MSの使用不能に伴って、当初予定していた使用料金を支払う必要がなかったこと、および研究代表者の異動が決定し、その準備のため、27年度末の2か月ほど研究を進めることができなかったことが大きな理由である。学内での共同機器を使用するために残しておいた分のうち、少額が残った。LC-MSが使用できない間、そのほかの実験は進めていた。異動先で準備が整い次第、すべての実験を同時進行で行う予定である。少額であるため、29年度配分額と合わせ、通常通りに執行する予定である。
分子プローブと光摂動ツールの開発－少数生体分子の可視化・操作技術－

本研究では、少数分子によって引き起こされる生理現象を可視化するプローブや生体内の分子数を制御するための光摂動ツールの開発を行った。これには、光スイッチング蛍光蛋白質、蛍光生理機能センサー蛋白質、光増感蛋白質、ケージドアミノ酸、リガンド応答性イオンチャネル、光摂動顕微鏡、吸収増幅顕微鏡などが含まれる。さらに、これら技術を他班の研究に適用するとともに、cAMPに対して細胞性粘菌が示す走化性応答のメカニズムにアプローチし、10数個/um^2という極めて低密度(=少数)で機能する分子を同定するとともに、数千細胞中のごく少数の細胞が自己組織的集合流形成において支配的な役割を担うことを見出した。本研究計画班では、生物における少数分子ネットワークにおける数および生理機能を定量可視化・操作可能とする技術の開発を目的としている。本年度は、1、細胞内の生理機能を可視化可能な蛍光・化学発光センサー2、蛍光強度ゆらぎを利用する超解像顕微鏡に用いることができる高頻度ブリンキング蛍光プローブ3、光操作を可能とするタンパク質および合成化合物4、細胞性粘菌における内在性遺伝子の蛍光タンパク質によるタグ化を中心とした開発を行ってきた。1に関しては、蛍光タンパク質の円順列変異体を利用したCa^<2+>センサーの高ダイナミックレンジ化、多色化に成功し、マルチカラー機能イメージングへ道を切り拓き、高輝度LED光源を利用して簡便・安価にマルチカラーイメージングを行うことが可能な共焦点顕微鏡システムの開発に成功した。また、旧来の化学発光タンパク質よりも10倍以上明るい化学発光タンパク質やCa^<2+>、ATP、cAMPに対する発光センサーの開発に成功し、生物学的な応用研究を遂行中である。2に関しては、従来の光変換型蛍光タンパク質に対し遺伝子改変を行うことで、光変換応答時間、蛍光槌色耐性の高い変異体を得ることに成功し、少数性生物学に必須の技術である超解像イメージング法への応用研究を展開している。3に関しては、大腸菌走化性応答における化学誘引物質セリンのケージド化合物を開発し、AO2-2班との連携を進めている。また、単量体型光増感タンパク質の開発に成功し、光不活性化法(CALI)へ応用中である。4に関しては、cAMPシグナル伝達系の構成因子であるCAMP受容体、cAMP合成酵素を緑色/赤色蛍光タンパク質でタグ化した細胞株を樹立し、これらの分子数計測を行っている。本年度は、【1】細胞内の生理機能を可視化可能な蛍光・化学発光センサー、【2】蛍光強度ゆらぎを利用する超解像顕微鏡に用いることができる高頻度ブリンキング蛍光プローブ、【3】光操作を可能とするタンパク質および合成化合物、【4】細胞性粘菌の多細胞体形成における細胞数依存性、を中心とした開発を行ってきた。【1】に関しては、光活性化型カルシウムセンサーの開発に成功し、個体内における任意の細胞を光でハイライトしてカルシウムの計測が可能になった。【2】に関しては、前年度に得た新規光スイッチング型蛍光タンパク質を用いてPALM, SOFI, RESOLFTなどの超解像イメージングを行い、特にRESOLFTでは従来の1000分の1の光照射で超解像イメージングを行うことが可能となた。【3】に関しては、光照射によってカルシウムイオンを遊離するタンパク質の開発に成功し、細胞内の任意の部位におけるカルシウムイオンの濃度ジャンプを行うことを可能にした。また、ホスホジエステラーゼと光応答性タンパク質を融合したキメラタンパク質を用い、光によるcAMP濃度制御に成功した。また、アルキン部を有する非天然アミノ酸の導入による光応答性タンパク質のモジュール化にも成功した。【4】に関しては、cAMPシグナル伝達の必須5因子についてゲノムのGFPタグ化を行い、細胞内での発現分子総数を計測した。その結果、シグナル入出力カスケードの上位から下位にかけて、細胞当たりの発現分子数が大きく減少することが明らかになった。最終エフェクターであるcAMP合成酵素を数千分子程度と少なく保つことで、反応ネットワークの機能制御点としていると考えられる。本研究計画班では、生物における少数分子ネットワークにおける数および生理機能を定量的に可視化し操作することを可能とする技術の開発を目的としている。本年度は、【1】細胞内の生理機能を可視化可能な蛍光・発光センサー、【2】超解像イメージングに用いることができる熱緩和スイッチング蛍光プローブ、【3】光操作を可能とするタンパク質および合成化合物、【4】細胞性粘菌の多細胞体形成における細胞数依存性、を中心とした研究を行った。【1】に関しては、昨年度開発に成功した光活性化型カルシウムセンサーのコントラストを更に改良するとともに、超解像イメージングに応用可能な光スイッチング型カルシウムセンサーの作製も行った。また、高光度発光タンパク質のシアン、オレンジ変異体の開発に成功し、論文発表を行った(PNAS 2015)。【2】に関しては、新規光スイッチング型蛍光タンパク質Kohinoorによる極めて生体に優しい超解像法を確立し論文投稿した。さらに素早い熱緩和により蛍光性が確率的にオンになる新規蛍光タンパク質を開発し、2000フレームの1分子画像を2秒で取得し35nmの空間分解能を有するDSSM画像を得ることに成功した。【3】に関しては、ホスホジエステラーゼと光応答性タンパク質を融合したキメラタンパク質や光応答性アデニル酸シクラーゼを用い、光によるcAMP濃度制御に成功した。また、アジド部を有する非天然アミノ酸の導入による光応答性タンパク質のモジュール化にも成功した。

【4】に関しては、単一細胞レベルで走化成に必須な機能分子の絶対数計測することで、細胞集団レベルでの発現数分布を定量化するとともにその時間変化を解析した。その結果、発現分子数が極めて少ないcAMP合成酵素の発現とその時間変化が複数のガンマ分布の重ね合わせで記述できる事が明らかになった。本研究計画班では、生物における少数分子ネットワークにおける数および生理機能を定量可視化・操作可能とする技術の開発を目的としている。本年度は、【1】細胞内のカルシウム動態の超解像イメージングを可能にする光スイッチング蛍光センサー、【2】光操作を可能とするタンパク質および化合物、【3】細胞性粘菌の多細胞体形成におけるシグナル伝達動態、を中心とした研究を行った。【1】に関しては、昨年度論文発表した生体に優しい超解像観察が可能な光スイッチング蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質をそれぞれFRETドナーおよびアクセプターに用いた光スイッチング型カルシウムセンサーの開発を進め、明暗コントラストが50倍程度に及ぶ新規光スイッチング型カルシウムセンサーの作製に成功した。【2】Photoactive Yellow ProteinとPhosphodiesteraseとの複合化によりセカンドメッセンジャー分子であるcAMCの濃度を光照射により能動的に制御できる系の構築に成功し、細胞走化性の光制御を試みた。また、リガンド添加により脂質膜におけるシグナル伝達を操作できる人工イオンチャネルの開発に成功した。【3】高感度化された新規赤色cAMP指示薬を開発し、1万個の細胞集団における自己組織的シグナル伝達動態を1分子/1細胞粒度で大規模解析できる系を確立した。内在機能分子数とcAMP動態を同時計測することで、少数個の分子が細胞単位での発振遷移を、また少数個の細胞がシグナル伝達能力の空間ヘテロ性の形成を制御していることを初めて明らかにした。本研究では、少数分子によって引き起こされる生理現象を可視化するプローブや生体内の分子数を制御するための光摂動ツールの開発を行った。これには、光スイッチング蛍光蛋白質、蛍光生理機能センサー蛋白質、光増感蛋白質、ケージドアミノ酸、リガンド応答性イオンチャネル、光摂動顕微鏡、吸収増幅顕微鏡などが含まれる。さらに、これら技術を他班の研究に適用するとともに、cAMPに対して細胞性粘菌が示す走化性応答のメカニズムにアプローチし、10数個/um^2という極めて低密度(=少数)で機能する分子を同定するとともに、数千細胞中のごく少数の細胞が自己組織的集合流形成において支配的な役割を担うことを見出した。本年度は、【1】細胞内の生理機能を可視化可能な蛍光・化学発光センサー、【2】蛍光強度ゆらぎを利用する超解像顕微鏡に用いることができる高頻度ブリンキング蛍光プローブ、【3】光操作を可能とするタンパク質および合成化合物、【4】細胞性粘菌の多細胞体形成における細胞数依存性、を中心とした開発を行ってきた。