hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白分解による細胞機能制御

(4)恒常性の維持・監視の制御:木南はリソソーム蛋白分解系のダイナミズムを調べるため、自食作用膜より分離した新しい膜蛋白の特性を明らかにするとともに、ファゴソームからファゴリソソームへの熟成過程ではカテプシン群の獲得機構に大きな差があることを見いだした。4つの重点項目について以下の研究成果を得た。(1)細胞周期制御:横沢は卵の分裂周期で一過的に上昇する細胞内カルシウムによるプロテアソームの活性化が、キナーゼ阻害剤で阻害されること、またプロテアソームの26Sから20Sへの解離がホスファターゼ処理によっておこることを見いだした。岸本は細胞周期におけるM期の終了はCdc2-サイクリンB複合体のサイクリンBの蛋白分解によってもたらされるが、Cdc2はその直前に解離している可能性を示した。(2)細胞増殖・文化の制御:名取はセンチニクバエ変態期において幼虫中腸を崩壊させる新規セリンプロテアーゼがプロテアーゼ活性に加え、ザルコトキシンIAと共通抗原性をもつ抗菌活性も併せ持つことを明らかにした。川島は、カルパスタチン遺伝子の翻訳開始点上流の5^1-非翻訳領域の構造に高い多様性を認め、カルパスタチンが複雑な転写制御を受けていることを示唆した。(3)細胞死制御:三浦はLPSで発現誘導されて自己活性化するカスパーゼ-11のノックアウトマウスを作製した。変異マウスは正常に発生し生殖可能であったが、septic shockに耐性であった。本酵素は生体でカスパーゼ-1の活性を上流で調節する遺伝子であることが示唆された。内山は、無血清、NGF無添加で誘起されるアポトーシスの系で、カスパーゼが活性化されない条件では、カテプシンD/Bによる細胞死制御系が働くことを明確に示した。(4)恒常性の維持・監視の制御:木南は、リソソームプロテアーゼ群がエンドソーム/ファゴソーム系とリソソーム系では個々のカテプシン量、獲得過程に大きな差があること、自食作用に伴い限定分解を受ける細胞質蛋白を同定し、自食作用の指標となる可能性を示した。大隅は、酵母の自食作用に必須なAPG遺伝子物産の同定を行ない、自食作用に伴う膜構造のマーカーとして有力な分子としてApg6,Apg8,Apg9を得た。(1)細胞周期制御:横沢は出芽酵母の増殖に伴って、定常期で顕著に26Sプロテアソームの活性と蛋白質量が変動することを見出し、増殖依存性の因子が26Sプロテアソームの構築を制御しているということを示唆した。岸本は細胞周期におけるM期の終了はCdc2-サイクリンB複合体のサイクリンBのAPCによる蛋白分解によってもたらされるが、Cdc2はその直前に解離し、APC以外の巨大分子複合体中に取り込まれていることを示した。(2)細胞増殖・分化の制御:名取はセンチニクバエ幼虫の体液細胞が、異物と接触した時に放出する二つのサブユニットからなるプロテアーゼは、一つの前駆体蛋白から翻訳後にプロセッシングを受けて生ずることを明らかにした。川島は下垂体由来GH4C1細胞において、TRHおよびTPA刺激によりカルパスタチンmRNA量の増加を観察し、PKCを介するカルパスタチンmRNA発現制御機構の存在を示唆した。(3)細胞死制御:三浦はショウジョウバエ複眼及びS2細胞においてCED-4の過剰発現は、caspaseの活性化を伴う細胞死を誘導すること、この活性化にはCED-4にあるP-loopモチーフが必要であることを示した。
abstinence の性教育カリキュラム編成に関する研究

性教育の現場に関する調査とその分析は遅れているが、初年度の現場教師たちへのインタビューによりかなりの情報が得られており、2年目は、インタビュー結果と文献調査の成果を踏まえつつ、カリキュラム編成の資料となる性教育教材の作成を、片岡政子氏(東京基督大学/看護学)の全面的協力を得て行った。また性教育に関わる社会・倫理・宗教等との関わりの考察に力を入れ、最終年度のまとめに向けた準備作業を進めた。そのなかで、米国などのキリスト教学校の背景から提唱されてきたabstinenceの性教育を日本社会に適応するための課題も改めて確認され、倫理・宗教、家族学、ジェンダー論との関わりから、より包括的な性教育カリキュラムに向けた検討を進めている。研究代表者の体調不良があり、性教育現場についてのアンケート調査とその分析が遅れているが、性教育カリキュラム作成に向けて大学での性教育教材の作成を行なった。また「包括的性教育」のカリキュラムの枠組みづくりは進展している。次年度(平成25年度)の計画は完成年度でもあるので総合的に以下の2つの方向で行う。1.小中学生期のいわゆる思春期前期に生理的成長に伴う性ホルモン活動が活発化してくる時期に、abstinenceの性教育は心理的・精神的・人格的な成長が、生理的成長が差し向ける未知のものへの好奇心、性行動へのに打ち勝つための葛藤が起こる。そのための教育的アドバイス(芸術的、文学的、体育的)はどのようになされるかを総合的、倫理学的に身体論の哲学的テーマと共に検討する。2.円満な大人に成長する段階での家庭教育のテーマがある。個体の自己防衛的、ヒューマンなabstinenceでは防げない、他の大人による性的虐待の実態が深刻であり、児童福祉、精神保健福祉上の大きな問題となっている。これは日本社会におけるジェンダー論の遅れと関係して被害を受けやすい子供に集中している。今後の性教育、家族学のテーマとしてまとめていきたい。1.先行研究の文献検討では,Abstinenceの性教育は若者のHIV,性感染症予防,妊娠防止のために重要な行動上の方略であることが明らかにされている。一方でAbstinenceの性教育が唯一の選択肢であることには慎重であること,その具体的な運用においては論争があることも事実である。しかしアメリカの公立学校の性教育においては,包括的な性教育の一環として必要かつ適切な内容は広く支持されている。一連の知見は本研究の目的であるAbstinenceの性教育カリキュラム編成を検討していくうえで貴重な示唆を得ることが出来た。2.現在,小学校,中学校の教育現場で性教育を実施している教師に,性教育への取り組みと具体的な展開についてインタビューを実施した。これはpilot studyの位置づけで行ったが、次年度の本調査に向けて質問票作成への具体的な手がかりが得られた。平成23年度の当初計画の骨子は1.国内外で実施されてきたAbstinenceの性教育の実際とその影響について,学術的な調査研究に関する先行研究の文献検討。2.国内外の教育機関やコミュ二ティで実施されているAbstinenceの性教育の実際を知る。この2点で進めてきた結果,前項で示した研究実績を得ることができた。平成23年度の研究実績を視野に入れながら,調査票を用いてアンケート調査を行う。調査対象は小学校,中学校の義務教育現場で保健,健康教育を担当する教師と性教育を受けた中学生,高校生とする。調査票の作成は,pilot studyの結果を参考に具体的な質問項目を作成し本調査の実施に備えていく。

調査研究の進め方でデータ収集に関しては,基本的には地域を視野に入れて公立学校を所管する教育委員会の協力を得るが,一方で私立中学校,高等学校にもアプローチし協力を依頼していく。というのは研究推進の方策として,将来的にAbstinenceの性教育のカリキュラムの検討,創案作成,試行に向けて私学の教育理念やschool mottoとのタイアップや教育効果を期待するからである。主要な経費は本調査実施に関わる諸経費で,調査協力機関や調査者への謝礼,調査協力依頼や調整のため教育機関への出向旅費,質問票作成の諸軽費,切手など通信経費,データ入力及び解析協力者への謝金である。
気泡核生成制御による超音波化学反応の高効率化に関する研究

超音波化学反応としてルミノール発光を用いて、種々の投入パワーで発光強度と液面振動振幅を計測した。投入パワーの増大とともに発光強度は増加しピークを示した後減少した。液面振動振幅は100ms程度であること、音波長の4分の1長さを越える変動は、反応に有効な共鳴定在波の音圧の腹と節の周期的構造の安定化を阻害することを、それぞれ明らかにした。本研究により高音圧振幅時の反応効率減少は液面ゆれが主因であることを解明できた。パルス超音波と核生成サイト供給のための粒子添加を組み合わせることで超音波化学反応の高効率化を実現するとともに、今回導入したレーザ変位計により液面振動を測定し高音圧振幅下における低反応効率の機構を解明する。具体的には、超音波化学反応としてルミノール発光を用いて、アルミナ粒子添加の下でパルス波照射を行い、連続波照射との発光強度比較を種々の投入パワーで行った。同パワー範囲で液面振動振幅を計測した。その結果、パルス波、連続波ともに添加粒子のないとき、投入パワーの増大とともに発光強度は増加しピークを示した後減少した。このパルス波の場合、その減少は急激かつ顕著であり、このときの液面振動振幅は100ms程度で、照射していないときの液面位置から音波長にして4分の1であることがわかった。投入パワーをさらに高くしても液面ゆれが大きくなるだけで発光強度の回復は観られなかった。音波長の4分の1長さを越える変動は、反応に有効な共鳴定在波の音圧の腹と節の周期的構造の安定化を阻害し、高音圧振幅時の反応効率減少は液面ゆれが主因であることを解明できた。また、パルス波の場合の発光強度は比較的低パワーのとき連続波のそれより高くなることがわかった。パルス波では連続波より気泡合体が阻害され大気泡生成量は少なく、音波の散乱が相対的に抑制されるため音圧振幅が高くなるので、また有効な微細気泡数の増大が見込めるため、このような結果となったと考えられる。容器内に空間的に均一な反応場を形成するのに有効な界面活性剤添加下で気泡の存在が音圧波形に与える影響を調べた。低パワーにおいては水と比べ1mM SDSではほとんど歪まなかった。界面活性剤の電荷の反発力の作用による気泡合体の阻害から気泡径は水中のそれより微小であり、周囲液体の粘性とSDS分子の気泡-液体界面での吸着脱離によるエネルギー損失が原因であると考察した。パルス超音波と核生成サイト供給のための粒子添加を組み合わせることで超音波化学反応の高効率化を実現するとともに、高音圧振幅下で発生する反応効率低下やアルコール添加時の濃度に応じ変化する反応効率の機構を解明する。アルコールは溶液中の超音波による核生成に影響を与える物質の一つであり、今回、溶液中の超音波による核生成に溶存気体濃度が与える影響を、アルコール添加条件下での音響発光測定により検討した。このテーマで実施した溶存気体濃度を変えながら行う実験は溶液調整に熟練を要した。従来報告されていたアルコール添加による音響発光増大効果が脱ガスとともに低減することを解明した。261kHz超音波を水溶液に照射し、溶存気体濃度が音響発光強度に与える影響について、超音波パワーや揮発性であるエタノールの添加濃度を変えて検討をおこなった。比較的低い投入パワーでかつ高い気体濃度の場合、低濃度のアルコールを添加した液は純水のときより高い発光強度を示すことを明らかにした。この、エタノール添加の純水に対する発光強度増強効果は、超音波の照射時間が経過するとともに減少した。この理由を次のように考察した。照射時間経過とともに純水での発光強度は上昇する一方、エタノール添加液では発光強度はほぼ一定あるいはわずかな減少を示していたためである。比較的低い投入パワーでは、純水時もエタノール添加時もともに、溶液から少量の脱ガスを行うことは高い発光強度をもたらすことがわかった。エタノール添加により脱ガスは純水の場合よりも促進されることが明らかになった。これは、ハイドロカーボンの蓄積が気泡内に生じ気泡径が増加し気泡内へ水蒸気がより多く取り込まれ、精留拡散が促進されることが原因として考えられる。パルス超音波と核生成サイト供給のための粒子・気泡添加を組み合わせることで超音波化学反応の高効率化を実現することを主な目的として以下の検討を行った。超音波化学反応場に適量かつ適切なサイズの気泡を添加すると、反応に有効な膨張収縮するアクティブ気泡が増えて反応量増加をもたらす。今回二流体ノズルで微小気泡添加の下で音響発光強度を測定し、超音波周波数、超音波パワー、投入気泡量の最適化条件等を探索した。微小気泡を添加しながら測定した音響発光強度の結果から、周波数と気泡添加条件の選択により気泡サイズを最適化でき、気泡無添加に比べて高強度の発光が得られることがわかった。

超音波周波数Fと気泡の共鳴半径Rの間にはF・R=3の関係があることは知られており、この関係が示唆するとおりの気泡サイズを、対応する周波数の音場中に投入することが肝要であることが明らかとなった点は、大変意義深い。このようにパルス超音波により休止時間で気泡が溶解する特徴を生かして気泡核を制御することに成功した。また、超音波化学反応の指標として観測された音響化学発光と、超音波霧化を同時に発生させるべく選択したパルス波のデューティサイクル条件下で、発生した霧の映像化を行うとともに連続波駆動時の霧の生成の様子との違いを明確にすることができた。超音波パワーが増大するにつれて、音場中の気泡量が増加し、よって気泡による音波の吸収、散乱に伴い音圧振幅を低下させる可能性がある。パワーを増大させたときに音圧振幅の直線的増加が緩やかとなる条件の、1Wよりも低いパワーにおいて、気泡が発生、存在していることを映像化して音圧低下との対応を確認することができた。レーザ散乱による気泡の膨張収縮の検出をおこなう中で、定在波の音圧の腹の面内では気泡群の分布はあまり変わらない一方で気泡数が変動することを明らかにした。
硫化カルボニルの四種硫黄同位体比に注目した、成層圏硫酸エアロゾル生成過程の解明

本年度は、前年度までに達成した硫化カルボニル(OCS)の消失反応である光解離、酸素ラジカル、OHラジカルによる同位体分別を学術論文に発表し、さらに素過程における分別を考慮したモデルを用いて成層圏大気化学を考察した。その結果、同位体のマスバランスより、バックグラウンド成層圏硫酸エアロゾルの起源としてOCSは矛盾しないことを明らかにした。また、前年度に実験によって求めたOCSの光解離における波長依存同位体分別を、第一原理計算を用いた再現することに成功し、結果として発表した実験結果と相補的な結果を得た。さらに、理論計算からもOCS光解離は質量非依存分別を引き起こさないことも明らかとなり、現世の酸化的大気で観測される硫黄の質量非依存分別にはOCS由来の硫黄化合物は関与していないことが示唆された。また、大規模火山噴火の際に生じる成層圏硫酸エアロゾルに関する研究でも成果を得た。本年度は、二酸化硫黄(SO_2)の光励起領域の紫外線吸収断面積の計測結果を共同で学術誌に発表した。その結果を組み込んだ火山噴煙のプルームモデルを用いることで、成層圏での大気化学反応により硫酸の硫黄安定同位体比が変化するメカニズムの解明に成功した。この結果、SO_2の光励起反応によって引き起こされる質量非依存分別によって極域の雪やアイスコアの記録を初めて再現した。今後、硫黄同位体記録を用いた火山噴火の規模や気候への影響の定量的な復元への展開が期待される。以上の結果を米国アカデミー紀要に発表し、プレスリリースを行った。当該年度に行った研究は、東工大における硫化カルボニルの安定同位体比測定装置の開発と、コペンハーゲン大学における硫化カルボニル消滅過程の同位体分別係数の決定である。前者は、世界でまだ例のない測定法の開発であり困難を伴い、今年度中の測定法の完成とは至っていない。しかし、5nmo1程度の極微量試料を用いた四種硫黄同位体比測定方法を確立した。コペンハーゲン大学での在外研究を2回合計2ヶ月間の実験を行った。本研究では、硫化カルボニル(OCS)の同位体分子種の紫外線吸収特性を比較し、光解離過程における同位体分別が従来の見積もりよりも小さいということを明らかにした。そして、OCSの光解離過程では質量非依存同位体分別はほとんど生じないであろうことを明らかにした。また、コペンハーゲン大学の所有する大気光化学チャンバーを用い、大気中ラジカル反応である酸素ラジカルとOCSの同位体分子種の実験を行い、実験条件などの検討を終わり、次年度以降に詳細なデータ取得を行う。昨年度に行った実験で、OCS同位体分子種の紫外線吸収断面積の測定より、OCS光解離反応の波長依存同位体分別係数を求めた。また、この結果と大気から成層圏に達する光の量より下部成層圏におけるOCS光解離によって生じる同位体分別係数が1‰程度と小さいことを明らかにした、この結果は、第一著者としてAtmosphoric Chemistry and Physics誌に発表した。次に、夏にコペンハーゲン大学に1ヶ月在外研究を行い、大気光化学リアクターを用いた実験を行った。この研究では、成層圏におけるOCS分解において、光解離に次いで2番目に寄与を有する酸素ラジカル(O(^3P))とOCSの反応における同位体分別を求めた。この結果、同位体分別係数は-20‰程度であるとわかり、理論計算結果とも一致した。なおこの結果はThe Journal of Physical Chemistry Aに掲載された。最後に、OCSの消滅反応として重要な最後の反応であるOHラジカルとOCSの反応に関しては共同研究者と理論計算を用いて同位体分別係数を見積もった。この反応は、反応経路が2種類あるため、その寄与が温度や圧力に応じて変化する。このため、実験でも求めにくい。理論計算と大気中の温度圧力変化から、OCS+OH反応の同位体分別の高度依存性を初めて見積もった。この結果は共同研究者の論文としてChemical Physics Letter誌に発表された。

今後、硫黄同位体記録を用いた火山噴火の規模や気候への影響の定量的な復元への展開が期待される。以上の結果を米国アカデミー紀要に発表し、プレスリリースを行った。研究課題の目標である成層圏硫酸エアロゾル生成過程を同位体的に議論する上で重要な硫化カルボニルの大気中消滅反応である光解離、OHラジカルや酸素ラジカルとの反応における同位体分別の決定が終了したことは今年度の非常に良い進展と言える。一方で、測定法の開発に時間を割けず、大気試料の観測はまだ観測が始められていないため、さらなる努力が必要なため。今年度まではコペンハーゲン大学での実験が主たる研究成果と結びついていたが、今後は所属研究機関における測定法の開発や観測に重点を置く。
Development of combined cellular and molecular target-directed therapies for glioblastoma

膠芽腫は最悪性の脳原発希少がんであり、新しい治療法の開発が望まれている。最近、間葉系幹細胞が膠芽腫局所で抗腫瘍効果を示すことが報告された。我々はGSK3βのがん促進作用を発見し、その阻害による膠芽腫治療効果を実証してきた。近年、GSK3βは間葉系幹細胞に抑制的に作用することが報告されている。そこで、膠芽腫細胞と動物モデルを対象に、GSK3β阻害剤と間葉系幹細胞移植の治療効果を調べた。その結果、膠芽腫の幹細胞性腫瘍細胞に対する間葉系幹細胞の治療的作用はGSK3β阻害剤の併用により増強された。本研究の結果は、間葉系幹細胞移植とGSK3β阻害剤の併用による新たな膠芽腫治療法の開発に有用である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
1細胞非増幅シーケンスを可能にするライブラリ調製法の開発

本件は、非増幅シーケンサーに適用可能なシーケンスライブラリの調製方法を確立することを目的とする。この実現のために、非増幅シーケンスのフローセル(シーケンス反応槽)内部でライブラリ調製を試みる方法(On-chip法)と、シーケンスフローセル外部で試みる方法(Off-chip法)の2つのアプローチを計画した。本年度は特にOff-chip法に関する検討を中心に進めた。Off-chip法として、RNAテンプレートからcDNAへと逆転写反応をする際に生じるTS(Template Switching)反応を活用する調製法を検討した。達成度の確認を段階的に行うために、PCRにより増幅したもの、および、PCRにより増幅しなかったもの(非増幅サンプル)の2つの段階での遺伝子の検出を試みた。PCRにより増幅したライブラリについてはさらに既存のシーケンス法(MiSeq,イルミナ社)でも計測し、非増幅シーケンス法のそれと比較した。増幅ライブラリに関しては既存シーケンス法に匹敵する遺伝子の検出に至った。一方、非増幅ライブラリにおいては有意な遺伝子の検出には至らなかった。また、非増幅シーケンスに際し、シーケンスの対象となるDNA分子(シーケンスライブラリ)は、シーケンスフローセル上に捕捉される必要がある。その捕捉を担う捕捉プローブの、シーケンスフローセルとの結合様式(結合強度)に関する検討も上記に並行し実施した。捕捉プローブとシーケンスフローセルの結合様式として、共有結合を活用する場合と、非共有結合を活用する場合がある。これまでの知見として、非共有結合の場合の方がシーケンス能が劣ることが分かっていた。しかし、本年度の検討において、非共有結合を活用した場合でも、共有結合する場合に匹敵する条件を見出すことができた。これを活用することで、Off-chip法の実現に向けた条件検討の選択肢が拡がった。共有結合を介した捕捉ブローブを用いたシーケンス解析と比較して、非共有結合を介した捕捉プローブを用いたそれは、シーケンスリード長(シーケンス解析によって読み出される塩基配列の長さ)が短くなるという問題があった。本年度は、非共有結合(具体的にはbiotin-avidin結合)であっても、共有結合と同等のリード長を得るにまで至った。これは特に計画しているOff-chipライブラリ調製法の実現に資するものであり、期待以上の進捗であった。一方、TS反応を活用し、かつPCR非増幅のライブラリについては、現状、遺伝子の検出に至っていない。進捗の見られた部分と遅れている部分を総じて、概ね順調な進捗と判断した。本年度の検討により、非共有結合捕捉プローブも実用可能なレベルにあることがわかった。このことは、特にOff-chip法の実現に向けて有用であることから、引き続きOff-chip法の実現に向けた検討を重点的に実施する。これと並行して、本年度得られた成果を論文として報告する準備を進める。

このことは、特にOff-chip法の実現に向けて有用であることから、引き続きOff-chip法の実現に向けた検討を重点的に実施する。これと並行して、本年度得られた成果を論文として報告する準備を進める。本年度、申請者の所属先が申請時の所属先から異動した(東京大学から理化学研究所)。それに伴い、研究環境の整備に時間を費やし、当初の計画に対して実験試行回数が減った。具体的にはシーケンスに必要な試薬等などの消耗が減ったことから、消耗品購入のために計上していたランニングコスト等が減り、次年度使用額が生じた。一方、実験の進捗としては期待以上の結果も得られたことから、異動による影響は少なかったと捉えているが、本年度に未実施分のシーケンスを次年度に実施する必要があり、主にこれらに次年度使用額を用いることを計画している。
新規がん変異同定技術基盤の開発によるがん分子病態解明への挑戦

がん抗原に対する自己抗体を指標にしてがん変異抗原を同定するためには、患者の少量のB細胞から抗体遺伝子配列を同定することが必須である。抗体遺伝子の特定には、多数の抗体の重鎖-軽鎖をランダムにつなぎ合わせるライブラリ法が一般的であるが、目的の抗体遺伝子の組み替え頻度が低すぎるために、少量の抗原特異的B細胞からの抗体遺伝子の取得は困難であった。本法では個々のB細胞を、短時間培養・活性化後にSingle cell sorterで分離し、個別の細胞における本来の重鎖-軽鎖のペアの抗体遺伝子配列を同定することに成功した。本法は、少量の患者由来の末梢血単核細胞にも適用可能であると考えられる。p53の変異ががんの発症・悪化を促進させることや、RASの変異が抗EGFR抗体の耐性メカニズムであるように、がんにおける「変異」を同定して病態との連関を解明することは、がんの分子病態の解明・治療薬の薬効予測などの点で非常に重要である。しかし、変異同定のブレイクスルーとして期待されたオミクス研究は、正常細胞/組織に比較して、がん細胞/組織での発現変動分子を数多く同定できても、意味ある変異の有無には運任せの要素が大きく含まれており、変異を積極的に探索する新たな切り口が求められている。その点、本研究は、「変異蛋白質に対して特異的抗体が産生される」・「特異的抗体産生細胞が血中に存在する」ことに着目し、がん患者特異的に産生される抗体の特性評価・抗原蛋白質のエピトープの解析を通じて、効率よく変異を同定する為の基盤技術の構築を目標としている。本観点からH27年度は、乳がんをモデルに、Her2に対する自己抗体を発現している患者を見出し、該当患者の末梢血単核細胞(PBMC)からファージ抗体ライブラリを作製・特異的抗体を発現しているファージを濃縮する操作を繰り返してHer2に対する特異的抗体の単離を試みたが、ファージ抗体ライブラリからの特異的抗体発現ファージの濃縮効率が悪かった。そこで代替策として、PBMC中の抗原特異的B細胞をシングルセルで単離すると同時に抗体遺伝子配列の解析を行なう事で、自己抗体の情報の取得を試みる。ELISAにて、抗Her2抗体の発現を確認した患者のPBMCを用い、ファージ抗体ライブラリを作製した。しかし、本ライブラリを用いて、Her2に対する特異的な抗体を発現しているファージを濃縮する操作(パンニング)を行なったところ、濃縮が認められず、有望な特異抗体の単離には至らなかった。現状は、代替案として、PBMCから回収したB細胞をシングルセル化し、それぞれのB細胞を単離・抗体遺伝子の配列を解析することで、乳がん患者の自己抗体の情報取得を目指している。昨年度では、がん患者の自己抗体取得に向け、モデル抗原であるHer2に対する自己抗体を発現している乳がん患者サンプルを用いて、従来法であるファージ抗体ライブラリを作製した。そのライブラリを用い、Her2に対して抗原特異的抗体発現ファージの濃縮を試みたところ、抗原特異的抗体発現ファージの濃縮効率が悪く、特異抗体の取得には至らなかった。この原因として、特異抗体の産生細胞の割合が低い、もしくは、自己抗体の親和性が低い事が推察された。本年度では、PBMCからB細胞をシングルセルで単離すると同時に、single cellで抗体遺伝子配列の解析を行なう事で、少量のがん患者由来末梢血から自己抗体の遺伝子情報を収集できる実験系の構築を試みた。その結果、ヒト末梢血単核細胞からB細胞を単離・刺激して、Fluidigm社のC1システムを用いてシングルセル化を行った。さらに、シングルセル化した細胞からの抗体遺伝子の増幅・シーケンス解析にも成功し、各々のB細胞が異なった抗体遺伝子を使用し、異なるアミノ酸配列を有している事が示唆された。以上の結果から、今後、B細胞の刺激条件や抗体遺伝子のprimer配列など多少の実験系の再検討は必要であるものの、少量のヒト末梢血単核細胞から、B細胞のsingle cell単位での抗体遺伝子解析を実施可能な実験系の構築に成功し、これは、従来法までのファージ抗体ライブラリ法の欠点を補う実験系であると言える。本研究は、ヒトサンプルからのがん抗原特異的抗体の同定、ひいては新規がん抗原の同定に資するものである考えられる。ファージに替わる代替案として、抗原特異的B細胞をシングルセルに分離後、それぞれの細胞の抗体遺伝子配列を解析する系の確立を目指す。具体的には、PBMCから抗原特異的B細胞を単離後、当研究所が有するFLUIDIGM社のC1systemによりシングルセルに分離・cDNAを回収し、発現している抗体遺伝子の配列を解析する。本手法は、ファージにおける欠点であった、VL-VH shuffling・PCRによる抗体遺伝子の増幅効率の違い・異なるhostでの発現のしやすさなどに左右されない、優れた系であると言える。
デンタルユニット給水系バイオフィルムの実験モデルの確立と関連遺伝子の解析

近年、歯科治療用ユニットの給水チューブ内面に細菌バイオフィルムが形成され、治療に使用される水が細菌の汚染を受けていることが問題視されている。そこで本研究では、細菌バイオフィルムについて詳細に解析するため、給水チューブ内のバイオフィルムをシミュレートした実験モデルの確立を試みた。その結果、三種の従属栄養菌がバイオフィルム形成に関与する主要細菌であることが分かり、これら三菌を一定条件のもとで混合培養することにより、臨床で観察されるものに酷似したバイオフィルムを作製することに成功した。本年度は、デンタルユニット給水系バイオフィルムの形成に関与する細菌の同定と、それらを用いてのin vitroバイオフィルムモデルの作成を試みた。1.大阪大学歯学部附属病院において使用されているデンタルユニットより水サンプルおよび給水チューブ内面に形成されたバイオフィルムサンプルを採取し、R2A寒天平板培地に播種して25°C、7日間の好気培養を行った。形成された優勢なコロニーを単離培養して同定を行った結果、Sphingomonas paucimobilis,Methylobacterium mesophilicum,Acinetobacter haemolyticsであると判明し、これら三種の従属栄養菌がユニット給水系のバイオフィルム形成の原因菌であることが明らかとなった。2.実験1により同定された各細菌の懸濁液中に、給水チューブとして頻用されているウレタンチューブを浸漬し、菌種ごとのチューブへの付着性を走査型電子顕微鏡観察により評価した。その結果、桿菌であるS. paucimobilisとA. haemolyticsf、系状菌であるM. mesophilicumよりも付着能が強いことが分かった。3.実験1により同定された三種の細菌混谷懸濁液中にウレタンチューブを浸漬し、各種の条件で培養を行った後にチューブ内面の走査型電子顕微鏡観察を行い、臨床でのバイオフィルム像に近い培養条件を検索した。その結果、S.paucimobills.M.mesophilicum.A.haemolyticsを18:1:1の比率で混合した菌液を用い、静置下にて25°C、48時間の好気培養を行うことにより臨床像に類似したバイオフィルムを再現できるごとが分かり、in vitroバイオフィルムモデルの確立に成功した。本研究課題は近年、重大な問題になっているデンタルユニット給水系の汚染に関して、その原因と考えられている給水チューブ内面に形域されたバイオフィルムrについて形成メカニズムを明らかにし、有効な汚染防止対策を検討することである。平成19年度の研究成果により、これらのバイオフィルムは主に3種の従属栄養菌から形成されており、これらの細菌を96時間の培養を行うことによって臨床像に類似したバイオフィルムを再現できることが明らかとなり、in vitroバイオフィルムモデルを確立することに成功した。そこでin vitroモデルを用いて、polyvinylidenefluoride(PVDF)チューブのバイオフィルム形成防止効果を検討した。その結果、96時間培養後の走査型電子顕微鏡観察において、桿菌の付着を認めるものの、バイオフィルム形成は認められず、PVDFチューブが汚染防止対策に有効であることが示唆された。さらに、バイオフィルム形成に関与する遺伝子の解析を行った。glycosyltansferase(gtf)は菌体外多糖の形成に関与する遺伝子として知られている。そこで同定された細菌について、塩基配列をもとにプライマーを作成し、gtfの有無を調べた。その結果、gtfは認められず、デンタルユニット給水系バイオフィルムへのgtfの関与は明らかとはならなかった。しかしながら、in vitroバイオフィルムモデルにより汚染防止対策に有効と考えられるチューブ素材を検討することができ、本研究により得られた知見はデンタルコニット給水系の汚染防止対策の開発を推進するものと考えられる。
酸性薬物の吸収・分布・排泄における有機アニオントランスポーターの生理的役割

薬物動態研究において重要であるモデル動物とヒトとの消化管吸収における種差を分子レベルで明らかにするため、マウス小腸においてエストロン硫酸(ES)をモデル薬物とし、ESの消化管吸収に関わるトランスポーターの同定を試みた。既にヒトにおいてはOATP2B1がESの取り込み輸送に重要であることを示しているが、そのマウスorthologであるOatp2b1はESをほとんど輸送しないことを明らかにした。しかしながらマウス小腸においてもESはトランスポーターを介して吸収され、その実体としてOATP1A subfamilyが関与すると考えられ、これはヒトにおいてはOATP2B1を介して吸収される機構と一部異なり、マウスなどのげっ歯類をヒトの消化管吸収モデル動物として評価する際にはOATP familyの種差に注意する必要があることを示している。また、近年非臨床試験において問題となるサルの薬物動態特性に関する研究を行った。サルは遺伝的にはヒトに近いものの特に経口投与後の薬物動態特性がヒトとは乖離していることが問題となっている。この原因は小腸における初回通過効果がこの原因と成り得ると考えられたためカニクイザル小腸における薬物の吸収特性とそのメカニズムを明らかにすることを試みた。消化管吸収を左右する重要な因子であるCYP3A4およびP-gpに注目し、その代表的基質であるミダゾラムおよびエトポシドのサル小腸における薬物動態特性を明らかにすることを試みた。Ussing chamber法によりサル小腸における代謝と輸送特性を評価したところ、サル小腸はCYP3A活性は極めて高く、またP-gpの関与は予想に反し小さく、むしろ取り込みに関与するトランスポーターの関与が小さいことが示唆された。これらの知見は今後、サルを用いて経口吸収性と評価する際の基盤情報として大変有益であると考えられる。薬物動態研究において重要であるモデル実験動物とヒトとの種差を分子レベルで明らかにするため、ヒト小腸において重要と予想された薬物トランスポーターOATP-BとそのマウスorthologであるOatp9の輸送機能を比較解析した。OATP-Bにおいて良好な基質になる新規利尿薬M17055およびEstorne-3-sulfate(ES)をモデル薬物として実験を行った結果、M17055はOatp9によって良好に輸送されるのに対し、ESはほとんど輸送されないことが明らかとなった。これはげっ歯類において低い消化管吸収性を示す化合物が、ヒトにおいて良好な消化管吸収を受ける可能性があることを示す知見であり、今後の前臨床段階の薬物動態試験において有益かつ留意すべき情報である。しかしながら、マウス小腸においてESの取り込み輸送を検討したところ、Oatpファミリーと特性が類似したトランスポーターの関与が推察された。上記の結果によりOatp9の寄与は少ないと考えられ、このことはortholog間の単純な比較のみならず、ファミリーに属する分子をも視野に入れた解析が重要であることを示唆している。現在、その他のOatpファミリーのうち関与している分子の同定を試みている。また、ヒト小腸における発現が考えられるOATP-Aに関してHEK293細胞遺伝子発現系を用いた薬物輸送試験を行った。M17055およびESはOATP-Aによって有意に輸送された。より高い輸送活性が得られることを期待して、現在OATP-Aの安定発現系を作成している最中である。さらにモデル薬物として非腎排泄型尿酸生合成阻害薬Y-700を選びOATPfamilyを検討し、結果としてNTCPが輸送することを示した。以上、ヒトおよびマウス小腸に発現するOatpファミリーの輸送機能と種差の解明を中心として、本研究は順調に進行している。
ムスカリン受容体により制御されるチャネルの活性化及び脱活性化機構の解明

パッチクランプ法により副腎髄質細胞をA1F化合物含有細胞内液で灌流すると、保持電位-55mVで内向きの非選択的カチオン(NS)電流が一過性に発生する。この電流の最大値及び誘発された電流が半分に減少するのにかかる時間(T_<1/2>)は、細胞内遊離Mg^<2+>濃度([Mg^<2+>])が1mMから12μMに減少するに従い大きくなった。アルカリ脱燐酸化酵素をA1F細胞内液に加えると、見かけ上[Mg^<2+>]を増加させるような効果を持ち、逆にバナジン酸の付加は[Mg^<2+>]を低下させるような効果を持った。細胞内にA1F化合物を投与すると、ムスカリン受容体刺激によるNS電流の発生は一過性になった。これらの結果は、G蛋白活性薬のA1F化合物の細胞内投与がNS電流の活性化ばかりでなく脱活性化をも促進すること、そして脱活性化にはMg^<2+>依存性脱燐酸化酵素が関与することを示唆する。次にA1F含有細胞内液のATPを除去又はAMP-PMPに置換して全細胞電流を記録した。これらの操作は、NS電流の最大値及びT_<1/2>に影響しなかった。しかし、内因性ATPをCN化合物の前処理により枯渇させた条件下では、NS電流の発生はまったくA1F含有細胞内液のATPに依存した。非加水分解性ATPアナログのAMP-PMPやATPγS、さらにGTP、ITP及びUTPは、全くこのATPの作用を持たなかった。これらの結果は、NSチャネルの活性化に燐酸化が関与することを示唆する。そこで、関与する燐酸化酵素を同定するために、まずCa^<2+>依存性を調べた。細胞外のCa^<2+>を除去すると、ムスカリンで誘発されるNS電流が細胞の1/3で約半分に減少した。cyclopiazonic acidをCa^<2+>除去液に加えると、このNS電流減少が2/3の細胞で観察された。一方、細胞外にA-23187を加えると、ムスカリン誘発性NS電流は30%増加した。これらの結果は、細胞内Ca^<2+>はNSチャネルに対して促進的作用を持つが、活性化には不可欠でないことを示唆する。パッチクランプ法により副腎髄質細胞をAIF化合物含有細胞内液で灌流すると、保持電位-55mvで徐々に内向きの非選択的カチオン(NS)電流が一過性に発生する。この電流は、細胞内遊離Mg^<2+>濃度([Mg^<2+>])が1mMの場合、灌流開始後約30秒から発生し始め、約2分で最大に達しその後徐々に減少した。誘発された電流が半分に減少するのにかかる時間(T^<1/2>)は、約100秒であった。[Mg^<2+>]が1mMから、12μMに減少していくと、それに従い大きいNS電流が発生し、またT_<1/2>が大きくなった。

[Mg^<2+>]が0μMの場合は、12μMに比べ小さくNS電流が発生したが、T_<1/2>はさらに大きくなり約500秒になった。アルカリ脱燐酸化酵素を、AIF細胞内液に加えると、見かけ上[Mg^<2+>]を増加させたような効果を持ち、逆にバナジン酸の付加は[Mg^<2+>]を低下させたような効果を持った。細胞内をAIF化合物を含まない液で灌流した場合、ムスカリン受容体刺激により持続的なNS電流が発生した。一方、細胞内に、AIF化合物を投与すると、同じ受容体刺激でもNS電流の発生は一過性であった。こらの結果は、G蛋白活性薬のAIF化合物の細胞内投与はNS電流の活性化ばかりでなく脱活性化も促進すること、そして脱感性化にはMg^<2+>依存性脱燐酸化酵素が関与しているという我々の仮説を強く支持する。そこで現在、caged化合物の光分解による瞬時の細胞内[Mg^<2+>]の増加(本年度購入機器)が、AIF化合物または受容体刺激のより誘発されたNS電流にどう影響するかを調べ、我々の仮説をさらに検討している。ニスタチン法により副腎髄質細胞の膜電位を-40mVに固定して全細胞電流を記録した。ムスカリン誘発性非選択的カチオン(NS)電流は、Krebs液中では記録20分間減弱することなく繰り返し誘発された。しかし、外液からCa^<2+>を除去すると、36%の細胞において20分後にムスカリン誘発性NS電流は約半分に減少した。このNS電流の減少は、cyclopiazonic acidをCa^<2+>除去液に加えると細胞の73%で観察された。一方、Krebs液中にA-23187を加えると、NS電流は約30%増加した。これらの結果は、細胞内Ca^<2+>が貯蔵部位と細胞質の間を循環する結果、ある程度の細胞内Ca^<2+>濃度が保たれていること、又細胞内Ca^<2+>はNS電流発生に不可欠ではないが、促進的に働くことを示唆する。外液にneomycinを投与すると、ムスカリンで誘発されるCa依存性K電流は時間依存性に減少し、投与15分でほとんど消失した。一方、NS電流はその大きさが33%減少するものの、時間依存性の減少は全くみられなかった。この結果は、NS電流の発生にはphospholipase Cは関与しないことを示唆する。細胞内にG蛋白活性薬のAlF化合物を注入すると、NSチャネルが活性化される。そこで、AlF誘発性NS電流のゆらぎをPower Mac (購入機器)を用いて解析した結果、NSチャネルの単一コンダクタンスは2.5pSであることが分かった。NSチャネルの活性化における燐酸化の関与を細胞内ATPを非加水分解性ATPアナログや他のnucleotideに置換して検討した。細胞内ATPをCN化合物で枯渇した条件下では、NS電流の発生は全くパッチ電極内のATPに依存した。AMP-PNP、ATPγS、GTP、ITP及びUTPは、全くこのATPの作用を持たなかった。これらの結果は、NSチャネル活性化に燐酸化が関与することを示唆する。現在、caged GTPγSの光分解(購入機器)による瞬時の細胞内GTPγSの増加が、受容体刺激により誘発されるNS電流にどう影響するかを調べ、脱活性化機構のG蛋白依存性をさらに検討している。
異種間グラフトによるゾウリムシの表層パターン形成機構の解析

ゾウリムシなどの単細胞繊毛虫類でみられるCytotaxisと呼ばれる現象は、表層繊毛列の配列が遺伝子の違いには関係がなく、旧いパターンが新しく作られるパターンを決定することをいう。オネガネラの自己構築による形態形成という多細胞生物では解析の難しい、しかし、形態形成解析には重要でユニークな解析を目指し、異種繊毛虫のグラフトを試みたものである。1.同種繊毛虫のグラフト:ブレファリスマやラッパムシは同種間では成功した。しかし、ゾウリムシやスチロニキアでは同種間でも成功していない。切断及び再生はゾウリムシでも成功しているが、グラフトには膜の硬さの影響することを考慮し温度・メチルセルロース処理・培地の効果を検討したが、いずれも成功していない。2.異種間繊毛虫のグラフト:外科手術によるグラフトは、同種では成功したブレファリスマとラッパムシでも成功していない。ゾウリムシでは接合が細胞の部分的融合を伴うことを利用して、異種間接合を誘導した。接合対形成には成功し、機械的な押し付けやヒートショックを組合せる方法も試みたが、ダブレット形成には至っていない。3.成果としては、ブレファリスマを縦切断したとき、両端が頭部と認識される再生過程を辿ることが分かった。形態形成における極性物質の存在を強く示唆しており、今後の重要課題である。また、異種間グラフトでは膜融合における種特異性を認識させる結果となった。現在、種特異性をもたらす遺伝子支配を緩和する手だてとして、スチロニキアの大核核質をゾウリムシに移植する実験を行っている。異種間繊毛虫の大核核質を移植する実験系はゾウリムシの仲間では成功しており、グラフトの成否のみならず、どのような表層パターンになるかはまさにCytotaxisの観点からも重要な示唆が得られると期待される。ゾウリムシなどの単細胞繊毛虫類でみられるCytotaxisと呼ばれる現象は、表層繊毛列の配列が遺伝子の違いには関係がなく、旧いパターンが新しく作られるパターンを決定するものである。この現象の解析することにより、オネガネラのセルフアッセムブリーによる形態形成という多細胞生物では解析の難しい、しかし、形態形成解析には重要でユニークな解析を目指し、本年度は材料の検討のため、細胞の切断と再生を観察し、以下の結果を得た。1) Paramecium multimicronucleatum:細胞体を半分で切断した場合、縦および横のいずれの切断でも、細胞は死に至る。口部装置を含む約1/3で横切断したときには、小片からは再生しないが、大片からは再生する。その場合、細胞後半部位からの再生率が高い。2) Blepharisma japonicum:P.multimicronucleatumより高い再生能を有し。細胞体の横切断では、後端の1/4片からも25%の細胞が完全な細胞体まで再生した。縦切断の場合、口部装置側(腹側)が背側より再生率は高く、再生過程で切断面を挟むように2つの突起を出してから完全な細胞体になるという、特異な過程を辿った。これらの結果は、繊毛虫の口部装置が形態形成には重要であることを再確認するものであるが、同時に見掛け上の口ではなく、細胞咽頭部の重要性を示唆する。また、Blepharismaで細胞を縦切断したとき、再生過程で2本の突起状の伸長があることは繊毛列の複製を伴ってなされているはずであり、統合された細胞体まで完成するときに必須の過程であると考えられる。この特異な伸長がなぜ必要とされるのかを明らかにすることは、形態形成の法則を見出すための鍵となる現象であると示唆される。
冠動脈の心筋血流予備量比と壁応力を測定できる超高速血管内光干渉断層法の開発

我々は、血管内光干渉断層法の技術を基礎にした、心臓冠動脈の血流循環・壁ストレス情報の獲得を可能にする、新しい画像診断装置を開発する。病理解剖例の摘出心臓の冠動脈で実験を行い、(1)心筋血流予備量比・壁ストレス測定の実行可能性を検証する。(2)急性心筋梗塞の発症予知の可能性を探る。(3)医療における有用性の検証と今後の臨床使用に向けての課題抽出を行う。
肝癌の分子標的治療におけるＶｉｔａｍｉｎ　Ｋ２アジュバント効果の基礎的研究

【低酸素誘導因子(HIF-1)誘導によるsorafenib抵抗性に対するvitamin K2(VK2)の効果の検討】肝癌のsorafenib抵抗性の原因として低酸素誘導因子(HIF)が関与する。我々は肝癌細胞Huh7においてprotein kinase C(PKC)刺激剤TPAがHIF活性化を3倍増強することを見出した。PKC活性を抑制するVK2はPKCによるHIF活性化を濃度依存性に抑制した。さらにPKCによるHIF活性化にはPKCδが関与していた(投稿中)。次にsorafenibによる肝癌細胞増殖抑制作用は低酸素環境下で減弱するが、VK2によりその増殖抑制が回復することを確認した。PKCδ阻害剤でも同様の作用がみられ、PKCδの関与が示唆された。以上より、VK2は低酸素下でのsorafenib抵抗性を解除する作用を持ち、この作用はPKCδを介している可能性が示唆された。【進行肝細胞癌に対するsorafenib+VK2併用療法の検討】【低酸素誘導因子(HIF-1)誘導によるsorafenib抵抗性に対するvitamin K2(VK2)の効果の検討】肝癌のsorafenib抵抗性の原因として低酸素誘導因子(HIF)が関与する。【進行肝細胞癌に対するsorafenib+VK2併用療法の検討】Sorafenibは現在進行肝癌に対する分子標的薬として臨床的に使用されているが、効果は限定的である。我々はVK2がNF-kBやMAPK、PKCの活性化を抑制することで肝癌細胞の増殖・浸潤に関する遺伝子の発現を抑制し、抗腫瘍効果を発揮していることを示してsorafenibとの併用は有用であると考えている。実際、VK2とsorafenibの併用はin vitroでの肝癌細胞の増殖を相加的に抑制することを確認した。近年、低酸素誘導因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)が血管内皮増殖因子(VEGF)を誘導して血管新生を促進、肝癌の発生・増殖や浸潤・転移に関与することが報告されており、治療抵抗性の一因となっていることが考えられている。我々はVK2がsorafenibに対する治療抵抗性を軽減する可能性を考え、VK2のHIF活性化に対する影響を検討した。その結果HIFはPKC刺激で活性が増強され、VK2はHIFの誘導をPKCの抑制を介して抑制していることが明らかとなった(2013肝臓学会総会発表予定)。またsiRNAによる実験からこの作用はPKCδを介していることが分かった。この結果はVK2の新たな作用機序を示すものでsorafenibとの併用のさらなる有用性を示していると考えられる。さらに進行肝癌に対するsorafenibとVK2の併用の臨床研究を同時に進めており、現在sorafenib単独治療よりもsorafenib/VK2併用療法の方が生存期間が有意に長い結果を得てている。平成24年度の最も重要な目標としていた肝癌細胞の増殖およびアポトーシスに対するsorafenibとVK2の相加・相乗効果とそれに対する細胞内シグナル伝達系の関与については確認でき、学会発表も行った。しかしまだ血管内皮細胞における同様の解析が十分に行えていない。この理由は血管内皮細胞の培養条件が安定しないことにある。一方次年度に予定していたsorafeibに対する肝癌細胞の治療抵抗性の一因と考えられるHIFの活性化をVK2が抑制することをすでに確認できており、今後の研究は予定通り進展するものと考えている。また臨床研究も同時進行させており、一定の結果が出つつある。Sorafenib抵抗性の一因であるHIFの活性化をVK2がPKCを介して抑制することから今後、PKC刺激がsorafenib耐性に関与することを確認し、PKC阻害剤との併用による抗腫瘍効果の検討を行う予定である。今後肝癌細胞において併用によるVEGFの発現に対する効果と、内皮細胞に対する効果を確認する。さらにin vivoの検討としてヌードマウスに対する肝癌細胞移植モデルを用いてsorafenibとVK2併用効果を検討する。進行肝癌に対するsorafenib/VK2併用の臨床研究も同時に進行させる予定である。培養器具、試薬等の購入に使用するとともに、動物実験を行うため、動物の購入・飼育費用へ使用する予定である。また一定のデータが揃った時点で学会発表・論文投稿を計画しており一部は旅費・投稿費用としての使用を予定している。
狭ギャップII-VI族半導体の極薄膜成長法に関する研究

MBE法により、InSb基板上にCdTe薄膜をヘテロエピタキシャル成長させて、結晶状態とその界面の電子状態を評価し、最適堆積温度Tsを求めた。ソ-スには6Nの多結晶CdTeを用い、堆積速度は1.6μm/hに固定した。Ts=207°C243°Cの範囲で鏡面の表面を持つ単結晶が得られ、また、これをMIS構造と考えた時のC-V特性から、77Kにおいて、界面が蓄積状態から反転状態まで変化することが示せた。なお、この温度範囲ではTsが高いほど良好な結晶性とC-V特性を示した。Ts=243°C場合について、タ-マン法で界面準位密度を評価し、密度分布がU字型をしており、その最低値が2×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>であることが分った。また、ゲ-ト絶縁膜に加えることのできる電界は1MV/cm程度であった。界面に誘起できる面電荷密度が10^<12>cm^<-2>程度と計算されるから、MIS電界効果トランジスタに利用可能な界面が実現できたと判断した。CdTe/InSbヘテルMISトランジスタを試作し、77Kにおけるトランジスタ動作を世界で初めて確認した。CdTeのコンタクト穴あけには、アルコンスパッタ法を用いた。低ドレイン電圧領域から算出した移動度は、1200cm^2/Vsであった。これらの結果、CdTe/InSbヘテロ接合がMIS構造として取扱えることが初めて実証され、しかも、ある成長温度範囲ではSiO_2/Si界面に準ずる良好な界面が実現できることを明らかにできた。水銀テルルのMBE成長のための基礎的検討を簡易装置を用いて行ない、Ts=200°Cにおいて多結晶膜を得た。成長に必要な水銀フラックスは6×10^<17>/s程度であって、水銀ビ-ムを直径cm程度に絞れれば、既存のMBE装置が使えるとの見通しを得た。
複雑液体としての粉体集団の流動特性

ガスを流入することによって散逸粒子系である粉体粒子は流動化して液体の様に振舞う。しかしながら散逸系であり流動特性が非一様であること,「沸騰」など様々な現象が起きること等から真に複雑液体と呼ぶに相応しい対象である。本研究では,複雑液体としての流動特性を明らかにするため大学院生の市來健吾氏と協力して大規模な数値計算を行い次のことが明らかになった。即ち、ガス注入流速が熱力学的温度の役割をすること、揺動散逸関係を過程をして求めた粘性率が実験と定性的に一致すること(即ち強非平衡系でも揺動散逸定理の有効性を示唆した)、チャンネル相と呼ばれるガスの流路を形成して圧力が急激に下がる状態と沸騰相(バブルが出来る)との違いを明らかにしたことなどである。目下理論については構築中である。同時に一次元流動層のモデルを提唱し、交通渋滞のモデルとの類似性の指摘及び安定相と不安定相への非平衡相分離の記述のために正規化された長波方程式の導出、キンク・反キンクの進行速度、振巾、巾に対する選択問題と不安相中に安定相のドメンイが成長していく様子などを理論的に記述することに成功した。更にパワースペクトルの巾分布についても考察を加えている。他にも振動層におけるフェルミ分布の有効性を理論的に明らかにしてフェルミ流体論の適用の可能性を議論したガスを流入することによって散逸粒子系である粉体粒子は流動化して液体の様に振舞う。他にも振動層におけるフェルミ分布の有効性を理論的に明らかにしてフェルミ流体論の適用の可能性を議論した
家兎肺腫瘍モデルに対するラジオ波凝固とGMーCSF局所注入による免疫賦活療法

VX2腫瘍を日本白色種兎の肺に移植し、左耳介に転移モデルを作成した。移植1週間後にCTにて左下肺に腫瘍が作成されていることを確認した。LeveenNeedle展開針2cm径を使用しCTガイド下にラジオ波凝固を施行した群(RFA単独治療群)。RFA施行部位にGM-CSFを局注した群(RFA+GM-CSF併用群)。BCGを注入群(RFA+BCG併用群)、無治療群(コントロール群)を作成した。この4群のsurvivalと左耳介の転移モデルの腫瘍体積を経時的に測定した。生存中央日数はRFA単独治療群39日、RFA+GM-CSF群42日、RFA+BCG併用群120日以上、コントロール群24日であった。統計的な評価は追って検討する。転移モデルの体積変化は、コントロール群では単調増加した。RFA単独治療群も単調増加を呈したが、コントロール群に比してやや鈍な傾きであった。RFA+GM-CSF併用群とRFA+BCG併用群は腫瘍体積の縮小が見られた。RFA治療では、治療後に腫瘍の抗原に対して炎症細胞が集積すると報告されている。GM-CSFは、顆粒球、マクロファージを直接賦活化する物質でありRFA治療後に薬剤を局注することにより、RFA後の腫瘍に対しての免疫反応をさらに賦活化し、局所制御率および生存が延長すると期待され、今回の実験結果から生存率の延長と転移モデルの縮小傾向が示された。GM-CSF併用群とBCG併用群については、検討数が少なく次年度に追加検討を行う予定である。日本白色種兎の肺にVX2腫瘍細胞を経皮的に穿刺し、肺腫瘍モデルと左耳介皮下に転移モデルを作成した。移植1週間後にCTで肺に腫瘍が作成されていることを確認し実験を行った。実験群は、無治療群、ラジオ波凝固(RFA)単独治療群、RFA後にGM-CSFを腫瘍に局注した群(RFA+GM-CSF)に分けた。ラジオ波凝固治療は展開針2cm径のLeVeenNeedleを使用、CTガイド下に電極針を穿刺し通電した。3群の生存率の検討と左耳介の転移モデルの腫瘍体積を経時的に測定した。生存週数平均は無治療群約3週、RFA単独治療群とRFA+GM-CSF群は約7週であった。転移モデルの体積変化は、無治療群は単調増加し、RFA単独治療群とRFA+GM-CSF併用群は4週まで単調増加を呈し、その後一定となった。非治療群とラジオ波治療群、GM-CSF併用群とで有意な生存率延長および遠隔モデルの体積に有意差が示された。ラジオ波凝固では治療後に腫瘍の抗原に対して炎症細胞が集積すると報告されている。GM-CSFは顆粒球、マクロファージを直接賦活化する物質でありラジオ波凝固治療後に同薬剤を局注することにより、抗腫瘍免疫反応をさらに賦活化し生存率の延長、さらにはラジオ波凝固を行っていない遠隔転移へ抗腫瘍縮小効果が期待された。今回の実験よりラジオ波凝固と免疫賦活因子の注入の同時併用療法が臨床応用できる可能性が示唆された。詳細な結果、統計や病理組織の検討を論文にまとめて雑誌に投稿中である