hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性骨腫瘍の転移制御機構の解明と抗転移療法の開発

骨肉腫の肺転移に重要な転写因子であるNFκBを天然阻害剤パルテノライド投与やデコイオリゴヌクレオチド吸入療法で阻害することにより転移抑制効果を得た。肺胞上皮細胞、マクロファージの培養上清が骨肉腫細胞のNFκB活性を促進することを見いだし、骨肉腫の肺指向性の一因である可能性が示唆された。HIF-1阻害剤アピジェニンも骨肉腫肺転移を抑制した。マウス骨肉腫細胞株DunnからFidlerの方法にて得られた高肺転移株LM8は皮下移植により腫瘍を形成し、その後自然肺転移を生じる。我々は以前、これらの細胞株の肺転移能の差を規定する遺伝子をSuppression subtractive hybridization法により同定し、その後のスクリーニングでvalosin-containing protein(VCP)がLM8で恒常的に高発現しており、LM8の高肺転移能に関与していることを報告した。VCPはユビキチン化を受けたIκBαの分解に直接関与する蛋白で、NFκBの活性化を促進するため、今回我々は、LM8の肺転移におけるNFκBの役割を検討した。NFκBが恒常的に活性化しているLM8に変異型IκBを強発現させ、選択的にNFκB活性を阻害した細胞株LM8mIκBを作成した。この細胞株あるいは天然NFκB阻害剤であるパルテノライド(PAR)を用いてLM8の転移能におけるNFκBの役割について検討した。皮下移植自然肺転移モデルによる検討では、LM8mIκB細胞はLM8に比べ低肺転移能を示した。またLM8の皮下移植でPARの予防的投与(移植と同時に開始)を行うと肺転移は容量依存性に抑制されたが、治療的投与(移植後17日目より開始)では抑制されなかった。一方、マウス尾静脈注による肺転移実験系においてもLM8mIκB細胞はLM8に比べ低肺転移能を示し、LM8尾静注と同時にPARによる治療を開始する実験でも肺転移が著明に抑制されたが、尾静注後48時間からPARの投与を開始した場合には肺転移は抑制されなかった。蛍光標識したLM8を尾静注した後、経時的に肺組織に生着した細胞の量を組織抽出液中の蛍光で計測したところ、尾静注と同時にPAR投与を開始するとした場合、未治療群に比べ尾静注後48時間で有意に肺に生着した細胞が減少することがわかった。このことからNFκBはLM8の肺転移に於いて、細胞の肺血管床着床後から肺組織内に浸潤して小コロニーを形成するまでの段階で重要な役割を担っていると考えられる。また、分子機構としては抗アポトーシス、VEGF産生促進などが重要なメカニズムであると推測している。アピジェニンは、紅茶やパセリ、オレンジ等の多くの野菜やフルーツに含まれるフラボノイドの1つで、古くから、その抗炎症作用、鎮痙作用、鎮静作用が知られている。前立腺癌、乳癌、大腸癌などで、抗腫瘍作用が報告され、食物摂取にてガン予防が出来る可能性があるものとして注目を集めている。今回、我々は、アピジェニンが、骨肉腫に対しても同様な抗腫瘍作用を有しているかどうかを検討した。マウスDunn骨肉腫細胞株、およびそのサブクローンで高率肺転移株のLM8を、アピジェニン(0,5,10,20,50μM)の存在下で培養し、WST-8 assayにてその細胞増殖への効果を、Tunel法、FACSにてアポトーシスへの効果を、scratch wound healingassayにて遊走能への効果を、それぞれ検討した。Dunn、LM8、いずれの細胞においても、アピジェニンは用量依存的に、その増殖を抑え、アポトーシスも用量依存的に、有意に増加させた。同様に細胞の遊走能も抑えた。アピジェニンは、骨肉腫細胞株の増殖を抑え、アポトーシスを誘導し、遊走能を抑え、強い抗腫瘍作用を示した。以上のことから、骨肉腫に対しても有用な治療薬となる可能性がある。さらに、骨肉腫を始め多くの悪性腫瘍の死因となっている肺転移に関しても、アピジェニンが有効である可能性が示された。アピジェニンの作用機能としては未知であるが、昨今、卵巣癌において、VEGFやhypoxia-induced factor 1(HIF-1)を抑制していることが報告された。VEGFやHIF-1の活性化は癌転移の成立に強く関与していることが示唆されており,また,悪性腫瘍治療の難治の一因として腫瘍のhypoxic areaへの治療の困難が挙げられる.アピジェニンは、このような点でも癌治療における有用性が期待され、従来の治療法と併用して行なうことで、さらなる治療効果が期待できると推測している。来年度、細胞レベルから担癌動物モデル,癌転移モデルへと実験をすすめる予定である。標的とした転写因子に特異的に結合し転写活性を抑制する約20塩基対の二重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド(decoy ODN)を用いた遺伝子治療が動脈硬化やアトピー性皮膚炎などで臨床応用へ向けて検討されている。

DecoyODNによる遺伝子治療を肺転移抑制に応用するための基礎的研究を行った。DecoyODNは細胞周期調節に重要な転写因子であるE2Fを阻害するE2F decoyと腫瘍細胞の増殖亢進やアポトーシス抑制に働くNFkBを選択的に阻害するNFkBdecoyを作成した。作成したdecoy ODNを高肺転移マウス骨肉腫細胞株LM8に導入し、WST-1 assayによる細胞増殖、FACSを用いた細胞周期解析を行った。いずれのdecoy ODNを導入したLM8においても、非導入細胞や特異的結合配列を持たないscramble decoy ODNを導入した細胞と比べ細胞増殖は抑制された。E2F decoyを導入したLM8において細胞周期解析で増殖期細胞数が減少していた。次にC3Hマウス皮下にLM8を接種して作成した骨肉腫自然肺転移モデルを用い、decoy ODNの経気道的投与(decoy ODN 1000μgをPBS 25μlに溶解し、麻酔下のマウス鼻孔に滴下して吸入)を行った。4週後に屠殺し肺転移巣面積を組織最大割面上で定量した。また同じ実験系を用い、生存期間について検討した。骨肉腫自然肺転移モデルではNFkBdecoy経気道的投与群において、肺転移巣の縮小がみられ、生存期間が有意に延長した。(p=0.001)細胞増殖に重要な転写因子E2Fや、転移、血管新生に関与する遺伝子群を制御する転写因子NFkBを抑制するdecoy ODNは骨肉腫肺転移の新たな治療方法になる可能性が示唆された。
脳Cl^--ATPaseのmRNAからの誘導発現

神経細胞内外でのcl^-濃度勾配形成の機構は,未だ解明されていない.我々は,脳の神経細胞膜にcl^-存在下で最大活性を示すcl^--ATPaseを見出し,本酵素が細胞膜cl^-ポンプとして機能する可能性を示唆した.本研究では,ラット脳mrNAを用いてアフリカツメガエル卵細胞膜にcl^--ATPaseを誘導発現させ,この酵素のイオン輸送機能を証明することを試みた.ラット脳よりmRNAをpoly A-RNAとして調整し,その23mg/ml溶液を,アフリカツメガエル卵細胞当たり約50ml注入した. mRNA注入後の卵細胞は, 20゚Cで14日間インクベートしのち, barth溶液中でホモゲナイズし,これから採取した膜分画についてcl^1-ATPaseのほかNa_2K-ATPaseおよびアニオン非感受性Mg=atpaseの各活性を測定した. mRNA注入卵と緩衡液のみ注入した対照卵のATPase活性を比較した. cl^-ATPase活性(μmal pi/mg proteln/br)は,非注入卵および対照卵では0.030.10であったが, mRNA注入卵では注入後1,2,3および4日目に,それぞれ0.23±0.03,0.17±0.01,0.23±0.01および0.19±0.06となり,対照値に比べ有意に活性上昇がみられた. Na,K-ATPaseおよびアニオン非感受性Mg=ATPase活性は,それぞれ非注入卵,対照卵で, 0.070.10および0.40.8てせあり, mRNA注入による有意な活性の変動は,みられなかった. cl^--ATPaseに対するモノクローン抗体と結合する蛋白は, mRNA注入卵のインクベート2または3日目に植物極または動物極に近い細胞膜に集中して出現した.以上の結果から,ラット脳由来のmRNAによりアフリカツメガエル卵細胞にcl^--ATPaseを発現させることが可能となったが,イオン輸送実験には細胞膜強度を保つための工夫が必要であることが分った.神経細胞内外でのcl^-濃度勾配形成の機構は,未だ解明されていない.我々は,脳の神経細胞膜にcl^-存在下で最大活性を示すcl^--ATPaseを見出し,本酵素が細胞膜cl^-ポンプとして機能する可能性を示唆した.本研究では,ラット脳mrNAを用いてアフリカツメガエル卵細胞膜にcl^--ATPaseを誘導発現させ,この酵素のイオン輸送機能を証明することを試みた.ラット脳よりmRNAをpoly A-RNAとして調整し,その23mg/ml溶液を,アフリカツメガエル卵細胞当たり約50ml注入した. mRNA注入後の卵細胞は, 20゚Cで14日間インクベートしのち, barth溶液中でホモゲナイズし,これから採取した膜分画についてcl^1-ATPaseのほかNa_2K-ATPaseおよびアニオン非感受性Mg=atpaseの各活性を測定した. mRNA注入卵と緩衡液のみ注入した対照卵のATPase活性を比較した. cl^-ATPase活性(μmal pi/mg proteln/br)は,非注入卵および対照卵では0.030.10であったが, mRNA注入卵では注入後1,2,3および4日目に,それぞれ0.23±0.03,0.17±0.01,0.23±0.01および0.19±0.06となり,対照値に比べ有意に活性上昇がみられた. Na,K-ATPaseおよびアニオン非感受性Mg=ATPase活性は,それぞれ非注入卵,対照卵で, 0.070.10および0.40.8てせあり, mRNA注入による有意な活性の変動は,みられなかった. cl^--ATPaseに対するモノクローン抗体と結合する蛋白は, mRNA注入卵のインクベート2または3日目に植物極または動物極に近い細胞膜に集中して出現した.以上の結果から,ラット脳由来のmRNAによりアフリカツメガエル卵細胞にcl^--ATPaseを発現させることが可能となったが,イオン輸送実験には細胞膜強度を保つための工夫が必要であることが分った.
着床を標的にした妊孕能制御システムの開発

本研究では、着床に関わる子宮機能を標的にした妊孕能制御システムの開発を目的として、以下の戦略により妊孕能の制御可能なマウスモデルの作成を試み、以下の点を明らかにした。着床期特異的発現パターンを示すことが報告されているCabp9Kを解析対象遺伝子として、その遺伝子導入のための条件設定を行うと同時に、Cabp9K発現ベクターおよび蛍光標識AS-ODNの作成とそれらの機能検定を行い、マウス線維芽細胞株を用いた遺伝子導入システムにおいて、それらが機能しうることを確認した。一方、LacZあるいはGFP発現ベクターなどをレポーターとして、HVJ-envelopeや様々なliposome系の導入試薬を用いて、子宮への導入遺伝子の浸透度・分布度の解析を行った。既報に比べて低い導入効率しか得られず、既報の方法の再検証の必要性を示唆する新しい知見と、今後のシステム開発のための有用な基盤情報が得られた。子宮内膜上皮特異的に発現すると考えられている遺伝子のプロモーターを組み込んだトランスジェニックコンストラクトを作製し、常法に従いマウス受精卵前核にマイクロインジェクションして複数系統のCre発現トランスジェニックマウスを得た。In vitroおよびin vivoにおいて子宮特異的にCreを誘導し得ることが、RT-PCRおよび免疫組織染色により明らかとなった。現在、ROSA26などのブルーマウスとの交配によって得られたF1マウスにおいて、時空間特異的にCre-loxPシステムが機能するか否かを検討中である。初年度は、子宮腔内へ直接薬剤を投与することにより、着床・胎盤形成に必須の内膜分化が調節されうるかを検討した。以前われわれは、ヒト子宮内膜分化を促進する薬剤として、チロシンキナーゼ阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を見出した。本研究では、性ステロイドおよび機械的刺激によるマウス内膜分化誘導系に、これらの薬剤を添加し、形態的・機能的分化が促進されるかを検討した。分化マーカーとしてはcyclooxygenase-2とprogesterone receptorを用いた。通常の分化誘導系では、これらのマーカーの発現増強がみられたが、上記阻害剤の添加実験では安定したデータを得るべく現在検討中である。一般にin vitro培養細胞系でこれらの薬剤の過量投与は細胞死を惹起するので、現在投与量および投与時期に関して条件設定を行っている。これらの基礎的検討に基づき、着床関与遺伝子に対するアンチセンスオリゴDNAや発現ベクターの投与条件を決定し、次年度以降は種々の薬剤のみならずマウス子宮に対して遺伝子導入を行っていく予定である。一方、子宮内膜特異的に発現すると考えられている遺伝子のプロモーター領域を組み込んだトランスジェニックコンストラクトを作製し、常法に従いマウス受精卵前核にマイクロインジェクションしてトランスジェニックマウスの作製を試みている。現段階では、これらの遺伝子操作を受けた受精卵よりマウスが得られた。さらに、実際の個体への遺伝子導入に加えて、そのF1へのgerm line transmissionも確認した。現在、子宮特異的な目的遺伝子の発現を解析中である。我々の意図通りにこのシステムが稼働すれば、ブラックボックスであるin vivoの着床現象を解析するうえで、極めて有用な生物資源となる可能性が高く、次年度も引き続きこのプロジェクトを展開していく。本年度は、初年度に引き続き、着床を標的にした妊孕能の制御可能なモデルマウスの開発を目指すべく、子宮への外的・物理的遺伝子操作によるシステムの確立を試みると同時に、誘導プロモーター下Cre-loxPシステムを用いた遺伝子改変マウスを作成した。着床期特異的発現パターンを示すことが報告されているCabp9Kを解析対象遺伝子として、その遺伝子導入のための条件設定を行うと同時に、Cabp9K発現ベクターおよび蛍光標識antisense ODNの作成とそれらの機能検定を行い、マウス線維芽細胞株を用いたin vitro遺伝子導入システムにおいて、それらが機能しうることを確認した。

既報に比べて低い導入効率しか得られず、既報の方法の再検証の必要性を示唆する新しい知見と、今後のシステム開発のための有用な基盤情報が得られた。子宮内膜特異的に発現する遺伝子のプロモーターによる複数系統のCre発現トランスジェニックマウスを作製した。Germ line transmissionを確認すると同時に、in vitroおよびin vivoにおいて子宮特異的にCreを誘導し得ることを、RT-PCRおよび免疫組織染色により確認した。
エイズウイルスプロテアーゼ阻害剤の分子内アシル転位型プロドラッグの合成研究

HIVプロテアーゼはアスパルチックプロテアーゼの一種で,疎水性アミノ酸を認識して切断する蛋白分解酵素である.よってこの阻害剤も疎水性アミノ酸をもとにデザインされており,脂溶性が高く水溶性が低いことが多い.我々の開発したHIVプロテアーゼ阻害剤も水溶性は低く,投与法が制限される.本研究ではHIVプロテアーゼ阻害剤の新しいタイプのプロドラッグを設計,合成し,その性質を検討したところ,水溶性を大幅に改善することができ,可溶化剤,吸収促進剤等を使用することなく良好な吸収を得た.分子内アシル転位反応を利用した新規プロドラッグは水溶性を大幅に改善することができ,さらに親化合物を生成する際に酵素の作用も不要であり,不必要な反応副成物も生成することがない.この様な利点をもつ新規プロドラッグの手法を,我々の開発した高活性HIVプロテアーゼ阻害剤(KNI-272)のプロドラッグ化に適用した.すなわち分子内にアシルアミノ基とそのβ位に水酸基を有しているKNI-272のΟ-アシル転位体をプロドラッグとしてデザインし,段階的縮合液相法にて合成した.合成したプロドラッグは親化合物より1000倍以上水溶性の向上が見られた.またプロドラッグを種々のpHの緩衝液に溶解し,経時的にサンプリングしてHPLCでプロドラッグと親化合物の存在比を測定したところ,血液や消化管中に相当するpHにて速やかな転位反応を経由し,活性型親化合物に変化することがわかった.さらに薬物動態実験では,本化合物は単純な水溶液の十二指腸投与により良好な吸収が得られることがわかった.これは親化合物が化溶化剤の非存在下では非常に吸収が低下することと対照的である.HIVプロテアーゼはアスパルチックプロテアーゼの一種で,疎水性アミノ酸を認識して切断する蛋白分解酵素である.よってこの阻害剤も疎水性アミノ酸をもとにデザインされており,脂溶性が高く水溶性が低いことが多い.我々の開発したHIVプロテアーゼ阻害剤も水溶性は低く,投与法が制限される.本研究ではHIVプロテアーゼ阻害剤の新しいタイプのプロドラッグを設計,合成し,その性質を検討したところ,水溶性を大幅に改善することができ,可溶化剤,吸収促進剤等を使用することなく良好な吸収を得た.分子内アシル転位反応を利用した新規プロドラッグは水溶性を大幅に改善することができ,さらに親化合物を生成する際に酵素の作用も不要であり,不必要な反応副成物も生成することがない.この様な利点をもつ新規プロドラッグの手法を,我々の開発した高活性HIVプロテアーゼ阻害剤(KNI-272)のプロドラッグ化に適用した.すなわち分子内にアシルアミノ基とそのβ位に水酸基を有しているKNI-272のΟ-アシル転位体をプロドラッグとしてデザインし,段階的縮合液相法にて合成した.合成したプロドラッグは親化合物より1000倍以上水溶性の向上が見られた.またプロドラッグを種々のpHの緩衝液に溶解し,経時的にサンプリングしてHPLCでプロドラッグと親化合物の存在比を測定したところ,血液や消化管中に相当するpHにて速やかな転位反応を経由し,活性型親化合物に変化することがわかった.さらに薬物動態実験では,本化合物は単純な水溶液の十二指腸投与により良好な吸収が得られることがわかった.これは親化合物が化溶化剤の非存在下では非常に吸収が低下することと対照的である.
シナプス分子のナノ配置の可視化解析から迫る自閉症病態メカニズム

精神疾患モデル動物の脳でのシナプス分子の微細配置解析に供する超解像イメージングプラットフォームの開発を行った。モデル動物の脳スライス標本をSTORM法で解析するための光学系や標本の蛍光標識法を最適化した。また、超解像イメージから分子配置の特徴抽出をするソフトウェア開発も行った。モデルマウスの脳内各部位のSTORMによる解析からDISC1ノックアウトマウスの線条体側坐核でのドパミン受容体が形成するナノクラスターの大きさや数の変容を明らかにした。DISC1ノックアウトマウスでのD2Rナノクラスターの変容は抗精神病薬クロザピンの投与によって改善することを明らかにした。自閉症は、社会性やコミュニケーション能力、固執傾向の異常を示す先天性の精神疾患である。これまでに自閉症患者のゲノム解析によって多くの自閉症関連分子候補が同定され、シナプス機能異常につながることが報告されているが、その分子メカニズムは未解明である。本研究では「自閉症の発症にはシナプス分子の微細配置の破綻によって生じるシナプス機能の変容が鍵となっている」との仮説を複数の自閉症モデルマウスの解析によって実証するとともに、微細配置の形成・維持の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。本年度では自閉症モデルマウスの凍結切片標本を用いて、大脳皮質、海馬、線条体、小脳で生じているシナプス分子の配置をStochastic optical reconstruction(STORM)顕微鏡を用いてナノメートルスケールの解像度で解析するために、野生型マウス由来の凍結脳切片を用いて最適な凍結切片の作成法、抗体の選定、染色プロトコル、顕微鏡の光学系設定の最適化を行い、対象分子に特異的な蛍光シグナルが高いシグナル/ノイズ比で得られるようにした。STORMイメージングでの解析対象分子として、まずプレシナプスに局在するシナプス小胞の輸送・開口放出関連分子(Munc13、RIM-1、Rabファミリータンパク質など)、ポストシナプスの受容体やイオンチャネル(グルタミン酸受容体、GABA受容体、カルシウムチャネルなど)、シナプス接着分子(Neuroligin、Neurexinなど)、スキャホールドタンパク質であるPSD95とPSD95との結合が報告されている分子を対象として、共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察によって標本作製の条件の最適化作業を進めた。さらに、グルタミン酸受容体のGluA1サブユニットを対象として、STORMイメージングを開始した。自閉症モデルマウスの導入が順調に進み、脳内でのシナプス分子の発現パターンの解析法の構築が完了した。また、Shank3ノックアウトマウスのシナプス分子の解析が計画通り開始できた。前年度にまでに確立したマウス脳切片でのSTORM顕微鏡を用いた超解像イメージングによって自閉症、統合失調症様の行動を示す遺伝子改変マウスでのシナプス関連分子の微足配置の変容についての解析を開始した。これまでに、Shank3ノックアウトマウス、Neuroligin3点変異導入マウス、DISC1ノックアウトマウス(DISC1 KOマウス)の大脳皮質、海馬、線条体での解析を完了し、特にDISC1 KOマウスの、腹側線条体(側坐核)において2型ドパミン受容体(DRD2)の興味深い発現パターンの変化を見出した。この領域ではDRD2の発現量が野生型マウスと比べて多く、STORM法による超解像イメージングを行いDRD2の分布を詳細に解析したところDRD2が5,000 nm2程度の大きさのクラスターを形成することが明らかになった。また、DISC1 KOマウスではDRD2のクラスターの大きさと数の増加が認められ、DOSC1 KOマウスにおいてDRD2の空間分布にナノスケールの異常が生じていることが明らかになった。また、DIS1 KOマウスで精神疾患症状の改善が認められている統合失調症治療薬クロザピンを投与したDISC1 KOマウスにおいてDRD2クラスターの数と大きさが野生型マウスと同等のレベルまで改善されることが明らかになった。加えて、DISC1 KOマウス側坐核のmediumspiny neuronのスパインの定量を行ったところ、第二分岐より先の樹状突起上のスパインの数の減少が観察され、この現象についてもクロザピンの投与によって野生型マウスと同等のレベルまで改善された。以上の知見は線条体側坐核で同定されたDRD2の微細な分布の変容やスパインの特徴が精神疾患での定量的な生物学的指標となりうることを示すものである。自閉症モデルマウスにおいてシナプス分子の発現パターンの異常を同定する。異常が見られた分子、部位については超解像顕微鏡を用いてナノスケールの空間解像度でより詳細にシナプス分子の配置の異常について調べる。薬理学購入を予定していた一部のシナプス分子の抗体については所属研究室にて優れた性能を有するモノクローナル抗体の作製に成功し、購入を見送ったため。
社会脳の再生: FASDモデルにおけるエピジェネティクス異常の解析と神経回路修復

胎児期アルコール暴露(FASD)モデルラットを用いて、認知・記憶、および社会性認知機能変化に対する系静脈的神経幹細胞移植療法の可能性について検討を実施した。Social interaction test、およびNovel objectrecognitiontestの各行動評価において、FASDモデルラットにおける障害が観察され、それらの障害が、胎児脳由来神経幹細胞の経静脈的移植によって改善することが示された。また、移植した神経幹細胞の一部は、脳内でGABA系の細胞に分化しており、脳内でのGABA系神経の再生に関係することが推察された他、FASDモデルの社会認知行動障害の脳病態と、細胞移植療法の効果発現のメカニズムに、前部帯状回、および扁桃体におけるPV陽性数の変化、ならびにPSD95発現変化を含むシナプス形成変化が関係することが示唆され、今後のFASD児の治療法開発の道しるべとなる可能性が示された。精神科臨床において発達障害や自閉症等における適応障害が増加の一途を示し重要な社会問題となっている。彼らの特徴として「他者に共感し心的状況に波長を合せて、社会で良好な関係を築く能力」といわれる社会的認知力の欠如、所謂「社会脳」の未成熟が重大な問題となっている。妊娠中の飲酒により、出生した子供に生じる障害は胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)と総称され注意障害や衝動性といった精神症状を認める。加えて他の発達障害に比べてFASDは他者の心的状況と感情を読み取る能力、社会的認知力が低い事が指摘されている。現状ではこれらの障害に根本的な治療法は確立されていない。我々は、新たな治療法の可能性を探る試みとして、FASDモデルラットに対する神経幹細胞移植を行い、社会性、認知機能、抑うつ気分などの機能変化について、それぞれの行動薬理的な評価系を用いて解析を加えた。胎生10日目から6mg/kgのエタノールを4日間連日で妊娠ラットに経口投与を行い出生した仔をFASDモデルとし、同用量の生理食塩水を投与して得た仔を対照群とした。両群に対して生後30日目にラット胎児脳由来神経幹細胞浮遊液あるいは生理食塩水を尾静脈から注入し、生後90日目より社会性活動の評価としてSocialinteraction testによる対照ラットとの接触回数、接触時間の測定、認知記憶注意障害の指標としてNovel object recognition testにおける新奇探索時間の測定を行った。各種行動評価では対照群に比べFASD群で社会性活動、認知記憶、注意力の低下などの出現が確認され、FASD群に移植を行うと、それぞれ対照群と同程度まで改善した。今回の結果より、FASDモデルラットにて社会活動性、認知記憶、注意力の低下の障害があり、それらが経静脈的神経幹細胞がFASDモデルラットの行動異常の改善に有効に働く可能性が示唆された。胎児期のアルコール暴露によって、脳を始めとした身体の各臓器の形成不全をきたすことが知られており、胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)という概念にまとめらえている。彼らの特徴として社会的認知力の欠如の問題が指摘され、精神科臨床において適応障害やうつ状態を呈す症例が急増し重大な社会問題となっている。しかし、その病態生理について不明な点が多く根本的な治療法は未だ存在しない。近年の報告で、胎児期アルコール暴露による、大脳皮質辺縁系でのGABA系interneuronの障害が報告されている。特に前部帯状回、海馬、および扁桃体領域のGABA神経サブタイプ、Parvalbumininterneuron(PV)の減少が示されるとともに、それがモデル動物の社会的行動異常と関連することが報告されたことから、これらの精神疾患における社会的行動異常の病態にGABA系神経の異常、特に特定のinterneuronの障害が関係することが推察されている。我々は、新たな治療法の可能性を探る試みとして、FASDモデルの社会的認知行動異常の脳病態解析と神経幹細胞移植療法の有効性ついての検討・解析を実施した。胎児期アルコール暴露(FASD)モデルラットを作成し、行動評価を行った(平成22年度実績)後、脳スライスでは,蛍光色素で標識した移植細胞が脳内に移行し,帯状回、海馬、SVZ(外側脳室下帯)、扁桃体など脳内に広く分布し、一部は、軸索形成と考えられる形態変化を示しGAD67抗体陽性の細胞であった。さらにFASD群では前部帯状回、海馬、および扁桃体領域において、PV陽性細胞数の有意な減少が認められ、FASD+移植群の前部帯状回および扁桃体領域では、それらの細胞数の減少が有意に抑制されていた。その結果、これらの結果と先のモデル動物の社会認知行動障害の改善効果より、FASDモデルにおいて、PV陽性細胞が、社会認知行動異常の病態に関係している可能性が考えられ、更に移植療法がその回復の一因となる可能性が考えられた。
単一NV中心における多量子ビット化へ向けた研究

ダイヤモンド中の窒素-空孔複合体(NV)中心が持つスピンの特徴は、固体中のスピンにも関わらず優れたスピンコヒーレンス特性を持ち、光により検出・操作することが可能な点である。水落らは特に^<13>Cの核スピンに注目し、複数量子ビット系の実現と優れた量子ビット操作性を示してきた。本研究ではこれまでの研究を発展させ、NV中心による量子レジスタ内の多量子ビット化を目指し、更に量子レジスタの量子ビット間の結合にも発展する仕組み作りを目指した。量子レジスタ内での多量子ビット化ではNV中心の電子スピンと結合した核スピンによる4量子ビット以上のNV中心を探索し、量子もつれ生成の実証を目指した。成果としては4量子ビットでの量子もつれ生成に成功した。成果は学会発表を行った。集積化等の優位性から固体系における量子情報素子の研究が活発になされているが、固体系で量子もつれ生成が報告されているのは3量子ビットまでであり、4量子ビットでしかも室温で実現した点は非常に意義深いと言える。他材料との量子ビット間の結合の仕組みつくりに関してはNV中心のスピンと超伝導量子ビットとの結合に成功した。本成果はNTT超伝導量子ビットグループ、NIIとの共同研究成果で、超伝導素子による測定はNTTが行った。阪大グループは試料作製とスピン特性の評価、及び超伝導量子ビットとのスピンの結合に関する議論を行った。成果はNature誌に掲載された。超伝導量子ビットは集積化に優位性を有するが、メモリー時間の短さに大きな課題があった。超伝導量子ビットと長いメモリー時間を有するNV中心のスピンを結合させた複合系の原理実験の成功は、その課題を克服し、集積化へ道を拓く点で非常に意義深いと言える。ダイヤモンド中の単一窒素-空孔複合体(NV)中心のスピンの特徴は、固体中のスピンにも関わらずイオン・原子などの微視的系に匹敵する優れたスピンコヒーレンス特性を持ち、光により検出・操作することが可能な点である。近年、水落らは特に^<13>Cの核スピンに注目し、複数量子ビット系の実現と優れた量子ビット操作性を示してきた。本研究ではこれまでの研究を発展させ、NV中心による量子レジスタ内及び量子レジスタ間の多量子ビット化を目指している。本研究は主に現有設備である共焦点レーザー顕微鏡にパルス磁気共鳴装置を加えた単一スピン操作・検出システムにより行った。大まかな分類としては量子レジスタ内と量子レジスタ間での多量子ビット化について研究を計画していた。量子レジスタ内での多量子ビット化はNV中心に近接した核スピンを用いて行った。核スピンとしてはNV中心に近接した13Cにより行った。量子レジスタ内で複数量子ビットを持ったNV中心による量子情報処理実証の研究としては、核スピンを2つと電子スピン1つからなる3量子ビット系において、量子中継に必要となるベル状態測定という基本動作の実証実験を行った。これまで固体においては実証されておらず、しかも室温でなされたことは重要である。量子レジスタ間での多量子ビット化ではナノ構造を持つ基板やナノ粒子等を用いた空間制御に関する試料準備を順調に進めていた。次年度にそれらを用いた実験を進める予定である。
カーバメートおよびウレアを活用した環境調和型触媒反応の開発

アミドやカーバメートなどのアミド様化合物はアミンの保護基として用いられる。しかしこれらアミド様化合物は非常に安定な構造を有するため、その切断には厳しい条件を必要とし、適用可能な基質に制限があった。この背景を踏まえ、本研究ではより温和かつ環境調和性に優れたアミド様化合物の切断法の開発を目的として、触媒的加水分解反応の検討を行った。昨年までにカーバメートにおける加水分解について初期検討を行ったが、いくつかの金属塩において活性を見出すことができなかった。一方で、8-アミノキノリンアミドの加水分解について種々検討した結果、ethylene glycol溶媒中、Zn触媒を用いることで最も良い反応性を見出した。これまでの最適条件において反応性は未だ不十分であるが、芳香族性、脂肪族性どちらのアミン由来のアミドも低収率ながら加水分解が進行することを確認できた。特にBr基を有する基質は、既存の酸化的付加を利用したアミドのエステル化反応ではではAryl bromideとの副反応が進行し得る基質であるが、本反応では副反応は確認できなかった。また、これまでに報告されている触媒的加アルコール分解でも切断困難な脂肪族性のアミン由来のアミドもわずかながら切断することができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。[1]ジエチレントリアミンを用いたカーバメートおよびウレアの切断反応の開発(これまでの続き)カーバメートやウレアは非常に安定な構造を有し、アミンの保護基や配向基として広く用いられている。これらの切断は有用な新規アミンの合成へとつながるため、アミン合成において強く求められている。しかし、一般的な切断には強塩基存在下における厳しい条件を必要とするため、官能基共存性に制限があった。私は、これまでの研究でジエチレントリアミンを用いた従来法よりも中性近い条件でのカーバメートおよびウレアの切断を達成した。また、アミド存在下におけるカーバメート選択的な切断という特徴的な反応性を見出した。申請書における研究成果に続き、更なる基質一般性の拡大、アミド存在下におけるウレア選択的な切断を達成した。また、本反応のアミド存在下における選択性発現のメカニズム解明を目的としていくつかの実験を行い、論文発表を行った。[2]カーバメートおよびウレアの触媒的加水分解反応の開発反応[1]は120-140°Cの加熱が必要であり、更なる官能基許容性を得るためには反応性向上が必要である。これまでの検討で、反応中間体からの二段階目の求核攻撃が律速段階とわかっている。そこで、二段階目を加速することが全体の反応性向上につながると考えた。一方、水は安価で無毒、非可燃性の循環再利用可能な環境負荷の少ないグリーンな試薬として近年注目されている。水を用いた脱保護の場合、中間体にカルバミン酸が生成し、脱炭酸を経て脱保護が完了するため、反応の加速が可能と考えられる。そこで、私はより温和な条件でのカーバメートおよびウレアの切断法として、触媒的加水分解の開発を目指した。[1]ジエチレントリアミンを用いたカーバメートおよびウレアの切断反応の開発本反応条件においてアミド存在下におけるウレア選択的な切断も達成した。このような選択性は従来法では達成し得ない本反応の大きな特徴である。加えて、農薬や医薬品といった生理活性物質に対して適用し、本反応の更なる有用性を示した。[2]カーバメートおよびウレアの触媒的加水分解反応の開発初めに、比較的切断しやすいカーバメートにおける加水分解について、いくつかの金属塩を用いて初期検討を行ったが、活性を見出すことができなかった。一方で、8-アミノキノリン由来のアミドについて触媒的加水分解が可能である結果が得られたため、この結果をもとにアミドの触媒的加水分解についてまず検討することとした。8-アミノキノリンアミドを基質として、種々検討を行った。現在、中程度の収率で目的物を得られる条件を見つけている。[2]カーバメートおよびウレアの触媒的加水分解反応の開発まずは、8-アミノキノリン由来のアミドについて触媒的加水分解について更なる検討を行う。

一方で、現在の条件でより切断が困難な脂肪族性アミドについては加水分解が進行しないことが分かっている。今後、8-アミノキノリンアミドの加水分解で得られた知見をもとに、脂肪族性アミドの加水分解や申請書記載のカーバメートやウレアの加水分解について検討し、きっかけを掴みたい。カーバメートおよびウレアを用いた新規二座配向基をデザインし、アルコールやアミンのα/β位選択的なC(sp3)-H結合官能基化反応の開発を目的とする。現在本課題についてほぼ検討を行えていないため、まずは触媒や配向基について最適化を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
V溝加工光ファイバプローブを用いた微小深穴内径測定器の開発

微細径の光ファイバプローブを用いた低測定力で高精度な微小径穴形状精度測定システムの開発を目的とする.プローブが穴内壁に接触した際のプローブのたわみを光学的手法により検出する.本研究では,基礎実験を行い本装置の測定精度を検証し,また直径100μmの微小径穴を測定することで本装置の有用性を確認した.微細径の光ファイバプローブを用いた低測定力で高精度な微小径穴形状精度測定システムの開発を目的とする.プローブが穴内壁に接触した際のプローブのたわみを光学的手法により検出する.本研究では,基礎実験を行い本装置の測定精度を検証し,また直径100μmの微小径穴を測定することで本装置の有用性を確認した.微細金型やマイクロマシン,微細ノズルなどの微細加工技術の進歩に伴い,細かい幾何形状を測定する重要性は増加している。本研究では,小径深穴の測定が可能なプローブとして,微細径の光ファイバを用いることにより,低測定力・検出機構が簡便で10μm以下の小径穴の測定が可能な微小穴内径測定器の開発を目的とする。本年度は光ファイバプローブの最適設計および製造技術の開発,各種理論解析を目的とした研究を実施し,以下の成果を得た。1.幾何光線追跡シミュレーションを用いた光学系設計パラメータの最適化Box-Muller法によりガウス分布の乱数を生成し,この分布に基づく光線を,投光用ファイバから射出する。その後,順次光学系内を光線追跡し,受光用ファイバ端面での結合効率解析を行い,各フォトダイオードで検出する光強度値を算出する。この解析結果から,ファイバ間距離などの光学系設計パラメータ最適値を算出した。また,シミュレーションによりプローブ用ファイバ変位の検出が可能であることを示した。2.小径プローブの製作フッ酸を用いたウェットエッチング技術により,光ファイバプローブの小径化(10μm以下)を達成した。また,アーク放電によりファイバ先端を溶融させることで微小径の測定子が作成できた。3.プローブ測定力の理論的解析接触プローブの測定力について理論的解析を行い,10μmファイバを使用し,先端変位が0.4μmの際に測定力が0.001μN以下,30μmファイバを使用し,先端変位が0.4μmの際に測定力が0.027μN以下であることを確認した。微細金型やマイクロマシン,微細ノズルなどの微細加工技術の進歩に伴い,細かい幾何形状を測定する重要性は増加している.本研究では,小径深穴の測定が可能なプローブとして,微細径の光ファイバを用いることにより,低測定力・検出機構が簡便で10μm以下の小径穴の測定が可能な微小穴内径測定器の開発を目的とする.本年度は光ファイバプローブの最適設計および製造技術の開発,各種理論解析を目的とした研究を実施し,以下の成果を得た.1.プローブ精度評価プローブ用ファイバ先端に変位を与えるとX, Y方向の出力に変化が生じるが,プローブ先端球と測定対象面の接触方位角度により同じ変位量でもX, Y方向出力の変化量はそれぞれ異なる。そこで,実際の穴測定を想定し,プローブ先端球と測定対象面の接触方位角度による測定分解能の違いを評価するために測定分解能の方向依存性評価を行った。この結果,プローブ接触子と測定対象面の接触方向に関係なく15nm以上の測定分解能を有することを確認した.2.プローブ動特性,測定力の解析今回の実験で用いた光ファイバプローブ(ヤング率E=72GPa,ファイバ長5mm)の固定端から接触子の中心まで断面直径が一様の円柱とし,自由端に集中質量(接触子)を持つ片持ちはりとして算出した一次の共振周波数はf=926Hzである.また,プローブ先端部が約4μm変位した場合で,算出した測定力は約1.3μNと低測定力であり,測定力による測定対象面への影響はないことが確認できた。3.測定装置の試作作装置性能を評価する目的で測定装置を試作し,実際に直径100μmの微小径穴の測定を行い本装置の有用性を確認した.本研究では,直径100μm以下の微小径穴内壁の表面粗さや真円度,真直度,円筒度などの形状精度,穴径をプローブの測定分解能0.01μm以下および形状測定の繰り返し誤差±0.05μm以下で高精度に測定することを目的とし,微小径・低測定力・高アスペクト比のプローブが容易に得られ,測定範囲が広く走査プローブとして利用可能な光ファイバを用いた新しい測定原理を提案する.提案プローブでは接触子の穴壁接触に伴う変位をレーザで非接触計測するために,プローブシャフトに剛性が必要なくさらにプローブを小径化した場合でも適用可能である.本年度は,微小径穴の精度を評価する目的で光ファイバプローブを用いた測定装置を試作し,測定システムの測定精度や繰返し性などの性能評価を目的として,標準粗さ片および直径100μmの小径穴を測定し次のような結果を得た.また,直径5μmのプローブ製作し直径10μm以下の小径穴を測定可能であることを確認した.1.標準粗さ片を10回繰返し測定した結果,繰り返し誤差はタッチトリガーモードで最大±0.1μm,スキャニングモードで最大±0.03μmである.

2.直径100μmの小径穴をスキャニングモードで10回繰返し測定した結果,繰り返し誤差は最大で±0.03μmである.3.標準粗さ片の全く同一箇所の測定ではないため,詳細な比較はできないが,本測定システムと市販の表面粗さ測定器の標準粗さ片を測定した結果は山の波長や形状,および振幅の絶対値に関して同様の傾向を示す.4.直径5μmの光ファイバプローブの製作技術を確立した.
形態形成期のアポトーシスを処理するマクロファージの分類

胎生期の形態形成においてみられる生理的な細胞死はプログラム細胞死と呼ばれ、アポトーシスの典型例とされている。本研究では胎生13、14日のマウス肢芽を用いて指間部で生じる細胞死の過程とそれらを処理する細胞を、DNAの断片化を検出するTUNEL法とマウスの単球-マクロファージ系細胞に対するモノクロナール抗体(F4/80、MOMA-2、MAC-2)を用いて免疫組織化学ならびに電子顕微鏡により形態学的に解析した。胎生13日の肢芽指間部では核濃縮を呈する死細胞が散在的にしか認められなかったのに対して、胎生14日になると核濃縮を呈する細胞が多数出現し、その多くは数個の集団を形成していた。TUNEL染色ではこの核濃縮を示す細胞に一致してTUNEL陽性像が認められた。胎生14日にみられる集団を形成するTUNEL陽性細胞はマクロファージに貪食されたものが主体であり、これらのマクロファージは免疫組織化学的にF4/80、MOMA-2両陽性またはMAC-2のみ陽性のどちらかを示すものがほとんどであった。一方、胎生13日および14日で集団を形成していないTUNEL陽性細胞は間葉細胞によって貪食されており、この間葉細胞もMOMA-2のみ陽性を呈した。以上の結果から、マウス肢芽指間部においてTUNEL陽性細胞を貪食する細胞にはまずマクロファージと間葉細胞の2系統があることが明らかになった。また死細胞を処理するマクロファージにはF4/80陽性またはMAC-2陽性の2タイプがあることが確認された。さらにマクロファージの出現はTUNEL陽性細胞の増加と一致することから、マクロファージは肢芽指間部での細胞死の発生機序にも関与している可能性が示唆された。
耐熱マグネシューム合金の新基本系の探索-高融点Mg-Sc-Zr系に注目して-

欧米の自動車産業におけるマグネシュウム合金の需要は、1993年以来年率20%の伸びを示し、この方面のニーズに見合った高温強度と耐クリープ特性に優れた新合金の開発が勢いを増しつつある。しかし、典型的なダイキャスト合金の使用上限温度は約130°Cであり、希土類元素等の添加による析出硬化によって高温強度の向上が計られているが、希土類元素はMgと共晶系を構成し、その添加によって合金の融点が降下するという本質的な問題がある。耐クリープ特性を改善するうえでマトリックスの融点降下は問題である。これらの添加元素によって析出硬化を計るなら、析出物によってMgマトリックスは可能な限り有効に強化されねばならない。本研究では、この本質的問題をクリアし得る新しい耐熱Mg合金の基本系としてMg-Sc系を取り上げ、本系をベースとする合金の相平衝関係と強度・変形特性を明らかにするための基礎研究を行なった。Mg-Sc系にはB2型構造のγ相(MgSc)が析出し、Zrが添加されていれば、ZrがScを一部置換し、Mg(Sc、Zr)を形成して析出硬化に寄与する。しかもScの添加によってMgマトリックスの融点が上昇する。ScはMgの他にNi、CoともB2型構造の金属間化合物を形成する。これら金属間化合物もMgマトリックスと整合性を保ちつつMgマトリックスえお有効に析出硬化すると期待される。これらマトリックスに分散される金属間化合物の中で、NiScは特に興味深い特性を示すことが判明した。NiScは常温で変形能を有し、融点も1270°Cと高い。本研究の目的は、高温強度に優れたマグネシュウム合金の開発であるが、検討した合金のいくつかは水素吸蔵合金としても興味ある性質を示すことが明らかになった。
パーキンソン病変性神経特異的病態背景の探索

神経前シナプスにおいて、神経活動依存的にalpha-Synucleinが取り込まれる系を樹立し、前シナプスでalpha-Synucleinの凝集と共局在するタンパク質を同定した。本タンパク質は、LRRK2のハエオルソログdLRRKノックアウトハエ前シナプスに蓄積が認められ、さらに、他のパーキンソン病原因遺伝子変異体アレルを組み合わせることによって、増減することを観察した。このことから、本タンパク質がalpha-Synucleinの伝搬に関与する可能性が考えられた。ドパミン神経の生存性に関わるミトコンドリアに関しては、膜電位の維持と脱共役タンパク質を介したmild uncouplingによる活性酸素種の除去が、その生存性に重要であることを人工的にミトコンドリアに導入したプロトンポンプを用いて明らかにした。バクテリア由来の本プロトンポンプは光刺激で駆動し、ミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子CHCHD2のモデルハエに組み込んだ。CHCHD2変異によるATP産生の低下の抑制、酸化ストレスの軽減、alpha-Synuclein凝集の抑制、ドパミン神経脱落の保護効果が観察された。この効果がドパミン神経特異的かどうか、非ドパミン神経、グリアとの比較を予定している。ドパミン神経活動に関与するCa2+チャネルのスクリーニングを運動機能試験とCa2+イメージングを組み合わせて実施し、2種類のCa2+チャネルを絞った。ミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子PINK1変異ハエ、CHCHD2変異ハエでは、神経刺激後のCa2+チャネルからのCa2+を、ミトコンドリアを介して緩衝する能力が低下していることを観察しており、この表現型を創薬の評価系として利用する検討をした。今後、Ca2+チャネル活性の操作が、ドパミン神経脱落の保護に働くかどうか検討する予定である。本年度はメンブレンダイナミクス関連パーキンソン病原因遺伝子LRRK2のオルソログdLRRKのノックアウトハエ前シナプスに蓄積するタンパク質を同定し、メンブレンダイナミクスに関与する別のパーキンソン病原因遺伝子、リスク遺伝子Auxilin, INPP5Fなどもこの分子の制御に関わることを見出したことが大きな成果である。またミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子CHCHD2の変異によるドパミン神経変性や疾患関連表現型がミトコンドリアへの光駆動型プロトンポンプの導入で抑制できることを示し、新たな治療法の可能性を見出した。iPS創薬に関しては、別途独立したプロジェクトとしてアカデミア-製薬企業の共同研究で大規模に行うことが決定したため、本計画ではすでに見つけている候補薬を用いて、ハエパーキンソン病モデルでの評価系の樹立を実施した。前シナプスに蓄積するタンパク質がalpha-Synucleinの凝集・伝搬に関わるか、ヒト病理組織での解析、培養細胞を用いた解析を進めていく。さらに、本タンパク質の機能制御を行う分子群の分子遺伝学的な同定を試みる。光駆動型プロトンポンプのパーキンソン病モデルにおける効果は、現在論文として投稿中であり、2019年度に成果として報告することを目指す。ミトコンドリアCa2+イメージングの系を用いて、前年度までに見出した2種類のCa2+チャネルの操作が、ミトコンドリアやドーパミン神経に対して保護的な効果をもつかどうかミトコンドリア関連パーキンソン病ハエモデルで解析する。本年度は、まずパーキンソン病との関連性が高い運動機能に関わるドパミン神経核を遺伝子操作することにより、光刺激依存的な行動異常を起こすハエ系統の樹立を進めた。光刺激には青色光、緑色光、赤色光それぞれに反応するチャネルロドプシンを導入し、光のon-off依存的にドパミン神経の活性化が見られる青色光チャネルロドプシンによるハエ系統の樹立進めた。青色光チャネルロドプシンの照射により、運動機能の持続的活性化、ドパミン神経の高度な脱落、シナプス構造への影響が認められた。この光依存的な神経興奮の系において、さらにalpha-Synucleinの伝搬と凝集をみることを試みたが、トランスジェニックハエのalpha-Synuclein発現がドパミン神経以外にも幅広くリークしているという問題が認められ、この課題は中止した。次に、ドパミン神経終末でのミトコンドリアのCaイメージングを実施するためのハエ系統の樹立と条件設定を行った。電気刺激後に、神経終末に流入するCaはGCaMP6でモニターし、その後にミトコンドリアへ吸収されるCaは、mito-GCaMPでモニターできる系を確立した。しかしながら、mito-GCaMPは感度が低いという問題があり、新たに改良型mito-GCaMPのハエ作製を進めた。並行して、ハエに存在する三種類のCaチャネルをドパミン神経でノックダウンし、いずれがドパミン神経興奮において主要な役割を持つかに関して行動解析を指標に進めた。ドパミン神経変調に関わる遺伝子として、既知パーキンソン病遺伝子の総当たり解析を進めた。その結果、パーキンソン病遺伝子で中心的役割を示すと考えられる遺伝子群を明らかにしつつあり、その抗体作製も進めた。神経終末でのmito-GCaMPの感度不足という問題はあったが、年度内に新たなハエ系統を樹立でき、次年度はじめにはキャラクタライズする予定である。一方、H30年度に予定していたドパミン神経変調に関わる遺伝子のスクリーニングが前倒しで進んでおり、新たな知見が得られている。H29年度樹立したハエ系統の利用により、この知見のデータ強化が望める。

神経前シナプスにおいて、神経活動依存的にalpha-Synucleinが取り込まれる系を樹立し、前シナプスでalpha-Synucleinの凝集と共局在するタンパク質を同定した。本タンパク質は、LRRK2のハエオルソログdLRRKノックアウトハエ前シナプスに蓄積が認められ、さらに、他のパーキンソン病原因遺伝子変異体アレルを組み合わせることによって、増減することを観察した。このことから、本タンパク質がalpha-Synucleinの伝搬に関与する可能性が考えられた。ドパミン神経の生存性に関わるミトコンドリアに関しては、膜電位の維持と脱共役タンパク質を介したmild uncouplingによる活性酸素種の除去が、その生存性に重要であることを人工的にミトコンドリアに導入したプロトンポンプを用いて明らかにした。バクテリア由来の本プロトンポンプは光刺激で駆動し、ミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子CHCHD2のモデルハエに組み込んだ。CHCHD2変異によるATP産生の低下の抑制、酸化ストレスの軽減、alpha-Synuclein凝集の抑制、ドパミン神経脱落の保護効果が観察された。この効果がドパミン神経特異的かどうか、非ドパミン神経、グリアとの比較を予定している。ドパミン神経活動に関与するCa2+チャネルのスクリーニングを運動機能試験とCa2+イメージングを組み合わせて実施し、2種類のCa2+チャネルを絞った。ミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子PINK1変異ハエ、CHCHD2変異ハエでは、神経刺激後のCa2+チャネルからのCa2+を、ミトコンドリアを介して緩衝する能力が低下していることを観察しており、この表現型を創薬の評価系として利用する検討をした。今後、Ca2+チャネル活性の操作が、ドパミン神経脱落の保護に働くかどうか検討する予定である。本年度はメンブレンダイナミクス関連パーキンソン病原因遺伝子LRRK2のオルソログdLRRKのノックアウトハエ前シナプスに蓄積するタンパク質を同定し、メンブレンダイナミクスに関与する別のパーキンソン病原因遺伝子、リスク遺伝子Auxilin, INPP5Fなどもこの分子の制御に関わることを見出したことが大きな成果である。またミトコンドリア関連パーキンソン病原因遺伝子CHCHD2の変異によるドパミン神経変性や疾患関連表現型がミトコンドリアへの光駆動型プロトンポンプの導入で抑制できることを示し、新たな治療法の可能性を見出した。iPS創薬に関しては、別途独立したプロジェクトとしてアカデミア-製薬企業の共同研究で大規模に行うことが決定したため、本計画ではすでに見つけている候補薬を用いて、ハエパーキンソン病モデルでの評価系の樹立を実施した。本年度はハエモデルを用いてドパミン神経変調に関わる遺伝子のキャラクタライズを中心に進める。特にパーキンソン病発症のキーワードとなるミトコンドリア、小胞輸送双方に関与すると考えられる遺伝子に重点を置く。これら遺伝子産物の抗体も前年度から作製しており、分子レベルでの詳細解析を行う予定である。前シナプスに蓄積するタンパク質がalpha-Synucleinの凝集・伝搬に関わるか、ヒト病理組織での解析、培養細胞を用いた解析を進めていく。
甲殻類におけるマイクロダイアリシス法による神経ホルモンのリアルタイム測定

甲殻類の脳をとりまく血リンパ中の液性調節物質を研究するにはマイクロダイアリシスHPLC法が適当と考え申請した。今年度はこの方法が適用できるかどうか、行動と連関させ、採血HPLC法で検討した。採血方法を開発するため、超遠心分離だけの場合や、キレート剤の使用、煮沸などを試み、アミン類ではキレート法、アミノ酸類では煮沸法が適当であることを決定した。ヤドカリ類、ザリガニ、ロブスターいずれの血リンパ中においても、既知の生体アミン類(ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、セロトニンおよび代謝産物)とアミノ酸類(グルタミン酸、γアミノ酪酸)が検出できた。特にザリガニとロブスターで威嚇行動に連関して、ドーパミン、セトロニンおよびその代謝産物の濃度変動が観察された。ロブスターではテストした個体8匹中検出できた個体6匹のすべてでドーパミンが威嚇行動にともなって増加した。ザリガニでは血液量が少ないので個体識別して比較分析することは不可能であったのでデータをプールしたが、全個体の平均値(n=8)で、有意に、威嚇行動中の個体でセロトニン量が増大した。同時にセロトニンの代謝産物5-HIAAが有意に減少した。その際、GABA等のアミノ酸濃度はまったく行動に連関しないことが分かった。また、アミン類の濃度はマイクロダイアリシスHPLC法の検出限界付近にあることが明らかになり、従って、マイクロダイアリシス法は技術的には必ずしも優れた方法ではないが他に物質濃度を測定する方法が開発されない限り、この方法で血中濃度を測定するのが当面の最適手段であると結論された。特にロブスターで顕著であったが、アミン類の濃度は個体差が著しいことが分かったことから、ベースラインレベルの濃度の違いによる神経系の働きのばらつき生じ、最終的には動物の個性をつくり出すのではないか、言い換えれば、アミン物質の精神神経生理機能が浮き彫りになるかもしれないという将来の展望が開けた。
超伝導ハイブリッドシステムの量子物理学

当グループの基盤Aプロジェクトは非常に成功を収め、その研究課題に関して、トップの物理学ジャーナルにおいて数多くの論文が出版された。研究成果であるこれらの論文リストは研究成果報告内容ファイルに記載されている通りである。Web of Scienceによると、論文の重要な結果のいくつかは多数引用されており、さらに、PIは、2017年に日本において選ばれた唯一の外国人の物理学者として選ばれ、高く評価されている。29年度が最終年度であるため、記入しない。理論物理学29年度が最終年度であるため、記入しない。