hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
末梢及び中枢神経再生のための人工基質と成長因子の応用

これまでに私達は、脊髄損傷と末梢神経障害の治療として、人工材料を用いて神経軸索の伸長を試みてきた。この人工材料にヘパリンを共有結合させることで、ヘパリン結合性蛋白である塩基性線維芽細胞成長因子を結合させることを可能にした。これにより塩基性線維芽細胞成長因子を徐々に放出することが可能となり、塩基性繊維芽細胞増殖因子の効果を持続させることに成功した。その結果、脊髄損傷後の空洞化の周りを囲んでいるアストロサイトのプロセスを越えて神経軸索が伸長していることを観察できた。また末梢神経でも離断した坐骨神経から腓骨神経と脛骨神経で、神経が再生していることが観察できた。これまでに脊髄損傷の治療方法として、空洞化した脊髄組織に私達の考案した人工材料と共に成長因子を移植することで神経軸索の伸長を促すことが可能であることを確認し報告してきた(2015年、24回日本形成外科学会基礎学術集会)。しかしながらも、臨床応用を考慮すると中枢神経再生の為の移植術は大きなリスクを伴うものと考えられる。このことから末梢神経での神経軸索伸長と生体への安全性を確かめることが重要であると考えた。その方法として、生後4週のラットを用いて、坐骨神経及び腓骨神経と脛骨神経を切断し、人工材料と共に塩基性繊維芽細胞成長因子を加えて切断部位に移植し、術後から継時的に行動学的観察と組織学的観察を行うこととした。術後8週では、肉眼的には離断した坐骨神経と腓骨神経、脛骨神経は結合しており、顕微鏡観察から髄鞘を伴って軸索が伸長していることを確認できた。また、肉眼での観察では移植した人工材料は残存していないかのように見えたが、顕微鏡観察では微量ながらも残存している人工材料を認めた。神経軸索は、この残存している人工材料の隙間を通って伸長していた。以上のことから私達の利用している人工材料は細胞再生の環境を整えているものと考える。また、塩基性繊維芽細胞成長因子は生体の様々な組織の再生に利用されているが、中枢神経や末梢神経の再生にも有用であると考える。神経軸索伸長において、人工材料の改良を検討中である。また、神経軸索伸長の為の成長因子として塩基性繊維芽細胞成長因子を利用しているが、それ以外にも神経軸索伸長の為に有用であると考えられる様々な成長因子や刺激因子が無数に存在しており、それらの中から最も有効であると考えられる因子を同定し検討するべきである。また、逆に神経軸索伸長に対して抑制的に働く因子も報告されており、これら抑制因子の検討も行うべきであると考える。これまでに脊髄損傷の治療方法として、脊髄損傷部位での空洞化を補うために私達の考案した人工材料を用いてきた。また人工材料にヘパリンを共有結合させることで、塩基性繊維芽細胞成長因子を人工材料から徐放させることを可能とすることにより、更に神経軸索の伸長を確認することができた。以上のことから私達は、更なる神経軸索伸長の早期再生と、伸長距離を少しでも伸ばすことを可能にするための実験に取り組んできた。人工材料に塩基性繊維芽細胞成長因子を結合させるためにヘパリンを使用してきた。人工材料にヘパリンを共有結合させることで、ヘパリン結合性蛋白である塩基性繊維芽細胞成長因子は人工材料と結合し、人工材料が生体内で分解吸収される期間内で塩基性繊維芽細胞成長因子が徐放されるものと考えてきた。更に、これまでの実験結果から、対象として人工材料のみを移植した群に比べて、ヘパリンを用いた人工材料では出血が多く、新生したと思われる毛細血管が無数に見られた。以上のことから、人工材料にヘパリンを加えるということは、ヘパリン結合性蛋白である様々な成長因子を結合させるだけでなく、新生毛細血管から供給される種々の栄養因子等により細胞再生の環境を整えていたと考えた。今後のことを含めて、現在この人工材料の改良を進めているが、ヘパリン結合性蛋白である種々の成長因子を利用するかどうかに関わらず、ヘパリンを共有結合させた材料の工夫が必要と考える。また、このことから、ヘパリン結合性蛋白である成長因子以外の有効な因子の同定と神経軸索伸長抑制因子の関わりを検討中である。脊髄損傷部位での神経軸索伸長において。現在までの実験結果から導かれることとして、人工材料の残存期間は生体に与える影響を考慮し、短期間が好ましいと考えてきた。然し、充分な神経軸索の伸長を誘導するためには、ある程度の人工材料の残存期間が必要と思われる結果を得られた。また、この人工材料の残存期間を延ばすことにより、塩基性繊維芽細胞成長因子の徐放効果の延長も期待できるものと考え、ヘパリンを共有結合させた人工材料の改良を行っている。この改良が終われば、種々のヘパリン結合性蛋白である成長因子を用いた神経軸索の伸長を可能にできるものと考える。私達は、脊髄損傷治療の方法として、脊髄損傷後に起こる空洞化を補うための人工材料を用いて神経軸索の伸長を試みてきた。更には、この人工材料にヘパリンを共有結合させることで神経軸索伸長の為の環境を整えることができると考えた。顕微鏡観察の結果、局所の出血を確認したが、それと同時に出血部位には新生毛細血管を数多く観察できた。これは神経軸索伸長の為に必要な様々な栄養因子や成長因子を導く栄養血管としての重要な現象であると考えた。又、ヘパリン結合性蛋白である塩基性線維芽細胞成長因子を結合させることで、更なる神経軸索伸長を試みた。

人工材料である私達の開発したアルギン酸にヘパリンを共有結合させ、ヘパリン結合性蛋白である塩基性線維芽細胞成長因子を加えることで、神経軸索はアストロサイトのプロセスで形成された障壁を越えて伸長していることが蛍光顕微鏡より観察された。私達は、この結果を考慮したうえで末梢神経の離断による障害についても検討を行った。末梢神経障害では、その離断距離によって神経の自家移植を行わなければならないこともある。又、この移植術は実態顕微鏡を用いたに微小手術で行わなければならない為、術者の手技の熟練も必要である。このことからヘパリン結合性アルギン酸に塩基性線維芽細胞成長因子を加えた人工材料を用いて、離断した末梢神経の両端を覆うだけで、離断した両端の神経がつながるかどうかを検討した。坐骨神経から腓骨神経と脛骨神経の分岐部を離断したラットの末梢神経を人工材料で覆い継時的に観察を行った。肉眼的観察からは坐骨神経から腓骨神経と脛骨神経は繋がっているように見えた。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いた観察からも髄鞘と神経軸索が確認されたことからこの人工材料は末梢神経でも有用であると考えた。これまでに私達は、脊髄損傷と末梢神経障害の治療として、人工材料を用いて神経軸索の伸長を試みてきた。この人工材料にヘパリンを共有結合させることで、ヘパリン結合性蛋白である塩基性線維芽細胞成長因子を結合させることを可能にした。これにより塩基性線維芽細胞成長因子を徐々に放出することが可能となり、塩基性繊維芽細胞増殖因子の効果を持続させることに成功した。その結果、脊髄損傷後の空洞化の周りを囲んでいるアストロサイトのプロセスを越えて神経軸索が伸長していることを観察できた。また末梢神経でも離断した坐骨神経から腓骨神経と脛骨神経で、神経が再生していることが観察できた。移植用人工材料の改良点として、私達の利用している人工材料は生体内吸収材料であるがより早く吸収されるのか、若しくはより長く存在し続けるのか、そのどちらが細胞再生に有効であるのか検討する。この人工材料を構成する分子を変えることで生体内での残存期間を調整することができる。また有効な成長因子としてHIF-1が知られているが、このHIF-1を有効に発現させることを検討する。発生学的には接着因子としてN-カドヘリンやT-カドヘリン等が神経細胞の成長に欠かせない因子であることが報告されており、これらの因子と神経細胞再生の関わりを精査することで更なる神経軸索伸長を検討する。神経軸索伸長に最も効果のある因子を検討する。これまでに塩基性繊維芽細胞成長因子が神経軸索伸長に有効であることを報告してきたが、詳細な顕微鏡観察を重ねた結果、人工材料に塩基性繊維芽細胞成長因子を結合させるためのヘパリンの存在も有効な因子であることが解った。このことからヘパリン結合性蛋白である種々の成長因子だけに着目せず、様々な成長因子を利用して神経軸索伸長を試みる。今後HIF-1を用いた実験系を計画しているが、それ以外の因子の検討も考えている。特にN-カドヘリンについては、既に神経再生において重要な因子であることが報告されており、これらの報告からN-カドヘリンによる神経再生はN-カドヘリンの濃度勾配により、神経軸索を一定方向へ伸長させることができると考え、今後の検討課題とする。再生医療本研究は中枢神経、及び末梢神経の再生を目的としており、神経障害モデルラット樹立と神経再生の為の手術は全て微小手術となる。
インスリン受容体基質とRNAの相互作用を介した新規タンパク質合成誘導機構の解明

本研究は、IGF/インスリンに応答したrRNAの転写後分子修飾制御によりリボソーム成熟・タンパク質合成の活性化がおこるという新規タンパク質合成誘導機構を提案するものである。この機構の証明のために、IGF/インスリンの細胞内シグナル伝達に重要な分子であるIRSが意外なことにU96AsnoRNAと呼ばれるRNAと相互作用するという最近の申請者の発見に着目し研究を遂行する。具体的には、IGF/インスリン刺激に応答したIRSによるU96AsnoRNAの産生の制御機構、IRSと相互作用した。野生型マウス胎仔由来繊維芽細胞(MEF)とIRS-1ノックアウトマウス由来MEFにおけるU96Aの存在量をノザンブロッティングにより解析・比較した結果、IRS-1ノックアウトマウス由来のMEFではU96A量が野生型と比べて3割減少していることを見出した。このことはIRS-1がU96Aの量を正に制御していることを示唆している。IRSとmRNAスプライシング関連因子が相互作用しているという我々の最近の知見を併せ、IRS-1がU96Aのホスト遺伝子であるRACK1 pre-mRNAのスプライシングを促進することでU96Aの量制御に関わっている可能性が考えられた。また、本年度はIRS-1とU96Aの結合を抑制する手法を開発するために、RNA pull down assayでIRS-1とU96Aの結合部位の同定を試みた。種々の領域を欠いたIRS変異体をin vitro転写により放射性標識したU96Aと混合した後、種々のIRS-1変異体と共免疫沈降されるRNAを抽出し、Urea-PAGEにより分離後オートラジオグラムによりU96Aを検出した。その結果、U96AはIRS-1のN末端側に存在するPH・PTBドメインと結合することが明らかにした。現在、この領域を細胞に過剰発現して、内在性のIRS-1とU96Aの相互作用を阻害する手法を構築中である。IRS-1は、受容体との結合に必要であることがわかっているPH・PTBドメインを介してU96Aと複合体を形成し、何らかの機構でU96Aの量を制御していることが示唆された。IRS-1は、PH・PTBドメインを介したRNAとの相互作用により新規の機能を有することが考えられ、インスリンやインスリン様成長因子の生理活性発現調節機構を解明する上で意義深い。U96Aを含むsnoRNAはリボソームの成熟・活性化に関与することが明らかになっていることから、今後IRS-1とsnoRNAの相互作用の意義を解明することでIGFに応答したタンパク質合成制御の全く新しい機構を解明できると期待している。申請者らは、IGF/インスリンの細胞内シグナル伝達に重要な分子であるIRSがU96A snoRNA(U96A)と呼ばれるRNAと相互作用することを見出した。この発見に着目し、IGF/インスリンに応答したrRNAの転写後分子修飾制御によりリボソーム成熟・タンパク質合成の活性化がおこるという新規タンパク質合成誘導機構を解明を目的とし、研究に着手した。本年度は、IRS-1によるU96Aの産生制御機構の解明を目的とした。まず、(1)野生型マウス胎仔由来繊維芽細胞(MEF)とIRS-1ノックアウトマウス由来MEFにおけるU96Aの存在量をノザンプロッティングにより解析・比較し、snoRNA産生におけるIRS-1の必要性を検討した。その結果、IRS-1ノックアウトマウス由来のMEFではU96A量が野生型と比べて3割減少していることを見出した。このことからIRS-1がU96Aの量を正に制御していることが考えられた。in vitroスプライシングによりこの可能性を検討するため、IUCK1 pre-mRNAをin vitro転写により合成し、HeLa細胞核抽出液を用いたin vitroスプライシングの実験系の確立を試みた。その結果、IUCK1 pre-mRNAのin vitroにおけるスプライシング活性が配列の特性により弱いことがわかったため、別手法による解析が必要となった。現在その手法を検討中である。続いて、(2)IRS-1とU96Aの結合部位を決定し、その結合を抑制する手法を開発するために、RNA pull down assayを行った。その結果、U96AはIRS-1のN末端側に存在するPH・PTBドメインと結合することが明らかになった。今後、この領域を細胞に過剰発現するなどして、内在性のIRS-1とU96Aの相互作用を阻害する手法を構築する。以上より、IRS-1は、受容体との結合に必要であることがわかっているPH・PTBドメインを介してU96Aと複合体を形成し、何らかの機構でU96Aの量を制御していることが示唆された。U96Aを含むsnoRNAはリボソームの成熟・活性化に関与することが明らかになっていることから、IRS-1とsnoRNAの相互作用の意義を解明することでIGFに応答したタンパク質合成制御の全く新しい機構を解明できると期待している。

本研究は、IGF/インスリンに応答したrRNAの転写後分子修飾制御によりリボソーム成熟・タンパク質合成の活性化がおこるという新規タンパク質合成誘導機構を提案するものである。この機構の証明のために、IGF/インスリンの細胞内シグナル伝達に重要な分子であるIRSが意外なことにU96AsnoRNAと呼ばれるRNAと相互作用するという最近の申請者の発見に着目し研究を遂行する。具体的には、IGF/インスリン刺激に応答したIRSによるU96AsnoRNAの産生の制御機構、IRSと相互作用した。野生型マウス胎仔由来繊維芽細胞(MEF)とIRS-1ノックアウトマウス由来MEFにおけるU96Aの存在量をノザンブロッティングにより解析・比較した結果、IRS-1ノックアウトマウス由来のMEFではU96A量が野生型と比べて3割減少していることを見出した。このことはIRS-1がU96Aの量を正に制御していることを示唆している。IRSとmRNAスプライシング関連因子が相互作用しているという我々の最近の知見を併せ、IRS-1がU96Aのホスト遺伝子であるRACK1 pre-mRNAのスプライシングを促進することでU96Aの量制御に関わっている可能性が考えられた。また、本年度はIRS-1とU96Aの結合を抑制する手法を開発するために、RNA pull down assayでIRS-1とU96Aの結合部位の同定を試みた。種々の領域を欠いたIRS変異体をin vitro転写により放射性標識したU96Aと混合した後、種々のIRS-1変異体と共免疫沈降されるRNAを抽出し、Urea-PAGEにより分離後オートラジオグラムによりU96Aを検出した。その結果、U96AはIRS-1のN末端側に存在するPH・PTBドメインと結合することが明らかにした。現在、この領域を細胞に過剰発現して、内在性のIRS-1とU96Aの相互作用を阻害する手法を構築中である。IRS-1は、受容体との結合に必要であることがわかっているPH・PTBドメインを介してU96Aと複合体を形成し、何らかの機構でU96Aの量を制御していることが示唆された。IRS-1は、PH・PTBドメインを介したRNAとの相互作用により新規の機能を有することが考えられ、インスリンやインスリン様成長因子の生理活性発現調節機構を解明する上で意義深い。U96Aを含むsnoRNAはリボソームの成熟・活性化に関与することが明らかになっていることから、今後IRS-1とsnoRNAの相互作用の意義を解明することでIGFに応答したタンパク質合成制御の全く新しい機構を解明できると期待している。IRS-1のU96A産生における新規の役割を明らかにし、またU96AとIRS-1が相互作用することを明らかにすることができたものの、当初予定していたRACK-1 pre-mRNAのin vitroスプライシングアッセイが困難であることがわかったため、IRS-1のU96A産生制御の作用点がスプライシング制御によるものかどうかを示すには至っていないため。
聴覚および言語に障害を持つ子供の早期発見・指導の体系化に関する研究

本研究は,聴覚機能,知的機能,運動機能など様々な発達の側面に重複する障害を持つ子どものことばやコミュニケーションの発達を支援するための方法と成果について実践的研究の成果をまとめた。まず,難聴を伴う重複障害児の原因疾患と聴覚障害の様相ならびに補聴器装用指導の成果,言語・コミュニケーション指導の方法について検討した。補聴器を装用して聴覚的な情報の受容を補償した上で,音声言語に限らず,身振りサイン,シンボルなど様々な手段を用いたコミュニケーションの発達を促すことが重要であることが明らかになった。次に,補聴器装用指導を試みた症例のうち,補聴器装用が困難であった症例の問題点とその対応について検討した。また,装用指導開始当初,補聴器の装用が困難であったが,症例に合わせた補聴器の選択などにより,常用が可能になった1症例に対する補聴器装用指導の過程について論じた。第3に,就学年齢になってから,補聴器装用指導がなされた1症例の言語訓練の方法とその成果について検討した。医療機関における言語指導と学校における教育の連携が症例のコミュニケーションの発達を促進させる上で効果をあげた点についても論じた。重複障害児においては,補聴効果に関連する複数の要因が複雑に関連しあうため,個々の症例の基礎疾患や合併症の種類と程度(難聴,知的障害,運動機能障害,行動特性など)を考慮して対応の遅れを防ぐこと,発達段階や難聴の程度など個々の症例の特徴に応じたコミュニケーション・モードを使用し,言語指導の方法を工夫することが重要と考えられた。1.はじめに:難聴児では早期から聴覚を活用することが重要であるが,重複障害児においては補聴器の装用に困難を伴う場合が少なくない。装用困難な理由は症例によって様々であり,個々のケースごとに検討を加える必要がある。今回,補聴器の常用までに時間を要した1症例について補聴器装用経過と聴性行動,言語およびコミュニケーションの発達との関連について検討したので報告する。2.症例:3歳の女児。初診時年齢1歳7カ月。診断は多発奇形,低身長,難聴,精神運動発達遅滞,視力障害;先天性心疾患。検査所見:聴力検査;CORによる閾値は7585dB。ABR閾値は右耳は65dB nHL,左耳は100dBnHLの刺激に対して無反応であった。新版K式発達検査による発達指数(DQ)は35であった。3.指導経過:(1)補聴器装用:1歳9カ月時に右耳に箱形補聴器を装用開始した。本症例がコードをひっぱって耳型を外すため,連続的な装用が困難であった。補聴器の調整や,ベビー形補聴器の試用を行ったが,改善しなかった。2歳2カ月時,耳掛形デジタルプログラマブル補聴器を装用し,2歳4カ月時にはほぼ1日装用が可能となったが,家族が本症例の相手をしていない時に補聴器を外す傾向がみられた。耳介が小さいため耳掛形は装用しにくいが,3歳頃より常用が可能になった。(2)聴性行動:TVや音楽に関心を示す,戸外の物音に気付く,発声の種類の増加や抑揚がつくなどの発達がみられた。(3)言語発達;場面の文脈的てがかりを必要とするが、簡単な言語指示,身体部位名,身近な人や事物の名称など30単語程度の理解,5車語程度の発語や音声模倣がみられるようになった。(4)コミュニケーション:発声を伴う指さしなど意図的な伝達行動,相互交渉の継続などが可能になった。4.まとめ二重複障害児においては個々の症例の補聴器装用に関する問題点や発達段階に対応した補聴器選択や指導が重要と考えられる。1.目的:聴性脳幹反応(ABR)の普及など診断学上の進歩により,重複障害児においても難聴の早期診断が可能になった。しかし,正確な聴力検査が難しく,補聴器適合に必要な情報が得られにくいなど補聴器装用指導に困難を伴うことが多く,補聴器の適用方法が確立しているとはいえない。

また,言語・コミュニケーションの発達など補聴器装用効果についても明らかになっていない。本研究では,過去15年間に補聴器装用指導を行った重複障害児の聴覚閾値,聴性行動,言語発達を評価し,補聴器装用効果について検討する。2.対象および方法:ABRで両側45dB以上の閾値上昇を認めた発達障害児89例のうち,補聴器装用指導を行い,6ヵ月以上経過観察を行った54例における補聴効果を聴性行動発達チェックリストにより評価した。3.結果:(1)89例の難聴の程度は,正常範囲6例(6.7%),軽度8例(9.0%),中等度18例(20.2%),高度25例(28.1%),重度32例(36.0%)であった。(2)6ヵ月以上経過観察を行った54例のうち,補聴器装用後,聴性行動に変化の認められた症例は35例(64.8%,うち4例はその後非装用),効果が認められなかったものが9例(16.7%),補聴器の装用が困難であったものが10例(18.5%)であった。(3)補聴効果の認められた35例が日常生活で主に用いたコミュニケーション・モードは,音声言語の表出;21例(60.0%),音声言語の理解;2例(5.7%),身振りサイン;8例(22.9%),発声・表情;4例(11.4%)であった。4.考察:重複障害児においては,補聴効果に関連する複数の要因が複雑に影響しあうため,個々の症例の基礎疾患や合併症の種類と程度(難聴,知的障害,運動機能障害,行動特性など)を考慮して対応の遅れを防ぐこと,発達段階や難聴の程度など個々の症例の特徴に応じたコミュニケーション・モードを使用し,言語指導の方法を工夫することが重要と考えられた。1.目的:難聴を伴う重複障害児の言語指導は,補聴器を装用して聴覚的な情報の受容を補償した上で,音声言語に限らず,身振りサイン,シンボルなど様々な手段を用いたコミュニケーションの発達を促すことが重要である。しかし,個々の症例に適切なコミュニケーション・モードの選択や,指導方法が確立しているとはいえない。本研究では,補聴器装用が遅れ,高度難聴および知的障害を合併する重複障害児1例を対象として,語彙の獲得過程と相互的コミュニケーションの発達におよぼす身振りサインの効果について検討する。2.症例:8歳の女児。初診時年齢は6歳8カ月,診断は難聴,精神遅滞,喉頭軟化症であった。聴力検査および補聴器装用:CORによる聴覚閾値は7080dB,ABR閾値は左右耳とも80dBであった。6歳5カ月時より補聴器両耳装用を開始した。3.指導経過:指導開始時(6歳8カ月)のS-S法言語発達遅滞検査により,言語記号の受信(理解)・発信(表出)とも単語レベルで可能であり,1歳7カ月レベルであった。基礎的プロセス(動作性課題)は2歳11カ月レベルであった。言語指導の方法は身振りを媒介として音声言語の受信・発信可能な語彙の拡大,実際のコミュニケーション場面における習得語彙の使用とやりとりの促進,学校との連携による日常生活における般化とした。現在(8歳)の言語およびコミュニケーションの発達は,言語記号の受信は音声言語のみで理解できる語が増加し,2歳10カ月レベルになった。身振りを伴えば23語連鎖の理解が可能になった。発信は事物名称,動作語,大小,色名など語彙が拡大した結果,3歳2カ月レベルとなり,習得語彙を学校でも用いることがみられた。
粘液細菌の真核生物様プロテインキナーゼ/ホスファターゼを介した情報伝達機構の解明

粘液細菌を用いて、2種の細菌型チロシンキナーゼの機能解析を行った結果、グラム陰性型チロシンキナーゼBtkBは増殖期に発現し、高温ストレス適応に関与しており、グラム陽性型チロシンキナーゼBtkAは飢餓誘導における成熟胞子形成期に発現し、成熟胞子形成に必須な酵素であった。両者とも菌体外多糖の生産に関与していた。一方、Ser/Thr/TyrホスファターゼPph3は飢餓誘導による胞子形成に関与し、PHPファミリーに属するホスファターゼPhpAは、細菌型チロシンキナーゼの自己リン酸化チロシン残基の脱リン酸化反応を行い、菌体外多糖の生産の調節に関与していると推察された。粘液細菌は、飢餓になると胞子からなる子実体を形成するという集団行動をとる細菌で、複雑な情報伝達機構を有することが推定される。一方、細菌のタンパク質のリン酸化を介した情報伝達系、特に真核生物様キナーゼ/ホスファターゼに関しては不明な点が多く残されている。そこで、今年度はSer/Thr/Tyrホスファターゼの機能解析とcAMPを介した情報伝達を明らかにするため、cNMP分解酵素の機能解析を行った。Ser/Thr/Tyrホスファターゼの機能解析:真核生物のSer/Thr/Tyrホスファターゼと相同性の高いホスファターゼ(Pph3)を選択し、酵素学的諸性質を検討したところ、本酵素はMn依存性でオカダ酸に阻害を受けないこと、リン酸化スレオニンペプチドを最も良い基質にすること、そのKm値はほ乳動物のPP2Cとよく似ていることなど、真核生物のPPMファミリーのそれらとよく似た性質を有していた。また、pph3遺伝子破壊株は、飢餓条件下で未成熟な子実体を形成し、最終的な胞子数は野生株の45%程度であったことから、本酵素は飢餓時の胞子及び子実体形成に関与していると推定された。cNMP分解酵素の機能解析:我々はcNMP分解酵素のclass 3に属する同酵素2種の酵素学的諸性質と機能を既に報告している。今回は真核微生物及び一部の細菌で報告されているclass 2のcNMPホスホジエステラーゼ(PdeE)の酵素学的諸性質を明らかにしたところ、本酵素はcAMP及びcGMPを基質としたほか、NTP,NDP,NMPなどに対し脱リン酸化活性がみられ、飢餓24-48時間後に最も発現が多かった。また、pdeE遺伝子破壊株は、飢餓条件下で子実体及び胞子形成が1日程遅れたが、最終的な胞子数は野生株と同程度であった。本酵素は本菌における最初のcGMP分解酵素の報告例となった。1.細菌型チロシンキナーゼの機能解析研究対象としているM.xanthusはグラム陰性型とグラム陽性型のチロシンキナーゼをそれぞれ1つずつ有しており、最初にグラム陽性型チロシンキナーゼBtkA(MXAN_3228)の機能解析を行った。グラム陽性型チロシンキナーゼは、レセプター型タンパク質と細胞質キナーゼがそれぞれ別のタンパク質で構成されているが、他の菌で報告されているようにBtkAはレセプタータンパク質(MXAN_3227)がないと自己リン酸化が起こらなかった。この酵素は生育期には見られず、飢餓誘導後、72時間程度で発現した。また、btkA遺伝子破壊株を作製し、その表現型を明らかにしたところ、本変異株は集合体を形成するものの熱処理及び超音波処理に対して耐性な成熟胞子を形成しなかった。成熟胞子を被うコートは数種のタンパク質と多糖から構成されており、タンパク質の組成及び量においては野生株と変異株の間では差は見られなかったが、変異株の多糖合成量において野生株のそれより、30%程度少なかった。このことから、BtkAは胞子のコートを形成する多糖の合成に関与している可能性が示唆された。2.Ser/ThrホスファターゼPph3の機能解析:粘液細菌において真核生物のSer/Thrホスファターゼと相同性の高いホスファターゼ(Pph3)を用いて金属塩、基質結合などに関与していると推定されるアミノ酸を別のアミノ酸に置換をした変異酵素を作製し、基質及び金属塩に対するアフィニティー、反応速度などを測定し、酵素学的諸性質を検討した。その結果、金属塩の結合に重要と考えられるアミノ酸を変異させた酵素において活性が全く消失し、また、基質結合に関与しているアミノ酸を置換したところ、基質結合能の減少がみられ、これらのアミノ酸は重要な働きを有していることを確認した。また、この酵素のC末端領域を欠損した変異酵素は、比活性の増加が見られたことから、C末端領域はこの酵素の活性を阻害していることが推定され、この領域にcAMP結合領域が存在することから、cAMPが活性に何らかの影響を与えていると考えられた。

1.細菌型チロシンキナーゼの機能解析研究対象としているMyxococcus xanthusはグラム陰性型とグラム陽性型のチロシンキナーゼをそれぞれ1つずつ有しており、昨年度、グラム陽性型チロシンキナーゼBtkA(MXAN_3228)の機能解析を終えているので今年度はグラム陰性型チロシンキナーゼ(BtkB)の機能解析を行った。グラム陰性型チロシンキナーゼは、レセプター型タンパク質と細胞質キナーゼが1つのタンパク質で構成されており、レセプターのN末端に存在する活性化領域とキナーゼ領域を大腸菌で発現させると、自己リン酸化活性が見られた。本酵素は対数増殖期、定常期、子実体形成期初期に発現が見られた。btkB遺伝子破壊株を作製し、その表現型を野生株と比較したところ、高温での生育不良や分化の遅延が見られた。また、変異株の多糖合成量において野生株のそれより、低下がみられたことから、BtkBも菌体外多糖の合成に関与している可能性が示唆された。2. PHPファミリーに属するチロシンホスファターゼの機能解析最近、枯草菌で報告された細菌特有のチロシンホスファターゼであるPHPファミリーに属するPhpAの酵素学的諸性質を明らかにしたところ、本酵素は活性にMn2+やCo2+を必要とし、リン酸化ペプチド基質の酵素活性より、リン酸化チロシンを特異的に脱リン酸化する酵素であることが明らかになった。この酵素はまた、上記の細菌型チロシンキナーゼの自己リン酸化されたチロシンの脱リン酸化を触媒した。また、本遺伝子破壊株は、飢餓誘導による分化が野生株より少し早く進むこと、菌体外多糖を多く合成することなどから、BtkA及びBtkBの脱リン酸化などに作用し、本菌の菌体外多糖合成の調節に関与していると推定された。目的としている酵素の諸性質の検討及び遺伝子確壊株を用いた細胞での機能解析などが順調になされており、下記の論文以外に現在、論文を3報投稿中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、目的とする酵素の諸性質を検討するとともに遺伝子破壊株を作製して機能解析を行っていく。また、目的のキナーゼが細胞内でどのようなタンパク質を基質としているのかを明らかにすることでさらに詳細な機能解析を行っていきたい。
作物の3次元的な形態変化が侵食量に及ぼす影響について

従来より農地からの土壌侵食量の予測に使用されてきたUSLE式は多雨,集中豪雨型地域の農業環境において適用するには多くの問題点がある.例えば季節的に消長を繰り返す植生被覆の効果について考察されていない.このために作物の季節的消長,特に根茎部も含めた3次元的形態変化や栽培体系,土中水分の変化と侵食量変化との関係についてのデータを揃える必要がある.本研究は,植物の成長による形態変化に伴う土壌侵食量変化を自然降雨および人工降雨による観測を通して調べ,更にこの結果に基づいてシミュレーションを進め,作物の種類と形態の相違が土壌侵食量に及ぼす影響についての解析と実験,土壌損失を許容量内に収めるためのシミュレーション手法および土壌保全法を開発することを目的とした.研究は次のステップを踏んで行った.(1)栽培作物の異なるプロットで作物の生長と土壌侵食量との関係を観測した.(2)降雨パターンを分類し,エネルギーや降雨量と侵食量の関係を調べた.(3)裸地に発生するリルと侵食量との関係を実験で調べた.(4)根茎部も含めた3次元的形態や栽培体系を考慮した簡単なシミュレーション手法を確立する.(5)将来,異なる植生下の一流域で侵食量を予測することの必要が生じることも考えて,裸地や植生からの反射エネルギーで土壌の水分状態や植生を特定できる手法も試みる(1),(2),(3)に関しての成果は報告書にまとめ.(4)に関しては,侵食量観測データから,侵食量の大小は地上部の植生の形態のみならず,根茎部の形態が影響を及ぼしていることが予想できた.今後は根の形態と侵食土量との関係に着目して実験を行う.また根の形態は複雑であるので,写真解析,画像処理を中心に数量化を行う.(5)は本研究の最終目的の一つである.将来,土壌の流出を含めた一流域の流出問題を扱うには裸地や植生からの反射エネルギーで土壌の水分状態や植生を特定する必要がある.今回分光反射計のみで三次元形態の解析が行えるかどうかを検討するのに十分なデータ収集ができなかった.しかし今後はリモートセンシングの技術と分光反射計の測定技術が必要不可欠と考えられ今後の課題としたい.今年度までに,幅5m×長さ10m,勾配10度の斜面で自然降雨による侵食実験を行い,形態の異なる5種類の作物(牧草,枝豆,とうもろこし,人参,裸地(対象区))を栽培し,被覆率,空間率と侵食量の関係について解析を行ってきた.土壌流亡量は裸地区が最も多く,次いで枝豆区,牧草,とうもろこし,にんじんの順序になったが,それぞれの成長段階において流出水量と土壌流亡量との間に明確な相関関係が見いだせなかった.この原因として,植生の生長に伴う形態変化による水分保持の影響や降雨パターンの変化が影響していると考えられた.そこで,今年度はさらに人工降雨装置を備えた斜面長5.0m,幅0.7m,勾配10°の斜面で自然降雨に近い2mm/h(0.33mm/10min)180mm/h(30mm/10min)の範囲の12の降雨パターンのもとで侵食実験を行った.各形態の降雨強度を変えて,(1)平面裸地(不耕地),(2)平面裸地(耕地),(3)裸地(畝有),(4)パセリ区(畝有)の作物生長段階別に様々な強度や持続期間の雨を降らして土壌流亡量および流出水量の観測を行い特に土壌流亡量の経時変化を細かく測定した.パセリの地上部は柔らかく高強度の降雨に対する抵抗力が低いため,この区でのデータ収集は十分ではないが,他区のデータは現在解析中である.土壌表面,植生の水分保持状態,植生形態解析の観測のために新規に購入したスペクトロメータは検定が必要のため,現在室内ボッスクモデル土層を用い,砂,マサ土,粘質土の3種類の土層において表面水分量を変化させて反射波スペクトル強度を測定することにより機械の試用および検定を行っている段階である.従来より農地からの土壌侵食量の予測に使用されてきたUSLE式は多雨,集中豪雨型地域の農業環境において適用するには多くの問題点がある.例えば季節的に消長を繰り返す植生被覆の効果について考察されていない.このために作物の季節的消長,特に根茎部も含めた3次元的形態変化や栽培体系,土中水分の変化と侵食量変化との関係についてのデータを揃える必要がある.本研究は,植物の成長による形態変化に伴う土壌侵食量変化を自然降雨および人工降雨による観測を通して調べ,更にこの結果に基づいてシミュレーションを進め,作物の種類と形態の相違が土壌侵食量に及ぼす影響についての解析と実験,土壌損失を許容量内に収めるためのシミュレーション手法および土壌保全法を開発することを目的とした.研究は次のステップを踏んで行った.(1)栽培作物の異なるプロットで作物の生長と土壌侵食量との関係を観測した.(2)降雨パターンを分類し,エネルギーや降雨量と侵食量の関係を調べた.(3)裸地に発生するリルと侵食量との関係を実験で調べた.(4)根茎部も含めた3次元的形態や栽培体系を考慮した簡単なシミュレーション手法を確立する.(5)将来,異なる植生下の一流域で侵食量を予測することの必要が生じることも考えて,裸地や植生からの反射エネルギーで土壌の水分状態や植生を特定できる手法も試みる(1),

(2),(3)に関しての成果は報告書にまとめ.(4)に関しては,侵食量観測データから,侵食量の大小は地上部の植生の形態のみならず,根茎部の形態が影響を及ぼしていることが予想できた.今後は根の形態と侵食土量との関係に着目して実験を行う.また根の形態は複雑であるので,写真解析,画像処理を中心に数量化を行う.(5)は本研究の最終目的の一つである.将来,土壌の流出を含めた一流域の流出問題を扱うには裸地や植生からの反射エネルギーで土壌の水分状態や植生を特定する必要がある.今回分光反射計のみで三次元形態の解析が行えるかどうかを検討するのに十分なデータ収集ができなかった.しかし今後はリモートセンシングの技術と分光反射計の測定技術が必要不可欠と考えられ今後の課題としたい.自然植生や畑地斜面からの土壌流亡量の予測を目的とした基礎研究である.特に植生の根を含む形態要素の数量化と侵食量に及ぼす影響を調べることを目的としている.前年度の植生斜面の侵食量観測データから,侵食量の大小は地上部の植生の形態のみならず,根茎部の形態が影響を及ぼしていることが予想された.今年度は根の形態と侵食土量との関係に着目して実験を行った.供試作物は牧草,とうもろこしである.根の形態は複雑であるので数量化する必要がある.写真解析,画像処理を中心に数量化を行った.この結果,根の形態解析では地表部の被覆率の大小よりも地表面近傍の根茎の形態が大きく影響を与える結果がでている.例えば,とうもろこしでは根系面積が地表部の被覆率に対して少ない.一方,前年度に引き続き,自然降雨による野外の枠試験区において降雨量と侵食量データを記録した.さらに人工降雨装置を用いた模擬裸地斜面での降雨侵食実験のデータの解析も継続中である.10分間降雨量記録より,降雨パターンの統計的特性について解析を行った.これは,高い精度で侵食量予測を目的とするならば,日本のような複雑な降雨形態についてその統計的特性を把握しておく必要があるからである.この結果,土壌侵食を伴わない弱い降雨の10分間降雨強度の確率密度分布は指数分布に従うが,土壌侵食を伴う降雨の場合には指数分布に従わないことがわかった.このような降雨の年間発生率と降雨強度の確率密度分布を調べることが今後の課題である.また,降雨時系列から侵食量を求めるための簡易解析手法の開発を行った.これは,日常,誰しもがデータの整理や解析業務に用いる表計算ソフトで侵食のシミュレーションを容易に行うことを目的にしている.通常のプログラミング言語を用いるよりは簡単にシミュレーションできることがわかった.平成9年度に引き続いて,人口降雨装置を備えた模擬斜面で降雨侵食実験を継続して行った.および降雨特性の解析を中心に行った.(1)実験は勾配10度,幅20cm,長さ60cmの斜面で表面流量を5段階に変え,表面に発生する微小なリルの3次元的な形態を写真で追跡した.写真はスキャナーでコンピュータに入力してデジタル化した後,画像解析ソフトを用いて解析を行った.また同時に流出土砂量の経時変化および粒度分析を行い微細粘土分の解析をった.また表面水の濁度の経時変化が3次元的な形態変化とどのように関わっているのかを調べた.(2)年間の降雨量やパターンの異なる全国3ヵ所の地域を選び,その場所で得られた10分間降雨量のデータを用いて降雨因子(一降雨の総エネルギー,総降雨量,最大10分間降雨量)と侵食量との相関性を調べた.その結果,(1)表面流量が安定に推移するのに対し,表面,3次元形態,濁度の変化が激しく,特に濁度と流出度量とは高い相関があった.
高感度ラマン分光法による固体表面吸着種の研究

本研究の目的はその化学吸着力が他の吸着系に比べて極めて弱いため電子分光法による研究が困難であった銀表面へのCO分子の吸着状態を高分解能ラマン分光法により明らかにすことにある.本研究によって得られた成果は次のようなものである.(1)吸着CO分子についてはその分子内振動モードによる一本のラマン帯の他に低エネルギー領域(100200cm^<-1>)に二本のラマン帯が存在する.それらの振動数の表面被履率依存性の観測からこれらが各々CO分子と下地金属原子間のAg-C振動モード及びCO分子の束縛回転モードに対応することが明らかとされた.(2)微量に初期吸着させたCO分子の近傍に異種分子(原子)を共存吸着させつつCO分子のラマン信号変化を観測するいわゆる共存吸着実験を行うことにより,共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱に応じてCO分子の分子間力及び下地原子への結合力が増減することを初めて見い出した.これらの現象はCO分子と下地原子間に形成された化学結合状態が共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱の度合を反映した変化を受けるというモデルで理解できることを示した.(3)低速電子銃を用いた減速電位法によりラマン実験に使用された銀薄膜のCO分子の吸着によって誘発される仕事関数変化を測定し,共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱に応じて金属の仕事関数が増減することを明らかとした.つまり,吸着CO分子の振動数変化と吸着に伴う下地金属の仕事関数変化という二つの物理量が(2)で述べたCO/Ag系におけるCO分子の吸着状態に関するモデルで統一的に理解されることが示された.本研究の目的はその化学吸着力が他の吸着系に比べて極めて弱いため電子分光法による研究が困難であった銀表面へのCO分子の吸着状態を高分解能ラマン分光法により明らかにすことにある.本研究によって得られた成果は次のようなものである.(1)吸着CO分子についてはその分子内振動モードによる一本のラマン帯の他に低エネルギー領域(100200cm^<-1>)に二本のラマン帯が存在する.それらの振動数の表面被履率依存性の観測からこれらが各々CO分子と下地金属原子間のAg-C振動モード及びCO分子の束縛回転モードに対応することが明らかとされた.(2)微量に初期吸着させたCO分子の近傍に異種分子(原子)を共存吸着させつつCO分子のラマン信号変化を観測するいわゆる共存吸着実験を行うことにより,共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱に応じてCO分子の分子間力及び下地原子への結合力が増減することを初めて見い出した.これらの現象はCO分子と下地原子間に形成された化学結合状態が共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱の度合を反映した変化を受けるというモデルで理解できることを示した.(3)低速電子銃を用いた減速電位法によりラマン実験に使用された銀薄膜のCO分子の吸着によって誘発される仕事関数変化を測定し,共存吸着分子(原子)の電気陰性度の強弱に応じて金属の仕事関数が増減することを明らかとした.つまり,吸着CO分子の振動数変化と吸着に伴う下地金属の仕事関数変化という二つの物理量が(2)で述べたCO/Ag系におけるCO分子の吸着状態に関するモデルで統一的に理解されることが示された.
セレノカルボニル基に由来する感応性化学種・機能性物質群の創製

カルボニル基の酸素原子をセレン原子に置き換えたセレノカルボニル化合物は、セレン原子上にLUMOが広がっていることから求核剤がセレン上を攻撃するなど、通常のカルボニル化合物とは異なる特異な反応性を示すため、合成化学上有用な官能基の一つである。その構築法としてカルボニル化合物に対してアミン存在下、単体セレン、ヒドロクロロシランとを反応させる方法が開発されてきた。これまですでにこれを用いてクマリンや2-ピロンのC=O基をC=Se基に置換える反応が行われ、得られた生成物の構造も解明されてきた。それに対してここでは、一連の2-ピロンやクマリンを系統的に合成し、それらに対する求核剤、親電子剤の反応を行い、以下の成果を得た。まず、4-アリール-6-メチル-2H-ピロンのセレノ化反応を検討した。組込まれている置換基によって反応条件の最適化が必要であったが、いずれの基質でも対応するセレノピロンの合成に成功した。更に同様の反応をイソクマリン及びクマリン誘導体でも検討し、低収率ではあるもののセレノ化体を得た。なおこれらの空気中質尾での安定性は、主骨格に組込む置換基に依存するが、無置換2-セレノピロンは室温で容易に分解した。ついで得られたセレノピロンの77Se NMRおよび紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。77Se NMRにおける化学シフトが置換基によって大きくシフトすることとは対照的に、紫外可視吸収スペクトルでは、極大吸収波長の変化はほとんど見られないことを明らかにできた。最後に反応性の調査も行い、セレノピロンに対してメチルトリフラートを作用させると、セレン上にメチル基が付加する反応が定量的に進行し、前例のないピリリウム塩を単離することに成功した。この塩のX線構造解析ならびに1H, 13C, 77Se NMRスペクトルより、塩は芳香族性を持つことを類推している。28年度が最終年度であるため、記入しない。それに対して今回一連の2-ピロンやクマリンを系統的に合成し、それらに対する求核剤、親電子剤の反応を行い、以下の成果を得た。まず、4-アリール-6-メチル-2H-ピロンのセレノ化反応を検討している。組込まれている置換基によって反応条件の最適化が必要であったが、いずれの基質でも対応するセレノピロンの合成に成功している。更に同様の反応をイソクマリン及びクマリン誘導体でも検討し、低収率ではあるもののセレノ化体を得ている。今後その反応性を解明する計画である。感応性化学種を発現すべく、C=Seを有する前例のないα-セレノピロンの合成を行ってきた。その結果。α-ピロンに対してアミン存在下、単体セレン、ヒドロクロロシランを加える反応条件を最適化することで、期待の生成物を得ることに成功した。その分子の安定性が置換基に依存すること、また分子構造もX構造解析より明らかにできたことから、概ね順調に進展していると言うことができる。ついで、反応性を探索すべく様々な求核剤の付加を行った。α-セレノピロンにGrignard反応剤を加えると、出発化合物は瞬時に消失するものの、複雑な混合物を与えたことから、この生成物分布の解明、他の反応剤との反応を行いたい。

最後に反応性の調査も行い、セレノピロンに対してメチルトリフラートを作用させると、セレン上にメチル基が付加する反応が定量的に進行し、前例のないピリリウム塩を単離することに成功した。この塩のX線構造解析ならびに1H, 13C, 77Se NMRスペクトルより、塩は芳香族性を持つことを類推している。これまで合成できたα-セレノピロンならびにクマリンの、求電子剤、求核剤との反応性を系統的に解明し、準安定な感応性化学種の創製を目指す。1、求核剤として、これまでは反応性の高いGrignard反応剤を用いていたが、これに替えて亜鉛反応剤やアリルシランのようなマイルドな反応性を示す求核剤を用いた反応を行い、単一の生成物を得ることを目的とする。2、さらに求電子剤としてヨウ化メチルのようなアルキル化剤を用いて、セレン原子上での選択的アルキル化を経た、活性化学種の創製を目指す。これに加えて、今年度はP=Se結合を有する化合物から発生できる活性種についても、合成方法の開拓、反応性や構造を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
新たなヘルパーT細胞と自然免疫から口腔粘膜のびらん・潰瘍病変の発現機序を解明する

IL-17はIL-6とTGF-ssの誘導で分化したTh17からIL-23の作用で産生され、上皮細胞や線維芽細胞などからの炎症メディエーターの産生を誘導し炎症性疾患や自己免疫疾患に関与している可能性がある。IL-18は多様な生物活性をもつサイトカインであり、IL-12存在下でTh1への分化とIFN-γの産生を誘導し、非存在下でTh2への分化を誘導し上皮細胞からも産生され、炎症性疾患や自己免疫疾患に関与している可能性がある。SS唾液腺組織ではIL-18およびIL-17を著明に発現しており、SS唾液腺に浸潤するリンパ球は主にCD4^+T細胞で、その多くでIL-17を発現していた。SS患者の唾液腺組織に発現しているIL-18は、Th17が産生するIL-17と共同して炎症性サイトカインやケモカインの産生を誘導することにより、SSにおける唾液腺の病態発現機序に関与する。1)正常歯肉組織でもこれら分子は発現していたが、炎症歯肉組織ではその発現が亢進していた。2)扁平苔癬患者の口腔粘膜上皮でも同様に、発現の亢進が認められた。3)慢性GVHD患者(免疫抑制剤の服用中)の口腔粘膜上皮、唾液腺上皮では発現はほとんど認められなかった。以上より、口腔上皮ではさまざまなパターン認識分子を介して侵襲細菌を認識し、抗菌物質などを産生して自然免疫応答に積極的に関与しているものと考えられた。2.新たなヘルパーT細胞の口腔粘膜における検索。1) IL-18は抗原刺激がなくても種々の細胞に作用してTh1反応とTh2反応を促進する唯一のサイトカインである。シェーグレン症候群患者の唾液腺組織においてはIL-18の発現が認められた。口腔扁平苔癬患者の口腔粘膜上皮では、IL-18の発現は正常粘膜と同様に認められた。2) IL-17は炎症性サイトカインであり、多くの炎症性疾患や自己免疫疾患への関与が示唆されている。シェーグレン症候群患者の唾液腺組織においては導管上皮細胞および浸潤細胞にI1-17の発現が認められた。慢性GVHD患者(免疫抑制剤の服用中)の口腔粘膜上皮、唾液腺上皮では発現はほとんど認められなかった。1)IL-18は抗原剃激がなくても種々の細胞に作用してTh1反応とTh2反応を促進する唯一のサイトカインである。2)IL-17は炎症性サイトカインであり、多くの炎症性疾患や自己免疫疾患への関与が示唆されている。シェーグレン症候群患者の唾液腺組織においては導管上皮細胞および浸潤細胞にIl-17の発現が認められた。異所性のMHC class II分子の発現は、組織特異的な自己免疫疾患の発症に大きく関与している。唾液腺や涙腺の破壊を特徴とする自己免疫疾患であるシェーグレン症候群においても、唾液腺上皮細胞における異所性のMHC class IIの発現がみられる。一方、細胞膜の破壊により組織中に放出された細胞外ATPは、細胞間伝達物質として働き、その受容体の一つであるP2X7受容体は、炎症および免疫反応においての役割が注目されている。本研究では、細胞外ATPが唾液腺上皮細胞におけるMHC class II分子の発現に及ぼす影響について解析し、細胞外ATPと唾液腺上皮細胞の免疫応答との関わりについて検討を行った。ヒト唾液腺上皮細胞株をATPで刺激すると、細胞膜表面にMHC class IIの発現が認められた。

細胞質内の解析では、無刺激の状態でも細胞質内に恒常的にMHC class IIが発現していたが、ATP刺激による発現量に変化はなかった。また、MHC class II転写調節因子CIITAの発現量についても増加は認められなかった。ヒト唾液腺上皮細胞株ではP2X7受容体の存在が確認され、P2X7受容体アゴニストであるBzATP刺激により、細胞膜表面でのMHC class IIの発現が誘導され、アンタゴニストであるoATP刺激により、ATPによるMHC class IIの発現が抑制された。さらに、ATP刺激により、細胞内でのオートファゴソームの形成の促進がみられ、MHC class II分子を内包したexosomeの放出が認められた。このexosomeはLC3-IIを発現していた。以上の結果から、ヒト唾液腺上皮細胞株は細胞内にMHC class II分子を恒常的に発現しており、細胞外ATP刺激によりP2X7受容体を介して、MHC class II分子を細胞膜表面へ表出させると同時に、オートファゴソームに関連したexosomeに内包された形で細胞外に放出する可能性が示された。これより、細胞外ATPがシェーグレン症候群発症に関与するという新たな可能性が示唆された。
DNAマーカーを用いた野生ワオキツネザルの繁殖戦略の研究

本研究は、マダガスカルに生息する昼行性原猿であるワオキツネザルの繁殖戦略を明らかにすることを目的とする。調査対象は、マダガスカル共和国ベレンティ保護区内に設定さ14.22haの主調査地域に生息するワオキツネザルで、現在は7つの群れが生息している。これうの個体は1989年以降、識別が継続されており、血縁関係、年齢、優劣関係、出自群、群れにおける滞在年数などの詳細な個体情報が利用可能である。本年度はこれまでにおこなってきたマイクロサテライトマーカーを用いた父子判定の結果をまとめた。父子判定には、マーカーとして有効であることが明らかになった10座位のマイクロサテライトを用いた。父子判定の結果、優位なオスが2年間にわたって子供を残していないことが明らかになった。この結果は、ワオキツネザルのオスの繁殖成功は偏りが小さいことを示唆する。それから、本年度もワオキツネザルの授乳期(10月から11月)に野外調査をおこなった。その結果、調査個体群は過去2年間で個体数が大幅に減少したことが明らかになった。2008年の平均群れサイズは9.9頭で、1989年以降の20年間で最も小さなサイズだった。また、2007年生まれの個体の死亡率が非常に高く、約1年間で死亡率は80.8%(n=26)に達した。幼児死亡率には群れによる変異があり、2007年に交尾行動の観察をおこなったC2A群とT1B群で全個体が死亡した一方で、C1群では比較的多くの子供が生存した。本研究の結果は、ワオキツネザルの幼児死亡率の変動はこれまでに考えられていた以上に大きいことを示した。本研究は、マダガスカルに生息する昼行性原猿であるワオキツネザルの繁殖戦略を、DNAマーカーを用いて明らかにすることを目的としている。調査対象は、マダガスカル共和国ベレンティ保護区内に設定された14.2haの主調査地域に生息するワオキツネザルで、1989年以降、全個体の識別が継続されている。本年度は、8月から11月にかけて3ヶ月間の野外調査をおこない、行動観察と捕獲調査をおこなった。調査群7群116頭のうち、76個体分の新たな遺伝試料を採取した。今回の調査における主な捕獲対象はオトナオス(3歳以上)および未成熟個体(1歳および2歳)で、オトナオスは2頭を除いたすべて、未成熟個体は4頭を除いたすべての遺伝試料を採取できた。帰国後、霊長類研究所集団遺伝分野において、口内細胞試料からDNAを抽出し、マイクロサテライトDNA解析をおこなった。口内細胞の84試料すべてでDNA抽出に成功した。血液から調製したDNAに比べると濃度は低いが、十分な量のDNAを採取できることが明らかになった。また、調製したDNAを用いて、シークエンサーを用いたフラグメント解析をおこなった。実験には、研究代表者がこれまでにおこなってきた実験でPCRによる増幅、多型を確認したプライマーを用いた。マーカーとして有効であることが確認されている11座位のマイクロサテライト遺伝子のうち、9座位について各試料の8割程度の遺伝子型を決定できた。来年度以降は、残り2割の遺伝子型を決定し、父子判定に用いる予定である。本研究は、マダガスカルに生息する昼行性原猿であるワオキツネザルの繁殖戦略を明らかにすることを目的としている。調査対象は、マダガスカル共和国ベレンティ保護区内に設定された14.2haの主調査地域に生息するワオキツネザルで、現在は7つの群れが生息している。これらの群れの個体は1989年以降、識別が継続されており、血縁関係、年齢、優劣関係、出自群、群れにおける滞在年数などの詳細な個体情報が利用可能である。本年度はワオキツネザルの交尾期(4月から5月)と出産期(9月から10月)の2回、野外調査をおこなった。4月から5月にかけては交尾行動の観察をおこなった。今年度の観察で得られた結果は、先行研究や研究代表者が1999年と2001年に観察した結果といくつかの点で異なっていた。第1に、メスの発情時期が4月末から5月にかけてで、例年よりも遅かった。第2に、メスの発情時期が群れによって大きく異なっていた。第3に、群れ外オスとの交尾が多く観察された。9月から10月にかけては、出産の確認をおこなった。その結果、出産率は76.5%(26/34)で例年に比べ、低い値ではなかった。しかし、発情日と出産日から算出した平均妊娠期間は141日間(n=6,140-142日間)で、他の年の結果(1998年138.7日間(n=6),1999年137.8日間(n=4),2001年138.9日間(n=9))より2-3日長かった。これらの変異は食物資源の量などの環境要因と関連している可能性がある。来年度以降、幼児死亡率やオスの繁殖成功(DNAマーカーを用いた父子判定)の年による違いとの関連も含めて分析を進める予定である。