hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植腎グラフトの長期生着をめざした慢性拒絶反応に対する予防・先制医療の導入

腎移植後慢性拒絶反応の前、さらにはドナーに対するHLA抗体(DSA)が産生される前の段階での対策、すなわち予防・先制医療の導入をめざしている。本年度に得られた研究成果を記す。(2)次世代シークエンスを用い、ドナー由来cfDNA存在比率を測定した。急性拒絶反応時には1.6%、高度な抗体関連型拒絶反応(怠薬による)時には3.3%であり、経過良好例では検出されなかった。ドナー由来cfDNAは、グラフト傷害の程度を反映していると推測された。(3) 1年後のプロトコール腎生検標本の再解析(microarray)を行なった。ABO不適合症例では、ABO適合症例と比較して、PD-L1が有意に高いことが判明し、graft accommodationの一つの要因として考えられた。また、B cell EPITOPEミスマッチレベルとde novo DSA産生との関連を見出した。ABO不適合移植では、class II de novo DSAの産生率が有意に低く、A/B抗体接着によるGraft Accommodationに起因すると推察された。臨床での維持期の至適免疫抑制療法に関する重要な情報を提供し、個別化医療の実現に役立つものと考えられた。Microarray解析、TCR/BCR解析については、さらに研究を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ドナーHLAに対する抗体(DSA)が引き起こす慢性抗体関連型拒絶反応を制御する研究である。グラフト機能傷害の前、さらにはDSAが産生される前の段階での対策、すなわち予防・先制医療の導入をめざす。H28年度に得られた研究成果は、(A) Pharmacodynamics (PD)解析に基づく免疫抑制療法の導入:T細胞をCD4, CD8サブセットに分けて解析し、ウイルス感染例ではCD8のCSA、TACの薬剤感受性が高いことを確認した。PD解析導入後の薬剤選択、投与量調整により、移植後のウイルス感染は10%以下に減少した。(B) Liquid BiopsyによるBiomarker探索:末梢血PBMC中のmiRNA解析では、DSA産生、慢性抗体関連型拒絶反応と、miR-142-5p、miR-182/486-5pの関連が認められた。mRNA解析では、CIITAがDSA産生例で正常機能例より低く、IL-10は慢性拒絶反応、DSA産生例で有意に高かった。(C)T細胞受容体(TCR), B細胞受容体(BCR)レパトア解析:TCRαV領域、βV領域、C領域のPrimerを設定し, single cell PCRによりヒト培養細胞に反応するT細胞クローンを数種類同定した。(D)末梢血メモリーB細胞培養:IL-2, R848, 96 wellプレートを用いたPBMC培養方法の改良により検出率が向上した。培養中のDSAがnonDSAよりも多量であり、末梢血ではDSAがグラフトに吸着され、B細胞培養の臨床的意義を明確にした。(E)グラフト内皮細胞のAccommodationを誘導する薬剤の探索:Prednisolone, Fluvastatinは,それぞれCIITA, HLA-DR mRNAを抑制し、EverolimusはCD63 CD82の抑制、翻訳後修飾によりHLA-DRの発現を抑制した。ほぼ順調に成果が得られており、計画は予定通り進行していると考える。(1)予防医療の実践、(2)先制医療に必要な発症前診断の開発、(3)発症前の有効な治療法の開発の3つのプロジェクトに分けて効率的に研究を進めている。(1)予防医療の実践については、Pharmacodynamics (PD)解析を臨床に近い形で抗体産生に重要なB細胞、とくにT-B communicationを考慮した薬剤感受性テストの確立をめざす。(2)では、Liquid BiopsyによるBiomarkerの探索を行っているが、臨床でのDSA産生、慢性抗体関連型拒絶反応(subclinicalからclinical)への変化をより早く検出できるBiomarkerが不可欠である。OMICS解析だけでなく、TCR、BCRに着目した解析は、T, B細胞の早期の反応を検出できるであろう。Direct RecognitionPathwayだけでなくIndirect Pathwayに関わるアッセイの開発も不可欠である。(3)では、従来からの内皮細胞研究を発展させている。さらに抗体療法、RNA干渉を用いた革新的な治療法の開発につながる可能性がある。今のところ、本研究の方向性に問題はなく、最終のH30年度に向けて、効率的な研究を行う予定である。腎移植後の長期成績の改善を目的として、ドナーHLAに対する抗体(DSA)によって引き起こされる慢性抗体関連型拒絶反応を制御する研究である。DSAが産生される前の段階での対策、すなわち予防・先制医療の導入をめざしている。H29年度に得られた研究成果を記す。(A) Pharmacodynamics (PD)解析に基づく免疫抑制療法の導入:CD8 T細胞に着目し、(Calcineurin Inhibitor)CNI感受性テストを確立し、CMV, VZVなどのウイルス感染のリスク予測が可能となり、効率的なValganciclovir予防投与が可能となる。また、抗体産生に重要な役割を果たすT-B communicationを考慮したアッセイを開発し、慢性抗体関連型拒絶反応を考慮した薬剤選択をめざす。(B) Liquid BiopsyによるBiomarker探索: Serum(Plasma)中のmiR-142-3p,1913,374-5pが慢性抗体関連型拒絶反応の関連する候補として検出された。

(C)T細胞受容体(TCR)βV領域に着目し、シングルセルPCR、次世代シーケンサーを用いた解析を継続中である。(D)末梢血メモリーB細胞培養の改良を行い、medium changeを頻回に行うことにより検出感度を高めることに成功したが、検出感度が不十分であり、さらなる方法の改良が必要である。ヒト化マウスの応用も考慮している。(E) EA. Hy926内皮細胞だけでなく、HUVECにおいても、Accommodationを誘導する薬剤(スタチン、mTOR阻害剤)、ABO血液型抗体の細胞傷害保護効果を明らかにした。IFNr誘導性のHLA-DR, DQ発現抑制が異なるメカニズム(CIITA mRNA抑制、HLA-DR mRNA抑制、Tetraspanin抑制)で引き起こされることを明らかにした。ほぼ順調に成果が得られており、計画は予定通り進行していると考える。(1)予防医療の実践については、Pharmacokinetics (PD)解析を臨床に応用するために、T細胞だけでなく、B細胞にも着目できるように、T/B共培養アッセイを確立し、維持期のde novo DSA産生抑制が可能な免疫抑制療法の選択をめざす。(2)先制医療に必要な発症前診断の開発では、Liquid BiopsyによるBiomarkerの探索を精力的に行っており、mRNA, miRNAだけでなく,ドナー由来cell freeDNA解析を開始する。DSA産生にはIndirect Recognition Pathway解析が不可欠であり、Dendritic Cellを用いた研究は不可欠である。少し遅れ気味であるが、次世代シーケンサー、Digital PCRを用いたTCRの解析は、より早期のドナー特異的な免疫応答を検出できる可能性がある。(3)発症前の有効な治療法の開発では、従来からの内皮細胞研究を発展させ、抗体療法、RNA干渉を用いた革新的な治療法の開発をめざす。今のところ、本研究の方向性に問題はなく、最終年度(H30年)で計画した研究を完了する予定である。腎移植後慢性拒絶反応の前、さらにはドナーに対するHLA抗体(DSA)が産生される前の段階での対策、すなわち予防・先制医療の導入をめざしている。本年度に得られた研究成果を記す。(2)次世代シークエンスを用い、ドナー由来cfDNA存在比率を測定した。急性拒絶反応時には1.6%、高度な抗体関連型拒絶反応(怠薬による)時には3.3%であり、経過良好例では検出されなかった。ドナー由来cfDNAは、グラフト傷害の程度を反映していると推測された。(3) 1年後のプロトコール腎生検標本の再解析(microarray)を行なった。ABO不適合症例では、ABO適合症例と比較して、PD-L1が有意に高いことが判明し、graft accommodationの一つの要因として考えられた。
対テロ政策をめぐる「国際機構間関係」論―国連安保理への《協力》と《抵抗》―

本研究の目的は、欧州連合(EU)や欧州審議会(CoE)といった地域的国際機構と、国際連合(国連)等の普遍的国際機構の間に生じる相互作用を題材として、国際関係論および国際法学における「国際機構間関係」の視座を発展させることにあった。この目的のもと平成28年度は、前年度まで実施していた「標的制裁」(国連安保理が主導する、テロリストとの関わりが疑われる個人や団体に対する制裁措置)の権利侵害性に関する研究を継続しつつ、他方、国際機構間関係の枠組が他事例においても妥当することを検証するため、EUの庇護政策を題材として選定し、分析した。同政策を選定するに至った理由は、「標的制裁」と同様に、〈国際機構が個人の権利を侵害し、各加盟国が直截にそれを匡正できない〉という構図が共通するからである。具体的には、EU加盟国に到着した庇護希望者をEU域内で移送するための「ダブリン規則」の権利侵害性が、UNHCR(国連難民高等弁務官事務所)やCoE、ならびに各種NGO等々の《異議申立》を通じて匡正されていった過程を分析し、さらにその理論的含意を検討した。以上の研究は、日本国内における文献調査に加えて、ベルギーに渡航し、ブリュッセル自由大学を拠点として行ったインタビュー調査に基づいている。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、国際連合安全保障理事会(国連安保理)が主導する対テロ政策の立案、実施および司法審査の諸過程を、国連と欧州連合(EU)や欧州審議会(CoE)などの地域的国際機構との「国際機構間関係」に着目し分析することを目的としていた。この目的を達成するため、本年度は、国際機構の相互作用、すなわち「国際機構間関係」論を基礎づけるための理論研究を中心に行った。特に、研究対象である国際機構の特質に鑑み、国際関係論と国際法学の双方の議論動向に目を配るよう心掛けた。国際関係論の視点からは、国際機構研究の系譜を、「レジーム(複合)」論を中心に検討した。また、国際法学の視点からは、「立憲化」論や「立憲的多元主義」の議論を検討した。その結果として、安保理のような国際機構の決定が帯びる権力性を、他の機構との国際機構間関係の中でいかに統御するかに関心を払うという問題意識をもつ本研究が、先行研究とより精緻に差異化された。また、理論研究を踏まえて、国連安保理決議、ならびに安保理関連機関や地域的国際機構の文書や判決を含む一次資料の調査を行った。その結果として、テロ対策に関連した安保理制裁(個人・団体を対象とした制裁=標的制裁)に伴う権利侵害の問題をめぐって、国連と他国際機構がどのような相互作用をし、いかなる帰結を生じたかを明らかにした。これらの成果は、「国際テロリズム規制における地域的国際機構の役割ー『標的制裁』への適正手続導入過程の分析からー」『国際政治』第182号、2015年、98-110頁として発表したほか、海外学会(Asian Society of International Law、2015年11月2627日、タイ)およびワークショップにおいて報告した。国際機構間関係を分析するための理論的な土台を固めるという作業は十分進展したと考える。また、事例研究の柱となる標的制裁に関する、文献資料を用いた調査はおおむね完了している。それゆえ、次に記す翌年度のインタビュー調査の準備はできつつある。しかしながら、Asian Society of International Lawにて報告したペーパーを修正し、Asian Journal of International Lawに投稿するという作業が年度をまたいでしまった点は遅延であり、早急に完了させたい。今後の研究は、2つの柱を中心に行う。第一に、標的制裁の事例以外でも国際機構間関係の枠組が有効であることを確認するために、テロ対策と関連した別の事例の検討を行う。具体的には移民・難民政策や、米国による特別移送(extraordinary rendition)といった事例が候補に挙がっている。第二に、文献調査からははっきりと確認できない部分に関するインタビュー調査をヨーロッパにおいて行う。実施時期は2016年夏期を予定している。また、2015年度に引き続き、国内外の研究者とのネットワーキングも積極的に行いながら、成果の報告・出版を試みる。
森林昆虫の"害虫化"をもたらす要因の解明〜とくに林木の防御機構との関連において

森林に生息している昆虫は通常、気候などの非生物的因子や寄主植物の抵抗性、捕食・寄生・競合などの生物的因子によって低密度に保たれていると考えれている。しかし、環境ストレスや自然攪乱、不適切な森林施業など様々な要因によって、昆虫の繁殖源となる寄主植物(林木)の質的、量的変化がおこり、その結果、密度レベルが上昇して"害虫化"する場合がしばしばみられる。本研究では、このような森林昆虫の"害虫化"をもたらす要因の一つとして、寄主植物(林木)が本来持つ、穿孔性昆虫、ゴール形成昆虫および種子食昆虫に対する防御機構に着目し、それらの発現様式や防御レベルを左右する近接要因の特定、およびそれらを突破して利用する昆虫の繁殖戦略と林木の健康度の観点から明らかにしようとした。平成11年度:直径日変化から樹木の水分生理状態を把握することを目的として、樹幹および枝の直径日変化の測定法を開発すると同時に、直径日変化と水分生理状態を表すその他のパラメータとの関係について調査した。また、スギカミキリやアンブロシアキクイムシなどの穿孔性昆虫が樹木を餌や住み場所としてどのように利用しているのかを、その穿孔様式と繁殖特性に結びつけて調査した。平成12年度:種子食昆虫の資源利用様式と昆虫類の摂食が寄主植物の種子生産と発芽に及ぼす影響を明らかにすることを目的として調査・実験を行った。平成13年度:コナラやモウソウチクにゴールを形成するタマバチ類、およびタマバチを利用する寄生蜂複合体を対象に、三栄養段階にわたる相互作用系の存在様式およびその特性を明らかにすることを目的として調査した。以上をまとめると、森林昆虫の繁殖特性は、「林木の昆虫の加害に対する防御戦略」と「それに対する昆虫の攻撃戦略」という微妙なバランスの上で成り立っているということであろう。このことは、環境ストレスや自然攪乱、不適切な森林施業など様々な要因によって、林木に質的、量的変化がおこれば、寄主植物である林木の昆虫の加害に対する防御機構が崩壊し、昆虫の密度レベルが上昇して"害虫化"する場合がしばしばみられることを示している。すなわち、森林生態系の健全な維持や林木の適切な管理が、いかに森林に生息する昆虫の密度を安定的に維持させているかということを示すものである。そうした見地から、本研究は新しい森林昆虫の管理システムを構築する上で、基礎的な情報を与えるものと思われる。1997年5月に、愛知県小牧市の小牧山においてスギの大量枯死が認められ、新聞紙上で枯死木から脱出したオナガキバチの加害がこの枯死の主因であると報告された。著者らはこの報告に疑問を感じ、このスギ枯死の原因を究明するために調査を行った。枯死木を観察したところ、楕円形の脱出孔およびハチカミ症状が認められ、スギカミキリが加害していたことが示唆された。また、枯死木を伐倒したところ木口面にニホンキバチの加害によると思われる星形の変色が認められるものが存在した。1998年に、粘着トラップによるスギカミキリの捕獲を試みたところ、多数のスギカミキリ成虫が捕獲された。以上のことから、この大量枯死の主因はスギカミキリの加害であると考えられた。

スギカミキリの加害により衰弱した木に産卵したニホンキバチがその際に菌を接種し、その菌を利用してオナガキバチが生育していたものと考えられた。スギカミキリのスギ利用様式を調査した。環状に樹幹を剥皮したスギ樹幹にスギカミキリ成虫を放して産卵させ、その後の昆虫の生存率と成虫の体重を測定した。その結果、剥皮部より上部では下部よりも幼虫生存率が高く、そこから羽化した成虫の体重も重い傾向がみられた。これらから、スギカミキリはやや衰弱した生立木を利用してスギ林で生活していることが示唆された。穿孔性昆虫の1種であるスギカミキリのスギ樹幹利用様式を調査した。スギにストレスを与えるため、スギ林に強度枝打ち区、断幹区、コントロール区を設定し、スギカミキリふ化幼虫を接種した。その結果、ストレスを与えていないコントロール区では、接種したふ化幼虫はすべて樹幹の樹脂によって死亡した。ところが、強度枝打ち区や断幹区では樹脂による死亡が少なく、ほとんどの幼虫が成虫まで生存した。このことはスギカミキリ幼虫にとってスギ樹幹から滲出する樹脂が死亡主要因であることを示唆している。さらに、環状に樹幹を剥皮したスギにスギカミキリ成虫を放して産卵させ、その後の幼虫の生存率と、成虫になった場合には、成虫の体重を測定した。その結果、剥皮部より上部では下部よりも生存率が高く、そこから羽化した成虫の体重も重い傾向がみられた。これらのことから、スギカミキリはやや衰弱した生立木を利用して過ぎ林で生活していることが示唆された。さらに、スギカミキリ雌成虫の体サイズが、それらに由来する幼虫の体サイズと生存率に及ぼす影響を知るために、体サイズの違う成虫をスギ樹幹に放してその後の幼虫生存率を体サイズを調査した。体重の重い成虫は多くの卵を産み、大きな1齢幼虫を産出した。成虫として脱出するまでの樹皮での幼虫の生存率は、大きい雌成虫に由来する生存率が小さい雌に由来する生存率よりも高い傾向がみられた。これらの結果から、大きい幼虫は生立木での死亡主要因である樹脂を突破する割合が高いことを示唆した。このように大きい雌は小さい雌よりも繁殖適応度が高いことが明らかになった。また樹木に与えるストレスの一種として枝打ちを取り上げ、強度の枝打ちがヒノキ樹幹の通水に当たる影響を調査した。強度に枝打ちしたヒノキの樹幹に染色液(1%酸性フクシン)を注入し、樹幹内の通水面積の変化を調べた。枝打ち痕に接する辺材部は染色液に染色されず、枝打ちによって辺材の樹液流動が部分的に阻害されていることが示唆された。この通水阻害部分は、枝打ち痕の長さの9倍にまで拡がっていたことが明らかになった。モウソウタマコバチAiolomorphus rhopaloides(以降タマコバチという)はモウソウチクPhyllostachys pubescensの小枝にモウソウチクエダフクレフシという細長いゴールを作るゴール形成者(Gall maker)である。1997年から2000年の早春に名古屋市天白区にある3ヶ所のモウソウチク林でこのゴールを採集し、そこから脱出したタマコバチ成虫と寄居者(Inquiline)であるモウソウタマオナガコバチDiomorus aiolomorphi(以降オナガコバチという)成虫を2,3日おきに数えた。
新しいホトクロミック化合物の合成に適した分子設計手法の確立に関する研究

本研究では、スピロピラン系、フルギド系、ベンゾジキサンテン系という、三種の異なるホトクロミック化合物について、それぞれ独立に研究してきた合成化学者達が、相互の有機的連携の下に分子設計手法の改良という一つのテーマに取り組み、種々の新しいホトクロミック化合物の開発を行うことができた。スピロピラン系では、「準安定系の熱安定化」をキーワードに種々の誘導体を合成し、その溶液における構造と固体における構造とが大きく異なることを初めて明らかにした。つぎに、スピロピラン誘導体をビニルモノマーと共重合し、ポリマーフィルム中における準安定系の熱安定性を評価した。また、ポリマーなどの媒体に依存せずに化学的安定性を向上させるために、スピロピラン誘導体を配位子に持つクロムカルボニル錯体を全く独自のアプローチとして合成し、その準安定系の熱安定性に関する考察を行った。さらに、関連化合物として、スピロベンゾセレナゾリノベンゾピランを側鎖とする逆ホトクロミックポリマーの合成についても研究し、準安定系の固定化に関して新しい知見を得た。フルギド系では、インドリルフルギド類のPPP分子軌道法計算を行い、実測データと比較することによりパラメーターの検討を行った。また、これら新規化合物の光反応の研究から、量子収率と構造の関係についてMNDO分子軌道法を援用して考察した。ベンゾジキサンテン系では、PPP法ならびにINDOIS法により窒素類縁体が長波長域に吸収を有することを予測し、近赤外領域に吸収を持つ新規ホノクロミック化合物を合成することができた。以上の一連の研究により、パーソナルコンピューターまたはワークステーションを用いる計算化学的手法を再吟味し、ホトクロミック化合物の熱安定性、吸収極大や量子収率の予測の効率化が実現できた。
医療ＤＢから抽出した準健康人を用いたコホート研究の可能性

高知大学病院が蓄積している大量の医療データの中には健康な人に近い患者(準健康人)も少なくない。その準健康人の中で長期間の受診歴を持つ人を抽出し、長期間の追跡調査を必要とする研究に活用できないか検討した。その結果、5年以上の受診歴があり、追跡初期において医療介入もない準健康人は少なくないが、50代女性で100名を超える対象が得られた。その人たちの虚血性心疾患発症の追跡調査により得られた結果は大規模な直接的な調査の結果と概ね一致することが示された。これにより、直ちに本調査手法が有効と断定することはできないが、準健康人を活用する調査は十分可能性のある調査手法であることは示されたと考える。高知大学の病院情報システムIMISに過去30年間に登録された約26万人の患者の中で、基本検査項目の初回検査値が基準範囲にある患者を準健常個体(何らかの健康上の問題があるので準とした。以下、英語表記Quasi-Healthy Individualの頭文字を取ってQHIと略記する。)として(約5万人が対象となる)、その中に長期間追跡調査できるQHIがどの程度いるかを調べた。対象期間を1985年から1989年の5年とし、そのどこかの時点で受診し5年以上の受診歴と6回以上の受診のあるQHIは性別・年齢層別(30代、40代、50代)で見ると30代は100名を切るが、40代と50代では男女共に100名以上いるので、有病率が数%ある疾患についてはその発症頻度を1因子で分けて比較できる可能性があることが分かった。また、QHIの人数の多い50代女性に対して虚血性心疾患の発症状況を総コレステロール値(TC値)で2群に分け追跡調査したところ、虚血性心疾患の発症頻度が全体で約4%、TC値が220mg/dl以上の群で高いという結果が得られた。発症頻度は他の調査研究より幾分高いが、TC値の違いによる傾向は一致しており、概ね妥当な結果であった。高知大学医学部附属病院の医療DBには過去30年間に約26万人の患者が登録されており、基本的生化学検査5項目(RBC、WBC、尿素窒素、総蛋白、GOT)すべてが基準値内にある患者(健常個体に近い患者ということで、準健常個体と以下呼ぶ)が約5万人おり、かつ長期間に何度も受診している準健常個体が一定数いることを前年度の研究で確認できた。さらに、準健常個体が最も多かった50代女性について、虚血性心疾患発症への血中総コレステロール値(T-C)の影響評価を行い、概ね他のコホート調査結果と一致する結果が得られることを確認できた。しかし、基本5検査だけでは初期癌の患者などが含まれ得るので、本年度はより厳しく対象者を選別し、追跡開始時のT-Cレベルも3群(200mg/dl未満、200mg/dl以上240mg/dl未満および240mg/dl以上)に分けて追跡調査した。本調査では追跡対象コホートは、準健常とした判断した時点から3ヶ月以内に12日以上の入院または侵襲の大きな手術がないこと、および5年以上の受診歴、5回以上の再来受診、1ヶ月以上の再来受診間隔があることを満たす1985年から5年間に初回受診した50代女性の準健常個体で構成することとした。追跡調査期間は7.5年とし、途中で受診を止めた個体も含めた。3群についてKaplan-Meier法で虚血性心疾患発症の生存率を求め、Log rank検定により血中T-Cレベルの影響を評価した。結果としては、240mg/dl以上の群が他群より虚血性心疾患発症率が有意に高いこととの結果が得られたが、高脂血症のボーダーラインである200mg/dl以上240mg/dl未満群は200mg/dl未満とほぼ同じ発症率であった。ボーダーライン群ではT-Cレベルが追跡調査期間中に変移する個体が約半数あり、初期値の評価方法について更なる検討が必要であることが認識された。保健医療情報学1985年から1989年の5年間に初めて受診し準健常個体として抽出された患者から、長期追跡できるQHIが性別年齢層別で男性は30代89名、40代127名、50代159名、女性は30代102名、40代173名、50代213名抽出できた。ただし、この内男性約20%が、女性約30%が初診後短期間に手術等負荷の大きな治療を受けているため、30代では対象者数が100名を切り追跡調査が難しいが、40代と50代では100名以上が長期追跡調査可能なQHIとして確保できた。

また、QHIを用いた虚血性心疾患発症に関する追跡調査で概ね妥当な結果が得られたことは、本研究者等の研究手法の妥当性を示しており、計画通り研究を遂行できる見通しが得られた。初年度抽出された1985年から1989年に初診の長期追跡調査可能なQHIに加え、同様な条件1995年から1999年でも長期追跡調査可能なQHIを抽出し、それぞれの特性を性別・年齢層別に調査すると共に、生活習慣病に関与すると考えられている血中コレステロール値や空腹時血糖値などの疾患発症への影響を調べる。また、それらの結果を大規模コホート調査の結果と比較し、大規模医療データベースのコホート調査への利用可能性を検討する。研究分担者との研究打合せが日程調整の関係で予定より1回少なかったため、分担者の旅費が余ることになった。生じた繰り越し予算は研究打合せ旅費として利用する計画である。
ルビジウムの生体内における代謝機構およびその機能の解明

1.ヒト血清中Rb濃度(平均値±SD)は男0.41±0.18、女0.33±0.15μg/mlであった。疾患を持たないヒトの脳中Rb濃度は脳を5領野に分けてRbを測定したが差はなく、約10μg/gであった。各領野のRb濃度は年齢と負相関があった。神経科を受診した患者の脳脊髄液中Rb濃度は血清中濃度の1/4であり、疾患とRb濃度の関連性は見られなかった。2.ラット脳中Rb濃度を8領野に分けて測定した。ヒト脳と同様、領野による差はなく、月齢と負相関があった。3.老化促進マウス(R1系とP10系)の脳中8領野のRb濃度は領野による差は少なく、月齢との関係も認められなかった。3ケ月齢のR1とP10の間に7領野で有意にP10の方が低値であった。4.マウスを低Rb食で飼育すると、Rb濃度は骨1/5、脾1/2に低下するが、脳、肝、腎、肺、膵、胸腺では変化しなかった。Rbに加えてMgとKも低濃度の餌を与えると、肝Rb濃度は低下した。ルビジウム(Rb)はこれまで注目を集める事の少ない元素であり、動植物における必須性は不明である。体内にも、食品にも、環境中にもかなりの濃度で存在するので、欠乏状態が生じにくいことによるのかもしれない。最近、分析法の発展により、感度、精度良く測れるようになった元素のひとつである。申請者らの分析結果では健康成人の血清中Rb濃度は男0.41±0.18μg/ml(n=337)、女0.33±0.15μg/ml(n=118)であった。これは人間ドックの廃棄血清を貰いうけた試料の結果である。Rbは脳のあらゆる部分にppmのオーダーで検出される。このことは血液-脳関門を通過し、濃縮されることを意味している。申請者らはこの事実に注目し、ルビジウムは必須元素の一つであり、その必要性から血液-脳関門を通過し、脳のそれらの部位に存在しているという仮説を立てた。精神科領域を受診した患者の血清と脳脊髄液を入手しRb濃度を測定したところ、血清では0.14±0.04μg/ml(n=56)、脊髄液では0.04±0.02μg/ml(n=59)でおり、脊髄液中の濃度は血清中の約1/4と低値であった。一方、動物実験においてintactマウスの臓器中Rb濃度は313μg/g wet organでおり。臓器による差は小さい。intactマウスの血漿中Rbは0.20±0.02μg/mlであり、ヒト血清中濃度と変わりない。低Rb食を給餌すると、骨Rb濃度は約1/5に、脾Rb濃度は約1/2に低下する。しかし脳、肝、腎、、膵、胸腺では変化しなかった。低Rb食で、かつマグネシウム・カリウム欠乏食を給餌した場合には肝Rb濃度が低下した。上記の結果から、Rbは血清中では組織中より1オーダー低い濃度で存在すること、さらに脳脊髄液中では血清中濃度の1/4程度であること、食事からのRb供給が少ない時、骨から動員し、臓器中の通常のレベルを維持することが判明した。その機能の解明は来年度実施する予定である。1)ヒト大脳の部位別ルビジウム(Rb)濃度と年齢相関特に疾病をもたない事故死14例(年齢454歳)の脳を前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉および小脳に分けてRb濃度を測定した結果、各部位の平均値±SEは11.02±1.01、11.30±1.07、11.61±1.11、10.72±0.86および9.67±0.73μg/g dry weightであった。部位による差は認められず、各部位で年齢と有意な負相関が認められた(r=-0.89-0.68)

2)ラットの脳中Rb濃度雄性Wisterラットの3および6週齢、3、6および12ケ月齢の脳の8部位(小脳、延髄と橋、視床下部、中脳と視床、線条体、海馬、大脳皮質および嗅球)のRbを測定した。その濃度、年齢との関係はヒト場合と類似していた。3)マウスの脳中Rb濃度老化促進マウス(SAM)の正常老化系R1と脳萎縮、記憶障害発症系P10の3,6,9,12ケ月齢を使って、ラットと同じ脳中8部位のRb濃度を測定した。その濃度はヒト脳、ラット脳と同程度であった。3ケ月齢で視床下部を除く7部位でRb濃度は有意にP10がR1より低値であった。月齢との相関は明らかでなかった。雄性ICRマウス(5週齢)を(1)低Rb、(2)低Rb・K、(3)通常Rb・低K、(4)通常飼料、で4週間飼育した。これらマウスの血液、肝臓および腎臓中のATPase活性を測定した。全ATPase(Ca-ATPase、Mg-ATPaseおよびNa・K-ATPaseの和)、EGTAを添加しCa-ATPase以外のATPase活性、ouabainを添加しMg-ATPase活性を測定し、計算によりNa・K-ATPase活性を求めた。ATPase活性は腎>肝>血液の順であった。与えた食餌の種類による活性の差は見出されなかった。
精子運動抑制因子のマウス尿路における細菌定着阻止効果について

ヒト精漿より分離精製したSPMlを用いて、マウス尿路細胞への細菌付着阻止実験を行った。当初SPMIは比較的入手の容易なブタ精嚢液より分離精製する計画であったが、ヒト材料の入手が可能となったのでヒト精漿由来SPMIを使用することとした。SPMIはヒト精漿よりイオン交換クロマトグラフィーおよびHPLCによって分離精製した。細菌株は標準株の黄色ブドウ球菌209P株、大腸菌NIHJ株、および尿路感染症の臨床分離株である腸球菌EF-14株を用いた。クローズドコロニーJcl:MCH(ICR)マウスの腎を摘出し、細切後トリプシン処理により単離したのも10%FCSを含むハムF12培養液にて培養した。培養後2-4日間で細胞がほぼ単層を形成したら、35mmプラスチックシャーレ中に置いたカバーグラス上に細胞を継代培養し、24-48時間後に取り出してPBSで洗浄後実験に用いた。マウス腎細胞を培養したカバーグラスは、最終濃度10、100、1000μg/mのSPMI溶液(in PBS)を満たした35mmプラスチックシャーレ内に置き、37°Cで1時間、40回転/minで振盪し、さらに菌数を最終濃度10^7CFU/mlとなるように液量を再調整し同様に1時間振盪した。非付着菌株をPBSで5回洗浄した後、カバーグラスを10%ホルマリン液にて固定、ギムザ液で染色後、細胞100個について検鏡し付着菌数を求めた。このとき生菌5個以上の付着を認めた細胞を陽性とした。SPMI添加しない対照群では細菌が付着した腎細胞が多数観察されたのに対し、SPMIを添加した実験群では、生菌付着陽性細胞数は、添加したSPMiの濃度が高いほど少なく、1000μg/mlでは生細胞には殆ど細菌が付着しなかった。以上により、ヒトSPMIがマウス尿路細胞への細菌付着を濃度依存性に阻害することが認められた。現在、本実験における阻害効果の定量化を試みている。
糖尿病ラットの廃用性筋萎縮に対する運動効果

非肥満型2型糖尿病ラットであるGoto-Kakizakiラット(以下GKラット)に対し、尾部懸垂法を2週間実施し廃用性筋萎縮を作成、その後再荷重を行いその回復過程について検討した。ラット後肢よりヒラメ筋、足底筋を摘出し、切片を作成、HE染色を行い、筋横断面積を測定した。ヒラメ筋については、WistarラットとGKラットは同様の経過を示したが、足底筋については、GKラットの方が萎縮しやすい傾向にあり、また再荷重を行っても回復しにくいことが筋横断面積より示唆された。壊死線維については有意差はみられなかったが、GKラットヒラメ筋において、若干多くみられ、高血糖による筋線維の脆弱性が示唆された。研究目的:糖尿病をもつ高齢者・運動困難者にも可能な効果的筋力強化運動確立のため,糖尿病ラットを用い廃用性筋萎縮モデルを作成,各種の運動を負荷し,その筋と毛細血管および血糖値に与える影響を組織化学的・生化学的に検証すること。平成25年度実施内容非肥満型糖尿病ラットであるGoto-Kakizakiラット(以下GKラット)とWistar系ラットに対し,尾部懸垂法を用いて廃用性筋萎縮モデルを作成し,ヒラメ筋・足底筋を対象に,筋湿重量と筋線維断面積、血糖値について比較検討した。方法は各ラットを対照群(以下C群)と尾部懸垂群(以下S群)8匹ずつに分け,実験期間を2週間に設定した.実験開始時および終了時に,足関節可動域,体重を測定,麻酔下にて採血し,血糖値(mg/dl)を測定した.ヒラメ筋・足底筋を摘出し、組織化学的分析のため超低温フリーザーにて冷凍保存し、それぞれの筋に対し、凍結横断切片(10μm)にHE染色を実施、光学顕微鏡で検鏡を行った。染色切片の顕微鏡画像を元に、画像解析ソフトImageJを用いて,200本以上の筋線維を計測し,筋線維断面積を求めた。結果、血糖値についてはGKラットがWistarラットよりも有意に高値を示し、尾部懸垂による影響はみられなかった。S群において、ヒラメ筋に対してはGKラットとWistarラットの筋線維断面積に有意差は認められなかったが、足底筋においてはGKラットが有意に筋線維断面積が小さかった。これらの結果より、GKラットにおいてTypeI線維が多いとされるヒラメ筋とTypeII線維が多いとされる足底筋において異なった廃用性筋萎縮傾向を示すことが考えられ、非肥満型糖尿病ラットにおいては、TypeII線維が廃用性筋萎縮の影響をうけやすいことが示唆された。この結果より、TypeII線維を意識した運動介入の必要性が考えられる。平成26年度は産前産後の休暇及び育児休業のため、一時研究を中断。中断期間:平成26年4月1日から平成27年3月31日まで・平成25年度に糖尿病ラット(以下GKラット)とWistarラットを用いて、尾部懸垂による廃用性筋萎縮を作成、ヒラメ筋、足底筋を採取しその筋横断面積による萎縮の程度の確認を行った。また、介入前後の血糖値を測定した。・平成26年度は出産時休暇および育児休暇のため、一旦研究を中止。・平成27年度はGKラットとWistarラットを用い、平成25年度同様に尾部懸垂にて廃用性筋萎縮を作成する群と尾部懸垂施行期間に毎日1時間の荷重を行い、その廃用性筋萎縮に対する予防効果について検討する実験を実施した。Gkラット、WistarラットからTypeI線維が多いとされるヒラメ筋、TypeII線維が多いとされる長趾伸筋、足底筋を採取、筋横断面積、筋線維タイプの変化、末梢血管数について検討中である。・妊娠時の体調不良および産休・育児休暇のための研究休止。・研究手技に不慣れであり、予備実験などに時間がかかっている。本研究の目的は糖尿病ラットの廃用性筋萎縮に対する運動効果を検証することである。これまでに、Wistar系ラットと糖尿病モデルラットであるGKラットを用い、尾部懸垂による廃用性筋萎縮を作成し、尾部懸垂が血糖値に影響をおよぼさないこと、尾部懸垂により、Wistar系ラット同様にGKラットも廃用性筋萎縮を惹起することを確認した。その後、一時研究を中止し、平成27年度に再開した。本年はGKラットとWistarラットを用い、尾部懸垂法を1週間行い、廃用性筋萎縮を作成する群と尾部懸垂期間に運動介入として毎日1時間荷重を行い、その廃用性筋萎縮予防効果について検討する実験を実施した。Wistarラット、GKラットをそれぞれ、コントロール群、(W群,G群)、尾部懸垂群(WS群,GS群)、尾部懸垂期間中、荷重を行う群(WW群,GW群)とし、実験後、TypeI線維が多いヒラメ筋、TypeII線維が多い長趾伸筋、GKラットで筋線維タイプの変化が報告されている足底筋を採取した。採取した筋は筋湿重量を測定し、その後急速凍結し実験まで保存した。ヒラメ筋について凍結切片を作成、HE染色を行い、筋横断面積、壊死線維数、中心核線維数についてそれぞれの群で検討した。筋湿重量においては、GS群よりGW群が有意に高値を示し、また、筋横断面積においても同様の結果が得られた。このことより、糖尿病であっても荷重による廃用性筋萎縮予防効果がWistarラット同様に認められることを確認した。ただし、GW群においては壊死線維数が他群に比べ多い傾向にあり、脆弱化した骨格筋が荷重負荷に対し損傷しやすい可能性が示唆された。

・平成28年度は5月より切迫早産にて休業、6月7日より出産時休暇及び育児休暇のため一旦研究を中止した。妊娠出産による研究休止、研究手技に不慣れなため予備実験に時間がかかっているため。本研究では、運動困難となった糖尿病患者に対し、適切な負荷での運動療法確立のための基礎実験として、動物実験を行った。なお糖尿病ラットは日本人に多いとされる非肥満型の2型糖尿病モデルであるGoto-Kakizakiラット(以下GKラット)を用いた。H25年度は、運動困難となった糖尿病患者を想定し、廃用性筋萎縮モデルを作成した。2週間の尾部懸垂法を用いて、GKラットとWistarラットの後肢に廃用性筋萎縮をおこさせ、typeI線維が多いとされるヒラメ筋とtypeII線維が多いとされる足底筋について組織学的に比較検討した。摘出した筋の切片に対しHE染色を用いて筋横断面積を測定したところ、ヒラメ筋についてはGKラット、Wistar系ラット伴に尾部懸垂によって、同程度の廃用性筋萎縮を示した。一方足底筋についても両ラット伴に廃用性筋萎縮を示したが、GKラットがより萎縮しやすい傾向がみられた。H27年度は初年度同様に、尾部懸垂を行う際に、毎日1時間荷重を加えることで、筋萎縮の予防効果について検討した。この結果、Wistar系ラット、GKラットともに、懸垂のみの群に比較し、荷重を加えた群では、筋横断面積が大きくなり、糖尿病ラットであっても荷重によって筋萎縮が予防されることが示唆された。H29年度は尾部懸垂による廃用性筋萎縮作成後、1週間、2週間と再荷重を行うことで、筋萎縮からの回復について検討した。1週間再荷重を行った群はヒラメ筋についてはWistarラット同様の回復を示したが、足底筋は萎縮しやすく、また、回復しにくい傾向が示唆された。以上より、糖尿病ラットでは、廃用性筋萎縮を起こしやすいとされるヒラメ筋に加えてtypeII線維が多いとされる足底筋でも萎縮しやすい傾向あり、かつ回復しにくいことが示唆され、糖尿病患者では、よりtypeII線維を意識した運動が必要である可能性が考えられた。非肥満型2型糖尿病ラットであるGoto-Kakizakiラット(以下GKラット)に対し、尾部懸垂法を2週間実施し廃用性筋萎縮を作成、その後再荷重を行いその回復過程について検討した。ラット後肢よりヒラメ筋、足底筋を摘出し、切片を作成、HE染色を行い、筋横断面積を測定した。ヒラメ筋については、WistarラットとGKラットは同様の経過を示したが、足底筋については、GKラットの方が萎縮しやすい傾向にあり、また再荷重を行っても回復しにくいことが筋横断面積より示唆された。壊死線維については有意差はみられなかったが、GKラットヒラメ筋において、若干多くみられ、高血糖による筋線維の脆弱性が示唆された。平成26年4月1日から平成27年3月31日まで産前産後の休暇及び育児休業を取得していたため平成28年度は、出産休暇・育児休暇を取得予定。平成29年度より、研究再開予定。昨年度までの研究に引き続き、足底筋、長趾伸筋について分析をすすめる。本年度は尾部懸垂時の運動介入としてトレッドミル走行を実施し、荷重運動との効果比較を行う予定。リハビリテーション科学25年度に作成した、廃用性筋萎縮の試料からさらに組織切片を作成し、ATPase染色を行い、筋線維タイプ分類を行う。また、免疫染色により、毛細血管についても検討する。
筋疾患モデルマウス骨格筋小胞体分画におけるクレアチンキナーゼ活性と筋疾患

本研究では、dystahyopathy:筋緊張性dystrophy及びカルニチン欠損症型筋萎縮症の疾患モデル動物であるB6CBA/J-cro系統マウスを用いて、これまでの研究によりcroマウスで欠損する蛋白のアミノ酸配列の解析結果からこの蛋白がCKである可能性が強く示唆されているので、この点をさらに追求し、筋疾患発症機序及び、正常筋における筋小胞体結合型CKの生理学的意義について考察するために以下の実験を行ない成果を得た。1.croマウスの筋小胞体分画で欠損する蛋白を同定するために、常法に従いCKM鎖特異抗体を用いて、筋小胞体ほかの分画におけるウエスタンブロッテイングを行った。その結果、コントロールにおいて欠損蛋白の位置に特異的反応が認められ、croマウスの筋小胞体分画で欠損する蛋白が筋小胞体結合CKM鎖であると考えられた。2.血中および筋組織各分画に於けるCK値の変動を明らかにするために、材料の血液、骨格筋を常法により前処理し、セルロースアセテート膜電気泳動によるアイソザイムを比較したところ、泳動像には明確な差は認められなかった。そこで、各分画のCK活性を分光光度計にて定量、比較した結果、croマウスではいずれの分画においても約1割の有意な活性低下が認められた。血清等で充分なCK活性が認められることは寿命や繁殖に問題のないcroマウスの筋疾患の程度と良く相関していた。このCK活性低下は筋小胞体分画におけるCK欠損に由来するものと考えられた。以上の結果から、筋小胞体におけるCKM鎖の欠損による筋収縮時のエネルギー代謝の問題が、croマウスの筋脱力と関連していることが推察された。
冠動脈疾患でのmicroRNAプロファイリングと遺伝子発現制御に関する研究

本研究では、冠動脈疾患での動脈硬化進展のメカニズムのうち血管内皮障害と血管炎症に着目した。具体的には、血管内皮前駆細胞(EPC)の分化増殖および免疫担当細胞の活性化、特に、Toll様受容体4シグナル(TLR4)の発現を制御する制御するmicroRNAの解析を行った。その結果、miR-221/222がEPCの分化増殖に関与し、miR-146a/bおよびlet-7iがTLR4シグナルの制御に関与していることが明らかとなった。また、スタチンおよびRAS阻害薬を用いた臨床試験を実施し、アトルバスタチンおよびテルミサルタンの有用性を立証した。EPCでのmicroRNA(miRNA)発現プロファイリングの作成EPCでのmiR-221/222発現とスタチンによる薬効評価CAD群:44例(男性/女性36/8名、平均年齢66±12歳)。対照群:冠動脈病変を有さない22例(男性/女性17/5名、平均年齢64±8歳)。CAD群および対照群の末梢血液からEPCを分離培養し、血中EPC数およびその機能を評価した。TaqMan MicroRNA assayを用いmiR-221/222の発現を定量測定した。また、CAD群を積極的脂質降下療法群(A群、アトルバスタチン10mg/日)と標準的脂質降下療法群(P群、プラバスタチン10mg/日)に無作為割付した。血中EPC数は、CAD群で対照群より低値で、miR-221/222の発現は、CAD群で対照群より高値であった。また、CAD群での血中EPC数とmiR-221/222の発現量には負の相関を認めた。投与12ヵ月後のEPC数は、A群で増加し、P群では変化を認めなかった。また、miR-221/222の発現は、A群で減少し、P群では変化を認めなかった。まとめ:CADのEPCでのmiR-221/222発現は亢進し、その発現はアトルバスタチンにより低下した。これらの結果は、CADでのmicroRNA発現とEPCの分化誘導との関連性を示し、さらに、これらのEPCの分化誘導機能に対するスタチンの有用性を示唆した.冠動脈疾患の末梢血単核細胞でのmiR-146a/bの挙現とスタチン・RAS阻害薬による薬効評価背景:冠動脈疾患(CAD)の発症には、単球・マクロファージなどの免疫担当細胞でのToll様受容体4(TLR4)シグナルの活性化が関与していると考えられている。近年、microRNA(miR)-146family(miR-146a/b)が、TLR4下流シグナル分子の発現を調節因子として注目されている。目的と方法:CAD群および非CAD群でのTLR4およびmiR-146a/bの発現を比較検討した。また、無作為臨床試験により、TLR4シグナルに対するRAS阻害薬とスタチンの効果を検証した。CAD群(n=66)および非CAD群(n=33)の末梢血液から遠心分離法により単球を分離した。Real-time PCR法により、miR-146a/bおよびTLR4 mRNAを定量測定した。また、FACSscanを用いてTLR4蛋白を定量測定した。CAD群は、ARB投与群(ARB+スタチン)およびACEI投与群(ACEI+スタチン)にランダム化し無作為臨床試験を実施した。結果:CAD群でのmiR-146a/bおよびTLR4 mRNAの発現は、非cAD群より高値であった(P<0.01)。また、miR-146a/bとTLR4 mRNAの発現には、正の相関を認めた。投与6ヵ月後のmiR-146a/bとTLR4の発現は、ARB群およびACEI群でともに減少し、これらの変化は、ARB群で有意に大きかった(P<0.05)。また、6ヵ月後のmiR-146a/bおよびTLR4 mRNAの発現は、心血管イベント合併群で非合併群と比較して有意に高値であった(P<0.05)。結語:単球でのmiR-146a/bおよびTLR4の発現の亢進は、CAD発症の一因であることが示唆された。また、ARBとスタチンとの併用療法は、miR-146a/bおよびTLR4の発現を抑制し、ARBおよびスタチンが持つ抗動脈硬化作用のメカニズムの一つと考えられる。背景:冠動脈疾患(CAD)の発症には、単球・マクロファージなどの免疫担当細胞でのToll様受容体4(TLR4)シグナルの活性化が関与していると考えられている。近年、let-7familyに属するmicroRNA、let-7iが、TLR4の発現を直接調節するmicroRNAとして注目されている。

目的と方法:ヒトTHP-1細胞を用いたlet-7iトランスフェクションモデルを作成し、let-7i万機能解析を行った。CAD群および非CAD群でのTLR4およびlet-7iの発現を比較検討した。また、無作為臨床試験(アトルバスタチンvs.ロスバスタチン)により、TLR4シグナルに対するストロングスタチンの効果を検証した。CAD群(n=98)および非CAD群(n=48)の末梢血液から遠心分離した末梢血単核細胞(PBMCs)を対象とした。Real-timePCR法により、let-7iおよびTLR4mRNAを定量測定した。また、FACSscanを用いてTLR4蛋白を定量測定した。CAD群は、アトルバスタチン群(10mg/日)およびロスバスタチン群(2.5mg/日)にランダム化し無作為臨床試験を実施した。結果:let-7iトランスフェクションモデルにより、let-7iは、TLR4の発現に必須な因子であることが明らかとなった。CAD群でのlet-7iの発現は、非CAD群より低値であった(P<0.01)。一方、CAD群でのTLR4(mRNAおよび蛋白)の発現は、非CAD群より高値であった(P<0.01)。投与12ヵ月後のアトルバスタチン群でのlet-7iの発現は増加し、TLR4の発現は減少した。一方、ロスバスタチン群でのlet-7iとTLR4の発現は、変化を認めなかった。結語:末梢血単核細胞でのlet-7iの発現低下に伴うTLR4の発現は、CAD発症の一因であることが示唆された。また、アトルバスタチンは、let-7iの発現を介したTLR4の発現を抑制し、アトルバスタチンが持つ抗動脈硬化作用のメカニズムの一つと考えられる。
近接場光によるナノ粒子配列技術の開発

本研究の目的は、容易な製造方法で超細密パターニングを行なうために、型から漏れ出す近接場光などの電場勾配を用いてポテンシャルウェルのパターンを作成し、それをテンプレートにして金属・ガラス・プラスチックなどのナノ粒子群を平面上に一括に配列させる方法を開発することである。申請者らは、波長441.6nmのレーザ光源(金門電気IK4131I-G HeCd 150mW TEM00)と光学部品(オリンパスIX-71・PlanApo100・FLOVEL HCC600)で粒子配列実験装置を作成した。その装置を用いて、純水溶液中に分散する直径200nmのポリスチレンナノ粒子(Polysciences, Inc. Fluoresbrite 17151)を単一粒子で捕捉できることを確認している。本年度は、同粒子配列実験装置で作成したピッチが約800nmの縦縞パターンをテンプレートとしてナノ粒子群を一括に配列させるための条件の検討と実験を行った。縦縞パターンがナノ粒子に及ぼす力は勾配力F_<grad>,散乱力F_<scat>,吸収力F_<abs>の合力とみなせるが、αをナノ粒子の半径とするとそれぞれの力がとり得る最大値の関係はF^<max>_<grad>/F^<max>_<scat>∝F^<max>_<abs>/F^<max>_<scat>∝α^<-3>となり、ポリスチレンナノ粒子においてはF_<grad>>>F_<scat>,F_<abs>と考えて良い。故に縦縞パターンが作るポテンシャルウェルの深さはI,α,ν,nをそれぞれ光強度,ナノ粒子の分極率,溶媒中の光速,溶媒の屈折率とするとU=I|α|/(2νn^2)となり、常温溶媒中でポリスチレンナノ粒子を捕捉するためにはk_b, Tをボルツマン定数,絶対温度とするとU>>k_bT≒3.77×10^<-21>Jを満たす必要がある。実験は出力約10mWのレーザ光を交差させて作成した縦縞パターンを常温純水溶媒中に分散する濃度2.5×10^<-9>%,2.5×10^<-8>%,2.5×10^<-7>%のポリスチレンナノ粒子群に入射して行った。このときポテンシャルウェルの深さはU≒1.98×10^<-16>Jであったが、ナノ粒子群の配列を確認することはできなかった。本研究の目的は、容易な製造方法で超細密パターニングを行なうために、型から漏れ出す近接場光などの電場勾配を用いてポテンシャルウェルのパターンを作成し、それをテンプレートにして金属・ガラス・プラスチックなどのナノ粒子を平面上に配列させる方法を開発することである。平成15年度の研究計画調書の研究計画方法に記した通り、申請者らは、波長441.6nmのコヒーレントなレーザ光源(金門電気IK4131I-G HeCd 150mWTEM00)と光学部品(オリンパスIX-71・PlanApo100・FLOVEL HCC600)で粒子配列実験装置を作成した。その実験装置を用いて、純水溶液中に分散する直径200nmのポリスチレン粒子(Polysciences, Inc.Fluoresbright17151)を蛍光観察しながら一つずつトラップすることに成功しており、光のポテンシャルウェルでナノ粒子が捕捉できることが確認できている。また、粒子配列方法として研究計画調書で提案した干渉縞法・感光材料法・凹凸法のための基礎実験を同実験装置で行い、干渉縞法・感光材料法のために必要な光によるナノオーダの縦縞パターンの作成に成功している。具体的には、フォトレジスト(東京応化TSMR-V90LB)と蛍光材料(Molecular Probes, Inc.FluoSpheres F-8800)でピッチ800nm以下の縦縞パターンをそれぞれ作成、確認できている。現在、作成したパターンにナノ粒子を並べるための条件出しの実験を進めている。縦縞パターンがナノ粒子に及ぼす力は勾配力F_<grad>,散乱力F_<scat>,吸収力F_<abs>の合力とみなせるが、αをナノ粒子の半径とするとそれぞれの力がとり得る最大値の関係はF^<max>_<grad>/F^<max>_<scat>∝F^<max>_<abs>/F^<max>_

<scat>∝α^<-3>となり、ポリスチレンナノ粒子においてはF_<grad>>>F_<scat>,F_<abs>と考えて良い。故に縦縞パターンが作るポテンシャルウェルの深さはI,α,ν,nをそれぞれ光強度,ナノ粒子の分極率,溶媒中の光速,溶媒の屈折率とするとU=I|α|/(2νn^2)となり、常温溶媒中でポリスチレンナノ粒子を捕捉するためにはk_b, Tをボルツマン定数,絶対温度とするとU>>k_bT≒3.77×10^<-21>Jを満たす必要がある。実験は出力約10mWのレーザ光を交差させて作成した縦縞パターンを常温純水溶媒中に分散する濃度2.5×10^<-9>%,2.5×10^<-8>%,2.5×10^<-7>%のポリスチレンナノ粒子群に入射して行った。このときポテンシャルウェルの深さはU≒1.98×10^<-16>Jであったが、ナノ粒子群の配列を確認することはできなかった。