hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経発達におけるセプチンの機能と自閉症・広汎性発達障害との関連性の解析

Sept14は神経組織に大量に存在し、発生過程の大脳皮質の形成過程において必須の役割を果たすことから、小児知的障害・発達障害との関連性が示唆される。本研究ではSept14とSept4について生化学的な相互作用分子スクリーニングを行い、その分子機能の解明を試みた。親和性クロマトグラフィーと質量分析(shotgunLC-MS/MS)を組み合わせる手法で網羅的スクリーニングを実施した結果、細胞骨格系蛋白質のダイナミクス制御において重要な役割を担っている分子を相互作用候補として複数見出した。これらの候補分子の中には神経細胞遊走に関与することがすでに報告されているものもあり、Septinの分子作用機序を解明する上での重要な手がかりとなると考えられる。Sept14はSeptinと呼ばれる細胞骨格関連蛋白質ファミリーのメンバーで、神経組織に大量に存在する。発生過程の大脳皮質の形成過程において必須の役割を果たすことから、小児知的障害・発達障害との関連性が示唆される。実際、胎生期マウスの脳室帯細胞でのSept14やSept4の発現抑制を行うと、皮質錐体神経細胞の移動異常が生じた。その結果、Sept14発現抑制細胞が局在の異常、さらに神経細胞の形態的な異常も観察された。一方、神経幹細胞の分化過程はSept14の発現抑制による影響を受けなかった。さらに、Sept14とSept4の機能を分子レベルで解明するために結合蛋白質の探索を行い、アクチン細胞骨格を制御する蛋白質であるdrebrinとcofilinを見出した。胎児期のマウス脳でderebrinを発現抑制すると、Sept14やSept4の発現抑制の場合と非常に良く似た表現型が観察され、神経細胞の移動と形態の異常が観祭された。Sept8は、ラット脳の発達に伴って増加し、成熟マウスでは神経シナプスに存在するSeptinである。Sept8の異常も知的障害や発達障害と関連する可能性がある。そこで、Sept8の神経における生理機能を個体レベルで明らかにすることを目指し、Sept8のノックアウトマウスの作成を行い、これまでにfloxedマウスの作成を完了した。現在、神経組織特異的なコンディショナル・ノックアウトマウスを作成中である。他のセプチンSept9の神経組織特異的なコンディショナル・ノックアウトマウスも作成中であり、順調な経過を辿っている。Sept14は神経特異的な発現を示すSeptinファミリー分子のひとつである。神経発達障害におけるセプチンの異常発現が報告されていることから、セプチンは神経発達に重要な役割を果たすと考えられる。我々はこれまでの研究で1)Sept14が皮質神経細胞のradial migrationに関与する、2)Sept14のC末端領域がSept4と生理条件下にて相互作用しうることを見出している。本研究ではSept4も同様に皮質神経細胞遊走に関与する可能性を検討した。子宮内遺伝子導入法を用いてマウス胎児の脳室帯細胞でのSept4の発現抑制を行った結果,Sept14発現抑制時と同様に皮質神経細胞の局在異常が認められた。次に両分子の相互作用の生理学的意義を検討した。Sept14のKnockdown & Rescue実験を行った結果、Sept4との相互作用領域を欠失した変異型Sept14ではrescue効果が認められなかった。またSept14のSept4結合領域を脳室帯細胞で過剰発現させた結果、皮質神経細胞の局在異常が観察された。これらの結果から、Sept14およびSept4はその相互作用を介して神経細胞遊走に関与することが示唆された。さらに我々はSept14およびSept4が1)遊走中の皮質神経細胞の先導突起形成、および2)培養海馬神経細胞の神経突起伸張に関与することを見出した。興味深いことに皮質神経細胞の先導突起形成と細胞遊走との関連性がすでに報告されている。よってSept14およびSept4は先導突起の形成を介して細胞遊走に関与することが推測される。細胞骨格関連GTP/GDP結合蛋白質であるSeptinファミリーの分子機能についての知見は多くはなく、細胞遊走という現象においてSeptinがどのような作用機序で関与しているかは不明である。私共はこれまでにSept14およびSept4を含むSeptinファミリーの一部の分子が、大脳皮質発生時の興奮性神経細胞遊走に機能的に関与することを見出している。本研究では興奮性神経細胞遊走に関与するSeptin分子であるSept14さらにSept4について生化学的な相互作用分子スクリーニングを行い、その分子機能の解明を試みた。

親和性クロマトグラフィーと質量分析(shotgun LC-MS/MS)を組み合わせる手法で網羅的スクリーニングを実施した結果、細胞骨格系蛋白質のダイナミクス制御において重要な役割を担っている分子を相互作用候補として複数見出した。これらの候補分子の中にはcoffilin, drebrin, filaminなど神経細胞遊走に関与することがすでに報告されているものもあり、Septinの分子作用機序を解明する上での重要な手がかりとなると考えられる。一方、Sept8は、ラット脳の発達に伴って増加し、成熟マウスでは神経シナプスに存在するSeptinである。Sept8の異常も知的障害や発達障害と関連する可能性がある。そこで、Sept8の神経における生理機能を個体レベルで明らかにすることを目指し、Sept8のノックアウトマウスの作成と包括的解析を遂行中である。これまでに組織染色により、大脳皮質における血管走行の異常があることを見出している。また、Sept8は大脳皮質発生時の神経細胞移動には無関係と考えられた。23年度が最終年度であるため、記入しない。
リチウム同位体分離用コアシェル型吸着剤の開発

核融合ブランケット材としての90 %濃縮6リチウムの大量製造を目的として,置換クロマトグラフィー法の研究に取り組み,コアシェル型吸着剤の調製と分離性能解析手法の開発を行った.粒径5 μmのコアシェル型担体にBenzo-15-crown-5を液相担持して吸着剤を調製し,内径4 mmのカラムで約4 cmのHETP値を得た.実験データをもとに,供給抜き出しのあるプロセスのシミュレーションを行い,分離パワーを最大とする最適な供給抜き出し割合を評価した.90%濃縮6リチウムを年間100 t生産するための設備は,単純スケールアップによれば,概ね直径50 cmのカラムが35本必要であることがわかった.平成26年度の最も重要な課題は,粒子径が数十μm程度のコアシェル型の担体の調製である.調製方法として,無孔質のシリカビーズ上にゾルゲル法により多孔質層を成長させる方法に取り組んだ.無孔質シリカビーズとして粒径が大きなものの入手が難しかったため,多孔質シリカビーズ(富士シリシア製,クロマトレックスMB,50μm)を熱処理して無孔質化して用いた.次に,無孔質シリカビーズ5 g,界面活性剤としてドデシルアミン0.7 g,蒸留水30 gを入れ,さらに分散液の全量が80 mlとなるようにエタノールで希釈した後,これらを十分に混合し,分散液とした.続いて,25°Cの条件下で分散液を撹拌しながらテトラエトキシシラン0.2 gを加えた.撹拌は20時間継続し,テトラエトキシシランを加水分解させて粒子表面に多孔質層の前駆体を形成した.濾過回収した前駆体を,50 mlのエタノールに分散させ,70°Cで1時間撹拌し,ドデシルアミンの一部を溶解除去した.これを濾過回収し,550°Cで3時間焼成した.調製した担体を,走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ,多孔質層の形成が確認できなかった.ゾルゲル法の各種条件を変更して取り組んだが,これまでに多孔質層を形成できていない.分離性能解析手法の開発については,置換クロマトグラフィーの物質移動過程をバルク流れ,境膜移動,粒内拡散,吸脱着から成ると仮定し,これら全ての素過程を境界条件により接続して直接計算するモデルを開発した。この計算コードにより,コアシェル型担体の多孔質層の厚さをパラメータとして分離性能評価を行い,コアシェル型担体の採用によりHETPを低減できることを示した.平成26年度からコアシェル型の担体の調製に取り組んだが,吸着剤の担体として利用可能なものはできなかった.そこで,市販のUHPLC用のコアシェルビーズから利用可能なものを選定した.具体的には,Phenomenex社製のKinetex 5 μm,HILICを採用した.対照試料として,全多項性のPhenomenex社製Luna 5 μm,HILICも用意した.大環状化合物としては,Benzo-15-crown-5(B15C5)を選定した.多孔質シリカビーズへのB15C5の担持について予備実験を行った.水に非混和で,B15C5を十分に溶解する溶媒として,キシレンを選定した.典型的な調製方法は次の様である.まず,0.1 gのB15C5を0.5 gのキシレンに溶解させる.キシレンを適量のアセトンで希釈する.次に,5 gの多孔質シリカビーズを,B15C5のキシレン溶液に浸し,含浸させる.最後に,ロータリーエバポレータを用いて40°Cに加熱し,不要なアセトンを除去する.多孔質シリカビーズとしては,粒径が60,100,250 μmの3種類を用いた.調製した吸着剤を,内径4 mm,有効充填長250 mmのカラムに詰めて,LiCl水溶液を用いて,前端分析法により,充填カラムのHETP値を評価した.HETP値は,吸着剤の粒径とともに小さくなり,粒径が60 μmの場合に0.16 mmと非常に小さな値を得た.以上により,吸着剤の調製技術が整えられた.平成26年度に開発した数値シミュレーションによれば,粒径5 μmのコアシェル粒子を用いた場合,HETP値は10 μmと評価された.実験上は,微小粒子を充填した充填塔に特有の軸方向混合が影響を及ぼし,数値シミュレーションの予測値に比べて大きな値になると考えられる.平成28年度には,粒径5 μmの吸着剤を調製し,実験によりHETP値を得る予定である.コアシェル型の担体を新規に調製することに時間がかかり,結局,実用に耐えるものは調製できなかった.コアシェル型シリカビーズとしては,市販のものを選定して用いることとし,コアシェル型吸着剤を完成させる.平成27年度は,使用できそうなコアシェル型シリカビーズを選定し,調達できたことと,シリカビーズへのB15C5の担持方法を確立できたことから,平成28年度内に,コアシェル型吸着剤を完成させる目処が十分に立ったため,自己判定として,「やや遅れている」とした.

コアシェル型多孔質シリカ担体としてPhenomenex社製のKinetex 5 μm HILICを,対照試料の全多孔質担体として同社のLuna 5 μm HILICを用い,大環状化合物としてBenzo-15-crown-5(B15C5)を選定し,B15C5をキシレンに溶解し,担体の細孔に含浸保持させて,リチウム同位体分離用吸着剤を調製した.調製した吸着剤を,内径4 mm,有効充填長250 mmのカラムに充填して,0.5 mol/LのCH3COOLi水溶液を0.5 mL/minの流量で流し,前端分析法によりHETP値を評価した.液相担持したB15C5が溶出してしまい,カラムの性能は繰り返し使用とともに低下した.最初の操作時におけるコアシェル型および全多孔質型の吸着剤充填カラムのHETP値は,どちらも約4 cmとなり,既存の吸着剤に対して優位な値とはならず,また,担体構造の差も認められなかった.改善策として,シラノール基を介して担体とB15C5を化学的に結合し,耐久性の高い吸着剤とすることが考えられる.開発した計算コードを用いて,供給抜き出しのあるプロセスのシミュレーションを行い,供給抜き出しの割合が分離性能に及ぼす影響を評価した.分離性能の指標として分離パワーδUを計算した.内径8 mmのカラムに直径が350 μmのクリプタンド樹脂を充填し,濃度が0.5 mol/Lの酢酸リチウム水溶液を0.5 mL/minで流し,吸着帯長さを1 m,抜き出しを展開2 m毎に行う条件において,抜き出し割合が12%の場合に分離パワーが最大値0.14 mmol/hとなった.90%濃縮された6Liを年間100 t生産するためには,単純スケールアップすると,直径50 cmのカラムが35本必要であることがわかった.核融合ブランケット材としての90 %濃縮6リチウムの大量製造を目的として,置換クロマトグラフィー法の研究に取り組み,コアシェル型吸着剤の調製と分離性能解析手法の開発を行った.粒径5 μmのコアシェル型担体にBenzo-15-crown-5を液相担持して吸着剤を調製し,内径4 mmのカラムで約4 cmのHETP値を得た.実験データをもとに,供給抜き出しのあるプロセスのシミュレーションを行い,分離パワーを最大とする最適な供給抜き出し割合を評価した.90%濃縮6リチウムを年間100 t生産するための設備は,単純スケールアップによれば,概ね直径50 cmのカラムが35本必要であることがわかった.本研究計画の最も挑戦的で困難な課題は,平成26年度に予定していた粒子径が数十μm程度のコアシェル型の担体の調製である.当初の計画より,平成26年度に担体調製を達成できなければ,平成27年度に延長して取り組むことを想定していたため,遅れを取り戻す余地は十分に残されている.一方,もう一つの主要課題である分離性能解析手法の開発は,先行して進捗し,当初の目的をほとんど達成している.以上の事情により,やや遅れているとの自己評価とした.平成27年度までの進捗状況で述べたように,コアシェル型吸着剤を完成させる目処はたった.また,置換クロマトグラフィー法によるリチウム同位体分離の数値シミュレーションについては,既に完成させ,計算結果を利用しながら実験を進めているところである.したがって,このままの進捗で,当初予定していた研究内容を平成28年度内に完了できる見通しである.平成28年4月に参加したトリチウムの国際会議(TRITIUM2016,米国,チャールストン)において,本研究の進捗を報告したところ,ドイツ・カールスルーエ研究所の研究者から反響があり,今後,情報交換を進めるとともに,リチウム同位体分離への置換クロマトグラフィー法の適用性を評価してゆくこととなった.28年度が最終年度であるため、記入しない。
価値多元化社会における憲法裁判の<ゆらぎ>の解明

本研究は、ドイツ連邦憲法裁所における<ゆらぎ>と見られる判例傾向を分析することを主たる目的とした。具体的には、基本法の重要な解釈が問題になっており、かつ国民の注目度も高いにも関わらず、あえて憲法解釈の重要な部分についての判断を回避する判例傾向を、他国と比較しながら研究した。研究の結果、価値多元化社会において憲法裁判所が一定の判断を下すこと自体に大きな価値対立を生むといったような困難さが、このような傾向を引き起こしている原因ではないかという結論に至った。今年度は、(1)ドイツ連邦憲法裁判における<ゆらぎ>と考えられる最近の判例傾向の分析及び(2)(1)の判例における判断手法について研究を実施した。とくに十字架判決、イスラム教の女性教師のスカーフ判決、L-E-R判決などを中心として、連邦憲法裁判所の判例だけではなく、下級審である専門裁判所などの諸判例についても遡り総合的に検討を加えた。同時に判例評釈及び論文などについても研究の対象とした。・(1)については、結論には至っていないが、価値多元化社会において憲法裁判所が一定の判断を下すこと自体に大きな価値対立を生むといったような困難さが、このような<ゆらぎ>を引き起こしている原因ではないかという仮説を立てながら、検証を実施した。これに対して、日本の判例についても比較検討したが、より総合的な研究は次年度に進めていく予定である。また(2)において、とくに憲法裁判における和解について、訴訟法、裁判所法、専門裁判所の実務などの観点からも調査・研究を行った。本年度は、ユング・フライハイト判決で問題となった新聞社に赴き、インタヴューを実施し、その和解プロセスを調査した。また連邦憲法裁判所によって誘導されたスカーフ判決及びL-E-R判決についての州の立法状況についても調査し、その動向を探った。この分野についても日本との比較が必要であるが、次年度に実施することとする。今年度は、前年度に研究したドイツ連邦憲法裁判における<ゆらぎ>と考えられる最近の判例傾向分析の中から、L-E-R判決についての成果を『ドイツの憲法判例III』に掲載した。とくに和解判決とブランデンブルグ州改正学校法には、かなりの類似性が見られ、連邦憲法裁判所での和解が州議会の立法活動に一定のインセンティブを与えたと言わざるを得ず、今後、和解という手法が頻繁に利用されることになると、連邦憲法裁判所の中で、対立する政治主張について交渉と妥協が行われ、連邦憲法裁判所が政治の斡旋者的役割を果たすことになるおそれがあることを指摘した。またユンゲ・フライハイト判決を中心として、憲法裁判所の判例傾向として見られたスティグマの問題について、憲法理論研究会にて報告を行った。さらに日本の憲法裁判における和解の位置づけを中心として検討を加えるとともに、具体的審査制及び抽象的審査制の異同を踏まえた憲法裁判における和解の位置づけについて研究を行った。同時に一般的に和解が許されないとされている抗告訴訟における和解の許容性について、憲法裁判における和解との関係で再検証した。最後にドイツ連邦憲法裁判所における<ゆらぎ>が、他国の憲法裁判制度との対比で、どのように意義付けられるかについて検証し、価値多元化社会において憲法裁判所が一定の判断を下すこと自体に大きな価値対立を生むといったような困難さが、このような<ゆらぎ>を引き起こしている原因ではないかという結論に至った。
ネパール中世王宮建築の設計モデュールの研究

この研究は、ネパールの中世王宮建築におけるチョク建築および層塔の平面・立面の寸法構成を検討し、王宮建築の設計モデュールを明らかにするものである。研究実績は以下の通りである。パタン王宮のムール・チョク、スンダラ・チョク、アガン・マンディールを例に、れんが壁厚およびれんがと木が接する位置などに着目し、王宮建築の各部寸法を写真測量による実測図から抽出し、整理した。同時に"The Stupa Its Religious,Historical Architectural Significance""Heritage of the Kathmandu Valley"などの文献を収集した。チョク建築の平面については、14世紀末以来の基準寸法による基準格子に基づくことなど、ネパール建築の平面設計概念を初めて明らかにした。しかし、平面設計と立面・断面寸法との関係については不明な点が多い。このため、上記のデータをもとに、チョク建築の立面寸法と基準尺の検討を行なった結果、【.encircled1.】柱等に刻まれた木彫の細部寸法と外壁のれんが寸法の検討が、基準尺や立断面の寸法構成にも重要な意味を持つ、【.encircled2.】これが新たな高さ方向への設計方法解明の鍵となる、ことなどが分ってきた。いっぽう、チョク建築とチョク建築の上部に載る層塔との基準寸法の関係を明らかにするため、パタン王宮ブジャー・マンデールの形態を復原し、その寸法構成を検討し、設計モデュールの解明を試みており、結果の一部はすでに建築学会大会学術講演梗概集に発表した。
宮城沖マントル内における蛇紋岩化域のマッピング-アスペリティ分布の起源-

今年度前半は,昨年度得られた「宮城県沖および福島県沖のマントルウェッジ内速度構造不均質とプレート間固着・大地震発生域の広がりとの関係」についての研究発表を国内外で行うことにより,さらに議論を深めることに重点を置いた.その後,これまでプレート境界の位置を示す指標として用いていた震源メカニズム解を,3次元速度構造を用いた波線追跡によって求めるように,プログラムの改良を行った.その結果,プレート境界で発生していると陸上観測によって推定されている地震について,昨年度までの1次元速度構造を用いて推定していたメカニズム解に比べ,速度イメージから推定されるマントルウェッジ・海洋性地殻の速度境界の傾斜角により近いメカニズム解を得ることが出来た.このことから,昨年度得られていた速度構造イメージおよびプレート境界面の推定位置が精度よく求められていると判断し,マントルウェッジの速度構造分布とプレート間固着の関係および3次元速度構造から推定したメカニズム解分布について、学術誌に投稿し、掲載された.また,自然地震データのみならず、人工地震のデータをも3次元速度構造推定に用いるため、データ処理およびプログラムの改良を行った.人工地震探査データに対する走時遅れ補正値の見積もりとしては、震源を海底に仮想的に移動させることと、震源直下の堆積層による走時遅れの値を周囲の海底地震計直下における補正値の補間によって得ることでほぼ説明可能であり、この補正値を用いることで、自然地震データと統合処理できることを示すことが出来た.統合処理の結果、これまで自然地震データのみを用いて推定していた速度構造では、人工地震におけるPnの走時を説明できないことが明らかとなった.また,自然地震と人工地震をともに用いた構造推定を行う際には、自然地震データのみを用いた解析を行う場合以上に初期速度構造依存が大きいことがわかった.宮城県沖および福島県沖における2004年から2005年までの海底地震観測データを用いて,陸上観測点におけるデータと統合処理することにより,海底下に位置するプレート境界周辺の詳細な速度構造を推定した.拘束条件およびデータの重み付けを工夫することと,解析手法としてdouble-difference tomography法を適用することにより,これまで海域において困難であったS波速度構造の推定,およびVp/Vsの空間変化の検出に初めて成功した.また,震源再決定結果からは,プレート境界面を想定させるような明瞭な面をなす震源分布が得られた.これらの震源分布から,プレート境界の形状がこれまで以上に詳細にイメージできた.震源分布を元に作製したプレート境界面を用いて,海陸プレートの識別を行い,それぞれの速度構造を解釈した.その結果,沈み込む海洋地殻については,全体的に高Vp/Vsで特徴付けられること,過去の宮城県沖地震の本震周辺のみ低Vp/Vsであることが明らかとなった.このことは,沈み込む海洋性地殻の中に速度構造不均質が存在することを明瞭に示す結果であるとともに,その不均質とプレート境界における地震発生との関連を示唆する.一方,陸側プレートのマントルウェッジに着目すると,1978年および2005年の宮城県沖地震震源域が低Vp/Vsであること,福島県沖においてはマントルウェッジ先端部が高Vp/Vsとなっている.この結果は,宮城県沖地震震源域におけるマントルウェッジの非蛇紋岩化および福島県沖マントルウェッジの先端部の蛇紋岩化を反映したものと考えられ,宮城県沖に比べて大きな地震が発生しない福島県沖では,先端部の蛇紋岩化によって破壊域の広がりが制限されていると解釈できる.このように,本研究で立てていた「蛇紋岩化していないマントルウェッジ領域と接するプレート境界が大地震発生域となる」という仮説の検証に前進した.今年度前半は,昨年度得られた「宮城県沖および福島県沖のマントルウェッジ内速度構造不均質とプレート間固着・大地震発生域の広がりとの関係」についての研究発表を国内外で行うことにより,さらに議論を深めることに重点を置いた.その後,これまでプレート境界の位置を示す指標として用いていた震源メカニズム解を,3次元速度構造を用いた波線追跡によって求めるように,プログラムの改良を行った.その結果,プレート境界で発生していると陸上観測によって推定されている地震について,昨年度までの1次元速度構造を用いて推定していたメカニズム解に比べ,速度イメージから推定されるマントルウェッジ・海洋性地殻の速度境界の傾斜角により近いメカニズム解を得ることが出来た.このことから,昨年度得られていた速度構造イメージおよびプレート境界面の推定位置が精度よく求められていると判断し,マントルウェッジの速度構造分布とプレート間固着の関係および3次元速度構造から推定したメカニズム解分布について、学術誌に投稿し、掲載された.また,自然地震データのみならず、人工地震のデータをも3次元速度構造推定に用いるため、データ処理およびプログラムの改良を行った.人工地震探査データに対する走時遅れ補正値の見積もりとしては、震源を海底に仮想的に移動させることと、震源直下の堆積層による走時遅れの値を周囲の海底地震計直下における補正値の補間によって得ることでほぼ説明可能であり、この補正値を用いることで、自然地震データと統合処理できることを示すことが出来た.統合処理の結果、これまで自然地震データのみを用いて推定していた速度構造では、人工地震におけるPnの走時を説明できないことが明らかとなった.また,自然地震と人工地震をともに用いた構造推定を行う際には、自然地震データのみを用いた解析を行う場合以上に初期速度構造依存が大きいことがわかった.
高齢がん患者の治療後サルコペニア・フレイル：新たな退院後リハビリテーションの開発

本邦を含め先進各国では高齢がん患者が増加しており、治療成績の向上が喫緊の課題である。高齢がん患者の治療成績(アウトカム)は生存期間だけでなく、健康寿命の延伸も重要である。高齢がん患者において、がん治療によって治療後に健康寿命の延伸を阻害するサルコペニア、フレイルが誘発されていると考えられるが、頻度や要因は明らかになっていない。本研究の目的は、根治療法後のサルコペニア、フレイルの有病率とがんを罹患していない同年代の高齢者の有病率を比較すること、根治療法後のサルコペニア、フレイル発生とがん治療や退院後の生活習慣との関係を明らかにすることである。
糸球体腎炎の病勢進展における血液凝固系の関与・実験的ならびに臨床的研究

糸球体腎炎や、膠原病においては、その発症に免疫機序が関与していると考えられている。これら疾患での組織病変の悪化進展には免疫反応の結果引き起される補体系の活性化や、白血球の遊走とともに、血液凝固系の活性化も重要視されている。私共は、血液凝固の際に起こる血小板の放出反応に注目し、これら疾患患者の血漿中、ならびに血小板中のセロトニンの測定を、高速液体クロマトグラフィーで行った。今回用いた方法では、1100pmoleの範囲で再現性よく測定が可能であった。測定方法は、まずクエン酸採血を行い、遠心して血小板浮遊液(PRP)と血漿を分離採取した。PRPは血小板数20万ケ/μlに調製して、その400μlに除蛋白液として6M過塩素酸液20μlを加えて、遠心後の上清を測定に供した。血漿についても、同様に除蛋白を行った上清について測定した。各疾患における血小板【10^5】ケ当りのセロトニン含量は、SLEで0.26±0.12pmole,他の膠原病では0.34±0.11,IgA腎症で0.44±0.17,非IgA腎炎では0.34±0.10,健常人では0.34±0.09であり、SLEで有意の低い値を、IgA腎症で高い値を示した。SLEの一部症例では、疾病の活動期に一致してセロトニン値が低く、病勢の改善につれて高い値を示すようになった。他の疾患群ではこのような相関は認めなかった。また、血漿中のセロトニン値はいずれも低値を示し、同時に測定したβ-トロンボグロブリン値も上昇を示した例はなかった。次に、外から血小板にセロトニンを加え、60分後のセロトニンの取り込み量を各疾患について検討したが、いずれの疾患群も健常人より高い取り込みを示した。セロトニンは小分子であり、血中に放出されても尿中へ速かに排泄される可能性が高い。SLEや、IgA腎症でみられた異常値の発症機序を解明するには、尿中排泄量を合せ検討する必要があると思われる。
強度近視における網脈絡膜萎縮と脈絡膜循環量の関係

[研究の目的]ヒト強度近視眼の脈絡膜循環をインドシアニングリーン赤外蛍光眼底造影法を用いて測定し、近視性網膜脈絡膜萎縮への脈絡膜循環の関与を検討した。[対象及び方法]屈折度が-8.00D以上の強度近視眼を対象にした。手始めとして本年度は近視性網膜脈絡膜萎縮病変の中でも、豹紋状眼底・Lacquer crack lesion・血管新生型黄斑部出血の3者について検討した。上記の病変に対してインドシアニングリーン赤外蛍光眼底造影法(IA)を施行し、従来のフルオレセイン蛍光眼底造影法(FA)と対比・検討し、また対照として正視眼・弱度近視眼とも比較した。[結果・結論]1.正視眼・弱度近視眼では多くの場合、後極部に脈絡毛細管板由来と思われるベール状の背景蛍光を認め、そのため脈絡膜中・大血管の陰影は比較的不明瞭であった。2.豹紋状眼底では、多くの場合後極部に脈絡毛細管板由来と思われるベール状の背景蛍光を欠き、脈絡膜中・大血管の陰影は明瞭であった。また黄斑部に低蛍光領域を有するものもみられ、脈絡毛細管板の障害を示唆する症例もみられた。3.Lacquer cracklesionは、FAでは全例過蛍光を呈するが。IAでは多くの場合造影後期に低蛍光を示し、その範囲も広いものがあり、脈絡毛細管板の障害程度の把握に有用であった。4.活動期の血管新生型黄斑部出血は、FAでは全例脈絡膜新生血管からの蛍光漏出がみられたが、IAでは約80%で脈絡膜新生血管を検出できた。さらに蛍光漏出の程度にも差がみられ、活動性の評価に有用であると思われた。
バイオテクノロジーによる菌根性イグチ類の育種技術の開発

1.ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチの3種のイグチ類の菌根性きのこの培養菌糸体からプロトプラストの調製方法を開発した。2.ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチのプロトプラストの培養方法を開発した.この際通常プロトプラストの培養に使われる寒天が良くないことを明らかにし、その代わりにゲランガムが良いことを示した。3.ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチの培養に対する培地成分、培養温度など各種条件の影響を合成培地を用いて明らかにした。4.ハナイグチを中心にイグチ類の遺伝資源を26株収集した。5.ハナイグチの11系統のミトコンドリアDNAのRFLP分析によりこれらが3つのグループに分けられることを明らかにした。これはミトコンドリアDNAの大きさの違いによる分類とも一致した。6.ヌメリイグチのプロトプラスト再生株に形態変異や酸化酵素活性の変異が表われ、これらの間に関連性があることを明らかにした。7.ヌメリイグチの細胞学的な性質を明らかにした。8.以上の知見から、プロトプラストや交配を用いることによりヌメリイグチの育種が可能なことが明らかになった。9.アカマツの無菌的に育成した実生に、ヌメリイグチ、ハナイグチの菌根を合成することに成功した。10.イグチ類のキアミアシイグチから、新しいマクロライドフェノール性物質を抽出し構造決定した.又、菌根菌のケロウジからはこれまでにない新しいタイプの抗細菌性物質を抽出し、構造を決定した。1)菌株の収集を進め、ハナイグチ、ヌメリイグチ、アミハナイグチなど約20菌株の収集を行った。現在継代培養を行って保存しているが、超低温保存の検討を始めた。そのための準備として-140度まで冷えるフリーザ-を購入した。2)イグチ類の培養法の改良を行うために、ハナイグチを中心に培養法の検討を進めており、特に、合成培地の検討を進めている。太田の開発した培地は天然成分を含む浜田培地や馬鈴薯・デキストロース培地よりも成長が良いため、さらに太田の培地の成分の検討を加えた。その結果、糖源などで改良を加えることが出来た。プロトプラスト調製法に関し、ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチに関し酵素の種類、酵素の処理の数条件、菌糸体の培養方法の検討を行い、良好な条件を求めた。3)プロトプラストの培養法に関しては、ヌメリイグチ、ハナイグチについて太田の開発した培地を主として用い、培養を数度試みたが良好な結果が得られなかった。4)アイソザイム分析に関してはイグチ類に比べて成長の速いシイタケを用い、エステラーゼの分析法を確立した。本実験、プロトプラスト実験に必要な低温恒温水槽を購入した。5)ミトコンドリアDNAの簡易抽出法として、精製ミトコンドリアから抽出する方法を検討し、比較的良好な条件を見いだした。本法を用いると短時間で、ハナイグチのミトコンドリアDNAのRFLP分析が可能になった。さらに特定領域の分析を進めるための準備としてPCRを購入した。6)きのこ類子実体を中心にテルペンの分析法を開発した。7)カラマツの種子の選定を行い、無菌的な実生の育て方の検討を始めた。1)菌根菌のハナイグチ、ヌメリイグチ、カラマツベニハナイグチ、ホンシメジなどの野生の11菌株の収集を行い、保存した。2)ハナイグチ、ヌメリイグチ、アミハナイグチの合成培地による培養法の検討を行い、pH、炭素源、窒素源などでそれぞれのきのこに適する条件を決定した。

3)ハナイグチ、ヌメリイグチ、アミハナイグチのプロトプラスト調製法と培養法を検討し、それぞれのプロトプラストの培養が可能になった。これによりプロトプラストの利用による変異株の分離や一核化、交配株の作製などの可能性が開けた。結果の一部は日本菌学会第41回大会で発表した。4)アイソザイムの分析について予備的検討を行った。5)ハナイグチ11株のミトコンドリアDNAのRFLP分析を行い、それらが大きく3つのグループに分かれることを見出した。この結果についても一部を日本菌学会第41回大会において発表した。6)菌根菌のケロウジを中心にテルペン成分の検討を行い、又、ハナイグチについて予備的検討を行った。7)イグチ類の宿主として重要なカラマツやアカマツの種子の発芽試験、菌根合成試験に用いる培地支持体の検討を行った。イグチ類の菌根性きのこのヌメリイグチについて、プロトプラスト再生株の変異性を検討した結果、腐生性きのこに比べて顕著な変異が見られた。菌叢形態の変異で再生株は数グループに分かれた。スポットテストによる酸化酵素活性の検討でも変異が見られ、形態変異との間に関連性が観察された。ヌメリイグチの液体培養のコロニーの細胞の核数を検討した結果、一つの巨大コロニーに細胞当たり1核から数核のものまで存在することが明らかになった。しかも核数の分布に菌株間の違いが認められた。このことはヌメリイグチの1核化が比較的容易に行えることを示唆している。又、プロトプラスト再生株を分離と培養を繰り返して1核のみからなるコロニーも得られた。以上の知見は、培養菌糸から出発してプロトブラストや交配を利用するヌメリイグチの育種が可能なことを示している。ハナイグチやアミハナイグチでも同様に可能と思われる。アカマツの無菌的に育成した実生にヌメリイグチ、ハナイグチを接種して菌根の合成に成功した。ハナイグチはカラマツ林のきのことして知られているが、アカマツとも菌根を形成することが分かった。この菌根合成の際にパーライトがバーミキュライトと培地基材として同等以上の成績を示した。ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチの菌根菌の生育の温度依存性を明らかにした。イグチ類のキアミアシイグチから、新しいマクロライドフェノール性物質を抽出し構造決定することができた。又、菌根菌のケロウジからはこれまでにない新しいタイプの抗細菌性物質を抽出し、構造を決定した。
リサイクル材を用いたポーラスセメント複合材の開発に関する研究

種々のリサイクル材例えば、使用済み骨材、煉瓦、歴、木材チップ、再生コンクリート、貝殻及びヤシ油燃料灰等を用いてポーラスセメント複合材パネルを作成し、曲げ試験、圧縮試験、耐久試験、せん断引き抜き摩擦試験等を行った。実験結果に基づき、亀裂応力および限界モーメントを求める新たな式を提案した。短期的及び長期的実験研究の結果、ポーラスセメント複合材パネルはコンクリートや土構造物における構成要素として十分適用可能な能力を有していることが判明した。近年世界的に環境保全,防災保全のためのリサイクル骨材及び建設廃棄物の再利用が注目されている.日本でもリサイクル材料の処理に毎年多額の経費が費やされている.これらの材料の有効利用を進める上でその材質,強度,経済性,環境への負荷などに対する精密で信頼性の高い手法を発展させなければならないが,未解決の技術的問題が山積しているのが現状である.本研究では,以下の研究項目を通して環境保全,防災保全を考慮したリサイクル材によるポーラスセメント複合材等の性状を研究し,それらが構造物を構成する材料として利用できるような技術の創成を目的としている.1.種々のリサイクル材料を用いたポーラスセメント複合材の強度性状に関する研究2.建設廃棄物を利用したポーラスセメント複合材の透水性及びクリープ試験に関する研究3.リサイクル材を用いた各種構造物に対する設計手法の確4.セメント複合材の最適設計及び有効利用法の確立.種々のリサイクル材例えば、使用済み骨材、煉瓦、歴、木材チップ、再生コンクリート、貝殻及びヤシ油燃料灰等を用いてポーラスセメント複合材パネルを作成し、曲げ試験、圧縮試験、耐久試験、せん断引き抜き摩擦試験等を行った。セメント複合材の曲げに対する亀裂応力や限界モーメントは,設計を行う上で重要なパラメータである.本研究では,ジオグリッド,チキンメッシュ,四角メッシュ,ハイブリッドメッシュの4種類で補強したセメント複合材の曲げによる亀裂応力,および限界モーメントを実験により求め,まず,これら実験結果に基づき,亀裂応力および限界モーメントを求める新たな式を提案した.つづいて,本提案式と従来から提案されてきた式との比較を行い,両者が比較的良い一致を示すことを確認するとともに,提案した単純な式によっても,亀裂応力および限界モーメントを求めることが可能であることを示した.朝夕の温度差による負荷のため,フェロセメント構造物の耐久性の低下が考えられる.このため,フェロセメントを用いた貯水構造物の設計における初期亀裂応力を考える場合,自然条件での気温変動の影響を考慮することが必要である.本研究では,有効鉄筋量を変化させたフェロセメント要素について,加熱および非加熱条件での実験を行い,フェロセメントの亀裂応力における加熱回数と有効鉄筋量との影響を調べた.その結果,初期亀裂応力は,繰り返し回数増加に伴うモルタル強度の上昇のため大きくなった.また,加熱しない場合に比べ,加熱した場合には応力低下が顕著であることが認められた.さらに,亀裂応力は,有効鉄筋量が0.75%から1.5%の間で大きくなった.本研究の結果,最適な有効鉄筋量は0.75%であり,これより有効鉄筋量が大きくなると,モルタルと補強材の間で生じる損失によって,亀裂応力は低下することが明らかとなった.砂質土及び粘性土に対してポーラスセメント複合材およびフォートラック(ジオグリッド)とスタビランカ(ジオオウベン)の2種類のジオシンセティクスを用い,それぞれ6つの垂直応力の下で一連の引き抜き実験を行った。本論文では,砂質土及び粘性土における両ジオシンセティクスの引き抜き強度に関するパラメータとして粘着力とせん断抵抗角を選びこれらを比較した。実験結果から粘性土ではジオオウベンの方がジオグリッドより大きな摩擦抵抗を持つのに対して,砂質土のそれはより低い値となった。両試料に対してジオオウベンの方がジオグリッドよりかなり高い粘着力を示すことが明らかになった。従前よりリサイクル材を用いたポーラスセメント複合材およびフェロセメント材料の研究は,物質開拓とその解析理論的解釈が協力し合う学際的学問領域であったが,その構造物組成である高張力ワイヤーメッシュと十分な大きさの摩擦抵抗を持つセメントモルタルの破壊メカニズムはまだ必ずしも見たらない。本研究では,引抜きテストやせん断テストによるセメント複合材やフェロセメントの破壊メカニズムの解析とそれに伴う応力技術を考察し,せん断、引抜き破壊,モルタル破壊,メッシュ破壊及び付着破壊の状況からフェロセメント要素,新たなセメント複合材開発について報告した。本論文は普通ポルトランドセメントの部分的代用としてのリサイクル材としてヤシ油燃料灰(POFA)を含んだコンクリートの性能に関するいくつかの実験結果を示した。コンクリートに対するPOFAの使用はワーカビリティーのみならずブリージングをも効果的に減少させることを明らかにした。圧縮強度についてはセメントに30%のPOFAを用いても何ら強度損失は生じない。強度性状とともに強い化学的環境のもとでのコンクリートの性状についても言及している。短期的及び長期的実験研究の結果,ヤシ油燃料灰はコンクリート構造物におけるセメント代替材料として十分適用可能な能力を有していることが判明した。十分な摩擦抵抗と伸張力を持つフェロセメントの開発は補強土工法のために重要な補強材であるので補強土工法への適用を念頭に置いてモルタル内の高張力ワイヤーメッシュからなるフェロセメントの性能を検討し、親素材を開発した.

つまり,高張力ワイヤーメッシュによって引張り強度が確保される一方,埋込め土とセメントモルタル間には十分な大きさの摩擦抵抗が発生した.これらの条件は個々にコントロールすることができたので与えられた条件の下で複合材としての最適設計が可能となった.従前よりフェロセメント材料の研究は、物質開拓とその解析・理論的解釈が協力し合う学際的学問領域であったが、その構造物組成である高張力ワイヤーメッシュと十分な大きさの摩擦抵抗を持つセメントモルタルの破壊メカニズムは見たらなかった。本研究では,引抜きテストやせん断テストによるフェロセメントの破壊メカニズムの解析とそれに伴う応力技術を考察し、せん断・引抜き破壊、モルタル破壊、メッシュ破壊及び付着破壊の状況からフェロセメント要素、新たなセメント複合材開発について報告した。また、リサイクル材および表面にチャネルを用いた新複合材の開発について検討した。リサイクル材を用いたポーラスセメント複合材せん断試験を実施し、表面摩擦抵抗を求めた。実験で得られた結果にもとづいて、リサイクル材を用いたポーラスセメント複合材を現地で実用のためには、法面保護に応用した。さらに、リサイクルシステムを構築することで貝殻を効率良く回収できるシステムの構築を目指し、本研究では廃棄された貝殻をコンクリートの骨材として有効利用する方法について研究を行った。具体的には、材料としての適性を判断するために圧縮試験、透水試験、海中耐性試験、浸透試験、単位体積重量測定、静弾性係数試験を実施するとともに、リサイクルシステムを構築するためにコスト面や必要なシステムについての検証を行い、貝殻コンクリートの実用化にむけて材料としての適性、リサイクルシステムの構築の可能性について検証を行った。その結果、貝殻含有率が大きくなるにつれ、圧縮強度と単位体積重量は低下する。貝殻含有率が020%の場合、斜面保護の吹き付け工などの適用基準が15Mpaであり、これに使用できる可能性があることが分かった。また、貝殻含有率が2050%の場合、強度は小さいが単位体積重量が小さく、コンクリート舗装道路とプラスターボードの適用基準強度がそれぞれ1.47MPa、1.72MPaであり、これに利用できる可能性があることが分かった。コンクリートに貝殻を使用することで施工費用を削減することができ、非常に経済的でシェルコンクリートを使用することで貝殻を処理することができる可能性が明らかとなった。
金属酸化物の擬似容量を利用した固体高分子形燃料電池用高耐久性カソード触媒の創製

市販Pt/GCB(黒鉛化カーボンブラック)触媒に、火炎法で合成したNb-SnO2を添加することにより、電流ステップによる電極の電位上昇が大きく抑制された。また、膜電極接合体(MEA)の起動停止模擬試験においても、Nb-SnO2添加により、試験サイクルによる電気化学活性表面積(ECA)の減少が抑制された。試験後の構造・組成解析からもその耐久性向上の原因がカーボン劣化の抑制であることが強く示唆された。今年度に得られた研究成果は以下のようである。1.まず、使用する金属酸化物を、強酸性下で化学的に安定であり、比較的高い擬似容量を示すことから、酸化スズ(主としてSnO_2)に絞り、その作製法を検討した。作製手順として、まず一定量の塩化スズ(SnCl_2)をエタノールに溶解後、水を加え、pH調整し、放置することによりコロイド溶液を作製した。このコロイド溶液をろ過後、得られた試料を溶媒で洗浄し、さらに溶媒を十分に除去するために、空気中で自然乾燥(1日)あるいは真空乾燥(30分)を行った。得られた粉末試料のSEM観察の結果、自然乾燥した試料では、粒子の凝集や増大が起こり、粒径が数μm以上の大きな粒子が多数見られた。一方、真空乾燥した試料では、ほとんどが数十から数百nmの粒径の小さな粒子が観測された。X線回折から真空乾燥した試料は主としてSn_6O_4(OH)_4相から成ることがわかったが、これを空気中で熱処理(400°C、2h)することにより、粒子径はほとんど変化せずに、SnO_2相に変化することが明らかとなった。2.この熱処理した試料を市販のPt/GC触媒と体積比で1:1になるように混合し、電極を作製した。サイクリックボルタンメトリー(0.1 M HClO_4中)では、酸化スズを混合することでPtの電気化学活性表面積はほとんど変化しないが、二重層領域の容量(capacitance)が約1.4倍に増大することを見出した。また、電極に一定のアノード電流を流したときの電位応答を観測した結果、Pt/GC触媒に酸化スズを混合することにより、電位上昇がかなり抑制されることが明らかとなった。これは、酸化スズの混合により電極の容量が増大したためであり、燃料電池の起動停止時におけるカソードの電位上昇を抑制し、カーボン酸化(腐食)を低減する可能性を示唆するものである。今年度に得られた主な研究成果は以下のようである。1.昨年度にゾルゲル法により作製した酸化スズと本研究室で火炎法により作製したアンチモンあるいはニオブをドープした酸化スズについて、市販のPt/GC触媒に体積比で1:1で添加した際の電極特性について比較検討を行った。サイクリックボルタンメトリー(0.1MHCIO_4中)から、火炎法により作製した試料を添加した電極の二重層領域の容量(capacitance)は、無添加のPt/GC触媒のみの電極の約1.8倍を示し、またゾルゲル法による試料を添加した電極よりもさらに約1.4倍大きかった。これは、火炎法による試料の方が一次粒子径が小さいため、比表面積が大きいことと、それぞれの粒子が三次元的に連結した連珠構造で、かつアンチモンあるいはニオブドープのため、電子伝導性が向上し、酸化物の利用率も向上したためと考えられる。また、電極に一定の酸化電流を流したときの電位応答を観測した結果、火炎法による試料の添加により、Pt/GC電極触媒の電位上昇がかなり抑制されることも明らかとなった。2.膜電極接合体(MEA)を作製し、実際の燃料電池の起動停止を模擬し、水素と空気を交互にアノードに導入する実験系を構築し、耐久性試験を行った。市販のPt/CB触媒を用い、まず、標準データとして酸化スズが無添加のMEAについて評価した。水素と空気の導入を30秒毎に切り替えることにより、それぞれセル電圧の上昇と低下が交互に観測され、このサイクルに伴いカソードでのPtの電気化学活性表面積は大きく減少した(500サイクルで初期の30%以下)。また、電流-電位曲線の評価でも、サイクルに伴いセル性能が低下することも観測された。よって、この触媒のみの場合は、アノードでの水素と空気の導入の切り替えにより、カソードでのカーボン担体の酸化(劣化)が大きく促進されることが示唆された。今年度得られた主な研究実績は以下の通りである。前年度に良好な特性を見出した三次元的な連珠構造を有する火炎法で作製したニオブドープ酸化スズ(Nb-SnO2)を市販のPt/カーボンブラック(CB)あるいはPt/黒鉛化カーボンブラック(GCB)触媒と混合(体積比1:1)し、これをカソード触媒層に用いて膜電極接合体(MEA)を作製した。起動停止模擬試験では、水素と空気を自動で30秒毎に交互にアノードに導入するコンピュータ制御のシステムを構築し、耐久性試験(65°C、100%RH)を行った。

その結果、いずれのMEAの場合でも水素と空気の導入の切り替えにより、それぞれセル電圧の上昇と低下が交互に観測された。Pt/CBにNb-SnO2を添加した場合、基本的に無添加のものと同等の良好な初期電流-電位(I-V)特性を示すことがわかった。しかし、起動停止模擬試験では、100サイクル程度までは電気化学的活性表面積(ECA)の減少率がNb-SnO2添加により若干抑えられたものの、顕著な耐久性の向上は見られなかった。一方、Pt/GCBにNb-SnO2を添加した場合は、初期のI-V性能は少し低下したものの、サイクリックボルタモグラムでの二重層電流が2倍に増加した。また、起動停止模擬試験では、200サイクル以降でECAおよび質量活性の減少速度が明らかに抑制され(ECAの半減期は約1.5倍向上)、Nb-SnO2の添加効果が実証できた。さらに、試験後のMEAのSEM、EDX、ラマン分光分析により、触媒層の薄層化やカーボン担体の劣化が抑制され、Ptバンドの電解質膜内部への広がりも抑制されることを見出した。これらの結果は、Nb-SnO2の疑似容量がカソードの電位上昇を抑制し、カーボン劣化を抑制したことを強く示唆している。燃料電池の起動停止を模擬した新たな実験系の構築にある程度時間を費やすとともに、水素、空気の導入の切り替えを、人為的な要因による実験誤差を防ぐために、手動からコンピュータ制御による自動切り替えに変更することとし、準備を進めたため予定以上に時間を要した。現在はそれもほぼ完了したので、次年度にはすぐに自動切り替えによる実験系にてそれぞれのセルの比較検討を行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。三次元的に連珠構造を有する火炎法で作製したニオブドープ酸化スズ試料を中心に、まず、その効果を最大限に引き出すために、作製時の熱処理条件等も検討し、その試料の微細構造、比表面積が電極の擬似容量、レート特性や、電位上昇の抑制に及ぼす効果を検討し、最適化を図る。そして、その試料を用いてMEAを作製し、自動化した実験系で、燃料電池の起動停止模擬試験を行う。カソードのPtの電気化学的表面積やMEAの電流-電位曲線の変化を測定するとともに、カソードでの二酸化炭素の発生量や触媒層の構造変化も調べ、劣化機構も解析する。得られた知見から、新たに試料の微細構造の再設計および試料作製を行い、再び上記の特性評価を実施していく。
トランス翻訳の分子機構と生理機能

トランス翻訳は、mRNAとtRNAの両機能を持つキメラ分子tmRNAの働きによる変則的翻訳機構で、真性細菌に普遍的に存在する。本研究では反応に関わる単離した成分のみによる試験管内トランス翻訳系を用いて、反応各ステップの中間体を作成し、そこでのtmRNA、SmpB(トランス翻訳因子)のリボソームとの相互作用の位置をprobing法やFRET測定を用いて決定し、反応過程における各分子の動きを明らかにした。またtmRNA/SmpB/EF-Tu/GTP複合体はリボソーム入りGTP加水分解を行った後にmRNAの3'末端の状態を認識し、3'末端が存在する場合はリボソームから解離していくことを示した。本研究は細菌におけるトランス翻訳機構の(1)分子機構の詳細と、(2)新しい生理機能の解明を目的としている。(1)については、これまで開発してきた純粋成分だけによる試験管内トランス翻訳系で反応の各ステップでの中間体を、反応因子やステップ特異的な抗生物質を用いて単離し、化学修飾法、hydroxyladicalprobing法などで各要素の結合様式・位置を決定を行った。特に今年度はpeptide-transfer以後のtranslocation前後のtmRNAとSmpBの位置決定を試み、その間の両者とリボソームとの相互作用の実態とその動きを明らかにしようとして一定の結果を得ている。またこれまでに蓄積のあるtmRNAとSmpBの各種変異体を使って各ステップの活性を測定した。(2)については、我々が単離した枯草菌のtmRNA依存性温度感受性株(SerSの変異でtmRNA存在下でのみ増殖が阻害される:従来のトランス翻訳の働きでは説明がつかない)の解析を通して原因究明を行うことにより新しい機能解明につなげようとしている。本年度はこの変異株から回復株(高温での増殖が回復する)を多数単離し、それらの変異を(1)tmRNA遺伝子、(2)SerS遺伝子、および(3)それ以外の部位の変異に分類した。それらのうち(3)のintergenicsuppressor変異に焦点をしぼり、transformationの手法を用いてその変異部位(遺伝子)の特定を行っているが、未だ結果は出ていない。真正細菌に普遍的に存在するtmRNAはtRNAとmRNAの両機能を有し、トランス翻訳反応に関与している。本研究はトランス翻訳機構の1分子機構の詳細と、2新しい生理機能の解明を目的としている。1トランス翻訳は切断されたmRNAの3'末端で優先的におこり、切断されていないmRNA上ではおこらないと考えられている。実際に我々が開発した精製した純粋成分だけによる試験管内トランス翻訳系において、切断されたmRNAを用いたときにのみAla-tRNA・SmpBからpeptidyl-tRNAへのペプチド転移反応がおこった。面白いことに、EF-TuのGTP加水分解反応は、mRNAの切断に関係なく同じようにおこった。これらの結果は、切断されたmRNAの識別はEF-TuのGTP加水分解後におこることを示している。2我々が単離した枯草菌のtmRNA依存性温度感受性株(SerSの変異でtmRNA存在下でのみ増殖が阻害される)は、その新奇の表現系を従来のトランス翻訳の働きでは説明することが難しい。本年度はこの変異株にtmRNAの変異体を導入して高温での増殖を見たところ、温度感受性はtmRNAのトランス翻訳反応自身が関与し、不完全ペプチドの分解とは無関係であることが判明した。また温度感受性の原因を探る目的で、変異株からの回復株(高温での増殖が回復する)を多数単離し、それらのうちのintergenic suppressor変異を対象に、transformationの手法を用いてその変異部位(遺伝子)の特定を行っているが、未だ結果は出ていない。トランス翻訳は、mRNAとtRNAの両方の機能を持つキメラ分子tmRNAの働きによる変則的翻訳機構であり、一連の反応は翻訳を中断したペプチドにtmRNAにコードされているタグペプチドを翻訳付加して翻訳を完了させ、「滞った翻訳を解消することにより停滞したリボソームの再利用を可能にし、翻訳に失敗したタンパク質を分解処理する品質管理システム」と解釈されている。一方、細胞内でこの反応は、カタボライト抑制等の様々な生理機能に関与することも知られてきた。本研究は、細菌におけるトランス翻訳機構の1分子機構の詳細、および2新しい生理機能の解明を目的としている。1これまで開発してきた純粋成分(翻訳停滞中のリボソーム、Ala-tmRNA、SmpB、EF-Tu・GTP)だけによる試験管内トランス翻訳系を用いて、反応の各ステップでの中間体を単離する方法を開発した。こうして得られたトランス翻訳中間体に対して、化学修飾法、hydroxyladical probing法などにより、主にトランス翻訳因子であるSmpBのリボソームとの結合様式・位置の決定をトランス翻訳の各ステップにおいて行い、一定の結果を得ている。