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重症心身障害児（者）に対するリフレクソロジーの効果に関する研究

本研究は、重症心身障がい児(者)にリフレクソロジーを施行し、身体面・精神面にもたらす効果について、明らかにすることを目的とした。施術前後に、心拍数、SpO2、皮膚血流量、皮膚温、足関節の可動域の測定、顔色、表情、筋緊張等の変化の観察および保護者へのアンケートを実施した。結果として、リフレクソロジーの効果は、1身体面や精神面に効果をもたらすことが明らかになった。2多くの保護者が抹消冷感や排泄の改善、身体の緊張の緩和などの効果を感じていた。3重症児(者)の安楽を促す援助の一つとして、日常的に実施することの有用性が示唆された。1.研究成果の発表(第38回静岡県小児保健学会、平成25年10月19日)1テーマ:リフレクソロジーおよび温罨法が重症心身障がい児にもたらす効果2研究目的:重症心身障がい児の下肢へのリフレクソロジーおよび温罨法の施行の効果をバイタルサイン、表情、皮膚血流量等を測定することにより明らかにする。3調査方法:重症心身障がい児(9名、4歳14歳)の下肢へのリフレクソロジーおよび温罨法の施行の前後に、バイタルサイン、SpO2、皮膚血流量、平均血流スピード、皮膚温を測定し、四肢冷感、筋緊張、発汗、表情、顔色に関する7項目を5段階尺度で評価した。4結果および考察:リフレクソロジーおよび温罨法の施行により、副交感神経が優位の状態(心拍数の減少、収縮期圧・拡張期圧の低下、表情と筋緊張の改善)、抹消循環・血流の改善(手足の冷感の改善、顔色の改善、血流スピードの低下、皮膚温の上昇)がみられ、心身にリラックス効果をもたらしていると考えられる。2.研究の実施1テーマ:重症心身障がい児(者)におけるリフレクソロジーの効果2研究目的:重症心身障がい児(者)にリフレクソロジーを施行することにより、身体面・精神面にもたらす効果について明らかにする。3研究方法:A重症心身障がい児(者)施設において、継続的にリフレクソロジーを受けている重症児(者)とその保護者とした。重症児(者)については、リフレクソロジー施行前後に心拍数、SpO2、皮膚血流量、皮膚温、足関節可動域の測定をし、顔色・表情・筋緊張等の変化を観察した。保護者には、リフレクソロジーに関するアンケート調査をし、加えて1ヶ月間自宅でリフレクソロジーを行うことを依頼した。4研究期間:平成25年8月12月5結果および考察:リフレクソロジーを施行することによって、身体面や精神面に効果があり、安楽をもたらす援助であることが明らかになった。保護者の期待も大きい。1.足浴およびリフレクソロジーのもたらす効果本研究の第一段階として、1922歳の健康な女子大生27名を対象として、足浴およびリフレクソロジーのもたらす効果を調査した。調査期間は、2012年9月10月であった。実施方法は、足浴およびリフレクソロジーの実施前後に、1バイタルサインズの測定、2血液中酸素飽和度、3質問紙調査(快適感、湿潤感、温冷感等19項目)、4皮膚レーザードップラー血流計(moorVMS)による測定(皮膚血流量、皮膚温、血流速度)を行った。結果として、足浴およびリフレクソロジーを実施後、皮膚血流量、皮膚温、血流速度、体温、心拍数、血液中酸素飽和度が上昇し、収縮期血圧が下降した。質問紙による調査においては、実施後、身体が温かい、身体が軽い、心地よい、眠気を感じる、安心している等の肯定的な意味をもつ項目は高くなった。身体が疲れている、汗をかいている、身体に痛いところがある。不快に感じている等の否定的な意味をもつ項目は低くなった。足浴およびリフレクソロジーは、療養する患者の安楽に繋がる看護援助として有効であることが示唆された。2.リフレクソロジーおよび温罨法が障害児にもたらす効果本研究では、リフレクソロジーおよび温罨法の効果について、A重症心身障害児者施設を利用する318歳の障害児のうち、家族の同意が得られた9名を対象に調査を実施した。主な調査の内容は、1対象者の基礎データ(年齢、病名等)、2バイタルサインズ、3冷感、筋緊張、表情、4皮膚レーザードップラー血流計(moor VMS)による測定(皮膚血流量、皮膚温、血流速度)であり、234はリフレクソロジーおよび温罨法の前後で実施した。結果として、リフレクソロジーおよび温罨法を実施後、徐々に子どもたちの表情がやわらぎ、リラックスし、顔色も良好になり、足部への血流が改善した。看護ケアとして有効であろう。今年度は、ヨーロッパにおけるリフレクソロジーの実施状況について、国際若石健康研究会ヨーロッパ分会(オーストリア、インスブルック)の協力を得て、以下の内容を調査した。1.リフレクソロジーが医療としてどのように実施されているか:西洋医学、中国医学、若石リフレクソロジーを混ぜ合わせた総合的なものとして実施している。治療を行う前(予防)の処置、手術が必要とされるケースについてもその補助として実施している。2.リフレクソロジーの対象となる疾病と症状は何か:主な疾病および症状:脳性麻痺、免疫疾患、リウマチ、椎間板ヘルニア、関節炎等である。また、医師による治療を受けているが、効果がない人にも実施している。対象者の年齢は、生後3か月(早産児)96歳である。3.何人/日、実施しているか:20人/日を対象にし、一人に約1時間かけている。

診察→診断→治療(リフレクソロジー)の流れで行う。通常、1若石リフレクソロジー2点穴3ハリの3種類を行う。4.リフレクソロジーの費用および保険の適応について:費用は、1初診(診察)45ユーロ、2ハリ治療70ユーロ、3リフレクソロジー70ユーロ、全身マッサージ80ユーロである。保険適応については、施術者にテラピストの資格(国家資格)があれば、すべての治療(ハリ、リフレクソロジー、点穴)に保険が適応される。治療費の50%は社会保険、50%は個人保険(個人で入っている保険)である。治療以外のリフレクソロジーの施術については、個人保険が適応されるが、社会保険は適応されない。また、事故による治療については、社会保険とは別に、事故保険により支払われ個人負担はない。オーストリアの現状は、1先天性疾患の治療費:50%チロル州が負担、50%社会保険が負担、後天性疾患の治療費:社会保険で負担、2後天性疾患の治療費:社会保険で負担、318歳以下の子ども:チロル州と児童補助金。I.重症心身障がい児(者)におけるリフレクソロジーの効果について、研究協力者である若石リフレクソロジストの西野厚子氏が、研究成果を2015日本若石健康研究会において発表した(2015.11.28記念誌255-259)。研究目的:普段足への刺激を受ける機会が少ない重症児(者)を対象に、リフレクソロジーを施行することにより、身体面・精神面にもたらす効果について明らかにすることを目的にした。研究対象:継続的にリフレクソロジーを受けている重症心身障がい児(者)6名とその保護者。また、6名以外の協力が得られた保護者。研究方法:1施術前後に心拍数、SpO2、皮膚血流量、皮膚温、足関節の可動域の測定、顔色、表情、筋緊張等の変化の観察2保護者へのアンケート。結果:1リフレクソロジーの効果は施行5分後にあらわれやすく、重症児(者)の身体面や精神面に効果をもたらすことが明らかになった。2多くの保護者が抹消冷感や排泄の改善、足関節の緩和などの効果を感じており、自宅でもリフレクソロジーを行っていた。3重症児(者)の安楽を促す援助の一つとして、看護職は他職種や家族と協働しながらリフレクソロジーを行っていくことが大切であると考える。II.冊子の作成:家族やスタッフが行う日常ケアに役立てるように「重症心身障がい児(者)へのリフレクソロジー」の小冊子(A5版、15ページ)を作成し、配布することとした。主な内容は、1リフレクソロジーとは2心身障がい児(者)に対する実施3具体的手順と注意事項4具体的手順(手の使い方)5施術後の注意事項等である。III.冊子を活用しての効果に関する調査:今後、冊子を活用して行ったリフレクソロジーについて、重症心身障がい児(者)への効果があったか、冊子がどのように役立ったかを明らかにする予定である。本研究は、重症心身障がい児(者)にリフレクソロジーを施行し、身体面・精神面にもたらす効果について、明らかにすることを目的とした。施術前後に、心拍数、SpO2、皮膚血流量、皮膚温、足関節の可動域の測定、顔色、表情、筋緊張等の変化の観察および保護者へのアンケートを実施した。結果として、リフレクソロジーの効果は、1身体面や精神面に効果をもたらすことが明らかになった。2多くの保護者が抹消冷感や排泄の改善、身体の緊張の緩和などの効果を感じていた。
腸管コレステロール吸収制御機構の新規パラダイムの提唱と検証

血中コレステロール(chol)上昇は動脈硬化を介した心疾患の主要リスク因子である。腸管からのchol吸収亢進はそのリスク増加に寄与するが、その量的制御機構は未解明のままである。我々はその吸収量が取り込まれたcholの一部を管腔内へ戻すこと(排出)により調節されているとする新たなモデルを提唱する。マウス腸管において、管腔内のcholが細胞膜に取り込まれた後、chol輸送膜タンパク質Niemann-PickC1-like 1(NPC1L1)により細胞内の膜輸送システムに渡されるか、もしくはABCG5/G8で管腔側へ排出されることを確認した。飽食や高齢化により高脂血症の患者数は近年増加の一途をたどっている。従って腸管コレステロール吸収制御機構の解明は、高脂血症を対象とする臨床栄養学・予防医学の実用面での発展に不可欠な要素である。コレステロール吸収に関するこれまでの実験結果、その解釈には矛盾があった。申請者はそれらの矛盾を解決できる新たな吸収制御システムを着想した。すなわち、コレステロールは透過で細胞膜に取り込まれる。その先はNPC1L1(Niemann-Pick C1 Like 1)タンパク質(微絨毛に発現するコレステロール輸送分子)により細胞内の膜輸送システムへ渡される、もしくはATP依存排出ポンプタンパク質(ATP-binding cassette G5/G8; ABCG5/G8)で逆方向の管腔側に排出される。その排出により体内へ吸収するコレステロール量を調節している、というものである。本研究の目的は提示する吸収と排出に関わる分子の動的な連携を証明し、提唱するシステムの検証を完成させることである。野生型マウス(C57BL/6J)を用いた実験では腸管からのコレステロールの排出効率は細胞内への輸送タンパク質NPC1L1の阻害を強めるに従って増え、吸収効率と逆相関する結果をすでに我々は得ていた。つまり細胞膜へ流入(透過)したコレステロールが細胞内に輸送されるか、管腔内へ戻されるかでコレステロールの実質的な吸収量が動的に制御されていることが予想された。コレステロールの排出経路としてABCG5/G8が働いていることを確認するため、当該遺伝子を欠損したマウスを導入し、同様に一連の試験を行ったところ、NPC1L1阻害による排出亢進は消失した。この結果はABCG5/G8が食後のコレステロール吸収時に調節因子としての役割を担っていることを示唆し、また我々が提示するモデルに合致する結果であった。本研究は腸管におけるコレステロール吸収制御機構の解明、ならびにそのコレステロール低下作用への応用を目的として、マウスを用いてステロールの吸収動態解析を試みた。そのために我々はluminal perfusion assay法を確立した。すなわち、経口にて投与したステロールトレーサーで腸管をラベリングし、その後開腹して腸管の一部をカニュレーション、さらに外部からの灌流によって腸管膜からのコレステロールの排出をモニタリングする方法である。本法によって、コレステロールが腸管管腔内へ恒常的に排出されていること、また吸収効率とその排出効率に逆相関関係があることを確認した。すなわち、その同時的な排出が吸収量調節に関与していると推察された。これらの成果は腸管を介したコレステロール恒常性との関連についても興味深い。さらに我々は非コレステロール系ステロールである植物ステロール2種(シトステロール、シトスタノール)のトレーサーを用いてluminal perfusion assayに供試したところ、同様に吸収効率と排出効率に逆相関関係を認めた。すなわち、同様のシステムがステロール種選別に寄与していることを示唆した。吸収阻害はすなわち、体内から管腔内への排出増加と関連している可能性がある。腸管からのコレステロール排出としてtrans-intestinal cholesterol effluxという概念が提示されている。コレステロール吸収阻害剤ezetimibeを処理して、trans-intestinal cholesterol effluxの評価を試みたところ、その排出は増加していた。これら結果は我々の提示する腸管コレステロールに関する一元的モデルを支持するものであった。腸上皮細胞膜において、取り込まれたコレステロールの一部が直ちに管腔内へ戻ること(排出)により、吸収される量が抑制されるという興味深い現象の発見した。その現象をマウスを用いて実験的に検証するとともに、腸管における新たなコレステロール吸収・排出制御モデルを提示すること目的とした。コレステロール含有油脂を経口投与したとき、2/3程度のコレステロールは腸上皮にトラップされた。吸収阻害剤エゼチミブはトラップされたコレステロール排出を促進した。また、同薬剤は血漿コレステロールの腸管管腔への排出をも促進した。これらの結果は腸上皮からのコレステロール排出がコレステロール吸収制御要因であること、さらにはコレステロールの吸収効率と腸管からの排出効率は逆相関の関係にあることが示唆された。コレステロール排出トランスポーター欠損マウスではエゼチミブによるコレステロール排出促進が減弱していたことから、この排出促進は能動的プロセスであること考えられた。植物ステロールや他の薬剤によるコレステロール吸収阻害においても、腸管からの内因性コレステロール排出が促進していることが他論文で示唆されている。これらのことは本研究で見出された腸管におけるコレステロール吸収排出モデルがエゼチミブに限定的な現象でないことを示す。コレステロール吸収阻害や腸管からのコレステロール排出、またはコレステロール逆輸送は個々の現象と捉えられてきた。本研究の成果はそれらを統合し、1つのモデルで説明できる現象であることを示す。

我々はその吸収量が取り込まれたcholの一部を管腔内へ戻すこと(排出)により調節されているとする新たなモデルを提唱する。マウス腸管において、管腔内のcholが細胞膜に取り込まれた後、chol輸送膜タンパク質Niemann-PickC1-like 1(NPC1L1)により細胞内の膜輸送システムに渡されるか、もしくはABCG5/G8で管腔側へ排出されることを確認した。我々が検証を目的とするモデルを支持する結果は得た。病態生化学論文投稿ならびにその過程で生じうる追加実験をH27年度内に完了させ、論文発表することを目的として進めたい。提示するコレステロール吸収制御機構の主要経路に関する検証はABCG5/G8欠損マウスを用いた一連の検討により、ほぼ検証を終えた。さらに我々はコレステロール吸収制御とカイロミクロンの合成との関連にも着目し、その食後高脂血症との直接的な関連も平行して検討を進めている。さらには本制御機構を非コレステロール性ステロール(例えば植物ステロール)の吸収制御機構にも適用し、腸上皮細胞がどのようにステロール種を識別しているかについての応用研究にも着手している。試薬について購入先を検討し、納入価をできるかぎり低く抑えたため。腸管コレステロール吸収制御機構の解明は、高脂血症を対象とする臨床栄養学・予防医学の実用面での発展に不可欠な要素である。しかしながら、その制御システムは未解明のままとなっている。本研究による提唱するコレステロール吸収制御機構の証明によってその上皮細胞における取込みレベルでの調節が明らかとなった。さらに我々はコレステロール吸収制御とカイロミクロンの合成との関連や、非コレステロール性ステロール(例えば植物ステロール)の吸収制御機構について腸管コレステロール吸収制御機構を適用しながら解明していきたい。消耗品に当てる。マウスの繁殖が想定よりも効率よくできたため、飼育費が予定より少なくなった。今後もマウスは繁殖させ多様な実験に用いる予定であることから飼育費が予定よりも多くなると予想される。その増加分に充当予定である。
ニコチンが血管内皮細胞を介し骨吸収を促進することを証明する

喫煙が歯周病のリスクファクターであることを実験的に証明するためにヒト静脈血管内皮細胞(HUVEC)に対しニコチンが骨吸収を促進するサイトカインの産生を制御するか否かについて検索を行った。その結果、ニコチンはHUVECから豊富に産生され、骨吸収に抑制的に作用するOsteoprotegerin(OPG)のmRNA発現を抑制した。一方これとは反対に骨吸収を促進するReceptor activator of nuclear factor kappa-B ligand(RANKL)のmRNA発現を促進した。以上の結果は、喫煙が歯周病のリスクファクターとなることを強く示す基礎的知見である。喫煙による歯周病への影響を検討するために歯肉上皮細胞を用い、特に歯槽骨吸収に強く関与するRANKLの発現に対するニコチンの影響を検索してきた。その結果、ニコチンはアセチルコリンレセプターを介して歯肉上皮細胞からのRANKL発現をm-RNAレベルで促進していることを見い出した。一方、ニコチンは歯肉上皮細胞におけるToll-Like Receptor2(TLR-2)の発現を穏やかに誘導した。TLR-2は歯周病原性細菌であるPorphyromonasi gingivalisのリポ多糖の受容体である。そこで、歯周病原性細菌とニコチンとの相乗作用についても検索を行った。その結果、ニコチン添加群においてIkBαのデグラデーションがより促進されることが示された。さらに、重要な免疫担当細胞であるマクロファージを用いた検討では、ニコチンリポ多糖が誘導する同細胞からの炎症性サイトカインを一時的に誘導することを見い出した。そして、この一時的産生誘導にインフラマソームであるNLRP3の一時的活性化が関与していることを確認した。以上の結果から、ニコチンは歯周組織のバリアである上皮のみならず免疫担当細胞に対しても強い害作用を及ぼすことが確かめられた。喫煙が歯周病のリスクファクターであることが知られている。しかしながら歯周病の典型的症状である骨吸収を喫煙が促進することを示す直接証拠は少ない。そこで、ヒト血管内皮細胞に対するニコチンの作用を、骨代謝に重要な役割を果たしているOPGとRANKLに着目し検索を行った。血管内皮細胞はヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)を用いた。HUVECにニコチンを作用させ、HUVECからRNA等を回収しOPGとRANKLの発現動態検索の試料とした。その結果、ニコチンはHUVECにおけるOPGのmRNA発現を抑制したが、これとは反対的にRANKLのmRNA発現を促進した。このことは、ニコチンが血管内皮細胞を介し骨吸収を促進させることを示唆する。そこでこのニコチンによるOPG/RANKLのmRNA発現動態の詳細を調べるために、ツボクラリンをニコチンと同時添加して検索を行った。その結果、ニコチンの作用を完全に抑制することはできなかった。次にニコチンによるOPG/RANKLのmRNA発現に対するシグナルトランスダクションを調べるためにMAPKおよびPKCインヒビターを用い検討を行った。その結果、ニコチンによるHUVECからのRANKLのmRNA発現はSB203580により抑制された。このことから、HUVECにおけるRANKLの発現はp38が関与している可能性が示された。一方、ニコチンによるRANKLのmRNA発現において炎症性サイトカインの関与が示唆されていることから、ニコチンによりHUVECからのinterleukin-1(IL-1)産生が促進されているか否かの検索を行った。その結果、ニコチンはHUVECからのIL-1産生を促進する傾向が見られた。以上の結果から、ニコチンによるRANKLの発現促進はIL-1のオートクリンの系を介し、一部p38MAPKの関与により制御されている可能性が示された。喫煙が歯周病のリスクファクターであることが広く知られている。これら知見を支える基礎的研究において歯周病の典型病変である骨吸収を喫煙が直接増強するという結果は報告されていない。そこで本年度における研究では、血管内皮細胞に対するニコチンの作用をin vitroにおいて検討を行った。血管内皮細胞(HUVEC)に対しニコチンを101000mMの濃度で添加し、10分24時間培養を行った。培養終了後、細胞からTotal RNAを回収し、RT-PCRにて骨吸収因子及び炎症性サイトカインのmRNA発現の解析を行った。その結果、ニコチンはHUVRCからのRANKLのmRNA発現をニコチンの濃度依存的に促進した。一方、これとは反対にOPGのmRNA発現を抑制した。ニコチン受容体のアンタゴニストであるツボクラリンをニコチンの同時にHUVECに添加しその効果を検証したところ、ツボクラリンはニコチンの作用を完全には制御することができなかった。

そこで、ニコチンが誘導した培養上清中のサイトカインがオートクリンの系を介しRANKLとOPGのmRNA発現を制御している可能性を検証するため、IL-1、TNFに対する抗体を用いたinhibition assayを行った。その結果、ツボクラリンと同様、完全にニコチンの作用を制御することはできなかったが、ニコチンは細胞の受容体へ結合するのみならず、炎症性サイトカインによるオートクリン機構をも動員して骨吸収を促進する可能性が示唆された。歯肉上皮細胞に対するニコチンの作用についてRANKLを標的とした検索を2年間実施した。その結果、当初の計画である、ニコチンが細胞の受容体を介して発揮するRANKLのmRNA発現促進機構にNF-kBが介していること、さらには、ニコチンがIkBの安定性を阻害することを歯肉上皮はもとよりマクロファージにおいても確認している。よって、当初の研究計画に照らし概ね順調に展開していると自己評価する。平成23年度においては、血管内皮細胞におけるニコチンのシグナル伝達バイパス経路を明らかにすることを目標とした。すなわち、ニコチンのアンタゴニストであるツボクラリンではニコチンの効果を完全抑制できないことが示された。そこで培養上清中に産生されたサイトカインによるオートクリンによる経路を考え、抗体を用い検証したところ、そのバイパス経路が確認できた。このことから、当初目標を概ね達成したものと考えている。マクロファージにおけるインフラマソームの活性化作用をニコチンが持つことを見い出したことから、さらにこの現象と当初のRANKLの発現促進とを関連付け研究を推進する。また、ヒト喫煙者と非喫煙者における歯肉溝滲出液中のOPG濃度の測定を行い、ベンチワークとフィールドワークの融合から喫煙の歯周病における害作用について考察する予定である。各種阻害剤を用いたシグナルトランスダクションの検証を行うとともに、歯周病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisのリポ多糖と線毛によるニコチンとの相乗効果を、特にAP1/JunとIkBに着目し検索する。全額を物品費に充当する。その内訳の主なものは、OPG測定のためのELISA Kit及び試薬である。試薬、組織培養用培地、組織培養器具などの消耗品費として使用します。
地方自治体における環境会計の構築と活用-環境会計による環境施策検証の可能性-

本研究は、地方自治体の環境施策の進行管理に環境会計を利用する方途を考察するものである。現在、地方自治体の環境施策には効率性・有効性が求められている。環境施策を効果的かつ有効に行うためには経済面と環境保全面の両側面から、講じた環境施策をフォローアップする必要がある。環境会計はこういったフォローアップに有用性を発揮するものである。本研究では初めに、文献調査によって環境会計の導入の実情を概観した。その結果、環境会計には2つのタイプがあることがわかった。1つは役所の内部(管理オフィス分野)に関するもの、そしてもう1つは役所の外部(地域の環境施策)に関するものである。このうち後者のタイプに焦点を絞って環境会計を研究した。中でも特に環境会計の導入が実務的に進んでいる水道事業を調査対象とした。調査の方法は、当初の研究計画に則して、文献調査と内外の現地調査及びアンケート調査などである。これらの調査の結果から、環境会計導入の実態が明らかになった。さらに、環境会計の活用方法として、環境基本計画などの環境施策の検証、他の水道事業者の環境効率性との比較可能性の増幅、予算要求の際の基礎情報の提供といった重要な役割を担うことが期待されていることが明確になった。そして、環境施策が中長期的視点から行われているため、環境会計は現在のような単年度のフロー情報のみではなく、ストック情報を内包する必要があることがわかった。環境会計がストック情報を内包することによって環境施策の進行管理に役立たせることができる。そこで、環壌簿記、環境財務諸表について検討を進めた。これらの研究結果は、日本会計研究学会で報告した。残された課題については、今後ざらに研究していくこととする。本研究は、企業の環境会計とは異なる型で発展を遂げつつある自治体の環境会計について、その類型化や課題の検討を行い、自治体の施策の検証として環境会計を導入する方向性について考察しようとするものである。初年度である本年度においては、自治体の環境会計の一類型である水道局の環境会計(地方公営企業、特別会計部門)について、特に調査対象を政令指定都市に絞って調査・研究を行った。具体的には、まず、既に環境会計を導入している大阪市、名古屋市、福岡市、北九州市、札幌市などの環境会計担当者を訪問し、各都市が導入している環境会計の構成要素や考え方の違い、活用方法、政策のフォローアップや次年度施策への結果の反映などについての意見交換を行った。調査・意見交換によってもたらされた特に重要な論点は、環境会計の新たな活用方法として、地域独占型の水道事業の経営活性化のために、環境会計情報がもたらす指標(環境効率性、環境収益率など)を用いた地域間の情報比較が有用であることが確認できた点である。この水道事業における環境会計情報の比較可能性を中心内容にして、2004年11月に日本計画行政学会北海道部会で「水道事業における環境会計の展開」として報告を行ったほか、次ページ「研究発表」に記したように明治大学経営学研究所の『経営論集』に当面のとりまとめとして「水道事業における環境会計の展開-有用性と発展方向-」を発表した。本原稿は、政令指定都市の水道局の環境会計の概要も網羅しているため、他の地域における環境会計導入の参考資料とすべく、70余の地方自治体に送付した。その際、返信用書簡を同封し、アンケートの返信を依頼しているので、これを次年度の研究に生かしていくつもりである。本研究では、地方自治体の環境会計全般について概観した後、その中でも実務的に導入が先行している水道事業の環境会計に絞ってより深く内容の検討を行っている。研究1年目に当たる前年度においては国内の地方自治体(水道事業中心)について研究を進めたので、2年目に当たる本年度においては海外の先進的実態について研究し、内外の比較検討から今後の発展方向を検討する研究計画をたてた。

上記研究計画に沿い、本年度においては海外の文献収集・インターネットによる情報収集を行い、ドイツのフライブルグ、フランスのストラスブールを調査地として選定し、アポイントを取り付けて訪問調査した(具体的には、フライブルグでは市環境局の環境保全対策局長Dr. Woerner氏、環境情報センターのHans-Georg氏と意見交換。ストラスブールでは県環境政策局長Marnot-Houdayer氏、在ストラスブール日本国総領事館富士書記官と意見交換、Bas-Rhin浄水場視察など)。これらの地域では地方自治体における環境保全対策の推進に当たって、総合的な費用対効果の検証を行った上で民間活力の導入が広範囲に行われていることがわかった。これは、わが国の自治体の環境会計の構築・環境施策検証の方向性を検討する上で有意義な示唆であった。2年問におよぶ調査研究の成果については、その一部を日本会計研究学会全国大会(2005年9月、於・関西大学)で報告するとともに、後掲論文に執筆・掲載した。上記のとおり、本研究は当初の予定通り順調に進捗した。現在、さらなる調査のとりまとめを行い、引き続き学会発表を行うための準備をしているところである。
ＡＲＴにおける適切な治療方針決定のための新しい精液検査法に関する研究

不妊カップルの約半数原因に男性因子が見られるものの、その多くは原因不明であり、生殖補助技術(ART)を利用せざるを得ない現状である。研究代表者らは従来の精液検査に加えて治療方針決定のために精子の妊孕性を診断出来る新しい検査法の開発に取り組んだ。精子運動が不良なために妊娠しにくい精子無力症の原因の一つとなる精嚢タンパクのSemenogelin(Sg)に注目し妊娠中のパートナーの精子へのSg結合率、結合量と男性不妊症例とで比較し後者でより有意に高値であることを明らかにした。男性不妊患者精子のSg結合率、結合量測定が新しい検査法になりうるのか今後妊娠率、出産率との関連性を明らかにしなければならない。昨年度は、精子に対するsemenogelin(Sg)結合率を測定するため、精液から精子洗浄および固定の後、抗Sg抗体による免疫染色を行い、フローサイトメトリーによる解析を行う実験系を構築した。本年度は、その方法に準拠して男性不妊症患者からの精液サンプルを用いて精子に対するSg結合率の測定を行なった。精液採取当日にPFA固定まで行い、Sg結合率をまず40症例ほど測定した。このデータと精液検査結果との相関を検討したが、Teraiらが報告したような運動率とSg結合率、結合量との相関は得られなかった。その原因として手技上の問題や検体採取から固定までの条件、フローサイトメトリーでの測定条件の違いが考えられたので、吉田分担研究者にも数度、国際医療福祉大学病院に来てもらい、技術的な問題、試薬調整の問題等を検討した。吉池分担研究者とも意見交換を行った。その結果、手技、実験条件には問題が無く、Teraiらの報告と異なり、症例を精子無力症に限定していないことが主な原因ではないかと考え、測定は継続することにした。念のため、陰性コントロールとして、男性不妊の患者ではなく自然妊娠した妊婦のパートナーを健常者ボランティアとして精液試料を収集しSg結合能、結合量を測定し、現在解析を行っている。なお、Sg結合率を測定した不妊カップルがどのようなART治療によって妊娠・出産に至ったのか、また、男性側の身体所見、精液所見、内分泌検査所見等のデータベースの構築は引き続き行っている。前々年度までに確立された96穴プレートhigh-throughput測定系による精子へのsemenogelin(Sg)結合率測定法を用いて、国際医療福祉大学病院リプロダクションセンター男性不妊部門を受診した患者の精液をサンプルとして、Sg結合率と精子運動率その他のパラメータとの関連性を検討した。まず実際の臨床検体を取り扱う上で重要となる検体の保存方法を検討したところ、精液の凍結(-80°C、-196°C)によりSg結合率は大幅に上昇すること、4°C保存でも時間とともに急激にSg結合率は上昇することが分かり、検体採取後速やかに固定処理をする必要があることが示された。以上の事に留意しつつ、精液検査データのみならず、妊孕性とSg結合率との関連性を明らかにするべく、精液検査所見が正常かつ妊孕能が明らかなボランティア(妊娠20週以上の妊婦のパートナー)にICを取り20人より精液を採取しコントロールとした。コントロールに比べ男性不妊患者のSg結合率は有意に高いことが明らかになった。しかし男性不妊患者においてSg結合率と精子運動率との間に有意な相関を認めなかった。これは以前に我々が報告した内容に一致しないが、その理由として今回の検討では対象患者を精子無力症患者のみに限定していないことが考えられた。今後はサブグループ解析を行うとともに、妊娠率、出産率などのアウトカムとの関連性を確かめるために全例予後調査を行う計画である。精子に対するsemenogelin(Sg)結合率を測定するため、精液から精子洗浄および固定の後、抗Sg抗体による免疫染色を行い、FACSによる解析を行う実験系を立ち上げた。既報に基づき試薬や器具を揃えた上で、実際の臨床精液検体を用いて一連の操作を行ったが、当初は抗Sg抗体による精子の染色シグナルが検出できず、結合率が測定できなかった。緩衝化パラホルムアルデヒドによる固定に問題があると考え、そのpHを測定したところ強塩基性となっていた。固定中に強塩基性溶液中で、抗原(Sg)が精子膜表面より流出してしまったことが予想された。そこで、緩衝液を変更し中性付近となるようにしたうえで固定を行ったところ、抗Sg抗体による染色が検出できるようになった。このことよりSgの立体構造はpHの影響を強く受け、精子膜との結合性に影響することが推察された。今後はこの点を更に追求し、その意義を検討していきたいと考えている。

また、大量の臨床精液検体を処理する必要があるため、96穴プレートを用いた小スケールでの精子染色法の条件を検討し、実際の臨床検体を用いてその有効性を確認することができた。現在はこれらの成果の下に、臨床精液検体におけるSg結合率のデータを蓄積している段階である。一方、精子無力症患者の精子におけるSgの結合形態を明らかにする目的で、電子顕微鏡による観察を行っているが、前処理(洗浄)、固定、輸送によるアーチファクトがみられ、現在これらの最適条件を検討している。また、運動率の良い精子での結合様式を明らかにする目的で未固定での染色を検討したところ、運動精子は染色されないことを確認した。なお、Sg結合率を測定している不妊カップルがどのようなART治療によって妊娠・出産に至ったのか、また、男性側の身体所見、精液所見、内分泌検査所見等のデータベースの構築は順調に行なっている。不妊カップルの精液試料バンクの構築を行なうために当院リプロダクションセンター男性不妊部門を受診した患者の精子を収集出来ている。これらの試料を基に精子に対するSg結合率、結合量を測定するための精子の前処理の方法について予備実験を行い、フローサイトメトリー測定系の立ち上げは終了している。また、実際に測定も40検体分終了している。これらの試料を基に精子に対するSPMI結合率、結合量を測定するための精子の前処理の方法について予備実験を行なってフローサイトメトリー測定系の立ち上げを行なっており、種々の問題点が出てきたこともあり班会議を行なって検討しておおむね測定のプロセスが良いことが確認され順調に進んでいる。男性不妊症患者における、精子へのSg結合率、結合量のデータと精液検査及び臨床データとを比較し、Sg結合率、結合量がARTに使用する精子の質を判定する、新しい精液検査指標になり得るのか明らかにして行きたい。精子無力症患者の精子に対するSPMI結合率、結合量の測定に関して精度管理を行なって安定した測定結果が出るように分担研究者の英知を集め測定方法を確立して行きたい。Sg付着の有無を検討する精子の光顕、電顕検索については精子の固定方法、試料の作成方法を検討していく。男性不妊症患者における、精子へのSg結合率、結合量測定のための消耗品、と精液検査及び臨床データ等データベースの入力のための人件費・謝金、旅費、その他に研究費を充てたい。特に次年度新たな研究費の使用計画はありません。平成23年度と同様の使用計画です。
投影パターン光を適応的に変更する三次元シーン計測法(動的パターン投影法)の確立

本研究は,パターン光投影法をもとにして,変化のあるシーンへの対応も考慮した動的パターン投影法という新しい三次元シーン計測法を開発し,その原理的な実用性を検証することを目的としている.本研究では,CCDビデオカメラと液晶ビデオプロジェクタを垂直に配置し,それらとホストマシンを接続した計測システムを開発した.システムにおいて,投影パターンはプログラムで制御されており,随時変更できる.これまでに,カメラとプロジェクタの焦点深度およびそれらの位置関係から得られるエピポーラ拘束条件を利用して,一枚の画像から多くの三次元データを得るような計測アルゴリズムを開発した.このアルゴリズムでは,STRIPEと呼ばれる水平なスリット光を一度に多数同定するために,それらに交差するエピポーラ線に沿ったSPIKEと呼ばれる短い線分を用いる.できるだけ多くのSPIKEをそれらの像が画像上でお互いに重ならないように投影し,STRIPEとともに投影することによって,画像にとらえられたSPIKEの像のそれぞれを一意に同定し,また同時にそれらと交差するSTRIPEの像を一度に同定することができる.また同定の結果を利用して,さらに多くのSTRIPEが同定できるようにSPIKEを再配置するようにしている.また今年度は,他のアルゴリズムをシステムに容易に組み込めるようにするために,システムプログラムの改良を行った.現在,「投影パターンの初期化」,「パターンの抽出」,「パターン同定」,「パターン修正」,および「三次元形状の計算」の一連のモジュールをプログラムに追加することで新しいアルゴリズムをシステムに導入することが可能になっており,パターン投影法でよく利用される一本のスリット光をスキャンさせる計測アルゴリズムを実装した.これにより,原理的には,現在のシステムの枠組みの範囲であらゆるパターン投影法をシミュレートすることが可能になり,さまざまなアルゴリズムを適応的に切り換えながら計測を行うことができる柔軟なシステムへと発展させることが期待できる.本研究は,パターン光投影法をベースとして,シーンの変化への対応も考慮した動的パターン投影法という新しい三次元シーン計測法を開発し,その原理的な実用性を検証することを目的としている.本研究で開発した計測システムは垂直方法に並んだCCDビデオカメラと液晶ビデオプロジェクタ及びホストマシンから構成されている.このシステムでは,CCDビデオカメラと液晶ビデオプロジェクタの幾何的関係は相対的に固定されている.そのため,プロジェクタから投影した光パターンとその観測画像上での像の間の対応関係の拘束条件(エピポーラ構造)はシーンによらず常に一定となっている.今年度は,このエピポーラ拘束条件及び各計測機器の焦点深度を考慮して,一枚の画像から多くの三次元データを取り出すことが可能な計測アルゴリズムを開発した.このアルゴリズムでは,光パターン構成要素として,水平方向の長い線分(STRIPE)群とそれらと交差するエピポ-ラ線方向に沿った短い線分(SPIKE)群とを用いる.上記の拘束条件を用いて,できるだけ多くのSPIKEをそれらの像がお互いに重ならないように配置し,全STRIPEとともに投影することによって,観測画像にとらえられたSPIKEの像のそれぞれを一意に同定し,また同時にそれらと交差するSTRIPEの像を一度に同定することが可能になった.またこの結果を利用して,シーンの変化が小さいこと仮定して,次の観測画像において,さらに多くのSTRIPEが同定できるようにSPIKEを再配置するようにした.なおパターン同定プロセスは,シーンの変化には依存しないため,シーンの変化が大きいときでも,正しい同定が可能である.本研究は,パターン光投影法をもとにして,変化のあるシーンへの対応も考慮した動的パターン投影法という新しい三次元シーン計測法を開発し,その原理的な実用性を検証することを目的としている.本研究では,CCDビデオカメラと液晶ビデオプロジェクタを垂直に配置し,それらとホストマシンを接続した計測システムを開発した.システムにおいて,投影パターンはプログラムで制御されており,随時変更できる.これまでに,カメラとプロジェクタの焦点深度およびそれらの位置関係から得られるエピポーラ拘束条件を利用して,一枚の画像から多くの三次元データを得るような計測アルゴリズムを開発した.このアルゴリズムでは,STRIPEと呼ばれる水平なスリット光を一度に多数同定するために,それらに交差するエピポーラ線に沿ったSPIKEと呼ばれる短い線分を用いる.できるだけ多くのSPIKEをそれらの像が画像上でお互いに重ならないように投影し,STRIPEとともに投影することによって,画像にとらえられたSPIKEの像のそれぞれを一意に同定し,また同時にそれらと交差するSTRIPEの像を一度に同定することができる.また同定の結果を利用して,さらに多くのSTRIPEが同定できるようにSPIKEを再配置するようにしている.また今年度は,他のアルゴリズムをシステムに容易に組み込めるようにするために,システムプログラムの改良を行った.現在,「投影パターンの初期化」,「パターンの抽出」,「パターン同定」,「パターン修正」,および「三次元形状の計算」の一連のモジュールをプログラムに追加することで新しいアルゴリズムをシステムに導入することが可能になっており,パターン投影法でよく利用される一本のスリット光をスキャンさせる計測アルゴリズムを実装した.これにより,原理的には,現在のシステムの枠組みの範囲であらゆるパターン投影法をシミュレートすることが可能になり,さまざまなアルゴリズムを適応的に切り換えながら計測を行うことができる柔軟なシステムへと発展させることが期待できる.
四重極型タンデム質量分析器によるハロゲン化チロシンの微量検出法の開発と応用

好中球ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は次亜塩素酸(HOCl)あるいは次亜臭素酸(HOBr)を産出する酵素である。好酸球ペルオキシダーゼ(EPO)もHOBrを産出する。本研究ではタンパク質の酸化生成物であるハロゲン化チロシン(ブロモチロシンBrY、ジブロモチロシンDiBrY)及びその他のチロシン修飾物(ジチロシンDiY、ニトロチロシンNY)を測定するため、液体クロマトグラフィー/四重極型タンデム質量分析器(LC/MS/MS : Applied Biosystems API-3000)を用いて微量検出定量法の開発及び応用を行った。7種類のチロシン修飾物をLC/MS/MSにより一斉分析する条件を構築したところ、DiY・チロシン測定、そしてさらにブチル化して他の修飾チロシンを測定するという二段階分析法を構築した。ヒトの尿からクロロチロシン類は多くの試料で検出限界以下であった。LC/MS/MSによるこの測定系を利用して尿からの微量検出定量を行ったところ、8.8±0.6(DiY),1.4±0.4(NY),3.8±0.3(BrY),and 0.7±0.1(DiBrY)mol/mol of creatinine(n=23)という数値が得られた。種々のマーカー(80xodGやヘキサノイルリジン)との相関を見たところ、ニトロチロシン以外のマーカーは相関していた。糖尿病患者及び腎症患者の尿を用いて測定を行ったところ有意な差が認められた。食品摂取による変動を調べたところ、ココア飲用により、尿中ジチロシンが有意に減少した。このように尿中の修飾チロシン測定は生体の酸化ストレスを評価する一つのマーカーとなることが示唆された。構築したハロゲン化チロシン微量検出法は食品成分によるペルオキシダーゼ活性の抑制評価系に応用できることから、LC/MS/MSを用いたEPO阻害アッセイ系を構築しており、詳細は検討中であるが、ポリフェノールなど抗酸化剤に強い抑制作用を見出している。炎症の指標である好中球ミエロペルオキシダーゼは次亜塩素酸(HOC1)を産出し、好酸球ペルオキシダーゼはHOBrを産出する。本研究ではハロゲンを含んだ活性酸素に着目し、タンパク質の特異的な酸化生成物である「ハロゲン化チロシン」を測定するための微量検出定量の開発を行った。具体的には液体クロマトグラフィー/四重極型タンデム質量分析器(LC/MS/MS、Applied Biosystems API-3000)を用いて、ブロモチロシンなどのハロゲン化チロシン類及びその他のチロシン修飾物(ジチロシン、ニトロチロシン)の微量検出定量法を開発することを目的とした。まずハロゲン化チロシン類及びその安定同位体を合成した。安定同位体ジブロモチロシンはL-チロシン(13[C]9Y,13[C]6Y)を臭素化試薬(N-ブロモスクシニイミド)で処理し、HPLC精製した。ジクロロチロシンの場合はNα-アセチルチロシンを合成したのち、NaOC1処理によりNα-アセチル-ジクロロチロシンを合成し、脱保護して用いた。数種類のチロシン修飾物をLC/MS/MSにより一斉分析する条件を構築するため、合成標品カクテルを用いて検討を行った。その結果、試料を固相抽出して分析するとチロシンやジチロシンについては測定可能であるが、ニトロチロシンやハロゲン化チロシンなどの修飾物については検出できないことがわかった。このためブタノール/塩酸系で試料のブチル化を行ったところ、ヒトの尿から(クロロチロシン類は検出限界以下であったが)これらの物質を検出定量すること成功した。現在、疾病や食生活との関連について検討している。また、LC/MS/MSによる手法は高感度であるが、装置自体が高価であるため、抗ジハロゲン化チロシン抗体を用いたELISAによる簡便測定法についても同時に検討している。

食品摂取による変動を調べたところ、ココア飲用により、尿中ジチロシンが有意に減少した。このように尿中の修飾チロシン測定は生体の酸化ストレスを評価する一つのマーカーとなることが示唆された。構築したハロゲン化チロシン微量検出法は食品成分によるペルオキシダーゼ活性の抑制評価系に応用できることから、LC/MS/MSを用いたEPO阻害アッセイ系を構築しており、詳細は検討中であるが、ポリフェノールなど抗酸化剤に強い抑制作用を見出している。
遺伝子ネットワーク解明に向けた高機能性人工デコイ核酸の開発

1.人工デコイ核酸の設計と合成について(2)NF-kBに対する人工デコイ核酸の従来の標的配列に加え新たに種々のデコイ分子配列を設計し、その合成にあたった。(今西)2.人工デコイ核酸の物性評価について人工デコイ核酸の安定性をTm測定により、各種転写因子との結合親和性をゲルシフトアッセイ等により詳細に評価した。(今西、土井)3.細胞系での人工デコイ核酸の機能評価について(1)培養細胞に対し人工デコイ核酸を導入し、細胞内における各種遺伝子の発現の様子を、ディファレンシャルディスプレイ法、リアルタイムPCR法及び発現タンパク質に対する蛍光標識抗体を用い詳細に解析した。(土井)(2)上記検討にて見い出した遺伝子群を対応するアンチセンス分子などにて発現抑制し、関連遺伝しの発現レベルを解析することで、遺伝子ネットワークの詳細を検討した。(土井)(3)得られた結果をもとに遺伝子ネットワークのモデルを構築しその検証を行なった。(土井)1.人工デコイ核酸の設計と合成について(2)NF-kBに対する人工デコイ核酸の従来の標的配列に加え新たに種々のデコイ分子配列を設計し、その合成にあたった。(土井)
コケ植物を用いたABA、低温および浸透圧応答の統合的制御に関する基礎研究

ABA・高浸透圧・低温に非感受性のヒメツリガネゴケ変異株の解析から同定されたグループB3 Raf様プロテインキナーゼARKの活性化の仕組みを調べるため、ARK-GFPを発現する形質転換体から抗GFP抗体ビーズを用いてタンパク質を精製し、LC-MS/MS解析により相互作用タンパク質およびリン酸化ペプチドの解析を行った。相互作用タンパク質の解析からは、ARK-interacting kinase (ARIK)が新たに同定された。リコンビナントタンパク質を用いた実験からARIKはin vitroでARKによるリン酸化を受けることが明らかとなった。また、そのリン酸化部位の候補を特定した。ARKの抗リン酸化抗体を用いた解析から、キナーゼドメインのアクチベーションループ内に存在するSer1029のリン酸化がABAにより増大し、Ser1029のAlaへの変異はABA応答を低下させることが明らかとなった。キナーゼ活性を失ったarkD995N株においてはSer1029のリン酸化が完全に抑えられたことから、Ser1029のリン酸化は他のキナーゼによるものではなく、自己リン酸化により行われると考えられた。しかし、ABAによるリン酸化亢進の仕組みは不明である。ABA応答の負の制御因子PpABI1欠損株(ppabi1a/b)では、Ser1029のリン酸化が亢進されたことから、このリン酸がPpABI1による負の制御を受ける可能性が示された。一方、ABA非存在下ではppabi1a/b株でもSer1029のリン酸化は野生株と同様に低く抑えられていたことから、PpABI1以外の因子による負の制御が存在することも示唆された。これらの結果から、ABAやストレスシグナルの伝達、およびそれらの統合におけるRaf様キナーゼの役割と、そのリン酸化による制御の仕組みの一端が明らかとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、コケ植物を用い、ABAや低温、乾燥、高浸透圧応答に欠損を持つ変異株の解析や、既知シグナル因子との相互作用解析から、ストレス情報の統合的制御に関わる因子の同定を目指している。紫外線照射したヒメツリガネゴケ原糸体細胞からABA非感受性変異株約を単離し、ABA、高浸透圧、低温馴化能について解析した。これらのうちの多くがRaf様プロテインキナーゼをコードするARK遺伝子に変異が検出された。arkミスセンス変異の多くはC末端のキナーゼドメインに見つかったが、N末端の非キナーゼドメインにある特定の領域にも変異が見つかり、ARKタンパク質の機能調節に重要な領域であることが示唆された。一過的遺伝子発現系を用いた欠失解析からもN末端ドメインの活性制御領域としての重要性が示唆された。ヒメツリガネゴケRaf様プロテインキナーゼARKのGFP融合タンパク質を発現する形質転換体から抗GFP抗体ビーズを用いてタンパク質を精製し、LC-MS/MS解析によりリン酸化ペプチドおよび相互作用タンパク質の解析を行った。リン酸化解析では、ARKキナーゼドメイン内のアクチベーションドメインにあるSer1029のリン酸化が検出された。抗リン酸化抗体を用いた解析から、S1029のリン酸化はABAにより亢進することが明らかとなり、Ser1029をAlaに置換した形質転換体ではABA応答や高浸透圧応答が著しく低下していた。相互作用タンパク質の解析では、ヒメツリガネゴケが持つすべてのエチレン受容体との相互作用が示唆された。エチレン受容体の一つPpETR7を過剰発現する形質転換体では、ABA応答が低下し、エチレンシグナルがARKを介してABA応答を負に制御していることが示唆された。ヒメツリガネゴケ原糸体細胞からABA非感受性変異株約100株を単離し、解析することができた。これらのうち55株についてはRaf様プロテインキナーゼをコードするARK遺伝子に変異が検出され、ナンセンス変異株とミスセンス変異を解析することができた。変異の多くはC末端のキナーゼドメインに見つかったが、N末端の非キナーゼドメインにある特定の領域にも2箇所の変異を同定することができた。一過的遺伝子発現系を用いた欠失解析からもN末端ドメインの活性制御領域を同定することができた。また、ARKのGFP融合タンパク質を発現する形質転換体から抗GFP抗体ビーズを用いてタンパク質を精製し、LC-MS/MS解析によりリン酸化ペプチドおよび相互作用タンパク質の解析を行った実験では、最終的にSer1029がリン酸化が部位であることを確定することができた。抗リン酸化抗体を用いた解析からもSer1029のリン酸化はABAにより亢進することが証明できた。Ser1029をAlaに置換した形質転換体ではABA応答や高浸透圧応答が著しく低下していたことから、Ser1029の重要性を示すことができた。上記のN末端ドメインにarkミスセンス変異が検出された株では、Ser1029のリン酸化がほとんど検出できなかった。ARK-GFP形質転換体を用いた相互作用タンパク質の解析では、ヒメツリガネゴケが持つ7つすべてのエチレン受容体とARKとの相互作用が示唆された。エチレン受容体の一つPpETR7を過剰発現する形質転換体では、ABA応答の低下を示すことができた。これらの結果はエチレンシグナルがARKを介してABA応答を負に制御していることを示し、環境適応におけるホルモンシグナルのクロストークについてその一部を明らかにすることができた。

ABA・高浸透圧・低温に非感受性のヒメツリガネゴケ変異株の解析から同定されたグループB3 Raf様プロテインキナーゼARKの活性化の仕組みを調べるため、ARK-GFPを発現する形質転換体から抗GFP抗体ビーズを用いてタンパク質を精製し、LC-MS/MS解析により相互作用タンパク質およびリン酸化ペプチドの解析を行った。相互作用タンパク質の解析からは、ARK-interacting kinase (ARIK)が新たに同定された。リコンビナントタンパク質を用いた実験からARIKはin vitroでARKによるリン酸化を受けることが明らかとなった。また、そのリン酸化部位の候補を特定した。ARKの抗リン酸化抗体を用いた解析から、キナーゼドメインのアクチベーションループ内に存在するSer1029のリン酸化がABAにより増大し、Ser1029のAlaへの変異はABA応答を低下させることが明らかとなった。キナーゼ活性を失ったarkD995N株においてはSer1029のリン酸化が完全に抑えられたことから、Ser1029のリン酸化は他のキナーゼによるものではなく、自己リン酸化により行われると考えられた。しかし、ABAによるリン酸化亢進の仕組みは不明である。ABA応答の負の制御因子PpABI1欠損株(ppabi1a/b)では、Ser1029のリン酸化が亢進されたことから、このリン酸がPpABI1による負の制御を受ける可能性が示された。一方、ABA非存在下ではppabi1a/b株でもSer1029のリン酸化は野生株と同様に低く抑えられていたことから、PpABI1以外の因子による負の制御が存在することも示唆された。これらの結果から、ABAやストレスシグナルの伝達、およびそれらの統合におけるRaf様キナーゼの役割と、そのリン酸化による制御の仕組みの一端が明らかとなった。1.ヒメツリガネゴケ変異株の配列解析をさらに進める。また、本年度はark以外の変異株とarkサプレッサーの単離を目指す。そのため、ARK遺伝子を重複した株を親株として用い、ABA非感受性株のスクリーニングを行う。得られた株については、ARK遺伝子を導入し、相補しない株を中心に解析を進める。サプレッサーについては、ark株を親株として高浸透圧条件でのスクリーニングをおこない、ABA依存的な耐性を回復する株の単離を目指す。2.ゼニゴケARKについても解析を進める。過剰発現株およびゲノム編集株について、ABA応答、高浸透圧応答、および低温応答について明らかにする。ゼニゴケではARK以外にB3MAPKKKが2つ、B2MAPKKKが2つ存在する。これらの遺伝子についても過剰発現株の解析や一過的発現系における実験から、ABA応答、高浸透圧応答における機能を解析する。3.ARK相互作用因子の解析から同定された新規のプロテインキナーゼARIKについての解析を進める。一過的遺伝子発現実験とともにヒメツリガネゴケの遺伝子破壊株、過剰発現株の作出を行う。また、ARIKのリコンビナントタンパク質を作成し、ARKのプルダウンアッセイやキナーゼアッセイに用いる。29年度が最終年度であるため、記入しない。