hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内シグナル伝達におけるイソプレノイドの機能発現機構

今年度は、ファルネシル基と特異的に相互作用をする蛋白質を探索する為、化学合成したプレニルシステイン残基を含むオリゴペプチドをリガンドにしたアフィニティークロマトグラフィーを試みた。リガンドは、以下の3種類を化学合成した。Ki-rasのC末端のシステイン残基を含むヘプタペプチド(SKTKC)のN末端のセリンをビオチン化した。その後、システイン残基をファルネシル化し、システインのカルボキシル基をメチル化したもの(♯1)と、メチル化しないもの(♯2)をそれぞれ分離精製した。また、システイン残基未修飾のリガンド(♯3)も作製した。これら3種類のアフィニティーリガンドを用いて、ラット脳由来の細胞質画分に、ファルネシル基と特異的に相互作用する蛋白質があるかどうか調べた。その結果、リガンド♯1と特異的に相互作用する蛋白質の存在が確認され。その中でも、分子量約50kDa(P50)と90kDa(P90)の蛋白質が顕著であった。この2種類の蛋白質の構造を解析するため、それぞれの蛋白質をラット脳細胞質画分から2種類のクロマトグラフィー(DE52、MonoQ)で分離精製後、アフィニティクロマトグラフィーで更に濃縮した。これらの蛋白質のアミノ酸配列を決定する為、PVDE膜に転写して、目的の蛋白質を大量に回収した。回収したそれぞれの蛋白質をLysyl endopeptidaseで加水分解後、ペプチド断片を逆相HPLCで精製した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列決定したところP50はα,β-チューブリンの混合物であった。一方、P90は、α,β-熱ショック蛋白質90(HSP90)の混合物であった。またP90とファルネシル基との相互作用は、ATP処理によって増強されることが示唆された。これは、ATPによるP90のコンホ-メーション変化によって、P90とプレニル基との結合がより強くなった為ではないかと考えられる。HSP90はストレス蛋白質として知られているが、細胞内では分子シャペロンとして機能していることが示唆されていることから、生合成されたプレニル化蛋白質は細胞質内ではHSP90と複合体を形成し、形質膜へターゲティングされる可能性も考えられるが、実際in vivoでこの様なターゲティング機構があるかどうか今後検討しなければならない。細胞質にあるプロテイン・ファルネシルトランスフェラーゼでファルネシル化されたRas蛋白質は、小胞体のエンドプロテアーゼ、カルボキシメチラーゼなどの酵素によってプロセシングされた後、形質膜へターゲティングされることがわかっているが、ファルネシル基を介した特異的ターゲティング機構の詳細は全く不明である。また、Rasによる細胞内シグナリングカスケードにおいて、ファルネシル基は必須であることから、Rasのファルネシル基は、蛋白質-蛋白質相互作用において、必須の役割を果たしていることが示唆されている。そこで、今年度は、ファルネシル基と特異的に相互作用をする蛋白質を探索する為、化学合成したプレニルシステイン残基を含むオリゴペプチドをリガンドにしたアフィニティークロマトグラフィーを試みた。

リガンドは、以下の3種類を化学合成した。Ki-RasのC末端のシステイン残基を含むヘプタペプチド(SKTKC)のN末端のセリンをビオチン化した。その後、システイン残基をファルネシル化し、システインのカルボキシル基をメチル化したもの(♯1)と、メチル化しないもの(♯2)をそれぞれ分離精製した。また、システイン残基未修飾のリガンド(♯3)も作製した。これら3種類のアフィニティーリガンドを用いて、ラット脳由来の細胞質画分に、ファルネシル基と特異的に相互作用する蛋白質があるかどうか調べた。その結果、リガンド♯1と特異的に相互作用する蛋白質の存在が確認された。その中でも、分子量約50kDaと90kDaの蛋白質が顕著であった。この2種類の蛋白質の構造を解析する為、それぞれの蛋白質をラット脳細胞質画分から2種類のクロマトグラフィー(DE52、MonoQ)で分離精製後、アフィニティークロマトグラフィーで更に濃縮した。現在、これらの蛋白質のアミノ酸配列を決定する為、PVDF膜に転写して、目的の蛋白質を大量に回収している。アミノ酸配列決定後、これらの蛋白質をコードしているcDNAをクローニングする予定である。今年度は、ファルネシル基と特異的に相互作用をする蛋白質を探索する為、化学合成したプレニルシステイン残基を含むオリゴペプチドをリガンドにしたアフィニティークロマトグラフィーを試みた。Ki-rasのC末端のシステイン残基を含むヘプタペプチド(SKTKC)のN末端のセリンをビオチン化した。その後、システイン残基をファルネシル化し、システインのカルボキシル基をメチル化したもの(‰1)と、メチル化しないもの(‰2)をそれぞれ分離精製した。また、システイン残基未修飾のリガンド(‰3)も作製した。その結果、リガンド‰1と特異的に相互作用する蛋白質の存在が確認された。その中でも、分子量約50kDa(P50)と90kDa(P90)の蛋白質が顕著であった。この2種類の蛋白質の構造を解析する為、それぞれの蛋白質をラット脳細胞質画分から2種類のクロマトグラフィー(DE52、MonoQ)で分離精製後、アフィニティクロマトグラフィーで更に濃縮した。これらの蛋白質のアミノ酸配列を決定する為、PVDE膜に転写して、目的の蛋白質を大量に回収した。回収したそれぞれの蛋白質をLysyl endopeptidaseで加水分解後、ペプチド断片を逆相HPLCで精製した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列決定したところP50はα,β-チューブリンの混合物であった。一方、P90は、α,β-熱ショック蛋白質90(HSP90)の混合物であった。またP90とファルネシル基との相互作用は、ATP処理によって増強されることが示唆された。これは、ATPによるP90のコンホ-メーション変化によって、P90とプレニル基との結合がより強くなった為ではないかと考えられる。
薬物代謝酵素CYP2D6の遺伝子解析をEBM実践に応用するための基盤研究

我々はCYP2D6^*10が日本人において抗うつ薬venlafaxineの血中濃度推移を説明する上で重要であることを見出した。日本人においてもCYP2D6の基質薬物についてCYP2D6の遺伝子多型より個人にあった適正用量を検討することが重要であると考え、本研究を計画した。CYP2D6で代謝されるメキシレチンについてCYP2D6の野生型とCYP2D6^*10/^*10群の代謝を比較した。さらに、代謝の低下した被験者からCYP2D6^*36をタンデムに有する遺伝子型を発見した。この遺伝子型の頻度は3%であった。CYP2D6.1,CYP2D6.10,CYP2D6.36の発現系を構築し基質薬物としてbufurarolとvenlafaxineについて検討した。その結果CYP2D6^*10、CYP2D6^*36を有するヒトの代謝クリアランスの低下が酵素の低発現とKmの上昇によることが示された。さらに各種のβブロッカーのbufuralolに対する阻害の検討では阻害はすべて競合阻害であり、Ki値はCYP2D.36>>CYP2D6.10>CYP2D6.1であった。多剤併用時の相互作用の影響はCYP2D6^*10、CYP2D6^*36の人ではCYP2D6野生型の人より少ないことが示唆された。日本人において、PMになる重要な遺伝子型であるCYP2D6^*5のアレル頻度は4.5%であった。従来から使用されているlong-PCR法によるCYP2D6^*5の判定では、CYP2D6^*5でない場合でも遺伝子構造によってはCYP2D6^*5と誤判定される場合があることを見出した。遺伝子解析の結果、新規の遺伝子構造を見出した。我々はこれまでに東洋人に特徴的なCYP2D6*10(以下、*10)の薬物代謝における重要性を見出してきている。今回は、この*10の酵母発現系を構築し、*10の活性について検討した。これにより、*10の活性低下が本酵素の発現量の低下と、基質への親和性の低下によることを明らかとした。さらに、CYP2D6の基質薬物である抗不整脈薬メキシレチンの健常人での薬物代謝について検討した。すなわち、メキシレチンの血中動態の個人差に及ぼす*10の影響を検討した。その結果、CYP2D6*1/*1(n=5)とCYP2D6*10/*10(n=4)の被験者間で血中濃度には顕著な差が認められなかった。しかし、CYP2D6代謝活性の指標として算出した尿中のメキシレチンと代謝物の水酸化メキシレチンの比では上記の2群間に有意な差が認められた。また、*10/*10と分類した被験者の一名が他の*10/*10の被験者に比して低い活性であることが認められた。そこで、この一例につき新規の遺伝子変異の存在を考慮して検討を行った。サザン法による遺伝子構造の解析ではこれまでの報告と同様であったため、このCYP2D6の全塩基配列を決定した。その結果、CYP2D6のexon9に14個の遺伝子変異を持つ遺伝子型であることが判明した。この変異型の遺伝子配列はCYP2D6*10CもしくはCYP2D6*36として報告されているものであった。

しかし、日本人については詳細に検討されていなかったため、その重要性を考慮し、遺伝子型判定法を開発し頻度解析を行った。その結果、4%の日本人がこの遺伝子型を有することが判明した。また、発現系を用いた検討でも*10に比してCYP2D6*36の活性が顕著に低下していることを明らかにした。この当研究室により構築した発現系によりCYP2D6^*1、CYP2D6^*10、CYP2D6^*36のブフラロールについての代謝活性について検討した。Vmax/Kmは^*10、^*36とも^*1より低下していた。CYP2D6^*36のアレル頻度は約2%であった。CYP2D6は多くのβ遮断薬の代謝に係わっていること、さらにCYP2D6は多くの循環器系、精神科系の薬物の代謝に係わっていることなどより多剤が併用されることが多く、薬物問相互作用について把握しておくことが必要である。このため数種のβ遮断薬のCYP2D6^*1、CYP2D6^*10、CYP2D6^*36におけるブフラロールの代謝に対する阻害作用を発現系を用いて検討した。メトプロローノレ、チモロール、ピンドロールとも競合阻害であり、Ki値はCYP2D6^*1<CYP2D6^*10<CYP2D6^*36であった。遺伝子型により阻害の強さは異なった。CYP2D6^*5のアレル頻度は我々の検討では4.5%存在し、日本人ではpoor metabolizerとなる遺伝子型である。CYP2D6^*10/^*5はCYP2D6^*10/^*10の遺伝子型より活性の低下が予想されるためメキシレチンと臨床試験中の抗精神病薬について遺伝子型による代謝能について検討した。メキシレチンについてはAUCおいてCYP2D6^*10/^*5はCYP2D6^*1/^*1に対して有意に高値を示した。臨床試験中の抗精神病薬ではCYP2D6^*10/^*10、CYP2D6^*10/^*5でAUCの増大が認められた。CYP2D6^*5の遺伝子型の判定では簡便であるlongPCR法が汎用されているが、この判定法ではCYP2D6^*1であってもCYP2D6^*5と誤判定される遺伝子構造があることを見出した。
Deliver-bodyを用いた抗体導入による細胞イメージング

本研究では、細胞膜透過能を有するペプチド配列と抗体結合タンパク質との融合タンパク質を用いて抗体を細胞内に導入し、生細胞内タンパク質をイメージングすることを目的とした。可視化の方法として、抗原の異なる部位を認識する2種類の抗体を細胞内に導入し、両者が細胞内抗原に結合した際にのみシグナルが得られるシステムの構築を試みた。その結果、細胞外において、このシステムが機能することを示し、今後の更なる研究により生細胞内のタンパク質のイメージングが可能になることを明らかにした。本研究は、生細胞内への抗体導入による細胞内タンパク質の可視化を目的とする。その方法として、細胞膜透過能を有するペプチド配列(PTD)と抗体結合能を有するprotein Gとの融合タンパク質を蛍光標識し、抗原の異なる部位を認識する2種類の抗体が細胞内に導入された抗原に結合した際のFRETシグナルの検出を計画した。しかしながら、研究初年度は、FRETよりも感度が高くなるものと期待されるluciferaseの発光反応を利用した。ここでは、luciferase分子を分割し、近接時にluciferase活性が回復する系を試みた。はじめにluciferaseの分割位置について検討を行った。Luciferaseを適当な位置で切断し、その間にRNA結合ペプチドを挿入したlucifearase融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質の1つは、RNA分子と結合すると構造変化を引き起こし、luciferase活性の回復を示した。この結果から、分割したluciferae分子が近接した際に活性値の明らかな回復する位置を決定し、分割したluciferase断片と抗体結合能を有するprotein Gとの新規融合タンパク質を構築した。この構築した融合タンパク質のタンパク質濃度を高くすると、分割したluciferaseが近接し、luciferaseの活性が回復することを確認した。これにより、このluciferase融合タンパク質を用いて、細胞内分子のイメージングが可能になることが示唆された。ここでは、細胞膜透過能を有するペプチド配列(PTD)と抗体結合タンパク質との融合タンパク質を用いて、抗原の異なる部位を認識する2種類の抗体を導入し、細胞内抗原に結合した際のシグナル検出を計画した。平成21年度は、前年度に構築した分割luciferaseと抗体結合タンパク質との融合タンパク質を用いて、ホモジニアス系において抗原分子認識に伴うシグナルが得られかを検討した。作製した融合タンパク質と抗体を混合し複合体を形成させた後、抗原分子存在下においてluciferase発光測定を行なったところ抗原分子の濃度に依存した発光が観測された。この結果は、抗体・融合タンパク質の複合体が、抗原分子に結合することによりluciferaseが再会合し、活性を回復したことを示す。また、これと並行して細胞内へと導入された抗体が目的分子を認識可能であるかを検討した。ここでは、細胞増殖に関与するSTAT3を標的とし、抗STAT3抗体を、STAT3を恒常的に発現する細胞に導入した。その結果、抗STAT3抗体を導入した細胞は、細胞増殖が抑制され、導入された抗体の結合によりSTAT3シグナルが阻害されたことが示唆された。この結果より、導入された抗体が分子認識能を保持しているが示唆され、前述したluciferaseシステムとの組み合わせにより細胞内分子イメージングが可能であることが示された。
磁気光学イメージングによるFeAs系超伝導体の臨界電流特性改善と対対称性の解明

銅酸化物高温超伝導体の実用化への研究が山場を迎え、いよいよ超伝導体が社会に浸透し始めようとしている。しかし、経済性や使い易さを考慮した場合、現状の銅酸化物高温超伝導体にも問題が残っており、新規超伝導体の開発が求められている。2008年始めに発見された鉄系超伝導体は大きな可能性を秘めた物質系である。鉄系超伝導体は、既に5種類以上のタイプが発見されており、超伝導転移温度も当初の26Kから55Kを超える物質も合成されている。しかし、新しい超伝導物質が発見されても、T_cが高いだけでは実用化できない。磁場下でも大きな臨界電流密度(J_c)を持つ必要がある。そのために、鉄系超伝導体における混合状態(磁束状態)の詳細を明らかにする必要がある。本研究の主な目的は鉄系超伝導体における磁束状態を磁気光学イメージングを用いて明らかにすることである。この目的の為にCoドープされたBaFe_2As_2薄膜および単結晶を研究に用いた。本年度は、これまで123型の銅酸化物超伝導体のみで観測されていた再磁化後の磁束侵入における超伝導乱流による磁束-反磁束境界の不安定性の研究を行った。このために良質な最適ドープBa(Fe_<1-x>CO_x)_2As_2単結晶を用いた。H=-300 Oeの下で磁場中冷却された試料にH=+200 Oeの磁場を印加し再磁化したところ、磁束-反磁束境界の顕著な曲がりを伴う不安定性を磁気光学イメージングを用いて観察することができた。この不安定性と同時に、磁束-反磁束境界に顕著な局所磁束密度の変化を確認した。これは、磁東-反磁束境界に過剰電流が流れていることを示している。このことから観測された磁束-反磁束境界の不安定性が"マイスナーホール"に起因するものであることが確認できた。この観察により、"マイスナーホール"は、これまでに観察されていた123型銅酸化物高温超伝導体だけでなく、第2種超伝導体に共通の性質であることを確認することができた。磁気光学イメージングを用いて鉄系超伝導体の微視的な評価を行うことができた。また、鉄系超伝導体単結晶試料において、磁束と反磁束の境界に生じるマイスナーホールと言う磁束系の不安定性の存在を直接的に示すことができた。これは、マイスナーホールがこれまでに唯一観測されていた銅酸化物高温超伝導体特有の現象ではなく、第2種超伝導体に一般的な現象であることを示している。本研究と平行して、鉄系超伝導体線材の特性改善が進んでいる。本研究で用いた磁気光学イメージングは実用的な超伝導線材の電流制限機構を知るのに最適な手段であるので、今後は特性の改善しつつある鉄系超伝導線材の更なる特性の向上に寄与して行く必要がある。Fe系超伝導体における臨界電流密度の定量的な評価と、その増強を試みるための準備として、高品質な単結晶および多結晶試料の作製を行った。手始めのターゲットとして、既に良質の単結晶が作製できることの知られているFeサイトをCoで置換したBaFe_2As_2およびFe (Te, Se)単結晶を自己フラックス法および除冷法で作製した。Coで置換したBaFe_2As_2単結晶に関しては、先行研究(Y.Nakajima, T.Taen, and T.Tamegai, Physica C470, S408 (2010).))と矛盾の無いT_cおよび特性を示す試料を広いドーピング領域にわたり得ることができた。Fe (Te, Se)単結晶についても我々のグループの先行研究(T.Taen, Y.Tsuchiya, Y.Nakajima, and T.Tamegai, Phys.Rev.B80, 092502 (2009).)と同程度の高品質の単結晶を得ることができた。多結晶試料に関しては最近注目されているAsサイトをPに置換したBaFe_2As_2単結晶の作製準備として、高品質の多結晶作製を試みた。Pが置換されにくいとの情報をもとに、原料をNb管に封入し1200°C以上の高温に保たれArを流した炉心管に挿入し作製した。その結果、T_cが30Kを超え、超伝導転移幅の狭い純良多結晶試料を得ることに成功した。また、同じ温度で最高温度から冷却する時間を長くして結晶粒の成長をねらったが、数十μm以上の結晶粒を得ることはできなかった。磁気光学イメージング実験の効率化・柔軟性を高めるため、LabVIEWでCCDカメラからの画像取得に加え、磁場印加・温度制御を自動的に測定する為のシステムを構築した。Fe系超伝導体における臨界電流密度の定量的な評価と、その増強を試みるため、以下の項目を研究した。(1)高品質薄膜試料における臨界電流密度(J_c)の測定、(2)磁束侵入過程、再磁化過程における磁束密度分布測定、(3)P置換したBaFe_2As_2単結晶試料の作製。(2)BaFe_2As_2単結晶において磁束侵入と再磁化過程(磁場を印加後、反対向きの磁場を印加)における磁束分布を磁気光学イメージングを用いて観察した。その結果、再磁化過程においてゼロ磁場付近の磁束密度分布に弱いが再現性のある跳びが現れることを確認した。

これは、ゼロ磁場付近において試料中にマイスナー領域(マイスナーホール)が発生し、J_c以上の電流を流していることが原因である可能性がある。(3)昨年度に引く続き、P置換したBaFe_2As_2単結晶試料の作製を行った。本年度は石英管を用いて1250°Cまでの温度での結晶成長を試みた。しかしながら、未だ十分に大きな単結晶は得られていない。銅酸化物高温超伝導体の実用化への研究が山場を迎え、いよいよ超伝導体が社会に浸透し始めようとしている。しかし、経済性や使い易さを考慮した場合、現状の銅酸化物高温超伝導体にも問題が残っており、新規超伝導体の開発が求められている。2008年始めに発見された鉄系超伝導体は大きな可能性を秘めた物質系である。鉄系超伝導体は、既に5種類以上のタイプが発見されており、超伝導転移温度も当初の26Kから55Kを超える物質も合成されている。しかし、新しい超伝導物質が発見されても、T_cが高いだけでは実用化できない。磁場下でも大きな臨界電流密度(J_c)を持つ必要がある。そのために、鉄系超伝導体における混合状態(磁束状態)の詳細を明らかにする必要がある。本研究の主な目的は鉄系超伝導体における磁束状態を磁気光学イメージングを用いて明らかにすることである。この目的の為にCoドープされたBaFe_2As_2薄膜および単結晶を研究に用いた。本年度は、これまで123型の銅酸化物超伝導体のみで観測されていた再磁化後の磁束侵入における超伝導乱流による磁束-反磁束境界の不安定性の研究を行った。このために良質な最適ドープBa(Fe_<1-x>CO_x)_2As_2単結晶を用いた。H=-300 Oeの下で磁場中冷却された試料にH=+200 Oeの磁場を印加し再磁化したところ、磁束-反磁束境界の顕著な曲がりを伴う不安定性を磁気光学イメージングを用いて観察することができた。この不安定性と同時に、磁束-反磁束境界に顕著な局所磁束密度の変化を確認した。これは、磁東-反磁束境界に過剰電流が流れていることを示している。このことから観測された磁束-反磁束境界の不安定性が"マイスナーホール"に起因するものであることが確認できた。この観察により、"マイスナーホール"は、これまでに観察されていた123型銅酸化物高温超伝導体だけでなく、第2種超伝導体に共通の性質であることを確認することができた。磁気光学イメージングを用いて鉄系超伝導体の微視的な評価を行うことができた。また、鉄系超伝導体単結晶試料において、磁束と反磁束の境界に生じるマイスナーホールと言う磁束系の不安定性の存在を直接的に示すことができた。これは、マイスナーホールがこれまでに唯一観測されていた銅酸化物高温超伝導体特有の現象ではなく、第2種超伝導体に一般的な現象であることを示している。本研究と平行して、鉄系超伝導体線材の特性改善が進んでいる。本研究で用いた磁気光学イメージングは実用的な超伝導線材の電流制限機構を知るのに最適な手段であるので、今後は特性の改善しつつある鉄系超伝導線材の更なる特性の向上に寄与して行く必要がある。
リンパ管新生を制御する分子の同定とリンパ節転移およびリンパ浮腫の治療研究

リンパ管新生、リンパ節転移、肺内転移の評価系確立のため、ルシフェラーゼ安定発現ヒト肺がん細胞株(A549)の樹立を行った。肺がん細胞における細胞内シグナル経路を調べ、血管新生、リンパ管新生に重要であるHIF1aの活性に影響を及ぼす化合物を同定した。これらの化合物のリンパ管新生阻害効果ならびに促進効果を検討した。またA549ルシフェラーゼ安定発現細胞をマウスに移植し、これらの化合物の腫瘍形成、増殖に及ぼす効果、リンパ管新生、リンパ節転移、肺内転移に対する効果を検討した。これまでにin vitroにおけるリンパ管新生評価系のセットアップ、ならびにin vivoイメージングを用いた肺癌同所移植モデルの確立とリンパ管新生、リンパ節転移、肺内転移の評価系確立のため、ルシフェラーゼ安定発現ヒト肺癌細胞株(A549, PC-9)の樹立を行った。さらにリンパ管新生に関連する転写活性を網羅的に解析するため、in vitroにおけるデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて天然物由来ケミカルライブラリーのスクリーニングを行った。肺癌細胞における細胞内シグナル経路について検討する目的で、17種のレポーターベクターを構築した。それぞれのシグナル応答配列に結合する転写因子は、CREB, ERSF, FOXO, GLI, HIF1α, ISGF3, MYC, NANOG, NFκB, OCT3/4, p53, RBP. SMAD2/3, SOX2, TCF/LEFである。このアッセイ系により血管新生、リンパ管新生に重要であるHIF1aの活性に影響を及ぼす化合物を同定した。これらの化合物のリンパ管新生阻害効果を検討するため、in vitroにおけるマトリゲルプラグアッセイによってリンパ管新生阻害、ならびに促進効果を検討した。またA549ルシフェラーゼ安定発現細胞をscidマウスに同所移植し、これらの化合物の腫瘍形成、増殖に及ぼす効果、リンパ管新生、リンパ節転移、肺内転移に対する効果を検討した。腫瘍の増殖、形成についてはルシフェラーゼ発光イメージングにより定量的かつ経時的に評価をした。またリンパ管新生については組織サンプルを採取して病理組織学的に検討した。リンパ節転移、ならびに肺内転移については摘出臓器のルシフェラーゼ発光イメージングによって定量評価をした。今回はケミカルライブラリーのスクリーニングによりリンパ管新生を特異的に阻害する化合物の同定には至らなかったが、今後は肺癌治療薬との併用による効果など検証していく事で新たな治療戦略の確立につなげたい。in vitroにおけるリンパ管新生評価系のセットアップを行った。リンパ管内皮細胞を用いたマトリゲルを用いたin vitroリンパ管新生モデルにおいて遺伝子発現、およびMAPK経路のシグナル伝達についてウェスタンブロッティグによって解析した。またMAPK経路の阻害剤を用いてリンパ管新生に対する影響を調査した。今回検討した条件では大きな変化は見られなかった。またin vivoリンパ管新生阻害、促進を定量的に評価する目的でヒト肺がん同所移植モデルにおいてルシフェラーゼ発現肺がん細胞株の樹立を行った。ヒト肺がん細胞株A549またはPC9にホタルルシフェラーゼ発現プラスミドをリポフェクション法にて導入し、薬剤耐性遺伝子発現によりセレクションを行い、限界希釈法にてA549またはPC9ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞株(A549 Luc2細胞、PC-9 Luc2細胞)を樹立した。A549 Luc2細胞、PC9 Luc2細胞の可移植性についてnudeマウス、およびscidマウスに皮下移植、経尾静脈接種によって検討した。今回樹立したPC9 Luc2細胞はin vivoにおいていずれの移植モデルでも造腫瘍性を示さなかったがA549細胞は造腫瘍性を示した。予定通り、in vitroにおける網羅的なリンパ管新生評価系の解析は終了した。各論的にA549 Luc2細胞、PC9 Luc2細胞の可移植性について、nudeマウスおよびscidマウスに皮下移植、経尾静脈接種によって検討するまでにいたった。平成25年度目標のin vivoの足掛かりまで検討することができた。今後は肺同所性移植モデルの確立と、リンパ節転移の定量評価についての検討をリンパ管新生阻害のin vivoでの評価を行う。またすでに判明しているin vitroにおける網羅的なリンパ管新生評価系の解析データをもとに、MAPK経路以外のリンパ管新生評価系の解析もおこなう。リンパ管細胞および腫瘍細胞培養のための消耗品、また動物実験のためのマウス購入費用が主な支出となる。また今回確立したルシフェラーゼ発現肺がん細胞株以外にも多種のルシフェラーゼ発現肺がん細胞株を樹立する必要があり、Luciferinを含む消耗品が必要になる。また次年度は研究内容の学会発表および論文作成の校閲を予算化した。今年度の予算は、教室に常備されている消耗品の在庫のため、請求額が少額となったが、実質的には物品が使用されている。若干時間的ずれが生じてしまったためと考えらえる。次年度は、より早い段階で消耗品が使用される見込みである。
PETを用いた難治性中枢神経腫瘍に対するホウ素中性子捕捉療法の新規適応の可能性

基礎実験において、F-BPAとBPAの集積には若干の解離があった。F-BPA PETの集積が高い例ではこれに依存してLAT-1染色が強陽性となった。一部の例では血管のみが強陽性で、BNCTへの適応は慎重であるべきと考える。また、多くの転移性脳腫瘍ではF-BPAPETの集積が中等度にとどまり、転移性脳腫瘍に対しBPAを用いたBNCTの適応を判断する際には、BPA-PETは必須の検査と考える。ホウ素中性子捕捉療法(Boron Neutron Capture Therapy ; BNCT)は"細胞選択的粒子線治療"であり、悪性神経膠腫のごとく浸潤性の腫瘍に対し効果が期待さる。照射線量は、用いられるホウ素化合物の分布によって決定され、近年PET(positron emission tomography)検査の導入により、その技術は飛躍的の向上している。最近PETを用いて、BNCTの新規適応拡大に応用する試みがなされているが、検査に用いるF-BPAの薬物動態や、治療に用いるBPAとの比較など、未だ詳細には検討されていない。本申請では、標準治療のない難治性臨床例に本検査を適用し、BNCTの新規適応の可能性を探索するとともに、BPAとF-BPAの動態につき基礎的研究を行い、本検査法による適応判断の妥当性を検証することを目的とする。本年度、これまでの臨床症例でBPA-PETを術前に施行した例を中心に組織学的検討を加え、主たるトランスポーターと考えられるLAT-1の免疫染色を施行し、BPA-PETで高いL/N比を示した症例でLAT-1が強陽性となる傾向を認めた。これをもとに、これまでの経験症例に対し免疫染色を加え、中性子捕捉療法の新規適応に関して検討を行うこととする。実験系では、F-BPAとBPAの薬物動態に関して双方に比較検討を行っているが、現時点では、F-BPAとBPAの集積には若干の解離がみられており、今後引き続き検討が必要である。また、臨床例では新規にPETを施行し、脳原発悪性リンパ腫での高集積を認めた。さらに転移性脳腫瘍での組織型による集積の違いが明らかとなり、一部の症例でホウ素中性子捕捉療法の適応となりうることを示した。今後、さらなる症例の蓄積を行い、新規適応の可能性に関し詳細を検討する。照射線量は、用いられるホウ素化合物の分布によって決定され、近年PET (positron emission tomography)検査の導入により、その技術は飛躍的の向上している。これまでの臨床症例において、BPA-PETを術前に施行した例を中心に組織学的検討を加え、主たるトランスポーターと考えられるLAT-1の免疫染色を施行し、BPA-PETで高いL/N比を示した症例でLAT-1が強陽性となる傾向を認めた。これによれば、基本的に神経膠腫では染色強度は悪性度に依存して上昇したが、低悪性度の神経膠腫には一部染色が強陽性となった。しかしながら染色は主に、腫瘍の栄養血管に強い傾向があり、腫瘍細胞そのものではなかったため、BNCTへの適応は慎重であるべきと考える。実験系では、F-BPAとBPAの集積には若干の解離がみられており、その後の検討ではアミノ酸の光学異性体の含有率など、微細な相違が関与していることが考えられた。また、臨床例では新規にPETを施行し、多くの転移性脳腫瘍では中等度の集積にとどまることが解った。転移性脳腫瘍に対しBPAを用いたBNCTの適応を判断する際には、BPA-PETは必須の検査と考える。
食品ゲルにおける官能評価と網目の構造及び運動性との関係

本年度は前年度までに確立した拡散係数の幅広い拡散時間での測定方法をさらに向上させるために、西シドニー大学のWilliam Price教授の研究室を訪問・滞在し、具体的なパルスシーケンスの改良などの作業を行って来た。その結果、特に長い拡散時間を設定した場合のスペクトルのゆがみを解決することができた。これまでの成果を投稿論文としてまとめ、この分野で高い評価にあるFood HydrocolloidsやCarbohydrate Polymersなどに投稿し、受理された。他にも国際会議などにおいて多くの成果発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、食品の官能評価性を物理化学観点からアプローチする研究手法を確立する事を目的とする。即ち、食品ゲルの食感や呈味挙動などをゲル内における物質拡散挙動から検討する。本年度は、食品ゲル内における物質拡散空間の評価を行うために必要になってくるプローブ分子の拡散係数を拡散時間が5msから5000msまで幅広い拡散時間において計測する手法を確立することを目的とした。そのために、長いT1緩和時間を持つポリエチレングリコール鎖を末端修飾鎖として持つデンドリマーをプローブとして用いることを念頭にポリエチレンの緩和時間測定を行った。その結果、1HT1と13CT1はともに数秒程度の値となり、この程度までの拡散時間での測定が可能であることが分かった。これらの結果から、本研究において上記のデンドリマーをプローブとして用いることが有効であることが示された。また、その網目構造の間隙(拡散空間)におけるプローブ分子の拡散時間依存性を計算機シミュレーションによる検討を行うため、高分子鎖が凝集して網目を形成する過程を格子モデルを用いてプログラム化した。その結果、凝集した網目鎖は2前後のフラクタル次元を持つ空間構造となる事が分かった。さらに、呈味成分などが拡散・浸出できる網目の間隙は、高分子の鎖長、温度低下速度に依存することが明らかとなった。これらの結果は拡散時間を幅広く変動させた拡散係数測定結果を解析するための有用な情報となる。以上の結果は、今後、プローブ分子の拡散挙動から、網目構造や呈味成分の放出挙動を検討する上で有用な基礎的知見となる。前年度の検討で得られた結果を基にプローブデンドリマーの拡散係数を拡散時間を幅広く変えて行う検討を行った。その結果、デンドリマーの緩和時間は数百ミリ秒程度であり、数秒までの拡散時間での測定が難しい事が分かった。そこでプローブ高分子としてポリエチレングリコールを用いて検討を行った。しかし、拡散時間を幅広く変えるとそれに伴い、NMR緩和(T1及びT2緩和)によるピーク信号の減衰が起こり、緩和時間の長い成分が相対的に強調される結果となって、拡散時間の変化を正しく反映しなかった。そこで、NMR緩和による減衰の影響が一定となるように拡散係数測定のパルスシーケンスを作成して、拡散時間を10ミリ秒から1000ミリ秒までの幅広い範囲で変えて測定を行った。得られた結果からはプローブ高分子の拡散係数の拡散時間依存性は非常に小さなものであり、拡散空間の構造(フラクタル次元など)を検討するには至らなかった。ゲル構造形成過程の計算機シミュレーションから得られた結果は降温速度などのゲル化条件と保存時間によって網目構造とその隙間の拡散空間に違いが見られた。また、水透過性の実験においても網目構造の違いが反映された。前年度には超高磁場勾配NMRプローブの海外修理のために約2か月の間、測定不能となるトラブルのため本研究課題の中心となっているプローブ高分子の拡散係数測定に大きな遅れが出たが、今年度はこの測定を中心に行った。特に、緩和の影響を一定に保ったまま拡散時間を10ミリ秒から1000ミリ秒までの幅広い範囲で変えて行うための拡散係数測定用のパルスシーケンスを作成し、当初、目的とした測定を行う事が出来た。また、プローブ高分子としてポリエチレングリコールを用いることにより、長い拡散時間での測定を行う事が出来た。平成26年度で検討に用いた分子量数百万のポリエチレングリコールよりも、さらにサイズが大きいプローブを用いて拡散挙動を測定することにより、拡散空間のゲル作成条件による違いを検出する。また、これらの拡散空間の違いと咀嚼時の水分放出との関連を検討する。そのために、数十ナノメートルの核にポリエチレングリコールがグラフトされたナノ粒子を用いて実験を行う。さらに、拡散時間を数千ミリ秒まで長くするために、西シドニー大学のWill S. Price教授と共同でスピンエコー法をベースとしたパルス状磁場勾配測定を改良する。得られた成果は食品化学工学会の年次大会において発表する予定である。本研究課題の中心となっている拡散係数測定用超高磁場勾配NMRプローブが温度センサー不良のため、海外での修理が必要になり、その間の約2か月の間、測定不能となった。

そのため、通常の多核用測定プローブを用いたT1緩和時間測定と計算機シミュレーションを中心に研究を進め,全体の達成度に遅れが出ないようにした。なお、NMR装置は全学共同利用機器となっており、磁場勾配プローブの修理費用は共同利用機器運営費用から支出される予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の検討で得られた結果を基にプローブデンドリマーの拡散係数を拡散時間を幅広く変えて行い、拡散空間の構造(フラクタル次元など)を検討し、計算機シミュレーションで得られた結果と比較する。さらに、官能評価との関連を明らかにするために、NaClや糖などの拡散と咀嚼応力下での滲み出し・放出挙動を測定し、プローブデンドリマーの拡散測定から得られた拡散空間と比較・検討する。その中で、官能評価性の物理化学的手法によるアプローチとしての本法の有用性を評価し、改良などの可能性を検討する。
交叉耐性適応機構解明のための高温耐性適応ラットの生理的特性研究と関連遺伝子の探索

高温ストレス耐性と他の環境ストレス耐性との関係(交差耐性・交差適応)を、遺伝的に高温ストレス耐性FOKラットと対照系で比較研究して、下記の成果を得た。[a] FOKラットにのみ高温域で強力に発動されてくる蒸発性熱放散が見られた。FOKラットは体重の14%の脱水に耐えながら、中枢神経によるネガティブ・フィードバック調節によって蒸発を精密に調節しいた。体温を37°Cまで下げることなく39-40°Cに維持して暑熱と脱水に耐えるメカニズムであった。[b]各種の脳傷害の検討をおこなった。estrogenは、3-NPAによる脳血管上皮細胞障害を予防した。脳線状体出血後、出血部位周囲と中脳黒質に有機オスモライトであるNa/myo-inositol cotransporter (SMIT)mRNAが発現した。線状体は3-NPAにたいして脆弱であった。そのの原因は、細胞傷害性ニューロンが多い事や血管脆弱性等によった。heat strokeによる傷害にたいしても、線状体が脆弱である可能性がある。[c]近交系FOKラットは多面的特性、とくに交差耐性があった。FOKラットは、耐寒性でもあり、血中脂質濃度が低くて高脂血症になりにくかった。さらに心理的ストレス発熱が大きい系統の一つであり、LPS発熱が大きな系統の一つであった。1,FOKラットで高体温域で強力に発動されてくる熱放散機構の意義とメカニズムの研究(1)、中枢の体温調節機構と唾液分泌量の間にnegative feedback調節系があることを発見した。FOKラットは、Ketamine麻酔下で体温39.0°C以上で体温上昇に比例して顎下腺から大量の唾液を分泌した。これによって、無麻酔下ではnegative feedback機構により体温を39.5°C-40.0°Cに保持することがわかった。Donryuラットは唾液分泌はわずかで、体温は急速に上昇した。SDラットはかなりの唾液を分泌したが体温上昇に比例していなかった。これは、高温環境で体温を一定に保持しにくいことを示唆している。ACIラットは、体温40.0°C以上で体温に比例して唾液分泌量が増加するが分泌量が少なかった。FOKが他系統より広く体表へ唾液拡散する環境温度域は38.5°C以上であった。(2)、各系統の摘出顎下腺のacetylcholine刺激時の唾液分泌量を比較したところFOKラットで唾液量が多いという系統差はあったが、無麻酔時に比べるとわずかな差であった。これは、温熱性唾液分泌の系統差の原因が主として中枢性調節にあることを示唆している。(3)、FOKラットの顎下腺の形態的特徴、とくにaquaporin5の発現を検討中である。(4)、唾液中のpanncreastatin様物質の系統差を検討したところ、高濃度noradrenaline刺激ではFOKラットで多かった。2,我々が開発したFOKラットの広汎な諸性質の研究(1)、寒冷環境ではラットの体温が約1°C上昇した。FOKラットは、ストレス発熱が大きい系統の一つだった。(2)、FOKラットは対照系よりも血中脂質濃度が低くて不飽和脂肪酸が多い傾向にあったが、さらに検討を必要とする。3,高体温および諸耐性適応に関与する遺伝子の同定(1)、高温暴露時に視床下部に多く発現してくる遺伝子を同定する準備をしている(3年計画)。(2)、高温耐性関連遺伝子の連鎖解析(Quality Trait Loci法)ための勉強をしている。(a)無麻酔ラットを様々な高温環境に暴露して、体表へ唾液拡散する閾値体温を測定したところ、閾値は系統によって異なっていた。FOKラットは、閾値が38.7。Cにあり、もっとも低い系統の一つであったが、抜きん出ているわけではなかった。(b)温熱性唾液分泌の中枢性調節の実験は今年度は実施しなかった。II,我々が開発したFOKラットの広汎な諸性質の研究(a)[脂質プロファイル]

FOKラットは対照ラットに比べて血中トリグリセリド濃度が1/3くらいしかなく、このことはFOKラットはコレステロールも含めたVLDL値が低い低脂血を呈していることがわかった。さらに、ベータ・ブロッカーであるプロプラノロール事前投与によりトリグリセリド値が半分回復した。このことは、この低脂血症が一部がベータ受容体を介しておこっており、その他にも未知の経路が関与していることを示唆している。さらに、FOKラットは血中トリグリセリド中の高級不飽和脂肪酸(アラキドン酸とDHAが対照ラットより多く、寒冷暴露による増加も大きかった。FOKラットは血中リン脂質中のDHAが対照ラットより多く、寒冷暴露による増加も大きかった。これらの知見は、FOKラットの血中脂質プロファイルは先天的に寒冷反応型であることを示唆している。(b)[脱共役タンパク質]各種臓器のUCPをFOKラットと対照ラットで比較している。現在のところ、胸腺UCP2がFOKラットで多い。その免疫学的意義は不明である。環境温度25°Cで両系統の視床下部をパントバルビタール麻酔下に摘出し、細胞ストレス用DNAチップによるマイクロアレイ法を使って遺伝子発現を比較しました。発現が増加していると考えられる遺伝子(3)発現増加が示唆される遺伝子(6)これらの遺伝子は、細胞死、DNAミスマッチ及びその修復に関与するするものの一部です。ナトリウム代謝、鉄代謝、酸素濃度に対する作用をあわせ持つものも含まれています。[II]、ラットの尾の血管の暑熱反応暑熱暴露時にラットの尾の表在動脈が拡張することが判明しました。
セラミックス積層材の焼結過程での発生応力評価モデルの構築

各種のセラミックスの成形体から焼結体に至るまでの熱弾性的性質の変化から,異なるセラミックスで構成される積層材中に焼結過程で発生する応力を評価するためのモデルを構築することを目的とした.まず,弾性体,弾塑性体,粘弾性体およびこれらの組み合わせた一般的な積層材モデルについての理論解析を行い,積層材の熱応力評価に関する包括的なモデルを構築した.次に共同研究者の最近の研究成果から成形体の均質性自体が焼結過程での亀裂発生に大きな影響を与えることがわかったので,研究の方向を修正して研究期間の後半では,成形体の均質化過程について理論解析を行い,その妥当性を実験的に検証した.最後に,本研究を総括した.本研究では,代表的なセラミックスに対して,成形体から半焼成体を経て焼結体に至るまでの機械的性質,熱膨張係数,焼結ひずみの変化を測定して,これらの材料で構成される積層材中に焼結過程で発生する応力を定量的に評価することを目的とする.また,これに合わせて,高温下での仮焼体も応力/ひずみ関係を調べ,焼結過程における粒子構造変化と構成方程式の関係を学術的に議論することを行い,セラミックス積層材の最適構造設計のための応力評価モデルの構築を行う.平成25年度には,既往の研究で仮定していた弾性体から,弾塑性体,粘性体,粘弾性体に構成方程式を拡張して理論の一般化を行った.また,これまで対称3層積層材での解析であったのを,n層からなる多層積層材にも適用できるように拡張し,その極限として,組成が連続分布する機能傾斜材料での応力評価モデルも定式化した.これらの研究成果を国内外の学会で公表したところ,複数の研究者から問い合わせがあり,具体的な計算の方法を説明して彼らの試料でも検討してもらうことになった.このように,当初の計画より応力評価モデル構築のための理論解析を集中的に検討したが,実験としても,新規購入した顕微強の整備を行うと共に,超音波探傷法により積層材中の欠陥形成の検出の可能性を検討した.また,平成26年度の計画を一部修正して窒化ケイ素セラミックスについて検討することにしたので,今年度は,窒化ケイ素セラミックスの1700度までの熱膨張係数についても予備的に検討した.また,研究分担者はアルミナセラミックス焼結中の粗大気孔の形成過程を検討し,成形時の顆粒間欠陥および顆粒内欠陥を制御することが重要であることを示した.そこで,研究代表者と共に.顆粒のCIP成形体中の応力分布解析のモデルについても検討した.本研究では,代表的なセラミックスに対して,成形体から半焼成体を経て焼結体に至るまでの機械的性質,熱膨張係数,焼結ひずみの変化を測定して,これらの材料で構成されるセラミックス積層材中に焼結過程で発生する応力を定量的に評価するための応力評価モデルの構築を行うことを目的とする.また,これに合わせて,高温下での仮焼体も応力/ひずみ関係を調べ,焼結過程における粒子構造変化と構成方程式の関係を議論することも行う.これらの検討により,積層材の最適設計構造設計の基礎的な考え方を確立することとしている.平成26年度には,昨年度,理論解析をした結果について,招待講演の依頼が多数あり,弾性体だけでなく,弾塑性体,粘性体,粘弾性体に構成方程式を拡張した理論と,n層からなる多層積層材に拡張した理論を,適宜,組み合わせて,国内外の学会で招待講演を複数行った.このため,当初の計画で予定していた仮焼した単層材の特性評価や仮焼体の構成方程式の実験は十分できなかったが,窒化ケイ素焼結体についてのみ,1700°Cの高温域までの熱膨張特性の測定を行って,国内外の学会で発表をしている.また,研究分担者の検討結果によれば,アルミナ単層材の亀裂生成を支配するのは,成形体中の均質性が重要であり,その特性評価法には単一顆粒の圧縮試験を検討すべきであるとの指摘があったので,仮焼した単層材の実験を行う前に,まずは,成形体の均質性について,十分注意を払うことが認識された.そこで,当初の計画から一部変更して,研究代表者と研究分担者で,顆粒の崩壊過程の観点から,成形体の均質性について,まずは,理論的に考察することにした.本研究では,代表的なセラミックスに対して,成形体から半焼成体を経て焼結体に至るまでの機械的性質,熱膨張係数,焼結ひずみの変化を測定して,これらの材料で構成されるセラミックス積層材中に焼結過程で発生する応力を定量的に評価するための応力評価モデルの構築を行うことを目的とする.また,これに合わせて,高温下での仮焼体の応力/ひずみ関係を調べ,焼結過程における粒子構造変化と構成方程式の関係を議論することも行う.これらの検討により,積層材の最適設計構造設計の基礎的な考え方を確立することとしている.理論解析については,既に,最初の2年間で,一般的なモデルが構築できており,当初の予定では,後半の2年間では,仮焼体の構成方程式に研究を進めるつもりであった.しかし,昨年度の研究により,成形体の均質性が,発生応力そのものと同様に,焼結過程での亀裂発生に大きな影響を与えることが推測されたので,平成27年度には,この成形体の均質性について,理論と実験の両面から集中的に検討することにした.

具体的には,研究代表者は,ヤング率が半径方向で変化する球状成形体に対して(通常の材料力学では,ヤング率が一定の場合が解かれている),外部から等方圧を負荷したときに成形体内に発生する応力分布を求めるための新たな微分方程式を理論的に導出し,また,それを数値計算で解くことにより,加圧成形時の成形体に発生する不均質な応力分布を求めた.さらに,その応力分布に破壊位置の確率論を適用して,顆粒の崩壊確率の半径方向依存性を計算する手法を開発した.また,研究分担者は,アルミナ単層材の欠陥生成の様子を,仮焼温度を変えながら逐次観察して,顆粒の変形,粒子の移動,気孔の集積の観点から,実験的に欠陥生成を検討し,むしろ,焼結の後半では,巨大気孔が成長するとことを明らかにした平成25年度には,研究の全期間で構築予定であった積層材の焼結中における内部応力評価モデルについて,弾性体だけでなく,弾塑性体,粘性体,粘弾性体に構成方程式を拡張することができ,また,3層積層材からn層積層材や連続分布の場合にも一般化することができた.そういう意味では,本研究の当初の目的は,この時点でほぼ達成されたことになる.そして,平成26年度は,これらの理論解析の結果を国内外の会議で発表することを重点的に行ってきた.また,実験的検証については,国内外の発表に時間を取られたため,当初,予定していた実験は十分にできなかったが,アルミナセラミックス中の亀裂生成を超音波探傷で検出することと,窒化ケイ素単層材の1700度までの熱膨張係数を検討することは実施できて,それらの結果も国内外の会議で発表した.また,分担者による研究では,単層材焼結中の欠陥生成は,成形時の顆粒の崩壊過程に影響されるので,成形体の均質性をキチンと評価してから,単層材の特性評価や高温での構成方程式を検討する必要性があることがわかった.これらの結果を受けて,さらに,平成27年度には,焼結過程での発生応力と同様に,亀裂生成に重大な影響を与える成形体の均質性に,研究代表者と研究分担者で集中して検討し,理論と実験の両面で,新たな知見を得ることができた.このように,本研究の当初の目的であるモデルの構築は,すでに達成されており,仮焼体の構成方程式についての実験については,まだ,十分行っていないが,その前に,成形体の均質性の評価が必要になったので,実験の計画を一部修正して検討を進めているところである.ただし,特に,研究分担者が平成27年度行った実験は,見方を変えると,仮焼体の構造変化を検討しているものであるので,そういう意味では,当初の計画については,大体,着手していると考えることもできる.本研究では,代表的なセラミックスに対して,成形体から半焼成体を経て焼結体に至るまでの機械的性質,熱膨張係数,焼結ひずみの変化を測定して,これらの材料で構成されるセラミックス積層材中に焼結過程で発生する応力を定量的に評価するための応力評価モデルの構築を行うこと,また,これに合わせて,高温下での仮焼体の応力/ひずみ関係を調べ,焼結過程における粒子構造変化と構成方程式の関係を議論することを目的とした.これらの検討により,積層材の最適設計構造設計の基礎的な考え方を確立することとしている.まず,前半の応力評価モデルに関する理論解析については,既に,最初の2年間で,弾性体,弾塑性体,粘弾性体およびこれらの組み合わせた一般的な積層材モデルについての解析が成功し,積層材の熱応力評価に関する包括的な解釈が可能となった.
蛋白添加前処理法を用いたESPによる血漿エンドトキシン測定法の開発

従来の比濁時間比濁時間分析法では1.0pg/mlのエンドトキシンを測定するのに119分を要していたが、今回開発した検体の前処理にヒト血漿タンパクを添加したESPによる測定では30分以上の測定時間の短縮が可能であり、また測定感度も従来法に比べ上昇した。敗血症の原因物質である血漿中エンドトキシンの測定方法は現在においても確立されていない。現在保険適応されている測定法は比濁時間分析器を用い検体前処理にはTritonXでの10倍希釈加熱する方法であるが、以前よりその測定感度の低さが指摘されていた。今回我々は測定機器にESP法を用い、前処理にはTritonXにかわりヒト血清アルブミンを用いた方法を開発し検討を添加した試薬を用いたESP法により新規エンドトキシン測定法の開発について研究を行った。まず測定系の精度であるが、今回の検討では従来の前処理法を用いた比濁時間分析法およびESP法ではそれぞれ感度57.0%・特異度97.0%、感度が75.9%・特異度が97.0%であった。それに比較し今回の検討を行ったアルブミン添加法によるESP法では感度が82.1%、特異度が97.0%と良好な成績であった。また測定時間においても1.0pg/mlのエンドトキシンを測定するのに従来の前処理法では比濁時間法が119分、ESP法が60分を要していたが新規方法では43分であった。目標としてベッドサイドでの測定系の確立も目座しているがいまのところ測定精度にばらつきがみられ臨床応用には至っていない。新規測定法の開発目標としていた測定感度の上昇と測定時間の短縮においては良好の結果を得られ、現在論文作成中である。基礎的検討による新規血漿前処理法を用いたESP法による血中エンドトキシン測定法の検証について、まずリムルステストによる検討では健常人血液検体にエンドトキシン標準試薬を添加に比濁時間分析法、従来の前処理法を用いたESP法(以下旧ESP法)、今回新規開発中の前処理法を用いたESP法(以下新ESP法)で測定し検討したところ、比濁時間分析法と新ESP法ではほぼ同様な値を呈することが明らかとなり、また旧ESP法では偽陽性を示す症例や異常高値を示す症例を認め、臨床応用には非常に問題があることが再確認できた。またフローサイトメトリー法による検討ではフローサイトメトリーを用いて血液内のエンドトキシンの局在を検討したところ、血漿中にフリーの状態で遊離しているエンドトキシンに比較し、白血球に結合し存在しているエンドトキシンが多いことが判明した。エンドトキシン特異性の検討についてはリムルスカスケードの第一段階であるファクターCに対するモノクロナール抗体を添加しリムルスカスケードを完全に抑制しそれぞれの測定法にてエンドトキシンしてところ、旧ESP法では偽陽性反応を呈する症例が多く認められ、測定値が真のエンドトキシンではない可能性が示唆された。新ESP法ではこの方法で処理した検体ではエンドトキシンが検出された症例は見られなかった。測定時間の迅速化については新ESP法では測定感度が上昇したため測定時間も必然的に短縮した。しかし前処理法はまだ検討する予知もありさらに時間の短縮が可能となる余地もあると考えている。基礎的検討による新規血漿前処理法を用いたESP法による血中エンドトキシン測定法の検証、エンドトキシン特異性の検討については23年度で約100例以上の症例で検討し一定の見解を得ることができている。測定時間の迅速化については新規前処理法が確立されれば具体的な短縮時間も数値として示すことが可能であると考えている。現在、健常人の血液検体にエンドトキシン試薬を添加し各測定法にて検討を行っているが、今後は臨床検体を用いて測定し、同時に測定するサイトカインや血液培養、グラム染色結果と照らし合わせながら、新ESP法の陽性的中率を検討していく、また新ESP法が真のエンドトキシンを測定していると十分証明されるようであれば、当施設で検討を行っているルシフェラーゼ反応を用いたエンドトキシン測定との組み合わせによりベットサイドでのエンドトキシン測定の確立を目指したいと考えている。今年度からの繰り越しは1307円で、従来の計画どおり次年度は研究を行う予定です。サイトカインの測定をメインに行うため、その測定キットの購入分が今年度より増す予定。