hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
書かれた論争からの学習メカニズムの検討

複数テキストの対立する議論を批判的に統合した場合,それらのテキスト(書かれた論争)から人は何を学ぶのか。本研究では,複数文書モデル枠組みの観点から,批判的統合を介して構築される心的表象と,その構築に影響する要因を検討する6つの実験を実施した。実験の結果,批判的統合は,メンタル・モデルと間テキスト・モデルからなる複数文書モデルの構築を促進することが示された。また,複数文書モデル構築が課題依存型の過程であるという考えと整合する知見として,読解課題がその過程に影響を及ぼすことも示された。ただし,出所情報の質と認知欲求が影響するという証拠は得られなかった。本年度は,まず,書かれた論争からの学習メカニズムに関して昨年度実施した実験の結果を分析し論文にまとめて投稿した(この論文は学会誌に掲載が確定している)。加えて,次の3つの研究を実施した。1.出所が批判的統合に有用な情報を提供する場合に論争的な複数テキストから複数文書モデルが構築されるか検討する実験を,大学生を対象にして実施した。実験の結果,予想に反して,出所情報の有用性にかかわらず,複数状況モデルと間テキスト・モデルを備えた複数文書モデルが構築されることが示された。2.書かれた論争からの学習において重要なテキスト間関係の理解に及ぼす読解課題の影響を検討する実験を,大学生を対象にして実施した。この実験では,読解中にとったメモの内容に着目し,読解課題がその内容に影響するかどうかだけでなく,メモがテキスト間関係の理解に影響を与えるかどうかについても検討した。実験の結果,読解中に,テキスト間関係に注目したメモをとること,あるいはテキスト間関係にメモを向けることがテキスト関係の理解を促進することが示された。この結果は,書かれた論争からの学習においてテキスト間関係を自発的に理解しようとしないことが,学習の失敗につながることを示唆しており,書かれた論争からの学習メカニズムの一端を明らかにする重要な知見と言える。現在,これらの成果を論文としてまとめ投稿する準備を進めている。3.書かれた論争からの学習メカニズムと関係性が深い持続的影響効果に関する先行研究の知見を整理・統合するメタ分析を実施した。メタ分析の結果,誤情報の訂正によって状況モデルが部分的に更新されるが完全に更新されるわけではないこと,誤情報の撤回に加えて代替説明・原因を提示することが更新を促すことが示された。現在,この成果をまとめて学会発表する準備を進めている。本年度は,論争的な複数テキストから批判的統合を介して構築される記憶表象の性質について検討するために,次の3つの研究を行った。1.論争的な複数テキストから構築される記憶表象の性質を調べた国内外の研究を幅広くレビューし,現時点での到達点と課題を整理した。この結果についてはレビュー論文としてまとめ,本年度刊行の大学紀要において発表している。2.批判的統合を介して構築される記憶表象の性質を調べるために新しく開発した実験パラダイムを用いて,大学生を対象とした個別実験(実験1)を実施し,構築される記憶表象の性質について対照的な2つの仮説(選択融合仮説とアーギュメント仮説)を検証した。しかし,学習測度の問題から得られた実験データでは2つの仮説を差別化することができなかった。そこで実験2では,学習測度を一部改変して追試を実施した。その結果,(複数テキストから複数文書モデル[複数状況モデルと間テキスト・モデルが統合された記憶表象]が構築されるとする)複数文書モデル枠組みの仮定と一致するアーギュメント仮説を支持する結果が得られた。複数文書モデル枠組みが複数テキストからの学習においてもっとも有望な理論的枠組みとされていながら十分な検証が行われていないことに照らして,これは重要な成果と言える。2つの実験結果は論文としてまとめ国際誌に投稿中である。3.「1」の実験パラダイムで用いたテキスト材料が現実場面で用いられている複数テキストとかなり異なることから,できるだけ現実の複数テキストに近いテキスト材料を用いて,複数文書モデル枠組みの仮定をさらに検証する実験を大学生を対象に実施した。現在,その実験で得られたデータを分析中である。本年度は,研究期間の最終年度にあたる年であり,書かれた論争からの学習メカニズムに関して,追加の研究と3年間にわたる研究結果の総合をおこなった。1.追加の研究:書かれた論争からの学習において,複数文書モデル枠組み(e.g., Britt & Rouet, 2012)でいう2つの表象,メンタル・モデルと間テキスト・モデルが構築されることを明らかにした,申請者の実験研究をさらに発展させるために,保持期間の要因を組み込んだ実験を実施した。論争的な複数テキストを材料にして,メタル・モデルと間テキスト・モデルの構築促進あり群となし群を比較し,2つのモデルが1週間後どの程度,保持されているか調べた。

その結果,1週間後の保持期間を経て2つのモデルは共に減衰することが示されたが,予想に反し,促進の有無による違いは見られなかった。2.研究結果の総合:本研究では,書かれた論争からの学習に関して,選択融合仮説(学習者は複数テキストの見解から確実性や信ぴょう性の高い見解のみを選び出すことで,できるだけ対立・矛盾のない状況モデルの構築を目指す)とアーギュメント仮説(テキストの見解の妥当性を判断するために学習者が自己内で行う批判的討議を状況モデルとして構築する)を仮定し,どちらの仮説がより妥当か検討することを主たる目的として一連の実験を実施している。この目的について,3年間の研究結果を総合すると,選択融合仮説よりもアーギュメント仮説が支持されることが示唆された。また,関連して,アーギュメント仮説から得られる理論的・実践的な示唆についても考究した。教育心理学本年度の計画では,昨年度に引き続き,論争的な複数テキストから批判的統合を介して構築される記憶表象の解明に向けた研究をおこなうこと,さらにその構築過程の解明につながる研究をおこなうことも目標としていた。この目標に照らして,大きく3つの研究を実施した。その結果,出所情報が有用な場合であっても複数文書モデルが構築されることや,読解中にテキスト間関係に注目すること(あるいは,さらにメモという形で外化すること)がテキスト間関係の理解を促すことを実験的に示し,持続的影響効果に関するメタ分析を通して書かれた論争からの学習メカニズム解明の手がかりをいくつか得ることができた。以上のことから,「おおむね順調に進展している」と評価した。本年度の計画では,実験的手法を用いて,書かれた論争から批判的統合を介して構築される記憶表象の解明を主たる目的としていた。この目的に関して本年度は2つの実験を行い,さらに補足的な実験を実施したが,本研究のもっとも基本的な理論的枠組みである,複数文書モデル枠組みと批判的統合の枠組みに照らして,十分に解明できたとは言えない。本年度に記憶表象の性質を明らかにし,次年度は記憶表象が構築される過程を明らかにするという当初の研究計画通りに研究を進めていくのはまだ時期尚早であろう。さらに,記憶表象の解明に向けた実験もあわせて実施していく必要がある。その意味で,「やや遅れている」と評価した。次年度における研究の推進方策は次の3点である。1.書かれた論争からの学習メカニズムの解明をさらに進めるため,今年度の研究で検討できなかった要因の影響を調べる実験をおこなう。具体的には,論争的な複数テキストから構築された記憶表象が時間の経過とともにどう変化し,またそれらの変化は読解時の処理とどのように関係するのかを実験的に検討する。2.これまで得られた実験データのうちまだ論文にまとめていないものや,「1」の研究により新しく得られるだろうデータを論文にまとめ,学会誌に投稿したり学会発表したりする。3.次年度は,本研究課題の最終年度にあたるため,3年間の研究を通して得られた知見を統合する作業を行う。そして,それらの知見や関連する先行研究の知見を合理的に説明できる,書かれた論争からの学習メカニズムに関するモデルを作成し提案する。次年度以降における研究の推進方策は次の通りである。
ｐＨ調節トランスポータＮＨＥ１から発信される膜局所ｐＨシグナルの形成機構の解明

Na+/H+交換輸送体NHE1の活性化はNHE1に直接結合するカルシニューリンを介してその下流の転写因子NFATへシグナルを伝えることを示してきたが、本研究では、CaNとNHE1またはNFATとの結合親和性の差がシグナル伝達に重要であることを明らかにした。さらに、NHE1/CaN複合体がTRPC6チャネルと相互作用することを明らかにし、TRPC6がNHE1/CaN/NFATシグナルを増幅させ得ることを示唆した。Na/H交換輸送体NHE1の結合蛋白質として心肥大形成に関わる脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)を発見Na/H交換輸送体NHE1の結合蛋白質として心肥大形成に関わる脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)を発見し、NHE1自身の活性化によるおそらく近傍のアルカリ化により直接結合したCaNが活性化され、下流の転写因子NFATの活性化を引き起こし、肥大化関連遺伝子の発現を促進するという新たなシグナル伝達機構が存在することを提案してきた。しかし、CaNによるNFATの脱リン酸化反応には両者の結合が必須であり、CaNは同一部位を介してNHE1またはNFATと結合することから、CaN/NFAT経路の活性化にはCaNがNHE1から一旦解離する必要があるが、その機構はまだ分かっていない。そこで平成26年度は、どのような機構でNHE1からCaNが解離し、下流のNFATにシグナルが伝わるのか、CaNのNHE1からNFATへの移行はそれぞれの結合親和性の差によって起こると予想し、検討した。野生型NHE1が持つCaN結合配列をNFAT由来のそれと置き換えたNHE1変異体を発現する細胞を用いて調べたところ、共沈するCaN量は変異体NHE1で多かった。これらの細胞の細胞内CaN活性をレポーターアッセイで調べたところ、変異体NHE1発現細胞ではCaN活性増幅作用は認められなかった。また、野生型NHE1のCaN結合配列のアラニンによる一置換変異体を発現する細胞を用いて調べたところ、共沈するCaN量は変異体間で差があり、野生型よりも多くても少なくてもCaN活性化作用は消失した。これらの結果は、野生型NHE1のCaNに対する結合親和性がNFATのそれよりも低いこと、野生型NHE1がもつ強すぎず、弱すぎずの中間的な親和性が効率的なシグナル伝達に重要であることを示唆している。Na/H交換輸送体NHE1の結合蛋白質として心肥大形成に関わる脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)発見し、NHE1に結合したCaNがおおそらくNHE1自身の活性化による近傍のアルカリ化により活性化されることで下流の転写因子Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT)の核移行を引き起こし、肥大化関連遺伝子の発現を促進するという新たなシグナル伝達機構が存在することを提案してきた。最近申請者らはTRPファミリーに属するCa透過性チャネルとNHE1が物理的に相互作用することを見つけた。CaNの活性化にはCaイオンが必須である。そこで、当該チャネルがNHE1によるCaN/NFAT活性化機構に影響するか調べた。内在性NHE活性を持たない細胞株に外来性のNHE1とチャネルを発現し共免疫沈降実験を行ったところ両者は共沈した。このような細胞を免疫染色すると両者の一部は形質膜でドット状に重なって染色され、それらの一部は脂質ラフトマーカーとも重なった。この結果と一致するように、これらの細胞のtriton x-100可溶化ライセートをショ糖密度勾配遠心で分離したところ、NHE1、CaN、チャネルの一部は脂質ラフトまたはカベオラマーカーと同じ画分に存在した。これらのことから、NHE1、CaN、チャネルの一部は、形質膜の脂質ラフトで複合体を形成していうると考えられた。一方、NFAT応答配列を持つルシフェラーゼによるレポーターアッセイでチャネルのNHE1によるCaN/NFAT活性化機構に対する影響を調べたところ、内在性CaN/NFAT経路はNHE1またはチャネルそれぞれを単独で発現させた場合よりも両者を共発現させた場合に相乗的に活性化した。これらの結果は、チャネルとNHE1/CaN複合体が機能的にも相互作用していることを示唆している。平成27年度の研究実施計画の一つ、NHE1と物理的に相互作用する事が分かってきたあるCa透過性チャネルが、機能的にもNHE1によるCaN活性化機構と相互作用することが分かった。膜局所で形成されるpHシグナルを担う複合体の構成因子の一つが明らかになろうとしていると考えている。Na/H交換輸送体NHE1の結合タンパク質として心肥大形成に関わる脱リン酸化酵素カルシニューリン(CaN)を発見し、NHE1に結合したCaNがおそらくNHE1自身の活性化によるNHE1分子近傍のアルカリ化により活性化されることで下流の転写因子Nuclear Factor of Activated T-cell(NFAT)の核移行を引き起こし、肥大化関連遺伝子の発現を促進するという新たなシグナル伝達機構が存在することを提案してきた。本申請では、NHE1に結合して活性化したCaNがどの様にNHE1から解離し下流のNFATに結合するか調べたところ、これまでに、野生型NHE1のCaNに対する結合親和性がNFATのそれよりも低く、かつ弱すぎずの中間的な親和性が効率的なシグナル伝達に重要であることを示してきた。

さらに、TRPファミリーに属するCa透過性チャネルとNHE1が物理的に相互作用することを見つけ、NHE1によるCaN/NFAT活性化機構に対する影響を調べたところ、内在性CaN/NFAT経路はNHE1またはチャネルそれぞれを単独で発現させた場合よりも両者を共発現させた場合に相乗的に活性化することを示唆した。本年度は、NHE1活性化に伴うNHE1分子近傍のpH変化と細胞質中心部のpH変化との比較を試みた。NHE1サブユニットとpHセンサーdeGFPを連結したpHプローブは、NHE1発現細胞の形質膜に集積することを確認したが、実験の至適条件を見出すまでには至らず、NHE1分子近傍と細胞質中心部との比較は出来なかった。蛍光検出装置の時間・空間分解能が不十分である可能性も考えられた。Na+/H+交換輸送体NHE1の活性化はNHE1に直接結合するカルシニューリンを介してその下流の転写因子NFATへシグナルを伝えることを示してきたが、本研究では、CaNとNHE1またはNFATとの結合親和性の差がシグナル伝達に重要であることを明らかにした。さらに、NHE1/CaN複合体がTRPC6チャネルと相互作用することを明らかにし、TRPC6がNHE1/CaN/NFATシグナルを増幅させ得ることを示唆した。平成26年度の研究実施計画の一つ、NHE1とCaNとの適度な均衡の取れた結合がNFATへのシグナル伝達効率を決めている、という仮説が正しいことを示す証拠が集まっている。また、2つめの計画、NHE1分子近傍のpHを測定する実験については、プローブを作成し、条件検討を行っているところであり、おおむね計画通りである。本研究課題は、ほぼ当初計画通り進んでいるのでこのまま進めていきたい。局所pHの測定は難航しているが様々な事を考慮して引き続き検討を進める。細胞生理学本研究は、pHシグナル経路の存在とそれを支持する分子の構成と役割を示そうとするものであり、まずはNHE1によるCaN活性化の機構を明らかにし、さらに他の分子の関与を示すことを目標とする。局所pHの測定は、実験条件の設定が難しいことが分かってきたが、本研究の重要な位置を占めるので注力したい。当該年度の使用額は、ほぼ予定通りの使用であったと考えている。物品購入にかかる金額が当初予定より低いことに起因する。当初計画通りに執行する予定である。次年度は、若干の計画変更に伴いNHE1とCaNの結合定数を求める為に必要な合成ペプチドおよび蛍光標識試薬を比較的大量に購入する必要があるのでこれに充てる予定である。
人工知能システムや遺伝子多型を用いた、生活習慣病発症予防のための縦断研究

2560歳の非糖尿病者における6年間の縦断的検討で、男性では耐糖能改善が2名、不変347名、悪化41名、女性では改善は0名、不変133名、悪化14名であった。男性で不変=0/悪化=1を従属変数としたステップワイズ多重回帰分析にて、男性ではベースラインの血糖、HMW-ADPN (F= 11.5, r'= -0.165)、年齢の順に採択された(P<0.0001, R2= 0.156)。総合大学在籍の教職員を対象に6年間の健康診断データを追跡し、耐糖能の悪化に寄与するベースラインの因子があるか否かを検討した。ベースラインの時点で25-60歳,かつ糖尿病(DM)でなく、6年後にも当施設の定期健康診断を受診し本研究に関してインフォームドコンセントの得られた男性390名(44.8±8.3歳、BMI 23.6±3.1 kg/m2)を対象とした。身長,体重,血圧,脈拍数を測定し、血液検査は午前中空腹時に行った。ベースラインおよび6年後の各時点で、空腹時血糖(FPG)126 mg/dl以上またはHbA1c(NGSP) 6.5%以上のDM群、FPG 110-125かつ/またはHbA1c 6.0-6.4%のPreDM群、FPG 109以下かつHbA1c 5.9%以下の正常群に分類して改善・不変・悪化群とし、これらに寄与するベースラインの因子を、年齢, BMI,血糖,血清脂質,インスリン抵抗性指数(HOMA-IR), HOMA-β,および高分子量アディポネクチン(HMW-ADPN)濃度を含めて検討した。血清インスリン濃度はEIAにて、HMW-ADPN濃度は富士レビオ社のELISAキットを用いて測定した。その結果、1) 6年後の耐糖能は、改善群2名、不変群347名、悪化群41名であった。2)不変/悪化を従属変数としたステップワイズ多重回帰分析にて、男性ではベースラインの血糖(除外F値51.2, r'= 0.300)、HMW-ADPN (F= 11.5, r'= -0.165)、および年齢(F= 5.1, r'= 0.110)の順に採択された。25-60歳の非糖尿病男性における6年間の縦断的検討で、ベースラインの血糖以外にHMW-ADPN低値および年齢高値が耐糖能悪化の予知因子であることが示唆された。メタボリックシンドローム(MetS)や動脈硬化症が増加の一途をたどる中、生活習慣の改善による一次予防や二次予防の重要性がいわれている。本研究では、当施設の定期健康診断を受けた健常人や糖尿病患者のうち、インフォームドコンセントの得られた方を対象とした。高分子量アディポネクチン(HMW-ADPN)濃度は、市販のELISAキットを用いて測定した。その結果、HMW-ADPNには性差があり、男性では女性の約半分の値であった。男女ともHDLコレステロールと強い正の相関、BMIやTG,インスリン抵抗性指数(HOMA-R)と負の相関を示し、HMW-ADPNの低い群ではMetSの者が多かった。ベースラインで30-59歳の男性における6年間の縦断研究で、HMW-ADPN濃度の低い群では年齢およびBMIで補正後も6年後のMetS発症と有意に関連していた(ハザード比1.56, 95%信頼区間1.05-2.29, P= 0.028)。MetSの男性16名を対象に食事や運動の指導を3か月間行った介入研究では、食後2時間のインスリンおよびTG値,腹囲が低下し、HMW-ADPN濃度は有意に増加した。2型糖尿病患者にピオグリタゾン30mg/日で3か月間治療したところ、血圧,血糖, HbA1c, HOMA-Rなどが改善し、HMW-ADPNは平均で約3倍に増加した。以上より、血中HMW-ADPN濃度はMetSの構成因子やインスリン抵抗性と強く関連しており、重要な血中マーカーであると考えられた。SNPsの解析では2型糖尿病と関連のある49のSNPsによるGenetic riskscoreの有用性が認められた。肥満や糖尿病・高血圧・脂質異常症などは、内臓脂肪蓄積およびインスリン抵抗性を基盤として互いに合併しやすく、メタボリックシンドロームとして注目されている。その病態は虚血性心疾患や脳卒中といった心臓病や脳血管障害の強い危険因子であり、医療経済的な問題にとどまらず、発症した本人の仕事や生活の質を著しく低下させてしまうため、予防が最も重要である。

本研究では、耐糖能異常や高血圧、脂質異常症といった生活習慣病の発症を予知・予防することを目的として、人工的ニューラルネットワーク(ANN)などの人工知能システムを用い、ベースラインの各種健診項目や高分子量(HMW)アディポネクチン濃度、遺伝子多型(SNPs)、およびライフスタイルなどの意義を検討した。慶應義塾大学保健管理センターの実施する定期健康診断の対象となる教職員(主に日吉・三田・信濃町地区、2071歳)および慶應義塾大学病院内科に入院中または外来通院中の患者(2080歳)のうち、本研究に関してインフォームド・コンセントの得られた者を対象とした。ライフスタイルの調査は、健康診断の際毎年調査票にて行っており、2000年や2004年, 2010年などの結果もインフォームド・コンセントを得た上で活用した。採血した血液10 mLからDNAを抽出し、遺伝子多型解析に供した。提供者から研究試料の提供を受ける場合は、提供者に対して事前に十分な説明を行った上で、自由意志に基づく同意(インフォームド・コンセント)が与えられなければならない。また、提供者の遺伝情報は厳重に管理され、十分に保護されなければならない。このために、提供資料の匿名化を行い、提供者と新たに付ける符号との対応表は個人識別情報管理者によって厳重に管理されている。なお、本研究計画は当大学医学部倫理審査委員会において、既に承認を受けている(13-70-3号)。メタボリックシンドローム(MetS)や動脈硬化症が増加の一途をたどる中、生活習慣の改善による一次予防や二次予防の重要性がいわれている。本研究では、人間ドック受診者を対象に臍高部CTで計測した内臓脂肪面積(VFA),皮下脂肪面積(SFA)やHOMA-R, HOMA-βとMetS,糖尿病(DM),高血圧(HT)などとの関係を検討した。1.正常血糖からDM治療中の4群で、VFAの平均±SDは101±44, 117±43, 133±54, 124±54(cm2)で有意差を認めた(F= 31.6, P<0.0001)。2.正常血圧からHT治療中の4群でも、VFAは95±42, 109±43, 118±46, 128±49(cm2)と強い有意差を認め、HOMA-Rの中央値(Q1-Q3)は4群でそれぞれ1.2 (0.8-1.8), 1.4 (1.0-1.9), 1.5 (1.0-2.1), 1.6 (1.1-2.7)と有意差を認めた(どちらもP<0.0001)。3.DMの有無を目的変数とした多重ロジスティック回帰分析(MLR)では、HOMA-β低値, HOMA-R高値,年齢, VFA,現在の喫煙が採択された。4.HTの有無を目的変数としたMLRでは、年齢, VFA, BMI, 1日平均1合以上の飲酒, HOMA-Rが採択された。以上より、人間ドックを受診した4574歳の男性においてVFAやHOMA-Rは耐糖能やMetSだけでなくHTとも関連しており、病態の予防や治療・管理に際して大変重要な指標であることが示唆された。また、KCNJ15内のSNPであるrs3746876は日本人集団においても2型糖尿病と有意に関連しており(P= 0.028; OR 0.82)、この関連はBMI≧25の肥満2型糖尿病症例でより強く認められた(P= 0.0025, OR 0.62)。スポーツ・健康科学ベースラインの時点で25-60歳,かつ糖尿病(DM)でなく、6年後にも当施設の定期健康診断を受診し本研究に関してインフォームドコンセントの得られた男性390名(44.8±8.3歳、BMI 23.6±3.1 kg/m2)を対象とした。身長,体重,血圧,脈拍数を測定し、血液検査は午前中空腹時に行った。ベースラインおよび6年後の各時点で、空腹時血糖(FPG)126 mg/dl以上またはHbA1c(NGSP) 6.5%以上のDM群、FPG 110-125かつ/またはHbA1c 6.0-6.4%のPreDM群、FPG 109以下かつHbA1c 5.9%以下の正常群に分類して改善
ニトロソアミン類の電極酸化過程に関する速度論的研究

種々の置換様式を有する5種のN-ニトロソピペリジン類の電極酸化過程をN-ニトロソジアルキルアミン類との比較において詳細に検討し、以下に述べる知見を得た。1.酸化反応生成物のひとつであるニトラミンの生成について、次の2つの経路が存在し、どちらの経路が優勢となるかは立体的因子、特に2,6位のアルキル置換様式や、ニトロソアミンからの一電子引抜きによって生じるラジカルカチオンの反応性が関与していることを明らかにした。まずひとつの経路はラジカルカチオンに対して溶存酸素分子が攻撃する一電子過程であり、N-ニトロソジアルキルアミン類において見られるのと同様のものである。もう一方の経路はラジカルカチオンに対して溶媒中に混在する水分子が攻撃する二電子過程で、2,6位のメチル置換基が増加するほどこの経路をとる割合が大きくなる。2.上記ニトロソアミンから生ずるラジカルカチオンの安定性は-30°付近でのサイクリックボルタンメトリーにおいて見られる酸化還元波の可逆性の度合いで相対的に見積ることができることを示した。また定量的にはESRキャビティ内で電解によりラジカルカチオンを発生させ、シグナル強度をモニターすることによって速度測定を行う方法を確立した。3.1項で述べた2つの経路のうち後者について、2項の方法を用いて種々の条件下、ラジカルカチオンの消失速度を測定し、系に水を添加した際の影響【D_2】Oを用いたときの効果等、詳細な速度論的検討を行った。その結果、ラジカルカチオンに対する水分子の求核攻撃が律速段階であると結論された。
妊娠中のエピゲノム変化を起こす栄養・生活環境要因と母児の健康指標との関連

妊娠期の母体は胎児の成長に最適な状態を作り出すため、短期間の間に身体的および生理学的に劇的な変化を受ける。特に妊娠中期から後期にかけては、母体の脂質代謝は同化状態から異化状態への変化を特徴とし、脂肪蓄積や胎児成長などに伴う体重増加、ならびに血中脂質濃度の上昇といった肥満類似形質が出現する。成人の末梢血白血球を用いたEWAS研究では、脂質代謝関連遺伝子CPT1Aイントロン1およびSREBF1イントロン1のDNAメチル化レベルと、BMIや血中脂質濃度が関連することが報告されているが、妊娠期間の形質変化によって、これら遺伝子のDNAメチル化が変わるかは知られていない。そこで本学附属病院での前向き出生コホート研究において採取された妊娠中期および後期の母体血を用いてDNAメチル化レベルを測定し、妊娠中のBMIおよび血清LDL-C濃度との関連を調べたところ、これらの関連性は、妊娠中であっても成人EWAS解析で見られた所見と同様の傾向が認められたが、興味深いことに、SREBF1イントロン1におけるこれらの関連性は、妊娠期の脂質代謝の同化から異化への代謝シフトと同調するように、妊娠後期において弱まった。一方でCPT1Aイントロン1のDNAメチル化とBMIとの関連性は、妊娠後期に強まる傾向がみられた。この部位のDNAメチル化は、血球細胞の種類によって差があるため、本研究では細胞種特異的なマーカー遺伝子のDNAメチル化レベルから全血の白血球細胞組成を推定することを試みた。その結果、この関連性は妊娠中期から後期にかけてのリンパ球の割合の妊娠前BMI依存的変化によって仲介されていることが明らかとなった。以上のことから、妊娠期におけるこれら脂質代謝関連遺伝子のDNAメチル化の変化は、その対象者の代謝的変化および免疫学的変化を反映することがわかった。本年度は、妊娠中の体重増加や血中脂質濃度上昇などの肥満形質の形成と、脂質代謝遺伝子のDNAメチル化との関連を明らかにし、妊娠期の脂質代謝関連遺伝子のDNAメチル化は、妊娠中の代謝変化あるいは妊娠前BMIに依存した白血球比率の変化に仲介されるという知見を得て、論文にまとめた。本母子コホート研究のリクルート状況については、最終的な解析対象人数を100-200名としていたが、本年度までに120名を超える対象者の同意を得ることができた。さまざまな事由により母体血の取得が困難な例も含まれるが、およそ100組の母児を解析対象として、生活環境要因や食事摂取状況などとともに、他の遺伝子のDNAメチル化との関連についても解析することが可能である。DNAメチル化解析については、他の候補遺伝子についても徐々に着手している状況である。さらに本研究では、従来の末梢血を用いたDNAメチル化解析において考慮されることが少なかった白血球比率の違いを調整した上で解析を行うために、細胞種特異的なマーカーを用いて、DNAメチル化レベルから細胞組成の推定を試み、その方法の妥当性も検証できている。これらの状況から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本年度で対象者のリクルートは予定通り完了したため、今後は健診情報、食事記録、メンタルヘルスや生活状況調査の結果を統合し、同一母児に対する妊娠期から出生後までの総合データベース作成を迅速に進める。またDNAメチル化解析をさらに進め、妊娠中のエピゲノムと母児の健康指標との関連を調べていく予定である。栄養代謝に関連する遺伝子の解析では、遺伝子多型の影響を考慮する必要性があるため、必要に応じて遺伝子多型のタイピングを進めていく。妊娠期を健康に経過することは、出産後の健康および児の生涯の健康にも重要である。しかしながら、妊娠期の健康の評価は、母体への身体的・心理的負荷や生理的変化の必需的な曝露、栄養・生活環境といった様々な要因が関与することから容易でない。これまでの研究において申請者は、食後高血糖などの栄養刺激による炎症反応の根底には、エピジェネティックな変化・維持が関与することを明らかにしている。このことから、内外的な影響を受けやすい妊娠期においてもエピジェネティックな変化が生じており、妊娠期の健康を左右する様々な要因を反映するパラメーターとして有用ではないかと考えた。本研究の目的は、妊娠中期および後期に採取した血液におけるエピゲノム変化と、妊娠中の母体の栄養・生活環境要因との関連を調べ、妊娠中のエピゲノム変化を起こす要因や母児の健康指標との関連を明らかにすることである。平成29年度は、対象者のリクルートおよびデータの取得・蓄積と、ゲノム・エピゲノム解析を並行して進めた。本研究は、東京医科歯科大学附属病院で出産予定の母児を対象とした前向きコホート研究で、現時点で約100名の母親から研究協力の同意を得ており、うち82名が出産済みである。また、妊娠中に行った栄養・生活環境要因調査、健診情報等をまとめたデータベースは65名分を作成し、データの取得・蓄積が進んでいる。エピゲノム解析は、平成29年度に予定していた解析対象検体の選定や検体データベースの作成、候補遺伝子領域のパイロット試験が終了し、母体血を用いた定量的DNAメチル化解析に着手した。CPT1A遺伝子やSREBF1遺伝子のDNAメチル化を測定し、LDLコレステロール等の血液生化学指標や体重データなどと合わせて、妊娠期の体格や血中脂質濃度の変化が母体のエピゲノムに与える影響について検討している。本研究では、最終的な解析対象人数を100-200名とし、平成30年度までに目標対象者数の同意を得る予定であった。

現時点での同意人数は100名を越えており、本研究の解析対象となる情報は、児の出生児体格等の形質データまでとなるため、予定通りに対象者のデータ取得は終了する見込みである。しかしながら、早産等の事由により、母体血が中期および後期で揃わなかった対象は解析から除外する予定のため、検体の採取状況をふまえながらリクルートを継続していく予定である。また、対象者ごとの栄養・生活環境要因、形質情報をまとめた統合データの作成も予定通りに進行している。エピゲノム解析では、妊娠の経過によって変わる体格や脂質関連要因とCPT1A遺伝子およびSREBF1遺伝子のDNAメチル化との関連を検討するため、解析対象検体を選定し、データ整理を行った。現在までに母体血でのDNAメチル化測定まで着手できており、おおむね測定が終了している。今後は、遺伝子多型が基となるエピゲノム変化を併せて検討するため、遺伝子多型のタイピングなども行っていく予定である。これらの状況から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。妊娠期の母体は胎児の成長に最適な状態を作り出すため、短期間の間に身体的および生理学的に劇的な変化を受ける。特に妊娠中期から後期にかけては、母体の脂質代謝は同化状態から異化状態への変化を特徴とし、脂肪蓄積や胎児成長などに伴う体重増加、ならびに血中脂質濃度の上昇といった肥満類似形質が出現する。成人の末梢血白血球を用いたEWAS研究では、脂質代謝関連遺伝子CPT1Aイントロン1およびSREBF1イントロン1のDNAメチル化レベルと、BMIや血中脂質濃度が関連することが報告されているが、妊娠期間の形質変化によって、これら遺伝子のDNAメチル化が変わるかは知られていない。そこで本学附属病院での前向き出生コホート研究において採取された妊娠中期および後期の母体血を用いてDNAメチル化レベルを測定し、妊娠中のBMIおよび血清LDL-C濃度との関連を調べたところ、これらの関連性は、妊娠中であっても成人EWAS解析で見られた所見と同様の傾向が認められたが、興味深いことに、SREBF1イントロン1におけるこれらの関連性は、妊娠期の脂質代謝の同化から異化への代謝シフトと同調するように、妊娠後期において弱まった。一方でCPT1Aイントロン1のDNAメチル化とBMIとの関連性は、妊娠後期に強まる傾向がみられた。この部位のDNAメチル化は、血球細胞の種類によって差があるため、本研究では細胞種特異的なマーカー遺伝子のDNAメチル化レベルから全血の白血球細胞組成を推定することを試みた。その結果、この関連性は妊娠中期から後期にかけてのリンパ球の割合の妊娠前BMI依存的変化によって仲介されていることが明らかとなった。以上のことから、妊娠期におけるこれら脂質代謝関連遺伝子のDNAメチル化の変化は、その対象者の代謝的変化および免疫学的変化を反映することがわかった。本年度は、妊娠中の体重増加や血中脂質濃度上昇などの肥満形質の形成と、脂質代謝遺伝子のDNAメチル化との関連を明らかにし、妊娠期の脂質代謝関連遺伝子のDNAメチル化は、妊娠中の代謝変化あるいは妊娠前BMIに依存した白血球比率の変化に仲介されるという知見を得て、論文にまとめた。本母子コホート研究のリクルート状況については、最終的な解析対象人数を100-200名としていたが、本年度までに120名を超える対象者の同意を得ることができた。
開腹手術映像の知的アーカイブのための基盤技術の開発

本研究では,開腹手術映像の知的アーカイブのための基盤技術を開発した.複数カメラ映像からの映像合成手法に関して,射影変換による粗い合成の後, FFD(Free Form Deformation)による非剛体位置合わせを実装した.評価実験の結果,位置合わせ誤差を60.5ピクセル(±7.9)まで改善することができた.また,頭部に装着した小型カメラと固定カメラとの合成手法を検討し,高い没入感が得られる映像表示装置(Oculus)による高精細立体視画像の表示法を開発した.構築した手法を実際の手術室での環境で性能評価した.改善の余地はあるものの概ね良好に映像合成ができた.研究室内に手術室を模した実験環境を構築し、以下の項目について検討した。1.複数カメラ映像からの映像再構成複数のカメラ映像から手術映像を合成する手法を開発した。実際の手術で使用するウンドリトラクタ(切開領域を保持するリング状の器具)にマーカシールを貼り、カメラ位置合わせのランドマークとした。合成映像において、医師の手及び頭領域を認識し、術野を遮っている場合に手や頭を除去して術野を露出する機構を組み込んだ。ただし、メスなどの器具は除去しないように工夫した。また、頭部に小型カメラを装着し、固定カメラ映像との合成手法について検討した。2.複数映像ストリームからのシーン解析術前に立てた計画のどこを今着手しているかといった手術のワークフロー解析について検討した。本年度は映像を大きく3つ(手術前、手術中、手術後)に分けるための特徴量と識別方法を検討した。3.カメラ配置の検討実際の手術室にて、可能なカメラ配置を検討した。ベッド脇には4台までカメラを配置可能であることを確認した。無影灯に4つ、術者と助手の頭部にそれぞれ2つ設置可能と考える。装着型カメラも、頭部に固定やメガネ型が使用できると分かった。また、手術室の照明の強さについて、新たに検討の余地があることが確認された。4.手術室を模した実験環境による評価実験開発した映像合成手法を人体モデルと手術グローブ及びキャップを用いて評価した。今回は3台のカメラを用いた。術者の手や頭部による遮蔽を除去し、術野が見えることを確認した。誤差評価の結果、ウンドリトラクタ内部では平均約??画素であった。鮮明な映像合成のためには、非剛体位置合わせを組み込んだ映像合成が必須であることも分かった。手術室を模した環境での性能評価を行い、初期段階としては期待通りの性能を得た。カメラ配置も実際の手術室での映像を用いた実験を通して、研究実績の概要で述べた内容まで吟味することができた。さらなる映像合成精度向上に向けての課題も明らかになっており,その解決策もいくつか考えており,順次取り組んでいる.これらにより、おおむね順調に進捗していると判断する。研究室内に整備した実験環境を基に,以下の項目について検討した.1.複数カメラ映像からの映像再構成複数カメラ映像(4台以上)から手術映像を合成する手法の精度改善に取り組んだ.実際の手術室で使用するウンドリトラクタ(切開領域を保持するリング状の器具)に基準位置合わせ用マーカーと誤差評価用のマーカーをそれぞれ貼付し,カメラ位置合わせのランドマークおよび評価点とした.今年度は,細部の位置合わせ向上を目指し,非剛体レジストレーションとしてTPS(Thin Plate Spline)による非剛体位置合わせを実装した.評価実験の結果,41.5画素(±8.5)あった誤差を,5.5画素(±0.4)まで改善することができた.また,引き続き頭部に装着した小型カメラと固定カメラとの合成手法を検討した.特に,高い没入感が得られる映像表示装置(Oculus)による表示を検討した.2.複数映像ストリームからのシーン解析手術のワークフロー解析において,術前計画のどこを現在着手しているかを解析する手法を検討した.本年度は手術中のシーン解析において,CNN(Convolutional Neural Network)に基づく手法を重点的に検討した.3.手術室を模した実験環境による評価実験実際の手術台に人体モデルおよび周囲に4台のカメラを設置し,開発した映像合成手法の評価を行った.術者の手や頭部による遮蔽を除去した術野を再構成できることを確認した.誤差評価の結果,研究室内での精度に比べ,56.2画素(±3.4)と若干の精度低下が見られたが,おおむね良好な結果であった.非剛体レジストレーションを組み込むことで,映像合成精度の大幅な向上が達成できた.術野映像の高精度化・立体視のための装置も整備し,表示手法を検討中である.腹部臓器の重畳表示のための臓器認識についても検討を進め,論文誌(International Journal of Computer Assisted Radiology and Surgery)に採録された.また,実際の手術室での映像も撮影を進めている.これらにより,おおむね順調に進捗していると判断する.研究室内に整備した実験環境を基に,以下の項目について検討した.1.複数カメラ映像からの映像再構成手法の改善4台のカメラを配置して,複数カメラ映像から手術映像を合成する手法の精度改善に取り組んだ.

実際の手術室で使用するウンドリトラクタ(切開領域を保持するリング状の器具)に基準位置合わせ用マーカーと誤差評価用のマーカーをそれぞれ貼付し,カメラ位置合わせのランドマークおよび評価点とした.最終年度も引き続き,細部の位置合わせ向上を目指し,非剛体レジストレーションとしてFFD(Free Form Deformation)による非剛体位置合わせを実装した.FFDとして計算速度に優れるDropという手法を実装した.評価実験の結果,昨年度のTPSによる位置合わせと比べて4.9画素(±1.5)改善することができた.また,引き続き頭部に装着した小型カメラと固定カメラとの合成手法を検討した.高い没入感が得られる映像表示装置(Oculus)による高精細立体視画像の表示を検討した.2.複数映像ストリームからのシーン解析手術のワークフロー解析において,術前計画のどこを現在着手しているかを解析する手法を検討した.本年度も手術中のシーン解析において,CNN(Convolutional Neural Network)に基づく手法を重点的に検討した.3.手術室を模した実験環境による評価実験実際の手術台に人体モデルおよび周囲に4台のカメラを設置し,開発した映像合成手法の評価を行った.術者の手や頭部による遮蔽を除去した術野を再構成できることを確認した.誤差評価の結果,研究室内での精度に比べ,2.1画素(±4.4)と若干の精度低下が見られたが,おおむね良好な結果であった.本研究では,開腹手術映像の知的アーカイブのための基盤技術を開発した.複数カメラ映像からの映像合成手法に関して,射影変換による粗い合成の後, FFD(Free Form Deformation)による非剛体位置合わせを実装した.評価実験の結果,位置合わせ誤差を60.5ピクセル(±7.9)まで改善することができた.また,頭部に装着した小型カメラと固定カメラとの合成手法を検討し,高い没入感が得られる映像表示装置(Oculus)による高精細立体視画像の表示法を開発した.構築した手法を実際の手術室での環境で性能評価した.改善の余地はあるものの概ね良好に映像合成ができた.1.映像合成・超解像化アルゴリズムの高度化について固定カメラ同士の合成は、非剛体位置合わせ処理を組み込んで高度化を目指す。頭部カメラと固定カメラの合成についても、カメラにマーカーを設置する、あるいはマーカーレスの手法を開発し、術野映像の高解像度化・立体視を目指す。2.映像シーンの解析について手術前・中・後の大まかな3シーンの分割に加えて、手術中の映像を作業に沿って細かく分類することに取り組む。そのために必要な画像特徴量、識別方法についてさらに検討を進める。特に,映像データにはサンプルとなるフレームが多量にあるため,Deep Learningに代表される最新の識別手法を検討する予定である.3.実際の手術での評価についてここまでの実験において、ある程度期待していた成果が得られたので、当該施設の倫理委員会に手術映像の撮影許可をもらい、実シーンの解析・評価に取り組む。得られた結果を映像合成アルゴリズムにフィードバックし、実際に使えるシステム構築へと発展させていく。1.映像合成・超解像化アルゴリズムの高度化について,マーカー位置を合わせるTPSを実装して精度向上を達成したが,さらなる精度向上に向けて,マーカーフリーの非剛体位置合わせ手法を組み込む予定である.また,高い没入感を表現できる表示方法についてもさらに検討を進める.2.映像シーンの解析についてより頑健で高精度なシーン解析手法として,CNNに基づく手法を引き続き開発していく.
空孔励起による等、新しい機構の超流動、量子凝縮現象の探査

固体ヘリウムは結晶格子を組み固体の性質を保持しながら同時に流体が粘性なく細い通り道を通り抜けると言う超流動の性質を持つ「超流動固体」状態を取り得ると言う議論が1960年代の理論的議論があって世界中で35年余りも探査が続けられて来たが、2003年米国のペンシルバニア大のMoses Chan教授のグループが初めて超流動固体の非古典的角運動量を観測したと言う報告を行った。その後各地で追試が試みられたが、2005年末から本年初めにかけて3つのグループが、超流動固体にまつわる非古典的角運動量の観測を行った。Andrey Penzyevと私たちはその一つのグループである。単に非古典的角運動量を計るだけでなく、固体ヘリウム試料をアニールする事によって密度分布を均一にし、より大きな信号が得られる事を示した。更に、高感度捻り振子法を回転している固体ヘリウムの系に適用し、量子渦状態を研究する試みが続いている。なお、文献1は、どのようにして渦糸が捻り振子に依って超流動固体中で観測されるかを議論したものである。この様な、固体超流動の回転実験は世界にまたとない実験であり、今後の展開に期待している。2004年10月11日来日したウクライナ・カルコフ低温研究所の若手研究員Andrey PENZYEV博士の参加を得て、新しい機構による超流動・量子凝現象の探査の研究活動は急速に進展をしている。この事はPENZYEV氏による2005年3月の日本物理学会での講演にも表われている。しかし、一方ミリケルビン温度領域での微小信号検出実験はその準備に長時間を要している。現在超流動検出に用いる精密捻り振子の改良を行ない検出感度の高揚と安定化を行なって居り、10^<-4>の振幅安定度と10^<-8>の周波安定度を実現しており、固体基盤上の^4Heのいわゆる「不活性層」のdynamicsを調査中である。この層の量子性に起因する現象を検出しようとしている。超流動現象は長年液体ヘリウムでのみ観測されて来た。これは超流動現象が相互作用の無い系で実現すると考えられて来たボーズ凝縮と深い関わりを持つ事からすると不思議な事柄である。状況を更に極端にするのは強い相互作用て多数粒子からなる系が粒子間の相互作用で固体を形成する様な系での超流動の可能性を議論する事である。実はこの間題は古く1960年代終わりから盛んに理論的に議論され、実験的にも多くの探査実験が報告されている。しかし2004年のMoses Chanによる固体ヘリウムでの報告まで30数年間に亘って決定的な観測は皆無であった。PENZYEV博士は、He単原子薄膜系、及び固体ヘリウム中での新しい機構の超流動、量子凝縮現象の探査を研究代表者久保田と共に実験的に探求している。久保田研究室で開発した高感度捻り振り子法を用い、新しい超流動及び量子凝縮現象の観測を狙って来た。最近、慎重に準備して来た独自の捻り振り子でバルクの固体ヘリウムの超流動個体状態を観測し、そのメカニスムを明らかにする為結晶内の空孔等不完全性を取り除くアニーリングの操作の影響を調べた。この結果の一部は久保田がカリフォルニア大学サンタバーバラ校理論物理学研究所で開かれた次の国際ワークショップで口頭発表した。また、これ以前、超流動性を確認するため量子渦の存在とその観測方法に付いて久保田、Penzyevらは低温物理国際会議で多孔質中のHe薄膜からなる「3次元超流動」の性質と3次元渦糸を議論し、これとの類似性から超流動固体ヘリウム中での量子渦糸の観測法の提案を行った。
固体NMRによる新規室温磁場配向膜を用いた膜表在性タンパク質脂質結合機能の解明

本研究では、ヒト由来のPLC-δ1の脂質結合部位であるPHドメイン(hPH)の脂質結合機構を解明するため、新規開発したNative-PAGEを用いた評価法により、hPHのIP3への結合活性、および熱安定性を解析した。次に溶液NMRを用いた解析で、水相でのhPHのIP3結合に伴うα2へリックス部位が関与する連鎖的な局所的構造変化を検出し、分子内相互作用ネットワークにより、hPHのリガンド結合機能が調節されていることが判明した。さらに、固体NMRを用いた解析から、hPHがPIP2を含有する脂質二重膜の表面に結合後、不均一構造を誘起することが判明し、不可逆的な脂質膜内部への挿入が示唆された。本研究では固体NMR解析手段として、十分に水和された配向および非配向脂質二重膜に結合した膜表在性タンパク質を、配向およびマジック角回転(MAS)双方の手法を組み合わせることにより、系統的に当該タンパク質の動的立体構造決定するための手法の開発を目的としている。本年度は手法開発のためのモデル膜表在型タンパク質としてヒト由来PLC-δ1 PHドメイン(hPH)の大腸菌を用いた大量発現系構築を新たに行い、十分な量の当該タンパク質の発現、精製および安定同位体標識試料の作成に成功した。また、当該タンパク質のリガンド分子の一つであるD-myo-inositol 1,4,5-triphosphate (IP_3)の有無による水溶液中での構造および状態変化について溶液NMRを用いて解析した。また、不飽和、および飽和脂質分子を適切な割合で混合することにより、少なくとも30°Cから65°Cの温度領域で安定的に自発磁場配向する超楕円体脂質膜試料の開発に成功した。その磁場配向特性について^<31>P-固体NMRを用いて評価し、自作のプログラムによるコンピューターシミュレーションによりスペクトル線形の解析を行い、楕円体短軸に対する長軸の比を解析した。さらに市販の固体MASNMRプローブを改造し、上記のような脂質膜など生体配向試料を対象とした精密な温度調節が可能な高感度・高効率な固体静止プローブおよび試料管を開発した。また、別途独自設計の高感度、高耐電圧固体NMRプローブの設計を完了し、製作中である。本研究は膜表在性タンパク質(ヒト由来PLC-δ1PHドメイン;hPH)をモデルタンパク質として、NMRを用いて膜表在性タンパク質の構造、および機能解析のための手法開発、および同タンパク質の機能発現機構を解明することを目的としている。野生型および部位特異的変異導入hPEのゲルシフトアッセイによる基質結合活性解析を行った。その結果、hPHに特徴的に存在するα2ヘリックスの二次構造変調が、基質結合を著しく阻害することが明らかとなり、さらに基質結合部位とα2ヘリックスとの相互作用を媒介する残基の同定に成功した。これは、基質とは直接結合しないα2ヘリックスが、hPHの機能発現に極めて重要であることを示す発見である。また、研究期間中に主解析装置であるNMR分光器が故障したため、復旧までの間、共通機器の溶液NMR分光器を用いて、以下の研究を行った。hPHに関して特定のアミノ酸残基の部位特異的同位体標識試料および、その欠損株を用いて信号帰属を行い、IP3の結合に伴うPHドメイン全体構造の変化を溶液NMRで解析した。PLC-δ1のPHドメインが特徴的に持つα2ヘリックスは、PHドメインのPIP2への結合の際、脂質膜表面に非特異的脂質結合することによって脂質結合を保持する補助的な役割を果たすと考えられていた。本α2ヘリックスはIP3非結合状態では不均一であるが、IP3結合に伴い、構造が均一化すること、さらにIP3結合を安定化させる役割を担うことが新たに判明した。また、当該研究に資する静止試料用プローブの開発、および測定に必要な周辺機器の開発中である。本研究は膜表在性タンパク質(ヒト由来PLC-δ1 PHドメイン;hPH)をモデルタンパク質として、NMRを用いて膜表在性タンパク質の構造、および機能解析のための手法開発、および同タンパク質の機能発現機構を解明することを目的としている。Native PAGEによる機能解析法を開発し、生理的環境に近い状態での膜表在性タンパク質ヒト由来PLC-δ1 PHドメイン(hPH)の機能解析法、およびタンパク質の熱安定性評価法の確立に成功した。これらの解析により、hPHに特徴的に存在し基質とは直接結合しないα2ヘリックスが、hPHの基質結合状態の安定化およびタンパク質の熱安定性の上昇に寄与していることを明らかにした。また、主鎖Lys残基特異的に15N安定同位体標識したhPH、およびその部位特異的変異体について溶液NMRによる解析を行った。

昨年度の解析で、hPHに特徴的に存在するα2ヘリックスが基質結合に伴って構造の安定化が起こることを明らかにしたが、この効果は基質結合に伴い、α2ヘリックスが、空間的に離れた位置に存在するα3-α4ループと、間接的に相互作用することにより生じることを明らかにした。また、Ala残基側鎖メチル基を特異的に13C安定同位体標識したhPHをPOPC/PIP2マルチラメラベシクル最表面上に結合させた試料の、CP-MAS,シングルパルスによる13C磁化の直接励起、および試料回転同期型INEPTによる固体NMR測定を400、および920MHzNMRの双方で行った。しかし、どの場合にも信号強度は極めて低く、かつ広幅であった。このため、同タンパク質は脂質膜表面結合状態では、不均一構造を取っていることが示唆された。本結果は、他研究グループにより報告されている脂質挿入の知見とも一致した。測定の中心となるNMR分光器が長期間に渡って故障したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。装置の修理は完了したので、粛々と研究を遂行する。
ニュージーランドにおける植物の適応放散的種分化の解析

適応放散的種分化とは、単一祖先から、周辺のさまざまな環境に適応し、形態や生態学的特徴が分化した種が進化していく現象を指す。この現象は通常、比較的短時間で起こり、少数の突然変異による遺伝的変化によって、大きな形態、生態、生理形質の分化が生じたと推定されるため、種分化のモデル系として注目されている。適応放散的種分化は通常、大洋島など、新たな生育地が形成された場合に起こる。本研究の対象地域に選んだニュージーランドは大陸から離れた太平洋上に位置する。また、高緯度に位置するため、特に南島は氷河期には大部分が氷河に覆われていたと考えられる。このような環境から、氷期以後に大きな裸地が形成され、その結果、大規模な適応放散が数多くの生物群で起きている。本研究では、ニュージーランドにおいて大規模適応放散を起こしている植物群で、適応放散的種分化過程の詳細とその種分化機構の解明を行った。キク科のCelmisia属の解析では、オーストラリア内で分化したOleariaの1群がニュージーランドへ移入して二次的な放散が起きたことを示唆している。本研究の結果は、この放散の中で生じた群であるCelmisia属がニュージーランド内で大規模な適応放散を起こし、その後にその中の1群が再びオーストラリアへ分布を拡大して適応放散をしたということを示唆している。一方、シダ植物コケシノブ科では、科内の系統樹の基部で分岐する種を多数含み、その起源が古い種を含むと同時に、広分布域種複合体の中の1種や、オセアニア地域に近縁種が生育する種など最近種分化した種も同時に含むことが明らかになった。本年度は10月にLandcare Researchを訪問、標本調査と研究打合わせを行った。12月には南島にて、野外調査を行い、キク科Celmisia属の観察および試料採集を行った。採集したCelmisia属植物約50種について、DNA抽出を行い、種分化様式や種分化過程を明らかにするため、分子系統解析を行った。本年度は葉緑体DNAのtrnL-trnF遺伝子間領域と核DNAのITS領域をPCR法により増幅し、塩基配列を決定した。その結果、葉緑体DNAのtrnL-trnF遺伝子間領域では種間での塩基配列の変異が見られなかった。葉緑体DNAの進化速度は比較的遅いものの、非コード領域に変異がないことは、ニュージーランドにおいてのCelmisia属の種分化は比較的新しい時代に起きたことを示唆している。一方、核DNAのITS領域においては種間での塩基配列に変異が見られ、その塩基配列を基にして分子系藤樹を作成した。近縁属のOlearia属やシオン連のニュージーランド固有属を含めて系藤樹を作成した結果、1)Celmisia属は2つの大きなクレードに分かれる、2)Celmisia属はシオン連のニュージーランド固有属とともにOlearia属の内群となることが明らかになった。Celmisia属の大クレード、シオン連のニュージーランド固有属、Olearia属の数種の間の関係は今回の解析で明らかにできなかったが、Celmisia属が多系統である可能性が示唆された。