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光学活性擬アザヘリセンの合成と不斉反応への展開

これまで様々な不斉反応が開発されており,その反応剤としてもっぱら点不斉や軸不斉などを有する化合物が用いられている。一方,精密有機合成化学において,らせん不斉触媒を用いた不斉反応の例は少ない。代表的ならせん化合物にヘリセンが挙げられる。ヘリセンの内部は優れた不斉環境であり,そのらせん内部に窒素原子などの配位部位を持つ化合物を合成出来れば優れたらせん不斉反応剤となると期待される。本研究では新たならせん不斉反応剤として擬アザヘリセンジオールを取り上げその合成を目的として検討を行った。その結果シスおよびトランス体の擬アザヘリセンジオールの合成に成功した。1,14-ジアザ[5]ヘリセン(1)はらせん型のねじれた構造をとるヘリセン内部に窒素原子を有する化合物である。1の共役酸のpKaは10.3であり,一般のピリジンと比べて高い塩基性を有する。これは,有機塩基触媒として用いられるN,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)とほぼ同程度の値である。従って,1は不斉塩基触媒として利用できると期待されるが,1自身を用いている限りそれは難しい。アザヘリセン1のらせん不斉の異性化は早いためである。アザヘリセン1の7, 8位の二つ炭素がsp3炭素となるアザヘリセン型化合物(擬アザヘリセン,1')の窒素周辺の環境はアザヘリセンと大きく変わらない。擬アザヘリセンも,アザヘリセン1と同様にらせん不斉を維持できないが,1'の7,8位にヒドロキシ基が置換したトランスジオールについては,そのジオールが置換した炭素の中心不斉を制御することができればそのヒドロキシ基を足がかりにらせん不斉を制御することが出来ると期待される。その結果,シス体の擬アザヘリセンジオールの合成法を開発し,さらにこのジオールから2段階でトランス体のジオールへと誘導することが出来た。これまで様々な不斉反応が開発されており,その触媒は点不斉や軸不斉などを有する化合物がもっぱら用いられている。らせん不斉触媒を用いた不斉反応の例はほとんど無いが,ヘリセンのらせん内部に配位部位を持つアザヘリセンを合成できれば新しい不斉触媒になると期待される。らせん不斉触媒を合成するには,歪んだ構造をいかに構築するか,また,いかに光学活性体を得るかが鍵である。これまで,不斉反応に利用されたヘリセン型らせん不斉化合物として, [5]アザヘリセンN-オキシドおよびその[6]ヘリセン誘導体のみが知られており,らせん不斉を有する不斉触媒の開発は,未開拓の領域である。一般にヘリセンのらせん異性は[6]ヘリセンでは保たれるが,[5]ヘリセンでは容易に失われる。特にペリ位が炭素から窒素に置き換わったアザヘリセンはペリ位の立体障害が減少し,異性化しやすいことが知られており,先述の[5]アザヘリセンN-オキシドの還元体であるアザヘリセンはらせん不斉を維持できない。先に我々は分子内ピナコールカップリングにより,不斉転写を利用した光学活性なジヒドロ[5]ヘリセンの合成法を開発している。本研究では含窒素ビアリールジカルボニル化合物から不斉転写ピナコールカップリングを用いて,光学活性な擬[5]アザヘリセン類を合成し,そのらせん不斉を活用した不斉反応を開発することを目指し検討している。当該年度は,不斉転写を伴う,分子内ピナコールカップリングにより,光学活性擬[5]ジアザヘリセンを合成するためのピナコールカップリング前駆体,7,7'-ジカルボニル-8,8'-ビキノリンの合成について検討し,7,7'-ジカルボニル-8,8'-ビキノリンのアセタールを合成することに成功した。研究実績の概要で述べたように,本研究はアゼヘリセンの合成,光学活性体合成,および,それを用いた合成反応の開発を目指し検討している。現在,アゼヘリセン合成の前駆体の合成に成功しており,研究は順調に進んでいる研究実績の概要で述べたように,本研究はアゼヘリセンの合成,光学活性体合成,および,それを用いた合成反応の開発を目指し検討している。現在,アゼヘリセン合成の前駆体の合成に成功しており,今後は早急に,このアゼヘリセン前駆体の大量合成を行い,ピナコールカップリングを行い,アゼヘリセンを合成する。アゼヘリセンの光学活性体合成ならびにそれを用いた不斉合成について検討する予定である。

今年度の配分額の10%以下に相当する108,645円を次年度に繰り越した。これは,当初予定した,試薬類等の購入を次年度に行うことにしたためである。次年度予算は当初配分予定額(1,600,000円)と併せて,1,708,645円となる。次年度は当初申請品目と変更なく,消耗品(1,600千円,ガラス器具,試薬,溶媒,クロマト用シリカゲル)および旅費(108,645円)に補助金を使用する予定である。
余剰次元模型と超対称性

本研究課題は、余剰次元模型を主として超対称理論の観点から取り上げ、壁、渦糸、磁気単極子、インスタントンなどさまざまなソリトンを研究し、それらのソリトンを用いて超対称な余剰次元模型を研究することを目的として遂行された。本計画では大きく分けて、I)超対称理論におけるソリトンの研究、II)超対称理論でのソリトンをブレーンワールドに応用するための研究、の二つの方向の研究を目標としたが、それぞれについて成果をあげることができた。特に中心的な研究課題となったのは,場の理論の非線形微分方程式の解としてのソリトンである.場の理論の非摂動的な取扱いへの発展をひとつの狙いとして,ソリトンのダイナミックスについても考察した.まず,超対称性が8個ある非線形シグマ模型でドメーンウォール解を構成し,解が保存する超対称性を保つ方法を検討した.さらに,超対称な非アーベルゲージ理論で,ファイエ・イリオプロス項とハイパー多重項の質量項とがあるときに,真空を求めた.これによって,この理論にドメーンウォールが存在できることがわかった.この事実に基づき、超対称性非アーベルゲージ理論でのドメーンウォール解を完全に構成することに成功し、解のパラメターであるモデュライの空間が全体として複素グラスマン多様体となることを示した.6次元時空での超対称な非アーベルゲージ理論を用いて,渦糸状のソリトンを構成し、渦糸上の有効理論を考察した。超対称性非アーベルゲージ理論で,1/4の超対称性を保存する複合ソリトンとして,ドメーンウォールと渦糸と磁気単極子とが共存する場合の解を構成する一般的方法を与えた.5次元超対称アーベルゲージ理論で,ハイパー多重項の質量が複素数である場合に,ジャンクションの厳密解を具体的に構成できることを示した.これは超対称性が8個ある理論でドメーンウォール・ジャンクションを構成した世界最初の例である.超対称性が8個ある非線形シグマ模型で,超対称性を半分保存するランプ解が互いに任意の角度をなす場合にも,部分的に超対称性を保存する解があることを示した.本研究課題は、余剰次元模型を主として超対称理論の観点から取り上げ、壁、渦糸、磁気単極子、インスタントンなどさまざまなソリトンを研究し、それらのソリトンを用いて超対称な余剰次元模型を研究することを目的として遂行された。超対称性非アーベルゲージ理論で,1/4の超対称性を保存する複合ソリトンとして,ドメーンウォールと渦糸と磁気単極子とが共存する場合の解を構成する一般的方法を与えた.5次元超対称アーベルゲージ理論で,ハイパー多重項の質量が複素数である場合に,ジャンクションの厳密解を具体的に構成できることを示した.これは超対称性が8個ある理論でドメーンウォール・ジャンクションを構成した世界最初の例である.超対称性が8個ある非線形シグマ模型で,超対称性を半分保存するランプ解が互いに任意の角度をなす場合にも,部分的に超対称性を保存する解があることを示した.本年度は,超対称ゲージ理論や超弦理論に現れるブレーンなどのソリトンを研究し、その結果を用いて余剰次元模型を超対称性の観点から研究した。我々はすでに,ドメーンウォール解が複数集まると,ジャンクションを生じることを示し,解析的な解を世界で始めて構成してみせた。本年度は超対称な非線形シグマ模型を取り上げ,ドメーンウォールやジャンクションの厳密解を研究した。その結果,4次元時空で4個の超対称電荷を持つ非線形模型において,ジャンクション厳密解を持つ一連の非線形シグマ模型を発見した。一方,8個の超対称電荷を持つ非線形シグマ模型では,ランプ解と呼ばれるひも状のソリトンが知られているが,これらが実空間でさまざまな方向を向いて共存している場合に,超対称性を部分的に保存する配位が可能であることを示し,そのような配位に対する条件を求めることに成功した。また,ウォールは全空間よりも1次元低い配位であるが,2次元低い配位として,弦状のソリトンが考えられる。これらの配位が共存する解を構成することに成功した。これによって,基本理論としてさらに高い次元の理論から出発することができる。

異なるドメーンウォールが複数あると,その共存によって超対称性が破れることがあるが,この機構の模型として,非BPS状態の厳密解を持つ模型を発見し,その厳密解上のモードを求めて,安定な配位であることを示した。これは超対称性が破れても,巻きつき数というトポロジカルな量子数があることによって安定性が保証されることを示している。本年度は,超対称な場の理論と超重力理論,超弦理論を用いてブレーンなどのソリトンを研究し、その結果を応用して余剰次元模型を超対称性の観点から研究した。近年、余剰次元の模型は超対称統一理論と並んで国内外で多くの研究者の注目を集めている。5次元またはそれ以上の高次元基本理論では,超対称性は少なくと0と1/2の粒子だけの模型では,相互作用する理論は運動エネルギーが非線形でなければならない。このような超対称非線形シグマ模型でウォールやジャンクションの解を構成した。我々は既に,異なるドメーンウォールが複数あると,その共存によって超対称性が破れることがあり,それを超対称性の破れの模型として用いることができることを示した。このように超対称性が破れても,巻きつき数などのトポロジカルな量子数があれば,安定性が保証される。この機構の実例をさらに構成し,その有用性を示すために,一般に巻きつき数を模型に導入する方法を提案した。その結果,簡単な模型を考察することによって,ウォールの束縛状態が存在することを発見した。この結果は,超弦理論でのさまざまのブレーンの模型を,場の理論を用いて作ったと見ることができる。さらに,超重力理論の中で矛盾のないウォールの厳密解を世界で初めて構成した。まず4次元超重力理論で超対称性が4個ある場合について,厳密解を求め,さらに5次元超重力理論で超対称性が8個ある場合について,厳密解を求めることに成功した。本年度は,超対称場の理論と超重力理論を主に用い,ブレーンなどのソリトンを研究した。また、その結果を応用して超対称性を持つ余剰次元模型を構築した。近年、余剰次元模型は超対称統一理論と並んで国内外で多くの研究者の注目を集めている。高次元理論では,ドメーンウォールが複数あるとそれらのジャンクションが生じる可能性がある。高次元では少なくとも8個の超対称電荷が必要である。8個の超対称性がある場合にジャンクション解を初めて構成することに成功した。半径が力学変数となる重力理論では,この安定性は再検討する必要がある。超重力理論の中に模型を埋め込むことができることを示し,その安定性を証明した。一般に超対称性が4個ある4次元の解ける模型を超重力理論に埋め込む場合について,超重力理論でも厳密解が存在するために充分な条件を確定し,実際に解を得ることができることを示した。余剰次元模型では,ドメーンウォールに局在する粒子を必要とする。ゲージ粒子を局在させることは今まで困難であったが,超対称模型で局在を得ることに成功した。本年度は、超対称性を持つ場の量子論を主として用いて、ソリトンを研究した。また、それらのソリトンを超重力理論や弦理論との関連で考察した。一方、それらの結果を用いて、超対称性を持つ余剰次元模型の構築を試みた。
コンディショナルRac1欠損マウスを用いた発がんの研究

個体レベルでRhoファミリーG蛋白質Racの発がんに関する役割を検討するため、発がん・転移に関与すると考えられるRac1およびRac3をコンディショナルにノックアウトするマウスの作製を行なった。すなわち1)rac1遺伝子の開始コドンを含むエキソンをloxPで挟んだアリルを導入したヘテロ型racl(+/flox)マウス、2)rac3遺伝子の開始コドンを含むエキソンの5'非翻訳領域にloxPを導入し、rac3遺伝子の最終エキソンのpolyA付加シグナルの3'領域にloxP-HcRedを導入したヘテロ型rac3(+/flox-HcRed)マウスをfeeder free ES細胞を用いたジーンターゲッティング法により作製した。また、in situハイブリダイゼーション法によりrac1,rac3mRNAの発現を検討し、rac1は胎児期から体全体で強く発現しており、rac3は幼弱期から神経系での発現が強く、特に発達期に強いシグナルが脳全体で見られるが、成熟脳での発現は低いことが明かとなった。さらに、Rac1及びRac3の欠損とがん遺伝子の発現が同時に同一の細胞で起こるためのマウスの作成も行った。すなわち、乳腺特異的プロモーターMMTV-LTRの制御下にドキシサイクリン投与によって転写活性が抑制できるテトラサイクリン調節性トランス活性化因子(tTA)を発現するTgと両方向性のテトラサイクリン応答因子(TRE)制御下にCreとポリオーマウイルスミドルT(PyV-mT)を発現するTgの2重Tgを前年度7系統作成したのに加え、今年度プロモーターと翻訳領域の間にイントロンを入れる等構築し直したTgを4系統作製した。新たに作製した4系統の内、1系統では生後9週で腫瘍を形成した。
心拍変動スペクトル解析による自律神経系活動評価に関わる標準値の作成

本研究では、様々な年代の健常被験者を対象として、安静時心拍変動の他に、呼吸循環系作業能力の測定を行い、1)各種評価手法によって算出された評価値の各々の統計的性質を比較検討するとともに、2)総合的な体力の一指標としての副交感神経系活動の標準値を作成する可能性を探ることを目的とした。2176歳の健常男女178名が、5分以上の座位安静の後に、自転車エルゴメーターを用いて、各被験者の推定最大心拍数の75%に達するまでの漸増運動負荷試験(男性15W/分、女性10W/分)を行った。5分間の安静時心拍変動データから分散(SDrr)ならびに変動係数(CVrr)を算出し、FFT法、MEM法、CGSA法の3手法によって、スペクトル解析を行い、各々について低周波成分(LO)、高周波成分(HI)、および全パワー(T)から、HI/T比、LO/HI比を算出した(以後、FFT法のHI値の場合はHI[FFT]のように略記)。これらの3手法のうちMEM法による指標については、他の指標との相関が極めて低く、指標間の定量的な比較を行うことが困難であった。また、CGSA法では非フラクタル成分が全く残らない事例もあり、このような例では自律神経系活動指標を推定できなかった。さらに、HI[MEM]、HI/T比[MEM]、HI/T比[CGSA]については、加齢に伴う有意な低下は認められず、全ての被験者を包含して同一の基準で定量評価することが困難であることが示唆された。一方、SDrr、CVrr、LO[FFT]、HI[FFT]、LO[CGSA]については、男女ともに、加齢に伴う有意な低下が認められるとともに、性差がなく、推定最大酸素摂取量の影響は認められなかった。すなわち、これらの変量は、いわゆる呼吸循環系の体力とは独立の加齢に関係する指標であり、従来の経験的知見に従えば、副交感神経系活動を反映するものであるということができる。これらの結果に基づいて、年代別標準値が作成された。
毒薬危検薬を含まない血液ヘモグロビン測定試薬の開発

1.陰イオン性界面活性剤による方法入手しうる限りの多種の陰イオン性界面活性剤を検討し、ヘモグロビン(Hb)測定に利用できるもの数種が見出されたが、そのうち純品として最も入手し易くしかも安価なラウリル硫酸ナトリウム(SLS)を採用し、これを用いて実用上満足すべきHb測定試薬を開発することができた。(1)反応機序Hb【O_2】液及びメトヘモグロビン(Hi)液とSLSの反応を吸収スペクトル的に解析して次の機序が推定された。SLSによりHb【O_2】はHiに転化し、さらにHiの誘導体【I】に変化する。この反応はHi1分子に対しSLS約100分子で完結する。SLSの量が多いと誘導体【I】から誘導体【II】を生ずるが、SLSが10,000分子に至っても反応は完結せず【I】と【II】の平衡的状態にある。たゞしこれは巨視的解釈であって微視的には【II】はSLSの量に応じて生成される連続的誘導体の総称と解すべきである。【I】,【II】ともに535mmに極大吸収を持ち、SLSが多いほど吸光係数が低い。(2)以上の反応にはpH,イオン強度,非イオン性界面活性剤の有無が影響する。血液Hb測定に好適な条件はpH7.48.0,リン酸緩衝液M/15M/60,トリトン×1000,0.30.1g/dl,SLS25mMである。(3)用手的方法で血液についてSLS法と従来のシアンメトヘモグロビン法を比較したところ、両者の成績は満足すべき精度で一致した。(4)今後実施予定の研究事項病院の臨床検査室において担当の検査技師が実地に本法を使用し、現行のシアンメトヘモグロビン法と一致する値がえられることを確認する必要がある。次に本法を自動多項目血球計数機に組込むことを工夫する。2.陽イオン性界面活性剤法,アルカリヘマチン法については今後も検討を進める。血液ヘモグロビン(Hbと略)測定に当っては血球を溶解して試薬を透明にするために界面活性剤を併用するのが常である。一方界面活性剤は種類及び条件によってはHbの吸収スペクトルを変化させることが知られており、これはHb測定上好ましからざる反応とされて来た。私はこの反応を逆に利用して界面活性剤によるHb誘導体を血液Hb測定に利用しようとの着想を抱き、広範な種類にわたって界面活性剤を検討し、毒薬危険薬を含まない血液Hb測定試薬として次の3種の方法を確立した。なおこの実験は今回の科研費で購入した島津UV260形を用いての吸収スペクトルの解析によって遂行されたものである。1.陰イオン性界面活性剤を用いる方法活性剤としては純粋な品が容易にえられる点からラウリル硫酸ナトリウムが最適である。この活性剤とHbの反応は2段階の過程で進行し、第1段階反応の産物がHb測定に利用される。活性剤の濃度0.5%,pH7.27.5とし、非イオン性界面活性剤トリトンX100の終末濃度0.1%を含ませる。波長535nm。2.陽イオン性界面活性剤を用いる方法活性剤としては水への溶解度が大きいという点からラウリルトリメチルアンモニウムクロライドが最適である。活性剤の濃度1%、pH7.0とする。測定波長495nm。3.非イオン性界面活性剤のNaOH溶液を用いる方法活性剤としてはトリトンX100など若干のものが使用できる。その濃度は2.5%とする。NaOHの濃度は0.1Nとする。この試薬にHbを溶かすとアルカリヘマチンと界面活性剤の結合物が生成される。576nmに極大吸収があり、それは比較的平坦で比色に好適である。以上3種の方法は臨床検査室の使用に供しうるが、このうち最も優れているのは第3の方法である。現在この測定法の化学反応の機序を究明し、理論的根拠を固める実験を進めつつある。

血液Hb測定に好適な条件はpH7.48.0,リン酸緩衝液M/15M/60,トリトン×1000,0.30.1g/dl,SLS25mMである。(3)用手的方法で血液についてSLS法と従来のシアンメトヘモグロビン法を比較したところ、両者の成績は満足すべき精度で一致した。(4)今後実施予定の研究事項病院の臨床検査室において担当の検査技師が実地に本法を使用し、現行のシアンメトヘモグロビン法と一致する値がえられることを確認する必要がある。次に本法を自動多項目血球計数機に組込むことを工夫する。2.陽イオン性界面活性剤法,アルカリヘマチン法については今後も検討を進める。
生命金属動態を鍵反応とするセンサー分子システムの構築と生理機能制御

本研究では、遷移金属を構成要素とするセンサーモジュールを有したセンサータンパク質の生合成過程におけるセンサーモジュールの構築とタンパク質部分への組込みの詳細な分子機構を解明することにより、細胞内生命金属動態制御を鍵反応とするセンサー分子システムの構築原理を理解し、「生命金属科学研究基盤の構築」のための基礎的知見を得る。さらに、センサーモジュールによる気体分子センシングの動的過程、気体分子センシングにおいて誘起されるタンパク質構造変化・機能制御を各種分光学的測定、結晶構造解析、生化学・分子生物学的解析によって明らかにし、生命金属が制御する細胞内構造ダイナミクスと機能の解明を行う。
新規触媒開発のためのリグニン特異的芳香環解裂酵素のアミノ酸配列の解析

本研究は、Sphingomonas paucimobilis SYK-6のリグニン芳香環解裂に関与するプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼと、リグニン・ビフェニル特異的環解裂酵素に着目して、類似した反応機構を持つが基質特異性の特異性の異なる2種類のリグニン特異的環解裂酵素のアミノ酸配列情報を明らかにして比較検討することで両酵素の基質特異性を決定している要因を探る事を目的として実施した。本研究の結果リグニン・ビフェニル分解酵素(LigZ)が単一のポリペプチド鎖から構成される酵素であるのに対し、プロトカテク酸4、5-ジオキシゲナーゼ(LigA,B)は大小2このポリペプチド鎖で構成される酵素である事、また両酵素の基質特異性は共通性が低い事が明らかになった。さらに本研究では、リグニン・ビフェニル分解酵素(LigZ)のアミノ酸配列に類似した一次構造を有するタンパク質をコンピューターで検索した。高い類似性を示すタンパク質はデータバンクから見いだすことが出来なかったが、低い類似性を示す物としてプロトカテク酸4、5-ジオキシゲナーゼ(LigA,B)のLigBサブユニット(大サブユニット)が検索されてきた。両ポリペプチド鎖の類似性は21%であり、この結果から、リグニン・ビフェニル分解酵素(LigZ)の200番目から254番目のアミノ酸領域が、プロトカテク酸4、5-ジオキシゲナーゼ(LigA,B)のLigBサブユニット(大サブユニット)の147番目から195番目領域と類似性がかなり高い事が明らかになった。この領域が酵素反応機構の共通性を支える領域である可能性が高く、両者は進化的に保存された領域を持つことが明かとなった。
3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼの反応機構

大腸菌3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼIIは、強力な突然変異、致死作用を有するアルキル化剤によるDNA損傷のうち、主にN-メチルプリン塩基を除去し、生命の維持に働くDNA修復酵素であるが、酵素反応機構はもちろん、活性部位、並びに、3次元レベルでの構造研究については、全く報告がなかった。申請者は本酵素のX線構造回析を行ない、2.3A分解能の3次元構造を得た。本研究は、本酵素の3次元構造をもとに、活性部位を決定し、ラウエ法でグリコシラーゼ反応機構を解明するための基礎的データを得ることを目的としているが、本年度は以下の成果を得た。(1)部位特異的突然変異誘発法を利用して(変異遺伝子については九大関口睦夫教授から提供を受けた)3次元構造から推定した活性残基を部位特異的に変換した変異蛋白質を調製し、各変異蛋白質の酵素反応を調べ、活性残基をAsp238と同定した。さらに、Trp218が基質認識に重要であることが示唆された。(2)コンピューターグラフィックスを利用し、DNA基質との相互作用モデルを提案、基質アナログ-TagII複合体結晶作成に適したDNAオリゴマーの鎖長を決め、DNAオリゴマー合成可能な3-メチル、3-デアザ-9-デアゼプリンを含む基質DNAオリゴマーを合成している。(3)ヒトリゾチーム変異型結晶を用いて、高エネルギー物理研究所でラウエ法によるデータ収集、データ処理法を修得した。
SNPマーカーを利用したトウモロコシ開花期の遺伝子診断技術の開発

早生品種を早期に育成するためには早生遺伝子型の効率的な選抜技術が不可欠であることから、これまでの知見を生かし、北方型フリント種の早生性の鍵となる遺伝子について遺伝子型を識別できる遺伝子診断マーカーを開発を目指す。これまでに、Thornsberryら(2001)のAssociation studyにより開花期との関連が示唆されたd8遺伝子内変異がトウモロコシ早生系統に多く見られることを確認した。本年度は、このd8遺伝子内変異を識別する挿入欠失変異(InDel)マーカーの早生性の遺伝子診断への利用を検証するため、d8遺伝子内変異を晩生系統に導入した準同質遺伝子系統による遺伝解析を行った。準同質遺伝子系統2系統(d8-1,d8-2)の早生系統ゲノム領域を調査した結果、それぞれd8遺伝子近傍領域62.2cMおよび5.3cM保有していた。特に、d8-2の導入されたゲノム領域は、物理地図で約1.2Mbp以下と、ゲノムの99.94%が戻し交配親由来ゲノム領域であった。d8-1およびd8-2に戻し交配親を交配した交雑後代集団において、d8遺伝子内変異と開花期との関係を単純線形回帰分析により解析した結果、いずれの集団においてもd8遺伝子内変異と開花期の間に有意な関係は認められなかった。Thornsberryら(2001)は、Association studyによりこのd8遺伝子内変異が、711日の開花期の差と関係し、選抜マーカーへの利用が可能であると報告している。しかし、本研究からは、Thornsberryら(2001)の結果を裏付ける結果は得られなかった。2005年以降、Thornsberryら(2001)の結果について、別集団を用いたAssociation studyによる検証が行われているが、明確な結果が得られず、準同質遺伝子系統による検証が必要とされていた。本研究は、Association studyによる結果を準同質遺伝子系統による遺伝解析で検証した初めての事例である。今後、このd8遺伝子内変異がAssociation studyにより開花期との関係が示唆された原因を解明することは、Association studyを実施するうえで有用な知見を提供できると考えられる。本年度は、北方型フリント種自殖系統とデント種自殖系統を交配した後代F_<2:3>集団を用いて開花期関連形質のQTL解析を行った。Mi29xTo85のF_2世代150個体の連鎖地図は全長1287cM、平均遺伝距離12.4cM、マーカー間の最大遺伝距離26.5cMとQTL解析を行うのに十分な精度であった。マーカーの分離比についてx検定を行った結果、理論値と1%水準で有意に異なる分離比を示したマーカーは0.9%(1/114)と、分離比の歪みはほとんどみられなかった。両親、F_1系統およびF_3世代150系統についての絹糸抽出期および雄穂開花期のGDDはいずれも正規分布に従っていた。両親間の絹糸抽出期および雄穂開花期のGDDの差はそれぞれ184°Cおよび193°Cであった。開花期関連形質のQTL解析を行った結果、絹糸抽出期および雄穂開花期でQTLがそれぞれ8および6個みつかった。このうち4個は位置および優性効果と相加効果の比が両形質でほぼ同じであり、これらは両形質に影響するQTLと考えられた。また、遺伝子とQTLの関係は、第1染色体のAn1とD8の間に絹糸抽出期のQTLがみつかり、第8染色体のepcの連鎖マーカーであるbnlg1067(epcとの遺伝距離0.4cM)の近傍に絹糸抽出期および雄穂開花期のQTLがみつかった。また、絹糸抽出期および雄穂開花期のほとんどのQTLは稈長および着雌穂高のQTLと一致しなかった。本年度は、トウモロコシ第1染色体長腕にある開花期に関するQTLおよびこの領域内に座乗する開花期関連遺伝子(D8およびAnl)のNIL候補を育成するため、BC3BC4世代を材料にマーカー選抜を行った。BC3集団のマーカー選抜の結果、QTLを含む個体とD8近傍領域を含む個体をそれぞれ選抜した。選抜した個体の調査形質は戻し交配親系統とほぼ同じであった。昨年度のQTL解析の結果、QTLの優性度が劣性と推定されていることから、劣性(早生)ホモ型を含まないBC3集団ではQTLの影響を確認できなかったものと考えられる。選抜した個体の後代BC4集団についてマーカー選抜を行った結果、QTL近傍領域(D8およびAnlを含む)がヘテロである個体を2個体、D8近傍領域(Anlを含まない)がヘテロである個体を2個体およびAnl近傍領域(D8を含まない)がヘテロである個体を2個体、それぞれ選抜した。次年度はBC_4F_2集団について開花調査および多型解析を行い、QTLおよび開花期関連遺伝子内変異の開花期への影響を調査する。また、自殖系統および集団を用い、それぞれの開花期関連遺伝子内変異と開花期との関係について調査する。

本年度は、このd8遺伝子内変異を識別する挿入欠失変異(InDel)マーカーの早生性の遺伝子診断への利用を検証するため、d8遺伝子内変異を晩生系統に導入した準同質遺伝子系統による遺伝解析を行った。準同質遺伝子系統2系統(d8-1,d8-2)の早生系統ゲノム領域を調査した結果、それぞれd8遺伝子近傍領域62.2cMおよび5.3cM保有していた。特に、d8-2の導入されたゲノム領域は、物理地図で約1.2Mbp以下と、ゲノムの99.94%が戻し交配親由来ゲノム領域であった。d8-1およびd8-2に戻し交配親を交配した交雑後代集団において、d8遺伝子内変異と開花期との関係を単純線形回帰分析により解析した結果、いずれの集団においてもd8遺伝子内変異と開花期の間に有意な関係は認められなかった。Thornsberryら(2001)は、Association studyによりこのd8遺伝子内変異が、711日の開花期の差と関係し、選抜マーカーへの利用が可能であると報告している。しかし、本研究からは、Thornsberryら(2001)の結果を裏付ける結果は得られなかった。2005年以降、Thornsberryら(2001)の結果について、別集団を用いたAssociation studyによる検証が行われているが、明確な結果が得られず、準同質遺伝子系統による検証が必要とされていた。本研究は、Association studyによる結果を準同質遺伝子系統による遺伝解析で検証した初めての事例である。今後、このd8遺伝子内変異がAssociation studyにより開花期との関係が示唆された原因を解明することは、Association studyを実施するうえで有用な知見を提供できると考えられる。
代謝型グルタミン酸受容体の分子構築と機能制御機構の解明

本研究者らは代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)がグルタミン酸のみならず細胞外のCa^<2+>やGd^<3+>といった多価陽イオンによっても活性化されることを見いだした。その後、TsuchiyaらによりmGluR1の細胞外領域の結晶構造の解析により、Gd^<3+>の結合部位が、Glu238を含むサブユニット間のインターフェイス部分に同定された。しかし、この部位が、Gd^<3+>による受容体の活性化を引きおこすことに機能的に関与しているかどうかは明らかにされていない。我々は、この部位の機能的意義を明らかにすることを目的としてE238Q変異体を作成し、そのGd^<3+>感受性を解析した。その結果、E238Q変異により、Gd^<3+>に対する感受性がほぼ完全に失われること、それに対し、グルタミン酸、Ca^<2+>に対する感受性は変化しないことが明らかになった。さらに、Gd^<3+>の存在下では、mGluR1のグルタミン酸に対する感受性を高めること、そしてこの効果もE238Q変異により失われることを見いだした。これらの結果は、Gd^<3+>もしくは、類縁の生理的に脳脊髄液中に存在する内因性の物質がmGluR1のこの部位へ結合することにより、単独でもしくはグルタミン酸と共働的に、mGluR1を活性化するということを示唆する。今後、Gd^<3+>の作用をmimicする内因性の物質の同定を目指して研究をすすめていく計画である。我々は,代謝型グルタミン酸受容体(mGluR1α)が示す細胞外Ca^<2+>やGd^<3+>などの多価陽イオン感知能を解析する過程において、発現系によりmGluR1αのGd^<3+>応答能に差が見られることを見いだした。その分子基盤の一つとして、mGluR1αをクラスター化/離散化させる分子であるHomerの有無を想定し、Homerの共発現がmGluR1αの受容体機能に及ぼす作用について、HEK293細胞一過性発現系を用いて細胞内Ca^<2+>濃度の測定により解析した。その結果、(1)Homerの共発現がmGluR1αのグルタミン酸応答のピーク値・応答の立ち上がり速度・グルタミン酸に対する用量応答関係に影響を及ぼすこと、(2)mGluR1αをクラスター化させる分子であるHomer1cの共発現によりGd^<3+>投与に対する応答が出現すること、を明らかにしてきた。本年度は(1)Homer結合能を欠くmGluR1αmutantP1147Eでは上記に示したHomer共発現の影響が観察されないという結果から、mGluR1αとHomerとの結合がグルタミン酸応答に対する性質に影響を与えていることを実証し、(2)mGluR1αの細胞表面での発現量に対するHomer共発現の影響の免疫組織学的解析により、クラスター能を欠くHomer1aの共発現は細胞表面でのmGlluR1の発現を増大させ、一方Homer1cは細胞表面での発現を減少させることを示し、(3)Homer分子が、グルタミン酸応答に対する影響と同様の効果を細胞外Ca^<2+>に対する応答に関しても示すことを明らかにした。Homerがグルタミン酸に対する用量応答関係に与えた影響の一部は、細胞表面におけるmGluR1α量の制御により説明できると思われる。しがしながらこのメカニズムではGd^<3+>投与に対する応答が出現することを説明することはできず、mGluR1αのリガンド受容という機能がHomer分子との結合により何らがの質的変化を示している可能性が示唆される。
高エネルギークラスターイオンを用いた新しい顕微質量分析法

高速イオンを非晶質シリコン窒化膜に担持した生体高分子材料の試料に照射した際に、前方に放出される無傷の2次イオン収量が後方に比べて大きくなることを見出した。この前方二次イオン質量分析法を2次電子顕微鏡と組み合わせることにより、新しい顕微質量分析法を開発した。この方法では、高速イオンが試料を通過した際に前方に放出される2次イオンの質量分析を行うとともに、試料後方に放出された2次電子を2次電子顕微鏡を用いて観察し、イオンの入射点を特定することにより、試料中の特定の分子の空間分布を測定することができる。開発した装置を用いて、1ミクロン程度の分解能でアミノ酸の空間分布が測定可能であることを示した。日本原子力機構高崎量子応用研究所において、5MeVのC60イオンビームによる、アミノ酸薄膜試料からの前方放出2次イオンの測定を行い、無傷のアミノ酸分子イオン収量とアミノ酸分子が分解して生じた分解片イオンの収量を測定した。その結果、通常の2次イオン質量分析法で行われる後方放出2次イオンの分析に比べて、無傷のアミノ酸分子イオン収量が1桁ほど増加し、分解片イオンの収量が大きく減少することを確認した。この原因を探るために試料の厚さを様々に変化させて、同様の測定を行った。試料中ではC60イオンは入射時に分解して、個々の炭素イオンとして試料中を進み、出射面では空間的に広がっている。この炭素イオンの空間分布の広がりをパラメーターとして、無傷のアミノ酸分子イオンと分解片イオンの収量比を調べると、空間分布の広がりが増加すると収量比も増加することがわかった。このことから、出射面におけるエネルギー付与密度が適度な値のときに、アミノ酸分子の分解が抑えられて、無傷のアミノ酸分子イオン収量が増加することがわかった。これらの研究と並行して、C60イオンの照射により試料表面から放出された2次イオンを、飛行時間型の質量分析器により分析するとともに、同時に放出された2次電子を、低エネルギー電子顕微鏡で観察して個々のイオンの照射位置を特定することにより、2次イオンのイメージングを行うための装置の設計を行った。設計を基にして、超高真空散乱槽を製作し加速器と接続できるようにビームラインの設計と製作も行った。窒化シリコンの自己支持膜上にペプチド(ロイシンエンケファリンおよびアンジオテンシンII)の薄膜を形成する方法を検討した。作成したペプチド薄膜を用いて、日本原子力機構高崎量子応用研究所において、5MeVのC60イオンビームによる二次イオン質量分析を行い、前方放出時と後方放出時の違いを調べた。その結果、前方・後方ともに無傷のペプチド分子イオンとともに、ペプチドが分解して生成したフラグメントイオンが観測された。前方放出の二次イオン収率と後方放出の二次イオン収率の比が二次イオンの質量が小さくなると急激に低下して、前方放出では分子イオンの分解が抑制されることが分かった。これらの研究と並行して、昨年度完成した超高真空散乱槽に光電子顕微鏡を設置した。水銀ランプ照射により生じる光電子像の観察によりこの光電子顕微鏡の性能の確認を行った。また、飛行時間型質量分析器の製作を進めて、分子イメージング装置がほぼ完成した。この装置を京都大学の量子理工学教育研究センターの加速器に接続した。高速のC60イオン照射による二次イオン放出のメカニズムを解明するために、C60イオン照射時にピコ秒程度の短時間だけ生じる試料表面の温度上昇を測定する方法を提案して、実際に温度の測定が可能であることを示した。この方法を用いて、窒化シリコンの自己支持膜にC60イオンを照射したときにはイオンの照射点周りの温度分布は、出射表面では入射表面に比べて、温度のピークが低くより広い範囲に広がっていることがわかった。このことが、前方放出において、無傷の分子イオンの収率が高くフラグメントイオンの収率が低いことを定性的に説明できると考えられる。分子イメージング装置の設計・製作がほぼ完了して、実際に加速器に接続した状態での2次電子顕微鏡の性能評価を行い、100nmよりも良い分解能を得ることができた。また、高速のC60イオン照射による二次イオン放出のメカニズムを解明して前方放出と後方放出の違いを理解するために、C60イオン照射時の試料表面の温度上昇を測定する方法を提案した。提案した方法でイオンの照射点周りの温度分布を測定したところ、出射表面と入射表面では異なっていることを明らかにすることができた。このように、研究はほぼ予定通り進展しているといえる。高速のC60イオン照射による2次イオン放出のメカニズムを解明するために、統合熱スパイクモデルを基にして、イオン照射時に表面から放出される分子およびその解離片の収量を計算するモデルを構築した。このモデルを用いて5 MeVのC60イオンを非晶質シリコン窒化膜に担持したフェニルアラニン試料に照射したときに、前方および後方に放出される無傷の分子および解離片の収量を計算した。その結果、前方放出では無傷の分子の収量と解離片の収量の比が後方放出に比べて大きくなるという実験結果を説明することができた。一方、昨年度に完成した分子イメージング装置で、2次電子顕微鏡の焦点調整の際に使用する水銀ランプ照射により試料基板の非晶質シリコン窒化膜が破れることが問題であった。今年度は、まず水銀ランプの光量を調整して非晶質シリコン窒化膜の破損を防ぐことを検討した。しかしながら、破損が生じない光量では焦点調整に必要な明るい光電子像が得られないことが判明した。

そこで、試料と同じ位置にシリコンウエファーの標準試料をおいて焦点調整を行った後に、フェニルアラニンをパターン蒸着した非晶質シリコン窒化膜試料に交換して、分子イメージングを試みた。開発した装置を京都大学の量子理工工学研究センターの加速器に接続して、6MeVの銅イオンを1次イオンとして測定を行ったところ、分子イメージングが可能であることが示されたが、空間分解能は5μm程度であった。そこで、個々の高速イオン照射により放出される2次電子像を用いて、実際の試料で2次電子顕微鏡の焦点調整をする方法を考案した。その結果1μm程度の空間分解能で、分子イメージングが可能であることを実証できた。高速イオンを非晶質シリコン窒化膜に担持した生体高分子材料の試料に照射した際に、前方に放出される無傷の2次イオン収量が後方に比べて大きくなることを見出した。この前方二次イオン質量分析法を2次電子顕微鏡と組み合わせることにより、新しい顕微質量分析法を開発した。この方法では、高速イオンが試料を通過した際に前方に放出される2次イオンの質量分析を行うとともに、試料後方に放出された2次電子を2次電子顕微鏡を用いて観察し、イオンの入射点を特定することにより、試料中の特定の分子の空間分布を測定することができる。開発した装置を用いて、1ミクロン程度の分解能でアミノ酸の空間分布が測定可能であることを示した。C60イオンの薄膜試料透過に伴う前方への無傷のアミノ酸イオン放出が後方放出よりも増加する原因が、試料中で乖離したC60イオンから生じる炭素イオンの空間分布と関係することを突き止めた。また、このC60イオンの前方放出2次イオンを利用した分子イメージング装置の設計が完了し、装置の一部を製作した。また、これらハード部分の設計製作に加えて、2次電子顕微鏡における2次電子の2次元位置検出方法の検討を行うとともに、2次電子信号に加えて試料を透過した1次イオン信号、試料から前方に放出された2次イオン信号を同時に処理するための計測システムの設計を行った。以上のことから、平成26年度の研究実施計画の内容を概ね達成したといえる。今後は、当初の予定通り二次電子顕微鏡と二次イオン質量分析装置を結合した分子イメージング装置を用いて、まず京都大学の量子理工学教育研究センターの加速器を利用して、分子イメージングのための動作確認と調整を行う。その後、量子科学技術研究開発機構の高崎量子応用研究所に装置を搬入して、C60イオンビームの加速が可能な3MVタンデム加速器に接続して、5MeVのC60イオンビームを用いて装置の調整を行う。装置の調整後に、作成した標準試料を用いて、二次イオンの質量分析と二次電子の放出位置測定の同時計測により分子イメージングが実際に可能であることを確認する予定である。なお、二次電子顕微鏡のピント調整には、水銀ランプ照射による光電子像を用いる予定であった。ところが、実際の薄膜試料に水銀ランプを照射すると、自己支持膜が破れることが判明した。このため、薄膜試料と同じ位置にシリコンウエファーを置いてピント調整を行った後に実際の薄膜試料と交換して、分子イメージングの測定を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ガングリオシドによる細胞周期制御―悪性グリオーマに対する新規治療法の開発―

酸性糖シアル酸を持つ糖脂質、ガングリオシドが細胞周期に影響を与えることに注目し、そのなかでGM3がグリオーマ細胞の増殖抑制に有効ではないかと考え検討を行った。その結果、20から200μMの濃度でのGM3投与群はコントロール群に比べ有意にグリオーマ細胞株の増殖を抑制し、抑制度はGM3の濃度に依存した。その結果をもとにC6グリオーマ細胞をラット大槽内に移植し脳腫瘍モデルを作成し、in vivoの検討を行った。GM3投与群では800μMのGM3を移植10日目に大槽内に投与し、グリオーマ細胞移植後のラット生存日数を比較検討した。その結果、コントロール群の平均生存日数は19.5日であったがGM3の大槽内投与群の生存日数は22.0日に延長した(P<0.05)。さらに、その腫瘍細胞増殖抑制作用がGM3投与によるアポトーシス誘導によるものであることがTUNEL法により解明した。脳槽内単回投与では3日目を境にアポトーシス細胞は消退していき、GM3の脳あるいは脳腫瘍内への浸潤効果は限られることが示された。一方ではグリオーマ細胞の接着浸潤に対する作用の解明を行った。GM3による細胞運動能への作用をBoyden Chamber Assayより求めたところ、GM3の濃度依存性に細胞運動が抑制された。さらに三次元構築脳組織培養モデル(slice culture)に共焦点レーザーを組み合わせ、腫瘍塊から脳組織に浸潤するグリオーマ細胞を経時的に生細胞として捉え、脳内浸潤への影響を明らかにした。その結果GM3が腫瘍増殖抑制のみならず、浸潤能の抑制に働いていることが明らかになった。以上のことより、高濃度のGM3局所投与が、悪性グリオーマに対して増殖、浸潤ともに抑制することがわかり、グリオーマ治療におけるGM3の局所投与は比較的安全でかつ有効な新しい治療方法となる可能性が示唆された。酸性糖シアル酸を持つ糖脂質、ガングリオシドが細胞周期に影響を与えていることに注目し、とくにそのなかでGM3に注目した。GM3がグリオーマ細胞の増殖抑制に有効ではないかと考え、in vitroおよびin vivoにおける検討を行った。1、初代継代培養グリオーマ細胞4種類およびグリオーマ細胞株4種類を用いてin vitroの検討をおこなった。GM3投与3、5、7日後にMTT assayによりその細胞増殖抑制効果を検討した。その結果、初代継代培養細胞およびグリオーマ細胞株ともに20から200μMの濃度でのGM3投与群はコントロール群に比べ有意に増殖が抑制され、抑制度はGM3の濃度に依存した。グリオーマ細胞株では初代継代培養細胞にくらべ抑制率が高く、細胞増殖速度の速い株ほどGM3による抑制効果が高い傾向を示した。2、C6グリオーマ細胞をラット大槽内に移植し、実験脳腫瘍モデルを作成し、in vivoの検討を行った。コントロール群(n=20)とGM3投与群(n=15)に分け、投与群では800μMのGM3 100μlを移植10日目に大槽内に投与した。グリオーマ細胞移植後のラット生存日数を比較検討した。その結果GM3大槽内投与による急性毒性はみられなかった。コントロール群の平均生存日数は19.5日であったがGM3の大槽内投与群の生存日数は22.0日と軽度ながら有意に延長した(P<0.05)。以上よりグリオーマ治療におけるGM3の局所投与は比較的安全でかつ有効な新しい治療方法となる可能性が示唆された。

初年度にあたる昨年はGM3投与による悪性グリオーマへの影響をinvitroおよびin vivoで調べた。その結果、高濃度のGM3との接触によりグリオーマ細胞の増殖は有意に抑制され、また実験グリオーマ脳腫瘍モデルでのGM3投与実験でもその生存日数は有意に延長した。本年度は研究計画どおり、一方ではin vivoでのGM3投与実験をさらに進め、そのグリーマ増殖抑制効果の病理動態を検討した。その結果、腫瘍細胞増殖抑制作用がGM3投与によるグリオーマ細胞のアポトーシス誘導によるものであることがTUNEL法により解明された。また、その効果は、アポトーシス細胞の出現を見る限り、脳槽内単回投与では3日目を境に消退していくことがわかった。またその効果は腫瘍塊の表面に限られ、GM3の脳あるいは脳腫瘍内への浸潤効果は限られることが示された。さらに、もう一方ではグリオーマ細胞の接着浸潤に対する作用の解明を行った。すなわち、GM3による細胞運動能への作用をBoyden Chamber Assayにより明らかにした。その結果、GM3の濃度依存性に細胞運動が抑制されることがわかった。さらに当教室で開発した三次元構築脳組織培養モデル(slice culture)に共焦点レーザーを組み合わせ、腫瘍塊から脳組織に浸潤するグリオーマ細胞を経時的に生細胞として捉えることができ、脳内浸潤への影響を明らかにした。その結果GM3が腫瘍増殖抑制のみならず、浸潤能の抑制に働いていることが明らかになった。以上のことより、高濃度のGM3局所投与が、悪性グリオーマに対して増殖、浸潤ともに抑制することより、今後有川な治療法のひとつになる可能性を示した。
動吸振器による張力安定化構造の振動制御

本研究の目的は,弦や膜面などの張力安定化構造の振動を効果的かつロバストに抑制することである.特に,主構造の代わりに自らが振動することで制振効果を発揮する動吸振器に着目して研究を行った.主な成果としては,動吸振器のロバスト最適設計手法の確立と,マイコンを利用したセルフセンシング制振手法の確立が挙げられる.これにより,動吸振器の欠点である適応性の低さを克服することができ,張力安定化構造の制振を従来よりも効果的かつロバストに行えるようになった.本研究の目的は,弦や膜面などの張力安定化構造の振動を効果的かつロバストに抑制することである.特に,主構造の代わりに自らが振動することで制振効果を発揮する動吸振器に着目して研究を行った.主な成果としては,動吸振器のロバスト最適設計手法の確立と,マイコンを利用したセルフセンシング制振手法の確立が挙げられる.これにより,動吸振器の欠点である適応性の低さを克服することができ,張力安定化構造の制振を従来よりも効果的かつロバストに行えるようになった.本研究は,張力安定化構造の効果的な制振手法を確立することを目指している.近年,宇宙科学においては,ミッション内容の高度化・細分化が進んでおり,構造システムに対する要求は,より高精度かつ高機能なものへと高まっている.そのため,収納展開性に優れ,軽量で大規模な構造を実現可能な張力安定化構造の高精度化,とりわけ振動制御は,重要な課題である.張力安定化構造の主構造である弦や膜面は,変形の方向と変位の方向が直交するため,従来の制振手法をそのまま適用しても十分な効果を得ることができない.そこで,本研究では,張力安定化構造の支持部を梁,主構造を膜面とモデル化し,前者は圧電素子によるスマート化,後者は動吸振器による振動制御によって,効果的な制振の実現を試みている.本年度は,特に支持部の振動制御に着目し,研究を進めて来た.従来の手法よりもロバスト性を向上させるため,複数に分割した圧電素子をアルミニウム梁に貼付し,それぞれにわずかに特性を変えた電気回路を接続することで,多重動吸振器としての振舞いを模擬するような系を考えた.電気回路の特性は,ガラーキン法に基づくモデルを導出し,自作の最適化アルゴリズムにより数値的に決定した.その上で,周波数特性実験を行い,モデルの有効性と提案する手法の効果を確認した.さらに,次の段階の実験を行うために,膜面を2本の梁で支持した張力安定化構造の実験装置を製作した.今後は,圧電素子による支持部の制振と,動吸振器による膜面の制振を協調させていくことが課題である.本研究は,張力安定化構造の効果的な制振手法を確立することを目指している.近年,宇宙科学においては,ミッション内容の高度化・細分化が進んでおり,構造システムに対する要求は,より高精度かつ高機能なものへと高まっている.そのため,収納展開性に優れ,軽量で大規模な構造を実現可能な張力安定化構造の高精度化,とりわけ振動制御は,重要な課題である.張力安定化構造の主構造である弦や膜面は,変形の方向と変位の方向が直交するため,従来の制振手法をそのまま適用しても十分な効果を得ることができない.そこで,本研究では,張力安定化構造の支持部を梁,主構造を膜面とモデル化し,前者は圧電素子によるスマート化,後者は動吸振器による振動制御によって,効果的な制振の実現を試みている.昨年度は,複数の圧電素子と電気回路を接続し,多重動吸振器としての振舞いを模擬することで,支持部である片持ち梁の受動的な振動制御が従来よりも高いロバスト性で実現できることを示した.今年度は,電気回路の特性の最適化手法を,モデル誤差を加味した伝達関数を導入することで,ロバスト最適設計法へと高度化した.また,弦を2本の梁で支持した張力安定化構造の実験装置を製作し,スマート構造と動吸振器により,主要構造である弦の振動を効果的に減衰できることを確認した.さらに,2本の梁で支持された弦の振動モードを解析的に導出し,上述のロバスト最適化設計手法によって多重動吸振器の最適設計を行った.
骨粗鬆症に対する幹細胞を用いたアンチエイジング治療法の開発

本年度は前年度に継続し、卵巣摘出することにより成功した骨粗鬆症モデルラットにおいてさらなる検討を行った。DXA(2重エネルギーX線吸収計)における骨密度の測定結果から、骨粗鬆症ラットにおいて骨密度の低下が確認されており、このラットに対し骨髄から分離、培養した未分化間葉系幹細胞(MSCs;GFP遺伝子組み換えラットからの骨髄由来未分化間葉系幹細胞(GFPMSCs)を注入した。投与することにより、著名な有害事象は確認されていない。また、投与細胞は保存することも可能で、高齢化社会に対するバンキングの有用性も示唆された。この細胞を用いた注入方法は(1)全身投与群;GFPMSCsを脈管内経静脈的に投与後、1ケ月後には改善が見られ、DXA値の上昇に加え、μCT、組織学的にも骨梁の増加、亢進が確認された。また、(2)局所投与群;局所的には骨粗鬆症において頻発する大腿骨に焦点をあて、この骨粗鬆症モデル成立ラット大腿骨に上記MSCsを、PRPに懸濁することにより骨髄穿刺針を用いて注入した。同様に骨密度の改善が確認され、μCT、組織学的にも改善傾向が認められた。注入操作、サイトカインの応用という観点から担体としては局所投与にはPRPが、全身投与では安全性、汎用性の観点から生食にて投与することが有用であることが示唆された。さらに、細胞デリバリーの観点から、骨髄輸送の条件についても検討を加え有用な知見を得ることができた。本研究により、低侵襲な、細胞を用いた再生医療による骨粗鬆症改善に対する新たな治療法の可能性を見出すことができた。本年度はラットの卵巣を摘出することにより骨粗魅症モデルラットを作製することに成功した。つまり、DXA(2重エネルギーX線吸収計)というCT機を用いて骨密度を測定した結果、卵巣摘出ラットでは骨密度の低下が観察され、骨質の低下が確認できた。また、幹細胞の分離、培養に関しても、ラット骨髄から未分化間葉系幹細胞(MSCs)の分離、増殖させる方法を応用し、GFP遺伝子組み換えラット(全ての組織にGFP遺伝子が組み込まれているラット)からの骨髄由来未分化間葉系幹細胞(GFPMSCs)の採取にも成功した。さらに、分離した幹細胞を移植に必要な細胞数まで、培養操作により増殖させ、移植に用いることを可能とした。計画していた2グループに分けた検討項目に従い、つまり、(1)間葉系幹細胞(GFPMSCs)を、脈管内経静脈的に全身投与する群においては経静脈的に幹細胞を投与した。投与後、DXAにて骨密度を計測した結果、骨粗鬆症モデルラットのDXA値は細胞を注入し、1ヶ月後には改善が見られた。今後さらなるN数を加え、評価を行うことで、効果を判断すると同時に、組織学的評価の裏付けを行う予定である。さらに、移植細胞の動態についても検討する。また、(2)骨粗鬆症患者では、大腿骨骨折が多く、その場合、寝たきりになるなどきわめてquality of life (QOL)低下をきたすため、骨粗鬆症モデル成立ラットの大腿骨を用い、局所への投与を検討した。間葉系幹細胞(MSCs)をマトリックスとともに局所注入した結果、細胞注入群において、骨密度の改善が得られたため、引き続き、効率良いサイトカイン、スキャホールドの検討を進める予定である。同時に、マトリックス内での細胞生存期間、細胞障害性、最適マトリックスを評価する。本研究は計画通りに進んでおり、さらなる成果を上げるべく、研究を精力的に進めていきたい。