hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬用植物におけるトリテルペノイド生合成遺伝子のクローニングと物質生産への応用

本研究では、朝鮮人参毛状根(Panax ginseng)からトリテルペノイド生合成に関与するスクアレンエポキシダーゼ(SQE)とスクアレン合成酵素(SQS)のcDNAクローニングを行った。まず、毛状根からmRNAを調製し、ラット、酵母のSQEにおいて極めて相同性の高い2つのアミノ酸配列(PDRILGE,TGGGMTV)に基づくプライマーを合成し、RT-PCRを行ったが、予想される位置にバンドが検出されなかった。そして、次に人参λZapII cDNAラィブラリーより、Arabidopsis由来のESTクローン(129F12T7)をプローブとして、スクリーニングを行い、独立した約65万クローンから、1個の陽性クローン(pPGSE-1)を単離した。塩基配列の結果、pPGSE-1は全長1846bpで470アミノ酸残基からなる分子量51,710のポリペプチドをコードしていることが示された。また、pPGSE-1はラット、酵母のSQEとアミノ酸レベルでそれぞれ42%,37%の相同性を示し、補酵素FADの結合領域及び先の実験で用いた2つのアミノ酸領域もよく保存されていた。なお、植物界においてSQE遺伝子が単離されたのは、本クローンが最初である。また、同ライブラリーからArabidopsis由来のpATSS-4(SQScDNAを含む)をプローブとして、2個の陽性クローン(pPGSS-1,pPGSS-2)を単離した。pPGSS-1は1518bpのインサートcDNAを有し、415アミノ酸残基からなる分子量47,123のポリペプチドをコードしていることが示され、他の植物(甘草、タバコ)のSQSと比較して、アミノ酸レベル約80%の高い相同性を示した。また、pPGSS-2はN末端のアミノ酸領域が欠失したクローンであり、pPGSS-1との比較により人参には少なくとも2種類のSQSが存在することが明らかとなった。現在、単離したpPGSE-1及びpPGSS-1の酵母での発現解析を利用して、酵素活性触媒に必須なDNA領域の決定を遂行している。
ペプチドシグナルを介した植物成長の分子機構

植物の成長制御に関わる新しい分子群として,内生の分泌型ペプチドホルモンや篩管移行性の非分泌型ペプチド,病原微生物由来の外生ペプチドなどに注目が集まっている.本研究は,ペプチドシグナルの探索や,受容および細胞内情報伝達機構の解明を進め,植物成長の新しい分子機構を明らかにすることを目的としている.以下に項目ごとに研究実績を示す.1.分泌型ペプチドホルモン:受容体下流の初期情報伝達に関わる分子群を同定するため,15Nを用いた安定同位体標識法によるリン酸化変動プロテオミクスの系を確立した.また,共同研究として,側根が等間隔でできる過程に関わるペプチドホルモンTOLS2の受容機構の解明や,マメ科植物ミヤコグサの根で根粒形成の抑制に働くPLENTYがペプチドホルモンの糖鎖修飾酵素であることの証明に貢献した.2.篩管移行性非分泌型ペプチド:葉の篩部では,根の窒素欠乏を葉に伝えるペプチドホルモンCEPの下流で機能するCEPDのホモログが多数発現している.そのひとつ,CEPDL2に着目して解析を進めたところ,CEPDL2は葉自身の窒素状況に応じて発現上昇し,根へ移行して根における硝酸取り込みを制御するシグナルであることが明らかとなった.植物は,根の窒素欠乏に応答するCEP-CEPD経路と葉自身の窒素状況を根に伝えるCEPDL2経路の両方によって,全身的な窒素ホメオスタシスを維持していることが明らかとなった.3.外生ペプチドシグナル:バクテリアべん毛由来のペプチドの認識に関わる受容体であるFLS2をビーズに固定化し,べん毛由来のペプチド断片混合物のどの断片と結合するかを,リガンドフィッシングにより解析したところ,従来から知られていたflg22断片に加えて,アンタゴニストとして機能する断片が得られることが明らかとなった.植物と微生物の攻防の一端と考えられる.新規分泌型ペプチドホルモンについては,これまでの解析によりリガンド構造および受容体が明らかなものに加え,リガンド構造が明らかで受容体を探索中のものがさらに1種類ある.これらについて機能解明を進めている段階である.今年度確立できたリン酸化変動プロテオミクスの系はペプチドホルモン解析の強力なツールになると考えている.実際にこの系を用いて解析を進めたところ,根の形成に必要なペプチドホルモンRGFについて,ペプチド処理後10分以内にリン酸化されるタンパク質を複数検出した.その欠損株の表現型やRGF感受性の変化を解析するとともに,この系を機能未知リガンドの機能解明にも応用していく.地上部の篩管特異的非分泌型ペプチドについては,21種類あるCEPDホモログに加え,篩管特異的トランスクリプトームデータを用いて,CEPDファミリー以外の新規候補因子群についても絞り込みを終え,誘導発現系とRNA-Seqを組み合わせた機能解析を進めている.いずれも100アミノ酸程度のポリペプチドであり,GFP融合ペプチドの局在観察から,遺伝子発現は地上部のみであるにも関わらず,ペプチドレベルでは根に移行することを確認している.それらのひとつ,CEPDL2は葉自身の窒素状況に応じて発現上昇し,根へ移行して根における硝酸取り込みを制御するシグナルであることが明らかとなり,投稿中の状況である.外生ペプチドシグナルについては,固相固定化した受容体を用いたリガンドフィッシング系の実用性を確認するために,FLS2をモデルとして菌培養液から天然リガンドの釣り上げを試みたが,精度の高さが十分であることが明らかになった.新しいシグナルの同定という研究は,同定できるかできないかの2者択一であるが,新規分泌型ペプチドホルモンについては複数の候補を得ていることから,リスクを分散しながら機能解析を続けていく予定である.篩管移行性のペプチドについても,多数の候補を得ており,今後の研究計画に大きな変更はない.外生ペプチドシグナルについては,固相固定化した受容体を用いたリガンドフィッシング系の実用性と精度の高さが十分であることが確かめられたことから,今後はリガンド構造未知の受容体へと研究を展開していく予定である.植物の成長制御に関わる新しい分子群として,内生の分泌型ペプチドホルモンや篩管移行性の非分泌型ペプチド,病原微生物由来の外生ペプチドなどに注目が集まっている.本研究は,ペプチドシグナルの探索や,受容および細胞内情報伝達機構の解明を進め,植物成長の新しい分子機構を明らかにすることを目的としている.以下に項目ごとに研究実績を示す.1.分泌型ペプチドホルモン:受容体下流の初期情報伝達に関わる分子群を同定するため,15Nを用いた安定同位体標識法によるリン酸化変動プロテオミクスの系を確立した.また,共同研究として,側根が等間隔でできる過程に関わるペプチドホルモンTOLS2の受容機構の解明や,マメ科植物ミヤコグサの根で根粒形成の抑制に働くPLENTYがペプチドホルモンの糖鎖修飾酵素であることの証明に貢献した.2.篩管移行性非分泌型ペプチド:葉の篩部では,根の窒素欠乏を葉に伝えるペプチドホルモンCEPの下流で機能するCEPDのホモログが多数発現している.そのひとつ,CEPDL2に着目して解析を進めたところ,CEPDL2は葉自身の窒素状況に応じて発現上昇し,根へ移行して根における硝酸取り込みを制御するシグナルであることが明らかとなった.植物は,根の窒素欠乏に応答するCEP-CEPD経路と葉自身の窒素状況を根に伝えるCEPDL2経路の両方によって,全身的な窒素ホメオスタシスを維持していることが明らかとなった.3.外生ペプチドシグナル:バクテリアべん毛由来のペプチドの認識に関わる受容体であるFLS2をビーズに固定化し,べん毛由来のペプチド

断片混合物のどの断片と結合するかを,リガンドフィッシングにより解析したところ,従来から知られていたflg22断片に加えて,アンタゴニストとして機能する断片が得られることが明らかとなった.植物と微生物の攻防の一端と考えられる.新規分泌型ペプチドホルモンについては,これまでの解析によりリガンド構造および受容体が明らかなものに加え,リガンド構造が明らかで受容体を探索中のものがさらに1種類ある.これらについて機能解明を進めている段階である.今年度確立できたリン酸化変動プロテオミクスの系はペプチドホルモン解析の強力なツールになると考えている.実際にこの系を用いて解析を進めたところ,根の形成に必要なペプチドホルモンRGFについて,ペプチド処理後10分以内にリン酸化されるタンパク質を複数検出した.その欠損株の表現型やRGF感受性の変化を解析するとともに,この系を機能未知リガンドの機能解明にも応用していく.地上部の篩管特異的非分泌型ペプチドについては,21種類あるCEPDホモログに加え,篩管特異的トランスクリプトームデータを用いて,CEPDファミリー以外の新規候補因子群についても絞り込みを終え,誘導発現系とRNA-Seqを組み合わせた機能解析を進めている.いずれも100アミノ酸程度のポリペプチドであり,GFP融合ペプチドの局在観察から,遺伝子発現は地上部のみであるにも関わらず,ペプチドレベルでは根に移行することを確認している.それらのひとつ,CEPDL2は葉自身の窒素状況に応じて発現上昇し,根へ移行して根における硝酸取り込みを制御するシグナルであることが明らかとなり,投稿中の状況である.外生ペプチドシグナルについては,固相固定化した受容体を用いたリガンドフィッシング系の実用性を確認するために,FLS2をモデルとして菌培養液から天然リガンドの釣り上げを試みたが,精度の高さが十分であることが明らかになった.新しいシグナルの同定という研究は,同定できるかできないかの2者択一であるが,新規分泌型ペプチドホルモンについては複数の候補を得ていることから,リスクを分散しながら機能解析を続けていく予定である.篩管移行性のペプチドについても,多数の候補を得ており,今後の研究計画に大きな変更はない.外生ペプチドシグナルについては,固相固定化した受容体を用いたリガンドフィッシング系の実用性と精度の高さが十分であることが確かめられたことから,今後はリガンド構造未知の受容体へと研究を展開していく予定である.
コドン選択

コドン選択を決めている要因を網羅的に解析し、コドン選択の持つ生物学的意味の総合的理解を目指した。コドン3文字目が極端にGCに富むヒト遺伝子類が熱安定性の高いTバンドや末端Rバンドに集中する傾向を見い出した。ヒト染色体では染色体ごとにTバンド領域の大きさが異なるが、この染色体ごとの性質と、コドン選択とが関連することが示された。GC含量の大きく変化する領域での構造解析を行った(池村)。温血動物でポリユビキチン遺伝子はGCに富む領域に、モノユビキチン遺伝子はATに富む領域に位置すると推定され、異なったコドン選択性を有する。遺伝子発現機構との関係を解析した(三田)。コドン選択性と蛋白質合成効率の関係を明らかにした。放線菌へ低使用頻度コドンを持つ遺伝子を導入すると、蛋白合成率が低いことが示され、その際のUUA解読もRNAの働きが明らかになった(熊谷)。コドン3文字目によるAT/GC使用の相殺調節を解析し、種の特異性を超えた塩基配列に関する共通法則を求めた(和田)。方向性のある変異圧によりコドン選択に偏りが生じ不使用コドンができ,tRNAも使用されずunassigned codonを生じ、tRNAの変化で他のアミノ酸に捕獲される。強いAT圧が働いたマイコプラズマでのコドン、アンチコドンの系統を追った変化をたどり、UGAのTrpコドンへの変化の道筋を明らかにした(武藤)。HIVとHBVウィルスでの塩基置換パタ-ンの解析から複製酵素のエラ-生成時の性質の差を明らかにし、AT/GC圧を量的に推定する方法を開発した(五條堀)。方向性のある変異圧とDNA複製機構との関連につき、大腸菌mutT遺伝子産物を用いた酵素学的解析を行った。AーTからCーGへのトランスバ-ジョンがヌクレオチドプ-ルに含まれる微量の変異原性誘導体に起因し、mutT蛋白質はこれを分解する酵素であるとの結果を得た(真木)。
廃棄資源のみからなるコンクリートと補強用竹筋を複合化した環境配慮型建設材料の開発

本研究は、環境負荷の高いセメントや鉄筋、環境資源である天然の砂や砂利などを使わず、廃棄資源のみからなるコンクリート(廃棄資源コンクリート)や里山荒廃の原因となっている竹を複合化した新しい環境配慮型構造材料の実用化に向けた実験を行い、その適用法を提案するものである。本実験では、フライアッシュ、高炉スラグ微粉末、脱硫石こう、高炉スラグ骨材、再生骨材などからなる廃棄資源コンクリートを製造し、耐凍害性、耐酸性、耐硫酸塩性などを調査するとともに、補強材として用いる竹の耐水性や補強効果を検討し、これらの問題点や改善策を検証した。本研究成果として、廃棄資源コンクリートは、耐凍害性、耐酸性、耐硫酸塩性に問題を有するが、ビニロン繊維、ポリマー混和材、高性能減水剤、フライアッシュ、AE剤などを用いたセメントモルタル製永久型枠の使用で改善すること、廃棄資源コンクリートに用いる無処理の竹は、耐水性や補強効果に問題を有するが、樹脂や砂を接着することで改善すること、液体窒素を用いる凍結融解試験は、通常の方法に比べて消費電力や試験時間の面で有利となることなどが確認できた。本研究は,セメントや天然骨材を使用せず,廃棄資源のみで製造するコンクリート(廃棄資源コンクリート)とその補強材として有効利用が望まれる竹を用いる環境負荷低減に有効な建設材料を開発することが目的であり,平成20年度は,廃棄資源コンクリートや竹筋の耐久性改善策を検討した。廃棄資源コンクリートは,結合材であるセメントの代わりに高炉スラグ微粉末,フライアッシュおよび脱硫石こう,天然骨材の代わりに高炉スラグ骨材や再生骨材を用いて製造し,凍結融解試験や酸や硫酸塩による耐薬品性試験を行った。その結果,AE剤添加による空気泡連行によって若干改善するものの強度発現性が低い廃棄資源コンクリートの耐凍害性はかなり低いこと,その空気泡連行性は通常のコンクリート用よりもフライアッシュ用のAE剤の方が高いこと,廃棄資源コンクリートの質量は通常のコンクリートと同様に硫酸塩水溶液に浸漬すると増加して塩酸水溶液に浸漬すると減少するので,耐硫酸塩性や耐酸性に問題のあることなどが確認できた。竹は,水とくにアルカリ性の水に浸漬すると品質が低下する。そこで,竹に加熱油抜き,燻煙,海水浸漬,樹脂塗布,樹脂塗布砂付け,ポリマー塗布などの処理を施し,アルカリ水に浸漬して色や強度の変化を調べるとともに,これらの処理を施した竹と廃棄資源コンクリートを複合化させて小形はりを作製し,載荷試験を行って竹の補強効果を調べた。その結果,アルカリ水に浸漬しない場合,油抜きや燻煙などの加熱処理や樹脂による被覆処理を施した竹材の方が,無処理や海水処理よりも高い強度を示すこと,いずれの竹材もアルカリ水への浸漬で強度低下を生じるが,樹脂やポリマーによる被覆処理にはその抑制効果があること,樹脂塗布後に砂を散布した竹は,付着性が高まるために廃棄資源コンクリートの補強効果が高いことなどが確認できた。本研究の目的は,環境負荷の高いセメントや天然骨材を使わない廃棄資源のみからなるコンクリート(廃棄資源コンクリート)と,その補強材として里山保全の観点から有効利用が望まれている竹を用い,環境負荷低減に有効な建設材料を開発することである。平成21年度は,繊維補強ポリマーセメントモルタルで永久埋設型枠を作製し,廃棄資源コンクリートや竹筋廃棄資源コンクリートと複合化させた試験体の耐久性能や力学性状の検討を実験によって行った。実験では,セメントに代わる結合材として高炉スラグ微粉末,フライアッシュおよび脱硫石こうを用い,天然骨材の代わりに高炉スラグ骨材や再生骨材からなる廃棄資源コンクリートを製造した。また,セメント,スチレンアクリル酸エステル系のポリマー混和材,フライアッシュ,標準砂,ビニロン短繊維を用いて厚さ十数mmの永久型枠を製造した。つぎに,永久型枠と廃棄資源コンクリートを複合化させた円柱試験体で凍結融解試験や薬品浸漬試験を行った。また,永久型枠やエポキシ樹脂で砂を接着した竹筋を廃棄資源コンクリートはりに用いた場合の曲げ載荷試験も行った。

実験結果より,廃棄資源コンクリートの耐酸性や耐硫酸塩性は,普通コンクリートと比べて再生骨材使用時に試験体の質量変動が大きくなって問題となるが,永久型枠の使用で改善されること,廃棄資源コンクリートは,普通コンクリートと比べて凍結融解抵抗性が低く,永久型枠の使用による改善効果も低いこと,竹筋廃棄資源コンクリートはりは,砂を接着した竹筋の使用,フライアッシュの砂置換使用を行ったビニロン繊維補強ポリマーセメントモルタル製永久型枠の利用で曲げ性状が向上することなどが確認できた。世界的なコンクリート,鋼材等の生産増により,炭酸ガス,廃棄物等の排出量拡大やそれらの原材料採取時の環境破壊が深刻化し,老朽構造物の解体で生じるコンクリート塊等も増加している。また,わが国では竹の利用衰退によって竹林繁茂や里山荒廃が進んでいる。本研究は,様々な環境対策として,製造時に炭酸ガスを大量放出するセメントや貴重な環境資源である砂や小石を使わず,石炭灰,スラグ,コンクリート塊,生コン工場の洗浄排水,海水等を使った廃棄資源のみからなるコンクリート(以下,廃棄資源コンクリートと略記)の製造法を確立し,成長の早い竹を鉄筋に代わる補強材として用いる新しい環境配慮型構造材料の実用化に向けた検討を行うものである。平成22年度は,セメントに代わり高炉スラグ微粉末,フライアッシュおよび脱硫石こう,天然骨材に代わり高炉スラグ骨材や再生骨材を用い,回収水で製造する廃棄資源コンクリートで問題が判明した耐凍害性や耐化学薬品性の改善のため,ポリマー混和材や高性能減水材を用いたビニロン繊維補強セメントモルタル製の永久型枠と廃棄資源コンクリートの複合効果について,AE剤による空気泡連行効果と併せ,既存ならびに本科研費で準備した装置を用い,本研究機関の卒業研究生とともに実験により検討した。本研究成果として,廃棄資源コンクリートの耐久性で問題となる耐凍害性や耐化学薬品性の改善策として,ポリマー混和材や高性能減水剤を用いたビニロン繊維補強セメントモルタル製の永久埋設型枠の利用が有効であること,廃棄資源コンクリートや永久埋設型枠へのAE剤の使用効果も認められること,液体窒素による凍結融解試験は,窒素ガス吹付け時間に留意を要するが電力をほとんど使わず短時間で耐凍害性を評価できる優れた試験法となること等が確認できた。
触・圧刺激を利用した新式テープ材の鎮痛効果の検討―疼痛ケアへの応用を目指して

前年度までに、新式テープ材が種々の実験的疼痛(電気刺激によるpricking pain、爪根部の圧痛、及び冷水痛)に即時的な痛みを軽減することを明らかにした(成果の1つは2009年9月の日本看護技術学会第8回学術集会大会賞を受賞)。また、このテープ材を捻挫や打撲、筋肉痛など運動器の痛みに試用した結果、大多数の対象にテープ材の貼用直後から鎮痛効果が認められ、剥がすと痛みが再燃した。そこで最終年度は、(1)テープ材の臨床痛への鎮痛効果を痛覚定量装置(Pain Vision、ニプロ社)を用いて検討すること、(2)テープ材の皮膚接着面の性状と鎮痛作用との関係を検討すること、さらに(3)テープ材試用例を増やし、テープ材の臨床痛への適用方法を模索すること、さらに実用化への問題点の整理と適用基準の作成を目的とした。その結果、以下のような暫定的結論を得た。(1)新式テープ材が運動器の痛みを軽滅することを痛覚定量装置で確認することが出来た。(2)テープ材の基本形は直径1.5mmのビーズを5mm間隔に敷き詰めたものであるが、圧迫圧と可動性により優れたガラス球の方が、若干鎮痛効果が大きい傾向があり、鎮痛効果がテープ材粘着部に貼り付けた素材の軽微な可変性皮膚接触圧によることが特定されつつある。(3)テープ材試用は現在までに200余例、痛みの種類は11となり、少なくとも表在痛と深部痛への鎮痛効果はほぼ実証された。これらの結果を踏まえ、さらに、今後も例数を増やしながら無効例を詳細に検討し、その原因追究と改良を行う。現在、この新式テープ材に注目する企業(医療用各種テープ製造販売元、現在までに2社)に実用化に向けた試作品製作を依頼中である。実用化にあたっては、本研究で得たエビデンスを元に作成したテープ材の適用ガイドラインを企業に提案し、痛みのケア用具としての汎用化を目指す。本研究の成果は本年度中に論文発表する予定である。1.健康者における鎮痛効果の検討ビーズテープ材の鎮痛メカニズムを検討するために,(1)テープのみとビーズテープ,(2)ビーズとガラス球,(3)ビーズ分布密度の大小,(4)ビーズテープの貼付面積,それぞれが比較できる実験系で,まず初年度は,ニプロの知覚・痛覚定量分析装置を用いて健康者の痛覚閾値を検討した(痛覚定量分析装置を用いて痛覚・触覚を定量したことは新しい試みである)。その結果,5mm間隔のビーズテープ貼付時,10mm間隔のビーズテープ貼付時,ガラス球テープ貼付時に痛覚閾値の平均値が上昇していた。小さなサンプルサイズのため危険率5%未満の有意差を得るには至らなかったが,最も鎮痛効果が大きい傾向がみられたのはガラス球テープで,痛覚閾値は10%以上上昇していた。また,実験中,皮膚温や心拍数はほとんど変化しなかった。これらの結果から,ビーズやガラス球を用いたテープ式鎮痛剤が中等度の痛みだけでなく,閾値レベルの痛みにも鎮痛効果をもたらす可能性のあることが示された。すなわち,ビーズ又はガラス球による皮膚の触・圧覚刺激が痛覚の上行性経路を抑制したことが推察された。また,テープのみ,ビーズ,ガラス球の順に鎮痛効果が高かったことから,ビーズテープ材の鎮痛効果は皮膚のより有効な触・圧刺激が原因する可能性も示唆された。この成果は日本看護技術学会第7回学術集会(2009年9月,青森市)で発表した。2.痛みのある患者における鎮痛効果の検討痛みをもつ人を対象に,ビーズテープの長期的な効果を5種類の痔痛評価ツールにより検討した。今年度は約100例のデータが集積できた。その成果を平成21年度開催の学会で発表する予定である。平成21年度の研究成果平成21年度は、健康者に実験痛を用いるほか、臨床痛患者を被験者に、実験室内で痛みと痛み反応を定量的に計測する方法を利用しながら、ビーズテープ材の鎮痛効果を検討した。1.実験痛への短時間の効果:(深井)今年度は実験痛として冷水刺激による痛みを使用し、ビーズテープの鎮痛効果を検討した。痛み反応として血圧・心拍数を測定した(B)ほか、痛み自体は5種類のアセスメントツールにより測定・評価した(A1)。その結果、11名の健康学生において、閾値レベル・耐痛レベルともにビーズテープ材に鎮痛効果があることが確認された。(この成果発表は、平成21年9月、第8回日本看護技術学会にて発表、大会賞を受賞した)2)臨床痛への短時間の効果:(深井)部活動で打撲や捻挫などを負った承諾の得られた学生を対象に、痛覚定量分析装置による痛み評価(A2)、A1、Bによって痛み及び痛み反応測定を行った。臨床痛においてもいくつかの対照群を作り、鎮痛メカニズムを探究した。その結果、ビーズテープの効果が実験室内でも定量的に証明された(平成22年度表予定)3)フィールドでの長時間の効果:(深井・佐知)研究者の身近の知人や外来患者で痛みをもつ人を対象に、ビーズテープの長期的な効果を、A1により痛みの測定・評価を、20年度に引き続き行った。その結果、痛みをもつ対象は地域で生活する70名で,延べ151の痛みを体験していた。

その内訳は,突き指・打撲・筋肉痛などの整形外科的痛みが125,次いで切り傷・擦過傷9,頭痛5などであった。これら151の痛みのほとんどがビーズテープによって軽減した。鎮痛効果の出現時間は一様ではなかったが,効果は痛みの種類に無関係であった。また,粘着部分に貼付する素材は扁平なビーズより球形の方がより効果的な傾向がみられた。(平成21年7月、第31回日本疼痛学会にて発表)前年度までに、新式テープ材が種々の実験的疼痛(電気刺激によるpricking pain、爪根部の圧痛、及び冷水痛)に即時的な痛みを軽減することを明らかにした(成果の1つは2009年9月の日本看護技術学会第8回学術集会大会賞を受賞)。また、このテープ材を捻挫や打撲、筋肉痛など運動器の痛みに試用した結果、大多数の対象にテープ材の貼用直後から鎮痛効果が認められ、剥がすと痛みが再燃した。そこで最終年度は、(1)テープ材の臨床痛への鎮痛効果を痛覚定量装置(Pain Vision、ニプロ社)を用いて検討すること、(2)テープ材の皮膚接着面の性状と鎮痛作用との関係を検討すること、さらに(3)テープ材試用例を増やし、テープ材の臨床痛への適用方法を模索すること、さらに実用化への問題点の整理と適用基準の作成を目的とした。その結果、以下のような暫定的結論を得た。(1)新式テープ材が運動器の痛みを軽滅することを痛覚定量装置で確認することが出来た。(2)テープ材の基本形は直径1.5mmのビーズを5mm間隔に敷き詰めたものであるが、圧迫圧と可動性により優れたガラス球の方が、若干鎮痛効果が大きい傾向があり、鎮痛効果がテープ材粘着部に貼り付けた素材の軽微な可変性皮膚接触圧によることが特定されつつある。(3)テープ材試用は現在までに200余例、痛みの種類は11となり、少なくとも表在痛と深部痛への鎮痛効果はほぼ実証された。これらの結果を踏まえ、さらに、今後も例数を増やしながら無効例を詳細に検討し、その原因追究と改良を行う。現在、この新式テープ材に注目する企業(医療用各種テープ製造販売元、現在までに2社)に実用化に向けた試作品製作を依頼中である。実用化にあたっては、本研究で得たエビデンスを元に作成したテープ材の適用ガイドラインを企業に提案し、痛みのケア用具としての汎用化を目指す。本研究の成果は本年度中に論文発表する予定である。
猫免疫不全ウイルス感染症の予防と治療に関する研究

日本全国各地における猫免疫不全ウイルス(FIV)env遺伝子の塩基配列を解析した結果、東日本ではサブタイプBが、西日本ではサブタイプDが主要なサブタイプであり、散発的にサブタイプAおよびCが存在することが明らかとなった。ヒトのHIVにおいて、ウイルスのco-receptorとして同定されているケモカインレセプターのリガンドであるCC-ケモカインおよびCXC-ケモカインについて、猫の遺伝子クローニングを行った。これらケモカインのうち、SDF-1βは、猫のTリンパ球におけるFIVの増殖を濃度依存的に抑制することが明らかとなった。さらに、CXC-ケモカインリプターと結合する物質として同定されたT22についてもFIV増殖抑制効果が確認された。一方、FIVによって誘導されるアポトーシスは免疫不全症の発症に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。そこで、抗酸化剤であるN-アセチルシステインおよびアスコルビン酸をFIVによるアポトーシス誘導系に添加して培養したところ、それらによるアポトーシス抑制効果が認められた。さらに、同様のFIVによるアポトーシス誘導系にIL-12およびIL-10を加えて培養したところ、IL-12はアポトーシスおよびFIV増殖を抑制する効果が確認され、その効果はIFN-γの発現を介していることが明らかとなった。IL-10にはそれら抑制効果は認められなかった。さらに、これらFIV増殖抑制剤およびアポトーシス抑制剤の生体内投与における効果を判定するため、FIV感染猫における血漿中ウイルスRNA量をQC-PCR法によって定量した。その結果、非症候性キャリアー期の猫では10^5コピー/ml以下の低いウイルス量を有する個体が多かったが、エイズ期の猫では10^7コピー/ml以上の高いウイルス量を有する個体が多かった。現在、このFIV感染猫におけるウイルスRNA定量系を用いて、ウイルス動態の解析および抗ウイルス薬の治療効果の判定を行っている。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)の日本分離株のうち、サブタイプA,B,C,Dの各1株のenv遺伝子を発現ブラスミドベクターに組み込み、大腸菌での蛋白の発現を行った。これらFIV Env蛋白は、感染ネコ血清によって認識され、FIVワクチンの基盤材料として利用できることが示された。FIVの増殖を阻害する薬剤を選定するため、シクロスポリン、タクロリムス、プロテアーゼ阻害剤(MK-639)についてFIV感染リンパ系細胞を用いて検討したところ、FIV増殖阻害効果はシクロスポリンおよびタクロリムスに認められ、MK-639には認められなかった。つぎにケモカインによるFIV増殖抑制効果を検討したところ、ネコのリンパ系細胞を用いた系では、FIV増殖抑制効果は、β-ケモカイン(MIP-1α,MIP-1β,RANTES)には存在せず、α-ケモカイン(SDF-1β)に存在することが明らかとなった。また、サイトカインのIL-10およびIL-12についても同様の検討を行った結果、FIV増殖抑制効果はIL-10には認められなかったが、IL-12の添加によって用量依存的に認められた。このことから、FIV増殖抑制剤として、シクロスポリン、タクロリムス、SDF-1βおよびIL-12が有望と考えられ、今後これらを感染ネコに臨床応用できるよう検討する予定である。また、FIV感染によるアポトーシスを抑制する薬剤を選定するため、抗酸化剤について検討したところ、N-アセチルシステインおよびアスコルビン酸にアポトーシス抑制効果があることが見いだされ、これら抗酸化剤によってFIV感染症における免疫不全症の進行を抑制できる可能性があることが示された。日本全国各地における猫免疫不全ウイルス(FIV)env

遺伝子の塩基配列を解析した結果、東日本ではサブタイプBが、西日本ではサブタイプDが主要なサブタイプであり、散発的にサブタイプAおよびCが存在することが明らかとなった。ヒトのHIVにおいて、ウイルスのco-receptorとして同定されているケモカインレセプターのリガンドであるCC-ケモカインおよびCXC-ケモカインについて、猫の遺伝子クローニングを行った。これらケモカインのうち、SDF-1βは、猫のTリンバ球におけるFIVの増殖を濃度依存的に抑制することが明らかとなった。さらに、CXC-ケモカインリプターと結合する物質として同定されたT22についてもFIV増殖抑制効果が確認された。一方、FIVによって誘導されるアポトーシスは免疫不全症の発症に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。そこで、抗酸化剤であるN-アセチルシステインおよびアスコルビン酸をFIVによるアポトーシス誘導系に添加して培養したところ、それらによるアポトーシス抑制効果が認められた。さらに、同様のFIVによるアポトーシス誘導系にIL-12およびIL-10を加えて培養したところ、IL-12はアポトーシスおよびFIV増殖を抑制する効果が確認され、その効果はIFN-γの発現を介していることが明らかとなった。IL-10にはそれら抑制効果は認められなかった。さらに、これらFIV増殖抑制剤およびアポトーシス抑制剤の生体内投与における効果を判定するため、FIV感染猫における血漿中ウイルスRNA量をQC-PCR法によって定量した。その結果、非症候性キャリアー期の猫では10^5コピー/ml以下の低いウイルス量を有する個体が多かったが、エイズ期の猫では10^7コピー/ml以上の高いウイルス量を有する個体が多かった。現在、このFIV感染猫におけるウイルスRNA定量系を用いて、ウイルス動態の解析および抗ウイルス薬の治療効果の判定を行っている。
ラベル付けアルゴリズムに基づく句構造研究

本研究では、Chomsky (2013, 2014)のラベル付けアルゴリズム(LA)の観点から、英語と日本語の句構造を観察し、これまで様々な条件を措定することによって説明されて来た言語現象に対して、LAの観点から統一的な説明を与えることを目的とした。その際、生成文法理論の最新の枠組みであるミニマリスト・プログラムを採用し、LAはどのように行われるのかという問題と、LAはそもそもなぜ必要なのかという問題を実証的に検証することによって目的の達成を目指した。研究成果として、LAはSpell-Outを介して決定可能であるということと、LAは探査を最小化するために必要であるということが明らかになった。本研究は、英語と日本語の句構造を観察し、これまでさまざまな条件を措定することによって説明されて来た言語現象に対して、Chomsky (2013, 2015)の「ラベル付けアルゴリズム」の観点から統一的な説明を与えることを目的としている。特に、「ラベル付けはどのように行われるのか?」というメカニズムの問題と「ラベル付けはそもそもなぜ必要なのか?」という理論的根拠の問題を実証的に検証することによって目的の達成を目指している。平成27年度は、この2つの問に対してそれぞれ、ミニマリスト・プログラムのから「XP-YP構造はSpell-Outの適用によりラベル付けられるようになる」という提案と「ラベルはMergeのinputとなるnの値を決定する際に関与するsearchの領域を最小化する為に必要である」という提案を行い、そこから得られた研究成果はそれぞれ[1]と[2]の業績として纏めることができた。現在までの進捗状況としては「当初の計画以上に進展している」と言える。その理由としては、本研究の成果として「XP-YP構造は主要部移動によりラベル付け可能になる」という新たな着想が生まれ、論文の形として纏めることができ、現在、国際学術雑誌に投稿中であるからである。この新たな着想により、Chomsky (2015)が提案した「Tの強さ」に関する措定的媒介変数(strong/weak paramter on T)が排除できる可能性が得られ、最適な言語デザインを設計する上で非常に重要な視点になりつつある。また、「XP-YP構造は主要部移動によりラベル付け可能になる」という主張は「主要部移動の適用を受けたXP-YP構造からの摘出は許される」という新たな予測をももたらしている。XP-YP構造は、主要部移動によりXP-t構造のラベル付け可能な構造、すなわち、searchにとって接近可能な領域になるため(上記[2]参照)、その中からの摘出は許されると予測されるのである。この予測は、当初の研究計画を越えたものであり、現在、「主語摘出現象」と「指定的効果現象」を中心に予測の検証を行っている。本研究は、ChomskyのLabeling Algorithm (LA)理論の観点から英語と日本語の句構造を観察し、これまで様々な条件を措定することによって説明されて来た言語現象に対してLAの観点から統一的な説明を与えることを目的とした。その際、生成文法理論の最新の枠組みであるミニマリスト・プログラムを採用し、LAが行われていると考えられている統語演算システムに焦点を当て、ラベル付けはどのように行われるのかという問題と、ラベル付けはそもそもなぜ必要なのかという問題を実証的に検証することによって目的の達成を目指した。平成28年度は、[1]の仮説を提案し、後者の問題を検証した。[1]ラベル付けは探査の適用を最小化するために必要であり、探査はラベル付けられない構造の深部にはアクセスしない。上記の仮説の観点から英語と日本語の間で観察される主語の抜き出し効果に対して統一的な説明を与え、LA理論に基づく新たなパラメータ変異の研究を提示した。その成果は、Proceedings of GLOW in Asia XIや日本英文学会支部統合号に論文として掲載された。研究期間全体を通じて実施した研究の成果は、The Linguistic Review、NELS, GLOW in Asia,日本言語学会、日本英語学会、等の国内外の学会及び学術誌で発表され、一定の成果を得ることができた。LA理論に基づくパラメータ変異の研究は、世界的に見てまだ殆ど行われていないため、本研究はその新たな可能性・方向性を示唆する先駆的な取り組みとなった。本研究を通して自由併合の適用可能性とレキシコン形成に関する新たな知見も得られたので、今後これらの点をさらに明らかにしながら、LA理論に基づくパラメータ変異の研究を引き続き行っていく。今後の研究の推進方策としては、「XP-YP構造は主要部移動によりラベル付け可能になる」という視点をさらに実証的に検証し、ラベル理論における主要部移動の働きについて深く考察していく予定である。

特に、主要部移動がある言語とない言語では「EPP効果」に対して「主要部移動がない言語(英語)では、EPPはXP移動により満たされるが、主要部移動がある言語(イタリア語)では、EPPはX移動により満たされる」という予測が得られたため、今後の研究課題として[3]の目標を掲げる。[3]顕在的wh移動言語(英語)と非顕在的wh移動言語(日本語)のパラメータ的違いをどのようにしてラベル理論のもとで捉えることができるか?この課題に対して、現在考えてる方向性としては、可視的な疑問詞マーカー「か・の」の有無が重要な働きをしているのではないかと考えている。今年度1年間の研究を通して、その本質を明らかにし、当初計画していた以上の成果をラベル理論に対してもたらしたいと考えている。理論言語学(統語論)予定していた国際学会(GLWO in Europe)が1つ不採択になったため。今年度開催される国際学会(未定)に応募予定。
骨粗鬆症に対するテーラーメイド予防策立案のための大規模遺伝子解析研究

1996年に実施された全国7地区の1579歳の女性住民を対象とした約4,500人の大規模な無作為抽出標本調査(骨粗鬆症予防のための疫学調査:JPOS study)および、1999年と2002年に3地区で行われた約1500人の追跡調査のデータベースを使用した。データには腰椎、大腿骨、橈尺骨の骨密度、踵骨の超音波骨強度、体格、筋力、運動習慣、労働強度、飲酒、喫煙、第二次性徴、月経・妊娠・出産や婦人科疾患および骨折の既往歴、食事習慣、カルシウム摂取量、血液および尿中の骨代謝指標が含まれている。なお、データの使用や遺伝子解析については対象者の文書による承諾を得るとともに、近畿大学医学部倫理委員会の審査を受け、個人情報保護に万全を期している。1、追跡調査を行った3地区の対象者のゲノムDNAを用い、PCR-RFLP法や対立遺伝子識別アッセイ法によって、VDR(4カ所)、TGF-β(2カ所)、Osteocalcin、MTHFR、CYP19(2カ所)、CYP1A1(2カ所)、およびCOMT遺伝子の多型を同定した。ほとんどの遺伝子頻度は、先行研究と有意差はなかった。現在、PPARγ、Alox遺伝子などの多型を検索するとともに、骨形成促進条件の基礎的検討を行い、GDF-5などの塩基配列との関連を見ている。2、VDR遺伝子の多型について、単独では骨密度への影響は小さかったが牛乳摂取など生活習慣との相互作用が見られた事を、学会誌に発表した。TGF-β,Osteocalcin,CYP19,CYP1A1,COMT遺伝子多型はそれぞれ単独では、骨密度と有意な関連を認めなかった。生活習慣の解析から、納豆摂取頻度が閉経者の骨量変化率に関係することがわかり、CYP1A1およびCOMT遺伝子で納豆摂取との骨密度への相互作用が見られた。また、CYP19遺伝子型により骨粗鬆症有病率に有意な差があった。1996年に実施された全国7地区の1579歳の女性住民を対象とした約4,500人の大規模な無作為抽出標本調査(骨粗鬆症予防のための疫学調査:JPOS study)および、1999年と2002年に3地区で行われた約1500人の追跡調査のデータベースを使用する。データには腰椎、大腿骨および橈尺骨の骨密度、踵骨の超音波骨強度、体格、筋力、運動習慣、労働強度、飲酒、喫煙、第二次性徴、月経・妊娠・出産や婦人科疾患および骨折の既往歴、食事習慣、カルシウム摂取量、血液および尿中の骨代謝指標が含まれている。1、遺伝子多型は、追跡調査を行った3地区の対象者のゲノムDNAを用い、PCR-RFLP法および対立遺伝子識別アッセイ法で同定した。現在までに、VDR遺伝子4カ所、TGF-β遺伝子2カ所、Osteocalcin遺伝子1カ所の多型の同定が終了した。それぞれの遺伝子頻度は、先行研究と有意差はなかった。現在、MTHFR遺伝子、CYP19遺伝子の多型を同定中であり、NPY遺伝子、Alox遺伝子の多型の同定方法を検索している。

2、遺伝子多型と骨密度との関連については、VDR遺伝子のFokI,ApaI,TaqIの3カ所の多型は、単独でも組み合わせた遺伝子型でも骨密度やその変化との関連はほとんど無いことを示し、学会誌に発表した。Promotor部位の多型については、単独では骨密度やその変化への影響は小さかったが、牛乳摂取など生活習慣との相互作用が見られ、現在論文を投稿中である。超音波骨強度については、年齢別平均値などの基本解析が終了したので、今後遺伝子多型との関連を分析していく。TGF-β遺伝子、Osteocalcin遺伝子との関連については解析中である。1996年に実施された全国7地区の1579歳の女性を対象とした約4,500人の大規模な無作為抽出標本調査(骨粗鬆症予防のための疫学調査:JPOS study)および、1999年と2002年に3地区で行われた約1500人の追跡調査のデータベースを使用した。データには腰椎、大腿骨および橈尺骨の骨密度、踵骨の超音波骨強度、体格、筋力、運動習慣、労働強度、飲酒、喫煙、第二次性徴、月経・妊娠・出産や婦人科疾患および骨折の既往歴、食事習慣、カルシウム摂取量、血液・尿中の骨代謝指標が含まれている。なお、データの使用や遺伝子解析については対象者の文書による承諾を得るとともに、近畿大学医学部倫理委員会の審査を受け、個人情報保護に万全を期している。1、遺伝子多型は、追跡調査を行った3地区の対象者のゲノムDNAを用い、PCR-RFLP法および対立遺伝子識別アッセイ法で同定した。平成17年度は、VDRなどに加え、MTHFR、CYP19(2カ所)、CYP1A1(2カ所)、およびCOMT遺伝子の多型を同定した。ほとんどの遺伝子頻度は、先行研究と有意差はなかった。引き続き、PPARγ、Alox遺伝子などの多型の同定とともに、骨形成促進条件の基礎的検討を行い、GDF-5などの塩基配列との関連を検索中である。2、遺伝子多型と骨密度との関連については、各遺伝子型単独の骨密度への影響は非常に小さかった。VDR遺伝子Promotor部位の多型は、牛乳摂取などとの相互作用が見られ、学会誌に発表した。調査全体の解析から、納豆摂取頻度が閉経者の骨量変化率に関係することがわかり、CYP1A1およびCOMT遺伝子で納豆摂取との骨密度への相互作用が見られた。また、CYP19遺伝子型により骨粗鬆症有病率に有意な差があった。超音波骨強度については基本解析が終了したので、今後遺伝子多型との関連を分析していく。
昆虫の概日羽化リズムにおける温度較差反応を探る

タマネギバエは地下20cmぐらいまでさまざまな深さで蛹化し、温度周期が重要な羽化の同調因子となる。最高温度と最低温度の較差は土中の深さとともに小さくなり最低温度の時間は遅れていくが、どの深さの蛹も早朝に羽化する。すなわち温度較差が小さくなるほど、羽化時刻を前進させている。本研究は以下のことを明らかにした。(1)全暗と比較して全明は時計と温度周期のカプリングを弱くする。(2)概日時計には、高温あるいは低温に反応して羽化時刻を遅らせる位相と早める位相がある。(3)8°C較差と1°C較差でのperiodの発現量は振動しており、羽化と同様に8°C較差よりも1°C較差でより早くピークに達する。タマネギバエは地下220cmで蛹化し、温度変化に同調した概日時計によって早朝に羽化時刻を設定し、温度の日較差が小さいとき羽化時刻を早めることで、土深に伴う温度変化の遅れに対応している。羽化時刻が1日の温度較差によって変わるしくみはどのようなものであろうか?そこで、温度変化のサイクルから25°C一定に移した蛹を、さまざまな時刻で12時間だけ26°Cまたは29°Cの高温、24°Cまたは21°Cの低温へさらし、羽化時刻がどのように変わるかを調べた。結果をもとに位相反応曲線(PRC)を描いたところ、概日時計には、高温に反応して羽化時刻を遅らせる位相と早める位相があり、それらはそれぞれ低温に反応して羽化時刻を早める位相と遅らせる位相でもあることがわかった。自然界の毎日の高温と低温は、羽化時刻が遅れるように時計の位相に当たり、温度変化量が大きいほどより効果的なようである。そのため、結果として1日の温度較差が大きいときよりも小さいときに羽化時刻が早まると考えられた。パルスの強さ(変化量または期間)によってPRCのタイプが変わることが知られている。そこで、2°C較差の正弦波状温度サイクル(最高26°C最低24°C)を与えてから25°Cでフリーランさせ、さまざまな時刻で12時間のパルス(26°Cまたは29°Cの高温、24°Cまたは21°Cの低温、680ルクスの光)を与えた。結果をもとにPRCを描いたところ、26°Cと24°Cのパルスではタイプ1の、29°Cと21°C、そして光パルスではタイプ0のPRCが得られた。次に、フリーラン前の正弦波状温度変化の振幅を20°C(最高35°C最低15°C)とし、フリーラン後12時間のパルス(29°C、21°C、光)を与えた。得られたPRCはタイプ1に分類されるものだった。つまり、2°C較差からフリーランさせた場合はタイプ0の位相反応を引き起こす刺激は、20°C較差からフリーランさせた場合はタイプ1の反応しか引き起こさなかった。タマネギバエは土中のさまざまな深さで蛹になり、地温の変化をもとに早朝に羽化する。土中では深くなるほど温度変化の位相は遅れ、地温の日較差も小さくなるので、タマネギバエは温度の日較差が小さいほど羽化時刻を早めることで、土深に伴う温度変化の遅れを補正している。まず120°Cの較差を持つ矩形波および正弦波状の温度サイクル(平均25°C)の下でタマネギバエの羽化時刻を記録した。矩形波状サイクルでは、較差を1°Cから12°Cまで変えるとそれに伴って羽化時刻は遅れた。12°C較差と16°C較差では差はほとんどなく、20°C較差では羽化は起こらなかった。1°C較差と12°C較差の羽化時刻の差は5.9時間だった。正弦波状サイクルでは、較差を1°Cから20°Cまで変えるとそれに伴って羽化時刻は遅れた。羽化時刻の変化は較差が2°Cから6°Cの範囲で顕著であり、8°C以上でゆるやかであった。1°C較差と20°C較差の羽化時刻の差は6.6時間だった。このように、温度較差に対する羽化時刻設定は量的な反応を示した。最近になって背景の光の有無が温度周期の効果に影響することが明らかになってきた。蛹を異なる光条件(全暗あるいは全明)および温度周期(平均25°C、8°Cあるいは1°C較差)の組み合わせのもとに置いたとき、温度周期は全暗でも全明でも明瞭は羽化リズムを誘導した。しかし、羽化時刻は全明よりも全暗で、大きな温度較差よりも小さな較差で早くなった。

また、羽化のばらつきは、全暗よりも全明で、大きな較差よりも小さな較差で大きくなった。後者については、光条件や温度較差が羽化時計と温度周期のカップリングの強さに影響する可能性が示唆された。蛹の一部を一定温度条件に移して羽化の様子をみたところ、リズムの減衰は小さな温度較差よりも全明において顕著であった。背景の光条件が時計と温度周期のカプリングに及ぼす影響は温度較差よりも有意に大きいことが示唆された。タマネギバエは土中(地下2cm20cm)で蛹になり、どの深さの蛹も早朝に羽化して地上に出る。土中では、深くなればなるほど温度変化の位相は遅れるようになり、また同時に、地温の日較差は小さくなる。つまり、タマネギバエは、地温の日較差が小さいほど羽化を早めることで、深さに伴う温度変化の遅れを補正し、蛹がどの深さにいても早朝に羽化できる(Tanaka and Watari, 2003; Naturwissenschaften 90:76-79)。では、この補正機構が働きかけるのは、羽化を支配する概日時計そのものだろうか。それとも時計より下流に存在する羽化制御機構だろうか。これを明らかにするために、概日時計遺伝子periodの断片をタマネギバエからクローニングし、8°C較差または1°C較差の温度周期(全明)の下でその発現を調べた。全明・12時間29°C12時間21°C(8°C較差)または全明・12時間25.5°C12時間24.5°C(1°C較差)にさなぎを置き、羽化直前1日前に相当する時期に5個体の頭部をサンプリングした。real-timePCRにより発現量(rp49 mRNA発現量に対する割合)を調べ、各条件で比較した。その結果、8°C較差では同調因子時刻(Zt)14で極大,Zt 2で極小となり、1°C較差ではZt 8で極大、Zt 0で極小となった。つまり、8°C較差よりも1°C較差でより早くピークに達した。これらの結果は、温度較差が概日時計の位相設定に影響し、温度較差が小さいほど時計の位相を前進させることを示ししている。すなわち、羽化時刻補正機構は、概日時計に働きかけていることがわかった。しかしながら、そのしくみはまだわかっていない。今後は、温度較差が概日時計の位相設定にどのように影響するのかを明らかにする必要があるだろう。時間生物学本研究の目的は以下の4つである。1タマネギバエの羽化リズムの位相決定における温度レベルと温度較差の相対的重要性を明らかにする。2温度較差が時計遺伝子の発現に及ぼす影響を明らかにする。3タマネギバエの羽化時計における2振動体モデルの検証を行う。4温度較差を測定する時刻補正機構を行う部位を明らかにする。以上の研究目的のうち、1から3の研究を24年度に推進する計画であった。1に関しては研究実績の概要で示した通りである。2に関しては現在進行中であり、26年度には成果が出る予定である。3に関しては、科研費によるNKsystem低温恒温器が26年度中にさらに1台追加されるので、実験を進めていく予定である。本研究の目的は以下の4つである。2に関しては現在進行中であり、25年度には成果が出る予定である。3に関しては、購入予定であったNKsystem
プラスミドＤＮＡ内包ポリイオンコンプレックスミセルの核酸医薬開発に向けた構造制御

遺伝子治療の臨床応用実現のためには、プラスミドDNA (pDNA)を標的細胞に確実に送達し、高効率に治療遺伝子を発現する遺伝子キャリアを開発することが不可欠である。我々は遺伝子キャリアとして、poly(ethylene glycol) (PEG)とpoly(L-lysine) (PLys)とからなるブロック共重合体PEG-PLysが、pDNAと形成するポリプレックスミセル(PM)を開発してきた。特に、PM内部へパッケージングされるpDNAの形態を制御することにより、遺伝子発現効率を向上させることに取り組んできた。前年度までに、PEG-PLysによるpDNA凝縮において、pDNA表層のPEG密度が重要な形態制御因子となっていることを明らかにし、パッケージング形態の制御によって無細胞遺伝子発現系における遺伝子発現効率を大きく向上させた。しかしながら、全身投与型遺伝子キャリアとしてPMを用いるには、未だ血中における不安定性が課題となっている。本年度は、血管内において血液の流れによって生じているせん断応力に着目し、せん断応力下でのPMの構造安定性の観点より、PMの血中滞留性低下の要因を検討した。PMへのせん断応力の負荷は、回転レオメーターを用いて行った。血管内相当のせん断応力を負荷する前後で、PMに結合しているポリマー本数を超遠心を用いた手法により定量したところ、pDNA1分子あたりに結合しているポリマー本数は、せん断応力の負荷によって減少することが確認された。さらに、せん断応力下でのPMのDNA分解酵素耐性をRT-PCRにより評価したところ、せん断応力が無い条件下と比較して、有意に低下することが確認された。以上より、せん断応力によるポリマーの引き剥がしがDNA分解酵素耐性を低下させるという一連の流れが、PMの血中安定性低下のひとつの要因となっていることを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子治療の臨床応用実現のためには、pDNAの体内動態を的確に制御する遺伝子キャリアの開発が必要である。我々は、poly(ethylene glycol) (PEG)とpoly(L-lysine) (PLys)とからなるブロック共重合体PEG-PLysがpDNAと形成するポリイオンコンプレックスミセル(PICミセル)を遺伝子キャリアとして開発してきた。特に、PICミセルの形態の制御が治療効果に与える影響を見出すべく、PICミセル内部へのpDNAパッケージングの構造制御に取り組んできた。前年度までの研究により、PEG-PLysのPEG分子量を12kに固定しPLys重合度を変調することでpDNAへのPEGの会合本数を変化させた場合、PEG会合本数が多いほどrod状構造体、少ないほどglobule状構造体が形成されやすいとの傾向を見出した。これに基づき本年度の研究では、pDNAパッケージングの構造選択におけるPEGの具体的役割について、PEG結合本数の定量的評価により考察を深めた。種々PEG分子量X (X=2k, 12k, 20k, 30k, 42k)、PLys重合度Yからなる一連のPEG-PLys X-Yを用意し、凝縮開始時点のpDNA上におけるPEG密度をPLys重合度とPEG分子量との両方により変調させ、それぞれの場合のpDNAのパッケージング形態を評価した。また、PEG密度について定量的に議論するため、用意した各PEG-PLys全てについてpDNAへの結合本数を定量し、凝縮開始時点のpDNA上のPEG密度を算出した。以上の実験より、隣接PEGが丁度重なり始める密度を境界に、それよりPEGが密な場合はrod状が、逆に重ならず隙間がある場合はglobule状が形成されやすくなることが明らかとなり、まさにPEG密度がPICミセル内部へのpDNAパッケージングの構造制御における支配因子として寄与していることを見出した。前年度までの研究では、種々PEG分子量X (X = 2k, 12k, 20k, 30k, 42k)、PLys重合度Yからなる一連のPEG-PLys X-Y PEG-PLysのPEG分子量とPLys重合度を用いた実験により、凝縮開始時点のpDNA上のPEG密度が高い場合にはrod状構造体、少ない場合にはglobule状構造体が形成されることが明らかとなった。PEG密度の定量的解析からrod状形成とglobule状形成の境界PEG密度が見出され、pDNAのrod状/glouble状の形成率を制御することが可能となった。これに基づき本年度の研究では、パッケージング形態の違いが実際に遺伝子キャリアとしての性能にどのように影響するかについて評価した。本年度に行った評価では、主に無細胞遺伝子発現系を用いた。この系を用いることで、細胞への取り込み効率やエンドソームエスケープ等の因子が除外され、培養細胞系を用いるより直接的に凝縮構造の違いと遺伝子発現との相関を評価可能である。遺伝子発現活性を評価した結果、globule状の形成率が高くなるにつれて遺伝子発現が低くなることが確認され、パッケージング形態と遺伝子発現に一定の相関があることが示された。