hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極微量油切削加工のトライボロジー

延展性の高いアルミ合金切削におけるエステル油剤のすくい面での挙動を独自に開発した新生面摩擦試験機を用いて詳細に調べた.機械的にはスクイーズ作用により表面粗さ程度の厚み以上の油剤は切削に寄与しない可能性が示された.また,油剤の潤滑作用は工具表面温度に大きく影響を受ける.これは油剤の吸着特性における転移温度の存在とよく対応しており,水ミストによる冷却がMQLで効果的であることを示唆している.この転移温度による潤滑性発現の有無から,工具表面温度が高いステンレス鋼の切削では,エステル油剤の潤滑性は発現しないことが予想された.そこで,ステンレス鋼SUS303の断続旋削により微量油加工の効果を工具-被削材熱伝対法で工具刃先温度をモニターしながら調べた.水ミストの付与により工具刃先温度は低下するが,実用切削速度域ではエステル転移温度以下とはならないため,摩擦低下の形で効果は発現しなかった.このことからステンレス等,工具温度が上昇しやすい切削における微量油潤滑は吸着膜潤滑によらない潤滑メカニズムが必要であることが示された.また,硫黄系極圧添加剤を1wt%程度添加した油剤を微量供給した場合,水ミストとの併用により大きな潤滑効果が得られることが分かった.同じ油剤をフラッド供給しても大きな効果が得られなかったことと併せて考えると,高温場で水によるステンレス最表面の酸化が促進され硫化鉄の生成による摩擦低減効果が発現したと考えられる。これらの知見は難削化が進む部品加工の現場における潤滑設計の指針となるものと考えられる.延展性の高いアルミ合金切削におけるエステル油剤のすくい面での挙動を独自に開発した新生面摩擦試験機を用いて詳細に調べた.機械的にはスクイーズ作用により表面粗さ程度の厚み以上の油剤は切削に寄与しない可能性が示された.また,油剤の潤滑作用は工具表面温度に大きく影響を受ける.これは油剤の吸着特性における転移温度の存在とよく対応しており,水ミストによる冷却がMQLで効果的であることを示唆している.この転移温度による潤滑性発現の有無から,工具表面温度が高いステンレス鋼の切削では,エステル油剤の潤滑性は発現しないことが予想された.そこで,ステンレス鋼SUS303の断続旋削により微量油加工の効果を工具-被削材熱伝対法で工具刃先温度をモニターしながら調べた.水ミストの付与により工具刃先温度は低下するが,実用切削速度域ではエステル転移温度以下とはならないため,摩擦低下の形で効果は発現しなかった.このことからステンレス等,工具温度が上昇しやすい切削における微量油潤滑は吸着膜潤滑によらない潤滑メカニズムが必要であることが示された.また,硫黄系極圧添加剤を1wt%程度添加した油剤を微量供給した場合,水ミストとの併用により大きな潤滑効果が得られることが分かった.同じ油剤をフラッド供給しても大きな効果が得られなかったことと併せて考えると,高温場で水によるステンレス最表面の酸化が促進され硫化鉄の生成による摩擦低減効果が発現したと考えられる。これらの知見は難削化が進む部品加工の現場における潤滑設計の指針となるものと考えられる.わずかな正の工具逃げ角を付与したモデル工具を用いてピン状試片を加工することで,いわゆる工具逃げ面に新生面を強く押し付けながら摩擦する形式の摩擦試験機を用いて,微量油剤の効果を確かめるために,スクイズ作用とせん断作用による油剤の工具表面での平均厚さを算出する式を導出した.これにより算出された平均油膜厚さと工具表面粗さの比(油膜パラメータ)をパラメータとして各種油剤の摩擦低減効果を調べた.油膜パラメータが1より大きい領域では油剤による摩擦低減の程度に相違はなく,切削においてでも金属接触の抑止はかなり広い範囲でスクイズ油膜によると考えられる.一方,油膜パラメータが1より小さくなると,油剤粘度が低い場合,無極性油であるパラフィン系鉱油では摩擦低減効果は著しく失われるが,吸着効果の高いエステルでは油膜パラメータが0.1程度まで,摩擦低減効果が持続する.油剤粘度を著しく高くすると,無極性のパラフィン油でも油膜パラメータの小さな領域まで,摩擦低減効果が持続した.このことから,油剤が極微量となり表面粗さに対して平均油膜が薄くなると,表面近傍の実効粘度が高いことが,工具と被削材の接触部において油剤が存在できる要件のひとつであることが示された.上記の表面近傍での実効粘度を確かめるため油中でのAFM探針によるスクイズ試験を行った.この結果から,パラフィン油とエステルでは金属表面近傍での実効粘度が著しくことなり,流動しにくい吸着層の厚みが1桁近く違うことが示された.これら摩擦試験の結果が温度上昇が生じる実切削で検証するため,アルミ合金6063の断続旋削を行った.エステルでは予想通り,初期に摩擦が小さく漸増傾向を示した.また,エステルおよび高粘度鉱油では切削後半以降の凝着が抑止しされ摩擦の急激な増加を防いでだ.延展性の高いアルミ合金切削におけるエステル油剤のすくい面での挙動を独自に開発した新生面摩擦試験機を用いて詳細に調べた。機械的にはスクイーズ作用により表面粗さ程度の厚み以上の油剤は切削に寄与しない可能性が示された。また,油剤の潤滑作用は工具表面温度に大きく影響を受ける。これは油剤の吸着特性における転移温度の存在とよく対応しており,水ミストによる冷却がMQLで効果的であることを示唆している。

この転移温度による潤滑性発現の有無から,工具表面温度が高いステンレス鋼の切削では,エステル油剤の潤滑性は発現しないことが予想された。そこで,ステンレス鋼SUS303の断続旋削により微量油加工の効果を工具-被削材熱伝対法で工具刃先温度をモニターしながら調べた。水ミストの付与により工具刃先温度は低下するが,実用切削速度域ではエステル転移温度以下とはならないため,摩擦低下の形で効果は発現しなかった。このことからステンレス等,工具温度が上昇しやすい切削における微量油潤滑は吸着膜潤滑によらない潤滑メカニズムが必要であることが示された。また,硫黄系極圧添加剤を1wt%程度添加した油剤を微量供給した場合,水ミストとの併用により大きな潤滑効果が得られることが分かった。同じ油剤をフラッド供給しても大きな効果が得られなかったことと併せて考えると,高温場で水によるステンレス最表面の酸化が促進され硫化鉄の生成による摩擦低減効果が発現したと考えられる。これらの知見は難削化が進む部品加工の現場における潤滑設計の指針となるものと考えられる。
市民性と専門性の往還能力を鍛える高度教養教育の国際比較研究：医学教育における展開

本研究は、専門性と市民性を往還する能力を育むことを企図した高度教養教育の開発と効果的な実践について、主に国際比較分析を通じて考究することを目的とする。得られた知見に基づき、多彩な専門教育のコンテクストで援用可能な高度教養教育モデルを提案する。その教育の浸透を通じて、将来の各専門家が、それぞれの専門に閉じることなく、自身の専門性の社会的位置づけに理解を深め、他分野との協働能力を高め、より効果的に社会へ貢献していく総合的な力を身につけることにつながることが期待される。
ポリオウイルスの体内動態と宿主機能

ポリオウイルス(PV)感受性トランスジェニック(Tg)マウスを用い、PVの体内動態を解析した。主な研究項目は、Tgマウスへの経口感染について、PVの血液脳関門(BBB)透過機構について、骨格筋から中枢に至る逆行性軸索輸送機構について、神経細胞のPV抵抗性についてなどである。その結果、BBB透過には、宿主のトランスフェリン受容体を利用していること、逆行性軸索輸送には、PV受容体依存的な機構と非依存的な機構があることなどを見いだした。ポリオウイルス(PV)の体内動態に関する多くの事柄の内、腸管での増殖機構、中枢神経系への伝播機構、神経細胞への病原性発現機構に焦点を絞り、感染過程進行にとって、作用する宿主機能の解析を進め、宿主内におけるウイルスの感染現象の基本を理解する。ポリオウイルス(PV)感受性トランスジェニック(Tg)マウスを使用しても、PVの経口感染は成立しない。考えられる二点について、改良を加えることで感染が成立するマウス感染モデルの作出に成功した。一点目は、胃の強い酸性領域におけるPVの失活である。pHが1に近い環境では、非常に速い速度でPVは失活することが明らかとなった。これまでエンテロウイルスは酸性に抵抗性であるとの考えがあり、見逃されていた事実である。そこで、PVを経口投与する際に、3%炭酸水素ナトリウム溶液を使用した。その結果、腸管に達するウイルス量は飛躍的に増加することが明らかとなった。二点目は、腸管における自然免疫の強さである。多くの自然免疫系が関与していることが考えられるが、今回はI型インターフェロン(IFN)系の影響をなくすため、I型IFN受容体KOマウスを使用した。以上の二点の改良により、経口投与したPVにより、マウスはウイルス血症を引き起こし、さらにマヒを発症して死に至ることが判明した。世界に先駆け、ポリオのマウス経口感染モデルの作製に成功した。血中から血液脳関門を透過して中枢神経系に侵入するメカニズムの検討を行った。昨年までに、トランスフェリンによりPVの血液脳関門透過が阻害されることを見出していたので、今年度は、in vitroにおける、PVとトランスフェリン受容体との結合を検討したが、結合するという結果は得られなかった。今後は、in vivoで鉄などによる阻害を検討するつもりである。神経の細胞体部分と軸索部分の分離培養は、培養器具作製から進めており、作製に関し、企業との共同研究が進行している。一回のPV感染に抵抗性を示す神経細胞は、PVの2Aプロテアーゼに対し抵抗性であることが判明した。神経細胞もPVの複数回感染に対しては、細胞変性効果を示すので、その原因を追究したところ、P1キャプシド蛋白質が影響していることを示唆する結果を得た。ポリオウイルスのキャプシド蛋白質の前駆体であるP1蛋白質領域をワクシニアウイルスバクターを使用し,発現させたところ,神経細胞は細胞変性効果(CPE)を示した。神経細胞はP1蛋白質の連続発現によりCPEを呈することが示唆された。プロテオミクス解析に使用する二次元ゲル電気泳動装置の欠点を直すとの名目でメーカーによる改造が行われ,重要な実験が阻害されたため,サンプル調製等の条件検討を行うと同時に,神経細胞内に産生されると考えられるポリオウイルスIRESの阻害物質がトランスに働くかを検討した。すなわち,アデノウイルスベクターで発現させたジシストロニックmRNA(第2シストロンがポリオウイルスIRESで発現)からの蛋白質の翻訳効率の変化をポリオウイルス感染の有無で検討した。その結果,この物質はトランスに働くことが明らかとなった。2Aプロテアーゼコーディング領域を欠損させたRNAをゲノムとして持っポリオウイルスも複製活性を有していた。すなわち,P1蛋白質コーディング領域とP2蛋白質コーディング領域の間にEMCVのIRESを挿入し,ゲノムをジシストロニックとした上で,ゲノムの2Aプロテアーゼ領域を欠損させたRNAゲノムを細胞にトランスフェクションし,ウイルス粒子を得た。そのウイルス粒子を神経細胞に感染させたが,その複製効率は低く,P1領域の細胞毒性観察は困難であった。カニクイザルへのポリオウイルスの経口投与実験を行い,ポリオウイルス感受性を示す条件を見付けた。経口感染モデルとなる可能性がある。神経細胞はポリオウイルス(PV)の2Aプロテアーゼではなく、キャブシド蛋白質により細胞変性効果を現すということを、ワクシニアウイルス発現ベクターを用いて示したが、プラスミドによるキャブシド蛋白質発現でも証明する方針であった。しかし、プラスミドによる発現では、同じ結果が得られなかった。発現量の不足のためと考えている。BBB透過に関する研究では、トランスフェリンとPVが競合すること、また両者がマウス脳血管内皮細胞内の同一のエンドソームに取り込まれ得ることが判明し、再びPVとトランスフェリン受容体との結合実験を条件検討しながら行った。その結果、両者は直接に結合することが明らかとなった。さらにトランスフェリン受容体上のPV結合に関するペプチド領域を同定した。

現在、PVの粒子表面のトランスフェリン受容体結合に関与するペプチド領域を探索中である。PVの逆行性軸索輸送に関してはここれまでに、ダイニン複合体による速い輸送系が使われていることを示していたが、本年度の研究により、遅い輸送系も存在すること、さらにヒトPV受容体を必要としない逆行性輸送系が存在することも証明した。また、逆行性輸送が終了した後、神経細胞体においてPVの複製が開始される機構を研究するために開発していた神経細胞の分離培養のシステムの構築に成功した。ポリオウイルスの中枢神経系への侵入経路は2つ知られている。一つは血液脳関門透過経路であり、もう一つは逆行性軸索輸送経路である。今年度は、この2つの体内伝播経路を解析したが、特に前者に関する研究に重点をおいた。昨年度までに、ポリオウイルスの血液脳関門透過(血管内皮細胞のトランスサイトーシス)には、トランスフェリン受容体が関与していることを示すことが出来た。今年度は、この知見を確実なものとするために、トランスフェリン受容体上のウイルス粒子表面と相互作用するペプチド部分を同定する実験を行った。すなわち、トランスフェリン受容体の各ペプチド部分とポリオウイルス粒子との直接結合を免疫沈降法を用いて検討した。その結果、トランスフェリン受容体のアピカルドメインに存在する9アミノ酸を同定することが出来た。次に、その9アミノ酸からなるペプチドに結合するポリオウイルス粒子表面のペプチドについて検討した。現在までに、その候補部位を同定することに成功し、さらに詳細な実験により、ペプチド部位を同定するつもりである。後者については、プライマリー運動神経培養を使用したin vitro系とマウスを使用したin vivo系では、ウイルスの細胞内への取り込みメカニズムに根本的な違いがあることが明らかとなった。すなわち、in vitro系では、ポリオウイルス受容体(PVR)が存在しないと、ポリオウイルスの運動神経軸索への取り込みは観察されないが、in vivo系では、骨格筋に接種したポリオウイルスはPVRを持たない普通のマウスの軸索へも取り込まれることが明らかとなった。ポリオウイルスの中枢神経系への侵入経路は二つ知られている。一つは血流からの血液脳関門透過であり、もう一つは骨格筋からの逆行性軸索輸送経路である。平成22年度は、新たな研究環境でウイルス研究室を立ち上げたため、実際にウイルスを使えるようになるまでの時間が掛かった。そのため、ウイルスを使う必要のない研究を行った。これまでに、ポリオウイルスの血液脳関門透過に働く宿主側分子は、トランスフェリン受容体であり、その受容体上の9アミノ酸からなるペプチドがポリオウイルスが結合するために働いていることを明らかにしていた。そこで今年度は、ポリオウイルス粒子表面のどのペプチド部位がトランスフェリンとの結合に必要かを検討した。ポリオウイルス粒子の表面に存在する種々なペプチド部位にMBP(maltose binding protein)を付加し、トランスフェリン受容体上の9アミノ酸と効率良く結合するペプチドを免疫沈降法で探索した。
オートファジーが関与する抗がん剤耐性獲得過程の数理モデル解析

本研究計画では、オートファジー関連分子の活性化バランスが生み出す細胞死・耐性獲得の運命選択を数理モデルにより解析することで、抗がん剤耐性獲得機構における細胞選択の原理・特徴の理解を目指す。平成31年度/令和元年度は、がん細胞の抗がん剤に対する短期的な応答の数理モデル構築を行い、細胞死・生存の表現型に大きく寄与する反応を推定する。令和2年度は、前年度作成したモデルを元に抗がん剤長期投与による耐性獲得の数理モデル構築を行い、耐性獲得に大きく寄与する反応を推定する。最後に得られた推定結果を実験的に検証し、抗がん剤耐性獲得過程における新規生物学的知見を見出す。
Total Lymphoid Irradiationによる腎移植免疫応答の調節

平成元年度は腎移植片に対して免疫寛容を導入する目的で組織不適合間の雌雄の異なるbeagle犬を用いて術前全リンパ組織照射(FLI)、腎移植時の腎donorからの骨髄移植(BMT)、さらに術後にFK506の小量投与の3者併用法を用いて検索した。(1)FLIは150rad/日、10日間計1500rad、BMTはPHA無反応BMC、平均2×10^7/kg、FKは0.08mg/kg/日90日間投与法である。(2)この3者併用(I群)により骨髄donorからの腎移植片(KG)はFK中止後も生着し続ける症例があった(3/6例)。一方BMTを併用しないFLIをFKの併用(II群)では腎は生着延長するがFKを中止すると腎は約220週の間に全例拒絶された。(3)I群でFK中止後約30日後に2次的に皮膚移植を行ったところ、2/3例において骨髄・腎donorからのSGは約2週間以内に拒絶された。またII群ではFK中止後、腎は拒絶されるが同様に移植した腎donorからのSGは2/4例が生着し続けた。(4)I、II群のSGについて約200日後にSG内のIa陽性細胞の有無およびその由来について抗Iamonoclonal抗体(ISCR3)、lymphocytotoxic抗体(Host抗Donor)、(Donor抗Host)を用いてdouble labelling Immunofluorescenceを行った。その結果I群のSGに存在するIa陽性細胞はdonor由来であり、一方II群のSGのIa陽性細胞はrecipient由来の細胞で置換されていることが判明した。この所見はtolerantSGを再び各々のdonorへ戻し移植を行うとI群では全て生着し、II群では全て拒絶されることから確認できた。(5)I群のrecipientの未血や骨髄の性染色体分析によるchimeraの検索では陰性であったが、microchimerism成立の可能性は否定できない。(6)リンパ球混合培養抑制試験ではtolerantのrecipientの血清中に術前のrecipientのリンパ球に対するdonorの反応をのみ抑制する抗体が出現し持続する傾向がみられた。(7)本法はazathioprineやcyeloaporinとの併用でみられた骨髄抑制や肝障害などの副作用がほとんどなく、安全な方法で臨床応用に向けてさらに検討中である。2.本年度はとくにFLI,腎移植時の腎donorからのBMT,術後CYAの3著併用群について免疫学的モニタリングを行なったが,免疫抑制剤投与中止後も生蓄し続ける症例では,術前redipfentのリンパ球に対するdonorの反応をのみ抑制する抗idiotypic様抗体が術後12ヶ月間で発現することが判明した.また二次リンパ球混合培養抑制法の結果から抗原特異的抑制性細胞が検出された.一方,腎移植時にBMTを行わないFLIとCYAの群でも長期生着例が存在したが,この群には前述のような特異的抗体やdonor特異的抑制細胞の発現は認められず,真のdonor特異免疫不応性にはBMTが重要で役割を果していることが推測された.3.術後の免疫抑制剤として新しく開発されたFK506, 90日間筋注投与法を検討した.FK506, 0.94mg/kg/日では,単独投与, FLIとの併用さらにBMTを加えた3著併用では生着延長は全く得られなかったが, FK506の投与量を2倍に, 0.08mg/kg/日に増加させたところ, 3著併用群では生着延長効果が顕著で,骨髄障害,肝障害などの副作用はCYAよりも軽度のようであり,投与を90日間で中止後も生着し続ける症例も得られた.現在,症例を重ねてFK506の併用効果およびFK506使用例の各種臓器の組織学的検索を行なっている.(1) 63年度はbeagle成犬を用い術前fractionated lymphoid irradiation(FLI)150rad/日、10日間、腎移植時の腎donorよりの骨髄移入(BMT)、さらに術後に新たにFK506の小量投与(0.08mg/kg/日、90日間筋注)の3者併用を用いたが、腎移植片の長期の生着を再現性よく得ることができた。FKの本実験の投与量ではAZAやCyAに比し骨髄障害や肝障害が殆んどみられなかった。しかし安全性を高めるにはCyAと同様に血中濃度をtroughlevelで約0.2ng/mlに調整する必要があった。(2) FK使用群で注目すべき点は、AZAやCYAでみられなかったFLIとFKのみによる安定した(>90日)腎生着延長効果である。しかし約半数(6例中3例)は90日目でFKを中止後2ー3週目で拒絶されているがさらに検索中である。(3) FLIと腎移植時のBMT、術後90日間のFK投与(I群)とBMTを施行しないFLIとFKのみの群(II群)の免疫学的検索を行なった。まずI群においてFK投与を中止しても腎移植片が生着し続ける症例において、118日目に骨髄、腎のdonorおよび固定の第3者個体からの皮膚移植を何ら免疫抑制法を用いずに行ったところ、前者は生着し後者は7日で拒絶された。さらに生着した移植片(tolerant skin)をdonorに194日目に戻し再移植したところ、この移植片も生着し続けている。

またtolerant skinをrecipientの片側の耳介にautologouslyに移植したところ生着し続けている。一方FLIとFKの併用群(II群)の2例についてみると腎donorよりの皮膚移植を63日目と117日目に行なったがそれぞれ23、21日目で拒絶された。固定の第3者からの皮膚移植片は13。7日目で拒絶された。II群において90日以降FKを中止後も生着する症例について皮膚移植実験を追加中である。二次的に移植された皮膚移植片が生着するか否かが腎移植の生着とどのように関わるのか、さらに骨髄移植を腎移植時に併用したことが皮膚移植片の生着をdonor特異的に左右するのか、さらに症例を増やしてこの免疫不応答性についてin vivo、in vitroのmonitoringを行なう計画である。平成元年度は腎移植片に対して免疫寛容を導入する目的で組織不適合間の雌雄の異なるbeagle犬を用いて術前全リンパ組織照射(FLI)、腎移植時の腎donorからの骨髄移植(BMT)、さらに術後にFK506の小量投与の3者併用法を用いて検索した。(1)FLIは150rad/日、10日間計1500rad、BMTはPHA無反応BMC、平均2×10^7/kg、FKは0.08mg/kg/日90日間投与法である。(2)この3者併用(I群)により骨髄donorからの腎移植片(KG)はFK中止後も生着し続ける症例があった(3/6例)。一方BMTを併用しないFLIをFKの併用(II群)では腎は生着延長するがFKを中止すると腎は約220週の間に全例拒絶された。(3)I群でFK中止後約30日後に2次的に皮膚移植を行ったところ、2/3例において骨髄・腎donorからのSGは約2週間以内に拒絶された。またII群ではFK中止後、腎は拒絶されるが同様に移植した腎donorからのSGは2/4例が生着し続けた。(4)I、II群のSGについて約200日後にSG内のIa陽性細胞の有無およびその由来について抗Iamonoclonal抗体(ISCR3)、lymphocytotoxic抗体(Host抗Donor)、(Donor抗Host)を用いてdouble labelling Immunofluorescenceを行った。その結果I群のSGに存在するIa陽性細胞はdonor由来であり、一方II群のSGのIa陽性細胞はrecipient由来の細胞で置換されていることが判明した。この所見はtolerantSGを再び各々のdonorへ戻し移植を行うとI群では全て生着し、II群では全て拒絶されることから確認できた。(5)I群のrecipientの未血や骨髄の性染色体分析によるchimeraの検索では陰性であったが、microchimerism成立の可能性は否定できない。(6)リンパ球混合培養抑制試験ではtolerantのrecipientの血清中に術前のrecipientのリンパ球に対するdonorの反応をのみ抑制する抗体が出現し持続する傾向がみられた。(7)本法はazathioprineやcyeloaporinとの併用でみられた骨髄抑制や肝障害などの副作用がほとんどなく、安全な方法で臨床応用に向けてさらに検討中である。
がん微小環境における間質細胞・間葉系幹細胞による免疫抑制機構の解明と克服法の開発

本研究では、がん微小環境における間葉系幹細胞(MSC)の免疫学的役割を解析した。骨髄由来のMSCはがん局所に遊走し、がん細胞の増殖を増長させている可能性がマウスモデルを用いて示された。ヒトMSCはIL6,VEGFなどの免疫抑制分子を産生し、樹状細胞を抑制して免疫抑制を誘導している事も分かった。以上より、担癌生体では骨髄由来のMSCががん局所で免疫抑制を誘導している事、MSCが治療ターゲットとなりうることが示唆された。本研究の目的は、がん組織の間質細胞、特に骨髄由来の間葉系幹細胞(MSC)が各種免疫細胞に対して及ぼす作用、また、がん細胞・免疫細胞・間質細胞の三者の相互作用を検討し、がん微小環境における免疫抑制の分子機構を解明する事、さらに間質細胞を標的とした免疫抑制の解除法を追究する事である。平成21年度は、がん微小環境中のMSCを解析するための良いマウスモデル構築を試みた。GFPマウスの骨髄をコラゲナーゼ処理しMSCをより多く回収した状態で野生型マウスに移植し、骨髄由来のMSC及び血球がGFPで標識されているマウスを作製した。このマウスに悪性黒色腫、肉腫、大腸癌など各種マウスの癌細胞株を皮下移植し、腫瘍が増大した時点で組織中のGFP陽性かつMSCマーカー陽性(PDGFRa,Sca1)細胞の割合をFACSにて測定した。その結果、大腸癌細胞株で腫瘍移植後2週間で最も多くの骨髄由来MSCが腫瘍中に遊走し、よいマウスモデルとなりうることが判明した。今後、この細胞株を用いて腫瘍中MSCを分離し機能解析を行う予定である。本年度は更に、ヒト腫瘍細胞が線維芽細胞に与える影響もin vitroにて評価した。ヒト膵臓癌細胞株の培養上清を含む培地でヒト線維芽細胞を培養し、線維芽細胞の産生する各種免疫抑制分子の発現変化を定量PCR法にて測定した。その結果、免疫抑制性サイトカインであるTGF-ssなどが上昇しており、がん微小環境下では線維芽細胞はより多くの免疫抑制分子を産生し腫瘍免疫逃避に関与している可能性が示唆された。更にこのin vitro実験モデルを用いてヒトMSCが腫瘍存在下でどのような変化を起こすかを解析する予定である。以上のように平成21年度の研究では腫瘍中のMSCの性質を解析するのに最適なモデルの検討を行い、条件を決定することができたので、平成22年度更に解析を進める事ができると考えられる。本研究で用いる新しい定義(PDGFRα+,Sca1+)の間葉系幹細胞(MSC)が、がん微小環境でどのように変化し、腫瘍にどのような影響を与えるかを評価した。マウス骨髄よりMSCを分離培養し、大腸がん細胞と共にマウスに皮下移植すると腫瘍の増殖が亢進する事から、MSCはがんの増殖に対して影響を与えている事が示唆された。次にGFPマウスの骨髄を野生型(WT)マウスに移植し、骨髄由来のMSC及び血球がGFPで標識されているマウスを作製した。このマウスに癌細胞株を皮下移植し、腫瘍が増大した時点で組織中のGFP陽性かつMSCマーカー陽性細胞の割合をFACSにて測定した。その結果、骨髄MSCはがん局所に移動し、一部はがん細胞と融合する可能性が示唆された。次にGFPマウスより骨髄MSCを、WTマウスより骨髄細胞を採取し、WTマウスに骨髄移植しMSC由来の細胞のみがGFPでマーキングされたキメラマウスを作製した。このマウスに大腸がん細胞を皮下に移植したところ、腫瘍局所にGFP陽性細胞を認め、このモデルでも骨髄由来のMSCが癌局所に移動している事が分かった。現在、骨髄由来の腫瘍局所MSCを分離し、網羅的な発現遺伝子解析を行っている。また、ヒト骨髄より二つのマーカーで分離し、ヒトのMSCの免疫学的特性も評価した。Bio-plex(Bio-Rad社)を用いた網羅的な液性因子の解析では、免疫抑制性のIL-6、MCP-1、VEGFや、免疫細胞の誘導に関連したIL-8とGRO-aなどが高産生していることが確認された。膜分子では、CD80、CD83、CD86の発現は無く、免疫抑制に関わるPD-L1やPD-L2が発現していた。また、MSCは、単球から抑制性樹状細胞を誘導する事や、末梢血単核球の増殖を抑制する事が分かった。これらの事より、本方法で分離されたヒトMSCは免疫抑制能を有することが示唆された。
ファジィロジックを備えた創発システムモデルの交通需要マネージメントへの適用

研究の目的は、地域あるいは都市の複雑で大規模な活動と交通需要の相互作用を定常性と非定常性双方の視点で検討することであった。本年度は、交通需要と都市地域活動の相互作用を表す構造モデルの開発、非定常性の関係把握、交通システムの安定化に対する施策とその協力システムのモデル構築、さらに得られたモデルによるシミュレーションの実施という研究プロセスの考え方を示した。その結果、複雑系の中で、交通システム計画における創発的現象は、積雪寒冷地域における冬期交通の円滑な管理と、その協力システムに見ることができ、それについてのシステムモデルと、実際の実証研究を札幌市を中心とした地域でおこなった。その結果、冬期交通の円滑なシステムを確保するためには、都市内のロードヒーティングシステムが必要であり、広域的システムを考えた場合、膨大な費用が必要となることが分かった。それらの費用を各事業体、熱供給、熱利用及び道路管理の各事業体で出し合うことによって、創発的なシステム構築の可能性が生まれることが分かった。すなわち、各事業体がそれぞれ独自で、それぞれの独自のシステムを作ることより、エネルギーカスケードを考えた利用形態とその責任負担を行うことにより、システム構築が可能となり、また環境汚染付加軽減効果による間接的な費用を考えることにより、より現実的なシステム構築ができ、それらによって新しい協力システムによる交通計画が可能となった。本年度は、交通需要と都市地域活動の相互作用を表す構造モデルの開発、交通需要発生のメカニズムと、非定常性の関係把握、交通システムの安定化に対する施策とその協力システムのモデル構築、さらに得られたモデルにおるシミュレーションの実施という研究プロセスの考え方を示すことであった。その結果、複雑系の中で、交通システム計画における創発的現象は、交通渋滞、交通環境汚染、災害や事故等のシステムに現れることを把握した。しかしながら、より詳細な検討は、積雪寒冷地域における冬期交通の円滑な管理と、その協力システムに見ることができ、それについてのシステムモデルと、実際の実証研究が札幌市を中心とした地域で行われた。その結果、冬期交通の円滑なシステムを確保するためには、都市内のロードヒ-ティングシステムが必要であり、広域的システムを考えた場合、膨大な費用が必要となることが分かった。すなわち、各事業体がそれぞれ独自で、それぞれの独自のシステムを作ることより、エネルギーカスケードを考えた利用形態とその責任負担を行うことにより、ほとんど不可能なシステム構築が、実現可能となり、また環境汚染付加軽減効果による間接的な費用を考えることにより、その実現性が加速度的に増加することが分かった。
軟骨内骨化過程におけるメカノセンサーTRPV4チャネルの役割に関する研究

TRPV4は機械刺激で活性化するCa^<2+>透過性陽イオンチャネルであり、軟骨細胞にも発現している。新たにTRPV4との相互作用が推定される分子として見いだしたMtap7d1も軟骨細胞に発現している。我々は軟骨におけるこれら分子の機能解明のため、遺伝子欠損マウス、TRPV4KOとMtap7d1KOの骨格と成長板軟骨を調べた。TRPV4KOは尾椎の短縮と成長板軟骨部に部分的な発達異常を示した。Mtap7d1KO新生仔には軟骨発達異常があり、軟骨細胞の分化と整列に障害が見られた。以上の結果から、両者は軟骨細胞の形成と分化に関わる重要な分子であることが示唆される。1)進捗状況(研究遅延):平成22年度には、研究代表者の病気事由により、実験を中断せざるを得ず、研究計画の見直しと縮小を行い、主な実験課題を翌年度繰り越しとした。さらに、平成23年3月以降、東日本大震災の影響下で、研究環境は23年度前半、長期間悪化した。特に、本研究の主な研究材料である遺伝子改変マウス繁殖群の大幅縮小を余儀なくされた。そのため実験再開は大幅に遅延した。3)新実験場所の整備:平成23年3月、大学内で実験研究場所異動となり、それに伴い元施設でのマウス飼育を中止した。22年度繰越予算の一部を本課題実験に必須の機器購入に充て、研究環境の整備に向け、新実験室の設備拡充を図った。また、大学内共同施設内にマウス飼育場所を申請確保した。4)平成23年3月に、研究代表者が作製・維持繁殖・解析してきたMtap7d1遺伝子改変マウス系統(正式名称:B6.Cg-Mtap7d1^<tml>)を、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター(RIKENBRC)に系統寄託した。本マウスは遺伝子資源としてRIKENBRCで長期安定保存され、近く、研究材料として、広く国内外の医学・生命科学研究者に無償(輸送料等の実費負担のみで)提供される予定である。このマウス系統は、これまで未解明部分が多い軟骨形成および軟骨とメカニカルストレスについて新たな知見を得るのに好適なツールとして活用されると考えられる。今後、RIKENBRCからB6.Cg-Mtap7d1^<tml>を再導入し、繁殖後、胎児解析および初代軟骨細胞培養等の実験再開を予定している。TRPV4チャネルは、低浸透圧・メカニカルストレス・温熱等の物理刺激で一過性に開口する陽イオンチャネルで、メカニカルストレス応答がよく知られている骨組織において圧感知受容体の重要分子としての生理機能が示唆されている。研究代表者らは、特に軟骨細胞増殖・分化とTRPV4との関連に注目し、TRPV4ノックアウトマウスの表現型解析を継続している。その骨格異常については解析結果の一部を2012年12月発刊の著作にて公開した。また、軟骨細胞の分化におけるマスター制御因子Sox9はTRPV4チャネルの下流での機能が推察されている。そこで、TRPV4欠損マウス等を材料に用い、TRPV4およびSox9その他軟骨細胞関連因子の発現解析を他大学と共同で行っている。一方、研究代表者らが新たにTRPV4との相互作用の可能性を見いだした分子Mtap7d1(本課題での旧表記、Map7R)は軟骨細胞で高発現している。代表者自ら作製したノックアウトマウスは、その育種成績と表現型解析から、欠損ホモ個体では致死であった。それらは出生直後に無呼吸で死亡し、主要臓器での異常は現時点では特に認められていないが、骨格解析から軟骨の低形成が全例で確認された。Mtap7d1はその推定アミノ酸配列から、細胞骨格に関わる分子ファミリーに属する未報告の分子と推定され、軟骨細胞の増殖分化に関わる新たな重要分子であることが示唆された。細胞内におけるMtap7d1分子動態の解析を目的に、既に作製済みのN末抗体に加え、今回新たにC末抗体を作製した。TRPV4チャネルはメカニカルストレス応答が知られている骨組織において圧感知受容体の重要分子であることが示唆されている。研究代表者らは、特に軟骨細胞増殖・分化とTRPV4との関連に注目し、TRPV4ノックアウトマウスの表現型解析を行い、骨格異常に関する解析結果の一部を報告した。TRPV4チャネル下流では軟骨細胞分化主要制御因子Sox9の機能が示唆されているが詳細は不明である。我々はTRPV4ノックアウトマウスを用い、TRPV4およびSox9その他軟骨細胞関連因子の遺伝子発現解析を行った。一方、TRPV4との相互作用の可能性があるMtap7d1(本課題での旧表記、Map7R)は軟骨細胞で高発現している。Mtap7d1の遺伝子解析により、その推定アミノ酸配列は既に報告があるMAP7と全体で約40%相同であり、特にMAP7N末端側のチューブリン結合部位およびC末端側にある種間で保存性の高い特徴的な領域(結合分子不明)で特に高い相同性が認められ機能的にも類似性が示唆された。これらの結果から、Mtap7d1はチューブリン結合タンパク質MAPファミリーの新規分子と推察された。さらに研究代表者らのMtap7d1ノックアウトマウス(RIKENBRCへ22年度に寄託済み)では、欠損ホモ個体全例が周産期致死で、軟骨細胞分化異常による軟骨低形成が確認されたことから、Mtap7d1は生命維持に関わる必須分子であり、軟骨細胞の増殖分化に関わる新たな重要分子であることが示唆された。

当該課題については、現在、研究代表者の病気により追加解析と投稿を中断している。研究代表者の病状の回復を待って再投稿を目指す予定である。TRPV4は機械刺激で活性化するCa^<2+>透過性陽イオンチャネルであり、軟骨細胞にも発現している。新たにTRPV4との相互作用が推定される分子として見いだしたMtap7d1も軟骨細胞に発現している。我々は軟骨におけるこれら分子の機能解明のため、遺伝子欠損マウス、TRPV4KOとMtap7d1KOの骨格と成長板軟骨を調べた。TRPV4KOは尾椎の短縮と成長板軟骨部に部分的な発達異常を示した。Mtap7d1KO新生仔には軟骨発達異常があり、軟骨細胞の分化と整列に障害が見られた。以上の結果から、両者は軟骨細胞の形成と分化に関わる重要な分子であることが示唆される。医歯薬学研究代表者は、職場労働環境の変化および代表者自身の健康上の理由から、従来職場での本課題の実験研究が実施困難な状況に陥った。そのため23年度経費を翌年度に繰り越し、24年度春より実験実施場所を大学内の他講座ラボに移して研究再開を目指した。移動に伴い実験に必要なシステムの再構築(実験器具・試薬類の購入とセッティング)が必要となり時間を費やした。また当初計画していた他大学施設での初代軟骨細胞培養と軟骨細胞への負荷実験は、研究代表者の体調不良により中止した。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに蓄積した新規の実験データを基に知見をまとめ、研究代表者の病状の回復を待って再投稿を目指す。同時に、Mtap7d1遺伝子欠損マウス(RIKENBRCへ22年度に寄託済み)に関する軟骨細胞解析研究は、知見の公開もしくは研究課題の委譲について検討を進をめる予定である。
身体失認・失行症における身体性変容の解明とニューロリハビリテーション法の開発

映像遅延装置システムを用いて,失行症における身体性の変容を定量的に明らかにすることを研究目的とした.加えて,身体性の変容が運動パフォーマンスおよび運動関連脳領域に与える影響を,映像遅延装置システムを用いて明らかにすることを目的とした.研究1:脳卒中を罹患した患者22名を,失行評価に基づき,失行群(7名)・偽失行群(6名)・非失行群(9名)に分類することができた.その結果,触覚刺激と受動運動における遅延検出閾値(delay detection threshold:DDT)と遅延検出確率曲線の勾配(steepness)に群間差は認めなかった.一方,能動運動では,失行群は,偽・非失行群と比較して,DDTの有意な延長とsteepnessの有意な低下を示した.また失行重症度と能動運動条件におけるDDT/steepnessとの間には,有意な相関関係を認めた.これらの結果から,失行症には,motor predictionsの障害があることを示唆した.研究2:健常者を対象に,運動-感覚不一致による身体性の変容と共に生じる運動学的変化および運動関連脳領域の活動変化を捉えることを目的とし,実験を行ったところ,主観的知覚である身体の損失感,重さ及び疲労は,遅延時間の延長に伴って有意に増大した.また,運動リズム及び筋活動量は遅延時間増大に伴って有意に緩慢化・減少した.さらに,対側一次運動野の運動関連電位の振幅ピーク潜時は遅延時間増大に伴って遅延する傾向にあった.本研究では,運動ー感覚の不一致が主観的知覚の変容をもたらすだけでなく,運動リズムおよび筋出力にも影響を与えることを明らかにした.加えて,その背景には運動関連脳領域の活動変化が関係していることを示唆する結果を得た.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,脳損傷後の運動機能回復を阻害する身体失認および失行症における身体性(身体所有感・運動主体感)を変容を明らかにし,それらに対するニューロリハビリテーションを開発することとしている.本年度においては,映像遅延システムを用いて,身体失認および失行症を有する者を対象に,視覚-体性感覚間あるいは運動-感覚間の不一致の検出特性を明らかにし,身体性変容の定量的評価方法を確立した.具体的には,精神科疾患の既往,重度の認知障害,視野障害のない脳卒中患者20名を対象に,触覚-視覚間,固有感覚-視覚間,随意運動-視覚間の時間的遅延の検出特性を調査した.遅延条件には, 33・99・198・297・396・495・594msecの7つの遅延条件を設定し,得られた結果に対してロジスティック回帰曲線を適合し,心理物理曲線を求めた.求められた心理物理曲線から,遅延検出閾値と遅延検出曲線の勾配を算出した.そして各刺激条件における群間の比較と重症度との相関分析を実施した.その結果,失行罹患群では,非失行罹患群よりも,随意運動-視覚間の遅延検出が困難であった.また失行の重症度と随意運動-視覚間の遅延検出能力との間には有意な相関関係が認められた.このことから,失行症を有する脳卒中患者には運動プログラムの段階で何らかのエラーが生じていることが明らかとなり,今回実施した心理物理的評価方法が運動主体感の変容を捉えるための評価方法として妥当であるということを示した.さらに,これらの課題結果は感覚障害や運動麻痺とは関係しておらず,失行症状とのみ相関関係が認められたことから,本研究で実施した定量的評価方法が,身体性の変容を特異的に捉えることのできるものであることが裏付けられた.本年度に予定していた運動主体感および身体所有感の定量的評価方法の作成も成功し,実際の臨床現場での計測も実施することができた.さらには,運動主体感が変容しているであろう失行症の遅延弁別特性を明らかにすることにも成功した.一方で,身体所有感が変容している身体失認患者に対する評価に関しては,今回実施した心理物理的評価方法の理解そのものが乏しいこと,注意が散漫になり課題を正確に実施できないなどの問題が生じた.これに対しては,課題を簡略化するなどの工夫をして対応するとともに,身体所有感が軽度でも変容されている者も対象としていくことで対応していく.今回の実験参加者の中でも,身体失認を呈していなくても,軽度の身体所有感を変容を訴える脳卒中片麻痺患者では遅延検出能力が低下しているいう結果も得られていることから,そのような患者を対象とすることが望ましいことが想定される.映像遅延装置システムを用いて,失行症における身体性の変容を定量的に明らかにすることを研究目的とした.加えて,身体性の変容が運動パフォーマンスおよび運動関連脳領域に与える影響を,映像遅延装置システムを用いて明らかにすることを目的とした.研究1:脳卒中を罹患した患者22名を,失行評価に基づき,失行群(7名)・偽失行群(6名)・非失行群(9名)に分類することができた.その結果,触覚刺激と受動運動における遅延検出閾値(delay detection threshold:DDT)と遅延検出確率曲線の勾配(steepness)に群間差は認めなかった.

一方,能動運動では,失行群は,偽・非失行群と比較して,DDTの有意な延長とsteepnessの有意な低下を示した.また失行重症度と能動運動条件におけるDDT/steepnessとの間には,有意な相関関係を認めた.これらの結果から,失行症には,motor predictionsの障害があることを示唆した.研究2:健常者を対象に,運動-感覚不一致による身体性の変容と共に生じる運動学的変化および運動関連脳領域の活動変化を捉えることを目的とし,実験を行ったところ,主観的知覚である身体の損失感,重さ及び疲労は,遅延時間の延長に伴って有意に増大した.また,運動リズム及び筋活動量は遅延時間増大に伴って有意に緩慢化・減少した.さらに,対側一次運動野の運動関連電位の振幅ピーク潜時は遅延時間増大に伴って遅延する傾向にあった.本研究では,運動ー感覚の不一致が主観的知覚の変容をもたらすだけでなく,運動リズムおよび筋出力にも影響を与えることを明らかにした.加えて,その背景には運動関連脳領域の活動変化が関係していることを示唆する結果を得た.今後は症例数をさらに増やして計測することと同時に,損傷部位の同定あるいは運動準備電位の計測を通して,脳内神経メカニズムの探索を行っていく.さらには,それぞれの症例に合ったニューロリハビリテーションを開発する.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
バクテリアのべん毛モータの人工膜内再構築

本研究の目的であるべん毛基部体を人工膜内に再構成するためには、基部体の全構造とそれが細胞膜内でどのように配置しているのか知ることが不可欠である。今まで基部体は単離されたものの構造しか知られてなかったが、前年度までの我々の研究により細胞質側に新たな成分が明らかにされた。それらはスウィッチ・タンパク質からなるCリングとべん毛タンパク質専用の輸送装置と思われるCロッドである。本年度、我々は急速凍結レプリカ法を使ってCロッドの構造をさらに詳しく調べた。べん毛を形成するためには40もの遺伝子が関与しているが、そのうち約10の遺伝子の役割はまだわかっていない。特にRegionIIIに属するfliOオペロンの遺伝子群は小さな分子量の膜タンパク質らしく、その検出は容易ではなかった。我々はfliOオペロンの各遺伝子の安定な突然変異体(欠失のある)を用いて、急速凍結レプリカ法によりべん毛の基部を細胞質側から観察した。その結果、fliOではCロッドが欠失していることがわかった。また、fliQではCロッドは存在するが変形していた。fliPとfliRでは野性株となんら変わりはなかった。これらの観察からFliOとFliQはCロッドの形成に直接関与していると考えられる。本年度の研究目標は、精製したべん毛基部体およびスウィチ・タンパク質を人工膜に埋めるための条件を検討することであった。従来から、べん毛基部体の精製には中性界面活性剤であるTriton X-100を用いてきた。しかし、この界面活性剤はタンパク質に強固に結合し完全な除去がむつかしいため、後に人工脂質との置き換える時支障をきたす可能性がある。そこで、以下の界面活性剤を用いてべん毛基部体の精製を試みた。これらのうち、最終産物の純度から判断してLDAOがもっとも基部体の可溶化に適していた。スウィチ遺伝子を大量発現ベクターにクローンし、スウィチ・タンパク質3種類(FliG,FliM,FLiN)を大量発現することができた。FliGは遺伝子上で隣合ったFliFと、またFliMはFliNと同時にほぼ等量だけ発現された。個々のタンパク質を精製するために、尿素による可溶化、mono-QやSephadexカラムを用いたFPLCによる高速分離等を組み合わせた精製法を開発した。バクテリアのべん毛モータのMSリング複合体は、その半分が細胞膜内に埋まっている。大腸菌で大量発現したMSリング複合体を精製するために、非イオン性の界面活性剤であるトライトンx-100が用いてきた。しかし、人工膜形成のための脂質との交換を考慮にいれて、さらに結合力の弱いといわれるLDAO(Lauryldimethylamine oxide)を用いて精製を行った。また、従来の精製法では超遠心法によってMSリング複合体のペレットを作るため、その後の可溶化が難しかった。光散乱法による測定では、可溶化の激しい処理のあとでもいくつかの複合体からなる塊が存在することが示唆された。そこで、超遠心の際に庶糖溶液をクッションにしたところ、複合体の可溶性がよくなった。このようにして精製したMSリング複合体に、さまざまな濃度の(脂質/界面活性剤)溶液を加え2、3時間保温ののち、一晩透析により界面活性剤を除いた。用いた脂質はDMPC、CLである。脂質溶解のための界面活性剤にはトライトンX-100、LDAO、オクチルグルコシド、CHAPSを用いた。透析により界面活性剤の除かれた試料を電子顕微鏡で観察したところ、いくつかの(脂質/界面活性剤)の組み合わせで小さなベシクル(脂質膜)にリング構造が入っているのが観察された。膜内に取り込まれたMSリング複合体の量は、タンパク質濃度を上げれば増加するようである。ただいま詳細な条件を検討中である。本研究の目的であるべん毛基部体を人工膜に埋め込むにあたり、実際の基部体が細胞膜の中でどのような配置しているのか知ることは再構成系の成否を評価する上で大切である。

今までべん毛の基部体の構造解析は主に単離した試料を用いて行ってきた。従来のべん毛基部体精製法の条件を少し緩和した方法では、べん毛基部体の最下部のベル状の構造体が結合していた。この構造体はCリングと呼ばれる。Cリングにはスイッチタンパク質が3つとも含まれていることからスイッチ複合体であることが明らかである。私たちはべん毛の基部構造を膜から抽出しないで観察する方法を開発した。それは急速凍結法、ディープフリーズ法、レプリカ電顕法を組み合わせたもので、時間分解能および空間分解能が極めて高い方法である。細胞内部には多くの酵素の他にDNAがあり、ただ単に膜画分を取ってきたのでは膜表面は酵素やDNAに覆われて観察することができない。浸透圧ショックをかけて膜を分離すると内部がきれいに洗い流されることがわかった。この方法により、私たちは初めて細胞の内側からべん毛モーターの構造を観察することに成功した。MSリングはほとんど膜の中に埋まっていた。Cリングは細胞質側にポット状に突き出ており、シグナルの受容体であるための条件を満たしていた。航空写真技術を応用したステレオ写真解析法によりMSリングおよびCリングの寸法を正確に計測した。さらに、Cリングの中にロッド状の構造が新たに発見された。この構造は単離精製したべん毛基部体にはなかったものである。Cロッドと名付けた。状況証拠からCロッドはべん毛タンパク質専用の輸送装置の可能性が高い。Cロッドがべん毛の再構成にどのような影響を及ぼすかは今後の課題である。
2次元運動解析を用いたラット嚥下造影法の開発

実験的重症筋無力症(MG)ラットの摂食・嚥下機能の解析法を新たに確立して研究を行った。重症筋無力症ラットの嚥下機能の解析のためにアセチルコリン受容体モノクロナル抗体、mAb35(150320μg)をエーテル麻酔下に尾静脈から静注してMG群を作成し、対照群と比較検討した。計測項目は、初回嚥下時間(食物の取り込み開始から初回嚥下開始までに要した時間)、連続嚥下時間(連続する2回の嚥下動作において嚥下開始から次の嚥下開始までに要した時間)、咽頭・食道通過時間(嚥下開始から食塊が胃に達するまでに要した時間)、ならびに連続嚥下時間における咀嚼回数とした。正常ラット5匹(正常群)の計測結果(平均値±SD)は、初回嚥下時間3.01±1.14秒、連続嚥下時間3.52±0.23秒、咽頭・食道通過時間2.00±0.27秒であった。連続嚥下時間における咀嚼回数は15.6±0.02回であった。mAb35を投与した2匹に関しては48時間後に軽度なMG(K. Poulasの分類1)を発症した(MG群)。MG群の結果は初回嚥下時間30.49±14.69秒、連続嚥下時間6.40±1.66秒、咽頭・食道通過時間1.99±0.08秒であった。連続嚥下時間における咀嚼回数は23.3±1.41回であった。MG群の初回嚥下時間および連続嚥下時間は、正常群のmean±3SDと比較して明らかに延長した。また、連続嚥下時間における咀嚼回数に関しても、正常群のmean±3SDより高値を示した。ラットの嚥下造影法を用いて、MGラットの摂食・嚥下機能評価を行いMGラットでは正常ラットと比較して摂食・嚥下機能が著明に低下していることが示された。ラットの嚥下造影法は摂食・.嚥下機能の研究モデルとして有効であると考えられた。本研究の基礎データから本実験方法が、MG患者の嚥下障害の機序を検討する動物モデルとしてさら発展的研究になる可能性があると考えられた。本年度は、ラット嚥下造影法の手技を確立することと、2次元運動解析ソフトのセットアップと操作テクニックの修得を目的に研究を行った。雌ルイスラット(体重250g-300g)に造影剤入り検査食を摂取させ、X投透視装置(日立製medites3000)を用いて嚥下造影撮影を行った。撮影時にはケージ内に仕切りを設置し、ラットの方向を一定にしたうえで側面からX線照射を行い嚥下時の側面像をDVDに動画記録した。記録した動画をスローモーションで再生し、取り込み開始から食道通過終了までの食塊通過時間および咀嚼回数等を計測した。実際の嚥下造影検査では、ラットが検査食を摂取しない場合が多く、様々な液体、固形物を用いて条件を変えながら検査を試みた。また、撮影時にラットのポジションを一定に保つ必要があり、ケージ内の間仕切りや検査食の固定法などに工夫が必要であった。本年度の研究では、上記の撮影が可能であることを確認できたのと同時に、ラット嚥下造影撮影および動画記録のための様々な手技を試み、一定の安定した撮影方法が修得できた。さらに2次元運動解析ソフト(DIPP-Motion XD DITECT)をセットアップし、データ取り込みや分析を試みた。その結果、舌骨解析を行う上での問題点が明確になったと同時に、解析についてのテクニックを修得できた。これにより、次年度は2次元運動解析が可能となる見込みである。また、重症筋無力症ラットの作成についても文献、学会などでの情報を収集しており、数匹のラットに対して軽度な発症を確認できた。次年度は重症筋無力症ラットを用いた嚥下造影撮影を行い、舌骨運動解析を試みる予定である。本年度は、重症筋無力症ラットの作成を行い、さらに健常ラットと重症筋無力症ラットの嚥下機能を比較するための具体的な実験手技を確立した。(1)重症筋無力症ラットの作成重症筋無力症の惹起性か・報告されているアセチルコリン受容体モノクロナル抗体、mAb35(150320μg)をエーテル麻酔下に尾静脈から静注した。個体の大きさと抗体の投与量によって、重症筋無力症を発症する場合と発症しない場合があったが、ほぼ安定して重症筋無力症を発症させることに成功した。(2)実験手技の確立雌ルイスラット(体重270g-330g)に造影剤入り検査食を摂取させ、X投透視装置(日立製medites3000)を用いて嚥下造影撮影を行い、DVDに動画記録した。撮影時にはケージ内に仕切りを設置し、ラットの方向を一定にしたうえで側面からX線照射を行い嚥下時の側面像を記録した。また、検査食摂取を促す目的で嚥下造影撮影開始48時間前より絶飲食とした。検査食はラット飼育用飼料と100%硫酸バリウムを混合・乾燥させた固形食を用いた。