hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海馬錐体細胞の長期増強現象(LTP)にともなうカルシウム変動の観察

海馬の長期増強現象の誘導に必要とされている細胞内へのカルシウムイオンの流入は、どのような経路を介して起こるのであろうか。これまでは、グルタミン酸受容体のサブタイプの一つであるNMDA受容体からの流入がほとんどであると考えられていたが、本研究の結果によればNMDA受容体からよりも、むしろ電位依存性のカルシウムチャネルからの流入が主であるという結論を得た。細胞内カルシウムは、カルシウム蛍光指示薬をCA1錐体細胞に注入し、紫外光で励起して得られる蛍光を冷却型CCDカメラで経時的に測定する。CA1の神経細胞に高頻度のシナプス入力を加えると活動電位が発生し、それに伴い細胞内のカルシウムが増大する。これをコントロールとして、NMDA受容体の拮抗薬であるAPVを投与しても高頻度によるカルシウム増大反応にほとんど変化は見られないが、電位依存性カルシウムチャネルブロッカーであるω-アガトキシン(P型チャネルブロッカー)の潅流により、細胞体、遠位樹状突起および基底樹状突起でコントロール群と比較し、それぞれ40±18%、34±9%、38±17%(n=6)の減少がみられた。さらに、これらの薬物が高頻度刺激による長期増強現象の誘導にどのように関るかを細胞外電位記録を用いて調べた。NMDA受容体の拮抗薬であるAPVでは、完全に長期増強の誘導を阻止し、Herron等(1986)の報告とよく一致する。コントロール群での長期増強は、93±12%(n=8)であるのに対し、ω-アガトキシンでは31±14%(n=8)と有意な抑制効果が観察された。ω-アガトキシンは、低頻度のシナプス入力に何等影響を与えないことから、APV感受性の長期増強の形成に、電位依存性カルシウムチャネルが関与していると結論した。そして、長期増強形成に必要である細胞内カルシウム増大は、主にP型の電位依存性カルシウムチャネルからの流入であろうと推測した。しかし、電位依存性のカルシウムチャネルには、P型以外にL,T,N型の3つがあり、長期増強との関連について現在研究を進めている。
近世における私法理論の構築契機－原状回復論の解体プロセスに着目して

本研究の目的は、後期スコラ学派の原状回復論の解体プロセスを眺めることで、近世の合意を主体とする私法理論の構築契機を明らかにすることである。後期スコラ学派は、契約、不法行為、不当利得を原因として発生するあらゆる債務を「原状回復」概念を用いて説明するが、グロチウスやプーフェンドルフといった近世自然法論者になると債務の発生原因を合意とその他(不当利得・不法行為)に大別するようになる。本研究では、原状回復主体の法理論から合意主体の法理論への転換に関する積極的な理由およびそれぞれの法理論を基礎付ける法的思考を探求することで、近世の合意を主体とする私法理論の構築契機を解明する。
分光測定を再現するMaxwell方程式と融合した分子動力学マルチスケール法の開発

光と分子の両方の動きを同時に記述する新しい計算化学シミュレーションを確立し、光を用いた分子や物質の分光測定シグナルをシミュレーションでリアルに再現する手法を開発する。入射パルス光が分子系と相互作用することにより、変形したパルスが反射あるいは透過波シグナルとして得られる、という実験系を模倣した直接的な計算で"測定"することが特徴である。特に比較的計算が安価な分子のモデル(分極力場モデル)を採用することにより様々な系に適用が可能となる。赤外・テラヘルツ分光やラマン分光実験のシミュレーションを行い、分子の運動を分光シグナルと結び付けて微視的なダイナミクスを明らかにする。
虚血における自然免疫機構(Toll様受容体)の関与

自然免疫とは、微生物感染時に迅速に機能する免疫応答機構であり、昆虫から哺乳類まで進化上幅広く存在している。最近外来微生物に共通する分子構造を認識し、細胞内シグナル伝達系を活性化するToll様受容体(TLR)と呼ばれる一連の膜蛋白質の構造と機能が明らかとなってきた(Nat Immunol 2;675-680,2001)。TLR familyのうちTLR4はグラム陰性桿菌の外膜に存在するリポ多糖類(LPS)にと結合し、細胞内シグナル伝達を活性化する事が知られている(Science 282:2085-88,1998)。これ以外にTLR4はネクローシスによる細胞死に伴う炎症性反応(TNF-alpha,IL-1beta,iNOS等の発現)に関与する事が知られている(J Immunol 166;7128-35,2001)。そこで本研究では脳虚血・再灌流障害により引き起こされる炎症反応にTLR4が関与しているかどうかを検討した。その結果、TLR4 knock-out(TLR4KO)マウスとそのwild type(Wt)マウスで脳虚血病変に差があるかどうかを中大脳動脈永久閉塞モデルと一過性閉塞モデルとで検討した。その結果、永久閉塞モデルでも一過性閉塞モデルでもTLR4KOマウスで梗塞量の減少が認められた。次いでWtマウスに致死量の放射線を照射後、TLR4KOマウスの骨髄を移植すると、Wtマウスの骨髄を移植する場合に比して有意に梗塞量の減少が認められた。更に初代培養神経細胞に4時間の低酸素負荷を与えた後、マイクログリアと共培養すると、TLR4KOマウス由来のマイクログリアと共培養した方がWtマウス由来のマイクログリアと共培養した場合より、優位に神経細胞障害が軽減した。従って脳虚血障害機構に骨髄由来の単球・マクロファージが密接に関与すると考えられた。最近外来微生物に共通する分子構造を認識し、細胞内シグナル伝達系を活性化するToll様受容体(TLR)familyと呼ばれる一連の膜蛋白質の構造と機能が明らかとなってきた(Nat Immunol2;675-680,2001)。TLR familyのうちTLR4はグラム陰性桿菌の外膜に存在するリポ多糖類(LPS)にと結合し、細胞内シグナル伝達を活性化する事が知られている(Science282:2085-88,1998)。これ以外にTLR4はネクローシスによる細胞死に伴う炎症性反応(TNF-alpha, IL-lbeta, iNOS等の発現)に関与する事が知られている(J Immunol166;7128-35,2001)。そこで本研究では脳虚血・再灌流障害により引き起こされる炎症反応にTLR4が関与しているかどうかを検討し、脳血管障害の治療に応用可能であるかどうかを検討することを目的としている。初年度の本年はまずTLR4のノックアウトマウスとそのwild type(littermate)で脳虚血病変に差があるかどうかを中大脳動脈永久閉塞モデルと一過性閉塞モデルとで検討した。その結果、永久閉塞モデルでも一過性閉塞モデルでもTLR4のノックアウトマウスで梗塞量の減少が認められた。現在その分子機構を解明するため、脳内マイクログリアのLPSやその他の炎症性サイトカインに対する反応性の検討を行っている。
酸化ストレスによる歯髄培養細胞内SODの動態と免疫応答

好中球やマクロファージから産生される活性酸素を含むフリーラジカルは生体に対して為害性をもたらすことがいわれている。生体防御系として働いている酵素のなかで特にスーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)はスーパーオキサイドを不均化する酵素として認識されている。今回炎症をきたしたヒト歯髄細胞と正常細胞とでのSOD活性を2種類の方法を用いて検討し、歯髄におけるSOD活性測定法の確立を試みた。またそれと同時に歯髄細胞内において、炎症時におけるSOD(Mn-SODとCu, Zn-SOD)の遺伝子発現と炎症性サイトカインの遺伝子発現について検討を行った。結果:1.炎症をした下歯髄細胞においてESR spin trapping法を用いてスーパーオキサイドを検出した。2.Radical EIA法とNBT法を用いて歯髄細胞内SOD活性測定した結果、NBT法では活性測定数値が高く検出される傾向であった。3.歯髄における炎症性サイトカインの発現はIL-1βは3時間後から発現し6時間後においてピークであった。Cu, Zn-SODに関しては最初から24時間後まで発現が認められた。またMn-SODは6時間後から検出された。以上の結果から本研究において歯髄内におけるSOSAはNBT法よりもRadical-EIA法を用いたほうが信頼性があり、歯髄内においてSODの発現は炎症に抑制的に働くIL-4やIL-8を発現し炎症反応を軽減させる働きがあることが示唆された。フリーラジカルは、近年細胞内情報伝達シグナルとしての新たな役割が見出され、それに伴って活性酸素を選択的に消去する酵素であるSODの存在とその生理作用が生体恒常性を担う一つの重要な因子として認識されている。本研究では、歯髄炎のメカニズムを解明する目的で、歯髄培養線維芽細胞に酸化ストレスを作用させ、細胞内SODの動態を検討した。酸化ストレスはスーパーオキサイド(O_2^-)を産生するヒポキサンチン-キサンチンオキシデース(HX-HOD)系を用いて細胞に作用させ、細胞内SODの動態を検討した。同時にNitric oxideを産生する酵素であるNitric Oxide Sythase(NOS)の生成をNOS detect kitを用いて分光学的に検討した。HX-XOD系から発生するO_2^-を作用させると、歯髄培養線維芽細胞における細胞内SODは上昇し、ESRスピンとラッピング法において検索したSOD様活性は、2.09unit/lであった。次に、NOS蛋白量を検討した結果、O_2^-を作用させた後に蛋白量の増加を認めた。また、炎症性サイトカインであるIL-1βおよびIL-6の生成量を検討した結果、その生成量は増加した。次に、歯髄培養線維芽細胞内のSOD量をあらかじめ高くした後にLPSを作用させた結果、IL-1βおよびIL-6の生成量は減少した。以上の結果から、酸化ストレスを作用させると細胞内SOD量とNOS量は増加し、同時に炎症性サイトカインであるIL-1βとIL-6も増加した。酸化ストレスに対して細胞は炎症反応を示すことが示唆されたが、細胞内SODの増加に伴ってIL-1βとIL-6はその生成量が抑制されることが示唆された。酸化ストレスによって一度は炎症性サイトカインは上昇を認めるが細胞内SODの量の増加に伴って炎症性サイトカインは抑制され、炎症反応における防御反応が認められた。今後、SODと炎症性サイトカインとの因果関係を詳しく検討する予定である。SODは近年細胞内情報伝達シグナルとしてその生理作用が生体恒常性を担う一つの重要な因子として認識されている。そこで、歯髄炎のメカニズムを解明する目的で歯髄培養線維芽細胞に酸化ストレスを作用させ、細胞内SODの動態を検討した結果、HX-HOD系から発生するO_2^-を細胞に作用させ、細胞内SODとNOSの動態を検討した。O_2^-を歯髄線維芽細胞に作用させると細胞内SODは上昇し、ESRスピンとラッピング法において検索したSOD様活性は、2.09unit/lであった。次に、NOS蛋白量を検討した結果、O_2^-を作用させた後に増加を認めた。

また、炎症性サイトカインであるIL-1βおよぴIL-6の生成量も増加した。次に、歯髄培養線維芽細胞内のSOD量をあらかじめ高くしLPSを作用させた結果、IL-1βおよぴIL-6の生成量は減少した。SODの産生に伴う炎症性サイトカイン産生を明確にするために時間依存における酸化ストレスを作用させた際のSOD,各炎症性サイトカインの遺伝子発現を検討した結果、SODの発現が時間依存的認められ各炎症性サイトカインの発現が抑制されたことから、細胞内SODの発現に伴う炎症性サイトカインの抑制が示唆された。また細胞内NOS発現に伴う炎症性サイトカインの動態を検討した結果、SODと同様に炎症性サイトカインの発現は減少したが、IL-10の発現が認められた。以上のことから、酸化ストレスに対する防御反応として、NOSの発現に伴い、IL-10の発現により炎症反応が抑制されている可能性が示唆された。細胞内における2つの防御機構としてSODとNOSの炎症反応における動態を検討したわけだが、今後細胞内におけるSODとNOSとの相互作用についても検討を行い、歯髄における炎症反応メカニズムを解明したいと考える。
構造-反応性相関の新展開

(1)陰イオン生成反応系芳香族ラジカルアニオン種,ニトロベンゼン,ベンズアルデヒド,アセトフェノン,メチルベンゾエ-ト及びベンゾフェノン系の気相における熱力学的安定性を電子移動平衡に基づいて決定し、各系の置換基効果を詳細に検討した結果,湯川-都野式による取り扱いが可能で,置換基定数も基本的には液相の値が使用できることが明らかになった。さらに相関から得られた共鳴要求度は母体ラジカルアニオン種(ベンゼン環置換基=H)の安定性の増加とともに低下し、ベンジル位炭素陽イオンの安定性に及ぼす置換基効果の挙動に完全に一致した。(2)陽イオン生成反応β-置換基としてH,Me,t-Bu,CF_3基を有するフェニルアセチレンの気相塩基性度をプロトン移動平衡に基づいて測定し、置換基効果を解析した。ρ値は-10で一定値となり,共鳴要求度は母体カチオンの安定性の増大の順にCF_3=1.39からt-Bu=0.98まで減少した。この結果はベンジルカチオン系で観測された挙動に完全に一致し,両系には共鳴要求度と母体カチオン間の単一直線関係が存在することが明らかになった。この事実は、共鳴要求度がカチオンの分子構造に依存したパラメータで、特にイオンの安定性を反映したパラメータであることを支持する。(3)α-置換ベンジルカチオンおよびβ-置換基-α-フェニルビニルカチオンの最適化構造を非経験的分子軌道法計算により求めた。MP2//HF/6-31G^*レベルで得た各カチオンの構造パラメータと共鳴要求度との間に優れた相関関係が見いだされ、共鳴要求度が電荷中心とベンゼン環間の共鳴相互作用を表すパラメータであることが理論的に実証された。また,ラジカルアニオン系についても種々のbasis setに基づくab initio MO計算を行い,共鳴要求度と固定置換基のパラ位のπ電子密度との間に相関性を見いだした。これらの結果から陰イオン系においても共鳴要求度の物理的意味が確立した。芳香族ラジカルアニオン種,特にベンゾフェノン類の気相における熱力学的安定性を電子移動反応の平衡定数のTF-ICRによる測定に基づいて決定した。また、ニトロベンゼン,ベンズアルデヒド,アセトフェノン,及びメチルベンゾエ-ト系についても詳細な解析を行うために必要な置換基を追加した。これらの系の置換基効果を詳細に検討した結果,湯川-都野式による取り扱いが可能で,置換基定数も基本的には液相の値が使用できることが明らかになった。さらに相関結果の総合的な解析は母体ラジカルアニオン種(ベンゼン環置換基=H)の安定性の増加とともに共鳴要求が低下することを示した。この傾向は先に検討したベンジル位炭素陽イオンの安定性に及ぼす置換基効果の挙動に完全に一致し,共鳴要求度の概念の一般性が確立した。また,これらの系についてラジカルアニオンのエネルギーを種々のbasis setに基づくab initio MOにより計算した。ラジカルアニオンの相対安定性の計算値と実験値の間には良い直線相関が認められ,ラジカルアニオンの理論計算に対して危惧されていた計算の信頼性が系統的な実験値との比較から初めて確認された。さらに,共鳴要求度と固定置換基のパラ位のπ電子密度との間は相関性が認められ,共鳴要求度の本質は陰電荷と置換基間のパイ電子相互作用であることが理論的にも支持された。気相酸性度における置換基効果の研究に関しては,高い酸性度を有する炭素酸として取り上げるα,α-ビストリフルオロメチルトルエン誘導体の合成がほぼ終了したので,現在測定が進行中であり,当初予想した結果が得られつつある。

また,ラジカルアニオン系についても種々のbasis setに基づくab initio MO計算を行い,共鳴要求度と固定置換基のパラ位のπ電子密度との間に相関性を見いだした。これらの結果から陰イオン系においても共鳴要求度の物理的意味が確立した。今年度は、前年の実験の継続とともに、気相イオンの熱力学的安定性に及ぼす置換基効果の解析結果と量子化学に基づく理論計算の結果との比較を中心にすえて研究を進めた。(1)気相中のβ-置換-α-フェニルビニルカチオンの安定性に及ぼす置換基効果β-置換基としてH,Me,t-Bu,CF_3基を持つフェニルアセチレンの気相塩基性度をプロトン移動平衡に基づいて測定した。β位置換基による各系の無置換体の安定性は、CF_3<H<Me<t-Buの順に増大した。各系における置換基効果は湯川-都野式により精度良く相関され、-10で一定のρ値が得られた。一方、共鳴要求度は母体カチオンの安定性の増大の順にCF_3=1.39から<H<Me<t-Bu=0.98まで減少した。この結果はベンジルカチオン系で観測された挙動に完全に一致し、さらに両系の共鳴要求度と母体カチオン間には単一直線関係が存在することが見いだされた。この事実は、共鳴要求度がカチオンの分子構造に依存したパラメータで、特にイオンの安定性を反映したパラメータであることを示唆する。(2)α-置換-ベンジルカチオンおよびβ-置換-α-フェニルビニルカチオンの最適化構造を非経験的分子軌道法計算により求めた。MP2//HF/6-31G^*レベルで計算した各カチオンの最適化構造における結合距離(C1-C7)、(C2-C3),(C5-C6)とベンジルカチオン系の気相における熱力学的安定性に及ぼす置換基効果の解析から得た共鳴要求度との間に優れた直線関係が見いだされ、共鳴要求度が電荷中心とベンゼン環間の共鳴相互作用を表すパラメータであることが理論的に実証された。同じ結論は、陰イオン系の芳香族ラジカルアニオン(ニトロベンゼン、ベンゾニトリル、ベンゾニトリル、ベンズアルデヒドおよびベンゼン)系のMP2//HF/6-31+G^*レベルの理論計算からも得られた。
文脈の影響を考慮した脳機能からの感性レベル定量化の研究

本研究では,人間の快不快や嗜好といった感性情報を,脳活動パターンから定量化する技術について検討する.特に,感性に基づく脳活動パターンに継時的な変化をもたらすヒトの注意や学習について着目し,これらを文脈として定義して,その影響の検証を脳活動計測を通して行なった.実験結果より,感性的な刺激の種別によって,注意のレベルが高い時と低い時で,その脳活動パターンに与えられる影響の強さが異なることが確認された.本研究では,人間の感性情報を脳活動情報から定量化するにあたり,学習や注意などによって生じる脳活動の変動,遷移のメカニズムを明らかにすることである.人が外的な刺激に対して感じる嗜好や快不快などの感性的な反応は,それまでの経験や,人の精神状態,環境の影響(=文脈)などによって変容しやすいため,これらの影響を明らかにすることで,脳活動からの感性情報のデコーディング精度をより向上させることができると考えられる.本年度は,人間の注意状態が,感性に基づく脳活動に与える影響を検証するための脳機能計測実験を行った.PVT課題によって人間の持続的注意の強さを計測しながら,快不快の刺激画像を呈示し,そのときの脳活動を核磁気共鳴画像法によって計測した.実験は,被験者が異なる注意状態にあるときの脳活動を計測するために,複数Session,複数Runに渡って行われた.解析では,PVTの課題成績によって,持続的注意の高さを被験者ごとに3段階に分け,該当する各Runにおける快・中性・不快画像刺激に対する脳活動の活性について調査した.実験結果より,注意のレベルによって快刺激,不快刺激に対する反応が同一被験者でも異なることが示された.被験者の持続的注意力が低下している状況では,特に快刺激に対する脳活動の反応が減弱する傾向が確認された.不快刺激にも同様の減弱傾向は見られたが,快刺激に比べると影響は少なかった.このことから被験者の持続的注意が快・不快反応に影響し,特に快はその影響を受けやすいことが示唆された.一方で,今回の実験設計においては,注意の測定と刺激呈示がほぼ同時に行われることによる交絡の影響が懸念される.よって,今後は実験手順の見直しを行う.新たな実験設計において十分な被験者数を確保し,統計的解析を行う.本研究成果については,共同研究先との協議の上,適切なタイミングで研究会・学会等で発表する予定である.当初の予定通り,持続的注意が情動に与える影響について脳機能計測実験を終えることができたが,装置の予約と被験者の予定の確保が原因となり,実験の実施予定に遅れが生じていたため,発表にまで至ることができなかった.本研究では,人間の感性情報を脳活動情報から定量化するにあたり,学習や注意などによって生じる脳活動の変動,遷移のメカニズムを明らかにすることである.人が外的な刺激に対して感じる嗜好や快不快などの感性的な反応は,それまでの経験や人の精神状態,経時的に変化する環境の影響(本研究ではこれを文脈と呼ぶ)などによって変容しやすいため,これらの影響を明らかにすることで,脳活動からの感性情報のデコーディング精度をより向上させることが出来ると考えられる.昨年度はヒトの持続的注意の高低によって,快/不快の強さが快時と不快時で異なる影響を受けることを被験者実験で確認した.本年度はそれらの快不快を含めた脳活動における感性情報の定量化手法について検討し,経時的な変化や異なる領野の活動を統一的に扱うための枠組みの開発,および検証を行った.具体的には,呈示刺激に対する脳活動パターンの相関からRepresentational Similarity Matrix (RSM)を計算,MDSによって可視化する手法を用いた.脳活動を脳活動パターンのベクトルではなく,刺激同士の相関をとるRSMに変換することで,通常のデコーディングでは処理することが難しい異なる領野における活動パターンの違いを吸収することができ,また経時的な変化の比較,ひいては被験者のグルーピングなども容易となる.本手法によって脳活動上の表象を可視化できること,また,それによるデコーディングの成績が既存のデコーディングとほぼ同等の成績を示すことを確認した.本研究では,人間の快不快や嗜好といった感性情報を,脳活動パターンから定量化する技術について検討する.特に,感性に基づく脳活動パターンに継時的な変化をもたらすヒトの注意や学習について着目し,これらを文脈として定義して,その影響の検証を脳活動計測を通して行なった.実験結果より,感性的な刺激の種別によって,注意のレベルが高い時と低い時で,その脳活動パターンに与えられる影響の強さが異なることが確認された.今後はこれまでの実験に関する結果のまとめと発表を行う.また,実験計画の修正による再実験を行う.このとき,マインドワンダリング状態といった注意が呈示刺激以外へと向けられる精神状態についても考慮した実験計画を検討する予定である.2年目の学習過程が感性情報に与える影響については,当初の予定通り推進する.生体計測装置のレンタル費用が当初予定したものよりも安価に抑えられたため,その差分が次年度使用額として繰り越された.発生した次年度使用額の分,次に予定している実験の回数を増やすことができるため,被験者の謝礼や生体計測装置のレンタル費用へ充当する予定である.
ベスタチンの歯周病関連細菌に対する増殖抑制作用の機序についての研究

成人性歯周炎は、Porphyromonas gingivalis(以下P.gingivalis)の関与が強く示唆されており、近年、本菌の増殖を選択的に抑制する物質として、アミノペプチダーゼBの阻害剤であるベスタチンの効果が報告されているが、その作用機序は不明である。本研究の目的は、トランスポゾンによるランダム変異導入法を用いてベスタチン耐性変異株を分離し、トランスポゾンをマーカーとして変異したDNA領域をクローニング、その塩基配列を決定し、その結果をもとにベスタチン作用部位の遺伝子について検討を加えることである。トランスポゾンを持つ大腸菌とP.gingivalis33277株とを混合・接合させトランスポゾンをP.gingivalisへ導入、エリスロマイシン耐性の変異株(トランスコンジュガント)を選択分離した。約20回の接合実験を行い合計約25000株のトランスコンジュガントを得た。得られたトランスコンジュガントを最小発育阻止濃度(MIC)の48倍量のベスタチンを添加した培地で培養し、ベスタチン耐性株の分離を試みた。その結果、1株のベスタチン耐性株(TnB1)が分離された。変異株TnB1のMICは親株の510倍であった。プロテアーゼ活性は若干の低下を示したが有意差は見られなかった。サザンブロット法を用いてトランスポゾンの挿入形式を解析した結果、単一のトランスポジションやコインテグレーションといった典型的な挿入形態はとっていなかった。トランスポゾンの挿入されている部位のDNA断片を大腸菌に一部クローニングした。クローニングした断片について、約3kbの塩基配列を決定し、相同性の検索を行ったところ、相同性の高い配列は見つからなかった。塩基配列の決定されているP.gingivalisW83株とは一致する配列が一部に見られたが、一致しない部分も多く、変異が挿入された部分の機能について塩基配列から検討することはできなかった。現在、親株の同部位に薬剤耐性カセットによる変異を生じさせ、ベスタチン耐性が得られるか検討を行っている。また、トランスポゾンの挿入形式が複雑であるため、他の部位にも変異が生じている可能性について調べている。本年度までに得られた結果を以下に示す。トランスコンジュガントの分離:トランスポゾンを持つ大腸菌とP.gingivalisとを混合・接合させトランスポゾンをP.gingivalisへ導入、エリスロマイシン耐性の変異株(トランスコンジュガント)を選択分離した。ベスタチン耐性株の分離:得られたトランスコンジュガントを最小発育阻止濃度(MIC)の48倍量のベスタチンを添加した培地で培養し、ベスタチン耐性株の分離を試みた。その結果、1株のベスタチン耐性株(TnB1とした)が分離された。ベスタチン耐性株の性状についての検討:変異株TnB1のMICは親株の510倍であった。トランスポゾンの挿入形態が複雑なため、一箇所のみの変異ではない可能性がある。トランスポゾンにより変異が生じた遺伝領域のクローニング:トランスポゾンの挿入されている部位のDNA断片を大腸菌に一部クローニングした。現在その塩基配列決定作業を行っているが、挿入部位が一箇所のみではない可能性があるため、他の挿入部位もクローニングする必要があると思われる。

サザンブロット法を用いてトランスポゾンの挿入形式を解析した結果、単一のトランスポジションやコインテグレーションといった典型的な挿入形態はとっていなかった。トランスポゾンの挿入されている部位のDNA断片を大腸菌に一部クローニングした。クローニングした断片について、約3kbの塩基配列を決定し、相同性の検索を行ったところ、相同性の高い配列は見つからなかった。塩基配列の決定されているP.gingivalisW83株とは一致する配列が一部に見られたが、一致しない部分も多く、変異が挿入された部分の機能について塩基配列から検討することはできなかった。現在、親株の同部位に薬剤耐性カセットによる変異を生じさせ、ベスタチン耐性が得られるか検討を行っている。また、トランスポゾンの挿入形式が複雑であるため、他の部位にも変異が生じている可能性について調べている。
高弾性・高反発力型金属基複合材料の開発とその応用

1)高反発力型複合材料の作製Ti-6Al-4V合金板間に、タングステンの100μm長繊維のメッシュ(100メッシュ/in)とTi-6Al-4Vパウダーを挿入し、10^<-2>Paの真空中でホットプレス成形を行い、W/Ti-6Al-4V複合材料を作製でき、HIPよりも高密度の材料で、100x100mm角の複合材料が完成した。2)複合材料の評価試験(1)複合材料の微細組織観察ではタングステンメッシュとTi-6Al-4vパウダーがホットプレスによって緻密に成形され、タングステン線は変形せず初期形状を維持し、界面状況も良好であることが分かった。(2)複合材料にタングステンメッシュを1枚挿入したときの材料厚さによる高反発力の検出を行った。その結果,材料厚さが薄くなるにしたがって反発係数の上昇が認められた。(3)複合材料の曲げ試験によるその場観察の結果、破壊はTi-6Al-4V合金板間のタングステンメッシュ近傍から発生し、タングステン表面に酸化膜が形成されている可能生を示唆している。しかし、タングステンの張力を有効に発揮するためにはマトリックスとタングステン界面がルーズになっていることが望ましく、反発力を向上させるには良い条件であると判断できた。3)FEM解析W/Ti-6Al-4V複合材料をゴルフクラブのフェース面に使用した場合の最適材料厚さを得るため,チタン合金にタングステンシートで複合化したモデルを考え、有限要素解析を行った。(1)タングステンシートの厚さおよび,フェース面の厚さを変化させて解析を行い,フェース面変位分布を得た。(2)板厚とたわみの間には一次関数の関係があり、高弾性率のタングステンを用いることで、薄肉化が可能で、高反発特性を持つゴルフクラブヘッド開発への指針を得ることができた。1)TiAl作製の系高反発力型複合材料マトリックスにはTi-6Al-4V合金の微粒子を用い、この微粒子はアトマイズ法で製造されたもので粒径150μm未満である。強化材の繊維短タングステンは表面が電解研磨された直径20μmのタングステン線をボールミルで粉砕したものを用いた。繊維体積率を20%に配合し、カプセルに真空封入し950°C、100MPa、1.5時間の条件で熱間等方加圧処理(HIP)を行った。作製したHIPし出り切を試験片で放電加工ワイヤーからカプセルの処理後、評価した。2)評価試験の高反発力型複合材料べるため調を依存性さ厚の反発係数1.7mm、3.0mmの2種類の条件で測定した。より平均値の測定結果1.7mmのが反発係数の試験片0.870、3.02mm反発係数の試験片のは0.861が得られた。測定誤差は1.2、であり程度%高精度の結果とにおいて同一材料。えられる考の反発係数は、厚さが薄い材料の方が反発係数が高い結果が得られた。本材料の摩擦撹拌接合を試みたが高融点材料ツールを用いていないため、十分な接合を実現することができなかった。しかし、アルミニウム合金では十分な接合実験ができた。3)FEM解析複合材料の諸特性を用い、タングステン繊維とマトリックスとの歪み分布や残留応力の解析を行っている。曲げ試験およびマイクロビッカース硬さによる強度特性との検討も進めている。4)今後の計画タングステン長繊維を用いたTi-6Al-4V合金の複合材料の作製を計画中である。

1)高反発力型複合材料の作製Ti-6Al-4V合金板間に、タングステンの100μm長繊維のメッシュ(100メッシュ/in)とTi-6Al-4Vパウダーを挿入し、10-2Paの真空中でホットプレス成形を行い、W/Ti-6Al-4V複合材料を作製した。昨年度のHIPよりも高密度の材料で、100x100mm角の複合材料が完成した。2)複合材料の評価試験(1)複合材料の微細組織観察ではタングステンメッシュとTi-6Al-4vパウダーがホットプレスによって緻密に成形され、タングステン線は変形せず初期形状を維持し、界面状況も良好であることが分かった。(2)複合材料にタングステンメッシュを1枚挿入したときの材料厚さによる高反発力の検出を行った。その結果、材料厚さが薄くなるにしたがって反発係数の上昇が認められた。(3)複合材料の曲げ試験によるその場観察の結果、破壊はTi-6Al-4v合金板間のタングステンメッシュ近傍から発生し、タングステン表面に酸化膜が形成されている可能生を示唆している。しかし、タングステンの張力を有効に発揮するためにはマトリックスとタングステン界面がルーズになっていることが望ましく、反発力を向上させるには良い条件であると判断できた。3)FEM解析W/Ti-6Al-4v複合材料をゴルフクラブのフェース面に使用した場合の最適材料厚さを得るため,チタン合金にタングステンシートで複合化したモデルを考え、有限要素解析を行った。(1)タングステンシートの厚さおよび,フェース面の厚さを変化させて解析を行い,フェース面変位分布を得た。(2)板厚とたわみの間には一次関数の関係があり、高弾性率のタングステンを用いることで、薄肉化が可能で、高反発特性を持つゴルフクラブヘッド開発への指針を得ることができた。
がん分子標的薬の合理的投与設計手法の構築

キナーゼ阻害薬はがん薬物療法において極めて重要な薬剤であるが、副作用の発症機構に未だ不明な点が多く、臨床用量の適切な設定手法も確立されていない。本研究では効果発現・副作用発症の分子機構理解に立脚したPK-PD/TD解析を行うことで、これら薬物の効果を維持しつつ副作用を最小限に抑えるための合理的な投与量設定法を確立することを目標とする。in silico、in vitro、in vivoの融合的方法論により、副作用発症機構の解析と薬物血漿中濃度との定量的関係の解析、抗がん効果と薬物血漿中濃度との定量的関係の分子基盤に基づく解析を行い、最終的にこれらを統合による薬物治療濃度基準を定めることを目標とする。2018年度は、in silicoでの副作用・主作用に関して、分子基盤からの予測する方法論の構築を中心に解析を進めた。具体的には、分子基盤に関して、詳細な機構論を仮定せずにモデル化する機械学習的アプローチ、および、機構論に基づくモデルを、定量的に解析する手法の構築を進めており、プロトタイプとなる手法が確立されつつある。また、in vivoでの検証解析の準備として、まず、副作用評価に関する実験系の準備を進めている。次年度以降は、in silico解析に関して、構築されたプロトタイプの予測系を、in silico解析での工夫による改善を目指すほか、in vitro細胞系を用いて、in silico解析結果の検証を進める。良好な予測性が認められる薬物と、予測から大きく外れる薬物を分類することで、現状の予測系において、適切に予測されていこない要因を分析し、更なる予測モデルの精緻化を進める予定である。本年度は、特にin silico解析における予測系の構築に注力し、研究を遂行した。その過程で当初の予定していた、機構論に基づく予測系確立に加えて、詳細な機構論を仮定せずにモデル化する機械学習的アプローチでのモデル構築にも一定の目処がつきつつあり、薬効(主作用・副作用)の定量予測の基盤構築という研究目的に対して、適切に進展していると判断している。一例としては、主作用の予測系において、ある種のがん細胞に対する殺細胞効果に対して、極めて大きな寄与が想定されるキナーゼを抽出し、in vitroにて、そのキナーゼの発現抑制の効果を検証するほか、単独のキナーゼの影響のみならず、複数のキナーゼの影響を予測した場合の、トータルとしての薬理効果を適切に予測できているか、検証を進める。この過程で、良好な予測性が認められる薬物と、予測から大きく外れる薬物を分類することで、現状の予測系において、適切に予測されていこない要因を分析し、更なる予測モデルの精緻化を進める予定である。また、上記の解析は、主として主作用に着目した検証となる。これらの解析は、データベース上に、遺伝子発現・変異・薬理効果などの膨大なデータベースがある抗がん剤による抗がん効果(主作用)の予測解析において実施していく計画である。副作用に関しては、主に、薬理効果(各種臓器機能の障害度合い)と薬物の関係に関して、統一的なプラットフォームで取得されたデータが必ずしも多くないため、各種臓器由来の初代培養細胞に対する薬物の効果をin vitroにて評価しつつ、予測系の精度評価や精緻化を進める予定である。

一例としては、主作用の予測系において、ある種のがん細胞に対する殺細胞効果に対して、極めて大きな寄与が想定されるキナーゼを抽出し、in vitroにて、そのキナーゼの発現抑制の効果を検証するほか、単独のキナーゼの影響のみならず、複数のキナーゼの影響を予測した場合の、トータルとしての薬理効果を適切に予測できているか、検証を進める。この過程で、良好な予測性が認められる薬物と、予測から大きく外れる薬物を分類することで、現状の予測系において、適切に予測されていこない要因を分析し、更なる予測モデルの精緻化を進める予定である。また、上記の解析は、主として主作用に着目した検証となる。これらの解析は、データベース上に、遺伝子発現・変異・薬理効果などの膨大なデータベースがある抗がん剤による抗がん効果(主作用)の予測解析において実施していく計画である。副作用に関しては、主に、薬理効果(各種臓器機能の障害度合い)と薬物の関係に関して、統一的なプラットフォームで取得されたデータが必ずしも多くないため、各種臓器由来の初代培養細胞に対する薬物の効果をin vitroにて評価しつつ、予測系の精度評価や精緻化を進める予定である。
アソシエーションスキームと有限群の指標

1.有限群のp-blockの構造とそのカルタン行列の固有値については、群が正規p-部分群を持つ場合に新しい結果が得られ、以前から得られている結果とともに和田倶幸氏との共著論文で発表された。論文中の予想の一般的解決は今後の課題として残されている。2.シャープ指標については、多くの実例が野村により計算機を用いて構成された。それらの実例にもとづいて理論的考察を行なった結果、有理整数値を1つだけ持つシャープ指標の分類問題が、D.Alvis、野澤宗平、清田の共同研究により解決された。そこで用いられたアイデアや手法の拡張が考察されていて、より広いクラスのシャープ指標の分類理論が展開されつつある。これらの結果は、以前からの研究成果とともに代数的組合せ論国際会議(1993年11月、九州大学)に於いて、清田により口頭発表され、国内および外国の研究者との意見交換が行なわれた。またシャープ指標の一般化に関しても、清田により研究され、代数的組合わせ論の研究(1993年11月、京都大学数理解析研究所)に於いて口頭発表された。3.スピンモデルについては、野村によりtwisted extensionの理論、およびsmall multiplicityを持つスピンモデルの分類が研究され、これらの結果はそれぞれ第11回代数的組合わせ論シンポジウム(1993年6月、大阪教育大学)、代数的組合せ論国際会議(前出)に於いて口頭発表された。スピンモデルの構成および分類は今後の重要な研究課題と思われる。
肢芽内の未知のレチノイン酸分布の可視化による探索

レチノイン酸は食物として摂取したビタミンAが体内において変換された化合物であり、脊椎動物の多くの器官形成を制御する。手足においても正常な形態形成に中心的な化合物の一つとして認められており、そのメカニズムが研究されている。レチノイン酸の発生中の四肢における分布については様々な説が提唱されているが、それらの説を支持するようなレチノイン酸分布は検出されていない。この発生中四肢におけるレチノイン酸分布を申請者らが開発した定量的レチノイン酸プローブ、GEPRAを用いて可視化・探索し、四肢の形態形成における分子メカニズムを解明する。
網膜色素変性症に対する骨髄由来幹細胞薬剤賦活と低線量・低線量率放射線治療の実現

網膜色素変性マウスを用いて顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)エリスロポエチン(EPO)投与によって誘導される細胞の網膜に対する働きを詳細に検討した。網膜の変性に従って、末梢血中の骨髄由来細胞が網膜内に誘導されマイクログリアなどの細胞に分化することはすでに示したが、それらの細胞を網膜内に誘導するメカニズムとそれによって誘導される細胞について詳細は明らかにされていない。以前SDF-1にて誘導される細胞が網膜神経保護的に働くのではないかというデータを発表したが、今回はより広く知られているMCP-1について検討した。MCP-1の受容体であるCCR2のノックアウトマウスと網膜変性マウスを交配させ、CCR2-/-変性マウスを作製し、網膜変性の変化を確認した。半年まで経過観察を行ったが、MCP-1により誘導される細胞はSDF-1と異なり、神経障害的に働く可能性があることがわかった。つまり、同じ骨髄由来、末梢血細胞であり変性に従って網膜に誘導される細胞でありながら、神経変性には反対の働きをする細胞群が存在することが分かった。GCSF EPO治療では両細胞群ともに増加するが、より効率的な神経保護を考えると誘導細胞にも注目する必要がありそうであった。低線量放射線治療では論文が受理された。線量と照射間隔についてはまだ検討の余地がある。放射線のよる生体への影響が地震の後からより関心を持って議論されるようになっている。我々の研究は放射線の使い方によって生体反応がかわることを示しているもので、悪影響がないものであると主張しているのではない。より効率的で効果的な方法を見出していく。薬剤濃度はGCSF150μ/kg,EPO500IU/kg、GCSF100μ/kg,EPO500IU/kgのセットをrd12マウスに3週間に一度の皮下注射を行った。rd12は他の変性モデルと比較して進行が遅く、長期効果の判定には価値がある。1カ月から12カ月以降まで機能(網膜電図)と構造(組織化学的,光干渉断層計OCTによる検討)の検討ではどちらの指標においてもGCSF,EPO投与マウスがコントロールマウスに比べ有意に網膜構造と機能が保護されていた。体重など生体への影響も確認した範囲では投与群、コントロール軍とも差はなく、GCSF150μ/kg,EPO500IU/kg投与での安全性が確認された。低線量放射線では、これまで使っていたベータ線に加えガンマ線、エックス線での効果を検証中である。また、より低線量による効果を検討している。また、鉛を使って線量調節をしていたが、直接低線量を照射したときの効果も検証した。錐体細胞機能の評価はハンフリー視野計10-2中心視野プログラムを6ヶ月ごとの測定をほぼ全ての典型的色素変性症患者で行った。多くの患者で進行が検出され、進行予測に最も有効なプログラムを開発中である。特に中心視野の変化では個人によって大きな進行の差があり、治療効果の判定だけでなく、治験の際の症例選択にも注意を要することが分かった。眼底断層診断装置による形態的評価では網膜変性症の新たな所見を見出した。クリスタリン網膜症における網膜外層の視細胞層の球状変化、小口病における視物質代謝の変化をOCTで可視化、網膜色素変性での色素上皮細胞の変性パターンの違いが病態に関連することなど、学会で発表、現在投稿準備中である。
デジタル化の進展と集団的労使関係法の変容－争議行為法理の基礎研究

本研究は、ICT(情報通信技術)やAI(人工知能)、ロボット等のデジタル技術が発達し、雇用社会が大きく変化することが見込まれるなかで、わが国の集団的労使関係法が今後どのように展開しうるのか、することが望ましいのかを探求することを目的とする。その第一歩として、本研究では、労務給付態様の変化によりその規整内容がダイレクトな影響を受ける争議行為法の分野に着目して、デジタル化によって生じうる争議行為法の変化と展開の可能性を考察する。
小児てんかん症例における空間フィルター法を用いた脳磁場解析

症例におけるてんかん症候群分類は、国際抗てんかん連盟による発作型・てんかん症候群分類(1987)に従うと、症候性局在関連てんかん85例、特発性局在関連てんかん15例、症候性全般てんかん5例、特発性全般てんかん2例、未決定てんかん2例であった。全症例に対して、従来まで用いられてきた等価性電流双極子(Equivalent current dipole: ECD)の推定を行った。この推定により、電流源が単一脳回に局在し、ECDの局在に集積傾向を示したものが、症候性局在関連てんかん65例、特発性局在関連てんかん12例、症候性全般てんかん3例、特発性全般てんかん1例、未決定てんかん2例であった。これらの症例は、限局、あるいは単純な磁場分布を示しているもので、それらの結果と臨床発作対応が得られた。一方、単一双極子法にて解が求められない症例に対して、dynamic statistical parametric mapping(dSPM)を用いた解析を行った。dSPMでは、脳磁場分布が広汎に存在する、16例(症候性局在関連てんかん10例、特発性局在関連てんかん3例、症候性全般てんかん2例、特発性全般てんかん1例)の検討が可能であった。更に、これらの解析によっても解が得られない、低振幅棘波律動、広汎性棘波律動、棘・徐波律動、徐波律動を磁場反応として持つ症候性局在関連てんかん10例に対して、短時間フーリエ変換を用いて、特異的に出現する周波数帯域の局在を求めた。これらの所見は、後に施行した頭蓋内脳波所見と一致し、前頭葉てんかん症例では一側半球より先行して出現する棘律動の出現が見出され、確定診断に至った。これらの手法を用いることにより、全てのてんかん症候群に対して、脳磁図検査が可能になった。北海道大学病院小児科に通院している、109例のてんかん症例に対して脳磁場測定を行った。脳磁場測定には、北海道大学病院に設置されている306ch全頭型脳磁場計測装置(Vector View system, Neuromag Inc, Helsinki)を用いた。各々の症例の3D-MRI(T1WI)を同時に撮影し、解析結果を投影した。全症例に対して、従来まで用いられてきた単一双極子法を用いた、等価性電流双極子(Equivalent current dipole : ECD)の推定を行った。一方、単一双極子法にて解が求められない症例に対して、dynamic statistical parametric mapping (dSPM)を用いた解析を行った。これらの症例は、脳磁場分布が広汎に存在、あるいは両大脳半球に広がって存在する症例であった。dSPM法を用いて、症候性局在関連てんかん10例、特発性局在関連てんかん3例、症候性全般てんかん2例、特発性全般てんかん1例において、臨床発作対応の得られる磁場分布の表現が可能であった。これらの解析によっても解が得られない症例が、症候性局在関連てんかんにおいて10例存在した。

これらは、低振幅棘波律動、あるいは広汎性棘波律動、棘・徐波律動、あるいは徐波律動を磁場反応として持つものであった。これらの症例に対しては、周波数解析などの新しい解析手法の開発が必要と考えられた。症例におけるてんかん症候群分類は、国際抗てんかん連盟による発作型・てんかん症候群分類(1987)に従うと、症候性局在関連てんかん85例、特発性局在関連てんかん15例、症候性全般てんかん5例、特発性全般てんかん2例、未決定てんかん2例であった。昨年度まで従来の単一双極子法を用いた、等価性電流双極子(Equivalent current dipole: ECD)の推定、更に、単一双極子法にて解が求められない症例に対して、dynamic statistical parametric mapping(dsPM)を用いた解析を行った。ECD法ではてんかん原性焦点の局在が得られる、83例(症候性局在関連てんかん65例、特発性局在関連てんかん12例、症候性全般てんかん3例、特発性全般てんかん1例、未決定てんかん2例)の検討が可能であった。更にdSPMでは、脳磁場分布が広汎に存在する、16例(症候性局在関連てんかん10例、特発性局在関連てんかん3例、症候性全般てんかん2例、特発性全般てんかん1例)の検討が可能であった。本年度は、これらの解析によっても解が得られない、低振幅棘波律動、広汎性棘波律動、棘・徐波律動、徐波律動を磁場反応として持つ症候性局在関連てんかん10例に対して、短時間フーリエ変換を用いて、特異的に出現する周波数帯域の局在を求めた。これらの所見は、後に施行した頭蓋内脳波所見と一致し、前頭葉てんかん症例では一側半球より先行して出現する棘律動の出現が見出され、確定診断に至った。これらの手法を用いることにより、全てのてんかん症候群に対して、脳磁図検査が可能になった。
発達障害児(者)脳に見られる促進加齢現象に関する基礎研究

心身障害児(者)は「早く年をとる」とも言われ、剖検例でも脳を含めて老化の徴候とも言うべき年齢不相応な形態学的肇化がしばしば見られる。そこで、愛知県コロニー脳及び組織保存機構に登録されている症例を含めて、10歳代18例、20歳代8例を含む15歳以上の36症例について、海馬、海馬傍回、青斑核でのAT8陽性の過剰リン酸化タウ蛋白(NFT、Neuropile threads)、抗ユビキチン抗体陽性像、ストレス蛋白(αBクリスタリン、Hsp27、Hsp70)の発現頻度などを検討した。その結果、AT8陽性像は10歳代でも16.7%、30歳代は50%に、40歳を過ぎるとほとんどの症例に過剰リン酸化タウの蓄積が見られた。福山型筋ジストロフィー症など、NFTが早期から出現することが知られている疾患を除外しても、10歳代で6.3%、20歳代で43%にAT8陽性像を認めた。また、抗ユビキチン抗体陽性像はAT8の所見に類似した像を呈する一方で、神経原線維変化とは別に雪の結晶類似の構造物(仮称:UPSS=Ubiquitin Positive Snow-like Structure)が広範に散見された。その本態はMicrogliaなのかSwollen oligodendrocyteなのかの鑑別が今後の検討課題として残った。一方、これら異常タウやUPSSなどが出現している症例でも老人斑は全く認められず、一般に見る高齢老人の脳とは少々異なっていた。また、αBクリスタリンは陽性像が見られるものの、Hsp27、Hsp70ではほとんど陰性で、症例の積み重ねと生化学的検索が必要である。本年度は「障害児(者)の新鮮脳組織の採取と確保」、「既保存剖検脳組織を用いた加齢性変化の評価法の確立に関する検討」、「促進老化のモデルを用いたユビキチン発現の検討」をおこなった。1.障害児脳組織の確保:「脳および組織保存機構」として愛知県コロニー倫理委員会、および愛知県の承認を受け、脳および他の臓器、障害児外来患者血液からのDNA採取と保存をおこなった。平成13年2月1日現在での確保は96症例(臓器24例、DNA抽出72例)である。今後、促進老化の指標となる項目について検討をする予定。2.加齢性変化の評価法の検討:30歳代、60歳代の障害者(児)の症例を数例ずつ抽出し、海馬に関してタウ蛋白、ユビキチン蛋白の免疫染色態度と、血管周囲細胞群(以下PVCと略す、Mato cellも含む)との相関に関してパイロットスタディをおこなった。促進老化の評価を試みたが、神経原線維変化(NFT)とPVCとの相関は現時点での検索症例数では明らかには出来なかった。3.促進老化のモデルを用いた老化の傍証予備実験:剖検症例は原疾患、病悩期間、死亡時年齢等、非常にヘテロである。純系の促進老化のモデルマウス(SAMP10)の脳をユビキチン抗体にて検索した。学習障害を示すSAMP10では、ユビキチン化された細胞質内封入体が、内嗅領域と扁桃体前部に始まり、海馬や嗅球へと拡がっていた。分布のあり方がヒト脳におけるNFTのそれに類似していた。
腎細胞癌のコレステロール蓄積機構の解明

ヒト腎細胞癌においてACATのアイソザイムの1つであるACAT-1の発現上昇、それにともなうACAT活性の上昇を報告した。更に臨床的悪性度との相関では、腫瘍サイズや転移の有無、臨床病期との相関は認めなかった。組織学的悪性度とはACAT-1の発現、ACAT活性ともに正の相関を認めた。淡明細胞型(clear cell type)腎細胞癌には、細胞内にコレステロールエステルを蓄積するという形態的な特徴がある。最近、細胞内コレステロールエステル代謝に重要な分子としてAcyl-coenzyme A : cholesterol acyltransferase (ACAT)の2種類のisozymeが明らかとなった。腎細胞癌におけるACATの役割に注目し、実験を行った。熊本大学附属病院にて腎細胞癌の診断にて腎摘出術を施行された症例より癌組織と正常組織をインフォームドコンセントを得た後に実験に使用した。ヒトACAT特異抗体を用いた免疫組織学的手法にて腎細胞癌におけるACAT-IとACAT-IIの発現を定性的に検討した。腎細胞癌にACAT-1が過剰に発現していることが確認された。これに対してACAT-IIの発現は同定できなかった。そこで、Immunoblot法にて正常腎組織と腎細胞癌における発現を定量的に検討した。腎細胞癌では正常腎に比較して約20倍のACAT-1の発現が観察された。リポゾーム再構成法にて腎細胞癌組織と正常腎組織におけるACAT活性を検討した。生化学的手法を用いたACAT活性測定でも腎細胞癌では正常腎に比較して約20倍のACAT活性が確認された。以上により腎細胞癌におけるコレステロールエステルの蓄積にはACAT-1の発現亢進が関与していることが示唆された。組織形態、生物学的悪性度、臨床的悪性度とACAT酵素活性、ACAT-I発現との関連を統計学的考察を加えInternational Journal of Urology誌に投稿し、現在revice中である。腎細胞癌は、細胞内にコレステロールの脂肪酸エステルであるコレステロールエステル(CE)が蓄積していることが知られている。CE蓄積が亢進する原因の1つとしてACyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase(ACAT)の活性の上昇が挙げられる。腎癌の発生母地である尿細管上皮はACAT抗体染色性を呈することが明らかとなっている。そこで、本研究では腎癌のコレステロール蓄積機構を明らかにすることを目標とし、特にACAT発現に注目する。第2段階として、明らかになったコレステロール代謝の特性に注目し、その制御機構を解明することを目的とした。昨年度の研究から腎細胞癌におけるACAT活性が亢進していることが明らかとなった。その成果をふまえ、今年度は更に症例数を増やして、ACATの2つのアイソザイム、すなわちACAT-1と2の発現を、ヒトACAT特異抗体を用いた免疫組織学的手法およびImmunoblot法にて定性的、定量的に検討した。更に、癌の生物学的悪性度および臨床的悪性度とACAT発現亢進との関連を統計学的に検討した。その結果、免疫組織学的検討、免疫生化学的検討から、腎細胞癌では正常腎に比較してACAT-1の有意な発現の上昇を認めた。ACAT-2は腎細胞癌、正常腎どちらでも発現を認めなかった。更に、ACAT活性とACAT-1の発現は癌の生物学的悪性度と有意な相関を認めた。以上の成果はKenshi Matsumoto, et. al. International Journal of Urology, 15, 166-70,2008に発表した。平成20年度は、2008年2月にinternational journal of urology誌2008 Feb ; 15(2):166-70 2008Feb ; 15(2) : 166-70に発表した"Expression of two isozymes ofacyl-coenzyme A : chol esterol acyltransferase-1 and-2 inclear cell type renalcell carcinoma"に基づきさらに腎癌コレステロール蓄積機構についての研究を発展させた。すなわち、前述の論文で腎癌にコレステロールエステル蓄積が亢進する原因の1つとしてAcyl-coenzyme A : cholesterol acyltransferase(ACAT)活性の上昇とアイソザイムの1つであるACAT-1発現の亢進を報告した。平成20年度はコレステロール取り込みに関わるスカベンジャー受容体に注目し、その一員であるSR-AIおよびCD36の発現を検討した。具体的な方法として、腎細胞癌患者12症例より組織を得た。SR-AI、CD36、および生理的なコレステロール取り込みを担うLDL受容体、さらにコレステロール合成の律速酵素であるHMG-CoA reductaseのprimerを用いてRT-PCRを行った。その結果、腎細胞癌では正常組織と比較してLDL受容体およびHMG-CoA reductaseの発現は変わらなかった。これに対してSR-AとCD36は、発現の増加を認めた。更に、コレステロール引き抜きに関与する分子の1つであるABCA-1の腎癌における発現亢進も観察された。以上の結果から、以下のように考察した。