hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高湿潤場における降水機構にエアロゾル過程の与える影響に関する研究

開発の目処は立っているので、早急に開発を終える予定である。また、CReSS-SPRINTARS結合モデルの作成に関連して、CReSSにおいて行うべき改修(暖かい雨過程の2-moment化、雲氷の粒径分布と落下速度の関係式の見直し)については、予定通り完了した。CReSS-SPRINTARSにおける雲・降水粒子に取り込まれたエアロゾル粒子の取り扱いの検討とCReSSのダブルモーメントスキームのテストに時間を要したために、モデル開発は予定よりも若干遅れ気味である。一方で、CReSS-SPRINTARSを用いた検証実験を行うケースを衛星データとの比較から抽出することができたなど、進んでいる部分もある。来年度は本研究課題の最終年度である。モデル開発の上では、残る過程は凝結核・氷晶核の形成過程と雲粒子への変換過程である。この過程を早急に作成し、予定しているケースでの比較検証を行っていくつもりである。SPRINTARSは全球モデル用に開発されていたため、降水粒子に取り込まれたエアロゾルは1タイムステップのうちに地上まで落下してしまうと規定されていた。しかしながら、雲解像モデルでは雲粒子や降水粒子に取り込まれたエアロゾル粒子は、それらの粒子の移流、拡散、落下と同時に移動する必要がある。このため、凝結物とエアロゾルの種類のマトリクスの計算を行う部分の作成を行っている。この過程におけるメモリ使用量の節約と計算の高速化の検討に時間をかけたために、in-cloud scavensing過程の作成が遅れてしまった。現在、マトリクス計算の部分の作り込みは終了し、in-cloud scavensing過程についても目処がついているために、遅れは回復すると考えている。本研究の目的は、梅雨前線帯などの高湿潤域において発達する降水システムの構造や機構へのエアロゾル過程を導入した影響を見積ることである。この目的のために、エアロゾル過程を導入した雲解像モデルCReSS-SPRINTARSの開発を行っている。現時点までに、CReSS-SPRINTARSのうち移流、拡散、重力沈降、乾性・湿性沈着などの開発を終えており、凝結核・氷晶核の形成過程の組み込みを残す状態である。最終年度である本年度は、凝結核・氷晶核の形成過程と雲粒子への変換過程のコード化を行い、CReSS-SPRINTARSのプロトタイプを完成させる予定である。そして、梅雨期の降水システムを対象としてエアロゾル過程を導入したモデル(CReSS-SPRINTARS)の結果と導入していないモデル(CReSS単体)の結果の比較を行う予定である。2010年梅雨期の台湾・沖縄周辺域を対象としてCReSSを用いたシミュレーション結果については、様々な人工衛星により取得されたデータとの比較を行うことで、雲物理量の検証をこれまでに行っている。検証結果のうち、いくつかの問題点についてはエアロゾル過程の導入により改善されることが見込まれると想定している。このため、同様の検証手法をエアロゾル過程を導入したモデルの結果に適用して、改善の有無の検討を行うつもりである。In-cloud scavensingの部分のコード化を終えた後、エアロゾル粒子が雲に対して凝結核
増殖前糖尿病性網膜症の硝子体蛍光値による分類と、その治療法に関する研究

増殖前糖尿病性網膜症を,その後部硝子体螢光値より軽症,中等症,重症の3群に分け,主として網膜光凝固(アルゴン・レ-ザ-光)による治療法の選択・効果(6カ月後の視力・網膜所見の変化により有効,不変,無効に分けた)を検討した。1.軽症例(螢光値20ng/ml以下)12眼:病巣凝固を全例実施し、有効8眼,不変2眼,無効1眼で、有効例は全例ヘモグロビンAic値は8.5%以下であった。2.中等症例(螢光値2135ng/ml)13眼:病巣凝固を全例実施し、有効6眼,不変4眼、無効3眼で、有効例及び不変2眼(1例)のヘモグロビンAic値は8.5%以下であった。3.重症例(螢光値36ng/ml以上)4眼:汎網膜光凝固を全例実施し,有効1眼,不変1眼,無効2眼で、全例ヘモグロビンAic値は10.0%以上であった。増殖前網膜症には原則的に全例病巣凝固でよいと考えていたが、螢光値の高いものは汎網膜光凝固が必要である。螢光値より増殖前網膜症の診断をつけることも可能と考えていたが、螢光値の分散が広く,20ng/ml以下のものも多く,10ng/ml以下のものも4眼あり,この診断は眼底所見を主とするべきであることが判明した。ヘモグロビンAic値(糖尿液コントロ-ル)も光凝固効果を左右する有力因子で,これが%以下のものは病巣凝固の成功率が極めて高い。今後は更に症例を増加し、より成功率の高い病巣凝固法の適応を確立したい。
都市域における新たな地下水管理手法による都市環境の改善

前年度の実施内容により,東京都区部において主に下水に由来すると考えられる多くの物質による地下水汚染の実態が明らかになった。生活排水一般に含まれる物質と,病院排水に高濃度に含まれるガドリニウムの地下水中の分布が異なっていたことから,物質によっては病院排水による汚染の度合いが環境中濃度に大きく影響する可能性が考えられた。病院排水には様々な医薬品類が高濃度に含まれるため河川や地下水などの水環境への影響が懸念されている。水環境中への医薬品類の負荷低減のためには下水処理場での高度処理が効果的であるが,コストの面から全ての下水処理場に導入することは非現実的であり,処理場流域の医薬品排出量や放流先濃度に応じて導入を決定することが重要と考えられている。また,病院にオンサイトの処理施設を設ける考え方も提示されている。このような背景から,複数の流域において環境中の医薬品類の排出量や濃度を比較的簡易に推定する方法の確立や,病院排水における医薬品の排出量の推定方法の確立が求められている。そこで本年度は,病院排水に関連した水環境中医薬品の実態とその低減方法を研究しているスイス連邦水域科学技術研究所(Eawag)において,病院をポイントソースとしたスイス国内の下水及び河川水中の医薬品濃度のモデル化を行い,採水調査によってモデルを検証した。結果は,CT検査に用いられるX線造影剤やMRI検査に用いられるガドリニウムは,病院から排出される割合が高いために病院をポイントソースとしたモデルと実測値がよく整合しており,本モデルがこれらの物質の環境中濃度の推定に有効であることが示された。また,これらの物質は流域における病院排水の度合いが環境中濃度に大きく影響するため,東京のように下水が地下水を汚染する状況においては生活排水一般に含まれる物質と分布が異なる可能性が示され,前年度の実施内容と整合性のある結果となった。本年度は,東京都区部の50地点で採水した地下水試料から医薬品類,人為起源ガドリニウムを分析することで,地下水の下水による汚染の実態を明らかにした。医薬品類は不圧地下水32地点中21地点,被圧地下水16地点中7地点,湧水2地点中2地点で,人為起源ガドリニウムは同じく7地点,1地点,0地点で検出された。医薬品類の中でcarbamazepineが19地点,crotamitonが18地点と最も多くの地点で検出された。地下水中で検出された医薬品類や人為起源ガドリニウムは下水の漏れに起因している可能性が高いと考えられた。医薬品類と人為起源ガドリニウムの分布は異なっており,E.coliの検出地点ではすべて医薬品類が検出されていたことから,測定した医薬品類は汚水一般に由来しており,人為起源ガドリニウムは病院排水に主として由来していると考えられた。下水と地下水における医薬品類の平均濃度を用いると,下水の1%相当が不圧地下水に漏出していると推定された。次に,同じく東京都区部で採水した53地点の地下水試料から有機フッ素化合物(PFCs)を分析し,PFCsによる地下水汚染の実態を明らかにし,起源推定や汚染防止対策を推定した。次に,同じく東京都区部で採水した53地点の地下水試料から有機フッ素化合物(PFCs)を分析し,PFCsによる地下水汚染の実態を明らかにし,起源推定と汚染防止対策の立案を行った。PFCsは不圧地下水・被圧地下水・湧水ともに多くの地点で検出された。PFOA・PFOS・PFNAの濃度が1000ng/L近い地点も存在したことから,場所により深刻な汚染がみられた。地下水におけるPFCsの主起源には下水と道路排水が存在する。長鎖/(長鎖+短鎖)比を用いた下水と道路排水の寄与の推定結果では,4PFCAs(PFOA,PFNA,PFDA,PFUnDA)が100ng/Lを超える地点では下水が主たる汚染源と推定されたことから,下水による汚染の低減が効果的な対策であると推定された。長鎖/(長鎖+短鎖)比を用いて推定された下水由来の4PFCAs濃度は医薬品類と有意な正の相関があり,長鎖/(長鎖+短鎖)比を用いて推定された道路排水由来の4PFCAs濃度は重金属類と有意な正の相関があったことは,長鎖/(長鎖+短鎖)比による下水と道路排水の寄与の推定の妥当性を裏付けるものであった。

そこで本年度は,病院排水に関連した水環境中医薬品の実態とその低減方法を研究しているスイス連邦水域科学技術研究所(Eawag)において,病院をポイントソースとしたスイス国内の下水及び河川水中の医薬品濃度のモデル化を行い,採水調査によってモデルを検証した。結果は,CT検査に用いられるX線造影剤やMRI検査に用いられるガドリニウムは,病院から排出される割合が高いために病院をポイントソースとしたモデルと実測値がよく整合しており,本モデルがこれらの物質の環境中濃度の推定に有効であることが示された。また,これらの物質は流域における病院排水の度合いが環境中濃度に大きく影響するため,東京のように下水が地下水を汚染する状況においては生活排水一般に含まれる物質と分布が異なる可能性が示され,前年度の実施内容と整合性のある結果となった。
分子モデリングに基づく擬似対称型酵素阻害剤の分子設計

基質遷移状態を模倣した理想的なヒドロキシルメチルカルボニル(HMC)構造とヒドラジド構造を融合した「HMC-ヒドラジド」を組み込む擬似対称型化合物をデザインした。HIVプロテアーゼとの複合体の分子モデリングを構築し、実際にHMC-ヒドラジド化合物を合成して、強力なHIVプロテアーゼ阻害剤へと導いた。また、本デザイン手法をマラリア原虫プラスメプシンの阻害剤にも応用し、対称型酵素でないアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤にも適応可能であることを示した。1.HMC構造を擬似対称型化合物に組み込む分子設計のため、HMC構造に基づくジペプチド型阻害剤KNI-577を用いた。すなわちKNI-577のHMCのα炭素とカルボニル炭素の間にC_2回転軸を想定し、回転前のKNI-577と180度回転した後のKNI-577を重ね合わせた。次にそれぞれのP'部位を除去し、残った部分を融合するためにHMC-ヒドラジド構造を導入することによりKNI-1276をデザインした。この方法を用いて、既存の高活性HIVプロテアーゼ阻害剤であるジペプチド型のKNI-727と、トリペプチド型のKNI-272を用いた擬似対称型化合物の合成を行った。また、得られたHMC-ヒドラジド構造を有する擬似対称型化合物について、HMCの水酸基の立体化学が異なるジアステレオマーを同様に合成した。2.KNI-1276のデザイン手法は2つの阻害剤の組合せへと応用できることから、KNI-577、KNI-727、KNI-272を基に、分子モデリングの構築により可能な組み合わせについて、デザインし、合成した。HMCの水酸基の立体化学の異なるジアステレオマーも同様に合成した。3.基質切断部位であるPhe-Leuに基づいたPlm阻害剤として、HMC-ヒドラジド構造を組み込んだ擬似対称型分子の設計を行い、擬似対称型化合物を合成した。4.合成した擬似対称型化合物のHIVプロテアーゼ阻害活性を測定したところ、阻害剤構造の長さとHMC-ヒドラジドの水酸基の立体化学において、HIVプロテアーゼ阻害活性の相関関係が見られた。中でも、KNI-272由来の擬似対称型化合物はKNI-272と同等の酵素阻害活性を示した。本年度の結果より、HMC-ヒドラジド構造に基づく擬似対称型化合物の分子設計を行い、いくつかの強力な新規HIVプロテアーゼ阻害剤を獲得することができた。1.基質遷移状態概念に基づいたヒドロキシルメチルカルボニル(HMC)を組み込んだHIVプロテアーゼ阻害剤とHIV-1プロテアーゼとの相互作用が、これまでX線結晶構造解析およびNMR解析により推察されていたが、今回、中性子結晶構造解析により水素結合相互作用が明らかにされ、HMCが理想的な基質遷移状態ミミックであることが証明された。そこで、HMC-ヒドラジドを組込んだ擬似対称型化合物のデザイン手法により合成した比較的強いHIVプロテアーゼ阻害活性を示す化合物をリードとして、HIV-1プロテアーゼとの複合体の分子モデリングを構築した。得られた分子間相互作用から、より良い相互作用が得られるように、両N末端部位を構造変換した擬似対称型化合物をデザインした。擬似対称型化合物の合成は、HMCの水酸基を保護する合成経路を確立した。得られた擬似対称型化合物のHIV-1プロテアーゼ阻害活性を評価したところ、nMレベルの阻害活性を示した。2.アタザナビルのコア構造をHMC-ヒドラジドへと変換した擬似対称型化合物を合成した。HIV-1プロテアーゼ阻害活性の評価より、これらの擬似対称型化合物は有為な阻害活性をもつことが分かった。3. HMC-ヒドラジドを組込むデザイン手法をマラリア原虫由来のプラスメプシンに応用して、擬似対称型化合物を合成し、プラスメプシンII阻害活性を評価したところ、若干活性は低いが、有為な阻害活性を示した。よって、HMC-ヒドラジドを用いたデザイン手法が、他のアスパラギン酸プロテアーゼにも応用できることが分かった。
免疫系リセットによる炎症性腸疾患の画期的根治療法の開発

白血病が骨髄移植の恩恵で根治する時代になったが、IBDは良性疾患にも関わらず根治が困難である。我々はIBD関連腸炎惹起性メモリーT細胞が全身に長期に潜在することを突き止めた。その維持にはIL-7と腸内細菌が必須であることを明らかとしてきた。そのメモリーT細胞にはTh17細胞とTh1細胞が重要であるが、腸炎生体内で両者は干渉する現象を見つけた。さらに、Th17細胞とTh1細胞の発生にTh17→Th1細胞の経路があることを見出し、我々はalternativeTh1細胞と命名し、このalternative Th1細胞がclassical Th1細胞よりも腸炎には重要ではないかと提唱していた。さらに、制御性T細胞はこのTh17→Th1細胞の経路を阻害することで非腸炎状態でTh17細胞の蓄積という現象を見つけた。我々は免疫難病IBDが永続的に難治化する要因として腸内細菌とメモリーT細胞維持因子IL-7の相補的な寄与によって維持される腸炎惹起性CD4^+メモリーT細胞の永続的潜在性が原因であることを本年度研究計画最終年に解明した。(2)腸炎惹起性CD4^+メモリーT細胞の潜在には、驚くべきことに腸内細菌の存在は必須ではなく、メモリー細胞維持因子サイトカインであるIL-7によって維持されており、IBD治療の根本に抗生剤投与の無効性を指示する証明を行なった。一方で、腸内細菌が再燃因子である可能性を示唆したデータを示した。(Nemoto Y, Kanai T, et al. J Immunol. 2009)腸炎惹起性メモリーT細胞の加齢現象と緩解の関連性(1)CD4+CD45RBhighT細胞移入慢性大腸炎マウスより分離した腸炎粘膜内CD4+T細胞を新規SCIDマウスに移入し再び発症した腸炎粘膜内CD4+T細胞の再移入を繰り返すin vivo系において、6世代以降(総計2年以上)になると、腸炎の減弱、発症期の延長、発症率の減少を認めることを明らかとした。(2)重要な事実として未発症マウスから分離したCD4+T細胞を新たに分離したCD4+CD45RBhighT細胞と新規SCIDマウスへ共移入すると腸炎の発症を抑制することを明らかとした。さらに、未発症マウスCD4+T細胞には抑制性共刺激分子PD-1を強く発現していることを見出した。(3)腸炎惹起性メモリーT細胞は生体において免疫学的加齢過程で抑制性メモリーT細胞ヘコンバージョンすることを明らかとした。加齢にともなう抑制性CD4+T細胞はProgrammed celldeth-1(PD-1)分子の発現が亢進していることを明らかとした。(4)加齢抑制性メモリーT細胞はFoxp3陰性でIL-10を産生するTr1細胞に類似することを明らかとした。以上、平成22年度の研究において、腸炎惹起性メモリーT細胞は免疫学的加齢過程を経て、IL-10産生性の抑制性T細胞へと変貌を遂げることを実験的に証明し、ヒトIBDにおいて、発症後の早期の手術症例を防止することで、加齢に伴い、寛解へと誘導できる可能性を示唆した。炎症性腸疾患(IBD)は疾患のプロトタイプを記億してしまった細胞、すなわち、移動可能な(mobile)腸炎惹起性記憶(メモリー)T細胞が生涯にわたって全身に播種した病態であるという独自の仮説に立脚し、記憶を'悪性'から'良性'へとコンバートする免疫学的メカニズムを明らかし、IBD根治につながる基盤的研究に挑んだ。腸炎惹起性メモリーT細胞の生体維持機構の解明Helicobacter hepatitcus(Hh)という代表的な腸炎惹起性腸内細菌はノトシステムを用いて実験で、単独では腸炎を発症しないことを見出した。このことから腸炎には複合的な腸内細菌の関与が指摘され、感染症のような単独菌説より、dysbiosis説を指示する結果となった。さらに、SPF下で腸炎を惹起させたマウス腸管粘膜より採取した腸炎惹起性T細胞をHhノトマウスに再移入した場合にも腸炎は再現できず、腸炎惹起性T細胞の維持にも複合的な腸内細菌の存在が必要であることを示唆した。腸炎惹起性メモリーT細胞の加齢現象と緩解の関連性腸炎惹起性メモリー

T細胞の発達分化過程にこれまでTh1細胞とTh17細胞が関与し、それぞれが独立して支持分子の助けを借りて産生されると考えられて来たが、本研究で我々はin vivoでTh17→Th1細胞へ直線的に分化する経路が存在することを証明した(Sujino T,Kanai T,et al.Gastroenterology 2011.Kanai T,et al.Mucosal Immunol,2012)。以上、Th17細胞はそれ自体腸炎のエフェクター細胞ではなく、Th1細胞の幹細胞である可能性を提唱するきっかけとなった。したがって、これまで考えられてきたTh17細胞の二面性の複雑な性状を説明する好例として世界に発信することができた。
レーザープラズマ軟X線最のスペクトル強度増大に関する研究

レーザープラズマからの軟X線輻射効率のプラズマ体積依存性について実験的検証を行った。金及び銅の平板ターゲットに前駆レーザーバルス及び主レーザーパルスを約100μm300μmのスポット径に絞って照射する。前駆パルスと主パルスの時間間隔は約1nsから3nsの間で可変であった。前駆パルスを用いた目的は、主パルスのターゲットへの照射前に予かじめ、X線輻射を行なう為のプラズマを作っておくことである。こうしてつくられたプラズマの大きさはほぼレーザー軸方向に一次元であり、Cst(Cs:音速、t:パルス問隔)できまる。本実験の場合、Csは10^7cn/sec程度であり1nsのパルス間隔を使った場合、100μmとなり、直径100μm、長さ100μmの円筒状に近いプラズマが形成されていることになる。主パルスには263nmのレーザーと527nmのレーザーを用いた。主パルスの強度は10^<14>W/cm^2に、セットされ、パルスの時間幅は200psであった。前駆パルスの強度は主パルスによるX線輻射に影響を及ぼさないように、8×10^<13>W/cm^2という値にとられた。主バルスに263nmレーザーを使用した場合はhv=100-200eVの軟X線が最高3倍迄、体積増加により、増やすことができた。527nmのレーザーを使用した場合、100-200eVの軟X線は最高2倍、hv=1-3keV軟のX線は最高3倍迄、増加させることができる。
材料デ-タシステムを活用した技術アセスメントに関する基礎的研究

高度技術社会のパ-スペクティプを得るために、未踏の材料開発の探索の可能性を意識しつつ、デ-タベ-スを利用して金属、合金、セラミックス、有機材料、復合材料を含んだ材料技術全体像についての“地図"、“地質図"を作成した。一般に高度技術における材料は最も荷酷な条件下に置かれ、最も複雑でダイナミックなふるまいをし、最も精緻に制御され、最も安全に利用されるべき人工物である。サブヘプト秒の短い原子間衝突から数年の期待寿命に至る広い時間幅、原子レベルから数mにおよぶ寸法幅を持つ。材料を活用するためには、それぞれの材料の実像を把握するための高度の検索、編集、集約、モデル化支援、推算、可視化機能が必要である。つ、膨大なデ-タの検索編集というデ-タベ-ス管理システムの提供する機能、錯綜した論理操作を間違いなく効率的に行う知的機能、それぞれ異なる前提、適用範囲、計算効率/精度をもつ計算モデルの効率的実行、以上の処理結果の評価と意志決定、等々の諸機能が必要となる。材料の多様な使用目的に対応するに際して重要な点は、入手可能な情報を目的に合わせて組織化し、複合事象の可視化、評価を行い、次の意志決定に活用するダイナミズムにある。高度技術社会での材料技術の目標は、人間に合わせた関連事象の設計、制御、管理である。大局的な材料統計では、需要、インフラストラクチャ-、資源制約、環境などの外部性によって議論されているが、工学としては、そこで課題が生じたときの問題解決に出番、役割がある。象徴的には、kcal/mol近傍の領域から、MeV,mRy双方向への領域の視野の拡大こそ、目標とすべきところであると考えている。本年度は、そのためのシナリオの概要を作成し、またデ-タベ-ス部分については出版の準備を行った。
微量検体からの遺伝子変異診断による消化管間質腫瘍の新規治療戦略

消化管間質腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor:GIST)の腫瘍細胞DNAは、ホットスポット(多発域)Hotspotと呼ばれるある特定領域に遺伝子変異が多く、その中でも腫瘍遺伝子変異の中で最も頻度が高いKIT遺伝子のエクソン11の特定部位の変異に注目して、本研究をすすめてきた。粘膜下から発生する消化管間質腫瘍は、癌と異なり内視鏡にて直接観察が不可能であるため微量な腫瘍検体から得られた腫瘍由来DNAから変異DNAを検出することを目標として、増幅効率の良い高感度かつ特異的なAssayを開発することを目的としてきた。Assayの感度および定量性の検討を行うために、実際の臨床検体組織に応用する前に正常配列を含む正常配列プラスミドと変異遺伝子配列を含む変異配列プラスミドを作成した。プラスミドDNAの作成により、正確な定量が可能となったため、これらのDNAを標準コントロールDNAとして用いて、様々なコピー数・希釈率の検体を作成して増幅等の基礎実験を行い、高感度かつ特異度も高いAssay系の確立が可能であった。最終的には、本Assayを実際のGISTの臨床検体に応用した。消化管の粘膜下に存在する腫瘍に細い針を刺して得られた微量検体から抽出した変異の有無不明なDNAを用いて、Blind testにて特異的に変異遺伝子が検出できるか実験を行った。その結果、KIT遺伝子エクソン11の特定の変異に対して特異的に検出可能であり、今回開発したAssayは臨床応用可能であることが確認できた。胃などの消化管に多く発生する消化管腫瘍の一つである消化管間質腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor : GIST)の腫瘍細胞DNAはホットスポット(多発域)Hotspotと言われるある特定部位に遺伝子変異が多いことが知られている。その特徴的なDNA変異遺伝子の一つであるKIT遺伝子のエクソン11の特定領域に着目して、本研究をすすめている。研究目標としては、微量な腫瘍由来のDNAを高感度に検出する手法の開発を主眼においている。本年度は、微量なDNAからKIT遺伝子のエクソン11領域の遺伝子増幅をpolymerase chain reaction : PCR(以下、PCR)で高率よく行うための準備段階として適切なPCR反応が可能な条件設定を行った。当初は培養細胞から抽出したDNAを鋳型DNAとして用いて、適切な条件設定下にて良好なDNA増幅が得られることを確認した。その後臨床検体を用いて検体からの抽出DNAに対しても、前述した設定条件下でのPCRによるターゲット領域のDNA増幅が確認できた。さらにGIST本体の腫瘍部分のみを分離後DNA抽出を行い腫瘍成分を多く含有するDNAを用いて、同様に良好な遺伝子増幅が可能であった。PCR増幅後にDirect sequencingを行うことでDNAの遺伝子配列を決定することができるため、当初は細胞から抽出したDNAから増幅したPCR産物をDirect sequencing法にてDNA配列を決定して正常配列であることを確認した。同様の手法にて、臨床検体から抽出したDNAの遺伝子配列を検討したところ、複数にKIT遺伝子のエクソン11領域の遺伝子配列の異常が見つかった。目的とするKIT遺伝子のエクソン11領域の遺伝子増幅をpolymerase chain reaction (PCR)で高率よく行うための、最適なPCR反応の条件設定が可能であった。本研究初期において、基礎実験としての特定領域に対しての良好な遺伝子増幅を得ることが最も重要な課題であったため、次の実験段階にすすむことが可能となった。さらに腫瘍組織からのDNA抽出を行い、そのサンプル中でターゲットとしている変異DNAの同定もできたため、今後のコントロールにも応用可能となった。本年度は、特定遺伝子変異を含むKIT遺伝子のエクソン11領域の変異コントロールおよび正常DNA配列を含む標準コントロールのプラスミドDNAの作成に成功した。これらの標準コントロールDNAは正確なコピー数が事前に測定できるため、これらのDNAをテンプレートDNAとして、様々なコピー数のテンプレートDNAからのPCR増幅の確認を行った。さらに、作成した正常配列を含むコントロールDNAと変異配列を含むコントロールDNAが混在した様々な希釈列のBackground DNAを作成して、検出系でのDNA増幅、感度、特異度を検討している。コントロールDNAだけでなく臨床サンプルを用いての実験が最終的な目的のため、当施設の倫理委員会に実験の消化管間質腫瘍の病気の概要実験計画、臨床サンプルの採取方法などのプロトコールを提出、倫理委員会の承認が得られたため、臨床で消化管間質腫瘍と診断された症例から、継続的にサンプルを集積している。実際、微量な生体試料からの特異度、感度などの検討も現在行っている。研究2年目に目標としていた、標準コントロールのプラスミドDNAの作成に成功した。これを用いて次のステップに進むことが可能となった。また実際の臨床サンプル使用のため、倫理委員会の承認も得られており、継続的に実験試料を集積している。胃などの消化管に多く発生する消化管腫瘍の一つである消化管間質腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor:GIST)の腫瘍細胞DNAは、ホットスポット(多発域)Hotspotと呼ばれるある特定領域に遺伝子変異が多いことが知られている。

今回は、その中でも腫瘍遺伝子変異の中で最も頻度が高いKIT遺伝子のエクソン11の特定部位の変異に注目して、本研究をすすめてきた。微量な検体から採取した腫瘍由来DNAからでも変異DNAを検出することを可能とするため、増幅効率の良い高感度かつ特異的なAssayを開発することを目的としてきた。実際の臨床検体組織に応用する前に、正常配列を含む正常配列プラスミドと変異遺伝子配列を含む変異配列プラスミドを作成した。これらのプラスミドDNAは正確なコピー数が事前に測定できるため、これらのDNAを標準コントロールDNAとして用いて、様々なコピー数・希釈率の検体を作成して、増幅等の基礎実験を行い本Assayでの効率の良いPCR増幅の条件をはじめに設定した。次いで、これらの既知のコピー数が判明しているプラスミドを用いて、本Assayの感度・特異度を検討した。各種条件設定の検討の結果、感度は非常に良好で、特異度も高いAssay系の確立が可能であった。更に、実際の臨床でGISTサンプルから得られた微量な検体から抽出したDNAを使用しての臨床応用実験においても、同様に高感度で特異性の高いAssayであることが確認された。基礎実験は比較的順調に行うことが可能であったが、消化管間質腫瘍自体は、高頻度に発生する疾患ではないため、臨床検体の集積が遅れている。現在も継続的に、実験応用可能な試料を集積している。消化管間質腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor:GIST)の腫瘍細胞DNAは、ホットスポット(多発域)Hotspotと呼ばれるある特定領域に遺伝子変異が多く、その中でも腫瘍遺伝子変異の中で最も頻度が高いKIT遺伝子のエクソン11の特定部位の変異に注目して、本研究をすすめてきた。粘膜下から発生する消化管間質腫瘍は、癌と異なり内視鏡にて直接観察が不可能であるため微量な腫瘍検体から得られた腫瘍由来DNAから変異DNAを検出することを目標として、増幅効率の良い高感度かつ特異的なAssayを開発することを目的としてきた。Assayの感度および定量性の検討を行うために、実際の臨床検体組織に応用する前に正常配列を含む正常配列プラスミドと変異遺伝子配列を含む変異配列プラスミドを作成した。プラスミドDNAの作成により、正確な定量が可能となったため、これらのDNAを標準コントロールDNAとして用いて、様々なコピー数・希釈率の検体を作成して増幅等の基礎実験を行い、高感度かつ特異度も高いAssay系の確立が可能であった。最終的には、本Assayを実際のGISTの臨床検体に応用した。消化管の粘膜下に存在する腫瘍に細い針を刺して得られた微量検体から抽出した変異の有無
真核生物におけるD型セリンの機能と代謝

D型セリンの合成・分解を担う二酵素(細胞性粘菌セリンラセマーゼ、出芽酵母由来D.セリンデヒドラターゼ)の生化学的な解析を行った。細胞性粘菌由来セリンラセマーゼが、Mg^<2+>やCa^<2+>に加え、Na^+によっても活性化されることを見いだし、Na^+による活性化効果が、二価金属への結合に起因することを明らかとした。また、出芽酵母D.セリンデヒドラターゼが要求するZn^<2+>の意義について検証した。Zn^<2+>はD.セリンからのαプロトンおよびヒドロキシル基の脱離に必須であった。また、本酵素反応において、D.セリンからのαプロトンの引き抜きとヒドロキシル基の脱離が共役することを明らかとした。D-セリンは哺乳動物脳内でNMDAレセプターのコアゴニストとして作用する他、さまざまな神経疾患や発生との関連などが示唆されているが、その生理機能の全貌はまだ明らかではない。本研究ではD-セリンの代謝関連酵素の解析を通じて、真核生物におけるD-セリンの生理的役割の解明を目指している。本年度は、D-セリンに高い特異性を示す出芽酵母由来D-セリンデヒドラターゼの結晶構造解析を試みた。タンパク質結晶の析出条件等を検討し、2.4オングストロームの分解能のデータを得た。また、同酵素が有するユニークな亜鉛の依存性について検討した。その結果、亜鉛がD-セリンからのCαプロトンの引き抜きと、ヒドロキシル基の脱離の双方に必須であることが示された。同酵素を用いたD-セリンの高感度定量法の開発を行った結果、サブマイクロモルオーダーのD-セリンの定量が可能となった。本定量法をウシ血清やマウス脳抽出液、各種食品サンプル中のD-セリンの定量に適用し、これら試料に、本定量法が利用可能であることを示した。今後は、臨床応用を目指したより簡便な前処理法の確立を目指す必要がある。哺乳動物と同様のD-セリン代謝関連酵素を有する細胞性粘菌をモデルとし、その遺伝子破壊などを通して真核生物におけるD-セリンの生理的役割を検討した。細胞性粘菌におけるD-セリン合成酵素(セリンラセマーゼ)および分解酵素(D-セリンデヒドラターゼ)破壊株作製用プラスミドベクターを構築し、D-セリンデヒドラターゼ破壊株を所得した。Diセリンは哺乳動物脳内でNMDAレセプターのコアゴニストとして作用する他、さまざまな神経疾患や発生との関連などが示唆されているが、その生理機能の全貌はまだ明らかではない。本年度は、ヒト尿中に高濃度排出されるD-セリンの臨床的な意義の解明の第一段階として、D-セリンに極めて高い特異性を有する出芽酵母由来D-セリンデヒドラターゼ(Dsdlp)を利用したD-セリン酵素定量法(既に開発済み)のハイスループット化を目指した。96ウェルプレートを用いた酵素定量法の最適化を行い、ヒト尿中D-セリンの迅速定量が可能となった。また、Dsdlpはその活性にピリドキサールリン酸に加えて亜鉛を要求するユニークな酵素であり、その亜鉛の要求性を生化学的に検証した。その結果、亜鉛が酵素C末端のシステイン、ヒスチジン残基によって保持され、D-セリンからのヒドロキシル基の脱離に必須であること、また、このヒドロキシル基の脱離は、αプロトンの引き抜きと共役することを示した。さらに、細胞性粘菌D.discoideum由来Dsdlpのノックアウト株の構築と、そのフェノタイプの検証を遂行した。D.discoideum、Dsdlp欠損株は多細胞期でD-セリンの蓄積が観察され、発達遅延が観察された。またDsdlp欠損株では、胞子形成率が野生株と比較して1%以下に低下することが明らかとなった。
トルク検層を利用した山はね,ガス突出の危険性評価に関する研究

炭層ボーリングにおいてボーリングマシンに加わる負荷トルクと石炭の力学的性質および地圧との関係、さらにジャミングの発生条件を解明するために、直方体の石炭試料を用いてボーリングの模擬実験を行った。その結果、石炭試料に加わる応力が増加するのに伴って削孔時の負荷トルクおよび排出繰粉量が増大し、さらに最大主応力が石炭の単軸圧縮強度の3倍以上の地圧条件下ではジャミングが発生することが明らかになった。またジャミングが発生する際には、ボアホール周壁及び孔底先端で石炭が破砕することが確認された。さらに模擬実験に加えてボアホール周辺の変形・破壊を理論的に解明するために、石炭を線形ひずみ軟化を有する連続体としてモデル化し、軸対称問題の解を導き、あわせて数値計算を行った。その結果、ボアホール周辺の降伏域半径および内空変位は、石炭の破壊後の変形特性が脆性的なほど、また平均炭層地圧が増加するほど飛躍的に増大することが立証され、トルク検層の有効性が実験的のみでなく理論的にも裏づけられた。以上の基礎研究の成果に立って、本研究では炭鉱坑内にも適用できるトルク検層機器を開発した。計測機器はボーリングマシンの負荷トルクを検出し信号を送信するための非接触型のテレメータ発信機、トルク信号を受信するためのテレメータ受信機、およびトルクを連続的に記録するためのデータレコーダから成り、これらはそれぞれ本質安全および耐圧防爆構造となっている。これらのトルク検層機器を炭鉱の現場試験に適用した結果、ボーリング作業に何ら支障を来すことなく削孔時のトルクを連続的に計測しうることを確認することができた。また3孔のトルク検層試験の結果、トルク検層は切羽前方の高地圧帯の探索のみならず、ノンコアボーリングにおける岩相の判定や、断層等の地質的不連続面の探査にも有望な計測データを提供しうる可能性があることが示された。
3D shave-off分析法の開発と装置化

一辺が数マイクロメートルの固体を試料として,12時間の分析時間で,高い空間分解能と高感度での三次元分析ができる表面分析法を開発して装置化する。目標とする空間分解能は,X軸とY軸が数ナノメートル,Z軸が数10ナノメートルである。基礎となる分析法は,高い面方向分解能で,高感度なガリウム収束イオンビーム二次イオン質量分析法である。この目標を達成するために,一辺が数マイクロメートルのshave-off断面から同時に放出された複数のイオンをエネルギー収束・質量分散し,多元素を同時に,かつ元素ごとにZ軸方向で拡大結像できる検出原理を開発する。
子どもの睡眠の問題への認知行動療法プログラムの開発と有効性の検討

子どもの眠りは心身の発達上重要であるが、眠りの問題を有する児は多く、本邦の生活文化に適した評価法と介入法の開発が緊急課題である。本研究では、1子ども自身の眠りについての考え方の評価尺度(子どもの睡眠に対する非機能的信念と態度質問票;DBAS-C10J)を開発した。2本邦の文化と子どもへの親和性を鑑みて、カルタ形式の睡眠健康教育授業を開発し、効果を確認した。3睡眠障害を有する子どもへの認知行動療法プログラムを開発し、試行例全てで睡眠と社会生活の問題が改善した。4中学生版子どもの眠りの質問票を開発し、全国18中学校(3,084組)の回答を分析し、中学生の睡眠習慣や尺度の因子構造を確認した。本年度は、子ども自身の眠りに対する捉え方を測る尺度の日本語版の実施に必要な研究ツールの開発を行った。子ども自身の眠りに対する捉え方を測る尺度の原版(英語版)の開発過程では、外的妥当性の確認のために、英語版の小児用睡眠評価尺度が用いられており、本研究でも同様に、対象年齢に応じた子ども用の睡眠評価尺度を用いることが望ましい。そこで課題となるのは、小学生用には、我が国で信頼性・妥当性が十分確認された日本版小学生睡眠質問票(三星ら,2013)が存在するが、小学生睡眠質問票と連続性を持った中学生用の評価尺度が存在しないという点である。そこで、睡眠に対する信念を測る尺度の開発に先立って、小学生版との連続性を持ち、我が国の中学生の生活や睡眠の実情に見合った睡眠質問票を開発し、信頼性・妥当性を確認する作業が必要となった。まず、三星ら(2013)の小学生睡眠質問票をもとに、小学生版の作成に携わった小児睡眠医療の専門医師らにより、我が国の中学生の生活や睡眠の現状にふさわしくなるよう項目内容の修正や新規項目の選定を行った。この年齢では養育者と別室での就寝が増えることや遅寝の生徒が増えることなどにより、子どもの睡眠の実情を養育者が把握していない家庭も多い。また、中学生では本人がある程度自らの眠りについて報告可能と考えられる。そこで質問紙には、養育者が回答する質問群と、中学生本人が回答する質問群を用意した。完成した中学生睡眠質問票を、国内8府県の公立中学校18校において約4000名の中学生とその保護者に配布し、約3200名から回答協力を得た。また、各協力校の希望に基づき、各校の生徒の平均起床・就床時刻や睡眠時間などの基礎的なデータについて、各校に結果のフィードバックを済ませた。現在データについては引き続き解析中であり、日本版中学生睡眠質問票の信頼性・妥当性検討のための分析作業を進行する。今年度は、昨年度にデータを収集した日本版中学生睡眠質問票の結果を分析し、わが国の中学生の睡眠に関連する習慣の実態や、中学生の眠りの問題についての親子それぞれからの報告についてまとめ、国際学会で発表した。この質問紙は、睡眠習慣(起床・就床時刻など)や睡眠に関連する症状等について、保護者が子どもの睡眠について報告するパートと、子ども自身が自己報告するパートに分かれているが、1年生では保護者の報告と自己報告の間のずれは小さいが、2・3年生では、保護者の報告と子どもの自己報告の間にずれが見られた。3年生では、保護者の報告よりも子どもは実際には遅くに就床しており、総睡眠時間も短かった。また、保護者に、子どもの睡眠の良好さについて尋ねた項目(「全体として、お子さんの睡眠はよいと思いますか」)への回答は、子どもの自己報告による睡眠に関連する症状の重さとは関連が弱く、子どもの就床時刻の遅さとの関連が見られた。このことより、保護者は、「子どもが早く寝ること」を子どもの睡眠の良好さの指標として捉えがちである可能性が示唆された。また、日本版中学生睡眠質問票の標準化のために、さらに多くのデータを得るため、Webでの調査も計画・実施し、データ会社を通じて、全国の約2000名の中学生とその保護者に調査協力を依頼した。このデータについても、今後分析を進めていき、日本版中学生睡眠質問票の信頼性・妥当性検討を行う。前年度までに、我が国の中学生の生活や睡眠の実情に見合った中学生睡眠質問票を専門家チームにより開発しており、完成した質問票について、国内の公立中学校(18校)で約3200名から回答協力を得ていたが、本年度は、当該データについて解析を進行し、学会での発表を行った。解析により、本邦の中学生の睡眠習慣やライフスタイルにおいては、小学生版と同様に学年差が見られ、高学年になるほど、個室就床が進み、遅寝になり、それによって睡眠時間が短縮し、入眠潜時は長くなる傾向が見られた。また、高学年になるほど親子の報告する睡眠習慣のズレが拡大し、夜間のメディア利用時間が増加していた。また、保護者の報告の正確さについて検討した結果、本邦の保護者は、中学生年齢においても、子どもの睡眠習慣について比較的正確に把握していることが明らかになった。一方で、保護者の評価した「子どもの眠りの良さ」は、子どもの睡眠に関する諸症状よりも、就床時刻との関連が強く、本邦の保護者は、子どもが早く就床することを眠りの良好さの判断材料にしている可能性が示唆された。

また、一般の中学生における睡眠の評価尺度の因子構造を検討した結果、保護者の尺度では3因子(睡眠時無呼吸、パラソムニア、日中の行動/気分)、生徒の自記式尺度では6因子(概日リズムの問題、遅刻/欠席、朝の症状、日中の問題、不眠/悪夢、レストレスレッグス症候群)の因子構造を確認し、学会にて発表を行った。さらに、臨床群のデータの蓄積を進行した。子どもの眠りに対する捉え方を測る尺度の信頼性・妥当性を検討する上で必要なツールとして、まずその外的妥当性を検討するための中学生用睡眠評価尺度を開発する作業が必要となった。中学生用睡眠評価尺度の開発において、全国の多くの中学校から協力を得ることができたため(合計18校、4000名超)、データ収集に時間がかかった。また全ての協力校が結果のフィードバックを希望したため、各校の傾向の分析とフィードバック資料の作成等に多くの時間を要したことも、進捗の遅れの一因である。また、臨床群のデータの蓄積に時間を要している。上記手続きにより、それ以降の進捗に遅れが生じている。平成25年度は、本研究の遂行に欠かせない、中学生年齢の睡眠関連疾患を適切に鑑別可能な睡眠質問票(日本版中学生版子どもの眠りの質問票)を、小学生版の作成・標準化に携わった複数の小児睡眠の専門家の助言のもと作成し、全国18校(約4000組の親子)を対象に調査を実施した。平成26年度は、25年度に実施した質問紙調査の結果を解析し、国際学会で報告した。さらに、本邦の中学生の睡眠習慣をより広い地域において網羅できるよう、WEBによる全国調査(約2000組の親子)を計画・実施し、データを収集した。平成27年度は、日本版・中学生版子どもの眠りの質問票の結果を解析し、養育者と子どもの報告のズレ(不一致)の程度や、進級によるズレの加速、眠りに関連するライフスタイルの特徴についてまとめ、学会において報告した。本邦の養育者は、子どもの睡眠スケジュールをおおむね適切に把握できている一方で、子どもの“就床時刻の速さ"を手がかりに“眠りのよさ"を評価している可能性があり、それ以外の子どもの睡眠に関連する症状については、この年代では子ども本人から十分情報を得る必要があることが示唆された。さらに、中学生年齢での、主観的・客観的な睡眠症状の評価尺度の因子構造について解析し、睡眠を専門とする国際学会において報告した。平成28年度は、国内の小学校において、高学年を対象に睡眠健康教育の授業を複数回行い、授業の前後に親子へのアンケート調査を実施することで、子ども自身の眠りに対する考え方(信念)や態度について測る質問票の日本語版の信頼性・妥当性を検討するためのデータを収集した。また、睡眠関連疾患を有する小児を対象に、子どもの眠りの問題改善のための認知行動療法プログラムを構成し、実際に実施した。その結果、現在まで少数例の施行ではあるが、一定の効果と有用性を確認しており、今後も実践を重ねる予定である。子どもの眠りは心身の発達上重要であるが、眠りの問題を有する児は多く、本邦の生活文化に適した評価法と介入法の開発が緊急課題である。本研究では、1子ども自身の眠りについての考え方の評価尺度(子どもの睡眠に対する非機能的信念と態度質問票;DBAS-C10J)を開発した。2本邦の文化と子どもへの親和性を鑑みて、カルタ形式の睡眠健康教育授業を開発し、効果を確認した。3睡眠障害を有する子どもへの認知行動療法プログラムを開発し、試行例全てで睡眠と社会生活の問題が改善した。4中学生版子どもの眠りの質問票を開発し、全国18中学校(3,084組)の回答を分析し、中学生の睡眠習慣や尺度の因子構造を確認した。
周期領域でみた地震動強さの距離減衰に関わる関東東海地域の波動伝播特性に関する研究

埼玉県東松山市、千葉県館山市及び銚子市、伊豆半島修善寺町の4サイトを観測ネットとして、1979年6月からその本観測が開始された岩盤強震アレ-観測(表俊一郎委員長)は、1983年8月より更に埼玉県小川町、茨城県大洗町及び千葉県館山市の補助観測点を追加して、合計7サイト21点63成分のアレ-観測が実施継続されており、今日まで既に12年以上の期間にわたって多くの貴重な地震動記録を蓄積してきた。本研究は、これらの膨大なアレ-観測デ-タの中から特に比較的観測振幅の大きな305地震による4966成分の加速度時刻歴デ-タを用いて関東東海地域における短周期地震動の距離減衰特性に関する平均的な実験式を周期領域で求め、これよりQ値及びその周波数依存性を定量評価した。次に、この実験式を当該地域における平均的な距離減衰特性を表わす標準尺度として用いることにより、観測値とこの実験式による計算値との差異から短周期地震動の距離減衰特性に関わる地域特性を抽出し、その結果を他の地震学的デ-タと比較考察をして、本研究結果の妥当性を吟味した。なお、1989年以降は当該地域における地震発生がそれ以前に比し極めて少なかったため、最終年度用いたデ-タは初年度にそれに特に新たに追加することはしなかった。しかし、S波のQ値に関する新たな研究が最近幾つか発表されているので、本研究で求められたQ値およびその周波数依存性[Q(f)=af^nにおけるnの値]をこれらと比較照合して考察した事項もとりまとめ、初年度の1990年12月に東京で開催された第8回日本地震工学シンポジウムで発表した研究成果に次いで、1992年7月にマドリッドで開催される第10回世界地震工学会議にて発表致すべく論文を作成し、原稿を事務局宛て既に送付済みである。1.本研究は、地震動距離減衰特性を研究する基礎資料として優れた条件を具備している広域アレ-による岩盤強震アレ-観測観測、すなわち、岩盤強震アレ-観測委員会(表俊一郎委員長)により埼玉県の東松山及び小川、茨城県の大洗、千葉県の銚子及び館山A・館山B、伊豆半島修善寺、の7サイトの硬質地盤における合計21観測点63成分のアレ-観測により1979年以降十年余にわたり蓄積してきた膨大な地震動加速度記録の中から、周期2秒以下の短周期成分について充分信頼できる305地震による4966成分の加速度記録について時刻歴解析を今年度までにその都度実施し、デ-タベ-スの構築を計ってきた。2.これらの解析資料のうち、主として実体波が支配的とみられる短周期地震動(本研究ではT=0.1秒1.0秒に対象を絞る)の水平成分について周期領域における距離減衰式を作成し、距離減衰項に関わる回帰係数から、下式の如く周波数の0.73乗に比例するQ値の経験式を関東地方の平均な距離減衰式として提案した。これは、例えば科学技術庁防災科学技術研究所の関東東海地域における地震予知観測網によるデ-タを用いて佐藤(1986)が求めた結果とおおよそ符号するものであることを確認した。3.次に、これより得られた地震動水平成分の周期領域における回帰式を、関東東海地域の地殻・上部マントルを対象とした平均的距離減衰式として用いることにより、関東東海地域における距離減衰の3次元的地域特性を各震源ゾ-ン毎に検討し、伝播経路の相違による影響についてその特性を抽出した。

埼玉県東松山市、千葉県館山市及び銚子市、伊豆半島修善寺町の4サイトを観測ネットとして、1979年6月からその本観測が開始された岩盤強震アレ-観測(表俊一郎委員長)は、その後1983年8月より更に埼玉県小川町、茨城県大洗町及び千葉県館山市に補助観測点を追加し、合計ワサイト21点63成分の大規換広域同時観測によるアレ-観測が実施継続されており、今日まで既に12年以上の期間にわたって多くの貴重な地震動記録を蓄積してきた。本研究は、これら膨大なアレ-観測デ-タを用いて、関東東海地域における短周期地震動の距離減衰特性に関する平均的な実験式を求め、これよりQ値を定量評価した。次にこの実験式を当該地域における平均的な距離減衰特性を表わす標準尺度として用いることにより、観測値とこの実験式による計算値との差異から短周期地震動の距離減衰特性に関わる地域特性を抽出し、その結果を他の地震学的デ-タと比較考察して本研究成果の妥当性を吟味した。なお、1989年以降は当該地域における地震発生がそれ以前に比し極めて少なかったため(ちなみに主要な地震としては1990年2月の伊豆大島近海地震(M=6.5)及び東京震度Vを記録した1992年2月の東京湾南部浦賀水道地震(M=5.7)に限られ、後者は本研究課題最終年度末の地震であったため本研究で使用するには至らなかった)、今年度用いたデ-タは初年度のそれに特に追加することはしなかった。しかし、S波のQ値に関する新たな研究が今年度幾つか発表されているので、本研究で、ためられたQ値及びその周波数依存性に関わる特性、すなわちQ(f)∞f^nにおけるnの値とをこれらと比較照合して考察した事項をとりまとめ、1992年7月下旬にスペイン・マドリッドで開催される第10回世界地震工学会議発表論文として作成し、すでに事務局宛発送済みである。
インフルエンザ脳症を誘発する感受性因子の解明を基盤にした診断・治療法の開発

インフルエンザで重症化すると脳症や多臓器不全等を引き起こすが、その詳細な機序は不明である。そこで申請者らはインフルエンザの重症化モデル(CPT2遺伝子改変)マウスを作出し、ウイルス感染試験を実施した結果、全身性のATPの枯渇が認められた。以上の結果から、本病態の主要因は全身性のATPの枯渇であることが明確になった。さらに、本結果を基盤にした新規の重症度診断法と治療薬(代謝改善薬)を開発することに成功した。インフルエンザは急性の呼吸器感染症であり,特に小児では脳症や多臓器不全を来たして重症化する傾向が高い.一般的にウイルスに感染すると炎症性サイトカイン,NO,O^<2->等が過剰産生され,これらが血管内皮細胞を障害することが報告されている.従って,脳症は脳の血管内皮細胞の透過性亢進による急速な脳の浮腫であると考えられ,また多臓器不全は血管内皮細胞の浮腫による末梢血循環不全が原因であるものと推定されている.しかし血管内皮細胞の障害は程度の差こそあれ感染者に共通するものであり,小児で重症化が起こりやすい説明にはならない.我々は,重症化を左右する感受性因子はATP(アデノシン三リン酸)であることを明らかにした.すなわち,成人と比較して小児ではATPの体内消費が大きく,脂肪酸代謝への依存度も高いために,持続的な高熱に晒されることで脂肪酸代謝酵素(CPT2)が熱失活し,これにより全身性のエネルギー産生障害(ATPの枯渇状態)に陥りやすいことを明らかにした.当該年度はインフルエンザの重症化に関与すると考えられる遺伝子(CPT2, PRSS1, PRSS2等)の欠損マウスを作製して,ウイルスの感染試験を実施した。その結果,CPT2遺伝子の欠損マウスでは野生型マウスと比較して,重症化すること,そして全身組織でATPが著名に低下していることを再確認した.さらに全身組織でのATPの枯渇は脂肪酸代謝酵素の鍵酵素であるCPT2の熱失活の他にも,糖代謝の鍵酵素であるPDHの活性が阻害されている事実を見出した.以上の観点から,インフルエンザの重症化の防止薬(代謝改善薬)として脂質代謝異常改善薬であるBezafibrateあるいは糖代謝改善薬であるLiverall(ジクロロ酢酸製剤)の投薬は安全性かつ治療効果が高いと推定された.今後は,当該年度に作製した各種遺伝子欠損マウスを用いたウイルス感染試験を実施し,上述の薬剤の治療効果について評価する。インフルエンザ罹患患児検体あるいは本研究で作出した遺伝子欠損マウスを用いた解析により、インフルエンザの重症化には以下の2つの因子が重要であることが明らかになった。1.共通因子インフルエンザ罹患後に一過的に起こるサイトカインの産生が、血管内皮障害・異所性トリプシンの過剰産生を引き起こし、このトリプシンがウイルスの増殖能を活性化するサイクル「Influenza virus-Cytokine-Protease Cycle」の存在が明確になった。2.特定因子ミトコンドリアの脂肪酸代謝酵素であるCPT2遺伝子上に特定の多型を保因する患児(特に日本人に多い)は、インフルエンザ罹患後の高熱時に本酵素の酵素活性の低下、すなわち全身組織のエネルギー(ATP)枯渇に陥り、エネルギー需要量の多い組織(脳・心臓)では機能不全に陥りやすいことを実証した。さらに小児では糖代謝と比べ脂肪酸代謝によるATP産生の依存度が高く、本多型の保因児ではウイルス罹患時に重症化すると判断した。以上の結果を基盤にした診断・治療法の開発を実施した。1.診断法の開発インフルエンザを含む多様な疾患で重症化する患者では血液を含む全身組織でATPが枯渇することを見出し、患者の未梢血中のATPの定量を基盤にした革新的な重症度診断法を開発した。2.治療法の開発インフルエンザの重症化の主要因は全身性のATPの枯渇、すなわちミトコンドリアの脂肪酸代謝の低下が原因であることから脂肪酸代謝の改善薬(Bezafibrate)の投薬が有効であることを見出した。他にも、脂肪酸代謝の代わりに糖代謝を亢進させてATPの枯渇を防止する治療法(ジクロロ酢酸誘導体の投薬)がインフルエンザの症状を劇的に改善することを見出した。上述した治療法はマウスを用いた動物試験の結果であり、今後はこれらの治療法がヒトでも有効であることを慎重に検討し、評価する予定である。