hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物活性二次代謝産物に見る多様性の分子基盤の解析と展開

結晶構造解析の結果から、重水素置換によりβ-カロチンの炭素-炭素間の結合長が縮小されることを発見した。(1)ラクタムポリケチド抗生物質ビセニスタチンの糖部分はビセニサミンであるが、マイカロースを糖とするビセニスタチンMも生産される。この構造多様性は糖転移酵素の基質特異性に由来すると考えられ、生合成遺伝子クラスターの解析からvinCが本酵素をコードすると推定された。vinCを大腸菌にて大量発現し、酵素精製を行い、さらに活性を確認した。上記二種の糖のdTDP誘導体が真の基質であり、またdTDP-2-デオキシグルコースも基質となることを明らかにし、本酵素の基質特異性が緩やかであることを確認した。(2)ビセニスタチン生産菌Streptomyces halstedii HC34に新たなPKS遺伝子を発見し、紫外部吸収を指標に培養液を検索して新物質を見いだした。現在構造研究、新規遺伝子との対応関係、及び生物活性試験を進めている。(3)Streptomyces gliseolosporeusの産するジテルペン型抗生物質テルペンテシンの骨格炭化水素テルペンテトリエンの生合成機構について、環化酵素遺伝子をSt. lividansで発現するとともに、我々が開発した完全重水素化メバロン酸による標識と重水素標識代謝産物の^1H-NMRによる詳細な解析で、環化の立体化学、メチル及びヒドリドの転位、配座の転換などの諸過程を精密に解明した。(4)アミノ配糖体抗生物質の多様性の分子基盤を解明するために、これまでに解読のほぼ終わっているブチロシン生合成遺伝子(btr)クラスターに加え、カナマイシン生産菌Streptomyces kanamyceticusゲノムについてbtrS類似遺伝子を指標に生合成遺伝子を検索した。btrSに対応するkanSとともに、btrCに対応するDOI合成酵素遺伝子kanCを放線菌で初めて同定した。本研究は、二次代謝系の多様性発現基盤を遺伝子解析と反応特異性の観点から明らかにし、有用物質生産に資することを目的とし、(1)ラクタムポリケチドビセニスタチンの生合成における糖転移酵素遺伝子vinCの破壊株を樹立し、またスタータ活性化に関わるvinM及びvinNの発現系を確立し、酵素精製と機能解析を進めた。(2)VinCを大量精製し、基質本体をdTDP-ビセニサミンと証明した。さらにアグリコンの異性体ネオビセニスタチンアグリコンを新たに合成し、糖転移反応が天然型と同効率で進行することを示した。全く異なる骨格を持つBrefeldin A及びEstradiolをビセニサミン受容体として全く新規な配糖体の創製に成功し、VinCが適切な疎水性結合と分子サイズにより多様なアグリコンを認識出来ることを示した。(3)ビセニスタチン生産菌に発見した新規ポリケチド合成酵素に対応する代謝物を精査し、新規28員環マクロリドHalstoctacosanolide A及びBを単離構造決定し、その生合成遺伝子の約70%を解読した。(4)イソプレノイド生合成の精密解析プローブとして完全重水素化メバロノラクトンの実用的不斉合成法を開発し、放線菌のジテルペン環化酵素の反応機構を動的に解明した。(5)放線菌Streptoalloteichushindstanusのアミノ配糖体生合成遺伝子の解析を進め、糖質環化酵素遺伝子を大量発現して機能を確認した。
BMP活性を促進する血清由来タンパク性因子の単離・同定と生理的役割の解明

我々は、骨芽細胞の分化促進作用を指標として、血清からタンパク性因子を精製・単離した。本因子は単独で活性を示さないものの、骨誘導因子(BMP)による骨芽細胞分化誘導活性を促進する因子であった。本因子とBMPを作用させた細胞内では、BMPのシグナル伝達因子であるSmad1/5/8のリン酸化レベルが更新した。本因子は、経時的に標的細胞の中に取り込まれることも明らかとなった。これは温度感受性で、細胞表面のタンパク質を除去すると取り込みが抑制されるが、ヘパラン硫酸などの糖鎖を除去しても取り込みに変化は認められないことから、タンパク質を介したエンドサイトーシスによって取り込まれると考えられた。本因子を血小板内で過剰発現させたトランスジェニックマウスと、本因子を欠失したノックアウトマウスを用いて、骨折の再生過程を比較した。その結果、ノックアウトマウスでは骨折治癒が遅延し、トランスジェニックマウスでは逆に治癒が促進することが明らかとなった。これらの結果は、本因子が骨再生に重要な因子であることを示している。また、我々は血清中にBMPが高比活性な高分子複合体として存在することを明らかにした。血清中のこれらの因子が骨代謝を制御している可能性が示唆される。同時に、我々はヘパリンのような硫酸化多糖がBMP活性を強力に促進することを見いだした。このヘパリンによるBMP活性の促進作用は、マウスを用いたin vivoの異所性骨形成実験でも確認された。ヘパリンの作用メカニズムとして、主に分解によると考えられるBMPの急激な消失を抑制し、BMPの半減期を約20倍に延長することが重要と考えられた。我々が見出した因子は、ヘパリンと異なり短時間で作用を示したことから、ヘパリンと本因子の作用メカニズムは異なることが示唆された。本因子は、生理的な骨形成や骨再生を制御する重要な因子と考えられる。骨形成を強力に促進する成長因子として、骨誘導因子(Bone Morphogenetic Protein, BMP)が知られている。培養細胞や小型動物では、BMPによって効率よく骨形成が誘導されるが、ヒトを含めた大型動物ではBMPの骨誘導活性が低い。この原因は明らかでないが、BMPの活性を促進する方法を確立できれば、BMPの臨床応用が可能になると期待される。本研究では、BMPによる骨芽細胞の分化誘導活性を促進するような因子を探索し、ウシ血清より活性本体を単離・同定することに成功した。本因子を大腸菌内で発現させたリコンビナント標品も、in vitroでBMP活性を促進することを確認した。さらに、BMPと本因子をマウスに移植したところ、本因子はBMPの骨誘導活性を促進することが明らかとなった。したがって、本因子は培養細胞のみならず、in vivoでもBMP活性を強力に促進することが確認された。現在、大量のリコンビナント標品を取得するために、大腸菌以外にもカイコを用いたタンパク質生産システムを構築している。当初、本因子の遺伝子改変マウス(ノックアウトマウス、及びトランスジェニックマウス)を作成し、それらの骨組織を解析する予定であった。しかし、米国のグループによりこれらのマウスが発表されたため、急遽、計画を変更し、その米国の研究グループからマウスの供与を受けることとした。この変更に伴い、本年度購入したPCRサーマルサイクラーが必要となった。すでにマウスを輸入し、実験に必要な数を確保するために繁殖を開始した。以上のように、本年度の研究により、我々が発見した血清由来タンパク質がin vivoでもBMPが誘導する骨形成を促進することが明らかとなった。

次年度は、本因子の作用機序と共に、骨代謝における生理的な役割を解析する予定である。前年度の研究により、我々が血清から単離・同定した血小板由来因子は、BMPによる骨芽細胞分化を強力に促進することが判明した。本因子の作用はBMP-2と同時に標的細胞に作用したときに認められ、本因子で前処理した細胞には全く効果を示さないことが判明した。本因子とBMPを作用させた細胞内では、BMPのシグナル伝達因子であるSmad1/5/8のリン酸化が更新したことから、これがBMP作用の促進を引き起こすものと考えられた。本因子は、経時的に標的細胞の中に取り込まれることも明らかとなった。これは温度感受性で、細胞表面のタンパク質を除去すると取り込みが抑制されるが、ヘパラン硫酸などの糖鎖を除去しても取り込みに変化は認められないことから、タンパク質を介したエンドサイトーシスによって取り込まれると考えられた。本因子を血小板内で過剰発現させたトランスジェニックマウスと、本因子を欠失したノックアウトマウスを用いて、骨折の再生過程を比較した。その結果、ノックアウトマウスでは骨折治癒が遅延し、トランスジェニックマウスでは逆に治癒が促進することが明らかとなった。同時に、我々はヘパリンのような硫酸化多糖がBMP活性を強力に促進することを見いだした。このヘパリンによるBMP活性の促進作用は、マウスを用いたin vivoの異所性骨形成実験でも確認された。ヘパリンの作用メカニズムとして、主に分解によると考えられるBMPの急激な消失を抑制し、BMPの半減期を約20倍に延長することが重要と考えられた。我々が見出した因子は、ヘパリンと異なり短時間で作用を示したことから、ヘパリンと本因子の作用メカニズムは異なることが示唆された。本因子は、生理的な骨形成や骨再生を制御する重要な因子と考えられる。
ナノ界面を制御したMg複合ナノ粒子の創製による常温付近での高密度水素貯蔵

再生可能エネルギーの有効利用のためには、水素によるエネルギー貯蔵が有効であり、この実現のためには低コストかつ高性能な水素貯蔵材料の開発が喫緊の課題となっている。本研究では安価なMgをベースとして遷移金属との界面を有した複合ナノ材料を開発し、界面状態を制御することで水素吸蔵能の向上を目指している。平成30年においてはMgとMnを同時に蒸発させることで複合ナノ粒子の作製に成功した。透過型電子顕微鏡観察から見積もられた粒径は10 nm程度であり、粒子内でMgとMnが均一に混ざり合っていることが明らかとなった。この傾向は組成を変化させても変わることがなかった。MgとMnはバルク状態では混ざりあうことのない金属同士にも関わらず、ナノ粒子中で均一に分散していることは大変興味深い。しかし、現時点での懸念として、大気中での試料輸送を経て分析を行っているため、分析結果に対する大気酸化による影響は除去しきれない。そこで、高真空下での試料輸送を可能とするトランスファーベッセルの制作および、試料の水素化と試料輸送が可能なトランスファーベッセルの設計を行った。Mgナノ粒子は真空下においてでさえ残留ガスによってすぐさま酸化してしまうが、高真空対応のトランスファーベッセルを用いることで運搬時の酸化を抑制し、そのままの状態を分析することが可能である。また試料の酸化抑制と水素化を同時に満たすべく、加熱とガス導入が可能なトランスファーベッセルを設計した。これらを併用しつつ、X線吸収微細構造分析や水素化した試料に対する昇温脱離測定を行うことで、界面状態と水素吸蔵能の関係を調べていく予定である。すでに試料作製装置の立ち上げとその調整を終えている。試料作製に成功し電子顕微鏡による観察等の分析も実施済みであり、外部実験施設での測定の準備も特段の問題なく進めている状況のため、おおむね順調といえる。今後は高真空対応トランスファーベッセルと水素化反応トランスファーベッセルを用いることで、Mg複合ナノ粒子の水素化前後における界面状態の分析を進めるとともに、昇温脱離実験を行う予定である。事前の予想に反して、既存の備品の流用によって実験装置を構成することが可能となった。当該年度に執行予定であった予算を次年度以降の計画実施に用いることで、より良い研究への昇華させることを着想したため。
ツイスター空間の幾何学

1.「実2次元トーラスの作用を許容する単連結コンパクト自己双対多様体は,ある自然数mに対する複素射影平面m個の連結和mCP(2)と微分同相であり,その自己双対構造はJoyceが1995年に構成した例のいずれかと同型である」,というJoyceの予想を,このような多様体に対しそのtwistor空間の構造を詳細に調べることにより,解決した.実際,より一般に,単連結の仮定なしに,トーラス作用を許す自己双対多様体を完全に分類した.この研究の副産物としてJoyceの自己双対計量に対応するtwistor空間の複素多様体としての精密な構造を明らかにすることができた.特にその適当な双有理型モデルは,射影toric曲面のファイバー空間として実現され,この構造がもとのトーラスのmCP(2)への作用の不変量から完全に決定できる.この多様体はMoishezonであるがその射影モデルの構成は今後の興味ある課題である.2.Joyce twistor空間の変形空間を研究しその倉西空間が非特異であることを示した.また,このような変形を用いて,4以上の任意の整数mに対しmCP(2)上の正型の自己双対構造で,対応するtwistor空間の代数次元が2であるものの最初の例を与え,これにより,mCP(2)に随伴するtwistor空間の代数次元の分布について一つの決着を与えた.さらに,4CP(2)上の場合には代数次元が2となるtwistor空間の構造を一般的に楕円ファイバー空間として詳細に記述し,さらにこれらから分岐被覆をとることにより,標準束が自明となるコンパクト複素多様体の興味ある系列を構成した.後者の構造については,今後さらに詳細に研究したい.1.「実2次元トーラスの作用を許容する単連結コンパクト自己双対多様体は,ある自然数mに対する複素射影平面m個の連結和mCP(2)と微分同相であり,その自己双対構造はJoyceが1995年に構成した例のいずれかと同型である」,というJoyceの予想を,このような多様体に対しそのtwistor空間の構造を詳細に調べることにより,解決した.実際,より一般に,単連結の仮定なしに,トーラス作用を許す自己双対多様体を完全に分類した.この研究の副産物としてJoyceの自己双対計量に対応するtwistor空間の複素多様体としての精密な構造を明らかにすることができた.特にその適当な双有理型モデルは,射影toric曲面のファイバー空間として実現され,この構造がもとのトーラスのmCP(2)への作用の不変量から完全に決定できる.この多様体はMoishezonであるがその射影モデルの構成は今後の興味ある課題である.2.Joyce twistor空間の変形空間を研究しその倉西空間が非特異であることを示した.また,このような変形を用いて,4以上の任意の整数mに対しmCP(2)上の正型の自己双対構造で,対応するtwistor空間の代数次元が2であるものの最初の例を与え,これにより,mCP(2)に随伴するtwistor空間の代数次元の分布について一つの決着を与えた.さらに,4CP(2)上の場合には代数次元が2となるtwistor空間の構造を一般的に楕円ファイバー空間として詳細に記述し,さらにこれらから分岐被覆をとることにより,標準束が自明となるコンパクト複素多様体の興味ある系列を構成した.後者の構造については,今後さらに詳細に研究したい.4次元コンパクト自己双対多様体Mに対応するtwistor空間Zについて,その代数次元a=a(z)が正(i.e=1,2or3)となる場合を研究した.基本結果は“この場合もとのMに強い位相的制限がつく"との発現である.正確に述べると,a>0なら,Mは(1)mCP^2=CP^2#...#CP^2(m個,m>0)と同相であるか,(2)(有限次不分岐被覆を除き)(S^1×S^3)#mCP^2(m>0)と同相であるか,(3)(有限次不分岐被覆を除き)hyperkahler多様体であるか[このときa=1],4)(おそらく存在しない)ある例外的な場合[このときa=1]であるか,のいずれかである。(ただしCP^2は複素射影平面,#は連絡和S^kは次元球面を表す。)[よってToubesの一般的構成によるMに対してはほとんどの場合a=0となる]さて1),3)の場合には研究が進んでいることから,おもに(a≠3となる)2)の場合に主に研究を行った。まずm=0の場合:(有限二次不分岐被覆を除き)Mは標準的な共形平坦エルミートHopf曲面に限ることを示し,Mのパラメータに依存して対応するa(z)を決定し,Zの代数reductionfの構成を詳しく調べた。特にa=1の場合Mはhypenernitianであるかまたはfの一般ファイバーは種数1の線維面であり一般には正規でないことがわかった。さらにm>0の場合,a=2とするとZのNevon-Severi群に特長的な性質が現れ,その応用としてしてある種の条件のもとでa【less than or equal】1を示した。

この結果はLaBrunによる一連のtwistor空間の代数次元に関するLaBrunの予想の解決を1.「実2次元ト-ラスの作用を許容する単連結コンパクト自己双対多様体は,ある自然数mに対する複素射影空間m個の連結和mCP(2)と微分同相であり,その自己双対構造はJoyceが1995年に構成した例のいずれかと同型である」,というJoyceの予想を,このような多様体に対しそのtwistor空間の構造を詳細に調べることにより,解決した.実際,より一般に,単連結の仮定なしに,トーラス作用を許す目己双対多様体を完全に分類した.この研究の副産物としてJoyceの自己双対計量に対応するtwistor空間の複素多様体としての精密な構造を明らかにすることができた.特にその適当な双有理型モデルは,射影toric曲面のファイバ-空間として実現され,この構造が、もとのト一ラスのmCP(2)への作用の不変量から完全に決定できる.この多様体はMoishezonであるがその射影モデルの構成は今後の興味ある課題である.2.Joyce twistor空間の変形空間を研究しその倉西空間が非特異であることを示した.また,このような変形を用いて,4以上の任意の整数mに対しmCP(2)上の正型の自己双対構造で,対応するtwistor空間の代数次元が2であるものの最初の例を与え,これにより,mCP(2)に随伴するtwistor空間の代数次元の分布について一つの決着を与えた.さらに,4CP(2)上の場合には代数次元が2となるtwisor空間の構造を一般的に楕円ファイバー空間として詳細に記述し,さらに.これらから分岐被覆をとることにより,標準束が自明となるコンパクト複素多様体の興味ある系列を構成した,後者の構造については,今後さらに詳細に研究したい.
正常中皮・中皮腫特異的な糖鎖マーカーの開発と，その構造的・機能的解析

正常中皮細胞や悪性中皮腫細胞の膜上に6-硫酸化シアリルラクトサミンという糖鎖が発現していることを、免疫組織化学・高速液体クロマトグラフィー・質量分析法で突き止めた。様々な亜型の悪性中皮腫でも発現していることから、中皮細胞に特異的に発現するマーカーは病理診断において非常に有用であり、診断応用が期待される。また、この糖鎖はマウスの実験によって、中皮細胞内に存在するKSGal6ST・GlcNAc6ST-1・GlcNAc6ST-2という酵素によって生合成されていると考えられた。これは硫酸化糖鎖の生体分布に関する糖鎖生物学的な新知見である。福井大学医学部附属病院で9例の悪性中皮腫・2例のadenomatoid tumor・2例の正常中皮症例を収集し,ホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて中皮細胞に発現する糖鎖プロファイルを検証した.糖鎖をエピトープとする各種抗体を用いて免疫組織化学を施行し,中皮細胞上に発現する糖鎖はO型糖鎖コア2上に発現する6-硫酸化シアリルN-アセチルラクトサミンと推定できた.特に悪性中皮腫ではepithelioid・sarcomatoid・desmoplasitcのいずれの組織亜型でも陽性となったことから,悪性中皮腫の組織学的マーカーとしての役割が期待できる.また悪性中皮腫株ならびに不死化中皮細胞株を複数入手し,コア2糖鎖構造の構築に必要なcore2 branching enzymeならびにN-アセチルグルコサミンの6-硫酸化に必要なGlcNAc6ST-2がmRNAレベルで発現していることを確認し,免疫組織化学的見地との整合性を確認した.さらに糖鎖生物学的な解析をいくつか加えた.マウスの胸膜を採取してウェスタンブロット解析したところ,6-硫酸化糖鎖を含むタンパク質は250kD以上の大きさであり,この糖鎖はムチンなどの巨大分子上に発現していると考えられた.また各種硫酸転移酵素KSGla6ST・GlcNAc6ST-1・GlcNAc6ST-2欠損マウスを用いて検証し,これらのトリプルノックアウトマウスでは胸膜中皮細胞上に発現しているN-アセチルグルコサミンの6-硫酸化が行われていないことを確認した.これらの結果は,未知な部分が多い硫酸化糖鎖の生体内での発現分布や発現機構の解明に新たな知見を与えるものである.概ね研究計画通りに進行しており,研究計画を大きく遅延させるような要素は今のところは無い.正常中皮のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)材料では,免疫組織化学的に,中皮細胞表面に6-硫酸化シアリルラクトサミンが発現している一方で,core 1 extension上のN-アセチルグルコサミンは硫酸化されていないことを突き止めた.一方で,中皮不死化細胞・悪性中皮腫細胞を計16株を用意し,細胞表面に発現している糖鎖プロファイルを検証したところ,6-硫酸化シアリルラクトサミンの構造発現は15株で確認できなかった.残り1株では発現が微量に確認できたが,core 1 extension上のN-アセチルグルコサミンの6位も硫酸化されていると考えられ,FFPE材料から類推された糖鎖構造とはdiscrepancyが生じた.今後は生体から直接得られた材料を中心に解析する方針とし,ヒト正常胸膜を剖検時に採取して,中皮細胞に発現する糖鎖プロファイルを高速液体クロマトグラフィーならびに質量分析法で解析した.その結果,6-硫酸化シアリルラクトサミンの存在が確認でき,少なくともin vivo環境では6-硫酸化シアリルラクトサミンが中皮細胞膜上に発現していると考えられた.また同時に,シアル酸も硫酸化されている可能性が示唆された.特に硫酸化シアル酸を含む糖鎖が中皮細胞上に発現している点は,未知な部分が多い硫酸化糖鎖の生体内での発現分布や発現機構の解明に新たな知見を与えるもので,現在英語論文の投稿準備を進めている.また,論文への掲載の見込みが立ち次第,国内外での学会発表を予定している.正常中皮細胞や悪性中皮腫細胞の膜上に6-硫酸化シアリルラクトサミンという糖鎖が発現していることを、免疫組織化学・高速液体クロマトグラフィー・質量分析法で突き止めた。当初の研究計画に従って,研究を進めていく.推定された糖鎖構造を詳細同定させるため,高速液体クロマトグラフィーや質量分析を行う.また胸膜の人体材料を収集して,ヒトでの糖転移酵素・硫酸転移酵素の発現を検証していく.糖鎖生物学
マイクロRNAによるミクログリア活性化制御の解明

神経傷害後の脊髄でマイクロRNAの発現量をマイクロアレイ技術を用いて網羅的に解析した。また同時に脊髄内遺伝子発現情報をDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。解析の結果、炎症反応に関連する遺伝子群で時間依存的な発現増加を示すデータが得られた。この中で、転写因子mafbについては病態形成時早期から脊髄のミクログリア細胞に限局してその発現がみられ疼痛発症過程に関与することを見出した。平成23年度までに神経障害性疼痛モデル動物の脊髄内で発現変動するマイクロRNAを見出していたが、変動したマイクロRNAのターゲット予測とDNAマイクロアレイの解析結果、及び脊髄標本の免疫染色結果から骨髄由来マクロファージの分化に関与するとされる転写因子mafbの発現増加がミクログリア特異的に起こっていることが示唆された。末梢神経切断後、一部の脊髄ミクログリアの核内でMafB発現は顕著に増加しており、MafB陽性ミクログリアは、末梢神経損傷後1日目から観察され、増殖マーカーおよび活性化表現型マーカーCD68の局在と一致していた。培養ミクログリアにおいてsiRNAによってMafb遺伝子をノックダウンすると、痛みに関連した遺伝子の発現レベルが低下した。神経障害性疼痛モデルマウスに対しsiRNAをマウス脊髄腔内に投与することによってミクログリアにおけるmafb発現増加を抑制すると、モデル動物における疼痛関連行動が有意に抑制された。また、この動物における脊髄内での疼痛関連遺伝子の発現量は対照群に対して抑制することをリアルタイムPCR法を用いて確認した。傷害を受けた後根神経より産生放出されるケモカインの一つであるCCL21は、in vitroおよびin vivo両方の試験においてミクログリアのMafB発現を増強した。本研究結果は、MafBは末梢神経傷害後の活性化ミクログリアに誘導され、疼痛発症に関与する重要な転写因子であることを示唆している。平成23年度は、マウスを用いて神経障害性疼痛モデル動物を作成し、動物の脊髄組織をサンプルとして神経傷害側と非傷害側に分けてRNAを抽出した。術後1、3、10日のそれぞれの時間において損傷側、非損傷側のマイクロRNA発現パターンをマイクロアレイ技術を用いて網羅的に解析した。また同時に同じRNAサンプルを用いて脊髄内遺伝子発現情報をDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。解析の結果、ケモカインシグナリングに関連する遺伝子群25個で一過性または時間依存的な発現増加を示すデータが得られた。サイトカインシグナルを含めると53個、転写因子を含む核内タンパク質をコードする遺伝子は39個で発現上昇が見られた。この中には未だ公に研究報告のない遺伝子も含まれており、新規疼痛関連遺伝子候補として重要な情報を得ることができた。特に転写因子mafbについては病態形成時早期からミクログリアに限局してその発現がみられており、これをターゲットとするマイクロRNAについても注目している。脊髄マイクロRNAの発現は全体的に発現量や変化率は低いものであったが、20%以上の発現増加を示すものが10種、20%以上の発現低下を示すものが4種挙げることができた。これらすべてのマイクロRNAとすでに免疫系との相関が報告されている11種のマイクロRNAを測定するためのDNAプローブを設計し、RNAサンプルに関しても術後0.5、1、2、3、5、7、10、14、28日における脊髄サンプルを作成した。これらサンプルを用いることによって詳細なマイクロRNA発現タイムコースを測定することができ、遺伝子発現パターンを照らし合わせることによって、効率よく病態に強く関与するマイクロRNA種を解析することができる。当初計画よりRNAサンプルの取得タイムコースを長くしたため解析により時間がかかっているが、病態が徐々に自然回復へ向かっていく過程を含ませるように設定しており、ここにおける情報には能動的に病態を回復へ向かわせるための重要な情報が含まれていると考えている。当初研究計画通り解析項目をできるだけ早く消化してゆく。ミクログリアに限局して見られた転写因子mafbについては特に注目して疼痛病態への関与を追究する。解析によって抽出されたマイクロRNA種についてはTaqmanプローブを用いたリアルタイムRTPCR法を用いてより詳細な発現変化パターンを定量的に解析すると同時に、in situハイブリダイゼーションを行い、細胞種特異的マーカーとマイクロRNAの局在を明らかにする。発現変化が見られたマイクロRNAの標的遺伝子をホモロジー検索によって選択する。マイクロRNA又は、その相補的な配列によりマイクロRNAの活性を阻害する配列をコードするレンチウイルスベクターを用いて神経障害性疼痛モデル動物の脊髄内にベクターを局所注入し、マイクロRNAもしくはその抑制配列をベクターを介して発現させ、その疼痛抑制効果を検討する。
「睡眠不足」と慢性疲労状態の持続を観察・評価する方法の開発

本研究は,1週間から10日前後の実験研究およびフィールド調査において,睡眠脳波による睡眠構造の変化と,尿中17-KS-Sと17-OHCSのバランス,主観評定,生活時間調査および疲労感の評定尺度との関連を捉え,「睡眠不足」状態を定義,新しい疲労観測法を開発することを目的として行った。実験研究は,10日間にわたる5時間睡眠短縮実験であり,フィールド調査は16時間連続夜勤を行う病棟看護師であった。実験室実験の結果は,数週間にわたる慢性疲労状態では,労働日,特に勤務週の後半日において眠気や身体のだるさなどの疲労感の増大や熟眠感の低下が見られ,勤務や勤務後の生活に意識的な努力が必要となる事態が出現,その睡眠時の尿中S/OH値も低下した。また,休日でもこれらの値は回復せず,主観評価値や尿中S/OH値の低下が持続し,2日程度の休日では休息効果が認められなかった。またフィールド調査では,休日日数が1日の場合より2日以上の連続となった場合のS/OH値は大きい値を示した。2連続休日における健康水準が良好であることが示された。中でも特に3日以上の場合に有効性が高い結果が示された。2勤務サイクル調査での連続休日が2日以上配置されていた例の解析からは,尿中S/OHの変化の結果は3パターンが見られた。また,休日後の尿中S/OHの変化が次第に低下する事例において,連続休日が健康水準を回復させる上でどの程度有効となっているのかを検討した結果,図示された3例とも尿中S/OHは上昇していた。休日における生活調整の結果が示唆された。したがって,これらのことから,尿中17-KS-Sと17-OHCSのバランスは,睡眠短縮実験の疲労回復度との相関が高く,測定時点も少なく,調査対象者の負担も少ないことから,慢性疲労指標として有効性が高いと結論付けた。財団法人労働科学研究所1)睡眠時間を短時間と固定した実験;男性3名(2642歳)を対象に、822時就業で5時間睡眠(16時)を10日間(月翌水曜日を想定)継続する実験を行った。実験日後には、917時就業で0時からの7時間睡眠の回復日を4日間配置すると共に基準日を2日間(95時就業、7時間睡眠)設けた。被験者には通常のオフィス作業を遂行させると共に直腸温の連続測定、1時間毎の血圧測定と生理心理的機能検査と疲労感、眠気感などの測定を行った。睡眠脳波も記録した。2)夜勤を模擬した実験;覚醒水準維持に最も効果的な仮眠時間と時刻の有効配置を検討した。男子大学生6名を対象に、0時と4時から各60分、120分の仮眠と仮眠なしの5条件を実施。228時までに毎時30分の作業量測定と自覚症状、パソコンによるパフォーマンステストを実施すると共に直腸温を連続測定。模擬夜勤後は6時間の昼間睡眠と7時間の夜間睡眠を配置した。睡眠脳波も記録した。2.睡眠調整が行われる現場調査週休2日制の製品組立工場の中年作業者3名を対象に、現行の休憩パターンに加え、2通りの休憩パターンを作りだし、休憩の効果を検討した(現行の休憩パターン;午前と午後に10分間の休憩が各1回計20分間、Aパターン;午前1回7分、午後2回(7分+6分)に分割、Bパターン;午前1回10分、午後2回(10分+10分)に分割)。

効果判定は尿中17-Ketosteroid-Sulfates /17-Hydro-xycorticosteroids((S/OH)を測定して行った。現行パターンに比べて、午後の一連続作業時間を短くし、2回の休憩を挿入するA,Bパターンでの尿中(S/OH)比が高値を示し、A,Bパターンでの負担は少ないと判断できた。また、2名ではAパターンの場合よりBパターンで高値を示し、両パターンでの効果の差異が示唆された。数週間にわたり、対象者にあまり負担をかけずに心身状態を観測するために、主観評定、身体活動量と睡眠時の尿中尿中17-KS-S/17-OHCS値を組み合わせ、「睡眠不足」慢性疲労状態の持続を観測・評価する方法を確立するための2年目の研究である。今年度は「調査期間が数週間とした場合の検討」を行い、以下の結果を得た。1.モバイル勤務を行っている営業部門労働者の調査労働と生活のリズムバランスが崩れて睡眠位相が変化した際の慢性疲労状態の実態を現場調査で調べた。対象者は、週3日以上のモバイル勤務を行っている営業部門労働者6名とした。方法は1ケ月間の生活時間調査および身体活動計の装着によって労働-生活リズムの記録・観察を行った。同時に主要な生活行動を行った場所、疲労感などの主観評定の記録も得た。対象者の疲れの程度は労働時間の長さに依存し、疲労感が強い日には職場外でのIT機器を用いた労働時間が長いという結果が得られた。2.自動車組立作業者の調査比較的身体強度が強く、その内容の把握が比較的容易で、反復繰り返しが多い作業を主としている組み立て工程の中で類似の作業形態をとっている作業者(20-30歳代と中高年の男性作業者)を5名選び、5週間、連続的に作業と疲労・ストレス状態さらに睡眠時の様相を測定記録した。睡眠時の様相は、尿中17-KS-S/17-OHCSと主観評定、身体活動計によって測定した。また、勤務中および勤務前後の疲労・ストレス状態の様相は質問紙で把握した。尿中17-KS-S/17-OHCS値は対象者毎に低値を示した割合により、睡眠不足および心身状態の週内および週間変動を表していた。以上の成績から、現場調査において「睡眠不足」慢性疲労状態の持続を観測・評価する方法として主観評定、身体活動量と睡眠時の尿中尿中17-KS-S/17-OHCS値を組み合わせた方法が有効であると結論された。
植物性染色体の進化-雌雄異株と雌性両全性異株を利用した性決定遺伝子の単離

X, Y性染色体により性を決定する雌雄異株植物ヒロハノマンテマをもちいて、性染色体遺伝子を単離・マッピングした。X染色体の組み換え価とY染色体欠損変異体をもちいて性染色体遺伝子の遺伝地図を作成し、Fluorescent in situ hybridization (FISH)解析で決定した物理的位置情報を加えて、X, Y性染色体の細胞遺伝学地図を作成した。さらに性染色体遺伝子の構造や塩基置換率等の遺伝子配列情報を加えて、性染色体の進化過程で起こった染色体再配列について考察した。X,Y性染色体で性決定する雌雄異株植物ヒロハノマンテマ(Silene latifolia)とその近縁種Silene属は、性染色体を持たない両性の植物から性染色体を持つ雌雄異株植物へと進化した。これらの雌雄異株植物の性染色体上に存在する性決定遺伝子を単離することを目的とし、シロイヌナズナの花形態形成遺伝子のヒロハノマンテマホモログを探索した。そのうち、シロイヌナズナの雄蕊と花弁形成に関わるAPETALA3のホモログ、SIAP3X,SIAP3Y遺伝子がヒロハノマンテマのX,Y性染色体上に存在した。SIAP3Yは雄蕊と花弁で、SIAP3Xは花弁のみで発現していたことから、SIAP3Y遺伝子は雄蕊を形成するのに必要な遺伝子と考えられた。Fluorescent in situ hybridization (FISH)により、SIAP3Y,SIAP3X遺伝子の性染色体上での位置をマッピングした。さらに、2つの遺伝子のイントロンを含むゲノム配列を明らかにし、X,Y性染色体間の配列の違いと性染色体上の位置から、ヒロハノマンテマの性染色体がどのように進化したのか考察した。ヒロハノマンテマの近縁種には、性染色体を持たない両性のヒメシラタマソウや雌性両全性異株(ほとんどが両性花だが時々雌花が現れる)のシラタマソウがあるが、それらの近縁種をもちいたゲノミックサザン解析から、Silene属が分岐した後AP3遺伝子が存在する常染色体が性染色体へと変化していったことが推測された(論文投稿中)。X,Y性染色体で性決定する雌雄異株植物ヒロハノマンテマ(Silene latifolia)をもちいて、性染色体上の遺伝子の相対的な位置をX染色体の組換え価とFluorescent in situ hybridization (FISH)解析により決定し、X,Y性染色体の地図を作成することを目的とした。まず2系統のヒロハノマンテマの多型を利用して、雄蕊と花弁形成に関わるSIAP3遺伝子がX,Y性染色体上に存在することを明らかにした(SIAP3Y, SIA3X)。X性染色体上にあるSIAP3遺伝子と既知の4つのX染色体遺伝子の相対的位置を、組換え価より算出しX染色体の遺伝地図を作成した。そしてY染色体欠損変異体をもちいたY染色体遺伝地図(Zluvova et.al. 2005)と比較した。さらにFISH解析でSIAP3Y, SIAP3X遺伝子の性染色体上での位置をマッピングし、遺伝地図情報に付け加えてX,Y性染色体の細胞学的地図を作成した。またSIAP3Y, SIAP3X遺伝子のイントロンを含むゲノム配列を明らかにし、イントロン中の塩基配列変異率を計算した。イントロン変異率と染色体地図上り位置をSIAP3Y, SIAP3X遺伝子と既知の4つの性染色体遺伝子とで比較し、ヒロハノマンテマの性染色体がどのように進化したのか考察した。これらの結果は原X,Y性染色体のPARから遠い領域から変異が蓄積し現在のX,Y性染色体へ進化していったという従来の性染色体進化仮説を覆すものであり、ヒロハノマンテマの性染色体は複雑な染色体再配列によって現在の形に進化したことが示唆された(論文2報投稿中)。
環境単位に着目した都市住宅地の変容に関する研究

本研究は緩やかに形成された町並みや集落などの住宅地が社会的まとまりをもち、人々の日常の営みと環境の調和が維持される仕組みを持つことに比較して、近代的に計画された住宅地がこれらを必ずしも持ち得ない理由は何であり、どのような住宅地づくりがそのような成熟された町並みを形成しうるのかという問題意識に基づいて、百年から数十年を経た住宅地を調査し、その構成要素を検討している。それにより、個々の住宅とその集合の形式、特に相隣環境における住宅間の関係性(プロトコル)がどのように維持、調整されどのような構造が継承されるのかを明らかにすることを目的としている。今年度は特に計画住宅地における街路の構成と個々の敷地との関係に着目し、高度経済成長期に開発された神戸市近郊の3住宅地を対象事例とし、空中写真分析による物的な経年変化の把握、アンケート調査による屋外での生活行為の把握を行った。その結果、1)接道条件によって住戸配置や公私接続形式、公私境界面の物的形態に差異が生じること、2)敷地内屋外空間および前面道路で行われる生活行為は、屋外生活行為よりも園芸系行為が多く行われており、敷地の空間構成に規定されている部分があること、3)居住者による物的環境の構築は、生活行為が展開する範囲および発生率と一致しており、物的環境の形成は生活行為と相互関係の上に成り立っていることが明らかになった。さらにこれらの知見の他、昨年度の調査対象地区での知見を加え、住宅地計画における計画基準として6つの評価項目を整理した。本研究は大都市郊外の計画的戸建て住宅地における個々の住宅とその集合の形式、特に相隣環境における住宅間の関係性(プロトコル)に着目し、それらの維持、調整の仕組みが住宅地の成熟と変容のプロセスにおよぼす影響を明らかにすることを目的としている。今年度は、まず日本及びヨーロッパの住宅地計画資料および空中写真を収集し、個々の住宅の配置とその集合形式に着目し類型化をおこなった。さらに上記で得られた類型の中から、典型的事例を対象としてフィールドワークを行った。具体的には、国内の事例として大阪府内の大美野地区および星田地区を対象とし、街区構成、敷地内外部空間の使われ方、敷地境界部分の構成およびそれらの経年変化等の調査を行った。また海外の事例としてイギリスのレッチワースガーデンシティ地区及びハムステッド地区、オランダのエコロニア地区、フランスのセルジーポントワース地区等を対象として、敷地内外部空間の使われ方、経年変化等の現地調査および居住者ヒアリング調査を行った。また研究成果として得られた着想を被災居住地の復興計画に適用した計画案を提案し日本建築学会技術部門設計競技「自然災害で居住地が甚大な被害を受けた農山漁村集落の再建計画」にて優秀賞を受賞した。次年度は今年度に得たデータを基にさらに分析を進めることによって、計画的住宅地における経年変容プロセスを定量的に把握し、類型間の比較を進めていく予定である。
グラフェン量子ドットにおける単キャリア輸送現象と量子情報デバイス応用の研究

グラフェン量子ドット中の電子のスピンは、スピン-軌道相互作用や超微細相互作用といったデコヒーレンス要因が少ないため、固体量子ビット等の量子情報処理素子実現のキーファクターとして期待され注目されている。量子ビット素子開発のためには、グラフェンで制御性の良い量子ドット素子を作製し、電子一個を閉じ込める必要がある。しかし、電荷不純物やエッジラフネス等に起因するポテンシャル不均一性により、意図しない多重量子ドットがグラフェン中に形成され、ドット数を正確に定義することが困難となっている。本研究ではグラフェン素子に単一量子ドットを定義するために、これまでに行ってきた電荷不純物の検出及び低減する方法、さらには二次元原子層絶縁体である六方晶窒化ホウ素でグラフェンを挟み込んだ積層ヘテロ構造作製技術を組み合わせることにより、主にエッジラフネスに起因するポテンシャル不均一性により形成されるドットが単一となるグラフェン素子構造を探索した。様々な寸法の単一狭窄構造を持つ素子を作製し、低温において電子輸送特性を調べた結果、バックゲート変調のみで単一量子ドットが支配的となるクーロンブロッケード特性が観測される狭窄寸法を見出した。第一原理計算を用いた解析によりこの輸送特性が狭窄構造に現れるメカニズムを調べた結果、チャネルの電子輸送方向への閉じ込め効果により局所状態密度の離散化および透過係数スペクトルの共鳴準位が現れることが分かり、狭窄構造とその外側にある広いリード構造との接合が量子ドット形成に重要な役割を果たしている可能性を示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。グラフェン中の電子はデコヒーレンス時間が長いため、量子情報処理デバイス応用に期待されている。グラフェン中の電子を制御するために、グラフェンで量子ドットデバイス・単電子トランジスタを作製し、単一キャリア輸送特性の測定を行った。デバイスは単一ドット構造に設計・作製したが、エッチング時に入ってしまうエッジラフネス及び電荷不純物によるドーピングの影響が大きく、ディラック点付近の単一キャリア輸送特性の観測は困難であった。ドーピングの問題解決のために、まずはチップ増強ラマン分光法(TERS)を用いてグラフェン中のドーピングの空間的な広がりの検出を行った。これまでほとんど報告例のなかったSiO2/Si基板上グラフェンに対してTERSを行い、空間分解能228 nmを達成した。標準的なデバイス作製プロセス後のグラフェンにおいて、1 μm以内で大きくドーピング濃度が変化していることを明らかにした。次にアニールによりドーピングの軽減・制御を試みた。アクセプターとして振舞うグラフェン表面やグラフェン-基板間のガス分子や不純物は、真空中でアニールすることで除去可能であることが判明した。真空中で長時間アニールするとSiO2表面に発生するダングリングボンドによる電荷遷移が発生し、グラフェンはnドープされる。一方、先に水素混合ガス中でアニールした場合、真空中で長時間アニールしてもグラフェンがnドープされにくい傾向が見られ、移動度および電気伝導率の減少を観測した。密度半関数法により計算した結果、水素アニールによりグラフェン-SiO2間の距離が縮まることが分かり、クーロン散乱による電気特性の劣化が示唆された。また、グラフェン-基板間に水素が入り込み、SiO2のダングリングボンドが水素で終端されnドープされにくくなったと考えられる。結果として、条件を選択してアニールすることで電荷中性点位置の制御を達成した。現在までの研究で、グラフェンで単一の量子ドット構造を作製しても、ポテンシャル不均一性により、単一クーロンアイランドを介したキャリア輸送特性を得ることは難しいことが分かった。ドーピングの空間的広がりを検出した結果、グラフェン中に単一のクーロンアイランドを得るためにはドーピングが無視できないことが示唆された。現在まで、グラフェン(量子ドット)デバイスの問題点であるドーピング状態を示す電荷中性点位置の制御に成功している。また、もう一方のエッジラフネスの問題に関しては、これまで様々なナノスケール構造のデバイスを作製し測定したところ、デバイス構造を最適化することで最小限に抑えられる可能性があるという知見を得ている。

今後はデバイス構造の最適化を行うとともに、基板に原子レベルでフラットな材料である六方晶窒化ホウ素を用いて作製し、ドーピング及びエッジラフネスの影響のさらなる低減を図る。エッジラフネスに関しては、ヘリウムイオン顕微鏡を用いたイオンビームミリング加工などが解決策として考えられる。ドーピングが制御されたグラフェンにおいて、ディラック点における単一のクーロンアイランドを介した単一電子・正孔輸送特性の観測を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
臨床看護師のフォロワーシップの概念に関する探索的研究

看護師は、医療専門職として、管理者であろうがあるまいが、チームのなかでリーダーシップを発揮することが期待されてきた。これまでリーダーシップの重要性は語られてきたが、近年になり、組織の成果にはフォロワーの存在が重要であることが語られ、研究テーマとしても関心が高まってきている。この研究では、先ず、臨床看護師のフォロワーシップがどのような概念で構成されているのかを調査する。続いて、看護師の専門職としてのフォロワーシップ行動を質問紙調査で測定し、看護師のフォロワーシップ行動の類型化を目指す。医療施設や地域社会において良質な医療・看護を提供するための看護師の効果的なフォロワーシップを検討する。
X染色体再活性化の空間的・経時的解析を通したエピジェネティクス制御開始機構の解析

前年度までに、iPS細胞誘導時のX染色体再活性化を検出するために、HprtノックアウトC57BL/6J(B6)とM. spretus(Sp)を掛け合わせたマウスから調整したMEFからiPS細胞誘導を行い、その誘導過程で、二本あるX染色体のいずれからRNAの転写が起きているかSNP cDNA typingで検定する系を構築した。そして、我々独自の3S reprogrammingsystemを用いて作製した、誘導が途中で停止したiPS細胞に対してSNP cDNA typingを行い、X染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞を得ることに成功した。そこで本年度は、それらのX染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞において、X染色体上のどの領域から転写が起きているかRNA-seqによって明らかにし、その情報を元にX染色体再活性化において転写が開始される領域を同定することを試みた。まず始めに、二本あるX染色体のいずれからRNAの転写が起きているか区別するためのRNA-seqの条件を決めるために、B6とSpを掛け合わせたマウスの体細胞から抽出したRNAに対してRNA-seqを行い、SNPの読み分けを試みた。その結果、通常のRNA-seqより2倍程度深く読むことによってSNPの区別が可能であることを明らかにした。次に、同様の条件を用いて、X染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞についてRNA-seqを行い、各細胞におけるX染色体全体の転写プロファイルの情報を得た。SNPを用いて、各細胞において不活化X染色体からRNAが転写されている領域を探索した結果、X染色体上の二つの領域から、X染色体再活性化初期にRNAが転写されていることを明らかにした。今後は、この同定した領域に結合する転写因子やヒストン修飾を明らかにすることによって、X染色体再活性化の分子機構を明らかにすることを目指す。mRNA上のSNPを判別できるシステムであるSNP cDNA typing法を用いて、iPS細胞誘導におけるX染色体の再活性化を解析する系の構築を始めに行った。まず、M. musculusのC57BL/6J(B6)とM. spretus(Sp)の間には多数のSNPが存在することから、B6由来のHprt遺伝子ノックアウトマウスとSpを掛け合わせて、マウス胎児繊維芽細胞(MEF)を作製した。そして、このMEFをHAT培地で培養することにより、Hprt発現細胞、すなわちSp由来のX染色体が活性化されている(bXi,sXa)MEFを選択することに成功した。同様に、B6とSpを掛け合わせて得たMEFを、6-Thioguanineを含む培地で培養することにより、Hprt非発現細胞、すなわちB6由来のX染色体が活性化されている(bXa,sXi)MEFを選択することにも成功した。次に、選択してきたMEFにiPS細胞誘導用SeVdpベクターを感染させることによって初期化を誘導し、誘導過程で起きると考えられている、不活性化X染色体の再活性化によるmRNAの発現誘導が、SNP cDNA typingによって検出できるか検討した。その結果、HAT処理をしたMEFからiPS細胞を誘導した場合、誘導前は、Sp由来のX染色体からの発現が90%以上であるのに対し、誘導28日後には、Sp、B6由来いずれのX染色体からも、ほぼ等しくmRNAの発現が確認された。この結果から、1)HAT処理をしたMEFからもiPS細胞誘導ができる、2)iPS細胞誘導時に起こるX染色体の再活性化をSNP cDNA typing法で検出できる、ということが明らかになった。また、既に確立していたLamp2 mRNAの発現を検出するSNP cDNA typing法に加えて、Msn mRNAの発現を検出する系も構築し、X染色体再活性化を空間的に解析する準備を整えた。iPS細胞誘導時のX染色体再活性化を検出するために、HprtノックアウトC57BL/6J(B6)とM. spretus(Sp)を掛け合わせたマウスから調整したMEFからiPS細胞誘導を行い、その誘導過程で、二本あるX染色体のいずれからRNAの転写が起きているかSNP cDNA typingで検定する系を前年度構築した。そしてその系を使って、B6由来のX染色体から転写されるRNAと、Sp由来のものの比率がiPS細胞誘導の進行に従って50:50に近づき、X染色体再活性化が実際に検出できることを明らかにした。今年度はまず、SNP cDNA typingで得られた比率がX染色体から転写されたRNAの比率を反映しているか検討するために、転写されているRNAをクローニングして実際に配列を読んでどちらのSNPを持つか調べることによって比率を検討した。その結果、クローニングで得られたSNPの比率の結果とSNP cDNA typingの結果がほぼ一致したので、SNP cDNA typingで得られた結果は実際のRNA転写比率を反映していることが明らかになった。次に、X染色体再活性化を経時的に解析するために、我々独自の3S reprogrammingsystemを用いて作製した、誘導が途中で停止したiPS細胞に対してSNP cDNA typingを行い、X染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞を誘導できるか検討した。その結果、低Klf4発現で誘導されたiPS細胞では再活性化が起きていなかったのに対し、高Klf4発現で誘導された細胞では再活性化が起きていた。このことから、iPS細胞誘導の経時的な進行度とX染色体再活性化を、Klf4発現量を調節することによって対応させることが可能であり、Klf4を変えて誘導したiPS細胞を用いて、経時的なX染色体再活性化の解析が可能であることを明らかにした。

前年度までに、iPS細胞誘導時のX染色体再活性化を検出するために、HprtノックアウトC57BL/6J(B6)とM. spretus(Sp)を掛け合わせたマウスから調整したMEFからiPS細胞誘導を行い、その誘導過程で、二本あるX染色体のいずれからRNAの転写が起きているかSNP cDNA typingで検定する系を構築した。そして、我々独自の3S reprogrammingsystemを用いて作製した、誘導が途中で停止したiPS細胞に対してSNP cDNA typingを行い、X染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞を得ることに成功した。そこで本年度は、それらのX染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞において、X染色体上のどの領域から転写が起きているかRNA-seqによって明らかにし、その情報を元にX染色体再活性化において転写が開始される領域を同定することを試みた。まず始めに、二本あるX染色体のいずれからRNAの転写が起きているか区別するためのRNA-seqの条件を決めるために、B6とSpを掛け合わせたマウスの体細胞から抽出したRNAに対してRNA-seqを行い、SNPの読み分けを試みた。その結果、通常のRNA-seqより2倍程度深く読むことによってSNPの区別が可能であることを明らかにした。次に、同様の条件を用いて、X染色体の再活性化状態の異なるiPS細胞についてRNA-seqを行い、各細胞におけるX染色体全体の転写プロファイルの情報を得た。SNPを用いて、各細胞において不活化X染色体からRNAが転写されている領域を探索した結果、X染色体上の二つの領域から、X染色体再活性化初期にRNAが転写されていることを明らかにした。今後は、この同定した領域に結合する転写因子やヒストン修飾を明らかにすることによって、X染色体再活性化の分子機構を明らかにすることを目指す。我々独自のpaused iPS細胞において、X染色体の再活性化が起きているのか解析を行い、さらに、再活性化の進行度がKlf4量依存的に調節可能であるか検証する。X染色体活性化状態が異なる細胞を、Klf4発現量を変えることによって複数用意し、それらに対してRNA-seqを行って、iPS細胞誘導のどの段階でどこが再活性化されているか、経時的・空間的にX染色体再活性化を解析する。SNP cDNA typing用に、プローブを多く設計する予定であったが、今年度中には2つしかプローブを設計しなかったために、当初の予定よりも支出が少なくなった。次世代シークエンサーを用いた解析のために、「その他」として受託解析費を多く見積もっていたが、今年度は少ししか進めることができなかった。サンプルの準備は順調に進んでいるので、次年度は受託解析費が多く必要になる予定である。今年度設計できなかったプローブを次年度に設計する予定であるため、物品費が当初の予定よりも多く必要になる予定。
東南アジアの言語資料に見る国家意識の形成

吉川は、タイの13世紀に製作されたラームカムヘーン王碑文が19世紀中頃に創作されたとする偽作説を踏まえて、その内容に盛られた国王と仏教と民衆の結びつきがタイ固有の政治的伝統として強調されていく過程で、「民族・宗教・国王」の三位一体を「タイ的原理」とする、明確な国家イデオロギーに発展させていった可能性を考え、その過程を追求する。つまりタイの伝統的政治理念は、19世紀から20世紀の初めにかけて行われた、新しい歴史と伝統の創出のなかで始まると推測した。桃木は、中国と対等な「もうひとつの中華」を自認するベトナム型の華夷意識に着目し、その形成と変遷を、世界像(あるべきベトナムの領域とベトナムに服属すべき「蛮夷」の範囲はどこまでか、ベトナムの東西南北はとはどんな世界か)と歴史像(どんな歴史ゆえにベトナムは世界の中心たりうるのか)の両面から考察した。渡辺は、ビルマの王権研究を行うなかで、正統性論理の絶対性と現実の脆弱性の齟齬の分析から、王権の時代性、固有性を明らかにするという手法を確認した。また正統性論理の中で、仏教の理念では全世界を支配ししかも非暴力性、非継承性が強調され転輪聖王の概念が、本来無限であるはずの支配領域が限りあるものとして意識され、有限の支配領域が時代とともに変化していることを明らかにした。菅谷は、18世紀のマニラの中国人移民社会の分析から、18世紀半ばのアランディア総督に始まり半世紀にわたって実施されたスペイン政庁による非カトリック中国人追放策が、マニラを中心とする中国人移民社会を従来の出稼ぎ型からカトリックからなる小規模な定住型の社会に変容させ、その結果、中国人移民社会が民族共同意識の形成過程でフィリピン正統に構成する要素となった中国系メスティーソを生み出す母胎となったことを指摘した。