hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎盤におけるソニックヘッジホッグシグナルの機能解析

健全な胎児発育の成否は、主に胎盤機能に依存している。胎盤機能が著しく低下すると、胎児発育不全(fetal growth restriction:FGR)をきたすだけでなく、早期の娩出を余儀なくされるため、脳や肺など主要臓器の機能が未熟であり、児の死亡率、合併症罹患率が高くなる。つぎに、母体-胎児間のガス交換や母体からのグルコースやアミノ酸の供給に、合胞体栄養膜細胞は重要な役割を果たしているが、機能低下を来した胎盤では、絨毛の過成熟や胞体結節が多数認められることに着目し、合胞体性栄養膜細胞への分化とShh pathwayとの関係について検討をおこなった。胎盤から細胞性栄養膜細胞を分離して培養し、Shh pathway阻害剤であるCyclopamineを添加したところ、Syncytin-1,2やGCMの発現が低下し、hCG産生能も低下した。平成28年度は1. Shh pathwayを構成する遺伝子群の発現解析、2. Shh pathwayの機能解析を予定し、順調に実験も遂行されているため。平成29年度はSHH pathwayを構成する転写因子の1つGLI2に着目し、その発現がpreeclampsia(PE)の胎盤で有意に低下していたため、その発現制御機構としてメチル化の解析を行った。ControlとPE胎盤(n=2)を用いてGLI2のメチル化解析を行うと、PE胎盤で有意に高メチル化状態であることが明らかとなった。これは、胎盤におけるGLI2がメチル化により制御されている可能性が示唆された。また、SHH pathwayが児体重と高い正の相関があることより、2つのマイクロアレイデータセットを用いてこのpathwayと高い相関のあるpathwayを抽出し、その中に胎児発育に関与する遺伝子IGF1Rを同定した。Primary cytotrophoblastを用いてSHH pathwayの阻害剤であるcyclopamineを添加すると、IGF1Rの発現が抑制され、recombinant SHH蛋白を添加するとIGF1Rの発現が増加したことより、SHH pathwayはIGF1Rを介して、胎児発育に関与している可能性が示唆された。平成29年度は、1)SHH pathwayの主要構成遺伝子の発現制御(メチル化)の解析、2)SHH pathwayと高い相関のある遺伝子群の抽出およびその発現制御の解析を予定し、順調に実験も遂行されているため。平成29年度は当初予定通り研究を推進する。すなわち、低酸素、炎症、酸化ストレスがShh pathwayに及ぼす影響を解析する。また、Shh pathway主要構成遺伝子の発現制御を明らかにするため、Shh pathwayを構成する主要な転写因子であるGLIのメチル化について解析する。平成30年度は当初予定通り研究を推進する。すなわち、妊娠マウスを用いてSHH pathwayの阻害剤を胎盤に局注し、母獣の血圧や尿蛋白測定、胎仔や胎盤の重量を測定する。また得られた胎盤を用いて、SHH pathwayを構成する遺伝子群の発現解析を行う。該当金額では必要試薬の購入が難しく、次年度予算と併せて必要試薬購入予定として繰越した。(理由)当該金額では必要試薬の購入が難しく、次年度予算と併せて購入予定として繰越した。(使用計画)次年度予算と併せて試薬代に充当する。次年度予算と併せて試薬代に充当する。
筋弛緩のセルフコントロ-ルに関する生理心理学的研究

平成元年度から平成3年度までに研究課題について実験的研究を行い、得られた研究成果はつぎの通りである。(1)片腕を斜め上にあげ、肩の緊張はそのままでひじのみ弛緩させるセルフコントロ-ルは、弛緩訓練の初心者はほとんど成功しなかった。(2)ひじ弛緩に際し上腕及び肩からEMGを誘導する筋電図は緊張・弛緩の生理心理的指標として有効であった。特にひじ曲げにおける緊張と弛緩の過程が弁別できた。また上腕の緊張・弛緩の部位差が認められた。(3)訓練の初心者でひじ曲げはできなくてもひじ附近の筋の弛緩が認められた。外顕行動には表出されないセルフコントロ-ルの働きのあることが分かった。(4)弛緩訓練熟練者と初心者とにはEMGと外顕行動で、前者はひじ曲げの成功率が後者より圧倒的に高く、また筋弛緩の達成率が高かった。(5)ひじ曲げ訓練にモデリングを用いると、ひじ曲げが促進された。モデリングはひじ曲げとひじ弛緩の認知的制御を促進する働き、つまりセルフコントロ-ルの力を高める要因であった。(6)内省報告とEMGの結果からひじ弛緩・曲げに際し、一時的に「こぶしをつくる」「肩の緊張はそのままで」「腕が頭上に落ちる」などが心理的負荷となって筋弛緩のセルフコントロ-ルの力を減弱させるものであることが分かった。(7)不随意化した随意反応の随意化には個人の身体内感覚の認知的制御やモデリングがセルフコントロ-ルや心理的ストラティジの働きをすることが明らかになった。(1)健常成人被験者を用いて、片腕を斜め上にあげ、肩の緊張はそのままに、ひじのみの弛緩のコントロ-ルがどのようにできるかをひじの筋から誘導されるEMC(筋電図)を用いて、実験した。その結果、実験前にひじの筋弛緩がどんなにできても、片腕を斜めに上にあげた姿勢では、ひじの弛緩のセルフコントロ-ルは全被験者ができなかった。従って、ひじの筋から誘導したEMCにほとんど変化が見られなかったことから、負荷(腕あげ)によってセルフコントロ-ルの力が失われることが実証された。(2)同じ被験者を用いて、ひじの筋弛緩訓練を10回くり返し、その後ひじの筋弛緩時のEMCを誘導した。その結果肩の筋緊張は変化しないが、ひじの特定の筋が弛緩し、訓練によってセルフコントロ-ルができることが分かった。更に、ひじの筋弛緩訓練を行った被験者に、片腕を斜め上にあげさせ、被験者が意図的に上げた腕の手でコブシをつくる(手を握りしめる)よう教示し、その直後にひじ弛緩を行わせた。しかるに、全被験者がひじ弛緩ができなくなった。これらの被験者は腕を下げているときは自由にコブシをつくり、同時にひじを弛緩させることができた。この事実は筋弛緩のセルフコントロ-ルが可能であっても、その筋の神経支配が関連する他の筋の部位に負荷がかかると前者の筋のセルフコントロ-ルの力が失われることを示している。(3)全被験者に(1)、(2)の実験直後に内省報告を求めた。その結果次の点が明らかになった。何らかの弛緩訓練を受けないと片腕を斜め上にあげるのみで、それまで可能であったひじ弛緩のセルフコントロ-ルの力はまったく発揮できず、意図的関与ができなくなる。

このことは弛緩訓練の後に腕を斜めに上げ、コブシを作っても同じように、セルフコントロ-ルの力が失われた。平成二年度においては、被験部位から誘導した筋電図(EMG)とその積分値を指標として筋弛緩のセルフコントロ-ルの機制を検証した。1.方法被験者は、弛緩訓練の未経験健常男子9名女子40名。EMG誘導被験部位前腕伸筋、とう側手根屈筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋。筋電図誘導は表面電極誘導であった。教示は「片腕斜め上げ、ひじ弛緩」であった。なお腕斜め上げ時のEMGを弛緩EMGと呼称する。2.成果(1)EMG誘導部位差が大であった。緊張EMGの積分値によると、上腕三頭筋、前腕伸筋、とう側手根屈筋、上腕二頭筋の順で、最大の上腕三頭筋と最小の上腕二頭筋では3:1であった。(2)弛緩教示に対し全被験者49名中弛緩達成者は1名に過ぎなかった。腕を上げていなければひじ弛緩が可能であったのに、腕を上げ、肩の緊張はそのままで、ひじを弛緩することはほとんど不可能であることが検証された。(3)外見上のひじ曲げはほとんどの被験者が不可能であったが、EMGの積分値の分析によると、筋は弛緩していた。弛緩教示時の積分値を大から小へと並列すると上腕二頭筋、前腕伸筋、上腕三頭筋、とう側手根屈筋の順であった。最も大きいとう側手根屈筋と最も小さい上腕二頭筋との比は約3:1であった。更に緊張EMGに対する弛緩EMGを比較してみると最も弛緩が著しいのが前腕伸筋で、次に上腕二頭筋、上腕三頭筋、とう側手根屈筋の順であった。前腕伸筋の緊張EMG:弛緩EMG積分値比はほぼ4:1に対し、とう側手根屈筋のそれは約1:0.7であった。平成元年度において筋弛緩の外顕行動に及ぼすセルフコントロ-ルの機制を明らかにした。平成2年度においては主としてEMGを指標としてセルフコントロ-ルの機制を追究した。その結果、セルフコントロ-ルは筋弛緩の外顕反応とEMGとには異なった効果を持つことが明らかになった。そこで、本研究の最終年度である平成3年度においては(1)セルフコントロ-ルに習熟した被験群とまったく未習熟の被験群の両群の筋弛緩に及ぼす効果の比較、(2)セルフコントロ-ルに密接に関係するモデリング(観察学習)を媒介にした行動変容にこのセルフコントロ-ルの効果がどう働くかを実証しようとした。方法被験者は(1)では男女健常成人24名であった。(2)においては、健常成人49名であった。EMGの誘導部位及び外顕反応の弛緩の基準は平成2年度の研究報告書に記述されたものと同じであった。モデリングのモデルは実験者の1人が当たり、モデリグの教示はすべて言語で行った。成果(1)一般に誘導部位差がみられた。緊張時には非習熟群は習熟群に比し高いEMGがみられた。これに対し、習熟群は弛緩時に三角筋で非習熟群より著しく低いEMGがみられた。しかし、ひじが曲がらなくても、つまり外顕反応としてはひじの非曲状態であっても、EMGは小さくなった。僧帽筋を除いては肩が弛緩すると全部位でEMGが小さくなった。肩の緊張・弛緩が他の部位の緊張・弛緩に影響することを示している。(2)モデリングはひじが曲がることにきわめて大きい効果のあることが分かった。弦緩時にはいずれの群もEMGの低下がみられた。またモデリングによってひじ曲げができなかった群との間にはEMGの差は少なかった。(1)における習熟群と非習熟群の緊張時及び弛緩時の差は習熟度によって起ったと考えられる。
スペースブロックによる立体化した人間環境系の設計方法に関する研究

空間の表記法として提案されたスペースブロックを、立体化した人間環境系に焦点を当てた設計方法として展開を図った。理論的側面としては、生活のある場面を表すまとまりをもった単位としてスペースブロックを分節することで、設計行為を、不連続な構成要素の関係としては表せない濃密な記号を扱うスペースブロックレベルと、スペースブロックという不連続な記号間の関係を扱うスペースブロックネットレベルに分けて考えられることがわかった。この二つのレベルが、設計ツールとしてスペースブロックを実現するために、模型やインタラクティブなコンピュータグラフィックス、あるいはスケッチや図面、さらには文章などのメディアやそれらの組み合わせを用いる場合に保持されることで、実現メディア間を容易に変換しながら設計することが可能になる。スペースブロックを利用する実践的側面としては、学生を対象に設計のワークショップを開き、その中で具体的方法を探った。ワークショップに利用する道具として、2.5mキューブの3,4,5個からなる規格化したスペースブロックを考え、プラスチック板で100分の1スケールで作成しベーシックスペースブロックと呼んだ。ワークショップは、一つのベーシックスペースブロックを用いる場合と、複数を用いる場合とを行った。その結果、スペースブロックレベルとしては、制約の強い形をしたベーシックスペースブロックを用いることで、空間の形とその使い方についての想像力が刺激されること、外部空間と内部空間を等価に考えやすいことが効果として見られた。また、透明と白(不透明)のベーシックスペースブロックを用いると、内部/外部、パブリック/プライベートなど様々な対立軸をあてはめて考えやすいこともわかった。スペースブロックネットレベルとしては、普通に平面図や断面図を利用していたのでは考えられないような複雑に立体化した空間が、アクセスや外部との関係などを把握しながら作り出せるという効果がみられた。
密度汎関数法による大規模分子軌道法の開発

研究者らはヘムタンパク質や光合成反応中心のように金属錯体がタンパク質の活性中心として働き、さまざまな反応性を示す金属タンパク質のメカニズムを電子レベルで明らかにすることを目標とした。このような系における定量的な計算には電子相関効果が重要となるため、ab initio Hartree-Fock法と同程度の計算量で電子相関を取り込むことができるKohn-Sham-Roothaan方程式に基づく密度汎関数法に着目し、プログラムProteinDFを開発した。2001年、これを並列化し、ワークステーションクラスタに用いてヘムタンパク質の1つであるシトクロムcの全電子計算を世界で始めて達成した。さらに、本研究ではタンパク質を構成するペプチド鎖を次第に大きくしながら計算を進める収束法と、小ペプチド鎖の計算結果を組み合わせてより大型のペプチド鎖計算のための精度の良い初期値を作成する擬カノニカル局在化軌道法をそれぞれ開発した。これに加えて、問題が生じた場合はいつでも人間が小ペプチド鎖断片から最終目的のタンパク質までどのような段階を経て徐々に大きくしていくかという全電子計算シナリオを簡便に修正できるシステムを開発した。本システムは人間が判断しやすいようにタンパク質の様々な構造情報を提供するツールと計算のシナリオをグラフィカルかつ自由に変更することができるエディタで構成されたProteinDFの統合環境である。本システムは一般ユーザによるタンパク質量子化学計算の普及への鍵を握るものと考えられる。このような結果と計算機の能力変遷を考慮に入れると、それほど遠くない未来でタンパク質の本格的な量子化学計算の時代が到来すると考えられる。本研究者らはヘムタンパク質や光合成反応中心のように金属錯体を活性中心に持ち、さまざまな反応性を示すタンパク質の機能を電子レベルで明らかにすることを目標としている。このような系における定量的な理論計算のためにab initio Hartree-Fock法と同程度の計算量で電子相関を取り込むことができるKohn-Sham-Roothaan方程式に基づく密度汎関数法に着目し、プログラムProteinDFを開発してきた。ProteinDFはオブジェクト指向言語C++でコーディングされている。C++のプログラム単位はデータとその処理関数群を1体とした独立性の高いクラスであり、プログラムの保守性や拡張性が高く、並列処理とも相性がよい。実際にProteinDFのほとんどのルーチンは並列化されており、その効率は分散並列マシンにおいて80%程度である。今年度、Alphaマシン15台を100BaseTXイーサーネットでつないだ分散ワークステーションクラスタを用いてヘムタンパク質の1つであるシトクロムcの全電子計算を達成した(F.Sato et al.Chem.Phys.Lett.(2001)in press)。原子数、電子数、使用した軌道および補助基底関数の総数はそれぞれ1,738、6,586、9,600および17,578であった。SCF計算1回当たり約20時間を要し、途中本研究で開発した様々な大規模分子計算収束法を使用して、59回の繰り返し計算で収束解を得た。本研究は密度汎関数法による世界初の金属タンパク質全電子計算である。シトクロムcは呼吸鎖中でヘムFeの酸化還元を利用してタンパク質間の電子授受を担っている。電子運搬に深くかかわるHOMOはd_<xy>を主成分とする局在軌道では表わすことができないカノニカル軌道であり、タンパク質分子表面をはみ出したところでもかなりの値を持っていた。この結果は金属錯体が関与するタンパク質電子伝達機構解明に一石を投じるものとなった。
フィンランドにおけるCLIL（内容言語統合型学習）とその成功要因に関する調査研究

本研究の目的は、現在世界的規模で拡大しつつあるCLIL(Content-Language Integrated Learning)、つまり「内容言語統合型学習」について、特に外国語としての英語教育と平行する形で、急速な発展と広がりを示しているフィンランドのCLILに着目し、その成功要因を、教授的・制度的・社会的観点から分析するとともに、その分析結果をもとに我が国でも小学校から大学に至るまで様々な校種や地域で急速な広がりを見せつつあるCLILが今後進むべき方向性を明示することにあります。この目的を達成するために、3年間(平成29年度31年度)にわたる研究の2年目に当たる本年度(平成30年度)の研究においては、主にフィンランドでのCLILを取り扱っている文献の収集とその分析をとおして、フィンランドにおけるCLIL発展の背景を探るとともに、フィンランドでCLILを実施している小学校と中学校(ポリ市にシグナエウクセン小学校、ならびにユバスキュラ市にあるコルテポヒアン小学校とヴィータニエメン中学校)を訪問し、CLILで学ぶ学習者の割合、外国語(英語)での授業の割合、CLILで扱う内容の中身、CLIL授業の担当者、CLILでの成績評価の方法等についてさらなる情報収集を行うとともに、実際にCLILの授業も参観しました。また、CLIL担当教員に対する聞き取り調査も実施し、CLILに対する当事者意識に関するデータの収集にも努めました。今回の科研費研究の主題であるフィンランドにおけるCLIL(内容言語統合型学習)に関しての研究が、文献調査や、現地調査をとおして、おおむね当初の予定どおりに順調に遂行できているため。3年間にわたる研究の最終年度にあたる平成31年度においては、まず、これまで2年間にわたる研究でも行ってきましたが、ヨーロッパ特にフィンランドにおけるCLIL(内容言語統合型学習)に関する研究論文の収集と分析を行い、特にCLILの発展を支えてきた要因に関する理解を深化させます。次に、再度フィンランドに赴き、CLIL実施校での現地調査を実施します。加えて、CLIL担当教師に対してCLILの成功要因についての聞き取り調査も実施します。最終的には、3年間にわたる研究の成果を報告書にまとめることにしています。なお、現地調査は現在の勤務校および現地の学校での授業スケジュール等を考慮し、秋季あるいは冬季に10日間程度の日程で実施する予定です。本研究の目的は,現在世界的規模で拡大しつつあるCLIL(Content-Language Integrated Learning,内容言語統合型学習)について,特に外国語としての英語教育と平行する形で、急速な発展を示しているフィンランドのCLILに着目し,その成功要因を,教授的,制度的,社会的観点から分析するとともに,その分析結果をもとに我が国でも広がりを見せつつあるCLILが今後進むべき方向性を明示することにある。この目的を達成するために、3年間(平成29年度31年度)にわたる研究の初年度に当たる本年度(平成29年度)の研究においては、ヨーロッパ特にフィンランドでのCLILを取り扱っている文献の収集とその分析をとおしてCLIL誕生の歴史的背景やその指導原理・理路的基盤等について基本的理解を深め、本研究の土台作りを行うとともに、フィンランドでCLILを実施している小学校と中学校(トゥルク市にあるプオララン小・中学校、ユバスキュラ市にあるコルテポヒアン小学校とヴィータニエメン中学校、タンペレ市にあるタンメラン小学校,バーサ市にあるスヴィラーデン小学校)を訪問し、CLILで学ぶ学習者の割合,外国語(英語)での授業の割合,CLILで扱う内容の中身,CLIL授業の担当者,CLILでの成績評価の方法等について情報収集を行うとともに、実際にCLILの授業を参観した。加えて、CLIL研究者(主に大学教員)への聞き取り調査を実施し,文献研究では得られないCLILに関する当事者情報の入手に努めた。これら文献研究や現地調査で得られた情報をまとめて論文化し、『四国英語教育学会紀要』および『関西外国語大学研究論集』への投稿を行った。

3年間にわたる研究の2年目にあたる平成30年度においては、初年度と同様、ヨーロッパ特にフィンランドにおけるCLIL(内容言語統合型学習)に関する研究論文の収集と分析を行い、CLILに関する理解をさらに深化させるとともに、フィンランドに赴き、CLIL実施校での現地調査を実施する。本年度の計画としては、まず、初年度に訪問した小・中学校を再度訪問し、そこで実施されているCLILプログラムについてさらに理解を深めるとともに、CLIL担当教師からCLILの成功要因についての基礎的調査を行う。さらに、初年度には訪問できていない学校への訪問調査も実施し、フィンランドにおけるCLILの実態についてなるべく全体的な把握に努めることとする。加えて、CLIL研究者への聞き取り調査も実施し、最終年度に実施予定のCLILの成功要因に関する調査の具体的方策について詰めの作業を行う予定である。なお、現地調査は現在の勤務校および現地の大学の授業スケジュール等を考慮し、秋季(10月下旬)に1回だけ10日間程度の日程で実施の予定である。3年間にわたる研究の最終年度にあたる平成31年度においては、まず、これまで2年間にわたる研究でも行ってきましたが、ヨーロッパ特にフィンランドにおけるCLIL(内容言語統合型学習)に関する研究論文の収集と分析を行い、特にCLILの発展を支えてきた要因に関する理解を深化させます。次に、再度フィンランドに赴き、CLIL実施校での現地調査を実施します。加えて、CLIL担当教師に対してCLILの成功要因についての聞き取り調査も実施します。最終的には、3年間にわたる研究の成果を報告書にまとめることにしています。なお、現地調査は現在の勤務校および現地の学校での授業スケジュール等を考慮し、秋季あるいは冬季に10日間程度の日程で実施する予定です。研究初年度に計画されていたフィンランドでの現地調査を、2017年9月に引き続いて、勤務校での業務予定とフィンランドの学校の都合を考慮して、2018年3月に実施した。航空券等の支払いは完了しているものの、現地での移動にかかった交通費や宿泊費等の科研費からの支払いが3月までには完了しなかったため。次年度使用額が83,737円生じていますが、これは、本年度に実施した海外調査の経費が予想以上にかかったため、次年度の予算から20万円ほど前倒ししました。その20万円の残額が次年度使用額として計上されています。
超高精度結晶構造解析によるプロトン輸送タンパク質の全水素原子位置決定

プロトン輸送は光合成や電子伝達、物質輸送などに関与する膜タンパク質に広くみられる現象であり、生命活動のなかで最も重要な素過程のひとつである。そこで、代表的なプロトン輸送タンパク質であるバクテリオロドプシンについて高分解能X線結晶構造解析を実施した。結晶化条件とX線回折条件の最適化を進めることによって、X線損傷のないX線回折データセットを収集することに成功した。この回折データについて解析と構造精密化をおこなったところ、個々の非水素原子の電子密度を分離して観察することができた。また、一部の水素原子に対応する電子密度も確認することができた。ところが、これらの膜タンパク質のプロトンや水素原子の位置情報は全く実験的に決定されていないこともあり、プロトン輸送現象の本質はいまだ議論の的である。そこで、代表的なプロトン輸送タンパク質である高度好塩菌の光駆動プロトンポンプ、バクテリオロドプシンについて高分解能X線結晶構造解析を実施し、タンパク質中の全水素原子の位置情報だけでなく、分極度などの精度の高い構造情報を実験的に決定して、プロトン輸送メカニズムを解明することが本研究の目的である。しかしながら、バクテリオロドプシンの結晶は、流動性の低い脂質立法相の中で結晶化するために、結晶性が良いにもかかわらず大型化が困難である。本年度は、バクテリオロドプシンについて、高精度な構造解析を可能にするために必要な大型結晶の作製条件の確立をおこなった。脂質立法相を利用した結晶化に適した添加剤の検索をおこない、長鎖の界面活性剤と脂質の混合物を利用することで立法相を形成させたまま流動性を高めることが可能となった。また、大きな結晶を確率良く作成するために、種結晶育成(シーディング)法の開発をおこなった。これらの方法を組み合わせることにより、再現性良く大型結晶の作製ができる条件を確立することができた。また、脂質相を溶かして結晶を取り出すのに必要な脂溶性化合物の検索をおこない、この化合物をそのまま抗凍結剤として使用した結晶凍結方法も確立できた。さらには、作製した結晶を使用して回折実験をおこない、最高で1.1Å分解能の回折データの測定にも成功した。そこで、代表的なプロトン輸送タンパク質であるバクテリオロドプシンについて高分解能X線結晶構造解析を実施し、タンパク質中の全水素原子の位置情報だけでなく、分極度などの精度の高い構造情報を実験的に決定して、プロトン輸送メカニズムを解明することが本研究の目的である。前年度に大型(最長辺約0.3mm)の結晶を作製することに成功しており、本年度は精製方法と結晶化方法に改良を加え、より短期間で収率よく大型結晶を作製できるようになった。多数の大型結晶を用意することは、X線によるダメージの影響の少ない回折データセットを取得するために必要である。作製した結晶を使用して、放射光施設にてX線回折実験をおこない、測定温度や露光時間、照射線量などの最適化をおこなった。また、回折データを解析し、結晶ごとの格子定数のバラつきやX線損傷による損傷の進行による統計値や温度因子の変化について研究した。その結果、X線損傷の影響が小さい1.3 A分解能の回折データセットを取得することに成功した。また、最大エントロピー(MEM)法解析プログラムの改良に取り組んだ。前年度までに大型(最長辺0.3mm以上)の結晶の作製と1.1 A分解能の回折斑点の確認、1.3 A分解能の回折データセットの収集に成功していた。本年度は、大型結晶を多数作製し、測定温度や露光時間、照射線量などの実験条件の最適化を進めることによって、1.2 A分解能のX線損傷のないX線回折データセットを収集することに成功した。これは、これまでに報告されているバクテリオロドプシンのX線回折データの中で最も分解能が高いものである。この回折データについて解析と構造精密化をおこなったところ、個々の非水素原子を分離して観察することができた。レチナールや機能性残基における結合次数やマルチコンフォメーションに関する情報を得ることができた。

結晶化条件とX線回折条件の最適化を進めることによって、X線損傷のないX線回折データセットを収集することに成功した。この回折データについて解析と構造精密化をおこなったところ、個々の非水素原子の電子密度を分離して観察することができた。また、一部の水素原子に対応する電子密度も確認することができた。平成26年度の目標は、測定温度や露光時間、照射線量などの実験条件を最適化して、多数の結晶から高分解能なデータセットの構築をおこなうことであった。放射光施設にて多数(100個)の結晶から回折データを収集した。解析の結果、結晶同士の同型性が低く、複数の結晶から収集したデータ同士をマージして分解能を稼ぐことはできなかった。しかしながら、最も分解能の良い1個の結晶からの回折データのみを使用して、1.3 A分解能の回折データセットを取得することに成功した。これは、これまでに報告されているバクテリオロドプシンのX線回折データの中で最も分解能が高いものである。構造生物学平成26年度に測定した1.3 A分解能のデータセットを使用して構造解析をおこなう予定である。この分解能でも温度因子の低い分子中心部の水素原子を観測できることが期待される。また、個々の非水素原子が分離して観測されるために、結合次数に関する情報を得ることが可能となる。一方で、タンパク質中の全水素原子の位置を決定するためには、1.0 Aより高分解能な回折データが必要である。測定温度や露光時間、照射線量などの実験条件を最適化し、同型性が高く分解能も高いデータを選別して1.0 Aより高分解能なデータセットの取得を目指す。平成25年度の目標は、高精度構造解析に必要な結晶の結晶化条件の確立であった。これまでに、最大辺が0.3mm以上の結晶を多数作成することに成功し、高分解能の回折データの観測にも成功している。これは、これまで報告されている中で最も高分解能である。また同時に、結晶の取り出しや凍結についても、従来よりも簡便な方法を確立することができた。したがって、今回の成果をもとにして、今後高精度構造解析を展開していく基盤が整ったと言える。大型結晶の作製:前年度に確立した結晶化条件をもちいて、高精度構造解析に必要な大型結晶を準備する。高精度X線回折データ収集:タンパク質中の水素原子を感度よく観察するためには、回折データが単に高分解能であるということだけではなく、その測定精度が極めて高いことが要求される。測定精度の低下を招くX線損傷の影響を排除するためには、1個の結晶からは数フレームしか回折像を取得できないと予想される。徹底してX線損傷を抑制した上で、同型性が高く分解能も高いデータを選別して1つのデータセットを再構成する。したがって、新たに回折データ収集の方法を確立させる必要がある。これまでに放射光X線を使用した回折実験で1.1Å分解能の回折斑点を記録することに成功しているので、測定温度や露光時間、照射線量などの実験条件を最適化する。水素原子の電子密度を感度よく可視化する技術の開発:水素原子の電子密度は非常に弱いため、高分解能データであっても観察するのは容易ではない。
ハイテク産業における合併規制の違法性判断基準のあり方

ハイテク産業における合併規制の違法性判断基準のあり方について、米国および欧州との比較から、日本法への示唆を得ることを目的に研究を行った。2004年度に「ハイテク産業における企業結合規制」にて米国反トラスト法における規制事例を網羅的に検討した後に、その後の米国法をフォローするとともに、改正後のEC集中規則の適用事例を整理・検討している。そこでの成果は、独占禁止法の適用余地が少ないと考えられてきたハイテク産業においても独占禁止法適用の価値は大きく、またこれまでの伝統的産業とは異なる全く新しい違法性判断基準作りが必要というものである。「市場獲得のための競争(competition for the market)」は、その分析基軸になるものと考えている。ECではしばしばそのような考え方を規制事例に確認することができ、米国においても政権による揺らぎはあるものの、同様の反トラスト法思想は既に存在するものと考えられる。以上のような比較法研究と同時に、日本法との比較を行うための準備作業を進めた。具体的には、我が国におけるこれまでの企業結合規制の特色を抽出するために、過去の公表相談事例を整理・分析した。本年度はその成果を「企業結合規制にみる公取委の市場画定・市場分析手法」にて公表することができた。また、昨年度のジョンソン&ジョンソンの事例に見られるように、市場の国際化に伴い外国会社同志の合併が大きな問題になるものと考えられることから、市場画定、独禁法の域外適用の問題について基礎研究を蓄積しつつある。本年度は、まず米国におけるハイテク産業の競争法的問題を検討した。これまでわが国において紹介されたことのない「市場の中の競争(competition in the market)」と「市場を求めた競争(competition for the market)」という概念を明らかにして、米国における判例法を検討した。「市場を求めた競争」とは、ハイテク産業を特徴付けるイノベーションやネットワーク効果等を包含する上位概念であり、同概念を用いることによって、ハイテク産業における市場分析のあり方を再構成することができるものと考える。そこでの重要な発見は、米国の反トラスト法において、「市場を求めた競争」も価格競争等と同じく価値あるものとして法的保護の対象となっているということである。同発見により、伝統的な反トラスト政策とハイテク産業における反トラスト政策との連続性を示すことができ、実務上もインテル事件やマイクロソフト事件等、わが国の独禁政策に直接的な示唆を与えるものであると自負する。同研究成果は阪大法学に「ハイテク産業における企業結合規制」として公表することができた。さらに、EUにおける政策も検討を開始しており、事件研究を進めることができた。米国とは異なる競争法原理が存在すると言われるEUにおいてどのような政策が採られているのか、また米国における政策との違いは何かを分析することが、来年度以降の課題である。これまでの研究を継続することにより、大変興味深い成果が期待できるものと考えている。
初期エンドソームにおける脂質膜ダイナミクスの分子機構

初期エンドソームは細胞が外部から物質を取り込んだ際の最初の選別器官である。本研究では初期エンドソームでの輸送機構に関わる分子の同定・解析を進めた。その結果、関連分子としてダイナミン・コルタクチン・アクチンを同定した。更に脂質リン酸化酵素であるPI4KIIαとその産生物であるPI(4)Pが初期エンドソームに局在し、輸送に関与することを見出した。これら一連の発見は、初期エンドソームにおける輸送機構を解明する上で重要な知見になると考えられる。初期エンドソームからの選別輸送は、細胞外から取り込んだ物質の選別を行う場として知られており、シグナル伝達においても重要な役割を果たしているが、その分子メカニズムは多くの謎が残っている。なかでも輸送の最終段階である膜の変形、切断については関与する分子も含めてほとんどわかっていない。本研究では初期エンドソームからの選別輸送に着目し、その脂質膜変形/切断に関与する分子の同定/解析を行う。昨年度、我々は輸送小胞切断に必須のタンパク質であるダイナミンが初期エンドソームからの輸送に必須であること(Mesaki et al., PLoS ONE 2011)、さらに細胞膜アクチンとその制御因子であるコルタクチンも初期エンドソームで働いていることを見出し、報告した(Ohashi et al., PLoSONE 2011, Tanabe et al., Commun. Integr. Biol. 2011)。我々はさらに阻害剤を用いたスクリーニングを行い、初期エンドソームに必須のタンパク質として新たに脂質膜リン酸化酵素を同定した。さらに酵素の産生するリン脂質が初期エンドソーム上に集積しており、初期エンドソーム上のリン脂質産生に必須である酵素であることを証明した。更に、そのリン脂質の下流にあると考えられる細胞内輸送制御タンパク質も同定し、その制御メカニズム解明に大きく貢献した(論文投稿中)初期エンドソームは外部から取り込んだ物質の選別を担う重要な細胞内小器官である。その選別輸送では、内腔と膜画分を分離するための特徴的な脂質膜のチューブ状構造が形成される。本研究ではチューブ状構造を伴う選別輸送を制御する分子の同定を行い、その結果、ダイナミンやコルタクチン、脂質リン酸化酵素などを同定した。本年度は脂質膜のチューブ状構造形成を担う分子の同定とその解析を進めた。in vitroでのチューブ状構造形成を観察するための実験系を構築し、詳細な分子機構解析を進めている。我々は、輸送小胞の切断に必須のタンパク質であるダイナミンが初期エンドソームからの輸送に必須であることを見出した(Mesaki et al., PLoS ONE 2011)。本報告では、選別輸送の完了がエンドソームの移動能や酸性化のトリガーになっていることを見出し、そのカスケード機構を提唱した。さらに、細胞骨格アクチンとその制御因子であるコルタクチンも初期エンドソームで働いていることを見出し(Ohashi et al., PLoS ONE 2011, Tanabe et al., Commun. Integr. Biol. 2011)、長い間謎に包まれていた選別輸送機構のメカニズムが明らかになってきた。以上の報告では膜変形に関わるダイナミンや切断の張力となるアクチン・コルタクチンを同定し、報告してきた。我々は更なる阻害剤スクリーニングによって、脂質リン酸化酵素の同定を行い、初期エンドソームに特異的に局在するリン脂質を世界で初めて見出した。更に、そのリン脂質に結合する細胞内輸送制御タンパク質も同定し、その制御メカニズム解明が進んでいる(論文投稿中)。23年度に計画していた輸送関連タンパク質の同定/解析や複合体形成の解析はほぼ順調に進んでおり、その成果も学術論文の形で発表している(Mesaki et al., 2011, Ohashi et al., 2011, Tanabe et al., 2011)。24年度は初期エンドソームに必要な脂質リン酸化酵素について研究を進め、その産物であるフォスファチジルイノシトール4リン酸が初期エンドソーム上にあることを世界で初めて見出した(論文投稿中)。以上のことから、初期エンドソームからの輸送に必要なタンパク質の同定・解析は順調に進んでおり、その成果も着実に発表できているといえる。また、23年度の課題であったタンパク質間相互作用や電子顕微鏡を用いた微細構造の解析についても実験手技が確立し、順調に動き始めている。一方で所属の移動に伴う研究環境の変化があり、実験手技の変更もあったため、これらの実験手技を用いた成果の発表が多少遅れている。

そのため、業績面・材料の面でも予定通りに進展してはいるが2の評価とした。23年度に計画していた輸送関連タンパク質の同定/解析や複合体形成の解析はほぼ順調に進んでおり、その成果も学術論文の形で発表している(Mesaki et al., 2011, Ohashi et al., 2011, Tanabe et al., 2011)。ダイナミンの阻害剤であるDynasoreが初期エンドソームからの輸送を阻害すること、さらにその阻害がエンドソームの酸性化・移動能も阻害することを見出し、報告した(Mesaki et al., 2011)。さらに細胞骨格の一つアクチンも初期エンドソームからの輸送に必須であることや、アクチン制御タンパク質の一つであるコルタクチンも輸送に必要であることを見出し、報告した(Ohashi et al., 2011)。現在は脂質りん酸化酵素の一つであるフォスファチジルイノシトール4キナーゼの一つも輸送に必須であり、その産物であるフォスファチジルイノシトール4リン酸が初期エンドソーム上にあることを世界で初めて見出した(論文投稿中)。以上のことから、初期エンドソームからの輸送に必要なタンパク質の同定・解析は順調に進んでおり、その成果も着実に発表できている。一方、各タンパク質間の結合については再現性の得られる結果が得られず、条件検討が引き続き必要である。また、電子顕微鏡を用いた微細構造の解析についても未だ問題が残されており、実験系が完全に確立したとは言えない。24年度に予定している活性調節・脂質形態形成の実験系についてはほぼ確立している。以上のことから、業績面・材料の面でも予定以上に進展しているが、一部の実験系が確立できていないことから(2)の評価とした。これまでは主に細胞レベルでの解析を行なってきたが、同定したタンパク質の分子レベルでの役割については明らかにできていない。そこで今後はさらなる機構解明を目指し、生化学的アプローチ・形態学的アプローチを中心とした詳細な分子機構解明を目指す。タンパク質ー脂質間相互作用について、新たに我々が確立した分子間相互作用解析を用いた生化学的解析を行う。さらに電子顕微鏡を用いた脂質膜形態形成解析を行い、分子レベルでの制御機構解明を目指す。一方、我々が同定したタンパク質の酵素活性についても、タンパク質間相互作用もしくはタンパク質ー脂質間相互作用がどのような役割を演じているのか明らかにする。23年度で達成できなかった実験と平行して24年度に予定していた実験を開始する。23年度の実験として、電子顕微鏡を用いた細胞内の膜形態形成が充分に観察できていない。この問題については細胞固定法・透過処理の検討を進めており、予備実験段階では問題なく進んでいる。処理条件等の検討が必要な可能性はあるものの、実験遂行自体は可能と考えられる。各タンパク質間相互作用についても実験系の確立が必要であるが、各種阻害剤・塩濃度・界面活性剤の有無などを検討する事で改善が見られると思われ、予備実験でもはっきりした結合が見られるようになった組み合わせがあることを確認している。
社会学と「生の哲学」の思想的・理論的連関に関する研究

「生の哲学」と行為理論の思想的・理論的関連を解明し、その関連を「生活態度」の構造論として再構成するための準備作業として、本研究では、主としてマックス・ヴェーバーの哲学的・形而上学的想定と行為論との関連に焦点を絞って分析し、以下の諸点を明らかにすることができた。1、ヴェーバーとゲオルク・ジンメルにおいては、「魂」、「生」及び「生の諸力」といった形而上学的諸概念が社会理論の決定的な構成要素になっている。2、この点で、両者の社会学は当時のドイツの「生の哲学」の時代思潮に規定されてお、カール・ヤスパースの実存哲学もこの流れに位置づけられる。3、「生の諸力」による「生」と「世界]の形成というのが彼らに共通する形而上学的想定である。4、「生の諸力」は「魂」の態度決定によって選択されるが、選択された「力」は魂に対して自ら(力)をその「内的固有法則性」に従って実現するよう要請(命令)し、魂はその「存在と行い」においてこれを実現するというのが、歴史的「生」に関するヴェーバーの形而上学的想定である。5、[生の諸力」は、ヴェーバーの場合もマックス・シェーラーと同様、「価値」理論的に形式化されており、この点では新カント派哲学の影響が窺われる。6、その形式化に基づいて、ヴェーバーは[行為]を「価値実現のプロセス」として歴史哲学的に定義し直しており、これが彼の理解社会学の方法、すなわち「行為の主観的に思われた意味」の「解明的理解」を理論上可能ならしめている。7、「価値判断」ないしは「実践的な価値関係」による行為の「意味賦与」というヴェーバーの想定が、行為の「意味解明」というヴェーバー独自の認識方法を可能ならしめた。「生の問題(Lebensproblem)」は、ドイツの古典的社会学においては、近代人の文化生活の「意味」問題として論じられている。(1) M.ヴエーバーの場合:社会学においては、「生の諸力」(社会秩序、宗教、倫理、文化)に対する「魂(Seele)」の「態度決定」を媒介にした、生の諸力の「固有法則性」よる生の「規制」「様式化」「形成」が問題となり、生の諸力の自己実現に奉仕すべきものとしての「生」(=「文化的生Kulturleben)の無意味性が指摘されている。(2) G.ジンメルの場合:社会学においては、「魂の運動」ないしは魂の「相互作用」による「社会化それ自体の形式」が「純粋に形式的かつ中立的な生の諸力」として問題となり、生と生の諸力との相互作用は問題とならない。他方、「魂の運動」の二重性に関連して、「事物の固有法則性」に従って発展する「客観的文化」と「魂の法則性」(個性的運動)の結果としての「主観的文化」の「パラドクス」が哲学的に論じられている。この場合、「生は、より以上の生であり、生より以上のものである」との「生の本質」に由来する、「魂」と「事物」の同一性が問題となる。したがって、ジンメルにおいては、「文化的生」の意味問題はヴェーバーの場合のように「悲劇的」「消極的」に観察されることはなく、むしろ積極的に評価されているように見える。M.ヴェーバーは、「行為」を歴史哲学的な観点から「価値の実現過程」と定義づけ、行為と「生」に「形(Form)」を与えるのは価値の「内的固有法則性」だと考えていたが、これと同種の想定をしていたのはM.シェーラーとK.ヤスパースである。

(1)シェーラーの場合、「人格」はその「行為」において「愛の秩序」の価値実現過程を担う「道徳的主体」として定義される。「価値」への「愛」、すなわち「価値感情」と価値関心が人格と歴史のいわば規定根拠である。同時にまた、価値実現過程それ自体が「道徳的価値」として、他の諸価値(聖価値を除く)の上位に置かれる。これは、価値実現は善(悪)である、との倫理的世界観に結び付く考え方だと思われる。博愛主義、価値主観主義、労働価値主義及び有用価値主義のすべてを近代の「価値の転倒」とみるシェーラーの近代分化批判は、隣人愛の倫理的立場に立つものであろう。(2)ヤスパースの場合は、ヴェーバーのいう「生の諸力」が「実存」に規定的に作用する「符牒(Ziffer)」として理解され、-ザーナーもいうように-特定の思想及び行為における符牒を見極めることが哲学の重要な課題のひとつとされている。この諸力は、ヴェーバーの場合と同様に、いわば実存の前で支配力を競い合い、実存の内部においても葛藤を繰り広げる。だが、ヴェーバーの場合はこの諸力が「デーモン」「神」あるいは「価値」と同視されているのに対して、ヤスパースにおいてこれはあくまで符牒であり、普遍性を持たないように思える。この符牒は、それゆえ「社会性」(ヴェーバーではVergemeinschaftungおよびVergesel Ischaftung)の問題地平への射程が遮断されているように見える。「生の哲学」と行為理論の思想的・理論的関連を掘り起こし、これを「生活態度」の構造論として再構成するための準備作業として、本研究では、特にマックス・ヴェーバーとゲオルク・ジンメル、主として前者の哲学的・形而上学的想定と行為論との関連に焦点を絞って分析し、以下の諸点を明らかにすることができた。1、ヴェーバーとジンメルにおいては、「魂」、「生」及び「生の諸力」といった形而上学的諸概念が社会理論の決定的な構成要素になっている。2、この点で、両者の社会学は当時のドイツの「生の哲学」の時代思潮に規定されており、カール・ヤスパースの実存哲学もこの流れに位置づけられる。3、「生の諸力」による「生」と「世界」の形成というのが彼らに共通する形而上学的想定である。4、「生の諸力」は「魂」の態度決定によって選択されるが、選択された「力」は魂に対して自ら(力)をその「内的固有法則性」に従って実現するよう要請(命令)し、魂はその「存在と行い」においてこれを実現するというのが、歴史的「生」に関するヴェーバーの形而上学的想定である。5、「生の諸力」は、ヴェーバーの場合もマックス・シェーラーと同様、「価値」理論的に形式化されており、この点では新カント派哲学の影響が窺われる。6、その形式化に基づいて、ヴェーバーは「行為」を「価値実現のプロセス」として歴史哲学的に定義し直しており、これが彼の理解社会学の方法、すなわち「行為の主観的に思われた意味」の「解明的理解」を理論上可能ならしめている。6、「価値判断」ないしは「実践的な価値関係」による行為の「意味賦与」というヴェーバーの想定が、行為の「意味解明」という独自の認識方法を可能ならしめている。
金属原子とタンパク質イオンの反応による新規ラジカル分解質量分析法の開発

タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化や糖鎖付加などによってタンパク質の活性が調節され、生命活動が営まれている。この翻訳後修飾の重要性は広く認識されるようになってきているが、タンパク質の中のどの位置に、どのような修飾が存在するのか、という詳細な情報を得ることは現在の分析手法では困難であることが多い。本研究では、この翻訳後修飾を含むタンパク質の「真の姿」を明らかにするために、タンパク質分析に広く用いられている「タンデム質量分析法」を高度化することで、タンパク質分析の基盤技術を構築することを目的とする。タンパク質分析の真の姿を明らかにするために適した分析手法は、タンパク質のラジカル分解を利用したタンデム質量分析法である。しかしながら、分解効率の低さなどが本手法の実用への課題として認識されている。本研究では、反応性の高い金属原子やラジカルなどの中性原子を質量分析装置内に導入しタンパク質イオンと反応させることで、ラジカル分解の効率を飛躍的に向上させることを目標とする。イオントラップ型のタンデム質量分析装置に、ペプチドのイオンを導入し、原子との反応によりラジカル化を行った。ペプチドのラジカル化に伴う分解反応について、密度汎関数理論を用いた計算化学シミュレーションによって検討した。本手法によってリン酸化ペプチドなど重要な生体分子の詳細な配列解析が可能となることを明らかにした。本研究の成果によって、これまで同定できなかったタンパク質内の翻訳後修飾の位置情報が得られるようになり、疾患の早期発見のためのバイオマーカー探索や治療薬の開発などへの貢献が期待される。本研究では、この翻訳後修飾を含むタンパク質の「真の姿」を明らかにするために、タンパク質分析に広く用いられている「質量分析法」を高度化することで、タンパク質分析の基盤技術を構築することを目的とする。我々が研究を行っているタンパク質のラジカルに伴う分解を利用したタンデム質量分析法は、タンパク質の真の姿を検出するために適した手法である。しかしながら実用への課題としては、分解効率が低い点である。この欠点から、微量にしか存在しない未知タンパク質試料には適用できていないのが現状である。エレクトロスプレー四重極飛行時間型タンデム質量分析計内で衝突室として用いられているイオンガイドを新規ラジカル誘起フラグメンテーション法の実証実験のために最適化したものを作成し、交換を行った。新たな構成においても、従来のタンデム質量分析装置と同様に、ペプチド・代謝物など生体分子の分析が可能であることを確認した。本研究では、ペプチドやタンパク質イオンと金属原子の反応によりラジカル化を行う計画である。まずこの実験の準備段階として、金属原子源と四重極質量分析計を接続し、金属原子が真空中へ導入されていることを確認する実験を行った。この結果から通電加熱により金属原子を発生させるフィラメントが比較的安定的に使用でき、この研究に適していることがわかった。このフィラメントをエレクトロスプレー四重極飛行時間型タンデム質量分析計に取り付け新規ラジカル誘起フラグメンテーション法の実証実験を行う。通電加熱により金属原子を生成するフィラメントをエレクトロスプレー四重極飛行時間型タンデム質量分析計に取り付け、新規ラジカル誘起フラグメンテーション法の実証実験を行う。

蒸気のように、現在までに各々の環境において、金属原子の真空中への導入、衝突室を最適化したエレクトロスプレー四重極飛行時間型タンデム質量分析計でのペプチドの計測という技術基盤が整っているので、これらを組み合わせることで、目標としていた新規ラジカル誘起フラグメンテーション法の実証が達成できると考えている。タンデム質量分析計を構築する予定であったが、廃棄予定の質量分析装置を再利用することで対応したため、新たに購入した部品が本研究に最適化した衝突室のみであったため、使用額が計画よりも小額となった。未使用額は、衝突室の電源、熱電対、ヒータやタンパク質など生体分子の購入費用に充てる予定である。
マイクロ流路熱センサによる微小液滴のリアルタイムモニタリングに関する研究

微小液滴を用いたマイクロ流体技術はpLnLという極微量を単位とする分析や高品位な合成への利用が期待されており,実用化には微小な液滴の情報を高速に取得する技術が肝要となる.本研究ではMEMS熱センサを適用し,液滴サイズや生成速度に対して高い空間分解能・応答性および温度分解能を兼ね備えた計測基盤を構築する.さらに,取得される温度および伝熱特性を液滴内の合成反応へリアルタイムにフィードバックする系など,微小液滴モニタリングに基づく新たなマイクロ熱流体システムを創出する.微小液滴を用いたマイクロ流体技術はpLnLという極微量を単位とする分析や高品位な合成への利用が期待されており,実用化には微小な液滴の情報を高速に取得する技術が肝要となる.本研究ではMEMS熱センサを適用し,液滴サイズや生成速度に対して高い空間分解能・応答性および温度分解能を兼ね備えた計測基盤を構築する.さらに,取得される温度および伝熱特性を液滴内の合成反応へリアルタイムにフィードバックする系など,微小液滴モニタリングに基づく新たなマイクロ熱流体システムを創出する.
ウナギの体液調節におけるナトリウム利尿ペプチドの役割

心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は、血漿Na^+濃度を減少させ、ウナギを海水へ適応させるホルモンである。これまでの実験により、ANPの血漿Na^+濃度減少作用は、飲水や腸からのNa^+摂取の抑制によるもので、鰓や腎臓からのNa^+排出の促進によるものでないことが明らかとなった。本年度は、ANPの飲水抑制機構に着目し、ANPの脳内作用部位を同定した。まず、脳を6つに分け各部位におけるANP受容体(NPR-A)の発現をRT-PCRで調べたところ、全ての部位でNPR-Aの発現がみられた。次に免疫染色法を用いてNPR-Aの脳内分布を詳しく調べた。その結果、脳全体の血管系にNPR-Aが局在し、RT-PCRの結果と一致した。また、NPR-A陽性の神経細胞は、延髄の網様体に存在する比較的大きな神経細胞や、飲水調節に関与している舌咽・迷走神経運動野ニューロン、哺乳類で嘔吐や血圧調節に関与している最後野の神経細胞にNPR-Aが局在していた。いっぽう、血液中のANPが飲水を抑制することから、ANPは血液脳関門を欠く脳室周囲器官群に作用していると考えられる。そこで、アルブミンに結合するため血液脳関門を通過できないトリパンブルーを血中に投与しところ、視索前核、および最後野や松果体などの脳室周囲器官にトリパンプルーの蛍光反応がみられた。NPR-Aが存在して血液脳関門を欠く部位が最後野のみであったことから、血中のANPが最後野に作用して飲水を抑制していることが示唆された。そこで、海水ウナギの最後野を破壊したところ、実験群は偽手術群と比べて飲水量が減少するとともに、血液中に投与したANPにより飲水量が抑制されなくなった。このことから、最後野が魚類の飲水調節、とりわけANPの飲水抑制作用に関与していることが示唆された。これまでの研究により、ANPは海水に適応したウナギの飲水を抑制し、腸からのNa^+吸収を抑制することによって血漿Na^+濃度を減少させることが明らかとなった。しかし、魚類において最も重要な浸透圧調節器官である鰓におけるANPの作用は未だ明らかにされていない。本年度の実験は、鰓が全体表面積の90%以上を占め、水やイオンの透過性が他の体表と比べて著しく高いという特徴をいかして、体内外に投与した^<22>Naの動きから鰓におけるNa^+の流入、流出速度を調べ、今まで困難とされてきたin vivoにおける鯛のNa^+動態やANPの作用を明らかにした。鰓を介したNa^+の流入、流出の速度はともに^<22>Naを加えたのち4時間まで直線的に上昇し、10時間後にほぼ平衡に達していた。このようにNa^+の流入や流出の速度が、実験開始後4時間まで直線的であったため、その期間内にANPを連続投与し、生理食塩水の連続投与時と比べて、流入、流出の速度が変化するかどうかを調べた。しかし、ANPの連続投与による流入、流出速度の変化はみられなかった。以上の結果から、ANPによる血漿Na^+濃度減少作用は、体外からのNa^+摂取の抑制によるもので、鰓からのNa^+排出の促進によるものではないことが明らかとなった。このように、個体レベルでのANPの血漿Na^+濃度減少作用の全貌が明らかとなったため、今後はANPの作用のあった各部位(飲水、腸)についてさらに詳しく調べていきたい。そのためにまず、ANP特異的受容体NPR-Aの発現部位を分子生物学的、免疫組織化学的手法を用いて同定していきたい。また今現在、内因性のANPの生理作用を調べるため、ANPの抗体を投与して血漿中のANP活性を抑える実験も行っている。これまでの研究により、ANPの血漿Na^+濃度減少作用は、飲水や腸からのNa^+摂取の抑制によるもので、鰓や腎臓からのNa^+排出の促進によるものではないことが明らかになった。しかし、これまで明らかにされてきたANPの生理作用は、外部からANPを投与することによって調べたものであり、実際に体内に存在する内因性ANPが海水適応に関与しているか否かは不明である。本年度は、ANPに特異的に結合する抗体をウナギに投与し、血液中に循環するANPの活性を抑え、内因性ANPの海水適応への作用を調べた。海水ウナギに抗体を投与すると、飲水量が徐々に増加し、アンジオテンシンII(ANGII)濃度も増加した。これまでANPは直接飲水を抑制することが知られていたが、ANGIIレベルを下げることによっても飲水を抑えられることが示唆された。次に、血液中のANPレベルが上昇するとともに飲水が一時的に抑制される海水移行時や、血液中のANPが急激に上昇して飲水が一時的に抑制される浸透圧刺激時に抗体を投与したが、飲水量、ANGII濃度、血漿Na^+濃度ともに対照群と変わらなかった。