hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カーボンナノチューブによるプロセッシングツールの開発

1.ナノチューブを用いた発光・発熱ツール発光・発熱ツールを作成しシステムに組み込んだ後,近赤外ディテクタで分光計測を行い,その放射スペクトルがプランクの黒体輻射である事を確認した.次に,この領域に吸収をもつ試料(高OH濃度石英ファイバ)の吸収スペクトルの計測にナノツールを用い妥当な吸収スペクトルを得た.また,到達温度とナノチューブの長さの関係を検討した結果,2000K程度の高温域に於けるナノチューブの熱伝導度が室温の銅と同程度と高い事,および,ナノチューブが短くなると熱伝導度が低下し,これがフォノンの平均自由行程で説明できる事を見いだしフォノン散乱長が約270nmであると見積った.2.ナノチューブ・ナノツールのSPMシステムへの組み込み環境制御型でガス導入可能なSPMに非接触AFM検出系を搭載し,ナノツールをシステムに組み込む準備が完了した.3.ナノチューブヒーターを用いた局所ホットフィラメントCVD(秋田)局所CVDに先立ちアルコールを原料ガスとする熱CVD装置の立ち上げと成長を行い触媒の検討を行った.Co/Mo混合触媒を用いる事で良好なナノチューブの成長を確認し,これを用いたFETも作製した.また,減圧下でガス導入を行う予備実験としタングステンヘキサカルボニルを原料ガスとしSEMチャンバー内に導入し電子線誘起堆積をナノチューブ先端部に行った.本堆積物の物性を調べるためにナノチューブを用いた超高感度質量計測法を考案し,各種条件におけるナノスケール堆積物(直径100nm以下)の密度計測に成功した.4.ナノチューブ・ナノツールによるナノ加工(中山)発熱ツールとしてナノチューブ先端に堆積した直径100nm以下の非晶質カーボンの加熱/蒸発に成功した.1.ナノチューブを用いた発光・発熱ツール発光・発熱ツールを作成しシステムに組み込んだ後,近赤外ディテクタで分光計測を行い,その放射スペクトルがプランクの黒体輻射である事を確認した.次に,この領域に吸収をもつ試料(高OH濃度石英ファイバ)の吸収スペクトルの計測にナノツールを用い妥当な吸収スペクトルを得た.また,到達温度とナノチューブの長さの関係を検討した結果,2000K程度の高温域に於けるナノチューブの熱伝導度が室温の銅と同程度と高い事,および,ナノチューブが短くなると熱伝導度が低下し,これがフォノンの平均自由行程で説明できる事を見いだしフォノン散乱長が約270nmであると見積った.2.ナノチューブ・ナノツールのSPMシステムへの組み込み環境制御型でガス導入可能なSPMに非接触AFM検出系を搭載し,ナノツールをシステムに組み込む準備が完了した.3.ナノチューブヒーターを用いた局所ホットフィラメントCVD(秋田)局所CVDに先立ちアルコールを原料ガスとする熱CVD装置の立ち上げと成長を行い触媒の検討を行った.Co/Mo混合触媒を用いる事で良好なナノチューブの成長を確認し,これを用いたFETも作製した.また,減圧下でガス導入を行う予備実験としタングステンヘキサカルボニルを原料ガスとしSEMチャンバー内に導入し電子線誘起堆積をナノチューブ先端部に行った.本堆積物の物性を調べるためにナノチューブを用いた超高感度質量計測法を考案し,各種条件におけるナノスケール堆積物(直径100nm以下)の密度計測に成功した.4.ナノチューブ・ナノツールによるナノ加工(中山)発熱ツールとしてナノチューブ先端に堆積した直径100nm以下の非晶質カーボンの加熱/蒸発に成功した.1.カーボンナノチューブの準備(担当:秋田)本提案に示すナノプロセッシングツールに適したナノチューブがどのようなナノチューブかを検討した.その結果,アーク放電法によるナノチューブが適しており,これらナノチューブに対して最大許容電流が10^8A/cm^2,到達温度が約3000Kであることを明らかにした.2.ナノチューブの発光・発熱プロセスの基礎評価(担当:中山)(1)ナノチューブの高電流密度領域における特性アーク放電で合成された多層ナノチューブでは室温でのバリスティック伝導が報告され,本研究により室温におけるキャリアの局在長は約1μmであることが分った.電流密度の増加による温度上昇のメカニズムはバリスティック伝導だけでは説明できず,温度上昇により伝導モードが変化する.このような,電流密度の増加に伴うナノチューブの伝導モードの変化を室温域からナノチューブが昇華し始める2500Kにわたって詳細に観測し検討した.(2)ナノチューブヒーターの製作と基礎特性評価石英製の光ファイバーを延伸し電極を蒸着後ナノチューブをSEM内マニピュレーションにより取り付けた.上記検討項目で性能の高かったナノチューブを用いる.これは,光ファイバー端にヒーターを形成するため,ヒーター部の輻射発光スペクトルから使用時の温度が測定できるツールとなる.また,対向電極に引き出し電圧を印加し熱電子放出特性の検討の準備を行った.3.ナノチューブナノヒーターを具備したガスノズルへの展開(秋田)ノズル先端に取り付けたナノチューブに通電加熱することでナノチューブをヒーターとして動作させた.ヒーターとして一本のナノチューブをループ状に取り付け2500Kの到達温度を確認した.1.ナノチューブを用いた発光・発熱ツール発光・発熱ツールを作成しシステムに組み込んだ後,近赤外ディテクタで分光計測を行い,その放射スペクトルがプランクの黒体輻射である事を確認した.次に,この領域に吸収をもつ試料(高OH:濃度石英ファイバ)の吸収スペクトルの計測にナノツールを用い妥当な吸収スペクトルを得た.

また,到達温度とナノチューブの長さの関係を検討した結果,2000K程度の高温域に於けるナノチューブの熱伝導度が室温の銅と同程度と高い事,および,ナノチューブが短くなると熱伝導度が低下し,これがフォノンの平均自由行程で説明できる事を見いだしフォノン散乱長が約270nmであると見積った.2.ナノチューブ・ナノツールのSPMシステムへの組み込み環境制御型でガス導入可能なSPMに非接触AFM検出系を搭載し,ナノツールをシステムに組み込む準備が完了した.3.ナノチューブヒーターを用いた局所ホットフィラメントCVD(秋田)局所CVDに先立ちアルコールを原料ガスとする熱CVD装置の立ち上げと成長を行い触媒の検討を行った.Co/Mo混合触媒を用いる事で良好なナノチューブの成長を確認し,これを用いたFETも作製した.また,減圧下でガス導入を行う予備実験としタングステンヘキサカルボニルを原料ガスとしSEMチャンバー内に導入し電子線誘起堆積をナノチューブ先端部に行った.本堆積物の物性を調べるためにナノチューブを用いた超高感度質量計測法を考案し,各種条件におけるナノスケール堆積物(直径100nm以下)の密度計測に成功した.4.ナノチューブ・ナノツールによるナノ加工(中山)発熱ツールとしてナノチューブ先端に堆積した直径100mm以下の非晶質カーボンの加熱/蒸発に成功した.
英語史研究支援のコンピューター可読異写本パラレル・テクストの果たす役割に関する研究

英語史研究において、研究の対象となる文献について、その異写本も言語的には一種の「翻訳作品」とみなし得ることからそれらに主写本と対等の位置を与え、それら異写本間に見られる異同を詳細に調査することによって時間的、方言的その他の言語変異・言語変化に関する情報を得ようとする試みは最近の注目すべき傾向といえよう。この試みは、特に、英語史の上で文献が乏しいため研究が進んでいなかった古英語から中英語へのいわゆる「移行期」について、研究の可能性が残されていることを示唆している。本研究はこれらの点に着目し、所期中英語期の宗教散文を代表する『修道女案内』(Ancrene Wisse、以下AW)を取り上げ、関連する全ての異写本テクストを写本の句読点を含め厳密に検討の上転写して電子テクスト化し、さらにそれらを成立年代順にパラレルに並置することによって得られる異写本パラレル・テクストに基づき、このようなフォーマットの電子テクストが英語史研究に今後どのような役割を果たし得るか検討し、英語史研究支援のデーターベースのあり方を追求することを目的とする。本年度は、羅仏訳を含め各写本について写本マイクロフィルム、ファクシミリ、校訂本、関連図書の入手に務め、入手分から写本テクストを検討し、序文、第1、2章の順に電子テクスト化を行った。入力分について厳密な校正を施すとともに、パラレル化テクストによる言語研究について具体的な検討作業を進めた。オックスフォード大学開発の校訂プログラムCollateの開発者P.Robinson博士との意見交換も有益であった。研究成果は一部池上が10月「人文科学とコンピュータ」シンポジウムにおいて、また、Scahill,久保内が日本英文学会第68回大会シンポジウムにおいて発表を行った。
開始タンパク質の濃度を介した複製開始制御

大腸菌ゲノム上に存在するdatA領域は、複製開始タンパク質DnaAを多量に結合することにより遊離DnaAの濃度を低下させ、過剰な複製開始を抑制する事をこれまでに明らかにしてきた。本研究では細胞内のDnaA濃度と複製開始制御の関係をより完全に理解する目的で以下の研究を行った。1.datAの機能へのIHFの関与datA内に存在するIHF認識配列にIHFが非常に高い親和性を示すことが判明した。DnaA boxとIHF結合部位、およびそれらの近傍にいろいろな変異を導入した株の解析から、IHFにより折り曲げられたdatA領域全体に、秩序正しい3次元構造の変化が引き起こされ、多量のDnaA分子が結合するというモデルが示唆された。2.dnaA遺伝子の染色体上の位置と複製開始制御の関係dnaA遺伝子は染色体上でoriC近傍に位置し、oriCとともに複製開始後しばらく細胞膜に隔離される。この間は、転写が抑制されている。dnaA遺伝子の位置を本来の位置から移動させると、細胞膜への隔離の時期がずれ、細胞周期における転写抑制の時期が本来の時期とずれることになる。このような株を系統的に作成、解析した。その結果、dnaA遺伝子の隔離が複製開始制御に関与することが示唆された。この結果はこれまでの一般的な考えとは異なるものである。細胞周期における細胞内のDnaAの挙動を知る目的で、染色体上のdnaA遺伝子内のドメインIIの一部をGFPに置換した株を作成した。この株はDnaA-GFP融合タンパク質に依存して生育した。現在、蛍光顕微鏡によりDnaAの挙動を詳細に解析中である。このような複製制御の機能は他のDnaA結合部位には見られず、datAに固有と考えられる。本研究ではこのdatA固有の多量DnaA結合の分子機構を解析し以下の結果を得た。1.datA変異株の作成と解析datA内には5つのDnaA認識配列(DnaA box)が存在し、このうち2番目と3番目のDnaA boxは、datAが複製制御を行う上で必須である。これらの2つのDnaA boxの間にIHFタンパク質の結合配列が存在する。染色体上のIHF結合部位に変異を導入した株はdatA欠失株と同様に過剰開始反応を行うことから、実際にIHFが細胞内で開始制御に関与すると考えられる。DnaA boxとIHF結合部位の近傍のいろいろな部位に変異を導入した株を作成し、フローサイトメトリーによる解析を行った。その結果、DnaA boxへの少量のDnaA分子の結合が引き金となって、IHFにより折り曲げられたdatA領域全体に、秩序正しい3次元構造の変化が引き起こされながら多量のDnaA分子が結合するというモデルが示唆された。2.試験管内での結合実験ビアコアを用いた表面プラズモン共鳴の解析から、DnaAはdatAに対してoriCと同程度の速度で会合し、一方、解離速度はoriCに較べて速いことが明らかになった。細胞内ではdatAはoriCに較べて数倍多量のDnaA分子を結合すると見積もられているが、試験管内では同程度の分子数の結合が観察された。従ってIHFがdatAへのDnaAの結合量を上昇させることが期待された。しかしながら、いろいろ条件を検討しても、結合量の上昇は観察されなかった。他の未知の因子の関与が考えられる。

大腸菌ゲノム上に存在するdatA領域は、複製開始タンパク質DnaAを多量に結合することにより遊離DnaAの濃度を低下させ、過剰な複製開始を抑制する事をこれまでに明らかにしてきた。本研究では細胞内のDnaA濃度と複製開始制御の関係をより完全に理解する目的で以下の研究を行った。1.datAの機能へのIHFの関与datA内に存在するIHF認識配列にIHFが非常に高い親和性を示すことが判明した。DnaA boxとIHF結合部位、およびそれらの近傍にいろいろな変異を導入した株の解析から、IHFにより折り曲げられたdatA領域全体に、秩序正しい3次元構造の変化が引き起こされ、多量のDnaA分子が結合するというモデルが示唆された。2.dnaA遺伝子の染色体上の位置と複製開始制御の関係dnaA遺伝子は染色体上でoriC近傍に位置し、oriCとともに複製開始後しばらく細胞膜に隔離される。この間は、転写が抑制されている。dnaA遺伝子の位置を本来の位置から移動させると、細胞膜への隔離の時期がずれ、細胞周期における転写抑制の時期が本来の時期とずれることになる。このような株を系統的に作成、解析した。その結果、dnaA遺伝子の隔離が複製開始制御に関与することが示唆された。この結果はこれまでの一般的な考えとは異なるものである。細胞周期における細胞内のDnaAの挙動を知る目的で、染色体上のdnaA遺伝子内のドメインIIの一部をGFPに置換した株を作成した。この株はDnaA-GFP融合タンパク質に依存して生育した。現在、蛍光顕微鏡によりDnaAの挙動を詳細に解析中である。
ヒト老化T細胞の機能異常の解析とその対策ーシグナル伝達と遺伝子発現の解析ー

ヒトリンパ球をCD8陽性T細胞、CD4腸性下細胞、B細胞に分離精製し、イオノマイシン(IM)とフオルボ-ルエステル(PMA)の混合刺激を行い,分裂増殖反応を誘導する実験系を確立した。その結果、老年者では何れのリンパ球サブセットにおいて、若年者に比しリンパ球の分裂増殖能の低下が認められたが、CD8陽性T細胞が低下の度合が最も著しく、次にCD4陽性T細胞、B細胞の順であった。IMとPMAの混合刺激の後の細胞内遊離カルシウム濃度を測定し、老若間で比較した。その結果、老年者では有選に低下していた。殊に、低濃度のIMの場合、老若間の差が著しかった。次に癌原遺伝子c-myc及びcーmyb遺伝の活性の度合をcーmyc mRNA,cーmyb mRNAの濃度で比較した。cーmyc及びcーmyb mRNAの発現の程度や最高値に達する時間には両者の差を認めなかった。しかし,老年者ではcーmyc mRNAの分解過程が遅延しているという結果が得られた。1L-2mRNA,1Lー2Lセプタ-α及びβmRNA、NFーKB mRNAについては現在解析中である。次に、cーmyc遺伝子のメケル化の程度を老若間で比較した。老年者では,cーmyc遺伝子Xon Iに存在するメチル化感受性酵素XhoIサイトのメチル化の程度が低下(脱メケル化の亢進)していることが明らかになった。興味深いことに、脱メチル化の程度は、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞の順に著しく、老化に伴う分裂増殖胞低下の順と一致した。最後に、タラリン等、細胞内カルシウムイオン濃度の調節作用を持つ薬物の老化T細胞に対する作用を検討した。その結果、我々がすでにマラスを用いた事で明らかにした様に一程の効果が認められることが明らかになった。さらに、今後稿細な解析を進めたい。
大進化の分子機構の解明

基盤研究B「大進化の分子機構の解明」は大きく分けて二つから成り立っている。一つは進化の過程でゲノムに挿入される転移因子の大進化における寄与である。我々は二次口蓋を作るWint5aのエンハンサーが、三つの転移因子によって構成されていること、三つのうちのそれぞれの転移因子は進化の特定の異なった時期に挿入され、独自の機能を持ったということを証明した。もう一つは戦いとは何か、という問題である。これは強いボスに率いられた率いられた集団は生き残りやすいという重要な行動である。我々は闘魚を材料に戦いを分析した結果、対戦相手同士の脳内の転写産物が戦うことによって同調するという非常に面白い現象を見出した。これまでに哺乳類の脳および二次口蓋の進化に関与した2つのエンハンサーを発見し、それらを欠損させたノックアウトマウスを確立した。そのうち大脳新皮質特異的なAS021エンハンサーの欠損マウスを用い、Satb2、Ctip2、Lmo4などの発現パターンを免疫染色で解析した。またKOマウスにおける神経束の構造を明らかにするため、NPYやTAG1等の抗体を用いた免疫染色もおこなった。一方、二次口蓋の形成過程で機能するAS3_9エンハンサーの解析を、当初の予定を繰り上げて開始した。比較ゲノム解析および反復配列の詳細な解析から、AS3_9エンハンサー配列が複数のレトロポゾンやDNAトランスポゾンに由来し、その機能も哺乳類の進化過程で段階的に確立されたことを明らかにした。このエンハンサーの欠損マウスでは野生型と比較して制御対象遺伝子の発現パターンに異常が見られている。現在はノックアウトマウスにおける口蓋形成の異常を明らかにするため、組織学的な解析をおこなっている。以上のように哺乳類の脳と二次口蓋の進化において重要な役割を果たしてきたエンハンサーに関して、その役割を明らかにした。陸上動物出現の分子基盤に関しては、シーラカンスゲノムを基盤とした比較ゲノム解析をおこなった。シーラカンスと哺乳類で保存された領域が数万箇所存在することから、その中でエンハンサーの候補領域の絞り込みをおこなっている。従来我々のグループはSINEの一種であるAmnSINE1が哺乳類の共通祖先で増幅し、それが哺乳類特異的な形態の形成に関わっていることを証明してきた。今回はその中の一つがWint5aのエンハンサーであり、しかもそのエンハンサーが三つの異なる転移因子から構成されていることを証明した。この三つの転移因子とは、AmnSINE1に加え、新たに見つかったX6b_DNAとMER117である。様々な哺乳類でのオルソログでのこれらの反復配列の存在の有無を調べたところ、AmnSINE1は全て哺乳類の共通祖先で挿入され、X6b_DNAは単孔類が分岐した後、MER117は有袋類が分岐した後の真獣類に至る共通祖先でそれぞれ挿入されたことが明らかになった。このエンハンサーは、Wint5aのエンハンサーとして働き、哺乳類の二次口蓋の形成に貢献するが、非常に面白いことに、AmnSINE1のみではエンハンサーに機能を持たず、三つの反復配列が揃って初めてエンハンサーとして働く。これは、複数の反復配列が組み合わさることによってエンハンサー機能を持つ初めての例である。このように複数の反復配列が、一つの遺伝子のエンハンサーになっているというような例が今後は多く発見されるものと期待される。さらに我々はこのエンハンサーをノックアウトしたマウスを作成し、二次口蓋が形成されるか否かの検討を行った。面白いことにこのノックアウトマウスにおいてはWint5aの発現が不安定になるにもかかわらず、正常な二次口蓋が形成されることが示された。不安定ながらも発現されるWint5aは、ここで発見された以外のエンハンサーによってその発現が制御されているものと想定される。今年度から「戦いの実態の解明とその進化」というテーマで研究を開始した。闘魚を使い、戦いの前、最中、後で、闘魚の脳からRNAを抽出し、RNA-seqを行ってトランスクリプトームの変遷を調べた。三つの異なる反復配列が組み合わさることで一つのエンハンサーを形成していることは予想を超えた発見である。なぜなら従来発見されている反復配列由来のエンハンサーは全て一種類の反復配列が一つのエンハンサーを形成しているという例であるからである。この発見は、ゲノム中に存在する多くの反復配列が組み合わせて様々に異なったエンハンサーを作り得るという新たな可能性を示す。今後このような多くの例が発見されるに違いない。現在この論文は一流誌に投稿中である。また今年度より、「戦いとその進化」という研究を開始し、大きな成果を上げることができた。同種内での戦いは、その種の社会構造安定化のための進化的に保存された現象である。このプロトタイプを闘魚を使って研究し、戦いの実態(neurogenomic state)を明らかにすることに成功した。戦いの前、最中、後の魚から脳を取り出し、RNAを分析することで、戦いの実態を解明した。この研究費では主に二つのテーマを取り扱った。一つはレトロポゾンの一種であるSINEの機能の問題である。もう一つは闘魚を用いて、戦いの分析を分子生物学的観点から遂行した。1)AmnSINE1の座位であるAS3_9を含む領域がWint5aのエンハンサーであることは我々の研究室で兼ねてから明らかにされてきた。今回、この領域が実は三つの領域から構成されていることが明らかになった。AmnSINE

1, X6b_DNA, MER117の三つである。2)進化のプロセスを考えたところ、AmnSINE1が最もい古く哺乳動物の共通祖先で挿入され、その後単孔類の分岐後, X6b_DNAが挿入され、真獣類の祖先で最後にMER117が挿入された。二次口蓋はこの三つが揃って初めて形成される。3)AmnSINE1が最初に挿入された時にはWint5aに関しては機能を持たないがその後の他の二つの転移因子の挿入によって初めて真獣類の共通祖先で機能を持ったということになる。このようなことなる転移因子の組み合わせが一つのエンハンサー活性を作っているというのは初めての例である。4)闘魚を用いて、戦いを分析する系を構築した。60分の戦いの行動分析から、対戦相手同士の行動が同調するという現象が見出された。闘魚にはmouth-lockingというお互いが取っ組み合いの喧嘩をするような行動が知られていて、この頻度、長さ、分布が戦いを特徴づけていると考えられる。5)各段階から転写産物の配列を決定し、其の転写量の相関係数を調べることで、対戦相手同士の転写産物が同調しているという現象が見出された。これは対戦相手が同じように考え、それが同じような行動に転化され、さらにそれが転写産物の同調という現象として見出されたということであろう。このような行動が同調するという現象は世界で初めての発見である。SINEの研究、闘魚の研究とも、思わぬ新しい発見があった。SINEについてはPlosGenetに論文を発表した。闘魚研究については現在論文を完成し、これから投稿という段階である。基盤研究B「大進化の分子機構の解明」のテーマの中で、闘魚関連の研究が論文作成途中であったので、本来は28年度で終了であったところを一年間延長した。闘魚は狭い水槽にオスを二頭入れておくと、1時間以上取っ組み合いの喧嘩をする。その闘魚の脳を単離し、RNAを抽出してRNA-seq分析を行ったところ、約2万の転写産物がシンクロナイズすることが明らかになった。今まで一対のペアーの脳の転写産物がシンクロナイズするということを示した研究者は存在しなかったので、これは非常に面白い現象である。論文を作成したが、分析の個体数が少ないということで、台湾のアカデミアシニカのリー教授と共同で個体数を増やし塩基配列の決定を行った。これで、闘う前が5個体、20分の戦いが5ペアー(10個体)、60分の戦い5ペアー(10個体)、で総計25ライブラリーの塩基配列が得られ、現在再解析の最中である。興味ふかいことは、戦っているときにいつも共通にシンクロナイズされる遺伝子と、あるペアーに特異的にシンクロナイズする遺伝子があることである。記憶や意欲に関わる遺伝子がシンクロナイズしていることが見出された。これはお互いの個体が戦いそのものを記憶しなければならないこと、一方の意欲に引きずられて他方も同様の意欲を持つ、という戦いの性質を反映しているものと思われる。基盤研究B「大進化の分子機構の解明」は大きく分けて二つから成り立っている。一つは進化の過程でゲノムに挿入される転移因子の大進化における寄与である。
多孔性結晶薄膜を用いた分子イオンの配向制御に関する研究

多孔質薄膜を用いた分子イオンビームの分子軸配向制御を目的として、ナノメートルサイズのストレート孔内壁と透過分子イオンの間に生じる相互作用の解明を行う。(1)クーロン爆発イメージング法による分子イオンの配向角度分布測定装置の高検出効率化を行った。(2)TS-1ゼオライト結晶自立薄膜及びイオン穿孔カプトン薄膜を用いてイオン透過実験を行った。分子イオン透過のためにゼオライト結晶薄膜に対して高い結晶性が要求されることがわかった。穿孔カプトン薄膜を透過した分子イオンについては薄膜内壁表面に生じたウエイクポテンシャルによる相互作用を示唆する結果が得られた。本研究では、多孔質薄膜を用いた高速分子イオンビームの分子軸配向制御の実現を目的として、ナノメートルサイズのストレート孔内壁と透過高速分子イオンの間に生じる相互作用の解明を行う。初年度は分子イオンの配向角度測定システムを構築し、次年度は多孔質結晶自立薄膜に高速分子イオンを透過させることで分子軸配向現象の観測及び配向制御のための最適条件を明らかにする。平成25年度は、クーロン爆発イメージング法を用いた分子イオンの配向角度測定システムの構築を行った。この測定システムでは、多孔性薄膜から出射した分子イオンを再度カーボン薄膜に入射させ、クーロン爆発による解離を誘起させる。クーロン爆発では分子構造によって解離イオンの散乱方向・エネルギーが決定されるため、カーボン薄膜の背後に設置したマイクロチャンネルプレートで解離片の二次元イメージングを行うことで、分子イオンの配向角度を求めることができる。本システムを用いて細孔の直進性・平行性が高いイオン穿孔薄膜について分子イオンの透過実験を行った。具体的には、6 MeVのC_2分子イオンを照射し透過粒子の運動エネルギーの測定を行い、透過分子イオンと穿孔カプトン膜内壁との相互作用の有無を検証した。この結果、透過したイオンは細孔内部で解離しなかったがエネルギーの損失が観測され、多孔薄膜内壁との相互作用があったことが確認できた。この相互作用による分子イオンの配向角度変化の有無、もし変化がある場合にはその制御条件を次年度に明らかにする予定である。本実験は独立行政法人日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所イオン照射研究施設施設(TIARA)のイオン加速器を用いて行われた。最終年度では以下の研究開発を行った。(1)昨年度に構築したクーロン爆発イメージング法による分子イオンの配向角度分布測定装置で用いるマイクロチャンネルプレート(MCP)の検出効率の向上を図った。入射口にテーパー加工を施して実効的に開口率を約100%にしたMCPの検出効率が、100 keV以上のHeイオン及びArイオンに対して開口率と一致する100%になることを明らかにした。従来のMCPの検出効率は60%程度であり、テーパー型MCPを組み込むことでクーロン爆発イメージング法の高検出効率化を達成した。(2)昨年度に作製した細孔径120 nmのイオン穿孔カプトン薄膜に6 MeVのC2イオンを入射させ、出射したC2イオン分子軸の配向分布をクーロン爆発イメージング法を用いて調べた。具体的には、透過粒子を炭素薄膜に入射させてクーロン解離させ、その空間分布の二次元画像を測定した。炭素膜のみのクーロン解離画像と比較したところ、穿孔膜を透過した炭素イオンの方が平均電荷が高く、空間分布では広がっていることが観測された。以上から、細孔表面の誘起電荷によってC2イオンがビーム軸に対して垂直に配向したか、膜内で解離した炭素イオン対が測定に含まれていることを示唆する結果が得られた。(3)細孔表面と透過イオンの相互作用の細孔径依存性を調べるために、細孔径0.6 nmのTS-1ゼオライト結晶自立薄膜を用いてイオン透過実験を行った。3 MeVのH+ビームを入射させた実験では細孔を透過したイオンは観測されなかった。使用したゼオライト薄膜では細孔の直進性が低く、高い結晶性を持つ多孔質結晶自立薄膜が必要であることが分かった。原子分子物理学本年度は、配向度測定システムの構築及びイオン穿孔カプトン薄膜を用いた分子イオン透過実験を行った。しかし、ゴニオメーターの故障により分子イオンの配向角度変化の測定に着手することは出来なかった。現在、ゴニオメーターの修理は完了しており、次年度早々にイオン穿孔カプトン膜を透過した分子イオンの配向角度の測定及び結晶薄膜透過実験に着手する予定である。構築した分子イオンの配向角度測定システムを用いて、次年度ではイオン穿孔薄膜に加えて多孔質結晶薄膜を用いた透過実験を実施する。

まずは、二原子分子イオンを用いて、結晶薄膜の細孔径・材質及び分子イオンの双極子モーメント・入射速度・回転定数(安定同位体を用いる)・分子量を変化させ、透過した分子イオンの配向角度を測定する。薄膜の細孔径・材質及び分子イオンの入射速度によってウエイク相互作用が、また、薄膜の細孔径・材質及び分子イオンの双極子モーメントによって結晶電場との相互作用が、さらには、回転定数によって分子イオンの回転のしやすさが変化することが予想されるため、これらの相互作用・現象による配向角度の変化を検証する。次に、代表的な直線分子であるC_nイオン(n=1-8)を用いて同様の測定を行い、クラスター分子イオンの配向制御の実効性を検証する。上記の実験を通じて、配向制御に最適な結晶薄膜や分子イオンビームの条件を見出す。配向を制御した大強度イオンビームへの応用を目的として、耐放射線性や機械強度に優れた配向制御のための薄膜結晶を提案する。当初、分子イオンの配向度測定に用いる検出器(マイクロチャンネルプレート)の検出効率について、外部の人間に委託し謝金を支払う予定であった。しかし、この測定を自身で行ったため、謝金が不要になった。謝金として計上した経費は物品費に振り分け、検出効率測定を効率化する実験機器を購入する予定である。
水系反応で使用可能な高分子固定化型不斉触媒の創成

不斉有機分子触媒として機能するキラル第四級アンモニウム塩(^*Q^+X^-)を高分子上に固定化するための新たな手法を開発し、その固定化条件と不斉触媒機能について徹底的に調査した。従来^*Q^+X^-は、触媒作用を持つ^*Q^+が共有結合を介して高分子上に固定化されてきた。今回我々はイオン結合による固定化を新たに提案し、架橋ポリマーに導入したスルホン酸塩基の対カチオンとして^*Q^+を高分子に固定化することに成功した(-SO_3^<-*>Q^+)。固定化のために^*Q^+の構造を修飾する必要がないため、目的の反応に応じて適切な触媒構造を容易に高分子に固定化することが可能となった。合成したポリマーはグリシン誘導体の不斉アルキル化反応などの有用な不斉反応において、固定化してない低分子触媒よりも優れた不斉触媒機能を発揮し、反応後には活性を損なうことなく再利用することが可能であった。カルボン酸塩型の高分子に固定化された触媒(-CO_2^<-*>Q^+)には再利用性がなく、スルホン酸塩型高分子であることの重要性が示唆された。^*Q^+X^-のような不斉有機分子触媒は金属元素を含まず、水の存在下においても安定に使用することができるため、環境にやさしい理想的な有機合成を与えるが、一般に触媒活性が低く、一度に多量の触媒量を必要とする。そのため、今回のように不斉有機分子触媒を再利用できることには極めて大きな意義がある。今回得られた研究成果は、重要な学術雑誌、および国内外の学会において発表した。理想的な有機合成プロセスとして水系反応で使用可能な「高分子固定型不斉有機分子触媒」の開発を目的とし、キラル第四級アンモニウム塩の生成条件ならびにそれらの高分子への固定化法を徹底的に調査した。その成果として、我々はあらゆるキラル第四級アンモニウム塩を容易に高分子へ固定化することのできる新たな手法を見出した。従来開発されてきた手法は、キラル第四級アンモニウム塩構造を共有結合を介して高分子鎖へ固定化させるものであった。しかしながら構造中になんらかの反応性官能基を導入する必要があるため、これまでは予め固定化に敵した数ケ所の反応点を有し、かつ不斉有機分子触媒優れた性能が認められているシンコナアルカロイド誘導体の固定化に限定されていた。我々は、スルホン酸塩基(-SO_3^-X^+)をペンダント有するポリスチレンを設計し、その体力チオン(X^+)として種々のキラル第四級アンモ」ニウムカチスレンを固定化させることに成功した。この手法を用いれば、構造中に官能基を修飾することなく、目的の不斉反応に応じて適切な構造のキラル第四級アンモニウム塩を容易に高分子に固定化することが可能である。特に我々は、現在最も優れたキラル相間移動触媒の一つとして知られる丸岡らによって開発されたキタル第四級アンモニウム塩構造を高分子に固定化することにも成功し、工業的応用も十分に期待できる成果を得た。この高分子不斉触媒は、グリシン誘導体の水系での不斉アルキル化に反応において、対応する光学活性体を高収率、98%eeで与え、しかも触媒性能を損なうことまくすくなくとも3回の再使用が可能であることが確認された。
インスリン抵抗性症候群発症基盤としてのアディポネクチンの発生工学的、遺伝的解析

糖尿病、高脂血症、高血圧などの動脈硬化危険因子を合併するマルチプルリスクファクター症候群の中に、リスクの偶然の合併でなく共通の発症基盤をもつ病態が想定されている。しばしばインスリン作用不全を示すため「インスリン抵抗性症候群」とも呼ばれるが本態は明らかでない。私達は内臓脂肪蓄積がインスリン抵抗性の上流に存在し、脂肪細胞が分泌する多彩な生理活性物質(adipocytokineと呼ぶ)の分泌異常が病態に関わることを明らかにしてきた。本研究は、私達が発見した新規脂肪細胞分泌因子、adiponectinの機能とインスリン抵抗性症候群に果たす役割を明らかにするものである。1)adiponectin欠損マウスは、高脂肪高ショ糖食負荷により強いインスリン抵抗性がおこり(Nat Med 2002)、血管内皮傷害により強い内膜肥厚が生じた(JBC 2002)。また内皮依存性血管拡張反応が障害され、高血圧にも関与すると考えられた(Hypertension 2003,JBC 2003)。2)一方遺伝子スクリーニングにより、血中濃度減少を伴うミスセンス変異を見い出し、この変異を有するものはインスリン抵抗性症候群の形質を示し(Diabetes 2002)、冠動脈疾患での頻度も高かった(JACC 2004)。また3)動脈硬化を好発するマウスにadiponectinを高発現すると粥状動脈硬化巣の進展が抑制され、(Circulation 2002)。4)臨床的にも血中濃度の高い群は、その後の糖尿病罹患率や心血管イベント発症率が低かった(Lancet 2002,JASN 2002)。以上よりadiponectinはインスリン抵抗性、動脈硬化双方に防御的に働くbi-functional moleculeで、「インスリン抵抗性症候群」において中心的な役割を果たすと考えられた。内臓脂肪蓄積時には多彩なadipocytokine分泌異常がおこるが、adiponectinの動脈硬化防御作用はインスリン抵抗性防御作用とは独立している。このような動脈硬化易発症状態を「インスリン抵抗性」症候群と呼ぶ妥当性については再考の余地があると考えられる。糖尿病、高脂血症、高血圧などの動脈硬化危険因子を合併するマルチプルリスクファクター症候群の中に、これらの危険因子が偶然合併するのではなく、共通の発症基盤をもつ独立した病態が想定されている。このような病態では、インスリンに対する反応不全、すなわちインスリン抵抗性をしばしば示すためインスリン抵抗性症候群とも呼ばれているが、その本態は未だ明らかではない。私達は過栄養による腹腔内内臓脂肪蓄積がインスリン抵抗性症候群の上流に存在し、環境負荷による脂肪組織発現遺伝子発現異常こそが多彩な病態の基盤となっていると考え検討を行ってきた。その結果、単にエネルギー備蓄細胞と考えられてきた脂肪細胞が多彩な生理活性物質(adipocytokine)を分泌する内分泌細胞であり、過栄養による分泌異常が病態に関わることを明らかにした。この過程で発見したadiponectinは、1)血管平滑節細胞の増殖抑制や、マクロファージ泡沫化抑制などの抗動脈硬化作用を有しており、2)血管傷害時に局所に集積する。3)脂肪細胞特異的な分泌蛋白でありながら、肥満、特に内臓脂肪蓄積時に血中濃度が低下する、などの特徴を有している。本研究の目的は、この脂肪細胞由来分子の生体防御作用を明らかにし、その分泌異常がインスリン抵抗性症候群においてどのような役割を果たすかを示すことにある。本年度は、まずadiponectin欠損マウスを作成し、その形質を検討した。1)Adiponectinノックアウト

マウスは発育に異常はなく体重も正常であった。筋肉FATP遺伝子発現の減少、脂肪組織TNFa遺伝子発現の増加を認めたが、通常食下ではインスリン感受性も正常であった。しかし高脂肪高ショ糖食負荷により強いインスリン抵抗性が惹起された(Nat Med 2002)。インスリン感受性が正常な通常食下でも、内皮傷害を加えると強い内膜肥厚が生じた(JBC 2002)。つまりadiponectinノックアウトマウスは環境負荷によりインスリン抵抗性、動脈硬化をきたしやすいモデルマウスと考えられた。2)一方ヒトAdiponectin遺伝子異常のスクリーニング過程で、血中濃度減少を伴うミスセンス変異を見い出した。この変異は糖尿病患者に有意に多く、非糖尿病群でも高血圧、脂質代謝異常、動脈硬化疾患合併するインスリン抵抗性症候群の形質を示した(Diabetes 2002)。一方3)血中adiponectin濃度の高い群は、その後の糖羅病罹患率(Lancet 2002)や心血管イベント発症率(JASN 2002)が低いことが示された。4)さらに動脈硬化を好発するアポE欠損マウス(このモデルはインスリン感受性に異常はない)にヒトAdiponectinを高発現し血中濃度を上昇させたところ、粥状動脈硬化巣の進展が抑制された(Circulation 2002)。これらの検討より脂肪細胞分泌因子adiponectinはインスリン抵抗性、動脈硬化双方に防御的に働くbi-functional moleculeであることが明らかになった。ここで重要なことは1)この分子は環境負荷が加わった時に働く防御因子であること、2)動脈硬化防御作用はインスリン抵抗性防御作用とは独立していることである。過栄養により多彩なadipocytokineの分泌異常がおこり、adiponectin分泌不全は動脈硬化発症の一翼をになうと考えられる。このような動脈硬化易発症状態を「インスリン抵抗性」症候群と呼ぶ妥当性については再考の余地があると考えられる。糖尿病、高脂血症、高血圧などの動脈硬化危険因子を合併するマルチプルリスクファクター症候群は、インスリン抵抗性をしばしば示すためインスリン抵抗性症候群とも呼ばれるが、その本態は未だ明らかではない。私達は過栄養による腹腔内内臓脂肪蓄積がインスリン抵抗性症候群の上流に存在し、adipocytokine分泌異常が多彩な病態の基盤となっていることを明らかにしてきた。私達が発見したadiponectinは、脂肪細胞由来分泌蛋白でありながら、肥満、特に内臓脂肪蓄積時に血中濃度が低下する。本研究の目的は、adiponectinの生理作用を明らかにし、その分泌異常がインスリン抵抗性症候群においてどのような役割を果たすかを示すことにある。
臍帯平滑筋の増殖調節とその異常に関する分子生物学的研究

本年度は昨年に引き続き臍帯の分化及び老化を分子レベルで解析した。特に臍帯の分化及び老化にアポトーシスが関与するか否かを調べた。アポトーシス関連因子bcl-2を組織レベル、タンパクレベル、遺伝子レベルで解析し、実際にアポトーシスが起きているかどうか検討した。bcl-2について組織レベルで解析を行い、TUNEL(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling)法を用いてアポトーシスを検出した結果、僅かにアポトーシスが検出されたが、臍帯の週齢別では変化が無かった。また患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、各30μgをSDS-PAGEにて分離、Western blotting法にてニトロセルロースフィルターに移してbcl-2の抗体を反応させ、ECLキットを用いて蛍光反応によりタンパク質発現を解析したがbcl-2のタンパク質の量は、臍帯の各週齢別では変化が無かった。次に臍帯の分化及び老化に老化関連因子であるテロメラーゼが関与するか否かを検討した。患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、テロメラーゼアッセイを行った。抽出したタンパク質中のテロメラーゼはその3'末端にtelomeric repeatsという特定の配列を作るので、3'末端にtelomeric repeatsの配列を作らせ、telomerase productsはその3'末端にtelomeric repeatsの配列と、その配列に相補的なプライマーCX[5'-(CCCTTA)_3 CCCTAA-3']とdNTPを臍帯組織抽出液と混合し、PCRにて増幅、そのproductsを電気泳動にて検出した。その結果、各週齢の違った臍帯抽出したタンパク質では、各週齢でのテロメラーゼ活性の違いが見出せなかった。本課題全体を通じて、臍帯の発生ではその初期に、Cyclin Eが強く発現することを明らかにすることができた。本研究は妊娠14週から40週までのさまざまな週齢の臍帯における細胞周期調節因子等の発現を比較することにより、臍帯の発生過程における細胞増殖がどのように制御されているのかをあきらかにすることを目的として開始された。免疫染色の結果、発生初期の臍帯(14週19週)動脈平滑筋細胞においてcyclinE強陽性の細胞が多くみられ、発生後期の臍帯(3940週)動脈平滑筋細胞においてはcyclinE陽性細胞の数が低下していた。これとは逆にp21は発生後期の臍帯動脈平滑筋細胞において発現が強く、発生初期の臍帯動脈平滑筋細胞においては発現が弱かった。ウエスタンブロッティング法を施行したところ、2種類のcyclinEモノクローナル抗体のどちらも免疫染色と同じ傾向を示した。発生初期の臍帯(14週19週)において強発現し、それ以降発現が低下していく。ウエスタンブロッティング法においては転写調節因子E2F1,DNA複製関連因子PCNAも同様に発生初期の臍帯(14週19週)においてのみ発現した。cyclinEと複合体を形成するp33cdk2の発現は発生の全期間を通じて観察されたが、その発現量は週齢があがるにつれ減弱した。一方p33cdk4は発生の全期間を通じて観察され、その発現量に変動は見られなかった。ウエスタンブロッティング法ではp21、p27の発現については一定の結果が得られなかった。またRT-PCR法でp21の発現を検討したところ発生の全期間で有為差は認められなかった。また発生初期の臍帯ではテロメレースが発現している可能性があるのではないかと考え、テロメレースアッセイを施行したが、14週以降ではどの週齢においてお発現は認められなかった。これまでの結果より、臍帯の発生ではその初期に、cyclinEが強く発現していることが確認された。

抽出したタンパク質中のテロメラーゼはその3'末端にtelomeric repeatsという特定の配列を作るので、3'末端にtelomeric repeatsの配列を作らせ、telomerase productsはその3'末端にtelomeric repeatsの配列と、その配列に相補的なプライマーCX[5'-(CCCTTA)_3 CCCTAA-3']とdNTPを臍帯組織抽出液と混合し、PCRにて増幅、そのproductsを電気泳動にて検出した。その結果、各週齢の違った臍帯抽出したタンパク質では、各週齢でのテロメラーゼ活性の違いが見出せなかった。本課題全体を通じて、臍帯の発生ではその初期に、Cyclin Eが強く発現することを明らかにすることができた。
元素分析における難燃性含フッ素化合物の分析法に関する研究

元素分析において、難燃性含フッ素化合物を分析する際は不完全燃焼を防ぐ必要があるが、従来の対策では克服できない新規化合物DCNBT(ジクロロナフタレンビストリフラート)に遭遇したことをきっかけとして本研究を行うこととなった。本研究では対象となる分析装置(ヤナコCHNコーダーMT-5)の改造をすることなく、また通常の設定を大きく変更することなく克服できる様な分析条件を見つけ出すことを目標とした。テフロンの分析ではBaCl_2・2H_2Oを添加すれば通常の分析条件でも酸素量を増加させた場合でも、どちらも概ね良好な結果(誤差が±0.3%以内)が得られたが、Co_3O_4やCuOなどの添加剤では効果が得られなかった。研究の発端となった化合物DCNBTは検討の結果、BaCl_2・2H_2Oを添加して酸素流量を約120mL/minに上げ、試料導入を75秒とした時に良好な結果が得られた。あるいは、Co_3O_4を添加して酸素約120mL/min、導入75秒の時も良好な結果が得られた。また、DCNBTより難度の高い試料になるとの予想のもと、本研究のために新規に合成されたDBNBT(ジブロモナフタレンビストリフラート)についても検討を行なったところ、DCNBTの場合と同様、上記の2つの分析条件で良好な結果を得ることができた。以上の検討結果から、テフロンの様に分子中に水素原子を全く含まないものについてはBaCl_2・2H_2Oを添加した時だけが成功し、分子中に水素原子を含む新規化合物DCNBTやDBNBTは、BaCl_2・2H_2OかCo_3O_4を添加して酸素流量と導入時間を工夫することで良好な結果が得られることがわかった。今回検討した試料に関しては、装置の設定、特に電気炉の温度を変更することなく、酸素流量を上げるだけという、分析条件の最小限の変更で克服できたことは有意義であった。
不活性化学種の活性化を鍵とする触媒的炭素ー炭素結合生成反応の開発

エノラートを用いる炭素一炭素結合生成反応は有機化学の最も基本的な反応であり、これまでに触媒的反応を含め数多く報告されている。しかしながら、一般には求核剤の活性化のためには等量の金属を用いることが多く、系中において触媒的に求核剤を活性化させる、いわゆる直接的求核付加反応の報告例は少ない。それら報告例においても、カルボニル基のα位に電子吸引性基が置換した化合物がもっぱら用いられており、基質一般性に課題が残されている。当研究室ではα位にアルキル基が置換したスルポニルイミデートを求核剤として用いると触媒量の塩基(三級アミン)により系中にてスルポニルイミデートが活性化され、イミンへの付加反応が円滑に進行することを報告していた。反応生成物のスルポニルイミデートは、水和反応や還元反応により容易に対応するエステルやアルデヒドへと変換することができるため、有用性は高い。本研究では、スルホニルイミデートのさらなる可能性を探求すべく、金属塩基を触媒として用い反応を検討した。金属塩基を用いる利点としては、金属の持つ特異なルイス酸性により反応が促進されることが期待できること、不斉反応へと展開する際種々のリガンドを簡便にスクリーニングできること等が挙げられる。種々の検討の結果、アルカリ土類金属のアルコキシド塩を用いると、反応が円滑に進行し、目的付加体を高収率で与えることを見いだした。さらに、溶媒等の反応条件を最適化し、スルポニルイミデートの構造を修飾することにより、これまで得られなかった高いsyn選択性が発現することを見いだし、本反応の一般性をさらに広げることが出来た。またキラルリガンドを用いることで触媒的不斉反応への展開も行い、最高57%鏡像体過剰率で目的物を得ることができた。スルポニルイミデートは付加反応のみならず置換反応においても機能し、パラジウム触媒を用いるアリル化が触媒的に進行することも見出した。
魚類生殖系列キメラを用いた絶滅危惧種の保存と復活

本研究は絶滅危惧種であるタナゴ類の保全と復活を目的とし、発生工学的手法を用いて対象種の生殖細胞を他魚種の生殖巣で生産するシステムを開発することを目指している。これまでに、対象種であるニッポンバラタナゴの始原生殖細胞(PGCs)を可視化し、その動態を人工培養下で観察することを可能とした。この可視化したPGCsを不妊化を施したゼブラフィッシュやキンギョに移植し、生殖系列キメラを作出したが、いづれのキメラにおいてもニッポンバラタナゴの配偶子は形成されていなかった。そこで、ニッポンバラタナゴに近縁なタイリクバラタナゴをホストとするために不妊化の条件を検討し、されに生殖系列キメラ作出を行った。1.タイリクバラタナゴの不妊化本種のdnd遺伝子に対するモルフォリノオリゴを用いて不妊化を施した個体の生殖腺を組織学的に調べたところ、20日齢の稚魚(浮上時)の生殖腺が対象魚と異なり未発達であった。このことから、本手法により不妊化を誘導できると考えられた。2.タイリクバラタナゴを宿主とした生殖系列キメラ作出胞胚期のタイリクバラタナゴの不妊化胚に蛍光ラベルしたニッポンバラタナゴのPGCを移植しキメラ胚を誘導した。移植したPGCは移動ルート上を自立的に移動していることが観察されたが、いづれのキメラ胚も正常に発生しなかった。これは従来の胚操作や培養方法がタイリクバラタナゴ胚に適していないことが考えられた。本研究は発生工学的手法を用いて、絶滅危惧種であるタナゴの保存と復活の手法を確立することを目的としている。これまでに、同コイ科であるゼブラフィッシュやキンギョを宿主とし生殖系列キメラを作出してきたが、これらの種の生殖巣ではニッポンバラタナゴの配偶子は形成されなかった。そのため本年度はニッポンバラタナゴと近縁種であるタイリクバラタナゴを宿主として用いるための基礎的知見の集積をおこなった。1タイリクバラタナゴの不妊化の検討(1)生殖細胞特異的に発現するdnd遺伝子の単離宿主の生殖細胞を欠損させることで効率的にドナーの配偶子を形成させることができることから、タイリクバラタナゴの生殖細胞を欠損させる分子ツールとしてdnd遺伝子を部分的に単離し、これに対するモルフォリノオリゴの作成を行った。(2)不妊化条件の検討(1)で作出したモルフォリノオリゴを受精後胚に注入し、稚魚の生殖巣を組織学的に観察したところ、生殖細胞は観察されなかったことから、不妊化を誘導できることを確認した。しかしながら、注入胚の生残率が低いため、さらなる検討が必要と考えられた。また本年度は、宿主として不妊化条件を確立したキンギョの研究成果を42nd Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction(SSR)にて発表した。さらに、キメラ魚におけるドナーと宿主の遺伝的判別マーカーを作出するためのfluoMEP法の有効性を検討するために、本手法の確立者であるシンガポールテマセックライフサイエンス研究所のOrban博士を訪問した。検討した結果、fluoMEP法が本研究で有効であることが明らかとなったため、本実験を遂行するために、22年度6月30日よりOrban博士の研究室に訪問、研究することとなった(平成21年度第2回優秀若手研究者海外派遣事業採択内定)。
マラリア原虫ミトコンドリア特異的呼吸酵素群の分子構築と生理機能

1.赤血球内型マラリア原虫ミトコンドリアにおける特異的電子伝達系の解析われわれは赤血球内型の熱帯熱マラリア原虫をN_2 cavitation法で破砕することによって、呼吸活性のあるミトコンドリアを単離する方法を確立した。そしてこの標品を用い赤血球内型原虫ミトコンドリアにおけるマラリア原虫特異的な呼吸鎖電子伝達系について生化学的解析を行なっている。マラリア原虫のオルガネラのひとつであるアピコプラストとミトコンドリアを明確に分離する系を探索している。本年度は以前試みて失敗に終わっているパーコールを用いた分離法を検討した。その結果、35%(V/V)パーコール、10,000g、1時間の遠心で再現性よくミトコンドリアが2つの画分に分離した。このうち密度の高い画分は高いジヒドロオロト酸-シトクロムC還元酵素活性を示し、純度が高い事が判った。2.寄生原虫ミトコンドリアのシアン耐性酸化酵素とその阻害剤アスコフラノン寄生原虫の中には哺乳類ミトコンドリアに見られるシアン耐性酸化酵素(Alternativeoxidase : AOX)を持つものがあるが、宿主はこの酵素を持たない事から極めて有望な標的であり、Trypanosoma brucei bruceiの培養系やマウスの系で劇的な効果を示すアスコフラノンを見い出している。アスコフラノンの標的であるTAO自体の構造と機能との関係については、依然として限られた情報しか得られていない。そこで、活性に必須であると思われるアミノ酸の同定を部位特異的変異により行った。また、ランダム変異導入により得られた変異酵素のアスコフラノンに対する感受性の違いについて調べた。TAOのcDNAを鋳型とし、PCR法により部位特異的変異を加え解析を行った。その結果、E(X)_6Yという他のdi-ironタンパク質に共通して見られるモチーフが存在し、活性発現に重要な役割を果たしていることが明らかになった。またアスコフラノンに対する感受性に変化をもたらすアミノ酸残基も見い出された。本研究では寄生適応に必須な基本要素である各種代謝系のなかでも特にエネルギー代謝系に焦点を絞り、マラリア原虫ミトコンドリア電子伝達系の特異性を解析することにより、最終的に化学療法の標的として捉えたいと考えている。最近、活性を保持したミトコンドリアの単離法を確立し、これまで不可能とされていた生化学的アプローチを可能にした成果をふまえ、熱帯熱マラリア原虫におけるエネルギー代謝系を先端的なエネルギー転換系研究の視点から追求し、細胞質とオルガネラの協調的役割、また生活環におけるその変動を解析しマラリア原虫、ひいては寄生現象全般に共通する適応戦略の分子基盤とその多様性を明らかにする事を目的としている。本年度は以下の成果をあげる事ができた。1.マラリア原虫複合体II(コハク酸脱水素酵素複合体)の酵素学的性質:複合体IIはTCA回路の酵素であると同時に呼吸鎖の脱水素酵素であり、両者を直接結ぶ重要な酵素である。また、ミトコンドリアのマーカー酵素としても知られている。これまでに他の寄生虫ミトコンドリア複合体IIを阻害する事が判明しているアトペニン、フルトラニルなどの阻害剤に対する感受性が大きく異なっている事が明らかになった。2.マラリア原虫複合体IIの細胞内