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地方教育行政の在り方に関する総合的調査研究

『「地方教育行政法案に対する各新聞の社説・論評等(15)」の目録』(平成11年2月)、『「地教行法制定経過に関する行政文書史料」の目録』(平成11年3月)。(2)「学校の自律性と自己責任に関する調査」の実施準備全国の公立小学校長と公立中学校長各1000名を対象として、次年度に実施を予定している標記の調査について、その方法や内容等に関して検討を進め、調査票の作成作業に着手した。(3)欧米諸国における地方教育行政の現状と改革動向に関する研究わが国の現行教育委員会制度のモデルとなったアメリカの教育委員会制度をはじめ、ドイツ、フランス、イギリスの地方教育行政制度について、現行制度の構造と運用実態、当面の課題、改革動向等を、理論および法制の分析によって、わが国に引きつけて分析・考察すべく作業を進めた。(4)地方教育行政に関する資料・文献リストの作成戦後の教育改革以降、今日に至るまでの地方教育行政に関する主要な資料や文献について、そのリストを「地方教育行政に関する戦後研究論文目録」(平成11年2月)として作成し刊行すべく作業を進めた。本研究は、戦後改革期以降におけるわが国の地方教育行政制度の変遷を踏まえ、また欧米諸国における近年の教育行政改革の動向を視野に含めながら、"(1)"多様化する住民のニーズに対応した行政運営の在り方、"(2)"教育委員会と学校等の関係の在り方、"(3)"教育委員会の事務処理体制の在り方、"(4)"国、都道府県、市町村の関係の在り方、等を主要な検討課題とし、「市町村教育委員会の行政機能に関する調査」等の実態調査と歴史的・比較教育行政的な理論研究を実施することによって、この課題に実証的・理論的にアプローチしようとしたものであり、以下のような研究・調査を実施した。(1)わが国における教育委員会制度の成立と定着過程に関する研究(2)市町村教育委員会の行政機能に関する調査研究(3)学校の自律性と自己責任に関する調査研究(4)地方教育行政の分権改革と学校の自律性に関する研究(5)欧米諸国における地方教育行政の現状と改革動向に関する研究報告書の内容と構成は以下の通りである。I市町村教育委員会の行政機能と学校の自律性に関する調査1市町村教育委員会の行政機能に関する調査2学校の自律性と自己責任に関する調査IIわが国における教育委員会制度の成立と定着過程1教育委員会法の制定過程研究考2「地教行法」の制定過程に関する研究覚え書き-「行政文書資料」の紹介と解題-III地方教育行政の分権改革と学校の自律性1分権改革と地方教育行政2地方教育行政における-審議会の活動3現代の学校経営改革-学校経営の基調とその変容-4「自主的・自立的な学校経営」を考える5学校裁量と学校予算6「学校自治」論と「学校の自律」論IV地方教育行政改革の比較研究1米国におけるSMB法制の構造-カリフォルニア州を中心に-2学校の自己評価体制と教育委員会の役割-米国シカゴ学区の事例-3資料:イギリスの地方教育当局と学校との関係に関する運用4フランスにおける教育行政の地方分権化の歴史・現状・課題
水産政策改革後の中小漁業の経営展開に関する研究

1研究目的は、2018年に改革された水産政策が実施されると、沖合漁業においては、存続経営体数の減少による地域経済への負の影響が危惧される。そのため、本研究は、当該改革後の沖合漁業に従事する中小漁業経営体の経営を継続するための条件を検討することである。2考察対象は、国内の沖合底びき網漁業において主要地域にある経営体とする。考察方法は、当該経営体の経営展開を、地域特性、経営内容の把握によって検討する。3本研究の意義は、水産政策の改革に伴う地域漁業への影響を検討し、その環境の中で経営を継続しうる経営のあり方を提案できることである。
膵ランゲルハンス島の急速凍結保存とその生物学的機能維持に関する研究

ゴ-ルデンハムスタ-(雑種)膵よりランゲルハンス島(以下ラ島)を分離し,プログラムフリ-ザ-を用いて比較的急速な冷却速度(25°C/min)による凍結保存を試みた。急速凍結保存の可能性と,その免疫原性の低下の有無を,非凍結培養ラ島を対照として検討した。(1)解凍後のラ島の回収率は,Me_2SO濃度が15%の時でもっとも高く,25°C/minの冷却速度では83.2±13.0%と,1°C/minの82.9±4.1と同様の回収率が得られた。一方,組織学的検索でも解凍後のラ島の形態は、一部のラ島には凍結解凍の過程により被ったと思われる損傷がみられたが概して凍結以前のラ島と相違ない形態を保持し、免疫学的検索でもインスリン、グルカゴンの存在が確認され、その分布も正常ラ島と同様であった。(2)凍結保存後のラ島のインスリン分泌能も,対照の培養ラ島とほぼ同様の分泌能を示し,細胞1個当りのインスリン含有量を示すインスリン/DNA比も,対照群や1°C/minとほぼ同等の値を示した。また、labelling indexからみた凍結ラ島の複製能も,対照群と同様であった。(3)同種同系移植実験で,急速凍結保存ラ島約1000個の腎被膜下への移植によって,STZ糖尿ハムスタ-の血糖値は著明に低下し,8週目に行った腎摘によって血糖値の再上昇が観察された。HーE染色で,移植ラ島は腎被膜下に容易に観察でき,免疫組織学的検索ではラ島集塊に一致してインスリンが染色され,labelling indexの結果も両群間で有意の差はなく,良好な移植結果が得られた。約300個のラ島移植後の血糖値は300mg/dl前後であり,糖尿病を完全に改善されるに至らなかった。これらの“suboptimal"なラ島数の腎被膜下,脾臓内への移植時のlabelling indexはそれぞれ0.88±0.19,0.28±0.03で,腎被膜下への移植がラ島の再生にとってより有利であると考えられた。(4)異種移植実験では,対照群と同様に,移植後23日後には血糖値の再上昇をみ,期待された凍結保存ラ島の免疫原性の低下を示唆する所見は得られなかった。ゴールデンハムスター(雑種)膵よりランゲルハンス島(以下ラ島)を分離し、3日間の培養を付加した後、急速冷却速度を用いて凍結保存を試みた。凍結方法はプログラムフリーザーを用い、凍害防止剤としてMe_2SOを使用し、0°Cにて30分間浸積した後、1°C/分、又は25°C/分で-70°Cまで冷却、以後2週間液体窒素(-196°C)内に保存した。対照には非凍結培養ラ島を用いた。1.実験(1)凍害防止剤のMe_2SO濃度を5,10,15,20%として、それぞれの解凍後の回収率を検討した。(2)凍結保存ラ

島の生物学的活性は、グルコース負荷によるインスリン分泌能、含有量、DNA含有量で検討した。(3)凍結保存ラ島の再生能はオートラジオグラフィー法で検索した。即ち、解凍後の培地に^3H-thymidine1μCi/mlを添加し、これらの取り込みをラ島切片を作製し顕微鏡下で検討した。2.結果(1)回収率は1°C/分群にて5、10、15、20%Me_2SOでそれぞれ約2、70、83、45%であり、25°C/分群では13、64、83、63%であった。最も回収率が良好であったのは両群ともMe_2SO15%であった。(2)グルコース濃度30mg/dlの刺激では対照、1°C/分及び25°C/分群のインスリン分泌能はそれぞれ162.1±10.7、145.0±37.5、168.1±66.7μU/10ラ島であった。グルコース刺激を300mg/dlにするとそれぞれの群で約3倍の分泌能の増加をみ、グルコース刺激に対し同様の反応を示した。DNA含有量は対照1°C/分及び25°C/分群でそれぞれ0、588±0.075、0、445±0.042、0.465±0.067ng/10ラ島であり、凍結群で約20%のDNA含有量の減少をみた。インスリン含有量でも同様の傾向であった。(3)対照、1°C/分及び25°C/分群のlabelling indexはともに約2%で3群のラ島再生能に差は見られなかった。以上より、急速冷却凍結保存では若干の細胞障害はみられるものの、十分に生物学的機能を維持しつつ、凍結保存が可能であると推察された。ゴ-ルデンハムスタ-(雑種)膵よりランゲルハンス島(以下ラ島)を文理し、3日間の培養(培置:RPMI1640)を付加した後、急速冷却速度を用いて凍結保存を試みた。凍結方法はプログラムフリ-ザ-を用い、凍害防止剤として15%Me_2SOを使用し、0°Cにて30分間浸積した後、25°C/分で-70°Cまで冷却、以後2週間液体窒素(-196°C)内に保存した。これらの凍結ラ島を用い以下の実験を試みた。なお対照には非凍結培養ラ島を用いた。1.実験;(1)解凍後の培養において、そのグルコ-ス濃度を50、100、200、300、500mg/dlとして、その回収率を検討するとともに、得られたラ島のグルコ-ス付加によるインスリン分泌能を検索した。(2)約300個の凍結保存ラ島をSTZ誘発糖尿ハムスタ-(GN種)の腎被膜下、あるいは脾臓内に移植し、その再生能をオ-トラジオグラフィ-法で検索した。即ち、犠牲死6時間前に^3H-thymidine30μCiを腹腔内に投与し、これらの取り込みを顕微鏡下でラ島細胞のlabelling indexを算出することによって検討した。(3)腎被膜下、あるいは脾臓内に移植された凍結保存ラ島にヘマトキシリン・エオジン(以下H-E)染色、あるいは免疫組織染色を施し形態学的に検討した。2.結果:(1)対照ラ島の回収率はそれぞれのグルコ-ス濃度において92%前後で有意差をみなかった。凍結ラ島において最も良好な回収率(83%)を示したものは、500mg/dlのグルコ-スを培地に添加した時であり、また同ラ島はインスリン分泌能の検索でも良好であった。(2)約300個のラ島移植後の血糖値は300mg/dl前後であり、糖尿病を完全に改善させるに至らなかった。これらのsuboptimal"なラ島数の移植における腎被膜下、脾臓内でのlabellimg indexはそれぞれ0.88±0.19、0.28±0.03であった。(3)H-E染色、免疫組織染色で、viableな移植ラ島を腎被膜下、脾臓内に観察することができた。ゴ-ルデンハムスタ-(雑種)膵よりランゲルハンス島(以下ラ島)を分離し,プログラムフリ-ザ-を用いて比較的急速な冷却速度(25°C/min)による凍結保存を試みた.
ビタミンDリンガンドー受容体の立体構造と細胞内相互作用

活性型ビタミンDの生物作用は転写レベルで制御され、この制御ではビタミンDリガンドのコンフォメーションに依存したビタミンD受容体(VDR)の三次元構造が重要である。本研究では、VDR結合時のビタミンDの立体構造をフッ素化ビタミンDアナログおよびフッ素置換受容体タンパクを用いて^<19>FNMR法により解析する。更に、蛍光標識ビタミンDアナログをプローブとして細胞内でのビタミンDー受容体相互作用を探る。合成した4、4ージフッ素化および19ーフッ素化アナログは温度可変^<19>FNMR分析およびVDRに対する強い結合能を保持(Kd値は約10^<-9>M)することから特にビタミンDのA環コンフォメーション解析用プローブとして有用であった。VDRはラット由来の受容体cDNAを挿入したpET-14b発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に導入した形質転換体から合成した。フッ素化アナログを用いてVDR複合体中のリガンドのコンフォメーションを^<19>FNMRにて解析した。ビタミンDのA環部は二つの主コンフォメーション(α-およびβ-型)を取り得るが、19ーフッ素化アナログはα-コンフォメーションで受容体と相互作用していることが観測された。最近、天然リガンドー変異VDR複合体のX線結晶構造が解明され、A環部はβ-コンフォメーションであることが示された。生物作用発現に関与する真のA環コンフォメーションを決定するためには更に検討する必要がある。VDR結合に重要なA環構造を残し、側鎖部に蛍光発色団を含む二種の蛍光標識ビタミンDアナログを設計および合成した。ニトロベンゾフラザンおよびダンシル発色基を含むアナログのVDR結合活性は天然リガンドに比べ約0.1%であった。蛍光リガンドを用いて細胞内相互作用を視覚的に観察している。活性型ビタミンDの生物作用は転写レベルで制御されている。この転写制御ではリガンドのコンフォメーションに依存したビタミンD受容体の三次元構造が重要であることが明らかになってきた。本研究では、受容体に結合している状態のビタミンDの立体構造をフッ素化ビタミンDアナログおよびフッ素置換受容体蛋白を用いてリガンド側および受容体蛋白側の両面から^<19>FNMR法により明らかにする。更に、蛍光標識ビタミンDアナログをプローブとして生きた細胞中でのビタミンD-受容体相互作用を探る。本年度は以下の点について検討した。1.ビタミンDの生物作用発現にとって重要なA環コンフォメーションを解明するための二つのプローブ4-および19-フッ素化ビタミンDアナログの合成は既に完成している。これらのアナログは、詳細なNMR解析からA環部の二つの主コンフォメーションを明瞭に観察できる優れたプローブであることが判明した。2.天然リガンドと比べ二つのフッ素化アナログの受容体結合活性は約10100分の1、転写活性化能は24分の1と低下したが、受容体との相互作用を調べるためのプローブ化合物として十分な活性を持つ(Kd値は約10^<-8>Mを維持している)ことを確認した。3.フッ素化アナログを用いて受容体複合体中のビタミンDのA環コンフォメーションを^<19>FNMRで解析したところ、二つの主コンフォメーションの内の一つ(α-コンフォマー)が受容体と複合体を形成していることを確認した。共役トリエン部や側鎖部も含めて受容体相互作用時のビタミンD分子全体のコンフォメーションを解明していく予定である。活性型ビタミンDの生物作用は転写レベルで制御され、この転写制御ではビタミンDリガンドのコンフォメーションに依存したビタミンD受容体(VDR)の三次元構造が重要である。本研究では、VDR結合時のビタミンDの立体構造をフッ素化ビタミンDアナログおよびフッ素置換VDRを用いて^<19>F NMR法により明らかにする。

更に、蛍光標識ビタミンDアナログをプローブとして細胞内でのビタミンD-受容体相互作用を探る。本年度は以下の点について検討した。1.ビタミンDのA環部は二つの主立体配座(α-およびβ-型)を取り得る。A環配座解析用プローブ、4、4-ジフッ素化および19-フッ素化ビタミンDアナログを用いてVDR複合体中のリガンドのA環立体配座を^<19>F NMRで解析した。19-フッ素化アナログでは、α-コンフォメーションでVDRと複合体を形成していることが観測された。一方、4、4-ジフッ素化アナログでは、ゲミナルフッ素-VDRタンパクとの相互作用によりシグナルが広幅化し、A環コンフォメーションに関して明確な結論を得ることができなかった。2.フッ素置換されたアミノ酸を含むVDRタンパクの合成には成功しなかった。3.受容体結合に重要なA環構造を残し、側鎖部に蛍光発色団を含む二種の蛍光標識ビタミンDアナログを設計および合成した。ニトロベンゾフラザンおよびダンシル発色基を含むアナログのVDR結合活性は天然リガンドの約0.1%であった。蛍光性ビタミンDアナログとの細胞相互作用を視覚的に観察している。
好塩性緑藻Dunaliella sp.の嫌気性と光合成

好塩性緑藻Dunaliellaは海洋,塩湖等に棲息し,細胞内にグリセロール貯蔵して浸透圧に対抗している事で良く知られている.西オーストラリアの湖で採集した単細胞の緑藻は最適塩濃度が4.0Mと非常に高く,また何より顕著な特性は嫌気条件を好む事であった.光学顕微鏡による形態観察及び電子顕微鏡による超薄切片の観察により, Dunaliellaの一種であると同定された.細胞のATP含量を測定すると,好気条件下では光照射によりATPは通常とは逆に減少した.嫌気条件下におくとはじめて光によるATP量の増大が見られた.この現象がこの緑藻の嫌気性と密接に関連していると考えられる.好気条件下における光によるATP減少の波長依存性を測定した.単純なパターンは得られなかったが,クロロフィルの吸収曲線と一致するとも言い難い.660nm付近に一つのピークが得られている.これについては更に実験検討が必要である.またDCMU等の光合成電子伝達阻害剤やFCCP等のプロトンコンダクターを加えた条件下で光照射を行うと光による酸素の吸収が見られ,同時にH^+の放出が見られた.光による酸素吸収と光によるATP減少とからいわゆる光吸収が原因ではないかとも考えられたが, Co_2を充分に与えた条件下でも光によるATP,減少は見られ,また光強度を下げてもやはり光照射によってATPは減少した.この事から通常の光呼吸がその原因であるとは考えにくい.次に細胞を温和な条件で破砕して葉緑体を取り出し, ATPを与えて光照射を行った.光によってATP減少は起こったが,嫌気条件下においても光によるATPの増大は見られなかった.従ってこの緑藻の嫌気性の原因は未だ明らかになっていない.現在,細胞の各分画について同様の実験を続行中である.マイクロソーム分画中でも光によるATPの分解が起きる事を確かめている.好塩性緑藻Dunaliellaは海洋,塩湖等に棲息し,細胞内にグリセロール貯蔵して浸透圧に対抗している事で良く知られている.西オーストラリアの湖で採集した単細胞の緑藻は最適塩濃度が4.0Mと非常に高く,また何より顕著な特性は嫌気条件を好む事であった.光学顕微鏡による形態観察及び電子顕微鏡による超薄切片の観察により, Dunaliellaの一種であると同定された.細胞のATP含量を測定すると,好気条件下では光照射によりATPは通常とは逆に減少した.嫌気条件下におくとはじめて光によるATP量の増大が見られた.この現象がこの緑藻の嫌気性と密接に関連していると考えられる.好気条件下における光によるATP減少の波長依存性を測定した.単純なパターンは得られなかったが,クロロフィルの吸収曲線と一致するとも言い難い.660nm付近に一つのピークが得られている.これについては更に実験検討が必要である.またDCMU等の光合成電子伝達阻害剤やFCCP等のプロトンコンダクターを加えた条件下で光照射を行うと光による酸素の吸収が見られ,同時にH^+の放出が見られた.光による酸素吸収と光によるATP減少とからいわゆる光吸収が原因ではないかとも考えられたが, Co_2を充分に与えた条件下でも光によるATP,減少は見られ,また光強度を下げてもやはり光照射によってATPは減少した.この事から通常の光呼吸がその原因であるとは考えにくい.次に細胞を温和な条件で破砕して葉緑体を取り出し, ATPを与えて光照射を行った.光によってATP減少は起こったが,嫌気条件下においても光によるATPの増大は見られなかった.従ってこの緑藻の嫌気性の原因は未だ明らかになっていない.現在,細胞の各分画について同様の実験を続行中である.マイクロソーム分画中でも光によるATPの分解が起きる事を確かめている.
心筋細胞のβ受容体依存性クロライドチャネルの調節機構の解明

1.燐酸化とチャネル活性の関係......C1チャネル活動のagonist濃度依存性モルモット心室筋細胞に対してoutside-out patch法を応用し、agonist濃度とC1チャネル活動の定量的関係を求めた。初めに高濃度(5μM)のadrenalineを作用させ、C1チャネル電流が出現したことを確認した後,adrenalineの濃度を低下させ(0.5μM)チャネル活動の変化を観測記録した。再びadrenalineの濃度を上昇させチャネル活動の回復を見た。その結果、高濃度adrenaline下で35個の多チャネル記録であったものが定濃度adrenaline下で23個の多チャネル記録に変化することを観測できた。これらの記録からNPoを計算したところ、個々のチャネルの開確率はadrenaline濃度に関わらずほぼ一定(0.70.9)であり、adrenalineの濃度低下の効果はactiveなチャネルの数をall or nohlingに減少させるものであることが判明した。すなわち、燐酸化は開口可能なチャネルの数を増やすがチャネル自体の開確率には影響しないことが示唆された。単一チャネルレベルにおけるα-and β-adrenergic interactionのメカニズム2.同じくoutside-out patch法によりβ-agonistとα-agonistのC1チャネルに対する相互作用を検討した。すなわちadrenalineを作用により出現したチャネル活動に対するphenylephrineの作用を観測記録した。その結果、単一チャネル記録においてphenylephrineによりチャネル活動が消失するもの、多チャネル記録においてphenylephrineによりactiveなチャネル数が減少するものが観察された。後者においてはNPoの計算により、個々のチャネルの開確率は変化しないことがわかった。すなわち、α-agonistの作用は、activeなチャネルの数をall or nothingに減少させるものであり、燐酸化に拮抗していることが示唆された。
メラノーマ幹細胞をプロモートする新たな内皮細胞由来因子の同定

共培養実験によりリンパ管内皮細胞がメラノーマ幹細胞の自己複製能を強力にサポートすることが分かった。124個の遺伝子プライマーを用いたスクリーニングで、メラノーマ幹細胞との共培養によりリンパ管内皮細胞におけるCXCL9、10、11の発現が著しく亢進した。リコンビナントのCXCL10、CXCL11蛋白はメラノーマ幹細胞の自己複製能を有意に亢進させ、CXCR3の中和抗体は自己複製能を著しく抑制させた。メラノーマ幹細胞にはCXCR3が強く発現しており、リンパ管内皮細胞から分泌されるCXCL10、CXCL11が、CXCR3を介してメラノーマ幹細胞を強力にサポートすることが明らかとなった。我々は以前に乳癌幹細胞を用いて、血管・リンパ管内皮細胞との共培養システムを確立し、内皮細胞が乳癌幹細胞の遊走能、増殖能、自己複製能をサポートすることを明らかにした。さらに、内皮細胞のコンディションメディウム中のいかなる物質が癌幹細胞をサポートするのか遺伝子発現の比較によるスクリーニングを行い、ある特定の因子を同定した。今回は、同様のシステムを用いて、メラノーマ幹細胞をサポートする内皮細胞由来の因子の同定を試みた。まず、前回と同じ共培養システムを用いて、メラノーマ幹細胞でも同様に、リンパ管内皮細胞がメラノーマ幹細胞の自己複製能を強力にサポートすることが分かった。そして、メラノーマ幹細胞と内皮細胞との共培養を用いたスクリーニングの結果、乳癌幹細胞で同定された特定因子と同じ物質(分泌因子)がメラノーマ幹細胞でも同様に発現が増強することが分かった。同因子のリコンビナント蛋白を実際にメラノーマ幹細胞の培地に添加すると、sphere形成能、遊走能、増殖能が有意に促進させた。また、同因子のレセプターの中和抗体を添加して、同因子の働きをブロックすると、メラノーマ幹細胞の自己複製能が著しく抑制されることをsphere formation assayで明らかにした。以上の結果から、メラノーマ幹細胞を制御する内皮細胞由来の特定因子が同定され、同因子の阻害剤やレセプター阻害剤が化学療法抵抗性のメラノーマに対する新たな治療選択肢となり得る可能性が示唆された。昨年度に、我々は共培養システムを用いて、内皮細胞のメラノーマ幹細胞に対する影響を調べた結果、リンパ管内皮細胞がメラノーマ幹細胞の自己複製能を強力にサポートすることを明らかにした。また、124個の遺伝子プライマーを用いて共培養による遺伝子発現プロファイリングを行った結果、メラノーマ幹細胞と共培養することで、リンパ管内皮細胞におけるCXCL9、10、11の発現が著しく亢進することが分かった。実際に、リコンビナントのCXCL10、CXCL11蛋白をメラノーマ幹細胞の培地に添加してsphere formation assayを行うと、両者ともにメラノーマ幹細胞の自己複製能を有意に亢進させ、また、CXCL9、CXCL10、CXCL11のレセプターであるCXCR3の中和抗体を用いて、sphere formation assayを行うと、メラノーマ幹細胞の自己複製能が著しく抑制することを明らかにした。次に、メラノーマ幹細胞におけるCXCR3の発現をreal time RT-PCRで調べた結果、メラノーマ幹細胞(sphere)におけるCXCR3の発現は、通常の接着培養時(adherent)と比較して明らかに増強していることが分かった。更に、メラノーマの組織におけるCXCR3の発現をCXCR3抗体を用いて免疫組織学的に検討した結果、メラノーマではCXCR3が強発現しており、その染色は一部の細胞集団でより強く認められた。その後、我々はCXCR3をstableにノックダウンしたメラノーマ幹細胞を作成した。同細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射し、形成される腫瘍の形成能をや転移能の抑制効果を現在も検討中である。本研究により、リンパ管内皮細胞から分泌されるCXCL10、CXCL11が、CXCR3を介してメラノーマ幹細胞の自己複製能を強力にサポートすることが少なくともvitroの実験で明らかとなった。CXCR3の阻害剤が化学療法抵抗性のメラノーマに対する新たな治療選択肢になりうる可能性が示唆された。リンパ管内皮細胞とメラノーマ幹細胞の共培養アッセイより、メラノーマ幹細胞は内皮細胞から分泌される物質によって、その増殖や自己複製能、遊走能が促進されることが分かった。また、我々が独自で行った共培養と定量PCRによる遺伝子発現スクリーニングによって、ある分泌因子が候補に挙がり、同因子のリコンビナント蛋白がメラノーマ幹細胞の増殖能、遊走能、自己複製能を実際に促進させることを明らかにした。

同因子のレセプター中和抗体を用いて、同因子の働きを阻害すると、メラノーマ幹細胞の自己複製能が有意に抑制された。以上の結果が本年度中に明らかとなり、本研究の達成度はおおむね順調に進展していると自己評価した。皮膚悪性腫瘍今回明らかとなった培養細胞(in vitro)での結果がマウスを用いたin vivoでも同様に見られるかどうかを今後明らかにしていく予定である。具体的には、同因子のレセプターをターゲットにしたshRNAをレンチウィルスを用いてメラノーマ幹細胞に導入し、stableに同因子のレセプターをノックダウンした幹細胞を作成する予定である。この細胞とコントロールの細胞を同じ数、NOD/SCIDマウスの皮下に注射し、実際に腫瘍形成能力が抑制されるかどうか。そして、腫瘍の浸潤能や転移能力も抑制されるかどうかを調べる。両者に明らかな差が見られれば、同因子に対するインヒビターの開発を学外の組織と協力して推進させ、実際にヒトに対して応用可能かどうか、副作用等を十分検討した上で、治験が可能な方向にプロジェクトを進めていく予定である。まず大きな理由の一つは、学会での成果発表が本年度は国内での発表のみであり、海外での発表・情報収集を予定して計画した費用を大幅に下回ったことが挙げられる。また、物品費については、すでに独自で確立したシステムを使って行ったために、必要最小限の試薬等の注文でまかなえたことが挙げられる。翌年度はマウスなどの動物飼育費や国外での学会発表を予定しており、本年度以上の費用がかかることが予測される。
波動論から探る系外ガス惑星の大気構造

惑星大気モデルを構築するためには、定常状態の理解が重要となる。しかしながら、いまだ系外惑星の大気は観測的な情報が少ないこともありその理解は不十分である。特に惑星大気は中心星の照射にさらされており、大気中の光の散乱の効果をできる限り精密に取り扱う輻射輸送計算がモデル構築に大きく貢献する。また、大気を構成する物質の理解、特にダストの理解が重要となる。大気中に生成するダストの影響や周囲のダストの影響の可能性についても、惑星大気の観測の議論に際して無視できない。柔軟で、かつさまざまな応用が期待できるよう汎用的な輻射輸送計算のプログラムの開発・改良を続け、同時に応用計算を進めた。大気中のダストなどによる散乱も重要であると考えられるが、光の散乱に際してはしばしば光の振動状態が特殊な影響を受ける。いわゆる偏光状態を正しく取り扱う必要がある。輻射輸送計算においてはダストなどの光学的特性をふまえて、偏光状態の散乱による変化を追うようにもすることができている。具体的な応用計算として、系外惑星ができつつある可能性がある遷移天体の実際の観測例への応用を進めた。さらに、偏光を取り扱うにはその偏光の成分として、直線偏光だけでなく円偏光の理解も重要となる。しかし、赤外線での円偏光観測例は少なくまだよくわかっていないことが多く、その生成機構についてもはっきりしていなかった。我々は、大規模な星惑星形成領域であるオリオン領域の、類を見ない広視野での近赤外円偏光撮像観測の研究を進めた。画像上の直線偏光や円偏光などの物理量の相関を調べ非球体のダストの整列がオリオン領域での円偏光生成を引き起こしていることを明らかにした。1母星に近く強い照射を受けたhot Jupiterなどの系外惑星大気中から流出した物質が母星の周囲に漂う場合、独特の輝線を発する可能性がある。そのことから惑星大気モデルの外側境界条件の理解を深められないか研究を行った。大気散逸に伴う彗星のような尾から輝線が発する場合、母星と惑星からの光を空間的に分離できなければ、惑星の公転に伴い母星のスペクトル上で輝線が振動する可能性がある。さらに、系外惑星の周囲に木星同様な惑星磁気圏に捕獲されたプラズマトーラスが存在する場合にも独特の輝線を発する可能性がある。その特徴から惑星の超高層大気となっているプラズマトーラスの理解につながりうる。特に、衛星によるトーラス輝線の遮蔽効果が無視できなければ、その超高層大気から届く輝線が特有の振動を起こすことがわかった。この振動を観測できれば、衛星の存在及び、プラズマトーラスの存在そのものの理解につながると思われる。また、トーラスのモデル化に関して、降着円盤の理論を応用しさらに複雑なモデル化も行った。2惑星大気中にはダストが存在すると思われるが、惑星大気の流出にひきずられることでダストが流出してくる可能性があり、この点から惑星大気中のダストに対して理解が深められないか検討を行った。現在見つかっている、ある系外ガス惑星で検討してみたところダストの大きな流出は難しいようである。3大気モデルを考察する上で大気の組成が重要であるため、特定の波長の光によつて大気中の特定の元素が流出させられる可能性を考察した。まず水素原子特有のある一つの輝線だけで考察したところ、熱的散逸に比べて効果は小さいようである。複数の波長の光による効果や他の原子に関しても調べる必要があるだろう。惑星大気のモデル構築のためには、定常状態の理解が重要であるが、いまだ系外惑星大気の理解は不十分である。特に惑星大気は中心星の照射にさらされており、大気中の光の挙動をできる限り精密に取り扱う輻射輸送計算がモデル構築に大きく貢献する。また、そのような計算は振動数ごとの放射エネルギー分布を導出することや、観測と理論の比較のためにも重要となる。そこで、できる限りさまざまな物理プロセスをモデリングし取り込んでいけるよう、なるべく柔軟で、かつさまざまな応用が期待できるよう汎用的な輻射輸送計算のプログラムの開発・改良を続け、計算を行った。プログラムは空間3次元的であり、かつ空間に対称性を仮定していない。このことにより、系外惑星大気が中心星の潮汐力などの効果により球からずれ非対称性が重要になるような状況があっても対応できるものと考えられる。また、大気中のダストなどによる効果も重要であると考えられるため、ダストなどの光学的特性をふまえて、偏光状態も加味した計算となっている。計算例の応用を続けており、学会等で研究発表を行った。また、大気の流体としての基本的な物理機構として、熱的不安定性は、不安定の成長、振動の可能性をもっておりその理解が重要となっている。惑星大気は冷却および加熱のプロセスが単純ではなく、また部分的に電離している効果が表れる可能性もある。部分電離プラズマの熱不安定性に関して、磁場の効果や摩擦の効果が特徴的に表れうることを示した理論研究が論文として出版されるにいたった。

柔軟で、かつさまざまな応用が期待できるよう汎用的な輻射輸送計算のプログラムの開発・改良を続け、同時に応用計算を進めた。大気中のダストなどによる散乱も重要であると考えられるが、光の散乱に際してはしばしば光の振動状態が特殊な影響を受ける。いわゆる偏光状態を正しく取り扱う必要がある。輻射輸送計算においてはダストなどの光学的特性をふまえて、偏光状態の散乱による変化を追うようにもすることができている。具体的な応用計算として、系外惑星ができつつある可能性がある遷移天体の実際の観測例への応用を進めた。さらに、偏光を取り扱うにはその偏光の成分として、直線偏光だけでなく円偏光の理解も重要となる。しかし、赤外線での円偏光観測例は少なくまだよくわかっていないことが多く、その生成機構についてもはっきりしていなかった。我々は、大規模な星惑星形成領域であるオリオン領域の、類を見ない広視野での近赤外円偏光撮像観測の研究を進めた。画像上の直線偏光や円偏光などの物理量の相関を調べ非球体のダストの整列がオリオン領域での円偏光生成を引き起こしていることを明らかにした。
管理会計情報に対する組織構成員の認知様式に組織文化が及ぼす影響に関する実証研究

本年度は,最初に,住友電工(株)グループにおけるラインカンパニー制の情報特性ならびに運用方法に対するカンパニー・リーダーの認知様式が,内発的動機づけに及ぼす効果を実証的に分析した。その結果,情報特性・運用方法が,リーダーに情報的事象として認知されている場合,有能感を媒介して内発的動機づけに正の効果を,それらが制御的事象として認知されている場合,強制感を媒介して内発的動機づけに負の効果を及ぼしていることを明らかにした。次に,上記の分析結果を受け,「同じ」ラインカンパニー制を導入しているにもかかわらず,その情報特性・運用方法に対するリーダーの認知様式が異なる理由を明らかにした。認知様式の相違が有能感や強制感を媒介して間接的に内発的動機づけを促進あるいは抑制していると考えられるわけであるから,その理由を明らかにすることは重要である。ラインカンパニー制に対する認知様式は組織間で異なっており,その組織間の相違をもたらす原因は組織文化にあることが明らかにされた。本研究では住友電工グループ7社からデータを収集しているが,それに基づき因子分析を行い組織文化の次元を抽出したところ,慣行レベル(カンパニー・リーダーの観点からの管理者の慣行)の組織文化次元として「暖かみ」,「コントロール(部下に自由裁量の余地をほとんど与えず,自分で指示する)」,「困難な課題設定」,および「自律性支援」の4つが見出され,価値観レベル(カンパニー・リーダーの価値観)の組織文化次元として「利益第一主義」,「実験主義」,および「慎重主義」の3つが見出された。そして,これらの組織文化の次元と,特定の組織におけるリーダーの認知様式の全体的傾向との間の関係を追及したところ,「暖かみ」,「自律性支援」,「実験主義」の程度が高い組織では,ラインカンパニー制の情報特性・運用方法に対して組織的に情報的と認知する傾向が高いことが明らかにされた。なお,これについては,2004年9月の日本会計研究学会にて,「ラインカンパニー制の効果に対する組織文化の影響」というタイトルで研究報告を行う予定である。管理会計システムは、情報システムとしての機能と、影響システムとしての機能とを,二重に有するとされる。本研究では,後者の側面に焦点をあてた。管理会計を影響システムとして捉えた場合,組織構成員がそれに対して意識的・無意識的に認知する影響要因は,次のとおりである。第一に,情報の特性であり,これは目標情報と実績情報の特性に分類しうる。前者については目標の明白さ,理解の容易さ,およびタイトネス,後者については努力結果の反映度およびフィードバックの頻度と適時性という特性が考えられる。第二に,管理会計システムの運用方法である。目標設定にどの程度の参加を認めるか,フィードバックをどの程度建設的かつ支援的に行うか,あるいは評価方法をどのように設定するかなどによって,組織成員に心理的コンテクストが形成され,結果として組織成員の行動に影響を及ぼす。両要因は相即不離の関係にあり,一つの要因を独立して考察しても,影響システムとしての管理会計に対する組織成員の認知様式を適切に捉えることはできない。このことは,住友電工(株)のライン・カンパニー制に対する調査(業績報告会への参加やカンパニーのリーダーに対するインタビュー調査)によっても確認した。上記の二つの影響要因に対する組織成員の認知には,組織文化が重要な影響を及ぼしている。本研究では,最初に,多様な組織文化概念を整理した。その結果,組織文化を,ある特定の組織の構成員が共有している価値観であると捉えることが,管理会計の文脈から最も適当であると結論付けた。そのうえで,文献研究およびヒアリング調査などによって,特にミニ・プロフィットセンターにおける情報特性と運用方法との関連から,自律性支援リスク・テーキング,他者への配慮,協調主義,未来志向という組織文化の構成概念を導出し,両者の関連性を推測した仮説を構築した。

なお,これについては,2004年9月の日本会計研究学会にて,「ラインカンパニー制の効果に対する組織文化の影響」というタイトルで研究報告を行う予定である。
メルケル細胞癌の生存、増殖、分化に対する有棘細胞癌の影響およびその修飾因子の解明

メルケル細胞癌は原発性皮膚癌のなかで最も予後不良なものの一つであり、その大部分の発症にメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)が関与しているとされる。今回、MCPyV陽性、陰性のメルケル細胞癌細胞株をコラーゲンゲル中で培養した。単独培養で通常2週間以上生存維持させることができるが、有棘細胞癌細胞株と混合培養することによりウイルス陽性のメルケル細胞癌細胞癌はその生存・増殖能が低下、アポトーシスは増加した。また逆に有棘細胞癌細胞も、MCPyV陽性メルケル細胞癌との混合培養で生存・増殖能が低下した。メルケル細胞癌細胞の制御機構に関与する因子を同定することで、治療のさらなる発展が期待出来る。メルケル細胞癌の細胞株のうち、メルケル細胞ポリオーマウイルス陽性であるMKL-1とウイルス陰性であるMCC13, UISOの培養を行った。それぞれを気相-液相界面培養系(air-liquid interface culture system)を用いてコラーゲンゲル中で培養し、ゲル内で2週間以上生存維持させることが出来る事が確認できた。またそのゲル上に有棘細胞癌細胞株DJM-1を播種して混合培養を行い、有棘細胞癌細胞との相互作用の評価をすすめることに成功した。有棘細胞癌との混合培養下において、ウイルス陽性のメルケル細胞癌は形態学的に変性/壊死を多く認めるようになり、その増殖能も有意に低下した。この変化はウイルス陰性細胞では確認されなかった。今回の研究ではメルケル細胞癌単独の培養をゲル内で行う事で、今回の実験系における至適な培養条件を決定することができた。そのうえで有棘細胞癌との混合培養によるメルケル細胞癌細胞の形態および増殖能がウイルス陽性細胞と陰性細胞の間で差異が認める事が確認できたことは非常に意義のあるものである。これまでの研究で得られた結果は、実臨床でみられるメルケル細胞癌と有棘細胞癌を中心とした他の上皮系腫瘍との併存例がほぼすべてメルケル細胞ポリオーマウイルス陰性例であるというわれわれの検討に矛盾しないものであった。すなわち、有棘細胞癌細胞はメルケル細胞癌細胞のうちウイルス陽性例のみに増殖抑制をきたすことから、有棘細胞癌とウイルス陽性のメルケル細胞癌がきわめて稀なのだと推測される。さらにアポトーシスや遊走能、浸潤能などの解析を進めることで謎多きメルケル細胞癌の細胞動態についてのさらなる解明が期待できる。メルケル細胞癌の細胞株のうち、メルケル細胞癌の発症要因の一つとされるメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)が陽性であるMKL-1, MKL-2, WaGaとMCPyV陰性であるMCC13, UISOの培養を行った。それぞれを気相ー液相界面培養系(air-liquid interface culture system)を用いてコラーゲンゲル中で培養し、ゲル内で2週間以上生存維持させることが確認できた。また、そのゲル上に有棘細胞癌細胞株DJM-1を播種して混合培養を行い、有棘細胞癌細胞との相互作用の評価を進めることに成功した。有棘細胞癌との混合培養下において、MCPyV陽性のメルケル細胞癌では形態学的に変性/壊死を多く認めるようになり、その増殖能も有意に低下した。この変化はMCPyV陰性のメルケル細胞癌細胞では確認されなかった。新たに細胞株を入手し、使用する細胞株の種類を増やすことができたことで、解析に使用できる実験結果(サンプル数)も増やすことが可能となった。現時点までの実験で、有棘細胞癌との混合培養条件下でメルケル細胞癌の細胞生物学的動態がMCPyV陽性と陰性で差異があることが確認できており、現在遊走や浸潤、アポトーシスなどに関する影響を解析しているところである。これまでの研究で得られた結果は、実臨床で見られるメルケル細胞癌と有棘細胞癌などの他種上皮系腫瘍との併存例がほぼ全てMCPyV陰性であるという知見に矛盾しないものである。平成26年度になって、一部のメルケル細胞癌細胞株がメルケル細胞癌の細胞株として適切ではないとの論文が発表された。そのこともありMCPyV陽性/陰性それぞれの腫瘍細胞(メルケル細胞癌細胞株)と有棘細胞癌との相互作用を確認するため、新たに複数種の細胞株を入手する必要があった。もともとその種類が多いわけではなく米国を中心とした研究者から入手することとなり、また提供を受けた細胞株それぞれでの至適培養条件設定にも時間を要してしまったため研究の進行が遅れている。メルケル細胞癌は原発性皮膚癌のなかでも最も予後不良なものの一つであり、その年間発生数は急速に増加している。その大部分の発症にメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)が関与しているとされるが、その細胞動態にはまだ不明な点が多い。さらに現在、本邦において転移性・再発性メルケル細胞癌に対して保険適用となる抗癌剤も存在せず、その予後の悪さもあり治療のさらなる発展が期待されている。今回、MCPyV陽性、陰性それぞれ複数種のメルケル細胞癌細胞株を用いて気相ー液相界面培養系を用いてコラーゲンゲル中で培養した。単独培養で通常2週間以上生存維持させることができるが、有棘細胞癌細胞株と混合培養することによりMCPyV陽性のメルケル細胞癌細胞癌は形態学的に変性/壊死が目立つようになり、その生存・増殖能は低下、アポトーシスは増加した。

これらの変化はMCPyV陰性メルケル細胞癌細胞株では確認できず、MCPyV陽性と陰性とでその細胞動態に明らかな差を認めた。また逆に有棘細胞癌細胞も、MCPyV陽性メルケル細胞癌との混合培養で生存・増殖能が低下した。この相互関係をきたす明らかな仲介因子の特定には至っておらず、これら2種の癌細胞が直接接触する環境そのものが影響している可能性がある。今回確立した培養法は種々の解析に有用であり、今後有棘細胞癌との混合培養以外にもさらにメルケル細胞癌細胞の培養条件を検討し、その制御機構に関与する因子を同定することで、治療のさらなる発展が期待出来る。メルケル細胞癌は原発性皮膚癌のなかで最も予後不良なものの一つであり、その大部分の発症にメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)が関与しているとされる。今回、MCPyV陽性、陰性のメルケル細胞癌細胞株をコラーゲンゲル中で培養した。単独培養で通常2週間以上生存維持させることができるが、有棘細胞癌細胞株と混合培養することによりウイルス陽性のメルケル細胞癌細胞癌はその生存・増殖能が低下、アポトーシスは増加した。メルケル細胞癌細胞の制御機構に関与する因子を同定することで、治療のさらなる発展が期待出来る。腫瘍間の相互作用を観察/解析するために、気相-液相界面培養系(air-liquid interface culture system)を用いてコラーゲンゲル内に複数種のメルケル細胞癌細胞を培養する必要があった。そのためそれぞれの細胞種におけるゲル中の細胞密度などの指摘条件設定に時間を要してしまい、若干研究の進行が遅れている。平成27年度になって新たに入手した細胞株を用いてメルケル細胞癌と有棘細胞癌の三次元共培養条件下の混合培養をすすめ、組織化学、免疫組織化学、collagen invasion assay, FACS, PCR, Western blotを用いた解析を行う。これまでに得ていた結果との比較・検討もすすめry。また混合培養系でのcDNA microarrayによる網羅的遺伝子解析と候補遺伝子の蛋白やその阻害因子の投与実験により、腫瘍細胞の細胞動態の仲介因子を同定する。メルケル細胞癌平成26年度になって、ポリオーマウイルス陰性のメルケル細胞癌細胞株として使用していたMCC13とUISOがともにメルケル細胞癌細胞株として適切ではないとの論文が報告された。そのためウイルス陰性細胞株として今後の研究には他細胞種を使用すべきと判断し、入手をすすめている。その新規細胞株を用いてメルケル細胞癌および有棘細胞癌の三次元強培養条件下の混合培養をすすめ、組織化学、免疫組織化学、collagen gel invasion assay、FACS、PCR、Western blotを用いて解析を行う。平成26年度の研究を開始して以降になり、一部のメルケル細胞癌細胞株が細胞株として不適だとの論文発表がなされため、他種の細胞株の入手とそれにともなう至適細胞条件の検討にも時間を要し実験計画が遅れ、当初予定していた実験を遂行できていないものも多く、そのため次年度使用額が生じている。
ＭｉＲ－２１とＴＧＦβシグナル経路の相互作用：難治性創傷における重要性

本研究では、糖尿病性創傷においてのmiR-21とTGFβの相互作用を明らかにし,糖尿病性創傷治癒に対しmiR-21の役割を評価することにした。マウス繊維芽細胞を用いての実験により、高糖条件でのmiR-21の発現を調べたところ、TGFβ1によるmiR-21の発現増加が見られた。TGFβ1によるmiR-21の発現増加にはNFkB転写制御因子活性を介した反応性酸素生成物(ROS)活性化が必要であることを明らかにした。miR-21が創傷部位への細胞遊走に必要であるが,糖尿病性マウスから得られた線維芽細胞では発現低下されていることが明らかになった。本研究では、in vitroおよびin vivoの実験系により、糖尿病性創傷において(a)TGFβシグナル経路がmiR-21発現におよぼす影響、および(b) miR-21がTGFβシグナル経路に及ぼす影響を明らかにするとともに、(c) miR-21の減少と創傷治癒の遷延化の関係について明らかにする。miR-21とTGFβ1シグナル経路の相互作用を調べるために発現促進物質あるいはアンタゴニスト(機能獲得と機能喪失型のアプローチ)を利用し,リアルタイムPCR,遺伝子レポーターアッセイ,電気泳動移動度シフト解析(EMSA)、免疫組織染色法(IHC)およびクロマチン免疫沈降法(CHIP)などの手法により研究を進めている。マウス繊維芽細胞を用いてのin vitro実験により、高糖(high glucose)条件でのmiR-21の発現を調べたところ、発現変更が見られた。高糖条件でTGFβ1プラスミドベクターを細胞内へ導入させることでmiR-21の発現が増加された。TGFβ1によるmiR-21の発現にROSとNFkB転写制御因子が必要であることがわかった。現在、(a)miR-21がTGFβシグナル経路に及ぼす影響,(b)創傷治癒におけるmiR-21ーTGFβ相互作用の影響を検定するところである。miR-21とTGFβ1シグナル経路の相互作用を調べるために発現促進物質あるいはアンタゴニスト(機能獲得と機能喪失型のアプローチ)を利用し,リアルタイムPCR,遺伝子レポーターアッセイ,電気泳動移動度シフト解析(EMSA)およびクロマチン免疫沈降法(CHIP)などの手法により研究を進めている。マウス繊維芽細胞を用いてのin vitro実験により、高糖(high glucose)条件でのmiR-21の発現を調べたところ、計時的な発現変更が見られた。高糖条件でTGFβ1プラスミドベクターを細胞内へ導入させることでmiR-21の発現が増加される。反対にTGFβ1をノックダウンするとmiR-21発現が下方制御される。miR-21遺伝子のプロモーター領域には転写制御因子であるNFkBの結合部位がある。NFkBの活性化を抑制することにより高糖条件でのTGFβ1によるmiR-21の上方制御が抑制される。一方では、NFkB活性化によりTGFβ1自体の発現が抑制される。現在、TGFβ1ーNFkBーmiR-21経由あるいはNFkBーTGFβ1ーmiR-21経由を検定するところである。難治性創傷の重要な原因の一つとして、創傷治癒機転の異常が挙げられる。遷延性炎症期が続き,正常の治癒機転が働かず難治性になることはよく知られている。最近、低分子RNAであるmicroRNA (miRNA)が様々な疾患に関与することが次々と明らかになってきた。最近、我々は糖尿病性創傷においてのmiR-21調節が正常とは異なり、創傷治癒期に著しい発現低下が認められることを明らかにした。幾つかの疾患の病態生理においてmiR-21とTGFβ1の間の相互作用が報告されている。しかし,糖尿病性創傷を含む難治性創傷におけるmiR-21とTGFβ1間の相互作用と創傷治癒機転の異常との関連は未知である。本研究は、糖尿病性創傷においてmiR-21とTGFβファミリーの相互作用を明らかにし,糖尿病性創傷治癒に対しmiR-21の潜在的役割を評価することにした。マウス繊維芽細胞を用いての実験により、高糖条件でのmiR-21の発現を調べたところ、TGFβ1によるmiR-21(primary, precursor, mature段階での)発現増加が見られた。NFkBがTGFβ1による活性化され、細胞内ROS活性を起しmiR-21の発現を誘導することが明らかになった。

さらに,TGFβ1刺激によりNFkBp65がmiR-21遺伝子に結合することがCHIP法により確認された。NFkB活性化を介してSMAD2,3,4がPri-miR-21と結合されることがRNA-IP(RNA-免疫沈澱)法により検討された。正常マウスおよび糖尿病性マウスの皮膚から得られた線維芽細胞を用いてのin vitro実験により糖尿病性マウスから得られた繊維芽細胞においてのmiR-21遺伝子が下方制御されていることが確認された。MiR-21が細胞遊走に重要であることもwound scratch assay法により確認された。医歯薬学本研究の目的はmiR-21とTGFβファミリーの相互作用を明らかにするとともに、糖尿病性創傷におけるmiR-21ーTGFβ相互作用の意義を明らかにする。現在までは計画通りマウス繊維芽細胞を用いてのin vitro実験によりTGFβシグナル経路がmiR-21発現におよぼす影響を知ることができた。高糖条件でTGFβ1によるmiR-21発現上方制御があきらかになった。TGFβ1によるmiR-21の発現にROSとNFkB転写制御因子が必要であることがわかった。TGFβ1刺激によるSmad2/3が活性化され、Smad4と総合し、細胞質から核へと移行することを確認した。さらに、NFkBーp65の活性化と核への移行も確認した。ChiP assayによってNFkB-p65がmiR-21遺伝子のプロモーター領域に総合することも明らかになった。本研究の目的はmiR-21とTGFβファミリーの相互作用を明らかにするとともに、難治性創傷において創傷治癒の遷延化に対しmiR-21が果たす役割およびその機序を明らかにする。研究計画として実験を三つに分けることにした:(a)TGFβシグナル経路がmiR-21発現におよぼす影響、(b) miR-21がTGFβシグナル経路に及ぼす影響、(c) miR-21の減少と創傷治癒の遷延化の関係。本年度では計画通りマウス繊維芽細胞を用いてのin vitro実験により(a)TGFβシグナル経路がmiR-21発現におよぼす影響を知ることができた。また、TGFβ1によるmiR-21発現上方制御にはNFkB転写制御因子が必要であることがわかった。現在、TGFβ1ーNFkBーmiR-21経由あるいはNFkBーTGFβ1ーmiR-21経由を検定するところである。今後の計画は、(a)miR-21がTGFβシグナル経路に及ぼす影響,(b)糖尿病性創傷におけるmiR-21ーTGFβ相互作用の意義を検討することである。(a)miR-21発現を過剰あるいはノックダウンされた細胞を持ちいて,免疫組織化学的検査(IHC),Real time PCRおよび免疫ブロット法によりTGFβファミリー(特にTGFβ1, TGFβR2, SMADs 2, 3, 4, 7)の発現を解析する。TGFβR2とSMAD7mRNAの3'UTRにmiR-21と相補的な塩基配列が存在しているため,これらのmRNAがmiR-21の標的であろうと予想されている。miR-21結合部位を含む
アクテイブ流動制御によるスロッシングの制振特性と制振メカニズムの解明

本研究では、600x500x50の矩形タンク内の水の2次元スロッシングに対して、タンクの左右側面下部に取り付けたノズルから間欠的に内容液(水)をタンクのスロッシング液(木)に吹き出すことで、内容液に流動を与え、その間欠的吹き出しのスロッシングに対するタイミングと吹き出し時間、吹き出し角度がスロッシングに与える影響を実験的に検討し、タンク内液の流動とスロッシングの制振特性との関係を解明する。また間欠的な内容液の吹き出しによるスロッシングの制振が顕著な場合の内容液の流動パターンの可視化から本方法によるスロッシングの制振メカニズムを検討する。まず対象タンクに300mmの水深まで水を入れ、そのタンクを正弦波加振台に設置し、このタンク内水を循環させてタンクの左右側面下部のノズルから、間欠的に吹き出す実験装置を製作した。振動台を固定し、水ジェットの吹き出し周期を変化させタンク内水の振動の変位を測定した。この実験を水ジェットの吹き出し時間をパラメータとして実施し、水ジェットの吹き出し周期、または吹き出し振動数に対するスロッシングの周波数応答特性を明らかにしたところ、この水ジェットの吹き出しは、スロッシングを十分に励起する事が判明した。次に振動台でタンク内水の第1次スロッシングを十分に励起させてから、スロッシングの液面変位の平衡点に対する水ジェットの吹き出しタイミングを変化させ、スロッシングの定常変位を測定し、水ジェットのタイミングとスロッシングの定常変位との関係を実験的に検討した。この検討を水ジェットの吹き出し時間、吹き出し角度をパラメータとして実施した。その結果、いずれの吹き出し時間や吹き出し角度でも、水ジェットの吹き出しタイミングには、スロッシングを極めて効果的に制振させることのできるタイミングのある事が判明した。さらに、この制振効果の顕著な水ジェット吹き出しタイミングにおけるタンク内水の流動パターンを可視化して解析した結果、タンクの左右両半域に互いに反対向きの大きな渦が存在する事を明らかにした。これは、水ジェットの間欠的吹き出しによって、タンク内水の流動パターンをスロッシングに特有な下凸の往復流動から、渦流動のパターンにアクテイブに制御したことによると考えられる。スロッシング流動のFEM解析プログラムを作成し、スロッシングの正弦波加振応答を数値計算し、その妥当性を実験と比較して確かめた。しかしタンクの左右側面下部からの間欠的水ジェット吹き出しのあるスロッシング流動とジェットによる流動の共存するタンク内水流動のFEM解析には解決すべき問題が残された。実験水槽を長さ500mm、高さ600mm、幅50mmとし、水深を300mmとして、スロッシング水槽の質量を低減させ、振動台で精度よい加振が出来るようにしたこと及び水ジェット吹き出し管路を左右で対称とし、水ジェットの吹き出しタイミングの精度をよくした改良を実施した。次に水ジェット吹き出し角を0度(垂直)、30度、60度、90度(水平)に設定し、1回の水ジェット吹き出し量を50cc(=スロッシング水量×1/150)として、水