hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境と恐怖の連合学習を担う神経回路網の解明

前年度に引き続き、記憶形成に重要な脳領域である海馬と前頭皮質の神経回路に注目し、記憶学習後の海馬と前頭皮質間のシナプス伝達を調べた。今年度は、前年度に確立したin vivo系における海馬マルチユニット記録と前頭皮質ニューロンパッチクランプ記録の同時実行技術を最適化した。具体的には、既存の方法は、パッチクランプ記録を行うために動物を麻酔状態にする必要があったが、生体内のより自然な状態の神経活動を記録するために覚醒下の動物に同時記録法を適用できるようにした。この最適化によって、麻酔によるシナプス入力の遮断や神経活動の背景ノイズを排除した。電極セットを海馬に埋め込んだ動物にU字型の橋を繰り返し往復させる空間課題学習を行うことによって、課題学習と関連する海馬ニューロン(海馬場所細胞)の発火活動を記録した。そして、課題直後に動物を頭部固定台に移動させ、覚醒条件下において、海馬ニューロンの発火活動と前頭皮質ニューロンの膜電位を記録した。このような同時記録実験系は世界的に見ても例はなく、本研究が初めての試みである。この同時記録方法を用いて得られたデータから、海馬ニューロンの発火活動パターンと前頭皮質ニューロンの膜電位変動との関係を調べると、同じ情報を持つ一部の海馬ニューロン群が同時発火した時に前頭皮質ニューロンの膜電位が脱分極する傾向が見られた。これは、海馬で生成される情報の内容によって、前頭皮質ニューロンは異なるシナプス入力を受け取ることを示唆する。前年度は、麻酔中のラットに対してマルチユニット記録法とパッチクランプ記録法を同時適用していた。しかし、麻酔下での記録の際に、学習課題時に見られた多数の海馬ニューロンの発火活動が減少し、多数の海馬ニューロンの同期発火活動イベントを検出することが難しくなった。さらに、前頭皮質ニューロンの膜電位に周期的な徐波(アップ/ダウン)が生じ、海馬ニューロンの同期発火イベント時の膜電位変動を調べる際に、背景ノイズを捉えてしまう可能性が考えられたため、空間課題学習からパッチクランプ記録までの実験の全てのスケジュールを覚醒条件下で行う方針に切り替えることにした。覚醒条件下でのパッチクランプ記録は、世界的に見てもごく少数の研究グループにしかなせない極めて難しい技術であるが、3Dプリンターを用いて、覚醒動物用の固定器具と頭部保護具を独自に設計、印刷し、実験の細かい条件検討を行うことで技術的困難を克服した。現在は、ラット1匹から複数の前頭皮質ニューロンの膜電位記録に成功している。前年度に引き続き、覚醒条件下での海馬マルチユニット記録と前頭皮質ニューロンパッチクランプ記録を同時に行い、データ数を増やす予定である。また、当初の計画では、海馬リプレイ発生時の前頭皮質ニューロンの膜電位変動を調べる予定であったが、現在までに海馬リプレイ解析に十分な数の海馬場所細胞の発火活動が記録できていない。記録した海馬場所細胞数が少ない場合、2細胞、3細胞などの条件で同期発火イベントを検出し、その時の前頭皮質ニューロンの膜電位変動を調べる予定である。この時、ある特定の海馬場所細胞が含まれる同期発火イベント中に膜電位が変化する、同じ場所情報を持つ場所細胞群が同期発火した時に膜電位が変化するなどの特徴的な現象が、再現性良く、異なる個体間で見られるかどうかを検証する。また、海馬場所細胞の発火活動だけでなく、海馬で見られる特徴的な振動(シャープウェーブリップル)と前頭皮質ニューロンの膜電位変動との関係についても調べる予定である。本研究は、恐怖記憶を司る海馬と扁桃体の神経回路に焦点を当て、記憶学習時には全てのニューロンがランダムに活動するのではなく、「投射し合う一部のニューロンが優先的に活動する」という仮説を立てて研究を進めていた。しかし、腹側海馬-扁桃体基底核間において、本研究の主旨と類似した知見が報告された。そこで、本研究では海馬と扁桃体の局所回路だけでなく、恐怖記憶を含む様々な記憶が保存される脳部位である前頭皮質との神経回路に注目することにした。海馬でリップル波と呼ばれる脳波が生じると、前頭皮質や扁桃体などの他脳領域の様々なニューロンの活動が変化することが知られている。また、リップル波が生じると海馬で保持される情報の再生が生じ、この時、海馬から大脳新皮質に情報が伝達され、記憶の固定化が行われていると考えられている。従来の研究では、海馬リップル波の発生時の他脳領域ニューロンの発火活動が調べられていたが、海馬が伝達する情報の内容によって、他脳領域ニューロンの活動がどのように変化するかは明らかとなっていない。そこで本研究では、海馬が他脳領域へ伝達する情報の内容を海馬ニューロンの発火活動パターンから推測し、前頭皮質ニューロンの活動変化を従来のような発火活動レベルの観点ではなく、膜電位変動の観点から詳細に記述することを目指した。今年度は、多数のニューロンの発火活動を記録できる電極セット(テトロード)をラットの脳に埋める技術を習得し、さらに、麻酔下ラットを用いたin vivoホールセルパッチクランプ記録法を習得した。上記の実験手法を同一ラットに適用し、同側脳の海馬の活動と前頭皮質ニューロンの膜電位変動を対応づけることを可能とする新たな同時記録法を確立した。この一年間で、まず、ラットの脳に電極セット(テトロード)を埋め込み、自由行動下のラットの海馬ニューロンから発火活動を記録する手法を習得した。

このようなラットを用いて、学習課題と関連する海馬ニューロンの発火活動を記録するため、U字型の橋の上をラットに走らせる課題を構築した。現在は海馬から20細胞程度の発火活動を記録し、あるラットからは10細胞程度が学習課題と関連する発火活動を示すようなデータを得ることができた。また、前頭皮質ニューロンが受け取るシナプス入力様式を調べるため、in vivoホールセルパッチクランプ記録法の習得を目指した。脳表面に位置する運動皮質、前帯状皮質に存在するニューロンや、脳表面から2-3mm下に位置する前辺縁皮質、下辺縁皮質に存在するニューロンから膜電位変動を記録することができた。また、これら二つの技術を同一のラットに適用し、海馬ニューロンの発火活動パターンと前頭皮質ニューロンの膜電位変動を対応づけることを可能とする同時記録法を早期に確立できた。前年度に引き続き、記憶形成に重要な脳領域である海馬と前頭皮質の神経回路に注目し、記憶学習後の海馬と前頭皮質間のシナプス伝達を調べた。今年度は、前年度に確立したin vivo系における海馬マルチユニット記録と前頭皮質ニューロンパッチクランプ記録の同時実行技術を最適化した。具体的には、既存の方法は、パッチクランプ記録を行うために動物を麻酔状態にする必要があったが、生体内のより自然な状態の神経活動を記録するために覚醒下の動物に同時記録法を適用できるようにした。この最適化によって、麻酔によるシナプス入力の遮断や神経活動の背景ノイズを排除した。電極セットを海馬に埋め込んだ動物にU字型の橋を繰り返し往復させる空間課題学習を行うことによって、課題学習と関連する海馬ニューロン(海馬場所細胞)の発火活動を記録した。そして、課題直後に動物を頭部固定台に移動させ、覚醒条件下において、海馬ニューロンの発火活動と前頭皮質ニューロンの膜電位を記録した。このような同時記録実験系は世界的に見ても例はなく、本研究が初めての試みである。この同時記録方法を用いて得られたデータから、海馬ニューロンの発火活動パターンと前頭皮質ニューロンの膜電位変動との関係を調べると、同じ情報を持つ一部の海馬ニューロン群が同時発火した時に前頭皮質ニューロンの膜電位が脱分極する傾向が見られた。これは、海馬で生成される情報の内容によって、前頭皮質ニューロンは異なるシナプス入力を受け取ることを示唆する。前年度は、麻酔中のラットに対してマルチユニット記録法とパッチクランプ記録法を同時適用していた。しかし、麻酔下での記録の際に、学習課題時に見られた多数の海馬ニューロンの発火活動が減少し、多数の海馬ニューロンの同期発火活動イベントを検出することが難しくなった。さらに、前頭皮質ニューロンの膜電位に周期的な徐波(アップ/ダウン)が生じ、海馬ニューロンの同期発火イベント時の膜電位変動を調べる際に、背景ノイズを捉えてしまう可能性が考えられたため、空間課題学習からパッチクランプ記録までの実験の全てのスケジュールを覚醒条件下で行う方針に切り替えることにした。覚醒条件下でのパッチクランプ記録は、世界的に見てもごく少数の研究グループにしかなせない極めて難しい技術であるが、3Dプリンターを用いて、覚醒動物用の固定器具と頭部保護具を独自に設計、印刷し、実験の細かい条件検討を行うことで技術的困難を克服した。現在は、ラット1匹から複数の前頭皮質ニューロンの膜電位記録に成功している。
専門基礎知識を最大限に生かす基礎看護技術教育者の資質に関する研究

看護基礎教育課程において基礎看護技術に必要とされる専門基礎知識を検討するため、基礎看護技術教育における教授内容と専門基礎知識の関連について調査を行った。対象:全国の看護師養成機関624校(大学119校、短期大学3年課程31校、3年課程養成所474校)の基礎看護技術担当教員とした。質問項目:「所属」「基礎看護技術開講時期」「各専門基礎知識開講時期」「専門基礎知識の疑問の解決方法」などとした。データ収集法:自記式質問紙を用いて郵送法で行った。調査期間:平成17年11月。データ分析:記述統計量を算出した。倫理的配慮:調査の依頼書に調査の目的、研究結果は目的のみに用いることを明記し、回収を持って了承とした。質問紙は無記名とした。なお、調査開始前に、名古屋大学医学部迅速倫理審査の承認を得た。回収は272校(43.6%)であった。基礎看護技術開講開始時期は、1年前期が237校(87.8%)で最も多かった。この内45校(19.0%)は、1年前期のみで開講していた。1年前期の専門基礎科目の開講は、「解剖・形態学」150校(55.1%)、「生理・機能学」139校(51.1%)、「病理学」85校(31.3%)、「微生物学」150校(55.1%)などであった。基礎看護技術の単元の内容については、「ベッドメーキング・リネン交換」と「清拭・洗髪」で270校(99.3%)と最も多かった。また、基礎看護技術を1年前期のみで開講し、「薬物療法」「注射」の単元を教授している養成機関のうち29校は、「薬理学」について1年後期以後の開講であった。基礎看護技術の講義・学内演習を行う上で生じた専門科目基礎知識についての疑問に対する解決策については、「書籍で調べる」が248校(91.2%)で最も多かった。医学中央雑誌(19832004)において、キーワードを「看護学」と「解剖学」「病理学」「生理学」「微生物学」「生化学」「栄養学」などの専門基礎知識科目名、「看護教員」、「看護技術」とし、「看護学」とそれぞれの専門基礎知識科目名、「看護教員」と「看護技術」をクロスさせ、原著・総論について検索を行った。その結果、「看護学」とそれぞれの専門基礎知識科目名では、「生理学」関連の文献が240件と最も多く、「看護教員」と「看護技術」は22件であった。その後、研究者間でそれぞれの文献について、看護技術教育に専門基礎知識がどのように生かされているかを検討したが、看護学生に対しての専門基礎知識教育の教育評価がほとんどであった。並行して、看護師基礎教育課程での技術項目について、「看護基礎教育の過程で必要な看護技術と教育の可能性(日本看護学教育学会誌、12巻2号、2003)」、「看護基礎教育における技術教育のあり方に関する検討報告会報告書(厚生労働省、2002)」、「保健師助産師看護師学校養成所指定規則」、基礎看護技術についての書籍を参考として検討を行った。そして、主な技術項目として、ベッドメーキング、食事の援助、排泄の援助、活動と休息、寝衣交換、清潔(清拭、入浴・シャワー浴、足浴、洗髪)、感染予防、注射法、与薬法(注射法以外)、経管栄養法、高カロリー輸液法、包帯法、罨法、酸素吸入、吸引、導尿、浣腸を考えた。また、それぞれの技術項目において、必要な専門基礎知識について研究者間で検討を行い、一項目について39の専門基礎知識が必要であると考えらた。これらの内容を踏まえて、質問紙を作成した。次年度に調査を実施する予定である。

また、基礎看護技術を1年前期のみで開講し、「薬物療法」「注射」の単元を教授している養成機関のうち29校は、「薬理学」について1年後期以後の開講であった。基礎看護技術の講義・学内演習を行う上で生じた専門科目基礎知識についての疑問に対する解決策については、「書籍で調べる」が248校(91.2%)で最も多かった。
骨髄血管前駆細胞を使った網膜血管再生治療及び網膜神経保護療法の開発

前年度に引き続き、網膜色素変性患者から末梢血を採取しCFU-EC(血管内皮細胞コロニー形成能)、CFU-GM(顆粒球、マクロファージコロニー形成能)などを測定した。これまでに明らかにした加齢黄斑変性患者と同様に網膜色素変性患者でも関連が示唆された。網膜色素変性モデルマウスを使い、骨髄由来細胞の網膜神経細胞変性への関与を検討した。骨髄由来細胞は網膜神経細胞変性に伴い、網膜内へ誘導される。誘導された細胞は、多くがマイクログリアの形態を取り特に変性している細胞層に多く見られた。実験的に誘導される細胞を抑制したところ、網膜神経細胞変性、網膜血管萎縮は急速に進み、網膜機能もそれに追随して低下した。そこで我々は骨髄由来細胞を賦活すると神経変性が抑制されるのではないかと考え、その方法を開発した。既に広く利用されている顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)とエリスロポイエチン(EPO)を同時投与することにより、末梢血CFU-EC、CFU-GMが相乗的に亢進することを見出し、これをマウスモデルに投与してその臨床的効果を検討した。GCSF, EPO同時投与により、遺伝性網膜色素変性モデルマウスにおける網膜視細胞変性は優位に遅延し、その機能も保護できることが出来ることがわかった。視細胞のうち、遺伝子異常が存在するrod細胞に対しても保護効果が見られたが、特徴的にはcone細胞に対する効果であった。この方法は臨床応用も可能であると考え、特許出願の上、臨床応用へ向けて検討を始めている。骨髄血管前駆細胞から血管内皮細胞への分化培養系を確立した。マーカーとしてCD31,VEGFR2,VECAM1などを用い、免疫組織化学的手法を用いて内皮細胞への分化を確認した。ヒト末梢血細胞から単球を分離し、同培養系にて血管内皮前駆細胞へ分化させ、ヒトによる分化能、効率をみた。加齢の黄斑変性症患者、若年者、老年者ではそれら機能に違いがあることがわかった。検討した項目はコロニー形成能、細胞遊走能、細胞増殖能、管腔形成能などである。動物モデルとして、脈絡膜新生血管形成モデル、骨髄移植モデルを確立した。これにより、今後、骨髄細胞機能と眼疾患の関連を動物モデルを通して検証することが出来るようになった。網膜色素変性症モデルでは血管周囲細胞(アストロサイト、マクロファージ)などの形態、活性変化を詳細に観察、比較した。現在、網膜色素変性症マウス(RD1,RDS)、ラット(RCS)を使って骨髄血管前駆細胞投与による血管量増加、変性遅延効果を確かめている。また、骨髄投与の安全性を確認するため、成体マウスに骨髄Lin-細胞を硝子体投与し、それら細胞の動態と網膜を中心とした眼球変化をみた。一部細胞が硝子体に残存したものの、網膜自体には特に変化はなく、形態学的にも正常であった。投与した骨髄細胞はおそらく循環血中に出て、脾臓などに局在していると考えられるが、現在検索中である。現時点では安全性に特に問題は無いと考えられる。病態によって末梢血中のCD34陽性細胞数が変化することも確認できた。眼局所の小さい病変でもその活動性によって全身的に循環している末梢血細胞が影響を受けることを確認できたことは非常に意義が大きい。培養細胞と骨髄細胞とのin vitroでの細胞融合を試みるため、血管内皮細胞との共培養を試みた。共培養により血管内皮細胞の管腔形成能が上がること、人によりその誘導機能に差が有る可能性があることがわかり、そのメカニズムを調べたが、融合現象が関与していることを確認するには至らなかった。ヒトにより骨髄幹細胞機能に差があることがわかった。高齢者では若年者に比べ、幹細胞といっても、その機能が低下していることが知られている。我々も日本人で同様のコントロール研究を行い確認した。特に、若年者ではその機能が高く出るので、低下した際の影響がどう出るか興味のあるところである。我々は若年者に発症する、特発性脈絡膜新生血管を対象にして、末梢血幹細胞機能、血清機能の変化を調べた。血清機能は血管内皮細胞、末梢血幹細胞を用いて適当な血清希釈下に培養し、その変化を見た。その結果、特発性脈絡膜血管新生患者では若年であるにもかかわらず、それら機能は有意に低下しており、疾患発症の鍵となっている可能性が示唆された。これらに細胞融合現象が関与するのか検証するために作成した骨髄移植動物モデルでも細胞融合現象はほとんど確認できず、これらの効果は細胞融合とは関係なしにも十分起こりうることであることが示唆された。しかし、今後も更なる培養システム、条件の改善を行い検討を進めていく。

既に広く利用されている顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)とエリスロポイエチン(EPO)を同時投与することにより、末梢血CFU-EC、CFU-GMが相乗的に亢進することを見出し、これをマウスモデルに投与してその臨床的効果を検討した。GCSF, EPO同時投与により、遺伝性網膜色素変性モデルマウスにおける網膜視細胞変性は優位に遅延し、その機能も保護できることが出来ることがわかった。視細胞のうち、遺伝子異常が存在するrod細胞に対しても保護効果が見られたが、特徴的にはcone細胞に対する効果であった。この方法は臨床応用も可能であると考え、特許出願の上、臨床応用へ向けて検討を始めている。
CD44high/ALDH1high口腔癌細胞におけるRHAMMの機能解析

広島大学病院口腔顎顔面再建広島大学大学院医歯薬保健学研究院倫理委員会による承認の下で、患者の同意が得られた口腔扁平上皮癌患者の新鮮凍結材料を用いてRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法によりCD44、ALDH1、RHAMMの発現検索を行った。リンパ節転移例、STAGE III/IV症例、組織学的分化度の中分化から低分化例で、ALDH1mRNAの発現は高い傾向を示した。また免疫組織学的検索の結果、高分化型扁平上皮癌組織では、CD44陽性の例を認めたが、ほとんどの症例でALDH1の発現は陰性であった。一方低分化型扁平上皮癌では、多くの症例でCD44およびALDH1陽性を示し、ALDH1の発現と腫瘍の転移および組織学的分化度との関連性が示唆された。RHAMMについては一定の見解は得られず、今後の検討事項としたい。また、口腔扁平上皮癌症例のパラフィン包埋切片を用いて、免疫組織学的にCD44、ALDH1、RHAMMの発現検索を行った。高分化型扁平上皮癌組織では、CD44陽性例を認めたが、ほとんどの症例でALDH1の発現は陰性であった。一方低分化型扁平上皮癌では、多くの症例で、CD44およびALDH1陽性を示した。RHAMMとの関連については一定の見解が得られなかったが、低分化型の口腔扁平上皮癌ではCD44陽性およびALDH1陽性の細胞が多く存在することが示唆された。予後調査が可能である症例について、CD44、ALDH1の発現を認めた症例については予後も不良である症例を認めた。今後、過去の症例を含め、予後調査が可能である症例の全体数を増やし、統計的な調査を行う予定である。2.口腔扁平上皮癌症例の新鮮凍結材料を用いて、RT-PCR法により、RHAMM、CD44、ALDH1 mRNAの発現解析を行い、臨床病理学的指標との関連を検討する。RT-PCR法により口腔扁平上皮癌症例の新鮮凍結材料を用いてRHAMM、CD44、ALDH1 mRNAの発現解析を行い、臨床病理学的指標との関連を検討することを計画している。CD44high/ALDH1high細胞およびCD44high/ALDH1low細胞を用いて、DNAメチル化解析を行うことを計画している。これらの計画を実施するためには、抗体や試薬、施設費、その他費用が必要であり予定使用額が必要であると考えております。
金融リスクの計量化と統計的推測に関わる諸問題の解明

金融市場におけるリスク評価が適切でなければ、金融不安は極端な形で顕在化し、結果として生じる信用供与の低下は企業活動や人々の社会経済活動に深刻な影響を与えることとなる。本研究では、特定のモデルに依存しない金融市場リスク指標の開発、リスク指標の予測モデルの構築、高頻度市場データを利用したリスク評価の統計的分析などに関する研究を行い、それぞれ従来の問題点を改善する結果を得た。金融リスク指標開発に関しては,リスク指標として代表的なモデルフリーインプライドボラティリティが的確にリスクを捉えることができない状況を明らかにし,その欠点を改善した頑健な指標を開発した。この結果は大阪大学金融保険教育研究センターのホームページ上で閲覧できるようになっている。また累積分散の推定に関しては,その推定量である実現分散における市場のミクロ構造に起因するノイズの影響を考慮した推定方法を提案し,それが従来の方法と同等かそれ以上の精度であることを数値実験により確認した。さらにボラティリティに関するリスクプレミアムが将来の経済変数とどのような関連にあるかを分析し,それが景気予測に有効な変数であることを示した。金融リスク指標の予測モデル構築に関しては,ボラティリティ変動の長期記憶性と非対称性を考慮したARFIMAXモデルにより予測されたボラティリティをもちいた日経225株価指数オプションの価格付けを行い,そのパフォーマンスの良さを確認した。また予測精度に関しては,GARCHモデルにインプライドボラティリティを取り込むことでその予測精度が向上することを確認した。金融リスクに対する選好の推測に関しては,これまで導出された方法をサーベイするとともに,意思決定における投資主体のリスク回避性の影響に関する比較静学についての研究を推し進めるとともに,リスク中立密度のノンパラメトリック推定が頑健ではないことを実際の観測データをもちいることで確認した。「金融リスク指標の開発」に関しては,資産価格に関する2次モーメントでもあるモデルフリーインプライドボラティリティだけでなく,3次モーメントの情報を利用した指標の開発に着手し,いずれもモデルフリーである,インプライド歪度やインプライドレバレッジがどのようにリスクを捉えるかに関して研究を進めている。「金融リスク指標の予測モデル構築」に関しては,日次リターンと実現ボラティリティを同時にモデル化するRealized GARCHモデルがValue-at-Risk (VaR)や期待ショートフォール(ES)で有用であることが示された。VaRやESは金融実務でリスク管理に使われているため,この結果は金融実務の観点からも重要である。またボラティリティリスクプレミアムが,将来の株価収益率やクレジットスプレッド等に対して予測力を持つか否かについて検証をおこなった。さらにCEV型連続時間ボラティリティ変動モデルを日経平均のボラティリティの日次データを用いて推定し,実務で利用される機会の多いHestonモデルが棄却され,GARCH拡散過程モデルを支持する結果を得ている。「金融リスクに対する選好の推測」に関しては,モデルフリーのインプライドボラティリティの推測に用いる手法を応用することで,投資主体のリスク回避性を推定する方法に関して研究を推し進めている。「金融リスク指標の開発」に関しては、資産価格に関するモデルフリー・インプライドボラティリティだけでなく、3次モーメントの情報を利用した指標として、インプライド歪度やインプライドレバレッジの導出に関する研究を行った。その結果、モデルフリー・インプライドボラティリティの導出方法を応用して、それらを導出することが可能であることが明らかとなった。「金融リスク指標の予測モデル構築」に関しては、実現ボラティリティのバイアスを考慮して、日次リターンとを実現ボラティリティを同時にモデル化するRealized Stochastic Volatilityモデルにおいて、リターンの分布を一般双曲線非対称分布へ拡張した研究を行い、予測やVaRのパフォーマンスが改善する結果を得ている。また実現ボラティリティの2乗とモデルフリー・ボラティリティ・インデックスの2乗の差で定義されるボラティリティ・リスクプレミアムが将来の経済状態を予測する変数として有効かどうかを検討し、有効であるとの実証結果を得ている。ジャンプに関する研究としては、大きなジャンプに関するインプライド・ラージジャンプインデックスが金融危機の時期のような期間におけるボラティリティの予測に有効であることが明らかとなった。「金融リスクに対する選好の推測」については,関連する研究でノンパラメトリックなアプローチでは分析対象期間内で一定としなければ安定的な推定ができないことが判明している。従って,モデルフリー・インプライドボラティリティの推測に用いる手法を応用し,投資主体のリスク回避性を推定する方法に関して,その適用可能性について研究を行った。金融リスク指標の開発,金融リスク指標の予測モデル構築に関しては,研究成果を学術雑誌へ掲載する段階まで進展しており,金融リスクに対する選好の推測に関しても,研究会,学会で発表する段階まで達していることから,おおむね順調に進展していると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。順調に研究成果を出し始めており,現段階で研究計画の変更や遂行上の問題点はない。最終年度である次年度は,平成22, 23年度の研究成果をさらに進展させ,新しい金融リスク指標の提案,より精度の高い予測モデル構築を目指す。またリスクの選好の推測に関しては,現実の市場データによる推測を行う予定である。
フォトDNAインターカレーターの開発と新規光線力学療法への展開

3つのヘテロ芳香環がトライアングル状に連結したターアリーレン誘導体は光可逆なフォトクロミズムを示し、非常に高い光反応量子収率を示す。本研究ではターアリーレン分子の高い量子収率と熱安定な閉環状態に着目し、反応点炭素に脱離基を導入することで閉環体形成後、脱離反応により環化化合物が固定される不可逆な光反応系を構築した。ターアリーレンの分子骨格と既知の制がん剤であるインドロカルバゾール骨格が類似していることからターアリーレンの分子設計をベースに光による選択的な平面分子の形成を目標としていた。この一年においては既知のインドロカルバゾール骨格をモデル骨格として、分子内にマレイミドとインドール環を有し、その反応点炭素に水素とエトキシ基を導入した分子(MI-1)を合成した。比較分子として、反応点炭素に光照射によっても脱離しないと考えられるメチル基を有した分子(MI-2)も合成した。MI-2はヘキサン中において紫外光照射によって吸収スペクトルに顕著な変化が確認でき、また可視光照射によって元の状態へと戻る可逆反応が進行した。これは典型的なフォトクロミック反応であるといえる。それに対して、反応点炭素に脱離基を有したMI-1はヘキサン中において紫外光照射によって吸収スペクトルに変化が見られたが、その後可視光を照射しても元のスペクトルへとは戻らない非可逆反応を示した。紫外光照射後の生成物の質量分析、^1H-NMRを測定したところ、目的の縮環骨格が生成していることを確認した。同様の縮環反応は疎水環境であるBSA(ウシ血清アルブミン)やベシクル中でも確認できた。以上よりマレイミドとインドール環を有したターアリーレン誘導体の脱離反応・縮環反応を確認し、DNAインターカレーターとなるモデル骨格の創成を達成した。本研究ではターアリーレン分子の高い量子収率と熱安定な閉環状態に着目し、反応点炭素に脱離基を導入することで閉環体形成後脱離反応により環化化合物が固定される不可逆な光反応系を構築した。この一年ではインドロカルバゾール骨格に着手する前に脱離反応の反応機構を解明する目的でモデル分子を3種類合成した。それぞれの分子にはアルコキシ基とメチル基を導入した。メタノール脱離反応は酸添加、または高極性溶媒中で進行したため、カルボカチオン経由のE1脱離反応が進行していると仮定し実験した。化合物の同定、分光特性を評価した結果、脱離反応は予想通りカルボカチオン経由のE1脱離反応であることが示唆され、量子化学計算からも裏付けとなる結果が得られた。この成果については現在論文執筆中である。現在は制がん剤として機能するターアリーレンとしてまずターアリーレン分子を水溶化させることが重要と考え、分子内に糖を導入した分子骨格の合成を途中段階まで進めている。最終的に既知のインドロカルバゾール誘導体に近づけた分子の合成を目指す。
手紡ぎ動作の制御工学的解明と手紡ぎロボットの開発

初年度においては、主に手紡ぎに一番近い紡績機械としてガラ紡機を取り上げ、それについて研究を行い、それを手紡ぎに近づけるための改良と研究を行った。その結果、ガラ紡は糸の太さを制御量、紡糸点における糸張力をフィードバック量、糸に撚りを与える綿筒の回転速度を操作量とする自力制御系であることを明らかにした。次に、この原理を現在のメカトロニクス機器で構成した人間の手紡ぎロボットにつながる張力制御紡績機(綿筒式TDS)を製作した、ガラ紡およびTDSに関する実験により、綿筒の等価重量を増すと、糸張力は大きくなり、糸の撚率は小さくなり、糸の太さは大きくなることを明らかにした。また人間の手による原料の把持拘束力に対応する綿筒内での綿原料の緊密度を変えた場合の影響を調べ、緊密度が高いほど撚率が大きく、糸の太さは小さくなることを明らかにした。2年度においては、前年度までの研究実績をふまえ主に手紡ぎを行うロボットを製作し、関連した諸実験を行い糸を実際紡ぐことを可能にした。作業中の手首の運動は人間の場合をビデオ撮影し、これより基本パターンを決定した。糸形成の制御原理は、昨年までの研究成果より、基本的にはガラ紡の原理と同じと考えて、糸形成点の張力が一定となるよう撚率を制御することにした。ただし、ガラ紡では撚率を加減するには、撚りを与える筒の回転速度を変化させるのに対し、ホロボツトシステムでは手紡ぎの実際に近い形として、腕を紡鍾から遠ざける糸形成速度を変化させた。また、手紡ぎでは供給原料の把持圧力も操作量であり、これが手紡ぎの習熟に関係深いと考え、空気圧制御による基礎実験を行い、制御工学的意味を解明している。以上より、手紡ぎの制御学的原理をほぼ解明し、それにより実験紡績が可能であることを立証した。手紡ぎに一番近い紡績機械としてガラ紡機を取り上げ,それについて研究を行い,それを手紡ぎに近づけるための改良と研究を行った.ガラ紡は撚りを加減することで太さを制御する紡績法であるという点では手紡ぎと同じ紡績原理を使っていることになる.本研究では,まずこうした制御原理を制御工学的に明らかにする研究を行った.その結果,ガラ紡は糸の太さを制御量,紡糸点における糸張力をフィードバック量,糸に撚りを与える綿筒の回転速度を操作量とする自力制御系であることを明らかにした.次に,この原理を現在のメカトロニクス機器で構成した人間の手紡ぎロボットにつながる張力制御紡績機(綿筒式TDS)を製作した.製作された紡績機には糸張力,綿筒回転速度,糸の太さの変化の状況を連続して同時測定できる装置を付加した.ガラ紡に関する実験により,人間が原料を糸形成点から引き戻す力に対応する綿筒の等価重量を増すと,糸張力は大きくなり,糸の撚率は小さくなり,糸の太さは大きくなることが明かとなった.また,平均撚率と平均太さの間には逆比例に近い強い相関関係があり,他の条件が一定の場合,綿筒の等価荷重を変えることにより糸の太さをある範囲で自在に変え得ることが示された.また人間の手による原料の把持拘束力に対応する綿筒内での綿原料の緊密度を変えた場合の影響を調べ,緊密度が高いほど,撚率が大きく,糸の太さは小さくなることを明らかにした.

TDSについても同様の実験を行い,数値制御の設定張力(張力の目標値)を変えることにより糸の太さを制御できることを示した.最近,人間に近い制御の一方法としてファジィ制御を考え試行して見ている.現在のところ特に通常の比例制御やオンオフ制御より良好な結果を得るまでには至っていない.本年度は,前年度までの研究実績をふまえ,主に手紡ぎを行うロボットを製作し,関連した諸実験を行い糸を実際紡ぐことを可能にした。作業中の手首の運動は人間の場合をビデオ撮影し,これより基本パターンを決定した。糸形成の制御原理は,昨年までの研究成果より,基本的にはガラ紡の原理と同じと考えて,糸形成点の張力が一定となるよう撚率を制御することにした。ただし,ガラ紡では撚率を加減するには,撚りを与える筒の回転速度を変化させるのに対し,本ロボットシステムでは手紡ぎの実際に近い形として,腕を紡錘から遠ざける糸形成速度を変化さた。また,手紡ぎでは供給原料の把持圧力も操作量であり,これが手紡ぎの習熟に関係深いと考え,空気圧制御による基礎実験を行いそれの制御工学的意味を検討した。以上より,手紡ぎの制御学的原理をほぼ明らかにし,それにより実際に紡績が可能であることを立証した。
血小板活性化因子及び関連脂質による血管内皮細胞-顆粒球間認識の制御機構解析

[1]血小板活性因子(PAF)の産生制御機構の解析PAFの産生がどのように制御されているか明らかにするために、炎症細胞の一つであるマクロファージを用いて解析した。その結果、各種の刺激により産生されるPAFは同時に産生されるprostaglandin E2 (PGE2)によってdown-regulateされていることが明らかになった。さらに、各種のcyclooxygenase阻害薬にはPAF産生増強作用があることが明らかになり、この意義について今後明確にする予定である。[2]細胞間接着分子発現機序の解析[3]鼻粘膜血管内皮細胞の培養系確立ヒト鼻粘膜から血管内皮細胞を採取して培養する条件の設定を行った。さらに、本細胞を用いて白血球の接着に対するglucocorticoidの抑制作用について解析した。
初期心臓形成におけるCsrp1の機能解析

申請者はsmall LIM proteinファミリーの心臓形成における相互作用を網羅的に解析するため、同じsmall LIM proteinファミリーに属するCrip2(heart-specific LIM protein;HLP)に着目し、ノックダウン胚を用いてマイクロアレイ解析を行い、発現量が著しく変化するmicroRNA群を見出した。中でも、Dre-miR-143(miR143)は心臓の心室と流出路に強く発現しており、miR143の機能阻害は、心室筋の心房化を引き起こすという興味深い結果を得た。さらに、miR143は心拍動依存的に発現が制御されており、拍動の停止により発現が減少し、拍動の再開に伴って発現を回復するという、これまでに類を見ない制御機構であることがわかった。正常な心臓の発生には、心拍動や血流が必要不可欠であり、遺伝子情報は正常でも、血流を変化させると、心臓発生は正常に進行しなくなることが分かっている。しかし、その機構は未解明であり、拍動という機械的な刺激(メカニカルストレス)が、miR143の発現や心臓形成にどのような影響を与えているかを、物理学や工学の分野からの検証を行った。その結果、筋芽細胞や血管内皮細胞に直接伸展刺激やせん断応力を負荷すると、1時間ほどで、miR143の発現が上昇してくることがわかった。さらに、この発現制御機構の理解のために、miR143のプロモーター領域を解析したところ、特徴的なSRF(Serum Response Factor)のサイトが保存されていることが分かった。現在はプロモーターの解析をまとめ、論文投稿へ向け準備中である。さらに、これらの知見をもとに、日本生化学会の学会誌である、『生化学』の牡地集号に、『メカニカルストレスと転写制御』といらイトルで総説を投稿し、掲載された。申請者はsmall LIM proteinファミリーのCsrp1に着目し、初期心臓形成における機能解析を行うことで、心臓の器官構築と領域決定のテーマに取り組んできた。申請者のこれまでの研究で、Csrp1が非古典的なWntシグナルを調節することで、細胞骨格の再構築を促し、細胞移動を制御しており、心臓中胚葉の正中への移動をも制御していることが明らかとなった。また心臓中胚葉の移動には、中胚葉直下にシート状に広がる内胚葉が必要不可欠であることを示した。心臓中胚葉の移動に、非古典的なWntシグナルと直下の内胚葉が必要だという報告は、これまでほとんどなかったため、新たな心臓中胚葉の移動機構として評価を受け、米国科学アカデミー紀要に掲載された。更なる研究の発展のためマイクロアレイ解析を行い、small LIM proteinの機能阻害により発現量が著しく変化するmicroRNA群を見出した。中でも、Dre-miR-143(miR143)は機能阻害により、心室筋の心房化を引き起こすという興味深い結果を得た。さらに、miR143は心拍動依存的に発現が制御されるという、これまでに類を見ない制御機構であることがわかった。これらの結果は、心拍動という機械的ストレスが心臓の領域決定に大きく寄与していることを示唆している。このような知見は、心臓発生だけでなく発生生物学の分野でもこれまで報告がなされておらず、大いに発展性のあるテーマである。申請者は、表現形の特異性などから、miR143の標的としてレチノイン酸合成酵素のRaldh2を既に同定しており、現在は、拍動による発現制御機構の解明のために、miR143のプロモーター解析を進行中である。特別研究員採用の最終年度では、miR143の機能解析を手がかりとして、機械的ストレスの発生期における意義を踏まえた、領域決定機構のモデル化を目指す。
特発性および膠原病性間質性肺炎における急性増悪特異的自己抗原の解析

2型肺胞上皮癌培養株のcDNAライブラリーを用いたSEREX解析によって、特発性肺線維症急性憎悪症例における特異的自己抗体について検討した。急性憎悪症例15症例および安定例30例の検討では、12種類の自己抗体が検出された。His-標識抗原蛋白を用いたELISAでは、12種類のうち5種類の自己抗体が急性憎悪症例特異的に上昇していた。特にアネキシン1抗体は急性憎悪症例の血清および気管支肺胞洗浄(BAL)液において、それぞれ47%、53%の陽性率を呈していた。抗原特異的T細胞エピトープの有無について検討するために、BAL液中のCD4陽性T細胞を分離し、RT-PCR法による増幅産物のシークエンスによってCD4陽性T細胞の抗原結合部位の塩基配列の解析を行った。1から3ヶ月の感覚で検体の採取が可能であった、急性憎悪症例10例においては、すべての症例で経時的なBAL液中に同じ抗原結合部位を有するCD4陽性細胞の増生が確認された。それら10例中3例にその抗原結合部位とアネキシン1のN末端部位とhomologyがみられ、それらの症例はアネキシン1抗体も上昇していた。HLA-DR抗原を用いたTEPTOPE解析において、それら3例ではアネキシン1N末端が抗原結合性を有する部分に含まれていた。特発性肺線維症急性憎悪症例において、アネキシン1のN末端ペプチドが病態特異的な免疫反応に関与していることが示唆された。II型肺胞上皮癌培養株(A549)cDNAライブラリーを用いたSEREX(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)法による抗体スクリーニングにより、特発性間質性肺炎症特異的自己抗原を11種類検出した。これらすべての抗原蛋白をA549培養株のm-RNAを用いたRT-PCR法によって各遺伝子の全体を増幅し、QIA express蛋白質精製システムを用いて6XHisタグ標識自己抗原蛋白を作成した。得られた自己抗原蛋白を用いたNi-NTA HisSorb PlateによるELISA解析を確立した。このELISA法を用いて特発性間質性肺炎および膠原病性間質性肺炎の血清中および気管支肺胞洗浄液中の自己抗体の出現頻度について解析を継続している。現在までに施行した40症例の特発性肺線維症症例の解析では、急性増悪を認めた症例(10症例)において急性増悪を認めない症例(30症例)よりも抗annexin 1抗体、抗phosphoglycerate kinase 1抗体、抗Bax inhibitor 1抗体などの発現が高い傾向が認められた。現在、血清中および気管支肺胞洗浄液中に存在する急性増悪疾患特異的自己抗体について6XHis蛋白および免疫沈降によって培養株から抽出した抗原蛋白によるWestern blot法を用いた解析をさらに継続している。本研究により間質性肺炎急性増悪に特異的な自己抗体の確立が可能と考える。II型肺胞上皮癌培養株のcDNAライブラリーを用いたSEREX解析によって、特発性肺線維症急性増悪症例における特異的自己抗体について検討した。急性増悪症例15症例および安定例30例の検討では、12種類の自己抗体が検出された。His-標識抗原蛋白を用いたELISA法では、12種類のうち5種類の自己抗体が急性増悪症例特異的に上昇していた。特にアネキシン1抗体は急性増悪症例の血清部よび気管支肺胞洗浄(BAL)液において、それぞれ47%、53%の陽性率を呈していた。抗原特異的T細胞エピトープの有無について検索するために、BAL液中のCD4陽性T細胞を分離し、RT-PCR法による増幅産物のシークエンスによってCD4陽性T細胞の抗原結合部位の塩基配列の解析を行った。1から3ヶ月の間隔で検体の採取が可能であった、急性増悪症例10例においては、すべての症例で経時的なBAL液中に同じ抗原結合部位を有するCD4陽性細胞の増生が確認された。それら10例中3例にその抗原結合部位とアネキシシ1のN末端部位とhomologyがみられ、それらの症例はアネキシン1抗体も上昇していた。

HLA-DR抗原を用いたTEPITOPE解析において、それら3例ではアネキシン1N末端が抗原結合性を有する部分に含まれていた.特発性肺線維症急性増悪症例において、アネキシン1の末端ペプチドが病態特異的な免疫反応に関与していることが示唆された。
三量体GTP結合蛋白質による細胞接着・運動の制御機構

三量体G蛋白質による細胞接着・運動の制御機構を明らかにすることを目的にし、HeLa細胞におけるGq/11が誘導する接着斑様構造形成のメカニズムを昨年度に続き検討した。活性化型Gα11による接着斑様構造の形成は、カスパーゼによりRhoキナーゼ(ROCK-1)が切断されて活性化されたためであることが明らかになったので、Gαq/11によるカスパーゼの活性化機構を追求した。Bcl-2の過剰発現でROCK-1の切断が阻害されたのでミトコンドリア系細胞死シグナルの関与が示唆された。Aktの活性化型を発現してもカスパーゼの活性化が抑制された。インスリン刺激によりAktのリン酸化が増加するが、この増加はGq/11刺激で抑制された。Gq/11によるAktの活性化抑制についてさらに検討し、次の2つの経路の関与が明らかになった。1)IRS-1に特異的なチロシンホスファターゼが関与する経路:Gq/11刺激によるAktのリン酸化抑制は、orthovanadateにより一部回復した。インスリン受容体や基質のIRS-1のチロシンリン酸化のレベルはインスリン刺激で高くなるが、Gq/11刺激でIRS-1のリン酸化は有意に減少したが、インスリン受容体のリン酸化は変化しなかった。orthovanadate存在下ではインスリン単独、インスリン+Gq/11刺激どちらの場合もチロシンリン酸化のレベルは高くなったが、両者間で有意の差が見られなくなった。2)Rhoを介する経路:Rhoドミナントネガティブ変異体を発現するとGq/11によるAktのリン酸化の抑制が一部回復した。Gq/11刺激で内在性RhoAの活性化が観察された。これら2つの経路の阻害はどちらも部分的な効果しか示さないが、orthovanadateとRhoドミナントネガティブ体を同時に作用させると、Gq/11によるAktのリン酸化抑制およびROCK-1の切断はほぼ完全に消失した。これらの結果は両経路が独立なものであること、Gq/11により同時に活性化されることを示している。
量子科学館加速器装置を用いた高校生向き科学実践型IT教育プログラム開発と評価

東北大学工学部量子科学館加速器を大学の大型実験装置の例として,高度にITを活用した高校生向きの科学実践型課外授業を開発し実践評価した。15年度は対面授業を中心に開発し,16年度はジャパン・ギガビット・ネットワークを用いた遠隔授業を中心に研究を実施した。IT教材解説,関連小実験,加速器見学運転照射,討論で構成された2日間(午前・午後)または3日間(午後のみ)のプログラムとなった。生徒は自然に既習知識の活用や新知識獲得への挑戦的文脈を提供する大型実験装置の現場,または最新IT技術が提供した臨場感溢れる遠隔環境に実践的身体的に参加できた。強い動機を有した参加受講生徒は,際立った非日常的体験を確実に持った。今後の改善点はあるものの,すくなくとも好ましい影響を与えたことは,授業終了直後あるいは長期経過後の調査からも示唆され,効果的授業として本研究の開発目的は達成された。具体的には,本研究において行った2年間3回の授業実践を通して,研究目的:「大型システム(CW加速器)を教材とした高大連携型物理課外授業の可能性を探る」について,本授業の成果が生徒の実施時アンケート調査や実施後面接調査等により以下の通りに示された。(1)高校生に効果的な授業目標:既習項目と挑戦的項目を混ぜた目標を設定(2)授業全体の最適構成:導入,理論,小実験(ジグソー学習),加速器見学と運転,試料照射と観察,討論を配分。特に実験を重点とした。(3)対象高校生,実施時期,実施時間(長さ):2年生の課外授業で,夏休み,あるいは秋にかけての週末の複数日(2日間午前・午後,あるいは3日間午後)とした。(4)ITを含めて各種の教材:効果的で多様なIT教材を開発し提示実践ができた。(5)評価の方法:選択肢付き加速器構成要素ブロック図描画法の基本的妥当性は確認した。(6)IT技術と環境を高度に活用し,効果的な遠隔授業の実現可能性を示すことができた。本研究は以下の3項目を課題とする。新しい高大連携理科授業の提案、そのなかで、ITを活用した遠隔実践的物理授業の可能性、高校生にも存在する素朴概念の実態と解明。高大連携理科授業として大学の大型実験装置を開放し、高校生に物理実践授業の場を提供することを提案する。本研究では東北大学量子科学館600kVコッククロフトイオン加速器(工学部教育用)を用いる。本加速器は物理原理や現象の宝庫で、その構成、基本原理、機能、イオンビームの働きや利用を総合的に理解することは理科実践学習として最適である。一般には、大型で複雑なイオン加速器を短期間に理解することは高校生には通常は極めて難しい課題だが、代表者の提案する"新スキーマ理論"に基礎をおき、用意周到にマルチメディア教材を用意しITを活用した提供方法と体験的実験授業で可能で有効なことを2年間で明らかにする。本年度は近隣2高校と提携し授業参観、事前調査や検討を基に2年生約30人に対し土日に3回の課外授業を構成した。初回は加速器の構成と原理の導入+CD自習教材提供、2回目は主構成要素に関わる5題のグループ小実験(手作り実験教材も動員)とした。最後は量子館で加速器見学・運転・試料照射実験を行なった。3回とも電子黒板システム等を含むIT設備で柔軟に開発教材を提供し質疑に活用した。終了後の加速器構成とその原理や現象の関連概念地図構成の課題では、把握度は思った以上の高い結果を示した。最も活発だったのは小道具や装置を用いた小実験授業で、特に他グループ訪問時には生徒同士や生徒教師間で活発な議論が交わされた。生徒達は元来実験好きなことを認識した。IT活用遠隔授業では実際には上の最終回では生徒を二分し、一方を大学内の遠隔教室で試行した。現場と遠隔をDV映像と電子黒板をIPで双方向に結び、状況説明、指示、質問や議論に供した。概念地図構成課題は、「現場」組に劣るが十分合格に達した。ただし、生徒は遠隔映像では臨場感に欠け、意欲を削ぐとの不満を訴えた。次年度の本格遠隔実践授業設計の基礎資料を得た。

(1)高校生に効果的な授業目標:既習項目と挑戦的項目を混ぜた目標を設定(2)授業全体の最適構成:導入,理論,小実験(ジグソー学習),加速器見学と運転,試料照射と観察,討論を配分。特に実験を重点とした。(3)対象高校生,実施時期,実施時間(長さ):2年生の課外授業で,夏休み,あるいは秋にかけての週末の複数日(2日間午前・午後,あるいは3日間午後)とした。(4)ITを含めて各種の教材:効果的で多様なIT教材を開発し提示実践ができた。(5)評価の方法:選択肢付き加速器構成要素ブロック図描画法の基本的妥当性は確認した。(6)IT技術と環境を高度に活用し,効果的な遠隔授業の実現可能性を示すことができた。
精巣決定因子SRYを中心としたヒト性分化カスケードの分子遺伝学的解析

ヒトY染色体上の精巣決定因子SRYは男性における性決定の最初の鍵となる遺伝子であるが、未だにその機能は明らかでない。本研究では、まずSRYの下流の遺伝子を探索した。報告されている既知の遺伝子の発現パターンより、セルトリー細胞のtight junction形成に重要なclaudin11がSryの下流遺伝子の一つである可能性を考えた。そこで、SRYがclaudin11プロモーター活性に影響を与えるか否かをヒトNT2/D1細胞を用いて、ホタルルシフェラーゼをレポーターとして検討した。その結果、SRY過剰発現のもとではclaudin11プロモーター活性がコントロールと比べて2.5倍増加した。興味深いことにclaudin11のプロモーター領域には3カ所のSRY/SOX結合部位が存在していた。SOX9についてもSRYと同様な実験で、claudin11のプロモーター活性をコントロールと比べて1.7倍増加させた。これらのことから、SRY/SOXがclaudin11の制御に関わっている可能性が考えられた。またY染色体上の遺伝子でSRY以外にも精巣特異的に発現しているものがいくつか知られているが、その機能は殆ど明らかとなっていない。我々はその中でHSFY (HSF-like factor encoded on the Y chromosome)に着目し、その機能解析を行った。新規に作成したHSFY特異的抗体およびmRNA発現解析の結果から、この遺伝子は精巣のセルトリー細胞と精子形成細胞に特異的に発現していることが判明した。またY染色体上の無精子症候補領域AZFbの欠失をもつ無精子症患者2名においてこの領域を含む欠失があることを見出した。以上のことからHSFYは精子形成に重要な役割を担っていると考えられた。<研究の実績概要>SRYはヒトを含む哺乳類において男性性分化の鍵を握るタンパク質である.しかしながら単離されてからl0年以上が経過しているが,依然としてSRYが調節する遺伝子は現在まで不明のままである.またSRY遺伝子自身の発現調節やSRYと相互作用するタンパク質も明らかでない.我々はまずSRYと相互作用するタンパク質の同定を試みた.他の生物種ではエストロゲンの産生と作用が性決定や性分化の鍵を握ることが多い.そこでSRYがエストロゲン受容体(ER)の機能を抑制することで,男性の性決定に関わる可能性を考えた.ERαおよびERβの過剰発現ベクターをERE(estrogen responsive element)gがルシフェラーゼの上流に挿入されたレポーター遺伝子と同時にCOS1細胞に導入し,SRYの存在下でのルシフェラーゼ活性を検索した.結果,SRYはERαおよびβの持つ転写活性化能を抑制することが判明した.この活性はSRYのHMG boxの一部からC末端側を欠失する,ヒトのXY女性に由来するSRYタンパクでは認められなかったが,SRYのC末端側の41アミノ酸を欠失する症例に由来するSRYでは正常SRYと同様の活性の低下を認めた.現在,SRYとERの直接相互作用の確認のため,GST-pull downアッセイおよびCOS1細胞を用いたtwo hybridsystemによる検索を進めている.SRY遺伝子の発現調節機構を知るえめに,SRY遺伝子自身がそのプロモーター領域にSRY結合配列を有することに着目した.SRYプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したコンストラクトを作成し,これとSRY,および変異型SRYを同時に発現することで,SRYが自身の遺伝子発現にどのような影響を及ぼすかを検索した.結果SRYは自身の遺伝子発現に抑制的に機能することが明らかになった.ヒトY染色体上の精巣決定因子SRYは男性における性決定の最初の鍵となる遺伝子であるが、未だにその機能は明らかでない。<背景>Y染色体上の精巣決定因子であるSRYはクローン化されてから12年が経過しているが、未だに標的遺伝子は同定されておらず、その機能も依然不明である。

今年度我々は(1)発現のパターンからSRYの標的候補と予想される遺伝子のプロモーター活性をSRY強制発現下で測定すること、(2)SRYと複合体を形成するタンパク質の同定の2つのアプローチを用いてSRY機能の解明にアプローチした。<研究内容および考察>SOX9のプロモーター1kbpをホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したコンストラクトを作成し、NT2/D1細胞およびCos1細胞に導入した。SRY強制発現下においてコントロールに対しておのおのの細胞でそれそれ1.6倍および2.5倍程度の転写活性の増加が認められた。今回用いたSOX9プロモーターにはSRYが属するSOXファミリー遺伝子の結合配列が存在する。現在ゲルシフトアッセイ等により、SRYの結合部位を検討中である。Claudin11は細胞間接着分子の一つで性決定・性分化の時期にSertoli細胞で発現しており、SRYの下流遺伝子として有望であると考えた。Claudin11プロモーター1.5Kbpをホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したコンストラクトを作成し、NT2/D1細胞およびCos1細胞に導入した。転写活性はSRY強制発現下でNT2/D1細胞においては2.3倍に増加したが、Cos1細胞においてはコントロールと同様であった。現在Claudin11プロモーター領域の欠失コンストラクトを複数種類作成し、詳細を検討中である。FLAG-SRYを過剰発現するNT2/D1細胞株を樹立した。この細胞よりSRYを含むタンパク複合体の単離を開始した。今後はプロテオミクス的手法によってSRYに結合するタンパク質の同定を行う予定である。ヒトY染色体上の精巣決定因子SRYは男性における性決定の最初の鍵となる遺伝子であるが、未だにその機能は明らかでない。本研究では、SRYの下流の遺伝子を探索した。研究の途中において、胎生期のマウスにおいて、セルトリー細胞におけるtight junction構成要素の一つのclaudin11がSry発現直後より、発現が認められることが他の研究者より報告された。またclaudin11のノックアウトマウスは精巣が小さいことが以前に報告されていた。さらに細胞の接着は細胞分化に重要であることから、Claudin11がSryの下流の遺伝子の一つと考えて、SRYとclaudin11プロモーター活性の関連について解析を行った。データベース検索の結果、Claudin11のプロモーター領域には3カ所のSRY/SOX結合部位が存在していた。ヒトclaudin11のプロモーター領域1.1kbをホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポーターコンストラクトを作成し、SRY過剰発現ベクターとともにヒト精巣腫瘍由来のNT2/D1細胞に導入して転写活性を測定した。その結果、claudin11プロモーター活性がコントロールに比べて2.5倍増加した。次に様々な長さのclaudin11