hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌ワクチン療法による肝細胞癌再発予防に関する検討

4存在下に培養して採取した。2)腫瘍細胞は、マウス由来の肝癌細胞(BNL1MEA.7R.1)を用いた。3)樹状細胞と腫瘍細胞をPEG処理にて融合させた。4)FACSにて融合樹状細胞の表面マーカーの解析を行った。5)51 Cr release法にて、脾リンパ球のCTL活性を測定した。6)同系マウスに腫瘍細胞を皮下移植後、融合樹状細胞を投与し抗腫瘍効果を検討した。7)樹状細胞によるワクチン施行群と未施行群における、抗腫瘍活性及び腫瘍拒絶効果を検討した。樹状細胞を用いた癌ワクチン療法により強力な抗腫瘍活性が誘導され、マウス肝細胞癌モデルにおいて、肝細胞癌の退縮及びワクチン療法施行群における腫瘍拒絶が認められ、臨床応用の可能性が示唆された。次に、臨床応用にむけて検討を行った。問題点として、C型慢性肝炎患者では、末梢血の樹状細胞が数的・機能的に低下していることが報告されている。健常成人および慢性肝疾患患者末梢血より分離した細胞を、GM-CSFおよびIL-4存在下に培養し、樹状細胞を採取しその機能を比較検討した結果、慢性肝疾患患者由来の樹状細胞では、抗原提示能の低下が認められた。したがって、樹状細胞の機能修飾をはかる必要性が示唆され検討をした。
医薬品適正使用のための薬効および副作用の比較評価法の開発

生体内の受容体および酵素と相互作用することにより薬効・副作用を発現する薬物が数多く開発され臨床で用いられている。そこで、受容体あるいは酵素と薬物との結合動態に着目し、薬物動態学的情報と薬力学的情報を定量的に統合して解析する方法論を構築し、それを基にした最適な循環器系薬剤の選択と投与計画を支援する薬品情報システムの構築を目的とした。同一な作用機序の薬物間の評価に関しては、β-遮断薬を対象にその成果を既に報告している。本研究では、異なる作用機序の薬物間の評価法の確立を目指して、可逆的な抗血小板作用を有するシロスタゾール、サルポグレラートと非可逆的な抗血小板作用を有するアスピリン、チクロピジンを対象に検討を行なった。その結果、シロスタゾールとサルポグレラートの抗血小板作用は、ホスホジエステラーゼIIIおよびセロトニン受容体との結合解離を考慮した速度論モデルにより解析でき、連続投与ならびに投与量の増量において効果の蓄積は無く、薬効消失までに24-36時間を要することを理論的に明らかにした。アスピリンおよびチクロピジンに関しては、各々シクロオキシゲナーゼと未成熟血小板への非可逆的阻害モデルで解析可能でき、アスピリン80320mg投与時には、用量依存で最大効果発現時間の短縮が見られるが最大効果および投与中止後の回復期間は大きく変化しないこと、チクロピジン200600mg投与時には、用量依存で最大効果の増大が見られるが、最大効果発現時間の短縮は見られず、投与中止後の回復期間の延長が起こることが示唆された。以上の結果から、適切な用法・用量、および出血の危険性回避のための休薬期間などに関して、投与計画を理論的に設定できる支援システムを構築することができた。生体内のレセプターおよび酵素と相互作用することによって、薬効・薬理作用を発現する薬物群が数十種類開発され、臨床での薬物療法において主要な役割を担っている。一方、これらには多種類の同種同効薬が上市されており、薬物療法の多様化と混乱を招く一因になっている。本研究では、レセプターあるいは酵素と薬物の結合占有に着目し、薬物動態学的情報と薬力学的情報を定量的に統合して結合占有を解析する方法論を構築し、それを基にした最適な循環器系薬剤の選択と投与計画を支援する薬品情報システムの構築を目的としている。本研究においては、まず同一の作用機序を有する薬物間および異なる作用機序を有する薬物間の定量的な比較評価法の確立を試みた。前者においては、アドレナリンβ-レセプターと相互作用する同種同効薬の薬効・薬理作用および副作用・毒性作用の比較評価および医薬品適正使用のための合理的な処方設計に関して、既に我々は検討を終了しその成果を臨床報告している。本年度は後者の評価法の確立を目指し、虚血性心疾患治療に用いられる抗血小板剤を対象に検討を行った。対象とした薬物は、可逆的な抗血小板作用を有するシロスタゾール、サルポグレラート、非可逆的な抗血小板作用を有するアスピリン、チクロピジンである。可逆的な抗血小板剤の評価は終了し、適切な用法・用量、および出血の危険性回避のための休薬期間などに関して、患者個々に設定できるシステムを構築し、臨床報告を行った。今後は、アスピリンおよびチクロピジンの解析を行い、後者の解析法の確立を検討し、同一および異なる作用機序を有する薬物間の定量的な比較評価法の確立を検討する。

そこで、受容体あるいは酵素と薬物との結合動態に着目し、薬物動態学的情報と薬力学的情報を定量的に統合して解析する方法論を構築し、それを基にした最適な循環器系薬剤の選択と投与計画を支援する薬品情報システムの構築を目的とした。同一な作用機序の薬物間の評価に関しては、β-遮断薬を対象にその成果を既に報告している。本研究では、異なる作用機序の薬物間の評価法の確立を目指して、可逆的な抗血小板作用を有するシロスタゾール、サルポグレラートと非可逆的な抗血小板作用を有するアスピリン、チクロピジンを対象に検討を行なった。その結果、シロスタゾールとサルポグレラートの抗血小板作用は、ホスホジエステラーゼIIIおよびセロトニン受容体との結合解離を考慮した速度論モデルにより解析でき、連続投与ならびに投与量の増量において効果の蓄積は無く、薬効消失までに24-36時間を要することを理論的に明らかにした。アスピリンおよびチクロピジンに関しては、各々シクロオキシゲナーゼと未成熟血小板への非可逆的阻害モデルで解析可能でき、アスピリン80320mg投与時には、用量依存で最大効果発現時間の短縮が見られるが最大効果および投与中止後の回復期間は大きく変化しないこと、チクロピジン200600mg投与時には、用量依存で最大効果の増大が見られるが、最大効果発現時間の短縮は見られず、投与中止後の回復期間の延長が起こることが示唆された。以上の結果から、適切な用法・用量、および出血の危険性回避のための休薬期間などに関して、投与計画を理論的に設定できる支援システムを構築することができた。
イオノームによるミヤコグサの養分動態変異体の獲得と解析

マメ科モデル植物のミヤコグサ(Lotus japonicus)の養分吸収変異体を獲得するために、これまでに確立した吸収元素の網羅的解析手法であるイオノーム手法を用いた。変異体のスクリーニング対象としてはEMS(ethylmethane sulfonate)処理を行った種子を自分たちで調整した約200系統およびミヤコグサバイオリソースセンターから提供された約7000糸統を用いた。スクリーニング対象とした元素は必須元素としてはB, Mg, K, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, Mo、非必須元素としてはAI, As, Na, Ni, Sr, Cd, Csであり、非必須元素は野生株の生育に障害が出ない程度のレベルで培養液に添加して栽培を行なった。栽培は一定の環境条件下で同時に200系統を栽培し、全ての個体の地上部を別々に分解をし、対象元素含有率の測定をICP-MSを用いて行った。200系統全体を母集団として、その平均から3倍以上あるいは半分以下にいずれかの元素含有率が変動した場合に変異を生じている候補として選抜し、地上部を切除した後の根部から植物体を再生することで種子を獲得した。同様の操作を繰り返し4世代目にいたっても元素含有率に変動か生じることを確認した系統を変異系統とした。2000系統から32の変異系統が獲得された。得られた変異体の中で一つの元素だけが変動している系統は少なく、その平均は4-5種類の元素が同時に変異していることが示された。また元素の種類によっては変動株が多く得られるものがあり、その逆も認められた。実際に獲得したMoの変異株は体内めMoトランスポーターに変異が生じていることが確認され、本手法の有効性が認められた。また、化学的性質の異なる元素が体内においで一定のバランスを持っで存在するイオンホメオスタシスの現象が認められ、変異によってこのバランスかくずれる可能性が初めて示唆された。植物の養分吸収変異体の獲得のためにTCP-MSを利用したイオノーム手法を導入した。従来の変異体のスクリーニングでは多くの場合生育遅延、葉色変化などの表現系を対象としていたため、生育などに明瞭な変化が認められないような変異体の獲得は困難であった。そこで体内に吸収される15種類の元素(カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、マンガン、ホウ素といった必須元素の他に生育に障害が出ないレベルの有害元素であるニッケル、ヒ素、鉛、ストロンチウム、セシウム、ナトリウム、カドミウム)を同時分析するためにまず200個体を同じ条件で栽培可能な方法を決定した。続いて、EMSによる変位剤処理を施し、変位を起こした株をハイスループットにICP-MSを活用して解析する手法を確立した。その結果、約3週間で200個体x15元素のスクリーニングが可能となった。また、測定は地上部のみを対象とすることにより、培養液に残した根部(十茎下部)から植物体を再生させることに成功し、これによって特徴的な変異株候補の種子を得ることが可能となった。対象とした植物はマメ科のモデル植物であるミヤコクザであり、本手法によってモリブデンの吸収変異体、マグネシウムの吸収変異体といった新たな変異体が実際に獲得されるにいたった。また野生系統の養分吸収特性の比較を行ったところ、これまで酵母において知られていたマグネシウム、リン、ニッケル、モリブデンの化学的性質の異なる4つの元素間にイオンホメオスタシスが存在する可能性が見出された。
移植細胞の生着効率を高める合成化合物の創製

細胞治療では移植細胞の多くが細胞生着前に細胞死するため、十分な細胞生着を得るためには大量の移植細胞を調製しなくてはならない。この問題を解決するため、研究代表者らは高価なタンパク質製剤ではなく、安価に大量合成が可能な人工小分子による細胞死の抑制を目指した。細胞表面に接着する分子骨格(アドヘサミン)を用いて多様な誘導体を合成し、自己集合性のFFペプチドを導入したアドヘサミン誘導体(Adh-SFF)が効果的に細胞死を抑制することを見出した。WSTアッセイ・DLS・電子顕微鏡・免疫染色・Western blotなどの評価を行うことによって、本分子は細胞表面のシンデカン4を認識すると、サブミクロンサイズの自己集合体形成を介して細胞生存に関わるPKCα-MAPKシグナルを誘導することを解明した。さらに研究代表者らは細胞生着効率を高める新たな案として、上記の自己集合体構造にMMP2を修飾することを検討した。MMP2による細胞外マトリックスの分解で生じた隙間に細胞が浸潤することによって移植細胞を広範囲に生着させることを目的としている。本検討ではHalo-tag ligandを結合したAdh-SFF誘導体による自己集合体構造にHalo-tag/MMP2融合タンパク質を導入する技術を確立し、生存活性と浸潤能を同時に高めた移植細胞の調製を可能とした。共同研究先である東京理科大学西川研究室の下で、本技術で生存活性と浸潤能を高めた移植細胞をマウス皮下へ移植して24時間暴露後の生着状態を確認した。その結果、本技術で処理した移植細胞を用いると飛躍的に皮膚組織での生着効率が向上するだけでなく、近傍の筋組織内への細胞浸潤も確認された。現在、本技術の汎用性を確認すべく、心不全モデル動物への心筋細胞移植で本技術による効果を評価している。さらに将来的には、多様な細胞種へ展開可能かどうかを確認していく予定である。代表者らはインテグリンのリガンドを導入したアドへサミンを用いて、細胞表面のシンデカンとインテグリンのクラスターを促すことで細胞死を抑制することに成功した。細胞表面に存在するインテグリンは細胞種によって発現パターンが異なる。そこで、多様なインテグリンのペプチドリガンドを導入したアドへサミン誘導体(15種)を合成し、ヒト胎児プライマリー細胞(肝臓、副腎、肺、前立腺など)に対して細胞死を抑制するアドへサミン誘導体を抽出した。特に肝細胞において細胞死を効率よく抑制するアドへサミン誘導体を見出し、モデル動物への肝細胞移植を行った。しかし、肝細胞の移植に伴うアルブミン量の増加が認められなかった。その原因として、このアドへサミン誘導体を使用してもなお細胞生着率が低いこと、さらに移植した肝細胞が胆管細胞へ分化してしまったことが示唆された。細胞生着率が低くなる要因として、ヘパラン硫酸に対するアドへサミンの結合力が低いことが考えられる。アドへサミンはピリミジン部位がπ-πスタッキングすることで自己集合して、ヘパラン硫酸と強く結合できる。現在の設計では、ピリミジン部位にペプチドリガンドを導入すると、ヘパラン硫酸への結合能が著しく低下してしまう(π-πスタッキングを阻害するためと予想する)。そこで、新たに自己集合性ペプチドであるフェニルアラニン連続配列を導入したアドへサミン(Adh-SFF)を設計した。本設計によってヘパラン硫酸との結合力が4倍程度向上する。加えて、Adh-SFFは思いがけず細胞死の抑制能も示した。これはインテグリンに対するペプチドリガンドを必要としない新たなメカニズムでの細胞死抑制が可能であることを意味する。蛍光イメージングや電子顕微鏡での検討の結果、Adh-SFFはシンデカンのクラスタリングを介して細胞死抑制能を高めている可能性が示唆された。合成したアドへサミン誘導体の細胞移植実験を行い、低い細胞生着率や細胞分化の問題を見出した。低い細胞生着率を改善するには、アドへサミン誘導体のシンデカンに対する結合能をさらに高める必要があると思われる。自己集合性ペプチド(FF)をアドへサミンに導入し、自己集合性を増すことによってシンデカンに対する結合能の向上に成功した(Adh-SFF)。さらにインテグリンを介さない別のメカニズムによって細胞死抑制が可能であることを新たに見出した。Adh-SFFによる細胞死抑制メカニズムはシンデカンのクラスターを介した細胞内シグナリングによるものと予測している。シンデカンはすべての細胞において多く発現しており、汎用性の高い細胞死抑制が可能であると期待される。さらにAdh-SFFとルシフェラーゼを発現したNIH3T3細胞を用いて、マウス皮内への細胞移植実験を行った結果、細胞生着効率に改善が見られる移植条件を見出した。今後、さらに化合物の構造や移植条件の最適化によって細胞生着率の向上が期待できる結果である。

WSTアッセイ・DLS・電子顕微鏡・免疫染色・Western blotなどの評価を行うことによって、本分子は細胞表面のシンデカン4を認識すると、サブミクロンサイズの自己集合体形成を介して細胞生存に関わるPKCα-MAPKシグナルを誘導することを解明した。さらに研究代表者らは細胞生着効率を高める新たな案として、上記の自己集合体構造にMMP2を修飾することを検討した。MMP2による細胞外マトリックスの分解で生じた隙間に細胞が浸潤することによって移植細胞を広範囲に生着させることを目的としている。本検討ではHalo-tag ligandを結合したAdh-SFF誘導体による自己集合体構造にHalo-tag/MMP2融合タンパク質を導入する技術を確立し、生存活性と浸潤能を同時に高めた移植細胞の調製を可能とした。共同研究先である東京理科大学西川研究室の下で、本技術で生存活性と浸潤能を高めた移植細胞をマウス皮下へ移植して24時間暴露後の生着状態を確認した。その結果、本技術で処理した移植細胞を用いると飛躍的に皮膚組織での生着効率が向上するだけでなく、近傍の筋組織内への細胞浸潤も確認された。現在、本技術の汎用性を確認すべく、心不全モデル動物への心筋細胞移植で本技術による効果を評価している。さらに将来的には、多様な細胞種へ展開可能かどうかを確認していく予定である。新たに見出したアドへサミン誘導体(Adh-SFF)は、従来とは異なる細胞死抑制メカニズムを有することが期待される。今後はそのメカニズム解明を完結させる。具体的には、シンデカンのクラスター化を確認するとともに、その細胞内シグナル経路を同定する。さらにAdh-SFFを用いて、適用できる細胞種の確認や細胞移植での条件を最適化する。その検討で得た最も優れた移植条件を用いて、動物への細胞移植実験を再度試みていく。また上記とは別にAdh-SFFを用いて細胞表面へのタンパク質修飾技術を開発する。従来の細胞表面へのタンパク質修飾として、細胞膜に対して脂質アンカー分子を用いて修飾する技術や、細胞表面に存在する求核性アミノ酸残基に対して、求電子剤を用いた共有結合形成によって修飾する技術が報告されている。しかし、化合物の取扱い性(特に安定性や溶解性)が悪いことや、細胞の機能阻害や細胞へのダメージが懸念されていた。本手法は、取扱いが容易な小分子を用いて、細胞死を抑制しながら、細胞表面を修飾することができるマイルドな手法である。代表者らは、すでにアルキルハライドを導入したAdh-SFF誘導体を合成し、ハロタグシステムを介して蛍光タンパク質GFPを細胞表面に修飾することに成功した。今後は、成長因子などの機能性タンパク質を細胞表面に修飾し、移植細胞を機能化することで細胞移植効率の向上を目指していく。
Hybrid EMTの見地からみた胸管内微小腫瘍細胞の同定による新たな食道癌治療

(1)食道癌切除検体を用いた「Hybrid EMT」の臨床的意義の検討食道癌患者の血液サンプルを用い、「Hybrid EMT」のマーカーとなりうるmiRNAの解析を行った。既知であるEMT status別にそれぞれ4検体、計8検体に対して、高性能DNAチップ基板3D-Geneを用いてmiRNAの網羅的解析を施行し、候補遺伝子を同定した。さらに、教室の食道癌切除血清検体111例を用い、上記の候補miRNAにつき定量PCRにて測定した結果、TGF-βシグナルの調節因子として報告されているmiR-193bが有力な候補であることが判明した。(2)胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証一昨年度につづき昨年度も、胸管内リンパ液における微小癌細胞を同定する実験を試みた。食道癌手術中に胸管からリンパ液の回収を行い、EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule;上皮細胞接着分子)のモノクローナル抗体を用いて末梢血循環腫瘍細胞Circulating Tumor Cells (CTCs)を検出する試みであったが、信頼性に足る十分な結果が得られなかった。一つは術前化療症例が増加してchemo naiveの症例が稀であったこと、もう一つは鏡視下手術の導入により、検体採取自体が容易でない状況になったことが挙げられる。したがって、胸管内リンパ液の代替として血液サンプルを、微小癌細胞の代替としてmiRNAマーカーの同定を代替法とし、循環する微小癌細胞を分子生物学的に同定・評価することを新たな概要として設定した。結果としてmiRNAマーカーを複数用いてパネルを設定し、これを用いて化学療法感受性を予測できたことを論文報告した。当該年度では、次の2点の研究を実施した。(1)食道癌患者検体における「Hybrid EMT」臨床的意義の検討、(2)胸管内リンパ液中の微小癌細胞の同定手技の検証。(1)食道癌患者検体における「Hybrid EMT」臨床的意義の検討検体のうち特に血液検体サンプルを用いて、Hybrid EMT」のマーカーとなりうるマイクロRNAを、EMT status別にそれぞれ4検体計8検体に、高性能DNAチップ基板3D-Gene(R)を用いマイクロRNAの網羅的解析を施行し、候補マイクロRNAを同定した。食道癌患者血清検体111例に候補マイクロRNAの定量PCRを行った結果、TGF-βシグナルの調節因子として報告されているmiR-193bは食道癌化学療法の治療抵抗性にも関与していることが明らかとなった。(2)胸管内リンパ液中の微小癌細胞の同定手技の検証「Hybrid EMT」のマウスモデルでの検証を終了する予定であったが、モデルの作成および、購入・搬入に時間を要したため、次年度も検証を継続する予定である。また、術前治療の修飾のない胸管内リンパ液検体の集積に難渋していることが次年度以降の胸管内リンパ液中の微小癌細胞を用いた実験計画に影響を及ぼす見込みが高い。これまで研究代表者らは、食道癌における"tumor budding"の臨床的意義を報告し、またEMTの代表的マーカーであるE-cadherinとvimentinのmRNA発現比から算出される「EMT status」とtumor buddingの相関についても報告してきた。これらの成果をもとに、下記の研究計画を立案した。(1)食道癌切除検体を用いた「Hybrid EMT」の臨床的意義の検討(2)胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証(1)食道癌切除検体を用いた「Hybrid EMT」の臨床的意義の検討:食道癌患者の血液サンプルを用い、「Hybrid EMT」のマーカーとなりうるmiRNAの解析を行った。既知であるEMT status別に、それぞれ4検体、計8検体に対して、高性能DNAチップ基板3D-Geneを用いてmiRNAの網羅的解析を施行し、候補遺伝子を同定した。(2)胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証:昨年度は、胸管内リンパ液における微小癌細胞を用いた実験を試みた。食道癌手術中に胸管からリンパ液の回収を行い、微小癌細胞の同定が、末梢血循環腫瘍細胞Circulating Tumor Cells (CTCs)の検出方法であるEpCAM (Epithelial cell adhesion molecule;上皮細胞接着分子)のモノクローナル抗体を用いた免疫磁気的手法で実施可能かどうかを検証した。食道癌切除検体を用いた「Hybrid EMT」の臨床的意義の検討については、教室で保有している食道癌細胞株を用い、網羅的解析により候補miRNAがピックアップされ、さらに、臨床検体においてもその有用性が示唆された。このステップにおいては極めて順調に進行した。一方、本研究で最も困難が予想された、胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証についてであるが、食道癌術中に胸管内リンパ液を採取する手技の確立に難渋している。採取手技、サンプル量、クオリティの問題など、現在試行錯誤の段階である。従って、本年度では十分な検体が確保できなかったため、本ステップの微小癌細胞同定手技の検証が不十分のままである。

また、術前治療による修飾のない胸管内リンパ液検体の集積が必要であるが、昨今は術前治療を行う症例が多くなっているため、サンプル収集にも難渋している。さらに、本年度は「Hybrid EMT」をマウスモデルにより検証し、終了する予定であったが、マウスモデルの作成に時間を要しているため、次年度も実験を継続する予定である。(1)食道癌切除検体を用いた「Hybrid EMT」の臨床的意義の検討食道癌患者の血液サンプルを用い、「Hybrid EMT」のマーカーとなりうるmiRNAの解析を行った。既知であるEMT status別にそれぞれ4検体、計8検体に対して、高性能DNAチップ基板3D-Geneを用いてmiRNAの網羅的解析を施行し、候補遺伝子を同定した。さらに、教室の食道癌切除血清検体111例を用い、上記の候補miRNAにつき定量PCRにて測定した結果、TGF-βシグナルの調節因子として報告されているmiR-193bが有力な候補であることが判明した。(2)胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証一昨年度につづき昨年度も、胸管内リンパ液における微小癌細胞を同定する実験を試みた。食道癌手術中に胸管からリンパ液の回収を行い、EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule;上皮細胞接着分子)のモノクローナル抗体を用いて末梢血循環腫瘍細胞Circulating Tumor Cells (CTCs)を検出する試みであったが、信頼性に足る十分な結果が得られなかった。一つは術前化療症例が増加してchemo naiveの症例が稀であったこと、もう一つは鏡視下手術の導入により、検体採取自体が容易でない状況になったことが挙げられる。したがって、胸管内リンパ液の代替として血液サンプルを、微小癌細胞の代替としてmiRNAマーカーの同定を代替法とし、循環する微小癌細胞を分子生物学的に同定・評価することを新たな概要として設定した。結果としてmiRNAマーカーを複数用いてパネルを設定し、これを用いて化学療法感受性を予測できたことを論文報告した。次年度以降、当初の予定である胸管内リンパ液検体の微小癌細胞における「Hybrid EMT」型の同定と原発巣・血液検体との相関の検証を行う予定である。加えて、胸管内リンパ液検体の集積とマウスモデルでの検証を継続する。次年度も引き続き、胸管内リンパ液中における微小癌細胞同定手技の検証を行う必要がある。食道癌術中の胸管内リンパ液を採取する手技の確立については、食道チームと採取方法につき再度協議した上で、採取手技、サンプル量、クオリティの問題などを解決する予定である。また、術前治療による修飾のない胸管内リンパ液検体の集積が必要であるが、なるべく症例の取りこぼしのないように配慮する。「Hybrid EMT」をマウスモデルにより検証する実験については、基礎研究グループからのアドバイスも頂き、結果が出せるように次年度も実験を継続する予定である。「Hybrid EMT」のマウスモデルでの検証を終了する予定であったが、モデルの作成および、購入・搬入に時間を要したため修了出来ず、それに使用する予定であった備品費などを次年度に繰り越した。
異物排出トランスポーター発現制御ネットワーク解析ならびにその生理機能解明

本年度はサルモネラ異物排出トランスポーターAcrABの発現制御因子であるRamRの結晶構造解析と基質認識機構の解明に取り組んだ。RamRはAcrABアクチベーターのRamAを誘導し、AcrABを誘導する。まず、RamRの結晶化を行い、X線結晶構造解析を行った。RamRはホモダイマーであり、TetR familyに特徴的な構造であった。RamRは9個のα-helixにより構成されていた。また、α1からα3にかけて構成された3 helix budle構造は、helix-turn-helix motifであったことから、RamRのDNA結合ドメインであることが示唆された。また、α4からα9にかけて、空隙が存在することから、RamRはこの部分に基質を収容する可能性が示唆された。そこで、次に、基質とRamRとの相互作用様式について検討を行った。EthidiumおよびRhodaime 6GはRamRを介して、RamAを誘導することが分かった。そこで、EthidiumまたはRhodamine 6GとRamRとの共結晶化を行い、両化合物との複合体構造解析に成功した。その結果、両化合物ともα4からα9にかけて構成される空隙に結合することが分かった。また、RamRの両化合物の認識は、RamRのPhe155を介したπ-πstacking相互作用と複数の水素結合によって行われていることが分かった。また、EthidiumおよびRhodamine 6Gと水素結合するRamR残基は異なることから、RamRは基質をマルチサイト結合により認識していることが分かった。異物排出トランスポーターは多くの細菌に存在る内在性の薬剤耐性因子である。食中毒原因菌であるサルモネラには9種類の異物排出トランスポーターが存在する。その中でも、AcrABは幅広い基質を有し、最も強力に機能することが知られている。私は昨年度までにサルモネラAcrABは細菌代謝物インドールや胆汁酸により誘導されること、そして、その誘導にはサルモネラ特異的レギュレーターであるRamA依存的に行われていることを明ちかにした。そこで、本年度はRamAの機能同定を行った。まず、RamAがAcrABを直接誘導している可能性を考え、RamAがacrAの上流に結合するかゲルシフトアッセイにより検討を行ったところ、acrAの上流142bpから161bpにおいて結合し、AcrABを直接制御することが分かった。次に、私はインドールや胆汁酸によるRamAを介したAcrAB誘導機構の詳細について検討した。まず、インドールや胆汁酸によってRamAが誘導される可能性を考え検討したところ、インドールはRamAを誘導するが胆汁酸はRamAを誘導しないことが分かった。このことはインドールはRamAを過剰発現させてAcrABを誘導する一方で、胆汁酸はRamAを活性化させてAcrABを誘導することを示している。この詳細な機構について検討したところ、インドールによるRamA誘導にはRamRが関与すること、そして胆汁酸はRamAと結合してRamAを活性化させている可能性があることを明らかにした。異物排出トランスポーターは多くの細菌に存在する薬剤耐性因子である。食中毒原因菌であるサルモネラには少なくとも9つの異物排出トランスポーターが存在する。AcrABはサルモネラにおいて最も強力に機能する異物排出トランスポーターである。前年度までに,サルモネラAcrABがインドールや胆汁酸といったシグナルによってRamAを介して誘導されていることを明らかにした。また,インドールはRamRを介してRamAを誘導してAcrABを誘導するのに対し,胆汁酸はRamAを活性化してAcrABを誘導することを明らかにした。そこで本年度は,これらシグナルによるAcrAB誘導機構の詳細について検討した。RamRはramAの上流に結合してRamAの発現を抑制するリプレッサーであることを明らかにした。インドールは細菌に対し酸化ストレスを与えるが,インドールの酸化ストレス作用はRamRによるRamAの抑制解除に無関係であることが分かった。一方で,酸化剤であるパラコートはRamAでなくSoxS依存的にAcrABを誘導することが分かった。パラコートはSoxSを大量に誘導することから,パラコートはSoxSを大量に誘導することで,RamAによるAcrAB誘導効果を消失させる可能性が考えられる。AcrAB誘導機構を詳細に理解するには,AcrAB発現制御因子の構造情報を知る必要がある。そこで,本年度は,RamAおよびRamRの結晶化を行った。RamAに関しては様々な発現系を試したが,どの発現系においても発現RamAのほとんどが封入体を形成し,結晶化に必要な量を確保できなかった。現在,封入体RamAのリフォールディング条件の検討を行っている。一方,RamRに関しては,水溶性画分にRamRを大量に発現する発現系を構築することができた。RamRをnative formで精製し,結晶化を行ったところ,RamR結晶を得ることができた。X線回折実験を行ったところ2.0Åほどの分解能を持つことが分かった。しかしながら,得られた結晶は複合結晶であったため,構造解析には適さなかった。そこで現在,RamR結晶化の最適条件の検討を行っているところである。

RamRは9個のα-helixにより構成されていた。また、α1からα3にかけて構成された3 helix budle構造は、helix-turn-helix motifであったことから、RamRのDNA結合ドメインであることが示唆された。また、α4からα9にかけて、空隙が存在することから、RamRはこの部分に基質を収容する可能性が示唆された。そこで、次に、基質とRamRとの相互作用様式について検討を行った。EthidiumおよびRhodaime 6GはRamRを介して、RamAを誘導することが分かった。そこで、EthidiumまたはRhodamine 6GとRamRとの共結晶化を行い、両化合物との複合体構造解析に成功した。その結果、両化合物ともα4からα9にかけて構成される空隙に結合することが分かった。また、RamRの両化合物の認識は、RamRのPhe155を介したπ-πstacking相互作用と複数の水素結合によって行われていることが分かった。また、EthidiumおよびRhodamine 6Gと水素結合するRamR残基は異なることから、RamRは基質をマルチサイト結合により認識していることが分かった。
新規転移関連遺伝子及びアラキドン酸代謝酵素と発癌・浸潤・転移の解析

1)膀胱移行癌におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現と臨床的意義イムノブロット法と免疫組織染色法を用いた検討から,シクロオキシゲナーゼ2は正常膀胱粘膜上皮には発現しないが,移行上皮癌では34%に,上皮内癌では93%に,異型細胞では48%に発現した。また,移行上皮癌における発現は浸潤度と相関したが,予後とは相関しなかった。以上のことからシクロオキシゲナーゼ2は上皮内癌を経て筋層浸潤癌への発癌過程に関与すると考えられた。2)膀胱扁平上皮癌におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現イムノブロット法と免疫組織染色法によって膀胱扁平上皮癌におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現を検討した。シクロオキシゲナーゼ2は膀胱扁平上皮癌では100%に,扁平上皮化生においても100%に発現した。しかも,その発現はほとんどすべての癌細胞の細胞質にび漫性であった。以上から,シクロオキシゲナーゼ2は膀胱扁平上皮癌の発癌に関与すると考えられている炎症性発癌機構に重大な役割を果たすものと考えられた。3)腎盂・尿管移行上皮癌におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現と臨床的意義腎盂・尿管移行上皮癌では74%の症例がシクロオキシゲナーゼ2を発現しており,その発現は細胞の悪性度と相関したが,浸潤度や予後とは相関しなかった。シクロオキシゲナーゼ2は腎盂・尿管癌の発癌にも関与すると考えられた。4)精嚢腺上皮におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現シクロオキシゲナーゼ2は恒常的には発現しておらず,刺激によって誘導される遺伝子である。しかし,精嚢腺では恒常的に発現していること,前立腺癌で術前に内分泌療法を受けた症例ではその発現が減弱することから男性ホルモンによって調節を受けていることを明らかにした。5)アラキドン酸代謝酵素阻害剤による膀胱癌の増殖抑制諸種のアラキドン酸代謝酵素阻害剤の中で5-LOX阻害剤はもっとも強い細胞増殖抑制効果を示した。しかも,その効果は5-LOを発現する細胞のみにみられた。そして,その細胞増殖抑制効果は5-LOX代謝産物である5-HETEやLeukotriene C4で完全に阻害された。以上のように,5-LOX阻害剤は酵素活性依存性に膀胱癌細胞の増殖を抑制することから,5-LOX阻害剤は膀胱癌に対する特異的な治療法であるかもしれない。
乳児院の一時保護におけるリスクマネジメントプログラムの開発に関する研究

本研究の主な実績は、(1)乳児院の「一時保護」に関する施設調査、(2)「一時保護」担当保育士等への専門職調査である。(1)乳児院の「一時保護」に関する施設調査:本調査は、乳児院におけるおおむね過去3年間(201618年)における一時保護、および一時保護児についての状況を明らかにする。具体的には1「一時保護」における乳児院の役割と機能、リスクマネジメント、「一時保護」に関わる制度や施策の充実を図るための基礎資料を得ることを目的として実施した。乳児院の128施設に送付し84施設(返送率:65.6%)から回答が得られた。(2)「一時保護」担当保育士等(保育士・看護師等)への専門職調査:本調査は、「一時保護」担当の経験のある保育士等に調査協力を求めた。無記名の封書による回収とした。上記の一時保護実態調査の一時保護児数をもとに、施設ごとに525票を送付した。調査協力を求めたのは、過去3年間に、「一時保護児」を1ヶ月程度担当された保育士・看護師等とした。本研究の目的は、1「一時保護児」を担当することが保育士等の職務負担感にどのような影響を与えているか、2「一時保護児」のどのような点が、職務負担感に影響を与えるか、3「一時保護」に関わる制度や施策の充実を図るための基礎資料を得るために実施した。乳児院の128施設に1295票を送付した。上記と同じ乳児院84施設から614人(一施設あたり平均7.3人)の協力が得られた。本研究の次の質問内容は、平成25年「乳児院の一時保護実態調査」(全国乳児福祉協議会実施)の自由回答などをもとに作成し、大学の倫理委員会の承諾を得て無記名のアンケート調査として実施した。現在、アンケート調査の結果をもとに研究報告を準備している。本研究は,委託一時保護先である乳児院と一時保護された乳幼児(以下,要保護児)のリスクを明らかにし,リスクの対策と緩和を目的とするリスクマネジメントプログラムの開発である。具体的には(1)要保護児の抱えるリスクとして,1予防保健学的リスク,2要保護児のケアの困難性と他児等におよぼすリスク,(2)乳児院の抱えるリスクについてリスク対策と緩和の現状を明らかにすることである。本年度は研究目的を達成するために、情報収集と、調査の項目の精査を行うために、第1に研究分担者と乳児院の事例検討会に参加し、リスクに関する情報収集と質疑応答、施設長およびソーシャルワーカーとのリスクに関する研究活動を行った。第2に、全国乳児院協議会に「平成25年度一時保護実態調査(益満ら,2015))の研究使用の承諾が得られた。この実態調査の自由記述について、大谷尚によるSCAT (Steps for Coding And Theorization)を用いて分析を行った。分析対象とした自由記述の項目は「一時保護児」「職員体制」「一時保護のキャンセル理由」などである。その内容は、乳児院と要保護児の抱えるリスクには,1夜間など緊急保護等で母子手帳も無く出生・育成歴等の情報不足,2被虐待児等のケア困難,3感染症の感染リスク等,4要保護児とその家族が抱えるリスク等がある。さらに,措置期間の不確実ななかでの5職員のマンパワー不足からのリスク等についての実証的データが得られた。1年目の実績としては,上記以外に、全乳協の会議などに参加し、乳児院の施設長・スタッフなどから情報収集も精力的に行い,乳児院と要保護児の抱えるリスクの現状を明らかにできたので、この結果をもとに、アンケート調査の項目などに反映してゆきたい。本研究では(1)要保護児の抱えるリスクとして,1予防保健学的リスク,2要保護児のケアの困難性と他児等におよぼすリスク,(2)乳児院の抱えるリスクについて,上記のように1事例検討会に参加、2実態調査の自由記述の分析などにより,1乳児院の抱えるリスクの現状とその対策について,2要保護児の抱えるリスクの現状とその対策についての2種類の調査の準備ができた。しかし、分担研究者との研究協議がこれからであり、典型的な施設での聞き取り調査が実施できていないので、「おおむね」という評価にした。本研究は,乳児院に一時保護された乳幼児(以下,要保護児)のリスクを明らかにし,リスクの対策と緩和を目的とするリスクマネジメントプログラムの開発である。本年度も昨年度同様に研究目的を達成するために、情報収集と、調査の項目の精査を行うために、第1に研究分担者と乳児院の事例検討会に参加し、リスクに関する情報収集と質疑応答、施設長およびソーシャルワーカーとのリスクに関する研究活動を行った。第2に、「平成25年度一時保護実態調査(益満ら,2015))の研究の分析の精査を行った。2年目の実績としては,上記以外に、全乳協の会議などに参加し、乳児院の施設長・スタッフなどから情報収集も精力的に行い,乳児院と要保護児の抱えるリスクの現状を明らかにできたので、この結果をもとに、アンケート調査の項目を作成した。

また、上記の研究を推進する仲で、一時保護という緊急事態に対応する保育環境の要である「保育士の感情労働」に着目し、一時保護のおける保育士等の感情労働について明らかにする必要が明らかになった。これは、一時保護におけるリスクの対策と緩和を目的とするリスクマネジメントプログラムの開発においては、受け入れ保育環境の要である「保育士」の状況と課題を明らかにすることになり、保育士支援についてのプログラムを作成するをめざしている。本研究では(1)要保護児の抱えるリスクとして,1予防保健学的リスク,2要保護児のケアの困難性と他児等におよぼすリスク,(2)乳児院の抱えるリスクについて,上記のように1事例検討会に参加、2実態調査の自由記述の分析、3「平成25年度一時保護実態調査(益満ら,2015))の研究の分析の精査の結果を活かして、1乳児院の抱えるリスクの現状とその対策について,2要保護児の抱えるリスクの現状とその対策についての2種類の調査の準備ができた。さらに、保育士などへの感情労働の調査票も作成できた。次の内容で、6月までに調査票を配布し、8ー9月には集計分析、10月から分担研究者と結果について協議、12月から報告書を作成する。以上により科研費、おおむね順調に進展しているとした。本研究の主な実績は、(1)乳児院の「一時保護」に関する施設調査、(2)「一時保護」担当保育士等への専門職調査である。(1)乳児院の「一時保護」に関する施設調査:本調査は、乳児院におけるおおむね過去3年間(201618年)における一時保護、および一時保護児についての状況を明らかにする。具体的には1「一時保護」における乳児院の役割と機能、リスクマネジメント、「一時保護」に関わる制度や施策の充実を図るための基礎資料を得ることを目的として実施した。乳児院の128施設に送付し84施設(返送率:65.6%)から回答が得られた。(2)「一時保護」担当保育士等(保育士・看護師等)への専門職調査:本調査は、「一時保護」担当の経験のある保育士等に調査協力を求めた。無記名の封書による回収とした。上記の一時保護実態調査の一時保護児数をもとに、施設ごとに525票を送付した。調査協力を求めたのは、過去3年間に、「一時保護児」を1ヶ月程度担当された保育士・看護師等とした。本研究の目的は、1「一時保護児」を担当することが保育士等の職務負担感にどのような影響を与えているか、2「一時保護児」のどのような点が、職務負担感に影響を与えるか、3「一時保護」に関わる制度や施策の充実を図るための基礎資料を得るために実施した。乳児院の128施設に1295票を送付した。上記と同じ乳児院84施設から614人(一施設あたり平均7.3人)の協力が得られた。本研究の次の質問内容は、平成25年「乳児院の一時保護実態調査」(全国乳児福祉協議会実施)の自由回答などをもとに作成し、大学の倫理委員会の承諾を得て無記名のアンケート調査として実施した。現在、アンケート調査の結果をもとに研究報告を準備している。平成29ー30年度の計画は次のとおりである。平成29年度は、アンケート調査の実施と分析:「施設票」と「要保護児の個票」の調査を実施する。1調査対象:全国の乳児院134カ所(2014年10月現在)のすべてに調査票を送付し回収する。個票については、30カ所程度のサンプリング調査とする。全乳協には内諾を得ている。2調査方法:全施設にアンケート調査を送付して,研究協力をお願いする。3調査票:乳児院用の「施設票」は施設長等に記入を自記式で記入をお願いする。
大規模鉛直混合と拡散に関する自由対流圏大気化学の観測研究

富士山測候所(標高3776m)及び山腹の太郎坊(標高1300m)の2地点において、2002年9月11日-24日および2003年5月26日-6月13日の各約2週間にわたり大気化学の集中観測を実施した。大気擾乱が活発化する季節に観測を実施して、気塊の入れ替わりとそれにカップリングした化学諸過程にアプローチを試みた。そのため上層気塊/境界層気塊のトレーサーとして、^7Be/^<222>Rnを各々に対応させ観測を行った。他の観測項目は、SO_2,CO, O_3,CO_2,降水、霧水、エアロゾル個数、エアロゾル化学成分等である。また、両集中観測の間についても、多数の項目の連続データが取得でき、順次分析を行った。^7Be濃度は春と秋に極大、夏に極小を取ることがわかった。大気上層部からの気塊輸送の季節変動を反映していると考えられた。一方、^<222>Rnについては、富士山頂ではあまり季節変化がないことがわかった。現時点では、説明が難しいと思われる。いずれにせよ、両核種について、日本上空の自由対流圏で通年データを取得したのは、初めてである。ほぼ通年で観測が出来た結果、SO_2の濃度は、冬に高く、夏に低いパターンであること、さらに、冬には大陸から低気圧の通過に伴って、長距離輸送事象が発生することがわかった。この輸送に際しては、SO_2,CO,^<222>Rnが共に輸送される例が多く、共通する発生領域から由来することが示唆された。三宅島からのSO_2プリュームが捉えられたのは一度だけで、本州南岸で対流活動があり、かつ南東風がある場合以外には、富士山の高度まで到達しないことがわかった。これは、三宅の噴煙の到達高度が1kmほどしかないためと考えられる。気象庁富士山測候所(標高3776m)及び山腹の太郎坊(標高1300m)の2地点において、H14年9月11日24日のおよそ2週間にわたり大気化学の集中観測を実施した。本研究では、大気擾乱が活発化する季節に観測を実施することにより、気塊の入れ替わりとそれにカップリングした化学諸過程にアプローチしようというものである。観測項目は、SO_2、CO、O_3、CO_2、^<222>Rn、^7Be,降水、霧水、エアロゾル個数、エアロゾル化学成分等である。各観測データは分析中、解析中のものがほとんどであるが、部分的には解析を終えて学会、報告会などで発表した。以下概略を述べる。太郎坊でのオゾン濃度は、午後(16時頃)に極大となり、100ppbを超える高濃度のオゾンも観測された。また、深夜から早朝にかけて濃度が低下したが、真夜中に濃度上昇現象も観測され、上層からの移流の影響と考えられる。エアロゾル個数濃度は、山頂より太郎坊のほうが高かった。太郎坊における個数濃度(0.30.5μm)は、日中に高く、夜間に低くなり、日中には、下層から汚染物質が運ばれているものと考えられた。霧水・降水を山頂、太郎坊で各々18,6個採取した。pHは、4.06.8程度で、酸性雨・酸性霧も観測された。[NO_3^-]/[SO_4^<2->濃度比は、降水の方が霧水より低かった。

また、太郎坊で濃度比が大きく、NO_3^-濃度(当量)がSO_4^<2->濃度より高い試料も多かった。陽イオン成分では、山頂での降水試料をのぞいて、NH_4^+が最も濃度が高く、酸を中和している。富士山測候所(標高3776m)及び山腹の太郎坊(標高1300m)の2地点において、2002年9月11日-24日および2003年5月26日-6月13日の各約2週間にわたり大気化学の集中観測を実施した。大気擾乱が活発化する季節に観測を実施して、気塊の入れ替わりとそれにカップリングした化学諸過程にアプローチを試みた。そのため上層気塊/境界層気塊のトレーサーとして、^7Be/^<222>Rnを各々に対応させ観測を行った。他の観測項目は、SO_2,CO,O_3,CO_2,降水、霧水、エアロゾル個数、エアロゾル化学成分等である。また、両集中観測の間についても、多数の項目の連続データが取得でき、順次分析を行った。2003年の結果概略を述べる。5月末にCO、エアロゾル個数、BCの大幅な濃度上昇が同時に観測され、シベリア森林火災のプリュームの輸送が明瞭に捉えられた。自然大気中に存在する硫黄化合物中で、最も高濃度で滞留時間が長く安定な硫化カルボニル(COS)を太郎坊と山頂で観測した。その結果、山頂の方が太郎坊よりも高濃度であることが示された。SO_2の濃度は、ほぼ通年で観測が出来た結果、冬に高く、夏に低いパターンであること、さらに、冬には大陸から低気圧の通過に伴って、長距離輸送事象が発生することがわかった。この輸送に際しては、SO_2,CO,^<222>Rnが共に輸送される例が多く、共通する発生領域から由来することが示唆された。三宅島からのSO_2プリュームが捉えられたのは一度だけで、本州南岸で対流活動があり、かつ南東風がある場合以外には、富士山の高度まで到達しないことがわかった。これは、三宅の噴煙の到達高度が1kmほどしかないためと考えられる。^7Be濃度は春と秋に極大、夏に極小を取ることがわかった。大気上層部からの気塊輸送の季節変動を反映していると考えられた。
心臓冠状動脈形成におけるメルトリンβ/ADAM19の機能解析

ADAM (adisintegrin and metalloprotease)ファミリーはメタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメインをもつ膜貫通型糖タンパク質で、様々な膜係留型タンパク、成長因子、細胞内シグナル分子、接着因子の細胞外ドメインシェディング(切断)をすると考えられている。受精、神経発生、血管新生、心発生そしてガンを含む様々な生物学的過程で重要な役割を担っている。ADAMファミリーの1つであるメルトリンβ/ADAM19を欠損するマウスでは心室中隔欠損と弁形成の異常を示す。心内膜細胞ではなく神経堤細胞で発現するメルトリンβは心室中隔と弁形成に重要であることがわかった。メルトリンβを欠損した神経堤細胞は正常に移動するが、心流出路の近位の左右クッション組織の癒合ができず、流出路と房室クッション組織の集合による心室中隔膜様部欠損を生じた。メルトリンβ欠損マウス心臓ではさらに冠状動脈の瘤、蛇行、異常起始がみられ、心室中隔内に大きく流れ込んだ後心室内に直接開口するcoronaryarteriovenous fistulaを形成していた。心室中隔内ではあたかももう一つの心室を形成するかのように大きなマスが形成されていた。この中隔枝の血流は収縮期に逆流波形を示すことが心エコーによってとらえることができた。メタロプロテアーゼ酵素の一つであるメルトリンβ/ADAM19は様々な膜分子をシェディングすることでその分子を活性化する酵素である。心臓では弁形態形成に関わる因子の一つとして考えられている。弁形態形成は上皮-間葉細胞転換により心内膜床が分厚くなり、次に出生直前までにその心内膜床は薄くなるリモデリングという2段階で成立することが考えられている。この過程ではいろいろな因子が関わることが判明しているが、メルトリンβは上皮-間葉細胞転換に関わるErbBのリガンドであるNeuregulinの分解制御に必要な酵素と考えられている。このメルトリンβを欠損させたマウスでは冠状動脈の異常が予想されたため、心エコー検査を実施した。冠血流を検査するには心拍数を遅くする必要があるため麻酔薬としてケタミンと鎮静剤としてキシラジンを併用腹腔投与して検査を行った。野生型の冠動脈中隔枝は右開口部から起始するが、本マウスの中隔枝は右側よりも左側から起始するものが多く認められた。さらに本マウスの冠動脈中隔枝は拡張し瘤状になっており、心室中隔内であたかももう一つの心室を形成するかのような大きなマスを形成し、その後血液は右心室に流れ込む瘻を形成していた。この中隔枝の血流は収縮期に逆流波形を示すことが判明した。メルトリンβ(ADAM19)はADAM (a disintegrin and metalloprotease)ファミリーに属する膜貫通型糖蛋白質である。このファミリー蛋白質は、ディスインテグリンドメインとメタロプロテアーゼドメインを持つので、細胞接着機能と蛋白質分解機能の両方を有すると考えられており、受精、筋発生、神経発生といった細胞間および細胞-マトリックス相互作用に関わる様々な生物学上の過程に関係している。心臓発生過程でメルトリンα(ADAM12)、メルトリンβ、メルトリンγ(ADAM9)、ADAM15、TACE (ADAM17)の発現はあるが、ADAM17、メルトリンβノックアウトマウスに心臓の房室弁異常が報告され、またADAM17とメルトリンβ、メルトリンγとメルトリンβのダブルノックアウトマウスでは単独のノックアウトマウスよりも心形態異常が報告されている(Dev Biol2005:283:459-471)。メルトリンβ欠損マウスでは心室中隔膜様部欠損と弁形成異常が認められる。この異常が心臓神経堤由来細胞によるのか、内皮細胞由来によるのかを検討した。心臓神経堤特異的発現するPO-Creマウスと内皮特異的発現するTie2-Creマウスを使って、メルトリンβ欠損マウスを検討した。心臓神経堤細胞のメルトリンβ欠損がこれら異常を引き起こすことが判明した。

さらに、この欠損マウスでは心臓流出路の近位にある左右クッションが癒合しないために、房室心内膜床クッション組織の発達が遅れて膜様部心室中隔が形成されないことが明らかとなった。このことは心臓形態形成メカニズムを知る上で重要な知見である。
炭化水素ガスハイドレートにおける内包ガス分子観測への挑戦

炭化水素ハイドレートの結晶構造に関して、低温における粉末中性子回折により研究を行った。クラスレートハイドレートに特化した冷凍機の設計整備を行った。この冷凍機では液体窒素を用いることで100K程度の低温で試料をセットでき、さらに試料位置で10K程度の低温まで下げられることに成功した。この冷凍機を用いて、メタンハイドレート及びメタンと二酸化炭素混合ガスハイドレート、エタンハイドレート、プロパンハイドレートの4試料に対して、中性子線を用いた測定を行い、結晶構造の違いについて明らかにした。本年度はメタンハイドレートとメタン二酸化炭素混合ガスハイドレートに関して試料合成を行い、分解後のガス放出量により、試料の合成状況を検討した。その後、冷凍機の整備を行い、10K程度の低温まで下げられることに成功した。この冷凍機を用いて、メタンハイドレート及びメタンと二酸化炭素混合ガスハイドレートの2試料に対して、中性子線を用いた測定を行った。結果としてメタンハイドレートと混合ガスハイドレートの粉末中性子回折パターンを比較すると、ピークの強度比が明らかに違うことが分かった。このことは結晶内部の構造に違いがあることを意味しており、メタンハイドレートと混合ガスハイドレートの構造の違いをとらえることに成功した。この回折パターンをさらにリートベルト法を用いた構造解析を行ったところ、メタンハイドレートに関しては、以前、我々が単色中性子線を用いた角度分散型粉末中性子回折装置で得られた構造モデルとよく一致していることが分かり、ホワイトビームを使用している飛行時間型粉末中性子回折装置でもほぼ同じ結果が得られることが確認できた。メタンと二酸化炭素混合ガスハイドレートに関しては、混合ガスハイドレートとドライアイスと氷とバナジウムセルの4相に分かれていることがこれまでに判明している。現状の結果としては、混合ガスハイドレートではある特定のカゴにはガス分子があまり内包されていない可能性があることが新たに分かった。さらに詳細な構造解析を進め検討を進めている状況である。この結果はガスハイドレート中に内包されたガス分子が受ける相互作用を知る上で、重要な結果となる可能性がある。本年度はメタンと二酸化炭素の混合ガスハイドレートの構造解析を行った結果、混合ガスハイドレート、ドライアイス、氷Ih、氷Ic、バナジウムセルの5相に分かれていることがリートベルト解析により明らかになった。さらに混合ガスハイドレートのスモールケージにはゲスト分子がほぼ存在せず、ラージケージにのみメタンと二酸化炭素の混合ガスが存在していることが明らかになった。ただし、存在する割合が、仕込みの混合ガス比がメタン7割、二酸化炭素3割であるのに対して、解析結果ではほぼ半々になっていることから、合成時の温度調整等により、選択的に二酸化炭素が多く混入してしまったのではないかと考えられる。スモールケージから選択的にゲスト分子が抜けることはこれまでにも報告されていたが、構造としてとらえたのは初と考えられる。結晶学会および中性子科学会にて研究成果の発表を行った。本年度はさらにエタンハイドレートおよびプロパンハイドレートの合成に成功し、飛行時間型粉末中性子回折装置を用いて、回折パターンを得ることに成功した。現状の大まかな解析結果では、両方とも単相で、従来から報告されている構造から期待されるピークの反射位置と一致していることが確認できており、さらに内包されているゲスト分子の詳細な原子座標を明らかにするよう解析を行っている。今回得られた回折パターンはきれいな単相のデータであることから、炭化水素ガスハイドレートの内包されたゲスト分子の様子を明らかにする上で、基礎となる重要なデータを得ることができたと考えられる。粉末中性子回折は空間および時間の平均としてとらえることができ、ガスハイドレートにおけるゲスト分子の様子または混合ガスの割合を分析する上で、有効な手段であることが証明できるのではないかと我々は期待している。