hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
障がい児者の家族成員の個と関係性のアイデンティティ様態に関する研究

計画通り、平成29年度は、前年度の面接調査で不明な点を中心に、再度、聞き取りを行い、作成したTEM図を調査協力者に確認・修正してもらい完成させることができた。また、質問紙調査を継続し、質的な視点から「個と関係性のアイデンティティ」を明らかにするために分析を行った。本研究は、障がい児者を家族にもって生きるということが、家族成員にとってどのような経験であり、どのような意味をもつのかについて、家族成員間の相互の影響に着目し、個と関係性のアイデンティティの視点から明らかにすることが目的である。平成30年度は、前年度の面接調査で不明な点を中心に聞き取り、作成したTEM図を調査協力者に確認・修正してもらい完成させるために、質問紙調査を継続し、分析を行った。また、前年度の質問紙調査の結果と面接調査で得られた結果の比較を行った。具体的には、前年度の質問紙調査の結果と平成27年度・28年度の面接調査で得られた結果と比較を行い、障がい児者家族であることの個と関係性のアイデンティティ様態について考察をした。障がい児者の家族の個と関係性の明らかにするために、TEM分析を行い、それについては当初の計画通り完了した。しかし、TEM分析をより発展させたTEA分析(複線径路等至性アプローチ,TEMはTEAの分析の一部)を用いて分析した方が、目的をより精緻に明らかにできる。TEAでは、本人の経験における分岐点での自己を記述するのが特徴であり、研究協力者に再度確認する必要がある。追加で面接とTEA分析を行うため、延長を希望し承認された。さらに、得られた成果は、書籍として出版予定であり、広く社会に還元する予定である。その実績を以下に記す。・共同研究者との打ち合わせを4回行った。・研究分担者との打ち合わせを5回行った。・面接調査を行った母親、きょうだいと、原稿の打ち合わせを8回行った。計画通り、平成30年度は、前年度の面接調査で不明な点を中心に、再度、聞き取りを行い、作成したTEM図を調査協力者に確認・修正してもらい完成させることができた。また、質問紙調査を継続し、質的な視点から「個と関係性のアイデンティティ」を明らかにするために分析を行い、前年度の質問紙調査の結果と面接調査で得られた結果の比較を行った。平成27年度の面接調査で不明な点を中心に聞き取り、作成したTEM図を調査協力者に確認・修正してもらい完成させる。その図をもとに家族間での相互作用について解明する。また量的アプローチとして、質問紙調査の準備を開始し、実施する。平成28年度の面接調査で不明な点を中心に聞き取り、音声データを文字化した原稿を調査協力者に確認・修正してもらい完成させる。平成28度中にTEM図を作成し、その図を基に家族間での相互作用について解明する予定であったが、面接者である調査協力者の生の声を分析し、インタビュー内容の家族間比較を検討する方が、個と関係性のアイデンティティの視点から明らかにすることが効果的であると考え、平成29年度は、TEM図での分析と量的アプローチである質問紙調査ではなく、面接調査を中心に質的な視点から「個と関係性のアイデンティティ」を明らかにすることを目指す。平成30年度は、前年度の質問紙調査の結果と面接調査で得られた結果と比較を行う。
SVZ神経前駆細胞の増殖を調節する神経回路

成体脳におけるニューロン新生領域のひとつ、脳室下帯(subventricylar zone; VSZ)には、神経幹/前駆細胞が存在するが、その増殖はニューロンの興奮により促進される。本研究から、ニューロンが過剰興奮すると、SVZ近傍の線条体ニューロンに於いてエピジェネティックな遺伝子発現変化が誘発されることが分かった。その結果、SVZ近傍での微小神経回路が改変され、SVZ神経幹/前駆細胞を取り巻く環境が変化するために、細胞増殖亢進につながることが示唆された。本年度はまず、本研究の基盤となる線条体ニューロンの形態変化についての基礎データを得るための条件設定を行った。成獣マウスへのピロカルピン(アセチルコリン受容体作動薬)投与により、重積てんかん発作を効率よく、しかもマウスの死亡率を低く抑えて誘発させる条件設定、更にはニューロンの形態を可視化する方法の条件設定を行った。当初の研究計画では、顕微鏡下で単一ニューロンに蛍光色素(ルシファーイエロー)を注入する方法を計画していた。しかし、遺伝子銃による蛍光色素(DiI)標識微小タングステン粒子を圧縮ヘリウムガスで脳スライスに射出する方法を用いることで、単一ニューロンを迅速かつ簡便に標識する事が可能なため、この手技の条件設定を行った。連携研究者である岡田らによって開発された、ニューロンの興奮性を人為的に改変させるレンチウイルスベクターを用いて、成獣マウス脳室下帯(SVZ)に存在する成体神経幹/前駆細胞の増殖性を変化させる神経回路の存在可能性について検討した。SVZ直近の線条体ニューロンに投射する終脳皮質ニューロンは、成獣ラットでは詳細に報告されているが、マウスでは報告がない。ます、ラットで報告されている終脳皮質ニューロンの存在をマウスで確認する予備実験を行った。微量の蛍光色素(Fluoro-Ruby)を、ラットで報告されている終脳皮質領域に注入した後、1週間後に灌流固定して検討したところ、マウスでもラットとほぼ同様の位置に、SVZ直近ニューロンに入力する終脳皮質ニューロンが存在する事が分かった。現在はこの位置に、上記のレンチウイルスベクター(興奮促進型、または興奮抑制型)を注入し、SVZ神経幹/前駆細胞の反応を解析中である。単一ニューロンの微細形態変化の検討については、研究環境の変更があったために、遺伝子銃を用いたDiI標識法から、より簡便な方法であるゴルジ染色法に変更した。本年度はゴルジ染色の条件設定をおこなった。ゴルジ染色法は、任意のニューロンを可視化することは困難で、本研究計画で標的とするSVZ(脳室下帯)直近ニューロンの可視化には、多くの個体を解析する必要がある。そのため、当初の研究計画よりも多数のマウスに対して重積てんかん誘発処理を行い、解析を行った。これまでのところ、コントロール群と比較して、重積てんかんモデル群におけるSVZ直近ニューロンの微細形態に違いが表れている印象を持っている。SVZ直近ニューロンに投射する、線条体以外のニューロンについて、さらに詳細に検討を行った。昨年度は、終脳皮質からの投射経路に絞って検討したが、本年度は逆行性トレーサーをSVZ直近の線条体に注入することで、この部位に投射する終脳皮質以外のニューロンを網羅的に捉える実験をおこなった。これらの部位に対してニューロンの興奮性を人為的に壊変させるレンチウイルスベクターを注入し、SVZの神経幹/前駆細胞の反応を検討する予定である。一連の実験の過程で、SVZに存在する神経幹/前駆細胞にも遺伝子発現変化と形態変化を誘発している可能性を示唆するデータを得ている。SVZ直近の微細環境の変化が起きていることを裏付けるデータとして注目している。平成27年度は、前年度までに条件設定を終わらせたゴルジ染色によって、SVZ直近ニューロンの形態学的な解析を行った。コントロールマウスと、重積てんかん(Status Epilepticus; SE)発作を誘発させたマウス(SEマウス)の間でのニューロン形態の変化(樹状突起の分岐状態、棘突起の数や形態)を解析した。前年度までの印象として、棘突起の数などが、SEマウスで減少している印象であったが、個体数を増やして解析したところ、有意差が検出できなかった。大脳皮質からSVZに投射する投射経路の探索として、内側前頭前野に順行性トレーサーを注入した結果、過去の文献通り側脳室直近の線条体までは投射することが分かったが、コントロールマウスでもSEマウスでもSVZ内にまで侵入する現象は検出されなかった。研究期間を通しておこなった解析では、上記の通り、SEマウスにおける大きな神経回路の改変、およびSVZ直近ニューロンの形態変化を検出することはできなかった。この結果は予想外であったが、本研究を通じて新たな発見があった。近年、SVZに存在する神経前駆細胞の増殖調節には、周囲のニューロンから放出される各種神経伝達物質が重要であることが、海外研究グループによって明らかにされている。そこで、本研究で用いたSEマウスにおいて、ある神経伝達物質の合成に関与する酵素の活性が、ごく少数のSVZ直近ニューロンにおいて有為に低下していることを突き止めた。このような変化を示すニューロンの数は非常に少ないため、ゴルジ染色ではこれらのニューロンの形態変化をとらえることができなかったと考えられる。本研究を通じて確立した、単一細胞内への色素注入技術により、これらのニューロンの形態学的解析を行うことが重要である。

成体脳におけるニューロン新生領域のひとつ、脳室下帯(subventricylar zone; VSZ)には、神経幹/前駆細胞が存在するが、その増殖はニューロンの興奮により促進される。本研究から、ニューロンが過剰興奮すると、SVZ近傍の線条体ニューロンに於いてエピジェネティックな遺伝子発現変化が誘発されることが分かった。その結果、SVZ近傍での微小神経回路が改変され、SVZ神経幹/前駆細胞を取り巻く環境が変化するために、細胞増殖亢進につながることが示唆された。昨年度は所属研究機関の異動があったために、研究環境に大きな変化があった。そのため一部の実験手技・条件を再度検討する必要に迫られた。例えば、遺伝子銃を用いた単一ニューロンの可視化については、新所属機関では実施困難なため、ニューロンの微細構造の検討はゴルジ染色に変更する点などである。神経解剖学重積てんかんモデルマウスを使用し、ゴルジ染色を施して、SVZ直近ニューロンの微細形態の変化を検討してゆく。特に、薬剤による発作誘発後の微細形態の経時的変化に注目する。樹状突起の数、棘突起の数などについて、コントロールマウス群と比較して統計学的処理を行う必要があるので、解析個体数を増やしてゆく方針である。SVZ直近の線条体ニューロンへの複数の投射経路について、個別に解析をおこなう予定である。これまでに得られた結果の裏付けデータの取得をすることで、科学的に信頼のおける成果を目指す。重積てんかんモデルマウスにおける線条体ニューロンの微細構造の変化を検討する点については、顕微鏡下で単一ニューロンへ蛍光色素を個別に注入するよりも、より効率的な方法の条件設定を修了した。今後はデータ取得の段階に進むことができる。レンチウイルスベクター注入によるニューロン興奮性変化の実験については、ラットで報告されている神経回路がマウスでも存在する事が必須の条件である。本年度はこの点を確認する事が出来たので、確実に次の段階へ進むことができる。研究手技の見直し・変更により、研究経費を削減することができた。平成26年4月1日をもって、研究代表者が所属研究機関を異動したため、研究環境に大きな変化が生じた。旧所属で行っていた実験装置のほとんどが、新所属の実験室に配置可能であるが、実験室立ち上げに若干の時間がかかると予想される。当面は、一部の実験を旧所属で行うなど、旧所属との連携を取って研究を遂行する必要がある。繰越金を使用することによって、実験動物数を増やし、統計学的に信頼性の高いデータを取得する。また、より多くの種類の一次抗体を購入することで、詳細な細胞マーカー発現を検討して、これまで取得したデータの裏付けデータを取得する。また、連携研究者が異動したことに伴い、打ち合わせのための旅費にも使用する。研究代表者の旧所属に設置済みの機器を使用するための旅費にも使用する。本年度は、各種実験の条件設定を行った。条件設定に、多くの実験動物、試薬を使用する予定であったが、短期間で条件設定を終わらせることができたため、繰越金が発生した。また、研究手技の見直し・変更により、研究経費を削減する事が出来たことも大きい。繰越金を使用する事によって、実験動物数を増やし、統計学的に信頼性の高いデータを取得する。
ポリグルタミン病の変性蛋白質核内移行制御および消去因子の解析

神経回路網形成の反発因子セマフォリンのシグナル伝達に関与する蛋白質CRMPの結合蛋白質として新規の神経特異的核内GTPase蛋白質(CRAGと命名)を同定した。CRAGは神経回路形成機構のみならず、ポリグルタミン病を引き起こす病原性蛋白質の核内移行に関連していることが示唆されたので、解析を行った。(結果)CRAGは様々なストレスにより発生する活性酸素種に応答して、核内に移行して独特の核内封入体を形成することが示された。ポリグルタミン病との関連を調べた結果、CRAGはポリグルタミン変性蛋白質により生じる小胞体ストレスに伴って発生する活性酸素種に応答して活性化することが示された。また、CRAGは結合するシャペロン分子を介してポリグルタミン変性蛋白質を認識し、核移行シグナルを介してポリグルタミン変性蛋白質の核内移行を促進した。さらにCRAGは核内封入体を形成しGTPase活性を用いて、ユビキチン化を誘導し、プロテアソーム系による分解機構に関与していることなどが示された。実際に、Machado-Joseph病患者脳においてCRAGの異常集積が見いだされている。以上の結果より、CRAGはポリグルタミン病の変性蛋白質核内移行制御因子および消去因子である可能性が強く示唆された。
オーレオクロムが関与する褐藻の光反応の解明

褐藻のオーレオクロムの標的反応を解明するために、培養が容易で生活環が速く回転する、小型で単純な体制をもつ褐藻を探索した.ハロプテリス、シオミドロ、アミジグサ、およびヤハズグサを約15°Cに保ったPESI培養液で培養し、種々強度、方向から青色光と赤色光で培養した.いずれの褐藻も、青色光では白色光と同じ成長を示したが、赤色光単独では、1ー2週間で枯死した.青色光に赤色光を1:1で混在させても、成育に青色光単独と有意差はなかった.この結果は生存には青色光が必要不可欠なことを示すが、有性生殖や光形態形成、また、光屈性や背腹性誘導などの光方向依存性反応は発見できなかった.さらなる研究が必要である.昨年まで研究に用いてきた褐藻ハロプテリス(Halopteris)は赤色光単独では枯死し,青色光単独では白色光と変わらない成長が維持されることを確認した。しかし,ハロプテリスは細胞列が一次元に成長するものの,藻体が半球状,または球状になるため,培養中に細胞の形態を観察することは不可能であった。また,上からの光においても球状となることは顕著な光屈性も示さないことを示唆する。そこで,神戸大学の系統保存施設から新に海産褐藻のシオミドロ(Ectocarpus)を入手し,青色光反応の予備的探索と十分量の藻体を得るための培養を開始した。入手した株は,最近,日本の研究者も参加しての国際的プロジェクトによってゲノム情報が解明され,公開されたと同一のEctocarpus siliculosus (Dilwyn) Lyngbyeの雄の配偶体である。この株には,4種のオーレオクロム遺伝子が存在している。まず,3ヶ月間,14°C,連続白色光下で育てたEctocarpusを細切りし,6cmペトリ皿に移し,連続光で育てたところ,やはり赤色光単独では成長しなかった。次いで,2台の赤/青混合LED昭明装置(CCS社ISC 201-2)を用いて,長日条件(14L - 10D)で育てた。青色光単独(40-80 umole/m2/s1)と,総光強度を等しくした赤/青混合光{青色光(30-40 umole/m2/s1)+赤色光(40-60 umole/m2/s1)}で育てた所,青色光と赤/青混合光での成長にほとんど差は無かった。現在,他の条件は同一に保ち,明暗周期だけを短日(8L - 16D)に変えて成長を観察中である。また,同一株の雌配偶体の培養も開始した。褐藻のオーレオクロムの標的反応を解明するために、培養が容易で生活環が速く回転する、小型で単純な体制をもつ褐藻を探索した.ハロプテリス、シオミドロ、アミジグサ、およびヤハズグサを約15°Cに保ったPESI培養液で培養し、種々強度、方向から青色光と赤色光で培養した.いずれの褐藻も、青色光では白色光と同じ成長を示したが、赤色光単独では、1ー2週間で枯死した.青色光に赤色光を1:1で混在させても、成育に青色光単独と有意差はなかった.この結果は生存には青色光が必要不可欠なことを示すが、有性生殖や光形態形成、また、光屈性や背腹性誘導などの光方向依存性反応は発見できなかった.さらなる研究が必要である.研究材料とした褐藻ハロプテリス(Halopteris)の成長は青色光(LED,460 nm, 14時間明・10時間暗)によって維持されるが,赤色光(LED, 660 nm)では,維持されず,数週間で枯死する.青色光の下で成長した藻体の形態は白色光下で成長したものとなんら変わらないので,深海での本褐藻の成長と繁殖は,海底に届くであろう青色光のみで行われていると想定できる.そこで,光の方向により細胞分裂面の向きが制御されている可能性を調べようとしたが,この藻は基質に定着したハプテラから半球状にきわめて緩慢に成長しつつ,分岐した枝を伸ばすので,短時間内の光の効果を捉えるのは,不可能であった.インキュベータ内の直径6cmのペトリ皿中で,一次元的,あるいは2時限的に成長し,その成長速度も数時間で検出可能な褐藻を探索し,シオミドロ(Ectocarpus)に注目した.シオミドロは,最近そのゲノム情報が国際的プロジェクトとして公開された.そのゲノムにはBLAST検索により,我々がはじめて発見同定した青色光受容体AUREOCHROMEを保存していることも確認した.シオミドロの藻体は数cmで成熟し生殖するので,光形態形成反応が見つかれば,解析可能であろう.多くの研究者がゲノム解析に参加しているのは不利ではあるものの,形態異常や成長の早い株の情報がいち早く入手できるかも知れない.そこで,神戸大学の系統保存施設KURCISから,ゲノム解析に用いられた物と同一の株を入手し,Halopterisと平行的に培養を開始した.しかし,現在までのところ,光強度や波長を種々に変えた条件で比較実験をするに十分な量の藻体は得られていない.研究代表者らが2007年に黄色植物(Ochrophyta)に共通に保存されている青色光受容体オーレオクロム(AUREOCHROME)を世界に先駆けて発見同定した.オーレオクロムは青色光を吸収すると標的遺伝子に結合し、その発現を制御する分子スイッチであることを明らかにしてきた.

しかし、オーレオクロムを発見したフシナシミドロは多核細胞であるため、遺伝子改変を用いた手法が使えない難点がある.同じ黄色植物であるケイ藻や褐藻は単核細胞でできており、ゲノム構造も明らかになりつつある.ただ、多くの褐藻は大型で、室内培養が困難であるため、生理学が非常に遅れている.そこで、褐藻のオーレオクロムの標的反応を解明するために、培養が容易で生活環が速く回転する、小型で単純な体制をもつ褐藻を神戸大学の系統保存施設(KURSIS)で継代培養されている株から探索し入手した.ハロプテリス(Halopteris congesta)、シオミドロ( Ectocarpus siliculosus)、アミジグサ(Dictyota dichotoma)、およびヤハズグサ(Dictyopteris latiuscula )をPESI培養液中で、約15°Cに保った培養庫で培養し、種々強度、明暗周期、照射方向から青色光と赤色光で培養した.いずれの褐藻も、青色光では白色光と同じ成長を示したが、赤色光単独では遅くても2-3週間で枯死した.青色光に赤色光を1:1で混在させても、成育に青色光単独と有意な差はなかった.この結果は成育や生存には青色光が必要不可欠なことを示し、オーレオクロムの関与を強く示唆するが、本研究期間、実験条件下では、有性生殖や光形態形成、または、光屈性や背腹性誘導などの光方向依存性反応は発見できなかった.さらなる研究が必要である.光生物学、植物生理学成長が予想以上に遅いことが問題である。その原因の一つに培養液の海水の違いがあるかもしれない。現在培養に用いている海水は宮城県七ヶ浜沖で10年近く前に採取したものである。以前ヒバマタ(Fucus)を用いた実験との連続性を重視したかったからである。しかし,神戸大学から入手したEctocarpusは数ヶ月ごとに淡路島で採取した海水を用いているという。成長の遅滞には,もちろん,季節変動や,光条件など環境の違いが影響している可能性も無視できない。神戸大学の研究者に問い合わせると,有性生殖能,栄養生殖能とも,2-4月が最大とのことだが,その理由は未解明だという。海水の採取地,保存期間の長さを変える必要があるかもしれない。また,狭い培養スペースや装置が限られているため,日長処理を種々に変えた培養を同時に行うことはできないなどの制限を凌駕する実験系を確立する必要がある。研究材料としてきた褐藻ハロプテリス(Halopteris)の成長が青色光により促進することは確認したが,その成長速度が極めて遅く,しかも,成長に伴い藻体が分岐しながら半球形になるため,青色光の入射方向と細胞分裂,並びに,光屈性の有無を調べる当初の研究計画には不適な材料であることがわかった.そこで,別途,同じく海産褐藻のシオミドロ(Ectocarpus)の光形態形成の解析を始めた.シオミドロは最近ゲノム情報が公開され,多くの研究者が参加しているという不利な点はあるものの,最新情報が入手できる利点がある.光強度と波長を数種類に変えた条件でその成長と形態形成を解析するためには,比較的多量の材料を用意する必要があるが,現在まだ必要量に達していない.共同研究者との提携を模索している.4月から5月にかけて,宮城県奥松島海岸から新しく海水を採取し,新旧の両海水で,成育特性の違いを調べる予定である。2014年3月末に神戸で開催されたEctocarpus国際会議に参加し,Ectocarpus研究の大家D. Mueller博士や,A. Peter博士たちからEctocarpusの生活史やゲノム解析に関する有益な情報を得た。これらの情報を今後の研究に活用したい。
小胞体・ミトコンドリア膜間領域の破綻に基づくALS病態の統合的理解

本年度は、昨年度の研究において樹立した小胞体・ミトコンドリア膜間領域(MAM)の破綻を可視化・定量化する培養細胞系(Nuro2a + pMAMtracker-Luc/Green)を用いて、家族性ALS原因遺伝子におけるMAMへの影響を検討した。その結果、検討した20種類の家族性ALS原因遺伝子のうち、半数をこえる12種類(TDP-43, TUBA4Aなど)でMAMの減少が認められ、7種類では変わらず、残り3種類では逆にMAMの増強が見られた。興味深いことに、MAMの増加が見られたALS原因遺伝子ではいずれも機能喪失(loss-of-function)による発症機序が想定されており、全体の3/4で病態におけるMAMの破綻が関与していることが考えられ、以上のことから、MAMの破綻はALSにおいて広く共通した病態である可能性が示唆された。特に、FUS、MATR3、VCPの各遺伝子については、野生型は正常なMAMの形成能を示す一方で、ALSを引き起こす変異体では特異的にMAMの減少が見られた。従って、これらの遺伝子においては、より直接的にMAMの破綻が病態と結びついている可能性が高いと考えられた。また、σ1受容体に人工改変ペルオキシダーゼ(APEX2)を融合して発現する系を構築し、これを用いてMAM近傍に局在する分子を特異的かつ網羅的に標識することが可能であることを確認した。次年度は、上記で同定された各ALS原因遺伝子がどのような分子機序でMAMの破綻を引き起こすのかを明らかにするため、この系を用いてMAMの破綻に関与する候補分子の同定を目指す計画である。本年度は研究計画にあったとおり、樹立したMAM破綻の定量化および可視化の系とALS原因遺伝子発現ライブラリーを用いて、MAMの破綻が多くのALS原因遺伝子で共通して引き起こされることを明らかに出来た。さらに、σ1受容体とAPEX2との融合タンパク質の発現系および、それを用いたMAMタンパク質の網羅的標識の系を樹立することによって、MAMの破綻に関与する候補分子同定のための準備を完了することができた。従って、概ね順調に進展しているものと考えられる。引き続き、MAM破綻の分子機序解明に向けて解析を進める計画である。本年度は、さきに樹立したMAMに局在する分子の網羅的な標識の系を用いて、質量分析法によりMAMに局在してMAM破綻に関与すると考えられる候補分子の同定を目指す。候補分子が絞り込めた後、siRNAを用いたノックダウンとMAM破綻のスクリーニング系を組み合わせて、候補分子の中で実際にMAMの構造維持に重要な分子を明らかにする。また、ALS原因遺伝子には過剰発現によってMAMを増強する分子が存在することが明らかとなった。本年度は当初の研究計画に従い、筋萎縮性側索硬化症(ALS)における小胞体・ミトコンドリア膜間領域(MAM)の破綻を細胞モデルで実証する実験系を樹立するため、ストレスや原因遺伝子の発現に応じたMAMの状態変化を可視化する方法の構築を行った。分割GFPなどを用いた既存の系においては、その結合の強さから人為的なMAMの架橋が生じてしまう恐れを考え、Alfordらによって開発された二量体化依存性緑色蛍光タンパク質(ddGFP, Kd=0.01mM)を利用し、MAM特異的に蛍光を生じるddGFP発現用コンストラクトを作製した。これをHeLa細胞やNeuro2a細胞に導入し、予想された細胞内局在を示すこと、および我々がMAMを破綻させることを報告している、変異SOD1の発現やSigmar1遺伝子のノックダウンによって蛍光輝度が低下することを確認した。また、このコンストラクトによるGFP蛍光輝度は飢餓ストレス下では上昇し、逆に富栄養下に戻すことで低下した。これは、既に報告されているMAMの飢餓ストレス依存的な形成とよく一致している。従って、本コンストラクトによるMAMの検出は可逆的かつストレス依存的であることが確認できた。ほとんどの導入細胞で、ミトコンドリアの形態は非導入細胞と比較して大きく変化しておらず、人為的なMAMの架橋の影響が生じていないと考えられた。以上のことから、哺乳動物細胞を用いてALS病態におけるMAM破綻を検証する系が構築できたと考えられる。また、今年度は同時にALS原因遺伝子のクローニングを行い、哺乳動物細胞での発現ライブラリーを構築したので、今後、これらを組み合わせて更なる検証を進める予定である。本年度は研究計画にあったとおり、実験系の構築と今後の検証に必要な発現ライブラリーの準備が完了した。従って、概ね計画通りに順調に進展していると考えられる。今回、樹立した系を用いれば、簡便にMAMの破綻状態を推定することが可能となり、今まで半日近くかかっていたMAMの生化学的単離からリアルタイムでMAMの状態を観察できると期待される。

興味深いことに、MAMの増加が見られたALS原因遺伝子ではいずれも機能喪失(loss-of-function)による発症機序が想定されており、全体の3/4で病態におけるMAMの破綻が関与していることが考えられ、以上のことから、MAMの破綻はALSにおいて広く共通した病態である可能性が示唆された。特に、FUS、MATR3、VCPの各遺伝子については、野生型は正常なMAMの形成能を示す一方で、ALSを引き起こす変異体では特異的にMAMの減少が見られた。従って、これらの遺伝子においては、より直接的にMAMの破綻が病態と結びついている可能性が高いと考えられた。また、σ1受容体に人工改変ペルオキシダーゼ(APEX2)を融合して発現する系を構築し、これを用いてMAM近傍に局在する分子を特異的かつ網羅的に標識することが可能であることを確認した。次年度は、上記で同定された各ALS原因遺伝子がどのような分子機序でMAMの破綻を引き起こすのかを明らかにするため、この系を用いてMAMの破綻に関与する候補分子の同定を目指す計画である。本年度は研究計画にあったとおり、樹立したMAM破綻の定量化および可視化の系とALS原因遺伝子発現ライブラリーを用いて、MAMの破綻が多くのALS原因遺伝子で共通して引き起こされることを明らかに出来た。さらに、σ1受容体とAPEX2との融合タンパク質の発現系および、それを用いたMAMタンパク質の網羅的標識の系を樹立することによって、MAMの破綻に関与する候補分子同定のための準備を完了することができた。従って、概ね順調に進展しているものと考えられる。引き続き、MAM破綻の分子機序解明に向けて解析を進める計画である。今年度は、ALS原因遺伝子のクローニングにより構築した哺乳動物細胞での発現ライブラリーを組み合わせて、MAM破綻が実際に幅広いALSで共通した病態基盤であるか検証する予定である。なお、今回樹立した系では、検出自体は可能な一方で蛍光輝度が通常のGFPよりも弱いため、分割GFPを用いた系と比較して感度や定量性が低下することが危惧された。人為的なMAMの架橋の恐れを回避しつつ、感度を向上させるため、本年度は並行してddGFPの代わりに分割ルシフェラーゼ(Kd=0.1mM)を用いて検出を行う、発光バージョンへの改良を併せて行う予定である。本年度は、さきに樹立したMAMに局在する分子の網羅的な標識の系を用いて、質量分析法によりMAMに局在してMAM破綻に関与すると考えられる候補分子の同定を目指す。候補分子が絞り込めた後、siRNAを用いたノックダウンとMAM破綻のスクリーニング系を組み合わせて、候補分子の中で実際にMAMの構造維持に重要な分子を明らかにする。また、ALS原因遺伝子には過剰発現によってMAMを増強する分子が存在することが明らかとなった。
複数の異質エリアを同時考慮した連続距離空間都市モデルによる最適都市政策設計

<分析1>伝統的なAlonso(1964)の都市モデルと食物連鎖の生物が生息する生態系エリアを統合したUrban-ecosystem modelを構築している.このモデルの定性分析に加えて,定量分析を行っている.データとしては,アメリカのデータを用いた.<分析2>は、Kono and Kawaguchi (2017)に自動車関連税を導入して、鉄道も考慮したモデルを構築した.本研究では,Buyukeren and Hiramatsu (2016)の2ゾーンと異なり,連続空間で検証している.その結果、連続都市モデルでも、彼らと同様に拡大すべきケースを得て,その条件も導出した.定量分析も行っている.また,異なり仙台都市圏を対象とした分析も進めている.計画調書のスケジュールで計画は進んでいる.<分析1>と<分析2>ともに,CGEモデル構築・分析を進める.特に詳細データの入手が必要である.<分析1>については生態系データが膨大である.これは山形(国立環境研究所)と大学院生で整理を行う.<分析2>については,道路ネットワークが大規模データである.仙台市の道路ネットワークについては財)計量計画研究所の協力を得て入手済みである.<分析1>伝統的なAlonso(1964)の都市モデルと食物連鎖の生物が生息する生態系エリアを統合したUrban-ecosystem modelを構築した。このモデルを用いて、距離に依存した市場の失敗を分析した。その結果、面積のみを考慮していたEichner and Pethig(2006, JEEM)とは異なり、都市拡大が最適になるケースも存在するという結論を得ている。また、その条件の導出も行っている。この違いの原因は、彼らの研究では面積のみから発生する外部性のみ考慮可能であるためである。現実の都市では本研究のように地点別に異なる外部性となるため、本研究の成果は有効である。今後は、この構築したモデルを用いて、土地利用規制研究を行う。<分析2>は、Kono and Kawaguchi (2017)に自動車関連税を導入して、鉄道も考慮したモデルを構築した。また、土地利用規制のないケースの分析も行った。鉄道と自動車の両手段を都市空間で考慮する研究はほとんどなく、土地利用研究ではBuyukerenand Hiramatsu (2016)の2ゾーンで構成される都市モデルに限られる。彼らは、鉄道の追加的考慮により都市境界規制を拡大すべき場合がある、すなわちコンパクトシティ化が間違いという興味深い結論を導出している。本研究は、彼らの結論を連続空間で検証した。その結果、連続都市モデルでも、彼らと同様に拡大すべきケースを得た。また、その条件も導出した。実際の都市は連続空間であるため、本研究の結論は有用である。現在まで、計画書に示した通り、順調に分析が進んでいる<分析1>伝統的なAlonso(1964)の都市モデルと食物連鎖の生物が生息する生態系エリアを統合したUrban-ecosystem modelを構築している.このモデルの定性分析に加えて,定量分析を行っている.データとしては,アメリカのデータを用いた.<分析2>は、Kono and Kawaguchi (2017)に自動車関連税を導入して、鉄道も考慮したモデルを構築した.本研究では,Buyukeren and Hiramatsu (2016)の2ゾーンと異なり,連続空間で検証している.その結果、連続都市モデルでも、彼らと同様に拡大すべきケースを得て,その条件も導出した.定量分析も行っている.また,異なり仙台都市圏を対象とした分析も進めている.計画調書のスケジュールで計画は進んでいる.【平成30年度】<分析1>、<分析2>ともに、理論モデルをもとに数値計算分析を行う。定量分析は数値解析である。数値解析は、仙台市をイメージした都市を対象とする。すなわち所得、都市規模、家計項目別支出構成等を仙台市に合わせる。なお、数値計算の結果と理論分析結果を比較検討し、必要に応じて理論分析を追加や見直しをする。理論(理論解析および数値解析)の論文を両新展開とも(つまり2論文)完成させる。【平成31年度】<分析1>、<分析2>ともに、CGEモデル構築・分析を始める。特に詳細データの入手が必要である。<分析1>については生態系データが膨大である。これは山形(国立環境研究所)と大学院生で整理を行う。<分析2>については、道路ネットワークが大規模データである。仙台市の道路ネットワークについては財)計量計画研究所の協力を得て入手済みである。大規模CGE分析では、均衡解が得られるかどうかがポイントとなる。現在のところ確定効用で空間均衡する解を得る予定であるものの、均衡解を得るのが難しい場合は、効用に確率項を入れて対処する。<分析1>と<分析2>ともに,CGEモデル構築・分析を進める.特に詳細データの入手が必要である.<分析1>については生態系データが膨大である.これは山形(国立環境研究所)と大学院生で整理を行う.<分析2>については,道路ネットワークが大規模データである.仙台市の道路ネットワークについては財)計量計画研究所の協力を得て入手済みである.
高加速度場下の事象地平からの熱輻射探索

高加速度場中を運動する電子(電磁相互作用)およびパートン(強い相互作用)が起こし得る事象地平経由の熱的輻射の探索を試みた。並行して、特に電磁相互作用の場合に、光子・光子散乱過程による背景事象となり得る輻射について考察した。探索については、系統誤差を詰める上で測定環境の問題と直面したが、今後解決すべき問題点を洗い出すことができた。背景事象光の考察においては、副産物として、弱く相互作用する軽い場の介在といった宇宙論的課題が検証し得る側面を含んでいることを見出せた。国際シンポジウムを主催し、これら関連する研究ついて公表した。ホーキング熱輻射は、ブラックホール内外の因果的に切れた事象地平の存在に起因する。一方、加速の要因に関わらず、等加速度系の観測者にとっても、慣性系の真空領域のうち因果的に入り込めない領域が存在する。その結果、加速度系の観測者にとって慣性系の真空が熱浴にみえる。そこで、高強度場がもたらす高加速度により、人工的な事象地平を慣性系時空上に導入することを考える。その際、加速度系にいる観測者が感受する熱浴の効果(ホーキング・アンルー温度)を、慣性系の観測者が実際に検出可能かどうか、その熱輻射の兆候を、電磁相互作用による加速度場、および、強い相互作用による加速度場により探ることを本研究の目的として、21年度は第1に、高強度レーザー電場による電子加速による輻射の兆候を探るべく、産業技術総合研究所(AIST)にて電子加速器運転に伴うノイズ低減のための試験を行った。その結果、ノイズは完全には落とせないが、AISTにて輻射兆候を探ることは不可能ではないことは確認できた。並行して、さらに有意な熱輻射量を得るため、より高強度(高加速度)のレーザーを有するドイツ・マックスプランク研究所において、ミュンヘン大学の研究者らと共同研究を開始した。その具体的なアクティビティーとして、本研究課題の物理的意義を深化させるため、複数回の研究会を高エネルギー加速器研究機構およびミュンヘン大学にて開催し、さらに日本物理学会においてもシンポジウム「高強度レーザーと基礎物理」を企画し、自らも講演した。第2に、強い相互作用による加速度場からの輻射の探索として、核子対あたり200GeVの重心系エネルギーを金原子核衝突で実現し、そのデータ取得を年明けから継続している。これと並行して、現在、解析コードの準備を整えつつある。レーザー場からの輻射探索について:レーザー・電子相互作用により、電子が瞬間的な静止系で感じる加速度が最大になる方向を、慣性系においてローレンツブーストした方向へ輻射される熱輻射の徴候を探るべく、産総研との連携を保ちつつ、22年度はより高強度のレーザーを有するドイツ・マックスプランク量子光学研究所に長期滞在し、ミュンヘン大学の協力研究者らと、実験を実施するための準備を重ねた。しかし、同レーザーシステムの移転計画が急遽浮上し、実験を実施できる見込みが断たれた。その代わり、EU全体としての出資が確定している遥かに高強度のレーザーシステム、Extreme Light Infrastructureへ向けた研究計画をミュンヘン大学の共同研究者らと立案することに専念した。この過程で、レーザーがより高強度になると、熱輻射に加え、さらに未観測の輻射機構が存在すること、また、レーザー・電子相互作用に限らず、レーザー・レーザー相互作用によっても、新種の輻射機構が存在し得ることを見出すこととなった。故に、レーザー場については、より一般的な衝突系で輻射を議論することが、学問の裾野を広げることに繋がるという展望が得られた。強い相互作用(QCD)をする場からの輻射探索について:米国ブルックヘブン国立研究所で実施されている高エネルギー原子核衝突において、パートンが感じる加速度が最大になる方向として、ビーム軸上に出る輻射を探索することを目指して、解析コードの準備を進めた。上記の研究は、QEDおよびQCDという力学の詳細に依らず、高強度場が高加速度場となることが本質である。こういった視点に基づき、国際会議Physics in Intense Field (PIF2010)をKEKにて開催し、そのプログラム編成委員としてQEDおよびQCDの専門家を集め学術交流を深めた。QED場からの熱輻射探索について:これまでに、産業技術総合研究所(AIST)にて、電子・レーザーパルス交差装置を用いて、熱輻射の徴候を検討するためのデータ取得を試みた結果、装置内で生じるバックグランドの水準は遮蔽体の追加によりある程度低減できたが、さらにバックグランドレベルを下げるべく実験を継続する必要があった。しかし、東日本大震災の影響のためAIST内装置の総運転時間が制限され、本実験について23年度内の割り当て時間を確保できなくなった。QCD場からの熱輻射探索について:高エネルギー原子核衝突において、パートンが感じる加速度が最大になる方向として、ビーム軸上に出る熱輻射を探索する。

金・金衝突データを用いて、中心衝突が起こっていることを要求した上で、ビーム軸上に設置された検出器に、熱輻射の徴候があるかどうか調査を試みた。しかし、一回の衝突あたりに複数の衝突事象が混入する事象と、超前方の輻射事象とを分離することは現状の検出器システムでは難しいという判断に至った。さらに、高強度レーザー場中の電子からの輻射をより広く捉えると、電子からの輻射光子とレーザー場中の相互作用に着眼する必要も生じる。その場合、(仮想)光子・光子散乱を議論しなければならなくなる。レーザー場中の光子・光子散乱は、第一にQEDの過程として理解されるが、光子・光子の散乱過程において、暗黒物質や暗黒エネルギー源等になり得る極めて軽い場の崩壊に起因する輻射もあり得る。いずれにしろ、光子・光子の前方散乱においては、レーザー光に含まれない高調波が発生する可能性があるため、これらについて考察を深めた。
中学生のスマートフォン利用の実態調査及び対策についての研究

子どもたちのスマートフォン(以下スマホ)使用調査の結果、その普及が予想以上に早いことがわかった。そこで、今度は、中高生に調査の幅を広げた。2013年7月の兵庫県での1987人の調査では男子生徒の85.0%、女子生徒の87.1%がスマホを所持していた。まず、不所持、ガラケー所持、スマホ所持で生徒の生活習慣等がどう違うか比較した。スマホ所持の生徒なちは「就寝時刻が遅い」「イライラしている」「勉強に自信がない」ことがわかった。特に勉強に自信がないと答える生徒については、その傾向が著しい。「勉強に自信がない」と答えるのは、不所持22.1%、ガラケー所持25.2%に対して、スマホ所持46.4%と有意差があった。広島県、兵庫県、大阪府等の中高生対象のインタビュー調査でこのアンケート結果を提示し、意見を求めると「LINEとパズドラ(パズル&ドラゴンズ)の影響だろう」「寝落ちするまでLINE」「パズドラははまったらなかなかやめられない」等、スマホならではの問題を指摘する声が多かった。さらにガラケー所持とスマホ所持の携帯電話の使用状況の比較を行った。スマホ所持は「SNSでけんかしたことが多い」「ゲームで課金したことが多い」「親に何度も説教されている」「個人情報を拡散された経験が多い」という結果であった。インタビュー調査では、「スマホはいろいろなことが簡単にできるので、課金とかしてしまう」「LINEは簡単に何でも書けたり写真とか動画を簡単にアップしたりすることができるのでトラブルも多い」等の声が聞かれた。今回の研究から、スマホ所持生徒の生活状況が他と比べていい状況ではないことがわかった。さらに機器の活用面でも危険なことがおおいことがわかった。スマホはまだ新しい機器であるので、使い方について啓発が必要であることが指摘できる。特に、子どもたち自身に賢い使い方を考えさせる等の取り組みが急務である。
腸内細菌叢が動脈硬化に及ぼす影響についての大規模疫学研究

本研究は腸内細菌叢と健康・各種疾病・病態との関係を解明することを目的として、腸内細菌叢、上腕足首脈波伝播速度(baPWV)、体脂肪率を測定し、解析を行った。対象は青森県弘前市岩木地区に在住する一般住民約1000人とした。腸内細菌とbaPWVの関係については一定の傾向は認められなかった。腸内細菌と肥満(BMI、体脂肪率)との関係については65歳以上の女性においてBMIが20未満の群がそれ以外の群に比してOCU332 (Lactobacillales)が有意に高値であった。近年、生活習慣病が最大の問題となっており、その多くが動脈硬化の危険因子となっている。最近になり動脈硬化を簡便にかっ客観的に評価する方法としてbaPWV(brachial-ankle pulse wave velocity、以下PWV)が報告されてきている。一方、分子生物学的手法(T-RFLP法、Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)を用いて糞便中における細菌のDNAを識別することで細菌叢の実態を全体的に把握する方法が開発されてきている。本研究では、「岩木健康増進プロジェクト」の一環として青森県の地域住民(弘前市岩木地区)を対象に腸内細菌叢の全体像と動脈硬化の指標としてPWVを測定し、両者の関係を検討することを目的とした。対象は「岩木健康増進プロジェクト」に参加した青森県の地域住民(弘前市岩木地区)全体の、約1000人とした。方法は糞便採取(約5g):(1)便中の種々の腸内細菌から特定のDNA(16SリボソームRNA遺伝子)を取り出した。(2)DNA合成の始点になる分子(プライマー)に蛍光色素を付けて増幅した後、2種類の制限酵素で切断した。(3)DNAには4種類の塩基が並んでおり、制限酵素は特定の塩基の並びでDNAを切断した。切断されたDNA断片はさまざまな長さ(塩基数)になり、各々のDNA断片の量を蛍光の強さとして測定した。2.PWV測定:血圧脈波検査装置(フォルムPWV/ABI、コーリン、東京)を使用した。現状までに1.糞便採取(約5g)2.PWV測定の測定結果を得ることができた。今後は解析が必要である。最近になり動脈硬化を簡便にかつ客観的に評価する方法としてbaPWV(brachial-ankle pulse wave velocity、以下PWV)が報告されてきている。一方、分子生物学的手法(T-RFLP法、Terminal Restriction Fragment Length Polymrphism)を用いて糞便中における細菌のDNAを識別することで細菌叢の実態を全体的に把握する方法が開発されてきている。対象は「岩木健康増進プロジェクト」に参加した青森県の地域住民(弘前市岩木地区:約1000人)の内、平成21年度、「岩木健康増進プロジェクト」参加していない人(約100名)を対象とした。今後、解析が必要である。最近になり動脈硬化を簡便にかつ客観的に評価する方法としてbaPW(brachial-ankle pulse wave velocity)が報告されてきている。一方、分子生物学的手法T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)法を用いて糞便中における細菌のDNAを識別することで細菌叢の実態を全体的に把握する方法が開発されてきている。

対象は「岩木健康増進プロジェクト」に参加した青森県の地域住民(弘前市岩木地区:約1000人)の内、平成21、22年度ともに「岩木健康増進プロジェクト」参加していない人(約100名)を対象とした。方法は糞便採取(約5g):(1)便中の種々の腸内細菌から特定のDNA(16SリボソームRNA遺伝子)を取り出した。(2)DNA合成の始点になる分子(プライマー)に蛍光色素を付けて増幅した後、2種類の制限酵素で切断した。(3)DNAには4種類の塩基が並んでおり、制限酵素は特定の塩基の並びでDNAを切断した。切断されたDNA断片はさまざまな長さ(塩基数)になり、各々のDNA断片の量を蛍光の強さとして測定した。PW測定は血圧脈波検査装置(フォルムPW/ABI、コーリン、東京)を使用した。腸内細菌とbaPWVの関係について検討を行ったが、一定の傾向は認められなかった。腸内細菌と肥満(BMI、体脂肪率)との関係についても65歳未満において男女ともに有意な関連は認めなかった。同様に65歳以上の男性においても有意な差は認めなかった。しかし、65歳以上の女性においてBMIが20未満の群がそれ以外の群に比してOCU332(Lactobacillales)が有意に高値であった。また、体脂肪率が低い群がOCU332の割合が多い傾向がみられた。
核酸治療によるKRAS遺伝子変異陽性肺癌に対する新規治療の確立

Driver Oncogeneの2番手でありながら、KRAS変異陽性NSCLCに関しては確立された治療がないのが現状で、MEK阻害薬であるselumetinibを用いた臨床試験でも有効性を示す事はできず、その原因の一つとして、FGFR1を介しAktのリン酸化が促進されるというbypass signalの存在が明らかとなった。miR-4689はMAPK/ERK経路の抑制だけでなく、Aktの蛋白発現そのものを抑制する可能性があるため、MEK阻害薬によって発生したようなAktを介した機序での耐性化は生じにくいと推測され、miR-4689を用いた核酸医療は臨床応用も十分可能と考えられる。
強誘電体薄膜における分極反転メカニズム解析と誘電特性劣化の低減

本研究は、強誘電体の分極スイッチングとその劣化のナノスケールでの機構解明に関してのものである。実験では、圧電応答顕微技術による強誘電性ドメインイメージングを局所的な圧電ヒステリシスにより測定した。理論的には、ランダウ理論による格子モデルによりPZT薄膜のマクロな分極ヒステリシスと局所的な圧電応答の関係を調べた。ゾルゲルとスッパッタリングにより作製されたPZT薄膜の初期と分極疲労した状態の評価を、原子間力顕微鏡と強誘電性テスターを組み合わせることによって行った。ゾルゲル膜では分極が10^7回の反転により劣化するが、スパッタPZT膜では10^9回でも飽和するだけである。この結果は、欠陥電荷の拡散と集積による空間的に不均一な強誘電性により説明出来た。インプリントしたヒステリシス領域による疲労機構はゾルゲル膜で起こり、ダイナミカルクランピング領域による疲労機構はスパッタ膜で起こると考えられる。さらに詳細なミクロとマクロの関係は、局所的なヒステリシスのパターンを確率的に解析することによって説明出来た。その目的は、全体のヒステリシスを局所的ヒステリシスパターンを適正化し平均化することによって、最も適切な局所的なヒステリシスを見い出すことにある。スパッタPZT膜の場合、初期と疲労の両状態は単一のパターンで説明できるが、ゾルゲルPZT膜の場合には種々の分極ヒステリシスが分布しており強誘電的性質がナノスケールで変化している。ヒステリシスの強い局所的相関がスパッタPZT膜にあり、相関が拡がっているのがゾルゲル膜である。これらの結果からスパッタPZT膜の強誘電的性質は高密度強誘電体メモリの小さなセルにスケールダウン出来る。分極反転の中間状態は種々の電界強度と時間で分極された微小領域の分極パターンの測定から調べられた。PZT膜のスイッチング機構は結晶構造に依存することが分かった。エピタキシャル膜ではスイッチングは平面方向に一様に広がるが、多結晶膜ではスイッチングの早い方向に進む。これらの結果は初期核が違った場所から起こり、平面方向と深さ方向の相互関係を考えることにより説明できる。
蛋白質デザインによる自己組織化ナノ繊維形成過程の解明

βシート研究のモデル蛋白質OspAを用いて変異体のX線結晶構造解析に成功した。また、フォールディング反応の研究から経路上の中間体を経るまきもどり過程であることを見いだした。本研究では、蛋白質デザインに基づいた、ペプチドの自己組織化を模倣した球状蛋白質(Peptide Self-Assembly Mimics;PSAM)を用いて、アミロイドなどポリペプチドの自己組織化によって生成するナノ繊維の形成過程を明らかにすることを目指している。本年度では初めに各種変異体の発現・精製系を構築し、基礎的なデータの測定から行った。まず、PSAMのフォールディング測定の解釈を容易にするため、C末端ドメインが欠落した変異体を構築した。この変異体は溶液中で単量体として安定であった。原子レベルの分解能で分子構造を決定するため、蛋白質の結晶化を行った。結晶化スクリーニングの結果、良好な結晶の生成に成功し、高エネルギー加速器研究機構PFにて2.2Åの反射データを得ることが出来た。結晶は非対称単位中に蛋白質を四分子含んでおり、これらの分子構造の間で単層βシート領域に構造の違いが観察された。現在、詳細な構造解析を進めている。また、ストップトフロー蛍光装置を用いてPSAMのフォールディング測定を行い、三状態の巻き戻り反応であることを見いだした。これは平衡測定において以前に報告された結果と一致しており、平衡測定の中間体と巻き戻り反応の中間体が類似の構造を持つことが予想される。PSAMのN末端ドメインには蛍光プローブとなるトリプトファン残基が無いため、詳細な測定を目指してトリプトファン残基をN末端ドメインに導入した変異体を構築した。本研究では、蛋白質デザインに基づいた、ペプチドの自己組織化を模倣した球状蛋白質(Peptide Self-Asaembly Mimica ; PSAM)を用いて、アミロイドなどポリペプチドの自己組織化によって生成するナノ繊維の形成過程を明らかにすることを目指している。21年度では20年度に引き続き、OspAのフォールディング測定を進めた。巻き戻り過程における詳細なトリプトファン蛍光変化の解析から、蛍光変化に先立って蛍光変化の無い遅延相が存在することを確認した。トリプトファン残基はC末端ドメインに存在し、天然状態の形成によってのみ蛍光変化が観察されると考えられるので、この遅延相の観察は巻き戻り反応過程における経路上中間体の形成によるものと結論した。蛍光の時間変化によって得られた二つの速度定数は円偏光二色性を用いた測定結果と一致した。さらに、N末端ドメインの形成を追跡するためにN末端ドメインにトリプトファン残基を導入した変異体を構築し、X線結晶構造の決定に成功した(分解能1.86Å)。得られた構造から、トリプトファンへの変異導入は蛋白質構造にほとんど影響を与えていないことを明らかにした。我々は最近、クロスβ構造をPSAM中にモデル化することに成功した。これはPSAMの界面をフェニルアラニン・ロイシンの繰り返しに変異することで二量体化を誘導するものである。この二量体化を誘導するのに必要な最小の変異を明らかにするために、フェニルアラニン繰り返し部位に対してアラニンスキャニングを行った。この結果、一つの芳香族残基あれば二量体化が誘導されることを見いだした。