hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国の大衆消費社会の成立進展過程における都市・農村地域の消費実態調査研究

(研究代表者が企画、実行委員長に務める)、日中共同開催シンポジューム「中国と日本の消費者行動と消費市場の国際比較研究会」(中国の北京大学、人民大学と中国・中央財政経済大学、湖北経済学院など共同開催)、日本消費者教育学会、山口大学の東亜経済学会誌「東亜経済研究」、広島経済大學の「経済学研究紀要」、それに本研究グループの定例研究会「中国大衆消費社会研究会」を開催し、公開発表している。日本国内外での研究成果の公表は、本研究分野における基礎的な研究を理論的に実証的に前進させていることは大きな意義がある。現在、これまでの調査データの統計処理、分析を続けていると同時に、来年度の具体的な調査実施、統計分析の準備を進めている。調査データの質的、量的に確保するため、当初調査の予定地域とサンプル数は多少変更したのです、しかしおおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、中国における社会主義市場経済の発展過程において、社会経済、消費市場がどのように変動しているか、大衆消費社会がどのように形成されているか等について、経済環境が大きく異なる地域、都市・農村で消費者の生活や意識行動の調査を行い、大衆消費社会の成立プロセスを解明する目的に達成するのに、今年度の研究は前進している。当初設定した今年度の研究計画は日中両国の「領土問題」による政治社会環境の影響に左右されながらも、調査実施方法を変更し、地方政府の公表した統計データや文献を活用し、またアメリカの大學の研究者たちの行った実態調査のデータを閲覧収集できたことによって、初年度に経済力水準の異なる都市・農村地域において、調査回収したデータの分析結果と比較することはでき、時系列の分析と同時に比較研究も進めることができた。中国の社会主義市場経済発展過程における消費者意識行動の変化メカニズムの解析、そしてどのように大衆消費社会が形成されているのか、その解明は前進しているので、おおむね順調に進展していると言える。次年度の農村地域における消費市場の調査、都市部の自家用車販売市場の調査を中心に調査準備の作業もすでに進めている。農村地域では、無作為によるサンプルの抽出(各調査地域200世帯-300世帯)、自動車販売市場でのインタービューによる調査など具体的な内容やスケジュールについての交渉を中国側の協力者と行い、調査段階での質の良いデータ確保のために、調査予定の各地域で実験的調査を実施し、問題点などについて検討している。これと同時に国際比較研究も進めている。研究成果公表のため、今年度も日本国内外での研究会やシンポジュームなどの開催を予定している、同時に雑誌論文や論文集の出版も計画している。これまで実施した調査データの統計処理、分析を続けると同時に、来年度の具体的な調査実施、統計分析の準備を進めている。次年度は、引き続き研究計画のとおりに、中国の人民大学や清華大学などの研究機関の教授や専門家たちと綿密に検討しながら、彼らの協力のもと、経済力水準の異なる都市・農村地域において、2013年8月から2014年2月まで調査を実施する。
肝細胞癌のソラフェニブ著効例における感受性規定遺伝子変異の探索

本研究の成果として、肝細胞がんに対するソラフェニブ治療著効例の効果予測因子となる11q13の遺伝子増幅を初めて特定した。動物実験において、FGF4強制発現がん細胞はソラフェニブに奏功することを確認した。臨床的因子としては、肺転移症例および低分化型組織例がソラフェニブ著効例の効果予測因子となることを示した。本研究の成果により、血管新生阻害薬の奏功メカニズムにおいてがん細胞側の効果規定因子があることを初めて示し、臨床的に有効なバイオマーカーを特定した。当該遺伝子増幅領域はFGF3,FGF4,FGF19,cyclinD1等の遺伝子が存在し、ソラフェニブの阻害活性を有するFGFシグナルのリガンドが3遺伝子含まれる。多施設共同臨床試験において全国からソラフェニブ著効例を集積して解析したところ、10例中3例に遺伝子増幅を認めたが、非著効例では1例も認めなかった(p=0.006)。FISH解析でもFGF3の著明な遺伝子増幅を確認した。これらの結果は現在投稿中である(Hepatology,in revise)。ソラフェニブに対して著効した肝細胞症例の組織(凍結、パラフィン包埋切片)は、現在も収集を続けている。CGH arrayのコピー数変化の解析については、ソラフェニブ著効例がん組織を試料に解析し、上記の11q13遺伝子増幅領域を同定した。パラフィン包埋切片由来のDNAでも簡便に検出できる新しい方法として、定量的PCRベースの技術であるCopy number assayを臨床応用した。MassArrayシステムを用いた遺伝子変異解析においては、29例の肝細胞がんに対して解析を行い、いくつかの異常を検出して検討を進めている。本研究では肝細胞がんに対するソラフェニブ治療について予定以上の成果が得られたと考えている。
小児がん診断のためのmyc系がん遺伝子産物定量法の開発

本研究はmyc系がん遺伝子の一つであるNーmyc癌遺伝子から作られるNーmycタンパクに対する抗体を用いてNーmycタンパクを定量化することにより神経芽腫の診断に役立たせようとするものである。この目的のなかで平成2年度はNーmycタンパクの免疫学的定量法に必須な道具である(1)Nーmyc特異抗原(2)panーmyc特異抗原(3)Nーpanーmyc特異抗原(4)Nーmyc特異抗体(5)panーmyc特異抗体の五つを作成した。抗Nーmyc抗体を用いて神経芽腫の手術摘出組織あるいは培養細胞株のNーmycタンパクを検出するためには免疫組織化学法・Western blot法・ELISA法などがあるが免疫組織化学法では細胞一個ずつのNーmycタンパク量が求まるのに対しWestern blot法やELISA法では細胞一個ずつのNーmycタンパク量は求まらず各細胞のNーmycタンパク量の平均値が求まる。本研究の進行中我々は免疫組織化学法により神経芽腫の手術摘出組織あるいは培養細胞株のNーmycタンパクの量に細胞ごとのばらつきがある事を見いだしこれがELISA法などによるNーmycタンパクの定量化に問題を与える可能性があるので平成2年度はNーmycタンパク量の細胞ごとのばらつきについて詳細に検討を行なった。その結果,(1)神経芽腫の細胞中のNーmycタンパク量は細胞周期により変動するが,それによる変動よりも細胞が個々に示すばらつきのほうがより大きな変動を示すことおよび(2)細胞集団の全体がNーmycタンパク量の変動を来す場合には個々の細胞のNーmycタンパク量のばらつきは保たれたままでいることが明らかとなった。すなわち臨床神経芽腫においてNーmycタンパク量を定量する際には,個々の細胞のばらつきを免疫組織化学的に求めなくても,Western blot法あるいはELISA法により全体の値を測定することにより腫瘍細胞全体のNーmycタンパク量が求められ得ることが明らかとなった。本研究はmyc系がん遺伝子の一つであるNーmycタンパクの免疫学的定量法を、平成2,3年度の2年間に開発し、神経芽腫のマススクリ-ニングなどに適用するための検討を行なうものである。このような全体的な目的の中で、本年度はNーmycタンパクの免疫学的定量法に必須な道具、1.Nーmyc特異抗原,2.panーmyc特異抗原,3.N・panーmycと融合蛋白,4.Nーmyc特異抗体,ならびに5.panーmyc特異抗体の5つを作製した。1については、mycファミリ-の中でNーmycに特異的な領域(Gly161ーSer245)を選択し、遺伝子DNA上の相当する部分を大腸菌発現べクタ-(bcA200)に組換え、熱誘導によりNーmyc特異領域を含んだ融合タンパクの大量生産を試みた。その結果、Nーmyc特異領域を三重連(three tandem repeats)に組込んだ組換体において、安定した量のNーmyc特異抗原(分子量=39.6K)を得ることが出来た。2では、mycファミリ-に共通の領域をpanーmyc領域(Ser347ーCys456)として選択し、1.の場合と同様の方法でpanーmyc特異抗原の作製を試みた。この場合は、repeatsなしの組換体で安定なpanーmyc特異抗原(分子量=28.5K)が得られた。3.はNーmyc特異領域を含んだ組換え体に、更にpanーmyc領域を組込んで、同様にN・panーmyc融合タンパクの作製を試みた。この場合も2と同様、repeatsなしの組換体で、安定なN・panーmyc特異抗原(分子量=52.1K)を得ることができた。

このN・panーmyc融合抗原を、Nーmycタンパクの免疫定量のための標準物質として用いることにより、抗Nーmyc抗体と抗panーmyc抗体の両方を用いた、高感度で特異性の高いサンドイッチ型のELISA法を確立するための準備が整ったことになる。4,5の抗体については、単離精製した各抗原を各々家兎に免疫して、各々に特異的ポリクロナル抗体を得た。抗ヒトNーmycタンパク抗体(抗Nーmyc抗体)はヒトのNーmyc癌遺伝子から作られるNーmycタンパクに対する抗体である。この抗体を用いてNーmycタンパク定量化することにより神経芽腫の役立たせようとするのが本研究の目的である。抗Nーmyc抗体を用いて神経芽腫の手術摘出組織あるいは培養細胞株のNーmycタンパクを検出するためには免疫組織化学法・Western blot法・ELISA法などがあるが免疫組織化学法では細胞一個ずつのNーmycタンパク量が求まるのに対しWestern blot法おELISA法では細胞一個ずつのNーmycタンパク量は求まらず各細胞のNーmycタンパク量の平均値が求まる。本研究の進行中我々は免疫組織化学法により神経芽腫の手術摘出組織あるいは培養細胞株のNーmycタンパクの量に細胞ごとのばらつきがある事を見いだしこれがELISA法などによるNーmycタンパクの定量化に問題を与える可能性があるので、Nーmycタンパク量の細胞ごとのばらつきについて詳細に検討を行なった。その結果、(1)神経芽腫の細胞中のNーmycタンパク量は細胞周期により変動するが、それによる変動よりも細胞が個々に示すばらつきの方がより大きな変動を示すことおよび(2)細胞集団の全体がNーmycタンパク量の変動を来す場合には個々の細胞のNーmycタンパク量のばらつきは保たれたままでいる事が明らかとなった。従って免疫組織化学染色で見られるNーmycタンパマ量のばらつきは、細胞固有のなんらかの性質により規定されており、薬剤処理などの外部環境によってばらつきは解消されない事が示唆された。すなわち臨床神経芽腫においてNーmycタンパク量を定量する際には、個々の細胞のばらつきを免疫組織化学的に求めなくても、Western blot法あるいはELISA法により全体の値を測定することにより腫瘍細胞全体のNーmycタンパク量が求められ得ることが明らかとなった。
N-ビニルアシルアミドから得られる熱刺激応答性高分子

N-ビニルアシルアミド系モノマーを中心に、その合成および重合・共重合を検討し、熱刺激に応答して高度な機能を発現する新規な高分子の開発を行った。lO年度に、N-ビニルイソブチルアミド(NVIBA)等のモノマー合成について確立し、次に、これらのビニルモノマーをラジカル重合・共重合させ水溶性高分子を合成した。また、架橋剤を加えた系ではヒドロゲルを得た。これらの感熱応答性を調べる基礎研究を行った。11年度は機能発現(感熱応答性)を、既存の熱刺激応答性高分子N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)ポリマーと比較しながら調べた。例えば、白金、銀等の金属コロイドが水溶性高分子により安定化されることに着目し、NVIBAおよびN-ビニルアミドポリマーを用いた。さらに、NIPAAmポリマーをコア、ポリスチレンをコアとする高分子超微粒子へ金属コロイドを担持させ、その触媒活性を調べた。アリルアルコールの水素化反応において、感熱応答性高分子の曇点以上では見かけの触媒活性が著しく低くなり、反応の暴走を押さえるシステムを構築でき、工業化学的に重要な知見が得られた。また、基礎研究であるが、NIPAAmポリマーとNVIBAポリマーのLCST挙動の相違を高圧下調べた。別途、水溶性高分子を用いる2相分離系へも熱刺激応答性高分子が応用できることを明らかとした。12年度には、市販されているモノマーである、N-ビニルホルムアミド、N-ビニルアセトアミドと酢酸ビニル共重合体が明瞭なLCSTを示すことを見いだした。感熱応答性高分子が工業的にも供給できることを明らかとした。12年度および13年度には応用展開を幅広く行った。DDS分野へ応用を目的にシリカゲル(無機)-感熱応答性高分子(有機)ハイブリッド研究を行った。さらに研究を派生させて、感熱応答性高分子ゲル合成時にシリカ微粒子を混入させ、HF水溶液によりシリカを溶解させ多孔性ヒドロゲルとすることにより感熱応答性を800倍加速することに成功した。本研究で得られた知見は単に新規感熱応答性高分子を開発したにとどまらず、工業的に意味ある新しいシステム開発を行ったと結論する。N-ビニルアシルアミド系モノマーを中心に、その合成および重合・共重合を検討し、熱に応答して高度な機能を発現する新規な高分子の開発を行って来ている。まず、N-ビニルイソブチルアミド(NVIBA)等のモノマー合成について確立し、次に、これらのビニルモノマーをラジカル重合・共重合させ水溶性高分子とし、架橋剤を加えた系ではヒドロゲル化し、感熱応答性を調べる基礎研究を行った。水溶性高分子では濁りを観測しDSC測定することにより、またヒドロゲルでは膨潤・収縮を調べることで相転移温度を求め、感熱応答性を評価した。既に多くの研究例のある、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PolyNIPAAm)と比較した。基盤研究は応用研究、展開研究がポイントであるが、まず,感熱応答性高分子鎖を既存高分子材料へグラフトした。ポリエチレンフィルムにPolyNIPAAm鎖を持つものは、通常の生活環境でその相転移温度を境に、低温で親水的、高温で疎水的であることが分かった。繊維などの様々な材料に感熱応答性を付与できると結論した。次に、水に分散安定性の高い、ポリスチレンコア-

水溶性グラフト鎖コロナの高分子ナノスフェアにPolyNIPAAmおよびPolyNVIBA鎖の導入を行った。相転移温度を境に、粒径が高温では小さく、低温では大きくなる。これらコア-コロナ型高分子ナノスフェアに白金および銀コロイドを固定化した。水中で安定な新しい触媒系であり、同時に回収、再精製、再使用可能な特徴を持つ。詳細な検討は次年度以降であるが、感熱応答性グラフト鎖の相転移により反応速度が制御されることが、最も重要な点であろう。無機担体に感熱応答性高分子をグラフト化する研究も開始した。さらに、市販のモノマーの組み合わせでも感熱応答性高分子を創製、応用展開する研究にも着手している。N-ビニルアシルアミド系モノマーを中心に、その合成および重合・共重合を検討し、熱刺激に応答して高度な機能を発現する新規な高分子の開発を行って来ている。10年度に、N-ビニルイソブチルアミド(NVIBA)等のモノマー合成について確立し、次に、これらのビニルモノマーをラジカル重合・共重合させ水溶性高分子を合成した。また、架橋剤を加えた系ではヒドロゲルを得た。これらの感熱応答性を調べる基礎研究を行った。11年度は機能発現を、既存の熱刺激応答性高分子N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)ポリマーと比較しながら調べた。まず、白金、銀等の金属コロイドが水溶性高分子により安定化されることに着目し、NVIBAおよびN-ビニルアミドポリマーを用い、さらに、NIPAAmポリマーをコア、ポリスチレンをコアとする高分子超微粒子へ金属コロイドを担持させ、その触媒活性を調べた。アリルアルコールの水素化反応において、感熱応答性高分子の曇天以上では見かけの触媒活性が著しく低くなった。反応の暴走を押さえるシステムを構築できたと考えている。また、ポリスチレンに代わりシリカゲルをコアに用いることでより工業的な展開が可能となると結論した。基礎研究としては、NIPAAmポリマーとNVIBAポリマーのLCST挙動の相違を高圧下調べた。別途、水溶性高分子を用いる2相分離系へも熱刺激応答性高分子が応用できることを明らかとした。さらに、市販されているモノマーである、N-ビニルホルムアミド、N-ビニルアセトアミドと酢酸ビニル共重合体が明瞭なLCSTを示すことを見いだし、次年度、研究展開させる予定である。外部環境の変化に応答して高分子の形状や物性が可逆的に変化する刺激応答性高分子が注目されている。本年度は、独自に開発したN-ビニルアシルアミド誘導体の共重合性(理想共重合性)に着目し、共重合体水溶液の下限臨界溶解温度(LCST)の制御を行い、応用研究を行うことを目的とした。また側鎖のアミド基を加水分解することで反応性の高い一級アミノ基を有する共重合体の合成について検討した。応用研究として、刺激応答性高分子を保護剤に用い白金(Pt)コロイドを調製し、調製したコロイドについてその触媒活性を中心に形態や物性を検討した。N-ビニルホルムアミド(NVF)、N-ビニルイソブチルアミド(NVIBA)から得られた共重合体(poly (NVF-co-NVIBA))は、モノマー反応性比よりランダム共重合体であることを明らかとした。
アポトーシス促進因子Bidの制御機構

昨年度単離したBid結合因子(clone-2)の機能解析を進めた。1,clone-2遺伝子の発現分布をNorthern Blotで解析した。正常組織(CLONTECH社のMultiple Tissue Northern Blotを利用した)ではBrain、Liverで強いmRNAの発現を検出した。培養細胞(Cos7,Hela, HEK293,HepG2,Jurkat K562,THP1)ではHepG2細胞でやや強く、Cos7,HEK293で弱いmRNA発現を検出した。RT-PCR解析では全てのcell lineで発現が確認された。2,clone-2の安定発現細胞株の樹立を試みた。Jurkat細胞にのcDNAを組み込んだpIRES2-EGFP(CLONTECH社)ベクターを導入し、G418耐性、GFP発現を指標にclone-2の安定発現クローンを4種類得た。4クローン中2クローンがレコンビナントFasリガンドで誘導されるアポトーシスに耐性を示した。3,clone-2の細胞内局在を調べた。clone-2に対するポリクローナル抗体を作製し、HepG2細胞を免疫染色したところ、ミトコンドリアに強い染色像が見られた。HepG2細胞を分画し、western blot解析したところ、ミトコンドリアを含むheavy membrane画分にclone-2のカルボキシ末端側とみられる14kDaのバンドを検出した。clone-2の全長に相当する蛋白のバンドは確認できなかった。4,アンチセンスRNA発現ベクター導入による内在性clone-2の発現阻害を試みたが、14kDaのバンドの消失は認められなかった。以上の結果より、過剰発現系においてはclone-2がBidで誘導されるアポトーシスに対して抑制的に働く可能性が示唆された。アポトーシス促進Bc1-2ファミリーBidは通常細胞質中に存在するが、デスレセプターを介する細胞死シグナルが入るとカスパーゼ8によってAsp59-Gly60間で切断され、C末端側フラグメントがミトコンドリアに移行し、シトクロームc放出を誘起する。このミトコンドリアヘの移行、局在に何らかの細胞因子が関与する可能性に着目し、Bid結合蛋白をycest two-hybridスクリーニングによって探索した。(1)human Tlymphoma, Fe-tal Liver, Brain cDNALibraryよりBidと結合しうる因子をコードするcDNA断片を12種類得た。これらについてiv vivoでの結合をCos-7細胞での共発現、免疫沈降で検証した。2種類のクローン(クローン2, 98)がBidとの結合を再現できた。クローン2は機能が未同定なhypothetical protein mRNA、クローン98はneurochondrin-1であった。(2)Bidで誘導されるアポトーシスに対するこれらクローンの作用を調べた。Cos細胞にBid発現ベクター、各クローンの発現ベクター、GFP発現ベクターをco-transfestionした。22時間後に細胞を固定、Hoechst染色し、蛍光顕微鏡下、GFP発現細胞中に占めるアポトーシス様核形態変化を示す細胞の割合を算出した。Bid単独発現では38%の細胞にアポトーシスの誘導が観察された。これに対しクローン2を共発現させると12%、クローン98では25%にそれそれアポトーシス細胞の割合が低下していた。Bidで誘導されるアポトーシスシグナル経路にこれらクローンが関与している可能性が示唆された。
環境要因がいかにして個体発生を制御するかに関する分子生態発生学的研究

生物の形質は遺伝子によってのみ一義的に決まるわけではなく,取り巻く環境条件に応じて状況依存的に形質を発現したり修飾したりする.しかしどのような生理発生機構によりそのようなしなやかな形質発現が行われているかは未解明であった.本研究課題では,表現型可塑性を発揮する節足動物のいくつかの種を用い,化学物質によるコミュニケーション,環境要因を介する生理機構,発生プログラムの改編機構と,段階的に焦点を当て,分子生物学や生化学的手法を用いて,研究を進めてきた.シロアリやアブラムシ,ミジンコなどで,フェロモン様物質の同定,幼若ホルモン濃度の変動パターン,発生制御因子の発現動態などの成果を得ることに成功した.結論として,既存の発生・生理機構に用いられている分子機構を上手く応用することにより,変動する環境に対応した適応的な可塑性を発揮するメカニズムが存在することが強く示唆された.生物の形質は遺伝子によってのみ一義的に決まるわけではなく,取り巻く環境条件に応じて状況依存的に形質を発現したり修飾したりする.しかしどのような生理発生機構によりそのようなしなやかな形質発現が行われているかは未解明であった.本研究課題では,表現型可塑性を発揮する節足動物のいくつかの種を用い,化学物質によるコミュニケーション,環境要因を介する生理機構,発生プログラムの改編機構と,段階的に焦点を当て,分子生物学や生化学的手法を用いて,研究を進めてきた.シロアリやアブラムシ,ミジンコなどで,フェロモン様物質の同定,幼若ホルモン濃度の変動パターン,発生制御因子の発現動態などの成果を得ることに成功した.結論として,既存の発生・生理機構に用いられている分子機構を上手く応用することにより,変動する環境に対応した適応的な可塑性を発揮するメカニズムが存在することが強く示唆された.本研究では,環境要因がいかにして個体に受容され発生機構に反映されていくのかを解明することを目的とする.環境要因は化学物質や個体間相互作用などによる外界シグナルであるが,この外界シグナルがいかにして個体に受容され,その個体の生理条件に影響を与え,ひいては発生プログラムを改変していくのかを,システマティックに理解することを試みている.18年度はオオシロアリHodotermopsis sjostedtiにおけるフェロモンタンパクの解析が大幅に進み,この分子の獲得が社会コミュニケーションの進化にどのように関わってきたかに関する興味深い示唆が得られた(三浦).更には,ヤマトシロアリReticulitermes speratusにおいても個体間相互作用による兵隊分化の抑制とその発生機構に関する重要な結果も得られた(前川).また,ハクウンボクハナフシアブラムシTuberaphis styraciの警報フェロモンと兵隊分化に関しても新たな知見が得られ,社会性昆虫における個体間相互作用への理解がいっそう深まった(柴尾).さらにはミジンコDaphnia pulexの防衛形態に関しても分子発生学的解析が進んだ(三浦).19年度は,上記の結果をふまえ,いかなる化学物質が上記の相互作用に寄与しているのか,また個体内の生理的変化にいかなる影響を与えるのかに関する,化学生態学的解析および生理学的解析に力点を置く.さらに,化学物質を外界シグナルとして受容するためには,何らかの化学受容器が生物個体に存在しなくてはならない.そこで触角などの組織形態学的観察を精力的に行う必要がある.さらに,外界シグナル受容と生理状態をつなぐ神経機構も無視はできない.これらのことをうまくつなげる解析手法の模索も試みる予定である.本研究では,環境要因がいかにして個体に受容され発生機構に反映されていくのかを解明することを目的として,シロアリ・アブラムシ・ミジンコを材料に研究を推進している.環境要因は化学物質や個体間相互作用などによる外界シグナルであるが,この外界シグナルがいかにして個体に受容され,その個体の生理条件に影響を与え,ひいては発生プログラムを改変していくのかを,システマティックに理解することを試みている.19年度は,オオシロアリHodotermopsis sjostedtiにおける外分泌腺の解析が進展し,大顎腺や唾液腺などからの分泌物が個体間相互作用に大きく関わることが,分子データにより示唆された.また,これらの外的要因を媒介するインスリンシグナリング経路に関する解析も進展した(三浦).ヤマトシロアリReticulitermes speratusにおける解析では,繁殖虫への分化における器官発達の詳細を解析し,特に複眼や生殖腺の発達に関する知見を蓄積した(前川).また,ハクウンボクハナフシアブラムシTuberaphis styraciの兵隊分化の解析においては,化学物質とその受容機構の関係を化学分析と電気生理学を組み合わせた新たな手法を用いることで,これまでよりも立ち入った解析が可能となった(柴尾).さらにはミジンコDaphnia pulexの防御形態の形成時に発現が上昇する遺伝子の同定と発現解析が完了した(三浦).20年度はこれらの結果をふまえて更なる解析を進めるとともに,各動物種で得られた知見を比較・検討し,外界シグナルと生理機構,ひいては発生分化のメカニズムを結びつけるような原理に関する考察を行い,研究をまとめていく予定である.

本研究では,環境要因がいかにして個体に受容され発生機構に反映されていくのかを解明することを目的として,シロアリ・アブラムシ・ミジンコを材料に研究を推進している.環境要因は化学物質や個体間相互作用などによる外界シグナルであるが,この外界シグナルがいかにして個体に受容され,その個体の生理条件に影響を与え,ひいては発生プログラムを改変していくのかを,システマティックに理解することを試みている.20年度は,オオシロアリHodotermopsis sjostedtiにおける外分泌腺の解析および兵隊特異的遺伝子の分子生物学的解析が進展し,大顎腺や唾液腺などからの分泌物が個体間相互作用に大きく関わること,およびそれらの機構が種を超えて保存されていることが,分子データにより示唆された(三浦).ヤマトシロアリReticulitermes speratusにおける解析では,繁殖虫への分化における器官発達の詳細を解析し,特に幼若ホルモンの変動パターンとカースト分化への関係を明らかにした(前川).また,バクウンボクハナフシアブラムシTuberaphis styraciの兵隊分化の解析においては,化学物質とその受容機構の関係を化学分析と電気生理学を組み合わせた新たな手法を用いることで,これまでよりも立ち入った解析が可能となった(柴尾).さらにはミジンコDaphnia pulexの防御形態の形成時に発現が上昇する発生制御因子を数多く同定し,定量的な発現解析を行った(三浦).20年度は最終年度であったが,様々な節足動物群で,外界シグナルを生理機構に反映させる共通の機構が明らかとなった.これらの成果は国際誌を含めいくつもの業績として公表した.
人工分子膜電極系での高機能電子メディエーションシステムの設計・開発

細胞膜への類似性が高い全合成の二分子膜、単分子膜およびLB膜を素材として用い、電子移動メディエーターとともに固定化し、これらの高度な分子配向場での電子移動反応系の設計・制御システムを開発することを目的に研究を行い、以下の成果を得た。1.二分子膜系でのメディエーション反応の制御メディエーターとして10N-オクタデシルイソアロキサジンを合成し、アンモニウム型脂質との混合単分子膜を気一液界面で形成させ、これを電極上へ移し取り、細胞膜様の二分子膜を形成させた。メディエーター分子のレドックス反応およびメディエーターを介した溶液中のレドックス活性化合物へのベクトル電子移動は、電極上の二分子膜の結晶相液晶相への相転移により制御できることが分かった。メディエーターは、脂質のわずか1モル%でも効率よく機能した。2.単分子膜系での電子移動反応の制御金電極上の自己組織化単分子膜の溶液種に対する選択的ブロック能を利用し、ベクトル電子移動システムを構築した。たとえば、ドデシルメルカプタン単分子膜電極は、フェロシアンはブロックするが、トリメチルアミンアンモニオフェロセンはブロックできない。両レドックス分子が共存すると、フェロシアン→トリメチルアンモニオメチルフェロセン→電極へのベクトル電子移動が生じた。トデシルメルカプタンの代わりに、リン酸型単分子膜を用いると、ベクトル電子移動のpH制御が可能であった。
ものづくり流体アプリケーションのエクサスケールへの進化

エクサスケールのスパコンにおいて、ものづくりを革新的に発展させるアプリケーションを開発するためには、既存のアプリケーションから根底から作り直す必要がある。所望する計算結果を得るまでの時間「Time to Solution」を最重要視した新しい陽的時間積分に基づいた数値計算手法と計算アルゴリズムを導入する研究を進めた。数値計算手法(離散化)に関して陰解法から陽解法、低次精度から高次精度空間離散化、非構造格子から局所的に均一な構造格子等への転換を行い、一方で計算アルゴリズムに対して、1データ移動の最小化、2演算密度の向上、3ノード間通信を隣接通信に限定等を行う。さらに詳細なパフォーマンス・モデルを構築し、エクサスケールの問題規模において高い実行性能を確実に達成する。手本となる流体アプリケーションの成功例を示し、ものづくり分野への大きな貢献を目的として研究に着手した。計算アルゴリズムの検討において、完全陽解法にすることで、ペタスケールの格子系アプリケーションで導入してきた演算と通信のオーバーラップによる通信時間の隠ぺいが計算の殆どの部分で可能になることを確認した。さらに、方向分離を双曲型方程式にTemporal Blockingによる時間積分方向のデータ再利用にキャッシュの利用を促進する計算アルゴリズムを導入を検討した。この段階で本基盤研究(A)を包含する基盤研究(S)の採択が決定し、以降の研究遂行を基盤研究(S)で行うこととした。26年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞の多様性を生み出す非対称分裂の解析

prospero遺伝子は、神経系の幹細胞から非対称分裂により生じる2次前駆細胞で、一過的に機能するホメオボックス遺伝子であり、神経発生に必須な役割を果たす。われわれは、prospero蛋白が転写因子であるにも関わらず、この神経幹細胞では細胞質にとどまり、細胞分裂に伴って2次前駆細胞に非対称に分配されることを示してきた。この知見は、転写因子の非対称分配という、細胞分裂にカップルした新しい分化の仕組を示すだけではなく、prospero蛋白が、神経幹細胞の非対称分裂のよいマーカーであることを意味する。そこで、神経幹細胞の非対称分裂を引き起こす細胞極性を解析することを目的に、prosperoとβ-galactosidaseの融合蛋白(pros-βgal)を発生過程の全ての細胞で発現するショウジョウバエ系統を作成し、このマーカー蛋白が、どの細胞で非対称に局在、あるいは分配されるかを検討した。初期胚の外胚葉と内胚葉を構成する上皮細胞では、本来、prosperoを発現しないが、これらの細胞でectopicにpros-βgal発現させると、分裂時には必ず、細胞のcortexに局在することを見い出した。さらに詳しく観察すると、細胞のcortexに局在したpros-βgalは、cortexのapical側からは排除され、basal側(あるいは、basal-lateral側)にだけ存在する。この観察から、上皮細胞、および、神経幹細胞でprosperoを局在させる活性は、上皮細胞に一般的なapical-basal極性に基づいていることが示唆された。prosperoの局在活性を指標として見る限り、幹細胞が非対称分裂を行う際の細胞極性は、上皮細胞の極性と共通の性質を持っている。従って、上皮細胞の極性という非常に一般的な細胞極性が、prosperoのような分化因子の非対称分配を介して、遺伝子発現のの非対称な調節に関わる可能性が浮び上がってきた。上皮細胞のapical-basal極性の形成と維持には、一層に並んだ上皮細胞間の相互作用が必要であるとされているが、非対称分裂を行う神経幹細胞や内胚葉幹細胞は、上皮細胞層から、細胞が離脱して形成される。その際、上皮細胞から幹細胞へ、いかにして、この極性が受け継がれるのかを解明することが、今後の課題であろう。
無機一有機傾斜複合体の合成と多孔体への応用

これまでにリン酸ジルコニウム(α-ZrP)の層間に有機物を導入して無機-有機傾斜複合体を合成し、多孔体に応用することを試みてきた。本年度は層間のシリル化を行い耐熱性のある多孔体の合成を試みた。α-ZrPを直接シリル化することを試みたが不可能であったので、あらがじめ層間に長さの異なるn-アルキルアミンおよびアニリンをインターカレーションしたものを出発物質としてシリル化を行った。シリル化は、出発物質をトルエン中に分散させ、これに3倍のモル比の各種のシラン化合物を加え、窒素雰囲気下で撹拌しながら還流することにより行った。種々のシラン化合物について試みた結果、現在までシリル化が確認されたものはDimethyldichlorosilane、Dimethyloctadecylchlorosilane、Dimethylphenylchlorosilane、Dimethoxymethylchlorosilane、1,2Bisdimethylchlorosilylethaneであった。Dimethyldichlorosilaneの場合、ヘキシルアミンをインターカレーとした出発物質ではシリル化は観察されなかったが、オクチルアミンをインターカレートしたものではシリル化が起こった。また、Dimethylphenylchlorosilaneの場合アルキルアミンの長さを長くしてもほとんどシリル化が起こらなかったが、アニリンインターカレーション化合物を用いることにより容易なシリル化が可能となった。したがって、中間化合物としてのインターカレーション化合物には、単に層間が広がっていることのみが必要ではなく、層間に存在する有機塩基の種類がシリル化に大きく影響を与えることがわかった。シリル化化合物は200-400°Cでの共存する有機塩基の脱離後も長い層間距離を保ち、有機物が直接層と結合したa-ZrPの有機誘導体と同等かそれ以上の高い温度まで安定に有機物が層間に存在していた。さらに加熱を続けることにより、有機物は酸化などにより取り除かれ、層間距離は減少する。しかし、α-ZrPとは異なり700°C以上の温度でもZrP207を生成せず、XRDパターンより層状構造が保たれていると考えられた。これは、シランが酸化されでシリカとなり、層間でピラーを形成しているものと考えられる。1000°Cで加熱した生成物の層間距離は、Si/Zr<1ではシランの種類によらず8.4Åであり、Si/Zr=1.83のDOXMCSでは12.5Åであった。酸化物架橋粘土鉱物などと比較して、格段に高い耐熱性を持っていることがわかる。このようにα-ZrPの層間に存在するOH基と有機金属を反応させることにより、新しい無機-有機複合体の合成が可能となった。
Type1フォンビルブランド病の病因解明にむけた基礎的研究

本研究では、type 1フォンビルブランド病(VWD)とフォンビルブランド因子(VWF)分子上の糖鎖構造の相関解明をめざして、各種レクチンを用いたスクリーニングを行った。あわせてヘビ毒由来の血栓形成制御因子の構造決定と作用機作の解析を行った。1)血液型認識レクチンのうち、HPAとUEA-IがそれぞれVWF上のA型、O(H)型糖鎖を高感度で認識し、糖鎖の分画にも有用であることを明らかにした(BBA,1525:50-57,2001)。また、O型由来のVWFとtype 1 VWD由来のVWFでは、末端のシアル酸を認識するレクチン(SSAやSNA)やH型構造を認識するTJA-IIやUEA-Iとよく反応する傾向を発見した。この結果は、O型由来のVWFやtype 1 VWD由来のVWFで、シアル酸含量が高いこと、また、type 1 VWDでH型構造が多い可能性を示唆した。2)VWFを特異的に一カ所で切断し、血小板凝集活性を消失させるコーシャギンの全アミノ酸配列を決定し、Cys-richドメインもジスインテグリンとして機能することを発見した(Biochemistry 40:4503-4511,2001)。VWF活性化因子であるビチセチンの立体構造を結晶解析により明らかにし、分子中央のくぼみに、負電荷に富み、VWF-結合サイトと思われるパッチ構造が存在することを発見した(Biochemistry40:13592-13597,2001)。1.血漿フォン・ビルブランド因子(VWF)のABO血液型糖鎖の識別と分画を行うための基礎データとして、血液型認識レクチンをスクリーニングした。カタツムリレクチン(HPA)、ドリコスマメレクチン(DBA)、ハリエニシダレクチン(UEA-I)など12種類の血液型識別レクチンを用いて、VWF、血液型糖鎖を持つムチン糖蛋白質や人工糖蛋白質、単離したAsn型糖鎖との反応性を調べた。その結果、HPAとUEA-IがVWF上のA型、O(H)型糖鎖を比較的高感度で認識し、糖鎖の分画にも有用であることを明らかにしたが、B型糖鎖の検出には優れたレクチンは見出せなかった(Biochim Biophys Acta,1525:50-57,2001)。2.VWF上のガラクトース残基に注目し、ガラクトース量を血液型別、typeI VWD、typeIII VWD別に比較するアッセイ系として、ELISA法を試行している。抗VWF抗体にもガラクトースが結合しているため、ガラクトシダーゼ消化して脱ガラクト化した抗体を調製した。この抗体は、VWFに対する結合性を保持したまま、ガラクトースに親和性を持つRCAレクチンとの反応性を失った。この抗体を用いてVWF上のガラクトースを認識できるようになったが、血漿中にまだ抗体と非特異的に結合し、RCAと反応する未知の成分が存在しており、現在その同定と、干渉をなくす方策を検討している。3.ヘビ毒中には様々な止血血栓形成を制御する因子が存在する(Biochim.Biophys.Acta 1477:146-156,2000)。タイコブラ毒からVWF切断活性を持ったメタロプロテアーゼを精製し、コーシャギンと命名しているが、全一次構造の決定に成功した。コーシャギンはメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、Cys-richドメインからなる高分子量メタロプロテアーゼの一種であり、Cys-richドメインにRGD配列を含むたいへんユニークな構造を持つことを発見した。さらに合成ペプチドを用いて、ジスインテグリン様配列のみならず、Cys-richドメインの配列もともにジスインテグリンとしての血小板凝集阻害活性を持つことをはじめて明らかにした(Biochemistry,2001,in press)。

1.健常人血漿由来のフォン・ビルブランド因子(VWF)とtype 1 VWD患者由来のVWF上の糖鎖に構造的な違いがあるかどうかをレクチンを用いたサンドイッチELISA法でスクリーニングした。抗体によってトラップされるVWFに対するレクチンの反応特異性は、VWFを含まないtype 3 VWD血漿を対照として判断した。用いたレクチンでは、非還元末端のガラクトース残基を認識するヒママメ由来のRCA120で、見かけの反応性が強く見られ、VWF上のガラクトース残基の量的な違いはこの方法では明らかにできなかった。しかしながら逆に末端のシアル酸を認識するニワトコ由来のSSAとSNAは、O型由来のVWFと強く反応すること、H型構造を認識するキカラスウリ由来のTJA-IIは、O型由来のVWFとよく反応し、type 1 VWD由来のVWFともよく反応する傾向を発見した。現在さらに詳細にこれらのレクチンの反応性を定量化すべく、アッセイ法を検討している。2.ヘビ毒中から見いだしたVWF活性化因子であるビチセチンの結晶化を行い、立体構造を明らかにした(Biochemistry 40:13592-13597,2001)。ビチセチンは二つのサブユニットが互いに抱き合い、中央部にリガンド(VWF)結合サイトと思われる窪みを持っていた。この部分には、酸性アミノ酸の集積が認められ、局所的な酸性パッチを形成していることが明らかとなった。これに対応すべくVWF上のビチセチン結合サイトの解析を、部位特異的モノクローナル抗体、アラニンスキャンニング法を用いて行った結果、A1ドメインのボトロセチン結合サイトの近傍に結合することが明らかとなった(論文投稿中)。3.血中でVWFを切断し、マルチマー構造を作り出すVWF切断酵素が、先天的な血栓性血小板減少性紫斑病であるUpshaw-Schulman症候群患者で欠損しており、このことがその病因となることを明らかにした(Int.J.Hematol.74:101-108,2001)。
機械学習を用いた描画像のデジタルパターン解析による精神機能障害の新指標探索

前年度までの実績を踏まえ、最終年度ではCNNを用いた樹木画の画型分類の推定精度を改善する手法を検討した.まず、ResNetにおける層数の異なる構造モデル、及び特徴マップを各チャネルで適応的に重み付けるネットワーク構造「Squeeze-and-Excitation block (SE block)」の適用も加えて検証した結果、画型4クラス分類の推定精度はSE-ResNet-34を用いた場合が69.7%と最も精度が高かった。ResNetの層数により推定精度が異なったのは、データセットの大きさに適した層の深さがある可能性を示唆する。さらにこのSE-ResNet-34を用いて、疑似画像と実物画像を識別する構造モデルである「Generative Adversarial Network(GAN)」による画型4クラス分類を行った結果では推定精度が67.3%と低くなった。これは、GANにより生成された疑似画像のうち、陰性画と合併画において小さい樹木画やほぼ白紙のような画像が多く認められたことから、それらの疑似画像がCNNの学習の効率を下げたのかもしれない。このように研究期間全体を通じて実施した成果として、樹木画のデータセットに画像処理を施してサンプル数を増加させる「data augmentation」、及びスケッチ画像の大規模データセット「The Sketchy Database」による学習済みのCNNの併用は有用であることが示唆された。そして、データセットの大きさに最適な層の深さを設定できればCNNの構造モデルにSE-ResNetを用いる手法の有用性がさらに高まる可能性も示唆された。また、臨床現場で収集できる樹木画のサンプル数を多く増やすには制約がある。そのため、本研究の場合にGANは有用であるが、画型の識別精度を高めるための疑似画像の最適枚数の検討が必要であることも確認できた。このように本研究の成果から、高い識別精度と樹木画の客観的な画型判定が期待できる方法を確認できた。平成28年度は、既知の樹木画分類による判定と比較するために、HOG特徴量によるSVM分類、および画像認識の分野でよく扱われている畳み込みニューラルネットワーク(CNN)による分類を用いて検証した。サンプルである樹木画343枚は、既知の判定基準に従って、異型画168枚と普通画175枚の2クラス分類、さらに異型画の下位分類である陽性画39枚と陰性画61枚と合併画68枚および普通画175枚の4クラス分類の条件下で判定された。CNNのモデルにIllustration2Vecを採用して2クラス分類と4クラス分類を実施した。バッチサイズは16、勾配降下法の最適化アルゴリズムはAdamとして100Epochの学習が行われた。実験の検証方法は10-fold Cross Validationを用いた。実験に用いた計算機のGPUはGeForce GTX TITAN X,OSはUbuntu 16.04であった。実験結果として、正しく推定された画像の枚数を全画像枚数で割った比率である全体の推定精度が2クラス分類と4クラス分類で算出された。2クラス分類では、Illustration2Vecによる全体の推定精度は79.9%であり、おおむね既知の判定基準と同程度であることが示唆された。4クラス分類では、HOG特徴量によるSVMは全体の推定精度が43.2%であり、一方のIllustration2Vecによる全体の推定精度は60.3%であった。4クラス分類の全体の推定精度において、Illustration2VecはHOG特徴量によるSVMよりも17.1ポイントの向上を認めたが、全体的に低い推定精度であることが示唆された。4クラス分類で低い推定精度であった一因として、サンプルである樹木画の画像枚数が少ないことが考えらえれた。HOG特徴量によるSVMよりも畳み込みニューラルネットワーク(CNN)による樹木画分類の方が精度高く分類できる可能性を確認できた。バウムテストの樹木画をコンピュータで自動的に分類できれば,検査者が樹木画の判断を行う際にコンピュータによる分類結果を参考にできる.また,専門的な知識を持たない者でも手軽に検査を行うことが可能となるので,実際に精神科を受診する手助けになると考えられる.これを実現するため,平成29年度はDeep Learningを用いて樹木画と検査者による判断(画型)を学習することでバウムテストの樹木画の分類器を構築することを試みる.そのために,バウムテストで描かれた樹木画を"normal", "positive","negative","chaos"の4クラスに分類する.この分類を高い精度で実現できる手法を検討する.前年度の課題として画像のサンプル数増加,小規模データセットでも良好な学習を得る手法の検討をあげていた。まず,サンプル数が少なく,クラスごとに偏りのあるデータセットでもData Augmentationの有効性が確認されたことによって,画像処理を施せばサンプル数を増加できることを確認した。そして,fine-tuningが適用であることも確認できたので,小規模データセットであってもthe Sketchy databaseの併用によるResNet-18の学習が良好であることも確認された。このようにして,スケッチ画像のデータセットであるthe Sketchy databaseを用いてResNet-18を事前学習し,その学習済みのResNet-18をバウムテストのデータセットにData Augmentationを行ったもので再学習する手法を用いた結果,全ての樹木画のうち正しく推定された割合は66.2%となった.

今後の課題としては,スケッチ画像のデータセットを用いた事前学習の際にもData Augmentationを適用すること,近年提案されている様々なCNNの改善手法を適用していくことなどが挙げられる.畳み込みニューラルネットワーク(CNN)による樹木画分類の精度をより高くするための改善点を確認できた。本研究の樹木画のようなスケッチ画像に対しては,画像処理の施工によるサンプル数を増加させるData Augmentationと,ResNet-18の併用が有効であることを確認した。前年度までの実績を踏まえ、最終年度ではCNNを用いた樹木画の画型分類の推定精度を改善する手法を検討した.まず、ResNetにおける層数の異なる構造モデル、及び特徴マップを各チャネルで適応的に重み付けるネットワーク構造「Squeeze-and-Excitation block (SE block)」の適用も加えて検証した結果、画型4クラス分類の推定精度はSE-ResNet-34を用いた場合が69.7%と最も精度が高かった。ResNetの層数により推定精度が異なったのは、データセットの大きさに適した層の深さがある可能性を示唆する。さらにこのSE-ResNet-34を用いて、疑似画像と実物画像を識別する構造モデルである「Generative Adversarial Network(GAN)」による画型4クラス分類を行った結果では推定精度が67.3%と低くなった。これは、GANにより生成された疑似画像のうち、陰性画と合併画において小さい樹木画やほぼ白紙のような画像が多く認められたことから、それらの疑似画像がCNNの学習の効率を下げたのかもしれない。このように研究期間全体を通じて実施した成果として、樹木画のデータセットに画像処理を施してサンプル数を増加させる「data augmentation」、及びスケッチ画像の大規模データセット「The Sketchy Database」による学習済みのCNNの併用は有用であることが示唆された。そして、データセットの大きさに最適な層の深さを設定できればCNNの構造モデルにSE-ResNetを用いる手法の有用性がさらに高まる可能性も示唆された。また、臨床現場で収集できる樹木画のサンプル数を多く増やすには制約がある。そのため、本研究の場合にGANは有用であるが、画型の識別精度を高めるための疑似画像の最適枚数の検討が必要であることも確認できた。このように本研究の成果から、高い識別精度と樹木画の客観的な画型判定が期待できる方法を確認できた。より多くのバウム画を収集するために、1枚目とは異なる指示によって2枚目を得る「2枚法」、および他者の干渉を制限して静音な環境下での集団実施も積極的に行う。機械学習による樹木画判定の精度を高めるために、(1)画型の部分的特徴を全体性の中に統合する条件、および(2)描画密度は高いがゲシュタルトが崩れた特徴を機械に学習させるための条件も検討する。また、機械学習の元になる既知の樹木画分類を判定するときに、複数の判定者による一致度も考慮する。一般的な物体認識ではCNNへの入力画像が高解像度であるほど認識精度が高まるといわれているが,今回の検討では解像度を上げないときと比べて高解像度では逆に精度を下げた。
マイクロバイオデジタルファブリケーション技術による三次元状細胞組織の作製

申請者らが独自に開発している静電マイクロドロップ・インジェクションは、市販のインクジェットプリンタよりも高画質で高粘性な液体の吐出が可能であり、細胞を高精度に生きたままプリント可能なことを実証してきた。また、十分高精度にスキャホールドをプリントできることも実証してきた。複数の細胞を有する細胞組織をプリントする場合、それぞれの細胞を含む液体を満たしたシリンジとスキャホールドを含む液体を満たしたシリンジをマルチノズル化し、各シリンジの位置と印加電圧を制御することで、作製可能である。細胞は、シリンジ内のメディウムに浮遊した状態であり、通常接着している細胞にとって大きなストレスである。浮遊している時間がより短くなるように、装置を改良する必要がある。本研究では、この改良をまず行った。さらに、内部に空洞を有する人工血管を有する三次元状バイオデバイスを作製し、この内部に血管内皮細胞を接着・成長させることが可能なことを実証した。難病の克服やドナー不足の解消などを主たる目的として,再生医療・人工臓器などのバイオテクノロジー分野の研究が盛んに行われている.特に京都大学の山中教授らによって作製されたiPS細胞やES細胞は,上記分野のブレークスルーの決定打になると考えられており,現在様々な研究が盛んに行われている.東京大学の中内教授らによって,iPS細胞を利用してマウスの体内にラットの膵臓を作ることに成功したことが先日報告された.この研究成果は,別の動物の体内で人間の臓器を作製できる可能性を示唆したものであり,ドナー不足の解消につながると考えられている.しかし,実際には臓器内部の血管組織や血液が人間と動物では異なるため,移植すると拒絶反応が起こるという決定的な問題を抱えている.また,iPS細胞はガン化しやすいという問題もクリアできていない.このように,バイオ分野では,任意の三次元状の人工臓器を製造する技術は未だ確立されていない.そこで,高粘性な液体を吐出可能な静電インクジェット原理を適用して,生きたままの細胞と細胞の足場となるスキャホールドなどのバイオマテリアルを超精密・高速に配列・積層する三次元細胞造形システムの確立を目指し,研究を行っている.申請者らが独自に開発している静電マイクロドロップ・インジェクションは,市販のインクジェットプリンタよりも高画質で高粘性な液体の吐出が可能であり,細胞を高精度に生きたままプリント可能なことを実証している.また,十分高精度にスキャホールドをプリントできることも実証している.これらの研究成果から,複数の細胞を有する細胞組織をプリントする場合,それぞれの細胞を含む液体を満たしたシリンジとスキャホールドを含む液体を満たしたシリンジをマルチノズル化し,各シリンジの位置と印加電圧を制御することで,作製可能である.細胞は,シリンジ内のメディウムに浮遊した状態であり,通常接着している細胞にとって大きなストレスである.浮遊している時間がより短くなるように,装置を改良する必要がある.現在は,ノズルと下方のメディウムを満たしたディッシュとの間に高電圧を印加することによって発生する静電力のみによって,微小な液滴を吐出している.ノズルの先端に液が溜まり,静電力によって下方に引っ張られることによって,三角錐状のテーラーコーンが形成され,この先端のみがちぎれることによって,液滴が吐出される.後方からの加圧を行うユニットを援用することで,液が溜まり,テーラーコーンが形成されるまでの時間を短縮でき,高速化が可能になるので,装置の改良を行う.ディッシュの一部に熱可逆性のメビオールを塗布した状態で,細胞を一面に播種し,37度にて一日培養すると,メビオールが塗られていない箇所のみ細胞が付着する.メビオールゲル上に細胞が付着しないためである.

これを低温にし,PBSを用いて,軽くウォッシュすると,メビオールゲルは液状化し,ディッシュ表面からはがれる.この状態で,別の種類の細胞を播種すると,最初に蒔かれた細胞が付着している箇所はコンフルエントなため,メビオールゲルが付着していた箇所にのみ足場を設け,成長する.この結果は,メビオールゲルを利用することで,細胞を一時的に付着させないことが可能なこと,洗い流した後で細胞毒性がなく,細胞の培養が可能なことを示しており,血管組織を作製するのに応用可能であると考えた.血管組織は,血液が通る空洞,血管内被細胞と平滑筋細胞の二層構造から構成される.空洞を設けつつ,これらの細胞を円柱状にプリントするだけでは,低剛性なため,血管内の空洞を維持できない.そこで,熱可逆性を有するメビオールゲルを空洞部分にプリントし,その周りに上記二種類の細胞をプリントする.これを37度環境下で一日培養し,細胞間の接着を確認した上で,低温環境に移し,メビオールを液状化させることで,空洞を有する血管組織が作製可能である.この血管の出入口にテフロン製のチューブをつなぎ,フィブリンのりでシールし,血清入りのメディウムを流すこと,血管組織として機能するように培養する.この血管組織の周りに他の細胞をパターニングした三次元状細胞組織を作製し,各細胞の生化学特性を調査する.空洞を有する三次元状細胞組織を作製するにあたり,メビオールなどの必要な薬品を購入し,各液体の実験条件の最適化を行なう.次に,任意の三次元状細胞組織の作製に挑戦する.また,空洞部分を血管として利用する予定であり,この部分に血液に相当する液体(血清入りのメディウム)を流す予定である.マイクロ流路の技術を援用するにあたり,小型のマイクロ放電加工機を購入し,これにより,必要な穴加工と溝加工を行う予定である.作製したマイクロ流路と三次元細胞組織とをつなぎ合わせ,血清入りのメディウムを流すことによって,三次元状の細胞組織を作製し,長期的に観察可能かどうかを検証する.