hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広範囲親和性と光振動エネルギーを利用した、見ながら探すリガンド探索法の開発

受容体とリガンドの関係は、鍵と鍵穴の如く厳密で排他的な対応関係があると考えられてきた。本研究では、申請者らが同定に成功した、複数の異なる受容体ファミリーの垣根を越えて結合が可能な合成ペプチドを、機能が未知のオーファン受容体の解析に応用する方法を開発した。広域親和性を保持した蛍光ペプチドの作成に困難な点があったが、解析候補受容体の抽出、光振動エネルギー移動を利用した測定計の効率化、新たなヘテロ二量体の発見、受容体細胞内局在の新知見、並びに受容体内在化の新機構の発見に繋がった。本研究の研究成果は、今後の未だ解析が進んでいないオーファン並びにヘテロ受容体の機能解明に大きく寄与すると考えられたオーファン受容体は、未だ生体内の活性物質が不明な受容体群である。これらの受容体機能を変化させる化合物は、新たな治療に繋がる大きな可能性がある。本研究では、最も困難を伴うステップである、「新規の薬物標的」をオーファン受容体の中から同定する。すなわち、オーファン受容体の天然リガンドと医薬品のリード化合物を、新たな手法で見出す。これまで、リガンドと受容体は、鍵と鍵穴の如く厳密な対応関係にあると考えられてきた。しかし申請者らは、広い親和性を持つ合成ペプチドの同定に成功した。本研究では、この合成ペプチドの広い結合能を、未知のオーファン受容体に対する新規のリガンド探索に利用する。特に、高感度ハイスループット検出系と、質量分析装置を独自に融合させることを特徴とする。特に受容体を発光タンパク質と融合させて、蛍光標識ペプチドとの相互作用を指標に、化合物ライブラリからリガンドを絞り込む。まず検索対象とするオーファン受容体に対し、リガンドを探索する高感度アッセイ系を確立する。2)発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現;細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する必要がある。発光タンパク付加により、受容体の結合能が障害されないことが必要である。3)光振動エネルギー移動の検出系構築;発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動(BRET)を、高感度で検出する測定系を確立する。本研究では、受容体を発光タンパク質と融合させて、蛍光標識ペプチドとの相互作用を指標に、リード化合物や組織抽出液中からリガンドを絞り込む。現時点までで、検索対象とするオーファン受容体を絞り込み、リガンドを探索する高感度アッセイ系の確立に取り組んでいる。1)解析対象オーファン受容体の抽出;in silicoの検索よりペプチドを離岸とする可能性の高いオーファン受容体を抽出した。この際、独自の"Pharmacological lineage analysis"(薬理学的リネージ解析)を用いた。実際にこの解析により、リガンドが既知であるヒト222受容体中より、GnRH受容体が特異的なペプチドに親和性を有することを予測し、実験的に確認した。2)発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現;蛍光あるいは発光タンパク質と受容体を融合させて細胞に強制発現し、機能の解析を行った。細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する必要がある。発光タンパク付加により、受容体の結合能は障害されないことをV1bバゾプレッシン受容体-ルシフェラーゼ融合タンパクで確認している。3)光振動エネルギー移動の検出系構築;発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動を、高感度で検出する測定系を確立する。ATPに対する細胞膜P2X受容体のサブユニット相互作用についてBRETを用いて解析した系を応用することとした。さらに発光タンパク質の付加部位、発光基質の種類、発現量の検討などを行って測定系の高感度化を目指している。オーファン受容体は、未だ生体内の活性物質が未知で機能が未解明である受容体群を指す。これらの受容体の機能を明らかにすることは、新たな治療薬の開発に繋がる。即ち、リガンドが未知のオーファン受容体には、大きな可能性が秘められている。本研究では、創薬研究において最初のチャレンジングなステップである、オーファン受容体の「新規の天然あるいは合成活性物質」を探索する。しかし申請者らは、既知のリガンドが作用する複数の受容体ファミリーに対し、ファミリー間の垣根を越えて結合が可能な、特異な性質を持つ合成ペプチドの同定に成功した。特に、高感度ハイスループット検出系を次のステップにて開発することを特徴とする。1)解析対象オーファン受容体の抽出;最近、申請者らは広範囲の受容体に親和性を有する合成ペプチドを見出した。まず、このペプチドに親和性を有するオーファン受容体を、in silicoの検索より抽出する。この際、独自の"Pharmacological lineage analysis"(薬理学的リネージ解析)を用いる。2)発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現;細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する。

3)光振動エネルギー移動の検出系構築;発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動(BRET)を、高感度で検出する測定系を確立する。「見ながら探す」リガンド探索では、受容体を発光タンパク質と融合させて、蛍光標識ペプチドとの相互作用を指標に、リード化合物や組織抽出液中からリガンドを絞り込む。本年度の研究では、受容体の活性に依存しない探索により、新たなリガンドー受容体ペアを探索した。1)解析対象遺伝子の網羅的抽出;Gタンパク質共役型受容体遺伝子群は種を超えて保存され、そのリガンドも多くの場合高度に保存されている。そこでこの受容体遺伝子群の塩基、アミノ酸配列情報を種を超えて収集した。5千に登る配列情報から分子系統樹を作成し、独自の"Pharmacological lineage analysis"(薬理学的リネージ解析)を用いて、既知のリガンドー受容体のペアから未知のリガンドを予測する解析を進めている。実際に申請者らは、リガンドが既知であるヒト222受容体を対象とし、GnRH受容体の新規リガンド予測に成功し報告した。2)発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現;これまでにも申請者らは、蛍光あるいは発光タンパク質と受容体を融合させて細胞に強制発現し、機能の解析を行ってきた。細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する必要がある。V1bバゾプレッシン受容体-ルシフェラーゼ融合タンパクでは、受容体アミノ基末端に発光タンパク付加しても、受容体のシグナル伝達能が損なわれないことを確認した。さらに、検出にどの程度の受容体発現量が必要か予備実験を行なった。発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動(BRET)を、高感度で検出する測定系の予備実験では、細胞培養ディッシュで培養したままでは検出に限界があり、細胞を一度回収するか膜分画とする必要があることが判明した。本研究では、遺伝子上は存在が確認されているが、未だ生体内の活性物質が未知で機能が未解明である受容体群(オーファン受容体)のリガンドを探索する方法を開発した。研究の進展により、当初計画の課題となる点も見出されたが、解決策を探り、研究を新たな方向に進展させることに成功した。まず成果の1)として、解析対象オーファン受容体を効率よく抽出することに成功した。すなわち、申請者らが発見した広範囲の受容体に親和性を有する合成ペプチドの知見を生かし、このペプチドに親和性を有すると予測されるオーファン受容体を、in silicoの検索より抽出した。この際には、独自に開発に成功した"Pharmacological lineage analysis"(薬理学的リネージ解析)を用いた。成果の2)として、発光タンパク質融合受容体を用いた探索系の確立に成功した。細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加した例に習い、新たに受容体アミノ基末端に付加することを試みた。
液体ヘリウムの熱伝達特性の表面処理及び伝熱面角度依存性

大面積伝熱面からの熱伝達特性の伝熱面角度依存性及び表面処理率依存性について評価を行った。本研究は浸漬冷却型大型超伝導磁石の冷却安定性解析に適用可能な熱伝達の測定を目的としている。サンプルは18mm×76mmの伝熱面を持ち、表面処理として黒化処理を施した。その黒化処理率は0、50、75、90、100%と系統的に変化させた。同時に伝熱面角度依存性の評価を行ったが、角度を0°(伝熱面:水平上向き)90°(伝熱面:垂直)180(伝熱面:水平下向き)と変化させた。次に表面処理率依存性については、表面処理率を0%から100%と増加させることにより限界、最小熱流束の向上が見られた。実験結果では限界、最小熱流束の表面処理率依存性に特異な傾向が見られ、限界熱流束はほぼ50%までは一定でありそれ以上で限界熱流束の増加がはじまる。最小熱流束はほぼ50%までに増加が終了し、それ以上では一定値となるという結果が得られた。この不連続性は黒化処理と銅裸面の核沸騰状態の熱伝達率が異なることに起因するものである。考察の結果、熱伝達特性の表面処理率依存性はそれぞれの表面処理の熱伝達の表面処理率に対する複合則により決定するということが実験結果及び解析により明らかとなった。
ネギの分げつ発生制御におけるジベレリンの役割解明

ジベレリン(GA)およびGA生合成阻害剤(UCZ)処理がネギの分げつ発生に及ぼす影響を調査した結果、分げつの発生はGA処理で促進、UCZ処理で抑制され、UCZによる抑制効果はその後のGA処理によって打ち消された。分げつ性の異なる複数のネギ品種について、内生GA濃度、GA関連遺伝子の発現量およびGAに対する感受性を調査した結果、分げつ性と内生GA濃度との間には正の相関はなかったが、GA処理による分げつ促進作用は、分げつ性の強い品種ほど強く発現した。これらの結果から、GAに対する感受性の違いがネギ品種の分げつ性を決定する重要な要素となっている可能性が考えられた。ネギの分げつ発生制御におけるジベレリンの関与を検証するため、以下の試験を実施した。1.ジベレリンおよびジベレリン生合成阻害剤処理が分げつ発生に及ぼす影響葉ネギ「杭州」へのジベレリン処理は分げつの発生を促進し、ジベレリン生合成阻害剤であるウニコナゾール処理はこれを抑制した。ウニコナゾール処理による分げつ抑制効果は、その後のジベレリン処理によって打破された。5種類のジベレリン(GA_1、GA_3、GA_4、GA_9、GA_<20>)処理はいずれも分げつ数を増加させ、分げつ芽誘導作用を有した。その作用は3β水酸化ジベレリンであるGA_1、GA_3、GA_4のうち、特に、GA_1、GA_3で強かった。これらの結果から、ネギの分げつ発生制御におけるジベレリンの関与を強く示す証拠が得られた。分げつ芽誘導作用における活性型ジベレリンは、伸長促進などの他の作用で活性型とされている3β水酸化ジベレリンであると考えられた。2.ネギの分げつ性と内生ジベレリン濃度との関係分げつ性の異なるネギ6品種を材料として、葉鞘基部中のジベレリン濃度(GA_1、GA_3、GA_4、GA_9、GA_<20>、GA_<34>)を分析し、分げつ性と内生ジベレリン濃度との関係を調査した。分析の結果、ネギには早期13位水酸化ジベレリン(GA_1、GA_3、GA_<20>)に比べて早期非水酸化ジベレリン(GA_4、GA_9、GA_<34>)が高濃度に含まれ特に、多量のGA_<34>の蓄積が認められた。活性型ジベレリンと考えられるGA_4濃度と分げつ性との間に関連は認められず、むしろ、多分げつ性品種「杭州」のGA_4濃度は他の5品種に比べて低かった。一方、GA_3濃度はGA_4濃度より格段に低いものの、分げつ性の強い品種で高い傾向が認められた。以上の試験では、分げつ性と内生ジベレリン濃度との関係を十分に解明することはできなかったため、次年度はこれを明確にするため、より局部的なジベレリン濃度の分析、また、各品種のジベレリンに対する感受性と分げつ性との関係解明を行う予定である。。試験1(ネギの分げつ性と内生ジベレリン濃度との関係)分げつ性の異なるネギ品種のジベレリン濃度およびジベレリン関連遺伝子の発現量を比較した。分げつ芽の分化部位である茎頂付近のジベレリン濃度をLC-MS/MSで定量した結果、GA_1、GA_3、GA_4、GA_9、GA_<34>濃度はいずれも、強分げつ性品種「小春」に比べて、弱分げつ性品種「羽緑一本太」で高く、内生ジベレリン濃度と分げつ性との間に正の相関は認められなかった。ジベレリンの生合成と不活性化に関わる3種類の酵素(GA 20-酸化酵素、GA 3-酸化酵素、GA 2-酸化酵素)遺伝子の発現量はいずれも「小春」に比べて「羽緑一本太」で高く、これら2品種のジベレリン濃度の違いを裏付ける結果が得られた。試験2(ネギの分げつ性とジベレリンに対する感受性との関係)分げつ性の異なる3品種(「杭州」、「湘南」、「吉蔵」)のネギ苗に対して、ジベレリン処理を行い、分げつ促進効果の発現を調査した。ジベレリン処理の効果は、分げつ性の最も強い「杭州」で最も強く発現し、次いで、分げつ性が中程度の「湘南」で強かった。分げつ性の最も弱い「吉蔵」では、ジベレリンによる分げつ促進効果はほとんど認められなかった。このように、ジベレリン処理に対する感受性は分げつ性の強い品種ほど高いことが明らかとなった。
ナノ制御したダイヤモンド表面の生体分子吸着によるFET型バイオセンサーの開発

本研究プロジェクトにおいて、昨年度までに(1)ダイヤモンド表面の終端元素改質、(2)電解質ゲートトランジスタの開発および動作モデルの構築、(3)改質したダイヤモンド表面への生体分子の固定と、傾向顕微鏡による評価。などの成果が得られている。これらの成果をふまえて、以下の研究を行った。1)電解質ゲートトランジスタ表面の官能基のプロトン化、脱プロトン化によるトランジスタ動作変化、安定性上限について実験およびイオン拡散モデルによる定量的な評価を行った。2)DNAやタンパク質がダイヤモンド表面に吸着した際のポテンシャル変化と、電解質ゲートトランジスタのチャネル領域へDNAやタンパク質を固定した際に得られる出力電流・閾値電圧の変化をポワッソン方程式および電流連続の式を用いた二次元デバイスシミュレータを用いて検証した。3)電解質ゲートダイヤモンドトランジスタのゲート絶縁領域へ一本鎖DNAを固定し、相補的、非相補的DNAによる処理を行い、相補的DNA処理による負電荷増加で引き起こされる闘値電圧シフトを評価する。4)上記電解質ゲートトランジスタ、およびサイドゲートトランジスタを微細化し、溶液中での動作が可能であるかを検討した。5)同一基板上に複数のチャネル修飾を有する電解質ゲートトランジスタを形成し、これらの特性(感応性)変化を評価した。6)単一生体分子検出に必要な0.1μm以下のゲート長を有する電解質ゲートトランジスタを試作・評価した。7)タンパク質センサへの発展を試みるために、(1)ダイヤモンド表面へのタンパク質・脂質膜の固定、(2)チャネル上へ固定したタンパク質・および脂質膜に固定による伝導性の変化を調査した。ダイヤモンドは、化学的安定性や広いポテンシャルウィンドウで未来の生体適合型バイオセンサー材料として期待されている。近年、溶液中で動作するダイヤモンド電解質ゲートFETが開発され、pH感応性等が調査されている。ダイヤモンドでは表面の終端元素の差によって官能イオン種が変化するため、化学的修飾方法を開発しその特性を調査することはバイオセンサー開発に重要である。そこで代表者は、ダイヤモンドへの化学修飾を目的としていくつかの手法を開発した。まず、プラズマを用いて水素終端ダイヤモンド表面をアミノ化、フッ素化した。アミノ化は水素/窒素混合ガスプラズマを用いて行った。表面結合状態はXPSで測定を行い評価した。プラズマ処理を行ったダイヤモンド基板はClsに窒素吸着によるピークシフトが見られ、表面の親水化による水分吸着でOlsのピークが見られた。また、C_3F_8プラズマ中に基板をさらすことによりフッ素終端ダイヤモンドが得られ、疎水性(超撥水性)表面が得られた。XPS測定では、Flsの大きなピークが見られた。超撥水性により、表面吸着による酸素ピークは見られなかった。また、フッ素終端表面中にパターニングしたアミノ基修飾表面を形成し、Cy5標識試薬を用いて表面チャージを確認したところ、アミノ基による修飾表面が正に帯電していることがわかった。これは、アミノ基が溶液中でプロトン化し、大きな表面電荷をもっていることが要因である。さらに、アミノ化表面に一本鎖DNAを修飾し、さらにこれと相補的な蛍光標識修飾DNAをハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡観察した。DNAを修飾したアミノ化表面と、フッ素化表面では蛍光差が得られ、ダイヤモンドの表面化学修飾が確認された。前年度の研究成果を踏まえ、以下の技術の開発と展開を行った。1)ダイヤモンド表面を直接アミノ化する技術を開発した。アンモニアガス雰囲気中にダイヤモンドを暴露し、UV(254,185nm)を照射することにより水素終端表面からアミノ終端表面に改質することに成功した。このアミノ終端表面はシランカップリング剤などを用いたアミノ基と違い、直接ダイヤモンド表面に存在するため、生体分子の吸着によるポテンシャル変化をダイヤモンド表面に伝達しやすく、DNAなどの生体分子認識が可能な電解質溶液ゲートFET開発に重要な技術である。2)ガス導入が可能な電子線リソグラフィー装置を用いて、ダイヤモンド表面に酸素ガスを噴射しながら電子線照射を行った所、ダイヤモンド表面の伝導性が35桁低下することが分かった。これは電子線照射で得たエネルギーで表面終端水素が酸素原子に置換することにより、水素終端表面伝導層が消失したものだと考えられる。伝導性の消失と同時に、二次電子放出効率の低下も認められている。また、フッ素終端表面に水素ガス噴射環境下で電子線照射することにより、伝導性が回復することも分かっている。現在では12ミクロンでの表面終端元素の置換が可能となっている。3)ナノダイヤモンドへの生体分子固定を実施した。爆射法を用いて水中で合成した超分散性ナノダイヤモンド粒子(粒径535nm)の表面に存在するカルボキシル基にEDC/NHS試薬を用いてアミノ化DNA(Cy5修飾)を固定し、蛍光顕微鏡観察にて評価を行った。DNA、もしくはナノダイヤモンド粒子単体では蛍光像は得られなかったが、DNAを固定したナノダイヤモンド粒子では蛍光像が得られた。処理中のpH環境下(pH=7.4)ではナノ粒子のゼータ電位が低下するために、DNA修飾したナノダイヤモンド粒子が部分的に凝集していることが認められた。

2)DNAやタンパク質がダイヤモンド表面に吸着した際のポテンシャル変化と、電解質ゲートトランジスタのチャネル領域へDNAやタンパク質を固定した際に得られる出力電流・閾値電圧の変化をポワッソン方程式および電流連続の式を用いた二次元デバイスシミュレータを用いて検証した。3)電解質ゲートダイヤモンドトランジスタのゲート絶縁領域へ一本鎖DNAを固定し、相補的、非相補的DNAによる処理を行い、相補的DNA処理による負電荷増加で引き起こされる闘値電圧シフトを評価する。4)上記電解質ゲートトランジスタ、およびサイドゲートトランジスタを微細化し、溶液中での動作が可能であるかを検討した。5)同一基板上に複数のチャネル修飾を有する電解質ゲートトランジスタを形成し、これらの特性(感応性)変化を評価した。6)単一生体分子検出に必要な0.1μm以下のゲート長を有する電解質ゲートトランジスタを試作・評価した。7)タンパク質センサへの発展を試みるために、(1)ダイヤモンド表面へのタンパク質・脂質膜の固定、(2)チャネル上へ固定したタンパク質・および脂質膜に固定による伝導性の変化を調査した。
視覚障害者歩行時の聴覚錯誤による事故の防止に関する研究

視覚障害者の歩行時に列車通過音や大型トラックの騒音等、突発的な騒音が発生した場合、方向が分からなくなるような錯誤が発生することがある。特に、鉄道駅プラットホームの空間で発生した場合、死亡事故に繋がるケースもある。本研究では、新幹線ホームで列車通過時の騒音を録音し、実験空間内でその音源を基にして聴感歩行実験を行ったところ、聴覚錯誤が発生していることが確認できた。その他、特に残響時間の長い空間内での聴感実験では聴覚錯誤が起きることが確認できている。今回の実験では、それがどのようなメカニズムで発生しているのか、詳細な内容までは突き詰められなかったが、突発的な騒音が発生した場合に錯誤が起きることは明らかとなった。本研究は、視覚障害者の歩行を対象として、聴覚錯誤による事故発生の要因を明らかにし、その防止策を提案することを目的として進めているが、今年度は特に、駅プラットホームからの転落事故が絶えないこともあり、鉄道駅の音響測定調査や実験室における歩行実験などで得た成果を報告する。今年度は鉄道駅より協力を得て、駅プラットホームでの空間音響特性や列車通過音など、様々な音響測定を実施することができた。視覚障害者が鉄道駅ホームを歩行していることを想定した実測調査であるため、ダミーヘッドマイクロホン(以下、ダミーヘッド)を歩行速度と同様に移動して測定した。そのため、移動体は移動の際に車輪の音などが発生しないことや、ダミーヘッド本体と測定機材を登載できることが条件となる。そこで、音響測定には車いすを利用した。測定に必要な装置の電源などは、ポータブルバッテリーを使用して確保した。今回、利用した測定システムは、身長が約150cmであった。音響測定調査の結果、調査した駅プラットホームはかなりの残響時間があり、視覚障害者にとってはアナウンス音の聞き取りや空間把握に多少なりとも影響があることが分かった。また、列車通過時には100dB以上の騒音値を確認できたことから、歩行には影響があることが予測される。また、駅プラットホームで収録した列車通過音などの音響データを利用して、晴眼者による実験室での歩行実験を実施した。11名の被験者に協力を得て、アナウンス放送時や列車通過時など、様々な音響環境下で歩行し、被験者のほとんどが、列車通過時には通常の歩行状況と異なる影響が出ていた。今後も、音響測定調査や歩行実験を繰り返し行ない、事故防止策について研究を進めていく。本研究は、視覚障害者の歩行を対象として、聴覚錯誤による事故発生の要因を明らかにし、その防止策を提案することを目的として進めている。今年度は、交付申請書の研究実施計画にも示したように、平成20年度の研究で実施済みの、鉄道駅プラットホーム上で測定したダミーヘッドマイクロホンにより収録した音場データをもとにして、聴感歩行実験を実施した。鉄道駅プラットホーム上の歩行を想定した晴眼者による歩行実験を大空間において繰り返し実施した。プラットホームで新幹線の通過時を想定した騒音で、歩行にどのような影響を及ぼすか、実験検討してきたが、通過していく列車に吸い寄せられるような歩行パターンも見られ、実際にホームを歩行していればかなり危険な事故に繋がる状況が確認された。それがどのような聴覚のメカニズムで発生しているのか、心理的な状況も含めて更なる実験や調査が必要である。また、今年度は、屋外歩道における音響測定調査を実施した。屋外での視覚障害者歩行時に大きな影響を与える騒音として、道路の工事騒音や建設騒音、バイクやトラックの排気音、クラクションなどが挙げられており、それらの実際の現場における音響測定調査を実施した。測定は国道の歩道で交通量の多い場所を選定して実施したが、測定予定以外の航空機の騒音や宣伝カーの音場条件としても収録することができた。騒音計による測定と同時にダミーヘッドマイクロホンによる音響測定も同時並行で実施したので、これらの音源も今後の聴感歩行実験に利用していけるものと考える。本研究は、視覚障害者の歩行を対象として、聴覚錯誤による事故発生の要因を明らかにし、その防止策を提案することを目的として進めてきた。本年度の研究実施計画としては、視覚障害者歩行時の移動音源の同定に関する研究として、昨年度まで、駅プラットホーム上で測定したダミーヘッドマイクロホンにより収録した音場データをもとにして、晴眼者による歩行実験を予備的に実施してきたが、聴覚錯誤の正確なメカニズム解明には至らなかったこともあり、本年度の計画上は、実験室における聴感実験を実施し、聴覚錯誤のメカニズムを解明するために固定音源及び移動音源を使用した聴感実験を通して、聴覚錯誤を明らかにしていくことを目的とした。本年度の研究実績の中で工夫した点は、聴感実験のための音源の同定に関する実験の設備を構築したことである。実験にはデジタルミキサーを使用し、スピーカー8chから交互またはランダムに音を発生させるシステムの構築をした。このシステムを利用して、被験者に音源の位置を示してもらう予備的な実験を行った。

固定音源(音源にはホワイトノイズを使用)を利用した実験では、実際の音源と被験者が認知した音源の位置とはどの程度方向誤差が生じるかを観察した。被験者の周りに円を描くようにスピーカーを8個配置し、音をランダムに発生させて聴感できた位置と実際の音源の位置について方向誤差を計測した。聴感実験の結果、180°の誤差が生じた被験者が数名おり、聴覚錯誤が発生していることが確認できた。本年度は移動音源に関する実験やメカニズムの解明までには至らなかったものの、聴覚錯誤の事象を確認することができた。今後、更に実験を繰り返し行い、メカニズムの解明をして事故の防止策を提案していきたい。
希土類含有ぺロブスカイト化合物の多形構造と磁気的性質

ぺロブスカイト型酸化物ABO3の物性を決定するBサイトに希土類(4f電子系)とオスミウム(5d電子系)を含む複合酸化物を新規合成した。オスミウムと希土類はBサイトでNaCl型に構造秩序していることをX線回折測定、中性子回折測定より明らかにした。磁化率、比熱測定から低温(2.4-100 K)で反強磁性転移していることを見出した。磁気比熱から磁気エントロピーを算出し、この磁気転移にはオスミウムと希土類のスピンが関与していることを定量的に示した。Nd化合物については中性子回折から磁気構造(type I)を決定した。Euメスバウア分光測定を行い、反強磁性秩序状態での電子状態を明らかにした。ペロブスカイト型化合物は、強誘電性、イオン伝導性、超伝導性、巨大磁気抵抗、触媒機能性など多彩な機能を発現、これまで多くの研究がなされてきた。しかし、その大部分は第一遷移金属がペロブスカイトABO3のBサイトに入った酸化物で、サイズの大きな希土類元素はペロブスカイトを構成しても物性を決定するBサイトに入らずAサイトに入ってしまい、その結果、希土類元素に由来する物性の報告はほとんどない。そこで希土類が物性の主役となったぺロブスカイト型複合酸化物の多形構造とその磁気的性質を調べるため、ペロブスカイトABO3の物性を決定するBサイトに希土類とサイズの小さな遷移金属を組み合わせた複合酸化物の合成に挑んだ。今年度は遷移金属としてオスミウムを選び、ペロブスカイトABO3(A=Ba)のBサイトをオスミウムと希土類が1:1の比で占める複合酸化物の合成に成功した。オスミウムと希土類はNaCl型にBサイトで構造秩序していること、そのBO6八面体は隣の八面体と頂点共有していること、結晶の対称性は高くほぼ立方晶であることなどの構造に関する知見を得た。磁化率、比熱の測定から低温で反強磁性転移し、その転移温度はBサイトの希土類の種類により、かなり変化する(2.5-100K)ことなどを見出した。磁気エントロピーの解析から、いずれの磁気転移にも、オスミウムと希土類のスピンが関与していることを定量的に示すことができた。希土類(4f電子系)のみなら磁気秩序してもせいぜい10-20Kであろうが、オスミウムの5d電子との相互作用により、強い磁気秩序を引き起こしたわけである。希土類が物性の主役となったぺロブスカイト型酸化物の多形構造とその磁気的性質を調べるため、ぺロブスカイト型酸化物ABO3の物性を決定するBサイトに希土類(4f電子系)とサイズの小さな遷移金属(4d、5d電子系)を組み合わせた複合酸化物を合成し、磁気的性質から希土類が示す物性、f-d混合電子が示す新たな物性、挙動を解明することを目的とした。希土類と遷移金属の比を変え、BO6八面体の並びに特異な積層構造を持たせ、これまでにない物性の発現と挙動解明を目指した。今年度の研究では、ペロブスカイトABO3の物性の中心的役割を果たすBサイトに、確実に4f電子系希土類元素を入れるため、サイズの小さなオスミウム(5d電子系)と組み合わせることで、ぺロブスカイトのBサイトでオスミウムと希土類を構造的に秩序化させたダブルぺロブスカイトの合成に成功した。オスミウムと希土類はBサイトでNaCl型に構造秩序していることをX線回折測定、中性子回折測定から明らかにした。磁化率、比熱測定から低温(2.5-100 K)で反強磁性転移していることを見出した。Nd化合物については中性子回折から磁気構造を決定した。さらに、Eu化合物ではEuメスバウア分光測定を行い、反強磁性秩序している状態での内部磁場を決定した。希土類が物性の主役となったぺロブスカイト型酸化物の多形構造とその磁気的性質を調べるため、ぺロブスカイト型酸化物ABO3の物性を決定するBサイトに希土類(4f電子系)とサイズの小さな遷移金属(4d、5d電子系)を組み合わせた複合酸化物の合成に挑んだ。磁気的性質から希土類が示す物性、f-d混合電子が示す新たな物性、挙動を解明すること、希土類と遷移金属の比を変え、BO6八面体の並びに特異な積層構造を持たせ、これまでにない物性の発現と挙動解明を目的とした。

これまで物性の表舞台に出ていなかった希土類元素と、4d、5d遷移金属がペロブスカイト構造中で示す新たな性質の発見が期待でき、物質科学としての新しい展開と新機能性物質の開発をめざした。ペロブスカイトABO3の物性の中心的役割を果たすBサイトに、確実に4f電子系希土類元素を入れるため、サイズの小さなルテニウム、オスミウム(4d、5d電子系)の遷移金属と組み合わせることで、構造的に秩序化させたペロブスカイト化合物をデザイン、系統的に新規合成し、その結晶構造を解析した。Bサイトに入る金属元素の比を1:1と選ぶことにより、隣り合うBO6八面体が頂点共有した"秩序化ペロブスカイト型酸化物"の合成に成功した。合成した化合物の結晶構造をX線回折測定し、リートベルト解析から、Bサイトに入った希土類元素とルテニウム、オスミウムはNaCl型に秩序配列していることがわかった。磁化率測定と相補的な関係にある比熱測定を行い、磁気転移を見出した。比熱測定データから磁気エントロピーを解析し、磁気転移温度でどの磁性イオンが秩序しているか、明らかにした。研究はおおむね順調に進んでいる。しかし、磁気秩序が見られた化合物については、中性子回折からその磁気構造を決定することにしていたが、研究用原子炉(茨城県東海村にある日本原子力研究開発機構に設置されている全国大学共同利用施設)が平成23年度と同様、平成24年度も稼働しなかったので中性子回折実験が行えず、この点については研究が進んでいない。おおむね順調に研究は進んでいるが、磁気秩序が見られた化合物については、中性子回折から磁気構造を決定することにしていたが、研究用原子炉(茨城県東海村の日本原子力研究開発機構に設置されている全国大学共同利用施設)が平成23年度は稼働しなかったので中性子回折実験が行えず、この点については進んでいない。【合成】1初年度、前年度で得た結果、経験をもとに、遷移金属として、ビスマス、アンチモンを選び、これと希土類元素がオーダリングした秩序化ペロブスカイト化合物A2BB'O6, A3BB'2O9等の新規合成を試みる。B元素、B'元素が構造的にオーダリングする場合、しない場合について、その原因を結晶化学の視点から考察する。その結果をもとに、Aサイトに入る元素をアルカリ土類金属(+2価)だけでなく、アルカリ金属(+1価)、Laなど+3価をとる金属元素を入れ、Bサイトに入る金属元素の酸化状態を変えた化合物について、検討する。2秩序化ペロブスカイト化合物にさらに伝導性を持たせるために、酸素原子を硫黄原子で置き換えた複合硫化物A2BB'S6、A3BB'2S9等の新規合成に挑戦する。このため、出発物質の酸化物をCS2/N2雰囲気下で硫化物に変え、それらを目的の金属比に秤量し、封管中で合成反応を行なう。【構造解析、物性】<平成23,24年度>と同様、X線回折、中性子回折、磁化率、比熱等の測定を行い、合成した新規化合物1、2の結晶構造、電子構造、磁気的性質を主とした物性を測定・解析し、d-f混合電子系の示す新しい物性の探索を行なう。さらに、必要に応じ、メスバウア分光測定、電子スピン共鳴(ESR)測定を行い、Bサイトイオンの内部磁場、結晶電場、化学的環境に関する知見を得る。磁性イオンの局所構造、およびその磁性イオンと周りとの磁気的挙動を明らかにするためには、メスバウア分光測定は有効な研究手段であり、希土類元素については151Euを、また遷移金属については57Feを、磁性イオンサイトにドープし、局所構造に関する情報を得る。初年度の結果、経験をもとに、遷移金属として、ロジウム、パラジウム(4d電子系)を選び、これと希土類元素がオーダリングした秩序化ペロブスカイト化合物A2BB'O6, A3BB'2O9等の新規合成を試みる。
小児の急性リンパ性白血病治療における有害事象に関わる遺伝子多型の解明

急性リンパ性白血病(ALL)は最も頻度の高い小児がんである。ALLの治療成績の改善はめざましく、約80%に長期生存が期待できるが、化学療法に伴う治療毒性は大きな問題である。近年のゲノム薬理学の進歩により、治療毒性に関わる遺伝子変異が同定されてきたが、人種による差異が大きい。本研究の第1の目的は、欧米でこれまで同定された遺伝子変異が我が国のALL患児において意義を有するかどうかを明らかにすることである。第2の目的は、全ゲノムシーケンス解析を行い、探索的に日本人ALL患児における治療毒性と密接に関連する遺伝子多型(変異)を発見することである。79人の急性リンパ性白血病の患者を対象に大量メソトレキサート(MTX)療法におけるMTXのクリアランスと関連する遺伝子多型としてSLCO1B1、SLC19A1、ABCB1、ABCC2、ABCG2、MTHFRの5種類の遺伝子を検討した。その結果、MTHFRの遺伝子多型とMTXのクリアランスとの間に相関がみられた。本年度は223人の患者を対象にGWAS(ゲノムワイド関連解析)を行った。6-メルカプトプリン(6-MP)の血液毒性に有意に相関する遺伝子多型としてNUDT15遺伝子が同定された。これは既報に一致する多型で、アジア人に多い。なお、我々の今までの報告に基づき、ALL患者におけるNUDT15の遺伝子多型検査が保険収載された。急性リンパ性白血病治療中にアスパラギナーゼによる重症膵炎を発症した17人の患者にみられる遺伝子多型を網羅的に検討するプロジェクトが計画され、実際に患者検体が収集された。現在遺伝子解析を行っている。小児の急性リンパ性白血病治療においては薬剤による毒性により治療変更を強いられることが起こりうる。大量MTX療法施行時には血中濃度の遷延が大きな問題である。ついで維持療法期間に1年以上にわたって毎日投与される6-MPについてはNUDT15の遺伝子多型が大きな意味を有することが明らかになったが、実際にはNUST15の何種類の遺伝子多型(ディプロタイプ)があるのか、またリスク多型があった場合の6-MPの至適投与量は決定していない。最後に、アスパラギナーゼによる有害事象は重篤で、重症膵炎が起こると治療が中断され、またアナフィラキシーが起こると同薬剤の続投が不可能となり、予後を悪化させる要因となる。平成31年度は当初の計画通りの研究を遂行する予定である。聖路加国際病院および東京小児がん研究グループ(TCCSG)で過去に治療が行われた患者のうち、有害事象を発症した患者を対象とする。予想される症例数は30-50である。患者の生殖細胞系列検体(末梢血または口腔粘膜等)からDNAを抽出し、全ゲノムシーケンス解析を行い、患者にみられた有害事象と統計的に有意に相関する候補遺伝子とを探索する。また、治療毒性のある患者の多型頻度が1000Genomesデータベース等の日本人における多型頻度と大きく乖離する遺伝子多型についても抽出する。毒性の発現した対象患者で候補となった遺伝子多型を新たなValidation cohortでも関連性の高い遺伝子多型であるかを確認する。この計画遂行について現在、特段の課題はないと考えている。6-メルカプトプリン(6-MP)の血液毒性とNUDT15の遺伝子多型についての研究では、ホモ変異型とコンパウンドヘテロ変異型を有する患者に対する6-MPの至適投与量の決定が必要である。これらの遺伝子多型を有する患者33人について、実際の投与量と毒性などの臨床情報を調査しているところである。

ついで維持療法期間に1年以上にわたって毎日投与される6-MPについてはNUDT15の遺伝子多型が大きな意味を有することが明らかになったが、実際にはNUST15の何種類の遺伝子多型(ディプロタイプ)があるのか、またリスク多型があった場合の6-MPの至適投与量は決定していない。最後に、アスパラギナーゼによる有害事象は重篤で、重症膵炎が起こると治療が中断され、またアナフィラキシーが起こると同薬剤の続投が不可能となり、予後を悪化させる要因となる。平成29年度は、MTX大量療法時のクリアランスに関連する遺伝子多型としてMTHFRの意義を明らかにした。またNUDT15のリスクアリルを有する患者の臨床情報の収集を進めている。最後に重症膵炎患者のリクルートが終了し、DNAの解析を開始した。急性リンパ性白血病(ALL)は最も頻度の高い小児がんである。ALLの治療成績の改善はめざましく、約80%に長期生存が期待できるが、化学療法に伴う治療毒性は大きな問題である。近年のゲノム薬理学の進歩により、治療毒性に関わる遺伝子変異が同定されてきたが、人種による差異が大きい。本研究の第1の目的は、欧米でこれまで同定された遺伝子変異が我が国のALL患児において意義を有するかどうかを明らかにすることである。第2の目的は、全ゲノムシーケンス解析を行い、探索的に日本人ALL患児における治療毒性と密接に関連する遺伝子多型(変異)を発見することである。79人の急性リンパ性白血病の患者を対象に大量メソトレキサート(MTX)療法におけるMTXのクリアランスと関連する遺伝子多型としてSLCO1B1、SLC19A1、ABCB1、ABCC2、ABCG2、MTHFRの5種類の遺伝子を検討した。その結果、MTHFRの遺伝子多型とMTXのクリアランスとの間に相関がみられた。本年度は223人の患者を対象にGWAS(ゲノムワイド関連解析)を行った。6-メルカプトプリン(6-MP)の血液毒性に有意に相関する遺伝子多型としてNUDT15遺伝子が同定された。これは既報に一致する多型で、アジア人に多い。なお、我々の今までの報告に基づき、ALL患者におけるNUDT15の遺伝子多型検査が保険収載された。急性リンパ性白血病治療中にアスパラギナーゼによる重症膵炎を発症した17人の患者にみられる遺伝子多型を網羅的に検討するプロジェクトが計画され、実際に患者検体が収集された。現在遺伝子解析を行っている。小児の急性リンパ性白血病治療においては薬剤による毒性により治療変更を強いられることが起こりうる。大量MTX療法施行時には血中濃度の遷延が大きな問題である。
先進的地熱抽出のための貯留層き裂の3次元同定法の構築

現代地熱抽出では人工き裂を貯留層の核のひとつとして導入するのが一般である.これは,より効率的かつ大規模な熱抽出を可能とするためである.この人工き裂は堆積岩のなかでは1個の卓越したき裂として形成されることが多い.本研究は,この人工き裂を,内部を流体に満たされた3次元き裂としてモデル化し,き裂の広がり,位置,流体通路としての特性,例えば局所的流動抵抗などのき裂情報を,弾性波を照射したときの,き裂の応答から,推定するための方法を提示し,さらに,フィールドデータへの適用性を明らかにした.現代地熱抽出では人工き裂を貯留層の核のひとつとして導入するのが一般である.これは,より効率的かつ大規模な熱抽出を可能とするためである.この人工き裂は堆積岩のなかでは1個の卓越したき裂として形成されることが多い.本研究は,この人工き裂を,内部を流体に満たされた3次元き裂としてモデル化し,き裂の広がり,位置,流体通路としての特性,例えば局所的流動抵抗などのき裂情報を,弾性波を照射したときの,き裂の応答から,推定するための方法を提示し,さらに,フィールドデータへの適用性を明らかにした.本研究は4つのサブテーマからなっている.すなわち(1)流体包有き裂の3次元動特性の解明(林),(2)室内実験による検証(関根,林),(3)フィールド実験データの解析と解釈(森谷,林),(4)き裂同定逆解析法の構築とそのフィールドへの適用である(伊藤). (1)は本研究の核であり,全体の展開を律速するものであるのでただちに,この解析を開始し,動特性の大略を把握することを試みた. (2)においては, (1)の進展状況を踏えつつ,実験モデルを作製するとともに計測システムを構築した.計測システムはレーザードップラー振動計,コントローラーとデータ集積解析部からなる.試験片は,透明なアクリルで作製されている.レーザ一照射光の試験片表面による反射のみならず表面を透過し,試験片内部境界(すなわち,き裂面)で直接反射してくる波を観測できるように配慮されている.ただし,本計測システムでは,このような配慮をしたのは一箇所のみである.他の計測点では加速度センサを用いた.実験は円板状き裂の軸対称変形の場合で,しかも安定した結果の出やすいケースを取り上げ,予備実験をくり返し習熟度を高めることに専念した. (3)では,東北大学東八幡平フィールドで水圧破砕時や注水試験時に計測された弾性波の周波数特性を解析するとともに,取りあげる各フィールドの特徴を明らかにしておく.本研究では東人幡平フィールドのほかにフランスのソルツフィールドおよびオーストラリアのクーパーベイスンフィールドの解析も視野に入れているが,その実施は2年度以降とする.本年度は対象フィールドを,東八幡平フィールドに限定した.基本的問題点の抽出を図ったためである.室内実験ではまだき裂波と見られる波は見つかっていない。慎重な検討の結果、エポキシを試験片素材として選んだことに主因があるのではないかという、結論に達した。そこでこれに代わるものとしてアルミ合金を選定した。今後は両者を併用する。エポキシの動弾性的な性質は、岩石よりはむしろ水に近い。数値シミュレーションでは、いまだ完全3次元のプログラムは完成していない。軸対称3次元で諸因子の効き方を推定し、完全3次元数値シミュレーションの初期値となるデータを、準備している。東北大学東八幡平実験場の地下き裂のキャラククリゼーションを3次元軸対象モデルを使って実施した。同フィールドは、強熔結凝灰岩を地質とする典型的な火山灰である堆積岩体である。そこには、地下約370mの深さに1枚のき裂が水圧破砕で作成されている。き裂には2本の坑井が接続されており、これら2本のうちの1本は、貯留層圧を制御するために使う。残りの坑井とき裂の交点には、ハイドロフォンが設置され、き裂内水圧つまり、貯留層圧をモニターする。震源としては、近接する坑井のドリリングノイズを用いた。結果は、以下の通りである。すなわち、貯留層圧力をゲージ圧で0MPaから3.5MPaまであげると開口幅は約1.8MPaで、大きく階段的に増大することがわかった。一方、き裂サイズ、き裂面接触剛性は、逆に、約1.8MPaで、急激に減少することがわかった。また、これらの個々のキャラクタライズされた値は、き裂サイズが約30m、開口幅が約0.4mm、き裂面接触剛性が約0.08mmであった。水圧破砕を実施すると網目状のき裂群からなる貯留層が形成されると言われている。しかし、溶結凝灰岩などの体積岩中に水圧破砕を行った場合、き裂群でなく、1ないし数枚のき裂が人工熱交換面あるいは人工の流路として機能するようになることが多い。本研究は能動的地熱抽出におけるこれらの卓越き裂について、その力学的および幾何学的特長を同定する手法の開発を目的とする研究である。室内実験により、き裂波と呼ばれる波を検出すべく東北大および秋田県立大で実験を行ったが、明瞭にき裂波と断定することの出来る境界波を検出することは困難であった。秋田県立大では、試験片の形状及び材質も種々変化させて実験を行うとともに、あわせて動的有限要素解析を実施し、計算及び実験の両面からアプローチを試みたが、室内実験での境界波の検出は困難であった。

これに対し、フィールドデータからの境界波の検出は比較的容易であり、これを用いて、本学東八幡平HDR(Hot Dry Rock)テストサイトならびにオーストラリアのCooper Basin HDRテストサイトで得られたフィールドデータの解析を試みた結果、極めて良好と思われる同定結果が得られた。東八幡テストサイトを例に取ると、以下のごとくである。本研究で得られた透水率は、3×10^<-12>-4×10^<-10>m^2であった。一方、同フィールドでは、き裂を層状の流路に置き換えて透水率を計測するトランスミッシビティテスト(この方法は、本研究では研究対象としては取り上げていない)を実施して透水率を推定している。結果は、5×10^<-12>-5×10^<-11>m^2であった。両者はよく整合している。
エビタケ由来ビリルビンオキシダーゼの反応機構と構造

本研究では、エビタケ由来のビリルビンオキシダーゼについて、反応速度論的および構造論的研究を行った。1.反応速度論的研究:本酵素はビリルビンの他にアスコルビン酸やフェノールなどを基質とするので、これらに対する速度パラメータを測定した。ジタウロビリルビン、アスコルビン酸に対するKm、K_<cat>はそれぞれ8.4±0.6muM、1.7±0.2mM、490±20s^<-1>、75±3s^<-1>と求められた。また本酵素の酸素に対するKm、K_<cat>はそれぞれ110±10muM、160±10s^<-1>となった。次に本酵素は、各種陰イオンによって活性が阻害されるが、その中で最も阻害の強いN_3^-の阻害について、その阻害形式と阻害物質定数を調べた。その結果、N_3^-はアスコルビン酸に対しては非拮抗的に阻害し、その阻害物質定数(Ki)は0.36±0.05muMであった。これに対して、もう一つの基質である酸素に対しては、Ki値が0.36±0.06muMとほぼ等しいものの、阻害形式は不拮抗型であった。またN_3^-、はアスコルビン酸によるタイプ1銅の還元速度にほとんど影響を与えなかった。以上の結果より、N_3^-はアスコルビン酸や酸素とは異なる部位に結合して酵素活性を阻害すると推定された。2.構造論的研究:遺伝子のクローニングを行うために、酵素の部分アミノ酸配列を決定した。まず本酵素を臭化シアン分解およびリシルエンドペプチダーゼ消化を行い、分離したペプチドをプロテインシーケンサーにかけることにより、約580残基中200残基以上のアミノ酸配列を決定することが出来た。この結果を用いてPCR法でクローニングを行い、ほぼ全長を含む2つのポジティブクローンが得られ、現在ケ-ケンシング中である。一方、X線結晶構造解析を行うための単結晶の調製を種々の条件で試みた所、(NH_4)_2SO_4より一辺が約0.10.2mmのサイコロ状の結晶が得られた。現在、得られた結晶の結晶学的性質について検討中である。
歯周疾患における歯槽骨吸収シグナルの解明と治療法の開発

研究計画書に記載した「Two-hybrid法を用いたTRAF6結合因子の同定」、「歯周炎モデルマウスの作成とLPSの作用機構の解析」、「モデルマウスを用いた治療法の開発」は現在研究継続中である。その他得られた結果は以下のとおりである。1.MyD88欠損マウスとTRIF欠損マウスを用いて、LPSとIL-1によるRANKL発現誘導はMyD88シグナルのみを必要とし、TRIFシグナルは関与しないことを明らかにした。2.菌体成分ムラミルジペプチド(MDP)はNod2シグナルを介し、LPSとIL-1によるRANKL発現誘導を更に促進することを明らかにした。3.PGE_2は破骨細胞前駆細胞のEP4に直接作用し、cAMP-PKAシグナル系を介して、RANKLが誘導する破骨細胞への分化を更に促進した。一方、EP4を破骨細胞に強制的に発現させると、EP4はカルシトニン刺激と同様にcAMP-PKAシグナル系を介して骨吸収活性を強力に抑制した。4.ヒト破骨細胞形成系を確立した。ヒト破骨細胞に対するカルシトニンの作用を解析した。ヒト破骨細胞においては、PKAとPKCの両シグナル系がカルシトニンによる骨吸収抑制に関与する可能性が示唆された。ヒト破骨細胞前駆細胞は、PGE_2に反応して、破骨細胞分を抑制する液性因子を産生することを明らかにした。5.骨誘導因子(BMP)を筋肉内に移植すると、骨芽細胞(OB)の出現と同時期に破骨細胞(OC)も移植片に出現する。この実験系を用いて、RANKLとM-CSFの産生以外に、骨芽細胞は破骨細胞形成に必要な微細環境を提供することが示された。多くの菌体成分の受容体としてToll-様受容体メンバー(TLRs)が働くことが示され、菌体成分の作用の解析が急速に進んでいる。一方、ペプチドグリカン(PNG)の構成成分であるムラミルジペプチド(MDP)は,細胞内のシグナル伝達因子であるNod2を介して作用を発現する。我々は、破骨細胞形成に対するMDPの作用を解析し、以下の結果を得た。(1)マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系において、MDPは単独では破骨細胞分化を誘導せず、活性型ビタミンD_3およびPGE_2が誘導した破骨細胞形成もMDPは促進しなかった。しかしMDPは、LPSおよびIL-1が誘導する破骨細胞形成を著しく促進した。(2)骨髄マクロファージの培養系において、RANKLとM-CSFが誘導する破骨細胞形成をMDPは促進しなかった。(3)LPS、IL-1、活性型ビタミンD_3は骨芽細胞のRANKLの発現を促進した。MDPは、LPSとIL-1が誘導するRANKLの発現を更に促進したが、活性型ビタミンD_3の作用を増強しなかった。(4)骨芽細胞は、MDPの受容体であるNod2 mRNAを発現していなかった。LPSとIL-1は骨芽細胞におけるNod2発現を誘導したが、活性型ビタミンD_3はNod2の発現を誘導しなかった。(5)Nod2のmRNAの発現をRNAiで抑制すると、MDPによる促進効果は消失した。以上の知見より、MDPは骨芽細胞に作用し、炎症性因子LPS、IL-1およびTNFαによるRANKL誘導作用を増強し、破骨細胞形成を促進した。LPS、IL-1およびTNFαは骨芽細胞のNod2の発現を誘導し、MDPはこの誘導されたNod2を介してRANKL発現を促進する可能性が示された。

1.炎症性因子によるRANKLとOPGの発現調節機構:菌体成分MDPはNod2を介して骨芽細胞のRANKLを誘導した。Nod1のリガンドであるFK156も骨芽細胞のRANKLの発現を誘導することを見出した。2.PGE_2の破骨細胞前駆細胞に対する分化促進作用:PGE_2はヒト破骨細胞前駆細胞CD14陽性細胞の破骨細胞への分化を抑制した。PGE_2は、CD14陽性細胞のEP2/EP4を介して、破骨細胞分化を抑制する液性因子を産生することを明らかにした。一方、また、PGE_2はEP2/EP4受容体を介してマウスの破骨細胞前駆細胞のTAK1のSer412のリン酸化を促進してRANKL誘導性の破骨細胞分化を促進した。3.炎症性因子による破骨細胞活性化機構:破骨細胞では、p38MAPKシグナルが通らない。骨吸収活性に対するp38MAPKシグナの役割を明らかにするために、恒常的活性型MKK6を破骨細胞に強制発現させ、p38MAPKを活性化させた。その結果破骨細胞の延命が促進され、p38MAPKシグナルは破骨細胞の細胞死に関わることが判明した。4.カルシトニンとビスフォスホネートの作用機構:小動物用X線CTを用い、リゼドロネート投与が卵巣摘出ラットの極めて効率よく骨吸収を抑制することを明らかにした。マウスの破骨細胞にEP4受容体を強制発現させるとカルシトニン処理と同様な骨吸収抑制作用が誘導された。一方、カルシトニンはヒト破骨細胞の骨吸収活性を抑制したが、その作用機構はマウスと異なり、PKCを介する可能性が示唆された。5.モデルマウスを用いた治療法の開発:小動物用X線CTを用い、ラットを用いて骨吸収抑制薬であるビスフォスホネートの作用を解析した。この小動物用X線CTを用いることによって、骨吸収と骨形成を正確にしかも短時間に評価できることが明らかとなった。
フレ-ムレス原子吸光におけるモル感度の周期性と原子化機構に関する基礎的研究

フレ-ムレス原子吸光においては目的元素と炭素との反応性,多孔貭な炉壁への試料溶液の浸透や生成原子の拡散が原子化機構に大きく関与している。本課題の研究では炉材中に試料溶液や生成原子が浸透しないメタル炉やメタルコ-ティング炉の感度の周期性及び原子化機構を速度論的に考察し,黒鉛炉と比較しながら,原子吸光の絶体定量法へのアプロ-チを目標とすると共に,メタルコ-ティング炉の環境試料及び生体試料への応用を試みた。得た結果は次の通りである。1、黒鉛炉にタングステンをコ-ティングした(W-)炉について感度を比較した。W-コ-ティングは従来浸漬法が用いられていたが,当研究では単にNa_2WO_4水溶液を100ul炉に注入し,原子化サイクルで焼き付けるだけで充分増感効果があることを見い出した。この炉はSn,Ta,Si,に有効で,とくにSnに対しては有機溶媒マトリックスで生じるダブルピ-クの発生を完全に押え,Siに対しては有機ケイ素に有効であった。2、単純なマトリックスからなる標準溶液中のSnに対しては,パイログラファィト炉(PG炉)にW-コ-ティングしたW-PGがPG炉に比べて5、8倍の増感を示して最良であるのに対して,スズの生体試料に対しては非パイログラファィト炉(NPG)にコ-ティングしたW-NPGが最良で,複雑なマトリックスに対して有効であった。これはNPGの表面の多孔性により保持性がよく,充分灰化が出来るためと考えられる。3、海水中のスズについては前処理なしでは定量が不可能であったが,W-NPG炉とマトリックス修飾剤としてPd(11)を用いると,灰化温度1700°Cで10/0吸収感度が0、028ngで定量が可能となった。4、W-コ-ティング炉を用いれば液体以外の有機ケイ素と無機ケイ素の高感度定量が可能となった。いずれの場合にもSiO_<2(s)>→SiO_<(s)>→SiO_<(g)>→Si_<(g)>の原子化機構を取ることを明らかにした。黒鉛炉原子吸光においては炭素との反応性、多孔質な炉壁への試料溶液の浸透や生成した原子の拡散が原子化機構と原子化効率に大きく関与している。本課題の研究では炉材中に試料溶液や生成原子が浸透しないメタル炉やメタンコ-ティング炉の感度の周期性および原子化機構を反応速度論的に考察し、黒鉛炉と比較しながら、原子吸光の絶体定量法へのアプロ-チを目標とした。本年度申請し購入したタングステン炉とタングステンコ-ティング炉による結果は次の通りである。1.黒鉛炉のモル感度の周期性はパイロコ-ティング炉と非パイロコ-ティング炉の両方ともにZnとMnに極大値を持ち、Ti、V、Ni、Geで極小値を持ったが、この周期性はタングステン炉でも全く同じであった。しかし絶体的感度は平均して約10倍低い。