hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳傷害後における神経ネットワークの再構築を促す創薬研究

ヒト神経芽細胞に野生型あるいは変異型ヒトプレセニリン(PS)1を遺伝子導入し、細胞の異常形態形成に対するPS1の関わりを解析した結果、フラグメント型PS1が形成されないドミナントネガティブ変異型PS1を過剰発現させた細胞でのみ神経様突起形成が認められなかったことから、PS1は細胞骨格関連蛋白質の発現量に作用し、神経突起の形成に重要であることが示唆された。一方、ラット発育脳を用いてアクチン重合関連蛋白質であるN-WASPやWAVEの発現・局在を解析した結果、脳の発育と共にこれらの蛋白質は増加すること、さらにプレシナプスに豊富に存在していることが示唆された。以上のことから、神経発芽や神経形態形成に必須な上流因子としてのPS1の機能が明らかとなり、アクチン関連因子など形態形成に関わる因子が正常な脳神経ネットワークの構築や維持に関与していることが示唆された。脳梗塞モデルラットを用いた解析では、初代培養ミクログリアやマウスES細胞または分化誘導したES細胞由来のニューロン様細胞を移植することによって、運動機能の改善および虚血性神経細胞死の抑制が認められた。ミクログリアの移植では、外来性ミクログリアが脳内傷害部位に遊走・集積し、さらに神経栄養因子であるGDNFを産生して神経保護作用に寄与していることが示唆された。マウスES細胞移植では、ES細胞由来のニューロン様細胞を移植することでより早期および高い改善傾向が見られた。パーキンソン病モデルラットを用いたマウスES細胞移植実験においても、未分化ES細胞移植と比べ、ES細胞由来のニューロン様細胞を移植するとより良い改善効果が得られ、黒質あるいは視床下核と線条体への同時移植によって改善効果が促進された。さらに、家族性パーキンソン病(PARK7)の原因遺伝子として同定されたDJ-1は活性酸素種のスカベンジ作用により神経保護作用があることが示唆された。パーキンソン病モデルラットにマウス胚性幹(ES)細胞およびES細胞をin vitro培養系で神経様に分化させた細胞(ES-ニューロン)を線条体、黒質あるいは視床下核に移植し、行動薬理学的、神経化学的に解析を行った。ES細胞移植群ではいずれの移植もパーキンソン病モデルラットの行動異常の改善傾向はあるものの、有意な作用は認められなかった。一方、ES-ニューロンの線条体への移植は有意な改善効果が認められた。ES-ニューロンの黒質あるいは視床下核への移植は、それ単独では改善効果は認められなかったが、線条体との同時移植により、線条体単独よりも改善効果の増強が認められた。移植ES-ニューロンは、ドパミンニューロンマーカーのチロシン水酸化酵素を発現していた。このように、マウスES細胞を神経様に分化させた細胞を移植すると、行動異常が改善され、この改善にはマウスES細胞由来のドパミンニューロンに分化した細胞が、主に寄与していることが推定された。また、脳梗塞モデルラットの脳室内に、初代培養したミクログリアを移植することによって、運動機能の改善および虚血性神経細胞死の抑制が認められた。このとき、外来性ミクログリアが内在性ミクログリアと同様に脳内傷害部位に遊走、蓄積すること、さらに神経栄養因子であるGDNFを産生することが神経保護作用に寄与していることが示唆された。ミクログリアの機能として神経傷害的に作用することが知られているが、脳梗塞急性期においては神経保護的に機能し、脳梗塞治療においてミクログリア細胞療法が有用であることが推察される。

ヒト神経芽細胞に野生型あるいは変異型ヒトプレセニリン(PS)1を遺伝子導入し、細胞の異常形態形成に対するPS1の関わりを解析した結果、フラグメント型PS1が形成されないドミナントネガティブ変異型PS1を過剰発現させた細胞でのみ神経様突起形成が認められなかったことから、PS1は細胞骨格関連蛋白質の発現量に作用し、神経突起の形成に重要であることが示唆された。一方、ラット発育脳を用いてアクチン重合関連蛋白質であるN-WASPやWAVEの発現・局在を解析した結果、脳の発育と共にこれらの蛋白質は増加すること、さらにプレシナプスに豊富に存在していることが示唆された。以上のことから、神経発芽や神経形態形成に必須な上流因子としてのPS1の機能が明らかとなり、アクチン関連因子など形態形成に関わる因子が正常な脳神経ネットワークの構築や維持に関与していることが示唆された。脳梗塞モデルラットを用いた解析では、マウスES細胞または分化誘導したES細胞由来のニューロン様細胞を移植することによって、運動機能の改善および虚血性神経細胞死の抑制が認められた。さらに、ES細胞由来のニューロン様細胞を移植することでより早期および高い改善傾向が見られた。パーキンソン病モデルラットを用いた解析により、家族性パーキンソン病(PARK7)の原因遺伝子として同定されたDJ-1の機能を検討した。その結果、野生型のヒトリコンビナントDJ1蛋白質は神経細胞内に取り込まれ活性酸素種のスカベンジ作用により神経保護作用があることが示唆された。一方、変異型であるL166P DJ-1ではそれらの機能が消失したLoss of function型の変異であり、神経保護作用を示さないことが示唆された。
日本近代女性作家による自己表現獲得の道程を文学史上に位置づける研究

本研究課題のもと、平成9年度には、<女性解放の先駆者>として自由民権期に活躍した岸田俊子=中島湘烟(18611901)と紫琴・清水豊子(18681933)の評論・小説に展開された女性論・女子教育論の具体的内容を確認。<同胞姉妹>に直接よびかけ書き手と読み手との間の連帯感を生じさせる文体や、<女>である自己の内面・真情を吐露する<私>語りの手法について中心に考察した。続く平成10年度には、ドイツの女性作家ラロッシュ(Sophie von La Roche,17301807)を対象に、日独女性作家の比較研究を進めることに努めた。すなわち、『シュテルンハイム嬢の物語』(1771)によってドイツで初めて成功した女性作家とみなされているラロッシュの主張には、女子教育論をとおして女性解放論を展開するという方法や、<女>自身の女権意識の向上という<女>自身が<書く>ことの意義についての認識など、湘烟や紫琴らとの類縁性が確認されたのである。上記の研究を踏まえて、本年度は、近代フェミニズムの幕開け期の小説であるヴォーベーザー(Wilhelmine Karoline von Wobeser,17691807)の『エリザ、またはあるべき女の姿』(1795)を参照し、日独の女性作家による<自己表現>獲得の成果を考究。また、女性作家による女性論を相対化するために、総合雑誌「太陽」の「博文館創業廿六周年紀念増刊近時之婦人問題」(大2・6第19巻第9号)や「中央公論」の「臨時増刊婦人問題號」(大2・7第28巻第9号)などに掲載された抱月・島村滝太郎(18711918)や筑水・金子馬治(18701937)ら男性執筆者による評論を検討。前近代的な性差の秩序を墨守しようとする言説が氾濫するなかで、<新しい女>論議に終始せず、<兩性問題><社會問題>として<婦人問題>を議論する潮流が<男>の側にも生まれていることを確認した。本年度は、上記研究課題のうち、近代日本最初のフェミニスト=岸田俊子(中島湘烟18611901)の人生行路と確認と、彼女の代表的評論『同胞姉妹に告ぐ』(1884)に展開された男女相愛の思想〈愛憐〉の具体的内容の検討、さらに中島信行との現実の結婚生活における俊子の理念の実践についての考察を踏まえて、日本近代社会のシステム確立期における〈女性〉に関する意識変遷のなかで、俊子の女権論・女子教育論の理念的先駆性と実践的連続性を把握することに努めた。その際、本年度の設備備品として購入を予定していた『叢書「青鞜」の女たち』全20巻(不二出版)が絶版になったため、『日本女性史論集』全10巻(吉川弘文館刊行継続中)他の書籍を入手して、女性史の研究状況を把握する際に活用した。また、俊子に先行する西洋の女性解放運動家Mary Wollstonecraft, Millicent Garrett Fawcett, Ellen Karolina Sofia Key, Loise Otto-Peters, Hedwig Dohm, Helene Lange, Malvida von Meysenburg, Fanny Lewaldらの女権論・女子教育論を考察するための参考文献収集に努めたので、来年度の課題のひとつとして、とくにドイツの女権論者の提言との比較・対照をとおして、岸田俊子始め近代日本女性解放論者の意識・文筆活動の考察をめざしている。さらに、今年度の本研究業績関連の論文として、俊子と同時期の評論家=高山樗牛(18711902)の病床随筆・書簡を考察対象とした「『太陽』文芸欄主筆期の高山樗牛--個人主義的国家主義から絶対主義的個人主義への必然性」(「日本研究」第17集1998・1)などをまとめたので、来年度は、これらの論文での成果をもとに、『湘烟日記』(1903)に記された俊子自身の生命観・人生観を考察することによって、その自己表現獲得の営為の意味を相対的に位置づけ、俊子に続く女性作家研究の糸口としたい。本年度は、上記研究課題のうち、近代日本の女性作家たちと直接の影響関係を論ずることはできないが、その女子教育論の内容や作家活動の意味の認識などにおいて、類縁性を見出すことのできるドイツ女性作家および作品についての検討を中心に進めた.すなわち、小説『シュテルンハイム嬢の物語』(1771)によって、ドイツで初めて成功した女性作家とされているラロッシュ(Sophie von La Roche.17301807)の、読者に直接訴えかける書簡体という手法や、常に女性読者を意識しての女の生き方を説いた内容、また作家自身が受けた女子教育の背景・内実を確認し、この作家が、手紙という書き言葉と話し言葉の中間に位置する言説を駆使して、自己(=女であること、女性作家であること)の認識表現を獲得したことを考察.女子職業教育や社会福祉活動への熱意など、生き方のうえでも、岸田俊子(中島湘烟)や清水紫琴ら、自由民権期の近代日本女性作家たちとの共通点を有することを確認した.

また、女性による初めての雑誌『ボモナ』を発行・編集し、女性読者と共同の場を用意したことも、平塚らいてうや長谷川時雨たちの活動の先例として対照されることを認識した.今後の課題としては、フランス革命や資本主義の発達による社会構造の変容を背景に、ドイツでも概成の家庭観や男女関係観を揺るがす女性論が流行した近代フェミニズム幕開け期の小説--ヴォーベーザー(Wilhelmine Karoline von Wobeser,17691807)の『エリザ、またはあるべき女の姿』(1795)などとの比較対照.さらに来年度は、雑誌『女性』全72冊(復刻版日本図書センター)など、モダニズム最盛期となる大正・昭和期に刊行された雑誌掲載の女権論・女子教育論・両性問題論を考察し、近代ジャーナリズムにおいて女性をめぐる言説がどのように展開されていったかを把握してゆきたい.本研究課題のもと、平成9年度には、<女性解放の先駆者>として自由民権期に活躍した岸田俊子=中島湘烟(18611901)と紫琴・清水豊子(18681933)の評論・小説に展開された女性論・女子教育論の具体的内容を確認。<同胞姉妹>に直接よびかけ書き手と読み手との間の連帯感を生じさせる文体や、<女>である自己の内面・真情を吐露する<私>語りの手法について中心に考察した。続く平成10年度には、ドイツの女性作家ラロッシュ(Sophie von La Roche,17301807)を対象に、日独女性作家の比較研究を進めることに努めた。すなわち、『シュテルンハイム嬢の物語』(1771)によってドイツで初めて成功した女性作家とみなされているラロッシュの主張には、女子教育論をとおして女性解放論を展開するという方法や、<女>自身の女権意識の向上という<女>自身が<書く>ことの意義についての認識など、湘烟や紫琴らとの類縁性が確認されたのである。上記の研究を踏まえて、本年度は、近代フェミニズムの幕開け期の小説であるヴォーベーザー(Wilhelmine Karoline von Wobeser,17691807)の『エリザ、またはあるべき女の姿』(1795)を参照し、日独の女性作家による<自己表現>獲得の成果を考究。また、女性作家による女性論を相対化するために、総合雑誌「太陽」の「博文館創業廿六周年紀念増刊近時之婦人問題」(大2・6第19巻第9号)や「中央公論」の「臨時増刊婦人問題號」(大2・7第28巻第9号)などに掲載された抱月・島村滝太郎(18711918)や筑水・金子馬治(18701937)ら男性執筆者による評論を検討。前近代的な性差の秩序を墨守しようとする言説が氾濫するなかで、<新しい女>論議に終始せず、<兩性問題><社會問題>として<婦人問題>を議論する潮流が<男>の側にも生まれていることを確認した。
複合機能性デバイスのためのZnOナノ構造の合成及びパターン形成

ナノ素子の研究が活発になされているが、ナノ材料の特性をフルに活用したデバイスを実現するためにはナノ材料の構造と配列を制御する技術の開発が不可欠である。本研究では前年に確立したZnOナノ構造の成長条件を利用してZnOナノ構造の配列及び電子デバイスへの応用を目的にした。MgOの厚さの調節によるZnOの極性(polarity)変化を利用したテンプレートを使って広い面積にマイクロ以下の間隔持った周期的なZnOのnanorodとnanowallのアレイ製作に成功した。このナノアレイ構造は広い表面積を持っていて光,化学センサーで使用が可能だ。またZnOの優秀な光学特性と規則配列の調和を利用すれば光学デバイスに応用ができることで期待される。一本のナノワイヤの配列はデバイスの最小化と効率の向上のために研究されている。本研究では一本のナノワイアを利用した電子デバイスを作成するために誘電泳動(dielectrophoresis)技術をを利用した。従来の誘電泳動技術では二つの電極間に多いナノワイヤの配列は可能だったが、一本を配することは難しかった。この問題点を乗り越えるためにマイクロ流路内での誘電泳動を行った。流路内の流速による力と誘電泳動の力を調節によって局所的な部分でのナノワイアの誘電泳動が可能だ。この技術を利用して高い収率と短い時間以内の一本のZnOナノワイヤ配列に成功した。さらに、つ二つの電極に配列されたナノワイヤを利用してUVセンサーと電気化学籍電界効果トランジスター(Electrochemical field effect transistor)の具現に成功した。このデバイスは化学及びバイオセンサー等の応用ができることと考えられる。本研究は金属触媒を使わないシード形成法の開発とナノ構造の特性分析を目的にした。新しいCrNバッファー構造を利用してII-IV族の酸化物化合物半導体ZnOナノ構造の垂直配享と直径調節に成功した。またZnOの極性を利用してマイクロ以下の周期的アレイを形成した。上のナノ構造の製作に対する実験から得た形象の制御能力を利用して均一な直径のナノ構造からのレーザー特性の差を糾明した。ナノワイアの場合、ZnOの光学的特性とナノの形態的な特徴を利用してナノレーザー特性を分析した。実験的結果から80nm以下の直径を持ったナノワイアは光学的損失によってレーザー特性を得にくく、直径が大きくなるほどレーザーパワーが増加することができることを証明した。さらに、テーパー形態のZnOナノ構造から新しい光学的空洞共振器を発見した。これは従来にナノ構造で発見された一直線な二つの面での反射によるFabry-Perotまたは多くの綿衣反射によるWhispering gallery modeの空洞共振器とは違う新しい形態の光学的空洞共振器である。当研究にて、実験的な結果と理論的な計算結果の連携を通じてテーパー形態のZnOナノ構造内部に光学的空洞共振器の形成を提示した。この発見はナノ構造の光学的デバイス応用の研究に対する発展及び新しいデバイスの製作に寄与されることと考えられる。
関節軟骨の情報伝達性エクソソーム網羅的解析と変形性関節症の新たな治療開発

変形性関節症の領域で重要なADAMTS遺伝子を制御するmicroRNAの働きが相次いで報告されている。microRNAの機能として興味深いのは、自身が作られた細胞にのみ作用するのではなく、エクソソームと呼ばれる微小な小胞に内包されて細胞外へ分泌され、エクソソームが取り込まれた先の新たな細胞でも作用しうるためで、新たな情報伝達メカニズムとして注目されている。本研究の目的は、変形性関節症で重要な働きをするADAMTSや関連分子を標的とするmicroRNAが含まれるエクソソームを分離し、microRNAを含んだエクソソームがどの様に細胞に取り込まれて機能するのかを明らかにすることでその役割を統合的に解析することである。2018年度はmicroRNAが機能発揮するメカニズムとしてのエクソソームがどのように細胞にとりこまれるかの解析を行った。エクソソームを蛍光標識した後に、培養ヒト関節軟骨様細胞の培地中に蛍光色素付加エクソソームを添加し、時間経過とともに細胞内へ取り込まれるかについて検討を行った。添加直後および6,12,24時間後において細胞を固定し蛍光観察を行ったところ、時間経過とともに取り込まれたエクソソームを確認できた。このエクソソームの取り込み機構として、クラスリン依存性エンドサイトーシスの中心的分子であるダイナミンを阻害するダイナソアを添加したところ、予想通り取り込みが阻害された。さらに、ADAMTSを標的とするmicroRNA候補配列を用いて、RNAサイレンシングおよび強制発現する実験系を構築した。当初の計画であったエクソソームの取り込み機能を明らかにすることができたと同時に、蛍光標識したエクソソームが細胞内に取り込まれる様子を観察することに成功した。細胞内取り込みに関しては、電子顕微鏡を用いた金コロイド粒子による免疫電顕法により、細胞内でのエクソソームの局在に迫る実験まで実施することができた。さらに、候補microRNAを強制発現及びRNAサイレンシングにてノックダウンする実験系の構築にも成功した。これにより、候補microRNAの機能解析を行うことが可能となった。候補microRNAが標的遺伝子に作用することを確認するとともに、サイトカインなどの刺激によって当初の目論見通りに発現変動をきたしているかを確認するステップが必要になると考えている。アレイ解析とリアルタイムPCRによる定量解析では、その解析手法の違いから発現変動が異なることも予想され、その際には改めてアレイ解析と定量PCRで同様の変動を示す候補配列を探索し、どちらの候補microRNAがより主体的な役割を果たしているかについても検討を行う。近年、microRNAがヒト全遺伝子の1/3以上のRNAを制御するエピジェネティック機構として注目されるようになり、変形性関節症の領域で重要なADAMTS遺伝子を制御するmicroRNAの働きが相次いで報告されている。一方で、microRNAは自身が作られた細胞にのみ作用するのではなく、エクソソームと呼ばれる小胞に内包されて細胞外へ分泌され、エクソソームが取り込まれた先の新たな細胞でも作用する可能性が示されている。今回、メカニカルストレスとサイトカイン刺激という二つのストレス刺激による細胞由来エクソソームの統合的解析を行った。ヒト軟骨様細胞株(OUMS-27)を用いて細胞から細胞外(すなわち培養液中)に分泌された小胞を回収した。回収した小胞について、その粒子径や表面マーカーなどからエクソソームが含まれていることを確認することができた。さらに、エクソソーム内部に含まれているmicroRNAの発現量比較をリアルタイム定量PCR法によって行った。in vitroの実験系で発現変化の大きなmicroRNAに対してRNA干渉法を用いたノックダウン実験を行った。次に、ラット膝関節に手術を施した変形性関節症モデルを作成し、膝関節液中のエクソソームを回収した。対象となるmicroRNAの網羅的解析を終了して、microRNAの機能解析に取り組んだ。標的となる遺伝子を同定し、microRNAの阻害配列および模倣する配列を組み込んだ実験系を構築して実施したところ、実際にその遺伝子に機能するデータを得ることが出来た。以上のことからおおむね順調に進展していると考えている。

このエクソソームの取り込み機構として、クラスリン依存性エンドサイトーシスの中心的分子であるダイナミンを阻害するダイナソアを添加したところ、予想通り取り込みが阻害された。さらに、ADAMTSを標的とするmicroRNA候補配列を用いて、RNAサイレンシングおよび強制発現する実験系を構築した。当初の計画であったエクソソームの取り込み機能を明らかにすることができたと同時に、蛍光標識したエクソソームが細胞内に取り込まれる様子を観察することに成功した。細胞内取り込みに関しては、電子顕微鏡を用いた金コロイド粒子による免疫電顕法により、細胞内でのエクソソームの局在に迫る実験まで実施することができた。さらに、候補microRNAを強制発現及びRNAサイレンシングにてノックダウンする実験系の構築にも成功した。これにより、候補microRNAの機能解析を行うことが可能となった。30年度はエクソソームの取り込みに関する研究を推進する。既に候補となる経路は想定しており、予備実験では取り込みを確認済みである。今後は想定経路に対する阻害剤などを用いて、エクソソーム取り込み経路に関する解析を進めていく。さらに、エクソソームに含まれるmicroRNAがどの様に細胞へ作用するのかについての見当を進めていく方針である。そのためには細胞内部へ取り込まれたエクソソームがその後どういった挙動を示すのかを明らかにすることが重要である。候補microRNAが標的遺伝子に作用することを確認するとともに、サイトカインなどの刺激によって当初の目論見通りに発現変動をきたしているかを確認するステップが必要になると考えている。アレイ解析とリアルタイムPCRによる定量解析では、その解析手法の違いから発現変動が異なることも予想され、その際には改めてアレイ解析と定量PCRで同様の変動を示す候補配列を探索し、どちらの候補microRNAがより主体的な役割を果たしているかについても検討を行う。
珪肺症をモデルとした環境要因に対する高感受性集団の分子生物学的解析

我々は遊離珪酸S_2O_2の長期暴露によって発症する珪肺症の患者を対象として、血清学的方法および分子遺伝学的方法を用いた遺伝標識の解析により、宿主の遺伝要因を解析している。昨年度までにHLA-Bw54-C4A3B5-DR4-DQw4が疾患感受性パフロタイプであり、HLA-Bw52-DR2-Dw12-DQw1が疾患抵抗性ハプロタイプであることを明らかにした。本年度は、HLA以外の免疫関連遺伝子である免疫グロブリン入鎖可変領域(IGLV)、T細胞レセプターの鎖(TCRα)およびβ鎖(TCRβ)のDNAプローブを用いた制限酵素DNA断片長多型(RFLP)解析により珪肺症の遺伝要因を検討した。HLAタイピングの完了した患者より46名を無作為に選び、その末梢血白血球よりDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によるRFLP解析を行った。IGLVの多型を解析するためにV_4Aプローブおよび制限酵素BamH_1を用いた。この解析により5.3kbと3.3kbの2本のバンドが対立遺伝子として検出された。患者集団では3.3kbホモ接合体が46名中19名(41%)と、健康対照127名中24名(19%)と比較して有為に(P<0.003)増加していた。ことに高ガンマグロブリン血症を合併した患者4名中3名がこのタイプであった。珪肺症にはしばしば高ガンマブロブリン血症の合併が認められるが、その遺伝要因としてIGLVあるいは、これと密に連鎖した遺伝子の関与が示唆された。TCRβのcDNAプローブおよび制限酵素TagIを用いたRFLP解析では、8.0kbと4.2kbの2本のバンドが対立遺伝子として検出されたが、その頻度は、患者と健康対照との間に差を認めなかった。同様にTCRβのcDNAプローブおよび制限酵素BglIIを用いたRFLP解析では、10kbと9.2kbの2本のバンドが対立遺伝子として検出されたが、患者との相関は認められなかった。したがって、珪肺症の遺伝要因としてHLA領域および免疫グロブリンλ鎖遺伝子領域の関与が明らかとなった。
慢性口腔顔面痛モデルを用いた、片頭痛発症の誘発因子としての三叉神経系感作の解明

慢性口腔顔面痛ラットモデルとして右側眼窩下神経結紮(IoN-CCI)モデル(神経障害性疼痛モデル)の確立を行った。結紮3週間後に脳硬膜にカプサイシンを投与して片頭痛モデルを作成し、投与4分後の三叉神経脊髄路核におけるERKのリン酸化(pERK)を免疫組織化学的手法にて確認した。その結果、ION-CCIモデルラットにカプサイシン処置を行った群では、右側のObexから1440μm尾側にかけて、抗pERK抗体陽性細胞数がカプサイシン処置のみの群に比べて有意に増加した。硬膜へのカプサイシン刺激により活性化された三叉神経第1枝により誘発されるpERK発現に三叉神経第2枝感作が影響を与えることが示唆された。これらの結果より、口腔顔面領域の慢性疼痛疾患の存在は片頭痛の増悪因子になり得る可能性が考えられた。片頭痛は人口の10%近くが罹息する疾患であり、発作の際には日常生活の継続が困難なほどの拍動性頭痛が起こり、悪心・嘔吐などを伴うこともある。また、発作中には歯痛や顔面痛を伴うことがあるため、患者が歯科を受診する場合も多い。片頭痛との合併疾患に関する疫学調査の結果、顎関節症(TMD)患者の約3割が片頭痛を合併し、また、片頭痛患者の多くは発作の前兆として、頭部から上肢にかけてのアロディニアを伴うこともあるという。片頭痛の発生機序にはCortical Spreading Depression (CSD、大脳皮質内拡延性抑制)が大きく関わっているといわれており、このCSDは三叉神経脊髄路核を活性化するととが分かっている。これらのことより、口腔顔面痛の痛みの一次中継核である三叉神経脊髄路核の痛みによる感作が、片頭痛の発生に多いに関与しているものと推測される。そこで、本研究の目的は、CSD動物モデルを用いて、三叉神経領域に慢性痛を与えた場合のCSDの変化を検討することで、片頭痛発症機序および増悪因子としての三叉神経系感作の影響を明らかにすることである。今年度は、CSDラットモデルの確立と慢性口腔顔面痛ラットモデルとして眼窩下神経結紮モデル(神経障害性疼痛モデル)の確立を行った。また、CSD測定装置とCSD発生に伴う脳血流変化測定装置のセットアップを行った。現在、眼窩下神経結紮ラットのアロディニア発症をvon Freyテストで確認し、CSD発生頻度、伝播速度、脳血流変化の検討を行うところである。片頭痛は人口の10%近くが罹患する疾患であり、発作の際には激烈な拍動性頭痛、悪心・嘔吐などが起こり、患者のQOLは著しく損なわれる。片頭痛の発生機序にはCortical Spreading Depression (CSD、大脳皮質拡延性抑制)が大きく関わっているといわれており、このCSDが三叉神経脊髄路核を活性化することで痛みを引き起こしているのではないかと考えられている。これらのことより、慢性口腔顔面痛の痛みの一次中継核でもある三叉神経脊髄路核の感作が、片頭痛の発生に深く関与している可能性が推測される。そこで、本研究の目的は、CSD動物モデルを用いて、慢性痛によって三叉神経系を感作した場合のCSD発生の変化やCSDによる三叉神経系活性化の変化等を検討することで、片頭痛発症機序および増悪因子としての三叉神経系感作の影響を明らかにすることである。今年度は、ラットの眼窩下神経結紮(IoN-CCI)を行い、その後、神経障害性疼痛が発症するかをvon Freyfilamentによる機械的侵害刺激を与えて経時的に評価した。その結果、今までの報告と同様に、約2週間で疹痛閾値が低下し、アロディニアが発症していた。発症率は約63%であった。この後、アロディニアが発症しているラットの大脳皮質表面に1M KC1による化学的刺激を与えてCSDを誘発し、CSD発生頻度(発生閾値)を電気生理学的に測定した。今のところ、sham ope群とIoN-CCI群でCSD発生閾値に違いはないと思われる。現在は、IoN-CCIによって三叉神経系が感作されているかを確認するために、三叉神経節におけるアストログリアの発現を免疫組織化学的に評価しているところである。

また、IoN-CCIによって感作された三叉神経系がCSDによってどの程度活性化されるのかを検討するために、三叉神経脊髄路核尾側亜核におけるc-fos発現を免疫組織化学的に確認している。片頭痛は人口の10%近くが罹患する疾患であり、発作の際には激烈な拍動性頭痛、悪心・嘔吐などが起こり、患者のQOLは著しく損なわれる。また、発作中には歯痛や顔面痛を伴うことがあるため、患者が歯科を受診する場合も多い。片頭痛の発生機序にはCortical Spreading Depression (CSD、大脳皮質拡延性抑制)が大きく関わっているといわれており、このCSDが三叉神経第1枝を介して三叉神経脊髄路核を活性化することで痛みを引き起こしているのではないかと考えられている。これらのことより、慢性口腔顔面痛の痛みの一次中継核でもある三叉神経脊髄路核の感作が、片頭痛の発生に深く関与している可能性が推測される。本研究の目的は、片頭痛動物モデルを用いて、慢性痛によって三叉神経系を感作した場合の三叉神経系の活性化の変化等を検討することで、片頭痛発症機序および増悪因子としての三叉神経系感作の影響を明らかにすることである。今年度は、片頭痛モデルの一つであるカプサイシン硬膜刺激モデルを用いて、眼窩下神経結紮(IoN-CCI)による第2枝への慢性刺激が第1枝も感作するかを免疫組織化学的手法を用いて検討した。その結果、三叉神経脊髄路核尾側亜核において、IoN-CCI+カプサイシン硬膜刺激群ではobexから尾側へ1440μmにかけて、痛覚伝達に関係するERKのリン酸化がIoN-CCI群、カプサイシン硬膜刺激群と比較して有意に増加していた。このことより、第2枝の感作が第1枝の活性化に影響を与えると考えられ、三叉神経系感作が片頭痛発症の増悪因子となりうる可能性が示唆された。今後は、もう一つの片頭痛モデルであるCSDモデルを用いて、同様の検討を行う予定である。本研究を進める上で、所属教室の研究環境が十分に整っていないところがあり、まずそのセットアップから行わなければならなかったため、データを集め始めるのが遅れてしまった。また、予想と少し違う結果が出たため、実験計画を少し修正しなければならず、進捗状況がやや遅くなってしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在は、計画通りに実験が進み始めており、順調にデータが集まると思われる。ただ、来年度は最終年度であること、予算に限りがあることから、ある程度のデータが出た時点で、本研究をまとめる方向へ進む予定である。
運動療法が高齢者の心筋保護効果を示すメカニズムについての研究

前回行った高齢ラットの運動負荷モデルで、心筋梗塞面積に対する作用は明確にできなかったが体重減少効果は明らかであった。今後高齢ラットと運動負荷の研究を行う上で参考になると思われる。最終年度は20年以上運動を続けている高齢者(65歳以上)と、非高齢者(50歳以下)で運動を行う前後の心血管系の変化について比較調査を行った。運動前後の変化では、交感神経系の緊張度、最高血圧は両群とも運動後に減少した。また寒冷時期(12ー1月)では運動前に測定できなかった組織還流係数(TPI: tissue perfusion index)が運動負荷後には可能になるという興味ある事実が判った。中高齢のラットで低い強度の運動療法が、虚血前心機能、虚血再灌流後の心機能を改善するか、また虚血再灌流後の心筋梗塞面積に影響するか否かを検討した。【方法】retired S-D rat 20匹(体重480-637g)を運動群(n=10)、対照群(n=10)に分け、運動群では、1日60分、週6日、5週間の運動療法を行った。第1週、第2週、および3-5週の速度はそれぞれ10m/分、15m/分、20m/分で開始し、電撃刺激で強制的に走行させた。運動療法開始前後の体重、60分間の走行距離を記録した。5週後、ランゲンドルフ装置を用いた孤立心筋モデルを作成し、30分間の全虚血後に、90分間の再灌流を行った。虚血直前、および再灌流終了時の左室収縮気圧、左室dp/dt max,左心室の心筋梗塞面積を測定し両群間で比較した。【結果】運動群の平均走行距離は、第1週末591m,第2週末900mと順調に増加したが、3週以降は1100mで頭打ちとなった。体重は運動群では10.8±30.9g減少したが、対照群は57.4±32.3g (mean±SD)増加した。虚血直前の左室収縮期圧は80.8±9.4 mmHg vs. 72.0±11.3 mmHg, dp/dt maxは2228±479 mmHg/s vs. 1951±287 mmHg/sと有意差がなかった。同様に再灌流終了時の左室収縮気圧、左室dp/dt maxにも差がなかった。左心室の心筋梗塞面積比も33.0±20.1% vs. 28.0±15.6%と減少傾向にはあったが有意差はなかった。【考察】低い強度の運動療法で体重減少効果が明らかとなったが、虚血前の心機能や虚血後の心機能・心筋梗塞面積に対する作用は明確にできなかった。今回の運動負荷モデルで体重減少効果は明らかで、今後高齢ラットと運動負荷の研究を行う上で参考になると思われる。対照群では、運動負荷なし。運動群では、ローラーベルト運動器で4週間の運動負荷を行った。1).運動療法:第1週:傾斜10度、速度10m/分60分、第2週:傾斜10度、速度15m/分60分、第3, 4週:傾斜10度、速度20m/分60分週6日既定の速度で走行できず30秒以内に2回以上電気刺激が加えられた場合は、1m/分ごと速度を低下させた。2).孤立心筋モデルにより測定するパラメータ心電図、左心室圧波形、心拍数、冠灌流量、大動脈基部の灌流液温度、Left Ventricular Developed Pressure (LVDP), dP/dt max, minを計測3).全虚血開始直前、再灌流直後、再灌流後10分、再灌流後90分の各時点で測定した。4)孤立心筋モデルから心筋梗塞範囲を定量した。当該年度に実施した研究の成果1).運動療法:高齢retiredラットでは、運動療法で4週の運動療法で平均1100m走行できるようになった。一部のラットは、蓄積疲労のためか走行不能になった。2).心拍数は、対象群と実験群で差はなく、ラット間で差が大きかったので、虚血再灌流実験では250/分でpacingを行った。3).現時点では、実験数が少ない(n=5、4)ため統計解析ができてないが、収縮期圧、左室収縮力は、両群で差がなく、虚血再灌流後の心筋梗塞面積は、運動群で小さい傾向があり、運度療法が高齢ラットでも心筋保護効果を示す可能性が示唆されている。1, 2年度は高齢retired ratを用い4週間の運動負荷を行った。非運動負荷群では体重増加が続くのに対し、運動負荷群では有意な体重の減少がみられた。

さらに両群でラット孤立心筋を用いて虚血・再灌流実験を行った。心筋の虚血域は運動負荷ラット群で減少傾向にあったが、有意差は認めなかった。以上から高齢ラットでの運動療法は体重減少効果をもたらすが、虚血発作時の心筋保護作用については不明である。しかし、高齢ラットでも運動負荷で、明らかな体重減少を認めたことは有意義であると思われた。最終年度は20年以上運動を続けている高齢者(65歳以上)と、非高齢者(50歳以下)で運動を行う前後の心血管系の変化について比較調査を行った。週末のグラウンドでサッカーの練習試合形式(20分間を2,3回)の運動を行い、前後の変化を測定した。心拍変動解析装置による交感神経系の緊張、最高血圧は両群ともは運動後に減少した。組織還流係数TPI:tissue perfusion index)も運動負荷後は改善した。寒冷時期(12ー1月)では運動前に測定できなかったTPIが運動負荷後にはすべての被験者が測定可能となるという興味ある事実が判明した。今回の研究で運動療法は血管抵抗を減少させ、血圧の減少を誘導したと推測される。これらの情報から高齢者の運動でもeNOS活性を通じて血管拡張、血圧減少という効果をもたらしていることが推測された。また、高齢者の寒冷刺激による末梢循環の悪化が運動で軽減される。今後の研究で高齢者の運動と健康(とくに心筋保護効果)との関連が解明できれば、高齢化社会における医療費削減にもつながると思われる。(理由)ラットの強制運動をプログラム通りに行うのは世界で初めての試みである。第1週:傾斜10度、速度10m/分60分、第2週:傾斜10度、速度15m/分60分、第3、4週:傾斜10度、速度20m/分60分週6日のように標準となるプログラムが完成した。(結果)運動群の平均走行距離は、第1週末591m,第2週末900mと順調に増加したが、3週以降は1100mで頭打ちとなった。体重は運動群では10.8±30.9g減少したが、対照群は57.4±32.3g (mean±SD)増加した。虚血直前の左室収縮期圧は80.8±9.4 mmHg vs. 72.0±11.3 mmHg, dp/dt maxは2228±479 mmHg/s vs. 1951±287 mmHg/sと有意差がなかった。同様に再灌流終了時の左室収縮気圧、左室dp/dt maxにも差がなかった。左心室の心筋梗塞面積比も33.0±20.1% vs. 28.0±15.6%と減少傾向にはあったが有意差はなかった。ラットの強制運動をプログラムどおりに行うのは世界で初めての試み第1週:傾斜10度、速度10m/分60分、第2週:傾斜10度、速度15m/分60分、第3,4週:傾斜10度、速度20m/分60分週6日のように標準となるプログラムが完成した。孤立心筋モデルは従来から完成しているので今後は例数を増やすだけとなった。(今後の推進方策)最終年度である。購入した器材(APGハートレータ)を用いてフィールドでの研究を推進する。具体的には週末に行われるシニア(60歳以上)のアスリートを対象に、運動前後の血圧、心拍数の変化から自律神経系の変化を調べる。同年代の非アスリートに運動負荷を加えたときの変化と比較する。(次年度の研究費の使用計画)次年度はフィールドでのデータ収集と、論文作成に充当している。第14回日本抗加齢学会で発表を行う。完成した運動負荷プログラムに従って予定通りの心筋虚血域の変化を検索する。研究が予定より若干順調に終了したため、消耗品購入が少なくて済んだ。翌年度使用する"ハートレータ"の消耗品(センサー、用紙など)、および専用プリンター用インクなどに使用する。
MR灌流画像による脳腫瘍の定量的鑑別と術中迅速病理診断支援の検討

本研究では、脳腫瘍の定量的鑑別に有用な放射線学的指標(ラジオロジカルマーカー)を明らかにすることを目的として、2種類のMR灌流画像による悪性神経膠腫、中枢神経悪性リンパ腫の鑑別に有用なラジオロジカルマーカーの検討を行った。MR灌流画像には、毛細血管レベルの微小な局所脳血流動態と、血管透過性を画像化したものがある。その結果、悪性神経膠腫では血管透過性が低く血管床は増加、悪性リンパ腫は血管透過性が高く血管床は低下する傾向にあった。これら2つのMR灌流画像を併用することで、悪性神経膠腫と悪性リンパ腫をより高い精度で鑑別することが可能であり、本手法は有用なラジオロジカルマーカーであると考えられた。本研究では、脳腫瘍の定量的鑑別に有用な放射線学的指標(ラジオロジカルマーカー)を明らかにするとともに、この手法を術中迅速病理診断支援に応用することを目的として、DCE-MRI(permeability imaging)とDSC-MRI(CBV)の2種類のMR灌流画像による悪性神経膠腫、中枢神経悪性リンパ腫の定量的性状解析、2病理組織所見との対比、3脳腫瘍の定量的鑑別に有用なラジオロジカルマーカーの検討を行った。病変部にマニュアル操作による関心領域を設定しCBV, Ktrans, Vp, Ve, KEPの各パラメータを測定した。各灌流画像マップにおいて病変内部は必ずしも均一ではないため、平均値±SDでは計測部位によって結果に差違が生じる可能性があり、ヒストグラム解析を用いて適切なパーセンタイルでの計測値を算出した。ヒストグラム解析ではROI内の灌流状態をより正確に表現していると考えられ、脳腫瘍の定量評価にはヒストグラム解析は必須であると考えられた。解析には専用の医用画像処理ワークステーションを用いて計測値の定量解析を行った。術後の病理組織所見に基づき定量解析結果を用いて統計学的有意差を検定し、鑑別に有用なパラメータとカットオフ値を検討した。その結果、悪性神経膠腫はKtrans低値、CBV高値、悪性リンパ腫はKtrans高値、CBV低値を示す傾向にあった。更にKtrans、CBVの両者を併用することで、悪性神経膠腫と悪性リンパ腫をより高い感度で鑑別することが可能であることが示された。従ってKtransを含むDCE-MRI及びDSC-MRI(CBV)の組み合わせによる評価法は、悪性神経膠腫と悪性リンパ腫の鑑別において有用なラジオロジカルマーカーであると考えられた。術中迅速病理診断で悪性神経膠腫と悪性リンパ腫を鑑別することは非常に重要であるが、悪性リンパ腫辺縁部の病理組織は神経膠腫と類似するため、術前画像診断と術中迅速病理所見に乖離がある場合、追加の標本採取が必要となり侵襲度が増大する。従って術前画像診断がいかに術中迅速病理診断に合致し合理的であるかが重要である。今後の研究の推進方法として、脳腫瘍生検術における術中迅速病理診断に我々の検討したラジオロジカルマーカーを用いることが有用であるか否かを検討する。

また、対象数を増やし悪性神経膠腫と悪性リンパ腫の鑑別に最適なパラメータとカットオフ値の検討を継続して行う。その他の脳腫瘍の鑑別への応用についても検討を続ける。神経放射線当該年度の実支出額と所要額はほぼ同額であり、研究計画はほぼ予定通り進行している。端数部分が次年度使用額として生じているのみである。今後の研究方針として、脳腫瘍生検術における術中迅速病理診断に我々の検討したラジオロジカルマーカーを用いることの有用性に関する検討、対象数を増やした悪性神経膠腫と悪性リンパ腫の鑑別に最適なパラメータとカットオフ値の検討、その他の脳腫瘍の鑑別への応用についての検討を継続して論文化するため、主に論文執筆のためのハード、ソフトウェアの整備、学会発表に係る旅費、論文執筆に係る英文校正費用などに助成金を使用する予定である。
南米高地における湖古環境変動解析

28年度が最終年度であるため、記入しない。クラーク氏が27年度予定している南米での野外調査の準備として南米の鮮新世・更新世時代の古環境に関する情報収集に当たってきた。研究が対象として過去2万年の古環境復元についてボリビアに分布する湖盆地が重要な情報を保持している可能性が高いが、これらの地域に関する研究成果はほとんど発表されていないのが現状である。かつてボリビアやチリ北部において広範囲に分布していた湖の多くが蒸発し、現在極浅い水体になっているか、完全に干上がった盆地になっているところがほとんどである。今回の調査で特に注目したいのが湖の周囲に分布する古段丘である。これらの段丘に湖から沈殿した炭酸塩岩「トゥーファ(tufa)」が存在すると期待できる。これらのtufaは古環境解析に最も適した試料の一つである。クラーク氏が様ざまな報告書などを検索し、これらの古段丘とtufaが存在する地域を特定してきた。また、効率のよい調査を行えるようにロジスティクス調整も行っている。また、南米のみならず日本国内の古環境復元の可能性について予備調査を行うために2014年12月に九州の天草における地質調査をおこなった。イギリスの共同研究者と熊本大の共同研究者が同行した。その調査の成果をまとめた原稿が投稿され、現在査読中である。クラーク氏はその原稿の共著者である。さらに、クラーク氏が日本の石灰岩を用いた古環境復元も試みるために論文を読み、5月複数の共同研究者と一緒に調査に岐阜件北部での調査に行く予定である。本研究に必要不可欠である炭酸塩岩の酸素同位体分析に豊富な経験のある東北大の高柳助教と連絡を取り、具体的な共同研究体制が固まりつつある。上記の通りで、短時間ではありますが、クラーク氏が期待通りの活躍していると判断する。クラーク氏が来日してから数ヶ月しか経っていないが、27年度予定している南米での野外調査の準備としてクラーク氏が南米の鮮新世・更新世時代の古環境に関する情報収集に当たってきた。研究が対象として過去2万年の古環境復元についてボリビアに分布する湖盆地が重要な情報を保持している可能性が高いが、これらの地域に関する研究成果はほとんど発表されていない。かつて存在していた湖の多くが蒸発し、現在極浅いものになっているか、完全に干上がった例も多い。今回特に注目したいのが湖の周囲に分布古段丘である。これらの段丘に湖から沈殿した炭酸塩がんトゥーファが存在すると期待できる。クラーク氏が様ざまな報告書などを検索し、これらの古段丘とtufaが存在する地域を特定した。また、ロジスティクス調整に力を入れているところであり、短時間ではありますが、期待通りの活躍していると判断します。平成27年度5月日本国内の炭酸塩岩の調査を予定している。その際、イギリスの共同研究者も同行する予定である。また、6月中旬から南米の湖調査を予定している。効率のよい調査を実施できるように、準備作業として衛星画像を用いた古段丘の分布やアクセスについて考察を加える予定である。また、安定同位体分析の助言を貰うために豊富な経験を持つ東北大の研究室を訪問する予定である。帰国後、採取した炭酸塩岩を新しく導入する予定のCL像で観察を行い、炭酸塩岩の成長段階を特定する予定である。また、同じ炭酸塩岩試料から貝虫(ostracod)化石を探しだし、安定同位体などの科学的な分析から古環境に関する情報を抽出する。
胎生期の低栄養が膵島の質的・機能的形成に及ぼす影響の解析

本研究の目的は、胎生期の低栄養が、胎児期、出生後の膵島量と膵島機能に及ぼす影響を明らかにすることである。そのために、膵島量を経時的に観察できるマウスモデル、膵島を三次元的に解析できる画像解析法を用いて、胎仔期から成体における膵島量の推移を解析を試みた。通常栄養群の栄養摂取量の個体間のばらつきが多く、代謝ケージまで導入して解析を試みたが胎生期の低栄養の影響を群分けしての解析に至らなかった。しかしながら、Rip-Lucマウス(ラットインスリンプロモーター下にルシフェラーゼを発現する遺伝子改変マウス)の胎児期の膵島をIVISで計量することができた。さらに、胎児期膵をOPT(optical projection tomography)で計量することができた。研究期間は終了したが、今後低栄養群と通常栄養群のマウスを用いた解析を行う予定である。本研究の目的は、胎生期の低栄養が、胎児期、出生後の膵島量と膵島機能に及す影響を明らかにすることである。そのために、膵島量を経時的に観察できるマウスモデル、膵島を三次元的に解析できる画像解析法を用いて、胎仔期から成体における膵島量の推移を解析することを試みた。具体的には、胎仔膵をOPTスキャナーで解析するために透明化処置を行った。予備段階でFocus Clear液を用いて観察した。Focus Clear液の利点は蛍光タンパクを保持したまま透明化できるため、膵β細胞特異的に蛍光タンパクを発現するマウスを用いた場合に、OPTによる解析が容易になる利点がある。予備段階で膵島を可視化できたが、実際に膵臓を処理したところサンプルの透明化がうまくいかなかったために当初予定していた解析ができなかった。よって、固定、染色、透明化に時間を要するが、従来の方法に従って透明化までの行程を行うことに変更し、胎仔の膵臓サンプル作りから再開した。カロリー制限は、元々の予定通り通常食(CD)群と30%カロリー制限(RD)群に分けることとした。カロリー制限は、毎日CD群の食事量を計量し、その70%量を与え、特にRD群が生まれた仔を食べないように18.5日にカロリー増量することとした。通常食群の摂取量について、餌がこぼれないようなガラス性容器を用いて行ったが、容器の口が広いために周辺への餌の散乱抑制できていないことが示唆された。よって、餌の散乱を抑制する専用のフィーダーに変更して再開した。平成23年度は、胎仔膵のOPT条件を検討するために、胎仔膵サンプルを調整した。交配後18.5日の胎仔より肝膵腸を一塊として摘出し固定した。固定したサンプルについてインスリン免疫染色作業を行った。OPT解析用に、透明化を通常の方法に従って行い、OPTで撮像した。その結果、膵臓に一致して膵島のスポットを認めた。画像解析ソフトで3Dイメージを構築でき、また膵島の数量を定量化できた。次に、雌のRip-Lucマウス(ラットインスリンプロモーター下にルシフェラーゼを発現する遺伝子改変マウス)を、通常食(CD)群と30%カロリー制限(RD)群に分ける予備検討を開始した。カロリー制限は、当初毎日CD群の食事量を計量し、その70%量を与える予定であった。食事量をマウス用のマルチフィーダーを用いて測定したが、毎日の測定では食事量の変化が少なく70%への調節が困難であった。よって、2日毎に摂取量を調節することに変更した。しかしながら、体重変動と食事摂取量の個体差が大きく解析ができなかった。平成24年度は、代謝ケージを用いて摂餌量を毎日測定する方針に変更した。その後、CD群とRD群について、(1)IVISシステムによる解析と(2)OPT Scannerによる解析を行う。解析ポイントは、胎生10日、14日、18日、出生時、以後離乳まで毎週、その後は2週間隔でIVISシステムによる解析を行う。その結果をもとに膵島量の変化点を特定し、OPT scannerによる解析ポイントを決定することとした。平成24年度は、胎仔膵のOPT解析最適化のため、OPT撮像による解析を継続して行った。OPTサンプルについて、膵臓のオリエンテーションを確保するために肝臓を付けたままの胎仔膵臓を固定処理してサンプルを調整し、免疫染色を行うが、解析の結果、肝臓内にもインスリン抗体で染まる部分が存在することが判明した。これが非特異的染色によるものか、実際に肝臓内にインスリンを発現する細胞が存在するのかどうか、同様の胎児サンプルを用いて、免疫染色等を行い検討したが、特定が困難であった。

次に、カロリー制限群の作製について、マウス用のマルチフィーダーを用いた方法での検討を再度試みたが、毎日の測定で食事量の変化が少なすぎることと変化量について個体間のばらつきが大きいために70%への調節が困難であった。そのため、雌のRip-Lucマウス(ラットインスリンプロモーター下にルシフェラーゼを発現する遺伝子改変マウス)を、代謝ケージを用いての通常食(CD)群と30%カロリー制限(RD)群に分ける予備検討を開始した。その際、カロリー制限は、当初毎日CD群の食事量を計量し、その70%量を与える予定であったが、摂取量の個体差が大きく、また同個体においても食事量が安定しないため、十分な検討を加えることができなかった。さらに、RD群では、出産後のマウスを食べてしまう問題もあり、解析が困難であった。・カロリー制限群の安定した作成がマウス用マルチフィーダーでは困難であることが判明したこと・厳密な摂取量評価に基づくカロリー制限を行うためには代謝ケージと判明したが、代謝ケージの導入を行い、運用を開始するまでに時間を要したこと・新生児マウスのIVIS撮像における問題点解決を検討した。具体的には、これまでルシフェリンの腹腔内注射後のIVIS撮像を行っていたが、新生児マウスが小さいために手技的に困難があり、安定したデータが得られなかった。そこで、皮下注射による観察法に切り替えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。・平成23年度に導入した代謝ケージを用いて、コントロール群とカロリー制限群の作成とその後の比較検討を行う。胎仔膵のOPTによる解析を行い、膵島量の定量と比較を行う。また、乳児期マウスに経時的にルシフェラーゼを投与してIVISによる前向きの定量解析を行う。膵島量の差を明らかにした上で、介入ポイントを設定し、膵島量回復の可能性ついて検討する。
レンズ上皮細胞のアポトーシス誘導因子の人工レンズへの提示

レンズ上皮細胞(LEC)にアポトーシスを誘導する分子を明らかにし、後発白内障の予防や治療に適用する。最初にレンズとその周辺組織におけるアポトーシス関連遺伝子発現状態を調べた。アポトーシス誘導因子のTRAILの遺伝子は虹彩と脈絡膜で発現が認められ、レンズ上皮では認められない。一方その受容体(DR5)は脈絡膜とレンズ上皮に認められた。TNFの発現は認められなかったが、これに対する受容体TNFRはレンズ上皮のみで検出された。レンズ上皮におけるTNFRとDR5の発現は免疫染色によって確認された。レンズ上皮を培養すると、TNFやTRAILとそれらの受容体が発現するようになる。以上の結果よりLECのTNFやTRAILによるアポトーシス誘導の可能性が示唆された。そこでTNFαやTRAILによるLECへの人為的アポトーシスの誘導を試みたが、因子単独では誘導されず、Actinomycin DやCycloheximidの共存により効果的に誘導された。Actinomycin DまたはCycloheximide単独でもLigand存在下と同様の効果が観察されたこと、また本研究の最終目的からするとActinomycin D(またはCycloheximide)単独でLECへのアポトーシス誘導が可能であるならば、その適用の可能性を追求することも有効な一方法であると考えられた。そこでActinomycin D処理の条件(濃度、処理時間)検討を行った。その結果、低濃度のActinomycin Dを一定時間処理する事により顕著なアポトーシスを誘導できた。このActinomycin Dによるアポトーシスはカスパーゼの阻害剤によって影響を受けなかった。また、抗TNFα抗体の投与によっても阻害を受けなかった。
視床障害者における皮膚交感神経活動測定と局所温熱療法の作用機序の解明

脳血管障害(脳出血、脳梗塞)で冒される部位は様々であるが、その1つに視床が挙げられる。視床に病巣を有する脳血管障害患者では感覚障害が見られる。また、感覚の伝導路である外側脊髄視床路は視床でシナプスを介し、視床下部や脳幹などの自律神経調節に関与する部分に達する経路も持ち、特に視床下部は体温調節の中枢であるので、皮膚交感神経活動(skin sympathetic nerve activity: SSNA)と密接に関わっていると考えられる。また、視床障害者においては、視床痛という耐えがたい痛みが、リハビリテーションの阻害因子となるケースが多々ある。視床痛やその他の反射性交感神経性ジストロフィー(reflex sympathetic dystrophy:RSD)と呼ばれる病態に対して、リハビリテーションにおける物理療法として、局所温熱療法(ホットパックなど)が治療手段のひとつとして施行されているが、その作用機序は厳密には不明である。当該研究の目的は、健常者と脳血管障害者(特に、視床)のSSNAを測定し、体温調節に重要な役割を担っているSSNAが脳のどの障害部位によってどう変化するのかを調べることである。また、視床痛などの治療としてホットパックが用いられているが、実際に、ホットパック負荷することによってどのようにSSNAが変化するかを調べることである。当該年度は、視床出血患者1名の安静時SSNAの導出に成功した。しかし、ホットパック負荷中の記録は困難であった。以上より、視床に病巣を持つ患者合計8名、健常者合計6名のSSNA導出に成功した。当該年度は、視床出血患者合計3名、健常者合計3名からの安静時SSNAの導出に成功した。ホットパック負荷については、視床出血患者1名、健常者1名で可能であった。今後、さらに症例を集めていく予定である。当該年度は、本研究を実施するシールドルームをより良い環境にするために、大規模な工事を行うこととなり、新しいシールドルームを平成24年11月に完成させた。その後、ノイズのチェックや必要物品の購入など環境整備を行い、若年健常者のデモでは良い環境でのSSNAの導出に成功した。また、1例のみであるが、脳血管障害者からの安静時のSSNAのデータも得ることができた。