hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
政治アリーナにおけるジェンダー構造の研究

本研究の目的は、政治アリーナにおいて女性の参画がなかなか進展しない要因と、政治家として活動する女性たちが期待される成果をあげることが困難な要因を、ジェンダーの視点から組織的・制度的に分析することにある。平成16年度はまず、過去3回の統一地方選を中心に、ここ10年ほどの神奈川県下における女性議員の変遷をまとめた。神奈川県は市町村議会における女性比率が全国のトップクラスであり、特に湘南から三浦半島にかけての市部は20%を越えるところが少なくない。それに比して町村部では女性議員比率は低かったが、その中で大磯町は2003年6月の選挙で女性議員50%なった。そこで、市部を代表する横浜市と、議員比率が男女半々の大磯町を中心に、インタビュー調査を実施した。平成17年度は、その結果を受けて、神奈川県下の市町村議会議員を対象に、アンケート調査を実施した。アンケート調査の目的自体は、議員になるプロセス、議員としてのプロダクトを明らかにし、そこにジェンダーの相違がどのように現れてくるかを探ることである。11月初旬に、神奈川県下の市町村議会議員のうち個人名と連絡先のわかった829名(うち女性167名、男性662名)にアンケート調査票を送付し、306名(女性70名、男性236名)から回答を得た(回収率36.9%)。その後、単純集計と性別クロス集計の結果をまとめ、簡単な報告書を作成した。平成18年度は、インタビュー調査、アンケート調査の結果をまとめ、議会議事録を収集・分析したりメディア関係者に補足的インタビューを実施したりしながら、本来の目的にこたえるかたちで研究分析を進め、報告書を作成した。報告書は3部構成である。まず第1部「日本における『女性と政治』の現状」では、「女性と政治」の現状と問題についてまとめている。そもそもの政治概念を検討し、女性が政治に参加・参画してきた経緯とその背景にある社会への女性の参画状況をまとめ、90年代以降増加してきた女性地方議員と地域、政党などにみられるその相違について概観し、さらに神奈川県の女性議員について概観した。第II部「調査結果の報告」は、インタビュー調査とアンケート調査の報告である。第III部「女性の政治参画に影響を及ぼすジェンダー構造の分析」では、インタビュー調査とアンケート調査の結果をもとに、家族、選挙、構造的・制度的要因、政治的活動、キャリアなど焦点を絞って分析考察した。そして最後に、民主主義やフェミニズムの観点も交えて、女性の政治参画の意義について総括した。本研究の目的は、政治アリーナへの女性参画の推進、阻害要因と、政治家として成果をあげるための要件を、議員や議会、政党をとりまく組織、制度のジェンダー構造に着目して分析することにある。政治アリーナといっても広大な領域であるので、調査対象地域を神奈川県に限定し、中でも横浜市、大磯町の女性議員を中心に調査を進めた。まず、過去3回の統一地方選を中心に、ここ10年ほどの神奈川県下における女性議員の変遷をまとめた。

神奈川県は市町村議会における女性比率が全国のトップクラスであり、特に湘南から三浦半島にかけての市部は20%を越えるところが少なくない。それに比して町村部では女性議員比率は低かったが、その中で大磯町は2003年6月の選挙で女性議員50%となった。そこで、市部を代表する横浜市と、議員比率が男女半々の大磯町を中心に、インタビュー調査を実施した。また、高齢の議員が多く、横浜市や大磯町とは議会特性が大きく異なると思われた南足柄市の議員もインタビューに加えた。インタビュー内容は、立候補までの経緯や選挙活動、地域の支援グループ・組織・政党との関係、当選後の議会活動などであり、実態をおさえた上で、議員自身の選挙の評価や、政治家としての意識、理念、そして当選後の成果などをたずねた。各インタビューは記録にとり、テープ起こしをしてまとめている段階であるが、議会の規模や特性、党派性、そして地域特性が女性議員数と女性議員の活動に及ぼす影響が浮かびあがってきた。たとえば、党派性が議会活動、議員活動を大きく規定する横浜市では、党派内の性別イデオロギーと女性の位置づけが問題となる。小規模で会派もなく歳費も低い大磯町では、議員個々人の能力と特性、地域との関わりが大きく影響する。一方、議員の名誉職的意味合いが強かった南足柄市では、女性議員の参入、増加が逆に議会活動の変化を生み出している。本研究の目的は、政治アリーナにおける女性の参画がなかなか進展しない要因と、政治家として活動する女性たちが期待される成果をあげることが困難な要因を、組織的・制度的ジェンダー構造の点から分析することにある。平成16年度は女性議員および関係者のインタビュー調査を行ったが、本年度はその結果を受けて、神奈川県下の市町村議会議員を対象に、アンケート調査を実施した。アンケート調査の目的自体は、議員になるプロセス、議員としてのプロダクトを明らかにし、そこにジェンダーの相違がどのように現れてくるかを探ることである。11月初旬に、神奈川県下の市町村議会議員のうち個人名と連絡先のわかった829名(うち女性167名、男性662名)にアンケート調査票を送付し、306名(女性70名、男性236名)から回答を得た(回収率369%)。その後、単純集計と性別クロス集計の結果をまとめ、簡単な報告書を作成した。調査結果にみられる男女の主要な相違をまとめる。まず、議員になるまでであるが、概して男性の方が多様なプロセスを経て政治家になっていると言える。政治的社会化過程や立候補までの経緯、職業(前職)との関係、政党との関係、地域との関係など、男性議員においてばらつきが大きい。それに対して女性議員の方は、子どもや地域の活動を経て政治に関心をもち、政党や政治的団体と関わり、選挙に立候補するという過程が多くみられる。選挙活動は、地域の友人、知人や政党、政治団体の支援を受け、女性の方が熱心である。また、政治家となってからも、議会活動や地域住民にたいする活動は女性議員の方が熱心である。取り組みたい問題・領域にも男女差がみられる。「行財政」「まちづくり」は男性の関心が強く、「少子化・子育て」「男女共同参画」は相対的に女性の方が関心を寄せている。調査結果については、来年度さらに分析を進める予定である。
シミュレーションベースモデリングのための高性能最適化システム基盤の構築

近年,モデル構築の複雑さの爆発という情報爆発に関する問題に対処するため,観測データからシミュレーションに基づいて自動的にモデリングを行うシミュレーションベースモデリング(SBM)が注目されている.現在, SBMのための最適化手法として遺伝アルゴリズム(GA)が有望視されているが,計算時間の爆発という新たな情報爆発に関する問題に直面している.グリッド計算環境でGAを高速に実行するためのシステム基盤として,昨年度はGbGA Framework 2の設計,実装を行った.本年度は,社会科学/生命科学の領域専門家がシングルCPU環境からグリッド環境までシームレスに利用可能な環境の構築を目指して, GOGA Framework 2の上にシングルCPU環境用GAライブラリとそのグリッド化モジュールを構築し,実アプリケーションへの適用を行った.シングルCPU環境用GAライブラリは, Javaベースのオブジェクト指向フレームワークであり,非常に拡張性に富んだ柔軟性の高いライブラリとなっている.標準的な交叉や世代交代モデルを提供しているが,利用者は,交叉,世代交代モデル,問題などの独自に開発したモジュールを組み込むことにより,容易にライブラリを拡張することができる.また,複数のパラメータについて乱数系列を変更して複数試行を行い,結果を統計処理するといったSBMにおいて典型的なワークフローもサポートしている.GAライブラリのグリッド化モジュールは,シングルCPU環境用GAライブラリをグリッド上で並列分散実行するためのモジュールである.設定ファイルを差し替えるだけで,任意のGAについて試行,個体評価のレベルで並列分散化を実現できる.また,世代交代モデルに依存する形であるが,世代交代についても並列分散化するためのモジュールも提供している.本年度は,既存のGOGA Frameworkで得られた知見を生かしつつ, GOGA Frameworkにおける利便性に関する問題点,すなわち,1)ミドルウェアGlobus Tool Kit Ver.2 (GTK2)が利用できる環境を想定しているため実運用可能なグリッド計算環境が限られる点,2)ノードを占有できる環境を想定しているため実運用可能なグリッド計算環境が限られる点,を克服するため,新たにGOGA Framework 2の設計および実装を行った.GOGAFramework 2では,シングルサインオンを一般的に利用されているSSHエージェント,セキュアなファイル転送をSCP,データの安全な転送をJava Secure Socket Extension(JSSE)を用いて実現することにより,問題点1を克服した.また,実行環境を,資源割り当て機構として広く使われているGrid Engineと連携してクラスタ内部のノードに起動させるようにすることにより,問題点2を克服した.GOGAFramework 2を用いて,並列GAモデルであるPMGG(Parallelized MGG)のグリッド化を行い,東工大すずかけ台キャンパスにある研究室のユーザ端末,東工大大岡山キャンパスにあるTSUBAMEクラスタ31CPU,東工大すずかけ台キャンパスにあるDISクラスタ72CPUを用いてGOGA Framework 2の動作検証を行った.ユーザ端末上でGOGA Framework 2を起動して,マスタをDISクラスタ内,70ワーカをDISクラスタ,30ワーカをTSUBAMEクラスタ内で動作させたところ,良好なスケーラビリティを示し,実験結果のGAのログが手元のユーザ端末上に正常に保存されることを確認した.近年,モデル構築の複雑さの爆発という情報爆発に関する問題に対処するため,観測データからシミュレーションに基づいて自動的にモデリングを行うシミュレーションベースモデリング(SBM)が注目されている.現在, SBMのための最適化手法として遺伝アルゴリズム(GA)が有望視されているが,計算時間の爆発という新たな情報爆発に関する問題に直面している.グリッド計算環境でGAを高速に実行するためのシステム基盤として,昨年度はGbGA Framework 2の設計,実装を行った.本年度は,社会科学/生命科学の領域専門家がシングルCPU環境からグリッド環境までシームレスに利用可能な環境の構築を目指して, GOGA Framework 2の上にシングルCPU環境用GAライブラリとそのグリッド化モジュールを構築し,実アプリケーションへの適用を行った.シングルCPU環境用GAライブラリは, Javaベースのオブジェクト指向フレームワークであり,非常に拡張性に富んだ柔軟性の高いライブラリとなっている.標準的な交叉や世代交代モデルを提供しているが,利用者は,交叉,世代交代モデル,問題などの独自に開発したモジュールを組み込むことにより,容易にライブラリを拡張することができる.また,複数のパラメータについて乱数系列を変更して複数試行を行い,結果を統計処理するといったSBMにおいて典型的なワークフローもサポートしている.GAライブラリのグリッド化モジュールは,シングルCPU環境用GAライブラリをグリッド上で並列分散実行するためのモジュールである.設定ファイルを差し替えるだけで,任意のGAについて試行,個体評価のレベルで並列分散化を実現できる.また,世代交代モデルに依存する形であるが,世代交代についても並列分散化するためのモジュールも提供している.
人間の安全保障規範の形成と伝播についての研究-北米、ヨーロッパ、アジアの比較

本研究では、人間の安全保障規範の形成と伝播のグローバルなプロセスを、地域的比較を通して明らかにした。第一に、人間の安全保障規範の形成と普及にイニシアティブをとった日本やカナダ、さらにはヨーロッパ諸国、タイや中国などのアジア諸国において、各地域の社会的規範や既存の政策との相互作用を経て、異なる形で受容されていることが分かった。第二に、規範の伝播は国際レベルからローカル・レベルへの一方向だけでなく、ローカル・レベルから国際レベルへの影響も重要であることが明らかになった。2007年度研究の目的に掲けたとおり、(1)人間の安全保障規範の形成と伝播のプロセスについてのリサーチデザインの拡充を行い、(2)地域ごとの多系的な規範の伝播プロセスの解明にとりくんだ。前半は、(1)の先行研究を網羅的にサーベイしつつ、社会学、文化人類学の文献にも目を向けることによって、新しい分析枠組みの提示を行なった。国際政治学会(2007年10月)において研究発表を行ない、多くの方面からの関心が高いことを感じた。(2)については、具体的にはヨーロッパと日本を中心に、事例調査を進めた。連合王国への調査(秋)によって、本領域における同地域の研究動向を把握すると同時に、ヨーロッパにおけ人間の安全保障概念の展開についての、聴き取り調査を行なった。また、先行研究の調査を進めるうちに、まずは日本を事例研究の対象とすることに意義があるとの結論にいたったため、夏以降は日本における人間の安全保障規範の受容、再構成、国際的な規範へのフィードバックのプロセスを、聴き取り調査を重ねることで明らかにした。また、3月の渡米調査において、日本政府国連代表部の関係者への聴取を行なう予定である。本年の聴き取り対象は、政策形成プロセスに直接かかわった国会議員(元政務次官)、外務官僚、NPO理事長、国連職員などである。この結果の一部についても、前述の国際政治学会において事例としてとりあげ、研究発表を行なった。本事例研究は、価値や規範のような従来日本政府が外交の柱として取り上げる経験のない分野において、どのようにして政策が進展したのかを解明する一つの興味深い事例となった。すなわち本規範の受容に関しては、官というよりは政治主導であり、首相のリーダーシップが重要であったこと、民間のブレーンの役割が相当程度あったこと、外務省内部でのイニシアティブもそれに比例して出てきたことなどで、これにより、外に対して規範を投影する方向性もうまれたことである。初年度は日本における人間の安全保障規範の受容プロセスを明らかにすることを中心にして、実証的な研究を行った。二年目にあたる20年度は、第一に、引き続き、日本における受容プロセスをフォローするとともに、第二に、アジア、北米など他地域における人間の安全保障の伝播と受容の解明にとりくんだ。第一の課題については、文献調査をさらに進めると同時に、東京において国際協力機構(JICA)において人間の安全保障規範を導入し、実施のためのガイドラインとして作成した担当者、また、人間の安全保障のガイドラインについてJICA職員への理解促進を進める担当者などを始め、関係者への聞き取り調査を行った。これにより、政府の実施機関がいかに国際的規範を実践へと導入するのか、そのプロセスを明らかにすることができた。第二の課題については、アジア、北米、また調査の過程であらためて重要性が明らかになったラテンアメリカ諸国との関係を中心に、文献調査を開始した。それと同時に、今回は、調査対象のアベイラビリティの関係から、タイに聞き取り調査をしぼりこみ、タイ外務省、在タイ日本大使館、在タイJICAなどにおいて、担当者から聞き取り調査を行うことができた。タイにおける調査を通じて、アジア諸国における受容プロセスの一例をさらに明らかにすることができると考えている。本年度は、第一に、アジア諸国(タイ、中国、日本)における人間の安全保障受容についての研究を進めた。日本の場合には教科書における記述など社会レベルでの受容にも着目しつつ調査し、中国、タイについてはインタビュー調査や文献調査を行った。また国連における言説分析を通じて、人間の安全保障規範が国際的にどの程度広まっているのかを明らかにした。第二に、日本政府による、国際的な規範促進過程について、調査をほぼ終えた。その調査結果を、現在論文として執筆中である。前年度の調査結果も含め、今年度は下記の成果公開を行った。4月にロンドンの国際シンポジウムにおいて日本の社会的受容の問題を提起した。8月には日本学術会議研究会において、日本政府による規範受容と促進についての研究成果を報告した。9月には、国際ワークショップ(東京大学)において、東アジア地域における人間の安全保障の伝播状況についての報告を行った。10月には、日本の人間の安全保障規範の重要と伝播促進についての報告を、国際ワークショップ(大阪大学)において行った。また日本による規範受容と促進について執筆した論文は、英文ジャーナルに投稿するため、現在、ネイティブの研究者によって英語翻訳と校正を受けている。最終年度の成果報告書を執筆し印刷を行った。
新規パーキンソン病モデルマウスを用いたドパミン神経細胞死メカニズムの解明

本研究の目的はパーキンソン病における神経細胞死のメカニズムを明らかにすることである。パーキンソン病でみられる異常たんぱく質の蓄積とドパミン神経細胞死を来す新規の2種類のモデルマウスを用い、脂質解析や広範囲での代謝産物測定、遺伝子発現解析を行う。これにより生体内でドパミン神経特異的な神経細胞死が起こる機序を明らかにする。本研究の成果はパーキンソン病の発症や進行を抑制する治療に繋がることが期待できる。
現代的な知覚研究のための哲学的基礎づけとその体系化

以下のことを遂行することにおいて課題に関するいくつかの成果を得た。すなわち、(1)色彩の存在論における投影説的見解に対する評価。(2)聴覚対象および嗅覚対象の存在論に対する、出来事意味論の観点からの、また共同知覚の観点からの検討。(3)いわゆる「共同注意」に関する体系的な哲学的概念分析。(4)知覚対象と知覚経験に関する可能世界的意味論に基づく理論化可能性の検討と評価。(5)知覚に関する表象説(志向説)のさまざまなヴァージョンに対する理論的評価。研究実施計画に基づき、22年度はまず、本プロジェクトにおける知覚の哲学各部門(心の哲学、言語哲学、形而上学)の、基礎的な中心問題の抽出と検討を行なった。それらの問題のうちのいくつかはすでに知られた比較的標準的なものであるが、研究分担者の篠原成彦は、とくに視覚の哲学の色彩論に関連して、形而上学的意義をもつ複数の知見を得た。その成果は、二つの学会にて講演および発表する機会を得、また当科研費の研究会においても報告された。代表者の柏端達也と分担者の美濃正は、それぞれの研究部門において当初の計画に沿った研究課題に取り組んだ。さらに篠原の上記諸成果を受ける形で、(1)知覚の表象説(志向説)の理論的是非と、(2)視覚に関する可能世界的意味論に基づく理論化の可能性を、今年度後半の主要な検討課題とするに至った。12月に行なわれた研究会では、外部から1名の講演者を迎え、またさらに3名の研究協力者(小草泰、藤川直也、前田高弘)の協力を得て、代替的理論との比較を含むより包括的な観点から、上記の検討課題に具体的に取り組んだ。平成23年8月に行なわれた研究会(震災により延期された3月の研究会の代替)では、聴覚の哲学と音の存在論に関する専門家1名を講演者として招き、さらに、研究協力者(小草、藤川、前田)と研究分担者の美濃と篠原を講演者として、公開の形で討論会および研究成果報告会を行なった。22年度の研究によって、色彩の存在論的な身分や、あるいは視覚における曖昧さといった現象に対して様相実在論的な哲学理論がもつ問題点は明確になっており、またそれらの事柄が表象説に対してもつ論理的帰結が明らかになった。加えて、聴覚や痛覚といった他のモダリティにおける同様の、または関連する問題に取り組む必要性も(次年度以降の課題として)明確になった。当初の研究実施計画に基づいて、平成23年度は、本プロジェクトにおける各部門(心の哲学、言語哲学、形而上学)がより連携を深める形で、前年度の基礎的研究を踏まえ、知覚の哲学の体系化という最終課題達成へ向けての研究を遂行した。とりわけ、前年度で得られた知覚の形而上学に関する知見を踏まえて、主要な既存の知覚理論との関連性についての検討が進んだ。すなわちそれは、いわゆる知覚の表象説と選言説に対する評価研究として進展し、そして具体的な成果として9月に当科研費メンバーによるワークショップの形で公表することができた(「知覚の哲学の最近における展開をめぐって」提題者:美濃正、篠原成彦、小草泰、前田高弘)。この理論的な研究は、本年度を通して各部門において継続的に推進された。また、視覚(おもに色彩に関する)とその他の感覚モダリティとの比較および関係の検討に関しても、ひきつづき着実な進展があったととくに言うことができる。研究活動としては、まず8月に千葉大学で公開の研究会を開き、平成22年度の研究成果の総括を行なった(この研究会は震災により開催が遅れていたもの)。それに続き、9月に応用哲学会第3回年次研究臨時大会で上述のワークショップを主催した。さらに平成24年の1月に信州で、3月に大阪で、講演者として計4人の講師も招いて、研究会を開いた。平成23年度の研究によって、次年度の具体的課題のいくつかが明確になり、さらに、最終目標である知覚に関する哲学的理論の体系化に向けて一定の見通しを得ることができた。研究実施計画に基づいて、平成24年度は、本プロジェクトにおける各部門(心の哲学、言語哲学、形而上学)を統合的な観点から結びつけ、また、当年度までに得られた成果を踏まえたうえで、知覚をめぐる本哲学的研究の最終的な体系化と基礎づけを行なった。最終的に本研究プロジェクトでは、そこにおいて検討を重ねた知覚に関するいわゆる「表象説」(「志向説」)を批判的に取り込む形で、直接実在論などの形而上学的理論との関連性をも考慮しつつ、より包括的なーすなわち、従来等閑視される傾向にあった視覚以外のモダリティや、あるいは行為としての知覚やアフォーダンスといった近隣領域における議論をも、包括的に扱いうる可能性をもつー知覚の理論の構築と、その評価を行なうことができた。

そしてその最も早い研究成果は、平成25年4月に開かれた応用哲学会(於南山大学)において、当科研費研究グループのメンバーによるワークショップ(「知覚の哲学の最近における展開をめぐって3」)として報告をした。24年度の主な研究活動としては、平成24年8月に慶應義塾大学で、平成25年2月に京都大学で公開の研究会を開き、合計4人の講師による講演会を開くとともに、本研究プロジェクトの研究成果の段階的な公開を行い、外部からの評価を得た。また平成25年3月には信州大学において、本プロジェクトの最終総括と、今後の(プロジェクト終了後の)成果公開に向けての具体的な検討を行なった。以上のように、本科研費による研究活動により、当初掲げた「現代的な知覚研究のための哲学的基礎づけとその体系化」という課題は、具体的な形で一定程度の達成を見たと自己評価するものである。研究実施計画のとおり、とりわけ主要な既存の知覚理論との関連性に関する研究が各部門において進み、かつ、体系化に向け期待した見通しも得られ、ここまでの段階の成果を24年4月中に公表できる予定であるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度の目標である理論的体系化のため、各部門の連絡と連携体制をさらに強化する必要があり、他方で研究協力者の若干の配置の変更にも対応するため、あらたな協力者を加え、かつ研究参与者の役割を微調整することにする。また、当初かならずしも中心的ではなかった「錯覚」を、研究をより焦点化するために、集中的なサブテーマの一つに加える。
メキシコイトスギ培養細胞におけるヒノキチオール生成経路と関与する酵素

本研究者はテルペンシンターゼによりゲラニル二リン酸からテルピノレンを合成し、さらに修飾を受けてヒノキチオールが生産されると予想している。この予想に基づき、C.lusitanica細胞に存在するヒノキチオール生産関連酵素の探索を行った。まず、テルペンシンターゼのクローニングを試みた。既知のテルペンシンターゼのcDNA配列を参考にホモロジーを用いたdegenerateRT-PCRにて対象遺伝子の断片を得た。このRT-PCR産物のDNA配列は従来のテルペンシンターゼに十分なホモロジーを持っていたので、これをもとにcDNAライブラリーからのテルピノレンシンターゼのスクリーニングを行った。このプローブによって、いくつかのクローンが得られた。しかしながら、すべてのクローンは5`末端の配列を欠いていたので、5'-RACE法を用い、欠損部分を補うことで全長配列を得た。この全長配列はすべて既知針葉樹テルペンシンターゼと十分に相同性を持つことが示された。大腸菌によるこの酵素の生産のためにはシグナルペプチドの切除が必要なため、適宜5'側配列を削った状態でこれらを遺伝子導入し、異種発現させ、誘導タンパクを得た。しかしながら、現在のところこのタンパクに酵素活性を得るには至っていない。一方で、本細胞内にあるモノテルペン類の探索から、炭化水素モノテルペンのP450酵素による代謝に興味が持たれた。そこで、ヒノキチオール生産の中間体と予想しているテルピノレンの粗酵素液による変換について調べた。一般的な植物P450の抽出・反応に使われる条件でC.lusitanica細胞粗酵素抽出液ミクロソーム画分を用いてテルピノレンを基質としたところ、生成物として5-Isopropylidene-2-methyl-cyclohex-2-enolが得られた。これが、さらに酸化・変換を受けてヒノキチオールとなる物と予想している。ヒノキチオール生合成に関わると思われる遺伝子(酵素)を二つの手法で得ることを試みた。計画調書に記載したごとく、本研究者はテルペンシンターゼによりゲラニル二リン酸からテルピノレンを合成し、さらに修飾を受けてヒノキチオールが生産されると予想している。そこで、既知のテルペンシンターゼのcDNA配列を参考にホモロジーを用いたdegenerate RT-PCRにて対象遺伝子の断片を得て、これをもとにcDNAライブラリーからのテルピノレンシンターゼのスクリーニングを行った。RT-PCR産物のDNA配列は従来のテルペンシンターゼに十分なホモロジーを持っていたので、これをプローブとして用い、現在までにいくつかの有望なクローンが得られた。このクローンについては、これらを異種発現させることでこの酵素の詳細を調べる。また、このテルピノレンシンターゼの酵素活性は、通常の培養条件下の細胞ではほとんど見られず、エリシターの刺激によって初めて活性が現れることがわかった。そこで、エリシターによって誘導されるmRNAがヒノキチオール生産関連遺伝子であろうと予想し、マクロアレイ法による発現遺伝子の検索を行った。エリシテーションを行った細胞のcDNAライブラリーを作成し、これに対してエリシテーション前後の細胞のmRNAをプローブとして発現に増減の見られるmRNAを検索した。その結果、エリシテーションにより増加する48のクローンが得られた。また、いくつかの活性が減少するクローンもあった。現在これらのクローンのDNA配列の決定作業をしており、エリシテーション関連シグナリング経路の情報とともにヒノキチオール生産酵素の候補となるクローンが得られると期待される。
遺伝子疾患の治療をmRNAのスプライシングの調節により行なう。

慢性肉芽腫症(CGD)を含めた遺伝病の約40%は、塩基置換により発生する中途ストップコドン(pre-mature stop)のために、正常な完全長の蛋白質ができないことが原因となる。CGDは、殺菌に必須である酵素、食細胞NADPHオキシダーゼの遺伝子異常により、好中球、好酸球や単球による殺菌能が低下し、小児期から致死的な細菌及び真菌感染を繰り返す疾患である。そこで、CGDの原因の一部ではあるが、治療によりpre-mature stopをmRNAから除くことができれば、正常に近い長さの蛋白質の翻訳が可能となり、症状の改善が期待できる。本応募課題では、期間中にCGD患者好中球におけるpre-mature stopの除去機構の解明とCGD患者の症状の改善を目的とする。将来的には他の遺伝病でも同様の治療方法の有効性を確認したい。平成21年度はまず、活性酸素生成法の開発を行ない、CGD患者好中球が生成する活性酸素の定量を可能にした(学会発表)。その定量法に基づき、CGD患者好中球の活性酸素量と症状に関する考え方を発表した(図書(英文査読あり))。治療を考えた場合、どの程度の活性酸素の生成ができれば、感染症を繰り返さないのか、との疑問がでる。ある程度の活性酸素を生成するCGD好中球(好酸球)の解析から、10%程度の白血球細胞が活性酸素を生成できれば、致命的な感染症は避けられると現在考えている。また、我々はこれまでCGDで欠損するタンパク質のプロモーター解析を行なってきたが(BBRC209-146,PNAS26-6085)、それらの発現調節の解析もおこなった(学会発表、雑誌論文)。
Semaphorin 3Aの軟骨再生能の検討

本研究は、近年骨代謝において重要な働きを要していることが明らかとなったSemaphorin3A (セマフォリンスリーエー:Sema3A)に着目し、下顎頭軟骨の増殖・分化におけるSema3Aのメカニズムを解明することを目的としている。これまでの研究成果を合わせると、顎関節にかかる過度な機械的刺激によって生じた軟骨損傷に対するSema3Aの抗炎症効果のみならず、Sema3Aの有する下顎頭軟骨の修復促進効果が明らかになると予測された。平成30年度において、in vitroにおいて培養軟骨細胞を用い、Sema3Aが軟骨代謝機構に及ぼす影響とそのシグナル伝達経路を解明し、次年度、in vivoではSema3Aをラット下顎頭高負荷モデルに適応し、軟骨再生の可否について検証する予定である。軟骨再生に対するSema3Aのメカニズムを制御することで、変形性顎関節症の新規治療法の確立を目指すことを究極的な目標とした。In vitro系での実験の再現性・整合性の確認が終了後、日本矯正歯科学会での学会発表および論文の執筆を行う。その後、in vivo系の実験を行う。すでに申請者らが確立しているラット下顎頭高負荷モデルを用いる。13週齢Wister系ラットの上下切歯に咬合挙上装置を装着する。これにより下顎頭は上方に押し上げられ、圧迫・変性を生じる。右側顎関節をSema3A投与群、左側顎関節を非投与群とする。咬合挙上装置を30日間装着させたのちにSema3Aを投与し、経時的に顎関節軟骨の採取を行う。軟骨基質構成タンパク、ヒアルロン酸合成酵素および軟骨分化制御因子について、定量PCR遺伝子解析および定量western blot解析を行う。また組織切片を作製し、軟骨基質構成タンパクおよびヒアルロン酸合成酵素について、免疫組織化学染色を行うことで軟骨基質の性状について評価を行う。また、Sema3A投与群と非投与群の下顎頭形態につてマイクロCTを用いて三次元的解析を行う。その後、それらの実験結果について、学会発表および論文執筆を行う。
炎症性蛋白質カルプロテクチンの歯周疾患活動性指標としての有用性とその役割

被験者は,徳島大学歯学部附属病院第二保存科を受診した歯周疾患あるいはその他の口腔疾患を有する初診患者200名(男性85名,女性115名,平均年齢49.7歳)とした。歯肉溝滲出液(GCF)は歯周ポケットあるいは歯肉溝に挿入したペリオペーパーから採取し,その容量をペリオトロンにより測定した。引き続きプロービング値(PD)を測定し,4mm以上をポケット部位,3mm以下を健常部位とし,プロービング時の出血(BOP),歯肉炎指数(GI)についても検査した。I型プロコラーゲンC末端ペプチド(P1CP),オステオカルシン(OCN),オステオポンチン(OPN))量の測定は,各種市販キットを用いて行った。GCF中の各蛋白量は全てポケット部位で有意に高く,とくにP1CPで6.1倍と顕著であった。P1CPおよびOCN量は,いずれもGIおよびPDと正の相関関係を示し,その傾向はP1CPで強かった。OPN量については,PDとのみ正の相関関係を認めた。また,P1CP量はBOP(+)部位で有意に高い値を示した。以上の結果より,GCF中のP1CP, OCN, OPNは歯周炎の骨代謝関連指標になる可能性があり,とくにP1CPは歯周炎における骨代謝回転を反映する指標として有力であることが示唆された。今回注目した骨代謝関連蛋白は,ペリオペーパーを挿入している一定時間内に採取した総量として分析したが,歯周疾患診断指標となりうる物質は,歯周疾患活動性を反映することが期待されるため,歯周ポケット中のGCF量に依存することなく変動することが重要視され,実際には濃度表示により分析されることが多い。今回データは示していないが,GCF中のP1CP, OCN, OPN濃度はPD, GI, BOPと相関関係を認めなかった。一方,以前までに報告しているように,カルプロテクテン(CPT)濃度は臨床的指標だけでなくIL-1β, PGE_2,コラゲナーゼ,ASTといった他の生化学的指標とも有意な正の相関関係を示すことから,CPTは歯周疾患活動性指標としてより有用性の高い蛋白であると考えられる。
音響電磁相互作用による脳の電気活動の実時間3次元イメージングと非侵襲的BMI

本研究は、研究代表者の発明である「音響電磁相互作用に基づく生体の計測と刺激」の基本原理(国内特許出願2006-280558、特許国際出願PCT/JP2008/056304)とその発展を、プロトタイプ実験装置の開発と検証実験の実施により検証することを主要な目的とし、その応用として「脳などの生体の電気活動のサブミリメートル分解能での非侵襲的なミリ秒リアルタイム3次元のイメージング」と非侵襲的なBMI(Brain Machine Interface:脳と機械のインターフェイス)を可能とする技術や装置の開発を最終的な目的とするものである。本年度、前年度までに開発した実験装置を用いた原理検証実験を実施した。その結果、A)生体への超音波パルスの照射装置に関しては基本的な動作には問題は無いが、B)高い周波数帯に対応した高感度の生体電磁場検出装置の感度は十分であるものの対ノイズ性能が不足しており、生体信号がノイズに埋もれ十分に検知できない問題が判明した。このため、これを解決する為の回路設計・回路開発を重点的に行った。また、ノイズに埋もれた信号を検出する為の情報処理ソフトウエアの開発も併行して実施した。これらの開発により対ノイズ性能の高い検出装置の開発に成功した。得られた知見・技術の論文・特許化を予定している。しかしながら、現時点においても生体信号の確認には至っていない。この原因を追究したところ、実験場所とした生理学研究所・岡崎統合バイオサイエンスセンター内に存在する多数の大型電機機器類が生じる電磁ノイズが本質的な障害となっているものと判明した。このため、本研究を最終的に完成させるには、装置を可搬化するなどし、人口過疎地域や地下などの人工電磁ノイズの少ない環境、あるいは高性能な電波暗室内で実験を実施する必要があるとの知見を得た。本研究は、研究代表者の発明である「音響電磁相互作用に基づく生体の計測と刺激」の基本原理(国内特許出願2006-280558、特許国際出願PCT/JP2008/056304)を、プロトタイプ実験装置の開発と検証実験の実施により検証することを主要な目的とし、その応用として「脳などの生体の電気活動のサブミリメートル分解能での非侵襲的なミリ秒リアルタイム3次元のイメージング」と非侵襲的なBMI(Brain Machine Interface:脳と機械のインターフェイス)を可能とする技術や装置の開発を最終的な目的とするものである。本年度、研究目的を達する為に必要なプロトタイプ実験装置の基本部分の開発を完了した。具体的には、当初計画で開発する予定の装置:A)生体への超音波パルスの照射装置、B)高い周波数帯に対応した高感度の生体電磁場検出装置を開発した。当初の研究計画では、年度内に生体を対象とした検証実験の実施を目指したが、装置開発過程において外来の電磁ノイズが問題になる事が判明し、その対策のための電磁シールドの開発に時間を費やす事になり、C)ソフトウエア開発と、研究の主目的である検証実験・応用実験を次年度に実施することとした。本年度の成果であるプロトタイプ実験装置の開発では、検証実験に必要となる感度の装置が実現できた事から、次年度中での目標達成が確実となった。この開発過程において得られた回路技術、検出技術、対ノイズ技術等は多枝に渡っており、今後の応用の展開においても重要な基礎となるものであり、先行した特許出願と論文発表を予定している。
エルロチニブ錠の簡易懸濁法に関する安全性と薬物動態学的検討

【研究目的】エルロチニブは、非小細胞肺がんに対する治療薬として広く使用される経口EGFRチロシンキナーゼ阻害剤である。肺がん患者においては、脳転移や頸部リンパ節転移による食道狭窄などにより、内服薬の服用が困難な症例も少なくない。内服困難症例に対し、安全かつ簡便に投与する方法として簡易懸濁法が近年注目されているが、エルロチニブの簡易懸濁法に関する情報は皆無である。本研究では、「エルロチニブの簡易懸濁法の確立」を目的として、エルロチニブ簡易懸濁法の条件を検討するとともに、肺がん患者における簡易懸濁投与時の薬物動態特性と安全性について評価した。【研究方法及び成果】懸濁時の温度条件及びpH条件を変化させ、エルロチニブの懸濁性及び安定性を検討した。さらに、簡易懸濁法を用いた非小細胞肺がん患者を対象として、エルロチニブ投与後の薬物血中濃度を高速液体クロマトグラフィー法により測定した。懸濁時の水の温度条件下(25°C、55°C、80°C)において、懸濁開始初期での懸濁性は温度の影響を認めたものの、開始5分以降では温度の影響は受けず一定の値を示した。pH条件下(pH3.62、6.97、8.96)において、懸濁開始10分以降ではpHの影響は認められなかった。簡易懸濁法によってエルロチニブを投与した患者3名における血中濃度推移は、0時間後、2時間後、4時間後、24時間後それぞれにおいて1134±722ng/mL、225g±1253ng/mL、2292±1369ng/mL、1122±457ng/mLとなり、個人差は大きかったが、平均的には添付文書記載の通常内服時と同様の推移を示した。以上より、エルロチニブの簡易懸濁法は溶解液の温度やpHの影響を受けにくく、薬物動態も内服時とほぼ同等であり、嚥下障害者に対する治療時の選択肢として有用であることが示唆された。
機能性精神疾患の皮質錐体細胞回路障害のtwo hit model仮説の構築

【背景】、遺伝的脆弱性と環境因による情報伝達系機能の発達過程の歪みが、機能性中枢疾患の病態に重要であり、脆弱性を補正する働きが情報伝達系形成過程の歪みを形成する可能性を示してきた。【目的】形質膜上に分布する機能性蛋白複合体の輸送蛋白に焦点を定め、イノシトール三燐酸(IP3)及びGABA_A受容体γ2subunit(SU)の輸送担体であるphospholipase C relatedinactive protein-1 (PRIP-1)蛋白をコードするPRIP-1遺伝子欠損マウス(PRIP-1KO)を用い、神経伝達物質遊離に対するPRIP-1蛋白機能の関与を検討した。【結果】8週齢の雄性PRIP1-KOで自発性けいれんを検出し、てんかん性放電は1200回/日の頻度であった。Diazepam(DZP)はPRIP-1KOの放電頻度を減少した。最大電撃けいれんに対するPRIP-1KOのDZP感受性はwild-typeと比較し低い。PRIP-1KO脳のスライスパッチでは、DZPによるmIPSC増加作用に対するPRIP-1KOの感受性変化はなかった。細胞質分画及び形質膜・祖面小胞体分画のGABAA受容体構成SU分布量に変化無く、PRIP-1KOの細胞質分画及び祖面小胞体分画のIP3受容体IP3R-1とIP3R-3の発現量が増加した。グルタミン酸遊離は変化せず、GABA遊離はPRIP-1KOで増加した。PRIP-1KOの遊離増加はIP3R関連性GABA開口分泌成分の増加であった。【考察】PRIP-1KOはGABA系及びIP3R系機能の情報伝達系機能に障害を持つ新たな自発性てんかんモデルの可能性がある。PRIP-1はGABAA受容体γ2SUの輸送担体であるが、GABAA受容体構成SUの形質膜輸送の変化、DZP感受性変化もなく、自発性けいれんに対しDZP感受性の低下から、PRIP-1KOのてんかん発現にGABA系以外の情報伝達系変化が関与する可能性がある。PRIP-1輸送に関与するIP3受容体の解析では、PRIP-1KOのIP3受容体関連性CICR機能が亢進する結果を得た。本研究はPRIP-1のIP3結合はIP3の緩衝機能を担う可能性を示唆する。ヒトてんかんから同定した変異遺伝子導入モデルラット(6系統)、ノックインモデルマウス(1系統)を作出し、自発性痙攣意外に異常のない遺伝子欠損モデル動物4系統で、てんかんの病態を解析している。解析結果から、一遺伝子の変異・欠損が多くの遺伝子発現・蛋白発現に影響し、発達過程で中枢神経系に特異的伝達機能変化をもたらし、特発性てんかんを起こすのであろうと考えている。

解析結果から、一遺伝子の変異・欠損が多くの遺伝子発現・蛋白発現に影響し、発達過程で中枢神経系に特異的伝達機能変化をもたらし、特発性てんかんを起こすのであろうと考えている。
マイクロＲＮＡを用いた子宮体部漿液性腺癌の新しい治療法の基礎的検討

子宮体部漿液性腺癌(漿液性腺癌)は、いまだに標準治療が確立されておらず婦人科悪性腫瘍の中でも極めて予後の悪い疾患の1つである。本研究では、近年癌において異常発現が報告されているマイクロRNA(miRNA)に着目し、漿液性腺癌とmiRNAの関連性および機能を検討した。癌組織において発現減少するmiRNAを細胞株へ導入することで癌抑制的効果を確認した。さらに癌抑制作用はmiRNAが標的遺伝子としてオンコジーンの抑制を介した効果と考えられる。本成果は漿液性腺癌での癌抑制的なmiRNAの同定とmiRNAを標的とした分子標的治療への応用に寄与するものと考えられる。我々はmiRNAマイクロアレイの網羅的な発現解析により、漿液性腺癌検体に特異的に減少するmiR-34bに焦点をあて、培養細胞株を用いて機能解析を行い癌においてのmiR-34bの役割について検討した。機能解析として、合成したmiR-34bを漿液性腺癌細胞株2株(USPC-1、SPAC1-L)に細胞導入を用い、導入後の細胞増殖能(WST-assay)、遊走性(Migration-assay)、浸潤性(Invarsion-assay)、アポトーシス活性(Caspase活性測定、annexinV検出)、標的遺伝子の発現をウエスタンブロットにて確認した。miR-34bのUSPC-1、SPAC1-L細胞への導入により、増殖能はそれぞれ16.8%、8.7%の有意差を持って減少した(p=0.0001,p=0.0055)。またCaspse活性はそれぞれ2.4倍、1.4倍上昇し(p=0.0001,p=0.0001)、AnnexinVによるフローサイトメトリー解析ではアポトーシス誘導細胞数は1.6倍、2.9倍に上昇した。さらに遊走性ではそれぞれ16.6%、42%の減少を示し(p=0.0062,p=0.0022)、さらに浸潤性はそれぞれ86.6%、80%の細胞数の減少が示された(p=0.001,p=0.0003)。またウエスタンブロットよりオンコジーンであるc-Metの発現が減少することが示された。以上、miR-34bは漿液性腺癌細胞株において抗腫瘍効果を示し、特に浸潤能の抑制効果が顕著に示すことがわかった。またそれらの効果はc-Metを介した制御機構が関与すると示唆された。これらの結果は漿液性腺癌において初めてmiRNAとの関連を示した報告であり、今後はさらに詳細な機能解析とin vivoでの抗腫瘍効果を確認し、さらには新たな抗腫瘍効果を示すmiRNAの同定・検証も行う予定である。これまでに子宮体部漿液性腺癌(漿液性腺癌)において発現が顕著に減少するmicroRNA-34b(miR-34b)を見出し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能に関与することを見出した。本年では、さらなる癌抑制効果を検討するため、miR-34b導入によるアポトーシス活性、足場非依存性増殖能、細胞周期の変化を検討した。また、miR-34bの標的遺伝子の同定するためin sillicoにより候補遺伝子を抽出し、実際にmiRNAによって制御されるか確認するため、Western-blotによりタンパク質レベルでの発現を確認し、標的遺伝子3'-UTRを含むレポーターベクターを用いてmiRNAと標的遺伝子の結合を確認した。miRNA標的遺伝子検索ソフト(TargetScan、Miranda)により、標的候補としてc-Met遺伝子が予測され、実際に細胞株へのmiR-34b導入試験によりc-Metタンパク質の発現が抑制されることがわかった。さらに、レポーターアッセイによりc-Met-3'UTRにmiR-34bが結合することが確認された。以上より、miR-34bは漿液性腺癌細胞において様々な癌抑制効果を示すことがわかり、それらの作用はc-Met遺伝子を介すると示唆された。これらの知見は漿液性腺癌において初めての報告であり、新しい治療法の開発につながる重要性の高い成果である。これまでに我々は子宮体部漿液性腺癌(漿液性腺癌)で発現減少するマイクロRNAであるmiR-34bに関して漿液性腺癌細胞株を用いた機能解析により細胞増殖や足場非依存性増殖、遊走能、浸潤能の抑制やアポトーシス誘導と様々な機能に関与することが分かった。本年では、より生体内に近い検討を行うためのin vivo移植モデルマウスの作成と、新たな漿液性腺癌関連miRNAの機能解析を行った。(1)漿液性腺癌移植モデルマウスの作成移植モデルマウスを作成するため漿液性腺癌細胞をヌードマウス皮下、腹腔、子宮同所に移植しマウス内での腫瘍増殖を確認した。

皮下移植においては12週間での観察で顕著に移植魂のボリュームの増加が観察された。また腹腔移植では腹膜、脂肪、膵臓などに転移が確認された。子宮への同所移植においては移植臓器においての定着を確認することはできなかった。同所移植に関しては移植方法など更なる条件検討が必要であると考えられる。(2)miR-101の漿液性腺癌細胞での機能解析我々はこれまでにmiR-34bの他にmiR-101が漿液性腺癌組織で顕著に減少することを見出しており、miR-101を漿液性腺癌細胞株へ導入してその影響を検討した。WST-assayにおいてmiR-101導入細胞株は対照に比較し顕著に細胞増殖能を抑制することが確認された。さらにCaspase 3/7 AssayおよびFACSによるAnnexin-V detection assayにより、miR-101導入細胞が顕著にアポトーシスを誘導することが確認された。以上よりmiR-34bだけでなくmiR-101においても漿液性腺癌細胞の細胞増殖の抑制とアポトーシス活性の誘導の癌抑制効果を示すことができた。これらの知見は今後miRNAを標的とした分子標的薬や核酸医療への応用につながる重要性の高い成果であると考えられる。これまでに子宮体部漿液性腺癌(漿液性腺癌)において顕著に発現減少するmicroRNA-34b(miR-34b)を同定し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能およびアポトーシス誘導に関与することを見出した。さらにmiR-34bがオンコジーンであるcMetを標的遺伝子にしていることがわかってきた。本年では、前年度までの結果が1つの細胞株由来の結果であるため、その再現性を検証するため新たな漿液性腺由来癌細胞株を用いて細胞増殖、足場非依存的増殖、遊走能、浸潤能、アポトーシス誘導に関与するか検討を行った。また、miR-34bが抗癌剤耐性に関与するか検討を行った。1新たな細胞株での再現性の検討:miR-34bの導入により、前年度までの同等の試験を行い細胞増殖性、遊走性、浸潤能、の抑制、足場非依存的増殖性、およびアポトーシスの誘導が確認でき再現性を得ることができた。2miR-34bの薬剤感受性の関与の検討:miR-34bを導入し、一般的に化学療法に用いられるパクリタキセル、シスプラチン、およびドキソルビシン添加での薬剤感受性の変化を検討したが、miR-34b導入による薬剤感受性の変化は3つの薬剤でも変化を確認することはできなかった。以上のことによりmiR-34bは漿液性腺癌細胞株において細胞増殖、遊走・浸潤性、足場非依存的増殖性、およびアポトーシス誘導など様々な癌抑制的な作用を示すことが確認できた。これらの知見は漿液性腺癌において初めての報告であり、新しい治療法の開発につながる重要性の高い成果である。これまでに本研究では、漿液性腺癌において顕著に発現が減少するmiR-34bを見出した。癌細胞でのmiR-34bの機能として細胞増殖、遊走性、浸潤性および相葉非依存的増殖能の抑制とアポトーシス活性の上昇などの癌抑制的作用を示すことを見出し、c-Met遺伝子がその標的遺伝子として示唆された。以上、これらの成果は漿液性腺癌において初めての報告であり、本研究はおおむね順調に進展していると評価できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
新規表面抗原の同定に基づくマウス肝幹細胞の分離および特性解析

我々のグループでは、マウス胎仔肝組織内の肝幹細胞(HPC)は、CD49f+/CD45-/Thy1-の分画に含まれることを示してきた。これに加えて、胎仔肝で発現し成熟肝で発現を認めない膜貫通型タンパク質であるgp38に着目し、この表面抗原で選り分けることにより、より特異的に肝幹細胞を分離できることを示した。また、gp38で選別した肝幹細胞の特性解析により、その未分化の維持にWnt signalの活性化が関与していることが示唆された。マウス肝幹細胞特異的遺伝子候補の選別1)マウス肝前駆/幹細胞分画の分離。我々が上記の先行研究においてすでに確立した方法に基づき、全身にgreen fluorescent protein(GFP)を発現する遺伝子改変マウスより蛍光励起セルソーター(FACS Vantage SE)を利用して、マウス成体肝臓由来肝前駆/幹細胞分画を分離した。また、同時に成熟肝細胞分画を分離し、同一個体より肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画とを分離した。2)肝幹細胞特異的発現遺伝子のスクリーニング上記のようにして同一個体より分離した肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画のそれぞれよりmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製したうえで、DNAサブトラクション解析を施行し、肝前駆/幹細胞分画に特異的に発現する36個の遺伝子候補を選別した(一次スクリーニング)。選別した候補遺伝子の中から蛍光励起セルソーターによる細胞分離に利用可能な細胞表面抗原遺伝子に焦点を絞り、genome infomaticsの情報を利用して、膜貫通ドメインを持つ24個の候補遺伝子をさらに選び出した。その上で、各候補遺伝子に対してPCR primerを設定し、改めて分離した肝前駆/幹細胞細胞分画に対してRT-PCRを行い、実際に遺伝子発現を確認した(二次スクリーニング)。さらに、肝前駆/幹細胞分画より発現蛋白質を抽出し、二次元電気泳動により発現遺伝子のタンパク発現を確認する(三次スクリーニング)。こうして肝幹細胞特異的発現遺伝子候補を6個に絞り込んだ。1.マウス胎仔肝幹細胞分離i)マウス胎仔肝での候補遺伝子発現解析細胞凝集塊形成法に基づき、マウス胎仔肝より肝前駆/幹細胞分画を分離・濃縮した上で、蛍光励起セルソーターを用いて、CD49f+/Thy1-/CD45-細胞(肝前駆/幹細胞)を分離した。各胎齢に基づき、経時的に細胞を分離した上で、昨年度までにスクリーニングした肝幹細胞特異的遺伝子候補の発現をRT-PCRにより胎齢ごとに比較解析することにより、より未分化状態で発現量の多い遺伝子を検証し、肝幹細胞特異的表面抗原遺伝子候補を同定した。2.マウス胎仔肝幹細胞の特性解析i)マーカー遺伝子発現解析今まで我々のグループでは、マウス胎仔肝組織内の肝幹細胞(HPC)は、CD49f+/CD45-/Thy1-の分画に含まれることを示してきたが、その分画に含まれる細胞もさまざまな分化段階の細胞を含みheterogeneousであるため、より特異的な表面抗原マーカーを見つけ、それを用いてより特異的な肝幹細胞の特性解析を行うことが、この研究の目的である。そこで、我々は胎仔肝で発現し成熟肝で発現を認めない膜貫通型タンパク質であるgp38に着目した。まず、胎生13.5日の胎仔肝よりCD49f+/CD45-/Thy1-の分画をsortingし、さらにgp38によるsortingを行い、CD49f+/CD45-/Thy1-/gp38+とCD49f+/CD45-/Thy1-/gp38-の分画に分け、特性解析を行った。gp38+の細胞は全体の1.7%程度とgp38-と比較して非常に少なかった。また免疫染色を行い、gp38-細胞がAFPとAlbumin, CK19を発現しているのに対して、gp38+細胞はAFPのみ陽性で、より幼弱であることが示唆された。さらにMTS assayにて、gp38+のほうがより高い増殖能をもつことが分かった。このように、gp38+分画の細胞のほうがより未分化な肝幹細胞であることが示唆された。このため、gp38+とgp38-の分画でDNA microarrayを行ったところ、gp38+分画でWnt4, 5a, 5b, 9a, 11などがgp38-分画より優位に発現しており、gp38+のHPCでは、Wnt signal pathwayの発現上昇があることが示唆された。ここで、gp38+分画細胞にWnt3a投与によるWnt signalの活性化を行うと、増殖能は有意に上昇するものの、分化傾向は示さず、Wnt signalの活性化は未分化の維持に寄与していると考えられた。
卵巣癌細胞の増殖における活性型ビタミンDの抑制効果に関する基礎的研究

ビタミンDの卵巣癌細胞に対する増殖抑制作用にを調べる目的で以下の添加実験を行った。今回はビタミンDとして活性型ビタミンDの誘導体で高カルシウム血症を来さないといわれる22-oxacalcitriol(OCTと略)と、比較対照のために活性型ビタミンDの前駆体である1-αhydroxy-vitaminD_3(1α-D_3)の2種を使用した。また培養卵巣癌細胞株として漿液性腺癌由来の細胞株であるSHIN-3、KF、NK211、HTOA-1と、粘液性腺癌由来の細胞株であるMN-1,OMC-3を用いた。実験方法は各細胞3×10^3個を24ウェルプレートに生着させ上記OCTおよび1α-D_3を1×10^<-7>Mから1×10^<-11>Mの濃度で添加しながら約2週間培養したのち、生着細胞数をビタミンD添加群と未添加群との間でMTT法によって測定した。結果はOCT添加においてはMN-1細胞で1×10^<-10>Mより濃度依存性に細胞増殖抑制を示し、1×10^<-7>Mでは50.1%の抑制を示した。その他の5種の細胞では明らかな抑制は観察されなかつた。また1α-D_3添加においては使用した6種の細胞とも明らかな抑制は観察されなかった。現在このOCTによる細胞増殖抑制効果がビタミンD受容体(VDRと略)を介した作用であるかを調べるために、VDRのmRNAの存在の有無を上記6種の細胞より抽出したRNAを用いてreverse transcriptase-polymerase chain reaction法により検討中であるが、今回の結果より活性型ビタミンD誘導体であるOCTはある種の卵巣癌に対して増殖抑制効果のあることが示され、OCTが新たな卵巣癌治療薬となりうる可能性が示唆された。