hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
弱視児に見やすいコンピュータ・フォントの分析と試作

弱視児は、通常の教科書等の文字をよく見ることができないため、読み書きの学習が不得意な場合が多い。この課題に対して、本研究では、平成4年度より、補助具を用いないで弱視児の読み書きの学習を効果的にするための手段として、弱視児に見やすいフォント(書体)について検討してきた。先行研究が、既存のフォントの中でどれが読みやすいかという相対比較を行うアプローチであるのに対し、本研究はフォントの特徴を操作して、見やすさを決定している要因を分析するという理論的観点からアプローチした。また、要因分析の結果を応用し、弱視者に見やすい新たなフォントを試作した。(1)フォントの試作方法に関する検討:前年度まではポストスクリプト形式のフォントの作成を実施してきた。しかし、近年のウインドウズOSの普及に伴いトゥル-タイプ形式のフォントが多く活用されるようになってきた。そこで、本年度は、トゥル-タイプ形式のフォントを加工する方法について検討した。その結果、トゥル-タイプ形式のフォント形成ツールにより、フォントの太さ等を簡便に操作できるようになった。(2)試作フォントの評価方法に関する検討:文字は単独で提示されるわけではなく、文章を構成する要素として位置づけられる。そこで、フォントが文章を読むときの読書効率に及ぼす影響を評価するための評価システムを構築した。(3)報告書の作成:平成4年度からの研究成果を報告書にまとめた。報告書には本研究で作成したフォントのサンプルも掲載した。本研究は、実際の教育場面で不都合なく利用でき、なおかつ、弱視児に見えやすいフォント(書体)の分析と試作を行うことを目的とする3年間の研究プロジェクトである。本年度はその第1年次で、弱視児に見やすいフォントに関して以下の3種類のアプローチで研究を実施した。(1)弱視シミュレーションによるフォントの見やすさに関する研究:弱視児童が利用する教科書に使用されている3つのフォント、すなわち、教科書体、明朝体、ゴシック体を比較し、どの書体が見やすいかを弱視シミュレーション実験により検討した。その結果、画像のボヤケに対しては、ゴシック体が最も強く、教科書体が最も弱いことがわかった。(2)弱視児の視覚特性に関する研究:フォントの見やすさは、弱視児の視覚特性との関係で捉える必要がある。そこで、弱視児の視覚特性を評価する方法に関する検討を行った。その結果、弱視の見えにくさの整理ができた。すなわち、a)ぼやけ、b)コントラストの低下、c)視野の狭さ、d)視野の中心が見えないといった見えにくさが弱視の主要な見えにくさであることがわかった。また、これらの見えにくさを踏まえて、さまざまな子どもの視覚特性を把握する方法について検討を行った。(3)弱視児の読書効率の測定方法に関する研究:フォントの見やすさが読書の効率に及ぼす影響を調べるための評価方法について検討を行った。検討の結果を踏まえ、弱視の読書効率を効果的に評価することが可能な弱視用読書効率測定システムを試作した。本年度得られたこれらの研究成果は、日本特殊教育学会、全国弱視教育研究会、視覚障害リハビリテーション研究発表大会等で発表した。また、第3年次に計画しているフォントの作成方法についての検討を開始した。本研究は、実際の教育場面で不都合なく利用でき、なおかつ、弱視児に見えやすいフォントの分析と試作を行うことを目的とする3年間の研究プロジェクトである。本年度はその第2年次で、弱視児に見やすいフォントに関して以下の3種類のアプローチで研究を実施した。(1)弱視シミュレーションによるフォントの見やすさに関する研究:白内障や角膜混濁など透光体混濁の見えにくさの原因だとされているコントラスト低下をシミュレートし、読書効率に与える影響を検討した。検討にあたって、コントラスト低下をシミュレートした評価票を試作した。さらに、フォントによる読みやすさの違いを評価するための評価票を試作した。(2)弱視の読書に影響を及ぼす要因の検討:弱視の読書効率はフォント以外の要因にも影響を受ける。この点を把握しておかなければ、フォントの効果を切り出すことはできない。そこで、文字サイズ、行長等の文章の提示条件が読書効率に及ぼす影響を検討した。

(3)弱視児の読書効率の測定方法に関する研究:昨年度に引き続き、フォントの見やすさが読書の効率に及ぼす影響を調べるための評価方法について検討を行った。そして、弱視の読書効率を効果的に評価するために、コンピュータを利用した弱視用読書効率測定システムを試作・改良した。本年度得られたこれらの研究成果は、日本特殊教育学会、弱視教育研究会、視覚障害リハビリテーション研究発表大会、感覚代行シンポジウム等で発表した。また、上記の研究成果を踏まえ、弱視者のためのリーディングエイドの試作を行い、コンピュータネットワークを通じて試用実験を開始した。弱視児は、通常の教科書等の文字をよく見ることができないため、読み書きの学習が不得意な場合が多い。この課題に対して、本研究では、平成4年度より、補助具を用いないで弱視児の読み書きの学習を効果的にするための手段として、弱視児に見やすいフォント(書体)について検討してきた。先行研究が、既存のフォントの中でどれが読みやすいかという相対比較を行うアプローチであるのに対し、本研究はフォントの特徴を操作して、見やすさを決定している要因を分析するという理論的観点からアプローチした。また、要因分析の結果を応用し、弱視者に見やすい新たなフォントを試作した。(1)フォントの試作方法に関する検討:前年度まではポストスクリプト形式のフォントの作成を実施してきた。しかし、近年のウインドウズOSの普及に伴いトゥル-タイプ形式のフォントが多く活用されるようになってきた。そこで、本年度は、トゥル-タイプ形式のフォントを加工する方法について検討した。その結果、トゥル-タイプ形式のフォント形成ツールにより、フォントの太さ等を簡便に操作できるようになった。(2)試作フォントの評価方法に関する検討:文字は単独で提示されるわけではなく、文章を構成する要素として位置づけられる。そこで、フォントが文章を読むときの読書効率に及ぼす影響を評価するための評価システムを構築した。(3)報告書の作成:平成4年度からの研究成果を報告書にまとめた。報告書には本研究で作成したフォントのサンプルも掲載した。
ブタモデルを用いた化学療法誘導性肝障害の薬物による克服～大腸癌予後改善に向けて～

大腸癌の化学療法に起因する肝障害で、肝転移に対する集学的治療において問題となるsinusoidal obstruction syndrome(SOS)では、これまでにヒトSOSの病態と全く同一と考えられる動物モデルは存在しなかった。我々は、まずヒトに遺伝・解剖的に最も近いブタを用いてオキサリプラチン誘導性SOSモデルを確立し、SOSの病態と発症のメカニズムを明らかにするとともに、そのバイオマーカーを同定することを目的としてきた。雄性12か月のマイクロミニブタを使用し、ヒトで大腸癌に対して用いられている化学療法レジメンFOLFOX療法(oxaliplatin + 5-FU + Leucovorin)を2週間ごとに施行した。観察期間は24週で、FOLFOXの投与前後に血液検査を行い、血中白金濃度及びAST・ALT・T-Bil・Hb・血小板値を測定。0・4・8・12・18・24週に開腹肝生検を行い、肝障害の評価を行った。対照群としてFOLFOXに代えて生理食塩水の投与と開腹肝生検を行ったsham群を作成した。FOLFOX投与群の病理組織所見にてSOSに特異的な類洞の拡張や肝細胞索の狭小化を確認、電子顕微鏡所見でも血管内皮細胞の脱落や類洞内の出血を認め、SOSと診断した。これまでFOLFOX群は5頭作成しており、全てで同様の所見を認め、再現性を確認した。sham群では血液検査・病理所見とも著変なく経過しており、対照群としての成立も確認した(第119回日本外科学会定期学術集会およびDDW 2019 Lecture Presentationで報告)。次年度は予防効果が報告されている薬剤によってSOSが予防できるのかどうかを経時的な肝生検で確認し、各々の薬剤の至適投与量や至適投与期間を同定して実臨床での使用に迅速に結び付ける予定である。初年度である今年は、ヒトに遺伝・解剖的に最も近いブタを用いてオキサリプラチン誘導性SOSモデルを確立することを目標としてきた。sham群では血液検査・病理所見とも著変なく経過しており、対照群としての成立も確認した。これにより、まずSOSミニブタモデルは確立したと考えている。今後は予防効果が報告されている薬剤(大建中湯、オルプリノン、ベバシズマブ)によってSOSが予防できるのかどうかを経時的な肝生検で確認し、各々の薬剤の至適投与量や至適投与期間を同定して、実臨床でのSOS予防目的の使用に迅速に結び付ける予定である。

雄性12か月のマイクロミニブタを使用し、ヒトで大腸癌に対して用いられている化学療法レジメンFOLFOX療法(oxaliplatin + 5-FU + Leucovorin)を2週間ごとに施行した。観察期間は24週で、FOLFOXの投与前後に血液検査を行い、血中白金濃度及びAST・ALT・T-Bil・Hb・血小板値を測定。0・4・8・12・18・24週に開腹肝生検を行い、肝障害の評価を行った。対照群としてFOLFOXに代えて生理食塩水の投与と開腹肝生検を行ったsham群を作成した。FOLFOX投与群の病理組織所見にてSOSに特異的な類洞の拡張や肝細胞索の狭小化を確認、電子顕微鏡所見でも血管内皮細胞の脱落や類洞内の出血を認め、SOSと診断した。これまでFOLFOX群は5頭作成しており、全てで同様の所見を認め、再現性を確認した。sham群では血液検査・病理所見とも著変なく経過しており、対照群としての成立も確認した。これにより、まずSOSミニブタモデルは確立したと考えている。今後は予防効果が報告されている薬剤(大建中湯、オルプリノン、ベバシズマブ)によってSOSが予防できるのかどうかを経時的な肝生検で確認し、各々の薬剤の至適投与量や至適投与期間を同定して、実臨床でのSOS予防目的の使用に迅速に結び付ける予定である。
設計および力学教育における動的教材の効果の評価

1)数値計算のための基本クラス、可視化クラスおよび機械要素クラスなどで構成されるライブラリを開発した.これを用いて以下を明らかにした.2)切断面実形テストにより、学習者の図形認知能力の差を計測するために実験を行い評価した.認知判断のエラーの原因を考察し、ステレオ立体視を利用して環境を改善する手法を提案した.3)設計工学の機械設計における力学モデルの内、「不静定はり」を、マサチューセッツ工科大学(以下MIT)との共同開発によるクラスライブラリによって実現し(Beam Master2007システム)、対話型のカタログシステムと、確認のためのクイズシステムを実装し、同大学および青山学院大学の大学院生によって効果を確認した.この教材アプリケーションは、構造設計において最も基本的な構成要素である「はり」の基本特性についての知識の整理、および知識獲得のための基盤ライブラリによって構成された。学習の最終段階において、クイズ形式の対話型Webアプリケーションによって知識獲得を図るという方式は、既往の教材内には見当たらず、より深い知識を得ることが可能であると、日米教員間で考察されている。さらに、開発されたクラスライブラリは、有限要素法における要素と同様のオブジェクトを与えることができ、この上でマトリックス法などの手法に基づく大規模な構造設計モデルを実装することにより、設計全般の自動化に寄与することが期待されている.4)本学大学院講義において、教材コンテンツを受講者自身が作成し、公開した.これを大学院生(MIT)によって、評価し、両大学院生による協調的学習を達成した.1)数値計算のための基本クラス、可視化クラスおよび機械要素クラスなどで構成されるライブラリを開発した.これを用いて以下を明らかにした.2)切断面実形テストにより、学習者の図形認知能力の差を計測するために実験を行い評価した.認知判断のエラーの原因を考察し、ステレオ立体視を利用して環境を改善する手法を提案した.3)設計工学の機械設計における力学モデルの内、「不静定はり」を、マサチューセッツ工科大学(以下MIT)との共同開発によるクラスライブラリによって実現し(Beam Master2007システム)、対話型のカタログシステムと、確認のためのクイズシステムを実装し、同大学および青山学院大学の大学院生によって効果を確認した.この教材アプリケーションは、構造設計において最も基本的な構成要素である「はり」の基本特性についての知識の整理、および知識獲得のための基盤ライブラリによって構成された。さらに、開発されたクラスライブラリは、有限要素法における要素と同様のオブジェクトを与えることができ、この上でマトリックス法などの手法に基づく大規模な構造設計モデルを実装することにより、設計全般の自動化に寄与することが期待されている.4)本学大学院講義において、教材コンテンツを受講者自身が作成し、公開した.これを大学院生(MIT)によって、評価し、両大学院生による協調的学習を達成した.平成18年度は、クラスライブラリの開発および検証実験を行った。開発ソフトウェアは、数値計算のための基本クラス、可視化クラスおよび機械要素クラスなどで構成される。これらを組み合わせることによって具体的な応用モデルを開発し、有効性を確認した。最終結果となる応用モデルは、Web上で公開され、利用者のブラウザのVM(仮想マシン)上で動作し、パラメータ入力や、境界条件や初期条件の変化に対応する応答を反映し、力学的複雑系の解析や機械設計に有効であることを確認することができた。開発されたクラスライブラリは、機械設計の基礎である図形科学において、表示およびベクトル幾何によるモデルの部分にも適用した。それによって、ライブラリの特徴であるアニメーション技術や3Dモデルの表現の妥当性と、人間の図形認知への適用性を確認した。本研究で提案された手法は、モデリングと数値計算、および、結果を視覚的に表現する手段を要素とするクラスを、一体化したライブラリとして提供した。これは、従来のモデリング、数値解析、可視化表現をそれぞれ分割したプロセスとする手法に比べ、モデルの保守性やモデル間の連携に利点がある。特に、人間の総合的な判断力や、認知能力を活用し、力学的な実体や3次元立体を知識として認識する手段として有効であることがわかった。また、個別のモデル開発については、解析結果を視覚的に表現する手段と一体化したライブラリがり開発者の作業効率を向上させることも明らかとなった。1)切断面実形テストにより、学習者の図形認知能力の差を計測するために実験を行い評価した.認知判断のエラーの原因を考察し、ステレオ立体視を利用して環境を改善する手法を提案した.2)設計工学の機械設計における力学モデルの内、「不静定はり」を、マサチューセッツ工科大学(以下MIT)との共同開発によるクラスライブラリによって実現し(Beam Master 2007システム)、対話型のカタログシステムと、確認のためのクイズシステムを実装し、同大学および青山学院大学の大学院生によって効果を確認した.この教材アプリケーションは、構造設計において最も基本的な構成要素である「はり」の基本特性についての知識の整理、および知識獲得のための基盤ライブラリによって構成された。さらに、開発されたクラスライブラリは、有限要素法における要素と同様のオブジェクトを与えることができ、この上でマトリックス法などの手法に基づく大規模な構造設計モデルを実装することにより、設計全般の自動化に寄与することが期待されている。
知識工学の方法によるオペラビリティ・スタディ自動解析システムの開発に関する研究

従来の配管を重視したオペラビリティ・スタディを改良して、システム工学の入出力の概念を適用したオペラビリティ・スタディを開発し、すでに報告している。この方法では、対象システムの変数を、入力(操作変数)と出力(状態変数)に分類する。入力のずれに対して、オペラビリティ・スタディの手引き用語を適用し、出力の状態変数に与える影響を考察すれば、対象とするプロセスのオペラビリティ・スタディを実施できる。本研究では、システム工学に基づくオペラビリティ・スタディを基礎として、知識工学の方法を用いるオペラビリティ・スタディ自動解析システムを開発した。対象プロセスの構造および反応等に関する知識を基に、装置異常に関する知識を組み合わせることにより、プロセス全体のオペラビリティ・スタディを完成するという方法である。解析対象プロセスに関する固有の情報、およびプロセスを構成する装置全般についての異常に関する知識を表現し、計算機に格納するための方法を確立した。連続プロセス、回分プロセスについて、異常の伝播の構造を明らかにした。この異常伝播構造に基づき、プロセス構成要素(バルブ、配管,ポンプなど)の異常に関する一般的知識をデンジョンテーブルを用いて表現した。また、回分プロセスでは、操作時刻の遅れが重大な影響を与えるため、操作時刻の異常に関する情報を考慮した。解析対象プロセスの構造および反応に関する情報を計算機に入力すれば、これらに対して、知識情報処理を実施し、オペラビリティ・スタディに変換する、オペラビリティ・スタディ自動解析プログラムを開発した。
主体間の相互作用を考慮した価格決定メカニズムの解明に関する研究

本研究では消費者・メーカー・小売業者間での相互作用を考慮した価格決定メカニズムを解明するために、以下の2点を中心に研究を進めた。1.メーカーおよび小売業者の価格決定の理論モデルの構築を行った。その際、消費者と企業間、およびメーカーと小売業者間の相互作用を考慮した。2.理論モデルと市場データを利用して、統計的手法により価格決定メカニズムの推定を行った。価格決定モデルは、メーカー間の競争、メーカーと小売業者の間の垂直的関係、小売価格と消費者選択行動、をもとに構成されている。特にメーカーと小売業者の間の垂直的関係では、メーカーは小売業者に対して卸売価格を決定するだけでなく、トレード・プロモーションとしてリベートがメーカーから小売業者へ供与されることにより利益が再配分されることも考慮した価格決定モデルとなっている。市場データからは価格と消費者選択行動しか観測されないが、理論モデルを利用することで、製品によってリベートが異なることを考慮しながらメーカーおよび小売業者が市場でどのように価格決定を行っているのかを、データから推定する方法をとった。モデルをもとに特定製品カテゴリーの市場データを利用して、理論モデルの推定を行った。得られたデータに対して推定すべきパラメータ数が多いため、ベイズ統計学にもとつくシミュレーション・ベースの推定方法を用いてモデルの特定を行った。推定結果からは分析対象とした製品カテゴリーではトレード・プロモーションを考慮したモデルがデータにあてはまりがよいことが示された。さらにメーカーと小売業者について製品別の経済学的コストと利潤が推定された。
完全非線形放物型方程式の粘性解理論

今年度は,低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形一様楕円型方程式の両側障害問題のLp粘性解の正則性と存在の研究を行った.発散型の障害問題は数多く研究されているが,非発散型に関しては全く研究が進んでいなかった.Duqueによるプレプリントで,最も単純な非発散型方程式の両側障害問題に対して,障害物の正則性が低い場合の粘性解の正則性が示されたが,彼の方法では方程式の平行移動不変性が必要であり,変数係数を持つ方程式の場合に適用することが難しい.我々の証明法によって,二階微分項に変数係数を持ち,一階微分係数と非斉次項が非有界の場合に一般化できた.証明の鍵は,両側障害問題に対して,上下の障害物に触れないように,粘性優解と粘性劣解に異なる摂動を施し,それらの振動を評価する際に弱Harnack不等式を用いることである.これにより,障害物が連続である場合のLp粘性解の同程度連続性を導いた.この評価を利用し,障害物が連続という仮定だけで, Lp粘性解の存在を示した.この研究に関する論文を現在投稿中である.また,本論文は小池茂昭教授との共著論文である.さらに,完全非線形放物型方程式のLp粘性解に対して,上記の研究に対応する正則性および存在の結果を得た.楕円型に対する結果との大きな違いは,空間微分に対する局所ヘルダー連続評価の方法である.放物型の弱Harnack不等式の積分領域と最小値をとる領域が時間に関してずれているため上の研究での方法は適用できない.そこで, Shahgholian(2008)の方法を参考にしてLp粘性解の空間微分に対する局所ヘルダー連続性を示した.上記の研究では,二つの障害物は接しないという仮定をしていたが,その仮定を楕円型でも放物型でも取り除くことができた.この研究に関する論文を現在執筆中である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形放物型偏微分方程式に対するLp粘性解の定性的性質について研究を行い、フラグメン・リンデレーフの定理と呼ばれる、時空の錐状領域上において無限遠点で適切な増大度条件を満たす解の最大値原理を得た。低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形楕円型方程式に対する結果はすでに知られている。この研究結果は、Avner Friedmanの線形放物型方程式の古典解に対する結果(1957)の一般化であり、Friedmanの結果以来の研究である。証明は、低階微分項の非有界係数に対し、適当な減衰度条件を仮定し、ハルナック不等式を用いて為された。また、非有界係数の減衰度条件や解の無限遠での増大度条件について、Friedmanの結果や非有界係数を持つ完全非線形楕円型方程式に対する結果との違いについても詳しく検討した。Lp粘性解のカルデロン・ジグムントの評価に関する研究を行った。この評価は、空間二階偏微分と時間一階微分のLpノルムの評価である。この低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形一様放物型方程式の研究は、準線形方程式へと理論を発展させるため重要である。最近Krylovを中心にして、ベルマン方程式を含む完全非線形楕円型・放物型方程式の可解性(強解)及び解のLp正則性を、簡易に、従来と異なる方法で示された。非有界係数を持つ完全非線形放物型方程式のLp粘性解に関する、Krylovの結果の一般化に取り組んでいる。Lp粘性解の放物型版Lp正則性の確立により、非等法的ソボレフの埋蔵定理をより精密に扱える可能性がある。本年度の研究結果に基づいた論文を現在執筆中である。弱ハルナック不等式の応用として,低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形一様楕円型・放物型偏微分方程式の両側障害問題のLp粘性解の正則性および存在の研究を行った.発散型の障害問題は数多く研究されているが,非発散型の障害問題に関しては全く研究が進んでいなかった.最近のL. F. Duqueによるプレプリントで,最も単純な非発散型の両側障害問題の粘性解に対して,障害物の正則性が低い場合の解の正則性が示された.具体的には,障害物に対してヘルダー連続性または勾配に対するヘルダー連続性を仮定した時に,両側障害問題の粘性解がそれぞれ同じ正則性を満たすことを示した.Duqueの方法では,二階微分項に変数係数を持つ方程式の場合に適用することが難しい.我々の証明法は二階微分項に変数係数を持ち、一階微分係数と非斉次項が非有界の場合にも一般化できる.具体的には,両側障害問題の解と二つの障害物に対して,適切な方程式を満たすような二つの解に変換する.さらに,二つの解に対して弱ハルナック不等式を用い,元の解の変動を評価するという方法をとる.この研究内容は,「若手のための偏微分方程式の数学解析」と「第19回北東数学解析研究会(英語)」で発表した.なお,この結果は,小池茂昭教授との共著論文として現在執筆中であり,秋の日本数学会での発表を予定している.また,両側障害問題の時間発展版も得ている.さらに,完全非線形一様放物型方程式が一階微分項に非有界係数がある場合のLp粘性解に対する正則性と定性的性質に関する結果について学会発表を行った.

当初の研究計画実施計画の内, Lp粘性解のLp正則性とリウヴィルの定理の確立には至っていないものの,弱Harnack不等式の応用として低階項に非有界係数を持つ完全非線形一様放物型方程式の両側障害問題に関して成果が得られていることからも,概ね順調に進展している.今年度は,低階微分項に非有界係数を持つ完全非線形一様楕円型方程式の両側障害問題のLp粘性解の正則性と存在の研究を行った.発散型の障害問題は数多く研究されているが,非発散型に関しては全く研究が進んでいなかった.Duqueによるプレプリントで,最も単純な非発散型方程式の両側障害問題に対して,障害物の正則性が低い場合の粘性解の正則性が示されたが,彼の方法では方程式の平行移動不変性が必要であり,変数係数を持つ方程式の場合に適用することが難しい.我々の証明法によって,二階微分項に変数係数を持ち,一階微分係数と非斉次項が非有界の場合に一般化できた.証明の鍵は,両側障害問題に対して,上下の障害物に触れないように,粘性優解と粘性劣解に異なる摂動を施し,それらの振動を評価する際に弱Harnack不等式を用いることである.これにより,障害物が連続である場合のLp粘性解の同程度連続性を導いた.この評価を利用し,障害物が連続という仮定だけで, Lp粘性解の存在を示した.この研究に関する論文を現在投稿中である.また,本論文は小池茂昭教授との共著論文である.さらに,完全非線形放物型方程式のLp粘性解に対して,上記の研究に対応する正則性および存在の結果を得た.楕円型に対する結果との大きな違いは,空間微分に対する局所ヘルダー連続評価の方法である.放物型の弱Harnack不等式の積分領域と最小値をとる領域が時間に関してずれているため上の研究での方法は適用できない.そこで, Shahgholian(2008)の方法を参考にしてLp粘性解の空間微分に対する局所ヘルダー連続性を示した.上記の研究では,二つの障害物は接しないという仮定をしていたが,その仮定を楕円型でも放物型でも取り除くことができた.この研究に関する論文を現在執筆中である.当初の研究計画に基づき、研究を進める予定である。ハルナック不等式を用い、非有界係数を持つ完全非線形放物型方程式のLp粘性解のLp正則性やリウヴィルの定理を導くことを目指す。当初の研究計画に基づき、研究を進める予定である。ハルナック不等式を用い、非有界係数を持つ完全非線形放物型方程式のLp粘性解のリウヴィルの定理を導くことを目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
金属酵素ＲＮＡポリメラーゼを標的とする抗インフルエンザ薬のＳＢＤＤ

インフルエンザウィルスのRNAポリメラーゼのサブユニットPANを標的とし、活性部位の金属イオンにキレートし機能阻害するジケト酸誘導体の構造基盤医薬品分子創製を計画した。水素結合受容基であるニトロ基あるいはカルボキシル基をもつフェニルあるいはビフェニルジケト酸誘導体を合成し、酵素阻害能を検討したところ、カルボキシル基をもつビフェニルジケト酸の阻害能が最も高かった。また得られたカルボキシル基を持つジケト酸誘導体の阻害能と分子ドッキングで得られた結合エネルギーとの間で良い相関が見られた。さらにPANのアポ体の単結晶を得ることができ、X線結晶構造解析を行うことが出来た。本研究の目的は、インフルエンザウィルス由来の金属酵素RNAポリメラーゼ内のエンドヌクレアーゼ(PAN)を標的として、その活性部位の金属イオンにキレートし阻害するジケト酸誘導体の構造基盤医薬品創製である。平成25年度では、24年度に合成したビフェニルジケト酸誘導体の単結晶化とX線結晶構造解析、さらにさらなる阻害能の増強を目指した新規ビフェニルジケト酸の分子設計と合成を行った。24年度に合成した化合物の合成中間体及び最終生成物に関して単結晶化を試み、単結晶が得られた化合物のX線結晶構造解析を行うことでその立体構造を明らかにすることが出来た。24年度に合成した化合物のうち,2位あるいは2'位にカルボキシル基をもつビフェニルジケト酸が最も阻害能が高かった。その分子ドッキングの結合様式から、ビフェニル基の3位の水素原子とPANの活性部位の表面との間に重原子が収まるほどの空間が存在することが示唆された。そこでファンデルワールス接触を高めることで阻害能が増強することを期待し、2'位にニトロ基あるいはカルボキシル基の水素結合受容基を持ち、3位にメチル基、フルオロ基、クロロ基を導入したビフェニルジケト酸を設計し合成した。オルト位にメチル基、フルオロ基、クロロ基とパラ位にブロモ基を有するアセトフェノン誘導体から鈴木-宮浦カップリングにより得たビフェニル誘導体を合成し、クライゼン縮合によりシュウ酸ジエチルを導入後,酸で加水分解することにより目的とするビフェニルジケト酸誘導体を得た。また,ジケト酸のアナログとしてN-ヒドロキシイソキノリンを合成し、その単結晶化とX線結晶構造解析から、それはケト型で存在することを明らかとした。さらにPANと阻害剤との共結晶化に適した試料を大量に調製するべく、エンドヌクレアーゼを効率よく発現・精製する最適条件の探索を行い、確立することが出来た。本研究の目的は、インフルエンザウィルス由来の金属酵素RNAポリメラーゼ内のエンドヌクレアーゼを標的として、その活性部位の金属イオンにキレートし阻害することで抗インフルエンザ薬になり得るジケト酸誘導体の構造基盤医薬品創製である。我々は、分子ドッキングにより強い阻害作用を示すと予測されたジケト酸誘導体を設計し、その詳細をすでに論文にて報告している。そこで平成24年度では、その分子設計指針に基づいたジケト酸誘導体の合成と酵素阻害能評価,及び酵素の結晶化とX線結晶構造解析を行った。水素結合供与体である84位のアルギニンに着目し,水素結合受容体としてニトロ基あるいはカルボキシル基をもつアセトフェノン誘導体,あるいは鈴木宮浦カップリングにより得たビフェニル誘導体に対してクライゼン縮合によりシュウ酸ジエチルを導入後,酸で加水分解することにより水素結合受容基を持つフェニルあるいはビフェニルジケト酸誘導体を得た。これらの化合物に関して,大量発現系から分離精製して得た酵素のエンドヌクレアーゼ活性に対する阻害能を検討した。基質として一本鎖DNAを用い,酵素反応による環状DNAから鎖状DNAへの形態変化をアガロースゲル電気泳動にて可視化することで,化合物の濃度依存的阻害能を評価した。合成した化合物の中で,カルボキシル基をもつビフェニルジケト酸が最も阻害能が高く,得られたジケト酸誘導体のIC50値は,分子ドッキングで得られた結合エネルギーと良い相関が見られ,84位のアルギニンに着目した分子設計が適切であることがわかった。また,H1N1株のエンドヌクレアーゼの結晶化を行ったところ,Mgイオン存在下で単結晶を得,3.1オングストロームの分解能で構造解析することが出来た。その構造は既報のH5N1株由来の構造とほぼ同一で,一つのMgイオンにアスパラギン酸とグルタミン酸が配位していることがわかった。平成26年度では、24,25年度に合成したビフェニルジケト酸誘導体-PAN複合体の単結晶化と、PANを阻害する分子の新規分子設計と合成、PAN阻害能の評価を行った。

24,25年度に合成したビフェニルジケト酸誘導体と、24年度に大量発現系を確立し精製したPANとの共結晶の単結晶化をMnイオン存在下で試みたところ、単結晶が得られ、PANと阻害剤ジケト酸誘導体の複合体と思われる結晶を得ることに成功した。得られた結晶はX線回折により分解能8.0 Åの回折像を得ることができた。しかし、分解能が低く構造解析までには至らなかった。また、新たにPANを阻害する新規分子設計と合成を行った。PANとHIVインテグラーゼの構造の関連性からHIVインテグラーゼ阻害剤である4-キノロン誘導体に着目し、その誘導体の合成を試みたところ、その中間合成物として新規化合物であるビキノリン誘導体が得られたことをX線結晶構造解析から明らかにした。2分子の4-キノロン誘導体を第二級アミンとケトン基の間で縮合させることで合成されるビキノリンは興味深い化学構造をしており、見出された反応機構は医薬品に限らず、他の分野への応用の可能性を秘めていると考えられた。中間合成物を加水分解することによりビキノリンカルビン酸誘導体を得た。これは当初分子設計の段階でポイントとしていた骨格や置換基の特徴を全て有していたので、様々な置換基を持つ誘導体の合成を試みたところ、最終的に6つのビキノリンカルビン酸誘導体が得られた。これらのうち2つにおいてPANの阻害能が確認されたが、それらの阻害能はジケト酸誘導体よりも劣るものであった。創薬化学合成はほぼ順調に行えているが、それらの阻害活性の測定と阻害剤との共結晶化が未完了である。新規ジケト酸誘導体の合成,酵素の大量発現系の構築,酵素阻害アッセイ系の確立,酵素の結晶化とそのX線結晶構造解析を行うことが出来た。SBDDに基づいて合成したジケト酸誘導体の酵素阻害能は,分子ドッキングの予想通り強いものであった。よって,適切なSBDDが行われたと考えている。また,阻害剤フリーではあるが,酵素の結晶構造が得られた。従って,当初の計画通りおおむね順調に進展していると考えている。1)活性部位の表面との隙間を埋めるよう分子設計・合成されたジケト酸誘導体の阻害活性評価を行う。2)これまで合成したジケト酸誘導体は酵素の活性部位において2つのMnイオンにキレートすると考えられるので,Mnイオン,ジケト酸誘導体及び酵素の共結晶化を行う。1)酵素阻害能を増強させるべくジケト酸誘導体のSBDDと合成,酵素阻害能の評価を引く続き行う。とくに,ジケト酸と酵素表面の隙間を埋めるよう最適化を行う。また,得られたジケト酸誘導体の単結晶構造解析を行うことで,分子構造のキャラクタリゼーションを行う。2)ジケト酸誘導体は酵素の活性部位において2つのMnイオンにキレートすると考えられるので,Mnイオン,ジケト酸誘導体及び酵素の共結晶化を行う。酵素阻害能を増強させるべくジケト酸誘導体の合成を行ったが,酵素阻害能の評価が予想より進行しなかった。またジケト酸誘導体は酵素の活性部位において2つのMnイオンにキレートすると考えられるので,Mnイオン,ジケト酸誘導体及び酵素の共結晶化を行ったが、単結晶が得られず、次年度に予定より多くの助成金を必要とすることが判明したため。また時年度の論文掲載費が予想よりも多く要することがわかったため。
ＡＴＬ細胞の癌遺伝子中毒と「ポリコーム－ｍｉＲＮＡ－シグナル伝達分子」回路の異常

ATL検体を用いた大規模解析データを基盤に、ATL細胞のシグナル伝達及びエピジェネティック異常を中心に解析を行った。CD7/TSLC1の発現パターンでATL細胞を分取する新たな系の構築に成功し、各病型の腫瘍細胞の正確な遺伝子発現パターンを明らかにした。またATL細胞におけるp38及びHedgehog経路の活性化、Helios遺伝子のスプライシング異常を発見し、機能的役割についても明らかにした。さらにエピジェネティック異常の原因であるEZH2の過剰発現の分子機構やATL細胞のエピエジェネティックな異常の全体像を明らかにした。ATL細胞はエピジェネティック異常に強く依存した腫瘍細胞であった。まず、今後のATLの研究領域全体の基盤となるゲノム、mRNA、及びmiRNAの網羅的解析のデータをまとめ、データベースに登録を行った。ATL細胞におけるmiR-31の発現減少と、その原因となるゲノム異常、エピジェネティック因子の挙動は、ATLの特徴として顕著であった。miR-31の発現低下は例外がなく、程度も著しいため、腫瘍細胞の新たなマーカーとしても有用である。またNF-kB経路の新しい活性化メカニズムを明らかにしたこと、ATLにおけるPolycomb依存的なエピジェネティックな異常をまとめ、論文に報告した(Yamagishi et al.,Cancer Cell,2012)。ATL患者由来腫瘍細胞に対してmiR-31の補充もしくはPolycombファミリーの阻害を行うことで、直接アポトーシスを誘導できたことから、これらの分子のバランスが遺伝子発現の撹乱と表現型に重要であり、分子標的として有用であることを明らかにした。さらに、同定したPolycomb-miR-31-NF-kBの経路について、一般性の検討を行った。miR-31の減少が報告されている転移性乳がん細胞や、NF-kB経路が正常機能に必須であるB細胞においても、この経路が保存されていることがわかった。miR-31の発現低下はがん細胞の一般的な特徴であり、またその厳密な制御機構が細胞機能に重要であることがわかった。Polycomb、miR-31、NF-kBはそれぞれが遺伝子制御の上流に位置する因子として広範な遺伝子を制御するが、それらが今回明らかとなったクロストークを形成することにより、より複雑な遺伝子制御システムを構築していると考えられる。Cancer Cellに報告した研究成果は、基礎及び臨床の分野で多くの重要な情報を含んでおり、当該研究の特筆すべき成果である。1. CD7/TSLC1の発現パターンに基づきATL及びHTLV-1キャリアにおける病態進行と遺伝子発現変化の関係を発現アレイによって明らかにした。キャリア中に存在する感染細胞クローンはすでに遺伝子発現異常を示しており、またエピジェネティックな異常があることが強く示唆された。これらの段階的な遺伝子発現パターンの変化がATLの腫瘍化、悪性化と関わっており、重要な研究成果であった。2. miRNAの全体的な発現減少やATL特異的な遺伝子発現パターンとエピジェネティック制御の関係を明らかにするため、ATL細胞、Tax発現不死化T細胞及び正常T細胞におけるH3K27me3及びH3K4me3のメチル化パターンを網羅的に解析した。ATL細胞はH3K27me3の蓄積が顕著であり、一方ATL細胞におけるEZH2遺伝子の活性化変異はまったく検出されず、EZH2の過剰発現が原因であることがわかった。またT細胞におけるTaxの発現はATL細胞で見られるメチル化異常の一部を再現したことから、HTLV-1感染からATL発症までのメチル化異常の実態が明らかになった。3. ATL細胞におけるEVC1/2の過剰発現がHedgehog経路の活性化を介してATL細胞の生存能に寄与していることを明らかにした。さらにEVC1/2の発現はH3K27me3及びH3K4me3の異常なメチル化変化によって誘導されており、エピジェネティックとHedgehog経路の新たな関係が示された。4. ATLの大規模解析をベースにpathway解析を行い、ATL細胞におけるp38シグナルの活性化を明らかにした。ATL細胞特異的なp38の恒常的なリン酸化はNF-kB経路を始めとする様々な経路に影響を与え、腫瘍細胞の生存能に寄与していることがわかった。5. ATL細胞におけるHelios遺伝子のスプライシング異常とその機能的役割について明らかにした。ATL細胞は様々な遺伝子のスプライシング制御に異常をきたしており、新たな分子標的としての可能性が考えられた。1内丸らが開発したTSLC1/CD7プロファイリングによる感染細胞の分取法を用いてATL細胞及び感染不死化細胞の網羅的発現解析を行い、不死化から腫瘍化へ段階的に異常を示す複数の遺伝子を同定した。miR-31は感染不死化細胞においてすでに大きく減少しており、感染細胞の段階でエピジェネティックな異常が誘導されていると考えられた。

2T細胞の複雑な活性化メカニズムとEZH2のプロモーター構造の関連に注目し、T細胞受容体(TCR)からの活性化シグナルがEZH2の発現誘導に重要であることを明らかにした。さらにNF-κBシグナルの恒常的な活性化がATLにおけるEZH2の過剰発現を誘導していることを明らかにした。3Taxを健常者PBMC及びT細胞に導入し、継時的な観察からTaxは宿主のエピジェネティクスに影響を与えて増殖や細胞死抵抗性に寄与していることを明らかにした。4miR-31の新規標的遺伝子としてPKCεを同定した。polycomb依存的なmiR-31の抑制がPKCεの発現を増強し、ATL細胞の増殖に寄与していることを明らかにした。5独自の網羅的解析からpathway解析を行い、ATLの生存シグナルにp38が関わっていることを明らかにした。p38のリン酸化を阻害することにより、NF-κBの活性化が低下し、細胞を強く誘導することがわかった。6ATL細胞で高頻度に起こる特徴的なHelios遺伝子のスプライシング異常を同定し、その機能的意義についても明らかにした。結果はCancer Science誌に報告した。7B細胞リンパ腫においてもmiR-31を含む複数のmiRNAの抑制が腫瘍細胞の特徴であることを明らかにした。miRNAの減少はリンパ腫細胞の増殖に必須なBCRシグナルやPI3K-Aktシグナルなどの各因子の発現レベルを増強し、シグナル活性化の底上げに関連することを明らかにした。初年度に計画した研究は完了し、学術誌に報告した。特に重要であるmiR-31の上流と下流の詳細な分子機構を明らかにした事は大きな成果であった。また網羅的解析から派生する情報を取り出し、リンパ腫における新たな標的シグナル伝達経路の存在も示唆された。ここまでの成果は、多くの腫瘍細胞で報告されているNF-kBの恒常的活性化の解明に貢献し、且つクロストークという新たな概念を提案した。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々が以前に公開した網羅的解析データから生じた新たな複数の疑問に対して体系的に解析を進め、ATLにおける新たな分子病態が明らかとなった。この中には、miR-31の発現減少やEZH2の過剰発現が持つ生物学的インパクトが強く示唆されており、提唱したPolycomb-miRNA-NF-κBの関係がATLに分子背景に重要であることがさらに支持された。またmiR-31の新規標的遺伝子やEZH2の制御機構などの新たな知見がこれらの関係性の新しい側面と可能性の大きさを示した。当初の計画と異なり、3年目に計画していたHTLV-1感染とエピジェネティック制御の関係や、他の腫瘍細胞などの応用研究が飛躍的に進んだ。外来因子による宿主エピゲノムへの影響は宿主の生存や多様性を考える上で重要な発見であった。またB細胞リンパ腫におけるmiRNAの減少とシグナル伝達の活性化は応用研究として今後さらなる展開が期待される。
クロマチンリモデリング機構の構造的基盤の解明

本研究員は、1年目、2年目に取り組んだ終止コドンを22番目のアミノ酸に読み替える、PylRS・tRNA^<Pyl>複合体の研究実績が評価され、今年度、栃木県宇都宮市市民賞を受賞した。さらにPylRSのプロジェクトにおいては、PylRSを用いたタンパク質工学への応用研究を東海大学北條教授との共同研究にて進めている。この研究においてはPylRSとtRNA^<Pyl>を使って任意の末端(終止コドン)にBoc基を導入したポリペプチド鎖を作り、糖鎖修飾を含む短いポリペプチドと縮合させることにより、真核生物特有の糖鎖修飾を持ったタンパク質を自在に作ることを目的としている。本年度は、真正細菌Desulfitobacterium hafniense由来PylRSで形質転換した大腸菌を用いたin vivoの経路、ならびにin vitroの経路を構築し、Boc基、Troc基を持つリジンをGSTタンパク質に導入することに成功、この成果を共著者として学術雑誌に発表した(Katayama et al.,2012)。現在、1年目に解明したPylRS・tRNA^<Pyl>複合体の構造情報をもとに、Boc基を含むより多くのアミノ酸を終止コドンに組み込めるように酵素改変を行っている。クロマチンリモデリング機構のプロジェクトでは、リモデリング因子BRG1/Brmを転写因子Fos-JunへとリクルートするBAF60aの機能性ドメインについて可用性画分に発現させることに成功した。加えて本年度は、真核生物の翻訳とカップルしたtRNA核外輸送において、核膜孔複合体上でアミノアシル化されたtRNAを核外輸送体から翻訳伸長因子に受け渡す(チャネリング機構)Cex1pの構造機能解析に成功した。本研究では、Cex1pホモログやCex1pのディスオーダー部分を除去した数十種類の変異体を作成するとともに、ultra low melting agarose gel中でゆっくりと結晶を成長させるin-gel crystallization法と表面のフレキシブルな残基に変異を導入することで結晶化のパッキングを安定化するSurface Entropy Reduction法を用いることで、出芽酵母由来Cex1pの結晶構造を2.2Åの分解能で決定した。構造解析からCex1pはキナーゼ様ドメインとhelix-loop-helixが帯状に連なったHEATリピートで構成されていることが明らかとなった。Cex1pを構成するHEATリピートはタンパク質間の相互作用に重要なモチーフであり、この領域が正電荷を帯びたパッチを形成していることがわかった。こうした構造は多くの核外受容体のtRNAの結合部位にも見られる特徴であり、Cex1p変異体を用いたtRNA結合実験(ゲルシフトアッセイ)からもその重要性が明らかとなった。PylRSについては非天然アミノ酸をタンパク質に導入する技術について論文を発表し、真核生物を用いることなく、糖鎖修飾を受けたタンパク質を合成する技術が構築されつつある。また、真核生物の成熟tRNAを核から細胞質の翻訳系に輸送するCex1pの立体構造を可視化することができ、Cex1pがHEATリピートを用いてtRNAのチャネリングを行う可能性が示唆された。クロマチンリモデリング機構のプロジェクトについて不溶性画分に発現してしまうFos-Junを可用性画分に発現させるために、このBAF60aの機能性ドメインと共発現させることを検討しており、多くのコンポーネントを同時に発現させるために有用なMultiBacシステムの構築を検討している。クロマチンを巻き戻すBRG1/Brmについては、いくつかのコンストラクトを作成し、DNA依存型ATPアーゼの酵素活性部位の発現系の構築を大腸菌と昆虫細胞を用いて試みる予定である。22番目のアミノ酸ピロリジンのアミノアシル化による終止コドンのリコーディングメカニズムを解明するためにピロリジルtRNA合成酵素PylRSとサプレッサーtRNA複合体のX線結晶構造解析を行った。この構造解析により、PylRSはtRNA^<Pyl>の特徴的なコア構造を形状相補的に認識することによってセンスコドンに対応するtRNAの中からtRNA^<Pyl>を識別していることが明らかとなった。さらに、構造解析に用いたDhPylRSがin vitro,in vitroにおいて直交性を持って機能するかどうかを検証した。in vitroにおけるアミノ酸転移実験では、DhPylRSは他のセンスコドンに対応するtRNAが存在している条件であってもtRNA^<Pyl>特異的にアミノ酸転移反応を行うことが示唆された。加えて、トリプトファン合成酵素遺伝子(TrpA)にアンバーコドンを導入して作成した遺伝子欠損株の生育をDhPylRS、tRNA^<Pyl>遺伝子で相補させたin vivoアミノ酸転移実験においてもPylRSは生体内で問題なく機能することが確かめられた。これらの実験結果から、PylRSは形状相補的にサプレッサーtRNA^<Pyl>を認識することで直交性を維持して機能していることが明らかとなった。また、新規に始めたクロマチンリモデリング因子の構造解析のプロジェクトに関しては、ヒストンのスペーシングを担うDNA依存型ATPアーゼBRG1/Brmを転写因子(Fos-Junヘテロ二量体)を介してクロマチンヘリクルートするBAF60aに関して、二次構造予測、ディスオーダー予測から十数種類のコンストラクトを作成した。その結果、機能を持つ最小ドメインとして大量発現させ、精製することに成功した。また高熱性真核生物のホモログにおいてもこのフラグメントを作成し精製・結晶化を行うと共にタンパク質のリジン側鎖をメチル化して結晶化に用いる方法も試みている。転写制御因子

c-Fos、c-Junに関しては、大腸菌での発現系に合わせてc-Fos-c-Junの遺伝子の二次構造やコドン使用頻度に合わせて配列を最適化し、二つの遺伝子を共発現ベクターに導入してc-Fos-c-Junヘテロ二量体として発現する条件を探索した。終止コドンのリコーディングを担うPylRSとtRNA^<Pyl>のプロジェクトでは、今年度第5回ロレアルユネスコ女性研究者奨励賞を受賞し、その研究をさらに掘り下げている。PylRSを人工タンパク質合成技術へ応用するために、そのN端のアミノ酸転移調節ドメイン(PylRSn)の構造解析に取り組んだ。PylRSn単独に加え、PylRSnをPylRSの触媒ドメイン(PylRSc)と共発現させるコンストラクトやPylRSnとPylRScを様々な長さのリンカーでつないだコンストラクトを作成し、発現条件を検討した。加えて、東海大学北條教授との共同研究にてPylRSを利用して糖タンパク質を原核生物で合成する研究も進めている。現在までに均一な糖鎖修飾を受けたペプチドを固相法で合成する系を立ち上げるとともに、DhPylRSとDhtRNA^<Pyl>遺伝子で形質転換した大腸菌を作成し、終止コドンにアミノ酸を導入できるin vivoの系を作りあげた。クロマチンリモデリング機構のプロジェクトでは、大腸菌でのタンパク質の共発現や昆虫細胞の発現系、遺伝子の全合成を駆使することでBAF60aならびにこれまで困難とされてきたFos-Jun複合体全長の大量発現に成功した。Fos-Jun複合体に関してはアルギニンによる可溶化やグアニジン塩酸を用いたrefolding処理、ターゲットDNAフラグメントの添加により可溶化効率をさらに上げる試みを行っている。BAF60aに関しては、昆虫細胞でも発現が確認され、大腸菌で発現させた種々のホモログと共に精製・結晶化を進めている。加えて、上記PylRSのプロジェクトの延長線上として、現在真核生物特有の翻訳とカップルしたtRNAの核外輸送メカニズムの構造基盤解明にも取り組んでいる。成熟したアミノアシルtRNAを翻訳系に送る輸送体Cexlpについて限定分解、相同性解析、二次構造予測を指標に数十種類のコンストラクトを調製し、複数種のホモログに関しても結晶化を試みた。その結果Cexlpのヒトホモログ全長に関して予備的な結晶が得られ、Cexlp変異体に関しては2.3Åという高分解能で回折データ収集に成功し、その構造解明目前のところまできている。本研究員は、1年目、2年目に取り組んだ終止コドンを22番目のアミノ酸に読み替える、PylRS・tRNA^<Pyl>複合体の研究実績が評価され、今年度、栃木県宇都宮市市民賞を受賞した。さらにPylRSのプロジェクトにおいては、PylRSを用いたタンパク質工学への応用研究を東海大学北條教授との共同研究にて進めている。
トランスポゾンの抗抑制因子が備える配列特異性創出機構の解明・応用

シロイヌナズナのトランスポゾンVANDALがコードする抗抑制因子VANCに着目し、その標的配列の特異性を創出するメカニズムを明らかにすることで、トランスポゾンが宿主の抑制に対しどう対抗してきたかの理解を試みる。VANCは特定の塩基配列への結合活性を持ちながら、その配列特異性をVANDAL属ごとに分化させている。一方、既知のタンパク質と相同性がなく、いかにして属全体に渡る多様な配列特異性を創出しているのかは明らかでない。本研究では以下の3点に焦点を当て、VANCのDNA結合様式の理解を試みる。1VANCが持つ未知のDNA結合構造、2配列特異性を決めるアミノ酸残基の同定、3その残基の人工的改変。
アルブミン-ヘムのヘムポケット構造制御による安定酸素錯体の構築

本研究は、単純蛋白質であるヒト血清アルブミンに所望のナノ空間を構築し、その内部へ取り込ませたヘムの酸素結合反応の解析から、空間構造と酸素配位能の相関を詳細に解明、酸素輸送人工ヘム蛋白質を創製することを目的としている。本来、酸素結合能はもとより補欠分子すら持たない血漿蛋白質のアルブミンに、酸素運搬能を付与するための方法論を確立する。具体的には、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトに近位・遠位塩基となるアミノ酸を導入、ヘムを包接させたアルブミン-ヘム錯体を調製し、分子構造、軸配位構造、酸素結合反応の解析から、ヘムポケット構造と酸素結合能の関連を解明、安定酸素錯体を形成できるアルブミン-ヘム錯体を創製する。さらに、溶液系のみならず固相系へも展開し、新しい酸素輸送材料としての可能性を探索、評価する。アルブミン-ヘム錯体については昨年度までに成果を得ているので、本年度はアルブミンからなる管状構造体の構築に重点を置き、その特徴と機能発現について基礎知見を集積した。アルブミン-ヘムからなるナノチューブが酸素を可逆的に吸脱着できることを明確にするとともに、その方法論を他のポリカチオンとの組合せへ拡張、様々な組成からなるアルブミンナノチューブを合成した。得られた管状構造体の形態を電子顕微鏡により観察し、安定構造が得られる組成は、アルブミンとポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リシン、ポリアリルアミンであることを見出した。得られた成果は2報の論文として、英国および米国化学会誌に発表した。本研究は、単純蛋白質であるヒト血清アルブミンに所望のアミノ酸配列を有するナノ空間を構築し、その内部へ取り込ませたヘムの酸素結合反応の解析から、空間構造と酸素配位能の相関を詳細に解明、酸素輸送人工ヘム蛋白質を創製することを目的としている。近位・遠位塩基を導入したアルブミンの設計と精製ヘム結合部位近傍のアミノ酸配列は把握しているので、ヘモグロビンのヘムポケット構造との比較から、安定酸素錯体を形成できるアミノ酸配置を分子シュミレーションにより精密設計した。近位塩基としてのヒスチジンはイソロイシン-142の位置に固定、遠位塩基として機能するヒスチジン、アスパラギン、グルタミンをロイシン-185の位置に導入した。得られたアルブミンの精製は膜処理、カラムクロマトグラフィー、FPLCにより実施した。アルビミン-ヘムナノチューブの合成と酸素結合能近位塩基を有する合成ヘムを包接したアルブミン-ヘムから構成されるナノチューブを初めて合成した。従来、アルブミンのみからなる構造体は得られていたが、アルブミン-ヘムを用いることにより、酸素結合能を有するナノチューブが構築できた。得られたチューブの形態と微細構造を走査型電子顕微鏡で観察、紫外可視吸収スペクトル測定から、酸素結合能を明らかにした。1.アルブミン-ヘム錯体の軸配位構造と酸素結合能の解析初年度に合成したアルブミンを用いて、安定度高いアルブミン-ヘム錯体の調製法を確立。可視吸収スペクトル測定から、中心鉄の軸配位構造を解析し、導入His残基の配位を確認した。酸素結合定数(酸素親和度)、酸素結合解離速度定数の測定から、ヘム蛋白質としての機能を評価。酸素結合反応の詳細をナノポケットの空間構造と相関させて明らかにした。2.アルブミン-ヘム薄膜の合成と酸素結合能アルブミン-ヘムの分子表面にポリ(エチレングリコール)(PEG)鎖を共有結合で導入したPEG修飾アルブミン-ヘムをガラス基板上で乾燥させると、均一薄膜ができることを見出した。この薄膜も可逆的に酸素を結合解離できる。酸素錯体の半減期(40hr)は水中より長く、酸素結合フィルムとしての医療領域での応用が期待される。3.アルブミン-ヘムナノチューブの酸素結合能合成ヘムを包接したアルブミン-ヘムナノチューブが酸素を吸脱着できることを見出したので、その酸素結合能の詳細を明らかにした。また、透過電子顕微鏡観察による構造解析に初めて成功した。現在、上記成果について、2報の論文を作成し、海外学会誌に投稿中である。

アルブミン-ヘム錯体については昨年度までに成果を得ているので、本年度はアルブミンからなる管状構造体の構築に重点を置き、その特徴と機能発現について基礎知見を集積した。アルブミン-ヘムからなるナノチューブが酸素を可逆的に吸脱着できることを明確にするとともに、その方法論を他のポリカチオンとの組合せへ拡張、様々な組成からなるアルブミンナノチューブを合成した。得られた管状構造体の形態を電子顕微鏡により観察し、安定構造が得られる組成は、アルブミンとポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リシン、ポリアリルアミンであることを見出した。得られた成果は2報の論文として、英国および米国化学会誌に発表した。