hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナメクジを先達とする匂い認識・学習の分子機構

はじめに純物質の匂いを条件刺激として用いて,嗅覚忌避学習を行うための条件を検討した.その結果,1-オクタノールや1-ヘキサノールの0.01%水溶液を条件刺激(CS)とし,キニジン水溶液を無条件刺激(US)として用いると学習が成立することがわかった.また無条件刺激として電気刺激を用いても学習が成立した.これらの刺激を用いることにより,従来より再現性のよい条件付けが可能になった.次に嗅覚学習における前脳葉の役割を明らかにするために,麻酔下のナメクジの前脳葉を両側性に破壊し,快復させたナメクジを用いて学習実験を行った.まず前脳葉破壊後,7日目にニンジンをCS,キニジン溶液をUSとして条件付けし,翌日の記憶保持を調べた.その結果,擬手術群に比べて前脳葉破壊群ではニンジンからの忌避率が有意に低下していた.また,条件付け後,3時間後,1日後,3日後,7日後のいずれかに前脳葉を破壊し,その3日後の記憶保持を調べたところ,いずれの条件においても擬手術群に比べて前脳葉破壊群ではニンジンからの忌避率が有意に低下していた.以上の結果から,ナメクジの前脳葉は嗅覚忌避学習記憶の保持または想起に必要な脳部位であることが明らかになった.また中枢神経系を個体より切り出しただけで発現誘導される遺伝子の多くが神経活動依存的に発現するものであることが,これまでの我々の研究から明らかになっている.そこでナメクジ神経系における活動マーカー遺伝子を取得するために,中枢神経系切り出し後に発現変化する遺伝子を探索した.differential display法により,72プライマーペアを用いて約10,000バンドを表示した結果,28バンドにおいて再現性ある発現変化が認められた,このうち24バンドは脳の単離により発現レベルの上昇を示し,4バンドは減少を示した,28バンド中10バンドについては既にクローニングに成功した.
新しいアシルCoA合成酵素の性状と生理機能の解明

アシルCoAは脂肪酸がCoAとチオエステル結合した化合物であり、脂肪酸の活性化物質である。様々な脂肪酸代謝、脂肪酸のリン脂質、中性脂質への導入はアシルCoAへ変換されてから行われることから、この物質は脂質代謝の中心的な役割を担う物質といえる。現在、アシルCoAの産生経路としてはアシルCoAシンセターゼ(ACS)が知られており、ATPのエネルギーを利用して遊離脂肪酸をアシルCoAへ変換する。一方、私たちのグループは、動物細胞の膜画分をCoAとインキュベートすると相当量のアシルCoAが生成することを発見した。ここで観察されたアシルCoA合成活性はATPを必要としないことからACSと全く異なるもので新規合成経路といえる。アシルCoAと同時にリゾリン脂質が生成することから「ATP非依存性アシルCoA合成酵素系」の基質はリン脂質であることが想定された。関与する酵素(系)を分子レベルで明らかにすることを目的として、「新規アシルCoA合成経路はリゾリン脂質を基質とするアシルトランスフェラーゼの逆反応により触媒される」という仮説を立てこれを検証した。実際にはリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼのなかで唯一cDNAクローニングが成功しているリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)を用いてこの酵素にATP非依存性アシルCoA合成活性があるかどうかを検討した。LPAATを発現させた膜に、ホスファチジン酸を基質としたATP非依存性アシルCoA合成活性が観察され、LPAATは逆反応を触媒しアシルCoAを生成しうることが明らかになった。LPAATに関しては仮説が正しいことが証明された。作業仮説を真のものと証明するためには、これを他のアシルトランスフェラーゼに適用し、確認する必要がある。他のアシルトランスフェラーゼの実体は明らかでないので、LPIアシルトランスフェラーゼ(LPIAT)の精製を試みた。肝臓ミクロソーム画分より、LPIATを可溶化、部分精製した。肝臓ミクロソーム画分には、様々なリゾリン脂質に対するアシルトランスフェラーゼ活性が存在するが、可溶化、精製を進めるにつれてLPIAT精製され、それに対応して他のリゾリン脂質に対するアシルトランスフェラーゼ活性は除かれた。この結果はリゾリン脂質の特異性が異なる別々のアシルトランスフェラーゼが存在することを意味する。また、同時にPIを基質(アシルドナー)としたATP非依存性アシルCoA合成活性が精製された。このアシルCoA合成活性はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、PAなど、他のリン脂質は基質とならず、アシルドナーはPIに特異的であった。これらの結果は、LPIATは逆反応を触媒し、PIを基質としてCoA依存的にアシルCoAを合成することが示された。LPIATに関しても概ね仮説は正しいと考えられる。

これらの結果は、LPIATは逆反応を触媒し、PIを基質としてCoA依存的にアシルCoAを合成することが示された。LPIATに関しても概ね仮説は正しいと考えられる。アシルCoAは脂肪酸がCoAとチオエステル結合した化合物であり、脂肪酸の活性化物質である。脂肪酸の酸化、合成、不飽和化、鎖延長など様々な脂肪酸代謝、さらに脂肪酸のリン脂質、中性脂質への導入はアシルCoAへ変換されてから行われることから、この物質は脂肪酸代謝、脂質代謝の中心的な役割を担う物質といえる。近年、アシルCoAが一見、脂肪酸代謝とは全く無関係な系にも重要な役割を演じていることが徐々に明らかとなっている。現在、アシルCoAの産生経路としてはアシルCoAシンセターゼ(ACS)が知られており、ATPのエネルギーを利用して遊離脂肪酸をアシルCoAへ変換する。一方、私たちのグループは、哺乳動物細胞、組織の膜画分をCoAとインキュベートすると相当量のアシルCoAが生成することを発見した。ここで観察されたアシルCoA合成活性はATPを必要としないことからACSと全く異なるもので新規合成経路といえる。アシルCoAと同時にリゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトールなどのリゾリン脂質が生成することから「ATP非依存性アシルCoA合成酵素系」の基質(アシルCoAの脂肪酸の由来)は膜リン脂質であることが考えられた。この反応系に関与する酵素(系)を分子レベルで明らかにすることを目的として、「新規アシルCoA合成経路はリゾリン脂質を基質とするアシルトランスフェラーゼの逆反応により触媒される」という作業仮説を立てこれを検証した。実際にはリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼのなかで唯一cDNAクローニングが成功しているリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)を用いて、この酵素にATP非依存性アシルCoA合成活性があるかどうかを検討した。LPAATを発現させた細胞膜に、ホスファチジン酸を基質としたATP非依存性アシルCoA合成活性が観察され、LPAATは逆反応を触媒しアシルCoAを生成しうることが明らかになった。アシルトランスフェラーゼの逆反応の重要性が示された。様々な脂肪酸代謝、脂肪酸のリン脂質、中性脂質への導入はアシルCoAへ変換されてから行われることから、この物質は脂質代謝の中心的な役割を担う物質といえる。一方、私たちのグループは、動物細胞の膜画分をCoAとインキュベートすると相当量のアシルCoAが生成することを発見した。アシルCoAと同時にリゾリン脂質が生成することから「ATP非依存性アシルCoA合成酵素系」の基質はリン脂質であることが想定された。
植物の新規オルガネラ(ERボディ)に注目したタンパク質集積の分子機構構

近年の研究から,植物の小胞体は生育段階に応じてその働きや構造を大きく変えることが明らかとなってきた.シロイヌナズナの小胞体の動態を観察するために,小胞体残留シグナルを付加した緑色蛍光タンパク質,SP-GFP-HDELを発現するシロイヌナズナ(GFPh株)を作成した.GFPh株の観察から,直径およそ10μmほどのERボディを発見した.ERボディは,幼植物体の表皮に普遍的に観察される.ERボディは,成長した植物体ではほとんど見られないが,傷害や傷害ホルモンであるジャスモン酸により誘導される.これらのことから,ERボディは虫害や病害に対する防御の役割があると予想される.ERボディの形成機構を調べる目的で,幼植物体でERボディが形成されない劣性変異体,nai1を単離,解析した.NAI1はbHLH型の転写制御因子をコードしていた.nai1では,小胞体残留シグナルをもつβグルコシダーゼ,PYK10の発現,蓄積が見られなかった.免疫電子顕微鏡観察から,PYK10はERボディに蓄積することが明らかとなった.興味深いことに,PYK10を過剰発現させたnai1では,ERボディが出現した.よって,PYK10の小胞体への蓄積が幼植物体のERボディ形成に重要であると考えられた.一方,ERボディの形成に関わるさらなる因子を同定することを目的として,GFPh株を親株としてアクチベーションタグ等の方法を用いてスクリーニングを行い,いくつかの候補を単離することができた.これらの突然変異体の解析から,ERボディ形成に関わる因子を同定することができた.現在,これらの遺伝子の働きを調べている.植物は,環境に応じて細胞内オルガネラを柔軟に変化させる能力を持っている.小胞体は分泌タンパク質合成の場であるが,虫害により小胞体からβグルコシダーゼ(PYK10)を大量に蓄積する新規オルガネラ(ERボディ)が形成されてくる.ERボディは虫害のみならず,幼植物体の表皮にも多くみられる.初年度はERボディ形成に関わる因子を同定することを目的として,以下の研究を行うとともに,ERボディや液胞に蓄積する液胞プロセシング酵素(VPE)の細胞死における役割を明らかにした.1.小胞体の形態に異常を来したシロイヌナズナ変異体の単離小胞体残留シグナルを持つ緑色蛍光タンパク質(GFP-HDEL)を強制発現させたシロイヌナズナ形質転換株(GFPh株)を作成した.この植物は小胞体がGFPにより可視化されている.GFPhを用いて,アクチベーションタグラインを作成し,小胞体の形態に注目してスクリーニングを行った.およそ5,000ラインをスクリーニングしたところ,ERボディの数や形が変化した変異体を見つけることができた.現在,これらの変異体の原因遺伝子の同定を目指している.ERボディには小胞体残留シグナルを持つβグルコシダーゼ,PYK10が大量に蓄積している.また,ERボディが蓄積しないnai1変異体では,PYK10の蓄積が見られない.そこで,PYK10遺伝子の欠損株を単離し,ERボディが蓄積するか調べたところ.PYK10欠損変異体では,ERボディの形成が押さえられていた.このことから,PYK10はERボディ形成に必要であることが明らかであった.現在,nai1変異体にPYK10を過剰発現させ,ERボディが形成されるか調べている.3.VPEの細胞死における役割植物における細胞死にはカスパーゼ活性を持つプロテアーゼが関与している.合成基質を使用した解析からカスパーゼ活性を持つ酵素として液胞プロセシング酵素(VPE)を同定した.VPEの発現を押さえたタバコでは,カスパーゼ活性が減少し,タバコモザイクウイルス(TMV)による過敏感細胞死が押さえられた.電子顕微鏡観察からTMVによる過敏感細胞死において細胞が死ぬ前に液胞が崩壊していることがわかった.これらのことから,VPEはカスパーゼ活性を持ち,液胞を崩壊することで細胞死を誘導していることが明らかとなった.この結果は,論文としてサイエンス誌に報告した.近年の研究から,植物の小胞体は生育段階に応じてその働きや構造を大きく変えることが明らかとなってきた.シロイヌナズナの小胞体の動態を観察するために,小胞体残留シグナルを付加した緑色蛍光タンパク質,SP-GFP-HDELを発現するシロイヌナズナ(GFPh株)を作成した.GFPh株の観察から,直径およそ10μmほどのERボディを発見した.ERボディは,幼植物体の表皮に普遍的に観察される.ERボディは,成長した植物体ではほとんど見られないが,傷害や傷害ホルモンであるジャスモン酸により誘導される.これらのことから,ERボディは虫害や病害に対する防御の役割があると予想される.ERボディの形成機構を調べる目的で,幼植物体でERボディが形成されない劣性変異体,nai1を単離,解析した.NAI1はbHLH型の転写制御因子をコードしていた.nai1では,小胞体残留シグナルをもつβグルコシダーゼ,PYK10の発現,蓄積が見られなかった.免疫電子顕微鏡観察から,PYK10はERボディに蓄積することが明らかとなった.興味深いことに,PYK10を過剰発現させたnai1では,ERボディが出現した.よって,PYK10の小胞体への蓄積が幼植物体のERボディ形成に重要であると考えられた.一方,ERボディの形成に関わるさらなる因子を同定することを目的として,GFPh株を親株としてアクチベーションタグ等の方法を用いてスクリーニングを行い,いくつかの候補を単離することができた.
聴覚障害者講義での質問者の手話の自動撮影による学生間の意思疎通支援に関する研究

本研究では,聴覚障害者集団を対象にした講義における学生間の意思疎通を支援する目的で,講義中に質問をした学生を自動的に撮影するシステムを開発した.本システムでは,受講者の中から画像処理により発言者を検出し、発言者を撮影するようにカメラで自動的に追う.手話を行っている間は発言者を撮影し,それを部屋の前面のモニターに映し出す.これを他の受講者が見ることによって,発言内容を把握する.これによって,従来では,発言内容が共有されないため同じ質問を繰り返し発言するという問題が起きていたが,それが解決される.また,講義中に講師から受講生に対して発言を促すこともしやすくなる.発言者を検出する方法として様々な方法が考えられるが,本システムでは挙手動作によって発言者を検出した.挙手動作は顔の周辺で行われるので,人物の顔位置を求める.まず,背景差分によって人物領域を求め,さらに肌色抽出,髪領域探索によって顔位置を求める.また,カメラに対する受講生の奥行きに応じて,閾値を使い分けることによって,カメラからの距離による影響を少なくした.挙手動作によって発言者を検出した後,カメラをその発言者に向け,ズーム撮影する.このとき,発言者がカメラの視野から外れないように,手話を行っている手がカメラの視野付近にある場合は,ズームアウトする.また,ズームが小さすぎる場合は,発言者の口の動きが分かりにくくなるため,ズームインする.本システムの有効性を検証するために,実際の聴覚障害者集団の講義において,実験を行った.その結果,挙手検出率は70%であった.また,受講者に本システムについての聞き取り調査を行い,本システムは役に立つと思われるという回答が多かった.本研究は、聴覚障害者の講義での質問者の手話発言が他の受講者にとって認識することが困難であるといったことを改善するためのものである。システムの流れとしては、質問者を自動で発見し、カメラがそれを追い、講義室前面のモニタに手話を映し出すといったものになる。システムの構成では、カメラは講義室前面の上部に配置することを考えている。これは受講者全体を把握する必要があることと、手話が前の人の陰にならないようにするためである。また、発言時以外はモニタの映像を切っておくが、その操作は講師のスイッチ操作によって実現する。質問者を発見する方法として挙手を用いる。そのためには、受講者の顔領域と腕の動作を認識する必要がある。まず、映像から顔領域を抽出する方法としてYUV表色系での肌色抽出を用いた。あらかじめ、肌色のモデルとなるヒストグラムを作成しておき、それに従って肌色と考えられる領域を抽出する。また、顔領域を正確に抽出するために顔の上部には髪があるという制限を加えた。これは肌色領域の上部に黒領域の面積が一定以上ある場合に、これを顔として認識する。また、顔はフレーム間で大きく移動しないと考えられるため、肌色抽出は前のフレームで得られた肌領域の周辺で行う。また、同様に顔はフレーム間でまったく動かないというわけではないので、顔候補の領域でフレーム間差分を行い、動きの無い領域は顔候補から外すことにした。このようにして得られた顔領域より上に、フレーム間差分で得られた動きがあった領域、手のひら以上のサイズ、肌だろうと考えられる色相(UV値)のすべての制約を満たすものを挙手として認識する。また、質問者の音声を検出し、講師の音声を分離し、質問者の位置を音源定位によって推定する。本研究では,聴覚障害者集団を対象にした講義における学生間の意思疎通を支援する目的で,講義中に質問をした学生を自動的に撮影するシステムを開発した.本システムでは,受講者の中から画像処理により発言者を検出し、発言者を撮影するようにカメラで自動的に追う.手話を行っている間は発言者を撮影し,それを部屋の前面のモニターに映し出す.これを他の受講者が見ることによって,発言内容を把握する.これによって,従来では,発言内容が共有されないため同じ質問を繰り返し発言するという問題が起きていたが,それが解決される.また,講義中に講師から受講生に対して発言を促すこともしやすくなる.発言者を検出する方法として様々な方法が考えられるが,本システムでは挙手動作によって発言者を検出した.挙手動作は顔の周辺で行われるので,人物の顔位置を求める.まず,背景差分によって人物領域を求め,さらに肌色抽出,髪領域探索によって顔位置を求める.また,カメラに対する受講生の奥行きに応じて,閾値を使い分けることによって,カメラからの距離による影響を少なくした.挙手動作によって発言者を検出した後,カメラをその発言者に向け,ズーム撮影する.このとき,発言者がカメラの視野から外れないように,手話を行っている手がカメラの視野付近にある場合は,ズームアウトする.また,ズームが小さすぎる場合は,発言者の口の動きが分かりにくくなるため,ズームインする.本システムの有効性を検証するために,実際の聴覚障害者集団の講義において,実験を行った.その結果,挙手検出率は70%であった.また,受講者に本システムについての聞き取り調査を行い,本システムは役に立つと思われるという回答が多かった.
CRISP/Cas9法を用いた多能性維持遺伝子破壊による癌幹細胞形成能の検証

CRISPR/Cas9を用いて、去勢抵抗性のヒト前立腺癌細胞DU145で発現しているNANOG1, NANOGP8を完全にノックアウトした。NANOG1とNANOGP8のノックアウト細胞は、いずれもスフェア形成、足場非依存性増殖、浸潤能、抗癌剤(Docetaxel)耐性能がいずれも低下し、2つの遺伝子間での差はなかった。SCIDマウスの皮内に腫瘍を形成ると、いずれの遺伝子欠損株でも、腫瘍形成が抑制された。これらの形質変化は、それぞれの欠損遺伝子の強発現で回復した。抗癌剤などの様々なストレスに癌細胞が暴露されることにより、一部の癌細胞が治療抵抗性の遺伝子発現を誘導するが、その際、多能性維持因子のNanog, Sox2, Oct4の発現が一過性に増強する。さらに癌幹細胞集団と考えられるスフェア形成時には、これら多能性維持因子の発現が急激に増強するが、スフェア形成を解除すると発現しなくなる。このことは、多能性維持因子が癌幹細胞形成に必須であることを示唆している。そこで、まずNanog遺伝子を完全にノックアウトした癌細胞をCRISPR/Cas9法により作成し、その癌細胞の腫瘍形成能、抗癌剤耐性能を評価し、癌幹細胞を決定づける遺伝子の同定を目指す。ヒト前立腺癌細胞DU145でCRISPR/Cas9を用いて、Nanog遺伝子をノックアウトを試みた。DU145にはNanog1の他に少なくとも10種類のpseudogeneがあることが分かり、その中でNanogP8のみが発現していた。そこで、Nanog1, NanogP8、それぞれのノックアウト細胞を作成した。いずれの細胞株も細胞増殖能は野生株と比較して差がなかったが、Snailの発現減少とE-cadherinの発現増強に伴う遊走能やSCIDマウスでの造腫瘍能はいずれも野生株と比較して著明に減少した。また抗癌剤のDocetaxel感受性も増大した。これらの形質はいずれもNanog1の遺伝子を導入して過剰発現させることで回復した。Nanog1, NanogP8のダブルノックアウト細胞を分離しようとしたが、312コロニーを検索したが1つも得られなかった。以上より、前立腺癌細胞ではNanog1, NanogP8が同等に働いて癌形質を維持しており、いずれも相補可能であるが、その発現は癌細胞の生存に必須であることが示唆された。癌幹細胞が豊富に存在すると考えられるスフェア形成をヒト前立腺癌細胞株でおこなったときに、多能性維持因子が強く発現し、中でもNANOGの発現が高まることを見出してきた。NANOGのsiRNAを導入した癌細胞はマウスでの腫瘍抑制能が劇的に低下することが報告されている。NANOGにはpseudogeneが10種類以上あり、その中のNANOGP8は正規のNANOG遺伝子(NANOG1)とは2つのアミノ酸が異なるだけで、NANOG1とほぼ同様のNANOG蛋白質を産生しており、癌細胞では特にその発現が高い。本研究では、CRISPR/Cas9を用いて、去勢抵抗性のヒト前立腺癌細胞DU145で発現しているNANOG1, NANOGP8を完全にノックアウトし、スフェア形成、腫瘍形成、抗癌剤耐性に及ぼす影響について検証した。しかしいずれも正常培地での増殖には影響がなかった。SCIDマウスの皮内に腫瘍を形成させたところ、いずれの遺伝子欠損株でも、きわめて小さい腫瘍形成が見られた。これらの形質変化は、それぞれの欠損遺伝子の強発現で回復したが、NANOG1欠損株にNANOGP8遺伝子を、NANOGP8欠損株にNANOG1遺伝子を強発現させても、正常に回復した。従来、ヒト前立腺癌細胞では腫瘍形成や抗癌剤耐性についてはNANOGP8の関与のほうが大きい報告されてきたが、2つの遺伝子は癌幹細胞の示す形質に対して同等に機能していることが明らかになった。次に、NANOG1, NANOGP8のダブルノックアウト細胞の分離を試みたが、300以上のコロニーを検索したが、いずれもダブル欠損株ではなかった。NANOG蛋白の発現は細胞の生存に必須であり、特にこの遺伝子が強く発現している癌幹細胞の維持にはきわめて重要な因子であることが示唆された。癌幹細胞の特性の維持にNanogの発現が必須であることが明らかになり、実際にCRISPR/Cas9法によりNanog1, NanogP8それぞれの欠損株を得ることができた。従来癌細胞ではNanogp8が主として機能していることが報告されてきたが、我々の実験で、Nanog1, NanogP8は相補できることが分かった。

病態医科学Nanogの癌細胞に賦与している特性をさらに解明することにより、癌幹細胞の特性に新たな発見が期待できるので、得られた細胞株の機能の解明に重点を置く予定である。
高等植物における相同組み換え制御因子の解析と効率的ジーンダーゲッティングへの活用

細胞周期制御による相同組換え効率の向上オープンなクロマチン構造をとり、姉妹染色分体の存在する細胞周期S-G2期は、DNA損傷修復機構として相同組換え修復が選択されやすい時期である。そこで、遺伝子相同組換え機構を利用するジーンターゲッティングの効率を向上させるには、S-G2期を延長させることが有効であると考え、イネ、シロイヌナズナを用いて、S-G2期延長法の確立を目指した研究を行っている。H20年度は、G2/M期の進行遅延を目的として、G2/M期の移行に関わるCDKB2の発現を抑制したイネを作出し、表現型の解析を行った。OsCDKB2恒常的RNAiを導入したイネカルスの核相を測定したところ、2Cの減少および、4Cの増加が観察され、予想通りG2/M期の進行遅延が生じていることが明らかとなった。しかし、OsCDKB2の恒常的な発現抑制は、再分化後のイネの生育に阻害的な効果を及ぼしたため、薬剤の添加により発現誘導が可能なOsCDKB2誘導的RNAiコンストラクトを作成し、形質転換を行った。誘導的RNAi形質転換カルスにおいては、G2/M進行阻害が薬剤の添加、除去により可逆的に制御可能であることを確認した。次世代の獲得を待って、ジーンターゲッティング効率の評価を行う予定である。また、OsCDKB2RNAiを導入した系統の一部では、8Cや16Cといった高次倍化が観察され、高次倍数性を示す細胞では核内染色体数も倍加していたことから、OsCDKB2の発現抑制は、endomitosisを誘導することが明らかとなった。イネにおいては胚乳以外の組織でDNA量の倍加が生じた報告はこれまでないことから、本発見は、イネ科植物の倍数性進化を考える上でも大変興味深いものであり、その理由については今後詳細な解析を進めていく予定である。1.ジーンターゲッティング(GT)機構の解明T-DNAを利用したGT系の利点の一つとして、複数の変異を同時にゲノムに導入できる点が挙げられるが、変異の位置や数がGT効率に及ぼす影響は明らかとなっていない。報告者は、イネゲノム中に、除草剤耐性を付与するALS遺伝子内の2点を含む、4点の変異を導入するGT系を試みており、H19年度は、点変異が飛び石状に導入された植物体を3個体見いだした。このことは、GTと共にミスマッチ修復も働いたことを強く示唆している。近年、アラビドプシスにおいてミスマッチ修復の変異体では相同組換え(HR)効率が向上することが報告されたことから、イネにおいてもミスマッチ修復の抑制がGT効率の向上に有効であると考えられる。この仮説を検証すべく、イネミスマッチ修復変異体の作成及びGT実験を計画検討中である。2.細胞周期制御によるHR効率の向上クロマチン構造や組換えの鋳型となる染色体の有無がHR効率に関与することが知られている。そこで、オープンな染色体構造をとり、姉妹染色分体の存在する細胞周期S-G2期の延長がHR効率の向上に有効であると考え、アラビドプシスを用いて、薬剤処理や細胞周期制御因子の改変がHR効率に及ぼす影響を解析したところ、DNA複製を遅延させるAphidicolin処理により、S-G2期の延長とHR効率の向上が観察された。また、G1/S,G2/M期の移行に関わるCAKのノックダウン植物体ではHR効率が低下し、DNA損傷に対して感受性を示すことが明らかとなった。CAK、CDKを介したリン酸化カスケードがHRに重要であるという酵母における報告も、この結果を支持するものである。今後は、CAKやCycD,CycAの過剰発現によりG1/S期の移行促進ならびにHRの活性化を図る予定である。

イネにおいては胚乳以外の組織でDNA量の倍加が生じた報告はこれまでないことから、本発見は、イネ科植物の倍数性進化を考える上でも大変興味深いものであり、その理由については今後詳細な解析を進めていく予定である。
網膜色素変性症モデルにおける視細胞アポトーシスの高濃度酸素療法による制御

2.低酸素状態はアポトーシスの誘因となるが、代謝活性の高い視細胞は酸素要求度は高いにもかかわらず、低酸素環境下にある。よって、高濃度酸素による網膜変性のより完全な抑制につき、MNUマウスモデルを用いて検討した。実験はC_<57>BLマウスに50mg/kg MNUを単回腹腔内投与し、直ちに21%、45%、70%、95%の酸素濃度環境下に3時間暴露し、7日後に屠殺して網膜を観察した。なお、95%酸素群では既法に則り(Lee AE and Wilson WR, Toxicol Appl Pharmacol,2000)、血流増大作用を有するニコチン酸アミド(NAM;1000mg/kg)をMNU投与直後に単回皮下注射し、酸素分配の増感作用を期待した。結果、高濃度酸素群(95%酸素)では、網膜の後極・辺像部を問わず、網膜全周性に視細胞アポトーシスの軽減をみた。ところがNAMの併用を中止するとアポトーシスの制御が不能なことが判明した。3.そこで、神経保護作用(抗アポトーシス作用)を併せもつNAM単独投与による病変制御にとりくんだところ、MNU誘発視細胞アポトーシスはラットにおいては25mg/kg NAMで、マウスにおいては1000mg/kg NAMの単回投与で病変の完全抑制が形態的に可能なことが判明した。1.我々の確立したN-methyl-N-nitrosourea(MNU)誘発網膜変性症は視細胞アポトーシスに起因し、ヒト網膜色素変性症と同一機転による(Am J Pathol,1996)。このモデルを用いて、caspase-3阻害剤による病変の制御に成功した(Exp Eye Res,2000)。なお、caspase-3阻害剤はrd遺伝子誘発網膜変性症の抑制にも有効である(印刷中)。しかし、caspase-3阻害剤による変性の制御はMNUモデルにおいては網膜辺像部においてのみで、後極部では不完全であり、rdモデルにおいては一過性であり、網膜変性の抑制は完全とは云い難い。よって、高濃度酸素による網膜微小環境の改善による網膜変性のより完全な抑制につき、MNUマウスモデルを用いて検討した。実験はC_<57>BLマウスに50mg/kgMNUを単回腹腔内投与し、直ちに21%、45%、70%、95%の酸素濃度環境下に3時間暴露し、7日後に屠殺して網膜を観察した。なお、95%酸素群では既法に則り(Lee AE and Wilson WR, Toxicol Appl Pharmacol, 2000)、血流増大作用を有するニコチン酸アミド(1000mg/kg)をMNU投与直後に単回皮下注射し、酸素分配の増感作用を期待した。微小環境(生理的低酸素状態)の改善により病変の完全制御が可能とのデータを得た。今後、ラットMNUモデルにおける実験を加えるとともに、酸素供給時間の検討やニコチン酸アミドの併用を中止した群も作製するとともに、病変抑制機序を解析し、データを補強する予定である。実験はC_<57>BLマウスに50mg/kg MNUを単同腹腔内投与し、直ちに21%、45%、70%、95%の酸素濃度環境下に3時間暴露し、7日後に屠殺して網膜を観察した。

なお、95%酸素群では,既法に則り(Lee AE and Wilson WR, Toxicol Appl Pharmacol,2000)、血流増大作用を有するニコチン酸アミド(NAM;1000mg/kg)をMNU投与直後に単回皮下注射し、酸素分配の増感作用を期待した。結果、高濃度酸素群(95%酸素)では、網膜の後極・辺像部を問わず、網膜全周性に視細胞アポトーシスの軽減をみた。ところがNAMの併用を中止するとアポトーシスの制御が不能なことが判明した。3.そこで、神経保護作用(抗アポトーシス作用)を併せもつNAM単独投与による病変制御にとりくんだところ、MNU誘発視細胞アポトーシスはラットにおいては25mg/kg NAMで、マウスにおいては1000mg/kg NAMの単回投与で病変の完全抑制が形態的に可能なことが判明した。
メカニズムに基づいたPK-PD解析モデルによる医薬品最適投与計画の再評価

本研究の目的は、薬物の生体内動態(pharmacokinetics : PK)と、薬理効果(pharmacodynamics : PD)の関係を、生体恒常系の日内変動やフィードバック調節系を含めた「メカニズムに基づいたPK-PD解析」を行うことで定量的化し、これを使用して医薬品の新しい投与計画設定法の確立を目指すものであった。生体恒常系の一つである血糖恒常系は顕著な日内変動を示すことが古くから知られており、糖尿病治療時にもこれら日内変動の影響を受けている。本研究ではスルホニルウレア系糖尿病治療薬トルブタミド(TB)についてラットを用いて検討を行った。その結果、ラットの血糖値および血漿中インスリン濃度は、それぞれ15時付近および18時付近に極大値を示す日周リズムをもつことを明らかにした。またTBを6時、18時のほかに、14時においてもi.v. bolus投与した結果、血糖低下効果は6時<14時<18時の順に増強し、夜間で薬効が亢進する日内変動が認められた。一方、血漿中TB濃度は顕著な日周リズムが存在するものの、薬効に直接関連する非結合型濃度推移には日内変動はほとんどないことを明らかにした。このことは、血糖低下効果に見られた日周リズムはTBの薬理学的機序との関連を示唆するものである。そこで、TBによる糖取り込み作用の指標として、TB投与後の脂肪細胞における糖輸送トランスポーターGLUT4の発現量を経時的に測定したところ、TB投与後、GLUT4発現量は直ちに増加したが、投与後30分にはほぼ基底値まで低下することが判った。また、これら発現量の増加は、6時と比べてわずかに18時で大きくなる傾向がみられた。そこで、6、14、18時におけるTBの体内動態と血糖低下率との関係を、血糖低下が最大となる投与後40分までについて速度論的に解析した。その結果、モデルによる解析は夜間に亢進する血糖低下効果を合理的に表すことができた。このとき、血糖低下率と直接関係のある因子の経時変化を推定したところ、GLUT4発現量の変化と類似していた。したがって、TBの血糖低下効果に認められた時刻差には末梢での糖取り込み能の時刻差が関与しているとの結論に至った。以上本研究で明らかにした研究結果は、糖尿病治療薬の最適投与計画及び最適投与製剤を設計する上で、極めて有用な情報を提供し得たものと考える。近年「時間薬理学」に関する研究の必要性が認識されるようになり、生体恒常系の日内変動を考慮した薬物投与計画の設定、DDS製剤の設計などが、ようやく注目されるようになってきた。本研究は特に生体恒常系のフィードバック調節系に着目し、投与された薬物の生体内動態(PK)と、薬理効果(PD)との関係を、生体恒常系の日内変動を含めた「メカニズムに基づいたPK-PD解析」を行うことで定量化し、これを使用して新しい投与計画設定法の確立を目指すものである。

本年度は血糖値に着目し、スルホニルウレア(SU)系糖尿病治療薬であるトルブタミド(TB)のPK-PDに及ぼす日内リズムの影響についてラットを用いて検討を行った。血糖値には15時頃を頂点とする有意な日周リズムの存在が認められているが、TBを6時または18時に単回i.v.bolus投与した後の血漿中非結合型薬物濃度は、今回のPK解析の結果、日周リズムは全く影響しないことが明らかとなった。一方、TBの血糖低下効果は6時投与に比べて18時で有意に大きいことが判った。この血漿中TB濃度と血糖低下効果を「日周リズムを組み込んだ結合モデル」を用いて解析を行ったが、両時刻の血糖低下効果を単一のPK-PDモデルで説明することはできなかった。この原因を究明するためTBによるインスリン(IRI)分泌を測定したところ、IRI分泌は急激かつ一過性であり、その量は6時に比べて18時に著しく亢進していることが明らかとなった。そこでTB投与量と血漿中IRI濃度を直接関連づけて解析したところ、両時刻の血糖低下効果は、単一のPK-PDモデルで説明することが出来た。このことはSU剤を長時間作用させた場合は、血漿中薬物濃度のみからでは判断できない薬効メカニズムに変化が生じている可能性が示唆され、次年度以降への研究課題として残されることとなった。本研究の目的は、薬物の生体内動態(pharmacokinetics : PK)と、薬理効果(pharmacodynamics : PD)の関係を、生体恒常系の日内変動やフィードバック調節系を含めた「メカニズムに基づいたPK-PD解析」を行うことで定量的化し、これを使用して医薬品の新しい投与計画設定法の確立を目指すものである。生体恒常系の一つである血糖恒常系は顕著な日内変動を示すことが古くから知られており、糖尿病治療時にもこれら日内変動の影響を受けている。本研究はスルホニルウレア系糖尿病治療薬トルブタミド(TB)についてラットを用いて検討を行ったものである。これまで(1)TBによる血糖低下効果は18:00投与群の方が6:00投与群よりも顕著に大きく、薬効に投与時刻による影響が認められること、(2)TBの体内動態にも投与時刻による影響があること、(3)TBによるInsulin分泌には投与時刻による影響が認められないこと、などを明らかにしてきた。本年度は、血糖調節機構の一つとして知られている脂肪細胞における糖取り込みトランスポーター(GLUT4)に着目し、日内変動によるGLUT4発現量の変化について検討を行った。方法としては、6:00点灯、18:00消灯の明暗サイクル下で飼育したWistar系雄性ラットを使用し、6:00および18:00にTBあるいはInsulinをi.v.bolus投与した後、経時的にラット脂肪細胞を摘出し、GLUT4発現量をWestern Blot法により測定した。その結果Insulin投与時、GLUT4による糖取り込みに時刻差が存在することが明らかになったが、GLUT4の発現量自体には時刻による有意な差は認められなかった。また、TB投与時のGLUT4発現量についても、時刻による影響は認められなかった。このことは、TBによる血糖低下効果の投与時刻による影響は、GLUT4の量的変化ではなく、GLUT4によるglucose turnover自体に時刻差が存在することを示唆しており、現在これについて検討中である。
複素解析多様体、解析空間に関連した解析学の共同研究の企画

1.平成元年1月25日より28日まで北海道大学において「特異点論とその応用」と題したシンポジウムを行い、60名近い(内中国人2名を含む)特異点理論関連研究者が集った。関数、写像、葉層構造の特異点、代数多様体、解析空間の特異点、微分方程式の特異点等比較的広範囲の講演を通じ、今までの結果に関する討論を行うと共に、将来進むべき方向を明らかにした。2.昭和64年1月5日より7日まで京都大学数理解析研究所において、複素解析幾何に関するworkshop的小研究集会が行われ、コンパクトkahler多様体のmoduli空間、L^2ー調和形式、有界領域の変形理論に関する詳細な講演が行われ、これらに関し活発な討論が行われた。3.昭和63年12月7日より10日まで京都大学数理解析研究所において、「複素解析幾何学とその周辺の研究」と題したシンポジウムが行われた。代数多様体の特異点、moduliの問題、解析空間のstratification、交叉コホモロジー理論、L^2ーコホモロジー理論、複素解析的葉層構造の特異点、Dー加群の理論の応用等いわゆる複素解析幾可の問題の他、これに関連し、Braid群、qー差分系、可積分系と量子群等の講演が行われ、関連諸分野の研究者間の交流がはかられ、これらの分野の有機的つながりが深められた。4.以上のような研究集会の他、arithmeticな代数幾何学、Kahler多様体のmoduli空間等の問題につき、個人的交流がはかられ共同研究の実をあげた。
乳児ビタミンK欠乏性出血症の誘因としての無症候性肝機能障害に関する研究

乳児ビタミンK欠乏性出血症における肝機能の関与について一連の研究を行った.生後3週のヘパプラスチンテスト(Hpt)スクリーニングで, Hpt50%未満の児の肝機能を追跡し, 2ヵ月以上追跡できた9例中8例に肝機能異常を認めた.また発症例2例に肝生検を行ったところ,いずれも巨細胞性肝炎の像を示した.この結果より,肝機能の未熟による凝固因子活性化不全が本症の背景に存在するのではないかと考え,セルロプラスミンを始めとしたrapid turnover proteinの測定を行った.その結果,予想に反し,これらのrapid turnover proteinは,肝機能の未熟性を示す低値ではなく,いずれも著しく高い値を示し,胆汁うっ滞の存在が示唆された.この結果から,ガスクロマトグラフィーを用いて乳児ビタミンK欠乏性出血症発症例,ニアミス例の血清胆汁酸分析を行った.8例の症例における血清胆汁酸パターンはいずれも著しい胆汁うっ滞パターンを呈した.以上の結果から,本症の発症要因として,消化管内への胆汁酸分泌不全によるビタミンK吸収障害が重要な役割を持つことが明らかとなった.次いで,早期および後期新生児期の血清総胆汁酸値について検討したところ,本症の発症が集中する生後1ヵ月に,生理的に胆汁うっ滞を示すことが明らかになった.さらにこの生理的胆汁うっ滞と,経口投与したビタミンKの吸収,血漿PIVKA-II値について検討した.生後5日の成熟児194例に対し, K2シロップ2ml(menaquinone-4として4mg)を経口投与した後の血中濃度は, 100倍以上の著しい個人差を認め, PIVKA-IIと強く関連していた.投与3時間後の血中濃度が測定限界以下であった7例の児では, 1例を除き,生後3週のPIVKA-IIも陽性であった.乳児ビタミンK欠乏性出血症における肝機能の関与について一連の研究を行った.生後3週のヘパプラスチンテスト(Hpt)スクリーニングで, Hpt50%未満の児の肝機能を追跡し, 2ヵ月以上追跡できた9例中8例に肝機能異常を認めた.また発症例2例に肝生検を行ったところ,いずれも巨細胞性肝炎の像を示した.この結果より,肝機能の未熟による凝固因子活性化不全が本症の背景に存在するのではないかと考え,セルロプラスミンを始めとしたrapid turnover proteinの測定を行った.その結果,予想に反し,これらのrapid turnover proteinは,肝機能の未熟性を示す低値ではなく,いずれも著しく高い値を示し,胆汁うっ滞の存在が示唆された.この結果から,ガスクロマトグラフィーを用いて乳児ビタミンK欠乏性出血症発症例,ニアミス例の血清胆汁酸分析を行った.8例の症例における血清胆汁酸パターンはいずれも著しい胆汁うっ滞パターンを呈した.以上の結果から,本症の発症要因として,消化管内への胆汁酸分泌不全によるビタミンK吸収障害が重要な役割を持つことが明らかとなった.次いで,早期および後期新生児期の血清総胆汁酸値について検討したところ,本症の発症が集中する生後1ヵ月に,生理的に胆汁うっ滞を示すことが明らかになった.さらにこの生理的胆汁うっ滞と,経口投与したビタミンKの吸収,血漿PIVKA-II値について検討した.生後5日の成熟児194例に対し, K2シロップ2ml(menaquinone-4として4mg)を経口投与した後の血中濃度は, 100倍以上の著しい個人差を認め, PIVKA-IIと強く関連していた.投与3時間後の血中濃度が測定限界以下であった7例の児では, 1例を除き,生後3週のPIVKA-IIも陽性であった.乳児ビタミンK欠乏性出血症の発症には、母乳中のビタミンK含有量、腸管におけるビタミンKの吸収、および吸収されたビタミンKの肝臓における利用の3つの因子が関与していると考えられる。前年度の研究で本症発症例において、血清セルロプラスミンなどがむしろ上昇し、胆汁うっ滞が本症発症に関与していることを強く示唆する結果を得た。今年度は、乳児ビタミンK欠乏症例における血清胆汁酸の分析を行い、本症発症要因としての肝内胆汁うっ滞について検討した。乳児ビタミンK欠乏症例9例における血清総胆汁酸値は、対照のヘパプラスチンテスト正常例30例に比し、5%の危険率で有意に高値を示した。胆汁うっ滞の指標となるC/CDC比も5%の危険率でビタミンK欠乏群で有意に高値であり、総胆汁酸の高値は胆汁うっ滞によるものと考えられた。検出された胆汁酸は、ほとんどの症例で、コール酸およびケノデオキシコール酸が主であり、一部の症例に微量の二次胆汁酸およびβ-OH-5-コレン酸を検出した。ビタミンK穴乏症例ではグリシン抱合型およびタウリン抱合型の上昇が著しく、胆汁酸の尿中排泄に重要と考えられる硫酸抱合型およびグルクロン酸抱合型の割合が有意に低値であり、胆汁酸排泄障害により、さらに胆汁うっ滞が強されるという悪循環を形成していることが推測された。本症の発生が生後4週前後に集中している事実についての説明は未だ不明であるが、血清胆汁酸値はこの時期に生理的に最大となることが報告されており、この時期と本症の発生時期が一致している事実も、本症の発症に胆汁酸排泄障害によるビタミンK吸収不良が関与していることを示唆する。
静的および準静的荷重を受ける薄肉鋼管圧縮材の耐荷力特性に関する研究

本研究の目的は静的・準静的荷重下における製作管の荷重一変形特性および耐荷力を理論的,実験的に求めることにあった。しかし、諸肢の部分で、静的荷重下における短柱の挙動のみに限定して研究を行った。実験的研究においては、6mm字のSM58Q材よりなるパイプ10体を製作し、初期不整(初期たわみ,真円度,残留応力)を測定すると共に、純圧縮耐荷力実験を行った。初期たわみ,真円度を測定するため時別の治見を製作した。残留応力は歪ゲージにより切断法により測定した。得られた結果は次の様になる。(1)束材の降伏応力はSM58材としては非常に高く60.9kgf/【mm^2】であった。(2)初期たわみ,真円度などの初期不整値はECCS,APIの規定値以内に収った。(3)残留応力分布は文献での実測例と形状がほぼ一致し、最大圧縮残留応力の値は降伏応力のほぼ20%であった。(4)短柱実験から得られた平均応力-平均ひずみみ関係は最高荷重までは部材の長さに無関係であったが、最高荷重後は長い部材ほど荷重の低下が急であった。(5)耐荷力は我国の道路指示方習の基準耐荷力式より推定できる。理論的研究はDynamcc Relaxatmの法(DR法)により円筒シェルの弾望性有限変位補助のための電算プログラムを開発した。この研究では特に、最適反復パラメータの効率的決定法の研究に重点を置いた。得られた成果は次のようである。(1)剛性行列の最大・最小固有値から反復パラメタを決定する方法により反復計算の回数を少くすることが可能である。(2)円筒シェルの耐荷力は初期たわみの形状,大きさにより大きく左右される。(3)短いシェルに対し得られた耐荷力は我国の道示とCCSの耐化力式のほぼ中間にある。(4)実験柱の長さ程度のシェルに対しては収れん性に対しまだ問題が残っている。
可視短波長レーザ用新材料(Zn,Hg)(S,Se)のエピタキシャル成長と評価

青緑色半導体レーザの大幅な特性改善を目指して、新たにGaAsと格子整合するZnHgSSeを活性層とする無歪みの素子構造を提案し、この新材料のエピタキシャル成長技術の開発と基礎物性の解明について成果を得た。主要な結果を以下にまとめる。1.原料として単体のZn,HgおよびH_2Seを用いる分子線エピタキシ-(MBE)により、GaAs基板上へのZn_<1-X>Hg_XSe(x=0-0.14)のエピタキシャル成長に初めて成功した。基板温度を170°Cと一定にした場合、Hg組成はHg/ZnおよびH_2Se/Znの両ビーム強度比に依存した。これらの傾向から、元来付着係数がZnに比較して著しく低いHgの膜中への取込みの機構を検討した。現時点では、成長表面上におけるZn-Se結合の形成に寄与しない過剰なSe原子が重要な役割を果たしており、Hg原子がこのようなSe原子とHg-Se結合を形成することによってHgの取込みが促進されると推測している。2.Zn_<1-X>Hg_XSe膜は、室温および35Kにおいて単一の幅の広い発光バンドからなるフォトルミネッセンスを示した。Hg組成の増加に従ってそのピーク位置は低エネルギー側に急速にシフトし、室温においてx=0-0.06というわずかなHg組成で全可視域の発光を得ることができた。さらに、励起スペクトルからこれらの発光がバンド端を起源としていることを明らかにし、このHg化合物が発光材料として優れた特性を有することを指摘した。3.原料としてZn,Hg,SeおよびZnSを用いるMBEにより、ZnHgSSe4元混晶のエピタキシャル成長に初めて成功した。この混晶ついて、格子定数を一定に保ちつつ禁制帯幅を変化させることが可能であることを明らかにし、ZnHgSSeから構成される格子整合したヘテロ接合をGaAs基板上に形成できることを示した。
金属集積分子カプセルを用いた精密組織化

我々が独自に開発したπ共役デンドリマーを分子カプセルとして、原子数の厳密に制御された金属錯体の超階層構造の構築を目指した。幾何学的に密度勾配をもつ樹状構造体(デンドリマー)には分子内電子勾配が存在すると予想し、従来の直鎖状高分子とは全く異なる幾何構造で、単一の分子量の球状剛体の新規π共役デンドリマーへ展開した。金属集積部位としてアゾメチン(イミン)を有する独自のπ共役デンドリマーの合成に成功した。興味あることに第1世代→2→3→第4世代と中心核の世代の金属配位が完全に終わらないとそれより外側の世代での錯形成が始まらないという、他に類例のない金属イオンの多段階放射状錯形成を世界で初めて発見した。すなわち、超分子中に金属を数と位置を決めて精密に配置できることに成った。この原理を応用して4種類の金属塩を層毎に精密に配置した階層構造の構築に成功した。
破骨細胞形成における交感神経および感覚神経の影響

骨吸収は交感神経刺激により促進され、感覚神経刺激により抑制されると言われている。以前、私は骨髄細胞においてアドレナリン作動薬が破骨細胞形成を促進し、感覚神経由来のニューロペプチドであるCGRPにより抑制されたという知見を見出し、骨吸収が交感神経及び感覚神経との生理学的相互作用により成り立つと示唆した。そこで本研究ではRANKL処理したマクロファージ様細胞RAW264.7に対するCGRPの影響を検討し、破骨細胞形成に対しCGRPは直接的に前駆破骨細胞に抑制的影響を及ぼすことを示し、その特性を明らかにした。交感神経系および感覚神経系の骨代謝に及ぼす相互作用を検討するため、マウス骨髄細胞において、アドレナリンβ作動薬であるイソプレナリン(Isp)により誘導された破骨細胞形成に及ぼすカルシトニン遺伝子関連ペプチド(calcitonin gene-related peptide ; CGRP)の影響を検討し、さらにRANKLおよびOPGへの作用を解析することにより、その作用機構を検討した。また、破骨細胞の前駆細胞であるマクロファージ様細胞RAW264.7を用いて、ニューロペプチドの破骨細胞の分化に及ぼす影響について検討した。その結果、Isp(1μM)はマウス骨髄細胞培養系において骨吸収活性を有するTRAP陽性多核細胞形成を著しく促進した。また、Isp(1μM)はRANKL産生促進およびOPG産生抑制により、破骨細胞形成を促進した。一方、CGRP(0.1μM)はIsp(1μM)によるRANKL産生促進およびOPG産生抑制に影響を及ぼさなかったが、破骨細胞形成を有意に抑制した。破骨細胞の前駆細胞として使われているRAW264.7のs-RANKL(50-100ng/ml)処理は、骨吸収活性を有する破骨細胞形成を促進し、RAW264.7には、ニューロペプチドに対する受容体の発現が認められた。以上の結果より、交感神経刺激による破骨細胞形成に対し、感覚神経刺激が直接的に前駆破骨細胞に抑制的影響を及ぼしている可能性を示した。さらに、破骨細胞形成に対し、CGRP由来の感覚神経刺激が直接的に前駆破骨細胞に抑制的影響を及ぼしていることを示し、このCGRPの作用機構を探る上でRAW264.7のs-RANKL処理が有用なモデルであることを示した。交感神経系および感覚神経系の骨代謝に及ぼす相互作用を検討するため、破骨細胞の前駆細胞であるマクロファージ様細胞RAW264.7を用いて、ニューロペプチドの破骨細胞の分化に及ぼす影響について検討した。RAW264.7のs-RANKL(50100ng/ml)処理は、破骨細胞の表現形質タンパクの遺伝子発現および骨吸収活性を有する破骨細胞形成を促進した。マクロファージ様細胞RAW264.7はカルシトニン遺伝子関連ペプチド(calcitonin gene-related peptide: CGRP)の受容体を発現しており、CGRPはs-RANKLによる破骨細胞の形成および骨吸収活性の促進を有意に抑制した。以上の結果は、破骨細胞形成に対し、CGRP由来の感覚神経刺激が直接的に前駆破骨細胞に抑制的影響を及ぼしていることを示し、このCGRPの作用機構を探る上でマクロファージ様細胞RAW264.7のs-RANKL処理が有用なモデルであることを示した。この結果を踏まえ、CGRP以外のニューロペプチドの受容体の発現についても検討した。その結果、マクロファージ様細胞RAW264.7は血管作用性小腸ペプチド(vasoactive intestinal peptide)およびサブスタンスP (substance P)の受容体を発現していることを示し、今後、様々なニューロペプチドの破骨細胞の分化に及ぼす影響について検討することができる可能性を示した。交感神経系および感覚神経系の骨代謝に及ぼす相互作用を検討するため、ニューロペプチドの破骨細胞の分化に及ぼす影響について検討した。以前、マクロファージ様細胞RAW264.7にs-RANKL(50100ng/ml)を処理し、破骨細胞の表現形質タンパクの遺伝子発現および骨吸収活性を有する破骨細胞形成を促進した。破骨細胞形成に対し、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(calcitonin gene-related peptide ; CGRP)由来の感覚神経刺激が直接的に前駆破骨細胞に抑制的影響を及ぼしていることを示し、CGRPの作用機構を探る上でマクロファージ様細胞RAW264.7のs-RANKL処理が有用なモデルであることを示した。この結果を踏まえ、このCGRPの破骨細胞形成抑制に、破骨細胞の細胞融合に関与するDC-STAMP (dendritic cell-specific transmembrane protein)および破骨細胞の分化に必須な転写因子であるNFATcl (nuclear factor of activated T cell cl)が関与しているか否か、このモデルを用いて検討を重ねた。その結果、CGRPは、破骨細胞の細胞融合および破骨細胞分化因子に対しては、影響を及ぼさないことを示した。また、破骨細胞形成に対し抑制的に作用する因子が関与している可能性も示唆された。