hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
卵巣顆粒膜細胞分化におけるプロスタグランジンD2の役割解明

本研究は、卵巣におけるプロスタグランジンD2(PGD2)の役割解明を目的としている。前年度の結果より、3週齢の雌マウスの卵巣には、PGD2合成酵素であるリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)、造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H-PGDS)およびプロスタグランジンD2受容体(PTGDR)の遺伝子が高発現していることが明らかになった。さらに、3週齢の雌マウスへの妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)投与は未処理のコントロール群と比較し、L-PGDS、H-PGDSおよびPTGDRの遺伝子発現を低下させることが明らかになった。そこで当該年度では、マウス卵巣顆粒膜細胞におけるPGD2の役割の解明を目指した。一般的に卵巣顆粒膜細胞の初代培養にはジエチルスチルベステロール(DES)で前処理した未成熟雌ラットが用いられる。この方法をマウスに適用し、卵巣顆粒膜細胞の初代培養系の確立を試みた。まず初めに、卵巣におけるL-PGDS、H-PGDSおよびPTGDRの遺伝子発現に対するDESの影響を調べた。3週齢雌マウス(C57BL/6)にDESを24時間毎に連続投与し、サンプリングを行った。初回のDES投与より、0、6、24、48、72および96時間後のマウスより卵巣を回収し、RNA精製およびcDNA合成を行った。定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析の結果、DES投与はL-PGDS、H-PGDSおよびPTGDRの発現量にほとんど影響を与えないことがわかった。そこで、3週齢雌マウスにDESを24時間毎に4日間連続投与した後、膨大した卵巣を摘出し、卵巣顆粒膜細胞の分離・培養を行った。マウス初代培養卵巣顆粒膜細胞を無血清培地で24時間培養した後、DPアゴニストにより刺激し、RNA精製およびcDNA合成を行った。現在、DPアゴニスト刺激の有無による遺伝子発現の差異を解析中である。平成30年度から進行中の動物実験施設改修のため、マウス飼育環境の変更を行った。しかしながら、新規の飼育環境下ではDPノックアウトマウスを含むマウス系統の繁殖がうまくいかず、現在、系統の復元を試みている。そのため、当該年度は野生型マウスのみを実験に用いたことから、実験計画にやや遅れが生じた。今年度は、前年度に引き続き、野生型マウスの初代培養卵巣顆粒膜細胞において、DPアゴニストにより発現誘導される遺伝子を網羅的に解析する予定である。また、DPノックアウトマウスからも初代卵巣顆粒膜細胞を分離・培養し、野生型マウス初代培養卵巣顆粒膜細胞との遺伝子発現の差異を明らかにする。さらに、野生型マウスおよびDPノックアウトマウスに直接DPアゴニストを投与し、卵巣顆粒膜細胞のマーカー遺伝子発現やステロイドホルモンの合成系遺伝子の発現を解析し、生体内においてのPGD2の役割を明らかにする予定である。プロスタグランジンの作用は、各プロスタグランジンに特異的な受容体を介して発揮される。これまで卵巣において、プロスタグランジンが排卵、卵丘細胞膨潤および黄体退縮などにおいて重要な役割を持つことが明らかにされている。本研究では、卵巣におけるプロスタグランジンD2(PGD2)の役割解明を目的とした。当該年度では、性周期(卵胞期、排卵、黄体期)のどの時点でPGD2が合成されるか明らかにするため、妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を投与した未成熟雌マウスから経時的に卵巣を摘出し、卵巣cDNAを合成した。定量的リアルタイムPCRを用いてPGD2合成酵素のmRNA発現変化について調べたところ、L-PGDSの発現レベルは、PMSG投与によって一時的に低下したが、その後のhCG投与によって上昇した。造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H-PGSD)の発現レベルも同様に、PMSG投与によって一時的に低下し、hCG投与によって上昇した。続いて、卵巣顆粒膜細胞由来のKGN細胞を培養し、プロスタグランジン受容体アゴニストを添加して遺伝子発現変化を解析したところ、DPアゴニストが濃度依存的にステロイド合成遺伝子の発現を上昇させた。以上の結果より、卵巣においてPGD2合成酵素はPMSGおよびhCG投与により変動し、合成されたPGD2はステロイド合成に関与する可能性が示唆された。マウス卵巣においてもPGD2合成酵素が発現しており、その発現はゴナドトロピン投与で変動することを明らかにできた。さらに、卵巣顆粒膜由来KGN細胞に対するDPアゴニストの作用を見出すことができたことから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。

この方法をマウスに適用し、卵巣顆粒膜細胞の初代培養系の確立を試みた。まず初めに、卵巣におけるL-PGDS、H-PGDSおよびPTGDRの遺伝子発現に対するDESの影響を調べた。3週齢雌マウス(C57BL/6)にDESを24時間毎に連続投与し、サンプリングを行った。初回のDES投与より、0、6、24、48、72および96時間後のマウスより卵巣を回収し、RNA精製およびcDNA合成を行った。定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析の結果、DES投与はL-PGDS、H-PGDSおよびPTGDRの発現量にほとんど影響を与えないことがわかった。そこで、3週齢雌マウスにDESを24時間毎に4日間連続投与した後、膨大した卵巣を摘出し、卵巣顆粒膜細胞の分離・培養を行った。マウス初代培養卵巣顆粒膜細胞を無血清培地で24時間培養した後、DPアゴニストにより刺激し、RNA精製およびcDNA合成を行った。現在、DPアゴニスト刺激の有無による遺伝子発現の差異を解析中である。平成30年度から進行中の動物実験施設改修のため、マウス飼育環境の変更を行った。しかしながら、新規の飼育環境下ではDPノックアウトマウスを含むマウス系統の繁殖がうまくいかず、現在、系統の復元を試みている。そのため、当該年度は野生型マウスのみを実験に用いたことから、実験計画にやや遅れが生じた。今年度は、前年度に引き続き、KGN細胞を用いてDPアゴニストが実際にステロイド産生に影響するのか培養細胞系を用いて検討する。DPアゴニストが直接DPに作用してステロイド合成遺伝子を発現上昇させるのかをsiRNAを用いたDPノックダウンにより調べる。ノックダウンがうまくいかない場合は、DPアンタゴニストを用いて調べる。DPに直接作用していると考えられた場合は、野生型マウスおよびDPノックアウトマウスより卵巣顆粒膜細胞を採取し、その初代培養細胞を用いて、DPアゴニストによる卵巣顆粒膜細胞のマーカー遺伝子の発現変化やステロイドホルモンの産生量の変化について詳細に調べる。DPアゴニストがDPに作用していないと考えられた場合は、DPアゴニストの各プロスタグランジン受容体に対する交差性や卵巣における遺伝子発現量を考慮して、DP以外の7つのプロスタグランジン受容体(EP1、EP2、EP3、EP4、FP、IPおよびTP)に対する検討を行う。具体的には、各プロスタグランジン受容体に対してsiRNAによるノックダウンを行い、ステロイド合成遺伝子の発現変化を指標として、DPアゴニストが作用するプロスタグランジン受容体を特定する。ノックダウンがうまくいかない場合は各プロスタグランジン受容体に対するアンタゴニストを用いる。DPアゴニストが作用する受容体が特定された場合は、野生型マウスおよび特定したプロスタグランジン受容体をノックアウトしたマウスからの初代培養卵巣顆粒膜細胞を用いて検討を行う。今年度は、前年度に引き続き、野生型マウスの初代培養卵巣顆粒膜細胞において、DPアゴニストにより発現誘導される遺伝子を網羅的に解析する予定である。また、DPノックアウトマウスからも初代卵巣顆粒膜細胞を分離・培養し、野生型マウス初代培養卵巣顆粒膜細胞との遺伝子発現の差異を明らかにする。
アイゼンメンガー症候群に対する片肺移植の応用-肺高血圧犬モデルを用いた高気圧酸素下72時間保存肺移植実験-

【目的】Dehydromonocrotaline 3.0mg/kgを幼若犬に投与することによって、8週間後には1)2000dyn・s・cm・5を超える肺血管抵抗の上昇、2)右室肥大、3)肺細小動脈の中膜肥厚の3条件を満たす肺高血圧犬モデルが作製できた。このモデルは一側肺動脈閉塞により容易に急性右心不全に陥る病的モデルであった。このモデルにおいて体外循環使用下に左片肺植を行い、移植後急性期の血行動態を非肺高血圧犬と比較検討した。【方法】6頭の犬にdehydromonocrotaline 3.0mg/kgを右房内投与したところ8週間後には収縮期肺動脈庄が2273から6078mmHg、肺血管抵抗が324780から23887441dyn・s・cm・5に上昇した。肺高血圧犬6頭のうち5分間の左肺動脈閉塞試験に辛うじて耐えた1頭に補助循環を用いず左片肺移植を施行したところ、移植操作中に右心不全のため死亡した。他の5頭は右房脱血、上行大動脈送血において新生児用膜型肺を用いて部分体外循環使用下に左片肺移植を施行した(PH群)。一方、6頭のcontrol犬には従来の方法で左片肺移植を施行した(C群)。【結果】PH群において体外循環を使用すると右心不全の症候は認められず、体外循環からの離脱は容易であった。移植前後の循環呼吸動態を以下に示す。----------------C群移植前→移植後2h--PH群移植前→移植後2hPH群では移植後の肺湿乾重貴比はgraft肺がnative肺より有意に高値を示した(6.3±1.0vs4.6±0.5)。【結果】Dehydromonocrotalineにより作製された肺高血圧犬において体外循環の使用下に片肺移植を実施した。移植後急性期には肺血管抵抗、肺動脈圧の低下、血流のgraft肺へのシフトが認められ、肺高血圧に対する片肺移植実験がより臨床に近い形で実施できた。1)モノクロタリンピロールの作成モノクロタリンを用いてラットの肺高血圧を作成することは比較的容易であるが、犬を用いて肺高血圧を作るのは困難であった。そこでモノクロタリンを精製し、モノクロタリンピロールを3ヵ月かけやっと作ることが出来た。2)幼若犬を用いた肺高血圧犬の作成モノクロタリンピロールを生食にとかし、右心房に留置したスワンガンツカテーテルより注入した。34mg/kgでは軽度の肺動脈圧の上昇をみたに過ぎなかったため、倍量とし8mg/kgを注入したところ、23日で犬が死亡してしまった。現在薬量と注入間隔を検討している。又、モノクロタリンピロールが茶色に変色していたため、効果が不充分と考えられ、白色の純粋な結晶であるモノクロタリンピロールを新たに作成している。3)72時間肺保存実験現在高圧酸素下に心肺を浸漬して4時間保存し、その後レシピエント犬に左片肺移植を行っている。その結果保存肺の機能は充分保たれており高圧酸素の有効性が示された。しかし移植肺のガス交換能は良好に保たれていたが、肺高血圧(肺動脈圧50mmHg以上)を呈し、長時間冷却保存の影響と思われる。

そのため、肺細小動脈のvasoconstrictionを抑制する薬剤を探している。現在保存時間を48時間に延長し、レシピエント犬に片肺移植を行い、保存肺の機能をみている。4)48時間保存が可能となり、肺高血圧犬が作成された段階で、初期の目的どおり、保存肺を肺高血圧犬に移植し、保存肺の機能を調べるとともに、肺動脈圧,右室圧などを経日的に調べ、右心機能の改善されることを証明し、アイゼンメンガー症候群に対する片肺移植の有用性について検討する予定である。[研究の目的]肺線維症、線維性肺胞炎、肺気腫、嚢胞性肺疾患等の末期的肺実質性疾患に対する片肺移植又は両肺移植の成績は良好であり、5年生存率は65%に達している。原発性肺高血圧症やアイゼンメンガー症候群等の肺血管性疾患に対しては従来より心肺移植が行われていた。しかし最近はドナー獲得困難のこともあり片肺もしくは両肺移植が行われ始めた。しかし肺高血圧症に対する片肺移植では右心不全状態にあったレシピエントの右心機能や残存した病的肺の機能が問題とされている。また拒絶反応のメカニズムが肺実質疾患と異なるとも言われている。そのためには正確な肺及び心の血行動態の評価が可能な大型動物のモデルがどうしても必要である。[研究の概要]3-5kgの幼弱ビーグ犬を用いた。デヒドロモノクロタリンをスワンガンツカテーテルを通して右房に注入した。デヒドロモノクロタリンを1.5mg/kg,3mg/kg,4.5mg/kgの3群に分け投与し1,2カ月後にスワンガンツカテーテルを挿入し心内圧、心拍出量等を測定し肺血管抵抗値を算出した。また右室左室重量比、血中エンドセリン等も測定した。結果1.5mg/kg群では肺動脈圧の上昇は軽度であったが、3mg/kgでは肺動脈圧(平均圧)は20mmHgから60mmHgと上昇し肺血管抵抗も150から1000dyne.sec.cm5.m2と著明に上昇した。血中エンドセリン-1も著明に上昇し肺動静脈の血管内皮細胞の障害が疑われた。4.5mg/kgでは全例1週間以内に肺水腫で死亡した。3mg/kg群を8週後犠牲死させ右室左室重量比を測定したところ右室重量が著明に増加していた。肺の組織所見では肺最小動脈の中膜の著明は肥厚が観察された。
ヒト歯槽骨におけるBMPおよびTGF‐beta活性について

1.研究材料の処理手術あるいは抜歯の際に採取した歯槽骨を脱水、脱脂した後、フリーザ-ミルにて粉砕して均一の骨粉を作成した。次いで0.5N塩酸にた脱灰後、4M塩酸グアニジンで処理し抽出物を得た。そして、この抽出物のBMP活性およびTGF-beta活性を測定している。2.BMP活性による骨誘導能の測定グアニジン抽出物と残渣物を混合してWistar系雄性ラットの背部皮下に埋入し、2週間後にこれを回収して骨誘導活性を測定している。骨誘導活性は埋入物のCaおよびP含量の測定により評価している。現在、CaおよびP含量の定量中である。また一部は、10%ホルマリンにて固定、パラフィンに包埋、薄切してH-Eおよびトルイジンブルー染色を施し、組織学的検索を行った。その結果、一部にトルイジンブルーに濃く染まっていると思われる所見が見られた。塩酸グアニジン抽出物を酸に溶解し、TGF-beta_1 ELISAシステムを用いて測定している。現在検体を増やし計測中である。
液体中の横波と縦波のＭｉｘｉｎｇメカニズムの解明：第一原理分子動力学法

我々は高校物理で、横波は固体中のみを伝わり、気体や液体中では伝わらないことを学ぶ。しかし2009年、液体中にも横波が存在することが細川らのX線非弾性散乱実験によって観測された。本研究では、第一原理分子動力学シミュレーションによって、液体中の横波は原子が周りの原子に囲まれて振動する「ケージ効果」によって起こることを定量的に明らかにした。さらに、横波が存在しているとき、その振動数に近い縦波も存在する、いわゆるMixing現象の存在を種々の液体についてシミュレーションによって示し、このMixing現象は、液体構造の異方性に起因することを明らかにした。平成24年度は,液体中の横波の起源が,ケージ内の原子の振動にあることを古典分子動力学を用いて定量的に明らかにした.古典分子動力学では,大規模,長時間のシミュレーションが可能であるため,統計精度の高い動的構造データが得られる.これを用いて,ケージと集団運動の関係を定量的に調べる方法を開発した.今年度は、この方法を第一原理分子動力学シミュレーションで計算した液体ナトリウム、液体シリコン,液体スズに適用して,ケージ内の原子の振動数と横波,縦波の振動数の関係を詳細に調べた.その結果,古典分子動力学による結果と同様に次の結果が得られた.(1)ケージ内の2つの原子を結ぶ方向と垂直方向への振動は、横方向のcurrent correlation functionの最大振動数と一致する。(2)縦方向のcurrent correlation functionの振動数は、平均原子間距離よりも近い位置に存在する2つの原子間の振動の振動数と一致するのみであり、原子間距離が離れるにつれて急激に振動数が小さくなる。つまり、原子集団のつくる縦波は、極近傍に存在する原子が次々に衝突して、それが伝播していくことによって起こることがわかった。一方,原子集団のつくる横方向の振動は、原子からなるケージ内の原子の振動が、その発生源であることがを明らかになった。さらに,横波が存在する場合は,2つの原子の横方向の振動は,ケージを超えて伝播していくが,横波が存在しない場合には,振動はケージ内にとどまっていることが新たに明らかになった.我々は高校物理で、横波は固体中のみを伝わり、気体や液体中では伝わらないことを学ぶ。これまでに横波発生機構のひとつは、ケージ効果であることを明らかにしてきた。今年度は、第一原理分子動力学シミュレーションにより、相互作用が等方的な液体としてナトリウム、異方的な液体としてシリコン、またその中間としてスズについて、横波、および、縦波と横波のミキシングについて詳細に調べた。その結果、横波は配位数の大きいナトリウムの場合に顕著に現れるが、ミキシングは逆に、シリコンで最も顕著となった。これは、横波の発生はケージ効果と関係するため、配位数が多くケージが作られることが前提となることを示している。また、ミキシングは、構造の異方性が重要であることが結晶についての解析から明らかになった。シリコンは、まさに液体中においても方向性を持つ構造をとるため、ミキシングが大きくなっていると考えられる。さらに、横波とケージの関係について定量的に調べるために、比較的容易に高い統計精度が得られる古典分子動力学を用いて、液体銅について調べた。その結果以下のことを明らかにした。ケージ内の2つの原子を結ぶ方向と垂直方向への振動は、横方向のcurrent correlation functionの最大振動数と一致する。一方、縦方向のcurrent correlation functionの振動数は、平均原子間距離よりも近い位置に存在する2つの原子間の振動の振動数と一致するのみであり、原子間距離が離れるにつれて急激に振動数が小さくなることがわかった。つまり、原子集団のつくる縦波は、極近傍に存在する原子が次々に衝突して、それが伝播していくことによって起こることが示唆された。一方、原子集団のつくる横方向の振動は、12個程度の原子からなるケージ内の原子の振動が、その発生源であることが示唆された。本研究の目的は、液体中の縦波と横波のMixingの起源を解明することである。ここでのMixingとは、液体中に横波が生じているとき、その振動数に近い振動数を持つ縦波も存在し、それが動的構造因子の中にピークとして現れることを意味する。このピークに対応する振動モードをT-modeと呼ぶことにする。これまで、「T-modeはMixing現象によって現れる」と考えられてきた。しかし、今年度、長時間の第一原理分子動力学シミュレーションによって液体Sn,Siの動的構造を精度良く求め、それを詳細に分析したところ、T-modeは、横波が存在しない場合にも存在することが分かった。液体中の横波は、原子スケールにおいても常に存在するわけではない。液体Siは隙間の多い構造のため、ケージ効果が弱く横波は生じない。また、液体Snは融点近傍であれば横波が存在するが、高温では消滅する。しかしこれらの場合でも明確にT-modeが存在することが分かってきた。つまり、T-modeは横波を起源として生じるという説では説明できない現象を得た。

T-modeが顕著に現れる液体はいずれも、動径分布関数の第一と第二ピークの間に小さなピークを持つことも分かった。中心の原子と、この小さなピークに存在する原子との相互作用は、第一近接原子との相互作用より弱い。このペアの振動が波源となって作られる波がT-modeの正体ではないかと考えられる。これを解明することが、本研究テーマの今後の課題である。以上のように、本研究では、従来提案されていた仮説を覆す重要な発見に至った。計算物理学計画どおり,液体中の横波の解析は,古典分子動力学のデータを用いた研究から,第一原理分子動力学によるデータの解析に進展し,横波発生のメカニズムを明らかにしてきた.本研究の最終目的である,縦波と横波のMixing機構の解明にとりかかる準備は整った.当初の計画通り、相互作用が等方的な液体から、異方的な液体までの横波、ミキシングについて第一原理MD法により調べることができた。また、液体の縦波・横波とケージ効果の関係を、分子動力学によるミクロなデータ直接用いて調べる方法は確立されていないため、どのような物理量を調べる必要があるかを詳しく検討し、2つの原子の間の相互速度相関関数を、縦方向、横方向に分離する方法を提案した。これにより、ケージ効果と横波の関係を古典分子動力学を用いて、定量的に明らかにすることができた。本研究の目的である、液体中に横波が生じ、さらに、横波と縦波のmixingが起こる機構を、第一原理分子動力学法により、ミクロに明らかにするためには,統計精度の高い分子動力学のデータが必要である.このため来年度は,これまでに得られたシミュレーションのデータの解析とともに,あらたに大規模,長時間の第一原理分子動力学シミュレーションを実施する.平成24年度は、古典分子動力学を用いて、ケージ効果と、横波、縦波についての関係を定量的に調べる方法を開発した。平成25年は、これを第一原理分子動力学シミュレーションで同様に実施し、横波発生および、ミキシングの機構について調べていく。これには、長時間のシミュレーションが必要となるため、新規にワークステーションを購入する。国内および海外の学会で発表および情報収集を行う。また、大規模長時間のシミュレーションを実施するために、新規にワークステーションを購入する。
ヒトES細胞から神経幹細胞・神経細胞への新規分化誘導法の確立

新規培養法を確立し、ヒトES細胞を一方向的に神経系細胞へ分化誘導し、均質な神経幹細胞を大量に調製することができた。この神経幹細胞は、選択的に神経細胞(主にドーパミン作動性神経細胞)に、あるいは、アストロサイトに分化誘導することが可能であった。さらに、その培養法の基本的な培養条件をわずかに変えることによって、ヒトES細胞を脳の領域が異なる様々な種類の神経系細胞に分化誘導できる可能性を開いた。ヒトES細胞から神経系の領域に特異的な種々の神経幹細胞および神経細胞を調製する分化誘導法を確立することを目的に、我々が既にマウスES細胞およびサルES細胞について確立したNeural Stem Sphere法(NSS法)を、ヒトES細胞に適用した。ヒトES細胞のコロニーをアストロサイト条件培地(ACM)中で浮遊培養し、NSSを形成させ、培養に伴うマーカー遺伝子のmRNA発現量の変化をリアルタイムRT-PCRで解析した。その結果、ES細胞のマーカー遺伝子であるOct-4およびNanogの発現量は培養によって減少した。一方、神経幹細胞、神経前駆細胞のマーカー遺伝子であるNestinおよびMusashi-1、神経細胞のマーカー遺伝子であるNF-MおよびMAP2の発現量は、培養10日目ごろまでは低値であったが、その後、培養20日目まで増加した。しかし、それぞれ中胚葉、初期内胚葉、表皮系外胚葉、アストロサイト、オリゴデンドロサイトのマーカー遺伝子であるbrachyury、GATA4、Cytokeratin-17、GFAP、MBPの発現量は非常に低値であり、増加しなかった。さらに、NSSをTUNEL法による解析することにより、この間、顕著なアポトーシスは起こらないことを確認した。これらの結果は、時間経過がマウスおよびサルES細胞よりも遅延するが、NSS法によりヒトES細胞を神経幹細胞、神経細胞ヘー方向的に分化できることを示すものであり意義深い。また、浮遊培養が12日目のNSSを接着培養することによって、純度が約90%である神経幹細胞を効率良く調製し、さらに、この均質な神経幹紳胞から選択的に神経細胞あるいはアストロサイトに分化誘導することもできたことは、移植用の細胞を調製する上で重要である。ヒトES細胞のコロニーを、マウスアストロサイト条件培地(ACM:マウス脳由来アストロサイトを事前に培養した培養液)中で浮遊培養し、NSSを形成させ、神経幹細胞、神経細胞を分化誘導した。このとき形成されるNSSの内部構造を、NSS切片の免疫組織染色により解析して、Nestin陽性の神経幹細胞がNSSの球体の表層に存在するとともに、NSSの内部に形成される中空の小さな球状の細胞集合体として存在すること、さらに、その中空球状細胞集合体にβIII-tubulinに陽性の神経細胞も出現することを認めた。これは、中枢神経系形成過程における神経幹構造と関連する可能性があり興味深い。NSS形成の過程において、脳の部位特異的マーカー遺伝子のmRNA発現量については、前脳、前・中脳、中脳、後脳のマーカー遺伝子は高発現であったが、脊髄のマーカー遺伝子の発現は低かった。これは、NSS法を基本にして、ES細胞コロニーの浮遊培養条件を詳細に検討することにより、前脳から後脳までの神経系細胞を分化誘導できる可能性を示すものである。NSSを接着培養して調製した神経幹細胞からアストロサイトを分化誘導し、このアウトロサイトを培養することにより調製したACM(ヒトACM)を用いて、ヒトES細胞から神経系細胞の分化誘導することに成功した。これは、ヒト由来の細胞だけを用いて神経細胞を自己完結的に作成できることを示すもので、移植用の細胞を調製する上で重要である。ヒトES細胞から神経系の領域に特異的な種々の神経幹細胞および神経細胞を調製する分化誘導法を確立することを目的に、マウスES細胞およびサルES細胞について確立したNeural Stem Sphere法(NSS法)を、ヒトES細胞に適用した。ヒトES細胞のコロニーは、アストロサイト条件培地(ACM)中で浮遊培養することによって、球体の細胞集合体であるNSSに成り、このときES細胞は一方向的に神経幹細胞、さらに神経細胞に分化した。領域に特異的なマーカー遺伝子の発現量は、神経幹細胞が主に存在する培養12日目のNSSでは、前脳と中脳のマーカーの発現が顕著であるのに対して、神経幹細胞と神経細胞が存在する培養20日目のNSSでは、12日目と比較して前脳のマーカーの発現が減少して、中脳のマーカーの発現が増加した。さらに、培養15日目と20日目のNSSを神経幹細胞の増殖因子添加条件で接着培養することによって調製した均質な神経幹細胞は、Neurosphere形成能を持ち、神経細胞への分化能も維持している一方、興味深い生物学的特徴の違いがあることを見出した。

これらの結果は、浮遊培養日数を変えることによって、異なる領域の神経系細胞を調製することができる可能性を示す重要なものである。一方、マウスES細胞では、浮遊培養にACMを用いるNSS法(原法)では、中脳から後脳の領域の神経系への分化誘導が優位であるが、ACMを変えるNSS法の変法によって、前脳から中脳の領域への分化誘導を優位であることを見出し、培養液を変えることにより、脳のより前方の領域への分化を誘導できることを示した。また、培養20日目のNSSには、ドーパミン作動性神経細胞のマーカー遺伝子が他の神経伝達物質関連遺伝子よりも顕著に発現することを明らかにし、さらに、調製した神経幹細胞からドーパミン作動性神経細胞に分化させることにも成功した。
DDSを目的とした超音波照射によるマイクロカプセルの破壊制御

マイクロカプセルを用いたDDSにおいて,カプセルに付加した薬剤が効率よく細胞内に取り込まれるよう超音波の照射条件を最適化し,カプセルの破壊を制御するには,マイクロカプセルなどの微小気泡の存在が細胞への薬剤取り込みを促進するメカニズムを明らかにする必要がある.そこで本年度は,下記の2点に関する検討を行った.1.細胞と気泡の相互作用の高速度観察前年度に行った高速度観察から,気泡が急速に収縮する際に微小な流れが発生し,これが気泡の崩壊の原因になっていることが示された.そこで本年度は,このような気泡のふるまいが細胞に作用を与える可能性に関する検討を行うために,培養した血管内皮細胞を用いて,細胞と微小気泡の相互作用の高速度撮影を行った.その結果,細胞の近傍に気泡が存在する場合に,明らかに気泡のふるまいに同期した細胞の変形が観察された.これは,気泡が存在しない場合には,超音波のエネルギは細胞にほとんど作用を及ぼさずに透過してしまうが,気泡が存在する場合には,超音波のエネルギが一旦気泡の運動エネルギに変換され.気泡のふるまいにより2次的に細胞が作用を受けているものと考えられた.高速度観察では,細胞の変形は観察できるものの画質が低く,細胞が受ける作用を詳細に観察することができなかった.そこで,パルス超音波照射下において気泡のふるまいが細胞膜に与える作用を高い感度で検出できる蛍光顕微法を用いて観察を行った.その結果,気泡が存在すると明らかに細胞膜が損傷を受ける確率が増大すること,損傷を受ける部位が気泡の崩壊が起きた部位と一致することが確認され,気泡のふるまいによる機械的な作用がSonoporationの発生機序の一つと考えられた.・倒立型顕微鏡と,照明光を高い精度で一点に集光する光学系を用いて観察システムを改良し,直径数ミクロンの気泡のふるまいを最高観察速度800万コマ毎秒,最大光学倍率200倍で観察することが可能となった.開発した観察システムを用いて直径3-5μmの模擬造影剤気泡,および直径1-3μmの超音波造影剤気泡のふるまいを観察し,気泡が単純な膨張・収縮運動だけではなく非等方的な変形をも生じていることを確認した.・数種類の気泡について超音波照射下での等方的な膨張・収縮運動を観察し,気泡のシェルや径の違いによる気泡のふるまいの違いを調べた.また,気泡のシェルや初期径を考慮して気泡の等方的な膨張・収縮のシミュレーションを行い(拡張Reyleigh-Plesset方程式),実測結果との比較を通じてシェルの物理特性の推定を行った.・気泡が強い音圧下で急速に収縮する際に非等方的な変形を生じ,その結果微小な流れを発生することを観察を通じて明らかにした.また,気泡の分割も気泡の収縮後に見られたことから,気泡の分割は気泡の非等方的な収縮により発生した微小な流れによるものと考えられた.・異なるシェルを有する気泡の懸濁液について透過減衰特性の実測とシミュレーションを行い,超音波の強度に依存して気泡懸濁液の減衰係数が変化すること,シェルの物理特性が減衰特性に強く影響を与えることを示唆する結果を得た.・任意波形発生器,アンプ,振動子,水槽からなる任意波形超音波発生装置を試作した.マイクロカプセルを用いたDDSにおいて,カプセルに付加した薬剤が効率よく細胞内に取り込まれるよう超音波の照射条件を最適化し,カプセルの破壊を制御するには,マイクロカプセルなどの微小気泡の存在が細胞への薬剤取り込みを促進するメカニズムを明らかにする必要がある.そこで本年度は,下記の2点に関する検討を行った.1.細胞と気泡の相互作用の高速度観察前年度に行った高速度観察から,気泡が急速に収縮する際に微小な流れが発生し,これが気泡の崩壊の原因になっていることが示された.そこで本年度は,このような気泡のふるまいが細胞に作用を与える可能性に関する検討を行うために,培養した血管内皮細胞を用いて,細胞と微小気泡の相互作用の高速度撮影を行った.その結果,細胞の近傍に気泡が存在する場合に,明らかに気泡のふるまいに同期した細胞の変形が観察された.これは,気泡が存在しない場合には,超音波のエネルギは細胞にほとんど作用を及ぼさずに透過してしまうが,気泡が存在する場合には,超音波のエネルギが一旦気泡の運動エネルギに変換され.気泡のふるまいにより2次的に細胞が作用を受けているものと考えられた.高速度観察では,細胞の変形は観察できるものの画質が低く,細胞が受ける作用を詳細に観察することができなかった.そこで,パルス超音波照射下において気泡のふるまいが細胞膜に与える作用を高い感度で検出できる蛍光顕微法を用いて観察を行った.その結果,気泡が存在すると明らかに細胞膜が損傷を受ける確率が増大すること,損傷を受ける部位が気泡の崩壊が起きた部位と一致することが確認され,気泡のふるまいによる機械的な作用がSonoporationの発生機序の一つと考えられた.
アパタイトファイバーをスキャフォルドとした再生骨の脊椎固定術への応用

今実験の目的は、アパタイトシートを、骨再生に適したスキャフォルドに改良し、骨欠損補填、特に脊椎固定術で使用する移植骨として利用可能な医療用デバイスを開発することにある。2004年度は、前年度に引き続き、気孔率、播種細胞数、細胞成長因子(主にBMP-2)の添加量などの作成条件をそれぞれ系統的に変化させ、種々の再生培養骨を作成した後、実験動物に移植し、骨再生におけるスキャフォルドとしての有用性を評価してきた。すなわち、1.ラット脊椎固定術モデルに対して、細胞成長因子(BMP-2)を負荷したアパタイトシートを移植骨として脊椎固定術を施行した。移植後2ヶ月以内に脊椎を摘出、骨と培養骨との骨癒合の程度を評価した。2.ラット骨髄細胞を、気孔率、気孔径の異なる数種類のアパタイ,シート内で培養、作成.た再生培養骨をヌードマウス皮下に移植した。移植後3ヶ月以内に、検体を摘出。病理組織学的検査により新生骨形成の程度を評価した。結果、平均気孔径100μm以上、気孔径98%以上に調節したシートでは、実験1でほぼ100%の肯癒合率を獲得し、実験2でもシート内部の旺盛な骨形成を得た。シート内部のmacroporeが高い連通製で結合する三次元構造を持つことが、内部への骨侵入を活発に促したために、BMP-2のcarrierとしても、骨再生のスキャフォルドとしても有用となったものと考えられた。2005年度は、高い気孔率を持つ反面、力学的強度に乏しくもとの形を保てないという欠点を克服するため、アパタイトシートの高強度化にも着手した。その結果、アテロコラーゲンやイノシトール燐酸などと複合化することにより、αTCP(バイオペックス【○!R】)と同等の初期強度を持つものが作成可能となっている。今年度は、1.高強度化したアパタイトファイバー(以下AFS)の、骨再生におけるスキャフォルドとしての有用性について、2.AFSのrhBMP-2の担体としての有用性について、特に脊椎固定術の移植骨として応用可能か、を評価するため以下の実験を行った。具体的には、1.豚由来のアテロコラーゲンと複合化したAFSにラット骨髄細胞を播種し、その後in vitroでの培養を継続した。所定の期間後にAFSのアルカリフォスファターゼ(ALP)活性およびOC量を定量した。2.1)rhBMP-2を付加したAFSを、PHを4に調整した酢酸緩衝溶液5mlに投入した。所定の期間静置したのち、遠心分離を行い、上澄み液のrhBMP-2濃度を計測、経時的な濃度変化を評価した。2.2)14週齢ラット(脊椎固定術モデル)を2群にわけ、同一量(10μg)のrhBMP-2をAFSと、比較対照として用いた市販アパタイト緻密体(以下HA)に付加した後、第56腰椎間両側後側方固定術に用いた。移植後に第56脊椎を一塊として摘出した。骨癒合の程度をX線撮影と徒手検査およびμCT撮影にて評価し、両群間で比較した。結果、1.AFS単独の場合と同様に、培養3週間の間ALP活性、OC量は経時的に増加しており、コラーゲン複合化AFSも、良好な生体適合性、細胞分化、増殖能をもっていた。2.1)rhBMP-2濃度は、投入後1日目に最高値となり、一旦低下するものの7日目にまた上昇する二峰性の濃度変化を呈した。2.2)AFS群のほうがより高い骨癒合率を示した。

μCT像によると、HA群では、脊椎からやや離れた位置に、内部に空洞の目立つ骨が形成されたのに対し、AFS群では、脊椎に密着したAFS中心に旺盛な骨形成が得られた。以上より、AFSは骨再生のスキャフォルドとしてのみならず、rhBMP-2の担体としても有用と考えられた。今実験の目的は、アパタイトシートを、骨再生に適したスキャフォルドに改良し、骨欠損補填、特に脊椎固定術で使用する移植骨として利用可能な医療用デバイスを開発することにある。今年度は、前年度に引き続き、気孔率、播種細胞数、細胞成長因子(主にBMP-2)の添加量などの作成条件をそれぞれ系統的に変化させ、種々の再生培養骨を作成した後、実験動物に移植し、骨再生におけるスキャフォルドとしての有用性を評価してきた。すなわち、1.ラット脊椎固定術モデルに対して、細胞成長因子(BMP-2)を負荷したアパタイトシートを移植骨として脊椎固定術を施行した。移植後2ヶ月以内に脊椎を摘出、骨と培養骨との骨癒合の程度を評価した。2.ラット骨髄細胞を、気孔率、気孔径の異なる数種類のアパタイトシート内で培養、作成した再生培養骨をヌードマウス皮下に移植した。移植後3ヶ月以内に、検体を摘出。病理組織学的検査により新生骨形成の程度を評価した。結果、平均気孔径100μm以上、気孔径98%以上に調節したシートでは、実験1でほぼ100%の骨癒合率を獲得し、実験2でもシート内部の旺盛な骨形成を得た。シート内部のmacroporeが高い連通製で結合する三次元構造を持つことが、内部への骨侵入を活発に促したために、BMP-2のcarrierとしても、骨再生のスキャフォルドとしても有用となったものと考えられた。高い気孔率を持つ反面、脆く壊れやすかったため、アテロコラーゲン、イノシトール燐酸などと複合化することにより、高強度化したアパタイトシートを作成することに成功した。現在では、αTCP(バイオペックス^<【○!R】>)と同等の初期強度を持つアパタイトシートが作成可能となっている。現在、高強度化アパタイトシートを用いて再生培養骨を作成し、実験動物に移植、その有用性について評価している。今後も、アパタイトシートに改良を加えていく予定である。
頭蓋底脊索腫の分子生物学的解析と予後因子の検討

脊索腫は脊索の遺残組織から発生し頭蓋底に好発する難治性の腫瘍です。今回私達は比較ゲノムハイブリダイゼーション法を用いた染色体解析を行い、経過との比較を行いました。また、近年脊索腫の進行において重要な役割を果たしているとされるT遺伝子とその産物であるbrachyuryタンパク質についても調べ、経過との比較を行いました。染色体1番短腕の欠失と1番長腕, 2番短腕の過剰がある症例、brachyuryの発現のある症例、T遺伝子のコピー数増加のある症例などは、再発までの期間が短く予後が悪いことが明らかになりました。今回の結果によりbrachyuryが分子標的治療の標的として有望である事がわかりました。脊索腫は脊索の遺残組織から発生し頭蓋底に好発する腫瘍である。通常術後に放射線治療が行われるが、高率に再発を認め、予後は不良である。これまで脊索腫について分子生物学的特徴と予後との関係を調べた報告は少ない。今回私は比較ゲノムハイブリダイゼーション(comparative genomic hybridization; CGH)法を用いた染色体解析を行い、予後との比較を行った。また、近年脊索腫の進行において重要な役割を果たしているとされるT遺伝子とその産物であるbrachyuryタンパク質についても調べ、予後との比較を行った。CGHの結果、37例中24例で染色体異常を認め、log-rank検定の結果、染色体1pの欠失と1q, 2pの過剰がPFSと関連した。brachyuryの免疫染色は30例で陽性で、log-rank検定で陽性の症例はPFSが有意に短かった。T遺伝子のFISHでは、27%の症例でコピー数の増加を認め、log-rank検定でコピー数増加のある症例は有意にPFSが短かった。単変量解析で有意であった項目について多変量解析を追加すると、brachyuryの発現と放射線未治療の症例でPFSと関連する傾向が認められ、また、T遺伝子の増幅を含めた解析では、2pの過剰と放射線未治療の症例は有意にPFSが短かった。近年in vitroの研究で、T遺伝子が脊索腫の進行において重要な役割を担い、腫瘍遺伝子として振るまうとする報告が相次いでいる。今回私は臨床的な側面からbrachyuryの発現が負の予後因子であることを示した。また、brachyuryは今後分子標的治療の最適な標的の一つとなりうると考えられた。これまでに我々は当施設において手術を施行した頭蓋底脊索腫37例について、comparative genomic hybridization (CGH)法による染色体異常の解析を施行した。その結果と予後(progression free survival; PFS)とをlog-rank検定を使った単変量解析で検討したところ、1pのlossと、1q, 2pのgainを有する脊索腫の患者のPFSが有為に短いことが明らかとなった。また近年、T遺伝子(brachyury)が脊索腫の形成や進行において重要な役割を果たしているとする報告が複数存在するため、brachyury蛋白の免疫染色とT遺伝子のfluorescence in situ hybridization(FISH)を追加で施行したが、これらの異常を有する脊索腫の患者のPFSは有為に短いということも明らかとなった。さらに手術における摘出度、放射線治療の有無、MIB-1 index等を含めたCox hazard modelを用いた多変量解析を行ったところ、2pのgainやbrachyuryの発現は単独でPFSと関連するとの結果を得ることができた。これらの結果から2pのgainやbrachyuryの異常がある症例ではよりいっそう注意深いフォローアップが必要であると考えられた。これらの知見は脊索腫の治療において重要な情報となりうると考えられ、現在これらの結果の確かさを再度検証するとともに文献発表に向けて準備を進めている。実験自体はすでに当研究室において確立されたものであり、標本となる腫瘍検体も実験室にすでに確保されているため、実験の妨げとなる問題もとくになく、予定通りの行程で進んでおり、期間内に終了し、文献を投稿するところまで見込める状態である。すでに結果の大部分をすでに得られているが、引き続き、結果の正当性の検証のための追加の実験を継続して行う予定である。主にFISHの結果については、結果が一定しないこともあり、何度か実験を繰り返し、結果の妥当性を再評価する必要がある。また、同時並行で統計ソフトを利用したデータの統計学的解析と英語論文の執筆を行う。作成した論文はできるだけ早い段階で、より世界的に評価の高い雑誌への投稿を行う予定である。未使用額の発生は、効率的な物品調達の結果であり、追加で必要となった翌年度のガラス製品やプラスチック製品などの消耗品の購入に充てる予定である。その他、試薬や実験器具などの購入を予定通り行う予定である。
ケロイド特異的発現分子の網羅的検索とその機能解析

本研究では、好発部位以外に発症したケロイドならびにピアスケロイドを研究対象から除き、病変部位と、それに近接する正常皮膚(scar)の両方を採取できた場合のみを研究材料とし、最終的に5例のサンプルを用いた。まずケロイド病変組織を用いたRNA採取を行った後、マイクロアレイ解析とパスウェイ解析を行い、次に発現分子の免疫染色を行った。マイクロアレイ解析で正常組織(CON)と病変組織(KL)を比較したところ、KLのみで2倍増加している分子が300個、4倍に絞ると40個あり、このうち約25%がマトリックス関連分子だった。興味深いことに約10%の中に神経、筋肉、骨に関連した分子が含まれていた。これら分子のうち、特に発現が高いFN1、WNT2、SOX2、MDFIを発生病理に関連した候補分子と定め、それぞれの免疫染色にて、その発現・局在を検討した。サンプルはKL、scar、CONと、それぞれの組織から得られた培養線維芽細胞を用いた。その結果、組織染色ではFN1とWNT2がKL++、scar+、CON-とケロイド病変で高い発現を認め、SOX2とMDFIがKL+、scar-、CON-と、ケロイド病変のみにおいて発現していた。培養線維芽細胞染色では全てのサンプルにおいて同等の染色性が見られた。このことから、ケロイド病変は中胚葉や外胚葉への多能性を有している細胞により構成されていると考えられた。また、これらの分子は培養線維芽細胞では全く異なる発現性を示しており、生体での病態を正確に反映していない可能性があるため、サンプルとしては適切ではないことが示唆された。今回、ケロイドの増殖間葉系細胞における強発現分子に着目した我々の研究データを通じて、ケロイドの本態は、従来の疾患概念とは異なり、何らかの契機で多分化能を有した細胞が長期間に渡って緩徐に増殖する腫瘍性疾患であると考えられた。
保型群のある種の部分群における極限的保型形式の零点の配置とリーマン仮説の類似

球面S^d上の有限個の点の集合で、異なる2点間の距離がs種類であるものをs-距離集合と呼ぶ。また、球面のある種の近似を与える有限集合で球面t-デザインという概念がある。球面上の有限個の点の集合を扱うとき、この二つの概念が非常に重要である。s-距離集合の一般化である局所s-距離集合には、ある種の特別な元の個数の上界が示される。その上界を達成する局所距離集合を堅い局所距離集合と呼ぶ。また、球面t-デザインの一般化である重み付き球面t-デザインにもある種の特別な元の個数の下界が知られている。この下界を満たす重み付き球面t-デザインを堅い重み付き球面デザインと呼ぶ。このとき、堅い局所距離集合と堅い重み付き球面デザインに1:1の対応があることを示した。このことから、堅い局所s-距離集合はs-距離集合になっていることが分かる。この結果は、堅い距離集合と堅い球面デザインの対応の拡張になっており、局所距離集合の意義を強調するものとなっている。sを固定したときに、どれ程多くの点を球面上に配置できるかがs-距離集合の問題である。このとき、元の個数に対する上界が非常に重要である。距離の値を固定したときに、知られている上界を改善する新たな上界を示した。この上界から、ある種の距離集合の非存在を導くことが出来る。Musinの論文では、この上界を効果的に用いて、次元dが小さいところで2-距離集合の元の個数の最大値を決定している。モジュラー群SL(2,II)の様々な部分群における保型形式の、ある自然の基本領域上の零点について、コンピューターにおける数値計算を行った。特に尖点の1つの無限遠点∞についてのEisenstein級数については、ある基本領域をとることで、その零点がすべて境界の円周上にあることが計算できた。また保型形式の一種であるextremal modular formについては、大部分がEisenstein級数と同じ円周上にあるが、ある一定の割合で円周上にない零点が現れることが計算できた。モジュラー群SL(2,II)のEisenstein級数の零点の配置をさらに詳しく見ていくなかで、ウエイトkのEisenstein級数の零点がウエイトk+12のEisenstein級数の継続する零点の間にちょうど一つずつ存在していることに気付いた。この零点の関係をinterlacementと呼ぶ。さらに、その事実を理論的に証明することが出来た。ウエイトが12増えるところでの関係はSL(2,II)の保型形式がウエイト4とウエイト6のEisenstein級数から生成できる事実から考えると、非常に自然である。この様な零点の関係は直交多項式を除いては非常に珍しい。Eisenstein級数を直交多項式に変換する方法は知られておらず、直交多項式に変換できない珍しい例である。この関係は他の部分群におけるEisenstein級数でも観察されている。SL(2,II)のEisenstein級数の零点がinterlacementの関係を持つことが理論的に証明できたことは、Eisenstein級数を初めとする円周上に零点を持つ保型形式の零点の配置を理論的に証明するために、interlacementを考えることが自然であることを示唆している。1.ある二つの群におけるアイゼンシュタイン級数のある基本領域上の零点が,すべて下の境界の円上に乗ることを示した,三枝崎,重住との共著の論文がJ. Math. Soc. Japanに掲載された.2.モジュラー群SL(2,Z)に対するアイゼンシュタイン級数の零点の配置についての性質を示した論文が,Bull. London Math. Soc.に掲載が決定した.この性質とは,重さk+12のアイゼンシュタイン級数の連続する2点の円弧上の零点の間に,重さkのアイゼンシュタイン級数の円弧上の零点が必ず一つ存在しているというものだ.3.実既約鏡映群W(E_8),W(H_4)の軌道から得られる球面デザインについて,ここで得られるデザインが剛的でないことを証明した論文がEurop. J. Comb.に掲載が決定した.4.ユークリッド空間における有限集合Xで,Xの各元xに対して,A(x)をxとは異なる元とxとの内積の集合と定義する.すべての元xに対して,A(x)の元の個数がs以下となるとき,Xを局所s-内積集合と呼ぶ.局所内積集合の元の個数の上界はDeza-Franklによって証明されていたが,これをより簡明な方法で証明することに成功した.この証明を考察することで,局所s-内積集合の一般化として内部s-内積集合を定義した.ここで,局所s-内積集合と内s-内積集合の上界は等しくなる.上界を達成する例が,局所内積集合は自明なものを除いて一つしか知られていないが,内部内積集合では,堅いユークリッドデザインから,いくつか発見または構成することができる.このことから,この上界については内部内積集合の定義が本質的であると言える.ユークリッドデザインの元の下界が内部内積集合の上界と等しく,内部内積集合とユークリッドデザイン(または,その他の求積公式)との関係性が非常に興味深い.球面S^d上の有限個の点の集合で、異なる2点間の距離がs種類であるものをs-距離集合と呼ぶ。

球面上の有限個の点の集合を扱うとき、この二つの概念が非常に重要である。s-距離集合の一般化である局所s-距離集合には、ある種の特別な元の個数の上界が示される。その上界を達成する局所距離集合を堅い局所距離集合と呼ぶ。また、球面t-デザインの一般化である重み付き球面t-デザインにもある種の特別な元の個数の下界が知られている。この下界を満たす重み付き球面t-デザインを堅い重み付き球面デザインと呼ぶ。このとき、堅い局所距離集合と堅い重み付き球面デザインに1:1の対応があることを示した。このことから、堅い局所s-距離集合はs-距離集合になっていることが分かる。この結果は、堅い距離集合と堅い球面デザインの対応の拡張になっており、局所距離集合の意義を強調するものとなっている。sを固定したときに、どれ程多くの点を球面上に配置できるかがs-距離集合の問題である。このとき、元の個数に対する上界が非常に重要である。距離の値を固定したときに、知られている上界を改善する新たな上界を示した。この上界から、ある種の距離集合の非存在を導くことが出来る。Musinの論文では、この上界を効果的に用いて、次元dが小さいところで2-距離集合の元の個数の最大値を決定している。
現代国際法における責任追及指向性ーその動態と理論

本研究は、国際刑事裁判の発展が国家間を規律する国際法規範の変化を誘発している現象を「責任追及指向性の増大」と概念設定し、これを現代国際法の変容の大きな特徴として析出することを目指している。そこでは、国際法に期待される役割・目的の観点から、「融和・協調指向モデル」と「責任追及指向モデル」という二つの理論モデルを想定し、「平和のための国際法」と「正義のための国際法」、「調整の国際法」と「介入の国際法」という二種類の機能的分析視角を用いている。平成30年度は、国際人権法の履行確保において刑事的処罰が強調される現象を、地域人権裁判所の動向を比較検討しながら析出し、それが持つ課題を明らかにした。人権侵害実行者に対する刑事的処罰の要請は米州人権裁判所の実行において顕著であったが、アフリカ司法人権裁判所が刑事部門を併設したことでこうした動向が大きく飛躍する結果となっている。アフリカ司法人権裁判所の設置に至る国際法的背景を分析し、それが責任追及指向性における地域主義的な展開であることを明らかにした。この研究結果の一部は、論文「国際刑事裁判の発展と直面する課題ー四半世紀の挑戦に対する評価ー」、『国際問題』No. 680(2019年4月)に公表された。さらに、こうした傾向は被害者への賠償に対する積極性にも反映されている。「加害者ー被害者」という関係性の強調が一方で刑事的処罰、他方で被害者賠償という発想を呼び起こしている。こうした処罰と賠償の関係性(「加害者ー被害者」関係への国際法のコミット)について、ICCにおける賠償判決を中心に検討を加え、その性格の変化を析出した。この研究成果は、論文「国際刑事裁判所における被害者賠償の展開ー個別的損失補填から行政目的の集団的賠償へー」、平・梅田・浜田編『人権と平和の国際法ー宮崎繁樹先生追悼論文集』(日本評論社、2019年8月刊行予定)に公表される。平成30年度に検討を計画していた事項については、関連する判例・文献の検討をおおむね完了することができた。ただし、ヨーロッパ人権裁判所の実行に関する分析が不十分のまま残された。これは次年度以降に検討される。国際的な展開としては、8月にウィーンで開催された国際刑事法専門家ウィーン会合に招待され、ヨーロッパの国際刑事法研究者と研究課題に関連する問題について意見交換を行うことができた。これにより、次年度以降の国際的な発信・ネットワーク形成の基礎固めができたと考える。また、こうした研究成果の一部は、年度内に2本の論文として結実している。研究課題に取り組む2年目では、当初の計画どおり、紛争解決の伝統的な手法の一つである審査(inquiry)あるいは事実調査(fact-finding)が、「中立的な事実の究明」から「刑事責任を立証するための証拠収集」へと転換しつつある動向を検討する。安保理の実施する近時の事実調査は、アドホックな刑事裁判所を設置するため、あるいはICCに事態を付託するための準備的調査として機能する傾向にある。さらに、シリアに対する調査委員会(Commission of Inquiry, COI)に代表されるように、安保理の機能不全(これに伴う、ICCへの非付託)を補う形で、人権理事会がCOIを使って人権侵害状況の責任追及を行う事例も見られる。こうした実行は、紛争当事者間の交渉による解決を誘引するために事実を鮮明にするという旧来の事実調査の機能とは一線を画するものであり、機能的転換の意義を探る。そのうえで、こうした現象を、多様な価値の並存を前提として、これらの衝突を回避し、相互の利害を調整する機能を示す「平和のための国際法」と、国際法の存在理由を普遍的な単一価値の実現ととらえ、国際的に統一された基準を定め、これに諸国の行動を統合化する機能を示す「正義のための国際法」という対抗概念をもって理論化することを試みる。