hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮膚感覚過敏の機序解明～脳機能評価を応用した新しい試み～

痒み過敏のメカニズムは体液因子や神経の可塑性等によって部分的に証明されているが、まだ十分な理解が得られておらず、痛み過敏ほど解明されていない。皮膚の真皮線維芽細胞から誘導される神経栄養因子アーテミンが熱過敏を引き起こし、アトピー性皮膚炎などかゆみを生じる皮膚疾患においてかゆみ過敏を生じていることが明らかとなった。本研究では、アーテミン中和抗体や治療薬投与により皮膚感覚野をはじめとした脳への影響を様々な角度から検証する。本研究によってかゆみ過敏のメカニズムの一端を明らかにし、難治性かゆみ疾患への新たなアプローチと治療薬開発に貢献することができると考える。
細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼによる細胞増殖の制御機構

本研究の目的はインスリンレセプターゼを中心に細胞増殖因子レセプターのもつチロシンキナーゼを介した細胞内シグナル伝達機構を明らかにすることである。従来まで、このチロシンキナーゼの基質はいろいろ報告されているがそれらが本当の生理的役割をもつチロシンキナーゼの基質であるのかどうか明らかでない。各種細胞増殖因子レセプターのチロシンキナーゼは一次構造でホモロジーが高いため、その基質も遺伝子ファミリーを形成している可能性が高い。そこでインスリンレセプターチロシンキナーゼの基質cDNAが分離できれば、他のチロシンキナーゼの基質も分離できる可能性がある。そこで我々はまず、このシグナル伝達の欠損細胞株を分離し、これに発現ライブラリーを導入し、complementationによりチロシンキナーゼの基質を直接クローニングしようと試みた。インスリンレセプターとインスリン反応性グルコーストランスポーターのcDNAを介して、両者を大量に発現している細胞から、この両者を結ぶmediatorの欠損株を分離できたと考えられるので、今後このmediatorのcDNAの分離を行ないたい。本研究は従来の方法とは異なり、チロシンキナーゼの基質cDNAを細胞工学的手法により分離しようとするものである。また最近グルコーストランスポーターは質および量とも細胞増殖および細胞ガン化に伴いfos遺伝子産物と同じぐらい早期に変動することが明らかとなってきた。そこで脳型グルコーストランスポーター遺伝子および筋型グルコーストランスポーター遺伝子のプロモーター領域の一次構造を明らかにし、転写開始部位も決定したので、この方面からの研究も今後行ないたい。
緑藻類クラミドモナスにおけるフィトクロム様蛋白質の遺伝子の単離と生化学的解析

遺伝学的、分子生物学的研究に適した単細胞性緑藻類であるChlamydomonasについて、分子生物学的手法によりフィトクロム様蛋白質をコードする遺伝子の探索を行なった。先ず、Fukuzawa等(1990)の方法によりmRNA文画を調製し、他植物種で既に知られているフィトクロム(緑藻類のMougeotiaのそれを含む)のアミノ酸配列間でよく保存されている部分に対応するオリゴDNAを合成しそれをプローブとしてノーザン・ハイブリダイゼーションを行ったがバンドは検出されなかった。つぎに、同様の配列をプライマーとして用い、ChlamydomonasのcDNAおよびゲノムDNAをテンプレートにしてPCR反応を行なった。なお、mRNAの調製法に関しては改良を加えた。また、内部標準として既報のChlamydomonasのCab遺伝子の配列を用いた。結果として、Cab遺伝子に関してもフィトクロム遺伝子に関してもほぼ予想されるサイズのDNA断片が増幅されてきた。しかしこれらの断片をクローン化し塩基配列を部分的に求めたところ、Cab遺伝子に関しては確かに既に報告されている配列が認められたが、フィトクロムに関しては既知のフィトクロム遺伝子とのホモロジーは認められず、フィトクロム遺伝子のホモログと見えた断片は何らかの非特異的反応の産物であることが示唆された。さらに、手持ちの抗フィトクロム単クローン性抗体を用いてChlamydomonasの粗抽出液をウェスタンブロット法により調べたが、交差反応を示す蛋白質は認められなかった。以上をまとめると、現状ではChlamydomonasのフィトクロム様蛋白質の遺伝子を検出することは困難と言わざるをえない。この結果はフィトクロム様蛋白質の存在を否定するものではないが、今後この方向の研究を進めるにはなんらかの新しいアプローチが必要と思われる。
小胞体ストレス応答不全による糖尿病発症機構の解析

膜タンパク質や分泌タンパク質は小胞体で合成され、正しく折りたたまれる。作りそこなったタンパク質が小胞体内に溜まることを小胞体ストレスと呼び、この小胞体ストレスを感知するタンパク質と糖尿病との関連については様々な研究がされているが、いまだに不明な点が多い。哺乳類細胞における小胞体ストレスを感知するタンパク質のひとつ、IRE1αをインスリン産生細胞である膵β細胞特異的に欠失させたマウスは、インスリン依存的な糖尿病を引き起こした。この原因の詳細を、IRE1α欠失β細胞を株化して解析したところ、インスリンタンパク質の成熟過程にIRE1αがかかわっていることがわかった。現在、論文投稿を準備中である。小胞体ストレスセンサーのひとつであるIRE1αの膵β細胞における役割を解析するため、膵β細胞特異的にIRE1αを欠失させたマウス(IRE1αCKO)を作製し、その解析を行ったところ、16週齢くらいから血糖値の上昇が見られた。さらに、ATF6とのダブルノックアウトマウスを作製し、血糖値を調べたところ、シングルノックアウトマウスに比べ、さらに早い4週齢くらいから血糖値の上昇がみられた。また、IRE1αRNaseドメインのfloxマウスと膵β細胞で特異的にガン化を起こすマウスとの掛け合わせにより、IRE1αflox遺伝子を持った膵β細胞の株化に成功した。この細胞にアデノウイルスでCreを発現させることによりIRE1αRNaseドメインを欠失させた細胞を樹立した。この細胞を用いて、インスリン分泌、インスリンタンパク質の合成を調べたところ、RNaseドメインを欠失させない細胞と比べ、明らかにインスリン分泌量が低下し、細胞内のインスリンタンパク質の量も減っていることがわかった。哺乳類細胞における小胞体ストレスセンサーのうちのひとつであるIRE1αの膵β細胞における機能を明らかにするため、膵β細胞特異的にIRE1αを欠失させたマウスを用い、解析を行っている。このマウスは、生後16週目あたりから血糖値の上昇が認められ、これはインスリン抵抗性のせいではなく、インスリン量の不足によるものであることがわかっている。また、糖負荷による解析で、インスリン分泌に低下が見られることもわかった。この詳細を調べるために、マウス個体ではなく細胞を用いて解析することとし、IRE1αRNaseドメインのfloxマウスと膵β細胞特異的にがん化を起こすマウスを掛け合わせたマウス膵臓より、IRE1αRNase floxの遺伝子座を持つ株化β細胞を樹立した。この細胞にアデノウイルスを用いてCreタンパク質を発現させ、IRE1αRNaseドメインを欠失した細胞を得ることができる。この細胞を用いて、インスリン分泌の低下、インスリンタンパク量の低下を確認した。この成熟型インスリンタンパク質の低下が何に起因するのかを調べるために、小胞体ストレスに関わる遺伝子群、タンパク質フォールディングに関わるシャペロン遺伝子群などの遺伝子発現解析を行ったところ、シャペロンの一部が減少していることがわかった。IRE1αRNaseドメインのfloxマウスと膵β細胞特異的にがん化を起こすマウスを掛け合わせ、得られたマウスの膵臓より、IRE1αRNase floxの遺伝子座を持つ株化β細胞を樹立した。この細胞にアデノウイルスを用いてCreタンパク質を発現させて、loxP配列で囲まれたIRE1αRNaseドメインを欠失した細胞を得た。この樹立した細胞からRNAを抽出し、小胞体ストレス関連遺伝子とタンパク質のフォールディングに関わる遺伝子群の発現を調べた。また、放射性同位元素を取り込ませて調べたところ、翻訳に大きな差はないが、成熟過程に変化が認められた。膵b細胞特異的にIRE1αRNaseドメインを欠失させたマウスの各週齢(8,12,16週)の組織学的解析を行い、血糖値上昇は膵島の数や面積の減少によるものではないことがわかった。本学動物実験施設が空調機更新工事のため、ほぼ10ヶ月使用することができなかったため、IRE1αとATF6のダブルノックアウトの解析に関しては行うことができなかった。糖尿病は膵β細胞の障害によりインスリン分泌の低下、もしくはインスリン抵抗性によって発症する。一方、小胞体内に異常タンパク質が蓄積し、恒常性が損なわれる「小胞体ストレス」と呼ばれる現象がある。これらふたつが密接に関わっているといわれているが詳細はいまだ明らかでない点が多い。本研究において、哺乳類細胞における小胞体ストレスセンサーのうちのひとつであるIRE1αの膵β細胞における機能を明らかにするため、膵α細胞特異的にIRE1αを欠失させたマウスを用いて解析を行った。このマウスは、インスリン依存的な糖尿病を引き起こす。IRE1αとインスリン分泌の関連を詳細に調べるため、Creタンパク質を発現させることによってIRE1αRNaseドメインを欠失し、下流のXBP1へのシグナルを遮断する細胞を樹立した。定量的PCRにより、インスリン1,2遺伝子、インスリンにかかわる転写因子、また小胞体関連遺伝子の転写にはIRE1α-XBP1経路は関係していないようであった。また、放射性同位元素を取り込ませてプロインスリン、インスリンの翻訳合成をみたところ、IRE1α-XBP1経路は、翻訳合成にも関係していないことがわかった。一方、qPCR、タンパク質発現の解析より、一部のフォールディングに関するPDIファミリーの5遺伝子の発現が減少していることがわかった。これらのことから、IRE1αーXBP1経路は、膵β細胞において、インスリンのフォールディング機能にかかわっていることが示唆された。

作りそこなったタンパク質が小胞体内に溜まることを小胞体ストレスと呼び、この小胞体ストレスを感知するタンパク質と糖尿病との関連については様々な研究がされているが、いまだに不明な点が多い。哺乳類細胞における小胞体ストレスを感知するタンパク質のひとつ、IRE1αをインスリン産生細胞である膵β細胞特異的に欠失させたマウスは、インスリン依存的な糖尿病を引き起こした。この原因の詳細を、IRE1α欠失β細胞を株化して解析したところ、インスリンタンパク質の成熟過程にIRE1αがかかわっていることがわかった。現在、論文投稿を準備中である。今年度の計画にあった、膵β細胞得意的にIRE1αのRNaseドメインを欠失したマウスとATF6 KOマウスを掛け合わせることによるATF6を全身で、IRE1αを膵β細胞で特異的に欠失したダブルノックアウトマウス(IRE1α-ATF6 DKOマウス)の作製は終了した。このマウスの血糖値を調べたところ生後4週以降、血糖値が高くなっていることがわかった。これは、IRE1α単独でノックアウトしたマウスよりも早い時期であった。また、IRE1αのRNaseドメインをloxPで囲んだfloxマウスと膵β細胞特異的にSV40Large T antigenを発現しガン化させるようにしたマウスとを掛け合わせることにより、IRE1αflox遺伝子を持った膵β細胞株を作製した。これらの樹立した細胞において、アデノウイルスでCreを発現させることによってIRE1αのRNaseドメインを欠失させた。このIRE1αKO細胞を用いて小胞体関連遺伝子やタンパクのfoldingに関わる遺伝子の転写やタンパク合成がどのように変化しているのか解析中である。マウスの表現型解析については、グルコース負荷による耐糖能試験はほぼ終了しているが、インスリン負荷試験、および組織学的解析が解析途中である。樹立したIRE1αRNaseドメイン欠失細胞において、成熟に差があることがわかってきたので、どの因子がインスリンタンパク質のフォールディングに関わっているのかを、遺伝子発現、タンパク質の発現などで確認する。因子がある程度特定できたら、その因子を細胞に導入しレスキューさせることができるのかどうか確認する。また、細胞で起こっている現象が、マウスでも起こっている現象であるのかどうか、マウス膵島を用いて遺伝子発現、タンパク質発現を確認する予定である。IRE1αとATF6のダブルノックアウトマウスに関しては、IRE1αRNase欠損細胞と同様に、細胞株を樹立し急激な血糖値上昇が起こる原因がどこにあるのか、詳細を調べる。まずは、IRE1αシングルノックアウト細胞で確認された因子がどのように変化しているのかを調べ、さらに別の因子にも差があるのかどうかを確認する。形態学的な差を調べるために、電子顕微鏡での観察を行う。動物細胞工学研究室は2017年3月31日に閉室となりましたが、研究内容や成果につきましては当面の期間、アーカイブとして公開します。
コロンビア大学図書館所蔵ア-サ-・シモンズ夫妻の自筆往復書簡の解読と活字化

1890年代の英国世紀末文学を代表する詩人・評論家として、近年になって再び注目を集めているア-サ-・シモンズ(1865ー1945)は、日本の文学者の間に愛読者が輩出したことでも知られている。これまでのシモンズ研究といえば、象徴派詩法の解明や文学史的評価が盛んであった。それに比較してシモンズに関する伝記研究ははるかに遅れている。本研究の目的は、シモンズ研究におけるこのような伝記研究の間隙をうめるために、もっとも重要な基礎資料といえるシモンズ夫妻の往復書簡をまず現地の所蔵図書館で調査し、次にマイクロ・フィルムとワ-プロの使用により解読テキストを作成し、最終的に往復書簡全体を整理することにある。1979年から毎年のように海外でシモンズの伝記調査を繰り返す間に、ほぼ1000通のシモンズ自筆書簡を整理できていた。最後まで手づかずでいたコロンビア大学図書館所蔵のシモンズ夫妻往復自筆書簡が、今回の科研費の補助により調査できるようになり、大きな励みになった。研究計画に沿って、初年度八月末にニュ-ヨ-クに滞在し、また次年度七月末の渡英により、この膨大な書簡コレクションをはじめて本格的に調査し整理する作業に取り組んだ。当初の予想では約1000通のコレクションであるはずが、今回の徹底調査によって作製した往復書簡リストでは、総数で2041通に達する膨大な資料であることが判明した。『報告書』の冊子では、まず全ての往復書簡の内容が概括的に把握できるように作製したリスト(pp.75ー141)を公表したので、内外のシモンズ伝記研究の基礎資料になることと思う。さらに、『報告書』において、解読と活字化の具体例としてロ-ダ宛シモンズ書簡の一部(pp.33ー73)を掲載した。総数で2041通の書簡を解読・活字化して作成した手元の英文タイプ原稿は、400字詰め原稿用紙に換算すれる10,000枚を凌駕している。今回のその全てを『報告書』の形で発表することは、印刷費用の上で困難であり、いわば氷山の一角という部分的な発表になったことが残念である。しかし、今回作成できた膨大な資料を最大限に活用して、念願のシモンズ略伝とシモンズ書簡集を近々執筆刊行したい予定である。英国世紀末文学者ア-サ-・シモンズの伝記研究を進める際に不可欠の基礎資料となる自筆書簡は、英国と米国を中心に各地の図書館に点在しているが、すでに数回の現地調査を行い、ほぼ1000通の解読を終えていた。最後まで手づかずでいたコロンビア大学図書館所蔵のシモンズ夫妻往復自筆書簡が、今回の科研費の補助によって調査可能になったことから、計画に沿って八月末にはロンドンからニュ-ヨ-クへ渡り、膨大な当該書簡コレクションをはじめて直に調査できた。帰国後に送付を受けたマイクロフィルムによる判読作業は、ワ-プロや大型機種の使用により、かっての電動や電子タイプライタ-しか普及していない時期に比べて予想以上の能率の良さで進行中である。

オズボ-ン宛書簡122通(プリンストン大学所蔵)、キャンプベル宛書簡231通(大英国書館)、クイント/シモンズ往復書簡168通(ニュ-ヨ-ク市立書簡)など、10年余りの間に調査を終えた大多数のシモンズ関係自筆書簡は、男性の文学仲間といえる人々を相手にしたものである。例えばシモンズに宛てたジョン・クイント書簡(1921年6月12日)で、「昔からの友達でもこうした頼みごとは自己防衛のために断らざると得ません」と悲鳴を挙げさせているように、シモンズの人間関係の特徴として、一旦親しくなったほとんど全ての友人が原稿を読んで欲してなどの頼みごとを矢継ぎばやに受けている。友人関係を原稿執筆生活の歯車にしてしまうシモンズの一方的な傾向に、文学的な情熱のみならず、1908年の狂気に通ずるものを感じてきたが、今回の研究対象である恋人・夫人宛書簡にまで、同じ傾向が認められることに驚いている。残された研究期間に、関連する他の書簡群を読み合わせながら、作品創造と狂気のプロセスを辿る確実な資料的裏付けにしたいと思う。ア-サ-・シモンズ(Arthur Symons:1865ー1945)は、1890年代の英国世紀末文学を代表する詩人・評論家であるが、明治時代このかた日本の文学者の間においても、印象批評の旗手として小林秀雄が「様々なる意匠」のなかで紹介するなど、愛読者が輩出したことで知られている。内外のシモンズの作品研究や文学史的評価は文学史的評価は戦後に盛んであったけれども、宇野浩二が嘆息したように、シモンズの伝記についてはほとんど知られていなかった。伝記研究を進めるうえで不可欠な基礎資料となる自筆私的文書類(autograph personal papers)が、欧米諸国の図書館に散在しているばかりでなく、数量的にも相当なものであるので、このような地味で基礎的な調査研究が余り顧みられなかったことが、伝記研究の遅れを招いた一因であろうと思われる。日本からの研究者が未刊書簡の海外所在先を探し廻り、現地で解読や転写に努める。これは新しい文学研究の方法であろうが、実際には容易でない。1979年から毎年のように海外でシモンズの伝記調査を繰る返す間に、ほぼ1000通の自筆書簡を整理できていた。最後まで手づかずいたコロンビア大学図書館所蔵のシモンズ夫妻往復自筆書簡が、今回の科研費の補助により調査できるようになり、大きな励みになった。研究計画に沿って、初年度八月末にニュ-ヨ-クに滞在し、また次年度七月末の渡英により、この膨大な書簡コレクションをはじめて本格的に調査し整理する作業に取り組んだ。当初の予想では約1000通のコレクションであるはずが、今回の徹底調査によって作製した往復書簡リストでは、総数で2041通に達する膨大な資料であることが判明した。別途に印刷して発表した『報告書』の冊子に、全ての往復書簡の内容が概括的に把握できるように作製したリストを公表するので、内外のシモンズ伝記研究の基礎資料になることと思う。『報告書』には解読と活字化の具体例としてロ-ダ宛シモンズ書簡の一部も掲載している。四百字詰め原稿用紙に換算すれば一万枚を凌駕する書簡解読のタイプ原稿が完了したので、私としては最大限に活用して念願のシモンズ伝を近々執筆刊行したい予定である。
オートファゴソーム膜の伸張メカニズムの解明

オートファジーは細胞内成分の主要な分解機構の一つであり、オートファジーが誘導されると「オートファゴソーム」と呼ばれる二重膜構造体が形成される。オートファゴソーム形成には多数のAtgタンパク質が必須である。その分子メカニズムを理解する上で、オートファゴソーム膜の伸張機構は最大の謎であり、その解明は不可欠である。本年度においては、膜の前駆体の電子顕微鏡解析による形態解析及び、共免疫沈降法による生化学的な解析から、「オートファゴソーム膜の前駆体」は、Atg9小胞よりもサイズが大きいことを明らかとした。Atg9小胞の直径は30-60nmだが、膜の前駆体の直径は60nmを超えた小胞であること、さらにAtg9小胞には存在しないが、膜の前駆体には存在するSNAREタンパク質を同定した。これらのことは、SNAREを介したAtg9小胞同士の融合、またはAtg9小胞と他の小胞との融合により、膜の前駆体が形成されることを強く示唆している。また、蛍光顕微鏡解析や免疫沈降実験により、伸張途中のオートファゴソームの膜には、いくつかのSNAREタンパク質や小胞融合関連因子が供給されることが明らかとなった。これらの因子は細胞内のある小胞輸送経路に特異的に機能することが報告されており、オートファゴソーム膜の伸張において、これらの因子が機能していることが示唆された。これまでの解析で同定されたオートファゴソーム膜の前駆体に、この小胞が連続的に融合することで、オートファゴソームが形成されるというモデルが考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度においては出芽酵母を用いて、「オートファゴソーム膜の前駆体」の電子顕微鏡解析による形態解析や、小胞体上の膜繋留装置及び膜融合を駆動するSNAREタンパク質のオートファゴソーム形成における役割の解析をおこなった。その結果、電子顕微鏡解析により膜の前駆体は、オートファゴソーム形成に必須の膜タンパク質であるAtg9を含む小胞が複数個会合し形成された構造体であることが示唆された。さらにその膜構造体には膜伸張に重要なAtg8とホスファチジルエタノールアミンとの結合体が含まれることが示唆された。この電子顕微鏡解析により初めて膜の前駆体の形態の観察に成功した。この形態観察はオートファゴソーム膜の伸張メカニズムを解明する際の重要な知見になる。また、小胞体上の膜繋留装置及びSNAREタンパク質をノックダウンした細胞では、オートファゴソーム形成に欠損が生じること、さらにその欠損は前駆体膜の形成、もしくはその後の膜伸張の段階で生じることが示唆された。オートファゴソーム膜の伸張メカニズムを解明する上で、Atgタンパク質のみならずこれら小胞体上の膜繋留装置及びSNAREタンパク質の存在も重要であることが明らかとなった。これまで、出芽酵母を用いた「オートファゴソーム膜の前駆体」の電子顕微鏡解析による形態解析から、膜の前駆体は、オートファゴソーム形成に必須の膜タンパク質であるAtg9を含む小胞に、膜伸張に重要なAtg8とホスファチジルエタノールアミンとの結合体が含まれることが示唆されていた。本年度においては、電子顕微鏡解析による形態解析及び、共免疫沈降法による生化学的な解析から、膜の前駆体には、Atg1タンパク質キナーゼ複合体のコンポーネントであるAtg1、Atg17や、オートファジー特異的なPI3キナーゼ複合体のコンポーネントであるAtg14や、その産物であるPI3Pが含まれていることを示した。さらにこの膜の前駆体にはいくつかのSNAREタンパク質が含まれていることが示された。また、膜の前駆体に含まれているSNAREタンパク質の一つは、これまでの解析から、ノックダウンによって、オートファゴソーム形成に欠損が生じること、さらにその欠損は前駆体膜の形成、もしくはその後の膜伸張の段階で生じることが示唆されていた。本年度においては、蛍光顕微鏡解析により、このSNAREタンパク質がオートファジー誘導条件下において、オートファゴソーム形成の場及び、伸張途中の膜に一様に局在することが示された。まとめると、膜の前駆体の構成タンパク質や、前駆体膜の形成もしくはその後の膜伸張の段階に関与するSNAREタンパク質を明らかにした。

本年度においては、膜の前駆体の電子顕微鏡解析による形態解析及び、共免疫沈降法による生化学的な解析から、「オートファゴソーム膜の前駆体」は、Atg9小胞よりもサイズが大きいことを明らかとした。Atg9小胞の直径は30-60nmだが、膜の前駆体の直径は60nmを超えた小胞であること、さらにAtg9小胞には存在しないが、膜の前駆体には存在するSNAREタンパク質を同定した。これらのことは、SNAREを介したAtg9小胞同士の融合、またはAtg9小胞と他の小胞との融合により、膜の前駆体が形成されることを強く示唆している。また、蛍光顕微鏡解析や免疫沈降実験により、伸張途中のオートファゴソームの膜には、いくつかのSNAREタンパク質や小胞融合関連因子が供給されることが明らかとなった。これらの因子は細胞内のある小胞輸送経路に特異的に機能することが報告されており、オートファゴソーム膜の伸張において、これらの因子が機能していることが示唆された。これまでの解析で同定されたオートファゴソーム膜の前駆体に、この小胞が連続的に融合することで、オートファゴソームが形成されるというモデルが考えられる。本研究員は昨年度において、「オートファゴソーム膜の前駆体」の電子顕微鏡解析による形態解析や、小胞体上の膜繋留装置及び膜融合を駆動するSNAREタンパク質のオートファゴソーム形成における役割の解析を進めていた。これまで、電子顕微鏡解析により膜の前駆体にはAtg9を含む小胞、さらにAtg8とホスファチジルエタノールアミンとの結合体が含まれていることを示していた。本年度において、さらにこの膜の前駆体には、オートファゴソーム形成に必須のAtg1、Atg17、Atg14(PI3K複合体のコンポーネント)が含まれていることを示した。また、オートファゴソーム形成においてPI3K複合体が必須であるが、PI3P結合タンパク質を用いた解析から、膜の前駆体上にPI3Pが存在することを示した。さらに、共免疫沈降解析や電子顕微鏡解析から、この膜の前駆体にはいくつかのSNAREタンパク質が含まれていることが示された。これらの結果はオートファゴソーム膜の伸張メカニズムを解明する上で非常に重要な知見であり、期待通り研究が進展したと評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は平成26年度の研究成果を踏まえ、膜の前駆体についてさらなる構成因子の探索や、細胞内におけるオルガネラとの関係などの解析を進めるとともに、in vitroでの膜の前駆体を用いた再構成系の構築に取り組む予定だ。また膜の前駆体に存在するSNAREタンパク質のオートファゴソーム形成における機能に関して、Atgタンパク質との相互作用の探索などをおこない、詳細な解析を進める予定だ。電子顕微鏡解析により、「オートファゴソーム膜の前駆体」の形態や、前駆体膜の形成もしくはその後の膜伸張の段階に関与する膜繋留装置とSNAREタンパク質を明らかにした。形態に関しては真に膜の前駆体であるか否かの議論の余地が残されているものの、研究はおおむね順調に進展している。平成25年度の研究成果を踏まえ、膜の前駆体についてさらに詳細に解析を進めるとともに、オートファゴソーム形成への関与が明らかとなった、小胞体上の膜繋留装置及びSNAREタンパク質が直接的にAtgタンパク質と共同して機能しているか
進行食道癌における放射線化学療法効果増強システムの開発

NFκB siRNAによる食道癌の化学療法効果増強作用を検討した。食道癌109例の免疫染色では、NFκB発現は60%の症例の癌細胞核に認め、癌の進行と相関した。進行度II,III68例の検討では、NFκB陽性例の予後は不良であった。培養癌細胞ではNFκBは細胞質に発現したが、刺激因子TNF-αを添加後にNFκBは細胞質から核へ移行し、5-Fu治療に抵抗した。これにNFκBsiRNAを作用させると癌細胞の増殖は抑制され、NFκBsiRNAの臨床応用への可能性を示唆した。【研究の目的】食道癌は治療に難渋し、予後も極めて悪い。根治手術後も多くが再発し、化学療法をせざるを得なくなる。また、気管、肺、大動脈へ浸潤した進行食道癌は、放射線化学療法(Chemo-raditherapy CRT)が第一選択となるが、その効果は満足するレベルではない。さらに、CRTは食道炎や肺臓炎などを誘発し、死に至る有害な副作用がある。進行、再発食道癌において、CRTの感度増強と副作用軽減は急務である。NFκB siRNAを食道癌局所に注入すると、癌細胞はNFκBを産生できなくなり、アポトーシスに陥り、放射線や化学療法の感受性が高まると期待される。NFκB siRNAとCRTの併用により、安全で腫瘍の縮小効果を最大限に引き出せるシステムの開発が研究の目的である。【研究の成果】食道癌症例におけるCRTの現状を調査した。対象は、平成6年1月平成18年4月までに当科で放射線化学療法を施行した食道癌患者53名で、Stage O,I(n=6),II(n=6),III(n=16),IVa(n=18),IVb(n=7)であった。放射線は4060Gy照射され、化学療法は5FU+Nedaplatinか5-FU+Docetaxelを使用した。53例のCRTの評価は、CR:19,PR;17,NC:9,PD=8で、responserateは67.9%であった。Response rateは、Stage I:100%,II:83.3%,III=81.3%,IVa=61.1%,IVb:14.3%と、進行するにつれてCRTの効果は減少した。5年生存率は、CR:100%,PR:40%であったが、NC,PD症例は全例1年半で死亡した。CRTに関連した死亡例は7例(13.2%)に認めた(放射線性肺臓炎:1,食道気管支瘻:2、食道大動脈瘻;2、胸水、心嚢水貯留:1、縦隔膿瘍:1)。次年度は、食道癌においてNFκBタンパク発現の程度を免疫組織学的に検討し、ヌードマウスへの食道癌細胞の移植と、NFκB siRNAと制癌剤の効果を検討する。研究の目的:食道癌は治療に難渋し、予後も極めて悪い。気管、肺、大動脈へ浸潤した進行食道癌は、手術適応でなく、放射線化学療法(Chemo-radiotherapy ; CRT)が第一選択となる。進行、再発食道癌において、CRTの感度増強と副作用軽減は食道癌治療において急務である。本年度の実施計画と結果:1.免疫染色:過去に切除された食道癌標本のブロックから切片を切り出し、食道癌組織におけるNFκBタンパクの発現を免疫染色によって確認する。結果;1982年から1997年まで、教室で手術が施行された食道扁平上皮癌109例の癌組織標本でNFκBの免疫組織染色を行った。NFκB陽性は65例(59.6%)に認められた。NFκB蛋白発現と、癌の深達、リンパ節転移が相関した。進行度II, III症例68例の予後をNFκB陽性、陰性で比較した。5年生存率は、NFκB陽性例(34例)で18%、陰性例(34例)で32%。有意の差ではないがNFκB陽性例の予後は不良で(P=0.058)、癌細胞におけるNFκB発現が食道癌の悪性度を推し量る指標となりうる可能性が示唆された。2.培養細胞を用いた研究:食道癌細胞におけるNFκB蛋白の発現とNFκB siRNAの作用を培養細胞株において検討した。結果;TE-4、TE-8食道癌細胞を培養し、NFκB蛋白が癌細胞質に発現することを確認した。この細胞にNFκB siRNAを作用させると、NFκB蛋白発現は著名に抑制され、癌細胞はアポトーシスに陥り、増殖が抑制された。

さらにこの細胞に、制癌剤である5-FUを単独で作用させても癌細胞の増殖は抑制されたが、5-FUにNFκB siRNAを加えて作用させると、癌細胞の増殖は相加的に抑制されており、NFκB siRNAの食道癌抑制効果が示唆された。研究の目的:進行食道癌における化学療法の感度増強と副作用軽減の目的で、NFκB siRNAと制癌剤の併用により、安全で腫瘍の縮小効果を最大限に引き出せるシステムの開発を行った。本年度の実施計画と結果培養細胞を用いた研究をさらに発展させた。前年度の研究において、食道癌細胞におけるNFκB蛋白の発現とNFκB siRNAの作用を培養細胞株において検討し、TE-4、TE-8食道癌細胞株において、NFκB蛋白が癌細胞質に発現すること、この細胞にNFκB siRNAを作用させると、NFκB蛋白発現は著名に抑制され、癌細胞はアポトーシスに陥り、増殖が抑制されることを確認した。しかし、実際の臨床の場では、食道上皮は様々な外的刺激にさらされている。食道癌組織のNFκBに対する免疫組織染色では、NFκB発現は細胞核に認められるが、培養細胞ではNFκB発現は全て細胞質であった。実際の臨床と培養細胞では環境が全くことなることが判明し、今回は、培養液にTNF-αを加え、培養細胞に外的刺激が加わる条件を付加して、NFκB siRNAを作用させた。TNF-αを培養液に添加すると、培養癌細胞の細胞質に発現していたNFκBが癌細胞核へ移行した。TNF-αを作用させ、NFκBが癌細胞核へ移行した癌細胞は、5-FUの治療に抵抗性を示し、癌細胞の増殖抑制は限定された状態であったが、これにNFκB siRNAを作用させると、癌細胞は再びアポトーシスに陥り、増殖は抑制された。以上の結果より、実臨床では食道癌細胞は様々な外的刺激を受け、その常態下では、NFκBは癌細胞核に移行しており、通常の制癌剤や放射線治療に抵抗性を示すと考えられる。TNF-αの存在下でも、NFκB siRNAはNFκB蛋白の発現を抑制し、癌細胞増殖を抑制した。NFκB siRNAの臨床応用への道筋を示すことができたと考えられる。
GTR法を応用した歯の移植-バリアー膜下で骨欠損部に歯根膜移植した後の組織再生-

1、材料及び方法(1)、実験動物及び被験部位:成ネコ20匹及びカニクイザル1匹の下顎臼歯。(2)、方法:被験歯の遠心根頬側歯槽骨部に縦5mm、幅3mmの裂開状骨欠損を作成。被験歯の遠心根を分割抜去し、左右被験歯間で交換移植。実験側は、骨欠損部の骨縁上に露出した移植歯の歯根膜がバリアー膜の下になり、骨欠損部を2mm越えて覆うようにバリアー膜を固着。反対側は対照としてバリアー膜はつけない。両側とも歯肉粘膜弁を戻し縫合し、移植歯は隣接歯と固定。2、結果(1)、ネコにおける結果:初期の創傷治癒が悪く、歯肉弁が壊死するものが多く見られ、その傾向は実験側で顕著であった。それらの中には膜の脱落、移植歯の脱落が見られたものもあった。歯肉弁が生着したものにおいては、術後3か月の組織標本において、上皮の根尖側への侵入はほとんど見られず、骨の再生はすくなかったものの、実験側で大きい傾向が見られた。(2)、カニクイザルにおける結果:初期の創傷治癒は比較的良好であり、実験側においては歯肉退縮が多少見られたが、術後3か月の組織標本において上皮の根尖側への侵入はほとんど見られなかった。骨の再生はわずかげあり、実験側と対照側で差は見られなかった。
Sawah 技術のODA破壊的イノベーションによる内発的なアフリカの緑の革命実現

サブサハラアフリカ(SSA)の緑の革命は育種・肥料・農薬・灌漑等の近代科学技術だけでは実現せず、科学技術を受け入れる質をもつ農地基盤のインフラ整備が前提となる。17-18世紀の英国の農業革命は14-18世紀のエンクロージャーによる畑地整備が、20世紀のアジアの緑の革命は、それ以前の数百年以上に及ぶ農民による水田整備の歴史が前提であった。同様の農地整備が必要である。人口爆発に対処するには、2050年ころまでにSSAにおける数千万ha規模の灌漑水田開発を実現するイノベーションが必要である。農民の自力灌漑水田開発と稲作技術であるアフリカ水田農法Sawah Technologyは、これを可能にする。これまでの研究サイトのフォローアップを実施し、Sawah技術の社会実装を実現するため、ガーナ、ナイジェリア両国の連携機関と構想をまとめ、担当省に提出した。ナイジェリアでは国立農業機械化センター(NCAM)及び農業農村開発省のATAにESTRASERIF(Sawah技術の普及プログラム)を提案し、承認された。2014年度にKogi, Nassarawa, Niger州で普及活動が開始される予定。Kebbi州と世銀支援のFadama IIIプログラムで、農民の自力による小型ポンプと耕耘機を使用するSawah技術の普及が進み2010年度の40ha規模から2013年度には200ha以上に拡大したと推定される。2013年9月にKebbi州知事が表明した1000台の耕耘機の供給政策が実施されれば、数年以内に数1000ha規模に達する可能性がある。ただし、現時点ではSawah技術の訓練を受けた人材は十分ではなく、質の悪い灌漑水田開発になると危惧される。ガーナでは1994年から開始した我々の水田Sawah技術研究をベースにした、JICAの天水稲作プロジェクト、JIRCASの低コスト灌漑水田整備手法研究が並行実施されているが、3者の連携がスムーズでないため社会実装は停滞状態にある。ただ2013年末に刊行されたAfricaRice年報によればSawah技術は、今後のアフリカ稲作振興のKey技術であると評価され、IFPRIも同様の評価を発表した。これを受けて我々は、土壌研究所(SRI)及び作物研究所(CRI)及びその上部機関の産業科学技術評議会(CSIR)と5年間、18億円の予算で、全国10州で5000haの灌漑水田開発と3300人の水田Sawah普及員と篤農の訓練を並行実施することを骨子とするSawah技術の実装提案書を作成し、IFAD、世銀、円借款等の資金による実現を目指すことで合意した。ナイジェリア北西部Kebbi州のSawah技術の普及状況を6-7月に調査した。先行の特別推進科研(2010-2011年度)により「大規模氾濫原で2台の耕耘機でSawah技術のOnTheJob訓練実施」を受けて、州内のArugungu等の4地域で、農民グループが18haの自力水田開発を行い、合計12.8トン(平均籾収量7.1t/ha)を実現した。州知事Dakingariは、2013年9月、首都Abujaの経済サミットで、この成果をRice Revolutionと呼んだ。農民は2014年5月末までに、22台の耕耘機を自費購入し、年間水田稲作面積(雨季と乾季合計)を326haに拡大し、2104トン(6.5t/ha)の籾生産を実現した。これを受けて州政府は1000台の耕耘機を購入し、2015年3月末の大統領選挙後から、1万ha規模の水田開発と整備プロジェクトを開始した。内陸小低地をターゲットとしてきたSawah技術は大規模氾濫原でも展開できるようになり、谷地田農法からアフリカ水田農法に進化した。2015年1月に農業省のSawah技術普及予算が国立農業機械化センター(NCAM)に初めて措置され、NigerとKogi両州で開始された。アフリカ稲作センターによるSawah技術の社会実装はトーゴとベナンに加えリベリアにも拡大する予定であったが、エボラ病で中断した。一方、ガーナではSawah技術の社会実装は停滞している。この要因は関連する日本側研究者と普及機関(科研チーム、JIRCAS、JICA)の連携の不調、ガーナ側研究機関(CSIR傘下のSRIやCRI)と普及とODAの実施機関(食料農業省)の連携の不調(実際には競合の発生)によると考えられる。アフリカ特有の湿地のうち、当初は内陸小低地をターゲットとして研究開発されたSawah technologyは「谷地田農法」としてガーナ、ナイジェリアに加え、国際機関のアフリカ稲センターAfricaRiceによりトーゴ、ベナン、タンザニア等で普及が進行している。一方、ナイジェリアKebbi州の「日本の弥生期の小区画水田に類似の準水田」をSawah Technologyにより、農民の自力で「標準型の水田に整備し進化」させることに成功し、収量が2-3t/haから6-7t/haに倍増した。これにより大規模氾濫原や内陸デルタの非氾濫期に10m以浅の地下水を管井戸の簡易ポンプと組み合わせて利用する「アフリカ水田農法」に進化した。

今年度はKebbi州の1000台の耕耘機による1万ha規模の水田進化と整備のための訓練をKebbi州のArugunguにて実施するとともに、Niger州の1000ha規模のEdozhigi灌漑準水田を進化させ整備するための拠点となる8haのモデル水田をアフリカ水田農法により周辺の農民の訓練も兼ねながら整備した。又、チャドのスーダン国境と中央アフリカ国境のTissiとHaraze地域において1000名規模の移住難民の定住化に資するために、国際移住機関(IOM)と連携して、アフリカ水田農法による灌漑水田開発と水田稲作の訓練とデモンストレーションを行った。これによりマリの内陸デルタとチャド湖からスッド湿地にかけての内陸サバンナ地域は1000万ha以上の灌漑水田稲作がSawah Technologyにより実施可能なことが明らかになりつつある。サブサハラアフリカのNo.1からエジプトも含むアフリカNo.1の米生産国となったナイジェリアのNo.1の稲生産州となったKebbi州の増産にSawah Technologyが寄与した。又、AfricaRiceも内陸小低地の稲作振興にSawah Technologyの推進と改良を進めている。以上の本科研の目的の達成に加えて、当初予想していなかった、マリの内陸デルタとチャド湖からスッド湿地にかけての内陸サバンナ地域は1000万ha以上の灌漑水田稲作ポテンシャルがあり、アフリカ水田農法により現地農民の自力による持続可能な開発が実施可能なことが明らかになりつつある。サハラ砂漠の南縁にあり多数の難民の発生等の社会不安と農業危機が集中して現れているこの地域の安定化や平和構築にSawah Technologyが大きな役割を果たせる新たな展望を開いた。アフリカ水田農法Sawah Technologyの社会実装を、ナイジェリアは国立農業機械化センター(NCAM)、ガーナは環境科技省の土壌研、チャドは国際移住機関と連携して、内陸デルタ、氾濫原、内陸小低地で行った。ナイジェリアではケッビ州の成功を全国化するための政策提言を農業農村開発省に行った。一方、ガーナではアフリカ開銀と食糧農業省が、過去10年、土壌研の自前技術でもあるアフリカ水田農法を拒否し、これまでの典型的なODA方式で内陸小低地の小規模灌漑水田開発(IVRDP)を実施したが、小低地を広範に破壊している現状を修正すべく、食糧農業省に政策提言を行った。チャドでは難民定住化のためにアフリカ水田農法を実装するためNCAMのスタッフが数百人の難民を訓練し国際ワークショップを行った。Sawah Technologyはアフリカ稲作センターがベニン、トーゴ、リベリア、シエラレオーネで普及活動を拡大した。雨期の氾濫原や内陸デルタの洪水を、農民レベルである程度水制御を可能にするため、小型耕耘機の1プラウと2レベラー、3土壌の液状化利用と4耕耘機サポートの人力を組み合わせた、畦畔造成と排水路切削の強化法を検討した。チャド湖では干拓水田用の導水路の切削の実証を行った。ブルドーザーやエクスカベーター等の重機の代用を目指した。強化畦畔や強化排水路(導水路)を人力の10分の1の費用、工期は半分以下で造成できた。サブサハラアフリカ(SSA)の緑の革命は育種・肥料・農薬・灌漑等の近代科学技術だけでは実現せず、科学技術を受け入れる質をもつ農地基盤のインフラ整備が前提となる。17-18世紀の英国の農業革命は14-18世紀のエンクロージャーによる畑地整備が、20世紀のアジアの緑の革命は、それ以前の数百年以上に及ぶ農民による水田整備の歴史が前提であった。同様の農地整備が必要である。人口爆発に対処するには、2050年ころまでにSSAにおける数千万ha規模の灌漑水田開発を実現するイノベーションが必要である。
Erファイバーコムを用いた可視域デュアルコム分光に関する研究

本研究は、デュアルコム分光において、長時間運転が可能でメンテナンスフリーという実用性の観点を捉え、可視域における信頼性の高いデュアルコム分光計を、光源発生から実証まで研究を進める。可視域光コムの発生では、導波路型周期的分極反転ニオブ酸リチウム結晶による広帯域コムの発生及びそのメカニズムの解明に成功した。また、開発した20 MHzの低繰り返し周波数光コムを用いたデュアルコム分光によってアセチレン分子の吸収スペクトルを観測した。さらに、可視域のよう素吸収線のデュアルコム分光による観測を行い、信号対雑音比においては背景フィッティングが有効であることが分かった。代表者(横国大)は、デュアル・コム分光の分解能を向上させるために、低い繰り返し周波数の光周波数コムの開発を行った。2台の低繰り返し周波数光周波数コムでデュアル・コム分光を行うことができれば、より密なスペクトルプロットを得ることができ、吸収線のより詳細な様子を観察することができる。11.4MHzの低繰り返し周波数モード同期Erファイバーレーザーを作製し、半値全幅は25 nm以上レーザースペクトルを得ることができた。また、レーザーからの出力光の増幅を行い、共振器から増幅器までの間のファイバー長を調節して増幅の最適化を行った。さらに、高非線形ファイバーを用いて、増幅後のスペクトル広帯域化を行った。その結果、光スペクトルを1オクターブ(12μm)以上に広げることができ、光コムのキャリアエンベロープオフセット周波数(fCEO)信号を検出することができた。新しく開発した低繰り返し周波数光コムの繰り返し周波数(frep)を制御するために、被覆の剥いた光ファイバーにピエゾアクチュエーターを取り付けた。従来技術と比べて約10倍の制御ダイナミックレンジを確保し、実際にfrepの制御に成功した。大久保(産総研)は、デュアルコム分光に向けて、2台のErファイバーコムをレファレンス用CWレーザーに同期し、相対線幅1Hz以下となっていることを確認した。光コムの出力をErファイバーアンプで増幅し、チャープ付き導波路型PPLN結晶に入射して中心波長780nmの第2次高調波コムを発生させた。高効率かつ広帯域な第2次高調波発生が可能なPPLN結晶のチャープ量、結晶長などのパラメータを探り、出力パワー20mW以上、スペクトル幅45nm以上の第2次高調波コムを得た。これらのことから、計画はおおむね順調に進んでいると考えている。大久保(産総研)においては、H27年度の当初計画では、高非線形ファイバーで広帯域化したコムを導波路型PPLN結晶に入射し、可視広帯域コムを発生させる予定であった。しかし、デュアルコム分光を行う場合には、光コムの2次高調波を発生させてからPCFで広帯域化して可視広帯域コムを発生させた方が自由度が高くなるので、こちらの方法に変更した。H27年度は、チャープ付き導波路型PPLN結晶を用いて光コムの広帯域第2次高調波発生を確認しており、当初計画の見込みと同程度の段階まで進んでいる。代表者(横国大)は、デュアルコム分光の分解能を向上させるために、低繰り返し周波数の光周波数コムの開発を行っている。光コムのキャリアエンベロープオフセット周波数(fCEO)信号の信号対雑音比(S/N)の最適化を行った結果、繰り返し周波数が約22 MHzのときに制御可能なfCEO信号を得ることができた。自己参照法によって検出されたfCEO信号のS/N比は、分解能バンド幅が300 kHzにおいて28 dBであった。このとき、モード同期レーザーの出力光スペクトルは半値全幅18 nm、中心波長1570 nmであった。モード同期レーザーの励起用半導体レーザーの電流を制御ポートとして用いることにより、fCEOの制御に成功した。また同時に、被覆を剥いた光ファイバーにつけたピエゾアクチュエーター共振器の温調を用いて共振器長を変化させ、frepの制御も行った。さらに可視域の分光データを得るために、コンパクトなレーザー光源による波長531 nm、561 nm及び594 nmの3つの波長帯でのヨウ素分子、ならびにフィルター型外部共振器半導体レーザーによる399 nmのイッテルビウム原子の超精密分光を行った。大久保(産総研)は、可視波長域のデュアルコム分光に向けて、Erファイバーコム、チャープ付き導波路型PPLN結晶、高非線形フォトニッククリスタルファイバーを用いて可視波長域の広帯域コムを得た。また、フォトニッククリスタルファイバーも用いず、チャープ付きPPLNから発生する3次高調波でも同程度の可視広帯域コムが得られることが分かった。

いずれの方法でもデュアルコムに使用できる可能性があり、まずは500nm帯のヨウ素分子の吸収スペクトル観測を目指す。代表者(横国大)は、デュアルコム分光の分解能を向上させるために、低繰り返し周波数の光周波数コムの開発を行った。光コムのキャリアエンベロープオフセット周波数(fCEO)信号の信号対雑音比(S/N)の最適化を行った結果、繰り返し周波数が約22 MHzのときに制御可能なfCEO信号を得ることができることを見出した。モード同期レーザーの励起用半導体レーザーの電流を制御ポートとして用いることにより、fCEOの制御に成功した。また、同時にfrepの制御も行った。さらに、各種の光源による波長531 nm、561 nm及び594 nmの3つの波長帯でのヨウ素分子、ならびに399 nmのイッテルビウム原子の超精密分光を行い、可視域分光に関する知見を得ることができた。これらのことから、計画はおおむね順調に進んでいると考えている。大久保(産総研)は、H28年度は、Erファイバーコムとチャープ付き導波路型PPLN結晶を用いて発生した波長780nmの第2次高調波コムを高非線形フォトニッククリスタルファイバーに入射し、短波長側が波長530 nmまで広がった可視広帯域コムを得た。また、チャープ付きPPLNからは2次高調波とともに発生する3次高調波でも波長500-570 nmの広帯域可視コムが得られることを発見した。ヨウ素分子の吸収スペクトルターゲットとし、PPLN前の分散を調整して最も効率的に波長500 nm帯のコムを発生させる条件を探った。本研究は、デュアルコム分光において、長時間運転が可能でメンテナンスフリーという実用性の観点を捉え、可視域における信頼性の高いデュアルコム分光計を、光源発生から実証まで研究を進める。可視域光コムの発生では、導波路型周期的分極反転ニオブ酸リチウム結晶による広帯域コムの発生及びそのメカニズムの解明に成功した。また、開発した20 MHzの低繰り返し周波数光コムを用いたデュアルコム分光によってアセチレン分子の吸収スペクトルを観測した。さらに、可視域のよう素吸収線のデュアルコム分光による観測を行い、信号対雑音比においては背景フィッティングが有効であることが分かった。代表者(横国大)は、低繰り返し周波数光コムのキャリアエベロープオフセット周波数(fCEO)信号の信号対雑音比の向上を図り、fCEOと繰り返し周波数(frep)の同時制御を行う。その後、デュアルコム分光計を構築し、分子のデュアルコム分光を行い、低繰り返し周波数によるデュアルコム分光の分解能の向上を確認する。さらに、測定の平均時間を伸ばすことにより、分光信号の信号対雑音比の向上を確認し、デュアルコム分光計の性能評価を行う。大久保(産総研)は、チャープ付き導波路型PPLN結晶からの出力光をフォトニッククリスタルファイバーに入射し、短波長側500nm程度を目標に可視光コムの広帯域化を図る。その後、得られた広帯域可視光コムを用いてデュアルコム分光計を構築し、インターフェログラムを取得する。
ラット肝臓類洞細胞による変性アルブミンの取り込みとその分解に関する研究

昭和61より3年間に渡ってこの研究テーマのもとに行なわれた研究は次の4部分からなる。1)改良した免疫細胞化学的方法によりラット肝臓におけるアルブミンの局在を検討した。アルブミンはその産生系である総ての肝実質細胞と類洞の内皮細胞やクッパー細胞(以後、類洞細胞と呼ぶ)のファゴソームに検出された。類洞細胞はアルブミンの分解系を構成するもと考えられた。2)次に種々の物質で標識した変性アルブミン(FDA)の類洞細胞による取り込みを調べた。FDAは類洞細胞によってのみ選択的に取り込まれた。アルブミンの分解と産生はそれぞれ異なる細胞によって分担されていることが証明された。また、取り込みは受容体を仲介して行なわれることが示された。3)次に変性アルブミンの取り込みおよびファゴリソソームに入る過程を経時的に調べた。取り込みは、コーテッド・ピッツ→コーテッド・ヴェシクル→管状構造→ファゴリソソームと進行する。ファゴリソソームは管状構造にコーテッド・ヴェシクルが次々と融合することによって形成される。しかし、ある時期に融和は止まり、二次リソソームへと変化していく。この二次リソソームにコーテッド・ヴェシクルが融合することはない。ファゴリソソームの中で変性アルブミンの分解は進み、30分後には終了する。4)この分解に関与するプロテアーゼを特定するため、カテプシンB、D、Hの免疫細胞化学的局在を検討した。変性アルブミン投与後20ー30分にその染色性を増大するのはカテプシンDとHであった。結果はカテプシンDとHはこの分解に関与していることを示唆するものである。この他にラット腎臓におけるタンパクの取り込みと分解過程を免疫細胞化学的に検討し、カテプシンBとHがこの分解に関与することが明らかにされた。フォルマリンで変性させたアルブミンのラット肝臓類洞細胞による取り込みと分解を追求するために、第一段階として、変性アルブミンを西洋わさびベルオキシダーゼ,フェリチン,およびコロイド金で標識することによりアルブミンを可視化して、その取り込みと分解を経時的に観察した。その結果、次のことが明らかとなった。(1)変性アルブミンは静注後、20秒にはすでに類洞細胞(内皮細胞およびクッパー細胞)の細胞膜に結合している。さらに30秒にはコーテッド・ビットに集中する。1-3分にはコーテッド・ヴェシクルおよびエンドソームにはいる。この時期にファゴソームの形成が始まる。ファゴソームにおける変性アルブミンの分解は静注後5分には始まり、60分にはほぼ終了する(2)またフェリチン標識およびベルオキシターゼ標識変性アルブミンを時間をおいて同一のラットに静注して、その取り込みを観察すると、既存のファゴソーム(フェリチン標識アルブミンを1時間前に取り込んだもの)と後から形成されるファゴソーム(ペルオキシターゼ標識アルブミンを含むもの)とは融合しない。これらの結果は次のことを示している。(A)変性アルブミンは受容体を介したエンドシトーシスによって、類洞の内皮細胞およびクッパー細胞に取り込まれ分解される。肝実質細胞には変性アルブミンに対する受容体がないので、取り込まれない。取り込まれた変性アルブミンはファゴソームに運ばれ分解される。(B)ファゴソームの形成は既存のファゴソームとの融合によって始まるのではなく、いくつかのエンドソームの融合によって起こるものと思われるしたがって、取り込みから分解まではワン・セットとして進行するものと推測される。