hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マラリア原虫ミトコンドリア特異的呼吸酵素群の分子構築と生理機能

局在:現在解析に用いているマラリア原虫ミトコンドリアは他のオルガネラや細胞膜を含み、その純度は低い。そこで、さらにその精製を試みた結果、パーコールによる分離法を確立した。ミトコンドリアのマーカー酵素である複合体IIはこの画分にのみ局在し、またアピコプラストなどは含まれていなかった。3.マラリア原虫DHODH(ジヒドロオロト酸脱水素酵素)の酵素学的性質:通常、ピリミジン合成系の第4酵素であるDHODHはその還元力を呼吸鎖に伝達している。本酵素からの電子伝達系をミトコンドリアを用いて解析した結果、マラリア原虫ミトコンドリアにはDHODH、ユビキノン、複合体III、シトクロムcと言う電子伝達系が存在し、高い活性を示す事が判った。さらにDHOD-シトクロムc還元酵素に対する阻害効果を調べる事によって、複合体IIIの特異的阻害剤をスクリーニングできる事が明らかになった。本研究では寄生適応に必須な基本要素である各種代謝系のなかでも特にエネルギー代謝系に焦点を絞り、マラリア原虫およびアフリカトリパノソーマのミトコンドリア電子伝達系の特異性を解析することにより、最終的に化学療法の標的として捉えたいと考えている。最近、活性を保持したマラリア原虫ミトコンドリアの単離法を確立し、これまで不可能とされていた生化学的アプローチを可能にした成果をふまえ、熱帯熱マラリア原虫におけるエネルギー代謝系を先端的なエネルギー転換系研究の視点から追求し、細胞質とオルガネラの協調的役割、また生活環におけるその変動を解析し寄生現象全般に共通する適応戦略の分子基盤とその多様性を明らかにする。1.抗マラリア剤アトバコンの標的分子について:クロロキン耐性のマラリア原虫に有効で最も新しい抗マラリア剤であるアトバコンの標的がミトコンドリアである事は判っていたが、実際の標的分子についてはピリミジン合成系の第4酵素であるDHODH(ジヒドロオロト酸脱水素酵素)と複合体III(ユビキノール-シトクロムc還元酵素の2つの酵素があげられていた。ミトコンドリアを用いた解析から、アトバコンの標的が複合体IIIであることを明らかにした。2.トリパノソーマのシアン耐性酸化酵素について:われわれはアフリカ睡眠病の病原体Trypanosoma brucei bruceiミトコンドリアのシアン耐性末端酸化酵素(Trypanosome alternative oxidase : TAO)がその増殖に必須な成分であり、化学療法剤の標的である事を見い出していた。実際にTAOを特異的に阻害するアスコフラノンと言う微生物の産生するフェノール性化合物は極めて低濃度で、増殖を阻害した。このTAOの組み換え酵素を大腸菌で発現し、精製する事ができた。これによって生化学的解析が可能となった。1.赤血球内型マラリア原虫ミトコンドリアにおける特異的電子伝達系の解析われわれは赤血球内型の熱帯熱マラリア原虫をN_2 cavitation法で破砕することによって、呼吸活性のあるミトコンドリアを単離する方法を確立した。そしてこの標品を用い赤血球内型原虫ミトコンドリアにおけるマラリア原虫特異的な呼吸鎖電子伝達系について生化学的解析を行なっている。マラリア原虫のオルガネラのひとつであるアピコプラストとミトコンドリアを明確に区別して観察する目的で、GFPのN末端にミトコンドリアに局在させるためのプレ配列を結合させ、ミトコンドリアをラベルした。
シミュレーションとロボットを用いた四足動物の移動パターン生成原理の究明

4足動物は低/中/高速において移動パターン(脚の動かし方)をwalk→trot→gallopと変化させることが知られている.生物学では,この3つの移動パターンは神経内に既存であり,それらを移動エネルギーが最少になるように速度に合わせて切替えていると報告されているが,個々の移動パターンがどのように神経内に構築されたのかは不明である.しかし,我々の4足歩行シミュレーションにおいて,速度変化と共に生じる胴体揺動変化に応じて,唯一プログラムに設定しているtrotからwalk,gallopが自然発生することを発見した.また,同様の成果を4足ロボットにおいても実現した.4足動物は低/中/高速において移動パターン(脚の動かし方)をwalk→trot→gallopと変化させることが知られている.生物学では,この3つの移動パターンは神経内に既存であり,それらを移動エネルギーが最少になるように速度に合わせて切替えていると報告されているが,個々の移動パターンがどのように神経内に構築されたのかは不明である.しかし,我々の4足歩行シミュレーションにおいて,速度変化と共に生じる胴体揺動変化に応じて,唯一プログラムに設定しているtrotからwalk,gallopが自然発生することを発見した.また,同様の成果を4足ロボットにおいても実現した.4足動物は低/中/高速において移動パターン(脚の動かし方)をwalk→trot→gallopと変化させることが知られている.生物学では,この3つの移動パターンは神経内に既存であり,それらを移動エネルギーが最少になるように速度に合わせて切替えていると報告されているが,個々の移動パターンがどのように神経内に構築されたのかは不明である.しかし,申請者が行った4足歩行シミュレーションにおいて,速度変化と共に生じる胴体揺動変化に応じて,唯一プログラムに設定しているtrotからwalk,gallopが自然発生することを発見していた.平成25年度は,当初計画通り,この詳細なメカニズムを明らかにするべく,シミュレーションでの詳細な定量分析を行った.その結果,walkとgallopはtrotを基盤とし,左右脚間と前後脚間で位相差が生じることによって自律的に発生することがわかった.また,walk,trot間のパターン遷移は滑らかな速度遷移として行われる一方,trotからgallopへのパターン遷移中の速度は著しく上昇することがわかった.これは加速度を様々に変化させても生じている.この結果は実際の動物にも生じている結果である.また,シミュレーションモデルに数種の錘を載せて遷移状態を調べることで,遷移速度と移動パターンの関係性を検証した.その結果,数種類の錘を載せた場合でも,錘を載せていないときと同じ速度でwalk, trot間,trot, gallop間を遷移することがわかった.この結果についても生物学で述べられている動物実験と同様の結果である.これらの成果はバイオメカニクスの専門論文誌,Biological Cyberneticsにおいて発表されている.4足動物は低/中/高速において移動パターン(脚の動かし方)をwalk→trot→gallopと変化させることが知られている.しかし,個々の移動パターンがどのように神経内に構築されたのかは不明である.我々は,シミュレーションモデルとロボットを用いてこれを明らかにすることを目標とした.H25年度に実施したシミュレーションにおいては,速度変化と共に生じる胴体傾き変化を制御系にフィードバックすることで,唯一プログラムに設定しているtrotからプログラムしていないwalk,gallopが自然発生することを発見した.これらは動物にもみられる移動パターンである.また,H26年度は新たに,実際の動物にも適用されている制御系への脚負荷フィードバックを胴体傾きフィードバックの変わりに用いることで,より動物に近い制御系を構築した.結果として,walk,gallopに加えて,さらにdiagonal walk, right-lead canter, left-lead canter, right-lead transverse gallop,left-lead transverse gallopというプログラムしていない移動パターンを出現させることに成功した.これらはまた,動物に実際にみられる移動パターンである.さらに,それらの移動パターンが出現する簡単な原理を発見することにも成功し,国際論文誌に発表した.そのような,あらゆる移動パターンの生成原理を説明できる一貫した簡素なルールを提案したのは我々が知る限り世界で始めてであり,生物学会においても有用な知見となると考えている.また,ロボットにおいてもH25年度に実現したシミュレーションと同様の移動パターン遷移を実現することにほぼ成功しているが,今後更なる改善を行う予定である.綿密なシミュレーションにより移動パターン遷移のルールを探るという当初の計画はほぼ達成されているが,それに加えて,当初は計画していなかった,足にかかる負荷での移動パターン遷移の実現,およびそのルールの提案にも成功している.これは生物学における有用な知見の提供となる可能性が高い.現在論文を執筆中である.さらに,次年度の計画であったロボットの製作も同時進行で行った.今後は,計画書の予定通り,シミュレーション同様の現象をロボットで実現することを目指す.また,上述した足にかかる負荷によって起こる移動パターンの遷移に関してさらに,シミュレーションとロボットで真理を追究して行く予定である.研究に携わる人員の減少から,当初予定していたソフトウェアライセンス料,およびパソコンに費用がかからなかったためであるが,優秀な少ない人材で予定以上の結果を得ることができた.歩行実験装置の追加制作費にする予定である.
ショットレス・ピーニング装置の試作と環境保全型加工法への展開

1.試作したショットレス・ピーニング装置により水を満たした水槽を用いることなく,気中キャビテーション噴流を生成できることを実証し,ウォータジェットや水槽中のキャビテーション噴流よりも,気中キャビテーション噴流の加工能力が大きいことを明らかにした。2.壊食試験やキャビテーション衝撃力の計測により種々の噴射条件における気中キャビテーション噴流の加工能力を計測し,最適噴射条件を明らかにした。3.種々の材料を気中キャビテーション噴流によりピーニングし,その表面の残留応力をX線回折式応力測定装置により計測した。その結果,材料表面に圧縮残留応力が導入でき,本ピーニングにより表面改質が可能であることを明らかにした。4.加工時間と圧縮残留応力の関係,および加工時間を変えて加工した試験片を用いた負荷応力を一定とした疲労試験から,最適加工時間を明らかにした。5.環境保全型加工法としてのショットレス・ピーニングと従来技術であるショット・ピーニングを比較するために,回転曲げ式疲労試験を行い,ショットレス・ピーニングは従来技術のショット・ピーニングよりも疲労強度を向上できることを明らかにした。6.ショットレス・ピーニングで加工した表面改質層の非破壊評価法を確立するために,ピーニングの加工時間を変えて,X線回折式応力測定装置により加工面の残留応力の計測,および残留オーステナイトの計測を行い,残留応力および残留オーステナイトの経時変化を明らかにした。7.歯車のまたぎ疲労試験により,ショット・ピーニングによる疲労強度との相違を明らかにして,本ピーニングの有効性を明らかにした。8.本ピーニングの種々の材料への適用のために,キャビテーション衝撃力の強さと材料の特性の関係について,キャビテーション衝撃力に対して材料固有のしきい値が存在することを壊食試験により実証した。本研究は,一般には流体機械に致命的損傷を与えるキャビテーション衝撃力を,キャビテーション噴流により制御してピーニングに有効利用するショットを使用しないピーニング,すなわちショットレス・ピーニングの実用化を目指して,ショットレス・ピーニング装置の試作,および最適加工条件の確立を目的とする。本年度は,ショットレス・ピーニング装置の試作および同装置のピーニング効果を実証するために以下の研究を実施した。1.ショットレス・ピーニング装置の試作キャビテーション噴流となる高速噴流とその周りに低速噴流を噴射することにより,水を満たした水槽を用いることなく,大気中に直接キャビテーション噴流を生成することに成功した。2.ショットレス・ピーニング装置の衝撃力エネルギーの計測試作したショットレス・ピーニング装置の加工能力を調べるために,アルミニウム製試験片を用いて壊食試験を行い,衝撃エネルギーとして質量損失を計量した。その結果,通常のウォータジェット(気中水噴流)や水槽中のキャビテーション噴流よりも,試作したショットレス・ピーニング装置の気中キャビテーション噴流の加工能力が最も大きいことが判明した。3.ショットレス・ピーニング装置によるピーニング効果の実証試作した装置により,合金工具鋼SKD61にショットレス・ピーニングを行い,その表面の残留応力を現有設備のX線回折式応力測定装置により計測した結果,材料表面に圧縮残留応力が導入でき,さらにショット・ピーニングよりもその値が大きいことが明らかになった。また表面粗さもショット・ピーニングに比べて極端に小さく,本ピーニングが機械材料の高強度化のための表面改質に最適であることがわかった。本研究は,一般には流体機械に致命的損傷を与えるキャビテーション気泡の崩壊衝撃力を,逆転発想的研究により,キャビテーション噴流により制御してピーニングに有効利用するショットを使用しない(ショットレス)ピーニング,すなわちショットレス・ピーニングによる機械やプラントの構成部品の疲労強度向上や耐食性向上の実用化を目指して,ショットレス・ピーニング装置の試作,および最適加工条件の確立を目的とする.本年度は,以下の研究項目を実施し,初年度の研究を発展させ,ショットレス・ピーニングの環境保全型加工法への展開を図った.

1.低速水噴流用噴射ノズル口径の最適化平成13年度に試作したショットレス・ピーニング装置を用いて,壊食試験やキャビテーション衝撃力の計測により気中キャビテーション噴流の加工能力を計測して,同ノズルの最適ノズル口径を明らかにした.さらに疲労試験を行って,ショット・ピーニングの結果と比較した.2.最適加工速度の確立ショットレス・ピーニングの実用化において重要なパラメータである加工速度の最適加工条件を確立するために,平成13年度に試作した装置により種々の条件でピーニングし,電解研磨により表面を除去して残留応力を計測した.加工速度と材料内部の残留応力分布の相関を明らかにし,圧縮残留応力導入・疲労強度向上における最適加工速度を明らかにした.3.最適作動流体の選定キャビテーション噴流ならびに低速噴流の作動流体についてpHなどを考慮して耐食性を飛躍的に向上させるショットレス・ピーニング条件を明らかにした.本研究は,一般には流体機械に致命的損傷を与えるキャビテーション気泡の崩壊衝撃力を,逆転発想的研究により,キャビテーション噴流により制御してピーニングに有効利用するショットを使用しない(ショットレス)ピーニング,すなわちショットレス・ピーニングによる機械やプラントの構成部品の疲労強度向上や耐食性向上の実用化を目指して,ショットレス・ピーニング装置の試作,および最適加工条件の確立を目的とする。最終年度である本年度は,以下の研究項目を実施し,これまでの研究を発展させ,ショットレス・ピーニングの環境保全型加工法への展開を図った。1.表面改質層の非破壊評価試作したショットレス・ピーニング装置を用いて,加工した表面改質層の非破壊評価法を確立するために,ピーニングの加工時間あるいは加工速度を変えて,X線応力測定装置により加工面の残留応力の計測,および残留オーステナイトの計測を行い,残留応力および残留オーステナイトの経時変化を明らかにした。ステンレス鋼や浸炭したクロムモリブデン鋼,合金工具鋼などの残留応力計測するなかで,従来技術であるショット・ピーニングでは回折X線の半価幅は増大するが,本ピーニングでは未処理材よりも半価幅が減少する本ピーニング特有の現象を発見した。2.実用部品のピーニング効果の実証本ショットレス・ピーニングの実用化を念頭にして,歯車などの機械部品へのピーニング効果を実証するために,試作したショットレス・ピーニング装置により歯車にピーニングを行い,残留応力を計測し,本ピーニングにより歯車への圧縮残留応力の導入を実証した。さらに歯車のまたぎ疲労試験により,従来技術であるショット・ピーニングによる疲労強度との相違を明らかにして,本ピーニングの有効性を明らかにした。また本ピーニングによりピーン・フォーミングが可能であることを実証した。
オーダーメイド型人工制限酵素・人工リプレッサーの開発

ヒト・ゲノム情報に基づいた新機能型亜鉛フィンガー蛋白質の研究は国内では他の追随を許さず、また国際的にも高い評価を受け、学術的に極めて優れた成果を挙げている。巨大分子である染色体遺伝子の特定位置を自在に切断したり、特定塩基部位に選択的に結合する分子の開発は、ポストゲノムの機能解析において不可欠であるばかりでなく、アンチセンス様分子や人エリプレッサーを用いる遺伝子医学に貢献することが期待される。亜鉛フィンガーによるDNA認識・DNA湾曲を基礎とした遺伝子制御分子の創製は、今迄とは、異なった新しい遺伝子治療の概念をもたらし、さらに遺伝子にかかわる疾病に対して重要な寄与が望める。このような設計された人工金属蛋白質による遺伝子機能の制御は、細胞機能をコントロールすることにつながるため、未知の細胞機能の化学的解明はもちろんのこと、薬学的応用としては疾病の診断・治療や蛋白質医薬の開発、また植物や微生物への新しいバイオテクノロジーとして農業や工業への応用も期待される。今後、実用化に向けては、1.長鎖DNA認識(1030塩基対)型人工制限酵素の実用化。天然制限酵素は通常、46塩基対の認識である。遺伝子工学や遺伝子医学に応用が待たれる。2.細胞通過性キャリアペプチドを用いた細胞非損傷的かつ効率的蛋白質および遺伝子導入法の実用化。この塩基性ペプチドを用いた方法は、幾つかの企業と共同開発中である。3.ミトコンドリアtRNA-Leu遺伝子の変異に基づく糖尿病における本変異mtDNAの選択的切断技術の確立。我が国の糖尿病患者(600万人)の約1%は本タイプであり、10塩基対認識型亜鉛フィンガーの開発がポイントである。亜鉛フィンガー型転写因子Sp1のDNA認識機構と転写制御機構の解明は、、DNA結合や構造変化に基づく機能分子の開発に大きな道を開いている。亜鉛フィンガーモチーフは1つのファンガー当り3つの塩基を厳密に認識することやGC配列以外にAT配列認識型亜鉛フィンガーが発見されており、任意の配列および任意の塩基数を認識する新しい亜鉛フィンガータンパク質を創製することが可能である。先ず、2030塩基の長い塩基配列を認識できるマルチ亜鉛フィンガータンパク質を設計し、この人工タンパク質がヒトY-ボックス結合タンパク質の遺伝子プロモーターなどの長いGCボックス配列に作用することを明らかにした。また、Sp1由来のDNA湾曲と転写とし関連研究から、DNA湾曲を誘発するポリグリシンリンカーを有するマルチ亜鉛フィンガータンパク質の創製にも成功し、DNA湾曲を制御する人工亜鉛フィンガータンパク質の開発に希望を示した。さらに、新規マルチ亜鉛フィンガータンパク質のN-末端にDNA切断機能を有するグリシルグリシルヒスチジンを導入することによって、長鎖DNA切断を可能にし、人工制限酵素としての可能性を与えた。このように、亜鉛フィンガーによるDNA認識・DNA湾曲を基礎にした人工制限酵素・人工リプレッサーの開発と実用化が進んでいる。亜鉛フィンガー型DNA結合モチーフは、その繰り返し構造ゆえに約3塩基ずつ認識するモジュールの連結体として見ることができ、この単純な構造は従来のDNA結合モチーフにはない特徴であり、新たな塩基配列を認識する分子の合理的な設計に大きな道を開いている。マルチ亜鉛フィンガーモチーフを利用して、巨大分子である染色体遺伝子の特定の位置を自在に切断したり、特定塩基配列部位に選択的に結合するような分子の開発は、ゲノム遺伝子解析やDNA結合蛋白質の機能解析に不可欠であるばかりでなく、アンチセンス分子や人工リプレッサーを用いる遺伝子治療の観点からも極めて興味深い。本年度は、新しいDNA湾曲能を有する亜鉛フィンガーペプチド、長いDNA塩基配列認識能を有するマルチ亜鉛フィンガーペプチド、さらには、GCとAT配列が混合したDNA塩基配列を認識する新規亜鉛フィンガーペプチドなどを設計・創製した。特に、鉛フィンガーの認識ヘリックス全体に着目し、新たなAT配列認識亜鉛フィンガーの創製研究から、新規亜鉛フィンガーのデザインにおける認識ヘリックス交換の有用性を明確に示すことが出来た。すなわち、GC配列認識型亜鉛フィンガータンパク質Sp1の3つの亜鉛フィンガーの認識

ヘリックスAT配列認識型亜鉛フィンガータンパク質CF2の対応する亜鉛フィンガーの認識ヘリックスに交換した人工亜鉛フィンガータンパク質は、特異的かつ強固にAT配列DNAに結合した。認識ヘリックス交換法は、ファージディスプレイ法よりもはるかに簡便で有用な手法である。新たに創られた人工亜鉛フィンガーペプチドのDNA認識能や転写制御能などの生物機能評価が行われ、この結果を基に、さらに優れた人工亜鉛フィンガーペプチドの研究を展開中である。(1)転滋因子Sp1の3つの亜鉛フィンガーを1ユニットとし、2ユニットつなげた6フィンガータンパク質を創製し、目的配列への結合を評価した。(2)ユニット間のリンカーの長さを変えた数種の6フィンガータンパク質をデザインし、GCボックスの相対位置を変えた同じ長さ・塩基組成のDNAフラグメントを用いて、ゲルシフト法によりDNA-タンパク質複合体の移動度の違いを解析することにより、DNAの湾曲の位置と程度を特定した。(3)Sp1のどの部分がDNAの湾曲を引き起こすのかを明らかにするために、Sp1のアミノ酸を改変または除去し、ゲルシフト法、フツトプリント法、干渉法などを利用して、改変前後の変化について検討した。(4)Sp1のフィンガー2における位置にCF2のフィンガー5で見られるアミノ酸V、Y、Kをそれぞれ導入したSp1-亜鉛フィンガー変異体(Sp1VYK2)やSp1とCF2のキメラ亜鉛フィンガー蛋白質など、p53や核受容体結合部位をもつ新しいAT認識型の亜鉛フィンガー蛋白質の分子設計を行ない、大腸菌中で発現させ、HPLCで高純度に精製した。得られた蛋白質を用いて、5'-GGG-TAT-GGG-3'のようなDNA配列への高選択的結合能などを評価した。任意の塩基配列の認識が可能となるような亜鉛フィンガーをSAAB法により探索した。以上の知見を基に、DNAの湾曲とSp1による転写との関係をSp1の変異体を用いたCATアッセイにより追究し、DNA湾曲を利用した特定遺伝子の転写および発現の人為的制御を細胞レベルで試みた。
肺癌における化学療法感受性関連蛋白の単離とイメージングによる感受性予測法の開発

肺癌における化学療法を合理的に選択するシステムを確立するため、肺癌細胞株の網羅的発現解析と感受性解析を行い、バイオイメージング可能な感受性関連因子の選択を行った。その中で、EGFRとVEGFRの阻害剤に対して、標的そのものが妥当なイメージング対象と考えられ、培養株およびマウスモデルで、同様のイメージング結果が定量的に得られた。これらのイメージングの情報により、標的分子を有する腫瘍量をリアルタイムに定量的に把握できることから、分子標的薬の治療適応により直接的な情報が得られると考えられた。肺癌における化学療法を合理的に選択するシステムの確立や標的分子のモニターリングを行うため、我々は、網羅的解析の種々の方法を利用し確かな感受性関連因子を単離することと、リアルタイムな解析のため、バイオイメージングの実現を目指すことを計画した。今年度は、この観点から感受性診断用因子を選択するため、2D-DIGEや抗体アレイなどの蛋白レベルの解析を行い、バイオイメージングによるリアルタイムな診断への活用が可能な適切な因子の選択を行った。具体的には、肺癌細胞株30株の感受性のパネルを用いたプロテオーム解析とバイオイメージングに適した膜蛋白、あるいは、代謝蓄積物質の選択、を行っている。まず、薬剤感受性パネルについて、2D-DIGE解析と抗体アレイを用いて、網羅的蛋白量解析データを得た。この解析結果と感受性データから感受性発現関連解析を行い、感受性と相関することが示された因子から、蛋白量の増加を認めるもの、肺組織の発現が障害にならないもの、治療効果発現機序に関わる因子、膜や代謝に関わるものなど、バイオイメージングに適した蛋白を選択している。この一方で、データの妥当性を検討するため、抗体アレイとトランスクリプトームの薬剤のクラスターリングを比較したが、再現性のあるデータを得ている。ただ、具体的な感受規定因子は解析により異なり、イメージングに適した因子は、蛋白解析から得るべきであると考えられた。この観点から感受性診断用因子を選択するため、2D-DIGEや抗体アレイ、シグナル関連因子などの蛋白レベルの解析を行い、バイオイメージングによるリアルタイムな診断への活用が可能な適切な因子の選択を行った。肺癌細胞株30株の感受性パネルの解析とバイオイメージングに適した膜蛋白、あるいは、代謝蓄積物質の選択、を行った。その中で、EGFRとVEGFRの阻害剤に対して、EGFRとVEGFRの分子標的そのものが妥当かっ現実的なイメージング対象と考えられ、マウス皮下移植腫瘍に対し、EGFR阻害剤、および、EGFRとVEGFRの阻害剤を投与し、その腫瘍のEGFR、VEGFRのイメージングを行った。その結果、培養株およびマウスモデルの抗腫瘍効果とほぼ同様の結果が定量的に得られた。また、その腫瘍に標的分子が存在することがリァルタイムにフォローアップ出来た。これらのイメージングの情報により、標的分子を有する腫瘍量を定量的に得られることから、分子標的薬の治療適応により直接的な情報が得られると考えられる。今後、確かな薬剤感受性予測因子と併せ用いることで、標的因子と感受性の両面から適切な薬剤投与が可能になると考えられた。
耐塩性嫌気性細菌と好塩性植物を利用した塩害土壌のハイブリッド修復

粉砕したギニアグラスに食塩を添加した試料(158 g-COD/kg-wet biomass, 70g-NaCl/kg-wet biomass)を模擬好塩性植物バイオマスとし、中温条件(35度)の連続実験を200日以上に亘って実施した。槽負荷を一時的に上昇させた時期を除き、約2.0kg/m3/dの典型的な槽負荷条件下であっても槽内の低級脂肪酸濃度は15 mg/COD/L程度に留まり、約50%の植物COD成分がメタン分解された。このことから、海水の2倍ほどの高塩濃度条件下でも嫌気性微生物群は実用化に充分な速度で低級脂肪酸から酢酸や水素を経由してメタンを生成できると考えられた。COD基準の物質収支によれば、投入した植物バイオマスのおよそ67%は本プロセスによってメタンに転換されていた。ただし、これらのほとんどは初期の立ち上げ時における回分条件で分解されており、連続条件に切り替えてからのメタン転換は50%ほどに留まった。これは、バイオマスの比分解速度が低いことによると考えられる。槽負荷を一時的に上昇させた時期を除き、約2.0kg/m3/dの典型的な槽負荷条件下であっても槽内の低級脂肪酸濃度は15 mg/COD/L程度に留まった。このことから、海水の2倍ほどの高塩濃度条件下でも嫌気性微生物群は実用化に充分な速度で低級脂肪酸から酢酸や水素を経由してメタンを生成できることが明らかになった。これら一連の反応を定量的に把握するために、国際水協会(IWA)の嫌気性消化モデルNo.1 (ADM1)を改変し、植物バイオマスの分解モデルを作成した。糖・蛋白質・脂質・不活性有機物を出発点とするADM1において、生物分解成分の微細化に伴うリグニンの溶解反応を追加し、メタン生成・槽内VSS濃度・溶解性TOC成分などの挙動に着目して反応の動力学定数を求めた。この結果、一般的な下水汚泥のメタン発酵におけるメタン生成古細菌よりも本条件下ではかなり比増殖速度が低くなっていると推定された。また、ウズベキスタン国立大学の協力により、ウズベキスタンのブハラ地方に生育する野生の好塩性植物30種をサンプリングすることかできた。現在、これら植物の化学分析を進めており、将来の研究用データベースに反映される予定である。アジア内陸地域で自生する代表的な好塩性植物(Kalidium caspicum,Climacoptera lanata, Salicornia europaea)の元素組成を分析するとともに、予備的に嫌気的生物分解度合いを調べた。これに基づき、乾燥牧草と食塩を用いてラボ実験用の模擬試料(78g-NaCl/kg-湿重, 178g-TVS/kg-湿重)を調整し、中温(35度)と高温(55度)の2条件で4.5kgCOD/m3/dの槽負荷でケモスタットの連続運転を行った。これらの条件で投入の模擬試料有機物は徐々に分解されはじめたが、いずれのリアクターにおいても数千mg/Lの溶解性TOC成分と1000-2000mgCOD/Lの低級脂肪酸(プロピオン酸と酢酸)が残留した。このことからリアクター内の微生物量が律速になっていると考え、ケモスタットの運転を止め、処理液を固液分離して微生物を含有する汚泥をリアクターに返送するようにした。この操作によって低級脂肪酸の濃度は当初の1/2ほどに低下した。一方で、数千mg/Lの溶解性TOC成分はほとんど減少しなかった。別の回分実験によってこの溶解性TOC成分はすみやかに生物分解されたことから、本成分が残留する原因は、植物の固形有機物を可溶化する反応速度と可溶化物の分解速度のアンバランスによるものと推定された。一般に固形有機物の可溶化速度は固形物の濃度に比例するため、槽負荷を半分以下に下げて槽内の固形物濃度を低く維持するよう運転条件を変更した。この改良操作によって溶解性TOC濃度は数百mg/Lに低下した。このときのリアクターからのメタン生成速度は1-1.2 kgCOD/m3/dであり、運転条件を最適化すれば生成は更に増えるものと予想された。

海水の2倍以上(78g-NaCl/kg-湿重)である高濃度の塩を含有する有機物を原料としても、プロセスフローを工夫することで一般的なメタン発酵の性能(1-1.2 kgCOD/m3/dのメタン生成速度)を得ることができた。本フローは研究計画段階で想定したものであり、予想通りの成果が得られたと考えている。メタン発酵実験のデータをもとに、植物体の嫌気的有機物分解反応を表す数学モデルの構築を進める。これにより、反応の律速段階に関する考察を理論化し、知見を性能向上の実験にフィードバックする。メタン発酵の連続実験を継続し、プロセスシミュレータによってデータを再現可能な数学モデル構造を構築する。また、これらによって予想した開発プロセスの適用性能をもとに、土壌の塩害が顕在化しているアジア内陸部の諸機関に対して研究成果の学術発表を行う。これにより、本萌芽研究の成果をニーズを有する機関と共有化し、国際共同研究をはじめとする次の開発ステージにつなげる。
トポロジーに基づくバンド構造制御と新奇物性探索

本年度は以下の3項目について研究を行った。第一に、空間反転対称性の破れた非磁性絶縁体において、圧力や化学組成などを連続的に変化させバンドギャップが閉じる際に現れるバンド構造変化の一般論を構築した。なおスピン軌道相互作用は有限に存在するとしている。このとき、系の空間群およびバンドギャップが閉じる波数によって、起こりうる無数の場合を分類することができ、各場合についてバンドギャップが閉じる点近傍での有効理論を構築することでバンド構造の発展を調べた。その結果、全ての場合についてワイル半金属ないしノーダルライン半金属となることを見出した。すなわち、絶縁体からバンドギャップを閉じて、また直ちに開くような絶縁体-絶縁体相転移が起こりえないことを示した。この理論は実際の物質に広く応用することができ、実際このような相転移の例をいくつか挙げるとともに、これを用いたワイル半金属、ノーダルライン半金属の新物質を見出した。第二に、ノーダルライン半金属のうちスピン軌道相互作用が無視できるものについて、ノーダルラインの存在が電子のフィリングによって強制的に決まるものを、空間群の立場からすべて網羅的に挙げて、対応するノーダルラインの形状を決定した。さらに候補物質の一つAl3FeSi2を見出し、第一原理計算によりそのノーダルラインの形状が理論的に予言されているものと一致することを確かめた。第三にノーダルライン半金属やワイル半金属に関する相転移の一般論を構築した。スピン軌道相互作用が無視できる場合のノーダルライン半金属を、ノーダルライン形状と位置によって2種に分類し、その相転移を論じた。特にノーダルラインが時間反転不変運動量を囲むときには、時間反転対称性を破ると必ずワイル半金属になることを示した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年は主に以下の2点について研究した。第一にトポロジカル絶縁体同士の界面など、スピン軌道相互作用が異なる絶縁体同士の界面で、ギャップが閉じる点がループ状をなすような特異なバンド構造が出現する場合があることを理論的に示した。またこれは、界面の両側の領域同士が互いに時間反転や空間反転対称性で移り合うような場合に起こることを示し、それを界面時間反転対称性、界面空間反転対称性と名付けた。こうしたループ状の縮退が、ある種の行列のパフィアンの符号反転で特徴づけられるトポロジカルな要因によることを示し、その実現方法についても議論した。まず絶縁体同士の界面でバンドギャップが閉じて金属的になることが例外的で面白い結果であるが、それ以上に、バンドギャップがループ状に閉じることは対称性からは普通は起こらないと予想されるため、この結果は非自明な結果である。第二にワイル半金属の有効模型の構築と、それを用いた表面フェルミアークの分散の計算などを行った。まずワイル点同士が近接している場合の有効模型を構築し、何らかのパラメタの変化に伴ってそのワイル半金属が絶縁体に相転移する様子を記述した。さらにこの相転移に伴って表面フェルミアークが発展して行く様子を一般的に記述することができた。これにより、空間反転対称性が破れている場合に、パラメタ変化に伴い、通常の絶縁体からワイル半金属となりさらにトポロジカル絶縁体となる様子を、一般的に記述することができた。これは空間反転対称性が破れた系に一般的に適用できる汎用性の高い結果である。また表面の終端方法が変化することにより、フェルミアークが変化する様子についても記述を行った。第一に、ワイル半金属の物質探索や物性に関して知見を得るため、らせん状の結晶構造を持つテルルの結晶について、加圧によりワイル半金属に転移することを第一原理計算により見いだした。また加圧とともにワイル点が波数空間を移動し対生成・対消滅する様子も計算で見いだした。さらにこうしたワイル点がどのようなパターンで出現するかについて群論を用いて説明した。これはワイル半金属の物質探索に対して重要な知見となり、他の同様の物質探索への波及効果が大きい結果である。また常圧下では伝導バンドのスピン構造が、波数空間でハリネズミ型の放射状となっていることを見いだした。これはスピントロニクスへの応用に関して興味深い結果である。第二に、テルルのようならせん状の結晶構造の物質に特有の新奇輸送現象を理論的に見いだし、カイラル伝導と名付けた。こうした物質はソレノイドの類似物と見なせ、右巻きと左巻きの結晶があるため、電流を流すと結晶の巻き方に応じて電流と平行ないし反平行に軌道磁化がでることを予想し、実際にベリー曲率を用いた計算でそのようになることを示した。また第三に、2層グラフェンの特異な輸送現象を理論的に予言した。2層グラフェンの有限の幅のリボンを考えて、層間に電場のバイアスを印加したときにリボンに沿った方向に電気分極が出ることを予想し、実際に出る分極量を有効模型と第一原理計算の2つの手法で調べて、良い一致が出ることを示した。面白いことにこの分極は、リボン幅を3で割った余りの値によってその符号を変えるなど非自明な振る舞いを見せるが、これは有効模型のレベルではリボンの幅による有限サイズ効果によるギャップが、幅により符号を変えることから来ることを示した。ワイル半金属について、圧力などの外部パラメタを変化させたときのバンド構造の変化やその物質探索について大きな研究の進展があった。

例えば加圧下でワイル半金属となる例として、カイラルな結晶構造を持つテルルという非常に興味深い例を見いだすことが出来て、これは今後のワイル半金属物質探索に大きな進歩をもたらすものである。またこうした空間反転対称性を持たない系に特有の輸送現象としてカイラル伝導を理論的に予言した。これは今後の実験・理論研究に大きな波及効果をもたらすものである。本年度は以下の3項目について研究を行った。第一に、映進対称性を持つトポロジカル結晶絶縁体について、通常の絶縁体との間での相転移の一般論を構築した。結果として、これらの2種類の絶縁体相の間には必ずワイル半金属相が挟まることを見いだした。またそのワイル半金属相でどのようにワイル点が移動すると相転移が起こるかについて一般論を構築し、具体的なモデルで実際にどのように相転移が起こるかを例示し、ワイル半金属のフェルミアーク表面状態がトポロジカル結晶絶縁体相のディラックコーンに発展する様子を示した。これは電子系のみならずフォトン、マグノン系などにも適用できる一般的で重要な結果で、トポロジカル結晶絶縁体相を示す物質系探索にも重要な示唆を与える。第二に、ワイル半金属と絶縁体との超格子で現れる物質相を理論的に解明した。ワイル点同士を結ぶベクトルと積層方向との相対関係で2つの積層パターンを考え、各層の厚さを変えることで出現する相図を、有効模型と格子模型の2つで計算した。特に一つの積層パターンではさまざまなチャーン数の量子異常ホール相が出るという興味深い結果が得られた。さらにこれらをワイル半金属でのフェルミアーク表面状態の混成という立場から解釈した。第三に、トポロジカル半金属の一種であるノーダルライン半金属に関して、ノーダルラインが表面での分極電荷をもたらすことを理論的に示した。第一原理計算で、Ca, Srなどのアルカリ土類金属についてはフェルミエネルギー上にノーダルラインがあることを示し、さらに高圧下でノーダルライン半金属になることを示した。さらにこのノーダルラインがザック位相の飛びをもたらすことから、ノーダルラインで囲まれた波数空間の領域では表面に巨大な量子化分極電荷が現れることを示した。またこの表面分極電荷がどのようにバルクキャリアでスクリーンされ、表面で電気双極子が現れる事を示した。ワイル半金属について、圧力などの外部パラメタを変化させたときのバンド構造の変化やその物質探索について成果をまとめることが出来た。これは空間反転対称性を持たない全ての空間群、全ての波数ベクトルについて、ギャップがどのように閉じるかを網羅的に調べ、必ずトポロジカル半金属となることを示したものである。これは空間反転対称性をもたない固体結晶全てに適用できる汎用的な結果であって、トポロジカル半金属物質を探索する上で非常に強力な武器となり、実際本研究でいくつかのトポロジカル半金属の新物質を発見することができた。第一に、空間反転対称性の破れた非磁性絶縁体において、圧力や化学組成などを連続的に変化させバンドギャップが閉じる際に現れるバンド構造変化の一般論を構築した。なおスピン軌道相互作用は有限に存在するとしている。
う蝕原因菌による頭蓋内出血の増強のメカニズム解明とバイオマーカーの探索

う蝕原因菌(S. mutans)の中で、コラーゲン結合蛋白(CBP)を有している菌が頭蓋内出血を悪化させる可能性を示した。本研究では頭蓋内出血を悪化させるメカニズムを検討した。培養内皮細胞に、CBPをもつTW295株とCBPを欠損させたTW295CNDを暴露しmRNA量の変化を比較した。結果、いずれの群においても、MMP-9の有意な上昇は認められなかった。しかし、TW295群において、ケモカイン(CCL2、CXCL1、CXCL2)の有意な上昇が認められた。従って、in vivo頭蓋内出血モデルでみられたMMP-9の発現亢進は、ケモカインの発現上昇による二次的な変化であることが示唆された。口腔細菌である、う蝕原因菌が頭蓋内出血のリスクファクタの1つである可能性を示し、この成果はNature Communicationsオンライン版に掲載された(Nat Commun. 2011Sep 27;2:485.doi:10.1038/ncomms1491)。上記研究では、う蝕原因菌(Streptococcus mutans : S. mutans)の中に高病原性菌が存在し、その菌は脳血管内皮傷害部位に集積し、matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)の産生・活性を増強し、血管の細胞外マトリックススを融解し、頭蓋内出血を増強する可能性を示した。さらに、この菌の表面にコラーゲン結合蛋白を発現していることを見出した。当該研究では、コラーゲン結合蛋白がどのようなメカニズムでMMP-9の産生亢進および活性化を行うか、さらにコラーゲン結合蛋白がリスクファクタのバイオマーカーとなり得るかを検討する。バイオマーカーとして活用できるためには、コラーゲン結合蛋白を測定する方法の確立が重要となる。当該研究期間内に測定系の確立を目指す。初年度である24年度においては、培養内皮細胞(bEnd.3)を用いて、菌暴露後のMMP-9量の変化を検討した。コラーゲン結合タンパクを有するS. mutans TW295株とコラーゲン結合タンパクを有しないS. mutans MT8148株を培養内皮細胞に暴露し、一定時間後のMMP-9mRNA量をリアルタイムPCR法にて比較した。結果、暴露1.5時間から3時間後のTW295暴露群においてMMP-9mRNAの上昇がみとめられた。今後はリコンビナントコラーゲン結合タンパクを暴露した際のMMP-9量の変化を比較検討する。加えて、細胞内シグナル伝達についても検討する予定である。口腔細菌である、う蝕原因菌が頭蓋内出血のリスクファクタの1つである可能性を示し、この成果はNature Communicationsオンライン版に掲載された(Nat Commun. 2011Sep 27;2:485.)。上記研究では、う蝕原因菌(Streptococcus mutans:S. mutans)の中に高病原性菌が存在し、その菌は脳血管内皮傷害部位に集積し、matrix metalloproteinase-9(MMP-9)の産生・活性を増強し、血管の細胞外マトリックススを融解し、頭蓋内出血を増強する可能性を示した。コラーゲン結合タンパクを有するS. mutans TW295株とコラーゲン結合タンパクを有しないS. mutans MT8148株を培養内皮細胞に暴露し、一定時間後のMMP-9 mRNA量をリアルタイムpolymerase chain reaction(PCR)法にて比較した。結果、暴露1.5時間から3時間後のTW295暴露群においてMMP-9 mRNAの上昇がみとめられた。本年度は,炎症初期に関連するケモカインに着目し検討を行った。TW295群において、CCL2 (monocyte chemotactic protein-1 [MCP-1])およびCXCL1/KC and CXCL2/MIP-2の有意な発現上昇が認められた。今後は、MMP-9の変化とケモカインの変化との関連を検証する予定である。口腔細菌である、う蝕原因菌が頭蓋内出血のリスクファクタの1つである可能性を示し、この成果はNature Communications

オンライン版に掲載された(Nat Commun. 2011Sep 27;2:485.doi: 10.1038/ncomms1491.)。上記研究では、う蝕原因菌(Streptococcus mutans:S. mutans)の中に高病原性菌が存在し、その菌は脳血管内皮傷害部位に集積し、matrix metalloproteinase-9(MMP-9)の産生・活性を増強し、血管の細胞外マトリックススを融解し、頭蓋内出血を増強する可能性を示した。さらに、この菌の表面にコラーゲン結合蛋白を発現していることを見出した。当該研究では、コラーゲン結合蛋白がどのようなメカニズムでMMP-9の産生亢進および活性化を行うか、さらにコラーゲン結合蛋白がリスクファクタのバイオマーカーとなり得るかを検討する。バイオマーカーとして活用できるためには、コラーゲン結合蛋白を測定する方法の確立が重要となる。当該研究期間内に測定系の確立を目指す。まず初めに、培養内皮細胞(bEnd.3)を用いて、菌暴露後のMMP-9量の変化を検討した。コラーゲン結合タンパクを有するS. mutans TW295株とコラーゲン結合タンパクを有しないS. mutans MT8148株を培養内皮細胞に暴露し、一定時間後のMMP-9 mRNA量をリアルタイムPCR法にて比較した。結果、TW295およびMT8148を暴露したいずれの群においても、MMP-9のmRNAの上昇はみとめられなかった。次いで、MMP-9と炎症の関連、および、菌と炎症に関するという報告を参考にケモカイン(CCL2 [MCP-1]およびCXCL1/KC and CXCL2/MIP-2)に着目し検討を行った。結果、TW295群において、CCL2 (MCP-1)およびCXCL1/KC and CXCL2/MIP-2の有意な発現上昇が認められた。以上の結果から、in vivo頭蓋内出血モデルでみられたMMP-9の発現亢進は、ケモカインの発現上昇による二次的な変化であることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。薬理学26年度が最終年度であるため、記入しない。高病原性う蝕原因菌および培養細胞を用いたMMP-9の評価系の確立はほぼ完了することができた。次年度以降,コラーゲン結合タンパクによる刺激後のMMP-9産生やシグナル伝達の解析を実施する予定である。次年度以降、MMP-9の変化とケモカインの変化との関連を検証する。また、細胞内シグナル伝達についても検証する予定である。1.高病原性う蝕原因菌によるMMP-9の産生亢進や活性化のメカニズム解明:培養内皮細胞において菌暴露後にMMP-9の産生が亢進することが確認できたので、toll-like receptor(TLR)関連シグナルを介しているか検討を行う。またTLRシグナル伝達がNFx-Bを介してMMP-9の産生に関与しているかを確認する。
ヒスタミン生合成の調節機構に関する生物薬学的研究

ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)の活性調節機構を明らかにするために、翻訳後修飾、および遺伝子発現の調節の両面から検討を行った。まず74kDa HDCをバキュロウイルス-昆虫細胞系に発現させたものを用いて、HDC酵素活性、及び分子量変化を解析したところ、74kDa分子種は比活性は低いものの活性体であることが明かとなり、また両分子種の細胞内における分布が異なるという知見が得られた。そこでラット好塩基球細胞株RBL-2H3を用いて両分子種の細胞内局在性を検討したところ、74kDa分子種は非常に代謝回転の速いタンパクであるのに対して、53kDa分子種は比較的安定なタンパクであることが明かとなった。そして74kDa分子種は細胞質で翻訳された後小胞体へ移行してプロセシングを受け53kDa分子種となることが明かとなった。さらに74kDa分子種がユビキチン-プロテアソーム経路で分解されていることを示唆する知見が得られた。次にHDCの産生調節を明らかにするために、ヒトHDCの解析を行った。その結果、ヒトHDC遺伝子5'上流域において複合的な因子による複雑な制御が行われていることが明らかになった。また、DNA結合蛋白質c-Myb、及びAP-1がコンセンサス配列に結合し、HDC遺伝子の転写を制御していることが示唆された。さらに、転写開始点より上流850bp周辺の位置にこれまで知られていなかった新規の正及び負の制御配列が存在し、機能蛋白質が結合していることが明らかになった。この負の制御因子はヒスタミンを合成しない細胞においてHDCの発現を阻害しており、ヒスタミン産生細胞では隣接する正の制御配列に結合する因子により負の因子の働きが解除され、HDCが発現していることが示唆された。HDCの酵素活性レベルでの調節機構を明らかにするために74kDaHDCをバキュロウイルス-昆虫細胞系ら発現させたものを用いて、HDC酵素活性、及び分子量変化の両面から検討した。リコンビナント74kDaHDCを基質とし、ブタ膵臓エラスターゼでこれを処理した反応液を、超遠心により沈殿画分と上清画分とにわけて調べたところ、上昇したHDC活性は上清画分に回収されることがわかった。そこで、この沈殿画分、上清画分をそれぞれSDS-電気泳動で分離し、ウェスタンブロット法により解析したところ、沈殿画分に存在する74kDaHDCはエラスターゼ処理により54kDaの分子種に変化し、しかも可溶性画分に遊離していることが判明した。また遊離した酵素をゲル濾過により解析したところ、我々が癌化肥満細胞から精製したHDCと同じくダイマーを形成していることがわかった。さらに、リコンビナント74kDaHDCの代わりに、マウス胃の沈殿画分を用いて同じ条件下でエラスターゼ処理実験を行ったところ、HDC活性の上昇、可溶性画分への移行、54kDa分子種の生成が同様に認められた。以上の結果は、不溶性の74kDa分子種として翻訳されたHDCがエラスターゼ様の基質特異性を持つプロテアーゼにより、活性、局在性の調節を受けている可能性を示唆するものである。予備的な検討の結果、マウスの胃にプロセシング酵素の候補を検出し、その活性がストレスなどの刺激により変動することを見いだしているため、さらに検討をすすめる予定である。癌化肥満細胞の抽出液のプロセシング活性は、この細胞が高HDC活性を保有しているため、その性質の検討にまでは至っていないが、今後、阻害剤等を検討することにより、in vitroのプロセシング系の再現を試みる予定である。前年度までの発現系におけるHDCの前駆体

分子種の解析により、74kDa分子種は比活性は低いものの活性体であることが明かとなり、また両分子種の細胞内における分布が異なるという知見が得られたので、今年度はラット好塩基球細胞株RBL-2H3を用いて両分子種の細胞内局在性を検討した。まずHDC抗体を用いて内在性HDCの翻訳後プロセシングおよびそれに伴う細胞内局在性の変化を解析したところ、本細胞において74kDa分子種は非常に代謝回転の速いタンパクであるのに対して、53kDa分子種は比較的安定なタンパクであることが明かとなった。また細胞内局在性に関する検討から74kDa分子種は細胞質で翻訳された後小胞体へとtargetingされ、そのlumen側においてプロセシングを受け53kDa分子種となることが明かとなった。さらにcytosolに存在する74kDa分子種が非常に不安定な理由として、これがユビキチン-プロテアソーム経路で分解されていることを示唆する知見が得られた。HDCの産生調節を明らかにするために、ヒトHDCの解析を行った。その結果、ヒトHDC遺伝子5上流域において複合的な因子による複雑な制御が行われていることが明らかになった。また、DNA結合蛋白質c-Myb、及びAP-1がコンセンサス配列に結合し、HDC遺伝子の転写を制御していることが示唆された。さらに、転写開始点より上流850bp周辺の位置にこれまで知られていなかった新規の正及び負の制御配列が存在し、機能蛋白質が結合していることが明らかになった。この負の制御因子はヒスタミンを合成しない細胞においてHDCの発現を阻害しており、ヒスタミン産正細胞では隣接する正の制御配列に結合する因子により負の因子の働きが解除され、HDCが発現していることが示唆された。
トランスジェニックマウスを用いた心筋細胞におけるPAF受容体の解析

生理活性脂質である血小板活性化因子(PAF)は降圧性の循環動態調節の作用をもっている。心臓はPAFを産生し代謝する能力を有し、摘出心や心筋細胞をPAFで刺激すると受容体を介した作用が表れるが、そのシグナル伝達系の分子的メカニズムはほとんど解明されていない。PAF受容体を過剰発現したトランスジェニックマウスの一系統では、心臓、骨格筋において特に発現量が多く、PAFの静注によって、血圧低下、徐脈などのため数分以内に死亡した。さらに、このマウスはエンドトキシンに対する感受性も増加していた。ヒト心筋からの遺伝子クローニングにより、心筋には白血球とは異なったプロモーターによって発現制御されているmRNAの存在が明らかになった。心筋型PAF受容体mRNAのプロモーター領域には、AP-2、Sp-1、AP-1、ERE、TRE、TIEが存在した。レポーター遺伝子を用いた解析によって、エストロゲンやレチノイン酸、サイロイドホルモン、TGF-βはそれぞれの応答配列を通じてPAF受容体の発現を実際にコントロールしている可能性が示された。ラットの心筋初代培養細胞にPAFを作用させると一過性のカルシウム上昇反応を認めることが、アルガス50によるカルシウムイメージングにより示された。また、この細胞系においてPAF刺激はc-mycなどの初期応答遺伝子の誘導をもたらした。現在、トランスジェニックマウスの表現系の解析をさらにおしすすめ、心筋初代培養細胞におけるPAF受容体を介したシグナル伝達の解明を試みている。さらに、PAF受容体欠損マウスの作製にも成功し表現型の解析を開始した。
新しいペプチド性の形態形成シグナル分子

本年度は足部形成に関わるHym-323と頭部領域を規定すると考えられるHym301について詳細な解析を進めた。同時に、足部形成を促進すると考えられる新たなペプチドの同定に成功した。1.Hym-323の機能解析Hym-323は16アミノ酸からなり、そのC-末端の10残基中5こが頭部形成を促進すると報告されたheadactivator(HA)と一致する。しかし、Hym-323には頭部形成促進能ははなく、足部形成を促進させた。この活性はHym-323がヒドラ体軸に沿う位置情報を動かし、体を足部化することによる。Hym-323遺伝子の発現パターンも抗Hym-323抗体を用いた免疫組織染色によるペプチドの存在部域も基本的に一致し、体幹両端を除いたほぼ全域で一様に発現している。このことから、Hym-323はヒドラの体軸を規定する位置情報因子そのものか或いはその制御に関わる形態形成因子と考える。2.Hym-301の機能解析Hym-301はアミノ酸14残基からなり分子内S-S結合をもち、C-末端がアミド化された新規のペプチドである。Hym-301をコードする遺伝子をとり、その発現パターンをin situハイブリダイゼーションで調べたところ、頭部域の外胚葉で発現し、しかも頭部再生或いは出芽において頭部構造が出来るはるかに前から発現を開始していた。このことから、Hym-301は頭部形成に関わると考え、その機能を様々な方法で調べた結果、触手形成を促進する事を見いだした。RNAiでHym-301遺伝子を部分的にノックアウトすると、触手形成が阻害される傾向にある。このことから、Hym-301は触手形成を制御すると考えている。