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結晶の成長単元に関する光散乱法による研究

溶液相や気相から結晶が成長する際,原子・イオン単位が成長単元になって結晶の成長が行なわれるのか,それとも環境中にはもっと大きなサイズの会合粒子(クラスター)がすでに存在し,それが成長単元の役割を果すのかは,結晶の成長機構,結晶の完全性,あるいは結晶のモルフォロジーの理解にとって基本的に重要な課題である.この問題はまた,溶液構造や錯塩化学と関連した問題でもある.結晶成長に関する従来の理論はすべて原子あるいはイオン単位の成長単元を前提として組みたてられている.一方,結晶成長についての実験結果の夛くは,もっと大きなクラスターを成長単元と考える必要性を示唆している.本研究のねらいは,この点の解明である.そのためにレーザー老による光散乱法(光混合法のうちの光子相関法)により, n.m.サイズの粒径測定を行なう装置を開発した.これは,市販の大塚電子製レーガー粒径解析システムのうち記録・データ処理部のみを利用し,独自に開発した原則・測定部とを組みあわせたものである.空気調節によって温度を制御した水溶液を不飽和→飽和→過飽和状態へと変化させ,この変化に伴なうクラスターサイズ変化を,クラスターのブラウン運動によるドップラー効果に起因するレーリー散乱光のスペクトルとしてとらえ,それを光混合法(光子相関法)によって解析し,粒径サイズを測定しようとする方法である.本装置を開発し,標準試料による検証を行なった上で,水溶液系での廣糖,およびロッシエル塩溶液を用いて,不飽和→飽和→過飽和変化に応ずる粒径変化をしらべた.その結果,両溶液ともで,粒径10n.m.以下のクラスターの存在が認められ,そのサイズはこの変化に応じて増大する傾向があることがわかった.この方法は,今後,溶液系での成長単元を実験的にしらべるのに有効であろうという見透しが,本研究を通じてたてられた.溶液相や気相から結晶が成長する際,原子・イオン単位が成長単元になって結晶の成長が行なわれるのか,それとも環境中にはもっと大きなサイズの会合粒子(クラスター)がすでに存在し,それが成長単元の役割を果すのかは,結晶の成長機構,結晶の完全性,あるいは結晶のモルフォロジーの理解にとって基本的に重要な課題である.この問題はまた,溶液構造や錯塩化学と関連した問題でもある.結晶成長に関する従来の理論はすべて原子あるいはイオン単位の成長単元を前提として組みたてられている.一方,結晶成長についての実験結果の夛くは,もっと大きなクラスターを成長単元と考える必要性を示唆している.本研究のねらいは,この点の解明である.そのためにレーザー老による光散乱法(光混合法のうちの光子相関法)により, n.m.サイズの粒径測定を行なう装置を開発した.これは,市販の大塚電子製レーガー粒径解析システムのうち記録・データ処理部のみを利用し,独自に開発した原則・測定部とを組みあわせたものである.空気調節によって温度を制御した水溶液を不飽和→飽和→過飽和状態へと変化させ,この変化に伴なうクラスターサイズ変化を,クラスターのブラウン運動によるドップラー効果に起因するレーリー散乱光のスペクトルとしてとらえ,それを光混合法(光子相関法)によって解析し,粒径サイズを測定しようとする方法である.本装置を開発し,標準試料による検証を行なった上で,水溶液系での廣糖,およびロッシエル塩溶液を用いて,不飽和→飽和→過飽和変化に応ずる粒径変化をしらべた.その結果,両溶液ともで,粒径10n.m.以下のクラスターの存在が認められ,そのサイズはこの変化に応じて増大する傾向があることがわかった.この方法は,今後,溶液系での成長単元を実験的にしらべるのに有効であろうという見透しが,本研究を通じてたてられた.本研究の目的は、主として溶液相から結晶が成長する場合の成長單元のサイズ、挙動を実験的に明らかにするところにある。数十オングストロームないしそれ以下のサイズの粒子の運動を把握しなければならないから、考えうる手段は、これら会合粒子(クラスター,胚芽状粒子)のブラウン運動を、レーザー光を用いて測定する光散乱法である。この方法と、すでに代表者の研究室で開発・成功している結晶成長過程のその場観察法、および成長中の結晶のまわりでの拡散場や対流を視覚化する方法とを組みあわせることによって、当初の目的を達成することができる。媒質中の徴細粒子のサイズや、その拡散定数の測定法として、コロイド中の懸濁粒子の測定のためサブミクロン粒子アナライザーが開発されている。これはブラウン運動をする粒子のレーザー光による散乱光のドップラー効果を測定することによって粒子サイズ、拡散定数を測定する方法である。しかしこの方法は、そのままでは粘性の小さい水溶液中での粒子サイズの測定には適さず、種々の改良をほどこすことが必要である。また、結晶の成長單元の測定にこの方法を適用した例はない。そこで、本年度は主としてこの方法を水溶液系に適用するための実験的検討を行ってきた。この検討に用いた系は、ロッシエル塩,シヨ糖,NaCl,KN【O_3】,Ba【(NOー3)ー2】の水溶液系である。その結果、必要な改良、組みあわせを行なうことによって、径30オングストローム程度まで測定できる見透しがたてられた。そこで、これらの結果をふまえて、まったく新しくシステムを考え、それをもとにサブミクロン粒子アナライザー1式、およびこの実験に必要な顕徴鏡,写眞撮影装置,デジタルマルチメーターなどの附属装置の発注を行ない、納入された。
東北地方におけるCATVと地域情報のあり方に関する社会学的研究

東北地方におけるCATVは、そのほとんどが山間部や新幹線による電波障害の難視聴対策のものであり、自主放送施設となっているのは、八戸市の南部ケーブルネットワーク、花巻市のみちのくメディコム、釜石市の釜石テレビ、一関市の一関テレビ、気仙沼市の気仙沼有線テレビ、酒田市の酒田ケーブル・テレビの6つである(昭和63年3月現在)。しかも、その多くは、営業内容、番組編成、バックアップ体制において、きわめてきびしい状態におかれている。これらのCATVの番組内容は、行事・催物、行政・広報など身近な情報や地域の情報からなるローカル・ワイド・ニュース、映画・音楽、教育・教養、また、お祭りや市議会の中継が多くなっている。しかし、その視聴率は、一般のテレビ番組に比べて極端に低い状態である。他方、人々の日常的な地域情報接触は、天気・気象、産業、身近な出来事、行事・催物、災害に関するものが多い。そして、地域情報要求としては、産業、行政、医療・福祉、文化・教育が多くなっている。したがって、「地域情報」の構成としては、身近な情報、地域の情報、および行政と産業の情報をベースに、医療・福祉、文化・教育、そして災害の情報がその上に存在しているといえる。CATVの今後のあり方としては、まず、身近な情報、地域の情報の伝達にいっそう努めるとともに、行政や産業の情報についても、その内容を拡大し、さらに、文化・教育、医療・福祉に関する情報を新たに開拓していき、また、地域の特性に応じて、災害情報の迅速かつ正確な提供に力を入れていく必要がある。これらのことによって、CATVは、今後、地域情報メディアとしての機能を十分に発揮することが可能となろう。1.東北地方におけるCATVの施設数は昭和60年3月現在約2400であるが、その大半は再送信だけのものであり、自主放送を実施中ないし実施予定のものは6施設である。そして自主放送施設のいずれもが現在のところ加入者や広告収入が少ないとか番組制作費がかかるなど経営上,番組制作上困難をかかえており、かなりきびしい状態に置かれている。しかし、各施設とも地域に密着した地域情報メディアとして次第に住民に親しいものとなっている。2.CATVの番組内容としては、(1)行事・催物,(2)教育・教養,(3)行政・広報,(4)文化・歴史,(5)娯楽・スポーツが多いが、とくに身近な情報や地域の情報,またお祭りや議会の中継がよく視聴されている。3.宮城県気仙沼市のCATV視聴者によってよく接触されている地域情報は、(1)農業・水産業・工業・商業,(2)身近な出来事,(3)天気・気象などがあげられるが、(1)買物や(2)文化・歴史はそれほど多くない。また、強く要求されている地域情報としては、(1)農業・水産業・工業・商業が最も多く、次いで(2)行政,(3)医療,(4)文化・歴史,(5)福祉に関するものが多くなっている。4.地域情報メディアとしてのCATVは、現在、身近な情報や地域の情報を多く提供することに力を入れており、また視聴者もそれを強く望んでいる。そして、視聴者の3人に1人がテレビ画面に出た経験をもっており、地域メディアとしてのCATVの機能を十分に発揮している。ただし、今後も画面に出たいと希望する人はあまり多くない。しかし、視聴者を参加させる番組を多くしてほしいという要望はなお強く、とくに、イベントや企画・制作への参加希望は若者を中心にむしろ多くなっている。さらに、将来において、CATVをつうじて多目的利用をしたいという希望はかなり強く、とりわけ(1)ヘルスケア,(2)セキュリティ,また(3)リザベーションへの要望が多いことは注目に値いする。

1.東北地方におけるCATVは,既に5年以上のキャリアをもち安定した経営を行なっているもの,逆に,かなり不安定な状態にあるもの,また,放送開始を公表しつつも実質的中止に追い込まれたもの,そして,近い将来において華々しくスタートしようとするものと多様な様相を呈している.2.酒田ケーブルテレビは地域教育の振興,地域情報の提供,住民相互のコミュニケーションの活発化を目的に昭和60年に営業を開始した.しかし,加入世帯がわずか500と少なく,現在,体制の建直しが行なわれている.不振の何よりの理由はエリア(商店街)内の住民のニーズを十分に把握できなかったことである.したがって,今後は,地域に密着した情報をいかに提供していくのかが課題である.そのために,酒田市のニューメディア・コミュニティ構想や庄内情報プラザとのかかわりを強めていくことが必要とされる.3.石巻テレビ放送は昭和60年に放送認可を得たが,実際に開局されることなく,現在,計画自体が中止状態となっている.電柱・道路使用の見込みちがい,架線技術の問題,そして,加入世帯が50にも達しないことが理由とされている.しかし,地域情報に対する住民の関15の低さ,ニーズのあいまいさに最大の原因が存在している.4.他方,都市型CATVを目指す仙台CATVは再送信に加えて,音楽・スポーツ・映画などのペイテレビ,ホテル宿泊者への番組提供,そして将来は,ホームショッピング,バンキング,セキュリティの実施を目指している.昭和64年11月に1万世帯の加入によってスタートすべく,現在,鋭意準備中である.指定都市の実現を目指す仙台市の地域情報化を促進するものとして人びとの期待は大きいが,その成否は住民のニーズを十分に把握し,身近な情報,地域の産業・行政・医療・福祉・災害・文化などの情報をきめこまかく提供することにかかっていよう.一関市民の地域への関心は、「自然環境」に関するものが最も多く、ついで、「福祉」、「産業」、「教育」、「医療」が多く挙げられている。また、一関市民におけ地域情報との接触は、(1)災害、(2)医療、(3)天気・気象、(4)教育、(5)自然環境に関するものが多い。そして、もっと知りたい地域情報としては、(1)医療、(2)行政、(3)福祉、(4)産業、(5)観光が多くなっている。したがって、「地域情報」としては、「災害」と「医療」に関するものが大きな比重を占めているといえる。次に、CATVに関して、そ加入理由としては、(1)「多くの民放番組を見たい」、(2)「地域のことをもっと知りたい」,(3)「衛生放送を見たい」が多くなっている。そして、CATVを見て得られたこととしては、(1)「地域のことをよく知るようになった」こと、(2)「身近なことをよく知るようになった」ことが多い。また、CATVに対して多くしてほしい地域情報としては、(1)行事・催物、(2)身近なこと、(3)観光、(4)行政、(5)文化・歴史が多く挙げられている。そして、CATVの今後の方向として、「地域情報の提供」と「身近な情報の提供」が多くなっている。地域情報メディアとしてCATVは一定の評価を得てきている。そして、一関市民の「地域情報科」のイメージは「地域産業の情報化」が最も多く、次いで「文化・教育の情報化」そして「行政サービスの情報化」が多い。
エクトイン遺伝子発現によるトマトおよびダイズの塩ストレス耐性の強化

植物の環境ストレス耐性の強化、特に塩ストレス耐性の強化はエジプトなど世界の約40%にも及ぶ乾燥、半乾燥地帯の持続的な食糧生産システムの確立のために必須である。レダ・モガイブ博士は、科学研究費補助金(特別研究員奨励費)によって、2か年間に渉って植物の塩ストレス耐性を強化するため研究を実施することができ、大きな成功を収めた。その研究の概要は次の通りである。(1)まず、海水の微生物が塩ストレス耐性に優れ、特に、古細菌(Haloferax alexandrinus)は5Mという極めて高い塩濃度下で増加速度が最も高いことを明らかにした。この点に着目し次のような研究を行った。(2)塩ストレス耐性に関る遺伝子(エクトイン合成酵素遺伝子)のクローニングに成功した。(3)また、エクトイン合成酵素遺伝子を用いて、形質転換体の作出を行い、タバコ及びトマトにおいて世界で初めて塩ストレス耐性の形質転換に成功した。以上のように、分子生物学的手法により新しい塩ストレス耐性植物を作出した。ついで、この形質転換体について、植物生理・生化学的手法によって、塩ストレス耐性を評価している。例えば、(4)転換体は相対生長から、塩ストレス耐性が野生株より高いこと、(5)その耐性強化の主要因は、光合成能をより高く維持することであり、それは、Rubisco濃度が高く、気孔伝導度も高く、蒸散流による葉への窒素供給の持続などによることを示した。これらの成果は、国際誌に投稿中である。以上のように、植物の塩ストレスを強化するための基盤を確立した。この成功に力を得て、(6)エクトイン遺伝子をダイズ、クローバなどの主要なマメ科作物に導入し形質転換を行い、耐塩性を高めると共に、同様の形質転換を根粒菌についても行い、この両者による植物-根粒菌共生系の塩ストレス耐性の強化のための研究を展開している。以上の研究は、世界的にも初めての成功であり独創性が高い研究であるのに加えて、特に、マメ科植物-根粒菌などの窒素固定共生系の塩ストレス耐性の強化は、発展途上国など食糧不足がしばしば深刻化する国々の持続的生産体系の確立に資する所、極めて大きいものと評価できる。
唾液中ストレスマーカーを用いた体重階級制アスリートのコンディション評価の確立

レスリングや柔道などの体重階級制競技は、短期間に急速な減量をすることより、試合時にコンディションを崩すことが経験的に問題視されてきた.しかしながら、これまで体重階級制アスリートに着目し、減量時のコンディショニングに関する研究は十分ではなかった.そこで本研究では、体重階級制競技における減量の実態把握と減量時の生体内ストレス応答変化を検討し、さらに心身のコンディションとの関連性を検討する.上述の研究課題を明らかにすることは、過剰な減量を制限するための指針案の作成や、選手の個人特性に応じたコンディショニングへの応用が可能となり、アスリートの競技力向上のためのコンディショニング法としての応用が期待できると考えられる.そこで、平成19年度では、体重階級制競技選手を対象とし、実際に行われる減量時のストレス状態の変化について検討し、減量時に特異的にみられる唾液中ストレスマーカーを探索することである.レスリング選手を対象とし、通常の体重時の測定(通常期)、実際の試合前に行われる計量時(減量期)、試合後の回復期(回復期)に測定を行った。測定項目は、唾液中ストレス因子として、コルチゾール(異化ホルモン)、テストステロン(同化ホルモン)、クロモグラニン(心理的ストレスの指標)、アミラーゼ(交感神経系の指標)とした。通常期に比べて減量期の唾液中ストレス因子は明らかに変化し、減量による心身のストレス状態を評価できるストレス因子として、アスリートのコンディション評価に応用できる可能性が示された.レスリングや柔道などの体重階級制競技は、短期間に急速な減量をすることより、試合時にコンディションを崩すことが経験的に問題視されてきた.しかしながら、これまで体重階級制アスリートに着目し、減量時のコンディショニングに関する研究は十分ではなかった.そこで本研究では、体重階級制競技における減量の実態把握と減量時の生体内ストレス応答変化を検討し、さらに心身のコンディションとの関連性を検討する.上述の研究課題を明らかにすることは、過剰な減量を制限するための指針案の作成や、選手の個人特性に応じたコンディショニングへの応用が可能となり、アスリートの競技力向上のためのコンディショニング法としての応用が期待できると考えられる.そこで、平成19年度では、体重階級制競技選手を対象とし、実際に行われる減量時のストレス状態の変化について検討し、減量時に特異的にみられる唾液中ストレスマーカーを探索することである.レスリング選手を対象とし、通常の体重時の測定(通常期)、実際の試合前に行われる計量時(減量期)、試合後の回復期(回復期)に測定を行った。通常期に比べて減量期の唾液中ストレス因子は明らかに変化し、減量による心身のストレス状態を評価できるストレス因子として、アスリートのコンディション評価に応用できる可能性が示された.
都市祭礼における山車の民俗学的調査研究−歴史的系譜と地域的類型−

従来の都市祭礼研究においては、主として氏子町組などで祭祀組織の研究に焦点が向けられており、山車の研究は疎略に扱われてきた。都市祭礼においては山車・仮装・つくり物などに地域的特色が反映され、これらが町中を練り歩く練物は、地域社会の独自性を体現する事象として注目すべきである。今年度は、三重県津市の津八幡宮祭礼、鹿児島市の鹿児島神宮祭礼、愛媛県西条市伊曽野神社との西条祭礼、三重県上野市の天神祭礼、長崎県長崎市の長崎クンチ、静岡県島田市大井神社の島田帯祭り、仙台市東地大学図書館における仙台東照宮祭礼(絵画と文献)、岩手県花巻市の花祭り、青森県三戸町の三戸祭り、岩手県盛岡市の盛岡祭り、山梨県富士吉田市の浅間神社祭礼、埼玉県秩父市秩父神社祭礼、和歌山県闘鶏神社祭礼、愛知県津島市の天王祭り、岡山市玉井宮の岡山東照宮祭礼、栃木県日光市の日光東照宮祭礼関係の祭礼資料を収集した。
光刺激による超分子キラリティの発現とその応用

本研究は"光応答性部位を持つアキラルなアモルファス高分子材料の薄膜において分子のらせん状3次元配列が光誘起される新現象について探求すること"、ならびに、"その光学的応用を検討すること"を目的としている。本年度は、まず"配向と構造化を記述する詳細モデル"の確立を掲げ、光学異方性分子の配向と構造化に由来する伝播光の状態変化を定式化する詳細モデルの確立を図った。その結果、光誘起キラリティ材料ならではの光アドレス型変調制御機能を理論的に予測し、デバイス応用に役立てることが可能になった。その結果を踏まえて、情報セキュリティ用途への新しい応用を検討し、1件の特許出願を行った。その他、光学機能を視野角補正板や特殊回折格子の考案と提案を行った。(ただし、代表研究者の退職により研究が最終年度途中にて中止せざるを得なくなったため、本研究提案にて予定していた光アドレス型新規光学デバイスの提案・実証の一部は完了しなかった。)考案した新規光学素子については、今後、特許取得や論文発表を行ってゆく予定である。理論的な検討に加えて、光学異方性分子の配向と構造化において、分子のn-π*遷移が非常に重要な鍵を握っていることが明らかとなった。n-π*遷移とπ-π*遷移を励起する2波長同時励起法による実験を行ったところ、2つの遷移を励起するレーザー強度のバランスが重要であることが分かり、その最適化の結果、約30%の光誘起光学回転の応答速度改善など、開発した材料のパフォーマンスを最大限に引き出すための新しい方法が見出された。その他、水素結合と液晶性を組み合わせた超分子群が極めて大きな光誘起複屈折性を発現することが明らかにし、高性能新規材料の創出に向けた手がかりを得た。今後、特許取得・論文発表を予定している。これらの結果は、2報の国際誌、1報の国内誌、1件の特許出願(国内)として発信した。本年度は、薄膜中に光形成されるらせん構造をIn Situ観測するためのポンプ-プローブ精密偏光光学系の構築を行った。全てのストークスパラメータのIn Situ自動測定が可能となり、光構造化過程のダイナミクス追跡が可能になった。その結果、他の材料では達成されていない極めて大きな光誘起光学回転値(42°/μm以上)が発現するプロセスの検討をより詳細に行うことができた。このことは分子の巨視的な構造化のメカニズムを考察するための大きな一歩になった。一方では、光応答性部位(ヘテロ環アゾ化合物)と大きな複屈折部位(固有複屈折0.6以上のπ共役化合物)を持つ共重合体について新規材料の合成に着手し、各セグメントの協同運動に基づく大きな光誘起旋光能や円二色性の発現を狙った。その結果、各セグメントの協同運動は光応答性部位と複屈折部位の双極子モーメントや化学構造のみならず、相溶性や固体中での運動性(立体障害性)にも大きく左右されることが明らかとなった。本年度購入した示差熱熱量計は共重合体の熱特性と光機能の関係を明らかにすることに大いに役立ち、現象機構解明の一助となった。このことは次年度も引き続き進める新規高性能材料の探索に良い指針を与える結果であった。さらに、エリプソメトリによって導かれた材料のトランスフォーメーション行列に基づいて、分子の光配向と構造化を簡便に記述する近似的理論モデルをまとめ、新規材料の物性評価・解析に役立てた。これらの結果は、4報の国際誌、1編の解説(図書)、1件の特許出願(外国PCT)、5件の国際会議発表(うち3件は依頼・招待講演)として積極的に発信した。(795字)本研究は"光応答性部位を持つアキラルなアモルファス高分子材料の薄膜において分子のらせん状3次元配列が光誘起される新現象について探求すること"、ならびに、"その光学的応用を検討すること"を目的としている。本年度は、エリプソメトリーの解析を厳密に行い、薄膜の光学機能を定量的に行った上で、昨年構築した数値モデルに基づく厳密なモデルにそのパラメータを反映させ、光学異方性分子の配向と構造化に由来する伝播光の状態変化について正確な予測を行うことができるようになった。その結果、極めて大きな光誘起光学回転値(42°/μm以上)を利用した光アドレス型偏光制御薄膜を実現した。一例として、半波長板としての機能の確認や、楕円率制御板としての昨日を確認できた。備品費は詳細な波長分散評価などを実験的に進めるために、現有のアルゴンレーザーでカバーできない波長領域の励起光源の購入に充てた。一方では、新しいコンセプトに基づく光応答性部位(アゾ化合物)を持つ化合物を合成し、さらに大きな光誘起複屈折性(0.35以上)と配向安定性を示す材料を見いだすことに成功した。この結果は、さらに優れた材料の開発に向けて非常に有意義な作業仮説をもたらしたと考えている。

これらの結果は、5報の国際誌、2報のプロシーディングス、1報の解説記事、1編の報告書(図書)、3件の特許出願(国内)、9件の国際会議発表(うち4件は依頼・招待講演)、18件の国内会議発表(うち7件は依頼・招待講演)として積極的に発信した。(637字)本研究は"光応答性部位を持つアキラルなアモルファス高分子材料の薄膜において分子のらせん状3次元配列が光誘起される新現象について探求すること"、ならびに、"その光学的応用を検討すること"を目的としている。本年度は、まず"配向と構造化を記述する詳細モデル"の確立を掲げ、光学異方性分子の配向と構造化に由来する伝播光の状態変化を定式化する詳細モデルの確立を図った。その結果、光誘起キラリティ材料ならではの光アドレス型変調制御機能を理論的に予測し、デバイス応用に役立てることが可能になった。その結果を踏まえて、情報セキュリティ用途への新しい応用を検討し、1件の特許出願を行った。その他、光学機能を視野角補正板や特殊回折格子の考案と提案を行った。(ただし、代表研究者の退職により研究が最終年度途中にて中止せざるを得なくなったため、本研究提案にて予定していた光アドレス型新規光学デバイスの提案・実証の一部は完了しなかった。)考案した新規光学素子については、今後、特許取得や論文発表を行ってゆく予定である。理論的な検討に加えて、光学異方性分子の配向と構造化において、分子のn-π*遷移が非常に重要な鍵を握っていることが明らかとなった。n-π*遷移とπ-π*遷移を励起する2波長同時励起法による実験を行ったところ、2つの遷移を励起するレーザー強度のバランスが重要であることが分かり、その最適化の結果、約30%の光誘起光学回転の応答速度改善など、開発した材料のパフォーマンスを最大限に引き出すための新しい方法が見出された。その他、水素結合と液晶性を組み合わせた超分子群が極めて大きな光誘起複屈折性を発現することが明らかにし、高性能新規材料の創出に向けた手がかりを得た。今後、特許取得・論文発表を予定している。これらの結果は、2報の国際誌、1報の国内誌、1件の特許出願(国内)として発信した。
人工土壌作出による土壌微生物および根圏微生物の動態解明

メタゲノム解析の結果、有機質肥料活用型養液栽培における根圏微生物のうち硝化菌が約1%を占める特異な生態系が明らかとなった。根圏微生物は植物種ごとに異なり、独自の微生物相を示した。根圏微生物から側根促進物質が抽出され、根の発達に大きく関与することが示唆された。単独では病原菌への拮抗性を示さず他の微生物と組み合わせると拮抗作用を示すペアが発見され、創発的な拮抗性が明らかとなった。有機質肥料活用型養液栽培は土耕栽培と比べ根圏の観察・サンプル採取が非常に容易でありながら、土壌と同じように有機質肥料を分解し硝酸を生成する特徴を備えるため、根圏の世界を解明する重要な研究材料として注目されている。栽培前の培養液の微生物群集構造をDGGE法により解析したところ、土壌と同様の硝化能を有しながら比較的シンプルな微生物相を形成し、解析の容易な系であることが明らかとなった。通常は増殖が極めて遅いとされるアンモニア酸化菌Nitrosomonas属細菌、亜硝酸酸化菌Nitrobacter属菌が、23週間程度のごく短期間に増殖することが明らかとなった。マイクロトム(研究用トマト品種)を有機質肥料活用型養液栽培で栽培し、その根圏のバイオフィルムを採取して微生物相の推移を解析したところ、定植前、定植直後、それ以降の3期間で大きく異なることが分かった。バイオフィルム内には硝化菌としてNitrobacter属、Nitrococcus属、Nitrospira属、Nitrosospira属、Nitrosococcus属、Nitrosomonas属が0.01%以上の存在比で確認でき、特に亜硝酸酸化菌であるNitrobacter属は、いずれのフェイズでも0.40.9%程度の非常に高い割合で存在することが確認された。環境メタゲノムデータセットとの比較では、本栽培の菌叢はどの環境メタゲノムとも親近性は低く、独特な菌叢を形成していることが示唆された。バイオフィルムから微生物を単離培養し、それぞれについて検討したところ、根部病害病原菌Fusarium oxysporumに対する増殖抑制効果は単独では示さないものの、複数の菌株を混合培養したものではF. oxysporumに対する増殖抑制効果が現れるなど、これまでの拮抗菌の研究では知られていない興味深い現象が確認された。効率的な硝化を実現する微生物資材を開発すべく検討したところ、Bacillus badius、Nitrosomonas europaea、Nitrobacter winogradskyiの3菌株を与わせることで有機物(ペプトンや酵母エキス)を出発物質として硝酸を生成することが分かり、微生物資材のデザイン化の可能性が示された。硝化菌は有機質肥料活用型養液栽培の培養液で突出して集積する(全微生物の0.40.9%、菌密度にして10の9乗10の10乗cfu/g)ことから、従来困難とされる硝化菌の単離培養を試みた。その結果、比較的容易にN. winogradskyiが容易に分離された。ただしAlicycliphilus sp.が伴生しやすく、本菌は硝化菌と強固な関係を構築している可能性が示唆された。硝化菌が有機成分により活性を失う現象を解析したところ、亜硝酸酸化菌N. europeaは12種類のアミノ酸、2種類の有機酸で、N. winogradskyiは5種類のアミノ酸、2種類の有機酸で活性が阻害されることが明らかとなった。メタゲノム解析により、バイオフィルム内での硝化菌の活動の推移を調べたところ、培養液中のアンモニア濃度がピークを迎えた後、アンモニア酸化酵素(amoA)の遺伝子発現が増え、亜硝酸酸化酵素(norB)は亜硝酸濃度がピークを迎えた後、急激に増加することが明らかとなった。pHを調整するとそれぞれの遺伝子発現が早まるとともに活性化することが示されたことから、pH調整による硝化促進が遺伝子の面からも確かめられた。有機質肥料活用型養液栽培の生産上の安全性を確認するため、食中毒菌である大腸菌やサルモネラを調べたところ、バイオフィルム中に含まれないことが判明した。また、培養液中に大腸菌O157やサルモネラを接種しても速やかに検出限界以下になることが確認され、高い安全性が示された。ホウレン草、ネギとチンゲンサイについて有機質肥料活用型養液栽培での栽培を行い、その根のバイオフィルムの微生物叢について次世代シークエンサーによる解析を行った。その結果、いずれの植物でもParacoccus属やArthrobacter属は、上位に位置していた。一方、「好硝酸性植物」であるチンゲンサイとホウレン草は、硝化菌の密度が他の植物と比べて低い傾向にあった。「好アンモニア性植物」であるネギの微生物相で上位を占める属(Polaromonas、Verminephrobacter、Bordetella、Spirosoma、Acinetobacter、Pedobacter、Alicycliphilus、Flavobacterium、Variovorax、Albidiferax、Delftia、Dyadobacter)が、他の植物では順位が低い傾向であった。根圏微生物が植物体に与える影響をみるべく、モデル植物としてトマト(マイクロトム)を選出しトランスクリプトーム解析を行った。有機質肥料活用型養液栽培と無機栽培にて生育させたマイクロトムの根をサンプリングし、トマト組織由来のRNAを抽出、cDNAを調製し、次世代シークエンサーにてRNAseqを行い、現在、in silico発現解析にてバイオフィルム形成によって活性化される遺伝子群を同定中である。有機質肥料活用型養液栽培の微生物から微生物を単離し、Fusarium病を抑止する微生物ペアを5組発見、微生物資材の可能性を示した。

メタゲノム解析の結果、有機質肥料活用型養液栽培における根圏微生物のうち硝化菌が約1%を占める特異な生態系が明らかとなった。根圏微生物は植物種ごとに異なり、独自の微生物相を示した。根圏微生物から側根促進物質が抽出され、根の発達に大きく関与することが示唆された。単独では病原菌への拮抗性を示さず他の微生物と組み合わせると拮抗作用を示すペアが発見され、創発的な拮抗性が明らかとなった。・特定の微生物だけで(有機物を出発物質とする)硝酸生成を実現できたことは、今後の土壌学の発展に寄与するところ大である。これまで、有機物を出発原料として硝酸を生成するには土壌を用いるしかなく、無数の微生物が混在する土壌微生物では解析が極めて困難であったことが、土壌学の発展に大きな阻害要因であった。今回、Bacillus badiusとアンモニア酸化菌、亜硝酸酸化菌の3菌株のみで硝酸化成を実現できたことで、「土壌微生物エレメント」を作出する可能性が示された。・硝化菌がどのような有機成分で阻害されるのかが明らかになったことは、硝酸生成を迅速化する微生物デザインを行う上で重大な知見である。硝化菌が有機成分の暴露により活性が阻害されることは従来、経験的に知られていたが、どのような成分で阻害されるのかはこれまで十分明らかではなかった。阻害作用をもたらす有機成分が明らかになったことにより、硝化菌へのダメージを最小限にする微生物デザインが可能になると期待される。・メタゲノム解析により、硝化菌がバイオフィルム内においてどのような挙動を示すのか、解析できたことは大きい。硝化菌は自然界では通常、菌密度が非常に低く、解析が非常に困難な微生物であった。しかし有機質肥料活用型養液栽培では硝化菌がバイオフィルム中の全微生物(10の11乗10の12乗cfu/g)のうち0.40.9%と高密度に集積しており、メタゲノム解析によりその消長が植物の生育ステージに合わせて解析できたことは画期的である。以上のように、これまで知られていなかった成果が着々と得られつつあることから、当初の計画以上に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。微生物学特定の微生物だけで構成した微生物資材が、繰り返し硝酸生成を進めることができるのか、検討する。硝化菌がダメージを受ける有機成分をさらに調査し、そのダメージを緩和する方法を検討する。複数種の植物を栽培し、それぞれの根圏微生物を採取してメタゲノム解析を行うことで、植物種によって根圏微生物で形成される微生物相に影響が出るのか、解明する。当初の計画通り、栽培前および栽培期間中の微生物相の推移をメタゲノムで解析するなど、順調に研究は推移している。その過程で、事前に想定していなかった興味深い成果が複数得られたので、当初の計画以上に進展していると判断した。下記に特に注目される成果を列挙する。・硝化菌は従来、10の4乗cfu/g程度の超低菌密度までしか増殖しないとされてきたが、本栽培におけるバイオフィルム内ではNitrobacter属菌が10の8乗10の9乗cfu/g存在すると推定された。
フォトニックバンど構造における量子化された光波・電子波間の相互作用の検証

フォトニックバント構造は光学波長オーダーの多次元的な周期性によって光の発生,伝搬を制御する新しい概念構造であり,特に半導体2次元構造は,効果的な光波・電子波の相互作用,高い設計自由度,比較的単純な製作プロセスといった特徴から超高効率発光素子への発展が期待されている.本研究では,同構造中の光の状態密度,半導体への光閉じ込め係数,放射パターンをフォトニックバンド計算より求め,バンドギャップ付近での電磁界の振る舞いや実験で観測される現象を予測した.そして0.3ミクロン以下の直径と1ミクロン以上の高さをもつ高アスペクト比超微細円柱の配列によって基板垂直方向偏波に対するバンドギャップが得られること,バンド下端で半導体へ効果的に光が局在化し,状態密度が高まること,光が半導体方向へ放射されること,等を明らかにした.また実験においては加工ダメ-ジや表面再結合の問題が小さいGaInAsP/InP半導体を上記の円柱構造に加工することを検討した,まず表面再結合の影響を考慮した円柱の発光効率を理論的に調べた結果,この材料と構造の組み合わせで1マイクロアンペアの微弱電流注入でも十分な効率が見込めることを確認した.次に電子ビーム描画法とメタン系反応性イオンビームエッチング法を併用した構造の製作条件を把握し,最適設計される円柱構造が形成可能な見通しを得た.さらに歪量子井戸発光層を含むウエハにこの加工を施したところ,直径0.3ミクロンの円柱において十分な発光強度と広がりの少ない発光スペクトルが確認され,本方法の有効性が確認された.さらに基板水平方向偏波の2次バンドギャップ条件で製作した構造の発光スペクトルを観測したところ,バンド計算で予測される偏波依存性が実際に確認された.以上の研究によりこれまで物理学の分野で概念的に語られてきたフォトニックバンド構造の実現の見通しが得られたものと考える.フォトニックバント構造は光学波長オーダーの多次元的な周期性によって光の発生,伝搬を制御する新しい概念構造であり,特に半導体2次元構造は,効果的な光波・電子波の相互作用,高い設計自由度,比較的単純な製作プロセスといった特徴から超高効率発光素子への発展が期待されている.本研究では,同構造中の光の状態密度,半導体への光閉じ込め係数,放射パターンをフォトニックバンド計算より求め,バンドギャップ付近での電磁界の振る舞いや実験で観測される現象を予測した.そして0.3ミクロン以下の直径と1ミクロン以上の高さをもつ高アスペクト比超微細円柱の配列によって基板垂直方向偏波に対するバンドギャップが得られること,バンド下端で半導体へ効果的に光が局在化し,状態密度が高まること,光が半導体方向へ放射されること,等を明らかにした.また実験においては加工ダメ-ジや表面再結合の問題が小さいGaInAsP/InP半導体を上記の円柱構造に加工することを検討した,まず表面再結合の影響を考慮した円柱の発光効率を理論的に調べた結果,この材料と構造の組み合わせで1マイクロアンペアの微弱電流注入でも十分な効率が見込めることを確認した.次に電子ビーム描画法とメタン系反応性イオンビームエッチング法を併用した構造の製作条件を把握し,最適設計される円柱構造が形成可能な見通しを得た.さらに歪量子井戸発光層を含むウエハにこの加工を施したところ,直径0.3ミクロンの円柱において十分な発光強度と広がりの少ない発光スペクトルが確認され,本方法の有効性が確認された.さらに基板水平方向偏波の2次バンドギャップ条件で製作した構造の発光スペクトルを観測したところ,バンド計算で予測される偏波依存性が実際に確認された.以上の研究によりこれまで物理学の分野で概念的に語られてきたフォトニックバンド構造の実現の見通しが得られたものと考える.
ウシグソヒトヨタケの傘分化に関わるIch1メチルトランスフェラーゼの基質探索

担子菌ウシグソヒトヨタケの子実体形成過程において傘が形成されない発生突然変異体を解析し、その原因遺伝子がo-メチルトランスフェラーゼドメインを持つタンパク質(Ich1)をコードしていることを見出した。本研究では、メチルトランスフェラーゼのメチル基供与体がS-アデノシルメチオニン(SAM)であることを利用し、Ich1酵素の基質(メチル基受容体)の特定を目指す。Ich1相同タンパク質は担子菌に広く存在されていることから、Ich1酵素基質およびその反応経路の解明は、担子菌類の子実体形成初期過程を分子レベルで理解する上で極めて重要なものになると期待される。
プラズマによる酸化ストレス損傷のメカニズム解明と革新的プリオン病治療法の開発

プリオン病原体を研究対象とし、酸化ストレス損傷の観点から大気圧プラズマトーチによる不活化機構の解析を行った。さらには、プリオン感染細胞と非感染細胞の酸化ストレス抵抗性の違いを利用した、感染細胞の選択的除去による治療応用へと展開するための基礎研究を行った。昨年までに大気圧プラズマトーチによる処理でプリオンが分解できるとともに試験管内増殖能も低下させることができることを明らかにしている。さらに、酸化ストレス物質が大気圧プラズマトーチから発生しているか確認するため、大気圧プラズマトーチ稼働時に発生している酸化ストレス物質を電子スピン共鳴(ESR, Electron Spin Resonance)を用い、スピントラップ剤を組み合わせてラジカル種同定を行った。その結果、HラジカルやOHラジカルの発生が確認された。このことから、大気圧プラズマトーチから酸化ストレス物質が産生していることが分かった。そこで平成30年度は、プリオン感染細胞に対する効果を調べるため、プリオン持続感染神経細胞ScN2aとプリオン非感染神経細胞N2aをシャーレ上で培養した状態でプラズマ照射を行った。その結果、ScN2a細胞の方がN2a細胞よりも高いプラズマ感受性を示した。ScN2aはN2aよりも酸化ストレスに弱いことが知られているため、プラズマに対する感受性の違いも酸化ストレス感受性で説明できるものと考えられた。さらに、酸化ストレス物質を消去するラジカルスカベンジャーを培地中に添加してプラズマ処理すると細胞死が抑制されたため、これも酸化ストレスの関与を示しているものと考えられた。現在までの研究で、大気圧プラズマトーチによるプリオンの分解効果や試験管内増殖能の低下が確認できただけでなく、プリオン持続感染神経細胞ScN2aとプリオン非感染神経細胞N2aに対して感受性の違いがあることも確認できた。さらには、ラジカルスカベンジャーを用いた実験で酸化ストレス物質の関与も証明できた。これらのことから、当初の予想よりも大幅に進展したと考える。一方で、さらにインパクトのある研究成果として取りまとめるための解析がいくつか必要と考えており、残りの研究期間で集中的にそれらの実験を行う。今年度、直接細胞を培養しているシャーレに大気圧プラズマトーチの処理を行い、プリオン持続感染神経細胞ScN2aとプリオン非感染神経細胞N2aの感受性の違いがあることを明らかにした。今後の研究では、大気圧プラズマトーチであらかじめ処理を行った培地でこれらの細胞を培養することで感染細胞が除去できるかを調べる。その際、酸化ストレス物質を消去するラジカルスカベンジャーを培地に添加した場合と比較し、培地中の酸化ストレス物質がプラズマによる細胞死に関与しているかの解析も行う。プラズマは活性種(ラジカル等)や紫外線などの複合的効果で酸化ストレス作用をもたらす。酸化ストレス損傷により、病原体は不活化され、細胞はアポトーシスに陥る。本研究では、プラズマにより誘導される酸化ストレス損傷に焦点を絞り研究を進めている。抵抗性の最も高い病原体であるプリオン病原体を研究対象とし、酸化ストレス損傷の観点からプラズマによる不活化機構の解析を行っている。さらには、プリオン感染細胞と非感染細胞の酸化ストレス抵抗性の違いを利用した、感染細胞の選択的除去による治療応用へと展開するための基礎となる研究を行っている。これらの目的達成のため、初年度である平成28年度には以下の研究成果を得た。まず、静電誘導サイリスタ電源を用いた窒素ガスプラズマ装置や高周波電源を用いたトーチ型プラズマ装置でプラズマの生成を行い、その際に発生する酸化ストレス物質をケミカルインジケーターで解析した。そして、トーチ型プラズマ装置については電子スピン共鳴による解析を進め、OHラジカルやHラジカルの発生を確認した。さらに、PMCA(protein misfoldng cyclic amplification,異常折りたたみ蛋白質反復増幅)を用いた解析で、窒素ガスプラズマ処理によりプリオンの試験管内増殖能が低下することを明らかにした。また、治療応用の研究を行うため、シャーレ上で培養しているプリオン感染細胞や培養液にガスプラズマ照射を行った後、細胞に培地を添加する実験を開始した。当初の計画通り研究が進んでおり、概ね順調に進展していると考えられる。これらの目的達成のため、平成29年度には以下の研究成果を得た。まず、高周波電源を用いたトーチ型プラズマ装置でプラズマの生成を行い、シャーレ上で培養している細胞にプラズマ照射を行った後、感染細胞と非感染細胞の細胞死の割合を比較したところ、プリオン感染細胞が非感染細胞に比べて感受性が高いことを明らかにした。さらに、培養液にプラズマ処理を行い、その培地を細胞に添加して培養した場合についてもプリオン感染細胞の方が非感染細胞に比べて細胞死の割合が高いことを明らかにした。また、培地に血清を添加することでプラズマ処理による細胞死が抑制されたため、酸化ストレス物質がこの感受性の違いに関わっている可能性が考えられた。そこで、プラズマ処理時に様々なラジカルスカベンジャーを添加した条件で実験することで酸化ストレス物質の寄与を明らかにする実験を開始した。

プリオン感染細胞が非感染細胞に比べてプラズマに対する感受性が高いことが様々な解析で明らかとなり、当初の計画以上に研究が進展しているといえる。プリオン病原体を研究対象とし、酸化ストレス損傷の観点から大気圧プラズマトーチによる不活化機構の解析を行った。さらには、プリオン感染細胞と非感染細胞の酸化ストレス抵抗性の違いを利用した、感染細胞の選択的除去による治療応用へと展開するための基礎研究を行った。昨年までに大気圧プラズマトーチによる処理でプリオンが分解できるとともに試験管内増殖能も低下させることができることを明らかにしている。さらに、酸化ストレス物質が大気圧プラズマトーチから発生しているか確認するため、大気圧プラズマトーチ稼働時に発生している酸化ストレス物質を電子スピン共鳴(ESR, Electron Spin Resonance)を用い、スピントラップ剤を組み合わせてラジカル種同定を行った。その結果、HラジカルやOHラジカルの発生が確認された。このことから、大気圧プラズマトーチから酸化ストレス物質が産生していることが分かった。そこで平成30年度は、プリオン感染細胞に対する効果を調べるため、プリオン持続感染神経細胞ScN2aとプリオン非感染神経細胞N2aをシャーレ上で培養した状態でプラズマ照射を行った。その結果、ScN2a細胞の方がN2a細胞よりも高いプラズマ感受性を示した。ScN2aはN2aよりも酸化ストレスに弱いことが知られているため、プラズマに対する感受性の違いも酸化ストレス感受性で説明できるものと考えられた。さらに、酸化ストレス物質を消去するラジカルスカベンジャーを培地中に添加してプラズマ処理すると細胞死が抑制されたため、これも酸化ストレスの関与を示しているものと考えられた。現在までの研究で、大気圧プラズマトーチによるプリオンの分解効果や試験管内増殖能の低下が確認できただけでなく、プリオン持続感染神経細胞ScN2aとプリオン非感染神経細胞N2aに対して感受性の違いがあることも確認できた。さらには、ラジカルスカベンジャーを用いた実験で酸化ストレス物質の関与も証明できた。これらのことから、当初の予想よりも大幅に進展したと考える。一方で、さらにインパクトのある研究成果として取りまとめるための解析がいくつか必要と考えており、残りの研究期間で集中的にそれらの実験を行う。当初の計画通り、1生成したプラズマの基礎特性と酸化ストレス物質の同定、2プラズマによる酸化ストレス損傷メカニズムの解明、3プリオンの活性を指標とした効果的なプラズマ殺菌パラメータの解明、4プリオン病の治療法開発を目的とするプラズマのプリオン感染細胞への作用解明を進めていく。プリオン感染細胞が非感染細胞に比べてプラズマに対する感受性が高いことが分かったため、これらの細胞が起こす細胞死がアポトーシスであるかについての解析やその分子機構の解析を進めていく。
遺伝性神経変性疾患に対する非侵襲遺伝子治療法の開発(BBBを越えられるか?)

1.リソゾーム酵素受容体発現ベクターの構築:ヒト胎盤RNAライブラリーからリソソーム酵素受容体である全長7.6kbのマンノース-6-リン酸レセプター(M6PR)遺伝子をPCRクローニングした。M6PRからinsulin-like growthfactor II receptor(IGFIIR)機能を欠損させた4.8kbのminigeneがリソゾーム酵素受容体活性をもつことを示した。Minigeneを組み込んだレンチウイルスベクターを作製し、浮遊系細胞を含む様々な細胞でM6PRを強制発現させることを可能にした。このレンチウイルスベクターをヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC細胞)やラットのBBB細胞に感染させたところM6PRminigeneの発現とASAの細胞内への取り込みが確認された。M6PRminigine発現レンチウイルスベクターはリソゾーム酵素の細胞内移動の研究に役立つだけでなく、リソゾーム病の酵素補充療法や作用増強や、BBBを越えての神経組織の治療に役立つことが期待される。2.ウイルスベクターの髄腔内投与による中枢神経系組織への遺伝子導入:現在、研究されているウイルスベクターを脳実質内に注射する侵襲的遺伝子治療は、ヒトへの治療法としては技術的にも倫理的にも問題がある。非侵襲的遺伝子導入法として髄腔内投与法の可能性を検討した。GFPを発現するAAV1ベクターをマウスの後頭蓋窩から注入した。8週間後の解析で、広範囲の脳組織でのベクターの導入が確認された。更に、脊髄後根神経節細胞及び後索神経線維でのGFPの発現を認めた。ASAノックアウトマウスへの髄腔内投与実験では有意なスルファチドの減少が確認された。AAV1ベクターの髄腔内注入はMLD等の遺伝性神経変性疾患の非侵襲的遺伝子治療として有用であるとともに、慢性疼痛などの末梢神経疾患の治療法としても期待される。異染性白質ジストロフィー(MLD)をモデルとして、遺伝性脳神経変性疾患に対する新しい非侵襲的遺伝子治療法の開発を目的としている。リソゾーム酵素欠損症では、一般的に酵素補充療法の有効性が期待できるが神経変性を伴う疾患に対しては血液脳関門(BBB)が障害となり、有効な治療戦略が立てられていない。ウイルスベクターを脳内に注射する侵襲的遺伝子治療は、ヒトの治療法として技術的或いは倫理的に大きな問題がある。本研究では、BBBを構成する血管内皮細胞でリソゾーム酵素のレセプターであるマンノース-6-リン酸受容体(M6PR)を強制発現させ、リソゾーム酵素を血中から神経組織に非侵襲的に輸送させる方法(Transcytosis)の可能性を検討している。肝臓や筋肉での正常リソゾーム酵素の発現と組み合わせることにより、脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が実現できると期待している。ヒト胎盤RNAライブラリーから7.6kbのM6PR遺伝子のPCRクローニングに成功した。M6PRはinsulin-like growth factor II receptor (IGFIIR)機能を持つ多機能蛋白質であるためIGFIIの結合部位に変異を導入したM6PRm遺伝子を構築した。M6PR及びM6PRmの発現プラスミドベクターを作製し、培養細胞での発現をNorthern及びWestern解析により確認した。更に、これらのレセプターを発現する細胞にASAが特異的に取り込まれることを示した。動物実験を行うためにgutlessアデノウイルスベクターの作製を進めるとともに、レセプター機能を保持したminigeneを作製するために様々なdeletion mutantの機能解析を行っている。Gutlessアデノウイルスベクターやminigeneを組み込んだレンチウイルスベクターを使った動物実験を進める予定である。

ArylsulfataseA(ASA)の欠損症である異染性白質ジストロフィー(MLD)をモデルとして、遺伝性脳神経変性疾患に対する新しい非侵襲的遺伝子治療法の開発を目的としている。リソゾーム酵素欠損症では、一般的に酵素補充療法の有効性が期待できるが神経変性を伴う疾患に対しては血液脳関門(BBB)が障害となり、有効な治療戦略が立てられていない。ウイルスベクターを脳内に注射する侵襲的遺伝子治療は、ヒトへの治療法としては技術的にも倫理的にも問題がある。本研究では、BBBを構成する血管内皮細胞でリソゾーム酵素のレセプターであるマンノース-6-リン酸受容体(M6PR)を強制発現させ、リソゾーム酵素を血中から神経組織に非侵襲的に輸送させる方法(Transcytosis)の可能性を検討している。肝臓や筋肉での正常リソゾーム酵素の発現と組み合わせることにより、脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が実現できると期待している。ヒト胎盤RNAライブラリーから7.6kbのM6PR遺伝子のPCRクローニングに成功した。M6PRは15回繰り返し構造をもつ膜貫通型の巨大分子であり、insulin-like growth factor II receptor(IGFIIR)機能を持つ多機能蛋白質である。IGFIIR活性を欠損し、ウイルスベクターに組み込むための変異M6PR遺伝子の構築を試みた。その結果、4.8kbのミニジーンがfull lengthのM6PRと同様に膜表面に発現しASAを細胞内に取り込んでリソゾームに移送させる活性をもつことを確認した。このミニジーンを組み込んだレンチウイルスベクターを作製しMLDも出るマウスを使った動物実験を計画している。更に、酵素補充療法を行うためにCHO細胞を使ったASAの大量発現系を構築した。具体的な研究成果については特許出願との関係から見合わせる。Arylsulfatase A(ASA)の欠損症である異染性白質ジストロフィー(MLD)をモデルとして、遺伝性脳神経変性疾患に対する新しい非侵襲的遺伝子治療法の開発を目的としている。
肺線維化における線維化抑制物質(デコリン)による発現遺伝子の変化とその解明

Decorinの発現は細胞の増殖や静止と密接に関係している。昨年度、我々はヒト肺筋線維芽細胞株MRC-5を用いて接触阻害による静止期と血清除去による静止期を作製し、両者のDecorin発現量の差が、細胞の活性化の指標となるα-smooth muscle actin(SMA)発現量に影響することを示唆した。今回このことを裏付けるためにMRC-5細胞にDecorinを導入し、過剰発現した細胞と反対にノックダウンした細胞よりα-SMA mRNA発現量を比較した。[結果]Decorin遺伝子を過剰発現させた細胞はコントロールに比べ、Decorin mRNAは30-300倍に増加し、α-SMA mRNAは約0.7倍に減少した。Decorin遺伝子をノックダウンさせた細胞はコントロールに比べDecorin mRNAは0.2倍に減少し、α-SMA mRNAは約1.3-4倍に増加した。[考察]Decorin遺伝子のMRC-5細胞への過剰発現によってα-SMA mRNAの減少が観察され、また、逆にDecorin遺伝子のノックダウンによってα-SMA mRNAの増加が得られた。以上より、Decorin遺伝子は、MRC-5細胞のα-SMA mRNAの発現量を抑制することが明らかになったと考えられる。すなわち、Decorinがヒト肺筋線維芽細胞の活性化を抑制し、肺線維化の抑制因子の一つであることが示唆された。Decorinの発現は細胞増殖と密接に関係しており、静止期にある線維芽細胞は増殖期の細胞に比べて多量のDecorinを産生している。また、ある腫瘍細胞ではDecorinの発現の増加がcyclin-dependent kinase inhibitorの1つであるp21の発現を高め、細胞周期をG1期で止めるとされている。[方法]ヒト肺筋線維芽細胞株MRC-5を用いて、接触阻害による静止期と血清除去による静止期を作製し、経時的に細胞数、細胞の活性化の指標となるα-smooth muscle actin (SMA)蛋白発現量、Decorin及びp21 mRNA発現量を比較した。細胞数はWST-8assay、蛋白発現量はwestern blot analysis、mRNA発現量はQuantitative RT-PCRにより解析した。[結果]細胞数は血清添加培地、無添加培地の両者とも3日目よりほとんど増減がなく、Decorin及びp21 mRNA発現量も両者ともこの時期より上昇し始め、その経時的変化は相関していた。しかし、p21 mRNA発現量は両者に差はなかったが、Decorin mRNA発現量は無添加培地の細胞が血清添加培地の細胞に比べ、約5倍の増加が観察された。また、α-SMA蛋白発現量は3日目までは両者に差がなかったが、7日目より無添加培地の細胞が血清添加培地の細胞に比べて増加率の抑制を認めた。[考察]細胞数、Decorin及びp21 mRNA発現量の経時的変化より両者とも3日目より静止期に至っており、この細胞もDecorin合成-p21合成-G1 arrestという系が考えられる。また、7日目以後に血清除去による静止期の細胞が接触阻害による静止期の細胞よりα-SMA蛋白発現量の低下を認めたことにより、細胞の活性化速度の抑制が考えられる。すなわち、両者のDecorin mRNA発現量の差が、細胞の活性化の違いにも反映している可能性が示唆された。