hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インクジェット技術による簡易型・多機能紙ベースマイクロ流体デバイスの開発と応用

カラーインクを印刷した透明フィルムを,インクジェット印刷したニッケル指示薬と重ねることで,ニッケルの測定結果を線の長さで表すことに成功した。8人のユーザーによるニッケル測定の結果から,開発したPADは従来の比色分析法より高い精度や正確性でターゲットの測定が可能であることを示した。3点目の内容では,家庭用のインクジェットプリンターと紙によって,金属ー金属指示薬錯体の化学量論比が測定可能であることを示した。インクジェットプリンターは少なくとも4色のインクカートリッジを持つ。カートリッジに金属塩や金属指示薬の溶液を充填し,印刷グラフィックの色味をソフトウェア上で調節して印刷することで,種々の任意の量でそれらを紙上で混合した。ソフトウェア上で設定した金属と金属指示薬の混合比と,紙上で金属ー金属指示薬錯体が示す色強度を用いてJob plotを作成することで,5種類の金属ー金属指示薬錯体の化学量論比を正確かつ迅速に分析することに成功した。当初、平成29年度に行う予定であった研究内容はすでに平成28年度で行った。そのため、平成28年度に計画されていた「温度計型PADの開発」の代替となる研究を今後行う。インクジェット印刷の機能を駆使したPAD開発に関する新たな研究として、「インクジェット印刷によるPAD上での化学両論比測定」を行う。化学両論比の測定は、リガンドが金属やタンパク質と結合する時の様式の基礎理解という意味で重要である。例えば、金属イオンと、そのリガンドである金属指示薬が錯体を形成する時の化学両論比の測定は、金属イオンと金属指示薬を異なる物質量比で溶液にて混合し、各混合比の溶液から得られる光学的シグナル(吸光度、蛍光強度など)を定量するという手順が必要である。そこで、従来の煩雑な手順を排除するため、金属や金属指示薬を異なる物質量比で混合するという操作を、インクジェット印刷を駆使して行う。インクジェットプリンタは、少なくとも4種類のインクカートリッジを持ち、それぞれからの吐出量を自在に操ることができる。従って、金属や金属指示薬の溶液を別々に充填し、任意の量で独立に紙基板上へ印刷することができれば、スキャンや目視によって化学両論比を測定できる可能性がある。平成29年度では、金属イオンと比色金属指示薬の化学両論比測定を目的とし、まず明確な色変化が確認できるニッケル(II)とNitro-PAPSを用いてモデル実験を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
超臨界二酸化炭素を含む自然混合流体を用いた給熱システムの設計

本研究は二酸化炭素(CO_2)の臨界点近傍でCO_2とジエチルカーポネート(DEC)とを混合させたときに現れる大きな発熱に着目し,この熱効果を利用した環境対応型の給熱システムを開発することを目的として着手したものである.本年度は,これまでの基盤研究においてに設計した流体のサイクルシステムのさらなる検討に加え,CO_2に組み合わせる溶剤の検索とシステムの完成を目的として次の諸項を行った.1.これまでの給熱システムは,流量を極めて少量に限定せざるを得なかった.そこでCO_2とDECの流量のアップとそれらを有効に混合させることをねらいとして混合部の改良を行った.すなわち,これまでの単管方式に改良を加えた改良型単管方式ならびに多管方式の2種のミキサーについて主に検討を試みた.流体の総流量は,改良型単管方式では0.2 mol/min.とし,また多管方式については0.3-0.4 mol/min.とした.混合熱回収実験の結果,改良型単管方式を用いると多管方式に比較してより多くの熱量(最大5.8 kJ/molを回収可能であった.混合熱の回収率はCO_2+DEC系の発熱の最大値(約9.0 kJ/mol)に比較して約70%であり,改良型単管方式を用いた本システムは,給熱システムとして利用できることを確認した.しかし,多管方式による結果はミキサーの管長を延長することによって混合効率が向上することを示唆するもので,ミキサーの改良に有用と考えられる.2.CO_2と組み合わせる流体としてDEC以外に大きな熱効果が得られるかどうかの検索を,混合熱の測定を通して行った.今回はCO_2にエーテルとしてジイソプロピルエーテルならびにメチルtert-ブチルエーテルを組み合わせて温度298-308K,圧力5.0-7.5MPaにおける混合熱の測定を精密熱量計を用いて行った.その結果,両系の発熱の最大値はともに298K,5.0 MPaにおいて約8.0kJ/molであった.この値はCO_2+DEC系の発熱の最大値に比較してやや小さいが,既往のCO_2+DEC系の発熱の最大値約5.0 kJ/molに比較して約1.6倍に達しており,溶剤検索の有用な成果であると考えられる.本研究は二酸化炭素(CO_2)の臨界点近傍でCO_2とジエチルカーポネート(DEC)とを混合させたときに現れる大きな発熱に着目し,この熱効果を利用した環境対応型の給熱システムを開発することを目的として着手したものである.本年度は,これまでの基盤研究においてに設計した流体のサイクルシステムのさらなる検討に加え,CO_2に組み合わせる溶剤の検索とシステムの完成を目的として次の諸項を行った.1.これまでの給熱システムは,流量を極めて少量に限定せざるを得なかった.そこでCO_2とDECの流量のアップとそれらを有効に混合させることをねらいとして混合部の改良を行った.すなわち,これまでの単管方式に改良を加えた改良型単管方式ならびに多管方式の2種のミキサーについて主に検討を試みた.流体の総流量は,改良型単管方式では0.2 mol/min.とし,また多管方式については0.3-0.4 mol/min.とした.混合熱回収実験の結果,改良型単管方式を用いると多管方式に比較してより多くの熱量(最大5.8 kJ/molを回収可能であった.混合熱の回収率はCO_2+DEC系の発熱の最大値(約9.0 kJ/mol)に比較して約70%であり,改良型単管方式を用いた本システムは,給熱システムとして利用できることを確認した.しかし,多管方式による結果はミキサーの管長を延長することによって混合効率が向上することを示唆するもので,ミキサーの改良に有用と考えられる.2.CO_2と組み合わせる流体としてDEC以外に大きな熱効果が得られるかどうかの検索を,混合熱の測定を通して行った.今回はCO_2にエーテルとしてジイソプロピルエーテルならびにメチルtert-ブチルエーテルを組み合わせて温度298-308K,圧力5.0-7.5MPaにおける混合熱の測定を精密熱量計を用いて行った.その結果,両系の発熱の最大値はともに298K,5.0 MPaにおいて約8.0kJ/molであった.この値はCO_2+DEC系の発熱の最大値に比較してやや小さいが,既往のCO_2+DEC系の発熱の最大値約5.0 kJ/molに比較して約1.6倍に達しており,溶剤検索の有用な成果であると考えられる.本研究は二酸化炭素の臨界点近傍で二酸化炭素とジエチルカーボネートとを混合させたときに現れる大きな発熱に着目し,この熱効果を利用した環境対応型の給熱システムを開発することを目的として着手したものである.本年度は,昨年度までに設計した流体のサイクルシステムを更に検討し,システムの完成を目指して次の諸項を行った.1.流体のサイクルシステムは,基本的には既存のものであるが,流量を極めて少量に限定せざるを得なかったので,この問題を克服するために,まず二酸化炭素とジエチルカーボネートの流量のアップとそれらを有効に混合させることをねらいとして混合部の改良を行った.すなわち,これまでの単管方式から多管方式に替え,各管内にミキサーセトラーを設置して流量上限のアップと混合の効率化を図った.また混合による発熱を直ちに捕捉できるよう多管をジャケットで囲み,熱交換器形式を採用した.

2.流体のサイクル流量の増加には,混合部からの流体を二酸化炭素分とジエチルカーボネート分に分離する際,流体の膨張による大きな体積変化が伴うので,本研究では分離器の改良も行った.分離器の内容積を大きくし,かつ断熱膨張による温度降下に伴う流体の過冷却を抑えるためにジャケット式熱交換器型とした.以上の改良を行って熱回収実験を進めた結果,現在のところ熱回収率はかなり増大したが,昇温の度合いに著しい改良が見られていない.これはコンプレッサーの能力が限られていることによるところが大きいと思われるが,更に操作条件を検討して,給熱システムの実用化につなげたいと考えている.本研究は二酸化炭素の臨界点近傍で二酸化炭素とジエチルカーボネートとを混合させたときに現れる大きな発熱に着目し,この熱効果を利用した環境対応型の給熱システムを開発することを目的として着手したものである.本年度は,昨年度までに設計した流体のサイクルシステムのさらなる検討に加え,二酸化炭素に組み合わせる溶剤の検索とシステムの完成を目的として次の諸項を行った.1.昨年度単管方式から多管方式に改良した混合部に水冷式熱交換器を組み合わせて,両流体の混合により発生した混合熱の回収を試みた.また,内部に5μmのフィルターが内蔵されたセルを新たに設置し,混合のさらなる効率化を図った.以上の改良を行ったシステムを用いて,混合部温度303K,混合部圧力5.0MPa,総流量0.3-0.4mol/minにて混合熱回収実験を行った.その結果,本年度えられた最大回収熱量は流量0.4mol/minにおいて3838J/molであった.この値は単管方式における最大回収熱量5785J/mol(総流量0.2mol/min)に比較して低い値となり,総流量のアップによる回収熱量の増加には至らなかった.これは多管方式の混合部の管径が細くために流体の流速が速く,かつ管長が十分でないため,流体の混合が十分でなかったためであると考え,本年度の結論としては,単管方式による熱交換器を採用することとする.2.二酸化炭素と組み合わせる流体としてジアルキルカーボネート以外に大きな熱効果が得られるかどうかの検索を,混合熱の測定を通して行った.本年度は二酸化炭素にエーテルとしてDiisopropyl ether(DIPE)を組み合わせて温度298-308K,圧力5.0-7.5MPaにおける混合熱の測定をアイソサーマルマイクロカロリメータを用いて行った.その結果,本系の発熱の最大値は298K,5.0MPaにおいて8.0kJ/molであり,二酸化炭素+ジアルキルカーボネート系に比較してやや発熱量が減少したが,溶剤検索における一定の成果をえた.
カテキンの血管保護・拡張作用を仲介する新奇受容体分子の同定とその食品分野での応用

本研究では、血管内皮細胞中の(+)-カテキンの標的分子を同定することにより、(+)-カテキンによる血管内皮細胞拡張作用の分子機構を解明することを目的とした。当初使用していたマウス血管内皮細胞由来培養細胞株であるbEnd.3細胞で、カテキン刺激応答としてのNO産生に再現性のよい結果が得られなかったため、文献的に同様のNO産生能をもつことがわかっているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を材料として用い、NO産生系の至適化も試みた。しかしながらHUVECにおけるNO産生系は、応答めバックグラウンドが高く、現在まで文献で報告されているNO産生の再現を得るに至っていない。そこで、ATCCからbEnd.3細胞を再度購入し、NO産生系の再構築を試みている。一方、in vivoにおける(+)-カテキンの作用が刺激後比較的早い段階で認められたことから、翻訳後修飾レベルでの蛋白質変化も予想され、二次元電気泳動上でスポットの変化となって検出されることが期待される。そこで、8週齢、♂のICRマウスに(+)-カテキンを100mg/kgで尾静脈注射により投与し、3時間後の(+)-カテキン投与マウスとコントロールマウスの脳抽出液のタンパク質発現プロファイルを2次元電気泳動で解析した。その結果、(+)-カテキン投与により、分子量約6万、pI約8.1および分子量約1.7万、pI約8.3のスポットの増大、分子量約2.2万、pI約5.7のスポットの減少が認められた。これらのスポットは、受容体候補分子、あるいはその下流に存在するシグナル伝達に関与する分子である可能性が考えられる。今後これらのスポットを同定していく予定である。本研究では、血管内皮細胞中のカテキンの標的分子を同定することにより、カテキンによる血管内皮細胞拡張作用の分子機構を解明することを目的とする。マウス血管内皮細胞由来培養細胞株であるbEnd3細胞で、eNOSが発現していることを、ウェスタンブロッティング法で確認した。また、bEnd3細胞では、カルシウムイオノフォア刺激によってNO産生が起こることが文献的に知られているが、これも追試により確認した。当初、bEnd3細胞でカテキン刺激応答としてのNO産生が認められていたが、その応答にはばらつきがあり、なかなか再現性のよい結果が得られなかった。そこで、カテキン刺激条件の至適化を試みたが、応答のばらつきという傾向は変わらなかった。結局、bEnd3細胞の使用を断念し、文献的に同様のNO産生能をもつことがわかっているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を材料として用いることにした。現在、HUVECにおける、カテキン刺激によるNO産生系の至適化を行っている。一方、in vivoにおけるカテキンの作用が、刺激後比較的早い段階で認められたことから、翻訳後修飾レベルでの蛋白質変化も予想される。受容体候補分子がカテキン刺激によって翻訳後修飾に変化を起こし、二次元電気泳動上でスポットのシフトとなって検出されることが期待される。そこで、カテキン投与マウスとコントロールマウスの脳抽出液のタンパク質発現プロファイルを2次元電気泳動で解析した。現段階ではまだ明確なスポットのシフトは得られていないが、今後ターゲット・プロテオミクスの手法を用いることによって検出を試みる予定である。昨年度、マウス血管内皮細胞由来培養細胞株であるbEnd.3細胞で、カテキン刺激応答としてのNO産生に再現性のよい結果が得られなかったため、文献的に同様のNO産生能をもつことがわかっているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を材料として用い、NO産生系の至適化を行ってきた。

しかしながらHUVECにおけるNO産生系は、応答のバックグラウンドが高く、現在まで文献で報告されているNO産生の再現を得るに至っていない。そこで、ATCCからbEnd.3細胞を再度購入し、NO産生系の再構築を試みている。一方、in vivoにおける(+)-カテキンの作用が刺激後比較的早い段階で認められたことから、翻訳後修飾レベルでの蛋白質変化も予想され、二次元電気泳動上でスポットの変化となって検出されることが期待される。そこで、8週齢、♂のICRマウスに(+)-カテキンを100mg/kgで尾静脈注射により投与し、3時間後の(+)-カテキン投与マウスとコントロールマウスの脳抽出液のタンパク質発現プロファイルを2次元電気泳動で解析した。その結果、(+)-カテキン投与により、分子量約6万、pI約8.1および分子量約1.7万、pI約8.3のスポットの増大、分子量約2.2万、pI約5.7のスポットの減少が認められた。これらのスポットは、受容体候補分子、あるいはその下流に存在するシグナル伝達に関与する分子である可能性が考えられる。今後これらのスポットを同定していく予定である。
複数の暗号通貨ウォレットで共通に利用できるコールドストレージ機能に関する研究

本研究は同一敷地内に配置された複数の暗号通貨ウォレットにおいて利便性と安全性のバランスのとれた秘密鍵の管理手法を確立することを目的としている。そのために、多数の暗号通貨の秘密鍵を管理することができる階層的決定性ウォレットを用いたコールドストレージを試作した。暗号通貨ウォレットとコールドストレージ間では、取引情報であるトランザクションとその電子署名のデータの送受信が行われる。この通信方式として、USBシリアル通信方式、microSDを用いた記憶媒体媒介体方式、そしてNFCを用いた記憶媒体媒介方式を実装し、操作時間を評価した。エアキャップであるmicroSDとNFCを用いた記憶媒体媒介方式では、NFCの平均操作時間がmicroSDの平均操作時間の68%となることを確認した。また暗号通貨の秘密鍵管理の教育用に、秘密鍵をペーパーウォレットに分離可能な暗号通貨ウォレットを開発した。開発した暗号通貨ウォレットは決済後に秘密鍵を消去することが選択できるものである。この暗号通貨ウォレットを用いて学内飲食店2店舗でQRコード決済ができる仕組みを構築した。この仕組みについて、学生53名に対して1週間の利用実験を行った。結果、決済後に毎回秘密鍵を消去したのは53%、全く秘密鍵を消去しなかったのは32%であった。決済後に秘密鍵を消去した場合、次の決済で改めて秘密鍵を読み込む必要がある。改めて秘密鍵を読み込む操作時間は、平均で4.6秒であった。暗号通貨のBitcoinについてはコールドストレージの試作は進んでいる。同様の暗号方式を利用しているEhtereumへの拡張も可能であると考えている。しかしながら、異なる暗号方式を持つNEMなどについて拡張する場合は、より抽象化された設計が必要である。Eコマースサービスへの適用と検証については、暗号通貨では少額な決済が可能であるため少額決済に適した取引方法を検討している。ブロックチェーン教育への適用と検証については、BitcoinやEthereumといった主要な暗号通貨でプライベートなブロックチェーンの構築が容易になったことからプライベートなブロックチェーンを用いた演習を実施した。暗号通貨のコールドウォレットについては、より利便性と安全性のバランスのとれた秘密鍵の管理手法を確立することを目指す。特に接続の安全性を高めるために暗号通信のソフトウェア実装としてTLS/JWT/XML暗号署名/SOAP(WS-Security)を適用し評価する。Eコマースサービスへの適用にについては、事前に商品を注文し決済も済ませた後に商品と取りに行くモバイルオーダ&ペイへの仕組みの適用を検討する。ブロックチェーン教育への適用については、プライベートブロックチェーンと専用の暗号通貨ウォレットを用いた教材を作成する予定です。暗号通貨ウォレットと秘密鍵を管理するコールドストレージのプロトコルを策定し、それぞれを実装し1対1での通信評価を行った。ウォレットソフトウェア側とコールドストレージ側のプロトコルについては次のような3ステップを策定した。1)ウォレットソフトウェアは支払先をWebブラウザやQRコードから読み取りトランザクションを作成する。2)ウォレットソフトウェアは端末がインターネットに接続していないこと確認した後にコールドストレージにある秘密鍵でトランザクションの電子署名の要求を送信し、電子署名を受け取る。3)最後にコールドウォレットに接続しないことを確認した後にインターネットに電子署名されたトランザクションを送信する。さらに上のプロトコルに、ウォレットソフトウェアとコールドストレージを分離したまま情報交換するエアギャップについても検討した。策定したプロトコルをウォレットソフトウェアをPCに、コールドストレージをマイコンボードに参照実装し、1対1の通信を試みた。プロトコルを参照実装した1台のPCをWiFi接続し、実際にBitcoinのTestnetと接続し通信量や通信速度を評価した。ウォレットソフトウェアを実装したPCとコールドストレージを実装したマイコンボードの通信には、物理的にUSB/Bluetoothを用いてシリアル通信で実装したシリアル通信方式と、SDカードを用いてエアキャップで実装した記憶媒体方式を準備した。被験者5名に対して1トランザクションが電子署名されるまでの一人当たりの平均時間はUSBシリアル通信方式は74.75秒、Bluetoothシリアル通信方式は77.64秒、記憶媒体媒介方式は77.83秒であった。今後は記憶媒体方式にNFCを採用し、複数のウォレットソフトウェアからの電子署名の効率化を目指す。ウォレットソフトウェア側とコールドストレージ側のプトロコルの策定において、計画では同一敷地内でWiFi接続や有線LANを用いることを想定していた。プトロコルをトランザクションとその電子署名をすることに特化し単純化することで、より安全性の高いシリアル通信方式や記憶媒体方式のみを実装することとした。またエアギャップのようにウォレットソフトウェア側が秘密鍵に直接触れないようにすることで、ウォレットソフトウェアが暗号通貨のP2Pネットワークと接続の有無を確認する手順も省くことも検討している。

この仕組みについて、学生53名に対して1週間の利用実験を行った。結果、決済後に毎回秘密鍵を消去したのは53%、全く秘密鍵を消去しなかったのは32%であった。決済後に秘密鍵を消去した場合、次の決済で改めて秘密鍵を読み込む必要がある。改めて秘密鍵を読み込む操作時間は、平均で4.6秒であった。暗号通貨のBitcoinについてはコールドストレージの試作は進んでいる。同様の暗号方式を利用しているEhtereumへの拡張も可能であると考えている。しかしながら、異なる暗号方式を持つNEMなどについて拡張する場合は、より抽象化された設計が必要である。Eコマースサービスへの適用と検証については、暗号通貨では少額な決済が可能であるため少額決済に適した取引方法を検討している。ブロックチェーン教育への適用と検証については、BitcoinやEthereumといった主要な暗号通貨でプライベートなブロックチェーンの構築が容易になったことからプライベートなブロックチェーンを用いた演習を実施した。複数の暗号通貨ウォレットとコールドストレージのプロトコルを策定し参照実装する。コールドストレージで多数の秘密鍵を管理するために、階層的決定性ウォレット(BIP0032/BIP0044)を用いる。高速かつ安全に秘密鍵を生成するアルゴリズムを検証する。さらにN個の複数の暗号通貨ウォレットと1個のコールドストレージを誤りなく接続するために、認証や識別の機能をプトコロルに追加し評価する。暗号通貨のコールドウォレットについては、より利便性と安全性のバランスのとれた秘密鍵の管理手法を確立することを目指す。特に接続の安全性を高めるために暗号通信のソフトウェア実装としてTLS/JWT/XML暗号署名/SOAP(WS-Security)を適用し評価する。Eコマースサービスへの適用にについては、事前に商品を注文し決済も済ませた後に商品と取りに行くモバイルオーダ&ペイへの仕組みの適用を検討する。ブロックチェーン教育への適用については、プライベートブロックチェーンと専用の暗号通貨ウォレットを用いた教材を作成する予定です。情報収集および研究成果発表のためにInternational Conference on E-Commerceにおいて参加および発表する計画を立てていた。しかしながら、校務と重なったため参加できなかった分が次年度使用額となった。
コンプレッサー特性の同定試験によるヒートポンプ暖冷房の実働性能計測法の確立

ルームエアコンディショナーの実働エネルギー効率をフィールド実測によって把握するために、冷媒エンタルピー法をベースとした冷媒側から暖冷房出力を推定する計測方法を検討した。人工気候室において冷媒流量や圧縮機回転数等を計測し、冷媒流量の推定方法を構築した。冷媒流量から計算した暖冷房負荷と室内機におけるAE法で計測した暖冷房負荷とを比較した。本研究において、ヒートポンプ暖冷房の能力を冷媒側の熱収支から推定する冷媒エンタルピー法を開発する。冷媒エンタルピー法は圧縮機の回転数と圧縮機の入口および出口の冷媒温度等から冷媒流量を推定する方法(冷媒流量推定法)と、冷媒流量推定法から求めた冷媒流量および熱交換器入口と出口の冷媒温度から暖冷房出力を推定する方法(暖冷房出力推定法)によって構成される。本年度は冷媒流量推定法を開発することを目的として、室内側と室外側の温湿度条件を再現するための2つの人工気候室内にルームエアコンディショナーを設置し、冷媒流量を推定する方法が正しいかどうかを検証するための冷媒流量計測装置を製作した。具体的には、凝縮器と膨張弁の間に冷媒流量計(コリオリ流量計)を設置し、流量および冷媒の状態(温度・圧力)を計測するセンサを取り付けた。製作した冷媒流量計測装置の試運転を行い、暖房条件および冷房条件における流量計測を実施した。流量計測は問題無く実施できたが、冷媒流量計測装置自身の圧力損失が高く、冷媒温度から推定したモリエル線図の検討結果から、通常の運転よりも高圧側冷媒の圧力が高くなっていること、膨張弁の開度が大きいことなどが指摘でき、計測装置の改良を行った。計測装置の改良を行うと伴に、圧縮機の仕様(吐出量など)や圧縮機回転数、圧縮機周りの冷媒状態を入力として、冷媒流量を予測する方法を開発した。圧縮機の消費電力を別途計測するとともに、高圧側の冷媒温度等からある程度、圧縮機効率を予測できる可能性を示した。本研究では、ヒートポンプ暖冷房の能力を冷媒側の熱収支から推定する冷媒エンタルピー法を開発している。本方法は圧縮機の回転数等から冷媒流量を推定する方法(冷媒流量推定法)と、冷媒流量推定法から求めた冷媒流量および熱交換器入口と出口の冷媒温度から暖冷房出力を推定する方法(暖冷房出力推定法)によって構成される。今年度は、冷媒流量計やサイトグラス、切替弁等の圧力損失が大きかった冷媒流量計測装置を改良して冷媒流量を計測し、CC法による計算値と測定値との冷媒流量の比較、空気エンタルピー法、冷媒エンタルピー法、CC法による処理能力の比較を行った。CC法による能力は、空気エンタルピー法や冷媒エンタルピー法に比べて10%程度の誤差を持つ結果となった。一方で、冷媒流量計測については、運転条件によっては非常に誤差が大きいと考えられる結果となった。CC法を検証する際、空気エンタルピー法により検証する場合にはある程度熱交換器入口・出口のエンタルピー差を推定する必要があるため、できれば冷媒流量で直接比較するのが望ましい。様々な条件で安定的に冷媒流量が計測できることが今後の課題であると思われる。昨年度、ルームエアコンディショナーを対象とした人口気候室内に製作した冷媒流量推定法を検証するための冷媒流量計測装置を用いて、JISの定格条件に基づく暖房及び冷房運転条件において冷媒流量を計測した。その際、冷媒の流れの状況を可視化する装置や温度・圧力等の計測装置が要因で冷媒流量計測装置自体の圧力損失が大きく、通常の運転と比較して冷凍サイクルの状態が異なってしまうという昨年度課題となっていた問題を解決するために、より実働状態(実際の運転に近い圧縮機と膨張弁の制御)で計測できるように測定装置の改良を行った。改良した本装置を用いて、室内側及び室外側の温湿度、暖冷房負荷等の運転条件をさまざまに変化させて、その場合の冷媒の圧力と流量の関係について検討した。検討の結果、運転条件及びそれに起因する冷媒状態によって冷媒の流量計の計測精度が著しく悪化することが分かり、それらを解決するための次年度に向けた課題抽出を行った。また、次年度にはルームエアコンの能力測定のためのフィールド実験を予定しており、計測サイトの選定及び次年度の夏期の冷房実測の計画をたてた。当初の計画通り、冷媒流量計測装置を製作し、試運転を行い、冷媒流量が計測できることが確認された。また、そこから得られた測定データを用いて、冷媒流量の推定ができる可能性を示した。ただし、冷媒流量計測装置の圧力損失が想定よりも大きく、装置をより圧力損失の小さいものに作り直したため、「(3)やや遅れている」とした。25年度が最終年度であるため、記入しない。

昨年度製作・改良した冷媒流量計測装置を用いて様々な運転条件における冷媒流量の測定と予測式の適用を行った。冷媒の状況によっては冷媒流量計測の精度が著しく低下することが見て取れたため、今後、予測方法の修正を行う。そのため、「(3)やや遅れている」とした。本年度は昨年度作成した冷媒流量計測装置を活用し、引き続き、冷媒流量推定法を開発することを目的として、室内側と室外側の温湿度条件を再現するための2つの人工気候室内にルームエアコンディショナーを設置して実験する。また、年度の後半において、熱交換器前後の冷媒エンタルピーを予測する手法を開発する。25年度が最終年度であるため、記入しない。次年度、ルームエアコンディショナーの夏期及び冬期の実測を計画している。加えて、本年度の冷媒流量計測の精度の検討結果より明らかとなった課題に対応するために、別途、圧縮機単体の流量計測を行う予定である。
多感覚統合による自他の統合と向社会的行動　―社会的共生に向けた基礎的研究―

従来の研究では、共感、援助行動などの向社会的行動が主に内集団の成員に対してしか示されないことを示している。本研究では、自己の行為と外集団成員の行為の随伴性を操作することにより、自己の行為に他者の反応が随伴し、かつ、自己の行為に対する他者の反応が予測できる時には、潜在的な外集団差別が低下し、外集団成員に対する援助行動が促進されることが示された。また、随伴性のある場合には、その他者の存在を近くに感じることも示された。共感、援助行動などの向社会的行動を調べた研究では、向社会的行動が主に内集団の成員に対してしか示されないことが示されている。本研究では、成人を対象に、自己の行為に対する外集団成員の応答の随伴性を操作し、随伴性のある場合には、外集団成員への潜在的な好感情が生じ、外集団成員に対する援助行動を示すようになるかを検討した。まず、感情誤帰属手続きにより外集団成員に対する潜在的な好悪を測定し、差別尺度や共感尺度などの顕在指標と潜在指標のどちらが実際の外集団への援助行動を予測するかを検討した。その結果、潜在指標のみが援助行動を有意に予測することが示された。顕在的な差別尺度や共感尺度のいずれも実際の援助行動をまったく予測しなかった。次に、実験参加者の行為に対する外集団成員の応答の随伴性を操作し、潜在的な好悪への効果を調べた。随伴性は、Δp=P(E/A)-P(E/A)(あることをして応答があった確率ー何もしないのに応答があった確率)により定義した。その結果、随伴性のある場合(Δp=0.5)に、ない場合(Δp=0)に比べ、外集団成員への潜在的な好感情が高まることが示された。なお、随伴性の操作に際しては、特定の外集団成員の顔刺激を用いたが、好感情はその特定個人に限らず、その外集団全般に般化されることが示された。操作に用いていない内集団成員に対しては条件差が見られなかった。本研究では、アイコンタクトのある刺激を用いており、アイコンタクトの有無が集団全般への般化に関与している可能性があり、現在、検討を続けている。動作に特定の結果が随伴するという経験を繰り返すと、動作の結果を予測し、予測された結果を引き起こすために意図的にその動作を選択することが可能となる。動作とその結果の双方向的関係に関する表象(行為表象)は、運動制御のみならず、自他弁別にも利用される。この行為表象は、自己の動作とそれに対する他者の動作の間にも形成され、他者の行為の理解や他者との行為の協調などに利用される。この行為表象は、連合学習の法則、すなわち、時間的近接性と随伴性に基づいて形成される。ボタンを押すと音が鳴るなど、動作に随伴する結果が物理的な環境変化の場合、動作によって結果が生じるまで1秒から2秒もかかるとそれだけ学習は困難になる。しかし、現実的な対人インタラクションでは、乳児と養育者の関係ですら乳児が行動してから養育者が反応するまでには1秒から2秒かかるのが普通である。それでも人が自己の行為と他者の行為の関係性を学習するとすれば、時間的な遅延を補う何らかのメカニズムが存在するはずである。そこで、本年度は、アイコンタクトに時間を縮める効果があると仮説を立て、恒常法など精神物理学的方法を用いたいくつかの実験によりその検証を行った。暫定的な結果は以下の通りである。1自己の行為に随伴する結果の場合、行為とは無関連な結果に比べて、行為と結果の間の時間が短く知覚された。2行為と結果の間が500 msと短い場合、1の効果は見られたが、結果が物理的な環境変化か、他者の行為か、さらには他者とアンコンタクトがあるかの違いは見られなかった。3しかし、行為と結果の間が1500 msと長い場合、1の効果のほかに、アイコンタクトの効果が見られ、アイコンタクトのある場合に全般的に時間が短く知覚された。また、12か月と14か月の乳児を対象に、他者と動作が同期さえすれば、音楽があってもなくても同程度に援助行動が示されることを見出した。本課題では、3年の期間内に、1模倣のように類似した動作でなくても、自己の動作に他者の行為が随伴しさえすれば、その他者が外集団成員だったとしても、その他者に対する好感情が生じ、潜在的な差別が低減することを示す。そのうえで、2同様の手続きによって、外集団成員に対しても、内集団の絆形成に関わるとされるオキシトシンなどのホルモンが分泌されることを示す。さらに、3乳児においても随伴性が向社会的行動を引き出す要因となることを示す、の3つを目指している。1は初年度に達せられ、外集団成員の行為が予測可能かつ自己の行為に随伴する場合に、それが自己の動作とは異なる動作であっても、外集団成員に対する潜在的な差別が低減し、外集団成員に対する援助行動が示されるようになることが見出されている。本年度は、さらに、自己の行為に随伴する結果の場合、行為と結果の間隔が短く知覚され、その分、学習が促進されること。また、特に行為と結果の間に遅延がある場合、アイコンタクトの有無によって時間知覚が変わり、アイコンタクトがある場合に時間が短く知覚される可能性があることを示した。

3については、先行研究において、乳児においても動作の同期により向社会的行動が促進されることが示されていたが、動作が同期していれば、必ずしも先行研究のように音楽を乳児が聴いている必要はないことが示唆された。しかし、統制条件の適切な設定など、課題も残っている。以上より、本課題はおおむね順調に進展していると判断した。初年度において、自己の行為に対して随伴的に外集団成員が応答する場合、外集団成員に対する潜在的な差別が低下し、外集団成員に対する援助行動が促進されることが示された。本年度は、以上の研究を踏まえ、1自己の行為に対して他者が随伴して応答する場合、物理的な距離は同一でも相手の存在をより身近に感じるようになるか、2多感覚統合による自他統合により相手の視点や感情の取り入れが促進されるかを検討した。1については、自己の行為に対して相手が随伴して応答する場合、相手が同一の行為を示しても随伴性がない場合や無反応の場合に比べて、相手との知覚的距離が縮小することが、顔の残像サイズを測定し、エンメルトの法則により知覚的距離を算出した実験により明らかとなった。昨年度の研究と合わせ、社会的随伴性は時間と空間の感覚を変容させることが示唆された。2については、画面上の顔と同期して鏡面で同一の部位を撫でる場合、異なる位置を撫でる場合に比べて、より自他統合が生じ、感情などの相手の状態の転移が生じやすいことが示された。すなわち、自他統合が促進される条件において、相手が幸福顔をしていれば、自身も幸福感をより強く感じ、創造性も高まることが示唆された。同一の表情顔を提示しても、自他統合が生じる場合で強い転移が生じており、これはいわゆるミラーニューロンを通じた「共感」的な効果ではない。一般的に外集団成員に対しては向社会的行動が示されにくい傾向がある。意識的な努力によって克服する方法も多く提案されているが、同時にその限界も指摘されている。多感覚統合により内集団範囲を拡大する本課題の方法はその限界を克服する一つの方法となりうる。従来の研究では、共感、援助行動などの向社会的行動が主に内集団の成員に対してしか示されないことを示している。本研究では、自己の行為と外集団成員の行為の随伴性を操作することにより、自己の行為に他者の反応が随伴し、かつ、自己の行為に対する他者の反応が予測できる時には、潜在的な外集団差別が低下し、外集団成員に対する援助行動が促進されることが示された。また、随伴性のある場合には、その他者の存在を近くに感じることも示された。本課題では、3年間の研究期間内に、成人を対象に、模倣のように類似した動作でなくても、1他者の動作が自己の動作と随伴さえしていれば(たとえば、右手を上げると口を膨らませるなど、一貫した応答がある)、その他者が外集団の成員だったとしても、その他者に対する好感情が生じ、潜在的な差別が低減することを示す。そのうえで、2同様な随伴性の操作によって、外集団の成員に対しても、内集団の絆形成に関わるとされるオキシトシンなどのホルモンが分泌されるようになることを示す。さらに、3乳幼児においても随伴性が向社会的行動を引き出す要因となることを示す、の3つを目指している。上記の平成26年度の課題である1は、上記の【研究実績の概要】に記したようにおおむね達成されており、現在はアイコンタクトの有無を操作するなどし、般化の要因を探っている。外集団成員を対象としたものではないが、動作を模倣されると模倣した相手ならびに同集団成員に対して援助行動を示すようになることを示した先行研究は存在する。本研究では、実験参加者とは異なる動作で相手が応答する場合でも同様な結果が得られる可能性が示唆されており、重要な要因は類似性というよりも社会的随伴性なのだと考えられる。
マウス一次視覚野ニューロンに方位選択性が生じる神経回路の解明

本研究課題は、マウス一次視覚野単一細胞への入力をスパインのin vivo2光子カルシウムイメージングを行い調べることを目標としている。この目標を進めるにあたってまず重要なことは、スパインイメージングを行うニューロンの細胞体活動を鎮静化することであると考えた。理由は、細胞体活動電位が樹状突起内へ逆行性伝播することによるシグナル解析への影響である。この電位逆伝播は樹状突起のみならず、スパイン内へも伝わり記録されるスパインシグナルに混入することで、スパインシグナルの評価に影響を与えることが知られている。本研究では、物体の形の認識に重要な、「線の傾き」情報の抽出を行う細胞への入力を解析している。様々な傾きをもつ線を提示すると、ある傾きに選択的に反応する細胞が一次視覚野には存在する。この選択的な反応は細胞体の活動として検出されるが、細胞体活動電位の発生を伴うため上記の機序によりスパインのシグナルが隠されてしまう。平成29年度は細胞体活動を鎮静化する方法として2つの抑制性分子を候補として挙げ検討を行いSwiChR++が有効であることを確認した。このような工夫により細胞体活動を抑え、逆伝播が存在しない条件下にスパイン活動のイメージングを行った。以上、平成30年度の目標として「皮質内ニューロンの鎮静下におけるスパインイメージングの開始」を設定し実施した。平成30年度の研究成果は、第41回日本神経科学会(神戸国際会議場)と第96回日本生理学会(神戸国際会議場)にて発表した。平成29年度に完成させた細胞体活動電位の発生を抑制する実験系を用いた実験を開始した。一次視覚野ニューロンにカルシウム感受性タンパクの一種であるGCaMP6sと細胞体活動電位の発生を抑制するための光遺伝学分子(SwiChR++)を、AAVを用いて遺伝子導入し発現させた。発現にはAAv2/1-hSyn-creを使うことで、一次視覚野のニューロンに低密度で発現するよう調整した。SwiChR++には分布が細胞体に限局するようにkv2.1シグナルを付加した。さまざまな線の傾きをもつ視覚刺激を提示しながら、マウス一次視覚野で2光子カルシウムイメージング行うと、ある傾きを持つ線に選択的に反応する細胞が認められた。またこの細胞から伸びる樹状突起を観察するとスパインを同定することが出来た。一方このスパインを2光子カルシウムイメージングしながら様々な傾きを持つ線の視覚刺激を同様に提示するとスパインが反応する様子が見られたが、特定の傾きを持つ線の提示により細胞体が活動し、その活動が樹状突起に逆伝播することですべてのスパインのシグナルが一斉に上昇する様子を確認した。次にこの逆伝播を抑止するため、光を照射することで抑制性分子を活性化させ、逆伝播が起こらない条件で個々のスパインの活動を記録した。光抑制は、細胞体に限局してレーザー光を照射しているため、樹状突起には抑制性作用はないと考えている。以上のように視覚刺激に対して細胞体活動を抑制した条件でスパインのイメージングを行い、1個の細胞から約1000個のスパインから記録し、現在データ解析を行っている。以上のように平成30年度の目標とした細胞体活動の抑制下にスパインイメージングのデータ収集が進んでいる。それゆえ研究は概ね順調に進捗しているものと考えている。上記のように平成30年度の目標であった「皮質内ニューロンの鎮静下におけるスパインイメージングの開始」は順調に進んでいる。今後も研究計画通り進むように最大限の努力を払い研究を継続させていく予定である。平成31年度は、平成29、30年度の2年間に新規開発を終えた抑制性光遺伝学分子を用いた方法により、細胞体活動電位の発生を抑えた条件下のスパインイメージングを継続して行う。論文報告する準備としてカルシウムの機能イメージングに加えて、以下の2つの解析を行う予定にしている。(1)記録したスパインの樹状突起上での空間分布を記述し、解剖学的な解析を行う。(2)入力と出力の関係を明らかにする解析として、数理モデルを検討する。入力の大きさ(カルシウムシグナルの変化の大きさ)によって、細胞体の興奮性に及ぼす影響が異なる可能性が考えられる。このような非線形加算を考慮した数理モデルを立て、入出力関係を検討する。平成31年度は、上記2つの解析も検討しつつスパインイメージングを行い、最終的な目標である「マウス一次視覚野ニューロンに方位選択性が生じる神経回路の解明」に向けて研究をより一層推進させる。

細胞体活動を鎮静化する方法として2つの抑制性分子を候補として挙げ検討を行った。抑制性分子であるGi-DREADDまたはSwiChR++を一次視覚野ニューロンに発現させ、これら抑制性分子に対する基質を投与するあるいは光を照射することで抑制性分子を活性化させた。このような工夫により細胞体活動を抑え、逆伝播が存在しない条件下にスパイン活動のイメージングを行う条件を決定した。平成29年度の目標として設定した「皮質内ニューロンの鎮静化とスパインイメージングの準備」を実施した。一次視覚野ニューロンにカルシウム感受性タンパクの一種であるGCaMP6sをAAVを用いて遺伝子導入し発現させた。発現にはAAv2/1-hSyn-creを数万倍に希釈したウィルス液と無希釈のAAV2/1-flex-GCaMP6sを混ぜてマウスの一次視覚野に注入し、一次視覚野のニューロンがまばらに光るように調整した。さまざまな線の傾きをもつ視覚刺激を提示しながら、GCaMP6sをまばらに発現させたマウス一次視覚野で2光子カルシウムイメージング行うと、ある傾きを持つ線に選択的に反応する細胞が認められた。またこの細胞から伸びる樹状突起を観察するとスパインを同定することが出来た。次にこのスパインを2光子カルシウムイメージングしながら様々な傾きを持つ線の視覚刺激を同様に提示するとスパインが反応する様子が見られたが、特定の傾きを持つ線の提示により細胞体が活動し、その活動が樹状突起に逆伝播することですべてのスパインのシグナルが一斉に上昇する様子を確認した。次にこの逆伝播を抑止するため、Gi-DREADDまたはSwiChR++分子を一次視覚野ニューロンに発現させ、これら抑制性分子に対する基質を投与するあるいは光を照射することで抑制性分子を活性化させ、その効果を検討した。その結果、Gi-DREADDの活性化は基質を腹腔内投与した場合には活動を抑制することはできなかった。一方脳に直接投与した場合には若干活動が弱まる傾向が見られた。しかしながら逆伝播を抑えることまではできず、実験には適用できないと考えられた。一方SwiChR++を発現させ、細胞体に限局してレーザー光を照射すると視覚刺激に対して細胞体活動を抑制することに成功し、また逆伝播も観察されなかった。以上のように平成29年度の目標とした細胞体活動の抑制を達成することができたため、研究は概ね順調に進んでいるものと考えている。本研究課題は、マウス一次視覚野単一細胞への入力をスパインのin vivo2光子カルシウムイメージングを行い調べることを目標としている。この目標を進めるにあたってまず重要なことは、スパインイメージングを行うニューロンの細胞体活動を鎮静化することであると考えた。理由は、細胞体活動電位が樹状突起内へ逆行性伝播することによるシグナル解析への影響である。この電位逆伝播は樹状突起のみならず、スパイン内へも伝わり記録されるスパインシグナルに混入することで、スパインシグナルの評価に影響を与えることが知られている。本研究では、物体の形の認識に重要な、「線の傾き」情報の抽出を行う細胞への入力を解析している。
痔瘻・肛門周囲膿瘍モデル動物の開発と肛門免疫の研究

当初、無菌マウスに腸内細菌叢を導入した際の肛門を用いて研究を行う計画であったが、無菌マウスの購入が不可能となり、この計画は中止せざるを得なかった。直腸切断術の手術標本から肛門組織を採取し、免疫染色等で肛門免疫機構について研究を行った。肛門には、肛門腺付近を中心とした豊富な免疫担当細胞が存在するが、機能的な解析には至らなかった。また、肛門免疫機構と密接に関連すると考えられる回腸嚢炎について研究を行った。回腸嚢炎は潰瘍性大腸炎に対する大腸全摘・回腸嚢肛門(管)吻合術後に発症する長期合併症であり、多くはciprofloxacinやmetronidazoleなどの抗菌薬内服により軽快する。我々はこれらの治療に抵抗した回腸嚢炎患者の便中にClostridium Difficile toxin(以下、CD toxin)を検出した3例を経験した。3例中2例は以前の回腸嚢炎に対しては通常の抗菌薬が奏効していたが、再燃時には効果を認めず、この時点で便中CD toxin陽性と判明した。残り1例は回腸嚢炎初発の時点で通常の抗菌薬治療が効果なく、便中CD toxin陽性と判明した。3例とも「C.Difficile関連難治性回腸嚢炎」と診断し、vancomycin内服により治療したところ速やかに軽快した。通常の抗菌薬治療によって改善しない回腸嚢炎ではC.Difficileの関与を疑い、適切な抗菌薬治療を行う必要がある。これらの研究成果を学会、論文で発表した。常在腸内細菌が宿主の粘膜組織に与える影響、また、宿主の粘膜免疫機構の腸内細菌への反応を研究することにより、生体と腸内細菌に対する防御機構と共存機構を解明することである。当初、以前た使用した無菌マウスを用いて常在腸内細菌を導入し(通常化モデルの作成)、ここから消化管粘膜固有層リンパ球や平滑筋細胞、血管内皮細胞を分離して通常化過程における遺伝子発現の変化や細胞機能を解析を行う予定であった。しかしごく最近になり無菌動物の販売が中止されたため、当初の計画を変更せざるを得なくなった。現在、無菌マウスを飼育している研究機関との共同研究が可能かどうか検討中であったが、未だ入手ルートは確立しておらず、直腸切断術手術標本から、肛門組織を採取し、免疫染色等で肛門免疫機構について研究する流れで実験を進めた。又、通常マウス肚門組織に細菌やLPS注入を行い、肛門免疫反応を検討する実験の準備を行った。また、現在、直腸切断手術症例から肛門組織と集積(現在までに3例)した。今後さらに組織を集積し、組織学的検討に使用する予定である。以上、19年度は今後の研究の準備に費やしたため、具体的成果は20年度以上に行われる見込みである。現在、直腸切断術の手術標本から肛門組織を採取し、免疫染色等で肛門免疫機構について研究中である。また、通常マウス肛門組織に細菌やLPS注入を行い、肛門免疫反応を検討する実験の準備中である。また、クローン病に伴う難治性痔瘻に対する標準的術式であるシートン法の長期経過例を臨床的に調査した。当科においてseton法を行ったCrohn病患者のうち、術後5年以上経過した27例を対象として再手術率とストーマ造設率をretrospectiveに検討した。術後観察期間は8.7±2.1年であった。Seton法施行後の再手術率・ストーマ造設率は経時的に増加し、観察期間中の再手術率は63%(17例)、ストーマ造設率は37%(10例)であった。ストーマ造設の適応は、肛門管癌に対して直腸切断術を行った1例以外は、すべて痔瘻の悪化によるものであった。結語: Crohn病に合併した難治性複雑痔瘻に対するseton法施行後の再手術率・ストーマ造設率は高く、免疫抑制剤や抗TNFα抗体などによる術後の緩解維持療法の改善が必要と思われる。これらの研究結果を学会および論文で発表した。

3例とも「C.Difficile関連難治性回腸嚢炎」と診断し、vancomycin内服により治療したところ速やかに軽快した。通常の抗菌薬治療によって改善しない回腸嚢炎ではC.Difficileの関与を疑い、適切な抗菌薬治療を行う必要がある。これらの研究成果を学会、論文で発表した。
血液細胞のHes-1発現様式及びその破綻が自己複製・分化に与える影響の解明

マウス胎仔肝から血液前駆細胞分画を分取し、単一細胞レベルでのHes-1発現を顕微鏡下にルシフェラーゼ反応の発光としてとらえ、Hes-1の発現が短時間で上下していることを証明した。MLL-AF9融合遺伝子を血液前駆細胞に導入しマウスに移植すると白血病を引き起こすが、Hes-1ノックアウトマウス由来の前駆細胞に導入した場合、野生型よりも、白血病によって早期にマウスが死亡した。これらから、MLL-AF9による白血病において、Hes-1は腫瘍抑制的にはたらくことが示された。Hes1プロモーターの下流にルシフェラーゼをコードする遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス(Hes1-Ub-Lucマウス)が京都大学ウイルス研究所の影山龍一郎先生の研究室で樹立されている。このマウスではHes-1の転写がオンの時にルシフェリン/ルシフェラーゼ反応による発光を単一細胞レベルで顕微鏡下にとらえることができる。(PNAS 103:1313-1318, 2006)。これを血液細胞に応用し,血液細胞におけるHes1発現のパターンを検証した。Hes1 mRNAの定量PCRなどの結果から、血液細胞におけるHes1発現はKSL細胞(cKit陽性・Sca1陽性・分化マーカー陰性細胞)分画において強く発現していることが明らかになった。これを受け、Hes1-Ub-Lucマウスの胎生14日の胎仔肝からKSL細胞を分取した。そのままでは発光はほとんど捉えられなかったが、Hes-1の上流シグナルであるNotchシグナルを、そのリガンドであるDelta1を発現したOP9細胞で刺激することで、神経前駆細胞でみられるようなHes1発現レベルの短時間での上下(発現振動)を観察することに成功した。Hes1と造血器腫瘍の発症機序を解明するべく、Hes1ノックアウト(KO)マウスを用いた実験を行った。白血病の主要な原因遺伝子のひとつであるMLL-AF9を骨髄前駆細胞に導入すると細胞が腫瘍化し、マウスを用いた移植モデルで白血病を引き起こすことができるが、Hes1-KOマウス由来の細胞にこの遺伝子を導入した場合、増殖力が強くなり、野生型よりも早期に白血病によってマウスが死亡した。これらの結果から、MLL-AF9による白血病において、Hes1は腫瘍抑制的にはたらくことが示された。これらの成果は、米国血液学会等で発表した。このマウスではHes-1プロモーターからの転写がオンになる状況下でルシフェラーゼが発現するため,Hes-1の転写がオンの時にルシフェリン/ルシフェラーゼ反応による発光を単一細胞レベルで顕微鏡下にとらえることができる。この方法で観察される発光のパターンは,内在性のHes-1タンパクの発現とよく相関することが報告されている(PNAS 103:1313-1318, 2006)。これを受け、Hes1-Ub-Lucマウスの胎生14日の胎仔肝からKSL細胞を分取することとした。KSL細胞の分取にはセルソーターを用いる方法や磁気ビーズ法などがあるが、FACSAriaを用いて分取する方法が最も安定してHes1発現を示す発光を捉えられることが分かった。当初は発光はほとんど捉えられなかったが、Hes-1の上流シグナルであるNotchシステムをリガンドであるDelta1で刺激することにより、発光を捉える確率を上昇させることができた。Delta1刺激としてDelta1タンパクをディッシュにコーティング方法では、発光確率は上昇するものの各細胞での発光は1回のみであったが、KSL細胞をDelta1を発現したOP9細胞上におくことで、神経前駆細胞でみられるようなHes1発現レベルの短時間での上下(発現振動)を観察することに成功した。23年度の研究計画では、神経前駆細胞でみられるようなHes1の発現振動を、血液細胞において証明することを最大の目標とした。我々はHes1-Ub-LucマウスからFACSAriaによってKSL細胞を分取し、Delta1を発現したOP9細胞上でこれを観察する系を確立し、血液細胞におけるHes1発現振動を証明した。この点で、23年度の目標は達成されており、研究は順調に進展している。23年度の計画の発展として,(1)他の白血病遺伝子をレトロウィルスで血液前駆細胞に導入して不死化させた場合に,Hes1の発現パターンが保たれているか否かを解析し,白血病遺伝子による癌化とHes

1発現パターンの関連を解明すること、および(2)Azami greenとKusabira orangeの2色の蛍光を用いて細胞分裂周期を可視化する技術(fucci)が報告されており、Hes1-ルシフェラーゼマウスとfucciマウスを交配させて得られるマウスのKSL細胞を観察することで、Hes1発現パターンと細胞分裂との関連を明らかにすること、を挙げた。(2)には着手できていないが、(1)については、Hes1遺伝子を欠失させたノックアウトマウス由来の血液前駆細胞にMLL-AF9遺伝子を導入することで、MLL-AF9による血液細胞の腫瘍化におけるHes1の役割の解析を開始した。MLL-AF9遺伝子を導入した血液前駆細胞は腫瘍化し、白血病を引き起こすことが知られている。Hes1ノックアウトマウス由来の血液前駆細胞にMLL-AF9遺伝子を導入し、野生型由来の細胞に導入した場合と比較することで、MLL-AF9による腫瘍化に、Hes1が果たす役割を解析する。また、Hes1遺伝子領域に蛍光タンパクであるVenusを挿入し、Hes1-Venus融合タンパクを作るノックインマウスを入手しており、このマウスから分取したKSL細胞を用いて、ルシフェラーゼシステムによって同定された発現振動を、蛍光で同定する系を確立する。ルシフェラーゼシステムと異なり、蛍光の系では蛍光レベルに応じて細胞をFACSで分取することが可能である。Hes1発現の高い細胞・低い細胞をそれぞれ分取し、分化アッセイや遺伝子導入による腫瘍化を行うことによって、Hes1発現振動が分化・腫瘍化に与える影響を解析する。HesファミリータンパクであるHes7も発現振動が知られているが、この発現振動を消失させると、胎生期における体節形成不全が引き起こされる(Nat Genetics 7:750-754, 2004)。これを参考に、Hes1の発現振動を血液細胞において消失させることで、発現振動が分化・腫瘍化に果たす役割を解析する。具体的には、Hesタンパクの発現振動はユビキチン化システムによるタンパク分解によって行われているため、ユビキチン化ターゲットとなるリシンをアルギニンに変えることで、発現振動を消失させる。マウスの維持(Hes1ノックアウトマウス、Hes1-Venusノックインマウス等)Hes1発現振動消失マウスの作製分化アッセイ、遺伝子導入による腫瘍化などにおける、培地や遺伝子導入キットなどの試薬類、あるいはプラスチックウェア等、主として物品費として使用予定である。