hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
わが国の大都市部における自殺未遂者の特性

なお、2011年5月にはA市において、救急出動現場で、もしくは搬送中・搬送後に死亡が確認された自損行為事例数も前月比・前年同月比ともに増加しており、精神疾患の既往のない層での増加がみられた。以上の結果から、2011年3月に発生した東日本大震災の影響などを考慮する必要はあるものの、著名人の自殺に関する大々的な報道が自殺企図のリスク、および女性や精神疾患の既往のある層における自殺未遂のリスクを高める背景要因のひとつである可能性が示唆された。本研究では、わが国の都市部における自殺未遂の実態およびその背景要因について明らかにするため、政令指定都市A市における2009年2011年の自損行為による救急搬送の悉皆データベースを用いて分析した。自殺未遂による救急搬送事例の65%は女性、特に2039歳の女性であった。男女ともに傷病程度の低い自損行為が多く、手段としては薬物・過量服薬および切傷が多くみられたが、これらの傾向は特に女性で顕著であった。身体疾患の既往歴は男性の事例でより多くみられた。一方、女性事例の80%、男性事例の約半数に精神疾患の既往歴が確認された。ただし、アルコール・物質使用障害のみは女性よりも男性で多くみられた。本研究では、本研究と並行して進めている総務省消防庁が保有する全国の自損行為による救急搬送資料の分析では検討できない、自殺未遂者における精神・身体疾患既往歴の有無や企図手段についての考察が可能であった。これらの要因について分析を行い、研究成果を投稿論文ならびに国際学会での発表というかたちで報告できた。以上の点を考慮し、当初の計画以上に進展していると判断した。認知行動学交付申請書に記載した研究計画に沿って、国内外で極めて研究が少ないメディアにおける自殺関連報道と自殺未遂の発生との関連を定量的・定性的手法により検討する。自殺未遂事例については、本年度研究と同様、大都市部における自損行為による救急搬送事例データベースを分析対象とする。自殺に関するメディア報道については、新聞における報道を分析対象とする。補足的に、本研究と並行して行っている全国の救急搬送事例データベースの分析結果と比較し、大都市部における自殺報道と自殺未遂との関連の特徴を明らかにすることも検討する。救急活動記録票データベースのクリーニング、研究実施に際しての倫理審査申請、ともに順調に進み、26年度以降研究成果を学術論文、学会発表のかたちで公表できる状態であるため。平成27年3月にシンポジストとして研究報告を行った国際学会の旅費が、事務処理の都合により翌年度分に計上されるため。自損行為の重症度とその背景要因としての主要精神・身体疾患既往歴との関連を明らかにするため、自損行為後の生存事例のみを対象として、自損行為の重症度(重症、中等症以下)別に、性・年齢などの基本属性、手段や主要身体・精神疾患の既往の分布に差がみられるかを検討する。平成27年3月に開催された国際学会の旅費に充当する。家族事情により、国内外の学会参加を見送ったため。また、物品の購入を26年度に変更したため。26年度には25年度以上に国際誌への論文投稿を見込んでいるため、英文校正関連費に充てる。また、国際学会に複数の演題を出すため、その参加費・旅費に充てる。さらには、前年度に予定していた統計解析パッケージの導入や学会発表用ノートPCなどの購入費に充てる。
思春期の顎顔面形態に関する出生コホート研究

不正咬合の発症に、妊娠期ならびに小児期の社会・環境要因がどのように影響しているのか、および不正咬合が心身の健康状態に与える影響を明らかにすることを目的に、山梨県甲州市の出生コホート「甲州市母子保健縦断調査」の思春期調査の追加調査として、甲州市立中学校5校に在籍する全生徒の実態調査を行った。結果として、不正咬合が頭痛や口腔関連QoLに与える影響および不正咬合と顎関節症との関連性を明らかにした。これらの結果は、不正咬合が思春期の子どもの健康状態に与える影響を示唆する重要な一知見と考えられる。本研究では、出生コホート研究により、一般集団における思春期の子どもの顎顔面形態を分析し、妊娠期ならびに小児期の社会・環境要因との関連性を検討すると同時に、不正咬合が健康状態に与える影響を明らかにすること、さらに既に得られている同一人種であるモンゴル人の顎顔面軟組織形態と比較検討するためのデータベースを構築することを目的としている。本研究は日本において20年以上継続して行われている数少ない大規模な出生コホート研究「甲州市母子保健縦断調査」の追加調査として、山梨県甲州市の全中学生を対象として行われる。評価項目は以下の項目である。1.妊娠期の母体の環境が思春期の子どもの顎顔面形態に与える影響について評価する(1)不正咬合の実態調査;Index of Orthodontic Treatment Need (IOTN)を用いて評価する。(2)顎顔面軟組織形態の三次元計測;三次元非侵襲的撮影装置を用いて撮影する。(3)妊娠期及び小児期の社会・環境要因のデータとリンケージを行い、不正咬合の発症要因に関して疫学的手法を用いて解析する。2.顎顔面形態が思春期の子どもの健康状態に与える影響について、健康状態の評価、抑うつ傾向、起立性調節障害、頭痛及び口腔関連のQOL(機能・心理面・疼痛/不快・社会面)を質問紙を用いて調査し、不正咬合の形態・機能的な問題点及び審美・社会的問題点が思春期の子どもの身体及び精神の健康状態に与える影響について疫学的手法を用いて解析する。3.日本人の思春期における顎顔面軟組織形態に関するデータベースの構築を行い、研究代表者等により、既に得られているモンゴル人の顎顔面軟組織形態の三次元データと比較検討を行い、同一人種であるが異なる社会的要因・生活環境等が顎顔面形態へ与える影響について評価する。平成26年度は実態調査の準備としてフィールドの確保および質問紙の作成等を行った。本研究では、出生コホート研究により、一般集団における思春期の子どもの顎顔面形態を分析し、妊娠期ならびに小児期の社会・環境要因との関連性を検討すると同時に、不正咬合が県境受胎に与える影響を明らかにすること、さらに既に得られている同一人種であるモンゴル人の顎顔面軟組織形態と比較検討するためのデータベースを構築することを目標としている。平成27年度は不正咬合の実態調査及び質問紙調査を行った。平成27年度は甲州市中学校において不正咬合の実態調査及び質問紙調査を行った。甲州市立中学校5校に在籍し欠席者を除く全ての生徒、966名(男子51.4 %、12-15歳)を対象とした。学校歯科健診時(平成27年4ー6月)に、不正咬合の診査を2名の矯正歯科医(東京医科歯科大学)が直接法にてIOTNを用いて行い、質問紙による調査(頭痛について)を行った。同時に顎関節の診査も行った。また、甲州市母子保健縦断調査思春期調査(平成27年7月)時に、質問紙による調査(生活習慣や健康状態について)を行った。現在は不正咬合のデータの解析を行い、不正咬合の発症率について、甲州市中学生においては45.2%(95%信頼区間[CI]: 41.8-48.6)であり、前歯部交叉咬合(18.7%)、上顎叢生(15.2%)、下顎叢生(15.2%)、上顎前突(8.3%)の順で多いという結果を得ることができた。不正咬合の評価や口腔内衛生環境の結果に関しては、各学校および各生徒および保護者に口腔衛生環境の向上のための冊子と合わせてフィードバックを行った。

現在、モンゴルのデータの比較および、甲州市母子保健縦断調査の出生時や幼少時のデータとのリンケージを行うべく準備中である。本研究は、学校や自治体との共同研究であるため、調査時間に制約があるため、三次元非侵襲的撮影装置(Morpheus)を用いた、顎顔面軟組織形態の計測や保護者を対象とした詳細な質問紙調査に関しては次年度以降に行うこととし、調査全体の遂行に影響が出ないよう配慮した。本研究では、出生コホート研究により、一般集団における思春期の子どもの顎顔面形態を分析し、妊娠期ならびに小児期の社会・環境要因との関連性を検討すると同時に、不正咬合が健康状態に与える影響を明らかにすること、さらに既に得られている同一人種であるモンゴル人の顎顔面軟組織形態と比較検討するためのデータベースを構築することを目標としている。本研究は日本において20年以上継続して行われている数少ない大規模な出生コホート研究「甲州市母子保健縦断調査」の追加調査として、山梨県甲州市の全中学生を対象として行われる。評価項目は以下の項目である。1.妊娠期の母体の環境が思春期の子どもの顎顔面形態に与える影響について評価する。(1)不正咬合の実態調査;Index of Orthodontic Treatment Need (IOTN)を用いて評価する。(2)顎顔面軟組織形態の三次元計測;三次元非侵襲的撮影装置を用いて撮影する。(3)妊娠期及び小児期の社会・環境要因のデータとリンケージを行い、不正咬合の発症要因に関して疫学的手法を用いて解析する。2.顎顔面形態が思春期の子どもの健康状態に与える影響について、健康状態の評価、抑うつ傾向、起立性調節障害、頭痛及び口腔関連のQOL(機能・心理面・疼痛/不快・社会面)を質問紙を用いて調査し、不正咬合の形態・機能的な問題点及び審美・社会的問題点が思春期の子どもの身体及び精神の健康状態に与える影響について疫学的手法を用いて解析する。3.日本人の思春期における顎顔面軟組織形態に関するデータベースの構築を行い、研究代表者等により、既に得られているモンゴル人の顎顔面軟組織形態の三次元データと比較検討を行い、同一人種であるが異なる社会的要因・生活環境等が顎顔面形態へ与える影響について評価する。平成28年度は前年度に行った実態調査の結果の解析および学会発表を行った。平成28年度は、平成27年度に実施した甲州市中学校における不正咬合の実態調査及び質問紙調査の結果の解析、学会発表を行った。甲州市立中学校全5校に在籍し健康診断の欠席者を除く全ての生徒(966名)を対象として、各校の学校歯科健診時に、矯正歯科医が矯正治療必要度指標(Index of Orthodontic Treatment Need)に準じて、不正咬合の診査を行った。同時に、触診による顎関節雑音の有無、顎関節痛および開口障害の有無を調査し、いずれか一つでも該当する場合に顎関節症と評価し、不正咬合と顎関節症の関連性について検討した。不正咬合の発症率は44.7%であり、顎関節症の有症率は12.0%であり、不正咬合を有する群で15.1%、不正咬合を有さない群で9.6%であった。不正咬合を有する群は有さない群より、顎関節症の有症率が高かった(adjusted Odds Ratio [OR], 1.65; 95%CI, 1.11-2.44)。
ユビキチン化修飾によるペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送の調節機構

細胞内小器官ペルオキシソームは、その欠損がヒトにおいて重篤な遺伝性代謝異常疾患に至ることが知られているように、生体内で重要かつ必要不可欠である。本研究では、ペルオキシソーム形成機構の中で最も重要であるペルオキシソームマトリクスタンパク質のペルオキシソーム内への輸送局在化が、ペルオキシソーム移行シグナル1型の細胞質レセプターであるPex5pに対する独特なユビキチン化修飾によって制御されていることを明らかにした。ペルオキシソーム形成因子(ペルオキシン)の一つであるPex5pは、ペルオキシソーム移行シグナル1型(PTS1)の細胞質レセプターである。Pex5pは細胞質とペルオキシソーム間を行き来するシャトルレセプターとして機能し、ペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送における鍵分子である。申請者は、RINGフィンガーを持つ2つのペルオキシソーム膜局在性ペルオキシンPex10pおよびPex12pからなる複合体が、Pex5pのユビキチン化修飾を触媒するE3として機能し、ペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送を制御することを明らかにした。本研究では上記研究成果をさらに発展させ、ユビキチン化Pex5pあるいは新規Pex5p結合因子の探索を含めた形で、ユビキチン化修飾を介したペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送制御の詳細な分子機構を明らかにすることを目的としている。当該年度の研究で計画したように、種々の方法によりPex5p結合タンパク質の検索を行ったところ、Pex5p安定発現HeLa細胞を用いたPex5pの免疫沈降、およびその共沈物の質量分析により、新規Pex5p結合タンパク質の候補を一つ同定した。現在、このタンパク質のcDNAクローン単離を終え、Pex5pとの結合部位探索、および新規Pex5p結合タンパク質であるかどうかの検証実験を行っている。この新規Pex5p結合タンパク質は、Pex5pと結合することでペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送に関与する可能性が高いと考えられることから、Pex5pのユビキチン化との関連を含めて解析を進める。これまでに、RINGフィンガーを持つ2つのペルオキシソーム膜局在性ペルオキシンPex10pおよびPex12pからなる複合体が、Pex5pのユビキチン化修飾を触媒するE3として機能し、ペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送を制御することを明らかにしてきた。本研究では、ユビキチン化修飾を介したペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送制御の詳細な分子機構を明らかにすることを目的として、ユビキチン化Pex5pに結合する新規因子の探索を行った。平成21年度に単離した新規Pex5p結合タンパク質(P5BP1と命名)の解析を進め、P5BP1が細胞質に主に局在するタンパク質で、そのN末領域でPex5pと結合することを見出した。P5BP1のsiRNAによるノックダウンは軽度のペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送阻害を示したことから、P5BP1は細胞質でPex5pと相互作用してペルオキシソームマトリクスタンパク質に関与する新規因子であることが判明した。一方、P5BP1はペルオキシソーム膜上におけるPex5pユビキチン化修飾に関与する可能性は低いことが明らかとなり、ユビキチン化Pex5pを認識する因子は他に存在すると考えられた。
新規抗ウイルス自然免疫機構を標的にした抗ウイルス薬スクリーニングシステムの開発

新興ウイルス感染症は、ひとたびアウトブレークが起こると急激にパンデミックをもたらす危険性がある。既存の抗ウイルス薬やワクチンはウイルス特異性が高いため、さまざまな新興ウイルス感染症に対してあまねく効果を発揮することはできない。一方で、現在治療法のないウイルス感染症も多い。そこで、広範なウイルス種に対して抑制効果がある治療薬の開発が望まれている。我々は、新規抗ウイルス自然免疫機構を見出し、いくつかのウイルスの複製に必要とされるホスト側の因子を見出した。我々は、ホスト因子の抗ウイルス作用に着目し、ホスト因子の発現レベルを高感度にリアルタイムでモニタリングするシステムを構築すれば、新たな抗ウイルス薬の創出が期待できると考えた。そこで、ホスト因子のプローモーターでドライブされる高感度レポーターを導入し、安定発現細胞株を作製した。次いで、この細胞株にホスト因子の発現を誘導した。経時間的にレポーターアッセイを行い、レポーター活性の有意な上昇を認めた。作製したレポーター細胞株は薬剤スクリーニングに使用できる可能性が確認できた。次年度以降は、作製したレポーター細胞株を用いて、新規抗ウイルス薬の候補化合物を化合物ライブラリーから探索する。また、見出した化合物の作用機序を詳細に検証する。はじめに、ホスト因子の発現をモニターするために、ホスト因子のプローモーターでドライブされる高感度レポーターを導入し、安定発現細胞株を作製した。次に、ウイルス感染以外にホスト因子の発現を誘導する条件(最適な濃度、培養期間)をリアルタイムRTーPCRで検討した。この結果をもとに、作製したレポーター細胞株を処理したところ、レポーター活性の有意な上昇を認めた。この結果より、作製したレポーター細胞株は薬剤スクリーニングに使用できる可能性が確認できた。2019と2020年度は、18年度に作製した細胞株を用いて、薬剤の1次および2次スクリーニングを行う。得られたヒット化合物をウイルス感染の前もしくは後に細胞に加え、抗ウイルス作用を検証しメカニズムを解析する。
陸上長距離選手における『バネ』を考慮したコンディショニングの試み

(研究1)長距離選手および短距離選手における筋腱の力学的特性と跳躍能の比較陸上長距離選手15名、陸上短距離選手15名を対象にして、下肢筋群(膝伸筋群、足底屈筋群)の筋厚、等尺性最大筋力、筋活動水準およびtwitch特性、腱の力学的特性、跳躍能(SJ,CMJ,DJ,連続ジャンプなど)を測定した。筋厚、最大筋力、活動水準は、長距離選手群が短距離選手群よりも有意に低い値を示した。電気刺激中の最大張力までの到達時間(筋の収縮速度を示す)は、速筋線維を多く有すると思われる短距離選手は短く、逆に遅筋線維を多く有すると思われる長距離選手は長かった。腱の力学的特性については、膝伸筋群において短距離選手が伸びやす<、足底屈筋群において長距離選手が伸びにくい傾向を示した。跳躍能についてはいずれにおいても長距離選手が短距離選手よりも有意に低い値を示した。現在は、上記の結果をもとにして投稿論文を作成中である。(研究2)陸上長距離選手における筋腱の力学的特性と跳躍能のシーズン毎の変化陸上競技長距離選手15名(箱根駅伝常連校のメンバー)を対象にして、休養期(2月)、トラック(スピード)練習期(5月)、鍛錬期(9月)の3回にわたり、下肢筋群(膝伸筋群、足底屈筋群)の筋厚、等尺性最大筋力、筋活動水準およびtwitch特性、腱の力学的特性、跳躍能(SJ,CMJ,DJ,連続ジャンプなど)、規定速度における走行中の酸素摂取量を測定した。最大筋力、活動水準、跳躍能には、有意な変化は観察されなかったが、9月における走行中の酸素摂取量が低<なる傾向を示した。その他の項目については、現在分析をすすめている。(研究1)腱ステイッフネスと関節ステイッフネスの関係ジャンプパフォーマンスにおける反動の効果とアキレス腱ステイッフネス、足関節ステイッフネスおよび筋活動水準との相互関係を検証した。24名の成人男性が足関節のみによる3種のジャンプ運動(SJ、CM、DJ)を実施した。SJに対するCMJおよびDJ跳躍高の増加率を反動効果として算出した。ジャンプ中の足底屈相における下腿三頭筋の平均筋電図積分値を筋活動水準の指標とした。足関節ステイッフネスはDJ中の背屈相における関節トルクー角度関係の傾きから、腱ステイッフネスは等尺性足底屈運動中のアキレス腱の張力-伸張量関係の傾きから各々算出した。腱ステイッフネスは、CMJおよびDJの反動効果と有意な相関関係が認められたが、関節ステイッフネスとは相関関係がみられなかった。SJに対するCMJにおける筋活動水準は、CMJの反動効果と有意な相関関係が認められたが、DJでは相関関係はみられなかった。以上の結果より、CMJの反動効果は腱ステイッフネスおよび筋活動水準増加の両方が関係し、DJの反動効果は筋活動水準増加よりも腱ステイッフネスがより影響を及ぼしている事が窺えた。さらに、関節ステイッフネスはジャンプ運動における反動効果と関係しない事が明らかになった。(Kuboら2007Eur J Appl Physiol)(研究2)陸上長距離選手の筋腱の力学的特性およびジャンプパフォーマンス陵上長距離選手15名を対象にして、下肢筋群(膝伸展筋群および足底屈筋群)の筋厚、最大筋力、筋の活動水準、腱の力学的特性、および各種ジャンプパフォーマンス(SJ、CMJ、DJ、連続ジャンプなど)を測定した。一般成人と比べて、足底屈筋群の筋厚が有意に厚く、いずれのジャンプ高も有意に低いことが明らかになった。さらに、1年間のシーズン毎の変化については来年度に測定する予定である。
心拍データによる睡眠評価方法を用いた睡眠への看護介入効果の評価

本研究課題では介護老人保健施設に入所している高齢者を対象として,心拍変動の周波数解析結果から睡眠の質を評価する方法について検討してきた。期間前半は,健康成人のデータを基に作成した評価方法を用いて高齢者の睡眠を評価可能かどうかについて検討した。期間後半では,高齢者の睡眠及び生体リズムの改善に効果があるとされている介入を実施し,心拍変動データによる睡眠評価結果を,腕時計型活動量計ならびにシート型睡眠評価機器から得られた結果と比較した。その結果,極端に活動量が低下している対象の睡眠状態を評価するには,活動量のみで睡眠を評価する方法よりも,心拍変動データによる評価がより適している可能性が示唆された。老健施設入所中の高齢者を対象に、音楽療法として提供されているアクティビティが、夜間の睡眠と自律神経系活動に及ぼす影響を検討した。被験者には他の入所者と共に1か月に2回、施設スタッフによる音楽療法を午後に1時間参加してもらい、実施日の午前と翌日の24時間および、活動のない土日曜日の24時間の心拍と身体活動データを得た。その4日間を含む3週間はシート型睡眠計による睡眠評価も行った。その結果、実施日と安静時との比較では、24時間、消灯点灯まで、睡眠中と推測される夜間の時間帯のいずれにおいても、心拍変動周波数解析の低周波成分値(LF)と高周波成分値(HF)の比[LF/HF]と、LFとHFを合計に対するHFの値[HF/(LF+HF)]、および心拍数[HR]の各平均値に差は認められなかった。また、活動計および睡眠計から得られた結果でも音楽療法の睡眠への影響を読み取れなかった。健康高齢者では運動した日としない日で入眠後1時間および3時間の心拍変動周波数解析結果を比較し、入眠後1時間のデータでは効果が評価できたが、入所高齢者のデータでは正確な入眠時間を明らかにすることができず評価できなかった。上記3種類の心拍変動解析データの時系列プロット結果からは、音楽療法への参加は対象者にとって交感神経系への刺激となっていることがわかった。いずれの対象でも音楽療法の時間帯とその20分までの区間では、その前後1時間よりもLF/HFとHRの上昇、HF/(LF+HF)の低下が目視できた。このことより、音楽療法の実施は対象者にとっては交感神経系活動を亢進させる刺激となっていたことは確認できたが、その刺激は夜間の睡眠に影響を及ぼすものではなかったと考えられた。たま、心拍変動データで睡眠やリズムを評価しやすい対象の条件として、24時間の平均心拍数が70bpm以上であることが示唆された。(今年度は,本研究者の家族に介護の必要性が生じデータ収集の都合がつかなかったことから,予定していたデータ収集を中断することとなり,1名の介入前後データと複数名分の介入前データを収集するのみとなってしまった。そのため研究期間を延長することとした。)サンプルサイズがまだ小さく統計解析には至っていないが,現データからは,活動量が少なく日中はベッドから出ているものの車いすに乗って傾眠していることの多い高齢者では,24時間の平均分時心拍数が70回以下の対象の場合,心拍変動を周波数解析して得られる自律神経系活動指標値の変化はサーカディアンリズムが明確にならないケースが複数あったが,そのようなケースでも24時間心拍数は昼夜のリズムは明確であった。心拍数の動態のみで睡眠の深さを評価することは難しく,それには自律神経系活動指標値も必要であるが,入眠時刻の推定には,特に24時間平均心拍数が少ない場合は,自律神経系活動指標値の変化よりも心拍数の変化のほうが指標として優れていることが窺えた。老健施設に入所している高齢者14名を対象として、日中の活動量の睡眠状況への影響を検討するために、活動量が増加すると予測されたリハビリテーション実施日、入浴日、およびそれ以外の日の心拍データと身体活動量データを比較した。データ収集期間中にリハビリテーション(12回/週)を受けていたものは6名であった。対象者の多くは運動機能障害や軽度中等度の認知症を伴い、昼間は、食事時以外は床上で過ごすことが多い、車椅子で過ごすことが多い、トイレ歩行以外は行動が少ない、などの身体活動量・レベル共に少ないことから、リハビリや入浴などの行動が睡眠に多少の影響があるのではないかと推測していた。しかし、身体活動量計により得られたデータからは、入浴やリハビリテーションが夜間の睡眠におよぼす影響は認められなかった。また、心拍データから得られる24時間の自律神経系活動量(RR間隔の周波数解析から得られる高周波成分と低周波成分から評価した交感神経系・副交感神経系活動)でも、入浴やリハビリテーションの影響は読み取れなかった。

その要因として、入浴は9時15時までの間の15分程度と短く、その実施時間帯も早く、また、リハビリテーションについても、9時からあるいは13時からの30分程度と短時間でかつ身体活動量の著しい増加を伴わない性質のものであったことから、睡眠に影響を与えなかったと考えられた。本研究課題では,介護老人保健施設に入所している認知症のある高齢者を対象として,心拍変動の周波数解析結果から睡眠の質を評価する方法について検討してきた。期間前半では,健康成人のデータを基に作成した評価方法を用いて高齢者の睡眠を評価することが可能かどうかについて検討した。その結果,日中の活動量の少ない高齢者でも心拍データで生体リズムのメリハリを評価可能なこと,睡眠中の心拍数が50bpm前半にまで低下することの多い対象では評価ができないこと,健康者に比べて評価が困難なケースが多いこと,評価方法に改善の余地があることが明らかとなった。期間後半では,高齢者の睡眠及び生体リズムの改善に効果があるとされている介入を実施し,介入前後で比較した。介入としては高照度光療法と日中のアクティビティを増加の両方の実施を試みたが,専用器具を用いた高照度光療法は眩しすぎるという理由により高齢者からの受け入れが良くなかったことから,午後に6090分間程度の時間を折り紙,塗り絵,談話などで過ごす日を週に4回程度設けるという介入を2週間行った。心拍変動データから得た睡眠の質の評価結果との比較には,腕時計型活動量計とシート型睡眠評価機器から得られた結果を用いた。その結果,心拍変動データからは介入前よりも夜間の副交感神経系活動の亢進が認められ睡眠の質が改善されている可能性を示唆する結果が得られたが,比較に用いた2種類の機器による評価結果とは必ずしも一致しない傾向にあった。今回の被験者の多くがADLが前回の被験者よりも低く通常は食事時間以外はベッド上で過ごしていたことから,活動量のみで睡眠を評価する方法の限界とも相まって評価が難しいところである。看護学H24年度は、高齢者のリハビリテーション・レクリーエーション向けにプログラムされた大型ゲーム機を用いた介入の成果を検討することが主たる目標であった。そこで、そのゲーム機をリースして、実際に施設入所の高齢者にそのゲーム機で遊んでいただいた。しかしながら、いずれのゲームも認知・運動機能が低下している対象者にとっては、ゲームの難易度は通常よりも低く設定してあるといえども、娯楽=活動につなげることが可能な内容ではなかった。そのため、大型ゲーム機を用いた介入ではなく、施設で実施されている音楽療法を介入として今年度はデータ収集を行った。データ収集を実施した冬季は感染症発生による施設における面会禁止や音楽療法を含む各種イベント中止などがあり、データ収集を計画通り遂行できなかった。また、継続中断や測定の不具合などでデータ欠損による分析対象外となったデータもあり、達成度はやや遅れていると考えられる。今年度は,本研究者の家族に介護の必要性が生じデータ収集の都合がつかなかったことから,予定していたデータ収集を中断することとなり,本年度の目標は達成できていない。今年度は高照度の光源を用いた光環境の調整による介入を予定していたが、照明器具からの高照度の光が眩しく不快と感じる対象が多かった。そのため、次年度に予定していたアクティビティプログラムを、入所高齢者を対象として今年度に実施することとした。
音響力学によるストレス・プレコンディショニング法の開発

本研究によって、超音波の音響化学効果で細胞環境に活性酸素種を生成しストレスタンパク質hemeoxygenase-1を発現させた細胞には自己防御機転が増強し、細胞が酸化ストレスに対する耐性を獲得することが明らかとなった。初年度はヒト肝癌細胞系の培養細胞HuH7を培養したシャーレに1MHzの超音波を照射し、細胞内シグナルを活性化してストレス応答を誘発できるか確認しようとした。培養細胞に超音波エネルギーを適正に照射すると、培養液中にキャビティー効果が現れ酸化ストレスが発生すること、その条件によって細胞にHO-1タンパク質を誘導し得ることが明らかになった。しかし、今までのところ細胞にHSP72誘導は確認できない。照射条件が難しく、エネルギーを効率よく培養細胞に照射するとHO-1タンパク質誘導には有利になるが、同時に波動の運動エネルギーによって培養細胞は容易に培地からはがれおちて死渇してしまうことが判明した。現在、浮遊細胞系であるヒト悪性リンパ腫系細胞U937を用いて超音波を照射し富山大学グループの研究結果と同等のHO-1誘導効果が我々の使用する超音波発生装置でも再現できるかどうか確認中である。一方、ラットを用いた動物実験は順調であり、ラットを開腹し肝表面から直接超音波を照射するとラット肝臓にHO-1が誘導されることが明らかとなった。ここでもHSP72の誘導は確認できていない。この操作はHO-1誘導と同時に、超音波エネルギーによる肝細胞障害も発生するため、目的とするHO-1発現量が充分大きく、しかも肝障害が少なくなるような超音波照射条件を探索中である。また、超音波照射後、時間経過を追って肝組織におけるHO-1タンパク発現の推移をWestern blotと免疫染色で確認中である。これらの条件を最適化したうえで超音波照射後の肝臓に虚血再還流をあたえ、超音波によるHO-1誘導が虚血再還流障害を軽減し肝細胞保護効果を示すかどうか、二年目に確認する予定である。37°C、5%CO_2インキュベータ内でFBS含有DMEM培地に培養したHuH7細胞を用い、超音波照射装置、周波数1MHz、出力0.52.3W可変(本多電子、豊橋市)に温度コントローラーを併設し、振動子と培養シャーレ底面とをgelで密着させて実験した。(1)無細胞シャーレに純水2mlを満たし出力1.4Wと2.3Wの超音波を照射したときシャーレ内純水中にH_2O_2の生成をKI法で確認した。出力1.4Wに比し2.3W照射でH_2O_2生成量は高く、照射時間経過と共にH_2O_2濃度は漸増し20分照射で1.4W;4.0μM、2.3W;17.0μMに達した。(2)HuH7細胞は定常状態でHSP72の発現を認めないが若干のHO-1を認める。出力1.4W照射後はHSP72、HO-1共に誘導されなかった。出力2.3Wを20分照射するとHO-1が誘導され6時間後の細胞内HO-1タンパク量が増加した。照射1、2、3時間後の免疫染色でNrf-2の核移行が確認された。培養液温度を管理しないと超音波照射に伴って発熱し細胞にHSP72発現を認めたが、厳密に温度管理すると出力2.3WでHO-1の誘導は明らかであったがHSP72は誘導されなかった。(3)出力2.3W20分間超音波照射後6時間培養した細胞と無前処置細胞の培地にH_2O_2を添加しH_2O_2濃度250μMで0、3、5、10時間培養後のCell viabilityをtrypan blueexclusion testで定量した。無前処置細胞に250μM H_2O_2を添加すると急速に細胞は死滅する。出力2.3W超音波20分間照射後6時間経過した細胞にH_2O_2を添加すると細胞のviabilityは無処置細胞よりも維持された。この結果から、超音波で細胞環境に活性酸素種を生成しストレス応答を誘導可能であること、この前処置sonochemical preconditioningによってHO-1を発現させた細胞にストレス耐性を誘導し得ることが明らかとなった。現在、超音波照射条件に係わる特許申請とここまでの研究成果の投稿を準備しつつ、動物個体の肝臓に超音波照射して肝虚血耐性を誘導する実験の前段階として、超音波照射の詳細な条件設定に取り組んでいる。本研究によって、超音波で細胞環境に活性酸素種を生成し細胞のストレス応答を有効に誘導することが可能であることを明らかにした。また、この前処置sonochemical preconditioningによってストレスタンパク質hemeoxygenase-1を発現させた細胞に自己防御機転が増強し、細胞が酸化ストレスに対する耐性を獲得することを明らかにした。この効果は特定の超音波照射条件によって実現することが明らかとなったので、その超音波照射条件に関わる特許を出願した。このような細胞のストレス耐性を誘導するための効果的な超音波エネルギーは、超音波のもたらす運動エネルギーや温熱エネルギーによってではなく、超音波の音響化学エネルギー(sonochemical enegy)によって細胞にもたらされることが明らかとなった。

また、この反応を誘導する化学刺激は細胞環境中に生成する酸化ストレスによって細胞反応を誘導するが、単純に細胞培養液(細胞外)に活性酸素種(過酸化水素)を添加するよりもはるかに少量の活性酸素種を超音波で細胞質内に生成する方が、少ない酸化ストレスで有効な細胞反応を誘導しうる事も明らかになった。この事実は細胞反応を惹起するに細胞外の培養液中で生成する酸化ストレスよりも細胞質内で生成する酸化ストレスがより直接に強力に細胞反応に影響しうることを示唆していると考えられた。動物個体の肝臓に超音波照射して肝虚血耐性を誘導する実験は複数の細胞が混在する肝臓という複雑な臓器に対してどの細胞に超音波照射条件の照準を合わせるか、解剖学的にかなりのボリュームがある肝臓の一定体積に目標の効果を実現するための超音波エネルギーの集約、分配の条件を考える必要があり、難しい課題を克服できないで居る。また、生体に超音波照射する場合、超音波の伝播経路に介在する他の臓器への影響を如何に回避するか、生体にとって有益な超音波効果だけを獲得し、有害事象を回避するための技術開発も、動物への照射を成功させるには重要な課題であることが明らかとなった。
試作による小口径表面コイルを用いた皮膚、皮下組織の小病変のMRI診断

研究経過試作した小口径表面コイル(口径約5cm)を用い,1.5テスラのMRI装置Signa・AdvantageおよびSigna・Horizonに装着して使用した。FOV(field of view)は8cm,スライス厚は3mm、画像計算マトリックスは256×256を基本とし、正常ボランティアの足底部、および手背部を撮像した。その結果,表皮と真皮の区別,皮下組織内の脂肪とその内部を貫く結合組織の網目構造の描出は容易であった。表皮はT1強調画像にて比較的高信号,真皮は比較的低信号の層として描出された.しかし、表皮内の層構造は描出できず,踵部で角質層を他の表皮層より分離することも困難であった。臨床例については皮膚・皮下組織の腫瘍性疾患、炎症性疾患等に正規のコイルのうち最小のもの(口径約8cm)を用いて撮像を行い,実験例との画像の対比を行った。小口径表面コイルを用いた場合、皮膚のコイルに密着する部分の信号が高くなりすぎ、距離が離れると信号が急に落ちるという欠点に遭遇した。これを克服するためにはコイルの口径とFOVに応じて皮膚の間に適当な距離を設定する必要があると考えられた。今後の展望更に小さな口径のコイルおよびFOVによる皮膚、皮下組織の撮像を行いたい。特に、指の爪下部、指関節部、手関節部、顔面部、頭皮等の表在構造について詳しく正常構造のMRI画像所見を確立し、病変の診断法の基礎としたい。加えて,同意の得られた患者については試作コイルによる腫瘍病変あるいは炎症性病変の描出能を検討したい。本院で稼働中のGE社製1.5テスラMRI装置SIGNAに装着可能な小口径(5cm径)の表面コイル1個を試作し,皮膚・皮下組織の描出能を検討した.撮像パラメーターは,field of view (FOV)8cm,スライス厚3cm,マトリックス256x256を用い,スピンエコー法T1強調像(TR/TE,450/20),T2強調像(TR/TE,1800/70),およびshort TI inversion recovery法(脂肪抑制画像)を用い,ファントム撮影の他,正常ボランティアの皮膚・皮下組織を撮像した.正常ボランティア7名の足底踵部スピンエコー法矢状断像の検討では,厚さ約1mmの表皮が高信号層,同じく厚さ約1mmの真皮が低信号層,それに厚さ数mm-数cmの皮下脂肪組織が高信号層として良好に描出された.また,脂肪抑制画像においても比較的良好に脂肪層の信号が低下した.以上より,小口径コイルによる表在病変の画像診断に役立つことが示唆された.来年度以降に続く問題点は,FOVを更に小さくして撮像できるか,スライス厚を更に小さくできるか,更に小口径のコイルの性能はどうか,これらのコイルを用いての病変の描出能はどうか,などである.研究目的:試作表面コイルを用いてMRIによる皮膚・皮下組織小病変の診断能を検討する.研究経過:6cm径のコイルを試作し,1.5テスラのMRI装置Signa・Advantageに装着して使用した.FOV8cm,スライス厚3mm,256マトリックスで正常ボランティア8名の足底部を撮像したところ,皮膚,皮下組織の良好な画像が得られた.皮膚の内部構造については、表皮と真皮との区別はつくものの,表皮内の層構造は抽出できなかった.また,少数ではあるが臨床例については正規のコイルのうち最少のもの(約8cm径)を用いて撮像を行い,実験例との画像の対比を行った.表面コイルの口径が小さくても,MRI装置で設定可能なFOVが大きければ,小病変の抽出は困難と考えられるので,平成8年度に導入された.

もっと小さなFOV設定の可能なMRI装置Signa・Horizonによる撮像も加え,比較検討した.ただ,当初の予定である6cm未満の小口径コイルの試作が遅れているので近い将来作製したい.また,臨床例が少ないため,実際の病変についての評価があまり行えていない.なお,平成8年度途中までの研究成果については,「インナービジョン11・8:38,1996」誌に掲載した.今後の予定新しいMRI装置Signa・Horizonにこの試作コイルを装着して撮像を継続し,正常ボランティアについては足底部の他,手指部その他の部位についても撮像し検討を加えたい.また,同意を得られた患者に試作コイルによる撮像を行い,腸瘍病変あるいは炎症性病変についての抽出能を検討したい.研究経過試作した小口径表面コイル(口径約5cm)を用い,1.5テスラのMRI装置Signa・AdvantageおよびSigna・Horizonに装着して使用した。FOV(field of view)は8cm,スライス厚は3mm、画像計算マトリックスは256x256を基本とし、正常ボランティアの手足部の皮膚・皮下組織を撮像したところ,表皮と真皮の区別は容易であり,皮下組織内の脂肪とその内部を貫く結合組織の網目構造も明瞭に抽出できた。表皮はT1強調画像にて比較的高信号,真皮は比較的低信号の、ともに厚さ1mm前後の層として描出された.しかし、表皮内の層構造は抽出できず,踵部で角質層を他の表皮層より分離することも困難であった。臨床例については皮膚・皮下組織の腫瘍性疾患、炎症性疾患等に正規のコイルのうち最小のもの(口径約8cm)を用いて撮像を行い,実験例との画像の対比を行った。小口径表面コイルを用いた場合、皮膚のコイルに密着する部分の信号が高くなりすぎ、距離が離れると信号が急に落ちるという欠点に遭遇した。これを克服するためにはコイルの口径とFOVに応じて皮膚の間に適当な距離を設定する必要があると考えられた。今後の展望MRI設置Signa・Horizonを用いて更に小さな口径のコイルおよびFOVによる皮膚、皮下組織の撮像したい。特に、指の爪下部、指関節部、手関節部、顔面部、頭皮等の表在構造について詳しく正常構造のMRI画像所見を確立し、病変の診断法の基礎としたい。加えて,同意の得られた患者については試作コイルによる腫瘍病変あるいは炎症性病変の抽出能を検討したい。
ソフトイオン化質量分析を用いた異常ヘモグロビンスクリーニング法の確立

<対象>H16年度中に学内外から依頼のあった異常ヘモグロビン症疑い症例28検体<方法>異常ヘモグロビンスクリーニング法第1段階:短時間(数分)での異常Hbの有無の検出a)陽イオン交換カラムを使用した異常Hbの検出:従来法120分/1検体から新分離法25分/1検体に短縮。b)エレクトロスプレー質量分析(現有設備)を使用した検出c)不安定性ヘモグロビンの検出(イソプロパノールテスト)第2段階:検出された異常Hbの構造解析1)変異成分の分離2)酵素消化3)質量分析器による変異部位およびアミノ酸の同定4)DNAシークエンシングによる変異の確認5)酸素親和性の測定<結果>第1段階で正常9検体、異常ヘモグロビン症8種11検体、αサラセミア4検体、βサラセミア5検体を検出した。(うち1検体は異常ヘモグロビンとβサラセミアの複合ヘテロ接合体)<対象>H15年度中に学内外から依頼のあった異常ヘモグロビン症疑い症例22検体<方法>異常ヘモグロビンスクリーニング法第1段階:短時間(数分)での異常Hbの有無の検出a)陽イオン交換カラムを使用した異常Hbの検出b)エレクトロスプレー質量分析(現有設備)を使用した検出c)不安定性ヘモグロビンの検出(イソプロパノールテスト)第2段階:検出された異常Hbの構造解析1)変異成分の分離2)酵素消化3)質量分析器による変異部位およびアミノ酸の同定4)DNAシークエンシングによる変異の確認<結果>第1段階で正常11検体、異常ヘモグロビン症6種11症例を検出した。(うち1検体は異常ヘモグロビンとβサラセミアの複合ヘテロ接合体)
硝酸還元アンモニア産生能をもつ通性嫌気性土壌細菌の性状とその応用

自然環境は、環境の変化に対して元の状態に回復しようとする能力をもっている。酸性化に対しても同様で、その主役は環境中に生息する酸性化に抵抗するような微生物を含めた多種多様な微生物である。これらの微生物は、生物圏における有機化合物の第一分解者であり、世代時間が短いことから、環境の変化に最も迅速に対応していると考えられる。そこで、土壌酸性化に対する土壌細菌の対応機構の一つとして中和機構を想定し、弱酸性条件下で硝酸・亜硝酸を還元してアンモニアを産生する弱酸性耐性細菌の検出を試み、その存在を確認するとともに単離に成功した。すなわち、硝酸を単一窒素源とした培地および培養条件を確立したのち、大阪府下の山林土壌・畑土壌・河川底質サンプルから硝酸酸性(pH4)培地上で嫌気性条件下に生育できる細菌を49株単離し、そのうち25株が硝酸を還元し、アンモニアを産生することを確認した。これらの菌株のうち硝酸還元、アンモニア産生、増殖の能力の高い3菌株(N203、N104、Y003)を選定し、細菌学的性状を検討した。その結果、N203株はClostridium属、N104とY003株はAeromonas属と分類された。また、硝酸を単一窒素源とした培地では3株ともpH3およびpH8、10ではあまり増殖できなかったが、pH4から中性付近に増殖の極大値がみられ、培養液のpHも上昇した。さらに、これらの菌株はアンモニア共存下でも硝酸還元能を示した。Aeromonas属の2株のこれらの能力は土壌成分によってもそれほど影響されなかった。以上から、土壌中には酸性化に対応する細菌が存在し、それらを土壌酸性化対策として利用できる可能性が示された。環境の変化に対して、自然環境はそれ自身の緩衝作用により元の状態に復元しようとする能力、すなわち自浄機能をもっている。その主役は環境中に生息する酸性化に抵抗するような微生物を含めた多種多様な微生物である。すなわち、硝酸を単一窒素源とした培地および培養条件を確立したのち、大阪府下の山林土壌・畑土壌・河川底質サンプルから硝酸酸性(pH4)、嫌気性条件下に生育できる細菌を49株単離し、そのうち25株が硝酸を還元し、アンモニアを産生することを確認した。その結果、N203株はClostridium属、他の2株はAeromonas属と分類された。また硝酸を単一窒素源とした培地では3株ともpH3およびpH8、10ではあまり増殖できなかったがpH4から中性付近に増殖の極大値がみられ、培地のpHも上昇した。以上から、土壌中に酸性化に対応する細菌が存在し、それらを土壌酸性化対策として利用できる可能性が示された。

これらの微生物は、生物圏における有機化合物の第一分解者である、世代時間が短いことから、環境の変化に最も迅速に対応していると考えられる。そこで、土壌酸性化に対する土壌細菌の対応機構の一つとして中和機構を想定し、弱酸性条件下で硝酸・亜硝酸を還元してアンモニアを産生する弱酸性耐性細菌の検出を試み、その存在を確認するとともに単離に成功した。すなわち、硝酸を単一窒素源とした培地および培養条件を確立したのち、大阪府下の山林土壌・畑土壌・河川底質サンプルから硝酸酸性(pH4)培地上で嫌気性条件下に生育できる細菌を49株単離し、そのうち25株が硝酸を還元し、アンモニアを産生することを確認した。これらの菌株のうち硝酸還元、アンモニア産生、増殖の能力の高い3菌株(N203、N104、Y003)を選定し、細菌学的性状を検討した。その結果、N203株はClostridium属、N104とY003株はAeromonas属と分類された。また、硝酸を単一窒素源とした培地では3株ともpH3およびpH8、10ではあまり増殖できなかったが、pH4から中性付近に増殖の極大値がみられ、培養液のpHも上昇した。さらに、これらの菌株はアンモニア共存下でも硝酸還元能を示した。Aeromonas属の2株のこれらの能力は土壌成分によってもそれほど影響されなかった。以上から、土壌中には酸性化に対応する細菌が存在し、それらを土壌酸性化対策として利用できる可能性が示された。
ヒト悪性骨巨細胞腫の組織起源と生物学的悪性度に関する研究

骨巨細胞腫,悪性骨巨細胞腫の組織起源を解明する為に3年間に至って下記の如き実験的研究が行なわれた.60年度我々は悪性骨巨細胞腫の1例でヌードマウス可移植株の樹立に成功したので,この株を用いて移植および培養による形態学的変化の観察,電顕による超微細構造の観察,免疫組織化学的手法による細胞機能学的な側面の観察を行った.その結果,移植細胞は継代を重ねるに従い紡錘形の細胞が多くなるが一部に巨細胞の起源を思わせる様な星状から立方体の組織球様基質細胞もみられ,これらの基質細胞は免疫組織化学的な検討でも組織球によくみられるsurface markerが陽性であった.61年度前年度に引き続き悪性骨巨細胞腫の移植株については移植を続け,又種々の条件下で培養を続け継代に伴う形態学的な変化を調査した.又機能面での観察としては,この細胞のコラゲナーゼ活性と墨汁に対する貪食能をみた.一方骨巨細胞腫の16例に関しても,光顕,電顕により形態学的な観察と共に貪食能,免疫組織学的観察が行なわれた.その結果としては悪性骨巨細胞腫の培養細胞は非常に高いコラゲナーゼ活性を示し,組織球的な性格を思わせた.骨巨細胞腫の構成細胞の超微細構造は組織球的な組織起源を思わせるものであり,機能面での観察でも巨細胞や星状基質細胞では組織球的な性格が保たれていた.62年度組織的,臨床的に悪性骨巨細胞腫に非常に類似していると云われる悪性線維性組織球腫(MFH)の13例とコントロール群としての2種類のfibroblastに対して,前年度と同様の研究が行なわれ,そのデータが比較された.その結果は形態学的観察,機能学的観察共に巨細胞腫に対して行われた研究結果と同じ傾向がみられた.この結果は対照群のfibroblastが示した結果とは異なっていた.以上の実験結果から,上記三種類の腫瘍は共に組織球的な性格を強く持った細胞から由来した腫瘍である事が示唆された.骨巨細胞腫,悪性骨巨細胞腫の組織起源を解明する為に3年間に至って下記の如き実験的研究が行なわれた.60年度我々は悪性骨巨細胞腫の1例でヌードマウス可移植株の樹立に成功したので,この株を用いて移植および培養による形態学的変化の観察,電顕による超微細構造の観察,免疫組織化学的手法による細胞機能学的な側面の観察を行った.その結果,移植細胞は継代を重ねるに従い紡錘形の細胞が多くなるが一部に巨細胞の起源を思わせる様な星状から立方体の組織球様基質細胞もみられ,これらの基質細胞は免疫組織化学的な検討でも組織球によくみられるsurface markerが陽性であった.61年度前年度に引き続き悪性骨巨細胞腫の移植株については移植を続け,又種々の条件下で培養を続け継代に伴う形態学的な変化を調査した.又機能面での観察としては,この細胞のコラゲナーゼ活性と墨汁に対する貪食能をみた.一方骨巨細胞腫の16例に関しても,光顕,電顕により形態学的な観察と共に貪食能,免疫組織学的観察が行なわれた.その結果としては悪性骨巨細胞腫の培養細胞は非常に高いコラゲナーゼ活性を示し,組織球的な性格を思わせた.骨巨細胞腫の構成細胞の超微細構造は組織球的な組織起源を思わせるものであり,機能面での観察でも巨細胞や星状基質細胞では組織球的な性格が保たれていた.62年度組織的,臨床的に悪性骨巨細胞腫に非常に類似していると云われる悪性線維性組織球腫(MFH)の13例とコントロール群としての2種類のfibroblastに対して,前年度と同様の研究が行なわれ,そのデータが比較された.その結果は形態学的観察,機能学的観察共に巨細胞腫に対して行われた研究結果と同じ傾向がみられた.この結果は対照群のfibroblastが示した結果とは異なっていた.以上の実験結果から,上記三種類の腫瘍は共に組織球的な性格を強く持った細胞から由来した腫瘍である事が示唆された.骨巨細胞腫はいまだにその組織起源に関して一定の見解が得られていない非常に興味深い腫瘍である。我々はこれまで教室で継代されているヌードマウス可移植性ヒト悪性骨巨細胞腫を用いて本腫瘍がマクロファージ由来であるとの考を強調して来た。今年度も引き続きさらにその点を検討する目的で以下の実験を行った。実験【I】材料手術によって摘出された3症例の骨巨細胞腫および当教室で継代移植されているヌードマウス可移植ヒト悪性骨巨細胞腫が用いられた。【II】方法および結果(1)形態学的観察得られた腫瘍細胞は光顕的、電顕的に形態学的な検討が加えられ、基質細胞中にマクロファージ類似の細胞が存在する事が認められた。また組織起源を検討する際にいつも問題になる多核巨細胞を、それが全て消失してしまった細胞集団より再発出現させるべく、宿主の骨と共に培養を続けて来たが、現在迄に再出現してはいない。(2)細胞機能的観察ヌードマウス可移植性ヒト悪性骨巨細胞腫の腫瘍細胞のコラゲナーゼ活性を測定した結果、コントロールとして用いたHeLa細胞、ヒト骨肉腫細胞に比べ、はるかに高い活性が多核巨細胞、類円形基質細胞で認められた。細胞機能的にそれらの細胞の由来がマクロファージである可能性が示唆された。

(3)Surface Makerによる観察(A)免疫組織学的観察d-1 Antitrypsin(AT),d-1 Antichymotrypsin(ACT),lysozyme(LYS)の局在を3例の骨巨細胞腫と1例の悪性骨巨細胞腫べ検討した結果、初代培養細胞では基質細胞、多核巨細胞の両者でこれらが陽性であったが、継代培養されるに従い陽性細胞は存在しなくなった。(B)組織化学的観察non-specific esteraseの局在を検索した、基質細胞、多核巨細胞共に陽性であり、(A)(B)の結果より上述の細胞がマクロファージ的性格を有している事が示された。
植物細胞分化の不可逆過程の解析

ヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素(道管・仮道管細胞)への細胞分化過程には変換点が存在(分化誘導後48時間目頃)し、この時期を境に、分化が可逆的な過程から不可逆過程に移行する。今回の研究ではこの不可逆過程を生化学・分子生物学的に解析した。まず,二次細胞壁形成の分子マーカーの単離を試み,二次細胞壁のパターン形成に関与するチューブリン遺伝子,二次細胞壁特異的なリグニンの合成に関与する遺伝子であるphenylalanine ammonia-lyase(PAL)と細胞壁結合peroxidaseの遺伝子(cDNA)を単離した。このうちperoxidase遺伝子ZPO-Cは,管状要素分化特異的に,しかも,リグニン合成の直前に一過的に発現することが示され,不可逆過程でのみ発現することが明らかになった.また自己分解のよいマーカーとなるシステインタンパク質分解酵素cDNAの単離に成功した。この遺伝子を単離し,細胞壁形成に関連する遺伝子との発現制御の比較をすることで,不可逆過程を引き起こす仕組みに迫れるものと期待される.次に,分化の変換点で発現する遺伝子の単離を試みた。そして、そのような遺伝子のcDNAクローンとして、遺伝子TED2-4を48時間目の培養細胞由来のcDNAライブラリーから単離した。in situ hybridizationにより、これらの遺伝子の植物体での発現を調べたところ、TED3が道管に分化する能力を持った細胞に、TED4が木部に分化する能力を持った細胞に、またTED2が木部、師部両方に分化する能力を持った細胞で発現することが分かった。そして、葉肉細胞から管状要素への分化系において、細胞分化能力は木部・師部→木部→道管(管状要素)へと次第に制限されていくと推定された。本研究では、ヒャクニチソウ葉肉細胞から管状要素(道管・仮道管細胞)への単細胞分化系を用いて、植物細胞分化の不可逆過程の解明を目指している。そのために、不可逆過程を二次細胞壁形成・成熟過程、細胞の自己分解過程に分け、それぞれの過程を生化学・分子生物学的に解析することとした。本年度は、以下に示すように、分子マーカーとなるいくつかの遺伝子及びタンパク質の単離とcharacterizationに成功し、同時にヒャクニチソウへの遺伝子導入系の作製にも成功した。次年度はこれらのマーカーを用い、不可逆過程の全体像を構築する。1.ヒャクニチソウ管状要素過程で発現する3種のβ-チューブリン遺伝子は異なった発現パターンを示すことが明らかになった。4.分化過程で発現するproteaseのうち最も主要な塩基性proteaseを部分精製した。5.TED2-4遺伝子の発現解析から、これらの遺伝子は不可逆過程で強く発現することが分かり、これらの遺伝子も不可逆過程マーカーになることが示された。6.外来遺伝子をRiプラズミドを用いてヒャクニチソウ細胞に導入し、外来遺伝子をもつ形質転換根を作ることに成功した。この結果、組織内でおこる木部分化過程での不可逆過程を外来遺伝子作用を通して解析する道が開かれた。まず、二次細胞壁形成の分子マーカーの単離を試み、二次細胞壁のパターン形成に関与するチューブリン遺伝子、二次細胞壁特異的なリグニンの合成に関与する遺伝子であるphenylalanine ammonia-lyase(PAL)と細胞壁結合peroxidaseの遺伝子(cDNA)を単離した。このうちperoxidase遺伝子ZPO-Cは、管状要素分化

特異的に、しかも、リグニン合成の直前に一過的に発現することが示され、不可逆過程でのみ発現することが明らかになった。また自己分解のよいマーカーとなるシステインタンパク質分解酵素cDNAの単離に成功した。この遺伝子を単離し、細胞壁形成に関連する遺伝子との発現制御の比較をすることで、不可逆過程を引き起こす仕組みに迫れるものと期待される。次に、分化の変換点で発現する遺伝子の単離を試みた。そして、そのような遺伝子のcDNAクローンとして、遺伝子TED2-4を48時間目の培養細胞由来のcDNAライブラリーから単離した。in situ hybridizationにより、これらの遺伝子の植物体での発現を調べたところ、TED3が道管に分化する能力を持った細胞に、TED4が木部に分化する能力を持った細胞に、またTED2が木部、師部両方に分化する能力を持った細胞で発現することが分かった。そして、葉肉細胞から管状要素への分化系において、細胞分化能力は木部・師部→木部→道管(管状要素)へと次第に制限されていくと推定された。