hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AID変異体ノックインマウスを用いたAIDの生理病態機構解明

抗体産生応答においてAID(activation-induced cytidine deaminase)の2つの活性、すなわち体細胞突然変異とクラススイッチ組換えの両者が効率良く外敵を排除するために重要であるが、体細胞突然変異単独の寄与は動物モデルがなかったため明らかでなかった。そこで体細胞突然変異の生体内での重要性を検討するため、体細胞突然変異を特異的に消失するAIDのN末mutant(G23S)のノックインマウスを作製し、生体防御とくに腸管免疫における意義を検討した。G23SノックインマウスではIgG,IgA,また腸管内にIgAの分泌が認められ、クラススイッチはほぼ正常である一方、体細胞突然変異は有意に減少していた。AIDノックアウトマウスと類似の表現型、脾臓やパイエル板の胚中心の過形成が認められたが、その程度は常にノックアウトと野生型マウスの中間を示した。この過形成の原因は今まで報告されてきたようにクラススイッチの障害、IgAやIgGの欠失によるものであることを否定できないが、G23Sマウスの結果から体細胞突然変異の減少による寄与も重要であることがはじめて明らかになった。コレラ毒素に対する防御反応はG23Sノックインマウスで有意に低下していた。つまり体細胞突然変異の減少は病原体排除能の低下だけでなく、リンパ組織の過形成などの免疫異常にも寄与していることが明らかになった。これらの結果は現在論文投稿準備中である。AID(activation-induced cytidine deaminase)の2つの活性、すなわち体細胞突然変異とクラススイッチ組換えの両者が生体内でそれぞれどのような機能分担をするかを明らかにするため、体細胞突然変異を特異的に消失するAIDのN末mutant(G23S)とクラススイッチを特異的に失うC末mutant(JP8B)のノックインマウスを作製した。これらのノックインマウスを用いて以下の3点について検討している。1)抗体産生機能について。G23Sノックインマウスではクラススイッチの軽度の減少はあるものの、血清中にIgG,IgA,また腸管内にIgAの分泌が認められ、クラススイッチはほぼ正常であった。体細胞突然変異は有意に減少しており、in vitroの実験から予想される結果を示した。JP8BノックインマウスはIgG,IgAともに血清中に検出されなかった。しかし体細胞突然変異も検出できず、in vitroの結果を再現できなかった。JP8B mRNAはほぼ正常に発現しているが、蛋白が検出できないことがクラススイッチ、体細胞突然変異ともに消失している原因と考えられた。なぜ蛋白が検出されないのか、検討中である。2)抗体遺伝子座とcmycなどの遺伝子座の染色体転座にAIDが関与しているが、どちらの活性によるのか、あるいは両方必要なのかを明らかにするため、リンパ腫好発系であるBalbc/Aへのバッククロスを行っている。3)AIDノックアウトマウスで観察される全身のリンパ臓器のおける過形成はどちらの活性に起因するのかを明らかにするため、G23Sノックインマウスの免疫組織を検索した。ノックアウトマウスと類似の表現型、つまり脾臓やバイエル板の胚中心の過形成が認められた。G23SノックインマウスではIgG,IgAはほぼ正常に発現しているので、この過形成の原因は体細胞突然変異の減少によるものと推察された。しかし、クラススイッチ活性を失うJP8Bノックインマウスではmutant蛋白を検出することができず免疫学的検討を中止した。、G23Sノックインマウスを用いて以下の3点について検討した。体細胞突然変異は有意に減少しており、マウスにおいてもin vitroの実験から予想される結果を示した。2)抗体遺伝子座とcmycなどの遺伝子座の染色体転座にAIDが関与しているが、どちらの活性によるのか、あるいは両方必要なのかを明らかにするため、リンパ腫好発系であるBalbc/Aへのバッククロスをほぼ終了した。今後、リンパ腫発生の頻度を検討する。ノックアウトマウスと類似の表現型、つまり脾臓臓やパイエル板の胚中心の過形成が認められたが、その程度は常にノックアウトと野生型マウスの中間を示した。この過形成の原因は今まで報告されてきたようにクラススイッチの障害、つまりIgAやIgGの欠失によるものであることを否定できないが、G23Sマウスの結果から体細胞突然変異の減少による寄与も重要であることがはじめて明らかになった。

そこで体細胞突然変異の生体内での重要性を検討するため、体細胞突然変異を特異的に消失するAIDのN末mutant(G23S)のノックインマウスを作製し、生体防御とくに腸管免疫における意義を検討した。G23SノックインマウスではIgG,IgA,また腸管内にIgAの分泌が認められ、クラススイッチはほぼ正常である一方、体細胞突然変異は有意に減少していた。AIDノックアウトマウスと類似の表現型、脾臓やパイエル板の胚中心の過形成が認められたが、その程度は常にノックアウトと野生型マウスの中間を示した。この過形成の原因は今まで報告されてきたようにクラススイッチの障害、IgAやIgGの欠失によるものであることを否定できないが、G23Sマウスの結果から体細胞突然変異の減少による寄与も重要であることがはじめて明らかになった。コレラ毒素に対する防御反応はG23Sノックインマウスで有意に低下していた。つまり体細胞突然変異の減少は病原体排除能の低下だけでなく、リンパ組織の過形成などの免疫異常にも寄与していることが明らかになった。これらの結果は現在論文投稿準備中である。
強迫性障害の病態および治療におけるセロトニン神経活動性変化によるメタ可塑性の関与

本年度も引き続き、強迫性障害の病態、治療におけるセロトニンシグナルの関与について検討を行った。前年度に作成した強迫性障害モデルマウスを用いてSSRIによる思考柔軟性の改善メカニズムの検討を行ったところ、SSRIの長期・高用量投与はT字迷路の逆転学習試験においてモデルマウスの逆転学習効率を改善させたことから、SSRIの長期・高用量投与による思考柔軟性の改善メカニズムついて、セロトニンシグナルの変動に着目して検討を行った。すると、セロトニン受容体のうち、5-HT2C受容体遮断薬の全身投与は、短期間の投与でもSSRIの長期・高用量投与と同様の逆転学習効率の改善作用を示した。こうした5-HT2C受容体遮断薬の作用メカニズムの検討のため、SSRIの長期・高用量投与で神経活動性の改善が認められている外側眼窩前頭皮質(lOFC)の錐体神経から電気生理学的に記録を行ったところ、記録液中に5-HT2C受容体遮断薬を添加することで、モデルマウスのlOFC錐体神経への抑制性入力の増加、および錐体神経自身の神経活動性の低下(正常化)が認められた。また、上記の5-HT2C受容体遮断薬の作用は、SSRIの長期・高用量投与をあらかじめ行っていた場合では認められなかった。以上の結果より、SSRIの長期・高用量投与は、lOFCの5-HT2C受容体シグナルの低下を介してlOFCの錐体神経活動を正常化させ、モデルマウスで生じた思考柔軟性の低下を改善させることが示唆される。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究ではquinpirole反復投与による強迫性障害モデルマウスの作製および予測妥当性を満たすような評価系の確立を目指した。Quinpiroleの反復投与は、強迫性障害様の確認行動の増加を引き起こしたが、第一選択薬である選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)の長期投与による治療効果発現は認められなかった。しかしながら、SSRIにより、モデルマウスの多動は改善されたことから、一定の側面での改善作用があることが示唆された。近年の臨床研究より、強迫性障害患者では、行動学習の際に習慣の形成が起こりやすいことが報告されている。そこで、モデルマウスにおいても、確認行動に代わる評価指標として、過剰学習による習慣の形成の評価を試みた。T字迷路を用いた左右弁別試験において、過剰学習後の逆転学習効率の変化を評価したところ、モデルマウスにおいて逆転学習の著しい障害が認められた。一方、SSRIを長期投与することで、モデルマウスで見られた逆転学習の障害が改善された。さらにモデルマウスより、強迫性障害患者で活動性亢進が報告されている眼窩前頭皮質の急性単離切片を作成し、眼窩前頭皮質神経の活動性を記録したところ、投射神経である錐体神経の神経活動性がモデルマウスにおいて亢進しており、SSRI長期投与によりこの活動亢進は改善した。また、SSRIの長期投与は、縫線核セロトニン神経の自発活動性を亢進させていた。以上の検討より、SSRI長期投与はセロトニン神経活動の亢進を介して眼窩前頭皮質神経活動を抑制し、モデルマウスで見られた習慣の易形成の改善に関与すると考えられる。強迫性障害モデルマウスの作製に関しては、当初の評価系である確認行動試験では既存の治療薬の応答性を評価することができなかった。この問題点を解決する実験系確立に時間を要したが、習慣行動の形成を指標とする新規評価系の導入することで解決に至った。この評価系においては、強迫性障害治療の第一選択薬であるSSRIが効果を示すことから、SSRIの治療メカニズムの解析や、新規治療候補薬の探索に応用が可能であると考えられる。病態、治療メカニズムの解析のための、急性単離切片を用いた電気生理学的解析では、モデルマウスにおける眼窩前頭皮質の神経活動性の異常、およびSSRIによる治療効果を検出することができた。具体的には、眼窩前頭皮質の投射神経である、錐体神経にcurrent injectionを行い発火活動を記録したところ、モデルマウスでは発火数が増加し、SSRIを長期投与することでコントロールマウスと同程度の発火数まで減少した。これは、眼窩前頭皮質の錐体神経の活動性異常が強迫性障害の病態、治療に関与する可能性を示唆する結果である。一方で、SSRIの長期投与による治療効果発現のメカニズムについて、縫線核セロトニン神経の活動性変化にも着目して検討を行った。縫線核セロトニン神経は自発的な発火活動性をもち、長期間SSRIを投与することでその自発活動性は亢進した。これは、通常時に働いているGABAB受容体由来の抑制機構が、SSRI投与によって減弱することに起因する現象であり、治療メカニズムの解明という点だけではなく、セロトニン神経の活動性調節機構の解明という点でも新規な知見であることから、現在、この結果については論文投稿準備中である。

すると、セロトニン受容体のうち、5-HT2C受容体遮断薬の全身投与は、短期間の投与でもSSRIの長期・高用量投与と同様の逆転学習効率の改善作用を示した。こうした5-HT2C受容体遮断薬の作用メカニズムの検討のため、SSRIの長期・高用量投与で神経活動性の改善が認められている外側眼窩前頭皮質(lOFC)の錐体神経から電気生理学的に記録を行ったところ、記録液中に5-HT2C受容体遮断薬を添加することで、モデルマウスのlOFC錐体神経への抑制性入力の増加、および錐体神経自身の神経活動性の低下(正常化)が認められた。また、上記の5-HT2C受容体遮断薬の作用は、SSRIの長期・高用量投与をあらかじめ行っていた場合では認められなかった。以上の結果より、SSRIの長期・高用量投与は、lOFCの5-HT2C受容体シグナルの低下を介してlOFCの錐体神経活動を正常化させ、モデルマウスで生じた思考柔軟性の低下を改善させることが示唆される。まず、昨年度の電気生理学的な検討によりに明らかにした、強迫性障害モデルマウスにおける眼窩前頭皮質の神経活動性の異常、およびSSRIによる治療効果に関して、詳細なメカニズムを検討する。SSRIの長期投与時には、各種セロトニン受容体のシグナルが変化していると考えられるため、薬理学的手法により、セロトニン受容体の関与の有無および関与する受容体の種類について検討する。また、眼窩前頭皮質は、皮質-線条体-視床-皮質回路の一部を担う領域であることから、眼窩前頭皮質の投射先領域である、背内側線条体の入力量及び、神経活動性の変化についても併せて検討を行う。これらの検討より、モデルマウスにおける臨床所見の再現性を評価するだけではなく、病態、治療における眼窩前頭皮質-背内側線条体経路の変化の関与についても検証を行う。また、昨年度に導入した習慣行動の形成を指標とする新規評価系は、予測妥当性に優れる評価系ではあるが、スループット性に問題があるため、今後はこの評価系に加え、自発的な反復行動を指標とした評価系の確立を目指す。具体的には、quinpirole反復投与後のホームケージ内での毛づくろい、巣作り行動の異常反復に着目する予定である。また、上記の電気生理学的検討によって、病態や治療効果発現に関与する脳部位、神経経路が判明した場合、ケミカルジェネティクスやオプトジェネティクスを用いた神経活動の操作を行い、症状の変化を観察することで、強迫性障害症状を引き起こす責任脳部位についても検討を行う予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ピーリング工具の実用化：径10μm以下の微細放電加工用電極の簡便な作製技術の確立

φ10μmのタングステン線の周囲に亜鉛をφ100μm以上になるまでめっきした工具電極を作製し、このような同軸円筒状の工具を、ピーリング工具と名付けている。作製した工具の表面粗さは2μm以下であり、ワイヤと工具外径の中心位置のずれは約2μmと精度よい。この工具を用いて、50μm厚の銅板に放電穴あけを試みると、工具外径に対応する浅い凹みと、その中心にワイヤ径に対応する貫通穴があいた。被覆部除去と微細穴の同時加工が実現しており、1穴加工後はワイヤを数十μm露出できた。引き続き同じ工具で複数の連続穴加工も可能であった。同一機上で微細軸形成から加工までの一連の作業が実現できることが実証された。微細放電加工で必要とされている工具電極はその細さ故に取り扱いが困難である。放電加工は非接触加工法であるため加工物の硬度によらず高精度な加工が可能であり、このメリットを生かして微細加工を実現するためにも、直径100μm以下の工具電極の簡便な作製技術の開発は重要な課題である。そこで我々は、取り扱いにくい細線ワイヤの外周を、把持しやすい径まで融点の低い別の金属で被覆した同軸円筒状の工具を作製し、加工に用いる際に被覆層の一部を除去(ピール)してワイヤを露出させ、そのワイヤを微細加工電極として用いる工具を開発しており、これをピーリング工具と名付けている。作製したピーリング工具は加工機に取り付け、微細軸成形から加工までの一連の作業を同一機上で実現することを目指している。この利用が確立されれば作業効率の向上と省資源化が達成される。以前までの研究により、直径100μmのタングステンワイヤへ膜厚100μm以上の亜鉛を電解めっきにより被覆することに成功している。被覆部の一部を、数十A、数百μsの単発放電によって除去し、軸中心部のワイヤを未溶融で露出することに成功した。これを加工に適用し、ワイヤが消耗した際には、加工機から工具を取り外さずに再度被覆部除去を行い、ワイヤを再露出させて加工を継続することができた。本研究は作製が極めて難しい10μm以下の工具作製を目指している。H26年度は、より細い、直径50μmや30μmのワイヤへのめっきを試み、その精度評価と単発放電による被覆部の除去を行った。工具精度が向上するめっきの添加剤を発見し、偏心量が約2μm、表面粗さも約2μmを達成できた。また、それらのピーリング工具を用いて単発放電による被覆部のみの除去が可能な電気条件を見いだし、微細放電穴あけ加工を実施した。本研究では、微細放電加工に用いる直径10μm以下の工具電極の簡便な作製技術を確立し、同一機上で微細軸形成から加工までの一連の作業を実現することを目的としている。取り扱いにくい細線電極をコアとして、その外周を把持しやすい径まで別の金属で被覆した同軸円筒状の工具を作製し、加工に用いる際に被覆層の一部を除去(ピール)してワイヤを露出させ、そのワイヤを微細加工電極として用いる工具を開発し、これをピーリング工具と名付けている。これまでの研究により、直径100μm、50μm、30μm、20μmのタングステンワイヤをコアに用いて、電解めっきにより外径200μmとなるまで亜鉛を被覆することに成功した。工具精度の向上を期待して、従来のめっきで使われているいくつかのpH緩衝剤や平滑剤を添加し、めっき面への効果を調べたところ、デキストリンを添加するとワイヤ直径によらず偏心量は約2μm、表面粗さも約2μmが達成できた。H27年度は、さらに細い直径10μmのタングステンワイヤを用いてピーリング工具の作製を試みた。外径が100μmとなるまで亜鉛を被覆したところ、工具精度は直径20μmのコアを用いて作製した場合と同程度であった。単発放電による被覆部除去は、コア径が小さいほど難しくなることが予想されたが、コアを未溶融で被覆部のみを除去する電気条件を見出した。単発放電によるコアの露出長さには限界があるため、被覆部除去と微細穴あけの同時加工を試みたところ、これらの同時加工は可能であり、板厚50μmのSK材に対して直径約20μmの貫通穴をあけることができた。本研究におけるめっきの重要点はワイヤ電極を把持しやすい太さまで均一に被覆すること、金属ワイヤよりも低い融点の金属で除去しやすいことであり、把持に必要な最低限の強度を有すれば、ち密である必要はない。これらは従来のめっきの目的から外れており、めっき条件の探索は困難と予想された。また、ピーリング工具を回転させて加工に用いる場合には、工具とワイヤの軸中心のずれがなく、工具表面(めっき面)が滑らかであることが重要である。工具精度は、偏心量(工具とワイヤの軸中心の差)と、めっき面の表面粗さ(Ra)を計測して評価した。添加剤としてpH緩衝材や平滑剤を選定してタングステンワイヤへのめっきを試みたところ、いくつかの添加剤で偏心量や表面粗さの改善が見受けられたが、特にデキストリンを添加した場合に大変改善した。

直径100μmから10μmのワイヤへのめっきを試みたが、ワイヤ直径によらず偏心量が約2μm、表面粗さも約2μmが達成できた。単発放電による被覆部除去の試みでは、ワイヤ直径10μmの場合も被覆部の除去が可能でワイヤが未溶融で露出できた。ワイヤが細いほど入力エネルギーが大きすぎるとコアまで溶けてしまう。また、単発放電によって露出できるワイヤの長さには限界があるため、コアを露出させずに微細放電加工を行い、被覆部除去と微細穴あけの同時加工を試みた。コア径10μm、外径100μmのピーリング工具を用いて、板厚50μmのSK材に対して直径約20μmの貫通穴をあけることができた。10μmのワイヤを用いるピーリング工具の作製や被覆部除去と穴あけの同時加工は、2年目に予定していた内容であり、順調に進展していると判断する。微細放電加工用電極の簡便な作製技術を確立し、同一機上で微細軸形成から加工までの一連の作業を実現することを目的としている。細線電極(コア)の外周を把持しやすい径まで別の金属で被覆した同軸円筒状の工具を作製し、加工に用いる際に工具先端の被覆層の一部を除去(ピール)してコアを露出させ、そのコアを微細加工電極として用いる工具を開発し、これをピーリング工具と名付けている。本研究では、特に取り扱いにくく、作製が難しい直径10μm以下の工具電極の作製に取り組んだ。直径10010μmのタングステン線をコアに用い、その周囲を電解めっきにより亜鉛を被覆した。亜鉛めっき浴にデキストリンを添加すると、より滑らかなめっき面が得られた。いずれのコア径に対しても表面粗さやコアと外径の中心のずれが各々約2μmの工具精度が得られる。単発放電によるピーリング工具の先端部の被覆部除去では、コアにダメージがなく、被覆層である亜鉛のみを瞬時除去できる放電条件を見いだした。単発放電において亜鉛のみを除去してコアを未溶融で露出できる最大長さは、いずれのコア径に対しても、コア径の約6倍であった。単発放電後の工具を用いた微細穴あけ加工は可能であった。単発放電を行わずにピーリング工具でそのまま金属板に微細放電加工を行うと、被覆部除去と微細穴あけ加工を同時に実現できることが分かった。コア径10μm/外径110μmのピーリング工具を用いて、銅板厚300μmに対して被覆部と穴あけの同時加工を行うと、工具外径と対応する深さ約100μmの凹みと、その中心にコア部による長さ約200μmの微細貫通穴をあけることができた。この時のコア露出長さは約200μmであり、単発放電により被覆部除去した場合の3倍以上であった。これらの研究成果により、同一機上で微細軸形成から加工までの一連の作業を実現できることを明らかにした。φ10μmのタングステン線の周囲に亜鉛をφ100μm以上になるまでめっきした工具電極を作製し、このような同軸円筒状の工具を、ピーリング工具と名付けている。作製した工具の表面粗さは2μm以下であり、ワイヤと工具外径の中心位置のずれは約2μmと精度よい。この工具を用いて、50μm厚の銅板に放電穴あけを試みると、工具外径に対応する浅い凹みと、その中心にワイヤ径に対応する貫通穴があいた。被覆部除去と微細穴の同時加工が実現しており、1穴加工後はワイヤを数十μm露出できた。引き続き同じ工具で複数の連続穴加工も可能であった。同一機上で微細軸形成から加工までの一連の作業が実現できることが実証された。本研究におけるめっきの重要点は、ワイヤ電極を把持しやすい太さまで均一に被覆すること、把持に必要な最低限の強度を有すること、金属ワイヤよりも低い融点の金属とすること、除去しやすく、ち密である必要はないことである。これらは従来のめっきの目的から外れており、めっき条件の探索は困難と予想された。
剥離を有する複合材パネルの座屈及び座屈後挙動に関する研究

複合材料は、層間の破壊靱性が小さく衝撃荷重などにより積層した層間に剥離を生じ易い材料である。剥離の発生により,引っ張り強度の低下はあまり問題にならないが、曲げ剛性が低下することに起因する座屈荷重の低下に伴う圧縮強度の減少が著しい。この現象はCompression After Impact(CAI)と呼ばれ、航空機などの複合材料構造物の設計上非常に問題となっている。本研究の目的は、損傷許容的な設計のためのデ-タを得るために、剥離の発生後の性能の劣化のメカニズムを明らかにし、CAI対策のデ-タを取得することである。第一年度は、一方向強化複合材パネルの主に中央剥離を有する場合に関して実験及び解析を行い、第二年度は第一年度の成果を踏まえ、実際に用いられる状態に近いと考えられる織布積層複合材料パネルに関して、様々な剥離状態、すなわち剥離の大きさ・位置などのパラメタ-を変えて、圧縮実験及び解析を行った。本研究により、様々な剥離状態パラメタ-が複合材料パネルの圧縮特性の劣化・座屈などの構造安定問題にどの様に影響し、さらに最終破壊に至るプロセスにおいてどの様な役割をし、強度低下へ寄与するのかに関して多くの知見を得ることができた。また、変分原理に基づいて剥離領域の接触問題を考慮し得る解析理論を導き、メカニスティックなモデル化を行いRayleigh-Ritz法を用いて展開することにより、座屈後の現象を取扱い得る簡便な解析手法を提案し、座屈荷重および解析上シミュレ-トすることが非常に難しい二次座屈を含めた座屈後の挙動を解析することが可能となった。この手法による解析結果は実験結果をよく説明でき、本解析法を応用することにより、剥離の発生による複合材料パネルの圧縮特性の劣化メカニズムを明かにし得ることを確認することが出来た。また本手法により、剥離を有するパネルの強度の推定が可能となり今後のCAIを考慮した設計に有効であると考える。複合材料は、層間の破壊〓性が小さく衝撃荷重などにより積層した層間に剥離を生じ易い。剥離による曲げ剛性の低下などの性能の劣化がジェットエンジンの開発だけでなく至るところで構造設計上問題になっている。本研究の目的は、損傷許容的な設計のためのデータを得るために、剥離の発生後のパネルの性能の劣化の程度を明らかにすることである。本年度は、基礎的な理論展開と、実験手法の確立を目標に研究を進めてきた。実験に関しては、圧縮実験の手法をほぼ確立できたと考える。さらに、様々な剥離状態、すなわち剥離の大きさ位置などのパラメターを変えた一方強化複合材の平板パネルを製作し、本方法によりこれらのパネルに圧縮荷重を与える実験を行った。本実験により、様々な剥離状態によるパネルの劣化が、座屈などの構造安定問題にどの様に影響し、さらに最終破壊に至るプロセスにおいてどの様な役割をし強度低下に寄与するのかに関して多くの知見を得ることができた。また、剥離したパネルのメカニスティックなモデル化を行い、Rayleigh-Ritz法に基づいて剥離領域の接触問題を含めた解析理論を導き、座屈後の現象を取扱い得る簡便な解析手法を確立した。この手法により、座屈荷重だけでなく解析上シミュレートすることが非常に難しい座屈後の挙動まで含めて実験結果を非常によく説明できた。本研究結果に関して、「層間剥離を有する一方向強化パネルの圧縮実験(第一報)」、航空学会構造強度講演会、昭和63年7月。「層間剥離を有する周辺固定複合材パネルの圧縮実験」、CAS(航空機構造強度委員会)例会、東京、昭和63年12月。等で発表報告した。次年度はこれらの結果を踏まえて、一方向強化パネルだけでなく、一般に用いられている積層パネルの場合の挙動について研究を進めて行きたい。

複合材料は、層間の破壊靱性が小さく衝撃荷重などにより積層した層間に剥離を生じ易い材料である。剥離の発生により、引っ張り強度の低下はあまり問題にならないが、曲げ剛性が低下することに起因する座屈荷重の低下に伴う圧縮強度の減少が著しい。この現象はCompression After Impact(CAI)と呼ばれ、航空機などの複合材料構造物の設計上非常に問題となっている。本研究の目的は、損傷許容的な設計のためのデ-タを得るために、剥離の発生後の性能の劣化のメカニズムを明らかにし、CAI対策のデ-タを取得することである。本年度は、第一年度の研究成果にもとづいて、実際に用いられる状態に近いと考えられる織布積層複合材料パネルに関して、様々な剥離状態、すなわち剥離の大きさ・位置などのパラメタ-を変えて、圧縮実験を行った。本実験により、様々な剥離状態パラメタ-がパネルの圧縮特性の劣化・座屈などの構造安定問題にどの様に影響し、さらに最終破壊に至るプロセスにおいてどの様な役割をし、強度低下へ寄与するのかに関して多くの知見を得ることができた。また、変分原理に基づいて剥離領域の接触問題を考慮し得る解析理論を導き、メカニスティックなモデル化を行いRayleigh Ritz法を用いて展開して、座屈後の現象を取扱い得る簡便な解析手法を第一年度に開発したが、この手法の改良を行い、本問題に関しても適用し、座屈荷重および解析上シミュレ-トすることが非常に難しい二次座屈を含めた座屈後の挙動を解析した。この解析結果は実験結果をよく説明でき、本解析法を応用することにより、剥離の発生による複合材料パネルの圧縮特性の劣化メカニズムを明かにし得ることを確認することが出来た。今後この手法を用い、CAIの問題をさらに究明していく予定である。
顕著な抗癌作用を有するマクロライド型天然有機化合物の全合成と構造活性相関

ラクチミドマイシンは放線菌Streptomyces amphibiosporus R310-104およびS. platensisの培養液から単離され、各種癌細胞に強力な細胞毒性を示すとともに、ヒト由来癌細胞MDA-MB-231に対して、極低濃度で転移を阻害する。合成の困難さは中程度ではあるが、逆に様々な構造の化学修飾がしやすいため実用的抗癌剤の創製に結びつく可能性があり、その合成化学的価値は高い。申請者は遠隔不斉誘導反応を適用したラクチミドマイシンの効率的全合成および大幅な構造改変も含めた構造活性相関研究(共同研究)の実施により実用的抗癌剤の開発を目的とした。アセトアルデヒドを出発原料として、各種不斉反応、カップリング反応を合成経路に効率的に組み込み、3つの二重結合の存在により環化が難しい12員環ラクトン構造の形成をα-セレン置換型セコ酸のマクロラクトン化反応によって克服することで僅か10段階、通算収率35%の高効率なラクチミドマイシン部分構造の立体選択的合成に成功した。この知見をもとにラクチミドマイシンの全不斉炭素・骨格を有する重要中間体の合成に成功したものの、最終段階の脱保護に問題が生じた。そこで現在、保護基を全く使用しない新たな合成経路を立案し、より効率的なラクチミドマイシンの全合成の完成を目指している。今後、標的化合物の全合成を完成し、これまで得られた合成中間体および別途調製する構造改変体の活性試験を行い、構造を単純化した高活性誘導体の創成を目指す。Lactimidomycinは放線菌Streptomyces amnphibiosporus R310-104およびS. platensisの培養液から単離され、各種癌細胞に強力な細胞毒性を示すとともに、ヒト由来癌細胞に対して、極低濃度で転移を阻害する。申請者は遠隔不斉誘導反応を適用したlactimidomycinの効率的全合成および大幅な構造改変も含めた構造活性相関研究(共同研究)の実施により、実用的抗癌剤の開発を目的とした。アセトアルデヒドをL-バリン由来光学活性試薬を用いた遠隔不斉誘導反応に付すことより連続不斉中心を一挙に構築した後、高立体選択的な不斉アルドール反応と続く各種官能基選択的な変換を経てビニルヨージドとした。これを別途調製したスズフラグメントと連結し、マクロラクトン化反応と酸化的な二重結合の導入を経て、最も合成困難なC1-C16部分に相当するlactimidomycinコア部の合成に成功した。一方、側鎖部分の合成はすでに完了しており、今後はこれら両者の合成的知見をもとにlactimidomycinの全合成を達成できるものと考えている。また、lactimidomycinの全合成を完成させしだい、構造活性相関解明のための構造改変体の調製に取りかかる予定である。ラクチミドマイシンは放線菌Streptomyces amphibiosporus R310-104およびS.latensisの培養液から単離され、各種癌細胞に強力な細胞毒性を示すとともに、ヒト由来癌細胞MDA-MB-231に対して、極低濃度で転移を阻害する。申請者は遠隔不斉誘導反応を適用したラクチミドマイシンの効率的全合成および大幅な構造改変も含めた構造活性相関研究(共同研究)の実施により、実用的抗癌剤の開発を目的とした。アセトアルデヒドより光学活性試薬を用いた遠隔位不斉誘導反応、カップリング反応(Stille型)、マクロラクトン化反応など各種変換反応を駆使することで、最も合成が困難だと考えられるラクトン部分に相当するラクチミドマイシンのコア構造の効率的・立体選択的な合成に成功した。この合成的知見をもとに、出発物質のグルタルイミドアルデヒドより側鎖の各種伸長反応と別途調製したフラグメントを順次連結し、ラクトン部分構造の構築を経てラクチミドマイシンの全不斉炭素・骨格を有する重要中間体の合成に成功した。今後は早期に標的化合物の全合成を完成し、構造改変体の調製に取りかかる予定である。また、これまでの合成研究で得られた各種誘導体と構造改変体の活性試験を行い、なるべく構造を単純化した高活性誘導体の創成を目指す。

この知見をもとにラクチミドマイシンの全不斉炭素・骨格を有する重要中間体の合成に成功したものの、最終段階の脱保護に問題が生じた。そこで現在、保護基を全く使用しない新たな合成経路を立案し、より効率的なラクチミドマイシンの全合成の完成を目指している。今後、標的化合物の全合成を完成し、これまで得られた合成中間体および別途調製する構造改変体の活性試験を行い、構造を単純化した高活性誘導体の創成を目指す。標的化合物であるラクチミドマイシンの最重要マクロラクトン骨格の構築に成功し、同時に形式合成を達成した。この知見をもとに、現在までにグルタルイミドアルデヒドから数段階の変換を経てラクチミドマイシン全不斉炭素・骨格を有する中間体の合成に成功している。これまでの合成研究で得た知見をもとに、早期にラクチミドマイシンの全合成を完成させる。また、活性相関のための構造改変体の調製にとりかかり、ラクチミドマイシンの合成研究で得られた各種誘導体とともに活性試験を行う。改変体の調製については、活性試験の結果をフィードバックさせながら臨機応変に進めていき、なるべく構造を単純化した高活性誘導体の創成を目指す。
Nerve predegenerationの軸索再生に対する効果と至適条件の検討

末梢神経損傷後、損傷部より遠位ではワーラー変性が生じるとともに、損傷部周辺の脱分化したシュワン細胞が増殖、遊走することによりビュングナー帯が形成される。これをガイダンスとして軸索再生がこることが知られているが、ビュングナー帯が形成されるまでに数日間のtime lagが生じる。この間有効な軸索伸長はほとんど行われず、軸索が過剰に分枝することによる多重・過誤支配の増加、及び瘢痕の伸経断端間への侵入による神経腫形成がしばしば起こる。したがって、このtime lagを短縮することで軸索再生が質的・量的に向上するのではないかと我々は考えている。この問題をnerve predegeneration(以下NP)という手法に着目した。すなわち、予め脱分化したシュワン細胞を含む変性神経graftを移植することで、これらのtime lagを低減できるのではないかと考えた。NPを設ける期間によって軸索再生の動態にどれほどの影響を与えるのかを検討するため、thy-1 YFP transgenicマウス同種神経移植モデルを用いて実験を行った。NPにより、損傷後早期における軸索伸長速度が加速することが明らかとなった。我々は過去にNP graft内のシュワン細胞遊走能は1週目に劇的に増加し、2週目にピークを迎えることを明らかにしたが、今回の実験結果はそれらと矛盾するものではなかった。軸索分枝に関しては、NPによる抑制効果は認めず、むしろ増加することが明らかとなった。我々は過去にミエリン内の軸索反発物質であるMAGが軸索分枝抑制効果を持つことを示したが、NP graftにおいてはMAGの発現が低下していることが予想される。その結果、損傷部におけるMAGの再生軸索への反発作用が低下し、軸索分枝が増加したのでないかと考えられる。末梢神経損傷後の機能回復を低下させる要因の一つとして、多重・過誤支配等の異常な神経再支配が挙げられる。これらの多くは損傷部において起こるが、このことは損傷後早期における軸索ガイダンス(ビュングナー帯)の欠如に一部起因していると我々は考えている。軸索ガイダンスが形成されるまでに数日間有効な軸索伸長はほとんど行われず、軸索が過過剰に分枝することによる多重・過誤支配の増加、及び瘢痕の神経断端間への侵入による神経腫形成がしばしば起こる。これを解決する目的でpredegenerated nerve graft(以下PNG)という手法に注目した。すなわち予め脱分化、活性化したシュワン細胞を含む神経グラフトを移植することで早期に軸索ガイダンスが形成されるのではないかと考えた。Explants assay及びS100-GFPトランスジェニックマウスを用いてPNG内シュワン細胞の遊走能をin vitro、in vivoにおいて評価した。その結果、7日間生体内で変性させたグラフト(7days-PNG)内シュワン細胞は対照群(fresh nerve graft)に比して有意に高い遊走能を示し、その後14days-PNGでピークを迎えた。その後、28days-PNGより次第にそのシュワン細胞遊走能は低下してゆき、56days-PNGではほぼ対照群のレベルに戻った。また、これらの遊走能変化はPNG内における侵入マクロファージ数と相関していた。これらの結果よりPNGが末梢神経損傷後の再建に有用である可能性が示唆された。
サイトカインのシグナル制御機構とその破綻

Spred/Sproutyファミリー分子はRas/Rafに結合して、ERK/MAP kinase経路を抑制する調節因子である。Spredは哺乳類では3種類報告されており、我々はSpred1,Spred2それぞれのノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。Spred1はマスト細胞や好酸球などの末梢血液細胞の増殖を、Spred2は胎児期の血球発生を負に制御することを示した。我々はSprouty2やSprouty4がVEGFのシグナルを抑制する可能性について生化学的に検討した。その結果、Sprouty4はEGFによるERKの活性化には全く影響しなかったが、VEGFによるRafおよびERKの活性化はSprouty4により完全に抑制されることを示した。Sprouty4は活性化型PKCδによるRafの活性化も完全に抑制した。またSprouty4はC末端のRaf結合モチーフを介してRafを直接相互作用することも明らかにした。これらの結果から我々はSprouty4はVEGFRのシグナルのうちPLCγ-PKCδ-Raf経路をC末端の領域を介して抑制するという説を提唱した。さらにSprouty2-KOマウスを用いた解析からSprouty2はGDNFシグナルを負に制御し消化管神経の生存や神経ネットワーク形成を統御する重要な分子であることを示した。ショウジョウバエの表現型とあわせて考察すればSproutyは気管系や神経系などネットワーク構造の正確なリモデリングに重要な役割を担っていると思われる。Spredはもともと造血組織に多く発現し、Spred-1,Spred-2それぞれの単独KOマウスも好酸球、マスト細胞、赤血球などの産生充進が認められた。Spred1/Spred-2のDKOマウスはリンパ管の過形成によりE1214に死亡する。SpredはVEGF-Cのシグナルをリンパ管内皮細胞内で制御するのか、あるいは血球細胞と血管/リンパ管前駆細胞との相互作用を調節するか、いずれかの作用があるものと考えられる。我々は炎症性疾患においてSTAT3の活性化と特にSOCS3/CIS3の高い発現を認めた。大腸炎のモデルとしてDSS(dextran sulfate sodium)を溶解させた水をマウスに投与することにより、下痢、血便、体重減少を伴う急性腸炎が誘導されることが知られている。マウスに7日間DSSを飲用させると腸炎が誘導され、その後蒸留水に換えると腸炎の回復が認められる。各時期でのSTAT3とSOCS3/CIS3の発現を検討したところ、DSS腸炎の経過とともにSTAT3のリン酸化が亢進し、CIS3の発現誘導が認められた。CIS3の発現はSTAT3の活性化が低下し、腸炎が改善傾向にある時期でも高発現を持続していた。我々はSTAT3は炎症の増悪化に、SOCS3/CIS3がその抑制に働くものと考えた。野生型SOCS1,SOCS3に対してドミナントネガティブに作用する変異SOCS1遺伝子(F59D-JAB)のトフンスジェニックマウスを作成したところコントロールマウスと比較してDSSによる大腸の著明なSTAT3の活性化の亢進が起こり体重減少率や組織学的スコアが増加し腸炎の増悪化を認めた。このことにより炎症の場においてSOCS3/CIS3が炎症に対して抑制的な働きを持つことが明らかとなった。また慢性関節炎リウマチ患者滑膜細胞やコラーゲン誘導性関節炎(CIA)や抗原依性関節炎(AIA)においてもSTAT3の活性化とCIS3の誘導が観察された。これらマウス関節炎モデルにCIS3やドミナントネガティブSTAT3(dnSTAT3)遺伝子をアデノウイルスを用いて導入したところ関節炎が著しく軽減した。ウイルス投与によって組織破壊も抑えられIL-6レベルも減少していた。CIAモデルにおいてはdnSTAT3よりもCIS3のほうが効果的であった。このことからもCIS3が炎症性疾患において抑制的な作用を持つことが示唆された。また我々はSOCS1を膵臓特異的に発現させるとコクサッキーウイルスに高感受性となり糖尿病に罹りやすくなることを見いだした。グラム陰性細菌細胞壁成分であるリポ多糖(lipopolysaccharide, LPS)は、生体の免疫反応を強力に誘起するとともに致死的な影響を与えることもある物質である。LPSの重要な標的細胞はマクロフアージや単核球細胞であり、TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γなどの炎症性サイトカインや活性酸素、亜硝酸イオンNO2-の産生を誘導する。LPSがLPS結合タンパク(LPB)とともに、細胞膜上のTLR4-MD2複合体に結合すると、アダプター分子MyD88を介して、セリンスレオニンキナーゼIRAKを活性化する。IRAKは、アダプター分子TRAF6を介してIκB kinase(IKK)を活性化させ、リン酸化をうけたIκBαが分解されると、NF-κBが核内へ移行して、転写因子としてiNOSやTNFαなどの発現を誘導する。また、同時にJNK/SAPK,p38,ERK,などのMAPKのカスケードも活性化され、転写因子AP-1も活性化されることが知られている。最近、MyD88欠損マクロフアージでもLPSによるNF-κBやJNK/SAPK,p38の活性化をみとめることから、LPSからNF-κB、JNK/SAPK、p38を活性化するMyD88非依存性の経路が存在する可能性が報告された。一方SOCS(suppressor of cytokine-signaling)

ファミリーはサイトカインシグナル経路を負に制御する分子として同定されたが、SOCS-1、SOCS-3分子が、JAK-STAT経路だけでなく、マクロフアージにおいてLPSやCpG-ODN刺激によっても発現誘導されることが報告された。我々も、LPSによるマクロフアージの活性化を抑制するIL-10の作用にSOCS-3が重要な役割を果たしていることを見い出した。さらにSOCS-1欠損マウスやマクロファージを用いた解析からSOCS1がLPSのシグナルやトレランスを制御していることを明らかにした。今後抑制分子のさらなる解析を通して、細菌感染によって引き起こされるエンドトキシンショックなどの致命的な障害の治療への応用が期待される。サイトカインシグナルの制御機構に関して、我々のグループは世界にさきがけてサイトカイン誘導性SH2蛋白質群であるCIS/SOCSファミリーを発見し、これらの遺伝子がサイトカインの主要経路であるJAK/STAT経路を負に制御し免疫系、造血系を調節していることを示してきた。本年度はサイトカインシグナル制御に関して以下のような成果が得られた。(1)SOCS1によるTLRシグナルの制御:これまでSOCS1はインターフェロンγの負の制御因子であると考えられてきたが我々の研究によってマクロファージにおいてLPSなどのTLRシグナルも制御することが明らかにされた。(2)SOCS1のよる樹状細胞制御/免疫寛容への新たな提言:我々はSOCS1-KOマウスとSOCS1-Tgマウスの掛け合わせによってリンパ球ではSOCS1が発現しているがそれ以外では発現していないマウスを作成した。このマウスは自己免疫疾患を呈し特に樹状細胞が活性化されていることが明らかとなった。この結果を基に、我々はSOCS1の発現が樹状細胞の機能ないしサブセットの恒常性を保つ上で重要な働きを持ち、その欠損は樹状細胞に大きな変化を与え、これが免疫監視機構の破綻を引き起こしている可能性を考えている。実際SOCS1-/-マウスでは、通常存在しない樹状細胞のサブセットが顕著に増加しており、異常な抗原認識を起こしている。我々はこの樹状細胞におけるサブセットないし機能の変化が、胸腺の段階で起こるT細胞の自己・非自己の選択あるいは抹消でのトレランスの成立に影響を与え、これが自己免疫性疾患の発症と関連すると考えている。このような考え方はまだ具体性に乏しいが免疫学上の重要な問題に全く新たな概念をもたらす可能性がありさらに追求していきたい。(3)SOCSと炎症性疾患:SOCS3が大腸炎や関節炎などの慢性炎症性疾患に発現が高いことを見いだし,さらにSOCS3の強制発現によって関節炎モデルを治癒できることを示した。(4)SOCS3とIL-6シグナル制御:SOCS3はマクロファージにおいてはIL-6シグナルを抑制するために必須でありもしSOCS3遺伝子がないとIL-6が抗炎症性サイトカインIL-10と同様な作用を有することを示した。(5)SOCS3とT細胞分化の制御とアレルギー性疾患:SOCS3はT細胞におけるIL-12シグナルを負に制御し、生体内においてTh1分化を抑制し、Th2分化を亢進させる働きを持っている。
文系学生における理数系科目不安の実態把握とその解消を促進する教授法の開発

本研究では、学生の抱く統計学に対する「不安感」を、可能な限り多様な観点から捉えることのできる統計学不安尺度の作成を行った。本研究での統計学不安尺度は、欧米で開発され使用されている尺度をベースとして、それを日本の学生に適した内容に修正し、さらに日本固有の内容も加えたものである。開発した不安尺度を用いた複数の調査とその解析により、質の異なる不安感を持つ複数の学生群を識別することができ、意図したその機能を十分に果たすことができることを確認できた。今後の改良の余地はあるが、統計学習に対する意識を測定するための適当な尺度であると考える。以上のような調査結果を踏まえ、本研究では、文系の学生にとって統計学習の極めて大きな障壁である数学的側面を可能な限り小さくした「統計学習のための教材」の開発を行った。教材は、推測統計学をテーマとしたもので、大きくは(1)標本抽出実験に基づく標本統計量の分布の学習、(2)統計的仮説検定・推定用ツールより構成される。このようなソフトウェアは既に数多く作られているが、(1)に関しては母集団として多様な分布を設定可能とした点、(2)は単なる解を求めるツールではなく、解に至る過程をトレースできるようにした点に特徴がある。これらの教材は本学の講義で利用しているが、さらに利用マニュアルの整備によって、他大学でも利用可能な形で公開する予定である。一般に文系学生には数学・理科嫌いが多いとされ、この理数系科目の学習に対する「負の心の構え」が、学生を理数系科目から遠ざけ、その理解を妨げる最も大きな要因となっている.本研究では、まずこの「負の心の構え」を、最近注目されるようになってきた統計学不安(statistical anxiety)の概念によって捉える.そのため、欧米で開発利用されているStatistical Anxiety Rating Scaleをもとに日本語版の統計学不安尺度を作成し、プリテストの結果に基づいて項目の精錬を行った.そして、最終的に34項目からなる不安尺度を作成し、統計学を履修している大学1年生(文科系学科所属85名、理科系学科所属76名)に対して実施した。またこの調査対象者に関しては、(1)高校での理数系科目履修状況や入試成績、(2)統計学の履修状況(成績・興味関心)についてもデータを取得し、「不安尺度」との関連を検討した。その結果、統計の学習に関しては、予想以上に多くの者が壁(ハードル)を感じているが、その壁は、文科系学生と理科系学生で異なっていることが明らかとなった。文科系の学生の感ずる壁は、統計の数学的側面に関するものであり、高校以来の数学嫌いがその原因である。しかし、彼らは統計学そのものには興味・関心を持っており、統計技術を身に付けて将来役立てたいと考えている者も多い。一方理科系学生の場合は、数学的側面に対する抵抗感は小さいが、統計学の役割やその有用性についての理解が不十分であり、そのために統計を学ぶ意欲が低くなる傾向が見られた。さらに理科系学生の場合には、社会的な事象に対する興味関心の低さが統計を学ぶ意欲の低さに繋がっている可能性も示唆された。昨年度作成した統計学不安尺度を用い、学力特性の異なる複数の学生群に対して「統計学に関する意識」を調査した。調査対象は、理系学科、文系学科所属の学生で構成され、さらに各学科内ではその選択した履修コースによって理系興味群、文系興味群に分けることができた。つまり、学生は学力の文理特性によって連続する4つの群として位置づけることができる。この4群の中で、統計学により強い興味を示したのは真ん中の2つ、つまり理系学科・文系興味、文系学科・理系興味群であり、特に前者は、社会的事象に対する興味の高さと、統計の学習を容易にする数学的学力の高さにより、最も高い学習意欲を示した。一方、文系学科・文系興味群は、社会的事象に対する興味の高さにも関わらず、数学に対する強い忌避感から、統計学習に対する意欲を失う傾向が強く現れた。また、逆に理系学科・理系興味群は、高い数学的学力にも関わらず、興味の方向の違いから、統計学習に対する意欲は必ずしも高くない。

以上のような調査結果を踏まえ、本研究では、文系の学生にとって統計学習の極めて大きな障壁である数学的側面を可能な限り小さくした「統計学習のための教材」の開発を行った。教材は、推測統計学をテーマとしたもので、大きくは(1)標本抽出実験に基づく標本統計量の分布の学習、(2)統計的仮説検定・推定用ツールより構成される。このようなソフトウェアは既に数多く作られているが、(1)に関しては母集団として多様な分布を設定可能とした点、(2)は単なる解を求めるツールではなく、解に至る過程をトレースできるようにした点に特徴がある。これらの教材は本学の講義で利用しているが、さらに利用マニュアルの整備によって、他大学でも利用可能な形で公開する予定である。
代謝拮抗剤5-FUによるDNA障害の機構とミスマッチ修復能の関与-マイクロサテライト不安定性は5-FU感受性予知因子となりうるか-

本研究では、5-FUの作用機序におけるDNA障害機構とミスマッチ修復の意義を解明し、マイクロサテライト不安定性解析によるミスマッチ修復能の検索が、5-FU感受性の予知因子となりうるのか決定する基礎データの集積を目的とする。ミスマッチ修復能の判明している種々の大腸癌細胞株を用いて、5-FU感受性とミスマッチ修復能との関連について解析した。この際、5-FUによる細胞のDNA障害に対しG1/SチェックポイントでのDNA修復かアポトーシスによる細胞死を選択するp53の発現や、5-FU感受性の主要酵素であるチミジル酸合成酵素(TS)の活性や発現、5-FUによるRNA障害や細胞周期の変化など詳細な検討を加え5-FU感受性におけるミスマッチ修復能の意義を考察した。その結果、p53は細胞周期の変化には関与しているが直接感受性を規定するものではないこと、TSがほぼ抑制されている状態では、ミスマッチ修復異常細胞はミスマッチ修復正常細胞より5-FU感受性が低いことが明らかとなった。(E.Tokunaga,etal.Eur J Cancer 36;1998-2006,2000)。さらに我々はミスマッチ修復遺伝子MSH2のノックアウトマウス由来の胚繊維芽細胞を用いて5-FU感受性を解析した。MSH2欠損細胞株は正常胚繊維芽細胞株より有意に5-FU感受性が低いことがわかった。今後はこれらのミスマッチ修復遺伝子欠損細胞にミスマッチ修復遺伝子を導入し、ミスマッチ修復能を回復した細胞の5-FU感受性の変化も解析する予定である。更に、他のミスマッチ修復遺伝子ノックアウトマウス由来の細胞を用いて同様の検討を加える予定である。臨床検体での解析系では、ミスマッチ修復異常の評価のためのより客観的なマイクロサテライト不安定性解析法を開発しており(S.Oda,et al.Nucleic Acids Res 25;3415-3420,1997)臨床解析症例も既に1000例を超えた。今後はマイクロサテライト不安定性により評価した各症例のミスマッチ修復異常と抗癌剤感受性試験での5-FU感受性、更に臨床効果との相関を検討していきたいと考える。本研究では、5-FUの作用機序におけるDNA障害機構とミスマッチ修復能の意義を解明し、マイクロサテライト不安定性解析におけるミスマッチ修復能の検索が、5-FU感受性の予知因子となりうるのか決定する基礎データの集積を目的とする。本年度は、ミスマッチ修復能の判明している種々の大腸癌細胞株を用いて、5-FU感受性とミスマッチ修復能との関連について解析を行った。この際、5-FUによる細胞のDNA障害の情報伝達分子であると考えられるp53の発現や5-FUの標的酵素と考えられるチミジル酸合成酵素(TS)の活性や発現、5-FUによるRNA障害や細胞周期の変化などの詳細な検討も加え、5-FU感受性におけるミスマッチ修復能の意義を考察した。その結果、p53は細胞周期の変化には関与しているが直接感受性を規定するものではないこと、TSがほぼ抑制されている状態では、ミスマッチ修復異常細胞はミスマッチ修復正常細胞よりも5-FU感受性が低いことが明らかになった(投稿中)。さらに我々はミスマッチ修復遺伝子MSH2のノックアウトマウス由来の胚線維芽細胞を用いて5-FU感受性を解析した。MSH2欠損細胞株は正常胚線維芽細胞株よりも有意に5-FU感受性が低いことがわかった。今後はこれらのミスマッチ修復遺伝子欠損細胞にミスマッチ修復遺伝子を導入し、ミスマッチ修復能を回復した細胞の5-FU感受性の変化も観察したい。さらに他のミスマッチ修復遺伝子ノックアウトマウス由来の細胞を用いて同様の検討を加える予定である。また、ミスマッチ修復の異常を評価する目的で従来から正確なマイクロサテライト不安定性解析法を確立してきたが、臨床例の解析も既に800例を超えた。今後はマイクロサテライト不安定性により評価した各症例のミスマッチ修復能と抗癌剤感受性試験などで得られた5-FU感受性との関連性の解析も進めていきたいと考える。更に、他のミスマッチ修復

遺伝子ノックアウトマウス由来の細胞を用いて同様の検討を加える予定である。臨床検体での解析系では、ミスマッチ修復異常の評価のためのより客観的なマイクロサテライト不安定性解析法を開発しており(S.Oda,et al.Nucleic Acids Res 25;3415-3420,1997)臨床解析症例も既に1000例を超えた。今後はマイクロサテライト不安定性により評価した各症例のミスマッチ修復異常と抗癌剤感受性試験での5-FU感受性、更に臨床効果との相関を検討していきたいと考える。