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次世代水質浄化を担うアナモックス菌による窒素除去の分子基盤の解明

アナモックス菌は、嫌気条件下で亜硝酸とアンモニアから3段階の反応で分子状窒素を生産する窒素除去反応を担っている。この反応の中で一酸化窒素とアンモニアからヒドラジンを合成する触媒するヒドラジン合成酵素(HZS)が、アナモックス菌の窒素代謝の鍵酵素である。本研究では、アナモックス菌を連続大量培養する装置を作成し、アナモックス菌からHZSを大量に高純度精製した。また、HZSの反応メカニズムの解明にはHZSの異種発現系が必要であるので、大腸菌を用いたモノシストロン性、およびポリシストロン性発現ベクターを構築した。一部のサブユニットのヘムc含有率が低いが、大腸菌によりHZSを発現するすることができた。汚水の浄化には窒素化合物の除去が必須であり、現行の方法では、窒素化合物を除去する微生物の生育のために有機物を投入し、動力を使って空気を送り込む等、大きなエネルギーを消費している。しかし近年発見された嫌気性かつ独立栄養性のアナモックス菌によって窒素除去を行うと、これらの処置がほとんど不要となり水質浄化の大幅な省エネルギー化が実現できる。この水質浄化の鍵を握るのが、アナモックス菌特有の窒素除去反応である。本研究ではこの反応に最も重要なヒドラジン合成酵素に注目し、それらのX線結晶構造解析などから、アナモックス菌による次世代省エネルギー水質浄化法と窒素化合物代謝の分子基盤を解明する。本年度はアナモックス菌による窒素除去反応の鍵となるヒドラジン合成酵素の結晶構造解析を進めるため、すでに培養に成功しているアナモックス菌の培養システムを活用し、大量培養を行った。また、このアナモックス菌からヒドラジン合成酵素(HZS)遺伝子クラスターをクローニングし、大腸菌を用いた発現系の構築を進めた。HZSはヘテロ3量体であるので、まず各サブユニット(A, B, Cサブユニット)の単独での発現を試み、A, Cサブユニットの発現を確認できた。しかし活性部位をもつBサブユニットの発現は確認されず、Aサブユニットにおいて電子伝達を担うと考えられるヘムcの挿入も確認されなかった。そこですべてのサブユニットの発現系を新たに構築した。この発現系でヘムcが挿入されたA,Bサブユニットの発現が確認された。来年度はHZSの結晶化を目指し、酵素活性の確認と発現条件の最適化を行う。亜硝酸を用いて嫌気的にアンモニアを分子状窒素に変換するアナモックスは、窒素循環のプロセスとして最後に見出された。このプロセスは、従来の硝化・脱窒による窒素除去に比べてエネルギー消費がほぼ半減する次世代の水質浄化法として応用が期待され、海洋の分子状窒素の生産のおよそ半分を担うと考えられている。本研究では、アナモックス菌による窒素代謝の鍵反応である一酸化窒素とアンモニアからヒドラジンを産生するヒドラジン合成酵素(HZS)の分子メカニズムの解明をめざし、この酵素のX線結晶構造解析を行う。昨年度までに、常温性アナモックス菌由来HZSの3つのサブユニットを単独のmRNAに転写するモノシストロン性発現ベクターを用いてHZSの発現に成功していたが、発現量が少なくheme cが取り込まれる割合も少なかった。そこで本年度は1つのmRNAに転写するポリシストロン性発現ベクターの構築を行った。HZSの細胞毒性により目的とするベクターの作成は困難であったが、コピー数を制御することで基底レベルの発現量を低く保つことができるpETcocoベクターを用いてポリシストロン性発現ベクターの構築に成功した。このベクターを用いて発現した場合、heme cが取り込まれる割合が増加し、HZSの切断を抑制することができた。また、高熱性アナモックス菌由来のHZSのモノシストロン製発現系を、常温性アナモックス菌由来HZSの場合と同様に構築することに成功した。さらに、本研究開始前から行っていたメンブレンバイオリアクターを用いたアナモックス菌の大量培養で、アナモックス菌を約100グラム得ることができた。このアナモックス菌からHZSを精製する手法についてもほぼ確立した。アナモックス菌は、亜硝酸を用いてアンモニアを嫌気的に分子状窒素へ酸化することで、海洋における窒素除去のおよそ半分を担っている。このプロセスは、近年汚水の浄化への応用が活発に進められており、アナモックスを利用した水質浄化プラントが欧州や日本を中心に世界各国で進められている。この窒素代謝の中で、一酸化窒素とアンモニアからヒドラジンを合成する段階はアナモックス菌独自の反応であり、この反応を触媒するヒドラジン合成酵素(HZS)がアナモックスの窒素代謝の鍵酵素である。近年、この酵素の結晶構造が報告され、分子内の2か所の活性部位をつなぐトンネルが存在し、ここを通って中間生成物が移動して、ヒドラジンが合成されるメカニズムが提案された。これを検証するためには、HZSやその変異体を異種発現することが必須である。本研究では、HZSの大腸菌での発現系の構築を進めた。昨年度までに構築したポリシストロン性発現ベクターを用いて、培養条件や発現誘導条件などを系統的に検討した結果、グルコースで発現を自動誘導すると、モノシストロン性発現系では一部不溶性画分に残っていたホロ型HZS Bがほぼ全て可溶性画分で発現し、HZS Aの切断が抑えられた。また、発現に用いる大腸菌株のスクリーニングを行うことでホロ型HZS Aの発現量が増加し、HZS Aの切断を抑えることができた。今後さらに発現条件の検討を進めることで、大腸菌を用いたHZSの大量発現が可能になると期待される。

アナモックス菌は、嫌気条件下で亜硝酸とアンモニアから3段階の反応で分子状窒素を生産する窒素除去反応を担っている。この反応の中で一酸化窒素とアンモニアからヒドラジンを合成する触媒するヒドラジン合成酵素(HZS)が、アナモックス菌の窒素代謝の鍵酵素である。本研究では、アナモックス菌を連続大量培養する装置を作成し、アナモックス菌からHZSを大量に高純度精製した。また、HZSの反応メカニズムの解明にはHZSの異種発現系が必要であるので、大腸菌を用いたモノシストロン性、およびポリシストロン性発現ベクターを構築した。一部のサブユニットのヘムc含有率が低いが、大腸菌によりHZSを発現するすることができた。メンブレンバイオリアクターで大量にアナモックス菌を培養することができ、HZSの精製方法もほぼ確立したため、天然のHZSを大量に精製し、結晶化試料を得る見込みを立てることができた。また、昨年度まで発現量と切断が課題になっていた大腸菌を用いた発現系も、ポリシストロン性発現ベクターを用いることで課題を解決しつつある。結晶化に適した安定なタンパク質を得られると期待される高熱性アナモックス菌由来のHZSについて、発現系を構築することができたため、今後の結晶化に期待ができる。27年度が最終年度であるため、記入しない。酵素化学高熱性アナモックス菌由来HZSについてもポリシストロン性発現ベクターを構築し、熱安定性の高いHZSの大量発現に取り組む。常温性のHZSについて、引き続き大量発現を行い、精製方法の確立に取り組む。アナモックス菌からHZSを精製する手法はすでに確立したので、この方法を用いてHZSの大量精製を行い、含有金属の分析、HZSヘテロ3量体および各サブユニットの分子量測定を行う。また、HZSはシグナル配列を持ち、成熟HZSではこれらが切断されている。この切断部位を明らかとするため、アミノ末端のアミノ酸配列を解読する。これまでに報告されている精製HZSのヒドラジン合成活性は、アナモックス菌そのものに比べて非常に低い値にとどまっている。そこで、得られたHZSを用いて、嫌気条件、金属イオンの添加などによる活性の変化を調べる。当初計画していた常温で生育するアナモックス菌の大量培養とヒドラジン合成酵素(HZS)の発現系構築に成功している。さらに、平成26年度に予定していた好熱性のアナモックス菌からHZSをクローニングし、発現系を構築することにも成功しているため。高熱性アナモックス菌由来HZSの発現ベクターは、常温性アナモックス菌由来HZSの発現ベクターを構築した手法にのっとって行ったため、計画していた酵素類の消費が抑えられ、次年度使用額が生じた。平成25年度に常温で生育するアナモックス菌および菱刈金山熱水由来のアナモックス金からヒドラジン合成酵素(HZS)の遺伝子をクローニングし、大腸菌をもちいた発現系を構築した。これらの発現系を用いて、HZSの大量発現条件の検討をまず進める。また、HZSの3つのサブユニットを単独のオペロンとして発現させる系も新たに構築し、大量発現条件の検討を進める。
テンセグリティ構造の開発の関する基礎的研究

軸力のみを受けるトラス部材(リンク部材)を断続的に配置し,これを引張り力にのみ抵抗するケーブルで連結し,部材長を調整することによってこれらの部材にプレストレスを与えると,力学的に安定な骨組み,いわゆるテンセグリティ構造となる.本研究では,このような構造系について主として構造解析の面から基礎的な考察を加え,将来の実用化に向けて設計計算手法を確立することを最終の目的としている.この種の構造系は土木工学の分野ではまだ実用化されるにはいたっていないが,建築の分野では大スパン屋根構造への適用例が若干見られる.本研究では,将来土木構造の分野でもこの構造のアイデアが応用可能か否かを知るために,これについて基礎的な立場から解析・設計上の問題点を抽出し検討を加えたものである.本研究で実施した内容は概略以下の通りである.1.テンセグリティ構造を厳密に解析するには,幾何学的非線形(大変形)を考慮した解析が必要であり,そのための専用数値計算プログラムを,既往のケーブル構造に関する研究成果に基づいて開発した.2.基本的な構造要素の力学的特性に関する各種のケーススタディにより,外力(とくに偏載荷重,非対称荷重)の作用下では著しい非線形性が現れることを示して線形理論の限界を明らかにし,上記の非線形解析プログラムの必要性・有用性を確かめた.種々の試算によってこの構造の強度の非線形性を明らかにした.3.上記のようなこの構造固有の大変形性状から見て,実際の構造設計を行なうには形状決定解析が必須であることを論じ,そのための計算プログラムを開発した.これは既往の研究成果によって得られた解析法を拡張したものである.これによってこの構造系が形状決定問題に対して極めて敏感な特性を持つことを知った.4.この構造系の実構造物への適用性を調べるため,ドーム状の設計モデルを想定して各種の検討を行なった.軸力のみを受けるトラス部材(リンク部材)を断続的に配置し,これを引張り力にのみ抵抗するケーブルで連結し,部材長を調整することによってこれらの部材にプレストレスを与えると,力学的に安定な骨組み,いわゆるテンセグリティ構造となる.本研究では,このような構造系について主として構造解析の面から基礎的な考察を加え,将来の実用化に向けて設計計算手法を確立することを最終の目的としている.この種の構造系は土木工学の分野ではまだ実用化されるにはいたっていないが,建築の分野では大スパン屋根構造への適用例が若干見られる.本研究では,将来土木構造の分野でもこの構造のアイデアが応用可能か否かを知るために,これについて基礎的な立場から解析・設計上の問題点を抽出し検討を加えたものである.本研究で実施した内容は概略以下の通りである.1.テンセグリティ構造を厳密に解析するには,幾何学的非線形(大変形)を考慮した解析が必要であり,そのための専用数値計算プログラムを,既往のケーブル構造に関する研究成果に基づいて開発した.2.基本的な構造要素の力学的特性に関する各種のケーススタディにより,外力(とくに偏載荷重,非対称荷重)の作用下では著しい非線形性が現れることを示して線形理論の限界を明らかにし,上記の非線形解析プログラムの必要性・有用性を確かめた.種々の試算によってこの構造の強度の非線形性を明らかにした.3.上記のようなこの構造固有の大変形性状から見て,実際の構造設計を行なうには形状決定解析が必須であることを論じ,そのための計算プログラムを開発した.これは既往の研究成果によって得られた解析法を拡張したものである.これによってこの構造系が形状決定問題に対して極めて敏感な特性を持つことを知った.4.この構造系の実構造物への適用性を調べるため,ドーム状の設計モデルを想定して各種の検討を行なった.抗張力部材としてのケーブルと抗圧材としてのリンク部材を組み合わせ,各部材にプレストレスを与えると,一つの安定な構造体(テンセグリティ構造)が得られる.この構造につき一連の基礎的な考察を行った.(1)文献調査:テンセグリティ構造に関する研究はまだ数が少ないので文献の調査から研究を開始した.現在この方面で進んだ研究がなされているイギリスとフランスの文献を主として収集,内容を検討した.(2)解析手法の研究:既往の研究において開発した「曲線要素を用いた有限要素法によるケーブル構造の大変形解析」の計算プログラムを基本として,これにリンク部材の大変形解析用のルーチンを付加して,テンセグリティ構造解析用のプログラムのプロトタイプとした.テンセグリティ構造では,どの部材にどのようにプレストレスを与えるかが設計上重要なポイントとなるから,プレストレスの導入や解除などが容易に行えるようにプログラムを整備した.今後さらに汎用的なプログラムに発展させる.(3)計算プログラムの検証:2次元のアーチ型テンセグリティ構造について基本的なケーススタディを実施し,プログラムの有用性を確認した.引き続き3次元のダブルレイヤー・タイプの構造について若干の試算を行い,今後の見通しを得た.(4)模型の設計と製作:この種の構造物の開発にあたっては,実験室内での精密モデルが有用な情報を与えることが多いので,2次元のアーチ型モデルと3次元ダブルレイヤー型モデル(いずれもスパン長は約60cm)を設計し,載荷実験を行うことを計画した.現在両モデルが完成,次年度に載荷実験を行う.抗張力部材としてのケーブルと,断続的に配置された抗圧材としてのリンク部材を組み合わせてプレストレスを導入したいわゆるテンセグリティ構造の開発を目指して,昨年度から一連の基礎的な考察を行っている.本年度に実施した研究の概要は以下の通りである.

(1)基本的なテンセグリティ構造要素として,2次元のアーチ型の系と3次元のダブルレイヤー型のユニットを想定し,これらの力学的性状を知るために各種の数値計算を行った.計算に用いたプログラムは,既往の研究において開発した「曲線要素を用いたケーブル構造の大変形解析」と「リンク部材の大変形解析」のプログラムを組み合わせたものであり,各部材へのプレストレスの導入も自由にシミュレート出来るようになっている.(2)各種のケーススタディにおける数値計算結果はいずれもこの構造要素の著しい非線形性を示しており,そのためつり合形状は初期値として設定された目標形状からかけ離れた値になることが多いことが判明した.(3)このため既往の研究で開発した「ケーブル構造の形状決定解析」のプログラムを改良して,テンセグリティ構造の形状決定問題にも適用できるようにし,さらに,解析結果を画像的に可視化するプログラムを作成した.このプログラムによれば,形状決定計算の結果(変形と部材力)が平面上の3次元座標によって具体的に画像として示されるので,その結果を見ながら設計のシミュレーションを容易に行うことが出来る.(4)前年度末に2次元のアーチ型モデルと3次元ダブルレイヤー型ユニットモデル(いずれもスパン長は約60cm)を製作したので,これについて簡単な載荷実験を行い,上記のプログラムによる計算結果と照合した.なお,載荷・測定用の治具に若干問題があったので改良した.これを用いて次年度引き続き実験を続行する.抗張力部材としてのケーブルを組んで作った系に,抗圧力部材としてのリンク部材(トラス)を断続的に配置して,相互の部材長を調節してプレストレスを導入すると一つの安定した構造系が出来る.これをテンセグリティ構造という.本研究ではこの構造系を実構造物に応用するための基礎的な考察を行なったものである.平成8,9年度には,この構造系の数値解析を行なうために専用のコンピュータープログラムを開発することを目指し,所定の成果を得た.このプログラムは,既往の研究において発表した「曲線要素を用いたケーブル構造の大変形解析」と「骨組構造の大変形解析」の理論に基づいたものであり,各部材へのプレストレスの導入過程も自由にシミュレート出来るようになっている.これにより所要の結果が得られることを確認した.これに引き続いて本年度に実施した研究の概要は以下の通りである.1.上記のように開発されたプログラムを用いて,テンセグリティ構造要素の力学的な特性を詳細に調べた.2.基本的な構造要素についての各種のケーススタディにより,この構造系にプレストレスを与える段階では線形の微小変位理論の適用も可能であるが,外力(とくに偏載荷重,非対称荷重)の作用下では著しい非線形性が現れ,線形理論には限界があることを示し,上記の非線形解析の有用性を確かめた.3.この非線形性のため,一般に外力を受けた時のつり合形状は初期値として設定された形状とは一致しなくなる.したがって,この構造を実際に設計する際には形状決定解析が不可欠となる.そこで既往の研究「ケーブル構造の形状決定解析」の理論を応用して,テンセグリティ構造の形状決定問題のための計算法を確立した.4.具体的な設計例として2次元アーチ型構造をとりあげ,その実構造としての実現可能性を検討した.
術後せん妄発症機序の分子遺伝学的解明

我が国は超高齢化社会を迎え,高齢者の手術件数増加に伴い,術後せん妄の増加が大きな問題となっている.術後せん妄は術後の回復期に起こり,患者にとって不快な体験となるだけではなく,生存率にも大きく影響することが明らかとなってきている.しかしながら,術後せん妄を引き起こすメカニズムや根拠のある予防法・治療法については,いまだに明らかではなく,その解明は喫緊の課題である.近年,術後せん妄と一塩基多型(SNPs)の関連が示唆されている.そこで,われわれは補完的全ゲノム関連解析(GWAS)により,術後せん妄における分子遺伝学的機序の解明を行い,術後せん妄の発症メカニズムを明らかにする.我が国は超高齢化社会を迎え,高齢者の手術件数増加に伴い,術後せん妄の増加が大きな問題となっている.術後せん妄は術後の回復期に起こり,患者にとって不快な体験となるだけではなく,生存率にも大きく影響することが明らかとなってきている.しかしながら,術後せん妄を引き起こすメカニズムや根拠のある予防法・治療法については,いまだに明らかではなく,その解明は喫緊の課題である.近年,術後せん妄と一塩基多型(SNPs)の関連が示唆されている.そこで,われわれは補完的全ゲノム関連解析(GWAS)により,術後せん妄における分子遺伝学的機序の解明を行い,術後せん妄の発症メカニズムを明らかにする.
生体超音波マイクロスペクトロスコピーによる生体高分子溶液の音響特性に関する研究

本研究は、生体超音波マイクロスペクトロスコピーの手法を生体高分子溶液の音響特性測定に適用し、10MHz以上の周波数帯において十分な研究が成されていない、生体高分子水溶液の音響特性を明らかにすることを目的として行った。さらに、この測定結果を基に、生体組織の音響特性測定結果の解析を行った。1.以前に開発した生体超音波スペクトロスコピー・システムの適用周波数範囲を、数MHz帯の低周波帯まで拡張するため、低周波用縦波超音波トランスジューサ-を製作した。本システムを用いてヒマシ油、綿実油の音響特性を2MHzから500MHzの周波帯において測定し、拡張されたシステムの信頼性を確認した。2.生体高分子溶液試料として、牛ヘモグロビン水溶液を取り上げ、音響特性を50MHz-200MHzの周波数範囲で、濃度および周波数の関数として測定した。ヘモグロビン水溶液に対して、4つの音響パラメータ(音速、減衰係数、音響インピーダンス、密度)を初めて同時に決定した。これらの音響パラメータの値は、全て濃度とほぼ比例関係にある。さらに、減衰係数の周波数依存性が、濃度・周波数の関数となっており、生体高分子溶液の特性を表す新たなパラメータとなることを明らかにした。3.生体組織の音響特性を解析するための基礎的検討として、牛の肝臓、心筋の音響特性を測定した。。ヘモグロビン水溶液に対する測定結果を用いて解析した結果、音響パラメータの全てにおいてタンパク質含有量の高い肝臓の方が大きな値をとり、組織の音響特性はタンパク質の含有量で特徴づけられることが明らかになった。。
応力腐食割れにおける塑性仕事と温度の関係

応力腐食割れ機構解明の一手法として歪電極法が用いられている。この方法は定電位下で材料に塑性変形を与え,得られる電流密度の変化から新生面における溶解挙動を明らかにしようとするものである。一般に,材料に塑性変形を与えるとなされる塑性仕事の大部分は熱に変換され,試料の温度は上昇する。試料の温度上昇はその後の溶解挙動に大きな影響を与える。本実験はSUS304鋼に熱電対をスポット溶接し,H_2SO_4ーNaCl溶液中において定電位下で塑性変形を与え,得られる温度と電流変化から歪電極法における塑性仕事の影響を検討した。塑性変形に伴う温度上昇は歪速度の影響を強く受け,歪速度が遅い場合には発生した熱が溶液に奪われて温度上昇が小さいのに対し,歪速度が速い場合には断熱効果により温度上昇が大きく,その値は歪量の増加と共に直線的に増加した。同時に得られる電流は歪量の増加と共に放物線的に増加した。同一歪速度および同一電位で溶液温度を変化させて同様の実験を行い,同一歪量における温度と電流密度の関係を求めた結果,良い直線関係が得られたのでこの直線式からそれぞれの歪量における電流値と温度上昇分に相当する電流値を引いた値の比より塑性仕事に伴う温度上昇の電流密度におよぼす影響を定量的に求めた。例えば歪速度4.2×10^<ー2>s^<ー1>では10%歪で得られる電流密度の約20%が塑性仕事の温度上昇に伴うものであり,この割合は前述のように歪速度に大きく依存した。従来から,歪電極法では非常に速い歪速度が用いられており,この観点から歪電極法を用いる場合には塑性仕事の効果を考慮しなければならないことが明らかとなった。
日本古代寺院造営機構の復原研究

7世紀から8世紀の日本では、都城・寺院・墳墓などの巨大な建造物が多く造られた。本研究では、このうちの寺院の建造について、官司機構の面から明らかにすることを目的とする。検討に先立ち、寺院造営に関する史料を簡便に調べられるように、当該期の歴史資料を網羅的に調査して「日本古代寺院造営データベース」を作成した。これを基に、もっとも多くの史料が残る東大寺を中心に検討をおこない、東大寺の造営における人員組織と官司機構の一端を明らかにすることができた。平成25年度における本研究では、データベース作成を主体とする基礎的作業の進行と、平成24年度の研究成果に基づく考察と成果発表という二つの実績を挙げることができた。まず、データベース作成では、日本古代史関係史料のうち六国史などの基礎的史料を網羅的に調査し、寺院造営に関わる史料を抽出してデータベース化した。なお、平成26年度は、『類聚三代格』や『延喜式』などの法制史料のほか、出土文字史料についても引き続き網羅的に調査し、平成25年度作成のデータベースと合わせて寺院造営関係史料データベースを完成させる予定である。次に、平成25年度中には1「古代の作画事業と画工司」(『古代文化』65-1、2013年6月)、2「画所解考」(『国史談話会雑誌』54、2014年1月)という2本の論文を発表した。これらは、正倉院文書を中心に研究を進めた平成24年度の本研究の成果に基づき、論文として発表したものである。1では、令外官司によって推し進められる寺院造営事業が、令制官司からの人員派遣によって支えられていたという構造を明らかにすることができた。この成果は、本研究全体の土台となる大きな成果であると考えられる。また、2では、本研究が主な事例として扱う東大寺の造営過程のうち、大仏殿の造営過程の一端を明らかにしたものである。その研究手法には、近年めざましく進展している正倉院文書研究の最新の成果を取り入れることに成功した。本研究課題では、古代国家の寺院造営機構の解明をめざし、1正倉院文書に残る寺院造営関係史料を検討して造東大寺司の機構と運営を復原解明すること、2六国史や寺史史料、縁起等を検討して「造寺司」の時期的な重複関係や内部組織を明らかにする、という2つの具体的課題を設定している。当該年度は1に挙げた正倉院文書の検討を行う計画を立てた。当該年度の成果としては、まず、正倉院文書を網羅的に検討して造営関係文書を抽出し、史料を検討した。その結果、東大寺を事例とした寺院造営を明らかにするには、東大寺造営がどのように行われたか造営関係文書から検討することと、造営主体である造東大寺司という官司がどのような機構で、どのように運営されていたか、という二つの課題の解決が必要であると思われた。換言すると、造営事業とその実行主体という二者である。東大寺造営事業については、既に福山敏男氏による一連の研究が存在する。本研究課題では、福山氏の成果を参考にして、造営事業の中でも特に工人の動員体制という点に絞って検討を行った。その成果は「古代の作画事業と画工司ー大仏殿廂絵作画の画工編成からー」と題した論文にまとめ、『古代文化』第65巻1号(2013年6月)への掲載が決定している。造営機構については、造東大寺司の成立過程に注目し、その前身機構と造東大寺司成立直後の体制を検討した。その成果は「東大寺の創建と造東大寺司の成立」(東北史学会日本古代中世史部会、2012年10月)、「造東大寺司の成立ー前身機構と初期体制を中心にー」(日本史研究会古代史部会、2012年11月)として学会で発表し、多くの研究者から有益な意見をいただいている。本研究課題の進展に意義のある研究成果を挙げることができたと考えている。本科研の最終年度では、前年度までに収集した寺院造営関係史料の補完とデータベース化の作業、及びその作業によって見えてくる寺院造営事業のあり方についての検討をおこなった。まず、データベース作成の作業は、当初の計画では資料収集要員として2名を予定していたが1名しか確保できなかったこともあり、前年度までにすべての資料収集を終えることができなかった。そこで、最終年度では資料収集作業とデータベース化作業という2つを行うこととなった。また、データベースをホームページ上に掲載し、広く閲覧できるようにすることを目標としたが、掲載許可等の問題によりすべての史料を掲載することはできないため、紙媒体に変更することとした。収集した資料およびデータベースを活用した寺院造営事業の検討については、当該年度は本科研のなかでも最も注目していた東大寺の造営に関する問題を中心に検討をおこなった。現在、論文としてまとめているところで、2015年度中に研究雑誌に発表する予定である。日本古代寺院造営研究にとって、本科研で作成したデータベース及び資料集は基礎となる成果であり、これを活用すれば今後も多くの研究成果につなげることが可能だと思われる。

本科研を通じ、日本古代寺院造営関係の史料のデータベース化作業を行ってきた。このデータベースは、古代寺院造営研究を行う際に、はじめにおこなう基礎作業を補助するものであり、さらには、寺院だけでなく宮都も含めた日本古代国家の造営事業全体の研究に寄与するところの大きい成果となったといえる。日本古代史本研究では、寺院造営機構の構成と運営の復原的解明を行い、日本古代における寺院造営の全容解明を目指す。そのために、1正倉院文書に残る寺院造営関係史料を検討して造東大寺司の機構と運営を復原解明する、2六国史や寺史史料、縁起等を検討して「造寺司」の時期的な重複関係内部組織を明らかにする、という二つの研究の柱を設定した。平成25年度までに、1である正倉院文書の研究はかなりの程度進展しており、研究開始時の予想以上に進んでいると言ってよい状況である。しかし、2に関しては、データベース作成に時間を費やしており、平成25年度までに完成させることはできなかった。平成26年度も引き続き資料収集に努め、データベースの完成を目指し、さらに検討に入らなければならない。上記のように1と2の進捗状況を総合的に判断して、「(2)おおむね順調に進展している。」と自己評価した。本研究課題では、古代国家の寺院造営機構の解明をめざし、1正倉院文書に残る寺院造営関係史料を検討して造東大寺司の機構と運営を復原解明すること、2六国史や寺史史料、縁起等を検討して「造寺司」の時期的な重複関係や内部組織を明らかにする、という2つの具体的課題を設定した。当該年度は、そのうち1に取りかかった。1の課題解決には、造営事業の解明とその実行主体である造営機構の解明という二点が必要と思われた。「研究実績の概要」に書いたように、造営事業に関してはその成果を論文という形にまとめることができ、造営機構に関しても、既に口頭での学会報告を行っている。学会では貴重な意見を多く得ることができた。日本古代史の史料自体が決して多くないという現状を鑑みるならば、質・量ともに豊富な一次史料群である正倉院文書は他に類をみない貴重な存在である。その正倉院文書に寺院造営関係の史料が多く遺されていることは、本研究課題にとって正に僥倖というべきである。しかし、文書の量が非常に多いため、正倉院文書全体を網羅した分析は困難であることが予想されていたが、当該年度の内にかなりの分析を進めることができた。また、研究発表を行う機会にも恵まれ、本研究課題にとって有益な年度になった。平成26年度は本研究の最終年度である。まず、第一に寺院造営関係史料データベースを完成させる。平成25年度までに六国史の資料収集を終えているので、平成26年度は、法制史料と出土文字史料を中心に資料収集を行い、データベースの完成を目指す。次に、正倉院文書を中心に、東大寺の造営についての検討を進め、平成26年度内にその成果を論文として発表することを目指す。第三に、作成したデータベースを基に寺院造営史料を検討し、日本古代における国家的寺院造営事業の特質を明らかにし、本研究のまとめとする。今後の本研究課題では、現状では研究計画の変更は必要なく、当初の研究計画に沿って進めていく予定である。次年度の本研究課題では二つの課題に取り組む。ひとつは、当該年度に学会で口頭発表した内容を基にして、成果を論文にまとめて発表することである。
義務教育段階における鑑賞活動に関する応用美学的研究-鑑賞学の構築に向けて-

論文「行為としての鑑賞-鑑賞学の序章としての鑑賞行為の分析-」を発展させた形態の理論的考察を、論文「「行為としての鑑賞」再考-鑑賞学の基礎理論の再検討-」としてまとめ、鑑賞学の理論を深化・発展させた。さらに、この理論に基づいて、学校現場(中学校)において生徒に向けて鑑賞授業を実践し、その実践研究の成果を二編の論文「鑑賞学実践研究19」および「鑑賞学実践研究20」の形態で学会誌に公表することによって、我国の美術鑑賞教育の進展に貢献した。目的(1)「鑑賞学の理論を深化・発展させる」ための研究計画に沿って、文学テクストおよび視覚テクストを読解する「読み」の理論に関する文献を収集し、収集した文献の中で目的(1)の達成にとって特に重要と思われる文献を精読・分析した。研究代表者が本年度の研究で特に注目した文献は、Wolfgang Iser "Der Aktdes Lesens", Wilhelm Fink Verlag(ヴォルフガング・イーザー『読書という行為』)である。この書は、「読み手」ないしは「鑑賞者」の能動的役割を積極的に評価し、読解行為は作品構造とその受容者=読者との相互作用によって初めて成り立つものであることを詳細に分析しているつまり、「読み」は、作者によって作られた文学テクストと、読者が成し遂げる「具体化」とが切り結ぶ地点において成立するのであり、文学作品は作者が書いたテクストそのものではなく、テクストと読者が収斂する場所に現れるものである。言い換えれば、文学作品は読書過程においてのみ顕在化するということになる。この考え方は、目的(1)にとって極めて重要であり、次年度の計画に予定している論考に取り入れていくつもりである。しかし、その際の問題点は、イーザーが文学的テクストを扱っているのに対し、研究代表者は視覚的テクストを研究対象にしているというところにある。これは次年度の課題となろう。目的(2)「イタリア・ルネサンス美術を題材として鑑賞教材を作成する」ための研究計画に関しては、イタリア・ルネサンス美術に関する文献資料を収集し、それらの文献資料により事前調査をした上で、平成21年9月7日22日まで、北イタリア(ミラノ、マントヴァ、ヴェネツィア、パドヴァ)にて、鑑賞学実践研究のための題材を求めて、実地調査した。47カ所にのぼる美術館および教会堂において調査した成果は、平成22年度以降に予定している実践研究において証明されるはずである。目的(1)「鑑賞学の理論を深化・発展させる」ための研究計画に沿って、拙論「行為としての鑑賞-鑑賞学の序章としての鑑賞行為の分析-」(『大学美術教育学会誌』第25号平成5年)を発展させた形態の理論的考察を論文としそまとめ、美術科教育学会誌『美術教育学』第32号(平成23年3月)に発表した。論文名は、「「行為としての鑑賞」再考-鑑賞学の基礎理論の再検討-」であり、本論文において、読解行為に関する昨年度の研究成果を活かしつつ、画像の読解の具体的な在り方について論究した。すなわち、(1)画像間の差異の関係を分析すること、(2)画像の表示的意味と共示的意味を読み取ること、(3)画像の「圧縮」と「置換」を読むこと、(4)画像間のインターテクスチュアルな関係を読むこと、の4点が鑑賞者の思考=読解に不可欠な技法として、具体的な事例を伴って提示された。そして、本論文において初めて、美術研究の世界において、鑑賞者の行為に基盤を置く鑑賞学が美学・芸術学・美術史学を基礎研究とする応用研究であること、また、鑑賞学に基づいて行われる鑑賞学実践研究が応用研究を基礎とする開発研究であることが指摘され、さらに、鑑賞学が、画像を深く繊細に享受する技法を活用することを通して人間性を高め・深める実践学として、広義の人間学であり得ることが指摘された。目的(2)「イタリア・ルネサンス美術を題材として鑑賞教材を作成する」ための研究計画に関しては、イタリア・ルネサンス美術に関する文献資料を収集し、それらの文献資料により事前調査をした上で、平成22年8月25日9月10日まで、南イタリア(ローマ、ティヴォリ、ヴィテルポ、ナポリ、ポンペイ、アマルフィ)にて、鑑賞学実践研究のためめ題材を求めて、実地調査した・56カ所にのぼる美術館・遺跡および教会堂において調査した成果は、平成23年度に予定している実践研究において証明されるはずである。本年度は、研究目的(3)「学校現場において生徒に向けて鑑賞授業を実践し、鑑賞学実践研究を完遂する」を達成し、かつ、3年間の研究期間の総合的成果を出す年度である。二件の鑑賞学実践研究を予定していたが、そのうち一件は平成21年度に実施された北イタリアでの調査に基づくもので、実施を一年前倒しして、平成23年3月に発表済みである(「鑑賞学実践研究19-ミケランジェロ作《ロンダニーニのピエタ》」)。

もう一件は、平成22年度に実施された南イタリアでの調査に基づく「鑑賞学実践研究20-ティツィアーノ作《パウルス3世とその孫たち》」であり、平成24年3月に発表された。いずれも査読有の学会誌(大学美術教育学会誌)掲載され、査読者から高評価を得た。鑑賞学実践研究の立案・作成過程は以下のように行われた。(1)まず、鑑賞課題作品に関する一定量の文献資料を収集・読解し、鑑賞課題作品についての標準的見解を確定する。(2)次に、(1)で得られた知見に基づきながら、自身の独自な解釈を含む、鑑賞課題作品についての見解をまとめる(=スクリプト)。(3)スクリプトを軸に授業の方向性を定め、授業展開を具体的に構成する発問文や説明文(=シナリオ)を作成する。シナリオは鑑賞者(=生徒)の独自な発想や思考を刺激する要素を持っていなければならない。(4)授業展開において必要となる資料・図版等を選定し、必要情報を含む文章を添えてパワーポイントによるスライドとして編集する。(5)授業を実践し、その分析結果を論文の形態で公表する。二件の鑑賞学実践研究を行った結果、「見る」「知る」「考える」という鑑賞行為を重視する鑑賞学理論の有効性が改めて確認できた。平成22年度に発表された理論的研究である「「行為としての鑑賞」再考-鑑賞学の基礎理論の再検討-」および上記の二件の鑑賞学実践研究によって本研究は総合的成果を提出できた。
融合する火災火炎性状の実験的研究とモデリング

複数火源の最も単純な組み合わせとして2個、3個および4個から成る火源群を対象とした。基準となる独立した単一火源からの火炎高さ(L_f)は発熱規模の関数で表され発熱規模を無次元発熱速度Q^*で表せばL_f〓Q^<*2/5>(円形火源)およびL_f〓Q^<*2/3>(線形火源)が得られた。火源が近接して行くと火災は傾斜し互いに融合した。火源間距離の変化につれて見かけの火源面積と発熱規模が変化するが、この変化の割合f_sは火源が付着した場合(S=0)での単一火源の性質および(S→∞)の場合は独立したn個の火源の性質を持つを考慮し、火炎は他の火炎に対して断熱である、融合以前においては火炎を通して他の火炎への雰囲気空気の巻き込みはない、火炎は乱流であって火炎相互の摩擦は無いと仮定すれぱ、線形火源についてはf_l=(DW+S^2)/2・(DW+S^2)と表現できた。しかもこれらは火源形状依存性を持つので、火源間距離が変化する場合の融合火源高さは、それぞれL/L_m=(f_s・Q^*)^<2/5>:円形(あるいは平方)火源L/L_m=(f_l・Q^*)^<2/3>:線形(あるいは矩型)火源、と表現できた。さて、壁面近傍に火源が設置された実火災状況についても上述のモデルが適用出来る。相同の虚火源を壁面を対象面として壁体内に在ると仮定して火炎高さを算出した。この場合も測定結果と計算結果は何れの火源形状に対してもよく一致し、上述の仮定に基づくモデルは十分な精度で火炎高さを表現していることが検証できた。今年度は初年度に当たるので、融合火炎のモデル化に必要となる基礎実験結果の収集、モデル化の準備を行った。1.予備実験:適正な実験結果を得るために機器の校正も含めて予備実験を行った。(a)火炎の均一性に確保:燃焼面として幅1cm長さ80cmのステンレス製の線状バーナーを作成し、これに微細な砂粒を詰めて拡散材としプロパンガスを燃料として供給した。燃料は拡散材によってほぼバーナー全面にわたって均一に拡散しバーナーの長辺方向にほぼ均一な火炎高さを形成できた。(b)温度、速度の測定:速度測定用に、精密微差圧計(今年度の予算による)を購入準備した。これに二方向管からの動圧と静圧を導入て差圧を測定し、圧の温度補正および管の形状因子補正を行って800°C程度の火炎中における上昇速度を測定可能とした。2.実験:床面上ほぼ30cmの高さに2本平行に線状火源を設置しこれらの火源上に融合した拡散火炎させた、火炎中および周辺部で速度および温度(熱電対(K-type)による)を測定した。燃料ガスの供給速度を変えて発熱量を単位長さ(m)当たり9.5、17、28.5および57kWの4段階与えた。バーナー間隔は0、5、12、20および30cmの5段階とし、各設定条件下で火炎高さ融合開始高さの観測記録を行った。3.モデル化:火炎の長さ(高さ)は熱量依存があると考えられるので、1つの火源上に形成される火炎形状をL/Dなる無次元火炎高さで表し、発熱速度QをρCT(gD)^<1/2>D^2で除して無次元化して表した。これによって火炎形状と発熱規模の関数関係を得た。

次に、融合する火炎の場合については火源間距離の増大は単位面積当たりの発熱束の減少と見なせるから、代表長さDを実火源面積を火源間面積で補正を行う事を試み、火源規模および火源間距離を変化させても火源高さを表現できるモデル式の導出を行った。平行火源上に形成された融合火源についてモデル式の妥当性の検討を行った。複数火源の最も単純な組み合わせとして2個、3個および4個からなる火源群を対象とした。基準となる独立した単一火源からの火炎高さ(L_f)は発熱規模の関数で表され発熱規模を無次元発熱速度Q^*で表せばL_f〓Q^<*2/5>(円形火源)およびL_f〓Q^<*2/3>(線形火源)が得られた。火源が接近して行くと火炎は傾斜し他がいに融合した。火源間距離の変化につれて見かけの火源面積と発熱規模が変化するが、この変化の割合f_Sは火源が付着した場合(S=0)での単一火源の性質および(S→∞)の場合は独立したn個の火炎の性質を持つを考慮し、火源は他の火炎に対して断熱である、融合以前においては火炎を通して他の火炎への雰囲気空気の巻き込みはない、火炎は乱流であって火炎相互の摩擦は無いと仮定すれば、線形火源については〓_l=(DW+S^2)2・(DW+S^2)と表現できた。しかもこれらは火源形状依存性を持つので、火源間距離が変化する場合の融合火源高さは、それぞれL/L_m=(〓_s・Q^*)^<2/5>:円形(あるいは平方)火源L/L_m=(〓_l・Q^*)^<2/3>:線形(あるいは短型)火源、と表現できた。さて、壁面近傍に火源が設置された実火災状況についても上述のモデルが適用出来る。相同の虚火源を壁面を対象面として壁体内に在ると仮定して火炎高さを算出した。この場合も測定結果と計算結果は何れの火源形状に対してもよく一致し、上述の仮定に基づくモデルは十分な精度で火炎高さを表現していることが検証できた。
脱灰琺瑯質結晶の修復に関する高分解能電子顕微鏡的研究

再石灰化実験に際して見られる高石灰化層内には、微小領域X線回折により、フルオロアパタイトの形成が認められたが、自然齲蝕病巣の高石灰化層にはそれが認められなかった。また、高分解能電子顕微鏡により両者の脱灰層および再石灰化層を観察したところ、自然齲蝕病巣脱灰層の結晶には、辺縁に大小の欠損を形成しているものや横断面中央に穿孔をもつもの、また溶解がいわゆるダ-クラインのところで止まっているものなどが観察された。一方、実験的脱灰層の結晶は、中央穿孔像がより多く認められた。穿孔周囲にバ-ガ-ス回路を描くと、ともに格子欠陥が存在していた。再石灰化実験の脱灰層と再石灰化層との移行部では、溶け残った本来の結晶の再成長および結晶間隙や穿孔内に新たに形成された六角形の小さな結晶の出現が観察された。また、自然齲蝕病巣の高石灰化層には、形態や方向の異なる大小さまざまな結晶が分布していたが、再石灰化実験のそこには、輪郭が鋭利で、比較的均一の大きさを示す多角形や六角形の結晶で占められていた。再石灰化実験の高石灰化層の結晶の(001)面の大きさを計測したところ、対照部および脱灰部のものより厚径、幅径共にかなり大きくなっていた。また、脱灰部の結晶は、対照部の結晶より大きくなっており、脱灰部でも結晶成長が起こっていることが示唆されたが、同様の結果が自然齲蝕病巣の脱灰部でも得られた。再石灰化実験の結果から、脱灰琺瑯質の再石灰化は、新生結晶の形成と成長および既存結晶の再生長によって進行し、その結果、既存結晶は修復されるとともに新生結晶と互いに融合しつつ、大きな六角形結晶に発展していく。結晶の融合部には、刃状転位、1/3格子ずれ、小角粒界、などが高頻度で発現するが、これらの欠陥部も時と共に改善される。自然齲蝕病巣と再石灰化実験に際して見られる高石灰化層内には多少の相違が見られた。すなわち、微小領域X線回折の所見によると、再石灰化実験により形成された高石灰化層にはフルオロアパタイトの形成が認められたが、自然齲蝕病巣のそれにはそれが認められなかった。また高分解能電顕により、両者の脱灰層および再石灰化実験により形成された高石灰化層を観察したところ、自然齲蝕病巣の脱灰層の結晶には、辺縁に大小の欠損を形成しているものや横断中央に穿孔をもつものが観察された。また、溶解がいわゆるダークラインのところで止まっているものが注意された。一方、実験的脱灰層の結晶は、辺縁欠損よりも結晶中央の穿孔像が多く認められ、穿孔の大きさも比較的大きく均一であった。穿孔の周囲にバーガース回路を描くとどちらにも格子欠陥があった。再石灰化実験の脱灰層の再石灰化層との移行部では、周縁欠損部など本来の溶け残った結晶の再成長と結晶間隙や穿孔内に新たに形成された小さなほぼ六角形の結晶の出現が観察された。

また、再石灰化層の中層では、中央穿孔をもつ結晶はほとんど見られなくなり、結晶成長や融合がいたるところに観察され、鋭利な隅角を持った長六角形ないし多角形の結晶が大部分占めるようになる。結晶の融合部にバーガース回路を描くと、そこに格子欠陥があることがわかり、高分解能像では、それらは刃状転位、小角粒界、1/3格子のずれとして観察される。再石灰化層の表層では、分布密度がますます増し、融合が完了した輪郭の鋭利となった多角形や六角形の結晶で占められるようになる。また、結晶間隙の形に応じて成長した結晶が、密なモザイク様の配列をとっているところもある。自然齲蝕病巣の高石灰化層には、形態、方向の事なる大小さまざまな結晶が分布しているが、再石灰化実験の高石灰化層には、輪郭の鋭利な大きな多角形や六角形の結晶で占められている。両者の形態の相違は、昨年報告したX線回折の結果に一致する。再石灰化実験の高石灰化層の結晶の001面の大きさを計測したところ、平均最大厚径524.2Å、平均最大幅径836.3Åであった。また、対照部の結晶の大きさは、平均最大厚径275.9Å、平均最大幅径477.6Å、脱灰部の結晶の大きさは、平均最大厚径426.9Å、平均最大幅径667.7Åであり、高石灰化層の結晶は、両者よりかなり大きくなっている。また、興味あることに脱灰部の結晶は、対照部の結晶より大きくなっており、脱灰部でも結晶成長が起こっていることが示唆されたが、この現象は自然齲蝕病巣の脱灰部でも同様の結果が得られた。再石灰化実験の結果から、脱灰琺瑯質の再石灰化は、新生結晶の形成と成長、既存結晶の再生長によって進行するといえる。その進行により、既存結晶は修復され、新生結晶と共に成長し、互いに融合しつつ、大きな六角形結晶に発展していく。結晶の融合部には、刃状転位、1/3格子ずれ、小角粒界、などが高頻度で発現するが、これらの欠陥部も時と共に改善されることが期待される。また、融合部の微小領域電子線回折像は、電顕像の格子欠陥を示す不規則なスポットが観察された。なお、歯頚部の白亜質、象牙質齲蝕病巣について、同様の実験と観察を行なう予定である。
HNF異常による糖尿病発生機構の解明

山縣らがMODY家系で発見したHNF遺伝子異常に伴う糖尿病は、現在知られている糖尿病の遺伝子異常としては、最も頻度の高いものであることが明らかになった。我々は、HNF遺伝子異常がMODY以外の1型、2型糖尿病の病型もとる可能性を考え、一般の糖尿病患者において、HNF遺伝子異常を検索した。46名の1型および52名の2型糖尿病(臨床的にMODYと診断される10名も含む)と診断されている糖尿病患者のHNF-1α,HNF-1β,HNF-4α遺伝子異常について、PCR直接シークエンス法にて解析した。その結果、4名の患者(3名の1型糖尿病、1名のMODY)において、HNF-1α遺伝子変異(G415R,R227C,A site(promoter),E48fsdelG)を同定した。これらの変異を導入した変異体HNF-1αでは、インスリン遺伝子の転写活性能が減弱しており、インスリン遺伝子の発現低下が糖尿病の発症に関与している可能性が示された。HNF-1βについては、1例のMODY患者においてS36F変異を同定した。また、群馬大学の武田教授との共同研究で、ヒトHNF-3βcDNAおよび遺伝子をクローニングし、80名の家族歴を有する2型糖尿病患者における遺伝子異常の有無を検討した結果、1名の濃厚な家族歴を有する2型患者においてA86T(転写活性領域のミスセンス変異)を同定した。一方、変異HNF-1α遺伝子を膵β細胞に発現させたトランスジェニックマウスでは、糖尿病が発症し、HNF遺伝子異常が糖尿病の原因となることをin vivoで証明した。平成10年度は、47名の日本人1型糖尿病患者、および、35歳以下で発症した2型糖尿病患者44名を対象に、末梢血よりDNAを抽出し、HNF-1α、HNF-4α遺伝子の異常の有無について、PCR直接シークエンス法にて検討した。また、変異を有する患者の臨床増を解析すると共に、変異体HNFの機能についてもあわせて検討した。その結果、1型糖尿病患者の3名(6.4%)において3種類(G415R、プロモーターAサイト、E43fsdelG)の、また、2型糖尿病患者の1名(2.1%)において1種類(R272C)の、新しいHNF-1α遺伝子異常を同定した。HNF-4α遺伝子異常は同定できなかった。これらのHNF-1α異常型糖尿病患者はいずれも、肥満は認めず、30歳以下で発症しており、インスリン分泌は低下していた。1名の患者(R272C変異)においてアルギニン負荷試験を施行したところ、インスリンの分泌低下に加えてグルカゴンの低反応も認められた。変異体の機能についてレポーターアッセイを施行したところ、G415R変異はhaploinsufficiency mutation、R272C変異はdominant negative mutation、Asite変異はgain of function mutationであることが判明した。その結果、4名の患者(3名の1型糖尿病、1名のMODY)において、HNF-1α遺伝子変異(G415R,R272C,A site(promoter),E48fsdelG)を同定した。

これらの変異を導入した変異体HNF-1αでは、インスリン遺伝子の転写活性能が減弱しており、インスリン遺伝子の発現低下が糖尿病の発症に関与している可能性が示された。HNF-1βについては、1例のMODY患者においてS36F変異を同定した。また、群馬大学武田教授との共同研究で、ヒトHNF-3βcDNAおよび遺伝子をクローニングし、80名の家族歴を有する2型糖尿病患者における遺伝子異常の有無を検討した結果、1名の濃厚な家族歴を有する2型患者においてA86T(転写活性領域のミスセンス変異)を同定した。一方、変異HNF-1α遺伝子を膵β細胞に発現させたトランスジェニックマウスでは、糖尿病が発症し、HNF遺伝子異常が糖尿病の原因となることをin vivoで証明した。
単球における異常発現表面分子と全身性エリテマトーデスの病態関与に関する研究

全身性エリテマトーデス(SLE)は腎、神経など多臓器に障害を起こす難治性自己免疫疾患である。ステロイドを中心とした治療を行っているが効果不十分な症例や治療関連合併症が多く、病態に即した治療標的を探索し、特異性の高い治療を行うことが重要と思われる。SLE患者の網羅的FACS解析を行ったところ単球においてCおよびSの異常発現したサブセットを活動期SLEで認め、これは新規の細胞分画である可能性が高かった。本研究ではこの新規単球分画の機能についてマイクロアレイ解析などを通じて検証を行い、SLE病態への関与を明らかとして、将来の新規治療法の開発への糸口としたい。
原子層堆積処理をした生体移植用材料のin vitroおよびin vivo評価

原子層堆積(ALD)は金属酸化物あるいは金属の超薄膜を成膜可能とするナノテクノロジーの一種であり、既に半導体工学分野において応用されている。2017年度は純チタンディスク上にジルコニアでALD成膜(約70 nm)し、同成膜試料上にマウス線維芽細胞様細胞およびマウス骨芽細胞様細胞を培養し、それぞれの増殖能および細胞形態をSEM像で観察した。2018年度は純チタンディスク上にシリカでALD成膜を試みた。先ず、成膜厚を計測したところ約35 nmであった。次に前年度同様にマウス線維芽細胞様細胞を同試料上で5日間培養し、細胞増殖能と細胞形態をSEM像で観察した結果、細胞数は経時的に増加し、コントロール(シリカ成膜なし)と同等の細胞増殖能を示した。また、各培養日数での細胞形態もコントロールと類似しており、培養2日目までは紡錘形あるいは多角形の細胞形態を呈していた。また、培養3日目以降では細胞は敷石状に試料上全体に増殖していたことから、培養3日目にコンフルエントに達したと考えられる。ALD成膜をした純チタン試料上での細胞の挙動は、成膜なしの試料と同様の様相を呈していた。このことは、ALDによる純チタン試料上へのシリカの成膜は細胞の増殖を妨げることはないが、一方で増殖能を促進しないということも示している。今後、酸化亜鉛、アルミナ等他のプリカーサーを用いても成膜する予定でいるが、成膜方法あるいは、成膜後にさらなる工夫が必要であると考える。2017年8月より2018年7月まで愛知学院大学在外研究員としてアメリカミズーリ大学カンザスシティ校に赴任していた。従ってこの間、本研究プロジェクトは中断していた。またALDによる成膜は企業に委嘱しているが、成膜装置の不調等により計画通り成膜試料が供給されないでいるため遅れている。これまでは電子ビーム粉末積層造形法(EBM)によって作製した純チタン試料にALD成膜した試料を使用してきたが、同試料は作製方法が特殊であるため通常の純チタン試料、即ち、チタン板から打ち抜きで作製した試料にALD成膜をして同様の実験を行う予定でいる。成膜後成分(ジルコニア、シリカ)が経時的に溶出しているか否か、また、溶出している場合にはその溶出量をICP発光分光分析装置を用いて計測する。さらに、インプラント埋入時は通常2535Ncmのトルクをかけて埋入するが、その際薄膜が剥離してしまう可能性が危惧される。従って、薄膜のチタンに対する密着強度の計測も検討している。本研究プロジェクトにおいてまず,電子ビーム粉末積層造型法(Electron Beam Melting;EBM)により作製した純チタンディスク(Tiディスク)上に原子層堆積(ALD)装置によるジルコニア(ZrO2)の成膜を行った.(設定成膜厚=50 nm)まずはTiディスク上の成膜の様子を走査型電子顕微鏡(SEM)にて観察したが,均一の厚さに成膜されているのが確認できたのと,さらに,少し入り組んだ部位にも同様に成膜されることが確認できた.次に成膜状態を詳細に検討するためにエックス線光電子分光法(XPS)による分析を行った.分析範囲(100 μm)内でTiは検出されなかったことからもZrO2による成膜がなされていることが元素レベルで確認できた.さらに,その表面状態を分析した結果,ZrはZrOとZrO2の2つの状態で存在していることが分かり,その比率は約1:4であった.また,Arイオンスパッタリング(スパッタレート:4nm/min)により成膜厚について検討したところ,Tiはスパッタ時間6分以降から検出され、ZrとTiの組成が逆転するスパッタ時間は約18分であったことから,ZrO2の成膜圧は約72nmであり,これは設定した膜厚よりも20 nmほど厚いことが分かった.一方,SEMにおいて純チタンとZrO2の間に異なる層が見られたが,同様に元素分析を行った結果,それはTiO2であることが分かり,30 nm程度の厚さであった.ALDによる成膜はALDジャパンに委託しているが,装置が不調で,設定通り(50 nm)の成膜厚になっていないことが分かった.これはコンプレッサーの容量不足が原因でなないかと考えている.近々コンプレッサーを取り替えて成膜する予定である.純チタンはオッセオインテグレーション能を有するため歯科用インプラント材料として広く臨床応用されているが、より高いオッセオインテグレーションが得られるよう、インプラント体表面は酸処理、ハイドロキシアパタイトコーティングなど,種々の表面処理が施されている。本研究において、電子ビーム粉末造形機(EBM)で作製した純チタンディスク上に原子層堆積(ALD)によるジルコニアの超薄膜を生成し、同試料上でマウス線維芽細胞(L929)および、マウス骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)をそれぞれ培養し、その増殖能を評価した。先ずALDによるジルコニア成膜についてであるが、透過型電子顕微鏡観察により成膜厚さは約65 nmであることが分かった。さらに、純チタンディスクとジルコニア超薄膜の間には約12 nmのチタニアが自然成膜されていることも分かった。純チタンディスク上でL929を5日間培養した結果、経時的に細胞数は増殖していたが、コントロール(ジルコニア超薄膜なし)と比較して細胞数が優位に増加していることはなかった。