hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天体におけるブラックホール蒸発を用いた高次元宇宙モデルの検証

1近年の観測技術の向上によって宇宙論パラメターがよく推定されるようになり、宇宙のインフレーションが実際に起きていたことが益々確かなこととして考えられるようになってきた。そこで、Randall-Sundrum高次元宇宙モデルとインフレーションとの整合性を原始ブラックホールを通じて調べるべく、インフレーションに由来するスカラー揺らぎを種として形成される原始ブラックホールの質量関数を導出した。質量関数が計算できれば、ブラックホールのHawking輻射によって生じる粒子のスペクトルと宇宙線の観測との整合性から、インフレーション期の宇宙の状態、特にスカラー揺らぎのスペクトルに対する制限が得られる。Randall-Sundrum宇宙モデルにおいては宇宙が四次元の場合に比べ小さなスケールの揺らぎに対応する原始ブラックホールの蒸発を観測していることになる為、大規模構造での観測値で規格化したスペクトルの冪指数は四次元よりも小さくなくてはならないことが示された。詳細な結果はJournal of Cosmology and Astroparticle Physics誌に論文として発表した。2超弦理論と類似の構造を備える、磁束によって支持される曲がった有限な大きさの二次元余次元を持つ六次元膜宇宙モデルにおいて、四次元膜上での重力相互作用および解そのものの動的安定性について調べた。この目的の為に、まず二次元の余剰次元を持つ時空において膜の内外で二重に共変的な形式での境界条件を与えた。今回用いた定式化では必要な程度の数学的厳密性と可搬性が実現されており、今後の同種の解析で幅広く応用できることが期待される。実際、上記の宇宙モデルに対して適用することで重力摂動のスペクトルの計算を行ない、二乗質量の正値性から時空の安定性を示した。詳細な結果はClassical and Quantum Gravity誌に論文として発表した。ブラックホールが蒸発する現象を適用し、宇宙が4以上の次元を持っているという仮説の検証を進める研究を行なった。研究対象とした高次元宇宙モデルの一つは、RandallとSundrumの提案したブレイン宇宙である。銀河系内にダークマターとして存在する可能性が指摘される始原的ブラックホールは、宇宙線として地球に到来する反陽子の放出源の候補の一つと見られているが、その蒸発の過程は通常の4次元宇宙とRandall-Sundrumモデルの宇宙とで大きく異なる。そこで、始原的ブラックホールが蒸発し放出される反陽子の流束量をブレイン宇宙の性質を取り込んで計算し、BESS実験による地球大気上層での反陽子流束の測定結果と比較した。成果として得た、ブラックホールの存在量およびブレイン宇宙を特徴付けるパラメターへの制限等は、Physical Review D誌に掲載された。また、初期宇宙における宇宙の膨張速度が通常と異なるのもブレイン宇宙の特徴の一つである。この性質は、宇宙最初期のインフレーション的膨張によって生じた密度揺らぎからの始原的ブラックホールの生成量に大きく影響するため、ブレイン宇宙におけるインフレーション期を調べる手がかりとなる。始原的ブラックホール生成量がブレイン宇宙におけるインフレーション起源密度揺らぎのパラメターにどのように依存するかを定式化し、日本物理学会2004年秋季大会で発表した。もう一つ研究対象とした高次元宇宙モデルは、DvaliとGabadadzeとPorratiによって提案されたブレイン宇宙である。このモデルでもブラックホールの蒸発は通常の4次元でのそれと大きく異なると予想されるが、ブレインに局在化したブラックホール解がまだ知られていないため、足がかりとしてブラックホール解を構成するためにバルクを「切る」スライシングの手法の解析を行なった。結果として、5次元ブラックストリング解におけるスライスの唯一性と、5次元Schwarzschild解におけるスライスの非存在を見出し、日本物理学会第60回年次大会で発表した。1研究課題であるブラックホール蒸発現象を利用した高次元宇宙モデルの検証のためには、通常の四次元宇宙と異なる状況でのブラックホールの形成過程がよく理解されなければならない。通常よく考慮される球状の物質を重力崩壊させる過程では、四次元であれば重力波は放出されないことが知られているが、宇宙が高次元であればその限りでない。この予想を、五次元Randall-Sundrum膜宇宙モデルに基づいた現実的な重力崩壊の過程に適用し、重力波の放出率を定式化した結果をKinoshita et al.(2005)に論文としてまとめた。この論文で行なった解析は余次元の広がりに対し十分大きな物質分布を考えたものであり、その範囲ではただちに現行の重力波干渉計での観測に掛かる振幅を与えるものではないことが示されたが、一方、研究代表者が手がける、宇宙初期の原始ブラックホールの生成に当たってはおびただしい重力波が放出されうることを示唆するものである。2超弦理論と類似の構造を備える新しい高次元宇宙モデルとして、磁束によって支持される曲がりを持った有限な大きさの二次元余次元を持つ、六次元膜宇宙モデルに着目し、我々の宇宙としての四次元膜上での重力相互作用、および解自体の安定性について調べ、Mukohyama et al.(2005)およびYoshiguchiet al.(2006)にまとめた。膜状の張力が変化することに対して宇宙膨張が通常の宇宙論と同じように応答することを示し、摂動に対する解の動的安定性を示すことができた。これらの結果は、この新しい高次元モデルが現実的な宇宙を表わすモデルとなりえることを示唆する。このモデルにおけるブラックホール解の性質についても解析を進めており、結果の一部は2006年3月の日本物理学会で発表する予定である。

そこで、Randall-Sundrum高次元宇宙モデルとインフレーションとの整合性を原始ブラックホールを通じて調べるべく、インフレーションに由来するスカラー揺らぎを種として形成される原始ブラックホールの質量関数を導出した。質量関数が計算できれば、ブラックホールのHawking輻射によって生じる粒子のスペクトルと宇宙線の観測との整合性から、インフレーション期の宇宙の状態、特にスカラー揺らぎのスペクトルに対する制限が得られる。Randall-Sundrum宇宙モデルにおいては宇宙が四次元の場合に比べ小さなスケールの揺らぎに対応する原始ブラックホールの蒸発を観測していることになる為、大規模構造での観測値で規格化したスペクトルの冪指数は四次元よりも小さくなくてはならないことが示された。詳細な結果はJournal of Cosmology and Astroparticle Physics誌に論文として発表した。2超弦理論と類似の構造を備える、磁束によって支持される曲がった有限な大きさの二次元余次元を持つ六次元膜宇宙モデルにおいて、四次元膜上での重力相互作用および解そのものの動的安定性について調べた。この目的の為に、まず二次元の余剰次元を持つ時空において膜の内外で二重に共変的な形式での境界条件を与えた。今回用いた定式化では必要な程度の数学的厳密性と可搬性が実現されており、今後の同種の解析で幅広く応用できることが期待される。実際、上記の宇宙モデルに対して適用することで重力摂動のスペクトルの計算を行ない、二乗質量の正値性から時空の安定性を示した。詳細な結果はClassical and Quantum Gravity誌に論文として発表した。
りんご果実ポリフェノールの示す抗真菌作用の研究

自然栽培したリンゴ果実の一部を殺菌し培養したところ、果実内部由来と推定される真菌の胞子形成を認めた。一方でリンゴ果皮のポリフェノールにはバクテリアの糖代謝を阻害する抗菌作用があり、またバクテリアの糖代謝産物は真菌の糖輸送を阻害する。そこで、リンゴはポリフェノールを介して共生バクテリアを、更には共生真菌を間接的に制御し、これら真菌と同一の栄養素を求める病害菌の増殖を抑制するとの作業仮説を立て、その様相を蛍光糖イメージングで探る予備実験を行ったところ、取り込みは極めて多様で従来法による解析は困難であった。そこで新たに3次元多面同時観察システムを開発した。今後、本システムによる解明が期待される。無肥料・無農薬で自然栽培されたリンゴ果実には病原菌に侵されにくいものが存在するが、その理由は十分明らかでない。そこで自然栽培されたリンゴ果実5mm四方を切り取り、表面をアルコール及び次亜塩素酸にて殺菌処理し培養したところ、Alterinaria属の胞子形成を認めた。これは果実内部の嫌気環境で共生する真菌由来と推定され、これら真菌が同一環境で類似栄養素を利用可能な病害真菌と競合し、その増殖を抑制している可能性もあり、興味深い。一方、リンゴ果実の皮下に多量に含まれるポリフェノールPhlorizin/Phloretinは、多様な糖輸送体を阻害すると共にバクテリアの糖代謝を阻害する抗菌作用を示す為、これらのポリフェノールと共生真菌の関係が注目される。幸いPhlorizin/Phloretinは真菌類の糖輸送体HXTを直接阻害しないが、最近HXTがバクテリアの糖代謝産物で阻害されると報告された。そこで、リンゴはポリフェノールを介して共生バクテリアを制御し、更に共生真菌を間接的に制御することにより、病害微生物から果実を保護するとの作業仮説を立てた。本研究ではこれら微生物の糖利用の様相をオリジナル技術「蛍光糖(fG)イメージング(日米欧特許取得)」を用いて探ることを目的とする。上記真菌に、異なる性質をもつfGを同時に適用したところ、胞子毎、節毎に取り込みの多様性が示唆されたが、レーザー共焦点顕微鏡による多点断層撮像では、高度な立体構造を示す真菌の評価に限界があった。そこで、生きた真菌を蛍光を用いて3次元的に多面同時観察するシステムの開発を進め、昨年度の国際出願に続き、今年度は実際的な使用を想定したシステムを新たに試作した結果、予想以上に優れた立体可視化性能が示された。本システムは、生きた共生菌の糖摂取のダイナミズムを蛍光で可視化する為の基盤技術として有望で、今後の展開が期待される。生理学
多様な認識特性の抗体の創出、相互作用検出、および生産のための統合システム

プロテオーム解析に基づく医薬品開発、医療診断・高度分析、バイオプロセスなど分野では極めて多種のタンパク質を識別し得る多様な認識能を持つ抗体分子の創出法、対象タンパク質と望ましい相互作用をする抗体の検出・スクリーニング法、ならびに抗体の効率的生産法の確立が必要である。そこで本研究では、本申請者らが開発してきた酵母のmatingによる大規模ライブラリーの作製法、高感度タンパク質相互作用検出法および酵母による組換えタンパク質分泌生産系の効率化の研究を基盤として、これらを統合的に展開・発展させて多様な対象タンパク質を認識・検出する抗体素子を簡便・迅速に創出・取得する手法を開発した。1.微小コロニーを寒天培地場で培養し、このコロニーから分泌されている抗体を、PVDFなどの疎水性膜に目的抗原を吸着させたものにブロットする、コロニーリフトアッセイ法を開発した。これによって、スクリーニング対象の高密度化、マイクロシステム化をはかり、スクリーニング可能数を増加させられる。2.パーオキシダーゼ内包抗体結合リポソームを用いて疎水性膜面にブロットした抗原タンパク質との結合特性を検討し、シグナル検出には化学発光物質を用いりことによって、従来の標識抗体法の数百倍倍以上の高感度化、すなわちpgオーダーの抗原の検出を可能にした。3.酵母のmatingによる抗体H鎖、L鎖大規模ライブラリーの作製を確立し、さらに酵母による分泌生産が可能なことを示した。4.ライブラリーからのリポソームを用いるバイオパンニング法を開発し、従来のプラスチックを用いる方法よりも効率的に所望の特性の対象を得ることが出来ることを示した。ゲノム解析の進展にともない、多様な発現タンパク質の特性、機能の解析、いわゆるプロテオーム解析が医薬品開発、医療診断・高度分析、バイオプロセスなどの応用分野での重要性を増している。このためには極めて多種のタンパク質を識別し得る多様な認識能を持つ抗体分子の創出法、対象タンパク質と望ましい相互作用をする抗体の検出・スクリーニング法、ならびに抗体の効率的生産法の確立が必要である。そこで本研究では、本申請者らが開発してきた酵母のmatingによる大規模ライブラリーの作製法、疎水性膜を用いる高感度タンパク質相互作用検出法および酵母による組換えタンパク質分泌生産系の効率化の研究を基盤として、これらを統合的に展開・発展させてプロテオーム解析のために、多様な対象タンパク質を認識・検出する抗体素子を簡便・迅速に創出・取得するという目的を達成することを目指している。2.パーオキシダーゼ内包抗体結合リポソームを用いて疎水性膜面にブロットした抗原タンパク質との結合特性を検討し、シグナル検出には化学発光物質を用いることによって、従来の標識抗体法の数百倍以上の高感度化、すなわちpgオーダーの抗原の検出を可能にした。本年度の研究では以下の成果を得た。

1.パーオキシダーゼ内包抗体結合リポソームを用いて疎水性膜面にマイクロブロットした抗原タンパク質からのシグナル強度におよぼす試料容積および濃度の影響ついて、従来の標識抗体法と比較検討し、本方法が微少量の試料分析において従来法より格段に優れており、マイクロプロテインアッセイへの適用が可能であることを示した。2.対象タンパク質を提示したリボソームを用いた新規なバイオパンニング法を開発し、本法が抗原-抗体などの、特異的バイオアフィニティの検出に優れており、ライブラリーからの目的物のスクリーニング効率が高いことを見いだした。3.一本鎖抗体(scFv)の大腸菌、および酵母Pichia pastorisによる発現を行い、これらが活性な抗体を産生し得ることを示すと共に、酵母の方が発現効率がよいことを明らかにした。
BRCA1/2陽性卵巣癌の浸透率を左右する因子の同定と発症予測モデル開発

遺伝性腫瘍の病的バリアントおよび意義不明なバリアント(variants of uncertain significance: VUS)を登録血縁腫瘍歴や臨床情報とともに登録を行った。2Germline DNAバイオバンクの構築本研究の協力者である遺伝性腫瘍のバリアント保持者および同意が得られた血縁者のgerm line DNAをバイオバンクに保管した。3国内外のデータシェアリング事業への参画申請者はHBOC関連遺伝子バリアントの国際データシェアリング事業であるEvidence-Based Network for theInterpretation of Germline Alleles(ENIGMA)に日本代表として参画している。本臨床研究で登録されたバリアントは国内外のデータシェアリング事業に登録することで、国内外の関連分野における研究推進に貢献する。その成果は長期的にみると、研究に協力頂いたクライアントおよび家系員に還元することで、個別化がん予防法につなげるなどの利益にもなる。最終的に本研究の成果によって発がん発症高リスク例に対するがん予防プロクラムを構築する事は、個人レベルではがん予防への動機の向上の促進やサーベイランスの最適化につながり、公衆衛生上ではがん死低減と費用対効果の最適化が期待できる。2018年度は登録症例数が増加した引きつづき追加解析を進め、疫学因子とともに、長期的なコホート研究を構築して日本人女性における個別化予防法の確率を目指している。卵巣癌は早期発見が困難で,5年生存率は40%以下と予後不良な疾患であり,近年まで40年間にわたり長期予後が改善していない.そのため,卵巣癌発症の高危険群に対しては適切ながん予防策を講じるとともに,発症例に対しては至適治療法を選択してその死亡率の減少をはかることが喫緊の課題である.ところで卵巣癌の約10-20%はがん関連遺伝子の生殖細胞系列の病的バリアント(病的変異,病原性多様体)を保持していることから遺伝性に発生するといわれている.そのため原因遺伝子の遺伝学的検査はがん予防策を構築する上での端緒となるものの,本邦における卵巣癌関連遺伝子の生殖細胞系列の病的バリアントの特徴は明らかになっていない.そこで卵巣癌個別化予防法を確立することを目的に,卵巣癌患者由来germline DNAを対象に生殖細胞系列バリアントを同定した.慶應義塾大学医学部産婦人科学教室バイオバンク(Keio Women's Health Biobank)に保管されている上皮性卵巣癌,卵管癌および腹膜癌,計230例由来のgermlineDNAを対象に,遺伝性卵巣癌に関連すると考えられる79遺伝子のバリアントをターゲットキャプチャー法にて解析した.41例(17.8%)で合計11遺伝子の生殖細胞系列病的バリアントを認めた.そのうち遺伝性乳癌卵巣癌症候群の原因遺伝子であるBRCA1とBRCA2(BRCA1 / 2)の病的バリアントをそれぞれ19例(8.3%)と8例(3.5%)で,リンチ症候群の原因遺伝子であるミスマッチ修復遺伝子の病的バリアントを6例(2.6%)で検出した.BRCA1 / 2病的バリアント保持者,あるいはすべての遺伝性卵巣癌関連遺伝子の病的バリアント保持者は,それぞれの変異を保持していない人と比べ,より若年で診断され,第1度または第2度近親者に卵巣癌患者がおり,高異型度漿液性癌が多いことが判明した.本成果は,日本人における個人のリスクにあわせたゲノム医療につながる個別のリスクを把握した予防や診療の基盤データとなり得る.遺伝性腫瘍の病的バリアントおよび意義不明なバリアント(variants of uncertain significance: VUS)を登録血縁腫瘍歴や臨床情報とともに登録を行った。2018年度は登録症例数が増加した今後は卵巣癌200例以上を追加解析することを目指している。また疫学因子とともに、長期的なコホート研究を構築して日本人女性における個別化予防法の確率を目指している。引きつづき追加解析を進め、疫学因子とともに、長期的なコホート研究を構築して日本人女性における個別化予防法の確率を目指している。2017年度に予定していた解析を2018年度に施行することにした。そのため2017年度に予定していた解析に関連する物品費、旅費、その他に充当することを計画している。当初は本年度に解析を行う予定であったが、検体数が当初の予定より少なかったため、次年度にまとめて解析することにしたため
窒素酸化物の個人曝露濃度算出モデルの開発

窒素酸化物の個人暴露濃度は、家屋内の窒素酸化物発生源の有無や、個人の生活用式の違いにより大きく変化する。これらの変動要因を踏まえつつ、一般大気測定局の窒素酸化物濃度データから個人暴露濃度を推定する適切なモデルを作成するためには、多くの個人暴露濃度の情報を収集する必要がある。本研究ではモデル開発に必要な基礎資料を得ることを目的として個人暴露濃度調査を行った。窒素酸化物の測定には、拡散型サンプラー(横浜式)を用いた。相模原市内に在住する本学学生を対象に、個人暴露濃度、家屋内居間付近および家屋内厨房付近の窒素酸化物濃度、家屋外窒素酸化物濃度の測定を行い、同時に記述式アンケートにより、生活時間調査、家屋内の窒素酸化物発生源調査、家屋構造調査を行った。その結果、窒素酸化物の個人暴露濃度は家屋内居間濃度、家屋内厨房濃度のいずれとも正の相関が高く、屋外濃度との間にも正の相関が認められた。また、家屋構造の違いや、暖房器具の使用状況により個人暴露濃度、家屋内濃度は大きく変動すること、とくに冬期においてその傾向が顕著であることが示唆された。今後、一般測定局の窒素酸化物濃度を入手し、個人暴露濃度算出モデルの作成を試みるが、屋外濃度から家屋内濃度を推定する作業が極めて重要であることが認識された。今後、家屋構造、屋内発生源に的を絞った枢密調査が必要である。
HOxラジカルの選択的な検出による新規な反応経路分岐比決定手法の開発

現在,大気化学で最も重要な連鎖反応の一つであるHOxサイクルを対象に,大気中で起こり得る化学反応の定性的かつ定量的な評価を目指し,HOx(OH, HO2, RO2)ラジカルの反応経路分岐比や反応収率の決定手法開発を目的とし,実験を行っている。特に,本研究では,重水素置換したODラジカルをHOxサイクルの開始剤として使用することで,各HOxラジカルの選択的な挙動観測を目指す。さらに,OHラジカルと揮発性有機化合物(VOC)の反応で生成する莫大な種類のRO2ラジカルを包括的に観測することで,HOxサイクルに関与する数多くのVOCを同定することなく,各HOxラジカルの経路分岐比および反応収率を決定することを試みている。OHラジカルは反応セル中でO3光解離に引き続く水との化学反応で生成し,A-X遷移に基づくレーザー誘起蛍光(LIF)法で検出を行う。HO2ラジカルおよびRO2ラジカルは,それぞれNOおよびO2との化学反応によってOHラジカルに変換し,OHラジカルとして検出を行う。OHラジカルへの再変換および検出は低圧の検出セルで行う。準備段階では,OHラジカルの検出および時間変化の観測に成功し,実験装置の組み立て等を行っていた。さらに,OH+CO反応,OH+C3H6反応で生成するHO2ラジカルおよびRO2ラジカルを化学反応によりOHラジカルに変換し,それぞれのラジカルの挙動を観測することにも成功していた。2018年度は,さらに,よりシンプルな構造をもつエタンや,大気中に放出されるVOCの中でも特に重要なVOCのひとつであるイソプレンとの反応で生成するRO2ラジカルの検出にも成功し,RO2検出のための実験装置や実験条件の最適化を行った。さらに,O3の光解離で生成したO原子とD2Oとの反応で生成するODラジカルの検出にも成功し,OHラジカルとの検出感度比較等を行った。本研究では,最終目標として実大気中の微小な化学種との化学反応の観測を目指すため,高い検出感度が必要である。そのため,2018年度にはLIFの検出感度を上げるために,検出セル中のサンプルガスを吸引するオイルロータリーポンプを現有のメカニカルブースターポンプに交換し,圧力を1Torr以上下げることに成功した。これにより,電子励起OHラジカルの窒素分子等によるクエンチングが減少し,LIF強度が増加した。さらに,LIFを検出する光電子増倍管や周辺装置の最適化を行うことで4倍ほど検出効率を増加させることに成功した。また,HO2およびRO2ラジカルの検出効率を上げるため,反応セルと検出セルをつなぐ管を10センチほど長くした。これにより,NOやO2との反応時間が長くなり,OHへの変換効率を上げることができる。これらの結果から,当初の予定よりも高い検出効率を達成することが出来た。さらに,高い検出効率により,OHラジカルとエタンやイソプレンの反応で生成したRO2ラジカルの定量的な観測が可能となった。さらに,ODラジカルの検出にも成功しており,研究課題の進捗は順調である。しかし,重水を使用した実験でもキャリアーガス等に含まれる水からOHラジカルが発生するという問題が発生した。さらに,HOxサイクルの複雑な反応メカニズムのため,より定量的に評価するためのいくつかの課題も出てきているため,進行具合をおおむね良好と判断した。まず,バックグランドのOHラジカルのLIF強度を差し引くためのキャリブレーションを行う。そして,定常的に水が存在した場合でも,定量的な反応経路分岐比を決定する手法をラボ実験で確立する。さらに,大気中のVOCの中には,HOxサイクルの開始剤を重水素置換しただけでは選択的にRO2ラジカルの観測が難しいものが存在していることが判明したため,検出セル内に酸素ガスを添加し,RO2ラジカルのOH変換効率の酸素濃度依存性から,RO2ラジカルの相対的な濃度を算出する工夫を用いる。そして,2020年度には確立した反応経路分岐比決定手法を用いて実大気観測を行う予定である。

2018年度は,さらに,よりシンプルな構造をもつエタンや,大気中に放出されるVOCの中でも特に重要なVOCのひとつであるイソプレンとの反応で生成するRO2ラジカルの検出にも成功し,RO2検出のための実験装置や実験条件の最適化を行った。さらに,O3の光解離で生成したO原子とD2Oとの反応で生成するODラジカルの検出にも成功し,OHラジカルとの検出感度比較等を行った。本研究では,最終目標として実大気中の微小な化学種との化学反応の観測を目指すため,高い検出感度が必要である。そのため,2018年度にはLIFの検出感度を上げるために,検出セル中のサンプルガスを吸引するオイルロータリーポンプを現有のメカニカルブースターポンプに交換し,圧力を1Torr以上下げることに成功した。これにより,電子励起OHラジカルの窒素分子等によるクエンチングが減少し,LIF強度が増加した。さらに,LIFを検出する光電子増倍管や周辺装置の最適化を行うことで4倍ほど検出効率を増加させることに成功した。また,HO2およびRO2ラジカルの検出効率を上げるため,反応セルと検出セルをつなぐ管を10センチほど長くした。これにより,NOやO2との反応時間が長くなり,OHへの変換効率を上げることができる。これらの結果から,当初の予定よりも高い検出効率を達成することが出来た。さらに,高い検出効率により,OHラジカルとエタンやイソプレンの反応で生成したRO2ラジカルの定量的な観測が可能となった。さらに,ODラジカルの検出にも成功しており,研究課題の進捗は順調である。しかし,重水を使用した実験でもキャリアーガス等に含まれる水からOHラジカルが発生するという問題が発生した。さらに,HOxサイクルの複雑な反応メカニズムのため,より定量的に評価するためのいくつかの課題も出てきているため,進行具合をおおむね良好と判断した。まず,バックグランドのOHラジカルのLIF強度を差し引くためのキャリブレーションを行う。そして,定常的に水が存在した場合でも,定量的な反応経路分岐比を決定する手法をラボ実験で確立する。さらに,大気中のVOCの中には,HOxサイクルの開始剤を重水素置換しただけでは選択的にRO2ラジカルの観測が難しいものが存在していることが判明したため,検出セル内に酸素ガスを添加し,RO2ラジカルのOH変換効率の酸素濃度依存性から,RO2ラジカルの相対的な濃度を算出する工夫を用いる。そして,2020年度には確立した反応経路分岐比決定手法を用いて実大気観測を行う予定である。
膜及び高分子界面の物性と機能に及ぼす麻酔薬の作用

脂質膜中の麻酔薬存在状態:麻酔薬分子は膜界面に吸着の形で存在し、その数が増すにつれて内部への分配が増加すると考えられる。2種の分光学的プローブを用いた系で、Taftパラメーターであるπの低下とβの上昇が観測された。このことは、低極性の麻酔薬分子が膜界面の構造水を破壊することによって界面の水素結合受容能が増したことを意味する。吸着の物性は活性炭界面への麻酔薬の吸着実験からも解析された。アルコールでは脂質膜にinterdigitated相を誘起することが知られている。圧力とエタノールはこの相の出現に相乗効果を示し、圧拮抗現象とは直接関与しないとことがわかった。膜への分配とカットオフ現像:脂質膜の熱誘起型相転移にはゲルII相からゲルI相への前転移とI相から液相への主転移がある。麻酔薬の転移温度降下作用は古くからみとめられているが、その程度は、前転移降下の方が大きい。ゲルI相と液相への分配係数をK(G)、K(L)とすると、麻酔薬の強度と膜への溶解度の相関が正であるかぎりはK(L)は常にK(G)より大きい。麻酔薬が水相から移行する際の膜の体積増は液晶相の方が大きい。圧力を加えるとこの値は減少し、膜中の麻酔薬の一部は水相へ追い出される。しかし麻酔薬分子の炭素数が大きくなると(ex.アルカノールでC11以上)、K(L)とK(G)の大きさは逆転する。これが、麻酔薬のカットオフ現象である。タンパク質への作用:ポリリジンにおけるαヘリックス-βシート転移(揮発性麻酔薬では順行、アルコールでは逆行の転移)、酵素反応(αキモトリプシン)の麻酔薬による非特異的活性化、など多様な知見が得られている。研究の総括:最近、麻酔薬の特異作用を主張する研究が、しばしば、発表されている。われわれの分析によれば、それらの観測結果も非特異的な膜及び膜蛋白質の物性変化と解釈できるものが多い。研究者間の研究交流を高め、合理的かつ機能的な共同研究が望まれる。膜界面における麻酔薬の存在状態:1981年にTaftが用いた分子の双極子モ-メントに関係するパラメ-タπ、水素結合の形成能に関するパラメ-タα及びβを用いて膜表面における麻酔薬の存在状態を2種の分光学的プロ-ブを用いて解析し、πの低下とβの上昇がおこることを認めた。このことは、双極子モ-メントの小さい麻酔薬分子が膜表面に接近し、界面の構造水の破壊によって界面の水素結合受容サイトが増したことを意味する。このような存在状態は局所麻酔薬についても認められている。卵黄レシチンにカルジオリピンを添加したリポソ-ムの高張グルコ-スによる安定性がテトラカインによって低下することから、テトラカインは膜表面に吸着して荷電を減らすことがわかった。この界面への麻酔薬の吸着は活性炭界面への吸着実験からも解析されている。麻酔薬による脂質膜の物性変化:脂質二重膜の相構造の温度変化はゲルII相からI相への前転移とゲルI相から液晶相への主転移によって起こる。麻酔薬が作用すると両転移温度は降下するが、両者を比較すると前転移降下の方が大きい。

この際、膜に分配する麻酔薬の分配係数はゲル相より液晶相で大きく、DPPC膜についてはそれぞれハロセンで820と3390、イソフルランで1089と2343、セボフルランで894と2212であった。麻酔薬が水相から移行する際の膜に体積増は液晶相の方が大きい。この値は加圧によって減少する。つまり加圧は膜中の麻酔薬を水相へ追い出す効果がある。モデル蛋白の麻酔薬による構造変化:ポリーLーリジンはpH条件によって二次構造を変えるが、ハロセン、クロロホルム、エンフルレンなどはαヘリックスをβシ-トに変える効果があるのに対し、アルコ-ルは逆の効果がある。バクテリオロドプシンの四次構造変化も検討した。他に膜電位、膜抵抗、水構造も検討した。脂質二重膜における麻酔薬存在状態:麻酔薬分子はそれ自体は疎水性が強いが、オリーブ油やオクタノールのような溶媒に対する溶解度と麻酔強度との相関のほうがヘキサンやベンゼンのような溶媒に対する溶解度と麻酔強度との相関より強い。したがって、麻酔薬は脂質膜内部に潜り込むよりは膜界面に吸着の形で存在し、麻酔分子の数が増すにつれて内部への分配が増加することが予想される。このことは2種の分光学的プローブを用いた系で、Taftパラメーターであるπの低下とβの上昇によって解析できたし、その吸着の物性は活性炭界面への麻酔薬の吸着実験からも解析された。膜における麻酔薬の分配とカットオフ現象:このような二重膜の熱誘起型相転移はゲルII相からゲるI相への前転移とI相から液相への主転移がみとめられる。麻酔薬の主転移における転移温度の降下作用は古くからみとめられているが、前転移と主転移とを比較すると、前転移降下の方が大きい。このゲルI相へも麻酔薬は溶解するが、この相への分配係数をK(G)、液相への分配係数をK(L)とすると、麻酔薬の強度と膜への溶解度の相関が正であるかぎりはK(L)は常にK(G)より大きい。しかし麻酔薬分子の炭素数がたとえば長鎖アルコールではウンデカノール(C11)以上になるとK(L)とK(G)の大きさは逆転する。つまり、麻酔薬のカットオフ現象である。モデル蛋白の麻酔薬による構造変化:ポリL-リジンの麻酔薬環境におけるαヘリックス-βシート変換(揮発性麻酔薬では順行、アルコールでは逆行の変換)、αキモトリプシンの酵素反応の律速段階であるアシル過程の麻酔薬による非特異的活性化、など多様な知見が得られている。麻酔薬メカニズム専門英文誌の刊行計画:佐賀における研究分担者研究集会では世界的にも少数でしかも学際的な研究者間の研究交流を高めるために定期的に雑誌を刊行する計画を練った。
代数的符号理論とそれに関連した代数的,幾何学的および解析的研究

研究代表者小関はいくつかの符号の基本問題(符号Cの被覆半径t(C)の問題、extremal self-dual codeの存在問題,符号のコセットの重みの分布問題,shadow理論,mass formula符号の分類問題)を解析する方法を他の研究者と共に開発し.またそれらを使って,これらの問題に顕著な成果を挙げつつある。(i)t(C)=7となる符号の例を含むいくつかの符号に関する結果を共著論文としてDescrete Mathematicsに発表。研究分担者内田伏一は非コンパクトリイ群SP(pig)の4p+4g-1の次元球面への可微分作用について研究した。研究分担者村林直樹はCM型アーベル曲面のゼータ関数に関する研究を行い、いくつかの成果を得ている。研究分担者佐野隆志はカッツ環の構成と標準型自己同型の可換性などの関係を研究して論文を準備中。研究分担者上野慶介はカルノー空間の間の調和写像の無限遠境界値問題を研究している。研究分担者原田昌晃は有限環上の自己双対符号の研究を行なった。符号自身だけでなく、離散教学の他分野との関係に着目して研究した。特に教論の一つの分野であるユニもジュラー格子と組合せ論の一つの分野である組合せデザインとの関係について調べた。研究代表者小関は、2元符号の被覆半径の問題を扱う一つの決定的方法を開発し、その方法を用いて長さ40の極値的自己双対2元符号の被覆半径を決定した。その成果は論文"Determination of covering radius and coset weight distributions of doubly even extremal binary self-dual codes of length 40"という題で、Theoretical Computer Science掲載されることが決まった。さらに、2元符号の場合では、長さが56の場合が次の攻撃目標になるが、この場合は計算的に膨大な時間を要することが判っている。例えば、上記の長さ40の符号に用いた方法をそのまま適用すれば、一つの場合だけでも40年は掛かることが推測される。この場合について、小関は理論的改良に成功し、計算時間を全部で半年程に縮小する見込み得た。目下計算により、長さが56の場合を研究中である。計算が終了すれば、理論上の成果とともに、論文として公表の予定。研究代表者小関はいくつかの符号の基本問題(符号Cの被覆半径t(C)の問題、extremal self-dual codeの存在問題,符号のコセットの重みの分布問題,shadow理論,mass formula符号の分類問題)を解析する方法を他の研究者と共に開発し.またそれらを使って、これらの問題に顕著な成果を挙げつつある。研究分担者内田伏一は非コンパクトリイ群sp(pig)の4p+4g-1の次元球面への可微分作用について研究した。特に数論の一つの分野であるユニモジュウー格子と組合せ論の一つの分野である組合せデザインとの関係について調べた。
C4植物に特化したCP12Lを介した光量依存的カルビン回路活性調節機構の解析

C4植物特有の明期における光律速光合成特性に必要な新しいカルビン回路制御に、新規に単離したCP12Lを介したNADP依存的なGAPDH・PRK複合体形成が関与している可能性が考えられ、その検証を行った。In vitro複合体再構成に成功し、これらの3つの因子が複合体形成をなしえることを証明し、さらに暗処理した葉の抽出液中においても同様の複合体の存在を認めた。これはin vivoにおいてもこれらの複合体が行われておることを強く示唆するデータである。本年は、我々が独自に見出した、新規C4葉緑体内複合体形成因子であるCP12Lの生化学的機能を明らかにするために、以下の実験を行った。(1)、代謝上の位置を同定する試みとして、どういった複合体をどういった条件において形成しうるのかをin vitro複合体再構成実験によって調査した。まず、大腸菌内で発現させた組換え体タンパク質をカラム内に固定化し、植物タンパク質粗抽出液と混合することで複合体形成を促した。非特異的に結合したタンパク質を十分に洗浄することで取り除き、結合したタンパク質のみをSDS-PAGEによって分離し解析した。この結果、従来のNAD存在下でのホスホリブロキナーゼとグリセロアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼの複合体形成とは異なり、NADP存在下において複合体が形成されることを見出した。複合体の構成タンパク質は従来のものと同じであるが、複合体形成のためのコファクターが異なることを示している。(2)また、フラベリア葉の抽出物中にこの複合体が存在するかどうかを、免疫沈降法にて確認した。明期の葉を一時間暗処理し、そこからタンパク質を抽出した。このタンパク質素抽出液において複合体をCP12L精製抗体により免疫沈降させ、沈降物をSDS-PAGEにより分離後、PRK抗体および、GAPDH抗体を用いて検出した。また、銀染色法により免疫沈降産物を可視化させ、複合体系性が主としてこれらのタンパク質によることを証明した。C4植物においてこの複合体形成が機能していることを示している。植物の大半は大気中の二酸化炭素濃度が低いために、この二酸化炭素濃度を律速要因として生育している。一部のC4植物と呼ばれる植物においては、特殊に発達させた二酸化炭素濃縮回路によって大気中の二酸化炭素を約70倍にも濃縮し、生育環境中の二酸化炭素律速を超越している。したがってこれらの植物においては、生育律速要因は主として光量である。光量は、雲や被陰物により、偶発的に大きく変動するため、C4植物は、明期における光量変化に応答するすべを発達させていると期待されるが、その実体はまったく不明であった。これまで、C4植物に多く発現する遺伝子を解析する過程において、カルビン回路制御に関わると考えられる新規因子CP12Lを単離した。このCP12Lの遺伝子発現やタンパク質局在解析などにより、C4植物に特異的に代謝酵素複合体形成に機能する可能性が考えられたので、これを介した複合体形成因子の同定により、どのようにC4光合成と関連しうるのかを検討した。本研究により、In vitro複合体再構成実験を行い、NADP依存的なGAPDH・PRK複合体形成を証明した。さらに暗処理した葉の抽出液中においても同様の複合体の存在を認めた。これらの結果は、In vitro, In vivoともに、CP12Lを介した複合体形成が起こっていることを示している。これらの結果から、CP12Lは、葉緑体内部のMDP/NADPHバランスをモニターし、NADPが多くなる環境下、つまり被陰条件下においてNADP依存的なGAPDH・PRK複合体形成を行い、カルビン回路の活性を制御していることが示唆され、従来から不明であったC4植物の光量応答機構の一端を明らかにすることができた。
ホスト機能をもつ外部指令感応型化学発光性色素の構築とその発光制御

1.「化学発光物質にホスト機能を導入し,ゲストを指令物質として能動的に化学発光を制御する」という新しい概念に基づき,外部指令感応型化学発光性色素の設計と発光操作に関する研究を行った.2.化学発光性色素としてロフィンペルオキシドおよびイソルミノール用い,それぞれをアザ-15-クラウン-5-エーテルで修飾してホスト機能を持つ化学発光物質を合成した.クラウンホスト機能を持つ化学発光物質は本研究で初めて合成された.3.クラウン機能化ロフィンペルオキシド(化合物1)は塩基の添加により黄色の化学発光を示した.アルカリあるいはアルカリ土類金属イオンの存在下に化合物1の化学発光挙動を検討したところ,発光強度は金属イオンのない場合に比べて,ナトリウムイオン存在下で約150%,マグネシウムイオン存在下では70%で,金属イオンの指令に応答して化合物1の化学発光強度が変化することがわかった.化合物1の発光強度は,リチウム,カリウム,カルシウム,バリウムイオンにほとんど影響を受けず,ナトリウムとマグネシウムイオンに対して特異的に応答することを見いだした.また,化合物1の化学発光の発光極大はナトリウムイオンにより約50nm短波長へシフトすることも観測され,発光強度のみならず発光波長も指令物質により操作できる可能性を見いだした4.クラウン機能化ロフィンペルオキシド(化合物2)は塩基性過酸化水素中,アルカリ金属イオンヨウ化物の添加で,青色の化学発光を示した.化合物2においては化学発光強度に対する金属イオンの効果は化合物1より顕著で,カリウムイオンに対して特異的に応答し,リチウムあるいはナトリウムイオンに比べ発光強度が600700%へ増大した.5.本研究で,当初計画した分子設計により外部指令に応答する化学発光性色素の構築とゲストによる化学発光操作が可能であることが明らかとなった.1.「化学発光物質にホスト機能を導入し,ゲストを指令物質として化学発光を制御する」という新しい概念に基づき,外部指令感応型化学発光性色素の設計と発光操作に関する研究を行った.2.化学発光性色素ロフィンペルオキシドをアザ-15-クラウン-5-エーテルで修飾し,ホスト機能を持つ化学発光物質を合成した.クラウン機能を持つ化学発光物質は今回初めて合成された.3.このクラウン機能化ロフィンペルオキシド(化合物1)は塩基の添加により黄色の化学発光を示した.アルカリあるいはアルカリ土類金属イオンの存在下に化合物1の化学発光挙動を検討したところ,発光強度は金属イオンのない場合に比べて,ナトリウムイオン存在下で約150%,マグネシウムイオン存在下では70%程度で,金属イオンの指令に応答して化合物1の化学発光強度が変化することがわかった.化合物1の発光強度は,リチウム,カリウム,カルシウム,バリウムイオンにほとんど影響を受けず,ナトリウムとマグネシウムイオンに対して特異的に応答することを見いだした.また,化合物1の化学発光の発光極大はナトリウムイオンにより約50nm短波長へシフトすることも観測され,発光強度のみならず発光波長も指令物質により操作できる可能性を見いだした.4.化合物1の発光反応における発光体としてジベンゾイルベンズアミジン誘導体(化合物2)を単離したが,化合物2は発光反応条件下で容易に加水分解生成物を与えるため,現在のところ発光体の蛍光特性を明らかにするには至っていない.化合物1の化学発光において指令物質応答性のメカニズム解明に重要な化合物2の蛍光特性に関して,14年度も引き続いて検討する予定である.1.「化学発光物質にホスト機能を導入し,ゲストを指令物質として能動的に化学発光を制御する」という新しい概念に基づき,外部指令感応型化学発光性色素の設計と発光操作に関する研究を行った.2.化学発光性色素としてロフィンペルオキシドおよびイソルミノール用い,それぞれをアザ-15-クラウン-5-エーテルで修飾してホスト機能を持つ化学発光物質を合成した.クラウンホスト機能を持つ化学発光物質は本研究で初めて合成された.3.クラウン機能化ロフィンペルオキシド(化合物1)は塩基の添加により黄色の化学発光を示した.アルカリあるいはアルカリ土類金属イオンの存在下に化合物1の化学発光挙動を検討したところ,発光強度は金属イオンのない場合に比べて,ナトリウムイオン存在下で約150%,マグネシウムイオン存在下では70%で,金属イオンの指令に応答して化合物1の化学発光強度が変化することがわかった.化合物1の発光強度は,リチウム,カリウム,カルシウム,バリウムイオンにほとんど影響を受けず,ナトリウムとマグネシウムイオンに対して特異的に応答することを見いだした.また,化合物1の化学発光の発光極大はナトリウムイオンにより約50nm短波長へシフトすることも観測され,発光強度のみならず発光波長も指令物質により操作できる可能性を見いだした4.クラウン機能化ロフィンペルオキシド(化合物2)は塩基性過酸化水素中,アルカリ金属イオンヨウ化物の添加で,青色の化学発光を示した.化合物2においては化学発光強度に対する金属イオンの効果は化合物1より顕著で,カリウムイオンに対して特異的に応答し,リチウムあるいはナトリウムイオンに比べ発光強度が600700%へ増大した.5.本研究で,当初計画した分子設計により外部指令に応答する化学発光性色素の構築とゲストによる化学発光操作が可能であることが明らかとなった.
マイクロデバイスを用いた均一径リポソームアレイの作成と膜タンパク機能解析への応用

本研究の目的は、膜タンパク質の機能解析のためにマイクロ・ナノ加工技術を用いることによりこれまで実現の不可能であった直径の揃ったジャイアントリポソームを効率的に作製し、操作するマイクロ流体デバイスを実現することである。そこで、本年度は,主に下記の項目について研究を行ってきた。パリレンシートの穴あきシートに金を蒸着し電極基板を作製し、基板上に脂質膜のパターンニングを行いそれぞれのパターンからからジャイアントリポソームを作成する方法を検討した。これまで作成されてきたジャイアントリポソームでは、リポソームは閉じた系であるため作成後にリポソーム内の溶液を変えることはできなかった。本方法では、作成されたリポソーム内の溶液を小穴を通して変換することが可能である。脂質のパターンニングは、パリレンリフト法を用いて行い、エレクトフォローメーション法により作成された脂質パターンから均一径のリポソームを作ることが可能になった。さらに、作成されたリポソーム内に直径が200nm-1μmのビーズを注入することができた。ビーズをDNAや試薬等に変えることでドラックデリパリーシステムや生物系の観察などの分野での応用が可能である。一般的にエレクトロフォーメーション法で作製されたリポソームは基板上に固定されており、リポソームを単独で使用することはできなかったが、本デバイスでは、基板の小穴から溶液を流すことにより、リポソームを切り離すことができた。本研究の目的は、膜タンパク質の機能解析のために、マイクロ・ナノ加工技術を用いることにより、これまで実現の不可能であった直径の揃ったジャイアントリポソームを効率的に作製し、操作するマイクロ流体デバイスを実現することである。そこで、本年度は、主に下記の2項目について研究を行ってきた。(1)パリレン樹脂の微細加工技術を用いてリン脂質膜をパターンニングし、均一サイズのリボソームを作製する方法を提案し、さらに、一枚膜構造を持つジャイアントリポソームを作製することができるエレクトロフォーメーション法に着目した。次に、作製されたジャイアントリポソーム内の溶液交換を行うことができるデバイスの作製を試みた。実験の結果、異なるサイズ(20μm×20μmと50μm×50μm)のリン脂質のパターンから作製されたリボソームの径は、パタ「ンサイズに依存して変化することが分かってきた.サイズの変動係数は、11%であり、リン脂質のパターンニングとエレクトロフォーメーション法を利用することで、より径の揃ったジャイアントリポソームを作製することができた.さらに、パリレンシートの微小な穴の上に、同様にリボソームを作製することができ、リボソーム内の溶液を小穴を通して行うことができた。(2)異なる種類のジャイアントリポソームを効率よく作製し、操作(輸送、回収)することができるマイクロ流路デバイスとリボソームを選択的に固定することができるマイクロデバイスを提案した.実験の結果、マイクロ流路デバイスを用いることにより、異なる種類のジャイアントリポソームを同一基板上の流路内に作製し、流れを利用しリボソームを回収することができた。また、同一基板上に異なる種類のジャイアントリポソームを選択的に固定することができた。本研究の目的は,膜タンパク質の機能解析のためにマイクロ・ナノ加工技術を用いることによりこれまで実現の不可能であった直径の揃ったジャイアントリポソームを効率的に作製し,操作するマイクロ流体デバイスを実現することである.そこで,本年度は,主に下記の2項目について研究を行ってきた.(1)微細加工技術を用いて作製された穴あきパリレン樹脂シートを使用しリン脂質膜をパクーンニングし作成されたジャイアントリポソームを基板上から回収する方法を提案した.通常リン脂質膜のパターンからエレクトロフォーメーション法により作成されたジャイアントリポソームは半ドーム状の形状で基板に固定されている.本実験では,脂質膜パターンのパターン間隔を変えることで,作成された隣接する半円形状のジャイアントリポソームが互いに押し合い基板から離れ球形のジャイアントリポソームが形成可能かどうか検討した.実験の結果より,脂質膜パターンサイズ(10μm×1μmn),パターン間隔を7μmにすることで球形のジャイアントリポソームを作成することができることが分かってきた.(2)パリレンシートの穴あきシートに金を蒸着し電極基板を作製し基板上に同様に脂質膜をパターンニングしジャイアントリポソームを作成することを検討した.これにより,作成されたリポソーム内の溶液を小穴を通して行うことを検討した.これまでエレクトロフォーメーション法で作成されたジャイアントリポソームでは,リポソームは閉じた系であるためリポソーム内の溶液を変えることはできなかった.本研究の方法では,作成されたリポソーム内に直径が200nmのビーズを注入することができた.ビーズをDNAや試薬等に変えることでドラックデリパリーシステムや生物系の観察などさまざまな分野での応用がが可能である.本研究の目的は、膜タンパク質の機能解析のためにマイクロ・ナノ加工技術を用いることによりこれまで実現の不可能であった直径の揃ったジャイアントリポソームを効率的に作製し、操作するマイクロ流体デバイスを実現することである。

本方法では、作成されたリポソーム内の溶液を小穴を通して変換することが可能である。脂質のパターンニングは、パリレンリフト法を用いて行い、エレクトフォローメーション法により作成された脂質パターンから均一径のリポソームを作ることが可能になった。さらに、作成されたリポソーム内に直径が200nm-1μmのビーズを注入することができた。ビーズをDNAや試薬等に変えることでドラックデリパリーシステムや生物系の観察などの分野での応用が可能である。一般的にエレクトロフォーメーション法で作製されたリポソームは基板上に固定されており、リポソームを単独で使用することはできなかったが、本デバイスでは、基板の小穴から溶液を流すことにより、リポソームを切り離すことができた。
肝細胞癌の進展に関与するエピジェネティック異常の解明

肝癌進展に伴う分子生物学的異常解明を目的として、結節内結節肝癌の統合的ゲノム・エピゲノム解析を行った。DNAメチル化異常の多くはOuterNoduleの段階ですでに獲得していたが、染色体コピー数変化はOuterNoduleからInnerNoduleへと進展する過程で加わっていた。一部の症例では、染色体コピー数の変化が少なく、DNAメチル化の変化が数多く見られた。以上より、ゲノム異常とエピゲノム異常が段階的に加わることで悪性化が進んでいる可能性が考えられた。本研究の目的は、肝細胞癌の発癌・進展過程におけるエピジェネティック異常の意義を明らかにすることである。癌細胞にはDNAメチル化やヒストン修飾の異常が数多く蓄積しているが、これらが発癌のどの段階で生じ、また癌の進展過程にどう関与しているかはほとんどわかっていない。癌におけるエピジェネティック異常の意義の解明は肝癌発癌と進展の分子生物学的機序の理解につながるだけでなく、この異常を標的とした治療法の開発など臨床応用にも重要な意味をもつ。本研究課題で実施した結果により、以下のことが明らかとなった。1) Outer Noduleとこの内部より生じたInner NoduleのDNAメチル化解析を行った結果、多くのDNAメチル化異常はOuter Noduleの段階ですでに獲得していることが明らかとなった。このことは、DNAメチル化異常の多くが癌化の初期段階で関与していることを示唆している。2)染色体コピー数変化を比較した結果、Outer NoduleからInner Noduleへと進展する過程で、多くの染色体異常が加わっていた。このことは、肝癌の進展過程でゲノム不安定性に伴う遺伝子異常が付加されていることを意味している。3)一部の症例においては、染色体コピー数の変化が少なく、DNAメチル化の変化が数多く見られた。4)遺伝子変異に関しては、Outer NoduleとInner Noduleを比較した場合、新規に獲得された変異と検出されなくなった変異の双方が認められた。このことは、癌の悪性化に寄与している変異が増加するだけでなく、悪性化の過程でSelectionも同時に進み、癌細胞のpolulationの変化が生まれていることを意味している。以上を総合すると、肝癌の進展過程において、ゲノム異常とエピゲノム異常がそれぞれ生じることで悪性化が進んでいる可能性が考えられた。平成23年度に実施した研究により、以下のことが明らかとなった。1)Outer Noduleとこの内部より生じたInner NoduleのDNAメチル化解析を行った結果、多くのDNAメチル化異常はOuter Noduleの段階ですでに獲得していることが明らかとなった。1)肝癌結節内結節(Nodule-in-Nodule)におけるメチル化プロファイル肝癌の結節内結節(Nodule-in-Nodule)の、Outer nodule、Inner noduleおよび非癌部肝組織のメチル化プロファイルをInfinium HumanMethylation27BeadChip(イルミナ社)を用いて解析を行った。2症例はInner noduleが複数存在したため、それぞれのOuter noduleを解析した。いずれのサンプルも良好な解析結果が得られ、Inner noduleで観察された異常メチル化には、Outer noduleにすでに存在していたものが数多く含まれていることが明らかとなった。また、変化する遺伝子群についても、GO(Gene Ontology)に基づいた遺伝子機能アノテーション解析より特徴的なグループを見出すことに成功した。肝癌臨床検体100例のメチル化プロファイルと比較することで、多くがOuter Noduleのパターンを継承しながら、Inner Noduleを形成していることを明らかにできた。2)肝癌の進展段階における遺伝子発現変化とプロモーター領域のメチル化の関係性Outernodule、Inner noduleおよび非癌部肝組織の遺伝子発現プロファイルをGeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array(アフィメトリクス社)を用いて解析した。

Outer noduleよりInner noduleが出現する過程での遺伝子発現変化に、遺伝子プロモーターのメチル化変化がどの程度関連しているかを検討したところ、必ずしもDNAメチル化の変化と遺伝子発現のすべての遺伝子で相関しているわけではないことが明らかとなった。1)癌進展に関与する染色体コピー数変化や点突然変異の解析初年度の解析で見られた、プロモーター領域のメチル化変化を伴わない遺伝子発現変化には、一部、染色体コピー数の異常や点突然変異に起因するものもあると考えられる。したがって、まずは、こうした遺伝子において、Inner noduleに生じた染色体の欠失あるいは増幅領域に位置するものがどの程度存在するか解析を行う。染色体コピー数はメチル化マイクロアレイのシグナル強度より推定することができる。癌組織と非癌部組織のシグナル強度比を算出し、これをゲノム上のポジションにしたがって移動平均をとることで、低解像度ながら染色体コピー数を推定しうる。点突然変異については、p53やβ-cateninなどの肝癌での既に報告のある遺伝子のほかに、国際癌コンソーシアム(ICGC)などで新たに判明する変異データも適宜参照しながら、変異頻度の高い遺伝子や発現解析から示唆されるシグナル経路に関わる遺伝子を中心に解析を行う。2)肝癌進展過程におけるシグナル経路異常の解明以上の、Nodule-in-Noduleでの解析から見出したエピジェネティック異常、ジェネティック異常および遺伝子発現の変化を統合し、肝癌の進展過程におけるシグナル経路の異常を明らかにする。関連するシグナル経路を代表する遺伝子セットは、米国Broad研究所(MIT)が提供するMSigDB(Molecular Signatures Database)を参考にする。次年度で行う点突然変異の網羅的解析には、次世代シーケンサーを用いたエクソーム解析が必要であり、主たる研究費をこれに使用する。あわせて、次年度までの解析で得られた成果を、国内・海外の学会で発表するとともに、学術論文の発表を行う。