hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬物副作用発現における「遺伝子-脳内物質-臨床症状」パラダイムの検証と確立

遺伝子多型の割合は、これまでに日本人で報告されているデータとほぼ一致した。そのうち24名において^<11>C-ドキセピンをトレーサーとしたPET検査を行ない、薬剤脳移行性の差と遺伝的多型の関係を評価した。PETにより計算された薬物ヒスタミン受容体占拠率の値をMDR遺伝子多型にしたがって分類しなおしたところ、変異型間で若干の差異が認められた。すなわち、野生型ホモの個体に比して変異型ホモの個体では薬剤の脳移行性が若干亢進しているという、「遺伝子変異」と「脳内物質」の移行性の差異を結び付ける成果が得られた。しかしながら、その「臨床症状」への影響は比較的小さく、最終的な結論を出すには更なる検討を要するものと考えられた。以上の成果は日本薬理学会および日本核医学会等ですでに報告を行い、成果をまとめた論文は現在投稿中である。健常被験者を対象とし、鎮静性坑ヒスタミン薬および非鎮静性抗ヒスタミン薬のフェキソフェナジンやベポタスチンを前投薬して[^<11>C]ドキセピン-PET検査を行ない、薬剤の脳移行性が鎮静作用の強さと相関することを確認し、抗ヒスタミン薬に関する初のプラセボ対照PET試験として論文発表した。次に健常被験者の血液サンプルからp糖蛋白をコードするMDR遺伝子の主要な多型(C3435T、G2677A/T変異など)を調べ、[^<11>C]ドキセピンをトレーサーとしたPET検査を行ない、フェキソフェナジンの脳移行性が遺伝子多型の種類によって異なるかどうかを検討した。その結果、薬物ヒスタミン受容体占拠率の値をMDR遺伝子多型にしたがって分類しなおしたところ、変異型間で若干の差異が認められた。しかし「臨床症状」への影響は比較的小さいことが示された。今回調べた抗ヒスタミン薬および認知機能試験に関しては、遺伝子多型は薬剤脳移行性に若干の差異をもたらすものの臨床症状への影響力は軽微であることを示唆した(投稿中)。さらに野外実車運転試験を組み合わせた多面的データを収集し、鎮静性坑ヒスタミン薬の服用状態ではブレーキ反応が遅延し、携帯電話通話時にはさらにブレーキ反応が遅延することを確認した(論文発表済)。そして、抗ヒスタミン薬服用時の自動車運転中の脳機能抑制メカニズムを明らかにするための研究も[^<15>O]H_2O-PETを用いて行い、自動車運転シミュレーション中の脳活動をプラセボ服用時と鎮静性抗ヒスタミン薬服用時で比較した。その結果、おもに視覚情報処理と運動調節機能に関わる脳内部位の活動が抑制されていることが示された(現在投稿中)。シミュレーションの結果が実車運転による脳活動とほぼ一致することを[^<18>F]FDG-PETを用いて確認した(論文発表済)。抗ヒスタミン薬に誘発された眠気とプラセボ効果による自発的な眠気の脳内反応の違いも検討したが、特異的な脳内変化がまだ検出されておらず、今後のさらなる検討を要するものと考察された。
特発性肺線維症の病態-慢性鳥飼病との関連

慢性の特発性間質性肺炎(特発性肺線維症)と診断された例の中に慢性過敏性肺炎例が含まれている可能性がある.慢性過敏性肺炎には急性エピソードを繰り返しつつ少量の抗原吸入が続くために慢性になる例と、当初より慢性型で発症する例とがある.現在慢性型過敏性肺炎の中でも注目されるのは少数の鳥を室内飼育する際に起こる鳥飼病の慢性型である.鳥飼病の(1)急性型,(2)急性エピソードを持つ慢性型,(3)当初より慢性型の三群でサイトカインを初め炎症のメディエーターをmRNAの発現を含めて比較検討した.1)鳥飼病の診断は,(1),(2)には鳥糞に対する抗体が陽性であることより容易であるが,(3)については一般の測定法では陰性であり部分精製抗原(50%硫酸アンモニウム処理抗原)を用いたIgGとIgAサブクラス抗体でBAL中IgG1,G3,IgA1抗体が弱陽性である.2)末梢血単核球に鳩血清を添加(現在抗原の精製が進行中)してサイトカインなどのmRNAの変化をみると,(1)(3)ともIL-2RmRNAの発現増強がある.また末梢血単核球を用いた^3H-Thymidine uptakeによる増殖反応は(1),(2)では全例陽性,(3)でも大部分が陽性であり,(1),(2),(3)とも細胞性免疫の成立が示唆される.3)(2)ではTGFβmRNAの発現増強,(3)ではIL-6mRNAの発現増強がみられる.以上から,当初より慢性発症で一般的方法による抗体陰性例でも,末梢血単核球を抗原添加して刺激すると,増殖反応を示しIL-2RmRNAとIL-6mRNAの発現増強を認め,細胞性免疫の成立とIL-6が慢性化と関連している可能性が示唆された.慢性の特発性間質性肺炎(特発性肺線維症)と診断された例の中に慢性過敏性肺炎例が含まれている可能性がある.慢性過敏性肺炎には急性エピソードを繰り返しつつ少量の抗原吸入が続くために慢性になる例と、当初より慢性型で発症する例とがある.現在慢性型過敏性肺炎の中でも注目されるのは少数の鳥を室内飼育する際に起こる鳥飼病の慢性型である.鳥飼病の(1)急性型,(2)急性エピソードを持つ慢性型,(3)当初より慢性型の三群でサイトカインを初め炎症のメディエーターをmRNAの発現を含めて比較検討した.1)鳥飼病の診断は,(1),(2)には鳥糞に対する抗体が陽性であることより容易であるが,(3)については一般の測定法では陰性であり部分精製抗原(50%硫酸アンモニウム処理抗原)を用いたIgGとIgAサブクラス抗体でBAL中IgG1,G3,IgA1抗体が弱陽性である.2)末梢血単核球に鳩血清を添加(現在抗原の精製が進行中)してサイトカインなどのmRNAの変化をみると,(1)(3)ともIL-2RmRNAの発現増強がある.また末梢血単核球を用いた^3H-Thymidine uptakeによる増殖反応は(1),(2)では全例陽性,(3)でも大部分が陽性であり,(1),(2),(3)とも細胞性免疫の成立が示唆される.3)(2)ではTGFβmRNAの発現増強,(3)ではIL-6mRNAの発現増強がみられる.以上から,当初より慢性発症で一般的方法による抗体陰性例でも,末梢血単核球を抗原添加して刺激すると,増殖反応を示しIL-2RmRNAとIL-6mRNAの発現増強を認め,細胞性免疫の成立とIL-6が慢性化と関連している可能性が示唆された.
ヒスタミンの迅速・高感度分析器の開発

水産食品のアレルギー中毒原因物質としての他に、ヒスタミンはヒトで胃酸の分泌促進、血小板凝集、血管収縮、細胞の分化増殖促進作用、免疫調節作用など種々の生理活性作用を有するこが知られており、各方面で高感度な定量法およびリアルタイムで結果が得られる簡便、迅速定量法が求められている。ヒスタミンの定量法として比色法、蛍光光度法、HPLC法など種々の方法があるが、生体試料の分析には妨害物質の除去など煩雑な前処理が必要とされるなど問題点が多い。本研究は、医学、生化学分野で求められている装置で、システムは大がかりなものになっても微量のヒスタミンが定量可能な高感度ヒスタミン分析装置と、水産食品・衛生学分野で求められている装置で、感度は多少劣るが簡便で、迅速な現場対応型のヒスタミシ分析器の開発を目指したものである。このうち初めの超高感度分析装置の開発では現行のスルファニル酸に代わるジアゾカップリング試薬を多数検討し、p-ニトロアニリンがより高感度でヒスタミンを検出できることを、またカラムを含むシステム全体をセミミクロ化に変更することで従来法の10数倍の高感度を達成し、最低検出感度も0.35pmolになり極微量のヒスタミンの定量が可能なことより、医学、生化学分野での研究に使用できる測定装置と言える。現場対応のヒスタミンの簡易・迅速測定装置については、本研究でろ紙電気泳動法による分離と、スルファニル酸を用いるジアゾカップリング発色法で、迅速で選択性の高い測定法が開発した。さらに、泳動用ろ紙に改良を加え速やかにろ紙を浸潤する方法と速やかに試料を添加できる方法に改め、熟練を要せず、簡便で、迅速で、一度に多数の試料を感度良く(最低検出感度は1030ng)ヒスタミンを分析できる装置を完成させた。本研究の成果は、水産業を含めた食品産業、食品衛生の分野に大きく貢献するものと考える。水産食品のアレルギー中毒原因物質としての他に、ヒスタミンはヒトで胃酸の分泌促進、血小板凝集、血管収縮、細胞の分化増殖促進作用、免疫調節作用など動物の平滑筋の収縮作用、胃酸の分泌促進作用など種々の生理活性作用を有することで知られている。このように、ヒスタミンの強力な生理活性作用に鑑み、より簡便で高感度な定量法が各方面で今なお求められている。本研究は、より簡便、迅速で高感度なヒスタミン分析法の開発を目指すものである。申請者らは先にジアゾカップリング誘導体化とHPLCによる分離定量法を開発したが、この方法は煩雑な前処理を無くしたヒスタミンのワンステップ簡便定量法である。本年度は本法の改良による高感度化を試みるとともに、ろ紙電気泳動法によるより簡便な定量法を検討した。ジアゾカップリング誘導体化はスルファニル酸を用いる従来の方法を継承し、HPLCによる分離条件のうちカラム、溶出液のpH、イオンペア試薬および検出波長などについて種々検討を加えた。その結果、ヒスタミンの検出限界は5pmolまで向上した。ろ紙電気泳動法による簡易定量法は以下の通りである。試料をスポットしたろ紙(ADVANTEC、No50)を酢酸・ピリジン緩衝液(pH3.7)で、800V、15min電気泳動する。ろ紙を乾燥し、ジアゾ発色試薬を噴霧しヒスタミンを発色させる。

呈色度をCCDカメラを用いるデンシトメーターで計測し、ヒスタミンを定量する。この方法でヒスタミンはヒスチジンおよびカルノシンと良く分離し、150pmol(16.65ng)50,000pmol(5.55μg)の範囲で定量可能であった。この方法は、精度はHPLC法に比べて劣るものの、多数の試料を迅速、簡便に定量できる点で優れており、現場対応型の簡便定量法といえる。申請者らは先にジアゾカップリング誘導体化とHPLCによるヒスタミン分析法を開発したが、本年度は本法に用いる発色試薬の改良、セミミクロHPLC分析法の検討などを通じより高感度化を試みるとともに、全自動化も検討した。一方、ろ紙電気泳動法による定量法では、スポット方法の改良、発色試薬の検討を行い、より簡便で感度の高い定量法の確立を模索した。ジアゾカップリング誘導体化試薬の検討では、4-メチルイミダゾールをモデル化合物とし、(A)スルファニル酸に加え、(B)p-ニトロアニリン、(C)m-ニトロ、p-メチルアニリン、(D)o-ニトロ、p-ヒドロキシメチルアニリン、(E)1-アミノナフタレン、(F)ベンゾチアイミダゾールおよびその他4種類の芳香族アミン化合物を用いて誘導体化試薬への利用の可否を調べた。検討項目は芳香族アミン化合物の溶解度、ジアゾ化速度、アゾカップリング速度、検出波長、色素の安定性、検出限界、副産物の確認など.について詳箱に調べた。その結果、(B)p-ニトロアニリンおよび(C)m-ニトロ、p-メチルアニリンが適していることが確認された。検出限界は(A)スルファニル酸に対し(B)で2倍、(C)で3倍に向上した。その他の化合物はジアゾカップリングしないか、カップリングしても溶解性や、安定性に問題があった。セミミクロ分析法はカラムとしてDevelosil ODS-UG内径1.5mmまたは2mmのカラムを用い、検出セルはセル容量3μlセミミクロテーパセルを用いた。その結果、ヒスタミン1ng当たりのS/N比で判断すると、従来の4.6mmカラムが31.2なのに対し、1.5mmセルが209.0また2.0mmカラムが139.1となり、1.5mmカラムで6.7倍に感度が上昇することが確認された。全自動化の検討はAS-960オートサンプラーを用いて試料の採取、誘導体化試薬1および2の順に添加・混合する方法で分析を行った。ピーク面積を手動法と比較したところ、繰り返し分析の変動係数が手動法が1.31%なのに対し、全自動化法は4.33%とバラツキが大きくなった。誘導体化試薬の変更とセミミクロHPLC分析法の採用により、ヒスタミンの検出感度が500fmol程度まで上昇し、食品はもとより生体中の微量ヒスタミンの定量も可能と考える。
再生前駆細胞と生体内成熟促進因子を活用した新規軟骨再生法の開発

本研究では、生体内で再生組織を構成する再生前駆細胞を同定して選別するとともに、生体内の軟骨成熟促進因子を明らかにし、両者を活用して軟骨再生組織の移植前成熟を実現し、再生組織の特性を飛躍的に向上させることを目的とした。移植母床からの成熟促進因子確認のために培養マウス軟骨細胞を播種したPPプレートをヌードマウス腹腔内に移植。移植後回収した腹水上清並びに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、遺伝子発現を評価した。腹水細胞のmRNAにおいて発現変化を検索し、軟骨成熟を強力に誘導する遺伝子を検索した。腹水上清中のタンパク質について解析を行い軟骨成熟を促進する因子を検索した。カバースリップに軟骨細胞を単層培養したものを移植して軟骨再生を組織学的に観察したところ、移植後経時的に島状の再生軟骨は次第に拡大し、最終的にはその島状の軟骨が癒合して一連の再生軟骨を形成した。よって、特定の培養軟骨細胞が生体内でモノクローナルに増殖し、再生軟骨領域を形成すると推測された。このような島状再生軟骨領域を形成する細胞(軟骨再生前駆細胞)の存在確率を推計した。培養軟骨細胞の直径を約0.1 mmと仮定すると、全培養軟骨細胞中1割程度が軟骨再生前駆細胞であると推計された。次に、軟骨再生前駆細胞の特性を検証するため、PKH26による蛍光標識を行って培養し、分裂速度の早い細胞集団を分取し、遅い細胞集団と比較した。各細胞群の軟骨への分化能を、まずは、in vitroの系を用いて分化誘導を行い、real time PCRによるcol2遺伝子発現やGAGの定量評価、トルイジンブルー染色による組織学的検索などで評価した。分化誘導後のcol2遺伝子の発現は、分裂速度の遅い群に比べ、早い細胞群では有意に高かった。GAG定量評価においても分裂速度の早い細胞群の方が遅い群より有意に高かった。トルイジンブルー染色組織学的検索においても、分裂速度の早い細胞群の方が遅い群よりメタクロマジーが強い傾向を示した。次いでin vivoの評価においては、移植後8週の再生軟骨組織のHE染色、トルイジンブルー染色を行い、組織像を評価した。HE所見では、分裂速度の早い細胞群、遅い群ともに再生軟骨内部でヘマトキシリン好性の領域が観察され、再生軟骨外周にはエオジン好性の線維性領域で構成される外周線維組織が観察され、組織学的に明らかな違いは認められなかった。しかし、トルイジンブルー所見では、分裂速度の速い細胞群では遅い群と比較し、広範にメタクロマジーが観察され、良好なプロテオグリカンの蓄積と軟骨再生が示された。移植母床からの成熟促進の確認について:成熟促進因子の評価を行うために、生体からの液性成分や細胞成分の採取が容易な腹腔内移植を検討した。まず、培養マウス軟骨細胞を播種したPPプレートをヌードマウス(6週齡雄、N=24)の腹腔内に移植した。移植後1、2、8、16週でPPプレートを摘出し、軟骨再生を確認した。さらにPPプレートの回収とともに、ヌードマウス腹腔から腹水を回収し、腹水上清と腹水細胞を遠心分離。腹水上清ならびに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、一週間培養後、軟骨細胞の遺伝子発現をRT-PCRで評価。I型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、アグリカン、Runx2などを評価し、成熟促進因子の発現、分泌を確認した。成熟促進因子の同定:採取した腹水細胞のmRNAにおいてマイクロアレイ法で発現変化を網羅的に検索し、対照群(PPプレートのみを移植)の腹水細胞と比較して、軟骨の成熟を強力に誘導する遺伝子を同定した。また腹水上清中のタンパク質についてはプロテオーム解析を実施し、同様に対照群の腹水上清と比較して、軟骨の成熟を強力に促進する因子を同定した。再生前駆細胞ならびに成熟促進因子を活用したヒト細胞由来再生軟骨組織の検証:ヒト軟骨細胞は手術時に従来は破棄されていた組織を患者の同意のもと回収して単離した。軟骨細胞は、ヒト耳介より約0.5gの軟骨を採取し、コラゲナーゼ処理で軟骨細胞を単離し培養皿に播種して、10%FBS含有培養液で培養を行った。この細胞を用いて成熟促進因子を含有した培養液でin vitroで培養し、軟骨再生を誘導した。比較対照には、再生前駆細胞を用いない群や成熟促進因子を用いない培養群などを用いた。計画書通り、4移植母床からの成熟促進の確認5成熟促進因子の同定6再生前駆細胞ならびに成熟促進因子を活用したヒト細胞由来再生軟骨組織の検証についてはおおむね結果が出ているが、7ビーグルを用いた軟骨再生モデルでの実証の結果がまだ出ていない。本研究の目的は、生体内で再生組織を構成する再生前駆細胞を同定して選別するとともに、生体内の修復力・再生力のメカニズムを明らかにし、両者を活用して軟骨再生組織の移植前成熟を実現し、再生組織の特性を飛躍的に向上させることである。まず、植母床からの成熟促進の確認のために、成熟促進因子の評価を行うために、生体からの液性成分や細胞成分の採取が容易な腹腔内移植を検討した。培養マウス軟骨細胞を播種したPPプレートをヌードマウスの腹腔内に移植。移植後1、2、8、16週でPPプレートを摘出し、軟骨再生を前項の方法を用いて確認。

腹水上清ならびに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、一週間培養後、軟骨細胞の遺伝子発現をRT-PCRで評価。I型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、アグリカン、Runx2などを評価し、成熟促進因子の発現、分泌を確認した。次に、成熟促進因子の同定を行った。前項で採取した腹水細胞のmRNAにおいてマイクロアレイ法で発現変化を網羅的に検索し、対照群(PPプレートのみを移植)の腹水細胞と比較して、軟骨の成熟を強力に誘導する遺伝子を同定する。また腹水上清中のタンパク質についてはプロテオーム解析を実施し、同様に対照群の腹水上清と比較して、軟骨の成熟を強力に促進する因子を同定した。さらに、再生前駆細胞ならびに成熟促進因子を活用したヒト細胞由来再生軟骨組織の検証を行った。培養ヒト軟骨細胞を、成熟促進因子を含有した培養液でin vitroで培養し、軟骨再生を誘導。比較対照には、再生前駆細胞を用いない群や成熟促進因子を用いない培養群などを用いた。本研究では、生体内で再生組織を構成する再生前駆細胞を同定して選別するとともに、生体内の軟骨成熟促進因子を明らかにし、両者を活用して軟骨再生組織の移植前成熟を実現し、再生組織の特性を飛躍的に向上させることを目的とした。移植母床からの成熟促進因子確認のために培養マウス軟骨細胞を播種したPPプレートをヌードマウス腹腔内に移植。移植後回収した腹水上清並びに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、遺伝子発現を評価した。腹水細胞のmRNAにおいて発現変化を検索し、軟骨成熟を強力に誘導する遺伝子を検索した。腹水上清中のタンパク質について解析を行い軟骨成熟を促進する因子を検索した。研究計画通り、1移植後に生体内で再生組織を形成する細胞ポピュレーションの推計。2再生前駆細胞の濃縮3再生前駆細胞による軟骨再生の検証についておおむね結果が出ているため。ビーグルを用いた軟骨再生モデルでの実証を行う。ビーグル(6ヶ月齢雄、N=3)の耳介軟骨より軟骨細胞を採取し、3項の分取法で細胞を準備しPLLA多孔体足場素材(20x10x3 mm)に投与し、成熟促進因子を添加した培養液で培養し、組織成熟を図る。3項に準じ、軟骨再生を評価するとともに、細胞を採取したビーグルで背部皮下移植モデルを作製し、8、24週で移植組織を摘出する。評価は3項に準じる。なお、比較対照には、再生前駆細胞を用いない群や成熟促進因子を用いない培養群などを用いる。顎口腔外科以下計画通りに推進予定である。4移植母床からの成熟促進の確認:成熟促進因子の評価を行うために、生体からの液性成分や細胞成分の採取が容易な腹腔内移植を検討する。移植後1、2、8、16週でPPプレートを摘出し、軟骨再生を前項の方法を用いて確認する。さらにPPプレートの回収とともに、ヌードマウス腹腔から腹水を回収し、腹水上清と腹水細胞を遠心分離する。腹水上清ならびに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、一週間培養後、軟骨細胞の遺伝子発現をRT-PCRで評価する。I型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、アグリカン、Runx2などを評価し、成熟促進因子の発現、分泌を確認する。5成熟促進因子の同定:4項で採取した腹水細胞のmRNAにおいてマイクロアレイ法で発現変化を網羅的に検索し、対照群の腹水細胞と比較して、軟骨の成熟を強力に誘導する遺伝子を同定する。
肝発癌肝再生における増殖因子と癌遺伝子産物のinvivoにおける相互作用-ダブルトランスジェニックマウスを用いた解析-

Transforming Growth Factor(TGF)αはreceptorであるEpidermal Growth Factor receptor(EGF-R)にbindした後その細胞内ドメインであるチロシンキナーゼがリン酸化し一連の情報伝達系が作動するが、チロシンキナーゼの活性化に伴いras遺伝子発現蛋白であるras-p21とGTPとの結合型が上昇する。本来生体内で発現しているras蛋白は,癌細胞において活性化している変異型rasとは異なり生理的に上記の情報伝達系の一部をになっている.今回の研究ではますTGFαトランスジェニックマウス(T)とproto型ras過剰発現トランスジェニックマウス(R)を一定数掛け合わせダブルトランスジェニックマウス(T+R)を作成した。それぞれT,R,T+Rとし、いずれのトランスジーンをも有していないコントロールマウス(C)とphenotypeを比較した。体重はT+RでT,Rに比し有意に低く、体重に対する肝重量比はT+Rで有意に高かった.生後12か月から18か月のT+Rで巨大肝腫瘍を認め(4/15),組織学的には肝細胞癌であった。Rでは皮膚及び尾部にpapillomaを認め(4/15)、Tでは肝腺腫を認めた(2/15)。Tの肝腺腫は癌化には至っていなかった。PCNA染色で生後1年後の各群のマウスの肝臓を染色し比較した。T+Rでは癌部で10%以上、非癌部で約1%の陽性率であった。一方singleのTとRではPCNA染色はO0.1%と低値であった。生後約一年でTとT+Rについて2/3肝切除を施行し,肝再生を比較した.肝再生はT、Rに比し,T+Rでは促進されていた.その他の皮膚腫瘍、脾腫瘍などの単独のトランスジェニックのPhenotypeは相互に増強作用を示さなかった.以上、TGFαとrasの同時過剰発現はマウス自体の発育を阻害し、必ずしも全身臓器の増殖は促進しないが、肝腫瘍発現に関しては弱い相乗作用を、また肝再生に関しては協調作用を有していることが判明した.また付随的に判明したことであるが、膵臓の重量が雌雑ともにTとRのシングルトランスジェニックマウスに比べ、ダブルマウスで増加していた.これは組織学的にも線維化の亢進として見られており、膵線維の増生に関しては、TGFαとrasは相加的に作用する可能性が示された.Transforming Growth Factor(TGF)αはreceptorであるEpidermal Growth Factor receptor(EGF-R)にbindした後その細胞内ドメインであるチロシンキナーゼがリン酸化し一連の情報伝達系が作動するが、チロシンキナーゼの活性化に伴いras遺伝子発現蛋白であるras-p21とGTPとの結合型が上昇する。生後約一年でTとT+Rについて2/3肝切除を施行し,肝再生を比較した.肝再生はT、Rに比し,T+Rでは促進されていた.その他の皮膚腫瘍、脾腫瘍などの単独のトランスジェニックのPhenotypeは相互に増強作用を示さなかった.以上、TGFαとrasの同時過剰発現はマウス自体の発育を阻害し、必ずしも全身臓器の増殖は促進しないが、肝腫瘍発現に関しては弱い相乗作用を、また肝再生に関しては協調作用を有していることが判明した.また付随的に判明したことであるが、膵臓の重量が雌雑ともにTとRのシングルトランスジェニックマウスに比べ、ダブルマウスで増加していた.これは組織学的にも線維化の亢進として見られており、膵線維の増生に関しては、TGFαとrasは相加的に作用する可能性が示された.TGFαの作用発現過程において、TGFαがEGF-Rにbindした後その細胞内ドメインであるチロシンキナーゼがリン酸し一連の情報伝達系が作動するが、チロシンキナーゼの活性化に伴いras遺伝子発現蛋白であるras-p21とGTPとの結合型が上昇する。この活性型ras蛋白質はさらにセリン-スレオニンプロテインキナーゼであるmitogenactivatedprotein(MAP)kinaseを活性化し遺伝子発現,細胞増殖をもたらすとされている.本来生体内で発現しているras蛋白は,癌細胞において活性化している変異型rasとは異なり生理的に上記の情報伝達系の一部をになっている.

今回前半の研究過程ではまずTGFαトランスジェニックマウス(T)とproto型ras過剰発現トランスジェニックマウス(R)を一定数掛け合わせダブルトランスジェニックマウス(T+R)を作成した。それぞれT,R,T+Rとし、いずれのトランスジーンをも有さないコントロールマウス(C)とphenotypeを比較した。各群の識別はPCRで行った。生後12か月から18か月のT+Rで巨大肝腫瘍を認め(2/5)、組織学的には肝細胞癌であった。Rでは皮膚及び尾部にpapillomaを認め(2/4)、Tでは肝腺腫を認めた(1/6)。Tの肝腺腫は癌化には至っていなかった。PCNA染色で生後1年後の各群のマウスの肝臓を染色し比較した。T+Rでは癌部で10%以上、非癌部で約1%の陽性率であった。一方singleのTとRではPCNA染色は00.1%と低値であった。これらの結果は個体数がいずれも10匹以内の少数例での検討であるため今後さらに数を増やして上記、情報伝達系の解析を行う。昨年度よりひき続き主に肝腫瘍の発生について、増殖因子と癌遺伝子の相互作用をin vivoで検証するために、すでに開発され、群馬大学で継代しているTransforminggrowthfactor α(TGFα)トランスジェニックマウス(T)と実中研よい供与されたrasのトランスジェニックマウス(R)をかけ合わせ、phenotypeの変化を検討した.体重はT+RでT,Rに比し有意に低く、体重に対する肝重量比はT+Rで有意に高かった.生後12か月から18か月のT+Rで巨大肝腫瘍を認め(4/15),組織学的には肝細胞癌であった。Rでは皮膚及び尾部にpapillomaを認め(4/15)、Tでは肝腺腫を認めた(2/15)。T十Rでは癌部で10%以上、非癌部で約1%の陽性率であった。2/3肝切除後の肝再生は、T+Rで有意に促進されていた.さらに一定年齢を越えるまで待機中のマウスもいる現在までの段階では、TGFαとrasは、肝発癌については弱い協調作用を有し、肝再生に関しては、明らかな協調性を有していた.その他の皮膚腫瘍、膵臓線維化などの単独のトランスジェニックのphenotypeは相互に増強作用を示さなかった.以上、TGFαとrasの同時過剰発現はマウス自体の発育を阻害し、必ずしも全身臓器の増殖は促進しないが、肝腫瘍発現に関しては弱い相乗作用を、また肝再生に関しては協調作用を有していることが判明した.
口腔癌に対するドセタキセル併用化学療法の新規効果予測因子の同定

本研究では抗癌剤ドセタキセル(DOC)耐性口腔扁平上皮癌細胞株を用いてDOC耐性機構を検討した。マイクロアレイ解析を用いて、口腔扁平上皮癌細胞株とそれぞれのDOC耐性口腔扁平上皮癌細胞株間に特異的な発現変動を示す遺伝子を検索することにより、口腔扁平上皮癌におけるDOC耐性因子として、receptor transporter protein 3 (RTP3)を同定した。またDOC併用化学療法を行った口腔扁平上皮癌患者40名において、RTP3の高発現は、本治療に対して有意に抵抗性を示すとともに転帰不良であった。RTP3はDOCを用いた化学療法の治療効果予測因子となる可能性が示唆された。初年度に口腔扁平上皮癌細胞株(HSC2、HSC3、HSC4)とそれらを親株とするDOC耐性口腔扁平上皮癌細胞株(HSC2/DOC、HSC3/DOC、HSC4/DOC)を作製し、両細胞株間で特異的な発現変動を示す遺伝子をマイクロアレイで検索することにより、RTP3をDOC耐性に関わる候補因子として同定できた。本年度はsiRNA (silencer; Thermo Fisher Scientific)を用いてRTP3の機能解析を行い、DOC耐性口腔扁平上皮癌細胞におけるRTP3発現を抑制するにより、DOC耐性株のDOCに対する感受性が回復することを確認できた。さらに、TS-1+DOC併用術前化学療法を行った口腔扁平上皮癌患者40名の治療前生検材料を用いて、免疫組織学的にRTP3の発現の有無・程度を検索し、さらに治療効果との相関性を検索することにより、RTP3の高発現は、本治療に対して有意(P<0.05)に抵抗性を示す可能性を明らかにできた。以上から、おおむね順調に進んでいると考えている。歯科口腔外科DOC耐性に関わる候補因子としてRTP3を同定できた。ただし、RTP3そのものが、Chemosensory Proteinの一つであること以外は、ほとんど研究が進んでいないため、IPAを用いたネットワーク解析により、RTP3の制御に関わる因子を探索し、口腔癌におけるドセタキセル耐性のメカニズムを検討して行く予定である。この研究の過程で新たなDOC耐性に関わる候補因子が見出された場合には、その因子について臨床的な有用性も併せて検討を行う。口腔癌細胞株をドセタキセルにて処理することで、ドセタキセル耐性口腔癌細胞株を樹立し、安定して培養できており、マイクロアレイ解析の結果、親株とそれらのドセタキセル耐性株間で特異的な変動を示す因子を同定でき、これまでに報告が無い新たなドセタキセル耐性因子を同定出来た。これにより、ドセタキセルを用いた化学療法における新規効果予測因子の同定ができる可能性がでてきたため。今回、親株とそれらのドセタキセル耐性株間で特異的な変動を示す因子を同定できたため、癌細胞におけるこの遺伝子の機能解析を進め、ドセタキセルを用いた化学療法における新規効果予測因子としての意義を確認してゆく。すなわちその遺伝子のsiRNAを耐性株に導入し、耐性が解除され感受性が増強するか否かを検索する。なおsiRNAはSTEALTH RNAi (Invitrogen)を用いる。またsiRNAの導入効率や遺伝子発現の制御能が不十分な際には、プラスミドベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、その発現を制御する予定である。マイクロアレイ解析とプロテオーム解析を共に行う予定であったが、マイクロアレイ解析のみで、ドセタキセル耐性因子の候補を見出すことができたこと、また予定していた学会発表を次年度に行うこととしたため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、本研究の成果の一部を、本年9月にアメリカのハワイにおいて学会発表の予定であり、旅費として使用予定である。また、ドセタキセル耐性因子の候補として見出した遺伝子の機能解析の費用にも使用予定である。
弾性動脈をリモデリングする小口径人工血管の開発

本研究の目的は、新しい移植用の小口径弾性動脈血管を提供するためのエラスチンマトリックスを用いた人工血管を開発することにある。1年目はエラスチンによる動的培養用シートを試作し検討した。2年目は更に血管系の細胞培養評価から培養用シートの機能特性を調査した。最終年度は、血管系細胞を用いた分化誘導や増殖抑制などの検討を繰り返し、また材料の種類による影響を確認し、本課題である小口径人工血管を作成するためにエラスチンを用いる方法は有用性を総合的に評価した。研究成果(1)血管内皮細胞と平滑筋細胞および線維芽細胞をエラスチンゲル上で培養するための動的培養基材としてのエラスチンシートを試作し、動的条件を変えて培養評価を行った。平滑筋動的培養による機能変化方法を確立し、シート状に成形したマトリックスに対する動的な血管系細胞接着試験の詳細な検討から、平滑筋細胞の分化誘導性および増殖抑制に関する知見が得られた。(2)血管系細胞の基質構造として綿状エラスチンの新規加工方法の開発に成功した以上より、小口径人工血管で問題となる内膜肥厚の原因として考えられる血管平滑筋細胞の増殖制御および分化誘導制御に、エラスチンを活用することが有用である知見を得ることに成功し、本課題を終了することができた。今年度はエラスチンによる動的培養用シートを試作し、血管内皮細胞および平滑筋細胞培養による検討を可能にするためのエラスチンマトリックスゲルの試作を行い、その材料作製条件および細胞培養条件を検討した。動脈血管壁の最大50-70%を占めるとされる細胞外マトリックスであるエラスチンを原料とし、独自に開発した成形方法で種々の弾性を有する培養基材を作成し、生体組織の弾性挙動に類似した特性のマトリックスを開発した。(成果の一部は平成16年10月6日第42回日本人工臓器学会大会「組織工学用バイオエラストマーの開発:動的培養基材としてのエラスチンゲルシート」にて発表)また、生体吸収性繊維を補強材として複合化することにより、高強度の物性を有するマトリックスの作成も種々可能にした。(成果の一部は平成16年9月17日第53回高分子討論会「動的組織培養を支援するエラスチン化ナノファイバー」にて発表)次に、シート状に成形したマトリックスに対する血管系細胞との相互作用の実験を、細胞接着試験により行った。その結果、我々の開発したエラスチン素材は主な動脈血管系細胞(動脈血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞)の良好な培養基質となりうることがわかった。また、血管内で発生する動的ストレスと同様条件を加える伸展装置にセットするための形状の素材開発にも成功した。次年度に向け現在は動的培養による細胞挙動変化を検討中。また動物体内への移植実験に向け材料を改良中。昨年度はエラスチンによる動的培養用シートを試作し検討したが、今年度は更に血管系の細胞培養評価から培養用シートの機能特性を調査した。2年目において(1)1年目で得られた知見・改良点を基に、血管内皮細胞と平滑筋細胞および線維芽細胞をエラスチンゲル上で培養するための動的培養基材としてのエラスチンシートを試作し、動的条件を変えて培養評価を行った。その際に、試作品の材料安定性に問題があることがわかったため、再現性のある作成方法を検討し完成させた。(2)平滑筋動的培養による機能変化方法を確立し、シート状に成形したマトリックスに対する動的な血管系細胞接着試験の詳細な検討から、平滑筋細胞のみに特徴的である可能性が明確になった。また血管内で発生する動的ストレスと同様条件を加える伸展装置の開発にも成功した。

以上の成果の一部は第43回日本人工臓器学会大会(平成17年9月;東京)にて「血管壁組織構造を模倣した伸縮基材による平滑筋細胞の培養評価」、および第21回ライフサポート学会大会(平成17年12月;三重)にて「エラスチンマトリックスを足場とする血管平滑筋細胞培養法に関する研究」として発表を行った。今年度は計画最終年であり、移植血管開発に向け更に多くの血管系細胞を用いた検討事項を繰り返し、最適材料(動脈用血管壁材料)の作成方法をめざす。本研究の目的は、新しい移植用の小口径弾性動脈血管を提供するためのエラスチンマトリックスを用いた人工血管を開発することにある。1年目はエラスチンによる動的培養用シートを試作し検討した。2年目は更に血管系の細胞培養評価から培養用シートの機能特性を調査した。最終年度は、血管系細胞を用いた分化誘導や増殖抑制などの検討を繰り返し、また材料の種類による影響を確認し、本課題である小口径人工血管を作成するためにエラスチンを用いる方法は有用性を総合的に評価した。最終年度の研究概要(1)1年目および2年目で得られた知見・改良点を基に、血管内皮細胞と平滑筋細胞および線維芽細胞をエラスチンゲル上で培養するための動的培養基材としてのエラスチンシートを試作し、動的条件を変えて培養評価を行った。検討課題であった材料安定性の問題は、徹底した材料物性評価により解決できた。(2)平滑筋動的培養による機能変化方法を確立し、シート状に成形したマトリックスに対する動的な血管系細胞接着試験の詳細な検討から、平滑筋細胞の分化誘導性および増殖抑制に関する知見が得られた。(3)血管系細胞の基質構造として綿状エラスチンの加工にも成功した以上より、小口径人工血管で問題となる内膜肥厚の原因として考えられる血管平滑筋細胞の増殖制御および分化誘導制御に、エラスチンを活用することが有用である知見を得ることに成功し、本課題を終了することができた。また以上の成果の一部は第44回日本人工臓器学会大会(平成18年11月;横浜)および第22回ライフサポート学会大会(平成18年9月;千葉)にて発表を行った。
B型肝炎モデルマウスを作製し，急性重症肝炎に対する新規治療薬を探索する

B型肝炎ウイルスHBVに新規に感染している患者は全国で年間10000人と推定されるが,急性B型肝炎に対する治療法が確立していない.本研究では, HBV感染マウスおよびHBV肝炎マウスを用いて,既存の薬剤を候補として急性B型肝炎に対する有用性を検討した.本研究によってインターフェロンと核酸アナログの併用投与によって早期にウイルス陰性化が得られること,中和抗体であるHBsヒト免疫グロブリンによってHBs抗原の陰性化が得られること,CTLAIgによる肝炎重症化の抑制が得られた.これらの結果より既存の薬剤を用いて急性B型肝炎に対する治療の可能性が示された.平成27年度の目標は、1TK-NOGマウスを用いたヒト肝細胞キメラマウスの作製2ヒト肝細胞移植マウスへのHBV感染3HBV感染マウスへのヒト末梢血単核球(PBMC)投与4肝炎モデルの確認である。まず、110匹のTK-NOGマウスへ、肝障害を惹起する為にガンシクロビル投与を行い、51匹がALT:600以上となり、5x105個のヒト肝細胞の移植を行った。移植後8週目のヒトアルブミン値の平均値は、2.4±0.4 ng/mLとなり、B型慢性肝炎患者血清を1x10^5 copy静脈内注射しB型肝炎ウイルス感染マウスを作製を行った。HBV接種後、マウス血中HBV DNA量は8.1±0.4 log copy/mLとなりプラトーに達した。HBV DNA量がプラトーに達した時点で、5 x 106 humanPBMCsの末梢血を腹腔投与し、投与2週後にマウス肝臓内のリンパ球を回収し、ヒトCD45をマーカーに生着したhuPBMCの表現型についてFACSを用いて解析を行い、マウス肝臓の病理組織的検討も行った。HBV感染マウスへhuPBMC投与2週投与後の生着率は84±2%であり、一方非感染マウスでの生着率は55±24%と有意にHBV感染マウスで生着率が高かった。また、ヒトアルブミン値がHBV感染マウスでは有意に減少しALT値が有意に上昇したのに対し非感染マウスではアルブミン値の減少やALTの上昇を認めなかった。さらに、HBV特異的細胞障害性T細胞を非感染マウスでは検出されなかったがHBV感染マウスでは検出され、HBV感染マウスのみマウス血中にGranzyme AとIFN-γを検出した。マウス肝組織の検討では、HBV感染マウスでは単核球の集簇を認めたが、非感染マウスでは認めなかった。HBV感染マウスへT細胞選択的共刺激調節剤CTLA4Igを投与したところ肝傷害が抑制された。平成27年度の目標は、1TK-NOGマウスを用いたヒト肝細胞キメラマウスの作製2ヒト肝細胞移植マウスへのHBV感染3HBV感染マウスへのヒト末梢血単核球(PBMC)投与4肝炎モデルの確認であったが、全ての項目について達成できた。B型慢性肝炎患者に対する治療目標はHBs抗原の消失であるが、既存の核酸アナログやインターフェロンではHBs抗原の消失は得られない。抗HBs人免疫グロブリン(ヘブスブリン)は、血中に存在しているHBVは肝細胞に取り込まれる前に血流中で抗HBs抗体により中和処理し、針刺し事故後のB型肝炎発症の予防や肝移植後のB型肝炎再発・発症の抑制に実臨床で使用されているが、B型慢性肝炎患者に対しては投与されていない。B型肝炎ウイルスは肝細胞に取り込まれ増殖し肝細胞外へ分泌され再感染を繰り返していると考えられているが、再感染についての実験系が無く詳細は不明である。平成28年度の目標として、B型肝炎ウイルスの感染したヒト肝細胞を移植したキメラマウスへヘプスブリンを投与して、HBV中和による再感染予防時の血中HBs抗原、HBs抗体とウイルス量の推移について検討した。B型慢性肝炎患者血清を1x105copy静脈内注射しB型肝炎ウイルス感染マウスの作製を行った。HBV接種後8週目にはマウス血中HBV DNA量は10.1±0.3 log copy/mLとなりプラトーに達した時点で、500IUのヘプスブリンの投与を行い、経時的にマウス血中HBV DNA量とHBs抗原、HBs抗体の測定を行った。500IUのヘプスブリン投与後ウイルス量の減少は投与後1, 3, 7日では、-1.9±0.5, -1.2±0.5, 0.2±0.5 log copy/mLとなり投与3日間は有意なウイルス量の減少を認め、HBs抗原は陰性化しHBs抗体は陽性化した。ヘプスブリン投与によりHBVを中和することでHBs抗原の陰性化を達成できる可能性が示された。B型慢性肝炎患者の治療目標であるHBs抗原の消失を達成するために、抗HBs人免疫グロブリン(ヘブスブリン)の有用性が示された。HBVは,肝細胞に取り込まれるとゲノムDNAを含むヌクレオカプシドが細胞質から核内へ移行しcovalently closed circular DNA(cccDNA)となりウイルス複製の鋳型となる.慢性B型肝炎患者の治療薬として,核酸アナログやPEG-IFN製剤が用いられているが,cccDNAの低下は得られない.

今回我々はHBV感染ヒト肝細胞キメラマウスを用いてエンテカビル(ETV)およびPEG-IFN併用治療によるcccDNA制御の可能性、およびcccDNAの制御が治療終了後のウイルス複製に与える影響について検討した.ヒト肝細胞移植マウスにHBVを接種し,血中HBV DNAがプラトーに達した後にETV,PEG-IFNを投与し,マウス血中のHBV DNA量,HBsAg,HBcrAgを経時的に測定し,マウスの肝臓内cccDNA量をreal-time PCR法を用いて定量した.ETV,PEG-IFNα2aを6週併用投与したところ,血中HBV DNAは早期に低下し,投与3-4週で検出感度以下となった.肝臓内cccDNA量は、治療前に比べ,6週投与により有意に減少した.治療終了後さらに観察した10頭のマウスのうち,3頭のマウスでは治療終了8および9週後に血中HBV DNAが再陽性化したが,4頭のマウスでは治療終了13週後まで検出感度以下が維持された.HBVDNAが再上昇したマウスでは血中のHBsAg, HBcrAgが治療終了後に上昇していた.治療終了13週後の肝臓内cccDNAは,血中HBV DNAが再陽性化したマウスに比べ,血中HBV DNAが検出感度以下を維持していたマウスでは,より低値だった.肝臓内cccDNAを十分に低下させる治療を行うことにより,治療中止後もdrug freeにて肝内HBVの増殖を制御できる可能性が示された.B型肝炎ウイルスHBVに新規に感染している患者は全国で年間10000人と推定されるが,急性B型肝炎に対する治療法が確立していない.本研究では, HBV感染マウスおよびHBV肝炎マウスを用いて,既存の薬剤を候補として急性B型肝炎に対する有用性を検討した.本研究によってインターフェロンと核酸アナログの併用投与によって早期にウイルス陰性化が得られること,中和抗体であるHBsヒト免疫グロブリンによってHBs抗原の陰性化が得られること,CTLAIgによる肝炎重症化の抑制が得られた.これらの結果より既存の薬剤を用いて急性B型肝炎に対する治療の可能性が示された.平成27年度に作製したモデルを用いて、すでに肝炎以外の各種疾患に対し,細胞障害性T細胞をターゲットとした薬剤の有効性が確認された薬剤を投与し、薬効を評価する。B型肝炎ウイルス感染マウスを用いて、既存の抗ウイルス薬やB型肝炎ウイルス疾患以外で臨床応用されている免疫制御薬について、薬効を評価する。肝炎ウイルス
単一高分子鎖のダイナミクスの実空間・実時間観察

前年度の研究において、デフォーカス顕微鏡計測システムの構築および分子運動性評価のための試料合成が完了したことを受け、本年度においては単一高分子鎖観察によるダイナミクスの評価を行った。試料として主鎖中央をペリレンジイミドによって蛍光ラベルされたポリブチルメタクリレート(PBMA)を用いた。この高分子の薄膜試料を作製し、個々の鎖のデフォーカス観察により色素分子の三次元配向を経時観察することでPBMA主鎖中央セグメントの運動を計測し、特にPBMAのガラス転移点(Tg=20°C)近傍における鎖の運動性について詳細に評価した。Tg以下においてはほとんどの分子は静止しており、観測のタイムスケールにおいて運動は観察されなかったが、Tg以上への昇温によって静止していた高分子鎖が運動を始め、温度の上昇とともに平均回転緩和時間が短縮、すなわち運動性が上昇することが分かった。個々の分子の運動について詳細に解析すると、Tg近傍では全ての鎖が一様に運動しているのではなく、静止している鎖と運動している鎖が存在しており、平均の回転緩和時間はその割合によって決まっていることが明らかとなった。また一つの分子の運動を経時的に観察すると、運動している鎖であっても、常に分子運動を続けているわけではなく、時間とともに静止・運動を繰り返していることが分かった。このようにガラス転移における高分子鎖ダイナミクスの空間的・時間的不均一性が単一高分子鎖の直接観察によって明らかとなった。本研究は高分子鎖に色素分子を導入し、個々の高分子鎖を蛍光顕微鏡によりデフォーカス条件下にて観察することで、鎖の位置および配向状態の時間変化を実時間で追跡し、高分子のダイナミクスを分子レベルで評価することを目的としている。本年度は単一分子計測のための(1)計測システムの構築および(2)試料合成について行った。(1)単一色素分子の配向角を同定するデフォーカス観察においては、ナノメートルの精度で焦点制御を行う必要がある。ピエゾアクチュエータによる対物レンズ駆動機構および近赤外レーザーを用いた焦点維持機構を導入することで高精度に単一分子観察を行うことを可能にした。実験により得られた単一色素分子のデフォーカス条件下における蛍光画像と理論計算によって得られるパターンとを比較することにより、位置については精度<10nm、配向角についてはく5度の精度で単一分子の状態を計測することに成功した。また温度可変ステージを導入することで、1060°Cで試料温度を制御することができた。(2)高分子鎖に導入する色素分子として高い吸光係数と発光量子収率を有するペリレンジイミド(PDI)を選択した。ペリレンテトラカルボン酸無水物と種々の官能基を有するアミンとの反応によりPDIを有する一官能性および二官能性重合開始剤を合成した。これらの開始剤よりリビングラジカル重合を行うことにより、鎖末端あるいは鎖中央セグメントのみにただ一つの色素分子を有する高分子鎖の合成を行うことができた。モノマーとしては様々なメタクリレート系モノマーが重合可能であり、ガラス転移点の異なる種々の高分子試料を得た。
ヒトＭＡＴＥ型輸送体の構造と機能及びトランスポートソーム

肝臓及び腎臓における薬物排出を司るtransepithelial輸送に関与するトランスポーター分子は数種類存在している。これらのトランスポーター分子群は協奏的に機能して薬物排出機能を発揮していると考えられている。このことから、腎臓の糸球体における薬物の排出は厳密に制御された機構により調節されていると予想される。すなわちMATEが何らかの活性調節を受けている可能性が示唆された。また、MATEのC末端付近には比較的長大な可溶性の部分が存在している。この仮定に基づきMATEの親水性領域等に相互作用する制御分子を探索した。その結果数種の機能性タンパク質が同定出来た。肝臓及ひ腎臓における薬物排出を司るtransepithelial輸送に関与するトランスポーター分子は数種類存在している。すなわちMATEが何らかの活性調節を受けている可能性が示唆される。探索にはTwoHybridシステムを利用した。そしてそれらのタンパク質遺伝子をクローニングし、MATEとの相互作用を詳細に調べてみたところ、確かにin vitroで相互作用していることが確認された。そして、腎臓におけるそれらトランスポートソーム分子の局在について、それぞれのタンパク質に特異的な抗体を作成し、詳細に検討した。その結果、確かにMATE型輸送体と相互作用しているタンパク質が、ラット及びマウスの腎臓の近位尿細管に存在していることを確認した。現在、それらのタンパク質をノックダウンし、MATE型輸送体の活性や基質認識に関わる影響を詳細に検討しているところである。腎臓の糸球体における薬物の排出は厳密に制御された機構により調節されていると予想される。そして、それらのタンパク質遺伝子をクローニングし、MATEとの相互作用を詳細に調べてみたところ、確かにin vitroで相互作用していることが確認された。実際には、podocalyxinが腎臓の近位尿細管刷子縁膜でMATE1と共局在していることが明らかになった。また、NHE3とNHERF2もMATE1と腎臓近位尿細管刷子縁膜上で共局在していることが明らかになった。これらの免疫組織化学的な検討の結果から、腎臓の近位尿細管刷子縁膜でMATE1、podocalyxin、NHERF2、NHE3が図3に示すようなトランスポートソームを形成している可能性を見い出した。この結果は、MATE1がNHE3によって生み出されるH+勾配を効率的に利用している事を示しており、NHE3を介してMATE1が機能調節されている可能性を示唆する。podocalyxinが腎臓の近位尿細管刷子縁膜でMATE1と共局在していることが明らかになった。この結果は、MATE1がNHE3によって生み出される勾配を効率的に利用している事を示しており、NHE3を介してMATE1が機能調節されている可能性を示唆する。現在、MATEを中心としたトランスポートソームの詳細を明らかにしつつあるところである。

当初の目的は、MATEと相互作用する蛋白質を同定し、機能解析を行うことであったが、実際に4つの蛋白質を同定することが出来、現在機能解析も進んでいる。それらの抗体を作成して近位尿細管での局在について明らかにした点は本研究の遂行に大きな進展を及ぼす。今後はMATEと相互作用するタンパク質の機能解析と、それらタンパク質についてノックダウンし、MATE型輸送体の活性や基質認識に関わる影響を解析することを中心に進めていく予定である。今後はMATEと相互作用するタンパク質の機能解析を中心に進めていく予定である。消耗品費として使用する。ほぼ消耗品に使用する。
曲面結び目の幾何的特徴と不変量の関係について

鎌田氏によって、4次元空間に埋め込まれた曲面を研究するために、平面上のグラフで表現する手法、chartが定義された。n-chartは平面上の向きが付いた、各辺に1からn-1までのどれかのラベルが付けられたグラフで、ある条件を満たすものである。頂点は次数1と4と6の3種類あり、次数1の頂点をblack vertexといい、次数4の頂点をcrossingという。chartにはC-moveという変形があり、このchartに対応する曲面のambient isotopy classを変えない。次数6の頂点を持たないchartに変形できるchartをribbon chartという。鎌田氏によって、どの3-chartもribbon chartであることが示された。今回の結果はラベルについて条件がなく『crossingが高々2つであるchartに対して、その対応する曲面が球面ならばそのchartはribbon chartである』ことが示された。これを示すために、『crossingが丁度2つであるminimalgeneralized n-chartは少なくとも4n-10個black vertexを含む』を示した。chartに対して、その対応する曲面が球面ならばそのchartは2n-2個black vertexを含む事実から結果が得られた。blackvertexの数を調べるためにtangleという概念を導入した。tangleのうち次数6の頂点が減らせる条件をいくつか発見した。4次元空間内の曲面を平面上のグラフを用いて表す手法(chart)が知られている。このグラフの辺には整数のラベルが付けられており、頂点は次数が1か4か6である。3重点は次数が6のwhite vertexと呼ばれる頂点に丁度対応している。以前5つや7つのwhite vertexをもつminimal chartが存在しないことを示した。white vertexの数は有限だが、次数が4の頂点(crossingと呼ばれる)など他の頂点が無数にあるので、グラフの種類としては無限通りある。辺にラベルが付いているがその種類も一般のものを考えなくてはいけない。この研究を通して、一般のchartを調べる手法が数多く開発された。特に「half lensと呼ばれる円板の中にはwhite vertexが3つ以上である」という性質はとても強力なものであった。今回の研究では、これらの手法も使いながら、white vertexはいくらあってもいいが、crossingが高々1つもつchartの性質について調べた。以前のminimal chartの定義はwhite vertexの数が少ないもの内freeedgeが多いものと決めていた。それに更に2角形が多いものがminimal chartと決める。この2角形はhalf lensと呼んでいたものの特殊なものである。そうすると、以前示したminimal 4-chartでcrossingが高々1つもつchartはwhite vertexを持たないということが簡単に示すことが出来た。以前示したことが簡単になったので、一般のn-chartに拡張することが出来そうである。頂点は次数1と4と6の3種類あり、次数4の頂点をcrossingという。永瀬氏と広田氏によって、crossingが高々1つである4-chartはribbon chartであることが示された。永瀬氏と志摩によって、crossingが高々2つである4-chartに対して、その対応する曲面が球面ならばそのchartはribbon chartであることが示された。今までの結果はラベルが1から3までしか考えていなかったが、今回の結果はラベルについて条件がなく『crossinを高々1つもつどんなchartもribbon chartである』ことが示せた。これを示すために、minimalの概念を拡張したgeneralized minimalを定義した。今までminimalの定義はC-move equivalentなchartの内、次数6の頂点が一番少ないものでfree edgeが一番多いchartであった。ここでfree edgeとは次数1の頂点を2つもつedgeのことである。