hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
携帯端末を利用した人口動態調査システムの途上国農村地域開発への利用

さらに10月にはナイロビ市内のテロ事件もあり、研究協力者を同行させるわけにはゆかない状況となり、代表者のみでの渡航を計画したが具体的な作業量との関係、出発がずれ込んだことにより、雨季が始まり、圃場での地下かんがいの施工が困難となったため24年度の施工とした。当初計画では24年度が計画最終年度であったが、補助期間延長の申請を行って目的達成に向けて研究を続ける。エチオピア農業研究所、バハルダール大学の協力が確認できているので、点滴かんがいプロットの設置と協力農家聞き取り調査(端末利用したベースライン調査)を実施する。農家向け運用手引書を準備し現地での研修を依頼、運用開始する。78月頃と12月に現地調査を行い、安価な点滴かんがいの効果を判定するための聞き取り、バハルダール大学での安価な点滴かんがいのワークショップ(78月)を開催する。その後、年度内にこれらを取りまとめて学術誌に投稿、報告書作成をおこなう。【次年度利用予定研究費】あり。今年度の現地調査、施工が実施できなかった事由は(1)震災津波による塩害と除塩対応による業務、協力の想定外の急増と(2)現地の干ばつ及び渡航予定直前のナイロビ市内のテロによる日程変更に対応できなかったことによる。【今後の推進方策】現地の調査、施工について24年度前半に集中的に実施し、夏休みまでに現地作業の準備等を協力機関と十分に打ち合わせを行う。現在、学期中ではあるが5月に短期間の現地での作業打ち合わせを予定している。とくに、ベースライン調査は夏休みまでに完了するよう準備を進めている。また、前年度に引き続き、塩害対策除塩の評価についての協力を行うが23年度ほどの作業量とならない予定で、夏休み期間中の日程管理を十分に行い研究の進捗をはかる。各費目について次のような計画である。【国内・海外旅費】エチオピア国(ケニア国)への渡航を78月(2名)、12月(1名)と国内打ち合わせ(長崎大学)を予定している。【消耗品・その他】IDE製安価な点滴かんがいシステムと付属品類の購入、調査協力者の研修資料準備、会場借り上げ等【研究補助謝金】安価な点滴かんがい設置作業、調査端末利用の協力者研修を8月までに実施し、タブレット端末ソフトを現地語化する。【通信費】エチオピアの協力機関とネット会議システムを利用して打ち合わせを行う。この他、バハルダール市内のインターネット接続費用に充てる。次年度はケニアの協力機関との打ち合わせ、ベースライン調査、現地の協力農家への説明と簡易点滴かんがい、地下かんがいの施工、使用用水量等、農作業記録等のデータ収集を予定しており、5月、6月の雨季終わり乾季の初めの期間に2度現地入りをして夏休み期間中の作業準備を行う。さらに、夏休み期間中(現地は乾季となる)には当初予定していた10日間の予定を25日程度に延長し集中的に研究の進捗を図る。
ステロイド筋症に対する低強度筋収縮運動と温熱刺激を併用した新たな治療の効果を探る

現在の医療においてステロイド剤を用いる治療は多いが、多岐にわたる副作用が問題となる。その中でも、筋萎縮が生じるステロイド筋症は患者の生活において重要な問題となる。その治療法として、低強度の筋収縮運動および温熱刺激は筋萎縮の進行を抑制することが明らかとなった。さらに、両者を併用するとステロイド筋症の進行抑制効果はより大きいことも明らかにした。そして、温熱刺激による筋萎縮進行抑制効果のメカニズムには、Hsp72の増加による筋タンパク質分解の抑制が関与している可能性がある。本研究では,前年度に示した温熱負荷と低強度筋収縮運動の併用がラット腓腹筋の廃用性筋萎縮の進行を抑制できる結果をもとに,温熱刺激と低強度筋収縮運動の併用がステロイド筋症ラットに及ぼす影響を検討することである.実験動物には8週齢のWistar系雄性ラットを用い,これらを無作為に,生理食塩水を投与する対照群(C群),ステロイド筋症を惹起させる目的で2週間のステロイド剤投与を行うSteroid群(S群),ステロイド剤投与中に温熱負荷を実施するSteroid &Heat群(SH群),ステロイド剤投与中に低強度の筋収縮運動を実施するSteroid &Electrical stimulation群(SE群),ステロイド剤投与中に温熱負荷と低強度の筋収縮運動を併用して実施するSteroid &Heat &Electricalstimulation群(SHE群)に振り分けた.生理食塩水およびステロイド剤は1週間に6日間の頻度で2mg/kg量を傍脊柱に皮下投与した。温熱負荷は約42°Cの温水浴内に60分間ラットの後肢を浸漬する方法で行った.筋収縮運動は経皮的に電気刺激する方法で行い,刺激条件は刺激強度2mA,周波数50Hz,パルス幅250μsec,実施時間20分とした.いずれも3日に1回の頻度で実施した.試料は長趾伸筋を供した.その結果,体重においてC群と比較してその他の群では著しい体重減少を認めた.筋湿重量と相対重量比ともにS群が最も低値を示し,次いでSH群,SE群,SHE群の順に高値となった.従って,ステロイド筋症ラットに対して温熱刺激または低強度筋収縮運動を単独で負荷するよりも,両者を併用した方が筋萎縮の進行抑制効果を得られることが示唆された.本年度の目的はステロイド筋症の進行抑制効果のメカニズムを検討することである.具体的には,筋量の増加を促進するinsulin-like growthfactor(IFG)-1や分子シャペロン機能によって筋タンパク質を修復するHeat shock protein (Hsp)72,ubiquitin proteasome system (UPS)の指標であるMuRF1およびatrogin-1の検索を実施した.実験動物には8週齢のWistar系雄性ラット32匹を用い,生理食塩水を投与する対照群(C群),2週間のステロイド剤投与を行うSteroid群(S群),ステロイド剤投与中に温熱負荷を実施するSteroid &Heat群(SH群)を用いた.生理食塩水およびステロイド剤は1週間に6日間の頻度で2mg/kg量を傍脊柱に皮下投与した。温熱負荷は約42°Cの温水浴内に60分間ラットの後肢を浸漬する方法で3日に1回の頻度で実施した.試料は長趾伸筋を供し,ELISA法によりIGF-1,Western blot法によりHsp72をタンパク質レベルで検索し,MuRF1およびatrogin-1はReal-Time PCR法によりmRNAレベルで検索を実施した.その結果,S群はC群と比較してIGF-1が減少し,MuRF1とatrogin-1が増加していた.SH群はS群と比較してHsp72が増加し,MuRF-1とatrogin-1が減少していた.以上のことから,温熱刺激単独のステロイド筋症の進行抑制効果のメカニズムには,Hsp72の増加によるUPSの抑制が関与していることが示唆された.しかしながら,温熱刺激と低強度筋収縮運動との併用におけるステロイド筋症の進行抑制メカニズムの検討には至らず,これは今後の課題である.現在の医療においてステロイド剤を用いる治療は多いが、多岐にわたる副作用が問題となる。本研究では筋収縮運動の強度に着目し,温熱負荷と筋収縮運動の併用がラット腓腹筋の廃用性筋萎縮の進行におよぼす影響を検討することである.実験動物には8週齢のWistar系雄性ラットを用い,対照群,廃用性筋萎縮を惹起させる目的で2週間のHSを行うHS群,HS期間中に温熱負荷を実施する温熱群,HS期間中に低強度の筋収縮運動を実施する低強度群,HS期間中に温熱負荷と低強度の筋収縮運動を併用して実施する温熱+低強度群,HS期間中に高強度の筋収縮運動を実施する高強度群,HS期間中に温熱負荷と高強度の筋収縮運動を併用して実施する温熱+高強度群に振り分けた.温熱負荷は約42°Cの温水浴内に60分間ラットの後肢を浸漬する方法で行った.

筋収縮運動は経皮的に電気刺激する方法で行い,刺激条件は周波数50Hz,パルス幅250μsec,実施時間20分とした.なお,刺激強度として低強度の場合は2mAとし,高強度の場合は4mAとした.いずれも3日に1回の頻度で実施した.試料は腓腹筋浅層部と深層部を供した.その結果,深層部のタイプI線維では,対照群と比較するとすべての実験群で有意に低値を示し,HS群と比較すると低強度群,温熱+低強度群,高強度群,温熱+高強度群が有意に高値を示した.次に,深層部のタイプIIa・IIb線維,浅層部のタイプIIb線維では,対照群と比較するとすべての実験群で有意に低値を示し, HS群と比較すると温熱+低強度群と高強度群が有意に高値を示した.深層部,浅層部ともに対照群とHS群の間に有意差は認められず,この2群に比べ温熱群,温熱+低強度群,温熱+高強度群は有意に高値を示した.以上のことから,廃用性筋萎縮に対して温熱負荷と筋収縮運動を併用する際は,低強度運動の方が高強度運動より効果的であることが示唆され,今後はステロイド筋症ラットに対し,温熱刺激と低強度運動の併用が効果的であるかを検討する.これまでの自験例において廃用性筋萎縮に対して低強度の筋収縮運動と温熱刺激の併用が有用であることは明らかになっていたが,低強度の筋収縮運動のみでの効果は検討できていなかった.そこで,昨年度はこの点に関する基礎データを得る目的で実験を行い,低強度の筋収縮運動よりも温熱刺激を併用した方が効果があることが明確となり,今年度からはステロイド筋症に対するこれらの影響を検討した.その結果,ステロイド筋症ラットに対しても温熱刺激と低強度の筋収縮運動を併用した方が最も効果的であることが分かった.これまでの自験例において廃用性筋萎縮に対して低強度の筋収縮運動と温熱刺激の併用が有用であることは明らかになっていたが,低強度の筋収縮運動のみでの効果は検討できていなかった.そこで,今年度はこの点に関する基礎データを得る目的で実験を行い,これまでの結果と比較検討した.今回の結果から、低強度の筋収縮運動よりも温熱刺激を併用した方が効果があることが明確となり,次年度からはステロイド筋症に対するこれらの影響を検討する予定である.これまでの結果から,ステロイド筋症ラットに対して温熱刺激と低強度の筋収縮運動の併用することは,各刺激を単独で負荷するよりも効果的である可能性があることが分かった.そのため,今後はその効果を明確にするための検索とその分子メカニズムの検討が必要である.これまでの結果から,廃用性筋萎縮に対する筋収縮運動と温熱刺激の併用療法については運動強度を考慮する必要があることが示唆されており,この知見を一つのエビデンスとして今後は,ステロイド筋症モデルラットに対して低強度の筋収縮運動と温熱刺激を単独と併用で負荷した場合の予防効果実験を推進していく予定である.
次世代シーケンスを用いた、若年発症糖尿病多発家系における発症原因遺伝子同定

遺伝因子の発症への影響が特に大きいと考えられる糖尿病多発家系を用い、次世代シーケンス解析にて新規糖尿病発症原因遺伝子変異を同定することで、糖尿病の遺伝素因解明に寄与することを目的とし研究を行った。インスリン分泌不全の顕著な非肥満糖尿病罹患者4名が存在する1家系につき全エクソーム解析にて検討を行った結果、家系の4名に共通して存在し、一般糖尿病患者において一般非糖尿病者に比して有意に高頻度で存在するADAMTSL3遺伝子A137T変異を同定でき、糖尿病発症感受性変異である可能性が示唆された。若年発症者(30歳以下)を有する糖尿病家系につき、協力の得られた家系構成員のゲノムDNAを用い、次世代シーケンサーにて全エクソンシーケンスを網羅的に行い、罹患者に共通し家系内非罹患者に存在しないエクソン変異を糖尿病発症原因候補として絞り込む作業を行った。4名につきインスリン分泌能がほぼ枯渇(空腹時血清C-ペプチド<0.5ng/ml)していた特徴的な1家系につき、既知遺伝子変異のないことを確認し、罹患者4名、家系内非罹患者2名の全エクソンシーケンスを行った。そして、罹患者に共通し、非罹患者に存在せず、データベース(1000 genomes, Human Genetic Variation Database)の一般人口における頻度が低く(<1%)、タンパク機能に変化を及ぼすことが予想される16変異を絞り込んだ。16変異につき、協力研究者から検体提供を得た2,102名の一般対照者および119名の一般糖尿病患者においてジェノタイピングした結果、糖尿病患者において有意に高頻度であったのは1変異のみであり、家系の糖尿病発症原因と考えられた。これにつき現在英文誌論文投稿中(被査読中)である。さらに、若年発症者(30歳以下)を有する糖尿病家系についての全エクソンシーケンス解析を継続しており、肥満歴を有しない12家系発端者につきまず優先し全エクソンシーケンス解析を開始した。2017年度に結果を解析する予定である。一方、家系解析の過程で、1家系につき、既知遺伝子(HNF1B)の未報告変異が糖尿病発症に関与する可能性が極めて高いことが明らかとなり、これについても現在英文誌投稿準備中である。発症原因候補遺伝子の絞り込みにつき、予定通り効率よく行っており、すでに論文発表の前段階に達しており、順調と考える。30歳以下の若年発症である糖尿病患者およびその家系につき、全エクソンシーケンス(WES)を用い、発症原因遺伝子変異を同定することを目的に研究を行った。検討した家系では、インスリン分泌不全の顕著な糖尿病罹患者4名および、両親・同胞に罹患者を有しない家系内非罹患者2名をWESの対象とした。罹患者に共通し非罹患者にみられない塩基配列変化で、SnpEffおよびPolyPhen-2を用いた予測にてタンパク機能への影響が示唆されたものを選択すると105個であった。このうち、1000 genomes projectおよび日本人データ(HGVD)において0.01以上のアレル頻度であるものを除外し、18個に絞り込み、これら18個が罹患者4名に共通することをSanger法にて確認した。さらに、55歳以上の日本人検診受診者で5年間にわたり空腹時血糖<100mg/dlかつHbA1c<6.0%を維持した105名の一般非罹患者における頻度を検討したところ、16個の塩基配列変化についてアレル頻度<0.01であった。この16個の塩基配列変化のうち、唯一ADAMTSL3遺伝子A137T変異(rs181914721)は119名の他の一般糖尿病患者において105名の一般非罹患者に比して高頻度に存在し(3/238アレル, 0/210アレル)、さらに2,102名の一般人口コホート非糖尿病者(11/4204アレル)に比して有意に高頻度(p=0.03,オッズ比1.35-17.86[95%CI])であり、糖尿病発症感受性変異である可能性が示唆された。この結果を論文報告とした。(Diabetes Research and Clinical Practice Volume 135, January 2018, Pages 143-149)遺伝因子の発症への影響が特に大きいと考えられる糖尿病多発家系を用い、次世代シーケンス解析にて新規糖尿病発症原因遺伝子変異を同定することで、糖尿病の遺伝素因解明に寄与することを目的とし研究を行った。解析対象の家系数を増やすことで、さらに糖尿病発症の遺伝的背景解明を目指す。代謝学
スルフォラファンによる血管新生の抑制-オートファジー抑制による抗癌作用の解明

昨年にひきつづき、大腸癌細胞株colon26に対するオートファジーの実験、それを抑制することで、SUL単独の時と比べ、より強くcolon26大腸癌細胞株の増殖を抑制することを確認してきた。しかし、その変化は血管内皮細胞の結果と比較すると弱いことから、時間設定の変更などを行ってきたが、十分な反応を得ることができなかった。その一方、初年度に血管内皮前駆細胞(EPCs)が低濃度SULにおいて3-MAでオートファジーを抑制するとアポトーシスを強く認めるという結果を認め、また管腔形成に関しても。SUL濃度依存的な管腔形成の抑制効果を認めたが、3-MAを加えると3-MA単独でもEPCsの管腔形成の抑制が認められ、いずれのSUL濃度でも管腔形成が認められないという結果であった。こうしたことから、EPCsは通常状態でもオートファジーを強くおこしている状態であり、3-MAでオートファジーを抑制するとそれだけでアポトーシスが強く誘導されることがわかっていた。この反応はこれまでに報告をした血管内皮細胞のSUL暴露の際にオートファジーを誘導し細胞死を逃れようとし、3-MAでオートファジーを抑制することでアポトーシスを誘導し血管新生の抑制を示すという結果とは異なるものであった。この結果が、末梢血中の単球から分離して行った実験であることが影響している可能性を考慮して、以前行っていたマウスの大腿骨、脛骨から分離した単球からEPCsを作成することの検討を行っていた。C57BL6Jマウスで行っていたことがあったため、同様のことを今後使用する予定であったBalb/cマウスを用いて行うことを検討した。血管内皮細胞に及ぼすスルフォラファン(SUL)の影響に関してはこれまでの報告の通りで、当初の実験の予定通り、もう1つの血管新生に関与している血管内皮前駆細胞のSUL濃度別のオートファジーの誘導の検討をin vitroで行った。まずはすでに検討を行っているSUL濃度別の血管内皮前駆細胞活性抑制効果をMTS assayにて確認。これまでの如くSUL濃度依存的に細胞活性が抑制されることが確認された。つづいて、SUL濃度別の血管内皮前駆細胞のAVOs形成の検出をacridine orangeを使用して行ったところ、濃度依存的にAVOs形成が行われていることが確認された。SUL40&micro;mで最も形成していることが分かったが、SULなしでも蛍光顕微鏡観察でかなりAVOsが形成されていることも同時にわかった。オートファジー阻害薬である3-MAを使用してアポトーシスの誘導をFlow-cytometryを用いて測定したところ低濃度SULにおいて3-MAでオートファジーを抑制するとアポトーシスを強く認めるという結果であった。高濃度SULではSUL単独でアポトーシスが誘導されているためか3-MAにてオートファジーを抑制しても強くアポトーシスは誘導されなかった。つづいて、SULによる血管内皮前駆細胞の基底膜マトリックス上での管腔形成への影響の評価を行った。これまで同様にSUL濃度依存的な管腔形成の抑制効果を認めたが、3-MAを加えると3-MA単独でも血管内皮前駆細胞の管腔形成の抑制が認められ、いずれのSUL濃度でも管腔形成が認められないという結果であった。今回の実験でわかったこととして、血管内皮前駆細胞は通常状態でもオートファジーを強くおこしている状態であり、3-MAでオートファジーを抑制するとそれだけでアポトーシスが強く誘導されることがわかった。血管内皮前駆細胞に及ぼすSULの影響に関しての結果をうけて、マウス実験を行うにあたり使用予定となっている大腸癌細胞株colon26のSUL濃度別の細胞増殖抑制効果についてin vitroで確認する必要が生じたと判断した。結果として、colon26もこれまでと同様にSUL濃度依存的に細胞増殖が抑制されることを確認した。今後のマウス実験にむけて、SUL濃度別のAVOs形成などオートファジーの確認、3-MAによるオートファジーの阻害とアポトーシスへの影響などin vitroでの実験を追加して行っていき確認していく。これまでにHUVECsを用いた血管内皮細胞はSULの暴露の際にオートファジーを誘導し細胞死を免れようとしていることがわかり、3ーMAでオートファジーを抑制することでアポトーシスを誘導し血管新生の抑制を示すことを論文で報告を行った。その結果を受け、前年度は同じく血管新生に関与している血管内皮前駆細胞のSULの暴露に対する反応を調べたところ、濃度依存的なことに加えてSUL非暴露の状態でもオートファジーが誘導されており、3ーMAでオートファジーを抑制するとSUL非暴露の状態でも強くアポトーシスを誘導することが分かった。いよいよ今年度は大腸癌細胞株colon26を用いてどのような反応を示すかの確認を行った。colon26においてもSUL濃度依存的に癌細胞の増殖が抑えらえることが分かった。さらにオートファジーを抑制する3ーMA加えるとSUL単独の時と比べ、より強くcolon26大腸癌細胞株の増殖を抑制することが分かった。アポトーシスの誘導についてつづいて検討をおこなってみた。SUL単独では80μmの濃度で強くアポトーシスを起こすことを確認。40μm以下ではアポトーシスの誘導が少ないことがわかり、この点でもこれまでの検討と同様であった。3-MAを加えオートファジーを抑制すると、SUL80μmではアポトーシスのためか大きな変化を認めなかったが、SUL40μmではアポートーシスの誘導が強くなる傾向が認められ、それ以下の濃度ではアポトーシスの誘導に大きな変化は認められなかった。

しかし、その変化は血管内皮細胞の結果と比較すると弱いことから、時間設定の変更などを行い現在検討を行っている。colon26大腸癌細胞株に対するSULのオートファジーの誘導がやや弱いことから、血管内皮細胞ほどの明確な変化とならないことから、時間設定を詳細にみているところである。オートファジーの誘導は確認できていることから、いくつかの時間設定で確認を行っている。昨年にひきつづき、大腸癌細胞株colon26に対するオートファジーの実験、それを抑制することで、SUL単独の時と比べ、より強くcolon26大腸癌細胞株の増殖を抑制することを確認してきた。しかし、その変化は血管内皮細胞の結果と比較すると弱いことから、時間設定の変更などを行ってきたが、十分な反応を得ることができなかった。その一方、初年度に血管内皮前駆細胞(EPCs)が低濃度SULにおいて3-MAでオートファジーを抑制するとアポトーシスを強く認めるという結果を認め、また管腔形成に関しても。SUL濃度依存的な管腔形成の抑制効果を認めたが、3-MAを加えると3-MA単独でもEPCsの管腔形成の抑制が認められ、いずれのSUL濃度でも管腔形成が認められないという結果であった。こうしたことから、EPCsは通常状態でもオートファジーを強くおこしている状態であり、3-MAでオートファジーを抑制するとそれだけでアポトーシスが強く誘導されることがわかっていた。この反応はこれまでに報告をした血管内皮細胞のSUL暴露の際にオートファジーを誘導し細胞死を逃れようとし、3-MAでオートファジーを抑制することでアポトーシスを誘導し血管新生の抑制を示すという結果とは異なるものであった。この結果が、末梢血中の単球から分離して行った実験であることが影響している可能性を考慮して、以前行っていたマウスの大腿骨、脛骨から分離した単球からEPCsを作成することの検討を行っていた。C57BL6Jマウスで行っていたことがあったため、同様のことを今後使用する予定であったBalb/cマウスを用いて行うことを検討した。vitroでの評価の後、vivoでの検討を行う。マウス大腸癌細胞のColon26をBALB/cマウスの側腹部に皮下注射する。4週間後皮下腫瘍が形成されたことを確認し、治療に入る。7日間連続してマウスに3-MA (10mmol/kg)の存在下または非存在下に25mg/kgのSULを含んだ餌を食べてもらう。その後マウスをSacrificeし、腫瘍を採取する。採取した腫瘍を用いて以下の検討を行う。1腫瘍体積、重量の評価2LC3発現の検討:Western blottingによる発現の検討3抗アポトーシス蛋白Bcl-2の発現の評価:Western blottingにて行う4血管新生の評価:顕微鏡下に密度を計測する。他、播種モデルの作成なども適宜行っていく。colon26によるオートファジーの誘導の実験をひきつづき行っていく。条件が定まった時点でvitroでの評価の後、vivoでの検討を行う。
π電子系と置換基との共役におけるポテンシャルエネルギーと運動エネルギーの役割

研究計画は、(1)系の相対的な電子の運動エネルギー(T)とポテンシャルエネルギー(V)を適切な精度で算出する基底関数系の決定。(2)π結合の形成およびビニルアミン、ニトロエチレン等の共役におけるTとVの役割の解析、(3)エネルギー成分の内部座標についての偏微分による、結合形成および共役の解析であった。結果:(1)22種の基底関数系、分子系としてエタン、メチルアミン、ブタジエン、ビニルアミン、ニトロエチレンを用いて検討した結果、最少基底関数系は使用不能、定性的議論にはどのようなsplit-ualence系でも使用できることがわかった(公表済)、(2)(a)エチレンの2つのメチレングループの回転、(b)ビニルアミンとニトロエチレンにおける置換基の回転によるエネルギー変化の解析、および(c)特定原子軌道間の相互作用を除いたときのエネルギー変化の解析を試みた。(a)では、π結合の成因は2P原子軌道の電子の運動エネルギー圧力の緩和が主因であることがわかった(公表済)。(b)電子供与性の置換基が共役するとき、その安定化はTにより、電子吸引性基が共役する場合はVの低下によることがわかった(ビニルアミンとニトロエチレンに関しては公表済、アニリンとニトロベンゼンに関しては投稿中)。(c)の検討中、理論と計算結果に矛盾が見つかり、現在も検討中である。(3)エネルギー成分の内部座標に関する偏微分値を求めるプログラムは3月になって完成した。45度捻れたエチレン系に適用したテスト計算では、EとTの捻れ角の偏微分値は供に負、Vのそれは正となり、π結合の形成は電子の運動エネルギーの低下に依ることがわかった。この結果は2-aの結果と一致し、この方法の有効性が示された(末発表)。
外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知や活動に着目した介入の有効性の検証

本研究は,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した心理的介入の効果について明らかにすることを目的とした。文献レビューに基づいて介入プログラムを作成し,外傷性ストレスを体験し,現在もPTSD症状を高く示している対象者に対して本プログラムを実施した。その結果,介入後にPTSD症状に対する否定的認知が低減し,レジリエンスが向上するなどプログラムの妥当性が示された。さらに,外傷性ストレス体験者のPTSD症状の改善に効果的であることが示され,抑うつ症状に対しても一定の効果が認められた。以上のことから,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した介入の有効性が示唆された。本研究は,外傷性ストレス体験後に生じるPTSD (外傷後ストレス障害)の発症と維持のメカニズムを解明し,効果的な支援方法を明らかにすることを目的とした心理学研究である。具体的には,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した心理的介入がPTSD症状や生活適応に及ぼす効果について明らかにすることを目的としている。今年度は,外傷性ストレス体験者に対する心理的介入に関する国内外の文献に基づいてレビューを実施し,認知行動理論に基づいた介入要素が含まれた介入プログラムが主に実施されていることが示された。さらに,文献レビューの結果を参考に,否定的認知や活動の低減と,肯定的な認知と活動の向上という両側面に着目したプログラムを開発した。その後,予備的研究として,外傷性ストレス体験者の中でも,PTSD症状を高く示している対象者に対して本プログラムを複数回実施した。以上のことから,本プログラムは外傷性ストレス体験者のメンタルヘルスに効果的であることが示唆された。今後は,本プログラムが外傷性ストレス体験者の生活適応に及ぼす影響や,否定的認知や活動の低減と肯定的な認知と活動の向上という要因の交互作用に関する検証を行う必要がある。今年度は,昨年度の研究成果に基づき,否定的・肯定的な認知と活動に着目した心理的介入プログラムを開発し,その効果に関する検証を複数回行った。その結果,本プログラムは,トラウマ体験者の外傷後ストレス症状の改善に効果的であり,その効果も一定期間維持されることは複数の介入研究から示された。その一方で,トラウマ体験者のうつ症状や生活支障度に対する効果は不十分であることが示唆された。以上の結果から,介入プログラムの構成については再度検討する余地が残されたと言える。具体的には,来年度は,外傷後ストレス症状に対する効果のみならず,うつ症状や生活支障度の改善を目的した基礎研究やそれに基づくプログラムの開発,効果研究を行う必要がある。すでにうつ症状や生活支障度の改善に向けたターゲットの選定に関する検討は実施されているため,その結果に基づいて,介入プログラムの内容を含めたプロトコルを検討したい。なお,本年度の成果に関しては,学術雑誌に採択され,国内外の学会発表などで公表されている。介入プログラムの効果検証を行うことできたことや,プログラム内容の修正のための基礎的研究にも取りかかれているため,順調に進展していると言える。今年度は,昨年度の研究成果に基づき,外傷後ストレス症状に対する効果のみならず,うつ症状や生活支障度の改善を目的した基礎研究やそれに基づくプログラムの開発,効果研究を行った。その結果,プログラムの妥当性は示唆された。一方,効果変数に変化がみられなかったことが課題としてみられたため,今後は,基礎研究に基づいて,介入プロトコルの改善を行う予定である。またこれらと平行して,外傷後ストレスの維持要因として,認知行動的要因として新たな変数に着目し,検討を行っていくことが今後の課題である。なお,本研究の成果は,国内外で発表されている。プログラムの効果検証を行うことできたことや,プログラム内容の修正のための基礎的研究にも取りかかれているため。具体的には,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した心理的介入が外傷後ストレス症状や生活適応に及ぼす効果について明らかにすることを目的としている。今年度は,昨年度の研究成果に基づき,思考内容が行動を制御するための他の有用な資源を抑えて支配的になる傾向を示す認知的フュージョンに着目し,外傷後ストレス症状に影響を及ぼす認知行動的プロセスを検討した。その結果,認知的フュージョンは,トラウマや外傷後ストレス症状に対する否定的認知を媒介し,外傷後ストレス症状を悪化させるというプロセスが示された。

認知的フュージョンは外傷後ストレス症状のみならず抑うつにも影響を及ぼすことが知られているため,生活適応を改善するための有効なターゲットになる可能性が高い。そのため,本プロセスのさらなる解明とその結果に基づく新たな介入技法の開発と効果に関する検証が期待される。本研究を通して,外傷性ストレス体験後に生じるPTSDや生活支障度を改善するための方策を複数提案することができた点は意義が認められる。今後は,どのような介入技法やその組み合わせがより効果的であるか引き続き検討していくことが求められる。なお,本研究の成果は,国内外で発表されている。本研究は,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した心理的介入の効果について明らかにすることを目的とした。文献レビューに基づいて介入プログラムを作成し,外傷性ストレスを体験し,現在もPTSD症状を高く示している対象者に対して本プログラムを実施した。その結果,介入後にPTSD症状に対する否定的認知が低減し,レジリエンスが向上するなどプログラムの妥当性が示された。さらに,外傷性ストレス体験者のPTSD症状の改善に効果的であることが示され,抑うつ症状に対しても一定の効果が認められた。以上のことから,外傷性ストレス体験者の否定的・肯定的な認知と活動に着目した介入の有効性が示唆された。文献レビューに基づいて介入プログラムが開発されたこと,さらに予備的検討であるものの,その効果検証が一部実施できたため,おおむね順調に進展しているといえる。外傷後ストレス症状に対する効果のみならず,うつ症状や生活支障度の改善を目的した基礎研究やそれに基づくプログラムの開発,効果研究を行う必要がある。すでにうつ症状や生活支障度の改善に向けたターゲットの選定に関する検討は実施されているため,その結果に基づいて,介入プログラムの内容を含めたプロトコルを検討する必要がある。うつ症状や生活支障度の改善を目的した基礎研究を実施し,ターゲットの選定に関する検討に基づいて介入プロトコルを引き続き検討する。またこれらと平行して,外傷後ストレスの維持要因として,認知行動的要因として新たな変数に着目し,検討を行っていく。臨床心理学本プログラムは外傷性ストレス体験者のメンタルヘルスに効果的であることが示唆された。今後は,本プログラムが外傷性ストレス体験者の生活適応に及ぼす影響や,否定的認知や活動の低減と肯定的な認知と活動の向上という要因の交互作用に関する検証を行う必要がある。H27年度内に成果公表のための学会出張を予定していたが、日程上、参加できず、未使用額が生じた。H28年度内に成果公表のための学会出張を予定していたが、日程上、参加できず、未使用額が生じたため。平成26年度に得られたデータ解析の結果,平成27年度以降に調査を実施する必要性が出てきたため,そのための経費として繰り越した。H28年度は研究成果報告のための国際学会を含めた出張が多くなるため、旅費として使用する予定である。
材料構成に基づくフライアッシュの強度発現性能評価手法の提案

本研究では、モルタルおよびコンクリートの強度発現に対するフライアッシュの結合材としての性能を表すセメント有効係数kが、フライアッシュの置換率によって変化することを示した。また、この変化するセメント有効係数を配合選定段階で把握することを目的に、結合材の成分により評価を行い、フライアッシュ中のSiO2とセメント中のC3SとC2Sの和の比によって評価できることがわかった。さらに、内部養生によりフライアッシュの強度発現性能が向上することも明らかにした。良質なポゾランであり、かつ石炭火力発電の副産物であるフライアッシュは、温度や配合条件に反応が大きく影響を受けること、また化学成分が一定でないことから、コンクリート混和材料としての利用が滞っている。本研究では、配合条件および化学成分に基づいた材料構成に着目し、フライアッシュの強度発現性状の変化を配合選定段階で把握することを目的としている。平成25年度は、モルタルを対象とし、フライアッシュの置換率およびセメントの種類を要因として、圧縮強度およびフライアッシュの結合材としての圧縮強度増進への貢献度を示すセメント有効係数(k値)について実験的に検討した。フライアッシュは、1種類、セメントは、研究用セメント、普通ポルトランドセメント、早強セメントの3種を用意した。養生条件は、20°C水中養生とした。この結果、材齢7日および28日強度においては、置換率が大きくなるにつれて、圧縮強度およびk値が小さくなり、これまでの知見と相違ないことを確認した。長期強度については平成26年4月以降に揃う予定であり、フライアッシュを懇話した場合に基準とする材齢91日強度の結果についても検討行い、これらを総合してフライアッシュの強度発現性能を統一的に評価する手法を提案する予定である。また、細孔径分布試験については、自身で測定する準備を整えた。細孔径分試験を実施し、強度発現と細孔構造の緻密化を関連づけた考察を行う予定である。なお、本検討においては水中養生を行いフライアッシュが強度発現性能を充分に発揮させる条件において検討しているが、実際の養生条件におけるフライアッシュの活用を検討するため、内部養生材によるフライアッシュコンクリートの性能向上についても検討した。また、実際の湿度条件における検討への展開を図るため、フライアッシュコンクリートの内部湿度変化について検討を始めた。良質なポゾランであり、かつ石炭火力発電の副産物であるフライアッシュは、化学成分が一定でないことなどから、コンクリート混和材料としての利用が滞っている。本研究では、配合条件および化学成分に基づいた材料構成に着目し、フライアッシュの強度発現性状の変化を配合選定段階で把握し、その有効利用を促進することを目的としている。平成26年度は、前年度に作製したモルタル供試体を対象として、フライアッシュの強度発現性能を検討した。この結果、セメント有効係数(以下、k値)を用いることで、フライアッシュのモルタル強度発現に対する貢献度を定量的に示した。コンクリートを対象とした場合も同様の結果を得られた。化学組成によるkー値の統一的評価を行うことを試み、概ね評価できた。しかし、置換率の影響が大きく、今後は鉱物組成に基づく詳細な検討ならびに更なるデータ蓄積による包括的検討を行う必要があり、この点を今後の課題とする。上記は水中養生を行いフライアッシュが強度発現性能を充分に発揮できる条件においての検討であった。実際の養生条件におけるフライアッシュの活用を検討するため、内部養生によるフライアッシュコンクリートの性能向上についても検討した。早強ポルトランドセメントを使用し、フライアッシュ置換率(20%および40%)、廃瓦骨材の置換率を要因として、強度発現性状および中性化性状を検討した。内部養生を直接的に把握するため、コンクリート内部湿度も経時的に計測した。この結果、内部養生材を混入した場合の内部湿度は、内部養生材を混入していないものと比較して、乾燥暴露条件下においても比較的高い湿度を維持できるとわかった。またこれにより、強度増進や中性化抵抗性向上などが得られた。材料構成に基づくフライアッシュの強度発現性能の評価が様々な環境条件においても適応できるように展開を目指す。土木工学研究実績に示したとおり、置換率、セメント種類を要因として、フライアッシュを混和したモルタルの圧縮強度発現に対するフライアッシュの貢献度についての検討を行い、これまでの知見と相違ないことを確認している。また、平成26年度のコンクリートを対象とした実験および検討を考慮し、先行してコンクリートの内部湿度の検討および内部養生材を用いたコンクリートにおける検討を行い、口頭発表を行った。しかし、当初の平成25年度計画である、材齢91日強度における検討および細孔径分布試験による細孔構造と関連づけた検討は、平成26年4月以降の実施となっているため、やや遅れていると評価した。今後は、平成25年度研究成果に継続して、モルタルを対象とした材齢91日における強度試験および細孔径分布試験を実施し、平成25年度成果と総合して基礎的知見の取りまとめを行う。また、コンクリートを対象とした検討に進み、フライアッシュおよびセメントの材料特性と配合条件からフライアッシュの強度発現性能を予測する手法の確立を目指す。
東海湖堆積盆地の発生過程と掛川新第三系堆積盆地発展過程との関連性

(1)知多半島の東海層群の火山灰層のフィッション・トラック年代測定を行い,以下の結果を得た.1)東谷火山灰層(上部の層準)・・・・・・・・・・3.6±0.2Ma2)大谷火山灰層(中部の層準)・・・・・・・・・・4.2±0.2Ma3)"豊浦"火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・3.7±0.6Ma(2)科研費とは別の研究費(名城大学および地質調査所)をも使用して,そのほかの火山灰層の年代測定も行い,以下の結果を得た.4)白沢の池火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・5.7±0.3Ma5)河和山火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・・4.3±0.8Ma6)古布火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・・・・4.5±0.5Ma7)矢梨ピンク火山灰層(基底の層準)・・・・・・・・6.5±0.6Ma(3)東谷,大谷,白沢の池,および矢梨ピンクの火山灰層は,火山灰層序的にも矛盾のない年代値と考えられる.(4)そのほかの火山灰層の年代値は,やや問題があり,年代値の当否・信頼性も含め,知多半島の東海層群の火山灰層序・層準・地質構造などについて,再検討が必要と判断され,現在,鋭意検討中である.(5)相良・掛川層群と東海層群の火山灰層の中で,互いに対比できるものがあるかどうか検討した結果,対比可能な火山灰層のあることが判明した.現在,さらに確定的な結果を得るために,鋭意検討中である.(1)知多半島の東海層群の火山灰層のフィッション・トラック年代測定を行い,以下の結果を得た.1)東谷火山灰層(上部の層準)・・・・・・・・・・3.6±0.2Ma2)大谷火山灰層(中部の層準)・・・・・・・・・・4.2±0.2Ma3)"豊浦"火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・3.7±0.6Ma(2)科研費とは別の研究費(名城大学および地質調査所)をも使用して,そのほかの火山灰層の年代測定も行い,以下の結果を得た.4)白沢の池火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・5.7±0.3Ma5)河和山火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・・4.3±0.8Ma6)古布火山灰層(下部の層準)・・・・・・・・・・・・4.5±0.5Ma7)矢梨ピンク火山灰層(基底の層準)・・・・・・・・6.5±0.6Ma(3)東谷,大谷,白沢の池,および矢梨ピンクの火山灰層は,火山灰層序的にも矛盾のない年代値と考えられる.(4)そのほかの火山灰層の年代値は,やや問題があり,年代値の当否・信頼性も含め,知多半島の東海層群の火山灰層序・層準・地質構造などについて,再検討が必要と判断され,現在,鋭意検討中である.(5)相良・掛川層群と東海層群の火山灰層の中で,互いに対比できるものがあるかどうか検討した結果,対比可能な火山灰層のあることが判明した.現在,さらに確定的な結果を得るために,鋭意検討中である.(1)静岡県の掛川・相良地方に露出する相良層群のうち,知多半島の東海層群とほぼ同層準と推定される層準について,地質調査を行った.(2)同時に,火山灰層の試料を採集し,火山ガラス屈折率の精密測定を行った.それらの屈折率は,Nd=1.4951.525の範囲にある.(3)知多半島の東海層群のうち,下半部にはさまれる火山灰層の試料を採集し,火山ガラス屈折率の精密測定を行った.それらの屈折率は,Nd=1.4951.520の範囲にある.(4)知多半島の東海層群のうち,上半部にはさまれる火山灰層1枚について,フイッション・トラック(F-T)年代測定を行った.この火山灰層の年代は,T=4.0±0.3Maと測定された.(5)相良層群と東海層群の火山灰層のなかで互いに対比できるものがあるかどうか,得られた屈折率を中心にして,岩質・層準なども考慮しつつ,現在検討中である.(6)得られたF-T年代値は,当初推定していたものより,100150万年も古く出てしまった.このことから,推定の根拠そのものが誤りであったのか,あるいは年代値に問題があるのか,現在検討中である.(7)もし,推定の根拠そのものに問題があったとすれば,知多半島の東海層群の層序・層準について,再検討が必要になる.(1)知多半島の東海層群のうち,下半部にはさまれる火山灰層の試料を採集し,火山ガラス屈折率の精密測定を行った.それらの屈折率は,Nd=1.4951.520の範囲にある.(2)知多半島の東海層群のうち,上半部にはさまれる火山灰層1枚について,昨年度,フイッション・トラック(F-T)年代測定を行ない,年代値T=4.0±0.3Maを得た.

しかし,この値は,層序学的に予想される値とやや異なっていたため,さらに,念入りに,再測定を試みた.その結果,T=3.6±0.2Maという年代値が得られ,この値は確定的と判断した.(3)知多半島の常滑層群のうち,中部にはさまれる火山灰層1枚について,フイッション・トラック(F-T)年代測定を行ない,年代値T=4.2±0.2Maを得た.この値は,層序学的に予想される従来の値とほぼ同じであったため,この値は確定的と判断した.(4)知多半島の常滑層群のうち,下部にはさまれる火山灰層1枚について,フイッション・トラック(F-T)年代測定を行ない,年代値T=3.7±0.6Maを得た.この値は,層序学的に予想される従来の値とは著しく異なっており,検討が必要である.(5)もし,(4)の年代値が信頼できるものとすれば,知多半島の東海層群の層序・層準・地質構造について,再検討が必要になる.(6)相良層群と東海層群の火山灰層のなかで互いに対比できるものがあるかどうか,得られた年代値・屈折率を中心にして,岩質・層準なども考慮しつつ検討した結果,対比可能な火山灰層のあることが判明した.現在,鋭意検討中である.1.前年度までの研究で,知多半島の東海層群にはさまれる火山灰層と,相良・掛川地域の新第三系にはさまれる火山灰層とで,互いに対比可能と判断できるものが,少なくとも1層あることが判明した.東海層群のものについてはすでに年代測定がなされているので,相良・掛川地域の対応する火山灰層のフィッション・トラック年代測定を行った.ところが,思うような結果が得られず,現在その原因について,検討を行っている.2.前年度までの研究で,知多半島の東海層群の火山灰層のフィッション・トラック年代植に,予想すらできなかった値をもつものが複数あることが明らかになっていた.これが何を意味するのか?検討を重ねるとともに,新たに別の火山灰層の年代測定を行った.しかし,得られた年代値もさることながら,測定試料としても,問題があるようにも見受けられ,こちらについても,その原因の検討を行っている.3.前年度までの年代測定結果は,本研究費で行ったもののほか,別の研究費で行ったものと併せて,とりあえず,学会誌に公表することとした.その原稿はほぼ完成し,平成9年夏までには,投稿できる予定である.
卵巣摘出と咬合の変化がラット顎関節に及ぼす影響について

卵巣摘出によるエストラジオールの減少と、臼歯削合による咬合の変化により惹起された顎関節の変化が、卵巣摘出後にエストラジオールを投与することにより、回復しうるかどうかを検討した。予備実験により決定された投与量のエストラジオールを一日一回、大腿部筋肉内に注射投与(間欠的投与)することにより、組織学的にみられた関節頭の変性、退行性変化が軽減されていた。また、関節頭表面の軟骨層の厚径においてもエストラジオール投与による回復傾向がみられ、2週目にはコントロール群と有意差がみられなくなっていた。骨形態計測においても、卵巣摘出群における骨量の減少はエストラジオール投与により抑制され、卵巣摘出+咬合変化群においては、逆に2週目には骨量の増加傾向も認められた。骨量の増加傾向がみられた理由としては、エストラジオールの投与量が生理的範囲を越えていたか、あるいは咬合の変化による影響と考えられた。以上の結果より、卵巣摘出により惹起された顎関節の変化が、卵巣摘出後にエストラジオールを投与することにより回復しうることが確認され、女性ホルモンが顎関節のリモデリングに関与していることが推察された。今後、持続的に投与した場合、間欠的投与との間に差が見られるかどうか、また、投与量を増やし、過剰投与の場合にはどうかなどを検討して行く予定である。
肝細胞癌特異的結合ペプチド付加抗癌剤の開発

癌細胞に特異的に結合するペプチドが同定できれば、そのペプチドで抗癌剤を修飾し、癌組織により高濃度に、また非癌部組織により低濃度に抗癌剤を分布させ、効果を高めつつ副作用の低減を図ることが可能となる。当研究では、ファージライブラリーを用いたバイオパンニング法という方法で、肝細胞癌に特異的に結合するペプチドを同定した。同ペプチドを提示したファージ、ならびにビオチン修飾した同合成ペプチドを用いて、各種悪性腫瘍由来細胞株ならびに肝細胞癌手術切除標本において、その肝細胞癌結合性を確認した。HBP提示ファージによる肝細胞癌特異的結合性は確認されたが、ファージ自体による結合性修飾の可能性を除去するため、HBPを化学的に合成し、これを用いて各種消化器癌由来細胞株、ならびに手術切除標本から得られた臨床検体を用いて、HBP自体の肝細胞癌特異的結合性の確認を行った。その結果、HBPは肝細胞癌以外の細胞株ならびに非癌部肝組織に比べ、肝細胞癌由来細胞株ならびに肝細胞癌組織により強く結合が認められた。以上の結果を、第107回日本外科学会定期学術集会ならびに第62回日本消化器外科学会定期学術集会総会において報告した。さらに、HBPを化学合成し、ビオチン修飾HBPを用いてHCC結合性の確認を行った。その結果、HBPはHCC以外の細胞株ならびに非癌部肝組織に比べ、HCC由来細胞株ならびにHCC組織により強く結合が認められた。BALB/cヌードマウスを用いてHCCモデルを作成し、ビオチン修飾HBPを尾静注し、HCC組織・背景肝組織・各種臓器組織を採取して、免疫染色にてHBP結合性を比較した。その結果、HBPは癌組織により強い結合を認めたが、背景肝組織ならびに他の正常組織にも結合が認められた。HBP結合対象となるHCC細胞の膜タンパク質の同定を、ウェスタンブロッティングならびに免疫沈降を応用した手技で試みたが、単一膜タンパク質の同定はできなかった。以上より、HBPはHCC結合性を有するが、複数の膜タンパクを認識している可能性、また結合する膜タンパクはHCC以外の細胞にも表出している可能性が考えられた。
脊柱靭帯骨化を起す間葉系幹細胞の異常の機序解明とそれに基づく治療薬の標的探索

本研究の柱は、脊柱靭帯の異所性骨化の機序を明らかにし、薬物治療の標的を見出すことである。我々は、これまでに脊柱靭帯の異所性骨化をもたらす本体が靭帯組織の間葉系幹細胞(MSC)であることを明らかにしてきた。本研究では、更に骨化患者の靭帯組織のMSCがどのように骨化に関与するかを明らかにする為、正常時と骨化病変時におけるMSCの局在を免疫組織化学並びに細胞化学的に解析した。その結果、1)正常時には靭帯組織にわずかに存在する血管の周囲にMSCは局在すること、一方で、2)骨化進展時にはそのMSCが病変部に移動して来ることを明らかにした。さらに、3)MSCの調節因子SDF-1とその受容体CXCR4がMSCに発現しており、4)患者由来のMSCではSDF-1/CXCR4が骨化病変部に強く発現していることを明らかにした。また患者由来のMSCを用いたインビトロ実験では、MSCの運動性並びにSDF-1に対する走化性は、CXCR4阻害薬によって抑制されることを見出した。これらの結果から、骨化の機序は次のように考えられた。すなわち、本来靭帯を修復する役割を持つMSCが損傷した靭帯の該当部位に移動し、靭帯組織の修復を図る。しかし、骨化患者のMSCは骨分化能が高く、SDF-1/CXCR4系の誘導によって骨化病変部に遊走したMSCsは、靭帯修復ではなく骨化を促進する可能性が考えられた。次に、内軟骨性骨化を抑制するコンドロモジュリン-1遺伝子の発現調節を解析した所、その発現調節部位が骨化患者由来MSCでは、非骨化患者由来MSCに比して強くメチル化を受けていて、その蛋白発現および機能発現が著しく抑制を受けていることを見出した。これはコンドロモジュリンが強くメチル化を受けて機能を抑制されると、骨化抑制を阻止できず、骨化が進展するという我々の仮説を支持する結果であった。脊柱靭帯の異所性骨化の発症機序を解明し、薬物治療の標的を見出すことが本研究の主題であり、その解明により、標的となりうるものを見出すことができたため。発症において重要な役割を果たすSDF-1/CXCR4経路の関与を見出したので、今後はその特異的阻害物質のスクリーニングを行い、治療薬のシーズ探索を行う予定である。また、DNAメチル化に依って発現調節を受け、骨化に関与する遺伝子を探索するべく、当大学研究科に導入された、次世代シークエンサーを用いたDNAメチル化の網羅的解析を始めている。それによって、骨化促進刺激によって変動するDNAメチル化の全貌を明らかにし、骨化の機序解明につなげたいと考えている。脊柱靭帯の異所性骨化の本体が間葉系幹細胞(MSC)であることを我々は既に明らかにしている。本研究では、なぜ骨化患者の靭帯組織のMSCが、正常組織のMSCに比べて、骨化しやすいのかを明らかにすることが第一の目標である。そのためには、研究資源である多数の間葉系幹細胞のセルラインの確立が欠かせない。十分なインフォームドコンセントを得た上で、手術時に摘出廃棄する靭帯組織を得て、そこから間葉系幹細胞を単離培養した(分担研究者和田)。これまで約300ほどの骨化組織由来MSCを確立した。ただ、そのコントロールとなる非骨化患者由来のMSCのセルライン数が、手術適用例が少ないために十分とはいえない。そこで更に充実させるべく、関連病院との連携のもと、収集を図っている。次に、骨化の機序として、我々はゲノムDNAのメチル化というエピジェネティックな機序に注目し、骨化関連の遺伝子のメチル化を両組織間で比較した。注目すべきは、コンドロモジュリン1という蛋白で、その遺伝子の発現調節部位が骨化組織由来MSCでは、正常MSCに比して強くメチル化を受けていて、その蛋白発現および機能が著しく抑制を受けていた。コンドロモジュリンは、軟骨組織で多く発現しており、骨組織への移行を阻止する役割を持つ。靭帯の骨化は内軟骨性骨化の過程をたどり、軟骨細胞の出現とその後の骨転換が起こるが、コンドロモジュリンは強くメチル化を受けて機能を抑制されると、その移行を阻止できず、骨化が進展するという我々の仮説を支持する結果が得られた。今後、コンドロモジュリンのメチル化以降、骨化につながる機序を解明してゆく予定である。一方、治療薬の基となる薬物の探索も並行して行っている。ヒスタミンH2受容体阻害薬のファモチジンが易骨化モデルマウスTWYマウスに投与すると、靭帯の骨化を著明に抑制することが明らかになった。現在その機序の解析を進めている。当初予定していた、マウスに患者由来のMSCを移植して、実際に骨化が誘発されやすいかどうかを調べる実験が、実験動物入手などの点で未着手になっているため。

さらに、3)MSCの調節因子SDF-1とその受容体CXCR4がMSCに発現しており、4)患者由来のMSCではSDF-1/CXCR4が骨化病変部に強く発現していることを明らかにした。また患者由来のMSCを用いたインビトロ実験では、MSCの運動性並びにSDF-1に対する走化性は、CXCR4阻害薬によって抑制されることを見出した。これらの結果から、骨化の機序は次のように考えられた。すなわち、本来靭帯を修復する役割を持つMSCが損傷した靭帯の該当部位に移動し、靭帯組織の修復を図る。しかし、骨化患者のMSCは骨分化能が高く、SDF-1/CXCR4系の誘導によって骨化病変部に遊走したMSCsは、靭帯修復ではなく骨化を促進する可能性が考えられた。次に、内軟骨性骨化を抑制するコンドロモジュリン-1遺伝子の発現調節を解析した所、その発現調節部位が骨化患者由来MSCでは、非骨化患者由来MSCに比して強くメチル化を受けていて、その蛋白発現および機能発現が著しく抑制を受けていることを見出した。これはコンドロモジュリンが強くメチル化を受けて機能を抑制されると、骨化抑制を阻止できず、骨化が進展するという我々の仮説を支持する結果であった。脊柱靭帯の異所性骨化の発症機序を解明し、薬物治療の標的を見出すことが本研究の主題であり、その解明により、標的となりうるものを見出すことができたため。患者にとって、骨化の予防、進行抑制出来る安全な薬物治療の開発が喫緊の課題である。そこで、病因の解明とともに、骨化を抑制する薬物の探索を重点的に行いたい。現在、既存薬であるが、候補がいくつか見つかっている。それをまず手がかりに構造活性相関等の手法を用いて新たな薬物の創出を行いたい。発症において重要な役割を果たすSDF-1/CXCR4経路の関与を見出したので、今後はその特異的阻害物質のスクリーニングを行い、治療薬のシーズ探索を行う予定である。また、DNAメチル化に依って発現調節を受け、骨化に関与する遺伝子を探索するべく、当大学研究科に導入された、次世代シークエンサーを用いたDNAメチル化の網羅的解析を始めている。それによって、骨化促進刺激によって変動するDNAメチル化の全貌を明らかにし、骨化の機序解明につなげたいと考えている。当初計画していたDNAメチル化の網羅的解析の準備が年度内に進まず、その受託解析依頼分の経費が繰り越したため、次年度使用額が生じた。次年度に実施を予定している。当初計画していたヒト脊椎靭帯由来間葉系幹細胞のDNAメチル化網羅的解析の準備が若干遅れ、実際の開始が次年度にずれ込んだため。次年度の実験消耗品へ充当する予定である。