hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複数時間ウィンドウでの哺乳類脳操作を実現する薬剤誘導性人工遺伝子スイッチ開発

申請者は哺乳類以外の生物種(細菌、酵母、植物、昆虫、両生類)の遺伝子発現系を基に、複数の薬剤誘導性遺伝子発現スイッチを作製し、哺乳類脳において特定の機能に関連する神経細胞集団を時間軸に沿って遺伝学的に切り分ける技術開発を行っている。平成29年度にはアメリカのマサチューセッツ工科大学Ian Wickersham研究室で、設計した遺伝子スイッチを用いた標識法の検討実験を行った。「複数時間ウィンドウ」の実現には誘導は一過性でありながら、その長期間細胞内に残る標識が必要とされる。申請者はその標識の候補として、近年複数の種類が報告されているセリンインテグラーゼ(Yang, et al, Nat Methods, 2014)という遺伝子組み換え酵素を選択した。Streptomyces scabiei 87.22由来のInt2、Geobacillus sp Y412MC61由来のInt7、Staphylococcus lugdunensis N920143由来のInt12を選抜し哺乳培養細胞で実験を行った。大腸菌における文献の結果と異なりInt2はHEK293細胞において認識配列であるattB2/attP2の組み換えを起こさなかった。一方でInt7は認識配列であるattB7/attP7のみを、Int12はattB12/attP12のみを組み換え蛍光タンパクを発現させた。以上からInt7とInt12のペアは哺乳培養細胞で機能することが証明され、異なるスイッチの下流で発現させる酵素として適当と考えられた。またこれまでにGeobacillus sp Y412MC61由来のInt7、Staphylococcus lugdunensis N920143由来のInt12といったセリンインテグラーゼを哺乳細胞で使用した例は報告されておらず、これが初めての哺乳細胞における成功例であると考えられる。既にin vivoで機能することが示されたスイッチ1種類については、その化合物摂取期間と誘導される遺伝子の発現量の関係を時系列に沿って定量的に測定する予定である。両側の海馬にスイッチを発現させ、個体ごとに化合物の摂取期間を振って右側の海馬を薄切し、左側の海馬をWesternblotにかけることで定性的及び定量的な測定を行う。またTet systemにおいて最初にOFFスイッチが作製され、次にONスイッチが作製されたように、このスイッチについても両方のスイッチを作製出来ないかと検討を重ねている。申請者が見出したスイッチはX線結晶構造解析のデータから、目的とする化合物が結合することで、アロステックな構造変化を起こし特定のDNA配列に結合することが分かっている。アミノ酸変異のアロステリックな構造変化に与える影響をin siliconで予測することは今なお困難であるため、このスイッチを内在性に持った生物種において目的とする変異体の報告があるかどうかを探している最中である。また残るスイッチ候補についても、in vivo実験を計画しており、レンチウイルスベクター作製用plasmidへの組み換えを予定している。
分子情報に基づく超臨界含浸プロセスの設計と眼科薬物輸送システム創製への展開

超臨界含浸を利用した眼科ドラッグデリバリーシステムの作製プロセスにおいて,含浸条件,水添加と薬物放出挙動との関連性について把握した.超臨界二酸化炭素に対する薬物の溶解度と,ハイドロゲル中への薬物含有量には相関関係があることを確認した.また,超臨界含浸プロセスで不可欠となる超臨界二酸化炭素相と水相間における薬物の分配係数に関する理論モデルを構築した.理論モデルには,薬物分子,水分子が形成する水素結合を考慮した局所組成モデルを導入した.超臨界含浸プロセスを利用し,ハイドロゲル中の薬物拡散抑制剤であるVitamin Eの導入を行った.従来の液体溶媒含浸と比較し,含浸時間を大幅に削減できた.ソフトコンタクトレンズに薬物を含浸させたドラッグデリバリーの作製において,超臨界二酸化炭素を含浸溶媒として利用する技術を適用した.薬物のモデル成分としてサリチル酸を,コンタクトレンズには,含水率59%の高含水性のHilafilcon Bを用いた.予め薬物とコンタクトレンズを導入した含浸セルへ高圧二酸化炭素を供給し,薬物を高圧二酸化炭素に溶解させ,コンタクトレンズに接触させることでドラッグデリバリーレンズを作製した.作製したドラッグデリバリーレンズについて,pH 6.8のリン酸緩衝水溶液中において,ドラッグデリバリーレンズからの薬物放出量の測定を行った.1030分毎に8時間,水溶液中の薬物濃度を紫外可視分光光度計により測定した.水溶液中で作製されたレンズでは,約10分程度で,サリチル酸がすべて放出されるのに対して,高圧二酸化炭素中にて作製したドラッグデリバリーレンズでは,約400分程度で放出される徐放性が示された.また,圧力が増大するに伴い,レンズ中のサリチル酸が増加する相関性がみられた.さらに,高圧二酸化炭素に対するサリチル酸の溶解度と,ドラッグデリバリーレンズ中の含有量には,線形的な相関性があることが確認された。このように,高圧二酸化炭素を利用したドラッグデリバリーレンズの作製条件と,薬物放出挙動ならびにレンズ中の薬物量との関連性を把握した.超臨界含浸法を利用したドラッグデリバリーレンズの作製においては,用いるコンタクトレンズがハイドロゲルであることから,高圧下における二酸化炭素+水系の相平衡挙動を把握することも不可欠となる.本研究では,上述した超臨界含浸法によるドラッグデリバリーシステムの作製とともに,状態方程式を用いた二酸化炭素+水系の相平衡理論モデルの構築にも着手しており,分子間相互作用と相平衡計算精度との関連性について検討している.眼科レンズ用に合成したシリコンハイドロゲルへのNorfloxacinの含浸について,超臨界二酸化炭素利用したプロセスの操作因子と,眼科レンズからのNorfloxacinの放出挙動について検証を行った.超臨界二酸化炭素を利用した含浸法として,超臨界二酸化炭素中に直接Norfloxacinを溶解させるSupercritical Solution Impregnation (SSI)法と,超臨界二酸化炭素を接触させた水相中において眼科レンズの含浸を行う,Pressurized-CO2 and Aqueous Impregnation (PCAI)法を適用した.また,シリコンハイドロゲルを合成する際には,親水性を有するN,N-dimethylacrylamide (DMA)と,疎水性を有する3-methacryloxypropyltris(trimethylsiloxa) silane (TRIS)の比を変えたハイドロゲルを作製し,Norfloxacinの放出挙動に及ぼす影響について考察した.作製したシリコンハイドゲルの熱分解性について,熱重量分析装置により測定した.SSI法により作製した眼科レンズからのNorfloxacinの放出挙動では,含浸工程における水和の有無が,Norfloxacinの含有量ならびに放出挙動に影響を与えることが確認された.また,親水性のDMAの含有比が大きいシリコンハイドロゲルに対して,Norfloxacinの含有量も増大することが確認された.PCAI法において,水溶液のみの含浸プロセスであるAqueous Impregnation (AI)法と比較して,Norfloxacinの含有量は減少した.これは,超臨界二酸化炭素と水相が接触することで,水中のpHが下がり,ハイドロゲルへのNorfloxacinの分配が低下したためであると考えられる.超臨界二酸化炭素を媒体としたシリコンハイドロゲルへのVitamin Eの含浸を行い,眼科薬物として用いたtimolol maleateの放出速度を抑制することが可能となった.Vitamin Eはハイドロゲル内の薬物成分の拡散を抑制する効果があることは把握されていたが,その含浸において1週間程度の長時間を有するという問題が懸念されていた.本研究で提案し超臨界二酸化炭素によるVitamin Eの含浸においては,30分程度でtimolol maleateの拡散抑制に十分なVitamin Eを導入することが可能となった.しかしながら,超臨界二酸化炭素中における含浸では,timolol maleateが超臨界二酸化炭素中へ抽出される点が懸念されたが,あらかじめシリコンハイドロゲルに水分を含有させハイドロゲル中のtimolol maleateをイオン化させることで,超臨界二酸化炭素中への抽出を抑制することも確認された.ここでは,超臨界二酸化炭素を利用した含浸プロセスにおいて,シリコンハイドロゲルに含浸されたVitamin E量と,timolol maleateの拡散挙動との関連性を定量的に把握しており,コンタクトレンズを利用した眼科薬物輸送システムの設計指針の確立に向けた基盤を構築した.また,超臨界二酸化炭素を利用した含浸プロセスにおいては,あらかじめ導入した薬物の抽出が懸念されるため,プロセス操作においては,超臨界二酸化炭素相と水相間における薬物の分配に関する知見を把握することが不可欠となる.本研究では,局所組成の概念を導入した状態方程式を開発し,超臨界二酸化炭素相と水相間における薬物の分配係数の計算を行い,本理論モデルが適用可能であることを確認した.超臨界含浸を利用した眼科ドラッグデリバリーシステムの作製プロセスにおいて,含浸条件,水添加と薬物放出挙動との関連性について把握した.

超臨界二酸化炭素に対する薬物の溶解度と,ハイドロゲル中への薬物含有量には相関関係があることを確認した.また,超臨界含浸プロセスで不可欠となる超臨界二酸化炭素相と水相間における薬物の分配係数に関する理論モデルを構築した.理論モデルには,薬物分子,水分子が形成する水素結合を考慮した局所組成モデルを導入した.超臨界含浸プロセスを利用し,ハイドロゲル中の薬物拡散抑制剤であるVitamin Eの導入を行った.従来の液体溶媒含浸と比較し,含浸時間を大幅に削減できた.眼科薬物としてNorfloxacinに対して,超臨界二酸化炭素を利用したシリコンハイドロゲルの含浸プロセスにおいて,当初計画していた超臨界二酸化炭素を直接的な含浸媒体として利用するSupercritical Solution Impregnation (SSI)法に加え,水相に超臨界二酸化炭素を接触させたPressurized-CO2 and Aqueous Impregnation (PCAI)法による含浸プロセスにも着手しており,当初の計画以上に進展している.SSIとPCAIを利用した含浸プロセスにおいて,それぞれの操作因子と,眼科レンズからのNorfloxacinの放出,ならびに眼科レンズ中のNorfloxacinの含有量について,系統的なデータを蓄積した.その結果,両手法において,超臨界二酸化炭素の効果により,Norfloxacinがシリコンハイドロゲルの内部にまで含有され,眼科レンズからの放出挙動において,徐放的な放出が確認された.27年度が最終年度であるため、記入しない。超臨界流体工学これまでの成果により,SSI法ならびにPCAI法において,超臨界二酸化炭素の効果により,眼科レンズへの薬物の徐放的な放出が達成されることが可能となることが示唆されている.今後の研究推進として,ここで示した薬物の徐放性をさらに促進するために,シリコンハイドロゲルの界面活性剤の添加について検証を行う.界面活性剤をシリコンハイドロゲルへ添加する際にも,界面活性剤をゲル内部まで含有させる手法として,超臨界二酸化炭素の効果が期待できる.さらに,SSI法におけるプロセス設計において必要となる超臨界二酸化炭素に対する薬物溶解度,PCAI法のプロセス設計において必要となる薬物の超臨界二酸化炭素相/水相間の分配について,局所組成を導入した状態方程式を提案し,それぞれの挙動を把握する.超臨界二酸化炭素を含浸溶媒として用いた眼科用のドラッグデリバリーシステムの作製においては,超臨界二酸化炭素に対する薬物の溶解度と,レンズ中の薬物量との関係に相関性があることを確認した.
低出力間歇的超音波物理療法による血管新生誘導を利用した褥瘡治療に関する研究

褥瘡に対する超音波療法の有効性を明らかにするためにヒト皮膚線維芽細胞の血管新生因子(PGE_2、bFGF、HGF、VEGF)産生に及ぼす超音波の影響を検討した。低出力超音波を細胞培養系に照射(7.5mW/m^2、20分)し経時的にmRNAを分離、逆転写後、PGE_2産生酵素であるCOX-1およびCOX-2、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現誘導をreal time PCR法を用いて半定量した。構成的に発現しているCOX-1に比較して誘導型酵素であるCOX-2のmRNA発現は照射直後から有意に増加した。また、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現は、照射240分後には有意な発現を認めた。次に、COX-2選択的阻害剤NS-398の存在下で実験を行ったが、bFGF mRNAの発現はNS-398の存在下でも誘導された。すなわち、低出力超音波はヒト皮膚線維芽細胞の血管新生因子産生を直接刺激することにより血管新生を促進し、創傷治癒に有効である可能性が大きい。次に、超音波による直接的な血管新生誘導を検討するために、鶏胎芽尿漿膜血管モデルについて検討したが、有効な刺激を与えることができず、今回は超音波照射が鶏胎芽尿漿膜血管新生を直接刺激するかどうかは、明らかにできなかった。最後に、今後の臨床現場での褥創に対する超音波療法の基礎データとするために、創傷被覆材の超音波透過性について検討した。フィルムドレッシング材は高い超音波の透過性を示すことが明らかとなったが、ハイドロコロイドドレッシング材は材質により超音波透過率の差を認めた。すなわち、創傷に対する超音波照射では、創傷被覆材の超音波透過率を考慮しなければ、褥創表面に適度な超音波が到達せず、超音波による創傷治療効果の有無を検討することはできない。このことは、今後、超音波照射を褥創治療に臨床応用する場合においても、必ず解決しなければならない課題である。褥瘡などの組織損傷治療に対する超音波照射療法の有効性を明らかにするために、ヒト皮膚線維芽細胞からの血管新生因子(プロスタグランディンE_2(PGE_2)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF))産生に及ぼす低出力超音波照射の影響を検討した。臨床的に骨折治療に用いられる強度と同程度の低出力超音波をヒト皮膚線維芽細胞単層培養系に照射(7.5mW/m^2、20分)し、経時的にヒト皮膚線維芽細胞からmRNAを分離、逆転写後、PGE_2産生酵素であるシクロオキシゲナーゼ(COX)-1およびCOX-2、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現誘導の有無をreal time PCR法を用いて半定量した。ヒト皮膚線維芽細胞に7.5mW/m^2の低出力超音波を照射したところ、構成的に発現しているCOX-1のmRNA発現は低出力超音波照射の影響を受けなかったが、誘導型酵素であるCOX-2のmRNA発現は照射直後から非照射群に比較して有意に増加した。また、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現は、COX-2mRNA

発現誘導と異なり、照射直後および60分後には非照射群と比較して有意な差は認められなかったが、照射240分後には非照射群と比較して有意なmRNAの発現誘導を認めた。すなわち、低出力超音波照射が照射直後にヒト皮膚線維芽細胞のPGE_2産生を促進することから、今回の超音波照射によるbFGF、VEGF、HGF産生促進が直接的な作用ではなく、PGE_2産生を介した間接作用である可能性も否定はできないが、低出力超音波照射はヒト皮膚線維芽細胞の血管新生因子産生を介して創傷部の血管新生を促進し、褥瘡などの創傷治癒に有効である可能性が大きいと考える。褥瘡に対する超音波療法の有効性を明らかにするためにヒト皮膚線維芽細胞の血管新生因子(PGE_2、bFGF、HGF、VEGF)産生に及ぼす超音波の影響を検討した。低出力超音波を細胞培養系に照射(7.5mW/m^2、20分)し経時的にmRNAを分離、逆転写後、PGE_2産生酵素であるCOX-1およびCOX-2、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現誘導をreal time PCR法を用いて半定量した。構成的に発現しているCOX-1に比較して誘導型酵素であるCOX-2のmRNA発現は照射直後から有意に増加した。また、bFGF、HGF、VEGF mRNAの発現は、照射240分後には有意な発現を認めた。次に、COX-2選択的阻害剤NS-398の存在下で実験を行ったが、bFGF mRNAの発現はNS-398の存在下でも誘導された。すなわち、低出力超音波はヒト皮膚線維芽細胞の血管新生因子産生を直接刺激することにより血管新生を促進し、創傷治癒に有効である可能性が大きい。次に、超音波による直接的な血管新生誘導を検討するために、鶏胎芽尿漿膜血管モデルについて検討したが、有効な刺激を与えることができず、今回は超音波照射が鶏胎芽尿漿膜血管新生を直接刺激するかどうかは、明らかにできなかった。最後に、今後の臨床現場での褥創に対する超音波療法の基礎データとするために、創傷被覆材の超音波透過性について検討した。フィルムドレッシング材は高い超音波の透過性を示すことが明らかとなったが、ハイドロコロイドドレッシング材は材質により超音波透過率の差を認めた。すなわち、創傷に対する超音波照射では、創傷被覆材の超音波透過率を考慮しなければ、褥創表面に適度な超音波が到達せず、超音波による創傷治療効果の有無を検討することはできない。このことは、今後、超音波照射を褥創治療に臨床応用する場合においても、必ず解決しなければならない課題である。
非対称微小構造体を用いた二次元分子分別システムの構築

脂質二分子膜は準安定状態にあり流動的な構造を持つことから特異的な分子操作の場として注目されている。こうした脂質膜の物理化学特性を理解し制御するためには、膜内分子のランダムな熱運動を微小時空間領域で検出・制御することが重要である。自身の研究では、ブラウニアン・ラチェット機構に注目し、非対称な微小構造の分子への作用により、一定方向の分子運動を抽出する分子操作を検討してきた。また不均一膜内の分子運動を単分子レベルで測定する手法を確立し、脂質膜本来の機能である膜導入分子との親和性に基づく局所的な分子分配能を積極的に用いた選択的分子操作を可能としてきた。従って、採用最終年度である本年度は分子拡散方向を微小空間にて制御可能なラチェット機構と、分子運動性を膜状態により制御可能な人工脂質二分子膜とを組み合わせることで、新規な構造体形状の創出を通し、広範な分子群に適応可能な新規膜内分子操作法を検討した。その結果流れの方向からの分子輸送方向の逸脱度合いを示す平均分別角度は通常構造を用いた場合に比べ狭小構造では二倍、流路構造では三倍程度の角度を伴って輸送方位に対して垂直方位へと偏在化した。この実験的な偏在度合いに対して、拡散シミュレーションを用いた計算結果との比較から考察を行った結果、実験と計算との違いは、構造体間隙部での拡散媒質である展開膜の不均一性に由来すると考えられた。これより、本結果はそれぞれ狭小構造間隙部での分子排斥および流路内における輸送速度減少により、ラチェット構造への衝突頻度増加に起因する付加的な偏在化発現に起因すると考えられる。本研究より既存の操作機構では拡散方向の制御が困難な蛍光脂質分子に対し、微小空間での展開膜構造変調とラチェット効果とを協奏的に発現させた結果、効果的な膜内分子操作が可能となった。脂質二分子膜上での高選択的な分子操作は、生体分子を対象とした微小場・微少量試料分析システム構築に重要である。これまで私は非バイアス下での分子輸送を可能とする脂質二分子膜の自発的展開挙動と、分子拡散性に基づいた分別が達成可能なブラウニアン・ラチェット機構を組み合わせることで、タンパク質Cholera Toxin B (CTB)とこの膜内レセプターganglioside GM1 (GM1)により形成される会合数の異なる複数の分子会合体を分別可能であることを示してきた。しかし、これらの会合体は経時的に複数の拡散状態間を遷移するため拡散係数を一義的に決定することが困難であった。そこで本年度は分子拡散性の揺らぎが小さい蛍光修飾脂質Texas Red【○!R】DHPEを用い、より定量的な分別効率評価を試みた。実験手順として、まずSiO2基板上に構造体短辺長aが250nmのCr/Au非対称金属構造を構築し、本基板上を自発的に展開するegg-PC脂質二分子膜内Texas Red【○!R】DHPEに対し、全反射顕微鏡を用いた単一分子追跡を行い、その軌跡解析から分子運動性を評価した。自発展開膜の展開方位に対して平行方位における平均変位量から各追跡分子輸送速度vを算出し、垂直方位の平均変位量解析と併せて展開方位に対する輸送角度を算出した。個々の分子に対する輸送角度をa,および個々の分子におけるD、vにより決定されるラチェット分別効率決定パラメータD/vaに対してプロットしたところ、TR-DHPE系ではCTB-GM1系よりも高い分別効率が発現した。これは構造体間隙部における分子と構造体壁面との摩擦抵抗、または脂質膜の構造変化に起因するvの特異的減少などにより生じた差異であると考えられる。従って本分子分別機構ではD/vaには含まれない、分別対象分子の分子サイズや脂質膜との相互作用特性が強く分子分別効率に関与していると考えられる。以上、非対称構造障壁と脂質二分子膜自発展開挙動を組み合わせにより新規な分子分別機構を提案した。これまで私は非バイアス下での分子輸送を可能とする脂質二分子膜の自発的展開挙動と、分子拡散性に基づいた分別が達成可能なブラウニアン・ラチェット機構を組み合わせることで、タンパク質とこの膜内レセプタからなる複数の分子会合体を分別可能であることを示してきた。また本分別機構においては分子拡散性のみだけではなく、その分子配向についても議論する必要があることがわかってきた。従って、本年度は単一分子蛍光を観察することにより、単一分子の3次元配向情報を取得可能な手法の開発を行った。観察対象分子としてはガラス基板上に分散した長軸長さ200nm程度の金属ナノロッドを用いた。これを532nm励起光を用い、全反射条件にて散乱光を検出した。このとき、通常焦点面にあわせると輝点として単一蛍光は観察されるが、焦点面を数umで制御し光路に収差を導入することで分子発光ダイポールの電磁場分布に従った、つまり分子3次元配向が反映された蛍光強度の分布がイメージング可能である。本年度はこれらのイメージから分子配向を近似解析する手法を確立し、観察したAu粒子が単純な一次元的な散乱ダイポールで近似できるものと、それよりも高次の散乱ダイポールで近似できる2種類が存在することを明らかとした。特に高次の散乱ダイポールの由来はAu粒子の長軸、これに垂直な断面内での直交する2軸の短軸に由来するものであると考えられた。

現在、本手法を脂質二分子膜内の蛍光分子観察に応用することで、微小領域での膜構造情報を取得可能であることを示している。今後、金属構造と脂質二分子膜を組み合わせた、分子分別系へと応用することで、極微小領域での分子運動の抑制度合いをより定量的に求めることができ、新たな分別パラメータとして考慮可能である。脂質二分子膜は準安定状態にあり流動的な構造を持つことから特異的な分子操作の場として注目されている。こうした脂質膜の物理化学特性を理解し制御するためには、膜内分子のランダムな熱運動を微小時空間領域で検出・制御することが重要である。自身の研究では、ブラウニアン・ラチェット機構に注目し、非対称な微小構造の分子への作用により、一定方向の分子運動を抽出する分子操作を検討してきた。また不均一膜内の分子運動を単分子レベルで測定する手法を確立し、脂質膜本来の機能である膜導入分子との親和性に基づく局所的な分子分配能を積極的に用いた選択的分子操作を可能としてきた。従って、採用最終年度である本年度は分子拡散方向を微小空間にて制御可能なラチェット機構と、分子運動性を膜状態により制御可能な人工脂質二分子膜とを組み合わせることで、新規な構造体形状の創出を通し、広範な分子群に適応可能な新規膜内分子操作法を検討した。その結果流れの方向からの分子輸送方向の逸脱度合いを示す平均分別角度は通常構造を用いた場合に比べ狭小構造では二倍、流路構造では三倍程度の角度を伴って輸送方位に対して垂直方位へと偏在化した。この実験的な偏在度合いに対して、拡散シミュレーションを用いた計算結果との比較から考察を行った結果、実験と計算との違いは、構造体間隙部での拡散媒質である展開膜の不均一性に由来すると考えられた。これより、本結果はそれぞれ狭小構造間隙部での分子排斥および流路内における輸送速度減少により、ラチェット構造への衝突頻度増加に起因する付加的な偏在化発現に起因すると考えられる。本研究より既存の操作機構では拡散方向の制御が困難な蛍光脂質分子に対し、微小空間での展開膜構造変調とラチェット効果とを協奏的に発現させた結果、効果的な膜内分子操作が可能となった。単一分子の高精度な脂質二分子膜内分子分別システムの確立を目指している。これまで異種分子を用いることでの膜親和性の違い、構造障壁の密度などによりその分別効率が変化、制御可能であることが判った。当該年度においては上記の分別パラメータに加え、3次元分子配向性が大きく分別効率を変化させることがわかった。更には、この3次元分子配向を脂質二分子膜内にて単一分子観察する手法を世界で初めて成功させた。既に、本手法を用いた結果に基づき複数の論文作成を行っている。従って、当該年度の成果は当初の、膜内分子配向を観察する手法の確立という目標を十分達成し、さらに周辺領域の金属ナノ粒子やその他蛍光発光半導体ナノ粒子などへの応用も検討し論文化しているという点から本評価をするに至った。当該年度の成果から、脂質二分子膜内での分子分別系においては、3次元分子配向性が大きく分別効率を変化させることがわかった。また膜微小領域における単一分子の蛍光発光分布観察から、その分子配向性を直接的に評価可能な手法を確立した。今後はこの配向を積極的に制御し、分別効率を向上させるために新規に提案する形状の金属構造障壁を用いた実験を遂行する。
冠動脈粥腫の不安定性を定量評価しうるマルチファンクショナル血管内エコー法の開発

本研究を通じて、血管内エコー法を用いて、血管内腔表面にかかるシェアストレスのカラーマッピングを行うことに成功した。その結果、シェアストレスの局所集中点が将来の破裂点になる可能性が高いことが示唆され、冠動脈粥腫の不安定性を定量評価できる方法の一つを確立したことになる。さらに期間後半では、プラーク破裂の3次元的メカニズムの解明やMDCTの画像上でもシェアストレスの分布を表示できる方法を確立した。A.背景・目的:プラークの破裂は心血管イベントにおける重要な病態であることが知られている。プラークの破綻は物理的な現象であり、血圧に起因するプラーク内引っ張り応力がプラーク表面の一点に過重に掛かることがその一因として考えられている。しかしながら、血流に起因するシェアストレスとプラークの破綻との関係をin vivoで検討した報告はない。そこで、3次元血管内エコー法を用いて得られた血管内腔形状を元にして、血管内壁にかかるシェアストレスの分布をカラー表示するプログラムを開発し、プラークの破綻との関係を検討した。B.研究方法:まず3次元血管内エコー法から血管内腔形状を抽出し、その後有限要素法を用いた構造力学シミュレーションプログラムにより、シェアストレスの分布をカラー表示するプログラムをまず開発した。計算を簡易化するために、血流は定常層流であると仮定した。血管内腔形状を抽出する対象症例は、実際にプラークが破綻している箇所を確認した症例とした。プラークが破綻する前のプラーク形状は外挿法を用いて補間して推定した。(倫理面への配慮)血管内エコー法については、その保険適用基準にのっとって、通常の心臓カテーテル検査を行った患者のデータを利用したものであり、特別に検査を行って得たものではない。その心臓カテーテル検査についても、血管内エコー法を行うことを含めてあらかじめ同意を得たものである。:C.研究結果:プラークの破綻点は、局所にシェアストレスが上昇しているプラーク表面にほぼ一致していた。この一致性は、kappa値=0.79であることが示された。D.考察:シェアストレスの絶対値は、プラーク組織を破綻させるほど大きなものではない。従って、シェアストレスは内分泌器官とされる血管内皮の細胞機能を修飾し、間接的にプラーク破綻のトリガーとなっている可能性がある。E.結論:プラーク表面の局所的シェアストレスの上昇はプラークの破綻と関連していることが示唆された。この結果は、プラークの不安定性を評価する意味で重要な所見である。A.背景・目的:本研究初年度である平成19年において血管内エコー法によるシェアストレスのカラーマッピング法は将来のプラークの破綻点の推測に有用であることを報告した。そこで本年度はプラークの不安定性をより正確に評価するために、破綻のメカニズムをさらに詳細に解明し、また非侵襲的にもシェアストレスを表示するシステムを開発することを研究目標とした。B.研究方法:(1)血管内エコー法からプラーク破綻像を描出し、それを3次元画像構成することによって破綻のメカニズムを3次元的に解析した。そしてプラークの破綻像を3次元的に分類を試みた。(2)非侵襲的にシェアストレスのマッピング表示を行うために、MDCTからの画像を利用した。そしてMDCTから血管内腔形状を抽出し、その後有限要素法を用いた構造力学シミュレーションプログラムにより、シェアストレスの分布をカラー表示するプログラムを開発した。(倫理面への配慮)侵襲的検査である血管内エコー法については、その保険適用基準にのっとって、通常の心臓カテーテル検査を行った患者のデータを利用したものであり、特別に検査を行って得たものではない。その心臓カテーテル検査についても、血管内エコー法を行うことを含めてあらかじめ患者に同意を得たものである。:C.研究結果:3次元的な解析によれば、プラークの破綻には種々のパターンがあり、複雑な過程を経ていることが判明した。(2)MDCTでのシェアストレス表示に成功し、シェアストレスが低い箇所にプラークが形成されやすいことが改めて示され、本法の正確性が示唆された。D.E.考察・結論:プラーク破綻のメカニズムが新たに解明され、シェアストレスの新しい表示法が開発できたことは、プラークの不安定性を定量評価する意味で重要な成果である。
ボルナウイルス感染におけるＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ２の意義と分子基盤の解明

ボルナ病ウイルス(BoDV)の感染初期にADAR2が関与しているかを明らかにするために、ADAR2ノックダウンオリゴデンドログリア細胞株を樹立し、BoDVを接種し、4日後に感染細胞率を免疫蛍光染色法により測定した。その結果、ADAR2をノックダウンした細胞ではBoDVの感染効率が有意に減少することが明らかとなった。次に、ADAR2がBoDV感染の広がりに重要であるかを明らかにするために、上記で感染させた細胞の継代を続け、ADAR2ノックダウン細胞における感染細胞数の同方法にて評価した。その結果、ADAR2をノックダウンすると、BoDV感染の広がりの遅延が観察され、その動態は陰性対照と有意に異なることが明かとなった。以上の結果より、ADAR2はBoDVの感染初期および、その後に続く感染の広がりの両方に重要であることが示唆された。BoDVの持続感染の維持にADAR2が重要であるかを調べるために、BoDVが持続感染しているオリゴデンドログリア細胞にレンチウイルを用いてADAR2に対するshRNAを導入し、BoDVゲノム量および、ウイルス力価を評価した。その結果、ADAR2をノックダウンするとBoDVのゲノムRNA量、ウイルス力価が共に有意に減少した。このとより、BoDVの持続感染の維持にADAR2が重要であることが示唆された。次に、ADAR2ノックダウンBoDV持続感染細胞から回収したウイルス粒子を用いて感染実験を行い、サイトカインの発現を定量した。その結果、ADAR2をノックダウンしたBoDV持続感染細胞から回収したウイルスは、陰性対照と比較して、L-6およびCXCL10といったサイトカインの発現を有意に上昇させた。これらのことより、BoDVのゲノムRNAがADAR2の編集活性を利用して自然免疫系の誘導を回避しているという仮説が考えられた。これまでに、ADAR2ノックダウン細胞を用いた感染実験から、BoDVの感染初期、感染伝播、および持続感染の維持にADAR2が重要であることを明らかにした。また、ADAR2ノックダウン細胞に対するマイクロアレイ解析およびsiRNAスクリーニングより、ADAR2が宿主の遺伝子であるCXCL1およびRab27bの発現を抑制することにより、間接的にBoDV感染効率に寄与していることを明らかにした。さらに、ADAR2ノックダウン持続感染細胞より回収したウイルス粒子を用いた感染実験を実施したところ、同細胞より回収されたウイルス粒子は、陰性対照と比較して有意に自然免疫関連遺伝子の発現を上昇させた。これらのことより、BoDVはゲノムRNA中にADAR2によるA-to-I編集を入れることで自然免疫系が誘導されるのを回避しているという仮説を立てるにいたった。現在、そのメカニズムをより詳しく検証するための実験を行っている。これまでに申請者は、BoDVの生活環全体を通してADAR2が重要であることを明らかにした。さらに現在、ADAR2によるBoDVゲノムRNAへの編集が自然免疫の誘導を回避していることを示唆するデータを得ている。そこで、本年度は、下記の実験を行い、BoDVがADAR2をどのように生活環に利用しているかを明らかにし、国際学術誌に論文を投稿する予定である。(1)BoDVゲノムRNA上におけるADAR2によるA-to-I編集の解析:BoDV持続感染細胞株にADAR2野生型および、編集活性欠損変異体を発現させ、BoDVのゲノムRNAにA-to-I編集が生じるかを、ダイレクトシークエンス法により解析する。また、A-to-I編集の起こったサイトが二本鎖RNA構造をとり得るかを評価するために周辺領域の特徴を解析する。(2) ADAR2とBoDVゲノムRNAの相互作用の解析:RIP assayによりADAR2とBoDVのゲノムRNAが直接相互作用しているかを評価する。ADAR2野生型と、RNA結合能が欠損した変異体を使用する。(3)A-to-I編集がBoDVの進化に及ぼす影響の解析:A-to-I編集がBoDV感染に重要であることを示唆するデータを得ているが、ウイルスにとって絶対的に必要なA-to-I変異はすでに獲得されていると考えらる。そのため、実験的にADAR2の発現を変動させても、過去に獲得されたA-to-I変異の重要性を評価することはできない。そこで、報告されているBoDVのゲノム配列中にある、ADARのpreference sequenceについて解析することで、BoDVの進化におけるA-to-I編集の意義を解明する予定である。BoDVの持続感染の維持にADAR2が重要であるかを調べるために、BoDVが持続感染しているオリゴデンドログリア細胞にレンチ

ウイルを用いてADAR2に対するshRNAを導入し、BoDVゲノム量および、ウイルス力価を評価した。その結果、ADAR2をノックダウンするとBoDVのゲノムRNA量、ウイルス力価が共に有意に減少した。このとより、BoDVの持続感染の維持にADAR2が重要であることが示唆された。次に、ADAR2ノックダウンBoDV持続感染細胞から回収したウイルス粒子を用いて感染実験を行い、サイトカインの発現を定量した。その結果、ADAR2をノックダウンしたBoDV持続感染細胞から回収したウイルスは、陰性対照と比較して、L-6およびCXCL10といったサイトカインの発現を有意に上昇させた。これらのことより、BoDVのゲノムRNAがADAR2の編集活性を利用して自然免疫系の誘導を回避しているという仮説が考えられた。これまでに、ADAR2ノックダウン細胞を用いた感染実験から、BoDVの感染初期、感染伝播、および持続感染の維持にADAR2が重要であることを明らかにした。また、ADAR2ノックダウン細胞に対するマイクロアレイ解析およびsiRNAスクリーニングより、ADAR2が宿主の遺伝子であるCXCL1およびRab27bの発現を抑制することにより、間接的にBoDV感染効率に寄与していることを明らかにした。さらに、ADAR2ノックダウン持続感染細胞より回収したウイルス粒子を用いた感染実験を実施したところ、同細胞より回収されたウイルス粒子は、陰性対照と比較して有意に自然免疫関連遺伝子の発現を上昇させた。これらのことより、BoDVはゲノムRNA中にADAR2によるA-to-I編集を入れることで自然免疫系が誘導されるのを回避しているという仮説を立てるにいたった。現在、そのメカニズムをより詳しく検証するための実験を行っている。これまでに申請者は、BoDVの生活環全体を通してADAR2が重要であることを明らかにした。さらに現在、ADAR2によるBoDVゲノムRNAへの編集が自然免疫の誘導を回避していることを示唆するデータを得ている。そこで、本年度は、下記の実験を行い、BoDVがADAR2をどのように生活環に利用しているかを明らかにし、国際学術誌に論文を投稿する予定である。(1)BoDVゲノムRNA上におけるADAR2によるA-to-I編集の解析:BoDV持続感染細胞株にADAR2野生型および、編集活性欠損変異体を発現させ、BoDVのゲノムRNAにA-to-I編集が生じるかを、ダイレクトシークエンス法により解析する。また、A-to-I編集の起こったサイトが二本鎖RNA構造をとり得るかを評価するために周辺領域の特徴を解析する。(2) ADAR2とBoDVゲノムRNAの相互作用の解析:RIP assayによりADAR2とBoDVのゲノムRNAが直接相互作用しているかを評価する。ADAR2野生型と、RNA結合能が欠損した変異体を使用する。(3)A-to-I編集がBoDVの進化に及ぼす影響の解析:A-to-
磁気浮上系の局所フィードバックによる負の剛性制御に関する研究

奨励研究18917006で補助を受け,局所フィードバックによる負の剛性制御を提案した.これはゼロパワー磁気浮上系よりも柔らかい負の剛性から,負の高剛性,PID制御のような無限大剛性,正の剛性まで,磁気浮上系の剛性を自由に調整することができる制御方法である.しかし提案した負の剛性制御は,渦電流が制御性に及ぼす影響,負の低剛性では摩擦に弱く,浮上体が低い周波数で発振を起こす問題,ギャップによって剛性の大きさが変化する問題,定常的には負の剛性の性質を示すが,過渡的に正の剛性と同一方向に変位する,逆応答の問題などがあった.これらを解決するため,制御方法の見直しと,実験装置の製作を行った.渦電流の影響については,定量的な結果が得られなかった.負の剛性は摩擦により発振する問題に対しては,非線形要素を挿入することとディザ信号によって解決した.(学会発表2)過渡的な逆応答の問題に対してはフィードフォワードによって解決した.またこの制御方法は,従来磁気浮上系に施されているゼロパワー制御,PID制御と比べ,磁気浮上系が支える荷重を大きくすることが可能である.ギャップによる剛性の変化は非線形補償により解決した.これらの他,非線形性を利用して,荷重によって剛性を切り替える制御方法を提案した.これはゼロパワーまたはPID制御が施された磁気浮上系に導入することにより,荷重が少ない場合には,それぞれの特徴を保ちながら,静的な荷重を増加させることができる.^<(学会発表1)>これら結果は,5月1日現在,日本機械学会C編に掲載決定の論文^<(雑誌論文1)>のほか,査読中の投稿論文が一編あり,埼玉大学総合研究機構技術部の第19回技術部研修会報告集に掲載されている.また今後,2009年8月,ブダペストで行われるEuropean Control Conference 2009.および,9月に福岡で行われる,第11回「運動と振動の制御」シンポジウム-MoVic2009-にて発表予定である.奨励研究18917006で補助を受け,局所フィードバックによる負の剛性制御を提案した.これはゼロパワー磁気浮上系よりも柔らかい負の剛性から,負の高剛性,PID制御のような無限大剛性,正の剛性まで,磁気浮上系の剛性を自由に調整することができる制御方法である.しかし提案した負の剛性制御は,渦電流が制御性に及ぼす影響,負の低剛性では摩擦に弱く,浮上体が低い周波数で発振を起こす問題,ギャップによって剛性の大きさが変化する問題,定常的には負の剛性の性質を示すが,過渡的に正の剛性と同一方向に変位する,逆応答の問題などがあった.これらを解決するため,制御方法の見直しと,実験装置の製作を行った.渦電流の影響については,定量的な結果が得られなかった.負の剛性は摩擦により発振する問題に対しては,非線形要素を挿入することとディザ信号によって解決した.(学会発表2)過渡的な逆応答の問題に対してはフィードフォワードによって解決した.またこの制御方法は,従来磁気浮上系に施されているゼロパワー制御,PID制御と比べ,磁気浮上系が支える荷重を大きくすることが可能である.ギャップによる剛性の変化は非線形補償により解決した.これらの他,非線形性を利用して,荷重によって剛性を切り替える制御方法を提案した.これはゼロパワーまたはPID制御が施された磁気浮上系に導入することにより,荷重が少ない場合には,それぞれの特徴を保ちながら,静的な荷重を増加させることができる.^<(学会発表1)>これら結果は,5月1日現在,日本機械学会C編に掲載決定の論文^<(雑誌論文1)>のほか,査読中の投稿論文が一編あり,埼玉大学総合研究機構技術部の第19回技術部研修会報告集に掲載されている.また今後,2009年8月,ブダペストで行われるEuropean Control Conference 2009.および,9月に福岡で行われる,第11回「運動と振動の制御」シンポジウム-MoVic2009-にて発表予定である.
小胞体MAMの構築と多様な機能の解明

ミトコンドリアに近接する小胞体のサブドメインであるMAM(mitochondria-associated membrane)やミトコンドリアに存在するsyntaxin 17(Stx17)は、オートファジーの初期および後期において機能していることが報告されていたが、我々はStx17が富栄養下ではミトコンドリアの分裂を促進し、またacyl-CoA synthetase 3(脂肪合成のための基質であるアシルCoAを産生する酵素)の局在を調節して脂肪滴形成に関与していることを明らかにしてきた(Stx17の脂肪滴形成への関与については本年度に論文として発表した)。それらの研究を進めて本年度は以下のことを明らかにした。(1)脂肪滴の形成には脂質ミクロドメインであるラフト(コレステロールとスフィンゴ脂質に富む膜構造)が重要であり、Stx17はacyl-CoA synthetase 3をラフト構造へとリクルートするために必要であることを示した。(2)PGAM5はミトコンドリア分裂因子であるDrp1を脱リン酸化・活性化するプロテインホスファターゼであり、ハエにおいては、PINK1-Parkin経路(マイトファジー経路)に関与している。Stx17がPGAM5と相互作用してDrp1の脱リン酸化を促進してミトコンドリアを分裂させ、またPINK1-Parkin依存性のマイトファジー経路においてはマイトファジー受容体であるFUNDC1のPGAM5による脱リン酸化を調節していることを明らかにした。(3)富栄養下ではStx17はDrp1と相互作用してミトコンドリアを分裂させ、栄養飢餓となると結合パートナーをAtg14Lに変えてオートファゴソームの形成に働く。このパートナーの切り替えにはMAP1B-LC1が関与していることを明らかにした。この研究は申請時に進行していたが、本年度に論文として発表できた。予想以上に多くの成果を得られた。Stx17に関しては(i)局在化・機能調節機構、(ii)脂肪滴形成とオートファジーの連携、(iii)NLRP3インフラマソーム形成における役割の解明を進める。更に、網羅的にMAMタンパク質を同定し、それらの機能の解明を進めてMAMの多様な機能の全貌の解明を目指す。
アブラムシにおける翅多型制御機構の解明

本年度は、多くの昆虫において発生制御に関わる幼若ホルモン(Juvenile hormone : JH)に注目し、アブラムシ翅多型における役割について解析した。まず、母虫の体内で生じる翅型運命決定における役割に注目した。LC-MSによって高/低密度処理下の母虫の体内JH濃度を計測したところ、密度処理間で有意な差はなかった。JH分泌阻害剤も子虫の翅型に影響を与えなかったことから、JHは翅型運命決定に関わらないと考えられた。次に、子虫の後胚発生過程で起こる有翅/無翅型の分化過程の制御におけるJHの役割について解析した。LC-MSによって35齢の有翅/無翅型でJH濃度を計測したところ、3齢の無翅型でJH濃度が有意に高かった。また3齢の有翅型にJHを塗布すると、飛翔器官形成が阻害されたことから、JHは有翅/無翅型の後胚発生で、飛翔器官の発達制御に関わると示唆された。アブラムシは、生活史の中で有翅型/無翅型を切り替える翅多型だけでなく、単為生殖と有性生殖を切り替える繁殖多型も示す。そこで、この繁殖多型におけるJHの役割についても解析を行った。材料にはゲノムプロジェクトが完了したエンドウヒゲナガアブラムシAcyrthosiphon pisumを用いた。アブラムシでは、短日条件により単為生殖から有性生殖への切り替えが誘導される。長日/短日条件下で育った母虫の体内JH濃度をLC-MSで解析すると、短日条件の母虫でJH濃度が顕著に低かった。また、短日条件下の母虫にJHを塗布し、人為的にJH濃度を上昇させると雄の産出が遅れた。以上から日長条件による繁殖様式の切り替えはJHにより制御されると示された。次に、JH濃度の制御機構を知るため、JHシグナルに関わる遺伝子群をゲノムデータベースから同定し、長/短日条件下での発現をqRT-PCRで解析した。すると、JH分解酵素をコードするJHEやJHEHが短日条件で高く発現した。従って、短日条件によって上昇したJH分解酵素遺伝子の発現によりJH濃度が低下し、有性生殖が誘導される可能性が示唆された。本研究では、アブラムシの翅多型という複雑な現象に対して多彩なアプローチを採用し、成果を上げている。翅型運命決定を担うメカニズムに対しては、候補因子の推定が困難であるため、Differential display法を用いて網羅的な遺伝子発現解析をすることで、NacαやWingless signaling経路などの候補遺伝子を得た。この結果は、論文として近日投稿される予定である。また、翅型運命が決定した後の翅型分化過程に対しては、形態形成因子や内分泌制御因子を中心に候補遺伝子を挙げ、real-time定量PCRを用いた発現動態の解析を行っている。この結果、hedgehogやinsulin receptorなどが翅型特異的に器官の発生制御を行う候補遺伝子として挙げられてきている。加えて、LC-MSを用いた幼若ホルモンの測定も行っており、翅多型に対するこれら形態形成、内分泌メカニズムの制御ネットワークが明らかになることで、アブラムシのみならず、昆虫で普遍的に見られる翅多型の総合的な理解に寄与することが強く期待される。昨年度挙げた翅型運命決定に関わるいくつかの候補因子の機能を推測するためには、母虫から子虫に対して密度情報がどのように渡されているのかを観察し、密度情報が受け渡しされるタイミングでこれらの因子の挙動を解析する必要がある。そこで、96-well microtiter plateを用いた有翅型誘導系を確立し、母虫に対して様々な時間の高密度処理を行うことで、密度情報がいつ、どのように胚に伝達され、どこで不連続な有翅/無翅シグナルに変換されるのか、また胚に密度情報を伝えるシステムはどのような性質を持つのかを明らかにしようと試みた。その結果、1)密度刺激は胚発生最終期のクチクラ形成期まで感受されること、2)10分という短い高密度刺激でも産まれる子虫が有翅型に切り替わること、3)母虫が受ける高密度処理時間に応じて、母虫が有翅型を産出する期間が長くなることが示された。このことから、母虫内には密度情報を反映するシグナル物質が存在すること、その物質は(1)母虫の受けた密度刺激に応じて即座に生成され(2)ある程度の期間体内で維持された後、徐々に消失し、(3)クチクラ形成期の胚に感受されることが示唆された。では、胚に密度を伝えるシグナル物質とは一体何だろうか。私は昨年度に挙げられた候補遺伝子の他に神経調節物質として知られるセロトニンにも注目した。HPLC-ECDを用い、microtiter plateによる高/低密度処理を行った母虫の頭部セロトニンレベルを計測すると、高密度処理によりセロトニンレベルが上昇していた。しかし、芽から離した直後の個体と比較すると、低密度処理でもセロトニンレベルが上昇する傾向にあった。また、1.5時間と6時間の高密度処理間では、セロトニンレベルは変わらなかった。この結果から、セロトニンは直接"密度シグナル物質として"翅型運命決定に関与している可能性は低いが、密度や飢餓などのストレスに応答して放出され、密度シグナル産出の上流に関与しているのではないかと考えられた。

LC-MSによって高/低密度処理下の母虫の体内JH濃度を計測したところ、密度処理間で有意な差はなかった。JH分泌阻害剤も子虫の翅型に影響を与えなかったことから、JHは翅型運命決定に関わらないと考えられた。次に、子虫の後胚発生過程で起こる有翅/無翅型の分化過程の制御におけるJHの役割について解析した。LC-MSによって35齢の有翅/無翅型でJH濃度を計測したところ、3齢の無翅型でJH濃度が有意に高かった。また3齢の有翅型にJHを塗布すると、飛翔器官形成が阻害されたことから、JHは有翅/無翅型の後胚発生で、飛翔器官の発達制御に関わると示唆された。アブラムシは、生活史の中で有翅型/無翅型を切り替える翅多型だけでなく、単為生殖と有性生殖を切り替える繁殖多型も示す。そこで、この繁殖多型におけるJHの役割についても解析を行った。材料にはゲノムプロジェクトが完了したエンドウヒゲナガアブラムシAcyrthosiphon pisumを用いた。アブラムシでは、短日条件により単為生殖から有性生殖への切り替えが誘導される。長日/短日条件下で育った母虫の体内JH濃度をLC-MSで解析すると、短日条件の母虫でJH濃度が顕著に低かった。また、短日条件下の母虫にJHを塗布し、人為的にJH濃度を上昇させると雄の産出が遅れた。以上から日長条件による繁殖様式の切り替えはJHにより制御されると示された。次に、JH濃度の制御機構を知るため、JHシグナルに関わる遺伝子群をゲノムデータベースから同定し、長/短日条件下での発現をqRT-PCRで解析した。すると、JH分解酵素をコードするJHEやJHEHが短日条件で高く発現した。従って、短日条件によって上昇したJH分解酵素遺伝子の発現によりJH濃度が低下し、有性生殖が誘導される可能性が示唆された。
Liposomeを用いたLPSの認識機構に関する研究

LPSのシグナル伝達はMyD88とTRIFの2つを介した経路が存在する。本研究で新たに開発したLPS-liposomeがTRIF経路のみを活性化することを明らかとし、さらにその活性化にはクラスリン依存性のエンドサイトーシスが重要であることを示した。このLPS-liposomeによる活性化は、これまでTRIF経路活性化に必須とされているCD14を必要としないことから、通常のLPSの認識においてCD14がクラスリン依存性エンドサイトーシスと強く関連することが予測される。リポ多糖(LPS)の認識には様々な分子の関与が報告されており、中でもTLR4はそのシグナルを細胞内へと伝える重要なレセプターの一つである。IPSによるTLR4を介したシグナル伝達はMyD88ならびにTRIFを介した経路が報告されているが、本研究によってTRIF依存的経路のみを活性化するLPS-liposomeの開発に成功した。このLPS-liposomeはLPSと比較して、TNFおよびIL-6産生を誘導しないが、typeI-IFN産生を誘導することをマウスマクロファージで確認した。LPSによるtypeI-IFN産生はCD14に依存することが報告されているため、ワイルドタイプのマウスおよびCD14ノックアウトマウス、さらにS-formおよびR-form-LPSの組み合わせを利用し、TRIF依存的経路のCD14の関与について検討を行ったところ、S-form、R-formに関わらずtypeI-HFN産生はCD14に依存することが確認できた。驚くことにこの系においてLPS-liposomeは、CD14ノックアウトマウスのマクロファージにおいて、S-form、R-formに関わらずtypeI-IFN産生を誘導することを明らかとした。この結果はすなわち、LPSによるTRIF依存的経路のシグナル伝達には、LPSがCD14によって細胞内に取り込まれることが重要であり、他方LPS-liposomeはCD14が存在しなくても効率良く細胞内に取り込まれるため、TRIF依存的経路のみが活性化されることを強く示唆するものである。さらにLPS-liposomeの取り込み経路について詳細な検討を行ったところ、クラスリン依存性のエンドサイトーシスで取り込まれ、且つlate endsomeマーカーと重ならないことから、early endosomeにおける認識が重要であることを見出している。今後、その詳細なメカニズムの解明を行っていく。昨年度までの研究において、LPS-liposomeはS-formおよびR-formに関わらず、CD14ノックアウトマウスにおいてもTRIF依存経路を活性化させることを明らかにした。これまでの多くの報告から、TRIF依存経路の活性化にはCDI4が必須であることが示されてきたが、本研究においてTRIF依存経路の活性化にはクラスリン依存性のエンドサイトーシスが必須であることが明らかとなった。すなわち、CDI4はS-formおよびR-formのLPSをクラスリン依存性のエンドサイトーシスで取り込むことによりTRIF経路を活性化させていることが示唆される。実際に、他の研究グループからも同様の報告が示されている。これらの知見に加え、TRIF依存経路のみを活性化するLPS-liposomeのワクチンアジュバント効果についても検討を行った。モデル抗原を封入したLPS-liposomeを新たに調製し、その効果について抗原特異的な免疫応答を指標に検討したところ、血清中の抗体産生が強く誘導され、特にTh1型の免疫応答の増強が認められた。この効果はCDI4ノックアウトマウスにおいても認められている。今後はこの詳細なメカニズムについて検討を進め、安全で効果的なワクチンアジュバントの開発を目指す。