hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
氷床コアの高精度解析のための水の安定同位体拡散および微粒子移動の定量評価

氷中のH_2O同位体の移動を定量的に評価するため,レーザーアブレーションと質量分析を組み合わせた装置の開発を行なった.氷試料を入れてアブレーション位置が観察可能な試料チャンバを新たに作成し,気化試料は質量分析器が設置された分析チャンバに導入する方式とした.試料チャンバは,アブレーションにより気化させた試料が高濃度となるよう,1Paオーダーの圧力レベルとした.このため,この圧力下で氷が固体として安定するよう,-70°C以下に冷却できるようにした.この結果,氷試料の表面が1Paオーダーで3時間以上安定して観察が可能となった.また,試料チャンバから分析チャンバに試料が導入され分析可能なことが分かったが,時間遅れがあり少量のアブレーション試料の分析が課題となっている.氷中のH_2O同位体の移動を定量的に評価するため,レーザーアブレーションと質量分析を組み合わせた装置の開発を行なった.氷試料を入れてアブレーション位置が観察可能な試料チャンバを新たに作成し,気化試料は質量分析器が設置された分析チャンバに導入する方式とした.試料チャンバは,アブレーションにより気化させた試料が高濃度となるよう,1Paオーダーの圧力レベルとした.このため,この圧力下で氷が固体として安定するよう,-70°C以下に冷却できるようにした.この結果,氷試料の表面が1Paオーダーで3時間以上安定して観察が可能となった.また,試料チャンバから分析チャンバに試料が導入され分析可能なことが分かったが,時間遅れがあり少量のアブレーション試料の分析が課題となっている.氷床コアの解析により,過去の気候を推定するため,水の安定同位体の分析が行なわれている.しかし氷は堆積後に氷の塑性変形変形を受けるため,堆積時の情報を正確には,それらの移動について知る必要がある.同位体の拡散については,自己拡散速度については推定されているが,粒界拡散を伴う多結晶氷の粒界拡散速度については,未知である.そさで,既知の同位体分布の氷を人工的に作成し,この分布の時間変化から同位体の拡散速度を明らかにすることを目的とする.まず,質量分析装置内で氷試料をアブレーションし,マススペクトルの変化に注目したが,あまり変化が見受けられなかった.そこで,アブレーシヨン用のチャンバを準備し,リークバルブを経由して気化試料を質量分析装置に導入する方法で,装置の開発を行なうた.このチャンバは,冷却および観察ができるよう,光学ガラスで仕切った2段の構造である.1段目は真空下で氷試料をアブレーションし,2段目は液体窒素を気化した冷却ガスを流すことにより1層目の氷試料を冷却する役割である.アブレーション位置が分かるよう観察システムを設け,アブレーション位置を変えるためXYステージ上に設置した.このチャンバおよび冷却方法において,まだ問題は残るものの,1Paの真空下で氷を安定させ,表面の粒界を観察できるようになった.また,実際の測定は,アブレーションチャンバは,バルブ操作により,排気,アブレーション,分析の状態を繰り仮す.そこで,将来的な自動化めため,予めバルブは電磁式とし,必要な電子回路を作成した.氷床コアの解析により,過去の気候を推定するため,水の安定同位体の分析が行なわれている.しかし氷は堆積後に氷の塑性変形変形を受けるため,堆積時の情報を正確には,それらの移動について知る必要がある.同位体の拡散については,自己拡散速度については推定されているが,粒界拡散を伴う多結晶氷の粒界拡散速度については,未知である.そこで,既知の同位体分布の氷を人工的に作成し,この分布の時間変化から同位体の拡散速度を明らかにすることを目的とする.今年度は,まず設計した装置を完成させた.次に試料チャンバでの氷試料の冷却方法を検討した.氷試料のアブレーションは,試料チャンバ中で,1Paオーダーで行なうので,試料温度は,-100°C以下とする必要がある.アブレーション時は,液体窒素を気化させたガスを試料チャンバ下層に導入し,ガラスで仕切られた上層の氷を伝熱で冷却する.このため,氷試料は,まず-10°C下で底面に真空グリスを塗布してガラス上に置き一部冷着し,試料チャンバを組立て,次にこのチャンバごと-60°Cまで予冷する.その後,液体窒素の気化ガスで冷却することにより,試料が割れることなく,1Paオーダーの真空下でほとんど昇華や凝結することなく2時間以上安定して試料表面の粒界が観察できるようになった.次に試料チャンバから質量分析器に試料導入を試みた.試料導入されることは確認できたが,時間遅れが生じ,また試料が残留するといった問題が明らかとなった.このため,質量分析器,試料チャンバ,試料導入部を高真空度化の方向で改善を行なった.
亜熱帯地域における壁面緑化の省エネ効果に関する研究

1.壁面緑化省エネ効果実例実験の方法(1)実験対象は、屋上緑化収集事例より沖縄県読谷村の住宅とした。当地は始めは米軍家族用住宅として造られた屋根スラブのみの平屋コンクリート住宅約30戸の住宅地である。実験は、屋根スラブ上面に棚をこさえ緑をはわせた緑化住宅と屋根スラブのみの住宅を比較対象とした。(2)測定は、気温を中心に屋根緑ネット内,屋根上部空気層,屋根表面,天井内,室内,戸外で行なうと同時に、室内湿度,屋根面日射量,微風速も測定した。測定器具は、自記温度計(マルチロガー12CH,銅・コンスタンタン熱電対),自記湿度計ロビッチ自記日射計,風速型指示風速計を用いた。(3)期間は、残暑厳しい10月2225日の4日間の快晴日で、自動記録で終始継続的に行われた。2.壁面緑化のふく射熱緩和効果一日の最も大きな温度変化は、緑化なし屋根面で、19.9°C(6:17)43.0°C(14:4)と23°Cの変動があるのに対し、緑化住宅屋根面では終日22°C(6:14)25.7°C(16:44)と大きな変動はなく安定している。特に、13時15時には、両邸の差は最大23°Cと著しい。直ぐに日射を受ける屋根面と、緑を施した場合とではふく射熱の差が大で、緑による遮へい効果の高さがうかがえる。(2)室内温の日変化は、緑化なし住宅が23.3°C29.7°Cで6°Cの変動に対し、緑化住宅では24.3°C28.7°Cと変動が小さい。両邸における室温の差は17時に最大3°Cとなる。(3)但し屋根面温度の著しい差がそのまま室内温に反映される訳ではなく、天井ふところによる緩和作用も大きいことが伺える。(4)緑なし住宅の室温や天井内温が緑化住宅のそれと同様な値となるのは2122時頃からであり、日中のふく射熱がかなり遅くまで蓄積されていることを如実に示す。
脳磁図を用いた体性感覚の時空間認知に関わる脳内ネットワークの研究

【目的】一次体性感覚野(S1)の誘発電位(N20)や誘発磁場反応(N20m)は加齢により潜時が延長し、振幅も増大することが知られている。しかしながら、二次体性感覚野(S2)の加齢による変化は知られていない。高次の体性感覚情報処理の研究にあたっての基礎的な研究として、今回S1、S2の誘発磁場応答の加齢変化を検討した。【方法】対象は健常者72名(M/F=36/36、22-69歳)。306Ch全頭型脳磁計を用いて正中神経刺激による誘発磁場を両上肢で記録した。S1(N20m)およびS2反応について頂点潜時、振幅、推定電流源の大きさを測定し、年齢との関係を回帰分析により検討した。また、周波数分析により、S1とS2における神経活動の同期性を検証した。【結果】N20mは加齢とともに有意に振幅が増大し、潜時は延長した。推定電流源の大きさについても有意な相関が認められた。一方、刺激対側半球のS2潜時(70-120ms)は有意に逆相関の傾向が見られた(加齢とともに潜時が短縮した)。刺激同側半球のS2潜時については明らかな年齢変化は認めなかった。振幅と推定電流源の大きさについては両側のS2とも有意な相関は見られなかった。周波数分析の結果では、高齢者においてSlとS2の神経活動の同期性(興奮性)が亢進しており、年齢に依存した皮質脱抑制の傾向がみられた。【考察】S1応答の変化については皮質脱抑制の機序が推察されているが、S2にはS1からの皮質問入力と視床からの直接入力の両者が存在するため、S1とは異なった生理学的代償機転が生じると考えられた。
超撥水・超親油、超親水・超撥油性含フッ素コンポジットの開発と水/油分離剤への展開

本研究では、マイクロサイズシリカ粒子、シクロデキストリンポリマー微粒子、有機化セルロース誘導体等の化合物をゲスト分子とし、フルオロアルキル基含有ビニルトリメトキシシランオリゴマーのゾル-ゲル反応により、対応する含フッ素オリゴマー/ゲスト分子コンポジット類の開発を行った。特に、これらコンポジット類は超撥油/超撥水性(超両疎媒性)、超親油/超撥水性さらには超撥油/超撥水性等のユニークな表面濡れ性を示すことを明らかにさせ、水/油分離用充填剤さらには水/油分離膜等への応用を可能とさせた。特に、これら表面濡れ性とゲスト分子の構造との相関性についても明確にさせた。平成30年度の研究においては、平成28年度および29年度に得られた上記知見を基に有機溶媒中に存在する水の除去に関してより詳細に検討を行った。具体的には磁性を示す含フッ素オリゴマー/マグネタイトコンポジットにより永久磁石を作用させることによりW/Oエマルションの解乳化に成功し、油中に存在する水を完全に除去しうるシステムの開発に成功した。さらに、本年度においてはマイクロメートルレベルに制御されたセルロースファイバー存在下、フルオロアルキル基含有ビニルトリメトキシシランオリゴマーのアルカリ性条件下におけるゾルーゲル反応により、目的とする含フッ素オリゴマー/セルロースファイバーコンポジット類の調製を行った。本コンポジット類は調製時における基質の仕込み比をコントロールさせることにより、コンポジット表面の濡れ性を超両疎媒性から超親油/超撥水性へとコントロールできることを初めて見いだした。特に、超両疎媒性を示すコンポジットは水中に存在する微量有機フッ素化合物を対応するフッ素を含まない化合物に比べ、効率よく吸着できることを明らかにさせた。これら研究成果は、コンポジット表面の濡れ性と微量有機化合物の吸着能との関係を示す結果として興味深い。高分子化合物として架橋ポリスチレン微粒子、ポリオキシエチレン誘導体、さらには有機化セルロース誘導体に注目し、これら一連のゲスト分子存在下におけるフルオロアルキル基含有ビニルトリメトキシシランオリゴマーのアルカリ性条件下におけるゾルーゲル反応により、対応するこれらゲスト分子がカプセル化された含フッ素オリゴマー/シリカコンポジット類の調製およびこれら一連のナノコンポジット類のキャラクタリゼーションおよび界面特性の解明を行った。その結果、無機微粒子としてタルクを用い、有機高分子として架橋ポリスチレン微粒子を用いて調製された超親油・超撥水性を示す含フッ素オリゴマーコンポジットと同様、新たに有機高分子ゲスト分子としてポリオキシエチレン誘導体、ポリ(テトラフルオロエチレン)微粒子さらには有機化セルロース誘導体を用いることにより、超親油/超撥水性を示すコンポジット類の開発に成功した。特に、有機化セルロース誘導体を含むコンポジット類により濾紙の表面改質をも可能とさせ、この改質濾紙膜を水/油分離膜へ展開させることにも成功した。この改質膜はオリジナルな濾紙とその外観は全く変わらず、改質膜の密着性も高いことを明らかにさせた。有機高分子ゲスト分子としてポリウレタン誘導体を用いることにより、超親油/超撥水性ではなく、超撥油/超親水性を示す含フッ素コンポジット類の開発に成功した。さらに、シクロデキストリンポリマー(CDP)をゲスト分子として調製された含フッ素コンポジット類は、オリジナルなCDPに比べ低分子有機化合物をより効率よく吸着させることを明確にさせた。これらの研究成果は、当初の研究計画に沿って進められた成果ではあるが、特に、ゲスト分子の構造の違いにより、これら界面特性を制御させることを可能とさせた結果、さらには低分子有機化合物の極めて高い捕捉能に関する成果は極めて興味深い。当初の研究計画では、含フッ素コンポジット類の構造と超親油/超撥水性および超撥油/超親水性に関する濡れ性の制御に関しては提案されなかったが、本研究を遂行させることによりコンポジット中の種々の高分子ゲスト分子の構造の違いにより、これら特性を容易に制御させることを可能とさせた。さらに、ゲスト分子として有機化セルロース誘導体を用いることによる密着性に優れた超親油/超撥油性含フッ素コンポジット類の開発は当初の予想では考えられなかった極めてユニークな研究成果である。シクロデキストリンポリマーをゲスト分子とした含フッ素コンポジット類における極めて高い低分子有機化合物の捕捉能に関する研究成果も意外であり、今後の応用展開が大いに期待される。本年度においては、超撥水・超親油性、超親水・超撥油性,さらには超両疎媒性を示す新たな含フッ素オリゴマーコンポジット類の開発に成功した。具体的な研究成果を以下の項目に示す。(1)シクロデキストリンポリマーを含有した超親油・超撥水性含フッ素オリゴマーコンポジット類による種々の有機化合物の吸着能とその構造との相関性を明確にさせた。(2)ミクロンサイズシリカ粒子を含有した超親油・超撥水性を示す含フッ素コンポジット類の開発に成功し、本コンポジット粒子をカートリッジタイプのシュリンジフィルター用充填剤へ応用でき、W/O型エマルションの分離をも可能となった。(3)六方晶窒化ホウ素をカプセル化させた含フッ素オリゴマーコンポジット類の開発に成功し、六方晶窒化ホウ素の粒子サイズを制御させることにより、超両疎媒性、超親油・超撥水性さらには超撥油・超親水性等の濡れ性をコントロールできるコンポジットの創出が可能となった。(4)グルコンアミドユニットを有する含フッ素ナノコンポジット類の開発に成功し、このコンポジット類による濾紙さらにはPET(ポリエチレンテレフタラート)布の表面改質にも成功した。

特に、PET布の表面改質においてはコンポジット調製時の仕込み比をコントロールさせることで、超親油・超撥水性さらには超両疎媒性等の濡れ性をコントロールさせることができ、超両疎媒性を示す改質PET布を分離膜とさせることにより、フッ素系オイルと炭化水素オイルとの混合物を効率よく分離させることに成功した。(5)マグネタイト微粒子をカプセル化させた含フッ素オリゴマーコンポジット類の開発に成功し、得られた磁性を示す含フッ素オリゴマーコンポジット類は超親油・超撥水性を示すことを見いだした。このコンポジットは興味深いことに、水中に存在する油を永久磁石を相互作用させることにより容易に回収させることができた。本年度の研究において、マイクロサイズのシリカ粒子を用いることにより調製される含フッ素コンポジット類が超親油・超撥水性を示す結果は当初の想定にはない新たな知見である。さらにこのコンポジット粒子が水・油エマルション分離用シュリンジフィルター充填剤への応用が可能となった点も特筆に値する。マグネタイト粒子をカプセル化させた含フッ素オリゴマーコンポジットが超親油・超撥水性を示す結果も興味深く、本含フッ素コンポジット類が水中に存在する油を永久磁石を作用させることにより容易に回収できる知見はプラクティカルな観点からも極めて興味深い研究成果といえる。本研究では、マイクロサイズシリカ粒子、シクロデキストリンポリマー微粒子、有機化セルロース誘導体等の化合物をゲスト分子とし、フルオロアルキル基含有ビニルトリメトキシシランオリゴマーのゾル-ゲル反応により、対応する含フッ素オリゴマー/ゲスト分子コンポジット類の開発を行った。特に、これらコンポジット類は超撥油/超撥水性(超両疎媒性)、超親油/超撥水性さらには超撥油/超撥水性等のユニークな表面濡れ性を示すことを明らかにさせ、水/油分離用充填剤さらには水/油分離膜等への応用を可能とさせた。特に、これら表面濡れ性とゲスト分子の構造との相関性についても明確にさせた。平成30年度の研究においては、平成28年度および29年度に得られた上記知見を基に有機溶媒中に存在する水の除去に関してより詳細に検討を行った。具体的には磁性を示す含フッ素オリゴマー/マグネタイトコンポジットにより永久磁石を作用させることによりW/Oエマルションの解乳化に成功し、油中に存在する水を完全に除去しうるシステムの開発に成功した。さらに、本年度においてはマイクロメートルレベルに制御されたセルロースファイバー存在下、フルオロアルキル基含有ビニルトリメトキシシランオリゴマーのアルカリ性条件下におけるゾルーゲル反応により、目的とする含フッ素オリゴマー/セルロースファイバーコンポジット類の調製を行った。本コンポジット類は調製時における基質の仕込み比をコントロールさせることにより、コンポジット表面の濡れ性を超両疎媒性から超親油/超撥水性へとコントロールできることを初めて見いだした。特に、超両疎媒性を示すコンポジットは水中に存在する微量有機フッ素化合物を対応するフッ素を含まない化合物に比べ、効率よく吸着できることを明らかにさせた。
途上国農村地域における初等教育の教育成果に関する調査ーコロンビアでの追跡調査

21世紀型人材育成において、認知能力と共に非認知的能力を見つけることがこれまで以上に重視されている。それを測る上で「教育の投入」「教育過程」「教育効果」については比較的多くの調査が実施されているのに対し、より深く長期的な調査を必要とする「教育成果」についてはあまり多くない。したがって当研究は、認知能力及び非認知的能力における教育の質(教育効果)に定評があり、グッドプラクティスとされるコロンビアのエスクエラヌエバ小学校の卒業生の追跡調査を通した事例研究を行うことによって、非認知能力が長期的に獲得されているかを検証した。2014年に先行研究によって抽出した「自律学習」「自尊心」「民主的態度」の3つの指標に基づき、2014年小学校卒業直後に配布した同じ質問票を中学卒業直前に同じ生徒(約1000名)に配布して調査を実施し、2014年の結果と比較分析した。分析方法は、因子分析、分散分析、回帰分析の3種類である。その結果、2014年の小学校卒業直後に効果のみられた「自律学習」は残念ながら3年後には残っていなかった。つまり、自律学習等非認知能力を伸ばす学習内容を取り入れても、伝統的な競争社会に基づく中等教育制度において、それは消滅していた。これは、児童は確かに「自律学習」を身に着けていたが、その環境を維持しなければそれは失われるということであり、継続的な教育のあり方が求められる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2013年7月6日に第一回国内研究者の連絡会議を上智大学にて開催。ここで黒田先生、西村先生、三輪先生、斉藤先生と研究計画について打ち合わせを行った。そのとき、南米の専門家である三輪先生と斉藤先生以外は、研究対象のエスクエラヌエバについてあまり詳しく知らなかったので、勉強会を開催することで合意した。これを受けて、2月17ー22日までコロンビアから研究協力者2名と、国際研究の権威であるアンジェラリトル先生を招へいして、早稲田大学においてエスクエラヌエバに関する公開ワークショップと第一回合同会議を開催した。ここで、2014年度の方向性について以下の通り合意した。コロンビアチームが現地調査にかかる計画の草案を2014年3月までに作成する。日本チームがエスクエラヌエバの資料をレビューし、2014年6月までに目的などについて分析し、調査の指標づくりを行う。これを受けて、調査規模や調査法を確定し、6年生を対象に、ベースラインサーベイを実施する。2014年3月より、1970・80年(代)からの資料レビューと、調査計画案の精査を開始した。2014年2月に開催した東京での国際合同会議を受けて、3月から8月にかけて、研究分担者と共にコロンビアのエスクエラヌエバ財団およびロスアンデス大学と国際連携調査の委託調査に関する協議をメールおよびスカイプで行い、8月14日に合意に至った。同じく2月の合意を受けて、エスクエラヌエバのレビューを研究代表者と研究分担者の3名でエスクエラヌエバの先行文献レビューを分担して行い、調査のための変数を絞った。8月1日に東京で研究分担者との国内会議を開催し、それぞれの分担箇所を持ち寄って調査ツールについて協議し、4つの変数に絞った。これをもとに、研究代表者と研究分担者の3名で3つの主要変数を一つずつ担当し、それぞれの指標を開発し質問票案を作成した。9月14日から10月13日まで研究代表者がコロンビアに渡航し、コロンビアの研究協力者とともに協議しながら質問票を作成した。10月6日に日本との合同スカイプを行い、質問票の最終原案に至った。10月30日にボゴタ近郊でパイロット調査を実施して質問票を加筆修正し、最終案をスペイン語訳した。11月15日に開催された国際教育研究フォーラムにおいて研究代表者が、この科研に関する初めての発表として、ここまでの成果について進捗状況を報告発表した。11月11日から18日までの5日間、コーヒープランテーションに位置する2郡の中学校30校で、エスクエラヌエバ小学校を卒業した6年生1,047名に質問票を配布した。12月から2015年2月まで調査結果のデータ入力、3月から4月にかけてデータ整理をしている途中である。平成26年(2014年)2月に開催した東京でのコロンビア・日本の国際合同会議を受けて、同年11月にコロンビアのコーヒープランテーション2州の中学校19校において、小学校卒業したての6年生の生徒1047人を対象に、追跡調査の元となるベースライン調査を実施した。その調査報告書とデータベース原本が3月に完成した。これを受けて本年度(2015年)4月以降、そのデータベース原本のデータクリーニングを行い、コロンビアとの数回のスカイプ会議や9月の現地での会議、東京における研究分担者等との協議2回とスカイプ数回を経て、データベースの最終版の合意に至った。9月に約1か月コロンビアに渡航し、ベースライン調査のフォローアップ調査を実施した。対象校19校全校を回って、対象の生徒の在籍確認と、学校関係者と調査の進捗状況を共有をすることによって、サンプルの減少を防ぐ努力をした。また11校で授業観察やインタビュー等の質的調査を実施することにより、量的調査の補完を試みた。この調査により在籍確認ができなかった生徒が数名いたことから、対象サンプル数は966名となった。

この最終的に確定したデータを使用して、3つの指標項目を研究分担者で分担して分析を行った。3月に研究分担者等で東京に集まり、それぞれの分析の進捗状況について共有し、さらなる合同分析について協議した。ここまでの中間発表として、スペイン(6月)、鳴門教育大学(6月)、カナダ(3月)において開催された3つの国際学会において英語で発表報告した。これらの学会での発表はある一定の評価を得て、二つの国際学会誌から論文投稿のお誘いを受けた他、来年の国際学会でのパネル発表の誘いを受けた。さらに、平成28年(2016年)6月に開催予定の日本比較教育学会及び8月に中国で開催予定の世界国際比較教育学会にすでに発表申し込みをし受け入れられているので、それぞれ発表をする予定である。平成27年度に計画していたことがほぼ100%達成できているから6月24-26日大阪大学で開催された日本比較教育学会にて、平成26年(2014年)及び平成27年(2015年)に実施したコロンビアにおける調査結果について日本語で共同発表をした。そのフィードバックを受けて、分析の修正や今後の計画について協議を重ねた。それを踏まえて、8月22日から26日まで北京師範大学で開催された世界国際比較教育学会において、英語で研究成果について発表をした。11月10日から11日にかけてコロンビアのボゴタで開催された第三回エスクエラヌエバ国際コングレスにおいて、英語でこれまでの進捗結果について発表をした。その後、11月13日から19日までコロンビアのアンテオキア州並びにキンディオ州の調査対象19校の中学校を回り、2014年度の調査のフォローアップを行って出席簿等の学校資料を収集した他、平成29年度(2017年)に実施予定の調査に関する調査許可を得た。ただし、この時の資料によりデータの欠損値が大きいことが発覚し、その対策のため、昨年度(平成27年)実施した1か月の調査と同様の予定が1週間に短縮されたので、今年度実施するはずだった残りの調査は、来年度(平成29年)に持ち越された。現在あるデータについては引き続き分析中である。調査結果の発信に先駆けて、3月に調査過程をまとめて発表した。11月13日から19日までコロンビアのアンテオキア州並びにキンディオ州の調査対象19校の中学校で収集した資料によりデータの欠損値が大きいことが発覚し、その対策のため昨年度(平成27年)実施した1か月の調査と同様の予定が1週間に短縮されたので、今年度実施するはずだった残りの調査は、来年度(平成29年)に持ち越されたため。4月27日に研究分担者とスカイプにて平成26年度(2014年)の調査分析に関して協議し、6月の日本比較教育学会の発表に申請する。6月24-25日に東京大學で開催された日本比較教育学会にて、2014年度の調査の研究成果について共同発表する。9月にコロンビアの中学校19校において現地調査を実施し、約800名の生徒に2014年と同様の調査票を配布し、非認知的能力に関するデータ収集を行った。10月以降、データ入力及びデータ分析に着手した。同時に、12月に研究成果に係る書籍出版にかかる骨子のプロポーザルを出版社に提出した。データ分析・執筆はまだ進行中である。現在データ入力と全体集計の出力までは終了しているが、具体的な分析がまだ残っている。
歯周治療における抗菌物質局所投与の効果に関する研究

最初に初期治療の有効性を確認し得る要因を知る目的で、スケーリング、ルートプレーニング後の臨床的及び細菌学的パラメーターの変化について3カ月間観察した。中等度から重度に進行した歯周炎患者9名の単根歯の5mm以上の歯周ポケットを有する36部位を対象とした。その結果、術後12週目の評価により、被験部位は2つに分けられた。1つは予後良好と考えれるグループであり、probing depth及びGCF量、spirochetesと黒色色素産生嫌気性桿菌(black pingmeted anaerobic rods,BPAR)の比率の減少が見られ、他の1つは予後不良と考えられるグループで、4つのパラメーターの減少量は前者より小さく、臨床的にはGCFが50ペリオトロン・ユニットで分けると、細菌学的な変化と相関して分けられた。これにより、判断し得ることが示された。さらに初期治療後、予後不良部位にミノサイクリン含有徐性剤(ペリオクリン^<(R)>)を2週毎に4回投与して、臨床的及び細菌学的な観察を行ったところ、probing depthおよびGCF量の減少は術後7カ月まで見られ、細菌学的な改善は投与後2週から3カ月程度認められた。次に初期治療においてスケーリング、ルートプレーニングにミノサイクリン含有徐放性剤(ペリオクリン^<(R)>)の局所投与を併用した場合の効果について臨床的,細菌学的に検討した。11名の中等度から重度に進行した歯周炎患者の5mm以上の歯周ポケットを有する単根歯44歯を選択した。局所麻酔下でグレーシー型のスケーラーによるスケーリング、ルートプレーニングを行ない、2週後に歯周ポケットが4mm以上残存していた部位にペリオクリン^<(R)>を1週毎に4回投与した。初期治療後2週の時点で4mmを超える歯周ポケットを持つ部位にペリオクリン^<(R)>を用いたことにより投与後30週まで経時的に症状の改善が見られたが,薬剤の併用効果は認められなかった。最初に、初期治療に有効性を確認し得る要因を知る目的で、スケ-リング、ル-トプレニング後の臨床的及び細菌学的パラメ-タ-の変化について3カ月間観察した。そのうち27部位はスケ-リング、ル-トプレ-ニングを繰り返し行い、9部位は対照部位とした。その結果、実験部位では4部位を除く全ての部位で歯周ポケットの減少が見られた。被験部位は術後12週目の臨床的及び細菌学的評価により、2つのグル-プに分けられた。1つは予後良好と考えられるグル-プであり、歯周ポケットの深さ及びGCF量、spirochetesとBPBの比率の減少が見られた。他の1つは予後不良と考えられるグル-プであり、4つのパラメ-タ-の減少量は前者より小さい値を示した。2つのグル-プは、臨床的にはGCF量の測定値が50ペリオトロン・ユニットで分けると、細菌学的な変化と相関して分けることができた。予後良好例では術後2週目で既に、GCF量の平均値は50ペリオトロン・ユニット以下となり3カ月間持続した。以上の結果から、初期治療の有効性は歯周ポケットの深さとGCF量の減少によって判断し得ることが示された。

さらにスケ-リング、ル-トプレ-ニング後予後不良を示す部位に対してテトラサイクリン含有徐放性剤(ペリオクリン^<(R)>)を2週毎に4回投与して、臨床的及び細菌学的な観察を行ったところ、probing depthの減少は術後7カ月まで見られた。GCF量については、術後2週から3カ月まで減少したが、その後7ヵ月まで有意の変化は見られなかった。spirochetes、BPBの比率についても、術後2週から3カ月まで減少したが、その後7カ月まで有意の変化は見られなかった。初期治療に良好な反応を示さない部位に抗生物質の局所投与を行った場合、細菌学的な改善は投与後2週から3カ月程度であった。初期治療においてスケーリング,ルートプレーニングによる器械的な歯肉縁下のプラークコントロールに加えてミノサイクリン含有徐放性剤(ペリオクリン(R))の局所投与を併用した場合の効果について臨床的,細菌学的に検討した.被験者としては中等度から重度に進行した歯周炎患者11名,被験歯としては上下顎左右4部位に存在する5mm以上の歯周ポケットを有する単根歯4歯を選択した.歯肉縁上プラークコントロールの後,被験歯のPlaque Indexがほぼ0になったことを確認して,超音波スケーラーによる全顎的なスケーリングおよび局所麻酔下で被験歯と両隣在歯にグレーシー型のスケーラーによるスケーリング,ルートプレーニングを行なった.2週後に歯周ポケットが4mm以上残存していた36部位中20部位にペリオクリン(R)を1週毎に4回投与した(MC群).他の16部位(SCI群)と,歯周ポケットが4mm以下であった8部位(SCII群)については経過観察を行なった.診査は,術前2週,スケーリング時,術後2週,ペリオクリン(R)〓投与後1週,2週,その後30週まで2週毎に行なった.臨床指数としては,Plaque Index,Gingival Index,probing depth,bleeding on probing,attachment level,gingival crevicular fluid(GCF),歯の動揺度を用い,細菌学的検査としては,暗視野顕微鏡下でcocci,rods,motile rods,spirocheteの比率と総菌数を算定し,嫌気的培養により黒色色素産生性嫌気性桿菌(black pigmented anaerobic rods,BPAR)の比率と総コロニー数およびActinobacillus actinomycetemcomitansの出現率について調べた.初期治療後2週の時点で4mmを超える歯周ポケットを持つ部位にペリオクリン(R)を用いることにより投与後30週まで経時的に症状の改善が見られた.しかし,同様の変化はスケーリング単独群でも見られ,ミノサイクリン含有徐放性剤(ペリオクリン(R))の局所投与の併用効果は認められなかった.
若年無業者に対するストレス対処力SOCを高める支援方策の探索的研究

本研究はA市のサポステで、精神疾患やメンタルヘルス不調を抱える若年無業者を対象に、対象の特性と支援内容の効果と関連要因、就労支援プログラムの開発を目的に調査を実施した。約300名の支援データからは就労決定には就労への準備性と相談回数の関連がわかった。対象者の特性は、66名の調査からはSOCが低く、精神健康には就労意欲とSOCの正の関連、就労経験は負の関連がわかった。定期的なピアグループからは、対象者の経験から作成した事例を用いたグループ学習、リラクゼーション演習が効果的であることが示唆された。グループは継続参加が難しく、課題は1回のプログラムで日常生活で生かせる学習内容、方法の検討である。本研究は、三重県のサポートステーションをフィールドとし、3年間でひきこもりや無業者への支援内容とその効果の関連を明らかにすること及び、ストレス対処力を高めるための探索的研究を目的としている。初年度の平成25年度には、1.平成24年度の支援データの統計的解析、2.サポートステーションの利用者で同意された50名を対象にしたストレス対処力と就労に関する調査、3.ストレス対処講座を実施した。1.の結果は平均年齢は28歳であり、男性が7割であった。進路決定に影響する要因の検討のために、進路決定を従属変数とし属性、進路決定と関連のあった変数を説明変数としたロジスティック回帰分析を行った。関連があったのは就業準備性と相談回数であった。相談の進路決定への効果を示していると同時に、相談回数が多くても必ずしも進路決定につながっていないことも明らかになった。相談やその他の支援・介入が、就業準備性をどう高めるのか、縦断データでの検証でより効果的な介入のあり方の示唆を得ることができると考えられる。2.の結果は平均年齢26.2歳で女性が多く、精神健康度GHQ得点の平均点は、カットオフポイントでみると、「4点以上」の不良群は76.0%であった。ストレス対処力SOC得点の平均点は45.3点であり、一般住民の平均得点(約55ー57点)と比べると低い可能性がある。また就労経験のない人の方が精神健康、健康状態も良好で、過去の就労経験がネガティブな経験になっていることが推察され今後の支援の中で検討の必要性が明らかとなった。3.の結果はストレス対処講座を5回実施し、ストレスの正しい知識と対処法を身につけるため、グループによる意見交換を中心に行った。参加者の考え方や捉え方の変化がうかがえた。課題はアウトカムとしてSOCを用いることやアミラーゼモニターの活用方法、講座の参加継続など、今後の研修内容や方法を検討していく必要がある。本研究は、三重県の北勢サポートステーションをフィールドとし、ひきこもり経験者や精神疾患を持つ対象者も含め、無業若年者への効果的な就労支援をめざし、ストレス対処力を高めるための探索的研究を行っている。サポステでは週5日間の相談会を実施しており、定期的に利用している希望者に対し、調査結果をもとに2日間のストレス対処講座を実施した。参加者は8名であった。昨年の調査からは精神健康度(GHQ)の得点が高く精神健康度が低いこと、またストレス対処が不得意であることがわかっており、アサーション効果を高めるために研修会の最初にタッピングタッチの演習を取り入れた。その後はストレスに対する講義を実施し、自分自身のストレスとその対応について考えた。グループディスカッションでは昨年度に対象者から聴取した意見をもとに、離職に至った状況や困難と感じた状況を設定し、その状況を自分と相手の立場からの言動の意図や思いを両側面から考え発表し合い、困難だと感じた状況を多角的に捉え再構成を行うことで、状況をとらえ直すことができていた。また他者の考えを聞くことにより対応の幅が広がったという感想もあった。研修前後ではストレス対処力(SOC)、精神健康度(GHQ)を測定するとともに、グループディスカッションで研修体験後の意見を聴いた。サポステ利用者の特性の分析からは過去の就労経験がネガティブな経験になっており、就労経験のある人ほど精神健康度が低い状況は、研修会参加者のディスカッションからも質的に捉えることができた。また実際の労働現場で就労支援にかかわるスタッフへの教育支援を実施した。平成27年度は効果的な支援を行う上で、ストレス対処力を高める具体的な方法としてパッシングポジティブチェンジを目指した、経験の捉えなおしや、ストレス対処の方法を身に着けられるような取り組みを強化して実施しプログラムの開発を目指す。本研究は、三重県の北勢サポートステーションをフィールドとし、若年無業者への効果的な就労支援をめざし、ストレス対処力を高めるための探索的研究を行っている。今年度は定期的な相談だけでなく、2ヶ月の集中プログラムに、コミュニケーション能力、社会人基礎力、就職の実践につながる講座、資格取得を目指す、より良い自分になるために、キャリアコンサルタントによる就職に向けた相談のコンテンツとともに、プログラム(ストレス対処、メンタルヘルスの基礎知識、リラクゼーション)として1日6時間をセットして実施した。集中プログラムには8名が参加した。昨年度の取り組みからは、サポステ利用者の精神健康度やストレス対処力(SOC)は一般住民に比べて低いことや、今までの経験をネガティブに捉え、それらの経験が有効に働いていないことが推測された。そのため、Perceived Positive Change(PPC)の考えを取り入れたプログラム展開を行った。まず、タッピングタッチやストレッチを実施し、緊張をほぐしリラックスして研修に取り組めるように工夫した。グループワークでは昨年に引き続き振り返りシートを用いて、参加者が今までに遭遇した困難な場面を取り上げ、多角的な方向から検討を行った。

研修会後のアンケートからは、SOCが上昇したものは、8名中5名であった。上昇がみられなかった3名は精神健康度が低い傾向にあった。また、6名がグループワークでの学びを今後に役立てそうだと回答していた。筆者らのグループではケアスタッフへの研修会を実施しているが、その中では、リラックス感覚やアサーション行動をとれる人ほど有意にSOCが高いことが明らかとなっている。したがって就労支援プログラムにも同様にリラクゼーションを取り入れることは効果的であると考える。北勢サポートステーションをフィールドとし、平成25年から2年間の調査結果を基にした、就労支援プログラムを立案し、研修会や相談を実施した。就労支援プログラムは調査結果と利用者のニーズを反映し、修正しながら実施しており、今年度は2ヶ月の集中プログラムの中で実施し、その効果をアンケートと聞き取りにより評価している。しかし、プログラムの効果としては単発のプログラムでなく、定期的な実施が必要であることと、参加者の精神健康度(GHQ)、ストレス対処力(SOC)、就労との関連については引き続き調査が必要であり、より効果的なプログラムにつなげていく必要がある。本研究は、A市のサポートステーション(以下サポステ)をフィールドとし、4年間でひきこもりやメンタルヘルス不調を抱える若年無業者を対象に、支援内容とその効果の関連及び、ストレス対処力(SOC)を高めるための支援の探索的研究を目的とした。平成25年度には若年無業者への就労支援と就労決定との関連要因研究を実施し、約300名の支援データから、就労決定には就労準備性とサポステでの相談回数が関連が明らかとなった。平成26年度には若年無業者のストレス対処力と精神健康に関連する要因として、66名の調査からは、サポステ利用者の約7割は精神的不健康状態にあり、SOCは一般住民に比べて低い傾向にあった。精神健康には就労意欲とSOCが関連しており、特にSOCとの関連が一番強いこと、過去の就労経験と精神健康度に負の関連があった。平成26年から28年には、ストレス対処講座と定期的なピアグループを開催した。講義形式の研修ではなく、タッピングタッチの演習、事例を用いたディスカッションを行った。事例は参加者の離職に至った状況や困難と感じた状況を参考に作成した。参加者は状況を自分自身と相手の立場から再構成を行うことができた。他者の考えを聞くことで、共感や対応の幅が広がったという感想が聞かれた。平成28年度は2か月に1度のピアグループを開催した。1回の参加者は2名10名と幅があったが、参加の機会を広げることができたと考える。参加者は緊張しており、緊張をとくための、プログラムを取り入れることが効果的なことが示唆された。グループの最後には振り返りと次の目標をカードに記入し、日常生活に活かせるように工夫した。今後もピアグループを定期的に開催し、参加者が就労にどのように就けるのかを縦断的に見ていく。
ミトコンドリア酸化障害による酸化ストレス関連疾患の発症・悪化機序の解明

本研究では、ミトコンドリア・OHによる酸化損傷がミトコンドリアの機能に及ぼす影響を明らかにするために、新規ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤を開発してin vitroおよびin vivoにおける解析を行った。その結果、ミトコンドリア・OHは酸化ストレスの誘導に中心的な役割を担うことを見出した。さらに、ミトコンドリア・OHはミトコンドリア膜を酸化し、膜電位の低下を引き起こすことが明らかになった。これにより、ミトコンドリア融合不全および断片化の亢進し、機能低下が引き起こされた。酸化ストレスは、細胞内における活性酸素種(ROS)の生成と消去のバランスが崩れ、ROSが過剰産生することによって生じる。ROSによって酸化障害された細胞は機能不全を引き起こし、様々な疾患の発症・悪化に関与すると考えられている。生体内の90%以上のROSは、ミトコンドリアの電子伝達系において、酸化的リン酸化によるATP産生過程で生じる。ミトコンドリアで生成されるROSの中でも・OHは酸化力が最も強力である。このことから、・OHがミトコンドリアの酸化障害に多大な影響を及ぼすと考えられるが、未だに不明瞭な点が多い。本研究では、ミトコンドリアの・OHを選択的に消去する抗酸化剤を開発し、これを種々の酸化ストレス関連疾患モデルマウスに用いることにより、・OHによるミトコンドリア酸化障害が疾患に及ぼす影響を明らかにすることを目的にしている。これまでに、ミトコンドリアROS誘導細胞に、ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤を用いてミトコンドリア・OHが酸化ストレスに及ぼす影響を調べた結果、ミトコンドリア・OHはミトコンドリアの酸化に多大な影響を及ぼし酸化ストレスを引き起こすこと、さらに酸化障害を受けたミトコンドリアは、ミトコンドリア品質管理機構により排除されることが明らかになってきた。現在、種々の酸化ストレス関連疾患モデルマウスを用い、ミトコンドリア・OHが疾患に及ぼす影響を分子レベルの解析による解明を進めている。ROSによって酸化障害された細胞は、機能不全を引き起こし、様々な疾患の発症・悪化に関与すると考えられている。本年度は、ミトコンドリアROS誘導細胞を用い、ミトコンドリア・OHに対するミトコンドリア・OH標的抗酸化剤の薬理効果を検討した。その結果、ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤はミトコンドリア・OHを効果的に消去し、ミトコンドリアの酸化障害を抑制した。現在、・OHによって酸化障害されたミトコンドリアに対する保護・防御および恒常性維持機構に着目し、詳細な解析を行っている。一方、in vivoにおいては、酸化ストレス関連疾患モデルマウスに対するミトコンドリア・OH標的抗酸化剤の薬理効果を調べた。その結果、これらの多くのモデルマウスでは薬理効果が認められ、さらに・OHによる生体内酸化の亢進を抑制することが明らかになった。今後、・OHによるミトコンドリア酸化障害と、これらの酸化ストレス関連疾患モデルマウスの疾患の発症・悪化との関連性を分子レベルの解析によって解明する予定である。本研究では、ミトコンドリア・OHを選択的に消去する抗酸化剤を開発し、これを種々の酸化ストレス関連疾患モデルマウスに用いることにより、・OHによるミトコンドリア酸化障害が疾患に及ぼす影響を明らかにすることを目的にしている。これまでに、我々が独自に開発したミトコンドリア・OH標的抗酸化剤をミトコンドリアROS誘導細胞に用い、ミトコンドリア・OHが酸化ストレスに及ぼす影響を検討した。その結果、ミトコンドリア・OHはミトコンドリアの酸化損傷に中心的な役割を担うことが明らかになった。

さらに、ミトコンドリア・OHによる酸化が起きると、ミトコンドリアの融合を抑制し断片化が誘導されることによって、これが引き金になりマイトファジーが引き起こされることが明らかになった。さらに、ミトコンドリアROSを誘導した酸化ストレス可視化Tgマウスを用いた解析から、ミトコンドリア・OHが酸化ストレス誘導の根源であることが明らかになった。現在、種々の酸化ストレス疾患モデルマウスを用いて、ミトコンドリア・OHが疾患に及ぼす影響について解析を行っている。これとは別に、最近、細胞質・OH標的抗酸化剤も開発した。これらの抗酸化剤を用いることによって、・OHによる細胞内酸化損傷部位の違いと酸化ストレス関連疾患の詳細な発症・悪化機序の解明を目指している。実験動物学昨年度までに、ミトコンドリアROS誘導細胞を材料に、新規ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤に用いた検討から、・OHがミトコンドリアの脂質成分であるミトコンドリア膜の酸化に多大な影響を及ぼすこと、ミトコンドリアの挙動解析から・OHによってミトコンドリア膜の酸化がミトコンドリアの断片化を引き起こすことが明らかになった。さらに分子レベルの解析においても、ミトコンドリア膜の融合を制御するOPA1の発現パターンが異常を示し、融合不全が引き起こされることが明らかになり、これに加えマイトファジーが誘導され断片化ミトコンドリアが排除されることが明らかになった。本年度は、新規ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤を種々の酸化ストレス関連疾患モデルマウスに用いて、・OHによる酸化ストレスが種々の酸化ストレス関連疾患に及ぼす影響を調べた。これまでの研究成果から、酸化ストレス関連疾患モデルマウスでは、新規ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤によってミトコンドリア・OHを抑制すると酸化ストレスの亢進が抑制され、これらの影響を受ける分子についても明らかになりつつある。その一方で、いくつかの酸化ストレス関連疾患モデルマウスでは、ミトコンドリア・OHを抑制しても酸化ストレスの亢進を抑制できないことが明らかになってきた。これらの臓器におけるROS産生源を調べた結果、細胞膜に局在するNADPHオキシダーゼで産生されるROSに起因することが明らかになった。このことから、新たに細胞質・OH標的抗酸化剤を開発し、細胞質・OHが酸化ストレスにどのように関与しているのか研究を進めている。本研究ではこれまでに、ミトコンドリアROS誘導細胞を新規ミトコンドリア・OH標的抗酸化剤に用いた検討から、・OHがミトコンドリアの脂質成分であるミトコンドリア膜の酸化障害に多大な影響を及ぼすことを明らかにした。また、ミトコンドリアの挙動解析から・OHによってミトコンドリアが酸化障害を受けると、ミトコンドリアは断片化を引き起こし、ミトコンドリア膜の融合を制御するOPA1の発現パターンが異常を示すことにより融合不全を引き起こすことが明らかになった。さらに、これらによってマイトファジーが誘導されることも明らかになった。これまでに、・OHによるミトコンドリアの酸化が細胞に及ぼす影響や、・OHによるミトコンドリアの酸化障害とミトコンドリア品質管理機構についての知見は皆無であり、マイトファジーの誘導機構についての知見もほとんど無かった。
ゲノムワイド多型解析による家禽ニホンウズラ集団の遺伝的差異と集団史の解明

これまでの研究によって家禽ウズラのミトコンドリア・D-loop領域のDNA配列における分子系統樹が、大きく二つのグループに分かれたことをうけ、2018年度は次世代シーケンサーMinIONを用いて家禽ウズラの全ミトコンドリアゲノム配列の解読と分子系統学的解析を行った。MinIONは、2日間で約7Gbのデータが得られる、手のひらサイズの次世代ロングリードシーケンサーである。取得データ量がリアルタイムで確認可能なため、データ量が十分と予想される任意のタイミングでシーケンシングを停止でき、サンプルの入れ替えが行えるため、無駄を省けることも利点である。まず、ウズラミトコンドリアゲノムをPCR増幅するため、全長の約1.6 kbのミトコンドリアゲノムをそれぞれの両端が重なり合う7 kb程度の領域に三分割し、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅・生成を行った。NEB社のライブラリ調整試薬を用いてアダプターおよび検体ごとに異なるバーコード配列(12種類)をライゲーションし、12検体のマルチプレックスシーケンシングを行った。開始から約14時間で4Gbのデータがえられたことを確認し、シーケンシングを停止させた。1検体当たり、2万4万個のリードが得られ、そのうち8,000以上ものリードが、リファレンスに用いたニホンウズラミトコンドリアゲノム配列(アクセション番号:AP003195)に90%以上の相同性を持ってマッピングされた。マッピングされたリードのうち9割は、7 kbp以上のロングリードであった。得られたミトコンドリアゲノム配列を用いた分子系統樹は大きく二つのグループに分かれ、D-loop配列の系統樹と同じ樹形を構築した。このことから、家禽ウズラのミトコンドリアゲノムには大きく二つのグループが存在することが明らかとなった。当初の予定ではMiseqによるミトコンドリアゲノムのシーケンシングを予定していたが、名古屋大学の共通実験施設が保有するMiseqが近年では稼働していないことと、独自にMiseqを行う場合、ライブラリ調整の費用が高額になるため、代わりのシーケンシング手法を探していた。Oxford NanoporeのMinIONの国内での取り扱いがちょうど2018年度から始まったため、実際に必要となるコストと使用方法の確認に時間を費やした。MinIONを用いたシーケンシングは申請者の実験室で手軽に実施可能なため、業者委託するよりも短時間でデータが取得でき、後れを取り戻せると期待している。ミトコンドリアゲノムの解析は、プライマーとDNAポリメラーゼの種類の選定と、24個のバーコード配列によるマルチプレックス、および十分量のデータが得られるシーケンシング時間の目安がついたため、より低コスト・短時間での解析が行えると予想している。ウズラ12集団各10個体について、ミトコンドリアゲノムの解読と分子系統学的解析を行う。また、ゲノムワイドなSNPデータの取得には、近年トヨタ自動車株式会社によって開発されたGRAS-Di法を用いる予定である。まず12集団から各1検体ずつ、12検体をGRAS-Diの予備解析に用いて、得られるSNP数とゲノム上の分布について確認する。十分量のSNPが得られることを確認したのちに、96検体の解析を委託する。得られたSNPデータをもとに集団遺伝学的解析を行い、家禽ウズラの育種の歴史の検証と、戦前および戦後のウズラの遺伝学的差異について明らかにする。H29年度に実施予定だったものは、以下の2点でした。1結血液・液浸組織からのDNA抽出・精製:使用するDNAサンプルの多くは、先行研究で既に抽出済みである。新規にDNAを抽出する必要があるサンプルについては、フェノール・クロロフォルム法によりDNAを抽出する。2ミトコンドリア(mtDNA)ゲノム配列の解読と分子系統学的解析:mtDNAゲノムを精製するため、PCRによるmtDNAゲノムの増幅を行う。ウズラのミトコンドリア全ゲノム(全長およそ16 kbp)を、両端が重なり合う10 kbp程度の二つの領域にわけ、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅・精製を行う。解析対象は、家禽ウズラ18集団各10個体、合計182個体とする。これまでに、10集団各10個体から採取した全血サンプルを用いて、ゲノムDNAの抽出を行いました。ゲノムDNAの質は、アガロースゲル電気泳動によって、高分子のゲノムDNAが得られていることを確認しました。ロングPCRによるミトコンドリアゲノム配列の増幅もできており、PCRに利用するプライマーも作成できています。しかし、当初ゲノムDNAの抽出実験で、高分子のゲノムDNAが採れない、採れても短期間で分解され、断片化してしまう、といったトラブルがあったため、予定よりも進行が遅れています。初めの半年ほど、ミトコンドリアゲノム10 kbpのロングPCRが成功しない、という問題が生じました。プライマーを数ペア設計し、PCRを試みましたが、増幅しませんでした。しかし、数年前に別の実験で飼養したウズラのゲノムDNAを用いたロングPCRでは、アガロースゲル電気泳動で10 kbpのバンドが確認でき、プライマーやPCRポリメラーゼが原因ではないことがわかりました。本実験で用いたゲノムDNAを、再度、アガロースゲル電気泳動で確認したところ、DNAの分解が起きていたことがわかり、DNAの断片化がロングPCR失敗の原因であることがわかりました。ゲノムDNAの抽出初期のバッファー(Lysis Buffer)と、抽出後のDNAの溶解に用いた溶解液(Tris-EDTA)を新たに作成しなおしたところ、高分子のゲノムDNAを長期間保存できるようになりました。改めて抽出したゲノムDNAでは、ロングPCRが成功しています。

よって、ゲノムDNAの抽出を再度行っています。これまでの研究によって家禽ウズラのミトコンドリア・D-loop領域のDNA配列における分子系統樹が、大きく二つのグループに分かれたことをうけ、2018年度は次世代シーケンサーMinIONを用いて家禽ウズラの全ミトコンドリアゲノム配列の解読と分子系統学的解析を行った。MinIONは、2日間で約7Gbのデータが得られる、手のひらサイズの次世代ロングリードシーケンサーである。取得データ量がリアルタイムで確認可能なため、データ量が十分と予想される任意のタイミングでシーケンシングを停止でき、サンプルの入れ替えが行えるため、無駄を省けることも利点である。まず、ウズラミトコンドリアゲノムをPCR増幅するため、全長の約1.6 kbのミトコンドリアゲノムをそれぞれの両端が重なり合う7 kb程度の領域に三分割し、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅・生成を行った。NEB社のライブラリ調整試薬を用いてアダプターおよび検体ごとに異なるバーコード配列(12種類)をライゲーションし、12検体のマルチプレックスシーケンシングを行った。開始から約14時間で4Gbのデータがえられたことを確認し、シーケンシングを停止させた。1検体当たり、2万4万個のリードが得られ、そのうち8,000以上ものリードが、リファレンスに用いたニホンウズラミトコンドリアゲノム配列(アクセション番号:AP003195)に90%以上の相同性を持ってマッピングされた。マッピングされたリードのうち9割は、7 kbp以上のロングリードであった。得られたミトコンドリアゲノム配列を用いた分子系統樹は大きく二つのグループに分かれ、D-loop配列の系統樹と同じ樹形を構築した。このことから、家禽ウズラのミトコンドリアゲノムには大きく二つのグループが存在することが明らかとなった。当初の予定ではMiseqによるミトコンドリアゲノムのシーケンシングを予定していたが、名古屋大学の共通実験施設が保有するMiseqが近年では稼働していないことと、独自にMiseqを行う場合、ライブラリ調整の費用が高額になるため、代わりのシーケンシング手法を探していた。Oxford NanoporeのMinIONの国内での取り扱いがちょうど2018年度から始まったため、実際に必要となるコストと使用方法の確認に時間を費やした。MinIONを用いたシーケンシングは申請者の実験室で手軽に実施可能なため、業者委託するよりも短時間でデータが取得でき、後れを取り戻せると期待している。現在、10集団10個体ずつから、高品質なゲノムDNAの抽出が完了しています。5月6月にかけて、残りの8集団についてゲノムDNAの抽出と、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅を行い、Miseqによる配列解読を行う予定です。また、ゲノムDNAの抽出が完了し次第、182個体についてRAD-seqによるゲノムワイド多型を用いた集団遺伝学的解析を依頼し、本年度の末ころには、代表個体の選抜とリシーケンスの依頼をだす予定です。