hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新興出血熱ウイルスの細胞内侵入受容体の探索と抗ウイルス薬への応用

そこで次に、PDGFRの遺伝子をsiRNAを用いて発現抑制させて、SFTSVpvの感染性を調べたところ、コントロールのVSVpvと比較して感染阻害が認められた。また、PDGFRの機能を中和できる抗体を用いても同じようにSFTSVpvの感染性を抑制することが明らかとなった。PDGFRがSFTSVの細胞侵入に関与する分子であることがわかったので、さらにSFTSVの感染によるPDGFRのリン酸化を調べたところ、感染直後にPDGFRのリン酸化が認められた。以上の結果から、SFTSVは細胞侵入の際にPDGFRがリン酸化されることで、エンドサイトーシス等が活性化され、細胞内にウイルスが取り込まれていることが示唆された。出血熱ウイルス感染症は致死率が高く重篤な疾患を引き起こすため、ウイルス感染そのものを阻止することが重要であり、感染初期の吸着・侵入機構を解明することが急務である。本研究では、ラッサウイルスの新規細胞侵入受容体であるリソソーム関連膜タンパク質1の関与および重症熱性血小板減少症候群ウイルス(SFTSV)の細胞侵入に関与するウイルス側エンベロープ蛋白質および宿主側因子の性状解析を行った。その結果、SFTSVの細胞侵入時に細胞融合に関与するエンベロープ蛋白質のアミノ酸を同定することができた。また、宿主側因子として細胞侵入の際に活性化されるシグナル分子も同定することができた。LAMP-1とラッサウイルスの相互作用に関しては、既報の論文通りに再現できるかもう少し検討し、これが確認できるようなら、実際にルジョウイルスでもLAMP-1が関与するかを検証する。これとは別に、酸性条件下で結合する分子の同定の解析を進める。SFTSVの解析は、阻害剤のターゲット分子を絞り込み、その分子がSFTSVの生活環のうちどこに作用しているのかを検証する。SFTSVの細胞侵入機構等に関する解析は引き続き進めていきたい。すでにターゲット分子候補の活性などは確認しているので、更に詳細に解析を進めていく。所属変更のため、ウイルスの取り扱い手続き等遅れている部分もあり、いくつか変更を余儀なくされる可能性もあるが、他のウイルス種に関しても、阻害剤の探索を始め順次解析を行っていく予定である。ウイルス学年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成27年度分についてはほぼ使用済みである。年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成28年度分についてはほぼ使用済みである。上記のとおり。上記のとおり。
蛍光リガンド・受容体一体型センサーによる細胞間コミュニケーションの解析

本研究は、分子内にリガンド部とその結合サイトをもつtethered蛍光リガンド型センサーを確立し、アセチルコリン(ACh)、アンジオテンシンII(AngII)、増殖因子などの細胞外メッセンジャーの可視化法を確立し、唾液腺におけるCa2+オシレーションの組織レベル同調のしくみや、歯原性上皮細胞(SF2細胞)と歯髄幹細胞(DPSC)の共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションのしくみを解明することである。今年度は、開発対象となる細胞外メッセンジャーを決定するために、in vivo Ca2+イメージング解析等によってラット唾液腺におけるCa2+オシレーション発生と、SF2細胞とDPSCの共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションに関与する増殖因子の同定を行った。この研究によって、唾液腺の組織レベルで同調したCa2+オシレーションには、局所的なACh濃度とAngII濃度の変化が関与することや、SF2細胞とDPSCの共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションには、TGFβやEGFが関与することが明らかになった。また、細胞外メッセンジャーを不動化する担体として、COOH基を付与したシリカ製不織布の開発を行った。またシリカ表面をアルミニウムで被覆することによって、非特異的結合を低減できることなどを明らかにした。このシリカ製不織布の特性と蛍光センサーを不動化する条件の最適化を行った。さらにこの不織布上で、FRETおよび競合FRET測定が可能であることを確認した。不織布を用いることによって、2種類の蛍光分子を使ったFRETセンサーを1つの担体上に結合させ、センサーとして用いることが可能になり、蛍光センサーの分子設計の自由度を大幅に高める事が可能になった。アセチルコリン(ACh)の持続投与によって発生する唾液腺におけるCa2+オシレーションの組織レベル同調にアンジオテンシンII(AngII)が関与することが明らかになった。この研究では、唾液腺のin vivo Ca2+イメージングに加えて、レーザースペックル血流計を使った血流イメージングを行う事によって、Ca2+オシレーションの同調に血流が関与することが明らかになった。さらにAT1受容体遮断薬のみならず、ACE阻害薬によってオシレーションが阻害されることや、AngIIの持続投与によってACE阻害薬によって停止したオシレーションを回復させることに成功した。この結果から、AChとAngIIの局所的な濃度変化の解析の重要性が明らかになった。また阻害剤を用いた解析によって、SF2細胞とDPSCの共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションには、TGFβやEGFが関与することが明らかになった。これらの結果によって、可視化が細胞外メッセンジャーが明らかになり、それらの分子設計を行っている。細胞外メッセンジャーの可視化には、細胞外に蛍光センサーを固定するための足場が必要である。その足場として、COOHラベルしたシリカ製不織布を開発した。不織布はガラスなどの平板と比較して表面積が大きく、自由に変形させることが可能である。さらに複数の分子を結合させることが可能である。これによって従来の1分子型センサーに加えて、2分子型のセンサーの設計が可能になった。さらに複数の蛍光センサーを固定したセンサー担体の作成など、細胞外センサー技術の応用の可能性を広げることが可能になった。研究協力者:蓑輪英里佳、郷賢治、石田成美、AzmereeJahanAChセンサーの開発:ACh結合タンパク質(ACh-BP)にCFPを連結したリガンド結合ドメインを発現させ、これをシリカ製不織布に結合させる。これに蛍光ラベルしたリガンド(蛍光αブンガロトキシンなど)を作用させてFRETを起こす。さらに、AChと蛍光リガンドの競合によるFRETの変化を利用してAChの測定を可能にする。AngIIセンサーの開発:AngII受容体(AT1)にCFPを連結した受容体細胞表面を発現させ、これに蛍光ラベルしたAngIIを作用させてFRETを起こす。さらに、AngIIと蛍光リガンドの競合によるFRETの変化を利用してAngIIの測定を可能にする。また、AngIIと蛍光AT1を連結したセンサーの開発を試みる。EGFおよびTGFβセンサーの開発:EGF受容体(EGFR)あるいはTGFβ受容体(TGFβR)のリガンド結合ドメイン(LBD)と蛍光タンパク質をタンデムに連結させ(LBD-CFP-LBD-YFP)、リガンドの結合によるFRETを利用したセンサーを作成する。これと並行して、蛍光ラベルしたこれらの受容体と蛍光ラベルした成長因子(EGFあるいはTGFβ)を使ったセンサーを開発する。この場合、蛍光LBDと蛍光成長因子を不織布に結合させたセンサーなどを試みる。

この研究によって、唾液腺の組織レベルで同調したCa2+オシレーションには、局所的なACh濃度とAngII濃度の変化が関与することや、SF2細胞とDPSCの共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションには、TGFβやEGFが関与することが明らかになった。また、細胞外メッセンジャーを不動化する担体として、COOH基を付与したシリカ製不織布の開発を行った。またシリカ表面をアルミニウムで被覆することによって、非特異的結合を低減できることなどを明らかにした。このシリカ製不織布の特性と蛍光センサーを不動化する条件の最適化を行った。さらにこの不織布上で、FRETおよび競合FRET測定が可能であることを確認した。不織布を用いることによって、2種類の蛍光分子を使ったFRETセンサーを1つの担体上に結合させ、センサーとして用いることが可能になり、蛍光センサーの分子設計の自由度を大幅に高める事が可能になった。アセチルコリン(ACh)の持続投与によって発生する唾液腺におけるCa2+オシレーションの組織レベル同調にアンジオテンシンII(AngII)が関与することが明らかになった。この研究では、唾液腺のin vivo Ca2+イメージングに加えて、レーザースペックル血流計を使った血流イメージングを行う事によって、Ca2+オシレーションの同調に血流が関与することが明らかになった。さらにAT1受容体遮断薬のみならず、ACE阻害薬によってオシレーションが阻害されることや、AngIIの持続投与によってACE阻害薬によって停止したオシレーションを回復させることに成功した。この結果から、AChとAngIIの局所的な濃度変化の解析の重要性が明らかになった。また阻害剤を用いた解析によって、SF2細胞とDPSCの共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションには、TGFβやEGFが関与することが明らかになった。これらの結果によって、可視化が細胞外メッセンジャーが明らかになり、それらの分子設計を行っている。細胞外メッセンジャーの可視化には、細胞外に蛍光センサーを固定するための足場が必要である。その足場として、COOHラベルしたシリカ製不織布を開発した。不織布はガラスなどの平板と比較して表面積が大きく、自由に変形させることが可能である。さらに複数の分子を結合させることが可能である。これによって従来の1分子型センサーに加えて、2分子型のセンサーの設計が可能になった。さらに複数の蛍光センサーを固定したセンサー担体の作成など、細胞外センサー技術の応用の可能性を広げることが可能になった。研究協力者:蓑輪英里佳、郷賢治、石田成美、AzmereeJahanAChセンサーの開発:ACh結合タンパク質(ACh-BP)にCFPを連結したリガンド結合ドメインを発現させ、これをシリカ製不織布に結合させる。これに蛍光ラベルしたリガンド(蛍光αブンガロトキシンなど)を作用させてFRETを起こす。さらに、AChと蛍光リガンドの競合によるFRETの変化を利用してAChの測定を可能にする。AngIIセンサーの開発:AngII受容体(AT1)にCFPを連結した受容体細胞表面を発現させ、これに蛍光ラベルしたAngIIを作用させてFRETを起こす。
MFG-E8によるNF-κB依存性シグナルの制御機構の解明と腸管の抗炎症薬開発

実験的に作製したマウス腸炎モデルの腸管炎症は、我々が作成した精製MFG-E8蛋白の投与によって有意に抑制された。そのメカニズムとして、MFG-E8のα5β3インテグリンへの結合部位であるRGDドメインに変異を加えた無機能型の蛋白では腸炎の抑制ができなかったことから、MFG-E8の抗炎症効果はα5β3インテグリンへのMFG-E8の結合に依存していることが想定された。本結果を踏まえてMFG-E8による炎症抑制メカニズムの詳細についてマクロファージを用いたin vitroの実験系で検証した。その結果、LPS刺激下で誘導される炎症惹起分子であるosteopontinと競合的にMFG-E8がα5β3インテグリンに結合することによって、osteopontinによる炎症シグナルがNF-κB依存性に抑制されることが明らかとなった。平成21年度後半からmfg-e8ノックアウトマウスの飼育を開始し、平成21年度からは本マウスを使った実験に着手した。腸管炎症におけるmfg-e8遺伝子の機能を明らかにする目的で、ノックアウトマウスにデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)で腸炎を作製し、野生型マウスの腸炎と比較した。腸炎の発症とともに、ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて体重減少、腸管短縮、組織学的炎症、炎症性サイトカイン産生が著明であった。ノックアウトマウスの結果は、これまでにおこなってきた我々の研究成果を支持する内容であった。これまでは、腸管の急性炎症におけるMFG-E8の働きを検討してきたが、今後はヒトの炎症性腸疾患に近い慢性モデルでの実験が必要と考える。デキストラン硫酸によって実験的に作製したマウス腸炎モデルの腸管炎症は、我々が作成した精製MFG-E8蛋白の投与によって有意に抑制されることが明らかとなった。MFG-E8のα5β3インテグリンへの結合部位であるRGDドメインに変異を加えた無機能型の蛋白では腸炎の抑制ができなかったことから、MFG-E8の抗炎症効果はα5β3インテグリンへのMFG-E8の結合に依存していることが想定された。その結果、LPS刺激下で誘導される炎症惹起分子であるosteopontipと競合的にMFG-E8がα5β3インテグリンに結合することによって、osteopontinによる炎症シグナルがNF-κB依存性に抑制されることが明らかとなった。本研究成果はJournal Immunogyに投稿し受理され、現在印刷中(in press)である。平成21年度は、上記の実験結果に基づいて、mfg-e8ノックアウトマウスを用いて腸炎による炎症発癌におけるMFG-E8の役割を明らかにしていく予定である。平成平成21年度後半からmfg-e8ノックアウトマウスの飼育を始めている。22年度は本マウスを用いて腸炎モデル作成し、慢性炎症による大腸癌発生におけるMFG-E8の役割を明らかにする。

また、MFG-E8の発現制御機構についてmfg-e8遺伝子のプロモーター解析をおこない、炎症性腸疾患の発症リスクに関わる検討を追加する。実験的に作製したマウス腸炎モデルの腸管炎症は、我々が作成した精製MFG-E8蛋白の投与によって有意に抑制された。そのメカニズムとして、MFG-E8のα5β3インテグリンへの結合部位であるRGDドメインに変異を加えた無機能型の蛋白では腸炎の抑制ができなかったことから、MFG-E8の抗炎症効果はα5β3インテグリンへのMFG-E8の結合に依存していることが想定された。本結果を踏まえてMFG-E8による炎症抑制メカニズムの詳細についてマクロファージを用いたin vitroの実験系で検証した。その結果、LPS刺激下で誘導される炎症惹起分子であるosteopontinと競合的にMFG-E8がα5β3インテグリンに結合することによって、osteopontinによる炎症シグナルがNF-κB依存性に抑制されることが明らかとなった。平成21年度後半からmfg-e8ノックアウトマウスの飼育を開始し、平成21年度からは本マウスを使った実験に着手した。腸管炎症におけるmfg-e8遺伝子の機能を明らかにする目的で、ノックアウトマウスにデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)で腸炎を作製し、野生型マウスの腸炎と比較した。腸炎の発症とともに、ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて体重減少、腸管短縮組織学的炎症、炎症性サイトカイン産生が著明であった。ノックアウトマウスの結果は、これまでにおこなってきた我々の研究成果を支持する内容であった。これまでは、腸管の急性炎症におけるMFG-E8の働きを検討してきたが、今後はヒトの炎症性腸疾患に近い慢性モデルでの実験が必要と考える。
光電子回折による金属/絶縁体薄膜界面反応プロセスの研究

1.金属/絶縁体薄膜界面を含む種々の薄膜界面反応の検討・実験当初の目標はAl/SiO_2界面であったが、それぞれの薄膜自身が秩序構造を保ちながら薄膜成長をしないことが明らかになったために、以下の薄膜界面の界面構造や界面反応過程を調べるための実験的な基礎検討を行った。a. Cu/Ge(111)系の界面構造(不整合構造での界面構造解析、熱反応)不整合構造を持つCu/Ge(111)系の界面構造を調べた。Cuを2.0ML蒸着させた系では、ドメイン内でCuが2層構造を形成し、最上層は0.6A下方緩和することがわかった。また、蒸着量を変化させた実験より、初期から2層構造で成長することがわかった。また加熱により形成したCuとGeと合金相の予備測定も行った。b. CaF_2/Ge(111)系の界面構造(欠陥構造を伴う界面反応)CaF_2/Ge(111)系の構造を光電子回折により調べた。また最表面に電子線照射により生成した金属Ca層の構造を、シンクロトロン放射光を用いて、光電子回折の角度・エネルギー依存性から測定した。金属Ca層の酸化後の構造も同様に調べた。2.薄膜成長システムの構築10年度購入したクヌーセンセルを既存の光電子回折-薄膜成長解析装置に組込み、多元系薄膜蒸着を可能とした。同時に、下地基盤原子を蒸着し、よく制御された基盤表面を作り出すことで、良質の薄膜成長が可能となった。その結果、SrF_2/Ge(111)やCaF_2/Ge(111)などの薄膜を制御良く成長させ、その構造や状態、薄膜成長のプロセスをX線光電子回折法により明らかにした。3. XPED測定の高速化についての基礎的検討界面反応を精度良くとらえるためには、従来のplot by plotの測定法では不充分であり、2次元同時検出システムによる光電子回折測定の高速化の理論的・実験的研究を行った。また光電子のロスの少ない新しいタイプの電子レンズの理論的検討を行った。金属/絶縁体薄膜界面を含む種々の薄膜における界面反応を研究するために、いくつかの実験および検討を行った。当初、第一の目標としていたのはAl/SiO_2界面であったが、それぞれの薄膜自身が秩序構造を保ちながら薄膜成長をしえないことが、検討の結果、明らかになったために、いくつかの薄膜界面において、その界面構造や界面反応過程を調べるための実験的な基礎検討を行った。本年度購入したヌ-センセルを新たに、既存の光電子回析-薄膜成長解析装置に組込み、多元系の薄膜蒸着を可能とした。これにより、複雑な化合物薄膜の蒸着も基本的には可能となった。ただし、本年度はむしろ、下地基盤原子を蒸着することにより、よく制御された基盤表面、すなわち薄膜成長時の界面を作り出し、いくつかの質のよい薄膜を成長させることが可能となった。その結果、SrF_2/Ge(111)やCaF_2/Ge(111)などの薄膜を制御良く成長させることができた。SrF_2/Ge(111)については、その薄膜や界面の構造や状態、薄膜成長のプロセスについてX線光電子回析法により明らかにした。

また、CaF_2/Ge(111)系ではこの系自身の構造の測定も行ったが、最表面に電子線照射により、金属Ca層を生成することができた。この金属/絶縁体界面の構造や状態を調べるために、シンクロトロン放射光を用いた光電子回析の角度依存性やエネルギー依存性を測定し、現在解析を行っている。さらに、Cu/Ge(111)界面構造やその酸化反応プロセスを調べるために、この系について基礎的な検討を行った。また、界面反応を精度良くとらえるために、2次元同時検出システムによる光電子回析測定の迅速化についての実験も行った。金属/絶縁体薄膜界面を含む種々の薄膜における界面反応を研究するために、いくつかの実験および検討を行った。昨年の検討の結果、第一候補のAl/SiO_2界面ではそれぞれの薄膜自身が秩序構造を保ちながら薄膜成長をしえないことが明らかになったために、本年度は下記のように、いくつかの薄膜界面において、その界面構造や界面反応過程を調べるための実験を行った。1. Cu/Ge(111)系の界面構造(不整合構造での界面構造解析)初年度に検討した不整合構造を持つCu/Ge(111)系についてその界面構造を調べた。Cuを2.0ML蒸着させた系では、ドメイン内でCuが2層構造を形成していることがXPEDにより明らかになった。この際にCuの最上層は0.6Å下方に緩和していることが詳細な解析の結果わかった。また、蒸着量を変化させた実験の結果、この系では初期からCuは2層構造で成長することが明らかになった。また加熱により形成したCuとGeと合金相についてRHEED、XPEDでの予備測定を行った。2. CaF_2/Ge(111)系の界面構造(欠陥構造を伴う界面反応)CaF_2/Ge(111)系では、最表面に電子線照射により生成した金属Ca層の構造を調べた。この系の構造を調べるために、シンクロトロン放射光を用いて、光電子回折の角度依存性やエネルギー依存性を測定した。またこの金属Ca層の酸化後の構造についても同様な測定を行った。3. XPED測定の高速化の検討界面反応を精度良くとらえるためには、従来の単純なplot by plotの測定法では不充分であることがわかった。そこで2次元同時検出システムによる光電子回折測定の高速化についての理論的・実験的研究を行った。また光電子のロスの少ない新しいタイプの電子レンズに対する理論的検討を行い、リアルタイム測定への予備検討を行った。
新規貪食細胞：濾胞樹状細胞　によるアポトーシスＢ細胞排除とその生理的意義の解明

【目的】死細胞貪食能を有する脾臓の間質細胞を同定すること。【結果】脾臓には主に4種類の間質細胞が存在し、それぞれの局在や機能、細胞表面マーカーによって定義されている。各間質細胞分画の貪食能を検討するために、フローサイトメーターを用いて組織より各間質細胞分画を単離する手法を樹立した(Sato K et al. Mol. Immunol. 2016)。単離した間質細胞の貪食能評価するために、経静脈的にアポトーシス細胞を投与したマウスや、細胞毒性を持つアラムアジュバント投与により内在性の死細胞が増加したマウスを解析した結果、濾胞樹状細胞や細網線維芽細胞は死細胞を貪食しなかった。一方で、血管内皮細胞および濾胞辺縁部に局在する辺縁細網細胞が死細胞を貪食することを見出した。肝臓の毛細血管を構成する特殊な血管内皮細胞は類洞内皮細胞と呼ばれ、高度に発達した貪食能を持つことが知られている。脾臓の血管内皮細胞も類洞内皮細胞に分類されることから、肝臓と同様に脾臓の血管内皮細胞も血中の老廃物や死細胞の排除に寄与していると考えられる。辺縁細網細胞は濾胞の辺縁部に局在する細胞であるが、その生理学的な役割は未だに明らかになっていない。その局在から辺縁細網細胞は胚中心形成に伴い大量に発生するアポトーシスB細胞を貪食していると仮説を立て、検証した。B細胞特異的GFP発現マウスの脾臓を解析したところ、胚中心形成に伴って辺縁細網細胞の細胞室内でB細胞由来のGFPが検出された。すなわち、辺縁細網細胞は脾臓における非専門貪食細胞として、アポトーシスB細胞の排除に寄与することが示された。【意義】胚中心形成に伴うアポトーシス細胞の排除機構の一端を明らかにし、辺縁細網細胞の新たな機能を明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。感染から生体を防御する免疫機構の中で、抗体は抗原を特異的に認識することで病原体を不活化もしくは免疫細胞を活性化させると役割を担う。抗体は成熟・分化したB細胞より産生されるが、そのためには特殊な間質細胞である濾胞樹状細胞(Follicular dendritic cell, FDC)が必要である。FDCは、リンパ組織の濾胞の中心部に局在し、樹状突起を伸ばし、3次元の網状組織を形成する。その形態的特徴を活かし、FDCは濾胞に侵入した抗原を細胞表面上に効率的に捕捉し、B細胞に提示することで胚中心形成や抗体のクラススイッチ、記憶B細胞の分化、二次免疫反応の増強などに寄与している。しかしながら、FDCはリンパ組織において非常に少数の細胞集団であり、物理的・化学的ストレスに対して脆弱であるため、組織からの単離が困難であり、in vitroにおける解析が十分に行われていない。そこでFDCの詳細な機能解析を行うために、我々はナイーブマウスからFDCを単離する手法を樹立した。しかしながら、その手法によって得られるFDCの純度が不十分であったため、我々は新たな細胞表面分子を加えて用いることで高純度FDCの単離法の確立を試みた。新規単離法によって得られたFDCは、従来法によって得られたFDCと比較して、種々のFDC特異的分子の発現が増加している傾向が認められた。これらの結果は、新規単離法により高純度のFDCを得ることが可能になったという点で、今後FDCの詳細な機能解析が可能であることを示している。【背景】抗体は胚中心において成熟・分化したB細胞より産生されるが、そのためには濾胞に局在する特殊な間質細胞である濾胞樹状細胞(Follicular dendritic cell, FDC)が必要である。FDCはB細胞の活性化のために抗原を提示し、様々なサイトカインを産生する極めて重要な細胞であるが、それ以外の生理的機能に関して未知の部分が多い。我々は胚中心形成時にFDCの周囲にアポトーシスB細胞が増加する点に着目した。親和性成熟の過程でB細胞受容体に不適切な変異が導入された結果、多くのB細胞はアポトーシスを引き起こす。アポトーシス細胞はマクロファージ等の貪食細胞に対して、"Eat me"シグナルを提示することで速やかに貪食されるが、FDCがアポトーシス細胞を認識するという報告は過去に無い。【目的】FDCがアポトーシスB細胞を認識しているか否かを明らかにし、その生理的意義を解明することである。【進捗状況】FDCによるアポトーシス細胞の貪食能を検討するために、ナイーブマウスと抗原投与マウスより単離したFDC (CD45陰性CD54陽性CD31陰性分画)に対して、アポトーシス細胞のDNA断片を検出するTdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)法による染色を行った。フローサイトメーターと共焦点顕微鏡を用いた解析の結果、ナイーブマウス由来FDCと比較して、抗原投与マウス由来FDCではTUNEL陽性FDCが有意に増加しており、TUNELで標識された顆粒がFDCの細胞質内で多数観察されたため、FDCが貪食細胞であることが強く示唆された。

FDCの貪食に関与する受容体を同定するために、種々の受容体の発現をナイーブマウス由来FDCと抗原投与マウス由来FDCで比較したところ、免疫に伴って発現が有意に上昇する受容体Xを同定した。このことより胚中心におけるFDCのアポトーシスB細胞の貪食に受容体Xが関与していることが示唆された。FDCが貪食細胞であるという新たな知見を示唆する結果を得た。【目的】死細胞貪食能を有する脾臓の間質細胞を同定すること。【結果】脾臓には主に4種類の間質細胞が存在し、それぞれの局在や機能、細胞表面マーカーによって定義されている。各間質細胞分画の貪食能を検討するために、フローサイトメーターを用いて組織より各間質細胞分画を単離する手法を樹立した(Sato K et al. Mol. Immunol. 2016)。単離した間質細胞の貪食能評価するために、経静脈的にアポトーシス細胞を投与したマウスや、細胞毒性を持つアラムアジュバント投与により内在性の死細胞が増加したマウスを解析した結果、濾胞樹状細胞や細網線維芽細胞は死細胞を貪食しなかった。一方で、血管内皮細胞および濾胞辺縁部に局在する辺縁細網細胞が死細胞を貪食することを見出した。肝臓の毛細血管を構成する特殊な血管内皮細胞は類洞内皮細胞と呼ばれ、高度に発達した貪食能を持つことが知られている。脾臓の血管内皮細胞も類洞内皮細胞に分類されることから、肝臓と同様に脾臓の血管内皮細胞も血中の老廃物や死細胞の排除に寄与していると考えられる。辺縁細網細胞は濾胞の辺縁部に局在する細胞であるが、その生理学的な役割は未だに明らかになっていない。その局在から辺縁細網細胞は胚中心形成に伴い大量に発生するアポトーシスB細胞を貪食していると仮説を立て、検証した。B細胞特異的GFP発現マウスの脾臓を解析したところ、胚中心形成に伴って辺縁細網細胞の細胞室内でB細胞由来のGFPが検出された。すなわち、辺縁細網細胞は脾臓における非専門貪食細胞として、アポトーシスB細胞の排除に寄与することが示された。【意義】胚中心形成に伴うアポトーシス細胞の排除機構の一端を明らかにし、辺縁細網細胞の新たな機能を明らかにした。FDCの新規単離方法を確立し、今後の解析の基盤を得た。FDCによるアポトーシス細胞貪食の生理的意義を明らかにするため、FDC特異的受容体X欠損マウスを樹立している。樹立したマウスを用いて、抗原投与に伴うFDCの貪食能や抗体産生に与える影響を評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。新たな手法で単離されたFDCが機能的・形態的にFDCの特徴を有しているか検討する。その後、新規単離法で得られたFDCを用いて予定通り解析を行う予定である。
競技現場におけるビデオを用いた動機づけ効果の実証と実践のリンク

モチベーションビデオは,実践的な研究において成果をあげてきた研究である.しかしながら,競技場面における映像のみについての効果を検討した実験的研究は行われていない.そこで,研究Iでは,自己の選手の試合映像から,ビデオを作製し,映像のみを視聴させることによる心理的側面およびパフォーマンス側面への効果の検討することを目的とした.また,研究IIでは,映像によるパフォーマンス向上のメカニズムを検証することを目的とした.研究Iの被験者は大学生バドミントン選手32名であった.被験者を自己の試合映像視聴群(以下Self-modeling群)と映像視聴なし群(以下Control群)に2群に無作為割付を行い,Self-modeling群の被験者には,自己の試合映像の中から,良いと感じるプレイ映像を自己選択させ,その映像を編集して,1本のビデオを作製し,パフォーマンス実験を行う1時間前に視聴させた.心理的側面を測定するために,PCI forモチベーションビデオを実験開始前,映像視聴後(パフォーマンス実験1時間前),パフォーマンス実験直前の3回記入した.パフォーマンス実験の評価として,試合時の成功ショット率を算出した.実験の結果,心理的側面では,Self-modeling群はControl群に比べて,全ての因子において有意に向上していた。また,パフォーマンス側面でも,Self-modeling群はControl群に比べて,有意に成功ショット率が高まったことが確認された.研究IIでは,研究Iの被験者から得られた心理的側面とパフォーマンス側面のデータを用いて,媒介変数検証法を用いて行った.その結果,心理的側面が媒介変数とはなりえなかったが,映像を視聴することは,心理的側面およびパフォーマンス側面を同時に向上させている可能性が示唆された.特に,パフォーマンスの上に大きく寄与していることが明らかになった.モチベーションビデオは,実践的な研究において成果をあげてきた研究である.しかしながら,競技場面における映像のみについての効果を検討した実験的研究は行われていない.そこで,研究Iでは,自己の選手の試合映像から,ビデオを作製し,映像のみを視聴させることによる心理的側面およびパフォーマンス側面への効果の検討することを目的とした.また,研究IIでは,映像によるパフォーマンス向上のメカニズムを検証することを目的とした.研究Iの被験者は大学生バドミントン選手32名であった.被験者を自己の試合映像視聴群(以下Self-modeling群)と映像視聴なし群(以下Control群)に2群に無作為割付を行い,Self-modeling群の被験者には,自己の試合映像の中から,良いと感じるプレイ映像を自己選択させ,その映像を編集して,1本のビデオを作製し,パフォーマンス実験を行う1時間前に視聴させた.心理的側面を測定するために,PCI forモチベーションビデオを実験開始前,映像視聴後(パフォーマンス実験1時間前),パフォーマンス実験直前の3回記入した.パフォーマンス実験の評価として,試合時の成功ショット率を算出した.実験の結果,心理的側面では,Self-modeling群はControl群に比べて,全ての因子において有意に向上していた。また,パフォーマンス側面でも,Self-modeling群はControl群に比べて,有意に成功ショット率が高まったことが確認された.研究IIでは,研究Iの被験者から得られた心理的側面とパフォーマンス側面のデータを用いて,媒介変数検証法を用いて行った.その結果,心理的側面が媒介変数とはなりえなかったが,映像を視聴することは,心理的側面およびパフォーマンス側面を同時に向上させている可能性が示唆された.特に,パフォーマンスの上に大きく寄与していることが明らかになった.
次世代省エネルギー半導体用高強度パルス金属イオンビーム発生とイオン注入への応用

次世代省エネルギー用半導体材料への新しいイオン注入技術であるパルスイオン注入法の実現に向け、本研究では真空アーク放電を利用した同軸プラズマガンイオン源を用いたp型ドーパント用のパルスアルミニウムイオンビーム発生技術の開発を行い、アルミニウムの比率が89%という従来技術よりも高純度のパルスアルミニウムイオンビームを得ることができた。さらに、アモルファスシリコン薄膜にイオンビームを照射した結果、アモルファス薄膜が多結晶化しており、パルスイオンビームによる照射効果を確認できた。次世代省エネルギーデバイスとして期待されている炭化ケイ素半導体に対して、高温アニールを必要とせずにイオン注入と同時にアニール処理を同時に行えるパルスイオン注入の実証実験を行うためには、高純度の大電流パルス重イオンビームが必要である。さらに、イオン注入法においてはn型・p型ドーパントの機能として作用するイオン種のイオンビームが必要であり、n型ドーパントとして機能する窒素に対してはこれまでの研究成果で対応できるが、p型ドーパントとして機能する元素の多くが固体であることから、固体をイオン源とする新しい高強度パルスイオンビーム発生技術の開発が不可欠である。今年度は、p型ドーパントとして機能するイオン種(アルミニウムイオン)が発生可能である真空アーク放電を利用した金属イオン発生技術をイオン源として用いることで、p型ドーパント用の高強度パルスアルミニウムイオンビーム発生技術を開発し、イオンビームの評価を行った。この装置において加速電圧のピーク値が220kV、パルス幅(半値幅)が100nsであるパルス電圧を加速ギャップに印加した時、アノード電極から50mm流においてイオン電流密度200A/cm^2、パルス幅40nsのパルスイオンビームを得ることができた。また、トムソンパラボラ分析器を用いてパルスイオンビームのエネルギーとイオン種の同定を行った。この結果、イオンビームに含まれているイオン種はエネルギー140740 keVの1-3価のアルミニウムイオンと160190 keVの水素イオンであった。さらに、アルミニウムと水素の比率を算出したところ、アルミニウムの比率が89%、水素は11%という従来技術よりも高純度のパルスアルミニウムイオンビームが得られた。来年度は、ビーム発生術の向上を目指し、より詳細なビーム特性評価、装置改良等を行い、そして照射実験を行う予定である。省エネルギーデバイスとして期待されている炭化ケイ素半導体材料に対して、高温アニールを必要とせずにイオン注入と同時にアニール処理を同時に行えるパルスイオン注入の実証実験を行うためには、高純度の大電流パルス重イオンビームが必要であり、それに加えてn型・p型ドーパントの機能を有するイオン種のイオンビームが必要である。本研究では、昨年度までにp型ドーパント用のアルミニウムイオンビーム発生技術として、真空アーク放電を利用した同軸プラズマガンのイオン源を用いたパルスイオンビーム発生技術を開発し、従来技術よりも高純度のパルスアルミニウムイオンビームが得られた。照射実験に向けて、まずイオン電流の空間分布とビーム発生の再現性のビーム品質を評価した。その結果、ビーム電流の空間分布はある特定の方向(ExBの方向)に強くなる傾向があった。また、ビーム電流の再現性はショットごとのバラツキが大きかった。これはイオン源であるプラズマガンの出力のショットごと再現性が悪いためである。さらに、パルスイオンビームの照射効果を検証するためにガラス基板上に生成されたアモルファスシリコン薄膜にイオンビームを照射した結果、アモルファス薄膜が多結晶化しており、パルスイオンビームによる照射効果を確認した。また、イオン注入に適用させるには更なるビーム純度向上が必要である。このためガス分析装置を使用して残留ガスや電極等の付着ガスによるビーム純度への影響を調べた結果、ビーム純度へ及ぼす影響が大きいことがわかった。今後、電極材料等を変更して吸着ガスの影響を軽減、真空度の改善、さらにはビーム純度を向上させる技術(両極性パルス加速技術)を適用するなどの装置の改良を行う必要がある。
マウスアミロイド蛋白(apoA-II)の構造交換と分子シャペロン

マウス老化アミロイド線維(AApoAII)と正常なapoA-II蛋白の一次構造は同一であるがAApoAIIはapoA-IIと接触し自己と同一な線維構造へと変換させ、連鎖反応的に線維が伸長して組織に沈着する「蛋白構造の伝播」という新たな疾患の概念が確立されつつある。アミロイド線維形成は核形成とそれに続く線維伸長からなるがi)最初のアミロイド核形成に必要な構造変換を捕助するシャペロン分子、ii)一旦形成されたアミロイド核はapoA-IIの構造変換を引き起こす第二のシャペロンが注目されている。この二つのシャペロンの同定とその機能、作用メカニズムを解明するため本年度は以下の研究を行った。1)mature apoA-IIのN-末端に5アミノ酸残基が残存したproapoA-IIが最初の線維核形成の鍵になる可能性を示した。2)飲水中にアミロイド線維を含ませ投与するとアミロイド沈着が誘発され、線維構造を維持したままAApoAIIが吸収され、重合核として働くことを示唆した。3)アミロイドーシスを発症しにくい系統のapoA-IIを(B型apoA-II)をアデノウイルスベクターを用いてin vivoで一過性に強制発現させると、アミロイド線維の伸長反応が抑制された。B型apoA-IIがアミロイド線維AApoAIIとの接触によるapoA-IIの構造変換を抑制したことを示唆し手織、そのメカニズムの解明が今後の重要課題と考えている。
形式化の数学対象を公理的射影幾何学からさらに限定し、有限幾何学、有限射影平面、有限アフィン平面を設定し、大学院生の協力を得て、有限射影平面の位数の定義や関連する基礎的補題、定理群からなる基礎理論を、証明支援システムCOQ/SSReflectを用いて形式化した。これは通常の(人の手による対話的な)証明支援システムの使用によるものであるが、形式化自体に意味があるのと同時に、ニューラルネットの教師付き学習データの作成としての意味をもつ。これに並行して、証明支援システムをニューラル・ネットワーク(具体的にはTensorFlowおよびKeras)と連携する方法として、pythonのsubprocessを用いて直接coqtopを実行する手法、COQ XML Protocolを用いて連携する手法、さらに開発途中のcoq SerApiを用いてS式を介して連携する手法、の3手法について、技術的問題をほぼ解消し、簡単な例について試験的に実行した。また、alpha-zero generalのコードからモンテカルロ木探索の部分を抽出し、二人対戦ゲームとしての特殊性を排して、汎用性を持たせた。これを数学証明に適用するにあたり、マルコフ決定過程としての状態と行動をどのように設定するべきかについて考察し、行動設定の粒度レベルの自由度があることを認識した。行動の粒度を上げる方法として、Coqの局所言語Ltacを用いて自動性の高いtacticsを作成する方法を試験的に作成した。もっとも粒度が低い行動設定(行動=tactic)および限定したtacticを用いて、試験的に深層学習を実行したが、学習が収束するには至らなかった。この研究の課題を達成するためには、次の項目について研究・開発を行う必要がある。1.適正な数学対象の設定と、証明支援系の通常の(対話的)使用による形式化の達成。2.証明支援系と深層学習フレームワークの連携技術3.方策改善のためのモンテカルロ木探索法の実装4.粒度の高い(大きい)行動設定。このうち、1.については、公理的射影幾何学からさらに限定し、有限幾何、有限射影平面、有限アフィン幾何について、大学院生の協力を得て、有限射影平面の位数の定義や関連する基礎的補題、定理群からなる基礎理論を、証明支援システムCOQ/SSReflectを用いて形式化した。2.については、pythonのsubprocessを用いて直接coqtopを実行する手法、COQ XML Protocolを用いて連携する手法、さらに開発途中のcoq SerApiを用いてS式を介して連携する手法、の3手法について、技術的問題をほぼ解消し、簡単な例について試験的に実行した。3.についてはalpha-zero generalのコードからモンテカルロ木探索の部分を抽出し、二人対戦ゲームとしての特殊性を排して、汎用性を持たせた。4.についてはCoqの局所言語Ltacを用いて自動性の高いtacticsを作成する方法を試験的に作成した。これらを総合的に組み合わせて、目標としている数学証明の学習が収束するまでには至ってないが、そのための準備として概ね順調に進展していると考える。有限射影平面から無限射影平面に形式化を拡張子、さらにデザルグの公理を設定することによって、古典的な平面射影幾何を形式化する。これによって深層学習への教室付き学習データを増やせる。これとは別に、数学証明を(一人)ゲームとして状態と行動を設定するにあたり、行動の「粒度」を複数考えることによって、階層的な深層学習システムを考える。もっとも大きい粒度として、形式化された定理、補題がある。すなわち個々の定理をapplyすることをそれぞれの行動と考えることによって、学習効率が高くなることが期待される。そのために、定理を柔軟にapply可能な「行動定理」に書き換える必要がある。このためにCoqの局所言語Ltacを用いて、「定理」を「行動定理」に書き換える方法を開発する。全く新しい試みとして、定理・補題発見がある。各時点でのゴールにどのどのように補題を設定して証明すればいいのか、という問題である。これについてもモンテカルロ木探索法を利用した強化学習が有効であると考えている。行動の粒度が異なるいくつかのマルコフ決定過程を用意し、状況によって使い分け、協調的にニューラすネットの学習の収束が進むようにする。
もっとも粒度が低い行動設定(行動=tactic)および限定したtacticを用いて、試験的に深層学習を実行したが、学習が収束するには至らなかった。この研究の課題を達成するためには、次の項目について研究・開発を行う必要がある。1.適正な数学対象の設定と、証明支援系の通常の(対話的)使用による形式化の達成。2.証明支援系と深層学習フレームワークの連携技術3.方策改善のためのモンテカルロ木探索法の実装4.粒度の高い(大きい)行動設定。このうち、1.については、公理的射影幾何学からさらに限定し、有限幾何、有限射影平面、有限アフィン幾何について、大学院生の協力を得て、有限射影平面の位数の定義や関連する基礎的補題、定理群からなる基礎理論を、証明支援システムCOQ/SSReflectを用いて形式化した。2.については、pythonのsubprocessを用いて直接coqtopを実行する手法、COQ XML Protocolを用いて連携する手法、さらに開発途中のcoq SerApiを用いてS式を介して連携する手法、の3手法について、技術的問題をほぼ解消し、簡単な例について試験的に実行した。3.についてはalpha-zero generalのコードからモンテカルロ木探索の部分を抽出し、二人対戦ゲームとしての特殊性を排して、汎用性を持たせた。4.についてはCoqの局所言語Ltacを用いて自動性の高いtacticsを作成する方法を試験的に作成した。これらを総合的に組み合わせて、目標としている数学証明の学習が収束するまでには至ってないが、そのための準備として概ね順調に進展していると考える。有限射影平面から無限射影平面に形式化を拡張子、さらにデザルグの公理を設定することによって、古典的な平面射影幾何を形式化する。これによって深層学習への教室付き学習データを増やせる。これとは別に、数学証明を(一人)ゲームとして状態と行動を設定するにあたり、行動の「粒度」を複数考えることによって、階層的な深層学習システムを考える。もっとも大きい粒度として、形式化された定理、補題がある。すなわち個々の定理をapplyすることをそれぞれの行動と考えることによって、学習効率が高くなることが期待される。そのために、定理を柔軟にapply可能な「行動定理」に書き換える必要がある。このためにCoqの局所言語Ltacを用いて、「定理」を「行動定理」に書き換える方法を開発する。全く新しい試みとして、定理・補題発見がある。各時点でのゴールにどのどのように補題を設定して証明すればいいのか、という問題である。これについてもモンテカルロ木探索法を利用した強化学習が有効であると考えている。行動の粒度が異なるいくつかのマルコフ決定過程を用意し、状況によって使い分け、協調的にニューラすネットの学習の収束が進むようにする。
テロメレース特異的癌融解ウイルスによる婦人科腫瘍の遺伝子治療の開発

我々は従来から遺伝子治療のベクターとして用いられてきたウイルスの毒性に着目し、ウイルス自らが生体内で増殖複製し、その感染毒性により細胞を死滅させるシステムを模索してきた。また我々はテロメレース触媒サブユニットであるhTERT(Human telomerase reverse transcriptase)遺伝子プロモーターを世界で初めてクローニングし、このプロモーターが癌細胞特異的に活性化されることを報告してきた。本研究ではhTERTプロモーターをアデノウイルスtype5の複製に必要な自己蛋白E1Aの遺伝子の上流に組み込んだ増殖型ウイルス(TRAD: telomerase-specific replication-competent adenovirus)を開発し、in vitroおよびin vivoで腫瘍特異的増殖を確認するとともに、その抗腫瘍効果を明らかにした。TRADの腫瘍への直接注入により明確な造腫瘍抑制効果が認められる一方で、他臓器への毒性は認められなかった。一方でTRADは注入部位より拡散し、血流に乗って遠隔病巣にも到達し得ることが明らかとなった。このことは転移病巣にも有効である可能性を示唆する。またTRADは抗癌剤耐性細胞にも有効であり、さらには既存の抗癌剤との併用で相乗作用を有することも報告してきた。現在このウイルスはOncolys社との共同開発により米国で臨床試験を行っている。我々はテロメレース触媒サブユニットであるhTERT(Human telomerase reverse transcriptase)遺伝子プロモーターを世界で初めてクローニングし、このプロモーターが癌細胞特異的に活性化されることを報告してきた。hTERT遺伝子プロモーターが高度の癌特異性を有することから、アデノウイルスの複製に必要な自己蛋白E1Aの遺伝子の上流にこのプロモーターを組み込みめば、E1Aがテロメレース陽性細胞でのみ発現することになり、ウイルスの複製が可能になる。したがってこのような組み替えウイルスは、テロメレース陽性の癌細胞においてのみ複製増殖可能な増殖型ウイルス(TRAD : telomerase-specific replication-competent adenovirus)であり、これを用いて従来型の遺伝子治療とは全く異なる新たなシステムを構築することを研究の目的とした。我々は今回の研究で、まず卵巣癌に対するTRADの抗腫傷効果について検討を加えた。はじめに卵巣癌細胞SKOV3に対するin vitroの抗腫瘍効果を検討した。TRADを種々のMOIにてSKOV3細胞およびコントロールとして正常線維芽細胞に作用させると、TRADはSKOV3細胞に対してのみ著明な殺細胞効果を有し、正常細胞に対する毒性は軽微なものであった。TRAD-GFPを感染させた実験では、TRADの癌細胞特異的複製増殖が確認された。次いで、SKOV3細胞をマウス腹腔内に接種し、腹膜播種が出来ることを確認し、TRADを単独(1-10MOI)あるいはCDDP併用(0.5mg/body)にて腹腔内注入した。48日後の検討ではCDDP単独およびTRAD単独で腹膜播種巣の数の有意な現象が確認できたが、両者の併用により著明な抗腫瘍効果が確認できた。また生存率の検討では併用群で単独群あるいは未治療群に比し有意な延長を認めた。これらの治療マウスには各臓器の異常や血液所見の異常は認められなかった。以上のことからTRADの卵巣癌、特に腹膜播種病変に対する有用性が示され、今後さらに臨床応用に向けた基礎実験と臨床試験(phaseI/II)を進めてゆく計画である。我々はテロメレース触媒サブユニットであるhTERT (Human telomerase reverse transcriptase)遺伝子プロモーターを世界で初めてクローニングし、このプロモーターが癌細胞特異的に活性化されることを報告してきた。したがってこのような組み替えウイルスは、テロメレース陽性の癌細胞においてのみ複製増殖可能な増殖型ウイルス(TRAD : telomerase-specific replication-competent adenovirus)であり、これを用いて婦人科がん、なかでも難治性の卵巣癌の治療への応用を目的とした。SKOV3卵巣癌細胞株によるマウス腹膜播種モデルを作製した。

TRADをこのマウスの腹腔内に注入し、抗腫瘍効果を検討したところ、TRAD 10MOI投与にて播種巣の有意な現象を認めた。TRADの局在はTRAD-GFPを新たに作製しGFP蛍光にて探索したところ、腹膜面め播種巣に限局して存在していた。CDDP腹腔内投与との併用では、CDDP単剤に比し有意に生存率の向上を認めた。TRADはCDDP耐性株にも感受性株と同等のIC50値を示した。以上の結果より腹膜播種巣を有する難治性野卵巣癌に対してTRADが有効な治療戦略となり得ることが明らかになった。我々は従来から遺伝子治療のベクターとして用いられてきたウイルスの毒性に着目し、ウイルス自らが生体内で増殖複製し、その感染毒性により細胞を死滅させるシステムを模索してきた。また我々はテロメレース触媒サブユニットであるhTERT(Human telomerase reversetranscriptase)遺伝子プロモーターを世界で初めてクローニングし、このプロモーターが癌細胞特異的に活性化されることを報告してきた。本研究ではhTERTプロモーターをアデノウイルスtype 5の複製に必要な自己蛋白E1Aの遺伝子の上流に組み込んだ増殖型ウイルス(TRAD:telomerase-specific replication-competent adenovirus)を開発し、in vitroおよびin vivoで腫瘍特異的増殖を確認するとともに、そのの抗腫瘍効果を明らかにした。TRADの腫瘍への直接注入により明確な造腫瘍抑制効果が認められる一方で、多臓器への毒性は認められなかった。またTRADは抗癌剤耐性細胞にも有効であり、さらには既存の抗癌剤との併用で相乗作用を有することも報告してきた。現在このウイルスはOncolys社との共同開発により米国で臨床試験を行っている。
ヒト糖輸送体の機能部位の解析

ヒト糖輸送体(GLUT)の基質認識部位の解析を目標にして、遺伝子操作の容易な酵母Saccaromyces cerevisiaeの、GLUTと同じMajor facilitator superfamilyに属する糖輸送体を用いて基質認識部位の解析を行った。酵母の高親和性糖輸送体Hxt2と低親和性糖輸送体Hxt1は、各々12個の膜貫通領域(TM)を持ち、両者のTMのアミノ酸は70%同一である。Hxt2の高親和性糖輸送に必要なTMを明らかにするため、Hxt2のすべてのTMを、対応するHxt1のTMでランダムに置換したキメラを作成し、糖濃度を制限した寒天培地上で高親和性糖輸送を行うクローンを選択した。Hxt2のTM1,5,7,8が高親和性糖輸送に必須である結果を得た。最近、MFSに属する細菌のラクトース輸送体LacYとグリセロール3リン酸輸送体GlpTの結晶解析の結果が報告された。TM1,5,7,8はいずれも基質通過のポアを構成していることが明らかになった(Biochem.J.372,247-252)。TM1,5,7,8中、Hxt1、Hxt2間で異なる20個のアミノ酸において、Hxt2のアミノ酸を、対応するHxt1のアミノ酸とランダムに置換したすべての組み合わせの変異体を作成し、その糖輸送活性の解析からTM5においてはLeu-201が高親和性糖輸送に必須であり、Cys-195とPhe-198が補助的役割を担っていることが明らかになった。これら3個のアミノ酸は膜貫通ヘリックスの同じ側面にあり、糖輸送のpathwayを形成していることが示唆される(J.Biol.Chem.in press)。ヒト糖輸送体GLUT1においてもLeu-201に対応するアミノ酸がやはりLeu-162であり、このアミノ酸が糖輸送の親和性に関与していることを強く示唆する。ヒト糖輸送体(Glut)の基質認識部位の解析を目標にして、遺伝子操作の容易な酵母Saccharomyces cerevisiaeのGlutと同じMajor facilitator superfamily(MFS)に属する2つの糖輸送体を用いてキメラを作成することにより基質認識部位の解析を行った。酵母の高親和性糖輸送体Hxt2と低親和性糖輸送体Hxt1は、各々12個の膜貫通領域(TM)を持ち、両者のTMおよびTM間ループのアミノ酸は70%同一である。Hxt2の高親和性糖輸送に必要なTMを明らかにするため、Hxt2のすべてのTMを、対応するHxt1のTMでランダムに置換した2^<12>=4,096個のキメラを作成した。20,000個以上のクローンから、高親和性糖輸送を行うクローンを寒天培地の糖濃度を下げて選択した。得られた39個のクローンは、2個の例外を除いて、Hxt2のTMl,5,7,8を持っていた。これらTMが必要かつ十分であることを確かめるため、4種のTMのすべての組み合わせをもった16個のキメラを作成した。16個のキメラの中で、ただひとつ、TM1,5,7,8のすべてを持つキメラがHxt2とほぼ同じ性質(Km、Vmax、基質特異性)を持っていた。従ってTM1,5,7,8が基質認識の重要な部分を担っていて、輸送体の膜貫通ポアを構成していることが示唆される。最近、MFSに属する細菌のオキザレート輸送体OxlTの低解像度結晶解析の結果が報告された。