hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経験型実習教育の研修プログラムの有効性に関する研究

グループワークは学生グループと教員・臨床指導者グループが別れて、発表は合同で実施するプログラムを企画した。研修後、教員・指導者側、学生側双方にとって相互理解が深まり、その後の実習展開が円滑に出来ているという報告を受けた。学生への授業介入では、「看護実践論」の授業で、講義とポートフォリオを活用したプロジェクト学習を実施した。「こうすれば看護実習を上手に乗り切れる知恵袋集」「看護実習で必要な学生のコンピテンシーを身につける方略集」を成果物として学生全員と実習運営部会の教員全員に渡し、活用できるようにした。また、不安についてのアンケート、授業後感想文、作成したポートフォリオの分析を行い、演習プログラムにおける学生の学びの実態の解明をめざしている。さらに今年度は、経験型実習教育の有効性と課題を明らかにするために、研究協力の得られた3年生の2グループ(4名と8名)、4年生の2グループ(7名と7名)、卒業生(1回生から5回生)の1グループ(12名)に対して、フォーカスグループインタビューを実施した。次年度は、グループインタビューの追加実施とシンポジウムを開催し、経験型実習教育の研修プログラムの有効性と課題について検討し、経験型実習教育の研修プログラムのパッケージ化をめざす。1.昨年度作成した事例ビデオ教材(老年看護学、精神看護学)を活用して授業を実施した。学生からは動画教材での事例展開は、ペーパーペイシェントを用いるよりも教員と学生が臨場感を共有でき、またリアリティのある場面を再現して体験させることもできて教育効果が上がった。臨床指導者への研修では、患者が経験していること、学生が経験していること、場面の意味をどう捉えるか、看護の方向性に関して等、意見交換が積極的に実施でき、解釈のバリエーションを広げるとともに共通理解を図ることができたとアンケート結果は良好であった。今年度は汎用性のある成人看護学の分野のDVDを作成したが、研修に活用するには至らなかった。2.研修プログラムの一つとして、プロジェクト学習を本学内外で、学生および実習指導者、看護教員を対象に広く展開した。このプロジェクト学習は、各人が潜在的に感じている不安や困難事などの課題を個人ワークにより顕在化し、チームを形成して解決方法を提案する方法である。また全てのプロジェクト学習終了後に評価アンケートを実施した。いずれの研修会においても満足度が高かった。3.3年生、4年生、卒業生を対象に経験型実習教育の演習プログラムの有効性を検討するために、グループインタビューを実施した。これらの結果は、「第32回日本看護科学学会学術集会」「第14回日本教師学学会」で口演および示説により発表した。4.第32回日本看護科学学会学術集会では、経験型実習教育を体験した卒業生、臨床指導者、看護教員を集めて、交流集会を実施し、学会参加者とともに経験型実習教育の有効性や課題について討議した。これは当初予定していたシンポジウムの代わりとした。5.経験型実習教育HPを制作した。
M細胞が分泌する解糖系酵素アルドラーゼAと膜受容体を介したプリオン侵入機構の解明

我々は、M細胞に分化したウシ腸管上皮細胞株より細胞内小胞を回収してLC-MS/MS解析を行い、プリオン蛋白に結合する解糖系酵素アルドラーゼAの同定に成功した。プリオン蛋白が腸管上皮M細胞より分泌されたアルドラーゼAと結合して輸送小胞へと取り込まれることが、プリオン侵入に必須であることを発見した。TALEN法によってアルドラーゼAをノックアウトしたMIE細胞によって取り込まれたプリオン蛋白結合蛍光ビーズ数は、野生型のMIE細胞による抗アルドラーゼA抗体処理と同等の減少率であった。以上より、アルドラーゼA発現の阻害はM細胞のプリオン蛋白結合蛍光ビーズのトランスサイトーシスを抑制することが判明した。英国で1986年に発見された牛海綿状脳症(BSE)はウシのプリオン病であり、日本においてもその発症が確認され、大きな政治・社会問題へ発展した。さらに、1996年英国において発症したヒトの新変異型クロイツフェルトヤコブ病が、牛由来食品を介したBSEのヒトへの伝播であることが証明された。我々は、世界に先駆けて黒毛和種牛小腸からウシ腸管上皮細胞株の樹立に成功し、確立したin vitro M細胞分化誘導系を用いて、M細胞が異状プリオン蛋白を取り込んでトランスサイトーシスを行うことを世界で初めて証明した。さらに、プリオンノックアウトマウスを用いて、経口投与した異状プリオン蛋白がマウス腸管M細胞により取り込まれ、マクロファージに受け渡されて腸間膜リンパ節および脾臓に運ばれ、その間に神経細胞と接触するプリオン伝播経路を初めて確認した。また、ウシ腸管上皮細胞株をM細胞に分化誘導させ、磁気ビーズを含有する細胞内小胞を回収してLC-MS/MS解析を行い、膜輸送蛋白複合体トランスポートゾームライブラリーの構築に成功し、プリオン蛋白に結合する解糖系酵素アルドラーゼAの同定に成功した。我々は、プリオン蛋白が腸管上皮M細胞より分泌された解糖系酵素アルドラーゼAと結合して輸送小胞へと取り込まれることが、プリオン侵入に必須であることを発見した。本研究では、輸送小胞の発芽がプリオン蛋白・アルドラーゼA複合体とM細胞膜上の受容体との結合によって誘導されることに着目し、受容体蛋白を膜輸送蛋白トランスポートゾームライブラリーより絞り込み、本研究終了時までにはその受容体を同定してM細胞を介したプリオン侵入機構の解明に加え、神経細胞への伝播機構の解明を試みるものである。解糖系酵素アルドラーゼAはsCJD患者とプリオン感染マウスの脳髄液で増加が確認され、神経細胞で発現しており、類似したAldolase Cがプリオン蛋白に親和性があることが報告されている。異常プリオン蛋白が細胞内へ侵入することによってプリオン感染は始動するが、その取り込み機構はほとんど解明されていないのが現状であった。我々は、M細胞がビーズ単体に比較してプリオン蛋白(PrP)結合ビーズを1.6倍多く取り込むことに加え、抗アルドラーゼ抗体処理がその取り込みを70%抑制するが、ビーズ単体の取り込みには影響を与えなかったことより、プリオン蛋白の取り込みにはアルドラーゼAとの結合が必須であることを発見した。アルドラーゼAは細胞質蛋白であるにもかかわらず、細胞外へ分泌される非常に珍しい蛋白であることを明らかにした。また、アルドラーゼAで処理は、M細胞によるプリオン蛋白結合ビーズの取り込みを50%抑制することに加え、処理したアルドラーゼAがトランスサイトーシスされることを新規に見いだした。この結果は、M細胞膜上にはアルドラーゼA受容体が存在し、プリオン蛋白との複合体形成がプリオン感染には必須の条件であることが判明したことより、研究は予想以上に進んでいると判断される。経口摂取したプリオン蛋白は腸管M細胞を介して侵入する。申請者は、プリオン蛋白が腸管上皮M細胞より分泌された解糖系酵素アルドラーゼAと結合して輸送小胞へと取り込まれることが、プリオン侵入に必須であることを発見した。アルドラーゼA添加処理は、M細胞の無処理蛍光ビーズ取込み量には影響を与えず、プリオン蛋白結合蛍光ビーズの取込み量を抑制することが判明した。さらに、添加したFITC標識アルドラーゼAが、M細胞によって取込まれて下部培地に輸送されることに加え、M細胞由来の細胞膜上アルドラーゼAが減少することが明らかとなった。FITC標識抗アルドラーゼA抗体を添加した実験では、下部培地中にFITC標識抗アルドラーゼA抗体が検出されたことより、M細胞膜上のアルドラーゼAにFITC標識抗アルドラーゼA抗体が結合し、M細胞がその複合体を取込み、下部培地に輸送することが判明した。この際も、M細胞由来の細胞膜上アルドラーゼAが減少することが確認された。以上より、M細胞は添加した抗アルドラーゼA抗体あるいはアルドラーゼAと細胞膜上のアルドラーゼAを共に取込むことによって、M細胞膜上のアルドラーゼA発現が減少し、プリオン蛋白の取り込みが抑制されることを発見した。マウス腸管上皮細胞(MIE細胞)をM細胞に分化誘導させ(M-MIE細胞)、アルドラーゼA結合

磁気ビーズを添加し、磁気スタンドを用いて膜タンパク質を回収し、二次元電気泳動を行いLC-MS/MS解析した。、同定したタンパク質の細胞および組織での局在は、蛍光免疫染色で解析した。磁気ビーズ添加区よりもアルドラーゼA結合磁気ビーズ添加区で高発現している二次元電気泳動のスポットをLC-MS/MS解析し、タンパク質を同定した。その中で、高スコアであるFibrillarin、HSP60とATP synthase Bについて蛍光免疫染色を行った。M-MIE細胞において、HSP60は細胞質および細胞膜に、ATP synthase Bは細胞質に発現が確認され、アルドラーゼAと共染色されたが、Fibrillarinは核内に確認されたがアルドラーゼAと共染色されなかった。。マウス腸管パイエル板において、HSP60はFAE上のM細胞に発現し陰窩付近で高発現し、アルドラーゼAと共染色された。これらの実験結果により、M細胞上のアルドラーゼA受容体の存在する可能性が高く、同定方法の確立に繋がると確信する。経口摂取したプリオン蛋白は腸管M細胞を介して侵入する。申請者は、プリオン蛋白が腸管上皮M細胞より分泌された解糖系酵素アルドラーゼAと結合して輸送小胞へと取り込まれることが、プリオン侵入に必須であることを発見した。そこで、細胞内アルドラーゼAをノックアウトすることでアルドラーゼAの機能を阻害し、アルドラーゼAのM細胞におけるプリオン蛋白質トランスサイトーシス機構における役割を解析した。先ず、M細胞に存在するアルドラーゼAを阻害する目的で、Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)をMIE細胞へトランスフェクションし、アルドラーゼAノックアウトを試みた。1stメチオニンを含む標的蛋白のエキソン部位の塩基配列を認識するようにTALENを設計することでC末端のエンドヌクレアーゼが目的部位を切断することにより、修復時に欠損して標的蛋白をノックアウトすることが出来る。TALEN法によってアルドラーゼAをノックアウトしたMIE細胞(MIE ALDOA-/-細胞)はアルドラーゼAの発現が無く、M細胞に分化誘導することによってM細胞マーカーGP-2の発現は確認された。M細胞分化MIE ALDOA-/-細胞にプリオン蛋白質結合蛍光ビーズを添加し、9時間後の下部培地中蛍光ビーズ数をフローサイトメトリー解析によってM-MIE細胞と比較解析した。トランスサイトーシスされた蛍光ビーズの量は、アルドラーゼAノックアウトによって無処理およびプリオン蛋白質結合蛍光ビーズ両方で減少したが、プリオン蛋白質結合蛍光ビーズの方がより減少し、野生型のM細胞分化MIE細胞による抗アルドラーゼA抗体処理と同等の減少率であった。以上より、アルドラーゼA発現の阻害はM細胞のプリオン蛋白質結合蛍光ビーズのトランスサイトーシスを抑制することが判明した。我々は、M細胞に分化したウシ腸管上皮細胞株より細胞内小胞を回収してLC-MS/MS解析を行い、プリオン蛋白に結合する解糖系酵素アルドラーゼAの同定に成功した。プリオン蛋白が腸管上皮M細胞より分泌されたアルドラーゼAと結合して輸送小胞へと取り込まれることが、プリオン侵入に必須であることを発見した。TALEN法によってアルドラーゼAをノックアウトしたMIE細胞によって取り込まれたプリオン蛋白結合蛍光
戦後日本における生活主体の形成に関する研究-生活意識と生活行動への総合的接近-

戦後日本の形成を生活主体の側面から、出生行動、消費行動、社会意識という3点に絞って検討した。前2者の日常生活の行動レベルでは、1940年代後半の政治的改革と60年代に入っての高度経済成長のあいだの、1950年代に大きな転換点はあったことを実証的に明らかにした。以下、3つの点について記す。出生行動近代化以来ほぼ安定的に推移してきた合計特殊出生率は、1950年代前半に初めて大きな変化を引き起こし、短期間のうちに従来の水準の2分の1に激減した。その実態は、年間100万件をこえる人工妊娠中絶によるものであったが、このような出生行動の変容が、その後の家族の在り方や生活変動に決定的な影響を及ぼした。消費行動1950年代に2つのポイントが見出せた。1つは50年代前半において、戦前回復にむけての消費水準の上昇が、とりわけ食費以外の費目で顕著であり、年間の実質増加率が高度成長期をも上回っていたことである。2つは50年代後半において、戦前とは全く異なる消費の高度化傾向が現れるとともに、これに対する評価も、奢侈から生活革新へと急速に変貌したことである。これら2つの消費行動の特徴は、その後の爆発的な大量消費の基盤を形成した。社会意識1960年代以降にみられる変化の兆しはまだ明らかではなかったが、上記の生活行動の変容が、家族関係や個別の生活意識に微妙な変化を及ぼし始めてはいた(理想子供数、倹約への態度等)。このような意識と行動の不整合が、60年代の生活変動に結びついていくことになった。
神経細胞とリンパ球に共通に存在する糖鎖抗原による新しい分化・増殖制御の解析

ジシアル酸構造は、神経突起形成とT細胞増殖の両方に関与する。神経細胞ではCD166など数種の糖タンパク質に存在する。CD166は哺乳類脳とT細胞に共通に存在する接着分子であるが、そのジシアル酸の役割は未解明である。本研究は、脳とT細胞に注目して、そのジシアル酸抗原が細胞分化や増殖を制御するメカニズムの理解を目指しており、下記の2点に取り組んだ。1.神経細胞上のジシアル酸構造による突起形成促進の分子機構の解明:神経細胞上のジシアル酸構造の存在を、CD166以外に130kDaカドヘリン上にも同定した。カドヘリンのジシアル酸構造はCD166と同様にΟ-型糖鎖上に存在し。また、このジシアル酸構造の生合成に関与するα2,8-シアル酸転移酵素の発現を確認した。さらに、神経突起形成において、ジシアル酸構造が突起形成部位のラフト上に集積することを見出し、ラフトに集積するCD166またはカドヘリン上のジシアル酸の機能的重要性が示唆された。2.リンパ球上のジシアル酸構造によるT細胞抗原非特異的増殖の制御の分子機構の解明:リンパ球上のジシアル酸構造は、マウスT細胞上の100kDaCD166と未同定の200kDa糖タンパク質上に見出された。また、T細胞増殖におけるジシアル酸糖鎖の役割解明を目指し、ジシアル酸に対する抗体を用いた解析を行った。まず、マウスT細胞を抗ジシアル酸抗体で処理すると、CD3/CD4架橋による増殖刺激が促進されることが見出された。次に、このT細胞活性化条件においては、CD166、ST8SiaIV、I、VIの劇的発現上昇が起こり、それに伴い糖脂質とCD166上のジシアル酸構造が増加した。また、ジシアル酸をもつ糖脂質およびCD166は同一ラフト上に共存することがわかり、CD166および糖脂質のジシアル酸構造の増加が協同的にT細胞増殖を刺激することが示唆された。シアル酸がタンデムに2残基連結したジシアル酸構造が神経細胞の分化とT細胞の抗原非依存的増殖を制御するメカニズムの解明を目的として、本年度は以下の課題に取り組んだ。第一に、神経細胞上のジシアル酸構造については、ジシアル酸をもつ糖タンパク質の同定をすすめ、既に明らかにしたCD166以外にも少なくとも130kDa糖タンパク質の存在をつきとめた。このタンパク質のジシアル酸構造をもつ糖鎖は、CD166と同様にO-型糖鎖であることが強く示唆された。現在、O-型糖鎖の構造解析を行っている。また、この130kDa上のジシアル酸の発現は発生段階によって異なることが判明した。ジシアル酸構造の生合成に関与すると考えられるシアル酸転移酵素について、発生段階に依存した発現様式を調べた。第二に、リンパ球上のジシアル酸構造については、マウスからT細胞を調製し、T細胞上のジシアル酸をもつ糖タンパク質として、100kDaと200kDa糖タンパク質を見いだした。これらの糖タンパク質に存在するジシアル酸はO型糖鎖上に存在することが強く示唆された。この100kDa糖タンパク質は、CD166であることを同定した。

マウスから単離したT細胞を抗ジシアル酸抗体で処理すると、CD3およびCD4を架橋することによって増殖刺激されるT細胞の増殖が促進されることを見いだした。この結果は、ラットで得られている結果と一致した。現在、そのメカニズムに関する解析を行っている。糖鎖が関与する分化・増殖の制御メカニズムの解明を目的として、神経細胞突起形成とT細胞抗原非依存的増殖という異なる現象に注目している。本年度は、以下の課題に取り組んだ。まず、CD166以外のジシアル酸をもつ糖タンパク質として、神経細胞においては、新たにカドヘリン分子が同定された。一方、T細胞については、量的に厳しい中いくつかの候補タンパク質を絞り込むことができた。また、CD166上のO-型糖鎖の構造解析では、試料の量的問題からコア構造の決定はできなかったが、シアル酸同士がα2,8で結合していることを確証した。次に、CD166が媒介する相互作用におけるジシアル酸糖鎖の役割解析に関して、ジシアル酸に対する抗体を用いてT細胞増殖に着目して解析した。その結果、CD3架橋によるT細胞活性化において、抗ジシアル酸抗体処理は、シアル酸転移酵素ST8SiaVIとCD166のmRNAの発現増加を誘導した。また、CD3/CD4共架橋によるT細胞活性化では、抗ジシアル酸抗体処理よって、CD166とST8SiaIVの発現上昇に加えて,ST8SiaIおよびVIのmRNAの劇的発現上昇が見出された。一方、本研究によって、T細胞活性化に伴う糖脂質とCD166上のジシアル酸の増加現象が見出された。この現象は、上記のシアル酸転移酵素の発現変化に呼応しており興味深い。さらに、ジシアル酸をもつ糖脂質およびCD166が、同一ラフト上に共存することも証明した。これらのことから、CD166上のジシアル酸と糖脂質のジシアル酸構造が協同的にT細胞増殖に関与することが示唆された。本研究を通じて、今後の研究の方向性として、抗ジシアル酸抗体を模倣するTリンパ球上のジシアル酸認識分子の検索と同定や、CD166のジシアル酸構造を介するT細胞増殖刺激シグナリングの解析の重要性が示された。
オペレーションズ・リサーチ適用のためのツール開発

企業活動や行政の各分野に至る広い領域において、さまざまなオペレーションや計画の段階で,オペレーションズ・リサーチの果す役割は大きいと期待されながら,現実の適用例数は,もうひとつ伸び悩んでいるというのが現況である.これは一つには,オペレーションズ・リサーチの手法が数理的表現に頼ることが多いため,世間一般には極度に難解な手法と受けとめられがちであるという事情によっている.このため,一般に利用しやすい環境を整備することが望まれるので,パソコンや図表などの利用により,気軽にオペレーションズ・リサーチの手法を適用できる態勢を作りたいと考え,この研究を企てた.このため,過去の事例や現実の企業で実施された事例を調査して,どのようなツールを開発するのが適当かについて考察を進めた.その結果,もっと広くORリテラシーとでもいうべき,ORのセンスを伸ばし活用するための諸手法の開発と普及が大切であるとの感を強くした.この間,1)ORの,特にわが国におけるそれの発展の概要と特徴,及び現状を踏まえた上での今後の発展方向の考察,2)OR入門教材の具体的な例の提示,3)パソコン程度の計算力でできるOR適用事例の具体的な研究,4)広い範囲で利用されるためのORのツールとして備えるべき特徴についての考察等について研究を進め,その各々に関して得られた知見や成果は報告書に記載したが,その一部は,適宜学会等で発表し,討議も行っている.企業活動や行政の各分野に至る広い領域において、さまざまなオペレーションや計画の段階で,オペレーションズ・リサーチの果す役割は大きいと期待されながら,現実の適用例数は,もうひとつ伸び悩んでいるというのが現況である.これは一つには,オペレーションズ・リサーチの手法が数理的表現に頼ることが多いため,世間一般には極度に難解な手法と受けとめられがちであるという事情によっている.このため,一般に利用しやすい環境を整備することが望まれるので,パソコンや図表などの利用により,気軽にオペレーションズ・リサーチの手法を適用できる態勢を作りたいと考え,この研究を企てた.このため,過去の事例や現実の企業で実施された事例を調査して,どのようなツールを開発するのが適当かについて考察を進めた.その結果,もっと広くORリテラシーとでもいうべき,ORのセンスを伸ばし活用するための諸手法の開発と普及が大切であるとの感を強くした.この間,1)ORの,特にわが国におけるそれの発展の概要と特徴,及び現状を踏まえた上での今後の発展方向の考察,2)OR入門教材の具体的な例の提示,3)パソコン程度の計算力でできるOR適用事例の具体的な研究,4)広い範囲で利用されるためのORのツールとして備えるべき特徴についての考察等について研究を進め,その各々に関して得られた知見や成果は報告書に記載したが,その一部は,適宜学会等で発表し,討議も行っている.この研究では,現実の問題の数理モデルによる表現を容易に行い,かつオペレ-ションズ・リサ-チの手法を簡単に適用できるツ-ルを開発するため,どのような状況ではどのようなモデルが適当で,どのような手法をどのように適用すべきかを判断し,その知見に基づいて,主としてパソコン上での適用のツ-ルを作成するという方向で研究を進めている。従来のオペレ-ションズ・リサ-チ法による解析ソフトは,とかく数値解析の手法に重点が置かれており,現実の事象のモデル化には目が向けられていないため,実務家には使い勝手がかならずしもよくない。それ故,モデル化の整理から始めて,どのようなツ-ルが実用上有効かを研究する必要があった。本年度は,主として以下の2点を行った。1.事例研究の整理研究の方向を決めるために,どのような計算法が現実の事例に多いか,過去の事例を数多く参照しながら分類整理中である。森村が過去にOR学会名で編集した「OR事例集」や,本年度に柳井慶応大学教授が編集した「OR事例集1991」を基に,日本科学技術連盟のOR部会の研究メンバ-等との討議を経て,事例の収集を試みた。現在,事例をパソコンに入力し,整理している段階である。2.パソコン/ワ-クステ-ション用のソフトの整備スプレッドシ-ト等のパソコン用汎用市販ソフトを使って,ORの計算を試みている。現在は,その使い勝手を調べる段階で,組織的な調査研究には踏出せないでいるが,来年度は近くにいるOR研究者や,学生(申請者の勤務している大学院の学生は全員社会人で,それぞれ昼間は企業等に勤務している)を被験者として,これらのソフトの使い勝手を調べる計画である。オペレーションズ・リサーチ(OR)は、解決したい現実の様々な問題をモデルに表現し、モデルを通して問題状況をより詳しく、より操作的に捉え、状況を改善する施策を創造し、評価し、より適切な意思決定に役立てるものである。しかしながら、現在のORを取り巻く環境は、だれにでもOR的な問題解決法が簡単に使える状態ではない。本研究では、このモデルによる表現を容易にし、かつ様々なOR的思考を簡単に問題状況に適用できるツールについて検討する。そのため、問題状況とモデルの適合性、モデルと手法の適合性を判断し、その知見に基づいて、主としてパソコン上で利用可能なORツールを作成、あるいは既存のORツールを評価することを目的としている。本年度は、昨年に引き続き以下の2点を行った。1.事例研究の整理ORの教科書として名高いHillier&Liebermanの“Operations Research"を中心に、様々な教科書に紹介されている事例の収集を試みた。現在、事例をパソコンに入力し、整現している段階である。

さらに、どのような問題状況に、どのようなモデルが使われ、そのモデルの解析にどのような手法が適用されているかを分類整理中である。2.パソコン/ワークステーション用のソフトの整備市販されているパソコン用ORツールを購入整備し、自ら0Rの計算を試み、その使い勝手を調べている。さらに、ORの初心者がこれらのツールを容易に使いこなせるかどうかを探るため、学部学生、大学院生を被験者として調査を開始した。企業活動や行政の各分野に至る広い領域において,さまざまなオペレーションや計画の段階で,オペレーションズ・リサーチの果す役割は大きいと期待されながら,現実の適用例数は,もうひとつ伸び悩んでいるというのが現況である。これは一つには,オペレーションズ・リサーチの手法が数理的表現に頼ることが多いため,世間一般には難解な手法と受けとめられがちであるという事情によっている。このため,一般に利用しやすい環境を整備することが望まれるので,パソコンや図表などの利用により,気軽にオペレーションズ・リサーチの手法を適用できる態勢を作りたいと考え,この研究を企てた。このため,初年度は特に過去の事例を調査して,どのようなツールを開発するのが適当かについての考察を進めようとしてきたが,今年度は更に,特定の企業を詳しく調べそこで実施された事例の現況を調査した。その結果の一部は報告書にも記載した。本年度は最終年度であるので,従来からの考察を纏めるようつとめたが,それらは大別すると,つぎの4項目になった。1)ORの,特にわが国におけるそれの発展の概要と特徴,及び現状を踏まえた上での今後の発展方向の考察,2)OR入門教材の具体的な例の提示,3)パソコン程度の計算力でできるOR適用事例の具体的な研究,4)低い範囲で利用されるためのORのツールとして備えるべき特徴についての考察その各々に関して得られた知見や成果は報告書に記載した。一部は、適宜学会等で発表し、討議も行っている。
非接触核融合プラズマモデリングを目指した周辺プラズマ・中性粒子輸送コード開発

本研究課題の目的は、3次元的な装置形状や磁場形状を取り扱うことのできるEMC3-EIRENEコードを用いて、非接触プラズマの数値モデル開発を行うことである。非接触プラズマは、プラズマが壁に達する前に再結合して中性ガス戻る状態にあり、核融合炉の壁への熱負荷軽減のために必須である。しかし、体積再結合を含めた計算は世界的にもまだ開発途上で、コード開発や実験による検証が必要である。そこで、再結合プラズマ実験に実績のある直線装置で研究開発を行い、その後により核融合炉に近い大型装置での検証を行う計画である。
英領植民地下のビルマ(ミャンマー)における土地・借金文書の研究

1.イギリス植民地時代のビルマ(1886年から1948年)において作成された、通称「チッティーサージョウッ」と呼ばれる土地の権利移動や借金に関する手書きの文書を、平成18年12月から平成19年1月にかけて、ミャンマーで収集した。今まで収集した文書はミャウンミャ、パテイン、モーラミャインチュン、ンガプードーなど、エーヤーワディ・デルタ深部の、開発の歴史が比較的新しい地域に偏っていたが、今回は、ダイウーやニャウンレービンなど、デルタの上部、開発の歴史が古いところの文書が収集できた。ただし、昨年と同じく、ミャンマーの書籍商に研究目的に合致する文書を所有している人物を探させて、彼を通じて購入するという方法を取った。理由は高橋自身が収集するには時間的に余裕がないだけでなく、外国人が買いに行くより現地の人が売りやすいと考えたからである。2.すでに東洋文化研究所が所蔵している同文書のうち、小作関係に関する文書186枚を探し出し、これらをスキャナーで読み込んでデジタル化した。さらにこれらの文書一枚一枚について、書かれた年月日、場所、農地貸借の当事者、農地の種類、面積、場所、小作料、小作期間、小作契約の解消および継続の条件、証人等について細かく分類し、データベースを作成した。3.連合王国・ロンドンにあるBritishLibraryのAsian and African Studies,ロンドン大学のLondon School Economics, School of Oriental and African StudiesおよびNational Archivesにて、「チッティーサージョウッ」が取り交わされた植民地期のビルマ農村に関連する諸資料のうち、ビルマとイギリス本国との間で交わされた多数の書簡の中から農地の集積問題に関する資料を閲覧し、必要な部分をコピーおよびデジタル撮影した。1.イギリス植民地時代のビルマ(1886年から1948年)において作成された、通称「チッティーサージョウッ」と呼ばれる土地の権利移動や借金に関する手書きの文書を、平成17年11月から12月にかけて、ミャンマーで収集することを試みた。しかし、地方の裁判所には残っておらず、元判事や弁護士のところにあることが多いことがわかった。また、図書館等にも所蔵されていないようであった。そこで、これらの人々に人脈のあるミャンマーの書籍商をまず探し出し、彼に研究目的に合致する文書を所有している人物を探させて、彼を通じて800枚ほど購入した。2.購入文書およびすでに東洋文化研究所に所蔵している文書のうち、文書471枚をスキャナーで読み込んでデジタル化した。さらにこれらの文書一枚一枚について、書かれた年月日、場所、貸し手と借り手あるいは売り手と借り手といった当事者、農地の種類、面積、場所、価格(質入の場合は貸与金額)、質入期間、買い戻し条件、質流れの条件、証人等について細かく分類し、エクセルでデータベースを作成した。3.連合王国・ロンドンにあるBritishLibraryのOriental and Indian Office Collections, London School EconomicsおよびNational Archivesにて、「チッティーサージョウッ」が取り交わされた植民地期のビルマ農村に関連する諸資料のうち、とくに関係の深い1920年代から30年代に組織された農地流動化および農民負債に関する諸委員会の報告書を閲覧し、必要箇所をコピーおよびデジタル撮影した。さらに、来年度はビルマとイギリス本国との間で交わされた多数の書簡を閲覧し分析する必要がある。
C-C結合形成反応を触媒できる人工生体触媒の創製

酵素(リパーゼ)に含窒素複素環式カルベン(N-heterocyclic carbene, NHC)有機触媒を化学修飾した人工生体触媒を創製し、それを用いてエナンチオ選択的なC-C結合形成反応を実施した。NHCは、変異導入部位(システイン)もしくは活性部位に導入した。ベンゾイン反応を試したところ、反応が進行し、低いながらもエナンチオ選択性が発現した。有機触媒と酵素を組み合わせた人工生体触媒の報告例は、未だに皆無である。本研究の目的は、酵素(リパーゼ)に含窒素複素環式カルベン(N-heterocyclic carbene, NHC)有機触媒を化学修飾した人工生体触媒を創製し、それを用いてエナンチオ選択的なC-C結合形成反応を触媒させることである。このような人工生体触媒を創成できれば、酵素の有用性をさらに高めることができ、生体触媒の更なる発展が期待できる。NHCは、タンパク質(アミノ酸残基)だけでは生成困難な反応中間体を発生してC-C結合形成反応を促進する。1つ目のアプローチとして、リパーゼにシステインを導入し(I287CとI290CとQ292C変異体)、そのシステイン残基とペンタフルオロフェニル基を有するトリアゾリウム塩(NHC前駆体)を反応させた。得られた酵素-NHC付加体を用いて、ベンズアルデヒド間のベンゾイン反応を試したところ、反応が進行した。得られた生成物(ベンゾイン)の光学純度は4% eeであった。低いながらもエナンチオ選択性が発現したことは、タンパク質内部で反応が進行したことを示唆しており、C-C結合形成反応を触媒できる人工生体触媒を創製できたと言える。2つ目のアプローチでも人工生体触媒を創製した。リパーゼ酵素阻害剤であるリン酸エステルは活性部位に入り込み共有結合を形成して不可逆的に結合することが知られている。NHC触媒を有するリン酸エステルをいくつか合成し、リパーゼと混ぜることによりNHCを導入した。酵素阻害剤のアニオンの大きさ、親水性、リンカー部位の長さが入り込みやすさに影響していた。得られた酵素-NHC付加体を用いたところ、反応が進行した。得られた生成物の光学純度は-4% eeであった。1つ目のアプローチとは逆のエナンチオマーが低い光学純度ながらも生成した。炭素-炭素(C-C)結合形成反応を触媒できる人工生体触媒を創製するべく検討を進めた。具体的には、酵素の内部に有機触媒を共有結合で連結して反応部位を構築する。有機触媒として含窒素複素環式カルベン(N-heterocyclic carbene, NHC)を選択し、タンパク質(アミノ酸残基)だけでは生成困難な反応中間体を発生してC-C結合形成反応を促進させる。まず、overlap-extention PCR法を使ってリパーゼ遺伝子にシステイン変異を導入した。作製した変異体は、I287CとI290CとQ292Cである。これらの遺伝子組換え大腸菌を培養後、大腸菌を超音波破砕し、尿素存在下でアクチベータータンパク質を加えてリフォールディングした。カラム精製した後、無機担体に固定化した。次に、エステル加水分解活性が最も高く効率よく調製できたI287C変異体を用いて、そのシステイン残基とペンタフルオロフェニル基を有するトリアゾリウム塩(NHC前駆体)を反応させた。未反応のトリアゾリウム塩を充分に洗浄して取り除いた。得られた酵素-NHC付加体を用いて、ベンズアルデヒド間のベンゾイン反応を試した。光学純度はキラルカラムを用いたHPLCにより決定した。低いながらもエナンチオ選択性が発現したことは、タンパク質内部で反応が進行したことを示唆していており、炭素-炭素結合形成反応を触媒できる人工生体触媒を創製できたと考えられる。今後、周辺のアミノ酸残基を改変すれば、エナンチオ選択性を向上できると期待される。炭素-炭素結合形成反応を触媒できる人工生体触媒を創製できたとはいえ、エナンチオ選択性が低かった。さらに、一連の実験を通して、以下の問題点が明らかになった。(1)これまでに当研究室で作製してきた種々の変異体に比べて、今回新たに作製したシステイン変異体は、エステル加水分解活性が低い。そのため、酵素精製段階において目的酵素を含むフラクションを活性測定によって見付けにくい。(2)エステル加水分解活性に比べると、ベンゾイン反応触媒活性が低いため、多量の酵素-NHC付加体を必要とする。しかし、多くの固定化酵素を加えると、それを懸濁させるためにより多くの溶媒が必要になり、それに伴って基質濃度も下がってしまう。これらの問題を解決するためにかなりの時間を費やしたため、当初の研究計画より遅れる結果となった。今後挽回する。トリアゾリウム塩を酵素活性中心に直接導入するやり方に切り替える方向で検討中である。リン酸エステルは、エステル加水分解反応の遷移状態アナログであり、酵素阻害剤である。

リン酸エステルにトリアゾリウム塩を取り付けたものを用意すれば、混ぜるだけで効率よく酵素-NHC付加体が得られると期待できる。これを用いて、種々のC-C結合形成反応(ベンゾイン反応、Stetter反応、aza-diene Diels-Alder反応、benzoin-oxy-Cope型タンデム反応など)を試す。人工生体触媒と反応の適した組み合わせが明らかになったら、タンパク質側に変異を導入してさらに触媒性能を上げる。酵素活性中心に直接導入するためのトリアゾリウム塩を有機合成する。リン酸エステルを有するトリアゾリウム塩であるため、比較的難しい合成になりそうである。試行錯誤の過程で種々の化学薬品を購入する必要が生じる。得られた酵素-NHC付加体の触媒反応を実施する際に必要な消耗品も購入する。合わせて、学会やシンポジウムなどに積極的に出席し、人工生体触媒と有機合成に関する最新の情報を収集する。NMR使用料などの分析機器測定料も計上する。
頭頚部癌浸潤におけるG-CSFリセプターとRhoファミリー蛋白発現の関与の検討

過去に、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の受容体(G-CSFR)を発現している頭頸部癌患者の予後が悪いことが判明し、その原因としてG-CSFR発現癌細胞株の浸潤能の亢進を確認した。頭頸部癌患者サンプルの免疫染色によりG-CSFR発現とRhoA発現とが相関していたことから、癌浸潤の一機序として細胞骨格制御因子であるRhoファミリー蛋白の関与が考えられたため、今回の実験を行った。以下に解明された結果を簡潔に述べる。1.G-CSFR発現頭頸部癌細胞株(T3N1)においてRhoAならびにRasの発現をウエスタンブロット法により確認した。2.この細胞株に対してrG-CSF刺激を行いG-CSFRを介したRhoファミリー蛋白の活性化が生じるかどうかをEZ-DetectTMRho activation kit (PIERCE biotechnology)を用い検討したところ、刺激5,10,20,30分後のRhoAの活性化は証明されなかった。時間を伸ばし60分後を検討してみたが、活性化は認められなかった。一方、Rasの活性化が5,10,15分で証明された。活性レベルのピークは10分で訪れ、30分で減衰した。従って、Rhoファミリー蛋白へのシグナル伝達は、刺激後15分までの早い時期に生じると考えられた。細胞骨格制御の主をなすと考えられるRhoAへのシグナル伝達は認められなかった。形態学的変化も認められなかった。3.rG-CSF刺激後のRasを介した癌細胞形態の変化、増殖能の亢進の有無について現在さらに検討中である。4.ケモカインレセプターのCCR6およびCCR7から、RhoAおよびRasへシグナルを伝達している可能性を突き止め、検討中である。研究目的癌細胞において、G-CSFR(granulocyte colony-stimulating factor receptor)を介したG-CSFのシグナルが細胞骨格・細胞運動を制御するRhoファミリー低分子量G蛋白質の発現および活性化に直接影響を及ぼし、浸潤能を亢進させるのかどうかを解明することを目的とした。ここまでの結果1,G-CSFR陽性頭頸部癌細胞株およびG-CSFR陰性同細胞株においてRhoAの発現をウエスタンブロット法にて確認した。どちらの細胞株にもRhoA蛋白は存在していた。2,この細胞株に対してrG-CSF刺激を行いG-CSFRを介したRhoAの活性化が生じるかどうかを検討した。rG-CSF刺激後5、10、15、20、30分後のRhoAの活性化を、EZ-Detect ^<TM>Rho activation kit(PIERCE biotechnology)を用い観察した。このキットではRhoAからのシグナルにより活性化されたPAKを検知する。PAKはRhoAの下流に存在するRhoファミリー蛋白質であり、活性化PAKと活性化RhoAの複合体を抗RhoA抗体により最終的にウエスタンブロット法により確認するため、G-CSFRからRhoAへシグナル伝達の証明となる。この結果、30分までのシグナル伝達は今のところ証明されていない。rG-CSF刺激後の蛋白採取の時間変更など、さらなる検討か必要である。3,同細胞株にRasが発現していることも確認し、同様にrG-CSF刺激よるG-CSFRを介したRasの活性化を検討したところ、その活性化が証明された。4,免疫染色により、頭頸部癌の臨床材料においてRhoAの下流蛋白であるRock、シトロンおよびRhoファミリー蛋白であるCdc42の発現を確認した。
酵母菌による各種ケト酸不斉還元の基礎と応用

(1)パン酵母菌を破砕した粗酵素液を用いる不斉還元基質として脂肪族δーケト酸を用いて粗酵素液に補酵素としてNADPHを加えて還元生成物を製取した。これを菌体をそのまま用いた還元の結果と比較したところ,どちらも立体配置はRで光学純度は>99%eeであり,収率でも大きい差異は認められなかった。しかし物質収支から判断して菌体内では基質が損失していることが推定された。また細胞壁(膜)にたいする基質あるいは生成物の透過性が重要であるとの結論は得られなかった。(2)金属塩添加の効果粗酵素液の酵素活性が種々の金属塩によって影響されることから,菌体を用いる還元にたいして金属塩添加の効果を調べたところ,MnCl_2によって還元収率が64%から8489%へ増加する基質があることがわかった。(3)多官能性β,δージケト酸のパン酵母による不斉還元δ位のケトンカルボニル基が還元されたものが主生成物であり,これはβ位がさらに還元されてβ,δージオ-ルにならないことがわかった。これにたいしてβ位のカルボニル基は比較的還元速度が遅い上に,さらにδ位のカルボニル基が還元されてジオ-ル体を生成し易いことがわかった。どれもすべて立体配置はRで,>99%eeであった。βーケトδーラクトンとβーヒドロキシδーラクトンとして単離精製できた。(4)βークロローγーケト酸のパン酵母による不斉還元(1)パン酵母菌を破砕した粗酵素液を用いる不斉還元基質として脂肪族δーケト酸を用いて粗酵素液に補酵素としてNADPHを加えて還元生成物を製取した。(4)βークロローγーケト酸のパン酵母による不斉還元1)パン酵母菌を破砕したホモジネ-トを用いる不斉還元基質としてδーケト酸RーC(=0)CH_2CH_2CO_2H,R=C_2H_5,nーC_3H_7,nーC_8H_<17>,nーC_<11>H_<23>を用いた結果,対応するδーヒドロキシ酸をそれぞれ1.6,37,41,52%の収率で得て,後の2者については>98%eeでR配置であることを確認した。これをホ-ルセルを用いて還元した結果と比較すると,収率が大幅に増加したものがないことから,細胞壁あるいは膜の透過性は収率にほとんど影響していないことが推定される。また,この還元において補酵素としてNADPHを用いていることから,この還元酵素がNADPH依存性であることが確認された。光学純度,立体配置ともにホ-ルセルの場合と同じであったことは,目的とする酵素がホモジネ-ト中に遊離していることを示すものである。2)添加物の不斉還元にたいする効果酵素活性を測定した際に,MnCl_2が活性を増加させることが認められたので,ホ-ルセルによる還元にたいしてのMnCl_2の効果を調べた。基質として,RC(C=0)CH_2CH_2CH_2CO_2H,R=n-C_3H_7,nーC_4H_9,nーC_5H_<11>,n-C_6H_<13>,nーC_8H_<17>を用いて,Mncl_2濃度(培養液中)0,0.5,1.0,1.5Mとして還元したところ,R=n-C_5H_<11>については,収率が6669,7681,8394,6567%と変化し,MnCl_2 1.0Mのとき極大値を示した。他のアルキル基Rについてはいずれも無添加のときが最大値であった。光学純度,立体配置に変化はなかった。大野ら(京大化研)はβーケトエステルの酵母還元でMgCl_2の添加によって,光学純度と収率の向上を報告しているが,MnCl_2の効果についてはこれまでに例がない。

基質としてRC(=0)CH_2(=0)CH_2CO_2H,R=C_2H_5,nーC_3H_7,nーC_4H_9,nーC_5H_<11>,nーC_8H_<17>を用いると,8位のC=0が還元されたものが1436%,これらからの脱炭酸生成物が614%,β位のC=0が還元されたものが03%,2つのC=0がともに還元されたものが012%の収率で得られた。いずれも>99%eeでR配置であった。これらから対応するβーケトーδーラクトン,βーヒドロキシーδーラクトンを製取した。δ位のC=0が優先して還元されるが,生成物のδーヒドロキシーβーケト酸はもはや還元されないことが明らかになった。一方,わずかに生成したβーヒドロキシーδーケト酸はさらに還元されて,β,δージヒドロキシ酸になることも明らかになった。R=CH_2=CHCH_2CH_2,C_6H_5CH_2CH_2,C_6H_5CH=CHを用いると,興味深いことに,δ位のC=0のみが還元された生成物が収率50%で得られた。コンパクチンなどの生理活性物質の合成に用いられるβーヒドロキシーδーラクトンの合成に向けた研究の端緒が開かれたといえる。C=0基のα位にCLを置換するとC=0の還元にどのような影響が出るのか,ケト酸の場合とケトエステルの場合でどのような差が見られるのか,を明らかにすることができた。ここでR=CH_3ではいずれもS配置の2級アルコ-ルを>98%eeで生成したが,C_2H_5→C_4H_9について,酸では段階的にR配置>98%eeへと変化し,エステルではS配置のまま85%eeへと低下した。収率,ジアステレオマ-比についても新しい知見を得ることができた。
遷移金属錯体の配位過程と反応過程における分子認識機能に関する理論的研究

エチレンの配位とそれに引き続いて起こる金属-ヒドリド、金属-シリル結合への挿入反応は、オレフィンのヒドロシリル化反応、ビスシリル化反応の素反応過程として重要である。そこで、1aおよび1b式について理論的研究を行なった。1には3つの異性体がありエチレンの配位がもっとも容易なものは、H,SiH_3配位子が互いにトランス位に位置し、エチレンのトランス位にPH_3が配位している構造であった。HとSiH_3が互いにシス位に位置している場合、Pt-SiH_3へのエチレン挿入、あるいはPt-Hへのエチレン挿入が可能である。各々の挿入反応の遷移状態(TS)構造をHartree-Fockレベルで、エネルギー変化をMP4レベルで求めたところPt-SiH_3へのエチレン挿入は54kcal/molの活性障壁(Ea)で進行し、挿入直後の生成物は、PtとSiH_3のH原子間に強いagostic相互作用(約19kcal/mol)を含んでおり、このagostic相互作用を切断した後、最も安定な生成物へ異性化する。同様な検討をPt-Hへのエチレン挿入について行ったが、この反応は21kcal/molのEaで進行するが、逆反応は、ほぼ障壁無しで起こる。挿入直後の生成物は、β-HとPt間に強いagostic相互作用(約17kcal/mol)を含んでおり、このagostic相互作用を切断して異性化し、最安定な化合物となる。HとSiH_3が互いにトランス位に存在する場合のPt-SiH_3への挿入反応は16kcal/molの活性障壁で、Pt-Hへの挿入反応は4.4kcal/molの活性障壁で進行する。これらの挿入反応の場合最も安定な生成物が直接生成する。以上の結果より、エチレンはPt-SiH_3よりPt-H結合に挿入しやすい事、HとSiH_3が互いにトランス位にあると挿入が容易であることが明らかとなった。
脳賦活時の機能的磁気共鳴断層撮影法による血液酸素濃度依存性信号発生機構の解明

機能的磁気共鳴断層撮影法(fMRI)により測定される脳賦活部位の血液酸素濃度依存性(BOLD)信号と局所脳血流量(CBF)および局所脳酸素消費量(CMRO_2)の変化量との関係を調べるべく、fMRIおよびポジトロン放出断層撮影法(PET)による測定を行った。測定は伊藤(研究代表者)が菅野(研究分担者)と茨木(研究分担者)の協力の下に行い、男性健常志願者を対象に安静時および手指運動負荷時のそれぞれの条件下でfMRIとPETによる測定が行われた。データ解析は、画像処理ソフトウェアパッケージのDr.View/LINUXおよびフリーのソフトウェアパッケージのSPM99を用いて伊藤(研究代表者)が茨木(研究分担者)と後藤(研究分担者)の協力の下に行い、結果の解釈については菅野(研究分担者)と討論を行った。この解析によると、手指運動負荷時の最も強い脳賦活部位である一次運動野およびその他の脳賦活部位におけるBOLD信号増加率とCBFおよびCMRO_2の増加率には有意な相関がみられた。また、従来の仮説と同様にCBFの増加率はCMRO_2の増加率よりも大きく両者の増加率には乖離がみられた。結果としてCMRO_2とCBFの比に相当する脳酸素摂取率(OEF)は脳賦活部位において低下しており、OEFの変化率はBOLD信号の変化率と有意な逆相関を示した。また、手指運動負荷時に観察される脳機能抑制部位においては、CBFおよびCMRO_2の低下がみられたがCBFの変化量はCMRO_2の変化量よりも大きく、結果としてOEFの上昇とBOLD信号の低下がみられた。これは脳賦活部位とは丁度逆の変化に相当する。これらの結果から、fMRIによる脳賦活部位および脳機能抑制部位のBOLD信号変化はCBFとCMRO_2の変化量の乖離による酸化ヘモグロビン濃度の変化に由来するものであるという仮説が、ヒトにおいて直接証明された。機能的磁気共鳴断層撮影法(fMRI)により測定される脳賦活部位の血液酸素濃度依存性(BOLD)信号と局所脳血流量(CBF)および局所脳酸素消費量(CMRO_2)の変化量との関係を調べるべく、今年度はfMRIおよびポジトロン放出断層撮影法(PET)を用いた測定が行われた。データ解析は、画像処理ソフトウェアパッケージのDr.View/LINUXおよびフリーのソフトウェアパッケージのSPM99を用いて伊藤(研究代表者)が茨木(研究分担者)と後藤(研究分担者)の協力の下に行った。現在までの測定および解析によると、手指運動負荷時の脳賦活部位である一次運動野におけるBOLD信号変化とCBFおよびCMRO_2の変化には有意な相関がみられた。また、従来の仮説と同様にCBFの変化量はCMRO_2の変化量よりも大きく両者の変化量には乖離がみられた。これらの結果は、fMRIによる脳賦活部位のBOLD信号発生はCBFとCMRO_2の変化量の乖離による酸化ヘモグロビン濃度の上昇に由来するものであるという仮説を直接支持するものである。

今後は手指運動負荷により観察されるその他の脳賦活部位および脳機能抑制部位についても同様の解析を行い、BOLD信号変化率とCBFおよびCMRO_2の変化量乖離との関係をさらに詳細に検討することによりfMRIによるBOLD信号発生機構の解明を進めていく予定である。また近年ではfMRIを用いてCMRO_2を測定する試みも行われはじめているが、この測定の理論式における未知の定数を本研究の結果から導き出すことについても試みる予定である。機能的磁気共鳴断層撮影法(fMRI)により測定される脳賦活部位の血液酸素濃度依存性(BOLD)信号と局所脳血流量(CBF)および局所脳酸素消費量(CMRO_2)の変化量との関係を調べるべく、今年度は昨年度中に測定されたfMRIおよびポジトロン放出断層撮影法(PET)のデータの解析を中心に行った。データ解析は、画像処理ソフトウェアパッケージのDr.View/LINUXおよびフリーのソフトウェアパッケージのSPM99を用いて伊藤(研究代表者)が茨木(研究分担者)と後藤(研究分担者)の協力の下に行い、結果の解釈については菅野(研究分担者)と討論を行った。この解析によると、手指運動負荷時の最も強い脳賦活部位である一次運動野およびその他の脳賦活部位におけるBOLD信号増加率とCBFおよびCMRO_2の増加率には有意な相関がみられた。また、従来の仮説と同様にCBFの増加率はCMRO_2の増加率よりも大きく両者の増加率には乖離がみられた。結果としてCMRO_2とCBFの比に相当する脳酸素摂取率(OEF)は脳賦活部位において低下しており、OEFの変化率はBOLD信号の変化率と有意な逆相関を示した。また、手指運動負荷時に観察される脳機能抑制部位においては、CBFおよびCMRO_2の低下がみられたがCBFの変化量はCMRO_2の変化量よりも大きく、結果としてOEFの上昇とBOLD信号の低下がみられた。これは脳賦活部位とは丁度逆の変化に相当する。これらの結果は、fMRIによる脳賦活部位および脳機能抑制部位のBOLD信号変化はCBFとCMRO_2の変化量の乖離による酸化ヘモグロビン濃度の変化に由来するものであるという仮説を直接支持するものである。また、近年行われ始めているfMRIを用いたCMRO_2測定の理論式における未知の定数を本研究の結果から導き出すことも行いこれに成功した。
幹細胞を用いたドライアイに対する研究手法の開発

ドライアイに対する治療の選択肢は拡大しているが、ドライアイに対する評価系は少ない。本研究では角膜上皮幹細胞を用いたドライアイ評価系の構築を目的に研究を行った。DMEM-F12, B-27, EGF存在下で幹細胞コロニーが採取でき、これらはPAS染色陽性でありムチンの発現が確認できた。対してERK1,2阻害剤であるFR1800204を用いることで、ムチン発現を抑制でき、かつERK1.2の他にERK5の抑制で細胞増殖が抑制でき、ERK1,2の抑制だけでは細胞増殖に悪影響を及ぼさないことを明らかにし、新たな評価系モデルとして期待できる成果を得た。近年、ムコスタなどのドライアイに対する新薬が投入されるなど治療の選択肢が拡大しているが、ドライアイに対する評価系は少ない。本研究では上皮が分泌するムチンについて着目し、評価系モデルの構築を試みた。米国輸入角膜より角膜輪部を採取し、細胞を分散させた。特注にて作成された住友べークライト社製低級着セルデスクLFに1000個/wellの細胞密度で播種し、一晩放置後洗浄することで、高付着能を持つ幹細胞を単離できた。DMEM-F12基礎培地にB-27 SupplementとEpidermal growthfactor(EGF)を添加し一週間培養することで幹細胞由来単一コロニーの細胞群を作成できた。これらのコロニーはムチンを染色できるPAS染色に陽性であり、幹細胞由来コロニーがムチンを分泌することが判明した。これらの培養系にEGFによる増殖経路の一つであるERK1,2の関与を各種阻害剤を用いて検証した。ERK1,2を阻害することで知られるFR1800204を用いることにより、コントールと比較して有意にPAS染色像の希薄化が認められ、ERK1,2の阻害により角膜上皮幹細胞のムチン産生が抑制できる。その一方でEGFによる細胞増殖は阻害しない。ERK1,2とともにERK-5を阻害できる、U0126を使用することで細胞増殖は完全に抑制できた。またERK-5のみを阻害できるBIXを使用したサンプルは細胞増殖が可能であり、ERK1,2とERK5の両方を抑えることが細胞増殖の阻害が可能てあった。これらのことより、FR1800204をもちいることで、ERK1,2を阻害することにより、細胞の増殖は阻害せず、ムチン発現を抑制できることが明らかとなり、新規のドライアイモデルとして期待できる。近年、ドライアイに対しては新規の点眼薬が投入されるなど治療の選択肢が広がっているが、ドライアイに対する有効な評価系モデルは少ない。我々はこれまでに角膜上皮幹細胞の単離法のほか、無血清培養法を報告した。今回これらの手法を発展させ、上皮が分泌する膜型ムチンをターゲットとした評価系モデルの構築を試みた。米国アイバンクのドナー角膜輪部組織より角膜輪部上皮細胞を採取し、セルデスク24well(住友ベークライト社製、未処理品:特注)に1×103cells / wellの密度で播種し、翌日洗浄することで高付着能の幹細胞を得た。これらの幹細胞をB27およびepidermal growthfactor添加DMEM/F12で一週間培養したものをコントロールとし、各種マップキナーゼ阻害剤を添加した培地で培養した細胞コロニーとの間でPAS染色によるムチン発現について検討した。培養された幹細胞コロニーはPAS染色陽性でありムチンを発現した。各種阻害剤のうちERK1、2を阻害するFR1800204の添加により、コントロールと比較してPAS陽性部分が有意に減少し、ムチン産出が抑制された。角膜上皮幹細胞はコロニー形成時においてムチンを産生する。ムチンの産生はMAPKのERK1、2を阻害するFR1800204を培地に添加することで、角膜上皮幹細胞を用いたムチン発現を抑制するドライアイ評価系モデルを構築できたと考えられる。角膜上皮幹細胞でのムチン発現を研究し、各種膜型ムチンの同定とムチン非発現系を探索しドライアイ研究における有用な評価系モデルを開発することを目的に研究を行っているが、ムチン非発現系の構築に成功し、研究目的の達成は概ね順調に推移している。角膜上皮に発現しているムチンの同定の他、各種ドライアイ治療薬の添加による効果の判定や、薬理機構の解明を目指すため、遺伝子の網羅的解析などを通じて、角膜上皮幹細胞を用いた評価系の確立を目指す。各種遺伝子発現の解析の他、膜型ムチン各種の免疫染色等を行う。またサンプル保存のためのフリーザーが必要となるため、-80°Cのディープフリーザーを購入する予定である。