hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト塩基除去修復酵素の遺伝子多型に基づく活性の個体差に関する研究

DNA中に生じた損傷塩基は突然変異の原因となる場合が多いため、その修復機構である塩基除去修復系の酵素遺伝子の一塩基多型(SNP)に基づく修復活性の差異は、各個人における遺伝子異常の起こりやすさを遺伝的に規定することになる。そこで、本研究は、塩基除去修復系遺伝子のSNPに基づく多型蛋白質の修復活性の差異を同定していくことを目的とする。これまでに、この系に属するOGG1,MYH, APEX遺伝子のSNPを同定し、その活性を、組み換え蛋白質あるいは大腸薗の系で比較してきた。そこで、本年度は、ヒト細胞内におけるこれらの多型蛋白質の活性を比較検討するため、まず、野性型蛋白質の突然変異抑制能を検討した。肺がん細胞株H1299のOGG1,MYH, APEX高発現株を樹立し、シャトルプラスミドpMY189に対する変異抑制能をsupF前進突然変異分析により検討した。pMY189のsupF遺伝子内に一ケ所損傷塩基である8-ヒドロキシグアニン(oh^8G):C塩基対を導入したpMY189-oh^8Gあるいは、pMY189をin vitroでベンゾ[a]ピレン代謝産物B[a]PDEと反応させて得たpMY189-B[a]PDEを、H1299に導入、複製後に回収し、大腸菌KS40/pKY241に導入することにより、ヒト細胞内でのsupF遺伝子変異頻度を調べた。すると、oh^8Gを含まないpMY189の場合と比べそれぞれ65倍、34倍の上昇を認めた。また、いずれの場合もG:C->T:A変異が優位に認められた。pMY189-oh^8Gの場合の、変異率および、oh^8G:C箇所におけるG:C->T:A変異率は、OGG1およびMYH高発現株で有意に減少したが、APEX高発現株では有意な差は認められなかった。一方、pMY189-B[a]PDEの場合は、いずれの高発現株でも親株と比べ有意な差は認められなかった。以上より、OGG1,MYH蛋白質は、ヒト細胞内においてoh^8GによるG:C->T:A突然変異のサプレッサーとして働くことが示唆された。この系を利用して現在、多型蛋白質間での活性の差を検討中である。DNA中に生じた損傷塩基は突然変異の原因となる場合が多いため、その修復機構である塩基除去修復系の酵素遺伝子の一塩基多型(SNP)に基づく修復活性の差異は、各個人における遺伝子異常め起こりやすさを遺伝的に規定することになる。本年度は、損傷塩基の一つである8-ヒドロキシグアニン(oh^8G)の修復に関わるヒトMYH, APEX遺伝子に注目し、11種類のSNPを同定し、その頻度を明らかにした。これらの多型のうち、7つはアミノ酸の置換を伴うものであった。また、MYH遺伝子については、その発現解析から、核移行型をコードするMYHβ型のIVSI+5G/C多型を同定した。そして、IVSI+5G/C多型は選択的スプライシングを引き起こすことを、構造解析およびin vivoスプライシング分析から示した。さらに、5C型の転写産物では、5G型と異なり、MYHのORFの上流に短いORFが存在するので、この上流ORFが本来のMYH ORFの翻訳に与える影響を検討した。5G型および5C型に基づく5'-非翻訳領或を導入したMYH-フラッグ発現ベクターを構築し、その安定発現株を樹立した。そして、MYH-フラッグの蛋白質/mRNA比を算出すると、5G型に比べ5C型ではその値(=翻訳効率)は30%に低下しており、5C型を持つヒト細胞では核型MYH蛋白質量が減少していることが示唆された。CGGI遺伝子については、ヒト細胞内における突然変異抑制能を検討した。シャトルプラスミドpMY189supF遺伝子内にoh^8Gを導入し、肺がん細胞株H1299およびそのOGGI高発現株で、前突然変異分析を行うことにより、oh^8Gによるヒト細胞内におけるG : C->T : A突然変異の誘導と、CGGI蛋白質によるその特異的な変異抑制が示された。pMY189のsupF遺伝子内に一ケ所損傷塩基である8-ヒドロキシグアニン(oh^8G):C塩基対を導入したpMY189-oh^8Gあるいは、pMY189をin vitroでベンゾ[a]ピレン代謝産物B

[a]PDEと反応させて得たpMY189-B[a]PDEを、H1299に導入、複製後に回収し、大腸菌KS40/pKY241に導入することにより、ヒト細胞内でのsupF遺伝子変異頻度を調べた。すると、oh^8Gを含まないpMY189の場合と比べそれぞれ65倍、34倍の上昇を認めた。また、いずれの場合もG:C->T:A変異が優位に認められた。pMY189-oh^8Gの場合の、変異率および、oh^8G:C箇所におけるG:C->T:A変異率は、OGG1およびMYH高発現株で有意に減少したが、APEX高発現株では有意な差は認められなかった。一方、pMY189-B[a]PDEの場合は、いずれの高発現株でも親株と比べ有意な差は認められなかった。以上より、OGG1,MYH蛋白質は、ヒト細胞内においてoh^8GによるG:C->T:A突然変異のサプレッサーとして働くことが示唆された。この系を利用して現在、多型蛋白質間での活性の差を検討中である。
線虫ゲノム機能解析情報に基づく発生メカニズムの解析

個体発生を制御する遺伝子ネットワークを明らかにするために、線虫C.elegansの初期発生をモデル系として、1)表現型を定量的に解析するためのツール(蛍光標識タンパク質発現株、抗体ライブラリー等)およびイメージング技術の確立とイメージングデータ取得、2)表現型データのコンピューター解析、3)定量的表現型解析とシミュレーションを組み合わせた研究戦略の開発、を実施した。本研究では線虫C.elegansの発生プロセスを制御する遺伝子ネットワークを明らかにするために以下の解析を行った。1.833の胚性致死遺伝子について、微分干渉顕微鏡によるRNAi最終表現型の表現型プロファイリングを行った。次に、表現型プロファイルの類似性に基づいた遺伝子クラスタリングを行い、機能未知遺伝子の機能予測を行った。また、遺伝子の複数の発生時期・複数の組織における機能を明らかにするため、発生時期特異的RNAiを行い、必須遺伝子について孵化後発生期の表現型データを体系的に取得した。その結果、約6割の胚性致死遺伝子は複数の発生時期において機能していることが明らかになった。2.さらに詳細な表現型情報を得るためのツールとして、特定の組織や細胞内器官を特異的に染色するモノクローナル抗体ライブラリーの整備を進め、新規モノクローナル抗体を約40種取得した。これらについて野生型胚発生期における時間的空間的染色パターンの画像データベースを作成した。3.細胞分裂パターン測定装置を使った細胞分裂パターンの測定の精度とスループットを高めるために、4次元顕微鏡撮影の撮影条件の設定と、測定装置のアルゴリズムの改良を行った。また、初期胚の構造の変化に関与する遺伝子とその機能を解明するために、細胞分裂パターンデータを解析するアルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムを活用して野生型胚とRNAi胚の差を統計的に解析し、過去の大規模な表現型解析では検出されなかったRNAi胚の表現型の検出に成功した。4.画像処理を使った雄性前核の微小振動の定量測定、および、GFP標識と画像処理を使った紡錘体の微小運動の定量測定により、雄性前核の移動から紡錘体の後極側への移動までの核の動きを支配する機構のモデルを構築し、計算機シミュレーションによるモデルの検証を行った。線虫C.elegansのゲノムには約20,000遺伝子が存在し、これらの遺伝子が時間的空間的に厳密に制御されて発現し機能することによって発生プログラムが進行する。この遺伝子ネットワークを理解することをめざして、本研究では以下の研究を実施した。1)コンピューター解析で使用できる表現型の記録法の確立とデータ取得:細胞分裂パターン測定装置を使い、RNAiにより胚性致死を引き起こす約200遺伝子についての細胞分裂パターンの測定を終了した。また表現型をより詳細に解析するためのマーカーとして、細胞内構造を標識する抗体およびGFP融合蛋白質を発現する株を多数構築した。2)表現型データのコンピューター解析:初期卵割パターンに異常を示す遺伝子群について、細胞分裂パターン測定装置およびGFP・抗体マーカーを用いてさらに詳細な表現系解析を行っている。細胞分裂パターンデータより算出が可能な細胞分裂の特徴の定量的な指標を146種類、数学的に定義しRNAi胚の細胞分裂パターンの異常を統計的に検討し、194種の未知の表現型を同定した。また、1)で構築したGFP株を用いて、細胞骨格系タンパク質等の初期胚におけるライブイメージングを行い、タンパク質動態の定量的評価方法を構築した。3)定量的表王型解析とシミュレーションを組み合わせた研究戦略の開発:2)で確立したGFPマーカーのライブイメージング画像解析を用いて、1細胞期胚の細胞質分裂における微小管の役割、および、前後軸確立におけるアクチン細胞骨格の制御機構を明らかにした。GFP画像処理を使った定量測定と計算機シミュレーションを組み合わせ、1細胞期胚の核の中央化、脱中央化の動きを支配する"核に働く力"の空間分布の時間変化を解明した。本研究では線虫C. elegansの発生プロセスをモデル系として、1)コンピューター解析で使用できる表現型の記録法の確立とデータ取得、2)表現型データのコンピューター解析、3)定量的表現型解析とシミュレーションを組み合わせた研究戦略の開発、を実施する。今年度は以下の成果を得た。1.蛍光蛋白質融合遺伝子発現株の作出法の効率化蛍光融合タンパク質発現用ベクターを作成するとともに、遺伝子銃による線虫への遺伝子導入法を最適化した。2.GFP/m Cherry融合蛋白質を用いた生体内蛋白質局在解析と表現型解析中心体と細胞膜を蛍光蛋白質で標識した胚の高分解能4次元ライブイメージングを行い、野生型胚、細胞極性確立に異常を示すRNAi胚の初期細胞分裂期における中心体の3次元的な動態を解析した。3.組織特異的モノクローナル抗体群の抗原同定生殖顆粒を認識する10種のモノクローナル抗体(mAb)のうち、2種について抗原を決定した。また、哺乳動物細胞で線虫遺伝子を発現させ、免疫染色によってmAb抗原をスクリーニングする方法を構築した。4.細胞分裂パターンデータを用いた発生プログラムの解析RNAi胚の定量的細胞分裂パターンデータおよび表現型指標を適用して2583種のRNAi表現型を同定し、階層的クラスター分析により胚発生に必須な遺伝子を16クラスターに分類した。

野生型胚の細胞分裂パターンデータを対象に、相関の高い表現型指標を連結し、8細胞期までの発生プロセス指標ネットワークを作成した。遺伝子ノックダウンプロファイルの相関関係のはずれ値を検出するアルゴリズムを開発し、発生プロセス指標間の因果関係を支配する遺伝子の推定を行った。5.画像認識を利用した新たな測定手法の開発様々な画質で撮影された線虫胚のDIC顕微鏡2+1次元動画像に適応可能な核領域検出アルゴリズムを開発した。1)線虫初期胚の多様な細胞内構造を可視化するための蛍光タンパク質融合遺伝子発現株の構築をすすめ、高時空間分解能で細胞骨格ダイナミクス(特に、紡錘体微小管および中心体動態)を解析するための技術開発を行った。(杉本)2)線虫胚の特定の組織や細胞内器官を特異的に染色する35種のモノクローナル抗体ライブラリーを作製し、発生時期ごとの染色パターン画像データベースの公表および希望者への配布を開始した。(杉本)3)上記モノクローナル抗体のうち、生殖顆粒を認識する11種に着目し染色パターン等のさらに詳細な解析を行った。うち2種については抗原がそれぞれPGL-1およびPGL-3タンパク質であることを同定した。さらに、PGL-1およびPGL-3タンパク質が哺乳動物細胞において生殖顆粒様の顆粒構造を形成することを見いだし、線虫の生殖顆粒形成カスケードの一端を明らかにした。(杉本)4)表現型の相関を利用して形態形成過程を推定する手法を開発し、第III染色体の全ての胚発生必須遺伝子(全97遺伝子)についてのRNAi胚の定量的細胞分裂パターンデータを用いて、365指標、1656関係で構成される発生フローチャートを作製した。発生フローチャート中の各関係の成立のために働く遺伝子を推定する手法を開発し、8409遺伝子機能を推定した。(大浪)5)多様な条件で撮影されたDIC顕微鏡動画像に対応する汎用的な細胞分裂パターン測定アルゴリズムを開発し、公共データベースに登録されている2DタイムラプスDIC顕微鏡画像を利用した包括的なRNAi胚の定量的細胞分裂パターン解析を開始した。(大浪)6)GFP標識タンパク質を使って細胞境界を可視化した動画像から細胞境界を自動検出する画像処理アルゴリズムと検出を補助するGUIを開発し、ショウジョウバエ気管原基、線虫初期胚の解析に適用した。(大浪)1)線虫初期胚の多色4次元ライブイメージングを活用して、紡錘体微小管の形成機構の解析を行い、γ-tubulin依存的微小管とAurora Aキナーゼ依存的微小管が異なる時空間制御を受けており、双方が協調的にはたらくことが紡錘体形成に重要であることを見いだした。(杉本)2)線虫初期胚の多因子4次元ライブイメージングと定量的画像解析を活用して、紡錘体位置制御・細胞分裂軸制御の解析を行った。
心不全における酸化ストレスの関与の検討

慢性心不全患者の治療薬による心不全改善作用を酸化ストレスおよび心筋酸素代謝の面から検討した。心筋酸素消費量を11C-asetate PETで、心筋仕事量はwork metabolic index(WMI)として算出。治療により左室駆出率(EF)の改善群と非改善群に分け、各指標の解析を行った。両群で基礎疾患や投与薬剤に有意差は認めなかった。結果、酸化ストレス過剰状態が観察され、大動脈ー冠状静脈濃度差は、PGF2α値とも相関した。EF改善群では仕事効率の改善もみられた。IL-6およびTNFα値は、非改善群では逆に増加し、心機能改善効果が得られない場合は、冠循環でのIL6やTNFαの増大が一因と考えられた。スタチンによる差は今回の検討では明らかではなかった。慢性心不全患者における酸化ストレスの定量化と内皮機能の予測因子として血中NOを計測し、心不全における酸化ストレスの過剰状態およびNOの低下状態を実際の心不全患者で明らかにすることが研究の目的である。さらに150-02PET検査により酸素消費量の定量計測を行い、心筋好気的エネルギー代謝異常や心筋血流予備能の低下を同時に明らかにすることである。また、HMG-CoA reductase阻害薬の心不全改善作用の機序として、酸化ストレスとNOの関与がいかにあるのかを冠循環系で検討し、PET検査で実際の心筋仕事効率や心筋血流予備能の改善について検討することにある。正常健常症例の検査データ収集、および対象症例の抽出・検査開始を現在行っている段階である。研究の目的:慢性心不全患者における酸化ストレスの定量化と内皮機能の予測因子として心不全における酸化ストレスの過剰状態を、実際の心不全患者で明らかにすること。さらに、PET検査により酸素消費量の定量計測を行い、心筋好気的エネルギー代謝異常や心筋血流予備能の低下を同時に明らかにすることである。また、β遮断薬やHMG-CoA reductase阻害薬の心不全改善作用の機序として、酸化ストレスとNOの関与がいかにあるのかを冠循環系で検討し、PET検査で実際の心筋仕事効率や心筋血流予備能の改善について検討することにある。平成20年度までの実績:本年度までに24例の心不全患者の同意を得てエントリーをおこなった。うち経過中に外科手術の適応と判断した1例・腎不全の進行により透析導入となった1例が脱落となったため合計22例である。そのうちβ遮断薬の導入後追跡できた症例が17例となっている。β遮断薬の投与前の患者背景は、22例中、拡張型心筋症11例(男性8名、女性3名)虚血性心不全が9例(男性3名、女性6名)、その他の疾患が2例である。現時点での平均年齢は70.85歳。投与したβ遮断薬はcarvedilolと1例のmetoprololであった。平均投与量は8.5mg。心臓超音波検査では左室駆出率、拡張能の改善をみた。BNP値も有意に低下する傾向にあった。IL-6、TNFα、VCAM-1、PGF2αに関しては現在測定を進めている。冠循環での検討は、症例数が少なく、現時点では有意差が出ていない。さらに、PET検査により酸素消費量の定量計測を行い、心筋仕事効率の低下や酸素代謝を明らかにすることである。また、β遮断薬やHMG-CoAreductase阻害薬の心不全改善作用の機序として、酸化ストレスの関与がいかにあるのかを冠循環系で検討し、PET検査で実際の心筋仕事効率改善について検討することにある平成21年度までの実績:最終的には、35例をエントリーし、28例で解析をおこなった。そのうちβ遮断薬の導入後追跡できた症例が20例となっている。平均年齢は67.1±13歳。投与したβ遮断薬はcarvedilol(喘息合併2症例のみmetoprolol)平均投与量は10±2.5mg、HMG-COA阻害薬の使用頻度は39.1%。心筋酸素消費量を11C-asetateのクリアランス曲線の傾きで示し(Kmono)、心筋仕事量は超音波検査法より既知の方法で求め、work metabolic index (WMI)=(stroke volume index)×(systolic blood pressure)×(heart rate)/Kmono,として算出した。治療により心筋仕事効率の改善した群と改善の得られなかった群に分け、各指標の解析をおこなった。また大動脈および冠静脈洞でのIL-6・TNFα・VCAM-1の値をそれぞれ検討した。

さらに酸化ストレスの指標としてPGF2αを測定した。両群において、虚血性心疾患の比率、HMG-CoA阻害薬の使用頻度および投与量、β遮断薬投与量には有意差は認めなかった。仕事効率の改善群・非改善群で開始時の左室駆出率は34±4%・34±4.1%、治療後は50±6.8%・45±5.7%であった。また、心不全患者では酸化ストレス過剰状態にあり、TNFαの大動脈-冠状静脈での濃度差が大きく、PGF2α値とも相関した。さらに仕事効率の改善群は、TNFα値が治療後に低下しており、非改善群では逆に増加していた。
口唇口蓋裂患者の咬合評価は顎顔面成長を予測できるか

85名の片側性唇顎口蓋裂患者の経年的研究模型におけるGoslon Yardstickによる咬合評価とその成人期に至るまでの顎顔面発育の相関分析、更には38名の男性唇顎口蓋裂患者と46名の女性患者の生後3カ月から成人期までのセファロにおける顎顔面形態の経年的成長研究を行い、次の結論を得た。Five-year-old index, Goslon Yardstickという咬合評価の尺度は、容易で簡便な方法であるが、あくまでも評価時点までの顎顔面頭蓋領域の成長の結果を評価しているものである。(2)5歳と10歳の咬合評価は大きく変動しなかったが、矯正治療はその評価を良くする傾向にあった。(3)これらの評価結果は、口唇裂口蓋裂患者に加わった口唇形成手術や口蓋形成手術による上顎複合体への影響よりも、派生した下顎骨の成長あるいは成長方向の変化の結果と関連性が高かった。(4)10歳頃に行われたGoslon Yardstickによる咬合評価結果は、それ以降成人に至るまでの顎顔面頭蓋領域の成長とは全く相関を示さなかった。この時期には旺盛な思春期成長が関与しているおり、10歳頃の咬合関係を異なるものへと変えてしまう可能性があることが考えられた。また本研究対象においても、Five-year-old index, Goslon Yardstick共に良好な咬合評価をえられていた患者が、成熟してみると外科矯正治療が必要になった症例があった。(5)集団としての片側性口唇顎裂、片側性唇顎口蓋裂、口蓋裂単独症例の検討からは、口唇裂口蓋裂患者に加わった口唇形成手術や口蓋形成手術による上顎複合体への影響が示唆されたが、下顎骨は類似した成長様相を示した。即ち、形成手術の上顎複合体への影響を考察しなければならないが、本研究対象の手術方法は一定であり、多施設間比較研究が必要と考えられる。(6)集団ではなく、個体の変化を見ると様々な成長変化が認められ、咬合評価あるいは顎顔面形態の評価、あるいは思春期成長を含むその家族の持つ遺伝的影響を成長予測に取り入れ、低年齢で評価・予測できる方法を模索・検討する必要がある。九州大学病院CLPクリニックで初回手術を受け、5歳時(平均60.2ヵ月)、10歳頃の研究模型がある85名(男45名、女40名)を用い5-year-old index、Goslon yardstickによる咬合評価を行った。また同対象の5歳時、10歳頃時、15歳以降(平均18歳3ヵ月)の側面頭部X線規格写真を計測し、顎顔面形態変化と咬合評価との関連を調べた。[咬合評価結果]5-year-old indexは平均2.96であり、Goslon Yardstickは平均2.85と良好であった。両咬合評価間では、有意な相関関係を認めた。5歳時から10歳までの咬合評価は、被験者の42.3%で変化なし,35.3%で良くなり,22.3%で悪化していた。男子は咬合評価が悪化、女子では改善する傾向が認められた。[咬合評価と顎顔面形態との関係]

側面セファロによる顎顔面形態とよる咬合評価の相関関係を調べると、下顎骨オトガイ部の前突と強い関係が認められた。10歳時Goslon yard stickは成人期における角度Angle of Convexity, A-B plane angleと正の相関、角度A-N-BやFacial planeangle, Y-axisangleと負の相関を示し、上下顎の相対的前後関係と有意な関係を認めた。[咬合評価と顎顔面成長との関係]5歳から10歳までの顎顔面の成長量はGoslon Yardstickによる咬合評価グループ間で有意差を認めた。しかし、10歳以降の顎顔面の成長変化とGoslon yard stickによる咬合評価の関係では、Pogの垂直的成長量とArの前後的成長量に統計的有意差を認めたが、他の部位には差を認めなかった。Goslon Yardstickは10歳以降の顎顔面の成長との間に関連性を認めず、これら咬合評価からは、その以降の成長変化の予測は不可能と考えらる。本研究結果はこの咬合評価をpredictive scaleとすることを支持できないと考える。口唇口蓋裂患者の顎顔面発育に関し乳幼児から成人期までの経年的研究は皆無である。口唇・口蓋形成術時に頭部X線規格写真撮影を行い、その成人における顎顔面形態との関連性の関する研究を行った。[対象]本院で初回形成術を施行した患者で、口唇形成術時(T1)、口蓋形成術時(T2)、15歳以上(T5)の頭部X線規格写真が確認できた59例(裂型はUCLA, U/B-CLP, CP)である。側面X線規格写真をトレースし、24計測点の座標をタブレット入力し、顎顔面形態について頭蓋底・上顎骨の10項目と下顎骨8項目の変数を得た。【結果】0歳(T1)での顎顔面形態の特徴は成人(T5)まで維持されてなかった。一方、0歳での顎顔面形態の特徴は4歳まで維持されるとの報告もあり、幼児期以降の各個体の顎顔面成長の相違や矯正・形成治療が、顎顔面成長発育に影響を及ぼす可能性があると考えられた。(1)頭蓋底は0歳時(T1)では3群間に差はなかったが、成人期(T5)ではCPが有意に小さかった。後頭蓋底長でも同様であった。(2)中顔面前方高径N-ANSは、4群で同様な変化を示した。BCLPはT1で有意に大きく、T2では同様な傾向があり、成人期(T5)でも大きかった。(3)中顔面後方高径S-PNSは、T1で差がないが、T2でCPが顎裂のある2群より有意に大きかった。成人期では、UCLPはUCLAより有意に小さく、CPと比較しても小さかった。(4)口蓋長径ANS-PNSは、T1,T2でUCLPがUCLAより短く、T5でも同じ傾向にあった。CPはT5で最も小さく、特にUCLAとの間で有意差を示した。(5)下顎は、T1でUCLAがUCLP・BCLPより大きかったが、成長とともに差はなくなった。85名の片側性唇顎口蓋裂患者の経年的研究模型におけるGoslon Yardstickによる咬合評価とその成人期に至るまでの顎顔面発育の相関分析、更には38名の男性唇顎口蓋裂患者と46名の女性患者の生後3カ月から成人期までのセファロにおける顎顔面形態の経年的成長研究を行い、次の結論を得た。(1)Five-year-old index, Goslon Yardstickという咬合評価の尺度は、容易で簡便な方法であるが、あくまでも評価時点までの顎顔面頭蓋領域の成長の結果を評価しているものである。
モノオキシゲナーゼ活性を有するルテニウム錯体の合成と反応

炭化水素類の中でも反応性の乏しいアルカン類へ官能基を導入することは工業的に大変重要であると共に、石油の代替資源として注目されている天然ガスの有効利用にもつながる。メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)に代表される非ヘム系酸化酵素は、温和な条件でメタンを酸素化できることで知られている。近年、ルテニウムを含む錯体が非ヘム系酸素化酵素のモデル錯体として注目されている。そこで、新しいルテニウム錯体触媒の開発を行い、アルカン類への官能基の導入を検討した。MMOの活性中心にある鉄イオンへはイミダゾールなどの含窒素複素環およびカルボキシル基が配位している。三座配位子と二座配位子を有する混合配位型ルテニウム錯体は、様々な構造と官能基を持つ錯体を比較的容易に合成できる。そこで、アミノ基、ピリジル基、カルボキシル基など多様な官能基を有する混合配位型ルテニウム錯体11種を合成し、そのアルカン酸化反応における触媒能を検討した。その結果、クロロ(N,N-ジメチルグリシナト)ターピリジンルテニウム錯体を触媒としアダマンタンを基質とした場合、1-アダマンタノールが最高66%得られ、これら錯体はアルカンの酸素化反応のルテニウム錯体触媒としては、これまでにない高活性な触媒であることがわかった。一方、エチルベンゼンを基質にすると、フェニルエチルアルコールが最高62%(α体48%、β体14%)得られた。炭化水素類など反応性の乏しい有機化合物へ官能基を導入し、従来限られた用途しかなかった炭素資源を有効に利用することは工業的にも大変有用である。メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)に代表される非ヘム系酸化酵素は、温和な条件でアルカン類を酸素化できることで知られているが、工業的な触媒では活性が低く選択性も不十分である。近年、ルテニウムを含む非ヘム系酸素化酵素のモデル錯体が炭化水素類の酸素化触媒として有効であることが見いだされたが、まだ十分満足のいく結果は得られていない。そこで、炭化水素類の酸素化反応の触媒となりうる新しい錯体触媒の開発を行い、アルカン類への官能基の導入を検討した。MMOの活性中心にある鉄イオンへはイミダゾールなどの含窒素複素環およびカルボキシル基が配位していることに着目し、トリス(ピコリル)アミンやN,N-ビス(ピコリル)グリシナトなど、ピリジル基・カルボキシル基を有する四座配位子を含む新規なルテニウム錯体を合成し、それらを触媒とするアルカン類の酸化反応を検討した。トリス(ピコリル)アミンのクロロ(ジメチルスルホキシド)ルテニウム錯体を触媒としアダマンタンを基質とした場合、1-アダマンタノールが最高75%得られ、これら錯体はアルカンの酸素化反応のルテニウム錯体触媒としては、これまでにない高活性な触媒であることがわかった。この反応は溶媒依存性が高く、クロロホルムがもっとも適した溶媒だった。さらに共酸化剤であるm-クロロ安息香酸の添加法を工夫することにより、最高88%まで1-アダマンタノールの収率を向上させることが出来、副生成物もほとんど見られなくなった。一方、シクロオクタンを基質にすると、シクロオクタノンが主生成物として得られた。今後、錯体の構造や性質を検討することで、他の基質でも高活性・高選択的な触媒の開発が期待される。

MMOの活性中心にある鉄イオンへはイミダゾールなどの含窒素複素環およびカルボキシル基が配位している。三座配位子と二座配位子を有する混合配位型ルテニウム錯体は、様々な構造と官能基を持つ錯体を比較的容易に合成できる。そこで、アミノ基、ピリジル基、カルボキシル基など多様な官能基を有する混合配位型ルテニウム錯体11種を合成し、そのアルカン酸化反応における触媒能を検討した。その結果、クロロ(N,N-ジメチルグリシナト)ターピリジンルテニウム錯体を触媒としアダマンタンを基質とした場合、1-アダマンタノールが最高66%得られ、これら錯体はアルカンの酸素化反応のルテニウム錯体触媒としては、これまでにない高活性な触媒であることがわかった。一方、エチルベンゼンを基質にすると、フェニルエチルアルコールが最高62%(α体48%、β体14%)得られた。
エコトロピック・マウスレトロウイルス受容体蛋白の発現制御機構に関する研究

同種指向性(エコトロピック)マウスレトロウイルス(eMuLV)の受容体であるカチオン型アミノ酸輸送体1型(CAT1)の発現制御機構には不明の点が多い。また、eMuLVの感染がCAT1の発現に与える影響も明らかではない。これらの点を解明するため、マウスCAT1(mCAT1)のC末に緑色蛍光蛋白(GFP)標識した融合蛋白(mCAT1-GFP)の発現ベクター(Masuda et al.,1999)をミンク由来細胞株CCL64に導入し形質転換細胞を得た。細胞膜上にmCAT1-GFPを発現するこの細胞はeMuLVの感染に感受性となったが、感染後には細胞表面のmCAT1-GFPが激減した。レーザー共焦点顕微鏡を用いた解析により、eMuLV感染細胞ではtrans-Golgi networkから細胞表面へのCAT1の輸送が抑制されている可能性が示された。この可能性をより詳細に検討するため、イヌ腎臓由来の株化上皮細胞MDCKにmCAT1-GFPベクターを導入し、安定発現株を得た。この細胞を用いた解析により、mCAT1-GFPが極性上皮細胞のbasolateral表面に発現すること、蛋白の細胞内輸送に関与するアダプター複合体AP1、AP2と共局在することが示された。免疫沈降法やウエスタン法により、mCAT1-GFPがAP1やAP2と直接あるいは間接に結合することも示された。一方、この細胞にeMuLVを感染させると、CCL64の場合と同様、細胞表面のmCAT1-GFPが激減した。それに伴い、mCAT1-GFPとAP1の結合が減少し、代わってAP3との相互作用が増加した。すなわち、eMuLV感染はCAT1と種々のアダプター複合体の相互作用に影響を与えることが新たに見出された。レトロウイルスの受容体干渉の機構解明にも寄与しうる成果と考えられる。同種指向性(エコトロピック)のマウスレトロウイルスの感染に際してはカチオン型アミノ酸の輸送体であるCAT1が受容体となることが知られている。CAT1は14回膜貫通型の細胞表面蛋白であり、その第3細胞外ドメインがウイルス受容体機能に重要であることが知られている。また、マウスCAT1(mCAT1)のC末に緑色蛍光蛋白(GFP)標識を行った融合蛋白(mCAT1-GFP)がゴルジ体を経て細胞表面に発現され、エコトロピック・マウスレトロウイルスの受容体として機能することが報告されている(Masuda, et al.,1999)。一方、CAT1蛋白の発現様式や細胞内輸送の詳細については不明の点が多い。これらについて解明するため、今年度はイヌの腎臓由来極性上皮細胞株MDCKにmCAT1-GFPの遺伝子を導入して安定発現株を単離し、その解析を行った。その結果、(1)CAT1は極性上皮細胞の主にbasolateral表面に発現され、apical表面にはあまり発現されないこと、(2)免疫染色後のレーザー共焦点顕微鏡観察によりCAT1は細胞内輸送に関与するアダプター複合体であるAP1やAP2と共局在すること、(3)エコトロピック・マウスレトロウイルス感染後はウイルス外被蛋白がapical表面に発現し、CAT1の細胞表面発現量は減少すること、(4)ウイルス感染後はCAT1とAP3の共局在が認められるようになることが明らかとなった。さらに、mCAT1-GFP発現用のアデノウイルスベクターの構築にも成功し、これにより、種々の細胞におけるCAT1の発現様式やその制御機構の解析が進められる予定である。

次年度はこれらの知見に基づいて、放射性アミノ酸を用いたパルス・チェイス標識後の免疫沈降法やウェスタン法などにより、CAT1とアダプター複合体などの蛋白-蛋白相互作用をより詳細に解析する予定である。同種指向性(エコトロピック)マウスレトロウイルス(eMuLV)の受容体は、カチオン型アミノ酸輸送体1型(cationic amino acid transporter 1;CAT1)である。CAT1は14回膜貫通型の細胞表面蛋白であり、その第3細胞外ドメインがウイルス受容体機能に重要であることが知られているが、その発現様式や細胞内輸送のメカニズムには不明の点が多い。これらの点を解明するため、マウスCAT1(mCAT1)のC末に緑色蛍光蛋白(GFP)標識した融合蛋白(mCAT1-GFP)の発現ベクター(Masuda et al.,1999)をイヌ腎臓由来の株化極性上皮細胞MDCKに導入し、安定発現株を樹立した。昨年度はレーザー共焦点顕微鏡を用いた細胞生物学的解析により、mCAT1-GFPが極性上皮細胞のbasolateral表面に発現すること、細胞内輸送に関与するアダプター複合体AP1、AP2と共局在することを示した。今年度は、免疫沈降法やウェスタン法等の蛋白化学的手法により、mCAT1-GFPとAP1、AP2が直接あるいは間接に結合することを明らかにした。従って、CAT1の細胞内輸送にはAP1やAP2が関与し、それが細胞内局在を規定すると示唆される。一方、mCAT1-GFPを発現するMDCK細胞にeMuLVを感染させると、mCAT1-GFP由来の蛍光が減少し、細胞内局在も変化した。細胞生物学および蛋白化学的手法により、eMuLV感染細胞ではmCAT1-GFPが主にアダプター複合体AP3と相互作用することも示された。これらの知見は、eMuLV感染が何らかの機序によってCAT1と相互作用するアダプター複合体をAP1/AP2からAP3へと切り替え、それによって受容体発現を抑制する可能性を示唆する。レトロウイルスの受容体干渉のメカニズム解明にも寄与しうる成果と考えられる。
力学的環境下における樹木細胞壁形成の分子機構の解析

力学的環境下における樹木細胞壁の形成機構を分子レベルで明らかにすることを目的とし、力学負荷を受ける植物培養細胞における細胞壁形成関連遺伝子の発現を定量的に調べ、細胞壁における二次代謝産物の蓄積を観察した。PAL遺伝子の発現は、培養細胞に対する比較的短時間の力学負荷で上昇し、負荷応力の明確な依存性は示さなかった。一部の二次壁形成転写因子の遺伝子については、その発現が検出できなかったが、MYB46遺伝子およびKNAT7遺伝子の発現は、負荷時間が長くなると増加することが認められた。力学負荷を受けかつ静置培養された植物細胞では、リグニンの堆積が観察された。平成21年度は、シロイヌナズナ培養細胞に対する力学的な作用が細胞壁の成分代謝や構造変化に与える影響について、おもに関連遺伝子の発現を定量解析により詳しく調べた。特に、力学的作用と細胞壁の二次代謝の関係に焦点を当て、二次代謝のキーとなる酵素や転写因子の遺伝子発現について詳しく解析した。二次代謝反応の初発段階における重要な酵素であるphenylalanine ammonia-lyase (PAL)の遺伝子は、植物培養細胞懸濁液への応力負荷を1時間とした場合、負荷応力に関係なく常に一定量の発現を示した。一方、負荷応力を一定とし、負荷時間を6時間とした場合、この遺伝子の発現量は増加した。この結果から、力学的作用に対するPALの発現応答は負荷時間に依存することが明らかとなった。また、リグニン合成の調節に大きく関わる酵素であるcinnamoyl CoA reductase (CCR)の遺伝子発現量についても、PALと同様、応力負荷を1時間とした場合では負荷応力に関係なく常に一定であり、6時間の応力負荷で遺伝子発現量は増加した。力学的作用に対するCCRの発現応答についても、PALと同様に負荷時間依存性があることが示された。シロイヌナズナ二次代謝転写因子であるsecondarywall-associated NAC domain protein 1 (SND1)について、力学的作用を受ける培養細胞におけるこの遺伝子の発現応答を定性的に調べた。応力負荷時間を1時間とした場合、SND1の発現は、負荷応力の増加とともに増加する傾向が認められた。このことから、力学的作用に対するSND1の発現応答には力学刺激の依存性があることが示唆された。二次代謝反応を担う酵素と転写因子の間で、力学的作用に対する発現に影響するパラメータが異なることが考えられ、このメカニズムの解析の重要性が示された。平成22年度は、力学負荷を受けた植物培養細胞におけるphenylalanin ammonia-lyase(PAL)およびcinnamoyl CoA reductase(CCR)の遺伝子発現について、定量解析を行った。PAL遺伝子の発現量は短時間の力学負荷で増加し、CCR遺伝子のそれは、比較的長い時間の力学負荷によって増加した。力学負荷を受けた培養細胞における二次代謝物の堆積の有無を調べるため、顕微鏡による観察を行った。比較的長時間の力学負荷を与えた培養細胞では、負荷直後にはリグニンの堆積が認められなかったが、その後にリグニンが堆積していくことが示された。以上から、植物細胞に対する力学的な刺激は、細胞壁の木化を誘導する重要な因子であることが示された。また、細胞壁二次代謝物の生合成は、比較的長時間の力学負荷によって促進され、その負荷時間に大きく依存すると考えられた。力学負荷を受けた植物培養細胞におけるcellulose synthase(CesA)の遺伝子発現について、定性的な解析を行った。二次細胞壁の形成に関与する3種のCesA遺伝子の発現を調べたが、いずれも力学負荷による明確な発現の増加は認められなかった。これについては、より詳細に定量発現解析を行う必要があると考えられた。平成23年度は、その前年度に引き続き、力学負荷を受ける植物培養細胞における細胞壁二次代謝関連遺伝子の発現について定量解析を行った。特に、培養細胞に対する応力負荷時間に加え、負荷応力の大きさが二次代謝関連遺伝子の発現に与える影響について詳しく調べた。また、解析の対象とする遺伝子については、その機能などについて見直しを行い、細胞壁二次代謝の転写因子をコードする遺伝子において新たな解析対象遺伝子を追加した。細胞壁二次代謝の初発反応を触媒するPALの遺伝子については、負荷応力が比較的小さい場合には遺伝子発現量の増加が認められたが、負荷応力が大きくなると、その増加は認められなかった。負荷応力が比較的小さい場合、PAL遺伝子の発現量は、応力負荷時間60分のときに大きくなり、応力負荷時間とともに減少した。同じく二次代謝生合成に重要なCCRの遺伝子については、負荷応力が増加すると、その遺伝子発現量はやや増加した。一方、応力負荷時間の増加によるCCR遺伝子の発現量の変化は明確ではなかった。細胞壁二次代謝の転写因子については、MYB46遺伝子の発現量は、比較的小さい応力負荷の場合では明確な変化は認められなかったが、負荷応力が大きくなると、その発現量は応力負荷時間とともに増加した。

その他の転写因子の遺伝子については、その発現量自体が小さく、負荷応力や応力負荷時間による遺伝子発現量の明確な変化は認められなかった。これらの結果から、力学的環境の変化が植物細胞の細胞壁二次代謝の初発反応に影響を与え、力学的作用が二次代謝反応の重要なシグナルであることが示された。一方で、力学的環境下にある植物細胞では、従来から説明されている細胞壁二次代謝の転写因子ではなく、別の転写因子が関わる遺伝子発現制御機構があると推測された。
Bリンパ細胞初期分化機構の解析

B細胞活性化シグナルの解析を行い、リンパ細胞増殖関連シグナル伝達分子α4の固定、遺伝子解析、およびα4分子のリンパ細胞シグナル伝達分子における役割を解析した。マウスのα4、ヒトのα4分子のcDNA解析、染色体遺伝子構造の解析、遺伝子発現調節の解析を行った。ヒトではX染色体に位置し、マウス同様リンパ細胞の増殖に関連する分子であることが示された。α4分子の機能を解析し、この分子が細胞内でタンパク質脱リン酸化酵素PP2Aの触媒ユニットと直接結合する分子であることを示した。その結合ドメイン、リン酸化部位、コンセンサス領域を検討した。免疫抑制剤ラパマイシンに感受性経路のシグナル伝達分子であることが明らかになり、α4分子とPP2A分子との直接の結合が、ラパマイシンによって制御されることも示した。α4/PP2A分子はラパマイシン結合分子からのTor(Target of Rapamycin)の下流に位置するリンパ細胞増殖制御シグナルを伝達する機能分子であることが、示された。免疫制御剤ラパマイシンのリンパ細胞における作用点を明確にしたとともに、新たなリンパ細胞増殖シグナル伝達経路を明示した。現在、この分子の果たす免疫応答における役割について解析を進めている。B細胞初期分化機構解析の目的でマウス胎生期10日の胎児肝臓の時期に選択的に発現している特異的遺伝子のクローニングを行った。特異的遺伝子クローニング法を用いて、胎児肝臓に発現し、成熟マウスの肝臓に発現していないクローンを選別した。次に、種々のリンパ細胞株での発現、成熟マウスのBリンパ細胞、胸腺T細胞での発現を解析した。そして、胎児肝臓特異的、リンパ細胞特異的に発現しているcDNAクローンを単離し、その遺伝子配列を調べ、マウス細胞における発現の特異性を解析した。50万クローンから最終的に200クローンを単離し、そのうちLL7,LL55の2種類の遺伝子が未知の遺伝子であること、そしてリンパ細胞の初期分化ステージで選択的に発現していることを確認した。これらの遺伝子はT細胞、B細胞の両方の系にごく初期に発現して、個体が成熟するにつれてその発現が減少することがわかった。ことに胎児では8日目ではまだ発現が見られず、11日、13日に発現のピークが見られ、17日にはほとんど発現していないことを確認した。これらの遺伝子はリンパ細胞の分化過程でT細胞にもB細胞にも最終的に決定していない時期に特異的に発現していることが示唆された。これらの遺伝子がコードするタンパクはリンパ細胞成熟、分化に重要な機能をはたしていることが考えられる。またこれらの遺伝子発現のメカニズムを解析することによりリンパ細胞分化プロセスの解明につながるものと期待される。B細胞抗原受容体のシグナル伝達とその活性化のメカニズムを明らかにするため、B細胞レセプターシグナル伝達の新規な機能分子の解析を行った。抗原レセプターコンプレックスのIgα(MB-1)に結合するリン酸化蛋白p52をみつけ、この分子をコードするα4遺伝子の構造、発現、機能の解析を進めた。この分子は未熟なステージのB前駆細胞、pre-B細胞、sIgM^+未熟B細胞の時期からすでに発現しており、これらの細胞で未知のリン酸化酵群と強固に結合しているシグナル伝達中継分子である可能性が示唆された。正常休止期のB細胞では通常結合リン酸化活性はほとんど検出できないが、抗原レセプターシグナルによって著しく上昇することを見つけた。また、この酵素活性は細胞周期の回転と密接に関連していることから、このα4遺伝子を介するシグナルがB細胞の増殖に重要な機能をする経路であることが考えられた。さらにα4遺伝子の酵母菌におけるホモローグTAP42はラパマイシン感受性経路で、細胞の栄養刺激から誘導される増殖反応に関与することから、リンパ細胞におけるラパマイシン経路との関連性について詳細な検討をおこなった。その結果、α4遺伝子及びコードする蛋白はリンパ細胞のラパマイシン感受性の経路に関連することが明らかになった。類似した免疫抑制剤サイクロスポリンA,FK506のシグナル伝達経路ではカルシニューリン(phosphatase2B)との結合を阻害することでT細胞シグナル伝達をブロックするが、α4分子はこの経路とは異なるphsophatase2Aを介する経路に関与していることが示唆された。この経路の解析を進め、免疫抑制剤の作用点を同定することが可能となると考えている。

B細胞活性化シグナルの解析を行い、リンパ細胞増殖関連シグナル伝達分子α4の固定、遺伝子解析、およびα4分子のリンパ細胞シグナル伝達分子における役割を解析した。マウスのα4、ヒトのα4分子のcDNA解析、染色体遺伝子構造の解析、遺伝子発現調節の解析を行った。ヒトではX染色体に位置し、マウス同様リンパ細胞の増殖に関連する分子であることが示された。α4分子の機能を解析し、この分子が細胞内でタンパク質脱リン酸化酵素PP2Aの触媒ユニットと直接結合する分子であることを示した。その結合ドメイン、リン酸化部位、コンセンサス領域を検討した。免疫抑制剤ラパマイシンに感受性経路のシグナル伝達分子であることが明らかになり、α4分子とPP2A分子との直接の結合が、ラパマイシンによって制御されることも示した。α4/PP2A分子はラパマイシン結合分子からのTor(Target of Rapamycin)の下流に位置するリンパ細胞増殖制御シグナルを伝達する機能分子であることが、示された。免疫制御剤ラパマイシンのリンパ細胞における作用点を明確にしたとともに、新たなリンパ細胞増殖シグナル伝達経路を明示した。現在、この分子の果たす免疫応答における役割について解析を進めている。
「立体街路」の計画手法に関する研究-住棟内共用空間における行動と空間評価-

本研究は、共用空間に立体街路を取り入れた実験集合住宅NEXT21において、立体街路に対する居住者の意識や行動等を調査・分析し、それらを統合して、集合住宅における立体街路計画のあり方を検討するものである。研究は3つの方法をとる。1つ目は、立体街路を回遊したときに人間の目に入ってくる情報を一眼レフカメラを用い記録し、その写真情報から立体街路における視覚構造と空間構成の関係を考察した。2つ目は、居住者に対するアンケート調査から、立体街路に対する意識と利用の関係について分析を行った。立体街路に対する居住者の印象は、かなり肯定的な結果であった。また、7つの行為に対する質問の回答を類型化すると8つのグループに分かれ、「必要活動型」「任意活動型」「社会活動型」等に意味づけられる。特に「居心地のよい空間」は、任意活動型を示す傾向が強い。3つ目は、ビデオ画像によって得られたNEXT21における立体街路の利用実態から、立体街路上の様々な活動の可能性を検討した。立体街路の天井に配置された5台のCCDカメラによって各階の主要部分の映像をタイムラプスビデオに記録し、活動範囲や経路を各カメラの映像から分析した。外出・帰宅(必要活動)については、経路の選択は、歩行目的・荷物・心理状態などが相互に影響しあいおこなわれているが、必要活動には、早さ・近さ・容易さといった効率が最も重視される。また「NEXT21内の活動」では、自住戸付近の掃除や植栽の手入れ、散歩等の「任意活動」や、立ち話などの他の人々との接触によって生まれる「社会活動」が見られた。立体街路の随所でJ.ゲ-ルのいう「屋外活動」が観察され、立体街路が生活空間として利用されていることがうかがえる。立体街区の計画手法を研究するにあたり、立体街路における人間の行動等を把握するため、前年度は集合住宅地の外部空間における意識行動の調査を行ったが、今年度は実験集合住宅NEXT21(1993年9月竣工、1994年4月入居、16戸)の住棟内共用空間において調査を行った。この集合住宅の特徴は、立体街路を導入した事例であり、公共性・開放性・回遊性・連続性・選択性等の条件を考慮して計画されたものである。この集合住宅で利用実態調査する住居者を対象に、住棟内共用空間に対する意識、及び快適性や使い勝手に対する評価をアンケート調査し、集合住宅の空間構成とアクティビティ及び意識の関係を明らかにした。具体的には、下記の3つの調査を実施した。(1)視覚特性調査この調査では、カメラを用いて立体街路の動線上の画像を記録し、コンピューターにより各視覚的要素ごとの面積比率を算出した。このデータをもとに、立体街路の視覚的要素の連続的変化(シークエンス)を把握した。(2)アンケート調査アンケート調査は、16戸の各住戸の主婦又は世帯主を対象に留置自記法により行った。アンケートの内容に関しては、住戸外である立体街路空間に関する利用・意識・行動に関する質問である。特に調査票で質問した七つの行為を因子分析にかけ考察すると立体街路上の各地点が8つのグループに分類された。必要活動・任意活動・社会活動が行われる場所が空間構成上の特徴とかなり関連性があることがわかった。(3)ビデオ観察調査立体街路上の利用実態を把握するためタイムラプスビデオを用いた観察調査を行っている。今回の調査は、11月22日、23日の2日間に録画を行った。あいにく季節的な影響もあり、活動の量的な分析に耐えるデータは得られなかったが、居住者の利用経路や散歩、遊び等の行動と利用空間の特徴的な例がみられ、意識を裏付ける利用行動の質的な分析を行うことができた。

本年度は下記に挙げる項目を中心に研究を行った。ひとつは昨年から継続的に調査を行っている都市型集合住宅における利用実態調査である。また、設計者側の立場から集合住宅の計画手法を採り、分析・考察を行った。・立体街路空間の利用実態都市部に立地する集合住宅NEXT21におけるビデオカメラによる観察から、居住者の立体街路における利用実態を考察した。一年を通じて特に活発な利用が見られる春季の観測結果を中心に分析を試みた。・立体街路空間の事例分析我が国を代表する集合住宅の設計を行っている3事務所の作品について、住棟内共用空間計画プロセスの変遷をまとめ、設計者側から見た立体街路計画の現状を明らかにした。・立体街路空間を構成する計画手法集合住宅事例の立体街路空間は、道の街路性を構成すると考えられる5つの条件、(1)住戸との結合性、(2)道の公共性、(3)経路の選択性、(4)道の回遊性、(5)道の開放性、のいずれかを実現しようとしており、これらの条件と照らし合わせて立体街路の計画手法の特徴を考察した。本年度は、研究の最終年度にあたり3年間の成果をまとめる方向で研究を進めた。研究は大きく、ビデオカメラを用いた立体街路の利用実態調査、アンケートによる居住者の意識調査、及び、立体街路の空間構成分析を継続的に行ってきた。本年度は、これらの調査・分析はさることながら、これら相互間の関係を考察し、立体街路の計画上の問題点や課題を挙げ、立体街路の計画・設計手法を確立した。(1)立体街路における利用観察・居住者の意識・空間構成による相互分析利用観察とアンケート調査は継続して行ってきたが、これらの調査結果をまとめ、また、空間構成を含めた相互分析を行い、より深い立体街路の特性を考察した。(2)計画手法としての立体街路の課題と展望これまでの分析をふまえ「立体街路」の実現性を高めるため、立体街路の総合的な、設計・計画手法を確立する。
全海洋域におけるタチウオ科タチウオ属魚類の分類学的再検討

全海洋域におけるタチウオ科タチウオ属魚類は,Trichiurus lepturusは、水産学上重要な魚種で、分類学的には多くの異論があったが、FAOのReviewにより全世界にNakamura and Parin(1993)によって1種とされた。その後も多くの異論がだされ、学名が混乱しているため国際間の漁業交渉では紛争の種となっている。申請者は、従来知られていなかった小型類似種群タチウオ属魚類4種を報告し、大型類似種群には、形態学的に区別される概ね10種を確認し、全海洋域におけるタチウオ科タチウオ属魚類の全種数と、その識別法および、正しい学名の検討を明らかにするため、以下のことを実施した。東太平洋および西大西洋におけるタチウオ属魚類の標本が十分ではないので、平成17年度は、現地採集調査および米国・メキシコ等の大学・博物館の所蔵標本の借用に全力を注ぎ、標本を得られた。また、台湾酉部にのみ分布する可能性のある生標本の入手・分析により、東アジアのタチウオ4種の標本を確保し、結果をだした。動物命名規約から、混乱の原因である最も古い名前であるTrichiurs lepturusの種の再検討を行い、再記載に全力をあげたが、命名規約上の難しい問題が有り、Linnneの標本を持つスウェーデンのクーランダ博士と検討を行っている。その後、遺伝学的に実体が明らかになったものから、随時記載・公表してきた。