hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソーシャルメディアの普及・発展と民主主義の変容

選択事例については、2年目に若干の変更をしたものの、3年目に当たる平成27年度は、2年目に行った微修正の方針を踏襲した研究を進めることができており、研究の取りまとめ準備も整いつつあるため。研究最終年度となる本年度は、これまで行ってきた研究の取りまとめ作業を行うと共に、研究を発展させていくための準備作業を行った。本研究の中心課題は、ソーシャルメディアと民主化、ソーシャルメディアと民主主義といったものである。このうち、ソーシャルメディアと民主化という視点からは、主に「アラブの春」を経験した中東地域を中心として考察をはじめ、後に台湾やタイなど、アジア圏の国々のケースも含めながら研究を進めてきた。ソーシャルメディアと民主主義という視点からは、主にヨーロッパ諸国およびアメリカを中心とした考察を行った。とりわけ注目したのは、「アラブの春モデル」とでも言えるような政治的なデモ活動とソーシャルメディアとの関係であり、邦訳も出され日本でも注目されるようになってきた「カウンターデモクラシー」という概念も交えつつ、ソーシャルメディア時代の民主主義についての分析を行った。本研究の2年目以降に取り入れるようになった、「国際環境の構造的な変化(主にエネルギー環境の変化とその影響を中心に)」という要因を考慮に入れつつ、先進諸国の民主主義について概観するならば、引き続きカウンターデモクラシーの動きは見られるであろうこと、関連して台頭しつつあるポピュリズムの動向が、先進民主主義国の民主主義を後退させかねない状況が浮き上がってきた。インターネットを介した政治的な動きとしては、表現の自由、言論の自由、プライバシーの保護といった民主主義的な諸価値が脅かされない状況に対する、対抗運動も確認される。代表的な例は、2000年代後半以降に政治的な活動にも関与するようになった「アノニマス」による各種作戦行動である。これら複数の要因を組み合わせつつ、全体の見取り図を描く作業を取りまとめとして行っている。世界中に普及したソーシャルメディアは、一国の民主化や政治変動に影響を与え得る。同時に、先進民主主義国において、民主主義を変容させる可能性もある。本研究は、ソーシャルメディアと民主化の観点から「アラブの春」を経験した中東およびアジア圏の国々のケースを分析し、民主主義の変容という視点からは、「カウンターデモクラシー」および「ポピュリズム」といった概念を使いながら、ヨーロッパおよびアメリカのケースを取りあげた。研究の結果、ソーシャルメディアは、民主主義にとってマイナスの影響を与え得る状況が明らかとなった。初年度、2年目共に、選択事例については当初予定から若干の変更があったものの、研究遂行に必要な調査およびデータの収集は順調であり、ほぼ計画通りに進んでいると評価できる。
異所性妊娠の鑑別診断に有用な分子マーカーの同定と臨床応用に関する研究

2018年度は、異所性妊娠の術前後の末梢血5サンプルを集積した。患者血漿中におけるmiR-518bを含むchromosome19 microRNA cluster (C19MC)領域内のmicroRNAならびにC14MC領域内のmiR-323-3pの循環量をリアルタイムRT-PCR法を用いて定量した。その結果、miR-518bは正常妊娠と異常妊娠(流産あるいは異所性妊娠)とを区別するマーカーとして有用であることが示唆された。そして、miR-323-3pは流産と異所性妊娠とを区別するマーカーであることが示唆された。miR-518bおよびmiR-323-3pは、いずれも妊娠のバイオマーカーであるhCGとは独立したバイオマーカーであった。とくに、miR-323-3pは異所性妊娠の新たなバイオマーカーとして期待され、C14MC領域内のmicroRNAを含む網羅的解析により、異所性妊娠の新たなバイオマーカーの同定と病態解明の手がかりに迫ることが期待された。本研究の目的である異所性妊娠に特異的なバイオマーカーの同定とその臨床的意義の解明について、miR-323-3pは異所性妊娠の新たなバイオマーカーとして期待されることが明らかになった。今後、C14MC領域内のmicroRNAを含む網羅的解析により、異所性妊娠の新たなバイオマーカーの同定と病態解明の手がかりを得る予定であり、研究計画はおおむね順調に進展している。従来から妊娠管理で用いられている血中hCG値と本研究で開発する異所性妊娠と関連する分子マーカーセットとを用いた異所性妊娠の早期診断法に関する臨床的意義を明らかにする。尿中hCG陽性かつ妊娠初期の経腟超音波で子宮内に胎嚢が確認されなかった妊婦例のうち、血中hCG値および母体血漿中の異所性妊娠と関連するmicroRNA流入量と妊娠転帰(正常妊娠、流産、異所性妊娠)との比較から、従来から妊娠管理で用いられている血中hCG値と本研究で開発する検査法とを組み合わせた妊娠初期の診断管理について検討する。現時点は、第1段階で正常妊娠と異常妊娠とを鑑別し、第2段階で異常妊娠と診断されたもののうち異所性妊娠と流産とを鑑別する診断ストラテジーを想定している。平成29年度は、妊娠初期における母体血漿中胎児・胎盤由来microRNAを同定し、異所性妊娠の検出率が高いマーカーセットを決定した。異所性妊娠18例(異所性妊娠群)および正常妊娠12例(コントロール群)を対象とした。母体血漿中に流入している胎盤特異的microRNA(miR-515-3p、miR-517a、miR-517c、およびmiR-518b)量をreal-time RT-PCR法を用いて定量し、コントロール群の中央値を基準としたmultiple of median(MoM)値として算出した。両群間における流入量を比較検討し、receiver operating characteristic curve(ROC曲線)を用いて異所性妊娠の診断における母体血漿中胎盤特異的microRNAsの精度を評価した。結論:母体血漿中胎盤特異的microRNA流入量は、異所性妊娠の分子マーカーとして有用であると示唆された。当初の予定通り、異所性妊娠の検出率が高いマーカーセットを決定することができた。しかし、妊娠初期の分子マーカーとして血清hCGとは独立した胎児由来microRNAを選定する研究は次年度に実施することになった。平成30年度は、妊娠初期の分子マーカーとして血清hCGとは独立した母体血漿中胎児・胎盤由来microRNAを選定する。そして、母体血漿中における胎児・胎盤由来microRNA流入量の基準値を決定し、異所性妊娠と関連するmicroRNAマーカーセットを用いた診断法の開発を目指す。

尿中hCG陽性かつ妊娠初期の経腟超音波で子宮内に胎嚢が確認されなかった妊婦例のうち、血中hCG値および母体血漿中の異所性妊娠と関連するmicroRNA流入量と妊娠転帰(正常妊娠、流産、異所性妊娠)との比較から、従来から妊娠管理で用いられている血中hCG値と本研究で開発する検査法とを組み合わせた妊娠初期の診断管理について検討する。現時点は、第1段階で正常妊娠と異常妊娠とを鑑別し、第2段階で異常妊娠と診断されたもののうち異所性妊娠と流産とを鑑別する診断ストラテジーを想定している。平成29年度は当初の計画の通り異所性妊娠と関連するマーカーセット(胎盤特異的microRNA:miR-517aおよびmiR-517c)を同定することができた。しかし、胎児由来microRNAの同定についてはH30年度に実施することにしたため、次年度使用額が生じたが、研究計画は概ね順調に進行しており、H30年度に予定通りマイクロアレイ解析で胎児特異的microRNAを同定するため、今回の次年度使用額は適正に使用される。2018年度は、miR-323-3pならびにmiR-518bを用いて、異所性妊娠の鑑別診断法に関する手がかりを得ることが出来たが、網羅的遺伝子解析(マイクロアレイ解析あるいは次世代シークエンス)を行うことが出来なかったので次年度使用額が生じた。2019年度には、当初の計画通り、網羅的遺伝子解析(マイクロアレイ解析あるいは次世代シークエンス)を行う予定であり、次年度使用額は使用される。
遺伝子発現量を指標とした適正リン摂取量決定法に関する研究

血中リン濃度は小児期には高値を示し、加齢とともに低下する。また、低リン血症および高リン血症でも骨障害による成長障害が見られる。このように、リン代謝が成長に関与していることが示唆される。しかし、食事性リンの過剰摂取が成長を障害するかは明らかではない。そこでリン摂取量の成長におよぼす影響についてラットを用いて検討した。Wistar系雄ラット(8週齢)を6群に分け、カルシウム含量を0.6%とし、リン含量を0.02%、。0.3%、0.6%、0.9%、1.2%および1.5%とした食餌をそれぞれ4週間与え実験に用いた。飼育終了前3日間にわたり、カルシウムおよびリンの出納試験を行った。飼育終了時に血中カルシウム、リン、副甲状腺ホルモン(PTH)および1,25ジヒドロキシビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3)濃度を測定し、さらに、腎尿細管刷子縁膜小胞(BBMV)を調製、腎臓よりtoal RNAを精製し、ナトリウム依存性リン(Na/Pi)輸送担体(I型;Npt-1およびII型;NaPi-2)のmRNA発現および蛋白発現について検討した。その結果、1)低リン食(0.02%)および高リン食(1.5%)で成長障害がみられた。2)血中PTHレベルは低リン食(0.02%,0.3%)で低値を、高リン食(1.5%)で高値を示し、1,25(OH)_2D_3濃度は低リン食(0.02%)で高値を示した。3)高リン食(1.5%)で腸管でのカルシウムの吸収は低下した。4)食餌中リン含量の増加に伴い尿中へのリン排泄量は増大し、食餌中リン含量が1.2%および1.5%ではマイナスバランスを示した。5)生体でのリン代謝は主に腎尿細管II型Na/Pi輸送担体の発現により調節されていた。以上のことより、8週齢ラットでは0.6%のカルシウム摂取時には、0.3%から0.9%のリン摂取が適当であると考えられた。腎尿細管に存在するナトリウム依存性リン輸送担体(NaPi)は血中リンレベルの恒常性維持において中心的役割を担っている。すなわち、リン摂取量に応じてNaPi発現は厳密に調節されている。しかし、リン摂取量が適正な閾値を逸脱すると正しく調節されないことが考えられる。したがって、リン摂取量とNaPi遺伝子発現との関係を検討することによって適正リン摂取量を明らかにすることが可能である。そこで、血中リン濃度を調節するラット腎尿細管のナトリウム依存性リン輸送担体(NaPi-2)の発現におよぼす摂取リン量の影響について検討した。0.02%の低リン食でリン輸送活性は増加し、刷子縁膜(BBM)上にNaPi-2蛋白の発現増加が確認された。一方、1.2%の高リン食により急速なリン輸送活性の低下とBBMでのNaPi-2蛋白の減少が見られた。これはNaPi-2がBBMから細胞質へtranslocationした結果であった。高リン食から低リン食に変更して4時間では、NaPi-2mRNAレベルは変化することなく、BBMのNaPi-2蛋白は増加した。これらはサイクロヘキシミドやアクチノマイシンD処理によっても影響は見られなかったが、ミクロチューブの機能を障害するコルヒチン処理で認められなくなった。さらに、副甲状腺を摘出したラットにおいても同様の結果が得られた。したがって、腎NaPi-2の細胞質とBBMの局在は副甲状腺ホルモンを介することなく、血中リンレベルによりtranslocationが調節されている可能性が示唆された。以上より、血中リンレベルの調節はNaPi-2遺伝子の転写レベルでの調節と急速なNaPi-2蛋白のtranslocationにより調節されていることが明らかになった。

2)血中PTHレベルは低リン食(0.02%,0.3%)で低値を、高リン食(1.5%)で高値を示し、1,25(OH)_2D_3濃度は低リン食(0.02%)で高値を示した。3)高リン食(1.5%)で腸管でのカルシウムの吸収は低下した。4)食餌中リン含量の増加に伴い尿中へのリン排泄量は増大し、食餌中リン含量が1.2%および1.5%ではマイナスバランスを示した。5)生体でのリン代謝は主に腎尿細管II型Na/Pi輸送担体の発現により調節されていた。以上のことより、8週齢ラットでは0.6%のカルシウム摂取時には、0.3%から0.9%のリン摂取が適当であると考えられた。
コンテキストアウェア技術を駆使したマルチメディア会議録システムの研究

1.コンテキストアウェア環境の基盤技術の検討と開発組織内の活動で生成されるさまざまな種類のコンテンツを扱うシステムの検討と開発を行った。会議の情報を整理、提示するためには、その組織を構成するメンバやグループの状況を把握する必要がある。そこで、会議参加中や会議外のメンバの状況を、人のコンテキスト情報を駆使して把握する手法を検討した。具体的には、このシステムはICタグやセンサ情報と連携して会議やユーザの状況を認識し、その場で行われた内容やデータを自動的に記録する。また、ユーザに提示すべきデータをコンテキスト情報やアノテーション情報を照らし合わせて自動的に選別する。このシステム内の基礎技術であるグループプレゼンス機能については、パッシブタグを用いたグループプレゼンス自動生成システムのプロトタイプを開発し、その有効性について検証した。また、アクティブタグを用いて、動的なグループの変化を加味したグループプレゼンス情報を自動生成するシステムについても設計した。2.会議発言録における協調記録に関する研究協調型テキスト発言録システムCollabMinutesの研究については、過去2年間における運用について評価を行った。その結果、記録された内容は量的な向上だけでなく質的向上も確認することが出来、発言者名を記録する手法に関しても4割以上の労力の削減が出来た。その上、発言を記録するスピードが話すスピードに追いついており、このことに伴い発言録としての記録情報量が多くなったことが分かった。3.会議内の参加者によるアノテーション収集と活用に関する研究プレゼンテーション発表時のコメント収集に焦点をあてたアノテーションシステムCollabStickyの研究では、人々が本を読む際に目印をつけたりメモをしたりするために付箋を貼るという行為に着目し、プレゼンテーション中にスライドの中にコメントを貼り付けるシステムを検討し、プロトタイプを開発した。プロトタイプによる実験では、それまでの典型的な意見収集システムであるチャット系のシステムに比べ、格段に多くのコメントを収集することが可能にすることを確認した。4.組織内blogに関するエントリ自動提示システムにおける研究組織内の非同期システムとして組織内blogを扱った研究に関しては、ユーザの動的な興味に対応したエントリ提示システムの検討と開発を行った。このシステムでは、興味ごとの特徴にあった興味判断をすることができる。本研究の中では、人の持つ興味を長期的な興味と一時的な興味というように分類し、興味ごとの特徴に合った興味判断をすることを可能にした。今年度は、コンテキストアウェア技術を駆使したマルチメディア会議録システムの実現をするために、以下の4点に焦点を当てて取り組んだ。1.マルチメディア会議録システムの拡張これまでに検討・開発してきたマルチメディア会議録システムを、研究室のゼミにおいて発言を協調記録するシステムとして評価を行い、複数人で分散協調し、有効に発言録の記録が出来ることを確認した。また、プレゼンテーション発表に対して本システムを用いると、参加者の中に潜在的に存在している疑問や意見を引き出すことができることを確認した。2.グループプレゼンス情報に関する研究会議において会議の状況や、参加者の状況を把握するための技術として、本年度はコンテキスト情報を用いた動的なグループと、グループブレゼンス情報の自動生成手法について検討を行った。

このシステムについては、ICタグを用いたWebアプリケーションとして設計・開発を行い、研究室のゼミを対象とした評価実験により有効性を検証できた。3.パーソナライズドアーキテクチャに関する研究ユーザが安全にサービス提供側に対し平等で柔軟にユーザ情報をパーソナライゼーションに利用可能とするパーソナライズドアーキテクチャを提案し、プロトタイプによる検証実験を行った。その結果、提案したパーソナライゼーション手法がユーザの望む検索結果と再現率を向上させることを確認できた。この技術は、本システムのコンテキストアウェア技術の利用基盤の一部として用いる。4.コンテキスト情報を利用したイベントレコメンデーションシステムの研究コンテキストアウェアシステムの一つとして、大学祭でイベントレコメンデーションを行うシステムの検討と実運用を行った。その結果、イベントコンテキストであるリアルタイム画像等を提示することにより、ユーザの行動に影響を与えるレコメンデーション補助が出来ることを確認できた。1.コンテキストアウェア環境の基盤技術の検討と開発組織内の活動で生成されるさまざまな種類のコンテンツを扱うシステムの検討と開発を行った。会議の情報を整理、提示するためには、その組織を構成するメンバやグループの状況を把握する必要がある。そこで、会議参加中や会議外のメンバの状況を、人のコンテキスト情報を駆使して把握する手法を検討した。具体的には、このシステムはICタグやセンサ情報と連携して会議やユーザの状況を認識し、その場で行われた内容やデータを自動的に記録する。また、ユーザに提示すべきデータをコンテキスト情報やアノテーション情報を照らし合わせて自動的に選別する。このシステム内の基礎技術であるグループプレゼンス機能については、パッシブタグを用いたグループプレゼンス自動生成システムのプロトタイプを開発し、その有効性について検証した。また、アクティブタグを用いて、動的なグループの変化を加味したグループプレゼンス情報を自動生成するシステムについても設計した。2.会議発言録における協調記録に関する研究協調型テキスト発言録システムCollabMinutesの研究については、過去2年間における運用について評価を行った。その結果、記録された内容は量的な向上だけでなく質的向上も確認することが出来、発言者名を記録する手法に関しても4割以上の労力の削減が出来た。その上、発言を記録するスピードが話すスピードに追いついており、このことに伴い発言録としての記録情報量が多くなったことが分かった。
ES細胞のにおけるOct-3/4の機能制御因子の探索

マウスES細胞はLIF存在下で自己複製する。その自己複製には、STAT3の活性化及びOct-3/4の発現が必須である。本研究ではES細胞の自己複製の分子機構を解明する目的で、Oct-3/4と結合する因子をyeast two-hybrid法により検索した。その結果、Oct-3/4と結合する因子として核内ホルモン受容体に属する転写因子DAX-1を得た。この両者の結合は共免疫沈降法からも確認された。またDAX-1の発現がLIFにより維持されることから、その下流の転写因子であるSTAT3とOct-3/4のどちらで制御されているか検討した。まず、STAT3のドミナントネガティブ変異体をES細胞に過剰発現させると、DAX-1 mRNAの発現量が減少した。またSTAT3ER ES細胞株で4HT除去によるSTAT3の不活性化によっても発現量が減少した。次にテトラサイクリン(Tet)の添加によりOct-3/4の発現が停止するZHBTc4 ES細胞株では、Tet添加によりDAX-1 mRNAの発現は速やかに停止し、その後Tetを除去し再びOct-3/4の発現を回復させるとDAX-1の発現も回復することを見出した。これはDAX-1の遺伝子発現が、STAT3とOct-3/4の両者により調節されていることを示唆している。このことより、2つの転写因子の下流に存在するDAX-1が、自己複製に重要な役割を担っている可能性が考えられる。ES細胞の自己複製の分子機構を解明するため、これまでにDNA chip解析から分化に伴って発現量が減少する遺伝子としてZfp57を得て、その未分化特異的な発現をノーザン及びウエスタンブロット解析で確認している。本研究では、Zfp57がLIFの下流に存在する2つの転写因子、STAT3とOct-3/4のうちどちらの下流であるかを検討した。STAT3のドミナントネガティブ変異体をES細胞に過剰発現させると、Zfp57 mRNAの発現量が減少した。一方、テトラサイクリンの添加によりOct-3/4の発現調節が可能なES細胞株を用い、Oct-3/4の発現を停止させても、Zfp57 mRNAの発現量に変化は認められなかった。これらの結果はZfp57がSTAT3の下流遺伝子であり、Oct-3/4のそれではないことを示す。一方我々は、Zfp57とOct-3/4が互いに相互作用することを既に見出し、さらにOct-3/4の標的遺伝子Rex-1のプロモーター上にあるOct-3/4結合配列を用いたレポーターアッセイからOct-3/4の転写活性化能がZfp57によって亢進されることを確認している。これらのことから、Zfp57はSTAT3の下流でOct-3/4と協同的にES細胞の自己複製に関与していると考えられる。現在、Zfp57欠損ES細胞を作成して、ES細胞の自己複製におけるZfp57の役割を検討している。
第二次性徴に合わせた配偶子形成開始機構の解明

昨年度までに、長さ数ミリの幼魚から生殖腺を単離する方法と、分解酵素の種類と作用時間を変えるなどの条件検討を行い、単離生殖腺からの細胞の解離を行った。そしてセルソーターの分離条件とプレート上への分取方法を検討し、最終的に384プレート上に細胞をひとつずつ、もしくは数個ずつ、生殖腺から解離した細胞を分取できることを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて確認した。さらにそこからseq2法の条件を検討しつつ、一細胞トランスクリプトームのためのライブラリー作製した。ライブラリーはバイオアナライザー等を用いて評価を行い、ライブラリー作製に十分の質を保つと判定されたライブラリーについて予備的に次世代シークエンサーにより解析した。その結果、かなりの確率で目的とする細胞で発現しているマーカーが確認できた。またゲノムマッピングも行い、今回新規に構築したアノーテーションファイルを用いて、アノテーションされたゲノム領域へIVGを通じてマッピングも確認された。このライブラリーを変異体と野生型メダカ幼魚生殖腺、第二次性徴直前の野生型メダカ生殖腺(体長サイズにより分類)から作製してトランスクリプトームデータを得、現在その評価をゲノムマッピングなどにより行っている。その結果、IVGとqPCRも併用して、DEGとなりうる候補遺伝子を得つつある。さらには、現在、第二次性徴直前の野生型メダカ生殖腺のマーカーとなりうる遺伝子を既存の論文や生殖腺、幹細胞の発生シグナルを参考にして、in situ hybridizationにより確認する実験を開始している。ライブラリーの評価とマーカーとなる遺伝子のスクリーニングも着実に進みつつある。いよいよDEGに向けて候補遺伝子のスクリーニングに入れることから、進捗状況は概ね良好と判断している。現在進行中のqPCRによるDEGの評価を行う。そのためのポジティブコントロールを、哺乳類での幹細胞ニッチで発現する遺伝子や成体で生殖周期を制御する遺伝子に着目して単離を行う。ここでスクリーニングされた遺伝子はさらにin situ hybridizationによるスクリーニングに供する。GO termなどのアノーテーション情報も考慮し候補遺伝子を絞り込む。候補遺伝子のガイドRNAを作製し、ゲノム編集技術による変異体作製を行う。変異体の表現型解析は共焦点レーザー顕微鏡を用いた固定組織と単離生殖腺を用いたライブイメージングにより行う。このDEGから得られた候補遺伝子が第二次性徴を抑制している因子であれば、その変異体メダカのオスにおける表現型は、早期の精子形成が見られることが期待される。候補遺伝子変異が致死性の場合は、当研究室ですでに確立されているキメラメダカや皮下移植の技術により、致死性を回避して、その遺伝子の生殖腺における機能を解析することになる。多くの脊椎動物において配偶子形成は第二次性徴と共に開始する。ところがどのようにしてこの時期に配偶子形成が開始するのかは大きな謎であった。申請者は生殖細胞の性決定を調べる過程で、生殖細胞は第二次性徴以前にすでに精子形成可能な状態になっていること、第二次性徴と精子形成開始の機構は区別されうるもので生殖腺の支持細胞が第二次性徴と精子形成開始とのタイミングを合わせていること、そこでは支持細胞と生殖細胞の性の一致が重要であることを見出した。さらに申請者はこの支持細胞で精子形成開始を抑制している遺伝子を見出した。これらの知見をもとに突然変異体を解析し、第二次性徴期にどのように精子形成が開始するのか、今まで解析されることのなかった生殖腺側からその分子機構を明らかにすることを目的とする。我々が見出している因子とfoxl3が機能しない二重変異体では、この因子による制御がかからず、支持細胞からのシグナルが送られないため精子形成開始の抑制機構が働かない。生殖細胞側もfoxl3機能欠損のために精子形成が直ちに可能な状態になっているため、雄の幼魚のうちから精子形成が開始されてしまう。そこで正常雄と二重変異体雄(あるいは因子の単一変異体)の支持細胞をセルソーターで単離し、次世代シークエンサーにより発現遺伝子の網羅的解析を行う第二次性徴開始前の因子を発現する支持細胞と、第二次性徴後の支持細胞をセルソーターで単離し、抑制シグナルを解除するシグナル同定するためにRNAの網羅的解析を行う。正常雄と二重変異体雄(あるいは因子の単一変異体)の支持細胞の発現遺伝子の網羅的解析を行うために、二重変異体を支持細胞と生殖細胞が蛍光を発するトランスジェニックメダカと交配してその幼魚を性タイピングして大量に得た。ここからを蛍光細胞を酵素的に解離し、セルソーターで単離する条件検討を行った。さらに次世代シークエンサーに供するライブラリー作成を行った。また因子を発現させるためのベクター作成を行った。研究のための基盤作りは着実に進んでいるため、概ね順調に推移していると判断できる。孵化後20日の幼魚の生殖腺から蛍光を発する細胞をセルソーターで単離することが可能となった。この単離細胞の純度はきわめてよかった。一方で、孵化後10日の生殖腺から蛍光を発する細胞を単離しその純度を検定したところ、90%以上の純度で細胞を単離可能となった。細胞解離の条件等はほぼ確立されたと判定される。しかしこの時期の生殖腺はきわめて小さく生殖腺以外の細胞の混入が認められた。この混入を防ぐために次の方法を用いたトランスクリプトームの解析に着手した。1:生殖腺のみに蛍光を発するトランスジェニックメダカの作製、2:一細胞(シングルセル)のトランスクリプトームの解析。これらを孵化後20日の幼魚にも適応して研究を行うこととした。

昨年度単離した蛍光を発する細胞の純度を検定したところ、生殖腺以外の細胞の混入が認められた。これは生殖腺を単離してから細胞をセルソーターで分取したものの、単離の際に体腔上皮や脊索などの生殖腺以外の細胞にも蛍光を発する細胞が存在するため、それらが混入したものと考えられた。そこで、1:生殖腺のみに蛍光を発するトランスジェニックメダカの作製、2:一細胞(シングルセル)のトランスクリプトームの解析、に切り替えて研究を行うこととした。1の方法は、セルソーターにおける細胞混入を防ぐため、2の方法は、多少の細胞の混入があっても、一細胞のトランスクリプトームを複数回行ってその発現を解析することにより、混入細胞をデータセットから除くことができるからである。現在トランスジェニックの作製を行っており、一細胞単離のプロトコールを確立しつつある。方法の変更が行われたがそれは研究過程を生じる通常のことであり、今回は方策や解決法もはっきりしているため全体としては順調に推移していると判断する。昨年度までに、長さ数ミリの幼魚から生殖腺を単離する方法と、分解酵素の種類と作用時間を変えるなどの条件検討を行い、単離生殖腺からの細胞の解離を行った。そしてセルソーターの分離条件とプレート上への分取方法を検討し、最終的に384プレート上に細胞をひとつずつ、もしくは数個ずつ、生殖腺から解離した細胞を分取できることを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて確認した。さらにそこからseq2法の条件を検討しつつ、一細胞トランスクリプトームのためのライブラリー作製した。ライブラリーはバイオアナライザー等を用いて評価を行い、ライブラリー作製に十分の質を保つと判定されたライブラリーについて予備的に次世代シークエンサーにより解析した。その結果、かなりの確率で目的とする細胞で発現しているマーカーが確認できた。またゲノムマッピングも行い、今回新規に構築したアノーテーションファイルを用いて、アノテーションされたゲノム領域へIVGを通じてマッピングも確認された。このライブラリーを変異体と野生型メダカ幼魚生殖腺、第二次性徴直前の野生型メダカ生殖腺(体長サイズにより分類)から作製してトランスクリプトームデータを得、現在その評価をゲノムマッピングなどにより行っている。その結果、IVGとqPCRも併用して、DEGとなりうる候補遺伝子を得つつある。さらには、現在、第二次性徴直前の野生型メダカ生殖腺のマーカーとなりうる遺伝子を既存の論文や生殖腺、幹細胞の発生シグナルを参考にして、in situ hybridizationにより確認する実験を開始している。ライブラリーの評価とマーカーとなる遺伝子のスクリーニングも着実に進みつつある。いよいよDEGに向けて候補遺伝子のスクリーニングに入れることから、進捗状況は概ね良好と判断している。ライブラリーの質の検定をバイオアナライザー等を用いて行う。一定水準の質が確認された時点で、次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子解析を行う。そのデータを用いて、バイオインフォマティクスを専門とする連携研究者と共同で正常雄と二重変異体雄(あるいは因子の単一変異体)の発現差の解析を行う。
水溶液中におけるDNAクラスター損傷生成機構の研究

本研究の目的は我々の予測,、即ち「水溶液中DNA分子において二本鎖切断は、エネルギー付与後の短時間かつ局所的に生成する領域で主に生成する」を確認するために、この領域の生成割合を変化させて、水溶液中のプラスミドDNAおよび細胞DNAに生成する一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率の比を調べることである。平成10年度は、細胞内を模擬するために比較的高濃度のラジカルスカベンジャー存在下で、照射X線エネルギーを変えて一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率を測定した。我々の仮説からの予測では、局所的に高密度でラジカル存在する領域で主に生成する二本鎖切断はスカベンジャーによってあまり押さえられないと推測された。実験の結果、予測通り、2.147keV、10keVのどちらのエネルギーでも二重鎖切断の方が押さえられなかった。平成11年度は(a)光子吸収当たりに生成するラジカル数がもっとも少ない真空紫外線領域での鎖切断の生成効率、および(b)パルスフィールド電気泳動法を用いて実際の細胞中での鎖切断効率の直接的測定法の開発と、それによって得られた結果を濃厚水溶液系と比較する、という目標で研究を行った。その結果、真空紫外領域では、水が光子を吸収し始めるのに対応して一本鎖切断と二本鎖切断の生成がみられたが、そのエネルギー依存性は異なっていた。また、パルスフィールド電気泳動装置を用いた実験では、直接DNA鎖切断が定量出来ることが判った。プラスミドDNAの実験と比べられるような精度のよい結果が得られるような泳動条件を検討している所である。本研究の目的は我々の予測,即ち「水溶液中DNA分子において二本鎖切断は、エネルギー付与後の短時間にかつ局所的に生成する領域で主に生成する」を確認するために、単色放射光を用いて広いエネルギー範囲で光子エネルギーを変えることによってこの領域の生成割合を変化させて、水溶液中のプラスミドDNAおよび細胞DNAに生成する一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率の比を調べることである。今年度は計画通りにプラスミドDNAを主な試料として照射実験を行い、二本鎖切断と一本鎖切断の生成比率に関するデータを蓄積した。照射実験は実験ステーションBL-27Aおよび27Bにおいて、210keV領域の単色軟X線を用いた。細胞内は多くの生体分子が溶けた濃厚水溶液状態と考えられ、放射線によって生成したラジカルは効率良くスカベンジされてしまうと考えられる。そこで細胞内を模擬するために比較的高濃度のラジカルスカベンジャー存在下で、照射X線エネルギーを変えて一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率を測定した。我々の仮説からの予測では、局所的に高密度でラジカルが存在する領域で主に生成する二本鎖切断はスカベンジャーによってあまり押さえられないのに対して、拡散してきた希薄なラジカルがDNAと反応して生成する一本鎖切断はより押さえられると推測された。実験の結果、予測通り、2.147keV.10keVのどちらのエネルギーでも二重鎖切断の方が押さえられなかった。しかし同じ鎖切断でのスカベンジャーによる抑制比率のエネルギー依存性を比較すると、低エネルギーの2.147keVの方が良く押さえられることが明らかになった。これらの結果は1999年7月に開かれる第11回国際放射線研究会議での招待講演で報告される。本研究の目的は我々の予測,「水溶液中DNA分子において二本鎖切断は、エネルギー付与後の短時間にかつ局所的に生成する領域で主に生成する」を確認するために、単色放射光を用いて広いエネルギー範囲で光子エネルギーを変えることによってこの領域の生成割合を変化させて、水溶液中のプラスミドDNAおよび細胞DNAに生成する一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率の比を調べることである。昨年度はプラスミドDNAを主な試料として、210keV領域の単色軟X線を用いて照射実験を行った。細胞内を模擬するために比較的高濃度のラジカルスカベンジャー存在下で、照射X線エネルギーを変えて一本鎖切断と二本鎖切断の生成効率を測定した。

実験の結果、予測通り、2.147keV、10keVのどちらのエネルギーでも二重鎖切断の方が押さえられなかった。今年度は(a)光子吸収当たりに生成するラジカル数がもっとも少ない真空紫外線領域での鎖切断の生成効率、および(b)パルスフィールド電気泳動法を用いて実際の細胞中での鎖切断効率の直接的測定法の開発と、それによって得られた結果を濃厚水溶液系と比較する、という目標で研究を行った。その結果、真空紫外領域では、水が光子を吸収し始めるのに対応して一本鎖切断と二本鎖切断の生成がみられたが、そのエネルギー依存性は異なっていた。似たような光子エネルギー依存性を示Fricke線量計の場合と併せてこれらの原因を検討している。また、パルスフィールド電気泳動装置を用いた実験では、直接DNAの鎖切断が定量出来ることが判った。プラスミドDNAの実験と比べられるような精度よい結果が得られるような泳動条件を検討している所である。
画像計測と仮想現実感による歴史文化出土品の復元

古墳から出土された歴史的遺物の中で,文化的,芸術的評価の高いものの修復と復元は,古い時代の生活様式の解明と多種類文化の研究,そして、メディアによる一般公開において重要な過程である.破損された文化出土品の復元は,今まで専門家の豊富な経験と多大な労働に頼ってきた.複雑な出土品を復元するには,空間想像力と判断力を要する.復元の過程を部品の欠落した立体ジグソパズルの組み立てと例えば,その難しさが想像できる.一方,画像処理技術の発展と仮想現実感の誕生は,コンピューターが考古学における出土品復元の作業を支援する可能性を与えてくれた.本研究の目的は,コンピューターによる出土品の復元である.破片の形状データーをコンピューターへ入力し,その中で仮想的に破片の接続を行い,復元後の様子を作り出す.その正確な結果を参照し,本物の破片接着を行う.その効果として,まず,破片の組み立て計画立案がコンピューターの中で行える.そして,仮想空間の無重力環境下で立体像を復元する作業には,力が不必要で,破片や復元品を自由に動かせる.破片を粘着しなくてもに全体の復元された様子が分かり,復元過程が進められる.さらに,復元された対象に対してコンピューターの中で出土品の色をマッピングし,退色した遺品の古い時代の輝きを再現できる.コンピューターの中で復元した様子が生成できるので,マルチメディアによる文化遺品の展示の面でも非常に意味がある。本研究は三つの部分からなる.まず,光切断方による出土破片の形状獲得と画像による表面模様の獲得である.次に,計測で得られた破片情報をグラフィックスデーターに直し,仮想空間内で表現する.そして,マウスや磁気センサーを利用したインターフェースを通じて出土の破片を仮想空間内で組み立て,出土品の本来の様子を復元する.現段階ではこの復元作業を手動で行うが,将来半自動の処理について研究する予定である.古墳から出土された歴史的遺物の中で,文化的,芸術的評価の高いものの修復と復元は,古い時代の生活様式の解明と多種類文化の研究,そして、メディアによる一般公開において重要な過程である.破損された文化出土品の復元は,今まで専門家の豊富な経験と多大な労働に頼ってきた.複雑な出土品を復元するには,空間想像力と判断力を要する.復元の過程を部品の欠落した立体ジグソパズルの組み立てと例えば,その難しさが想像できる.一方,画像処理技術の発展と仮想現実感の誕生は,コンピューターが考古学における出土品復元の作業を支援する可能性を与えてくれた.本研究の目的は,コンピューターによる出土品の復元である.破片の形状データーをコンピューターへ入力し,その中で仮想的に破片の接続を行い,復元後の様子を作り出す.その正確な結果を参照し,本物の破片接着を行う.その効果として,まず,破片の組み立て計画立案がコンピューターの中で行える.そして,仮想空間の無重力環境下で立体像を復元する作業には,力が不必要で,破片や復元品を自由に動かせる.破片を粘着しなくてもに全体の復元された様子が分かり,復元過程が進められる.さらに,復元された対象に対してコンピューターの中で出土品の色をマッピングし,退色した遺品の古い時代の輝きを再現できる.コンピューターの中で復元した様子が生成できるので,マルチメディアによる文化遺品の展示の面でも非常に意味がある。本研究は三つの部分からなる.まず,光切断方による出土破片の形状獲得と画像による表面模様の獲得である.次に,計測で得られた破片情報をグラフィックスデーターに直し,仮想空間内で表現する.そして,マウスや磁気センサーを利用したインターフェースを通じて出土の破片を仮想空間内で組み立て,出土品の本来の様子を復元する.現段階ではこの復元作業を手動で行うが,将来半自動の処理について研究する予定である.
温熱耐性克服のための基礎研究

1.ヒトHsp40遺伝子の構造および発現調節機構を明らかにした。転写開始点はATG翻訳開始コドンから47bp上流にあった。プロモーター解析の結果、熱ショックによるHsp40の誘導は、8つの連続した(A/G)GAANモチーフからなる熱ショックエレメント(HSE,heat shock element)に依存することが示された。このHSEに熱ショック転写因子であるHSF(heat shock factor)1が結合することも判明した。なお、第一イントロンにもHSE様の配列が存在しているが、これは熱ショック応答には関与していないことがわかった。このようなことからHsp40は真の熱ショック蛋白質であることが証明された。2.熱ショック蛋白質(Hsp)の温熱耐性における役割を直接的に証明するためには、特定のHspを条件的に高発現または発現抑制させる実験系が有効である。その1つにTet-on遺伝子発現系がある。まずHeLa細胞にpTet-onプラスミドを導入した。得られたTet-on HeLa細胞に、哺乳動物のDnaJ(Hsp40)相同体のひとつであるHSDJcDNAをpTREヴェクターに組み込んだプラスミドを導入して、doxycycline添加でHSDJを高発現する細胞株を得た。HSDJの発現はdoxycycline濃度依存的であり、約3倍の誘導がみられた。今後このほかに、Hsp70やHsp40についても条件的に高発現または発現抑制する細胞株を単離し、これらの細胞株を用いて各Hspの温熱耐性における役割を解析していく。
p53のユビキチンリガーゼMDM2の活性制御機構

p53のユビキチンリガーゼであるMDM2と類似構造を持つMDMXがMDM2のユビキチン化系になんらかの影響を与えることが考えられてきた。さらに近年、ユビキチン様タンパク質の一つSUMOによりp53や各種転写因子が翻訳後修飾されることが示され、p53のSUMO化は転写抑制に働くと示唆された。しかしながらSUMO化のp53の転写活性化への影響については未だ明確な回答が得られていない。本研究ではMDM2がRBタンパク質に対してもユビキチンリガーゼとして作用するのかどうか、またそれにMDMXがどのように寄与するのかについて検討するとともにSUMO化修飾の役割を詳細に解明することを目的とした。SUMO化の転写因子に対する作用を明らかにする目的で軟骨細胞転写因子SOX9へのSUMO化の影響も研究した。1、MDM2によるRBタンパク質のユビキチン化:癌抑制遺伝子産物RBタンパク質はMDM2によりユビキチン化されることならびにMDMXはその作用を増強することを明らかにした。2、PIAS1によるp53の転写活性増大:PIAS1はp53あるいはp53類似転写因子p63の転写活性を増加させた。しかしこの転写活性の増大はSUMO化されないp53においても同様に認められたことからこの活性化においてはPIAS1はp53のSUMO-E3として作用しているのではないことが確認された。3、SOX9のPIAS1による安定化:p53と同様にSUMO化される転写活性化因子SOX9もPIAS1によって転写活性化が増大することが認められた。SOX9はPIAS1と結合し、しかもSOX9は単独では非常に不安定であるが、PIAS1と共発現すると安定化することが明らかとなり、PIAS1はこの安定化機構によってSOX9の活性を増大しているものと考えられた。癌抑制遺伝子産物p53をユビキチン化しプロテオソームによる分解に導く癌遺伝子産物MDM2の活性制御機構を明らかにすることを目的とした。今年度の研究では癌抑制遺伝子産物Rbタンパク質がこのMDM2の新たな基質となりユビキチン化されるかどうかを検討した。その結果、in vitroならびにintact細胞いずれにおいてもE2としてUbcH5存在下Rbタンパク質はMDM2によってユビキチン化された。このことは細胞周期を制御するp53、Rb,二つの癌抑制遺伝子産物いずれもMDM2によってユビキチン化され、分解されることが示唆され、これはMDM2の細胞周期制御における重要性をさらに明らかにすることとなった。一方MDM2のホモログであるMDMXの作用がこれまで明らかとされていなかった、今回MDMXはMDM2に作用することによりそのユビキチンリガーゼ活性を上昇させることが明らかとなった。一方基質であるp53の翻訳後修飾、スモ化とp53のユビキチン化の関係を調べた結果、スモ化されたp53も非スモ化p53と同様にユビキチン化されたことからp53の場合、スモ化はユビキチン化反応に影響しないように思われた。そこでp53のスモ化の役割を明らかにするためにスモ化p53の大量精製系の確立を試みた。その結果GST-p53を大腸菌システムでスモ化した後、数本のカラムクロマトにより精製できるようになった。次年度はこのスモ化p53の性質を明らかにしたい。
撥水性ナノ薄膜の創製とカバーガラスフリー生体深部イメージングへの応用展開

顕微鏡によるイメージング技術は時々刻々と進化しており、生命現象をライブで可視化しありのままの情報を得る必要不可欠な観察法である。しかし、カバーガラスを介して生体組織を可視化するのが常套手段であるため、組織とカバーガラスの屈折率の相違による球面収差の課題に直面する。他方、厚みをナノ寸法に制御したナノ透明薄膜は、ナノ厚特有の高接着性が発現し、接着剤なしで生体組織に貼付できるユニークな性質をもつ。本研究では、組織の乾燥を防ぎかつ水とほぼ同じ屈折率をもつ撥水性ナノ薄膜を創製し、カバーガラスフリーの生体深部イメージング法を提唱する。従来のカバーガラスを使用する固定観念を払拭し、工学的見地から球面収差の解消と対物レンズの作動距離の向上を狙う「生体深部イメージング用アクセサリ」を開発して、組織環境の理解、その機能解明に迫る。フッ素系樹脂からなる撥水性ナノ薄膜を創製した。具体的には、シリコン基板上に水溶性犠牲層を形成させ、フッ素系樹脂溶液をスピンコートした。得られた基板を純水に浸漬させたところ、犠牲層が溶解して撥水性ナノ薄膜を回収した。また、シランカップリング法にて、撥水性ナノ薄膜の表面改質法も確立した。次いで、細胞に蛍光タンパク質を発現させた生体組織のイメージングを行った。その結果、ナノ薄膜を介してイメージングした場合、カバーガラスを介す従来法と比較して、深部まで観察可能となり、作動距離が劇的に向上することを実証した。今年度は、撥水性ナノ薄膜の創製法、ならびにその表面改質法を確立した。ナノ薄膜を介したイメージング法を提案し、生体組織をより深部まで可視化できることを実証した。したがって、本年度の研究目標は計画通りに達成され、おおむね順調に進展していると判断した。最終年度は、屈折率やユーザビリティーを鑑みたナノ薄膜のプロトタイプを完成させ、カバーガラスフリー生体深部イメージング法を世に発信する。
高次脳機能障害を有する外傷性脳損傷者に対する長時間作業時の注意力変化

高次脳機能障害を有する外傷性脳損傷者において長時間作業を継続することは復職において重要の因子である。そこで約21分の聴覚Odd-ball課題を若年健常者14名、外傷性脳損傷者11名に行った。反応時間は若年健常者、外傷性脳損傷者共に時間経過において延長を認めたが、有意差はなかった。一方、若年健常者においてP300潜時が前期と中期間、前期と後期間で有意な延長を認めた。P300振幅では、Fz、Czで前期と中期間、前期と後期間で有意な低下を認めた。外傷性脳損傷者においては、P300の潜時、振幅ともに有意な変化は認めなかった。このことは、健常者では長時間の作業において、時間経過とともに注意力低下を認めるが、外傷性脳損傷では課題遂行するために注意力を持続していることが示唆された。外傷性脳損傷者が復職に至らない、または復職できたとしても続かない1つの要因として、長時間作業時の疲労に伴う注意力低下があげられる。現在、用いられているsustained attentionの評価としては、sustained attention to response taskまたはcontinuous performance taskがあるが、いずれも評価時間が約10分程度と短い。そこで約20分の聴覚Odd-ball課題を用い、施行中の標的刺激が150回で、各50回で前・中・後に分けて時間経過でのP300の変化を検討した。併せて、注意障害評価を目的とした神経心理学的検査を施行した。健常者15名、患者5名の検査を行った。患者群はまだ症例数が少なく、詳細な解析を行っていない。健常者のうち解析可能なデータ9名について検討した。P300潜時は前351.9±25.8ms、中360.8±28.0ms、後361.7±35.6ms、振幅は前19.7±5.2μV、中18.7±7.9μV、後15.1±6.8μVであった。課題の時間経過において、P300潜時の延長、振幅の低下を認めるが、統計学的に有意ではなかった。P300振幅によるマッピングの結果は課題の前と後を比較して、前頭葉から頭頂葉正中部を中心に前と後において有意な変化を認めた。このことは以前のFunctional MRIを用いた報告と同様に前帯状回での変化を示唆しているものと考える。本年度は健常者5名、外傷性脳損傷者6名の被検者に対して検査を行い、昨年度の被検者とあわせて、健常者14名、外傷性脳損傷者11名について検討した。健常者群では、P300潜時は前348.9±21.5ms、中364.7±24.0ms、後371.3±36.0ms、振幅は前18.4±5.2μV、中17.2±6.8μV、後16.1±6.5μVであった。P300潜時において前期と中期、前期と後期で有意差を認めたが、P300振幅は各期において有意差を認めなかった。外傷性脳損傷者群では、P300潜時は前380.0±26.3ms、中394.6±26.4ms、後399.2±31.9ms、振幅は前11.7±3.7μV、中10.2±3.7μV、後11.0±5.7μVであった。P300潜時・振幅共に各2期において有意差を認めなかった。この結果から、健常者では時間経過と共に注意力の低下が示唆された。一方で、高次脳機能障害者は、時間経過での注意力の低下は認めるが、健常者よりも注意力を持続していることが示唆された。このことは、高次脳機能障害者の易疲労との関連があるものと考えた。
新規酸化SOD1特異抗体を用いたALS発症機構の解明

Cu/Zn-スーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn-SOD、以下SOD1)は生体にとって有害なスーパーオキシドを酸素と過酸化水素に変換する酵素で、酸化ストレスから生体を守る役割を果たしている。本酵素のCys111残基のSH基がスルフォン酸(SO_3H)にまで酸化されることを質量解析で同定した。さらにCys111のSH基がスルフォン酸(SO_3H)に酸化された酸化型SOD1を特異的に認識する抗体がALSモデルマウス脊髄の封入体と空胞の縁を特異的に染色することを見いだした。これはALSの病態において酸化ストレスおよび酸化型SOD1が関与していることを示唆するものである。本酵素の変異体が家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)の原因になることが明らかになっているが、その発症機構はまだ解明されていない。その生成物である過酸化水素でSOD1自身が酸化されて凝集化が起こること、野性型SOD1でも酸化されると変異SOD1と同じような毒性を持つようになることが示唆され始めてきた。Cys111はタンパク質分子の外側にあるGreek key loop内に存在し、特に反応性が高いと予想される。Cys111が他のアミノ酸残基よりも速く酸化されること、SH基がスルフィン酸(SO_2H)さらにはスルフォン酸(SO_3H)になることをMALDI-TOF-MSおよびLC-ESI-MSMSで同定した。Cysll1が酸化されたSOD1サブユニットのバンドはSDS-PAGEで少し上にシフトすること、Cys111に2-MEが結合した2-ME-SOD1ではCys111の酸化が起こらず2次元電気泳動で見られる数多くのチャージアイソマー生成が抑えられることを明らかにした。さらにCys111がスルフォン酸(SO_3H)になった酸化型SOD1を特異的に認識する抗体の作製に成功し、ALSモデルマウスの脊髄の封入体と空胞の縁を特異的に染色することを見いだした。CyslllはSOD1ダイマーが向き合うGreek keyloop内に存在する。Cyslllが他のアミノ酸残基よりも速く酸化されること、SH基がスルフィン酸(SO_2H)さらにはスルフォン酸(SO_3H)になることをMALDI-TOF-MSおよびLC-ESI-MSMSで同定した。Cyslllが酸化されたSOD1サブユニットのバンドはSDS-PAGEで少し上にシフトする。Cyslllに2-MEが結合した2-ME-SOD1ではCyslllの酸化が起こらず2次元電気泳動で見られる数多くのチャージアイソマー生成が抑えられた。さらにCyslllがスルフォン酸(SO_3H)になった酸化型SOD1を特異的に認識する抗体の作製に成功し、ALSモデルマウス脊髄の封入体と空胞の縁を特異的に染色することを見いだした。本酵素の生成物である過酸化水素でSOD1自身が酸化されて凝集化が起こること、野性型SOD1でも酸化されると変異SOD1と同じような毒性を有するようになることが示唆され始めている。本酵素のCys111残基が他のアミノ酸残基よりも速く酸化されること、SH基がスルフィン酸(SO_2H)さらにはスルフォン酸(SO_3H)に酸化されることをMALDI-TOF-MSおよびLC-ESI-MSMSで同定した。

Cys111のSH基がスルフォン酸(SO_3H)に酸化された酸化型SOD1を特異的に認識する抗体の作製に成功し、ALSモデルマウス脊髄の封入体と空胞の縁を特異的に染色することを見いだした。これはALSの病態において酸化ストレスおよび酸化型SOD1が関与していることを示唆するものである。現在、この酸化SOD1特異抗体を用いて、詳細な解析を行っているところである。
実機条件における原子炉圧力容器鋼中の不純物元素拡散係数の導出

この研究は原子炉圧力容器鋼中のCu等の不純物元素の拡散係数を原子炉稼働時の圧力容器の温度(300°C)に、できるだけ近い温度において、実験的に求めることを目的としている。本年度は3次元アトムプローブを用いて550°Cにおける純Fe中のCuの拡散係数を求めた。これまではSaljeらが、700°C付近の拡散係数を実験で求めたものが最も低温の領域で求めた値であったが、3次元アトムプローブを用いてFe中の不純物拡散を観察することで従来よりもわずかな拡散長で拡散係数を求めることが可能となり、より低温で拡散係数を求めることができるようになった。純FeにCuを蒸着し、550°Cで10^6秒間焼鈍した試料を3次元アトムプローブ観察した。純Fe中においてCuが蒸着面から拡散している様子が観察され、その濃度分布を求めることができた。濃度分布から拡散係数を導出すると、約4×10^<-11>[cm^2/s]であることが分かった。この結果を過去の研究例と比較すると、1977年にSaljeらが求めたものから外挿して求めた値と比較してわずかに高く、1968年にRothmanらが求めた値から外挿した値より低いことが分かった。また、拡散したCuの空間分布から、Cu原子同士の相互作用により局所的にCuが集まっている可能性が示唆された。このように、原子の空間分布を観察できる3次元アトムプローブを用いることで不純物拡散時のそれらの相互作用が拡散に及ぼす影響を調べることが可能となりつつある。以上のように、原子炉稼働時の圧力容器の温度に従来よりも近い温度で実験的に拡散係数を求めることができた。この結果は、より信頼性の高いFe中のCuの拡散係数として今後活用されることが期待される。予定通り、低温でのFe中のCuの拡散係数を求めることができた。この研究は原子炉圧力容器鋼中のCu等の不純物元素の拡散係数を原子炉稼働時の圧力容器の温度(300°C)にできるだけ近い温度において、実験的に求めることを目的としている。本年度は測定のための材料加工技術や測定時の条件の最適化を行い、純Fe中の不純物の拡散係数を実際に求めるところまで行う計画で実験を進めてきた。震災の影響や装置トラブルのため、やや遅れ気味ではあるが、3次元アトムプローブにおいて実際に測定するところまで行うことができた。以下に本年度に実施した内容の詳細を記述する。・純Fe試料の準備(加工)・焼鈍のための試料封入技術の習得・焼鈍用の装置の整備(熱電対の校正、電気炉の整備等)・不純物蒸着装置の修理蒸着用の純金属試料を入れるるつぼが急激な温度変動のため割れ、溶けた金属がヒーター等を破損させた。これを改善させるため、温度の変動速度を制御できるコントローラーを導入した。・純FeにCuを蒸着。・蒸着面を狙ってアトムプローブ用サンプルを作成するためのFIB加工の技術確立・蒸着したまま材、及び700°C焼鈍した試料の3次元アトムプローブ観察。3次元アトムプローブ観察により、純Fe中においてCuが蒸着表面から拡散している様子が観察され、その濃度分布を求めることができた。また、拡散時にCu原子どうしが集まって集合体(クラスター)を作ることが観察された。これはFe中のCuの拡散速度に大きく影響を及ぼすと考えられる。また、蒸着装置の整備や、蒸着条件、技術の確立、3次元アトムプローブ測定の条件の確立等を行うことができた。震災により3次元アトムプローブが故障し、修理に時間がかかった。

また、蒸着装置が故障し、故障原因の解明と対策のための時間が必要であった。予定通り、低温でのFe中のCuの拡散係数を求めることができた。今後はより低温において不純物を拡散させ、その温度での拡散係数を求める。また、原子炉圧力容器において同様の実験を行い、不純物の拡散係数を求める予定である。