hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
奥行き情報を持った自然情景動画像の獲得と合成

法では,特定の背景色を必要とすることや前景領域中のキ-色の抜け等の問題があるが,奥行きマップ信号を利用すれば,これらの制限から開放され,効率的な合成が期待できる.次年度は,ビデオ信号と同期して奥行きマップが伝送されることを前提に,エンドユーザレベルで可能な利用法を開発していく予定である.本年度は、3次元情報や奥行き情報に基づく画像の合成を目的として、複数の画像撮影環境を考え、それぞれの撮影環境下における画像の合成法について研究を行った。初めに、多視点からの撮影環境における奥行き情報の獲得と、それに基づく画像の合成法について検討を行った。この方法では、ブロックマッチングに基づいて視差を検出し、物体の面に関する仮定と水平および垂直走査に基づく面としての検証を行なうことで面領域の奥行き情報を得る。シミュレーション実験を行った結果、前景と背景の実時間分離に有効であり、背景の変更等に利用可能であることが確認された。また、切り出された前景物体のデータベース化において、画像の合成を効果的に行うのに必要な情報についても検討を行った。そして、動きに基づく背景画像のボヤケ効果や背景の明るさにマッチするための物体のテクスチャ全体の明るさ変換の手法を提案した。続いて、予めキャリブレーションされた複数台のカメラによる多視点動画像を用いて、動物体のボリュームデータを計測し、そのデータに基づいて3次元動き情報を獲得する方法を開発した。テクスチャ情報をボリュームデー夕表面に張り付けておくことで、背景画像との合成を行うことが可能であることも明らかにした。一方、単眼視画像でも、ある環境下においては奥行き情報として利用可能な情報が得られる。その1つの例として、本研究では鏡を利用する方法を開発した。自然情景中に置かれた実物体と、その後ろに置かれた鏡に写る鏡面像との位置関係から、エピポーラ幾何学に基づいて撮影環境情報を獲得し、その環境下で仮想的な物体を動かし、鏡面上にその仮想物体の反射像を3次元的に生成することで画像の合成を行うアニメーション作成システムを開発した。このようなシステムは、特殊な環境設定ではあるが、様々な画像合成手法の一つになると期待される。
2次元配位空間の制御

[Cu(bpy)_2(BF_4)]で与えられるLPCは特異な気体吸着現象であるゲート現象を示すことが報告されていた。本研究ではこのゲート現象の機構を解明するために、ゲート吸着前後におけるX線回折測定から、構造解析を行い、さらに、気体吸着機能を調節するために、2次元シート構造とシート間積層構造を修飾し、配位空間を制御することを試みた。さらに、LPCを構成する中心金属、対イオン、架橋リガンド分子および溶媒をそれぞれ変え、新たな配位高分子を調製するとともに、気体吸着特性と気体吸着に伴う構造変化を調べた。昨年度は[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nを調製し、2D配位高分子であること、2段階の窒素吸着等温線を示すこと、その構造変化について、詳細に報告した。本年度は昨年新たに調製した[Co(bpy)_2(OTf)_2]_nの構造を決定し、2D型であること、構造も窒素吸着挙動も[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nのものに似通っていることを明らかにした。また、Ni-bpy-(BF_4)系やNi-bpb-(BF_4)系(bpb=1,4-bis-(4-pyridil)benzene)の2D配位高分子を合成し、それらの気体吸着について調べた。詳細な構造は明らかではないが、気体吸着の様式や粉末X線回折の結果から、これらNi系の新規は配位高分子も2D型である可能性が示唆された。このように新たにいくつかの異なる2D型配位高分子を調製し、特異的吸着挙動を明らかにでき、中心金属、対イオン、架橋リガンド分子および溶媒の一連の組み合わせについて、系統的な知見を得ることができた。[Cu(bpy)_2(BF_4)_2]_nの対イオンをOTf^-にした[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nは、水-エタノール混合溶媒系から結晶を得ることができた。本物質は2次元グリッド構造を有し、LPC同様、これが積層して3次元構造を形成することが、X線粉末回折データをリートベルト解析することでわかった。[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nの気体吸着等温線測定の結果、特異的な等温線が得られ、3段階の吸着プロセス及び2段階の脱着プロセスに従うと考えられた。粉末XRDデータの解析から、P/P_0<0.2における吸着では、2次元グリッドの層間隔はほぼ一定で、層内の吸着サイトに窒素分子が収まり、その後の吸着は層間隔の拡張を伴うものであることが示唆された。[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nでは、対イオンがOTf^-であり、LPCのBF_4^-よりもかさ高いために層間隔が長く、初期状態からN_2分子が入り込むことができるために、低相対圧での吸着の立ち上がりが観察されたものと考られる。しかしながら、更なる吸着プロセスにおいてはLPC同様、層間隔の転移的な拡張に伴って、ほぼ垂直の吸着増加が観察されたと考えてよい。このように2D層間の相互作用を担っているピラー分子である対イオンの長さや構造を変えることで、吸着挙動を制御できることが示唆された。さらにアセトニトリル溶媒を用いることで[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nの金属イオンをCu^<2+>からCo^<2+>に変化させ、結晶を得ることができた。この場合、77Kにおける窒素吸着等温線は[Cu(bpy)_2(OTf)_2]_nのものに似通っており、多段階吸着を示した。しかしながら、詳細な構造は決定できておらず、2次元配位空間を有するかどうかは明らかではない。今後構造解析を進め、2次元配位空間を有するかどうかを確認する予定である。その他に、{[Cu(H_2O)_4Cu(azpy)_2(OTs)_2(H_2O)_2]・2(OTs)・2H_2O・2EtOH}_nを得たが、2D結晶ではなく1D結晶であり、気体吸着量は多くなかった。しかし、有機蒸気に特異な吸着現象を示すことを明らかにした。

また、Ni-bpy-(BF_4)系やNi-bpb-(BF_4)系(bpb=1,4-bis-(4-pyridil)benzene)の2D配位高分子を合成し、それらの気体吸着について調べた。詳細な構造は明らかではないが、気体吸着の様式や粉末X線回折の結果から、これらNi系の新規は配位高分子も2D型である可能性が示唆された。このように新たにいくつかの異なる2D型配位高分子を調製し、特異的吸着挙動を明らかにでき、中心金属、対イオン、架橋リガンド分子および溶媒の一連の組み合わせについて、系統的な知見を得ることができた。
ランキン・セルバーグL関数の解析数論的研究とその応用

保型形式からつくられるL関数として一変数保型形式のランキン・セルバーグL関数を扱い、保型形式のフーリエ係数に関する研究を進めてきた。これにより、今まで多くの一変数保型形式のフーリエ係数の情報を得ることができた。これはL関数の特殊値の研究など様々な研究の基本となる一つの情報である。従って、多変数保型形式であるヒルベルト保型形式のL関数の研究に対して、最初に必要となるものはヒルベルト保型形式のフーリエ係数の情報である。しかし、一変数の場合と違い、ヒルベルト保型形式についてはフーリエ係数の大きさに関するラマヌジャン予想が一般的に解決しておらず、一変数保型形式を扱うより困難がある。しかし、ラマヌジャン予想が成立していなくても、解析数論的にヒルベルト保型形式のL関数を調べる(例えばs=1におけるL関数の特殊値の評価など)ために十分なフーリエ係数の情報が得られることを示すことができた。この結果はまだ限られた場合のヒルベルト保型形式に関してのものであるので、より一般的にこの議論を進めていくことが今後の課題であり、有益な情報につながると期待できる。さて、L関数に関する大事な問題は多くあるが、最も重要なものの一つが零点の問題である。私はランキン・セルバーグL関数の零点の研究に取り組んできた。それはランキン・セルバーグL関数自体への興味と、より一般的にGL(N)のL関数の性質を研究するための準備という意味もある。ランキン・セルバーグL関数について、ジーゲル・竜沢の定理というジーゲルの零点の問題に関する定理を証明したことを切っ掛けに、今年度、より一般的にシンメトリックL関数についてジーゲル・竜沢の定理を証明することができ、更にこれを拡張し、一般のL関数に対するジーゲル・竜沢の定理の議論を確立することができた。この結果は今年の春の学会と3月にカナダのクイーンズ大学で発表をする予定である。保型形式に付随するL関数はその性質、特殊値、などが数論の様々な情報を含んでいることから、様々な視点から様々な手法を用いて研究が重ねられている。特に1変数の上半平面上で定義される保型形式からつくられるL関数に対しては一番単純なものはそれなりに調べられてきたが、まだまだ分かっていることは少なく、更に深い研究が必要である。さて、ひとつの保型形式に付随するL関数と二つの保型形式から作られるランキン・セルバーグL関数について私は関数等式の折り返しの点に置ける値に興味がある。その点に置けるL関数の値は深い意味を持つが、私はLindelof予想のmodulus版という問題に取り組んだ。まず私はL関数の係数の部分和の評価をmodulusに対して良くすることを目標とした。係数和の評価は様々な手法を用いて研究が進んでいるが、modulusに重きをおいた良い評価はまだまだ改良の余地があると思われるのがその理由である。Voronoi公式を用いて、更に工夫をすることによって、係数和の評価としてmodulusについて良いものを得ることには成功した。しかし、残念ながら、目標であったL関数特殊値のmodulusの評価の改良には至らなかった。また、1変数で上半空間という設定を更に拡張したヒルベルトモジュラー形式に対する研究にも取り組んだ。やはり1変数の時と同様に付随するL関数が定義されている。ただ、こちらは1変数の場合よりもまだまだ調べられていないことが多い。このL関数を調べる準備としていくつかの基本的な性質を導いたことも今年度の研究の中で重要な結果であったといえる。これらの結果はドイツのハイデルベルグ大学、フライブルグ大学で発表した。更に、3月の早稲田大学における研究集会でも発表する予定である。
共焦点内視鏡とスペクトロスコープによるHybrid消化管神経叢診断システムの確立

ヒルシュスプルング病の腸管を用いて神経ネットワークの観察を行い、病変部、移行部、無神経節部の診断における有用性について検討した。ヒルシュスプルング病腸管において、従来の診断法である病理所見と対比してCLEによる神経ネットワークの評価を行い、高い精度で診断可能である事が示された。CLEは術中迅速病理に比べて短時間で広範囲に連続性をもって観察することが可能であり、将来の臨床応用が期待される。【方法】小児外科手術により腸管切除の手術を受けた患者6人を対象とした。原疾患の内訳は鎖肛2例、メッケル憩室2例、空腸閉鎖症1例、ヒルシュスプルング病1例で年齢は9ヵ月10歳であった。切除検体にクレシールバイオレット色素を散布あるいは漿膜下に局所注射し漿膜側よりCLEを当てて観察した。観察した部位の病理組織標本を作製し、それぞれ3段階で評価した。CLEグレード0:染色不良、グレード1:神経叢あり、グレード2:神経叢なし、病理組織グレード0:標本作製不良、グレード1:神経叢あり、グレード2:神経叢なし。【結果】CLE観察において、クレシールバイオレット色素を注入して数分以内に神経叢が観察可能となり15分ほどでよりよく見えるようになった。ヒルシュスプルング病の症例においては、正常部と無神経節部の両方で観察を行ったが、正常部において梯子状の神経叢が明瞭に確認できるのに対して無神経節部では全く神経叢が確認されず、その差は明らかであった。CLEグレードと病理グレードを対比すると、6例で10検体の検討を行い、すべてにおいてグレードが一致し、感度、特異度ともに100%であった。ヒト検体による摘出標本により、CLEを用いた消化管神経節細胞可視化の技術は確立され、病理検体との比較検討も行った。対象を新生児小児の検体として、ヒルシュスプルング病の無神経節腸管から神経節腸管にいたる連続的な観察が可能であった。コントロールとしては鎖肛症例や、腸閉鎖などの正常の神経節腸管を有する疾患の摘出検体を用いた。具体的にはヒルシュスプルング病の症例において、経肛門的に手術標本を摘出し、手術中には術中迅速病理検査において、神経節細胞の有無を確認しそれを冷蔵保存して実験に用いることとした。鞘膜側からクレシルバイオレッドを局所注入し、色素を平滑筋層にいきわたるように分布させた。その後鞘膜側から共焦点内視鏡のプローブを接触させて、神経線維および神経節細胞の有無を注意深く行なった。切除断端から確認を開始したところ、術中迅速病理診断において、神経節細胞有と判断された部分は、神経線維のネットワーク構造と、加えて核が抜ける形で、複数の神経細胞が集積した神経節として可視化および確認可能であった。その後プローブを、神経節細胞の少ないOligoganglionosis部分からaganglionosis部分に徐々に移動させると神経線維は確認されるものの、核を有する神経細胞が減少し、aganglionosis部分においては、共焦点内視鏡では観察が不可能であった。この観察部分を連続的に固定標本としてHE染色で確認したところ、同様に神経節細胞の分布の有無が確認することができ、共焦点型内視鏡での所見とほぼ一致していた。少なくとも摘出検体での未固定標本での観察が技術的に可能あることを確認し、そのプロトコールを確立している。【目的】ヒルシュスプルング病の腸管を用いて神経ネットワークの観察を行い、病変部、移行部、無神経節部の診断における有用性について検討した【方法】ヒルシュスプルング病根治術を受けた患者11人を対象とした。病型の内訳はrectosigmoid type 10例、total colonic aganglionosis 1例で、年齢は1ヵ月13ヶ月(平均5.1ヶ月)であった。切除検体にクレシールバイオレット色素を漿膜下に局所注射し漿膜側よりCLEを当てて観察した。【結果】CLE観察において正常部では梯子状の神経叢が明瞭に確認できるのに対して無神経節部では全く神経叢が確認されず、その差は明らかであった。またrectosigmoid typeの全例において、移行部もしくは無神経節部で太い神経線維束を認めた。CLEグレードと病理グレードを対比すると、11例で78検体の検討を行い、感度83%、特異度95%、陽性的中率94%、陰性的中率87%、正診率90%であった。CLEで神経叢なし、病理で神経叢ありと診断された6検体はいずれも移行部であり病理においても神経叢はまばらであった。【考察】ヒルシュスプルング病腸管において、従来の診断法である病理所見と対比してCLEによる神経ネットワークの評価を行い、高い精度で診断可能である事が示された。

CLEは術中迅速病理に比べて短時間で広範囲に連続性をもって観察することが可能であり、将来の臨床応用が期待される。ヒト臨床検体において摘出後の腸管に対するCLEによる観察を行い、漿膜側から腸管神経叢の可視化が可能であることを確認できた。ヒルシュスプルング病の術中迅速病理と比較すると短時間で連続性をもって神経の分布を評価できる可能性があり、将来の臨床応用が期待されるためである実際の臨床手術の際の、術中迅速検査との比較が必要であり、今後はそれを行う予定である小児外科現在摘出検体による観察および病理標本との整合性を検討している。今後その検証が終わった後は、ヒルシュスプルング病の経肛門的腸管切除において生体での評価を行い臨床応用を目指す。その後は腹腔鏡における腹腔内での観察が可能なプロトコールを検討する臨床検体を用いた実験を平成28年度に行うため。臨床検体を用いた実験を平成27年度に行うため。引き続き臨床的有用性の検証のための動物実験を継続する。
単純ヘルペスウイルスの病原性発現におけるアクセサリー遺伝子の役割

単純ヘルペスウイルス(HSV)は少なくとも74種の遺伝子をコードするが、その半数以上は培養細胞での増殖には必須ではないアクセサリー遺伝子であることが明らかにされている。本研究はHSVの病原性発現におけるアクセサリー遺伝子の役割、作用機構を明らかにしようとするものである。マウスに対する病原性発現におけるUL56の重要性についてはBeckerのグループによる一連の研究があるが、その役割や機能については全く分かっていないといって良い。我々もUL56欠損ウイルスの病原性については、その特性を確認したが、特異抗体、真核発現系などを用いた解析から、この蛋白質が小胞輸送に関わることを示唆する結果を得た。UL56遺伝子は、塩基配列より235個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが予想された。大腸菌における発現系を作製し、精製したGST-UL56融合蛋白質を用いて特異抗体を作製した。この抗体はHSV2型感染細胞の35,34,33,32,31及び30kDa蛋白質と特異的に反応した。Vero細胞でのUL56単独発現では31、30kDaの蛋白質のみを検出した。HSV2型では1型と異なり、開始コドンの10アミノ酸上流部位にATGが存在する。上流部を含む発現系を作製し検討したところ、34,32,31,30 kDa、の4本のバンドが検出された。以上の結果は、上流のATGからも翻訳が開始されていることを示唆するものである。また、蛍光抗体法による観察では感染6時間後より検出され、ゴルジ体のマーカーGolgi58KProteinと共局在した。より感染の後期ではUL56蛋白質は核周囲の部に集積すると同時に、細胞質にも顆粒状に検出された。単独発現では、ゴルジ体への集積像とともに細胞質に顆粒状に分布し、後者はearly endosomeのマーカーEEA1と共局在した。さらに、界面活性剤に対する挙動、sucrose gradient fractionationによる解析の結果から、UL56蛋白質はlipid raftsと会合していることが示唆された。
ヒト精漿中の精子運動抑制因子に関する研究:精子無力症の原因と治療法への応用

1.ヒトSPMIの局在について剖検より得られた精嚢及び前立腺液そして精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、肝臓、腎臓の組織抽出液をそれぞれbiological assay,ELISA法にてSPMI濃度を測定した結果、精嚢においてのみ高濃度のSPMIを検出しSPMIは精嚢より分泌されることを明らかにした。精嚢液のbiological assayによるSPMI濃度は精漿中のそれより13.6倍高かった。しかしELISAによる精嚢液中のSPMI濃度は精漿中のわずか1.54倍であった。この理由は精嚢液が射出されるまでに前立腺液を含め他の副性器からの分泌液と混ざりSPMIが希釈されるだけでなく分解されSPMI活性が低下するのではと考えた。ブタSPMIの局在を免疫電顕法で観察しSPMIは精嚢上皮のapical surfaceのmicrovilliのみに局在していた。2.ブタSPMIの精製方法についてMolec Reprod Devel(31;55,1992)に発表した。ブタSPMIは14,16,18kDのポリペプチドからなる塩基性蛋白でpH6-11まで安定で熱にも比較的強いこと、SPMIの除膜精子の運動に対しての影響はMg.ATPの添加によって回復すること、dynein armの機能を障害することにより除膜精子の運動をブロックすることが判明した。3.男子不妊症患者の精漿中のSPMI濃度をbiological assayにて測定し運動率と比較検討した。精子濃度40X10^6/ml以上かつ運動率60%以上をもつsubfertile controlのSPMI濃度は324.4±188.1Units/ml(M±SD)で,運動率60-40%群,20%以下群はそれぞれ297.6±128.1,326.9±160.3,343.3±1314Units/mlと運動率とSPMI濃度とで相関関係を認めなかった。この結果は精子の運動が不良となる原因は精漿中のSPMI濃度ではなく精子細胞膜を介してのSPMIの関与が示唆された。4.精子運動不良(精子無力症)患者の精子細胞内抽出液中に精子の運動を抑制する因子の存在が運動率30%以下の症例では58%に見られたが今のところこの因子がSPMIと同一であるか不明である。1.精漿中に存在する精子運動抑制因子(Seminal plasma motility inhibitor以下SPMI)の精製分離をヒト及びブタ精漿より先ずSPーSephadex Cー25を通しSPMIの活性のあるフラクションをHPLC逆相カラムにかけ分離を試みているが活性が落ちて純粋なSPMIを現在まで得られていない。そこで本年度の補助金でゲルクロマトグラフィ-に必要なシステムを購入し我々がすでに発表した精製分離の手順に従って行っているところである。2.ヒトSPMIの局在について剖検より得られた精嚢及び前立腺液そして精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、肝臓、腎臓、の組織抽出液をそれぞれbiological assayとELISA法にてSPMI濃度を測定した。その結果、精嚢においてのみ高濃度のSPMIを検出しSPMIは精嚢より分泌されることを明らかにした。

ブタSPMIの局在は免疫組織学的検討から精嚢の上皮にあることをすでに発表している。本年度は長村らが開発した免疫電顕法(preーembedding method)を用いてSPMIは精嚢上皮のapical surfaceのmicrovilliのみに局在していた。光顕レベルでは精嚢上皮内に染まっていたがこれはSPMIが細胞内へ拡散した為と解釈しSPMIは膜蛋白であることが判明した。現在ブタの組織抽出液そして精嚢及び前立腺液中のSPMI濃度をbiological assay及びELISAにて測定中でSPMIの分泌過程を研究中である。3.不妊症患者の精漿中SPMI濃度と精液所見との関係を調べた。精子運動が活発な精子を有する精漿(control)と運動不良な精子を有する精漿(精子無力症)とでSPMI濃度を比較したところ相関関係を認めなかった。この結果から精子無力症の原因は精漿中のSPMI濃度ではなく精子細胞膜の障害を示唆した。今後精子無力症患者の精子細胞膜はSPMIが容易に通過し運動機構に重要なdynein armに存在するdynein ATPaseを抑制して精子運動に障害を与えたのかあるいは精子細胞膜に付着しsecond messengerがdynein ATPaseを抑制するのか検討したい。すでに私達はブタ精漿より精子運動抑制因子(Seminal plasma motility inhibitor以下SPMI)の分離精製に成功し、その分離能9.96、回収率18%であった。精製に要する日数は約2週間と比較的短期で行い得るが、その過程で5065%グリセロールを使用することからカラムのトラブルが多く再現性にやや乏しい点、また回収率が低値である点など問題点を有していた。今後のSPMIの研究において、精子運動を抑制する機序および生理学的役割を明らかにするには大量のSPMIを必要とすることから、より簡便で回収率が高い精製法の開発が望まれた。この1年間種々の試みを経て次のような方法を開発した。精嚢液が高濃度のSPMIを含んでいる事から、精嚢液からの精製分離を思いついた。先ず精嚢液をS-Sepharoseカラムに通し、SPMI活性fractionを集めC4逆相カラムを使ったHPLCにかけた。その結果分離能は12で、回収率30%と良好な結果であった。HPLCの第1番目のピークが、SDS-PAGEとブロッティングにて3つのバンドが得られ、精漿中SPMIと同様、分子量14K、16K、18Kのポリペプチドであった。今後これら3つのポリペプチドのそれぞれの抗体を作製中である。次に予備実験として精嚢液より精製したSPMIを使用し活発に運動する正常ブタ精子に対しての抑制効果及びその反応が可逆性であるかを観察した。除膜した精子の運動を抑制するのに必要なSPMI濃度を1Unit/mlとすると、細胞膜を有する正常精子の運動を完全にブロックするSPMIは約1500Units/mlを必要とした。この運動停止した精子をPercallにて洗浄したところ、その2030%の精子が運動を再開始した。このことからSPMIの作用機序は精子細胞膜に付着しsecond messengerがdynein ATP-aseの活性を抑制することにより運動がブロックされると考えられる。また精子無力症患者の精子細胞内抽出液がSPMIと同一のものか検討するため、精子を凍結保存中である。
重度身体障害者と家族の地域生活支援に関する調査・実証研究

1.所得保障制度のあり方の検討東京都内の自治体の協力を得て行われた質問紙調査「障害者生活実態調査」(2005年12月実施)に、調査票設計の段階から参加した。ここで得られたデータから障害者世帯の家計構造について分析を行った。この結果、障害者世帯はおおむね低所得の状態におかれており、とくに単独世帯の場合にそれが著しいこと、収入は公的年金と手当て、不足する場合には生活保護に依拠していることが明らかになった。支出については、障害にかんする支出額が少なからず存在した。まず低所得におかれている障害者について、早急に対策を講じる必要があること、また障害種別、障害程度、居住形態を考慮しつつ、住宅保障や介助保障など複数の制度を組みあわせた所得保障制度が有効であると結論づけた。上記は報告書としてまとめられ、来年度の社会福祉学会にて共同報告を行う予定である。2.障害をもつ人の地域生活実践の分析イギリスにおけるヤングケアラー(young carer)研究の文献レビューを行い、批判的検討を行った。この結果「ケアする子ども」という視点のみで子どもの経験をとらえることは難しく、その特殊性について「障害の親」と「非障害の子とも」の関係性という軸を立てて検討することが必要であると指摘した。またミクロレベルでの「障害者家族」の経験を明らかにするために、障害/病気の親とその子どもへのインタビュー調査を行った。親へのケアにかんして、担い手となる子どもは女子に偏っていること、実際にケアや家事役割を担うことで、子どもは時間的制約や就労の機会の喪失を経験していることが明らかになった。また、「障害」については年齢階層別に、病気/障害の受け入れにかんする「困難」の内容と程度が異なっていた。これについては今後も検討していく予定である。上記は第2回障害学会および第78回日本社会学会において報告し、障害学会学会誌『障害学研究』へ投稿した(掲載予定)。1.障害をもつ人の地域生活について、マクロレベルでの生活実態を把握するための枠組みづくりを行った。とくに所得保障に焦点化したが、その理由として、障害者の所得保障にかんして1980年代から多くの問題点が提示されているが、現在まで解決されないままに残されていること、また、所得保障にかんする研究はきわめて手薄であり、実態把握についてはほとんど行われていないことがある。昨年に引きつづき、身体、知的、精神障害者あわせて18名へのインタビュー調査から得られたデータをもとに、所得保障制度の活用実態と制度への意味づけを分析した。この結果、年金額の水準の問題が確認され、さらに社会福祉サービスとの関連で生じた問題と住宅にかかわる問題が、生活保護受給の要因であることが明らかになった。これらから障害者の地域生活を支援するためには、スティグマ的な意味をもつ生活保護ではなく、基礎年金を核とし住宅保障や介助保障を組みあわせた所得保障制度が有効であると結論づけた。上記は第52回日本社会福祉学会において報告し、同学会誌へ投稿した(査読中)。2.ミクロレベルでの「障害者家族」の経験を明らかにするために、障害をもつ人とその家族へインタビュー調査を行った。とくに、「障害をもつ親とその子ども」を対象とし、インフォーマントへのインタビューを行った。今年度は記録を作成しまとめたところで終了したが、家族全体をふくめた分析については来年度以降すすめていき、随時学会にて報告、学会誌へ投稿していく予定である。3.障害者の地域生活を実践している事例をふまえつつ、暮らしに密着した地域福祉と、地域における福祉と保健・医療の連携について考察した論考を発表した(「生活と福祉」)。また、障害者の地域生活移行への大きな要因となっている「性」の問題について考察した(「障害をもつ子どもの性をめぐる問題構成」)。
ナノピンセットを用いた繊維性タンパク質‐薬物相互作用検出システムの基礎研究

Siの微細加工技術を用いて作成されたピンセットを用いて、高周波電圧の印加によって線維性のタンパク質を伸長・捕獲する技術を開発した。アクチン繊維とアクチン結合タンパク質との結合反応を、プローブ間に捕獲されたアクチン繊維を流れる電流を計測することで検出した。ピンセットに伸長・補足されたアクチン繊維に対して、線維を切断する作用を持つタンパク質を加えることで、アクチン線維の結合の乖離反応を、導電性の低下を用いて測定できることを示した。これにより、アクチンなどの繊維性タンパク質の他種タンパクとの結合・乖離反応や薬物応答を、導電性の変化により計測できる可能性が示された。さらに、線維性タンパク質の高周波電気計測のために、マイクロス-トリップライン構造の対向電極デバイスを作成した。デバイスは、パイレックスガラス基板上に、10ナノメートルCr薄膜+50ナノメートルAu薄膜をスパッタリングにて形成後に、GND電極と信号電極をエッチングAuおよびCrのエッチングによって形成した。信号電極は分子を伸長・捕獲できるように対抗しており、信号線はGND電極で挟まれた構造となっている。市販のλ-DNAを用いて、プローブ間に分子が伸長・捕獲されることを確認した。半導体微細加工技術を用いて製作された分子ピンセットを用いて、線維性タンパク質のプローブ間への捕獲実験を行い、安定的な分取トラップのための交流印加条件を明らかにした。アクチン繊維のプローブ間への捕獲では、DNAの分取条件(1MHz)よりも高周波側の10MHzで、直径が数十ナノ数百ナノメートルの分子束が安定的に捕獲されることが分かった。また、分子ピンセットに捕捉された繊維性タンパク質(アクチンおよび微小管)の電気計測を個々のタンパク質緩衝液中で、分子ピンセットのプローブ両端に直流電圧を印加して実施し、直流電圧特性を明らかにした。アクチン・微小管ともに導電性は非常に低く、数十GΩであった。また、アクチン繊維とアクチン結合タンパク質との結合反応を、プローブ間に捕獲されたアクチン繊維を流れる電流を計測することで検出した。また、プローブ間に捕獲された分子の種々の反応(他分子との結合や乖離、変性など)を、分子の剛性の変化から計測することも試みた。力計測では、市販のλ-DNA分子を対象として、分子ピンセットによる分子の伸張実験を行った。分子の伸張は、捕獲用の分子ピンセットに一体形成された静電型櫛歯アクチュエータを用いて行い、分子の伸びを対向するプローブ先端の変位計測によって測定し4タンパク質とDNAの相互作用によるDNA分子の特性の変化を計測する系を試作した。また、今後の交流電気計測のために、マイクロストリップライン構造の対向電極デバイスを作成した。デバイスは、ガラス基板上にAu薄膜で形成(Cr薄膜の上に形成)された信号電極が対向して構造となっており、この信号線の両側にGND線を設計した。
人口減少地域の多胎育児家庭と地域の支援者の情報格差を減らす準備モデルの検討

人口減少地域の多胎育児家庭と医療機関・保健行政機関、地域の育児支援者が多胎育児家庭に対する支援を考える際に共通の情報を用いることのメリット・デメリット、支援者側の多胎育児支援に対する意識などについて半構成式質問紙による面接調査と自記式質問紙による調査を行う。共通の情報源として、大木らが作成した多胎育児家庭用副読本「ふたご手帖(妊娠-出産-育児サポートガイドブック)」を用いる。研究対象・調査方法は秋田県内に在住する多胎妊婦と1歳未満の多胎育児家庭には、手帖を配布し、面接調査を行う。秋田県内の医療機関・保健行政機関の専門職、地域の子育て支援者には研修会参加後、郵送による質問紙調査を実施する。
アポトーシス阻害因子遺伝子導入と異種移植による卵巣内潜在的卵母細胞の救命法の創出

食肉処理場では優れた形質の雌家畜の卵母細胞が無為に廃棄され続けている。本研究によって卵子の品質を評価し、それを調節している細胞死阻害因子を人的に制御することで卵胞とその中の卵子を救命する手法の開発がすすめられ、無為に廃棄されている卵子(卵巣内潜在的卵子)の有効利用の路が開かれてきて、雌家畜側からの高効率的育種改良が期待される。加えて家畜のみならず担癌患者の卵母細胞を救命できる基盤的技術が整ってきており、この成果は農学や医学等の広領域で社会に貢献することが期待される。近年哺乳類においては様々な動物発生工学技術が編み出され、体細胞クローン羊やプリオン遺伝子ノックアウトウシのような人為的に操作した家畜を作出できるようになってきた。しかしこれらに供する卵母細胞が不足しており、その確保は急務である。哺乳類の卵胞とそれに内含される卵母細胞の死滅を調節している数々の細胞内因子を同定し、その制御機構を解明する過程でいくつかの因子が細胞死を阻害することで卵胞・卵母細胞の死滅を調節していることを明らかにしてきた。本研究では、細胞死阻害因子の遺伝子を食肉処理場で得た卵胞上皮細胞に導入して卵胞閉鎖を阻害し、これを異種移植して救命して利用する潜在的卵母細胞救命法を創出しようとするものである。本年度は、細胞死阻害因子を調節している因子の探索を進めとともに阻害因子の発現を人為的に調節することで卵胞・卵子の救命が可能であることの確認をすすめた。さらに卵巣組織細片への一過性の遺伝子導入法を検討するとともに、凍結保存卵巣組織細片の免疫不全マウス腎漿膜下腔への異種移植とそこでの卵胞発育ならびにこのようにして得た卵子の体外成熟と体外受精および胚の発育能の評価も進めた。研究の過程で異種移植を腎漿膜下におこなった場合に、移植細片の保持はよいものの、そこから発育する卵胞に対して丈夫な漿膜が阻害的に作用するので、漿膜に小穴を開くなどの術式の工夫を重ねている。加えて、一層優れた救命因子として遺伝子導入などの煩瑣なプロセスを要しないと考えられる可溶性受容体の有用性の可否を検討している。哺乳類においては様々な動物発生工学技術が編み出され、体細胞クローン動物やプリオン遺伝子ノックアウトウシのような遺伝子改変動物を作出できるようになってきた。哺乳類の卵胞・卵母細胞の死滅を調節している数々の細胞内因子を同定し、その制御機構を解明する過程でいくつかの因子が細胞死を阻害することで卵胞・卵母細胞の死滅を調節していることを明らかにしてきたが、本研究では、細胞死阻害因子の遺伝子を食肉処理場で得た卵胞上皮細胞に導入して卵胞閉鎖を阻害し、これを異種移植して救命して利用する潜在的卵母細胞救命法を創出しようとするものである。本年度、細胞死阻害因子を調節している因子の探索とその分子制御機構の解明を進めとともに阻害因子の発現を人為的に調節することで卵胞・卵子の救命が可能であることを確認し、卵巣組織細片への一過性の遺伝子導入、卵巣組織細片の凍結保存、凍結融解後の組織細片の免疫不全マウスの腎漿膜下腔への異種移植とそこでの卵胞発育の誘導、ならびにこのようにして得た卵子の体外成熟と体外受精および胚の発育能の評価を進めた。より優れた救命因子として可溶性受容体、囮受容体等の検索を進めるとともに顆粒層細胞のアポトーシス調節因子ゲートキーパーp53の卵胞組織における機能を解析し、アポトーシス阻害因子遺伝子導入と異種移植による卵巣内潜在的卵母細胞の救命法の創出におけるこれらの有用性を検討した。近年家畜においても様々な動物発生工学技術が編み出され、体細胞クローン羊やプリオン遺伝子ノックアウトウシのような人為的に操作した家畜を作出できるようになってきた。しかしこれらに供する高品質の卵母細胞(卵子)が不足しており、その確保は急務である。家畜の卵胞とそれに内含される卵母細胞の死滅を調節している数々の細胞内のアポトーシス阻害因子を探索して、その制御機構を解明する過程でいくつかが細胞死を阻害することで卵胞・卵母細胞の死滅を支配的に調節していることがわかってきた。本研究で、細胞死阻害因子の遺伝子を食肉処理場で得た卵胞上皮細胞に導入して卵胞閉鎖を阻害し、これを異種移植して救命して利用する潜在的卵母細胞救命法を創出しようとするものである。細胞死阻害因子を調節している因子の探索を進めた。併行して、アポトーシス阻害因子の発現を人為的に調節することで卵胞と卵子の救命が可能であることの確認をすすめた。

家畜の卵巣組織の細片への一過性の遺伝子導入法を検討するとともに、凍結保存卵巣組織細片の免疫不全マウス腎漿膜下腔への異種移植とそこでの卵胞発育ならびにこのようにして得た卵子の体外成熟と体外受精および胚の発育能の評価も進め、卵巣組織の凍結保存とそれからの卵巣内潜在的卵子の回収システムの構築を進めた。研究の過程で異種移植を腎漿膜下におこなった場合に、移植細片の保持はよいものの、そこから発育する卵胞に対して丈夫な漿膜が阻害的に作用するので、昨年度から継続して漿膜に小穴を開くなどの術式の工夫などを重ねるなどして、一層優れたシステムの改築を遂行した。また救命因子として遺伝子導入などの煩瑣なプロセスを要しないと考えられる可溶性受容体の有用性の可否の検討もすすめた。家畜繁殖学研究計画の予定をほぼ満たし、加えて、研究の過程で異種移植を腎漿膜下におこなった場合に、移植細片の保持はよいものの、そこから発育する卵胞に対して丈夫な漿膜が阻害的に作用するので、漿膜に小穴を開くなどの術式の工夫を重ねている。さらに加えて、一層優れた救命因子として遺伝子導入などの煩瑣なプロセスを要しないと考えられる可溶性受容体の有用性の可否を検討しているところまで踏み込んで進展しているので、順調に進展していると評価した。平成23年3月11日に研究室所在地の笠間市では震度6強を5分間以上の震災を経験し、これによって多くの研究設備・機器が破損したり修理を要する状況になり、平成24年になってもこれらは完全に回復していない。完全に回復するものと想定して研究計画調書を作成したが、よって研究の進展が遅れた。しかし、卵胞の選択的死滅を調節しているアポトーシス阻害因子の発現推移を詳細にしらべ、それの制御においてインターロイキン6が重要な司令塔的な役割を果たしていることを見出すことができた。さらにこれに関連する囮受容体にかかわる研究については論文化できた。最終年度の来年度には、研究期間中に遂行した各項目を統合し、ブラシュアップして汎用的に広く活用できるものとする。加えて、上述のように、可溶性受容体の有用性の可否に関わる研究を鋭意深めたい。上述のように、震災に起因するハードウエアーの不備に起因する研究進展の遅滞を除けば、概ね順調に進捗している。また破損したり修理を要する研究設備・機器の新調や修繕もおおむね終えることができたので、研究計画調書に記載した年次計画に従って粛々と遂行して、最終年度までには当初の目標を達成する。(1)「顆粒層細胞におけるアポトーシス・シグナルの阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)の発現を指標にすれば卵子の健常度を見極めることができる」との仮説の確認(A)卵子の正常性、体外授精後の初期胚の発生の正常性、卵胞液の性状、これらと同じ卵胞内の顆粒層細胞における阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)の発現レベルとの関連性の精査:A-1.卵胞(卵子、顆粒層細胞)の調製・A-2.卵子の受精能および初期胚の正常性の評価・A-3.顆粒層細胞における阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)の発現推移・A-4.顆粒層細胞における性腺刺激ホルモン受容体などの発現推移(2)阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)発現の調節因子探索とその分子制御機構:(A)阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)発現を調節している因子の探索・(B)阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)発現の調節機構の解析(3)阻害因子(cFLIP、XIAP、囮受容体3など)発現を人為的に調節することで卵子の救命が可能か否かの確認:(A)凍結保存・異種移植・遺伝子導入
リボソーム蛋白質によるrRNAの構造構築と翻訳発現の制御

S7と結合する16S rRNAフラグメントは3'大ドメインの下部と特定されている.本研究では,そのフラグメントとS7との間での複合体の結晶化実験を行なった.Bacillus stearothermophilusのS7を大量に精製,一方,16S rRNAのフラグメント(926-986/1219-1393)はT7 RNA polymeraseを用いた転写系によって大量調製した.この際,リボザイムを末端につけることにより末端がそろったRNAを作ることができた.現在複合体の結晶化の準備中である.既に構造解析を行なったS7と16S rRNAのモデルとの複合体モデルをコンピュータグラフィクスを使って調べることにより,S7のリボソーム上での位置と向きを決定すると共にこれまで提出されていた16S rRNAのモデルが正しいことを示した(RNA印刷公表).ペプチジルトランスフェラーゼセンターにあるリボソームタンパク質L2のRNA結合ドメインの結晶化に成功し(J.Struct.Biol.印刷中)その立体構造解析を行なった.この構造解析により,リボソームの中で最大のL2タンパク質がドメインより構成されていること,それぞれのドメインは70残基ほどの大きさからなること,ドメイン間にRNA結合部位が存在することを示した(EMBO.J.印刷中).S7と結合する16S rRNAフラグメントは3'大ドメインの下部と特定されている.本研究では,そのフラグメントとS7との間での複合体の結晶化実験を行なった.Bacillus stearothermophilusのS7を大量に精製,一方,16S rRNAのフラグメント(926-986/1219-1393)はT7 RNA polymeraseを用いた転写系によって大量調製した.この際,リボザイムを末端につけることにより末端がそろったRNAを作ることができた.現在複合体の結晶化の準備中である.既に構造解析を行なったS7と16S rRNAのモデルとの複合体モデルをコンピュータグラフィクスを使って調べることにより,S7のリボソーム上での位置と向きを決定すると共にこれまで提出されていた16S rRNAのモデルが正しいことを示した(RNA印刷公表).ペプチジルトランスフェラーゼセンターにあるリボソームタンパク質L2のRNA結合ドメインの結晶化に成功し(J.Struct.Biol.印刷中)その立体構造解析を行なった.この構造解析により,リボソームの中で最大のL2タンパク質がドメインより構成されていること,それぞれのドメインは70残基ほどの大きさからなること,ドメイン間にRNA結合部位が存在することを示した(EMBO.J.印刷中).
部落問題の解決と地域福祉活動-同和地区における社会福祉施設の役割-

本研究の目的は大きく変化した同和地区の実態を踏まえて、部落問題の解決を実現するための最終的な課題を提起するとともに、わが国において一つの社会問題が解決可能といわれるような実態をつくりだした同和対策事業の教訓を明らかにする点にある。そのために、ここでは(1)戦後直後より同和地区を拠点として地域福祉活動を展開してきた一社会福祉施設の資料収集と関係者の聞き取り(2)京都市内同和保育所「乳幼児とその家族の生活調査」(3)「障害者(児)とその家族の生活調査」(4)「公務労働者の人権意識調査」(5)「乳幼児とその家族の健康調査」「妊娠とその家族の健康調査」に取り組んだ。これらの調査により、地域福祉・地域医療をはじめとする住民のいのちと暮らしを守るうえで果してきた積極的な部分、すなわち一般施策に教訓とすべき部分が明らかとなり、また同和対策事業によって新たに形成された克服すべき住民の自治・自立を妨げる事業手法の問題点も明らかとなった。部落問題の解決に積極的な役割を果している同和対策事業は"安心して子どもを産み育て老いることのできる地域政策"づくりのあり方を我々に教えているが、封建的身分を再確認し、身分をアイデンティティーとして固定化するような同和対策事業はその是正を求められている。初年度である平成7ねんど(1)1969年以前(同和対策事業特別措置法制定以前)より未解放部落を拠点として地域福祉活動を展開してきた社会福祉施設.機関に関する、当時の運営方針や内容を示す資料収集及び、当時の施設関係者、利用者の事業や活動に対する評価の聞き取り調査(2)1970年以後同和地区に設立され、地域福祉活動を展開してきた社会福祉施設の設立の目的や運営方針.事業内容を示す資料収集及び、それらの施設・施策・制度の理解度、利用度、貢献度に関する実態調査(3)これからの課題や市民の要求に関する調査を実施し、(4)また大阪府八尾市、和歌山県吉備町、同橋本市、京都市において「地域改善対策財政特別措置法」以後の事業の在り方を展望する政策研究会・検討会を開催し、地域保健福祉計画、子育て支援の地域の地域計画等の策定にも関わりつつ一定の方向を提起してきた。これらの取組みにより、一般対策、とりわけ保健・福祉対策事業の教訓とすべき同和対策事業が地域福祉推進のうえで果たしてきた積極的な部分と、逆に住民の自治・自立の妨げとなる部分が明かとなってきた。2年目にあたる平成8年度は新たに大阪府八尾市において「市民の暮らしの実態と人権・福祉に関する調査(仮)」を、和歌山県橋本市において「市民の健康実態調査」を実施し、本年度の実績とともに、研究成果を『部落問題の解決と地域福祉活動』としてまとめる。平成7年度は(1)同和対策事業特別措置法が制定される1969年以前、同和地区を拠点として地域福祉活動を展開してきた社会福祉施設である大阪市浪速区にあった「浪速温心寮」や「さかえ隣保館」「さかえ保育園」等の資料収集と関係者の聞き取り(2)京都市内同和保育所「乳幼児とその家族の生活調査」(3)大阪市内・府下衛星都市で生活する障害者(児)とその家族の生活調査(施策・制度の認知・利用・貢献度)(4)大阪府八尾市・和歌山県橋本市における福祉関係職員の意識調査(5)大阪府八尾市・和歌山県橋本市・京都市におけるこれからの地域福祉施策のあり方に関する政策研究に取り組んだ。平成8年度は新たに和歌山県橋本市で「乳幼児とその家族の健康調査」「妊婦とその家族の健康調査」に取り組んだ。これらの調査により、同和対策事業は戦後日本社会において部落問題という一つの社会問題の解決が可能であるということを初めて明らかにした取り組みであったが、その中でも地域福祉・地域医療をはじめとする住民のいのちと暮らしを守るうえで果たしてきた積極的部分-一般施策に教訓とすべき部分が明らかとなり、また同和対策事業によって新たに形成された克服すべき住民の自治・自立を妨げる事業手法の問題点も明らかとなった。安心して子どもを産み育て老いることのできる地域社会の具体像を同和地区に学ぶことができる。
植物病原糸状菌の宿主特異的毒素生成と宿主応答の分子機構

1.新規宿主特異的毒素の構造決定アブラナ科野菜黒すす病菌、トマト褐色輪紋病菌およびセイヨウナシbrown spot病菌では、新規宿主特異的毒素(HST)としてそれぞれAB、CCTおよびSV毒素を生産するが、これらHSTの中で、CCT毒素は、グルコースが結合した環状ペプチド(分子量2780.6)であることが明らかとなった。また、SV毒素では効率の良い単離・精製法が確立された。2.宿主特異的毒素生成機構リンゴ斑点落葉病菌は環状ペプチドHST(AM毒素)を生成するが、環状ペプチド合成酵素遺伝子配列から設計されたPCRプライマーを用いて、AM毒素生合成遺伝子のクローニングに成功した。さらに、本遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRによるリンゴ斑点落葉病菌の特異的検出法が確立され、本法から、最近、新潟県で発生しているセイヨウナシ黒斑病の病原菌がリンゴ斑点落葉病菌であることが明らかとなった。3.宿主特異的毒素応答機構リンゴ斑点落葉病感受性リンゴ品種に放射線を照射して得られた抵抗性変異体と元の感受性品種の蛋白質を二次元電気泳動法によって解析し、感受性品種のみに存在する60kDa、pI5のスポット(SA60)を見い出した。そこで、SA60を抽出し、アミノ酸配列を解析した結果、葉緑体シャペロニン(CPN60)と極めて高い相同性を示し、CPN60のホモログであることが示唆された。本菌の生産するAM毒素は、感受性リンゴ品種の葉緑体に直接作用するので、SA60がAM毒素受容に関与する因子である可能性が高い。
桜の葉に含まれるクマリン酸配糖体を用いた中高生向け酵素反応モデル実験の検討

中高生の理系科目への興味喚起や理科志向の動機付けを実験・体験を通じて行う際に主題の理解を深める為、五感を介して認識するようなモデル実験系の構築を目指し本研究を遂行した。日本人にとって最も身近な樹木のひとつであるサクラの葉を材料として、サクラ葉成分のクマリン酸配糖体が糖分解酵素β-グルコシダーゼにより分解される過程で生じる香気成分(クマリン)の分析や、酵素反応での分子構造変換による分子構造と物性の変化を、クロマトグラフィーでの検出に加えて、蛍光性、匂いの変化として感知する系を検討する。1構内のサクラ葉を6月、10月の2回採集し、水洗浄後-30°Cで保存しサンプルとした。2標品(クマリン酸配糖体(メリロトシド)、β-グルコシダーゼ、クマリン)を用いて、蛍光スペクトル、薄層クロマトグラフィー(TLC)を測定手段として酵素反応の経時変化、物性、等を検討し、反応条件を決定、生成物を同定した。結果、(1)クマリンの蛍光は325nm励起で、395-420nmの範囲に濃度、溶媒条件による蛍光極大を示す。β-グルコシダーゼによる糖分解反応は、37°C、0.1M酢酸ナトリウムー酢酸、pH5.6(pH3.2-11.0の緩衝液で検討)が至適条件である。(2)クマリン酸配糖体の酵素分解ではまずクマリニック酸が生成し、その後徐々に閉環してクマリンとなる。クマリニック酸は500nmに強い蛍光を示し、反応開始30秒で検出され、クマリンは、60分以降で検出されてくる。(3)TLC分画:シリカゲルを担体として2種類の溶媒系(酢酸エチル/ヘキサン)、(エタノール/アンモニア/水)で展開すると、メリロトシドと、中間生成物、クマリンの分離同定ができる。(4)上記反応進行により、クマリン芳香を感知できる。本研究により、モデル実験系を構築する基礎条件が得られた。
一分子計測法による複製フォークDNA特異的モーター蛋白質の機能解析

高精度で蛋白質やDNAの動きを計測、制御できる一分子計測技術を用いて、大腸菌のUvrDというDNAヘリケースやHolliday構造DNAの分岐点移動を促進するモーター蛋白質であるRuvBの機能解析を行った。またDNA塩基配列特異的にDNAと相互作用する小化合物Pyrrole-Imidazole polyamideの構造とDNAに対する結合解離速度との関連性を明らかにすることに成功しました。UvrDは蛍光標識されたATPを加水分解して、二本鎖DNAをほどくことを確認した。RuvB蛋白質については活性を保持した蛍光標識されたRuvBの作製に成功し、RuvBの六量体形成過程に関する研究を行った。RuvBの六量体形成には高濃度のRuvBが必要で、一分子レベルでの解析には新たな一分子蛍光イメージング技術が必要となり、本研究ではナノ開口基板と呼ばれる、次世代DNAシークエンサーに用いられる技術を応用して、Holliday構造DNA上でのRuvBの複合体が形成している様子を観察することに成功した。また、ADPやATPγS等の様々なヌクレオチドを用いることで、RuvBがどのような状況で、より六量体形成を促進するのかを明らかにすることができた。現在はこのRuvBの研究については論文投稿準備中である。また、本研究において、DNA塩基配列特異的にDNAと相互作用する小化合物Pyrrole-Imidazole(PI)polyamideを用いた研究を行った。蛍光標識したPI polyamideをNucleosomeに加えることで部位特異的にNucleosomeを蛍光標識することが可能となり、このような部位特異的に蛍光標識されたNucleosomeを用いて、Nucleosomeの動的変化を蛍光エネルギー移動効率を指標に解析することに成功しました(現在、論文投稿準備中)。また、この研究過程でPI polyamideの構造とDNAに対する結合解離のKineticsの関連性を明らかにすることに成功し、Nucleic Acids Research誌に発表した。高精度で蛋白質やDNAの動きを計測、制御できる一分子計測技術を用いて、大腸菌のDNAヘリケースの機能解析を行っている。具体的には個々のDNAヘリケースがATP一分子の加水分解で何bpのDNAをほどくのか?二本鎖DNAに正または負のスーパーコイルを導入する事で、それぞれのDNAヘリケースがどのように振る舞うのか?等のこれまでの解析では困難であった個々のDNAヘリケースのダイナミックな動きを解析する事が本研究の目的である。解析方法として、ガラス基板に蛍光標識された二本鎖DNAを固定し、二本鎖DNAの巻き戻しに伴うDNAの解離を観察すること、またはガラス基板に固定されたDNAの他端に蛍光標識された磁気ビーズを結合させることで、DNAの解離に伴うDNAの回転を蛍光標識磁気ビーズの回転として観察することでDNAヘリケースの機能解析を行っている。単量体または二量体で機能する大腸菌RecQまたはUvrDヘリケースについては蛍光標識された蛋白質の作製に成功し、ガラス基板上でDNAをほどく様子も観察できた。また、UvrDヘリケースについては蛍光標識されたATPを利用して、DNAをほどく事ができる事も確認できた。六量体リング構造で二本鎖DNAに結合する大腸菌RuvB蛋白質についても蛍光標識された蛋白質の作製に成功した。まだ、ステップサイズについての解析まで進展していないが、二本鎖DNA上での六量体形成過程を議論できるような結果がいくつか得られている。当初はDNAヘリケースによるDNAをほどく過程を観察するのは2年目の研究計画であったが、計画より、早くDNAヘリケースの機能解析が進んでいる。単量体や二量体で機能する大腸菌RecQやUvrDヘリケースでは、蛍光標識RecQやUvrDの作製に成功し、その動きを蛍光標識DNAと共に同時観察することで解析する系を確立する事ができた。また、UvrDでは蛍光標識ATPを利用して、二本鎖DNAをほどく事が確認でき、UvrDのステップサイズを測定するだけでなく、UvrDがATPを結合してから、加水分解し、その後ADPの解離までの間にUvrDはどのような挙動を示すのかを明らかにする事が大いに期待できる。また、六量体で機能する大腸菌RuvBについても蛍光標識RuvBの作製に成功した。こちらは現在、RuvBの六量体形成過程を解析している。UvrDが現在、蛍光標識ATPを加水分解して、二本鎖DNAをほどくと言う事を明らかにできたので、それを直接観察する事が今後の研究の推進方策の一つである。研究は研究計画で計画したようにそれぞれの蛍光分子を光学顕微鏡で観察する予定である。

また、RuvBも現在、蛍光標識RuvBを用いる事でRuvB多量体の様子を観察できるようになったので、UvrDと同様に光学顕微鏡上でのどのようにして二本鎖DNA上で六量体を形成するのかをATPや加水分解できないATPアナログであるATPγSそして加水分解されたADP等を用いて、RuvBのDNA上での複合体の状況を観察する事がもう一つの今後の研究の推進方策だと考えている。現在は継続して蛍光標識蛋白質、DNAやATPの観察を行っていて、その作製に必要な試薬、そして、それらを光学顕微鏡上で観察するための石英ガラスの購入が次年度の研究費の主たるものとなる。また、今回の研究の結果、現在論文を投稿中で、次年度ではこの論文の雑誌への掲載料にも使用する予定である。そして、そのような研究結果を発表するために国内および海外の学会にも参加し、発表する予定であり、そのためにも研究費を使用する予定である。