hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳・神経細胞の維持における活性酸素によるDNA傷害の修復機構の役割

細胞におけるMTH1蛋白質の局在を解析し、細胞質とミトコンドリアに局在すること、さらにMYH、OGG1蛋白質が核とミトコンドリアに局在することを明らかにした。(3) 3つの遺伝子の欠損マウスの作成と解析MTH1、OGG1、MYHの単独の遺伝子欠損マウスを樹立した。現在、二重遺伝子、三重遺伝子欠損マウスの樹立進めている。(4)脳・神経細胞の生存に於けるMTH1遺伝子産物の役割の解明MTH1に対する特異的抗体を用いた免疫染色法およびウエスタンブロットによりパーキンソン病の患者の中脳黒質のドーパミンニューロンにMTH1が特異的に発現していることを見い出した。コントロールの患者の中脳黒質のドーパミンニューロンには全く発現は見出せなかった。パーキンソン病患者の中脳黒質のドーパミンニューロンでは8-oxoGも高度に蓄積しており、酸化ストレスとパーキンソン病の関連が強く示唆され、MTH1の発現誘導が、ドーパミンニューロンの生存維持に寄与している可能性が示唆された。我々は、脳・神経細胞の維持における活性酸素によるDNA傷害の修復機構の役割を解明する目的で,「DNAの酸化障害とその防御機構」について研究を進め、ヒト脳・神経細胞が酸化されたDNAを効率よく修復する酵素とそのヌクレオチド前駆体の酸化体を分解、排除する酵素を備えていることを明らかにした。(B)OGG1遺伝子は,DNA中のシトシンと対合している8-オキソグアニンを特異的に切り出す8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼをコードするが,スプライシングの違いにより核型(OGG1-1a)とミトコンドリア型(OGG1-2a)が合成されることを明らかにした。(C)MYH遺伝子はDNA中の8-オキソグアニンが複製時に誤って対合したアデニンを特異的に切り出すアデニンDNAグリコシラーゼをコードするとされていたが,アデニンの酸化体2-OH-アデニンをDNA中から除去修復する活性を持つことを明らかにした。このような酵素群は,核とミトコンドアリアに存在することから,核とミトコンドリアのゲノムを維持するためには,酸化DNA損傷の修復機構が重要と考えられる。さらに,これらの蛋白質の筋萎縮性側索硬化症(ALS)とパーキンソン病(PD)患者における発現解析を進め,(1)ALS,PDともに患者の変性部位の神経細胞に酸化塩基「8-オキソグアニン」が蓄積していること,(2)さらにPD患者においてはMTH1蛋白質の発現亢進,(3)ALS患者においてはミトコンドリア型OGG1蛋白質の発現低下を認めた。以上の結果はヒトの脳・神経細胞の障害にDNAの酸化損傷の蓄積,あるいはその修復系の異常が関与する可能性を示唆する。本研究においては,脳・神経細胞の維持におけるDNAの酸化傷害の修復系の役割を明らかにし,その分子機構を解明することを目指している.平成12年度はDNAの酸化傷害の中でも複製,転写時に誤まった塩基対の形成をひき起こすため突然変異と異常蛋白質の生成の原因となる8-オキソグアニン(8-oxoG)と2-ヒドロキシアデニン(2-OH-A)に注目し,そのDNAへの取込みの抑制や修復に関わるMTH1とOGG1に焦点を当て解析を行い,以下の成果を得た.
ヒト骨髄におけるNKおよびLAK前駆細胞の分化促進因子の研究

《目的》本研究ではインターロイキン2(1L2)依存性のヒト骨髄NK前駆細胞の分化促進因子を見出すことを目的とした.《方法》健常人から骨髄を採取し,比重遠心法により単核球を分離した.これらをナイロンウールカラムに通し粘着細胞を除去した後,半赤血球ロゼット形成法,単クローン抗体(T101, OKM1, OKT11, Leu111)+家克補体処理により成熟型TおよびNK細胞を除去した.既報のごとくこれらの前処理細胞を組換え型1L2(γ1L2)添加イスコフDMEM培地に浮遊し培養した.この培養系に組換え型1L1(γ1L1)γインターフエロンα(γIFNα)rIFNγ, TNFをそれぞれ添加し, ^3Hチミジン摂取, NK活性および表面形質の発現におよぼす影響を観察した.《結果》(1)1L11100U/mlを培養系に添加すると培養7日目の^3Hチミジン摂取が1L1の濃度依存性に増加し100U/mlで最高となった.第8日目のNK(K562)活性も1L1添加により増大した.培養21日目にFACSIVにより表面形質を観察すると,成熟型(NKH1^+CD16^+)NK細胞の比率は, 1L2単独群では5-10%であった.これに対し1L2+1L1添加群では成熟型が20-25%であり成熟型の増加を認めた.さらに1L1添加群では, CD2陽性率も増加傾向を示した.(2)上記の培養系にIFNαを添加すると^3Hチミジン摂取, NK活性発現ともに濃度依存性に抑制された.IFNα添加培養21日目では, NKH1^+細胞の比率は有意に低下したが,その中の成熟型の比率には変化なかった. γIFNα添加培養では, ^3H摂取, NK活性の発現に対する抑制効果はIFNαに比して少なく, NKH1^+細胞率にも著変なかった. (3)TNFの効果は, IFNαとほぼ同様であった.《結論》以上の結果から次の結論を得た. (1)1L1は,骨髄NK前駆細胞の分化促進傾向を示したが,全細胞の成熟を完成させるには他の要因が必要と考えられる.(2)IFNα, IFNγおよびTNFにはNK細胞の分化促進作用を認めない.《目的》本研究ではインターロイキン2(1L2)依存性のヒト骨髄NK前駆細胞の分化促進因子を見出すことを目的とした.《方法》健常人から骨髄を採取し,比重遠心法により単核球を分離した.これらをナイロンウールカラムに通し粘着細胞を除去した後,半赤血球ロゼット形成法,単クローン抗体(T101, OKM1, OKT11, Leu111)+家克補体処理により成熟型TおよびNK細胞を除去した.既報のごとくこれらの前処理細胞を組換え型1L2(γ1L2)添加イスコフDMEM培地に浮遊し培養した.この培養系に組換え型1L1(γ1L1)γインターフエロンα(γIFNα)rIFNγ, TNFをそれぞれ添加し, ^3Hチミジン摂取, NK活性および表面形質の発現におよぼす影響を観察した.《結果》(1)1L11100U/mlを培養系に添加すると培養7日目の^3Hチミジン摂取が1L1の濃度依存性に増加し100U/mlで最高となった.第8日目のNK(K562)活性も1L1添加により増大した.培養21日目にFACSIVにより表面形質を観察すると,成熟型(NKH1^+CD16^+)NK細胞の比率は, 1L2単独群では5-10%であった.これに対し1L2+1L1添加群では成熟型が20-25%であり成熟型の増加を認めた.さらに1L1添加群では, CD2陽性率も増加傾向を示した.(2)上記の培養系にIFNαを添加すると^3Hチミジン摂取, NK活性発現ともに濃度依存性に抑制された.IFNα添加培養21日目では, NKH1^+細胞の比率は有意に低下したが,その中の成熟型の比率には変化なかった. γIFNα添加培養では, ^3H摂取, NK活性の発現に対する抑制効果はIFNαに比して少なく, NKH1^+細胞率にも著変なかった. (3)TNFの効果は, IFNαとほぼ同様であった.《結論》以上の結果から次の結論を得た. (1)1L1は,骨髄NK前駆細胞の分化促進傾向を示したが,全細胞の成熟を完成させるには他の要因が必要と考えられる.(2)IFNα, IFNγおよびTNFにはNK細胞の分化促進作用を認めない.
三次元アニメーション像による直腸肛門奇形患児の術前術後評価

本研究では、直腸肛門奇形(以下鎖肛)患児の術前術後にコンピュータ上で骨盤部臓器の三次元アニメーション像を作成して、筋群と腸管の解剖学的位置関係を把握し、病型による差異、各術式による差異を明かとし、各術式における問題点を明らかにしようとした。研究計画に従い、術前術後鎖肛患児について骨盤底のMRI像を撮影する一方、パーソナル・コンピューター式を購入し、MRI付属のソフトウェア、およびパーソナルコンピュータによる画像処理により、各症例の骨盤部三次元表示像(静止画像、アニメーション像、バーチャルリアリティ画像)を作成した。その結果、術前症例では、対照例と鎖肛症例との三次元表示像の比較により、低位症例では、瘻孔が括約筋筋塊の前方を貫くのが観察され、肛門形成術の目的は本来の直腸肛門の描く曲線を作成することととらえられた。高位鎖肛症例では、直腸盲端の位置が立体的にとらえられるとともに、理想的な腸管貫通経路は、肛門挙筋の前方で会陰横筋が中央で合する点を同定して直腸を導き、この点と肛門窩の中心とを結ぶ経路を正確に作成して直腸肛門角を形成することであると考えられた。この成果は、日本小児外科学会雑誌(第32巻7号)に論文発表し、第5回コンピュータ外科学会(平成8年10月)において口演発表した。また、術後症例に対しても術式別に検討を加え、筋群と直腸肛門の位置関係は、(1)直腸肛門が前方に凸の曲線を描き、対照と同様に筋群を貫くもの、(2)直腸肛門が前方に凸の曲線を描かず、筋群の前方を貫くもの、(3)直腸肛門が正中より側方に偏位して筋群を貫くもの、(4)筋群の断裂などその他の所見を呈するものに分類した。さらに、術式別に臨床的状態との対比を試み、第34回日本小児外科学会総会(平成9年6月)で口演発表予定である。
一過性全脳虚血モデルにおけるRhoキナーゼ阻害薬ファスジルの脳微小循環への影響

一過性全脳虚血モデルにおけるRhoキナーゼ阻害薬ファスジルの脳微小循環への影響を検討した。日本白色家兎に頭窓法を設置し、生体顕微鏡下で脳軟膜上動静脈を観察した。ネックターニケット法を用いて、一過性全脳虚血を導入し、その前後における脳微小循環とファスジルが及ぼす影響について検討した。ファスジルは、二酸化炭素や吸入麻酔薬による脳血管拡張反応に影響を及ぼさなかった。また一過性全脳虚血を導入すると二酸化炭素や吸入麻酔薬による脳血管拡張応答は消失したが、ファスジルはこれを回復させなかった。ファスジルは、脳低体温中の脳微小循環に対しても影響を及ぼさなかった。以上より、ファスジルはそれ自体も、二酸化炭素や吸入麻酔薬による脳血管応答にも影響を与えないため、安全に使用できる薬剤である。ペントバルビタールで麻酔した日本白色ウサギに頭窓を作成した。ネックターニケットを装着し,二酸化炭素応答とアセチルコリンに対する脳軟膜動脈血管の反応を,生体顕微鏡を用いて直接観察できるように設定した。これはネックターニケットにより,体表から700mHの圧を加えることにより,一過性に全脳虚血を作り出すことができる方法である。また脳動脈を直接結紮する方法と比べて,簡便かつ低侵襲であるので,生体に大きな負担が加わらないため,より臨床現場にそくした動物モデルと考えられる。さらに頭窓法により,脳軟膜静動脈を直接観察できるため,虚血状態の定量評価もよういである。本研究では,生体顕微鏡可の観察により一過性全脳完全虚血に維持されていることを確認した。6分間の一過性全脳完全虚血により,ターニケット前で認められていた二酸化炭素応答は完全に消失した。まず,常温におけるリドカインを脳虚血前後に脳槽内に注入し,脳軟膜情動静脈の血管応答を観察した。二酸化炭素応答は100マイクロm以上と未満の血管が,1.2±0.6mcm/mmHg,1.7±0.9mcm/mmHgが,0.3±0.5,0.4±0.5mcm/mmHgとなった。リドカインでは,10-3Mから-6Mの濃度で投与したが,いずれも投与前,投与後とも脳軟膜静動脈を拡張させた。また拡張した程度は虚血前と同程度であった。アセチルコリンは実験終了後に,脳血管内皮と神経細胞の障害の程度を確認するために用いた。ネックターニケットを装着し、二酸化炭素応答とアセチルコリンに対する脳軟膜動脈血管の反応を、生体顕微鏡を用いて直接観察できるように設定した。これはネックターニケットにより、体表から700mHの圧を加えることにより、一過性に全脳虚血を作り出すことができる方法である。また脳動脈を直接結紮する方法と比べて、簡便かつ低侵襲であるので、生体に大きな負担が加わらないため、より臨床現場にそくした動物モデルと考えられる。さらに頭窓法により、脳軟膜静動脈を直接観察できるため、虚血状態の定量評価もよういである。本研究では、生体顕微鏡可の観察により一過性全脳完全虚血に維持されていることを確認した。6分間の一過性全脳完全虚血により、ターニケット前で認められていた二酸化炭素応答は完全に消失した。まず、常温におけるファスジル10^<-5>10^<-7>モルを脳虚血前後に脳槽内に注入し、脳軟膜情動静脈の血管応答を観察した。二酸化炭素応答は100マイクロメートル以上と未満の血管が、1.0±0.5 micrm/mmHg、1.8±1.0 micrm/mmHgであったが、ファスジルによって有意な二酸化炭素応答の血管拡張は得られなかった。ネックターニケット後の反応も同様で、ファスジルは二酸化炭素応答の消失を回復させなかった。ペントバールビタールで麻酔した日本白色家兎に頭窓を作成した。ネックターニケットを装着し、二酸化炭素応答とアセチルコリンによる脳軟膜動静脈の反応を、生体顕微鏡を用いて直接観察できるように設定した。これはネックターニケットにて体表から700mmHgの圧を加えることにより、一過性に全脳虚血を低侵襲で作り出すことができる方法である。従来の方法と比べて手術侵襲が省ける特長を持つ。ファスジルを全身投与および脳槽内に投与した後に、二酸化炭素応答とアセチルコリンによる脳血管応答を、一過性全脳虚血の導入前後にわたり観察した。脳槽内に投与するファスジルは10^<-5>から10^<-7>モルを用いた。全身投与ではファスジルを1mg/kg投与した。

常温における観察下では、ファスジルは、脳軟膜動静脈の二酸化炭素に対する応答を変化させなかった.また一過性全脳虚血を導入しても、やはり二酸化炭素応答は回復させなかった。一過性全脳虚血後では、二酸化炭素に対する反応性は失われたままであったが、アセチルコリンに対する反応性は回復させたが、フナスジルはこれに影響を与えなかった。日本白色家兎の直腸温を33度に低下させて同様の研究を行った。しかし、低体温により、二酸化炭素応答は抑制させたが、脳槽内へのファスジルの併用による影響は認められなかった。以上よりファスジルは一過性全脳虚血後の脳微小循環には影響を与えないと考えられた。
中学校数学の一斉授業を志向したコンピューター利用の関数・図形教材の開発とその試行

1.研究の目的中学校数学の関数・図形領域を対象に、教室に1台のパソコンを持ち込み、数学上の性質や法則などを子ども自身が発見する、気づくことを側面から援助するような、動的で視覚的な教材を開発し、その一部を実際の数学の授業で試行することによって、一斉授業形態における1台のパソコンの利用法の有効性と問題点とに関する実証的な検討飼料を得ることを目的とする。2.教材分析とコンピューター利用教材の開発関数・図形領域について、1.の目的達成を意図した教材分析を行うとともに、コンピューター利用教材を開発した。開発した教材は、関数に関しては「点の位置と座標」「原点の移動と座標の変化」「Xの2乗に比例する関数グラフの特徴」、図形に関しては「直線と角」「平行線と角」である。3.教材の試行2.に示した教材のうち、「点の位置と座標」「Xの2乗に比例する関数のグラフの特徴」の二つについて、中学生を対象に実際の数学の授業で試行した。4.得られた知見(1)1台のパソコンであっても、教材提示用機器として、数学の授業には十分有効である。子どもは楽しくかつ充実した学習をした。(2)多様な視点さえ含んでいれば、教材がどんなに単純なものであっても子どもはさまざまなことを思考する。(3)このような子どもの思考の多様さは、同一個人というよりも、集団としてひろがりをもつので、授業実施にあたっては、個々人の考えを集団で話し合う機会をもつことが必須条件である。
好中球エラスターゼ阻害剤による致死的放射線肺障害の防止に関する実験的研究

C57BL/6J(12週齡雌)マウスの全肺に20Gy照射直前、照射後1+3+6時間目に好中球エラスターゼ阻害剤(シベレスタットナトリウム水和剤)を反復投与することにより、最も重篤化して問題となる急性肺障害の発症を防止・低減し生存率の改善に寄与しただけでなく、引き続いて起こる晩期障害である肺の線維化を軽減することも病理組織学的に明らかにし得た。好中球エラスターゼ阻害剤は放射線治療に伴う放射線肺障害を防止に期待が持てる。C57BL/6Jマウス(8週齢雌)を使用し、頭部と腹部はブロックし、フォーレン麻酔下にて両側肺に照射した。線量は12Gyを1回で投与した。好中球エラスターゼ阻害剤としてシベレスタットナトリウム水和剤(SN剤)を30mg/kgを照射直後、3時間後,6時間後,12時間後に腹腔内に1回投与した。血漿中のNE活性は照射24時間後に血液を遠心分離し、上清をただちに凍結保存したのちに血漿中の好中球エラスターゼ活性を測定した。採血後は肺を摘出しホルマリン固定した後にHE染色とN-ASDCLA染色を行った。照射後24時間後に好中球エラスターゼ活性は照射単独群とくらべ照射3時間,6時間後SN投与群で有意な低下を示した。N-ASDCLAは好中球系細胞で強い活性を示し、エラスターゼ陽性顆粒は赤茶褐色に染色される。肺浸潤N-ASDCLA陽性細胞数は照射3時間,6時間,12時間後SN剤投与群で照射後に増加した。すなわちSN剤は好中球からの末梢血中への遊離を阻害することが示された。HE染色で放射線照射群では、肺胞内好中球浸潤、血管周囲の浮腫、肺胞壁の変性、壊死等が認められ、SN剤投与群ではこれらの変化は軽度であった。エラスターゼ阻害剤は放射線肺障害を抑制し、その効果は放射線照射後早期にSN剤を投与することが必要であり、かつSN剤の体内半減期(3時間)を考慮すれば2回以上の投与が望ましいと考えられた。急性肺障害の発症の時期と致命率は動物種により極端に異なることが判っている。今回の実験でエラスポールの肺障害防止効果を明確にするためにC57BL/6J(8週齢雌)の投与線量と致死率・肺障害の状況を様々な線量を投与することにより明らかにした。各線量群ごとに15匹のマウスを用意し、そのうちの10匹は生存率を求めるために、残りの5匹は急性肺障害の組織学的観察のために用いた。今回の実験では14Gy, 16Gy, 18Gy, 20Gy, 22Gy, 24Gyを肺に1回照射した。14-16Gy照射群では照射後90日以上の経過観察にても死亡したマウスはなかった。しかし、18Gy照射群では照射後10日目より死亡例がみられ、照射後40日目で生存率が40%まで低下した。同様に20Gy照射群では照射後10日目、24Gy照射群では照射後6日目にそれぞれ生存率が40%まで低下した。照射後6日目,10日目,14日目に肺を摘出して組織学的に急性肺障害の有無と程度を観察した。14-16Gyでは肺には目立った障害は生じなかった。しかし、18Gy以上では浮腫・充血・出血等の急性反応が見られ、その程度は線量の増加とともに増強し、かつより早期に生じた。よって本実験モデルとして20Gy1回照射が最も適していると考えられた。そこで次に肺に20Gy照射後エラスポールを1, 1+3, 1+3+6, 1+3+6+12時間目に腹腔内投与した。1+3+6時間目にエラスポールを投与した群で最も生存率の改善が見られ、照射後6日目の肺障害の程度も軽微であった。ただし、おそらく放射線による肺障害は回復が急速に見られるために、エラスポールによる肺障害防止効果をより明確にするためには肺障害の組織学的解析の時期をこまめに行う必要があると考える。そのために平成23年度は照射後1, 3, 5, 7日目に肺組織を摘出して肺障害の推移をより詳細に解析する予定である。好中球エラスターゼ阻害剤(シベレスタットナトリウム水和剤)が放射線肺障害の防止・低減に対して有効であることを明らかにし、放射線治療の結果生ずる肺障害の中で、最も重篤化して問題となる急性肺障害の発症の防止・低減に資することを目的として以下の検討を行った。C57BL/6Jマウス(8週齢雌)を用いて14,16,18,20,22,24 Gyを肺に1回照射した。

14-16 Gy照射群では照射後90目以上の経過観察にても死亡したマウスはなかった。しかし、18 Gy照射群では照射後10日目より死亡例がみられ、照射後40日目で生存率が40%まで低下した。同様に20 Gy照射群では照射後10日目、24 Gy照射群では照射後6日目にそれぞれ生存率が40%まで低下した。照射後6日目,10日目,14日目に肺を摘出して組織学的に急性肺障害の有無と程度を観察した。14-16Gyでは肺には目立った障害は生じなかった。しかし、18 Gy以上では浮腫・充血・出血等の急性反応が見られ、その程度は線量の増加とともに増強し、かつより早期に生じた。よって本実験モデルとして20 Gy1回照射が最も適していると考えられた。次に肺に20 Gy照射後エラスポールを1,1+3,1+3+6,1+3+6+12時間目に腹腔内投与した。1+3+6時間目にエラスポールを投与した群で最も生存率の改善が見られ照射後6日目の肺障害の程度も軽微であった。放射線障害防止効果をマウスの生存期間・生存率にて評価した結果をもとにして、マウスが死亡する予想時期の前にマウスを屠殺して摘出・保存した肺は後にHEおよび鍍銀染色にて線維化を観察しシベレスタットナトリウムの肺線維化防止効果を定量的に評価した。その結果、シベレスタットナトリウムは急性障害に引き続いて起こりうる肺線維化の抑制にも有効であることを明らかにした。
骨髄細胞の細胞表面態鎖改変による肝細胞分化誘導と肝細胞移植療法の開発

近年,骨髄細胞が造血系の細胞のみならず様々な組織に分化する可能性が報告されており,肝細胞にも分化することが示唆されている.このようなことから骨髄細胞を肝臓疾患に対する細胞移植療法の細胞ソースとして利用することが注目されている.しかしながら,この骨髄細胞の肝細胞分化に関してその頻度は大変低く,また肝細胞分化ではなく骨髄細胞と肝細胞との細胞融合であるということが報告され,骨髄細胞の肝細胞療法には否定的な報告も多い.このような中で申請者らは,骨髄細胞の肝細胞に対する接触頻度を上昇させれば,分化ないし細胞融合の頻度が上昇し骨髄細胞由来の肝細胞を数多く出現させることが期待できると仮説を立て検討を行ってきた.骨髄細胞を肝臓に集積させるために骨髄細胞表面をシアリダーゼで処理行い,骨髄細胞表面にガラクトース糖鎖を出現させた.これらの骨髄細胞は,肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターと呼ばれるガラクトース結合性のレセプターに認識されるようになる.このような処理を施した骨髄細胞をウィルソン病のモデルラットであるLECラットに投与したところ,骨髄細胞の肝臓への集積と骨髄由来肝細胞の出現を認めた.骨髄由来肝細胞の遺伝子発現を検討したところ,LECラットが欠損しているATP7B遺伝子を発現していることが明らかになった.このことから骨髄細胞移植によって欠損した遺伝子を補充することのできる遺伝子治療ができる可能性が示唆された.骨髄細胞を用いた肝再生医療を実現するためには,移植された骨髄細胞の効率の良い肝臓の集積と骨髄細胞由来の肝細胞の出現が重要である.本研究において我々は,骨髄細胞の細胞表面の糖鎖をシアリダーゼで処理することでガラクトースを表面に露出させる改変を行った.その結果,骨髄細胞をシアリダーゼで処理したところ細胞表面にガラクトースを露出させることが可能であることを,蛍光標識ガラクトース結合レクチンを用いたフローサイトメトリーで確認した.このシアリダーゼ処理骨髄細胞を培養ラット肝細胞と共培養したところこれらの骨髄細胞は,肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターを介して高い効率で接着していることが明らかになった.さらにこれらの骨髄細胞をラットに尾静注したところ肝臓に高効率で集積させることが可能であることが明らかになった.このことから骨髄細胞をシアリダーゼで処理することで骨髄細胞表面にガラクトースを露出させることが可能になることが明らかになり,さらに尾静注でラットに投与することでこれらの骨髄細胞を肝臓に効率良く集積させることが可能になった.次にこれらの骨髄細胞をウィルソン病のモデルラットであるLECラットに投与することで,骨髄細胞による代謝性疾患の治療が可能になるか検討を行った.シアリダーゼ処理骨髄細胞をLECラットに投与して5ヶ月後にこれらのラットの肝臓の凍結切片を確認したところ,骨髄由来の遺伝子を持つ肝細胞のコロニーが多数存在していることが明らかになった.さらにこれらのコロニーについて遺伝子発現をRT-PCRで検討したところ,LECラットが欠損しているATP7Bを発現していることが明らかになった.また血液中のセルロプラスミンの活性を調べたところ通常のLECラットと比べて高い活性を持ったセルロプラスミンを分泌していることがわかった.以上のことから骨髄細胞をシアリダーゼ処理をすることで肝臓への集積を促進することが可能になり,さらに骨髄由来の遺伝子を持つ肝細胞を出現させ血中のセルロプラスミンの活性を改善させることに成功した.これらの骨髄細胞を用いた代謝性肝疾患の新たな治療法の開発が期待される.骨髄細胞のシアリダーゼ処理による細胞表面のガラクトース露出を蛍光標識ガラクトース結合タンパク(レクチン)のFACS解析で検討したところ,骨髄細胞表面においてガラクトース末端を持つ糖鎖が存在していることが明らかになった.このアシアロ化骨髄細胞を細胞膜染色物質PKH26で染色し,これを正常ラットに尾静注で投与したところ,処理された多くの骨髄細胞が肝臓に集積していることを明らかにした.次に代謝性肝疾患モデルラット(LECラット:ウイルソン病のモデルラット)にシアリダーゼ処理を行ったアシアロ化骨髄細胞を尾静注にて投与を行った.その結果,骨髄細胞由来の肝細胞の出現を確認することができた.そして血清のセルロプラスミンの活性わずかではあるが,改善傾向が確認された.さらに骨髄細胞由来の肝細胞が細胞融合かもしくは分化転換で出現したのか確認するために,骨髄細胞はアルブミンを発現するとDsRed(蛍光物質;赤)を発現するDsRed-Albumin promoterラットからのものを採取し,EGFP(蛍光物質;緑)を恒常的に発現する肝細胞と共培養を行った.その結果,培養条件下においてEGFPとDsRedを同時に発現している肝細胞の出現が認められ,骨髄細胞と肝細胞は細胞融合していることが明らかになった.以上のことから骨髄細胞表面にガラクトース末端を持つ糖鎖を出現させることで効率よく肝臓に集積させることができ,さらに骨髄細胞由来の肝細胞を出現させることに成功した.近年,骨髄細胞が造血系の細胞のみならず様々な組織に分化する可能性が報告されており,肝細胞にも分化することが示唆されている.このようなことから骨髄細胞を肝臓疾患に対する細胞移植療法の細胞ソースとして利用することが注目されている.しかしながら,この骨髄細胞の肝細胞分化に関してその頻度は大変低く,また肝細胞分化ではなく骨髄細胞と肝細胞との細胞融合であるということが報告され,骨髄細胞の肝細胞療法には否定的な報告も多い.このような中で申請者らは,骨髄細胞の肝細胞に対する接触頻度を上昇させれば,分化ないし細胞融合の頻度が上昇し骨髄細胞由来の肝細胞を数多く出現させることが期待できると仮説を立て検討を行ってきた.

骨髄細胞を肝臓に集積させるために骨髄細胞表面をシアリダーゼで処理行い,骨髄細胞表面にガラクトース糖鎖を出現させた.これらの骨髄細胞は,肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターと呼ばれるガラクトース結合性のレセプターに認識されるようになる.このような処理を施した骨髄細胞をウィルソン病のモデルラットであるLECラットに投与したところ,骨髄細胞の肝臓への集積と骨髄由来肝細胞の出現を認めた.骨髄由来肝細胞の遺伝子発現を検討したところ,LECラットが欠損しているATP7B遺伝子を発現していることが明らかになった.このことから骨髄細胞移植によって欠損した遺伝子を補充することのできる遺伝子治療ができる可能性が示唆された.
ゴードン・クレイグの日本人形劇受容に関する草稿研究

本研究は20世紀に活躍した英国の演出家ゴードン・クレイグが日本の人形劇をいかに受容し、どのような影響を受けたかについて、彼の手書きの草稿等を対象に検討するものである。そのために報告者はまず、フランス国立図書館に所蔵されている彼に関する資料を調査収集し、その内容を分析した。その後、その成果を踏まえ彼の演劇論や舞台作品とそれら資料の関連を明らかにし、学会等で報告を実施した。本研究によって得られた成果をもとに、今後はクレイグが日本の人形劇に与えた影響とその波及について検討を行なっていく予定である。本研究はゴードン・クレイグの「俳優と超人形」をはじめとする演劇論やその他演劇活動に、日本人形劇がいかなる影響を与えていたかについて資料調査を踏まえて明らかにし、その成果を網羅したデータベースを作成するものである。当初の計画では本年度に海外のクレイグ資料調査に出向く予定であったが、前年度までの調査により収集済みであった資料を子細に検討したところ、本研究と密接に関わる記述を複数発見した。そのことを受け、本年度は予定を変更してフランス国立図書館、テキサス大学オースティン校、大阪大谷大学にてこれまで収集してきた資料分析を重点的に行なった。本年度はとりわけ、発表された20世紀当時から現代まで多くの議論を呼び続けているクレイグの代表的な演劇論「俳優と超人形」との関連についての分析を行なった。この演劇論の中でクレイグは、人間俳優に代わって登場すべき理想の演技者として超人形を提起しているが、その定義は「曖昧」で「非現実的」な概念と評されることが少なくない。しかし、報告者が検証を行なった未発表資料の中で、クレイグが日本人形劇の特に人形浄瑠璃に着目し、その人形遣いと人形の表象を自身の創始した超人形と関連付けていることが分かった。この事実が極めて興味深いのは、クレイグがそもそも舞台に登場する人間俳優の身体が理性や感情に支配されることを嫌い、それを避けるために超人形という概念を創始したという背景による。すなわち、これまで学術研究の分野で高く評価されてきたとはいえない超人形という概念を考察するにあたり、彼の日本人形劇受容のありようを踏まえることが重要な手掛かりとなる可能性が出てきたのである。以上のことから本年度の研究によって、超人形という概念の根源には日本人形劇の特異な上演形態からの影響を見出しうる可能性が浮かび上がり、更なる検証を行なう必要が生じることとなった。本研究は、ゴードン・クレイグの「俳優と超人形」をはじめとする演劇論やその他演劇活動と、日本人形劇にどのような関連を見出せるかについて資料調査を踏まえて検討するものである。本年度は当初の研究計画通り、フランス国立図書館に出向き、クレイグに関連する資料の調査を行なった。帰国後は本年度収集した資料だけでなく、前年度までに収集済みの資料についての検証作業も実施した。前年度は日本人形劇と「俳優と超人形」の関連について重点的に検討を行なったが、本年度はクレイグの他の演劇論や人形劇作品にもその対象を広げた。そうしたことによって、クレイグの演劇活動において日本人形劇がどの程度重要であったのかを改めて検討することが出来た。こうした作業から明らかになったのは主に二点である。一点目は、日本人形劇はクレイグの演劇活動において重要な霊感源のひとつであったということ、そしてもう一点目は、クレイグが日本人形劇に対しそれほど正確な知識は持ち合わせておらず、そのことを踏まえると演劇論や作品への彼の「引用」を分析するには、それが「誤解」を大いに含むものであったことを念頭に置く必要があろうということである。もちろん前年度までに明らかになったような、クレイグの超人形のイメージに日本人形劇における操り手と人形の関係が見出せる点などは極めて興味深い事実である。しかし一方で、日本人形劇がクレイグのもとにどのような「ねじれ」をはらんで伝わっていたかについては、本研究で収集した資料をもう少し慎重に検証する作業を経なければ明らかにはならないだろう。よって次年度はその点を含めて改めて資料を検討し、最終的な成果へと結びつけていきたい。「研究実績の概要」でも示したように、本年度は当初の予定通り、フランス国立図書館へ出向き、クレイグの未発表資料の収集とその検証作業を行なった。次年度に向けての課題もそうした作業の中から抽出できたためおおむね順調に進展しているといえる。本研究計画はゴードン・クレイグが日本人形劇をどのように受容し、それが彼の演劇論や舞台作品にどのように影響を与えていたかを明らかにすることを目的とするものであった。26、27年度は主に資料収集とその分析を実施し、クレイグが日本の人形浄瑠璃をはじめとする人形劇にいかに強い関心を示していたかを明らかにした。28年度は前年度までの調査等で収集した資料とその情報をもとに成果発信につとめた。当初はクレイグがいかに日本人形劇を受容し得たかという観点に絞った検証を行なう予定であったが、20世紀初頭から第二次大戦前後の状況を鑑みると、クレイグが日本人形劇、人形文化に与えた影響もまた小さくないということが分かってきた。つまりそこには相互的な影響関係を見出すことが出来、その双方を検証しなければ十全な成果は得られないのである。そうした点を考慮し、28年度はクレイグが日本人形劇に与えた影響やその波及まで視野に入れて検討を行なった上で、成果発信を行なった。当初予定していたよりもより広範な対象が扱われることとなったが、そのことによってクレイグという人物の重要性やその演劇論の強度が再確認された。

以上のことから報告者は今後、クレイグを起点とした大正から昭和にかけての日本人形劇の活動の実態とその波及について新たに検討を行なう予定である。そのことによって、これまで十分に学術的検討がなされてきていないこの時期の日本人形劇を研究するための新たな切り口を提示することが可能になるはずである。本研究は20世紀に活躍した英国の演出家ゴードン・クレイグが日本の人形劇をいかに受容し、どのような影響を受けたかについて、彼の手書きの草稿等を対象に検討するものである。そのために報告者はまず、フランス国立図書館に所蔵されている彼に関する資料を調査収集し、その内容を分析した。その後、その成果を踏まえ彼の演劇論や舞台作品とそれら資料の関連を明らかにし、学会等で報告を実施した。本研究によって得られた成果をもとに、今後はクレイグが日本の人形劇に与えた影響とその波及について検討を行なっていく予定である。「研究実績の概要」においても示したように、本年度は当初の予定を変更して既に収集済み未発表資料の検証を行なった。これは当初計画されていた作業を一部前倒しして行なったものであるため大きな変更とはいえず、上記の通り一定の成果を上げることが出来たため、おおむね順調に進展しているといえる。本研究課題の今後の推進方策として、来年度は最終年度であるため、成果の発信につとめる。そのためにこれまでに収集、検証を行なった資料をもとに研究報告を実施する予定である。人形劇本研究課題の今後の推進方策として、来年度は本年度中に行なう予定であった海外機関への出張をし、資料調査・収集を行ない、一定の成果を上げることを目指す。なお本研究において収集する予定の資料の中には手書きのものが多く含まれているため、それらを整理・解読してデジタル化し作品についての情報を記したデータベースも順次作成していく。このデータベースには、資料の全文や図版に加え、執筆時期や保存状態、所蔵箇所といった情報も収録することで、今後の報告者による研究を円滑に推進出来ると考えられる。当初購入予定であった複数の書籍の発売が遅れ、年度内に購入することがかなわなかったため。購入予定書籍が発売され次第、次年度使用額を使い購入する予定である。
熱中症予防を目指した熱放散反応のガラニン関連メカニズム解明

本研究は3年計画(2019-2021年)で行う。実験では、本研究代表者が世界で初めて開発した新型の透析プローブを用いる。本研究では、1体温上昇時の皮下でガラニン及びガラニン様ペプチドが増加するのか、2ガラニンとガラニン様ペプチドを皮下に投与することで、熱放散反応が亢進するのか、3体温上昇時の熱放散反応がガラニン受容体ブロックにより抑制されるのか、をそれぞれ検討する。以上の結果より、熱放散反応のガラニン関連メカニズムを解明する。
幼児を対象としたインパクトバイオメカニクス

本研究では研究代表者らの研究実績を基に,幼児に対する衝突安全技術の開発と向上を試みた.また,新たに幼児の不慮の事故に関する研究を試みた.衝突時の安全性向上の観点から数値シミュレーションを用いたチャイルドシート衝突安全解析を行った.また,最適化アルゴリズムを組み合わせ,チャイルドシート形状の最適化を行った.新たに取り組んだ幼児の事故に関しての研究では,不慮の事故に対する効果的な対策の考案及び評価のために,幼児のマルチボディモデルを成人の特性をスケーリングすることで構築した.また構築したモデルの生体忠実性を衝撃試験シミュレーションによって評価し,簡単な事故再現シミュレーションを行った.本研究では研究代表者らの研究実績を基に,幼児に対する衝突安全技術の開発と向上を試みた.また,新たに幼児の不慮の事故に関する研究を試みた.衝突時の安全性向上の観点から数値シミュレーションを用いたチャイルドシート衝突安全解析を行った.また,最適化アルゴリズムを組み合わせ,チャイルドシート形状の最適化を行った.新たに取り組んだ幼児の事故に関しての研究では,不慮の事故に対する効果的な対策の考案及び評価のために,幼児のマルチボディモデルを成人の特性をスケーリングすることで構築した.また構築したモデルの生体忠実性を衝撃試験シミュレーションによって評価し,簡単な事故再現シミュレーションを行った.本年度は研究代表者らの研究実績を基に,幼児に対する衝突安全技術の開発と向上を試みた.幼児有限要素人体モデルの開発に関しては,3歳児を中心に有限要素人体モデルの高精度化を試みた.モデル作成は基本データとしてEUで完成された成人有限要素人体モデルのスケールダウン数値を用い,クリング法を用いる事で信頼性の高いデータベースを作成した.また信頼性の高いダミーでの衝突実験データで人体物性値の補完を行った.得られた幼児有限要素人体モデルを用いてインパクトダイナミクス解析の確立を図った.これらのデータベースは3歳児を中心とした幼児のあらゆるインパクト負荷時の解析に資するものである.幼児にインパクト荷重が掛かる代表事象である衝突時の安全性向上の観点からチャイルドシートの方式と形状最適化を進めた.本年度は形状最適化に取り組み,多目的最適化問題の一種として捉えることで大規模シミュレーションを行った.多目的最適化の手段としては遺伝的アルゴリズムを多目的問題に拡大し,パレット最適解を求める事で具体的な形状の改善指針を得た.これらの成果の一部は日本機械学会D&Dコンフェレンスで2件の研究発表を行い,さらに国際会議ICRASHで報告予定である.本年度は研究代表者らの研究実績を基に,幼児に対する衝突安全技術の開発と向上を試みた.また,新たに幼児の不慮の事故に関する研究を試みた.幼児にインパクト荷重が掛かる代表事象である衝突時の安全性向上の観点から数値シミュレーションを用いたチャイルドシートの衝突安全解析を行った.チャイルドシートモデルにロードリミッタモデルおよびエアバッグモデルを付加し,安全性能に対する影響を検証した.次に実験計画法に基づき衝突シミュレーションを行い,その結果を用いて応答曲面を作成し,応答曲面と最適化アルゴリズムを組み合わせてチャイルドシートモデルの最適化を行った.新たに取り組んだ幼児の事故再現に関しては,幼児の不慮の事故に対する効果的な対策の考案及び評価のため,事故再現を行い,事故状況を把握する必要があると考えた.事故再現に用いるための幼児マルチボディモデルを成人の特性をスケーリングすることで構築した.構築したモデルの生体忠実性をQ3ダミー人形の校正試験である衝撃試験シミュレーションによって評価し,簡単な事故再現シミュレーションを行った.これらの成果の一部は国際会議ICRASH,国際会議ISMA,日本機会学会年次大会,日本機会学会関西支部で研究発表を行った.
炎症性腸疾患における内因性抗菌ペプチドの病態への関与と治療応用の研究

本研究では臨床患者材料と分子生物学的および細胞免疫学的手法を用いてヒトの炎症性腸疾患における内因性抗菌ペプチドの発現量および異常の有無について検索し,これを明らかにすることを目的とした。平成13年度は以下の点を明らかにし,関連学会で報告するとともに現在投稿中となっている。1)ヒトの正常小腸cryptにおいてもマウスと同様,LPSの刺激によって抗菌活性物質の放出がおこることを初めて明らかにした。2)この抗菌活性物質は,in situ hybridization,および単離cryptを用いたRT-PCRの結果からヒトα-defensinであるHD-5およびHD-6であること,またその産生細胞はPaneth細胞であることを初めて明らかにした。3)炎症性腸疾患患者における小腸cryptにおいても,正常と同様に抗菌活性物質の分泌が見られることが明らかになった。4)潰瘍性大腸炎の大腸に見られるPaneth細胞は,小腸Paneth細胞と同様に抗菌活性物質の分泌を行っていることを初めて明らかにし,この抗菌活性物質がHD-5およびHD-6である可能性が示唆されている。また,本研究に関連して5)ヒト胃に見られる腸上皮化生粘膜のPaneth細胞も小腸と同様に抗菌活性物質の分泌を行っていることを初めて明らかにし,この物質はH, Pylori菌に対しても抗菌活性を示すこと,この物質はHD-5およびHD-6である可能性が同様に示唆されている。本研究の目的は,臨床患者材料と分子生物学的および細胞免疫学的手法を用いてヒトの炎症性腸疾患における内因性抗菌ペプチドの発現量および異常の有無について検索し,これを明らかにすることである。また,これらの物質は生体内に既に存在する物質であることから臨床応用が比較的安全であると考えられ,ヒトの治療薬としての応用の可能性について明らかにすることである。平成11年度は,研究手法および材料についての情報交換のため,蘆田知史および斎藤浩之が,平成11年9月6日-平成11年9月12日の期間,カリフォルニア大学医学部へ出向し,NRAMPおよびIL-18Rについての研究成果を報告すると共に,マウス小腸よりlive cryptを分離する方法について指導を受けた。また,高後裕,藤本佳範,本村亘(研究協力者)平成11年9月6日-平成11年9月12日の期間,カリフォルニア大学医学部へ出向し,syndecan,PR-39についての研究成果を報告すると共に,ヒトpaneth cell defensin抗体の作成について研究打ち合わせを行った。平成12年1月21日-平成12年1月26日の期間,アンドレウオレット教授が旭川医科大学を訪問し,内因性抗菌ペプチド全般について指導を行うと共に,paneth cell defensinの前駆ペプチドからの生体内での活性発現機構の解明,炎症性腸疾患患者小腸および肛門病変部におけるdefensinの発現解析について研究打ち合わせを行った。現在,ヒトpaneth cell defensin抗体の作成,mRNAレベルでの炎症性腸疾患患者小腸および肛門病変部におけるdefensinの発現の解析が進行中である。消化管粘膜に獲得免疫機構の発動を必要としない自然免疫機構が存在することはよく知られているが,これまで自然免疫めエフェクターである抗菌ペプチドの実際の働きについては不明であった。われわれは,消化管抗菌ペプチドをマウスと炎症性腸疾患患者を含むヒトの両方で検討した。小腸Paneth細胞alpha-defensinの分泌をわれわれの確立した分離陰窩アッセイ系を用いて解析し,ワイルドタイプマウス,二次的defensin欠損マウスおよび生後一定期間Paneth細胞を欠くトランスジェニックマウスの比較検討から,マウスの腸管感染防御機構におけるその重要性を明らかにした。さらに,この研究結果をヒトに対して応用することによって,各種抗菌物質の発現と炎症性腸疾患の病態が関連している可能性を示すことができた。炎症性腸疾患における抗菌ペプチドの発現および機能に健常対照と異なる場合があることを明らかにした。ヒトにおけるPaneth細胞分泌の機序および調節因子に関する解析については,健常対照者における検討において顕著な進展がみられた。また,炎症性腸疾患患者での検討を開始した。本年度,本国際学術研究は各研究分担者の専門領域における先端的研究とそれぞれの研究結果の有機的統合により,大きく進展したと考えられる。

国外研究分担者との研究分担は,本年度も相互に教室を訪問した際に研究実績を交換し,報告会および公開セミナーを行った。その上でさらなる研究計画方針を決定するという着実な分担研究を続行している。本研究では臨床患者材料と分子生物学的および細胞免疫学的手法を用いてヒトの炎症性腸疾患における内因性抗菌ペプチドの発現量および異常の有無について検索し,これを明らかにすることを目的とした。平成13年度は以下の点を明らかにし,関連学会で報告するとともに現在投稿中となっている。1)ヒトの正常小腸cryptにおいてもマウスと同様,LPSの刺激によって抗菌活性物質の放出がおこることを初めて明らかにした。2)この抗菌活性物質は,in situ hybridization,および単離cryptを用いたRT-PCRの結果からヒトα-defensinであるHD-5およびHD-6であること,またその産生細胞はPaneth細胞であることを初めて明らかにした。3)炎症性腸疾患患者における小腸cryptにおいても,正常と同様に抗菌活性物質の分泌が見られることが明らかになった。4)潰瘍性大腸炎の大腸に見られるPaneth細胞は,小腸Paneth細胞と同様に抗菌活性物質の分泌を行っていることを初めて明らかにし,この抗菌活性物質がHD-5およびHD-6である可能性が示唆されている。また,本研究に関連して5)ヒト胃に見られる腸上皮化生粘膜のPaneth細胞も小腸と同様に抗菌活性物質の分泌を行っていることを初めて明らかにし,この物質はH.Pylori菌に対しても抗菌活性を示すこと,この物質はHD-5およびHD-6である可能性が同様に示唆されている。
シアリルルイス糖鎖及びアナログの微生物プロセスによる生産

シアリルルイス糖鎖は、ガン転移や免疫反応に深く関わっていることが知られている。本研究では、ある種のB群溶血性連鎖球菌Streptococcus agalactiaeがシアリルルイス糖鎖のアナログであるシアリルラクトサミンのポリマーを細胞外多糖として生産することに着目し、遺伝子工学的手法を用いてシアリルルイス糖鎖やアナログを生産することを目的とした。B群溶血性連鎖球菌由来のきょう膜多糖が実際にガン細胞と血管内皮細胞の間の接着を阻害するかどうかを確認するために、この多糖を1lの培養上清からエタノール沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを経て精製し、最終標品0.5mgを得た。この多糖は分子量約500kDaを示し、1分子当たりシアリルラクトサミン側鎖を少なくとも400残基含むことが推定された。試験管内におけるガン細胞と血管内皮細胞の接着阻害を調べるためにヒト由来の血管内皮細胞をシャーレ-面に培養し、これにインターロイキン-1βを加えてセレクチンの発現を誘導した。そこに転移性の大腸ガン細胞Colo201及び白血病細胞HL60を放射性メチオニンで標識した後加えて接着させた。洗浄後、残った放射能を測定してこれを接着活性とした。インターロイキン-1βを加え、セレクチンを発現させたものでは顕著な接着活性を示すが、加えないものでは全く接着が起こらなかった。またこの多糖を加えると顕著に細胞の接着が阻害された。一方この微生物多糖の生産を効率化するため、S.agalactiae Ia株より多糖の生合成に必要な酵素遺伝子の一部をクローン化し塩基配列を決定した。ホモロジー検索より、このDNA断片には3個の糖転移酵素が含まれると思われる。現在、生合成系遺伝子全体をクローン化することを試みている。
5.7ーDHT投与後,ラット青斑核におけるセロトニン免疫組織化学的研究

ウイスタ-ラットの青斑核のセロトニン免疫反応性(5ーHTーIR)をunlabelied peroxidaseーantiperoxidase(PAP)methodにより検討した。抗体生成はGrotaとBrown('74)の方法に従った。青斑核を含むslabの5μmcryostat連続切片を作製し、交互に5ーHT反応とcresylーviolet染色を施し比較観察した。5,6ーdihydroxytryptamine(5,6ーDHT)又は,5,7ーDHTを術前14日にラット側脳室へ電気泳動的に注入し、次にMAO阻害剤pargyline(75mg/kg)と5ーHTP(200mg/kg)を2hと1hほどperfusion前に注入してから、5ーHTーIRを検出すると脱マスクされた状況で青斑核神経細胞の陽性反応を検出できる。小脳と縫線核を陽性対照群、正常ウサギ血清や生理的食塩水を陰性対照群に用い、神経細胞数はSwanson('76)により3.285±25を基準とし、computer(CosmosomesーS Nikon)を用いて統計学的処理を部分的に実施した。神経細胞の分類法はLaughlinら('86)に従った。青斑核の全体にわたってすべての型の半数以上の神経細胞が5ーHTーIRを示したが、ことにcore cellsがdominantであった。5ーHT uptake blockerであるLillie 110140は青斑核内部で5ーHTーIR減少を示さなかった。血管内皮細胞が5ーHTの血液ー脳関門であるとの従来の説は死後数分間に起こる現象に由来する可能性が強い。5,6ーDHT又は5,7ーDHTの術前投与を行ったすべての例で、青斑核の少なくとも半数の神経細胞が5ーHTーIRを示した事は、青斑核の背側縫線核などからの5ーHTergicaxonterminalsを神経毒で除外しても、有意の量の5ーHTが青斑核内に合成される事を強く示唆する。Lillie110140投与の無効の結果を考えて(1)青斑核の多数の神経細胞が、本来、血液からの5ーHTPを素材として5ーHTを生産する能力を保有する事、(2)この能力は青斑核自体がもつ強いMAO活性によってマスクされていると結論する。この研究成果はActa histochemica vol 89.p.141ー156(1990)に原著論文として発表する。
核内ホルモンによる負のフィードバック分子機構の解明-内分泌腫瘍の成因との関わり

1)ヒト乳癌MCF7細胞において、活性型ビタミンDのみならず、エストロゲン、アンドロゲン、デキサメサゾン、甲状腺ホルモンさらにプロゲステロンもまた、いずれも10nMの濃度で内因性のPTHrP遺伝子の発現を4060%抑制した。ホルモン投与後、恒常的にnVDREに集積してくるDNA-PKcsと違い、nVDRE領域を含むクロマチンへのHDAC2の動員は、45-60分を周期とするサイクリックなものであり、この動員はヒストンアセチル化と鏡像関係にあった。2)同様のChlPアッセイにおいて、それぞれのNRのnVDREクロマチン部への動員はホルモン依存的で、やはりサイクリックなパターンをとっていた。3)MCF-7細胞への、DNA-PKまたは、PI3Kサブユニットp105βに対するSiRNAの導入によるこれらの遺伝子転写発現は、いずれも7090%抑制された。そこで、MCF-7細胞におけるPTHrP遺伝子の各ホルモンによる転写抑制に与えるSiRNAの効果を調べたところ、PNA-PKのSiRNA導入ではこの転写抑制がほとんど解除されたのに対して、PI3Kサブユニットp105βのSiRNA導入では有意な変化が見られなかった。4)IP-ウェスタン法によって、上記の結果から予想される各NRと、DNA-PKcsおよびp70、p86から構成されるKu抗原とのホルモン依存的な結合を調べた。各ホルモン投与6時間後にMCF7細胞から抽出した核タンパクを各NRまたは、DNA-PKcs/Ku抗原で免疫沈降させSDS-PAGE後ブロットしたものを、逆の組み合わせの抗体で検出したところ、各NRと、DNA-PKcsおよびp70、p86から構成されるKu抗原とは、いずれもホルモン投与によって両者間の結合が著明に増強することがわかった。1)ヒト乳癌MCF7細胞において、活性型ビタミンDのみならず、エストロゲン(17βE2)、アンドロゲン(DHT)、デキサメサゾン、甲状腺ホルモン(T3)、さらにプロゲステロンもまた、いずれも10nMの濃度で内因性のPTHrP遺伝子の発現を4060%抑制することをRT-PCR法で確認した。抑制のピークはいずれもホルモン投与後46時間であった。2)これらのホルモン受容体は程度の差こそあるものの、いずれもMCF7細胞において発現されていた。3)この抑制はDNA-PK阻害薬として機能する高濃度ウォルトマニン(4μM)ですべて解除された。4)DNA-PKのサブユニットのKu抗原のアンチセンスDNAを導入してKu抗原の発現量を20%程度まで低下させることによっても、1)で見られた抑制はすべて解除された。5)PTHrP遺伝子が活性型ビタミンDによって発現抑制を受けるのに必要なDNA配列(nVDRE)を持つレポーター遺伝子の発現は、1)に述べた他のすべてのホルモンによっても1)と同様の時間経過で同程度に抑制された。nVDRE配列を持たないコントロールのレポーター遺伝子の発現は変化しなかった。6)クロマチン免疫沈降(ChlP)法を用いて、DNA-PKの酵素活性を有するサブユニット(DNA-PKcs)が上述のいずれのホルモンによっても、その投与1530分後以降、nVDREを含む領域に数時間にわたって恒常的に動員されることを見い出した。一方、これらのホルモン受容体はいずれも同領域にホルモンの存在にかかわりなく恒常的に動員されていた。以上より、種々のステロイドホルモン/甲状腺ホルモン/ビタミンDによる遺伝子発現抑制機構の少なくとも一部に、DNA-PKとnVDRE配列を介する共通の分子機構が存在することがわかった。我々は、活性型ビタミンD依存的にDNA-PKによるビタミンD受容体(VDR)の燐酸化が起こり、その結果PTHrP遺伝子発現が抑制される機構を提唱した(BBRC2003)。

今回我々は、a)非常に興味あることに培養乳癌MCF-7細胞において、ビタミンDだけでなくエストロゲン(17βE2)、テストステロン(DHT)、デキサメサゾン、甲状腺ホルモン(T3)、プロゲステロンによっても、同様の濃度(10nM)と時間経過(投与後5時間に6070%の最大効果が認められる)によって各核内受容体(NR)依存的にPTHrP遺伝子が抑制されることを見い出した(Okazaki et al. J.Bone Min.Res.(Abst) 2004 & 2005)。b)さらにDNA-PKのSiRNAやアンチセンスDNAの導入および阻害薬を用いた実験によって、これらのホルモンによるPTHrP遺伝子発現抑制は完全に解除された。c)IP-ウェスタンおよびChIPアッセイから、これらの核内ホルモンによるPTHrP遺伝子発現抑制には、各NRとDNA-PKおよび、PTHrP遺伝子上の20数塩基から成るDNA配列(nVDRE)の、各ホルモン依存的な結合(または動員)が必要であることが分かった。不思議なことにレチノイン酸(all-transおよび9-cis)やトログリタゾンではこの抑制は認められなかった(投稿準備中)。d)同様の転写抑制は内因性のPTHrP遺伝子ばかりでなく、nVDRE配列を持ったレポーター遺伝子においてもこの配列特異的に認められた。これらの結果については米国骨ミネラル学会で、04年および05年oral presentationと成果をあげ、現在2編の論文にまとめ投稿準備中である。