hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
F1-ATPaseの回転触媒機構にせまる構造解析

F1ATPase(F1:サブユニット組成α3β3γε)は、呼吸鎖が形成する膜を隔てた水素イオンの濃度差をATPに変換するATP合成酵素の膜から突き出した部分である.私たちは回転触媒機構の詳細を知る目的で、好熱菌F1・α3β3γε複合体を用いて、異なるヌクレオチド結合モードがひきおこす構造変化の詳細を調べている.今年度は、Mg-free ADPが1個だけβサブユニットに結合したF1の結晶構造と触媒機構との関連について議論した。Mgヌクレオチドを結合したβサブユニットが2個以上あるF1の従来の結晶構造との比較により、ヌクレオチド結合の変化に伴うα3β3コア部分の構造変化、γサブユニットの構造変化を特定することができた.ただしMg-freeの制約の十分な考慮が必要であった。この構造をF1の従来の結晶構造と比べると、従来の結晶構造中で活性サブユニットと思われるclosed βDPサブユニット型の構造が見られない。これが通常のmuliti-site反応に比べてunisite反応が非常に遅いことと照合している。またγサブユニットを2個ヌクレオチドを結合したβサブユニットをもつF1構造のγサブユニットと比べると、約25度ねじれていた。これは1分子計測から得られた、産物ADP Piの放出に伴う30度回転と大きさ、方向ともに合致した。Mgが存在しないため好熱菌F1は軽く阻害された状態にある。これに対応してεサブユニットがα3β3コア部分にそのヘリックス部分を差し込んでいた。F1ATPase(サブユニット構成α3β3γδε、分子量38万)は、呼吸鎖が形成する、膜を隔てた水素イオン濃度勾配をATPに交換するATP合成酵素の可溶性部分である。γサブユニットのα3β3部分に対する回転により巧妙に制御されるこの酵素のユニークな回転触媒機構を構造の側面から理解するために、F1とどぼ同じような酵素学的性質をもつ。α3β3γ複合体について、種々のヌクレオチドリガンド結合状態での構造を明らかにし、小さいサブユニットγ(回転子)と主要β、αサブユニットとの相互作用の様式を明らかにしようとしている。このため、今年度はα3β3γ複合体の結晶化条件の改良を行い、得られた結晶を用いてSPring8でデータ収集を行った。α3β3γ複合体の結晶の改善については、今年度更に、(1)熱処理、硫安分画などの全処理が結晶化に大きな正の効果をもたらすこと、(2)非イオン性界面活性化剤の導入により従来の多結晶的形ではなく、板状もしくは棒状の形をした大きな結晶が得られること、の二点を見いだした。これらの結晶使って、実験室のX線源で初めて約20Åの回折模様を記録できた。また上の基本的な改良の上に、多くの結晶化実験を行い、ヌクレオチド非結合型の結晶、ATP,ADP,AMPPNP,ATPγSなどのヌクレオチド結合型に関しては、Mg濃度、ヌクレオチド濃度を変えて、様々なリガンド結合状態での結晶を得ることができた。SPring8でデータ収集を行うためには、結晶を液体窒素温度まで冷却できる溶液条件をさがさねばならない。上に述べた様々な条件で得られた結晶はいずれも母液の置き換えが不可能であることがわかり、冷却できる溶液条件下での結晶成長条件の探索を行った。SPring8でのデータ収集は、大きい結晶は10Åの回折模様を与えるのが結晶格子に乱れがあり、小さい結晶は結晶格子に乱れがないが20Åの回折模様与えすぎず、更に冷却の検討が必要である。F1ATPase(サブユニット構成α3β3γδε、分子量38万)は,呼吸鎖が形成する、膜を隔てた水素イオンの濃度勾配をATPに変換するATP合成酵素の可溶性部分である.γサブユニットのα3β3部分に対する回転により巧妙に制御されるこの酵素の触媒機構を構造の側面から理解するため、F1のα3β3γ、α3β3γε部分複合体の種々のリガンド結合状態の構造決定を目指し、今年度はα3β3γ複合体については回折実験、α3β3γε複合体については結晶化、回折実験を行った.α3β3γ複合体結晶については、クライオの条件を検討したあとSPring8で回折実験を行った.実験室のX線源で20Åの回折模様を与えるこの結晶はSPring8では10Åの回折を与えた.更に高分解の反射を与える結晶化条件を検討している.平行して実験を行ったα3β3γε複合体はSPring8で4.5Åの回折を与えることがわかった.なお、この複合体は結晶化条件を大規模、系統的に探索した結果、種々のリガンド結合状態の結晶が得られている.現在0.5mMADP存在下でできた結晶を中心に解析を進めている。0.2x0.2x0.1mm程度の中程度の大きさの結晶を液体プロパンで凍結後、100Kの窒素ガスのon/offアニールにより凍結結晶を準備した。格子定数は225.3,225.7,224.6Å,94.1,117.5,117.8度(P1)と決定された。単位格子中に4(1)22の回転対称で配置している8個のα3β3γε複合体が存在する。分子置換法による解析が進行中である.

F1ATPase(サブユニット構成α3β3γδε、分子量38万)は,呼吸鎖が形成する、膜を隔てた水素イオンの濃度勾配をATPに変換するATP合成酵素の可溶性部分である.γサブユニットのα3β3部分に対する回転により巧妙に制御されるこの酵素の触媒機構を構造の側面から理解するため、F1のα3β3γ、α3β3γε部分複合体の種々のリガンド結合状態の構造決定を目指し、今年度は主としてα3β3γε複合体の結晶化、回折実験を行った.α3β3γε複合体については、昨年度行った0.5mMADP存在下でできた結晶の解析(4.5A分解能)の経験をもとに、今年はMg/ヌクレオチド非存在下でできた結晶構造を解析した.よりよい結晶凍結法を見出した結果SPring8/阪大蛋白研ビームライン(BL44XU)で3.8A分解能データを得た.分解能の向上により結晶格子もI4122, a=B=233.3A, c=305.3Aと確定した.結合ヌクレオチドの定量と電子密度分布から、得られた結晶中の分子は、1個ADPを結合していると結論した.標品中の1個ADPを結合している分子種が選択的に結晶化したと考えられる.ヌクレオチド非結合型α3β3複合体構造を初期モデルとした分子置換法の解析の結果、すべてのサブユニットの構造が得られた.ADPはヌクレオチド結合型の構造をとっているβサブユニットに結合していた.他の2つのヌクレオチド非結合型βサブユニットのうち、従来の2個ヌクレオチド結合型F1構造で最も強くヌクレオチドが結合しているβサブユニットと等価な位置にあるβサブユニットは、典型的なヌクレオチド非結合型の構造をしていた.この構造の違いにより、1個ADP結合型のα3β3γε構造ではεサブユニットのC末のヘリックスがα3β3下部に挿入されることが可能になり、これがεサブユニットの位置とコンホメーションが従来のものとは大きく異なる原因となったと考えられる.F1ATPase(F1:サブユニット組成α3β3γε)は、呼吸鎖が形成する膜を隔てた水素イオンの濃度差をATPに変換するATP合成酵素の膜から突き出した部分である.私たちは回転触媒機構の詳細を知る目的で、好熱菌F1・α3β3γε複合体を用いて、異なるヌクレオチド結合モードがひきおこす構造変化の詳細を調べている.今年度は、Mg-free ADPが1個だけβサブユニットに結合したF1の結晶構造と触媒機構との関連について議論した。Mgヌクレオチドを結合したβサブユニットが2個以上あるF1の従来の結晶構造との比較により、ヌクレオチド結合の変化に伴うα3β3コア部分の構造変化、γサブユニットの構造変化を特定することができた.ただしMg-freeの制約の十分な考慮が必要であった。この構造をF1の従来の結晶構造と比べると、従来の結晶構造中で活性サブユニットと思われるclosed βDPサブユニット型の構造が見られない。これが通常のmuliti-site反応に比べてunisite反応が非常に遅いことと照合している。またγサブユニットを2個ヌクレオチドを結合したβサブユニットをもつF1構造のγサブユニットと比べると、約25度ねじれていた。これは1分子計測から得られた、産物ADP Piの放出に伴う30度回転と大きさ、方向ともに合致した。Mgが存在しないため好熱菌F1は軽く阻害された状態にある。これに対応してεサブユニットがα3β3コア部分にそのヘリックス部分を差し込んでいた。
活版印刷技術黎明期の形態的特徴の変遷から見る書物の表象と読書の様態

本研究の目的は、これまで具体的な検証が進んでこなかった活版印刷術黎明期の書物の表象の変化を明らかにすることである。そのため、1)書物の形態の変化の調査、2)その背後にある書物の表象の変化の検討、3)読書の様態からの書物の表象の変化の分析、という三つの課題を設定した。調査対象は書物の表象を高度に具現化していると予想される聖書とし、15世紀に出版された注釈なしのラテン語聖書80点全てを対象に、目録・画像データベース・複写画像・原資料閲覧により調査した。本年度は、原資料調査によって1)の補足を行うとともに、2)3)の課題について検討した。特に西洋最初の本格的な印刷本であるグーテンベルク聖書が達成した写本の形態の標準化、精緻化という二つの方向性の継承に着目した。その結果、標準化・精緻化は一層進んだものの、一様ではなく、継承されなかった試みもあることが明らかになった。文章構造の視覚的な提示方法としては、最初期には写本の伝統である色が意識されていたが、1470年代後半には中央寄せや空白行の挿入などの配置による提示を行うという精緻化が進んでおり、印刷本独自の発展が確認できた。同時に、巻末のヘブライ人名辞典や、要約、欄外の参照記号など、読者のためのツールが徐々に増え、15世紀末には標準的になっていることがわかった。また、読者によって参照記号や目次が補われている場合も散見された。この変化は、印刷業者、読者の双方が実用的な付加価値を求めたことの反映だと考えられる。一方、冒頭ページの扱いや木版画装飾の少なさなど、初期刊本全般とは異なる傾向があり、ラテン語聖書は書物の典型というよりは、独自の表象を持っていたのではないかと考えられる。この目的のため、1)書物の形態の変化の調査、2)その背後にある書物の表象の変化の検討、3)読書の様態からの書物の表象の変化の分析、という三つの課題を設定した。調査対象は、書物の表象の変化を高度に具現化していると予想されるラテン語の聖書とする。本年度は、主として課題1)についての研究を行った。初期刊本の総合目録データベースIISTC、および詳細な初期刊本目録BMCとGWを用いて、注釈が本文ページに印刷されていない初期刊本のラテン語聖書という条件を満たす80点を調査対象に選定した。IISTC収録の白黒画像や、取り寄せた複写デジタル画像による調査に加え、国内外の図書館を訪問して原資料の調査を行い、形態的特徴を具体的な詳細にわたって調査した。なお、許可された場合にはデジタルカメラで資料を撮影した。80点の調査対象それぞれについて、基本的なページ・レイアウトに加え、標題紙の扱い、文章構造の表現方法、行末揃えの方法、句読点の種類、単語の分かれ方、本文以外の要素、ツールの有無、書および各書への序文の構成と順序、読者による書き込みなどの項目について詳細に調査し、調査結果をノートパソコン上でデータベース化した。その結果、形態面での標準化は一様に進展していったのではないことや、色による構造化から複雑な組版技術を必要とする配置による構造化への転換など、技術的にはより複雑で経済面の効率化には反するような多くの特徴が導入されていることがわかった。来年度は、本年度の調査結果に基づき、様々な角度から書物の形態の類型化や統計的な解析を試みることにより、第二、第三の課題について研究を進める必要がある。
希土類を基盤とする精密共重合触媒系の構築と高機能性高分子材料の開発

ホスフィンオキシド側鎖を有するスカンジウム触媒を用いて、1,6-ヘプタジエンとイソプレン共重合反応を行うことにより、対応する交互共重合体の合成に初めて成功した。また、カチオン性イットリウムアルキル触媒を用いることにより、2,6-ジメチルピリジン類のメチル基のC-H結合によるアルケン類への付加反応に成功した。さらに、スカンジウム触媒存在下、スチレンの重合に連鎖移動剤としてアニソール類を用いることにより末端にアニシル基を有するシンジオタクチックポリスチレンの触媒的合成に成功した。本研究では、優れた物性を持つ高分子材料の合成を目指して、希土類錯体の特異な性質を利用した高活性、高選択的な重合触媒系の構築を行っている。本年度は、様々なフルオレニル配位子を持つハーフサンドイッチ型スカンジウムジアルキル錯体を合成するとともに、これらを用いて、スチレンの重合及びスチレンとエチレンの共重合について詳細に検討した。その結果、ジアルキル錯体と[Ph3C][B(C6F5)4]の反応によって生成するカチオン性スカンジウムアルキル触媒は、以前に我々が開発した(C5Me4SiMe3)Sc(CH2SiMe3)2(THF)から生成するカチオン性スカンジウムアルキル触媒と比較して、触媒活性は低かったものの、スチレンのシンジオ選択性はほぼ同等の高い選択性を示した。さらにジアルキル錯体と[Ph3C][B(C6F5)4]からなる触媒系に15等量のトリイソブチルアルミ(AiiBu3)を添加した三元系触媒では、高い立体選択性を保持したまま触媒活性が劇的に向上することが明らかになった。このAliBu3の効果を明らかにするためにDFT計算により触媒活性化の機構を検討した結果、まずAliBu3が錯体に配位したTHFを引きはがし、続いて[Ph3C][B(C6F5)4]との反応により金属周りの立体障害が少ないTHFフリーのカチオン性アルキル活性種が生成していることが示唆されている。このような三元系触媒は広く研究がおこなわれているが、DFT計算によりトリイソブチルアルミの効果や活性化の過程を調査した例は限られており、今後、精密オレフィン重合触媒の開発において重要な知見を与えると期待される。本年度は、本年度は、様々な配位子を持つハーフサンドイッチ型スカンジウムジアルキル錯体を用いて、1,6-ヘプタジエン(HPD)とイソプレン(IP)の共重合について詳細に検討したところ、触媒活性や立体選択性において顕著な配位子の効果が見いだされた。THFが配位したスカンジウム錯体またはメトキシ基を側鎖として有するスカンジウム錯体を用いて共重合を行うことにより、メチレン-1,3-シクロヘキサン(MCH), 3,4-ポリイソプレン(3,4-IP)と1,4-ポリイソプレン(1,4-IP)ユニットを有するランダム共重合体が得られた。またモノマーの仕込み比を変えることにより、HPDモノマーユニットの含有率を11ー55モル%で制御できることが明らかとなった。またホスフィンオキシド側鎖を有するスカンジウム触媒を用いて共重合反応を行うことにより、3,4-IP, 1,4-IPとMCH構造を有する交互共重合体の合成に初めて成功した。この触媒によるHPDの環化重合は位置および立体選択的に進行し、cis-MCHの選択性が最高99%に達した。この共重合体の機械物性を測定した結果、引っ張り強度は最高67 MPa、弾性率は最高2900 MPaに達し、対応するイソプレンと1,6-ヘプタジエンのランダム共重合体に比べて数倍の強度を示した。今後新たな重合触媒を開発し、特異な機能を発現する高分子材料の開発を進める予定である。本年度は、様々な配位子を持つハーフサンドイッチ型スカンジウムジアルキル錯体を用いて、1,6-ヘプタジエンとスチレンの共重合について詳細に検討したところ、共重合活性において顕著な配位子の効果が見いだされた。THFが配位したスカンジウム錯体(C5Me4SiMe3)Sc(CH2SiMe3)2(thf)(1)を用いてヘプタジエンとスチレンを反応させるとヘプタジエンとスチレンのホモポリマーの混合物を与えた。一方、ホスフィンオキシド側鎖を有するハーフサンドイッチ型スカンジウムアルキル触媒(C5Me4SiMe2CH2P(O)Ph2)Sc(CH2SiMe3)2(2)を用いて共重合反応を行うとメチレン-1,3-シクロヘキサン(MCH)やポリスチレンユニットを有するランダム共重合体が得られた。ポリマーのミクロ構造は、HMQCやHSQCなどの2次元NMR測定により明らかにした。またモノマーの仕込み比を変えることにより、HPDモノマーユニットの含有率を7ー85モル%と比較的広い範囲で制御できることが明らかとなった。錯体1と2で顕著な反応性の違いが現れたことから、シクロペンタジエニル配位子上の置換基を変えることにより、共重合反応における活性や選択性を制御できることが明らかとなった。

本研究では、希土類錯体触媒を用いて高効率な有機合成反応や優れた物性を持つ高分子材料の開発を行っている。シンジオタクチックポリスチレン(sPS)は耐熱性、耐薬品性に優れているが粘着性や相溶性に乏しいという欠点が指摘されている。この問題を解決する一つの手法として多段階反応によるポリマー末端への極性基の導入が数多く報告されているが、触媒的合成は報告されていない。我々はハーフサンドイッチ型希土類ジアルキル触媒が、スチレンの重合に対して高い活性及びシンジオタクチック選択性を示すことを報告した。また、同様の触媒がオレフィンへのC-H結合付加反応を経由するピリジン類のo-アルキル化反応に対して高い活性を示すことを見出した。本年度はこれらの反応を組み合わせ、スチレンの重合に連鎖移動剤としてピリジン類を用いることによりポリマー鎖へのピリジル基の導入を試みた。ハーフサンドイッチ型のガドリニウム触媒を用いて、tーブチルピリジン存在下スチレン重合を行なうことにより、末端にo-ピリジル基を有するシンジオタクチックポリスチレンの合成に成功した。一方、スカンジウム触媒を用いて同様の反応を行うと、ガドリニウム触媒系とは対照的に、ピリジンのオルト位には一分子のみスチレンが挿入され、tーブチル基上の一つのメチル基にポリスチレン鎖が挿入していることがNMR解析により明らかとなった。これはスカンジウム触媒がピリジン類のオルト位(α位)だけでなく、γ位のC-H結合を活性化できる極めて特異な触媒であることを示している。ホスフィンオキシド側鎖を有するスカンジウム触媒を用いて、1,6-ヘプタジエンとイソプレン共重合反応を行うことにより、対応する交互共重合体の合成に初めて成功した。また、カチオン性イットリウムアルキル触媒を用いることにより、2,6-ジメチルピリジン類のメチル基のC-H結合によるアルケン類への付加反応に成功した。さらに、スカンジウム触媒存在下、スチレンの重合に連鎖移動剤としてアニソール類を用いることにより末端にアニシル基を有するシンジオタクチックポリスチレンの触媒的合成に成功した。希土類触媒を用いることにより、スチレンと非共役ジエンの共重合反応が初めて達成され、新規高分子材料の開発に成功し、おおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。化学引き続き希土類重合触媒を開発するとともに、C-H結合活性化を利用したオレフィン類とヘテロ芳香族化合物との重付加反応やリビング重合技術を用いて耐熱性に優れたエラストマーの開発に向けて研究を進める予定である。フルオレニル配位子を有するハーフサンドイッチ型スカンジウム触媒を用いたスチレンとエチレンの共重合において、アルキルアルミニウムの添加により触媒活性が大きく向上することが見出され、おおむね順調に進展している。ヘプタジエンとイソプレンの共重合反応において、触媒の配位子を制御することにより、ランダム共重合体と交互共重合体を作り分けることが可能であり、得られた共重合体の物性が大きくミクロ構造に依存することが見出され、おおむね順調に進展している。今年度後半にこの研究に参画する博士研究員が新たに配属される予定であり、一部の基金を残している。引き続き希土類重合触媒を開発するとともに、2種類の重合触媒を組み合わせてアルキルアルミニウムやアルキル亜鉛をチェーンシャトリング試剤として用いることにより、新しいオレフィン類の立体選択的共重合反応の開発に向けて研究を進める予定である。
非小細胞肺癌を標的とするNrf2阻害剤の開発

Nrf2阻害剤のスクリーニング系の確立するために、Nrf2の抑制因子であるKeap1欠損マウス線維芽細胞(Keap1 KO MEF)を用いた検出系を構築しようと試みた。Keap1欠損によりNrf2が蓄積する状態を非小細胞肺癌におけるNrf2の過剰蓄積のモデル系と見立てて、Keap1 KO MEFにおけるNrf2機能抑制効果を検出する。既にNrf2の主要標的遺伝子の1つであるヘムオキシゲナーゼ(HO-1)遺伝子座にGFPをノックインしたマウス(HO-1EGFP/+マウス)を用いて、HO-1EGFP/+マウスとKeap1 KOマウスとの交配により、Keap1-/-::HO-1EGFP/+マウスを得てそのMEFを樹立した。同細胞においては、恒常的に安定化したNrf2によりHO-1遺伝子座のEGFPが恒常的に発現する。しかしNrf2のsiRNAを導入した際のEGFP蛍光強度の減少がはっきりと確認できなかった。この原因として、Keap1 KO MEFには既にNrf2が過剰に蓄積しており、EGFPの蛍光強度が強すぎて、一過性のsiRNA導入ではEGFPが分解できなかった可能性がある。このスクリーニング系では、ハイスループットスクリーニングに利用することは困難と考えられた。現在、Keap1 KO MEFを用いて、アデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で測ることで生細胞数をモニターすることで、直接ハイスループットスクリーニングに使用できるか検討を始めた段階である。本研究は、酸化ストレスに対する生体防御の中で中心的な役割を果たす転写因子Nrf2が、非小細胞肺癌において高頻度で恒常的に活性化するのとともに、それが予後不良因子であるという知見をもとに、Nrf2の機能阻害剤を開発する事を目的として計画を行ってきた。初年度は、Nrf2の機能阻害剤の創薬へむけたスクリーニング系の構築を最優先課題として実験を進めている。Keap1はNrf2の抑制因子であり、その欠損によりNrf2が恒常的に活性化する。この状態を非小細胞肺癌におけるNrf2タンパク質の過剰蓄積モデルと考えた。研究協力者らはすでにNrf2の主要標的遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ(HO-1)遺伝子座にGFPをノックインしたマウス(HO-1/EGFP/+マウス)を作成しており、これとKeap1欠損マウスを交配により、Keap1 -/-::HO-1 EGFP/+マウスを得て、そのマウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いる事でNrf2の活性強度を蛍光強度で評価できると考えて交配を進めているが、細胞の樹立に計画した以上に時間を要している。また今後抗腫瘍薬として使用していくにあたり、細胞増殖の点からのスクリーニング系を構築していく必要があると考え、細胞数をATP濃度でモニターするスクリーニング系を同時に作成中である。当初の予定よりMEFの作成に時間がかかっている事と、計画していたスクリーニング系をより改善しようと他のスクリーニング系も同時に作成を進めており、計画当初の予定よりやや遅れている。計画当初のスクリーニング系を作成していくにあたり必要なMEFの作成に時間がかかっている事と、他のスクリーニング系も同時に進めており、全体としては当初の予定よりやや遅れている。初年度に創薬スクリーニング用に既存薬ライブラリーの使用が可能となり、上記スクリーニング系が構築できれば、すぐにそれを利用して標的薬剤を同定する計画である。スクリーニング系の構築が計画より遅れているために、実験試薬などで使用額が予定よりも小額になった。スクリーニング系の構築に際して、試薬などの物品費で使用額が増える予定である。さらにスクリーニング系の構築が完成した後に、ライブラリーを用いた創薬スクリーニングを行う予定であり、その際にも物品などの使用額がさらに増える予定である。
全エクソンシーケンス(EXOME)による永久歯先天欠如の原因遺伝子同定

永久歯先天欠如は、顎顔面領域に見られる最も頻度の高い疾患の一つである。その原因に複数の転写因子の変異によって優性遺伝形式を呈する家族性に引き起こされることが知られている。一方、近年"Exome sequencing(全エクソンシーケンス)"により、家族性稀少疾患の原因遺伝子同定の成功例が報告されている。"Exome"とはヒトゲノムにおけるすべてのエクソン領域を示し、その配列に含まれる変異が疾患原因の約85%を説明すると推定されている。本申請課題において、次世代シーケンサーによる全エクソンシーケンスにより下顎前歯先天性欠如の原因と考えられる興味深い候補3遺伝子変異を同定した。一方、近年“Exome sequencing(全エクソンシーケンス)"により、家族性稀少疾患の原因遺伝子同定の成功例が報告されている。“Exome"とはヒトゲノムにおけるすべてのエクソン領域を示し、その配列に含まれる変異が疾患原因の約85%を説明すると推定されている。本申請課題の目的は次世代シーケンサーによる全エクソンシーケンスにより永久歯先天性欠如、特に日本人に多い下顎前歯先天性欠如家族性症例においてその原因遺伝子を同定することにある。申請者らは歯科矯正治療を受診する外来患者3683名について永久歯先天性欠如と家族性について検討した。永久歯先天性欠如を有する数家系を見出すとともに、下顎前歯のみに限局した先天欠如を有する家系の存在を確認、リストアップした。そして、下顎前歯に限局する先天性欠如2家系について全エクソンシーケンスにより原因遺伝子を探索した結果、候補3遺伝子変異を同定した。興味深いことにその内のひとつはエナメル質形成不全を伴う先天異常の原因遺伝子の一つであった。下顎前歯に限局する先天欠如は日本人に多く、欧米人に少ないとする人種差が存在する。しかし、今現在、その原因遺伝子探索結果の報告はなされていない。日本人における発症率・出現頻度が高いことは、本研究成果が国民に還元できるところが大きい。約10%もの児童に認められる永久歯先天性欠如にもかかわらず、動物実験をも含めたこれまでの長期かつ膨大な歯の発生学的研究において先天性欠如の歯種の違いをもたらす機序の解明は未踏のままである。今後、永久歯先天性欠如の遺伝子変異から空間的制御機構(永久歯先天性欠如の歯種の違いを生み出す機序)の解明につなげたい。
女性がんサバイバーの心理的適応をアシストする看護介入「アプリ」の開発

2018年度は,心理的適応をアシストするアプリのコンテンツの体系化に向けて,女性がんサバイバーが,女性性という視点から自己をどのように受け止めているのかをインタビュー調査した。手術療法や化学療法,ホルモン療法・放射線療法などの治療を現在受けている,あるいは受けたことがある乳がんおよび女性生殖器がん(子宮頸がん,子宮体がん,卵巣がん等)患者であり,外来通院中の女性29名に対して調査した。分析の結果,女性性の喪失や妊孕性の喪失,パートナーや周囲との関係性の変化,職場復帰への葛藤,病気の成り行きの不確かさなどの様々な状況の中で夫や家族,同じ境遇の人,友人,仕事,社会などで≪女性だから誰か何かとつながっている≫自己を自覚しながら,今は≪いつもの等身大でいる≫ことこそが女性としての自分であると感じてきているという結果を得た。このことを踏まえなばら,他者との情報共有ができること,および等身大の女性として生きるための情報提供という2視点が,女性がんサバイバーの心理的適応をアシストするためには必須アイテムになることを確認した。さらに,これらをシステム的に提供するためのアプリのコンテンツ構想を検討した。アプリ開発のプログラミングやセキュリティシステム制御などは情報工学教育のスペシャリストが研究分担しながら同時進行した。2018年度は心理的適応をアシストするアプリのコンテンツの体系化に向けて,まず,女性がんサバイバーが,女性性という視点から自己をどのように受け止めているのかの構成概念を抽出する質的な調査を実施した。同時にアプリのコンテンツ構想を研究者間で検討した。しかし,当初予定の心理的適応をアシストするアプリのコンテンツのプロトタイプ開発までは至っていないことから,やや遅れていると判断する。2019年度は,心理的適応をアシストするアプリのコンテンツの体系化とプロトタイプを開発し,アプリを使用した看護介入につなげていく。iOS用のアプリ開発にはapple社のパソコンiMacが,Android用のアプリ開発にはWindowsのPCが必要であることから、初年度にその購入費用を計上していた。しかし、プロトタイプ開発まで研究が進捗せず、iMacパソコンの購入を次年度に変更した。このことが次年度使用額が生じた原因である。2019年度にはiMacパソコンを購入する予定である。
交感神経-内皮細胞間の相互作用による微小循環調節機構に関する研究

生体の循環調節は、交感神経や内皮細胞が重要な役割を担っているが、これらの相互作用メカニズムに関しては未だ不明である。本研究ではこのような相互作用が交感神経と内皮細胞の間に存在するかどうか、またその調節機構についても腸管膜動脈標本を用いて細胞内微小電極法により検索した。1)機能的な神経支配の開始は3週齢の個体で、発現し、8週齢以上の個体で成熟する結果を得た。また、血管支配神経の主要な情報伝達物質はATPであることが明らかとなった。2)内皮由来の過分極電流は細胞間連絡ではなく内皮依存性拡散因子であるが、一酸化窒素やプロスタサイクリンではないことを明らかにした。3)末梢血管抵抗に関連が深い再動脈において交感神経終末から遊離した神経情報伝達物質が内皮細胞のプリン受容体P2Yを活性化し、内皮性過分極因子を遊離することにより過分極に続いて弛緩を誘発させた。4)内皮性過分極因子による交感神経調節効果を調べると、交感神経の情報伝達物質であるATPの遊離を抑制したが、ATPによる平滑筋直接作用には無影響であった。5)冬眠下の末梢循環調節について調べると冬眠時には心拍数・呼吸数・末梢血流量は正常時の1/501/8に著しく減弱し、弾性型の太い血管は拡張・筋型の末梢血管は収縮状態にあることを見出した。動脈血管はプリン作動性とノルアドレナリン作動性の興奮神経支配を受けていると共に内皮細胞性の抑制性支配下にもあるが、冬眠時ではプリン作動性興奮神経支配が主体であり、内皮細胞性の抑制支配は著しく減弱していることを見出した。以上、本研究は、交感神経性のプリン作動性およびノルアドレナリン作動性興奮神経と内皮細胞との間には血管緊張を調節する上で直接的な相互作用が存在することを初めて明らかにしたもので、循環系の局所血流調節機構を解明する研究の発展に寄与するものと思われる。これらの相互作用は、抵抗血管における局所血流調節において重要な役割を担っているものと推察される。循環器における血流動態は生命維持に大きく関わっている。特に、末梢血流に関する神経と血管内皮細胞の相互作用は近年注目を集めている。本年度の研究から明らかになったことは、(1)抵抗血管である細動脈における支配神経はATPを伝達物質とするプリン作動性ニューロンであり、一方、生理活性物質の刺激により内皮細胞から遊離される因子は一酸化窒素やカリウムイオン以外の平滑筋細胞過分極因子であることを示した。(2)動脈の内径が100um以下の細動脈では、支配神経であるプリン作動性ニューロンの神経の刺激により平滑筋細胞の脱分極とそれに引き続いて収縮が誘発されるが、この直接効果をプリン受容体拮抗薬(P2X)によって予め阻止した下では、平滑筋細胞の過分極と弛緩反応を呈する。この平滑筋抑制効果は、血管内皮細胞の除去により消失することから神経刺激により遊離した神経情報伝達物質が血管内皮細胞に作用した結果生じたものと考えられる。動脈の内径が200um以上の動脈では、血管周囲神経と内皮細胞との相互関係は確認できなかった。以上の結果は、微小循環系において支配血管神経と内皮細胞は平滑筋への直接作用に加えて、間接的な相互作用により血流の調節に極めて重要な役割を果たしているものと示唆される。

生体の循環調節は、交感神経や内皮細胞が重要な役割を担っているが、これらの相互作用メカニズムに関しては未だ不明である。本研究ではこのような相互作用が交感神経と内皮細胞の間に存在するかどうか、またその調節機構についても腸管膜動脈標本を用いて細胞内微小電極法により検索した。1)機能的な神経支配の開始は3週齢の個体で、発現し、8週齢以上の個体で成熟する結果を得た。また、血管支配神経の主要な情報伝達物質はATPであることが明らかとなった。2)内皮由来の過分極電流は細胞間連絡ではなく内皮依存性拡散因子であるが、一酸化窒素やプロスタサイクリンではないことを明らかにした。3)末梢血管抵抗に関連が深い再動脈において交感神経終末から遊離した神経情報伝達物質が内皮細胞のプリン受容体P2Yを活性化し、内皮性過分極因子を遊離することにより過分極に続いて弛緩を誘発させた。4)内皮性過分極因子による交感神経調節効果を調べると、交感神経の情報伝達物質であるATPの遊離を抑制したが、ATPによる平滑筋直接作用には無影響であった。5)冬眠下の末梢循環調節について調べると冬眠時には心拍数・呼吸数・末梢血流量は正常時の1/501/8に著しく減弱し、弾性型の太い血管は拡張・筋型の末梢血管は収縮状態にあることを見出した。動脈血管はプリン作動性とノルアドレナリン作動性の興奮神経支配を受けていると共に内皮細胞性の抑制性支配下にもあるが、冬眠時ではプリン作動性興奮神経支配が主体であり、内皮細胞性の抑制支配は著しく減弱していることを見出した。以上、本研究は、交感神経性のプリン作動性およびノルアドレナリン作動性興奮神経と内皮細胞との間には血管緊張を調節する上で直接的な相互作用が存在することを初めて明らかにしたもので、循環系の局所血流調節機構を解明する研究の発展に寄与するものと思われる。これらの相互作用は、抵抗血管における局所血流調節において重要な役割を担っているものと推察される。
鉄筋腐食RC部材の耐震性能評価に関する基礎研究

本研究では鉄筋腐食RC部材の耐震性能評価を目的とし、腐食による付着劣化と繰返し荷重が引張主筋腐食RCはりの曲げ破壊挙動に及ぼす影響と、圧縮主筋の腐食ひび割れが曲げ破壊挙動に及ぼす影響を実験と解析により検討した。その結果、リブの損失や表面に達しない腐食ひび割れは終局変位にほとんど影響せず、引張鉄筋比の減少と腐食ひび割れが終局変位に影響を及ぼすこと、また、ひび割れ幅の大きい圧縮主鉄筋の腐食ひび割れは終局変位を減少させることを明らにした。FEM解析における初期ひび割れや接合要素による腐食ひび割れは、圧縮抵抗断面の減少により実挙動を評価できず、圧縮主筋腐食ひび割れのモデル化のさらなる検討が必要である。引張主鉄筋の腐食による付着劣化が、RCはりの曲げ破壊挙動に与える影響を実験的に検討した。腐食による付着劣化の要因である,腐食ひび割れとリブ損失を独立して検討するため、それぞれを人工的にモデル化したRCはりを製作して実験を行った。鉄筋のリブを削り、人工的にリブ高さを変える事で付着性状を変化させ、断面減少率0%、10%、20%、25%相当の試験体を作成した。疑似クラックは,鉄筋周りに金属板により部材軸方向のコンクリート不連続面を形成した。疑似クラックはかぶりの半分程度とした。実験の結果、終局変位は健全なRC梁に比較して1ケースを除き概ね5mmの範囲に収まった。ひび割れ性状は断面減少率20%相当のもので、圧縮破壊域の局所化傾向が見られたが、他のケースでは顕著な傾向は見られず,付着性状を示すひび割れ間隔もほとんど変化は無かった。また鉄筋ひずみ分布からはいずれも付着が有効である事が確認された。これは、リブ以外の摩擦付着の影響、疑似クラック範囲が小さくかつせん断補強筋による拘束の影響が大きかった事が考えられる。以上の実験結果から、リブの損失による付着劣化の影響はさほど大きくない事、腐食ひび割れによる付着への影響は、部材表面に貫通する程度までは影響が小さい事などが明らかとなり、付着劣化の原因を限定するために重要な情報が得られた。しかし、この結果は当初予想とは異なるものであり、当初計画における、付着劣化パラメータと圧縮破壊領域、終局変位の関係構築には至らなかった。腐食RC部材の有限解析における非局所理論の有効性については、今回実施した解析において適用しなかった場合との大きな差異は見られなかった。より局所的な破壊をする場合に対してさらに検討が必要である。前年度の実験において、腐食によるリブ損失が付着劣化与える影響が極めて小さいことが解り、今年度の計画である終局変位の簡易評価式の構築が困難となった。そこで、研究目的である鉄筋腐食構造物の耐震性能評価のもと、計画を一部変更した。地震荷重下では圧縮域のかぶり剥落と主筋座屈が最大荷重を決定し、コアコンクリートの破壊がその後の荷重低下性状を決定する。そこで、圧縮側鉄筋の腐食ひび割れが最大荷重と最大荷重時変位に与える影響の解明を行った。研究代表者は過去の実験で、圧縮側の腐食ひび割れがせん断圧縮破壊挙動に影響を及ぼすことを示している。FEM解析における腐食ひび割れのモデル化方法をこの実験で検討し、そのモデルで圧縮側腐食ひび割れの曲げ破壊挙動解析を行った。開発したひび割れモデルではせん断耐力と最大荷重時変位が減少し、実験でのひび割れによるせん断耐力上昇は上手く評価できず、このひび割れモデルによる圧縮鉄筋が腐食したはりの曲げ破壊解析も曲げ耐力と最大荷重時変位が減少する結果となった。圧縮鉄筋が腐食したはりの曲げ破壊実験を実施したところ、かぶりに対して鉄筋径が大きい場合は、終局変位のみが大幅に減少することがわかった。また、破壊性状から、この原因は腐食ひび割れが鉄筋の拘束を弱め、鉄筋座屈が早まったためであることがわかった。従って、かぶりに対して鉄筋径が大きい場合に、圧縮側腐食ひび割れにより変形性能が低下することが考えられる。一方、実験でのひび割れの影響メカニズムは解析と異なるため、腐食ひび割れによる拘束力減少を考慮した座屈モデルを導入し、正確に評価可能な解析手法の開発が必要である。また、引張側主鉄筋が腐食したRCはりの片振り繰返し載荷試験も行い、試験結果は片押しの場合と変わらず、繰返し挙動に対する引張側腐食の影響は極めて小さいことを確認した。工学当初は、人工的なリブの加工および疑似ひび割れによる付着劣化により、曲げ終局変位が変化すると想定し、その変位と観察される圧縮破壊領域、実験パラメータの相関性を導く事が可能と考えていたが、今回の試験体ではリブの付着劣化への影響がほとんど見られなかったこと、また疑似ひび割れの影響もほとんど見られなかったため、計画における終局変位と圧縮破壊領域の寸法、実験パラメータとの相関式について検討する事ができなかった。さらに、非局所理論の妥当性についても影響が顕著な実験を対象とできず、妥当性の評価は十分ではない。

終局変位と観察される圧縮破壊領域、実験パラメータの相関性を導く事ができておらず、当初計画の終局変位の簡易評価式の構築は難しい。そこで、これまでに行った実験のシミュレーションを行った上で、有限要素解析により付着性状をパラメトリックに変化させ、付着劣化による影響について構造形式と破壊形態で整理を行う。これと、初年度の結果により、今後検討すべき破壊形態、部材、実験パラメータが限定されることとなる。またこれについては、1方向だけでなく、交番繰り返し載荷の場合にも同様に検討する。非局所理論の適用性については、引き続き検討を行う。印刷関連消耗品の使用が予定より少なくなったため。次年度、印刷関連の消耗品として使用する。
高フィネス光共振器と冷却原子集団を用いた光子数状態の時間的分離

本研究では、高い量子操作性とコヒーレンスを持つ冷却原子集団を高フィネス光共振器と組み合わせ、これら二つの間の強結合により得られる少数光子での光学非線形性を用いて、光パルスを光子数状態に応じて時間的に分離することを目的とした。この目的を達成するために新たな共振器を考案し作製した。また、共振器安定化の機構の開発および、原子集団を共振器中にトラップするための光源の準備を行った。ここまでで、真空装置以外の実験装置の準備がほぼ整った。さらに、光子統計の時間変化と光子数状態の時間分離の関係についての理論的な解析を行った。これにより、実験を遂行する際に精緻な解析を行うことができると期待される。光子を基軸とした量子情報処理を実装する上では、想定を超えた光子数の発生が様々な場面で大きな障壁となっている。この障壁を打破するためには、光パルス中の光子数を計測することのできる光子数分解検出器の開発が必要不可欠である。本研究では、高い量子操作性とコヒーレンスを持つ冷却原子集団を高フィネス光共振器と組み合わせ、これら二つの間の強結合により得られる少数光子での光学非線形性を用いて、光パルスを光子数状態に応じて時間的に分離することを目的としている。これにより、これまでに開発されている光子数分解検出器の弱点である検出器の量子効率の影響を緩和し、現存する単一光子検出器を用いて確実に光子数を測定できるようになることが期待される。光子数分離の実現に向けて、平成24年度は、(1)高フィネス光共振器の設計、(2)冷却原子集団トラップ用の光源開発、および(3)大気中における共振器のフィネスおよび安定性の評価を行うことを計画した。(1)に関しては、(A)異なる2つの縦モードが原子の持つ2つの電子励起遷移に共鳴する、(B)原子と共振器モードの強結合実現のために小さいモード径を持つ、という二つの要請を満たす共振器を設計し作成した。(2)については、波長852 nmのDBRレーザーダイオードを準備し、電流および温度変調の入力と、ノイズフィルターおよび逆電圧クランプ機構を備えたレーザーダイオードマウントを作成した。(3)については、特注の高フィネスミラーをシグマ光機株式会社から購入し、そのフィネスを評価した。具体的には、高フィネスミラーを用いて試験用の共振器を作成し、共振器長に変調を加えることで共振器内の光の減衰を観測した。ここから共振器の線幅を見積もり、フィネスを決定した。光子を用いた量子情報処理の実装においては想定を超えた光子数の発生が大きな障壁となっている。この障壁を打破するためには、光パルス中の光子数を計測できる光子数分解検出器の開発が必要不可欠である。本研究では、高い量子操作性とコヒーレンスを持つ冷却原子集団と高フィネス光共振器との間の強結合により得られる少数光子での光学非線形性を用いて、光パルスを光子数状態に応じて時間的に分離することを目的とする。これによりこれまでに開発された光子数分解検出器の弱点である量子効率の影響を緩和し、現存する単一光子検出器を用いて確実に光子数を測定できるようになることが期待される。上記を踏まえ平成25年度は以下のような計画で研究を行った。(1)高フィネスミラーのフィネス低下の原因解明と共振器の安定性評価、(2)真空装置への共振器の導入、トラップ用光源の共振器に対する安定化、および共振器中での冷却原子集団の捕捉、(3)共振器周波数安定化用の参照共振器の開発および原子の近共鳴光と非共鳴光の同時安定化、(4)参照共振器を介した実験用共振器の原子共鳴に対する安定化および強結合の確認、(5)共振器から放出される光子の自己相関関数の時間依存性の測定。(1)についてはミラー表面での損失がフィネス低下の原因と判明したためコーティングをやり直し、フィネスが改善した。また安定的に共振器モードが立つことを確認した。(2)については共振器を真空装置中に保持するマウントの設計を行った。(3)については参照共振器の開発および2種の光源と同時安定化用の電気回路の準備を完了し、これから安定化を行うところである。(4)については原子共鳴に対して安定化した参照光および電気回路の作製が完了した。現在行っている真空漏れの修理ができ次第(2)(4)(5)を完了させる予定である。また、光子統計の時間変化と光子数状態の時間分離の関係についての理論的な解析も行った。

平成24年度の計画で設定した目標は(1)高フィネス光共振器の設計、(2)冷却原子集団トラップ用の光源開発、および(3)大気中における共振器のフィネスおよび安定性の評価、の三項目である。このうち高フィネス光共振器の設計は終了し、作成まで行った。また、冷却原子集団トラップ用の光源も完成している。すなわち(1)と(2)については完了している。(3)については、高フィネスミラーを用いて共振器を作成し、フィネスの評価までは行った。ただ、その結果はミラーの設計上の値である100,000に対して一桁低い約15,000であった。現在その原因を究明しているところであるため、共振器の安定性の評価にまでは至らなかったが、平成25年度初頭には達成できる見通しである。上記を総合的に判断すると、本研究はおおむね順調に進展していると言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、以下の計画で研究を推進する予定である。(1)高フィネスミラーのフィネス低下の原因を解明する。その上で共振器の安定性を評価する。(2)共振器を真空装置へ導入し、ベーキングを行う。温度が十分に下がった後でカップリング効率を測定し、光軸のずれがないことを確認する。また、ベーキングの過程で共振器のフィネスに変化がなかったことを確認する。さらにトラップ用の光源の周波数をPDH法により共振器に対して安定化させ、冷却原子集団をトラップする。(3)共振器周波数安定化用の参照共振器を開発し、その共振器に対してPDH法により原子の近共鳴光と非共鳴光を同時に安定化させる。(4)上述の参照共振器を用いて実験用共振器の共鳴周波数を原子の共鳴に対して安定化させる。また、共振器の透過スペクトルを観測することにより強結合を確認する。(5)光ポンプ法を用いて原子集団を特定の量子状態に初期化した後、この量子状態から電子励起状態への遷移周波数に対応する光を共振器に入射する。入射光の偏光状態と直交する偏光状態を持つ共振器からの出射光の自己相関関数の時間依存性を、ビームスプリッターと二台の単一光子検出器を用いて測定する。
骨代謝異常に対応可能な骨代替材料と破骨細胞前駆細胞による次世代骨再生医療の展開

本研究課題は、骨欠損部位にセラミック顆粒と骨芽細胞に分化する骨髄間葉系幹細胞及び破骨細胞を移植することで、骨再生を促進することを目指して行われた。骨髄間葉系細胞移植は骨形成と破骨細胞誘導を同時にもたらし、移植物の骨組織への置換に単独で寄与することを示した。また、水熱法で作製された柱状粒子ハイドロキシアパタイトを移植すると、骨髄間葉系細胞を移植しなくても破骨細胞に近い形質の多核巨細胞が形成され、さらに、移植条件により破骨細胞に近い形質のものから異物巨細胞に近い形質のものまで異なる巨細胞が形成されることを示し、破骨細胞と異物巨細胞の分化機構に関する重要な細胞生物学的知見を得ることができた。骨新生を促す治療には骨芽細胞だけでなく破骨細胞も共に移植することが重要であるという仮説のもと、皮下移植系で最適条件を見いだすための第1段階の研究を行った。皮下移植の系では、Fisherラットの背部に左右2か所、40 mgずつのセラミックを移植した。間葉系幹細胞なし、間葉系幹細胞を5x105個、1x106個、2x106個の各条件で移植したが、新生骨形成は乏しく、皮下では安定した骨形成が認められなかった。これは予備実験と全く同様であり、再現性が確認された。しかしその一方で、驚くべき副所見が得られた。皮下に移植した柱状粒子HA周囲の多核巨細胞の80%以上が、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ陽性かつカテプシンK陽性の破骨細胞であったが、皮下に移植した通常のHA周囲の多核巨細胞の80%以上は酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ陰性、カテプシンK陰性の異物巨細胞であった。特に間葉系幹細胞を加えないセラミックのみの移植部位で明確な結果が得られた。同部には骨形成及びアルカリホスファターゼ陽性細胞の出現は全く見られず、骨または骨への分化傾向を有する細胞が全くない骨外環境で柱状粒子HAは破骨細胞を誘導したと判断された。この思いがけずに得られた所見は、骨芽細胞形成が先か、破骨細胞形成が先かという長年の疑問に対して現在少しずつ集まりつつある研究成果のいずれもが骨芽細胞形成が先であることを示唆しているのに対し、全く相反する情報を提供している。また、破骨細胞が骨芽細胞の誘導や骨形成に重要であるという、本研究の大胆な仮説を強く支持する結果として注目される。今年度の実験では移植4週後、7週後に試料を採取しているが、骨形成を促すにはさらに長期間必要なのかもしれない。骨再生医療には骨芽細胞またはその前駆細胞が必要であり、骨芽細胞に分化誘導可能な様々な幹細胞が紹介されている。本研究課題では、骨を誘導するには骨芽細胞系細胞だけでなく、破骨細胞系の細胞も共存させることが効果的であるという仮説が正しいか否かを明らかにすることを目的としている。破骨細胞誘導因子RANKLで3日間刺激したマウス骨髄由来マクロファージを直径0.5 mmのハイドロキシアパタイト(HA)球状顆粒と混合し、I型コラーゲンゲルで固めたものを頭頂部皮下組織に移植した。その結果、骨組織の誘導は認められなかったものの、少数のアルカリホスファターゼ(ALP)活性陽性細胞の出現が認められた。次に、マウス頭蓋冠より骨芽細胞を単離し、増殖させた上、骨髄由来マクロファージと1:1の割合で混合し、I型コラーゲンゲルで固めて頭頂部皮下組織に移植した。移植1ヶ月後に移植部位を摘出し、マイクロCTにて石灰化物の量を比較検討した。その結果、対照となるセラミック顆粒のみを移植した群に対して、骨芽細胞及び骨髄由来マクロファージを同時に移植した群では硬組織形成明らかに多いと判断された。現在これらの非脱灰薄切標本を作成し、詳細な所見を検討中である。さらに、本研究の遂行過程で偶然に明らかになったことであるが、皮下にセラミック顆粒をI型コラーゲンで固めて移植した場合、セラミックの種類により出現細胞が異なる事を明らかにした。柱状粒子を有するHAを移植すると、周囲に形成された多核巨細胞の多くが酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ及びカテプシンK陽性の破骨細胞様細胞となり、一般的な球状粒子を有するHAの周囲にはどちらも陰性の異物巨細胞が多く出現し、生体内吸収性セラミックとして広く用いられているβ-リン酸三カルシウム顆粒周囲には、異物巨細胞以外全く形成されないことがわかった。現在これらのデータを学術論文としてまとめている。骨代替材料として用いられるbeta-TCP顆粒をラット皮下組織に移植した場合、周囲には主に異物巨細胞が形成された。一方、骨芽細胞前駆細胞を含むラット骨髄間葉細胞をbeta-TCP顆粒とともに移植した場合、骨形成を伴いかつその周囲には破骨細胞が誘導され、結果として骨形成及び骨代替材料の速やかな吸収が行われることが明らかとなった。この結果から、骨欠損部位に骨代替材料を移植する場合、破骨細胞の誘導が異物巨細胞の誘導よりも望ましく、骨代替材料の骨への置換を促進し骨組織の再生に寄与すること、骨組織及び破骨細胞の誘導という2つの作用を発揮する骨芽細胞前駆細胞の移植が、骨代替材料を移植した骨欠損部位の再生に有利であることが示唆された。(論文投稿中)

また、微細構造が異なる骨代替材料、柱状粒子ハイドロキシアパタイト(HA)または非柱状粒子HAをラット皮下組織に移植した場合、移植物周囲には酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陽性・カテプシンK陽性(TRAP+ CTSK+)多核巨細胞、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ陰性・カテプシンK陽性(TRAP- CTSK+)多核巨細胞及び共に陰性の多核巨細胞という3種類の多核巨細胞が誘導された。TRAP+ CTSK+多核巨細胞は柱状粒子HA顆粒を血漿で固めて移植した場合出現しやすく、ヒト精製fibrinで固めて移植した場合にはTRAP- CTSK+多核巨細胞が出現しやすく、非柱状粒子HA周囲では共に陰性の多核巨細胞が出現しやすかった。さらに、TRAP+多核巨細胞の誘導には血漿及び柱状粒子構造が関与し、CTSK+の多核巨細胞の誘導には血漿が関与することを突き止めた。この成果から、異物巨細胞の多様性、異物巨細胞と破骨細胞との高い類似性を示すとともに、これら異なる多核巨細胞の誘導条件も明らかにした。(Acta Biomater.,in press)本研究課題は、骨欠損部位にセラミック顆粒と骨芽細胞に分化する骨髄間葉系幹細胞及び破骨細胞を移植することで、骨再生を促進することを目指して行われた。骨髄間葉系細胞移植は骨形成と破骨細胞誘導を同時にもたらし、移植物の骨組織への置換に単独で寄与することを示した。また、水熱法で作製された柱状粒子ハイドロキシアパタイトを移植すると、骨髄間葉系細胞を移植しなくても破骨細胞に近い形質の多核巨細胞が形成され、さらに、移植条件により破骨細胞に近い形質のものから異物巨細胞に近い形質のものまで異なる巨細胞が形成されることを示し、破骨細胞と異物巨細胞の分化機構に関する重要な細胞生物学的知見を得ることができた。本研究課題の目的は、骨を誘導する移植医療において、骨芽細胞系細胞のみならず破骨細胞系細胞を同時に移植することが有効であるという仮説を明らかにすることに絞られている。マイクロCT画像上ではあるが、骨芽細胞系細胞及び破骨細胞系細胞の前駆細胞である骨髄マクロファージを同時に移植することで多量の骨形成があると判断され、この仮説が正しい事が示唆されている。口腔病理学本研究課題が今後の骨再生医療分野でイノベーションをもたらす可能性がある。今後は詳細な組織所見と定量評価によって全容を明らかにする予定である。また、骨外細胞形細胞とマクロファージの最適な比率を求めるとともに、これら2種類の細胞を移植することで骨誘導が活発になる分子機構を明らかにして行く方針である。本研究課題を開始する直前に研究分担者の西村が、研究代表者が所属する長崎大学から鹿児島大学に転任し、研究体制の立ち上げが予想より遅れた。その影響もあり、移植実験の進行状況はやや遅れていると言わざるを得ない。しかしながらその過程で、我々が開発した柱状粒子HAは骨芽細胞や骨がない状況で骨外に破骨細胞を誘導できるという生物学的に極めて興味深くかつ重大な所見が得られた。その意義の大きさを考慮すると、総合的には本研究課題の目的を十分に達成しつつあると判断される。破骨細胞または破骨細胞前駆細胞を骨芽細胞と共に移植することが骨誘導に効果的であることを、今後計画通り間葉系幹細胞と破骨細胞前駆細胞を種々の混合比にて移植し、比較検討する。一方で、純粋に生物学的な興味として、なぜ骨芽細胞または骨組織がない部位に柱状粒子HAは破骨細胞を誘導できたのかを確認することも重要である。そのために、破骨細胞誘導と異物巨細胞誘導という現象を何が振り分けているのか、細胞生物学的に少しでも情報を得るための基礎研究も行う。未使用額393円ほどの少額必要物品がなかったため。