hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ガソリン小売価格で見られる周期的振動の発生機構の解明：時空モデルによるアプローチ

価格競争が行われる財の小売価格の推移において、エッジワース・サイクル(EC)と呼ばれる周期的変動が現れることがある。ECとは価格の急激な高騰と緩やかな下落を繰り返す周期的変動のことである。日本のガソリン小売市場では、小売価格が同期して周期的(EC)変動をする店舗のクラスタと、非周期変動をする店舗のクラスタが空間的に共存している。これは、周期的クラスタのような秩序的現象と、非周期的クラスタのような非秩序的現象が空間的に共存していること、つまり、部分的に秩序立っていることを意味する。本研究の目的は、現実のガソリン小売価格の変動に見られる時間的・空間的秩序、特に、部分秩序的な変動が発生する機構の解明である。本年度では新たにオーストラリア・NSW州のガソリン小売市場の価格データを入手した。そして分析の結果、NSW州の市場においても日本と同様に部分秩序的な現象が見られることを確認した。更にNSW州では、地域によって周期の異なるECが現れていることがわかった。地域によって周期の異なるECが発生する背景を小売店の行動様式のレベルから分析することは、本研究の目的を達成するためには必要不可欠である。従って本年度はこの分析も行った。分析の結果から、(1)人口あたりの店舗数が多い地域ほどECの周期が長くなる傾向があることと、(2)店舗の価格決定様式が地域的要因から影響を受けること、そして、このことがECの周期を説明するためには重要であることがわかった。これらの分析結果をまとめ上げ査読雑誌へ投稿した結果、条件付き採録の判定を受けた。現在再投稿中である。当初はアンケート調査をすることで日本における小売店の行動様式を推定する予定であった。しかし、精度の高いオーストラリア・NSW州の価格データが手に入り、このデータを分析することで小売店の行動様式を推定することが可能になったためアンケート調査は行わなかった。研究の進め方に変更はあったが期待通りの進展があったといえる。この理由として次の三つが挙げられる。(1)現実の小売店の行動様式を推定した。(2)査読付き雑誌への投稿を行った。(3)シミュレーション・モデルの作成に取り掛かっている。本年度は主にオーストラリア・NSW州のガソリン小売市場に対する検証を行った。NSW州の市場においても日本と同様に部分秩序的な現象が見られることを実データの分析によって確認した。従って、部分秩序的な現象は様々な国でも現れうる頑健なものであると考えられる。今後は、どのような条件において部分秩序的な現象が現れるかを日本とNSW州のデータを用いて検証する。また、現実の小売店の行動様式をもとに時空モデルを構築し、シミュレーションを行う。得られた結果を国際会議で発表し、そして、査読付き雑誌へ投稿する。現在再投稿中である。
ミツバチ由来のアピデシンをモデルとした抗菌ペプチドの実験室内進化

本研究は、ミツバチ由来の抗菌ペプチドで、18アミノ酸残基からなる“アピデシン"(apidaecin)に着目し、これを動植物への病原菌の感染防止や食品保存に応用するためのモデル抗菌ペプチドと位置づけ、実験室内進化の手法を開発することを目的とした。平成7-9年度の3年間で得た成果は次の通りである。まず、アピデシン遺伝子に対してヒドロキシルアミンやPCRによる限定域ランダム突然変異と、独自に開発したin vivoアッセイ・スクリーニング系を組み合わせ(本来アピデシン感受性の大腸菌宿主ベクター系であえて変異アピデシンを発現させ、活性変異体を分離できる)、多数の低活性変異体を得ることに成功した。これにより、アピデシン分子のC末端領域や、Pro,Arg残基が活性発現に重要であるというような「機能マッピング」が可能になった。また、この機能マッピングをさらに完成させつつ、上記in vivoアッセイ系(多数サンプルに対応可)が直接活性を測定するin vitroアッセイ系と明らかな相関関係にあることを確認、さらに高活性変異体スクリーニングに有力なアンピシリンスクリーニング用宿主ベクターを構築、目的とする高活性変異体を10^2-10^3倍に濃縮しうることを確認した(初年度)。次いでアピデシン生産法の工夫、高活性変異体取得への予備実験、抗菌作用メカニズム解明の予備実験等を経て(2年度)、最終年度ではこれまでの成果をふまえ、活性に必須と考えられるアミノ酸残基以外の残基をランダマイズするようアピデシン遺伝子を化学合成し、その結果、高活性型変異アピデシンを取得するに至った。また、アピデシン以外の抗菌ペプチドとして、グラム陰性・陽性細菌のみならず、真菌にも作用するカメムシ由来の「タナチン」についても本研究で開発した方法論を適用し、アピデシン同様多数の変異型タナチンを取得することができ、本実験室内進化系の汎用性を証明しえた。本研究は、ミツバチ由来の抗菌ペプチド"アピデシン(apidaecin)"に注目し、これを動植物への感染防止や、食品保存に応用するためのモデル抗菌ペプチドと位置づけ、実験進化の手法を開発することを目的としている。本年度は、初期の目標の第一項目である「野性型アピデシンから種々の誘導体を得、一次構造と機能(抗菌活性)との相関を検討すること」を実施した。このため、ヒドロキシルアミン処理およびPCRによる限定域in vitroランダム突然変異とin vivoスクリーニング系を組み合わせた独自の方法(本来アピデシン感受性の大腸菌の宿主ベクター系であえて変異アピデシンを発現させ、活性変異体を分離できる方法)を駆使し、多数の「低活性変異体」を得、塩基配列決定による変異点の解析を行った。その結果、18残基からなるアピデシン分子のうち、複数のプロリン残基およびC末端側がアピデシンの活性に大きく関与していることが分かった。多くの変異体ペプチドを分離精製することは時間的に困難なので、ここで用いた抗菌活性評価法は、上記大腸菌宿主ペクター系を巧みに応用したin vivoアッセイ系による簡便法である。この簡便法による活性評価が、実際にin vitroでの活性評価と一致しているかどうかを確認するため、3種の低活性変異体(P6L,P13Q,P14L)から変異アピデシンを融合タンパク質として発現、アピデシン分子を遊離切断後精製し、大腸菌をインディケーターとして直接活性測定を行った。その結果、明らかにin vivo系とin vitro系での活性評価に相関性がみられ、上記の結論を裏付けることができた。次年度は、これらの成果を基盤として、目標の第2項目である「実験進化による高活性アピデシン変異体取得」の可能性にチャレンジする予定である。

本研究は、ミツバチ由来の抗菌ペプチドで、18アミノ酸残基からなる"アピデシン"(apidaecin)に着目し、これを動植物への感染防止や、食品保存に応用するためのモデル抗菌ペプチドと位置づけ、実験進化の手法を開発することを目的としている。前年度には、アピデシン遺伝子に対してヒドロキシルアミンとPCRによる限定域in vitroランダム突然変異と、in vivoアッセイ・スクリーニング系を組み合わせた独自の方法(本来アピデシン感受性大腸菌の宿主ベクター系であえて変異アピデシンを発現させ、活性変異体を分離できる)を駆使し、多数の低活性変異体を得、アピデシン分子の機能マッピングを行うと同時に、in vivoとin vitroでの活性評価の一致を確認した。本年度は、これらの実績をもとに次のような成果を得た。1.高活性変異体のデザインをより容易にするため、アピデシン遺伝子を2つタンデム(正逆それぞれ)に連結し、発現ベクターを構築した。2.高活性変異体が上記in vivoスクリーニング系で出現したとき、野生型活性体が死滅し、それより高活性の変異体のみが生存できるような実験系として「アンピシリンスクリーニング系」を組み、それによって約1000倍の効率で高活性変異体の選抜が実現することを確認した。3.アピデシンの抗菌スペクトルに関し、グラム陰性菌に効き、陽性菌には効かないとの従来の知見に対し、陽性菌でも効く場合のあることを、枯草菌の特殊株を用いて証明した。4.アピデシンの抗菌作用との比較研究のため、カメムシ由来のサナチン(21アミノ酸残基からなり、グラム陰性菌、陽性菌、真菌のいずれにも作用)の遺伝子を化学合成し、プロテアーゼインヒビター"SSI"の遺伝子と融合後、上記in vivoアッセイ系に組み込んだ。次年度には、これらの成果を活用して、高活性変異や抗菌スペクトル変異体への実験進化に向けた研究を展開する。本研究は、ミツバチ由来の抗菌ペプチドで、18アミノ酸残基からなる“アピデシン"(apidaecin)に着目し、これを動植物への病原菌の感染防止や食品保存に応用するためのモデル抗菌ペプチドと位置づけ、実験室内進化の手法を開発することを目的としている。前年度までに、アピデシン遺伝子に対してヒドロキシルアミンやPCRによる限定域ランダム突然変異と、in vivoアッセイ・スクリーニング系とを組み合わせた独自の方法(本来アピデシン感受性の大腸菌宿主ベクター系であえて変異アピデシンを発現させ、活性変異体を分離できる)を駆使し、多数の低活性変異体を得、アピデシン分子の機能マッピング、その他の解析を行った。(1)実験室内進化で重要なプロセスであるランダム変異法を改良して、活性に必須と考えられるアミノ酸残基以外の残基をランダマイズするようアピデシン遺伝子を化学合成し、その結果、高活性型を含む多数の変異型アピデシンの取得が可能になった。今回の実験でも、従来見いだした通り塩基性アミノ酸残基の重要性が示唆された。(2)抗菌ペプチド全般に対する本実験室内進化系の有用性を確かめるため、カメムシ由来の抗菌ペプチド“タナチン"(thanatin)の解析を試みた。
テトラヒドロビオプテリンの血管内皮保護作用とその機序に関する検討

ほ乳類の細胞のテトラヒドロビオプテリン(BH4)産生には二つの経路が存在することが知られている:GTPCHによって始まるde novo synthetic pathwayと存在するダイハイドロビオプテリン(BH2)を利用するsalvage pathwayである。BH4のde novo合成の律速酵素GTP cyclohydrolase I(GTPCH)は血管平滑筋においてはlipopolysaccharide(LPS)によって誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)と共誘導され、このことがBH4産生そしてNO産生に必須である。外因性BH4の供給にはBH2がdihydrofolate reductaseを経てBH4となるsalvage pathwayが主な役割を果たしていると考えられた。外因性のBH4としての効率はBH4およびそのprecursorとしてのBH2/sepiapterinを用いて比較検討したが、その効率はsepiapterin>BH2>>BH4の順で、細胞膜の透過の機構がどうやら重要な問題であると考えられた。今年度は、以上のことを、補足し確認する実験を行ってきた。ほ乳類の細胞のBH4産生には二つの経路が存在することが知られている: GTPCHによって始まるde novosynthetic pathwayと存在するBH2を利用するsalvage pathwayである。BH4のde novo合成の律速酵素GTP cyclohydrolase I (GTPCH)は血管平滑筋においてはLPSによってiNOSと共誘導され、このことがBH4産生そしてNO産生に必須である。GTPCHを阻害剤DAHPでブロックして、血管平滑筋をLPSで刺激すると、inactiveなiNOS apoenzyme (relative to BH4)が細胞内に誘導され蓄積される。このような細胞を用いて、外因性のBH4がどうように利用されるかを、BH4およびそのprecursorとしてのBH2/seplapterlnを用いて比較検討した。BH4を血管平滑筋細胞に加えると、NO産生がその濃度依存的に増加した。sepiapterinあるいはBH2を加えても、濃度依存的にNO産生が誘導された。これらのEC50は0.05(sepiapterin)<0.1(BH2)<<1(BH4)μMであった。sepiapterinおよびBH2はdihydrofolate reductaseの阻害剤MTXが存在するともはやNO産生を誘導することはできず、一方BH4は高濃度においてはじめて、NO産生をかなり抑制されているがある程度の可能にすることができた。以上より、外因性BH4の供給にはBH2がdihydrofolate reductaseを経てBH4となるsalvage pathwayが主な役割を果たしていると考えられた。ほ乳類の細胞のBH4産生には二つの経路が存在することが知られている:GTPCHによって始まるde novo synthetic pathwayと存在するBH2を利用するsalvage pathwayである。BH4のde novo合成の律速酵素GTP cyclohydrolase I(GTPCH)は血管平滑筋においてはLPSによってiNOSと共誘導され、このことがBH4産生そしてNO産生に必須である。GTPCHを阻害剤DAHPでブロックして、血管平滑筋をLPSで刺激すると、inactiveなiNOS apoenzyme(relative to BH4)が細胞内に誘導され蓄積される。このような細胞を用いて、外因性のBH4がどうように利用されるかを、BH4およびそのprecursorとしてのBH2/sepiapterinを用いて比較検討した。これらのEC50は0.05(sepiapterin)<0.1(EH2)<<1(BH4)μMであった。さらに、我々はstatinの多面的効果の1つである血管内皮機能の改善作用にstatinによる血管内皮細胞におけるBH4の合成の亢進が関与していることを見いだし、検討中である。
炎症関連大腸がんの発がんに対するＭＩＦワクチン療法の開発

MIF DNAワクチンは腸炎を含む多くの炎症モデルにおいて予防・治療効果を示す。ワクチンには抗MIF自己抗体を誘導するために破傷風毒素(TTX)型ヘルパーTエピトープを組み込んである。本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらに破傷風毒素TET830をエピトープとする新規MIFワクチンを作製した。一方、炎症誘発大腸がんモデルではMIFの発現に各種サイトカイン(IL-4、IL-17a、GMーCSF)やケモカイン(CCL12、CCL20)、MMP3の発現が呼応することが確認された。初期型MIF-DNAワクチンを接種したところ、発がん抑制効果が再現良く確認できた。昨年度、従来のマウスMIF DNAワクチンのデザインを基に新規MIF-DNAワクチンを立案、設計した。従来用いてきたThエピトープは破傷風毒素(TTX)由来のものだが、本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらに破傷風毒素に関しては活性を増強することが知られているTET830をはじめとする数種類を候補とした。これらのタンパク質では、それぞれQAVHAAHAEINE、SALLSSDITASVNCA、AQYIKANSKFIGITELが高い免疫増強活性を持つことが知られており、これらを含む新規MIFワクチンをデザインした。従来型ワクチンではMIF立体構造の2番目のループをThエピトープで置換した変異MIFをワクチンとしたが、中和抗体誘導に効果的であったので本研究でもまず最初に同じ位置にエピトープを置換挿入することとした。本年度はこの方針に基づき、現行のワクチンを鋳型としてThエピトープをコードするプライマーを用い、上記のThエピトープを含む新規改変型MIF発現プラスミドの2種類(OVA型とHEL型)を作製、大量調製を行った。また、TET型も作成中である。一方、AOMとDSSによる炎症誘発大腸癌モデルにおいてMIFを含むサイトカインやケモカイン、並びにがんの増殖と進展に関わる遺伝子の発現を経時的に解析した。その結果、大腸発がん誘導70日前後をピークとした大腸におけるMIFの発現に呼応してサイトカイン(IL-1a、IL-4、GMーCSF)、ケモカイン(CCL12、CXCL13)やMMP3の発現がピークに達していた。電気穿孔法によるMIF-DNAワクチン接種法は、抗MIF抗体産生を誘導できたが、発がん抑制効果は不十分であったので、Hydrodynamic gene delivery法を用いてMIF-DNAワクチン接種したところ、発がん抑制効果が確認できた。従来のマウスMIF DNAワクチンのデザインを基に新規MIF-DNAワクチンを立案し、設計するのが本年度の計画である。用いるThエピトープは、従来型では破傷風毒素(TTX)由来のものだが、本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらにに破傷風毒素に関しては活性を増強することが知られているTET830をはじめとする数種類を候補とし、それぞれQAVHAAHAEINE、SALLSSDITASVNCA、AQYIKANSKFIGITELを選びその配列を含む新規MIFワクチンをデザインした。この方針に基づき、現行のワクチンを鋳型としてThエピトープをコードするプライマーを用い、上記のThエピトープを含む新規改変型MIF発現プラスミドの一部を作製した。一方、平成25年度におけるワクチンによる発がん抑制実験の予備実験として、大腸発がんモデルを作製し、このモデルにおける発がんの時期を明からにした。AOM(10 mg/kg)を投与しその1週間後に1%DSSを飲水にて反復投与(7日間連続、7日間休止を3サイクル)を開始して大腸発がんを誘発した結果、およそ70日で全てのマウスの大腸に腫瘍の発生を認めた。組織染色の結果、全ての腫瘍は腺癌化していることを確認した。本研究課題において、初期型のマウスMIF DNAワクチンのデザインを基に新規MIF-DNAワクチンを立案、作成してきた。初期型ワクチンに用いたThエピトープは破傷風毒素(TTX)由来のものだが、本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらに破傷風毒素に関しては活性を増強することが知られているTET830をはじめとする数種類を候補とした。初期型ワクチンではMIF立体構造の2番目のループをThエピトープで置換した変異MIFをワクチンとしたが、中和抗体誘導に効果的であったので本研究でもまず最初に同じ位置にエピトープを置換挿入することとした。初期型ワクチンを鋳型としてThエピトープをコードするプライマーを用い、上記のThエピトープを含む新規改変型MIF発現プラスミドの2種類(OVA型とHEL型)を作製、大量調製を行った。TET型に関しては、エピトープの挿入が難航し、新たな方法で作成を試みている。

その結果、大腸発がん誘導70日前後をピークとした大腸におけるMIFの発現に呼応してサイトカイン(IL-1a、IL-4、GMーCSF)、ケモカイン(CCL12、CXCL13)やMMP3の発現がピークに達していた。Hydrodynamic gene delivery法を用いて初期型MIF-DNAワクチン接種したところ、発がん抑制効果が確認できた。この抑制効果の再現性も新たに確認された。本研究課題では、初期型のマウスMIF DNAワクチンのデザインを基に新規MIF-DNAワクチンをこれまで立案、作成してきた。初期型ワクチンに用いたThエピトープは破傷風毒素(TTX)由来のものだが、本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらに破傷風毒素に関しては活性を増強することが知られているTET830をはじめとする数種類を候補とした。これらのタンパク質では、それぞれQAVHAAHAEINE、SALLSSDITASVNCA、AQYIKANSKFIGITELが高い免疫増強活性を持つことが知られており、これらを含む新規MIFワクチンをデザインした。初期型ワクチンではMIF立体構造の2番目のループをThエピトープで置換した変異MIFをワクチンとしたが、中和抗体誘導に効果的であったので本研究でもまず最初に同じ位置にエピトープを置換挿入することとした。初期型ワクチンを鋳型としてThエピトープをコードするプライマーを用い、上記のThエピトープを含む新規改変型MIF発現プラスミドの2種類(OVA型とHEL型)を作製、これまで調製を終えている。最終年度ではTET型エピトープの挿入に成功した。ワクチンの大量調製系を構築し、十分量の調製に取りかかっている。一方、AOMとDSSによる炎症誘発大腸癌モデルにおいてMIFを含むサイトカインやケモカイン、並びにがんの増殖と進展に関わる遺伝子の発現を経時的に解析した。その結果、これまで大腸発がん誘導に伴うMIFの発現に、各種のサイトカイン(IL-1a、IL-4、GMーCSF)やケモカイン(CCL12、CXCL13)、MMP3の発現が呼応することが確認されている。このモデルにMIF-DNAワクチンを接種したところ、発がん抑制効果が再現性も含め確認できた。MIF DNAワクチンは腸炎を含む多くの炎症モデルにおいて予防・治療効果を示す。ワクチンには抗MIF自己抗体を誘導するために破傷風毒素(TTX)型ヘルパーTエピトープを組み込んである。本研究では新たに卵白アルブミン(OVA)、卵白リゾチウム(HEL)、さらに破傷風毒素TET830をエピトープとする新規MIFワクチンを作製した。一方、炎症誘発大腸がんモデルではMIFの発現に各種サイトカイン(IL-4、IL-17a、GMーCSF)やケモカイン(CCL12、CCL20)、MMP3の発現が呼応することが確認された。初期型MIF-DNAワクチンを接種したところ、発がん抑制効果が再現良く確認できた。新規ワクチンのうち、2種類を作出し、動物実験に供するに足る量の調製が済んだ。初期型ワクチンを用いた炎症誘発大腸癌モデルにおいて、各種液性因子の動態や遺伝子の発現の解析を行った。さらに、Hydrodynamic gene delivery-MIF-DNAワクチンによる発がん抑制効果を確認している。
原虫の宿主細胞内環境への適応とその排除機構の解明

核酸生合成系の酵素として重要なRibonucleotide reductaseを構成する2つのサブユニットのうち、小サブユニット(R2)遺伝子のクローニングを行った。T.sergenti牛感染血液からピロプラズマを精製、mRNAを得た。既に塩基配列の知られているT.annulataR2遺伝子からプライマーを設計し、RT-PCRにより遺伝子増幅した。得られたcDNA断片は全長を含んでいなかったため、5`、3'方向へRACE(rapid amplification of cDNA ends)法によって全長cDNAを得た。さらにcDNA断片をプローブとして染色体DNAライブラリーをスクリーニングして、R2遺伝子領域を含むクローンを得た。その塩基配列解析の結果、R2遺伝子には少なくとも2カ所のイントロンが存在することが判った。予想アミノ酸配列のC末端(R1サブユニットとの会合部位)は、宿主のR2分子の構造とは異なっており、合成ペプチドによる阻害が可能であると考えられた。赤血球侵入に際し赤血球レセプター結合と結合する蛋白質の遺伝子クローニングをB.equi,B.caballiについて行った。すなわち両原虫のcDNAライブラリーから、抗体を用いた免疫スクリーニングによって、前者からは2クローン、後者からは1クローンを得た。塩基配列決定の結果、B.equiの1クローンはグルタミン酸の連続するモチーフを持つ蛋白質蛋白質で、マラリア原虫の表面蛋白質とも構造が共通するものであった。また、B.caballiの1クローンは、赤血球侵入に重要な役割を果たすロプトリ-関連蛋白質であることが判明した。T.sergentiveilについて、いくつかのバンドを単離してN末端アミノ酸配列を決定したところ、いずれも宿主の蛋白質とのホモロジーは認められず、原虫由来蛋白質であると考えられた。Theileria sergentiおよびT.buffeli感染赤血球から原虫および感染赤血球付帯構造物であるveilを精製した。veil構成蛋白質は、SDSで可溶化後、SDS-PAGEにより分画、各蛋白質バンドを精製、それぞれのN-末端アミノ酸配列を決定した。23kDaおよび18kDaの2種の蛋白質についてはN-末端から約20個のアミノ酸配列が決定できた。この配列を蛋白質データバンクに登録されている蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索を行ったが、既知の分子とのホモロジーは見いだせず、原虫にユニークな配列と考えられた。さらに各分子のトリプシン消化断片の内部アミノ酸配列決定することにより、一次構造解析を継続して行っている。ピロプラズマの保有するメタロプロテアーゼに関しては、合成ペプチドを基質(アミノクマリン標識)としたタンパク分解酵素活性を調べ、基質となる合成ペプチドを選び出した。さらに、この基質の分解活性を指標にして、虫体抽出液から液体クロマトグラフィーで酵素を部分精製した。解析に必要な量が得られ次第、一次構造解析を行う。核酸代謝関連酵素であるribonuclease reductase遺伝子をクローニングするため、マラリア等赤血球寄生性原虫の相同分子の遺伝子配列からプライマーを設計し、PCRを行った。しかし、特異的なバンドの増幅は認められなかったため、最近クローニングされたT.annulataの同遺伝子情報なども加え、プライマー設計、PCR条件の検討を行っている。核酸生合成系の酵素として重要なRibonucleotide reductaseを構成する2つめサブユニットのうち、小サブユニット(R2)遺伝子のクローニングを行った。得られたcDNA断片は全長を含んでいなかったため、5′、3′方向へRACE(rapid amplification of cDNA ends)法によって全長cDNAを得た。その塩基

配列解析の結果、R2遺伝子には少なくとも2カ所のイントロンが存在することが判った。予想アミノ酸配列のC末端(R1サブユニットとの会合部位)は、宿主のR2分子の構造とは異なっており、合成ペプチドによる阻害が可能であると考えられた。赤血球侵入に際し赤血球レセプター結合と結合する蛋白質の遺伝子クローニングをB.equi,B.caballiについて行った。すなわち両原虫のcDNAライブラリーから、抗体を用いた免疫スクリーニングによって、前者からは2クローン、後者からは1クローンを得た。塩基配列決定の結果、B.equiの1クローンはグルタミン酸の連続するモチーフを持つ蛋白質蛋白質で、マラリア原虫の表面蛋白質とも構造が共通するものであった。また、B.caballiの1クローンは、赤血球侵入に重要な役割を果たすロプトリ-関連蛋白質であることが判明した。T.sergentiveilについて、いくつかのバンドを単離してN末端アミノ酸配列を決定したところ、いずれも宿主の蛋白質とのホモロジーは認められず、原虫由来蛋白質であると考えられた。
神経芽腫の新たなバイオマーカーとしてのエクソソーム含有microRNAの有用性

神経芽腫の新たなバイオマーカーとして、血中exosome中のmicroRNAが役に立つかを検討するために、マウス神経芽腫担癌マウスを用いて、microRNAの種類と増減を検討した。Hsa-miR-143,-145, -210, Leg-7g, -15b, -155, -328では増加したが、あるものは減少した。さらに詳細な検討が必要であるが、microRNAが新たなバイオマーカーとなりうると考えられた。【マウス神経芽腫担癌モデルおよびマウス神経芽腫肝転移モデルの作成】神経芽腫細胞の入手:独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室から、継代可能神経芽腫細胞株(C1300及びNB-1)の供与を受けた。細胞培養:Gibco RPMI1640に10%FBSおよびPenicilinを添加して、5%CO2 37°Cにて神経芽腫細胞を培養した。実験動物:三共ラボラトリーからA/Jマウスを購入して、繁殖させ、実験動物経費を削減した。実験動物は当大学実験動物センターにて飼育した。マウス神経芽腫担癌モデルの作成:神経芽腫細胞1X107個をマウス臀部皮下移植して、腫瘍径を経時的に測定した。マウス神経芽腫肝転移モデルの作成:神経芽腫細胞1X106個をプロトコールに従ってマウスを麻酔した後、左肋弓下を切開して、脾臓を体外へ脱展して、脾臓内へ30G針を用いて移植した。経時的に腹部を触診して、肝転移の有無を観察した。この記録には、研究費で購入したビデオシステムおよびエコスマートペンを用いた。【神経芽腫治療】神経芽腫に対する現行の化学療法(シスプラチンを中心とする化学療法薬)および新たな治療法として注目されている分子標的薬(PD-1抗体)を用いた治療を施した。【マウス血液採取】正常マウス・担癌モデルマウス・肝転移モデルマウス・治療後担癌マウス・治療後肝転移モデルマウスの尾静脈から血液を採取した。【エクソソーム抽出】miRCURYExosome Isolation Kit-Serum and Plasmaを用いて、正常マウス・担癌モデルマウス・肝転移モデルマウス・治療後担癌マウス・治療後肝転移モデルマウスそれぞれの血液からエクソソームを抽出した。本研究においては、血液中のエクソソームからmicroRNAを抽出して、その種類や増減を検出して、神経芽腫の診断に利用することを目標にしている。そのためには、正常値を把握する必要があるが。成長発達によって血液中のエクソソームの正常値に変化があるか否かが、不明である。すなわち日齢・週齢・月齢・年齢による変化があるか否かをまず、把握する必要がある。特に、ヒト神経芽腫の後発年齢は1歳以下であるために、日齢・週齢による正常値の変化の有無を確認す必要がある。そこで、平成27年度には、A/Jマウスの日齢3、7日、週齢2,3,4週、月齢2,3か月のマウスの血液を採取して、エクソソームを抽出することをおこなった。一方、血中エクソソームのmicroRNAをがんの診断に用いる研究が大腸がんにおいて報告が多いため、ラット大腸がんを用いた研究を平行しておこなうことで、研究方法の正確性を確認しながら、目的である神経芽腫の血中エクソソームのmicroRNAの解析を行うこととした。ラットの大腸がん細胞であるRCNー9細胞を用いて、大腸がん肝転移モデルと担がんモデルを作製して、血液を採取して、エクソソームの抽出とmicroRNAの抽出をおこなった。大腸がんに特有の血中エクソソーム中のmicroRNAと神経芽腫細胞において特異的に発言してるmicroRNAとの相違を検討して、どのmicroRNAが神経芽腫の血液診断とするのが有効であるのかを決定する。平成26年度には、1マウス神経芽腫嘆願モデルと肝転移モデルを作製すること、2これらのマウスの血液中および培養細胞駅中のエクソソームを抽出し、さらにmicroRNAを測定することであった。この計画に基づき、平成26年度には、神経芽腫細胞の培養およびこれを用いたマウス神経芽腫担癌モデルや肝転移モデルの作成は計画通りに進行した。そして、それぞれの状況下の血液を採取して、エクソソームの抽出も順調に進んでいる。さらに、化学療法薬おおび分子標的薬による治療をおこなった場合のエクソソームの変化を検討するため、治療群の血液も採取した。平成27年度の計画では、マウスの日齢ごとに採血を行い、それぞれの血中エクソソームを抽出することを予定通りにおこなった。平成28年度は研究最終年であるので、エクソソーム中のみmicroRNAの解析を行い目的としている神経芽腫における特異的な血中エクソソーム中のmicroRNAの検出が可能であると考えている。本研究では、血液中のエクソソームからmicroRNAを抽出して、その種類や増減を検出し、神経芽腫の診断に利用することを目標にしている。そのためには、正常値を把握すす必要があるが、成長発達によって血液中のエクソソームの正常値に変化があるか否かが不明である。すなわち、日齢・週齢・月齢・年齢による変化があるか否かを測定により明らかにする。(平成27年度にサンプリング終了している。)また、神経芽腫担癌マウスにおいて、血中のエクソソームを抽出して、これに含まれるmicroRNAを解析する。

エクソソーム中のmicroRNAを用いた癌診断は、大腸癌において証明されているので、併行して、ラット大腸癌担癌モデルを作成して、神経芽腫と比較検討しながら、研究を実行する。(平成27年度に50%終了)大腸癌担癌状態でのエクソソーム中のmicroRNAと神経芽腫担癌状態でのエクソソーム中のmicroRNAとを比較検討し、microRNAが神経芽腫の血液診断に有用であるかを検討する。(平成29年度予定)神経芽腫細胞培養過程で細菌の混入があり、この復旧のために、研究計画に大幅な遅延が発生した。また、併行して実施していた他の研究に時間を要したこともあり、研究計画に遅れを生じた。神経芽腫担癌マウスの血中エクソソーム中のmicroRNAの特異性について検討することが本研究の目的である。多種類のmicroRNAの中でどのmicroRNAが神経芽腫の血液診断とするのが有効であるのかが、これまでには明らかでなかったが、血中エクソソーム中のmicroRNAをがんの診断に用いる研究が大腸がんにおいて報告が多いため、ラット大腸がんを用いた研究を並行しておこなうことで、研究方法の正確性を確認しながら、目的である神経芽腫の血中エクソソーム中のmicroRNAの解析を行うこととした。そこで、ラットの大腸がん細胞であるRCNー9細胞を用いて、大腸がん肝転移モデルと担がんモデルを作製して、血液を採取して、エクソソームの抽出とmicroRNAの抽出をおこなった。また、正常マウス中の血中エクソソーム中microRNAの種類と値のデータはなく、また、成長発達によって血液中のエクソソームの正常値に変化があるか否かも不明であった。すなわち日齢・週齢・月齢・年齢による変化があるか否かをまず、把握する必要がある。特に、ヒト神経芽腫の後発年齢は1歳以下であるために、日齢・週齢による正常値の変化の有無を確認す必要がある。そこで、A/Jマウスの日齢3、7日、週齢2,3,4週、月齢2,3か月のマウスの血液を採取して、エクソソームを抽出することをおこなった。本研究は神経芽腫の新たな診断や治療にmicroRNAが利用可能か否かを検討するための、基礎的な情報となる貴重な成果である。神経芽腫の新たなバイオマーカーとして、血中exosome中のmicroRNAが役に立つかを検討するために、マウス神経芽腫担癌マウスを用いて、microRNAの種類と増減を検討した。Hsa-miR-143,-145, -210, Leg-7g, -15b, -155, -328では増加したが、あるものは減少した。さらに詳細な検討が必要であるが、microRNAが新たなバイオマーカーとなりうると考えられた。平成26年度の計画では、1マウス神経芽腫担癌モデルと肝転移モデルを作製すること、2これらのマウスの血液中および培養細胞液中のエクソソームを抽出し、さらにmicroRNAを測定することであった。この計画に基づき、平成26年度には、神経芽腫細胞の培養およびこれを用いたマウス神経芽腫担癌モデルや肝転移モデルの作成は計画通りに進んでいる。そして、それぞれの状況下の血液を採取して、エクソソームの抽出も順調に進んでいる。さらに、化学療法薬および分子標的薬による治療をおこなった場合のエクソソームの変化を検討するため、治療群の血液も採取した。
敗血症時の脳内サイトカイン誘導に麻酔薬が及ぼす影響についての分子生物学的検討

全身麻酔薬(代表的薬剤としてイソフルランおよびプロポフォール)は、マイクログリアの培養系において、LPS刺激下での炎症性サイトカインとくにIL-1bの誘導を、容量/時間依存的に抑制した。また麻酔薬は、LPSにより誘導されるMAPKのリン酸化を抑制し、この機構が麻酔薬作用の機序であることが示唆された。一方、マウスにLPSを投与した敗血症モデルにおいても、イソフルランは脳内のIL-1b誘導を抑制し、血中ACTHの誘導も抑制することが示された。以上から、麻酔薬は敗血症時の脳内IL-1b誘導を抑制し、副腎ー下垂体軸によるストレス反応に大きな影響を与える可能性があると考えられた。敗血症時の脳における炎症反応は、急性期には、炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α)の産生により開始されるが、これらサイトカインは主としてマイクログリアやアストロサイトといったグリア細胞によって産生される。申請者は、マウス由来初代培養グリア細胞において、全身麻酔薬(イソフルラン、プロポフォール、バルビタール、ミダゾラム、ケタミン)が共通して、リポ多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激下での炎症性サイトカイン、特にIL-1βの誘導を、転写レベルにおいて濃度依存的に抑制することを見いだした。この機序として、MAPKのリン酸化が、各種麻酔薬によって共通して抑制されることを見いだし、これらの作用を精査することで、全身麻酔薬の作用の新たな一面を明らかにできるのではないかと考えている。敗血症時の、脳における炎症性サイトカイン誘導に、麻酔・鎮静薬が与える影響とその機序について研究を行った。具体的には、中枢神経系の主たるサイトカイン源であるグリア細胞(アストロサイト、マイクログリア)の培養系を確立し、LPSによる炎症性サイトカイン誘導(IL-1b, Il-6)に多種の麻酔薬が共通して抑制作用を有することを分子生物学的手法を用いて明らかにした。またマウス敗血症性モデルを使用して、麻酔薬によるIL-1b誘導抑制の作用がin vivoの系でも生じうること、また視床下部ー下垂体を介するストレス応答(ACTHの血中濃度抑制)に大きな影響を与えることを示した。麻酔科学実験上、ほぼ予定どおり進行した。マウスにおいて同様の実験を施行する予定である。
異種ユビキタスプラットフォームを横断する，保障を伴う自己適応に関する研究

IoT環境で動作するアプリケーションなどでは,ハードウェア故障,ネットワーク切断,制御対象となる物理環境の変化など,実行時に様々な変化が起こりうるため,これらに耐えるような適用性が求められる.複数の機器にまたがり多数のプロセスが動作する中で,安全性等の観点で正しさが担保された適応動作を実現する必要がある.本研究ではこのような適応動作を支援するための技術として,3つの取り組みを行った.第一に,様々なサービス,プロセス,機能オペレーションを統合したアプリケーションを開発するためのEnsemble言語を対象とし,実行時において,第三者により独立に開発された機能の発見,配備,置き換え,および相互作用を行うための機構を実現した.次に,上記のEnsemble言語に対して,Session Typeを扱うように拡張を行うことで,検証を実現可能にした.最後に,C++ Actor Frameworkという実用性の高い実装を対象とし,機械学習技術を活用して,機能部品の自動置き換え機能を実現した.以上の取り組みにより,安全性を担保しつつ,効率性の高い自己適応の実現を支援する機構を確立することができた.Session Typeという理論的基盤に基づいた安全性検証を行う一方で,機械学習技術も用いて実践的な実証を行うことでき,自己適応のための包括的な枠組みを示すことができた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。IoT環境の発展により,様々な種類のセンサ・アクチュエータがインターネット上につながり,それらを連携させたアプリケーションが容易に開発できるようになってきた.このようなアプリケーションは,ハードウェア故障,ネットワーク切断,制御対象の物理環境の変化など,実行時に起こりうる様々な変化に対して柔軟に耐える適応性が求められる.このような適応性を異なるプラットフォームを横断して実現する必要がある.そこで本研究では,このような異種プラットフォームを横断する環境において,正しさが保証された適応を実現するフレームワークを提案する.具体的には(1)異種プラットフォームを横断するアプリケーションを記述する言語と検証手法の構築,(2)言語と検証手法を用いた自己適応フレームワークの開発,(3)プロトタイプアプリケーションの開発と評価を行うことを目的とする.平成28年度は,主に言語の設計を行った.異種プラットフォームを横断する分散アプリケーションを記述するアクターモデルベースの言語を設計した.アクターは状態を持ち,独立し,外部とコミュニケーションを行うモジュール単位であり,異種プラットフォーム上で動作するアプリケーションのモデル化に適している.また,Session Typeをもちいて,アクター間のインタラクションを形式的に記述する言語を設計した.Session Typeで記述されたインタラクションモデルから,インタラクションに参加する個々のアクターの振る舞いモデルを生成するモデルコンパイラを開発した.当初の予定していた目標を達成できている.IoT環境の発展により,様々な種類のセンサ・アクチュエータがインターネット上につながり,それらを連携させたアプリケーションが容易に開発できるようになってきた.このようなアプリケーションは,ハードウェア故障,ネットワーク切断,制御対象の物理環境の変化など,実行時に起こりうる様々な変化に対して柔軟に耐える適応性が求められる.このような適応性を,異なるプラットフォームを横断して実現する必要がある.本研究では,このような異種プラットフォームを横断する環境において,正しさが保証された適応を実現するフレームワークを提案する.具体的には,(1)異種プラットフォームを横断するアプリケーションを記述する言語と検証手法の構築,(2)言語と検証手法を用いた自己適応フレームワークの開発,(3)プロトタイプアプリケーションの開発と評価を行う.平成29年度は,まず,平成28年度で開発した言語とコンパイラを用いて,ロボット制御IoTアプリケーションのプロトタイプを実装し,そのケーススタディを通して言語の記述能力や検証能力を評価・改善した.また,異種プラットフォーム対応の自己適応フレームワークを,既存の単一プラットフォーム向けの自己適応フレームワークを,実行時における検証,プログラム再生成が可能となるよう拡張することで実現した.また,異種プラットフォームに必要な情報を観測するためのプルーバー,実行時に設定変更を可能とするエフェクタを埋め込み可能とするフレームワークを開発した.加えてこのフレームワーク上に,アクターベース言語で書かれたプログラムに基づき,アプリケーションの検証や,プログラムの変更を行う自己適応エンジンを開発した.当初の目的通り,プロトタイプアプリケーション開発を通じたケーススタディの実施,異種プラットフォーム対応の自己適応フレームワーク開発,フレームワーク上で動作する自己適応エンジンの開発を達成した.IoT環境で動作するアプリケーションなどでは,ハードウェア故障,ネットワーク切断,制御対象となる物理環境の変化など,実行時に様々な変化が起こりうるため,これらに耐えるような適用性が求められる.複数の機器にまたがり多数のプロセスが動作する中で,安全性等の観点で正しさが担保された適応動作を実現する必要がある.本研究ではこのような適応動作を支援するための技術として,3つの取り組みを行った.第一に,様々なサービス,プロセス,機能オペレーションを統合したアプリケーションを開発するためのEnsemble言語を対象とし,実行時において,第三者により独立に開発された機能の発見,配備,置き換え,および相互作用を行うための機構を実現した.次に,上記のEnsemble言語に対して,Session Typeを扱うように拡張を行うことで,検証を実現可能にした.最後に,C++ Actor Frameworkという実用性の高い実装を対象とし,機械学習技術を活用して,機能部品の自動置き換え機能を実現した.以上の取り組みにより,安全性を担保しつつ,効率性の高い自己適応の実現を支援する機構を確立することができた.Session Typeという理論的基盤に基づいた安全性検証を行う一方で,機械学習技術も用いて実践的な実証を行うことでき,自己適応のための包括的な枠組みを示すことができた.引き続き当初の計画に従い,平成29年度では開発した言語とコンパイラを用いてIoTアプリケーションのプロトタイプ実装や,自己適応性を付加したフレームワークの開発に従事する.

平成30年度は,主に,平成29年度に開発したフレームワークを用いた評価を行う.平成28年度で作成したプロトタイプを拡張し,作り込みではなくフレームワークを用いた実装に改良する.また,実行中の変化に対する適応を行い,正しさが保証された適応による品質維持能力について評価する.また,その実験結果を基にフレームワークの改良を行う.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
実世界を認識する視覚エージェントの試作研究

本研究は,複数の異なる知的エージェントが自律協調してタスクを実行する方式の確立を目的として,自由に行動し,環境に働きかけながら観測する視覚エージェントを試作し,実験を行った.〔1〕同種エージェントの協調:視線を自由に制御する複数台のエージェントを持つロボットを試作した.これらのエージェントをMVA(Multiple Vision Agents)と呼ぶ.このMVAにより,実環境内において実時間でロバストな環境認識が実現できることを実験により示した.また,与えられたタスクに対してMVAが自律的に行動する時の協調手法について考察した.〔2〕異種エージェントの協調:空中を浮遊しながら観測するエージェントと,床面を走行するエージェントからなる,異なる視覚を持つ複数ロボットシステムを試作した.このシステムを用いて,複数ロボットの協調に関する種々の実験を行うことにより,今後のロボット研究において解決すべき幾つかの基本問題を明らかにした.本研究は,複数の異なる知的エージェントが自律協調してタスクを実行する方式の確立を目的として,自由に行動し,環境に働きかけながら観測する視覚エージェントを試作し,実験を行った.〔1〕同種エージェントの協調:視線を自由に制御する複数台のエージェントを持つロボットを試作した.これらのエージェントをMVA(Multiple Vision Agents)と呼ぶ.このMVAにより,実環境内において実時間でロバストな環境認識が実現できることを実験により示した.また,与えられたタスクに対してMVAが自律的に行動する時の協調手法について考察した.〔2〕異種エージェントの協調:空中を浮遊しながら観測するエージェントと,床面を走行するエージェントからなる,異なる視覚を持つ複数ロボットシステムを試作した.このシステムを用いて,複数ロボットの協調に関する種々の実験を行うことにより,今後のロボット研究において解決すべき幾つかの基本問題を明らかにした.本研究では,複数の異なる知的エージェントが自律協調してタスクを実行する方式の確率を目的として,自由に行動し,環境に働きかけながら観測する視覚エージェントを試作し,実験を行う.具体的には,空中を遊泳しながら観測するエージェントと,床面を走行し,さらに視線を自由に制御する複数台のエージェントを試作し,それらが協調して実世界の定性的環境構造を認知し,さらに定量的局所地図を作成する能力の獲得を目標とする.この目標の達成のために,本年度行った研究活動は以下の通りである.視覚エージェントの試作4つの視覚エージェントを持つ走行ロボット,視覚エージェントとマニピュレータを持つ走行ロボット,空中を浮遊する視覚エージェントのハードウェア,それらを制御するソフトウェアを試作し,それぞれの性能を確認した.また,各視覚エージェントの視覚情報処理システムを試作した.4つの視覚エージェントを持つ走行ロボットは,独立に回転運動が可能な4つのカメラシステムからなり,4つのカメラシステムは後で述べる視覚エージェントの協調方法により,互いに協調しながら,環境を観測することができる.マニピュレータを持つ走行ロボットは,触覚センサのついた2自由度の腕を2本持ち,物体に対して様々な働きかけを可能とする(押す,さわる等の動作).空中を浮遊する視覚エージェントは,気球部と,姿勢制御のためのプロペラ部,画像入力のためのカメラ部からなり,地上で働くエージェントの様子や,環境を上空からみた様子を知覚することができる.視覚情報処理システムは,実時間で動く対象を検出し,追跡する多重ウインドウ相関システムを供え,フローベクトルを実時間で算定することができる.視覚エージェント協調の研究4つの視覚エージェントを持つ走行ロボットにおいて,各々の視覚エージェントに埋め込まれた本能的行動により,4つの視覚エージェントが協調する方式を考え,その方式をシミュレーションと実験により検証した.観測行動の動的プランニングの研究本年度は,特に,空中を浮遊するエージェントと,地面を徘徊するエージェント間での協調について考察した.地面を徘徊するエージェントは,自らの視覚センサでは得られない情報を,空中を浮遊するエージェントに求め,自らの環境知覚をより正確なものにする.これに関しては,今後更なる考察が必要である.本年度では,複数の異なる知的エージェントが自律協調してタスクを実行する方式の確立を目的として,自由に行動し,環境に働きかけながら観測する視覚エージェントを試作し,実験を行った.具体的には、空中を浮遊しながら環境を上空から見渡し観測するエージェントと,限られた視野により環境を観測する、床面を走行するエージェントからなる,異なる視覚を持つ複数ロボットシステムを試作した。この複数ロボットシステムをもとに、エージェント間の通信が制限されない場合と制限される場合について、協調方法を考案した。通信が制限されない場合は、互いとのモデルを交換することで、協調動作を実現する。通信が制限される場合には、相手の動作理解機能をもとに、協調のための自らの行動を決定するメカニズムを考案した。また、前年度作成した視線を自由に制御する複数視覚エージェントについても、さらなる考察と実験を行った。
心臓幹細胞と血管内皮前駆細胞を用いた細胞シートに依る新規心筋再生療法の確立

まず、ヒト心臓幹細胞に対する培養条件の検討では、低密度で培養した細胞、高密度で培養した細胞、或いは、高密度で培養しながらNotchシグナルを阻害した細胞を急性期心筋梗塞モデルラットの心臓へ移植し、培養する際の細胞密度がそれらの細胞が有する治療能力に与える影響を評価した。その結果、低密度培養、或いは高密度培養でもNotc虹シグナルを阻害する事で、その治療能力が高く維持される事が判明した。具体的には、血管密度と組織の繊維化率に関して、それら2つの群で有意な治療効果が認められた。さらにそれらの群では、移植した細胞が心筋細胞に分化している事も確認された。一方で、高密度培養した細胞は、細胞を移植しなかった際に比べて血管密度を有意に上昇させたものの、心機能や組織の繊維化率において治療効果が認められず、心筋細胞への分化も確認されなかった。これらの結果より、低密度培養の様にNotchシグナルを抑制する事に依り、ヒト心臓幹細胞のラット急性期心筋梗塞モデルに対する治療能力が高く維持されるという事が考えられた。次に、心臓幹細胞と血管内皮前駆細胞を用いた心筋再生療法に関わる研究では、心臓幹細胞シートと血管内皮前駆細胞をラット亜急性期心筋梗塞モデルの心臓へ移植した。その結果、心機能において、心臓幹細胞と血管内皮前駆細胞を同時に移植した群において治療効果を認めた。続いて、そのラットの心臓を回収し組織学的な解析を行った。その結果、血管内皮前駆細胞の移植に因り、移植領域である梗塞領域周辺において血管密度が上昇する事が確認された。さらに、心臓幹細胞シートを構成する細胞が、移植後4週目において心筋細胞へ分化している事も確認された。これらの結果より、心臓幹細胞シートを用いた心筋再生治療においては、その細胞シートを単独で移植するだけでは治療効果があるとは言えないものの、血管内皮前駆細胞と同時に移植する事に依り、その血管新生効果に依り移植した細胞の生着が助けられ、心筋再生を伴った治療効果が得られるという事が考えられた。初年度にあたり、最先端の技術である心臓幹細胞の単離・培養技術に関する詳細な条件を検討した。具体的には、1、各種心疾患と心臓幹細胞の分離効率の関係、2、心臓の部位と心臓幹細胞の分離効率の関係、3、細胞を組織から分離する際のコラゲナーゼ反応時間と心臓幹細胞の分離効率の関係、4、播種細胞密度と1継代当りの培養日数がC-Kit陽性率に与える効果の検討、を行った。その結果、1、全ての心疾患患者から心臓幹細胞は単離可能であること、2、右心房が最も心臓幹細胞の分離効率が高い傾向であり、3、12時間以内のコラゲナーゼ反応時間が最も心臓幹細胞の分離効率が高いこと、さらに、4、2x10^4 cells/10cm dish, 5 days/passageという条件が最もC-Kit陽性率の低下を抑制でき、細胞倍化時間の遅延を抑制できること、が明らかになった。これらの実験結果から、臨床応用可能かどうかに関しては今後慎重に検討する必要があるものの、最も効率の良い心臓幹細胞の単離・培養方法として、『右房から組織を採取し、12時間以内のコラゲナーゼ反応を用いて細胞を分離し、C-Kit陽性細胞を単離した後、2x10^4 cells/10cm dish, 5 days/passageという条件で培養する』という方法が考えられた。幹細胞は、一般的に、その未分化性を維持しながら培養し、数を増やす事が難しい。しかしながら、少ない組織検体から多量の治療用細胞を調製する臨床応用の実際を見据えると、それらの培養技術は必須である。よって、今年度に確立した、上記単離・培養技術は、本研究において、基礎となる技術と言え、それ故、重要な技術となる。初年度において、それらの基礎技術を確立できたという事は、大変意義深く、今後の研究の進展が期待される。本年度は、前年度までに決定した心臓幹細胞に対する培養条件の妥当性を検証すると共に、それら条件を用いて調製した心臓幹細胞で細胞シートを作製し、実験動物に作製した心筋梗塞モデルの心臓に移植する事に依り、その治療効果を確認した。実験動物を用いた実験では、特に、血管内皮前駆細胞を同時に移植する事に依り、心臓幹細胞シートの治療効果が増強されるかどうかを確認した。その結果、心臓幹細胞の培養条件に関しては、我々が最適だと考えている、340cells/cm^2という播種細胞密度で、継代毎に5日間培養する(5days/passage)条件で培養した細胞では、不適当だと考えられた条件(5500cells/cm^2, 5days/passage)で培養された細胞に比べて、細胞周期制御蛋白質であるp53やp21の発現や、血管内皮細胞のマーカーであるEts1やTie2、さらに、血管平滑筋細胞のマーカーであるGata6やalpha Smooth Muscle Actinの発現が抑制された。これらの事から、最適な条件では、心臓幹細胞の増殖活性が維持されつつ、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞への分化が抑えられ、未分化な状態が維持されると考えられた。加えて、それら最適な条件で培養された心臓幹細胞は、不適当な条件で培養された細胞に比べて、分化誘導後に心筋細胞マーカーであるCardiac Troponin Tやalpha Sarcomeric Actin、血管内皮細胞のマーカーであるTie2、さらに、血管平滑筋細胞のマーカーであるPdgfrbの発現量が有意に高かった事から、それら最適な条件では、心臓幹細胞の多分化能を維持していると考えられた。