hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プラズマ遺伝子導入の機序解明と作用要因のバランス制御による高効率非侵襲化

計画初年度のH27年度は、大別して3項目の実験実施を計画していた。それぞれ、(1)酸素由来・水由来のラジカルの効果の評価:雰囲気を制御できる容器を作成して、前記ラジカルの甲賀の評価を実施した。(2)導入条件のプラスミドの分子量依存性の評価:使用しているプラスミド(pCX-EGFP: 5.5kb,360万Da)のGFPコード部を残して異なる分子量(2k10kb程度)のプラスミドを調整して、YOYO-1(1.3kDa)等も準備し、導入分子の大きさとプラズマ照射条件の関係を求めた結果、導入分子がYOYO-1等の低分子の場合とプラスミドなどの高分子に曲線が二分されることから、低分子と高分子で導入機序が異なっていることが示唆された。(3)有効ラジカルと作用タイミングの特定(次年度前半も継続):ラジカルスカベンジャーを用いて検討した結果、高分子では、クラスリン依存エンドサイトーシスが導入事象の60%に関与している一方で、低分子ではクラスリン依存エンドサイトーシスを阻害しても導入効率は低下しないことから、低分子はエンドサイトーシスが主要な導入機序となっていない事が判明した。また、カタラーゼによりH2O2の効果を阻害することで高分子の場合、導入の60%にプラズマ由来のH2O2が寄与しているが、H2O2の摘果だけでは導入が生じないため、H2O2が有効になるには、放電由来の電気的要因とのシナジー効果が不可欠である事が判明した。このように、プラズマ遺伝子導入法においては、電流や電界などの電気的要因とラジカルなどの化学的要因のシナジー効果が重要であり、また、プラズマの生成条件・照射条件を調整することで、電気的要因と化学的要因の重みを変化させることが出来、柔軟に多種多様な標的細胞に対応できる可能性がある事が判明した。研究実績の概要でも示したように、3項目の実験計画に対して、酸素由来・水由来のラジカルの効果の評価については、雰囲気容器内での遺伝子導入実験はまだ十分名データが得られていないが、ラジカルスカベンジャーの利用でH2O2の重要性は確認できており、結果として、順調に進展している。プラスミドの分子量依存性については、曲線が低分子と高分子に二分され、導入機序が低分子と高分子で異なっていると示唆されるという興味深い結果が得られている。さらに、有効ラジカルと作用タイミングの特定については、クラスリン依存エンドサイトーシスとH2O2の重要性、さらには、プラズマ法の良さを示す電気的要因と化学的要因のシナジー効果が確認できるなど、概ね、順調に進展している。初年度が概ね計画通りに進展しているので、次年度は初年度の結果を踏まえ、遺伝子導入機序の解明をさらに進めること、プラズマ照射条件の最適化、実用レベルでの導入法の確立に取り組む事に加えて、まだ十分なデータが得られていない雰囲気制御の実験を継続して実施することする。

初年度が概ね計画通りに進展しているので、次年度は初年度の結果を踏まえ、遺伝子導入機序の解明をさらに進めること、プラズマ照射条件の最適化、実用レベルでの導入法の確立に取り組む事に加えて、まだ十分なデータが得られていない雰囲気制御の実験を継続して実施することする。
二次性能動輸送タンパク質の共役イオン結合部位の構造の研究

本研究は、ほぼ計画通りに進行し、次の段階への足がかりができたと考えている。二次性能動輸送反応の機械論的メカニズムは、研究代表者が提案した逐次結合モデルにより説明されている。そのモデルでは、共役イオン結合にともなう輸送タンパク質のコンフォメーション変化を不可欠なものと考える。そこで、共役イオン結合部位の構造と、その結合に伴うタンパク質コンフォメーション変化の解明が必要となる。本研究では、まず大腸菌プロリン輸送タンパク質の共役イオン結合部位の構造について、Na^+が共役イオンである利点を活かし、各種変異およびその抑圧変異の解析から一次構造上の特徴を抽出することを主目的とした。1.これまでの大腸菌プロリン輸送タンパク質の研究によって得られた共役イオン結合についての変異タンパク質遺伝子に対し、亜硝酸処理によるランダム変異導入法を用いて、表現型を抑圧する変異を得た。2.それらの抑圧変異タンパク質遺伝子のDNA塩基配列を2株について決定し、変異部位を同定した。3.これら変異及び抑圧変異輸送タンパク質による輸送活性と基質結合活性を測定することにより、変異の性質を検討した。その結果、プロリン輸送タンパク質内でG22やC141は膜中央より外部に存在すると推定され、それが細胞外部での共役イオン結合に関わることが速度論的解析から示唆された。またR257は内部に存在すると推定され、その速度論的解析から、細胞内部でのNa^+結合に関わることが示唆された。このように、輸送反応モデルの各ステップの反応に関わるアミノ酸が、この研究を継続することにより明らかになってくると期待される。
血小板凝集能を持つ新規複合材料の歯周組織再生療法への応用

口腔外科領域や歯周病治療において骨欠損は共通点がある。自家骨移植は2回の手術が必要で採取骨の可能な量は限定される。それゆえ、外科領域に適用される生体吸収性の足場材料には優れた操作性や自己の組織に置換する特徴が必要である。そこでPro-Hyp-Glyのシークエンスで構成されたPoly(PHG)とαTCPを熱架橋により作製されたスポンジ材料を開発した。そしてその移植材を下顎骨に骨欠損を作成し移植を行った。術後2週、4週ではPolyPHG/αTCPグループの骨体積はその他のPoly(PHG)単体群、骨欠損のみを形成した群に比べて有意に高かった。術後8週においては骨体積に大きな差は見られなかった。歯周病などによって生じた重度の垂直性骨吸収を治療するために様々な骨補填材料やエムドゲインなどの成長因子を用いた治療が行われているが、スペースメイキングや移植材の残存など課題も多く存在する。そこで申請者は長期にわたり再生の足場を提供し、また移植材自身もPRP効果を持つ人工コラーゲンとαTCPスポンジを組み合わせて新たな骨再生材料を開発することが本研究の目的である。プロリン(P)ーヒドロキシプロリン(H)ーグリシン(G)からトリペプチドを作製後、縮重合を行い1%Poly(PHG)ゲル水溶液を作製した。凍結乾燥後に熱架橋を行い複合体を完成させた。ゲル水溶液に対するαーTCP粉末の混合比と粉末位径について検討を行った。その結果、100-200μm群と700-1000μm群を重量比1:1で混和したものが移植を行う上で最も優れているという知見を得た。また、エックス線回析によって組成を調べた結果、αTCPがハイドロキシアパタイトに転化していないことも明らかとなった。ラットの頭蓋骨の中心に直径9mm、深さが1mmとなるようなクリティカルサイズの骨欠損を形成し、複合体を移植し、2,4,8週後にマイクロCTおよび病理組織学的手法でHE染色にて観察を行った。その結果、マイクロフォーカスCTから得られた骨体積と骨塩量は人工コラーゲン単独のスポンジに比較して有意に高い値を示した。またHE染色の結果、4週までは人工コラーゲンが残存し8週ではαTCPは吸収され成熟した骨組織に置換されていることが確認された。複合体作成と小動物における実験が終了したため。骨欠損は歯科領域において重度の歯周炎や外傷などでしばしば遭遇する。骨欠損に対する治療法は現在にいても自家骨移植がゴールドスタンダードとされているが、採取量の限界や2箇所の手術が必要なことなど様々な欠点もある。このような事象を踏まえ自己組織に置換する生体吸収性材料が必要とされている。外科領域に適用される生体吸収性の足場材料には優れた操作性や自己の組織に置換する特徴が必要である。しかしながら従来型の粒子上の材料は骨欠損に適応することが難しい場合も存在する。様々なハイドロキシアパタイやリン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウム系の材料は生体安定性と生体活性に優れすでに様々な臨床症例において使用されている。臨床現場ではコラーゲンは様々な形状で使用され広く使用されている。なぜなら良好な生体分解性、生体安定性、吸収性を示すからである。例えばコラーゲンスポンジは様々な種類の組織の足場材料として使用されている。以前のレポートでプロリン・ヒドロキシプロリン・グリシンの塩基配列を持ち3次元の立体構造を持つ化学合成型コラーゲンを開発した。今回の実験では、Poly(PHG)と細管構造を持つαTCPを脱水熱架橋法により構成されたスポンジを足場材料として使用して骨形成が起こるかを実験した。組織学的評価では、術後4週においてPoly(PHG)の吸収とαTCP粒子の周囲を取り囲むような新生骨の形成を認めた。術後8週においては、ハーバース構造を持った母床骨に連続した成熟骨を認めた。実験により判明した複合体条件で試料を作成する。その後、イヌ下顎骨欠損モデルもしくは脛骨骨欠損モデル、ウサギの頭蓋骨欠損モデルを用いた移植実験を行う。前回の実験と同様にマイクロフォーカスエックス線CTによる骨再生評価と病理組織学的な評価も行う。歯周病学複合体のin vitro評価を完了させることができておらず、それら実験に関する費用を使用していないため。29年度はビーグル犬などの実験動物、病理組織学的評価の費用に充填したい。
ポラリトン―プラズモン励起系を利用したコヒーレントテラヘルツ発振素子の基礎的研究

半導体電子液体のコヒーレントプラズマ共鳴特性の解明を目的として、DyakonovとShurの提案した2次元プラズマ電子波に対する流体力学方程式(摂動論的な線形結合近似による1次元モデル)を出発点として電子流体力学シミュレータを構築した。数値解析には有限差分時間領域(FDTD)解析手法を採用した。従来はEuler方程式に則って定式化し、プラズマ電子流体の特性を左右する各種散乱因子:フォノン散乱、不純物散乱、電子間散乱を電子寿命として全て外部摩擦項として簡略化近似していた。本来は、電子間散乱の効果は内部摩擦すなわち粘性項として表現すべきであり、これによる計算誤差の程度を定量的に評価するために、Navier-Stokes方程式に則った定式化を行い、FDTDシミュレータを構築した。テラヘルツ帯共鳴動作が期待できるゲート長0.1ミクロン程度の化合物系微細化HEMT構造を対象として、液体水素温度から室温にわたり各種散乱がプラズマ波動に与える影響を解析した。その結果、フォノン散乱の影響が低下する液体水素温度条件では、共鳴周波数とともに粘性項を外部摩擦として近似する場合には摩擦力が過大評価され、20THzにおいては正規の約3倍程度にもなることが明らかにしなった。一方、室温付近においては、外部摩擦として近似しても大きな誤差は生じないことが明らかになった。両者の定式化において、計算時間に大きな差異は見られないものの、数値解の収束性においては大きな違いが見られ、Navier-Stokes方程式の収束性の改善は今後の課題である。更に、2次元電子流体シミュレータにより得られた電子濃度と電子局所速度の値を電流源として3次元電磁界シミュレータに与えることにより、プラズマ共鳴からテラヘルツ電磁波放射に至る一連のダイナミクスのシミュレーションを可能とした。ケーススタディとして、2次元電子層がチャネル方向に周期性を帯びた回折格子構造と、単一構造との特性比較を行い、回折格子構造の電磁波放射モード変換機能を確認するとともに、構築したシミュレータの有効性を確認した。1.プラズマ電子波共鳴トランジスタの動作特性解析DyakonovとShurの提案したプラズマ電子波に対する流体力学方程式(摂動論的な線形結合近似による1次元モデル)を出発点として、Si及び化合物半導体による電界効果型トランジスタのテラヘルツ波励起に対するプラズマ電子波共鳴特性を数値解析し、化合物半導体素子において室温テラヘルツ共鳴発振動作の実現性を確認した。3次元数値解析シミュレータ構築の足がかりとして、有限差分時間領域解析手法による3次元電磁界シミュレータを構築し、プラズマ電子流体シミュレータとしての適用性について検討した。Maxwell電磁界方程式とEuler流体力学方程式との分散関係の対応から、プラズマ電子流体を非圧縮性と動粘性係数の周波数無依存性とを仮定できれば、前者における導電率を後者における電子寿命に対応させることによってプラズマ電子流体の挙動を模擬できることが判明した。今後は流体力学方程式の有限差分化による3次元流体力学シミュレータを構築し、素子特性解析と発振素子設計への適用を図る。2.テラヘルツ波共鳴発振動作の実験的検討テラヘルツプローバシステムを用いて、ポラリトン-プラズモン相互作用を利用したレーザ2光波混合による差周波テラヘルツ励起の手法により、ゲート長80mmの極限微細化GaAs MESFETを対象としてプラズマ共鳴特性観測実験を遂行した。プラズマ共鳴効果によって生じるソース・ドレインポテンシャルの直流変調成分を測定することによってプラズマ共鳴特性を観測した。設定した1.0,1.50,2.50THzの3周波数において明瞭なプラズマ共鳴効果の観測に成功するとともに、プラズマ共鳴周波数のゲートバイアス依存性を初めて実験的に検証することに成功した。得られたプラズマ共鳴周波数のゲートバイアス依存性は一次元単純近似モデルに基づく理論解析と比較的よい一致を示し、プラズマ共鳴トランジスタの最大の特徴である、光注入同期型コヒーレントテラヘルツ帯波長可変発振素子としての実現性に見通しを得ることができた。1.半導体内電子液体のテラヘルツ帯プラズマ共鳴効果の動作特性解析半導体電子液体のコヒーレントプラズマ共鳴振動特性の解明を目的として、DyakonovとShurの提案したプラズマ電子波に対する流体力学方程式(摂動論的な線形結合近似による1次元モデル)を出発点として電子流体力学シミュレータの構築を進めた。プラズマ電子流体の特性を左右する動粘性係数にはフォノン散乱、不純物散乱とともにCoulomb相互作用による電子間散乱の効果を電子寿命として与えた。サブ100nmスケールの電界効果型トランジスタの電子走行チャネルに対する物理的・電気的な構造・境界条件下において、大局的には1次元近似モデルに対する解析解を支持する数値解析結果を得るとともに、キャリア濃度の異なる境界面での回折・散乱現象などの構造依存の波動伝搬特性を再現でき、プラズマ電子流体の挙動を高精度に模擬することに成功した。今後はテラヘルツ帯電磁波放射・発振特性の解析を進め、素子設計ツールとしての適用を図る。2.半導体内電子液体のテラヘルツ帯共鳴発振動作の実験的検証ポラリトン・プラズモン励起系を利用したレーザ2光波混合励起の手法により、ゲート長80nmの微細化GaAs MESFETを対象としてプラズマ共鳴特性観測実験を進展させた。プラズマ共鳴で生じるソース・ドレインポテンシャルの直流変調成分を測定することにより1.07.5THzの範囲で共鳴強度特性を観測した。3次高調波に相当する周波数での共鳴条件が基本共鳴周波数のそれらとほぼ同一条件であったことから、3次高調波共鳴の観測にはじめて成功したと考えられる。共鳴周波数のゲートバイアス依存性は一次元近似モデルの理論解析と異なり、光励起キャリアを考慮したチャネル内電子分布を反映した非線形応答を示した。

本素子の最大の特徴である、光注入同期型コヒーレントテラヘルツ帯波長可変発振素子としての実現性に見通しを得ることができた。今後はより理想特性が期待されるHEMTを対象として時間分解計測へと発展させる。半導体電子液体のコヒーレントプラズマ共鳴特性の解明を目的として、DyakonovとShurの提案した2次元プラズマ電子波に対する流体力学方程式(摂動論的な線形結合近似による1次元モデル)を出発点として電子流体力学シミュレータを構築した。数値解析には有限差分時間領域(FDTD)解析手法を採用した。従来はEuler方程式に則って定式化し、プラズマ電子流体の特性を左右する各種散乱因子:フォノン散乱、不純物散乱、電子間散乱を電子寿命として全て外部摩擦項として簡略化近似していた。本来は、電子間散乱の効果は内部摩擦すなわち粘性項として表現すべきであり、これによる計算誤差の程度を定量的に評価するために、Navier-Stokes方程式に則った定式化を行い、FDTDシミュレータを構築した。テラヘルツ帯共鳴動作が期待できるゲート長0.1ミクロン程度の化合物系微細化HEMT構造を対象として、液体水素温度から室温にわたり各種散乱がプラズマ波動に与える影響を解析した。その結果、フォノン散乱の影響が低下する液体水素温度条件では、共鳴周波数とともに粘性項を外部摩擦として近似する場合には摩擦力が過大評価され、20THzにおいては正規の約3倍程度にもなることが明らかにしなった。一方、室温付近においては、外部摩擦として近似しても大きな誤差は生じないことが明らかになった。両者の定式化において、計算時間に大きな差異は見られないものの、数値解の収束性においては大きな違いが見られ、Navier-Stokes方程式の収束性の改善は今後の課題である。更に、2次元電子流体シミュレータにより得られた電子濃度と電子局所速度の値を電流源として3次元電磁界シミュレータに与えることにより、プラズマ共鳴からテラヘルツ電磁波放射に至る一連のダイナミクスのシミュレーションを可能とした。ケーススタディとして、2次元電子層がチャネル方向に周期性を帯びた回折格子構造と、単一構造との特性比較を行い、回折格子構造の電磁波放射モード変換機能を確認するとともに、構築したシミュレータの有効性を確認した。
Antisense Display-新しい機能性遺伝子スクリーニング法開発の試み

本研究は、新しい遺伝子機能解析手段としての"Antisense Display"法の創出を目的とする。本法は、(1)mRNAの5'領域に対し全mRNA分子種をカバーするアンチセンスDNAレパトリ-の作製→(2)所定の細胞形質変化を来すアンチセンス分子種のスクリーニング→(3)5'センスプライマーと3'アンカー型プライマーを用いた翻訳枠全長のクローニング→(4)構造決定→(5)候補遺伝子の機能検定の5ステップからなる。本年度は、ステップ(1)、(2)の検証を行った。1.Kozakのコンセンサス配列に対応する鎖長612塩基のホスホロチオエ-ト型アンチセンスDNAレパートリー化学合成した。2.当該レパートリーの翻訳阻害活性を無細胞蛋白合成系で検証した。その結果、(1)ウサギ網状赤血球ライゼ-トでの翻訳反応はアンチセンスDNAの鎖長に依存して阻害され、10mer以上のレパトリ-ではほぼ完全な阻害が得られた。この蛋白合成阻害は、(2)RNaseHで増強され、(3)鋳型RNAの熱変形なしに達成された。3.以上の検証に基づき、鎖長10merのアンチセンスレパートリーを計128のサブグループに分けて大量合成し、2段階のHPLCで精製した。4.本法は、アンチセンス効果がgain-of-functionとなる抑制性因子の探索により大きな適応があると考えられたので、まず血管新生抑制遺伝子を候補遺伝子として細胞でのスクリーニングを開始した。すなわち、ヒト微小血管内皮細胞を96穴プレートに播種後、アンチセンスサブグループあるいは対照の10merオリゴd(A)の存在下に培養し、内皮細胞の(1)増殖促進と(2)マトリゲル上での管腔形成促進を指標として全サブグループの一次スクリーニングを完了した。この結果、数種の候補サブグループを得、現在二次スクリーニングを進めている。
多波長コヒーレント合成による高繰り返し極短光パルス発生の研究

発振波長(媒質)の異なる複数の超短パルスレーザーからの光パルスのタイミングと光波位相を高精度に同期制御し、それらを合成することによって、位相の揃った超広帯域光を作り出し、高繰り返しで時間幅の極めて短いパルス光源を実現するための要素技術を開発した。3種類の異なる超短パルスレーザーの同期制御技術を確立した。光化学反応の初期過程などの超高速現象を解明する超高速ブローブとして、極短光パルスは重要性を増している。本研究では、100MHz程度の高繰り返しで未踏の4フェムト秒以下の極短パルスを発生することを目的とし、3種類の異なる帯域のレーザー光のタイミング及び光波位相を高精度に同期制御し、合成する技術を確立し、波長600nm1400nmに渡るコヒーレントな超広帯域光を発生させ、全帯域で分散補償を行うことにより、単一レーザー帯域の壁を超える極短光パルスの発生を実現する。これまでに、チタンサファイアレーザー(中心波長800nm)及びクロムフォルステライトレーザー(中心波長1250nm)の2種類のレーザーのタイミングと位相を0.1フェムト秒という世界最高の精度で同期制御することに成功している。今年度は、この2つのレーザーの波長領域の中間に位置するイッテルビウムファイバレーザー(中心波長1040nm)をさらに追加して、切れ目のない広帯域光を実現するために、チタンサファイアレーザーとイッテルビウムファイバレーザーの間の高精度なタイミング同期を試みた。低ジッターで安定性に優れた光の相互位相変調を利用する受動的方法を用いた。チタンサファイアレーザーからの光パルス列をイッテルビウムファイバレーザーの共振器中に注入し、非線形による相互位相変調を発生させることにより、受動的なタイミング同期を行うことができた。タイミングジッターは1.4フェムト秒であり、非常に低ジッターのタイミング同期を達成することができた。また、8時間以上にわたる長時間安定性を確認することができた。今後は、位相同期を行うことにより、超広帯域光を実現し、極短光パルス発生をめざす。光化学反応の初期過程などの超高速現象を解明する超高速プローブとして、極短光パルスは重要性を増している。これまでに、チタンサファイアレーザー(中心波長800nm)及びクロムフォルステライトレーザー(中心波長1250nm)の2種類のレーザーのタイミングと位相を0.1フェムト秒という世界最高の精度で同期制御することに成功していることに加え、この2つのレーザーの波長領域の中間に位置するイッテルビウムファイバレーザー(中心波長1040nm)とチタンサファイアレーザーとの間にジッター1.4フェムト秒の高精度なタイミング同期を実現している。本年度は、チタンサファイアレーザーとクロムフォルステライトレーザーの共振器を改良することにより、広帯域化を行い、両レーザーともに、半値全幅において100nm程度の帯域を実現できた。さらに、レーザー光の位相関係が合成波の第二高調波自己相関にどのように影響を与えるかについての数値計算を行った。光化学反応の初期過程などの超高速現象を解明する超高速プローブとして、極短パルス光は重要性を増している。本研究では、100MHz程度の高繰返しで未踏の4フェムト秒以下の極短パルスを発生することを目的とし、3種類の異なる帯域のレーザー光のタイミング及び光波位相を高精度に同期制御し、合成する技術を確立し、波長600nm1400nmにわたるコヒーレントな超広帯域光を発生させ、全帯域で分散補償を行うことにより、単一レーザー帯域の壁を超える極短パルス光の発生を実現することを目的とした。さらに2つのレーザーの波長領域の中間に位置するイッテルビウムファイバレーザー(中心波長1040nm)とチタンサファイアレーザーとの間にジッター1.4フェムト秒の高精度なタイミング同期を実現している。本年度は、長期安定的な同期動作を実現するために、イッテルビウムファイバレーザーの温度安定化を行った。ベースプレートの温度制御を行い、4時間で繰り返し周波数2Hz以内の揺らぎに抑えることができた。これにより、チタンサファイアレーザーとイッテルビウムファイバレーザーとの間で6時間の長期安定動作を実現することができ、繰り返し周波数揺らぎとして1mHz以内の安定な同期動作を実現した。これまでに3種類の波長の異なる超短パルスレーザーのタイミングの高精度な同期が実現しており、本年度、位相の同期を行うことにより、目的の達成は可能と思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。

これまで実現できている高精度タイミング同期に加え、位相同期を行い、広帯域光の計測を行う。さらなる広帯域化を行う可能性があるが、高非線形ファイバなどを用いて、帯域拡張を試みる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞分化を制御する連鎖的遺伝子発現ネットワークのダイナミクス

細胞分化は、時期特異的な転写因子の機能によって制御される。転写因子は、特異的DNA配列を認識することで、標的遺伝子を選択し遺伝子発現ネットワーク(GRN;Gene regulatory network)を起動させる。本研究は、転写因子FoxO1とその下流で活性化される転写因子による、連鎖的なGRNの詳細を明らかにすることを目的とする。現在までに転写因子FoxO1によるGRNは解明したため、下流転写因子によるGRN解析を進めている。これらの解析により、連鎖的GRNによる細胞分化誘導のメカニズム解明が期待される。本研究の目的は、転写因子による連鎖的な細胞分化制御の遺伝子発現ネットワークの解析である。転写因子FoxO1は、プレB細胞において種々の標的遺伝子を制御することにより細胞分化を誘導する(Ochiai K. Nature Immunology 2012)。今回、FoxO1の下流因子として新規に転写因子Bach2を同定した。そこで、FoxO1-Bach2による経時的な三次元的遺伝子発現ネットワーク構築を目指した。はじめに、Bach2標的遺伝子同定を目指しChIPsequence(ChIPseq)を行なうための抗Bach2抗体のスクリーングを行なった。数種の市販抗体およびオリジナル作製抗体を用いたが、効率的な抗体を得ることができなかった。そこで、タグ付Bach2を組み込んだレトロウイルスベクターを構築し、タグ付Bach2細胞を作製しタグ抗体でのChIPを行なったが、既知の標的遺伝子上への優位な結合を検出することが出来なかった。これらの結果を受け、現在は異なるFoxO1標的遺伝子である転写因子IRF4をモデルに、FoxO1-IRF4三次元的遺伝子発現ネットワーク構築に移行している。利点として、研究者は内在性IRF4 ChIPseqを既に確立しており技術的な問題点がないこと、プレB細胞分化ではIRF4が必須であることが明らかであることが挙げられる。そのため、当初使用していたIrf4/Irf8遺伝子ノックアウト(dKO)プレB細胞株に代わり、新たにIrf4発現誘導型dKOプレB細胞株を樹立した。この新細胞株を用い、IRF4発現誘導およびIRF4標的遺伝子発現誘導を確認し、近日中に同細胞株におけるIRF4 ChIPseq解析実行を予定している。本研究は、細胞分化における経時的な転写因子発現ネットワークを解析を目的とする。B細胞分化では抗体の多様性を高めるために様々な分化段階で抗体遺伝子組み換えが生じる。そこで本研究では、代表者が既に明らかにしたFoxo1遺伝子発現ネットワークに加え(Ochiai K. Nature Immunology 2012)、Foxo1下流因子である転写抑制因子Bach2により形成される遺伝子発現ネットワークを統合解析することにより、時経軸を加えた三次元的な動的遺伝子発現ネットワークの構築を試みる。現在までの研究では、一転写因子によって制御される遺伝子発現ネットワークについて着目されてきた。近年、これに加えDNA結合配列依存的に機能する複数の転写因子による協調的遺伝子発現ネットワークの構築が試みられている。こうした研究はいわば、平面的な横のつながりを拡大したネットワーク構築と言える。一方で本研究では、時経軸を加えた三次元的なネットワークの構築を提案する。そのためにまず、代表者はFoxo1転写因子によって制御される遺伝子発現ネットワークには転写因子Bach2が含まれることを示した。次段階として、遺伝子発現ネットワークに時経軸を反映させるため、転写因子Bach2標的遺伝子の網羅的解析を行う必要がある。そこで研究計画に従い、Bach2標的遺伝子を網羅的に解析するためのChIP-sequenceを行うことを最優先事項とし、実験を進行している。平成24年度の研究実施計画では、内在性Bach2を標的としたChIP-sequenceまでを終了する予定であった。ChIP-sequenceにより転写因子結合データを得るためには、効率よく転写因子を免疫沈降することのできる抗体が必要である。そのために、まず入手可能な多数の抗Bach2抗体によるChIPアッセイの検討を行った。しかし、内在性Bach2のChIPを行うに適した抗体は得ることができなかった。そこで解決方法として、タグ付Bach2を過剰発現させ抗タグ抗体を用いたChIPアッセイを行うこととした。そのために、(1)タグ付Bach2発現レトロウイルスベクターの構築、(2)同ベクターを使用細胞へ感染させることによるタグ付Bach2発現の確認、(3)同ベクター感染細胞およびコントロール細胞を用いたChIPアッセイ、を順次行った。その結果、タグ付Bach2発現細胞におけるBach2結合領域DNAの特異的濃縮が認められた。現在、同実験系を用いてChIP-sequence解析へ進めるために、(4) ChIPアッセイによる標的領域への特異的Bach2結合効率能の最至適条件検討、を行っており、終了次第、実験計画を遂行する。Bach2 ChIP-sequenceの解析の最終最至適条件を検討する間に、プレB細胞株における機能的標的遺伝子をスクリーニングの準備を行う。具体的には、1Bach2過剰発現細胞、2Bach2遺伝子ノックダウン細胞における遺伝子発現をマイクロアレイを用いて解析する。

この解析により、プレB細胞株におけるBach2遺伝子の機能の概略を掴む。追ってBach2 ChIP-sequenceを行うことにより、マイクロアレイでスクリーニグされた遺伝子と照らし合わせ、プレB細胞株における直接標的遺伝子を同定する。次に、Bach2とその標的遺伝子を明らかにし、Bach2遺伝子発現ネットワークを構築する。そして、Bach2遺伝子発現を制御するFoxo転写因子による遺伝子発現ネットワークと照らし合わせ、さらにFoxoからBach2遺伝子制御という時間軸を入れた三次元的ネットワークへと変換する。該当なし
東欧における武道文化拠点の形成　‐ユーロ武道アカデミーの構築‐

海外における日本武道の受容のされかたは、競技性に終始することなくその文化性に興味がもたれている所に大きな特徴がある。この傾向は、特にヨーロッパに顕著である。しかし、欧州における武道文化に関する情報提供は十分ではなく、我われ日本人研究者・武道指導者が欧州に出向いて、現地に「ユーロ武道アカデミー」を構築できないかというのが、本プロジェクトの基本的な発想である。本研究においては、ハンガリーの3大学と協定を結び、ブダペストを拠点とした組織ネットワークを構築した。アカデミー用教材として、ハンガリー語と英語の文献を発行した。プログラムの試行として、学生・院生を帯同し「海外武者修行プログラム」を試行した。武道は、世界中からその文化性に関心がもたれ、多くの外国人実践者が武道の文化的な知識を得るために来日している。この状況を鑑み、本研究は、逆に我々が海外に赴いて、現地において武道の文化特性を発信できないかという試みである。武道学を中核となって主導する日・欧の学者と一流の実技指導者が叡智を結集し、あえて未だこの分野においな未開拓な東欧において、剣道をモデルとしながら、武道文化に関する発信拠点を形成する。具体的には、文武両道を標榜した「ユーロ武道アカデミー」を、日本人学生の研修(海外武者修行)とリンクさせつつ、構築しようとする挑戦である。これにより外国人実践者は、現地に居ながらにして日本文化の実際を肌で感じ、知りたいことを学ぶことができる、世界で初の、武道文化拠点が実現する。本年度における具体的な実績としては、以下のものがあげられる。・「ユーロ武道アカデミー」の拠点として、筑波大学体育系を中心とした、エトヴェシュ・ロラーンド大学、セメルワイズ大学、タンカプヤ仏教単科大学の四大学からなるネットワークを構築した。・在ハンガリー日本大使館が本プロジェクトの趣旨を非常によく理解したうえで今後の協力を約束してくれており、欧州における国際戦略の拠点を当地に展開する上で非常に有効なパイプが確立できた。日本固有の運動文化である武道は、現在世界的に普及され盛んに実践されているが、海外における武道実践者の興味は我々が想像している以上に日本武道そのものが内在している文化性に向けられている場合が多い。日本文化理解のための武道実践である場合も少なくない。本研究は、このような現状に鑑み、近年世界中から関心がもたれている武道文化に関する発信拠点を東欧に形成し、ひいては文武両道の「ユーロ武道アカデミー」構築につなげようとするものである。本年は、基礎研究に必要な史料(近世における武芸関係古文書)収集とともに、東欧におけるネットワークの構築に重点をおいた。ネットワークに関しては、ハンガリーにおいてNPO学術団体である「Forum for Budo Culture」との連携のもとエトベシュ・ロラーンド大学(ELTE)東アジア研究所およびハンガリー仏教大学とコンタクトをとり協力関係を構築した。また、セメルワイズ大学においても拠点を形成する準備の交渉を行った・武道は、世界中からその文化性に関心がもたれ、多くの外国人実践者が武道の文化的な知識を得るために来日している。武道学を中核となって主導する日・欧の学者と一流の実技指導者が叡智を結集し、あえて未だこの分野において未開拓な東欧において、剣道をモデルとしながら、武道文化に関する発信拠点を形成する。主に東欧ハンガリーを拠点とし、エトヴェシュ・ロラーンド大学(ELTE)、タンカプヤ仏教単科大学、センメルヴァイス大学(現在はハンガリー体育大学)と協定を締結し、この3大学からなるコンソーシアムで今後「ユーロ武道アカデミー」を展開していく基盤を築いた。「ユーロ武道アカデミー」における文武両道プログラムの試行として、2014年7月に開催された剣道ハンガリーカップにおいて実技指導ならびに日本文化講演を行った。またこの際、研究成果物としての映像教材DVD「The heart and technique of Kendogu Craftsmen」を上映し、好評を得た。さらに日本人学生の研修(海外武者修行)として、学生4名を同行させ、プログラムに参加させた。「ユーロ武道アカデミー」の教材として、以下の英語ならびにハンガリー語の著書を執筆し出版した。武道学武道協議連盟および現地3大学とのネットワークの構築がほぼ完了し、おおむね計画通りに進んでいる。24年度における重点課題であった東欧における組織ネットワークの構築は、エトベシュ・ロラーンド大学(ELTE)東アジア研究所およびハンガリー仏教大学との協力関係が確立したことから、当初の予定通り順調に展開しているといってよいエトヴェシュ・ロラーンド大学、セメルワイズ大学、タンカプヤ仏教単科大学のハンガリー3大学と武道競技連盟(剣道・柔道・合気道)の協力のもと、「ユーロ武道アカデミー」を実際に試行・完成する。

今後は、エトベシュ・ロラーンド大学(ELTE)東アジア研究所およびハンガリー仏教大学と筑波大学との間で正式な協定を締結し、オフィシャルなネットワークを確立したうえで、「ユーロ武道アカデミー」の構想図を検討し、教材開発をしつつ、武道実践現場との連携のもとアカデミーのプログラムを試行していく。25年度中に「ユーロ武道アカデミー」の試行を行う予定であったが、競技連盟ならびにエトヴェシュ・ロラーンド大学)・セメルワイズ大学・タンカプヤ仏教単科大学のハンガリー3大学コンソーシアムの予定調整が年度内にできず、これを26年度に繰り越したため。ハンガリーにおいて25年度までに形成されているネットワークを駆使して、「ユーロ武道アカデミー」を東欧を中心に呼びかけ、試行する。受講者による評価を行い、これを本プロセスの冒頭にフィードバックし、東欧における武道文化拠点における「ユーロ武道アカデミー」プログラムを完成させる。組織ネットワーク確立・強化および「ユーロ武道アカデミー」試行のための渡航費。「ユーロ武道アカデミー」は学術面と実技実践面を融合させた文武両道プログラムにより遂行されるが、学術面では基礎研究に加えて教材開発費、実技実践面に関しては海外における実技実践特有の問題点(気温・湿度など気候の違いにより道具の不具合等)解決のための費用として使用する計画である。尚、H25年度へ繰越額が生じているが、これは3月分の旅費が4月に支払われるためであり、実際には次度使用額は0円となる。
合成ステロイドＣＳＡの感染症治療薬へのアプロ－チ

ステロイド環を有する抗菌剤であるCeragenin(CSA)は歯科材料に被覆および混合することで、それらの表層に細菌がバイオフィルムを形成することと被覆・混合したCSAが培養液中に浸出することで液中の細菌の増殖をも著明に抑制した。また、低濃度のCSAとブドウ球菌を混合して培養を繰り返しても耐性菌が誘導されなかった。さらに、がん細胞に対してアポトーシスを誘導することで抗腫瘍作用を示した。CSA-13でコートしたハイドロキシアパタイト(HA)やCSA-13を混合した歯科用セメントでのS.mutansの増殖阻止作用について検討した。本実験での培養条件下でCSA-13のコートをされなかったHA表面(2.5×10^5/cm^2)には細菌のバイオフィルムが24時間の静置で形成された。それに対し、CSA-13でコートされたHA表面には検出限界(1.1×10^1/cm^2)以上の細菌が認められなかった。CSA-13をコートしたHAおよびコートしていないHAをBHI培地中に浸漬しS.mutansの増殖に及ぼす効果を比較した実験ではCSA-13をコートしたHA小片は細菌の増殖を著明に抑制した(14.6% vs medium only, P<0.01)。これに対し、CSA-13のコートをしていないHA小片はS.mutansの増殖を抑制せず、かえって増殖の促進を示した(144.9% vs medium only, P<0.01)。走査電子顕微鏡観察において、CSA-13をコートされていないHA小片表面には平均3.3±2.4×10^5/cm^2の球菌が観察されたが、CSA-13をコートされたHA小片表面には球菌が計測されなかった。歯科用セメントにCSA-13を混合した場合の細菌に対する増殖抑制効果は著明であった。増殖抑制効果はCSA-13の濃度が100μg/gでも認められた。本実験で、これらの歯科材料はS.mutansの定着や増殖をほぼ完全に阻止した。本研究結果から、実際の歯科診療において細菌感染に起因する口腔疾患の予防・治療にCSA-13をコートあるいは混合させた歯科材料を使用することによる有用性が示唆された。CSAによるバイオフィルム形成阻害に関する検討CSAが口腔細菌によるバイオフィルム形成に対して阻害作用を有するかどうかを検討した。前年度までの研究で虫歯の原因細菌であるS.mutansや歯周病の原因細菌であるP.gingivalisに対して、CSAが抗菌活性を有することを明らかにしてきたが、23年度では具体的にハイドロキシアパタイトや歯科用セメントを用いて、その表面での細菌によるバイオフィルム形成に対する阻害効果を検討し、良好な結果を得た。細菌の培養液中にCSAをコーティングしていないハイドロキシアパタイト片を投入すると、その表面には無数の細菌が付着し増殖をすることでバイオフィルムが形成された。しかし、同様のハイドロキシアパタイト片の表面にCSAをコーティングしておくと、その表面にはほとんど細菌が付着することはなかった。細菌培養液中から取り出したハイドロキシアパタイト片を洗浄して無菌の培養液に投入して培養しても菌の増殖が認められなかったことや、走査型電子顕微鏡による表面の観察で菌の集塊が認められなかったことから、これはCSAのコーティングが細菌によるバイオフィルム形成を阻害したためであることが証明された。歯科用セメントにCSAを混入した素材を用いた抗菌作用の検討においても、その表面には細菌が付着できず、バイオフィルム形成も阻止されていた。さらに、その持続力を検討するために細菌の培養液中に2週間セメント片を浸漬したままにしておいたが、培養液中の細菌の濃度が上昇することはなく、セメント片から浸出したCSAによる抗菌作用がセメント片の表面のみならず、その周囲に対しても抗菌作用をおよぼしていた。このことはCSAをコーティングした歯科材料を使用することで、口腔の衛生状態を良好に持続的に維持させる可能性を示しているものと思われた。23年度までの研究でCSAが口腔細菌によるバイオフィルム形成に対して阻害作用を有することが明らかになり、24年度では歯科材料に混入させる実験を継続した。さらに、25年度ではCSAの抗菌作用に抵抗性を有する細菌が誘導されるかどうかの検討、およびCSAの実験の比較に用いる抗菌タンパクを遺伝子操作によって、大量に作成する検討を行った。CSAの抗菌作用に対して抵抗性を有する細菌の出現に関する検討では、抗菌作用を示さない濃度のCSAを培地中に混合し、臨床分離株の大腸菌とブドウ球菌を継代を繰り返しながら継続的に1カ月間培養する実験を行った。1か月後に殺菌量のCSAを加えた培地に菌を戻し培養を行ったが、実験期間内では抵抗性株の出現は認められなかった。抗菌タンパクを遺伝子操作によって作成する実験では、SUMOタンパク遺伝子とCAP18遺伝子を連結させることで大腸菌に産生させる段階での抗菌活性を抑制させ、産生後にプロテアーゼ処理をすることで効率よくリコンビナント抗菌タンパクを作り出すことができるようになった。しかしながら、シグナルタンパク、カセリンタンパクおよび活性タンパクを含む

CAMPタンパク全体をコードする遺伝子を挿入すると挿入された大腸菌が傷害されてタンパクを回収することができなかった。これは、シグナルあるいはカセリンタンパクのいずれかに活性タンパクを切り離す作用を持つプロテアーゼが格納されていることを示唆した。一方、CAP以外の抗菌タンパクについては、牛由来の抗菌タンパクであるBMAP28について、リコンビナントタンパクの作成を試みたが、BMAP28については、シグナルタンパクを含む大きなタンパクでも活性部分のみでも大腸菌に産生させることができなかった。23年度までの研究でCSAが口腔細菌によるバイオフィルム形成に対して阻害作用を有することが明らかになり、24年度では歯科材料に混入させる実験を継続した。さらに、CSAの抗菌作用に抵抗性を有する細菌が誘導されるかどうかの検討、およびCSAの実験の比較に用いる抗菌タンパクを遺伝子操作によって、大量に作成する検討を行った。CSAの抗菌作用に対して抵抗性を有する細菌の出現に関する検討では、抗菌作用を示さない濃度のCSAを培地中に混合し、臨床分離株の大腸菌とブドウ球菌を継代を繰り返しながら継続的に1カ月間培養する実験を行った。1か月後に殺菌量のCSAを加えた培地に菌を戻し培養を行ったが、実験期間内では抵抗性株の出現は認められなかった。抗菌タンパクを遺伝子操作によって作成する実験では、SUMOタンパク遺伝子とCAP18遺伝子を連結させることで大腸菌に産生させる段階での抗菌活性を抑制させ、産生後にプロテアーゼ処理をすることで効率よくリコンビナント抗菌タンパクを作り出すことができるようになった。毎年度の計画に沿った成果が確実に得られてきている。昨年度報告書および今年度報告書に記載した通り、成果は論文および国際学会で着実に報告できている。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画は4年間で完了できる見込みである。23年度まででCSAの抗菌活性や医療材料に混入した場合の効果についてのデータが得られてきている。また、CSAの効果と比較するための抗菌タンパクの分子生物学を応用した合成についても進行しつつあり、24年度および25年度にはそれらの活性を比較して医療材料および薬品としての応用に道を開けることが予想できてきている。
手指の巧緻性の実態と被服製作学習の課題

被服製作学習の今後の展開を検討する事を目的として、現代の子ども達の手指の巧緻性の実態と意識を測定した。また、手指の巧緻性の優劣が生活の自立と学力に及ぼす影響、被服製作の基礎的技能の習得の意識と実態を明らかにし、指導上の課題を考察した。また、手縫い技能の向上を目指した教材の学習効果を明らかにした。本年度の研究は、児童・生徒および大学生の手指の微細運動能力を糸結びテストにより測定し、1996年に本研究グループが行った全国規模の調査結果との比較から、現代の児童・生徒の手指の巧緻性の推移を把握するとともに、同時に質問紙調査を行い、手指の巧緻性が及ぼす生活面や学習面への影響、あるいは巧緻性の優劣を左右する要因の追究、被服製作学習の手指の巧緻性の発達を促す可能性について考察した。調査の結果、現代の糸結びの成績は1996年に比べ男女ともに低下し、特に男子において顕著であった。小学生においては糸結び数の上位群と下位群の比較から、生活の自立度、手指を使う作業への得意意識、物作りへの意識が手指の巧緻性に関与することが認められた。また、小テスト形式で行った学力との関連では、成績上位群に糸結び数の高いものが多いことが確認され、手指の巧緻性に優れることの意義と、それを発達させる可能性のあるもの作り学習の効果と意義が示されたと考える。大学生においては、糸結びの成績と生活面や手指を使う作業経験との関係を考察したところ、日常生活における手指を使う作業の有無が巧緻性を発達させることが推測されたが、その作業に要する基礎的・基本的な技術の定着とも関連が見られた。このことから、被服製作学習の基礎的、基本的技術の定着の実態と手指の巧緻性との関連および学習者の手指の巧緻性を配慮した指導法について、次年度に向けて研究を進めることとした。小学校を対象として糸結びテスト、手縫いの基礎的・基本的な技能の習得・得意意識および定着などに対するアンケート調査及び学習実態観察を行った。また、中学生を対象に、刺し子の授業観察から縫製技能の実態を把握するとともに、もの作り学習への意識と手指の巧緻性との関係を考察した。その結果、1.小学生において手縫いの基礎的・基本的な技能の学習への意識および技能の習得・得意意識と糸結びテストの成績間に正の相関が認められた。2.手指の巧緻性と手縫いの基礎的・基本的な技能の学習の実態観察において、学習後1年たった6年生および中学生において、5年生で学習した方法以外で糸通し・玉留め・玉結びをしている児童が散見された。糸通しは、針の穴を横にして持ったり、針山に針を刺した状態で糸通しをする、針穴を下向きにする、玉結びは糸の先を手で結わえて結び目を作る、玉留めは糸の終わりを手で結ぶ方法や、糸を針に巻きつけたあとに針を上手く押し出すことができない様子が観察された。6年生のアンケートの調査結果では、7割を超える児童が5年生で学習した方法を理解できていると回答したが、実態ではそれ以外の方法で実施されており、意識と実態の差がみられた。これらの方法は、指導通りの方法では対応できない児童・生徒自身が生み出した工夫ととらえることもでき、今後の指導の留意点である。4.小学生においてイチゴの図案に玉留め・玉結びで種を作る教材などで学習進度を測ったところ、糸結びの成績と玉結び・玉留めの個数に正の相関があることが確認でき、手指の巧緻性は学習進度に影響していることがわかった。以上の結果から、指導に当たっては、児童・生徒の個別の手指の巧緻性およびもの作りに対する意識を把握し、その特性を踏まえた上で、学習環境を整えることが重要であることが示唆された。今後はさらに具体的な指導方法等についての検討進める予定である。手縫いの基礎技能の習得において、手指の巧緻性が深く関与することが前年度の研究から明らかになったことから、小学校で学習する手縫いの基礎技能(玉結び、玉どめ)の習得における困難点と課題を検討した。その結果、学習後、1年経過した時点での基礎技能の定着に関する自己評価は向上しているにも関わらず、巧緻性の低い児童は得意意識が低下していた。さらに定着したと自己評価している基礎技能について実態を確認したところ、指導通りの方法が定着していることと手指の巧緻性の優劣とに関係が認められ、成績の低い児童には自己流の方法で糸の端に玉を作る傾向が強いことが確認された。これらの結果から、手縫いの基礎技能の指導においては個別の手指の巧緻性の把握が必要であること、巧緻性の低い児童においては、「糸端をつまむ」操作から困難な状況があり、そのために被服製作学習の最も基本となる技能の的確な定着がなされないことが明らかになった。

なお、小学校の学習から10年を経た大学生についても同様の確認をしたところ、「玉結び」の自己流による定着の割合が小学生を上回る高い割合で出現することが確認され、学校教育以外での縫製経験の機会が少ない環境での基礎技能の的確な定着の困難さが伺えた。一方、手縫いの基礎技能(玉結び、玉どめ、並縫い等)の習得を目指した教材として、中学校における「刺し子」の学習について手指の巧緻性との関連を踏まえて有効性を検討したところ、手指の巧緻性は作業の進度、目視評価によるできばえと関連が見られた。また、男女ともに達成感が高いことは、針を刺す位置が記され、同じ作業を反復する刺し子の特徴が、作業の見通しの明確さと技能の向上を自覚できることに起因するものと推察された。高校生(3年生)における糸結びテストの成績は、男子10.6ポイント、女子16.0ポイントで前回測定(1995年1,2年生)との差はみられなかった。
培養顆粒膜細胞の機能調節におけるエンドセリン-Iの影響に関する研究

我々は、強力な血管収縮作用を有する活性ペプチドホルモンであるET-1を卵巣機能の局所調節因子の一つと推定し、顆粒膜細胞の機能調節に及ぼすET-1の影響について検討した。ブタ顆粒膜細胞には単一でかつ特異的な高親和性のET-1レセプターが存在し、これはET-3とも同様の親和性を持つET_Bレセプター・サブタイプを示した。培養ブタ顆粒膜細胞からは高濃度のET-1が分泌され、前駆体プレプロET-1 mRNAの発現が証明されその産生能も確認された。また、ヒト卵胞液中においても高濃度のET-1が検出された。ブタ顆粒膜細胞培養系においるsteroidogenesisへの影響を検討すると、ET-1は短時間(2時間)の刺激では顆粒膜細胞のprogesterone(P)分泌には促進的に作用し、estradiol(E_2)分泌には有意な変化を与えなかった。一方、48時間長期培養においては、ET-1はLHによるP分泌を抑制的に作用した。細胞内情報伝達系の検索では、培養ブタ顆粒膜細胞において10^<-7>10^<-9>M ET-1刺激後イノシトール三燐酸(IP_3)産生量は用量依存性に有意に上昇した。さらに、10^<-7>10^<-9>MのET-1刺激後の細胞内カルシウム濃度は急激な上昇を示し、15秒以内にピークを示し以後基礎レベルに復し、この作用は用量依存性を示した。また、48時間培養におけるET-1の作用発現にはcyclic AMPの関与も認められた。以上の結果より、顆粒膜細胞より分泌されるET-1はlocal factorとして、paracri-ne/autocrine的に卵巣の機能調節に関与していることが強く示唆された。さらに、妊娠初期の脱落化子宮内膜におけるET-1分泌能について検討すると、ヒト妊娠初期脱落膜より活発に産生されるET-1は細胞膜のETレセプターと結合し、その情報は細胞内にイノシトール燐脂質代謝やCa^<2+>の変動を介して伝達され、脱落膜細胞に対してもオートクリン/パラクリン的に作用することが明らかとなった。平成3年度は、ブタ顆粒膜細胞からの性ステロイド分泌に及ぼすendothelinー1(ETー1)の影響、ETー1受容体の存在と細胞内情報伝達系の変動に中心に研究した。ブタ顆粒膜細胞培養系で、ETー1を添加し2時間培養における培養液中progesterone(P)濃度や、△^4ーandrostenedione添加後のestradiol(E_2)濃度をRIAで測定すると、10^<ー8>と10^<ー7>MのETー1はP分泌を有意に上昇させたが、E_2分泌には有意な変化を与えなかった。この作用発現を解明するため、細胞内カルシウム濃度[Ca^<2+>]_iの変化と細胞内イノシ-トル燐酸(IP_x)産生量を検索した。10^<ー7>ー10^<ー9>M ETー1刺激後の[Ca^<2+>]_iは急激な上昇を示し、15秒以内にピ-クを示し以後基礎レベルに復した。この作用は、Ca^<2+>拮抗剤であるニカルジピンやEGTAの前処理で影響を受けなかった。同様に10^<ー7>一10^<ー9>M ETー1刺激後細胞内IP_x

産生量は用量依存性に有意に上昇した。しかし、ETー1は細胞内cAMP産生量には影響を与えなかった。次にブタ顆粒膜細胞におけるETー1受容体の検索を行なった。培養細胞の膜分画を分離し、^<125>IーETー1を用いて非標識ETー1によるdisplecement'法による結合実験を行ない、Scatchard analysisによりKd=0.59pM,B_<max>=1.84pmol/mg proteinの単一で高親和性のETー1受容体が存在した。さらに、ブタ顆粒膜細胞の24時間培養により、その培養液中に高濃度のETー1が特異的RIAにより測定され、この培養液中ETー1をreverse phase高速液体クロマトグラフィ-で分析すると、そのretention timeは標準ETー1のそれと一致した。以上により、ブタ顆粒膜細胞には親和性の高いETー1受容体が存在し、ETー1はこの膜受容体に結合した後、細胞中のイノシト-ル燐脂質代謝系を経て[Ca^<2+>]_iを上昇させ、この作用により細胞かららのP分泌を促進することが明らかとなった。また、顆粒膜細胞はそれ自身ETー1分泌能を有し、このETー1がparacrine/autocrine的に作用することが示唆された。平成4年度までに、ブタ顆粒膜細胞からの性ステロイド分泌に及ぼすendothelin-1(ET-1)の影響、ET-1受容体の存在と細胞内情報伝達系の変動などについて探究した。顆粒膜細胞培養系において、ET-1はProgesterone(P)分泌を有意に上昇させたが、estradiol(E_2)分泌には有意な変化を与えず、この作用発現には細胞内情報伝達系として細胞内カルシウム濃度[Ca^<2+>]_iの変化と細胞内イノシトール燐脂質代謝系が関与することを示した。またブタ類粒膜細胞におけるET-1受容体の検索では、単一で高親和性のET-1受容体が存在することを証明し、その内容はJournal of Endocrinology(1992)に掲載された。それに加え、ブタ顆粒膜細胞からのET-1産生・分泌機序に焦点を絞り、ブタ中・小卵胞より得られた顆粒膜細胞の培養液中のET-1濃度を特異的RIAにて測定し、顆粒膜細胞からのET-1分泌を証明した。また、分子生物学的手法により細胞内におけるET-1のmRNAレベルでの検討を行なった。培養顆粒膜細胞から抽出したpoly(A)^+RNAについて、ヒトプレプロET-1のcDNAをプローブとしてNorthern解析を行ない、ET-1の合成能を証明した。この報告は、Journal of Endocrinological Investigationに投稿中である。さらにヒト卵胞液中にも高濃度のET-1が存在し、小卵胞(直径15mm以下)由来の卵胞液中の方が高いことを示した。以上平成4年までの研究により、ブタ顆粒膜細胞から合成・分泌されるET-1はこの細胞自身の膜受容体に結合し、細胞内のイノシトール燐脂質代謝系を経て[Ca^<2+>]_iを上昇させ、細胞からのP分泌を促進することが明らかとなり、ET-1の顆粒膜細胞に及ぼすparacrine/autocrine作用が証明された。平成4年度までの成績では、endothelin(ET)-1はブタ顆粒膜細胞培養系においてProgesterone(P)分泌を有意に上昇させたが、estradiol(E_2)分泌には有意な変化を与えず、この作用発現には、細胞内情報伝達系として細胞内カルシウム濃度[Ca^<2+>]_iの変化と細胞内イノシトール燐脂質代謝系が関与することが示された。