hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の生活・認知機能維持に資する運動療法に関する縦断研究

運動療法の早期介入および持続的な効果を検討するために,2004年から10年間の縦断調査として,8000人を対象に全国体操教室を施行している。評価項目は,(1)運動機能(2)生活自立(3)物忘れ(4)うつ(5)老年症候群(6)社会交流(7)健康感・活動(8)転倒経験(9)困難な課題への取り組み-についての36項目を設け,自立から虚弱,虚弱から寝たきりの機能評価も詳細な項目を設けた。2005年度では、24都道府県で体操教室に参加した5,500人の横断データと2700名の縦断データが得られた。全体で活力度は上昇(47.8→48.1)し、カテゴリー別では、生活自立は上昇、健康意識、社会交流、うつは上昇、老年症候群、認知機能は下降、運動機能、意欲は不変であった。転倒予防では,年齢別では、60歳代は、20.1%が13.3%に減少(p<0.01)、70歳代は30.8%が25.9%に減少(p=0.053)した。転倒スコア(21点満点)は、5.76から5.41に改善した(p=0.06)。運動習慣は、転倒頻度を減少させる。運動効果の詳細を検討するため、47-72歳の体操参加66名に熟達度に応じ、年齢をマッチングさせ、指導者、熟達者、初心者に分け、身体計測、骨検査(DXA、脊椎X線撮影)、動脈硬化検査(動脈脈波速度)、バランス・柔軟検査を行った。身体計測では指導者、熟達者ともに有意にウエスト/ヒップ比の低値が見られた。またDXAにおいて大腿骨頚部の骨密度が指導者において高値を示した。動脈脈波速度ではba-PWVが指導者、熟達者において低値を示し、定期的な均整柔軟体操は骨密度、動脈硬化指数の改善が得られると考えられた。この機序の一部に、運動による液性因子の改善を認めている。運動療法の早期介入および持続的効果を検討するために,2004年から縦断調査として8,000人を対象に全国体操教室を施行している。評価項目は昨年と同じ活力度指標36項目である。60歳以上の高齢者運動群550名を運動経験年数1年未満、2-7年、8年以上の3群に分け、非運動群335名を加えて4群で比較した結果、経験年数に応じて活力度は高値を示し、下位尺度として健康感・活動、うつ、老年症候群、運動機能、生活自立の項目でそれぞれ経験年数による高値が認められた。また、21項目の転倒スコアを用いて、運動による転倒予防効果を解析した結果、将来の転倒を予測する因子として、過去の転倒歴転倒歴(OR=3.9,p<0.0001)、つまずき(OR=2.0,p<0.0001)、近所に坂道がある(OR=1.5,p<0.01)の3因子が抽出された。運動の効果の詳細を検討するため、47-72歳の体操参加者66名について、年齢をマッチングさせ、熟達度に応じて指導者、熟達者、初心者に分け、身体計測値、骨量検査(DXA)、動脈硬化検査(PWV,ABI)、バランス・柔軟検査、血液検査を行った。3年間の経時変化の観察で、初心者ではバランスが、熟達者と指導者ではバランスとABIに改善が認められた。以上、定期的な均整柔軟体操はバランスだけでなく動脈硬化にも好影響をもたらす可能性が示された。
希少種ニホンイヌワシの保全－餌利用の季節的変化を考慮した生息地管理策の構築－

落葉林の季節的な空間構造の変化は、ニホンイヌワシの採餌環境選択に影響する。そこで本研究は、展葉前後におけるニホンイヌワシの採餌環境特性を航空レーザー測量によって評価すると共に、行動圏内の潜在的な採餌場所を明らかにした。展葉前は、ニホンイヌワシの採餌環境は積雪した大きな林冠ギャップであり、それらは行動圏内に広く分布していた。一方、展葉後の採餌環境は、サイズや形状の値が大きい林冠ギャップとなり、結果として、潜在的な採餌場所は著しく減少した。以上より、ニホンイヌワシが周年、餌を採餌するには、サイズや形状の値が大きい林冠ギャップを維持すると共に、それらを植林地に人為創出することが必要と考えられた。平成25年4月から6月にかけて、ニホンイヌワシの採餌に重要な林冠ギャップの空間特性を解析した。これにより、平成24年度に生じた解析の遅延を迅速に処理することができた。平成25月7月以降は、当初計画通り、ニホンイヌワシの生息地管理プランの構築を行った。本プランは、ニホンイヌワシの採餌に重要な林冠ギャップを現状維持するための保護区づくり、および林冠ギャップの未分布域での人為的なギャップ創出を主な対策としている。解析の結果、保護区としては、樹木の天然更新によって恒常的に林冠ギャップを形成する林齢80年以上の落葉広葉樹林帯、あるいは裸地・岩場などの地表露出帯が選定された。一方、人為的なギャップ創出の候補地としてはスギ人工林が選ばれ、その面積はイヌワシ行動圏の約20%にも達した。上記のように、林冠ギャップが常に形成される落葉広葉樹林帯や裸地・岩場を保護区に指定するとともに、スギ人工林にて人為的に林冠ギャップを創出することがニホンイヌワシの生息地を管理する上で不可欠であることが示唆された。ニホンイヌワシの餌利用は、ブナの葉の消長と対応し、落葉期にはノウサギ、展葉期にはヘビ類となることが報告されている。これは、絶滅危惧種であるニホンイヌワシが周年、安定して餌を利用するには、ノウサギとヘビ類がセットとして必要となることを意味している。このような状況を踏まえ、本研究はブナの葉の落葉期と展葉期を対象に、ニホンイヌワシが餌を捕獲する上で鍵とする環境の特徴を明らかにすると共に、本種に一年を通じて安定して餌を供給する生息地管理策を立案することを目的とした。研究の初年度となる平成24年度は、ニホンイヌワシが餌を捕獲する上で鍵とする環境の特徴を評価するための基盤整備を主に行った。特に、申請者らの事前調査にて、ノウサギとヘビ類の捕獲地点は、共にブナ林に形成された開空部(以下、林冠ギャップとする)である点で一致するものの、その大きさや形などの空間特性には大きな相違があるが観察されていたことから、本研究では、新たな空間解析技術として着目されているレーザープロファリングの手法を用いることにより、林冠ギャップの空間特性を正確に把握することを試みた。レーザープロファイリングは、2012年8月にレーザプロファイラーを搭載したセスナ機を用いて調査つがいの行動圏2,555haを対象に実施された。本研究におけるレーザーの照射頻度は、1秒間に20万発であった。その後、レーザープロファイリングによる標高誤差を検証するために、2012年11月に調査つがいの行動圏の4地点にて、GPSを用いた標高測量を行った。現地にて得られた標高を基にレーザープロファイリングによる標高誤差を検証したところ、誤差は-1±3cmであり、樹高の高低差による林冠ギャップの判読に十分に適用できるデータであることが立証された。現在は、樹高の高低差による林冠ギャップの判読を終え、その空間特性を解析中である。平成26年度は、当初予定どおりに研究成果の公表を行った。本研究では、国際鳥学会(26th International Ornithological Congress)を研究成果の公表の場として選定した。国際鳥学会は、4年に一度開催される大規模な国際大会であり、本研究成果を公表する場として最適な大会と言える。発表タイトルは、Spatial characteristics of foraging habitat and seasonal changes in potentialforaging area of Golden Eagle in deciduousbroadleaf forestであり、ニホンイヌワシが利用する林冠ギャップのサイズや形状を報告すると共に、それらの特徴を有するギャップの現存面積の合計値が夏季に著しく減少することを紹介した。

また、林冠ギャップの現存面積が夏季に激減することを踏まえ、ニホンイヌワシを保全するためには、1現存する林冠ギャップのうち、ニホンイヌワシが利用可能なサイズや形状を有するものを積極的に保護すること、2林冠ギャップが形成されない地域(スギ人工林など)に、ニホンイヌワシが利用可能なギャップを人為的に創出することが必要であることを指摘した。本研究は、新たな空間解析技法として注目されているレーザープロファイリングの技術を応用し、ニホンイヌワシが利用する林冠ギャップのサイズや形状を詳細に解明した。これらの成果により、ニホンイヌワシの保全策を具体的に計画することができた。また、レーザープロファイリングの技術が野生生物の生息地管理の分野において、極めて有用であることを示すことができた。動物生態学平成25年6月までに計画の遅延を取り戻し、7月以降にニホンイヌワシの生息地管理プランを構築した。これは、本研究が当初計画どおりに進展したことを意味する。現状を鑑みると、研究の達成度は、おおむね順調に進展していると判断できる。本研究は、1)レーザープロファイリング技術を用いて林冠ギャップの判読を行い、その後、2)ニホンイヌワシの採餌に重要な林冠ギャップの空間特性を解析し、その特徴を有する林冠ギャップの分布をイヌワシ行動圏内にて評価した後に、3)得られた分布を地図上に図示し、それらを現状維持する保護区づくりや、林冠ギャップの未分布な区域での人為的なギャップ創出方法を検討し、これらの手法を組み合わせたニホンイヌワシの生息地管理プランを構築する計画である。このうち、平成24年度は1)および2)を実施する予定であった。1)については、誤差-1±3cmの精度にて樹高の高低差による林冠ギャップの判読が実施されたため、当初の計画どおりの実績を残すことができたと判断できる。一方、2)については、当初の計画よりやや遅れ、現在も解析中である。ただし、6月中にすべての解析は終了する予定であり、計画に大幅な遅延が生じる訳ではない。よって、1)および2)の現状を鑑みると、現在の達成度としては、当初の計画どおりおおむね順調に進展していると言える。平成24年度および平成25年度の調査計画をおおむね順調に遂行したことにより、主な研究結果は整った状況にある。この現状を踏まえ、平成26年度は、当初計画通りに研究成果の公表を行う期間と位置づける。成果の公表としては、国際学会での発表および学術雑誌への論文投稿を行う予定である。国際学会での発表は、平成26年8月に開催される26th International Ornithological Congressにて行う予定である。また、平成26年度中に学術雑誌への投稿を行うため、国際学会への参加後、投稿論文を速やかに作成する予定である。平成25年度は、平成24年度に実施した1)および2)の研究結果を基に、調査つがいの行動圏内にてニホンイヌワシの採餌に重要な林冠ギャップの分布図を作成し、それらを現状維持する保護区づくりなどの生息地管理プランを構築する計画である。ただし、2)の解析の終了時期は、平成25年度の6月まで遅延する見込みであるため、本年度の調査計画は、6月以降に推進することとなる。上記のように平成25年度研究は当初の計画よりやや遅れて実施することとなるが、大幅な遅延ではないため、本年度の研究計画を変更・修正する必要はないと判断できる。よって、今後は6月までに2)の解析を終了させた、その後、当初の計画どおりに平成25年度の研究計画を実施する予定である。
極小真核生物シアニゾスキゾン類を用いた細胞核ゲノムによる細胞質支配のネットワーク

シアニゾスキゾンが真核生物で最小のゲノムサイズ(8MBp)であることをVIM測定法で見いだし、その分裂増殖の制御機構を分子細胞生物学的に解析するための基本的現象を検討した。本年度は主に、1)真核細胞の成りたちに必要とされる最小限の基本的オルガネラとは何かを系統的に検証。2)オルガネラの増殖周期を完全に同調化するための方法の開発。3)オルガネラの増殖に関わる全ゲノム解析の可能性の検討。4)分裂周期に於ける細胞核ゲノムによるミトコンドリア、葉緑体の増殖制御の方法についての解析を行なった。その結果、1)については、シアニゾスキゾンにはゴルジ体が観察されず、従ってゴルジ体が欠如しても真核生物細胞は成立し、分裂できることが明らかとなった。2)については、光の明暗周期と薬剤処理によって葉緑体とミトコンドリアの分裂を95%同調することができるようになった。3)については、パルスフィールド電気泳動法で染色体を完全に17本に分けることができるようになり、分裂制御に関わる遺伝子(アクチンなど)の染色体の解析及びその上での位置の決定ができるようになった。4)については、既にC.caldariumの葉緑体で発見している分裂装置を、C.merolaeの葉緑体でも観察した他、ミトコンドリアの分裂装置を世界で初めて発見した。また細胞壁もなく分裂装置の単離も可能であること、及びこれらの装置の指令は細胞核ゲノムから出ているらしいことを明らかにした。これらの結果は、今後細胞核ゲノムによる葉緑体とミトコンドリアの増殖制御のネットワークを解析する糸口となると考えられる。
ネットワークを介したゲーム(オンラインゲーム)の数理モデルを確立すると共にシミュレータを開発する

多人数参加型ゲーム(いわゆるオンラインゲーム)のモデル・シミュレータを作成する事を目的とした。ネットワークを介して多人数が参加するオンラインゲームは最近急激に盛んになりつつあるゲームであり、今後のゲームの主流になるだろうとの予測もある。したがって、オンラインゲームの研究や開発を進めるためには、その特性を考慮したモデル構築やオンラインゲームの各種のシミュレーションを行うシミュレータの構築が必須である。しかしながら、ネットワークを介することによる遅延などの問題、多人数参加による分散型システムの持つ問題、ゲームというリアルタイム性に関する問題などを考慮する必要があり、現時点ではオンラインゲームの適切なモデル・シミュレータは存在しないのが実状である。そのため現在は、各ゲームメーカは試行錯誤的にゲームを開発しているのが実状であり、オンラインゲームの研究・市場の発展の大きな障害となる恐れがある。平成18年度は、平成17年度に行なったオンラインゲームモデルの理論的検討に基づき、オンラインゲームシミュレータを開発した。そのために高機能パソコンを購入した。また、構築したシミュレータ上で実際に簡易なゲームを構築し、ゲームの評価を行う事により、モデルの正当性を検証した。モデル、シミュレータ、シミュレータ上のゲーム、モデルの評価などに関する研究結果を複数の海外における国際会議で発表した。本研究の結果得られるモデル・シミュレータは、オンラインゲームの研究やオンラインゲームの開発の進展に大きな貢献をすると期待される。本研究は、多人数参加型ゲーム(いわゆるオンラインゲーム)のモデル・シミュレータを作成する事を目的としている。当初、平成17年度は国内の主たるゲームメーカを訪問してオンラインゲーム開発環境の調査を行い、オンラインゲーム開発における問題点の抽出を行なうとともに、その結果に基づき、これまで理論的研究に重点をおいて進めてきたオンラインゲームモデルの改良、細部の仕様の研究を行なう予定であった。しかしながら、国内でオンラインゲーム開発を行なっているメーカが少なく、かつ調査に協力的でなかったため、17年度は研究文献やニュースなどに基づくオンラインゲームの開発状況や研究動向の調査を行う事とした。また、この調査やその結果格納のためパソコンを1台購入した。この調査の結果、オンラインゲームはまだ安定性や応答性で種々の問題を抱えており、将来的なオンラインゲームの健全な発展のためにも、適切なオンラインゲームモデルの開発が急務である事が明らかになった。上記の結果に基づき、これまで検討を進めてきたオンラインゲームモデルを高速パソコン上にインプリメントするとともに、その上に具体的なコンテンツを持ったオンラインゲームシミュレータを開発する事とした。このために高速パソコン1台を購入した。具体的なコンテンツとしては、ストーリーベースのゲームを採用する事とし、文献調査に基づきストーリーベースのゲームに関する研究状況の調査を行った。また、その結果を反映して、具体的なオンラインシミュレータの仕様検討を進めた。また、当初は予算の一部を調査研究のための旅費等に使用する予定であったが、研究の早期立ち上げのため、17年度はWebを用いた文献調査を行う事とし、調査研究にあてる予定だった予算をすべて備品購入にあてたが、研究遂行上は支障はなかった。
中性子星観測によるアクシオン暗黒物質の間接検出に向けた理論研究

現在の我々の宇宙を満たす正体不明の「暗黒物質」の解明は自然科学における最重要課題の一つに挙げられるが、本研究では暗黒物質の有力候補「アクシオン」に焦点を当て、近傍宇宙に点在する中性子星の観測を通じてアクシオンの間接的検出が可能かどうかを理論的に検証する。特に中性子星近傍でアクシオンが引き起こす特異な電磁気現象をシミュレーションを用いて解析し、将来の電波望遠鏡による検出可能性を明らかにする。
幹細胞技術と遺伝子編集技術を組み合わせアルツハイマー病治療戦略を洗練させる

iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、ヒト神経細胞でのアルツハイマー病の分子メカニズムを解明し臨床応用のシーズとなる新たな治療戦略を探索する目的で研究を継続した。平成30年度の成果概要は以下の通りである。1、平成29年度には、γセクレターゼ活性をより正確に測定する方法を確立したうえで、γセクレターゼ阻害薬とされてきた治験薬のほとんどが、γセクレターゼを阻害するのではなくAβの分泌阻害薬であることを明らかにした。本年度も第2ー3相治験で使用された分子標的薬剤が設計通りの機能を神経細胞で発揮するか検討を加えた。その結果、最近臨床治験の進んでいるBACE阻害薬については「γセクレターゼに影響を与えず」、「細胞内にAβの集積を来さない」、という設計通りの作用を発揮していることが明らかになった。この結果は現在進行中の治験薬の作用機序について詳細な検討でも何ら問題がないことを示すものである。2、CRISPR CAS法を用いたゲノム遺伝子編集技術を用いてアルツハイマー病原因遺伝子プレセニリンKO細胞を作成し、その細胞のAβ産生がどのように変化するか検討した。細胞内Aβ集積の増大、γバイプロダクトの低下、分泌Aβの低下が変異の種類によりパターンは異なるものの一貫して認められた。βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞を作成するなど遺伝子編集技術を用いて患者細胞を病原性の低い神経細胞に変化させることができないかこころみている。βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞を作成したが、現時点では患者細胞特有の性質は見つかっていない。3、病原性がないと考えられる「βAPP遺伝子を削除したiPS細胞」による「患者細胞への効果、つまり病原性Aβ42低下効果」の検討を行う予定である1、「iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、分泌Aβ測定や我々が開発した細胞内γセクレターゼ活性を正確に測定するアッセイ法を駆使しアルツハイマー病薬剤開発に応用する」については、第3相治験に使用された薬剤の作用点が当初目標と異なることを明らかにした。この手法はうまくいっており、さらに現在治験中のBACE阻害薬について検討し、これらが期待通りの効果を発揮しているという結果を得た。2、「患者iPS幹細胞に遺伝子編集を行い病原性を著しく低下させたアルツハイマー病患者神経細胞を作成することができるか検討する」については、βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞の作製に成功した。検討を進めているが、現時点では患者細胞特有の性質は見つかっていない。3、病原性が低いと考えられる「βAPP遺伝子を削除したiPS細胞」を作成した。我々はCRISPR CAS9遺伝子編集技術をiPS細胞に応用している。遺伝子編集技術を用いて患者細胞を病原性の低い神経細胞に変化させることができるようになってきたが、技術的に不十分でありさらに実験を続ける。具体的にはβAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞の作製が安定してできるように研究を続ける。そして新規作成細胞の性質の検討をさらに行う。βAPP遺伝子を削除したiPSが「アルツハイマー病モデル」細胞にどのような影響を与えるかまず検討する。さらには、iPS神経細胞の応用可能性について、認知機能改善に資するかどうかの検討に向かってできる限り近づく。iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、ヒト神経細胞でのアルツハイマー病の分子メカニズムを解明し臨床応用のシーズとなる新たな治療戦略を探索する当初研究を計画通り実施した。平成29年度の成果概要は以下の通りである。1、Aβ分泌測定・細胞内Aβ測定・我々が開発したγセクレターゼ産物を測定などを総合して、Aβ産生を行うγセクレターゼ活性をより正確に測定する方法を確立した。そして、第2ー3相治験で使用された分子標的薬剤が設計通りの機能を神経細胞で発揮するか検討した。その結果、γセクレターゼ阻害薬とされてきた薬剤は実は酵素の阻害を十分に行わず、細胞外に分泌されるAβを減らしているだけであることが明らかになった。その結果をCell Reports誌に発表した。これは、既存の不十分な見えてこなかった、今まで置き去りにされてきた薬剤の作用の問題点に明らかにする結果である。2、阪大病院で診察中の患者とその家族からから皮膚繊維芽細胞を採取し(大阪大学付属病院・倫理委員会承認番号803-3)、山中因子を導入することでiPS細胞化しそれを大脳皮質神経細胞に効率的に分化させた。また、CRISPR CAS法を用いたゲノム遺伝子編集技術を用いてアルツハイマー病原因遺伝子プレセニリンKO細胞を作成し、その細胞のAβ産生がどのように変化するか検討している。βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞を作成中である。3、マウスでの遺伝子編集技術を用いた研究は30年度以降に実施の予定である。本研究計画の柱のうち1、「iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、分泌Aβ測定や我々が開発した細胞内γセクレターゼ活性を正確に測定するアッセイ法を駆使しアルツハイマー病薬剤開発に応用する」については、第3相治験に使用された薬剤の作用点が当初目標と異なることを明らかにし所定の目標に到達した。2、「患者iPS幹細胞に遺伝子編集を行い病原性を著しく低下させたアルツハイマー病患者神経細胞を作成することができるか検討する」については、βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞の作製に取り掛かっている。

3、「病原性の低いマウスiPSを作成し、アルツハイマー病モデルマウス脳内に投与しその認知機能低下を改善できるか検討する」については、次年度以降に開始する。iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、ヒト神経細胞でのアルツハイマー病の分子メカニズムを解明し臨床応用のシーズとなる新たな治療戦略を探索する目的で研究を継続した。平成30年度の成果概要は以下の通りである。1、平成29年度には、γセクレターゼ活性をより正確に測定する方法を確立したうえで、γセクレターゼ阻害薬とされてきた治験薬のほとんどが、γセクレターゼを阻害するのではなくAβの分泌阻害薬であることを明らかにした。本年度も第2ー3相治験で使用された分子標的薬剤が設計通りの機能を神経細胞で発揮するか検討を加えた。その結果、最近臨床治験の進んでいるBACE阻害薬については「γセクレターゼに影響を与えず」、「細胞内にAβの集積を来さない」、という設計通りの作用を発揮していることが明らかになった。この結果は現在進行中の治験薬の作用機序について詳細な検討でも何ら問題がないことを示すものである。2、CRISPR CAS法を用いたゲノム遺伝子編集技術を用いてアルツハイマー病原因遺伝子プレセニリンKO細胞を作成し、その細胞のAβ産生がどのように変化するか検討した。細胞内Aβ集積の増大、γバイプロダクトの低下、分泌Aβの低下が変異の種類によりパターンは異なるものの一貫して認められた。βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞を作成するなど遺伝子編集技術を用いて患者細胞を病原性の低い神経細胞に変化させることができないかこころみている。βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞を作成したが、現時点では患者細胞特有の性質は見つかっていない。3、病原性がないと考えられる「βAPP遺伝子を削除したiPS細胞」による「患者細胞への効果、つまり病原性Aβ42低下効果」の検討を行う予定である1、「iPS幹細胞技術とCRISPR CAS9遺伝子編集技術を組み合わせ、分泌Aβ測定や我々が開発した細胞内γセクレターゼ活性を正確に測定するアッセイ法を駆使しアルツハイマー病薬剤開発に応用する」については、第3相治験に使用された薬剤の作用点が当初目標と異なることを明らかにした。この手法はうまくいっており、さらに現在治験中のBACE阻害薬について検討し、これらが期待通りの効果を発揮しているという結果を得た。2、「患者iPS幹細胞に遺伝子編集を行い病原性を著しく低下させたアルツハイマー病患者神経細胞を作成することができるか検討する」については、βAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞の作製に成功した。検討を進めているが、現時点では患者細胞特有の性質は見つかっていない。3、病原性が低いと考えられる「βAPP遺伝子を削除したiPS細胞」を作成した。・患者iPS幹細胞にβAPP遺伝子を削除し病原性を著しく低下させたアルツハイマー病患者神経細胞を作成し、神経細胞に分化させその性質について検討する。我々はCRISPR CAS9遺伝子編集技術をiPS細胞に応用している。遺伝子編集技術を用いて患者細胞を病原性の低い神経細胞に変化させることができないか検討する。具体的にはβAPP遺伝子を削除したiPS神経細胞の作製を試みる。
淡水環境におけるかび臭発生の原因解明とその発生抑制手法の開発

淡水環境で発生する異臭味の主原因物質であるかび臭物質、geosminや2-MIBを産生する原因生物の一つ放線菌を研究対象に、カビ臭物質発生に係る環境因子とその環境因子が変化した時の反応を解析した。その結果、放線菌のカビ臭産生に可視光の波長の違い、溶存酸素濃度やその変化が影響を与えることが判明した。また、浄水場生物処理施設の生物膜を用いた通年のかび臭物質分解実験から、10°C以上の水温環境下では生物膜のカビ臭物質の分解活性が温度依存的に高まること、生物膜中にはかび臭物質分解菌が常在していることが明らかとなった。本研究は、極低濃度でも人間の嗅覚で感知されるかび臭の水域での発生により国や地方自治体に膨大な除去費用を計上させたり臭い吸着による水産物の経済的損失を与えている問題を重視し、水源池や湖沼で安価にできるかび臭発生抑制法を構築することを目的に実施するものである。具体的には、(1)かび臭物質産生放線菌と藍藻類の動態とかび臭発生との関係解明、(2)放線菌のかび臭物質産生制御機構の解明、(3)(1)と(2)の知見を基礎に水源池でかび臭発生抑制手法の構築、を行うものである。H25年度は、(1)に関して霞ヶ浦を水源とする浄水場での定期サンプリングを実施し湖水他のかび臭物質濃度他の変動について調査研究を行った他、近年の霞ヶ浦でのかび臭物質産生原因生物の特定およびかび臭物質産生生物の現存量と各種環境因子との関係解析を行った。その結果、霞ヶ浦において過去6年間と同様、2月から4月にかけて高濃度のかび臭物質(ジェオスミン)が発生していたことが判明し、この時期のかび臭物質産生生物は藍藻類である可能性が極めて高いこと、2007年以降のかび臭物質濃度上昇に、湖内水質の変化が関係していることが判明した。(2)に関して、湖底にきわめて普遍的に生息するかび臭物質産生生物である放線菌群集のかび臭物質産生に関与する環境因子を検討するため、光環境条件とかび臭物質産生量との関係について指標放線菌を用いて検討した。その結果、長波長(緑赤)光よりも短波長光(青)や白色光がより低強度の光照射条件でかび臭物質産生が活性化されること、照射する光の強度が増加すると放線菌のかび臭物質産生量が増加することが判明した。光照射の条件で放線菌のかび臭物質産生能が変化することから、光の制御により湖底放線菌群集のかび臭物質産生制御できる可能性が示された。本研究は、極低濃度でも人間の嗅覚で感知されるかび臭が水域で発生していることで国や地方自治体に膨大な除去費用(数億円/年)を計上させたり、臭い吸着による水産物の経済的損失を与えている問題を重視し、水源池や湖沼で安価にできるかび臭発生抑制法を構築することを目的に実施するものである。具体的には、(1)かび臭物質産生放線菌とラン藻類の動態とかび臭発生との関係解明、(2)放線菌のかび臭物質産生制御機構の解明、(3) (1)と(2)の知見を基礎に水源池でのかび臭発生予測手法の構築、を行うものである。H26年度は(1)に関して霞ヶ浦を水源とする浄水場でのサンプリングを実施し、昨年度と同様近年の霞ヶ浦でのかび臭物質産生原因生物の特定、およびかび臭物質産生生物と各種環境因子との関係解析を継続し、H25年度と同様、2月から4月にかけてかび臭(主にジェオスミンと2MIB)が発生しており、原因生物としてラン藻類が考えられることを明らかとした。(2)に関して、昨年度に引き続き湖底に普遍的に生息するかび臭物質産生生物である放線菌のかび臭物質産生に関与する環境因子を検討するため、本年度は、光環境条件、および溶存酸素濃度条件の2つの環境因子とかび臭物質産生量との関係について、指標放線菌を用いて検討した。その結果、光照射条件に関しては、短波長(青)を含む光照射により放線菌のかび臭産生量が増加すること、光強度に放線菌のかび臭産生に対する閾値が存在している可能性があることが判明した。また、溶存酸素濃度条件に関しては、飽和濃度条件下でのモデル放線菌の増殖および培地中のかび臭物質濃度変化から、放線菌が対数増殖期にかび臭物質を産生すること、極めて低い溶存酸素濃度および嫌気環境下では増殖およびかび臭産生が行なわれないこと、中程度の濃度(24 mg O2/L)では1細胞当りのかび臭物質産生量が増加することが明らかとなった。本研究は、極低濃度でも人間の嗅覚で感知されるかび臭が水域で発生していることで国や地方自治体に膨大な除去費用(数億円/年)を計上させたり、臭い吸着による水産物の経済的損失を与えている問題を重視し、水源池や湖沼で安価にできるかび臭発生抑制手法を構築することを目的に実施するものである。具体的には(1)かび臭物質産生放線菌とラン藻類の動態とかび臭発生との関係解析、(2)放線菌のかび臭物質産生制御機構の解明、(3) (1)と(2)の知見を基礎に水源池でのかび臭発生予測手法の構築、を行うものである。

H27年度は溶存酸素濃度の変化と放線菌のかび臭産生量との関係について、培養期間中の溶存酸素濃度環境を変化させる条件を設定し、指標放線菌を用いて検討した。その結果、放線菌の増殖およびかび臭物質(geosmin)産生に対して、溶存酸素濃度の経時的な変化が影響を与ることが判明した。前培養時の好気環境条件後の1日程度の嫌気環境への暴露では、好気環境回復後に放線菌の増殖には影響が認められなかったが、細胞密度当たりのgeosmin産生量が低下していた。3日嫌気環境に暴露した後好気環境に回復させた場合、放線菌の増殖が緩慢に、すなわち対数増殖期間が長くなった他、細胞密度当たりのgeosmin産生量はさらに低下した。したがって、嫌気環境の継続期間が長くなるほど、放線菌の増殖およびgeosmin産生が低下すること、この傾向はgeosmin産生において特に顕著であることが判明した。淡水環境で発生する異臭味の主原因物質であるかび臭物質、geosminや2-MIBを産生する原因生物の一つ放線菌を研究対象に、カビ臭物質発生に係る環境因子とその環境因子が変化した時の反応を解析した。その結果、放線菌のカビ臭産生に可視光の波長の違い、溶存酸素濃度やその変化が影響を与えることが判明した。また、浄水場生物処理施設の生物膜を用いた通年のかび臭物質分解実験から、10°C以上の水温環境下では生物膜のカビ臭物質の分解活性が温度依存的に高まること、生物膜中にはかび臭物質分解菌が常在していることが明らかとなった。本研究申請の目的は、申請者らがこれまで継続的にグループで研究を実施している水源池でのかび臭物質産生生物の動態解析、かび臭物質産生と各種環境因子との関係解析、等の研究を発展させ、(1)かび臭物質産生放線菌とラン藻類の動態とかび臭発生との関係解明、(2)放線菌のかび臭物質産生制御機構の解明、(3) (1)と(2)の知見を基礎に水源池でのかび臭発生予測手法の構築、を行うものである。H26年度はH25年度に引き続き(1)および(2)の展開に資する研究を精力的に進め、研究対象である霞ヶ浦でのかび臭物質産生生物とかび臭濃度の変動に関する知見、かび臭物質産生生物である放線菌の光条件や溶存酸素濃度条件とかび臭物質産生との関係に関する新しい知見を得ることが出来た。これらの知見の集積が申請者らか最終目標とする(3)にあるかび臭発生抑制手法構築に資することは間違いなく、研究目的に掲げた内容に関して順調にその成果を蓄積できた、と判断している。27年度が最終年度であるため、記入しない。水環境生態工学研究の最終年度に当たるH27年度は特に(2)の放線菌のかび臭物質産生制御機構を解明していくことに注力し、(3)の水源池でのかび臭発生予測手法の構築を目指す。具体的には、H26年度の溶存酸素濃度と放線菌のかび臭産生との関係解析をさらに進める他、有機物の種類や濃度との関係解析にも着手する。また、これまでの研究で得られた知見を集積し(3)のかび臭発生抑制手法を提言する。本研究申請の研究目的は、申請者らがこれまで継続的にグループで研究を実施してきている水源池でのかび臭物質産生生物の動態解析、かび臭物質産生と各種環境因子との関係解析、等の研究を発展させ、(1)かび臭物質産生放線菌と藍藻類の動態とかび臭発生との関係解明、(2)放線菌のかび臭物質産生制御機構の解明、(3)(1)と(2)の知見を基礎に水源池でかび臭発生抑制手法の構築、を行うものである。H25年度は(1)および(2)の展開に資する研究を精力的に進めた結果、研究対象としている霞ヶ浦でのかび臭濃度やかび臭物質産生生物の変動、かび臭物質産生生物である放線菌の飢餓条件や光照射条件とかび臭物質産生との関係など多くの新しい知見を得ることが出来た。これらの知見の集積が、申請者らが最終目標とする(3)にあるかび臭発生抑制手法構築につながることは間違いなく、研究目的に掲げた内容に関して順調にその結果を蓄積できた、と判断している。
多発性嚢胞腎の病因解明と治療の試み

【背景】多発性嚢胞腎(polycystic kidney disease、PKD)は、腎不全に至る重篤な遺伝性腎疾患である。現在治療法がなく、遺伝子治療を含む治療法の確立が待たれている。Mitogen-activated protein kinase (MAPK)ファミリーは細胞内シグナル伝達の中心的役割を果たす酵素である。MAPKのERKは、増殖因子刺激により活性化され細胞増殖・分化を媒介する。また、p38、JNKは、ストレス、サイトカインにより刺激され、ストレス応答・細胞増殖抑制・アポトーシスを媒介する。正常ラット腎発生において、ERK、p38は胎児腎に、JNKは成熟腎に発現する。またERK、p38は、ネフロン形成、尿細管の増殖・分化に関与する。正常マウス腎の器官培養では、MEK阻害剤下において、腎重量の低下、尿管芽の狭小化、糸球体数の減少を認める。【方法】胎生15日(E15)、日齢1、7(N1、N7)、週齢8、25(8W、25W)のDBA/2-pcyマウス腎(pcy)および対照マウス腎(con)のMAPKおよび活性型MAPK発現を免疫組織染色により検討した。E14のpcyをERK活性化酵素MEK阻害剤U0126 10μM存在下、非存在下で5日間器官培養後、HE染色で嚢胞形成を検討した。【結果】pcyでは嚢胞上皮細胞におけるERK、p38の発現が増加した。対照的にJNKは、生後7日以降の正常尿細管では認められたが、嚢胞上皮細胞では認められなかった。ERK、活性型ERKは、pcyのN1以降の拡張した尿細管、嚢胞上皮細胞において強く染色された。pERKはコントロールでは認められなかったp38は、全経過においてpcyの尿細管および嚢胞上皮細胞に発現が認められた。一方コントロールではN1以降には認められなかった。ERK活性阻害下では嚢胞形成、ネフロン形成が抑制された。ERKはアポトーシスを抑制することによりネフロン形成、嚢胞形成に関与する可能性が示唆された【結語】pcy嚢胞壁ではERK、活性型ERK、p38の発現増加と、JNKの発現減少がみられた。また、ERK阻害下において嚢胞形成が抑制された。ERKは機能的に嚢胞形成に関与する。1研究の目的多発性嚢胞腎(polycystic kidney disease、PKD)は、腎不全に至る遺伝性腎疾患である。PKDにおいて種々の成長因子およびプロトオンコジーンが嚢胞形成に関与していることが報告されているが、両者を結ぶシグナル伝達に関しては何も分かっていない。MAPキナーゼ(以下MAPK)は細胞内信号伝達において重要な役割をはたす酵素である。本研究の目的はPKDにおけるMAPKの病因的意義を明らかにすることである。2研究の内容藤田保健衛生大学、高橋久英先生より供与されたPKDモデルpcyマウスの検討を行った。pcyマウスの胎児腎、新生児腎、成熟腎、を用いて、MAPKの時間的・空間的発現を明らかにした。またヒト胎児、および腎摘出術により得られたPKDにおけるMAPKの局在を免疫組織染色により検討した。3結果pcyマウスの腎嚢胞壁上皮細胞において、MAPKの中で増殖に関与するextracellular signal-regulated kinase(ERK)、増殖またはアポトーシスに関与するp38MAPK(p38)発現の増加、アポトーシスに関与するc-Jun N-terminal kinase(JNK)発現が減少した。ヒトにおいてもERK、p38の発現増加、JNKの発現減少が認められ、異なる動物種においても同様の結果を得られることを確認した。また、細胞増殖は嚢胞上皮細胞で増加、アポトーシス陽性細胞は嚢胞周囲の間質組織で増加を認めた。4考察PKDにおける嚢胞形成過程においてMAPKの発現が特異的に調節されていることが考えられた。またPKDにおけるMAPK発現は増殖、アポトーシスのマーカーと相関を示し、増殖、アポトーシスを制御していることが示唆された。今後、マウスの胎児腎の器官培養をおこない、ERK、p38の阻害剤やdominant negative、またはJNK活性型強制発現の、嚢胞形成への影響を検討する予定である。

【方法】胎生15日(E15)、日齢1、7(N1、N7)、週齢8、25(8W、25W)のDBA/2-pcyマウス腎(pcy)および対照マウス腎(con)のMAPKおよび活性型MAPK発現を免疫組織染色により検討した。E14のpcyをERK活性化酵素MEK阻害剤U0126 10μM存在下、非存在下で5日間器官培養後、HE染色で嚢胞形成を検討した。【結果】pcyでは嚢胞上皮細胞におけるERK、p38の発現が増加した。対照的にJNKは、生後7日以降の正常尿細管では認められたが、嚢胞上皮細胞では認められなかった。ERK、活性型ERKは、pcyのN1以降の拡張した尿細管、嚢胞上皮細胞において強く染色された。pERKはコントロールでは認められなかったp38は、全経過においてpcyの尿細管および嚢胞上皮細胞に発現が認められた。一方コントロールではN1以降には認められなかった。ERK活性阻害下では嚢胞形成、ネフロン形成が抑制された。ERKはアポトーシスを抑制することによりネフロン形成、嚢胞形成に関与する可能性が示唆された【結語】pcy嚢胞壁ではERK、活性型ERK、p38の発現増加と、JNKの発現減少がみられた。また、ERK阻害下において嚢胞形成が抑制された。ERKは機能的に嚢胞形成に関与する。
ホヤ胚におけるホメオボックス遺伝子の発現制御

昨年度単離したマボヤホメオボックス遺伝子(AHoxl)について、その構造をcDNAクロ-ニングにより推定した。コ-ドされるタンパク質は741残基で、そのホメオドメインはdevergeした配列を持つ。既知のものと比較した場合、ホウジョウバエH2.0のホメオドメインにのみ高い相同性(70%)を示し、他とは30ー50%の相同性しか示さない。AHoxlの発現をノザンブロットにより調べたところ、受精卵および中期尾芽胚までの初期胚においては発現のレベルは低いが、幼生期に達すると高レベルとなることが判明した。(In situハイブリダイゼ-ションによれば、変態後の幼若個体において消化管に発現が認められた。)成体においては、小腸、内柱などの消化器管および肝などの内胚葉由来の組織に高レベルの発現が認められた。この発現パタ-ンは、ショウジョウバエのH2.0のそれと類似しており、AHoxlは内胚葉の器官分化、あるいはその組織特異性の維持に働いているものと考えている(投稿準備中)。昨年度以来さらに他のホメオボックス遺伝子の探索を種々のプロ-ブを用い試みてきたが、オリゴヌクレオチドプロ-ブと3M塩化テトラメチルアンモニウムによる洗浄を用いる方法により第二のホメオボックス遺伝子を受精卵cDNAライブラリ-より単離することに成功した。この遺伝子のホメオドメインもまたdivergeした配列を持ち、約2.8kbのmRNAをコ-ドする。その発現のレベルは、受精卵、8.16細胞期をピ-クとして発生を追って次第に低下する。このような発現パタ-ンは、我々が当初ホヤを用いるのに当たり期待していたものであり、現在、細胞系譜との関連に注目しながらin situハイブリダイゼ-ションを試みている。In situハイブリダイゼ-ションについては、マボヤでは当初予想していたようには満足に働かなかったが、89年秋佐藤がJefferyの研究室より技術を習得し、徐々にではあるが結果が出せる状態になりつつある。
活性型転移因子を利用したゲノムショック育種法の開発

イネゲノムで例外的に高い転移活性を有する転移因子mPingの転移がイネゲノムに及ぼす効果を検証するため、mPing挿入によって種々の環境ストレス条件下の遺伝子発現を改変してストレス耐性獲得に繋げる技術開発を試みた。まず、銀坊主集団10,000個体をガラス室で栽培し、15日齢の幼苗に塩処理を施して耐性個体を目視で選抜した。選抜した181個体は自殖により種子増殖し次代系統を育成して同様に耐塩性系統を選抜した。その結果5系統が選抜できた。次に、耐塩性系統の葉身から抽出したDNAを用いて、次世代シーケンスにより耐塩性系統がもつmPing隣接配列を網羅的に解析した結果、5系統から2,085個の特異的なmPing挿入が検出された。検出した挿入のうち、遺伝子内または遺伝子の500bp以内の新規挿入を抽出し、29の挿入を耐性獲得と関連する候補挿入とした。候補挿入の遺伝子型と個体の耐塩性との関連を調べた結果、157のOs05g0320300上流237bpに挿入したmPing挿入が葉身の枯死率と関連していた。残り4系統は耐性と関連するmPing挿入を特定できなかった。さらに、対照区と塩処理区におけるOs05g0320300の発現量を調べた結果、157は対照区において原品種の0.4倍、塩処理区においては原品種の12.7倍の発現量を示した。また、12日齢の幼苗への塩ストレス条件下で、157の葉身の枯死率が減少した。また、地上部と根のNaイオン濃度、根のNaイオン/Kイオン比が157では低下していた。以上のことから、多様なmPing挿入が蓄積した銀坊主集団からはストレス耐性を獲得した個体を選抜できることが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1)同一のIM294個体の自殖次代に分離したVGI個体とIM294型個体を用いてmPing挿入箇所を次世代シークエンス(NGS)で特定した。この結果、復帰当代のVGI個体(R1)のmPing挿入箇所は704箇所であり、IM294型個体(R1-sib)は580箇であった。さらに、VGI個体の次代の1個体(R2)およびIM294型個体(R2-sib)では、588箇所および627箇所であった。したがって、VGI個体ではmPing転移の活性化によって却ってmPingのコピー数が減少していた。これら4個体に共通する挿入箇所は347であり、R1およびR2に特異的なmPing挿入箇所は89および101あった。IM294型個体であるR1-sibおよびR2-sibが、それぞれ146および104箇所であったことから、VGI個体におけるmPingコピー数の減少は切り出しの増加によるものと考えられた。2)高温条件下で栽培したIM294系統から生育が旺盛な個体(HAI: Heat Adaptive IM294)が分離した。HAIのRurm1座はmPing挿入が保持されていることから、復帰に伴う変異ではない。Rurm1はtRNAのチオ化修飾経路に関与しており、Rurm1が非機能型のIM294はタンパク質の翻訳異常を示す。生育温度が高い場合(30°C)、銀坊主に比べてIM294の生育が遅延するのはタンパク質翻訳効率の低下に起因すると考えられる。しかし、生育温度が低い場合(25°C)、IM294型個体の生育は銀坊主と変わらない。タンパク質翻訳効率の温度依存性は酵母でも確認されており、生育温度が低い場合には翻訳速度が低下して翻訳効率が被覆される。したがって、HAIは高温で生育させたIM294系統において高温適応性を獲得した可能性がある。易変性突然変異遺伝子Rurm1の復帰に伴う生育強勢個体(VGI個体)が分離するメカニズムの解明を容易にするために、VGI個体分離頻度に関する系統間差異を観察した。Rurm1座にmPing挿入をもつ系統(IM294)を20系統、約2000個体を栽培してVGI出現頻度を比較した結果、Rurm1からのmPing切り出しに伴う復帰型個体の出現頻度には大きな系統間差異が見出され、復帰型個体の出現頻度が高い系統がVGIが分離頻度が高くなる傾向が認められた。観察されたVGI個体に関してmPingの新規挿入数を調査した結果、通常の復帰型個体に比べてmPing転移頻度が著しく高いことが判明した。このことは、VGI個体出現時にはmPingの転移活性が一時的に著しく高くなることを示している。したがって、VGI個体においてはmPing転移を誘導する自律因子活性PingおよびPongの挙動の解析に重要と考えられた。イネトランスポゾンmPingは近傍遺伝子に塩および低温応答性を付与することが明らかになっている。このことから、塩および低温応答性の転写因子がmPing上のシス因子を結合し、下流にある遺伝子の発現を促進していると考えられる。本年度も昨年度に引き続き、銀坊主をストレス条件下で栽培してストレス耐性個体を選抜してストレス応答性に優れた個体を選抜した。このために、乾燥ストレス圃場で栽培した銀坊主の後代系統を乾燥ストレス条件下および通常条件下で栽培して種子稔性に関して調査した。

乾燥ストレス条件下で高い種子稔性を示す系統が認められたが、ストレス圃場での水分制御が均一でなかったことから、再評価が必要と考えられた。昨年度、高温ストレス条件下で旺盛な生育を示す個体がIM294系統が分離できた。この系統より分離する復帰型個体を得て高温耐性に関する調査を行う目的で、個体の自殖後代を栽培した。しかし、供試個体数が少なかったため、高温耐性IM294系統から復帰型個体を見出すことはできなかった。当初の交付申請書に記載した研究計画では、VGI個体について、草丈、穂数、穂長、粒形など、バイオマスの大型化に直結する個々の形質に関する遺伝解析を主眼においていた。これは、生育強勢個体分離には転移が活性化されたmPingによるゲノム改変に関与すると考えたためである。しかし、生育強勢は復帰初期世代が最も強く現われ、世代が進むにつれてバイオマスに認められる生育強勢は認められなくなった。このため、次年度よりVGI個体の分離当代での解析を重点的に実施することとした。本年度はVGI個体の特性調査に必要な系統を確保するとともに、ストレス条件下で2ヵ年に亘って栽培した銀坊主のストレス耐性獲得系統を評価することができた。細粒突然変異系統の自殖後代に分離する復帰型個体において、生育強勢個体が認められる遺伝的機構を明らかにするため、生育強勢個体の次代に分離したバイオマス生産性の高い個体と日本晴との交雑後代を用いた。生育強勢関連形質に関してmPing-SCARマーカー(mPing挿入多型)を利用した予備的解析を実施した。その結果、粒重、粒大、二次枝梗数に関して新たなQTL遺伝子座が見出された。また、複数の復帰突然変異個体から数世代自殖を重ねて育成した系統群(1系統群が1復帰突然変異個体由来)を供試して、農業形質の分離を観察した。明瞭な形質分離に観察された系統群に関しては、形質分離と連関するmPing挿入を特定する。mPingの遺伝子上流部位への挿入が下流遺伝子のストレス応答性に及す効果を明らかにするため、mPing挿入を遺伝子上流にもつ遺伝子をライブラリーから探索した。複数個の遺伝子座について上流へのmPing挿入によるストレス応答性の変化を観察したが、mPing挿入が遺伝子のストレス応答性を大きく改変する事例は多くはなかった。さらに、複数系統の細粒突然変異系統IM294を供試して復帰突然変異頻度ならびに生育強勢個体分離頻度に関する系統間差異を観察した。この結果、復帰型個体の中から生育強勢個体が一定の割合で分離する訳ではなく、復帰頻度と生育強個体分離頻度との間には一定の関係は認められなかった。したがって、生育強勢個体の出現のきっかけは復帰突然変異であるが、生育強勢が分離するためには一定の条件が必要と推察された。生育強勢個体の解析に関しては、供試材料の育成および観察は予定通り進行している。生育初期において復帰型個体および復帰に伴って生育強勢を示す個体は概して細粒突然変異個体に比べて生育速度が早い。しかし、幼苗期における両者の差異は小さく生育強勢個体を区別することができない。両者の差異が顕著になるのは出穂開花期以降であるが、生育初期において生育強勢個体を特定できればバイオマス生産が向上に特徴的な遺伝子発現を継続的に観察・解析できる。現在、生育初期段階で生育強勢個体を識別する方法を検討している。また、mPing挿入により下流の遺伝子発現のストレス応答性の改変をストレス耐性育種に繋げるためには、遺伝子毎にmPing挿入位置との関連の詳細な調査が必要と考えられた。
自己免疫性肝炎の肝細胞障害機序:類洞壁内皮細胞障害とその病態生理的意義

自己免疫性肝炎における肝細胞障害機序について従来より肝細胞膜抗体の出現を基盤にした抗体依存性細胞介在性細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)が関与していると考えられてきた。われわれはラット肝類洞壁内皮細泡を用いて肝類洞璧内皮細胞に対するIgGクラスの抗体を種々の慢性肝疾患患者について検索した。その結果、B型慢性肝炎、C型慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変患者における本抗体陽性率はそれぞれ7.9、5.9、13.0%に過ぎないのに対し、自己免疫性肝炎患者の97.1%と高率に本抗体が検出された。また、本抗体が肝類洞壁内皮細胞に対して障害作用を示すことを明らかにし、自己免疫性肝炎では、ADCCのみならず肝類洞壁内皮細胞障害に基づく循環障害も肝細胞障害の発現に関わっている可能性を示した。患者血清由来のF(ab')_2をウシ頸動脈内皮細胞で吸収するとラット類洞内皮細胞との反応性は消失したが、ラット肝細胞、ラット由来の培養細胞株dRLh84による吸収では消失しなかった。したがって、本抗体は内皮細胞特異的エピトープを認識していると推測された。ヒト肝類洞璧内皮細胞、ヒト臍帯血管内皮細胞を用いた検索でも内皮細胞抗体が自己免疫性肝炎患者血清中に存在することを示した。また、私達は自己免疫性肝炎患者血清中にはスルファチド抗体が高率に、また、自己免疫性肝炎特異的に出現することを報告してきたが、本抗体がヘパリンと強い交叉反応性を示すことを明らかにした。このことは内皮細胞抗体の標的抗原が内皮細胞表面に存在するヘパリンである可能性を示している。自己免疫性肝炎における肝細胞障害機序について、類洞内皮細胞抗体のみならず、肝細胞膜抗体の面からアプローチした。類洞内皮細胞はKnookらの方法に従いラット肝より分離した後、18時間培養後、グルタルアルデヒドで固定した。1/250希釈血清をこれに加え、結合したIgGをペロキシダーゼ標識プロテインAを用いて定量した。その結果、自己免疫性肝炎患者の97.1%に正常者の平均OD値+3SDを越えるIgG結合がみられ、抗体陽性と判定した。一方、慢性B型、C型肝炎、原発性胆汁性肝硬変患者での陽性率はそれぞれ7.9、5.9、13%であり、本抗体は自己免疫性肝炎に特異的な抗体であることが明らかとなった。また、本抗体の内皮細胞障害作用については患者血清IgG存在下で、内皮細胞を培養後、プレートに接着した細胞数を算定することより行った。その結果、自己免疫性肝炎患者血清IgG存在下では正常血清IgGと比較して60%の生着率であったのに対し、ウイルス性慢性肝炎患者の血清IgGの存在下では正常血清IgGの存在下と比較して生着率の差はみられなかった。すなわち、自己免疫性肝炎患者のIgGは細胞障害作用を有することが明らかとなった。また、肝細胞膜抗体の検索についてはHepG2細胞より分離したアシアロ糖蛋白に対する抗体をELISA法を用いて検索した。その結果、自己免疫性肝炎では90%の陽性率であったのに対し、他の肝疾患者ではいずれも10%以下の陽性率であった。今後、自己免疫性肝炎の肝細胞障害機序については、この二つの面からアプローチする計画である。ラット肝よりKnnokらの方法に準じて類洞内皮細胞を分離し、18時間培養後、グルタルアルデヒド固定し、類洞内皮細胞抗体の検出に用いた。抗体検出はRosenbaumらの方法に従い、ELISA法により行なった。すなわち、血清は250倍希釈後、上記処理類洞内皮細胞とインキュベートし、結合した抗体はperoxidase標識プロテインAを用いて検出した。