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RNAアナログによる病原性大腸菌産生ベロ毒素阻害剤の開発

さらに、環状アデノシンアナログのうちでは、2'-OMeアデノシンを組み込んだものが最も強く毒素に結合し、その解離定数は9.6x10^<-6>Mであった。28SrRNAアナログの最適構造を探索するために、べロ毒素を同様の作用機構を持つ植物由来細胞毒素PAPを用いてGAGAテトラループ構造を合成し、毒素阻害能を測定した。その結果、やはり、PAP阻害にはGAGAテトラループ構造の形成が不可欠であること、ループ部分の配列は阻害活性にほとんど影響しないことが分かった。以上の結果より、GAGAテトラループ構造を有するヘアピンループ構造がPAP阻害に対して必要条件であることが分かったので、ステム部分を安定な塩基対であるGCとし、その長さの最適化を計を計るため、PAPを用いたRNA分解反応における速度論的なパラメータを測定した。測定では、反応の結果遊離するアデニンをクロロアセトアルデヒドとの反応で蛍光性のエテノアデニンへと変換し、HPLCを用いて蛍光検出することにより定量した。その結果、56塩基対のステム部分を持つRNAアナログののk_<cat>/Kmの値が最も大きく、阻害剤の構造として適していることが示された。以上の結果をもとに、15量体ステムループ構造を有するリン酸部分とリボース部分を化学修飾したデオキシリボース体、チオリン酸エステル体、2'-OMe体、の3種のアナログについて同じく速度論パラメータを測定した。その結果、デオキシリボース体、チオリン酸エステル体や2'-OMe体でも、毒素への取り込みNグリコシル化が起こることが示された。また、チオリン酸エステル体では分解が非常に遅いこと、また、RNAに近い構造を取ると予想される2'-OMe体では取り込みの親和性が低いことなどが分かった。一方、デオキシリボース体は毒素への親和性が高く、阻害剤の構造としてはむしろ適していることが示された。これらの誘導体についてはリボソーム存在下でのPAP阻害定数Kiを測定した。その結果、デオキシリボース体の阻害定数が最も小さく、最も低い濃度で阻害効果を発揮することが示された。ベロ毒素の作用機構に基づき、その阻害剤として期待される28SrRNA中のGAGAテトラループ構造を含む化学修飾RNAを合成し,阻害剤および検出プローブとしての評価を行った。この化学修飾RNA中のベロ毒素作用部位である4324番目に当たるアデニン部位には酸触媒条件下でも脱プリン反応をおこさないアデノシンアナログを導入した。構造を最適化した結果得られた16量体ステムループ構造を有するリン酸部分とリボース部分を化学修飾したDNA体、チオ-DNA体、2'-OMe体の3種のアナログについて速度論パラメータを測定した。その結果、DNA体、チオ-DNA体や2'-OMe体でも毒素への取り込み,N-グリコシル化が起こることが示された。また、チオ-DNAでは分解が非常に遅いこと、RNAに近い構造を取ると予想される2'OMe体では取り込みの親和性が低いことなどが分かった。一方、DNA体は毒素への親和性が高く、阻害剤の構造としてはむしろ適していることが示された。さらに,これらの誘導体についてはリボソーム存在下でのPAP阻害定数Kiを測定した。その結果、DNA体の阻害定数が最も小さく、最も低い濃度で阻害効果を発揮することが示された。
アクティブ流動系における同期現象と協同的ダイナミクスの理論

本研究課題では流体力学的相互作用による繊毛や鞭毛の集団運動について数理モデルを構築し、次の結果を得た。繊毛の剛体回転子モデルを構築し、繊毛のペアおよび1次元、2次元配列におけるダイナミクスを解析した。繊毛の駆動力のパターン、基盤からの距離、軌道の形状や傾き、繊毛の柔軟性に依存して、多様な同期状態、進行波パターンが生じることを示した。またバクテリアカーペットにおける多数の鞭毛による協同的輸送現象を数値的に解析した。また一般的な長距離相互作用による集団同期転移の特性を場の理論的手法により明らかにした。繊毛の流体力学相互作用のモデルとして前年度までに構築した剛体球回転子のモデルについて、2体の回転子の非線形ダイナミクスを詳細に解析した。回転子の位相差が従う有効ポテンシャルについて次の結果が得られた。(1)軌道の形状の効果:直線軌道については線形解析で予想できなかった同期状態が見つかった。楕円軌道については双安定型のポテンシャルを持つ場合がある。(2)回転子間の距離や平面基盤からの高さの効果:回転子間の距離が近い場合はポテンシャル形状が軌道の傾きに強く依存する。これらの結果は、繊毛集団の協同的なダイナミクスが、個々の繊毛の運動パターンの詳細に強く依存することを意味する。また、(3)2つの回転子が作り出す流れの流量およびエネルギー散逸率を解析した。円軌道の場合、これらはいずれも流体相互作用によって増大する一方、回転の周期は流体相互作用によって短くなる。このことは、繊毛が集団運動を制御するためにエネルギー効率を犠牲にしている可能性を示唆する。さらに我々は(4)繊毛の柔軟性の効果を検討するため上記の回転子にバネを取り付けたモデルを考案、解析した。その結果、柔軟性の効果で位相遅れが生じることが分かった。またバクテリアカーペットのモデルについては、前年度までに構築したモデルをGPGPU並列計算機環境に移植し、3次元流速場の構造およびその中に置かれたトレーサー粒子の拡散を解析した。その結果、渦状の流れに捕捉されたトレーサー粒子が基盤に対して垂直方向に輸送されることが判明した。一般の長距離結合振動子系については、自己無撞着場理論の2ループ近似での解析を実行し、秩序変数および空間相関関数を計算した。その結果、摂動パラメータ(相互作用のべき指数と空間次元の差)がより大きい所まで理論の適用可能性を広げることができた。最終年度は、繊毛の多体系(1次元および2次元配列)の集団ダイナミクスについて、前年度までに構築した剛体回転子モデルを用いて数値解析を進めた。その結果、円軌道を描く回転子について、自己駆動トルクの周期パターン(1次および2次のフーリエ成分の振幅と位相)、平面基盤に対する軌道の傾き、回転子間の距離をパラメータとして変えて、繊毛の配列が描く時空パターンの動的相図を描くことができた。時空パターンのうちメタクロナル波(進行波)については、駆動トルクが最大になるときの繊毛の運動方向と進行方向が平行になるシンプレクティック波と、反平行になるアンチプレクティック波を再現することができた。更にこれらの波が共存する状態や、波面がジグザグになる状態、乱流状態の合わせて5つの時空パターンを同定した。一方、2本の繊毛の相互作用については、海外の複数の実験グループから、クラミドモナスおよび光駆動コロイドを用いた検証方法が提示されたため、実験との比較のため追加的な数値計算を行なった。これらの結果により、繊毛の集団ダイナミクス、特に進行波パターンの理解が進展し、実験系との定量的比較の可能性が視野に入る所まで来た。現在これらの結果を3報の論文にまとめている所である。研究実施計画に従って、繊毛のモデル及びバクテリアカーペット(鞭毛多体系)のモデルを構築した。繊毛については、周期的に変動する剛体球回転子の直線的(1次元的)配列および平面的(2次元的)配列における動的パターンを、理論解析および数値計算によって調べた。理論解析においては、駆動力の変動振幅について1次までの近似において、進行波パターンの安定性条件を求めることができた。また駆動力の変動が大きい場合の動的パターンを数値シミュレーションによって求めた。その結果、直線的配列においては進行波が存在することが示されたが、平面的配列においては進行波のみならず秩序的なパターンは見られず、一見ランダムだが異方的な方向相関を持つ動的定常状態に陥ることが示された。ゾウリムシに見られるような繊毛の平面的配列における進行波を再現するため、モデルを拡張する必要性を現在検討している。バクテリアカーペットについては、個々の鞭毛の基盤への固着による回転自由度の制限を現象論的なランダム場としてモデルに導入した。さらに、実験系で見られている鞭毛のからみ合いを表現するため、近接引力相互作用をモデルに導入した。このモデルを用いた数値シミュレーションの結果、渦状の流れが散在する空間パターンが得られた。

これは実験系で見られる空間パターンに定性的に類似しているが、より詳細な比較検討を進めている。また長距離流体力学相互作用の数値計算を高速化するため、汎用画像処理プロセッサを用いた並列計算(GPGPU)環境を構築した。GPGPU専用ワークステーションを導入し、一般的な並列計算プログラムの作成方法を習得した。繊毛のモデルについては、多体系が示す進行波パターンの再現、理解にまでは至らなかったものの、実際の繊毛が持つ多様な性質を取り入れてモデルを拡張し、2体系のダイナミクスを詳細に調べることができた。モデル及び解析手法がほぼ完成したため、2体系から多体系への進展は容易であると考えている。バクテリアカーペットについては、3次元流速場を構成して輸送現象を調べられたことは当初計画にない進展であった。一般の長距離結合振動子系については、理論的解析は当初計画通りに進展している一方、数値的解析はまだ十分には行えていない。繊毛のモデルにおいては、理論解析、数値計算ともおおむね当初計画通りに進んでいる。ただ、平面的配列において進行波、ラセン波などの秩序パターンが見られなかったことは予想外の結果であり、ゾウリムシのメタクローナル波の再現に向けて、さらにモデルを拡張する必要があると思われる。バクテリアカーペット(鞭毛多体系)については、モデル構築、数値計算とも当初計画通りに進んでいる。数値計算については、当初計画にあったワークステーション本体に加え、画像処理プロセッサを前倒しで購入したため、実機を用いてGPGPU専用並列計算プログラムの作成方法を習得することができた。繊毛系については、既に構築したモデルを用い、1次元配列、2次元配列などの多体系におけるダイナミクス、特に進行波(メタクロナル波)の発生条件や性質を明らかにする。バクテリアカーペットについては、流速場の統計的解析を進め、低レイノルズ数における乱流的輸送としての特徴を抽出する。一般の長距離結合振動子系については数値解析を進めて理論的結果との比較、検討を行う。またこれらの結果について研究成果発表を順次進める予定である。繊毛のモデルについては、平面的配列における進行波の再現、動的相図の作成を目指して、現在のミニマルモデルを拡張する。具体的には、繊毛の弾性変形による流体駆動の効果を、剛体にアクティブポンプを付加することで表現する。バクテリアカーペットについては、鞭毛の排除体積効果を取り入れて、液晶相転移(方向秩序の形成)が起きる可能性を検討する。さらに排除体積効果と流体相互作用、からみあい効果の競合によって、実験で見られる複雑な空間パターンを説明、再現する。また、多体系の数理的解析の基礎となる、長距離(べき乗型)相互作用を持つ結合振動子系の一般理論を展開する。既に応募者が開発した摂動論的方法を用いて、空間相関の解析を摂動の2次まで進める。さらにこの結合振動子の1次元格子および2次元格子について数値計算を行い、理論予測と比較する。数値計算においては、以上のそれぞれの系についてGPGPU専用並列計算プログラムを作成し、従来より高速かつ大規模な計算を行う。
認知症高齢者における時間認知とその障害に関わる神経基盤

アルツハイマー病(AD)と前頭側頭型変性症(FTLD)では、初期の臨床症状として時間認知の障害に関連した症状が特徴的に生じることが知られている。しかしAD、FTLDの時間認知に関する研究は数少ない。本研究では、AD例、FTLD例、および健常高齢者の時間認知能力とその能力に関連する神経基盤を比較検討し、1正常加齢と病的加齢の違い、2AD例とFTLD例の違い、を明らかにすることで、最終的には時間認知障害の背景にある認知的・神経学的基盤の解明を目指す。
周囲の環境に応じた感染細胞の運命決定機構の解明

本研究は、感染細胞の外(周囲の環境)に主眼をおき、感染細胞自身ではなく、その周囲の環境も潜伏感染の成立・維持に寄与するという新たな原理とその分子基盤の解明を目指す。全人口の90%以上が感染しているEpstein-Barrウイルスを主な研究対象として、周囲の環境が感染細胞の運命決定(潜伏感染を継続するか溶解感染へ移行するかなど)に、どのような影響を及ぼすかを解析する。EBVは、感染者の一部に腫瘍を引き起こすが、ほとんどは不顕性感染状態である。病原性と非病原性が同居するウイルスであり、本研究は従来のウイルス学とネオウイルス学の2つのウイルス学の発展と理解に貢献する。
老年期クローン病患者の療養生活の実際および看護実践開発に向けた基礎的研究

平成30年度は以下の3点を実施した。1老年期クローン病患者の経験およびニーズを明確にすることを目的に、6名の患者にインタビューを実施した(平成29年度に2名実施しており、計8名となる)。分析方法は逐語録を作成した後、コード化し、個人毎にサブカテゴリーを抽出し、関係性を図式化した後、全対象者で類似性、相違点を比較しカテゴリーを抽出した。分析の結果、インタビューの時点で対象者は加齢による影響によりADLやセルフマネジメントに支障をきたしていなかった。しかし、今後年齢を重ねることで下肢の衰えや認知機能の低下が生じ療養に影響をきすと予期しており、すでに対策をとっていた。21について3名の老年期クローン病患者のデータを基にして、「老年期クローン病患者のニーズの明確化(第1報)」として研究結果をまとめ、平成30年11月に開催された第9回日本炎症性腸疾患学会学術集会において発表した。3看護師が捉える老年期のクローン病患者に対するケアの課題を明らかにすることを目的に、看護師5名を対象にインタビューを実施した。分析は1の方法に準じて実施した。結果、看護師は老年期患者について、加齢や長期罹患がセルフケアに影響しやすいことを捉えており、セルフモニタリングの低下や症状を正確に伝達できないことをケアの課題として認識していた。老年期クローン病患者の特徴を踏まえた問診と客観的な観察を重視したフィジカルアセスメントや家族を含めたセルフケア支援の重要性が明らかになった。平成29年度より難渋していた老年期患者の家族については平成30年度も対象者の選定ができず、インタビューは実施できなかった。その理由として、インタビューを実施した患者はすべて一人での通院であり、家族は同行しておらず協力を依頼できなかった。この対策として、炎症性腸疾患(以下、IBDとする)の患者会の全国組織であるIBDネットワークに協力を依頼し、患者・家族について研究協力の応募(会報誌に掲載)を試みたが、応募はなかった。更に九州地区の患者会に紹介も依頼をしたが、患者会に入会する65歳以上のクローン病患者およびその家族がおらず、想定以上に家族の対象者選定は困難を極めた。以上を踏まえ、研究実施計画および体制を見直し、家族へのインタビューは中止し、老年期クローン病患者のニーズを明確にすることを本研究の主眼にすることにした。よって、クローン病患者の対象者数を増やし8名にインタビューを実施することにした。医師に対するインタビュー、フィールドワークについても実施できなかった。理由として、研究協力病院の診療体制の変更と当初依頼をしていた医師の異動があったこと、老年期患者来院時に研究者がタイミングを合わせてフィールドに入ることに困難を極めスケジュール調整ができなかった。以上を踏まえ、以下のとおり研究実施計画および体制を見直した。1看護師のインタビュー対象者の人数を予定より増やし5名に行うことにした。2幅広い知見を得るため、平成31年度(令和元年)に九州に限定せず全国のIBD専門病院で多くのクローン病患者に対しケアを実践している看護師を召喚し、「老年期クローン病患者に対する看護の方向性(看護指針)」を検討する会を実施する。最終年度となる平成31年度(令和元年)は、以下の4点を実施する。1インタビューで明らかになった「老年期クローン病患者のニーズ」と「老年期クローン病患者のケアの課題」について比較検討し、「老年期の特徴をふまえたクローン病患者に対する看護」を明確にする。21の結果を基にして、全国のIBD専門病院で多くのクローン病患者に対しケアを実践している看護師を召喚し、令和元年6月に「老年期クローン病患者に対する看護の方向性(看護指針)」についての検討会を実施する。3以下の3学会で研究結果を発表する。1)第45回日本看護研究学会(令和元年8月開催)「老年期クローン病患者のニーズの明確化(第2報)加齢による影響、心理的変化、ニーズに焦点をあてた分析」、2)第24回日本難病看護学会(令和元年8月開催)「老年期クローン病患者に対するケアの課題の明確化」、3)第10回日本炎症性腸疾患学会(令和元年10月開催)「老年期クローン病患者に対する看護実践の検討老年期の特徴を踏まえた支援」。共に、質疑応答でのディスカッションを受け、分析結果の修正、研究結果および考察の参考にして論文としてまとめる。413をまとめ、実際の臨床現場で活用できる報告書を作成し、研究協力病院をはじめとした全国のIBDの専門病院に配布する。本研究の目的は、老年期クローン病患者の療養生活における経験とニーズ、ケアの課題を明らかにし、看護指針を明確にすることである。平成29年度は以下の4点を中心に実施した。1文献検討および炎症性腸疾患や老年慢性疾患の看護に関連する学会や研修会に参加し、老年期の発達段階と加齢による影響を踏まえたケアの特徴と課題を明らかにした。2研究者が所属する大学および研究協力病院の研究倫理審査を受け、研究実施の承認を得た。本研究は患者および医療者の両側面からアプローチするため、「1.老年期クローン病患者とその家族のニーズの明確化」、「2.老年期クローン病患者に対するケアの課題の明確化」に分けて倫理審査を受け、承認を得ている。3研究協力施設の研究協力者に研究概要の説明と対象者の選定およびフィールド調整を依頼し、4施設より紹介を受けた2名の老年期患者に対するインタビューを実施した。

年齢を重ね変化したこと、それに対処していること、看護医療や社会に期待する支援についてインタビューすることで、加齢による影響や工夫している療養の実際、期待する具体的な支援内容を明らかにすることができると考えた。現在インタビューデータをコード化、カテゴリー化する質的記述的分析を進めている。老年期患者に対するインタビューの実施では、療養生活の実際や心理的側面について明らかにできつつあり、老年期患者特有のニーズについて今後明確化していく予定である。倫理審査について、「1.老年期クローン病患者とその家族のニーズの明確化」、「2.老年期クローン病患者に対するケアの課題の明確化」の2つを研究者所属大学および研究協力病院の2機関での承認を得る必要があったため時間を要した。老年期患者およびその家族の研究対象者の選定は想定以上に難渋しており、予定していた人数には及ばず、患者2名のインタビューの実施であった。家族については病院の受診に同行していないことが多く、研究協力の依頼ができていない。また、看護師、医師のインタビューについては、研究実施計画を修正した。その理由は、患者および家族のインタビューをまとめた後に実施した方が、老年期に焦点をあてたケアの課題の明確化が検討できると考えたためである。フィールドワークについても未実施の状況であることから、やや遅れているとした。平成30年度は以下の3点を実施した。1老年期クローン病患者の経験およびニーズを明確にすることを目的に、6名の患者にインタビューを実施した(平成29年度に2名実施しており、計8名となる)。分析方法は逐語録を作成した後、コード化し、個人毎にサブカテゴリーを抽出し、関係性を図式化した後、全対象者で類似性、相違点を比較しカテゴリーを抽出した。分析の結果、インタビューの時点で対象者は加齢による影響によりADLやセルフマネジメントに支障をきたしていなかった。しかし、今後年齢を重ねることで下肢の衰えや認知機能の低下が生じ療養に影響をきすと予期しており、すでに対策をとっていた。21について3名の老年期クローン病患者のデータを基にして、「老年期クローン病患者のニーズの明確化(第1報)」として研究結果をまとめ、平成30年11月に開催された第9回日本炎症性腸疾患学会学術集会において発表した。3看護師が捉える老年期のクローン病患者に対するケアの課題を明らかにすることを目的に、看護師5名を対象にインタビューを実施した。分析は1の方法に準じて実施した。結果、看護師は老年期患者について、加齢や長期罹患がセルフケアに影響しやすいことを捉えており、セルフモニタリングの低下や症状を正確に伝達できないことをケアの課題として認識していた。老年期クローン病患者の特徴を踏まえた問診と客観的な観察を重視したフィジカルアセスメントや家族を含めたセルフケア支援の重要性が明らかになった。平成29年度より難渋していた老年期患者の家族については平成30年度も対象者の選定ができず、インタビューは実施できなかった。その理由として、インタビューを実施した患者はすべて一人での通院であり、家族は同行しておらず協力を依頼できなかった。この対策として、炎症性腸疾患(以下、IBDとする)の患者会の全国組織であるIBDネットワークに協力を依頼し、患者・家族について研究協力の応募(会報誌に掲載)を試みたが、応募はなかった。
植物由来低分子ポリフェノールの骨代謝改善作用

齲蝕や歯周病の予防には、機械的なプラークコントロールの他、洗口剤や歯磨剤への殺菌薬や消毒薬およびフッ素などの添加がおこなわれている。しかしながら、これらの添加剤の十分な効果は不明である。また、抗菌性の高い薬剤はアレルギーや強い刺激があるなど、生体への侵襲性も強く日常的な使用に適さない。一方、植物に含まれるポリフェノールは、抗酸化作用・抗ウィルス作用・抗菌作用および抗腫瘍増殖作用などが知られているが、その効果や作用機序についての詳細は解明されていない。万葉集にも登場する日本古来の食物であるマコモダケ由来のポリフェノールの効果を検討した。マコモダケの粉末化を行い、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデル動物(マウス)にマコモダケ粉末を内服させる実験を行った。その結果、マコモダケ成分の投与は、ぶどう膜炎の炎症度を軽くすることを明らかにした。ポリフェノールは、ほとんどの植物に色素として含まれている苦味や渋みの成分であり、5000種類以上存在するとも言われている。赤ワインに含まれているポリフェノールが心臓疾患発症率を低下させるという結果やお茶に含まれるカテニンの殺菌作用・コレステロール低下作用は良く知られている。マコモダケの中にも、各種ポリフェノールが含まれている可能性が十分ある。また、リポ多糖(LPS)によって促進されるマウスマクロファージにおける炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-1β)産生を、マコモダケ抽出成分が抑制するとする実験結果が得られた。本実験の結果から、マコモタケを経口摂取することで細菌成分が引き起こす眼内の炎症発症を抑制する可能性が示された。マコモタケおよびその抽出成分は眼内炎をはじめとした炎症性疾患の発生防止、症状の緩和に有効な栄養補助食品、薬剤としての利用が期待できる。マコモ(Zizania latifolia)は、東・東南アジアに分布するイネ科の水生植物である。黒穂菌の一種であるUstilago esculentaに寄生され変成したマコモの新芽をマコモタケと呼び、古来より日本や中国で食用に利用されてきた。近年、マコモタケを肌の美白や、歯の漂白作用を期待する民間レベルでの利用、商品開発も行われている。また、マコモタケ成分には抗肥満症、抗酸化、抗炎症作用およびアレルギー抑制作用があることも報告されている。そこで、今回我々はこのマコモタケ成分の抗炎症作用に着目し、ぶどう膜炎に対する抗炎症作用にについて検討した。ベーチェット病のぶどう膜炎モデルともされるエンドトキシン誘発性ぶどう膜炎(endotoxin-induced uveitis: EIU)を用いた。LPS投与から24時間後、対照群、マコモタケ懸濁液内服群ともに、眼球に充血などの臨床所見は確認できなかった。しかし、ヘマトキシリン・エオジン染色による眼球の組織像では対照群の前房、硝子体中に好中球が浸潤しているのが認められた。一方、マコモタケ懸濁液内服群では前房、硝子体内部における好中球浸潤はほとんど認められず、眼内の炎症性反応が有意に抑制された。さらに、LPSによって誘導される単球・マクロファージ系細胞の炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β産生促進に対するマコモタケ抽出液の効果について検討を行った。LPS存在下での培養は,骨髄マクロファージのTNF-α産生を誘導し、マコモタケタノール抽出成分はそれを濃度依存的に抑制した。また、LPSによるIL-1β産生誘導に対し、マコモタケタノール抽出成分は低濃度では抑制効果を示さなかったが、高濃度で有意に抑制した。ベーチェット病のぶどう膜炎モデルにおいて、マコモタケ懸濁液内服群では前房、硝子体内部における好中球浸潤はほとんど認められず、眼内の炎症性反応が有意に抑制されることがわかった。破骨細胞の分化と骨吸収機能の分子機構の解明により、RANKL中和抗体などの新たな骨吸収抑制剤が開発され、骨粗鬆症や関節リウマチをはじめとする代謝性骨疾患治療薬の地図が塗り替えられようとしている現在、骨吸収と共役して骨形成を促進する薬剤の開発が望まれている。従来から骨粗鬆症の治療方法として女性ホルモンであるエストロゲンの補充療法が行われてきたが、副作用他があるため使用には制限がある。そこで注目されたのが、エストロゲン様構造を有する大豆などに多く含まれるイソフラボンである。しかしながら、イソフラボン系薬剤には骨粗鬆症患者の骨折予防効果は認められない。そこで本研究では、イネ科植物マコモダケ抽出成分に注目した。マコモダケは食物繊維・ビタミン・ミネラルが豊富であり、健康食品としても有用である。我々は、長野県で栽培しているマコモダケの粉末化を行い、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデル動物(マウス)にマコモダケ粉末を内服させる実験を行った。リポ多糖(LPS)によって促進されるマウスマクロファージにおける炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-1β)

産生を、マコモダケ抽出成分が抑制するとする実験結果が得られた。リポ多糖(LPS)によって促進されるマウスマクロファージにおける炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-1β)産生を、マコモダケ抽出成分が抑制するとする実験結果が得られた。齲蝕や歯周病の予防には、機械的なプラークコントロールの他、洗口剤や歯磨剤への殺菌薬や消毒薬およびフッ素などの添加がおこなわれている。しかしながら、これらの添加剤の十分な効果は不明である。また、抗菌性の高い薬剤はアレルギーや強い刺激があるなど、生体への侵襲性も強く日常的な使用に適さない。一方、植物に含まれるポリフェノールは、抗酸化作用・抗ウィルス作用・抗菌作用および抗腫瘍増殖作用などが知られているが、その効果や作用機序についての詳細は解明されていない。万葉集にも登場する日本古来の食物であるマコモダケ由来のポリフェノールの効果を検討した。マコモダケの粉末化を行い、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデル動物(マウス)にマコモダケ粉末を内服させる実験を行った。その結果、マコモダケ成分の投与は、ぶどう膜炎の炎症度を軽くすることを明らかにした。ポリフェノールは、ほとんどの植物に色素として含まれている苦味や渋みの成分であり、5000種類以上存在するとも言われている。赤ワインに含まれているポリフェノールが心臓疾患発症率を低下させるという結果やお茶に含まれるカテニンの殺菌作用・コレステロール低下作用は良く知られている。マコモダケの中にも、各種ポリフェノールが含まれている可能性が十分ある。また、リポ多糖(LPS)によって促進されるマウスマクロファージにおける炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-1β)産生を、マコモダケ抽出成分が抑制するとする実験結果が得られた。本実験の結果から、マコモタケを経口摂取することで細菌成分が引き起こす眼内の炎症発症を抑制する可能性が示された。マコモタケおよびその抽出成分は眼内炎をはじめとした炎症性疾患の発生防止、症状の緩和に有効な栄養補助食品、薬剤としての利用が期待できる。カンジダ菌増殖抑制作用の検討のほか、骨粗鬆症モデルマウスの実験系を用いて、各種植物成分の歯周病や骨粗鬆症などの骨代謝疾患に対する臨床応用の可能性の手掛かりを探す。歯槽骨吸収モデルマウスを用いた骨形成促進機構の解析OPG欠損マウスは全身性の骨吸収の亢進と共に骨形成の促進が共役して認められるモデルである。このマウスを用いて、我々は、新規かつ簡便な歯槽骨吸収解析モデルを作製することに成功した。そこで、低分子ポリフェノールおよびマコモダケ粉末エタノール抽出成分の歯槽骨吸収改善効果について、マイクロCTを用いた形態学的な解析を実施する。骨粗鬆症モデルマウスの購入が遅れたため。(理由)歯槽骨吸収モデルマウスを用いた骨形成促進機構の解析実験が遅延したため。(使用計画)上記実験を早急に開始する予定である。カンジダ菌増殖抑制作用の実験と骨粗鬆症モデルマウスの実験に使用する予定である。
非貫通ひび割れの発生した鉄筋コンクリート部材の透水性に関する研究

本研究は、鉄筋コンクリート部材の非貫通ひび割れ(引張側に発生したひび割れが部材の中立軸付近で止まっているもの)とその部材の透水性との関係を実験的の調べることを目的としたものである。実験は、1本の鉄筋を配した梁型の供試体の引張側中央に設けたノッチよりひび割れを発生させ、持続荷重下でひび割れに液体状のX線造影剤を注入し、X線造影撮影により内部の造影剤の浸透領域を検出する方法により行った。実験の結果、実験の範囲内で次のことがいえる。(1)供試体に発生したひび割れを通じて造影剤がコンクリートに浸透して行く状況をX線造影撮影法により検出することに成功した。(2)造影剤を圧力245kPaでひび割れに注入し、ひび割れ内部の圧力を測定した結果、ひび割れ先端部で225kPaとなり、約8%の圧力損失が有ることが分かった。(3)造影剤を圧力490kPaでひび割れに注入した場合には、コンクリート中の浸透領域の面積が、245kPAの圧力で注入した場合に比べて、約2倍になった。注入圧力が高いほど、造影剤がひび割れを通ってコンクリート内に浸透する速度が大きくなるといえる。(4)コンクリート供試体の全表面をシールした場合には、造影剤がひび割れを通して浸透する領域の面積は、シールしない場合に比べて小さくなった。コンクリートが乾燥していれば、造影剤の浸透速度は高くなるといえる。(5)X線造影撮影法によって求めた透水性実験結果とコンクリートを割裂して直接内部の水の浸透状況観察によって求めた透水実験結果とは同じ値とはならなかった。そこで、なぜこのような相違が生じるかを実験によって明らかにした。その原因の一つは造影剤(50%濃度)の動粘性係数が水のそれに比べて、1.06となることであった。実験の結果、(1)供試体に発生したひび割れを通じて造影剤がコンクリートに浸透していく状況をX線造影撮影法により検出することに成功した。(3)浸透領域の経時変化に測定から造影剤の拡散係数を求めた結果、浸透初期では高い値を示し、その後徐々に低下し、浸透開始から10日程度経過するとほぼ一定値になり安定した。これは、拡散係数が高い値を示す期間は、造影剤がまず幅の比較的広いひび割れに浸透し、次にその近傍に発生している微細なひび割れに浸透して行く期間であり、拡散係数が一定となる期間は、造影剤が微細ひび割れの発生していない健全なコンクリートを浸透していく期間であると考え等れる。(4)ひび割れを通じてコンクリート中を造影剤が浸透して行く速度は、注入圧力が高いほどまたコンクリートが乾燥しているほど大きいことが分かった。本研究は、鉄筋コンクリート部材の非貫通ひび割れ(引張側に発生したひび割れが部材の中立軸付近で止まっているもの)とその部材の透水性との関係を実験的に調べることを目的としたものである。前年度に引き続き、本年度は供試体の全表面をシールし、コンクリートの含水状態を一定にして実験を行った。

また、造影剤の注入圧力の大きさの測定範囲を広げ、高圧状態でのひび割れを通る水の拡散係数を求めた。さらに、本実験で使用した造影剤との水の浸透性状について実験を行った。実験の結果、(1)コンクリート供試体の全表面をシールして、含水状態を一定にした場合には、シールしなかった供試体に比べて浸透領域面積は小さくなった。これは、シールしなかった供試体は、乾燥収縮の影響でセメントペースト中の毛細管の間の水和生成物の一部が破壊され新たな水の通路ができたためではないかと思われる。(2)造影剤の注入圧力を245kPa、490kPaで行った場合、浸透領域面積は、圧力が高くなるほど大きくなり、その関係はおよそ1:2となった。(3)水と造影剤(濃度59%、30%、20%)の動粘度を測定した結果、水:濃度20%:濃度30%:濃度50%=1:1.02:1.04:1.06となった。
浸透圧ストレス感知を制御する分子メカニズムの解析

浸透圧ストレス応答は、乾燥などの様々な環境ストレスの初期応答として、重要なストレス感知メカニズムである。浸透圧ストレスは、キー酵素であるリン酸化タンパク質SnRK2を活性化する。その後、植物の環境応答の要として重要な植物ホルモン、アブシジン酸(ABA)の合成を促し、耐性付与を導く。しかし、その浸透圧ストレスの感受機構は全く明らかになっていない。本研究では、SnRK2の活性を制御する低分子ペプチドに着目し、浸透圧応答に重要な初期の感受機構、とくに、細胞間シグナルを介した浸透圧ストレスの初期応答に関わるペプチドシグナルの解析を行った。本年度は、ペプチドによるSnRK2タンパク質の活性化制御に関して、主に研究を進めた。ペプチドのRNAi抑制変異体を作成し、浸透圧ストレス時のSnRK2の活性化に関して、ゲル内リン酸化法を用いて解析を行った。SnRK2は、浸透圧処理後1分から10分以内の早い段階で、タンパク質のリン酸化を介した活性化が起こる。しかし、ペプチド抑制変異体を用いた解析から、この早いSnRK2の活性化が抑制されていることを明らかにした。この結果は標的ペプチドが、SnRK2の上流で機能していることを示すだけでなく、細胞内でおこる素早いリン酸化シグナル伝達系も制御していることを示す重要な結果を得たことになる。一方、SnRK2は10遺伝子からなるファミリーを形成し、サブクラスIとIIが浸透圧応答、サブクラスIIIがアブシジン酸(ABA)応答に関わる事が示されている。今回の実験から、ペプチドは全てのSnRK2の活性を制御することが示唆されたことから、ペプチドーSnRK2sモジュールは、細胞内での浸透圧応答における、非常に初期で上流の制御因子群であるという重要な知見となる結果を得ることができた。また、これまでに浸透圧ストレスをSnRK2に伝え、活性化をONにする分子メカニズムは全く分かっていない。本年度は、さらに、ペプチドに結合する相互作用因子の同定も行った。まずはじめに、ペプチドとSnRK2との結合を検証したが、両者の直接的な結合作用を見いだすことはできなかった。そこで、ハブ因子を介したペプチドとの相互作用に関して、研究を進めていくこととした。スクリーニングに関しては、現在進行中である。本年度は、ペプチドによるSnRK2の活性化制御に関して、重要な知見を得ることができ、順調に解析を進めることができた。特に、10個あるSnRK2ファミリーの全ての活性を、ペプチドが制御することを明らかにすることができ、ペプチドーSnRK2sモジュールが、細胞内での浸透圧応答における、非常に初期で上流の制御因子群であるという重要な知見を得ることができたことが大きな成果といえる。また、生化学的解析の準備となるペプチドの遺伝子抑制変異体を迅速に作成したことも、初年度において研究成果を上げることができた一因である。現在は、恒常的発現プロモーターを使った過剰発現体だけでなく、ペプチド遺伝子自身のプロモーターをタンデムにつなげた過剰発現体も作出中である。28年度には、これらの植物体を使って解析を進めることができる予定である。また、ペプチド遺伝子のプロモーターにGUSレポーターを連結させた形質転換植物体も作成中である。これにより次年度以降に、ペプチドが発現し、作用する植物体内の組織局在性に関しても、解析し議論することができ、より詳細な浸透圧ストレスの感知メカニズムを明らかにできると期待している。さらに今年度は、ペプチドに結合する相互作用因子の同定に関しても、解析を進めることができた。ペプチドはSnRK2の活性化を制御するが、これはペプチドがSnRK2に直接結合して制御するのではなく、ハブ因子を介して制御している可能性を考察することができた。現在は、ペプチドと結合する相互作用因子の同定に向けて、スクリーニング系を立ち上げ解析を進めている。今年度は、SnRK2タンパク質の活性を制御するペプチドに結合する、相互作用因子の探索を行った。まずはじめにin silicoデータ解析を行い、候補タンパク質の絞り込みを行った。その結果、候補遺伝子を約30遺伝子に絞り込むことに成功した。その後、SALK instituteから候補遺伝子の遺伝子破壊植物体の種子を取り寄せ、singleおよびdouble knockout mutantsライブラリーを作製した。このライブラリーを用いて、ペプチド、およびSnRK2タンパク質が制御する下流マーカー遺伝子の発現変動を指標にすることで、ペプチドーSnRK2タンパク質に関与する相互作用因子のスクリーニングを行うこととした。マーカー遺伝子は、アブシジン酸(ABA)合成酵素や、乾燥およびABA処理誘導性遺伝子群の中から、代表となる3遺伝子に着目し、発現変動解析を行った。その結果、1つのdouble knockout mutantsでは、乾燥ストレス処理において、マーカー遺伝子の発現が顕著に低下していることを明らかにした。これは、このdouble mutantsの原因因子となる2遺伝子が、ペプチドーSnRK2シグナル伝達系に関与することを示唆する。この原因因子2遺伝子は、受容体キナーゼをコードする遺伝子であることから、ペプチドの受容体候補であることが考えられた。以上の研究結果は、ペプチドー受容体ーSnRK2キナーゼコンプレックスを同定することに成功したことを示す。また、ペプチドのプロモーター領域とGUSタンパク質を融合させたコンストラクトを形質転換させた植物体を用いて、組織特異的に発現するペプチドの様態を解析することができた。その結果、ペプチドは根や葉の維管束柔組織で、主に発現していることが明らかになった。これはペプチドがストレス依存的に細胞外に放出され、根から地上部に移動しやすい組織で、発現制御されている可能性を示唆する結果である。

(理由)本年度は、ペプチドーSnRK2タンパク質のシグナル伝達系をつなぐ、重要な相互作用因子を同定することができ、順調に解析を進めることができた。研究を進めていく中で、ペプチドと結合する相互作用因子の代表的なものは、受容体タンパク質が大部分を占めるのではないかということが考えられた。受容体タンパク質は、細胞外に突出したドメイン部分でペプチドと結合することが一般的なため、細胞内で発現させたタンパク質ドメインとの相互作用を検出する酵母Two Hybridスクリーニング法では、適切な相互作用因子を絞り込むことが難しいことが予想された。そこで、ペプチドの相互作用因子を同定するにあたり、まずはじめにin silicoデータ解析を行うことにした。最終的には、この候補遺伝子群の中で作製した2重遺伝子破壊変異体でポジティブな結果を得られたことを考えると、ペプチドの相互作用因子候補を絞り込むことに成功し、多重遺伝子破壊変異体のライブラリーを作製する手間と時間を大幅に短縮できたところが、今年度中に相互作用因子を同定することに成功した大きな要因であると考えている。さらに今年度は、ペプチドのプロモーター領域とGUSタンパク質を融合させたコンストラクトを形質転換させた植物体を作製し終わり、組織特異的に発現するペプチドの様態を解析することができた。その結果、ペプチドは根や葉の維管束柔組織で、主に発現していることが明らかになった。これはペプチドがストレス依存的に細胞外に放出され、根から地上部に移動しやすい組織で、発現制御されている可能性を示唆する結果である。本研究課題では、ペプチドによるSnRK2タンパク質の活性化制御のメカニズムの解明に関して、研究を行った。ペプチドのRNAi抑制変異体を作成し、浸透圧ストレス時のSnRK2の活性化を解析した結果、RNAi抑制変異体では、浸透圧処理後1分から10分以内の早い段階でおこるSnRK2タンパク質のリン酸化が抑制されていることを明らかにすることができた。この結果は、標的ペプチドが、SnRK2の上流で機能していることを示すだけでなく、細胞内でおこる素早いリン酸化シグナル伝達系も逝去していることを示す。さらにペプチドとSnRK2をつなぐ相互作用因子の探索を行った。in silicoデータ解析を行い、候補タンパク質の絞り込みを行った結果、約30個の候補タンパク質を見いだすことに成功した。その後、各遺伝子の遺伝子破壊変異体を作成し、ペプチドおよびSnRK2タンパク質が制御する下流マーカー遺伝子の発現変動を指標に、ペプチド-SnRK2タンパク質に関与する相互作用因子のスクリーニングを行った。マーカー遺伝子は、アブシジン酸(ABA)合成酵素や、乾燥およびABA処理誘導性遺伝子の中から代表となる3遺伝子に着目し、発現解析を行った。
緑内障の原因遺伝子の研究

正常眼圧緑内障の疾患感受性遺伝子を検索する目的で、600例以上の正常眼圧緑内障患者から採血を行い、DNAサンプルを抽出した。収集した緑内障患者DNA検体のうち、約280検体について、マイクロアレイを用いたゲノムワイドのSNPタイピングを行い、ケースコントロール関連解析を行った。さらに別の約320検体を用いてSNPタイピングを行った結果、正常眼圧緑内障に関連性の深い1つの遺伝子領域を見出した。(1)緑内障の家族歴調査(蕪城、新家、沼賀)東京大学付属病院眼科およびその関連病院に通院中の緑内障患者について問診による緑内障の家族歴調査を行い、緑内障の家族歴の頻度を調べた。調査の発端となる緑内障患者に関しては、家族歴調査研究への協力の同意を得た上で、東京大学附属病院研究倫理委員会の承諾を得た問診表に従って家族構成、それぞれの家族の緑内障への罹患の有無を問診した。家族歴があると答えた場合には、患者の同意の上でその家族に対して郵便あるいは電話で問診を行い、緑内障の有無と治療歴を調査する。可能であれば、家族に関しても来院して頂く、あるいは通院中の病院に照会するなどして、緑内障の有無を確認する。これらの患者の緑内障に関する臨床データー(年齢、性別、緑内障の病型、推定罹病期間、治療歴、治療内容、緑内障の進行度など)を調査する。可能な限り多くの患者にこの家族歴調査を行い、家族歴のある緑内障患者の頻度を算定する。(2)緑内障症例の血液サンプル集め(蕪城、沼賀)その上で、遺伝子解析に同意して頂ける複数の兄弟発症例の緑内障患者(目標数50家系100例)および弧発例の緑内障患者(目標数200例)から遺伝子解析を行うための血液サンプルの提供を受ける。血液サンプルは匿名化の上、凍結保存、後日まとめてDNA抽出を行う。血液サンプルの保存は東京大学付属病院眼科、および東京大学医学系研究科人類遺伝学教室で行う。(3)血液サンプルからのDM抽出(徳永、馬淵)凍結保存された血液サンプルから、DNAを抽出する。DNAサンプルの保存は東京大学医学系研究科人類遺伝学教室で行う。<緑内障症例の血液サンプルおよび臨床データの収集>(蕪城、沼賀)東京大学医学部附属病院および共同研究施設において、各施設に通院中の患者から本研究で定めた基準を満たす緑内障患者を抽出し、外来受診時に研究協力に関する説明と同意の取得、および血液検体・臨床データの収集、匿名化を実施した。各施設合計で昨年度と合わせて約450名の患者から研究協力について書面での同意を得、試料の提供を受けた。また、収集した試料は匿名化の上、東京大学付属病院眼科、および東京大学医学系研究科人類遺伝学教室で保存している。<DNAサンプルの多型解析>(徳永、馬淵)収集した患者DNA検体のうち、約200検体について、マイクロアレイを用いたSNPのタイピングを行った。コントロールデータと合わせて、厳しい基準をクリアできた約58万SNPについてケースコントロール関連解析を行った。関連解析の結果と、これまでに緑内障との関連が示唆されている遺伝子なども考慮し、選抜したSNPについては残る250検体を用いて、タイピングを行い、現在解析中である。〈緑内障症例の血液サンプルおよび臨床データの収集〉(蕪城、沼賀)当初の研究計画では、緑内障の同胞発症例の遺伝子を調べる予定であったが、緑内障は発症しても末期まで自覚症状が出にくく潜在的な患者が多いこと、一般的に緑内障という病名で包括される範囲が非常に広いことより、問診から正確な家族歴を聴取する事は困難を極めた。同時に、家族内発症例の血液サンプルを収集することはさらに困難であることが予想された。そこで、遺伝子解析を目的とした緑内障患者の血液サンプルの収集に関しては、関連解析を行うことを念頭に孤発例を中心にサンプル収集を行った。東京大学医学部附属病院および共同研究施設において、各施設に通院中の患者から本研究で定めた基準を満たす緑内障患者を抽出し、外来受診時に研究協力に関する説明と同意の取得、および血液検体・臨床データの牧集、匿名化を実施した。各施設合計で昨年度までと合わせて約600名の患者から研究協力について書面での同意を得、試料の提供を受けた。また、牧集した試料は匿名化の上、東京大学付属病院眼科、および東京大学医学系研究科人類遺伝学教室で保存している。〈DNAサンプルの多型解析〉(徳永、馬淵)収集した患者DNA検体のうち、約300検体について、マイクロアレイを用いたSNPのタイピングを行った。関連解析の結果と、これまでに緑内障との関連が示唆されている遺伝子なども考慮し、選抜したSNPについて残る検体を用いて、タイピングを行った。
マーモセット精巣の免疫不全マウスへの移植による精子形成in vivo実験系の開発

背景:未成熟精巣組織の免疫不全マウスへの異所移植は、多くの動物種で精子形成に成功しているが、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)では精母細胞で成熟停止が起こるという報告がある。我々は、正常組織の生着性が極めて高いことで知られるNOGマウス(遺伝子改変免疫不全系統NOD/SCID/γc^<null>)にコモンマーモセットの未成熟精巣組織を移植し、その成熟と精子形成の進行について検討した。方法:新生仔(0日齢、1頭)および幼仔期(7か月週齢、3頭)のマーモセットから摘出した精巣の組織片を、7匹のNOGマウスの背部皮下に5-8か所ずつ移植し、2-8か月後に摘出して精巣の成熟と精子形成の状態を形態的に評価した。結果と考察:移植片の生着率は新生仔の精巣では87%(13/15)、幼仔期の精巣では75%(24/32)であった。新生仔の精巣の精細管には前精原細胞が含まれていたが、移植7か月後の観察では、精細管径の拡大と精細胞の成熟(A型およびB型精原細胞)がみられ、一部の精細管に初期精母細胞の出現を認めた。この発生の進行は対照の7か月齢マーモセット精巣と同等か、やや促進していたE7か月齢マーモセットの移植前の精細胞の発達段階は大部分が前精原細胞とA型精原細胞であったが、移植後6-7か月ではパキテン期までの精母細胞を含む精細管が観察された。対照の14か月齢マーモセットの精巣には精子細胞が認められたので、移植下では二次精母細胞の段階で成熟停止が起きている可能性が示唆された。ヌードマウスを用いた他の研究グループによる新生仔マーモセットの精巣移植では、生着率が低く(34%)、移植3か月後の精細胞の発生段階は精原細胞までであった。本研究ではレシピエントマウスにNOGマウスを使用したことで、生着率が改善し、精子形成がさらに進んだ可能性がある。本研究の目的は、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)の未成熟な精巣組織を免疫不全マウスに移植することにより、ヒトの精子形成のモデルとなる実験系を作製することである。最初にレシピエントとして使用するNOGマウス(NOD/SCID/γ_c^<null>)への精巣組織の可移植性を検討するために、C57BL/6Jマウス(5-7日齢)をドナーとした未成熟精巣の同種間移植を行い、2ヵ月後にドナーの精巣移植片を回収した。その結果、C57BL/6Jマウスの未成熟な精巣がNOGマウスの皮下に100%生着したまま維持され、精巣組織の成熟と精子形成が観察された。次に、生後29-30週のマーモセット3頭より摘出した精巣の小片を、精巣を摘除した4匹のNOGマウスの背部皮下に各8箇所ずつ移植した。移植を受けたNOGマウスは、アイソレータ内で最長7.5ヶ月まで飼育した。移植片の生着率は75%(24/32)であった。

ドナーのマーモセットは幼仔期の個体で、移植した精巣片に含まれる精細胞の発達段階は大部分がA型精原細胞であったが、移植後6-7.5ヵ月で回収した移植片においては、精細管内に精母細胞(パキテン期、ザイゴテン期)の存在を確認した。他の研究者(Schlatt et al.,2002)によるヌードマウスへのマーモセット新生仔の精巣移植では、生着率が低く(34%),移植100日後の精細胞の発生段階は精原細胞までなので、レシピエントマウスとしてNOGマウスを使用したことで、移植片の精子形成がさらに進んだ可能性がある。しかし、マーモセットの日齢も、移植片がレシピエント皮下で維持されていた期間も異なるため、単純には比較できない。今後は、新生仔期から幼児期の間の幾つかの段階のマーモセット精巣についても移植を試みたい。異種動物の未成熟精巣組織を免疫不全マウスの背部皮下に移植することにより、移植片における精細胞の成熟と精子形成を可能にする実験系がある。これまでにマウス、ハムスター、ヤギ、ブタ、アカゲザルなどの新生仔をドナーとして完全な精子形成に成功しているが、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)の精巣では精原細胞までで発生が停止することが知られている。昨年度は、生後29-30週(幼仔期)のマーモセットより摘出した精巣のNOGマウス(遺伝子改変免疫不全系統NOD/SCID/γ_<c^null>)背部皮下への移植を試み、移植後3-7.5か月でパキテン期までの精母細胞を認める精細管を確認した。今年度は新たに生後10週未満(新生児期)のマーモセットを入手したので、同様にNOGマウスに移植し、7か月後における精巣組織の成熟と精子形成の状態を光学顕微鏡で観察した。移植時の新生仔マーモセットの精細管は未成熟な精原細胞で満たされていたが、移植7ヶ月後に観察すると、精細管径の拡大と精原細胞の成熟(A型およびB型精原細胞)がみられ、一部の精細管に精母細胞の出現を認めた。ごく一部に精細管欠如(Sertoli cell only)の精細管が観察される以外に精子形成の遅延や変性退行の様相を呈する精細管は殆どなかった。移植時の週齢(10週)に移植期間(7か月)を加えた期間は、in vivoでは生後40週に相当する。この週齢におけるマーモセットの精巣は初期の精母細胞が出現し始める時期にあたり、今回の結果は移植下でも同様の精子形成段階を再現していることが示唆された。今後は電子顕微鏡による観察および免疫組織化学的検討により移植条件下での精細胞および支持細胞(Sertoli cell、Leydig cell)の成熟度について検証したい。