hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光捕集アンテナにおける励起エネルギー移動の分子論的機構の理論的解明

光合成反応で重要な光捕集アンテナと呼ばれるタンパク質は、内部に含まれる色素で吸収した光エネルギーを励起エネルギー移動(EET)の形で高速・高効率に活性中心に伝達することが知られている。EETの反応速度は励起エネルギーの揺らぎが小さ過ぎても大き過ぎても低下するが、光捕集アンテナではEETの反応速度が最大になるように励起エネルギーの揺らぎが最適化されている。しかし、生体分子の微細な構造や揺らぎがどのように高速・高効率なEETを制御しているか全く明らかになっていない。そこで本研究では、分子レベルで励起エネルギーの揺らぎを解析するために、色素の励起エネルギーを高精度・低コストに計算可能な手法(MMSIC法)を開発した。MMSIC法では、分子力場と修正Shepard内挿法を組み合わせることで、色素の基底状態と励起状態を表すポテンシャル関数を高精度・低コストに生成する。修正Shepard内挿法を色素の構造だけでなく、色素にかかる静電ポテンシャルにも適用することで、周囲の生体分子の揺らぎの影響も取り込む。MMSIC法により必要な量子化学計算の計算コストを大幅に削減し、様々な構造で励起エネルギーを効率的に計算可能となる。このMMSIC法を光捕集アンテナの1つであるFenna-Matthews-Olsonタンパク中の色素バクテリオクロロフィルaに適用した。MMSIC法により励起状態のポテンシャルエネルギーの計算を精度を保ったまま約100万倍加速することに成功しただけでなく、シミュレーションにより得られた励起エネルギーの揺らぎを表すSpectral Densityは実験から得られたものとよく一致した。また、EETダイナミクスに重要なSpectral Densityの低振動数部分がほぼ色素の分子内振動によるものと明らかにした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
放射線影響研究の新しい展開

放射線の生物作用の機構は、放射線の人体影響並びに放射線の医学利用の生物学的基盤としてその重要性はますます高まってきている。従来の放斜線影響の基礎研究はDNAを標的とした標的理論を中心に展開されてきたが、放射線とヒトの関わりが多様化し、低線量・低線量率放射線の影響に関心が高まると、この理論は重大な矛盾に当面している。今や放射線影響は放射線に対する細胞、組織、器官、個体が示す機能的統一体としての分子応答機構として理解されなければならない。放射線影響研究の新しい動向として、(1)ゲノム安定性とその破綻、(2)放射線発がんの分子機構、(3)レドックス制御とその分子病態、(4)放射線応答とその分子機能制御に焦点を絞り、国内外の研究の現状を分析し、放射線影響の新しい生物学的基盤を構築するためにはどのような研究を重点的に推進すべきか検討を行った。その結果、遺伝子損傷をシグナルとした生体応答の分子機構とゲノム安定性の維持機構が従来の標的理論が見逃した重大な生物作用であり、放射線影響の新しい生物学的基盤として、その機構の解明は放射線影響の理解に革命的概念をもたらすものと考えた。そこで、この問題について検討小委員会を儲けてさらにデータの収集と検討を重ね、重点領域研究の研究課題「遺伝子損傷性ストレスに対する分子応答とゲノム安定性」を設定し、重点領域研究の研究領域設定を申請した。この放射線応答は生命科学の重要課題でもあるが、放射線影響の根本問題でもある。新しい研究領域であるが、我が国ではこの研究分野で先導的研究者も多く、世界に先駆けて放射線影響の新しい統一的理論の創出が期待できる。
紛争解決の分析から見るインド初期仏教教団の歴史的実態

本研究の究極的な目標は、インド初期仏教教団の分裂と異説共存の問題を明らかにすることである。そこで、初期仏教教団で発生したと判断される様々な紛争事件を集め、その内容及び解決法などを吟味し、教団で起こり得る紛争の種類と、その解決法の多様性を把握する作業を進めている。その過程で、現前僧伽、すなわち、教団の実質的な活動の基準となる境界がどのように運営されていたのか、その具体的な姿の解明に力を注いだ。なぜなら、現前僧伽こそ、教団紛争の拠点となるからである。その結果、一つの境界によって成立する現前僧伽というのは、地域的な意味だけではなく、むしろ、精神的に結ばれた比丘たちが一定の場所に居住しながら、教団の行事や会議を一緒にしたり、また、布施物を一緒に享受するというような性格を持っている可能性の高いことがわかった。ここで、精神的に結ばれたというのは、例えば、教理の面で異見をもつ者がなかったり、あるいは、教団の決定に対して反対立場を取らないようなことである。現前僧伽がもつ独立した性格は、パーリ律の注釈からはより明確な形で現れており、時代が進むにつれ、段々強くなっていったと思われる。時々、相手の境界を壊すという表現が出てくるが、これは、各現前僧伽が、ある意味で、対立していた状況を思い出させる。一方、罪を犯した比丘に下される懲罰羯磨に関する諸伝承からも、現前僧伽の運営方針の一面を確認することができた。懲罰羯磨とは、罪を犯した比丘に対して教団が懲罰を下すために行う会議であるが、パーリ律とその注釈、及び、これに相当する漢訳律を比較検討した結果、その対象となる罪に不可解な点が存在することがわかった。比丘が罪を犯した場合には、普通、懺悔によって罪を償うが、この羯磨は、教団が告白懺悔を促しても全く耳を傾けず、勝手に行動して、教団の秩序に危険をもたらす者が主な対象となる。しかし、対象となるその具体的な罪の内容は非常に包括的であり、かつ、曖昧である。そして、すべての場合において強調されるのは、`もし教団が欲するならば'という表現だけである。これは、同じ罪であっても、教団側の意思によって、懲罰羯磨の対象になることも、ならないこともあったことを推測させる。厳密な規則を立てず、すべてを現前僧伽の判断に委ねる態度からは、いつでも、問題児を現前僧伽から排除することができた可能性さえ窺える。点として数多く存在した現前僧伽は、むしろ、このような独立した性格に基づき、自由に分裂を重ね、また、それを包括する四方僧伽という概念によって仏教徒としてのアイデンティティを保つことができたと思われる。そこで先ず、初期仏教教団で発生したと判断される様々な紛争事件を集め、その内容及び解決法などを吟味することによって、これらを主なデータとして蓄積すべきである。これを通して、教団で起こり得る紛争の種類と、その解決法の多様性が把握できるし、また、いかなる場合に分裂という実態に陥ったのか垣間見ることができるからである。教団の紛争事件は様々な仏教文献に伝えられるが、特に律蔵と呼ばれる文献には、事件の始末が詳細に伝承されており、最も重要な資料である。従って、先ず律蔵に現れる紛争事件を集め、綿密に読み直す作業を進めている。平成17年11月から12月までは、律蔵の中でもパーリ律に伝えられる紛争記述を集め、翻訳および分析を行った。律蔵は六部派のものが現存しており、これから手順において他の部派の律蔵の記述も調査する予定であるが、漢訳として伝えられる他の律蔵に比べ、パーリ律は、パーリ上座部という伝統的な仏教教団内部で実際に適用されてきた事例を確認することができるという点で、教団内部の実態を把握するために必要な一つの基準を、最も明確な形で提示してくれると思ったので、最初の考察資料として選択した。また、パーリ律に伝承される紛争記述の翻訳および分析とともに、その一方では、テクストで紛争事件として直接言及されるわけではないが、何らかの形で教団の分裂と関連を持つと判断される幾つかの概念を取り上げ、検討を行った。その中でも、教団からの追放を意味するナーサナ(nAsana)という概念の検討に力を入れた。この用語の分析を通して、今まで知られていた教団追放の罪の内容に考え直す余地があることがわかった。また、紛争事件によって教団追放の罰を受けたという記述は見当たらず、紛争者に対する仏教教団の立場が間接的に確認できた。

その結果、一つの境界によって成立する現前僧伽というのは、地域的な意味だけではなく、むしろ、精神的に結ばれた比丘たちが一定の場所に居住しながら、教団の行事や会議を一緒にしたり、また、布施物を一緒に享受するというような性格を持っている可能性の高いことがわかった。ここで、精神的に結ばれたというのは、例えば、教理の面で異見をもつ者がなかったり、あるいは、教団の決定に対して反対立場を取らないようなことである。現前僧伽がもつ独立した性格は、パーリ律の注釈からはより明確な形で現れており、時代が進むにつれ、段々強くなっていったと思われる。時々、相手の境界を壊すという表現が出てくるが、これは、各現前僧伽が、ある意味で、対立していた状況を思い出させる。一方、罪を犯した比丘に下される懲罰羯磨に関する諸伝承からも、現前僧伽の運営方針の一面を確認することができた。懲罰羯磨とは、罪を犯した比丘に対して教団が懲罰を下すために行う会議であるが、パーリ律とその注釈、及び、これに相当する漢訳律を比較検討した結果、その対象となる罪に不可解な点が存在することがわかった。比丘が罪を犯した場合には、普通、懺悔によって罪を償うが、この羯磨は、教団が告白懺悔を促しても全く耳を傾けず、勝手に行動して、教団の秩序に危険をもたらす者が主な対象となる。しかし、対象となるその具体的な罪の内容は非常に包括的であり、かつ、曖昧である。そして、すべての場合において強調されるのは、`もし教団が欲するならば'という表現だけである。これは、同じ罪であっても、教団側の意思によって、懲罰羯磨の対象になることも、ならないこともあったことを推測させる。厳密な規則を立てず、すべてを現前僧伽の判断に委ねる態度からは、いつでも、問題児を現前僧伽から排除することができた可能性さえ窺える。点として数多く存在した現前僧伽は、むしろ、このような独立した性格に基づき、自由に分裂を重ね、また、それを包括する四方僧伽という概念によって仏教徒としてのアイデンティティを保つことができたと思われる。
ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の白血病発症における役割の解明と臨床応用

1)血液細胞におけるHDAC発現とその制御機構の解明:(1)正常造血幹細胞/前駆細胞(CD34陽性骨髄、臍帯血単核細胞)においてHDACの発現はきわめて低く、特に蛋白レベルでは検出限度以下であった。一方、committed progenitors(CD34陰性骨髄単核細胞)においては発現が認められたが、顆粒球・単球では再度発現が低下した。この発現パターンはin vitroの培養系でも再現された。(1)急性白血病においては細胞株(HL-60、U937、K562)、臨床検体ともにHDACの強発現を認めた。HL-60、U937を顆粒球ないし単球系に分化させると、HDACの発現は著明に低下した。一方、K562を赤芽球・巨核球系に分化させた場合は、HDACの発現は抑制されなかった。(3)HDAC1プロモーターはTATA lessで、GC box、CCAAT box、GATAおよびMZF-1の結合配列を認めた。プロモーター活性はSp-1、GATA-1によって活性化され、GATA-2、MZF-1、C/EBPα、C/EBPβによって抑制された。またGATA-1によるHDAC1転写活性化は、GATA-2+MZF-1によって著明に抑制された。2)造血幹細胞におけるHDACの機能と白血化への関与の解明:(1)純化した造血幹細胞にHDAC1を強発現させたが、明らかな増殖の促進は認めなかった。(2)C57BL/6(Ly-5.1)マウス由来の造血幹細胞(c-Kit陽性細胞)にレトロウイルスを用いてHDAC1を発現させ、放射線照射したC57BL/6(Ly-5.2)マウスに移植した。現在、約9か月の観察であるが、HDAC1発現群において有意の白血球減少が認められている。一方、赤血球数、血小板数は対照群(Mock)、無処置マウスと差を認めていない。1)血液細胞におけるHDAC発現とその制御機構1の解明:(1)正常造血幹細胞/前駆細胞(CD34陽性骨髄、臍帯血単核細胞)においてHDACの発現はきわめて低く、特に蛋白レベルでは検出限度以下であった。一方、committedpr genitors(CD34陰性骨髄単核細胞)においては発現が認められたが、顆粒球・単球では再度発現が低下した。(2)急性白血病においては細胞株(HL-60、U937、K562)、臨床検体ともにHDACの強発現を認めた。2)造血幹細胞におけるHDACの機能と白血化への関与の解明:

(1)純化した造血幹細胞にHDAC1を強発現させたが、明らかな増殖の促進は認めなかった。(2)C57BL/6(Ly-5.1)マウス由来の造血幹細胞(c-Kit陽性細胞)にレトロウイルスを用いてHDAC1を発現させ、放射線照射したC57BL/6(Ly-5.2)マウスに移植した。現在、約3か月の観察であるが、HDAC1発現群において有意の白血球減少が認められている。一方、赤血球数、血小板数は対照群(Mock)、無処置マウスと差を認めていない。1)血液細胞におけるHDAC発現とその制御機構の解明:(1)正常造血幹細胞/前駆細胞(CD34陽性骨髄、臍帯血単核細胞)においてHDACの発現はきわめて低く,特に蛋白レベルでは検出限度以下であった。一方,committed progenitors(CD34陰性骨髄単核細胞)においては発現が認められたが,顆粒球・単球では再度発現が低下した。この発現パターンはin vitroの培養系でも再現された。(2)急性白血病においては細胞株(HL-60、U937,K562),臨床検体ともにHDACの強発現を認めた。HL-60、U937を顆粒球ないし単球系に分化させると,HDACの発現は著明に低下した。一方, K562を赤芽球・巨核球系に分化させた場合は,HDACの発現は抑制されなかった。(3)HDAC1プロモーターはTATA lessで,GC box,CCAAT box,GATAおよびMZF-1の結合配列を認めた。プロモーター活性はSp-1,GATA-1によって活性化され,GATA-2、MZF-1,C/EBPα,C/EBPβによって抑制された。またGATA-1によるHDAC1転写活性化は,GATA-2+MZF-1によって著明に抑制された。2)造血幹細胞におけるHDACの機能と白血化への関与の解明:(1)純化した造血幹細胞にHDAC1を強発現させたが,明らかな増殖の促進は認めなかった。(2)C57BL/6(Ly-5.1)マウス由来の造血幹細胞(c-Kit陽性細胞)にレトロウイルスを用いてHDAC1を発現させ,放射線照射したC57BL/6(Ly-5.2)マウスに移植した。現在,約9か月の観察であるが,HDAC1発現群において有意の白血球減少が認められている。一方,赤血球数,血小板数は対照群(Mock),無処置マウスと差を認めていない。
閉Riemann面の退化族に付随した複素2次元特異点の研究

本研究では、(1)複素乗法群の作用を持つ,閉Riemann面の退化族の構造を調べた。正規2次元特異点上の関数fを考えたとき、その特異点解消空間を含む退化族を構成しそのファイバーリングを与える写像の制限がfとなるようなものの存在を、4年ほど前に都丸は示した。本研究では、複素乗法群の作用付きの状況で同様な事実を証明した。(2)閉Riemann面上のnegative line bundleの零切断を潰してできる特異点が、Kodaira特異点、またはKulikov特異点となる条件を求めた。この結果を用いて、KodairaではあるがKulikovでない特異点の具体例を与えた。(3)有理3重点のPencil種数を求めた。有理2重点のPencil種数を数年前に示したが、M.Artinの有理3重点の分類を用いてPencil種数を決定した。(4)特異点(X,o)の解消空間の例外集合の既約成分がすべて射影直線となるとき、(X,o)を擬有理特異点という。S.S.Ahbyankerは、これに関しいくつかの結果を示した。擬有理特異点と閉Riemann面の退化族との関連について実験的な具体例の計算を行った。本研究の、1つ目のテーマは、閉Riemann面の退化族で複素乗法群の作用を持つものの構造を調べ、2つ目のテーマは、閉Riemann面の退化族の局所モノドロミー群と、2変数関数のMilnorモノドロミー群との関係を調べることにある。現在までの進捗状況と、得られた結果は以下の通りである。1)「閉Riemann面の退化族で複素乗法群の作用を持つもの」の基本的な構成をあたえた。閉Riemann面上のある線形束の全空間を適当に改変して、このような退化族を構成した。2)複素乗法群の作用を持つ2次元特異点についてのOrlik-Wagreich、Pinkhamの結果の類似として、「閉Riemann面の退化族で複素乗法群の作用を持つもの」についても、同様な表示が与えられ、その結果として、退化族のfiberingを与える写像がある種の加群の元として、得ることが出来る事を示した。これらの研究の遂行の為に、多くの関連図書を購入した。また、頻繁に東京(日本大学文理学部の特異点セミナー、東京大学数理科学研究科)、その他の研究会に出張をおこなった。また、パソコンの買い換えを行い、数式処理ソフト・マテマティカの使用による、特異点解消計算のプログラミングための準備を終えた。正規2次元特異点上の関数fを考えたとき、その特異点解消空間を含む退化族を構成し、そのファイバーリングを与える写像の制限がfとなるようなものの存在を、4年ほど前に都丸は示した。上記の研究の内、(2),(3)の結果については、投稿中の論文「Pencil genus for normal surface singularities」に追加した。(1)については、第2回「トポロジー・代数幾何・玉原セミナー」で発表を行い、その成果について報告集に「代数曲線の${Bbb C}^*$-作用をもつ退化族と2次元擬斉次特異点」なる報告を行った(印刷中)。(1)に関しては、研究結果を論文へまとめる。上記の研究の遂行の為に、関連図書を購入した。
細胞内情報伝達機構網の研究

プロテイン・キナーゼCを介する細胞内情報伝達機構は生命科学の基礎研究において最大の関心を集める課題となっている。この細胞内情報伝達機構は、これまで個別に研究されてきた各種の情報伝達系などを包含する機構となっている処から、生体調節にかかわる多くの研究を統合し、これらを含み込んだ「細胞内の情報伝達網」、いわば「ネットワーク」の研究へと大きな構図を描いて展開されようとしている。そこで、本準備研究では本領域の研究を統合、推進することを目的とした平成6年度開始予定の新プログラム方式研究「細胞内情報伝達機構網の研究」の研究組織の準備を行った。まず、準備研究班により共同研究組織の総括班、サブグループ、サブリーダーおよびその研究課題について原案を作成し、サブリーダー予定者を加えた検討、意見交換により以下の6サブグループによる共同研究組織の立案を行った。1)細胞膜脂質を介した情報転換のネットワーク2)蛋白質相互作用による情報変換のネットワーク3)蛋白質リン酸化反応カスケードとその調節4)細胞核への情報伝達網の解析5)細胞分化シグナルのネットワーク6)細胞内情報伝達機構ネットワークの病態解析この間、準備研究班員、サブリーダー予定者およびその協力者が必要に応じて研究連絡のための相互訪問あるいは郵便等による打ち合わせを行い、総括班ならびに各サブグループの研究計画の検討を行った。これらの成果をふまえて、平成5年3月16日に神戸にて、準備研究準備研究9名に加えてサブリーダー予定者、研究分担者、研究協力者が参集し打ち合わせ会議を実施した。この会議において各サブグループの研究計画と申請計画全般について検討、意見交換を行ない、密接な連絡体制により主として神戸大学及び国内外の研究機関との積極的な共同研究を実施に向けて準備体制が整えられた。
心臓サルコイドーシスに対する抗菌薬治療の炎症進展抑制効果を検討する探索的研究

サルコイドーシス(サ症)は原因不明の全身性肉芽腫疾患であり侵される臓器は肺・皮膚・眼・心臓・肝臓・腎臓など多岐に渡る。古くから心病変合併の有無がサ症の生命予後を規定する最も重要な因子であるとされており、我が国では、諸外国に比べこの心病変の合併が多く、死因の3分の2を占めることも報告されている。治療としては経験的なステロイド治療が中心となるが、2015年に施行した心サ症の全国アンケート調査結果では、平均7.4mgが使用されているにもかかわらず、経過中ステロイドの増量が必要だった症例は、390名中55名(19.9%)であった。またサ症の再燃を抑制するために、副腎皮質ステロイドの必要維持量を510mgと比較的高用量に設定する必要があることや、長期にわたる内服が必要であることから、副腎皮質ステロイドによる様々な副作用や合併症の発現が問題となっている。これらの課題を解決するために、サ症の根本的な原因解明と治療法の開発が切望されている現状がある。近年、サ症の原因として、肉芽腫組織からPropionibacterium acnes(アクネ菌)が分離された一方、結核菌を含む他の細菌やウイルスが検出されなかったことを江石らが報告し、抗菌薬が効く可能性が報告されている。今回行っている心臓サルコイドーシスに対する抗菌薬治療の臨床的有用性を検討する探索的試験は、新規に診断された心臓サルコイドーシス患者に、通常のプレドニゾロン治療に加え、抗菌薬(クラリスロマイシン+ドキシサイクリン)を約半年間上乗せすることによるPET-CTによる炎症の変化、心機能の変化、抗生剤の副作用などを観察する前向き研究である。現在、患者リクルートを引き続き行っているが、トータルで20例弱と登録状況は予定よりも遅れている。世界初のエビデンス作りに向けて、症例登録を一層促していく予定である。久留米大学の倫理委員会通過に時間を要したこと、大阪北部地震の影響で症例登録を断念した症例があることから登録の進捗が遅れ気味である。60例を目指して症例登録を進める予定である。システム利用料を支払う予定だったが、1ヶ月分の料金に不足していた為、差額が発生した。
チタン表面改質による抗菌性インプラント材料の開発

歯科インプラントは軟組織を貫通し,細菌の巣窟である口腔と生体内の顎骨を連結するという構造のため,埋入時に無菌的に処置してもその後の感染のリスクは極めて高い.本研究では,インプラント(特にアバットメント部)に使用される材料表面へ抗菌蛋白質であるラクトフェリンを修飾し,抗菌性を持つインプラント材料を創製することを検討した.結果,ラクトフェリンを吸着したチタン,窒化チタン,ジルコニアにおいてプラーク初期形成菌であるS.gordoniiをはじめ,インプラント周囲炎原因菌であるP.gingivalis,F.nucleatumの付着を抑制できることがわかり,臨床応用への可能性が示された.本研究の目的は、インプラントに使用される材料表面への細菌付着のメカニズムを解明することと、材料表面へ抗菌蛋白質(ヒトラクトフェリン:LF)を修飾し、抗菌性を持つインプラント材料の開発をすることである。平成24年度は、純チタン(Ti)、窒化チタンをイオンプレート法でコーティングした純チタン(TiN)、イットリア安定化ジルコア(Zr)について、1LF吸着試料の細菌付着抑制効果についてS.gordonii(S.g)以外の細菌も調べる。2LF吸着試料の細胞への影響を調べる。3試料の表面ぬれ性や電位を変え、細菌付着への影響を検討し、インプラントに使用される材料表面と細菌の付着のメカニズムを検討する。以上3点であった。1については、P. gingivalis(P.g)、F. nucleatum(F.n)について検討した。さらにS.gとP.gまたはF.nの混合培養を行い、LF吸着群と対照群(水中に24時間浸漬した試料)への細菌付着について調べた。結果、P.gではLF吸着群と対照群の間に有意差は認められなかったが、F.n、S.g+P.g、S.g+F.nではLF吸着群で細菌付着量が著しく減少し、付着細菌において死細菌の量が増えていた。また、菌体が膨張している像や、複数の細菌が融合している像がSEMで観察された。2については、LF吸着群と対照群についてヒト歯肉線維芽細胞を48時間培養し、MTT法にて細胞の生死を比較した。結果、Ti、TiN、Zr、全ての試料においてLF吸着群と対照群の間に有意差は認められなかった。3については、酸性フッ化物溶液中にTiを浸漬することで表面が粗造化し、ぬれ性が向上した試料を作製し、細菌付着について検討した。結果、表面が粗造化し、ぬれ性が向上した純チタン上では細菌付着量が増加するが、LFを吸着することにより細菌付着を抑制できることが分かった。本研究の目的は、インプラントに使用される材料表面への細菌付着のメカニズムを解明することと、材料表面へ抗菌蛋白質(ヒトラクトフェリン:LF)を修飾し、抗菌性を持つインプラント材料の開発をすることである。平成25年度の計画は、これまでの研究に続き、1インプラント用材料表面への細菌付着、細胞への影響についてさらなる検討を行うこと。2唾液タンパク質の吸着、LFの吸着について調べること。3海外の学会で成果を発表すること。4これまでの成果を論文にまとめること。以上4点であった。1についてはLFの吸着条件をこれまでの24時間の処理時間から30秒の処理時間にしてもS.gordonii (S.g)の付着を抑制することがわかった。2については、LFを吸着した純チタン(Ti)をムチン等タンパク質を含有する人工唾液中に浸漬し、S.gの初期付着についてLFの抗菌性が維持されるかどうか検討した。LFの吸着、脱着は免疫染色法とXPSにて分析し、細菌の付着抑制についてはクリスタルバイオレット染色法、SEMによる形態観察、LIVE/DEAD染色と共焦点レーザー顕微鏡観察による抗菌性の分析を行った。結果、人工唾液浸漬後もTi表面にLFが残留し,抗菌作用が認められた。3についてはこれまでの成果を、平成25年度4月に東京で開催された第61回,63回日本歯科理工学会学術講演会で口頭,ポスター発表を行ったほか、平成25年9月にローマで開催されたThe 4th International Symposium on Surface and Interface of Biomaterialsにて口頭発表を行った。4については、これまでの成果を国際誌「Biointerphases」に投稿し受理された(Vol. 9, No. 2, 2014, in press)。以上、平成25年度の計画を予定通り遂行することができた。歯科インプラントは軟組織を貫通し,細菌の巣窟である口腔と生体内の顎骨を連結するという構造のため,埋入時に無菌的に処置してもその後の感染のリスクは極めて高い.本研究では,インプラント(特にアバットメント部)に使用される材料表面へ抗菌蛋白質であるラクトフェリンを修飾し,抗菌性を持つインプラント材料を創製することを検討した.結果,ラクトフェリンを吸着したチタン,窒化チタン,ジルコニアにおいてプラーク初期形成菌であるS.gordoniiをはじめ,インプラント周囲炎原因菌であるP.gingivalis,F.nucleatumの付着を抑制できることがわかり,臨床応用への可能性が示された.本研究の目的は、「インプラントに使用される材料表面への細菌付着のメカニズムを解明することと、材料表面へ抗菌蛋白質を修飾し、抗菌性を持つインプラント材料の開発をすること」である。平成23年度の研究計画は、「試料作製方法の確立と、適切な研究条件の設定をすること」であった。当該年度に実施した研究の具体的内容は、まず、純チタン、窒化チタンをイオン

プレート法でコーティングした純チタン、イットリア安定化ジルコアを必要数用意し、鏡面研磨した。次に、上記試料と抗菌蛋白質(ラクトフェリン・LF)の結合方法について、化学的に修飾する方法と、LF溶液中に24時間浸漬し、試料表面に吸着させる方法を検討した。結果、どちらも試料表面にLFが存在していることが、X線光電子分光分析による、N 1sスペクトルのピークから確認できたため、以降の実験にはLF吸着の方法を採択することにした。細菌付着については、プラーク形成の初期に関与する細菌として、S. gordoniiを選択した。実験に用いるための細菌の条件決め(濁度:OD600と菌数、適切な培地の選択、培養時間の設定)を行い、LF吸着試料と、対照群として水中に24時間浸漬した試料へのS. gordoniiの初期付着(OD600=1.0にPBSで調整した菌液と試料を2時間培養)について、クリスタルバイオレット染色により菌量の評価を行った。またLIVE/DEAD染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡にて、試料に付着した菌の生死を判定した。結果、全ての試料でLF浸漬群の細菌付着量が少なく、死細胞の量が多かった。以上の結果から、インプラントに使用される材料表面に、容易に抗菌蛋白質であるラクトフェリンを存在させることができ、さらに細菌付着を抑制することが示された。この結果は、抗菌性インプラント材料の開発の基礎実験として重要な意義を持つ。細菌付着、細胞への影響に関する研究は順調に進展している。しかし、当初の予定にある、インプラントに使用される材料表面への唾液タンパク質吸着についての検討については少し遅れているため平成25年度に集中的に行う。また、平成24年度は本研究について2度ほど国内の学会で発表し、平成24年度10月に開催された第60回日本歯科理工学会学術講演会で発表した演題について発表優秀賞を拝受した。平成23年度に行った研究は、平成24年の研究計画と多少前後する部分はあるが、研究は順調に進んでおり、平成23年度の目的はおおむね達成できた。しかし、平成23年度内に成果を発表することができなかったため、平成24年度では学会発表をする予定である。平成25年度はこれまでの研究に続き、1インプラント用材料表面への細菌付着、細胞への影響についてさらなる検討を行うこと。2試料表面への唾液タンパク質の吸着、LFの吸着について調べること。3海外の学会で成果を発表すること。4これまでの成果を論文にまとめること。以上4点を行っていく。平成24年度は、平成23年度にすでに着手したが、(1)LF吸着試料の細菌付着抑制効果について、他の条件下でも調べるとともに、プラーク形成中期、後期に優勢な菌など、他の細菌も調べる。(2)LF吸着試料の細胞への影響を調べる。(3)唾液蛋白質の吸着について調べる。また、平成23年度にやり残した、(4)試料の表面ぬれ性や電位を変え、細菌付着への影響を検討する。また、国内や海外の学会で今までの成果を発表する。平成25年度の直接経費は昨年度未使用分と合わせて752877円である。主に実験用の消耗品に使用するが、平成25年度は最終年度であるため国際学会での発表のための費用や論文の投稿費にも使用する必要がある。
文脈移動変換と高階書き換え理論に基づくプログラム検証法の研究

書き換えシステムに基づく新しいプログラム検証手法を開発することを目的として研究を進めている。最終年度である本年度に実施した研究では、以下のような成果が得られた。(1)束縛変数を伴う書き換えシステムに対しては、昨年度までの研究により、名目書き換えシステムと関連する体系における合流性の判定条件についての成果・知見が得られている。本年度は、群馬大学の浜名誠氏によって提案された高階の書き換え体系に対する合流性・停止性の自動判定システムであるSOLシステムの開発に携わった。SOLシステムは、本年度開催された国際合流性競技会および国際停止性競技会の高階部門において、最も多くの自動証明数を獲得することができた。この開発を通じて得られた合流性や停止性に関する知見は、従来の第一階項書き換えシステムに基づく帰納的定理証明手法である潜在帰納法および書き換え帰納法を、高階関数や多相型を持つ高階項に対する書き換えシステムに基づく手法へ拡張するにあたって重要になると考えられる。(2)文脈移動変換と関連する帰納的定理証明の手法に対しては、昨年度までの研究により、十分完全性を持たない書き換えシステムにおける潜在帰納法についての知見が得られている。本年度は、その知見を利用した新しいプログラム検証手法を、無限リストのような計算が停止しない式を部分的に含むプログラム例に適用し、その有効性を確認する調査を行った。この調査では、遅延評価の関数型言語とプログラム変換に精通している芝浦工業大学の篠埜功氏と共同で作業を進めた。また、提案する検証手法を適用する際に必要となる「項に対する十分完全性」を判定する手続きの構築に研究分担者とともに取り組み、第一階項書き換えシステムの場合を対象として判定のための導出システムを考案した。書き換えシステムに基づくプログラム検証手法を開発することを目的として研究を進めた。本年度の主な成果は、以下の通りである。(1)束縛変数を伴う書き換えシステムに基づく検証手法を開発するにあたって重要となる合流性に関して、以下の成果を得た。名目書き換えシステムについて研究代表者らの先行研究で得られていた合流性の判定基準を、危険対が存在する場合を含むいくつかのクラスに対する基準に拡張した。拡張された判定基準を合流性自動証明システムに実装し、さまざまな具体例による合流性判定の実験を行うことにより、その有効性を確認した。また、この合流性自動証明システムにおいて危険対生成と交差性判定の際に使用されている同変名目単一化の手続きを、推論規則の形で整理した。これらの理論的洞察と実証実験において得られた合流性や危険対に関する知見は、従来の書き換えシステムに基づく定理証明手法である完備化や帰納的定理証明手法である書き換え帰納法および潜在帰納法を、束縛変数を伴う書き換えシステムに基づく手法へ拡張するにあたって重要になると考えられる。(2)末尾再帰プログラムの性質の検証を容易にすることを目的としたプログラム変換である文脈移動変換については、以下の成果が得られた。十分完全性をもたない書き換えシステムに対する変換の正当性を定式化し、正当性が保証されるための条件を明らかにした。ここで取り扱った十分完全性をもたない書き換えシステムは、入力によって実行時エラーを発生する可能性があるプログラムに対応するため、本成果はそのようなプログラムに対する検証手法を開発するにあたって重要になると考えられる。名目書き換えシステムにおける合流性の判定基準と危険対の交差性判定手続きについて、おおむね計画通りに研究を進めることができ、検証手法を開発するために有用と考えられるさまざまな知見が得られたため。本年度の研究では、以下のような成果・知見が得られた。(1)左線形項書き換えシステムに対する並列閉包定理とその一般化による合流条件を、左線形名目書き換えシステムに対する合流条件に拡張した。この条件は、α安定性をもたない名目書き換えシステムに対しても有効であるため、従来の束縛変数を伴う高階書き換えの枠組みでは取り扱えない例に対しても適用可能である。一方、名目書き換えシステムのようにα同値性を明示的に扱うことはせず、α同値な項を同一視するような書き換えシステムの枠組みとその記述形式を提案し、分離並列簡約との強可換性を用いた合流条件を与えることを試みた。しかしながら、そのような枠組みにおいては書き換えシステムのクラスの条件を書き下すことが困難であることが分かり、合流条件の厳密な議論のためには名目書き換えシステムの枠組みのほうが優れているという知見が得られた。(2)プログラムを表す書き換えシステムの変換の一つである文脈移動変換においては、変換の正当性を保証するために文脈交換律などの等式が元の書き換えシステムの帰納的定理であることを証明する必要がある。研究代表者らの先行研究では、停止性や十分完全性をもたない書き換えシステムの変換の例について正当性を示しているが、その考え方を一般的な等式の帰納的定理の証明においても適用できないか検討した。帰納的定理の証明手法である潜在帰納法では、合流性と十分完全性が条件として必要であると考えられているが、本研究の検討の結果、十分完全性については全ての項に対してではなく証明すべき等式の両辺の項に対してのみ要求すればよいということが明らかになった。束縛変数を伴う書き換えシステムに対しては、名目書き換えシステムと関連する体系の合流条件についての成果・知見が、また、文脈移動変換に対しては、新しい帰納的定理の証明手法についての知見がそれぞれ得られ、おおむね計画通りに研究を進めることができたため。

(1)束縛変数を伴う書き換えシステムに対しては、昨年度までの研究により、名目書き換えシステムと関連する体系における合流性の判定条件についての成果・知見が得られている。本年度は、群馬大学の浜名誠氏によって提案された高階の書き換え体系に対する合流性・停止性の自動判定システムであるSOLシステムの開発に携わった。SOLシステムは、本年度開催された国際合流性競技会および国際停止性競技会の高階部門において、最も多くの自動証明数を獲得することができた。この開発を通じて得られた合流性や停止性に関する知見は、従来の第一階項書き換えシステムに基づく帰納的定理証明手法である潜在帰納法および書き換え帰納法を、高階関数や多相型を持つ高階項に対する書き換えシステムに基づく手法へ拡張するにあたって重要になると考えられる。(2)文脈移動変換と関連する帰納的定理証明の手法に対しては、昨年度までの研究により、十分完全性を持たない書き換えシステムにおける潜在帰納法についての知見が得られている。本年度は、その知見を利用した新しいプログラム検証手法を、無限リストのような計算が停止しない式を部分的に含むプログラム例に適用し、その有効性を確認する調査を行った。この調査では、遅延評価の関数型言語とプログラム変換に精通している芝浦工業大学の篠埜功氏と共同で作業を進めた。また、提案する検証手法を適用する際に必要となる「項に対する十分完全性」を判定する手続きの構築に研究分担者とともに取り組み、第一階項書き換えシステムの場合を対象として判定のための導出システムを考案した。束縛変数を伴う書き換えシステムに関して、名目書き換えシステム以外の関連する体系についても調査を進め、それぞれの体系の関係とそれらの体系に基づく検証手法の有効性を明らかにする。これまでに得られた成果・知見を利用して、書き換えシステムに基づく新しいプログラム検証手法を開発する。また、開発した検証手法を実際のプログラムの例に適用することにより、その有効性を明らかにする。受領額と支出額の差引額は874円となり、ほぼ予定通りに使用された。物品購入費の補充にあてる。
Lnk機能抑制タンパクによる造血幹細胞増幅法の開発と遺伝子治療への応用

造血幹細胞を用いた遺伝子治療で一般的に用いられるレトイロウイルスベクターは染色体にランダムに挿入される性質を持ち、がんを発症する危険性がある。この危険性を回避する目的で、本研究では目的タンパクと膜透過性ペプチド(アルギニンが8つtandemに並んだもの)の融合タンパクを発現するベクターを作製し、その機能を確認した。モデル系としてLnkタンパクを用いた。Lnkタンパクは造血幹細胞増殖因子の一つであるTPOからのシグナル伝達物質Jak2の機能を調節するアダプタータンパクである。まず初めにLnkタンパクまたはドミナントネガティブLnkタンパクと膜透過性ペプチドの融合タンパクを発現するベクターを作製し、大腸菌に産生させ、最終的に膜透過性ペプチドと融合させたタンパクを精製した。これらのタンパクを培養液中に添加すると培養細胞質内へ高率に移行した。このうち膜透過性LnkタンパクはJak2発現細胞株のTPOによる増殖反応を抑制した。さらにこの増殖抑制はアポトーシスの誘導によることを証明した。同様のアポトーシス誘導はJak2が恒常的に活性化されている白血病細胞株HELでも観察された。以上のことから、膜透過性LnkタンパクはJak2活性化が関与する骨髄増殖性疾患および白血病でアポトーシスを誘導し治療効果を発揮できるものと期待される。一方、ドミナントガティブLnkタンパクは造血幹細胞を増幅する。現在、膜透過性ドミナントネガテブLnkタンパクを用いて造血幹細胞増幅機序を検討中であり、造血幹細胞をex vivoで増幅する技術の開発につながることが期待される。造血幹細胞をex vivoで増幅する技術として、今年度はヒトLnk機能抑制作用を有するドミナントネガティブLnkと膜透過性ペプチドの融合タンパクを発現するベクターを作製し、大腸菌に産生させ、最終的に膜透過性ペプチドと融合したドミナントネガティブLnkタンパクを精製した。まず膜透過性ペプチドとして8つのアルギニンが並んだ配列RRRRRRRRをコードするオリゴヌクレオチドをドミナントネガティブLnkの5'端に結合させた膜透過性ドミナントネガティブLnkを作製した。ドミナントネガティブLnkとしてはヒト野生型Lnk368番目のアルギニンをグルタミン酸に置換しPHドメインとC末を削ったものを用いた。タンパクが発現するかどうかについてウエスタンブロットにて検討を行なったところ、予想されたサイズのバンドが検出された。上記膜透過性タンパクの精製および認識を容易にするためHis tag配列およびEGFPを付加したコンストラクトを作製し、大腸菌に産生させ、精製を行なった(R8-EGFP-Histag)。同様の手順で精製したR8を除いたタンパク(EGFP-His tag)を用いて、R8を付加したタンパクが機能するかどうかフローサイトメーターにて検討を行なったところ、R8を付加したタンパクのみ細胞内に取り込まれることを証明した。以上のことから培養上清に添加した細胞内タンパクが、細胞内に有意に取り込まれることを確認できた。現在、精製したドミナントネガティブLnkタンパクが機能するかどうかについて細胞レベルで研究を行なっている。
国際公共利益の制度化における国際立法過程の研究

研究期間内に、次の5つの作業を行った。第1は、国際刑事裁判所規程の立法過程における諸問題について、条約作成過程の当事者に、作成過程上の問題、条約の実際細目の作成上の問題点の聞き取りを行った。第2に、国際法における人権保護について、国際法における人権保護の正当化、特に人権基準をなぜ国際的に一律化する必要があったかという角度から分析するとともに、一国内の人権の侵害に対する国際的な対応においては、いかなる要因が重要視されたかの点から人権保護の位置づけを行った。その結果、人権の制度化および実行が国際競争秩序および国際安全保障の維持と結びついてきたこと、人権は国際福祉社会論の立場から主権に補完的な基準として位置づけられるべきことを結論として示し、報告した。第3に、国際法学会からの「国際紛争の統合的アプローチの模索」と題する報告依頼に対して、問題を、国際公共利益の制度化、就中、国際公共利益の国際立法の不備が国際紛争を複雑化している問題として位置づけ、その問題への公的対応としてはいかなる理論的基礎づけが必要かを中心に報告し、報告を加筆して国際法外交雑誌に掲載した。第4に、武力紛争法の研究の一環として、国際的な公的秩序の観点から、中立制度をどのように位置づけるべきかを検討し、中立の歴史研究および第二次大戦後の事例の位置づけについて、事実と規範の関係の理解を逆転することが必要であることを論じた。最後に、本研究の理論課題である、国際公共利益に関わる制度の一般化のための理論枠組がどうあるべきかについて、国際立法における動向、および慣習法論の諸見解を基に検討し、それを国際法規の一般的妥当の問題として位置づけ、理論的には一般性を解釈論的に構成することの必要性を論じた。本年は、次の4つの作業を行った。第1は、国際刑事裁判所規程の立法過程における諸問題について、条約作成過程に関わった当事者に、作成過程上の問題、条約実際細目の作成上の問題点の聞き取りを行った。特に後者の実施細目に関し、質問項目に上げた論点については、国際裁判としての信頼性を高めるための慎重な手続化がなされていることが示された。第2に、国際人権の位置づけについて、従来のように、社会権と自由権との関係を分離説と一体説の対立という角度から問題にせず、国際社会では歴史的になぜ社会権が自由権に先立って登場したかを、国際法における人権の正当化の角度、特に人権基準をなぜ国際的に一律化する必要があったかという角度から分析し、その結果、人権の制度化が国際競争秩序および国際安全保障の維持と結びついてきたこと、その点で、国際人権は主権と対立させる概念ではなく、国際福祉社会論の立場から主権に補完的な基準として位置づけられるべきことを、暫定的な結論として位置づけ、法理論研究会で報告した。第3に、国際法学会からの「国際紛争の統合的アプローチの模索」と題する年次大会における報告依頼に対して、その問題を、国際公共利益の制度化、とりわけ国際公共利益の国際立法の不備が国際紛争を複雑化している問題として位置づけ、その問題への対応は、いかなる国際秩序論に基づいて公的対応を構築することが必要であること、それ故に理論的には、実効性を持たない制度の妥当性の秩序論的再検討が必要であることを報告した。最後に、武力紛争法の研究の一環として、国際的な公的秩序の観点から、中立制度をどのように位置づけるべきかを検討し、中立の歴史研究および、第二次大戦後の事例の位置づけについて、事実と規範の関係の理解が逆転することが必要であることを論じた。

第2に、国際法における人権保護について、国際法における人権保護の正当化、特に人権基準をなぜ国際的に一律化する必要があったかという角度から分析するとともに、一国内の人権の侵害に対する国際的な対応においては、いかなる要因が重要視されたかの点から人権保護の位置づけを行った。その結果、人権の制度化および実行が国際競争秩序および国際安全保障の維持と結びついてきたこと、人権は国際福祉社会論の立場から主権に補完的な基準として位置づけられるべきことを結論として示し、報告した。第3に、国際法学会からの「国際紛争の統合的アプローチの模索」と題する報告依頼に対して、問題を、国際公共利益の制度化、就中、国際公共利益の国際立法の不備が国際紛争を複雑化している問題として位置づけ、その問題への公的対応としてはいかなる理論的基礎づけが必要かを中心に報告し、報告を加筆して国際法外交雑誌に掲載した。第4に、武力紛争法の研究の一環として、国際的な公的秩序の観点から、中立制度をどのように位置づけるべきかを検討し、中立の歴史研究および第二次大戦後の事例の位置づけについて、事実と規範の関係の理解を逆転することが必要であることを論じた。最後に、本研究の理論課題である、国際公共利益に関わる制度の一般化のための理論枠組がどうあるべきかについて、国際立法における動向、および慣習法論の諸見解を基に検討し、それを国際法規の一般的妥当の問題として位置づけ、理論的には一般性を解釈論的に構成することの必要性を論じた。
細菌型チロシンキナーゼを標的とした革新的抗菌薬の開発研究

細菌には、真核生物のものと類似性がなく、構造が全く異なるチロシンキナーゼが存在する。細菌型チロシンキナーゼの性質を調べるため、黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ触媒サブユニットCapB2と調節サブユニットCapA1に種々のタグを付加し、HEK293T細胞に発現させた。CapB2に対する抗体を作製し、25種類以上のタグを試したところ、細菌型チロシンキナーゼはN末に蛍光タンパクを付加させた場合にのみ、動物細胞で発現することがわかった。単独発現ではCapA1は細胞膜、CapB2は細胞質に局在した。共発現させるとCapB2は細胞質から膜に移行、CapA1と局在が一致し、CapB2とCapA1の相互作用を可視化することができた。また相互作用により、CapB2のチロシンキナーゼ活性は亢進した。CapA1全長ではなくC末の細胞質領域のみでも、CapB2との相互作用が観察された。CapA1活性化領域に四量体を形成する蛍光タンパクタグ、CapB2に単量体蛍光タンパクタグを付加して共発現させるとCapB2のリン酸化は著しく上昇した。リン酸化部位については、様々な状況証拠からタグ部分であると推測されていたが、実際に蛍光タンパクタグがチロシンリン酸化されることを確認した。また同時にCapB2のC末チロシンクラスターが自己リン酸化されることも明らかとなった。チロシンクラスターは変異、欠失させてもタグ部分のリン酸化は検出されることから、キナーゼ活性には自己リン酸化は必要ないことが判明した。CapA1のC末からアミノ酸6残基を欠失させるとCapB2と相互作用しなくなり、ここが結合部位の一部であると推定された。また類縁のCapB1はCapB2と70%以上の相同性があるにもかかわらず、不活性であると報告されてきたが、127番目のバリンがCapAとの相互作用とキナーゼ活性に大きく影響していることが明らかとなった。細菌型チロシンキナーゼ阻害物質のスクリーニングは予定通り進捗し、活性物質がいくつか見いだされている。黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼCapB2が、付加した蛍光タンパクタグをチロシンリン酸化することを証明した。蛍光タンパクがチロシンキナーゼの基質になる例は我々の知る限りなく、細菌型チロシンキナーゼは周囲の配列に依存しない基質特異性の低いチロシンキナーゼであると思われる。またHEK293T細胞内でCapB2のC末チロシンクラスターが実際に自己リン酸化されることも示した。触媒サブユニットと調節サブユニットの相互作用が可視化できるようになったことで、活性化機構の解析は進んだ。今までCapB1がなぜキナーゼとして不活性であるかは不明であったが、その理由の一部が127番目のバリンにあることが明らかとなった。127番目のアミノ酸近辺の領域は、グラム陰性菌のものも含め、細菌型チロシンキナーゼ間でよく保存されており、Walker domains、C末チロシンクラスターに加え、細菌型チロシンキナーゼのsignature motifと見なしてもよいと考えられる。現在CapB1とCapB2の様々なキメラを作製し、活性化機構をより詳しく解析している。引き続き黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ阻害物質のスクリーニングを行う。黄色ブドウ球菌以外のチロシンキナーゼの活性も検出可能となっているので、菌によって阻害剤感受性に違いがあるかどうかを調べる。異なる菌由来の触媒サブユニットと調節サブユニットをHEK293T細胞で共発現させると、相互作用、キナーゼ活性化が起きる場合と起きない場合がある。細菌型チロシンキナーゼの活性化について、種々の菌に共通する機構、個々のキナーゼに特有の機構、グラム陽性菌とグラム陰性菌の相違点等を調べる。また黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼとは相同性のない結核菌のチロシンキナーゼ、また結核菌チロシンホスファターゼをクローニングしたので、HEK293T細胞での活性発現の検討を行う。また、本研究で開発した手法を、一般的なタンパク質間相互作用の解析へ応用することを目指す。近年ほとんどの抗生物質が効かない多剤耐性菌が出現、大きな問題となっている。細菌のチロシンキナーゼは、真核生物のものと類似性がなく、構造が全く異なるため、その阻害剤は細菌のみに作用する選択性が期待できる。しかし活性の検出方法、評価系がまだ確立されておらず、BY-kinaseの阻害物質はまだ知られていない。本研究では細菌型チロシンキナーゼ阻害物質の評価系を構築し、スクリーニングを行い、細菌型チロシンキナーゼ阻害剤の抗菌薬、抗結核薬としての可能性を追求する。黄色ブドウ球菌のチロシンキナーゼの触媒サブユニットのCapB2と調節サブユニットのCapA1をクローニングし、CapB2の全長とCapA1の活性化領域を融合させたCapA1B2プラスミドを作製した。CapA1B2のN末にさらにタグを付加してHEK293T細胞に発現させ、cell-based ELISA系を構築した。所有する化合物ライブラリーに阻害物質を探索し、約200化合物を評価した。多くの保存された部位の変異体を作製し、キナーゼ活性に必要なアミノ酸残基や領域を特定することができた。CapB2とCapA1、それぞれの全長をHEK293T細胞に発現させたところ、単独発現ではCapA1は細胞膜、CapB2は細胞質に局在した。

共発現させるとCapB2は膜に移行、CapA1と局在が一致し、CapB2がCapA1と相互作用することが確認できた。CapA1とCapB2それぞれの欠失体を多数作製し、相互作用に関わるN末端およびC末端の領域を特定した。またCapB2はCapA1類縁のCapA2とも結合すること、キナーゼ活性が確認されないCapB1はCapA1ともCapA2とも相互作用しないことがわかった。スクリーニングは強力な阻害物質は得られなかったものの、順調に進捗した。CapA1の活性化領域とCapB2の融合ではなく、それぞれの全長を発現させ、CapB1の細胞内局在の変化を観察することにより、CapA1とCapB2の相互作用を解析できるようになったことは収穫であった。CapA1のC末端細胞質領域を欠失させるとCapB2の膜移行は観察されず、この部位がCapB2と結合することが示された。またCapB2変異体を多数作製し、CapA1結合能とキナーゼ活性の関連を調べたところ、CapB2キナーゼ活性にはCapA1との相互作用が必須であることが判明した。また類縁のCapB1はCapA1とは結合せず、それがCapB1にキナーゼ活性が観察されない理由の一つであると考えられた。黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ阻害剤スクリーニングは順調に進捗した。当初触媒サブユニットCapB2の全長と調節サブユニットCapAの活性化部位のキメラに蛍光タンパクを付加し、HEK293T細胞に発現させてキナーゼ活性を検出していた。昨年CapA、CapBをそれぞれ全長で、別々の蛍光タンパクを付加して発現させ、CapB2の細胞内局在変化を観察することにより、CapAとCapB2の相互作用が解析可能になった。引き続き種々CapB2変異体を作製しCapAと相互作用する領域を調べ、CapB2キナーゼ活性化にCapAとの結合が必須であることを明らかにした。またCapA全長ではなくC末の活性化部位のみを膜移行シグナルを付けた蛍光タンパクと融合し、別の蛍光タンパクを付加したCapB2と共発現させた。CapA全長と比較して活性化部位のみではHEK293T細胞での発現量が大幅に増加し、同時にCapB2のリン酸化が著しく上昇した。この時CapB2だけでなく蛍光タンパク付加したCapA活性化部位もリン酸化された。CapA部分にチロシンが存在しなくてもリン酸化は検出されることから、タグの蛍光タンパクがリン酸化されていると推測された。CapB2部分のリン酸化も「自己リン酸化」ではなく、付加した蛍光タンパクが基質となっていると思われる。CapB2はチロシン残基周囲の配列に依存しない基質特異性の低いチロシンキナーゼであると考えられる。また黄色ブドウ球菌だけでなく枯草菌と肺炎球菌のBY-kinaseの細胞での発現にも成功した。触媒サブユニットと調節サブユニットを交換しても、多くの場合両サブユニットの相互作用とチロシンリン酸化が観察され、BY-kinase活性化機構はグラム陽性菌間である程度共通していることが示唆された。さらにグラム陰性菌である大腸菌のBY-kinaseの活性発現にも成功した。CapA全長ではなく、C末の細胞質領域の活性化部位に膜移行シグナルを付加し、CapB2と共発現させたところ、CapB2のキナーゼ活性が著しく昂進した。