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原典資料の調査を基礎とした仮名垣魯文の著述活動に関する総合的研究

『大洋新話蛸入道魚説教』『松の栄千代田神徳』『松飾徳若譚』などを購入した。これらの結果、『高橋阿伝夜刃譚』の初編に複数の異版があることが確認され、また、「魯文閲」と称しているものにおける魯文の役割について新たな知見を得ることができた。これらの調査と並行して、前年度に引き続き、魯文の動向を具体的に再構成するための基礎調査(仮名読新聞・東京絵入新聞・いろは新聞などからの記事のピックアップ)を行いデータを蓄積した。魯文文献の書誌データ及び所在情報を掲載し、本研究参加者の用に供するために参加者限定のホームページを開設した。併せて同ホームページにおいて研究会の資料等の情報を掲載し、参加者間の情報の共有を図った。また、研究情報の交換に即時的に対応するためにメーリングリストを開設し、積極的に利用した。国文学研究資料館のメンバーを中心とした月例研究会を7回、研究分担者全員による研究会を2回開催し、著作解題作成に向けた基礎事項の調整と、個々の著作に関する研究討議を行い、『薄緑娘白波』『冬楓月夕栄』『松栄千代田神徳』『仮枕巽八景』『稗史年代記』等27作品について解題の基礎稿を作成した。仮名垣魯文の著作について個人蔵のものを中心に所在情報を追加した。これに基づき、研究分担者が所蔵する仮名垣魯文の著作の書誌調査を行い、本研究の用に供するためデジタルカメラにより全文画像を撮影した。本研究参加者によって、この画像は研究会における発表及び、解題の基礎稿の作成に際し積極的に利用された。また、『滑稽富士詣』『滑稽栗毛弥次馬』などを購入し、魯文著作の書誌上の諸問題を中心とする研究を行った。本研究課題のこれまでの研究成果を活用し、それを広く社会に発信することを目的として、10月17日から11月2日まで、国文学研究資料館において「仮名垣魯文百覧会」と題する展示を開催するとともに、それにあわせて公開シンポジウム「江戸から明治へ-仮名垣魯文を中心に-」を催した。昨年度に引き続き、国文学研究資料館のメンバーを中心とした月例研究会を6回、研究分担者全員による研究会を2回開催し、著作解題作成に向けた基礎事項の調整と、個々の著作に関する研究討議を行い、『西洋料理通』『夢物語高野実伝』『浮世機関西洋鑑』『大山道中膝栗毛』『俵藤太竜宮蜃話』等の作品について解題の基礎稿を作成した。研究会を6回開催し、参加者による討議を行う中で、『雨夜鐘四谷怪談』『江之嶋詣栗毛後馬』『義経蝦夷軍記』『男伊達花川戸』『日蓮上人御一代記』『甲越川中島軍記』など仮名垣魯文の著作22点に関する解題を分担作成した。このことにより、これまでその存在がほとんど知られていなかった江戸の菓子屋の配り本『福和内笑門新舖』をはじめ、従来研究の対象とされてこなかった魯文作品の分析を行うとともに、並行して進めた成田仏教図書館など各地の図書館・文庫に所蔵される魯文著作の調査、及び画譜・絵手本・端唄本・錦絵・引札などに残された魯文の序文・填詞などの調査とを合せ、魯文の多様な著述活動の全容解明へ向けた研究を前進させた。これらの研究により、『西洋道中膝栗毛』『胡瓜遣』『西洋料理通』『安愚楽鍋』などの一連の開化期戯作を万笈閣・誠之堂から出していった時期の魯文の動向を、北門社や横浜毎日新聞との関連を視野に入れつつ具体的に跡づけることが可能となったことは、文学のみならず今後の明治初期の文化状況の研究にとって重要な意味をもつことになろう。
三島由紀夫の演劇・映像・アダプテーションに関する総合的研究

本研究は、三島由紀夫作品が演劇や映像作品として上演され、あるいはアダプテーションとして創作・受容されてきた様相を探り、1950年代から没後50年近い現在に至る国内外の文化・社会状況との接合を通して、三島由紀夫とその文学が、複数のメディアを横断する、いわば〈総合的文化現象〉として生成されていく過程を明らかにすることを目的にしている。この目的のために、平成29年度に「三島由紀夫とアダプテーション研究会」を発足させて第1回研究会を開催したが、平成30年度は、引き続き2回の研究会を開くことができた。第2回(2018年9月8日、日本大学)は、「演劇特集」として、三島演劇に関する2本の研究発表(久保田裕子氏、嶋田直哉氏)と、三島由紀夫の戯曲を多く上演している三条会の演出家・関美能留氏に講演をしていただいた。第3回(2019年3月9日、日本大学)では、特集「三島由紀夫と映画ー「美しい星」の現在」として、三島映画や「美しい星」に関する2本の研究発表(柳瀬善治氏、田尻芳樹氏)と、映画「美しい星」(2017年)の吉田大八監督に制作の立場からの講演をしていただいた。関氏・吉田氏からは、実作の立場からアダプテーション研究を進めるうえでの大きなヒントをいただき、参加者からの評価も高かった。平成30年度に、研究代表者の有元伸子は、3つの口頭発表を行った。とりわけ日本近代文学会秋季大会のシンポジウムでは、特集「アダプトされた文学の可能性ー平準化する人文知の受容現象を問う」のなかで本科研における成果を大きく示すことができた。研究分担者の久保田裕子は、2本の口頭発表を行い、タイ国日本研究国際シンポジウム2018では三島戯曲の海外受容について成果を報告した。同じく研究分担者の武内佳代は、1本の論文と1本の口頭発表を行い、雑誌メディアにおける三島等の戦後派作家の受容の解明を進展させた。前年度に発足させた三島由紀夫とアダプテーション研究会を、9月・3月の2回開催して、研究発表と実作者による講演によって、充実した討議を行うことができた。また、研究代表者・分担者ともに、それぞれの研究を進めて、成果を発表することができた。平成31年度も、引き続き「三島由紀夫とアダプテーション研究会」の第4回を開催する。また、研究代表者・分担者ともに、各自の分担(演劇、海外受容、映像・雑誌メディア)に沿って研究を遂行するとともに、打合せ会において、各自の進捗状況を共有していく。また、最終年度であるために成果発表を積極的に行う。本研究は、三島由紀夫作品が演劇や映像(映画、テレビドラマ)作品として上演され、あるいはアダプテーションとして創作・受容されてきた様相を探り、1950年代から没後50年近い現在に至る国内外の文化・社会状況との接合を通して、三島由紀夫とその文学が、小説以外の複数のメディアを横断する、いわば〈総合的文化現象〉として生成されていく過程を明らかにすることを目的としている。平成29年度は「三島由紀夫とアダプテーション研究会」を発足して、第1回の研究会を広島大学で開催し、参加者を募って、3名による研究報告と討議を行った。研究の基盤となる資料の収集と整理につとめるとともに、アダプテーション、メディア、ジェンダー/セクシュアリティ、ポストコロニアルなどの観点による作品と受容の考察を行った。また、研究会を通じて、三島や演劇・映像・アダプテーションに関わる研究者のネットワーク形成と共同考察への基盤づくりを行った。平成29年度に、研究代表者の有元伸子は、3つの口頭報告を行った。特に、日本演劇学会と第1回三島由紀夫とアダプテーション研究会では、「黒蜥蜴」を上演史から検討して、乱歩の原作ー三島由紀夫の戯曲ー三島以降の脚本や上演による「黒蜥蜴」イメージの形成について考察し、アダプテーション検討の重要性を提示した。研究分担者の久保田裕子は、日本近代文学会国際研究集会において、三島由紀夫のタイ表象を検討し、海外における受容とアダプテーションの関係を提示した。同じく研究分担者の武内佳代は、『日本古書通信』に論考を断続連載し、女性誌に掲載された三島由紀夫作品を検討して女性読者による受容の解明に務めた。三島由紀夫とアダプテーションに関わる研究方法の検討・研究成果の発表・共同研究の基盤づくりのために、「三島由紀夫とアダプテーション研究会」を発足して、2018年3月に第1回の研究会を開催することができた。各地から三島由紀夫の専門家のみならず演劇・映像・アダプテーションに関心をもつ研究者が集まり、充実した討議を行った。

第2回(2018年9月8日、日本大学)は、「演劇特集」として、三島演劇に関する2本の研究発表(久保田裕子氏、嶋田直哉氏)と、三島由紀夫の戯曲を多く上演している三条会の演出家・関美能留氏に講演をしていただいた。第3回(2019年3月9日、日本大学)では、特集「三島由紀夫と映画ー「美しい星」の現在」として、三島映画や「美しい星」に関する2本の研究発表(柳瀬善治氏、田尻芳樹氏)と、映画「美しい星」(2017年)の吉田大八監督に制作の立場からの講演をしていただいた。関氏・吉田氏からは、実作の立場からアダプテーション研究を進めるうえでの大きなヒントをいただき、参加者からの評価も高かった。平成30年度に、研究代表者の有元伸子は、3つの口頭発表を行った。とりわけ日本近代文学会秋季大会のシンポジウムでは、特集「アダプトされた文学の可能性ー平準化する人文知の受容現象を問う」のなかで本科研における成果を大きく示すことができた。研究分担者の久保田裕子は、2本の口頭発表を行い、タイ国日本研究国際シンポジウム2018では三島戯曲の海外受容について成果を報告した。同じく研究分担者の武内佳代は、1本の論文と1本の口頭発表を行い、雑誌メディアにおける三島等の戦後派作家の受容の解明を進展させた。前年度に発足させた三島由紀夫とアダプテーション研究会を、9月・3月の2回開催して、研究発表と実作者による講演によって、充実した討議を行うことができた。また、研究代表者・分担者ともに、それぞれの研究を進めて、成果を発表することができた。平成30年度も、研究方法の検討、研究成果の発表、共同研究の基盤づくりのために、「三島由紀夫とアダプテーション研究会」の活動を継続する予定である。既に第2回研究会の日時・会場・報告者が内定しており、その後も継続して活動を続けていく。また、研究代表者・分担者ともに、各自の分担(演劇、海外での受容、映像)に沿って研究を遂行するとともに、打合せ会において互いの進捗状況と研究成果を共有していく。平成31年度も、引き続き「三島由紀夫とアダプテーション研究会」の第4回を開催する。また、研究代表者・分担者ともに、各自の分担(演劇、海外受容、映像・雑誌メディア)に沿って研究を遂行するとともに、打合せ会において、各自の進捗状況を共有していく。また、最終年度であるために成果発表を積極的に行う。(理由)演劇・映像関係資料に関して、古書店等で見つからず、購入できないものがあった。(使用計画)必要な書籍・雑誌・映像資料等の購入に務める。本年度も、研究会の開催を予定しており、招待発表者の旅費や講演料等に充当する。(理由)演劇・映像関係資料に関して、入手が難しいものがあった。本年度も研究会を開催して、招待発表者の旅費や講演料等に充当するとともに、成果発表を行う。
情報探索における思考停止現象の解明：中高生を対象とした支援方法への展開

現代社会において,自ら情報を探索し,その妥当性や信頼性を検証する能力の育成は学校教育の重要な課題の一つだといえる。本研究では,情報の探索や吟味を途中で放棄したり,諦めたりする学習者の状態を「思考停止」と表現し,思考停止現象の特徴を明らかにするとともに,そうした学習者への指導方法の提案を目的とする。本年度は,第1に,思考停止現象の特徴を明らかにするため,中学校1年生の1学級を対象とした情報探索課題(自分が選択した本の魅力を探索する)を実施し,その後に情報探索を終えた理由について記述するように求めた。自由記述の分析により,生徒は消極的な理由(e.g.,探索に飽きる)だけでなく,積極的な理由(e.g.,必要な情報は全て探索したと判断する)によって情報探索を終えていたことが示された。これらの分析結果をふまえ,情報探索を終えた理由に関する項目を作成した。第2に,中学校1年生の3学級を対象に同様の情報探索課題を実施し,その後に探索した情報を他者にプレゼンテーションする活動を行った。まず,情報探索課題後に情報探索を終えた理由に関する質問項目への回答を求めた。その際には,情報探索に影響を及ぼしうる個人差要因として読書量や批判的思考態度,およびプレゼンテーションにおける聴き手への意識も測定した。また,プレゼンテーションに対する聴き手の評価と情報探索,および思考停止との関連についても分析することとした。情報探索が含まれる学習活動(e.g.,調べ学習,探究型の学習)では,他に比べて早く,また少ない情報量で探索を終える学習者がしばしば確認される。こうした学習者が実際に探索を放棄した「思考停止」の状態にあるのか,あるいはその後の活動を見据えて積極的に探索を終えたのかによって,その後の指導方法は異なるだろう。本年度の研究は,こうした指導方法を考えるための基礎的知見を提供すると考えられる。申請時の計画通り,情報探索活動において思考停止現象が生起する原因についての検討を行った。また,その結果をふまえて情報探索を終えた理由についての項目を作成,測定すると共に,情報探索活動における「思考停止」がプレゼンテーション活動やその質とどのように関連しているかを検討するための実験授業を完了した。さらに,これらの知見を踏まえて,情報探索を促すための指導方法について,研究協力校とも十分に協議を重ねている。以上の事から,おおむね順調に進展していると判断できる。まず,本年度に収集したデータの解析を進め,研究知見をまとめていく。その結果をふまえ,情報探索を促すための指導方法について考案し,実際の授業を対象とした授業内実験を行うことで,その効果検証を行う。次年度使用額が生じた理由:申請時の計画通りに研究を遂行しデータも取得したが,データ入力の依頼候補者の都合により,データ入力を依頼できなかったことから,データ入力用の人件費が残金として発生した。

また,業務上の理由から当初予定していた学会参加ができなくなったため,旅費も残金として発生している。使用計画:遅れていたデータ入力を依頼すると共に,学会参加も継続し,基本的に申請時の計画通りに研究を進める。
多価陽イオン伝導性一軸配向多結晶体の材料設計と開発

結晶中に存在する多価陽イオンは、周囲に存在する陰イオンとの静電的相互作用が強く、固体中を伝導することは一般に極めて困難である。さらに多価陽イオンの伝導性に優れる化合物は、高温下での構造安定性に乏しい傾向にある。今回、異方性の強い結晶構造中に存在する多価陽イオンは、ある特定の結晶学的な一次元方向であれば、骨格構造を安定に保ちつつ、その方向に比較的容易に伝導し得るのではないかと考えた。本研究では、多価陽イオンが一次元的に伝導可能な結晶構造型の候補を見出し、さらにその化合物の結晶粒子を応募者が確立した最新の粒子配向手法を用いて一軸配向化し、高イオン伝導性配向多結晶体の開発を目指す。
ヒト組み換え活性化遺伝子(RAG)のゲノム構造の解析と転写調節機構の解明

1)ヒトRAGのゲノム構造に関する研究:ヒトRAG-1cDNAの断片を用いてRAG-1遺伝子の第一エクソンと第二エクソンを含むクローンを単離し、RAG1遺伝子のゲノム構造と転写開始点を決定した。次に、RAG2cDNAをプローブにしてRAG2遺伝子の第1エクソンと第2エクソンを含むクローンHRAG-4を単離し、制限酵素地図の作成および一部の塩基配列を決定した。同時に、RAG2遺伝子の転写開始点を決定し、RAG2ゲノム遺伝子構造を決定した。2)ヒトRAGのクロマチン構造に関する研究:RAG-1発現、非発現細胞、あるいは非リンパ系細胞におけるDNaseI高感受性領域の解析を行い、転写開始点の上流約3.5kbp(HS1)、約0.8kbp(HS2)、転写開始点付近(HS3)、イントロン(HS4)に合計4箇所のDNaseI高感受性領域が存在すること、HS1は全ての細胞株に認められたがHS2、3、4はRAG-1発現細胞株に特異的に認められることを明らかにした。3)ヒトRAGの転写調節に関する研究:RAG1遺伝子の転写開始点5′上流-2.8kbpまでの領域について、さまざまな挿入断片をルシフェラーゼ遺伝子に連結したベクターを作成しプロモーター活性を測定した。その結果、転写開始点5′上流-110bpから-86bpの領域がRAG-1遺伝子の基本的プロモーター活性に必要であること、転写開始点の上流97bpにあるCCAATboxがプロモーター活性に必須であることを明らかにした。この領域はDNaseI高感受性部位HS3に含まれていることから、RAG1の発現は、ccaat部位のクロマチン構造変化により制御されていると結論した。現在、同様の手法を用いてRAG2の転写調節に関する研究および他のシスエレメントに関する研究を行っている。
ミトコンドリア蛋白質の翻訳異常に伴う活性酸素の産生と細胞周期連関

ミトコンドリアには独自のゲノムがあり、電子伝達系に関わる蛋白を13コードしている。ミトコンドリアDNA維持機構は厳重に調整されていることが考えられているがその分子機構は明らかでない。我々はミトコンドリアDNA維持に関るTFAMに注目しTFAMに結合する蛋白を免疫沈降法で多数同定してきた。このうちERAL-1に着目しその機能解析を行った。本研究ではミトコンドリアDNA維持と翻訳に関わるERAL1およびp32蛋白質の機能について研究した。(方法と結果)(1)ERAL1に結合するRNA、蛋白を免疫沈降法で確認したところ、ERAL1はミトコンドリア12S rRNAと結合することを見出し、さらにミトコンドリア翻訳因子と多数結合することを見出した。sucrose gradientによるERAL1の局在はリボソーム小サブユニットと共局在していた。ERAL1 siRNAをHeLa細胞に処理したところミトコンドリア膜電位の低下を観察した。さらにROSの産生増加を確認した。ERAL1ノックダウンにより細胞はG2/M arrest, apoptosisを起こすことを見出した。これらの結果はERAL1はミトコンドリアリボソーム小サブユニットに結合し翻訳を制御することを示唆している。(2)p32の全身ノックアウトマウスを作製したところ、胎生10週前後で致死であった。この胎児マウスからMEF細胞株を樹立し、ミトコンドリア機能を測定したところ、電子伝達系活性が激減し、おそらくそれに付随してと思われるROSの産生増加を見出した。活性低下はmtDNAコード蛋白質の翻訳障害が原因であった。現在の所、p32はミトコンドリアリボソームにmRNAを結合させ翻訳を開始させる経路に必要であることを示唆する結果を得ている。このうちEEAL-1に着目しその機能解析を行った。本研究ではミトコンドリアDNA維持と翻訳に関わるERAL1の機能について研究した。(方法と結果)(1) ERAL-1は大腸菌からヒトまでよく保存された領域をもち細胞分画法によりミトコンドリアマトリックスに存在することを示した。さらに免疫組織染色法によりミトコンドリアに共局在することを確認した。(2) ERAL1に結合するRNA、蛋白を免疫沈降法で確認したところ、ERAL1はミトコンドリア12 SrRNAと結合することを見出し、さらにミトコンドリア翻訳因子と多数結合することを見出した。(3) sucrosegradientによるERAL1の局在はリボソーム小サブユニットと共局在していた。(4) ERAL1のミトコンドリアの機能を評価するためERAL1 siRNAをHeLa細胞に処理したところミトコンドリア膜電位の低下を観察した。さらにERAL1siRNAによりH_2DCFDAによりROSの産生増加を確認した。(6) ERAL1ノックダウンにより細胞はG2/M arrest,apoptosisを起こすことを見出した。(7) ERAL1さらに、TFAMに結合する種々の因子についても発現をノックダウンすることで細胞増殖停止を来たすことを見出している。
機能化ナノカーボンによる高性能金属空気二次電池の構築

金属空気電池は空気中の酸素を正極活物質とするため高い理論エネルギー密度を有しており、大容量蓄電池を要する産業分野において大きな期待が寄せられている。しかし、現行の金属空気電池は充電を行うと、空気極を構成するカーボンブラックが酸化消耗するため、空気電池の充電反応は困難である。そこで申請者はカーボンに替わる電極材料を探索してきた。その中で最近、ナノカーボンの一種であるグラフェンが充電反応に対して安定であることを見出した。しかし、グラフェンは充電反応に対する活性が低いことが問題であった。そこで本研究では、メカノケミカル法により異種元素ドープグラフェンの合成を試み、充放電両方が可能かつ高性能な金属空気電池用空気極の構築を目指す。昨年度の研究において、グラファイトのメカノケミカル反応によりグラフェンを得る際の合成条件の最適化を行った。また、メカノケミカル反応によるグラフェンは、これまでに多数報告例のある化学還元法によるグラフェンよりも酸素還元および酸素発生反応に対して高活性であることが明らかとなった。本年度は、窒素および硫黄の炭素骨格中への導入や、メカノケミカル法により導入した窒素や硫黄の結合状態について検討した。まず、メカノケミカル反応によりグラファイトからグラフェンを得る際にメラミンを共存させると窒素が、硫黄粉末を共存させると硫黄がグラフェン骨格中に導入され、酸素発生反応活性が向上することが明らかとなった。また、窒素および硫黄のグラフェン骨格中の炭素との結合状態は、メカノケミカル法によるグラフェンの合成プロセス(どのタイミングでメラミンや硫黄を添加するか)によって異なることが明らかとなった。また、結合状態が異なる窒素および硫黄の酸素還元・酸素発生反応活性を検討した結果、酸素還元反応と酸素発生反応それぞれで活性を示す窒素・硫黄の結合状態を特定することができた。当初はメカノケミカル法によりどのような異種元素がグラフェンに導入可能か、そしてどのような元素を導入すれば反応活性が向上するかを検討する予定であったが、異種元素の有効な結合状態まで明らかにすることが本年度で達成できたため。これまでの検討で、グラフェンへの窒素ドープ、硫黄ドープががグラフェンの酸素発生活性を高めること、そしてドープ方法の検討により活性を示す窒素および硫黄のグラフェンとの結合状態が明らかとなったため、今後は触媒担持によりグラフェンの酸素還元および酸素発生活性を高めるための検討を行う。まず、Ni系酸化物を中心に酸素発生活性の高い材料を、Mn系酸化物を中心に酸素還元活性の高い材料を選定し、選定した触媒をグラフェンに微細に担持する方法を検討する。その中で最近、ナノカーボンの一種であるグラフェンが充電電流で消耗しない安定な材料であることを見出した。しかし、グラフェンは充電反応に対する活性が低いことが問題であることも判った。そこで本申請研究では、グラフェンへの異種元素ドープや触媒の担持によりグラフェンの充電反応活性を補うことで、充放電両方が可能かつ高性能な金属空気電池用空気極を構築する。本年度は、グラフェンの合成とグラフェンへの異種元素ドープ方法について検討した。グラフェンの合成方法として、ボールミル装置を用いたメカノケミカル法を検討した結果、グラファイトを溶媒無しの条件下で大サイズのボールを用いてボールミル処理を行った結果、多層グラフェンをすることができ、グラフェンを合成可能な条件(ボールサイズ、回転速度、処理時間)を特定することができた。さらに、グラフェン合成時にメラミンを共存させることでグラフェンへの窒素ドープが可能となった。また、窒素ドープグラフェンを用いて空気極を作成し、酸素還元及び酸素発生特性を評価した結果、特に酸素発生活性が向上することが明らかとなった。当初、本年度内においてグラフェンのボールミル処理による合成と、グラフェンへの異種元素ドープが酸素還元および酸素発生活性に与える影響を調べる予定であり、予定していた内容をおおむね全て遂行することができたため、「(2)おおむねに順調に進展している」と判断した。

また、窒素および硫黄のグラフェン骨格中の炭素との結合状態は、メカノケミカル法によるグラフェンの合成プロセス(どのタイミングでメラミンや硫黄を添加するか)によって異なることが明らかとなった。また、結合状態が異なる窒素および硫黄の酸素還元・酸素発生反応活性を検討した結果、酸素還元反応と酸素発生反応それぞれで活性を示す窒素・硫黄の結合状態を特定することができた。当初はメカノケミカル法によりどのような異種元素がグラフェンに導入可能か、そしてどのような元素を導入すれば反応活性が向上するかを検討する予定であったが、異種元素の有効な結合状態まで明らかにすることが本年度で達成できたため。これまでの検討で、グラフェンへの窒素ドープがグラフェンの酸素発生活性を高めることができることがわかったため、今後は触媒担持によりグラフェンの酸素還元および酸素発生活性を高めるための検討を行う。まず、Ni系酸化物を中心に酸素発生活性の高い材料を、Mn系酸化物を中心に酸素還元活性の高い材料を選定し、選定した触媒をグラフェンに微細に担持する方法を検討する。これまでの検討で、グラフェンへの窒素ドープ、硫黄ドープががグラフェンの酸素発生活性を高めること、そしてドープ方法の検討により活性を示す窒素および硫黄のグラフェンとの結合状態が明らかとなったため、今後は触媒担持によりグラフェンの酸素還元および酸素発生活性を高めるための検討を行う。
βデフェンシンを指標としたシェーグレン症候群の高感度遺伝子診断法の開発

本研究はシェーグレン症候群の迅速確実な診断法の確立をRT-PCR法によるβデフェンシンの遺伝子発現量を基準にして行うためのものである。シックハウス症候群におけるβデフェンシンの発現の比較によりβデフェンシン4では炎症の急性期では発現が増加し、慢性期では発現が減少する特徴が明らかになった。シェーグレン症候群患者は口唇腺に慢性炎症が認められる状態であり、ヒトβデフェンシン4がわずかに認められた。シェーグレン症候群の疑いがあり、口唇生検を行ったが、シェーグレン症候群でないと診断された患者の中にβデフェンシン4が強く発現している群があった。βデフェンシン4の上記の特徴を考慮すると、これらの群はシェーグレン症候群に共通する何らかの変化が生じている可能性が考えられることが示唆された。口唇腺のヒトβデフェンシン4遺伝子発現を分析することで、シェーグレン症候群の予備軍を診断できる可能性が期待できる。本研究はシェーグレン症候群の迅速確実な診断法の確立を、RT-PCR法によるβデフェンシンの遺伝子発現量を基準にして行うためのものである。今年度、申請者らはRT-PCR法に用いるプライマーの設計を行った。cDNAライブラリーは、前回申請者らによってβデフェンシンの発現が確認されているヒト扁平上皮がん株HSC4を培養してRNA抽出、cDNA転写した。次に、NCBIのデータベースに基づいて各βデフェンシンの遺伝子配列からPrimer3を用いてプライマーを設計合成した。それぞれのプライマーを用い、上述のcDNAをテンプレートにして遺伝子を合成させ、シーケンサーを用いて合成された遺伝子の配列を分析した。CLUSTAL Wを用いてNCBIのデータベースと100%配列が一致したものを本研究用のプライマーとして採用した。なお、免疫染色ではHBD3はHSC4が発現していなかったため、HBD3のプライマー作成には市販のヒトcDNAライブラリーを用いた。実際口唇腺導管上皮細胞でのHBD3発現を免疫組織化学法で調べた結果、HSC4同様、発現していないということが判明した。以上から本年度に確定した各ヒトβデフェンシンのプライマー配列は次のとおりである。hbd1 : forward ;cgccatgagaacttcctacc , reverse ; cttctggtcactcccagctc、hbd2 : forward ;atcagccatgagggtcttgt, reverse ; gagaccacaggtgccaattt、hbd3:上記の方法で設計したプライマーは全てhbd3遺伝子発現を検出できなかった。hbd4:現在設計したプライマーの検討中である。一方、自己免疫疾患であるシェーグレン症候群の症状の進行を早める可能性が指摘されるトルエン曝露によるシックハウス症候群でのヒトβデフェンシンの発現を抗体法で検討した。HBD1はコントロール群、いずれの曝露群も一定の発現量を認め変化がなかった。HBD2では1回曝露群では変化はなかったが、4回曝露群では発現量が減少し、10回曝露群では発現量がさらに減少した。HBD3ではコントロール群も曝露群も発現は認めなかった。HBD4では4回曝露では発現量が増加したが、10回曝露群では発現量が減少した。以上のようにシックハウス症候群においてもβデフェンシンは特徴的な発現を示したことから、RT-PCR法によるヒトβデフェンシンの遺伝子発現解析はシックハウス症候群の診断にも有効であることが判明した。本研究はシェーグレン症候群の迅速確実な診断法の確立を、RT-PCR法によるヒトβデフェンシン(hBD)の遺伝子発現量を基準にして行うためのものである。申請者らはRT-PCR法に用いるプライマーの設計を試み、前年度から本年度にかけてhBDおよび内部標準のためのハウスキーピング遺伝子として選択したβアクチンの、最も合成効率の高いプライマー配列を確定した。ターゲット遺伝子のプライマーのPCR合成産物を段階希釈したスタンダードを作り、検量線を確認して実験に用いた。シェーグレン症候群患者の口唇腺とコントロールとしての正常口唇腺は、摘出後、RNAを抽出しcDNAに逆転写してRT-PCR法に用いる鋳型とした。このテンプレートを用いて、RT-PCRを行い、それぞれの口唇腺に存在するhBDの発現量を解析した。hBD1遺伝子はどの群にも一定の発現量が認められた。hBD2遺伝子はシェーグレン症候群では著しく発現量が減少した。hBD4遺伝子は正常群では発現が認められない傾向にあり、シェーグレン症候群ではhBD4遺伝子発現が上昇群と、発現しない群が共存することが判明した。また、正常群の中でもシェーグレン症候群に近似するhBD4遺伝子発現の特徴をもつ群の存在が判明した。

この特徴的な群がシェーグレン症候群の早期診断の鍵となっている可能性があることが示唆された。また、これまで本研究者らはシェーグレン症候群と正常唾液腺中におけるhBDの発現パターンを免疫組織科学的に比較し、シェーグレン症候群においてhBD1、hBD2の発現量が低下していることを明らかにしてきた。しかし、その研究発表後にその存在が発見されたhBD4に関してはシェーグレン症候群における発現変化が明らかにされてなかった。今年度、本研究者らは免疫組織化学的にシェーグレン症候群におけるhBD4タンパクの発現の変化を比較した。結果はhBD4の発現がシェーグレン症候群の病態に関連があることが示唆された。本研究はシェーグレン症候群の迅速確実な診断法の確立を、RT-PCR法によるβデフェンシンの遺伝子発現量を基準にして行うためのものである。申請者らは、前年度に引き続き、シェーグレン症候群の症状の進行を早める可能性が指摘されるトルエン曝露によるシックハウス症候群におけるβデフェンシンの発現も検討した。尚、マウスにトルエン曝露させ、シックハウス症候群モデルを作成し、気管におけるβデフェンシンの発現を抗体法で検討した。デフェンシン4の発現は、気管の損傷が認められはじめる4回トルエン曝露では発現量が増加したが、気管がほとんど損傷されてしまっている10回トルエン曝露群では発現量が減少していた。本結果からもデフェンシン4では炎症の急性期では発現が増加し、慢性期では発現が減少する特徴があることが示唆された。今年度、申請者らはシェーグレン症候群患者の口唇腺、およびシェーグレン症候群でないと診断された口唇腺を用いてhBDの遺伝子発現を分析した。hBD1ではすべての口唇腺において同程度の遺伝子発現が認められた。hBD2ではシェーグレン症候群の口唇腺において遺伝子量が減弱していた。hBD4ではシェーグレン症候群では遺伝子発現が認められた。さらに、シェーグレン症候群と診断されなかった群のなかで遺伝子発現が認められた例が認められた。hBD4は炎症の急性期では発現が増加し、慢性期では発現が減少する特徴があることを考慮すると、シェーグレン症候群と診断されていないにも関わらず、hBD4遺伝子が発現しているものは何らかの変化が生じている可能性があることが示唆された。口唇腺のhBD4遺伝子発現を分析することで、シェーグレン症候群の予備軍を診断できる可能性が期待できる。前年度に設計したプライマーをもとに今年度よりシェーグレン症候群と診断された口唇腺のサンプル、対照群であるシェーグレン症候群ではないと診断された口唇腺のサンプルのヒトβデフェンシン(hBD)のうちhBD1、hBD2、hBD4の遺伝子発現をRT-PCR法による定量を開始している。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き上記11のRT-PCR法による定量を行う。平成24年度にすべての結果および分析が終了する予定である。
キナーゼシグナルの活性制御を行うユビキチン・脱ユビキチン化酵素の網羅的同定

最近、ユビキチン化修飾・脱修飾酵素により、キナーゼシグナルの活性化のタイミング・持続時間・強さ・場所といった質的変化が調節制御される可能性が示唆され、キナーゼシグナルとユビキチン化の両シグナル経路のクロストークが注目されているが、どのユビキチン化・脱ユビキチン化酵素が個々のキナーゼ分子の活性制御を行うのか、その対応関係は不明である。本研究では、個々のキナーゼの活性制御に特異的なユビキチン化・脱ユビキチン化酵素を同定するためのスクリーニング系を確立し、同定した酵素の機能解析により、ユビキチン化による新たなシグナル制御機構と生理機能の解明を目的としている。今年度は、個々のキナーゼシグナルの活性制御を行う特異的ユビキチン化・脱ユビキチン化酵素を網羅的に同定するため、まず、キナーゼ分子やその制御因子の蛋白質分解とユビキチン化を指標としたスクリーニング系を確立することを目指した。個々の生細胞レベルでのライブイメージング解析を用い、生細胞での蛋白質分解やユビキチン化といった分子レベルでの動的変化を経時的に定量でき、短時間で客観性の高い統計的定量法によるスクリーニングが可能な系を構築した。この系とユビキチン関連分子に絞ったsiRNAライブラリーを用いて、実際に目的のキナーゼに対してスクリーニングを完了した。その結果、目的のキナーゼの分解制御に関わる新たなユビキチン化酵素を幾つか同定することができた。現在、同定したユビキチン化酵素の機能解析を進めると共に、それ以外の別なキナーゼに対して、構築したスクリーニング系の応用についても検討している。
最適化問題における進化型計算法の適合性評価に関する研究

本研究においては,さまざまな最適化問題に対して,効果的な進化型計算の構築法を提案するとともに,その有効性について計算機実験による多角的な評価を行った。また,個体間の構造的な距離を導入することにより,進化型計算の挙動を定量的に評価するための解析手法を提案した。提案した手法によれば,進化の過程における個体集団の多様性や交叉における形質遺伝性を,問題固有の解空間の観点から直観的に理解することが容易となり,進化型計算の挙動解析のみならず,理論的な発展にも寄与できるものと期待される。本年度は,昨年度からの自立行動ロボットに関する研究に加えて,NP困難な組合せ最適化問題の実質的なベンチマーク・テストである巡回セールスマン問題に対して,効果的な遺伝的アルゴリズムの構築を提案するとともに,個体間の距離に基づく挙動の解析を行った。(1)ロボットプログラムの自動生成:包摂アーキテクチャなど実際の自立行動ロボットのプログラムが,有限状態機械として記述されていることに着目して,進化型計算による有限状態機械の自動生成を試みた。特に,進化型計算の効率化においては,ラマルク進化論の概念を遺伝演算子に導入することにより,個体集団の進化速度を向上させるとともに,最終的に得られる個体の性能を高めることに成功した。昨年度は,有限状態機械に対するラマルク的な突然変異を提案したが,本年度は,新たに有限状態機械のラマルク的な交叉法を考案して,進化型計算による有限状態機械の自動生成手法を完成させた。(2)巡回セールスマン問題における遺伝的アルゴリズムの挙動解析:完全グラフ上のハミルトン閉路を個体と見なし,個体間に構造的な距離を定義することにより,巡回セールスマン問題対する遺伝的アルゴリズムの挙動を定量的に評価するための解析手法を提案した。さらに,順序問題に対する従来の交叉法において,個体間の距離を利用する調和交叉法を提案した。調和交叉法によれば,新たに得られる子の個体が解空間において常に両親の中間に位置するため,従来の交叉に比べて局所的探索能力が向上するとともに,交叉における形質遺伝性が個体間の距離に基づき定量的に保証されることを証明した。進化型計算とは,生物の進化過程に着想を得た探索・学習・最適化手法における計算論的枠組みの総称である.進化型計算は汎用性,柔軟性,拡張性などにすぐれ,たとえば,関数最適化問題においては,パラメータのチューニングのみならず,関数自体の構造を多様な遺伝演算子によって直接操作することにより,その構造を最適化することさえできる.本研究では,進化型計算を用いて自律行動ロボットのプログラムを自動生成することにより,進化型計算の特性を客観的に評価すると共に,効果的な進化型計算の利用方法を示している.ただし,本研究所で得られた進化型計算についての多くのテクニックや評価方法は,自律行動ロボットのプログラミングに限られたものではなく,巡回セールスマン問題など,工学的に意味のある一般的な最適化問題に対しても広く応用可能なものである.(1)ロボットのプログラム:Kozaの遺伝子的プログラミングなど,進化型計算を利用してプログラムを自動生成するための従来の手法では,汎用的なプログラムの自動生成を目的とし,プログラムの構造が適用可能な遺伝演算子によって決められていた.本研究では,包摂アーキテクチャなど,実際の自律行動ロボットのプログラムが有限状態機械で記述されていることに着目し,対象とするプログラムの構造を有限状態機械として,新たな遺伝演算子を提案した.(2)進化モデル:進化型計算が模倣する生物進化のモデルとしては,個体の適応度と遺伝形質の関係の違いによってダ-ウィン型,ラマルク型,これらの中間に位置するボールドウィン型などに大別される.本研究では,ダ-ウィン型の進化モデルに,ラマルク的確率に基づく突然変異を取り入れることにより,進化速度を高めると共に,より優れた個体が得られる進化型計算法を提案した.たとえば,自律行動ロボットのプログラミングでは,各個体(プログラム)のエミュレーションによる評価を通じて,その個体の優劣(適応度)のみならず,プログラムの挙動に関する様々な情報を得ることが可能であるため,これらの情報をラマルク的な遺伝演算子において活用する.(3)進化型計算の評価:進化型計算自体の評価においては,集団内(探索空間)における個体の挙動を把握することが必要となる.これまでは,エピスタシス分散,スキーマ統計,エントロピーなどに基づく間接的な手法によって個体集団の挙動が評価されてきた.本研究では,解空間と探索空間に対して適切な距離関数を導入することにより,進化の各過程における個体集団の動的な挙動を直接評価する手法を提案した.本研究においては,さまざまな最適化問題に対して,効果的な進化型計算の構築法を提案するとともに,その有効性について計算機実験による多角的な評価を行った。

特に,進化型計算の効率化においては,ラマルク進化論の概念を遺伝演算子に導入することにより,個体集団の進化速度を向上させるとともに,最終的に得られる個体の性能を高めることに成功した。昨年度は,有限状態機械に対するラマルク的な突然変異を提案したが,本年度は,新たに有限状態機械のラマルク的な交叉法を考案して,進化型計算による有限状態機械の自動生成手法を完成させた。(2)巡回セールスマン問題における遺伝的アルゴリズムの挙動解析:完全グラフ上のハミルトン閉路を個体と見なし,個体間に構造的な距離を定義することにより,巡回セールスマン問題対する遺伝的アルゴリズムの挙動を定量的に評価するための解析手法を提案した。さらに,順序問題に対する従来の交叉法において,個体間の距離を利用する調和交叉法を提案した。調和交叉法によれば,新たに得られる子の個体が解空間において常に両親の中間に位置するため,従来の交叉に比べて局所的探索能力が向上するとともに,交叉における形質遺伝性が個体間の距離に基づき定量的に保証されることを証明した。
抗薬物抗体と薬物血中濃度測定による抗TNF-α製剤の適正使用法の開発

アダリムマブ(ADA)は、関節リウマチの中心的治療薬となっている。高価なADAを適正に使用することは、患者のみならず医療経済においても、大きな貢献となる。ADA使用患者の一部に抗アダリムマブ抗体(AAA)が産生され、欧米では治療減弱に影響すると報告されているが、本邦では明らかにされていない。【目的】ADA投与患者におけるAAA産生率と、AAAのADA治療効果に与える影響を明らかにする。【方法】2009年から2014年7月までに、当院を含めた多施設通院中の66人のRA患者で、新規にADAを開始した患者の0、4、12、24、52週時点でのADAとAAAを測定し、AAA陽性頻度と薬剤継続率、治療効果に与える影響について検討した。【結果】AAAは37.9%で発現し、AAA陽性群は陰性群に比して薬剤継続率が有意に低く(44.0%, 70.7%)、52週での治療効果も有意に低かった(DAS28 : 3.6±1.8, 2.5±1.3)。中止例のほとんどが効果不足で副作用の発現頻度は低かった(11例、2例)。全検体でAAAとADAの血中濃度は明らかに有意な相関を示した。AAA陽性群では併用剤のMTX使用量が有意に少なく、MTX投与量とAAAの値は有意に負の相関を示した。また、AAAはADA開始3か月目までに陽性になる症例が多く、3か月目のAAA陽性の有無は薬剤継続率、最終効果の減弱に有意に影響を与えた。【結論】日本人においてAAAは欧米人より高頻度に産生され、ADA治療開始早期に出現し、治療効果を減弱させた。治療開始3か月でAAAを測定することで、ADA中止を決定出来る可能性が示唆された。尚、本研究は当センター倫理委員会(第0930号平成22年7月承認)及び、他施設の倫理委員会の承認のもと、患者の同意を得て行った。現在上記内容でModern rheumatologyに論文投稿準備中である。
刺激応答性機能分子の設計

本研究は、アルカリ金属イオンあるいはアルカリ土類金属イオンに対する錯形成能を有し、かつpH刺激に応答する新規環状多座配位子及びその非環状類縁体の分子設計と開発を目的として行い、以下の成果を得た。1.二つのカルボン酸部位を有する非環状多座配位子を5種類合成し、アルカリ土類金属イオンのpH制御バルク液膜輸送を行ったところ、二つのキナルジン酸部位をトリメチレン鎖で連結した誘導体が高いBa^<2+>選択性を示した。また、そのカチオン選択性はイオノホアが形成する擬環状構造の空孔サイズによく対応しており、電子供与性原子数とともにその適切な配置がイオノホアの分子設計上重要であることを見いだした。2.リチウムイオンに選択性を示すキナルジン酸型及びニトロフェノール型非環状イオノホアを新たに合成してバルク液膜系と乳化液膜系での輸送を行い、後者で高効率なリチウムイオンの選択的輸送に成功した。3.C-ピボット三鎖型非環状多座配位子の分子設計において、ピボット位の基本構造がトリメチロールエタン骨格とメチルグリセロール骨格では、後者の方がアルカリ金属イオンに対してはるかに高い錯形成能を示すことを見いだし、基本骨格選択の重要性を明らかにした。4.[15,17,18]及び[18,18,20]型モノアザクリプタンドの合成にはじめて成功し、アルカリ金属イオンに対する錯形成能を溶媒抽出法と液膜輸送系で評価したところ、高い錯形成能と空孔サイズに応じた選択性を示すことがわかった。クリプタンド類は錯形成能が強すぎるためにイオン輸送担体としては不適とされていたが,pHに応答する窒素原子を一つ導入したところ、高性能キャリヤ-として機能することを見いだした。中でも[18,18,20]型N-ドデシルモノアザクリプタンドは400倍を越える高いK^+/Na^+輸送選択性を示すことを見いだした。二つのカルボン酸部位を有する非環状多座配位子を新たに5種類合成し、アルカリ土類金属イオンのpH制御バルク液膜(ジクロロメタン)輸送を行ったところ、二つのキナルジン酸部位をトリメチレン鎖で連結した誘導体が高いバリウムイオン選択性を示した。また、そのカチオン選択性はイオノホアが形成する擬環状構造の空孔サイズによく対応しており、電子供与性原子の数とともにその適切な配置がイオノホアの分子設計上重要であることを見いだした。一方、15-クラウン-5、モノアザ17-クラウン-5、モノアザ18-クラウン-6の三環から構成される新規なC,C橋かけ大双環状モノアザポリエーテル(モノアザクリプタンド)の合成にはじめて成功し、アルカリ金属イオンに対する錯形成能を溶媒抽出法と液膜輸送系で評価したところ、極めて高い錯形成能と選択性を示すことがわかった。特にクリプタンド類は錯形成能が強すぎるために捕捉したカチオンを放しにくく、イオン輸送担体としては不適とされていたが、今回、クリプタンドにpHに応答する窒素原子を一つ導入したところ、プロトンの濃度勾配を利用して高性能キャリヤ-として機能することを見いだした。さらにN-メチルモノアザクリプタンドとNaI及びKIとのX線結晶解析を行ったところ、ナトリウムイオンはその三次元空孔の中央に、またカリウムイオンはその中央ではなく、モノアザ18-クラウン-6環の中心に取り込まれていることがわかった。N-

ドデシルモノアザクリプタンドはジクロロメタン液膜を通してのpH制御輸送においてナトリウムイオン選択性を示したことから、その三次元空孔への取り込みの深さと錯形成能に良好な相関関係があることが明かとなった。1.アルカリ金属イオンに対して高い錯形成能と選択性を示す新規多座配位子の開発を目的として、三次元的な配位が期待される新規C-ピボット三鎖型非環状多座配位子の分子設計、合成並びに物性評価を行なった。ピボット位の基本構造としてトリメチロールエタン骨格あるいはメチルグリセロール骨格をもち、また三つの分子末端位にはオキシキノリン環を配し、さらにそれらをオキシエチレン鎖で連結した構造をもつものである。錯形成能を比較検討したところ、メチルグリセロール骨格をもつ方がはるかに高い錯形成能を示した。この結果から、三次元的な配位を期待するには基本骨格の選択が極めて重要であることが明らかとなった。2.リチウムイオンに選択性を示すキナルジン酸型及びニトロフェノール型非環状イオノホアを新たに合成してバルク液膜系と乳化液膜系でのpH制御液膜輸送実験を行なった。後者の輸送系では、リチウムイオン選択性は低下するものの輸送速度が飛躍的に向上することがわかった。3.前年度に合成した[15,17,18]及び[18,18,20]型モノアザクリプタンドのアルカリ金属イオンに対するpH制御による選択的液膜輸送能を評価した。輸送速度は水相から有機液膜相への錯体の抽出率と密接な関係があるため、効果的な輸送を行なうにはアザクラウンエーテルの場合には対イオンとしてピクリン酸イオン等の親油性イオンの存在が必須であった。しかしながら、クリプタンドでは遙かに高い錯形成能をもつため塩化物イオンでも効果的な輸送が達成された。中でも[18,18,20]型N-ドデシルモノアザクリプタンドは400倍を越える高いK^+/Na^+輸送選択性を示すことを見いだした。
ショウジョウバエ嗅覚記憶中枢をモデルとした神経回路形成と機能発現の統合的解析

本研究では、ショウジョウバエの嗅覚記憶中枢であるキノコ体のローブ構造が特異的に異常になるDIP2変異体の解析及びこの変異体を利用した学習記憶における各ローブ構造の必要性の解析を計画していたが、DIP2のRNAiで得られた表現型と変異体の表現型が著しく異なり、学習記憶の解析が困難となったので、DIP2変異体の解析の方に焦点を置いている。昨年度までの研究によって、DIP2はキノコ体神経の軸索枝の投射パターンのみに関与すると考えられていたが、1細胞レベルでの変異体解析によって軸索枝の投射異常だけでなく軸索枝の過剰形成も観察された。そして、これらの表現型はAMP合成酵素ドメインを欠いたDIP2ではレスキューする事が出来なかった。これらの結果から、DIP2はAMP合成酵素ドメインを介して軸索枝の投射パターンの制御及び過剰な軸索枝の抑制を行っていると考えられる。DIP2がどのような因子との相互作用によって前述した表現型を示すのかを調べる為、in vitroでの結合因子の探索を行い複数の候補因子を同定する事が出来た。現在、in vivoでの結合の有無及び遺伝学的相互作用を検証している。また、既知の軸索誘導や軸索枝形成に関与する遺伝子とDIP2の遺伝学的相互作用を調べた所、Wnt5を始め複数の因子で相互作用が確認された。現在、DIP2による軸索枝制御の全体像を解明する為、相互作用が確認された因子との作用機序を検証している。どの因子もDIP2との相互作用及び軸索枝の表現型に関する知見は報告されておらず、未知の経路が関与している可能性が考えられる。従来の軸索枝に関する研究は軸索枝形成そのものに焦点が当てられており、軸索枝の投射機構や軸索枝の本数制御機構は全く議論されてこなかった。DIP2による軸索枝制御機構の解明はこれらの疑問に答え、神経発生研究において重要な意義を持っと期待される。(抄録なし)(抄録なし)本研究では、ショウジョウバエの嗅覚記憶中枢であるキノコ体を用いて、回路構造に基づいた機能発現という点から神経系の統合的理解を目指すため、神経系に於ける機能が未だに十分に解析されていない遺伝子を単離し、それらの遺伝子のキノコ体発生に於ける役割を解析することを当面の目標として実験を行う。当該年度前年度までに、キノコ体神経特異的RNAiスクリーニングによって機能未知の遺伝子であるDIP2が軸索枝の投射パターンに影響を及ぼすことを示していた。そこで、当該年度においてはDIP2の変異体を作製し、そのキノコ体の形状を解析した。その結果、DIP2変異体では軸索枝の投射パターンに異常が生じるだけでなく、ローブ構造が細くなるという表現型も観察された。この表現型は、神経幹細胞特異的にDIP2を抑制した場合でも観察されたことから、DIP2はキノコ体神経で軸索枝の投射パターンの制御に関与しているだけでなく、神経幹細胞においては増殖にも関与している可能性が強く示唆された。また、DIP2変異体においてはキノコ体だけでなく楕円体の形態にも異常が生じている点から、DIP2は多くの神経組織の形成に関与していることが考えられる。次に、DIP2の下流に位置する因子を探索するため、マイクロアレイ解析を行い、複数の有力因子を同定することが出来た。今後は、抗体染色によるDIP2タンパク質の発現部位の同定やGAL4-UASシステムを用いたレスキュー実験、マイクロアレイ解析によって同定された因子が真にDIP2の下流に位置するかの確認等を行う予定である。DIP2抗体を作成し発生期の中枢神経系での発現を確認した所、中枢神経系全体で発現していた。この結果は、DIP2変異体や神経系全体でDIP2を抑制した場合、キノコ体以外の構造でも形態異常が観察されていた事と一致している。また、DIP2の細胞内局在を確認した所、データベースと異なり核内には存在せず細胞膜に局在していた。DIP2には膜貫通ドメインやGPIアンカー等の膜に結合する構造を有していない事から、何らかの膜局在タンパク質と結合して膜に局在していると考えられる。UAS配列の下流にDIP2を組み込んだUAS-DIP2系統を作製し、キノコ体神経特異的に過剰発現させた所、非常に高い浸透率でキノコ体神経の投射異常が観察された。具体的には、背側のローブ構造が全て正中線側へ投射されており、これはRNAiでDIP2の発現を抑制した時に観察された表現型と間逆である。過剰発現時と発現抑制時の結果から、DIP2は濃度依存的にキノコ体神経の軸索枝の投射方向を制御している可能性を示唆している。DIP2のエキソン領域にトランスポゾンが挿入されている機能欠失系統を用いて復帰突然変異系統を作成した所、キノコ体投射異常の表現型が回復した。この結果は、DIP2がキノコ体の正常な投射に必要である事を示している。DIP2の下流で機能する遺伝子を探索する為、前年度に行ったマイクロアレイの結果から候補遺伝子を選び出し二次スクリーニングを行った。その結果、glaikit(gkt)を過剰発現させるとDIP2発現抑制時の表現型がレスキューされ、この結果はgktがDIP2の下流で機能している可能性が高い事を示している。また、軸索誘導に関与する事が知られているplexin BとDIP2の遺伝学的相互作用も観察された。

軸索枝の各々の投射方向を制御する機能を持つ遺伝子は未だ報告されておらず、DIP2による軸索枝投射パターン制御機構を解明出来れば神経発生研究に一石を投じる事が出来るといえる。本研究では、ショウジョウバエの嗅覚記憶中枢であるキノコ体のローブ構造が特異的に異常になるDIP2変異体の解析及びこの変異体を利用した学習記憶における各ローブ構造の必要性の解析を計画していたが、DIP2のRNAiで得られた表現型と変異体の表現型が著しく異なり、学習記憶の解析が困難となったので、DIP2変異体の解析の方に焦点を置いている。昨年度までの研究によって、DIP2はキノコ体神経の軸索枝の投射パターンのみに関与すると考えられていたが、1細胞レベルでの変異体解析によって軸索枝の投射異常だけでなく軸索枝の過剰形成も観察された。そして、これらの表現型はAMP合成酵素ドメインを欠いたDIP2ではレスキューする事が出来なかった。これらの結果から、DIP2はAMP合成酵素ドメインを介して軸索枝の投射パターンの制御及び過剰な軸索枝の抑制を行っていると考えられる。DIP2がどのような因子との相互作用によって前述した表現型を示すのかを調べる為、in vitroでの結合因子の探索を行い複数の候補因子を同定する事が出来た。現在、in vivoでの結合の有無及び遺伝学的相互作用を検証している。また、既知の軸索誘導や軸索枝形成に関与する遺伝子とDIP2の遺伝学的相互作用を調べた所、Wnt5を始め複数の因子で相互作用が確認された。現在、DIP2による軸索枝制御の全体像を解明する為、相互作用が確認された因子との作用機序を検証している。どの因子もDIP2との相互作用及び軸索枝の表現型に関する知見は報告されておらず、未知の経路が関与している可能性が考えられる。従来の軸索枝に関する研究は軸索枝形成そのものに焦点が当てられており、軸索枝の投射機構や軸索枝の本数制御機構は全く議論されてこなかった。DIP2による軸索枝制御機構の解明はこれらの疑問に答え、神経発生研究において重要な意義を持っと期待される。変異体作製に手間取ってしまい、当該年度中に抗体作製・レスキュー実験を行うことが出来なかったが、次年度に行う予定であったマイクロアレイ実験を行うことが出来たので、結果的に見れば順調に進展しているといえる。抗体及びUAS系統の作製により、解析手法の幅を大きく広げる事が出来た。その結果、DIP2が濃度依存的に軸索枝の投射パターンを制御しているという全く未知の機能を有している可能性が示唆された。しかし、データベースと異なりDIP2が核に局在せず、膜に局在しているという事実が判明し、解析方法の転換を余儀なくされている。(抄録なし)引き続き、キノコ体形成におけるDIP2の機能解析を進め、最終的にはDIP2から軸索誘導に直に関わると考えられる膜タンパク質までのシグナル経路を明らかにしたい。また、DIP2が神経幹細胞において細胞増殖に関与している可能性が考えられることから、嗅覚記憶などの機能解析をする場合、DIP2変異体を直接解析すると投射パターンの変化の影響だけを評価することが出来なくなってしまう。そのため、機能解析を行う場合はキノコ体神経特異的にDIP2を抑制した系統や、神経幹細胞特異的にDIP2をレスキューしたハエなどを用いて投射パターンだけが異常になっているハエを作成する必要がある。DIP2が投射制御に関与している事は証明出来たので、今後はDIP2がどの様な因子と相互作用をする事によって投射パターンを制御しているのかを解明する必要がある。