hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生分解性ポリマーを用いた固相脱窒処理および脱窒菌の動態解析

重合体であるPHBVを電子供与体とする固相脱窒プロセスが、最も硝酸除去性能が高いことが明らかになった。またPHBV固相脱窒プロセスから高い脱窒能力をもつPHB分解性の新規細菌を分離し、新属新種Diaphorobacter nitroreducensを提唱した。しかしながら、PHB馴養固相脱窒プロセスにおいて、実際に脱窒に関わっている細菌の正体については未だ十分に明らかになっていない。そこで、本プロセスの16S rDNAクローンライブラリー解析を行った結果、Betaproteobacteria、特にコマモナス科に属する細菌が優占することが明らかとなった。一方、同時に脱窒遺伝子(nirS,nosZ)のクローンライブラリー解析の結果からは、必ずしもコマモナス科細菌由来とは思われない遺伝子が多数取得された。そこでさらに、PHBV固相脱窒プロセスにおけるPHB非分解性脱窒細菌の計数と同定を行った。その結果、寒天平板法で得られる全生菌数の半数が脱窒細菌として定量された。脱窒の基質としてペプトンと3-ヒドロキシ酪酸(3HB)を使った場合には計数値に差がなかったが、PHBを用いた場合には、それらの1/71/8の菌数となった。得られた脱窒菌の大半は分離培地に関わらず、Betaproteobacteriaに属した。生菌数測定の結果から、PHBV固相脱窒プロセス内ではPHB分解性でない脱窒細菌が数的に優占しており、またその多くが3HB分解性であることが示唆された。本研究では、廃水処理分野における窒素除去への技術的対策の一つとして生分解性ポリマーを電子供給源として利用する固相脱窒法の適用を考え、これまでポリヒドロキシ酪酸とポリヒドロキシ吉草酸の共重合体であるPHBVを電子供与体とする固相脱窒プロセスを中心に実験を行ってきた。本年度は、この研究によって新たに分離された親属新種Diaphorobacter nitroreducensを利用してPHBVを基質とする連続培養固相脱窒プロセスを構築し、このプロセスの脱窒能力について検討した。段階的に硝酸負荷速度を上げながら連続培養を行った結果、負荷量の増加に対応して脱窒速度が上昇することが認められた。これらのデータを動力学的に解析した結果、硝酸負荷速度27mg NO_3-N/L/hで、V_<max>=19mg NO_3N/g dry wt/h,K_s=15mg/Lが得られた。これらの値は、活性汚泥を馴養して構築されたPHBV系脱窒プロセスの値と類似した。PHBV系固相脱窒プロセスでは、基質であるPHBVの製造コストが高い欠点があるため、より安価なポリ-ε-カプロラクトン(PCL)を使って固相脱窒プロセスを構築することを試みた。活性汚泥を接種源としてPCL馴養脱窒プロセスを構築した結果、PHBV系の約半分の脱窒速度が得られた。PCL系プロセズの群集構造をFISH法、キノンプロファイル法、および分離培養株の解析によって調べた結果、PHBV系とは異なり、アルファプロテオバクテリアとベータプロテオバクテリアが共存して優占化していることが示された。分離株の一部はParacoccusなどの既存の菌に同定されたが、多くはベータプロテオバクテリアであるComomasnas属の新種であることが示された。
積層セラミック・デジタルアクチュエータの開発

市販のPZT系圧電セラミックスを購入し、ステンレス製治具で積層、締結した構造の8ビット・デジタルアクチュエータを試作した。このデジタルアクチュエータは上位4ビットと下位4ビットの2つのユニットより成り、各30枚のセラミックスより構成されている。下位4ビットのユニットへは上位4ビットのユニットの変位の1/16となるような電界を印加することで総計60枚のセラミックスで8ビットにコード化されたアクチュエータが実現できた。試作されたアクチュエータの直線性は極めて優れ、最大非線形性誤差でアナログ方式では-38%もあるのに対し、デジタル方式では±0.2%以下であった。また、ヒステリシス特性も大幅に改善され1ディジットを数ms程度で変化されたときには殆んど識別できない。1ディジットを数min程度かけた極めて遅い変化のときにはヒステリシスが認められたが、これも新たにセラミックスを制御する電気信号を電圧ではなくて電荷で動作する駆動電源を設計、製作し使用したところ、いかなる遅い変化に対してもほとんどヒステリシスが見られないようになった。さらに、ヒステリシスの原因となる分域構造をとらない電歪材料を用いた実験も試みたが、この場合多少温度特性が悪くなったが電圧駆動方式による遅い変化があってもヒステリシスは認められなかった。問題点としては、デジタル・コードが変化するときスパイク的な変位であるグリッチ雑音を発生する場合があることである。これは信号の印加されていないセラミックスの質量の慣性効果によるものと考えられるので、動的特性を考慮した適切な時定数を有する信号を印加することで解決できる見込みである。
味細胞における苦味情報のコーディング

本研究では、1様々な苦味物質に対する応答プロファイルによりマウス苦味受容細胞が幾つかのタイプに分類されること、2茸状、有郭乳頭間でこれら苦味細胞の応答プロファイルに差がないこと、3これら細胞での苦味受容にはgustducin-PLCβ2-TRPM5を介する伝達経路が重要であること、4ヒト苦味受容体阻害剤がマウスの苦味応答には影響を与えないこと、5CCKが苦味受容細胞から味神経線維への情報伝達に関与する可能性を示した。これらにより、味細胞における苦味受容機構について明らかとし、末梢における苦味情報の伝達及びコーディングについての知見を得た。本研究では、味細胞における苦味受容および伝達機構に注目し、既知のT2R-Gαgust-PLCβ2-TRPM5を介した苦味受容機構と、これとは独立した新奇の苦味受容機構について生理学的、分子生物学的手法を用い追及し、味細胞における苦味受容機構の解明と、苦味情報のコーディングにおける味細胞の果たす役割ついて明らかとすることを目的とする。本年度は、マウス茸状乳頭gustducin-GFP発現味細胞の10種の苦味物質(キニーネ、シクロヘキシミド、デナトニウム、カフェイン、シュクロースオクタアセテート、テトラエチルアンモニウム、フェニルチオウレア、Lーフェニルアラニン、硫酸マグネシウム、高濃度サッカリン)および高濃度NaClに対する応答を解析した。その結果、多くのgustducin-GFP細胞はキニーネ、デナトニウム、シクロヘキシミドの3種の刺激に応答を示し、平均で3.46±0.39種の苦味刺激に応答した。これら苦味応答はTRPM5チャネル阻害剤であるTPPOで可逆的、かつほぼ完全に抑制された。またPLC阻害剤であるU73122によっても応答は完全に抑制されたが、この薬剤を使用した場合には応答の回復は見られなかった。一部のgustducin-GFP細胞は高濃度NaClにも応答を示し、他の苦味応答との相関を解析した結果、硫酸マグネシウムの応答と強い相関が見られた。また、本年度はこれまで困難であったマウス有郭乳頭味細胞からの応答記録法をほぼ確立し、現在gustducin-GFP発現細胞の苦味応答プロファイルの解析を進めている。さらに苦味受容とコレシストキニン(CCK)との関連性について解析を進めているところである。本年度は、マウス有郭乳頭gustducin-GFP発現味細胞の10種の苦味物質および高濃度NaClに対する応答を解析し、茸状乳頭の応答特性と比較した。その結果、有郭乳頭と茸状乳頭の間でgustducin-GFP味細胞の苦味物質に対する応答プロファイルに顕著な差は認められず、TRPM5阻害剤やPLCβ2阻害剤により苦味物質に対する応答は同様に抑制された。応答強度はキニーネ、シクロヘキシミド、高濃度NaCl、MgSO4に有意な差が認められた。これらの結果及び昨年度の結果から、有郭、茸状両乳頭のgustducin発現苦味細胞は同様の苦味受容機構(T2R-Gαgust-PLCβ2-TRPM5経路)により応答が生じ、苦味受容体T2Rの受容体発現パターンも大きな差は無いと推測される。苦味物質とコレシストキンとの関連性について解析した結果、CCK受容体ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較し、苦味物質に対する神経・行動応答が選択的に減少していた。CCKを静脈注射すると濃度依存的な鼓索神経活動が記録され、CCK受容体阻害剤によりその効果は消失した。これらの結果から、CCKがマウスの苦味応答に関与する可能性が示唆された。概ね当初に計画したとおりに実験を実施し、結果を得られている。本年度は、苦味受容体T2Rに対する阻害剤の影響について検討した。これまでに、GABAおよびNα-Nα-BM-LysineがヒトT2R4受容体の阻害剤として機能し、キニーネに対する応答を抑制すること、ProbenecidがヒトT2R38を阻害しフェニルチオカルバミドに対する応答を抑制することが報告されている。マウスの短時間リック応答において、3種のT2R阻害剤(GABA、Nα-Nα-BM-Lysine、Probenecid)の効果を調べた結果、これらの阻害剤はいずれもマウスの苦味物質(キニーネ、デナトニウム、シクロヘキサミド、フェニルチオウレア)に対するリック応答に影響を与えなかった。さらに、gustducin-GFP発現味細胞のキニーネ応答に対するGABAおよびNα-Nα-BM-Lysineの効果について検討した結果、行動応答の場合と同様明確な応答抑制効果は見られなかった。

これらの結果から、これまで報告されている3種の苦味受容体阻害剤(GABA、Nα-Nα-BM-Lysine、Probenecid)はマウスの苦味受容体には影響を与えない可能性が考えられる。また、苦味受容細胞に発現する受容体遺伝子について解析するため、gustducin-GFP味細胞を用い、single cell RNA-seqを行う予定であった。個々のgustducin-GFP細胞を回収し、次世代シーケンシング解析用ライブラリ作成を行う段階までは到達したが、シークエンシングを行うまでは到達していない。本研究では、1様々な苦味物質に対する応答プロファイルによりマウス苦味受容細胞が幾つかのタイプに分類されること、2茸状、有郭乳頭間でこれら苦味細胞の応答プロファイルに差がないこと、3これら細胞での苦味受容にはgustducin-PLCβ2-TRPM5を介する伝達経路が重要であること、4ヒト苦味受容体阻害剤がマウスの苦味応答には影響を与えないこと、5CCKが苦味受容細胞から味神経線維への情報伝達に関与する可能性を示した。これらにより、味細胞における苦味受容機構について明らかとし、末梢における苦味情報の伝達及びコーディングについての知見を得た。概ね当初に計画したとおりに実験を実施し、結果を得られている。来年度は、gustducin発現苦味細胞の応答やマウス神経・行動応答に対するT2R阻害剤(GABA、Nα-Nα-BM-Lysine、probenecidなど)の効果を検索する。また、ヒトの苦味認知閾値に対するT2R阻害剤の効果についても調べ、マウスーヒト間でのT2R阻害剤の効果について比較する。味細胞における分子発現を調べるため、免疫染色によりCCKやその受容体の発現パターンを解析する。さらに、苦味応答を記録した味細胞を回収しsingle cell RNA-SeqもしくはqRT-PCRなどによりT2Rの発現プロファイルを調べ、苦味応答とT2R発現との関連性について調べる。口腔生理学これまでの予備実験の段階で、コレシストキニンと苦味受容との関連性について興味深い結果が得られてきている。そこで、本年度はコレシストキニンの苦味受容における役割をについて解析を進める。同時に、有郭乳頭のgustducin-GFP味細胞の応答プロファイルを明らかとし、茸状乳頭のgustducin-GFP味細胞の応答プロファイルとの比較検討を行う予定である。当初予定していた実験補助のアルバイトの回数が当人の都合により少なくなってしまった。また、その後任が見つからなかったため謝金の支払額が減少した。今後の実験計画にある味細胞発現分子の解析に利用する試薬類が高価であり、これらを追加購入する資金として充当する予定である。
シコニン側鎖の水酸化およびエステル化に関わる酵素反応の研究

Geranylhydroquinone以降のシコニン生合成中間体を検出するために、ユニバーサル・ラベルのフェニルアラニンを用いてトレーサー実験を行なった。シコニン生産培地M9にムラサキ培養細胞を移植し、^<14>C-標識フェニルアラニンを投与した。投与時期の詳細な検討により、M9培地移植後7日目にフェニルアラニンを投与した場合、放射活性のシコニン誘導体への取り込み率が最も高いと判明した。抽出した放射活性物質を分析した結果、未知の疎水性シコニン生合成中間体は検出されなかったが、シコニン側鎖に水酸基を有しないデオキシシコニンの速やかな生成と減少が観察された。またそれに伴ってアセチルシコニンなど各種シコニン誘導体の生成も認められ、デオキシシコニンが生合成中間体であることが示唆された。そこで、ムラサキ培養細胞に生産させた放射活性デオキシシコニンを、prep.TLCにて単離し、新たにムラサキ培養細胞に投与したところ、シコニンのエステル誘導体へ約20%もの効率で放射活性が取り込まれた。一方、シコニンの標識化合物も同様に調製、投与したが、こちらは全くそのエステル誘導体には変換されなかった。このことから、シコニン生合成の場とされる細胞内vesicleにおいて2種類の酵素系がマルチエンザイム・コンプレックスを形成しており、デオキシシコニン側鎖の水酸化、およびエステル化をシコニンの遊離を経ることなく行なっていると考えられた。そこでショ糖密度勾配遠心法により得たvesicleフラクションを用いて、Triton-Xの存在下、酵素実験を行なったところ、シコニンは全く基質として取り込まれなかったのに対し、デオキシシコニンはin vitro系でアセチルシコニンまで変換されることが示された。以上の結果よりシコニン誘導体側鎖の酸素原子はgeranylhydroquinoneが閉環し、ナフトキノン核が形成された後、最後に導入されることが明らかとなった。
生体内での神経細胞樹状突起の再編と維持を制御する分子機構の解明

初期発生においていったん形成された樹状突起は、必要に応じてその形態を変化(リモデリング)させた後、長期間安定に維持される。このような樹状突起のリモデリングや維持には積極的な仕組みが存在することが示唆されているものの、具体的なメカニズムはほとんど明らかになっていない。ショウジョウバエの末梢神経系のdendritic arborization (da)neuronの一部では、蛹期に大規模な樹状突起リモデリングが起こった後、成虫の一生を通してその樹状突起パターンが維持されることが明らかになっている。そこで、樹状突起のリモデリングや維持に関わる遺伝子を同定するため、成虫da neuronをモデル系とした遺伝学的スクリーニングを開始した。前年度までに、樹状突起リモデリングに異常を示す変異体系統を18系統、樹状突起の維持に異常を示す系統を2系統分離した。本年度は、分離した変異体の中で、リモデリングに異常を示すCHORD変異体に注目し、さらに解析を行った。CHORD変異細胞の樹状突起パターンを定量的に解析したところ、樹状突起の全長や受容野の大きさは野生型に比べて顕著に減少していたのに対して、樹状突起の末端数や分岐の角度に関しては野生型と有意な差は見られなかった。以上の結果から、CHORD変異体は、野生型の「ミニチュア型」の樹状突起パターンへとリモデリングしていること、つまり細胞のサイズの制御に異常がある可能性が示唆された。さらに、野生型の個体を飢餓条件下において体のサイズを小さくしたところ、樹状突起パターンも体の大きさに合わせて縮小すること、つまり樹状突起パターンのスケーリングが起こることが明らかとなった。当初、スクリーニングにトランスポゾンの挿入変異体を用いることで、原因遺伝子のマッピングを省略できることを期待していた。しかし、得られたほとどんどの変異体において、樹状突起パターンへの異常がトランスポゾンではない、バックグラウンド変異に起因することが判明した。申請当初は予期していなかった、原因遺伝子のマッピングを行ったため、当初の計画より少し遅れることとなった。受容体を対象としたRNAiスクリーニングにより、da neuronが体のサイズを感知する分子機構の解明を目指す。また、タイムラプス観察により、野生型のニューロンとCHORD変異ニューロンでの樹状突起ダイナミクスを比較・定量化し、どのようなパラメータに異常が生じた結果、ミニチュア型の樹状突起へとリモデリングしてしまうのかを明らかにしたい。初期発生においていったんは完成した樹状突起は、リモデリングの後、長期間安定に維持されることが報告されており、積極的に樹状突起形態を維持する仕組みが存在することが示唆されているが、その仕組みについては未だ不明な点が多い。これまでに申請者は、単一細胞レベルの解像度で樹状突起維持の分子機構を解析できるように、ショウジョウバエ成虫のda neuronをモデル系として立ち上げた。本年度は、まず樹状突起リモデリングや維持に関わる分子を体系的に探索するために、第三染色体右腕上に変異を持つ約600系統を対象として、老齢個体におけるda neuronの樹状突起形態を指標としたスクリーニングを行い、老齢個体において樹状突起パターンに異常を示す変異体14系統を分離することに成功した。二次スクリーニングとして若齢個体においても樹状突起パターンの観察を行ったところ、全ての変異体がその樹状突起パターンに老齢での表現型と同様の異常を示した。これらの結果から、今回のスクリーニングで得られた変異体は、樹状突起リモデリングに異常が生じている可能性が示唆された。また、他の染色体腕においてもスクリーニングを行うために必要なショウジョウバエ系統の作製も行った。さらに、神経変性疾患に関わる既知の変異体において成虫da neuronの樹状突起パターンがどのように影響を受けるかを調べた。その結果、ユビキチン・プロテアソーム系に関わる遺伝子の変異体が、老齢個体においてのみ樹状突起パターンに異常を示した。以上の結果から、我々のモデル系が樹状突起維持の研究にも有用であることを確認できた。前年度までに、第3染色体右腕にトランスポゾンが挿入している変異体520系統を対象にスクリーニングを行い、樹状突起リモデリングに異常を示す変異体系統を14系統分離した。本年度はまず、これらの変異体の原因遺伝子がトランスポゾン挿入位置に存在する遺伝子であるかの確認実験を行った。その結果、一部の変異体の表現型は、トランスポゾンの挿入ではなくバックグラウンド変異に起因することが明らかとなった。そこで次に、次世代シーケンサーを用いて複数の変異体の全ゲノム配列を決定・比較することで、各変異体系統の原因遺伝子を同定することを試みた。その結果、1系統についてはフレームシフトを引き起こす1塩基の欠失がCHORD遺伝子内に存在することが明らかになった。さらに、CHORD

トランスジーンを発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製して変異細胞内でトランスジーンを発現させたところ、樹状突起リモデリングの異常がレスキューされた。この結果から、確かにCHORD遺伝子が原因遺伝子であることが明らかとなった。また、前年度に作製したショウジョウバエ系統を用いて、第2染色体左腕にトランスポゾンの挿入を持つ555系統を対象に、引き続き遺伝学的スクリーニングを行った。その結果、樹状突起のリモデリングに異常を生じる変異体4系統に加え、樹状突起維持にも異常を示す変異体を1系統分離することに成功した。初期発生においていったん形成された樹状突起は、必要に応じてその形態を変化(リモデリング)させた後、長期間安定に維持される。このような樹状突起のリモデリングや維持には積極的な仕組みが存在することが示唆されているものの、具体的なメカニズムはほとんど明らかになっていない。ショウジョウバエの末梢神経系のdendritic arborization (da)neuronの一部では、蛹期に大規模な樹状突起リモデリングが起こった後、成虫の一生を通してその樹状突起パターンが維持されることが明らかになっている。そこで、樹状突起のリモデリングや維持に関わる遺伝子を同定するため、成虫da neuronをモデル系とした遺伝学的スクリーニングを開始した。前年度までに、樹状突起リモデリングに異常を示す変異体系統を18系統、樹状突起の維持に異常を示す系統を2系統分離した。本年度は、分離した変異体の中で、リモデリングに異常を示すCHORD変異体に注目し、さらに解析を行った。CHORD変異細胞の樹状突起パターンを定量的に解析したところ、樹状突起の全長や受容野の大きさは野生型に比べて顕著に減少していたのに対して、樹状突起の末端数や分岐の角度に関しては野生型と有意な差は見られなかった。以上の結果から、CHORD変異体は、野生型の「ミニチュア型」の樹状突起パターンへとリモデリングしていること、つまり細胞のサイズの制御に異常がある可能性が示唆された。さらに、野生型の個体を飢餓条件下において体のサイズを小さくしたところ、樹状突起パターンも体の大きさに合わせて縮小すること、つまり樹状突起パターンのスケーリングが起こることが明らかとなった。前年度までに実施した遺伝学的スクリーニングによって得られたトランスポゾン挿入変異体の解析を行ったところ、多くの変異体の表現型がバックグラウンド変異に起因することが明らかとなった。しかしながら、申請者は次世代シーケンサを用いた新しいマッピング法を利用し、原因遺伝子の候補の同定に成功した。さらに、トランスジーンの発現によるレスキュー実験を行い、候補遺伝子が確かに原因遺伝子であることを明らかにした。また、遺伝学的スクリーニングを続行することで樹状突起パターンの維持に異常を示す変異体を同定することにも成功した。以上より、予想外の困難はあったものの、おおむね順調に進展しているといえる。当初、スクリーニングにトランスポゾンの挿入変異体を用いることで、原因遺伝子のマッピングを省略できることを期待していた。
マクロファージ-筋線維芽細胞系を標的とした慢性GVHD治療法の開発

昨年度にBlood誌に報告した慢性GVHDによる皮膚線維化に対するHSP47 siRNA標的療法に関する研究(Blood. 2018, 131(13): 1476)をさらに発展させた。本年度は,移植後慢性GVHD患者の生活の質を著しく障害する,ドライアイ症候群の発症機序を解明した。RecipientであるBALB/cマウスに前処置として全身放射線照射7Gyを行い,マイナー組織適合抗原不一致であるB10.D2 (Allo群)から採取した骨髄細胞5×10^6個と脾細胞2.5×10^7個を輸注すると慢性GVHDが発症する。こうしたマウスの涙腺を採取して組織標本を観察すると, HSP47陽性の線維芽細胞が多数集積し,涙腺の線維化が生じていることが判明した。皮膚の線維化病変とは異なり,これらの活性化した線維芽細胞にはalpha-SMAが陰性であり,筋線維芽細胞とは異なる細胞であった。同時期にマウスの涙液産生量をシルマー試験により測定すると,著明に低下しており, GVHDによるドライアイ症候群が発症していることが確認された。慢性GVHDによるドライアイ症候群の発症メカニズムに,涙腺の線維化があることが示唆されたため, HSP47を標的とするVitamin A結合Liposome(VA-lip)の点眼薬を作成し,移植後のマウスに点眼し,涙腺の観察を行ったところ, HSP47陽性線維芽細胞が著明に減少し,線維化領域が縮小していることが判明した。皮膚慢性GVHDのMacrophage-筋線維芽細胞系を標的とした慢性GVHD治療法の開発に関しては,既に昨年度末に論文発表が可能であった。本年度は,さらにその他の臓器での慢性GVHDのMacrophage-筋線維芽細胞系を標的とする治療法の開発に進んでいる。本年度は,慢性GVHDのドライアイの発症機序を解明し,さらにHSP47を標的とするVitamin A結合Liposome(VA-lip)の点眼薬というこれまで全く考えられていなかった治療法の開発を進めることが出来ており,計画以上の進展と考えられる。現在進行中の,慢性GVHDにおけるドライアイ症候群に対する, Macrophage-筋線維芽細胞系を標的する新規治療法の研究を,さらなる治療効果を示して論文発表につなげたい。HSP47を標的とするVitamin A結合Liposome(VA-lip)に関しては,現在米国で肝臓の線維化である肝硬変で臨床治験が進められている。本研究の知見から,本治療法は慢性GVHDにおける様々な臓器の線維化に有用である可能性が示唆されており臨床応用が待たれる。今後は,臨床試験も目指して製薬会社との協力が必要と考えられる。また,こうした新規治療薬に関しては薬剤費の上昇が社会問題となっているが,本研究で使用された点眼薬の様に,ごく少量の薬剤で効果を発揮できる場合は,医療経済的にも有利であり臨床応用につなげたい。慢性GVHDモデルである, B10.D2→BALB/cの骨髄移植を行った。レシピエントであるBALB/cマウスに前処置として全身放射線照射7Gyを行い,マイナー組織適合抗原不一致であるB10.D2 (Allo群)から採取した骨髄細胞5×10^6個と脾細胞2.5×10^7個を輸注したところ,移植後day20頃から皮膚の硬化性病変が出現した。Day42に背部の皮膚を採取し,線維化の評価を行ったところ, GVHDを発症したマウスでは, MT染色で有意に線維化部位の面積が増加しており,径5mmの皮膚あたりのコラーゲンも増加していた。蛍光免疫染色の結果,慢性GVHDによる線維化が生じている皮膚では, F4/80陽性マクロファージの著明な増加とHSP47陽性alpha-SMA陽性の筋線維芽細胞が著明に増加しており,マクロファージはTGF-betaを産生していることが判明した。マウスの皮膚から分離した線維芽細胞に, TGF-betaを加えて培養すると, HSP47の発現が増強し,筋線維芽細胞に分化することが判明した。つまり,マクロファージに産生されるTGF-betaが,筋線維芽細胞の活性化に寄与していると考えられた。抗CSF-1抗体によるマクロファージ除去を行うと,筋線維芽細胞の集積が見られなくなり線維化も改善された。筋線維芽細胞を標的とした新規薬剤輸送システムである,ビタミンA結合リポソーム(VA-lip)を利用して,筋線維芽細胞にHSP47 siRNAを作用させ, HSP47分子をノックダウンしたところ,筋線維芽細胞は減少し, GVHDによる線維化が著明に改善した。ここまでの結果をBlood誌に投稿し掲載された(Blood. 2018 Mar 29;131(13):1476-1485)。当初の平成29年度の予定であった,皮膚慢性GVHDの線維化評価法の確立は問題なく達成できた。免疫細胞のフローサイトメトリー法での評価は,当初皮膚からの細胞懸濁液の作製が困難であり,十分量の細胞を採取することができなかったが,皮下脂肪を可能な限り除去することによって,測定可能となった。炎症性マクロファージの浸潤のメカニズムについては, CSF-1レセプター抗体でほぼ完全に抑制することができたので,慢性GVHDのマクロファージ浸潤はCSF-1に依存することも解明された。CSF-1レセプターのシグナルは,特にLy6C陰性単球の生存に必須であるので(Hashimoto, etal.J

Exp Med 2011),これらの炎症性マクロファージの前駆細胞はLy6C陰性単球である可能性が高いと考えられる。さらに,当初は平成30年度に予定されていた,慢性GVHDによる皮膚線維化の新規治療法の確立のため,非常に興味深い知見を得ることもできた。皮膚に浸潤する筋線維芽細胞にHSP47が発現することに着目し, HSP47抑制による皮膚慢性GVHDの線維化治療法を確立することができた。さらに,治療法の臨床応用に向けて研究を続行する必要があるものの,この時点で1報の論文も発表できた。当初の計画より早い速度で研究は進行していると考えられる。昨年度にBlood誌に報告した慢性GVHDによる皮膚線維化に対するHSP47 siRNA標的療法に関する研究(Blood. 2018, 131(13): 1476)をさらに発展させた。本年度は,移植後慢性GVHD患者の生活の質を著しく障害する,ドライアイ症候群の発症機序を解明した。RecipientであるBALB/cマウスに前処置として全身放射線照射7Gyを行い,マイナー組織適合抗原不一致であるB10.D2 (Allo群)から採取した骨髄細胞5×10^6個と脾細胞2.5×10^7個を輸注すると慢性GVHDが発症する。こうしたマウスの涙腺を採取して組織標本を観察すると, HSP47陽性の線維芽細胞が多数集積し,涙腺の線維化が生じていることが判明した。皮膚の線維化病変とは異なり,これらの活性化した線維芽細胞にはalpha-SMAが陰性であり,筋線維芽細胞とは異なる細胞であった。同時期にマウスの涙液産生量をシルマー試験により測定すると,著明に低下しており, GVHDによるドライアイ症候群が発症していることが確認された。慢性GVHDによるドライアイ症候群の発症メカニズムに,涙腺の線維化があることが示唆されたため, HSP47を標的とするVitamin A結合Liposome(VA-lip)の点眼薬を作成し,移植後のマウスに点眼し,涙腺の観察を行ったところ, HSP47陽性線維芽細胞が著明に減少し,線維化領域が縮小していることが判明した。皮膚慢性GVHDのMacrophage-筋線維芽細胞系を標的とした慢性GVHD治療法の開発に関しては,既に昨年度末に論文発表が可能であった。本年度は,さらにその他の臓器での慢性GVHDのMacrophage-筋線維芽細胞系を標的とする治療法の開発に進んでいる。本年度は,慢性GVHDのドライアイの発症機序を解明し,さらにHSP47を標的とするVitamin A結合Liposome(VA-lip)の点眼薬というこれまで全く考えられていなかった治療法の開発を進めることが出来ており,計画以上の進展と考えられる。本研究で得られた, HSP47 siRNA含有VA-lipを用いた,筋線維芽細胞を標的とする慢性GVHD治療法は,治療標的が限定されていて,副作用を考える上で非常に有利である。しかし,慢性GVHDによる線維化病変は全身の様々な臓器や組織に生じる可能性があり,皮膚の線維化以外の多臓器にわたる線維化に対して,本治療法が効果があるか否かを検討する必要がある。また,逆に線維化がみられる、臓器や組織が限局しているような症例では, HSP47 siRNA含有VA-lipの全身投与は治療のコストが高く,局所療法が望ましいと考えられる。
離島水産業の発展を目指した市場適応型モデルの開発

奄美群島を中心に漁業経営への政策的支援の効果と課題について、市場適応に焦点を絞り分析した。島嶼域では各種補助金を活用した漁業経営改善の取り組みが展開しており、出荷経費の補助により水産物の島外出荷が促進され、経営振興に結びついていることを明らかにした。一方で、島外出荷は補助金に全面依存しており、それなしに事業は成り立たない状況に陥っていることを指摘した。また、高付加価値生産を目指した加工品の開発がすすむ一方で、販売役である漁協に十分なマーケティング能力がなく、製品開発が経営改善に直結していないことも判明した。補助金への依存と、製品販売力の欠如が、離島漁業経営の向上を妨げていることを明らかにした。本研究は、奄美群島を中心とした離島水産業の発展を目指した「市場適応モデル」の構築を目的としている。初年度においては、分析手法や方法論について研究分担者と議論した後、1)奄美群島における水産業と政策的支援の分析、2)フィリピンボラカイ島における観光事業と漁業との関連分析、を中心に調査研究を進めた。1)については、離島漁業再生支援交付金、奄美群島振興開発特別措置法などの法的枠組みの整理、それに基づいた取り組みについて分析した。与論島、奄美大島、種子島、甑島を中心に調査を行い、漁業経営が抱える課題と振興への対応策について、経営的視点と技術的視点より分析を加えた。新漁法の導入と出荷形態の見直しの効果について分析、その研究成果の一部を学会において報告する準備を進めた。2)については、海洋観光事業を中心にした離島振興をすすめるボラカイ島において、観光開発が周辺の漁業(使用漁具、操業海域、漁獲量、出荷先、魚価など)へ与えた影響を分析した。観光開発によって新たな消費市場が誕生する一方、消費市場へのアクセスは資本力に大きく左右されることが明らかとなった。資本力と生産力のある漁業者は、観光市場へむけて大量に出荷することで、収入機会を確保している。また、観光市場を目指して新たに養殖を経営する漁業者もみられるようになった。その一方で、零細漁民は市場との関わりを持てず、観光開発の経済的効果が波及しづらい現状にあった。国内調査については、沖永良部等での調査を除き、当初計画していた通り、実態調査を遂行することができた。海外における調査は、フィリピン大学ヴィザヤス校のカウンターパートの協力により、当初、想定していた以上の漁業者よりヒアリングすることができた。また、調査による成果の一部を、著書(共著)などとして整理した。2016年度は、1)鹿児島県内離島における市場適合(新たな出荷形態、ブランド化など)による漁業経営への効果分析、2)フィリピンパナイ島北部地域における漁業と観光産業の関連分析、を中心に調査研究を実施した。1)については、奄美大島、種子島、甑島、中之島などを中心に調査を行った。冷凍出荷の取り組みによる流通改善の効果(中之島)、キビナゴ自営加工による経営支援効果(甑島)、複合養殖経営による市場適合(長島)について調査した。また、離島において水産物ブランド化の取り組みが試みられていることから、ブランド化の先進的取り組みであるかぼすブリ(大分県)の分析を行い、その知見の活用を試みた。研究成果の一部を学会において報告するとともに、論文としてとりまとめた(投稿中)。なお、調査にご協力頂いた漁業関係者や加工業者などへ研究内容を報告して、成果の還元に努めた。2)については、2015年度の調査成果をうけて、パナイ島北部地域において、観光開発が周辺漁業へ与えた影響を分析した。フィリピンの一大観光地であるボラカイ島への魚介類出荷は、出荷地の魚介類供給構造に変化をもたらしていることが明らかとなった。観光地への魚介類供給が促進される一方で、産地においては需給構造が変化して価格上昇が発生していることを確認した。本研究成果については、2017年10月に開催予定の学会において、フィリピン大学のカウンターパートとともに報告する予定である。また、本研究のスキームを用い、従来より研究してきたフィジーやタイにおける漁業振興の分析に応用し、本研究の汎用性も検討した。国内調査については、当初計画していたとおり、実態調査を実施することができた。海外調査については、フィリピン大学ヴィザヤス校のカウンタパートからの全面的な協力も有り、調査は順調に進展した。また、研究成果についても、学会での報告はもとより、著書(分担執筆)や論文として整理した。調査研究を通じて離島における産業振興に興味をもつ研究者、行政関係者、コンサルタント、生産者、島嶼在住者らと問題意識を共有できたことから、彼らとともに「島嶼産業研究会」(https://international-islands.jimdo.com/)を組織して、調査・研究について議論し合う体制も整った。2017年度は、1)鹿児島県および長崎県の離島域における市場適合および漁業経営への経済的影響、2)フィリピン大学ヴィザヤス校からカウンタパートを招聘した研究会、3)国際学会での研究成果報告、4)研究の統括、を実施した。1)甑島、奄美大島、壱岐などを中心に調査を実施した。漁協の自営事業(甑島)の分析を通じて、市場適合に果たす漁協の役割と課題を抽出した。研究成果を論文として取り纏めるとともに、現場への研究成果の還元に勤めた。2)2017年10月、大東文化大学において実施した。パナイ島北部の観光産業と漁業との連携について、その成果と課題を報告するとともに、観光市場への適応の条件や課題について議論を深めた。その研究成果は現在、論文として取り纏めている。

3)2017年7月、オーストラリアで開催された国際島嶼学会において、新技術を用いた市場適応の条件や効果、課題について報告した。海外の離島部においても、市場への適応が課題になっていることが明らかになり、今後、情報交換を密にしながら課題の解消にあたることとした。4)研究分担者とともに3カ年にわたる研究成果を整理するとともに、残された研究課題の抽出をすすめた。3カ年にわたる調査の結果、補助金値の全面依存、生鮮出荷の限界、島内異業種との連携不足、産地側のマーケティング力欠如、が離島漁業経営の弱点であることが明らかとなった。生鮮出荷にかわる方法を可能とする新保蔵技術の導入、販売力ある民間企業との接合を可能とする条件について分析することを次年度以降の課題とすることとした。奄美群島を中心に漁業経営への政策的支援の効果と課題について、市場適応に焦点を絞り分析した。島嶼域では各種補助金を活用した漁業経営改善の取り組みが展開しており、出荷経費の補助により水産物の島外出荷が促進され、経営振興に結びついていることを明らかにした。一方で、島外出荷は補助金に全面依存しており、それなしに事業は成り立たない状況に陥っていることを指摘した。また、高付加価値生産を目指した加工品の開発がすすむ一方で、販売役である漁協に十分なマーケティング能力がなく、製品開発が経営改善に直結していないことも判明した。補助金への依存と、製品販売力の欠如が、離島漁業経営の向上を妨げていることを明らかにした。2016年度は引き続き、奄美群島を中心に水産業が抱える経営的・技術的課題の類型的把握と実態分析に努める。国内調査においては、トカラ列島や奄美大島を調査する。海外調査は当初、台湾を予定していたが、2016年度と2017年度の予定を入れ替え、2016年度も引き続きフィリピン・ボラカイ島を調査する(台湾調査は2017年度に実施)。研究成果については、学会において報告するとともに、論文等として整理する。2017年度は、奄美群島における流通改善、甑島における自営加工、種子島における新漁具導入と販路改善による経営改善、など市場適応を目指した漁業関係者の取り組みを中心に焦点を当てる。2017年10月にフィリピン調査のカウンターパート(フィリピン大学ヴィザヤス校)を招聘し、学会において研究成果を報告する。また、2017年度は調査の最終年にあたるため、研究成果のとりまとめ、報告書の作成、調査対象地への研究成果の還元に努める。3年間にわたる研究成果の学会誌への投稿を行う。農業経済沖永良部島において調査を予定していたが、調査対象者が急逝されたことから、ヒアリング調査を中止した。そのため、当初支出予定の予算の一部を次年度に繰り越した。フィリピンでの調査が、カウンタパートの協力により、想定よりも短期間で終えることができた。海外調査旅費が想定よりも少額となったため、翌年度への繰り越しが発生した。沖永良部島の代替候補地として、漁撈中および漁獲後の品質管理を徹底する十島村の事例を選定した。繰り越した予算は、十島村の実態調査に使用する。
ショウジョウバエの生殖細胞形成過程におけるNanosタンパク質の役割

多くの動物種で生殖細胞の形成に関わる因子が卵の一部の細胞質に局在する事が示唆されてきた。最も解析の進んでいるショウジョウバエでは、生殖細胞の形成に関わる因子が卵の後極の細胞質(生殖質)中に局在し、この細胞質を取り込む極細胞のみが生殖細胞に分化できることが明らかになっている。しかしながら、極細胞中に取り込まれる因子の実体は明らかになっていなかった。細胞質移植実験から、生殖質は生殖細胞形成因子とともに腹部形成因子をも含む事が示唆されてきた。また、遺伝学的解析からこれらの2つの因子は共通の機構によって生殖質に局在する事や、腹部形成因子の実体がNanosタンパク質である事が示されてきた。本研究では、このNanosタンパク質が、極細胞から生殖細胞への分化に関わる因子の1つがである事を以下のように明らかにした。また、結果は省略するが、極細胞の分化に関わる因子としてPgcRNAと命名した新規のRNAも同定した。Nanosタンパク質を欠くnanos突然変異胚では、極細胞は正常に形成されるが、腹部欠失により致死となるため、形成された極細胞が成虫の生殖巣内で生殖細胞に分化するか否かは容易に調べられない。そこで、nanos突然変異胚の極細胞を腹部が正常に形成される胚へと移植し、その極細胞の発生運命を調べたところ、Nanosタンパク質を欠く極細胞は生殖巣に侵入できず、そのため機能的な生殖細胞に分化できないことが明らかとなった。また、Nanosタンパク質は、生殖巣に取り込まれた後に極細胞中で開始する遺伝子発現(cyclin Bタンパク質の発現や、特定のエンハンサーの活性化)時期の決定に必須であることも明らかとなった。おそらく、Nosタンパク質は、生殖巣に取り込まれた後に極細胞中で開始する遺伝子発現を移動過程にある極細胞中で抑制することにより、極細胞の生殖巣への移動を正常に進行させる働きを持つと考えられる。
発癌予防のための形態形成シグナル系抑制ペプチドワクチンの開発

H18年度に作成した乳癌・膵癌等で活性化しているHedgehogシグナル(Hh)上の受容体抗Ptch1抗体(Ptch-Ab)のシグナル抑制機能を、ルシフェレースアッセイで検証した。Hhシグナルが活性化している細胞にGli1の転写活性測定用プラスミドを導入し、Ptch-Abと供に24時間共培養した。その後、ルシフェラーゼ活性を測定した。Ptch-Ab存在下ではGliの転写活性が低下していたが、コントロールのIgG存在下ではこの傾向を認めず、Ptch-Ab特異的なHhシグナル抑制効果を確認できた。また、Hhシグナルが活性化していないDLD1ではPtch-Abによる影響を認めず、Hhシグナル依存性癌細胞に対する特異性も確認できた。さらに、Hhシグナルの標的遺伝子であるGli1の活性化状態をreal time RT-PCRで計測した。膵癌細胞株Panc-1では、定常状態でGli1のmRNAが高発現している。Ptch-Ab存在下では、Gli1-mRNA発現量が低下しPtch-Abによるシグナル抑制機能が証明された。癌細胞株の増殖抑制効果は、Ptch-Ab存在下培養での細胞数で確認された。Panc-1細胞は、Ptch-Ab存在下で培養することで、細胞数がコントロールに比較し20%減少した。さらに別の膵癌細胞株SUIT-2でも確認され、Ptch-Ab存在下4日間培養で細胞数は、抗体の濃度依存性に減少した。以上より、Ptch-Abにより、Hh依存性増殖を示す腫瘍細胞の増殖活性制御が可能であることが示された。今後、ハイブリッド抗体や親和性ペプチドを作成することで、臨床応用へ向けた研究を続ける予定である。Patched1蛋白上で、三次元構造上でリガンドとの結合部位にあたる領域における親水性・表面存在確率・抗原性・進化上の保存性が高い9アミノ酸配列を選び標的配列とし、二羽の家兎を用いて抗ペプチド抗体を作成した。免疫した家兎血清を用いて、抗血清のin vitroでの抗原認識性を検証した。Patched1蛋白を高発現していることが確認できている膵癌腫瘍細胞株を用いてウエスタンブロッチングを行った。免疫前血清ではシグナルが検出されなかったが、免疫後血清はPatched1蛋白に相当する160kD蛋白を認識した。さらに、5種類のPatched1高発現乳癌・膵癌細胞株を用いたウエスタンブロットでも、全ての細胞で共通する160kD蛋白を認識し、他の抗Patched抗体による認識バンドとも一致した。次に、培養細胞を固定後に本抗体を用いた間接蛍光染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で観察した。細胞膜のみが鮮明に染色されてPatched1蛋白の分布に一致した。以上は、変性蛋白に対する認識能にあたる。実際にviable cellで増殖抑制作用を得るためには、変性していない蛋白の認識能を検証する必要がある。この目的で、培養中のviableな乳癌細胞の培養液に本血清を添加しincubation後、2次抗体を添加して蛍光観察を行った。本抗体は、変性していない蛋白で構成されるPatched1高発現なviablecellの膜蛋白を認識した。これに対し、コントロールのPatched1を発現していない大腸癌細胞は染色されなかった。以上、Hedgehogシグナル上の受容体であるPatched1蛋白に対するオリゴペプチド抗体の作成に成功し、natural及びdenatured両者の蛋白認識に成功した。今後、本抗体によるシグナル制御・腫瘍細胞増殖に対する効果を検証していく。
海水準上昇期における地層中の津波，高潮堆積物の解析：東北日本とバングラデシュの例

2015年に全長25 mの完新統コアを福島県南相馬市小高区井田川地区(海岸から約0.9 km)で掘削した.そこで,この研究ではさらに約0.7 km陸側で2018年6月に2本目のボーリング調査をおこない過去1万年間の完新統の試料約14 mを得た.このコアを記載するとともに軟X線写真を撮影した.含まれる木片5試料と貝化石3試料について放射性炭素年代測定を依頼した.また,粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析を10 cm間隔でおこなった.これらの分析から,今回の掘削地点では,おおよそ9000年前に海水が侵入して8000年前頃にはエスチュアリー化したことが分かった.前回の海側の掘削地点より,海水の侵入は500年以上遅かったと考えられる.一方,おおよそ5000年前にエスチュアリー中央盆地が埋積され,塩水湿地化すると津波起源と考えられるイベント砂層が挟在するようになりその数は2011年の3.11津波堆積物を含めて9層になる.従って,砂層の堆積周期はおおよそ550年となることがわかった.海側のコア中のイベント砂層との対比を現在進めている.これらの2本のコアの放射性炭素年代と堆積相解析に基づく結論は,Uchiyama et al. (2018,印刷中)として,国内誌である堆積学研究に英文で発表した.また,2019年2月にバングラデシュに渡航し,ガンジス川流域で砂州や周辺の堆積物を予備調査して,来年度以降の調査地などを選定した.また,1部の地域で試料を採取して,粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析を予察的に開始した.南相馬市井田川での2本目のボーリングコアの採取とその記載,分析も順調に進み,おおよそ予想どおりにデータが集まっている.ただ,コア対比のための年代のコントロールが難しい.昨年度掘削したコアについて実際は11試料の放射性炭素年代を依頼したが,そのうち深度1m程度から得た炭質物質3点が,0年前という測定結果となり,試料が地表から混入したことを示唆する値となった.また,この層準には逆に下位の年代値より古い値を示す試料も存在しており,地表からの人為的改変がどの深度まで及んでいるのか,慎重に検討する必要がある.バングラデシュの洪水・高潮堆積物についても,2019年4月から博士課程院生となったラジシャヒ大学講師モハンマド・マシダル・ハック氏が研究協力者として2018年2月から調査と試料分析に協力してくれており,極めてスムーズに研究を開始することが出来た.次年度は,まず,南相馬の2本のコアの砂層の対比を進める.古い木片のリサイクルや地表からの混入で,コア上部で放射性年代値として信頼できる数値を得られていない.特に,地表から深度2 mの区間は,干拓などの人為的影響により,新旧の物質が混じり合っている可能性が考えられる.このことをもう一度考慮して,二地点間の砂層の対比を再考する.必要があれば,二地点間で連続的に深さ2 m程度のジオスラーサー試料を採取し,炭素を含む試料を探して年代測定を依頼することも考える.また,砂層上下での珪藻化石分析などを細かい分析間隔でおこない,対比の根拠を見出したい.バングラデシュの研究は,これまでに採取した1998年のものと思われる洪水堆積物の粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析をさらに進める.あらたな試料については,春から秋の雨期には調査が難しいので,次年度末になる2020年2月頃に,ダッカより海側の地域の調査と試料採取をおこなう.また,バングラデシュ東部のチッタゴン周辺でのみ津波堆積物の可能性が指摘されているので,可能ならこちらの調査も予定したい.珪藻化石分析は,修士課程大学院生の内山しおり氏の協力により南相馬,バングラデシュの研究とも進める.また,バングラデシュでの現地調査とその試料の分析は,ハック氏の協力で進める.ハック氏は現在来日中なので,研究協力者として彼が現地調査をおこなうための旅費をこの研究費から支出する.2015年に全長25 mの完新統コアを福島県南相馬市小高区井田川地区(海岸から約0.9 km)で掘削した.そこで,この研究ではさらに約0.7 km陸側で2018年6月に2本目のボーリング調査をおこない過去1万年間の完新統の試料約14 mを得た.このコアを記載するとともに軟X線写真を撮影した.含まれる木片5試料と貝化石3試料について放射性炭素年代測定を依頼した.また,粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析を10 cm間隔でおこなった.これらの分析から,今回の掘削地点では,おおよそ9000年前に海水が侵入して8000年前頃にはエスチュアリー化したことが分かった.

前回の海側の掘削地点より,海水の侵入は500年以上遅かったと考えられる.一方,おおよそ5000年前にエスチュアリー中央盆地が埋積され,塩水湿地化すると津波起源と考えられるイベント砂層が挟在するようになりその数は2011年の3.11津波堆積物を含めて9層になる.従って,砂層の堆積周期はおおよそ550年となることがわかった.海側のコア中のイベント砂層との対比を現在進めている.これらの2本のコアの放射性炭素年代と堆積相解析に基づく結論は,Uchiyama et al. (2018,印刷中)として,国内誌である堆積学研究に英文で発表した.また,2019年2月にバングラデシュに渡航し,ガンジス川流域で砂州や周辺の堆積物を予備調査して,来年度以降の調査地などを選定した.また,1部の地域で試料を採取して,粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析を予察的に開始した.南相馬市井田川での2本目のボーリングコアの採取とその記載,分析も順調に進み,おおよそ予想どおりにデータが集まっている.ただ,コア対比のための年代のコントロールが難しい.昨年度掘削したコアについて実際は11試料の放射性炭素年代を依頼したが,そのうち深度1m程度から得た炭質物質3点が,0年前という測定結果となり,試料が地表から混入したことを示唆する値となった.また,この層準には逆に下位の年代値より古い値を示す試料も存在しており,地表からの人為的改変がどの深度まで及んでいるのか,慎重に検討する必要がある.バングラデシュの洪水・高潮堆積物についても,2019年4月から博士課程院生となったラジシャヒ大学講師モハンマド・マシダル・ハック氏が研究協力者として2018年2月から調査と試料分析に協力してくれており,極めてスムーズに研究を開始することが出来た.次年度は,まず,南相馬の2本のコアの砂層の対比を進める.古い木片のリサイクルや地表からの混入で,コア上部で放射性年代値として信頼できる数値を得られていない.特に,地表から深度2 mの区間は,干拓などの人為的影響により,新旧の物質が混じり合っている可能性が考えられる.このことをもう一度考慮して,二地点間の砂層の対比を再考する.必要があれば,二地点間で連続的に深さ2 m程度のジオスラーサー試料を採取し,炭素を含む試料を探して年代測定を依頼することも考える.また,砂層上下での珪藻化石分析などを細かい分析間隔でおこない,対比の根拠を見出したい.バングラデシュの研究は,これまでに採取した1998年のものと思われる洪水堆積物の粒度分析,全有機炭素量,全イオウ量,安定炭素同位体比,珪藻化石分析をさらに進める.あらたな試料については,春から秋の雨期には調査が難しいので,次年度末になる2020年2月頃に,ダッカより海側の地域の調査と試料採取をおこなう.また,バングラデシュ東部のチッタゴン周辺でのみ津波堆積物の可能性が指摘されているので,可能ならこちらの調査も予定したい.珪藻化石分析は,修士課程大学院生の内山しおり氏の協力により南相馬,バングラデシュの研究とも進める.また,バングラデシュでの現地調査とその試料の分析は,ハック氏の協力で進める.ハック氏は現在来日中なので,研究協力者として彼が現地調査をおこなうための旅費をこの研究費から支出する.今年度にバングラデシュへの渡航費用として30万円を予算計上してあった.バングラデシュの調査は予定どおりおこなったが,2018年度に信州大学から教育・学術交流に関わる予算の募集があったので,大学間の共同研究を推進することを目的としてこの予算に応募した.その結果,信州大学から渡航費用を得ることが出来た.そのため,科研費に今年度計上していたバングラデシュでの調査のための旅費を次年度に使用することにした.次年度は,来日中の研究協力者ハック氏が調査に日本から出かけるための費用を計上してあるが,これに,もう一名研究代表者もしくは研究協力者が同行して,一緒に調査を行うための費用として使用する予定である.
C型肝炎ウイルス発現モデル動物を用いたsiRNAによる感染抑制系の開発

本研究において申請者らはC型肝炎ウイルス(HCV)感染に対するRNAi治療の有効性・安全性を検証するため、HCV遺伝子導入マウス、およびHCV感染ヒト肝細胞生者マウスへのshort hairpin RNA(shRNA)発現ベクター導入による、肝組織でのウイルス発現・増殖抑制効果を解析し、以下の結果を得た。(1)HCVゲノムの異なるgenotype間での増殖抑制効果の検討:異なるgenotypeのHCV(1b,2a)に対するRNAiの効果を確認するため、genotype 2aレプリコンより新たにキメラレポーター(Feo)発現レプリコンを作成し、その効果をgenotype 1b Feoレプリコンと比較・検証を行った。レプリコン発現細胞に、HCV-shRNAを導入したところ、1b,2a同等の効果をもってHCV発現を抑制することを確認した。(2)HCV遺伝子発現トランスジェニックマウスモデルにおける解析:マウスアルブミンプロモーター下に肝特異的にHCV-5' UTR/β-galの融合遺伝子を発現するHCV5' UTR/β-galマウスを用いて、HCV shRNAおよびコントロールshRNA発現アデノウイルスベクターを眼窩静脈より投与し、肝細胞でのX-gal染色性を比較したところ、HCV-shRNA導入マウスにおいて肝組織X-Gal染色性が低下する所見を得た。Cre/lox-P制御性HCV遺伝子発現マウスにAxCANCreとsiRNA発現アデノウイルスを共感染させマウス肝臓内のHCV構造蛋白発現を定量したところ、HCV-siRNAせ導入することにより肝組織内core蛋白発現が約80%低下した。今後この結果をもとに、RNAiを応用した、新たな抗HCV治療の実用性と問題点を明確にし、その有効性・実用性について検証を進める。