hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
主要作物のミトコンドリアの全遺伝情報解読と育種的利用に関する研究企画

主要作物のミトコンドリアゲノムの全遺伝情報を解読し、その成果をオルガネラ分子育種へ応用することを目的とした共同研究を企画するため、研究動向の調査に加えて、数回に亘り打ち合わせ会議を開催した。その結果、下記のような基本構想の下に、分担研究者を中核とする新しい研究を組織することにした。(1)高等植物でミトコンドリアゲノムの全一次構造が決定されたのはシロイヌナズナとテンサイの2種に過ぎない。そのため、100個前後のミトコンドリアORFが機能未同定のまま残されている。植物ミトコンドリアの遺伝情報の全容解明には、さらに複数種のミトコンドリアゲノムの全構造解析を完成することが急務であり、分担者の連携によりイネとコムギの解析に本格的に着手する。(2)ミトコンドリアゲノムの転写マップの完成とRNAエディティングの網羅的分析が必須であり、これはテンサイを用いて行う。(3)細胞質雄性不稔性の原因ミトコンドリア遺伝子を同定し、ハイブリッド育種の分子基盤を確立することが重要課題である。この目的を達成するため、テンサイ細胞質雄性不稔株のミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決め、正常株ゲノムと構造・発現の詳細な比較解析を進める。(4)ミトコンドリアの分子育種を成功させる鍵は、ミトコンドリアを標的とするトランスフォーメーションシステムの開発にある。形質転換が容易なイネをモデル系として、その開発を推進する。(5)ミトコンドリアの機能の全容を理解するには、ミトコンドリア遺伝子産物と細胞核遺伝子産物とのクロストークの機構解明が重要である。イネとテンサイをモデル系として、分担者の緊密な連携の下に解析的研究を推進する。
ストレスと神経・免疫・内分泌連関-特に神経性食思不振症の病因と脳内IL-1との関連について-

神経性食欲不振症は種々のストレス下において、摂食減少、過活動、無月経等といった病状を呈する心身症である。我々は、Wistar系ラットを用いて歩行ストレスを強制的に加え、抑欝状態にありながら他動的に過活動状態を生じさせるという同症類似動物モデル作成を目指した。また、摂食量減少や体重減少をもたらすとされるサイトカインのひとつであるInterleukin-1(IL-1)の変動が、同モデル動物における免疫・神経・内分泌軸に如何に関与しているか否かについての可能性をもさぐることとした。本年度は、その予備実験としてまず、Wistar系ラットに対して強制歩行機を用いて、一日620時間の強制歩行(5m 15m/min)を加え、摂食量減少、体重減少させた一群を作成した。次に、IL-1betaを外的に負荷し、ストレス反応の客観的指標となる血中adrenocorticotropic hormone(ACTH)値を測定した。また、IL-1beta負荷によるACTH産生分泌が同モデルでどのように変化するかを知るために、IL-1beta receptor antagonist (IL-1ra)をOVLT (Organum Vasculosum Laminae Terminalis)に前投与し、IL-1beta負荷に対する血中ACTHの反応(0',15',30',90')を検索した。その結果、以下のデータが得られた。【.encircled1.】強制歩行のないコントロール群に比し、強制歩行群では、10日間で平均17.2%の体重減少をきたした。IL-1beta(50ng/100g体重)ivに対するACTHの反応は、両群に有意差が見られ、15′および30′で強制歩行群が有意に過剰な反応を示した(p<0.01)。しかし、ACTH基礎値には有意差は認められなかった。【.encircled2.】OVLTへIL-1ra(10mug)をIL-1beta投与の10分前にmicroinjection投与したところ、ACTH分泌は30′でほぼ完全に抑制されたが、同量のIL-1raの静脈内投与では抑制されなかった。以下により、本年度は、過活動、体重減少ラットを他動的に作成した場合、血中IL-1betaの視床下部・下垂体系賦活化に対する影響は増強されること、また、OVLTが本サイトカインが同系を賦活化する結合領域(ゲート)として重要であることが示唆され、同モデルで同系過剰反応のメカニズムにOVLTにおける何らかの変化が関与している可能性も考えられ今後の課題となった。神経性食欲不振症に、より類似した動物モデルの作成、次に同症モデルにおける免疫・神経・内分泌軸に対する脳内サイトカインはたす役割とそのメカニズムを今後より明かにしたい。
ヒト心筋細胞の生存促進制御機構の解明と治療応用に関する研究開発

心臓病は全世界的に主要な死因の一つとなっており、新たな治療法の開発が期待されている。心臓を構成している心筋細胞の細胞死は、様々な心臓病の病態の形成に大きな影響を与えているが、心筋細胞の生存を直接増強することで心臓疾患の治療に成功したというヒトでの研究は極めて少ない。本研究ではヒト多能性幹細胞由来心筋細胞とCRISPR/Cas9システムを用いた全ゲノムスケールの遺伝子ノックアウトスクリーニングを行ない、ヒト心筋細胞の生存を促進する遺伝子群を明らかにし、治療標的となりうる分子機構の探索を行うことで、画期的な心臓病の治療薬の開発を目指す。
哺乳類Ｍｉｔｏｔｉｃ　Ｅｘｉｔ　Ｎｅｔｗｏｒｋの腫瘍抑制機構解明

ノックアウトマウスの解析より細胞周期進行におけるcdk1(cyclin-dependent kinase1)の重要性が再認識されているが、その制御機構は酵母と比較すると十分明らかになっていないのが現状である。申請者は酵母でcdk1制御を司るシグナル伝達系であるMitotic Exit Network(MEN)の哺乳類における意義を明らかにすることを目的として本研究を行った。その結果、哺乳類MENは酵母と異なるシグナル伝達を介して機能している可能性が強く示唆された。この違いが単細胞生物と多細胞生物の差異に由来するか否かを含め、高等生物におけるMENシグナル伝達の意義を今後も検討したい。正常細胞や癌細胞の増殖に重要な役割を果しているCyclin-dependent kinase (Cdk)の制御機構として、Mitotic Exit Network (MEN)というシグナル伝達系が出芽酵母に存在する。申請者は哺乳類でも同経路が保存されていると仮定して、MEN構成分子Dbf2キナーゼの哺乳類ホモログLATS1の新規基質スクリーニングを行った。酵母ではDbf2キナーゼがCdc14ホスファターゼをリン酸化して制御することが知られているがLATS1の基質としてホスファターゼはこれまで報告されていなかった。申請者らのスクリーニングではCdc14ホスファターゼLATS1を基質として同定出来なかったが、新規基質としてProtein phosphatase 1C(PP1C)の制御サブユニットであるMYPT1 (myosin phosphatase-targeting subunit 1)をin vitroを初めて見出した。さらに部分欠失変異体などを用いてMYPT1のリン酸化部位を5か所に絞り込んだ。この5か所のうちショウジョウバエまで高度に保存されているのはS(セリン)445のみであった。興味深いことにS445A変異体は5か所すべてに対する変異体と同様にin vitroホスファターゼ活性が低下しており同部のリン酸化が活性化に重要であることが示唆された。またこのMYPT1/PP1Cの基質として細胞分裂と癌悪性化に重要な役割を果たすPLK1(polo-like kinase)に着目し、MYPT1 S445のリン酸化に特異的な抗体を用いてLATS1がPLK1活性をin vivoでも負に制御することを明らかにした。これらの結果からMYPT1を介したPLK1抑制作用が癌抑制タンパクLATS1の機能の一部を担うことが示唆された。申請者はLATS1がCdc14 Cdc14ホスファターゼのヒトホモログではなくProtein phosphatase 1C(PP1C)の制御サブユニットであるMYPT1 (myosin phosphatase-targeting subunit 1)をin vitroでリン酸化することを初めて見出した。この5か所のうちショウジョウバエまで高度に保存されているS(セリン)445に対するリン酸化抗体などを用いてMYPT1がin vivoでもリン酸化されていることを明らかにした。またこのLATS1によるリン酸化がMYPT1/PP1Cのホスファターゼ活性を増強させることをin vitroのホスファターゼアッセイで明らかにした。一方MYPT1が細胞分裂と癌悪性化に重要な役割を果たすPLK1(polo-like kinase)の活性化リン酸化部位(T(スレオニン)210)を脱リン酸化してその機能を抑制することが知られていた。申請者はLATS1がMYPT1を介してPLK1活性を抑制することを見出した。これらの結果からPLK1抑制作用が癌抑制タンパクLATS1の機能の一部を担うことが示唆された。ノックアウトマウスの解析より細胞周期進行におけるCdK1(cyclin-dependent kinase1)の重要性が再認識されているが、その制御機構は酵母と比較すると十分明らかになっていないのが現状である。酵母MENではRas様低分子Gタンパクであるtem1より発したシグナルがdbf2キナーゼによるcdc14ホスファターゼのリン酸化を誘導する。リン酸化cdc14はユビキチンリガーゼ複合体APC/Cの活性化やcdk抑制タンパクの誘導などを通してcdk1活性を抑制している。

しかし哺乳類のdbf2相同キナーゼであるLATS1ではCDC14を含めホスファターゼが基質であるという報告が未だなく、またLATS1がどのようにAPC/C活性を制御しているかも不明であった。そこで申請者らはLATS1キナーゼにより生じたリン酸化ペプチドを質量分析によりスクリーニングしてホスファターゼを検索したところ、予想に反してCDC14は検出されず、Protein phosphatase 1C(PP1C)の制御サブユニットであるMYPT1 (myosin phosphatase-targeting subunit 1)が新規基質として同定された。さらにLATS1がMYPT1をリン酸化することで、MYPT1を介したPLK1(polo-like kinase1)活性制御に関与することも見出した。またLATS1がAPC/Cの構成分子の一つであるCDC26をリン酸化することでAPC/C活性を直接制御し得ることも明らかにした。これらの結果はMENの哺乳類と酵母との違いを示唆するもので、そのシグナル伝達系の詳細と個体レベルでの意義解明を進めていきたい。腫瘍生物学MYPT1の活性化に重要なS445のリン酸化部位に対するリン酸化抗体をDundee大学Alessi博士より供与を受け、実際にLATS1が細胞内でMYPT1をリン酸化し、それと逆相関でPLK1の活性的リン酸化が低下していることを見出した。LATS1ノックダウンでPLK1の活性が増加する知見とあわせて、LATS1によるPLK1抑制がその癌抑制分子としての働きに重要であることが強く示唆される。以上よりMENの癌抑制機構の一部を見出したことで当初の目標の一つを達成することが出来たと考えている。MYPT1部分変異体を用いたキナーゼアッセイによりLATS1によるリン酸化部位を5か所に絞り込み、ショウジョウバエなどのホモログにおいても高度に保存されているSer445に着目した。リン酸化Ser445抗体はイギリスDundee大学のAlessi博士が開発していたものの供与を受けることが出来たため、当初の予定以上に研究を進展させる事が出来た。a) LATS1ノックアウトマウスにおける発癌でのMYPT1、PLK1の活性変化:LATS1ノックアウトマウスは軟部組織肉腫や卵巣腫瘍を形成することが報告されている。申請者らは独自にLATS1ノックアウトマウスを作製しており上述したリン酸化抗体などを用い、同マウスに生じた腫瘍と腫瘍周囲健常組織におけるMYPT1とPLK1の活性を比較検討する。b) LATS1欠失腫瘍におけるPLK1阻害剤の効果:Lats1-/-MEFと対照の野生型MEFをSV40 largeT抗原とH-RasV12D発現
アンドロイド・ロボットを用いた精神疾患患者シミュレータの研究開発

精神医学教育において,人間の模擬患者を用いることなく,臨場感があり症状の再現性の高い面接練習を実現することを目的に,姿形が人間に酷似したアンドロイド・ロボットを模擬患者役として用いた面接練習システムの開発を行った.本システムでは,最も罹患者が多いと言われる単極型のうつ病を対象とし,その症状を再現できるようにロボットの動作と発話を実装した.そして,実証実験を実施し,本システムの再現性と精神医学教育における教育効果について検証した本研究では,精神医学教育における面接演習用として,姿形が人間に酷似したアンドロイド・ロボットSAYAを模擬患者として用いた模擬面接システム(患者ロボット)の研究開発を目的とした.現在,人間の模擬患者を用いた面接演習は行われているが,訓練に時間が掛かる,人によって再現する症状に差が生じる,責任が大きい,人材不足,などの問題がある.そこで,模擬患者をアンドロイド・ロボットで代替することにより,臨場感(リアリティー)を保ちつつ再現性のある訓練が実現できると期待できる.本研究では,極めて罹患者が多いと言われる“うつ病(特に単極型うつ病)"を対象に,主に,(1)精神疾患患者ロボットのハードウェアとソフトウェアおよび操作インタフェースの開発,(2)アンドロイド・ロボットによる症状の再現性の検証,(3)実証実験による提案システムの有効性の検証,の3項目について取り組んだ.この内,項目(1)は前年度まででほぼ完成していたため,本年度では,主に項目(2)(3)について実施した.まず,項目(2)では,SIGH-D(ハミルトンうつ病評価尺度HAM-D構造化面接ガイド)に従って面接を行っている医師と模擬患者(最重症の症状を再現)の様子を映した面接演習用の動画を観察し,模擬患者の特徴的な言動を抽出した.そして,抽出した模擬患者の発話や動作を項目(1)で開発した面接演習システムの患者ロボットで再現できるようにした.次に,項目(3)では,精神科医師や精神医学を学ぶ学生を対象として,開発した患者ロボットを用いた面接ロールプレイを実施した.そして,患者ロボットで設定した重症度と医師または学生が診断した際の重症度を比較する事により,患者ロボットの再現性を検証した.また,質問紙を用いて患者ロボットの有効性や有用性,教育効果についても調査を行った.精神医学教育において,人間の模擬患者を用いることなく,臨場感があり症状の再現性の高い面接練習を実現することを目的に,姿形が人間に酷似したアンドロイド・ロボットを模擬患者役として用いた面接練習システムの開発を行った.本システムでは,最も罹患者が多いと言われる単極型のうつ病を対象とし,その症状を再現できるようにロボットの動作と発話を実装した.そして,実証実験を実施し,本システムの再現性と精神医学教育における教育効果について検証した本研究では,姿形が人間に酷似したアンドロイドロボットSAYA(以下,SAYA)を模擬患者として用いた精神医学教育用の面接演習システム(患者ロボット)の研究開発を目的とする.人間の模擬患者の場合,訓練に時間が掛かる,人によって再現する症状に差が生じる,責任が大きい,人材不足,などの問題があるが,これをロボットで代替した場合,同じ症状を全く同じ状態で繰り返す事ができ,いつでも再現性のある訓練を行うことができると考えられる.また,予め用意しておけば,症状の切り替えも容易である.さらに,SAYAのように人間に酷似したアンドロイドを用いることにより,臨場感(リアリティ)のある問診の演習が実現できると期待できる.本研究では,特に,現代において極めて罹患者が多いと言われる"うつ病"を主に取り上げる.本研究の具体的な内容は,(1)精神疾患患者ロボットのハードウェアとソフトウェアおよび操作インタフェースの開発,(2)アンドロイドロボットによる症状の再現性の検証,(3)実証実験による提案システムの有効性の検証,の3項目である.本年度では,主に項目(1)について取り組み,(2),(3)の項目についても一部取り組んだ.項目(1)では,まず,患者ロボットとその操作システムの開発を行った.SAYAの操作システムの開発では,問診のシナリオに従ってロボットの発話や動作を予め登録しておき,タッチパネルで簡単にSAYAの操作を行えるインタフェースの開発を行った.問診のシナリオの作成では,うつ病診断に広く用いられているハミルトンうつ病評価尺度(HAM-D)を原版とした構造化面接版(SIGH-D)を基に,質問とその回答のシナリオを用意した.次に,項目(2)(3)では,実際の精神医学教育における実証実験として開発した患者ロボットを用いた面接ロールプレイを実施し,その再現性と教育効果について検証した.本研究の目的は,(1)精神疾患患者ロボットのハードウェアとソフトウェアおよび操作インタフェースの開発,(2)アンドロイドロボットによる症状の再現性の検証,(3)実証実験による提案システムの有効性の検証,の3項目である.この3つの目的の内,本年度では主に項目(1)に注力し,精神疾患患者シミュレータのプラットフォームの開発を行った.ハードウェアには申請者らのこれまでの研究の成果物であるアンドロイドロボットSAYAを改良したものを用いており,高い耐久性を実現している.制御ソフトウェアおよび操作インタフェースに関しては一から開発を行ったが,実証実験を通して改良を行い,十分に実用的なものが完成している.

また,うつ病の問診シナリオの作成では,研究や臨床の場で広く用いられているハミルトンうつ病評価尺度(HAM-D)を原版とした構造化面接版(Structured Interview Guide for the Hamilton Depression Rating Scale,SIGH-D)を基に質問とそれに対応する回答を用意し,実際の問診に近い内容で問診訓練を実践できるようにした.以上の観点から,項目(1)の目標は十分に達成できたと評価できる.項目(2)(3)についても一部検討を行っており,長崎大学大学院医歯薬学総合研究科の中根秀之教授の協力の下,精神科医師や医学部の学生を対象として開発した患者ロボットを用いた実証実験を実施し,SIGH-Dを用いた面接演習を行った.その結果,患者ロボットに対する医師や学生の関心が高いことが明らかとなり,いくつかの改善点も見出された.しかしながら,症状の再現精度や教育効果に関する評価は十分に行えなかった.以上の観点から,項目(2)(3)の達成度は6割程度と判断する.今後(平成24年度)は,(1)システムの高度化,(2)実証実験と再現精度の向上,(3)研究の総括,を主に行う.まず,項目(1)のシステムの高度化では,前年度の実証実験の際に得られた知見を基に,アンドロイドロボットSAYAの発話や動作などの改善を行い,再現精度を向上させる.さらに,操作インタフェース等の改良も行い,システムの使い勝手を向上させる.また,当面はうつ病の一症状(最重症)のみに絞って検討を行う予定だが,高い再現精度が見込みる段階で,正常,軽症,重症など,数種類の症状も再現できるようにする.さらに,うつ病との区別が難しいとされる不安障害の症状についても再現することにより,各症状を判別するための訓練に応用することも検討する.次に項目(2)では,前年度と同様,実際に精神科医師や医学部の学生に患者ロボットとの面接ロールプレイを行ってもらう.そして,SIGH-Dに基づいて評価してもらい,前年度では評価が不十分であった症状の再現精度と教育効果について詳細に検証する.なお,教育効果については,これまでの精神医学教育で実践されてきた既存の方法との比較によりその効果を評価することを検討している.また,初めの段階ではうつ病の最重症の症状のみについて検討する予定であるが,その他の症状を呈する患者ロボットも用意し,症状の判別精度についても調査することを検討している.最後に項目(3)では,平成23,24年度の研究成果を基に,アンドロイドロボットを用いた精神疾患患者シミュレータの開発に関する設計指針をまとめる.つまり,システムの仕様や,精神疾患(特にうつ病)症状の再現手法についてまとめると共に,その再現精度や教育的効果を明らかにする.次年度への繰越額は24千円であるが,元々ロボットの輸送費や材料の工作・加工費,学会の参加費,会議費のための予算として計上していたが,大学内の別の予算で支出した費用もあるため,未使用分を次年度のその他の予算として繰り越すことにした.ハードウェアのメンテナンス代として,金属材料,電子部品,空気圧機器,アクチュエータ(McKibben型人工筋肉)の購入費を消耗品費(350千円)として計上した.国内の学会に12回出席する予定であり,国内旅費(25千円)として計上した.また,国外の学会にも12回出席する予定であるため,そのための旅費(360千円)も計上した.
蛋白質動的高次構造検出法の開発及びそれを用いた蛋白質構造・機能相関の解明

本研究で用いた主たる方法論は時間分解共鳴ラマン分光法と顕微赤外分光法である。サブテーマとして掲げているのは、1)ピコ秒時間分解可視共鳴ラマン分光法による発色団の速い構造変化の検出、2)サブナノ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光法による蛋白質高次構造変化の検出、3)レーザー温度ジャンプ法による蛋白質フォールディング/アンフォールディング、4)機能を軸とした新規分光法の開発、5)DNAフォトリアーゼによるDNA光修復過程の解明、6)蛋白質会合による高次構造変化とそのトリガーの顕微赤外分光法による検出、7)センサーヘム蛋白質の環境検知、情報伝達、及び機能発現機構の解明、8)ヘム酵素による酸素活性化及びプロトン能動輸送機構の解明である。2)、3)、5)-8)は岡崎で、1)、4)は神戸大学で実験したが、1つの蛋白分子の動的構造と機能の相関を調べる場合には、ピコ秒領域の速い構造変化とナノ秒からミリ秒にかけて起こる遅い構造変化を合わせて考える必要があるので、1)、2)及び7)については同じ蛋白試料を岡崎と神戸の両方で測定する協力体制で研究を進めた。4)では振動スペクルのバンド形の時間変化を通じて蛋白質の構造揺らぎを検出する新しい視点に立つもので、ピコ秒の時間分解共鳴ラマンスペクトルを高いシグナル/ノイズ比で観測し、広幅化したバンドのどの部分が先に反応して消えていくかを見る"反応ホールバーニング"の手法を編み出し、ミオグロビンのFe-His伸縮振動に適用した。また6)では、β_2ミクログロブリンのアミロイド化をフーリエ変換顕微赤外分光法で調べ、アミロイドフィブリルコアーの構造を議論した。特に#21-31ペプチドによるアミロイド化に関しては、^<13>C同位体ラベルアミノ酸でフィブリルを形成し、その残基がどの2次構造をとるかについて詳しい解析をした。研究は順調に進行した。神戸大学のグループ(現在は大阪大学へ異動)では、2)の期待以上にピコ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光法による蛋白質高次構造変化の検出に成功した。サブナノ秒の紫外共鳴ラマン測定システムの製作にとりかかった。その光源として、206,220,229,及び244nmの4波長のレーザー光が0.1nsのパルス幅、1kHzの繰り返しで発振するようになった。これとは別のピコ秒可視レーザー光を光源とする時間分解共鳴ラマン分光の実験においては、一酸化炭素ミオグロビンのCO光解離後の超高速蛋白ダイナミクスを調べた。鉄-ヒスチジン伸縮振動の振動数が時定数100psで高波数シフトする事を見つけた。その時定数が溶液の粘度を上げると長くなり、両者を対数プロットするとほぼ直線上にのった。この事から蛋白構造全体が100ピコ秒の時定数で変化する事がわかった。センサー蛋白としては、HemATとDosを調べた。HemATは細菌の化学走性を生み出すセンサーで、酸素に向かって泳いでいく生理シグナルを作り出す。この蛋白の酸素付加体の鉄-酸素伸縮振動によるラマンバンドを同位体置換法で帰属した。2本の同位体鋭敏バンドが観測された。1本は酸素が根元側原子で蛋白と強く水素結合しているもの、もう1本は遠位側原子で水素結合しているものに帰属した。その相対強度は、シグナル伝達部を切って短くしていくと変化した。

この事により、この蛋白の特異的酸素認識機構は、酸素と蛋白との水素結合によると推定された。一方、大腸菌の酸素センサー蛋白であるDosは自然な状態では6配位低スピンのヘムをもち、その軸配位子はHis77とMet95でないかと推定された。そのCO付加体の共鳴ラマンスペクトルから、Met95がCOと置換すると推定された。アポミオグロビンの酸変性状態から自然な形に折りたたまれていく過程を時間分解紫外共鳴ラマン分光法で追跡した。時間分解能100マイクロ秒の高速混合装置を製作し、混合フロー法で測定した。A, G, Hヘリックスは150μsで既にでき上がっており、1ms領域にもう一つの中間体を与えた後5msでモルテングロビュール状態となった。自然な形になるのに40msかかった。本研究では、蛋白質高次構造変化の中間体の振動スペクトルを観測する方法を開発し、動的高次構造の解明により構造・機能相関の理解を深める事を目標にして研究を進めた。主たる方法論は時間分解共鳴ラマン分光法と顕微赤外分光法で、対象としたテーマは1)センサーヘム蛋白質の環境感知、情報伝達、及び機能発現機構、2)DNA光修復酵素の反応機構、3)ナノ秒温度ジャンプ法を用いた蛋白質フォールディング/アンフォールディング初期課程、4)顕微偏光赤外分光法による蛋白質アミロイド化の構造化学、5)蛋白質の熱揺らぎと機能発現に沿った構造変化の相関、の解明である。1)4)は岡崎機構で、5)は神戸大学で研究を進めた。1)はNOセンサーである可溶性グアニレートシクラーゼのCO錯体がYC-1という薬剤の存在かで活性が100倍高くなる事に注目し、その共鳴ラマンスペクトルを詳しく調べた。O_2センサーとしてHemATのFe-O_2伸縮振動に注目して、この分子がO_2特異的に情報伝達する仕組みはディスタル側の水素結合ネットワークにある事を証明した。ヘモグロビンのCO脱着による4次構造変化を紫外共鳴分光法で検出し、α1-β2サブユニット界面を通してのサブユニット間情報伝達について詳しく調べた。この静的データを元に、本研究で製作中のサブナノ秒時間分解紫外共鳴ラマンの研究への戦略を練った。4)ではβ2マイクログロブリンのアミロイドフィブリルの顕微偏光赤外スペクトルを観測する事に成功した。そのコアを形成する11番目から21番目の11残基を化学合成し、これによるアミロイドフィブリルを作る事にも成功して、その赤外スペクトルからフィブリルの構造モデルを提案するに到った。本研究で用いた主たる方法論は時間分解共鳴ラマン分光法と顕微赤外分光法である。サブテーマとして掲げているのは、1)ピコ秒時間分解可視共鳴ラマン分光法による発色団の速い構造変化の検出、2)サブナノ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光法による蛋白質高次構造変化の検出、3)レーザー温度ジャンプ法による蛋白質フォールディング/アンフォールディング、4)機能を軸とした新規分光法の開発、5)DNAフォトリアーゼによるDNA光修復過程の解明、6)蛋白質会合による高次構造変化とそのトリガーの顕微赤外分光法による検出である。2)、3)、
心不全状態での肝臓機能の破綻が心臓リモデリングへ与える影響

肝臓から分泌されるヘパトカインであるセレノプロテインP (SeP)は、高血糖とインスリン抵抗性の病態形成に関与する。臨床的にインスリン抵抗性は、新規心不全発症の独立した危険因子だが、SePの心不全形成における役割は明らかでない。本研究では、心不全形成にかかわるSePの効果を検討するため、SePノックアウトマウス(KO)に横行大動脈縮窄モデルを作成した。SePKOは、WTと比較し、心不全死が有意に改善した。また、大動脈縮窄2週間後の左室重量、肺重量ならびに線維化の指標は、SePKOで有意に小さかった。これらの検討から、内因性のSePの欠損は圧負荷により誘導される心不全を抑制することが示唆された。圧負荷による心不全モデルにおいて臓器連関(心肝連関)が存在し、インスリン抵抗性の破綻が心不全病態形成に連関するメカニズムを検証する。今年度は、野生型マウスに圧負荷モデルを作成した。マウスを麻酔後、人工呼吸器管理下に開胸し、実体顕微鏡下に横行胸部大動脈を結紮し圧負荷モデルを作成した。大動脈に圧較差が作成されていることを小動物用超音波検査器(VEVO2100-70MHz)にて確認した。大動脈結紮14日後で結紮前後の圧較差は平均40-50mmHgあることを確認した。野生型マウスに、大動脈結紮圧負荷モデルを作成し、時間経過を観察した。手術後3日、7日、14日観察後、心臓、肺臓、肝臓などの臓器を摘出し臓器重量を測定した。心筋の肥大を反映する、心重量は、偽手術群と比較して、大動脈結紮7日後に有為に増加し、14日後も更なる増加が確認されてたが、7日目との有意差はなかった。うっ血を反映する、肺重量は、偽手術群と比較して、大動脈7日後に有意に増加し、14日後はさらに増加が認められた。7日目と比較して14日後の肺重量は有意に増大していた。これらの検討から、大動脈結紮7日後では、圧負荷により心筋肥大が形成され、14日後では、肥大による適応が破たんし、圧過負荷により心不全が誘導されているモデルと考えられた。右心系のうっ血を反映する肝重量は、いずれの群でも差は認められず、大動脈結紮により誘導される心不全は主に、左心不全と考えられた。心不全状態が形成された、14日後の肝臓よりmRNAを抽出し、偽手術群(n=3)と大動脈結紮群(n=3)でcDNAマイクロアレイを行った。25467の遺伝子が同定され、圧負荷の有無をP=0.001で識別できる遺伝子が、1273同定することができた。今後、これらの遺伝子の機能を解析を進める。野生型マウスに圧負荷を作成し、モデルが適当であることが確認できた。さらに、心臓に圧負荷を作成したモデルの肝臓ににおいて、偽手術モデルと比較して、mRNAプロファイリングが大きく異なっていることが分かった。圧負荷誘導性心不全状態において、心臓ー肝臓連関が存在することを示唆するデーターが得られた。昨年度までの検討で、圧負荷心不全モデルにおいて、心肝連関存在することを同定できた。今年度は、全身のインスリン抵抗性の形成に関与する肝分泌タンパクであるセレノプロテインP(SeP)に注目し検討を進めた。まず、野生型マウスに圧負荷モデルを作成し、心不全状態が形成された、14日後の心臓、肝臓よりmRNAを抽出し、偽手術群と大動脈結紮群でRT-PCR法にてSeP mRNA発現を検討した。心臓でのSePの発現は、定常状態でその発現は同定できるが、圧負荷による発現変化は確認できなかった。一方、肝臓でのSeP発現は、心臓での圧負荷(心不全)により上昇することを確認した。そこで内因性のSePが心不全病態形成における役割を検討するために、SeP遺伝子欠損マウスを用いた。SeP遺伝子欠損マウスとその同腹の野生マウスに大動脈縮窄による圧負荷誘導性心不全モデルを作成した。術後14日目の検討で、心臓、肺臓、肝臓を摘出し臓器重量を確認した。心肥大を反映する心重量は、偽手術群と比較して、大動脈縮窄により、SeP遺伝子欠損マウスおよび野生マウスのいずれにおいても有意に増大していたが、大動脈縮窄による心重量は、SeP遺伝子欠損マウスにおいて野生マウスと比較すると有意に抑制されていた。さらに、左心不全によるうっ血を反映する肺重量は、偽手術群と比較して、大動脈縮窄により、SeP遺伝子欠損マウスおよび野生マウスのいずれにおいても有意に増大していたが、大動脈縮窄による肺重量は、SeP遺伝子欠損マウスにおいて野生マウスと比較すると有意に抑制されていた。これらの結果から、SeP遺伝子欠損マウスでは、圧負荷により誘導される心不全形成、心臓リモデリングが抑制されていることが明らかになった。心不全の病態形成に、肝臓由来の分泌タンパクSePが関与している可能性を遺伝子欠損マウスに圧負荷誘導性心不全モデルを用いて検討し、その作用を確認できた。

昨年度までの検討で、圧負荷心不全モデルにおいて、心肝連関が存在し、圧負荷を作成すると、肝臓よりインスリン抵抗性の形成に関与する肝分泌タンパクであるセレノプロテインP(SeP)の発現が上昇することを明らかにした。また、内因性のSePが心不全病態形成に関与することをSeP遺伝子欠損マウスとその同腹の野生マウスに大動脈縮窄による圧負荷誘導性心不全モデルを作成し検討した。術後14日目の検討で、SeP遺伝子欠損マウスでは、圧負荷により誘導される心不全形成、心臓リモデリングが抑制されていることが明らかになった。今年度は、心不全促進メカニズムの検討を行った。組織学的検討では、圧負荷で誘導される心筋細胞肥大がSeP遺伝子欠損マウスでは野生マウスと比較して有意に抑制されていた。TUNEL染色による心筋細胞アポトーシスの評価では、野生マウスと比較してSeP遺伝子欠損マウスでは圧負荷で誘導される心筋細胞アポトーシスが有意に抑制されていた。シリウスレッド染色による線維化の評価では、野生マウスと比較してSeP遺伝子欠損マウスでは、有意に線維化が抑制されていた。同様の傾向はタイプIおよびタイプIIIaコラーゲンのmRNA発現でも確認された。また、圧負荷モデル作成後の心臓遺伝子プロファイリングをDNAマイクロアレイ法を用いて検討したところ、野生マウスとSeP遺伝子欠損マウスで発現が有意に変化している遺伝子群を同定できたので、詳細を検討しSePの心筋細胞におけるシグナル伝達系を明らかにする。肝臓から分泌されるヘパトカインであるセレノプロテインP (SeP)は、高血糖とインスリン抵抗性の病態形成に関与する。臨床的にインスリン抵抗性は、新規心不全発症の独立した危険因子だが、SePの心不全形成における役割は明らかでない。本研究では、心不全形成にかかわるSePの効果を検討するため、SePノックアウトマウス(KO)に横行大動脈縮窄モデルを作成した。SePKOは、WTと比較し、心不全死が有意に改善した。また、大動脈縮窄2週間後の左室重量、肺重量ならびに線維化の指標は、SePKOで有意に小さかった。これらの検討から、内因性のSePの欠損は圧負荷により誘導される心不全を抑制することが示唆された。圧負荷により誘導されるmRNA遺伝子変化の詳細を、metacoreやBRB-aray toolを用いて解析するとともに、ヘパトカインとして注目しているセレノポロテインPの発現も評価する。また、セレノプロテインP遺伝子欠損マウスに圧負荷誘導性心不全を作成し、心不全状態形成および生存に与える影響を検討する。SePがどのように作用し、心不全状態を形成するかを明らかにする。SeP遺伝子欠損マウスと野生マウスの心臓の検討(mRNA、ウエスタンブロット、免疫組織染色)をすすめ、心臓における、線維化、心筋アポトーシス、血管新生に及ぼす効果を明らかにするとともにそのメカニズムを検討する。また、その成果を国際学会等で発表し、広く研究者の意見をえられるようにする。循環器内科効率的な執行により端数が生じ未使用額となった。セレノプロテイン遺伝子欠損が圧負荷による心臓リモデリングに与える影響、生存率に与える影響を確定したのち、そのメカニズムの解析をおこなう。SeP遺伝子欠損が与える影響を同定するため、ウエスタン法やリアルタイムPCR法および免疫組織染色などを用い、既存のマーカを評価する。
非臨界弦理論とそれを応用した超弦理論の研究

1.2次元ブラックホール中を運動するD-braneの研究。2次元ブラックホール中を運動するD-braneを厳密に記述する境界状態を構成し、その物理的性質を調べた。特に、open-closed dualityとunitarityの両立性を厳密に示し、世界面上でのWick rotationの正しい取り扱い法を確立した。これによって、本研究者が昨年度に提唱した境界状態の構築法の正当性が明らかになった。また、量子重力的な相転移を厳密な弦理論の枠内で発見し、その具体的な性質を、境界状態を用いることで詳しく解析した。2.4次元超共形場理論の現象論への応用。4次元共形揚の理論を基礎にした新しい超対称性の伝達の破れの機構"conformal gauge mediation"を提唱した。このモデルは余計なパラメタを含まず、さらに超対称粒子に対して独自のスペクトラムの予言をするために、完全に実験によって、検証可能である。特に、軽いグラヴィティーノを予言するなど現象論的にも面白いモデルになっている。3.超対称共形場の指数の研究。超対称共形揚の理論を分類することは、場の理論・弦理論の枠組みを定めるのに重要である。超対称共系場理論の指数は超対称共形場を特徴付ける新しい量であり、その性質を詳しく調べた。具体的に、オービフォルドゲージ理論や、コニフォールドゲージ理論で指数を計算し、AdS-CFT対応から予言される結果を再現することを示した。また、有限のNに対する指数の研究を通じて、"maximally angularmomentum bound"という極限を定義し、超対称指数の具体的計算を行った。さらに、重力的な観点からその極限の、重要性、物理的意味を明らかにした。古典的な重力理論からのずれが大きくなると、ある種の相転移(ブラックホール・ストリング転移)が起こることを示した。この結果は、Kutasovによって予言された所謂「タキオン・ラディオン対応」を弦理論のα'の展開で厳密に示すものであり弦理論におけるα'補正における新しい知見をもたらすものである。超対称性の破れを標準模型に伝える機構を考える上で、グラビティーノ問題やフレーバー問題が存在する。4次元超共形場理論を用いることでこれらの解決が原理上可能であることは知られていたが具体的で有望なモデルは存在していなかった。私は超対称性を自発的に破る模型を4次元超共形場理論に埋め込むことで具体的にそのようなモデルを構築する事に成功した。超対称共形場の理論を分類することは、場の理論・弦理論の枠組みを定めるのに重要である。超対称共形場理論の指数は超対称共系場を特徴付ける新しい量であり、その性質を詳しく調べた。
力学的エネルギー利用の有効性からみた高齢者の歩行能力評価

本研究の目的は,動作分析法を用いて高齢者の歩行における力学的エネルギー利用の有効性について検討し,(1)その決定要因をバイオメカニクス的に明らかにすること,(2)エネルギー論的観点から高齢者の歩行能力評価の可能性を探ることである.6186歳の健康な高齢男性25名(74.5±6.7歳)と2228歳の健康な青年男性12名(24.5±1.8歳)に歩行路上で4種類の速度での歩行(自由歩行,緩歩,速歩,最速歩行)を行わせ,側方から高速度VTRカメラで撮影を行なった.また,歩行路に埋設したフォースプラットフォームを用いて歩行中の支持脚に作用する地面反力を測定した実験により得られたVTR画像を画像処理ボードを介してパソコンに転送し,ディジタイズにより矢状面における身体各部の2次元座標を算出した.身体を剛体リンクモデルにおき,身体各部の座標値と地面反力データより逆動力学解祈法をもちいて,下肢のキネティクス変数を算出した.本研究から得られた主な結果は以下の通りである.1.高齢者と青年では総仕事に占める各関節の仕事の割合(貢献度)が異なっていた.高齢者では青年よりも正仕事における足関節の貢献度が小さく,股関節の貢献度が大きかった.また,負仕事における足関節の貢献度が小さく,膝関節の貢献度が大きかった.2.力学的エネルギー利用の有効性は歩行速度の増加にともない低下したが,同程度の歩行速度では高齢者が青年よりも小さかった.以上のことから,同じ歩行速度での歩行においても高齢者と青年では下肢関節の貢献度が異なることが示された.また,高齢者では同速度の歩行における力学的エネルギー利用の有効性が青年より低いことから,下肢関節の貢献度や力学的エネルギー利用の有効性からみた歩行の老化度評価の可能性が示唆された.本研究の目的は,動作分析法を用いて高齢者の歩行における力学的エネルギー利用の有効性について検討し,(1)その決定要因をバイオメカニクス的に明らかにすること,(2)エネルギー論的観点から高齢者の歩行能力評価の可能性を探ることである.6186歳の健康な高齢男性25名(74.5±6.7歳)に歩行路上で4種類の速度での歩行(自由歩行,緩歩,速歩,最速歩行)を行わせ,側方から高速度VTRカメラで撮影を行なった.また,歩行路に埋設したフォースプラットフォームを用いて歩行中の支持脚に作用する地面反力を測定した.実験により得られたVTR画像を解析用VTRデッキから画像処理ボードを介してパソコンに転送し,ディジタイズにより矢状面における身体各部の2次元座標を算出した.身体を剛体リンクモデルにおき,身体各部の座標値と地面反力データより逆動力学解析法をもちいて,下肢のキネティクス変数を算出した.その結果,現在までに高齢者の歩行について以下のような知見を得ている.1.足関節では離地前の正のパワー発揮(足底屈筋群のコンセントリックなパワー),膝関節では接地直後および遊脚期の負のパワー発揮(膝伸展筋群および膝屈曲筋群のエキセントリックなパワー),股関節では遊脚期の正のパワー発揮(股屈曲筋群のコンセントリックなパワー)が大きかった.2.歩行速度の増加にともない正および負仕事のいずれにおいても,足関節の貢献度が小さくなり,膝および股関節の貢献度が大きくなる傾向がみられた.3.歩行速度の増加にともない力学的エネルギー利用の有効性が低下する傾向がみられた.15年度は研究を継続して行い、青年男性(対象群)について同様の分析を行う.高齢者と青年の分析結果を比較することにより,高齢者の特徴を明らかにし,高齢者の歩行能力の評価方法について検討する予定である.本研究の目的は,動作分析法を用いて高齢者の歩行における力学的エネルギー利用の有効性について検討し,(1)その決定要因をバイオメカニクス的に明らかにすること,(2)エネルギー論的観点から高齢者の歩行能力評価の可能性を探ることである.6186歳の健康な高齢男性25名(74.5±6.7歳)と2228歳の健康な青年男性12名(24.5±1.8歳)に歩行路上で4種類の速度での歩行(自由歩行,緩歩,速歩,最速歩行)を行わせ,側方から高速度VTRカメラで撮影を行なった.また,歩行路に埋設したフォースプラットフォームを用いて歩行中の支持脚に作用する地面反力を測定した実験により得られたVTR画像を画像処理ボードを介してパソコンに転送し,ディジタイズにより矢状面における身体各部の2次元座標を算出した.身体を剛体リンクモデルにおき,身体各部の座標値と地面反力データより逆動力学解祈法をもちいて,下肢のキネティクス変数を算出した.本研究から得られた主な結果は以下の通りである.1.高齢者と青年では総仕事に占める各関節の仕事の割合(貢献度)が異なっていた.高齢者では青年よりも正仕事における足関節の貢献度が小さく,股関節の貢献度が大きかった.また,負仕事における足関節の貢献度が小さく,膝関節の貢献度が大きかった.2.力学的エネルギー利用の有効性は歩行速度の増加にともない低下したが,同程度の歩行速度では高齢者が青年よりも小さかった.以上のことから,同じ歩行速度での歩行においても高齢者と青年では下肢関節の貢献度が異なることが示された.また,高齢者では同速度の歩行における力学的エネルギー利用の有効性が青年より低いことから,下肢関節の貢献度や力学的エネルギー利用の有効性からみた歩行の老化度評価の可能性が示唆された.
Gタンパク質共役受容体のリン酸化と脱感受性

Gタンパク質共役受容体の脱感受性とGタンパク質共役受容体キナーゼ2(GRK2)によるリン酸化の関係を、培養細胞に発現させたムスカリン性アセチルコリン受容体m2サブタイプ(m2受容体)を主な対象として調べた。その結果、m2受容体の細胞内移行(Intenalization)、焼失(Down Regulation)、脱共役(Uncoupling)いずれもが、GRK2の共発現によって促進されことが分かった。GRK2によるm2受容体のアゴニスト依存性リン酸化が、これら脱共役現象の引き金になると推測される。GRK2による細胞内移行促進は、ムスカリン受容体m3,m4,m5サブタイブやドパミンD2受容体でも観察された。一方、m1受容体はGRK2によってリン酸化されるにもかかわらず、GRK2共発現による細胞内移行の促進は見られなかった。また、D4受容体の細胞内移行は殆ど観察されなかった。GRKによるリン酸化と脱感受性の関係は多くのGタンパク質共役受容体にあてはまる現象と推測されるが、受容体の種類による違いの存在も明らかである。GRK2はGタンパク質βγサブユニットとアゴニスト結合受容体によって相乗的に活性化されるが、この活性化がCa・カルモジュリンによって阻害されることが見出された。また、GRK2は基質特異性が厳しく、これまで知られている基質はGタンパク質共役受容体に限られていたが、チュブリンがGRK2に結合し、リン酸化されることが分かった。試験管内反応で見いだされた、Ca・カルモジュリンによる阻害とチュブリンリン酸化の生理的意味はこれからの課題である。ムスカリン受容体m1-m5サブタイプ、ドパミン受容体D2サブタイプをCOS7またはBHK21細胞に一過性に発現させ、各受容体の細胞内移行を測定した。また、Gタンパク質共役受容体キナーゼGRK2、5、6あるいはドミナントネガティブGRK2(DNGRK2)を共発現させ、その影響を調べた。この結果、(1)m2-m5受容体の細胞内移行がGRK2共発現によって促進される、(2)DNGRK2共発現によってm2とm4受容体の細胞内移行は抑制されるが、m1,m3,m5受容体の細胞内移行は影響を受けない、(3)BHK21細胞に発現したm2受容体の細胞内移行はGRK5共発現で促進されるが、m3受容体の細胞内移行は影響されない、(4)GRK6共発現によっては、m1-m5どの受容体の細胞内移行も影響されない、(5)D2受容体の細胞内移行がGRK2あるいはGRK5共発現によって促進される、などの結果が得られた。これらの結果は、GRKによるリン酸化と細胞内移行の関係がGqと共役する受容体を含め一般的に成立する可能性があることを示唆する。また、個々のGRKは異なる基質特異性を持つと考えられる。試験管内実験系で、GRK2活性がカルモジュリンによってCa濃度依存性に抑制されることを見出した。Caカルモジュリンは触媒部位に直接作用するのではなく、アゴニスト結合受容体とGタンパク質βγサブユニットによるGRK2の活性化を抑制する。CHO細胞(Chinese Hamster Ovary Cells)にムスカリン受容体m2サブタイプ(m2受容体)、細胞内第三ループを欠損させたm2受容体(I3-delm2受容体)、Gタンパク質共役受容体キナーゼ2(GRK2)を安定的に発現させ、m2受容体の脱感受性(Desensitization)、細胞内移行(Internalization)、消失(Down Regulation)を調べた。内向き整流KチャネルGRK1とCRK1を一過性に発現させたCHO細胞で、心房細胞と同様のカルバミルコリン依存性K電流が測定できた。GRK2を共発現しない細胞では脱感受性が見られなかったが、GRK2を共発現した細胞では数分以内の早い経過で起こる脱感受性現象が見られた。

I3-del m2受容体とGRK2を発現した細胞では脱感受性は観察されなかった。CHO細胞を種々の濃度のカルバミルコリンで刺激すると、濃度依存的な受容体の細胞内移行と消失が観測された。GRK2を共発現した細胞では、低濃度のカルバミルコリンでの細胞内移行と消失が促進され、濃度依存曲線が左側にシフトした。カルバミルコリンで刺激し続けると、80-90%の受容体がt_<1/2>=9.5minで細胞内移行し、60-70%がt_<1/2>=2.3hで消失した。I3-del m2受容体では細胞内移行がt_<1/2>=8.4h、消失がt_<1/2>=9.9hと大幅に遅くなった。これらの結果は、GRK2によるリン酸化が受容体の脱感受性と早い細胞内移行に必要で、細胞内移行に接続して消失が起こることを示唆している。
Visuddhimagga(清浄道論)と達磨多羅禅経及び坐禅三昧経における瞑想の比較研究

今年度の前期は『達摩多羅禅経』とVissuddhimaggaとの比較研究を中心に進めた。当初は咋年度からの続きである『坐禅三昧経』の読解も継続して行ったが、すぐに次の経典である『達摩多羅禅経』の読解研究に移った。『達磨多羅禅経』の経序の部分は難解であり、時間を要した。全体は17章から構成されるが、最初の巻第一の読解と、Visuddhimaggaに関連する内容が見いだせるかの検討から始めた。最初の8章は入息出息念anapanaに関する章であり、さまざまな形態が見られるが、これらがパーリ上座部の伝承の中に見られる16種類のanapanaと共通するものであることを確認した。よって、『達摩多羅禅経』は、止samathaを中心に説く経典であると位置づけられ、そこから観vipassanaに継続すると考えていることが明らかになった。また、本経にも不浄観が説かれるが、これは大乗経典に説かれる十種不浄観ではなく、上座に特徴的な不浄観asubhabhabanaであることを確認した。また七月には、日本国内で瞑想を行っている道場として有名である福井県小浜市の仏国寺を訪問調査し、原田湛玄老師より現在行われている瞑想に関する教示を得た。また小浜では青井の妙徳寺にも赴き、古坂法師より聞き取り調査を行った。また八月下旬には、韓国の全羅南道の双渓寺、慶尚北道聞慶の鳳巌寺、慶尚南道慶州の興輪寺などの禅院を訪問調査し、瞑想の実際を調査した。朝鮮半島では、禅は看話禅(話頭禅とも呼ばれる)が主流であり、その境地は「一年万念」と表現され、それは「心一境性」を確保することであることを確認した。大まかな結論として、東アジア世界は、止samathaの境地を主に求め、それを梧りとする傾向にあることが知られた。なお、九月以降も『達磨多羅禅経』の読解を進め、また二年間の研究の総括を行った。Gyana ratna Sraman氏と『坐禅三昧経』の読解研究を進めている。研究は、漢訳経典の現代語訳を作成し必要に応じてVisuddhimaggaと比較しながら読解を進める方法を取り、ほぼ読解作業を終えた。但し、漢文が難解であり読解に予想以上に多くの時間を要していることを告白せざるを得ない。なお、不浄観はVisuddhimaggaのKayagatasati-bhavanaと比較が可能であり、paliの伝統では不浄の観察の対象として登場する身体の部位は髪の毛から足に至るまで32カ所が挙げられるが、『坐禅三昧経』では36カ所が数え上げられる。中でも「脈」という用語から、中国医学思想上、重要な概念が本経に影響を与えていることが察せられた。また読解を進めた結果、『坐禅三昧経』は上座系の瞑想を整理すると共に、上座とは異質な仏の姿を観想するという新たな瞑想(大乗系と考える)が入り込んでおり、両者の関係を整理して説こうとしたのが本『坐禅三昧経』ではないかとの一応の結論を得た(この成果は蓑輪「『坐禅三昧経』における修行道」に述べた)。また、現在、東南及び東アジア世界に行われている瞑想の実際を探るべく、平成14年9月には台湾を現地調査し、中台禅寺、法鼓山等に行われる瞑想の実際を調査し、それらがほぼsamatha(止)の系列に入ることを確認した。特に中国大陸の鼓山の伝統を受けると考えられる中台禅寺において「話頭禅」なるものが実際に行われていることを確認した。また12月にはミャンマーに現地調査に赴き、現在4つの流派(mahasi, ubhakin, swanlun, mokok)が存在するが、ほぼ体系的には入息出息を中心にsamatha(止)とvipassana(観)の両者を行っていることを確認した。また、平成15年2月には山形県善法寺の僧堂を訪ね、日本曹洞宗における瞑想の実際を調査し、そこでは「結跏趺坐」が強調されることを確認した。

また七月には、日本国内で瞑想を行っている道場として有名である福井県小浜市の仏国寺を訪問調査し、原田湛玄老師より現在行われている瞑想に関する教示を得た。また小浜では青井の妙徳寺にも赴き、古坂法師より聞き取り調査を行った。また八月下旬には、韓国の全羅南道の双渓寺、慶尚北道聞慶の鳳巌寺、慶尚南道慶州の興輪寺などの禅院を訪問調査し、瞑想の実際を調査した。朝鮮半島では、禅は看話禅(話頭禅とも呼ばれる)が主流であり、その境地は「一年万念」と表現され、それは「心一境性」を確保することであることを確認した。大まかな結論として、東アジア世界は、止samathaの境地を主に求め、それを梧りとする傾向にあることが知られた。なお、九月以降も『達磨多羅禅経』の読解を進め、また二年間の研究の総括を行った。
間質性膀胱炎の疼痛に対するボツリヌス毒素、トリカブト毒の作用機序

間質性膀胱炎に対して、ブシ末(トリカブト)中心とした漢方を処方した。3年間継続治療をして、副作用なく効果は持続している。低侵襲性で患者への貢献度は高い。また、ボツリヌス毒素の膀胱筋層内注入療法は10回以上繰り返しても、副作用、効果の減弱は認めない。また膀胱上皮細胞の伸展刺激におけるATP放出の分子メカニズムを、細胞内小胞へのATPの蓄積ならびに開口放出の視点から捉え、ボツリヌス毒素はこのATP放出を抑制する。膀胱痛症候群(PBS)の動物モデルにおいて、脊髄神経膠星状細胞(アストロサイト)の顕著な活性化が示された。マウスの実験でアストロサイトの活性化を漢方のブシによって抑制することが可能。5年前から漢方のブシ末を中心にした治療を開始して、疼痛のコントロール(痛みが長く続かないという特徴がある。)が長期に得られ、また慢性骨盤痛症候群にも処方することで患者のQOLはかなり改善している。この長期成績について2012.4第100回日本泌尿器科学会総会にて発表。また2011年当大学薬理学教室より、ブシ末の神経障害性疼痛に対する薬理学的研究の成果(The astrocyte-targeted therapy by Bushi for the neuropathic pain in mice)が発表された。漢方の薬理学的効果はなかなか立証できないが、今回臨床的効果を実証する研究成果が発表された。2012.8第19回日本排尿機能学会にて、間質性膀胱炎患者への附子末と新薬であるミラベグロン併用による頻尿の改善について発表。2013.4第101回日本泌尿器科学会総会にて臨床成果発表予定。またこの臨床結果について、長野看護大学から臨床研究課題として患者からの情報収集も行われている。膀胱(尿路)上皮は尿中侵害性物質などの膀胱壁内への侵入を阻止する防御機構としての働き以外に、伸展刺激や侵害刺激を感知して求心性伝達を担う役割を果たしていると考えられる。膀胱上皮細胞の伸展刺激におけるATP放出の分子メカニズムを、細胞内小胞へのATPの蓄積ならびに開口放出の視点から捉えた研究成果を発表する。ボツリヌス毒素はこのATP放出を抑制する。2011.7Workshop on LUTS Supplemental issue発表。2011.9International continence society(国際尿禁制学会)発表。2011.9日本排尿機能学会にて、泌尿器科領域でのボツリヌス毒素の使用アンケート調査結果について発表した。今回臨床的効果を実証する研究成果が発表された。2012.8第19回日本排尿機能学会にて、間質性膀胱炎患者への附子末(トリカブト)と新薬であるミラベグロン併用による頻尿の改善について発表。2013.4第101回日本泌尿器科学会総会にて臨床成果発表。またボツリヌス毒素の膀胱筋層内注入療法の繰り返し施行による、効果減弱や副作用等についても検討した。5年間に11回ボツリヌス毒素筋層内注入を行ったが、効果の減弱や、副作用は全く認めていない。さらに基礎研究において、漢方薬「ブシ」による治療効果が実証されてきており、現在、漢方薬「ブシ」の臨床的長期効果について、投稿中である。2011.9 International continence society(国際尿禁制学会)発表。この長期成績について2012.4第100回日本泌尿器科学会総会にて発表する。