hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
全組織イメージングとライブイメージングによるオジギソウの速い運動メカニズムの解析

これらの結果は、オジギソウ運動における細胞の体積変化を包括的かつ定量的に解析した初めての例であり、そのメカニズムの解明に大きく寄与するものである。本研究計画の進捗状況は、上述の「開いた状態で固定したオジギソウ葉枕が、染色・透明化の過程で自発的に閉じてしまう」という予想外の技術的困難に直面したものの、新規技術の開発によりその克服に成功しており、本年度の研究計画に沿っておおむね順調に進展している。一方で、申請者が研究実施前に提唱した「個々の細胞レベルで起こる比較的小さな体積変化が、細胞変形および細胞間隙の変化と組み合わさることで何倍にも増幅され、器官全体としての大きな変形・運動を引き起こす」という作業仮説に関しては、予備実験による運動細胞の体積変化の測定の結果、個々の細胞の収縮率が申請者の予想(最大10%程度)よりもはるかに高い値(39%)を示すことが明らかになり、仮説は否定される結果となった。結果自体は予想とは異なったものの、研究目標である「実測データに基づく仮説の検証」は達成されており、この点においても研究は順調に進展したといえる。研究実施計画に基づき、本年度はオジギソウの運動におけるカルシウム動態のイメージング解析、およびその延長線上の実験として新たな遺伝子改変オジギソウの作出を行った。すでに樹立済みのGCaMP6fカルシウムセンサー発現ラインに関しては、埼玉大学の豊田博士との共同研究により詳細な解析を進め、現在も継続中である。また、生体内のカルシウム濃度を人為的に上昇させる実験を行うために、光依存的にカルシウムイオンを放出するPACRタンパク質を導入したトランスジェニックオジギソウを作出した。これらと並行して、おじぎ運動の遺伝子レベルでの解析を行うために、オジギソウ遺伝子のノックアウト個体作出を行った。以前に行ったRNA-seq解析により、葉枕の収縮側に特異的に発現する遺伝子として機械刺激受容チャネル等、運動への関与が予想されるいくつかの遺伝子候補が同定されていた。本研究では、これらの遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いて植物体内で変異させると同時に、CRISPR/Cas9用の発現ベクター上にGCaMP6f発現カセットを搭載することにより、遺伝子変異個体が得られた際に同じ個体でシームレスにカルシウム動態のイメージングが行えるような実験系を構築した。15の候補遺伝子に関して上述のベクターを用いたトランスジェニック個体の作出を試み、そのうち12の遺伝子に関して正常遺伝子を欠失した個体を得ることができた。さらに、遺伝子欠失の運動への影響をマクロレベルで定量的に解析するために、小型コンピューターであるラズベリーパイを用い、簡単なロボットを用いた機械刺激からビデオ撮影までを全自動で行うマクロ運動解析システムの開発を行った。現在、試作システムの開発が終了し、目標とする解析に対して十分な精度とパフォーマンスを示すことが確認できた。現在、さらなる精度向上を目指して同システムの改良を行っている最中である。今年度の研究は、研究計画調書に記載の研究目的に沿って遂行された。カルシウム動態のイメージングに関しては、研究計画調書の作成時点では野生型をベースにしたトランスジェニック個体のみを解析対象としていたが、その後の研究進展によりおじぎ運動とカルシウム動態に関与すると期待されるいくつかの遺伝子候補が新たに同定された。
自治体財政難が公立博物館に及ぼす長期的影響に関する研究

博物館経営の民営化の動向は、日本の公立博物館にはその使命の明確化を、設置者である自治体には情報公開を促すものである。自治体の財政難は、我々に、博物館の立地条件の再考と、資料継承の方法を探ることを強いる。公立館を管理運営している自治体出資法人では、公益認定取得後も積極的な寄附金調達を行う館は少ないが、公益性の追求に基づく寄附金獲得をめざすべきである。本研究の目的は、自治体財政難が公立博物館に及ぼす影響について、戦後の公立博物館成立期から現在、将来に至る長期的視野から分析を行い、地域の実情に応じた博物館運営の可能性を探ることである。研究初年度は以下の内容を実施した。1.神戸市立須磨海浜水族園において、市の外郭団体から民間共同事業体へ指定管理者の交代が行われたため、その経緯と課題を調査・検討し、全日本博物館学会で口頭発表した。2.この調査の過程で、指定管理者公募の際の応募書類の公開が不十分であることに疑問を抱き、神戸市長に対して異議申立てを行った。この間の経緯を含め、日本社会教育学会においてラウンドテーブル「指定管理者制度と情報公開」を企画、田中孝男氏に法的課題を整理していただき、参考資料とともに『Musa』25号に掲載した。上記1,2の研究で、自治体の財政難を背景に、博物館への指定管理者制度の適用が進む中、弊害を防ぐには、制度設計の基本思想「企画と執行の分離」を適切に実現するためのモニタリングが欠かせないこと、しかし自治体側の情報公開制度の運用が不十分であることを指摘した。3.日本社会教育学会で「自治体財政の変動が公立博物館に及ぼす影響」の口頭発表を行い、中央集権的な階層化・分業化の孕む問題を見据えつつ、経済成長期型の博物館設置政策から、財政縮減期には資料の次世代バトンタッチ型政策に移行する必要性を問題提起した。4.公益法人制度改革については、第92回近世古文書研究会にて「博物館管理運営財団の公益法人制度改革への対応について」、滋賀県博物館協議会平成22年度第2回研修会・情報交換会にて「公益法人制度改革と博物館」を報告、制度を解説し、最新の公益法人制度改革への対応状況について情報提供した。この折の報告・調査内容は、全国歴史資料保存利用機関連絡協議会近畿部会会報『Network』No.43及び『Musa』25号に掲載した。2年目に当たる平成23年度は、以下の内容を実施した。1.前年度に行った神戸市への情報公開請求を切り口として、指定都市での指定管理者応募書類に対する情報公開請求への対応状況と問題点をまとめ、『日本史研究』591号で公表した。2.京都水族館への建設反対運動、及び神戸市立須磨海浜水族園の指定管理者交代を事例に、「水族館をめぐる価値観の多様化」として、日本社会教育学会で口頭発表を行った。京都水族館の場合は、市民による水族館建設反対運動が水族館の展示内容・施設を一部変更させ、京都大学野生動物研究センターと学術交流協定を結ぶきっかけを作ったことを指摘し、また、須磨海浜水族園の場合は、新指定管理者が意欲的な展示更新や学術・環境保全事業を行う一方、収益事業の積極的導入を図っている点等を指摘し、日本の水族館が抱える課題(集客施設と社会教育施設、両方の役割を担わされてきたこと、利用者の意識改革が必要な点等)について論じた。なおこの2事例については、追加調査及び論文化作業を行っている。3.全日本博物館学会で「公益認定取得後の博物館管理運営財団による寄附金獲得策について」のタイトルで口頭発表を行い、公益法人制度改革に伴う博物館管理運営財団の公益認定取得状況を報告するとともに、寄附金獲得に向けた広報戦略の先進事例を紹介し、かつその問題点を指摘した上で、望ましい広報戦略(寄附金の使途をあらかじめ明確にし、事後、実際の使途を公開すること、寄附金控除を具体的な計算例を交えて説明し、確定申告上の手続きに触れること、従来の友の会的組織との関係を整理・説明すること等)を提案した。4.大町山岳博物館の創立60周年記念式典、及びリニューアル計画について、現地での参与観察及び資料・情報収集を行った。最終年度に当たる平成24年度は、以下の内容を実施した。1.大阪市における博物館政策の変遷とその要因について、現存の大阪市出資の博物館群を、(1)大正期に開園した天王寺動物園及び主に教育委員会が所管してきた博物館群、(2)市制百周年記念事業等を契機として首長部局でスタートした施設群、(3)府市共同出資による館、の3グループに分け、その沿革を市の総合計画や政策課題(人口と税収)、積極的公共投資の時代から行革路線への転換期に着目して整理し、第59回日本社会教育学会大会で口頭発表を行った。

2.博物館入館料の問題に焦点を当て、全日本博物館学会第38回研究大会において、「日本の博物館はなぜ無料でないのか?」の口頭発表を行った。戦後の法制化過程では、博物館・図書館ともに無料入館に対しては本来の利用者でない人々を排除することが意識されていたこと、図書館法には占領軍の意向で無料閲覧制が導入されたが、博物館法・図書館法とも制定時に日本人側から無料制による教育の機会均等の保障という考えが育つには至らなかったことを明らかにした。そして、英米では「博物館の無料化=社会階層間の格差の是正」が念頭にあるが、日本では所得による優遇策を設ける発想がなく、無料にする意味を認識できないのではないかと考察した。2.は、「身近な問いから考えるー日本の博物館はなぜ無料でないのか?」のタイトルで、前平・渡邉編『学びのフィールドへー生涯学習概論』(松籟社、2013年)の16章として刊行予定である。交付申請書に記載した「研究の目的」のうち、「博物館行財政にかかわる国の政策」(指定管理者制度及び公益法人制度改革)に関しては、学会での口頭発表や『日本史研究』への寄稿により、一定の成果を公表できた。一方、「自治体の博物館政策」に関しては、神戸市・京都市に関しては水族館を切り口に、新しい動向の調査に基づく学会発表は出来たが、論文化が遅れていること、また長期的視野からの自治体財政・人口変動の把握が進んでいないため、(3)と自己評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度が本研究課題の最終年度であるため、これまでに口頭発表をしていながら論文化が進んでいない項目についての論文化を急ぐ。また、博物館法制定当時からの、博物館の入館料に関する議論と実態の推移を切り口に、公立博物館の存在意義を巡る考察を行い、また、当初の研究計画で予定していた、大町市・横須賀市・大阪市での長期的な人口・財政の変動が博物館政策に及ぼした影響について検討を行う予定である。
嚥下困難者に対応した固体膨化食品の創製に向けての食塊の力学・界面物性の制御

食品の唾液に対する濡れ性,唾液吸収挙動と凝集性・崩壊性,口腔・食道粘膜上での食塊の付着・摩擦・変形・流動を乳化剤により制御して,嚥下困難者が喫食可能な固体膨化食品を創製することを目的にした。乳化剤を対小麦粉0.25,1.00%(w/w)で添加してケーキ・マフィン様の固体膨化モデル食品を調製した。固体膨化モデル食品と,それから調製した人工食塊の理化学的性質を測定した。嚥下しやすい食塊の要件は,適切な付着性,凝集性,柔らかさであった。食品の唾液に対する濡れ性,唾液吸収挙動と凝集性・崩壊性,口腔・食道粘膜上での食塊の付着・摩擦・変形・流動を乳化剤により制御して,嚥下困難者が喫食可能な固体膨化食品を調製することを目的にした。乳化剤(デカグリセリンステアリン酸エステル(PoGES),グリセリンステアリン酸モノエステル(GMS)を対小麦粉0.25,1.00%(w/w)で添加してケーキ・マフィン様の固体膨化モデル食品を調製した。PoGES10(HLB値10)とGMSには内相の水分保持機能があった。乳化剤を添加により見掛け密度が減少した。内相の硬さは,乳化剤添加により焼成3日後でもその増加が抑制された。内相縦断面の気孔数がPoGES9,PoGES10やGMSの添加により増加した。気泡壁の表面状態は乳化剤添加により変化しなかった。乳化剤添加により人工唾液に対する動的接触角が低下して濡れ性が増加し,人工唾液吸収量が若干増加した。固体膨化モデル食品が最も膨潤するのは咀嚼中であり,嚥下の際には食塊の膨潤はほとんど見られないと考えられた。PoGES10やGMSの添加により固体膨化モデル食品の崩壊力が低下し,人工食塊の硬さと圧縮エネルギーが減少した。乳化剤添加は,人工食塊の動摩擦係数に影響を及ぼさなかった。固体膨化モデル食品は,唾液を十分に吸収して食塊を形成することで嚥下困難者用食品に求められる弱いゲル型を示した。食塊の咽頭部での最大流速は,水>ヨーグルト>ケーキ・マフィンであり,誤嚥しにくいといわれているヨーグルトの流速に最も近かったのがPoGES(HLB値10)添加試料であった。健常人の官能評価ではGMS添加試料が柔らかく,口中で崩壊しやすく,嚥下時の抵抗が少ないと評価された。嚥下しやすい食塊の要件は,適切な付着性,凝集性,柔らかさであり,今後は加工デンプンや多糖類と乳化剤の併用によりこれを制御する検討を行う。ケーキ・マフィン様膨化モデル食品を調製し,ショ糖ステアリン酸エステル(SES)がモデル食品の理化学的特性に及ぼす影響を検討した。SES配合により,気孔数の増加,見掛け密度の減少,硬化抑制,唾液吸収量が高まることが期待された。嚥下困難者対応の固体膨化食品としては,気泡壁の力学的強度を低下させることが望ましいが,空隙の体積分率が大きくなると,口中に入れた際の食品の唾液吸収量が多くなると考えられる。固体膨化食品の膨化に伴う気泡壁の薄膜化による気泡壁の力学的強度の低下を目指すのではなく,気泡壁の軟化により力学的強度の低下させることが望ましいと考えられた。モデル食品から人工食塊を調製し,そのレオロジー的,界面科学的およびトライボロジー的特性に及ぼす乳化剤の影響を検討した。人工食塊の硬さは,SESの配合により減少する傾向があった。0.25%(w/w)親水性SES配合試料から調製した人工食塊の付着力と圧縮エネルギーが対照試料の場合に比べて小さかった。0.25%(w/w)親油性SES配合試料の人工食塊が対照試料よりもやや粘性的になった。SES配合量の増加により試料は一般的に粘性的になった。人工食塊の摩擦力は,SES配合試料と対照試料とで有意差がほとんど見られなかった。モデル食品を咀嚼・嚥下した際の咽頭部での食塊の流速を測定した。乳化剤の配合が嚥下容易性に及ぼす影響を3点比較法および順位法で官能評価した。モデル食品の咽頭部での最大流速は,水やヨーグルトよりも遅かったため,唾液を十分に吸収したモデル食品の食塊は誤嚥性が低いと考えられた。口中での崩壊容易性と唾液吸収性については,いずれの試料においても有意差が見られなかったが,対照試料が有意に硬く,1% (w/w)親油性SES配合試料が有意に軟らかいと評価された。

嚥下時の抵抗は1%(w/w)親油性SES配合試料が有意に低いと評価された。平成24年度には,固体膨化食品のレオロジー特性と界面化学特性,食塊のレオロジー特性,トライボロジー特性および界面化学特性を数値化するための評価系をほぼ確立した。1.固体膨化モデル食品の理化学特性の評価:試料にする固体膨化モデル食品を特徴付けるために,固体膨化モデル食品の比容積,表面積,水分活性,圧縮特性(硬さ),気孔構造(気孔面積率,X-/Y-フェレ径,楕円率,ラフネス)を測定し,微細構造を観察した。2.固体膨化モデル食品の人工唾液に対する濡れ性の評価:モデル食品生地を圧延して調製した試料に対する人工唾液の接触角を測定した。3.固体膨化モデル食品の人工唾液吸収挙動と崩壊性の評価:立方体状のモデル食品を所定温度の人工唾液に浸漬して人工唾液吸収量を測定した。人工唾液吸収過程でのモデル食品の形状変化をデジタル高速度カメラにより計測した。4.口腔・食道粘膜上での食塊の界面挙動の評価:所定温度の人工唾液に浸漬して平衡吸収量に達した立方体状のモデル食品を試料にして,単軸圧縮・引張型レオメータを使用して等速圧縮変形を所定回数繰り替えした際に,試料から圧縮プランジャーが引き離される際に発生する付着力を測定した。5.口腔・食道粘膜上での食塊のレオロジー的挙動の評価:所定温度の人工唾液に浸漬して平衡吸収量に達した立方体状のモデル食品を試料にして,単軸圧縮・引張型レオメータを使用して等速圧縮変形を所定回数繰り替えして食塊を調製した。これを試料にしてひずみ制御型動的粘弾性測定装置を使用して動的粘弾性(貯蔵弾性率,損失弾性率,力学的損失正接)を測定した。6.口腔・食道粘膜上での食塊のトライボロジー挙動の評価:所定温度の人工唾液に浸漬して平衡吸収量に達した立方体状のモデル食品を試料にして,2分力ロードセル・X軸直動部を装着した単軸圧縮・引張型レオメータを使用して摩擦係数を測定した。次年度は,固体膨化モデル食品を嚥下困難者対応にするために,モデル食品およびその食塊のレオロジー特性,界面化学特性およびトライボロジー特性の目標値を明らかにする。1.固体膨化モデル食品の人工唾液に対する濡れ性の目標値の明確化:モデル食品生地を圧延して調製した試料に対する人工唾液の動的接触角と健常人が評価した嚥下しやすさとの相関を検討し,目標値を明確にする。2.固体膨化モデル食品の人工唾液吸収挙動と崩壊性の目標値の明確化:モデル食品の人工唾液吸収量および吸収速度,崩壊開始時間と健常人が評価した嚥下しやすさとの相関を検討し,目標値を明確にする。3.口腔・食道粘膜上での食塊の界面挙動の目標値の明確化:モデル食品から調製した食塊の付着力と健常人が評価した嚥下しやすさとの相関を検討し,目標値を明確にする。4.口腔・食道粘膜上での食塊のレオロジー的挙動の目標値の明確化:モデル食品から調製した食塊の動的粘弾性および大変形の応力成長と健常人が評価した嚥下しやすさとの相関を検討し,目標値を明確にする。5.口腔・食道粘膜上での食塊のトライボロジー挙動の目標値の明確化:モデル食品から調製した食塊の摩擦係数と健常人が評価した嚥下しやすさとの相関を検討し,目標値を明確にする。次年度は,平成24年度に確立した固体膨化食品のレオロジー特性と界面化学特性,食塊のレオロジー特性,トライボロジー特性および界面化学特性を数値化するための評価系を用いて,固体膨化モデル食品を嚥下困難者対応にするために,モデル食品およびその食塊のレオロジー特性,界面化学特性およびトライボロジー特性の目標値を明らかにする。この検討のために,食品原材料,試薬,ガラス・樹脂器具などの購入に研究費を使用する。
膜脂質輸送体ＡＢＣＡ１による善玉コレステロール（ＨＤＬ）産生メカニズムの解明

ABCA1はHDL産生に必須な脂質輸送体である。昨年度、セミインタクト細胞を用いた実験系を立ち上げる中、ABCA1発現細胞ではストレプトリジンO(SLO)による孔形成が起こらなくなることを発見した。この現象が、ABCA1によって細胞膜のコレステロール分布が変化したことを反映しているのではないかと考え、検討した。その結果、ABCA1によるSLO孔形成の抑制はATPase活性依存的であること、またABCA1の発現によって細胞の膜画分のコレステロール量に変化はなく、SLOの結合量にも変化がないことがわかった。これらのことから、ABCA1のコレステロールフロップ活性によって細胞膜内層のコレステロールが不足したため、ABCA1発現細胞ではSLOによって孔が開かなくなったことが示唆された。実際、コレステロール結合プローブを用いてフローサイトメトリーを行ったところ、ABCA1発現量依存的にプローブの結合量が増加し、ABCA1発現細胞では細胞膜外層のコレステロールが増加していることがわかった。さらに、細胞膜のスフィンゴミエリンを分解することによって細胞膜内層のコレステロールを増加させると、SLO孔形成が促進されることがわかった。これらの結果から、ABCA1は細胞膜において内層から外層へコレステロールをフロップしていることが明らかになった。これらの結果をScientific Reportに報告した。当初の予定とは異なったが、本研究によってABCA1がコレステロールを直接輸送していることを示すことができた。このことは、ABCA1が直接HDLを産生していることを強く支持している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。過去の研究から、ABCA1の持つ細胞外ドメインはHDL産生に重要な役割を果たすことが示唆されているが、その機構はわかっていない。そこで本研究では、ABCA1が輸送した脂質を一時的に自身の細胞外ドメインに蓄積し、それを一度にアクセプターに受け渡すことでHDLを産生する、という仮説を証明する。これまでの研究から、培養細胞系においてABCA1発現細胞をトリプシン処理すると培地中に脂質が放出されることがわかっている。そこで、その脂質放出とABCA1細胞外ドメイン切断の関係を示すため、細胞外ドメインにthrombin認識配列を挿入したABCA1を作製し、細胞外ドメインを特異的に切断できる系を確立した。しかし、切断ヶ所や速度の問題からトリプシン処理のような脂質放出は見られなかった。そこで、培地中に放出された細胞外ドメインを直接解析するため、細胞外ドメインにHAタグを挿入したABCA1を用いてトリプシン処理を行ったところ、培地中への脂質と細胞外ドメインの放出は同様な時間依存性を示した。この結果から、ABCA1細胞外ドメインに脂質が蓄積していることが示唆された。また、HDL産生をさらに詳細に解析するためABCA1発現細胞を用いたセミインタクト細胞系を確立した。この実験系では、細菌毒素であるストレプトリジンO(SLO)によって細胞膜に孔を開け、中身を入れ替えた状態の細胞を用いて解析を行う。予想外なことに、ABCA1発現細胞ではSLOによる孔形成が起こらないことがわかったが、この現象はABCA1が細胞膜コレステロールの状態を変化させたために起きた可能性が考えられた。そこで、SLO処理前にコレステロールを細胞膜に添加したところABCA1発現細胞にも孔を開けられるようになった。これにより翌年度からの解析の準備が整った。ABCA1細胞外ドメインの脂質蓄積の解析において、当初の計画とは異なる形ではあるが、ABCA1細胞外ドメイン切断と脂質放出の関係を示すことができた。また、セミインタクト細胞系確立の際に発見したABCA1発現細胞においてSLO孔形成が起こらないという現象は予想外であったが、その解析の過程においてABCA1が細胞膜コレステロールの状態を変化させていることを見出し、国内外の学会で報告するまでに至っている。当初の計画に加えてこの現象の解析をさらに進めていくことによって、ABCA1によるHDL産生メカニズムの解明がより一層進むことが期待できる。

このことは、ABCA1が直接HDLを産生していることを強く支持している。当初の計画通り、セミインタクト細胞系を用いたHDL産生過程の解析を行う。具体的には、細胞内のATP濃度や相互作用タンパクの有無によるHDL産生の変化を調べる。また、孔形成毒素SLOを用いてABCA1のコレステロール輸送活性を評価する。さらに、部分精製したABCA1細胞外ドメインの脂質との相互作用や複合体形成を試みる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
慢性肝疾患（特に肝細胞癌）におけるIRF−1の変化とIFN治療に関する研究

肝細胞癌は既報の遺伝子変化のみでは多段階発癌機構を説明できない癌であり新たな遺伝子の検討および解析手法の開発が持たれている。本研究において検討する転写因子IRF-1は新たな癌抑制遺伝子として注目されている。臨床的には血管腫瘍においてexon skippingが報告され、消化器癌においてもIRF-1 locusの変化が報告されているが、未だ臨床的検討は少ない。基礎的にはIRF-1がp53と非依存的に細胞周期を停止させることが報告され、今後多くの癌においてIRF-1遺伝子の変化が検出されることと思われる。そこで我々は肝細胞癌における遺伝子変化の一端を明らかとするためIRF-1とp21の発現量を検討した。【対象と方法】大阪市立大学第二外科にて切除された肝細胞癌20例を対象とした。癌部、非癌部よりRNAを抽出し測定に供した。IRF-1とp21の発現量は定量PCRを用いて検討した。コントロールとしてβ-actinを用いた。【結果】非癌部と比較して癌部では4例(20%)においてIRF-1の発現低下を認めた。またIRF-1の低下症例を含め7例においてp21の発現低下を認めた。すなわち肝細胞癌においてIRF-1依存性にp21発現が低下する症例が存在することが明らかとなった。【今後の課題】対象となる肝癌症例を増やしさらにp53遺伝子の変化の検討し、IRF-1、p53、P21の三者の相互関係を検討する。また肝癌切除例でのIFN治療効果(抗ウイルス効果と肝発癌予防効果)がIRF-1遺伝子の変化と関係があるのか否かをprospecitveに検討する計画である。
イオン液体を利用した鉄複核錯体固定化電極の構築

末端にジスルフィド基を有するホスホニウム型イオン液体を修飾したイオン液体修飾電極を作製し,鉄複各錯体を導入した.得られた鉄複各錯体を含むイオン液体修飾電極では酸素の還元に伴う触媒電流が観測され,電極上の鉄錯体が電気化学的に酸素を還元していることが示唆された.回転リング-ディスク電極を用いた解析では,酸素還元反応に関わる反応電指数は約3.2電子と見積もられ,酸素の2電子及び4電子還元反応が同時に起こっていることが示唆された.末端にジスルフィド基を有するホスホニウム型イオン液体を修飾したイオン液体修飾電極を作製し,鉄複各錯体を導入した.得られた鉄複各錯体を含むイオン液体修飾電極では酸素の還元に伴う触媒電流が観測され,電極上の鉄錯体が電気化学的に酸素を還元していることが示唆された.回転リング-ディスク電極を用いた解析では,酸素還元反応に関わる反応電指数は約3.2電子と見積もられ,酸素の2電子及び4電子還元反応が同時に起こっていることが示唆された.末端にジスルフィド基を有するホスホニウム型イオン液体を新規に合成し,Au電極上への修飾を行った.作成されたイオン液体修飾電極はIR-RASスペクトル,サイクリックボルタンメトリーおよび水晶振動子マイクロバランス法(QCM)により同定された.続いて得られたイオン液体修飾電極上への各種金属錯体の導入を試みた.その結果,イオン液体修飾電極作成後では金属錯体を含む溶液に修飾電極を浸漬させても上手く錯体が導入されないことが判明した.そこでイオン液体を修飾する際に同時に金属錯体を共存させたところ,様々な金属錯体を導入することに成功した.金属錯体の導入の確認はIR-RASスペクトルおよびサイクリックボルタンメトリーにより行った.導入された金属錯体はフェロセン,[Ru(NH_3)_6]^<2+>および[Fe(CN)_6]^<3->の3種類であるが,電荷を問わずいずれの錯体もイオン液体修飾電極上へ導入できたことから,単純な静電相互作用により各錯体が電極上に固定化された訳ではないことが示唆された.各金属錯体が導入されたイオン液体修飾電極の酸化還元電位は均一溶液中のものと近く,導入された各錯体の状態が溶液中の状態に近いことも示唆された.従って,当初の狙い通りのイオン液体修飾電極を構築することに成功した。現在,目的の鉄複核錯体の配位子合成に取り掛かっており,完成次第このイオン液体修飾電極に鉄複核錯体を導入し,各種物性の測定を行う予定である.昨年度までの成果により開発したホスホニウム型イオン液体修飾電極を鉄複核錯体が溶解した有機溶媒中に浸漬することで,目的の鉄複核錯体を導入したイオン液体修飾電極を得た,得られた修飾電極の評価は表面反射赤外分光測定および各種電気化学測定により行った.赤外吸収スペクトルでは,導入した鉄複核錯体に特徴的なピークが観測され,鉄錯体の電極上への固定化が示唆された。また電気化学測定では,導入した鉄複核錯体に由来する酸化還元波が観測され,電極上での鉄錯体の存在が確認された.また得られた酸化還元電位は溶液中の錯体の電位に近く,以前に報告した錯体を直接修飾した系に比べて,極端な電位のシフトは見られなかった,従って当初の目的通り,イオン液体修飾電極を用いて鉄錯体を電極上に修飾することにより,溶液中に近い状態で電極上に鉄錯体を固定化することに成功した.得られた鉄錯体修飾電極を用いて酸素の電気化学的還元反応を行ったところ,酸素の還元に伴う触媒電流が観測され,電極上の鉄錯体が電気化学的に酸素を還元していることが示唆された.また回転リング-ディスク電極を用いた解析では,酸素還元反応に関わる反応電指数は約3.2電子と見積もられた.これは酸素の2電子還元による過酸化水素の発生の他に,4電子還元反応の進行に伴う水の生成が同時に起こっていることを示唆する結果であった.以上の結果より,イオン液体修飾電極を利用して鉄複核錯体を電極上に固定化することにより,錯体による酸素の還元電位を変化させることなく,酸素の還元反応を行う事に成功した.また酸素の還元は2電子還元だけでなく,4電子還元も同時に起こっていること実験的に観測することに成功した.
確率群作用の絶対連続性と調和解析

X,Yを群Gに値をとる独立確率変数列で,Xは同分布列,またX・Yを項別積列とする。今XとX・YがG値列全体の空間に導く確率測度をそれぞれPとQとするときPとQの絶対連続性(PQと書く)をYの分布で特徴づけることが問題であった。この問題の最も簡単で基本的な場合がGが実数加群の場合であり,これについては(代表者佐藤の貢献を含め)多くの結果が知られている。今年度はまずGがこの実数加群の場合について知られていることを整理することから始めた。これらをまとめて「無限次元確率解析」日米シンポシウム(米国・バトンル-ジュ市)で発表し,好評を博した。次にGが正の実数のなす乗法群の場合に,Xの1次元分布がルベ-グ測度と互いに絶対連続であること,その密度関数がある種の積分正測性をみたすこと,を仮定することによって,Yの平均が2乗総和可能列であることがPQとなるための十分条件であることを示した。しかしこの場合は対数写像を考えるとGが実数加群の場合と本質的には同じであると考えられる。またXが実確率変数列でYが正値確率変数列の場合にもPQとなるための十分条件が得られた。しかしこのような簡単な場合でも必要条件はかなり難しいことが分かった。他方,ユークリッド空間上の局所可積分関数の最大関数について,(p,p)強有界性が次元に無関係に得られることがStein & Stroembergによって証明されている。これは無限次元ガウス測度の密度定理を考える上で大いに参考になりそうな結果がある。ところがその証明は大変難解である。そこでまず今年度はこの結果に完全証明をつけることから始めた。その成果は博士前期課程大塚正治君の修士論文としてまとめた。さらに分担者達もそれぞれの立場から成果を得た。
セマフォリン発現トランスジェニックマウスにおける皮膚免疫機能と肥満細胞の検証

Semaphorin 3a(Sema3a)を表皮基底細胞で過剰発現する遺伝子改変マウスを作成したところ、真皮内に肥満細胞の増殖が見られた。マウス骨髄より肥満細胞を培養し、これら細胞はSema3a受容体を発現することをFACS解析にて確認した。また、Sema3aはIL-3による肥満細胞の増殖を増強することが判明した。一方で、Sema3aはケラチノサイトからのSCF産生を低下させ、肥満細胞の過剰な増殖を抑制させるためのnegative feedback機構が皮膚環境において存在していることが示唆された。Semaphorin(Sema)3aは神経軸索反発因子として当初注目されていた分子であるが、近年Sema3aには血管新生、器官形成、癌の進展、免疫機能などに作用することが判明した。これまでの報告では、関節リウマチ患者から分離した活性化T細胞でSema3aの発現が障害されていたことや、アトピー性皮膚炎の患者における表皮内のSema3a発現が健常人に比べ低下していたことが判明している。このことから、Sema3aの発現低下は炎症性疾患に関連している可能性が推測される。我々は、肥満細胞をはじめとする免疫細胞に対するSema3aの作用の調査を開始し、マウス肥満細胞にSema3aの受容体であるNeuropilinとPlexinの複合体(NRP1/PlexA1)が発現していることをFACS解析にて確認した。また、培養したBMDMCにSema3aを添加することで、肥満細胞が増殖することをつきとめた。肥満細胞の膜表面にはC-kitが発現しており、そのLigandであるSCFは肥満細胞の増殖因子として働く。表皮ケラチノサイトはSCFの産生源として考えられ、Sema3aがケラチノサイトに作用することでSCFの産生が促進され、間接的に肥満細胞の増殖を誘導する可能性を考えた。マウス新生児の皮膚からkeratinocyteを培養し、FACS解析にてケラチノサイトにSema3aの受容体であるNRP1/PlexA1の発現が確認された。その後、マウス皮膚から培養したケラチノサイトをSema3a存在下で培養し、上清のSCFをELISAで評価した。予想に反し、SCFの産生量はSema3aの添加により減少する傾向にあることが確認された。Sema3aは肥満細胞に対し直接的には増殖促進作用を示したが、ケラチノサイトに対してはSCFの産生を抑制する方向に働くことが判明した。我々は、ケラチン14プロモーター制御下でSema3a遺伝子が発現するマウスを作成し、このマウスにおいて真皮内の肥満細胞が増殖している現象を確認した。肥満細胞は炎症に関わる重要な免疫細胞であり、Sema3aと肥満細胞との関わりを中心に研究を進めた。次に、培養したBMDMCにSema3aを作用させ、Alamar blue assayにて肥満細胞のproliferationへの作用を検証した。その結果、Sema3aには肥満細胞を増殖させる現象が有意差をもって確認された。Semaphorin3A(Sema3A)には神経軸索反発因子として機能以外に、血管新生、器官形成、癌の進展、さらには免疫変調作用などがあることが近年明らかとなってきている。我々は、Sema3Aと肥満細胞との関わりにつき研究を進めた。Sema3Aの発現は正常表皮において確認されるが、アトピー性皮膚炎患者の表皮ではその発現が低下する。表皮におけるSema3Aの発現が皮膚疾患の発症や病態に強く関わっている可能性が考えられ、表皮基底細胞にSema3Aが過剰発現するtransgenic mouse(Tgマウス)を作成した。当初このマウスを軸に研究を進める予定であったが、本Tgマウスの詳細な解析を行ったところ、genomeレベルでは遺伝子の発現がみられたものの、Southern-blotでは遺伝子の発現が確認されず、また皮膚組織におけるSema3Aの増加も確認されなかった。このため、肥満細胞とSema3Aとの関連を詳細に調べていく内容に研究の比重を変更した。Sema3Aは肥満細胞の増殖を促すことが判明した。一方で、表皮細胞は肥満細胞の増殖因子であるSCFを産生するが、興味深いことにSema3Aは表皮からのSCF産生には負の働きを示すことがわかった。また、肥満細胞の遊走能への作用を評価したところ、Sema3Aは肥満細胞の走化因子ではないことも分かった。皮膚科学また、Sema3aはアトピー患者の皮膚で発現が低下しており、その結果SCFの発現がケラチノサイトで高まる可能性も考えられる。アトピー性皮膚炎では様々な炎症細胞が皮膚病変に浸潤しており、肥満細胞も病態に大きくかかわっている。Sema3aの発現低下が炎症性病変での肥満細胞の増殖や遊走につながっている可能性が今回の結果から考えられる。Sema3aと肥満細胞の関わりを中心に、皮膚におけるSema3aの免疫学的作用を解明していくことが本研究の課題である。

そのfirst stepとして、今年度の研究目標としては:1肥満細胞におけるPlexA1発現の検証、2Sema3aによる肥満細胞への作用の検証、を予定していた。我々は、肥満細胞の培養方法を確立し、培養細胞(BMDMC)を用いてのin vitroな実験、解析を行うことに成功した。FACS解析にて、BMDMCにPlexA1が発現していることが確認されたことから、Sema3aが肥満細胞に作用することが可能であることが立証された。次に、我々はSema3aを肥満細胞に作用させ、Sema3aが肥満細胞の増殖に働くことを確認した。H26年度はアトピー性皮膚炎に関連する肥満細胞以外の炎症細胞とSema3aの関連を探っていく予定である。具体的にはT細胞との関わりにつき研究を進めていきたい。Sema3aは肥満細胞の増殖を促す結果であったが、肥満細胞にはpro-inflammatoryとanti-inflammatoryの両作用が備わっていることが指摘されており、増殖を促すことが必ずしも炎症を助長させることにはつながらない。アトピー性皮膚炎ではSema3aの発現が低下していることから、Sema3aには全体としてanti-inflammatoryな作用があると想定もできる。培養したT細胞にSema3aを作用させる実験をすすめていきたい。Sema3aによる作用は、これまでの報告では免疫抑制的な働きが多い。肥満細胞にはpro-inflammatoryな作用と抑制的な作用があり、前者はtryptaseやchymaseが関連しており、histamine、PAR2、pro-IL1β、TNFα、IL4などの分子が関与している。一方で、免疫抑制的な作用にはIL-10やTGF-βが関わっていると推測されている。Sema3aが肥満細胞に作用し、これらの分子の発現にどのような変化があるかを検証する必要がある。また、Sema3aがケラチノサイトなどの細胞に作用することで、肥満細胞の走化因子であるSCFなどの発現増加が誘導されるかにつき検証をすすめる。さらに、Sema3aは神経伸長および痒みに関与する因子であることから、痒みに関連した他の分子(Neuropeptideなど)との関わりについても検証を進める。該当なし
貯蔵環境の変動に対する青果物の応答に関する研究

流通過程における環境の変動に対して、青果物がどのような挙動を示すか検討することを目的として、昨年度は、基本的な温度変動パターンに対する青果物の呼吸特性、特に環境温度をステップ状に昇温および降温させた場合の青果物の呼吸速度を測定した。今年度は、異なる温度変動パターンとして、段階的に温度を昇温、降温させた場合、矩形状の温度変動を与えた場合、インパルス状の温度変動を与えた場合の、ホウレンソウおよびチンゲンサイの呼吸特性を調べるとともに、流通過程で産物が受ける温度変動について調査した。段階的な昇降温(温度変動幅5°C)および矩形状の温度変動(変動幅10°C)を与えた場合、呼吸速度は温度変動に対して指数関数的に変化した。また、インパルス状の温度変動を与えた場合、呼吸速度は温度に対して指数関数的に変化したが、温度変動が繰り返される度に、呼吸速度の値は低下する傾向が見られた。急激な温度変動を繰り返して与えることは、青果物の消耗に繋がると考えられる。流通過程の環境温度変動について、温湿度データロガー(CHINO,MR6661)を用いて調査した。青果物の流通経路は多岐にわたっているが、今回は生産現場から販売所へ直接納入する場合について調べた。この場合、環境温度は外気温度に左右されたが、測定時期が冬季であったため、流通期間における急激な温度上昇等はみられず、青果物の呼吸速度は温度に対してやや遅れて応答した。今後、夏期高温時のデータの蓄積が必要である。今回得られた結果から、環境温度に対する青果物の呼吸量を予測することが可能であると考えられるが、実際の流通過程での温度変動をより詳しく検討することにより、貯蔵生理及び流通技術改善のための基礎資料となるものと考えられる。流通過程における環境の変動に対して、青果物がどのような挙動を示すか検討するために、温度変動に対する青果物の呼吸速度の応答について調べた。本年度は、まず、基本的な温度変動パターンに対する青果物の呼吸特性を把握するため、環境温度をステップ状に昇温および降温させた場合の青果物の呼吸速度を測定した。供試材料として、ナス及びホウレンソウを用い、これらを入れたチャンバを低温恒温器内に設置し、降温及び昇温操作を行った。温度変動幅は10°Cとし、降温時は15°Cから5°Cに、昇温時は5°Cから15°Cに変動させた。また、チャンバ内を通過したガスのCO_2濃度は赤外線ガス分析計により測定し、この値から呼吸速度を算出した。環境温度及び品温はT型熱電対で測定し、記録した。ナス、ホウレンソウの呼吸速度は、ともに品温同様、環境温度に対して指数関数的に変動したが、降温時の方が昇温時に比べ、急激であった。ナスの場合、降温前の平均呼吸速度21.5 mg/kg/hが、降温後約100分で5.3mg/kg/hとほぼ一定となり、昇温時は8.0mg/kg/hであったものが、約270分で24.0mg/kg/hとなった。また、Q_<10>値は2.5程度であった。ホウレンソウの場合は、降温前52.8mg/kg/hであったものが、約45分後に9.5mg/kg/hとなり、昇温前12.5mg/kg/hであったものが、約200分で56.8mg/kg/hとなった。Q_<10>値は2.8程度であった。次年度は、温度変動パターン及び温度域を広げデータを蓄積し、呼吸特性のモデル化を検討するとともに、実際の流通過程での温度履歴に対する青果物の呼吸特性について調べ、流通過程における青果物の呼吸量の最適制御について検討する。温度変動に対する青果物呼吸速度の応答特性をモデル化し、流通過程の温度履歴に対応した青果物の呼吸量を予測することは、貯蔵生理及び流通技術改善の基礎資料として有用であると考えられる。

今回得られた結果から、環境温度に対する青果物の呼吸量を予測することが可能であると考えられるが、実際の流通過程での温度変動をより詳しく検討することにより、貯蔵生理及び流通技術改善のための基礎資料となるものと考えられる。
新規ドミノ反応を用いる抗癌剤カンプトテシン類の合成と原子レベルでの作用機序の解明

カンプトテシンはトポイソメラーゼI阻害に基ずいて、強力な抗腫瘍活性を示し、その類縁体が抗がん剤として臨床において使用されている。しかしながら副作用が強く、死亡例も報告されており、より低毒性な類縁体の開発が期待されている。研究代表者は以前3,4-dihydro-1-methyl-β-carbolineと不飽和マロン酸エステルを反応させて、一行程でインドロキノリチジン体を合成する反応を開発し、この反応成績体よりカンプトテシン及び10-メトキシカンプトテシンへと誘導している。そこでまず本反応を利用してのカンプトテシン類縁体の大量合成について検討を行なったが、反応行程を短縮することは出来なかった。そこでインドロキノリチジン誘導体の効率的な合成法の開拓を目的として検討した結果、新規な分子内二重ミカエル反応を考案した。本法はインドールの2位にα,β-不飽和エステル鎖を、3位に不飽和アミド基を持つ化合物を反応基質として、酸-塩基混合剤で処理することによって、2回のミカエル反応を連続的に行ってインドロキノリチジン体を一挙に合成する方法である。最近本法を利用して、ムスカリンM2レセプターに特異的に作用するインドールアルカロイドの一種であるタカモニンの効率的合成に成功した。さらに効率的合成法の開発を目指して、キノリンの2位にアセチレン単位、3位に不飽和アミド鎖を持つ化合物を調製し、分子内ディールス・エルダー反応を検討した結果カンプトテシンの基本骨格を一挙に合成することに成功した。現在本法を活用してのカンプトテシン類縁体の合成研究を活発に行っている。低毒性なカンプトテシン類縁体の創製とその原子レベルでの作用機序の解明を目的として、効率的な合成ルートの確立を目的として研究を行った。全合成の鍵反応は申請者がすでに開拓した環化反応を鍵反応とするが、この環化反応は、同じ反応系内でミカエル反応とラクタム化が進行する所謂ドミノ反応である。ドミノ反応は単一操作で複数の結合形式を行えることから、反応行程の短縮と経済性の面から、現在非常に注目を集めている合成手法である。申請者は近年、分子内二重ミカエル反応および分子内二重ミカエル・アルドール反応等のドミノ反応を開発しているが、本年度はまずその改良を検討した。すなわち、不飽和アミドとα,β-不飽和エステル基とを合わせ持つ化合物をトリアルキルシリルトリフロロメタンスルホネートと三級アミンとで処理すると分子内二重ミカエル反応が起って、橋頭位に窒素原子が存在する多環性化合物が生成することを明かにした。特にインドロキノリチジン合成に際してはインドールの窒素原子をトシル基で保護することが重要である。さらに、本手法はベンゾキノリチジン骨格の効率的な合成法となることを、示すことができた。また、シクロペンテノンの4位あるいは5位に共役不飽和エステル基を持つ化合物を反応基質として、ドミノ反応に付すことによって、構造的に全く異なる架橋化合物を得ることに成功した。この反応によって、二個の環が一挙に生成し、これらは6員環に融合する5、6あるいは7員環であり、様々な生理作用を示すテルペノイドの合成を簡便に行うことが可能となった。低毒性なカンプトテシン類緑体の創製とその原子レベルでの作用機序の解明を目的として、効率的な合成ルートを確立する。全合成の鍵反応は申請者がすでに開拓した環化反応を改良して目的の五環性構造をより短行程で構築する。さらに本法を利用してカンプトテシンのAおよびB環上に様々な置換基が存在する化合物を合成し、その抗癌作用を検討する。また同位原素でラベルした化合物の合成を行い、トポイソメラーゼIとの反応の検討によって、その活性部位の多次元構造を解明する手掛りを得ることを目的として研究を行なっている。

まず3,4-dihydro-1-methyl-β-carbolineと不飽和マロン酸エステルとを反応後、同一反応容器中で還元してイミンを経てラクタムを一挙に生成させる。このインドール環部を一重項酸素で開裂するとケトンとなり、これは反応条件下に再閉環して四環性化合物が得られた。このように2種類のドミノ反応を利用することによってカンプトテシンの合成に必要な全炭素原子を持つ重要合成中間体が極めて短行程で合成出来る。D環の芳香化、メチルエステルの選択的な還元、B環のクロル化によってカンプトテシンの五環性構造を構築する。最後に20位の水酸基は不斉反応条件下に導入して、目的の絶対構造を持つ光学活性体の合成を完成する。以上のように極めて短行程でカンプトテシンを光学活性体として合成するルートを開発する計画である。カンプトテシンはトポイソメラーゼI阻害に基ずいて、強力な抗腫瘍活性を示し、その類縁体が抗がん剤として臨床において使用されている。しかしながら副作用が強く、死亡例も報告されており、より低毒性な類縁体の開発が期待されている。研究代表者は以前3,4-dihydro-1-methyl-β-carbolineと不飽和マロン酸エステルを反応させて、一行程でインドロキノリチジン体を合成する反応を開発し、この反応成績体よりカンプトテシン及び10-メトキシカンプトテシンへと誘導している。そこでまず本反応を利用してのカンプトテシン類縁体の大量合成について検討を行なったが、反応行程を短縮することは出来なかった。そこでインドロキノリチジン誘導体の効率的な合成法の開拓を目的として検討した結果、新規な分子内二重ミカエル反応を考案した。本法はインドールの2位にα,β-不飽和エステル鎖を、3位に不飽和アミド基を持つ化合物を反応基質として、酸-塩基混合剤で処理することによって、2回のミカエル反応を連続的に行ってインドロキノリチジン体を一挙に合成する方法である。最近本法を利用して、ムスカリンM2レセプターに特異的に作用するインドールアルカロイドの一種であるタカモニンの効率的合成に成功した。さらに効率的合成法の開発を目指して、キノリンの2位にアセチレン単位、3位に不飽和アミド鎖を持つ化合物を調製し、分子内ディールス・エルダー反応を検討した結果カンプトテシンの基本骨格を一挙に合成することに成功した。現在本法を活用してのカンプトテシン類縁体の合成研究を活発に行っている。
先天性脱髄モデルにおけるオリゴデンドログリアのアポトーシス死機構の解明

twitcherはガラクトシルセラミダーゼ酵素欠損による遺伝性脱髄症クラッベ病のモデルマウスである。日令30以降、中枢神経系においてオリゴデンドログリア数が減少し、進行性の脱髄に認められる。初年度は、オリゴデンドログリアの形態変化、TUNEL法、免疫電顕、DNA ladderの証明により、twitcherの大脳皮質・白質におけるオリゴデンドログリアがアポトーシスによって消失していることを証明した。また、脊髄ではオリゴデンドログリアはアポトーシスというよりもむしろネクローシスにより死滅していることを見い出し、本態的な欠失は同一であっても脳の部位によってオリゴデンドログリアの二次的な障害経路が代わりうる可能性が示した。第2年度は、培養系においてオリゴデンドログリアのアポトーシスを誘導することが知られているTNF-αがtwitcherにおいて発現しているかどうかを調べ、その発現と脱髄病変との関連を検証した。TNF-αは、野生型ではいかなる年令においても発現していなかったが、twitcherにおいてはおいて脱髄の進行とともに活性型ミクログリア/マクロファージにTNF-αの発現が誘導され、しかも大脳よりも小脳・脳幹において発現が顕著であった。また、TNF-α陽性ミクログリアが多数認められる小脳白質や脳幹ではアポトーシス変化を示すオリゴデンドログリアが多数認められ、続発する脱髄病変も広範囲で高度であった。以上より、脱髄が高度な小脳/脳幹ではオリゴデンドログリアのアポトーシスはTNF-α経路を介している可能性があると考えられた。twitcherは遺伝性脱髄症であるクラッベ病のモデルマウスであり、日令20以降に中枢神経系に進行性の脱髄が認められる。日令15-45のtwitcher,wildのパラフィン切片をオリゴデンドログリアの特異的なマーカーであるpi-glutathione-S-transferase(pi-GST)にて染色し、大脳皮質・脳梁・頚髄灰白質・頚髄白質においてオリゴデンドログリアの数・形態の経時的変化を観察した。日令25以降大脳・脊髄いずれの部位においても正常対象に比してtwitcherのオリゴデンドログリア数は減少していたが、TUNEL法とpi-GSTとの二重染色によってラベルされるアポトーティックなオリゴデンドログリアはtwitcher大脳(皮質・脳梁)では最大総オリゴデンドログリアの10%にも達したのに対し、脊髄灰白質ではどの日令においても1%以下であった。大脳皮質、脳梁、脊髄灰白質におけるオリゴデンドログリアの形態変化をpi-GST免疫染色、電顕にて調べると、大脳においては白質・皮質ともにおいて突起や細胞質の退縮、核の変化などアポトーシスに合致する変化を示したのに対し、脊髄灰白質においては細胞質はむしろ膨張し、多数の空胞を認めた。また、アポトーシス実行分子である活性型caspase-3免疫陽性細胞も大脳や脳幹・脊髄白質には認めたが、脊髄灰白質には認めなかった。以上の結果は、twitcherにおけるオリゴデンドログリアの減少が、大脳皮質・脳梁・脊髄白質を始めとする多くの部位においてはアポトーシス死によるものであることの確証であると同時に、脊髄灰白質ではネクローシスによる可能性を示すものである。来年度は、種々のアポトーシス誘起・作動物質の脳・脊髄における発現の差異を調べる予定である。twitcherは遺伝性脱髄症であるクラッベ病のモデルマウスであり、日令30以降、中枢神経系においてオリゴデンドログリアのアポトーシスによる脱髄が明瞭に認められる。第2年度はin vitroにおいてオリゴデンドログリアのアポトーシスを誘導することが知られているTNF-αのtwitcherにおける発現と神経病理との対応を調べた。遺伝子診断を行った日令15-45のtwitcher,wild

凍結大脳・小脳からRNAを抽出してLight cyclerを用いた定量的RT-PCRにより、mRNA量を解析すると同時に、凍結無固定切片のTNF-α免疫染色、パラフィン切片の一般神経染色、MBP染色等のミエリン染色、TUNEL染色を行い、部位によるTNF-α発現の差異があるかどうか、TNF-α発現と脱髄病変/オリゴデンドログリアのアポトーシス変化との間に関連があるかどうかを調べた。結果は以下の通りである。1)調べたいかなる年令においてもwildでは免疫組織化学にてTNF-α陽性細胞は認めず、mRNA量も1コピー以下/G3PDH 10^5コピーと常に低かった。2)twitcherにおいてはTNF-αの発現量は日令20では大脳においてはwildとの間に差異を認めなかったが、小脳においては日令20においてwildの10倍以上に増加しており、日令30ではwildの40倍以上に著増していた。3)twitcherにおけるTNF-α陽性細胞は特異的レクチンマーカーによる標識より、ミクログリア/マクロファージであることが証明された。TNF-α陽性細胞局在部位は小脳白質・脳幹のアポトーティックなオリゴデンドログリアが多く、脱髄変化が強い部位に一致していた。以上より、twitcherの小脳、脳幹におけるオリゴデンドログリアのアポトーシスがTNF-α経路を介していることが示唆された。
微分方程式の数式処理による研究

微分方程式論に関する研究課題に対しては、数式処理を活用する研究計画を立案し、微分方程式の解の零点に関する研究を実行した。この結果、数式処理のアリゴリズムが可能な形での微分方程式の解の零点に関する比較定理とでも呼ぶべき定理を証明することができ、その定理を数式処理の計算機プログラムに移行させることにより、微分方程式の零点の精度とその分布位置に関する成果を得る一つの手法が確立できたと考えられる。しかし、様々な方程式に適用することは今後に残された。また、微分方程式を含む数学的手法としての数式処理及びシミュレーションを異分野における課題に適用することを試み、心理学あるいは社会学での共同研究として、いくつかの数理モデルを提唱し、そのモデルによる解決を学会論文として発表した。具体的には、杉万俊夫(京都大総合人間)らとの共同研究により、集団力学と呼ばれる実証的研究分野のデータをもとに微分方程式モデルを設定し、理論的解明を行ない、その成果を集団力学の機関誌,社会学の機関誌に発表した。数式処理の応用面では十分な成果が得られたと考えられる。また、本研究の分担者である佐藤静・田中康彦による代数的側面に関する研究については本年度は研究成果には到ってはいないが、本年度において数式処理を含む計算機的手法に十分習熟することができたので、次年度以降において、その成果が十分に期待されるものと思われる。