hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
G-CSFによる細胞増殖および分化に関与する刺激伝達物質のクローニング

G-CSFは好中球の増殖、分化、機能発現などを調整するサイトカインであるが、これら各々の作用に特異的なシグナル伝達経路に関しては不明な点が多い。そこで我々は、好中球造血に破綻を来した種々の造血異常症におけるG-CSFシグナル伝達経路の遺伝子解析を行ない、病態との相関から、新たな刺激伝達物質のクローニングを含めたシグナル伝達経路の解明を試みている。最初に、好中球の増殖が障害された先天性好中球減少症においてG-CSF受容体の増殖シグナル領域に遺伝し異常を発見した。この変異体を遺伝子導入した細胞はG-CSFに対する増殖反応性が不良であり、分化能は保たれていた。一方、分化シグナル領域のC端末側が欠損した症例も経験した。そこで現在は、増殖および分化シグナル領域に変異のあるG-CSF受容体をそれぞれ細胞に遺伝子導入し、純粋な実験系で比較検討を行なっている。さらに、新たなタイプの可溶性G-CSF受容体cDNAのクローニングに成功した。是は従来のタイプと異なり膜貫通ドメインが完全に欠落していた。各々のタイプの可溶性G-CSF受容体cDNAをCHO細胞に遺伝し導入し、上清中の活性を比較検討したが有意な差は認めなかった。そこで、新タイプの可溶性G-CSF受容体のモデルとしてキメラ蛋白を用いて検討し、G-CSFの作用を完全に阻害することを証明した。一方、骨髄性白血病細胞もG-CSF受容体を発現しており、G-CSFの刺激で旺盛に増殖するが分化に乏しい傾向にある。そこで白血病細胞におけるG-CSF受容体、Jakキナーゼの遺伝子解析を行なったが、病態と関連する遺伝子変異は発見できなかった。ただし、転写因子のStat 3 isoformの遺伝子発現に不均衡のあることが判明した。これらの検討は、G-CSFシグナル伝達経路を解明する手掛かりになるとともに、造血異常症の病態解明にも大きく寄与することが期待される。そこで,G-CSF刺激後早期に変動する増殖あるいは分化刺激伝達に関与すると考えられる蛋白の遺伝子を同定する.すなわち,G-CSFレセプターを有していないマウスBAF3細胞(proリンパ系),LGM1細胞,CTLL2細胞(Tリンパ系)にG-CSFレセプター遺伝子導入し,G-CSFに対する反応性の違いをマーカーとして各々の機能に関連する遺伝子を同定しクローニングを試みている.まず,発現ベクターに入れたG-CSFレセプターを作成した.これがマウスLGM1細胞などへは高効率で導入出来たことを確認した.クローン化されたG-CSFレセプター遺伝子をマウスCTLL2細胞に導入し,その発現をフローサイトメトリー,ウエスタンプロットで確かめている.BAF細胞がG-CSF刺激で強く増殖されにのに反し,マウスCTLL2細胞は増殖を認めない.このため2つの細胞で増殖・分化刺激伝達に重要と考えられるJakキナーゼ(Jak1,Jak2,Tyk2)のリン酸化の差を検出するためin vitro kinase assayで検索している.G-CSF依存性に増殖するマウス細胞株NSF60から得られたcDNAライブラリーを発現ベクターに組み込み,上記のCTLL2細胞に遺伝子導入し,G-CSFのみの存在下で増殖可能な細胞,すなわち,G-CSFの増殖シグナル伝達に必要な遺伝子(群)が導入された細胞,を選択中である.G-CSFは好中球の増殖、分化、機能発現などを調節するサイトカインであるが、これら各々の作用に特異的なシグナル伝達経路に関しては不明な点が多い。

そこで我々は、好中球造血に破綻を来した種々の造血異常症におけるG-CSFシグナル伝達経路の遺伝子解析を行ない、病態との相関から、新たな刺激伝達物質のクローニングを含めたシグナル伝達経路の解明を試みている。最初に、好中球の増殖が障害された先天性好中球減少症においてG-CSF受容体の増殖シグナル領域に遺伝子異常を発見した。この変異体を遺伝子導入した細胞はG-CSFに対する増殖反応が不良であり、分化能は保たれていた。一方、分化シグナル領域のC末端側が欠損した症例も経験した。そこで現在は、増殖および分化シグナル領域に変異のあるG-CSF受容体をそれぞれ細胞に遺伝子導入し、純粋な実験系で比較検討を行なっている。さらに、新たなタイプの可溶性G-CSF受容体cDNAのクローニングに成功した。これは従来のタイプと異なり膜貫通ドメインが完全に欠落していた。各々のタイプの可溶性G-CSF受容体cDNAをCHO細胞に遺伝子導入し、上清中の活性を比較検討したが有意な差は認めなかった。そこで、新タイプの可溶性G-CSF受容体のモデルとしてキメラ蛋白を用いて検討し、G-CSFの作用を完全に阻害することを証明した。一方、骨髄性白血病細胞もG-CSF受容体を発現しており、G-CSFの刺激で旺盛に増殖するが分化に乏しい傾向にある。そこで白血病細胞におけるG-CSF受容体、Jakキナーゼの遺伝子解析を行なったが、病態と関連する遺伝子変異は発見できなかった。ただし、転写因子のStat 3 isoformの遺伝子発現に不均衡のあることが判明した。これらの検討は、G-CSFシグナル伝達経路を解明する手掛かりになるとともに、造血異常症の病態解明にも大きく寄与することとが期待される。
角膜移植におけるドナー角膜の超低温凍結による半永久的保存に関する研究

ウサギ角膜をグリセリンにて凍結保護処理を行ったあと、SY-LAB社製コンピュータプログラミング・フリーザ-にて-70°Cまで凍結し、そののち液体窒素タンク(-196°C)内で永久保存した。3週間后おび3ヶ月后、20°C水浴にて急速解凍し、その后、形態学的に観察した。横断面においては、角膜実質の層構造をはじめとして比較的よく保たれており、角膜内皮の断裂等もみとめず、良好な結果であった。しかし角膜内皮細胞密度は、保存前の6580%に減少しており、新鮮角膜に比べ、この面ではやや問題が残ると思われた。凍結保存期間の長短には、この減少は依存しておらず、凍結時もしくは解凍時に生じるものと思われた。凍結のプログラミング、凍結保護剤等さらなる調整が必要と考えられる。同系ラットにおける移植については、上皮を除いて、新鮮角膜の場合と大きな変化はなかった。生着、透明性の維持とも良好であった。上皮代は、やや遅れる印象はあるものの有意な差はなかった。異系ラットにおける移植については、新鮮角膜の場合に比べ、拒絶反応が出現しにくい傾向にあったが、実験眼数が未だ少なく、現在追加実験中である。また、異物としての新生血管誘発能についても新鮮角膜と比べて誘発しにくい傾向にあった。以上、内皮細膜密度の点で問題はあるものの、将来的には臨床応用につながる可能性があると思われた。
偏微分方程式の幾何と解析

当研究に於て当初の目的のうち、ハミルトン-ヤコビ方程式のCauchy問題に関する研究は空間次元が一次元の場合にほぼ達成された。これらの方程式は一階の偏微分方程式のなかでも特に応用上重要な方程式でそれらの弱解も存在、一意性などは古くから良く研究されていたものであるが、そこに現われる特異性(衝撃波)等の肝心の現象については当研究によって始めて明らかにされてきたと言っても過言ではない。具体的には、これらの方程式の解を記述する正しい幾何学的モデルが構成され、その枠組みによって得異性の研究は特異点の幾何学の言葉によって研究することが可能になった。本年度は典型的な場合の具体的な得異性の分類を与えた。それにより、幾何学的な解の特異性と応用上に現われる特異性(解析学的)とは少々違いがある事が判り、従来から予測されていた事とは異なる事実も発見された。この研究は、まだ端緒についたばかりであり、現在、同様な方法がDirichlet問題についても有効であることが確認されつつある。その他、微分方程式の幾何学的研究に於いて重要なリー環論的手法による研究も進展があり、その応用として射影的微分幾何と偏微分方程式の関係が明らかにされた。また、障害物が存在する場合の最短線を求める問題に付随して現れるいわゆるラグランジュ特異部分多様体の特異点の安定性に関する研究や界面の発達を記述する平均曲率の発展方程式に対しても重要な進展が得られた。
各種雰囲気下におけるセラミックス薄膜弾性率測定器の開発

セラミックス薄膜の弾性的性質を調べることを目的として、片持ち梁基板による振動リ-ド法を用いた測定装置を開発した。この方法では、二種類の異なる基板を用いることによって、ヤング率とポアソン比の二つの弾性定数の測定が可能である。本装置を用いて測定したアルミニウムスパッタリング薄およびSiO_2スパッタリング非晶質膜の弾性率は、それぞれのバルクの場合の文献値とよい一致を示した。さらに、この装置を用いて、高周波スパッタリング法により作成したSiO_2-Al_2O_3系およびAlPO_4-Al_2O_3系非晶質膜の弾性率を測定した。得られた結果から体積弾性率を計算し、体積弾性率と平均原子容との関係から、非晶質膜中のアルミニウムイオンの酸素配位状態を推定した。本装置により、室温付近での弾性率測定は精度よく簡便に行うことが可能となったが、高温域での弾性率測定に本装置を適用することは困難であった。従って、高温域での薄膜の弾性率を測定することを目的として、懸垂による共振法を利用した薄膜のヤング率温度係数測定装置の開発を行った。本装置を用いて、スライドガラス基板上に作成したアルミニウム真空蒸着膜のヤング率とその温度係数を測定した。その結果、バルク状アルミニウム金属の文献とよい一致を示し、今回開発した高温域での薄膜弾性率測定器の信頼性が確かめられた。また、高周波スパッタリング法により作成した非晶質AlPO_4膜のヤング率の温度係数を測定し、正の値の温度係数を得た。この「弾性異常」は、SiO_2ガラスやGeO_2ガラスなどの四面体開放構造をもつ非晶質材料に見られる性質であることから、この結果は、非晶質AlPO_4膜が四面体を基本とした開放構造を有することを支持している。1.セラミックス薄膜を実用化する場合の力学的挙動を明らかにすることを目的として、高周波スパッタ法により作成したSiO_2ーAl_2O_3及びAlPO_4ーAl_2O_3系非晶質薄膜の弾性的性質に関する研究を行った。弾性率の測定は振動リード法を用い、二種類の異なる形状を持つステンレス板を基板とし、弾性率としてヤング率とポアソン比を求めた。得られた弾性率のデータからその物質の体積弾性率を計算し、体積弾性率とその物質の平均原子容との関係から、セラミックス中のアルミニウムイオンの酸素配位状態を推定した。得られた結果は、これまでに我々が他の物理的性質をもとに明らかにした。この系におけるアルミニウムイオンの配位状態の結果とよく一致し、SiO_2とAlPO_4は同様な固体構造を持つが、それぞれの弾性率にたいするアルミナの添加効果には、大きな違いがあることが解った。2.セラミックス薄膜の高温域での力学的挙動を推定するために弾性率の温度依存性測定装置を試作し、予備実験を行った。測定は、セラミックス薄膜弾性率測定用に開発した振動リード法の原理を応用し、これを一般にセラミックス材料の弾性率測定に用いられている懸垂式共振法をもとに作製した装置を用いて行った。高温炉内に薄膜と基板により構成された二重梁を懸垂し、懸垂線を通して基板を励振しながら共振周波数を測定した。基板には市販のスライドガラスを使用し、この基板上に真空蒸着装置を用いて金属アルミニウム薄膜を作成し、異なる膜厚の薄膜にたいして室温から230°C付近まで基板の共振周波数を求め、薄膜のヤング率の温度係数を求めた。結果は厳密に文献値と一致しないものの、オーダー的には適当であった。この予備実験の結果から、今回試作した測定装置が、セラミックス薄膜の高温における弾性率の温度依存性測定装置として有効なものと期待できることがわかった。

セラミックス薄膜の高温域での力学域での力学的挙動を推定することは重要である。そこで、薄膜のヤング率温度係数を測定する装置の開発を行った。高温域での測定を可能にするために、懸垂による共振法によって測定を行った。基板及び二重梁を二本の糸によって炉内に懸垂し、一方の懸垂線で励振しながら、他方の懸垂線で振動の様子を検出することにより共振周波数を測定した。各温度での基板の共振周波数と二重梁の共振周波数とから、薄膜のヤング率を計算し、その温度係数を求めた。開発した装置の信頼性、再現性についての評価を行うために、市販のスライドガラス基板上に作成したアルミニウム真空蒸着膜に対して、ヤング率温度係数の測定を行った。その結果、得られたヤング率及びその温度係数は、バルク状のアルミニウム金属の文献値とよい一致を示し、開発した装置の信頼性、再現性が確められた。次に、SiO_2ガラスやGeO_2ガラスと同じように四面体を基本とした開放構造をもつ非晶質AlPO_4スパッタリング膜について、弾性率が正の温度係数や負の圧力係数を示すという「弾性異常」を示すかどうかを調べるために、新たに開発した装置を用いて、そのヤング率の温度係数の測定を行った。高周波スパッタリング法によってSiO_2ガラス基板上に非晶質AlPO_4膜を作成し、室温から150°C付近までの温度範囲で試料膜のヤング率を求め、その温度係数を計算した。その結果、非晶質AlPO_4スパッタリング膜は、SiO_2ガラスと同様に正のヤング率温度係数をもち、「弾性異常」を示すことがわかった。また、その絶対値はSiO_2ガラスとほとんど同じであり、この結果は、両者の開放構造の程度がほとんど同じであることを示唆している。
長期財務データによる資本市場行政と会計政策に関する実証的研究

本研究は、計量的・歴史的アプローチを利用して、第2次世界大戦の戦前と戦後の会計制度の継承性、および資本市場行政における会計政策の機能を説明している。企業価値に関連する情報の観点から、わが国の会計制度は、1950年代から2010年代の60年間、資本市場のインフラストラクチャーの効率化を促進させていた。会計数値は単に事実を記述するだけではなく、保守的な会計測定を通じて、ステークホルダー間の利害の調整に重要な役割を果たしている。平成27年度では、複数の商用財務諸表データベースを統合した研究データベースを構築した。1950年代の戦後のデータは、最近のデータに比較して、データの精度が低く、実証研究を困難にさせている。データベースの信頼性向上のため、商用財務諸表データベースのクロスチェックおよび有価証券報告書等の原データと照合を行い、研究用データベースの構築を実施した。戦前の統制経済下で会計制度はどのように設計、維持されてきたかについては十分な研究の蓄積がない。1930年代の商工省の産業合理化行政と会計政策(商工省財務諸表準則、計理士制度など)、大蔵省の会社経理統制、1930年代後半からの陸軍と海軍の原価計算政策に関して、統制経済と会計政策の関連性を明らかにした。黒澤清、太田哲三、中西寅雄らの会計学者たちは業種別、企業別に原価計算基準を作成した。上野道輔、黒澤清、岩田巌、太田哲三、中西寅雄、岩田巌らは「企業会計原則」の開発などを行い、第2次世界大戦後の会計制度設計においても指導的な役割を果たした。さらに、ャウプ勧告と会計プロフェッションの関係を明らかにした。従来、シャウプ勧告は、税法との関係で論じられてきたが、会計基準設定機関の設立にはシャウプ勧告が大きな支援となっており、また、シャウプ勧告は当時の会計プロフェッションの欠如を指摘し、公認会計士制度など、会計プロフェッションの醸成の契機となったことが明らかになった。1950年代以降の会計政策と資本市場の価格形成に関して、大規模なサンプルに基づいて、その関連性を検証し、研究図書を取り纏めることができた。本年度はわが国の会計基準設定権限の源泉を調査した。成蹊大学図書館黒澤文庫の「企業会計基準法」の6つの草案を解析し、「企業会計基準法」の構成および目的,会計基準の役割ならびに会計基準委員会の行政機能を明らかにした。「企業会計基準法」は、1949年1月28日付の経済安定本部財政金融局案までは、企業会計基準を法案のなかに組み込んでいた。1949年2月8日付の経済安定本部財政金融局案および1949年3月30日付の経済安定本部最終案は、これらの会計基準を本案に含まず、会計基準設定権限の付与と設定主体の設置を目的とする組織法に変容した。「企業会計基準法」は、1949年3月30日案の「企業の会計を合理的にするため、企業会計に関する基準を設定し、維持し、且つ、これに関する行政の調整を行うことを目的とする」ことであった。この法律は、経済安定本部が企業会計基準および企業会計監査基準の設定、ならびに関係する各行政機関の総合調整を行うことと、「企業会計基準審議会」が「企業会計基準法」を根拠として設置することを意図していた。最終的に経済安定本部は「企業会計基準法案」を国会に提出することができなかったが、経済安定本部措置法を一部改正することによって、会計基準を設定する権限を得た。各省庁は経済安定本部だけが会計基準を設定することを合意した。大蔵省、その後金融庁はこの合意を継承し、経済安定本部の「会計基準法案」で構想された会計基準設定権限と相互調整機能が、わが国の会計制度設計の基礎となっていることが明らかになった。戦後日本の会計制度創設時の会計政策に関する合意形成について論文を完成させる。さらに、資本市場としての会計政策に焦点をあて、歴史的アプローチをといれた挑戦的・萌芽的実証研究を進める。また、本研究の成果をふまえ、会計制度に関する啓蒙的な活動を行う。会計学
Aktによる神経幹細胞の分化と運動性の制御機構の解析

これまでにPDK1-Akt経路が未分化神経系前駆細胞がニューロンへと分化する際に重要な役割を担うことを明らかにしている。PDK1のノックアウトでは形成されるneurosphereの数が顕著に減少した。また分化条件で培養したところ、ニューロン分化の割合が減少した。さらにニューロンの各サブタイプで分化能に差があるかどうか検討したところ、GABA作動性のニューロンへの分化が顕著に減少していた。転写因子であるMash1がGABA作動性のニューロンの分化に重要であることから、Mash1の転写活性にAkt経路が影響を及ぼす可能性について検討したところ、活性型のAktによつてMash1の転写活性が増強された。以上の結果からPDK1-Akt経路は神経幹細胞の増殖とニユーロンへの分化に関与し、分化に関しては特にMash1の転写活性の調節を介したGABA作動性ニユーロンへの分化制御の機構が存在することが示唆された。またPDK1のノックアウトでは分化したニューロンの大脳皮質内での細胞運動の異常が観察された。脳室帯で増殖した神経幹細胞がニューロンに分化する際には、細胞増殖の停止とともに、分化に伴う細胞の性質の転換や、大脳新皮質内の細胞運動の開始が協調的に起こらなければならない。細胞周期と細胞運動の制御に関わる分子の候補として、Cdk阻害因子であるp27とp57の機能について検討を行ったところ、P27あるいはP57をRNAiによってノックダウンすることにより、大脳皮質内での放射状の細胞運動の遅延が観察された。したがって、p27もしくはp57が、細胞周期と細胞運動の両方の制御に関わる可能性が示唆された。P27はAktのターゲットであることが報告されており、P27を介したAktによるニューロン移動の制御の可能性について今後検討を行いたい。増殖因子などの刺激で活性化されるPDK1-Akt経路が、未分化神経系前駆細胞がニューロンへと分化する際に重要な役割を担うことをこれまでに明らかにしており、一方で同じ経路が神経幹細胞の増殖の制御にも関わることを示す知見を得ている。本研究では未分化な神経幹細胞において特異的にPDK1遺伝子を欠いたコンディショナルノックアウトマウスの解析を行うことにより、大脳発生におけるPDK1-Akt経路の役割について検討を行った。ノックアウトでは形態的には大脳のサイズが小さくなる表現型が観察され、細胞レベルでは増殖細胞の割合の低下と細胞死の割合の増加が認められた。大脳から初代培養を調整し、neurosphereを形成させることで未分化神経幹細胞の割合を検討したところ、PDK1のノックアウトでは形成されるneurosphereの数が顕著に減少した。これまでにbHLH型の転写因子であるMash1がGABA作動性のニューロンの分化に重要であることが報告されていることから、Mash1の転写活性にAkt経路が影響を及ぼす可能性について検討したところ、活性型のAktによってMash1の転写活性が増強され、ファミリー分子であるNeurogenin1の転写活性は上昇させなかった。以上の結果からPDK1-Akt経路は神経幹細胞の増殖とニューロンへの分化に関与し、分化に関しては特にMash1の転写活性の調節を介したGABA作動性ニューロンへの分化制御の機構が存在することが示唆された。
クラミドモナスロドプシンの光受容-チャネル連関メカニズムの分子生理学的研究

単細胞緑藻類の一種クラミドモナスにおいては、チャネルロドプシン1(ChR1)と2(ChR2)の2種類の古細菌型ロドプシンが光を感知し、走行性や驚光性などの行動を制御している。これらは、分子的に高い相同性を有しており、ともに光によりゲートされるチャネルを形成していると考えられているが、いくつかの性質において異なっている。性質の違いが、分子構造のどのような違いに依存しているのかを検討した。また、イオンチャネル機能に関連している構造を同定した。前年度の研究において、ChR1、ChR2の第5膜貫通領域に、両者を区別する構造が示唆された。そこで、両者において異なる8個のアミノ酸残基を一つずつ置換した変異体を作製した。これらのプラスミドベクターをHEK293細胞にトランスフェクションし、発現細胞をVenusの蛍光で同定し、ホールセルパッチクランプ下に光電流を計測した。(1)ChR2の第5膜貫通領域をChR1の相同セグメントに置き換えることにより、光電流の性質は、以下のように変化した:(1)活性化スペクトルの長波長域シフト、(2)脱感作の減少、(3)オン・オフキネティクスの緩徐化。すなわち、第5膜貫通領域にChR1とChR2の光電流の性質を区別する構造が示唆された。また、ChR2のAsn187をChR1の相同残基であるチロシン(Tyr)に置換することにより、上記と同様の変化が認められた。この変異は可逆的であった。すなわち、Tyr226(ChR1)/Asn187(ChR2)が両者を区別する決定基であることが示唆された。(2)クラミドモナスおよびボルボックスの4種類のチャネルロドプシンを前核動物のロドプシンと区別する構造が第2-3膜貫通領域にある。ここの5つのグルタミン酸残基を一つずつアラニンまたはグルタミンに置換したChR2の変異体を作製した。Glu97を変異したものでは、光電流コンダクタンスが大きく減少したが、それ以外の性質に影響は認められなかった。すなわち、Glu97がチャネルのイオン透過に関運していることが示唆された。クラミドモナスロドプシンにおける光吸収特性およびチャネル特性を分子生物学的に同定し、その連関メカニズムを解析した。原核生物型ロドプシンの光吸収特性とイオン輸送特性が7回膜貫通領域へリックスA-Gにあるといわれていることに注目し、オーバーラップエクステンションPCR法により、chop1(表記:ABCDEFG)とchop2(表記:abcdefg)の膜貫通領域を組み替え、C末側にVenusを付加した融合タンパク質を発現させるようにデザインした哺乳類細胞発現用プラスミドベクターを作製した。これらを、リポフェクション法により遺伝子導入・発現させた培養HEK293細胞にパッチクランプ法を適用して、光電流を計測し、その光応答特性とイオンチャネル特性を解析した。さまざまな組み合わせのキメラについて解析することにより、光受容チャネルにおいて、光応答特性、イオン透過特性を、それぞれ制御している構造の同定を試みた。膜貫通領域の組み換えにより、12種類のキメラcDNAを作製した。これらは、すべてHEK293細胞において、膜に強く発現した。キメラABCDEfgは、吸収光波長応答特性が長波長側にシフトした。この特性は、野生型のchop1,ABCDEFGに類似していた。キメラABCDEfgは、野生型のchop2と同程度に高いNa^+透過性を示したが、キメラABCDEFgのコンダクタンスは小さかった。また、キメラABcdefgの光電流は、弱い不活性化する性質において、野生型のchop2,abcdefgと異なった。本研究において、クラミドモナスロドプシンの「モーダルシフト」に関与している構造を同定した。すなわち、膜貫通ドメインE/eが吸収波長特性制御に関与していること、膜貫通ドメインF/fがコンダクタンス制御に関与していること、膜貫通ドメインB/bが光電流キネティクス制御に関与していることが示唆される。

また、ChR2のAsn187をChR1の相同残基であるチロシン(Tyr)に置換することにより、上記と同様の変化が認められた。この変異は可逆的であった。すなわち、Tyr226(ChR1)/Asn187(ChR2)が両者を区別する決定基であることが示唆された。(2)クラミドモナスおよびボルボックスの4種類のチャネルロドプシンを前核動物のロドプシンと区別する構造が第2-3膜貫通領域にある。ここの5つのグルタミン酸残基を一つずつアラニンまたはグルタミンに置換したChR2の変異体を作製した。Glu97を変異したものでは、光電流コンダクタンスが大きく減少したが、それ以外の性質に影響は認められなかった。すなわち、Glu97がチャネルのイオン透過に関運していることが示唆された。
様相論理の決定手続きとソフトウェア検証への応用

様相論理を用いたポインタ操作プログラムの検証,特に停止性判定への応用を図るために必要な理論を構築した.ひとつには,クリプキ構造操作に対する最弱事前条件および最強事後条件の解明であり,もう一つは様相μ計算の意味論の拡張である.後者では,真偽値がmin-plus代数N∞に値をとるような体系を構築し,この体系上でのモデル検査問題と充足可能性判定問題に解を与えた.様相論理を用いたポインタ操作プログラムの検証,特に停止性判定への応用を図るために必要な理論を構築した.ひとつには,クリプキ構造操作に対する最弱事前条件および最強事後条件の解明であり,もう一つは様相μ計算の意味論の拡張である.後者では,真偽値がmin-plus代数N∞に値をとるような体系を構築し,この体系上でのモデル検査問題と充足可能性判定問題に解を与えた.われわれは,これまで,様相μ計算を用いた抽象化を基礎としたソフトウェア検証技法を研究してきた.その枠組みでは,主に安全性に分類される性質の検証を行えるようになったが,本研究では,それをさらに発展させ,より広い性質の検証をめざしたもので,具体的には,活性に分類される性質が対象となっている.本年度は,まず,抽象化技法の適用に関する理論的な基礎を整備した.具体的には,クリプキ構造に関する基本的な変換操作を定義し,様相μ計算の論理式で表現される条件について,これらの変換操作に関する,最弱事前条件と最強事後条件が,ふたたび,様相μ計算の論理式で表現されることを証明し,その計算方法をを確立した.このことを用いて,これらの変換に関し,後向きおよび前向きの推論を行うことが可能となった.Hoare論理と組み合わせることで,アルゴリズムの検証ができる.つづいて,N∞値クリプキ構造における様相μ計算のモデル検査法を開発した.検査法は従来も知られていたが,まず,従来法にあった「含意を含まない」という制限を撤廃し,適用範囲を広げ,さらに,従来法の適用可能な範囲についても,計算量を削減した.また,検査法の正当性証明を改良して,見通しの良いものとした.本研究全体としては,同じ設定における充足可能性判定手続きを見いだすことが目標である.2値の様相μ計算に関する理論がそうであるように,充足可能性判定を行う手法は,モデル検査法がそのベースとなる可能性が高いと考えられる.その観点から,今回の検査法は重要な一歩である.しかし,現在の検査法には,(今回拡張した範囲について)計算量の評価ができていないという問題がある.今後,この解明が可能なように,アルゴリズム自体を改良する研究をすすめる計画である.[項目1a:N∞値モデル検査法]2値の様相μ計算と同様に,充足可能性判定を行う手法は,モデル検査法がベースとなる可能性が高いため,この解明に取り組んでいる.前年度に得た部分的な結果である,正しい結果を必ず与えるモデル検査アルゴリズムのcomplexityの確定を目標として研究を進めた.残念ながら確定には至らなかったが,いくつかの関連する補題を証明した[項目1b:N∞値充足可能性判定法]前年度の成果である意味論のゲーム表現に基づき,判定法の開発に着手した.全体の方針としては,(A)2値の論理式に変換して,既存の判定手続きを用いる(B)N∞値用のオートマトンを定義し,既存判定手続きを参照しつつも新たなアルゴリズムを構築する,の2つが考えられる.本年度は,考察しやすい(A)の方針をまず採用した.このアルゴリズム,およびその正当性証明をWOLLIC2010において発表した,(B)については,次年度の検討とする[項目2a:2値の判定手続きの改良]現在の判定手続きにおける性能上のネックは特定できていたが,さらに調査した結果,案として持っていた方法がnominalを含む論理に対するタブロー法を様相μ計算に対して単純には適用できないことが明らかになった.このためため,いくつかの別の方法を検討した.(1)現在の手続きにおけるBDDの使用方法を見直し,より効率的なエンコーディング方法を検討した.いくつかの補助関数の性能において改良は得られたものの,依然として目標からは遠いのが現状である.このため,(2)Boolean SAT solverの適用の検討を開始した[項目3a:検証対象の調査・検討]モデル検査において頻繁に用いられる強連結成分の確定を行うアルゴリズム,および,強公平性のもとでの活性検証を行うアルゴリズム等を対象として,本研究における充足可能性判定手続きが得られたとの前提のもとで、アルゴリズムの検証を行う枠組みを検討した平成23年度には,(1)N∞値充足可能性判定法の研究,および(2)昨年度までの本研究での結果をモデル検査および定理証明支援系へ応用する研究を実施した.(1)昨年度までに得らた充足可能性判定法は,N∞値様相μ計算論理式を,それと充足可能性が同値となる2値論理式の充足可能性判定問題に帰着する変換を与えるものであった.この方式には,計算量的には不利であることと,判定可能な値が0と∞のみであることであるという問題点がある.これを解決するため,本年度は2値論理式を経由しない直接の判定手続きの構築に取り組んだ.昨年度までの検討では,タブローノードに意味を与えても展開がうまくできないという課題を抱えていた.これを,論理式の値が「k以下」,「kより大きい」という意味を与えうるようにタブローノードの構成を拡張することによって,すべての論理記号に関する展開をうまく機能させることに成功した.

もう一つの課題であった優先度関数の定義に関しても,ローカルに優先度を定義するのではなく,繰り返して現れるノード間に,否定に関する遷移が存在するかどうかに依存して優先度を変化させる方法を導入することで,充足可能性と整合する定義を与えることができた.この部分の正当性の証明には,21年度の成果であるゲーム意味論をうまく利用している.以上のアイディアをベースに,判定手続きは完成を見た.正当性証明については骨格をまとめた段階で年度末を迎えてしまったが,引き続き証明の執筆を行っている.(2)本研究の応用先として,定理証明支援系への組み込みに取り組んだ.N∞値が減少する列になることを示すことで,プログラムが停止することを示す枠組みである.本年度は,証明支援系CoqでN∞(min-plus代数)に関するライブラリを作成し,システム記述の際に取り込めるようにした.この上でモデル検査アルゴリズムの停止性証明を行うことを目指した実装を行った.
「被害」「責任」の認知と医療事故ADRの可能性:法社会学的アプローチ

平成18年度から20年度にかけて、医療事故をめぐる「被害」「責任」の認知と医療事故ADRの可能性:法社会学的アプローチ」をテーマとする研究を実施した。在外調査として、アメリカのジョンズホプキンス病院の医療事故システムのあり方や、イギリスのNHSなどの取り組みを調査した。この研究では、医療者及び患者側へのインタビュー調査やアンケート調査を通じて、その感情的葛藤を中心とする紛争解決・関係調整過程のメカニズムの検証と、それに基づく具体的なプロセス・モデルの提言、人材養成プログラムの開発などを行った(和田仁孝・中西淑美『医療コンフリクト・マネジメント』、日本医療メディエーター協会(JAHM)設立などを行い、各種シンポジウムにおいて非医療者と医療者の医療事故ADRについての考えを啓発した)。その過程で、こうした紛争解決・関係調整機能が、原因究明システムの在り方や、医療者やの行動規律システム、また金銭的救済システムとの連動の中で影響を受けていることが考察できた。更に、本研究では、法社会学研究者、医師、看護師からなる研究会を組織し、海外の医療事故防止システム、医療事故紛争処理システムについての研究を進めている。実証的研究ではないが、その準備となる文献研究として、現在進行中である。コロンビア大学ロースクールでメディエーションを講じ、医療メディエーションの推進者でもあるCarol Liebman教授とJAHMシンポジウムも開催した。医療事故当事者の「被害」「責任」観念の構造についての法社会学的分析を行ってきたが、その過程で、被害・責任のナラティヴ分析を的確に行うために、ナラティヴ分析一般、及び医療領域で注目されつつあるナラティヴ・ベイスド・メディスンなどの新たなアプローチについて文献を検討した。成果としては、日本学術会議特任連携会員として、医療事故紛争処理システム分科会における検討を重ね、分化会委員会のコンセンサスを得て、医療事故紛争処理システムについての提言をすることができた。また、リスクについての医療者と患者の認知の差異について「認知のたすき掛け現象」と名づけた概念を手がかりに分析した論文が、学会誌『法社会学』に投稿し採択され掲載された。平成18年度の研究進捗状況の総括:初年度である平成18年度は,医療事故紛争の領域におけるADRの可能性について、「ミクロな観点からの紛争当事者の認知と実践の研究」と「マクロな医療紛争処理・安全推進制度の機能分析」という研究目的に即して,以下の研究調査計画に従って研究を進めた.1.医療事故当事者への「被害」と「責任」についての医療者側(医師と看護師)と患者側の認識の相違を探るために、インタビュー調査(係争中事例1例含む)を行った。具体的には名古屋高裁のある事例の医療事故被害者家族と,医師と看護師の数名を実施した.2.海外医療紛争処理システムの文献研究のためにペンシルバニア州における不法行為改革,NY州のADR制度,フロリダ州におけるADR規制の検討などを中心に行った.3.海外調査では、NY州のトゥーロ大学法学部のハル・アブラムソン教授と,カゾーゾ・ロー・スクールのリーラ・ラブ教授,医療ADRの医療の質・安全に運用成果が著しいメリーランド州ジョンズ・ホプキンス病院訟務部のローリー・バラッカ弁護士とマーガレット・ギャルソン患者安全部顧問にインタビュー調査及び資料収集調査を実施した.4.法社会学的観点から「対話による医療紛争交渉スキル」プログラムの有効性と習得性調査において、財団法人医療機能評価機構の認定病院の医療安全に関わるリスクマネジャーを対象に,質問紙調査を実施した.これらの中間的成果として、医療ADRのわが国への適用可能性をテーマに,ジョンズ・ホプキンス病院の調査結果を雑誌「病院」と「患者安全推進ジャーナル」に掲載発表した.

また,早稲田大学紛争交渉研究所主催による医療ADRシンポにおいて,医療ADRの可能性と題し,シンポジストの一人として,調査の一部を発表した.平成19年度は,これらの調査をふまえ,実施調査の分析と研究調査活動に努めたい.平成19年度の研究進捗状況の総括平成19年度は、平成18年度の研究実績を基盤として、それをさらに深化させていくために、以下の研究調査計画に従って研究を進めた。1.昨年度に引き続き、「被害」と「責任」についての医療者側(医師と看護師)と患者側の認識の相違を探るために、さらにインタビュー調査(係争中事例1例含む)を行った。具体的には東京、名古屋、大阪において複数の患者被害者側にインタビューを実施した。医療事故医療者側当事者へのインタビューは、東京、神奈川、大阪において、医師と看護師へのインタビュー調査を実施した。2.海外医療紛争処理システムについて、イギリスの制度やその実態を中心に文献研究を実施した。3.さらに、海外調査として、英国において、ロンドンの複数のNHSトラストでの調査を実施した。具体的には、Hammersmith & Chelsea NHS Trust Royal London NHS Trustにおいて、院内のスタッフ関係メディエーション、Complaint ManagerおよびPALS (Patient Assistance & Liaison Service)の担当者へのインタビュー、さらにKentにおいて、医療メディエーション機関での調査を実施した。4.引き続き、法社会学的観点からの「対話による医療紛争交渉スキル」のプログラムの有効性と習得性調査のために、財団法人医療機能評価機構の認定病院の医療安全に関わるリスクマネジャーを対象に、質問調査紙による調査を実施した。これらの中間的成果として、雑誌『看護管理』に10回にわたる、医療事故紛争処理に関する連載を執筆した。また、日本学術会議特任連携会員として、医療事故紛争処理システム分科会にて、調査に基づく治験を提供した。最終年度である平成20年度は、これらの四つの調査やこれまでの中間的研究成果をふまえ、あるべき医療事故紛争解決システムについて提言を行うことにしたい。平成18年度から20年度にかけて、医療事故をめぐる「被害・責任の認知と医療事故ADRの可能性:法社会学的アプローチ」をテーマとする研究を実施した。この研究では、医療者及び患者側へのインタビュー調査やアンケート調査を通じて、その感情的葛藤を中心とする紛争解決・関係調整過程のメカニズムの検証と、それに基づく具体的なプロセス・モデルの提言、人材養成プログラムの開発などを行った(和田仁孝・中西淑美『医療コンフリクト・マネジメント』,日本医療メディエーター協会(JAHM)設立など)。
流体潤滑環境下におけるしゅう動面間距離と磁場が及ぼすMR流体のトライボロジー特性

1.近年,機能性材料等と呼ばれる圧電材料やMR流体等の研究が行われている.その中でもMR流体を利用したアクチュエータやダンパへの応用研究が進展しつつある.このアクチュエータやダンパには,二つの固体間にMR流体が入り込んだ状態で相対運動が生じている場合が多く,MR流体を用いた流体潤滑環境下の摩擦と捉えることができる.本研究では往復動流体潤滑摩擦試験装置を製作し,流体潤滑環境下におけるしゅう動面間距離と磁場が及ぼすMR流体のトライボロジー特性に関する調査を目的とする.2.本実験を実施するにあたり実験装置及び試験片の設計製作を行う.ピンオンフラット型の往復動流体潤滑摩擦試験装置製作を行った.本装置は下部試験片に往復動を与えるための加振部,上部試験片を上下させることによりしゅう動面間の距離変化させる変位制御部,ロードセルによる摩擦力測定部,流体槽から構成される.本実験で使用する試験片は上部試験片(固定側)を半球面形状,下部試験片(駆動側)を平面形状とし,接触形態はピンオンフラットとする.上下試験片の上部及び下部に永久磁石を取付けることにより,上下試験片間に磁場を印加しクラスタを形成させる.次に,流体槽に流体を準備し,上下試験片のしゅう動面間距離を設定し,加振器により下部試料へ往復動を与えることにより実験を行った.本実験の各条件を次に示す.(1)試験片:Cu, SUS304, SS400(2)使用流体:MR流体(3)振動数:0.22.OHzの0.2Hz間隔(4)しゅう動面間距離:1mm,2mm,4mm(SS400のみ)3.次の結果を得た.(1)しゅう動面間距離を変化可能な往復動流体潤滑摩擦試験装置を製作した(2)各試験片において振動数の変化に対する抵抗力の大きな変化は見られなかった(3)各試験片の各距離における抵抗力の平均値を以下のように得た.Cuでは1mm:0.32N, 2mm:0.30N, SUS304では1mm:0.49N, 2mm:0.23N, SS400では1mm:0.99N,2mm:0.70N,4mm:0.52N1.近年,機能性材料等と呼ばれる圧電材料やMR流体等の研究が行われている.その中でもMR流体を利用したアクチュエータやダンパへの応用研究が進展しつつある.このアクチュエータやダンパには,二つの固体間にMR流体が入り込んだ状態で相対運動が生じている場合が多く,MR流体を用いた流体潤滑環境下の摩擦と捉えることができる.本研究では往復動流体潤滑摩擦試験装置を製作し,流体潤滑環境下におけるしゅう動面間距離と磁場が及ぼすMR流体のトライボロジー特性に関する調査を目的とする.2.本実験を実施するにあたり実験装置及び試験片の設計製作を行う.ピンオンフラット型の往復動流体潤滑摩擦試験装置製作を行った.本装置は下部試験片に往復動を与えるための加振部,上部試験片を上下させることによりしゅう動面間の距離変化させる変位制御部,ロードセルによる摩擦力測定部,流体槽から構成される.本実験で使用する試験片は上部試験片(固定側)を半球面形状,下部試験片(駆動側)を平面形状とし,接触形態はピンオンフラットとする.上下試験片の上部及び下部に永久磁石を取付けることにより,上下試験片間に磁場を印加しクラスタを形成させる.次に,流体槽に流体を準備し,上下試験片のしゅう動面間距離を設定し,加振器により下部試料へ往復動を与えることにより実験を行った.本実験の各条件を次に示す.(1)試験片:Cu, SUS304, SS400(2)使用流体:MR流体(3)振動数:0.22.OHzの0.2Hz間隔(4)しゅう動面間距離:1mm,2mm,4mm(SS400のみ)3.次の結果を得た.(1)しゅう動面間距離を変化可能な往復動流体潤滑摩擦試験装置を製作した(2)各試験片において振動数の変化に対する抵抗力の大きな変化は見られなかった(3)各試験片の各距離における抵抗力の平均値を以下のように得た.Cuでは1mm:0.32N, 2mm:0.30N, SUS304では1mm:0.49N, 2mm:0.23N, SS400では1mm:0.99N,2mm:0.70N,4mm:0.52N
液状分子吸着による硬度低減効果を利用したセラミックス表面せん断加工の基礎研究

コバルト含有タングステンカーバイド(以下、WC-Co)の高精度形状加工のための基礎的研究として、ケモメカニカル効果を利用した加工模擬実験と表面状態計測を行い、その有効性を調べた。ケモメカニカル効果を発現させるためには表面の汚染がない状態で特定の加工液を表面吸着させる必要があるため、まず、表面を浄化する技術としてレーザー照射による方法を調べた。その結果、この方法(レーザークリーニング法)により、表面に吸着している油などを除去しつつ内部に分散しているコバルトが表面近傍に僅かに局在化し、硬さが低下することを明らかにした。この結果を受け、特定の加工液中でレーザークリーニングを行う方法を提案し、スクラッチ試験により加工性の評価を行うとともに、表面の顕微鏡観察や赤外吸収分光法による表面状態の評価を行った。加工液には切削加工に用いられるアルコール系液状高分子としてウンデカノール、同じくエステル系としてパルミチン酸ブチルおよびノナン酸メチル、また、比較のため市販の加工液(B905)を用いた。スクラッチ試験では、ロックウエル圧子を用いるが潤滑の効果が大きく加工状態の比較が困難であった。このため、ビッカース圧子を用いて模擬加工試験を行った。液中レーザークリーニング法による表面浄化であるが、ウンデカノール及びパルミチン酸ブチルでは、液中レーザークリーニング法により大幅に濡れ性が向上することがわかった。これは、赤外吸収分光法による表面状態測定の結果から、表面への直接吸着や配向吸着による効果であると推定された。ビッカース圧子を用いて模擬加工試験の結果、特にパルミチン酸ブチルでは、処理をしなかった場合と比べ加工痕上にクラックなどの発生が少なく、良好な加工が可能であることが示唆された。今後は、ビッカース圧子の方向や種類を替え、加工性の比較など行い実加工への展開を検討する。光学部品成形用型材料や半導体基盤材料として注目されている炭化タングステンを機械的に超精密加工するための基盤技術研究として、平成16年度はスクラッチ試験による液状分子塗布表面の表面破壊試験を中心に、清浄炭化タングステン表面への液状分子の吸着状態や単純切削試験による液状分子塗布表面の加工精度について調べた。スクラッチ試験による液状分子塗布表面の表面破壊試験において、これまでに表面硬度の低減効果が認められた液状分子と市販の加工液をそれぞれ塗布し、荷重や加工深さ、引っかき抗力等の関係を、スクラッチ試験(既存設備を使用)により無塗布試験片と比較して調べた。スクラッチ試験では、極微荷重から表面破壊荷重(横方向へのクラックの発生や進展)までを連続的に試験できるため、破壊の限界を見ることもできる。試験条件の最大荷重近傍ではその違いが明らかで、無塗布試験片では加工痕周辺に破壊が認めらたが、液状分子や市販の加工液を塗布した表面では、ほとんど破壊は起こっていなかった。液状分子と市販の加工液を引くらべると、いずれも潤滑の効果が大きく液の種類による明確な差は見られなかった。清浄炭化タングステン表面への液状分子の吸着計測では、レーザー照射後の表面が大気に触れることを避けるため、表面に液を塗布した後にレーザーの照射を行った。このため、まず液に変化が出るかどうかを調べたが、変化はなかった。また、16年度は赤外分光分析による表面吸着分子の状態分析に着手した。単純切削試験による液状分子塗布表面の加工においては、スクラッチ試験を利用し、一定荷重で圧子を押し込みながら試験片を水平に移動する試験のための準備を行った。圧子は稜数の異なる2種類のビッカース圧子を用意し、それぞれによる差を17年度に明らかにしていく。

コバルト含有タングステンカーバイド(以下、WC-Co)の高精度形状加工のための基礎的研究として、ケモメカニカル効果を利用した加工模擬実験と表面状態計測を行い、その有効性を調べた。ケモメカニカル効果を発現させるためには表面の汚染がない状態で特定の加工液を表面吸着させる必要があるため、まず、表面を浄化する技術としてレーザー照射による方法を調べた。その結果、この方法(レーザークリーニング法)により、表面に吸着している油などを除去しつつ内部に分散しているコバルトが表面近傍に僅かに局在化し、硬さが低下することを明らかにした。この結果を受け、特定の加工液中でレーザークリーニングを行う方法を提案し、スクラッチ試験により加工性の評価を行うとともに、表面の顕微鏡観察や赤外吸収分光法による表面状態の評価を行った。加工液には切削加工に用いられるアルコール系液状高分子としてウンデカノール、同じくエステル系としてパルミチン酸ブチルおよびノナン酸メチル、また、比較のため市販の加工液(B905)を用いた。スクラッチ試験では、ロックウエル圧子を用いるが潤滑の効果が大きく加工状態の比較が困難であった。このため、ビッカース圧子を用いて模擬加工試験を行った。液中レーザークリーニング法による表面浄化であるが、ウンデカノール及びパルミチン酸ブチルでは、液中レーザークリーニング法により大幅に濡れ性が向上することがわかった。これは、赤外吸収分光法による表面状態測定の結果から、表面への直接吸着や配向吸着による効果であると推定された。ビッカース圧子を用いて模擬加工試験の結果、特にパルミチン酸ブチルでは、処理をしなかった場合と比べ加工痕上にクラックなどの発生が少なく、良好な加工が可能であることが示唆された。今後は、ビッカース圧子の方向や種類を替え、加工性の比較など行い実加工への展開を検討する。
水稲-豆科作物系における亜酸化窒素・メタン・二酸化炭素放出の起源と相互作用解析

地球温暖化は急速に進行しつつあり、京都議定書の達成には多大な困難が残されている。その一つに農業活動で排出される微量温室効果ガス(メタン・亜酸化窒素)などがあり、食糧生産と環境との調和が課題となっている。本研究ではメタンの人為発生源で重要であり同時にアジア諸国を中心とした食糧生産の基盤である水田および土地生産性を挙げるためのマメ科作物との輪作体系で、メタン放出の削減とトレードオフの関係にあるとされる亜酸化窒素および二酸化炭素放出量について、まず起源別解析を行い安定同位体実験や反応速度論など数式モデルを組み合わせて、微量温室効果ガスの生成と放出の相互作用を解明した。本年度は亜酸化窒素放出に及ぼす温度、土壌水分変化の履歴、土壌タイプ、施肥(無機および有機)、被覆肥料・硝化抑制剤の影響を解析した。また、これと平行して水田モデル系による室内実験によって、土壌有機物分解量とメタン生成量との関係を明らかにした。これらのガス測定では二酸化炭素量も測定し、3種GHGの積分効果を定量化した。さらに、水稲と大豆を用いて^<15>Nおよび^<13>Cで標識した試料を作成し、その安定同位体比を測定した。そのうち、稲わらと尿素を施用した砂質水田土壌での湛水、水飽和および好気処理が3種GHG生成に及ぼす実験では、稲わらが亜酸化窒素放出を抑制しメタン放出を促進したが、温暖化ポテンシャルを考慮して定量化した結果、稲わら施用後、尿素を施肥し好気培養したのち湛水した場合が、ただちに湛水した場合に比べ積算GHGを最大64%削減できることを明らかにした。本研究ではメタンの人為発生源で重要であり同時にアジア諸国を中心とした食糧生産の基盤である水田および土地生産性を挙げるためのマメ科作物との輪作体系で、メタン放出の削減とトレードオフの関係にあるとされる亜酸化窒素および二酸化炭素放出量について、まず起源別解析を行い安定同位体実験や反応速度論など数式モデルを組み合わせて、微量温室効果ガスの生成と放出の相互作用を解明する。本年度は亜酸化窒素放出に及ぼす温度、土壌水分、土壌タイプ、施肥(無機および有機)、被覆肥料・硝化抑制剤の影響を解析した。さらに、同位体標識植物試料の作成実験の検討に着手した。そのうち、亜酸化窒素生成に及ぼす硝化抑制剤の影響については、ドイツ・ミュンヘン工科大学と共同で解析し、2種の硝化抑制剤を尿素の局所施用と組み合わせ、亜酸化窒素放出量を13-20%削減できることを明らかにした。また別の硝化抑制剤を尿素表面施用と組み合わせると、亜酸化窒素放出量は逆に増大することを示した。
多糖・オリゴ核酸複合体を用いた抗原提示細胞への免疫刺激性CpG配列のデリバリー

未修飾のSPGは抗原提示細胞のDectin-1に認識されることが知られているが、J774.Al細胞等を用いたin vitroにおける実験では、その特異的な取り込みは見られなかった。そこで、複合体の取り込み能を向上させるため、化学修飾化SPGの作製を試みた。ここでは、SPGがその主鎖部分で核酸と複合化するため、前項で示した合成法を用いて、SPGの側鎖部分にのみ化学修飾を施した。CpG DNAと未修飾のSPGからなる複合体を投与した場合では、CpG DNA単独の場合に比べて、サイトカイン産生量がIL-12、IL-6のどちらにおいても15%程度増加していた。これは、CpG DNAがSPGと複合化されることで培地中において安定化し、またBSA等のタンパク質との非特異的吸着が抑制されることによるものと考えられる。近年、ウイルスに特異的なDNAの配列であるメチル化されていないCpGDNAを免疫系の細胞である抗原提示細胞に取り込ませて、細胞性免疫の活性する方法が注目を浴びている。しかし、CpG DNAそのものは生体で分解されやすく、デリバリーシステムの開発が不可欠である。そこで、SPGと核酸の複合体をこのデリバリーに応用することを目的として研究を始めた。すでに明らかにされている様に、シゾフィラン(SPG)は水素結合と疎水的相互作用によって、DNAと2:1の3重螺旋複合体を形成する。この複合体は培地中のDNaseによるDNAの加水分解を大幅に抑制するとともに、アルブミン等の血漿タンパクとDNAの非特異的吸着を抑制する。あらかじめs-SPGに修飾された細胞表面結合部位によって、s-SPG/DNA複合体はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。たとえば、コレステロールを修飾したSPGとCpG DNAの細胞への取りこみでは、LDL受容体を介して細胞に取り込まれ、エンドソームへ移行する。後期エンドソームのベシクル内のpHは5程度まで低下することが知られている。pHが酸性側になると核酸塩基のプロトン化によって複合体が解離し、TLR9に認識されて免疫を刺激する。マウス由来のマクロファージにおけるIL12産生を比較したところ、細胞にCpG DNAを接触させた後24時間後のIL12の濃度をIL-12 ELISA Kit (ENDOGEN)にて定量した。NakedのCpG DNAを投与したときと比較して、4倍から5倍量のIL12が放出されていた。また、フルオロセインを修飾したSPGを細胞に接触させ、レーザー共焦点顕微鏡で観察したところ、R8とRGD修飾のSPGはマクロファージー内への取り込みが確認できた。本年度は、多くの抗原提示細胞に発現しているDectin1と呼ばれるパターンレコグニションレセプターがβグルカンを認識して取り込むことを利用して、マクロファージなどに選択的にSPGが取り込まれることを明らかにしてきた。さらに、抗原タンパクをSPGにコンジュゲートすることで、抗原タンパク特異的にTh1誘導を行い、アレルギー等の治療薬になりうることを示した。近年、ウイルスに特異的なDNAの配列であるメチル化されていないCpG DNAを免疫系の細胞である抗原提示細胞に取り込ませて、細胞性免疫の活性する方法が注目を浴びている。

そこで、SPGと核酸の複合体をこのデリバリーに応用することを目的として研究を始めた。すでに明らかにされている様に、シゾフィラン(SPG)は水素結合と疎水的相互作用によって、DNAと2:1の3重螺旋複合体を形成する。この複合体は培地中のDNaseによるDNAの加水分解を大幅に抑制するとともに、アルブミン等の血漿タンパクとDNAの非特異的吸着を抑制する。あらかじめs-SPGに修飾された細胞表面結合部位によって、s-SPG/DNA複合体はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。たとえば、コレステロールを修飾したSPGとCpG DNAの細胞への取りこみでは、LDL受容体を介して細胞に取り込まれ、エンドソームへ移行する。後期エンドソームのベシクル内のpHは5程度まで低下することが知られている。pHが酸性側になると核酸塩基のプロトン化によって複合体が解離し、TLR9に認識されて免疫を刺激する。本年度は、おおくの抗原提示細胞に発現しているDectin1と呼ばれるパターンレコグニッションレセプターがβグルカンを認識して取り込むことを利用して、マクロファージなどに選択的にSPGが取り込まれることを明らかにしてきた。さらに、抗原タンパクをSPGにコンジュゲートすることで、抗原タンパク特異的にTh1誘導を行い、アレルギー等の治療薬になりうることを示した。DDSの効率化を図るためにナノゲル作成の条件として、化学的架橋方法や粉砕方法を検討した。凍結乾燥した後に真空凍結乾燥して水分を完全に除去した綿状の乾燥物をボールミルで粉砕することによりナノサイズのゲル粒子を作成することに成功した。水分を完全に除去することが極めて大切であり、残存水分があると粒子径が大きくなり、ナノサイズの粒子が得られないことが判明した。さらに、dectin-1を介して特異的に抗原提示細胞に核酸医薬が送達され、MIFの過剰発現を抑えることをインビトロレベルで証明するために、dectin-1を強制発現している細胞(RAWとHEK)を入手して、核酸医薬の特異的な取り込みが起きるかを調べた。FITCを修飾したSPGやDNAの取り込みを、FACSを用いて検討した。Anti-dectin-1抗体で取り込みが抑制されたことから、根幹となるアイデアの正当性が証明された。