hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経活動依存的な軸索分岐を担う細胞骨格制御機構

軸索分岐は神経回路形成の最終段階として重要な現象である。本研究では大脳皮質ニューロンの軸索分岐に対するRho guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF)の作用を研究することによって、軸索分岐の分子・細胞基盤を明らかにすることを目指した。その結果、Rho-GEFの大脳皮質における発現様式に種を越えて共通な側面があること、さらに複数のRhoGEFが内在的に発現し、RhoAを介して皮質ニューロンの軸索分岐の形成に異なる様式で貢献していることが示唆された。私たちは、これまでに軸索分岐形成において低分子量GTPaseの一つRhoAが関与することを示しており(Ohnami et al., 2008)、本研究ではその上流に位置するRho-specific guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF)のに着目し、その軸索分岐に対する作用を解明することを目指した。まず、in situ hybridizationにより発達期大脳皮質には17種類のRhoGEFが強く発現することが示された。次に、これらRhoGEFの軸索分岐作用をラット大脳皮質の2/3層水平軸索の系を用いて、in vitro切片培養下で過剰発現法により調べた。そのために、生後1日齢のラット大脳皮質より切片を作製し14日間培養した。培養4日目、エレクトロポレーション法を用いて大脳皮質2/3層の細胞に、軸索を可視化するための蛍光タンパクのプラスミド(EGFP)と各RhoGEFの発現ベクターを遺伝子導入した。その結果、6種類のRhoGEFの過剰発現により軸索分岐が顕著に増加していることがわ見出された。定量的な解析の結果、RhoGEFメンバーのABRやBCRは微細な枝分かれの形成を促進し、ARHGEF12やARHGEF18は末端での分岐形成を促進することが明らかになった。このように、複数のRhoGEFが発達期大脳皮質ニューロンに発現し、異なる様式で軸索分岐に作用することが示唆された。本研究の目的の一つは、大脳皮質神経回路の形成における軸索分岐の分子メカニズムを明らかにすることである。本年度は、皮質ニューロンの細胞骨格制御に関わる分子群RhoGEFが軸索分岐に関与することを示す結果が得られたことから、目的達成への大きな布石となった。これまでに、低分子量GTPaseのRhoAの活性化を促すRhoGEFファミリーの中に大脳皮質ニューロンの軸索分岐に促進的に作用する分子が複数個あることを明らかにした。本研究では、その中のARHGEF18に着目し、その軸索成長に対する機能を調べた。まず、ARHGEF18の発現をin situ hybridization法を用いて、ラット大脳で調べたところ、皮質ニューロンの軸索分岐が生ずる生後1-2週の時期に全層で広範囲に発現していた。ARHGEF18の機能を調べるために、皮質切片培養と局所的な電気穿孔法を用いて、2/3層ニューロンにARHGEF18の過剰発現させ、共導入したEGFPにより軸索を可視化したところ、層と並行に走る水平軸索の分岐が顕著に増加した。逆にARHGEF18のshRNAを導入しノックダウンすると、軸索分岐はコントロールよりも有意に減少した。また、過剰発現によって得られた軸索分岐は特に末端で活発であること、この軸索分岐の増加がRhoA直下に位置するセリンスレオニンキナーゼROCK阻害剤によって著しく低下したことから、ARHGEF18はRhoA-ROCK経路を経て細胞骨格を制御することが示唆された。次に、内在的なARHGEF18のin vivoでの機能を調べるために、子宮内電気穿孔法により皮質2/3層ニューロンに対してノックダウンコンストラクトを導入した。その結果、生後2週の時期でコントロールに比べて、2/3層ニューロンの主軸索から伸長する水平軸索の本数、ならびに水平軸索の分岐数が有意に減少することが判った。以上の結果から、ARHGEF18は発達期に大脳皮質2/3層ニューロンの軸索分岐を制御していることが示された。RhoAの活性化を制御するRhoGEFファミリーの一つARHGEF18が発達期大脳皮質2/3層ニューロンの軸索分岐を制御していることが明らかになり、当初の目的の中で重要な点が達成できた。昨年度までに、Rho guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF)ファミリーの分子が大脳皮質ニューロンの軸索分岐形成に対して、RhoAを介して促進的に作用することを明らかにしたが、本年度はこの結果を踏まえてRhoGEFの進化的保存性や神経活動依存的な特性について研究した。まず、進化的保存性に関して、マカクザルの大脳皮質切片を用いてRhoAの活性化を促すRhoGEF(RhoA-GEF)28種類の発現を調べたところ、その多くが齧歯類と同様に大脳皮質全層に広く発現していることが見出された。また、それらの発現量は個々のRhoA-GEFでかなり異なっていたが、齧歯類大脳で強い発現を示すRhoA-GEF、ABRやBCRが霊長類大脳でも強い発現を示し、一方齧歯類大脳で発現の低いARHGEF5やARHGEF28は霊長類でも発現が弱い、すなわちRhoA-GEFの発現量は種間で強い正の相関があることがわかった。

さらに、大脳皮質の回路形成における遺伝学的要因と環境的要因との関連性を明らかにするために、RhoA-GEFの一つARHGEF18で神経活動依存的発現を培養下で調べたが、外液のKCl濃度増大による脱分極によってその発現量は変化しなかった。さらに、プルダウンアッセイによって活性化したARHGEF18のタンパク量を調べたが、神経活動によってその総量には有意な変化が見られなかった。以上より、RhoA-GEFの大脳皮質における役割が種を越えて共通な側面があること、その発現は環境依存的と言うよりはむしろ遺伝的に保存された回路形成に関与することが示唆された。軸索分岐は神経回路形成の最終段階として重要な現象である。本研究では大脳皮質ニューロンの軸索分岐に対するRho guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF)の作用を研究することによって、軸索分岐の分子・細胞基盤を明らかにすることを目指した。その結果、Rho-GEFの大脳皮質における発現様式に種を越えて共通な側面があること、さらに複数のRhoGEFが内在的に発現し、RhoAを介して皮質ニューロンの軸索分岐の形成に異なる様式で貢献していることが示唆された。過剰発現により軸索分岐を促進することが示されたRhoGEFについて、その役割をin vivoにおける過剰発現やノックダウン法により、それらの役割を明らかにすることを計画している。さらに、それらの神経活動依存的な様相を解析し、発達期における神経回路形成における役割を解明することを目指す。ARHGEF18の発現あるいは機能が神経活動依存性、非依存性のどちらかであることは重要なポイントである。また水平軸索はげっ歯類から霊長類に共通であることも、特質した点である。これらの問題を明らかにすることが今後の研究推進に重要である。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
陶質土器の出土状況から見た地域間比較研究

昨年は、集落及び古墳出土陶質土器の出土状況をまとめ、西瀬戸内での陶質土器のあり方の重要性を指摘した。それを受け、本年は、西瀬戸内と周辺地域との比較研究を進めた。南九州における資料調査の結果、陶質土器または陶邑産の須恵器とさられていた中に、松山平野産の初期須恵器があることを確認した。出土状況は複数個体、セット関係を保っており、より直接的な移動が想定された。当地域出土陶質土器と松山平野産の初期須恵器は、ともに小規模墳、地域色の強い地下式横穴からの出土であり、出土状況には共通点が多い。当地域への陶質土器の流入に際し、西瀬戸内の関与を具体的資料から想定できるようになった。しかし、畿内との関係を考えなくてはならない横瀬古墳等も存在する。北部九州では集落資料が充実し、総資料は、対馬・壱岐と並んで群を抜く。朝鮮半島に近い点、畿内に通じる交通ルートの要所である点によるものなどが考えられる。古墳出土資料に関しては、西瀬戸内と出土状況に共通点も見られる。松山平野産の初期須恵器は、北部九州地域で確認されず、松山平野以外では、今治市、西条市、岡山市、神戸市で出土している。その多くが、集落から同一器種が複数個体まとまって出土しており、より直接的な移動を示している。この動きから、西瀬戸内以東では、松山平野を介しての陶質土器の移動も十分考えられる。和歌山では、陶質土器の伝世例を確認し、伝世が西瀬戸内のみにとどまる現象ではないことを明らかにできた。特に本年度の成果としては、材質的に近似した在地色の強い初期須恵器が、陶質土器の流入の背景を探る重要な資料となることを示し、それを用いた検討の結果、瀬戸内が単に畿内への交通ルートに位置するだけでなく、陶質土器の流入に際して多様な対応を行っていたことが明らかになった。本研究は西日本を対象としたが、朝鮮半島・東日本を含めた比較検討が今後必要である。本年度は西日本地域を中心として、陶質土器のあり方に検討を加えた結果いくつかの傾向を読みとることができた。1.集落出土の陶質土器5世紀段階では、竪穴式住居等で土師器とともに最終廃棄される例があることを確認した。しかし、陶質土器が出土した遺構内で、陶質土器が在来の土師器・須恵器を凌駕する例はない。また、陶質土器の中には、一部に粗悪品が存在することも、実際の資料調査から明らかになった。2.古墳出土の陶質土器5世紀段階では、小規模な古墳に大量または複数個の陶質土器が存在する例が多いことを確認した。6世紀段階では、横穴式石室を主体部にもつ小規模古墳などから大量の須恵器に混じって、少量の陶質土器が出土するという例が多く見られることを確認した。また、瀬戸内地域で横穴式石室から出土した陶質土器の中に、共伴する須恵器より年代的に若干先行する例があることを確認した。こういった状況は、陶質土器が出土した地域における、陶質土器の位置づけを考える上での重要なデータになると考えられる。3.地域間の比較西部瀬戸内出土の陶質土器のあり方には、朝鮮半島と直接交流の下に陶質土器を入手していた対馬地域の陶質土器のあり方に共通する点が見られることを確認した。次年度は、陶質土器の集成を確実なものにすると同時に、九州・畿内地域の資料充実をはかり、これらの地域を含めた地域間の比較検討を行う必要がある。
カテプシンEの構造と生合成・プロセシング

1.カテプシンEのN端構造解析の結果、本酵素がアスパルティックプロテア-ゼ群の中で最も長いN端配列をもつことがわかった。また、プロカテプシンEから成熟型カテプシンEへの変換の際のプロセシングサイトが明らかとなった。2.プロカテプシンEからカテプシンEへのプロセシングは、酸性条件下で自己触媒的に起こり、この際2500Da分子量低下がみられた。一方は、マクロファ-ジと用いたpulseーchase実際では抗カテプシンE抗体により捕促される分子は46KDaであり、プロカテプシンEの分子量とは異っていた。この分子はchase48HR後も存在しており、より小さな分子種への変化はみられなかった。この分子がプレプロ型なのか、プロ型の糖鎖修飾体なのかは不明のままである。3.成熟型カテプシンEは1本のNリンクの高マンノ-ス型、鎖をもつことがわかった。このことは、カテプシンEが粗面小胞体で合成されることを意味する。しかし、生化学的な細胞内顆粒分画実験では、本酵素は細胞膜・ER画分とサイトソル画分に存在することが知られており、本酵素がERで合成されたのちにいかなる機構でサイトソルに移行するのかといった興味ある問題が未解決のまま残っている。4.カテプシンEは内皮細胞が分泌するエンドセリンの前駆体ビッグエンドセリンに特異的に働き、エンドセリンを産生する。この反応は酸性条件下でおこるが中性域ではカテプシンEの活性は認められなかった。また、内皮細胞がカテプシンEをもつという証拠は得られなかった。本研究および他の研究グル-プの努力により、カテプシンEの構造面でのデ-タは近年飛躍的に増加したが、機能面からの更なるアプロ-チが今後必要となろう。1.カテプシンEの一次構造を明らかにするための第一段階として、精製ラットカテプシンEのN端アミノ酸配列(50残基)を明らかにした。こきN端構造は、ペプシンA、C、レニン、カテプシンDといった他のアスパルティックプロテア-ゼのN端配列との間に高い相同性が認められ、カテプシンEが本酵素群の一員であることの構造面での証拠が得られた。また、カテプシンEがアスパルティックプロテア-ゼ中最も長いN端構造をもつことも明らかとなった。2.精製カテプシンEの単クロ-ン抗体を作製した。免疫したマウスの脾細胞とミエロ-マ細胞の融合により、抗体産性ハイブリッド-マ1株を得ることができた。この単クロ-ン抗体(3E5)はカテプシンEの蛋白質部分を認識し、生合成・プロセシングの調査に有用であることが分かった。3.精製カテプシンEのもつ糖鎖の数、およびその糖組成について明らかにした。カテプシンEをエンドグリコシダ-ゼH、Fで処理し、単クロ-ン抗体を用いたSDS-PAGE-イムノブロット解析を行ったところ、分子量2,000の減少がみられ、カテプシンEが高マンノ-ス型糖鎖を1本もつことが示唆された。また、ガスクロマトグラフィ-により糖組成を分析したところ、1本の高マンノ-ス型糖鎖の存在を支持する結果が得られた。4.現在進行中の生合成・プロセシングに関する調査において、(1)カテプシンEはまず、精製酵素より分子量4,000大きなformとして合成されること、(2)細胞抽出液中で認められる分子は、精製酵素よりも分子量2,000大きなformであることが明らかとなっている。

恐らく、カテプシンEのプロ配列部は二段階切断を受けるものとみられ、本酵素の活性化との関連で興味ある展開が期待される。1.ラットマクロファ-ジを^<35>Sーメチオニンでパルスラベルレ、抗力テプシンE抗体との複合物をSDSーPAGEで解析したところ、精製カテプシンEより4000Da大きな分子型が捕捉された。遺伝子の塩基配列から推定されている一次構造と比較して、この分子はプロ型と考えられた。しかし、チェイス48時間後でもこの分子の成熟酵素型への変換は認められず、本酵素のプロセシングの機構にはなお疑問が残っている。2.単クロ-ン抗体を用いた解析により、細胞・組織抽出液中の酵素分子と精製酵素分子との間に2500Daの違いがあることがわかった。この両型の構造的機能的関係を探るため、胸腺組織から両型を精製する方法を確立した。高分子量型は酸性条件下で低分子量型に変化し、この際、N端部26残基の切断がおこることがわかった。この変化はペプスタチンによって阻止され、ペプシノ-ゲンーペプシン変換の場合と同様、分子内切断機構が働いているものと思われる。両型について、活性のpH依存性を種々の基質を用いて調べた。その結果、高分子量型の至適pHが中性側にシフトすることを除くと、両型の分解特性に大きな変化はみられず、また、報告されているようなATPによるカテプシンEの中性域での安定化も認められなかった。3.上記実験途上で、ビッグエンドセリンからカテプシンEによりエンドセリンが産生されるという知見が得られた。ホルモンのプロセシングファクタ-としてのカテプシンEの役割を追探するため、ヒト、牛、ラットの内皮細胞に本酵素が存在するか否かを調べたがカテプシンE活性は認められなかった。カテプシンEは血球細胞中に存在しているので、エンドセリン産生における血球の関与を探ることが今後の課題の一つとして提起される。本年度は最終年度にあたり、これまでの知見の総括とカテプシンEの機能的・進化的観点からの考察を行った。1.カテプシンEの構造と他のアスパルティックプロテア-ゼの構造についてハイドロパチ-検索を行ったところ、カテプシンEと最も構造的に似ているのはペプシノ-ゲンAであった。この結果は一次構造上の両者の類似性と一致することである。しかし、ペプシノ-ゲンが分泌蛋白であるのになぜカテプシンE細胞内プロテア-ゼであるかという点については今のところ構造上の基盤は不明である。2.カテプシンEはin vitroで内皮細胞由来のホルモン、エンドセリンの変換酵素として作用し得ることがわかった。本酵素はビッグエンドセリンー1,ー2,ー3いずれにも働き、特異的にそれぞれの成熟型を産生した。しかし、この反応は中性条件下では消失し、また、内皮細胞がカテプシンEをもつという証拠が得られなかったため、生理的条件下でin vivoで本酵素が働いているのか否かは明らかではない。3.ラット胸腺よりプロカテプシンEおよびカテプシンEを分離し、その特性を調べた結果、プロカテプシンEも酸性溶液中で活性があることを示唆するデ-タが得られた。しかし、中性域では両型とも不活性であり、本酵素の機能、生理的基質についてはなお調査を要する。本酵素の主要な分布組織が胃粘膜であることを考え、今後は、胃組織を用いて更に重点的に本酵素の意義を調べる必要があると考える。
グリアーニューロン回路網による情報処理機構研究組織の構築

本領域研究は平成15年度に発足し、平成19年度に終了した特定領域「グリアーニューロン回路網による情報処理機構の解明」の報告書をまとめることを目的とした。本領域研究は計画班員14名に加えて、平成16年度から平成17年度までの二年間と平成18年度から平成19年度までの二年間に、それぞれ32名および26名の公募班員を加えて展開された。その成果は当初の予測を遙かにこえるレベルに達し、19年度の終了までに原著論文700編以上(IF4.0以上270件、NatureおよびNature group誌に13件を含む)を発表している。特定領域研究のグループとして非常によくまとまり、共同研究が円滑に行われた。また、サマーワークショップの開催により関連分野の研究者との交流を高め、若手研究者の育成にも大きな効果が得られた。国際交流を重視し、公開国際シンポジウムの開催、国内学会への海外からの講演者の招聘、さらに、海外での国際会議におけるシンポジウムやワークショップの企画開催、平成19年度には日米ジョイント会議などを開催してきた。その結果、本研究班で展開されている研究が国際的にもトップレベルにあることを世界のグリア研究者に印象付け、さらに自らもそれを認識するまでに至っている。本年度作成した報告書は、これらの成果とそれに関連する活動をできる限り包括したものでなければならないと考えた。そこで、これまでの多くの成果報告書に見られる、論文の別刷りを羅列した形ではなく、それぞれの班員の研究成果のまとめに加えて、5年間の成果報告会、サマーワークショップ、公開シンポジウム、さらに国内外でのシンポジウムの状況など蓄積してきた資料を整理してアレンジすることを試みた。仕上がった報告書は5年間の本領域の活発な研究活動を余すところなく伝えているとは言えないまでも、グリア研究の重要性とその研究に従事した班員の熱気は十分に伝えることができるものになったと考えている。本年度は総括班として下記のような事業を行い、研究グループ間の融合を計った。2)第一回総括班会議の開催(15.10.10):平成15年の研究推進方針の確認と、成果報告会、公開シンポジウムの企画を行った。さらに、今後の領域推進のために必要な企画委員会などを設置した。3)代表者会議の開催(15.10.10):計画班員として参加する14名の研究代表者に研究の狙い、研究方針などを披露させ、互いに協力、共同研究の可能性を検討した。4)第二回総括班会議の開催(16.1.28):平成15年度成果報告会に先立ち、平成16年度の研究推進、シンポジウム、ワークショップの内容について討議した。5)第一回公開シンポジウムの開催(16.1.28):本領域研究の第一回公開シンポジウムとして班員の研究成果を中心とした公開シンポジウムを行った。約200名の参加を得て、充実したシンポジウムであった。6)第一回班会議研究成果発表会の開催(16.1.29):14の研究チームの平成15年度の成果報告会を行った。スタートして間も何にもかかわらず各研究グループとも成果が挙がっていることを確認した。7)第一回企画委員会の開催(16.2.24):平成16年度開催予定のワークショップ、国際シンポジウム、成果報告会についての開催日、内容などについて検討しそれぞれの日程を定めた。8)外国人研究者招聘による共同研究の促進:生理学研究所における国際共同研究として、アメリカから3名およびフランスから1名のグリア研究者とグリア操作の技術者を招聘した。発足後二年目の平成16年度は14グループの計画班に32グループの公募班が加わった。そこで、平成16年7月15日、班員の意識向上と共同研究促進のために「グリア細胞の高次機能とその病態における役割」と題するサマーワークショップを行った。総括班メンバー、濱先生による特別講演「グリアの形態」から始まり、第一部「脳の生理と病理へのグリア細胞の寄与」および第二部「精神疾患にグリアは関与するか?」に、それぞれに四演題の講演をお願いした。活発な討論が展開され、グリアの機能についての共通の問題点を掘り起こすきっかけを作った。続いて16日は公募班員の研究テーマと展望についてのプレゼンテーションを行った。さらに、本特定領域研究の世界的展開の一環として、17年1月6日国際シンポジウム「Glial activities in neural plasticity and information processing」を開催した。演者としてアメリカからPhilip Haydon氏およびKen McCarthy氏,中国からShumin Duan氏を招聘した。さらに、日本の若手研究者として、東京薬科大学、森田光洋氏、理化学研究所、平瀬肇氏を演者として招いた。正月早々にもかかわらず、200名近い参加者が集まり、活発で印象深いシンポジウムを行うことができた。続く7日と8日の成果報告会では計画班員と公募班員の成果報告が行われた。内容は充実しており、計画二年目、公募一年目の成果としては十分であった。また、総括班として、グリア細胞の形態や病理に関する先人の貴重な成果を後に伝えることが必要であるとの認識のもとに、まず、生理学研究所名誉教授、濱先生の超高圧電子顕微鏡によるグリア細胞の形態に関する画像データを電子化する作業をバックアップすることにした。これらの成果は順次、我々のホームページの上に報告する。本特定領域は本年度が発足後三年目になる。発足以来、班員間の情報や技術の交換は順調に進展しており、理想的な領域研究として発展してきた。

総括班としては、本領域の新しい展開、所属班員間の相互理解に基づく情報伝達と協同研究のさらなる促進を目的として、平成17年度は以下に示す企画を推進し、満足すべき成果が挙がっている(内容についてはホームページを参照)。1)班員相互理解と共通認識を目的としたサマーワークショップの企画:本年度は「グリアをもっと知ろう」と題して、海外で活躍する日本の研究者を招待講演者とするなど、構造、`機能、病態にわたる広範囲の研究分野におけるグリア研究展開の可能性を探った。2)海外での国際会議におけるシンポジウムおよびワークショップの企画:平成17年度5月アムステルダムで開催されたヨーロッパグリア会議において、我々の領域から二つのワークショップを提案した。また、8月にインスブルックで開催された国際神経化学会大会においても二つのシンポジウムを企画し、ともに日本のグリア研究のレベルを十分にアピールできたものと満足している。3)本領域研究者の成果による公開シンポジウムの開催:平成18年1月公開シンポジウム「グリア細胞の機能と病態」を開催した。4)領域所属研究機関の成果報告会:シンポジウムに引き続き、成果報告会を行った。研究班内での共同研究の成果が目立った。5)データベースの構築:総括班評価担当、濱清名誉教授のグリア電子顕微鏡画像のデータベース化は順調に進んでいる。その他、企画班会議および総括班会議を随時行い、班運営の円滑化を図った。さらに、小規模ながら、ホームページによる広報活動の展開し、研究内容、実績、さらに企画やその成果についても随時アップしてきた。平成17年9月に本領域は三年目の中間評価を受けた。その結果、「A:このまま進めてよい」との判定を得た。本年度は本特定領域発足4年目にあたる。この一年間の我々の特定領域班の研究成果は目覚しいものがあった(ホームページ掲載準備中)。班内グループ間の共同研究も多く、平成19年1月に行われた成果報告会の内容は満足すべきものであった。特に、ミクログリア関連研究の進展が著しく、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトの研究にも興味ある展開を見ている。平成18年7月13日と14日に行ったサマーワークショップは「グリア研究の新しい展開」と題して、海外で活躍する若手日本人研究者を招聘し、さらに三名の特定領域研究「統合脳」の計画班員の講演を依頼した。グリア細胞のin vivo研究および精神神経疾患におけるグリア細胞の関与など新しい展開について活発な討論が展開された。平成19年1月10日には公開国際シンポジウム「Glial cell research : a new frontier of brain science」を行い、ミクログリア研究のHelmut Kettenmann、オリゴデンドロサイト研究のVittorio Galloおよびアストロサイト研究のFrank Kirchhoffを招聘し、二人の計画班員を加えた5名の講演を行った。参加者は約200名であり、活発な討論によって充実したシンポジウムとすることができた。続いて11日と12日に二日にわたって、成果報告会を行い、シンポジウムの講演者である二人の計画班員を除く、班員38名の成果報告を行った。
豚コレラウイルスゲノムの非コード領域の構造解析とその鑑別診断への応用

豚コレラウイルス(CSFV)はプラス鎖の1本鎖RNAをゲノムとしている。そこで、逆転写酵素を用いて我が国で分離されたCSFV株の5'端および3'端の非コード領域の塩基配列を決定し、これを国際的DNAデータバンクに登録されている既知のCSFVのものと比較するとともに、コンピュータを用いて二次構造の自由エネルギー値を計算し、合理的なステム・ループ構造を推定した。これまでの調査研究により、RT-PCRにより増幅された本ウイルスの5'端非コード領域には少なくとも3箇の可変領域が、また、3'非コード領域には少なくとも2箇の可変領域が存在し、それぞれの領域に特徴的な二次構造が想定されることが判明している。CSFVではループ領域の配列と長さはウイルス株により一定していないものの、ステム領域の配列はよく保存されており、固有のステム構造を呈することから、可変領域に想定される二次構造のステム領域に相当する回文様配列における点突然変異を比較検討することにより、CSFVの同定を遺伝子型のレベルで行うことができた。その結果、本ウイルスはCSFV-1,CSFV-2,CSFV-3の3型に分けることが適切であるとの結論に至った。これにより豚コレラの鑑別診断が一層精密に行なえるようになった。また、これはそれぞれのウイルス型が病原性とどのように関係するのかという新たな研究課題を提起するものでもあった。なお、型別の基準とした点突然変異を回文様塩基置換(palindromic nucleotide substitution)と命名し、新しい考え方に基づく分類方法として提案した。以上の研究成果は平成12年8月にイタリアで開催された第5回国際獣医ウイルス学会において発表した。本年度は、わが国で分離された豚コレラウイルス16株を対象に、現有のサーマルサイクラーを用いてネステッドRT-PCR法により、ウイルスゲノムの5'端非コード領域およびNS5B領域を増幅させ、その塩基配列を決定した。最初に、供試豚コレラウイルス材料からRNAを抽出し、ウイルスゲノムの5'端非コード領域および3'瑞のNS5B領域のそれぞれ下流に位置するプライマーを用いてcDNAをM-MLV逆転写酵素により合成した。得られた1本鎖のcDNAを基質として、逆転写反応に用いた下流のプライマーとそれぞれの上流に位置するプライマーを用いて、PCRを行った。これにより5'端非コード領域からは約300塩基対の、また3'端からは約400塩基対の大きさのPCR産物がそれぞれ得られた。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により分画し、紫外線トランスイルミネーターにより観察した。得られたPCR産物はダイデオキシ法によりその塩基配列を決定した。さらに、得られた塩基配列を既知の塩基配列とともにコンピュータにより系統解析を行ったところ、これらの豚コレラウイルス株が3群に分かれることが明らかになったので、その成果を日本獣医学会およびドイツにおいて開催されたペスティウイルス学会議において公表した。本年度は前年度に決定した豚コレラウイルス(CSFV)の塩基配列について、国際的DNAデータバンクに登録されている既知のCSFVのものと比較するとともに、コンピュータを用いて二次構造の自由エネルギー値を計算し、合理的なステム・ループ構造を推定した。申請者のこれまでの調査研究により、RT-PCRにより増幅された本ウイルスの5'端非コード領域には少なくとも3箇の可変領域が、また、3'非コード領域には少なくとも2箇の可変領域が存在し、それぞれの領域に特徴的な二次構造が想定されることが判明している。その結果、本ウイルスはCSFV-1,CSFV-

2,CSFV-3の3型に分けることが適切であるとの結論に至った。これにより豚コレラの鑑別診断が一層精密に行なえるようになった。また、これはそれぞれのウイルス型が病原性とどのように関係するのかという新たな研究課題を提起するものでもあった。なお、型別の基準とした点突然変異を回文様塩基置換(palindromic nucleotide substitution)と命名し、新しい考え方に基づく分類方法として提案した。以上の研究成果は平成12年8月にイタリアで開催された第5回国際獣医ウイルス学会において発表した。
高速ナノサーボ機構を用いたハイブリッド加工制御システムに関する研究

本研究の目的は,位置制御と圧力制御のハイブリッド制御を行い,高い形状精度と良好な表面粗さを持つ微細形状を創成するために,必要な加工機の送り系の開発を行う事である.まず,ボールねじ駆動の送り系に,圧電アクチュエータ駆動の高速ナノサーボ機構を組み込んだ加工システムを開発する.この加工システムを用いて,位置制御と圧力制御のハイブリッド制御を行う.次に,リニアモータ駆動の加工機を設計・製作し,同様のアプリケーションの適用可能性を調査する.前年度までに圧電アクチュエータ駆動の高速ナノサーボ機構を組み込んだ加工システムを開発した.しかし,市販のCNC加工機を用いて圧電アクチュエータを駆動するためには,PWMアンプとリニアアンプを実装したCNC加工機を開発する必要があるという問題があった.また,圧電アクチュエータは,湿気によって性質が劣化する問題があった.これらの問題を解決するため,高応答なリニアモータ駆動送り系からなら加工機を開発した.しかし,送り系に生じる摩擦の影響によって運動精度が低下するため,送り系に必要な0.1μmの運動精度を実現することができなかった.本年度は,フィードフォワード制御を用いて摩擦力の補正を試みた.フィードフォワード制御に用いる摩擦モデルを構築するために,摩擦力の特性の解析を行った.解析の成果より,速度と加速度の影響によって変化する摩擦力の特性を明らかにした.また,摩擦とテーブル位置の移動量の関係が示すヒステリシスループを接触面のすべり速度を考慮した移動マルチブラシモデルを用いて説明した.このモデルを用いる事で接触面の微小変位領域から大変位領域までの摩擦特性の示す定常特性と過渡特性を摩擦力の変化率と定常値,すべり速度分布の3つのパラメータで表現することが可能となった.このモデルを用いて摩擦補正を行い,数1000mm/minの高速円弧補間運動を行った場合に生じる運動誤差を従来の5分の1程度である最大1μmに抑えることが可能となった近年,精密金型や光学部品の応用分野では,微細形状を高速で創成可能な高精密加工法への要求が高まっている.従来までは,切削加工を行った後に研磨加工を行う事で,形状精度と表面粗さを実現する方法が用いられてきた.しかし,この方法では加工時間が長くなるという問題があり,また研磨加工では,工具を定圧で工作物に押しつけて加工を行うため,形状精度が悪化するという問題があった.本研究では,工具の位置制御と圧力制御を併用して形状精度と表面粗さの両立した形状の創成法の研究を行う.本研究では,前年度までに加工に用いるための高速ナノサーボ機構の開発と制御法の研究を行った.今年度は,比較対象機に用いるリニアモータ駆動の加工機開発を行い.リニアモータ駆動の加工機を用いて,ハイブリッド加工制御を適用した加工を行う予定であった.リニアモータ駆動の送り系では,同サイズのボールねじ駆動の送り系に比べて,モータの推力が小さいため摩擦の影響により運動精度が低下するという問題があった.そこで,リニアモータ駆動の送り系に生じる摩擦力の解析と補正方法の研究を行った.転がり案内に生じる摩擦力の測定のためのテストスタンドを製作し,摩擦力の測定を行った.測定のために,微小線分送りとドウェルを組み合わせた測定パターンを提案した.摩擦力の解析結果から従来は,分離できなかった材料の弾性変形によるスティック摩擦成分とスリップ摩擦成分を分離してモデル化することが可能となり,摩擦力補正のための簡易な補正モデルが提案できた.本研究の目的は,位置制御と圧力制御のハイブリッド制御を行い,高い形状精度と良好な表面粗さを持つ微細形状を創成するために,必要な加工機の送り系の開発を行う事である.まず,ボールねじ駆動の送り系に,圧電アクチュエータ駆動の高速ナノサーボ機構を組み込んだ加工システムを開発する.この加工システムを用いて,位置制御と圧力制御のハイブリッド制御を行う.次に,リニアモータ駆動の加工機を設計・製作し,同様のアプリケーションの適用可能性を調査する.前年度までに圧電アクチュエータ駆動の高速ナノサーボ機構を組み込んだ加工システムを開発した.しかし,市販のCNC加工機を用いて圧電アクチュエータを駆動するためには,PWMアンプとリニアアンプを実装したCNC加工機を開発する必要があるという問題があった.また,圧電アクチュエータは,湿気によって性質が劣化する問題があった.これらの問題を解決するため,高応答なリニアモータ駆動送り系からなら加工機を開発した.しかし,送り系に生じる摩擦の影響によって運動精度が低下するため,送り系に必要な0.1μmの運動精度を実現することができなかった.本年度は,フィードフォワード制御を用いて摩擦力の補正を試みた.フィードフォワード制御に用いる摩擦モデルを構築するために,摩擦力の特性の解析を行った.解析の成果より,速度と加速度の影響によって変化する摩擦力の特性を明らかにした.また,摩擦とテーブル位置の移動量の関係が示すヒステリシスループを接触面のすべり速度を考慮した移動マルチブラシモデルを用いて説明した.このモデルを用いる事で接触面の微小変位領域から大変位領域までの摩擦特性の示す定常特性と過渡特性を摩擦力の変化率と定常値,すべり速度分布の3つのパラメータで表現することが可能となった.このモデルを用いて摩擦補正を行い,数1000mm/minの高速円弧補間運動を行った場合に生じる運動誤差を従来の5分の1程度である最大1μmに抑えることが可能となった
植物発生・パターン形成に関する数理的研究

植物は土壌中に分布する栄養分を効率良く吸収するために、栄養環境に応答してその根系の構造および形態を大きく変化させる。窒素栄養は、植物にとって必須の栄養素の一つであり、根の成長に大きな影響を与える。例えば、側根の成長は低濃度の硝酸で促進されるのに対し、高濃度では抑制される。しかしながら、このような制御機構がどのようにして適応的に形成・進化してきたのかに関しては、現在ほとんど理解が進んでいない。そこで根の形成・維持にかかるcostと窒素栄養の吸収によるbenefitに基づいた適応度に関する数理モデルの構築および解析を行なった。最初に、吸収された窒素栄養が全てbenefitに反映される場合、窒素栄養は常に根の成長に対して促進的であることが示唆された。この結果は、低濃度の促進効果をうまく説明できるのに対し、高濃度での抑制効果は説明できない。一方で、benefitに上限を導入することによりその両方の効果をうまく説明できる。このことは、高濃度の過剰な窒素栄養は必ずしも植物にとって有用ではないことが、植物の応答において重要であることを示唆している。次に、モデルを空間的にheterogeneousな条件に対して拡張を行なうことにより、不均一な窒素栄養に対する植物の応答機構の理解を試みた。モデル解析により、高濃度窒素条件において、systemic(全身的)制御が必要となり、これは根の成長に対し常に抑制的に働くことが示唆された。このモデル予測は、シロイヌナズナ用いたsplit-root実験により支持された。またモデルにより、窒素栄養が空間的に局在するほど、根の成長は促進されることが予測され、この予測も実験的検証により支持された。これらの数理モデル解析の結果は、高濃度窒素によって誘導されるsystemicな制御機構は、過剰な窒素栄養に対する適応として進化してきたことを示唆している。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の葉序パターンは幾何学的な模様を作り出すことで広く知られている。この規則的パターンは、植物ホルモンのオーキシンとその膜輸送タンパク質PIN1の相互制御により形成されることが知られている。実際に、隣の細胞のオーキシン濃度に依存した細胞膜上のPIN1局在制御を組み込んだ単純な数理モデルにより、葉序の規則的パターンがうまく再現される。しかしながら、この数理モデルは極端に単純化されており、実際の植物細胞の特徴を必ずしも反映されている訳ではない。そこでより実際的な細胞環境を反映させるために、隣の細胞外領域のオーキシン濃度に依存的したPIN1局在制御に改変した数理モデルを構築し、理論的解析および数値シミュレーションによる検証を行なった。しかし驚くべきことに、この改変モデルにおいて規則的パターンは完全に崩壊するという予想外の事実を見出した。この結果は、葉序形成にはオーキシンとPIN1の相互制御だけでは十分ではなく、それに加えて未知の分子機構が存在することを強く示唆している。一般に自己組織的なパターン形成において、拡散性分子が中心的な役割を果たしていることが知られている。そこで予測された未知の分子機構を明らかにするために、仮想的な拡散性分子(X)をモデルに導入し、オーキシン-PIN1ダイナミクスとの間に様々なフィードバック制御を仮定して、それらの葉序パターンに対する影響を数値シミュレーションにより網羅的に検証した。その結果、オーキシンがPIN1局在を直接的に制御するのではなく、拡散性分子Xを介して間接的に制御することにより、規則的パターンが回復できることを明らかにした。この結果は葉序パターン形成において、まだ発見されていない未知の拡散性分子の存在を強く示唆するものである。(1)オーキシンによるパターン形成ダイナミクスに関しては、概ね順調に進捗している。オーキシンはPIN1と協調することにより、2種類の自己組織的パターン、(i)極性輸送と(ii)オーキシンスポット(auxin maxima)を形成し、それらはそれぞれ非常に簡略化された数理モデルにより説明されている。しかしながら、それらは現象論的に構築されており、分子的な制御機構を考える上では必ずしも適切ではない。そこで今までに私は、より分子的制御機構を考慮したモデルの構築・解析を行なってきた。それにより(i)極性輸送パターンでは局所的オーキシンによるPIN1局在制御により、また(ii) auxin maximaパターンでは拡散性分子を介したオーキシンの間接的なPIN1局在制御により、それぞれのパターン形成を説明できることを示してきた。それぞれのモデルは、オーキシンによるパターン形成機構の理解において重要な示唆を与えるものである。(2)花原基whorlパターン形成に関しても概ね順調に進捗しているが、オーキシンのパターン形成の研究を中心的に進めていたこともあり、一部遅れている部分がある。すなわち、シロイヌナズナでの実験結果から予測される制御ネットワークに基づいた数理モデルを構築し、数値シミュレーションにより野生型、および主な変異体の表現型の再現はすでに成功している。その一方で、whorlパターンの境界がシロイヌナズナのように明確ではなく、勾配を形成する場合に関しては検証が遅れている。

そこで根の形成・維持にかかるcostと窒素栄養の吸収によるbenefitに基づいた適応度に関する数理モデルの構築および解析を行なった。最初に、吸収された窒素栄養が全てbenefitに反映される場合、窒素栄養は常に根の成長に対して促進的であることが示唆された。この結果は、低濃度の促進効果をうまく説明できるのに対し、高濃度での抑制効果は説明できない。一方で、benefitに上限を導入することによりその両方の効果をうまく説明できる。このことは、高濃度の過剰な窒素栄養は必ずしも植物にとって有用ではないことが、植物の応答において重要であることを示唆している。次に、モデルを空間的にheterogeneousな条件に対して拡張を行なうことにより、不均一な窒素栄養に対する植物の応答機構の理解を試みた。モデル解析により、高濃度窒素条件において、systemic(全身的)制御が必要となり、これは根の成長に対し常に抑制的に働くことが示唆された。このモデル予測は、シロイヌナズナ用いたsplit-root実験により支持された。またモデルにより、窒素栄養が空間的に局在するほど、根の成長は促進されることが予測され、この予測も実験的検証により支持された。これらの数理モデル解析の結果は、高濃度窒素によって誘導されるsystemicな制御機構は、過剰な窒素栄養に対する適応として進化してきたことを示唆している。(1)オーキシンによるパターン形成ダイナミクスオーキシンとPIN1の相互制御により、極性輸送とオーキシンスポット(auxin maxima)の2つの自己組織的パターンが形成される。これらのパターンは常に単独で形成されている訳ではなく、興味深いことにはそれらの間に相互作用が行なわれている場合がある。例えば、葉原基や葉脈の形成過程において、最初にauxin maximaパターンが形成された後、そこから極性輸送パターンが形成されることが観察されている。この様なパターンの間の切り替えや相互作用により、それらが単独で機能する場合に比べて遥かに多様なパターンが創出される可能性がある。そこで、個々のパターン形成の分子的制御ダイナミクスの解明と同時に、これら2種類のモデルを融合させることにより、オーキシンパターンの切り替えの制御機構およびパターンの多様性創出の機構を明らかにすることを一つの目標にしたい。(2)花原基whorlパターン形成ABCモデル遺伝子群の発現パターンは必ずしも固定化されている訳ではなく、実際は時空間的にダイナミックに変化することが知られている。現在はすでに論文に報告されている情報を用いてモデルを構築しているが、それらの情報は断片的であり、また重要な部分が欠けていたりもする。もし時空間的な発現パターンの詳細で網羅的な実験データが取得できれば、より精密な数理モデルの検証が可能になる。その様な実験データの取得を試みることも検討したい。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
滑動性眼球運動に混在する小矩形波の臨床的意義

ゆっくりと移動する視標を注視して生じる滑動性眼球運動において、突然2度から10度の偏位が現れ、短時間その位置を保った後にもとの眼球運動になる現象を小矩形(Square Wave Jerks)という。この小矩形波の発現の機序と臨床的意義を明かにすることを研究の目的とした。水平方向に往復直線運動をする視標刺激で誘発される眼球運動を記録し、以下の結果を得た。(1)視標の大きさを変えたとき、視標の直径が大きくなると小矩形波の発現頻度は増加する。(2)視標の周波数は、0.1Hzで小矩形波の発現頻度は最も多く、0.2,0.3,0.4,0.5Hzと周波数が増加するのに伴って小矩形波の出現頻度は減少した。(3)小矩形波の発現頻度、振幅、持続時間のうち、若年者に比べて、高齢者では振幅と発現頻度が増加する。(4)抗不安薬のジアゼパムは、小矩形波の発現頻度、振幅、持続時間のいずれにも影響しない。(5)アルコールの血中濃度の上昇は、小矩形波の持続時間の延長をきたすが、発現頻度と振幅は変化しない。(6)382例のめまい平衡障害患者のうち、小矩形波が出現したのは47例(12.3%)であった。末梢前庭性めまい疾患では14.4%に、中枢性めまい疾患では38.2%に小矩形波の混入を認め、中枢性めまい疾患の発現頻度が高い結果をえた。(7)聴神経腫瘍と小脳髄変性症は全例小矩形波の混入がみられ、とくに聴神経腫瘍に比して、小脳脊髄変性症は小矩形波の発現頻度が有意に増加していた。以上の結果から、小矩形波は脳幹・小脳障害で多発するが、生理的条件でもみられることがある。小矩形波の発現は中枢障害を示唆する所見であるが、発現の有無ではなく、発現頻度の各年齢層で検討して病的意義を見いだすのが妥当である、との結論を得た。移動する指標を注視したときに生じる滑動性眼球運動に混入する小矩形波を健康成人を対象として検討した。眼球運動誘発装置で、水平性滑動性眼球運動を誘発し、電気眼振計で直流記録した。健康成人での小矩形波の発生と加齢との関係、薬物負荷の影響、病的症例の検討を行った。30度の指標振幅、0.2Hzの指標運動周波数で誘発した場合、小短形波の出現頻度は、20歳代で0.50、40歳代0.74、60歳代で1.01と、加齢により増加していた。20歳代の健康成人に30度の指標振幅、0.1Hzから0.5Hz指標運動周波数で誘発した場合指標運動周波数の増加に伴い小短形波の出現頻度は減少していた。30度の指標振幅、0.1Hzの指標運動周波数で、20歳代の健康成人に、ジアゼパムとアルコールを負荷して検討した。小矩形波の出現頻度は、アルコール負荷により増加したが、ジアゼパム負荷では変化しなかった。小矩形波の振幅と持続時間はジアゼパムとアルコール負荷により影響を受けなかった。脊髄小脳変性症と聴神経腫瘍の患者を対象として、小矩形波の出現頻度を検討した。30度の指標振幅、0.1Hzの指標

運動周波数では、小矩形波の出現頻度は健康成人に比べ増加する傾向を認めたが、前庭神経炎などの末梢性前庭障害患者でも増加する傾向が認められた。以上の結果から、滑動性眼球運動に混入する小矩形波の多彩な特徴が明らかになった。今後薬物負荷による影響を検討し、病的症例の集積をすすめてデータ・ベースを構築し、小矩形波の発現機序を検討していく予定である。このデータ・ベースによって多変量解析を行い、滑動性眼球運動に混入する小矩形波の臨床的意義を明らかにできると考える。移動する視標を注視したときに生じる滑動性眼球運動に混入する小矩形波(Square Wave Jerks)を検討した。まず視標の大きさが小矩形波の発現にどのように関与するかについて健康成人で検討した。0.1Hzの周波数で、水平に移動する視標の大きさを4段階に変えて小矩形波の出現について検討した。この結果は直径9mm(視角0.5°)と18mm(視角1.1°)の視標では差がみられないが、27mm(視角1.5°)、36mm(視角2.1°)と視標が大きくなるに従って、いずれも小矩形波の出現頻度の有意の増加がみられた。これらの結果をもとに、めまい・平衡障害を訴える患者382例を対象として、眼前1mのところを直径20mm(視角1.15°)の視標が0.10.5Hzで水平往復運動をするのを注視させ、その滑動性眼球運動を記録・分析した。382例のうち小矩形波が出現したのは、47例(12.3%)であった。末梢前庭性めまい疾患では14.4%に、中枢性めまい疾患では38.2%に小矩形波の混入を認め、中枢性めまい疾患の発現頻度が高い結果をえた。また、視標の周波数が0.1Hzのときに最も小矩形波の混在の頻度が高く、0.2、0.3、0.4、0.5Hzと周波数が大きくなるにしたがって発現頻度は有意にて低下した。小矩形波は脳幹・小脳障害で多発するが、生理的条件でもみられることがある。小矩形波の発現は中枢障害を示唆する所見であるが、発現の有無ではなく、発現頻度を各年齢層で検討して病的意義を見いだすのが妥当である、との結論を得た。
触媒トラップ法によるポリチオフェン末端への簡便で確実な官能基導入

本研究では、3,4位に置換基を導入したチオフェン誘導体を末端停止剤前駆体として合成し、熊田触媒移動型重合(KCTP)によって得られるポリ(3-ヘキシルチオフェン)の鎖末端を官能基修飾することを目的とした。メトキシチオフェンの場合、メトキシ基の置換位置によって末端修飾結果が大きく異なった。モデル反応から、電子豊富なチオフェンがゼロ価ニッケル錯体を捕捉していることが示唆された。一方、立体的に嵩高いオキサゾリルチオフェンの場合は、turboグリニャール試薬によって反応性を向上させ、過剰量のスチレンによってゼロ価ニッケル錯体を分子間捕捉することで、生長末端にのみ官能基を導入することに成功した。優れた化学安定性、高い電荷移動度、有機溶剤に対する溶解性などの点で注目を集めているポリ(3-ヘキシルチオフェン)は、横澤らが開発した熊田触媒移動型重合(KCTP)により一次構造が明確に定義されたポリマーが得られる。一方、KCTPは非常に洗練された重合法であるが、その機構ゆえ、ポリ(3-ヘキシルチオフェン)の末端修飾は、リビング生長末端を別のGrignard試薬で反応停止させるか、単離した高分子の開始末端にあるブロモ基を利用して高分子反応させるしか手段は無く、どちらも欠点を有している。応募者は、3位にピリジン環を有する2,5-ジブロモチオフェン誘導体とGrignard試薬との選択的なハロゲンー金属交換反応(いわゆるGRIM反応)を経由するKCTPにより、頭尾結合の割合が98%と非常に高く、分子量制御されたポリ(3-ピリジルチオフェン)を合成することに成功している。本研究では、これまでの知見を活用し、3,4位に置換基を導入した2,5-ジハロゲノチオフェン誘導体を合成し、ここから発生させたチオフェンGrignard試薬を停止剤、かつ官能基導入試薬として用いることにより、上に掲げた課題を解決する。今年度は、2-ブロモ-3-ヘキシル-5-ヨードチオフェン、および5-ブロモ-3-ヘキシル-2-ヨードチオフェンをモノマーとしたKCTPの終期において、さまざまな条件で2-ブロモ-3,4-ジヘキシル-5-ヨードチオフェンから発生させたGrignard試薬を加え、末端に対する反応性を詳細に議論した。その結果、これまで報告されている事実と一部異なる実験結果が得られ、末端官能基化における課題と今後の分子設計指針を示すことができた。一方、KCTPは非常に洗練された重合法であるが、ポリ(3-ヘキシルチオフェン)の末端修飾は限定的である。例えば、リビング生長末端を別のGrignard試薬で反応停止させる方法では、Grignard試薬の種類によって、片末端もしくは両末端に置換基導入される場合があり、その詳細は不明である。また、単離したポリ(3-ヘキシルチオフェン)を高分子反応によって末端修飾する場合、過剰量の試薬が必要になる上、定量的に反応させることは困難である。他方、ポリチオフェン誘導体をデバイス材料として応用するには、末端構造が重要であることが近年多くの研究者によって報告されている。従って、簡便で信頼性の高い末端修飾法の開発が急務となっている。本研究では、3,4位にさまざまな置換基を有するチオフェン誘導体から調製されるGrignard試薬を停止剤かつ官能基導入剤として用いることにより、上記問題を解決することを目的とする。今年度は、まず昨年度問題となった課題解決に向け、2-ブロモ-3,4-ジメチル-5-ヨードチオフェンを停止剤前駆体として合成した。これから調製されるGrignard試薬を停止剤とした場合、ニッケル触媒の配位子やリチウム塩の添加により付加の起こりやすさに違いが見られることを明らかにした。次に、3位あるいは4位にメトキシ基をもつ2-ヨードチオフェンを停止剤前駆体として合成した。配位子の種類に関わらず、3-メトキシ体の場合は片末端、4-メトキシ体の場合は両末端に停止剤が導入されることが分かった。これより、生長末端のビチオフェン単位の立体環境が触媒移動に影響することを明らかにした。チオフェンの3,4位にアルキル基を有する停止剤では、配位子やリチウム塩が及ぼす影響を明らかにした。予想した通り、触媒もしくは停止剤を活性化しないと立体障害から停止剤との反応が抑制されることが分かった。一方、マグネシウムに配位可能なエーテル酸素を導入することで、停止剤の反応性が向上することも分かった。これまでに研究代表者が合成、重合してきたピリジン型モノマーと矛盾しない結果となった。さらに、その導入位置を変えることにより、還元的脱離した後のゼロ価ニッケルの分子内移動しやすさを制御できた。これらの結果は、別途合成したモデル化合物との比較から支持されたが、これら化合物は熊田カップリングでは合成できず、鈴木カップリングによってのみ合成できた。チオフェンを基盤とする共役系高分子、なかでも最も単純な構造を有するポリ(3-ヘキシルチオフェン)は、優れた化学安定性、高い電荷移動度、有機溶剤に対する溶解性などの点から多くの注目を集めてきた。