hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノシン受容体を介する細胞内情報伝達機構の分子生物学的解明

アデノシン受容体の構造と機能を分子レベルで解明するため新しいアデノシン受容体の検索とアデノシン受容体遺伝子発現調節の二方面より研究を進めた。多彩なアデノシンの生理的働きは種々のアデノシン受容体サブクラスの存在を示唆しており、新しいサブクラスのアデノシン受容体を見いだそうとマウス脳のcDNAライブラリーをスクリーニングしたが既知の受容体以外のクローンは得られなかった。そこでアデノシン受容体の非特異的リガンドである[^3H]NECAに対する結合活性を指標として検索を行ったところ、ラット脳細胞膜画分に既知のアデノシン受容体とは異なる性質を持つタンパクが見いだされたので種々のクロマトを用いて高度に精製を行った。得られた標品の特異性を種々のリガンドを用い詳細に検討したところアデノシン受容体とATP受容体の中間的なものであり未知のアデノシン受容体(様)タンパクであることが明らかになった。一次構造を明らかにしようとクローニングを含めさらに詳しい構造解析を現在検討中である。ところで受容体の生理的役割を考える上でその発現調節は非常に重要であるが、アデノシン受容体のサブタイプA1およびA2の遺伝子レベルでの発現調節機構についてはほとんど研究がなされていない。そこで代表的な発現変動要素である受容体アゴニストとグルココルチコイドホルモンの効果をアデノシン受容体を発現している二種の培養細胞(DDT_1MF-2,PC12)を用いて検討した。DDT_1MF-2細胞のA1受容体活性はデキサメサゾンにより受容体mRNAの増加を伴う活性上昇(約50%)が、またPC12細胞のA2受容体はA2受容体の特異的アゴニストの添加により可逆的なmRNAの減少が観察された。したがって受容体を介する複数の経路による機構でアデノシン受容体の遺伝子発現が調節を受けることが明らかになった。遺伝子上のレスポンスエレメントなどこれらの機構の詳細を現在検討中である。アデノシン受容体の作用機構を遺伝子工学的手法とタンパク化学的手法を用いて解明しようとするのが本研究の目的である。1.アデノシン受容体のクローニングと共役系の同定:多彩なアデノシンの作用は既知以外のアデノシン受容体サブクラスの存在を示唆しており、遺伝子組み替え及び蛋白分離技術を利用して既知のアデノシン受容体とは異なるサブタイプの単離を試みた。マウス脳よりcDNAライブラリーを調製して、A1及びA2アデノシン受容体のcDNAプローブとハイブリダイズするコロニーを数多く得た。しかしながら現在のところそれらの中より既知の受容体以外のクローンは得られていない。一方、アデノシン受容体の非特異的リガンドである[^3H]NECAに対する結合活性を指標としてラット脳膜画分よりこれまで報告のないリガンド結合特異性を持つアデノシン結合蛋白を部分精製することに成功し、アデノシン受容体の新しいサブタイプの可能性を示唆した。2.受容体活性調節機構の解明:アデノシン受容体の脱感作現象を培養細胞やさらに実験動物を用いて分析して、タンパクおよび遺伝子レベルで受容体活性の発現調節の分子機構を明らかにしようと試みた。まず精製単離したA1アデノシン受容体がリン酸化酵素により修飾を受けるかを、in vitroでA-キナーゼによるリン酸化により試みたが受容体分子への有意なリン酸化や活性の変化は観察されなかった。しかしながら、アデノシンA2受容体を持つことが知られているラットPheochromocytoma PC

12細胞に培養条件下でアデノシンアゴニストを添加すると、迅速なA2受容体mRNAの減少とゆっくりとした回復が見いだされた。このmRNAレベルでの調節はアデノシン受容体では初めての例であり、さらに詳しい遺伝子レベルの解析を続けている。さらにPC12細胞はこの時いわゆる神経突起とは異なる短い突起をアデノシンA2受容体を介する機構で形成することも明らかになった。アデノシン受容体の構造と機能を分子レベルで明らかにするため新しいアデノシン受容体の検索および受容体遺伝子発現調節の解明という二方面より研究を進めた。1.新しいアデノシン受容体の検索と精製:マウス脳cDNAライブラリーをPCR法を利用しスクリーニングしたが、アデノシン受容体に属すると思われる新しいクローンを得ることができなかった。そこでアデノシン受容体のアゴニストの中で特異性が広い(すなわちA1、A2、A3のいずれのサブタイプとも親和性を持つ)[^3H]5'-N-ethylcarboxamidoadenosine(NECA)との結合活性を指標としてアデノシン受容体様蛋白の検索をおこなったところ既知のアデノシン受容体とは異なるアデノシン結合活性が見いだされたので、ラット脳の細胞膜より高度に精製を行った。その特異性を詳しく調べたところアデノシン受容体のアンタゴニストのキサンチン類に対して親和性がほとんどなく、アデノシンのみならずATPやADPなどのヌクレオチド類に対しては高親和性を示し、また種々のリガンドに対する特異性はこれまで報告された受容体とは異なるなど丁度アデノシン受容体とATP受容体の中間の特異性を持つ未知のアデノシン結合タンパクであることが明らかになったのでクローニングを含めさらに詳しい構造解析を検討中である。2.アデノシン受容体発現調節現象の解析:A1、A2のアデノシン受容体をそれぞれ発現するDDT1MF-2およびPC12培養細胞を用いてアデノシン受容体の遺伝子発現調節機構の検討を行った。今年度は代表的な発現調節要因であるグルココルチコイドホルモンとアゴニストの効果を主に調べた。DDT1MF-2細胞のA1アデノシン受容体活性はデキサメサゾン添加で50%以上の活性増加を示し、受容体mRNA量の増加を伴うことが観察された。またPC12細胞はこれとは逆にA2アデノシンアゴニストの添加で数時間内に可逆的なA2受容体mRNAの減少とゆっくりとした回復が見いだされた。したがって受容体を介する機構でアデノシン受容体の遺伝子発現が調節を受けることが明らかになった。
フランコ政権とスペイン西北アフリカ帝国の崩壊

第2次世界大戦中のフランコ政権のアフリカ植民地政策の策定とその実際、これに対する「現地」の「原住民」の反応とくにスペイン領モロッコの民族主義者の要求、スペインによるタンジャ(タンジール)占領の意図と結果、モロッコの民族主義者と連合軍・連合国との接触、連合軍・連合国の北アフリカ政策に対するフランコ政権の反応、以上のことを解明した。総じて、スペイン西北アフリカ帝国(構想)は第2次世界大戦中のドイツによるヨーロッパとくにフランス占領によって可能となったこと、しかし、第2次世界大戦末期になるとその地域的・国際的条件は消え失せたことを明らかにした。当該年度の研究は、第1に、スペイン内戦に勝利した後の第2次世界大戦中のフランコ政権はどのようなアフリカ植民地政策を策定したのか、第2に、上記の期間にスペインのアフリカ植民地の中軸を成したモロッコ保護領ではどのような植民地統治政策が実際に展開されたのか、とくにどのような「原住民」統治政策がおこなわれたのか、それに対して「原住民」はどのような反応を示したのか、第3に、フランコ政権の「西北アフリカ帝国」構想を枢軸諸国とくにドイツのアフリカ植民地政策との関連で明らかにすること、以上のことの解明を目的とした。1フランコ政権は、内戦中に自らに協力したモロッコ民族主義者を公的には宥和する政策(民族主義政党の承認、内戦に参加したモロッコ人兵士への年金、ハブー(ワクフ)のモロッコ人による管理、新聞・結社の自由など)を展開した。しかし実際には民族主義者を厳しく監視し、また2つの民族主義政党を相互に対立させて民族主義運動の分裂を図った。2身分証明書の発行など「原住民」は厳しく監視された。さらに農産・畜産税など徴税は強化された。3ドイツ「第三帝国」のヨーロッパ支配とくにドイツのフランス侵入を予期して、外務省内で「スペイン西北アフリカ帝国」構想を練り上げていた。とくに当面はタンジャの占領を立案した。以上の研究は、スペイン陸軍史料館(スペイン、マドリード)にマイクロフィルムで所蔵されているモロッコ植民地関係文書の閲覧と検討によって可能となった。さらに総合公文書館(スペイン、アルカラ・デ・エナーレス)、スペイン国立図書館旧アフリカ資料室、マドリード市立新聞資料館の各所蔵資料の閲覧によって可能となった。当該年度の研究は、第1に、第2次世界大戦中のスペイン・フランコ政権のアフリカ植民地政策とくにモロッコ保護領統治政策を明らかにすること、第2に以上の植民地政策・統治政策に対して「原住民」がどのような反応を見せたのか、とくにモロッコ民族主義者の動向はどうか、第3にドイツ第三帝国のフランス占領後のスペイン軍によるタンジャ占領またヘンダーヤでのフランコ・ヒトラー会談におけるフランコ政権の意図は何だったのか、以上のことの解明を目的とした。当該年度の研究によって以下のことが明らかとなった。1ドイツ第三帝国がヨーロッパで軍事的に優勢だった1941年前半頃までは、フランコ政権は北部モロッコだけでなく南部モロッコやアルジェリア西部も占領して「スペイン西北アフリカ帝国構想」を実現しようとの意図を持っていた。1940年6月のタンジャ占領はこのような意図のもとに遂行された。フランコ・ヒトラー会談でフランコ政権はこの意図を述べたが、ドイツ側はこれにかならずしも同意しなかった。この中でとくにモロッコ保護領では「原住民」に対する宥和政策が採られた。モロッコ民族主義者の一部にはフランスによる統治よりもスペインによる統治を期待する動きも見られた。2しかし、ドイツが次第にヨーロッパで不利な状況となった19421943年になると、連合国側の働きかけもあって民族主義者の多くはスペイン統治に反発を見せるようになった。民族主義者たちはこの頃から都市部だけでなく部族地域も含めたモロッコ保護領の多くの地ではっきりとモロッコ民族主義の旗を掲げるようになった。スペイン植民地当局は民族主義者の動向を監視し、民族主義の分裂を図る方策を採った。以上の研究は、スペイン陸軍資料館、スペイン総合公文書館、スペイン国立図書館旧アフリカ資料室の各所蔵資料の閲覧によって可能となった。当該年度の研究は、第1に、スペイン領モロッコ民族主義者たちのスペイン植民地当局への要求内容とこれらの要求に対する部族地域での「原住民」の反応を明らかにすること、第2に、モロッコ民族主義者たちは連合国・連合軍とどのような関係を持っていたか、他方で、ドイツが次第にヨーロッパで不利な状況となった19421943年以降に連合国・連合軍はフランコ政権に対してどのような姿勢で臨むようになったか、第3に、連合国・連合軍の北アフリカ政策に対するフランコ政権の反応、以上のことの解明を目的とした。当該年度の研究によって、以下のことが明らかとなった。1とくに1942年以降になると、スペイン領モロッコ民族主義者たちはいくつかの地域で集会を開き、スペイン植民地当局に対して自治要求を強めた。これらの民族主義者たちは部族地域にも出かけて行き「原住民」の支持を獲得しようとしたが、部族地域ではスペイン植民地当局の監視が厳しく、「原住民」の明確な支持は得られなかった。21943年頃まではモロッコ民族主義者たちと連合国・連合軍との関係は明確には見られない。1944年以降になると、双方の接触が確認される。この頃、連合国・連合軍ともフランコ政権のモロッコ統治に対して強い姿勢で臨んでいない。3フランコ政権は、1944年以降には、連合国・連合軍に対してとくにフランス領での「原住民」統治との差異(フランス領では民族主義者への抑圧政策、スペイン領では民族主義者への宥和政策)を強調し始めて、連合国の歓心を買おうとする。

以上の研究は、スペイン陸軍資料館、スペイン総合公文書館、スペイン国立図書館旧アフリカ資料室の各所蔵資料の閲覧によって可能となった。第2次世界大戦中のフランコ政権のアフリカ植民地政策の策定とその実際、これに対する「現地」の「原住民」の反応とくにスペイン領モロッコの民族主義者の要求、スペインによるタンジャ(タンジール)占領の意図と結果、モロッコの民族主義者と連合軍・連合国との接触、連合軍・連合国の北アフリカ政策に対するフランコ政権の反応、以上のことを解明した。総じて、スペイン西北アフリカ帝国(構想)は第2次世界大戦中のドイツによるヨーロッパとくにフランス占領によって可能となったこと、しかし、第2次世界大戦末期になるとその地域的・国際的条件は消え失せたことを明らかにした。「研究目的」で設定された3課題、つまり、1第2次世界大戦中のフランコ政権のアフリカ植民地政策、2とくにモロッコ保護領での「原住民」政策、3フランコ政権の「西北アフリカ帝国」構想について、とくに2についてスペイン陸軍資料館、スペイン総合公文書館、スペイン国立図書館旧アフリカ資料室の各所蔵資料の閲覧によって多くのことを明らかにできた。スペイン総合公文書館にはこの期のモロッコ民族主義者の動向についてスペイン植民地当局がいろいろな手段で集めた多くの報告が所蔵されており、これらの文書によって民族主義者の動きについて多くのことを知ることができた。民族主義者たちはこの頃からフランス領の民族主義者とも連絡をとるようになった。スペイン植民地当局は民族主義の分裂を図る方策を採った。人文学今後はとくに以下のことを重点的に研究する。1とくにモロッコ民族主義者たちの要求内容の検討、それに対する部族地域での「原住民」の反応、2モロッコ民族主義者たちは連合国・連合軍とどのような関係を持っていたか、ドイツが次第にヨーロッパで不利な状況となった19421943年以降に連合国・連合軍はフランコ政権に対してどのような姿勢で臨むようになったか、3連合国・連合軍の北アフリカ政策に対するフランコ政権の反応。以上のことを、スペイン総合公文書館とスペイン国立図書館旧アフリカ資料室の各所蔵資料を集中的に閲覧して明らかにする。「研究目的」で設定された3課題、つまり、1第2次世界大戦中のフランコ政権のアフリカ植民地政策、2その中でもとくにモロッコ保護領での「原住民」統治政策、3フランコ政権の「西北アフリカ帝国」構想について、スペイン陸軍文書、スペイン総理府(モロッコ保護領を管轄)文書それに外務省文書によってある程度まで明らかにできている。とくにスペイン国立図書館旧アフリカ資料室にはアフリカ派軍人が収集した非常に多くの冊子や文献、さらにスペインはもちろんヨーロッパと北アフリカで発行されていた新聞の切り抜きなどが所蔵されていることがわかった。また同資料室所蔵のアフリカ派軍人の策定になる政策文書も研究のために有益だった。マドリード市立新聞資料館にはスペインの北アフリカ領土(セウタ、メリーリャ)、タンジャ、スペイン領モロッコで発行されていた新聞が所蔵されており、これらによって保護領「現地」の様々な情報を得ることができた。
旧ユーゴスラヴィアのメディア、言語、アイデンティティー

本課題研究では、旧ユーゴ諸国、とりわけユーゴ戦争当事国であったクロアチア、セルビア、ボスニアにおけるメディア状況とそこに現れる言説を研究対象とした。そして、人々のアイデンティティーのあり方がどのように言語化され、また言語化されたものによって集団のイメージがどう形成されるかを、現地で発行されている新聞・雑誌に用いられる特定の語の分布分析や語連想による語の意味分析によって明らかにし、こうした言語分析の手法が社会心理学的問題を考察するためにも有効な方法であることを示した本研究は、旧ユ-ゴスラヴィアの構成国を地域的対象とし、これらの国々のメディアに見られる言説を分析することによって、旧ユ-ゴ崩壊から独立を経てこんにちに至る人々の意識の変化、アイデンティティ-形成のあり方を探ろうというものである。そこにおいては、具体的な事象、たとえばコソヴォをめぐるセルビアのメディア言説の分析などを行い、それを通して、これらの地域の人々の自己イメ-ジ、他者への態度の変化を追跡する。最終的な目的は、メディアが民族アイデンティティ-の形成に果たす役割、メディアと多民族・多言語共生の関係などを考察していくことである。そして、人々のアイデンティティーのあり方がどのように言語化され、また言語化されたものによって集団のイメージがどう形成されるかを、現地で発行されている新聞・雑誌に用いられる特定の語の分布分析や語連想による語の意味分析によって明らかにし、こうした言語分析の手法が社会心理学的問題を考察するためにも有効な方法であることを示した本研究は、旧ユーゴスラヴィアのスロヴェニアを除く独立国(クロアチア、ボスニア、セルビア、モンテネグロ)における現在のメディア状況と、そこに見られる言説の言語分析を通して、拡大EU加盟への道のりを模索する当該地域の人々のアイデンティティーを明らかにすることにある。この目的のために、平成18年度はまず、メディア・ディスコースの分析方法の検討を進め、それと平行して旧ユーゴ地域の新聞雑誌、またテレビ、インターネット上の報道などを収集しながら,当該地域の言説にどのような特徴が見られるかについて考察した。2006年には、ミロシェヴィッチ旧ユーゴスラヴィア(セルビア)大統領の急死、モンテネグロの独立、さらにはコソヴォの独立問題をめぐる議論など、重要な出来事があったため、これらの問題に関するセルビア、ボスニア、クロアチア、モンテネグロ各地における反応に注目した。具体的には、こうした出来事に関する記述を、旧ユーゴ各地の主要メディアから収集し、どのようなテーマの記事にどういった語彙が用いられているかを調査した。また、平成18年9月には、クロアチアならびにセルビアに赴き、現地の言語状況、メディア状況についての調査を行った。この一連の調査は、目下データをとりまとめて論文執筆に取りかかっている段階である。さらに、本課題研究を、言語とアイデンティティーというテーマでより発展的にとらえるために、上記の調査・研究と平行して、言葉の「自由連想」という角度からのアイデンティティーの模索という可能性についても検討した。この考察に関連して、平成18年度北海道大学スラブ研究センター冬期国際シンポジウムにおいて口頭発表を行った。平成19年度は、前年度の継続研究として、旧ユーゴスラヴィアの中のセルビア、クロアチアを中心にメディア状況を観察した。また同時に談話分析やテクスト分析の方法についても見当した。平成19年はセルビアのコソヴォ独立が重要な国際的問題となったことから、ここに注目しセルビアにおいてコソヴォに関してどのような言説が現れているか、またセルビア大統領選挙の前後における一般の人々の言語行動などを観察した。具体的には、セルビアの週刊誌Vremeからコソヴォ関連記事を集め、その主要テーマや語彙に注目して分析を行った。またセルビアを擁護するロシアの言説にも目を向け、ここでは、「間接的言語行為」としてのコソヴォ言及、すなわちコソヴォに言及する事でグルジアやチェチェンを牽制する大国の意向があることが明らかになった。セルビアの言説も同様に、「バルカンの安定」に言及することで、コソヴォ独立を拒否する、というレトリックを多用していることがわかった。またクロアチアやボスニアが自己をどのようにアイデンティファイしているかを調べるために、前年度の研究に引き続き、クロアチアとボスニアのメディアテクストからBalkanという語の用法を集め、セルビアのテクストと比較しながら分析を行った。またこれとは別に、オーストリアのブルゲンラント州にいるクロアチア系少数民族の言語調査を行ったが、これは祖国から切り離された民族集団がどのようにアイデンティティーを維持、あるいは喪失するかという問題であり、本研究とも密接な関わりを持つ研究テーマとして設定されることがわかった。平成19年度の成果は、平成20年1月に行われた北海道大学スラブ研究センター主催のシンポジウム「スラブ・ユーラシア学の幕開け」において、その一部を発表した。平成20年度は、前年度に引き続き、現在の旧ユーゴスラヴィアとくにコソヴォ独立を承認しないセルビアの状況に注目し、コソヴォ問題がどのようにメディアで伝えられているかについて観察した。またクロアチアとスロヴェニアの間に長年存在する国境問題が、スロヴェニアによるクロアチアの欧州連合加盟交渉ブロックという事態に至り、両国のメディアがこの問題を鋭く論じている事態にも注目した。これらについては、平成21年度の研究に引き継ぎ、現状をまとめる予定である。また平成20年度には、メディアが果たした歴史的役割に注目し、19世紀のクロアチア民族運動の推進力となったDanica Ilirska誌ならびに同時期に刊行されたKolo、Zora Dalmatinskaの比較に着手した。これについても、平成21年度に継続して研究する。

平成20年9月には、マケドニアのオフリドで開催された国際スラヴィスト会議に出席し、報告を行った。この国際会議出席のための旅費に本科研費を利用することができた。報告は南スラヴ語の文法に関するものであったが、会議会場でさまざまな国のスラヴ関係専門家と意見交換をすることができ、本課題研究の実施という観点からも有益であった。平成20年10月にはロシア東欧学会で、南モラヴィアに移住したクロアチア人の言語についての口頭報告を行った。この研究は本課題研究のテーマに直接関係するものではないが、言語とアイデンティティーの問題を多角的に考察するという意味で、本課題研究の考察にも連なるものと位置づけられる。平成21年度は本課題研究の最終年度として、次の2点を中心に研究を進めた。(1)過去三年間にわたって実施した調査、考察をまとめながら、さらに事例研究を行った。具体的には、2008年7月に旧ユーゴスラヴィア戦犯としてボスニアのセルビア人指導者ラドヴァン・カラジッチが逮捕されたことを受けてのセルビア、ボスニアにおけるメディアの反応、またそこに現われる当該社会の言説を考察し、かつてのミロシェヴィッチ裁判や彼の死をめぐる報道や、あるいはクロアチアのアンテ・ゴトヴィナの逮捕に関連する報道における言説と比較した。これらの考察は、今なおボスニア連邦とセルビア人住民の間で統合に困難を抱えているボスニアのさまざまな言説、情報発信の姿勢などとともにこれからも継続的に考察をしていく必要があると考えている。(2)本研究においては、メディアが担った歴史的役割にも注目する必要があると考えた。そこで、19世紀クロアチア民族主義興隆期にダルマチアで発行された雑誌『Zora Dalmatinska(ダルマチアの夜明け)』とその発行者であったアンテ・クズマニッチに注目し、雑誌の役割、そこで用いられている言語、またクズマニッチの言語観について考察した。クズマニッチは、同時代に首都ザグレブでリュデヴィト・ガイによって推進されていたイリリア運動に対立した偏狭な地域主義者であるという見方がしばしばなされてきたが、クズマニッチ自身の著述やその職業活動からそのような見方が正当ではないことが明らかとなった。この研究成果は平成22年度以降に論文としてまとめる予定である。
GAL4-UASを用いた時計遺伝子過剰発現システム

哺乳類の持つ体内時計においては、特定の遺伝子(時計遺伝子)が約24時問周期で自律的に発現の増減をくり返すことが、リズム発振の中心である。我々は、この時計遺伝子の振動の振幅を増大させ安定化させると考えられる新たな遺伝子群、DBP、HLF、TEF(以上PAR蛋自)及びE4BP4を見い出した。(Genes Dev.2001)体内時計の存在する脳の視交叉上核と呼ばれる部位では、E4BP4は夜間に多く発現し、昼間はPAR蛋白が多く発現していた。さらに興味深いことにE4BP4は時計遺伝子mPer1のプロモーターに結合し抑制するのに対しPAR蛋白は同じ場所に結合しmPer1の転写を活性化する。したがって、共通の結合配列に昼間は活性型、夜は抑制型の転写因子が結合するという極めて巧妙なメカニズムが存在し、時計遺伝子の振幅を大きくしていると考えられる。これらの転写因子の働きを生体内で実証するためGAL4-UASシステムを用いてE4BP4を視交叉上核に過剰発現させたトランスジェニックマウスの作成を行っている。GAL4を視交叉上核に発現させたトランスジェニックマウスは、既に複数ラインを樹立した。UASにE4BP4をつないだトランスジェニックマウスも、複数ライン樹立し、現在GAL4発現マウスと交配中である。今後これらのマウスを形態学的および行動学的に解析することで、E4BP4およびPAR蛋白の生体内での役割を解明する。
上皮細胞におけるアミノ酸・薬物のベクトル輸送形成機構の解析

上皮細胞の薬物およびアミノ酸の経細胞輸送を担う取り込み側・排泄側輸送体の多様性の解明と局在制御の機構を解析した。BCRPについてapical側への局在に必要な領域を明らかにした。腎臓(OAT1、OAT3)、脈絡叢(PEPT2、OAT3)における輸送体の寄与率を評価した。MRP3とBCRPの基質選択性を明らかにし、両者が小腸での薬物輸送に関与することが示唆された。極性細胞へ、取り込み(OATP2)、排出(MRP2)に関与する輸送体を共発現させ、肝胆系輸送における有機アニオンのベクトル輸送をin vitroで再構築した。P-gpについては、in vitroでの経細胞輸送評価が、消化管および血液脳関門におけるP-gpによる異物排泄の定量的な指標となった。同じくラット共遺伝子発現系(Oatp4/Mrp2)を用いて、in vivoでの胆汁排泄を予測できることを示した。胆汁酸の輸送に関わるNtcpとBsepの共遺伝子発現系を構築した。新規アミノ酸輸送体7種(Asc-2、AGT1、TAT1、LAT3、LAT4、CAT5、B^OAT1)を同定した。さらにBoAT1の遺伝子変異がHartnup病の原因であることを明らかにした。腎管腔側輸送体として、OATv1、URAT1、OAT7を同定し、特にURAT1の遺伝子変異が特発性腎性低尿酸血症の原因であることを明らかにした。rBATと4F2hcの膜貫通部位が、軽鎖とのパートナー認識に必要十分であることを示した。また、BAT1のC-末端細胞内領域("VVPP"配列)が膜移行に必須であることを明らかにした。酵母two-hybrid法による探索の結果、この配列に結合する蛋白として足場タンパク質RACK1を同定した。尿酸輸送体URAT1のPDZモチーフにPDZK1が結合することを明らかにし、腎刷子縁膜にPDZモチーフを介して輸送体が集積することが示唆された。肝実質細胞における有機化合物のベクトル輸送は、血管側膜上に発現される取り込み輸送担体、および胆管側膜上に発現される排出輸送担体により形成される。本研究では、これらの輸送担体をMDCK細胞に発現させ、ベクトル輸送が再現できるか否かについて検討を加えた。なお、特に有機アニオン系化合物の輸送に着目し、取り込み輸送担体としては、human organic anion transporting polypeptide2(OATP2)、排出輸送担体としてはhuman multidrug resistance associated protein2(MRP2)について検討した。HumanMRP2はretrovirusによりMDCK細胞に導入した。OATP2はゼオシン耐性で選択可能なプラスミドベクターによりMDCK細胞に導入した。その結果、OATP2はbasal側に、MRP2はapical側に発現されることが確認された。また、経細胞輸送について検討を加えたところ、OATP2およびMRP2の共基質となる、17bestradiol-17b-D-glucuronideやpravastatinのbasalからapicalへの経細胞輸送は、共発現細胞において顕著な方向性を示した。これらの結果は、本共発現系が肝細胞を介したベクトル輸送を解析する上で有用となることを示している。また、MRP2がapical側に局在する機構を解明するため、MRP2分子の細胞質ドメインに対してyeast two hybrid系を用いて新規細胞質蛋白を同定する試みを開始している。

上皮細胞における薬物のベクトル輸送について検討を加えるため、有機アニオン系化合物の肝取り込みに関与するOATP2、胆汁排泄に関与するMRP2を共発現する極性細胞(MDCK細胞)を介した化合物輸送について詳細な検討を加えた。生体内因性物質17beta estradiol-17beta-D-glucuronideや高脂血症治療薬プラバスタチンについて検討したところ、経細胞輸送の律速段階はOATP2による取り込みであることが明らかとなり、in vivoと対応したことから、本in vitro実験系がin vivoでの化合物輸送を予測する上で有用な系となることが示唆された。また、本年度はMRP2が上皮細胞頂側膜に局在する機構を明らかとするために、ヒトMRP2をプローブとして用い、yeast two hybrid法による探索を進め、候補となる蛋白を示唆しつつある。さらに、ヒト肝病態時においては、MRP2の膜局在を維持することができなくなり、細胞内へと内在化される可能性を示唆した。さらに吸収上皮におけるアミノ酸のベクトル輸送の分子機序を明らかにすることを目的として、未同定のアミノ酸トランスポーターのcDNAクローニング、及びヘテロダイマー型アミノ酸トランスポーターをモデル系とした、キメラ解析による蛋白質間相互作用と細胞膜へのsortingの機序の解析、その基盤となる会合蛋白分子のyeast two-hybrid法による探索を進行させている。平成13年度は、ヘテロ二量体型アミノ酸トランスポーターファミリーの既知のメンバーと有意の相同性を有しながら、既知の1回膜貫通型補助因子(rBAT及び4F2hc)とは連結しない新たな2種のトランスポーターを見い出した。これらとrBAT及び4F2hcとの融合タンパク質を作製することにより細胞膜へのsortingを可能とし、これらの輸送活性を実証した。すでに1回膜貫通型補助因子rBAT及び4F2hcのキメラ解析により限定したパートナー認識に関わる領域を、部位特異的変異導入により検討し、その妥当性を確認した。上皮細胞における薬物のベクトル輸送について、特に有機アニオン系化合物の胆汁排泄に焦点を当てた検討を進めた。極性細胞(MDCK細胞)にラット肝取り込みに関与するOatp4、ラット胆汁排泄に関与するMrp2を共発現させた。この細胞を介した一連の基質の経細胞輸送を定量化した。さらにラットを用いたin vivo実験を進め、定常状態における胆汁排泄クリアランスを求めた。速度論解析の結果、in vitro経細胞輸送実験の結果から、in vivoにおける胆汁排泄能力を定量的に予測しうることが示された。一方、吸収上皮におけるアミノ酸のベクトル輸送の分子機序を明らかにすることを目的として、未同定のアミノ酸トランスポーターのcDNAクローニング、及びヘテロダイマー型アミノ酸トランスポーターをモデル系とした、キメラ解析による蛋白質間相互作用と細胞膜へのsortingの機序の解析、その基盤となる会合蛋白分子のyeast two-hybrid法による探索を進行させている。
植物におけるDNA複製の分子機構

植物ではDNA複製が植物ホルモンによって支配されることが知られている。しかし、詳細な分子機構は不明である。本研究では、ジベレリン(【GA_3】)によって発現が制御される遺伝子のクローニングを当面の目標としている。矮性のエンドウマメの種子を吸水させ、3日間【GA_3】欠の状態で生長させてから2日間【GA_3】をあたえた。芽生えの子葉以外の部分からグアニジウム,チオシアネート法で全細胞RNAを抽出、mAP紙を用いてポリA(+)RNAを調製した。次に、逆転写酵素でcDNAを合成し、λgt11によってcDNAライブラリーを作成した。そのなかから【GA_3】によって発現された遺伝子のcDNAクローンを選択する作業を進めている。われわれは、ソラマメ種子の発芽胚で、核DNAの複製が不連続的様式に従うことを1975年に報告し、その後、ソラマメの岡崎断片の大きさが56Sで、さらに、89S,1011Sの中間体分子の存在も示している。この最初の単鎖DNAと中間体分子の普遍性を、ニンジンの根の培養組織を材料にして調査した。ニンジンの根組織片は、2,4-Dを含む培地に移すと同調的にDNA合成が開始されるが、その際、或種の高度反復配列DNAが他のDNA成分より早くから複製されることをわれわれは明らかにしている。(長谷達1979,加藤と谷藤1986)。今回の調査によると、ニンジンの岡崎断片は56Sで、さらに中間体分子としては、910S,1112S,20S,25Sの少くとも4種類の分子の存在することが明らかになった。そして、大部分のDNA成分は、時間経過とともに連結して長鎖のDNAに成長するが、ニンジンの早期複製型のDNAである反復配列のDNAは、この連結反応が2時間経過してもおこらぬことが証明された。これは、DNA複製の過程が、DNA分子種によって異なることを示した事例で重要な知見だと思われる。
ポリラジカルのスピン多重度制御とその機能に及ぼす元素相乗効果

電子スピンの向きは化学反応や物質の物性と構造を制御する極めて重要な因子である。したがってポリラジカル種のスピン整列に関する研究は極めて重要である。平成21年度は、以下の研究成果をあげた。1.ビラジカルの最安定スピン多重度に及ぼす窒素とケイ素の効果:高速コンピューターで長寿命一重項ビラジカルの分子設計をおこなった。一重項ビラジカルの寿命はその分子内環化反応の速度で決まるので、環化反応を抑制する手法を見出すことが一重項ビラジカルの長寿命化に直結する。分子内環化生成物よりもエネルギー的に安定な一重項ビラジカルの分子設計が可能であれば、極めて長寿命な一重項ビラジカルの発生が実現できる。そこで、一重項ビラジカルの熱力学的な安定化と同時に対応する分子内環化生成物の不安定化を達成するために、1,3-ビラジカルの骨格内にヘテロ原子、つまり窒素とケイ素原子を有するビラジカルに着目し、その最安定スピン多重度ならびにその環化体とのエネルギー差を見積盛った。その結果、1,2-ジアザ-4-シラシクロペンタン-3,5-ビラジカルの一重項が環化体よりも安定となる分子設計に成功した。2.一重項ビラジカルの実験化学的発生:窒素とケイ素原子を有するビラジカル誘導体の実験的発生は、対応するアゾ化合物の脱窒素反応を用いた。それらのアゾ化合物は、合成容易なピラゾール誘導体を用いた環化反応で合成した。その結果、これまで分子内反応の中間体としてのみ考えられてきたビラジカルの分子間反応に成功した。ポリラジカルのスピン多重度の制御とその機能に及ぼす元素相乗効果を解明するため,以下のとおり実施した。1.ポリラジカルとしてテトララジカルについて,そのスピン多重度の制御を検討した。テトララジカルには3つのスピン多重度,一重項(S),三重項(T),五重項(Q)があり,三重項には2種類のスピン配列(T-1, T-2)と一重項には3種類のスピン配列(S-1, S-2, S-3)パターンが存在可能である。そのため,それぞれのスピン配列はテトララジカル分子の構造と反応性に大きく影響を及ぼすと予想される。そこで, 2種の置換基を有するシクロペンタンから構成するテトララジカル分子に関して,量子化学計算を行い,最安定スピン配列における置換基の効果を調べた。2.理論的予測の実験的検証として,長寿命のテトララジカル分子の構築を検討した。これまでに見出した長寿命一重項ビラジカルに関する知見を適用し,分子設計および合成を行った。これまでに,シクロペンタン-1, 3-ビラジカルの最安定スピン多重度が2位の置換基により制御できることから,数種の置換基を有するテトララジカル前駆化合物の合成を行い,テトララジカルのスピン整列を試みた。現在,合成した化合物から生成したテトララジカルの最安定スピン配列と反応性に及ぼす置換基の効果について,量子化学計算と吸収スペクトルならびにESRを用いた分光学的手法を用いて調査している。
TCP/IPネットワークを用いたガスセンシング

本研究の目的は、QCM型センサを高感度化し、TCP/IPネットワークに接続することにより、実用に耐えうるガスセンサシステムを構築するとともに、実際に実環境において運用を行うことである。昨年度までに、QCM型ガスセンサの感応膜をナノメートルオーダーでコントロールすることにより、アンモニアガス・メチルメルカプタンガスに対する高感度ガスセンサを作製した。また、マイコン用Linuxを用いてこれをネットワーク化し、実際に老人ホームにおいて排泄物由来の悪臭を検知するシステムを構築・運用した。本年度は、QCM型ガスセンサのガス選択性を、分子インプリント法(MIP法)を用いて向上させるための各種検討を行った。MIPはクロスリンカー・ファンクショナルモノマー・検知ターゲット分子を含むポリマーを重合することにより作製され、その選択性の高さから注目されているが、現状では実用には至っていない。本研究においては現状の問題点(安定性・再現性)を解決するためにQCM-MIP間の結合を形成した。次に、MIPを粒子状でなくバルクの形状で得るために、MIPの重合を直接QCM基板上にて行った。これらの改良により、MIP-QCMが持つ問題を解決した。これらの改良を加えたMIP-QCMを用い、テルペン系化合物の識別を行ったところ、pinene・limonene・limonene oxideの3種の化合物を識別することに成功した。また、このセンサのガス検出限界は10ppm程度であり、従来のものより1桁高い感度を持つことが判明した。本研究の目的は、薄膜形状の多層化により、ガス感応膜の高感度化・高選択性化を図り、高性能ガス感応膜の統一的な設計方法・作製方法を確立すると共に、センサデバイスをTCP/IPネットワークを通じて連携させ、遠隔地におけるモニタリングシステム及びその長期保守方法を確立することである。その初年度である平成15年度は、ガス感応膜について、生活空間において問題となっているアンモニア(MH_3)ガス及びメチルメルカプタン(CH_3SH)ガスを対象とし、多孔質な物理的形状と高密度な反応サイトを共に有する感応膜を作製し、評価を行なった。多孔質薄膜作製技術であるLayer-by-Layer Self-Assembly Method(LbL-SA法)を用いることにより、薄膜の多孔性・ガス拡散性の制御を行った。その結果、これらのガスに対して人間の嗅覚閾値程度(1ppm以下)の感度を持つセンサ素子を作製することができた。特に、メチルメルカプタンガスに対しては100ppbという超低濃度のガスを検出することに成功した。また、ガスセンサのTCP/IPネットワーク化については、遠隔地モニタリングの基本的なプラットフォームを構築した。センサ出力の濃度への変換式の算出・実装、センサデバイスへのHTTPサーバ機能実装、JavaAppletによるデータベース構築を行い、汎用的なWebブラウザにより、特殊なソフトウェア無しで遠隔地のセンサ出力を参照するシステムを構築した。本研究により、ホームネットワーク・情報家電等への嗅覚センサ組み込みのためのシステムを構築することができた。目的IT技術とナノテクノロジーを用いた高感度ガスセンシング及びモニタリングシステムの開発を目的とする。薄膜技術においては、ガス感応膜を多孔化することにより1ppm以下のオーダーで悪臭ガスを検知する。また、システム面においては、センサ出力をTCP/IPネットワーク経由で出力し、遠隔地のガス発生をリアルタイムに検知することができるシステムを開発・運用する。成果1.センサの性能を向上させるため、センサ感応膜の形状を改良した。Al203を多孔化した薄膜上にセンサ感応膜を処理することにより、センサ感応膜の多孔化を行った。薄膜を多孔化することにより、センサ感度は向上した。これは、ガスと感応膜の接触面積が増え、感応膜がガスを吸着する量・速度が増加したためであると考えられる。2.センサのノイズ、或いは環境変化による干渉を抑えるため、センサ出力の補正関数を設定し、干渉軽減を行った。補正前は湿度変化によって出力が干渉を受けていたが、補正を行うことによって干渉を抑えることができた。補正前には800Hz程度のノイズがあったが、補正後にはその1/30程度の大きさにノイズが抑えられた。この手法は、他のセンサデバイスにも応用可能であると考えられる。3.システムの実環境への応用を目的とし、老人ホームにおいてシステム稼動試験を行った。病室にガスセンサを設置し、PCをナースステーションに置いてガス状況監視テストを行った。その結果、夜間にガス濃度の上昇が見られた。これは、夜間に介護者が居なくなり、その結果ガスが病室に充満してしまったためであると考えられる。

次に、MIPを粒子状でなくバルクの形状で得るために、MIPの重合を直接QCM基板上にて行った。これらの改良により、MIP-QCMが持つ問題を解決した。これらの改良を加えたMIP-QCMを用い、テルペン系化合物の識別を行ったところ、pinene・limonene・limonene oxideの3種の化合物を識別することに成功した。また、このセンサのガス検出限界は10ppm程度であり、従来のものより1桁高い感度を持つことが判明した。
肝障害特異的に活性化されるプロテアーゼPHBPのトランスジェニックマウスの作成

1)トランスジーンの構築マウスPHBPcDNAのコーディング領域1.6kbpを含むEcoR Iで切り出された部分をcytomegalovirus enhancer、chiken β-actin promoter、rabbit β-globin 3-flanking sequenceをもつpCAGGSベクターに挿入しセンス方向のクローンを作製し、これをpCAPHGSとした。PHBPの発現が上記で作製したトランスジーンから可能であるかを確認するため、構築したトランスジーンをCOS-7細胞、CHO細胞にLIPOFECTAMINE2000(Invitrogen社)を用いてトランスフェクションし、48時間後に回収した細胞を用いてウエスタンブロット法によりPHBP発現を解析した。その結果、両細胞でPHBPの発現を確認することができた。3)トランスジェニックマウスの作成と解析構築したpCAPHGSをC57BL/6マウス受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、それらを仮親マウスの卵管内に移植して出産させた。マウスの尾からゲノムDNAを抽出しPCRによってトランスジーンが導入されているかどうか確認した。その結果、1系統のトランスジェニックマウスを得た。そのマウスをF0とし、F0から生まれたマウスをF1とした。F1に関してWtのマウスと比較したところ、外見上の変化、異常行動はなく、体重の増減も見られなかった。導入した遺伝子を持つマウスに関して雄・雌の偏りは見られなかった。妊娠・出産に関しては、妊娠はするが出産する数がWtと比較して少ない傾向が見られた。トランスジェニックマウス同士を交配させたが生後12日で死亡した。しかし、出産した回数が一回なので今後の更なる検討が必要である。今後、ホモ体のトランスジェニックマウスを作成すると共に、トランスジェニックマウスの発生過程における造血系、肝形成の異常の有無を病理解剖学的に調べたり、肝部分切除後の肝再生における肝再生時間の変化等を測定する事により、PHBPの生体内での役割が詳細に明らかになることを期待している。1)トランスジェニックマウス作製用トランスジーンの構築マウスPHBPcDNAのコーディング領域をサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ-アクチンプロモーターを持つpCAGGSベクターにサブクローニングし、挿入されている方向を制限酵素消化により確認しPHBPmRNAが転写される方向に挿入されたものと、逆にPHBPmRNAと二本鎖を形成し、その翻訳を抑制するアンチセンスRNAが転写される方向に挿入されたものの二種類のトランスジーンを調製した。また、上記と同様の操作によりpCALNL5というCre-loxPシステムにより発現をコントロールできるベクターに組み込んだ発現ベクターも作成した。2)作成したトランスジーンの機能測定作成したトランスジーンが正常に機能するかを調べるために、トランスジーンをCHO細胞にトランスフェクションし、リコンビナント・マウスPHBPが合成され培地に分泌されているかをウエスタンブロット法により調べたところ、期待通りリコンビナント・マウスPHBPの合成が確認できた。3)トランスジェニックマウスの作成現在、マウス受精卵に作製したトランスジーンをマイクロインジェクション法により注入し、それらを仮親マウスの卵管内に移植して出産させる操作を行っているところである。今後は、生まれたマウスの尾からDNAを調整し、PCR及びサザンブロット解析によりトランスジーンが導入されているマウスを選択し、これらのマウスをメーティングする事により完全なトランスジェニックマウス系列を確立し、センス方向に導入されたものと、アンチセンス方向に導入されたものをそれぞれ三系列ずつ作製する予定である。1)トランスジーンの構築

マウスPHBPcDNAのコーディング領域1.6kbpを含むEcoR Iで切り出された部分をcytomegalovirus enhancer, chikenβ-actin promoter, rabbit β-globin 3-flanking sequenceをもつpCAGGSベクターに挿入しセンス方向のクローンを作製し、これをpCAPHGSとした。PHBPの発現が上記で作製したトランスジーンから可能であるかを確認するため、構築したトランスジーンをCOS-7細胞、CHO細胞にLIPOFECTAMINE2000(Invitrogen社)を用いてトランスフェクションし、48時間後に回収した細胞を用いてウエスタンブロット法によりPHBP発現を解析した。その結果、両細胞でPHBPの発現を確認することができた。3)トランスジェニックマウスの作成と解析構築したpCAPHGSをC57BL/6マウス受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、それらを仮親マウスの卵管内に移植して出産させた。マウスの尾からゲノムDNAを抽出しPCRによってトランスジーンが導入されているかどうか確認した。その結果、1系統のトランスジェニックマウスを得た。そのマウスをF0とし、F0から生まれたマウスをF1とした。F1に関してWtのマウスと比較したところ、外見上の変化、異常行動はなく、体重の増減も見られなかった。導入した遺伝子を持つマウスに関して雄・雌の偏りは見られなかった。妊娠・出産に関しては、妊娠はするが出産する数がWtと比較して少ない傾向が見られた。トランスジェニックマウス同士を交配させたが生後12日で死亡した。しかし、出産した回数が一回なので今後の更なる検討が必要である。今後、ホモ体のトランスジェニックマウスを作成すると共に、トランスジェニックマウスの発生過程における造血系、肝形成の異常の有無を病理解剖学的に調べたり、肝部分切除の肝再生における肝再生時間の変化等を測定することにより、PHBPの生体内での役割が詳細に明らかになることを期待している。
滑膜肉腫におけるHGFの局在及び機能に関する病理組織学的研究

滑膜肉腫の培養細胞株を用いたHGFならびにc-Metの発現を検討した結果、二相性滑膜肉腫の培養細胞株(SW982)、および単相性滑膜肉腫の培養細胞株(HS-SY-II)の両者ともNorthern blot法にてHGFのmRNAは検出されなかった。したがって、これら細胞培養株ではHGF産生能はないか、あったとしてもきわめて低いことが示唆された。一方、SW982、HS-SY-IIの両者でc-Metの発現がWestern blot法にて確認された。しかし、その発現はSW982において強く認められたものの、HS-SY-IIではSW982に比べ弱かった。さらに、HGFを添加した場合、SW982に発現しているc-Metにチロシンリン酸化が起こるか否か検討した結果、c-Metのチロシンリン酸化が確認された。したがって、これら細胞培養株でのc-Met発現量には差があると考えられ、また、発現しているc-Metは機能的にHGFへの反応性を有していると考えられた。リコンビナントHGFを添加し、SW982の培養細胞に形態変化が生じるか否か検討した。その結果、SW982に明かな上皮化を思わせる形態変化は観察されなかった。通常の2次元培養下ではこの変化をとらえることは困難で、今後のさらなる検討が必要と考えられた。二相性および単相性滑膜肉腫の凍結新鮮材料を用い、Eカドヘリン、Nカドヘリンの発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、二相性滑膜肉腫では上皮成分にのみEカドヘリン、Nカドヘリンの発現が認められた。単相性滑膜肉腫では上皮様胞巣部のみにEカドヘリンの発現が認められた。今後、細胞接着分子の観点からも滑膜肉腫における上皮化という現象を検討する必要があると考えられた。
電荷輸送特性におよぼす電荷移動度測定法・化合物の凝集状態・有機薄膜作製法の影響

本研究は、移動度測定法・化合物の凝集状態・有機薄膜作製法が電荷輸送特性におよぼす影響について検討し、有機固体における電荷輸送現象を理解するとともに、それを基礎として、有機薄膜を用いる電子デバイスの動作特性の理解と特性向上のための指針を得ることを目的としている。本年度は、前年度に引き続き、有機半導体の電荷移動度(μ)を飛行時間測定法(TOF法)および電界効果トランジスタ法(FET法)を用いて決定し、それらの値を比較・検討することにより、電荷移動度測定法が電荷輸送特性におよぼす影響を分子構造と相関させて詳細に検討した。また、化合物の凝集状態・有機薄膜作製法が電荷輸送特性におよぼす影響について検討した。研究代表者らが設計・合成した7種の化合物のガラス状態におけるμ_<FET>とμ_<TOF>を測定した。μ_<FET>とμ_<TOF>の関係は分子構造に大きく依存し、μ_<FET>とμ_<TOF>がほぼ等しい分子と、μ_<FET>がμ_<TOF>に比べて小さい分子が存在すること、ならびに、その差は大きいもので三桁程度であることを明らかにした。蒸着法ならびにスピンコート法により作製したアモルファス薄膜におけるμ_<FET>を測定し、蒸着膜におけるμ_<FET>がスピンコート膜に比べて大きいことを明らかにし、有機薄膜作製法が電荷輸送特性に影響をおよぼすことを示す結果を得た。さらに、アモルファス膜ならびにアモルファス膜の加熱処理により得られる結晶膜の移動度をTOF法を用いて決定し、結晶膜の移動度がアモルファス膜の移動度に比べて一桁程度大きいことを明らかにした。本年度は、有機半導体の電荷移動度(μ)を飛行時間測定法(TOF法)および電界効果トランジスタ法(FET法)を用いて決定し、それらの値を比較・検討することにより、電荷移動度の測定法が電荷輸送特性におよぼす影響について明らかにすることを目的として研究を行った。研究代表者らが設計・合成したtris[3-methylphenyl(phenyl)amino]triphenylamine (m-MTDATA)およびtris[4-(5-phenylthiophen-2-yl)phenyl]amine (TPTPA)のガラス状態におけるホール移動度をTOF法ならびにFET法により決定した。その結果、m-MTDAIAのμ_<FET>(1.0×10^<-5>cm^2V^<-1>s^<-1>)は、μ_<TOF>(2.7×10^<-5>cm^2V^<-1>s^<-1>)とほぼ等しいのに対して、TPTPAのμ_<FET>(2.4×10^<-4cm^2V^<-1>s^<-1>)は、μ_<TOF>(1.0×10^<-2>cm^2V^<-1>s^<-1>)に比べて二桁程度小さいことを見いだし、μ_<FET>とμ_<TOF>がほぼ等しい分子と、μ_<FET>がμ_<TOF>に比べて小さい分子が存在することを明らかにした。
「原価の流れ図」を活用した新しい教科指導法の研究・開発

原価計算は,原価要素の取得または確保から始まって,これらの消費額を原価計算対象に積み上げていく計算過程を明らかにすることである。本研究は,その計算過程を一種の「流れ」として捉え,「流れ図」を使用して指導する方法を研究・開発したものである。この指導法は,原価の集計プロセスをモデル化し,視覚化して教えることにその特長がある。この指導法によれば,生徒は,原価の集計過程を直感的,視覚的に理解することができるので,より深く集計過程を理解することができる。このアイディアは,早稲田大学大学院会計研究科教授小林啓孝先生が考案された「インプット→アウトプット流れ図」をベースとしたものである。「インプット→アウトプット流れ図」は,発生原価配分の論理を図解したもので,これにもとづいて学習することによって,生徒は,どういう流れの仮定にもとづいて原価が配分され,どの原価配分の公式を適用あるいは併用できるのかを,視覚的,論理的に理解できるようになる。『原価計算の基礎知識(原価計算編)』は,この「インプット→アウトプット流れ図」を,さらに応用・発展させた「原価の流れ図」を中核とした指導法を著したものである。また,本書には,原価計算の学習に活用できるe-ラーニング教材もセットされている。