hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病における血小板凝集能亢進と糖尿病性合併症進展との関連 -分子生物学的検討-

1.2型糖尿病患者血小板のPKC isoformの活性をウエスタンブロット法で測定し、健常者の免疫活性と比較検討した。糖尿病合併症、特に網膜症を有する患者血小板のPKCβ免疫活性は有意に高く、また、糖尿病性腎症を有する患者は逆に低下したが、糖尿病で顕性腎症のない患者血小板PKCβ免疫活性は明らかに、健常人に比して高かった。一方、PI 3-kinase,MAP kinaseの免疫活性を2型糖尿病患者血小板で検討した。MAP kinase燐酸化抗体による血小板の免疫活性は網膜症を有する患者で高い傾向がみられた。更に症例を増加させて、検討する必要がある。2.血小板からのセロトニン放出反応に関しては、糖尿病に高血圧を合併する例、合併しない例、非糖尿病で高血圧を有する例、健常人で比較検討した。糖尿病で高血圧を合併する例のみが、明らかにトロンビン刺激による[14C]5-hydroxytryptophanの放出が亢進しており、血小板からのセロトニンの放出が糖尿病に合併する高血圧の発症に関与する可能性が考えられた。3.肥満に関与する食行動調節ホルモン、レプチンはin vitroで血小板凝集を亢進させることを我々確認し、その上で、各種血小板受容体アゴニストであるコラーゲン、ADP,トロンビン刺激による凝集能と血中レプチンとの関連を検討した。ADP刺激による血小板凝集能は高レプチン群で高値を示した。以上より、糖尿病合併症の進展には血小板凝集能亢進が明らかに関与し、さらにこれに肥満が加わり、血中レプチン高値が相乗的に作用すると、セロトニン放出の亢進による高血圧が更に、加味され、microangiopathy,macroangiopathyへの進展が更に促進される。糖尿病性合併症を有する糖尿病患者血小板を単離し、血小板をホモジネート後に細胞質、膜、細胞骨格画分に分離後、血小板に豊富に存在するPKCα,β,δ,ζの各分子種の免疫活性をウエスタンブロット法で検討し、正常対照と比較した。従来、PKCは高血糖により、活性化され、これが血小板凝集亢進に働くことが糖尿病性合併症の発症と関連があることが推察されていた。この検討により、糖尿病性合併症の内、神経症、網膜症を有する患者では、PKCα,β,δ,ζ共に細胞質、膜画分で免疫活性が増加していた。一方、腎症では、顕性腎症のない症例ではPKCα,β,δ,ζは増加していたが、顕性腎症のある例ではPKCβのみはむしろ血清クレアチンと共に低下した。以上より、糖尿病性合併症の進展とPKC分子種の異常との関係を更に検討する必要があると考えられた。一方、血糖のコントロールは良好であるが、血小板の凝集が強く糖尿病合併症の強い症例での、低分子量G蛋白であるrhoAの活性亢進もその下流のphosphatidylinositol 3-kinaseの活性化を介して、二次凝集を促進すると考えられている。これら糖尿病患者血小板での、rhoAの免疫活性や、【α-^<32>P】GTP結合活性を検討すると上昇していることが家族的に証明され、FfamilialなrhoA活性の増加はなんらかの遺伝子異常によることが推察され、さらなる分子生物学的検討が必要と考えられた。そこで、ヒト血小板にジーンパルサーを使用して、GTPγS,やrhoA、PKC分子種を細胞内に導入し、その凝集への影響を検討した。糖尿病患者血小板は正常者に比較して、更に凝集の亢進をみた。

以上より、糖尿病性合併症の進展予防にこれらの分子生物学的検討が必要であることが示唆される。糖尿病合併症の進展と血小板凝集の亢進は関連があると考えられている。我々は、thiazolidinedionesのうちtroglitazoneはvitaminEと同様に血小板凝集抑制作用やPKC抑制作用を有していることをin vitroで明らかにした(Diabetes 47,1494-1500,1998)。これによりtroglitazoneはインスリン感受性を改善するばかりではなく、糖尿病性合併症の進展を防ぐ可能性も示された。最近、高血糖で活性化されるPKCβが糖尿病合併症の進展に関与することが腎、眼などで示されている。我々も、糖尿病患者血小板を単離し、血小板の細胞質、膜、細胞骨格の各分画のPKCisoformの免疫活性を検討し、明らかに細胞質画分でPKCα,βの免疫活性が増加していることを見いだした。それ故、血小板凝集を抑制し、conventional PKCを抑制するPKC阻害剤の開発は糖尿病合併症の治療としても有効であろう。従来より、開発されている各種PKC阻害剤、H7、sphingosine,GO6976,RO31-8220,RO32-0432,LY379196のトロンビン、ADP,collagenによるヒト血小板凝集に対する効果をアグリゴメー夕を使用して検討し、糖尿病合併症治療に対する有効性をin vitroのデーターより推察することが必要である。2型糖尿病患者血小板のPKCisoformの活性をウエスタンブロット法で測定し、健常者の免疫活性と比較検討した。糖尿病合併症特に網膜症を有する患者血小板のPKCβ免疫活性は有意に高く、また、糖尿病性腎症を有する患者は逆に低下したが、糖尿病で顕性腎症のない患者血小板PKCβ免疫活性は明らかに、健常人に比して高かった。現在、PI3-kinase,MAP kinaseの免疫活性を2型糖尿病患者血小板で検討中である。一方、血小板からのセロトニン放出反応に関しては、糖尿病に高血圧を合併する例、合併しない例、非糖尿病で高血圧を有する例、健常人で比較検討した。糖尿病で高血圧を合併する例のみが、明らかにトロンビン刺激による[14C]5-hydroxytryptophanの放出が亢進しており、血小板からのセロトニンの放出が糖尿病に合併する高血圧の発症に関与する可能性が考えられた。2型糖尿病患者血小板のPKC isoformの活性をウエスタンブロット法で測定し、健常者の免疫活性と比較検討した。糖尿病合併症、特に網膜症を有する患者血小板のPKCβ免疫活性は有意に高く、また、糖尿病性腎症を有する患者は逆に低下したが、糖尿病で顕性腎症のない患者血小板PKCβ免疫活性は明らかに、健常人に比して高かった。一方、PI3-kinase,MAP kinaseの免疫活性を2型糖尿病患者血小板で検討した。MAP kinase燐酸化抗体による血小板の免疫活性は網膜症を有する患者で高い傾向がみられた。更に症例を増加させて、検討する必要がある。血小板からのセロトニン放出反応に関しては、糖尿病に高血圧を合併する例、合併しない例、非糖尿病で高血圧を有する例、健常人で比較検討した。糖尿病で高血圧を合併する例のみが、明らかにトロンビン刺激による[^<14>C]5-hydroxytryptophanの放出が亢進しており、血小板からのセロトニンの放出が糖尿病に合併する高血圧の発症に関与する可能性が考えられた。
一次元およびナノ構造系における励起子協力現象の光制御

本年度は、シリコン高分子における一次元励起子の閉じこめ効果を調べるために、主鎖長を制御したシリコンオリゴマーを作製し、その光学特性を測定した。アルカリ元素によるハロゲン化シランの縮合重合反応によってシリコン原子をつないでいき、主鎖長が厳密に制御されたシリコンオリゴマーSi_n(CH_3)_<2n+n>(n=2,3,4,5,6,7,8,10,16)を作製した。主鎖長を短くするのに伴い、吸収ピークは高エネルギー側にシフトし、その幅は狭くなった。この主吸収ピークのシフトは一次元方向について励起子が閉じこめられた効果であると考えられる。また主査が短いほど幅が広くなる現象は、励起子の重心運動による先鋭化が起こりにくくなり電子格子相互作用を受けやすくなった結果として理解することができる。さらに、主ピークの約1eV高エネルギー側にはポリシランにおいては見られない小さなピークが観測された。これは、主鎖が無限大と見なせるポリシランにおいて最低励起子に集中していた振動子強度が高エネルギー側の励起準位にも分配されるようになったと考えられる。また励起子の閉じこめにともなう非線形光学効果の変化を考える上で重要になってくる励起準位構造を調べるためにn=8,10,16の薄膜試料について電場変調吸収法による三次非線形感受率スペクトルの測定を行った。その結果、励起子準位構造がポリシランの場合とほとんど変化はなく、励起状態間の振動子強度は減少することがわかった。
高度環境調和型ディスプレイインタフェース構築のための視覚特性の理解とその応用

近年、表示機器の利用環境が多様化し、視覚特性を新視点で研究する必要が生じた。心理物理実験の結果、(1) HDR(ハイダイナミックレンジ)環境では弁別力が低下すること発見し、従来困難とされていた全体処理のみを用いてHDR画像からSDR(標準)画像への変換方法を開発した、(2)色対比の評価において2色覚と3色覚の構造が連続的に変化することを発見した、(3a)曲面ディスプレイ利用時に個人差が大きい「曲面残効」と名付けた新たな錯視を発見した、(3b)視覚と平衡感覚の統合能力が優れた人ほど本残効が起きやすい、(3c)新しい視覚インタフェースの利用には慎重な検討が必要である、こと等の知見を得た。近年の大型テレビ受像機の急速な普及と2020年開催の東京オリンピックに向けた次世代ハイビジョンシステム(4K/8K)の開発加速、スマートフォン・タブレット端末の急速な普及、また、TVゲーム機器の立体表示(3D)化など、我々を取り巻く視環境は急速に変貌している。しかし、技術進歩を一歩誤れば、人間の視覚系に過度の負荷や適応不全を与える事態も予想される。そこで、このような事態を未然に防止し、より多くの人が安全で快適な視環境を入手できるように、本課題においては、特徴的な視環境の変化に対応し、(1)大型・高精細表示環境、(2)立体表示環境、(3) 2色覚者に配慮したユニバーサルカラー表示環境、における人間の視覚認知特性を理解し、併せて新しい表示機器の開発に資することを研究の目的としている。初年度である2015年度は、「(1)大型・高精細表示環境における人間の視覚認知特性の解明」に注力した。前年度に発見した「曲面ディスプレイの残効効果(新しい錯視)」や「ディスプレイの大型化に伴うニュース番組の構図の変化の調査」等についてディスプレイ分野で最も有名な国際会議「SID Display Week 2015」で発表を行うと同時に、前者については個人差の原因について継続的に研究を行った。その結果、個人差は複数感覚による外界情報の統合特性に影響されることを発見し、2016年の「SID Display Week」で発表予定である。その他の項目、すなわち、立体視機能の個人差、色覚の基礎特性、等については研究を継続している。初年度の進捗状況としては、研究実績の概要にも記載した通り、「曲面ディスプレイの残効効果(新しい錯視)」の個人差の原因解明に向けて精力的に実験を行った。その他ディスプレイ関連については、ハイダイナミックレンジ(HDR)環境における人間の知覚特性の解明に向けて基礎的な実験環境の構築を行った。この項目については、今後、順次実験を行ってデータを取得する予定である。立体視環境については、斜視の被験者における立体知覚特性の把握をおこなうための実験を行った。(未発表のため詳細の記述を控えるが)従来の知見を大きく覆す発見が得られたので、今後成果をまとめて発表予定である。2色覚者に配慮したユニバーサルカラー表示環境については、上記を優先したため若干の遅れがあるが、本年(2016年)より、「複数色間の親和性」について通常色覚者と2色覚者との差異を検討する予定である。2015年度はその準備調査を行った。その他の視知覚特性についても錯視研究をベースに検討を行っており、成果がまとまったものから順次発表予定である。近年の大型テレビ受像機の急速な普及と2020年開催の東京オリンピックに向けた次世代ハイビジョンシステム(4K/8K)の開発加速、スマートフォン・タブレット端末の急速な普及など、我々を取り巻く視環境は急速に変貌している。そこで、このような事態を未然に防止し、より多くの人が安全で快適な視環境を入手できるように、人間の視覚認知特性を理解し、併せて新しい表示機器の開発に資することを研究の目的としている。2年目の本年度は、複数の項目について研究を進展させた。まず、上記の結果を2016年5月に開催された国際会議「SID Display Week」で発表すると同時に、2016年12月には国際会議「IDW/AD 2016」で招待講演を行った。そのほかの項目についても研究を継続し、最近話題のHDR画像をSDR画像に容易かつ高速に変換するための新しい心理物理的知見を発見した。この成果は、2017年5月開催の「SID Display Week」に「Rate News Paper(採録率は例年20%-30%程度)」として採録された。さらに「スマートフォン等の急速な普及が引き金となって我々を取り巻く視環境は急速に変貌し、その結果として現実に人々の認知能力に問題が発生している証左をつかむこと」にも注力した。この報告書を記入する時点では、アメリカやフランスの大統領選挙等を通じて一般に広く認知されつつある「偽情報(Fake News)」の問題にも関連して、「ノートをきちんととること」と「長期的なふり返りを行うこと」の2点が従来にも増して重要であることを明らかにした。その結果をもとに、新しい携帯端末のコンセプトを同様に「SID Display Week」で発表予定である(こちらは、通常のオーラルで採録)。初年度(2015年度)の進捗状況としては、研究実績の概要にも記載した通り、「曲面ディスプレイの残効効果(新しい錯視)」の個人差の原因解明に向けて精力的に実験を行った。

その他ディスプレイ関連については、HDR環境における人間の知覚特性の解明に向けて基礎的な実験環境の構築を行った。また、立体視環境については、斜視の被験者における立体知覚特性の把握をおこなうための実験を行った。(未発表のため詳細の記述を控えるが)従来の知見を大きく覆す発見が得られた。他の項目の発表を優先させたため、今後成果をまとめて発表予定である。2年目(2016年度)の進捗状況にしては、まず、初年度に計画していたが、他項目を優先したため若干の遅れが出ていた「複数色間の親和性」について通常色覚者と2色覚者との差異の検討を開始した。その結果、一般的に色弱者として一つの範疇で考えられることが多い、「2色覚」と「異常3色覚」の知覚メカニズムに大きな差異がある可能性を示唆する実験データを得た。これについては、最終年度さらに実験的検証を行う予定である。つぎに、上述の「HDR環境における人間の知覚特性の解明」については、予定通りに心理物理実験を行うことができ、その結果を研究実績の概要で述べた通り、2017年5月の国際会議(SID Display Week)で発表予定である。さらに、「スマートフォン・タブレット端末の急速な普及が引き金となって我々を取り巻く視環境は急速に変貌し、その結果として現実に人々の認知能力に問題が発生している証左をつかむこと」についても、詳細には大規模な検証が必要であるが、一定の知見を得ることが出来た。この結果についても同じ国際会議で発表予定である。なお、上述の2件の国際会議発表案件については、特許出願も行った(2件は2016年度中、1件は2017年度になってから)。近年の大型テレビ受像機の急速な普及と2020年開催の東京オリンピックに向けた次世代ハイビジョンシステム(4K/8K)の開発加速、スマートフォン・タブレット端末の急速な普及、また、TVゲーム機器の立体表示(3D)化など、我々を取り巻く視環境は急速に変貌している。しかし、技術進歩を一歩誤れば、人間の視覚系に過度の負荷や適応不全を与える事態も予想される。そこで、このような事態を未然に防止し、より多くの人が安全で快適な視環境を入手できるように、本課題においては、特徴的な視環境の変化に対応し、(1)大型・高精細表示環境、(2)立体表示環境、(3) 2色覚者に配慮したユニバーサルカラー表示環境、における人間の視覚認知特性を理解し、併せて新しい表示機器の開発に資することを研究の目的としている。さらに2年目に新たに取り組んだ課題として、「スマートフォン・タブレット端末の急速な普及が引き金となって我々を取り巻く視環境は急速に変貌し、その結果として現実に人々の認知能力に問題が発生している証左をつかむこと」にも注力した。最終年度である本年度は、上記の結果をまとめて対外発表を行った。まず、2017年5月開催の「SID DW 2017」では、(1)ハイダイナミックレンジ(HDR)画像を通常の環境用のスタンダードダイナミックレンジ(SDR)画像に高速かつ容易に変換するための新しい心理物理的知見の発見、(2) ICTを活用することで若者の認知特性に変化が生じている実態とそれに対応した最近の新しい携帯端末コンセプトの提案、の2件を発表した。また、2017年12月開催の「IDW 2017」では、2色覚と3色覚の連続性に関する新たな知見について発表した。その他、関連する複数回の招待講演を行ない、知見の普及に努めた。
同種アポトーシス細胞貪食によって誘導される口腔扁平上皮癌の細胞活性化機序

病理組織標本でがん細胞による同種アポトーシス細胞貪食がしばしば見出されるが、本現象の生物学的意義は不明である。そこで「がん細胞は同種のアポトーシス細胞を貪食することで、自身の細胞機能を活性化する」という仮説を立て、検証した。アポトーシスを誘導した培養細胞を同種生活細胞と共培養すると、多くの生活細胞がアポトーシス細胞を細胞質内に取り込んだ。アポトーシス細胞は貪食細胞のファゴソームに局在しており、貪食はRac1阻害剤により抑制された。さらに、がん細胞の遊走浸潤能はアポトーシス細胞貪食後に亢進した。これより、同種アポトーシス細胞貪食によるがん細胞機能活性化が示され、新規治療標的として期待される。本年度は以下の実験を行った。1. pHrodoを用いた同種アポトーシス細胞貪食の観察と定量化:実験には口腔扁平上皮癌由来培養細胞Ca9-22・SASを用いた。UV照射によりアポトーシスを誘導した細胞を、酸性環境下特異的に明るい蛍光を発する蛍光色素pHrodoで標識し、生活がん細胞とともに共培養した。その結果、生活がん細胞の細胞質内に取り込まれた死細胞に一致して、強い蛍光が認められ、死細胞はファゴゾーム内の酸性状況にあることが示された。また、洗浄後に回収した細胞をフローサイトメーターで解析したところ、Ca9-22では90%以上、SASでは50%程度のがん細胞が死細胞を貪食していることがわかった。2.超微細構造観察:アポトーシス細胞と共培養した生活がん細胞を、透過電子顕微鏡にて観察すると、死細胞は生活がん細胞のファゴゾーム内に取り込まれており、その周囲からライソゾームの融合が認められた。3.同種死細胞貪食現象に関わる分子機構:マクロファージなどの貪食専門細胞では、アポトーシス細胞処理に低分子GTPアーゼRac-1が重要な役割を果たしている。がん細胞もマクロファージ同様の機序を利用している可能性があったので、貪食実験系にRac-1阻害剤を添加し貪食細胞率を解析したところ、死細胞貪食が有意に抑制された。したがって、貪食専門細胞と共通の分子機構が存在することが示唆された。4.同種死細胞貪食によるがん細胞の変化:アポトーシス細胞を貪食した後のがん細胞の機能変化を調べるために、遊走浸潤試験を行った。単独培養のがん細胞、アポトーシス細胞あるいはネクローシス細胞と共培養したがん細胞を比較すると、アポトーシス細胞と共培養したがん細胞でのみ遊走浸潤能が亢進し、この機能亢進はRac-1阻害剤添加によって解除された。以上より、同種アポトーシス細胞貪食ががん細胞機能を活性化する可能性が示された。当初の研究計画どおり、着実に結果が得られている。本年度の成果として、アポトーシス細胞貪食ががん細胞機能を亢進することを示すことができた。すなわち、仮説の根幹部分の証明がなされ、研究計画が妥当であったと評価している。1.同種アポトーシス細胞貪食後の遺伝子発現プロファイル解析:これまでの検討から、同種アポトーシス細胞を貪食したがん細胞の遊走・浸潤能の亢進が示されたので、アポトーシス細胞を貪食したがん細胞で生じる遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイ法にて解析した。本解析には、アポトーシス細胞貪食能が高いCa9-22細胞を用いた。単独培養系、アポトーシス細胞との共培養系、ネクローシス細胞との共培養系の3群において、発現変動量が大きい上位1000遺伝子を抽出し、クラスタリング解析を行った。その結果、3群の中でアポトーシス細胞との共培養系は他の2群とは異なる発現プロファイルを示した。次にアポトーシス細胞との共培養系のみで発現が上昇した509遺伝子を対象にGO解析を行ったところ、phagocytosisやphagosome assemblyに加えて、cell adhesionやcell migration等のGOが抽出され、これらにはCCL5, HCK等の遺伝子が含まれていた。以上より、同種アポトーシス細胞貪食による遊走・浸潤能亢進に関わる候補分子が示された。2.同種アポトーシス細胞貪食におけるRAC1活性化の検討:同種アポトーシス細胞貪食は選択的RAC1阻害剤NSC23766の添加により有意に抑制されたことから、アポトーシス細胞と共培養した際のRAC1活性化レベルをプルダウンアッセイにて検討した。アポトーシス細胞の添加から10分48時間の時系列で検索したものの、単独培養系との明らかな差は認められなかった。既報によるとRAC1活性化の持続時間は極めて短く、また、本実験系ではアポトーシス貪食が必ずしも一斉に起こっていないため、プルダウンアッセイでは有意な差を検出できなかった可能性が考えられた。本年度の研究成果から、同種アポトーシス細胞貪食によってもたらされる遊走・浸潤能亢進に関与する候補分子が複数示されたものの、分子機構の同定には至らなかった。現在、定量PCRによる検証を進めており、候補分子の絞り込みを行っている。一方、RAC1活性化の検出に関しては、活性化型RAC1に対するモノクローナル抗体を用いた検討を予定している。当初の実験計画から若干進行が遅れているが、研究の方向性については妥当と考えている。最終年度には以下の実験を行った。

1.同種アポトーシス細胞貪食の共焦点レーザー顕微鏡観察:口腔扁平上皮癌細胞株Ca9-22およびSASを用いて、アポトーシス細胞を緑色蛍光色素で、生活細胞を赤色蛍光色素で予め標識し、両者を共培養した。洗浄・固定後に共焦点レーザー顕微鏡にて解析したところ、生活細胞はその細胞質内にアポトーシス細胞を取り込んでいた。さらに、23個の生活細胞が1個のアポトーシス細胞を取り囲む像が高頻度に認められ、複数の生活細胞が協調あるいは競合してアポトーシス細胞を貪食する可能性が示唆された。2.アポトーシス細胞貪食細胞における活性化型Rac1の局在検討:選択的Rac1阻害剤を用いた実験から、アポトーシス細胞貪食にRac1が関わることが示された。プルダウンアッセイの結果、Ca9-22細胞ではRac1の恒常的な活性化が見られたが、アポトーシス細胞の添加によるRac1活性化レベルの亢進は検出できなかった。そこで、活性化型Rac1に対する特異抗体を用いて蛍光抗体染色を行ったところ、アポトーシス細胞周囲に形成されたphagocyticcupに一致した活性化型Rac1の局在が示された。3.アポトーシス細胞貪食後の細胞内分子イベントの探索:昨年度実施のDNAマイクロアレイによる発現解析の結果から、phagocytosisやphagosome assembly, cell adhesion, cell migrationなどのGOを有する遺伝子の発現上昇が見出された。これらの遺伝子のいくつかに対し定量PCRにて検証を行ったが、再現性をもって明らかな発現上昇を確認できなかった。さらに、抗体アレイ法にて各種の細胞内シグナル分子のリン酸化レベルを検討したものの、有意な結果は得られず、アポトーシス細胞貪食後に遊走・浸潤能が亢進する分子機構については今後の課題として残された。病理組織標本でがん細胞による同種アポトーシス細胞貪食がしばしば見出されるが、本現象の生物学的意義は不明である。そこで「がん細胞は同種のアポトーシス細胞を貪食することで、自身の細胞機能を活性化する」という仮説を立て、検証した。アポトーシスを誘導した培養細胞を同種生活細胞と共培養すると、多くの生活細胞がアポトーシス細胞を細胞質内に取り込んだ。アポトーシス細胞は貪食細胞のファゴソームに局在しており、貪食はRac1阻害剤により抑制された。さらに、がん細胞の遊走浸潤能はアポトーシス細胞貪食後に亢進した。これより、同種アポトーシス細胞貪食によるがん細胞機能活性化が示され、新規治療標的として期待される。研究計画にしたがって次年度より、アポトーシス細胞貪食後に貪食がん細胞で生じる分子発現プロファイルの変化をDNAマイクロアレイ法などで網羅的に解析し、そこから得られた個々の結果について検証を進めていく予定である。細胞増殖や遊走浸潤に関連するシグナル伝達経路に加え、アポトーシス貪食による脂質負荷増大が予想されるので、脂質代謝関連分子の発現変化に注目していく。DNAマイクロアレイの結果から示唆された分子について定量PCRで検証を行い、これらがアポトーシス細胞貪食および遊走・浸潤にどのように寄与するかを検討する。さらに、アポトーシス細胞貪食により活性化するシグナル伝達経路を抗体アレイ法を用いて探索する。口腔病理学研究計画にしたがって物品費および旅費を支出してきたが、最終的に必要試薬の購入額に満たない残額が生じた。不必要な支出を避けるために、次年度使用額として計上した次第である。
人工知能の応用による近赤外スペクトルを用いた普及型プラスチック種類判別機の開発

ハロゲン光源(近赤外光源)、光チョッパー、モノクロメーター、光センサー、プリアンプ、ロックインアンプ(高い信号対ノイズ比を実現するための特殊なアンプ)、モノクロメーターの波長送りモーター、制御およびデータ処理用PCをUSBで接続するタイプの原価20万円程度のプラスチック種類判別機を開発した。判別できるプラスチックの種類は13種類程度であるが、国内のプラスチック総生産量の約90%程度の種類判別をカバーできる。各種プラスチックの近赤外分光スペクトルから、樹木の構造をもった分類樹を用いてその種類判別条件を探る検討を進めた。その結果、近赤外領域(波長800nmから2500nm)のスペクトルデータのごく一部を使うことにより、代表的な15種類のスペクトル判別におけるポイントを明確化することができた。データのごく一部のみを使うため、簡便な判別器でも、代表的なプラスチックの判別が可能になるとの見通しから、普及型判別器の開発に着手した。一般的な分光器は、光源とチョッパー、および、モノクロメーター、回折格子の駆動モーター、アンプと検出器からなる。光源としてハロゲン光源を用いた分光計を組み立て、スペクトルが得られることを確認できた。次に、チョッパーを用いない方式としてLED光源の活用を考案した。LEDは、自在な変調をソフトウエアにより容易に実現できる。この方式が実現すれば、チョッパーとそれに伴うモーター、およびその回転数制御装置を削減でき、装置の小型化と駆動部分が減少する。すなわち、装置の安定化につながる。LED光源を用い、固定周波数(500Hz)のみに対応するロックインアンプを試作することにより、この方式でスペクトルを取得できることを確認できた。ただし、LED光源は中心波長とその前後200から100nm領域の波長を持つことから、複数のLEDを用いて同時に変調し、比較的広い波長領域をカバーできる光源を製作した。一方で、広い領域の近赤外光を照射できるハロゲン光源の長所を再認識するに至った。そこで、当初の計画には予定していなかったが、ハロゲン光源の自在な変調を実現できる装置の開発も併せて推進している。H21年度の研究実施計画のうち、簡易分光器の製作は実現できた。また、判別モデル構築のための基礎データを収集中である。LED変調方式と固定周波数ロックインアンプの開発を進めることができた。研究の目的はプラスチックの種類判別を実現する、普及型の低コスト判別器(分光器)を開発することである。H21年度には、判別器の主たる構成パーツ、ハロゲン光源、チョッパー、モノクロメーター、センサー、ロックインアンプ、アンプとADコンバーターとモノクロメーターを駆動するステッピングモーターを結合し、スペクトルの取得を実現した。このうち、判別器の核心部分の一つである特殊な増幅器、ロックインアンプを試作した。さらに、ハロゲン光源とは異なる性質を持ち、変調の容易なLED光源を用いて、チョッパーを利用しないタイプの判別器の可能性を確認できた。H22年度には、具体的なプラスチック試料の測定を開始した。H21年度にその可能性を見出したLED光源を利用する場合、発光波長領域が狭い帯域であることから、判別には、より高分解能が必要となることがわかった。開発したロックインアンプについては、そのチューニングの容易さや安定性について検討を重ね、実用的なアンプへと改善した。また、H21年度までは、プラスチックの透過光を測定する方式であったが、より実用的な方式として反射方式の測定を開始した。その結果、正反射光の検出によるスペクトルの歪みに対する対策の必要性が浮上した。そこで、試料からの反射光を積分球+モノクロメーター+センサーで測定する方式、積分球からの受光を光ファイバーを用いてモノクロメーター+センサーへ入射する方式、さらに、積分球を用いないで、光ファイバーにより試料へ光を入射し、反射光も光ファイバーにて受光しセンサーにて受光する方式の三種類の測定方式について比較検討を進めている。プラスチックのリサイクル促進を目的とした種類判別を近赤外分光計にて行う方法は、比較的、広範に利用されている。しかしながら、大部分はリサイクル専門業者が使用している状況である。これは、1台、約300万円と専門業者でなくては購入しない価格となっていることが大きな理由であろう。プラスチックの種類分別を近赤外分光スペクトルを用いて行う場合、市販の分光装置の大部分は過剰仕様と考えられる。各種プラスチックのスペクトルの種類判別条件を人工知能を用いて解析してみると、幾つかの重要なポイントに着目すれば良い事がわかる。そこで、プラスチックの種類分別が可能となるレベルの分解能を持ち、なおかつ、原価20万円程度(価格は現行装置の1/10程度)の普及型プラスチック種類判別機の開発を目的とした。この開発により、大きな病院、学校、スーパーなどの公共の場でも利用できる分散型のプラスチック分別が普及し、リサイクルマーケットも拡充することが期待される。開発装置は、ハロゲン光源、レンズ、光チョッパー、モノクロメーター、光センサー、信号増幅器(プリアンプ、ロックイアンプ)からなる。また、その制御と信号処理はUSB接続型でPCにより一括して行う。

H23年度は、装置のSN比対策として、光源電源を交流から直流へ変更し、入力オペアンプのアップグレード、各種抵抗の被膜を金属に変更する事、および、スリット部位への集光効率を向上させるためのレンズの適正化と光源パワーのアップを推進した。また、PCによる制御とデータ処理については、その使い勝手を向上するために、測定信号のリアルタイム表示、スペクトル表示、さらに、主なプラスチック、13種類のいずれに最も近いのかなどを一括してウインドウに表示する方式とした。分析化学に関わる学会で発表したところ、化学と電気・情報分野の異分野融合研究として、また、安価な部品から装置を製作するため、ブラックボックス化する分析装置の原理と仕組みを理解するための教育用キットとしても評価頂いた。
高分子溶液を内包したベシクルの外部揺動に伴う内部粘弾性と形の揺らぎ

本研究では、細胞がみせる形態変化を、様々なゆらぎのもとで、粘弾性体である細胞質と細胞膜が強く相関する「ゆらぎ・構造相関」の視点から解析することを目的としている。本目的のために、H28年度は高粘性な高分子溶液を内包したベシクルに、熱的・非熱的ゆらぎを与えた際の高分子溶液の粘度と膜形態の変化を解析した。その平成28年度の成果から、ベシクルに閉じ込められた高分子溶液の粘度がバルクとは異なり、それが膜変形へ影響を及ぼしているという示唆が得られた。そこで平成29年度は、膜により細胞サイズ空間へ閉じ込められた分子粘性を分子拡散から解析し、高分子濃度や閉じ込めサイズにより内部粘度は変化するという結果が得られたので、以下に報告する。ミクロサイズ空間への閉じ込めが高分子粘度に対して及ぼす影響を解明するために、高分子溶液を油中液滴として脂質膜により覆われたミクロ液滴とし、蛍光相関分光法(FCS)によりミクロ高分子液滴中の分子拡散を測定し、粘度を推定した。拡散分子に緑色蛍光タンパク質(GFP)を、高分子溶液には水溶性鎖状高分子であるポリエチレングリコール(PEG)を用い、高分子鎖の重なり合い濃度c*前後の濃度で実験を行った。その結果、c*以上の高分子濃度において、0.1 ms以上の長時間スケールでの拡散係数や異常拡散性を表す冪数が、液滴サイズへ強く依存することが明らかになった。以上から、高濃度高分子溶液を内包したベシクルの膜変形を解明するためには、膜変形の時間スケールに応じて示す高分子溶液の粘度をもとに、詳細に解析する必要があることが明らかとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。本目的のために、高濃度の高分子溶液を内包したリン脂質膜小胞(ベシクル)やリン脂質で覆われたエマルション(ミクロ液滴)を細胞モデルとして用い、熱的・非熱的ゆらぎを与えた際の高分子の粘弾性と膜形態の変化を解析する。平成28年度は、(1)粘性流体を内包したリポソームの形態変形、(2)非熱的ゆらぎを与えた際のベシクルの形態変化について主に実験を行い、以下の結果を得たので報告する。(1)高分子溶液を内包したベシクルの高浸透圧下での変形我々はこれまでに、高粘性流体である高分子溶液を内包したベシクルを高浸透圧環境に置くと、内部粘性に依存して膜小胞形成(budding)かチューブ状突出形成(tubing)が現れることを報告している。しかし、これらの変形を決定付ける要因が、内部粘度であるという明快な証拠が無かった。そこで本研究では、粘度が既知の高分子溶液をベシクルに内包し、その後高浸透圧下に置くことで、内部粘度と膜変形との相関関係を調べた。その結果、初期の内部粘度に依存しており、水の約2倍の粘度を超えると、budding変形からtubing変形へ転移することを見出した。(2)ベシクルの一次的な強制変形とその履歴非熱的ゆらぎを加えたベシクルの膜形状ゆらぎを解析するために、均一相ベシクルに対してマイクロピペット吸引により一時的に外力を与え、強制変形させた後の、膜形状の緩和過程を解析した。その結果、強制変形させた部分がtubingすること、またレーザー照射により熱ゆらぎを与えると、元の球形状へ戻ることを見出した。平成28年度は、ベシクルに対し、レーザー照射による熱的ゆらぎと、高浸透圧下での脱水とマイクロピペットによる吸引という非熱的ゆらぎを与えた際の、ベシクルの膜変形を解析した。その結果、これらの熱的・非熱的ゆらぎにより熱平衡状態では見られなかった膜変形が現れること、またそれらは内部の粘度に強く依存することを、実験的に見出した。

以上から、高濃度高分子溶液を内包したベシクルの膜変形を解明するためには、膜変形の時間スケールに応じて示す高分子溶液の粘度をもとに、詳細に解析する必要があることが明らかとなった。平成28年度の研究成果で観察されたベシクルの膜変形を内部粘度と相関付けて解析する過程で、ベシクル内に封入された高分子溶液の粘度がバルクとは異なるという示唆が得られた。そこで、ベシクルと同様に、リン脂質膜で覆われたミクロ空間に高分子溶液を閉じ込め、高分子濃度や閉じ込めサイズに応じた高分子溶液の粘度を、高分子拡散から推定する研究を行うこととする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
フェノ-ル・ユリア交互共重合体の合成に関する基礎的研究とその応用

メチロ-ルフェノ-ル(MP)とユリア(U)を共縮合させる際には、MPのオルト位とパラ位のメチロ-ル基のUとの反応性の違いが生成する共縮合体の化学構造を左右する。本研究では、この共縮合体合成における基礎反応であるメチレン結合生成の化学動力学を、2,4,6ートリメチロ-ルフェノ-ル(TMP)、2ーヒドロキシベンジルアルコ-ル(OMP)、4ーヒドロキシベンジルアルコ-ル(PMP)をモデル化合物に用いて解析し次の結果を得た。1.OMPおよびPMPをそれぞれ過剰のUと反応することにより共縮合反応を擬1次反応として取り扱い、PMPの反応性がOMPより10倍程度高いことを認めた。2.TMPとUとの共縮合反応においては、オルトメチロ-ル基とパラメチロ-ル基がUと同時に反応する併発系となる。この系の反応を2次反応として速度定数の比をr=ko/kpとすると、rは値は各種の酸触媒で0.06ー0.08の範囲にあった。3.メチロ-ルフェノ-ル混合物とUから実用的な共縮合樹脂を合成する際には、共縮合と同時にメチロ-ルフェノ-ル同士関のメチレン結合生成による自己縮合が併発する。このような系について、OMPとPMPを用いてそれぞれの自己縮合と共縮合の2次反応速度定数の比(K=k〔自己縮合〕/k〔共縮合〕)を決定することができた。その結果、OMPのKの値は5ー10程度であった。一方、PMPのKの値は0.5程度であった。このことから未置換のパラ位の存在が、自己縮合生成に大きく関与することが判明した。以上の結果より、共縮合率の高いフェノ-ル・ユリア共縮合樹脂を合成する条件が理論的に設定できることになり実用的な応用が期待される。また、このような併発反応系の動力学的解析は、今までホルムアルデヒド系樹脂の分野ではなされておらず、この手法がこの分野の発展に繋がると思われる。フェノ-ルとユリアをホルムアルデヒドで共縮合させるには、メチロ-ルフェノ-ルを既め合成しこれとユリアを反応する方法が望ましい。この基礎的な反応を、2-ヒドロキシベンジルアルコ-ル(OMP)と4-ヒドロキシベンジルアルコ-ル(PMP)を用い動力学的に扱い次のような結果を得た。1.逆相系のカラムを用いると、OMP、PMPならびにこれらのユリアとの共縮合物とが効率よく分離定量でき、動力学解析に応用できる。2.前項と^<13>C-NMRの測定から共縮合反応系における各化合物のモル濃度が定量できる。3.OMPあるいはPMPとユリアの反応では、ユリアを大過剰に用いると、メチロ-ルフェノ-ルの自己縮合を抑制でき、共縮合だけを動力学的に解析できる。この方法によると、共縮合反応は擬一次反応によく一致し、OMP、PMPのユリアとの反応についてpH3.5付近における反応速度定数を決定した。4.OMPとPMPを共存させユリアとの縮合反応を同時に解析する方法を確立した。

5.以上の動力学的解析により、オルソ-位のメチロ-ル基の反応性は、パラ-位のメチロ-ル基に比べ1/71/10程度であった。6.反応速度が酸触媒の種類に依存することを硫酸、塩酸、種々の有機酸を用いて明らかにした。また、反応速度の酸性度依存性ならびに温度依存性を明らかにした。以上の結果より、モノメチロ-ルフェノ-ルの反応性を把握したので来年度は、ジ-およびトリメチロ-ルフェノ-ルをモデルとして用い動力学解析を行う。これにより、実用的な共縮合樹脂を合成する際の至適な条件が設定できるものと考えている。メチロ-ルフェノ-ルとユリア(U)より共縮合体を合体する際の基礎反応であるメチレン結合生成の化学動力学を、2,4,6ートリメチロ-ルフェノ-ル(TMP)、2ーヒドロキシベンジルアルコ-ル(OMP)、4ーヒドロキシベンジルアルコ-ル(PMP)をモデル化合物に用いて解析し次の結果を得た。1.TMPとUとの共縮合反応においては、オルトメチロ-ル基とパラメチロ-ル基がUと同時に反応する併発系となる。これらの反応を2次反応として速度定数の比(反応性比)をr=ko/kpとすると、rはUの濃度に依存せずそれぞれの初期濃度と反応後の濃度から精度よく求められることが確認された。その結果、シュウ酸、硫酸、塩酸、硝酸などの酸触媒を用いた反応系の反応性比の値は0.06ー0.08の範囲にあり、パラメチロ-ル基の反応性が高いことが確認された。2.メチロ-ルフェノ-ル混合物とUから実用的な共縮合樹脂を合成する際には、共縮合と同時にメチロ-ルフェノ-ル同士間のメチレン結合生成による自己縮合が併発する。このような系について、OMPとPMPを用いてそれぞれの自己縮合と共縮合の2次反応速度定数の比(K=k[自己縮合]/k[共縮合])を決定することができた。その結果、OMPは、Uとの共縮合よりもオルト位とパラ位間の自己縮合が起りやすく、Kの値は5ー10程度であった。一方、PMPのKの値は0.5程度であり共縮合生成が優先することが判明した。これらのことから未置換のパラ位の存在が、自己縮合生成に大きく関与することが判明した。このような複雑な併発反応系の動力学的解析は、今までホルムアルデヒド系樹脂の分野ではなされておらず、この手法がこの分野の発展に繋がると思われる。また、これらの結果より、共縮合率の高いフェノ-ル・ユリア共縮合樹脂を合成する条件が理論的に設定できることになり実用的な応用が期待される。
細胞内浸透圧を調節する遺伝子の研究

trkAv遺伝子とその近傍の遺伝子K^+取り込みに関与するtrkAv遺伝子と、その下流にあるtrkHv遺伝子をクローニングし塩基配列を決定した。海洋細菌のK^+取り込み系遺伝子を持つ大腸菌の蛋白発現を、ミニセルで検討した。また、K^+取り込み系に変異を持つ大腸菌にこれらの遺伝子を導入し、低濃度K^+培地での生育を補うかどうか検討した。さらに、K^+の取り込み活性を測定した。mscL遺伝子の生理的活性測定大腸菌のmscL遺伝子を欠失させた変異株を作製した。大腸菌には第二、第三のメカノセンシティブチャンネル遺伝子の存在が電気生理学的手法で存在が示唆されていた。予想どうり、mscLを欠失させた変異株も、浸透圧ショックに対して弱くならなかった。しかし、mscLを導入させた海洋細菌Vibrioalginolyticusは、浸透圧ストレスに対して抵抗性を増大させた。NhaBvのトポロジーの決定細菌の耐塩性に関与する、Na^+の排出系(Na^+/H^+ antiporter)NhaBvのトポロジーが、NhaAvとは異なり奇数回の膜質通領域を持つことが、phoA遺伝子の融合実験により明らかにできた。この実験の結果、NhaBvの膜貫通領域に存在する酸性アミノ酸が推定でき、部位特異的変異導入の目標が定まった。proCvとその近傍の遺伝子K^+取り込みに欠損がある大腸菌TK420を補う遺伝子をクローニングし塩基配列を決定した。クローニングした遺伝子は、プロリン合成酵素の遺伝子(proCv)と、K^+輸送に関与する遺伝子(ktrAv、ktrBv)を含んでいた。trkAvとその近傍の遺伝子K^+取り込みに関与するktrAv遺伝子の近傍の塩基配列を決定し、ktrAv遺伝子と共にK^+取り込み系を形成するktrBv遺伝子を見い出した。mscL遺伝子のVibrioへの導入浸透圧調節に関与する大腸菌の遺伝子(mscL)を組み込んだプラスミドを構築しVibrioへ導入した。nhaBv遺伝子のクローニングNa^+排出に関与する第二の遺伝子(nhaBv)遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。海洋細胞のK^+取り込み系遺伝子を持つ大腸菌の蛋白発現を、ミニセルで検討した。さらに、K^+取り込み活性を測定した。NhaBvのトポロジーの決定細菌の耐塩性に関与する、Na^+の排出系(Na^+/H^+antiporter) NhaBvのトポロジーが、NhaAvとは異なり奇数回の膜貫通領域を持つことが、phoA遺伝子の融合実験により明らかにできた。
サイトカイン遺伝子及び単純ヘルペスウイルスを用いた悪性脳腫瘍への遺伝子治療の研究

悪性脳腫瘍の治療に資するべく、単純ヘルペスウイルス(HSV)を用いた、遺伝子治療の研究を行い、若干の成果を得たので報告する。helper HSVの存在下でのみ複製し、単独では複製不能なdefective HSV vectorを作成し、このベクターにより、サイトカイン遺伝子が脳腫瘍細胞に導入可能かどうか、in vitroおよびin vivoで検討することが目的であった。当初IFN-rおよびIL-2遺伝子を発現するウイルスベクターを作成する予定であったが、amplicon plasmidの調整に手間取り、成果を得られた研究としては、HSVのthymidine kinase(tk)を発現するdefective HSVを作成し、このウイルスおよび、helper HSVである、mutant HSV R3616(神経毒性を示さない)との相乗効果をマウス悪性脳腫瘍株GL261を標的として、in vitroおよびin vivoで検討した。まず、作成したdefective HSV(dvHCtk)は一ウイルス粒子当たり、約10コピーのtk遺伝子を含んでおり、in vitroにおいて、感染した細胞で強力なtk活性を発現することを明らかにした。次いでこのウイルスをGL261細胞にin vitroで感染させ、ganciclovir(GCV)を投与することにより、著名な坑腫瘍効果が得られることを確認した。最後にin vivoの治療実験としてsyngeneic mouseにGL261腫瘍魂を形成させ、この腫瘍魂にdvHCtkとR3616を投与し、GCVを投与することにより、腫瘍発育の著名な抑制効果を認めた。コントロールとして作成したlacZ遺伝子を発現するdefective HSVでは坑腫瘍効果は得られなかった。今後は当初の予定のサイトカイン遺伝子を発現するdefective HSV vectorを作成し、研究を進めていきたい。
突然変異によるダイズ種子貯蔵タンパク質の遺伝的変異の誘発

ダイズ種子タンパク質の栄養価向上のためには、タンパク質中の含硫アミノ酸含量を高めることが必要である。そのためにはダイズ種子貯蔵タンパク質の2つの主要成分のうち、7Sグロブリンの生成量を減少させればよく、7Sグロブリンのサブユニット(α',αおよびβ)の欠失をもたらす変異遺伝子を見出す必要がある。このうち、α'サブユニットの欠失遺伝子はダイズの既存品種の中に既に見出されているので、残る2つのサブユニットの欠失遺伝子をガンマ-線照射による突然変異誘発により見出すことを本研究の目的とした。品種ワセスズナリの種子にガンマ-線40KRを照射した後代の種子をSDS電気泳動法で調査したところ、M_4の種子からαおよびβの2つのサブユニットが同時に欠失した突然変異を選抜することに成功した。この変異遺伝子はホモ接合型になると、幼植物段階でクロロシスを起して致死すること、しかしながらヘテロ接合型では生存上異常は生じないので、この変異遺伝子の維持増殖は可能であること、ヘテロ接合型植物に着生する種子には正常:αおよびβサブユニット量半減:両サブユニットの欠失が3:4:1の比で分離していることが明らかにされた。これと同じ時期に品種ワセスズナリにガンマ-線40KRを照射した後代M_3種子の中に、11Sグロブリンの酸性サブユニットタンパク質の一部を成すグル-プIサブユニット(A_1,A_2,A_3)が欠失しているものが誘発されていることを見出した。この変異遺伝子は1遺伝子座の劣性遺伝子として働らき、正常:グル-プIサブユニット半減:同サブユニット欠失が1:2:1の比で分離を生じることが明らかにされた。この変異遺伝子はホモ接合型植物でも生育には何ら異常は示さなかった。1988年および1989年にダイズ品種「ワセスズナリ」および「毛振」の乾燥種子にガンマ-線を2040KR照射し、適宜世代促進を行いながらM_1M_5植物までを養成した。その間、M_2種子M_3種子を材料にして種子の一部をナイフで削り取ってタンパク質を抽出し、SDS電気泳動法により種子タンパク質のバンドパタ-ンの変異探索を行った。その結果、これまで既存品種の中には見られなかった変異を発見し、その特質を明らかにしたほか、一部の変異については遺伝様式も明らかにした。1.ワセスズナリに30KR照射した後代から、グリシニン(11Sグロブリン)のグル-プIサブユニットのタンパク質が大幅に減少した変異体を見出した。この変異体は生存可能であり単因子劣性遺伝を示した。βコングリシニン(7Sグロブリン)に対するグリシニンの比率は原品種に比べて大幅に低下していることが、デ-ビス系電気泳動によるバンドのデンシトメトリ-で明らかにされたが、タンパク質の全体としての含量(%)は原品種に比べて僅かに低下した程度であった。2.ワセスズナリに40KRを照射した後代から、βコングリシニン(7Sグロブリン)のαおよびβサブユニットのタンパク質がほとんど欠失している変異体を見出した。この変異はヘテロ遺伝子型からの分離体として見出されたが、幼植物段階でクロロシスを起し致死した。この変異体はその後もツギツギと分離し出現したが、いすれの種子も幼植物でクロロシスを起し致死した。同様の変異は毛振に20KRの照射を行ったものからも見出されたが、この変異体は開花期まで育ったものの結実には到らなかった。3.毛振はβコングリシニンのα'サブユニットタンパク質の欠失に特徴があるが、このバンドの復活して来る変異体も見出された。

この変異の遺伝性は今後の検討課題である。ダイズ種子タンパク質の栄養価や食品加工適性の遺伝的改良を行うため、主成分タンパク質の11Sグロブリン(グリシニン)と7Sグロブリン(ベ-タコングリシニン)のサブユニットタンパク質の生成に関する遺伝的変異をガンマ-線照射により誘発し、その遺伝様式等いくつかの特性を調べた。ダイズ品種ワセスズナリ等いくつかの品種の乾燥種子にガンマ-線照射して得た11Sグロブリンのグル-プ1サブユニットの欠失変異については、本年度は増殖を行い得られた種子を材料として、タンパク質含量、油脂含量および豆腐加工適性などの調査を行った。その結果、豆腐には適さないが、従来のダイズ品種には見られないタンパク質ゲルの物理化学的特性が見出された。また、7Sグロブリンに関しては、αおよびβサブユニットの欠失性変異の遺伝様式(致死性)に関してさらに詳しい分析を進める一方、新たにγサブユニットの欠失変異(生存可能)を発見した。これらの変異の相互組換えの可能性等を見るため、夏には交雑実験を精力的に行い、変異の相互交雑F_1種子や毛振(α'サブユニットの欠失)など別の変異をもつ品種との交雑を行い、いずれもF_1種子の獲得に成功した。現在、温室にてF_1植物を養成中である。7Sグロブリンのαおよびβサブユニットの同時欠失性変異の致死がクロロフィル生成の異常にあることは、発芽種子の生長過程の観察から明らかであるが、それが根からの栄養吸収力の異常にあるかどうかを見るため、若干の予備的培養実験も試みたが、致死までの期間(初生葉の展開まで)の延長を実現することはできなかった。ゲノムDNAの単離を行い、DNAの塩基配列の面からの原因究明も準備中である。本研究の初めの段階で見出したダイズ種子貯蔵タンパク質の2つの主要成分のサブユニットタンパク質の欠失性遺伝子を通常の品種に導入するため多数の交配実験を行った。1つは7Sグログリンのαおよびβサブユニットの欠失性変異遺伝子であるが、この変異遺伝子はホモ接合型植物では幼植物段階で致死するので、ヘテロ接合求型植物を用いて交雑実験を行った。もう1つは11Sグロブリンの酸性サブユニットの一部のグル-プIサブユニット(A_1,A_2,A_3)を欠失する変異であるが,これはホモ接合型植物が生存可能であるので交雑は容易であった。このほか、7Sグロブリンのα^1サブユニットを欠失する品種「毛振」も加え、相互の交雑も行った。SDS電気泳動法で確かめたところ、交雑種子_1であることが明らかであるもの多数を収穫することができた。平成元年度から3年度までの研究結果を重要な部分のみ取り上げ、報告書にまとめる仕事を行った。
リポソーム法を用いたIL-15遺伝子導入による膀胱癌治療および再発予防効果

リポソーム法を用い、MBT-2細胞に対してin vitroにIL-15遺伝子を効率的に導入し、IL-15を分泌させることができた。さらにin situにIL-15遺伝子をマウス膀胱癌(MBT-2細胞)モデルに導入することによって、膀胱腫瘍の生育が有意に抑制され、また生存率を上昇させることが証明された。またその抗腫瘍効果には、CD8陽性T細胞が関与していることが判明した。IL-15遺伝子導入治療を受けたマウスに、再度MBT-2細胞を皮下に移植したところ、その腫瘍生育が有意に抑制された。よってIL-15遺伝子導入治療を受けたマウスは、膀胱癌に対する免疫記憶を獲得している可能性が示唆された。よって本治療法は、筋層非浸潤性膀胱癌のAdjuvantとしての膀胱内注入治療に応用できる可能性があると考えられた。【目的】表在性膀胱癌に対してはBCG膀胱内注入による免疫治療が再発予防の主役を担っているが、長期の免疫誘導は期待できず、膀胱癌に対する新たな免疫療法の確立が望まれる。IL-15は自然免疫系細胞の分化成熟を誘導し、さらに長期の免疫記憶を担うメモリ-T細胞の維持に重要であることが知られている。今回、膀胱癌へのIL-15遺伝子導入治療について研究を行った。【方法】In vitroにてマウス膀胱癌細胞株MBT-2にLacZ遺伝子をliposome法にて導入し、その導入効率をX-gal染色にて確認した。次いでIL-15遺伝子を同様の方法にて導入し、上清中のIL-15分泌量をELISAにて測定した。マウス膀胱癌同所性モデルを用い、腫瘍の生着した膀胱へin situにLacZおよびIL-15遺伝子のlipoplexを膀胱内注入し、腫瘍への導入効率、腫瘍重量の推移、および病理組織学的所見を検討した。【成績】In vitroにおいて効率的にLacZ遺伝子をMBT-2細胞に導入しえた。また遺伝子の濃度依存性にIL-15分泌量の増加が確認された。In situでの膀胱内への遺伝子導入では腫瘍巣に強いX-gal染色を認め、遺伝子導入が確認された。またIL-15遺伝子導入により有意に腫瘍増殖抑制効果を認め、またコントロール群に比べ有意に生存率の延長を認めた。IL-15治療群の腫瘍周囲には多くのCD8陽性細胞の浸潤を認めた。【結論】In situによるIL-15遺伝子治療にて、マウス膀胱癌に対する腫瘍増殖抑制を認めた。その抗腫瘍効果には、CD8陽性T細胞が関与しているものと考えられた。IL-15は自然免疫系細胞の分化成熟を誘導し、さらに長期の免疫記憶を担うメモリーT細胞の維持に重要であることが知られている。【方法】マウス膀胱癌同所性モデルを用い、腫瘍の生清した膀胱へin situにLacZおよびIL-15遺伝子のlipoplexを膀胱内注入し、腫瘍への導入効率、尿中IL-15濃度の変化、腫瘍重量の推移、および病理組織学的所見を検討した。さらに腫瘍抑制をみとめたIL-15治療群マウスに対し、再度皮下にMBT-2細胞を移植し、抗腫瘍免疫記憶につき検討を行った。【成績】In situでの膀胱内への遺伝子導入では腫瘍巣に強いX-gal染色を認め、遺伝子導入が確認された。またIL-15遺伝子導入により尿中IL-15濃度の上昇を確認した。またIL-15治療群のマウスにおいては、コントロール群に比べ有意に腫瘍増殖抑制効果を認め、さらに生存率の延長を認めた。またIL-15治療群のマウス皮下にRe-challengeしたMBT-2細胞の増殖速度は、新たなコントロール群に比べ有意に抑制された。【結論】In situによるIL-15遺伝子治療にて、効率的な遺伝子導入とIL-15の発現が確認され、またマウス膀胱癌に対する腫瘍増殖抑制を認めた。その抗腫瘍効果には、CD8陽性了細胞が関与しているものと考えられた。さらにRe-challengeされた皮下腫瘍が拒絶されたことより、抗腫瘍免疫記憶を獲得している可能性が示唆された。