hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原始惑星系円盤の雪線より内側の領域における固体微粒子の形成進化過程の解明

本研究では、太陽系誕生時の姿である原始惑星系円盤内でも特に雪線領域に着目し、円盤内に存在している固体微粒子の形成進化プロセスや星雲環境の推定を行うことを目的に研究を行ってきた。原始惑星系円盤の情報を調べるためには、母天体集積後、熱や水などの二次的な変成の程度が極めて低い始原的な隕石を研究対象とする必要がある。そのため、未だ詳細研究が行われていない南極隕石6試料を岩石鉱物学的観点から詳細に調べ、隕石母天体上における変成の程度が極めて低い始原的な隕石を特定した(以下、始原隕石と記載)。始原隕石は、太陽系最古の物質である難揮発性包有物(Ca, Al-rich inclusion: CAI)、原始惑星系円盤内で何らかの高温プロセスを経て形成されたコンドリュール、サブミクロンからミクロンサイズの微細な鉱物から成るマトリックスから構成されている。本研究では、これらの中でも特にコンドリュールに着目し、酸素同位体分析と短寿命放射性核種26Alを用いた年代分析の結果を総合的に捉えることで、(1)雪線領域におけるコンドリュールの形成進化(2)雪線領域における原始惑星系円盤の星雲環境(3)隕石母天体上での初期進化過程という三つの項目に着目して研究を行った。(1)と(2)に関しては、対象とした始原隕石中のコンドリュールの形成年代は、組成や組織によらず、CAI形成後200300万年後であることを明らかにした。また、各々のコンドリュールは酸化還元状態が異なる二つのリザーバー下で形成されたことがわかった。(3)に関しては、始原隕石の隕石母天体上では、表層物質と表層から十数km深さに存在していた物質が混ざり合うような角礫岩化が生じていたことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、雪線より内側に存在していたと考えられる隕石の中でも、特に、母天体上で熱や水による二次的な変成をほとんど受けていない始原的な隕石を研究することにより、(1)雪線以内の円盤領域における細粒物質の形成進化と相互付着過程(2)太陽系最古の高温物質であるCAI(calcium-aluminum rich inclusion)形成後、もう一つの高温物質であるコンドリュールが形成されるまでの空白の200万年における高温現象の頻度と強度分布という二つの項目に着目して研究を行っている。(1)に関しては、様々な円盤内の領域で異なる物理・化学過程を経て形成されたと考えられる組織の異なるマトリックスを鉱物学的かつ化学的に分類し、その後、各グループの詳細分析を行った。具体的には、集束イオンビームを用いて切り出した各マトリックスの切片を高エネルギー加速器研究機構にて放射光X線回折実験を行い、その後、マイクロトームで同試料の超薄切片を作成して透過型電子顕微鏡観察を行った。その結果、隕石中に含まれるマトリックスを大まかに三種類に分類することが出来た。(2)に関しては、これまでの詳細な組織観察により、年代測定可能な単体のコンドリュールやCAIに加え、形成年代がCAIとコンドリュール形成期間の間の年代を示すPRC(plagioclase-rich inclusion)という物質や、コンドリュールとCAIが複合した物質を発見することができた。これらの物質の酸素同位体比を求めるため、北海道大学設置の二次イオン質量分析計(ims-1270 SIMS)を用いて同位体測定を行ったところ、各々の酸素同位体の測定に成功した。本研究では、雪線より内側に存在していたと考えられる隕石の中でも、特に、母天体上における二次変成の程度の低い始原的な隕石を研究することにより、1.雪線以内の円盤領域における細粒物質の形成進化と相互付着過程、2.太陽系最古の高温物質であるCAIs (calcium-aluminum rich inclusions)形成後、もう一つの高温物質であるコンドリュールが形成されるまでの空白の200万年における高温現象の頻度と強度分布という二つの項目に着目して研究を行つている。昨年度は、主に2.の課題に関して研究を進めた。北海道大学創生研究機構所有の二次イオン質量分析計を用いて、様々な種類のコンドリュールの局所酸素同位体分析を行つた。測定したコンドリュールの内訳としては、Mgに富むTypeIコンドリュールが9個、Feに富むTypeIIコンドリュールが3個、斜長石に富むPlagioclase-richコンドリュールが2個である。結果、全てのコンドリュールの酸素同位体組成は、先行研究で報告されている、本研究で使用している隕石と同タイプの隕石中に見られるコンドリュールと同様の組成範囲にプロットされた。コンドリュールの化学組成に着目してみると、Mg-richなコンドリュールと比べてFe-richなコンドリュールの酸素同位体組成は^<16>Oに乏しくなつており、異なる星雲環境下で両者のコンドリュールが形成されたことを示唆している。また、形成年代が現在見つかっている物質の中で唯一CAIsとコンドリュールの間の形成年代を示すPlagioclase-richコンドリュールの酸素同位体組成を測定した結果、原始惑星系円盤内で複数の加熱を経験したことが示唆された。

今後は、コンドリュールの形成年代及び原始惑星系円盤における高温現象の頻度と強度分布を調べるため、^<26>Al-^<26>Mgシステムによる年代測定と希土類元素の測定を行い、原始惑星系円盤内のコンドリュール形成イベントや星雲環境に制約を与えていきたいと考えている。本研究では、太陽系誕生時の姿である原始惑星系円盤内でも特に雪線領域に着目し、円盤内に存在している固体微粒子の形成進化プロセスや星雲環境の推定を行うことを目的に研究を行ってきた。原始惑星系円盤の情報を調べるためには、母天体集積後、熱や水などの二次的な変成の程度が極めて低い始原的な隕石を研究対象とする必要がある。そのため、未だ詳細研究が行われていない南極隕石6試料を岩石鉱物学的観点から詳細に調べ、隕石母天体上における変成の程度が極めて低い始原的な隕石を特定した(以下、始原隕石と記載)。始原隕石は、太陽系最古の物質である難揮発性包有物(Ca, Al-rich inclusion: CAI)、原始惑星系円盤内で何らかの高温プロセスを経て形成されたコンドリュール、サブミクロンからミクロンサイズの微細な鉱物から成るマトリックスから構成されている。本研究では、これらの中でも特にコンドリュールに着目し、酸素同位体分析と短寿命放射性核種26Alを用いた年代分析の結果を総合的に捉えることで、(1)雪線領域におけるコンドリュールの形成進化(2)雪線領域における原始惑星系円盤の星雲環境(3)隕石母天体上での初期進化過程という三つの項目に着目して研究を行った。(1)と(2)に関しては、対象とした始原隕石中のコンドリュールの形成年代は、組成や組織によらず、CAI形成後200300万年後であることを明らかにした。また、各々のコンドリュールは酸化還元状態が異なる二つのリザーバー下で形成されたことがわかった。(3)に関しては、始原隕石の隕石母天体上では、表層物質と表層から十数km深さに存在していた物質が混ざり合うような角礫岩化が生じていたことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。東日本大震災以降、所属大学の二次イオン質量分析計が復旧しないため同位体分析が行えない状況だったが、他大学の装置を使用できることになったため、今後の進展に期待が持てる。東日本大震災の影響で研究室所有の二次イオン質量分析計が未だに定常的に動いていないため、同位体分析に関しては他大学の装置を使用している状況である。ある程度のデータは出しているものの、マシンタイム等の問題で当初の計画以上の分析ができているとは言えず、上記のような評価となった。現状、二次イオン質量分析計(SIMS)を用いた同位体分析のうち、酸素同位体の測定に成功している。今後は、同じくSIMSを用いた^<26>Al^<-26>Mg年代測定法によってPRCの形成年代を調べると共に、CAIや、CAIとコンドリュールの複合物などの希土類元素を測定する予定である。マトリックスに関しては、フランスにあるNano-SIMSを使用した1μm大サイズの微粒子の局所同位体分析を進めているが、こちらは粒子サイズの問題で個々の微粒子の測定には成功していないため、今後、分析手法の改善を行っていく予定である。昨年度と本年度の分析で酸素同位体分析に関してはある程度の目途がたったため、今後は、^<26>Al-^<26>Mgシステムによるコンドリュールの年代測定と希土類元素の測定を行う予定である。
スフィンゴ糖脂質代謝マシーナリの構造と機能及び応用に関する研究

報告者の研究室で同定、クローニングしたスフィンゴ脂質代謝に関わる新規酵素(セラミダーゼ、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ、Hex1、NgaP、EGCrP1, EGALC)の構造と機能を調べた。セラミダーゼとスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼは、金属酵素であり亜鉛が触媒中心であることが分かった。Hex1、NgaPはどちらも糖脂質に作用するエキソ型グリコシダーゼであるが、Hex1はGlcNAc/GalNAc残基に作用するヘキソサミニダーゼであるのに対して、NgaPはGalNAc残基に特異的なβ-N-アセチルガラクトサミニダーゼであった。NgaPは、基質のGalNAcのC2アセタミド基のカルボニル酸素が触媒求核基として機能するsubstrate-assisted catalysis機構で糖脂質を分解することを示した。真菌類のグルコシルセラミド合成酵素としてEGCrP1を同定した。EGCrP1が真菌類のグルコシルセラミドの品質管理に携わっていることを証明した。また、これらの酵素を用いた、糖脂質の微量同定法、標識法を開発した。さらに、マウスとゼブラフィッシュにおけるGM4合成の責任酵素を同定した。スフィンゴ糖脂質(以下糖脂質)は、主として形質膜表層で脂質ラフトと呼ばれるマイクロドメインを形成し、様々な細胞機能を制御している。また、糖脂質やスフィンゴミエリンの代謝産物(セラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン-1-リン酸)は、種々のシグナル伝達系のメディエーターとして機能している。このような観点から、糖脂質・スフィンゴ脂質及びそれらの代謝酵素は医薬、機能性食品、化粧品、機能性素材の開発ターゲットとしても注目を集めている。本研究は、申請者らが発見したスフィンゴ糖脂質代謝酵素のX線結晶構造、触媒機能、生理機能を解明するとともに、それらの触媒機能と特異性を利用した、糖脂質の新しい微量定量法、細胞表層糖脂質の機能解析法の開発を目的としている。本年度は、セラミドに作用しスフィンゴシンと脂肪酸を遊離する酵素セラミダーゼおよび糖脂質とスフィンゴミエリンに作用して、それぞれのリゾ体と脂肪酸を遊離するスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼのX線結晶構造とその触媒機構を解明することが出来た。両酵素は、スフィンゴ脂質の酸アミド結合を加水分解する酵素であるが、興味深いことに、両酵素とも触媒部位に亜鉛を持つ金属酵素であった。セラミダーゼの場合は、触媒部位の亜鉛によって水分子からプロトンが引き抜かれ、活性化されたヒドロキシイオンがセラミドのカルボニンル炭素を求核攻撃し、隣接する酸アミド結合を開裂する触媒機構を提案した。セラミダーゼの場合は、C2-セラミドとの共結晶から触媒機構が明らかにされることが出来たが、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの場合は詳細な反応機構を解くためには、さらに基質との共結晶の構造を明らかにする必要がある。一方、6-ガラ系列糖脂質に特異的に作用するEGALCの糖鎖転移反応と蛍光基質を用いた6-ガラ系列糖脂質の微量定量法を開発した。こうの方法を用いて、海藻に特有に存在するフィトール骨格を持つ新奇の6-ガラ糖脂質を見出し、NMR,MS等を用いてその完全構造を明らかにした。本年度は、病原性の真菌類に広く存在する糖脂質分解酵素について大きな進展が得られた。病原性の真菌類のグルコシルセラミドは感染や細胞分裂に重要であることが知られていた。このグルコシルセラミドの合成酵素は、ヒトから真菌に至るまでその一次構造が保存されているが、真菌類のグルコシルセラミド分解酵素は未同定であった。本研究の対象である、エンドグリコセラミダーゼは放線菌から報告者らによって初めて見出された糖脂質分解酵素である。エンドグリコセラミダーゼは様々な糖脂質に作用し、糖鎖とセラミドを遊離する。しかし、グルコシルセラミドには作用しない。本研究で、エンドグリコセラミダーゼの真菌オルソログ(EGCrP)がグルコシルセラミド分解酵素であることを見出した。また、クリプトコッカスにおいては、EGCrPの2つのパラログが存在することも明らかにした。さらに、クリプトコッカスのEGCrP-1ノックアウト変異株を作製したところ、合成途上のグルコシルセラミドが蓄積することを見出した。

つまり、本酵素は糖脂質合成の品質管理(Quality control)を行っていることが初めて明らかにされた。糖タンパク質の品質管理に関しては、研究が進んでいるが糖脂質の品質管理についての報告はこれが初めてである。一方、EGCrP-2のノックアウト変異株においては、グルコシルセラミド以外にも未知の糖脂質が蓄積し、細胞分裂が異常になることが分かった。次年度では、その未知の糖脂質の構造を明らかにし、EGCrP-2の生理機能を解明したい。クリプトコッカスの糖脂質(グルコシルセラミド)は、その脂質(セラミド)部位の構造がヒトと大きく異なっていて、病原性に強く関わっていることが知られている。この糖脂質がクリプトコッカス菌体内でどのように代謝されているのかは全く分かっていなかった。今回、この糖脂質の代謝に係わる酵素(EGCrP1)を同定することに初めて成功した。この酵素は菌体内で不要になった真菌型グルコシルセラミドを分解するだけでなく、合成途上で誤って合成された規格外のグルコシルセラミドも分解除去していることが初めて分かった。規格外のグノレコシルセラミドは病原性に関与しないことが分かっているので、本酵素による糖脂質の品質管理は、クリプトコッカスが病原性を保つための重要な機構の1つと考えられる。この酵素遺伝子を破壊すると、病原性に重要な役割を持つ莢膜形成の異常も観察された。さらに、EGCrP1のホモログ遺伝子EGCrP2も同定された。EGCrP2の欠損変異体は、エルゴステロールグルコシドが蓄積し、細胞分裂の異常が観察された。今回見出された糖脂質分解酵素遺伝子は、クリプトコッカスのみならず、四大真菌症と呼ばれるムコール症、アスペルギルス症、カンジダ症の原因菌にも存在することが分かった。今回の発見は、病原性真菌に共通する糖脂質代謝機構の解明、それを標的にした抗真菌剤の開発につながることが期待される。また、エンドグリコセラミダーゼを用いた新しい糖脂質の細胞グリコミクス法を開発した。本法によって、様々な細胞の糖脂質パターンを解析した。これらの糖脂質から疾病や細胞分化の新しい糖鎖マーカーが得られる可能性がある。
EGFR変異陽性肺癌のペメトレキセド耐性獲得機構の解明と克服

Pemetrexed(PEM)耐性におけるEGFRとthymidylate synthase (TS)の関連性、およびEGFR遺伝子変異別の耐性機序の違いは明らかではない。これまでに、PC-9細胞(Exon19欠失)やA549(野生型)ではTSおよびDHFRのPEM耐性への関与を報告しているが、今回、H1975細胞株(L858R+T790M)においても、PEM耐性化によるTS発現の増強と上皮間葉移行の関与も示唆された。一方で、PC-9 PEM耐性株ではEGFR-TKIへの感受性が増強していた。これらの結果をもとにさらに前臨床試験を進め、実臨床においてより効果の高い治療シークエンスを考案したい。本研究では、非扁平上皮・非小細胞肺癌患者への標準治療薬であるペメトレキセドと上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異の関係、そしてペメトレキセド耐性機序の解明と、その克服方法について検討するべく、研究を進めている。申請者らがすでに樹立したEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌細胞株(PC-9)と野生型EGFR遺伝子を有する肺腺癌細胞株(A549)のペメトレキセド耐性細胞株(PC-9/PEMR, A549/PEMR)について、幾つかの殺細胞性抗がん剤との感受性を検討している。EGFR遺伝子exon21のL858R変異を有する肺腺癌細胞株(H3255)に対して、ペメトレキセドへの感受性(IC50)をMTTアッセイにより決定したのち、十分な低濃度からペメトレキセドの持続曝露を開始した。これまでの同様の検討では数ヶ月かけて徐々にペメトレキセドの濃度を段階的に上昇させ、耐性を誘導することが可能であった。しかしながらH3255に関しては細胞の成長がもともと非常に緩徐であることに加え、わずかなペメトレキセドの濃度上昇によっても容易に死滅してしまう状況が続き、現時点で耐性の誘導に難渋している。引き続き継続すると共に、他のEGFR変異を有する細胞株(H1975;Exon21 L858R変異+Exon20 T790M耐性化変異)に対しても同様の方法を用いてペメトレキセド耐性を誘導可能か併行して検討を行っている。この性質が細胞種によるものか、EGFR遺伝子変異パターンによるものかを検討する必要がある。我々の樹立したPC-9/PEMR, A549/PEMRにおいてはthymidylate synthase(TS)の高発現がペメトレキセド耐性に関与していることから、TS特異的siRNAを用いてそれぞれTS発現を抑制することで、ペメトレキセドへの感受性が回復することを確認した。本研究では、非扁平上皮・非小細胞肺癌患者への標準治療薬であるペメトレキセド(pemetrexed: PEM)と上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異の関係、そしてPEM耐性機序の解明と、その克服方法について検討するべく、研究を進めている。申請者らがすでに樹立したEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌細胞株(PC-9)と野生型EGFR遺伝子を有する肺腺癌細胞株(A549)のPEM耐性細胞株(PC-9/PEMR, A549/PEMR)について、幾つかの殺細胞性抗がん剤との感受性を検討している。昨年に引き続きEGFR遺伝子exon21のL858R変異を有する肺腺癌細胞株(H3255)に対して、これまで同様の手法でPEMへ持続曝露による耐性誘導を試みたが、成長の緩徐なH3255特有の問題か耐性誘導を為し得なかった。代替としてEGFR遺伝子exon21 L858R変異+耐性遺伝子変異T790Mを持つH1975細胞についてPEM耐性誘導を試み、最終的に親株に比べ約300倍程度の耐性株を3クローン(H1975/PEMR A-C)樹立した。H1975/PEMRについて遺伝子発現を検討した結果、これまでの耐性株同様thymidylate synthase(TS)が有意に高発現していた。H1975/PEMRについても引き続き、他の細胞株同様の解析を進める。当初想定していたEGFR遺伝子Exon21 L858R変異細胞株であるH3255でのペメトレキセド(pemetrexed: PEM)耐性誘導が予定通り進んでいなかった。昨年の報告でオリジナルのH3255細胞株を購入し直すことを予定していたが、購入元のATCCでは明かな理由が不明なものの取扱いを停止しており、新規に入手するという方向性が断たれてしまった。そのため視点を変えて、H1975細胞株(L858R+T790M変異)にてPEM耐性株の樹立を行った。こちらは予定通り3クローンを新たに樹立出来たため、今後解析を進める予定である。また実験計画で当初予定していた異種移植片マウスによるin vivoの実験系についてこれまで共同研究を行っていた岡山大学医学部内の動物実験施設が建て替えにより規模を縮小していることから、当面はin vivoの実験が行うのが困難となっている。自施設では来年度以降に動物実験が可能となるが、現状でのin vivo実験は、動物実験施設の立ち上げも含めてもう少し時間を要する。

岡山大学あるいは当院での動物実験開始に備えて、in vitroの実験を進めていく。本研究では、非扁平上皮・非小細胞肺癌患者への標準治療薬であるペメトレキセド(pemetrexed: PEM)と上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異の関係、そしてPEM耐性機序の解明と、その克服方法について検討するべく、研究を進めている。申請者らがすでに樹立したEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌細胞株(PC-9)と野生型EGFR遺伝子を有する肺腺癌細胞株(A549)のPEM耐性細胞株(PC-9/PEMR, A549/PEMR)について、幾つかの殺細胞性抗がん剤との感受性を検討している。昨年までの検討でEGFR遺伝子exon21 L858R変異を持つH3255細胞でのPEM耐性株樹立は断念し、代わりにEGFR遺伝子exon21 L858R変異+耐性遺伝子変異T790Mを持つH1975細胞についてPEM耐性誘導を試みた。最終的に親株に比べ約300倍程度の耐性株を3クローン(H1975/PEMR A-C)を樹立した。H1975/PEMRについて遺伝子発現を検討した結果、これまでの耐性株同様thymidylate synthase(TS)が有意に高発現しておりPEM耐性機序を担っていると考えられた。EMT関連マーカーとしてVimentin, E-cadherinを検討したところ、PC-9では変化を認めず、A549ではPEM耐性株でVimentinの発現上昇を認め、H1975においてはE-cadherinが消失し、Vimentinの発現が増加しており、耐性機序にEMTの関与も考えられた。親株と耐性株で細胞形態に大きな変化は認めなかった。PC-9とPC-9/PEMRを用いてxenograftモデルによるin vivoでのPEMへの耐性化を検討したが、条件設定とPC-9/PEMR自体の細胞増殖の問題もあり、今回の検討ではPC-9/PEMRのPEM耐性を示すことができなかった。Pemetrexed(PEM)耐性におけるEGFRとthymidylate synthase (TS)の関連性、およびEGFR遺伝子変異別の耐性機序の違いは明らかではない。これまでに、PC-9細胞(Exon19欠失)やA549(野生型)ではTSおよびDHFRのPEM耐性への関与を報告しているが、今回、H1975細胞株(L858R+T790M)においても、PEM耐性化によるTS発現の増強と上皮間葉移行の関与も示唆された。一方で、PC-9 PEM耐性株ではEGFR-TKIへの感受性が増強していた。これらの結果をもとにさらに前臨床試験を進め、実臨床においてより効果の高い治療シークエンスを考案したい。当初想定していたEGFR遺伝子Exon21 L858R変異細胞株であるH3255でのペメトレキセド耐性誘導が予定通り進まず、難渋している。これまで他の細胞株で成功している手法と同様に極低濃度のペメトレキセド曝露から開始し、徐々に濃度を上げていく方法を行っているが、ある濃度を超えると急速に細胞増殖が抑制されてしまう。境界濃度で長期間培養する方法を試行したものの本来の増殖が緩徐であるためか、その濃度を超えての培養に至らない。培養・継代方法をさまざま変更して試行錯誤しているが、本来の増殖が緩徐であることによるものか細胞固有の問題かは不明であるが、耐性獲得に至っていない。
世界的流行を示す腸管毒素原性大腸菌O169の新規接着因子による人獣共通感染の検証

腸管毒素原性大腸菌(Enterotoxigenic Escherichia coli:ETEC)が起こす下痢症によって毎年30万人から50万人の幼児が死亡しており、本菌の疫学的重要性は高い。1991年に申請者が担当した集団下痢症の調査においてETECの新しい血清型O169:H41を検出し米国CDCに速報した(Emerg Infect Dis 1995)。その後この新型菌による集団発生が全国的に多発し、ETECによる集団発生の8割をO169が占める年さえあった。本菌は、in vitroでは他のETECよりも容易に病原プラスミドを失い下痢原性を喪失する。したがって、このプラスミドは強い感染性を大腸菌に付与し、菌を途切れることなく生体内にとどまらせる病原因子を保持していると推察される。申請者は、本菌が粘膜上皮細胞に対して特異な凝集接着性を有することを先に発見した(Epidemiol Infect 1998)。このような接着性は他のETECには希なものであり、この強い接着性がその流行に寄与していると考えている。この接着性の本体を解明し本菌の病原性を明らかにすることを目的として研究を実施した。本菌プラスミドの全シーケンスにより3種の腸管接着因子候補遺伝子を見つけ、これら3遺伝子それぞれを挿入した組み換え体の接着性を調べた。その結果、K88-like遺伝子が本菌の特異な接着性に寄与していること、その宿主特異性が広くヒトとブタさらにはウシの腸粘膜上皮細胞にも接着性を発揮することを見出した。ヒトのETECはヒトにのみ感染するとされており、今回の家畜調査でも本遺伝子は検出されなかった。しかしながら、本菌の接着性に関する結果は、本プラスミドがその宿主大腸菌を人以外の動物にも感染させ、人獣共通感染症を起こさせることで大腸菌にプラスミドを保持させている可能性を示唆している。今回発見した接着因子K88-likeは、これまで報告のない広い宿主特異性を有するが、線毛構造を示さず菌体における局在や形態、そして宿主細胞側の受容体は不明である。今年度の実験では、【6.研究実績の概要】で述べた成果以外に本接着因子に対するモノクローナル抗体の作製も同時に進めており、免疫電顕により接着因子の局在を明らかにする予定であった。K88-like遺伝子の塩基配列に基づいて合成したペプチドを抗原として用い、モノクローナル抗体産生細胞を3株得た。ペプチド抗原に対するELISA、K88-like遺伝子で組み替えた大腸菌株TOP10に対する凝集試験で抗体の特異性も確認した。しかしながら、病原プラスミドからクローニングした3種の接着因子遺伝子で組み替えたTOP10とこれらの抗体を用いた免疫電顕やウェスタンブロッティングでは、K88-like遺伝子に特異的な反応は検出されなかった。精査の結果、これらの抗体はTOP10の菌体と結合することが分かった。他の大腸菌とは反応しなかったことから、非常に偶然ながらTOP10は合成したペプチドと類似の抗原を持っており、これと交差反応するモノクローナル抗体を選別していたようだ。そのために特異的な抗体を得ることができず遅れが生じている。【8.現在までの進捗状況】に記述した失敗を踏まえ、合成ペプチドではなくK88-likeそのものを抗原としてモノクローナル抗体の作製に再度挑戦する。そのため、His-TagをK88-like遺伝子につけた組換え体を作製した。これから抽出精製したK88-likeの構成タンパク質を抗原とする予定であり、あわせてポリクローナル抗体作製を委託発注する。K88-likeの構成タンパク質をうまく分取精製できれば、単なる抗原としてだけでなく、宿主細胞側の受容体を探るためのグリカンアレイによる解析にも利用できるので申請当初の予定に近づくことが期待される。

しかしながら、本菌の接着性に関する結果は、本プラスミドがその宿主大腸菌を人以外の動物にも感染させ、人獣共通感染症を起こさせることで大腸菌にプラスミドを保持させている可能性を示唆している。今回発見した接着因子K88-likeは、これまで報告のない広い宿主特異性を有するが、線毛構造を示さず菌体における局在や形態、そして宿主細胞側の受容体は不明である。今年度の実験では、【6.研究実績の概要】で述べた成果以外に本接着因子に対するモノクローナル抗体の作製も同時に進めており、免疫電顕により接着因子の局在を明らかにする予定であった。K88-like遺伝子の塩基配列に基づいて合成したペプチドを抗原として用い、モノクローナル抗体産生細胞を3株得た。ペプチド抗原に対するELISA、K88-like遺伝子で組み替えた大腸菌株TOP10に対する凝集試験で抗体の特異性も確認した。しかしながら、病原プラスミドからクローニングした3種の接着因子遺伝子で組み替えたTOP10とこれらの抗体を用いた免疫電顕やウェスタンブロッティングでは、K88-like遺伝子に特異的な反応は検出されなかった。精査の結果、これらの抗体はTOP10の菌体と結合することが分かった。他の大腸菌とは反応しなかったことから、非常に偶然ながらTOP10は合成したペプチドと類似の抗原を持っており、これと交差反応するモノクローナル抗体を選別していたようだ。そのために特異的な抗体を得ることができず遅れが生じている。【8.現在までの進捗状況】に記述した失敗を踏まえ、合成ペプチドではなくK88-likeそのものを抗原としてモノクローナル抗体の作製に再度挑戦する。そのため、His-TagをK88-like遺伝子につけた組換え体を作製した。これから抽出精製したK88-likeの構成タンパク質を抗原とする予定であり、あわせてポリクローナル抗体作製を委託発注する。K88-likeの構成タンパク質をうまく分取精製できれば、単なる抗原としてだけでなく、宿主細胞側の受容体を探るためのグリカンアレイによる解析にも利用できるので申請当初の予定に近づくことが期待される。
「永遠の今」と体験ー西田幾多郎における美学と時間論

本研究においては、西田幾多郎の美学について、次の3点を目的として、時間論からのアプローチを行ない、同時に関連文献をイタリア語に翻訳する。1)西田の思想の発展に伴う芸術哲学の変化を、時間論との関係において論考することを試みる。2)晩年の西田に見られる「永遠の今」という概念のうち、特に「永遠」の意味するところについて西田の芸術論と時間論を結び、ドゥルーズを中心とした西洋美学・哲学の観点から比較・考察する。3)上記2点を行なうために不可欠な作業である、西田幾多郎の著作のイタリア語への翻訳および注釈を順次出版し、イタリアをはじめとしたヨーロッパに向けて研究成果を発信する。
基底小体と付随中心子の連結機構についての分子細胞生物学的研究

中心体はペアの中心子と中心子周囲物質から構築される。特定の細胞型で細胞周期のG0期に母中心子が基底小体に分化し、一次線毛を形成する。線毛を伸長した基底小体と娘中心子には、横紋を有する線維構造のstriated rootletが付随する。Striated rootletは基底小体と娘中心子との連結にも関与し、この部分のrootletはstriated connectorとも呼ばれる。Striated connectorは、striated rootletと同様にrootletinによってつくられる。本研究の目的は、これらの線維状構造の構築と機能を解明することである。線毛や中心体の構成分子に対する抗体を用いて免疫組織化学的に解析し、ARL13Aと類似のアミノ酸配列を有する分子がrootletin分子と相互作用している可能性が示唆された。RootletinはC-Nap1を介して基底小体に連結し、この連絡はNEK2によって阻害される。培養線維芽細胞を用いた解析で、細胞周期のM期に複製中心子が分離して移動する際に、striated rootletとstriatedconnectorはC-Nap1に結合した状態で小片化して基底小体から分離し、次いで消失すること、この小片にはNEK2が局在しないことを明らかにした。RootletinをsiRNA実験でノックアウト細胞では、細胞接着能が低下して形態像が変化するが、大部分の細胞で基底小体と娘中心子の連結は保存され、線毛の材料となる分子の輸送は障害されず一次線毛の形成に大きな異常はなかった。RootletinとともにC-Nap1の発現も低下し、C-Nap1の基底小体への局在維持にrootletinが関与することが示された。Rootletinと共局在する分子の解明では、ARL13Aがrootletinと相互作用をする可能性が考えられたので、分子細胞生物学的手法を用いて解析を進めた。その結果、使用した抗ARL13A抗体が別の分子を認識している可能性が高くなり、分子量やアミノ酸配列からデータベースを利用して認識される分子の解明を進めている。また市販の抗体を利用してstriated connectorやstriated rootletに局在する新たな分子の探索を行ったが、候補となる分子の発見には至らなかった。Rootletinの機能についてはsiRNA実験や細胞生物学的手法により順調に研究が進み、striated connectorの細胞生物学的意義について新たな知見を得ることができた。同様のノックアウト実験をC-Nap1についても実施すべく準備を進めている。本研究課題に付随して得られた一次線毛についての解析で、論文をまとめることができた。抗rootletin抗体、R67抗体を用いた免疫沈降実験では、多量の基底小体・striated connector・striated rootletを準備する必要がある。そのためrootletinを強制発現した細胞株の樹立を計画したが、予定通り樹立することができた。免疫沈降実験、共沈してくる分子群の分析については予定通りに進行できなかったが、現在実験の準備を進めている。細胞周期のM期に、複製した中心体は互いに分離し、striated rootletとstriated connectorは断片化して中心子から分離する。細胞分裂時のstriated rootletとstriatedconnectorの構造変化について超微形態学的に解析する。Rootletinを強制発現した細胞株を用いて細胞周期性のrootletin分子の動態を解析する。次いでこの細胞株を大量培養し、striated connector・striated rootlet分画を調整し、抗rootletin抗体、R67抗体を用いて免疫沈降実験を行う。Rootletinとの相互作用が疑われた分子については、免疫組織化学、免疫電顕法を用いて細胞内局在を明らかにするとともに、siRNA実験などの分子細胞生物学的手法により、基底小体からの線毛形成における役割、striated rootletやstriated connector形成における役割、二つの中心子の結合における働き、さらに紡錘体や微小管形成における機能について解析する。Striated connectorおよびstriated rootletについての実験に際し、これらと密接に関連する一次線毛やチュブリン分子の動態についても並行して解析を行う。一次線毛は、母中心子の遠位端から伸長する。母中心子すなわち基底小体とそれとペアをつくる娘中心子は、横紋を示す線維状構造(striated connector)で連結し、striated rootletと同様にrootletin分子が存在することが知られているが、これ以外の構成分子については不明な点が多い。本研究は、striated connectorの新たな構成分子、形成機構、機能について解明し、基底小体と付随中心子の連結機構を明らかにすることを目的にしている。平成29年度は主に既存の中心体構成分子(CEPなど)、線毛関連分子(ARL、tubulinなど)などに対する抗体およびrootletin認識抗体(R67)を用いて、免疫組織化学的手法によりstriuated connectorあるいいはstriated rootletに局在する新たな分子の解明に取り組み、現時点では、rootletinと局在が重なる分子としてARL13BとC-Nap1の2つを見いだすことができた。C-Nap1については、striated rootletが基底小体から伸長するときに重要な役割を演じていることがすでに知られているが、rootletinとC-Nap1の局在についての解析で、細胞分裂時のrootletの消失過程におけるC-Nap1の新たな機能についても明らかにすることができた。今後その成果を学会等で発表する予定である。ARL13Bのルートレットへの局在に関しては、偽陽性反応の可能性もあるので、分子生物学的手法を利用してさらに詳細に解析を進めている。

また、これらの研究に関連して、母中心子(基底小体)と娘中心子の可視化に利用したtubulin分子、およびTAT1分子の局在解析からTAT1分子の細胞内局在について興味ある知見を得ることもできた。この知見に関しては論文として成果をまとめている。Striated rootletもstriated connectorも、基底小体(母中心子)と娘中心子に連結する構造なので、中心子周囲領域に局在が知られている分子の中から、これらの構造に局在する分子を見つけ出すことを主な目的として、初年度の計画が立てられた。研究はおおむね順調に行われ、CEPを中心に約50種類の分子について追及し、rootletinと局在が重なる分子としてARL13BとC-Nap1の2つを確認することができた。C-Nap1とrootletの関係についてはすでによく知られているが、rootletの消失におけるC-Nap1の新たな働きを見出すことができた。ARL13Bのrootletへの局在に関しては、抗体の偽陽性反応の可能性もあるので、分子生物学的手法の追加など、さらなる詳細な解析が必要であると考えている。R67抗体を用いた免疫沈降実験によるrootletin局在分子の解明については、実験に用いる試料を現在調整中である。中心体はペアの中心子と中心子周囲物質から構築される。特定の細胞型で細胞周期のG0期に母中心子が基底小体に分化し、一次線毛を形成する。線毛を伸長した基底小体と娘中心子には、横紋を有する線維構造のstriated rootletが付随する。Striated rootletは基底小体と娘中心子との連結にも関与し、この部分のrootletはstriated connectorとも呼ばれる。Striated connectorは、striated rootletと同様にrootletinによってつくられる。本研究の目的は、これらの線維状構造の構築と機能を解明することである。線毛や中心体の構成分子に対する抗体を用いて免疫組織化学的に解析し、ARL13Aと類似のアミノ酸配列を有する分子がrootletin分子と相互作用している可能性が示唆された。RootletinはC-Nap1を介して基底小体に連結し、この連絡はNEK2によって阻害される。培養線維芽細胞を用いた解析で、細胞周期のM期に複製中心子が分離して移動する際に、striated rootletとstriatedconnectorはC-Nap1に結合した状態で小片化して基底小体から分離し、次いで消失すること、この小片にはNEK2が局在しないことを明らかにした。RootletinをsiRNA
電位依存性Na^+チャネルβ‐サブユニットの細胞接着分子としての新たな役割

電位依存性Na^+チャネルβ-サブユニットは、細胞接着分子特有の構造を持っている。本研究では、β-サブユニットの新たな生理機能を明らかにするため、その発現調節機構、細胞分化における役割、細胞内動態を解析した。ウシ副腎髄質細胞を、インスリン、IGF-1存在下で培養すると、細胞膜のNa^+チャネル数が増加した。このとき、α-サブユニットのmRNAレベルは増加したが、β_1-サブユニットのmRNAレベルは変化しなかった。ラット褐色細胞腫PC12細胞では、神経成長因子(NGF)による神経分化に伴い、β_1-サブユニットmRNAレベルは増加したがβ_3-サブユニットmRNAは変化しなかった。これらのことより、α-サブユニットと各β-サブユニットの発現調節機序は、異なっていることが明らかとなった。一方、β_1-サブユニットGFP融合遺伝子をHEK293細胞に導入すると、細胞膜に強く発現し、小胞体にも少量発現した。一方、β_2-サブユニットGFPは、細胞膜に強く発現し、この細胞は細胞膜から多数の微絨毛を伸ばした。β_3-サブユニットGFPは、細胞膜の他、核周囲の球状膜構造に強く発現しており、この細胞も微絨毛を伸ばした。よって、各サブユニットは、それぞれの細胞内輸送機序、また、細胞の形態形成や運動における機能が、異なっていることが明らかとなった。さらに、PC12細胞に各β-サブユニットGFP遺伝子を強制発現させると、NGF非存在下でも神経突起を伸ばした。その作用は、β_1より、β_2またはβ_3-サブユニットの方が強かった。各β-サブユニット-GFP発現PC12細胞の、NGFによる神経突起伸長作用は、対照に比べ強かった。以上のことから、各β-サブユニットは細胞分化を調節する機能を持っており、それぞれの細胞内輸送機序細胞膜発現機序は異なっていることが明らかとなった。Na^+チャネルは、イオンチャネルを形成するα-サブユニット単独で、またはβ-サブユニットと会合しヘテロ2量体もしくは3量体として発現している。本研究ではβ-サブユニットの新たな生理機能を明らかにすることを目的とし、その発現調節機構おける蛋白リン酸化酵素の役割と、細胞分化の影響を解析した。ウシ副腎髄質細胞を無血清培地で培養すると、^3H-サキトキシンの結合を指標として測定した細胞表面のNa^+チャネル数が、濃度依存的かつ時間依存的に増加した。無血清培養により、MAPキナーゼファミリーのうち、ERKのリン酸化レベルが低下したが、p38とJNKのリン酸化レベルは変化しなかった。さらに、ERKの阻害薬であるPD98059とU0126を血清存在下の培養細胞に添加する、と、Na^+チャネル数が増加した。無血清培養またはERKの阻害薬によりα-サブユニットのmRNAレベルは増加したが、β1-サブユニットのmRNAレベルは変化しなかった。よって、α-サブユニットとβ1-サブユニットの発現調節機序は異なっており、ERKの抑制はα-サブユニットの発現のみを上昇させることが明らかとなった。一方、ラット褐色細胞腫PC12細胞はβ-サブユニットファミリーのうちβ1-とβ3-サブユニットを発現していた。神経成長因子(NGF)による神経分化に伴い、β1-サブユニットmRNAレベルは増加したがβ3-サブユニットmRNAは変化しなかった。以上の結果から、β-サブユニットの発現は神経分化によって調節されており、その細胞内機序はERKの活性化に非依存的であることが示唆された。

電位依存性Na^+チャネルβ-サブユニットの生理的役割を明らかにしようとした。このため、強制発現させたβ-サブユニットGFP融合遺伝子の細胞内局在と、その細胞の形態変化、および細胞接着による神経伝達物質合成酵素レベルの変化を調べた。β1-サブユニットGFP融合遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、細胞膜に強く発現したが、小胞体にも発現した。一方、β2-サブユニットGFPは、細胞膜に強く発現したが、この細胞は細胞膜から多数の微絨毛を伸ばしていた。β3-サブユニットGFPは、細胞膜の他、核周囲の球状構造に強く発現しており、この細胞も微絨毛を伸ばしていた。よって、各サブユニットは、それぞれの細胞内輸送機序、また、細胞の形態形成や運動における機能が、異なっていることが明らかとなった。さらに、各β-サブユニットGFP遺伝子の安定発現HEK293細胞を作製した。PC12細胞と共培養し、β-サブユニットとの接着による、PC12細胞の性質の変化を調べた。神経分化の指標としてニューロフィラメント、カテコールアミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素、アセチルコリン合成酵素であるコリンアセチル転移酵素の蛋白レベルを測定した。しかしながら、各サブユニット発現細胞との共培養による、有意な変化は見られなかった。一方、PC12細胞に各β-サブユニットGFP遺伝子を強制発現させると、NGF非存在下でも神経突起を伸ばした。その作用は、β1より、β2またはβ3-サブユニットの方が強かった。各β-サブユニットGFP発現PC12細胞の、NGFによる神経突起伸長作用は、対照に比べ強かった。以上のことから、各β-サブユニットは細胞分化を調節する機能を持っており、それぞれの細胞内輸送機序、細胞膜発現機序は異なっていることが明らかとなった。
材料力学手法の環境負荷評価技術への応用

材料力学の代表的手法である構造解析と信頼性工学を取り上げ、機械製品のライフサイクルの環境負荷への適用性の評価を行った。これまでは、ライフサイクル評価手法は、個々のプロセスごとの環境排出物を積算することによって計算が行われてきたが、必ずしも数学的な取り扱いの厳密性は求めて来なかった。本研究では、材力手法の拡張からマテリアルのバランスを検討し、マトリックスを組み立てる定式化を行うことによって、連立一次方程式の解として環境負荷評価を行う枠組みを検討した。マトリックス法としての定式化を完成させた後に、構造解析で確立している有限要素法技術の導入を行った。この結果、計算効率が飛躍的に向上するばかりでなく、境界条件の不足についても見通しを与えることが可能となった。この結果、与えられた境界条件のもとで、解が求まるか否かの判断を純粋に数学的考察から検討することが可能となった。また、リサイクルのようなループが存在する場合に、従来法では繰り返し計算により収束するまで評価を行ってが、本手法の開発によってどのような条件が不足していることが原因であるかの見通しを得ることが実現された。さらに、ループが多重に存在しても容易に解析が実現できる。データやモデルの不確定性の取り扱いに対しては、信頼性工学手法を導入した。この結果、ライフサイクルアセスメント後に最終的に必要となる改善解析の際、感度解析を有効に活用できることを示した。マトリックス法の導入を確立したことにより、確率有限要素法の適用を実現し、感度分析の評価も容易となった。定式化に基づいてエクセル上のワークシート処理により、マトリックス法による環境負荷分析、感度分析、不確定性解析、影響度解析の一連の流れを実現した。開発したシステムを用いて、複写機、製鉄プロセスを例にインベントリ解析を実施し、システムの性能とともに、重要データの抽出まで実現できることを確認した。材料力学手法の応用可能性の検討既存の材料力学手法のうち、主に有限要素法と構造信頼性手法をとりあげ、環境問題への応用可能性を検討する。特に、環境関係の文献サーベイにより、手法としての類似性を明らかにした。マトリックス法の定式化材料力学手法の活用を容易にするため、環境負荷評価のためのライフサイクルアセスメント手法のマトリックスによる取り扱いを厳密に定式化した。この結果、マトリックスによる取り扱いが確立している有限要素法や、構造信頼性の各種手法の導入を可能とした。LCAにおける感度分析の定式化摂動法をベースとする確率有限要素法の手法をLCAに導入するための定式化を行うとともに、その応用可能性を検討した。これにより、システム全体で、環境負荷に最も大きな影響を与えている要素を特定できるとともに、優先的に集めるべきデータを特定することが可能となった。実際問題への感度分析の適用製鉄プロセスを対象として、定式化した感度分析手法を適用し、その有効性を検討した。その結果、通常のインベントリ解析とマトリックス法の結果が一致することを確認するとともに、感度値についても、問題なく算出できることを確認した。今後、重要要素の抽出と結びつけることが可能となることを示した。
企業の研究開発活動に基づく経済成長理論での賃金格差および特許政策の分析

現実経済において、企業の生産性(全要素生産性)、企業の規模(売上高・雇用者数)や技術の品質改善幅(学術論文や特許の引用数・特許のライセンス収入)はパレート分布に従う。パレート分布では、正規分布と比べて非常に大きな値を引く確率が大きい。つまり、非常に大きな企業の生産性・規模および非常に大きな技術の改善が、正規分布の想定よりも多く観測される。当該年度の研究では、技術の拡散現象に注目することで、このようなパレート分布を生み出す経済成長理論の開発を行った。現実の企業では他社の所有する技術・知識を学習することで、自社の生産性の改善を行う側面がある。このような技術の拡散によって、世界の最先端技術を身に着けて生産活動を行うことができる企業もいれば、一方では最先端技術からほど遠い技術を利用する企業もいるだろう。このような技術の拡散過程において、もし最先端技術を生産活動に利用することが極めて困難であれば、企業の生産性・企業規模・技術の改善幅はパレート分布に従うことを示した。さらに、上記の経済成長理論を特許政策分析へ応用する研究も行った。現実には、発明が特許権を取得するためには、特許庁の行う品質テストの最低合格ラインを超えなければならない。この最低合格ラインを引き上げると、特許の平均品質が下落する可能性があることを示した。すなわち、高品質な発明に特許権を付与するようなルールに変更すると、低品質な発明が特許を取得し始める。28年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度、本研究では、進歩性要件がイノベーションの量と質に与える影響を理論的に分析した。ある発明が特許権を取得するためには特許庁の定めた進歩性要件を満たす必要がある。進歩性を満たすためには、ある発明が先行技術と比べて十分に優れていなければならない。経済学的に言い換えると、進歩性とは、特許取得のために必要な財・サービスの最小品質改善幅のことである。つまり、企業の研究開発(R&D)活動による既存の財・サービスの品質改善の幅が、特許庁の設定した最小品質改善幅(進歩性)を超える技術進歩に対してのみ特許が付与される。以下では進歩性のことを最小品質改善幅と呼ぶこととする。本研究では、最小品質改善幅が総R&D投資量および特許を取得した技術の平均品質改善幅に与える影響を分析した。本研究により、最小品質改善幅と総R&D投資量の間に非単調もしくは負の関係があることが示された。さらに、最小品質改善幅の引き上げると、長期的に平均品質改善幅を引き下げるという逆説的な結論が導かれた。つまり、より優れた技術に対して特許を付与するようなルールに変更すると、平均的に品質の劣った技術が特許を取得し始める。このような最小品質改善幅と平均品質改善幅の関係は、Federal Trade Commission (FTC)およびNational Academy of Sciences(NAS)の期待する政策効果と異なる。FTCとNASは、アメリカの特許の品質向上のために、最小品質改善幅の上昇を提案していた。そして実際に、2007年のアメリカ最高裁判決により、アメリカの最小品質改善幅が引き上げられることになった。しかし本研究によると、最小品質改善幅引き上げが平均品質改善幅を下落させるため、FTCとNASの期待通りに最小品質改善幅の上昇がアメリカの特許品質を向上させるとは限らない。1.当初の計画では特許政策に関する理論分析を解析的に行うことが困難であると予想していたが、実際にはすべての分析を解析的に行うことができた。2.当初の計画では特許政策に関する論文を2015年度に査読付学術雑誌に投稿することが目標であったが、実際には2015年度中に査読付学術雑誌に掲載が決まった。当初の研究計画では、2016年度は賃金格差の研究に集中する予定でいた。しかし、2015年度に実施した特許政策に関する研究における企業の生産性(技術水準)分布が、実証研究で支持できない特性を持っていることが判明した。

したがって、2016年度では、賃金格差に関する研究だけでなく、生産性分布が現実経済と整合的となる理論モデルについて研究を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトアルドース還元酵素発現マウスを用いた糖尿病性自律神経障害の発症機構の解明

糖尿病性神経障害の発症におけるポリオール代謝の役割を解明するため、ヒトアルドース還元酵素(hAR)発現トランスジェニックマウス(Tg)を高血糖状態にし、Tgに生じた神経障害について解析した。対照にはhAR陰性マウス(LM)を用い、糖尿病群の半数にはAR阻害剤の投与を行った。経時的に血糖、体重、痛覚閾値、運動神経伝導速度(MNCV)の測定を行い、病期12週目で末梢神経、腹腔神経節を摘出した。腹腔神経節はグルタール固定エポン包埋標本を作製し、トルイジンブルー染色標本にて神経節細胞の形態計測を行った。凍結末梢神経標本を用いて、Na^+/K^+ ATPase活性、Protein kinase C(PKC)活性を測定した。その結果、痛覚閾値は、5週では正常群に比し、糖尿病Tg群で低下したが、9週以後は有意に延長した。MNCVは、糖尿病Tg群で、正常群、糖尿病LM群に比し有意に延長した。神経節の形態計測では、細胞横断面積が、糖尿病LM群で11%、糖尿病Tg群で28%、有意に低下した。膜分画のPKC活性は、正常群に比し、糖尿病LM群で13%、糖尿病Tg群で28%低下した。Na+/K+ ATPase活性は、正常群に比し、糖尿病LM群で46%、糖尿病Tg群で62%低下した。これらの変化をAR阻害剤は、糖尿病Tg群、糖尿病LM群共、有意に改善した。神経節の免疫染色では、高血糖、ポリオール代謝亢進と共に、PKCαの細胞質から膜への移動障害が認められた。以上、糖尿病Tgの神経では、主としてPKCα分画の変化に起因する有意なPKC活性低下、Na^+/K^+ ATPase活性低下が生じ、形態学的にも、自律神経節でヒト糖尿病と同様の細胞萎縮が生じることを示した。このことから、ポリオール代謝の亢進は、神経障害発症に重要な役割を果たしており、自律神経障害にも関与していると考えられた。TgおよびhAR陰性マウス(LM)を生後8週目にSTZ腹腔内投与により糖尿病とし、経時的に血糖、体重、痛覚閾値の測定を行った。病期12週目で、運動神経伝導速度(MNCV)、F波潜時を測定した後、末梢神経を摘出した。凍結保存した末梢神経標本を用いて、神経Na^+/K^+ATPase活性、神経protein kinase C(PKC)活性を測定した。腹腔神経節を含む大動脈周囲組織をグルタール固定し、エポン包埋標本を作製し、トルイジンブルー染色標本にて神経節細胞の形態計測を行った。痛覚閾値は、5週では正常群に比し、糖尿病Tg群で低下したが、9週以後は有意に延長した。MNCVは、正常群に比し、糖尿病LM群で22%、糖尿病Tg群で30%遅延した。F波潜時は、糖尿病Tg群で、正常群、糖尿病LM群に比し21%延長した。Na^+/K^+ATPase活性は、正常群に比し、糖尿病LM群で46%、糖尿病Tg群で62%低下した。膜分画のPKC活性では、正常群に比し、糖尿病LM群で13%、糖尿病Tg群で28%低下した。腹腔神経節の形態計測では、平均核横断面積に差はみられなかったが、平均細胞横断面積が、糖尿病LM群で11%、糖尿病Tg群で28%、有意に低下した。糖尿病Tgの神経では、有意なPKC活性低下、Na^+/K^+ATPase活性低下が生じ、形態学的にも、自律神経節でヒト糖尿病と同様の細胞萎縮を示した。このことから、ポリオール代謝の亢進は、神経障害発症に重要な役割を果たしており、自律神経障害にも関与している可能性が考えられた。今後、自律神経障害発症機構の解明およびARI投与による傷害抑制実験を行う予定である。

膜分画のPKC活性は、正常群に比し、糖尿病LM群で13%、糖尿病Tg群で28%低下した。Na+/K+ ATPase活性は、正常群に比し、糖尿病LM群で46%、糖尿病Tg群で62%低下した。これらの変化をAR阻害剤は、糖尿病Tg群、糖尿病LM群共、有意に改善した。神経節の免疫染色では、高血糖、ポリオール代謝亢進と共に、PKCαの細胞質から膜への移動障害が認められた。以上、糖尿病Tgの神経では、主としてPKCα分画の変化に起因する有意なPKC活性低下、Na^+/K^+ ATPase活性低下が生じ、形態学的にも、自律神経節でヒト糖尿病と同様の細胞萎縮が生じることを示した。このことから、ポリオール代謝の亢進は、神経障害発症に重要な役割を果たしており、自律神経障害にも関与していると考えられた。