hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＢＤプラズマアクチュエータによる平板後縁はく離流れの制御

本研究では,DBDプラズマアクチュエータ(Dielectric Barrier Discharge Plasma Actuator,DBDPAと呼ぶ)によって,平板の後縁付近に発生させた噴流が,速度分布に及ぼす影響を実験的に調べた.DBDPAへの入力電圧・周波数を変化させて誘起噴流の強さを制御した.DBDPAが強く発光する条件のときに,誘起噴流速度が最大となることをピトー管測定で明らかにした.DBDPAにより,後流中心付近の速度欠損を増速制御することが可能であること,それが噴流の向きに強く依存することが示された.本研究は,流れ場を制御するためのPlasma Actuator(PA)の誘起壁面噴流特性を明らかにしようとするものである.昨年度作成したPAを長平板の両側に発達する後縁近傍の乱流境界層に設置し,そのPAを駆動したときに発生する流れと並行で逆向きの壁面噴流が,長平板のはく離後の後流の発達に及ぼすを調査した.その際,印加電圧を変化させることで,誘起壁面噴流の速度を制御し,後流の速度分布への影響を把握した.具体的には,まず昨年度確立PAを塩化ビニール製の測定平板の両側に貼り付けることによって,スパン方向に一様なダブルジェットを,平板の両側に発生させた.このダブルジェットがある場合とない場合とで,後流の速度分布に変化が現れることを確認した.実験には,高電圧高周波パルス電源から,入力電圧・周波数をそれぞれ24kV・10kHzとして,PAによって発生する壁面噴流を発生させた.2.4kVで薄紫色の一様放電が現れ,2.6kVでは濃い紫色の一様放電となり,2.8kV以上ではかなり強い放電となった.近傍後流の測度分布は,PAを駆動した場合には,後流中心に近い長平板背後側で増速した.逆に,後流中新から主流側に少し離れた位置では,PAを駆動した場合には,後流は減速した.この位置は,測度分布の編曲点にあたり,乱流エネルギーの生成機構においても極めて大切な領域である.また,印加電圧を大きくすると,PA駆動による減速域が主流側に拡大することが見出された.「現在までの達成度」に記載の事情により、当該年度に実施した研究の成果はない。本研究では,DBDプラズマアクチュエータ(Dielectric Barrier Discharge Plasma Actuator,DBDPAと呼ぶ)によって,平板の後縁付近に発生させた噴流が,速度分布に及ぼす影響を実験的に調べた.DBDPAへの入力電圧・周波数を変化させて誘起噴流の強さを制御した.DBDPAが強く発光する条件のときに,誘起噴流速度が最大となることをピトー管測定で明らかにした.DBDPAにより,後流中心付近の速度欠損を増速制御することが可能であること,それが噴流の向きに強く依存することが示された.本研究は,流れ場を制御するためのPlasma Actuator(PA)の誘起壁面噴流特性を明らかにしようとするものである.1年目はPAへの印加電圧・周波数を変化させ,誘起壁面噴流の最適条件を把握した.具体的には,まずPAによる壁面噴流を生成するため,木製基板上に導電銅箔テープ(幅12.7mm×厚さ0.074mm)を貼り,これを埋設電極とする.次に,電極の一端に導電性布テープ(幅10mm×厚さ0.12mm)を貼り,グランド端子とする.続いて,電極の上からカプトンテープ(幅19mm×厚さ0.1mm)を複数枚貼り,これを誘電体とする.この上から,導電銅箔テープ(幅2mm×厚さ0.074mm)を貼り,これを露出電極とする.その一端に前述の導電性布テープを貼り,高電圧側端子とする.最後に,短絡防止用にカプトンテープで上部電極の両端と背面側とをシールしてPAが完成した.実験には,今回導入した高電圧高周波パルス電源を上記PAに接続し,入力電圧・周波数をそれぞれ310kV・440kHzの間で変化させて,PAによって発生する壁面噴流の速度vを自作のポリイミド製ピトー管(内径0.60mm×肉厚0.06mm)によって測定し,噴流の最適条件を決定した.PAによる壁面噴流速度を考慮した1.64.0m/sにおいて,ピトー管の速度係数が0.981.00であることを,一様流れ内での検定から確認した.実験結果として,まず噴流速度の印加電圧依存性(周波数を10kHzに固定)については,6kV以上で噴流速度の増加傾向が頭打ちし,6.5Vにおいてv=2.6m/sの噴流を得た.また,噴流速度の印加周波数依存性(電圧を4kVに固定)については,1525kHzにおいて強いプラズマの発光とともにv=2.8m/sの噴流が得られるが,6kHz以下と30kHz以上とでは十分な噴流は得られないことが分かった.本研究では,DBDプラズマアクチュエータ(Dielectric Barrier Discharge Plasma Actuator,PAと呼ぶ)によって,長い平板の後縁付近に発生させたダブルジェットが,後流の速度分布に及ぼす影響を風洞実験により調べることを目的とする.報告者はこれまでに,摩擦抗力が支配的な長平板の乱流境界層の発達に及ぼす受動制御を研究してきたが,これはその発展となる後流の能動制御である.

スパン150mmの試作PAへの印加電圧・周波数を変化させ,誘起壁面噴流の最適条件を把握した.本PAは,平板側に埋没された電極と気流側に露出した電極との間に誘電体を挟んだ構造である.高電圧高周波パルス電源をPAに接続し,入力電圧・周波数をそれぞれ310kV・440kHzの間で変化させて,PAによって発生する壁面噴流速度を自作のポリイミド製ピトー管によって測定し,噴流の最適条件を決定した.噴流速度の印加電圧依存性(周波数を10kHzに固定)については,6kV以上で噴流速度の増加傾向が頭打ちし,6.5Vにおいて2.6m/sの噴流を得た.また,噴流速度の印加周波数依存性(電圧を4kVに固定)については,1525kHzにおいて強いプラズマの発光とともに2.8m/sの噴流が得られるが,6kHz以下と30kHz以上とでは十分な噴流は得られない.風洞実験流路内の測定平板の後縁近傍の両側にスパン240mmのPAを貼り付け.電極間に2.6kV以上の,10kHzの交流電圧を印加することにより,PA近傍に強い発光を伴なう平板と平行なダブルジェットが生成される.これによって,後流中心付近の速度欠損が回復(増速)する.その増速効果は,下流に行くほど,流れに直交するy方向に広がることが明らかとなった.さらに,ダブルジェットを逆に下流向きに発生させると,増速領域が著しく広がる.流体工学風洞実験流路内の測定平板の後縁近傍にPlasma Actuator(PA)を貼り付け,それを駆動することで上流向きのダブルジェットを発生させ,結果として後流速度分布の制御が可能であることを実現したため.平成25年度に、平板後縁はく離流れの制御実験を行う予定であったが、当該年度に高等専門学校機構の在外研究員に採択されて渡航したため、本課題を平成26年度に延期することにした。平成26年3月19日付で本補助事業期間延長申請書が発行された。本研究の初年度の第一目標である,Plasma Actuator(PA)の誘起壁面噴流特性の解明を達成したため.PAの貼り付け位置や方向を工夫することで,後流速度分布がどのように変化するかを系統的に調査する.Plasma Actuator(PA)の貼り付け位置や方向を工夫することで、後流速度分布がどのように変化するかを系統的に調査する。PAを測定平板両面の後縁近傍に貼り付け,誘起壁面噴流の生成させ,PAによる境界層特性とはく離渦構造の変化を明らかにする.速度データから各種統計量を演算するための演算処理を自動化し,PAによる流れの制御効果を定量的に評価する.「現在までの達成度」に記載の事情により、平成25年度の支出実績がないため。速度データから各種統計量を演算する目的に使用する。次年度導入する1チャンネル熱線流速計システムを活用する.これと,既存の2チャンネル熱線流速計システムによる速度二成分の測定とを組み合わせた二点相関から,位相平均速度・位相変動強度・位相平均渦度を調べる.
大型レーザーを用いた重力不安定性の実験的研究：初期地球分化への応用

地球型惑星の重力不安定による核/マントル分離様式を解明することを目的として、本研究では高温高圧下における鉄合金融体の重力不安定性その場観察を行った。実験は鉄合金試料箔に大型レーザーを用いて重力を付加し、重力不安定による鉄試料の表面擾乱の時間変化をX線透過像から測定した。この結果、鉄合金試料は時間と共に表面擾乱が成長していることがわかった。さらに軽元素やケイ酸塩膜の有無により擾乱成長率に変化が生ずることが明らかとなった。本課題によって鉄合金融体の重力不安定による擾乱成長を初めてその場観察することに成功した。これより中心核形成過程およびタイムスケールに関する重要な知見を得ることが出来た。地球型惑星の中心核形成過程は、固体マントルと鉄合金融体との分離様式が形成過程に大きく影響する。密度の大きい鉄合金が軽い固体マントル上に溜まり重力不安定によって分離するプロセスが核形成の主要な分離過程として提唱されてきた。しかし実際の鉄合金を用いた実験報告例は皆無で、このメカニズムの実験的な検証が必要とされてきた。そこで本研究では、大型レーザーを用い試料加速により重力を付加し、レイリー・テイラー型重力不安定による鉄合金試料の表面擾乱の変化の観察を目的とした。さらに試料表面の擾乱成長速度を求め、地球核形成シナリオ及びタイムスケールに対する指標を得ることを目指す。26年度は、鉄試料を用いた実験を行い、実験条件および手法の最適化を実施した。実験手法:大型の激光XII号レーザーを使って試料加速により鉄試料に重力を付加し、重力不安定による試料表面擾乱変化の観察を行った。試料にはYAGレーザーで縞状の初期擾乱加工を施した。付加される重力方向(レーザー照射方向)と同じ向きからX線ストリークカメラを用いて透過X線による測定を行い、透過X線強度変化から擾乱振幅の時間変化を求めた。結果:鉄試料の測定条件の最適化を実施した後、鉄試料と鉄表面に珪酸塩膜を付加した試料の2種の試料を用いた。この結果、得られた試料の透過X線画像から擾乱の試料厚み変化に対応する明瞭な縞状のコントラストを確認できた。このX線透過強度比の時間変化を調べることで、擾乱形状変化を評価した。鉄試料については、X線透過強度比が時間と共に単調に増加し、擾乱が時間と共に成長する傾向が見られた。更に鉄の表面擾乱上に珪酸塩膜を施した試料では擾乱成長が抑えられていることがわかった。以上の結果から、本課題の測定によって鉄試料については高温高圧下での重力不安定による擾乱成長を観察することが可能となり、珪酸塩膜の効果も調べることができた。地球型惑星の中心核形成過程において、固体マントルと鉄合金融体との分離様式が形成過程に大きく影響する。固体マントル上に溜まった鉄合金が重力不安定により入れ替わる過程が理論的に支持されてきたが、これには実験的な検証が必要とされてきた。本研究では、大型レーザーを使って試料加速で重力を付加し、重力不安定による鉄合金試料の表面擾乱変化の観察を目的とし、擾乱成長速度から核形成タイムスケールに対する指標を得ることを目標とする。地球型惑星の核は鉄に加え軽元素を10%ほど含んでいる。このような軽元素は鉄の重力不安定性の成長率にも大きく影響する可能性がある。そこで27年度は、核中の有力軽元素のSiに注目し、Fe-Si合金の重力不安定性の観察を行った。本結果と昨年度の鉄の結果とを比較することで、擾乱成長率に対する軽元素の効果を明らかにできる。実験手法:大型レーザー(激光XII号レーザー)を使って試料加速により鉄箔試料に重力を付加し、重力不安定による鉄試料の表面擾乱変化の観察を行った。26年度に最適化した測定セットアップを用い、ドライブレーザー照射方向の対向にX線ストリークカメラを設置し、付加される重力方向と同じ向きから透過X線による測定を行った。透過X線強度変化から擾乱振幅の時間変化を求めた。試料にはFe-Si(Si=0-20 wt%)及び表面にForsterite蒸着を施した試料を用いた。結果:本課題で初期擾乱の波長・振幅の最適化により、擾乱に対応する明瞭な縞状のコントラストを確認できた。その結果、全ての組成において擾乱振幅が時間と共に成長していることがわかった。またSiを含む試料は、Fe試料に比べて擾乱振幅の時間変化の傾きが大きいことが明らかとなり、Siの効果が無視できないことが明らかとなった。以上の結果は、核形成タイムスケールを制約する上で極めて重要である。

当初予定していた計画通り、今年度は計測機器・実験条件の最適化を行い、鉄試料を用いた重力不安定性の観察を実施して擾乱成長を観察することができたため。具体的に測定の最適化については、鉄試料の表面擾乱成長観察のために、複数のドライブレーザー及び観測用X線発生レーザーに遅延をかけ、測定時間を延ばす工夫を行った。また試料の初期擾乱振幅を数種類準備し、その初期振幅の違いによる影響も評価した。測定方法についても、試料側面からの観測とドライブレーザーと同じ方向からの2方向からの測定をX線ストリークカメラとフレーミングカメラを用いてそれぞれ実施し、擾乱観察の評価を行った。結果として、概要に記述した手法が最適であると判断した。測定結果については、鉄試料については高温高圧下での重力不安定による擾乱成長を観察することが可能となり、珪酸塩膜の効果も調べることができた。高圧地球科学27年度は、26年度に最適化したX線ストリークカメラを用いた透過X線による測定から、Fe-SiやFe-Cといった鉄-軽元素試料を用いて、これらの試料表面の重力不安定による擾乱成長を観察する。得られた結果から、中心核に実際に含まれる軽元素(Si、C)の重力不安定性の成長率に与える効果を明らかにする。また鉄合金試料表面に蒸着する珪酸塩膜の厚みも変化させて、珪酸塩層の擾乱成長率に与える効果をより定量的に評価する。以上より、得られた重力不安定による擾乱成長率から、スケーリングを考慮し様々な核組成に対応する核形成タイムスケールを推定していく。
アルツハイマー病原因遺伝子プレセニリン1の頭蓋骨形成における役割

これまでに研究代表者は、神経堤細胞特異的プレセニリン1欠損マウス(Wnt1-cre-induced presenilin-1-cKO mice)を作製した。この遺伝子改変マウスでは、頭蓋骨肥大と胴体部の発育不全が認められた。そこで、当該マウスの病態を解析して体の発育並びに頭蓋骨形成過程におけるプレセニリン1の役割を解明し、頭蓋骨形成制御機構の一端を明らかにする試みを開始した。平成18年度の研究では、出生直後の当該マウスで頭蓋骨の形態に大きな異常が認められないことが明らかになった。また、神経堤由来細胞の移動について検討したが、頭蓋冠への移動を含めて当該マウスでは明らかな異常は認められなかった。即ち、当該マウスの形態異常は頭蓋骨形成不全を原発とするものでない可能性が示唆された。平成19年度の研究では、発育不全・骨形成不全を二次的に招く何らかの異常が当該マウスの病態の成因であると考え、内分泌系に注目して解析を行った。視床下部-下垂体系は内分泌系の中心であり、下垂体前葉は咽頭の上壁から生じるラートケ嚢を経て神経堤細胞から発生することが知られている。まず、当該マウスの体重の変化を詳細に調べたところ、約50%の確立で3週齢頃までに頭蓋骨肥大に加えて低体重が顕著となった。次に、成長ホルモン分泌不全症との関連性を探る目的で血中成長ホルモン濃度の測定を試みたが、対照を含めて検出限界以下であった。しかし、成長ホルモンの下流で発現制御を受けるIGF-Iの血中濃度では低体重の変異マウスで明らかな低下傾向が認められた。さらに、低体重の変異マウスの下垂体を調べたところ前葉部分で明らかな低形成が認められ、組織学的にも前葉構成細胞の細胞体の萎縮が確認された。下垂体前葉ホルモン(GH,TSH,ACTH,FSH,LH,PRL)の免疫組織化学及び定量的RT-PCR解析に関しては今後の検討課題としたい。神経堤細胞特異的プレセニリン1欠損マウス(Wnt1-cre-induced PS1-cKO mice)を作製したところ、胴体部の発育不全と頭蓋骨肥大(特に頭頂骨の肥大)が認められた。頭蓋顔面骨は、由来の異なる間充織細胞から膜性骨化の過程を経て形成される。一部の間充織細胞は中胚葉に由来し、それ以外の間充織細胞は神経堤に由来する。咽頭弓から分化する上顎・下顎骨や舌骨、歯などは神経堤細胞に由来する。頭蓋冠は主に前頭骨と頭頂骨で構成されるが、前者は神経堤細胞に由来し、後者は中胚葉に由来する。しかし、神経堤細胞に由来する髄膜が頭頂骨の直下に位置しており、中胚葉由来の頭頂骨の成長にも神経堤由来の髄膜細胞が影響を与えるとする報告があり、神経堤に由来する細胞が頭蓋冠全体の形成・成長に大きな影響を与えていると考えられる。申請者が作製した神経堤細胞特異的プレセニリン1欠損マウスでは胴体部の発育不全と頭蓋骨肥大が認められるが、頭蓋骨肥大に関しては、上記の理由により、プレセニリン1欠損神経堤由来細胞の機能不全が直接の原因である可能性が考えられた。そこでまず、出生する時期まで当該変異マウスの頭蓋骨形成が正常に進んでいるか否かについて、アルシアンブルー・アリザリンレッドによる生後1日マウスの骨・軟骨のホールマウント染色を行った。

頸部から後頭部にかけての軟骨の一部に形成不全が認められたが、頭頂骨形成に関して異常は全く認められなかった。次に、CAG-CAT-Zレポーターマウスを交配し、神経堤由来細胞系列を追跡できる実験系を構築した。当該変異マウスの神経堤由来細胞の移動について検討したが、頭蓋冠への移動を含めて明らかな異常は認められなかった。以上の結果より、当該変異マウスの異常は頭蓋骨形成異常を主因とするものではないことが示唆された。今後は、当該変異マウスについて内分泌系異常の可能性を含めて検討範囲を広げる計画である。これまでに研究代表者は,神経堤細胞特異的プレセニリン1欠損マウス(Wnt1-cre-induced presenilin-1-cKO mice)を作製した。この遺伝子改変マウスでは,頭蓋骨肥大と胴体部の発育不全が認められた。そこで,当該マウスの病明らかにする試みを開始した。昨年度までの研究で,出生直後の当該マウスでは頭蓋骨の形態に大きな異常が認められないことが明らかになった。また,神経堤由来細胞の移動について検討したが,頭蓋冠への移動を含めて当該マウスでは明らかな異常は認められなかった。即ち,当該マウスの形態異常は頭蓋骨形成不全を原発とするものでない可態を解析して体の発育並びに頭蓋骨形成過程におけるプレセニリン1の役割を解明し,頭蓋骨形成制御機構の一端を能性が示唆された。そこで本年度は,発育不全,骨形成不全を二次的に招く何らかの異常が当該マウスの病態の成因であると考え,内分泌系に注目して解析を行った。視床下部-下垂体系は内分泌系の心であり,下垂前葉は咽頭の上壁から生じるラートケ嚢を経て神経堤細胞から発生することが知られている。まず,当該マウスの体重の変化を詳細に調べたところ,約50%の確立で3週齢頃までに頭蓋骨肥大に加えて低体重が顕著となった。次に,成長ホルモン分泌不全症との関連性を探る目的で血中成長ホルモシ濃度の測定を試みたが,対照を含めて検出限界以下であった。しかし,成長ホルモンの下流で発現制御を受けるIGF-Iの血中濃度では低体重の変異マウスで明らかな低下傾向が認められた。さらに,低体量の変異マウスの下垂体を調べたところ前葉部分で明らかな低形成が認められ,組織学的にも前葉構成細胞の細胞体の萎縮が確認された。下垂体前葉ホルモン(GH,TSH,ACTH,FSH,LH,PRL)の免疫組織化学および定量的RT-PCR解析に関しては今後の検討課題としたい。
サツマイモ野生2倍体種の自家不和合性における自他認識因子の決定

サツマイモ野生2倍体種は胞子体型自家不和合性を示し、S候補遺伝子としてAB2、SE2、SEAが同定されている。雄側S遺伝子を決定するために、S1-AB2ペプチドを合成して受粉時に供するバイオアッセイを行ったところ、S1柱頭にS1-AB2ペプチドを処理した際にS3花粉が拒絶されたことから、AB2が雄側のS遺伝子である可能性が強く示唆された。雌側S遺伝子を決定するためにS1-S候補遺伝子をS10系統に導入したが交配実験には至らなかった。そこで自家不和合性系統4系統と自家和合性系統2系統のI.trifidaとI.nilのS遺伝子座を比較したところ、SEAが雌側のS遺伝子である可能性が強く示唆された。自家不和合性を示す植物では、雌雄の生殖器官が正常に発達するにも関わらず、自殖および同一の自家不和合性表現型(S表現型)を示す個体間で受粉したとしても種子は得られない。サツマイモ野生2倍体種を含むヒルガオ科植物は胞子体型自家不和合性を示すが、同型のアブラナ科植物の自家不和合性において自他認識に直接的に関わる因子をコードする遺伝子(S遺伝子)とは異なる遺伝子が機能している。本研究ではサツマイモ野生2倍体種のS遺伝子を決定する。雄側S候補遺伝子がコードするAB2タンパク質の部分ペプチドを合成して受粉時に供するバイオアッセイの実験では、S1-AB2の部分ペプチドをS1表現型の柱頭に予め処理し非自己の花粉を受粉した際に、花粉管発芽の抑制傾向が示された。このことから雄側のS遺伝子はAB2である可能性が強く示唆されたが、これで得られる情報は間接的なものでしかなく、直接的な証拠を得るためには、形質転換体の作出が必要不可欠である。これまでに、各S候補遺伝子に関しては、複数の選択的スプライシング産物が確認されたため、cDNAを導入することは非常に困難である。そこで、S1およびS10ホモ型系統の各S候補遺伝子に関して、約2kbpのプロモーター領域、コード領域(イントロンを含む)、1kbp以上のターミネーター領域を含むゲノムクローンをPCRにより増幅(4.58.5kbp)し、一旦、大腸菌のプラスミドベクターに組み込み、各クローンの両末端の配列を確認した後にバイナリーベクターに導入した。構築した遺伝子は、アグロバクテリウムを介してサツマイモ野生種に導入するが、これまでに、一部系統において、成長点培養により胚性カルスの誘導ができることが確認された。今後、これらに対して遺伝子導入を行って得られる形質転換体の自家不和合性表現型について検討を行う。自家不和合性は、雌雄の生殖器官が正常に発達するにも関わらず、自殖および同一の自家不和合性表現型(S表現型)を示す植物間の交配では種子が得られない他殖促進の機構である。サツマイモ野生2倍体種を含むヒルガオ科植物は胞子体型自家不和合性を示すが、同型のアブラナ科植物の自家不和合性とは異なる遺伝子が機能している。本研究ではサツマイモ野生2倍体種のS遺伝子を決定すべく、既知のS候補遺伝子からS遺伝子の絞り込みを行う。雄側S候補遺伝子産物であるAB2タンパク質の部分ペプチドを合成して受粉時に供するバイオアッセイの実験により、AB2が自己花粉の花粉管伸長を抑制する傾向が認められ、AB2が雄側のS候補遺伝子である可能性が示唆されたが、AB2が雄側のS遺伝子であることの直接的証明、ならびに雌側のS候補遺伝子の同定に至ることはできない。そこで、サツマイモ野生2倍体種のS候補遺伝子を導入した形質転換体の作出を試みた。サツマイモ野生2倍体種への遺伝子導入実験に関する報告は僅かであり、しかも成長点由来カルスに対する導入実験のみが報告されている。そこで今回改めて、各器官に由来するカルスに対しての形質転換系の確立を試みた。サツマイモ野生2倍体種の成長点、葉片、葉柄、根、茎からのカルス誘導を試みたところ、既報に記された成長点に由来するカルスのみならず、葉片、葉柄からの旺盛なカルス形成が認められた。遺伝子導入カルスについては再分化に向けた培養を継続しているが、再分化効率が極めて低い状況にある。既報に基づくと、サツマイモ野生2倍体種及び栽培種の再分化においてはGA3及びABAの施用が効率的であるとされているが、他の植物の形質転換系ではサイトカイニン類の施用が常法であることから、現在検討を進めている。当初予定では、S候補遺伝子のcDNAをセンス方向に導入した形質転換体を作出し、自家不和合性の表現型の解析を進める予定であったが、各S候補遺伝子に関しては、複数の選択的スプライシング産物が確認されたことから、各S候補遺伝子に関してプロモーター領域からターミネーター領域までのゲノムクローンの単離を行うこととした。当初予定のまま進めていた場合には、真に機能する選択的スプライシング産物由来のcDNAを導入しなければ自家不和合性の表現型の変化を観察できなかった可能性が非常に高く、実験方法の変更により対処できるものと考えている。S候補遺伝子を導入したサツマイモ野生2倍体種の作出のためには、成長点由来の胚性カルスを誘導しなければならないが、一部系統においては、比較的効率的に胚性カルスが誘導できることが、昨年度の実験から明らかになった。

また、成長点以外の組織からも胚性カルスの誘導が確認され、遺伝子導入の対象が大幅に広がり、今後、効率的な形質転換系が確立できると考えている。サツマイモ野生2倍体種の自家不和合性は直線的な優劣性関係を示しているため、S1-S候補遺伝子を導入する際には、より劣性側の系統を使用する必要がある。現有のSホモ型系統への遺伝子導入効率も検討したところ、激しい系統間格差が認められた。今後の形質転換体の作出においては、系統毎の遺伝子導入条件および培養条件の検討が必要であるが克服できると考えている。高等植物の自家不和合性においては雌雄の生殖器官が正常に発達するものの、自殖または同一自家不和合性表現型(S表現型)の個体間での交配では種子が得られない。サツマイモ野生2倍体種は胞子体型自家不和合性を示し、雄側のS候補遺伝子としてAB2、雌側のS候補遺伝子としてSE2とSEAがそれぞれ同定されているが、S遺伝子を決定する直接的証拠を得るには至っていない。そこで各S候補遺伝子を導入した形質転換体の作出を行い、導入遺伝子の効果の検証を試みるべく実験を行ったが、サツマイモ野生2倍体種の形質転換効率は非常に低いものであった。そこで培養条件の検討を進めると共に、カルス誘導の際の初発器官(成長点、葉柄、葉身等)間の差異、サツマイモ野生2倍体種の系統間差異について検討し、最適な培養条件、初発材料、系統を見出した。導入遺伝子については、各S候補遺伝子の2kbp前後のプロモーター並びにターミネーターを含む領域をPCRで増幅しバイナリーベクター上に導入したセンスコンストラクト、各S候補遺伝子のノックアウトを行うためのガイドRNAとCRISPR/Cas9の遺伝子をバイナリーベクター上に導入したゲノム編集コンストラクトを作成た。これまでに、これらを導入した形質転換個体が得られたため、今後これらの開花促進を行い、交配によって導入遺伝子の効果を確認する。また、一方で、これまで明らかにしたS1及びS10-S遺伝子座の配列に加え、新たにS3及びSc(自家和合性系統)のS遺伝子座の配列を決定した。これら配列の比較検討を行ったところ、S候補遺伝子のうち雄側のAB2と雌側のSEAは全ての自家不和合性系統(S1, S10, S3)で維持されており、全てのS候補遺伝子が自家和合性系統で機能していなかったことから、AB2とSEAがS遺伝子の最有力候補となった。当初予定では平成28年度内にS遺伝子の決定を行う予定であったが、形質転換体の獲得に予想以上に時間がかかり、研究期間の延長を行った。サツマイモ野生2倍体種の形質転換については研究報告例が極めて少なく、培養条件、カルス誘導の際の初発器官(成長点、葉柄、葉身等)間の差異、サツマイモ野生2倍体種の系統間差異について検討せざるを得なかったが、約1年間の検討により、最適な培養条件、初発器官、系統を見出すことができた。現在、確立した条件に基づき、S候補遺伝子のセンスコンストラクト並びにゲノム編集コンストラクトを導入した形質転換体が得られつつある状況で、今後、得られた再分化個体の開花促進を行い、形質転換体間ならびに非形質転換体との交配を行うことで導入した遺伝子の効果を検討し、S遺伝子の決定を行う予定である。形質転換体獲得に時間が要することが年度当初に予想されたため、複数系統のS遺伝子座配列を比較することで研究目的を達成できないかと考え、新たにS3系統とSc(自家和合性)系統のS遺伝子座配列を決定し、既知のS1, S10-S遺伝子座と比較検討した。
ハイスループットフェノタイピングに向けた植物群落ファンクショナルイメージング

本研究では、植物の表現型解析(フェノタイピング)において、植物の光合成や生産力などの機能形質の評価を可能にする、群落を対象とした画像解析手法を開発することを目的とする。特に、安価な計測・撮影機器を利用し、クロロフィル蛍光や光化学分光反射指数の画像計測と葉面受光強度分布画像解析を組み合わせて、群落表面におけるPS2量子収率・電子伝達速度などの情報を高速に取得することで、育種分野だけでなく、スマート農業分野において有用となる手法の開発をめざす。
漢方薬の抗認知症効果を担う脳内薬効メディエータに関する研究

本研究は,認知症モデル動物を用い,釣藤散,抑肝散および冠元顆粒の抗認知症効果を明らかにした。さらにこれらの薬物の効果には学習記憶に重要なコリン神経系や神経可塑性シグナリング系の亢進に加え,血管内皮細胞成長因子VEGFや血小板由来栄養因子PDGF系が関与することが示唆された。VEGF/PDGFとそれらの受容体は,大脳皮質神経細胞中ではNMDA受容体と共発現していることも明らかになり,これらの因子が上記漢方薬の薬効メディエータとして働く可能性が推測された。本研究は,釣藤散を中心に漢方薬の抗認知症効果に関わる脳内メディエータを単離同定し、その機能を解明することにより老年期認知症の臨床治療に「即応用」可能な新規の方法論を創出することを目的とする。本年度は老化促進マウス(SAMP8)を用い,脳虚血障害と老化要因を併せ持つ認知症病態モデルの作製及び本モデルにおける漢方薬釣藤散の効果を検討した。20週齢雄性SAMP8の両側総頸動脈を20分間結紮後,再灌流した(SAMP8-T2V0)。SAMP8の対照群にはSAMR1を用いた。手術3日後より薬物投与を開始し,投与開始の2週間後より行動試験を行った。行動試験のうち,学習記憶行動は水迷路試験で,情動行動は高架式十字迷路試験で評価した。偽手術SAMP8群(SAMP8-sham)ではSAMR1群と比べ有意な学習記憶障害が発現した。SAMP8-T2V0群の学習記憶障害はSAMP8-shamと比べに悪化傾向がみられたが,統計的に有意ではなかった。釣藤散(750mg/kg/日)投与により,SAMP8-shamおよびSAMP8-T2V0群の学習記憶障害は何れも有意に改善された。一方,SAMP8-shamおよびSAMP8-T2V0群ではSAMR1と比べ,不安情動行動の有意な低下が認められた。不安情動レベルの低下は釣藤散(750mg/kg/日)投与により改善されたが,漢方薬冠元顆粒(100mg/kg/日)は無効であった。以上から,釣藤散は老年期認知症の中核症状や周辺症状にも有効である可能性が示唆され,釣藤散処置動物の脳組織を抗認知症効果の脳内メディエータの探索に利用可能と判断された。また予備試験から,環境刺激が釣藤散と同様に脳虚血動物の学習記憶障害を改善し,その効果に血管内皮増殖因子系(VEGF)の関与が示唆された。このことから,VEGFが脳内メディエータ候補の一つになり得ると推測された。本研究は,釣藤散を中心に漢方薬の抗認知症効果に関わる脳内メディエータを単離同定し,その機能を解明することにより老年期認知症の臨床治療に「即応用」可能な新規の方法論を創出することを目的とする。釣藤散処置により認知障害が改善された学習記憶障害モデル動物である老化促進マウス(SAMP8)を用い,学習記憶に重要な脳内神経可塑性に関与する因子,即ちNMDA受容体(NMDAR),カルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素(CaMKII)等のリン酸化,および血管内皮細胞増殖因子VEGFとその受容体蛋白発現に及ぼす釣藤散の影響を検討した。対照動物SAMR1群と比べ,SAMP8群では有意な認知障害とNMDAR,CaMKII,サイクリックAMP応答配列結合タンパク質(CREB)のリン酸化及び脳由来神経栄養因子(BDNF)レベルの低下が認められた。また一過性脳虚血処置したSAMP8 (SAMP8-T)群では軽度ではあるものの,学習障害の有意な増悪が観察された。一方,釣藤散投与(750mg/kg/day、経口)は,SAMP8群およびSAMP8-T群の認知障害および脳内NMDAR,CaMKII,及びCREBのリン酸化体レベルおよびBDNFレベルを何れも有意に回復させることが明らかになった。更にSAMP8及びSAMP8-T群では血管新生や神経再生に関与する血管内皮細胞増殖因子VEGFとその受容体VEGFR2の発現量が有意に低下していることおよび釣藤散投与によって有意に回復することも明らかなった。更に心血管系障害改善作用を有する漢薬の冠元顆粒(100mg/kg/day,経口)投与によっても釣藤散と類似した抗認知症効果とVEGF系に対する改善作用が認められた。以上の成績から,漢方薬の抗認知症効果発現における薬効メディエータとしてVEGF系が重要な役割を担う可能性が示唆された。

これまでに我々は,虚血処置を施した老化促進動物SAMP8を用い,漢方方剤の釣藤散や漢薬の冠元顆粒の抗認知症効果には神経可塑性シグナリング系および血管内皮細胞成長因子VEGF系が関与することを示唆し,薬効メディエータとしてのVEGFの可能性を明らかにした。最終年度はVEGFファミリーに属する血小板由来成長因子PDGF系と認知障害との関連並びに釣藤散投与の影響を検討した。またこれらの成長因子(VEFG,PDGF)と神経可塑性シグナリング系の起始部に相当するNMDA型グルタミン酸受容体(NMAR)との共存性についても検討した。ウエスタンブロット法により脳内PDGF-A及びその受容体PDGFRαの発現レベルを測定した結果,認知行動障害を呈したSAMP8ではそれらの発現量が有意に低下していることが明らかになった。一方,釣藤散(750mg/kg/day)処置によって認知行動障害が改善されたSAMP8群では,PDGF-A及びPDGFRα発現量の有意な回復が認められた。これらの成績は,VEGF及びVEGF受容体(VEGFR)に関する前年度の結果と一致し,釣藤散の抗認知症効果にVEGF及びPDGF系が関わる可能性を示唆する。更に免疫組織化学的検討を行った結果,VEGF及びPDGFは何れもNMDARIを発現する大脳皮質神経細胞中に共発現しているだけでなく,VEGFR及びPDGFRαもNMDARIと共存していることが明らかになった。これらの成績から,釣藤散や冠元顆粒の抗認知症効果にはVEGF/VEGFR及びPDGF-A/PDGFRα(チロシンキナーゼ型受容体)シグナリング系を介したNMDA受容体の機能修飾機構が存在する可能性が高いと推測された。
タンニンの網羅的解析と遺伝子組換えによるユーカリの新規アルミニウム耐性機構の解明

ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis)は、酸性土壌で問題となるアルミニウム過剰害に強い耐性を示す。我々は、ユーカリのアルミニウム耐性機構として、根に侵入したアルミニウムを加水分解性タンニン(以下、タンニン)が無毒化するという新しい機構を提唱している。この新機構の全体像を理解するために、本研究は以下の二つを目的とする。(1)種々のタンニンがアルミニウム無毒化に果たす役割を明らかにするために、ユーカリに含まれるタンニンを網羅的に探索し、それらのアルミニウム無毒化能を調べる。(2)タンニンがアルミニウム耐性に必須である直接的な証拠を示すために、タンニン量を減らした遺伝子組換えユーカリを作出し、アルミニウム耐性を非組換えユーカリと比較する。ユーカリの根と葉に含まれるタンニン類を、溶媒抽出法および各種カラムクロマトグラフィーによって分離・精製した。単離したタンニンの化学構造を、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)、ESI-HR-MS(エレクトロスプレーイオン化高分解能質量分析法)、NMR(核磁気共鳴)分光法を用いて解析した。その結果、根からは、β-グルコガリン(β-glucogallin)、1,6-ジガロイルグルコース(1,6-digalloyl glucose)、テリマグランジンI(tellimagrandin I)、ペドゥンクラジン(pedunculagin)、エノテインB(oenothein B)の5種類のタンニンが同定された。葉からは、根に含まれる5種類のタンニンに加え、ストリクチニン(strictinin)が単離・同定された。また、タンニン量が少ない遺伝子組換えユーカリの作製に向けて、ユーカリの胚軸由来カルスから植物体が再生できることを確認するとともに、ベクターDNAの作製に着手した。計画通り、ユーカリが含む加水分解性タンニンを同定し、遺伝子組換え用ベクターDNAの作製に着手したので「おおむね順調に進展している」とした。計画通り、ユーカリが含む加水分解性タンニンを定量し、タンニン生合成遺伝子の発現を抑制した遺伝子組換えユーカリの作出する。
ハニカム構造新量子液体の実現と素励起研究

近年ハニカム(蜂の巣)格子上で厳密解としてキタエフ模型が提唱され着目されている。量子スピン液体は、古典秩序変数によらないトポロジカルな量で特徴づけられるが、この模型上ではマヨラナ準粒子を検出することでスピン液体を実在性を証明することができる。ただし、「真のキタエフ液体物質」は未発見であるから、本課題では量子磁性研究が未開拓のランタノイド擬スピン1/2ハニカム構造化合物を主対象とし、最先端超高圧測定と薄膜形成技術を駆使して新キタエフ液体相と周辺相図を開拓する。更には、マヨラナ物理の証拠を掴むため、新量子液体及びプロトタイプ量子液体H3LiIr2O6での孤立マヨラナ準粒子の検出を初の試みとして行う。
P. gingivalisバイオフィルム剥離に関わる新規プロテアーゼの解明

心内膜炎、動脈硬化、冠状動脈疾患等において歯周病細菌によるバイオフィルムが病変部位より検出されることが知られている。歯周病患者の8割以上に生息している主要な歯周病細菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)の分泌タンパクには、強い病原性を持つAggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)の形成したバイオフィルムを剥離する働きがあることを見出した。一方でStreptococcus gordoniiによってPgのバイオフィルム形成阻害されることが報告されている。本研究では、心疾患において検出されるPgバイオフィルムが他の主要な歯周病細菌によって、どのように口腔内バイオフィルムから剥離され血流に乗っているのかを解明していくことを目的とする。各種細菌の培養上清中のプロテアーゼについてPgバイオフィルム剥離効果、凝集阻害効果を測定し、剥離効果のあった培養上清中のプロテアーゼを同定する。Pgの付着、凝集阻害因子に対してプロテオーム解析を行い、目的タンパクを同定する。歯周病細菌のある病原性を担うタンパクについて同定することから始まるので、タンパクの分画や抽出を迅速に行う必要があると考えている。また、菌の持つタンパクは、これまでの研究から単量体ではなく複合体を形成して高分子タンパクを形成している可能性があると考えられるため、SDS-PAGEと合わせて2D-PAGEにて分画を行うことにより複雑なバイオフィルム構造の解明に繋がり、慢性歯周炎の進行を阻止し、全身疾患に波及する歯性病巣感染の機序解明と効果的な予防法へと貢献するものと考えている。昨年度は96wellマイクロタイタープレート内に各線毛型のPgバイオフィルムを作成し、Td、Tf、Piの培養上清で処理し、バイオフィルム剥離試験を行った。予想通り線毛型によってバイオフィルム形成量、凝集量に差があったが、予想以上に差があり剥離効果、凝集阻害効果の検証をすることに時間がかかっていた。そこで今年度それぞれの培養上清の濃縮等も検討に入れて実験系を再構築した。限外濾過のより濃縮、分画を行った所、複数の分画において剥離効果が認められた。これにより剥離因子の蛋白が複数あることが示唆され蛋白が複合体または単量体を形成している可能性を考慮に入れて実験を進めていく必要があったため予定よりやや遅れている。剥離試験、凝集阻害試験を継続して行い、剥離因子、凝集阻害因子の解明に努める。また、特定のプロテアーゼインヒビターを用いてそれぞれの濃縮分画における剥離試験を行い影響のあるプロテアーゼの種類を特定する。Pgバイオフィルム表面形態の変化をSEMにて評価する。各株の培養上清を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、フラクション毎にPg剥離試験を行う。目的タンパクを各フラクションごとに回収し、2D-PAGEにて分離同定。アミノ酸配列解析後、遺伝子変異株により剥離、凝集阻害実験を行い、目的タンパクの解明を継続する。96wellマイクロタイタープレート内に各線毛型のPgバイオフィルムを作成し、Td、Tf、Piの培養上清で処理し、バイオフィルム剥離試験を行った。予想通り線毛型によってバイオフィルム形成量、凝集量に差があったが、予想以上に差があり剥離効果、凝集阻害効果の検証をすることに時間がかかっている。それぞれの培養上清の濃縮等も検討に入れて実験系を再構築しているため進捗状況が想定よりやや遅れている。

本研究では、心疾患において検出されるPgバイオフィルムが他の主要な歯周病細菌によって、どのように口腔内バイオフィルムから剥離され血流に乗っているのかを解明していくことを目的とする。各種細菌の培養上清中のプロテアーゼについてPgバイオフィルム剥離効果、凝集阻害効果を測定し、剥離効果のあった培養上清中のプロテアーゼを同定する。Pgの付着、凝集阻害因子に対してプロテオーム解析を行い、目的タンパクを同定する。歯周病細菌のある病原性を担うタンパクについて同定することから始まるので、タンパクの分画や抽出を迅速に行う必要があると考えている。また、菌の持つタンパクは、これまでの研究から単量体ではなく複合体を形成して高分子タンパクを形成している可能性があると考えられるため、SDS-PAGEと合わせて2D-PAGEにて分画を行うことにより複雑なバイオフィルム構造の解明に繋がり、慢性歯周炎の進行を阻止し、全身疾患に波及する歯性病巣感染の機序解明と効果的な予防法へと貢献するものと考えている。昨年度は96wellマイクロタイタープレート内に各線毛型のPgバイオフィルムを作成し、Td、Tf、Piの培養上清で処理し、バイオフィルム剥離試験を行った。予想通り線毛型によってバイオフィルム形成量、凝集量に差があったが、予想以上に差があり剥離効果、凝集阻害効果の検証をすることに時間がかかっていた。そこで今年度それぞれの培養上清の濃縮等も検討に入れて実験系を再構築した。限外濾過のより濃縮、分画を行った所、複数の分画において剥離効果が認められた。これにより剥離因子の蛋白が複数あることが示唆され蛋白が複合体または単量体を形成している可能性を考慮に入れて実験を進めていく必要があったため予定よりやや遅れている。今後は剥離試験、凝集阻害試験を同時並行で行い、剥離因子、凝集阻害因子の解明に努める。また、特定のプロテアーゼインヒビターを用いて剥離試験を行い影響のあるプロテアーゼの種類を特定する。Pgバイオフィルム表面形態の変化をSEMにて評価する。各株の培養上清を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、フラクション毎にPg剥離試験を行う。目的タンパクを各フラクションごとに回収し、2D-PAGEにて分離同定。アミノ酸配列解析後、遺伝子変異株により剥離、凝集阻害実験を行い、目的タンパクの解明していく。剥離試験、凝集阻害試験を継続して行い、剥離因子、凝集阻害因子の解明に努める。また、特定のプロテアーゼインヒビターを用いてそれぞれの濃縮分画における剥離試験を行い影響のあるプロテアーゼの種類を特定する。アミノ酸配列解析後、遺伝子変異株により剥離、凝集阻害実験を行い、目的タンパクの解明を継続する。
催眠薬代謝物の合成，分析及び催眠薬代謝に対する法医学的アプローチ

睡眠薬クアゼパムを服用していた死者の胆汁、尿、血液からクアゼパム及びその代謝物を定量した。胆汁には一部の代謝物が非常に高い濃度で含まれていた。さらに、胆汁中に新たな代謝物を発見した。睡眠薬ゾルピデムを服用していた死者の胆汁、尿について、ゾルピデム代謝物を分析したところ、既知の代謝物の他にピリジン環が水酸化された代謝物が発見された。睡眠薬トリアゾラムの水酸化体のグルクロン酸抱合体を合成し、これを標準品としてトリアゾラム服用者の尿から直接抱合体を検出することに成功した。クアゼパムを服用した死者から得られた血液、尿、及び胆汁に含まれるクアゼパムとその代謝物の定量分析を行った。その結果、胆汁に3-ヒドロキシ-2-オキソクアゼパムが高濃度で蓄積されていることが分かった。さらに、胆汁にはクアゼパム由来の他の新規代謝物が高濃度に蓄積されていた。これらの代謝物は薬物を摂取した後に腸肝循環し、その結果長い間体内に留まっている可能性がある。これらの代謝物は、薬物を摂取して長時間経過した場合でも薬物使用を証明できる可能性がある他、薬物の連続使用を証明できる可能性があり、排泄、消失時間などの特徴を詳細に調査する必要があると考えられた。トリアゾラム、アルプラゾラムの尿中主要代謝物である、α-ヒドロキシトリアゾラム(HT)、α-ヒドロキシアルプラゾラム(HA)のグルクロン酸抱合体を合成した。まず合成前駆体としてHT、HAがグラム単位で必要である。HT及びHAはそれぞれ相当する2-アミノベンゾフェノンから、4ステップで合成できた。続いてグルクロン酸部分を導入するため、保護基を有するグルクロン酸のトリクロロアセトイミデートを合成した。グルクロノラクトンをメタノール中NaOMeで処理した後、ピリジン存在下塩化イソブチリルと反応させて1,2,3,4-テトラ-O-イソブチリル-β-D-グルクロン酸メチルを得た。さらに、トリブチルスズメトキシドを作用させて1位のイソブチリル基を脱離させた後、トリクロロアセトニトリルと反応させて2,3,4-トリ-O-イソブチリル-O-(トリクロロアセトイミドイル)-β-D-グルクロン酸メチル(1)合成した。1とHTもしくはHAをBF3OEt2存在下で反応させ、グルクロン酸部分をHT及びHAに導入した。最後に保護基の脱離を試みた。アルカリ性条件下でイソプロピル基及びメチル基を脱離させた。生成物はSepPakC18で精製した。NMR及び質量分析の結果からほぼ純粋なものが得られていると考えられるものの、元素分析では不純物を含有している可能性が示唆された。現在、さらなる精製を試みている。得られたグルクロン酸抱合体はLC/MSで分析した。グルクロン酸抱合体は非常に親水性が高いことが知られているが、HT及びHAのグルクロン酸抱合体は、一般的なC18の逆相カラムで保持することができ、通常のLC/MSシステムで分析可能であった。また、トリアゾラムもしくはアルプラゾラムを摂取したヒトの尿に、これらが含まれていることを確認した。ゾルピデムは日本で最も多く販売されている睡眠薬である。そのためしばしば犯罪にも用いられている。このゾルピデムの代謝物のうち、体内に長く留まる代謝物は、睡眠薬使用を立証する上でとても有用な物質になる可能性がある。本研究では、胆汁に蓄積しているゾルピデム代謝物についてその構造を明らかにすることを目標とした。ゾルピデムを服用していた死者の胆汁及び尿に含まれるゾルピデム代謝物について、LC-MS/MSで分析した。既知の代謝物であるゾルピデムのメチル基の水酸化体の他に、新規水酸化体が検出された。この水酸化体の構造をMS/MSにより解析したところ、ピリジン環が水酸化されていることが分かった。胆汁抽出液のクロマトグラム上に現れたピークの高さから推測すると、この水酸化体は既知の水酸化体よりも濃度が高いことが予想された。新規代謝物の水酸基の位置を明らかにするために、標準品の合成を試みた。ピリジン環には3つの未置換水素(8、7、5位)があるが、このうち8ーヒドロキシゾルピデムを合成した。合成は2-アミノ-3-ブロモ-5-メチルピリジンと3-(4-メチルベンゾイル)プロピルジメチルアミドとの反応により8-ブロモゾルピデムを合成した後、臭素をメトキシ化し、脱メチル化により合成した。しかしながら、得られた標準品を同じ条件でLC-MS/MS分析したところ、保持時間が胆汁抽出物から検出されたものと異なっていた。

この結果から、水酸基の位置は8位ではなく、7位もしくは5位が水酸化されたものであると考えられた。5-ヒドロキシ及び7-ヒドロキシゾルピデムの合成と胆汁抽出物中のものとの照合は今後の課題である。法医学(法医中毒学)グルクロン酸抱合体はほぼ順調に合成できた。特に、グルクロン酸部分の導入はベンゾジアゼピン系薬物が複雑な構造を有するにもかかわらず、十分実用的な収率で合成可能であった。しかし、最終生成物の精製が困難であった。当初、保護基の脱離がうまくいかなかったが、さまざまな条件を試みることで徐々に改善している。NMRや質量分析の結果からほぼ純粋のものが得られていると考えられるが、純度が保証された標準品として使用できる状態になっていない。クアゼパムを服用したヒトの胆汁中には、新規代謝物が数種類含まれている可能性が示唆された。そこで、これらの構造を質量分析等の機器分析で推定した後、化学合成で別途合成する。合成品を標準物質として用いてヒトの資料中の代謝物を同定し、濃度を決定したい。さらに、それら代謝物の特徴(消失時間や排泄経路など)を明らかにしたい。合成したα-ヒドロキシトリアゾラム及びα-ヒドロキシアルプラゾラムのグルクロン酸抱合体(以下HTGlu及びHAGlu)が標準品として使用できる純度になるよう、精製法を再検討する。その後、HTGlu及びHAGluの分析法を確立を目指す。HTG及びHAGは親水性が高いものの、通常のLC/MSシステムで分析可能であったことが明らかになっている。そこで、除タンパクや固相抽出などの前処理法と、LC/MS分析を組み合わせて分析バリデーションの確立を目指す。さらに、これまで得られたノウハウを活かし、リルマザホン、ソルピデムなどの代謝物合成にも取り組む予定である。分析に必要な液体クロマトグラフ用カラム等の購入に際し、劣化がそれほど進んでいなかったため、新しいカラムの購入が現時点で必要なかったこと、また、抽出で用いる固相抽出カートリッジが比較的安く購入できたこと等による。代謝物の化学合成等に必要な試薬、分析のためのカラム等を購入する予定。次年度使用額がそれほど高額ではないため、研究計画に大きな変更はない。合成に関しては、必要な器具は概ね購入してあるため、試薬など消耗品の購入が主なものとなる。分析に関しては、分析カラムに加えて固相抽出カートリッジなどの前処理消耗品などが主なものである。また、結果を論文を発表する際の英文校正費などが必要である。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのアルギニンカルボキシペプチダーゼの病原性について

歯周病原性細菌のPorphyromonas gingivalisは、糖を分解することができないため、様々なタンパク分解酵素を産生し、これらの酵素によって遊離したアミノ酸を代謝してエネルギーを獲得しているものと考えられている。著者は、本菌の培養上清においてアルギニンの著しい消失を認め、またアルギニンからのATP産生を認めたことから、アルギニンを本菌の生育に関与するアミノ酸の一つとして考えている。そこで、タンパク質からアルギニンの遊離に関与するアルギニンカルボキシペプチダーゼを菌体より抽出し、分離・精製を行った。精製した酵素の部分アミノ酸配列を調べ、このアミノ酸配列をコードする本菌のゲノムマップを構築しているコンティグを探し、遺伝子解析を行った。推定されたタンパク質をコードするopenreading frameに基づいたアミノ酸配列のホモロジー検索を行ったところ、zinccarboxypeptidase familyと相同性が認められ、zinc-binding regions signatureを示す共通配列が存在することが明らかとなった。また酵素活性の阻害実験においても同様の性質を示すことがわかった。カルボキシペプチダーゼの特異的阻害剤であるDL-2-mercaptomethyl-3-guanidinoethylthio-propanoic acid(MGTA)を培地に添加して、本菌の増殖に対する影響を調べたところ、濃度依存的に生育の阻害を示した。以上のことから、本酵素は、同菌の産生するアルギニンアミノペプチダーゼ(Arg-gingipain,trypsin-like protease)との共同作用により、栄養源となるアルギニンを周囲の組織から遊離し、このことが本菌の増殖と病原性に重要な役割を果たしていると考えられる。本年度は、歯周病原性細菌のPorphyromonas gingivalisの産生するアルギニンカルボキシペプチダーゼを菌体より抽出し、陰イオン交換及びゲルろ過HPLCにて、分離・精製を行った。精製された酵素は、ゲルろ過では、分子量が約35kDaで、SDS-PAGEでは、42,33と32kDaの3つの主なバンドが見られた。それぞれのN末端アミノ酸シークエンスを調べた結果、YEWNAYPTYEAYISMMEEFQTKYPSLXTXSであることが明らかとなり、30残基まで全て、同一であった。本酵素の酵素学的性質について調べたところ、C末端側のアルギニン以外に、リジンも切断できることが明らかとなった。Km値はリジンの方が小さく、基質親和性がより高いことがわかった。また酵素活性はCu^<2+>,Zn^<2+>とCd^<2+>により阻害され、o-phenanthrollinやEGTAによっても阻害された。一方、Co^<2+>により活性が上昇され、すでに報告されている哺乳動物由来のカルボキシペプチダーゼの性質と類似していたが、それぞれのN末端アミノ酸シークエンスに相同性は認められなかった。本酵素は、ペブチドの内部にアルギニンを有するタンパク質を分解することができなかった。しかし、本菌はトリプシン様酵素を産生するため、先ずタンパク質中のアルギニンのカルボキシル基側で切断し、その後、本酵素が作用して、アルギニンを遊離させることにより生育のエネルギー獲得に利用されると考えられる。本菌の増殖は、歯周病原性を示すと考えられる様々な生理活性の発現に重要であると考えている。