hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
浸透圧ストレス応答としての硫酸化糖脂質発現制御機序の解明

MDCK細胞における,硫酸化糖脂質の機能を解析するため,セレブロシドスルホトランスフェラーゼとセラミドガラクトシルトランスフェラーゼのダブルトランスフォーマントを作成し,SM4s(GalCerI3-sulfate)の発現上昇を確認した.この発現株ではプレートに対する接着性の上昇がみられることから,ラミニンなどの基質への接着性の変化を解析中である.また,硫酸化多糖との結合ペプチドモチーフの解析を端緒として,真核生物のタンパクには同一のアミノ酸の繰り返しがみられることを見出し報告した.ショウジョウバエとヒトとの間で保存されているタンパクについても,この反復性がみられることから,遺伝子断片の挿入欠失を伴わずに,こうした反復を生じる機構の存在が示唆された.一方,コドンの第3ポジションの塩基については,(アミノ酸の反復を伴わない)原始的タンパク(大腸菌との相似があるもの)においても,反復性がみられることから,点突然変異そのものにも,例えば周りにCが多いとCに変わりやすいという傾向があることが示唆された.実際,哺乳動物間の多数のアラインメントからもこうした傾向は明らかになった.また,遺伝子配列の反復性と局所的重複の起こりやすさの関連について不明の点が多いため,従来の挿入欠失を扱えなかったモデルと異なり,数値的シミュレーションとマルコフ連鎖モンテカルロ法を利用し一般化した,DNAアラインメント・分子進化解析モデルを作成した.解析の結果,数ntスケールの挿入,欠失の多くのケースで,いわゆるDNAslippageが関与していることが示唆された.MDCK細胞における、浸透圧応答性のセレブドシドスルホトランスフェラーゼ(CST)活性調節機構を解析するため、ノーザン解析を行なったところ、mRNAの発現量は浸透圧の変化による影響を受けないことが分かった。このことは、翻訳後調節の関与を示唆する。一方、このCSTの細胞内での機能を、さらによく知るため、そのcDNAをMDCK細胞に導入し安定発現株を得た。この発現株の一部に、CSTの基質を生成するCGT(セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ)のcDNAをも導入した。現在、糖脂質の成分分析を行ない、両酵素の厳密な機能を明らかにしようとしている。また、CST-CGTのダブルトランスフォーマントの多くで、プレートに対する接着性が明らかに強まっていることから、細胞接着への関連性をさらに解析する予定である。一方、タンパク質データベースを用いた、硫酸化多糖との結合モチーフの解析により当初予想しなかった知見が得られた。こうしたモチーフは塩基性アミノ酸がクラスターをなしているものであるが、我々は、真核生物のタンパク質モチーフの多くがこうした、性質の類似したアミノ酸の連なりからなることに注目をし、タンパク配列中のアミノ酸の並び方を、統計的に解析した。すると、真核生物のタンパクにはこうした同一のアミノ酸の繰り返しが頻繁に見られることが分かった。さらにcDNA配列の解析から、真核生物のゲノムには、同種のアミノ酸の繰り返しを生じやすい性質が備わっていることが分かった。この、性質について、さらに厳密な分析を行なうため、現在、哺乳動物間で、多数のcDNA配列を比較し、どのようにアミノ酸の反復性が(変更により消失せず)保たれるかを調べている。MDCK細胞における,硫酸化糖脂質の機能を解析するため,セレブロシドスルホトランスフェラーゼとセラミドガラクトシルトランスフェラーゼのダブルトランスフォーマントを作成し,SM4s(GalCerI3-sulfate)の発現上昇を確認した.この発現株ではプレートに対する接着性の上昇がみられることから,ラミニンなどの基質への接着性の変化を解析中である.また,硫酸化多糖との結合ペプチドモチーフの解析を端緒として,真核生物のタンパクには同一のアミノ酸の繰り返しがみられることを見出し報告した.ショウジョウバエとヒトとの間で保存されているタンパクについても,この反復性がみられることから,遺伝子断片の挿入欠失を伴わずに,こうした反復を生じる機構の存在が示唆された.一方,コドンの第3ポジションの塩基については,(アミノ酸の反復を伴わない)原始的タンパク(大腸菌との相似があるもの)においても,反復性がみられることから,点突然変異そのものにも,例えば周りにCが多いとCに変わりやすいという傾向があることが示唆された.実際,哺乳動物間の多数のアラインメントからもこうした傾向は明らかになった.また,遺伝子配列の反復性と局所的重複の起こりやすさの関連について不明の点が多いため,従来の挿入欠失を扱えなかったモデルと異なり,数値的シミュレーションとマルコフ連鎖モンテカルロ法を利用し一般化した,DNAアラインメント・分子進化解析モデルを作成した.解析の結果,数ntスケールの挿入,欠失の多くのケースで,いわゆるDNAslippageが関与していることが示唆された.
一酸化窒素の血管調節作用に及ぼす身体トレーニングおよび不活動の影響

血流増や低酸素をともなう長期の身体トレーニングは、一酸化窒素(nitric oxide ; NO)を経由した血管応答性などのNO代謝に変動を生じさせる可能性があるが、NO代謝におよぼすトレーニング、トレーニング停止、および不活動よるNO作用の変動様態などについてはいまだよく知られていない。そこで本研究は、長期のトレーニングとトレーニング停止後ならびに長期安静の状態による血管応答の変動をNOの反応性に焦点を合わせて評価し、その変動にデ・トレーニングや不活動の日数による順序性が見られるのか否かを明らかにすることを目的とした。実験にはWistar系ラット33匹を用い、(1)8週間のトレーニングおよび(2)3週間のデ・トレーニングならびに(3)1および3週間の不活動状態(後肢懸垂法)のラットについて、NOに対する血管応答性および代謝を通常飼育の対照ラットと比較検討した。8週間のトレーニングによって、ヒラメ筋のタンパク重量あたりのクエン酸合成酵素(CS)活性は26%上昇し、この差は有意であった(p<0.05)。また、デ・トレーニングによってCS活性は有意に低下し(p<0.01)、対照群との差は見られなくなった。不活動状態において、筋重量は1および3週間の不活動でそれぞれ27%および36%減少し(p<0.05)、CS活性も低下した。この環境において、血漿中のNO代謝物(NO_2^-およびNO_3^-の測定値より算出)はトレーニングにより55%増加(p<0.01)し、デ・トレーニングによって対照群を下回る水準に低下した(p>0.05)。また、不活動状態では懸垂1週間目で81%、3週間目で46%高値を示していた。なお、これらの変動は、昨年度発表したNO発生剤に対する大動脈の弛緩との相関は認められなかった。「背景」血管系に対するNOの作用に及ぼすトレーニングの効果に関する報告は,現状ではいまだ少数にすぎない.血流増や低酸素をともなう長期の身体トレーニングは,NOを経由した血管応答性に変動を生じさせる可能性が推察されることから,いわゆるトレーニングの効果について,解明すべき興味深い課題が少なくない.「目的」長期のトレーニングとトレーニング後(デ・トレーニング),ならびに長期安静の状態による血管応答の変動を,NO反応性に焦点を合わせて評価し,その変動にデ・トレーニングや不活動の日数による順序性が見られるのか否かを明らかにすることとした.「方法」対象にWistar系ラットを用い,(1)9週間のトレッドミル走行の2日後、(2)同等のトレーニング3週間後,(3)後肢懸垂法による1週間の不活動状態および(4)3週間の不活動状態のラットについて,NOに対する血管応答性を通常飼育の対照ラットと比較検討した.血管の応答性は,マグヌス装置を用いて,腹部大動脈血管リング標本より,10^<-10>から10^<-3>MのNO発生剤(NOC18)及びアセチルコリン(Ach)を用いて,ノルエピネフリン(NE)の先行収縮に対する拡張能を評価した.「結果と考察」NEによる収縮に群間の差は認められなかった.このため,すべて10^<-7>M濃度を先行収縮に利用した.Achの添加はトレーニング群で容量反応曲線を右方に,不活動群で左に変移させた.一方,NOC18による変動も同様であったが,Achの変動より小さかった.以上の結果は,身体不活動によりNO依存の血管拡張能は亢進し,トレーニングによって減弱化することを示している.これらの機序について引き続き検討していく予定である.血流増や低酸素をともなう長期の身体トレーニングは、一酸化窒素(nitric oxide ; NO)を経由した血管応答性などのNO代謝に変動を生じさせる可能性があるが、NO代謝におよぼすトレーニング、トレーニング停止、および不活動よるNO作用の変動様態などについてはいまだよく知られていない。
居住者にわかりやすく揺れ性能レベルを説明する資料の提案

本年度は,これまでに実施してきた被験者に対する振動感覚実験,ユーザーや専門家に対するヒアリング・アンケート調査や実態・実測調査の結果をふまえ,ユーザーによりわかりやすく,実感できる表現として揺れ性能を説明するための資料を提案した。本年度は特に,従来より検討してきた水平方向の揺れに関する性能説明資料の試案をほぼ確定した段階で,対象となる揺れを鉛直方向に拡大するため,鉛直振動に対する感覚評価を知るための被験者実験を行った。これらの実験結果に基づいて,揺れ性能の説明に用いる項目の種類や数,説明資料としてのわかりやすさなどについて試行錯誤を繰り返した。その結果,揺れに対する知覚閾および感覚評価における回答確率が,居住性能評価の対象となる加速度範囲でほぼ0100%に変動する項目を選択し,振動数ごとに各項目の回答確率を加速度最大値と対応させた説明資料を提示した。これによって「○%の人が××と感じる」という具体的な表現で,揺れ性能レベルを段階的に評価することが可能であり,ユーザーに身近な表現で示されたこれらの性能レベルが何galに相当するのか,専門家が設計指標としてくみ取れる資料を提示した。これらの結果は,日本建築学会から4月に刊行予定の「建築物の振動に関する居住性能評価指針・同解説」に反映されている。本年度は,これまでに蓄積した調査・実験データに基づいて,居住者にとってわかりやすく実感できるような揺れ性能レベルの説明資料の試案を作成することを中心に研究を進めた。これまでに行った実験では,知覚閾に加えて揺れの大きさや揺れに対する不快感などの心理評価を対象としてきた。これらの結果に基づいて,まず,従来から揺れ性能評価の基盤とされてきた知覚閾による評価レベルを設定した。これは設計指標となる揺れの物理量を用いたものであるが,この場合も「○%の人が揺れを感じる」という,ユーザーにとって実感しやすい表現と対応させた。この設計指標に,揺れに対する心理・感覚評価の表現を対応させて「○%の人が××と感じる」というかたちで,揺れ性能をより具体的に説明するような資料の案を作成した。現段階では,これらの説明項目は実験から得られたデータをできる限り数多く用い,多角的に性能レベルを表現するようにしている。今後は,ユーザーと専門家の双方にヒアリング調査を行いながら,ユーザーがわかりやすいと感じたり,具体的にイメージしやすい項目に絞ったり,専門家が設計指標として用いる上で有効な項目に絞るなど,いくつかの側面からこの資料を洗練していく計画である。並行して,新幹線や高速道路の沿線住宅地,高層住宅など,居住性能に支障をきたす可能性のある揺れが生じる各地に赴き,揺れの実測および付近のユーザーに対するアンケート・ヒアリング調査を行っている。この実態調査は研究期間中継続して実施し,実務において有益な資料とする基礎データとしたい。
構造場と音響場の連成メカニズムを考慮した能動的放射音制御

交付申請書に記載の通り、年度当初の目的は、構造と音響の連成系の運動方程式を固有値問題として解き、構造エネルギと音響エネルギの双方に対する直交因子(直交因子A)を求め、更に、これを昨年度までに別の方法(構造エネルギと音響エネルギの和を評価関数として設定し、その中に固有値問題を見出すというもの)によって導出した直交因子(直交因子B)と比較検討することであった。比較対象となる重要項目の一つは、モード・フィルタ(固有ベクトル)の特性である。直交因子Aのモード・フィルタは、構造振動と音圧を陽として定式化された運動方程式を基調として導出される為、振動の計測だけでなく、騒音の計測も前提とする。複数点の騒音を計測することは、空間を確保するという観点から、実用的に難しい。一方、直交因子Bのモード・フィルタは、構造振動を陽として定式化された評価関数を基調として導出される為、振動の計測だけを前提とすれば良い。そこで、直交因子Bに焦点を当て、研究を継続することとした。昨年度、直交因子Bのモード・フィルタを用いた能動制御系を定式化した。また、これを矩形平板等の単純な構造物に適用して、その効果を数値解析し、振動と騒音の統合的制御の成就を確認した。本年度は、この制御系をより実際的な構造物に適用し、その実用性を検証することとした。適用対象としては、二重壁を取り上げた。二重壁は、重量を抑えつつ、遮音性能を高めるための構造である。しかし、二重壁の遮音性能は、周波数の低くなるにつれて劣化してしまう。そこで、多くの研究者が、二重壁に能動制御系を適用し、低周波数における遮音性の向上に取り組んでいる。ところが、振動と騒音の大小は、必ずしも比例しない、為、能動制御による騒音低減の副作用として、振動の増大を招きかねない。二重壁に直交因子Bのモード・フィルタを適用し、振働と騒音を統合的に制御することで、この問題を解決した。本年度の研究成果は,以下の理論の構築,および,その妥当性の数値解析的検証である。1.クラスタ制御:閉空間の場合対称閉空間における構造と音響の連成問題を考える場合,構造モードは,そのモード関数を規範として,偶関数,奇関数に帰属し,音響モードは,そのモード関数を規範として,偶関数,奇関数に帰属する。すなわち,構造の偶関数クラスタ,奇関数クラスタと音響の偶関数クラスタ,奇関数クラスタを定義できる。このとき,構造と音響の連成は,構造と音響の偶関数クラスタの間,構造と音響の奇関数クラスタの間にのみ生じる。この現象は,構造計測,構造制御を基調とした放射音制御系の設計にあたり,次の様な洞察を与えてくれる。すなわち,放射音を音響の偶関数クラスタ,奇関数クラスタに判別し,それと連成関係にある構造の偶関数クラスタ,奇関数クラスタを選択的に計測制御すべきである。クラスタ・フィルタは,構造と音響の偶関数クラスタ,奇関数クラスタの独立計測を可能とする。クラスタ・アクチュエータは,構造と音響の偶関数クラスタ,奇関数クラスタの独立励起を可能とする。2.クラスタ制御:開空間の場合対称構造物を考える場合,構造モードは,そのモード関数を規範として,偶関数,奇関数に帰属する。すなわち,偶関数クラスタ,奇関数クラスタを定義できる。このとき,音響場における構造モード同士の連成は,偶関数クラスタの間,奇関数クラスタの間にのみ生じる。また,偶関数クラスタは,特に高い音響放射効率を有する。すなわち,音響放射効率の高い偶関数クラスタを選択的に計測制御すべきである。クラスタ・フィルタは,偶関数クラスタ,奇関数クラスタの独立計測を可能とする。クラスタ・アクチュエータは,偶関数クラスタ,奇関数クラスタの独立励起を可能とする。振動と騒音の統合的制御を志向し,構造エネルギと音響エネルギの和に対する直交因子「構造音響モード」を定式化した。構造音響モードの形式は,構造物の表面を分割した有限要素を陽にして導出される「有限要素形式」,構造物に固有の構造モードを陽にして導出される「構造モード形式」の2つに分けられる。構造音響モードを主軸とした制御系の設計思想は,制御系の低次元化と振動と騒音の統合的制御系を構築することを可能とする。また,構造音響モードの複素振幅を計測するための空間フィルタ「構造音響モード・フィルタ」,各構造音響モードの構造エネルギと音響エネルギの和に対する寄与度を推定するための「重みフィルタ」を考案した。いずれのフィルタも,音響伝達関数を基に設計されるため,周波数に依存する。重みフィルタは,空間フィルタではないため,比較的低次のディジタル・フィルタによって構築できる。一方,構造音響モード・フィルタは,空間フィルタであるため,比較的高次のディジタル・フィルタによってしか構築できない。それ故,実用上の観点からすれば,構造音響モード・フィルタは,その周波数依存性を無視し,固定ゲインとして構築されるべきである。本研究では,バフル周りの開空間,閉空間を対象に議論を進め,構造音響モード・フィルタの周波数依存性を無視することの妥当性を理論的に証明した。なお,有限要素形式を採用する場合,構造音響モード・フィルタも重みフィルタも,構造物表面の質量分布,有限要素間の音響伝達関数を基にして設計される。

構造モード形式の場合,構造音響モード・フィルタも重みフィルタも,構造モードの形状関数,構造モード間の音響伝達関数を基にして設計される。さらに,これらのフィルタを用いた制御系をバフル内の矩形平板,直方体閉空間に適用し,その制御性能を数値解析し,所望の結果を得た。交付申請書に記載の通り、年度当初の目的は、構造と音響の連成系の運動方程式を固有値問題として解き、構造エネルギと音響エネルギの双方に対する直交因子(直交因子A)を求め、更に、これを昨年度までに別の方法(構造エネルギと音響エネルギの和を評価関数として設定し、その中に固有値問題を見出すというもの)によって導出した直交因子(直交因子B)と比較検討することであった。比較対象となる重要項目の一つは、モード・フィルタ(固有ベクトル)の特性である。直交因子Aのモード・フィルタは、構造振動と音圧を陽として定式化された運動方程式を基調として導出される為、振動の計測だけでなく、騒音の計測も前提とする。複数点の騒音を計測することは、空間を確保するという観点から、実用的に難しい。一方、直交因子Bのモード・フィルタは、構造振動を陽として定式化された評価関数を基調として導出される為、振動の計測だけを前提とすれば良い。そこで、直交因子Bに焦点を当て、研究を継続することとした。昨年度、直交因子Bのモード・フィルタを用いた能動制御系を定式化した。また、これを矩形平板等の単純な構造物に適用して、その効果を数値解析し、振動と騒音の統合的制御の成就を確認した。本年度は、この制御系をより実際的な構造物に適用し、その実用性を検証することとした。適用対象としては、二重壁を取り上げた。二重壁は、重量を抑えつつ、遮音性能を高めるための構造である。しかし、二重壁の遮音性能は、周波数の低くなるにつれて劣化してしまう。そこで、多くの研究者が、二重壁に能動制御系を適用し、低周波数における遮音性の向上に取り組んでいる。ところが、振動と騒音の大小は、必ずしも比例しない、為、能動制御による騒音低減の副作用として、振動の増大を招きかねない。二重壁に直交因子Bのモード・フィルタを適用し、振働と騒音を統合的に制御することで、この問題を解決した。
被子植物の起源と胚珠の進化に関する研究

1.被子植物の原始的な胚珠の形態を明らかにするために、モクレン科タイサンボクの胚珠を観察した。外珠皮は幌状の構造として発生し、後に珠柄突起が外珠皮の間隙を埋めて見かけ上コップ状となることがわかった。また、原始的被子植物アウストロバイレヤ目3科の胚珠を観察して、アウストロバイレヤとトリメニアの外珠皮は幌状であるのに対して、シキミではコップ状であることをたしかめた。これら以外の原始的な被子植物の胚珠のデータおよび系統関係を考慮して、胚珠の進化を推定した。その結果、被子植物の胚珠は外珠皮が幌状の倒生胚珠が原始的であると推定した。このような構造は葉のように背腹性のある側生器官によく似ていることが示唆された。2.原始的な被子植物の胚珠と心皮の相同性をさらに遺伝子レベルから確かめるために、側生器官の背腹性の決定にかかわるYABBY遺伝子の相同遺伝子が原始的な被子植物の胚珠でどのような発現様式を示すかを調べた。スイレン属2種から単離したINO相同遺伝子NaINOは外珠皮の最外層で発現した。これから、外珠皮が葉と相同の側生器官である可能性が示唆された。また、アンボレラ属から単離したYABBY2相同遺伝子AmbF1は葉の向軸側と心皮の内側で発現し、真正双子葉類シロイヌナズナとは非常に異なることが明らかになった。この結果からは、心皮が葉の二つ折れによるか、あるいは楯状葉の袋状化によって生じたとするこれまでの説は支持されなかった。3.これらの結果から、被子植物に特有の外珠皮は葉のような側生器官から派生したあと多様化する一方、側生器官の特性に関与する遺伝子が進化し、発現様式も変化した可能性が示唆された。1.準原始的被子植物のタイサンボクの外珠皮と珠柄突起の発生を光学切片観察,走査型電子顕微鏡観察によって調べた.その結果,外珠皮は幌型の構造として,珠柄突起は外珠皮の隙間を埋めるように発生するが,両者は独立の構造であり,今までコップ状の外珠皮とされた器官は外珠皮と珠柄突起からなる複合体であることが確かめられた.したがって,原始的な胚珠は幌型の外珠皮をもち,しかも,同じようにコップ状のスイレン科の外珠皮とは異なる過程を経て進化したと推定される.2.原始的被子植物アウストロバイレヤ目3科の胚珠および種子の形態を観察した.アウストロバイレヤ科とトリメニア科は幌型の外珠皮をもつが,シキミ科ではコップ状であった.系統関係を考慮すると,原始的被子植物ANITAでは幌型の外珠皮が原始的であると示唆された.3.原始的被子植物の外珠皮と心皮における遺伝子発現様式をin situ hybridization法によって調べた.スイレン属2種から単離したINO相同遺伝子の1つNaINOは外珠皮の最外層で発現した.これは,シロイヌナズナの発現様式と同じであり,外珠皮の外側は葉の背軸側に相当することが示唆された.また,内珠皮全体と珠心でも発現したが,これはシロイヌナズナでは見られないことであった.4.アンボレラ属からYABBY

2相同遺伝子AmbF1を単離し,発現部位を調べたところ,シロイヌナズナでYABBY2が発現する葉の背軸側,心皮の外側ではなく,意外にもアンボレラでは葉の向軸側,心皮の内側であった.この結果から,被子植物の進化の過程で遺伝子発現に逆転が起こった可能性が示唆され,さらに,心皮が葉の2つ折れによるか,盾状葉の袋状化によって生じたとする従来の有力な2説は支持されなかった.最近の被子植物の分子系統解析により、現生被子植物の中でスイレン科とアンボレラがもっとも基部で分岐したことが示唆されている。そのため、被子植物の起源と進化を探る上で、これらの植物の花について解析することは有効であると考えられた。2珠皮性胚珠と心皮は被子植物に独特の器官であるので被子植物の起源を明らかにするためには、両植物においてこれらの器官の遺伝子発現パターンを比較することが有効であると考え、発現パターンの解析を行った。スイレン属からINNER NO OUTER (INO)相同遺伝子NaINOを単離し、in situハイブリダイゼーションにより発現パターンを調べたところ、真正双子葉類シロイヌナズナと同様、外珠皮の外側(背軸側)で発現することを明らかにした。さらにアンボレラでYABBY遺伝子の発現解析を行った。YABBY遺伝子はシロイヌナズナで葉など側生器官の背軸側で発現し、その背腹性の決定に関わっていると見られている。YABBY2相同遺伝子AmbF1をアンボレラから単離し、in situハイブリダイゼーションにより発現パターンを観察したところ、葉とすべての花器官(花被、雄蕊、心皮)の向軸側で発現していることを明らかにした。これはシロイヌナズナで背軸側で発現することとは正反対である。この結果から、側生器官の背腹性の決定に当たりYABBY2相同遺伝子は被子植物の中で異なる発現バターンを進化させたと示唆された。発現パターンから、原始的被子植物の花器官と葉は相同であることが支持された。また、心皮は1枚の胞子葉が内側に折れたたまれてできたとする二つ折れ説が有力であるが、AmbF1の発現パターンからは胞子葉の向軸側が窪んで子房室ひいては心皮がっくられた可能性が示唆され、今後の大きな課題となった。
水生生物に対する総毒性をベースにした流域圏での新たな化学物質汚染評価手法の構築

徳島県を流れる吉野川流域圏の農業排水を含む河川水や事業所排水,道路流出水等を採水し,それぞれ26回、環境省で現在検討中の水生生物3種(魚類,ミジンコ,藻類)を用いた亜慢性試験で総毒性を測定した。その結果,一般事業所や下水処理施設のほとんど(放流先河川の一部)でミジンコや魚類に対して強い毒性影響が検出された一方で,藻類は増殖した排水が多かった。河川水に毒性影響が検出されたのは主に都市部の汚染度が高い河川の一部に限られていた。道路流出水はミジンコや藻類に対して強い毒性が検出され,化学分析により、その一部がPAHsや重金属による可能性が高いことがわかった。徳島県を流れる吉野川流域圏の河川水7箇所,事業所9箇所(一般事業所と下水処理施設)およびその放流先河川6箇所,道路流出水1箇所について採水をおこない,それぞれ,2から4回にわたって総毒性を調べた。総毒性は米国環境保護庁(USEPA)の総毒性試験(Whole Effluent Toxicity:WET)の亜慢性試験法に準じて,甲殻類のニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)の繁殖阻害,藻類のムレミカヅキモ(Pseudokirchneriella subcapitata)の生長阻害,魚類のゼブラフィッシュ(Danio rerio)もしくはヒメダカ(Oryzias latipes)の胚・仔魚期の亜慢性毒性試験を実施した。その結果,一般事業所や下水処理施設のほとんどでミジンコもしくは魚類に対する強い毒性影響(放流先で影響が検出されなくなるまでに必要な希釈倍率であるTUが10を上回る)が検出された一方で,藻類に対する毒性影響が検出された事業所や下水処理施設は少なかった。協力が得られた事業所については,毒性の原因として無機系の物質がほぼ同定された。しかしながら,実際に放流先で毒性影響が検出されたケースはほとんどなかった。栄養塩類等による増殖効果の結果,藻類に対する毒性影響がマスキングされている可能性が指摘された。河川水についてもほぼ同様にミジンコ・魚類の検出率が藻類よりも高かったが,毒性影響が検出されたのは都市部の汚染度が高い河川の一部に限られた。一方,ノンポイント汚染の一つである道路流出水に対する毒性影響試験を実施したところ,ミジンコや藻類に対して強い毒性が検出され,その一部がマンガンや亜鉛などの重金属による可能性が高いことがわかった。本年度は、昨年に引き続いて吉野川流域圏の未処理ならびに処理した生活排水が多く流れ込む河川や吉野川本川の環境基準点(高瀬潜水橋)ならびに幹線道路の流出水などののべ10地点程度について採水を実施したほか、さらに農業排水を含む河川や用水路のべ5地点程度を追加して採水をおこなった。採水した水については、実験室に持ち帰り、できるだけ速やかに水生生物3種(ムレミカヅキモ、ニセネコゼミジンコ、ゼブラフィッシュ)の亜慢性試験に供した。その結果、藻類の試験において環境省での検討試験法に合わせてろ過を実施したところ、増殖促進された試料は減って、道路排水では非常に強い毒性が、また夏季の河川水や農業排水、生活排水の流れ込む河川でもほぼ全ての時期において弱いながらも増殖が阻害された。ミジンコについては、ほとんどの地点で繁殖阻害は検出されなかったが、山部の都市河川や道路排水では致死および繁殖に影響が検出された。ゼブラフィッシュの胚の艀化や仔魚致死に対しても、生活排水の流れ込む河川で毒性影響炉検出された。生活排水を含む河川については界面活性剤や抗菌剤の寄与が比較的大きく、浄化槽等の汚水処理設備の整備や適切な維持管理が重要であることが示唆された。農業排水については、除草剤濃度の測定を一部実施したが、その関与は明らかではなく、今後は殺虫剤等の寄与についても合わせて検討を進めていく予定である。道路排水については、重金属類に比べて、PAHs等の疎水性有機物質の関与が示唆されたほか、その現場での低減策の必要性が示唆された。本研究では、吉野川流域圏における、毒性発生源や負荷に関する基礎情報が集まったので、今後はより広範な流域に適用可能で体系的な総毒性評価をベースにした毒性同定・分画、ならびに効率的な毒性低減策の策定に活用していければと考えている。
転写因子群による血液細胞・分化の制御機構の解明

本研究の目的は、血球系転写因子群の血液細胞の分化における機能を明らかにすることであった。現在、血液細胞を含む臓器の分化は、複数の転写因子の幹細胞内でのバランスで決定されるとの考え方が有力であるが、その仮説を個体内で検証した。血球系転写因子群の機能解析を通して、転写因子による血液細胞の分化の方向性の制御機構に、全子レベル・個体レベルで詳細にアプローチした。a)GATA転写因子群欠損マウスにおける好酸球分化の解析:これまでの我々の解析で、GATA-1は赤血球の赤芽球から成熟赤血球への分化段階で、また、巨核球から血小板の放出に必須の転写因子であることが明かとなっている。一方、好酸球分化におけるGATA-1の機能は、マウスでは末梢血に存在する好酸球数が非常に少ないこと、好酸球の培養がヒトに比較して難しいこと等から、解析がほとんど行われていなかった。そこで、我々が作製したGATA-1ノックダウンマウスを用いて、好酸球の分化状態を解析したところGATA-1が欠損すると好酸球が形成されないことが明らかになった。b)MafB欠損マウスおよびMafB、c-Maf重複欠損マウスの解析:我々の昨年度までの解析結果より、MafBおよびc-Mafがマクロファージ系列の細胞に発現していることを、個体レベルで確認した。MafB欠損マウスで軽度のマクロファージの分化異常を認めた。それぞれの単独欠損マウスでは著明な表現型が認められなかったため、MafBおよびc-Mafの重複欠損マウスを作製した。その結果MafB+/-::c-Maf+/-マウスで、マクロファージ系統の細胞の著明な増殖が見られ、リンパ節、脾臓の腫張が観察された。また、それらのマウスでは、抗核抗体値の上昇、皮膚炎等の自己免疫様病態が観察された。以上の事から大Maf群転写因子は、マクロファージ系統の細胞の正常な分化に必須の転写因子であることが示唆された。本研究の目的は、血球系転写因子群の血液細胞の分化における機能を明らかにすることである。現在、血液細胞を含む臓器の分化は、複数の転写因子の幹細胞内でのバランスで決定されるとの考え方が有力であるが、その仮説を個体内で検証する。血球系転写因子群の機能解析を通して、転写因子による血液細胞の分化の方向性の制御機構に、分子レベル・個体レベルで詳細にアプローチする。a)MafB遺伝子欠損マウスの解析:これまでの細胞培養系を用いた実験より、単球系細胞の分化にはc-Maf、MafB等の大Maf転写因子群が必須な機能を果たしていることが示唆されている。既に申請者らは、c-Maf遺伝子欠損マウスの作製を行いその表現型を解析した。c-Maf遺伝子欠損マウスは、目の水晶体線維細胞の分化および増殖不全が認められたが、単球系の細胞分化を含め、血液系の細胞には異常が認められなかった。この結果は、単球系にはc-Mafと同様にMafBが発現しており、MafBにより機能が相補された可能性と、個体内では、単球系の細胞分化には大Maf群転写因子が必須ではない可能性が考えられる。前者の可能性を検証するために、MafB欠損マウスを作製しその表現型を解析した。その結果、マクロファージの分化が、阻害されていることが明らかになった。b)GATA転写因子群欠損マウスにおける好酸球分化め

解析:これまでの我々の解析で、GATA-1は赤血球の赤芽球から成熟赤血球への分化段階で、また、巨核球から虫小板の放出に必須の転写因子であることが明かとなっている。一方、好酸球分化におけるGATA-1の機能は、マウスでは末梢血に存在する好酸球数が非常に少ないこと、好酸球の培養が、ヒトに比較して難しいこと等から、解析がほとんど行われていなかった。そこで、我々が作製したGATA-1ノックダウンマウスを用いて、好酸球の分化状態を解析したところGATA-1が欠損すると好酸球が形成されないことが明らかになった。本研究の目的は、血球系転写因子群の血液細胞の分化における機能を明らかにすることであった。現在、血液細胞を含む臓器の分化は、複数の転写因子の幹細胞内でのバランスで決定されるとの考え方が有力であるが、その仮説を個体内で検証した。血球系転写因子群の機能解析を通して、転写因子による血液細胞の分化の方向性の制御機構に、分子レベル・個体レベルで詳細にアプローチを行った。我々の昨年度までの解析結果より、MafBおよびc-Mafがマクロファージ系列の細胞に発現していることを、個体レベルで確認した。それぞれの単独欠損マウスでは著明な表現型が認められなかったため、MafBおよびc-Mafの重複欠損マウスを作製した。その結果MafB+/-::c-Maf+/-マウスで、マクロファージ系統の細胞の著明な増殖が見られ、リンパ節、脾臓の腫張が観察された。また、それらのマウスでは、抗核抗体値の上昇、皮膚炎等の自己免疫様病態が観察された。以上の事から大Maf群転写因子は、マクロファージ系統の細胞の正常な分化に必須の転写因子であることが示唆された。b)GATA-1の初期造血の血球分化決定における機能解析:中胚葉から血球および血管内皮細胞が分化誘導されてくるが、その分子機構はほとんど明らかにされていない。そこで本研究では、初期中胚葉から血球が分化誘導される過程に必須な転写因子の探索を行った。様々な転写因子の発現を細胞レベルで解析したところ、血球の分化と転写因子GATA-1の発現が、ほとんど一致することを明らかにした。このことはGATA-1もしくはGATA転写因子群が、血球分化に必須な転写因子であることを示唆していると考えられた。
mRNAの塩基配列に基づく陸上植物の起源と進化に関する研究

RNAエディティングがあると、ゲノムDNAから予測されていたタンパク質のアミノ酸配列は実は架空のもので、真のアミノ酸配列はmRNAのアミノ酸配列からでないと推定することはできない。そこで我々は、ホウライツノゴケの葉緑体にあるrbcL遺伝子のmRNAに相補的なDNA(cDNA)を作りその塩基配列を決定することにより、mRNAの配列を調べた。その結果、20の部位でエディティングが行われていることを見つけた(前年度報告済み)。エディティング部位でコードされるアミノ酸の化学的性質を遺伝子構造から予測されていたものと比較すると、エディットされたためにコードされるようになったアミノ酸の方がより疎水的な性質が強い。これらのアミノ酸をRubico大サブユニットタンパク質の立体構造上にプロットすると、殆ど例外なくタンパク質の内部に位置することがわかった(論文準備中)。このことは、RNAエディティングなしでは、タンパク質は正しくホールディングできず、機能あるタンパク質はできないことを示唆している。ホウライツノゴケ葉緑体のATPaseβサブユニットの真のアミノ酸配列を調べて、原始的な陸上植物の系統樹を再構築するために、atpB遺伝子のmRNAに対するcDNAを作り、その塩基配列を決定した。その結果、29の部位でのエディティングが見つけた。これはこれまで葉緑体で見つかっているエディティングの内で最も高頻度なもので、atpBのmRNAで見つかったのも初めてのことである。また、29部位の内14の部位ではリバースタイプと呼ばれているUからCへの変換が見られた。また、このmRNAの塩基配列を他の植物のatpB遺伝子の塩基配列と比較して、真嚢シダのリュウビンタイで3ヶ所、裸子植物のクロマツで1ヶ所のエディティングがあることを予言した(論文準備中)。
タウ遺伝子変異による結合蛋白との関係の変化と神経変性過程の解析

前頭側頭型認知症FTDP-17の神経変性メカニズムは明らかにするために、変異型タウ蛋白と14-3-3蛋白との結合親和性を検討した。変異型タウとの結合親和性は亢進していたが、タウ蛋白はリン酸化されると両者は全て同定度にまで結合親和性は亢進した。次に、14-3-3蛋白を添加して重合をモニターしたところ、野生型タウに比べて変異型のタウは重合が促進されていたが、リン酸化されるとタウ蛋白の重合は全て抑性された。また、リン酸化に関してはSer214部位のリン酸化ができない変異型タウは分解が促進した。そして、PSAによる分解プロセスに関して検討したところ、PSAはタウのN末端のみを分解することが示唆された。タウ遺伝子の変異による認知症はFTDP-17 (Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17)と呼ばれるが、アミノ酸置換を伴うエクソン内の変異(ΔK280、P301L、V337M、R406Wなど)および、アミノ酸置換を伴わないインントロン内の変異(第10-11エクソン間イントロン内変異)などさまざまな遺伝子変異家系が知られている。今までの検討(タウ野生型および変異型(V337M、R406W))では、変異型タウ導入細胞においてはタウ蛋白リン酸化が亢進していることと、タウ蛋白の分解は遅延していることを報告してきた。そこで、その他のFTDP-17遺伝子変異(ΔK280、P301L)およびリン酸化により14-3-3蛋白との結合に影響を与える変異(S214A、S214D)などを有するタウ蛋白を細胞(HEK293)に強制発現させ、その分解過程をパルスチェイス法により検討した。結果として、FTDP-17遺伝子変異ではタウ蛋白の分解は遅延していた。また、14-3-3蛋白との結合に影響を与える変異ではタウ蛋白の分解は促進していた。変異によるリン酸化への影響が、タウ蛋白分解の速度を制御している可能性が示唆された。タウ蛋白の自己重合は前述のように14-3-3蛋白などの結合因子が作用すると加速されるが、その中で14-3-3蛋白は細胞内にける含有量が多いにもかかわらず、リン酸化やタウ遺伝子変異重合に関してはほとんど研究されていなかった。我々は今までにタウ蛋白のSer214部位がリン酸化されると14-3-3蛋白との結合親和性が増大することとタウ重合を抑制することを報告してきた。そこでタウ遺伝子変異が原因となっている家族性前頭側頭型認知症FTDP-17にて認められた変異(ΔK280、P301L、V337M、R406W)を導入した全長型リコンビナントタウ蛋白を用い、まずタウ蛋白と14-3-3蛋白の間の結合親和性を表面プラズモン共鳴法などで定量化して、比較検討する。表面プラズモン共鳴法ではBiacore2000を用い、マニュアルに従って14-3-3蛋白をフローセル上に不動化し、リガンドとしてタウ蛋白を注入してResponse Unitを測定し、解離常数を算出し、結合親和性に関して検討をおこなった。さらに、我々はタウ蛋白のSer214部位がリン酸化されると14-3-3蛋白との結合親和性が増大すると結合親和性が低下することを把握しているので、この部位をリン酸化するprotein kinase A (PKA)またはprotein kinase B (PKB)などでタウ蛋白をあらかじめリン酸化し、リン酸化を受けた状態でのFTDP-17変異を受けたタウ蛋白の結合親和性を比較検討した。結果として、遺伝子変異したタウは野生型タウに比して14-3-3蛋白との結合親和性が増大した。さらに、リン酸化すると14-3-3蛋白との結合親和性はさらに亢進し全て同じレベルとなった。FTDP-17にて認められた(ΔK280、P301L、V337M、R406W等)のアミノ酸置換をともなう変異を導入した全長型リコンビナントタウ蛋白を用い、タウ蛋白と14-3-3蛋白の間の結合親和性を表面プラズモン共鳴法などで定量化したところ、変異タウは野生型タウに比較して結合親和性が亢進していた。さらに、タウ蛋白をPKAによってリン酸化して同様の検討を行ったところ、結合親和性はさらに亢進したが、野生型と変異型との間に差はなかった。そこで、微小官結合部位における結合は変異によって親和性が変化するが、リン酸化Ser214部位における結合は変異によっては変化しないことが示唆された。さらに、変異タウおよび野生型タウを14-3-3蛋白存在下で重合を誘導させると変異タウの重合は野生型タウに比べて亢進していた。しかし、PKAによってリン酸化されたタウは野生型も変異型も重合性は消失した。

このことから、Ser214部位のリン酸化誘導は遺伝性タウオパチーにおいて治療的有効性があることが示唆された。タウ蛋白の分解に関しては、PSA(Puromycin sensitive aminopeptidasse)によるin vitroにおけるタウ蛋白の分解過程を検討したところ、タウ全体の分解は認められなかった。しかし、タウ蛋白のN末端を認識する抗タウ特異抗体を用いた検討では、タウ蛋白のN末端は分解された。次にタウ遺伝子を導入したHEK細胞にPSA遺伝子を導入すると、今度は細胞内タウ蛋白量が減少し、PSAに対するsiRNAを添加、あるいは酵素阻害剤を添加すると、細胞内タウ蛋白量は増加した。よって、PSA自身はタウ蛋白のN末端を部分分解するだけだが、このことが引き金となり細胞内の他の分解酵素と協同してタウの分解が制御されている可能性が示唆された。老年精神医学、認知症、神経化学初年度にパルスチェイスのセットアップに時間を要したが、概ね解決された。タウ分解過程に関する研究が遅れているが、パルスチェイスの細かいセットアップに時間を要したためである。これは概ね解決されつつあるので、今後は推進したい。基本的なコンストラクトは準備されたので、これらを用いて効率的にデータを蓄積したい。今後の研究推進に関しては、さまざまなリコンビナント蛋白を作成したが、この蛋白の精製に多くの時間を要したので、この点を克服する。次年度は遺伝子変異したタウ蛋白と他のタウ蛋白結合因子との関係をより詳細に解析する予定であるが、できるだけ効率的にマテリアルを準備し活用したい。前年度より計画に若干の遅れがあり、リコンビナント蛋白合成および抽出に関して予算を使用しきれなかた。リコンビナント蛋白合成および抽出に使用する。タウの遺伝子変異による細胞内分解過程をパルスチェイス法により解析する検討が遅延していたので、この点に関して研究費を使用する。
DGGE法を用いた感染性心内膜炎の原因となる口腔フローラの網羅的解析

IEの口腔内での最大の原因菌である口腔レンサ球菌を標的としてRod shape-determining protein遺伝子(rodA)の多様性に基づいたDGGE法を確立した。これに基づき、唾液を検体として細菌叢の網羅的解析を行った。実際に感染性心内膜炎を引き起こした菌株の生化学的性状検査と16S rRNA遺伝子から菌種を推定、特にStreptococcus mutansと同定された菌株のゲノムDNAのドラフトシークエンスを決定し、既にデータベース上に発表されているゲノムシークエンスとの比較を行い、心内膜炎特異的な病原因子の検討を行った。レンサ球菌以外の口腔細菌も調査するため、う蝕検査、歯周疾患検査、日和見菌検査を利用し、小児患児の唾液を検体とした調査もあわせて行った。口腔フローラは300種を超える細菌種で構成される複雑な細菌叢である。この口腔フローラで大多数を占める種が口腔レンサ球菌と呼ばれるStreptococcus属である。この口腔レンサ球菌は常在菌で通常は強い病原性を示さないが、Streptococcus mutansのように齪蝕病原性を示したり、ミティスグループレンサ球菌のように日和見感染により亜急性感染性心内膜炎を引き起こしたりするものが含まれている。そこで本研究ではまずこれらの口腔レンサ球菌を標的として網羅的解析を行うための手法を開発することにした。また、これまで我々は細菌細胞の形態形成に関与するRod shape-determining protein遺伝子(rodA)に関する研究を行っており、このrodA遺伝子が口腔レンサ球菌をはじめとした多くの細菌が有していること、遺伝系統解析から細菌叢の網羅的解析に通常使用される16S rRNA遺伝子よりも10倍以上の多様性を有していることがわかった。そこで本年度は、rodA遺伝子の多様性に基づいた口腔レンサ球菌を検出するためのDGGE法を確立し、Journal of oral microbiology誌に報告を行った。その一方で実際に感染性心内膜炎を引き起こし、口腔由来と考えられるレンサ球菌の臨床分離株を入手出来たことからこの菌株の生化学的性状検査と16S rRNA遺伝子の決定を行って大体の菌種を推定した。また、この菌株のゲノムDNAを抽出精製し、特異的な病原遺伝子、特にDGGE法などにより心内膜炎起炎菌の検出に有効な遺伝子の特定を行うためにホールゲノムのシークエンスの決定を行うこととした。現在ドラフトシークエンスが終了し、得られたデータコンティグのアッセンブルとアノテーションの作成を行っている。今後は他のレンサ球菌ゲノムとの比較により、目的遺伝子の抽出を行っていく予定である。この口腔レンサ球菌は常在菌で通常は強い病原性を示さないが、日和見感染により亜急性感染性心内膜炎を引き起こすものが含まれている。平成21年度はこれらの口腔レンサ球菌を標的としてRod shape-determining protein遺伝子(rodA)の多様性に基づいたDGGE法を確立し、これに基づいて平成22年度は唾液を検体として細菌叢の網羅的解析を行った。また、実際に感染性心内膜炎を引き起こし、口腔由来と考えられるレンサ球菌の臨床分離株を入手出来たことからこの菌株の生化学的性状検査と16S rRNA遺伝子から菌種を推定した。特にStreptococcus mutansと同定された菌株のゲノムDNAのドラフトシークエンスを決定し、既にデータベース上に発表されているゲノムシークエンスとの比較を行い、心内膜炎特異的な病原因子の検討を行っている。その一方で、レンサ球菌以外の口腔細菌も調査するために、BML社のう蝕検査、歯周疾患検査、日和見菌検査を利用して、小児歯科外来患児の唾液を検体として、Lactobacillus属などのう蝕関連細菌、Porphyromonas gingivalisやAggregatibacter actinomycetemcomitansなどの歯周病菌、Streptococcus pneumoniaeやHaemophilus influenzaeなどの日和見感染菌の調査もあわせて行っているところである。口腔内からの菌にて感染性心内膜炎を引き起こした場合がほとんどこれにあたる。

平成21年度はこれらの口腔レンサ球菌を標的としてRod shape-determining protein遺伝子(rodA)の多様性に基づいたDGGE法を確立し、これに基づいて平成22年度は唾液を検体として細菌叢の網羅的解析を行った。また、実際に感染性心内膜炎を引き起こし、口腔由来と考えられるレンサ球菌の臨床分離株を入手出来たことからこの菌株の生化学的性状検査と16SrRNA遺伝子から菌種を推定した。特にStreptococcus mutansと同定された菌株のゲノムDNAのドラフトシークエンスを決定し、既にデータベース上に発表されているゲノムシークエンスとの比較を行い、心内膜炎特異的な病原因子の検討を行った。平成23年度はレンサ球菌以外の口腔細菌も調査するために、BML社のう蝕検査、歯周疾患検査、日和見菌検査を利用して、小児歯科外来患児の唾液を検体として、Lactobacillus属などのう蝕関連細菌、Porphyromonas gingivalisやAggregatibacter actinomycetemcomitansなどの歯周病菌、Streptococcus pneumoniaeやHaemophilus influenzaeなどの日和見感染菌の調査もあわせて行った。更に、IEを起こした患児から分離されたStreptococcus oralisのゲノムシークエンスを行い、現在10個ほど残ったgapシークエンスを解析しているところである。また本菌のゲノム状の特徴としてはハウスキーピング遺伝子はStreptococcus oralisに分類されるものであるが他のシークエンスのホモロジーがデータベース上に存在するものの比較で8095%と低いため、この点でIEとの関連が示唆できないか検討中である。
マウスにおける減数分裂制御機構の解析

1.分裂酵母のmei2遺伝子がコードするRNA結合タンパク質と、sme2遺伝子がコードするmeiRNAは複合体を形成して減数分裂の制御に関わっている。mei2またはsme2変異を機能的に相補するマウス遺伝子を12種類単離した。sme2を相補するクローンのひとつ(♯MTA6)は精巣で特に強く発現し、その遺伝子産物はpolyA結合タンパク質と高い相同性をもっていた。このタンパク質は精巣において精母細胞の核に局在することから、減数分裂の進行に重要な役割を果たしていることが示唆された。2.分裂酵母mes1は減数第二分裂に必須な遺伝子である。mes1変異を抑圧するマウス遺伝子として、癌原遺伝子のc-cbl、アクチン、チューブリンおよびダイニン中間鎖をコードする遺伝子を単離した。3.分裂酵母においてmes1変異を抑圧する劣性変異としてsms1-sms11の遺伝子座を同定した。複数のsms変異がタイプ1プロテインフォスファターゼをコードするdis2遺伝子の過剰発現により抑圧された。またmes1のマルチコピーサプレッサーとして、DNA修復後の細胞周期の再開を制御することが示唆されているslp1遺伝子と、α-tubulinをコードするnda2およびβ-tubulinをコードするben1遺伝子を単離した。4.分裂酵母mam4遺伝子はRasタンパク質や接合フェロモンを修飾するメチルトランスフェラーゼをコードする。mam4変異を機能的に相補する遺伝子を種々の脊椎動物のcDNAライブラリーを用いて検索し、アフリカツメガエルよりmam4の相同な遺伝子(Xmam4)を単離した。またEST(expressed sequence tags)プロジェクトによりマウスにおけるXmam4の相同遺伝子が報告され、この遺伝子のファミリーが酵母から哺乳動物まで保存されていることが明らかとなった。5.分裂酵母の減数分裂期の染色体の挙動を蛍光in situ hydridization法により解析し、接合フェロモンのシグナルにより、テロメアがSPB(spindle pole body)の近くにクラスターを形成することを示した。分裂酵母の減数分裂不能な突然変異を相補するマウス遺伝子を検索して、減数分裂の制御機構が分裂酵母とマウスの間で保存されているか否かを検討した。分裂酵母のmei2は減数分裂開始および減数第一分裂を制御し、その遺伝子産物はmeiRNA(sme2遺伝子産物)と複合体を形成するRNA結合タンパク質である。mei2-197E変異株は減数分裂前DNA合成不能であり、mei2-33変異株およびsme2欠損変異株は減数分裂前DNA合成は可能だが、減数第一分裂不能である。これらの突然変異を相補するマウス遺伝子を12種類単離した。sme2を相補するクローンのひとつは新規のRNA結合タンパク質をコードし、複数の転写産物のうち1.2kbのmRNAが精巣特異的に発現していた。mei2-197Eを相補する遺伝子のひとつはDnaJファミリーに属する新規遺伝子であり、精巣で強く発現することがわかった。また、アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼをコードするNedd2遺伝子がmei2-197E変異とmei2-33変異の両方を相補した。一方、分裂酵母のmes1遺伝子は減数第二分裂特異的に働く遺伝子である。mes1遺伝子産物は既存のタンパク質と相同性をもたず、その生化学的な活性は明らかでない。mes1を相補するマウス遺伝子を単離したところ、αチューブリン、アクチンおよびダイニンをコードする遺伝子と癌原遺伝子のc-cblが得られ、mes

1遺伝子産物は減数第二分裂期における細胞骨格調節に関与することが示唆された。c-cbl遺伝子産物はN末端領域が癌原遺伝子として必須であるが、mes1の相補にはC末端領域のみが必須であり、c-cblがどのような活性によりmes1を相補するのかは不明である。これまでの解析からは、分裂酵母で明らかにされた減数分裂の制御系がマウスにおいて保存されているか否かは明らかではない。今後さらに得られた遺伝子の解析を進める予定である。1.分裂酵母のmei2遺伝子がコードするRNA結合タンパク質と、sme2遺伝子がコードするmeiRNAは複合体を形成して減数分裂の制御に関わっている。sme2変異を機能的に相補する遺伝子として前年度までに単離したマウスのクローン(♯MTA6)について解析を進めた。この遺伝子は長さの異なる複数のmRNAに転写されているが、そのうちの1.2kbの転写産物は精巣特異的に検出された。遺伝子産物はpolyA結合タンパク質と高い相同性をもっているが、抗体を調製して精巣の切片を染色すると精母細胞の核が染色され、このタンパク質が減数分裂の進行に重要な役割を果たしていることが示唆された。2.分裂酵母mes1は減数第二分裂に必須な遺伝子であるが、mes1によりコードされる約11kDのタンパク質の生化学的な機能は不明である。mes1変異を抑圧する劣性変異としてsms1-sms11の11の遺伝子座を同定した。これらのうち少なくともsms1、sms3、sms4およびsms5は、タイプIプロテインフォスファターゼをコードするdis2遺伝子を過剰発現することにより抑圧されることがわかった。またsms1変異のマルチコピーサプレッサーとして、DNA修復後の細胞周期の再開を制御することが示唆されているslp1遺伝子を同定し、mes1がチェックポイント制御に関わっている可能性が示唆された。3.分裂酵母の減数分裂の開始には接合フェロモンによる情報伝達が必須であり、mam4遺伝子は接合フェロモンM-ファクターを修飾するメチルトランスフェラーゼをコードする。マウスおよびアフリカツメガエルのcDNAライブラリーを用いてmam4変異を相補する遺伝子の検索を行ない、アフリカツメガエルよりmam4に相同な遺伝子(Xmam4)を単離した。また最近になってEST(expressed sequence tags)プロジェクトによりマウスにおける相同遺伝子が報告されたことから、この遺伝子のファミリーが酵母から哺乳動物に至るまで保存されていることが明らかとなった。