hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規細胞外マトリックス因子を用いた歯根膜再生技術の開発

そこでADAMTSL4βが歯根膜内でfibrillin-1と共局在しているかを、各々の特異抗体を用いた二重免疫染色で確認した。その結果、ADAMTSL4βはfibrillin-1抗体陽性のオキシタラン線維と共局在することが判明した。次にfibrillin-1のミスセンス変異で引き起こされるMarfan症候群のモデルマウスであるmgRマウスの歯根膜において、ADAMTSL4β陽性のオキシタラン線維に影響が出ているかを調べた。その結果、mgRマウスの歯根膜は野生型と比較して3倍以上に広がっており、異常な形態を示していた。次にmgRマウスの歯根膜を抗fibrillin-1抗体で免疫染色を行った結果、マイクロフィブリル線維の断片化に伴うオキシタラン線維の断裂化が観察された。そこで抗ADAMTSL4抗体を用いて免疫染色を行うと、ADAMTSL4β陽性のマイクロフィブリルの断裂化が観察された。これらの解析結果より、ADAMTSL4βはfibrillin-1と結合してオキシタラン線維を構成しており、この複合体はマルファン症候群では崩壊を受ける事が判明した。またマルファン症候群では重症の歯周病を引きこしている患者が多いことから、ADAMTSL4βとfibrillin-1により構成されているオキシタラン線維が歯根膜形成に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
テトラスパニンCD82を標的とした新規白血病治療方法確立のための基礎研究

接着分子CD82は正常細胞と比較して薬剤耐性白血病細胞で高発現しているため、CD82を標的とした白血病治療の有効性について検討した。まずCD82の機能をブロックできる抗体を見出し、白血病発症マウスにこの抗体を投与すると、骨髄から末梢血へCD34陽性細胞が動員されることが判明した。そこでCD82抗体によって末梢血中に動員された薬剤耐性白血病細胞を攻撃するために既存の抗がん剤AraCも投与すると、各種単剤投与群と比較して、併用投与群では抗腫瘍効果が有意に高められた。CD82は抗アポトーシスタンパク質などの発現も制御しており、CD82を標的とした白血病の治療は効果的であると思われる。平成26年度は、異なる抗原配列を認識するCD82抗体の機能解析を行い、エピトープ95-267を認識する抗体が最も効果的にCD82の機能を抑制することを見出した。そして、この抗体と既存の抗がん剤シタラビンの併用による急性骨髄性白血病(AML)細胞増殖抑制効果についてin vitroで検討した。その結果、各種単剤投与群と比較して併用投与群ではAML細胞の細胞増殖を有意に抑制することを確認した。また、in vivoでのCD82抗体の作用を検討した。まず重度免疫不全(NSG)マウスに患者から採取したAML細胞を移植し、AML細胞がNSGマウスに生着したことを確認後、CD82抗体を投与した。投与3時間後に、CD34陽性白血病細胞が末梢血中に増加したことから、CD82抗体はCD34陽性白血病細胞の骨髄から末梢血への遊走能を高めている可能性が示唆された。さらにAML細胞株MOLM13に、MSCV-GFP-T2A-Luciferaseレンチウイルスベクターを遺伝子導入後、NSGマウスに移植し、AML細胞の動態のイメージングを行うためのAML発症マウスを作製した。このAML発症マウスモデルを用いたCD82抗体とAraCの併用効果については平成27年度に行う予定である。さらにCD82の機能解析を行った。白血病細胞をCD82抗体で処理するとp38シグナルが活性化し、ヒストンメチル化酵素EZH2の発現が低下した。同時に、がん抑制遺伝子であるPTENとp16のプロモーター領域におけるEZH2の結合、ヒストンH3のトリメチル化を抑制した。さらにこれらの遺伝子のプロモーター領域におけるDNAのメチル化を低下させ、これらの遺伝子の発現を増強した。以上の結果から、CD82はEZH2を介してエピジェネティックにがん抑制遺伝子の発現を制御している可能性を示唆した。AML発症マウスに及ぼすヒトCD82を特異的に認識するモノクローナル抗体の効果を検討した。その結果、CD82モノクローナル抗体を投与すると、CD34+細胞の割合が末梢血中に増加し、CD82モノクローナル抗体がCD34+細胞の骨髄から末梢血への細胞動員剤として作用している可能性が伺えた。さらにAML細胞の動態のイメージングを行うためのAML発症マウスにCD82モノクローナル抗体と既存の抗がん剤キロサイドを投与したところ、各種単剤投与群と比較して併用投与群では腫瘍量が抑制されており、有意に生存期間が延長することを確認できた。以上の結果から、CD82抗体と抗がん剤の併用は白血病治療において効果的である可能性が考えられる。さらに、CD82が制御している分子基盤の解明を行った。AML患者から採取したCD34+/CD38-分画のCD82をshRNAを用いて抑制後、マイクロアレイ解析を行い、CD82によって発現が制御されている遺伝子として、ヒストンメチル化酵素EZH2、DNAメチル化酵素3A(DNMT3A)、抗アポトーシスタンパク質BCL2L12を同定した。real time RT-PCRを用いてマイクロアレイの結果を確認したところ、同様の結果が得られた。CD82がSTAT5を活性化することは既に報告しているが、このSTAT5がDNMT3Aの転写を制御することでその発現を制御している可能性を示唆した。従って、CD82がSTAT5を介してDNMT3Aの発現を制御している可能性がある。さらに、CD82がAKTとSTAT5シグナルを介してBCL2L12の発現を制御していることを見出した。このBCL2L12がアポトーシス促進タンパク質BAXやカスパーゼ3活性を抑制することで白血病細胞の生存を高めていることを示した。またin vivo実験でもBCL2L12が白血病細胞の生着や生存期間に影響を与えていることが確認できた。平成27年度に実施予定であったCD82モノクローナル抗体と既存の抗がん剤のin vivoにおける併用効果のみならず、平成28年度の実施予定であったCD82が制御している分子基盤についても検討を始めることができたため。接着分子CD82が発現を制御しているIL-10の白血病細胞における機能解析を行った.その結果、IL-10がエピジェネティック制御遺伝子であるDNAメチル化酵素3A(DNMT3A)を介してmicroRNA9 (miR-9)のメチル化を誘導し、その発現低下を引き起こしていることが判明した。そして、miR-9の発現低下に伴い接着分子E-cadherinの発現が増加することを見出した。さらにIL-10は白血病細胞の間葉系幹細胞(MSCs)への接着を高めたが、白血病細胞のE-cadherinを抑制するとIL-10を加えてもMSCsへの接着の増加は見られなかった。このことからIL-10はE-cadherinを介してMSCsへの接着を高めている可能性が伺えた。

また、IL-10を抑制した白血病細胞を移植した免疫不全マウス(IL-10抑制群)では、IL-10を抑制していない白血病細胞を移植した免疫不全マウス(コントロール群)と比較して白血病細胞の骨髄への生着は抑制され、同時にIL-10抑制群の骨髄細胞中のE-cadherin、IL-10、DNMT3Aの発現レベルはコントロール群と比較して低下した。一方、miR-9の発現レベルは増加した。また、コントロール群とIL-10抑制群に既存の抗がん剤AraCを投与したところ、IL-10抑制群はコントロール群と比較して有意に生存期間の延長が見られた。このときIL-10抑制群の骨髄細胞中のE-cadherin、IL-10、DNMT3Aの発現レベルはコントロール群と比較して低い状態を維持し、逆にmiR-9の発現レベルは高い状態を維持していた。以上の結果から、IL-10はE-cadherinを介して白血病細胞の骨髄への生着を高める作用を持つ可能性が示唆された。従って、CD82の下流シグナル分子であるIL-10も白血病治療の標的となり得る可能性が伺える。接着分子CD82は正常細胞と比較して薬剤耐性白血病細胞で高発現しているため、CD82を標的とした白血病治療の有効性について検討した。まずCD82の機能をブロックできる抗体を見出し、白血病発症マウスにこの抗体を投与すると、骨髄から末梢血へCD34陽性細胞が動員されることが判明した。そこでCD82抗体によって末梢血中に動員された薬剤耐性白血病細胞を攻撃するために既存の抗がん剤AraCも投与すると、各種単剤投与群と比較して、併用投与群では抗腫瘍効果が有意に高められた。CD82は抗アポトーシスタンパク質などの発現も制御しており、CD82を標的とした白血病の治療は効果的であると思われる。AML細胞においてCD82抗体と既存の抗がん剤の併用効果をin vitroで検証し、各種単剤と比較して併用によってAML細胞の細胞増殖を有意に抑制することを見出した。また、in vivoにおけるCD82抗体の作用を検証し、CD82抗体がCD34陽性白血病細胞の骨髄から末梢血への遊走を高める可能性について示唆した。CD82抗体と抗がん剤の併用効果を確認するためのin vivoイメージング用のAML発症マウスモデルも完成しており、このマウスを用いたin vivoでの研究も現在進行中である。さらにAML細胞に及ぼすCD82抗体の効果をin vitroで検証した結果、CD82抗体によってAML細胞のp38シグナル経路が活性化し、ヒストンメチル化酵素EZH2の発現を抑制した。そして、このEZH2の発現抑制によってがん抑制遺伝子の発現が増強することを見出した。CD82がEZH2を介してエピジェネティックにがん抑制遺伝子の発現を制御している可能性についても示唆しており、研究はおおむね順調に進展している。CD82によって制御されている分子の白血病細胞に及ぼす効果について検討し、C82の下流分子を標的とした白血病の治療方法の可能性についても模索する。CD82によって発現が制御されているEZH2とIL-10に焦点を当て、これらの遺伝子が白血病細胞に及ぼす効果について検討する。
自律神経制御の観点に立った骨リモデリングにおける生物時計の関わりの解析

平成18年度から引き続き,骨芽細胞に対するアセチルコリンの作用について,培養細胞株を用いた実験を行った.その結果,アセチルコリンは骨芽細胞のアセチルコリン受容体であるニコチン性アセチルコリン受容体およびムスカリン性アセチルコリン受容体を介して,がcyclinD1の発現レベルを上昇させて,骨芽細胞の増殖を促進することが明らかとなった.骨芽細胞で発現があるニコチン性受容体はα7およびβ4サブユニットで,ムスカリン性受容体はM1およびM4であったが,アセチルコリンを作用させることで,α7サブユニットおよびM1のmRNAが上昇することが示された.また,分化培地での培養条件で,アセチルコリンは骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ活性を低下させることが示された.オステオカルシンについては,発現レベルの差は認められなかった.これらのことから,アセチルコリンは骨芽細胞への分化初期において抑制効果があると考えられる.さらに,アセチルコリンは骨芽細胞に対して,破骨細胞への分化を促進するRANKL,炎症性サイトカインであるIL-1の発現を上昇させることがわかった.このことから,アセチルコリンが骨吸収を促進する可能性が示唆された.以上の実験について骨芽細胞の初代培養細胞を用いて同様の実験を行ったところ,同様の結果が得られた.動物実験においては,迷走神経刺激による骨量の増減について,骨密度測定を行ったが有意な変化は認められなかった.平成18年度の計画では骨芽細胞に対する副交感神経系の神経伝達物質の作用についてin vitroでの検討を行う予定であった。骨芽細胞様細胞株であるMC3T3-E1にアセチルコリンを作用させたところ細胞増殖が引き起こされた。さらに、ニコチンを作用させたところ同様に細胞増殖が引き起こされた。これらのリガンドに対する受容体について各種阻害剤を用いて検討したところ、ニコチン性アセチルコリン受容体α7サブユニットを介していることが明らかとなった。MC3T3-Elはα7サブユニットmRNAを発現しておらず、アセチルコリンおよびニコチンによってmRNAが誘導された。次に増殖作用を引き起こす細胞内シグナル伝達機構について解析した。ニコチンは他種の細胞に対して増殖作用を引き起こすことが知られており、細胞内シグナル分子として、cyclinD1、SrcおよびMAPKカスケードの分子などが関与しているという報告がある。そこで、cyclinD1の発現を検討したところ、発現が上昇していた。さらに、Src阻害剤により増殖が抑制されたことから、Srcの関与が示唆された。また、MAPKカスケード阻害剤により増殖は完全に抑制はされなかったが、経路の一部を担っていると考えられる。アセチルコリンについて同様の実験を行ったところ、一部同様の結果が得られており現在解析をすすめている。以上のように副交感神経系の神経伝達物質は骨芽細胞の増殖を引き起こすことが明らかとなった。今後シグナル伝達機構のさらなる解析とin vivoにおける実験を行っていく予定である。平成18年度から引き続き,骨芽細胞に対するアセチルコリンの作用について,培養細胞株を用いた実験を行った.その結果,アセチルコリンは骨芽細胞のアセチルコリン受容体であるニコチン性アセチルコリン受容体およびムスカリン性アセチルコリン受容体を介して,がcyclinD1の発現レベルを上昇させて,骨芽細胞の増殖を促進することが明らかとなった.骨芽細胞で発現があるニコチン性受容体はα7およびβ4サブユニットで,ムスカリン性受容体はM1およびM4であったが,アセチルコリンを作用させることで,α7サブユニットおよびM1のmRNAが上昇することが示された.また,分化培地での培養条件で,アセチルコリンは骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ活性を低下させることが示された.オステオカルシンについては,発現レベルの差は認められなかった.これらのことから,アセチルコリンは骨芽細胞への分化初期において抑制効果があると考えられる.さらに,アセチルコリンは骨芽細胞に対して,破骨細胞への分化を促進するRANKL,炎症性サイトカインであるIL-1の発現を上昇させることがわかった.このことから,アセチルコリンが骨吸収を促進する可能性が示唆された.以上の実験について骨芽細胞の初代培養細胞を用いて同様の実験を行ったところ,同様の結果が得られた.動物実験においては,迷走神経刺激による骨量の増減について,骨密度測定を行ったが有意な変化は認められなかった.
北海道に新規侵入したカササギ個体群の由来と定着条件の解明

北海道・九州・ロシア・韓国・中国などから収集したカササギ体組織のサンプルについてミトコンドリアおよび核DNAを解析した結果、1980年代から北海道南部に定着しているカササギ個体群はロシアに由来する可能性が高いことが判明した。カササギの卵や羽毛と潜在的な餌資源の安定同位体から、カササギは産卵期で約6割、換羽期で約4割の餌資源をペットフードに依存していると推定された。文献調査とウェブでの目撃情報収集、現地調査より、現在では苫小牧市に約200羽ともっとも多くの個体が生息しているが、分布域は胆振地方のほぼ全域から札幌市にまで及んでいることが明らかとなった。個体数と分布域のモニタリングについては,苫小牧市内全域を探索して164羽を確認するとともに,苫小牧市の分布地からそれぞれ約10kmと14km離れた白老町とむかわ町に少数が定着して繁殖していることを確認した。その他に過去に記録のある場所などを再探索したが,個体数の大きな変化や分布の急速な拡大は認められなかった。以上の集中的な現地調査以外でも,短期的・散発的に新しい場所で観察されたり,市民からの報告が寄せられたりしていることから,これらの情報を地図上から入力して効率的に収集・集約するためのウェブサイトを作成した。このウェブサイトは,試用期間を経て次年度の早いうちに一般に公開できる見込みである。また,過去の地域鳥類資料約50冊分をデータベース化した。DNA解析については,苫小牧・九州北部・韓国・ロシアから収集してきた200個体分以上のサンプルについてマイクロサテライトの多型を解析した結果,苫小牧個体群は北海道以外では国内で唯一定着している九州北部個体群には由来せず,ロシアの沿海地方に由来する可能性が高いと推定された。次年度にはロシアを中心に引き続きサンプル収集を進めて推定精度の向上を図る。人為的な餌資源への依存度を推定するための安定同位体比の分析については,カササギの生体試料として4つの巣から卵を収集した。次年度も卵の収集を進めるとともに,潜在的な餌資源である地上性・半地中性無脊椎動物やペットフードなどを同じ時期に収集し,一定量に達した段階でまとめて分析する予定である。また,ペットフードなどの利用実態を直接確認するため,カメラトラップ12台を設置した。DNA解析による由来地と創始者数の推定については、課題であったロシアでのサンプル収集が、担当者による現地調査によって大きく進んだ。その他に北海道や九州等で収集されたサンプルを含めて約100個体のマイクロサテライト遺伝子型を新たに決定した。人為的餌資源の利用実態については、夏までにサンプル収集を終えて集中的に分析した。カササギの卵17個と羽毛57枚、潜在的な餌資源としてペットフード11種類と地上性無脊椎動物75個体などの窒素と炭素の安定同位体比を分析し、餌組成をベイズ推定したところ、カササギは、産卵期の早春で約6割、換羽期である夏でも約4割をペットフードに依存していることが明らかとなった。苫小牧のカササギはペットフードなしには定住できないと考えられ、苫小牧への侵入以前からペットフードなどを利用する習性を身につけていたという当初の仮説を支持する結果が得られた。分布域のモニタリングについては、地図上をクリックして目撃情報を入力できるウェブサイトの構築により大きく進んだ。地域の新聞に掲載されたこともあり、ウェブ入力以外の電話や電子メールによるものも含めて266件の情報提供があった。これらの情報は地図上で誰でも確認できるようにするとともに、分布拡大予測に貢献できるようにデータベースとして共同研究者間で共有している。営巣数・個体数の把握については、苫小牧市以外での調査に重点を置き、苫小牧市以外の胆振地方の数か所で10羽以上が定着している一方で、札幌市を含めて他の地域では繁殖成功の事例はあるものの、安定した群れの形成には至っていないことが確認された。DNA解析がやや遅れているが、最終年度の解析により由来地をほぼ確定できる見通しである。安定同位体比分析による餌資源の推定は最終年度を待たずに結論を得ることができた。苫小牧市以外での分布や繁殖の確認は、ウェブサイトの開設やそれが新聞等で取り上げられたことでによって大きく進み、最終年度の分布拡大予測につながる成果が得られた。繁殖数・個体数のモニタリングも継続できている。DNA解析による由来地と創始者数の解明については、北海道・九州・ロシア・韓国・台湾などから200近いサンプルを収集し、マイクロサテライトとミトコンドリアDNAのコントロール領域について解析を進めた結果、北海道個体群はロシアに由来する可能性がもっとも高いことがわかった。創始者数を推定するには至らなかったが、少数個体の人為的な持ち込みが由来である九州個体群に比べて北海道個体群では遺伝的多様性がはるかに高いことから、多数あるいは繰り返しの侵入が示唆された。人為的餌資源の利用実態の解明については、北海道苫小牧市において収集したカササギの卵や羽毛および潜在的な餌資源の炭素と窒素の安定同位体比を分析した結果、産卵期で約6割、夏で約4割の栄養源がペットフード由来であると推定された。この結果は、北海道におけるカササギの生息環境が主に住宅地であることや、近年の海外におけるカササギの都市鳥化の報告と一致している。個体数と分布域のモニタリングについては、現在の分布の中心地である苫小牧市において全域の総数調査を繰り返し実施し、総個体数が約200羽であることを明らかにした。

その他の北海道内での分布状況については、文献調査とウェブを利用した情報収集システム、および現地の探索調査を組み合わせることにより、1980年代以降に室蘭から苫小牧の沿岸部から少しずつ分布範囲が広がり、現在では札幌市でも繁殖していることを明らかにした。しかしながら、巣内の観察が難しく、繁殖成功度を評価できなかったため、分布中心地と周辺域におけるアリー効果の比較はできなかった。そのため、将来の分布については、現時点では信頼性の高い予測が不可能と判断し、予測地図の提示は見送った。北海道・九州・ロシア・韓国・中国などから収集したカササギ体組織のサンプルについてミトコンドリアおよび核DNAを解析した結果、1980年代から北海道南部に定着しているカササギ個体群はロシアに由来する可能性が高いことが判明した。カササギの卵や羽毛と潜在的な餌資源の安定同位体から、カササギは産卵期で約6割、換羽期で約4割の餌資源をペットフードに依存していると推定された。文献調査とウェブでの目撃情報収集、現地調査より、現在では苫小牧市に約200羽ともっとも多くの個体が生息しているが、分布域は胆振地方のほぼ全域から札幌市にまで及んでいることが明らかとなった。苫小牧市内における個体数と分布のモニタリングは計画通り進めることができた。DNAサンプルの収集と分析は計画通り,ないしは計画よりやや前倒しに進んでいる。一方,苫小牧市以外での分布や繁殖の確認は,対象地域が広大であることから,やや遅れている。しかし,この点についてはウェブサイトやマスコミを通した広報などにより今後市民からの情報提供が増えることによって補える見通しである。安定同位体比のサンプル収集は,アクセス可能な巣が限られているが,人為的な餌資源への依存度を検証できる程度のサンプルは2年間で得られる見込みである。DNA解析については、ロシア等で得たサンプルの分析を進めて由来地を確定する。さらに、原産地での遺伝的多様性と苫小牧市およびその周辺域での遺伝的多様性の比較から有効集団サイズを推定するとともに、景観遺伝学的解析を試みる。個体数と分布域のモニタリングは引き続き継続する。特に毎年繁殖が確認されている地域において営巣数を確認するとともに、秋冬期の集団ねぐら調査によって個体数の正確な把握に努める。ウェブサイトでの情報と合わせて、分布拡大モデルを構築し、当初計画通り、20年後の道内の分布域を予測する。ただし、アリー効果については、繁殖成功度の地域間比較で間接的に検証することを想定していたが、繁殖成功度の把握が困難であることや、理論的な難点から、細部を見直す予定である。カササギの基本情報や北海道における生息情報を提供するとともに、一般市民が目撃情報を地図上から容易に入力できるシステムを提供。科研費終了後も存続するように手配済み。動物生態学個体数と分布のモニタリングおよび苫小牧での安定同位体比・DNAサンプルの収集は前年度と同様に進める。安定同位体比については夏までにサンプルの収集を終えて分析を始める予定である。さらに,由来地である可能性が高いロシアを訪問してDNAサンプルを収集するとともに,ロシアにおける都市部と郊外でのカササギの主要な生息環境を確認する。過去の文献記録および市民からの情報の収集をさらに加速し,最終年度に行う分布拡大予測の準備として,地理情報システム上でのデータベース化を始める。
サケの嗅覚機能を指標とした母川水識別機構に関する研究

我国の重要な水産資源であるシロザケ・サクラマス・ベニザケ(ヒメマス)は、生まれた川(母川)を降河する時に、母川固有の溶存遊離アミノ酸(DFAA)組成を母川水のニオイ成分として記憶し、数年後に成熟した時に、嗅覚によりDAFF組成を識別して高い確率で母川を選択したが、カラフトマスは選択しなかった。また、DFAAは主に河床の付着微生物の集合体であるバイオフィルムが産生し、流域・季節・年変動の少ないDFAA組成が存在した。我国で再生産している4種のサケ(シロザケ・カラフトマス・ベニザケ・サクラマス)親魚の嗅覚機能を指標とした母川水識別機構を解析して、シロザケ・カラフトマスの安定回帰、およびサクラマス・ベニザケの資源増産させるための方法を明らかにするため、以下の研究を行った。1)河川水のアミノ酸組成に対するサケの嗅覚機能の解析:(1)Y字水路を用いた選択行動実験:シロザケ・カラフトマス・ベニザケ・サクラマス親魚が回帰した河川水のアミノ酸組成をアミノ酸分析システムにより解析し、人工アミノ酸母川水(人工母川水)に対する選択行動実験を調べたところ、カラフトマス以外のサケは人工母川水に対して75%以上の選択性を示したが、カラフトマスは57%と選択性を示さなかった。(2)ニオイ受容体遺伝子(OR)の分子生物学的解析:RT-PCRによりヒメマスORの検索を行い、新たなMainORを1種類(LSSOR2)のおよびOR断片を6種類の塩基配列を決定した。2)河川水のアミノ酸の起源と季節変化の解析:(1)アミノ酸の起源の解析:豊平川の河床の礫岩を採集し培養したところ、付着している藻類などの微生物がアミノ酸を産出していることが判明したが、付着微生物と河川水中のアミノ酸組成に相関があるかは不明であった。(2)アミノ酸の季節変化の解析:天塩川の源流部から河口域までの流域生態系が異なる7地点において年4回、河川水のアミノ酸組成を分析したところ、地点および季節によって変化しないアミノ断組成があることが判明した。3)アミノ酸以外のニオイ成分の解析:天塩川の源流部から河口域までの流域生態系が異なる7地点の河川水を電子味識別システムによりニオイ成分を行ったところ、水質が定性的に変化したが、その成分の特定はできなかった。4)サケ嗅上皮DNAチップによる水質診断法の開発:ヒメマスの嗅上皮のcDNAライブラリーからOR関連cDNAをランダムにピックアップし、ヒメマス嗅上皮cDNAチップの作製を進めている。1)河川水のアミノ酸組成に対するサケの嗅覚機能の解析:(1)Y字水路を用いた選択行動実験:サクラマス・ベニザケ・シロザケ・カラフトマス親魚が回帰した河川水のアミノ酸組成をアミノ酸分析システムにより解析し、人工アミノ酸母川水(人工母川水)に対する選択行動実験を調べたところ、それぞれ81.3・75.9・85.7・59.3%の選択率を示し、カラフトマス以外は有意に人工アミノ酸河川水を選択することが判明した。(2)ニオイ受容体遺伝子(OR)の分子生物学的解析:2種類のヒメマスOR(LSSOR1・2)とシロザケOR(CSOR1・2)の母川記銘時(銀化期と降河回遊時)と母川回帰時の発現量の変動をリアルタイムPCRにより解析したところ、LSSOR1・2は母川記銘時に、CSOR1は母川回帰時に発現量が増加した。2)河川水のアミノ酸の起源と季節変化の解析:(1)アミノ酸の起源の解析:豊平川の付着藻類の単藻培養したところ、付着藻類がアミノ酸を産生していることが判明した。付着藻類以外の微生物が産生しているアミノ酸を分析している。(2)アミノ酸の季節変化の解析:天塩川の源流部から河口域までの流域生態系が異なる7地点において4年間にわたってアミノ酸組成を分析したところ、変動アミノ断組成があることが判明した。3)海水のニオイ成分の解析:海水中のアミノ酸組成をアミノ酸分析システムにより分析する方法を確立し、海水中のアミノ酸組成を分析した。4)サケ嗅上皮DNAチップによる水質診断法の開発:シロザケ嗅上皮のcDNAを用いて、母川記銘と母川回帰行動に関わる遺伝子を網羅的に検索するための、発現解析型cDNAマイクロアレイを作製した。作製されたマイクロアレイには約650種類のcDNAが搭載されていると考えられた。サケの嗅覚機能を指標とした母川水識別機構を解明するため、以下の解析を行った。1、河川水のアミノ酸組成に対するサケの嗅覚機能の解析:(1)ヒメマス

幼魚(スモルト)の電気生理学的嗅覚応答実験:スモルトに2005年3-7月にプロリン(1μM)を2週間暴露し、2005-2007年の6月と10月にプロリンに対する電気生理学的嗅覚応答を解析した。3-6月に暴露すると2006・2007年の6月・10月には対照群に比べて有意に嗅覚応答が高く記銘されたが、7月には記銘されなかった。(2)ヒメマス成熟親魚のY字水路における選択行動実験: 2005年3-7月に1μMプロリン(Test water)を各月2週間暴露して記銘させたスモルトを2007年10月に成熟するまで飼育し、Y字水路を遡上した個体と遡上した個体がTest waterを選択した割合を調べた。3-6月にプロリンを記銘させた成熟親魚はTest waterを有意に選択したが、7月に記銘させた成熟親魚は選択しなかったことから、ヒメマス1歳魚は3-6月に1種類のアミノ酸を記銘できることが明らかになった。2、河川水の溶存遊離アミノ酸(DFAA)の起源の解析:豊平川河床に礫岩切片を沈めてバイオフィルム(様々な細菌・藻類・原生動物などの微生物の共同体)を形成させ、培養実験を行った。バイオフィルムは豊平川の河川水中のDFAAの濃度・組成とほぼ同じDFAAを産生していること、また付着藻類が産生するDFAAの組成は、藻類の種類により異なり、また濃度も低いことが解析され、河川水中のDFAAは主にバイオフィルムにより産生されていることが明らかになった。3、サケ嗅上皮DNAチップによる水質診断法の開発:シロザケ稚魚嗅上皮のcDNAを用いて、降河行動にともなう嗅覚系の遺伝子変動の解析を行い、変動の大きかった遺伝子の機能と働きを調べたところ、マイクロアレイ上の25の遺伝子で大きな変化(亢進・低下)が見られ、現在これら25の遺伝子の塩基配列を解析し、相同性解析を行っている。
未熟児網膜症における遺伝子要因の解析とシグナル伝達系への関与

各症例のゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子のエクソン部分をPCR法にて増幅し、得られた産物の塩基配列を同定した。その結果、ノリエ病遺伝子については翻訳領域には全例変異はみられなかったが、5'側の非翻訳領域に変異があるものが一例あった。このことはノリエ病遺伝子の発現の調整に異常をきたしている可能性が示唆された。FZD-4遺伝子については、アミノ酸翻訳全領域と5'側の非翻訳領域の解析を行ったが、遺伝子変異を持つ症例はみられなかった。LPR5遺伝子は翻訳領域が23エクソンに及ぶ長い遺伝子である。その全てのエクソンについて、全例の塩基配列の同定を行った。その結果、複数症例でヘテロな遺伝子変異が見いだされた。これらのうち、新規の変異であるか、またこの変異によってアミノ酸の配列が変わるかについて、現在解析中である。今まで未熟児網膜症の発症には出生時の状態や出生後の酸素投与などの環境因子が要因と考えられてきたが、本研究の結果から内的因子、特に遺伝子の異常が本症の発症に寄与している可能性が示唆された。本研究の目的は、本邦での未熟児網膜症におけるノリエ病遺伝子、FZD-4遺伝子、およびLRP5遺伝子の変異をスクリーニングし、これらの遺伝子変異が対象例に比べ未熟児網膜症に有意に認められるか否かを検討する。さらに上記のスクリーニングから正常群との違いが見出された遺伝子変異については、培養細胞系に過剰発現させ、βカテニンの発現量を比較することによって、変異遺伝子による細胞内Wntシグナル伝達系への影響を検討する。本年度の研究実施計画は、臨床検体の収集と上記の3種の遺伝子のスクリーニングを行うものである。1.臨床検体の収集(計画)初年度から2年間で、各施設の遺伝子倫理委員会の承認のもと、対照群と未熟児網膜症群についてそれぞれ100余例の末梢血の臨床検体を収集する。(実績)対照群については、112例の検体の収集を終了した。未熟児網膜症群については、8例の検体が収集された。2.検体の遺伝子解析(計画)収集された各検体からゲノムDNAを抽出し、PCRにて上記の3種の目的遺伝子を増幅し、得られたDNA断片の塩基配列をシークエンサーで同定する。(実績)対照群については、全ての検体のゲノムDNA抽出が完了し、全例にPCRを行った。未熟児網膜症例については、収集された全例のゲノムDNA抽出が行われ、それぞれについてノリエ病遺伝子とFZD-4遺伝子のPCR、及びその塩基配列の同定が行われた。本概究の目的は、本邦での未熟児網膜症におけるノリエ病遺伝子、FZD-4遺伝子、およびLRP5遺伝子の変異をスクリーニングし、これらの遺伝子変異が対象例に比べ未熟児網膜症に有意に認められるか否かを検討する。本年度の研究実施計画は、臨床検体の収集と上記の3種の遺伝子のスクリーニングを初年度に引き続き行い、症例数を増やしていくものである。さらに目的遺伝子(FZD-4,LPR5,ND)の翻訳領域のcDNAを作成し、発現ベクターに組み込み、これをCos7細胞に遺伝子導入し、それぞれの目的遺伝子のタンパクを過剰発現させる。これらの細胞培養系でのWntシグナル伝達系への関与をβカテニンの発現で比較する。1.臨床検体の収集(計画)初年度から2年間で、各施設の遺伝子倫理委員会の承認のもと、未熟児網膜症群について末梢血の臨床検体を収集し、そのゲノムDNAから、目的遺伝子の塩基配列の同定を行う。(実績)未熟児網膜症群については、重症度の高い17例の検体が収集され、それぞれについて目的遺伝子の塩基配列の同定が行われた。2.培養細胞系での遺伝子導入による目的タンパクの過剰発現系の作成(計画)目的遺伝子(FZD-4,LPR5,ND)の翻訳領域のcDNAを作成し、発現ベクターに組み込み、これをCos7細胞に遺伝子導入し、それぞれの目的遺伝子のタンパクを過剰発現させる。(実績)目的遺伝子(FZD-4,LPR5,ND)の翻訳領域のcDNAが作成され、それをそれぞれHAタグの付いた発現ベクターに組み込まれた。

Cos7細胞に遺伝子導入し、タンパクの過剰発現がウエスタンプロットにて確認された。本研究の目的は、本邦での未熟児網膜症におけるノリエ病遺伝子、FZD-4遺伝子、およびLRP5遺伝子の変異をスクリーニングし、これらの遺伝子変異が対象例に比べ未熟児網膜症に有意に認められるか否かを検討する。さらに上記のスクリーニングから正常群との違いが検出された遺伝子変異については、培養細胞系に過剰発現させ、βカテニンの発現量を比較することによって、変異遺伝子による細胞内Wntシグナル伝達系への影響を検討する。本年度の研究実施計画は、収集された臨床検体の上記の3種n遺伝子のスクリーニングを完了し、見いだされた変異によるシグナル伝達系への影響を細胞培養系で再現する。1.臨床検体の遺伝子スクリーニング(計画)各施設の遺伝子倫理委員会の承認のもと、収集された未熟児網膜症群の末梢血の臨床検体から抽出されたゲノムDNAを用いて、目的遺伝子の塩基配列の同定を行う。(実績)それぞれの未熟児網膜症群の検体において、前年度までノリエ病遺伝子、FZD-4遺伝子の翻訳領域の塩基配列のスクリーニングが完了していた。今年度は上記の2つの遺伝子の非翻訳領域の塩基配列のスクリーニングが完了した。さらにLRP5遺伝子について23個すべてのエクソンの塩基配列を同定した。その結果、未熟児網膜症群に上記の遺伝子の変異を持つものがあった。2.データの総括と論文作成現在、データの解析を終了し、論文作成中である。
タ-ゲティング型製剤の製剤特性ー機能相関の体系化

本研究では、薬物の体内分布過程を制御し特定の標的部位に送達させると共に作用部位以外への臓器への移行を回避することにより、薬物適用と治療の最適化を図る“薬物タ-ゲティング"の学問および技術体系の確立を目的として、(1)標的指向化効率の評価解析法の確立、(2)運搬体システムの体内挙動特性の系統的整理、(3)標的指向化の方法論の確立、の三つの観点より検討を行った。第一の問題については、標的指向化に利用される各種運搬体システムの全身レベルでの動態特性を、生理学的薬物速度論を基礎とし解析する方法を確立し、引き続いて臓器潅流実験法や細胞培養系を利用して臓器、細胞レベルにおけるこれらの動態機構を全身レベルの動態と関連づけて解析する実験法を開発した。こうした実験系を利用して、各種高分子性あるいは微粒子性運搬体システムの動態特性をそれぞれの物理化学的あるいは生物学的特性と関連づけて整理した結果、前者に関しては分子サイズや電荷などの物理化学的特性あるいは糖鎖構造などの生物学的機能性官能基が肝臓への取り込み、腎排泄あるいは癌病巣などの標的臓器への移行に及ぼす影響を明らかにすることができた。また、各種微粒子性運搬体の製剤特性と動態の関連についても同様にいくつかの新しい知見を得た。そこで、以上のような知見を基礎として確立した設計指針に基づき実際に抗癌剤などを対象薬物としてその応用の可能性を検討した結果、モノクロ-ナル抗体を利用した癌病巣への送達システムや、糖鎖認識機構を利用した肝臓実質細胞への送達システムの開発に到達し、こうした体系化された情報に基づく総合的設計アプロ-チの有用性が確認された。
フラミドモナスの新奇アクチン(NAP)の構造と機能

クラミドモナスには骨格筋アクチンと90%のアミノ酸相同性を持つアクチンと、それとは非常に異なる配列を持つNAP(アクチンとの相同性64%)の、二種のアクチン遺伝子が存在し、互いに排他的に発現している。一生物種内に保守的なアクチンと非保守的なNAPが共存している例はこれまでに報告がない。今年度は2種のアクチンの機能的差異を検討するために、分裂酵母発現系を用いた機能解析を行った。また、他生物種におけるNAPホモログの有無を検討した。1.アクチンとNAPの酵母発現モデルの作成・解析NAP、及びアクチン遺伝子を分裂酵母の発現用ベクター(pREP1、pREP81)に導入した。NAP-pREP1で形質転換した分裂酵母株は細胞質分裂が著しく阻害され、多核の長い細胞が多く現れた。2割程度の細胞では抗NAP抗体による染色で分列環に似たリング状構造が確認され、リング内に少量の内在性アクチンが共局在した。2.他生物種におけるNAPの存在の有無近縁種のボルボックスを用い、NAP遺伝子ホモログの有無をサザンブロット法により検討した。NAPのcDNAコード領域の中間部をプローブに用い、ハイブリダイゼーションを行ったところ、反応するバンドは全く検出されなかった。徐々にストリンジェンシーを下げると、ボルボックスのアクチン遺伝子に相当するバンドが薄く検出された。ボルボックス・アクチンとNAPのアミノ酸配列相同性は65%である。実験結果はこの生物に少なくともアクチン以上にNAPと相同性を持つようなNAPホモログは存在しないことを強く示唆した。これは両種のアクチンが98%の高い相同性を持つこととは対照的である。クラミドモナスには骨格筋アクチンと約90%のアミノ酸相同性を持つアクチンと、それとは非常に異なる配列を持つNAP(アクチンとの相同性64%)の、二種のアクチン遺伝子が存在する。現在のところ一生物種内に保守的なアクチンと非保守的なNAPが共存している例は他に報告がなく、この二種のアクチンが機能的にどのような役割分担をしているのかは、大変興味深い。本研究ではアクチン遺伝子欠損株ida5を用いて、アクチンとNAPの機能的差異を検討した。1.栄養増殖中のクラミドモナス細胞内でのアクチンとNAPの発現様式アクチン、NAPそれぞれのN末端を特異的に認識する抗体を作成し、栄養増殖中の野生株及びida5の全タンパク質のウエスタンブロットを行った。その結果野生株ではアクチンのみ、ida5ではNAPのみが検出され、通常の野生株でNAPがほとんど発現していないことが明らかになった。ノザンブロットの結果、野生株ではアクチンのmRNA発現量に比べNAPのそれはごく微量であるが、ida5では大量に発現していることがわかり、ウエスタンブロットの結果を支持した。2.分裂時、接合時におけるアクチン、NAPの局在蛍光抗体法による観察では、野生株でアクチンは間期の細胞中心付近の細胞質に、分裂期の分裂溝付近にそれぞれ局在するが、これと同様の局在がida5におけるNAPにみられた。さらに、人為的に接合管を誘導する処理を行ったプラス配偶子では、野生株でアクチンによる接合管形成が見られるのに対し、ida5では接合管が形成されるべき根本にNAPが局在した。一部の野生株配偶子では接合管にNAPが共局在し、アクチンとNAPが接合管内で共重合している可能性が示唆された。
新しいNLO‐クロモフォアの合成とその機能評価

光学レセプターのもつ分子情報処理機能を検証することは次世代フォトニクス分子材料の動作プロセスの確立に有効な基礎的知見を提供するであろう。その具体的検討のなかで、波長や屈折率など光の属性を操作できる非線形光学特性とレセプターのもつ分子認識機能とを連携させれば、分子レベルで非線形光学特性のスイッチングが可能と考えた。これは、分子情報によって光波を操作する技術の開発につながるので、フォトニクス材料の高度化に資すると思われる。本研究では、そのプロトタイプの性質が期待できるビス(インドアニリン)ジエチルアセテート誘導型カリックス[4]アレーン(1)の分子超分極率(β)をハイパーレーリー散乱(HRS)法を用いておこなった。実験は次のように、まず種々の試料溶液を調整し、フィルターを通した。Nd:YAGレーザーの1.064nmを基本波を用いて、基本波強度を変化させながら高次の散乱光を集光系で集め、基本波をカット後、干渉フィルターを通して光電子倍増管とボックスカ-検出器で532nmの光強度を測定した。各濃度における532nmのハイパーレーリー散乱強度が基本波入射強度の2次に比例することから、その係数の濃度依存の切片と傾きからβ値を算出した。興味深いことに、1のβ値は外部刺激因子であるCa^<2+>との選択的錯体形成によって変化することを見出し、外部刺激に基づくβのスイッチングの可能性を示唆した。
労働法における管理職労働者の法的規律に関する研究

管理職労働者は労働者の一部であり、労働法上の保護の対象とされている。他方で、部下の労働者に対して指揮命令を行うなど、使用者・経営者の役割の一部を担うという点で、一般労働者とは異なる特殊な存在であり、またワーク・ライフ・バランス等との関係で非常に重要な存在でもある。そのため、労働法上も、労働時間規制の適用除外をはじめとして、管理職労働者に関する特別なルールが存在する。本研究は、特殊な存在である管理職労働者について、労働法上どのような保護を与え、また、どのような責任を課すべきであるかについて、ドイツ法における立法や判例などを参考にしつつ、明らかにする。本年度は、当初の計画通り、ドイツ法における管理職労働者の法的取扱いに関する立法の変遷や判例ないし学説上の議論について文献調査を中心として研究を行なった。ドイツ法においては、いくつか領域において管理職労働者に関する議論が行われているが、その中でも事業所組織法と解雇制限法における特別取扱いに関する議論を中心として、主要な文献の収集・通読を行なった。なお、文献収集に関して、短期の在外研究を行い、ドイツのハイデルベルク大学及びオーストリアのウィーン大学の図書館を利用した。文献調査に関しては来年度も引き続き行う予定である。両法律を研究の中心としたのは、それらの議論を確認することにより、ドイツ法における管理職労働者の基本的な位置付けを明らかにすることができると考えたためである。管理職労働者について、当初は、両法律の保護の対象からは除外されていたが、その後の社会状況の変化を受けて保護の対象に追加されたという歴史的経緯及び、それぞれの法律に固有の特別取扱いの根拠について分析を行なった。これらは、日本における管理職労働者の法的取扱いを検討する上でも参考となるものであり、本研究課題にとって重要な意義を有する。本年度の研究成果については、来年度において、日本労働法学会での個別報告をはじめとして、いくつかの研究会において研究報告を行うことを予定している。また、それらの学会等での議論を踏まえつつ、論文として公表する予定である。本年度は、ドイツ法における管理職労働者の法的取扱いについて文献調査を中心に研究するとともに、ドイツ企業実務における管理職労働者の取扱いについても調査することを予定していたが、少し遅れている。その理由は、法当初の予定していた管理職労働者だけでなく、会社法上の機関構成員に関する労働法上の取扱いについても調査することが有益であると考え、予定よりも対象を広げて調査を行なっているためである。今後も計画通り、引き続き、ドイツ法における管理職労働者の法的取扱いについて、調査・分析を行なう。また、並行して、日本法における管理職労働者の取扱いについても調査・分析を行なっていく予定である。これらを通じて、管理職労働者に関する法的規律のあり方を示したい。
生産工程の国際分割に関するミクロ計量実証研究

日本企業に関するミクロ・データを用いて、生産工程の国際分割が企業の特性(生産性、資本・労働比率、研究開発集約度等)と統計的に有意な関係を有していることを実証的に明らかにした。(1)本研究では、企業のグローバル化の内で、生産工程の国際分割に絞って分析を行う。これにより、企業経営・経済理論両面で注目を集めているfragmentationのミクロ定量的把握が可能となり、雇用、所得、生産性等の面で国内経済にも重要なインプリケーションを有する国際分業の新たな形態に関する理解が深まると期待される。(2)具体的には、経済産業省が毎年実施している「企業活動基本調査」で把握された個別企業レベルのミクロ・データを、異常値のデータ・クリーニング等を経て、パネル・データの形式で整理した。この結果、産業特性のみならず時点効果も制御して、生産工程の国際分割と企業特性(企業規模、生産性、研究開発集約度、資本集約度等)との関係について今後計量分析するに有益なデータ・セットが構築された。個別企業に直接調査したミクロ・データに基づく本研究は、従来の産業連関表等の粗い集計データに比べ、生産工程の国際分割に関する定量的実態把握の精度が格段に増すこととなる。既に、同一産業でも部品を輸出し最終組み立て製品を輸入するという国際分業パターンが日本で主流になってきつつあるが、本研究は、最も詳細な分類に遡っても従来の産業ベースでは把握し得ない生産工程ごとの国際分業の理解に資する。(3)併せて、従来分析を行っていた「商工業実態基本調査」のミクロ企業データを用いた関連研究(海外アウトソーシングと海外生産・輸出の関係についての計量実証分析)について、研究成果をまとめ査読を経て学術専門雑誌に刊行した。また、当該先行調査の長所(中小企業を含む対象企業の幅広さ)・短所(海外アウトソーシングについて製造業務の委託のみを対象とした狭さ)について改めて検討し、新たな企業調査の参考とした。(1)本研究では、企業のグローバル化の内で、生産工程の国際分割に絞って分析を行っている。これにより、企業経営・経済理論両面で注目を集めているfragmentationのミクロ定量的把握が可能となり、雇用、所得、生産性等の面で国内経済にも重要なインプリケーションを有する国際分業の新たな形態に関する理解が深まる。(2)具体的には、経済産業省が実施した「企業活動基本調査」で把握された個別企業レベルのミクロ・データから2000-2005年にわたるパネル・データセットを整備し、生産工程の国際分割に関連した予備的な記述統計的分析を加えた。特に、他の企業調査結果と組み合わせることによって、海外に移転される工程が多国籍企業の社内で遂行されるのか他社にアウトソーシングされるのかの区別に注目して、資本・労働比率の企業比較等を試み、オフショアリングをテーマとして英国で開催されたコンファレンスにおいて研究成果を発表した。更に、コメントもふまえ、企業の選択に関する多項ロジット.モデルの推定に進みつつある。(3)併せて、従来分析を行っていた「商工業実態基本調査」のミクロ企業データを用いた関連研究(海外アウトソーシングと技術(プロダクト・サイクルや研究開発集約度)の関係についての計量実証分析)について、査読を経て海外の学術専門雑誌に2本の論文を刊行した。1.本研究では、企業のグローバル化の内で、生産工程の国際分割に絞って分析を行った。これにより、企業経営・経済理論両面で注目を集めているfragmentationのミクロ定量的把握に貢献し、雇用、所得、生産性等の面で国内経済にも重要なインプリケーショシを有する国際分業の新たな形態に関する理解を深めることを目指した。2.具体的には、経済産業省が実施した「企業活動基本調査」で把握された個別企業レベルのミクロ・データから2000-2005年にわたり整備されたパネル・データセットを利用し、生産工程の国際分割に関連した計量分析を行った。特に、他の企業調査結果と組み合わせることによって、海外に移転される工程が多国籍企業の社内で遂行されるのか他社にアウトソーシングされるのかの区別に注目して、資本・労働比率の企業比較を行った。その結果、労働集約的な企業の方が他社にアウトソーシングする傾向が統計的に有意に強いことが、企業規模、研究開発集約度等の様々な企業特性、仕向地域、業種等を制御しても多項選択モデルの推定により確認された。この結論は、先行研究で提示され集計レベルでの実証にとどまっていた理論的仮説の現実妥当性を企業レベルで直接検証したものである。個別企業に直接調査したミクロ・データに基づく本研究は、従来の産業連関表等の粗い集計データに比べ、生産工程の国際分割に関する定量的実態把握の精度が格段に増すものである。3.併せて、生産工程の国際分割と密接に関連する海外直接投資の理論的研究も行い、査読を経て海外の学術専門雑誌に合計で2本の論文を刊行した。
生命の生存限界を探る：海底下高温高圧環境での活動的生命圏の限界と生き残り戦略

本研究では、生命の存続に必須の「栄養供給」と均衡する生命活動を明らかにするため、海底下地層環境を題材として、そこで連続的、経時的に変化する温度・圧力条件と生命およびその存続についての観察を実施する。この観察により、地球内部での生命圏限界、または限界をもたらす物理化学的、生理学的因子を解明し、さらに限界生命圏の姿、生命の適応メカニズム、進化学的な議論を展開することを目的としている。地球の生命圏はどこまで続くのか、生命圏の限界を規定する環境要因(条件)とは何なのか、どのようにして生命は広い環境条件に適応する能力を得たのか、という生命に対する根源的な問いに答える研究である。数千万年程度でゆっくりと物理化学的環境条件が変化する海底下地層試料を天然の実験装置として活用し、海底掘削試料の微生物学的分析と模擬環境下での培養実験、数理モデル等の手法を用いて問いに迫ろうとしている。研究目的が達成されることにより、生命に対する根源的な問いの一部が解明される。また、存在限界の未知な地球微生物について、新たな知見が得られ、極限環境微生物の進化系統樹上の位置や、代謝反応の特性について、生命の起源論や地球外天体の生命圏の可能性の議論につながることが期待できる。
アキラルな分子の結晶化によるキラリティーの自然発現と光不斉反応の新展開

組織化された結晶空間には,均一系とは異なる特異な反応場が提供され,各々の分子は特徴ある反応挙動を示す。我々の研究グループでは結晶の特性を利用した次のテーマについて研究した。(1)組織化された結晶中での光反応による分子や結晶構造の動的現象の解明。(2)結晶により提供される特異な不斉環境の場を利用し,固相光反応による絶対不斉合成の開拓。(3)結晶化により記録された不斉な分子環境の異相間での絶対不斉合成への展開。結晶化の過程は分子の選択性に,結晶相反応は反応の選択性に優れている。この特性を巧みに活用し,自然晶出法によるキラリティーの自然発生や不斉結晶の固相光反応による絶対不斉合成を報告してきた。しかし,反応の選択性に優れていることは,逆に,限られた反応でしか利用できないことを意味している。反応の場を均一系やアモルファスへ展開する事によりこの問題を解決できる。すなわち,基質の結晶化によりキラリティーなどの分子情報を記録し,この情報を溶液系での多様性に活用することが可能になる。鎖状イミドはsp^2平面構造の窒素原子を有し,非対称なイミドの窒素原子上に非対称な置換基を導入すると置換基の回転がラセミ化に相当する。芳香環状の置換基が小さい場合は,C-N結合の自由回転によりアキラルである。ところが,この置換基を嵩高くしていくとある程度の寿命を持つようになる。もし,この分子が自然晶出により不斉結晶を形成すると,この結晶は溶解した後でも分子不斉を保つことができる。例えば窒素原子上にTetrahydronaphthy1基を有するプロキラルな非対称イミドの不斉結晶を低温のTHFに溶解し,CDスペクトルを測定すると,ラセミ化の半減期は7.7分(-20°C),31.7分(-30°C),147分(-40°C)であり,結晶化により記録された不斉分子情報を低温では長時間記憶していることを見出した。これらの不斉結晶を用いた固相光反応では,単一の立体配置の光学活性体(>99% ee)のオキセタンが得られた。さらに,低温溶液中での光反応でも90%eeの生成物が生成した。この溶液を-80°Cで4日放置した後の光照射でも78%eeのオキセタンと、固相光反応ではほとんど得られないジアステレオマーも76%eeで得られた。このイミドはη-BuLi,MeLi,LAHなどの求核試薬との反応でも高い選択性で光学活性体が83%eeの付加生成物が得られた。η-BuLiとの反応ではTHF中,-80°Cでの反応で83%eeの付加体が得られ,MeLiでは塩化メチレン中-80°Cでの反応で79%eeの生成物を合成することに成功した。また,アキラルな2-ベンゾイルベンズアミドの中で,N,N-Diethy1およびN-Benzyl-N-ethyl誘導体が不斉結晶を形成し,さらに,低温で不斉環境を保持していることを見いだした(式3)。η-BuLiとの反応では70-82%eeの光学純度でBu付加体が得ることに成功した。以上のように,アキラルな基質の不斉結晶化を見出し,さらに今まで報告例のない均一系反応や有機金属試薬との反応に展開でき,新たな絶対不斉合成の領域を開拓した。

これらの不斉結晶を用いた固相光反応では,単一の立体配置の光学活性体(>99% ee)のオキセタンが得られた。さらに,低温溶液中での光反応でも90%eeの生成物が生成した。この溶液を-80°Cで4日放置した後の光照射でも78%eeのオキセタンと、固相光反応ではほとんど得られないジアステレオマーも76%eeで得られた。このイミドはη-BuLi,MeLi,LAHなどの求核試薬との反応でも高い選択性で光学活性体が83%eeの付加生成物が得られた。η-BuLiとの反応ではTHF中,-80°Cでの反応で83%eeの付加体が得られ,MeLiでは塩化メチレン中-80°Cでの反応で79%eeの生成物を合成することに成功した。また,アキラルな2-ベンゾイルベンズアミドの中で,N,N-Diethy1およびN-Benzyl-N-ethyl誘導体が不斉結晶を形成し,さらに,低温で不斉環境を保持していることを見いだした(式3)。η-BuLiとの反応では70-82%eeの光学純度でBu付加体が得ることに成功した。以上のように,アキラルな基質の不斉結晶化を見出し,さらに今まで報告例のない均一系反応や有機金属試薬との反応に展開でき,新たな絶対不斉合成の領域を開拓した。