hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臓器の炎症におけるCD1dの病態生理学的意義

臓器の炎症におけるCD1dの役割を肝臓と肺を対象に動物実験と人体症例の解析を多面的に行った。肝炎の重症化や劇症肝炎はウィルス、薬剤、原因不明のものがあり、致死率が高く、発症前の診断と適切な制御法の開発が急務である。病因により肝細胞傷害機序の違いが示唆されている。私たちは、動物実験から、MKT細胞は肝臓類洞内に多く存在し、肝炎の重症化に重要な指標となるとともに直接的な役割を果たすことを見いだした。1)肝炎自然発症ラットを通常飼料で飼育すると、急性肝炎発症ラットのうち約80%が黄疽を認めた後、数日以内に重症化し、hyperacute liver failureにて死亡する。この際劇症化個体は早期(黄疸発症後3日7日以内)に肉眼的黄疽・消耗が顕著で、具体的指標として血清ビリルビン値が3mg/dl以上のものを重症化(劇症化)として確定できた。2)組織学的観察により、肝炎発症前にはほぼ正常で、急性肝炎発症後には肝細胞の大型化と核の腫大、クッパー細胞の増加、肝細胞の単細胞壊死がみられた。劇症化時には亜広範性壊死、クッパー細胞の増加、類洞内リンパ球の浸潤の増加が見られた。肝炎発症と重症化の違いは壊死の程度・範囲とリンパ球浸潤であった。以上より、急性肝炎の発症は細胞傷害性因子(重金属:銅、フリーラジカルなど)が重要であり、劇症化にはリンパ球を含めた免疫系の関与が示唆された。3)TNFalphaとIFNgammaが重症化時にわずかに上昇する。さらに、4)ヒトの先天性銅代謝異常疾患であるウィルソン病の同胞例(2名)で、同一の変異遺伝子を両方のアリルに保有する未発症例を経過観察した。両者とも肝臓への銅蓄積は同程度で組織学的にもまったく差がないにもかかわらず、肝障害を発症した者では末梢血中NKT細胞のsemi-invariant TCR鎖を保有するものが著増していた。さらに多くの症例の解析を行い、劇症化時の知見を蓄積している。肺の炎症・アレルギー疾患として、キノコ工場就労者に発症するヒトの職業性喘息症例について、免疫学的なマーカー(末梢血リンパ球分画、サイトカイン、IgE、沈降抗体、症状の程度)を指標に詳細に解析し、フォローアップスタディを行い、就労(胞子暴露)早期からのCD1b,陽性単球の増加と引き続く軽度のTh2偏倚状態を明らかにした。CD1ファミリー分子は脂肪(脂質、糖脂質)を結合して、特殊なT細胞(NKT細胞、γδT細胞)を活性化し、様々なサイトカインを産生せしめ、また、細胞傷害活性を生じせしめ、自然免疫と獲得性免疫の橋渡しを担う分子であることが明らかにされつつある。私たちが対象としているCD1d分子は全ての哺乳類でその構造や発現様式が類似している。本年度の助成により先ず以下の基本的な事が明らかになった。

(1)自己のCD1dを認識して反応する細胞は肝臓に多く存在すること、(2)それらの細胞の多くはCD3陽性CD161陽性の均一なVα14T細胞レセプターを発現する、(3)Vα14T細胞レセプターには相補的決定領域CDR2に多様性を有する複数(少なくとも4個)の遺伝子サブファミリーがあり、配列から2つのタイプに分類できる。(4)2タイプのVα14T細胞レセプターは臓器・組織ごとに異なる頻度で分布する(type1は脾臓にtype2は肝臓に多い)。以上のことから、NKT細胞は臓器・細胞ごとに異なる高次構造をとるCD1d・リガンド複合体を認識していることが示唆された。臓器・組織特異的な内因性リガンドの存在が推定され、正常および病的状態での内因性物質を特定する方向性を視野に入れる新しい方向性が開かれた。(5)また、肝臓でのCD1d発現は細胞質に多いが、刺激物質を投与すると肝細胞表面に急速に発現が増し、リンパ球浸潤も観察されるようになることを見いだした。このことは老化や癌化、薬剤やストレスなどによりCD1dの細胞表面への発現が増加したり、CD1d・リガンド複合体の性状が変化すると、その臓器に局在する組織特異的な性質を持った自己反応性のNKT細胞による傷害が起こり、変異した細胞を除去するという合目的可能性を印象付ける。さらに、(6)CD1dの細胞質内ドメイン、細胞外ドメインの様々なモチーフ(endosomal localization signal,β2m結合領域、CD8結合領域、など)に部位特異的突然変異法により特異的な変異を導入し、また、Fidelityの低いポリメラーゼを用いてランダムに変異を導入したCD1d変異体を多種類作成した。(7)それらの変異体の細胞表面発現を検討し、いくつかのCD1d分子の特定領域が膜表面へのCD1d移送に重要であることを初めて明らかにした。本研究により炎症におけるCD1dの直接的関与および修飾について解明する端緒が開かれた。急性肝炎の重症化および劇症肝炎はA型、B型肝炎ウィルスによるもの、薬剤によるもの、原因不明のものがあるが、致死率が高く、発症前の診断と適切な制御法が開発されることが急務である。病因により肝細胞傷害の機序が違うという証拠が提示されている。細胞傷害性T細胞のFas/Fasリガンド、TNF/TNFレセプターシステムによるアポトーシス・中毒性やクッパー・マクロフアージ系の関与などである。最近ではNKT細胞がそのサイトカイン分泌(IL-4とIFNgamma)を介して、様々な免疫応答の関与する疾患でTh1/Th2バランスを決定的に制御することが示唆されている。我々は肝炎の重症度の様々な指標やNKT細胞について検討した結果以下の結論を得た。1)肝炎自然発症ラットを通常飼料で飼育し、黄疸の有無、血清トランスアミナーゼ値などで経過を観察した。急性肝炎発症ラットのうち約80%が黄疸を認めた後、数日以内に重症化し、hyperacute Ilver failureにて死亡する。この際劇症化個体は早期に(黄疸発症後3日-7日以内)に血清ビリルビン値が3mg/dl以上になり、肉眼的にも黄疽、消耗が顕著である。よって重症化(劇症化)の目安を血清ビリルピン値が3mg/dl以上とした。2)肝炎発症前、肝炎発症後、重症化後のラット肝臓の組織学的観察により、肝炎発症前にはほぼ正常で、急性肝炎発症後には肝細胞の大型化と核の腫大、クッパー細胞の増加、肝細胞の単細胞壊死がみられたが、劇症化時には亜広範性壊死、クッパー細胞の増加、類洞内リンパ球の浸潤の増加が見られた。つまり、肝炎発症と重症化の違いは壊死の程度・範囲とリンパ球浸潤であった。
哺乳類の分泌する生理活性色素の研究

カバの赤い汗に含まれる赤色色素(ヒポスドール酸)とオレンジ色色素(ノルヒポスドール酸)の比は、採集時によって異なる。これは、個体によってもどちらかが多いといったような傾向はあるが、何が原因でその比が変わるのかはよくわかっていない。構造からは、赤色色素が脱炭酸するとオレンジ色色素になるが、一度生成した赤色色素は緩衝溶液中や水中で脱炭酸を起こさないことがわかった。この色素は、カバの無色の汗が皮膚上に分泌されてから、色素前駆体であるホモゲンチシン酸が、同時に分泌される酵素の触媒作用により酸化されて生じることがわかってきた。この反応をアルゴン雰囲気下で行うと、酸化反応は起こらないことから、真の酸化剤は空気であることがわかった。この酵素反応を同一の緩衝溶液中でpHを変えて行っても、その比はあまり変わらないが、同じpHでも緩衝溶液の種類が異なると、その比が変わってくることがわかった。この酵素反応を用いて、今後この脱炭酸反応の原因を調べる予定である。一方で、ヒポスドール酸類を化学的に合成する際には、対応する不安定なジヒドロキノンを合成し、これを最終段階で酸化して、不安定な色素へ変換する段階が鍵段階となる。検討の結果、酸化剤として空気を使い、触媒として2価の銅を用いると30%程度(2段階)の収率で、両色素をそれぞれの前駆体(ジヒドロキノン)から合成できた。この酸化反応の際に、赤色色素の前駆体からは、条件によってオレンジ色色素が副生することがわかった。酵素反応の際と同様に、この条件下で赤色色素からオレンジ色色素への脱炭酸は起こらない。しかし、反応時の緩衝溶液のpHには依存する。これは酸化の過程で生じる中間体が脱炭酸を起こすと解釈することができる。カバの汗は皮膚上に分泌された時点では無色であるが、数分で赤く色づき、数時間で茶色に変色してしまう。この赤い色の原因はヒポスドール酸および、ノルヒポスドール酸であり、それぞれ、赤色、オレンジ色の不安定な色素であることがわかっている。これらの色素が不安定な理由を解明するためには、色素を供給できることが必用であるため、色素の合成法の開発を行った。フルオレン骨格を合成するために、2つのベンゼン誘導体を出発物質とし、アリールリチウムをアリールアルデヒドに付加をさせ、生成したアルコールを酸化してベンゾフェノン誘導体とした。次に、このオルト位同志のカップリングにはPschorr反応を用い、フルオレノン骨格を形成した。この基本骨格に対して、増炭反応、酸化段階の調製を行って、上記色素の前駆体となるビスヒドロキノン誘導体を合成した。これを酸化して天然物へと導くわけだが、天然物は非常に不安定であり、濃縮、非プロトン性有機溶媒に触れる、吸着性のゲルに触れる等の操作により重合してしまう。そこで、素早く反応を行い、薄い溶液にした上で精製することが必用であった。酸化剤としては塩化鉄(III)を用い、グリセロールと水の混合溶媒中で反応を行ったところ、目的物が得られたが、収率は10%程度であった。グリセロールは溶液の粘性を増し、拡散が遅くなることを期待して用いた。種々の検討の後に、より温和な条件として、酸化の触媒として硫酸銅を用い、空気存在下で反応を行うと、収率も35%程度まで向上した。また、赤色色素の酸化過程でオレンジ色色素が副生することがわかった。この副生成物の割合は溶媒として用いた緩衝液のpHに依存することもわかった。哺乳類の中で色のついた汗をかく代表はカバ(Hippopotamus amphibius)である。

カバは血のような赤い汗をかくと言われるが、これは無色透明の汗が皮膚の上に分泌されてから数分のうちに赤く色づいたものであり、これが更に数時間後には茶色に変色してしまう。この赤く色付く現象の原因物質として、薄い溶液中でのみ存在できる非常に重合しやすい2つの色素(ヒポスドール酸(赤色)とノルヒポスドール酸(オレンジ色))を単離・構造決定することに成功した。次の疑問は、この色素の前駆体はどのような構造であるか、また何によって酸化されて着色するのかという点であった。これを調べるために、発汗直後の無色の汗を着色しないように、0.2Mリン酸緩衝液(pH6.1)を使って反応を止め、汗の低分子分画の成分を分析したところ、^1H NMRとMSデータよりホモゲンチシン酸が主成分であることがわかった。真っ赤になった汗に含まれる色素のおよその濃度とホモゲンチシン酸の濃度を比べると、色素の約15倍のホモゲンチシン酸が含まれていることになり、二量体に相当する色素の前駆体はホモゲンチシン酸であることがわかった。この時の酸化剤として働く可能性のあるものとして、空気、微生物、光、酵素が考えられるが、検討の結果、酵素反応であることがわかった。汗に含まれる高分子画分を種々の緩衝液中ホモゲンチシン酸と反応させたところ、目的色素が生じることがわかった。高分子画分を熱処理してから作用させると反応が起こらないことも、酵素による反応であることを示している。反応条件により赤色とオレンジ色の比が変化すること、天然においても採集時によってその比が異なることから、この原因を探ることが今後の課題の一つとなった。カバの赤い汗に含まれる赤色色素(ヒポスドール酸)とオレンジ色色素(ノルヒポスドール酸)の比は、採集時によって異なる。これは、個体によってもどちらかが多いといったような傾向はあるが、何が原因でその比が変わるのかはよくわかっていない。構造からは、赤色色素が脱炭酸するとオレンジ色色素になるが、一度生成した赤色色素は緩衝溶液中や水中で脱炭酸を起こさないことがわかった。この色素は、カバの無色の汗が皮膚上に分泌されてから、色素前駆体であるホモゲンチシン酸が、同時に分泌される酵素の触媒作用により酸化されて生じることがわかってきた。この反応をアルゴン雰囲気下で行うと、酸化反応は起こらないことから、真の酸化剤は空気であることがわかった。この酵素反応を同一の緩衝溶液中でpHを変えて行っても、その比はあまり変わらないが、同じpHでも緩衝溶液の種類が異なると、その比が変わってくることがわかった。この酵素反応を用いて、今後この脱炭酸反応の原因を調べる予定である。一方で、ヒポスドール酸類を化学的に合成する際には、対応する不安定なジヒドロキノンを合成し、これを最終段階で酸化して、不安定な色素へ変換する段階が鍵段階となる。検討の結果、酸化剤として空気を使い、触媒として2価の銅を用いると30%程度(2段階)の収率で、両色素をそれぞれの前駆体(ジヒドロキノン)から合成できた。この酸化反応の際に、赤色色素の前駆体からは、条件によってオレンジ色色素が副生することがわかった。酵素反応の際と同様に、この条件下で赤色色素からオレンジ色色素への脱炭酸は起こらない。しかし、反応時の緩衝溶液のpHには依存する。これは酸化の過程で生じる中間体が脱炭酸を起こすと解釈することができる。
LHCにおけるヒッグス結合定数測定のためのトリガーレベル解析

本研究の目的は、現時点で不可能であるとされる、チャームクォークとヒッグス粒子の湯川結合定数やヒッグス自己結合定数の測定をLHCにおいて実現するための基盤を、トリガーレベル解析により形成することにある。当該年度の一番の成果として挙げられるのが、Higgs粒子が2つのボトムクォークに崩壊するH→bbモードの発見が5σを超え、証拠(Observation)を得るに至ったことである。このH→bbモードは、本研究の主目的であるトリガーレベル解析のターゲットの一つである、Higgs粒子の自己結合定数の測定に用いる崩壊モードである。この成果は将来に渡る実験計画の基盤を盤石なものとした、大きなマイルストーン的な結果である。この物理に関連した面では、ヒッグス粒子に関連した物理を議論するための国際会議、Higgs Couplings 2018を11月末に東京おいて5日間の日程で行った。主な参加者は海外からHiggsの物理の研究者で、理論家と実験家を合わせて125名であった。上記の結果の議論も含め、最新結果の共有および問題点の洗い出しや改善手法に至るまで、理論と実験の両面で非常な活発な議論を交わすことができた。トリガーレベル解析のベース技術については、ATLAS実験の液体アルゴンカロリメータのトリガー読出し用のファームウエア開発を進めている。2018年はテスト読出し回路系統を新設、5.12Gbpsを40本、10GbpsベースのUDP通信を確立し、陽子・陽子衝突Runにおいてデータ取得を行った。現在この新しいデータ取得法で出てきた問題点の整理、改善方法の検討を行っている。また得られたデータ解析も行いつつ、安定動作するファームウエアを構築している。昨年度の計画の中で重要な項目は、トリガーレベル解析のための膨大になる情報を如何にFPGAへの入力するか、ということであった。これには合計96本の光ファイバーを接続できるデバイスを用いて、実際にデータを入力し、その処理をFPGA上にて行うファームウエアの整備が目標であった。当初、メザニーカードの製作も行うことを考えていたが、共同研究を行っているフランスのLAPPグループが製作したATLAS実験の液体アルゴン(LAr)カロリメータのアップグレード計画用のメザニーカードを使うことにより、このテストおよび開発が遂行できる目途がつき、研究を進めた。全部で96本の光ファイバーにて受信および送信を実現し、合計で400 Gbpsを超えるデータを処理できることを確認した。また、多変数解析(機械深層学習)の演算をFPGA上に実装するためのライブラリ作りなどを進めている。トリガーレベル解析に使うソフトウエアに関しても新設したカロリメータの読出し回路を用いて開発を進めている。2018年末までに行われた陽子・陽子衝突ランでは、外部からの特殊な信号を元にデータ取得する手法を確立し、実際にデータを取得した。実際の物理量の演算を行い、それをヒストグラムにするという一連の作業をすべてFPGA上で行い、その結果を読み出すというトリガーレベル解析で不可欠な処理を実際に行えることを示すことができた。この結果に読出しやFPGAの制御には10 Gbpsで動作するUDPサーバーをFPGA上に組み込み、実現させている。これはどのような実験にも使える非常に汎用性の高い技術である。前述の物理解析自体についてはH→bbモードのObservationを確立や国際会議を開催したこともあり、実りの多い年であった。本年度は本研究の最終年度と位置付けて計画を進めてきた。これまでの研究成果を組み合わせ、実際のトリガーレベル解析の具体的な計画を提案することが目標となる。ソフトウエアおよびファームウエア、そしてそのオペレーションについてはかなり知見が蓄積できた。これに加え、今まで使用してきたハードウエアを改良するようなカードの製作を進めていきたいと考えている。これにより、具体的な計画が提案できると考えている。実際の運用に関しても、より安定性、冗長性を向上させるためのシステムについて、実際のハードウエアを用いたテストを実行しながら検討を進め、より良いシステムの構築を目指す。実際のヒッグス粒子の自己結合定数の感度見積もりには、系統誤差の評価方法を見直す必要がある。これには背景事象の理解は勿論のこと、信号事象の記述における理論不定性を含めて研究を進めていく必要がある。これにはLHC Higgs Cross section working groupと共同研究していくことを考えている。最終的な感度が足りない場合の対策を練ることも本研究のテーマである。これについても、当初の研究計画の通り、今までの感度見積もり時に考慮していない改善を試していく事が大切であると考えている。cジェット同定への多変量解析の導入や、大統計データ解析の特徴を生かした系統誤差の削減手法の開発を進めていく。最終的にはヒッグスの物理だけに限らず、トリガーレベル解析によって実現可能となる物理解析を提案していきたいと考えている。研究成果は国内および国際会議で発表し、より具体的なステージへ進めるように尽力していきたい。初年度にあたる平成29年度は研究体制の形成に尽力した。一つ目のターゲットはトリガーレベル解析に適したプロセスの選定である。これに関してはヒッグス粒子が二つのボトムクォークに崩壊するモードを実験的に世界で初めて3σの有意度を超える兆候(Observation)を得ることができた。この成果を纏める過程で、アメリカで行われた会議に参加、発表をしている。

これはトリガーレベル解析にとっても非常に重要なベンチマーク解析となり、大きなマイルストーンが達成できたと言ってよい。実際にトリガーレベル解析の課題である2つのヒッグス粒子が作る共鳴状態の探索を、終状態に4つのボトムクォークからなるモードについて進めている。信号の力学的振る舞いの理解、そして背景事象の見積もり方などの研究を進め、日本物理学会において報告している。このような物理に関連したところで、ヒッグス粒子に関連した物理を議論するための国際会議、Higgs Couplings2018の招致に成功し、2018年11月に東京において開催することが決まった。トリガーレベル解析のベース技術となるのが、FPGA上で演算処理を行うためのファームウエアの開発であり、Intel社Arria-10の評価キットを用いて進めている。この演算処理には10 Gbpsを超える高速通信と高度なパラレル処理を達成しなければならない。これについてはATLAS実験の液体アルゴン(LAr)カロリメータのアップグレード計画と共に進めており、ハードウエア上での検証を進めている。このATLAS LArカロリーメータの全体会合もアジアで初めて2018年3月開催した。当初の予定であった、解析モデルの構築、研究体制の形成という観点では、ほぼ順調に進展していると言える。物理解析モデルでは、ボトムクォークを終状態に持つ、ベクターボソンV(Wボソン又はZボソン)とヒッグスボソンが生成されるVH随伴生成過程、そしてトップクォーク対とヒッグスボソンが生成されるttH生成過程の研究を進め、信号の再構成手法や系統誤差の評価方法を確立、2016年までに蓄積されたデータを使い、これらの生成過程の兆候(observation)を確認した。これらをトリガーレベル解析で行うための演算手法について、ファームウエアの開発を進めている。実際にFPGAを使う研究体制の形成についても、評価キットを中心とし、高密度・高速通信のテストも可能なシステムを構築、そして必要なファームウエア、およびそのコンパイルに必要なソフトウエアの整備を行った。しかしながら、すべてがうまく行っているわけではない。物理解析モデルに関しては、4つのボトムクォークが終状態になる解析の主要背景事象のモデリングについて、一番の系統誤差が何から来るのか、という点はまだ明らかにできていない。これは必要なモンテカルロ・データの準備に時間がかかっていることが主要な要因となっている。昨年度の計画として、FPGAの並列計算処理を活かす基本ロジックを集めたライブラリの構築を挙げていた。基本的なロジックは準備できているものの、効率の良いロジックとなっているかについては、更なる工夫が必要となっている状況である。具体的には、多変数解析(機械深層学習)の演算をFPGA上に実装するためのライブラリ作りなどである。これは当初の計画には入れていなかったが、解析モデルの研究の過程でこの導入が必要と判断した。
「無削除版日記」以降のアナイス・ニン――パリンプセストとしての再読

本研究は、無削除版日記の出版以降新たな局面を迎えたアナイス・ニン研究を、諸テクストをパリンプセストとして再読することで更新しようとする試みである。ニンの主著である日記は、編集版、初期の日記、無削除版の3シリーズからなるが、無削除版もまた編集されたものであることがわかっている。本研究は編集版・無削除版日記、UCLA図書館が所蔵する手書き日記、小説、書簡集等を等価なテクストとして重ね読みする。ニンにおいて「文」と「人」が分かちがたくあることは前提としつつ、人格/人生への価値判断を排し、ジェンダー/セクシュアリティ・精神分析・親族研究等の最新の知見を援用しつつ、21世紀的なニン再読を行う。
膜変形タンパク質のプロテオスタシスを基軸とする小胞体の恒常性維持機構の解明

小胞体の恒常性は選択的オートファジー(ER-phagy)により維持されており、小胞体の不要になった領域が膜変形、膜分裂し、隔離膜に包まれて排除される。オルガネラ全体が排除されるオートファジーとは異なり、ER-phagyでは隔離膜に共役して生じる小胞体の局所の膜変形と膜分裂を理解しなければならないが、そのメカニズムは不明な点が多い。本研究では、膜変形タンパク質の作用機序を解析することで、ER-phagyにおける小胞体の局所の膜変形と膜分裂の分子メカニズムを明らかにし、膜変形タンパク質のプロテオスタシスの立場から小胞体の恒常性維持機構を解明する。チューブ状小胞体を連結する三つ又構造はthree-way junctionと呼ばれ、最近、three-way junctionがER-phagyの調節に重要な働きをしていることが明らかにされつつある。そこで本年度は、three-way junctionに着目し、その形成機構の解析を行った。その結果、three-way junctionに局在する新しい小胞体膜タンパク質としてp57を発見した。p57はthree-way junctionの形成に必須の働きをする膜変形タンパク質atlastinおよびlunaparkと結合した。p57のsiRNAノックダウンはthree-way junctionの数を減少した。これらのことから、p57自身が膜変形タンパク質として、あるいは膜変形タンパク質の調節因子として機能することで、three-way junctionの形成を制御していることが明らかになった。このように本年度は、ER-phagyに重要なthree-way junctionの制御機構について新しい知見が得られた。本年度は、three-way junctionの形成を調節する新しい小胞体膜タンパク質p57を発見した。p57はN末細胞質領域にあるcoiled-coil領域を介してthree-way junctionへ局在すること、C末膜貫通領域を介して膜変形タンパク質atlastinおよびlunaparkに結合することを明らかにした。Three-way junctionはER-phagyの調節に重要な働きをしていることが知られている。従って今後、ER-phagy誘導時におけるp57のプロテオスタシスの解析を推し進めることで、隔離膜に共役して生じる小胞体の局所の膜変形と膜分裂の分子メカニズムの解明に繋がると考えられた。このように小胞体の恒常性維持機構に関わる新しい分子、新しい知見が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。ER-phagyを誘導した培養細胞から小胞体膜画分を単離し、界面活性剤で可溶化する。可溶性画分をショ糖密度勾配遠心分離し、本年度発見したp57を含む様々な膜変形タンパク質とER-phagy受容体(FAM134BやReticulon3B等)の両方を含むフラクションを決定する。このフラクションから膜変形タンパク質を免疫沈降し、共沈したタンパク質を質量分析で網羅的に同定する。同定したタンパク質群をsiRNAノックダウンして、膜変形タンパク質の局在と膜変形に与える効果を検討し、膜変形タンパク質のER-phagy標的部位への集積と膜変形誘導の分子基盤を明らかにする。膜分裂は、膜変形タンパク質が化学機械的な働きをするタンパク質をリクルートし、協力して膜分裂を行うと考えられているが、ER-phagyにおける化学機械分子の実体は不明である。そこで、オートファジー欠損細胞株にER-phagy受容体と膜変形タンパク質を過剰発現し、膜安定化因子をsiRNAノックダウンする。この細胞から小胞体膜画分を単離し、膜分裂の準備状態にある小胞体膜を人工的に調製する。他方、ER-phagyを誘導した培養細胞から細胞質画分を調製する。小胞体膜画分と細胞質画分を化学エネルギー(ATP再生系およびGTP)存在下で混合し、試験管内で膜分裂反応を進行させる。膜分裂活性を指標にして、各種カラムクロマトグラフィーにより細胞質画分から膜分裂を担うタンパク質を精製し、化学機械分子の実体を明らかにする。

本年度は、three-way junctionの形成を調節する新しい小胞体膜タンパク質p57を発見した。p57はN末細胞質領域にあるcoiled-coil領域を介してthree-way junctionへ局在すること、C末膜貫通領域を介して膜変形タンパク質atlastinおよびlunaparkに結合することを明らかにした。Three-way junctionはER-phagyの調節に重要な働きをしていることが知られている。従って今後、ER-phagy誘導時におけるp57のプロテオスタシスの解析を推し進めることで、隔離膜に共役して生じる小胞体の局所の膜変形と膜分裂の分子メカニズムの解明に繋がると考えられた。このように小胞体の恒常性維持機構に関わる新しい分子、新しい知見が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。ER-phagyを誘導した培養細胞から小胞体膜画分を単離し、界面活性剤で可溶化する。可溶性画分をショ糖密度勾配遠心分離し、本年度発見したp57を含む様々な膜変形タンパク質とER-phagy受容体(FAM134BやReticulon3B等)の両方を含むフラクションを決定する。このフラクションから膜変形タンパク質を免疫沈降し、共沈したタンパク質を質量分析で網羅的に同定する。同定したタンパク質群をsiRNAノックダウンして、膜変形タンパク質の局在と膜変形に与える効果を検討し、膜変形タンパク質のER-phagy標的部位への集積と膜変形誘導の分子基盤を明らかにする。膜分裂は、膜変形タンパク質が化学機械的な働きをするタンパク質をリクルートし、協力して膜分裂を行うと考えられているが、ER-phagyにおける化学機械分子の実体は不明である。そこで、オートファジー欠損細胞株にER-phagy受容体と膜変形タンパク質を過剰発現し、膜安定化因子をsiRNAノックダウンする。この細胞から小胞体膜画分を単離し、膜分裂の準備状態にある小胞体膜を人工的に調製する。他方、ER-phagyを誘導した培養細胞から細胞質画分を調製する。小胞体膜画分と細胞質画分を化学エネルギー(ATP再生系およびGTP)存在下で混合し、試験管内で膜分裂反応を進行させる。膜分裂活性を指標にして、各種カラムクロマトグラフィーにより細胞質画分から膜分裂を担うタンパク質を精製し、化学機械分子の実体を明らかにする。
粘土と有機カチオン分子の吸着時における電荷分布の解析

層状化合物は、規則性のある層構造を有しており、その種類によって層間の環境は多種多様であり、層間に他分子をインターカレーションすることによる修飾も可能であり、多方面で利用が検討されている。アニオン性粘土表面へのカチオン性色素、界面活性剤の吸着挙動、層状半導体ニオブ酸へのカチオン性色素、界面活性剤の吸着挙動、層状複水酸化物LDHへの色素の吸着挙動などを検討した。これらは、全て層状化合物であるが、粘土とLDHは平滑な表面形状をしているのに対し、ニオブ酸は、凹凸を持ち複雑な層間の形状をもつ。粘土とLDHは同形置換によって電荷が発生するため、置換原子の種類と位置とその数によって電荷分布が大きく異なり、物理化学的性質も異なる。それぞれの結晶構造を作成し、分子軌道計算によって比較検討した。粘土表面へのカチオン性ポルフィリン吸着におけるサイズマッチング則を、カチオン間距離の異なるポルフィリンと粘土の複合体に関して見いだした。層間を光反応場として利用する場合には、懸濁溶液では散乱によって光の吸収効率が悪く材料としての使用が難しい。そこで薄膜化を行なうことにより色素の密度を高め、さらに透明化によって散乱を減少させ、材料としての性能を高めた。ニオブ酸には、2種類の層間があり、電荷密度が低く剥離し易い層間に多フッ素化アゾベンゼン界面活性剤をインターカレーションすることを実現した。この層は、インターカレーション後、剥離し、同時に自発的に円筒形に巻くことによって、ナノチューブを形成した。これをXRD、AFMによって確認した。光照射によってアゾベンゼン部位による応答性を確認することができた。Sumeton SA等、数々の粘土モデルを作成し電荷発生源の位置を変化させた場合について、4価のカチオン性ポルフィリンの吸着挙動を調べた。その結果、ポルフィリンの初期位置にはよらず、電荷発生位置近傍に移動した収束構造が得られ、計算手法としては、局所安定解にとらわれることの少ない安定した構造最適化計算が行えるようになった。これらについて、2004年日本コンピューター化学会春季年会及び第48回粘土科学討論会にて発表した。また、2価ポルフィリンの場合は、4価ポルフィリンとは吸着挙動が異なり、溶媒組成(極性)の変化により粘土表面に平面吸着する場合と、ある角度をもって立ち上がった構造をとる場合があることを、光二色性測定などによって共同研究者らが実験的に確認している。これらの構造についてMOPAC/PM3,PM5,AM1法により検討し、粘土表面にポルフィリンが立った状態が、局所安定構造として存在することを確認した。また、吸収スペクトル及び、遷移モーメントの計算を行い、実測値と良い相関を得た。粘土と同様の層状化合物であるニオブ酸(K_4Nb_7O_<16>)は、表面電荷の発生メカニズムとその密度が粘土と異なり、環境の異なる2種類の層間を持っているなど、色素を吸着させた場合の光化学的挙動は粘土と同様に興味深い。ニオブ酸の結晶構造模型をX線回折による実測値を基に作成した。半経験的分子軌道法プログラムMOPACは、Nb原子のパラメータを持たず計算不可能なため、小さな系を非経験的分子軌道法プログラムGaussian98及び03を用いて計算した。また、同じ系についてNbをVA族などの原子について置き換えた構造について計算した。結合長と電荷等を比較検討したところNbをSbに置き換えたケースが最適であった。Sbは、MOPACによって計算可能であるので、原子数の多い(1001000)系についての検討を行っている。

我々は、アニオン性粘土表面へのカチオン性色素、界面活性剤の吸着挙動、層状半導体ニオブ酸へのカチオン性色素、界面活性剤の吸着挙動、層状複水酸化物LDHへの色素の吸着挙動などを検討している。これらは、全て層状化合物であるが、粘土とLDHは平滑な表面形状をしているのに対し、ニオブ酸は、凹凸を持ち複雑な層間の形状をもつ。粘土とLDHは同形置換によって電荷が発生するため、置換原子の種類と位置とその数によって電荷分布が大きく異なる。それぞれの結晶構造を作成し、分子軌道計算によって電荷分布を求めて、比較検討した。光反応を行なう場合には、懸濁溶液では散乱によって光の吸収効率が悪く材料としての使用が難しい。そこで薄膜化を行なうことにより色素の密度を高め、さらに透明化によって散乱を減少させ、材料としての性能を高めた。ニオブ酸には、2種類の層間があり、電荷密度が低く剥離し易い層間に多フッ素化アゾベンゼン界面活性剤をインターカレーションすることを実現した。この層は、インターカレーション後、剥離し、同時に自発的に円筒形に巻くことによって、ナノチューブを形成した。これをXRD、AFMによって確認した。光照射によってアゾベンゼン部位による応答性を確認することができた。
炭酸ガスレーザーを応用した歯質のセラミックス化によるう蝕予防と修復

う蝕予肪あるいは修復治療などのために,エナメル質表面に種々の陶材やガラメ系粉末材料を塗布し,炭酸ガスレーザーを照射し,エナメル質表面のセラミックス化について検討した。セラミツクスには,試作のメタリン酸カルシウム系キャスタブルセラミックス(PGC),市販歯科用キャスタブノレセラミックス(Crys-Cera),ならびに焼付用低溶陶材(Duceram-LFC)および(Degeceram Gold)を用いた.各セラミックスを粉砕し,400meshパスしたものを蒸留水に50mg/mlで懸濁液とし用いた。炭酸ガスレーザーは,オペレーザー-03s(ヨシダ製作所)を用い,照射筒先端と照射試料面との距離を20mmに固定した。照射条件は,照射時間30秒,照射強度1.0ワット,照射ビーム径0.49mmとした.レーザー照射によるそれらセラミックスの溶融性を調べるために,スライドガラス板状にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射したところ,各セラミックスは十分溶融することが分かった.次にエナメル質表面上にそれちセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.エナメル質試料表面の走査型電子顕微鏡観察では,メタリン酸カルシウム系のPGCおよび市販のCrys-Ceraにおいて,溶融したセラミックスがエナメル歯質に浸蓬し融着した像が観察され,エナメル質表面をセラミックス化することができた。また,セラミックス化した各試料表面に直径3mmの面積を残し,他の面をネイルバーニッシュで被覆し,pH4.0の酢酸緩衝溶液10ml中に吊り下げ,室温下,30分間,200rpmでスターラーを回転させ耐酸性試験を行った。エナメル質より溶出した溶液中のCaイオンを原子吸光分析により定量した。その結果,PGCを塗布し,レーザー照射したエナメル質表面は,未照射のエナメル質に比べ高い耐酸性を示すことが分かった。う蝕予防あるいは修復治療などのために、エナメル質表面に種々の陶材やガラス系粉末材料を塗布し、炭酸ガスレーザーを用いたエナメル質表面のセラミックス化について検討した。炭酸ガスレーザーにはオペレーザー-03S(ヨシダ製作所)を用い、照射筒先端と照射試料面との距離を20mmに固定した。セラミックスには歯科用キャスタブルおよび焼付用低溶陶材などを粉砕し、400meshパスしたものを蒸留水に50mg/mlで懸濁した液を用いた。レーザー照射によるそれらセラミックスの溶融性を調べるために,スライドガラス板状にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.本レーザーの照射エネルギーを変え,レーザーをセラミックスに照射したところ,それらセラミックスは十分溶融することが分かった.さらにエナメル質面上にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.エナメル質試料表面の走査型電子顕微鏡観察では、リン酸系のキャスタブルセラミックスPGC(旭ガラス社製)およびCrys-Cera(九耐デントセラム社製)において、溶融したセラミックスがエナメル歯質に浸透し融着した像が観察され、エナメル質表面をセラミックス化することができることが分かった。また、セラミックス化した各試料表面に直径3mmの面積を残し、他の面をネイルバーニッシュで被覆し、pH4.0の酢酸緩衝溶液10ml中に吊り下げ、室温下、30分間、200rpmでスターラーを回転させ耐酸性試験を行った。その結果、エナメル質表面にレーザーを照射すると、未照射のエナメル質に比べわずかに耐酸性が向上した。

炭酸ガスレーザーにはオペレーザー-03S(ヨシダ製作所)を用い、照射筒先端と照射試料面との距離を20mmに固定した。セラミックスには歯科用キャスタブルおよび焼付用低溶陶材などを粉砕し、400meshパスしたものを蒸留水に50mg/mlで懸濁した液を用いた。レーザー照射によるそれらセラミックスの溶融性を調べるために,スライドガラス板状にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.本レーザーの照射エネルギーを変え,レーザーをセラミックスに照射したところ,それらセラミックスは十分溶融することが分かった.さらにエナメル質面上にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.エナメル質試料表面の走査型電子顕微鏡観察では、リン酸系のキャスタブルセラミックスPGC(旭ガラス社製)およびCrys-Cera(九耐デントセラム社製)において、溶融したセラミックスがエナメル歯質に浸透し融着した像が観察され、エナメル質表面をセラミックス化することができることが分かった。また、セラミックス化した各試料表面に直径3mmの面積を残し、他の面をネイルバーニッシュで被覆し、pH4.0の酢酸緩衝溶液10ml中に吊り下げ、室温下、30分間、200rpmでスターラーを回転させ耐酸性試験を行った。エナメル質より溶出した溶液中のCaイオンを原子吸光分析により定量した。その結果、エナメル質表面にレーザーを照射すると、未照射のエナメル質に比べわずかに耐酸性が向上した。う蝕予防あるいは修復治療などのために,エナメル質表面に種々の陶材やガラス系粉末材料を塗布し,炭酸ガスレーザーを照射し,エナメル質表面のセラミックス化について検討した。セラミックスには,試作のメタリン酸カルシウム系キャスタブルセラミックス(PGC,旭ガラス社製),市販歯科用キャスタブルセラミックス(Crys-Cera,九耐デントセラム社製),ならびに焼付用低溶陶材(Duceram-LFC, Decera社製)および(Degeceram Gold,三金社製)を用いた.各セラミックスを粉砕し,400meshパスしたものを蒸留水に50mg/mlで懸濁液とし用いた。炭酸ガスレーザーには,オペレーザー-03S(ヨシダ製作所)を用い,照射筒先端と照射試料面との距離を20mmに固定した。照射条件は,照射時間30秒,照射強度1.0ワット,照射ビーム径0.49mmした.レーザー照射によるそれらセラミックスの溶融性を調べるために,スライドガラス板状にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射したところ,各セラミックスは十分溶融することが分かった.次にエナメル質表面上にそれらセラミックスを塗布し,レーザーを照射した.エナメル質試料表面の走査型電子顕微鏡観察では,メタリン酸カルシウム系の試作キャスタブルセラミックスのPGCおよび市販のCrys-Ceraにおいて,溶融したセラミックスがエナメル歯質に浸透し融着した像が観察され,エナメル質表面をセラミックス化することができた。また,セラミックス化した各試料表面に直径3mmの面積を残し,他の面をネイルバーニッシュで被覆し,pH4.0の酢酸緩衝溶液10ml中に吊り下げ,室温下,30分間,200rpmでスターラーを回転させ耐酸性試験を行った。
イオン導電性高分子アクチュエータの機能を支配する表面・界面力学パラメータの解明

イオン導電性高分子に電場をかけると,水和したカウンターイオンが陰極に移動し,陰極側が膨潤,陽極側が収縮することで湾曲が生じ,アクチュエータとしての機能を果たしている.しかしながら, MEMS (NEMS)などのマイクロ・ナノスケールにおけるアクチュエータやセンサとしての利用を考えた場合,マイクロ・ナノスケールにおけるアクチュエータの機能・特性を把握しておく必要がある.本研究では,イオン導電性高分子の表面・界面の力学的挙動の解明,イオン導電性高分子と電極金属薄膜との界面強度が及ぼすアクチュエータの変形特性への影響,表面・界面の力学・電磁場を考慮したマルチフィジックスモデルの構築とイオン導電性高分子アクチュエータの機能を支配する力学パラメータを解明することを目的として研究を行ってきた.本年度は,従来用いられている金電極の代わりに,安価で製造が可能なパラジウム(Pd)を用いて,無電解メッキ法によりイオン導電性高分子膜にパラジウム(Pd)を電極膜として成膜する方法を確立した.そして,NaOH水溶液中でのアクチュエータ特性の評価を行った.また,電極膜の界面付着強度を評価する方法として,ナノインデンテーションを用いた試験法を提案し,ビール試験との比較を行い,その妥当性について検証した.さらに,界面付着強度と電極膜の破損とは密接に関係があることから,本研究では,電極膜の信頼院を評価するために引張試験を行い,電極膜上に形成されるき裂のその場観察を行った.そして,界面付着強度とき裂形成との関係について明らかにした.イオン導電性高分子に電場をかけると,水和したカウンターイオンが陰極に移動し,陰極側が膨潤,陽極側が収縮することで湾曲が生じ,アクチュエータとしての機能を果たしている.しかしながら,MEMS(NEMS)などのマイクロ・ナノスケールのおけるアクチュエータやセンサとしての利用を考えた場合,マイクロ・ナノスケールにおけるアクチュエータの機能・特性を把握しておく必要がある.本研究では,イオン導電性高分子の表面・界面の力学的挙動の解明,イオン導電性高分子と電極金属薄膜との界面強度が及ぼすアクチュエータの変形特性への影響,表面・界面の力学・電磁場を考慮したマルチフィジックスモデルの構築とイオン導電性高分子アクチュエータの機能を支配する力学パラメータの解明することを目的とする.本年度はイオン導電性高分子アクチュエータの力学的挙動の実験的解明を目的とし,以下の研究を行った.1)ナノスケールにおけるイオン導電性高分子膜の力学的特性評価ナノインデンテーション試験法により,厚さの異なるイオン導電性高分子(Nafion膜)の力学的特性(硬さ,弾性率,降伏応力)の測定を行った.2)走査プローブ原子間力顕微鏡(AFM)による界面強度測定電極金属箔膜とイオン導電性高分子との界面強度(密着性)が,アクチュエータの機能を決定するひとつのパラメータとなっていると考えられる.そのため,AFMチップとイオン導電性高分子間との吸着力の測定を行い,AFMチップに施した金属メッキの種類により,高分子表面との吸着力が変化することがわかった.イオン導電性高分子に電場をかけると,水和したカウンターイオンが陰極に移動し,陰極側が膨潤,陽極側が収縮することで湾曲が生じ,アクチュエータとしての機能を果たしている.しかしながら, MEMS (NEMS)などのマイクロ・ナノスケールにおけるアクチュエータやセンサとしての利用を考えた場合,マイクロ・ナノスケールにおけるアクチュエータの機能・特性を把握しておく必要がある.本研究では,イオン導電性高分子の表面・界面の力学的挙動の解明,イオン導電性高分子と電極金属薄膜との界面強度が及ぼすアクチュエータの変形特性への影響,表面・界面の力学・電磁場を考慮したマルチフィジックスモデルの構築とイオン導電性高分子アクチュエータの機能を支配する力学パラメータを解明することを目的として研究を行ってきた.本年度は,従来用いられている金電極の代わりに,安価で製造が可能なパラジウム(Pd)を用いて,無電解メッキ法によりイオン導電性高分子膜にパラジウム(Pd)を電極膜として成膜する方法を確立した.そして,NaOH水溶液中でのアクチュエータ特性の評価を行った.また,電極膜の界面付着強度を評価する方法として,ナノインデンテーションを用いた試験法を提案し,ビール試験との比較を行い,その妥当性について検証した.さらに,界面付着強度と電極膜の破損とは密接に関係があることから,本研究では,電極膜の信頼院を評価するために引張試験を行い,電極膜上に形成されるき裂のその場観察を行った.そして,界面付着強度とき裂形成との関係について明らかにした.
遺伝子損傷検出法TDPCR法の改良とその子宮内膜癌発生の研究への応用

子宮内膜癌発生過程におけるエストロゲンの関与についてはよくわかっていない。そこで我々は内膜細胞にエストロゲンがDNA損傷を惹起し得るかをターミナルトランスフェラーゼ依存PCR(TDPCR)法にて検出を試みた。TDPCR法は煩雑であるが、キャピラリーシーケンサーを応用することで、簡便に検出が可能となった。本法を用いた結果、エストロゲンではPTEN領域にDNA損傷は検出できなかったが、代謝産物ではDNA損傷が検出された。DNA損傷部位は内膜癌で遺伝子変異の報告されている領域と一致していた。この結果はエストロゲン代謝産物がPTEN遺伝子変異の誘因となる可能性を示唆するものである。標的遺伝子(p53, PTEN, K-ras, B-raf)の配列情報から、それぞれの遺伝子の複数領域に対し特異的primerを設定する。通常のMultiplex PCR同様、PCRのannealing温度を一致させるためGC含量を一定範囲内に調節する。また、primer extension反応の産物はビオチンによる修飾とストレプトアビジン磁器ビーズによる回収と、その増幅にnested primerを用い、特異性を担保する。可視化に用いる蛍光標識primerは各領域異なる修飾(6-FAM, TET, HEX, VIC等)とする。このような一連の工夫の結果、子官内膜癌細胞にDNA傷害性のあるアドリアマイシンを添加した後の、p53をはじめとする標的遺伝子に新たに発生したDNA傷害部位を同定することが可能になり、今後の研究への応用が可能となった。2.不死化子宮内膜上皮細胞の樹立不死化子宮内膜上皮細胞の作成にはいくつかの方法が報告されているが、今回我々はHombach-KlonischらのhTERT遺伝子単独導入法を採用して不死化子宮内膜上皮細胞を調整している。現在、20継代まで継代しているが、上皮性性質は保持されているので、不死化はほぼ達成されていると考えている。今後はこの細胞を用いて発癌と各種のホルモンやサイトカインとDNA損傷の部位の関係を上述のTDPCRを使用して検討する予定である。1.TDPCR法の改良-対象遺伝子の拡大子宮内膜癌において遺伝子変異の最も高頻度な遺伝子はPTENであるが、文献検討を行い、子宮内膜癌において報告のある286例の遺伝子変異のうち、exon5/codon130,exon6/codon233,exon7/codon267,およびexon8/codon317-323に遺伝子変異のhot spotがあることが判明したため、その部位を含む遺伝子領域に対してTDPCRのプライマーを設計した。子宮内膜癌の発がんにはエストロゲンまたはエストロゲン類似物質の関与が指摘されているため、子宮内膜癌細胞(PTEN wild type)および不死化内膜に対し、エストロゲンおよびカテコールエストロゲンを添加し、TDPCR法にてDNA損傷の有無につき検討を行った。その結果、PTENexon5、exon6においてニストロゲン(0.1μM)投与にてDNA損傷は検出できなかったが、カテコールエストロゲン添加では1nMにてもDNA損傷が検出された。TDPCR法に複数の蛍光プライマーを導入し、複数個所のDNA損傷の検出が可能か検討を行っている。複数色のピークを同時検出が可能であることを確認したが、単独のプライマー使用した結果との再現性が乏しく、今後更に条件設定を検討する必要がある。
イギリスの東アジア情勢認識と威海衛統治

本研究は、イギリスが中国から租借した山東省威海衛における統治政策と、同地をめぐるイギリスの対華政策の連関に焦点を当て、その租借から還付へ至るまでの過程において、両者が入れ子状に展開した過程を明らかにするものである。本研究計画の2年目にあたる2018年度には、以下のような活動をおこなった。まず、昨年度に引き続いて8月25日から9月7日にかけて香港・イギリスを訪問し、ロンドン(イギリス国立公文書館)およびオックスフォード(オックスフォード大学リージェンツ・パーク・カレッジ付属アンガス文書館・図書館)にてイギリスの公文書および威海衛関連文書を調査・収集した。後者の文書館を利用するのは今回が初めてであったが、従来の中国史研究では必ずしも十分に利用されているとは言い難い宣教師関係の文書が豊富に所蔵されていることが判明した。次に、昨年度の学会報告の成果として、第一次世界大戦期における威海衛からの華人労働者送出に関する論考と、香港返還をめぐる経緯と同地の現状を威海衛と比較した論文を、それぞれ刊行した。さらに、これまでに収集した資料を用いて、3月に華東師範大学(中華人民共和国)で開催された華東師範大学/金沢大学環日本海域環境研究センター連携部門合同シンポジウムにおいて、威海衛の救荒政策に関する報告を行った。来年度もまた、今年度の学会報告の成果を刊行するよう努力すると共に、これまで収集した資料の読解を進めるほか、その過程で必要性が明らかとなった資料の調査・収集を進めてゆく予定である。昨年度の学会報告の成果を刊行することができた上、イギリスに所蔵されている資料の調査・読解を進める過程において、従来の研究では注目されていなかった論点や資料などが明らかになったため。来年度も引き続き、イギリスおよび東アジア各地の史料館・大学図書館などで資料調査・収集を継続するほか、今年度の学会報告をもとにした論考の執筆をすすめる。本研究は、イギリスが中国から租借した山東省威海衛における統治政策と、同地をめぐるイギリスの対華政策の連関に焦点を当て、その租借から還付へ至るまでの過程において、両者が入れ子状に展開した過程を明らかにすることを目的とする。2017年度は本研究計画の初年度にあたるため、威海衛を研究する上で不可欠となるイギリスの公文書、および同地で長らく弁務官を務めたJ. S.ロックハートの個人文書の調査・収集に焦点を当てた。これを目的として、8月7日から18日にかけてイギリスへ渡航し、ロンドン(イギリス国立公文書館)およびエジンバラ(スコットランド国立図書館)において資料の調査・収集に当たった。一方、2017年6月に駒沢大学で開催された第22回東アジア近代史学会研究大会、および2018年2月に金沢大学で開催された第2回金沢大学環日本海域環境研究センター連携部門国際テーマシンポジウムにおいて、第1次世界大戦期における中国からの華人労働者送出事業と、威海衛における統治政策に関する報告を行った。また、香港返還をめぐる経緯と同地の現状を威海衛の場合と比較し、その特徴を検討する内容の論考を『歴史学研究』へ寄稿(2018年4月号に掲載予定)したほか、その内容をもとに2018年2月に中部大学で開催されたシンポジウムにおいて報告を行った。来年度は、今年度に収集し得た資料の読解を進めると共に、その過程で必要性が明らかとなった資料の調査・収集を進めていく予定である。イギリスに所蔵されている資料の調査が予想以上に順調に進んだ上、これらの読解を進めるなかで、従来の研究では必ずしも十分利用されていないが、検討すべき価値のある資料についての目処が立ったため。来年度以降も、引き続きイギリス、および東アジア各地の史料館・大学図書館などで資料調査を継続する。

今年度は当初予定していたよりもイギリスでの滞在期間が短かったため、次年度使用額が生じた。これらの助成金は主に来年度以降の資料調査の旅費に充てることとしたい。今年度もまたイギリスでの滞在期間が当初の予定よりも短かったため、次年度使用額が生じた。これらの助成金は来年度以降の資料調査の旅費に当てることとしたい。
洞房結節ペースメカー細胞の構造・機能の多様性に関する研究

洞房結節ぺースメーカー細胞特性の多様性と結節内部位差を明らかにするため、ウサギを用いた電気生理学実験と免疫組織・細胞化学実験を行い、その結果に基づいた活動電位シミュレーションモデルを構築して、洞房結節細胞多様性の生理学的意義を検討した。1.細胞膜イオンチャネル:(1)活動電位の持続時間は結節辺縁部に比べて中心の細胞で長いこと、(2)それが主に4-aminopyridine感受性持続電流(I_<sus>)と活性化の早い遅延整流K電流(I_<kr>)発現の部位差に起因することが判明した。(3)免疫染色では、結節中心部の細胞ではI_<sus>チャネルを構成すると推測されるKv1.5発現量が少なく発現様式も辺縁部細胞と異なっていた。2.ギャップ結合蛋白:(1)洞房結節中心の細胞ではCx45とCx40が発現していること、(2)分界稜心内膜側の洞房結節辺縁部の細胞ではCx45とCx43の両者が発現しており、心房筋への興奮伝播経路を形成すると考えられる。3.筋小胞体機能:筋小胞体Ca放出チャネル阻害剤を用いた電気生理学的検討と抗体を用いた免疫染色や分子生物学的検討から、筋小胞体からのCa放出は結節中心の細胞のぺースメーカー機能には殆ど寄与しないが、辺縁部の細胞のぺースメーカー機能には重要な役割を果たすことが判明した。4.迷走神経刺激:洞房結節領域の迷走神経節後終末を電気刺激すると、ぺースメーカー中心の位置が結節中心部から辺縁部に移り複雑に移動した。このぺ一スメーカー移動は細胞特性の結節内部位差を反映する現象と考えられる。5.シミュレーションモデル:イオン電流か解析の結果に基づいて洞房結節中心及び辺縁部細胞の活動電モデルを構築した。活動電位波形の特徴やイオン電流阻害に対する反応は動物実験の結果とよく一致した。このモデルは洞房結節における細胞電気特性の多様性や結節内部位差の生理学的意義の検討に有用である。1.洞房結節における細胞膜イオンチャネル発現の結節内部位差:ウサギ洞房結節の細胞内電位マッピング実験から、ペースメーカー中心では辺縁部の細胞に比べ、活動電位持続時間(APD)が長いことが判明した。これは、洞房結節の正常自動能が心房筋からのリエントリー性興奮により乱されることを防ぐ重要な機構と考えられる。選択的イオン電流阻害剤の効果や単離細胞を用いた膜電流解析から、4-aminoryridine感受性持続性電流および活性化の速い遅延整流K電流(I_<Kr>)の電流密度が、結節中心の細胞で小さいことが明らかになり、APDの結節内部位差に寄与することが明らかになった。免疫組織化学および分子生物学による検討では、4-AP感受性KチャネルKv1.5蛋白がモルモット心房筋および洞房結節細胞に発現しており、結節中心部ではその細胞膜発現様式が心房筋とは異なり、発現量も少ないことが明らかになった。2.洞房結節ペースメーカー中心から心房筋への興奮伝導:ウサギ洞房結節の免疫組織化学では、結節中心の細胞ではギャップ結合蛋白Cx45とCx40が発現しており、心房筋への興奮伝導に関わる分界稜側の辺縁部細胞にはCx43とCx45が共存することが判明した。