hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病発症機序における接着分子とサイトカインの役割

(1)CD3とCD2の同時架橋により、Sykのチロシンリン酸化とキナーゼ活性化が著明に増強した。(2)CD3とCD2同時架橋により、細胞内アダプター蛋白Shc,Cblのチロシンリン酸化が著明に増強した。(3)CD3とCD2同時架橋によりIL-2産生能と細胞増殖が著明に増強した。以上の結果より、CD2分子はチロシンキナーゼSykとPI3-キナーゼを介してNK細胞を活性化し、T細胞においてはCD3との協調作用により細胞活性化および増強増強を引き起こすことが明らかとなった。慢性炎症においては、CD2などの補助分子が細胞の活性化に重要であると考えられる。歯周病は病原性細菌による慢性炎症性疾患であり、病巣局所に浸潤した免疫担当細胞が歯周組織との間で相互作用を起こし、歯槽骨の破壊を伴う特徴的な病態を形成したものと考えられる。我々は、細胞間接着や細胞活性化に補助刺激を伝達するCD2分子によるNK細胞およびT細胞活性化シグナルについて検討した。1.NK細胞におけるCD2架橋刺激によるp72syk tyrosine kinaseおよびPI3-kinaseの活性化と顆粒放出能の増強:(1)CD2分子架橋刺激によりCD2抗体濃度依存性に細胞内顆粒放出の増強を認めた。また、チロシンキナーゼ阻害剤であるHerbimycinとPI3キナーゼ阻害剤であるWortmanninは、この効果を完全に抑制した。(2)CD2架橋刺激による、NK細胞内蛋白の数種のチロシンリン酸化蛋白が出現した。さらに、免疫沈降Sykのチロシンリン酸化とin vitro kinase assayによる検討により、CD2およびCD16架橋刺激によりSykの活性化が起こっていることを確認した。(3)CD2架橋刺激により、チロシンリン酸化蛋白に結合したPI3-キナーゼ活性が増強していた。さらにこの免疫沈降物のPI3-キナーゼ活性も増強していた。(4)細胞内アダプター蛋白Shcのチロシンリン酸化とPI3-キナーゼとの結合は、CD2およびCD16架橋刺激により著明に増強していた。2.T細胞活性化におけるCD2 costimulationによるSyk,tyrosine kinaseの活性化とアダプター蛋白Shc,Cblのチロシンリン酸化の増強:(1)CD3とCD2の同時架橋により、Sykのチロシンリン酸化とキナーゼ活性化が著明に増強した。以上の結果より、CD2分子はチロシンキナーゼSykとPI3-キナーゼを介してNK細胞を活性化し、T細胞においてはCD3との協調作用により細胞活性化および増殖増強を引き起こすことが明らかとなった。
ムキタケの新規栄養機能性成分の探索およびその調理・加工特性に関する研究

日本を含む先進国では、メタボリックシンドロームの増加により医療費の負担など大きな社会問題となっている。この予防・改善には食事への機能性成分の導入が重要であると考えられている。キシメジ科ワサビタケ属に分類されるキノコの一つにムキタケがある。これまでに我々は、ムキタケには脂肪肝・肝臓障害改善作用や抗メタボリックシンドローム作用があることを認めている。しかしながら、ムキタケ中のどの成分がこれらの生理作用に有効に機能しているかは明らかになっていない。そこで本研究では、ムキタケ中の栄養機能性成分の解析とその作用機序の解明を目的としている。これまでに、ムキタケには脂肪酸類をはじめどのような成分が含まれているかについて明らかではない。そこで2018年度は、ムキタケ可食部に含まれるさまざまな成分を知るために、メタボローム解析を行った。まず、LC-TOFMSを用いたムキタケ可食部のメタボローム解析の結果、91種類の化合物が確認された。この中で脂肪酸類では、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、などが確認された。その他には、リン脂質類やアシルカルニチン類、フィトステロール類、スフィンゴ脂質類なども含まれていることが認められた。次にCE-TOFMSを用いたメタボローム解析の結果、267種類の化合物が確認された。これらの化合物の中には、グルタミン酸やアスパラギン酸、オルニチンなどのアミノ酸類や核酸関連物質、糖代謝関連物質などが含まれていた。2018年度の当初の予定としては、ムキタケ中の成分を水溶性成分と脂溶性成分に分画し、さらに分子量サイズで細かく分画して、ヒト肝由来培養細胞HepG2細胞を用いてムキタケ中の栄養機能性成分のスクリーニングと評価を行う予定であった。さらに、これで得られた結果を基に抗メタボリックシンドローム作用を示すことが考えられる機能性成分を単離・精製し肥満糖尿病モデル動物を用いて生体内での機能性について検討する予定であった。しかしながら、スクリーニングをはじめようとした際、限られた時間と助成金を効果的に効率良く使用するために、ムキタケの未知の成分の中でどのような化合物から評価を行うべきか判断に迷いが生じた。また、ムキタケに含まれる糖質類やアミノ酸類、脂肪酸類などの基本的成分も明らかになっていなかった。そのため、2018年度はまずはじめにメタボローム解析によりムキタケ可食部に含まれる化合物について解析を行った。この結果より、現在はムキタケ中に確認された358種類の化合物の中から抗メタボリックシンドローム作用が期待できる化合物を検討し、スクリーニング評価と動物実験をはじめる準備を行っている。我々はこれまでに、ムキタケ中の熱水抽出物には脂肪肝・肝臓障害改善作用があることを、またエタノール抽出物には抗メタボリックシンドローム作用があることを認めている。2018年度はムキタケ可食部に含まれる化合物についてメタボローム解析を行った。その結果、LC-TOFMSを用いたムキタケ可食部のメタボローム解析によって、91種類の化合物が確認された。また、CE-TOFMSを用いたメタボローム解析によって、267種類の化合物が確認された。そこで2019年度では、まずこれらの結果について、さらに詳細に検討を行い、脂肪肝・肝臓障害改善作用をもつ可能性が考えられる水溶性の化合物と、抗メタボリックシンドローム作用をもつ可能性が考えられる脂溶性の化合物について選び出す。さらに、選び出された複数の化合物について、ヒト肝由来培養細胞HepG2細胞を用いてムキタケ中の栄養機能性成分のスクリーニングと評価を行う。評価では、脂質代謝関連遺伝子やメタボリックシンドローム関連遺伝子についてリアルタイムRT-PCR用サーマルサイクラーやマイクロプレートリーダーなどで分析する。この評価によりスクリーニングされた化合物を分離カラムを用いて単離・精製し、肥満糖尿病モデル動物を用いて生体内での機能性について検討する予定である。生体内での機能性の評価については、血液の生化学検査、内臓脂肪重量、肝臓の脂質量や脂質代謝関連酵素・遺伝子発現などを測定する予定である。

次にCE-TOFMSを用いたメタボローム解析の結果、267種類の化合物が確認された。これらの化合物の中には、グルタミン酸やアスパラギン酸、オルニチンなどのアミノ酸類や核酸関連物質、糖代謝関連物質などが含まれていた。2018年度の当初の予定としては、ムキタケ中の成分を水溶性成分と脂溶性成分に分画し、さらに分子量サイズで細かく分画して、ヒト肝由来培養細胞HepG2細胞を用いてムキタケ中の栄養機能性成分のスクリーニングと評価を行う予定であった。さらに、これで得られた結果を基に抗メタボリックシンドローム作用を示すことが考えられる機能性成分を単離・精製し肥満糖尿病モデル動物を用いて生体内での機能性について検討する予定であった。しかしながら、スクリーニングをはじめようとした際、限られた時間と助成金を効果的に効率良く使用するために、ムキタケの未知の成分の中でどのような化合物から評価を行うべきか判断に迷いが生じた。また、ムキタケに含まれる糖質類やアミノ酸類、脂肪酸類などの基本的成分も明らかになっていなかった。そのため、2018年度はまずはじめにメタボローム解析によりムキタケ可食部に含まれる化合物について解析を行った。この結果より、現在はムキタケ中に確認された358種類の化合物の中から抗メタボリックシンドローム作用が期待できる化合物を検討し、スクリーニング評価と動物実験をはじめる準備を行っている。我々はこれまでに、ムキタケ中の熱水抽出物には脂肪肝・肝臓障害改善作用があることを、またエタノール抽出物には抗メタボリックシンドローム作用があることを認めている。2018年度はムキタケ可食部に含まれる化合物についてメタボローム解析を行った。その結果、LC-TOFMSを用いたムキタケ可食部のメタボローム解析によって、91種類の化合物が確認された。また、CE-TOFMSを用いたメタボローム解析によって、267種類の化合物が確認された。そこで2019年度では、まずこれらの結果について、さらに詳細に検討を行い、脂肪肝・肝臓障害改善作用をもつ可能性が考えられる水溶性の化合物と、抗メタボリックシンドローム作用をもつ可能性が考えられる脂溶性の化合物について選び出す。さらに、選び出された複数の化合物について、ヒト肝由来培養細胞HepG2細胞を用いてムキタケ中の栄養機能性成分のスクリーニングと評価を行う。評価では、脂質代謝関連遺伝子やメタボリックシンドローム関連遺伝子についてリアルタイムRT-PCR用サーマルサイクラーやマイクロプレートリーダーなどで分析する。この評価によりスクリーニングされた化合物を分離カラムを用いて単離・精製し、肥満糖尿病モデル動物を用いて生体内での機能性について検討する予定である。生体内での機能性の評価については、血液の生化学検査、内臓脂肪重量、肝臓の脂質量や脂質代謝関連酵素・遺伝子発現などを測定する予定である。当初の計画では、2018年度にムキタケ中の栄養機能性成分をヒト肝由来培養細胞HepG2細胞を用いてスクリーニングし、さらにこれにより評価された機能性成分を分離カラムで単離・精製し肥満糖尿病モデル動物を用いて生体内での機能性について検討を行う予定であった。しかしながら、2018年度はムキタケ中の化合物をメタボローム解析により調べるまでであったために、モデル動物やその飼料、遺伝子関連測定試薬、血液生化学検査用試薬、分離カラム、その他実験用消耗品類の購入ができず、次年度使用額が生じた。
心停止時の脳循環動態に関する研究

心停止(完全全脳虚血)および心蘇生後の脳循環動態の変化を、光電法により検討した。ネコ36匹を用い、α-chloralose・urethaneによる麻酔後、人工呼吸器により調節呼吸とした。股動脈にて動脈血圧を連続記録し、平均動脈血圧(MABP)を計算した。我々の開発した光電法を用い、局所脳血液含量(CBV)の連続記録および組織平均通過時間(MTT)と局所脳血流量(CBF)の反復測定を行った。ネコ16匹では、心室細動発生器を用い、10秒、30秒および3分間の心停止後、除細動器にて心拍を再開させた。この間、脳循環パラメータの経時変化を3時間後まで観察した。ネコ20匹では、心停止10秒および心蘇生後の脳循環パラメータの変化を、adenosine拮抗剤であるtheophylline投与群と非投与群で比較した。心停止10秒、30秒および3分群では、心停止中にMABPの著しい低下を認めた。心停止10秒、30秒および3分群のすべてで、心拍の再開直後にCBVの一過性増加を認め、反応性充血と考えられた。反応性充血を生じるcritical timeは10秒以下と考えられた。反応性充血の持続時間は、心停止時間に依存した。心停止30秒および3分群では、心拍再開後にCBFが一度回復した後、再び遅発性に低下した(遅発性脳血流低下)。遅発性脳血流低下を生じるcritical timeは10-30秒の間と考えられた。また、theophylline投与群では非投与群に比べ心拍再開直後の反応性充血の程度が有意に抑制され、反応性充血の成因の一つにadenosineの関与が示唆された。心停止時および蘇生後の脳循環動態は、臨床的に極めて重要な問題であるが、脳循環測定法上の方法論的な制約もあり、十分に検討されていない。我々は、独自に開発した脳組織血液含量の連続測定および数秒間隔で脳血流量の反復測定が可能な光電法を用い、心停止時および蘇生後の脳微小循環動態を検討した。実験には猫を用いた。麻酔後、気管内挿管し、調節呼吸とした。全身動脈血圧を連続記録した。光電装置を頭頂部皮質直下に装着し、脳組織血液含量(CBV)を連続記録した。頸動脈より0.1mlのカーボンブラック溶液を適宜注入して脳組織希釈曲線を求め、血液平均通過時間(MTT)を計算した。またCBVとMTTより、脳血流量(CBF)を計算した。左第5肋間で開胸後、心室細動器を用い心臓を停止させた。心停止10秒、30秒、あるいは3分後に除細動器で心活動を再開さた、脳微小循環動態の変化を3時間後まで観察した。10秒、30秒、3分の各心停止群において、心停止と同時にCBVの急激な減少を認め、心停止の期間中CBV減少は持続した。いずれの群でも、心蘇生と同時にCBVの著しい増加(反応性充血)を認めた。この際MTTも短縮し、CBVとMTTより計算されるCBFの著明な増加を認めた。反応性充血の持続時間および程度は心停止時間に依存し、長い群ほど反応性充血の持続時間も長かった。その後、CBVおよびCBFは正常化した。さらに3時間の観察期間中、30秒および3分心停止群ではCBFの減少(delayed hypoperfusion)を認めたが、10秒心停止群ではみられなかった。delayed hypoperfusionは、脳血管抵抗の上昇を伴い、胸虚血による脳血管内外の二次的変化に起因すると考えられた。

また、心停止(完全脳虚血)10秒と30秒の間に、脳に不可逆変化を生じるか否かのcritical timeが存在すると考えられた。心停止による完全全脳虚血後に脳血流を再開すると、脳血液含量(CBV)と脳血流量(CBF)の一過性増加が認められ、反応性充血(reactive hyperemia)の生じることを報告した。本年度我々は、この反応性充血の成因におけるadenosineの関与の有無を検討した。ネコ20匹を用い、麻酔後、人工呼吸器により調節呼吸とした。股動脈にて動脈血圧を連続記録し、平均動脈血圧(MABP)を計算した。我々の開発した光電法を用い、局所CBVの連続記録および組織平均通過時間(MTT)と局所CBFの反復測定を行った。心室細動器を用い、約10秒間心臓を停止させた後、心拍を再開させた。ネコ9匹(T群)では、心停止作製の20分前にadenosine拮抗剤であるtheophylline10mg/kgを約30秒で静注し、theophylline非投与のネコ11匹(C群)をコントロールに用いた。心停止15分後までのCBV,MTT,CBF,MABPを両群で比較した。以上の結果より、心停止(完全全脳虚血)後の脳血流再開時に出現する反応性充血に、adenosineの関与している可能性が考えられた。
価格インパクトのモデリング及びラージトレーダーの取引執行戦略

生命保険会社や年金基金などの大口投資家や機関投資家(ラージトレーダー)は、大量の資金を用いて株式や債券で運用を行うことが多く、それにより金融市場へ大きな影響を与える。本研究では、ラージトレーダーの最適な売買取引戦略(最適執行戦略)は何によって決定されるのかを理論的に分析する。また、小口投資家などの他のトレーダーの売買取引によって、ラージトレーダーの売買取引戦略がどのような影響を受けるのかを分析する。
紅海沿岸のマングローブ林の動態とその生理生態的特性に関する研究

本研究では,紅海沿岸に自生するヒルギダマシを対象にした生理生態学的な現地調査と,遺伝子解析を行った。その結果,紅海沿岸に自生するヒルギダマシは,家畜による被食を受けることで葉量を調整し,乾燥年にも林分を維持していることが明らかになった。また,側方に伸長する枝を着床さて不定根を伸長させ,その根からの水を先端部に分配し,高い塩分濃度下でも樹形を維持できる可能性を認めた。また,紅海内での遺伝的多様性は高くはなく,それは種子の散布様態の影響で,さらに場所によっては人為的な遺伝子移動のインパクトを受けている可能性が認められ,古来からの交易はヒルギダマシの遺伝的多様性に影響を与えたものと考えられた。1)スーダンにおける調査およびサンプリング:スーダン科学技術大学と協力して,ヒルギダマシ林の分布状況の広域調査と,DNA解析のためのサンプリングを行った。あわせて,ラクダなど,家畜による食害の実態を調査した。現地では,中島(代表)を中心とした調査チームで対応した。2)サウジアラビアにおける調査およびサンプリング:サウジアラビアの紅海側において,王立サウジアラビア野生生物委員会(SWC)と協力して,ヒルギダマシ林の分布状況の調査と,DNA解析のためのサンプリングを行った。その際,現地の植林事情に詳しい,NGOマングローブ植林行動計画からの協力を得た。並行して,数カ所に10×10mから20×20 m程度の調査プロットを設定し,ヒルギダマシの形態と林分構造および土壌水の塩分濃度との関係について調査した。さらに,同カ所を中心に光合成・蒸散特性の調査のためのサンプリングを行った。なお,調査区の管理については,沿岸警備隊に監視を依頼した(継続)。現地では,吉川(分担者)を中心とした調査チームで対応した。3)DNAの解析:現地から持ち帰ったサンプルは,岡山大にてDNAの分析を行い(分担者・吉川,連携研究者・三木),マイクロサテライト法にてエリア間の遺伝的な近縁性について検討した。なお,ヒルギダマシに関しては,マーカー開発が途上であるため,これも並行して実施した。4)光合成・蒸散特性の解析:現地から持ち帰ったサンプルは,三重大にて光合成・蒸散特性の分析を行った(連携研究者・松尾)。ヒルギダマシに関しては水分の移動経路が明確になっていないため,同位体分析法を用い,水利用効率などに関する検討も行った。1)UAE,ジプチにおける調査およびサンプリング:UAEではウマルカイワン水産試験場の協力を得て,ペルシャ湾におけるヒルギダマシ林の分布状況の調査と,DNA分析用のサンプリングを行った(代表・中島,分担者・吉川)。ジプチでは,ジプチ大学の協力を得て,紅海出口付近のアデン湾におけるヒルギダマシ林の分布状況の調査と,DNA分析用のサンプリングを行った(代表・中島,分担者・吉川)。2)スーダンにおける調査およびサンプリング:紅海大学,スーダン科学技術大学と協力して,ヒルギダマシ林の分布状況の調査と分布状況の調査と,水動態,光合成,DNA分析用のサンプリングを行った(分担者・吉川,連携研究者・松尾)。3)ヒルギダマシの育成実験:沖縄においてヒルギダマシの育成実験を実施し(分担者・谷口),これまでにエジプト,スーダン,サウジアラビアにおけるマングローブで得たデータとの比較を行った(代表・中島,分担者・吉川,谷口,小見山)。4)DNAの分析:現地から持ち帰ったサンプルを岡山大学にてDNA分析を行い(分担者・吉川,連携研究者・三木),マイクロサテライト法における遺伝的多様性について解析した。5)光合成,蒸散特性の分析:現地から持ち帰ったサンプルを三重大学分析し,光合成,蒸散特性,特に水分動態について安定同位体法で解析した(連携研究者・松尾)。2014年度(一部2015年度に繰越)は,以下の4点に関しての研究を実施した。1)これまでにサンプリングしたサンプルの内,スーダンのサンプルのDNA分析を実施した。

2)遺伝子の比較研究の目的で,紅海と連続した海域のケニアにてサンプリングを行い,DNA分析を行った。3)ヒルギダマシ呼吸根の埋没実験を継続した。4)比較としてタイのデルタ地帯にて,マングローブ林の林分構造に関しての現地調査を行った。当初計画していたサンプリング箇所から,比較として周辺にまで拡大することを実現できており,また,計画時よりもカウンターパートの獲得範囲が増え(ケニア,コスタリカ),今後の展開が期待できる状況を実現でいたため,計画以上に進展していると判断した。1)現地調査およびサンプリング:エジプト,サウジアラビアでの調査およびサンプリングを想定していたが,政情が安定していると言えない状態にあったため,アフリカ(ケニア,ジプチ),南米エリア,タイ(比較として)などでの調査を実施し,ヒルギダマシ林の分布状況の広域調査とDNA解析のためのサンプリングを行った。あわせて,ラクダなど家畜による食害の実態を調査した。並行して,光合成・蒸散特性の調査のためのサンプリングを行った。2)DNAの解析:現地から持ち帰ったサンプルは,岡山大にてDNAの分析を行い,マイクロサテライト法にてエリア間の遺伝的な近縁性について検討した。並行して,ヒルギダマシのDNAマーカーの開発を実施した。3)光合成・蒸散特性の解析:現地から持ち帰ったサンプルを岡山大にて光合成・蒸散特性の分析を行った。4)研究成果を平易な媒体にまとめ,公開した。5)スーダンより研究者を和歌山大学に招聘し,公開研究会を実施した。本研究では,紅海沿岸に自生するヒルギダマシを対象にした生理生態学的な現地調査と,遺伝子解析を行った。その結果,紅海沿岸に自生するヒルギダマシは,家畜による被食を受けることで葉量を調整し,乾燥年にも林分を維持していることが明らかになった。また,側方に伸長する枝を着床さて不定根を伸長させ,その根からの水を先端部に分配し,高い塩分濃度下でも樹形を維持できる可能性を認めた。また,紅海内での遺伝的多様性は高くはなく,それは種子の散布様態の影響で,さらに場所によっては人為的な遺伝子移動のインパクトを受けている可能性が認められ,古来からの交易はヒルギダマシの遺伝的多様性に影響を与えたものと考えられた。本研究は,紅海,アラブ沿岸のみならず,少なくともインド洋全域にまで拡大して分析していく計画を立案することとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。森林生態学現地のカウンターパートとの関係も良好で,継続調査,新規調査地でのサンプリングも実施できている。国内での研究交流も実現できている。スーダンでは,多数のマングローブ林におけるサンプリングが終了し,サウジアラビアでは南端から中域までの半分以上の林分でのサンプリングを終えることができた。その結果,現地で問題となっているラクダの食害の影響の可能性を認め,DNAレベルでの分布傾向も把握できつつある。また,対象植物としたヒルギダマシの光合成,水利用特性についても,樹体内での水分布に関する新知見を得た。これらに関する公表にまで至っていないが,データの蓄積も計画通りであり,概ね順調に進展にしていると自己評価している。
組織押圧・吸引圧を利用した遺伝子導入システムの開発

本研究では、組織吸引圧法による肝臓および腎臓での長期遺伝子発現系の構築や病態時における遺伝子発現の評価をおこなった。長期遺伝子発現系の構築のため、pCpGfree-Luciaをベクターとして選択したところ、肝臓・腎臓吸引圧法ではそれぞれ2週間に渡る発現が得られた。また、治療戦略構築のため、遺伝子発現部位を評価した。その結果、腎臓吸引圧法では腎臓の間質領域で、肝臓吸引圧法では主に吸引部位限局的に臓器上部での発現が観察された。さらに、病態時における影響に関して、四塩化炭素誘発性急性肝炎モデルマウスおよび肝繊維症モデルマウスにおける肝臓での遺伝子発現特性を明らかにできた。遺伝子工学の生物医学領域や遺伝子治療への応用において臓器特異的遺伝子発現を実現するシンプルなin vivo遺伝子導入システムの開発が強く望まれている。本研究では、マウス組織吸引圧法の吸引圧最適化と組織押圧・吸引圧法における遺伝子導入メカニズムの解明について検討をおこなった。まず、吸引圧の影響に関して、肝臓では-5kPa、腎臓では-15kPa以上の吸引圧群で、非吸引圧群に比べ、それぞれの臓器において有意に高い遺伝子発現がみられた。安定して遺伝子発現が得られる-10kPaにおける肝臓吸引後の肝毒性は吸引直後に僅かにみられたが、すぐに正常レベルに回復した。一方、-30kPaにおける腎臓吸引後の腎毒性はほとんどみられなかった。次に、腎臓押圧法において重要な遺伝子発現の因子であったpDNAの細胞内透過亢進と転写因子結合の影響に着目し、腎臓吸引圧法におけるこれら因子の検討をおこなった。腎臓吸引とpDNA投与タイミングに関して、pDNA投与直後に比べ、投与10, 20, 60秒前に腎臓を吸引することで、遺伝子発現の著しい低下がみられた。これは、組織吸引圧により010秒間のpDNAの膜透過亢進がおこっていることを示唆している。また、転写因子への結合部位を持たないpDNAに比べ、結合部位を持つpDNA (AP-1, NF-kB)では、高い遺伝子発現を示した。これらの組織吸引圧法における知見は、以前我々が報告した組織押圧法での結果と一致するものであり、類似のメカニズムを示唆するものである。また、腎臓での遺伝子発現部位の検討をおこない、組織押圧・吸引圧法ともに尿細管の毛細血管付近において遺伝子発現がみられることを明らかにした。これらの知見は、組織押圧・吸引圧法を利用した遺伝子機能解析や遺伝子治療の開発において有益な情報を提供するものと考える。生物医学領域や遺伝子治療の領域において、臓器特異的遺伝子発現を実現するシンプルなin-vivo遺伝子導入システムの開発が強く望まれている。本研究では組織押圧・吸引圧法を利用した新規遺伝子治療法やin-vivo遺伝子機能解析へと展開するための基盤研究をおこなう。本年度は、組織吸引圧法による長期遺伝子発現系の構築や病態時における遺伝子発現の評価および最適化をおこなった。肝臓への組織吸引圧法に関して、遺伝子発現レベルの向上を目指し、組織吸引できる面積を5倍に増やした吸引デバイスの開発をおこなった。まず、長期遺伝子発現系の構築に関して、phiC31インテグラーゼを併用した系では腎臓において発現の持続化が得られなかった。この系では、長期発現を得るためには2種類のプラスミドを同時に同じ細胞に導入する必要があるため、組織吸引圧法では持続化できなかったものと推察された。そこで、単一のプラスミドによる発現持続化を目指すため、pCpGfree-luciaをベクターとして選択し、組織吸引圧法による長期発現系の構築をおこなった。腎臓ならびに肝臓へ遺伝子導入をおこなったところ、2週間に渡る長期間持続した発現を得ることができた。次に、遺伝子治療のための重要な基礎的知見を得るため、組織透明化を利用した腎臓における遺伝子発現部位の評価をおこなったところ、腎臓吸引圧法では、腎臓の血管内皮細胞ではなく、周皮細胞や繊維芽細胞に対して遺伝子導入されている可能性が示された。一方、病態時における影響に関して、正常マウスに対して、四塩化炭素誘発性急性肝炎モデルマウスでは同レベル、肝繊維症モデルマウスでは約1/10となったが高い肝臓での遺伝子発現が認められた。これらの結果により、組織吸引圧による遺伝子導入では、病態進行の程度により遺伝子発現レベルに影響が出る可能性が示された。ほぼ計画通りに進展している。組織内遺伝子発現の空間分布評価が進んだことは治療への応用に際して予想以上の成果である。本年度は、吸引圧法における肝臓と腎臓での遺伝子発現部位の評価と、腎臓吸引圧法における遺伝子発現細胞およびプラスミドDNA(pDNA)の移行部位の評価をおこなった。吸引圧を施した肝臓の組織内遺伝子発現の空間分布を組織透明化法により検討した結果、吸引部位に限局して発現がみとめられ、主に臓器上部で発現している様子が観察された。また、X-gal染色を用いて評価した結果、肝臓における遺伝子発現部位は肝臓実質細胞であることが示唆された。一方、吸引圧を施した腎臓では、組織透明化法により評価した結果、血管周囲の間質領域で広範に遺伝子発現が観察された。さらに、免疫染色をおこなった結果、主に尿細管周囲繊維芽細胞、部分的に血管周皮細胞に遺伝子導入されることが明らかとなった。また、蛍光標識pDNAの移行部位を評価したところ、遺伝子導入から10分後には間質細胞への取り込みが確認された。

さらに、24時間後には間質細胞での遺伝子発現とともにpDNAの核移行が観察された。以上、肝臓吸引圧法では肝臓実質細胞に、腎臓吸引圧法では主に間質領域の尿細管周囲繊維芽細胞に対して、それぞれ遺伝子導入される可能性が示された。さらに、長期発現を目的にpCpGfree-Lucを用いたところ、遺伝子発現の長期化がみられた。そこでhepatic growth factor(HGF)を長期発現させるためのpCpGfree-hHGFの構築をおこなった。また、病態時における影響に関して、四塩化炭素誘発性急性肝炎及び肝繊維症モデルマウスにおいて、遺伝子発現特性を明らかにできた。本研究では、組織吸引圧法による肝臓および腎臓での長期遺伝子発現系の構築や病態時における遺伝子発現の評価をおこなった。長期遺伝子発現系の構築のため、pCpGfree-Luciaをベクターとして選択したところ、肝臓・腎臓吸引圧法ではそれぞれ2週間に渡る発現が得られた。また、治療戦略構築のため、遺伝子発現部位を評価した。その結果、腎臓吸引圧法では腎臓の間質領域で、肝臓吸引圧法では主に吸引部位限局的に臓器上部での発現が観察された。さらに、病態時における影響に関して、四塩化炭素誘発性急性肝炎モデルマウスおよび肝繊維症モデルマウスにおける肝臓での遺伝子発現特性を明らかにできた。研究計画通りに順調に進展している。組織内遺伝子発現細胞や部位の特定に関する情報は、治療戦略を考える上で有益であるため検討を進める。医療系薬学今後も研究計画に従い、進めていきたい。投稿論文作成が僅かに遅れたことが主な理由である。1ヵ月ほど遅れたものの既に投稿論文作成は完了した。従来の計画通りの遂行が可能であると判断している。
LECラットの肝癌自然発症機構への細胞同期上に存在する拘束点制御の異常の関与

LECラットのskin fibroblastは放射線に対し高感受性を示す。我々は、この表型がLECラットにおけるG1/S或いはG2/M期の境界上に存在するチェックポイントコントロール異常に因るものか否かを調査した。LECラット及び、ノーマルラットよりskin fibroblastを単離し、放射線照射を行なった。照射後8h、24hでのfibroblastのG2 arrestの程度を調べた。LECラットのfibroblastは、ノーマルラットのそれと同程度のG2 arrestを起こすと判明した。細胞はG1或いはG2 arrest後アポトーシスを起こすものらしい。そこでfibroblastの放射線照射後、DNAを単離し、電気泳動することにより、DNA fragmentationの程度を調べた。LECラットのfibroblastはノーマルラットのそれと同様なDNAラダーのパターン、シグナル強度を示した。ゆえに、LECラットはノーマルラットと同程度のアポトーシスを起こすと判明した。これらの結果はLECラットの細胞周期上に存在する拘束点制御は正常に働いていることを示唆している。加えて、発癌物質の暴露後生じたLECラットの腫瘍細胞はノーマルラットの腫瘍細胞と同様に、今回調査された8つのlocusにおいて、microsatellite instabilityを示さなかった。この結果はLECラットがprimary defectとしてRER表型を持ち、それが発癌に関与するという可能性を否定すると考えられる。LECラットの肝自然発癌への同蓄積及び放射線高感受性という表型の役割をLECラットへの戻し交雑群、(LEC×F344)×LEC、を用いて検討中である。
教員養成系学生のための光グリーンケミストリー教育手法の開発

初年度は太陽光を利用する環境調和型反応系のスモールスケール実験手法の開発を行った。これまでに、この反応は(a)太陽光を利用できること。(b)屋外で、しかも試験管の中で、誰でも簡単に光反応が行えること。(c)二酸化炭素を有機物質に取り込む(固定化させる)ことができることを明らかにした。化学実験の小スケール化は、有害廃棄物を減らし環境低負荷を実現する観点と実験時間の短縮と安全性の向上が重要な検討課題であった。その結果、カルボン酸の収率を保持したまま光照射時間の短縮が可能となった。また、太陽光を効率よく照射するために光反応装置を開発した。次に、水を溶媒とする反応系の開発をめざしたが、環境負荷をかけないゼロエミッションシステムの構築を設計できた。次年度はグリーン・ケミストリー教育のための教材化の検討を行った。その結果、学生に新しく開発したグリーン・ルートによる「有機光化学体験実習」をさせて、グリーン・ケミストリーの考え方を学習させることができた。また物質資源のリサイクル利用(循環型資源)や環境負荷を最小とする化学物質の開発利用、環境調和・修復のための化学技術などについて成果を学会で公表した。太陽光を利用する環境調和型反応系のスモールスケール実験手法の開発を行った。今年度はさらに学生実験への適正化を図った。次に、現在、従来のヘキサンやアセトニトリルなどの有機溶媒に代わって、水を溶媒とする反応系の開発をめざしているが、環境負荷をかけないゼロエミッションシステムの構築を目指すことができた。また、多人数の学生のための化学実験において新たに簡単な定量分析による分析操作の簡略化を検討中である。なお、本年度の研究成果を学会で発表した。本年度はグリーン・ケミストリー教育のための教材化の検討を行った。
フェニールプロパノイド合成系鍵酵素遺伝子の器官特異的発現と環境シグナル応答

1.遺伝子改変プロモータを用いたLoss of functionの実験結果から、PSPAL1遺伝子5′-プロモータ領域に含まれるエリシターよる発現誘導応答に必要なシス因子として、box 1(L-box)およびbox 2(P-box)があげられる.このことはbox 2とbox4を4-8ユニット繰り返し配列で繋いだキメラ・プロモータを用いたGain function実験からも更に裏付けられた.トランジェントアッセイの解析に加え、box 1(L-box),box 2(P-box),box 4(AT-box)各ボックスシークエンスを除去した遺伝子改変プロモータをGUSレポーター遺伝子に連結したpBI系遺伝子組換えプラスミドをタバコに導入し、トランスジェニックタバコにおけるin planta loss of function実験を行った.その結果、これらのボックスシークエンスは、エリシターやUV照射による発現誘導応答に必要であるばかりでなく、basalなPSPAL1のプロモータの発現にも影響を及ぼすことが明らかとなった.これらのシス因子は単独ではプロモータの活性化に及ぼす効果が少なく、これらのボックスに結合する調節タンパク質が協調的に働いていると考えられる.2.エンドウカルコン合成酵素(CHS)遺伝子は少なくとも8つのメンバーからなる遺伝子ファミリーを形成していることが明らかとなり、各々のメンバーの組織特異的・環境刺激特異的発現パターンを調べたところ、CHS遺伝子ファミリーの8つのメンバーは少なくとも3つのサブファミリーにグループ分けすることができることが明らかとなった。これらのうち2つのエリシター応答性グループのプロモータにはBox-1,G-Box,Box-2配列が保存されており、これらの配列がエリシター応答に重要であることが、塩基置換を導入したプロモータのトランジェント・トランスフェクション・アッセイによっても確認された。また、エリシター等のシグナルによる急激なCHS活性の増加は転写の活性化のみならず、遺伝子ファミリーの各メンバーの協調的な活性化、並びに転写後の調節機構にも基因することが推察された。
家兎網膜における青錐体細胞の電気生理学的・組織学的研究

青錐体網膜電図(ERG)を記録するために青色LED内臓のコンタクトレンズ型電極を試作した。この電極を用いて、青錐体ERGの研究が進んでいる正常人眼を対象に種々の記録条件下での波形の変化を解析した。その結果、十分な白色背景光下であれば青色LEDの刺激強度と刺激時間を調節することにより、青錐体に由来するERGを明瞭に分離することが可能となった。しかしそのdynamic rangeはかなり狭く、また赤・緑錐体の影響を強く受けるために、刺激強度を上げたり、刺激時間を長くすると赤・緑錐体に飲み込まれてしまうことが判明した。刺激頻度を上げて時間周波数特性を調べると、赤・緑錐体は20Hz以上の刺激にも反応を示すのに対し、青錐体はこのような高頻度刺激では分離不可能となり、心理物理学的手法による研究を支持する結果となった。さらに家兎眼において、臨床疾患に類似した環境を人工的に作成し、一定のコントロールされた環境下における青錐体の変化を電気生理学的および組織学的に解析し、臨床疾患における青錐体の特異的変化の解明を試みるために、小さなサイズの電極を試作し白色家兎を対象に青錐体ERGの記録を行った。その結果、家兎眼でもヒトと同様に青錐体に由来すると思われるERG波形が観察された。しかしノイズが大きく、安定性、再現性の点で今後改良すべき点が多いことが明らかになった。また臨床症例で、X染色体性網膜分離症と多発性白点消失症候群において青錐体系ERGの検討を行い、興株深い新知見を得、論文に発表した。今後は家兎眼に応用するために小さなサイズの電極を試作し、同様な結果が得られるか検討を進めていく。青錐体綱膜電図(ERG)を記録するために青色LED内臓のコンタクトレンズ型電極を試作した。家兎眼において、臨床疾患に類似した環境を人工的に作成し、一定のコントロールされた環境下における青錐体の変化を電気生理学的および組織学的に解析し、臨床疾患における青錐体の特異的変化の解明を試みるために、小さなサイズの青色LED内臓のコンタクトレンズ型電極を試作し白色家兎を対象に青錐体ERGの記録を行った。

しかしノイズが大きく、安定性、再現性の点で今後改良すべき点が多いことが明らかになった。また臨床症例で、X染色体性網膜分離症と多発性白点消失症候群において青錐体系ERGの検討を行い、興味深い新知見を得、論文に発表した。
イトヨ雄特異タンパク(スピギン)を指標にした環境アンドロジェン評価法の開発

イトヨ(Gasterosteus aculeatus)は繁殖期に営巣するという特殊な生態を示す硬骨魚類であり、雄は巣を作る際に弾力性に富んだ不溶性の接着タンパクを合成および分泌することが古くから知られていた。近年、その接着タンパクが男性ホルモンの刺激によって腎臓で特異的に合成される「スピギン」という分子から成ることが明らかとなった。そこで本研究では、男性ホルモンによってその合成が強く支配されているこの「スピギン」分子に着目し、本分子をバイオマーカーに用いた男性ホルモン様作用評価システムの開発を行い、様々な化学物質の男性ホルモン様作用を明らかにすることを目的とする。昨年度、スピギン遺伝子のゲノム配列解析(エクソン-イントロン構造解析)を経て、スピギンmRNA量を測定可能なリアルタイムPCR測定系を確立した。本年度はまず、本測定系の感度と精度について検討した。イトヨ雌に10^110^<-6>μg/Lの濃度でメチルテストステロンを一週間曝露し、腎臓のスピギンmRNA量を測定した。その結果、10^<-2>μg/L(10ppt)と極めて低濃度の曝露においても、そのホルモン作用をバイオマーカーの増加として検出可能であった。また、同一個体の測定値のばらつきも小さく、本測定系の精度が高いことも窺えた。抗アンドロゲン剤であるフルタミドを上述と同様の曝露試験に添加したところ、スピギンmRNA濃度の低下もしくは消失が認められたことから、本試験法は外因性物質の男性ホルモン作用および抗男性ホルモン作用の両方を検出可能であることが明らかとなった。本年度、実際の河川および河口域で採取した水試料を用いた曝露試験を予定していたが、イトヨ個体が入手できなかったため、実施を見送った。今後、化学物質による汚染が進行していると予想される河川の水試料を用いた曝露試験を早急に実施する予定である。これまでにクローニングが終了している2種類のスピギン分子の発現比率を調べた結果、両方のタイプのスピギンが同程度に腎臓で発現していた。また、両タイプのスピギン遺伝子の転写は男性ホルモン特異的に誘起された。これら結果から、両タイプのスピギンを共に検出し得る測定系の構築を目指した。測走系として、タンパク分子として検出する酵素免疫測定系と遺伝子レベル(mRNA)で検出する両方を想定していたが、スピギンの粘着性が非常に高いことから、スピギンmRNA量を測定可能なリアルタイムPCR測定系を今回確立した。先ず、スピギン遺伝子のゲノム配列を明らかにし(エクソン-イントロン構造の理解)mRNA由来の増幅だけを可能にする特異的なプライマーの選定を行った。確立した測定系により、10万倍までの広範囲に渡る濃度差を同時に検出・比較することが可能となった。来年度、本測定系の精度について確認を行うと共に、実際の曝露サンプルを利用した環境アンドロジェン影響評価を実施したい。
腎マクラデンサ細胞のゲノミクスとプロテオミクス

株化したマクラデンサ細胞(NE-MD細胞)において、遺伝子(DNAマイクロアレイ解析)と機能タンパク(アガロース2次元電気泳動、MALDI-TOF-MS)の解析を行った。NE-MD細胞に12μM furosemide(Furo)を添加後、当該遺伝子の発現量をコントロールと比較した。その結果、COX-2,EP4(PGE_2受容体)遺伝子の発現量は経時的に増加し、各々1.4倍に増加した(120分)。NE-MD細胞では、細胞外[Cl^-]を低下させたり、FuroでCl^-輸送体(NKCC2)を阻害したりしなくても、forskolin(For)添加によって細胞内cAMP濃度を上昇させることにより、COX-2発現が亢進した。一方、Cl^-freeでCOX-2発現が亢進している状態では、For添加による相加的な発現亢進は認められなかったが、H-89添加によって発現亢進が抑えられることから、cAMP-PKA系が重要な役割を担っていることが明らかになった。また、RT-PCRの結果、4つのEP受容体アイソフォーム(EP1-EP4)の内、EP4の発現を確認した。また、PGE_2のEC_<50>=4.52nM(NE-MD細胞)は、CHO細胞の数値(3.91+/-0.31nM:Nishigaki N et al,1996)に近似していた。さらに、NE-MD細胞外に5pMPGE_2を添加すると、COX-2発現量が有意に増加した(5hr後)が、EP4受容体アンタゴニスト(AH-23848)存在下では、Cl^-free誘導PGE_2産生量は大幅に低下した。一方、Cl^-free刺激によりEP4の発現量が増加する点も重要である。通常、EP4受容体にPGE_2が感作すると脱感作が起こるが、NE-MD細胞では、Cl-free刺激によりPGE_2産生が増えて細胞膜表面上のEP4受容体に感作してもEP4発現が亢進した。以上の結果から、COX-2発現調節におけるEP4を介した正のフィードバック機構は、TGF機構の修飾が長期にわたる場合でも、安定してPGE_2を供給するために非常に重要であると考えられる。最後に,NE-MD細胞のFuro誘導タンパク質をアガロース2次元電気泳動で展開し、MALDI-TOF-MSで解析した。発現が増加したタンパク質としてサイトケラチン(CK)18と19を同定した。CK18とCK19(上皮細胞に発現する中間径フィラメントの構成要素)は、細胞の強度維持に必要である。株化培養マウスマクラデンサ細胞(NE-MD)の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS;65kD)は、furosemide(ループ利尿薬)投与や低[NaCl]溶液下で発現量が増加した(誘導型)。このため、脳・心筋(constitutive)や髄質内層集合管(depressive)のnNOS蛋白(140-160kD)とは、発現調節が異なると考えられる。NE-MD細胞の実験液にfurosemide(12μM)を添加し、2時間後、発現量が増加するスポット(6個)を選んだ(アガロースゲル二次元電気泳動法)。切り出したゲルを酵素処理し、MALDI-TOF MS法で各スポットのペプチド断片(配列)を解析した(MS Fit法)。Furosemide-induced nNOS蛋白(ペプチド断片)を同定し、その分子構造を明らかにした。その結果、酸化ドメインに位置するヘム結合部位、PDZ結合部位は存在していたが、還元ドメインに属するFMN結合部位、FAD結合部位、NADPH結合部位の主要配列が存在しなかった。2次元電気泳動のゲルをPVDF膜に転写し、抗nNOS抗体(Cayman社,USA)によるウェスタンブロット実験を行ったところ、11241140アミノ酸残基、15151526アミノ酸残基を認識する抗体によって認識された。しかし、還元ドメイン類似構造を持つ蛋白質を同定することはできなかった。NOS蛋白還元ドメインの欠如は、NO産生における電子伝達機能に大きな影響を与える事から、nNOS蛋白活性に少なからず影響している事が推察される。MD細胞のnNOS蛋白は、還元ドメインの大欠失にもかかわらず、L-Argを基質としてCa^<2+>濃度依存性にNO産生を増加させる機能を保持していた。これらの実験結果から、マウス腎MD細胞のnNOS蛋白は、カルモジュリン結合部位が残存していると推測される。

一方、Cl^-freeでCOX-2発現が亢進している状態では、For添加による相加的な発現亢進は認められなかったが、H-89添加によって発現亢進が抑えられることから、cAMP-PKA系が重要な役割を担っていることが明らかになった。また、RT-PCRの結果、4つのEP受容体アイソフォーム(EP1-EP4)の内、EP4の発現を確認した。また、PGE_2のEC_<50>=4.52nM(NE-MD細胞)は、CHO細胞の数値(3.91+/-0.31nM:Nishigaki N et al,1996)に近似していた。さらに、NE-MD細胞外に5pMPGE_2を添加すると、COX-2発現量が有意に増加した(5hr後)が、EP4受容体アンタゴニスト(AH-23848)存在下では、Cl^-free誘導PGE_2産生量は大幅に低下した。一方、Cl^-free刺激によりEP4の発現量が増加する点も重要である。通常、EP4受容体にPGE_2が感作すると脱感作が起こるが、NE-MD細胞では、Cl-free刺激によりPGE_2産生が増えて細胞膜表面上のEP4受容体に感作してもEP4発現が亢進した。以上の結果から、COX-2発現調節におけるEP4を介した正のフィードバック機構は、TGF機構の修飾が長期にわたる場合でも、安定してPGE_2を供給するために非常に重要であると考えられる。最後に,NE-MD細胞のFuro誘導タンパク質をアガロース2次元電気泳動で展開し、MALDI-TOF-MSで解析した。発現が増加したタンパク質としてサイトケラチン(CK)18と19を同定した。CK18とCK19(上皮細胞に発現する中間径フィラメントの構成要素)は、細胞の強度維持に必要である。
病原性大腸菌の粘膜上皮感染による細胞周期停止の作用機構の解析

EPEC感染による細胞周期の停止はEPECから分泌されるエフェクター分子Cifによるものであることを明らかにした。Cifは感染細胞内で標的分子と結合し、細胞周期をG1期に停止させる。この結果から、EPECは細胞周期を停止させることで腸管のターンオーバーを抑制し、上皮細胞へ効率よく定着すると考えられる。本研究では、病原性大腸菌の感染成立に至る過程を、特に各感染過程における宿主細胞の細胞周期制御に関わるエフェクターの機能を明らかにし、感染に果たす役割を解明することを目指す。本研究では、感染成立に重要な役割を果たすと推定される腸管病原性大腸菌(EPEC)のエフェクター(Cif)を解析し、これら粘膜病原細菌の感染成立を抑制する手法の開発につなげる。平成20年度には(1) EPECのエフェクターCifが感染成立に果たす役割を解析するため、野生型と上記エフェクター欠損株を上皮細胞に感染させ、細胞死誘導能力・細胞接着・細胞周期などを調べた。その結果、野生株感染では細胞周期の進行に以上があることが明らかになった。(2) GFPとの融合蛋白質発現系を作製し、エフェクターの宿主細胞内局在を蛍光顕微鏡で調べた。その結果、GFP-Cifは核に局在することを観察した。特に上記のエフェクターは細胞周期の進行に関わっていると予想されるため、細胞周期依存的に局在の変化を調べることは重要な情報である。最近開発された、細胞周期マーカー遺伝子と様々な蛍光蛋白質との融合蛋白質を安定的に発現する細胞株を用いて、野生株及びCif変異体株を感染させ、蛍光顕微鏡でlive-imagingを観察し、詳しくどの細胞周期に異常があるかを観察する。その結果、G1期-S期移行に異常があることを見いだした。(3) Cifの様々な部分欠失変異体や点変異体を作製し、(1)や(2)の結果から得られたエフェクターの表現型(局在の変化、細胞周期への影響など)を指標として、エフェクターの機能ドメインを決定し、システイン109が活性に大事であることを見いだした。これらの結果からシステイン109をアルギニンに置換したEPECの変異株を作成した。変異株をHeLa細胞に感染させ、細胞周期への影響などを調べた結果、細胞周期停止能がないことを見いだした。以上の結果からCifのシステイン109は細胞周期制御能に重要であることを示唆された。平成20年度の成果からEPEC感染時観察される細胞周期停止は(EPEC)のエフェクター(Cif)によるものであることが明らかになった。21年度には細胞周期停止の分子メカニズムを更に解明した。(1)Yeast-Two-hybrid法やProtein micro array法によりCifの宿主標的蛋白質の同定を試みた。その結果、いくつか標的宿主蛋白質を同定した。同定した標的宿主蛋白質に対してCifとの結合をin vitro pull-down assay及び免疫沈降を用いて宿主細胞内で結合していることを確認した。(2)同定した標的宿主蛋白質の抗体を作成し、細胞内の局在を調べた結果、GFP-Cifと同様に核内に局在することを見いだした。または細胞周期変動に伴う発現変化を調べた結果、G1-S期にかけて発現がみられ、M期には発現が下がることを見いだした。この結果から、Cifの影響がみられると思われる同じ細胞周期で働いていると考えられる。(3)細胞周期変動に伴う両者の結合を調べることにより、Cifと標的蛋白質の結合が細胞周期にどのように影響をするかを調べた。両者の発現がみられるG1-S期に結合することを見いだした。(4)標的宿主蛋白質と結合できないCifの変異株を作成し、感染させた場合の影響を調べることでその標的宿主蛋白質の結合の重要性を検討した。本研究の結果から、今までほとんど知られてなかったCifによる細胞周期の停止メカニズムや作用機構の解明につながると思われる。
細胞性修飾酵素によるレトロウイルスゲノムの染色体への組み込み機構の阻害

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に代表されるレトロウイルスの特徴として、標的細胞進入後に合成されたウイルスDNAを染色体に組み込むことがあげられる。この反応はインテグレーションとよばれ、ウイルス由来酵素であるインテグラーゼ(IN)によって触媒される。近年、INはウイルスDNAや様々な細胞性因子とともに高分子複合体を形成し、さらにはリン酸化やユビキチン化といった細胞内修飾を受けることが示されている。すでに研究代表者は、マウス白血病ウイルス(MLV)とHIVのINに結合する細胞性因子としてHuwe1を報告してきた。Huwe1はHECT型E3ユビキチンリガーゼであることから、この分子がINの細胞内修飾に関与する可能性が考えられる。そこで平成21年度は、レトロウイルス感染におけるHuwe1の役割について解析をおこなった。これまでに、INのユビキチン化は、INのみを発現した細胞でのみ報告されているが、我々の実験では、HIV感染によって標的細胞に持ち込まれたINもユビキチン化修飾を受けることを確認した。つまり、INのユビキチン化は実際のレトロウイルス感染で見られる現象である。次に、Huwe1の、INのユビキチン化への関与を検討したが、HIV INの細胞内ユビキチン化修飾はHuwe1のsiRNAノックタウンによって影響を受けなかった。このことは、INのユビキチン化を触媒する別の酵素が存在することを示唆している。さらに、Huwe1をノックダウンした細胞のHIVベクターに対する感受性は、コントロール細胞におけるそれと変化がみられなかった。しかし、ノックダウン細胞から放出されるHIVの感染性は、コントロール細胞由来のウイルスに比較して、有意に増加していた。これらの結果は、IN結合性E3ユビキチンリガーゼHuwe1がHIV複製の後期過程において感染性ウイルス粒子の形成を制御する可能性を示すものである。
岩石の衝撃破壊機構の解明-レーザー・ボーリング技術への展開-

本研究は、高速パルスパワーや短パルスレーザーを用いて種々の物性値を持つ岩石に衝撃エネルギー入力を行い、パルス・エネルギー注入による穿孔機構を解明するとともにレーザー・ボーリング技術への展開を検討することを目的とした。穿孔実験には、放電型のKrF・エキシマ・レーザー(出力200mJ/20nsec)を使用した。種々の岩石のサンプルを購入し、衝撃破壊に及ぼすエネルギー吸収率、熱伝導率、破壊応力限界、固体中での衝撃波の伝搬特性などに着目してデータ収集を行った。その結果、レーザー波長に透過しない物質では、穿孔速度は標的物質の熱容量と熱伝導率に依存性をもち、熱応力とアブレーション圧力に駆動される衝撃応力による穿孔機構が支配的であることが明らかになった。比較のために、石英板とCaF2板を購入し、穿孔実験を行ったところ、レーザー波長に対して透過性の物質ではレーザー出力密度がしきい値を越えると、標的内部から衝撃破壊が急速に進行し、穿孔速度が急激に大きくなることがわかった。基礎的な穿孔機構を明らかにする一方、レーザー・ボーリング技術を展開するには可搬性を持つ大出力レーザーを開発することが不可欠である。可搬性を持つ大出力レーザー(高エネルギー流体レーザー)の最も重要な要素技術である空力レーザー窓の開発と超音速混合流の圧力回復特性を明らかにした。開発したレーザー窓は、ディフューザー形状の改良により圧力比50を達成し、従来の3倍の圧力保持能力を持つことがわかった。また、超音速混合流の基本的な散逸機構と圧力回復特性を明らかにした。これらの研究結果を基にして、スケールアップしたパラメータ領域での穿孔実験を現在計画中である。
オレフィンメタセシスを鍵反応とした多糖系ブロックコポリマーの合成と物性評価

本研究では社会的要請が強い生分解性を有する天然物を原料とする機能性多糖系ブロックコポリマーの合成法を確立し、フィルム等としての物性、ガスの選択透過性などを評価し、これまで様々な用途で利用されている石油由来の難生分解性汎用ポリマーを代替する材料を開発することを目指す。具体的にはセルロースやデキストランのエチルエーテル誘導体をブロックポリマーの第一成分とし、第二成分としてオリゴ糖、多糖、オリゴペプチド、ポリアミノ酸、天然ゴム、ポリエステルや生分解性が期待できる合成ポリマーを想定し、ブロックコポリマー合成法として有用なオレフィンメタセシス反応を利用したブロックコポリマーの合成を行う。
MRIによる正常及び異常月経周期における子宮の変化についての研究

本年度はMR像と病理組織との対比に重点を置いて研究を進めた。婦人科の協力のもとに、約100症例のMR画像とマクロ切除標本、病理切片を対象とし信号の特性についての基礎的な検討を進めた。特にMR画像上の信号の変化をもたらす要因として、コラーゲンの有無、血管の寡多、細胞密度の程度、浮腫や壊死の有無について、詳細な検討を試みた。これにより正常例で見られる信号の変化を解析する上で重要な基本的データを収集する事ができた。子宮の筋層の信号に関しては、血管の多少のみならず、浮腫が非常に大きい役割を果たしていることが明らかとなり、また造影剤を用いた画像との対比によりこの浮腫の部分が造影されることを確認し他の臓器との違いが大きいことが明らかとなった。また筋腫の信号を詳細に検討することにより、コラーゲンの多少が信号を変化させる上で非常に大きい影響を示すことも明らかとなり、これらをまとめて今年度のうちにアトラスとして出版の予定である。また帝王切開及び経腟分娩前後の子宮頚部の変化を検討するためこれらMRI画像の蓄積につとめ信号の変化を中心に検討を進めた。帝王切開後の子宮頚部ついては、病理標本との対比により、頸部の菲薄化のみでなく菲薄部において平滑筋組織が繊維結合組織に置換している場合があること、及び、MRIはこういった変化を明瞭に示しうることが明らかとなった。この結果は次回分娩方法を決定する上で重要な指標となるものと考えられる。