hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
川崎病にみられる血小板増多機序の解析とトロンボポエチンの新しい調節機構

本研究は目的は川崎病ではどのような機序で血小板が増加するのか明らかにすることである。トロンボポエチン(TPO)は血小板と巨核球の造血を調節する主要なサイトカインである、従来、炎症性疾患で見られる血小板増多はIL-6の産生増加に起因すると推定され、TPOの関与については否定的に考えられてきた。平成10年度に得た結果は川崎病患児における血清TPO値は、血小板数が正常である発病第1週において有意に高値であった。血小板数が最高であった、発病第2から第3週においても血清TPO値は対象より高値または対象と同等であった。血清IL-6値は発病第1週に最高であり、IL-11とLIFは感度以下であった。soluble IL-6Rとsoluble c-kitには経過中に有意な変動は見られなかった。soluble gp130は回復期に高値になり、SCF値は急性期に低下した。以上の結果から、TPOはIL-6と共同して川崎病で見られる血小板数増加に寄与していると推測された。さらにTPOの産生は川崎病の急性期に増加している可能性が示唆された。平成11年度にはさらに、TPOはIL-6と共同して川崎病だけでなく感染症でも血小板数増加に寄与していると推測される結果を得た。また、TPOの産生は誘導され得るとの仮説について、動物実験を施行した。Northern hybridizationやcompetitive RT-PCRを用いて、肝や腎、骨髄でのTPOmRNAの発現の変動を検討したが、変動している証拠は見出されなかった。この点については方法論の改良も含めてさらに検討が必要である。川崎病は日本で発見され、日本において多発している疾患であるため、その研究は我が国の重要な課題である。本研究結果は川崎病の病態解明の一助になったと思われる。さらには重症例の治療として、TPOはIL-6やTNFなどとともに、将来は坑炎症療法の標的として応用される可能性もあると思われる。本研究の目的は川崎病ではどのような機序で血小板が増加するのが明らかにすることである.トロンボポエチン(TPO)は血小板と巨核球の造血を調節する主要なサイトカインである.炎症性疾患で見られる血小板増多はIL-6の産生増加に起因すると推定され,TPOの関与については否定的に考えられてきた.平成10年度は第一の研究目的である血清TPOが増加し,血小板造血を刺激するとの仮説を検証した.検討は蛋白レベルで行い,主としてELISA法を用いた.その結果,川崎病患児における血清TPO値は,血小板数が正常である発病第1週において有意に高値であった.その,ピークは第6病に平均5.9±2.6fmol/mlであり,その後徐々に低下した.血小板数が最高であった,発病第2から第3週においても血清TPO値は対象より高値または対象と同等であった.血小板数が正常であった川崎病患児では血清TPO値は対象より有意に高値であった.血清IL-6値は発病第1週に最高であり,IL-11とLIFは感度以下であった.soluble IL-6Rとsoluble c-kitには経過中に有意な変動は見られなかった.

solublegp130は回復期に高値になり,SCF値は急性期に低下した.以上の結果から,TPOはIL-6と共同して川崎病で見られる血小板数増加に寄与していると推測された.さらにTPOの産生は川崎病の急性期に増加している可能性が示唆された.本研究の目的は川崎病ではどのような機序で血小板が増加するのか明らかにすることである.トロンボポエチン(TPO)は血小板と巨核球の造血を調節する主要なサイトカインである.炎症性疾患で見られる血小板増多はIL-6の産生増加に起因すると推定され,TPOの関与については否定的に考えられてきた.平成10年度には川崎病では血清TPOが増加し,TPOはIL-6と共同して川崎病で見られる血小板数増加に寄与していることを示した.平成11年度にはさらに血小板数が増加した感染症の急性期においての血清TPO値の変動について検討した.感染症患児の血清TPO値は,血小板数が正常である発病第1週において有意に高値であった.血小板数が最高であった,発病第2から第3週においても血清TPO値は対象と同等であった.血清IL-6値は発病第1週に最高であった.以上の結果から,TPOはIL-6と共同して川崎病だけでなく感染症でも血小板数増加に寄与していると推測された.さらにTPOの産生は炎症性疾患の急性期に増加している可能性が示唆された.また,TPOの産生は誘導され得るとの仮説について,動物実験を施行した.Norhern hybridizationやcompetitive RT-PCRを用いて,肝や腎,骨髄でのTPOmRNAの発現の変動を検討したが,変動している証拠は見出されなかった.この点については方法論の改良も含めてさらに検討が必要である.川崎病は日本で発見され,日本において多発している疾患である.そのため,川崎病の研究は我が国の重要な課題である.本研究結果は川崎病の病態解明の一助になったと思われる.さらには重症例の治療として,TPOはIL-6やTNFなどとともに,将来は抗炎症療法の標的として応用される可能性もあると思われる.
リグノセルロ-ス資源の生物燃料への変換

リグノセルロ-スからの微生物によるエタノ-ル生産プロセスを開発するため、リグノセルロ-スの前処理と生成セルロ-スとキシランを直接エタノ-ル発酵する菌の育種について研究を行い、以下の結果を得た。リグノセルロ-スの前処理として蒸煮・爆砕処理と過酸化水素・アルカリ処理を併用した複合処理の効果を検討し、蒸煮・爆砕単独処理の場合に比べて23倍の高い酵素糖化率を得た(前川英一)。爆砕稲わらの抽出成分量、細孔径分布、酵素糖化率やアルコ-ル転換率を検討し、爆砕稲わらの糖化発酵には蒸気圧3.33.8MPa蒸煮時間1.03.5minの爆砕が最も効果的であるという結果を得た(沢田達郎)。担子菌Bjerkandera adustaのcDNAおよび染色体DNAからリグニンペルオキシダ-ゼ遺伝子をクロ-ニングし、その塩基配列を決定した。また培養にポリウレタンフォ-ムを用いて、本酵素の生産性を向上させた(桑原正章)。Saccharomyces cerevisiaeにクロ-ニングするためのセルラ-ゼ遺伝子の供与体としてセルロ-ス資化性の高い酵母を分離し、精製酵素遺伝子のクロ-ニングを行い数個のポジティブクロ-ンを得た(宮川都吉)。枯草菌由来の中性セルラ-ゼと好アルカリ菌由来のアルカリセルラ-ゼを材料に用い、蛋白工学的手法により、pH45の酸性領域での酵素活性に寄与する5個のアミノ酸残基を同定した(堀之内末治)。Bacillus pumilisのβーキシロシダ-ゼ遺伝子(xynB)を大腸菌の中で高発現させ、その遺伝子産物を単一にまで精製し、性質を検討したところキシロビオ-スに対して既知の酵素と比較して高い活性を示すことを認めた(卜部格)。キシロ-スリダクタ-ゼとキシリト-ルデヒドロゲナ-ゼの遺伝子をS.cerevisiaeにクロ-ニングし高い酵素活性が得られたが、キシロ-スからエタノ-ルを生産したりキシロ-スを炭素源として増殖するには至らなかった(吉田敏臣)。
J-PARCパルス中性子ビームを用いた中性子寿命測定:中性子寿命問題の解明

中性子は最も単純な原子核の一つであり、880.2+/-1.0秒で陽子、電子、反ニュートリノの3体にβ崩壊する。その寿命は素粒子、原子核、天文分野における重要なパラメーターのうちの一つであるが、現在報告されている中性子寿命はその測定手法により8.6秒(4.0σ)と大きく乖離しており、“中性子寿命問題(Neutron Lifetime Puzzle)"と呼ばれている。この乖離が単なる実験の間違いなのか、あるいは未知の現象によるものなのか議論を呼んでいる。本申請はJ-PARC大強度パルス中性子を用いた中性子寿命測定実験を遂行し、この問題の解決を目指す。現在、中性子の寿命測定は「ビーム法」と「貯蔵法」による結果が互いに食い違っており、ビーム法による高精度測定が望まれている。本計画は、これまでに行われたJ-PARCでの予備実験の測定精度を10分の1にまで高めるのを目標とし、中性子強度増強、中性子シャッターの素材変更、β崩壊電子の検出効率を正確に評価するための補助実験などを行う。中性子の寿命という基本的な物理量の測定が未だに確立していないことは大きな問題である。本研究により、ビーム法による精度が貯蔵法に近づくことになり、その結果従来の矛盾が解消されればよし、逆に矛盾が深まることになれば、従来の理解に問題があることが示唆され、いずれの結果が出ても興味深い。
台湾における刑事司法改革の比較法的研究――捜査取調の適正化を中心に

日本同様、自白偏重の傾向がある台湾では、1998年に刑事訴訟法が改正されて、警察、検察での取調過程に録音・録画を義務づける制度が導入された。取調全過程録音(ないし録画)はすっかり実務に定着し、今日では当たり前のことになった。しかし、義務違反が根絶されたわけではなく、義務に違反した取調調書の証拠能力について訴訟で争われる事例もなくなってはいない。その意味で義務違反の取調調書をいかに扱うかが今後の焦点となっている。他方で取調過程の可視化が自白を困難にさせていることは確認できず、この制度の導入によるデメリットも見つからなかった。台湾法の実践は日本の進むべき道を示唆していると考えられる。今年度は3年計画の2年目にあたることから、前年度の実績を踏まえ、基礎的な資料収集を継続するとともに、台湾における取調の可視化と夜間取調の原則的禁止がいかに実現し、運用されてきたかについて立ち入った検討を行った。1取調の可視化と夜間取調の原則的禁止制度導入の経緯が明らかになった。自白の任意性を確保し、被疑者・被告人の弁護人依頼権を保障することが目指されたことになる。具体的には刑事訴訟法が1997年に改正されることで、以下のような一連の改革が断行された。黙秘権の明定(95条1項2号)、脅迫、詐欺、疲労訊問の禁止(98条)、夜間(日の出前、日没後)訊問の原則禁止(100条の3)、これに反する方法で得られた自白は原則証拠から排除(158条の2)、取り調べ過程の可視化(訊問全過程の録音録画を原則義務づけ、調書と録音・録画が一致しない場合は証拠から排除)(100条の1)、弁護士依頼権を強化(被疑者の弁護士との接見・交通権を保障)(34条)、3年以上の有期懲役を科せられる可能性のある事件、知的障がい者の被告などにつき強制弁護制度導入(31条1項。公設弁護人制度)。2本研究において得られた中間的成果をアジア法学会(2012年11月17日、於東京大学東洋文化研究所)でシンポジウム「台湾法の歴史的展開と現状」の一環として、「台湾刑事手続の歴史的展開と現状」と題する報告を行い、参加者からの批判を仰いだ。結論的には、政治の民主化、社会の成熟と刑事司法改革が同時に進行こと(1997年以後19回の改正。大法官、最高法院の解釈、判例に変化)、憲法上の人権(8条人身自由、16条訴訟権)の価値への社会的コンセンサスが改革を後押していたこと、刑事司法改革には東アジアに共通する重い伝統文化との戦いが伴っていたこと、手続構造のドイツ型からアメリカ型への転換のなかで達成されていったことを指摘した。台湾では1982年に起きた王迎先事件をきっかけにして、警察や検察での取調過程の適正化問題が社会的に関心を集めるようになり、刑事手続改革が進展した。そして1998年の刑事訴訟法改正により取調の全過程を録音(ないし録画)することを義務づける制度(以下、本制度と略)を導入するに至った(100条の1)。本研究では台湾における本制度に関して以下の諸点からアプローチした。1.本制度導入の経緯、世論、学界、議会での議論状況。2.本制度の実務における運用状況(設備機材、録音・録画の現状、記録媒体の保存・利用のあり方、裁判における活用方法、当事者のアクセスのあり方など)。3.録音録画義務違反の法的効果(録音録画と一致しない供述調書の証拠能力、不十分な録音録画、ないしまったく録音録画がない場合の供述調書の効力など)。4.本制度導入により取調実務に与えたインパクトの有無(不適正な取調への影響、供述のあり方への影響など)。5.台湾の経験から日本法への示唆(自白偏重の傾向で共通する台湾法から得られる教訓)。以上の結果、以下のようなことが判明した。1.台湾では取調過程の全過程録音録画が実務では定着し、関係者の間に抵抗感はなくなっていること。2.けっして録音録画義務に反する取調が根絶されたわけではなく、しばしば違反は生じているが、判例では一律に証拠能力が否定されているわけではないこと。その意味で今後の問題は義務違反取調の効力の問題を立法的に解決することにあること。3.夜間尋問の禁止や弁護人の立ち会いを認める改正と相まって、不適正な取調は格段に減少しており、本制度の導入が実務に大きなプレッシャーとなったことが確認できること。4.本制度によりことさら自白をとりにくくなったという事実は確認できなかったこと。平成23年度は最初の年度であり、基礎的資料の収集と研究協力者からの専門的知識の提供およびその整理に重点に置いて、研究を進めた。

1基礎的資料の収集および読解:刑事司法構造全体の歴史にかかわる資料、刑事訴訟法改正過程に関する立法院の資料、犯罪捜査における取調可視化に関する制度改革にかかわる議論をフォローした。その際には次の2点に特に力点を置いた。(1)捜査取調べの可視化をもたらした刑事訴訟法改正の契機となった具体的な事例の検討、(2)台湾における刑事手続改革の比較法的な位置づけである。その結果、台湾における捜査取調べの可視化導入の法改正が韓国や中国にも影響を与えつつあることが分かった。2現地でのヒアリング調査:研究代表者が台湾でヒアリング調査を行った。捜査における取調可視化を実現させた背景、制度運用の状況、その評価などについて、研究協力者から専門的知識の提供を受けるとともに、これらについて実務家にヒアリングし、録音・録画をしている取調室を見学するなどした。インタビューを行った実務家は以下の通り。林俊益(司法院刑事庭庭長)、張永宏(司法院刑事庭法官)、蔡清遊(司法院大法官)、蔡碧玉(台北板橋地方法院検察署検察長)、顧立雄(萬国法律事務所パートナー弁護士、民間司法改革基金会常務理事)3初歩的成果の報告および分担者を交えた議論:研究代表者が以上の成果をまとめて、2011年9月23日に「体制転換と法」研究会(於北海道大学)において「台湾および中国における被疑者取調べ過程の録音・録画制度」と題して中間的な報告した。ここでは日本で取り調べ過程可視化が遅れている理由を中心として検討した。この研究会には研究分担者も参加し、報告・議論を通じて各自の情報を共有するとともに、問題点の整理を行い、今後の計画について話し合った。課題の解明に向けて資料収集、解読、現地調査、関係者に対するインタビューを順調に進め、中間的成果について学会での報告を終えたことで、最終的な目標に向けて前進することができた。実績概要で述べたように、ほぼ調書記載の計画どおりに進めることができた。王兆鵬教授(台湾大学法律学院)、陳運財教授(台湾東海大学)を招聘してのワークショップ開催は、日程の都合上調整がつかなかったが、今年度の実現に向けて調整中である。補充的な資料集を継続するとともに、今年度は最終年度にあたるため、これまで実現できていない研究協力者(台湾東海大学教授・陳運財、台湾大学教授・王兆鵬)を台湾から招聘して、札幌においてワークショップ「台湾における刑事手続改革」(仮)を開催する予定である。さらに最終的な成果のとりまとめを行う。今後も調書記載の計画に沿って研究を進めていく。なお、昨年度実現できなかった台湾からの研究者を招聘してワークショップの開催を目指す。基礎的資料の収集を継続するとともに、研究協力者からの専門的知識の提供、研究者を招聘してのワークショップの開催に重点に置く。具体的には以下の通りである。(1)研究代表者と分担者が台湾を訪問し、各地で本制度運用のキーパーソンたる裁判官、検察官、警察官、弁護士に対して、制度導入前後の実務の変化、とくにデメリットが生じているか、自白が取りにくくなっているのかなどの点につき、調査を行う。(2)取調過程の可視化、夜間取調拒否にかかわる裁判例を収集し、いかなる問題が実務では浮上し、それについて裁判所がいかなる判断を行っているかを分析する。とくに制度導入の理念が果たして裁判所に支持されているかが焦点となる。(3)台湾の研究協力者、王兆鵬教授(台湾大学法律学院)、陳運
シンクロトロン放射光による内殻励起分光法の理論並びに理論プログラムの開発

WorkingPackage (WP)1「XANESプログラムの開発」の実施計画に沿って、吸収サイトを複数持つ系にも対応したプログラム開発を行った。この成果の重要な点は、同種原子を複数含む分子や金属クラスターのXANES構造がフィッティング可能になった点である。金属を含む系の一例として、生体タンパク質がある。生体タンパク質では金属中心が生化学反応の鍵を握っているが、従来のプログラムでは計算や解析が不可能であった。本研究で開発したプログラムは、このような物質のXANES計算と解析を可能にし、今後化学反応解明に関わる研究の推進に寄与することが期待できるという点で、意義のある成果である。次にWP2「X線角度分解光電子分光プログラムの開発」において、量子化学計算プログラムMOLCASに対するインターフェースプログラムの開発を行った。光電子角度分光を精度よく計算するためには、光電子放出によって生じる電子空孔(コアホール)の存在を考慮して終状態を計算する必要があるが、第一原理計算で広く使われている密度汎関数法はコアホールが存在する励起状態については計算の正当性が原理的に保証されていない。そのために、X線角度分解光電子分光の計算には密度汎関数法を超えた取り扱いが必要である。第一原理計算プログラム“MOLCAS"は、RASSCF法に対応しており、励起状態の電荷密度をより正しく計算することができる。インターフェースプログラムを作成することによってこの電荷密度を利用し、我々が開発した多重散乱法と組み合わせることにより、光電子角度分光のより正確な計算が可能となった。この手法は、X線自由電子レーザーを用いた実験によって得られるスペクトルの解析に応用することによりフェムト秒オーダーの時間分解能で分子構造の解析が可能になる等、実験解析の観点からも重要な成果であるといえる。本研究プログラムの進捗は概ね順調であり、本研究プログラムの意義に即した成果が得られている。国内では東北大多元研の上田潔教授、山崎馨助教、首都大学東京の中谷直輝准教授、国外ではマドリード自治大Fernando Martin教授、CNRS-レンヌ第一大学Didier Sebilleau研究員らと共同研究を進め、量子化学計算における手法についての議論を行い、量子化学計算プログラムMOLCASを用いて、RASSCF法により、コアホールの空いた励起状態の電荷密度を高精度で計算することが可能になった。当研究計画の研究代表者が開発したフルポテンシャル多重散乱プログラムを用い、XANES並びにX線角度分解光電子分光を計算する理論プログラムの開発を引き続き行なっていく。国内では首都大学、東北大学の化学系のグループと共同研究をし、国外では、フランスレンヌ第一大学、スペインマドリード自治大学の理論グループとの共同研究を推進し、それぞれのグループの専門知識を活かし世界で通用するプログラムの開発を行う。各グループ間での人的交流を促進し、最新の研究動向のアップデートを行い、最適な研究方法を常に模索していく。本研究計画のWP

2「自己無撞着ループの開発」においてワークステーションを購入し、大規模計算プログラムの開発を行う予定であったが、量子化学計算プログラムによる自己無撞着電荷密度を利用することを優先することになったので、購入予定であったワークステーションの購入を一年遅らせた。当該ワークステーションは今年度購入する予定である。
ＤＮＡ修復機構の破綻に伴う大腸癌のゲノム・エピゲノム解析

マイクロサテライト不安定性(MSI)とは、腫瘍組織のマイクロサテライト反復配列が、DNA複製エラーを修復する機能の低下により正常組織のそれと異なる反復回数を示す現象である。1塩基反復配列マーカーであるBAT25,BAT26を含む計5マーカーのうち、2個以上がMSIであれば高頻度MSI(MSI-H)と米国国立癌研究所は定義している。本研究ではBAT25,BAT26がMSIである大腸がん(CRC)149例に対し全エクソン解析,メチル化解析,RNA解析,予後解析を行った。MSI-H CRCはリンチ症候群(LS)、MLH1メチル化群(MM)、ミスマッチ修復遺伝子の体細胞変異を有するリンチ様(LL)の3群に分類でき、LLは欠失挿入変異が少なく、KRAS,APC,PIK3CA変異が多く、BRAF(V600E)やRNF43変異は少なかった。右側大腸に多いのはMMであり、LS/LLは左右均等に分布していた。MMのうちKRAS/BRAF野生型の約半数(11/20)に治療標的となり得る融合キナーゼが同定され、融合キナーゼを有する患者は再発後の予後が不良であった。融合キナーゼは全大腸癌の2%未満とされているが、本研究で融合キナーゼがKRAS/BRAF野生型MMの約半数に存在したため、症例を追加して検討した。まず従来のMLH1メチル化測定法に代わり、MMを簡便かつ安価に分類する手法「MLH1メチル化アッセイ」を開発した。追加コホートのMSI-H CRCをMLH1メチル化アッセイとサンガー法により絞り込んだところ、KRAS/BRAF野生型MM CRC 4例のRNA解析を行っただけで新たに2例の融合キナーゼを同定した。融合キナーゼを標的とした治療がMSI-H CRCの予後改善をもたらす可能性が示唆され、MLH1メチル化アッセイはLS/LLを除外し、融合キナーゼの候補を絞り込むために有用と考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1) DNAミスマッチ修復機構の破綻した大腸腫瘍、すなわち高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する149の大腸腫瘍の全エクソン解析を行い、後天的体細胞変異及び生殖細胞系列のDNAミスマッチ修復遺伝子変異(リンチ症候群)を同定した。KRAS変異やAPC変異やPIK3CA変異はリンチ症候群に多く、BRAF変異やRNF43変異はリンチ症候群には少ないことが明らかになった。2)リンチ症候群が疑われる症例に対して、ミスマッチ修復蛋白の免疫染色を行った。MLH1の変異があると予想された症例に対し、ポリメラーゼ連鎖反応で変異の同定を試みたところ、MLH1遺伝子の1,221塩基の欠失という大きな構造変異が1例に同定できた。3) 111の高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する大腸腫瘍のRNAの融合遺伝子解析を行い、発癌ドライバ変異の同定を試みた。すると、治療標的となり得る融合キナーゼがKRASやBRAFのドライバ変異のない高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する大腸癌約40例のうちの11例と、比較的高頻度に認められることが明らかとなった。4) KRAS,BRAFおよび融合キナーゼの各ドライバ変異が相互排他的であったことに着目し、高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する大腸腫瘍の各ドライバ変異別の生存解析を行ったところ、融合キナーゼ群はKRAS発癌ドライバ変異群よりも、再発後の予後が有意に不良であるということが示された。当初の予定以上に症例を収集でき、高頻度マイクロサテライト不安定性を呈した149の大腸腫瘍の全エクソン解析を行うことができた。全エクソン解析のみでは捉えきれないMLH1の1221塩基の欠失という大きな構造変異を、ミスマッチ修復蛋白の免疫染色でMLH1に機能喪失型変異があると予想し、さらにゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応を行うことで同定することが出来た。高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する症例を更に集積することで、本邦においてどれだけの割合で、治療標的となり得る融合キナーゼがあるのか、頻度を確立し、実際に治療に結びつけることを目指す。
脳の領域間コミュニケーションを可視化する超高感度・多項目同時計測電気化学デバイス

ヒトの感情や行動を決定する脳は、様々な領域から構成されており神経伝達物質の授受を介して情報が伝達される。脳内に存在する複数の神経伝達物質を解析することで、複雑な脳の機能や神経変性疾患の理解・解明に貢献できる。これまで申請者は、集積回路型電気化学イメージングデバイスを開発し、直径数百μmの神経細胞凝集塊から放出される神経伝達物質をリアルタイムで計測することで、定量的評価・薬剤応答評価を達成している。本研究では、従来型デバイスにシグナル増幅機構および、選択的神経伝達物質検出機構を導入し、複雑な領域間コミュニケーションの可視化の実現を目指す。
小児の顎顔面立体モデルによる咬合力と下顎運動の機能解析

低年齢児にみられる顎の偏位を伴う歯列咬合異常は、放置されると次第に治療困難な骨格的変形に移行することがしばしば観察される。下顎の成長方向に影響を及ぼすと思われる口腔機能の中で、下顎運動と咬合力の要素を組み込んだ小児の顎顔面立体モデルを構築できれば、このような異常に対する運動力学的な解析が可能となる。研究代表者らは、これまでに下顎運動中の上下歯列の咬合接触解析や、歯列の立体再構築モデル上での咬合力解析を行ってきた。これらの結果を、歯列を取り囲む顎顔面形態まで拡大すれば、下顎の機能運動下での顎骨に作用する力の大きさと方向の推定が可能となり、力学的な環境要素が顎骨の成長に及ぼす影響を解析する手がかりとなることが期待されるため本研究を実施した。以下、解析した項目を示す。結果の詳細は、「11.研究発表」の項に記載した論文と著書、ならびに研究成果報告書(様式C-18,冊子体仕様)を参考にして頂きたい。1.3次元模型計測システムを開発し、経年歯列模型の形態解析をおこなった。これにより、顎顔面立体モデル作製のための歯列咬合の発育変化を経時的に把握することが可能となった。2.小児の下顎滑走運動面の定量化をおこない、顎顔面運動モデルの作製において考慮すべき咬合相における咀嚼運動時の接触滑走運動の詳細を解析した。3.咬合異常モデルの作製において必要となる反対咬合児の滑走運動と習慣性開閉口運動、および咀嚼運動の特徴を、正常咬合児との比較において解析した。4.3次元顎顔面シミュレーションモデルを用い、下顎頭長軸角や下顎角を変化させて咬合力負荷を加えた時に、顎関節部に及ぼされる影響について、下顎頭と関節円板の偏位方向と偏位量の解析をおこなった。5.その他、本研究に関連する論文、著書を多数執筆した。2003年2月に九州大学から鹿児島大学へ異動したため研究環境が大きく変わり、九大側と共同研究を進めながら研究を遂行した。以下、本研究課題に関連して行なった本年度の研究項目および結果の一部を示す。1)三次元模型計測システムの開発と乳歯列模型の形態解析接触型三次元測定器(マイクロスクライブ)を用い、形態解析プログラムを独自開発して、上下乳歯列の咬頭頂曲線と咬合状態を矢状、前頭、水平方向で再現する事ができた。これにより顎顔面立体モデル作製のための歯列咬合の発育変化を経時的に把握することが可能となった。2)小児の下顎滑走運動面の定量化および咀嚼運動時の接触滑走乳歯列小児と成人の両者において、咀嚼運動時に切歯点移動距離で2mm程度の上下歯列の接触滑走運動が行なわれていることが分った。顎顔面運動モデルの作製において考慮すべき知見を得た。3)小児の下顎運動時の頭部協調運動下顎運動が行なわれる時には、それと連動して頭部も協調的に運動することが知られている。小児と成人でこの頭部協調運動を比較し、小児の方が下顎運動が小さいにも関わらず、頭部運動幅が大きいことが分った。この知見は顎顔面運動モデルの作製において考慮すべきものである。4)反対咬合を有する混合歯列前期小児の習慣性開閉口運動咬合異常モデルの作製において必要となる反対咬合児の開閉口運動の特徴を、正常咬合児との比較において明示した。5)成長発育を考慮した若年者の顎関節症と顎関節形態との関係

6)咬合異常児の治療にともなう下顎運動の機能的推移(a)乳歯列期鋏状咬合の2治験例(b)低位乳臼歯に伴って臼歯部開咬を生じた症例2003年2月に九州大学から鹿児島大学へ異動したため研究環境が大きく変わり、九大側と共同研究を進めながら研究を遂行した。以下、本研究課題について行なった今年度の研究項目および結果を示す。1)三次元模型計測システムの改良と乳歯列模型の形態解析接触型三次元測定器(マイクロスクライブ)を用い、形態解析プログラムを2003年に独自開発したが、これに改良を加え、歯列咬合異常児の上下乳歯列の咬頭頂曲線と咬合状態を矢状、前頭、水平方向で再現できるように機能を付加した。これにより、歯列咬合異常児の咬合治療前後の顎顔面立体モデル作製するために必要となる基礎データを収集できるようになった。2)反対咬合を有する混合歯列前期小児の習慣性開閉口運動咬合異常モデルの作製において必要となる混合歯列反対咬合児の開閉口運動の特徴を論文報告した。3)咬合異常児の治療にともなう下顎運動の機能的推移について、乳歯列期鋏状咬合の2治験例の論文報告を行なった。4)現在、三次元力学シミュレーションモデルを用いた成長期顎関節の応力について、および乳歯列反対咬合児における下顎切歯点と顆頭点の咀嚼運動の特徴について解析中である。本研究課題について行なった今年度の研究項目および結果を示す。1)三次元模型計測システムの改良と乳歯列模型の形態解析接触型三次元測定器(マイクロスクライブ)を用い、形態解析プログラムを開発したが、これに改良を加え、歯列咬合異常児の上下乳歯列の咬頭頂曲線と咬合状態を矢状、前頭、水平方向で再現でいるように機能を付加した。このプログラムを使用し、小児歯科所蔵の正常咬合児20名の歯列形態分析を行った。2)反対咬合を有する乳歯列期小児の滑走運動と咀嚼運動解析咬合異常モデルの作製において必要となる乳歯列期小児の滑走運動と咀嚼運動の特徴を以下に示す。被験児は正常咬合を有する乳歯列期小児(正常咬合児群)20名と乳歯列期前歯部反対咬合を有する小児(反対咬合児群)15名とした。6自由度下顎運動測定装置を用い,各被験児において下顎前方滑走運動(以下,前方滑走運動)を各3回計測した。解析点は下顎乳切歯点(以下,切歯点),左右の解剖学的顆頭中央点(以下,顆頭点)とした。解析項目は,上下,左右,前後の運動範囲および三次元直線距離とし,さらに切歯点と顆頭点の運動の関連性を明らかにするため,これら2つの解析点間の相関係数を求めたところ,以下の結果を得た。(1)反対咬合児群の切歯点と顆頭点の運動範囲や距離は,正常咬合児群と比較して有意に小さかった。(2)正常咬合児群,反対咬合児群ともに前方滑走運動時の切歯点と顆頭点の運動範囲に高い相関が認められた。(3)反対咬合児群は,個人間相関係数が個人内相関係数よりも大きい傾向が認められ,正常咬合児群とは様相が異なっていた。
HLA領域のムチンMUC22遺伝子とアジア人の非嚢胞性線維症性気管支拡張症の検討

我々は、ヒト6番染色体のびまん性汎細気管支炎(DPB)疾患感受性候補遺伝領域内に新規ムチン遺伝子PBMUCL1(MUC22)・PBMUCL2をクローニングしたが、HLA領域に特有の連鎖不平衡状態とムチン遺伝子の長いリピート配列のため、従来のサンガーシークエンス法では解析に限界があった。最近この領域は、喘息との関連が報告され、また、MUC22はHLA領域で最も多型に富む遺伝子であるとされ、注目されている。本研究では、MUC22を中心とする領域の遺伝的多型が、アジア人の非嚢胞性肺線維症性気管支拡張症や近年急増する肺非結核性抗酸菌症など、様々な疾患と関連しているのではないかと考え、我々が既に集めた日本人のDPBを含む検体とベトナム人の副鼻腔気管支症候群検体の2か国のパネルで新しいシークエンス技術で再解析し、国際比較することにより、疾患関連候補領域をさらに狭めて、アジア人に特有の気道脆弱性に関わる遺伝的素因を明らかすることを目指している。今年度は、日本人DPB検体、ベトナム人副鼻腔気管支症候群検体を用い、まずDPB疾患感受性候補遺伝領域の中の約120 kbを、最大7kb長程度までの約30領域に分けてオーバーラップさせながらPCRで増幅した。PCR産物を患者ごとにプールしてライブラリー作成を行い、イルミナ社の次世代シークエンサーMiSeqでシークエンスを行い、特に過去にPCRサンガー法での解析が全く不可能であったMUC22のintron 2の10 kbについては、さらにDPB患者の検体数を増やしてMiSeqで配列解析を行った。これらの結果から、120kbの領域中でリピート配列のためにバリアント解析が困難で、長鎖シークエンサーによる解析が必要とされる領域を抽出し、Oxford Nanopore社のMinIONシークエンサーを用いたシークエンスの条件検討を行った。解析対象とするゲノム領域をPCRで増幅してシークエンス解析を行うターゲットリシークエンス法を用いているが、MiSeqを用いた遺伝バリアント解析の結果、既知の単塩基多型部位のヘテロ接合体において、全リード中の変異アリル由来のリード数の割合に大きな偏りがある領域が見られ、PCR増幅がアリル間で均等に行われていないことが原因と考えられた。このため、解析に必要なデータ量の再考と、我々が通常用いている次世代シークエンサーデータの解析パイプラインの解析条件設定の最適化を行い、片アリルから得られるリード数が少なくてもヘテロ接合体と判定できるようにすることが、本研究が対象とするゲノム領域の網羅的なバリアント探索において必要と考えられ、現在、方法の修正を行っている。今後、長鎖型のOxford Nanoporeシークエンサー(GridION、MinION)と短鎖型のイルミナ社MiSeqシークエンサーから得られたデータをあわせ、日本人のDPB患者検体とベトナム人の副鼻腔気管支症候群患者、さらに両国の健常人検体を解析して、今まで日本人集団の中だけでは絞り込めなかった疾患感受性領域をより狭めて、機能的に重要と思われる遺伝バリアントとハプロタイプを明らかにすることを目指す。さらに、我々が既に保有する初代培養気道上皮細胞パネルの中から、上記ハプロタイプを有するサンプルとコントロール検体を選び、遺伝子発現解析を行う。

このため、解析に必要なデータ量の再考と、我々が通常用いている次世代シークエンサーデータの解析パイプラインの解析条件設定の最適化を行い、片アリルから得られるリード数が少なくてもヘテロ接合体と判定できるようにすることが、本研究が対象とするゲノム領域の網羅的なバリアント探索において必要と考えられ、現在、方法の修正を行っている。今後、長鎖型のOxford Nanoporeシークエンサー(GridION、MinION)と短鎖型のイルミナ社MiSeqシークエンサーから得られたデータをあわせ、日本人のDPB患者検体とベトナム人の副鼻腔気管支症候群患者、さらに両国の健常人検体を解析して、今まで日本人集団の中だけでは絞り込めなかった疾患感受性領域をより狭めて、機能的に重要と思われる遺伝バリアントとハプロタイプを明らかにすることを目指す。さらに、我々が既に保有する初代培養気道上皮細胞パネルの中から、上記ハプロタイプを有するサンプルとコントロール検体を選び、遺伝子発現解析を行う。Oxford Nanopore社のMinIONを用いたシークエンスを行うにあたり実験条件の修正が必要になり、1回分のシークエンスランの試薬消耗品代相当額を次年度使用に持ち越して、次年度に新しい条件で行うこととした。
合成免疫アジュバントを用いる癌の免疫療法

本年は当研究班の3年次にあたり、3年間の研究の総括と将来への展望を試みる。1.抗腫瘍免疫アジュバントの開発東、関川、長谷川、芝らによって抗腫瘍免疫の増強活性を有する免疫アジュバントの開発を試みた。東らはすでにline10肝癌に強い退縮活性を示すキノニル-MDP-66を合成し、有効な水中油エマルジョン製剤を開発したが、本年度は更に強いマクロファージ活性化能を有する免疫アジュバントであるトレハロースジマイコレート(TDM)及びその関連化合物を化学合成し、その中でも特にTDNMがTDMに比し毒性が低く、旦キノニル-MDPや他のアシル-MDPと併用するとline10に対する抗腫瘍活性が飛躍的に増強されることを見出した。芝は大腸菌及びサルモネラのリポ多糖体の活性因子であるリピドAを完全合成すると共にその他関連糖脂質も化学合成した。合成リピドAは天然リピドAと同等の生物活性を示した。特にインターフェロンや腫瘍壊死因子(TNF)の誘導に強い活性を示した。長谷川はリピドA関連物を化学合成し、特にGLA27が毒性が低く、インターフェロンとTNF活性の誘導活性を示した。2.新しい実験モデルの確立岸本はMH134に対する単クローン抗体を作製し、免疫アジュバントが単クローン抗体によるADCCを増強するかを検討し、N-CWSが強い増強活性を有することを見出した。3.免疫アジュバントによる癌免疫療法安元は術後肺癌患者の胸膜腔内にIL-2(1000U)を連続7日間投与しても胸腔内リンパ球にLAK活性を誘導出来ないが、IL-2投与3日前にN-CWS(500μg)を胸腔内投与しておくとLAK活性が誘導出来ることを見出した。以上の成績は抗腫瘍活性を有する免疫アジュバントの開発と臨床応用の可能性を強く示唆するものである。
液体中の分子を右へ左へ自在に動かす技術～ソーレー・マスドライバーの開発

液体中の溶質分子を非接触にマニピュレーションする技術として,ソーレー効果とレーザー加熱を組み合わせた"ソーレー・マスドライバー"を実現するため,研究開発を行った.研究の当初は,数値計算による溶質分子の輸送効果の検討を進めた.その中で,拡散係数が小さくなる場合に,特に強い効果が得られることが明らかとなった.そこで,電気泳動用ゲルのような媒体にタンパク質を分散させ,ソーレー効果を用いて移動させることで1分子レベルでの分子輸送が実現できるのではないかと着想するにいたった.これを実現するため,装置開発を行った.一分子レベルのタンパク質の実験を可能にするため,高感度カメラの選定を進め,干渉計に変わる蛍光顕微鏡システムの構築を行った.2次元的な移動を可能にするため,当初は空間位相変調器の導入を想定していたが,シリンドリカルレンズを対角線で分割し組みあわせたレンズを用いることでアンカー状のパターンを発生でき,より高効率であることを発案したため,そのように改善することにした.以上のような装置開発により,タンパク質を1分子レベルで移動させる実験の準備が大方整った.液体中の溶質分子を非接触にマニピュレーションする技術として,ソーレー効果とレーザー加熱を組み合わせた"ソーレー・マスドライバー"を実現するため,研究開発を行った.研究の当初は,数値計算による溶質分子の輸送効果の検討を進めた.その中で,拡散係数が小さくなる場合に,特に強い効果が得られることが明らかとなった.そこで,電気泳動用ゲルのような媒体にタンパク質を分散させ,ソーレー効果を用いて移動させることで1分子レベルでの分子輸送が実現できるのではないかと着想するにいたった.これを実現するため,装置開発を行った.一分子レベルのタンパク質の実験を可能にするため,高感度カメラの選定を進め,干渉計に変わる蛍光顕微鏡システムの構築を行った.2次元的な移動を可能にするため,当初は空間位相変調器の導入を想定していたが,シリンドリカルレンズを対角線で分割し組みあわせたレンズを用いることでアンカー状のパターンを発生でき,より高効率であることを発案したため,そのように改善することにした.以上のような装置開発により,タンパク質を1分子レベルで移動させる実験の準備が大方整った.
損傷微量DNAにおけるSTR解析に最適な前処理方法の開発

法医学における個人識別では主にshort tandem repeat(STR)解析が用いられているが、環境への曝露などでDNAが損傷した場合にSTR解析は困難となることがある。そこで、ゲノムDNAをランダムに増幅する全ゲノム増幅法に着目し、全ゲノム増幅法が損傷DNAを用いたSTR解析に対して有効かどうかを検討した。UVA照射3日では、DNA5 ngと0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時と全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数に差は認められなかった。UVA照射7、14日、1ヶ月では、DNA5 ngを用いて全ゲノム増幅した時のSTR検出数はDNA0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時や全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数よりも有意に多かったが(p<0.05)、DNA0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時と全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数に差は認められなかった。従って、損傷したDNA試料では5 ngのDNAを用いて全ゲノム増幅を行うことでSTR解析が改善されることが示唆された。4名の試料提供者から唾液を採取し、濾紙に染み込ませた状態とスライドグラス上に滴下した状態の2条件で試料を作成し、犯行現場における遺留物の擬似試料とした。作成した唾液試料は異なる温度(4°C、室温、37°C)で保存、紫外線照射、屋外環境への曝露の3条件で処理を行い、DNAの損傷状態を調査した。全試料に対してSTR解析を行い、損傷処理日数に伴うアリルピーク高、正確に検出されたSTR数やヘテロ接合体ピーク高比率等の変化を分析した。処理期間は、未処理(0日)を含めて、3日、7日、14日、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年間の8群で、現時点では6ヶ月処理試料のSTR解析まで終了している。損傷試料のSTR解析成功率は、DNA損傷の種類や唾液が付着した素材によって、同じ処理日数でも大きく異なることが示された。また、損傷試料に効果があると報告されている全ゲノム増幅法modified improvedprimer extension preamplification(mIPEP)法に着目し、使用するDNA量や損傷処理日数がmIPEP法にどのような影響を与えているかを調査した。紫外線照射試料において、mIPEP法に用いるDNA量を5 ng(実務試料としては豊富なDNA量)、0.5 ng(通常のSTR解析に用いるDNA量)、0.05 ng(微量DNA)の3条件でSTR解析を行った結果、損傷処理日数が長いほど、mIPEPを行った試料はmIPEPを行わない試料よりもSTR検出数が多かった。従って、高度に損傷したDNA試料では全ゲノム増幅が有効であることが明らかになった。次年度は、様々な条件でDNA損傷させた試料を用いて、異なる増幅メカニズムであるmodified improvedprimer extension preamplification(mIPEP)とmultiple displacement amplification(MDA)法により全ゲノム増幅を行う。今年度は、DNA損傷試料における全ゲノム増幅法の有効性を明らかにするために、紫外線照射したDNA5 ng、0.5 ng、0.05 ngを用いてmIPEP法で検討したが、次年度は様々な条件下で損傷させた微量DNAを用いて、2種の主要な全ゲノム増幅法の有効性を検討する。特に0.05 ngの微量損傷DNAを用いた時、(1)全ゲノム増幅法によって検出されるSTR座位に違いはあるのか、(2)損傷を受けて検出困難となったSTR座位が、全ゲノム増幅によって検出されるようになるのか、について調査する。(1)では、今年度に準備した異なる温度で保存した試料や野外環境への曝露試料に対してSTR解析を行い、紫外線照射に限らず様々な損傷状態の試料について、全ゲノム増幅法が有効かどうかを検討する。(2)については、DNA損傷度をリアルタイムPCRにより算出し、全ゲノム増幅の効果がみられるDNA損傷度を示すことによって、どのようなDNA損傷度の時に全ゲノム増幅を行うとSTR解析の改善がみられるかを推定する。以上、次年度は様々な状況で損傷した微量DNAのSTR解析に全ゲノム増幅が有効かを、異なる手法で比較検討する。

全試料に対してSTR解析を行い、損傷処理日数に伴うアリルピーク高、正確に検出されたSTR数やヘテロ接合体ピーク高比率等の変化を分析した。処理期間は、未処理(0日)を含めて、3日、7日、14日、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年間の8群で、現時点では6ヶ月処理試料のSTR解析まで終了している。損傷試料のSTR解析成功率は、DNA損傷の種類や唾液が付着した素材によって、同じ処理日数でも大きく異なることが示された。また、損傷試料に効果があると報告されている全ゲノム増幅法modified improvedprimer extension preamplification(mIPEP)法に着目し、使用するDNA量や損傷処理日数がmIPEP法にどのような影響を与えているかを調査した。紫外線照射試料において、mIPEP法に用いるDNA量を5 ng(実務試料としては豊富なDNA量)、0.5 ng(通常のSTR解析に用いるDNA量)、0.05 ng(微量DNA)の3条件でSTR解析を行った結果、損傷処理日数が長いほど、mIPEPを行った試料はmIPEPを行わない試料よりもSTR検出数が多かった。従って、高度に損傷したDNA試料では全ゲノム増幅が有効であることが明らかになった。次年度は、様々な条件でDNA損傷させた試料を用いて、異なる増幅メカニズムであるmodified improvedprimer extension preamplification(mIPEP)とmultiple displacement amplification(MDA)法により全ゲノム増幅を行う。今年度は、DNA損傷試料における全ゲノム増幅法の有効性を明らかにするために、紫外線照射したDNA5 ng、0.5 ng、0.05 ngを用いてmIPEP法で検討したが、次年度は様々な条件下で損傷させた微量DNAを用いて、2種の主要な全ゲノム増幅法の有効性を検討する。特に0.05 ngの微量損傷DNAを用いた時、(1)全ゲノム増幅法によって検出されるSTR座位に違いはあるのか、(2)損傷を受けて検出困難となったSTR座位が、全ゲノム増幅によって検出されるようになるのか、について調査する。(1)では、今年度に準備した異なる温度で保存した試料や野外環境への曝露試料に対してSTR解析を行い、紫外線照射に限らず様々な損傷状態の試料について、全ゲノム増幅法が有効かどうかを検討する。(2)については、DNA損傷度をリアルタイムPCRにより算出し、全ゲノム増幅の効果がみられるDNA損傷度を示すことによって、どのようなDNA損傷度の時に全ゲノム増幅を行うとSTR解析の改善がみられるかを推定する。以上、次年度は様々な状況で損傷した微量DNAのSTR解析に全ゲノム増幅が有効かを、異なる手法で比較検討する。
麻酔を用いた睡眠時ブラキシズム新規動物実験系の確立

本年度は、ウレタン麻酔を投与したモルモットにおいて、脳電図、眼電図、心電図、開閉口筋筋電図、鼻部呼吸気流を記録した。また、顎運動の記録には、下顎正中部にLEDターゲットを装着し、CCDカメラでLEDターゲットの位置を検出した。その上でウレタン麻酔下でこれらの生体信号を記録する実験系の確立と、睡眠時ブラキシズムのモデルとして活用可能な減少が出現するかどうか検討した。過去のマウスやラットの研究で報告されているように、ウレタン麻酔下では、脳波活動の振幅が高く、δ波成分が優位な期間と、振幅が低くθ波成分が高い期間の2種類に分類できた。実験を実施したほとんどの動物において、2種類の期間がある一定の時間で交互に出現するウルトラディアンリズム様の変化を示した。一部の動物では、ウルトラディアンリズムが明瞭で脳波の振幅が高い期間が長いままのことがあった。この脳波活動のウルトラディアン変化に伴って、心拍数や呼吸数が変化した。とくに、脳波が振幅が高い時期から低い時期に切り替わるところでは、呼吸リズムの変化が明瞭であった。ウレタン麻酔下では、下顎位が緩やかに変動する他、、脳波活動が変化することに伴って、時折、反復性で側方への下顎運動が発生した。この下顎運動は、閉口筋の活動が著明で、開口筋の活動は低いが、時折歯がこすれる音が発生した。以上のことから、本年度は、ウレタン麻酔下において、反復性の閉口筋活動を伴う歯ぎしり様の下顎運動が発生することが明らかとなった。本年度はウレタン麻酔で発生するウルトラディアンリズムの状態や、歯ぎしり様の顎運動が発生するかどうかを確認できたが、麻酔や記録条件の設定に時間を要した。また、同一動物で無麻酔下で記録する顎運動とウレタン麻酔下で記録した顎運動との比較実験を実施することができなかったため。ウレタン麻酔下で発生する反復性の顎運動発生の生理学的特性を、脳波、心電図、呼吸、筋電図の解析をもとに定量的に明らかにし、顎運動の特性を詳細に解析する。また、ウルトラディアンリズムとの関連も同時に明らかにする。また、同一動物において、自然睡眠とウレタン麻酔の2条件での実験データを収集し、反復性の顎運動特性を比較する。また、可能であれば、脳内電気刺激を行い、発生する反復性の顎運動特性を修飾する領域を同定する。急性実験の実験系の確立を優先して実験を実施し、予定していた慢性実験記録との同時記録ができなかったため。
抗癌剤動脈内注入法の最適化のための実験的研究

1.臨床的に動脈造影例の検討を継続して行い層流を臨床画像から検討しこれまでの観察結果を確認した。臨床的には長距離に渡り層流の発生を回避することは困難であった。乱流を作成してもすぐに層流化した。この現象の速さは軸集中モデルで計算したグラフィックと酷似し軸集中が薬液濃度の不均衡の原因として大きいことが示唆された。2.血管樹モデルで破砕ゲルを用いた軸集中の問題の解決実験には排斥的容量の注入、あるいは持続振盪がいずれも有用であった。比粘度4の血液や破砕ゲル浮遊整理食塩水溶液はニュートン流体に酷似した圧、流量、抵抗、および迅速な層流化現象をしめした。一方で破砕ゲル溶液は軸集中は臨床写真ほどの迅速さを示さなかった。これは血球の回転にゲルの回転が劣ったためと考えられた。3.最適動注条件の提示(およびデヴァイスの提案・開発)についてバイブレータとパンピング装置が有用であった。(a)臨床データでの通常の動注での流体学的評価から、失敗例の問題点を整理し、層流や、軸集中を検討した。われわれの施設内では動注失敗例は他の診療科で後頭の脱毛以外、軟口蓋の穿孔があった。他施設では選択動注例で舌の動注側の壊死の報告を含む強い副作用が、有効性の一方でいろいろな施設から報告されていたことがわかった。この強すぎる効果については、大局的に言えばPoiseuille則による増強効果に合致する現象と解釈されるが、細部の検討に当たって選択的な血管造影をしていない状況でそういった事故が発生していることがわかった。この集計と検討内容は研究期間中にretrospectiveなレヴュー化を試みる。(b)血管樹モデルのなかで単純化したカテーテルモデルで、圧流量の比例関係を実証した。(c)動物モデルを用い動注時の血流を電磁血流計、超音波血流計、レーザー血流計、4種類の色素、抗がん剤(CDDP)の注入試験を、ウサギでなくより動脈確保の行いやすいビーグル犬に変えて左右のa.外頚動脈b.鎖骨下動脈d.下肢動脈に血管径や内腔に影響を与えない側枝からの注入方法により、それそれ選択的に注し、予定(最小27組織×5分析試薬、計135試験)の3分の一まで行った。反省点としては全身レベルでの残留が強くみられ、若干方法(試薬量)を修正する必要があった。分光光度計での測定については他教室の設備を借用するために、のちに一括して行う。得られた結果に対する流体学、薬物動態学的分析ではsigmaplotを用いて近似化を行う予定である。(a)前年度までの臨床データの流体学的検討は口唇や舌の動脈のような側副路の少ないタイプであったが、今年度の臨床検討では左右から同名の栄養動脈があり生理的に側副路の発達した状態:喉頭、下咽頭に分布する動脈も検討した。1側ずつからの異時性注入からでは不十分になるかあるいは過剰になる分布上の問題点が、同時注入の場合は解消された。(b)分岐型血管樹モデルを自作した。これに粘度および粒子のサイズの異なる流体を流して試験を行った。圧流量の比例関係は予想に反して血液と同程度ではニュートン流体に近いデータが得られた。モーターや粒子など再度調整して確認の目的で再試験を予定している。(d)CGによる理論試験、基礎実験および生体内での検討。乱流作成の有用性の検討:注入した薬液が一方によるのを防ぐため、乱流を発生させて攪拌させた。しかし通常の範囲ではすぐに層流化し軸集中現象も発生し、部分的な改善に留まった。(c)動物モデルとして犬を用いた動注薬物動態学的分析は試薬の調整に問題があり労力をかけたが結果がまとまらなかった。他の動物モデルで検討中である。これまでの研究から、予定の薬剤濃度と与えるため、標的領域の分時流量を制御して、至適濃度となるように薬剤を調整して注入することが必要になるが、そのためには非ニュートン性の高い血流を排除して薬液で置換する形に持っていく(この方法はニュートン流体化を促進する)。それが部分的でしかなければ乱流作成を行うことが対策になることが示唆された。
プロテオーム解析を用いた日本人腎癌患者の腫瘍発生機構の解明

本研究の目的は、プロテオーム解析を用いて日本人腎癌患者由来の癌組織と正常組織に含まれるタンパク質を比較し、癌細胞で特異的に欠失している、翻訳後修飾されている、もしくは過剰に発現しているタンパク質の同定を行い、新規癌抑制遺伝子の発見、及び腫瘍発生の原因解明の糸口を見つけることにある。本年度は主に、昨年度に確立した「ゲル内プロテアーゼ消化と質量分析計を組み合わせたマスフィンガープリンティング、及びタンデムマス解析を用いたシークエンスタグ法の2つの方法による微量でも可能なタンパク質同定法」と「腎癌サンプルの染色体欠失領域のプロファイリング(→Sarkar, S., Roy, B.C., Hatano, N., et al.)」をもとに、研究を進めた。今回の研究では、淡明細胞亜型(clear cell type)で、ヒト9番染色体短腕を一部もしくは全て欠失している腎癌患者5例を研究に用いた。その結果、このうち4例以上に癌組織で減少が見られるタンパク質を同定した。タンパク質量の比較は、タンパク質同定ソフトウェア(Mascot)による同定スコアを用いた。これらのタンパク質は、腎癌発生に関わる癌抑制遺伝子の産物、もしくはその遺伝子の下流にある遺伝子の産物であると考えられる。これらの遺伝子の機能解析を行うまでにはいたらなかったが、この成果をもとに今後も研究を続け、腫瘍発生の原因解明を行い、癌の診断、創薬、治療法の開発等に結びつけられる可能性が広がった。本研究の目的は、腎癌細胞から抽出したタンパク質を二次元電気泳動によるプロテオームマップを作成し、癌細胞で特異的に欠失もしくは過剰に発現しているタンパク質の同定を行い、腫瘍発生の原因解明のための糸口を見つけることにある。二次元電気泳動で展開されたゲル上のスポット(ごく微量のタンパク質)から同定を行うため、ゲル内プロテアーゼ消化と質量分析計を組み合わせたマスフィンガープリンティング法、タンデムマス解析をするシークエンスタグ法を用いる予定である。本年度は主に、二次元電気泳動の条件検討、質量分析計を用いた微量タンパク質解析のための技術習得、解析に用いるサンプルに関する染色体欠失領域のプロファイリングの仕上げを行った。その結果、二次元電気泳動では、泳動に用いるタンパク量、一次元目の等電点電気泳動の条件、タンパク質の銀染色法などを詳細に検討し、再現性の問題をほぼ解決できた。質量分析計を用いた解析では、200 fmol(フェムトモル)というごく微量のタンパク質をゲル電気泳動したものでも同定が可能になった。また、腎癌細胞における染色体欠失領域のプロファイリングに関しては、以前に行ったLOH(loss of heterozygosity)解析の結果に統計的な処理を加味し、腎癌患者で染色体欠失の頻度が高い、もしくは高い相関で同時に欠失が見られる領域を発見した。この結果は、多くの量的変動するタンパク質の中からその原因となりうる遺伝子を絞り込む際に、非常に役立つと考えられる。`本研究の目的は、プロテオーム解析を用いて日本人腎癌患者由来の癌組織と正常組織に含まれるタンパク質を比較し、癌細胞で特異的に欠失している、翻訳後修飾されている、もしくは過剰に発現しているタンパク質の同定を行い、新規癌抑制遺伝子の発見、及び腫瘍発生の原因解明の糸口を見つけることにある。