hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光エネルギー捕捉系を改変し光合成能を高めた形質転換植物の作製

申請は、人間が作った栽培条件では,植物は必ずしも最高の生産性を示していないと考え、太陽光を捕捉する光合成の集光装置を改変することが、植物の生産性の向上につながると考えた。集光装置の大きさを制御するのは、光化学系を構成する蛋白質ではなく、周辺集光装置を構成するクロロフィルbの合成活性と考えられてきた。我々が単離したCAOは二段階の酸素添加反応を触媒し,クロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素であり、クロロフィルb合成を単独で調節していると考えられる。そこで、シロイヌナズナの野生型,及びクロロフィルb欠損株に、35Sプロモーター制御のCAOを導入した。導入した株を様々な光条件下で育て、クロロフィルbの蓄積を調べた。野生株では、光の強度が増すに従って、クロロフィルa/クロロフィルb比が高くなり、集光装置が小さくなった。それに引き換え、CAOの発現が誘導されている株では、どのような光強度においてもクロロフィルbが活発に合成され、常に大きな集光装置を形成していた。昨年度の結果では、CAOを導入した株では、低照度下では集光装置が約20%大きくなったことが示されたが、本年度の結果は、さらい集光装置が大きくなったことを示した。この結果は、外部環境が変わっても、遺伝子工学的を用いて、集光装置の大きく保つことが可能なことを示している。植物は光エネルギーを利用して光合成を行っており,光エネルギーをどれだけ集めるかは植物の生産性に直接関係している。野外では植物は光環境や栄養条件に応答して光エネルギー捕捉装置の大きさを調節して最適な光合成を実現している。しかし,人間が作った栽培条件では,植物は必ずしも最高の生産性を示していない。集光装置を大きくすることは,光不足の栽培条件下では生産性の向上に必要であると思われる。集光装置の大きさを制御するのは,周辺集光装置を構成するクロロフィルbの合成活性と考えられてきた。我々が単離したCAOは二段階の酸素添加反応を触媒し,クロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素であり,クロロフィルb合成を単独で調節しており,この発現が集光装置の大きさを制御していることをこれまで明らかにした。そこで,シロイヌナズナの野生型,及びクロロフィルb欠損株に、35Sプロモーター制御のCAOを導入した。CAOを導入した株では,集光装置が約20%大きくなったことが示された。つぎに,CAOの発現が大きな株を単離し,野生株と成長との比較をしたところ,弱光下では野生株より有意に成長が早かった。これは,光合成機能そのものを改変し,生産性の向上に成功した最初の例である。さらに,CAOタンパク質そのものの改変を行ったところ,CAOが葉緑体内で安定に存在し,その結果非常に大きな集光装置を作成することに成功した。これらの結果は,光合成のエネルギー転換系を改変し,生産性を高めることが基本的に可能であることをしめし,今後の農業的応用に道を拓いたと考える。
身体に根ざした認知の生涯発達と神経可塑性

本研究の目的は、高齢期における認知機能低下の防止に役立つ身体活動に関する知見を得ることであり、以下の知見が得られた。(1)視触覚間相互作用による身体近傍空間の加齢変化の検討では、高齢者で身体近傍空間が拡大しており、その程度は運動機能低下と相関していた。(2)視覚ワーキングメモリ課題中の高齢者の脳機能データでは、複雑な歩行が遅い人ほど前頭前野の活動が昂進し、大脳基底核などの皮質下内側部の活動が低下していた。(3)高齢者への3ヶ月の運動+認知課題での介入の効果をランダム化比較試験で調べた結果、脳活動への介入効果は前頭前野の活動減少の形で現れ、前述(2)の横断的な結果と整合していた。【A】高齢者における運動機能と運動イメージ能力との関係を調べる目的で、メンタルローテーション(MR)実験をおこなった。その結果、手のMRは手先の器用さと、足のMRは歩行速度と相関することが示唆されたが、今回の参加者(6888歳)が高機能に偏っている可能性もうかがわれた。【B】身体近傍空間の加齢変化を調べるため、視触覚間干渉課題で高齢者(7084歳)と大学生の比較をおこなった。運動機能(TUG歩行課題)の成績によって2群に分けて分析したところ,高齢者の高成績群では大学生と同様に近距離条件でのみ干渉効果があったのに対し,低成績群では,近および中距離条件で干渉効果が見られた。【C】高齢者の視覚ワーキングメモリ(WM)は、運動(歩行)機能と相関があることが報告されている。これがどの脳部位の活動と関連しているのかを明らかにするために、高齢者に位置刺激と顔刺激のWM課題でfMRI脳機能計測をおこなった。その結果、歩行速度(10m)が速い高齢者は遅い群に比べ、WM課題中の頭頂葉(precunius)の活動が有意に高いことが明らかとなった。【D1】二重課題(DT)条件下での運動介入がどのような認知機能を向上させるかを、地域在住高齢者(6182歳)において検討した。介入群25名に対して、90分間の運動介入を週に1回12週間おこない、介入前と後での運動機能、認知機能を評価し、待機群25名と比較した。その結果、遅延再生を含む記憶などの行動データで、運動介入による有意な向上がみられた。【D2】足画像を用いたメンタルローテーション(MR)の直後に、立位姿勢動揺量が軽減するかを検証した。実験の結果、約10分間のMR直後に測定した片脚立位バランスにおいて、同容量の軽減効果を認めた。こうした効果は足画像以外の刺激(車画像)のMRでは認められず,また単に足刺激を見るだけでも認められなかった。【A】高齢者の運動イメージの加齢変化を調べるために、手・足・文字のメンタルローテーション課題などを実施した。その結果、文字より身体部位図形で加齢の影響が強い傾向がみられた。【B】身体近傍空間の加齢変化について、反応抑制機能および運動機能(TUG)との関連性を検討した。その結果、運動機能の低い高齢者は、反応抑制機能の関与が低いと考えられる単純検出課題でさえ、視触覚相互作用が生じる空間が広がる傾向にあることなどが示された。【C1】高齢者にみられる視覚ワーキングメモリー(WM)と歩行機能との相関が、どの脳部位の活動と関連しているのかを明らかにするために、視覚WM課題中のfMRIによる高機能計測をおこなった。その結果、歩行成績が低い高齢者ほど左前頭前野が強く活動し、右大脳基底核の活動が低下していることが明らかとなった。【C2】高齢者の視線制御行動にどのような特徴があるかを調べるため、視覚探索課題中の視線計測をおこなった。その結果、若年者ではポップアウトして検出が容易な刺激でも、高齢者ではより高次な処理が必要であることが示唆された。【D1】昨年度に行った、二重課題(DT)条件下での運動介入が地域在住高齢者のどのような認知機能を向上させるかの検証において、WM課題中の脳機能をfMRIを用いて介入前後変化を解析した。その結果、運動介入群においてWM課題中の前頭前野の活動が、介入後に有意に減少し、処理の効率が高まったことが示唆された。【D2】足刺激を用いたメンタルローテーション(MR)という認知課題を行った直後に、足関節の制御が重要な意味を持つ立位姿勢時の動揺量が減少する効果が、少なくともMR実施後60分経過しても見られることを報告した。この結果は、MRが立位姿勢訓練に応用可能であることを示唆する。【A1】高齢者の運動イメージの加齢変化を、手・足・文字のメンタルローテーション(MR)課題で検討した。その結果、身体部位図形(手・足)のMRにおいてのみ、後期高齢者で前期高齢者に比した反応時間の遅延がみられた。また、これらの反応時間に関して、手のMRではTMT(Trail Making Test)と、足のMRではTUG歩行検査と有意な相関がみられた。【A2】運動イメージの加齢変化の神経基盤を明らかにするために、上記の手・文字のメンタルローテーション課題中の脳活動をfMRIによって測定した。ここでは、神経加齢をやわらげる要因として運動習慣を取り上げ、運動群と非運動群の比較ができるように2群の高齢者データを収集した。【B】身体近傍空間の加齢変化について、行動データで得られた結果を踏まえ、事象関連電位による脳機能計測データと運動機能などとの相関分析をおこなった。

【C1】視線計測による認知機能低下の検出手法の開発を目指して、軽度認知障害者と健常高齢者とを、顔ワーキングメモリー(WM)課題中の視線計測で比較した。その結果、健常高齢者でみられる目・鼻への視線集中が、軽度認知障害では低下していることが分かった。【C2】高齢者にみられる視覚WMと歩行機能との相関が、どの脳部位の活動と関連しているのかを明らかにするために実施した実験に関して、結果を論文にまとめ刊行した。【D1】二重課題(DT)条件下での運動介入が地域在住高齢者のどのような認知機能を向上させるかの検証において、WM課題中の脳機能をfMRIを用いて介入前後変化を解析した実験に関して、結果を論文にまとめ刊行した。【D2】高齢者を対象に,足刺激のメンタルローテーション課題を行った直後に、足関節の制御が重要な意味を持つ立位姿勢時の動揺量が減少するかを検討した。その結果,若齢者には見られた姿勢動揺量減少効果が,高齢者では見られなかった。計画していたすべての研究項目において、学会発表できる成果が得られ、また、すでに学術雑誌に査読論文が掲載されたものや投稿直前まで準備が進んでいるものもある。本研究の目的は、高齢期における認知機能低下の防止に役立つ身体活動に関する知見を得ることであり、以下の知見が得られた。(1)視触覚間相互作用による身体近傍空間の加齢変化の検討では、高齢者で身体近傍空間が拡大しており、その程度は運動機能低下と相関していた。(2)視覚ワーキングメモリ課題中の高齢者の脳機能データでは、複雑な歩行が遅い人ほど前頭前野の活動が昂進し、大脳基底核などの皮質下内側部の活動が低下していた。(3)高齢者への3ヶ月の運動+認知課題での介入の効果をランダム化比較試験で調べた結果、脳活動への介入効果は前頭前野の活動減少の形で現れ、前述(2)の横断的な結果と整合していた。計画していたすべての研究項目において、学会発表できる成果が得られ、また、すでに学術雑誌に論文の査読が通ったものや投稿直前まで準備が進んでいるものもある。【A】運動イメージの加齢変化の神経基盤については、収集した膨大なデータを解析し、脳活動、脳の構造、およびそれらと行動成績との関連について、運動群と非運動群の差異を明らかにする。【B】身体近傍空間の加齢変化に関わる情報処理メカニズムを解明するため、これまでに行った実験データを分析し、視触覚相互作用と高齢者の運動能力、注意機能との関連性を明らかにする。また,高齢者被験者を追加し、データの信頼性を高め、論文にまとめる。【C】視線計測による認知機能低下の検出については、昨年度に収集したデータをまとめ、論文化する。【D】運動イメージを用いた認知介入に関して、高齢者において若齢者と異なる結果が出た理由について、高齢者についてはMR試行数を若齢者よりも多く設定する必要がある、という可能性を検討する。実験心理学、認知神経科学、加齢認知心理学【A】高齢者の運動イメージの加齢変化については、高機能に偏らないサンプリングに留意してデータ収集を今年度に完了させ、運動機能などとの相関分析に入る。【B】身体近傍空間の加齢変化については、行動データで得られた結果を踏まえ、事象関連電位による脳機能計測データと運動機能などとの相関分析をおこなう。【C】
転写因子Ｆｏｘｏ１の血管形成の制御機構における役割の解明

マウスES細胞による血管形成系を用いてFoxo1の役割を検討した。野生型の血管内皮細胞は血管構造を形成する【血管新生】。一方Foxo1欠損細胞では血管構造は見られない。また野生型では内皮細胞と壁細胞が結合する【血管成熟】の過程が見られるが、Foxo1欠損細胞では見られない。野生型とFoxo1欠損細胞について遺伝子発現解析と機能回復実験を行った。その結果、Foxo1の標的遺伝子の候補として、タンパク質ホスファターゼ1結合タンパク質のあるサブタイプを見いだした。また血管内皮細胞特異的Foxo1発現ES細胞の解析によって、【血管成熟】過程でFoxo1が主に血管内皮細胞で機能することを見いだした。血管形成メカニズムの解明は生理的血管発生の理解や病的血管新生の治療方法の確立につながる重要な課題である。フォークヘッド型転写因子Foxo1の欠損マウスは血管形成不全により胎生致死となる、この表現系から、Foxo1は血管形成の必須因子であることが示された。しかしFoxo1が血管形成をどのような分子メカニズムで調節するのかは明らかではなかった。そこで私は、マウスES細胞の試験管内分化系による血管形成モデルを用いて、Foxo1の役割を検討した。野生型の血管内皮細胞は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の刺激によって、伸長した血管様構造を形成する【血管新生】。一方、Foxo1欠損血管内皮細胞では血管様構造は見られず、異常な形態を示す。未分化ES細胞から血管内皮細胞への分化はFoxo1を欠損した場合でも正常である。よってFoxo1は、血管内皮細胞の分化過程ではなく、血管構造の形成過程に働くと考えられる。さらに、野生型では血管内皮細胞と血管壁細胞が結合する【血管成熟】の過程が見られるが、Foxo1欠損細胞ではこの過程が見られない。【血管新生】と【血管成熟】の2つの過程でのFoxo1の機能の詳細を明らかにするために、野生型とFoxo1欠損血管内皮細胞について、遺伝子発現の網羅的解析を行い、発現変化のあった遺伝子について伸張機能の回復を検討した。さらに、野生型とFoxo1欠損細胞の混合培養、また血管内皮細胞特異的にFoxo1を発現するES細胞の解析によって、【血管成熟】の過程において、Foxo1が主に血管内皮細胞で必要とされていることを見いだした。血管形成は、血管内皮細胞と壁細胞によって、多くの細胞生物学的プロセスが協調的に作用することで進行する。しかし、このプロセスを調節する分子機構の詳細は明らかではない。私は、複雑な血管形成の過程を試験管内培養系で観察でき、また分子生物学的解析が可能なマウス幹細胞(ES)細胞の血管細胞分化誘導系を用いて、血管形成のメカニズムの解析を行っており、現在、フォークヘッド型転写因子Foxo1が【血管内皮細胞の伸長:血管新生(発芽)】と【血管内皮細胞と壁細胞の結合:血管成熟】という2つの血管形成プロセスの調節に関与することを報告している。Foxo1はエネルギー代謝や酸化ストレス応答等の様々な細胞機能の調節に働くことが知られているが、血管形成や細胞形態の調節への関与については不明であった。しかし、最近、Foxo1の欠損マウスが血管形成不全により胎生致死となることから、Foxo1は血管形成の必須因子であることが示唆された。そこで私は、血管内皮細胞でのFoxo1の欠損が伸張機能の消失を引き起こすことに着目し、野生型とFoxo1欠損ES細胞由来の血管内皮細胞の遺伝子発現解析によって、血管内皮細胞の形態制御に関与するFoxo1の標的因子の同定を試みた。その結果、タンパク質ホスファターゼ1結合タンパク質のあるサブタイプが候補因子として同定された。この候補因子はタンパク質ホスファターゼ1を阻害する。そこで、この阻害剤であるオカダ酸でFoxo1欠損血管内皮細胞を刺激したとこる、伸張機能が回復した。さらに、Foxo1欠損血管内皮細胞の伸張機能は、この候補因子の遺伝子導入によって回復することが明らかになった。これらの結果は、Foxo1が候補因子の調節を介して血管内皮細胞の形態制御に働く可能性を初めて示唆するものであり、本研究によって新たな血管形成メカニズムを明らかに出来ると考えている。本年度は、ES細胞を用いた血管形成におけるFoxo1の分子機構の解析を目的とし、特に、【血管内皮細胞の伸長:血管新生(発芽)】でのFoxo1の分子メカニズムの解明研究を行った。

■遺伝子発現解析によるキーファクター(候補因子)の同定:Foxo1欠損血管内皮細胞では、タンパク質ホスファターゼ1結合タンパク質のあるサブタイプ(候補因子)の発現が減少していることをreal time PCR解析によって明らかにした。また、Foxo1欠損血管内皮細胞にこの候補因子を遺伝子導入したところ、伸長機能の回復が見られた。さらに、このようなFoxo1欠損血管内皮細胞の伸張機能の回復は、タンパク質ホスファターゼ1阻害剤の投与によっても見られた。この候補因子の遺伝子領域にはFoxo1結合部位があることが予測されており、現在、レポーターアッセイによるFoxo1による直接的な転写調節の可能性を解析中である。■細胞骨格調節機構の解析:試験管内血管形成モデルを用いて、免疫染色と共焦点顕微鏡による観察によって、ミオシン軽鎖等の細胞骨格制御因子の発現と分布の野生型とFoxo1欠損血管内皮細胞での違いを検討している。■【血管内皮細胞と壁細胞の結合:血管成熟】でのFoxo1の分子メカニズムの解明:血管成熟は、血管内皮細胞が壁細胞によって取り囲まれることで完成するがFoxo1を欠損した場合、血管成熟は見られない。血管成熟過程の効率的な解析のために、血管内皮細胞特異的エンハンサー(F10-44)によってEGFPを発現し、さらに血管壁細胞特異的プロモーター(SM22a)によってDsRed.T4を発現する野生型とFoxo1欠損型ES細胞を作成した。これらの細胞の血管形成モデルを用いて薬剤ライブラリーのスクリーニングや、タイムラプスイメージングによる血管形成過程の動態解析を行っている。次年度は、ES細胞による試験管内血管形成モデルを用いたFoxo1の分子メカニズムの解析と、遺伝子改変マウスを用いた血管形成におけるFoxo1の分子機構の解析を行う。■シグナル伝達の分子機構の解析:現在、Foxo1の標的因子として着目している候補因子の細胞運動、細胞骨格、細胞接着への関与と調節機構の詳細を、関連する阻害剤や活性化剤を用いて検討する。■Foxo1欠損マウスの解析:現在Foxo1(-/+)マウスの繁殖・維持を行っている。次年度は、Foxo1欠損マウス胚の血管内皮細胞と壁細胞の二重染色による血管伸張や血管成熟の生体での解析を行う。またFoxo1欠損マウス胚の全胚培養系において、遺伝子導入や阻害剤等を用い、ES細胞の試験管内分化系で得たFoxo1の分子メカニズムによって、実際にFoxo1欠損マウスの血管形成不全を説明できるかどうかを検証する。次年度では、マウスES細胞培養系とマウスを用いた解析を計画している。研究経費は、細胞培養、実験動物の作製と飼育、セルソーター、組織切片作製、免疫抗体染色、遺伝子工学、遺伝子発現解析などの試薬、消耗品費用、また研究成果の発表で使用する計画である。
消費者法における不招請勧誘禁止の立法化に向けた勧誘概念の横断的研究

本研究は、消費者取引において問題となっている不招請勧誘による被害を防止するために、不招請勧誘に対する規制の立法化を提言することであるが、立法化の提言は、勧誘を行う事業者に多大な影響を与えることから、その対象を整理し、適正な事業活動とともに消費者保護のバランスを目指すものである。本年は、3か年計画の研究の初年度にあたるため、日本における勧誘概念の調査・分析を中心に行った。まず、「勧誘」が法令上初出した鉄道営業法での勧誘概念の整理を行った。この整理により、消費者契約法の立法時に主張されていた勧誘・広告の二元論は見られなかったことから、二元論の発端を探るとともに、勧誘及び広告を規制している「特定商取引に関する法律」と「金融商品取引法」を取り上げ、同法における「勧誘」「広告」概念を明らかにすることに努めた。これにより、以前は、広告と勧誘の二元論について、一定程度の合理性が見られたものの、現代では、そうした区別では説明のつかない事態も生じていることから、これまで主張されてきた特定・不特定とは異なる基準の提唱することを試みた。これらの研究については、研究会において発表を行うとともに、論文の形で公表した。また、イギリスで2018年に不招請勧誘への新たな規制が導入された情報を得たことから、具体的な実施状況について調査・検討を行った。電話勧誘業者へのナンバーディスプレーの義務化、ナンバー表示をしていなかった場合の執行の方法や、PPI(Payment Protection Insurance:収入補償保険)の契約締結に関する不招請勧誘の全面禁止について、国会での審議状況を整理し、日本で不招請勧誘を立法化する際の手がかりを得ることができた。上記研究実績の概要で示したように、本研究の目的である消費者法における不招請勧誘禁止の立法化に向け、勧誘概念に関する我が国の状況について整理をすることができた。また、ヨーロッパやイギリスでの不招請勧誘への規制状況を把握するために、2019年2月にヴェネツィア、マンチェスターで調査を行い、本研究テーマに関する多くの知見を得ることができた。そして、取得した情報をもとにした研究会での報告に対して、各種分野の研究者、実務家と意見交換ができた。2019年度は、イギリス法における不招請勧誘の概念について、文献をもとに整理するとともに、さらに必要な情報については、現地の研究者との意見交換を通した調査を行っていく。旅費に伴う費用のうち、航空機代や宿泊代をできるだけ安価に抑えることに努めた結果、残額が発生した。
薬物誘発性歯肉肥大の動物および細胞レベルの実験による発生メカニズムの解明

I.歯肉線維芽細胞を用いたin vitroの実験1)ヒト歯肉線維芽細胞培養(HGF)系にカルシウム拮抗薬ニフェジピンを添加し,細胞増殖とアポトシースに対する影響を調べた.その結果,HGFの細胞死および増殖能はニフェジピンの濃度依存性に抑制された.2)マクロファージ様細胞(RAW264)において,内毒素性リポ多糖(LPS)の刺激で誘導される一酸化窒素(NO)の産生およびアポトーシスは,ニフェジピンによって抑制された.またLPS刺激によるRAW264の誘導型NO合成酵素(iNOS)産生も,ニフェジピンで抑制された.3)LPSはRAW264との共培養系でHGFのアポトーシスを誘導するが,ニフェジピンはこのHGF細胞死を抑制した.4)フェニトイン刺激によって,HGFのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)およびそのインヒビター(TMPs)のmRNA発現が促進された.以上のことから,HGFの増殖,アポトーシスおよび炎症反応に対するニフェジピンやフェニトインの作用が,薬物誘発性歯肉肥大の発生と進行に深く関与していることが示唆された.II.ラットを用いた薬物相互作用のin vivo実験1)薬物誘発性歯肉肥大における薬物間相互作用の影響をみるため,ラットにニフェジピンとその代謝阻害剤と考えられるケトコナゾールを併用投与した.その結果,ケトコナゾール投与によりニフェジピンの血中濃度は上昇し,歯肉肥大も重症化した.2)ラットにニフェジピンとともにグレープフルーツジュース(GFJ)あるいはbergamot oil (BO)を投与した.GFJの投与によって歯肉肥大は重症化した.しかしGFJの薬物代謝阻害成分と考えられるフラノクマリン誘導体を含むBO投与では,有意の変化は示されなかった.I.歯肉線維芽細胞を用いたin vitroの実験1)ヒト歯肉線維芽細胞培養(HGF)系にカルシウム拮抗薬ニフェジピンを添加し,細胞増殖とアポトシースに対する影響を調べた.その結果,HGFの細胞死および増殖能はニフェジピンの濃度依存性に抑制された.2)マクロファージ様細胞(RAW264)において,内毒素性リポ多糖(LPS)の刺激で誘導される一酸化窒素(NO)の産生およびアポトーシスは,ニフェジピンによって抑制された.またLPS刺激によるRAW264の誘導型NO合成酵素(iNOS)産生も,ニフェジピンで抑制された.3)LPSはRAW264との共培養系でHGFのアポトーシスを誘導するが,ニフェジピンはこのHGF細胞死を抑制した.4)フェニトイン刺激によって,HGFのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)およびそのインヒビター(TMPs)のmRNA発現が促進された.以上のことから,HGFの増殖,アポトーシスおよび炎症反応に対するニフェジピンやフェニトインの作用が,薬物誘発性歯肉肥大の発生と進行に深く関与していることが示唆された.II.ラットを用いた薬物相互作用のin vivo実験1)薬物誘発性歯肉肥大における薬物間相互作用の影響をみるため,ラットにニフェジピンとその代謝阻害剤と考えられるケトコナゾールを併用投与した.その結果,ケトコナゾール投与によりニフェジピンの血中濃度は上昇し,歯肉肥大も重症化した.2)ラットにニフェジピンとともにグレープフルーツジュース(GFJ)あるいはbergamot oil (BO)を投与した.GFJの投与によって歯肉肥大は重症化した.しかしGFJの薬物代謝阻害成分と考えられるフラノクマリン誘導体を含むBO投与では,有意の変化は示されなかった.I.歯肉線維芽細胞を用いたin vitroの研究1)ヒト由来の線維芽細胞培養系に,カルシウム拮抗薬のニフェジピンを添加し,細胞の増殖と細胞死に対する影響を調べた.その結果,コンフルエントになった後の細胞死および増殖能は,培養液中のニフェジピン濃度依存性に抑制されることが示された.2)マクロファージ様RAW264細胞において内毒素性リポ多糖(LPS)の刺激で誘導される一酸化窒素(NO)の産生および細胞死は,ニフェジピンによって抑制された.また,LPS刺激によってRAW264細胞で誘導されてくる誘導型N0合成酵素(iN0S)の産生は,ニフェジピンによって抑制された.3)歯肉線維芽細胞とRAW264細胞の共培養系にLPSを添加すると,線維芽細胞の細胞死が誘導されるが,ニフェジピンによってこのアポトーシスが抑制された.これらのことから,歯肉線維芽細胞の増殖とアポトーシス,および炎症反応に対するニフェジピンの作用が薬物誘発性歯肉肥大の発生に深く関わっていることが示唆された.II.ラットを用いた薬物相互作用のin vivo実験1)薬物誘発性歯肉肥大における薬物間の相互作用の影響をみるため,ラットを用いてニフェジピンのチトクロームによる薬物代謝と競合する可能性のあるケトコナゾールを併用投与した.独自に確立した歯肉肥大誘発実験系を用いて,ニフェジピンとケトコナゾールを42日間,連続経口投与し,血中ニフェジピン濃度と歯肉肥大の程度を調べた.その結果,ケトコナゾールの投与によってニフェジピンの血中濃度は上昇してお.り,同時に歯肉肥大も重症化することが示された.I.歯肉線維芽細胞を用いたin vitroの実験1)ヒト歯肉線維芽

細胞培養(HGF)系にカルシウム拮抗薬ニフェジピンを添加し,細胞増殖とアポトシースに対する影響を調べた.その結果,HGFの細胞死および増殖能はニフェジピンの濃度依存性に抑制された.2)マクロファージ様細胞(RAW264)において,内毒素性リポ多糖(LPS)の刺激で誘導される一酸化窒素(NO)の産生およびアポトーシスは,ニフェジピンによって抑制された.またLPS刺激によるRAW264の誘導型NO合成酵素(iNOS)産生も,ニフェジピンで抑制された.3)LPSはRAW264との共培養系でHGFのアポトーシスを誘導するが,ニフェジピンはこのHGF細胞死を抑制した.4)フェニトイン刺激によって,HGFのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)およびそのインヒビター(TIMPs)のmRNA発現が促進された.以上のことから,HGFの増殖,アポトーシスおよび炎症反応に対するニフェジピンやフェニトインの作用が,薬物誘発性歯肉肥大の発生戸進行に深く関与していることが示唆された.II.ラットを用いた薬物相互作用のin vivo実験1)薬物誘発性歯肉肥大における薬物間相互作用の影響をみるため,ラットにニフェジピンとその代謝阻害剤と考えられるケトコナゾールを併用投与した.その結果,ケトコナゾール投与によりニフェジピンの血中濃度は上昇し,歯肉肥大も重症化した.2)ラットにニフェジピンとともにグレープフルーツジュース(GFJ)あるいはbergamot oil(BO)を投与した.GFJの投与によって歯肉肥大は重症化した.しかしGFJの薬物代謝阻害成分と考えられるフラノクマリン誘導体を含むBO投与では,有意の変化は示されなかった.
精神分裂病の神経発達障害モデル動物における精神異常惹起物質による行動感作の研究

近年、精神分裂病の病因として神経発達障害の関与が想定され、そのモデルとして新生仔期に腹側海馬を傷害した(Neonatal Ventral Hippocampal Lesion ; NVHL)ラットを用いた研究が行われている。このラットは思春期後に初めて行動異常を呈するため、精神分裂病の発症の機序を包含した動物モデルと考えられている。本研究では、NVHLラットにコカインを反復投与し精神分裂病の再燃の薬理学的モデルである行動感作が成立するか否かを検討し、より精神分裂病に近似した動物モデルの作成を試みた。Sprague-Dawley雄性の生後7日のラットを用いた。定位脳手術で両側の腹側海馬にイボテン酸を1.5μgづつシリンジポンプにて注入した(Lesion群)。対照として同量のPBS緩衝液を注入した(Sham群)。ラットの思春期後に相当する生後49日に両群にコカイン(20mg/kg)を7目間連続投与し、投与1、4、7日目の行動量と、投与終了後1週間の離脱期間をおいてコカインを再投与して行動量を測定した。その結果、1.NVHLラットにコカインを7日間連続投与し、7日間の断薬後コカインを再投与することによりLesion群、Sham群ともに行動感作が成立した。2.NVHLラットでは、Sham群に比して常同行動が長時間持続することが確認され、行動感作の程度が異なる可能性が示唆された。3.NVHLラットにコカインを連続投与して行動感作を成立させることで精神分裂病の発症と再発の病態生理を内包した、より精神分裂病に近い従来にない動物モデルが作成できると考えられた。本研究の目的は、新生仔期に腹側海馬を傷害した神経発達障害モデルラットを用いて行動薬理学的にその異常を検討し、精神分裂病の病態生理を解明することにある。そのためにこのラットに精神異常惹起物質であるコカインを反復投与して行動感作の程度を検討する。定位脳手術で、両側の腹側海馬にイボテン酸を1.5μgづつシリンジポンプにて注入した(Lesion群)。生後21日に離乳し、両群それぞれ別のケージで23匹づつに分けて飼育した。生後35日にこれらのラットを行動測定用のケージに移し、新規環境での行動量を30分間測定し、その後両群とも生理食塩水を腹腔内に投与し、注射によるストレスを負荷した時の行動量を30分間測定した。その結果、新規環境、注射とも行動量に両群間で有意な差はなかった。この神経発達モデル動物において行動の異常は思春期前には顕在化せず、思春期以後に明らかになることが報告されている。生後35日はラットの思春期前であり、本実験でも同様のことが確認された。現在本実験は進行中であり、生後49日に両群にコカイン(20mg/kg)を7日間連続投与し、投与期間中の行動量と常同行動を測定する。投与終了後1週間の離脱期間をおいてコカインを再投与して行動量と常同行動を測定し行動感作の程度を比較する予定である。近年、統合失調症(精神分裂病)の病因として神経発達障害の関与が想定され、そのモデルとして新生仔期に腹側海馬を傷害したラットを用いた研究が行われている。このラットは思春期後に初めて行動異常を呈するため、統合失調症の発症の機序を包含した動物モデルと考えられている。本研究の目的は、このラットにコカインを反復投与して統合失調症の再燃の薬理学的モデルである行動

感作の程度を検討し、より統合失調症に近似した動物モデルの作成をめざすことにある。Sprague-Dawley雄性の生後7日のラットを用いた。定位脳手術で両側の腹側海馬にイボテン酸を1.5μgづつシリンジポンプにて注入した(Lesion群)。対照として同量のPBS緩衝液を注入した(Sham群)。生後21日に離乳し、両群それぞれ別のケージで23匹づつに分けて飼育した。ラットの思春期前に相当する生後35日に、これらのラットを行動測定用のケージに移し、新規環境での行動量を30分間測定し、その後両群とも生理食塩水を腹腔内に投与し、注射によるストレスを負荷した時の行動量を30分間測定した。その結果、従来の報告のように新規環境、注射とも行動量に両群間に有意な差を認めなかった。ラットの思春期後に相当する生後49日に両群にコカイン(20mg/kg)を7日間連続投与し、投与1、4、7日目の行動量と、投与終了後1週間の離脱期間をおいてコカインを再投与して行動量を測定した。その結果、全ての測定日においてLesion群はSham群に比して過活動の傾向を認めたが、統計学的に有意な差を認めなかった。この理由として、本研究のコカイン投与方法が、行動感作を惹起するために十分ではなかった可能性や、Lesion群ではコカイン投与以前にすでに過活動になっているためにこれ以上の行動感作による過活動にはなり難い可能性が考えられた。
高感度バイオセンサの開発

1.新検出方式:基礎的解明粘菌の外部情報の認識、選択、判断および伝達機能の一部が解明され、ダイナミックセンシングシステムの確立の基礎を得た(加茂)。イオン選択性電極界面を利用するアンペロメトリー型バイオセンサを作製し、高性能化を達成した(角谷)。脂質二分子膜の化学受容による膜電位変化をモデルとして臭いまたは味を測定する人工膜センサを開発した(栗原)。2.微小化電界効果トランジスターを用いたバイオセンサ開発へのLB膜の有用性を示した(長)。半導体製造技術を応用してアンペロメトリー型微小酸素センサを作製した(軽部)。3.高感度化オプテカルpHセンサを用いた酵素センサによるグルコース等の高感度計測を検討した(白井)。リポソーム等の破壊反応を利用したテオフィリンおよびジゴキシン測定用の高感度免疫センサを開発した(鈴木)。電気化学ルミネッセンス等種々の新しい原理を応用したオプテカルイムノセンサを用いて生体成分の微量測定を実施した(相澤)。4.多機能化複合酵素系の反応時間のずれを利用したデンプン/グルコースおよびラクトース/グルコース系の分別計測を行なった(渡辺)。グルコース、尿酸および尿系等の同時迅速計測システムの開発を行った(加藤)。5.診断・臨床用センサ生体適合性グルコースセンサのin vivo特性を検討した(伊藤)。フェロセンをメディエーターとしたグルコースセンサの開発を行い、低酸素分圧下での有用性を示した(七里)。重症糖尿病ならびに肝臓の代謝障害時のマーカーである血中ケトン体測定システムを開発し、臨床応用への道を開いた(戸谷)。ヒト血清リポタンパク構成成分認識バイオセンサシステムの高性能化を検討した(牧野)。IgEを用いたセロトニン測定システムを開発しアレルギー反応の診断用センサとして用いた(松永)。
高等学校における学科編成・履修システムの改善に関する総合的研究

本研究では、今次の高校教育改革の目玉である「総合学科」を中心に取り上げ、理論的・実証的な検討を加えた。1994年度から設置された「総合学科」は、改革のさまざまな要素を内包している。本研究の中心的な特徴は、都道府県や個々の学校の意思決定のレベルにまで踏み込んで調査を実施した点にある。と同時に、総合選択制高校や単位制高校などいわゆる「新しいタイプの高校」が直面している課題を浮き彫りにするとともに、教授・学習過程をめぐる諸問題についてもあわせて考察の対象とした。その結果、高等学校における学科編成と履修システムの改革に関して、以下の知見が得られた。1.総合学科は生徒の進路希望や学力の「多様性」に対応するために導入された新しい学科であるが、個々の高校にとっては組織の「生き残り戦略」として位置づけられている。国と都道府県と高校といった3つのレベルで異なった「思惑」が存在する。2.これら3種の意思決定は、多くの場合矛盾なく符合しているようにみえる。しかし、実際には財政的な支援や教員の加配は必ずしも充分ではなく、都道府県や高校では、小規模な改革への「軌道修正」が行なわれる。また、改革プランの策定をめぐって、国と都道府県との間には微妙な「齟齬」も見られ、意思決定の方法を再検討する余地を示している。3.普通科志向が依然として強いこともあって、総合学科を「普通科よりも進学に有利な学科」と捉えられる傾向があった。この点は、普通科総合選択制高校についての検討からも容易に推測される。総合学科をはじめとした高校教育改革が「進学校」で実現されないこともあり、改革が大きな成果をもたらすかどうか微妙である。今年度は、いくつかの高校を訪問することによって、履修システムと学科編成の改革動向を理論的・実証的に把握した。その結果、次のような知見が得られた。高校教育改革への取り組みは、次第に広ままりつつある。最も一般的な改革類型のひとつが「特色ある教育課程の設置」であり、芸術・国際・体育などトレンディな学科等が設定され魅力ある高校づくりが行なわれている。しかし、大仕掛な改革であればあるほど、教員数不足などの現実的制約を前に立ち尽してしまう。特例措置を受けといない高校の場合、柔軟性を欠いた「大学進学者向けコース(類型)の設定」で妥協せざるを得ない。私立高校が台頭する中で、「公立こ校活性化」の戦略は、進学実績の向上という形をとることになる。改革の背景・経緯からも、進学実績の向上がいかに重視されているかがわかる。早期の進路選択と入試を見据えた「効率的学習によって、成果を上げている高校も少なくない(ホームルーム単位の習熟度別学級編成も同様)。ごく一部の特例を除けば、大部分の高校は教員配置の点で特別な配慮を受けておらず、選択科目を多く設定することはできない。戦後幾度となく論じられた「普通科と職業学科の一体化」というベクトルとは逆方向へと収斂する傾向がある。高校新設が期待薄のいま、残された方法は学校統合による大規模化であるが、現実にはその可能性はきわめて小さい。教員定数の改変などを中心として人的・材政的支援を訴える声がひときわ目立ったのもそのためだろう。次年度は、履修システムと学科編成の変更が生徒や教師に対してどのような影響を及ぼすこという点についてさらに仔細な検討を加える予定である。本研究では、今次の高校教育改革の目玉である「総合学科」を中心に取り上げ、理論的・実証的な検討を加えることとした。しかしながら、「総合学科」の導入は次年度であり、その教育効果そのものを現在の段階で把握することはできない。そこで、本年度は間接的に「総合学科」と関連すると考えられるいくつかの先導的実践に焦点を合わせて考察を行った。高校教育改革への取り組みは次第に広まりつつあり、「特色ある教育課程の設置」が試みられている。しかし、多くの改革は充分な教育資源に裏付けられておらず、従来の「類型制」と大同小異である。この動きは、私立高校の台頭(あるいは、「公立高校の地盤沈下」という背景のもとに生じている。「総合学科」を構想・実施する場合も、この歴史的な事実を見落としてはならない。とはいえ、先導的な実践の中にもいくつかの興味深いものがある。ひとつは大規模な総合選択制高校であり、もうひとつは、単位制高校である。まず前者は、大幅な選択科目を用意することで生徒の多様なニーズに対応しており、生徒の学校生活への構えを積極的にする効果をもっている。しかし、より仔細に検討すると、その<成功>の背景には学区制や推薦入学などの「特例措置」を受けているという事情がある。単位制高校もまたきめ細かな個別指導によって不登校の生徒を<回復>へと導いている。今後「総合学科」の有効性について考察するとき、以上の経験的事実や過去の歴史的事実を素材としながら改革の「構造」を解読していくことが必要である。次年度は、「総合学科」の導入をめぐって立ち現れるさまざまな問題に迫る予定である。本研究の中心的な特徴は、都道府県や個々の学校の意志決定のレベルにまで踏み込んで調査を実施した点にある。

と同時に、総合選択制高校や単位制高校などいわゆる「新しいタイプの高校」が直面している課題を浮き彫りにするとともに、教授・学習過程をめぐる諸問題についてもあわせて考察の対象とした。その結果、高等学校における学科編成と履修システムの改革に関する、以下の知見が得られた。1.総合学科は生徒の進路希望や学力の「多様性」に対するために導入された新しい学科であるが、個々の高校にとっては組織の「生き残り戦略」として位置づけられている。国と都道府県と高校といった3つのレベルで異なった「思惑」が存在する。2.これら3種の意思決定は、多くの場合矛盾なく符合しているようにみえる。しかし、実際には財政的な支援や教員の加配は必ずしも充分ではなく、都道府県や高校では、小規模な改革への「軌道修正」が行なわれる。また、改革プランの策定をめぐって、国と都道府県との間には微妙な「齟齬」も見られ、意思決定の方法を再検討する余地を示している。3.普通科志向が依然として強いこともあって、総合学科を「普通科よりも進学に有利な学科」と捉えられる傾向があった。この点は、普通科総合選択制高校についての検討からも容易に推測される。総合学科をはじめとした高校教育改革が「進学校」で実現されないこともあり、改革が大きな成果をもたらすかどうか微妙である。本研究では、今次の高校教育改革の目玉である「総合学科」を中心に取り上げ、理論的・実証的な検討を加えた。1994年度から設置された「総合学科」は、改革のさまざまな要素を内包している。本研究の中心的な特徴は、都道府県や個々の学校の意思決定のレベルにまで踏み込んで調査を実施した点にある。その結果、高等学校における学科編成と履修システムの改革に関して、以下の知見が得られた。1.総合学科は生徒の進路希望や学力の「多様性」に対応するために導入された新しい学科であるが、個々の高校にとっては組織の「生き残り戦略」として位置づけられている。
移動中の神経細胞の挙動制御

マウス発生期大脳皮質における多極性移動細胞がいかなる細胞外シグナルを受容し、その挙動が制御されているのかを明らかにするため、これらの細胞に発現し分泌シグナルを有する蛋白質(膜貫通蛋白質または分泌蛋白質。以下略してS/TMと記す)を同定することを目指した。そのため、まずは多極性移動細胞を多く含む部位をマウス大脳皮質から実体顕微鏡下でほぼ正確に切り出す手法を確立し、シグナルシークエンストラップ法(SST)によるS/TMの検索を行った。これまでに103クローンを得て、うち96クローンのin situ hybridizationを終えた。また、SSTと並行して、HiCEP法を使った検索も行った。すなわち、子宮内マウス胎児脳への電気穿孔法による遺伝子導入で緑色蛍光蛋白質(GFP)発現プラスミドを脳室面に導入し、多極性細胞が多くラベルされる時期、及び、その前段階として脳室帯細胞が多くラベルされる時期を検討した。次に、各々の時期に該当部位を切り出し、セルソーターで蛍光ラベルされた細胞をそれぞれ濃縮した。それらからRNAを抽出し、HiCEP法を用いて両者のトランスクリプトームを比較することにより、多極性細胞を多く含む画分に強く発現するピークを検索した。その結果、「多極性細胞画分」で5倍以上高いピークを示すクローン273個を同定した。HiCEPデータベースで各ピークを予測して得た2960遺伝子のうち、S/TMに絞って、計271のうち249遺伝子のin situ hybridizationを終えた。以上の結果、多極性細胞が多く局在する脳室下帯に発現する遺伝子を13個同定することができた。その内、受容体型膜蛋白質が5個、分泌蛋白質が1個であった。これらいずれの分子も、軸索ガイダンスに関わると推定されるものであった。以上の結果から、多極性移動細胞は、脳室下帯において軸索ガイダンスに深く関わっている可能性が考えられた。
テルペン関連合成酵素の機能解析および新規機能性環化酵素の創製

スクアレン環化酵素(SHC)、結核菌が生産するジテルペン及びスクアレン合成酵素(SQS)の機能解析を取り上げ、以下の成果を得た。スクアレン環化酵素(SHC)1.SHCによる最終反応の脱プロトン化は、高度に分極した水分子がプロトン受容体として機能する事を部位特異的変異株の作成及び速度論を含む機能解析で実証した。2.メチル基の位置異性体を各種合成し、SHCとの酵素反応を解析した。7位や11位にMe基が存在すると環化反応が全く進行せず、また、14位にMe基が存在すると反応収率が低かった。酵素と基質との立体的な相互作用について考察した。3.スクアレンは鎖長C_<30>であるが、短鎖のgeraniol(C_<10>), farnesol(C_<15>), C_<20>やC_<25> analogとの反応を検討した。C_<10>は全く反応しなかったが、C_<15>C_<25>の収率は3065%であった。特にC_<15>の基質はC_<20>やC_<25>と比較して約2倍高収率であった。4.原核生物型から(3S)-OXSQに特異的な真核生物型へ改変できた。5.非天然型アミノ酸導入により、カチオン/π相互作用を始めて実証できた。結核菌が生産するジテルペン2.TBPPを脱リン酸化する遺伝子をRv3378cと同定し、水付加反応によって得られる新規酵素産物であった(isotuberculosinolと命名)。Rv3378c酵素の基質特異性を検討した。ent-copalylPPとも反応し、こけ類から見いだされたent-manoolを生産することも見いだした。最近、我々は両遺伝子が病原性Mycobacterium属のみに存在することを見いだした。テルペノイド関連酵素として1)結核菌由来のジテルペン合成酵素をとりあげ、ゲラニルゲラニルニリン酸が環化してハリマン骨格を形成する事を日本農芸化学会で発表した。酵素反応で得られるハリマン化合物には二リン酸が脱離してアルコール体として得られるが、これは大腸菌由来のフォスファターゼで加水分解するために起こる事を明らかにした。2)スクアレン合成酵素も取り上げ、メタンガス資化細菌のスクアレン合成酵素のクローニングに成功し、現在部位特異的変異酵素を作成し機能解析を進めている。3)メタンガス資化細菌にはステロールを含む事が報告されていた。この細菌の無細胞抽出液を用いいてオキシドスクアレンを基質とした酵素反応を行ったところ、ラノステロールを生成する事をGC-MSやNMRで確定した。現在スクアレンエポキシダーゼやラノステロール合成酵素をクローニング実験を進めている。4)スクアレン環化酵素に部位特異的に非天然型アミノ酸の導入することを目指し成功した。その成果を日本農芸化学会で発表した。この研究はスクアレン環化酵素の触媒機構の一つとしてカチオン/π相互作用が提案されているが、その実証が不十分であることから開始した。現在O-メチルチロシンとP-アミノフェニルチロシンの部位特異的変異株の作成に成功し、機能解析を進めている。5)スクアレンが環化して最終カチオンが生成するが、そのカチオンをクエンチするために脱プロトンが起き、二重結合が導入される。その最終カチオンの周りに存在するアミノ酸を部位特異的変異手法を用いて徹底的に機能解析した。

その成果をBiosci.Biotechnol.Biochem.に投稿し受理された。まだ、論文作成に至ってない研究進行中のものが多いが、確実に研究成果が上がってきていると考えている。平成16年度の本研究成果を要約すると下記の点が挙げられる。1.スクアレン環化酵素による反応は末端メチル基からの脱プロトンにより終止する。推定の脱プロトン化部位に位置する10個のアミノ酸残基(Thr41,Glu45,Glu93,Arg127,Trp133,Gln262,Pro263,Tyr267,Phe434およびPhe437)を標的にした変異型酵素を作成し、生成物の分布や速度論定数を解析した。最終中間体ホパニルカチオンのイソプロピル基における脱プロトン化において、Gln262とPro263が"front water"を適切な場所に配置し、ホパノールやhop-21(22)-eneの様な副生成物の形成を抑えるために有効に働くことが判明した。また、"back waters"を取り巻く水素結合ネットワークの構成アミノ酸残基(Thr41,Glu45,Glu93,Arg127およびTrp133)は、"back waters"を通して"front water"を高度に分極化させ、脱プロトン化の反応速度を促進するために重要であることが解った。Biosci.Biotechnol.Biochem.68,728-738(2004).2.重水素スクアレンを合成し、C(22)-Z-Meから脱プロトンすることを証明した。また、末端メチル基の環化反応に果たす役割を究明するために、末端メチル基が欠如したアナログを合成し、環化反応を調べた。E環が6員環の構造が主生成物となり、HOMO-LUMO相互作用により、その環化反応が規制されることを証明した。Org.Biomol.Chem.2,1456-1470(2004).3.スクアレンは規則正しい位置にメチル基を持つ。各種のメチル基位置異性体を合成し、メチル基の役割を更に追求した。7位、14位にMeが存在すると環化反応が著しく阻害されること、及び18位に存在すると環化反応がマルコフニコフ則に従って環化反応が進行することなどを明らかにした。Org.Biomol.Chem.2,2012-2022(2004)..4.スクアレン環化酵素が短鎖のアナログでも環化するかどうか検討した。C10環化せず、C15はかなりの高収率で反応すること、C20やC25は反応収率があまり高くないこと等を明らかにした。Org.Biomol.Chem.2,2650-2657(2004)5.スクアレン環化酵素のG600を欠如するとスクアレンでは全く反応せず、3S-オキシドスクアレンは反応し、3R-体は全く反応しなかった。これは、真核生物のオキシドスクアレン環化酵素の基質特異性に類似した環化酵素を始めて創製した例となった。Angew.Chem.Int.Ed.48,6700-6703(2004).6.結核菌にジテルペン環化酵素が存在することを始めて証明し、tuberculosinolと命名した。この遺伝子は病原性結核菌のみに存在することを見いだし、興味深い知見を得た。Chem.Commun.1016-1018(2004).今年度は、1)結核菌由来の新規ジテルペン合成酵素Rv3377c及びRv3378c遺伝子産物の機能解析、2)スクアレン環化酵素(SHC)によるジオール体及び短鎖・長鎖アナログからの新規テルペン化合物の創製及びカチオン/π相互作用の証明、3)スクアレン合成酵素の機能解析を取り上げて下記の成果を得た。
経路選択的光遺伝学機能操作法による行動制御

げっ歯類において、中脳上丘から反対側網様体へ投射経路は視覚刺激等に対する指向運動を制御しているのに対し、同側網様体への投射経路は逃避行動を制御しているという仮説が提唱されてきた。しかし、その実験的証拠はあくまで間接的だった。本研究では、ウィルスベクターのみを用いて経路選択的にチャネルロドプシンを発現させ、それによってそれぞれの経路選択的に特異的な行動が観察されるかどうかを観察し、上記の仮説の検証を目的としている。今回、そのための第一歩として、AAV1-CAG-ChR2(H134R)-tdTomatoをマウスの片側上丘に注入し、5ー7週間後に波長473nmの青色レーザーを直径250μmないしは500μmの光ファイバーを上丘の直上に埋めて照射し、行動を観察した。すると、直径250μmで尾外側部を刺激した際には、反対側への頭部の指向運動が誘発され、2ー3秒にわたる長い時間の刺激では全身の回旋運動が誘発された。それに対し、吻内側部の刺激では上方向に頭を向ける指向運動様の動きが観察された。一方で、直径500μmの光ファイバーで上丘全体を強く刺激した際には、全身の逃避行動が観察された。次に、第二段階として、左の橋・延髄網様体に逆行性のウィルスベクターであるFuGC- MSCV-Creを注入し、その後右側の上丘にAAV-EF1α-double flex hChR2-YFPを注入し、交叉性上丘ー網様体投射経路に選択的にチャネルロドプシンを発現させた。数か月以降に上丘に波長473 nmの青色レーザー光を照射したところ、反対側の頭部の指向運動を誘発できた。その後麻酔下でも上丘ニューロンがレーザー刺激に発火応答していることが確認できた。このようにして、遺伝子改変動物を作製することなく、2種類のウィルスベクターの組み合わせのみで、経路選択的な光遺伝学的手法によって、行動に影響を与えることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。マウスの中脳上丘から反対側の橋・延髄網様体に至る経路を選択的に遮断すべく、橋・延髄網様体に高頻度逆行性レンチウィルスベクターにテトラサイクリン反応性配列TREに緑色蛍光タンパクFPと破傷風毒素(eTeNT)を搭載したウィルスベクター(HiRet-TRE-eGFP.eTeNT)を注入。約1週間後に反対側上丘に高感度Tet-ON配列rtTAV16を搭載したアデノ随伴ウィルスベクター(AAV2-CMV-rtTAV16)を注入した。そして6週間後にマウスにドキシサイクリンを投与したところ、上丘の反対側に向かう頭部の指向運動、visual placing response、回旋運動が阻害された。また、このウィルスベクター感染による選択的・可逆的経路遮断技術の技術的詳細について、このマウスの指向運動系を対象として最適化を行った。ウィルスベクター2重感染による経路遮断をマウスでも成功させた。そして、現在、破傷風毒素の代わりにチャネルロドプシンを搭載する、またHiRet-Tetのウィルス系だけでなく、HiRetにCre-floxの系を用いた経路選択的機能操作系の開発も行っている。

マウスでの経路選択的機能操作の技法について確立してきたので、平成26年度は、同側の上丘ー網様体路に遮断を適用し、さらにチャネルロドプシンを適用することで経路選択的な活性化を行い、マウスで指向運動と逃避行動を別々に制御したい。
一般合流超幾何関数の研究

この研究の目的は古典的に知られている超幾何関数および合流型超幾何関数を含む多変数超幾何関数の理論を建設することである.当該年度の研究目的は具体的には次の2点であった.(2)合流型超幾何関数の隣接関係式とTodalatticeの関係の解明.上記の目的についての研究成果は次のとおりである.(1)について.合流型超幾何関数が1重積分で表される場合には,積分に意味を与えるhomologyはfamily of supportsを持つtwisted homologyで記述されるが,homologyの代表元を与えるcycleを具体的に構成することができた.またcohomologyについては,rational twisted de Rham cohomologyを具体的に計算した.更に,多重積分で与えられるAiry関数の場合には,付随するrational de Rham cohomologyについて,特異点理論における孤立特異点に関する結果を用いることにより,その消滅と生き残るcohomologyの次元についての結果を得た.(2)について.Toda latticeとの関係は未だに不明であるが,隣接関係式を生成する1階微分作用素の作るLie環に関する結果として,このLie環がGL(n)のLie環の必ずしもsemisimpleでない極大可換部分環に関するroot space分解によって自然に記述されることを明らかにした.この研究の目的は古典的に知られている超幾何関数および合流型超幾何関数を含む多変数超幾何関数の理論を建設することである.当該年度の研究目的は具体的には次の2点であった.(2)合流型超幾何関数の隣接関係式とTodalatticeの関係の解明.上記の目的についての研究成果は次のとおりである.(1)について.合流型超幾何関数が1重積分で表される場合には,積分に意味を与えるhomologyはfamily of supportsを持つtwisted homologyで記述されるが,homologyの代表元を与えるcycleを具体的に構成することができた.またcohomologyについては,rational twisted de Rham cohomologyを具体的に計算した.更に,多重積分で与えられるAiry関数の場合には,付随するrational de Rham cohomologyについて,特異点理論における孤立特異点に関する結果を用いることにより,その消滅と生き残るcohomologyの次元についての結果を得た.(2)について.Toda latticeとの関係は未だに不明であるが,隣接関係式を生成する1階微分作用素の作るLie環に関する結果として,このLie環がGL(n)のLie環の必ずしもsemisimpleでない極大可換部分環に関するroot space分解によって自然に記述されることを明らかにした.