hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工ヌクレアーゼを用いた早老症ｉＰＳ細胞の遺伝子修正と治療への応用

ウェルナー症候群(WS)は,皮膚潰瘍,糖尿病,動脈硬化、がんなどを早期に発症する早老症である。本研究では,患者iPS細胞の変異遺伝子を人工ヌクレアーゼにより修正し,正常で拒絶のない患者iPS細胞を樹立することを目的とする。正常WRN遺伝子を含むターゲティングベクターをWRN遺伝子標的TALEヌクレアーゼとともに患者iPS細胞に導入し、ターゲティングベクターが変異WRN遺伝子の標的部位と置き換わったクローンを選択し、さらにシーケンシングによりMut-4が正常に修正されているクローンを同定した。今後はQOL低下の原因である皮膚潰瘍の治療への応用に向け、遺伝子修正iPS細胞の性状解析を進める。ウェルナー症候群(WS)は,テロメア機能不全による体細胞の早期老化が全身性に加齢を促進して,皮膚萎縮,糖尿病,動脈硬化、がんなどを早期に発症する早老症であり,根本的な治療法はなく,下肢切断などによるQOLの低下が著しい難治疾患である。本研究は,患者iPS細胞の変異遺伝子を人工ヌクレアーゼにより修正し,正常で拒絶のない患者iPS細胞を樹立し,修正されたiPS細胞の安全性と性状,主な病変部として分化誘導した表皮,脾臓β細胞,血管内皮細胞の病態改善の検証を進め,安全で効果の期待できるウェルナー症候群のためのテーラーメイド細胞移植治療の開発を行う。25年度ウェルナー症候群原因遺伝子WRNを標的とした人工ヌクレアーゼの構築を行った。日本人のウェルナー症候群患者で高頻度に認められるWRN遺伝子変異Mut-4 (c.3139-1G>C)はエクソン26の上流側に近接する塩基GがCに置換したイントロンの変異である。Mut-4を含むエクソン2527をカバーする正常WRN遺伝子の領域を組み込んだターゲティングベクターを用いて、Mut-4を相同組換えにより修復するために、エクソン26とエクソン27の間のイントロンの塩基配列を認識するWRN遺伝子標的TALEヌクレアーゼ(WRN_TALEN)2セットを構築した。Single strand annealing assayにより、高い標的切断活性を有するWRN_TALENを同定した。本研究ではWS患者由来iPS細胞及びWRN遺伝子変異が修復されたiPS細胞からそれぞれ分化誘導した細胞を用いて、WRN遺伝子変異が修復されたiPS細胞では早期老化の表現形が抑制されていることを証明することを目的とする。そこでWS患者由来iPS細胞を用いた胚葉体を経由した自発的な分化誘導の条件検討を行った。ウェルナー症候群(WS)は,テロメア機能不全による体細胞の早期老化が全身性に加齢を促進して,皮膚潰瘍,糖尿病,動脈硬化、がんなどを早期に発症する早老症である。本年度はまず、患者iPS細胞が有するWRN遺伝子変異Mut-4 (c.3139-1G>C)の領域を含むエクソン2527をカバーする正常WRN遺伝子を、健常者ゲノムDNAを鋳型として増幅し、この領域を組み込んだターゲティングベクターを構築した。そして、前年度に構築したWRN遺伝子標的TALEヌクレアーゼとともにiPS細胞に導入し、ターゲティングベクターのイントロン部分に組み込まれたpuromycin耐性遺伝子をマーカーとして、puromycin耐性のiPS細胞クローンを選択培養により多数樹立した。ターゲティングベクターでカバーされたWRN遺伝子領域のより上流及びより下流のプライマーと、puromycin耐性遺伝子にデザインされたプライマーを組み合わせて、PCRによりターゲティングベクターがiPS細胞の染色体におけるWRN遺伝子標的部位と置き換わっているクローンを選択し、さらにシーケンシングによりMut-4が正常に修正されているクローンを同定した。今後の検討課題として、WSのQOL低下の原因の一つである皮膚潰瘍を対象とした、間葉系幹細胞を用いた治療を想定し、患者iPS細胞及び変異が修正されたiPS細胞から誘導した間葉系幹細胞の性状を比較して、変異が修復されたiPS細胞由来間葉系幹細胞では早期老化の表現形が抑制されていることを証明するとともに、皮膚潰瘍モデルマウスへの移植実験を通じて、間葉系幹細胞を用いた皮膚潰瘍治療のPOCを確立したい。細胞生物学25年度の当初の計画ではでWRNの変異が正常WRN遺伝子に置換した正常化iPS細胞を作製・樹立することになっていたが,実際にはWRN遺伝子のゲノム編集に用いる人工ヌクレアーゼのデザイン・構築と評価、そしてWRN遺伝子のMut-4変異を修正するターゲティングベクターの構築を行っている。一方、26年度に行う予定のiPS細胞の分化誘導条件の一部を、胚様体形成を経由した自発的分化誘導系を用いて検討した。したがって、概ね順調に進展しているという評価とした。エクソン26とエクソン27の間のイントロンの塩基配列を認識するWRN

遺伝子標的TALEヌクレアーゼとMut-4を含むエクソン2527をカバーする正常WRN遺伝子の領域を組み込んだターゲティングベクターを用いて、Mut-4変異が修正されたWS患者由来iPS細胞を作製する。そしてWS患者由来iPS細胞及びWRN遺伝子変異が修復されたiPS細胞を分化させて、Mut-4変異が修正された分化誘導細胞において早期老化・ゲノム不安定性の表現型が抑制されていることを明らかにする。研究計画の遂行に使う試薬や消耗品に充てるには、この残高は非常に少額なので次年度に繰り越すこととした。次年度の交付額と合わせて、研究計画の遂行に必要な試薬・消耗品に適切に使用する予定である。
実数構造上の組み合わせから定まる基数不変量

研究実績は以下のとおり.今年度は、纏まった結果を得ることができなかった。部分的に得られた結果を以下に述べる。神戸大学のJ.Brendle教授は、「一定区間で常にpredictする」の相対概念である「どんな間隔でもある部分で続けてevadeされる」から定まる碁数不変量達e_k(n)(ただし、K<ω,n<ω)を導入し、チホンの図式の基数不変量との関係に関して、様々な結果を得ている。そこでの未解決問題として、e_2(n),e_2,cov(M),dの関係を挙げている。J.Brendle教授には、「一定区間で常にpredictされる」から定まる基数不変量に関して、私の提出した問題を解かれた借りがあり、この借りを返したいと思い、彼の提出した未解決問題を中心に研究を進めた。その結果、e_2(n)<d, for all n<ωを得た。この時点で、d<e_2が可能である(矛盾しない)と予想して、それの成立するgeneric modelの捜索を始めた。まず、d=ω_1の成立する既存のgeneric modelでe_2の値がどうなっているか調べてみたが、どのmodelにおいてもe_2の値はdの値と同じくω_1であった。そこで、方針を変更して、d<e_2を満たすgeneric modelを新たに構成しようとしているが、現在のところうまくいっていない。「分割の性質を持たない正規ウルトラフィルターの存在」に関しては、前年度までにそこからweakly compact基数の存在が得られることが分かっていたが、これに関する目標は、相互無矛盾な巨大基数を見つけることである。(K.Kunenの結果からそれがineffable基数より小さいことは知られているが、weakly compactはineffableに比べるとかなり弱い(小さい)巨大基数である。)今年度判ったことは、weakly compact基数が無限個あることだけであり、大きな前進は得られなかった。ルベーグ測度が0である実数の部分集合(measure zero set)全体のなすイデアルを${\cal N}$で、第1類の部分集合(meager set)全体のなすイデアルを${\cal M}$で表す。$2\leq K\leq\omeg$に対して、$K$-Predictorにより無限回(一定間隔で)predictされる部分集合から生成されるイデアルを、${\cal X}^\infty_K$(${\cal X}_K$)で表す。実数の構造を反映する指標のひとつにこれらのイデアルの基数不変量がある。${\cal N}$と${\cal M}$から定まる基数不変量については、既に多くの研究者によりよく調べられ、いわゆるチホンの図式として表されている。また、T.Bartoszynskiの結果から容易にわかることであるが、${\bf cov}({\cal X}^\infty_\omega)${\bf non}({\cal M})$は一致する。${\bf cov}({\cal X}_K)$に関して科研費申請時に残っていた疑問は次の2点であった。残念ながら、(Q.1),(Q.2)のどちらも述べられる結果の前進を得ることはできなかった。全く異なる対象であるが、${\cal P}_\kappa\lambda$上の正規ウルトラフィルターの性質を考えるとき、実数上の基数不変量を扱う場合の組み合わせ論的な議論と技法が有効である場合がある。(Q.1)と(Q.2)を解析していたときに得た技法を用いて、${\cal P}_\kappa\lambda$上のイデアルの分割性に関して次の3つの結果を得た。(2)$\kapp$が$\lambda$-supercompactなら${\cal P}_\kappa\lambda$上に分割の性質を持つ正規ウルトラフィルターがある。(3)${\cal P}_\kappa\lambda$上に分割の性質を持たない正規ウルトラフィルター$U$があれば、$U$による超積において$\kappa$より大きいweakly compact基数がある。これらの結果は、研究発表欄の2番目と3番目の論文で示される。

そこで、方針を変更して、d<e_2を満たすgeneric modelを新たに構成しようとしているが、現在のところうまくいっていない。「分割の性質を持たない正規ウルトラフィルターの存在」に関しては、前年度までにそこからweakly compact基数の存在が得られることが分かっていたが、これに関する目標は、相互無矛盾な巨大基数を見つけることである。(K.Kunenの結果からそれがineffable基数より小さいことは知られているが、weakly compactはineffableに比べるとかなり弱い(小さい)巨大基数である。)今年度判ったことは、weakly compact基数が無限個あることだけであり、大きな前進は得られなかった。
家族性高HDL血症の病因解析

HDL-C>120mg/dlの著しい高HDL血症を呈しながらcommonな既知cholesterylester transfer protein(CETP)遺伝子変異が証明されない症例(n=5)について,稀な遺伝子型であるInt14T,Q309X,G181Xの検索とCETP活性測定を行った.いずれの症例もコントロールより低いCETP活性を認めたが,既知の変異型は検出されなかった.このことから,未知CETP変異の可能性が示唆されたので,CETP遺伝子の全エクソンとエクソン/イントロン境界部についてPCR産物の直接DNAシークエンシングを行ったが,検索いえた範囲ではどの患者のDNA配列にも異常を見いだせなかった.この結果の意味するところは,大きな欠失または挿入により異常DNA鎖がPCR増幅されなかったか,CETP遺伝子の上流の調節域に異常がある可能性が考えられる.この問題を明らかにするために,現在我々は,上記患者のゲノムに対してCETP遺伝子cDNAをプローブとするサザンブロッティング,更には,上流および下流のDNAシークエンスを行っている.リンパ球のHDL-binding protein活性測定のために,蛍光色素FITCを用いて正常HDLを標識し培養リンパ球と混和後,フローサイトメトリーに供した.正常者リンパ球で平均約20%が蛍光陽性となる条件で既知のCETP遺伝子変異を有しない高HDL血症患者(n=5)からのリンパ球について検討を行ったところ,患者リンパ球の陽性率は正常コントロールと有意な差を認めなかった.今後も更にスクリーニングを継続する予定である.HDL-C>120mg/dlの著しい高HDL血症を呈しながらcommonな既知cholesterylester transfer protein(CETP)遺伝子変異が証明されない症例(n=5)について,稀な遺伝子型であるInt14T,Q309X,G181Xの検索とCETP活性測定を行った.いずれの症例もコントロールより低いCETP活性を認めたが,既知の変異型は検出されなかった.このことから,未知CETP変異の可能性が示唆されたので,CETP遺伝子の全エクソンとエクソン/イントロン境界部についてPCR産物の直接DNAシークエンシングを行ったが,検索いえた範囲ではどの患者のDNA配列にも異常を見いだせなかった.この結果の意味するところは,大きな欠失または挿入により異常DNA鎖がPCR増幅されなかったか,CETP遺伝子の上流の調節域に異常がある可能性が考えられる.この問題を明らかにするために,現在我々は,上記患者のゲノムに対してCETP遺伝子cDNAをプローブとするサザンブロッティング,更には,上流および下流のDNAシークエンスを行っている.リンパ球のHDL-binding protein活性測定のために,蛍光色素FITCを用いて正常HDLを標識し培養リンパ球と混和後,フローサイトメトリーに供した.正常者リンパ球で平均約20%が蛍光陽性となる条件で既知のCETP遺伝子変異を有しない高HDL血症患者(n=5)からのリンパ球について検討を行ったところ,患者リンパ球の陽性率は正常コントロールと有意な差を認めなかった.今後も更にスクリーニングを継続する予定である.平成8年度は高HDLコレステロール血症の未知の病因を解析するための実験系の確立を主な目標に研究を進めてきた。中でも,MDEゲルを用いてのヘテロデュープレックス解析により未知変異のヘテロ接合体を検出するシステムを確立することが重要目標であったが,CETP遺伝子に関してはこのシステムは確立でき,実際の高HDLコレステロール血症患者に適用中である。また,CETP遺伝子の全エクソンのDNAシークエンス解析システムも順調に稼働しはじめた。まだ,新奇な変異型を発見するに至ってはいないが,それを発見できる条件は整備されたといえる。平成8年度の間に既知のCETP遺伝子異常例を数多く集積することができ,各遺伝子型におけるHDLサブクラスの定量的および定性的研究をJournal of Lipid Researchに発表することができた。HDL-binding proteinについても実験中であるが,昨年,Science誌に,HDL-binding proteinよりもHDL受容体候補として疑わしいスカベンジャー受容体(SR-BI)が報告されたことに配慮し,研究の力点をHDL-binding proteinからSR-BIに移す方向で実験を進めている。フローサイトメーターを用いてのHDL受容体欠損のスクリーニングは,HDLの蛍光標識は完了し,リンパ球の培養条件が決定された段階に達しており,今後は実際に高HDL血症患者に適用する。phospholipid tranfer proteinに関してはまだ成果が上がっていないが,今後研究を進める予定である。HDL-C>120mg/dlの著しい高HDL血症を呈しながらcommonな既知cholesterylester transfer protein(CETP)遺伝子変異が証明されない症例(n=5)について,稀な遺伝子型であるIntl4T,Q309X,G181Xの検索とCETP活性測定をおこなった.いずれの症例もコントロールより低いCETP活性を認めたが,既知の変異型は検出されなかった.このことから,未知CETP変異の可能性が示唆されたので,CETP遺伝子の全エクソンとエクソン/イントロン境界部についてPCR産物の直接DNAシークエンシングを行ったが,検索しえた範囲ではどの患者のDNA配列にも異常を見いだせなかった.この結果の意味するところは,大きな欠失または挿入により異常DNA鎖がPCR増幅されなかったか,CETP遺伝子の上流ないし下流の調節域に異常がある可能性が考えられる.この問題を明らかにするために,現在我々は,上記患者のゲノムに対してCETP遺伝子cDNAをプローブとするサザンブロッティング,更には,上流および下流のDNAシークエンスを行っており,近日中にその結果が得られると考えている.

リンパ球のHDL-binding protein活性測定のために,蛍光色素FITCを用いて正常HDLを標識し培養リンパ球と混和後,フローサイトメトリーに供した.正常者リンパ球で平均約20%が蛍光陽性となる条件で既知のCETP遺伝子変異を有しない高HDL血症患者(n=5)からのリンパ球について検討を行ったところ,患者リンパ球の陽性率は正常コントロールと有意な差を認めなかった.今後も更にスクリーニングを継続する予定である.
治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進

研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』の基盤として取り組んだ研究より,がん患者のセルフケアは『情報の探索と活用により意思決定を行いながら,状況に応じた対処と保健行動の実行から構成される』と定義づけられた。また,治療期にあるがん患者のセルフケア能力には,1.体調の変化をとらえる能力,2.自主的に判断し保健行動を形成する能力,3.がんの存在にとらわれないよう思考を和らげ進む能力,4.人とのつながりを保ち社会生活を調整する能力,5.生き方を見つめ自己の発達を促す能力が含まれた。これらの能力を全体的に考慮し客観的に測定できるがん患者用のセルフケア能力尺度として「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度:Self-careAgency scale for Cancer patientsunder treatment(SAC)」を開発し英論文にて発表した。尺度の因子は【生きる姿勢を整える能力】はCronbach'α=0.883,【人とのつながりをもち活力を得る能力】は0.831,【体調管理に取り組む能力】0.795であった。さらに,GFI= 0.911, AdjustedGFI = 0.878, Cronbach'sα=0.900.を示し信頼性と妥当性を備えた尺度として証明された。治療中のがん患者のセルフケア能力支援プログラム案は,がん患者のセルフケア能力の状態をSACにより情報として得た上で,心理的支援やソーシャルサポートも考慮し,支援内容を組み合わせ看護を行うプランを立案している。そして,介入研究で支援プログラム案の効果を評価していく予定である。研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』に向け、「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度:Self-care Agency scale for Cancer patients under treatment(SAC)」を開発し、英論文で公表してきた。そしてその尺度を活用しながらセルフケア能力が向上するよう支援プログラム案を開発中であることから、今後も順調に進めていくことが可能である。セルフケア支援プログラム案は、心理的支援やソーシャルサポートも考慮し支援内容を組み合わせ検討している段階である。プログラム案では、がん患者のセルフケア能力の状態を捉えることができるよう、「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度:Self-care Agency scale for Cancer patients under treatment(SAC)」により情報として得た上で,看護支援を行うプランを立案している。そして、介入研究を実施し支援プログラム案の効果を評価していくことができるよう、介入研究の計画書を提出段階にあり、承認を得て実施予定である。平成28年度に、治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度を開発した。尺度は3因子15項目から構成された。構成概念妥当性は、Cronbachのα係数は.900、確証的因子分析からはGFI=0.911、AGFI=0.878、CFI=0.945の値が示された。また、基準関連妥当性の結果からも妥当性を備えた尺度として証明された。研究成果は国際学会で発表し、論文を投稿した。平成28年度に「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度」を開発し、信頼性と妥当性を備えた尺度として証明され学会誌に発表できた。現在は開発した尺度の実用化と、がん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発について検討している段階であり、段階を経て研究を進めていく予定である。研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』の基盤として取り組んだ研究より,がん患者のセルフケアは『情報の探索と活用により意思決定を行いながら,状況に応じた対処と保健行動の実行から構成される』と定義づけられた(吉田・神田,2010)。また,治療期にあるがん患者のセルフケア能力には,1.体調の変化をとらえる能力,2.自主的に判断し保健行動を形成する能力,3.がんの存在にとらわれないよう思考を和らげ進む能力,4.人とのつながりを保ち社会生活を調整する能力,5.生き方を見つめ自己の発達を促す能力が含まれた(吉田・神田,2012)。これらの能力を全体的に考慮し客観的に測定できるがん患者用のセルフケア能力尺度として「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度」Self-care Agency scale for Cancer patientsunder treatment(SAC)を開発し英論文にて発表した。この尺度を活用しセルフケア能力の向上に向けた支援プログラムの作成に向け,オレム看護論も活用し心理的支援やソーシャルサポートをプログラムの柱とし支援内容を組み合わせプログラム案を開発している段階である。支援プログラム案は第1 3段階の構成で患者のセルフケア能力の状態をSACにより情報として得た上で,看護の産生として個別支援を行うプランを立案している。支援プログラム案を具体的に計画し実施後に評価を行う予定である。支援プログラム案の大枠が組み立てられており、今後具体的な支援方法を検討する必要がある。そのことについて、具体的な意見を求め、協力者を得られる状況にあることなどから、予定通り進めていくことが可能と捉えている。

研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』の基盤として取り組んだ研究より,がん患者のセルフケアは『情報の探索と活用により意思決定を行いながら,状況に応じた対処と保健行動の実行から構成される』と定義づけられた。また,治療期にあるがん患者のセルフケア能力には,1.体調の変化をとらえる能力,2.自主的に判断し保健行動を形成する能力,3.がんの存在にとらわれないよう思考を和らげ進む能力,4.人とのつながりを保ち社会生活を調整する能力,5.生き方を見つめ自己の発達を促す能力が含まれた。これらの能力を全体的に考慮し客観的に測定できるがん患者用のセルフケア能力尺度として「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度:Self-careAgency scale for Cancer patientsunder treatment(SAC)」を開発し英論文にて発表した。尺度の因子は【生きる姿勢を整える能力】はCronbach'α=0.883,【人とのつながりをもち活力を得る能力】は0.831,【体調管理に取り組む能力】0.795であった。さらに,GFI= 0.911, AdjustedGFI = 0.878, Cronbach'sα=0.900.を示し信頼性と妥当性を備えた尺度として証明された。治療中のがん患者のセルフケア能力支援プログラム案は,がん患者のセルフケア能力の状態をSACにより情報として得た上で,心理的支援やソーシャルサポートも考慮し,支援内容を組み合わせ看護を行うプランを立案している。そして,介入研究で支援プログラム案の効果を評価していく予定である。研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』に向け、「治療期にあるがん患者のセルフケア能力尺度:Self-care Agency scale for Cancer patients under treatment(SAC)」を開発し、英論文で公表してきた。そしてその尺度を活用しながらセルフケア能力が向上するよう支援プログラム案を開発中であることから、今後も順調に進めていくことが可能である。今後の研究を推進するために、研究分担者と開発した「がん患者のセルフケア能力尺度」の実用化に向け検討を重ね、研究施設の選定や協力者との打合せを進めていく予定である。そして、患者へのプレテストを経て、本調査では対象者の背景を考慮した尺度の使用結果をまとめることができるよう計画書に沿って取り組んでいくことが方策である。特に対象者の限定は援助の優先性を考慮し、治療別の患者を対象とすることなども検討していく。研究テーマ『治療中のがん患者のセルフケア能力向上支援プログラムの開発と活用の促進』の今後の研究の推進方策として、1.支援プログラム案について、これまで開発したセルフケア能力尺度を活用しながら支援できるよう、オレム看護論と心理学、ソーシャルサポートを柱に具体的支援を構築すること、2.構築した支援プログラム案を対象者へ実施し結果を分析すること、3.分析した結果をまとめ公表していくことが含まれる。
抗リン脂質抗体症候群モデル動物を用いた血栓発症機構の解析

本研究では、抗リン脂質抗体症候群(以下APS)のモデル動物を用いてリン脂質に対するモノクローナル抗体を作製しそのエピトープを同定する。さらに、血小板や内皮細胞におけるphospholipid(PL)の細胞膜表面への発現機序を明らかにすることで、APSにおける血栓形成機構のメカニズムの一旦を明らかにし、新しい治療法の可能性を検討する事を目的としてる。抗リン脂質抗体のエピトープの決定:我々は今回の計画でW/BF1マウスより6種類のモノクローナルな抗リン脂質抗体(aPL)を作製することに成功した。そのうち数種類がβ2GPIに対する抗体であることが明らかとなった。興味あることにこれらの抗体のうち2種類は酸化LDLとも交差反応することを証明した。さらに、これら抗体のβ2GPI上のエピトープを決定するために、5つのドメインをもつβ2GPIの各ドメイン部分を個別に欠失させた変異蛋白を作製し抗体との結合を検討した。6種類の抗体を何れもこれら変異蛋白とは結合しなかった。このことからaPLの対応抗原はリニア構造ではなく5つのドメイン部分からなる立体構造により構成されていると考えられた。細胞膜表面へのPS発現機構に関する検討:aPLの血栓形成にはβ2GPIやannexin Vなどのphospholipid-binding protein(PBP)が膜上のPL、特にカルジオリピン(CL)やphosphatidylserine(PS)と結合することが重要であるが、これらは通常膜の内側に存在しており、アポトーシス時にしか外側へ露出してこない。我々は各種アゴニスト刺激により膜表面上(血小板、内皮細胞)にCLやPSがどのように発現されるのか(膜のflip-flop)、APS患者と正常との間で検討した。その結果、APS患者血小板において膜上へのPL誘導がわずかに亢進しておりaPLの血栓形成機序(Fcレセプターを介した血小板の活性化など)を考える上で重要と考えられた。本研究では、抗リン脂質抗体症候群(以下APS)のモデル動物よりリン脂質に対するモノクローナル抗体を作製しそのエピトープを同定すると共に、血小板や内皮細胞におけるphospholipid(PL)の細胞膜表面への発現機序を明らかにすることで、APSにおける血栓形成機構のメカニズムの一旦を明らかにし、新しい治療法の可能性を検討する事を目的としている。1)抗リン脂質抗体のエピトープの決定:我々は今回の計画でW/BF1マウスより6種類のモノクロナールな抗リン脂質抗体(aPL)を作製した。さらに興味あることにこれらの抗体の内2種類は酸化LDLとも交差反応することが判明した。今後、これら抗体のβ2GPI上のエピトープを決定するために、まず5つのドメインをもつβ2GPIの各部分の欠損させた変異蛋白を作製する予定である。2)細胞膜表面へのPS発現機構に関する検討aPLの血栓形成にはβ2GPIやannexinVなどのphospholipid-binding protein(PBP)が膜上のPL、特にカルジオリピンやphosphatidlserine(PS)と結合することが重要であるが、これらは通常膜の内側に存在しており、アポトーシス時にしか外側へ露出してこない。現在、各種刺激により膜表面上(血小板、内皮細胞)にカルジオリピンやPSがどのように発現されるか、APS患者と正常との間に差がないかどうかを検討中である。

さらに、血小板や内皮細胞におけるphospholipid(PL)の細胞膜表面への発現機序を明らかにすることで、APSにおける血栓形成機構のメカニズムの一旦を明らかにし、新しい治療法の可能性を検討する事を目的としている。抗リン脂質抗体のエピトープの決定:今回、APSモデルマウスより作製したβ2GPIを認識するモノクローナル抗体のエピトープを決定するために、5つのドメインをもつβ2GPIの各ドメイン部分を個別に欠失させた変異蛋白を作製し抗体との結合を検討した。その結果、何れの抗体もこれら変異蛋白とは結合しないことが判明した。このことからaPLの対応抗原は5つのドメイン部分からなる立体構造により構成されていると考えられた。細胞膜表面へのPS発現機構に関する検討:aPLの血栓形成にはphospholipid-binding protein(β2GPI、annexin Vなど)が膜表面上のPL[カルジオリピン(CL)、phosphatigylserine(PS)など]に結合することが重要であるが、これらは通常膜の内側に存在しており、アポトーシス時にしか外側へ露出してこない。我々は各種アゴニスト刺激により血小板膜表面上にCLやPSがどのように発現されるか(膜のflip-flop)、APS患者と正常との間で検討した。その結果、APS患者血小板において膜上へのPL誘導がわずかに亢進しておりaPLの血栓形成機序(Fcレセプターを介した血小板の活性化など)を考える上で重要と考えられた。
星周高温低圧条件での金属鉄均質核形成実験

ダストは恒星の誕生から死,惑星系形成,銀河化学進化と様々な局面で重要な役割を果たす.星周環境でのダスト形成解明には,形成過程の速度論的理解が不可欠である.制御された星周条件での鉱物成長実験の手法を応用し,星周温度・圧力条件を制御・再現した金属鉄均質核形成実験をおこない,星周条件での金属鉄均質核形成速度および臨界過飽和比を得ることを目的とし,高温真空加熱装置の設計,開発をおこなった.作成した装置は到達真空度10-4Pa,最高到達温度1500°Cと設計通りの性能を示し,星周環境での金属鉄凝縮実験をおこなうことが可能となった.ダストは恒星の誕生から死,惑星系形成,銀河化学進化と様々な局面で重要な役割を果たす.星周環境でのダスト形成解明には,形成過程の速度論的理解が不可欠である.制御された星周条件での鉱物成長実験の手法を応用し,星周温度・圧力条件を制御・再現した金属鉄均質核形成実験をおこない,星周条件での金属鉄均質核形成速度および臨界過飽和比を得ることを目的とし,高温真空加熱装置の設計,開発をおこなった.作成した装置は到達真空度10-4Pa,最高到達温度1500°Cと設計通りの性能を示し,星周環境での金属鉄凝縮実験をおこなうことが可能となった.ダストは恒星の誕生から死,惑星系形成,銀河化学進化と様々な局面で重要な役割を果たす.星周環境でのダスト形成解明には,形成過程の速度論的理解が不可欠である.ダスト候補物質の均質核形成実験はおこなわれてきたが,実験上の問題で星周環境に直接応用するのが難しい.本研究では,申請者がおこなってきた制御された星周条件での鉱物成長実験の手法を応用し,星周温度・圧力条件を制御・再現した金属鉄均質核形成実験をおこない,星周条件での金属鉄均質核形成速度および臨界過飽和比を得る.得られた核形成パラメータを用いて,晩期型星周,原始惑星系円盤条件での金属鉄ダスト形成挙動(形成温度圧力条件,均質核形成による単一ダスト形成/前駆ダスト(酸化物・ケイ酸塩)上での不均質核形成による複合ダスト形成など)を明らかにする.今年度は制御された温度・圧力・過飽和条件で金属鉄均質核形成実験をおこなうシステムの作成を目標に,新型真空炉の設計・開発をおこなった.当初は作成までおこなう予定であったが,設計に時間がかかり,来年度早々に作成を開始することとした.ダストは恒星の誕生から死,惑星系形成,銀河化学進化と様々な局面で重要な役割を果たす.星周環境でのダスト形成解明には,形成過程の速度論的理解が不可欠である.ダスト候補物質の均質核形成実験はおこなわれてきたが,実験上の問題で星周環境に直接応用するのが難しい.本研究では,申請者がおこなってきた制御された星周条件での鉱物成長実験の手法を応用し,星周温度・圧力条件を制御・再現した金属鉄均質核形成実験をおこない,星周条件での金属鉄均質核形成速度および臨界過飽和比を得る.得られた核形成パラメータを用いて,晩期型星周,原始惑星系円盤条件での金属鉄ダスト形成挙動(形成温度圧力条件,均質核形成による単一ダスト形成/前駆ダスト(酸化物・ケイ酸塩)上での不均質核形成による複合ダスト形成などを明らかにする.今年度は新型真空加熱炉の開発,ならびに作成をおこなった.新型炉ではグラファイトホルダーに複数本のアルミナ管を設置し,管底部に入れた金属鉄線を一定温度で加熱することが可能とする.蒸発によって発生した定温の鉄蒸気を,アルミナ管を通して放出させることで集束し(Tachibana et al., 2011),一箇所に集中させ,局所的に過飽和条件(過飽和比5-30)をつくり,気相からの均質核形成を誘発させるシステムの構築に成功した.また,形成した金属鉄の観察・分析をおこなうための集束イオンビーム加工手法の開発もおこなった.惑星物質科学新型真空炉の設計に時間がかかり,作成まで至らなかった.装置の設計は済んでおり,次年度早々に作成にとりかかることになっている.装置設計に時間がかかり,今年度作成ができなかった.設計は終わっており,次年度早々に作成に入る予定である.
感染防御因子としての抗菌性,エンドトキシン中和蛋白による感染症治療への新戦略

本研究では,ヒト好中球から得られたCAP18(抗菌活性およびLPS中和活性をもつ18kDa)の蛋白の構造と機能との関係を中心に解析してきたが,助成金が交付された期間に得られた成果を以下に概略する。1.CAP18の活性ドメインはC末端の27残基からなるペプチドであったが,活性維持のためにはNおよびC末端を化学修飾する必要があった。2.27残基ペプチドでは疎水性アミノ酸の導入により抗菌活性およびLPS中和活性が有意に高まった。3.18残基のペプチドにおいても,疎水基および親水基(塩基性残基)の導入で活性が高まった。4.ペプチドのα-ヘリックス構造が活性発現に重要であり,さらに,親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の配列やそれらのバランスが活性を支配していた。5.緑膿菌感染マウスにおけるエンドトキシンショックが27残基ペプチドで有意にブロックされた。6.E.coli O157感染マウスに対しても27残基置換体は防御能を示した。7.置換するアミノ酸の数および種類によって,グラム陰性菌およびグラム陽性菌に対する抗菌活性に違いがみられた。スペクトルが異なるペプチドの合成が可能と思われる。8.細菌の膜障害(グラム陰性菌では外膜および内膜)を介して抗菌活性が発現される。9.LPSによる細胞の活性化の最初の段階,すなわち,LPSとLBP(LPS結合蛋白)との結合をCAP18ペプチドが阻害する。10.CAP18ペプチドは,MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)に対しても抗菌活性を示した。セラチア菌に対する抗菌活性は弱かったが,ポリミキシン耐性菌に対しても同じ程度の活性を示した。CAP18の生体防御因子としての意義がさらに高まり,また,エンドトキシンショックや難治性感染症の治療薬としての応用の可能性がさらに高まった。CAP18は抗菌活性およびLPS中和活性をもつ18kDaの塩基性蛋白で140個のアミノ酸残基からなるが,そのC末端側の27残基(27mer)が活性ドメインである。初年度は,生体内での安定性を高めたり,より活性の高いペプチドを探索することを目的として,アミノ酸修飾体や置換体について種々の活性を比較検討し以下の成績を得た。アミノ酸修飾体の活性(1)27mer(F12-V38),22mer(El7-V38)のN末端およびC末端をそれぞれアセチル化,アミド化したペプチド(修飾体)のLPS結合活性は両端がフリーのものと同程度であった。(2)LPS投与による致死活性は修飾体で有意にブロックされたがフリーのものでは抑制されなかった。(3)E.coll O157に対する抗菌活性も修飾体で高かった。アミノ酸置換体の活性(4)27mer,22merのE22とK31を疎水性アミノ酸のロイシシ(L)で置換するとLPS結合活性は1530倍高まった。(5)LPS投与によるショック死も置換体の投与で有意に防御された。(6)O157に対する抗菌活性は置換体で10倍以上も高まった。(7)Lを他の疎水性アミノ酸であるフェニルアラニンで置換した場合も高い活性を示した。(8)1ケ所(E22)のみLで置換した場合,LPS結合活性および抗菌活性は2ケ所置換体とほぼ同じであったが,LPS中和能は低かった。以上のことから、CAP18ペプチドの活性発現にはα-へリックス構造,親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の配列およびそれらのバランスが重要であることが認められた。

また,アミノ酸修飾やアミノ酸置換ですべての活性が高まることから,これらのペプチドは生体内での安定性がより優れていることが示され,エンドトキシンショックなどの治療薬としての臨床応用が期待される。ヒト好中球由来の抗菌活性およびLPS中和活性を示す18kDaの蛋白(CAP18)について,C末端の18アミノ酸残基のぺプチド(18mer)を中心に,構造と活性について検討し以下の成績を得た。1.18merのLPS結合活性は27merに比べて1/4に低下した。グラム陰性菌に対して抗菌活性を示したがMRSAなどのグラム陽性菌に対する活性は弱かった。また,18merはLPSによるショック死を防御できなかった。2.18merの2ケ所のアミノ酸をロイシンで置換すると(18LL),LPS結合活性は40倍程度高まった。グラム陰性菌に対する抗菌活性は非置換体とほぼ同じであったが,MRSAに対する活性が34倍高まった。18LLにはLPS中和能はみられなかった。3.18LLの3ケ所をリジンで置換すると(18LLKKK),LPS結合活性は18merの120倍程度に高まり,グラム陰性菌に対する抗菌活性も高まった。さらに,エンドトキシンショックを劇的に防御した。グラム陽性菌に対する活性は逆に1/2程度に低下した。以上の結果から,疎水性アミノ酸への置換や塩基性アミノ酸の導入によりLPS結合活性,LSP中和活性およびグラム陰性菌に対する抗菌活性が高まることが示された。ペプチドの活性発現に両親媒性のα-ヘリックス構造が重要であること,また,アミノ酸置換によりプロテアーゼなどの酵素に対する抵抗性が高まり活性の上昇につながることが予想された。種々の動物の体液,細胞に含まれるリゾチーム,デイフェンシンファミリー,CAP18などは感染に対する非特異的防御機構(Innate immunity)に重要な役割を演じている。CAP18は我々がウサギおよびヒト好中球から発見した18kDaの抗菌蛋白であり,かつ,エンドトキシン(LPS)中和活性をもつユニークな物質である。最終年度の研究成果を以下に記載する。1.CAP18由来の2737残基ペプチドはE.coliO157,サルモネラ,緑膿菌などのグラム陰性菌およびMRSAなどのグラム陽性菌に対しても幅広い殺菌活性を示した。デイフェンシンの殺菌活性は150mM-NaCl存在下で消失するが,CAP18はNaCl抵抗性を示し,かつ,同条件下でデイフェンシンとCAP18に相乗作用がみられた。細胞外での殺菌に両者が協同で作用していることが示唆された。大腸菌を用いた実験で,ペプチドは外膜および内膜を障害することが認められた。2.院内感染で問題となでいるセラチア菌に対する殺菌作用は一般の腸内細菌に対するものより弱かったが,ポリミキシン耐性菌に対しても同程度の殺菌作用を示した。3.CAP18はin vitroおよびin vivoにおいてさまざまの種類のLPSを中和した。LPS投与によるショック死を防御し,また,緑膿菌感染マウスにおいて抗生剤で誘発されたエンドトキシンショックをも防御した。4.アミノ酸の修飾または置換により,安定性と活性が高い数種類のペプチドを得ることに成功した。アミノ酸置換体などの合成ペプチドを用いた実験から,ペプチドのα-へリックス構造がLPSのリピドA部分との結合に関与することが示唆された。
後続バイオ医薬品開発を目指した環状化サイトカインの分子設計と合成

バイオ医薬品として認可済みのサイトカインタンパク質の生体内安定性を向上させたバイオベター型後続バイオ医薬品の開発を目指して、同タンパク質を構成するポリペプチド主鎖の両末端をアミド結合で連結した環状化サイトカインを合成し、その機能と構造に関するin vitro分子特性を評価した。その結果、環状化サイトカインのレセプター結合活性および細胞増殖活性は野生型と同等であり、かつその構造安定性とプロテアーゼ分解耐性は野生型より優れたものであることが明らかになった。これは、当該分子があらたなバイオ医薬品として有望な創薬シーズであることを示すものである。本研究の目的は、バイオ医薬品として認可済みのサイトカインタンパク質の生体内安定性を向上させた後続バイオ医薬品の開発を目指して、同タンパク質を構成するポリペプチド主鎖の両末端を連結した環状化サイトカインを合成し、その機能と構造に関するin vitro分子特性を解析することである。平成23、24年度は、「(1)連結配列設計プログラムの開発」、「(2)スプリットインテイン融合タンパク質発現ベクターの構築」、「(3)野生型サイトカインの合成と精製」、「(4)環状化サイトカインの合成と精製」、および「(5)環状化サイトカインのレセプター結合活性の測定」を実施した。平成25年度は、以下の3項目を実施した。「(6)環状化サイトカインの熱安定性解析」では、円偏光二色性測定器を用いて試料溶液の温度を一定速度で昇温し、得られた熱変性曲線を解析した。熱変性温度と変性エンタルピーを定量的に評価したところ、サイトカインの立体構造が環状化により安定化していることを明らかにした。「(7)環状化サイトカインの細胞増殖活性の測定」では、細胞増殖活性はNFS-60細胞を用いてアッセイし、ロジスティック回帰により各々の試料のEC50値を算出したところ、環状化サイトカインが活性な状態を維持していることを確認した。「(8)環状化サイトカインのプロテアーゼ分解耐性解析」では、一定量のエキソプロテアーゼと混合したときの試料の残存量を測定して、サイトカインのプロテアーゼ分解耐性が環状化により向上していることを明らかにした。以上のin vitro分子特性解析により、期間全体を通じた研究成果として、環状化サイトカインのレセプター結合活性および細胞増殖活性は野生型と同等であり、かつその構造安定性とプロテアーゼ分解耐性は野生型より優れたものであることが明らかにした。これは、当該分子が後続バイオ医薬品として有望な創薬シーズであることを示すものである。複合新領域
球状定容容器を用いた可燃混合気体の発火と燃焼制御に関する研究

直径200mm、容器内の点火位置可変の球状燃焼容器を試作し、火炎の広がりと壁面干渉による熱損失変化、多点火による火炎形成制御を行って熱発生率比較試験と、熱発生率形状の変化による排ガス特性に及ぼす影響についての熱力学的検討を行った。本研究で試作した球状燃焼容器を用いた試験では、点火位置が中心軸上で任意に6箇所まで設定できることと、別に開発した多点点火が可能な点火時期制御点火装置を併用することによって初期火炎形成過程を種々変化させることができた。また、空気可動ピストンを持つ可変容積型外部混合容器を開発し、可動ピストンにかける空気圧によって球状燃焼容器の各種初期状態を作ることができる。この外部混合器はまた、負圧管路を使用することによって燃焼後の排ガス採取装置としても動作させることができる。今年度は、DMEの予混合定容燃焼試験を実施し、熱発生率の変化によってNOx生成傾向の変化を計測すると同時に燃焼モデルを用いた、拡大ゼルドヴィッチモデルによる生成予測との比較を行い、モデルの妥当性を検証した。予混合燃焼過程では、単位時間に燃焼する領域が次々と形成されていくという多領域の状態変化を考えた燃焼モラルを用い、火炎の形成過程と壁面からの熱損失を考慮しながら予測計算を行って排ガス分析による実測値の予測が可能なことを確かめた。この知見をもとに、燃料噴射のあるディーゼル燃焼過程についても、燃料が次々と燃焼室内に送り込まれ、末燃焼の領域は空気と考える3領域燃焼モデルを適用して、実用DMEディーゼル機関の指圧線区を利用して、実測される圧力経過と各領域の温度経過やそれに基づくNOx生成過程の検討を行い、DMEディーゼルサイクルの燃焼過程予測のための基本的なモデルを構築することができた。16年度研究では、試作燃焼容器を用いた熱発生率比較試験と、熱発生率形状の変化によるエンジン排ガス特性に及ぼす影響についてのサイクルシミュレーターの開発整備を行った。直径200mmの球状燃焼容器と、可変容積型外部混合容器の組み合わせによって各種初期状態を変化できる予混合気燃焼容器を用いた。燃焼容器には、点火位置を6箇所まで設定できるようになっており、位置と点火時期の組み合わせによっていろいろな火炎発生過程を実現できる。点火時期位相の変更は、新たに開発した時間制御高電圧放電回路によって制御し、ある程度、熱発生過程を変更することができた。この装置を用いてDME(ジメチルエーテル)並びにメタンの混合気について火炎伝播過程の異なる二種類の燃焼過程について比較検討した。DMEは炭化水素系燃料に比べ燃焼速度が速く、発火誘導期間も短いので、成層燃焼を行わせる場合の制御性がよいと考えられる。また、希薄燃焼限界についても明らかにした。本装置は、DME等のガス状燃料の燃焼特性を調査することを目的としているので、直ちにディーゼル燃焼などの成層燃焼特性と結びつくものではないが、燃焼の速さ、到達燃焼温度などサイクルシミュレーションの為の情報を得ることができる。熱発生過程の変更によるエンジンサイクル性能予測のため、燃焼した領域が次々と新しい燃焼領域を作り出すという多領域燃焼過程を仮定し、次々と作られる既燃焼領域の状態変化による排ガス特性の変化を求めるサイクルシミュレーターを構築整備した。定容容器による燃焼特性試験とサイクルシミュレーションより、最大熱発生率が前高となる熱発生はサイクル性能をあまり損なうことなく排ガス特性を改善できることが分かり、熱発生過程の制御によるエンジン性能並びに排ガス特性の最適化の方向性が明らかになった。直径200mm、容器内の点火位置可変の球状燃焼容器を試作し、火炎の広がりと壁面干渉による熱損失変化、多重点火による火炎形成制御を行って熱発生率比較試験と、熱発生率形状の変化による排ガス特性に及ぼす影響についての熱力学的検討を行った。

本研究で試作した球状燃焼容器を用いた試験では、点火位置が中心軸上で任意に6箇所まで設定できることと、別に開発した多点点火が可能な点火時期制御点火装置を併用することによって初期火炎形成過程を種々変化させることができた。また、空気可動ピストンを持つ可変容積型外部混合容器を開発し、可動ピストンにかける空気圧によって球状燃焼容器の各種初期状態を作ることができる。この外部混合器はまた、負圧管路を使用することによって燃焼後の排ガス採取装置としても動作させることができる。今年度は、DMEの予混合定容燃焼試験を実施し、熱発生率の変化によってNOx生成傾向の変化を計測すると同時に燃焼モデルを用いた、拡大ゼルドヴィッチモデルによる生成予測との比較を行い、モデルの妥当性を検証した。予混合燃焼過程では、単位時間に燃焼する領域が次々と形成されていくという多領域の状態変化を考えた燃焼モデルを用い、火炎の形成過程と壁面からの熱損失を考慮しながら予測計算を行って排ガス分析による実測値の予測が可能なことを確かめた。この知見をもとに、燃料噴射のあるディーゼル燃焼過程についても、燃料が次々と燃焼室内に送り込まれ、未燃焼の領域は空気と考える3領域燃焼モデルを適用して、実用DMEディーゼル機関の指圧線図を利用して、実測される圧力経過と各領域の温度経過やそれに基づくNOx生成過程の検討を行い、DMEディーゼルサイクルの燃焼過程予測のための基本的なモデルを構築することができた。
単一粒径ナノ粒子の連続調製システムの構築

溶液中のプラズマを利用してナノ粒子を大量製造することを試みた。タングステン線を電極とし、高圧パルス電源を使用して、電極間に放電させ、プラズマを発生させた。電極間隔、印加電圧、電流、パルス間隔は、電極間にアーク放電が生じないようにするために適切に制御する必要があった。また、溶液の導電率をアルカリ金属塩の添加によって制御したが、それにはあまり大きく影響されなかった。このとき発生するラジカル、水素、電子によって金属イオンが還元されることが見出された。プラズマ計測を行ってみたところ、このような還元種が生成していることが見出された。また、金、白金、銀、パラジウム、ロジウムなどの貴金属イオンは還元されやすく、ナノ粒子を得ることができた。遷移金属塩からもナノ粒子が得られたように見受けられるが、十分な検証ができていない。多くの金属塩からナノ粒子を作ることに成功したが、ナノ粒子の安定性をさらに向上させるためには原料液の導電性制御のためのアルカリ金属塩の排除を行う必要があることが分かる。一方、原料塩のみでは還元によって導電性が変化していく問題があり、原料のさらなる検討が今後求められる。粒子径は、金属種にも依存するが、単一粒子径にほぼ近い形のものができ、全て球形のものが得られた。異方形状のものは残念ながら得られず、今後、更なる条件検討が必要である。さらに、連続調製装置を作製し、検討を行った。連続調製には、溶液の冷却が必要なため、投げ込みクーラーを取り付けた。さらに条件設定を密に行うことによって、連続大量製造に道筋をつけていく。成果としては、知的財産権として特許を出願し、学会発表を数回行った。今後は、さらに検討を進め、論文を執筆するほか、ナノ粒子原料についてより安価な原料からの調製を行っていく。本研究は液中プラズマを用いたナノ粒子の連続調製への挑戦である。本年度の研究において、まずは還元が容易であり、現在でも十分に研究・実用ともに利用価値の高い金および銀ナノ粒子、ナノロッドの連続調製を行える環境をつくることを目標とした。まずは、名古屋大学と共同して液中プラズマを行うための基本的な条件設定と、その装置の設計・構築を行った。タングステン電極を利用し、プラズマを発生させ、金属イオンを還元することに成功した。すでに、東京大学・名古屋大学における電子顕微鏡観察の結果から、金、銀についてはナノ粒子を得ており、その高度安定化と形状制御の段階に移っている。形状は金属イオン濃度などによって変化することが見出されている。また、他の金属種についてもナノ粒子が得られることが明らかとなっている。保護剤として、現在はポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンなどの水溶性高分子を利用し、ナノ粒子の安定化にも成功しているが、さらに金属塩濃度、高分子濃度を適切化して安定なナノ粒子分散液を連続して得られるように検討中である。また、装置は循環でもフローでも行える電極装置を作った。電源は、高度に制御しようとすると比較的高価なパルスDC電源が適切であると思われるので、現時点では名古屋大学の電源を借用する一方、安価な電源についても検討を行っている。研究成果の一部については現在、特許出願を各大学のTLOを通じて準備中であり、論文執筆を平行して行っているところである。論文ならびに学会での大きな発表は平成18年度中に行えるようにしたい。