hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内脂質滴の機能に関する細胞生物学的研究

脂質滴および細胞内脂質動態についての検索を行い,以下の成果を得た.1)肝細胞由来株でApolipoprotein B100(ApoB)が脂質滴周囲に貯留する構造(ApoB-crescent)について超微形態学,組織化学の手法で解析した.その結果,ApoB-crescentが脂質滴に扁平なER槽(以下,扁平槽)が融合した構造であること,ApoB,ER可溶性シャペロン,ER膜蛋白質,分泌蛋白質が扁平槽内にあること,扁平槽はグルコース6燐酸活性陽性であること,扁平槽の外側は単位膜構造を示すのに対し,内側(脂質滴側)には膜構造が見られないこと,さらに扁平槽がフィリピンで強染することなどを明らかにした,ApoB-crescentは脂質エステルがER膜の内部に蓄積する構造であり,脂質滴形成の中間段階と推測されてきた「脂質二重層に挟まれた脂質エステル蓄積」が動物細胞内で生じることが初めて明らかになった.2)イノシトール燐脂質(PIs)の一つであるPI3Pが細胞内小胞輸送に果たす役割について解析するため,急速凍結した細胞を白金・カーボン薄膜で物理的に固定する凍結割断レプリカを用い,定量的に解析する方法を創出した.8種類のPIsを等モル%含むリポソーム,プローブ中の1アミノ酸を置換した変異体,PI3キナーゼ欠損細胞などを用いた実験により標識の特異性は確かめられた.酵母細胞の凍結割断レプリカを標識して解析し,PI3Pが液胞膜などに多く,細胞膜,核膜,ミトコンドリア膜などには少ないことが明らかになった.脂質滴は哺乳類の細胞に普遍的に見られる.トリグリセリドやコレステロールエステルなどがコアとなり,コレステロールを含む燐脂質一重層が周囲を覆う構造である.脂質滴表層にはADRP,TIP47の他,我々が昨年度までの研究で同定したRab18などが局在する.1.脂質滴は他のオルガネラと異なる性質を持ち,その構成蛋白質を免疫組織化学的に検出するためには固定,透過性処理などの条件に特別な注意が必要であることを明らかにした.2.肝細胞のリポ蛋白質形成過程では,脂質滴に由来する脂質がApoBに付加され,過剰なApoBは複数の経路で分解される,我々は肝由来のHuh7細胞などで,脂質滴を三日月状に囲むApoB (ApoB-crescent)を発見した.ApoB-crescentはプロテアソームあるいはオートファジーの阻害で顕著に増加した.脂質滴画分にはApoB,プロテアソーム,ポリユビキチン,ポリユビキチン化ApoBが見られ,プロテアソーム阻害で増加した.免疫電顕によりApoB-crescentは脂質滴に近接した脂質性顆粒の集積であることが分かった.これらの結果は,脂質滴表層は分解を受けるApoBが貯留する場であること,貯留したApoBはプロテアソーム系,オートファゴソーム/リソゾーム系の両方によって分解を受けることを示唆した.3.TIP47はADRPと異なり,脂肪酸負荷時などに顕著に脂質滴に集中する.変異体の解析により,TIP47のC末部分で形成される疎水性ポケットが脂肪酸に対する反応に係わることを明らかにした.脂質滴および細胞内脂質動態についての検索を行い,以下の成果を得た.1)脂質滴特異的なPAT蛋白質の一つであるTIP47はADRPなどと類似しているが,正常培養条件下ではほとんど脂質滴に局在せず,大半は細胞質の可溶性蛋白質として存在する.本年度の実験により,細胞に脂肪酸などを負荷することにより,TIP47が急速に脂質滴にリクルートされることが明らかになった.また同一細胞内にはADRPとTIP47の両者を持つ脂質滴が大半を占めるが,ADRPのみあるいはTIP47のみの脂質滴もあり,多様な脂質滴が存在することが判明した.RNAiによりTIP47をノックダウンしてもADRPの発現量はほとんど変化しなかったが,逆にADRPを減少させるとTIP47の発現量が増加して脂質滴にリクルートされる傾向を示し,両者の機能の相補性が示唆された.種々のTIP47変異体を作製して細胞内局在を検索した結果,脂質滴への局在にはTIP47のN末が必須であり,また疎水性ポケットを形成すると予測されているC末部分を変異させると,正常培養条件でも脂質滴への局在が認められるようになった.これらの結果はADRPなどの結果と異なっており,TIP47のユニークさを示唆した.2)蛋白質分解系として注目されているオートファジーについて脂質との関連を検索した.methyl-β-cyclodextrin処理またはlipoprotein欠乏血清とスタチン存在下の培養でコレステロール含量を減少させると,オートファジーが誘導されることを見出した.この誘導効果は3-methyladenineなどのPI3キナーゼ阻害剤で阻害された.この経路は従来知られておらず,脂質ホメオスターシスとオートファジーの連関を示唆した.脂質滴および細胞内脂質動態についての検索を行い,以下の成果を得た.1)肝細胞由来株でApolipoprotein B100(ApoB)が脂質滴周囲に貯留する構造(ApoB-crescent)について超微形態学,組織化学の手法で解析した.その結果,ApoB-crescentが脂質滴に扁平なER槽

(以下,扁平槽)が融合した構造であること,ApoB,ER可溶性シャペロン,ER膜蛋白質,分泌蛋白質が扁平槽内にあること,扁平槽はグルコース6燐酸活性陽性であること,扁平槽の外側は単位膜構造を示すのに対し,内側(脂質滴側)には膜構造が見られないこと,さらに扁平槽がフィリピンで強染することなどを明らかにした,ApoB-crescentは脂質エステルがER膜の内部に蓄積する構造であり,脂質滴形成の中間段階と推測されてきた「脂質二重層に挟まれた脂質エステル蓄積」が動物細胞内で生じることが初めて明らかになった.2)イノシトール燐脂質(PIs)の一つであるPI3Pが細胞内小胞輸送に果たす役割について解析するため,急速凍結した細胞を白金・カーボン薄膜で物理的に固定する凍結割断レプリカを用い,定量的に解析する方法を創出した.8種類のPIsを等モル%含むリポソーム,プローブ中の1アミノ酸を置換した変異体,PI3キナーゼ欠損細胞などを用いた実験により標識の特異性は確かめられた.酵母細胞の凍結割断レプリカを標識して解析し,PI3Pが液胞膜などに多く,細胞膜,核膜,ミトコンドリア膜などには少ないことが明らかになった.
ビリルビン抱合酵素の新しいファミリーの遺伝子構造とその欠損機序

Crigler-Najjar症候群は先天的にグルクロン酸転移酵素の欠損を伴う疾患である。本研究ではこのモデル動物である高ビリルビン血症ラット(Gunnラット)を用いて、ビリルビン抱合酵素の遺伝子構造とその欠損機序を検討した。以下にその概要を記す。私共はグルクロン酸転移酵素ファミリーの一群には基質結合ドメインを異にし、同一のアミノ酸配列よりなる共通のUDP-グルクロン酸結合ドメインを持つキメラ酵素群が存在することを最らかにしている。今回これらキメラ酵素群を指定する遺伝子の構造解析を行った。その結果、5'上流に基質結合ドメインを指定するエクソンが約10kb間隔でクラスターを形成して配列(現在9個を確認、その内ビリルビンの抱合に関与するものは5個である)しており、3'下流にこれらアイソザイムに共通なUDP-グルクロン酸結分ドメインを指定するエクソンが1ヶ所存在する新しい遺伝子構造を有することが判明した。全体として約200kbの大きな遺伝子である。Gunnラットの遺伝子では、アイソザイムに共通なUDP-グルクロン酸結分ドメインにフレームシフトを伴う1塩基の欠失が見いだされた。この結果は、この疾患ラットに複数個のアイソザイムが同じ個体に同時に欠損する原因となることを示す。又、正常遺伝子の基質結合ドメインにもフレームシフトを伴う異常が見つかった。これらの結果は、酵素を完全欠損あるとは、部分欠損に導く原因となる。これらの研究成果により、ヒト疾患のヘテロジェナイティーを遺伝子の構造レベルで解析する基礎が確立された。
ABO及びLewis血液型糖鎖合成酵素遺伝子の諸集団における対立遺伝子の分布

ABO式血液型の抗原をA,B,H抗原と言い、糖鎖から成る。ABH抗原は、赤血球の膜のみならず分泌液にも存在することが知られている。古くから、唾液中にABH抗原を分泌している人(分泌型、secretor,Se)と分泌していない人(非分泌型、non-secretor,se)の存在が知られており、分泌型・非分泌型は、α(1,2)fucosyltransferaseという酵素により支配されており、最近その遺伝子(FUT2)も単離された。分泌型の遺伝子型は、Se/Se又はSe/se、非分泌型のそれはse/seである。私達はFUT2の対立遺伝子をアフリカ、ヨーロッパ、イラン、バングラディッシュ、中国、韓国、日本、サモアの諸集団で調べ、多数の対立遺伝子を見出した。興味あることに非分泌型遺伝子seは人種特異的であることである。se^<428>は、アフリカ人、ヨーロッパ人、イラン人、にのみ見出され、中国人、韓国人、日本人、サモア人、にはse^<357・385>が見出された。この2つの対立遺伝子は、上記諸集団では共に存在することはなく、しかもその遺伝子頻度はすべての集団で0.40.5である。しかし、バングラディッシュ人においてのみ2つの対立遺伝子が共存しており、se^<428>の頻度は0.234、se^<357・385>の頻度は0.074であり、バングラディッシュ或いはインドの東部で、いわゆる白人種とアジア人種の混血が進んでいることを示している。現在、現代人の起源はアフリカ起源説であるが、FUT2の非分泌型遺伝子が、アフリカ人及びいわゆる白人種(ヨーロッパ人、イラン人)で、se^<428>(頻度0.4-0.5)であり、アジア人のそれはse^<357・385>(頻度0.4-0.5)であることは、大変興味深い。即ちアジア人においてse^<428>が消失し、新たなse^<357・385>が生じ、しかもその遺伝子頻度が、0.4-0.5にまで広がったことは何を意味するか、今度の課題である。今回、私達は南アフリカのコーサ族及び南アフリカ在住のヨーロッパ人をそれぞれ100人について、ケープタウン大学組織免疫学du Toit教授の協力を得て、解析した。その結果、FUT2について新しい7つの対立遺伝子、FUT3について新しい5つの対立遺伝子を見出した。又se428は、アフリカ人、ヨーロッパ人に特異的であり、se385はアフリカ人、ヨーロッパ人には全く見出されず、又東洋人についてもse385のみ見い出され、人種特異的であることが明確に証明された(Hum Genet,102,675-680,1998.及び103,204-210,1998)。又、中国人の2集団(藩陽と広州)及び日本人の2集団(秋田と沖縄)について、特異な対立遺伝子であるse・fusについて調査したところ、中国人には全く見出されず、日本人にのみ(秋田、沖縄、福岡の3集団)見出され、現在のところ日本人に個有の対立遺伝子であることが判明した。しかし、se・fusについては更に東南アジア、南アジアについても調査する必要がある。

今年度採取したイラン人集団及び中国ウィグル人集団については現在解析中である。ABO式血液型の抗原をA,B,H抗原と言い、糖鎖から成る。ABH抗原は、赤血球の膜のみならず分泌液にも存在することが知られている。古くから、唾液中にABH抗原を分泌している人(分泌型、secretor,Se)と分泌していない人(非分泌型、non-secretor,se)の存在が知られており、分泌型・非分泌型は、α(1,2)fucosyltransferaseという酵素により支配されており、最近その遺伝子(FUT2)も単離された。分泌型の遺伝子型は、Se/Se又はSe/se、非分泌型のそれはse/seである。私達はFUT2の対立遺伝子をアフリカ、ヨーロッパ、イラン、バングラディッシュ、中国、韓国、日本、サモアの諸集団で調べ、多数の対立遺伝子を見出した。興味あることに非分泌型遺伝子seは人種特異的であることである。se^<428>は、アフリカ人、ヨーロッパ人、イラン人にのみ見出され、中国人、韓国人、日本人、サモア人にはse^<357・385>が見出された。この2つの対立遺伝子は、上記諸集団では共に存在することはなく、しかもその遺伝子頻度はすべての集団で0.40.5である。しかし、バングラディシュ人においてのみ2つの対立遺伝子が共存しており、se^<428>の頻度は0.234、se^<357・385>の頻度は0.074であり、バングラディッシュ或いはインドの東部で、いわゆる白人種とアジア人種の混血が進んでいることを示している。現在、現代人の起源はアフリカ起源説であるが、FUT2の非分泌型遺伝子が、アフリカ人及びいわゆる白人種(ヨーロッパ人、イラン人)で、se^<428>(頻度0.4-0.5)であり、アジア人のそれはse^<357・385>(頻度0.4-0.5)であることは、大変興味深い。即ちアジア人においてse^<428>が消失し、新たなse^<357・385>が生じ、しかもその遺伝子頻度が、0.4-0.5にまで広がったことは何を意味するか、今度の課題である。
マルチモーダル幼児行動コーパスの活用による喃語に着目した音声言語獲得過程の観察

人間の知能発達過程の根幹を記述する計算機モデル構築の中核を担う取り組みとして、幼児の自然な行動を映像と音声で経年的に収録したデータを基盤に、発話の状況や背景を多視点で記述したデータを包括的に利用した発話分析が可能なコーパスを構築した。マルチモーダル分析に基づく音声言語発達研究に有用な画期的な発話観察システムを開発した。構築コーパスの分析に基づき、最も初期の音声言語獲得過程のモデル化に繋がる知見を得た。平成19年度は、映像と音声でマルチモーダルに発話を記録し、同一幼児の経年変化を観測できるマルチモーダル幼児行動コーパスの方法論に基づき、音韻獲i得過程の分析に必要なコーパスの構造を検討し、哺語に関するマルチモーダル行動記述を持ったコーパスを構築した。以下、研究提案書のテーマ別に研究成果を述べる。1、データ収集:動き回る幼児の音声を安定した音質で収録するため開発したリュック型のウェアラブル音声収録装置を用いて、マルチモーダル幼児教室に参加した幼児8名の音声を収録した。年間32回の授業を実施し、300時間分の音声データを蓄積した。2、システム開発:開発済みのマルチモーダル行動観察システムを拡張し、音声波形・音声短時間スペクトル・音声パワー・基本周波数といった音声情報を、映像にリンクさせて提示する機構、及び特徴的な箇所に手動でラベリングできる機構を設計・実装した。3、哺語観察:発話がなされた状況を考慮して音韻獲得過程を分析するため、発話者・月齢・発話内容・音韻ラベル・取り組みの内容・しぐさ・目線・周囲の状況などの記述項目を設計した。開発した行動観察システムを用いて、幼児1名の月齢13ヶ月30ヶ月の340発話に対し、上述のマルチモーダル行動記述を付与したコーパスを構築した。この行動記述によって、成長に伴う発話の音韻的特徴の変化を、強く主張する、控えめに発言するといった状況別に詳細分析できることを確認した。本研究では、自然知能の観測を目的として構築したマルチモーダル幼児行動コーパスの方法論に基づき、音声データ収集・喃語解析システム開発・喃語に着目した行動分析を実施し、音声言語獲得過程の計算機モデル表現の検討を通して、コモンセンス推論に役立つセオリーの提案を狙った。平成20年度は、前年度に構築した喃語に関するマルチモーダル行動記述を持ったコーパスに基づいて、コモンセンス知識の構築に繋がる喃語発達過程のモデル化を検討した。以下、テーマ別に成果を述べる。(1)データ収集:教室環境での音声データ収集を同じ幼児で継続して進めた。(2)システム開発:前年度に検討したマルチモーダル行動記述項目から、喃語の発達過程を表現するのに有用となる特徴に着目し、ラベリング作業を効率化する仕組みを検討した。具体的には、コーパスから場面状況が揃った事例を抽出して発達変化を観測可能にするため、発話時の幼児の心的状態を表現する感情ラベリングを導入した。感情ラベルによる事例検索機能を実装し、ラベリング支援システムを改良した。(3)喃語観察:感情ラベルを手掛かりに、発話意図の観点から事例を整理し、音声言語獲得過程を分析した。前年度開発した音声波形・スペクトル・基本周波数といった音声情報を、映像にリンクさせて提示する機構、及び特徴的な箇所に手動でラベリングできる機構を駆使し、詳細分析を行った。例えば、心的状態が「嫌悪」の発話が、「いや」の一語文から「いやいや」という繰り返し発声、韻律を変化させた強調発声、「いや」以外の語彙による二語文へと変化する過程などが観測できた。その他、「疑問」や「拒否」の意図の発話についても興味深い発達変化が分析できた。さらに、成長に伴って相手や周囲状況によって言い方を変える様子など社会性の発達に関する分析結果も得られ、発話を手掛かりとした自然知能のモデル化に繋がる知見を多く獲得できた。
長期記憶の形成過程における記憶痕跡細胞の生成・成熟過程とニューラルデコーディング

エピソード記憶形成の初期段階は海馬依存的であるが、時間経過とともに海馬非依存的になり、長期記憶として大脳新皮質に格納されるようになる。この過程は記憶の固定化と呼ばれ、海馬に蓄えられた記憶は海馬のリップル波を介して大脳新皮質に移行すると考えられており、さらに前頭前皮質のスピンドル波がリップル波の直後に発生すると、記憶の固定化が進むことが分かっている。しかし前頭前皮質がリップル波を受信・解釈・統合する仕組みは不明である。本研究は学習中のマウスの海馬と前頭前皮質から神経電気活動を同時に記録し、リップル波とスピンドル波の脳情報解読を行い、前頭前皮質の記憶痕跡細胞が生成・成熟する過程を明らかにする。
伸長胚選別によるウシＥＳ細胞キメラ作出の効率化

[ウシES細胞の高品質化]幹細胞マーカーであるPOU5F1の発現量をTet-onシステムで調節可能なウシES細胞株を樹立した。1キメラ形成能を調べるため、DiIで蛍光標識したES細胞を5個注入した8-16細胞期のマウスあるいはウシ胚をドキシサイクリン(Dox)存在(1μg/ml)、非存在下で培養し、胚盤胞期胚における局在を調べた。8細胞期のマウス胚をホストとした場合、3株中2株において、Dox存在下の方がICM(inner cell mass)に局在する割合が1.8-3.2倍有意に高かった。Doxの添加時間を0、12、24、及び48時間に設定して局在を比較したところ、24時間ではICMへの局在が2倍以上に増加するものの、それ以上の添加は効果が認められなかった。8-16細胞期のウシ胚をホストにした場合もDox添加24時間でICMへの局在及び取り込みがそれぞれ2倍以上に増加したが、48時間以上の添加は胚発生に悪影響が認められた。TE(trophectoderm)への局在も増加したことから、Dox添加によるPOU5F1の上昇は細胞の未分化性よりも生存性の維持に影響を与え、寄与率が増加したと考えられた。2ウシES細胞とマウスES細胞を2日間単独、あるいは混合培養したマトリゲルビーズをDoxを徐放的に放出する浸透圧ポンプとともにヌードマウスに移植し、3週間後に腫瘍を回収して、蛍光観察及び免疫組織学的解析によりテラトーマ形成能を調べた。ウシES細胞のビーズを単独、あるいはマウスES細胞と隣接して移植した場合、ウシES細胞由来の奇形腫形成が認められたものの、特定の細胞系譜へ分化した像は観察できなかった。一方、両者を混合培養したビーズを移植したところ、マウスES細胞由来のテラトーマ中にウシES細胞由来の上皮、神経叢、血管内皮、及び腺組織が認められたことから、分化誘導をサポートする組織が存在することにより三胚葉に分化し得ることが確認された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。【キメラ胚の効率的作出法の検討】3株のウシES細胞株についてキメラ形成能を調べた。蛍光標識したウシES細胞を8細胞期胚に注入して胚盤胞期における局在を調べた結果、半数以上の胚でES細胞が内部細砲塊内あるいは周辺に存在していることが分かった。内部細胞塊に局在が確認された胚を牛に移植し、14日胚における寄与を調べたところ、株間で差があるものの、40-80%の胚において将来胎子になる胚盤にウシES細胞が局在しているのが確認された。また一部の胚において、胚体外組織へ分化していると思われる像が観察された。以上の結果から、ウシES細胞はキメラ形成能を有する可能性があること、またマウスES細胞とは異なり、胚体外組織へも分化し得る可能性が示唆された。【キメラ形成能の高いES細胞株の選別法の検討】ウシES細胞を未分化細胞マーカーであるSSEA-1及びSSEA-4抗体で染色しFCM解析を行った結果、SSEA-1陽性細胞が0.5%、SSEA-4陽性細胞が0.2%存在することが分かった。これらの細胞が出現する頻度は細胞株間で異なっており、キメラ形成能の高い株及び細胞集団を選別する指標となる可能性が示唆された。【ジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム改変操作】生殖系列細胞特異的に発現するウシVASAホモログ(BVH)のゲノム領域に蛍光タンパク質遺伝子を組み込むため、開始コドン近傍の特定の部位を認識・切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を設計・合成した。ウシ繊維芽細胞にZFNをコードする遺伝子を導入したところ、ZFNが部位特異的な切断活性を有すること、また相同組換えベクターを共導入することにより、実際に相同組換えが起きることを確認した。[ホスト胚のステージの検討]3株のウシES細胞株についてDay5及びDay8の胚をホスト胚としてキメラ胚を作成し、受胚牛に移植した。Day13伸長胚におけるES細胞の局在を調べた結果、ntES♀#2とntES♂#2はDay8胚が、ivfES♂#5はDay5胚がホスト胚が適していること、またntES♀#2が最も胚盤への局在率が高いことが分かった。両ステージで有意な差がなかったことから、胚盤胞期でエピブラストへのES細胞の局在が確認できるDay5胚がホスト胚として最適であると判断された。[ウシES細胞の高品質化]高品質化を目的に、Tet-on発現調節システムにPOU5F1遺伝子を連結したベクターをウシES細胞に導入した。ドキシサイクリン(Dox)存在下で樹立した細胞株は、コロニーの形態がよりドーム状となり、増殖の亢進が認められた。Dox除去により外因性POU5F1及びNANOGやE-Cadherin等の幹細胞関連因子の発現が低下したことから、POU5F1発現調節が設計通り動作すること、またPOU5F1の強制発現は幹細胞関連因子の発現誘導を介してES細胞の性状に影響を与えていることが示唆された。[ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)によるゲノム編集個体の作成]ZFNアシストによる相同組換えによって、生殖細胞特異的に発現するDDX4遺伝子をDsRedに置換したウシ繊維芽細胞を樹立した。

ゲノム解析の結果、この細胞は相同組換えが起きていないアリルにおいても675bpの欠失が起きていることが判明した。この細胞由来のクローン胎子を作成したところ、生殖腺のDDX4の発現は認められず、DDX4-/-であることが確認された。生殖腺におけるDsRedの発現は低く、内因性DDX4の低発現を反映していると推測された。以上の結果から、ウシにおいても高度なゲノム編集が可能であることが示された。【キメラ胎子の解析】胚盤胞期(Day7)及び伸長胚期(Day14)のキメラ胚において、ウシES様細胞は内部細胞塊(ICM)及び胚盤に局在することが確認されている。さらに発生が進んだ胎子期における局在を調べるため、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入したES細胞株を樹立した。8細胞期宿主胚にGFP導入ES様細胞を注入し、胚盤胞期胚のICMにES細胞が確認された胚22個を1頭の受胚牛に移植した。6日後に子宮潅流によって伸長胚を回収し、胚盤及びその近傍にGFP陽性細胞が確認された伸長胚4個を再度2個ずつ2頭の受胚牛に移植した。Day30の妊娠鑑定で両受胚牛とも1頭の胎子が確認されたが、Day40で1頭の受胚牛で胎芽死滅が確認された。Day62にと殺により胎子と胎膜を回収した。胎子は雄型の表現系を示し、形態的な異常は認められなかった。蛍光実体顕微鏡による胎子体表及び各臓器の観察では明確なGFP発現は認められなかったが、ゲノムDNAのPCR解析によって、腸、肝臓、胃、心臓、腎臓、右前足及び頭部(脳をのぞく)にES細胞が存在していることが明らかになった。また羊膜の一部にGFP陽性細胞のクラスターが観察され、PCR解析においても羊膜と絨毛膜、及び死亡胎子の残存胎盤にES細胞が存在していることが明らかになった。以上の結果より、ウシES細胞は少なくともDay62の胎子組織に存在すること、また、胚体外組織にも寄与する可能性が示された。【ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)によるゲノム改変操作】設計したZFNが配列特異的な切断活性を持つことは昨年度までに確認されている。標的部位に相同的な配列とともにウシ繊維芽細胞に共導入した結果、セレクション後の細胞のおよそ0.03%で相同組換えが起こっていることが確認された。[ウシES細胞の高品質化]幹細胞マーカーであるPOU5F1の発現量をTet-onシステムで調節可能なウシES細胞株を樹立した。1キメラ形成能を調べるため、DiIで蛍光標識したES細胞を5個注入した8-16細胞期のマウスあるいはウシ胚をドキシサイクリン(Dox)存在(1μg/ml)、非存在下で培養し、胚盤胞期胚における局在を調べた。8細胞期のマウス胚をホストとした場合、3株中2株において、Dox存在下の方がICM(inner cell mass)に局在する割合が1.8-3.2倍有意に高かった。Doxの添加時間を0、12、24、及び48時間に設定して局在を比較したところ、24時間ではICMへの局在が2倍以上に増加するものの、それ以上の添加は効果が認められなかった。8-16細胞期のウシ胚をホストにした場合もDox添加24時間でICMへの局在及び取り込みがそれぞれ2倍以上に増加したが、48時間以上の添加は胚発生に悪影響が認められた。TE(trophectoderm)への局在も増加したことから、Dox添加によるPOU5F1の上昇は細胞の未分化性よりも生存性の維持に影響を与え、寄与率が増加したと考えられた。
スキンコンダクタンスモニターを用いた痛みの客観的評価

医療行為は、患者の状態を改善させるための行為である一方で、侵襲を伴うことが多い。医療者が処置を行う際には、患者の痛みを最小限になるよう配慮すべきである。通常、痛みは患者自身の訴えによって評価する。しかし、鎮静されている患者や乳幼児など、痛みを伝えることが難しい患者の痛み評価には、客観的な指標が必要である。現在、痛みを客観的に評価するための確立した方法はない。スキンコンダクタンスモニターを用いて発汗による皮膚のコンダクタンスの変化から交感神経の興奮の程度を把握し、患者の痛みを客観的に評価することを目指す。この方法は簡便で無侵襲であり、客観的に痛みを評価するための理想的なツールとなる可能性がある。
3次元ハイブリッドシミュレーションによる磁気リコネクションの乱流イオン加速

本研究の目的は、宇宙空間で普遍的にみられる乱流現象と磁気エネルギーの変換過程として重要な磁気リコネクションと呼ばれる現象の関連性に注目しつつ、粒子加速の物理解明に繋げることである。今年度は、粒子加速の前段階となる乱流生成ついて議論すると同時に、生成された乱流が全体のダイナミクスにどう寄与するかを調べた。全体のダイナミクスに関しては、乱流効果を組み込んだモデル計算を行った。まず乱流生成について、重要な結論の一つはイオンの運動論効果が効くスケールでは、磁気リコネクションに伴ってできるジェットは不安定であり、自発的に乱流状態となることである。またその乱流状態への遷移の有無は初期のプラズマ温度に依存し、特にプラズマ温度が低い場合に乱流状態に発展してゆくことがわかった。この原因にっいては、様々な理論モデルと比較した結果、いくつかのプラズマ不安定の複合過程であることが示唆されている。リコネクションジェットでの自由エネルギーとなるのはイオンの温度異方性と、プラズマ全体の流れ(バルクフロー)の運動エネルギーであることがわかっている。そしてこれらを自由エネルギーとする不安定現象のうち、乱流生成のプラズマ温度依存性(シミュレーション結果)をコンシステントに説明できる候補として主に、温度異方性によって励起されるミクロなプラズマ不安定と、バルクフローを自由エネルギーとして発達するグローバルなモードの二つが考えられることがわかった。一方で乱流が存在する場合の磁気リコネクションのダイナミクス全体を理論的に理解する試みについても進めた。全体のダイナミクスにっいては、乱流モデルを組み込んだレイノルズ平均型のシミュレーションモデルを用い、発達した乱流が磁場のエネルギー変換効率の上昇に重要であることを示した。(抄録なし)今年度は、磁気リコネクションでのイオン加速に必要だと考えられている乱流生成と、乱流がマクロな物理に与える影響について、主に2次元ハイブリッドシミュレーションと新たに開発した乱流シミュレーションモデルにより調べてきた。乱流生成について明らかにすることは、乱流イオン加速のメカニズムを議論してゆく上で非常に重要である。例えば乱流はそのランダムな渦の動きから確率的な物理過程を引き起こし、観測から示唆されるようなMaxwell分布から外れた幕型のエネルギースペクトルを作り出す候補として有力である。研究に用いたハイブリッドシミュレーションコードはイオンを粒子として解き、電子を流体として解くことでイオンの運動論効果を議論することが可能であり、これを用いて2次元磁気リコネクション系でのイオンの運動論効果による乱流生成を詳しく調べた。シミュレーション結果と、プラズマ分散関数を用いた線形解析から以下のことがわかった。まず磁気リコネクションで、イオンは初期加速を受けイオンビームを作る。そして生成されたイオンビームは、背景にある電磁場と相互作用して波(ホイッスラー波)を励起する。またパラメータ研究を行うことでこのホイッスラー波を生成するイオンビームの速度や密度は、磁気リコネクション初期の磁気圧とプラズマ圧の比に依存する。この結果から、どのような条件で磁気リコネクションでの乱流生成が起きるかについて明らかになり、今後の乱流イオン加速の可能性を探る上で重要な結果を得た。一方、ハイブリッドコードでは議論が不可能なマクロな系で、乱流が磁気リコネクションの物理にどう影響するのかを調べるため、磁気流体乱流モデルを通常の磁気流体シミュレーションに組み込んだ新たな乱流シミュレーションモデルを開発し、乱流の存在によって磁気エネルギーの変換効率や構造といったマクロな磁気リコネクションの性質が変わることを明らかにした。例えば磁気リコネクションによるエネルギー変換効率の上昇は、背景にある電場の強度を増幅させる等、イオンの加速という観点からも重要であると考えられる。ミクロなスケールを見ることが可能な電磁ハイブリッドシミュレーションによって、2次元系であっても運動論に起因する乱流生成がおこることがわかり、その原因を突き止めることができた。それに加え、マクロな乱流の効果を見るために新たに開発した乱流シミュレーションコードにより、エネルギー変換効率等の重要課題に対する一つの新たな答えを提唱することが可能となった。

これらの結果は前者が投稿準備中で、後者はPhysical Review Letterに投稿し現在査読中であり、研究成果として着実に現れている。当初の予測では、イオンの運動論効果が入った乱流生成には、空間3次元性が重要だと考えていたが、これまでの研究で、空間2次元系でもプラズマパラメータによっては乱流生成が起こることが明らかとなった。従って、今後は空間2次元でも乱流によるイオン加速が見えるような空間サイズのシミュレーションを行ない、乱流の性質などを細かく議論しつつイオン加速について調べてゆく。また計算資源の面から、それ以上大きなスケールのリコネクション物理については、乱流をモデル化したシミュレーション手法によって、2次元3次元的な乱流効果を調べてゆく。(抄録なし)
Microdialysis法を用いた劇症肝不全における肝性脳症の病態解明

劇症肝不全における肝性脳症の病態を解明する為に,当施設で経験した劇症肝炎を対象に,血中アンモニア測定,アミノ酸解析結果と頭蓋内圧,肝性昏睡度との関係を検討した.その結果,血中アンモニア値と肝性昏睡度,頭蓋内圧との間に相関関係が得られることが判明した.すなわち劇症肝炎における肝性昏睡および続発する脳浮腫の機序にアンモニア血中濃度が関与していることが示唆された.これらの劇症肝炎症例に対し,血液透析を24時間行うといったhigh flow dialysate CHDF(HFCHDF)を行うことによりほとんどの症例でアンモニア血中濃度が低下し、さらに肝性昏睡も改善した。また、肝性昏睡II度の発症から24時間以内にIV度に達したいわゆるhyperacute typeの経過をとる劇症肝炎症例2例に対し,アンモニアをはじめとする肝性昏睡物質を持続的に除去する為に,HFCHDFを施行した.しかしながらこれらの2例では,通常のHFCHDFではアンモニア血中濃度を低下させることができず,また肝性昏睡を制御することができなかった.結果として通常のHFCHDFではアンモニアを中心とする肝性昏睡起因物質の除去が不十分であった.そこで,HFCHDFを2機,並行して同一症例に使用するなど,HFCHDFの血液浄化量を増加させることを試みた.その結果,血中アンモニア値および肝性昏睡状態が改善することができた.1例では亢進していた頭蓋内圧も制御することが可能であった.我々がこれまで経験した劇症肝炎ではHFCHDFにより肝性昏睡を制御することが可能であった.しかしながら今回経験したhyperacute typeの経過をとった2例については,通常条件下のHFCHDFでは肝性昏睡起因物質の除去が不十分であると考えられた.以上より,劇症肝炎に続発する肝性昏睡,脳浮腫の機序の一つにアンモニア血中濃度が関与していることが示唆された.このアンモニア血中濃度は肝性昏睡のモニタリングとしても有用であった.このアンモニアをはじめとする肝性昏睡起因物質を血中から除去し,肝性昏睡そのものを改善させるのにHFCHDFは有効であった.しかしながらhyperacute typeの劇症肝炎症例では通常のHFCHDFでは肝性昏睡物質の除去が不十分であり,HFCHDFを2機並列で行うといった血液浄化法の強化が必要であると考えられた.劇症肝不全(FHF)における肝性脳症の病態を解明する為に,microdialysis法,頭蓋内圧monitoring,アンモニア血中濃度,血中アミノ酸解析,サイトカイン血中濃度等を測定し検討した.さらに我々が臨床応用している高流量の透析液を用いたhigh flow dialysaste CHDF(HFCHDF)の肝性脳症に対する効果の機序について,これらの解析法を用いて検討した.FHF症例では,1)アンモニア血中濃度が高く,昏睡度との間に有意な相関が存在すること,2)IV度以上の昏睡症例の中には頭蓋内圧が異常に亢進し,この頭蓋内圧がコントロールできない症例では脳ヘルニアに至り死亡すること,3)頭蓋内圧とinterleukin-6血中濃度に正の相関があること,等が判明した.また,FHFに対しHFCHDFを施行した症例では,1)アンモニア血中濃度が有意に低下したこと,2)昏睡度が改善し,意識覚醒率は非施行群に比較し有意に高いこと等が判明した.研究は継続進行中であるが,現時点での結論として,1)肝性昏睡の機序に高アンモニア血症,高サイトカイン血症が関与していること,2)HFCHDFは肝性昏睡物質の除去に有効であること,が挙げられる.このアンモニア,サイトカイン等が脳内でどのような動態で脳症に関与しているのかが今後の課題である.一方,microdialysis法は国内での取扱業者の変更等により,測定システムの立ち上げに時間を要したが,ようやく本研究における測定システムが確立した.このmicrodialysis法を用い,脳内アミノ酸,アンモニア,乳酸等の動態と既に検討したアンモニア血中濃度,サイトカイン血中濃渡,頭蓋内圧等の関係を調査することによって,肝性昏睡の機序につきさらに検討する方針である.劇症肝不全における肝性脳症の病態を解明する為に,本研究を施行している.昨年度に引き続き本年度も,当施設で経験した劇症肝炎を対象に,血中アンモニア測定,アミノ酸解析結果と頭蓋内圧,肝性昏睡度との関係を検討した.その結果,血中アンモニア値と肝性昏睡度,頭蓋内圧との間に相関関係を認めた.さらに肝性昏睡II度の発症から24時間以内にIV度に達したいわゆるhyperacute typeの経過をとる劇症肝炎を2例経験し,これらに対し肝性昏睡物質の持続除去を強化する為に,high flow dialysate CHDF(HFCHDF)を施行した.これらの2例では,通常のHFCHDFでは肝性昏睡を制御することができなかった.血中アンモニア値も徐々に低下したものの,正常化するには程遠く,結果として通常のHFCHDFではアンモニアを中心とする肝性昏睡起因物質の除去が不十分であった.そこで,HFCHDFを2機,並行して同一症例に使用するなど,HFCHDFの血液浄化量を増加させることを試みた.その結果,血中アンモニア値および肝性昏睡状態が改善することができた.1例では亢進していた頭蓋内圧も制御することが可能であった.我々がこれまで経験した劇症肝炎ではHFCHDFにより肝性昏睡を制御することが可能であった.

しかしながら今回経験したhyperacute typeの経過をとった2例については,通常条件下のHFCHDFでは肝性昏睡起因物質の除去が不十分であると考えられた.残念ながら本2例ではmicrodialysisカテーテルを挿入するに至る同意は近親者から得られず,脳内代謝産物動態について検討することはできなかったが,今後も引き続き症例を重ねることにより,劇症肝不全の肝性脳症の病態解明を行う方針である。劇症肝不全における肝性脳症の病態を解明する為に,当施設で経験した劇症肝炎を対象に,血中アンモニア測定,アミノ酸解析結果と頭蓋内圧,肝性昏睡度との関係を検討した.その結果,血中アンモニア値と肝性昏睡度,頭蓋内圧との間に相関関係が得られることが判明した.すなわち劇症肝炎における肝性昏睡および続発する脳浮腫の機序にアンモニア血中濃度が関与していることが示唆された.これらの劇症肝炎症例に対し,血液透析を24時間行うといったhigh flow dialysate CHDF(HFCHDF)を行うことによりほとんどの症例でアンモニア血中濃度が低下し、さらに肝性昏睡も改善した。また、肝性昏睡II度の発症から24時間以内にIV度に達したいわゆるhyperacute typeの経過をとる劇症肝炎症例2例に対し,アンモニアをはじめとする肝性昏睡物質を持続的に除去する為に,HFCHDFを施行した.しかしながらこれらの2例では,通常のHFCHDFではアンモニア血中濃度を低下させることができず,また肝性昏睡を制御することができなかった.結果として通常のHFCHDFではアンモニアを中心とする肝性昏睡起因物質の除去が不十分であった.そこで,HFCHDFを2機,並行して同一症例に使用するなど,HFCHDFの血液浄化量を増加させることを試みた.その結果,血中アンモニア値および肝性昏睡状態が改善することができた.1例では亢進していた頭蓋内圧も制御することが可能であった.我々がこれまで経験した劇症肝炎ではHFCHDFにより肝性昏睡を制御することが可能であった.しかしながら今回経験したhyperacute typeの経過をとった2例については,通常条件下のHFCHDFでは肝性昏睡起因物質の除去が不十分であると考えられた.以上より,劇症肝炎に続発する肝性昏睡,脳浮腫の機序の一つにアンモニア血中濃度が関与していることが示唆された.このアンモニア血中濃度は肝性昏睡のモニタリングとしても有用であった.このアンモニアをはじめとする肝性昏睡起因物質を血中から除去し,肝性昏睡そのものを改善させるのにHFCHDFは有効であった.しかしながらhyperacute typeの劇症肝炎症例では通常のHFCHDFでは肝性昏睡物質の除去が不十分であり,HFCHDFを2機並列で行うといった血液浄化法の強化が必要であると考えられた.
脳神経発達障害におけるミトコンドリア膜透過性遷移の役割に関する研究

これまでに(平成15.16年度)、妊娠20日目のラットを対象に、片側子宮動脈30分間虚血・再灌流モデルを作成し遅発性のミトコンドリア機能障害とミトコンドリアが著明な膨化を示すことを確認し、アポトーシスと密接に関連するmPTが発生することを確認した。今年度は引き続き、同様の動物モデルを用い、ミトコンドリアを標的とした様々な薬物の治療効果を検討した。虚血前、虚血終了直後、再灌流1時間、4時間、8時間で、帝王切開にて胎仔を娩出、直ちに断頭し、脳組織を摘出、homogenateを作成、細胞分画法にてミトコンドリアを単離した。その後、単離ミトコンドリアの呼吸機能活性を、微量検体用のchamber内で、クラーク式酸素電極を用い測定し、遅発性のエネルギー代謝不全の出現を確認した。また、同様の試料より電子顕微鏡による観察を行った。その結果、様々な抗酸化物質、カルシウム拮抗剤で遅発性のエネルギー代謝不全が改善され、免疫抑制剤によりミトコンドリアの膨化が著明に抑制され、mPT発症を防ぐことが確認された。また、アスピリンは用量依存性に効果を示し、実臨床におけるハイリスク母体への低用量アスピリン療法の可能性を強く示唆する結果となった。本研究は、胎児、新生児期の低酸素傷害による脳神経発達障害とアポトーシスと密接に関連するミトコンドリア膜透過性遷移(mitochondrial permeability transition;mPT)の関連を明らかにすることを目的としている。そのため、平成15年度は、ミトコンドリア単離手技と電子顕微鏡によるミトコンドリア観察手技の確立を目的に以下の検討を行った。妊娠20日目のラットを対象に、片側子宮動脈30分間虚血・再灌流モデルを作成。単離ミトコンドリアの呼吸機能活性は、微量検体用のchamber内で、クラーク式酸素電極を用い測定した。その結果、虚血により一過性に低下したミトコンドリア呼吸機能は、再灌流により改善するものの、再灌流4時間以降、遅発性に二次的な不全に陥ることが明らかになった。この成績はpreliminaryに行った組織エネルギー代謝の推移と一致し、脳神経発達障害と密接に関連する遅発性のエネルギー代謝不全がミトコンドリア機能障害によるものであることを明らかにした。また、同様の実験系で電子顕微鏡による観察を行い、遅発性のミトコンドリア機能障害に伴い、ミトコンドリアが著明な膨化を示すことを確認した。次年度は、このミトコンドリアの膨化がmPT発現によるものか否か、mPT抑制作用が知られる免疫抑制剤の効果やcytochrome c放出との関連から検討してゆく予定である。平成16年度は、すでに確立したミトコンドリア単離手技と電子顕微鏡によるミトコンドリア観察手技を用い以下の検討を行った。また、同様の試料より電子顕微鏡による観察を行い、遅発性のミトコンドリア機能障害に伴い、ミトコンドリアが著明な膨化を示すことを確認した。引き続き同様のモデルにおいて、この遅発性のエネルギー代謝不全とミトコンドリアの膨化がmPT発現によるものか否かを明らかにするため、試験管内で強いmPT抑制作用が知られる免疫抑制剤を実験動物に投与し、ミトコンドリアの代謝不全と膨化が著明に抑制されることを確認した。以上の結果、子宮内の一過性虚血に対し、胎仔脳ではアポトーシスと密接に関連するmPTが発生することが推察された。

次年度はこれらの成績をもとに、ミトコンドリアを標的とした様々な薬物の治療効果を検討して行く予定である。これまでに(平成15-16年度)、妊娠20日目のラットを対象に、片側子宮動脈30分間虚血・再灌流モデルを作成し遅発性のミトコンドリア機能障害とミトコンドリアが著明な膨化を示すことを確認し、アポトーシスと密接に関連するmPTが発生することを確認した。今年度は引き続き、同様の動物モデルを用い、ミトコンドリアを標的とした様々な薬物の治療効果を検討した。虚血前、虚血終了直後、再灌流1時間、4時間、8時間で、帝王切開にて胎仔を娩出、直ちに断頭し、脳組織を摘出、homogenateを作成、細胞分画法にてミトコンドリアを単離した。その後、単離ミトコンドリアの呼吸機能活性を、微量検体用のchamber内で、クラーク式酸素電極を用い測定し、遅発性のエネルギー代謝不全の出現を確認した。また、同様の試料より電子顕微鏡による観察を行った。その結果、様々な抗酸化物質、カルシウム拮抗剤で遅発性のエネルギー代謝不全が改善され、免疫抑制剤によりミトコンドリアの膨化が著明に抑制され、mPT発症を防ぐことが確認された。また、アスピリンは用量依存性に効果を示し、実臨床におけるハイリスク母体への低用量アスピリン療法の可能性を強く示唆する結果となった。
走査透過型電子顕微鏡法を用いた定量元素マッピング

本研究では、次世代材料開発の基盤評価技術の確立を目指し、これまで定性的にしか評価し得なかった材料内部の局所元素を、単原子カラムの精度で定量評価する技術を開発する。本技術には電子線を極限まで絞りこむ走査型透過電子顕微鏡法(STEM)をベースとし、電子線と局所原子・電子構造との様々な反応・相互作用を情報源として原子レベルでの定量化を試みる。本年度は、昨年に引き続きYSZ粒界をにおける原子分解能STEM-EDSマッピングを実験的に行い、その結果を本研究で開発した定量評価手法と高度に融合することにより、YSZの粒界偏析現象の本質的な解明を目指した。原子分解能STEM-EDSマッピングの結果、Yイオンが原子レベルで粒界の特異サイトに偏析することが明らかとなったが、Oイオンも同様に粒界に濃化する傾向があることがわかった。この結果が定量的に正しいかどうかを本開発のシミュレーションを用いて理論的に検証した結果、動力学的回折効果はOイオン濃度を実際よりも低く見積もる傾向があることがわかった。つまり、本実験で得られたOイオンが粒界に濃化するという結果は、動力学的効果では説明がつかず、YSZ粒界に本質的な材料現象であることが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年は、特にSTEM-EDS法に着目し、本手法を原子分解能界面構造解析に応用可能な手法へと発展させることを目指した。本年は、ZrO2粒界をモデル界面とし、その粒界における原子分解能STEM-EDSマッピング実験結果と理論計算とを融合させることで、界面構造定量解析の可能性を検討した。ZrO2には通常Y203が添加されているが、このYが粒界部に偏析することで界面機能、特に酸素イオン導電性に大きな影響を及ぼすことが知られている。しかし、Yの存在状態を原子レベルで調べることは極めて困難であるため、原子分解能STEM-EDSの利用が期待されている。そこで、Zr02粒界におけるSTEM-EDSマッピングの理論解析を行うにあたり、まず界面解析用に理論計算コードを改良し、大きな計算セルでのシミュレーションを可能にする改良を行った。次に、実際の界面構造モデルを用いて原子分解能STEM-EDSの定量性を検討した。その結果、高対称結晶軸からの電子線入射時の場合、理想的な組成からずれた定量結果が得られることがわかった。一方、電子線入射方向をずらしていくと、理想値に近づくことがわかった。本結果は、原子分解能STEM-EDSの定量性には、結晶中での電子チャネリングの影響が顕著に表れる可能性が示唆された。本年度は、昨年度に引き続きSTEMーEDS法を原子分解能界面構造解析に応用可能な手法へと発展し、実際の材料解析に積極的に応用すること目指した。本年度は、まずSTO結晶を用いたシミュレーションによる理論解析を行い、原子分解能STEM-EDSの定量性に関する詳細な検討を行った。その結果、電子チャネリング現象の考慮が定量化には極めて重要であることが明らかとなり、定量性と試料傾斜などのファクターとの相関性を解明することに成功した。また、昨年に引き続きYSZ粒界をにおける原子分解能STEM-EDSマッピングを行い、YSZの粒界偏析現象の解明を目指した。実際の粒界の原子分解能STEM-EDS分析により、YSZ粒界ではYイオンが規則的に偏析する様子が明らかとなった。また、理論計算と組み合わせることにより、この結果の定量化を試みた。

つまり、本実験で得られたOイオンが粒界に濃化するという結果は、動力学的効果では説明がつかず、YSZ粒界に本質的な材料現象であることが明らかとなった。本年度はSTEM-EDSによる原子分解能定量マッピングの可能性が理論的にも実験的にも明らかとなり、その応用可能性が大きく広がった。また、この結果を海外の一流誌に掲載することもでき、順調に進捗していると判断できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在、原子分解能STEM-EDSに対する期待は大きく、今後も引き続き原子分解能STEMーEDSマッピングの定量評価基盤構築に関する先導的研究を行っていく予定である。また、この分野は現在世界的に熾烈な研究開発競争下にあるため、得られた結果をできる限りタイムリーに論文・学会などで報告する予定である。また、実際の界面解析への応用事例をさらに増やし、普遍的な手法へと昇華することも目指す。本年度は、現実の粒界において計測された原子分解能STEM-EDSマッピングの結果を定量解析することを目的として、理論計算によって求められた粒界構造を用いて粒界近傍における電子チャネリング効果などを取り入れたSTEM-EDSマッピングシミュレーションを展開している。この場合、粒界構造を考慮するため、計算コストが大きくなることが危惧されたが、プログラムの改良などを行うことにより克服し、順調に解析を進めている。今後も引き続き原子分解能STEM-EDSマッピングの定量評価基盤構築を継続するとともに、STEM像、STEM-EELSについても定量化に向けた研究を推進する。本研究では、特に原子構造が複雑に変化する界面をターゲットとしているため、界面構造解析応用に特化した開発を行い、局所的に構造が乱れた領域においても応用可能な定量評価法の確立を目指す。
微生物の無毒化作用による新たなセレン処理プロセスの開発

研究目的廃水処理におけるセレンの無毒化を行う処理方法に、低コストが期待され、二次汚染の心配がないバイオレメディエーションに着目した。この方法は微生物により、セレン酸および亜セレン酸を毒性の弱い元素態セレンに還元するものである。本研究ではこのうち比較的反応が速い元素態セレンへの異化還元を対象として、生物処理について検討を行い、実排水である石炭火力発電所における脱硫廃水に含まれるセレンの除去についてアプローチする。研究実施計画および研究結果セレン還元菌の入手が困難なことから、活性汚泥を元汚泥として亜セレン酸とセレン酸で馴養(純粋培養)することにより、低コストで2種類のセレン還元汚泥を得る。この汚泥を用いてセレンの無毒化を行う処理方法の検討を行った。・セレン還元汚泥による温度依存性、pH依存性の検討馴養で得られた2種類の汚泥を使用したセレン還元反応は0次的還元反応であることが判明した。還元速度の温度依存性についてアレニウスプロットで整理した結果、いずれも良好な直線が得られた。求められた活性化エネルギーは亜セレン酸の還元では約70kJ、セレン酸の還元では約40kJを示した。pH依存性については、亜セレン酸還元においてはpH≒7.2付近で最大値を示すベル型の依存性が得られた。一方、セレン酸還元においては、亜セレン酸還元と異なり酸性域で速度が上昇する傾向を示し、ベル型の依存性は見られなかった。温度依存性ならびにpH依存性の結果から、亜セレン酸とセレン酸の還元挙動に差があるため、それぞれの還元に関わる菌体が異なる可能性も示唆された。・セレン還元汚泥による硝酸態窒素共存時のセレン還元挙動の検討Se(VI)の還元は硝酸態窒による阻害を受けずに進行した。Se(VI)汚泥によるSe(IV)の還元は硝酸態窒濃度が高いほど影響を受け、20mg-N/l共存時にはほぼ完全にSe(IV)の還元反応が停止した。これらより、硝酸態窒素共存時の亜セレン酸とセレン酸の還元阻害の受け方の違いは、馴養時に使用した溶解性セレンの違いによってもたらされたものと考えられる。