hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発性胆汁性肝硬変の免疫病理学的,分子生物学的研究

【目的】PBCの患者血清中には自己抗体である抗ミトコンドリア抗体(AMA)が高率かつ特異的に出現する。この抗体の対応抗原であるピルビン酸脱水素酵素複合体のE2成分(PDC-E2が、最近、PBCの肝内の障害胆管上皮に異常にあるいは過剰に発現する現象が注目されている。この現象の解析を試みた。【材料・方法・結果】1.肝内小葉間胆管の胆管上皮でのPDC-E2発現の検討:PDC-E2のinner lipoicdomainを認識することが知られているモノクローナル抗体であるC355.1(米国の共同研究者が作成)を用い、材料はPBCの肝11例と慢性肝炎などの対照肝12例の凍結肝切片である。方法は酵素抗体間接法(ABC)、共焦点レーザー顕微鏡、免疫電顕である。一次抗体としてC355.1を使用した。主に肝内小葉間胆管、肝細胞、浸潤単核細胞、血管平滑筋に種々の強さで陽性像がみられた。PBCでは、小葉間胆管に強い発現がみられ、特に核上部の胞体で明瞭であった。非PBC症例の小葉間胆管では、少数の小葉間胆管が陽性であったが、弱陽性陰性の小葉間胆管が多くみられた。なお、グ鞘周囲の肝細胞と増生細胆管には、症例、疾患に関係なく、強い発現がみられた。2.肝内小葉間胆管の胆管上皮でのPDC-E2mRNAの発現:in situ hybridization法を用い検討した。材料はPBC肝11例と慢性肝炎等の対照肝12例の凍結切片を用いた。in situ hybridization法として、PDC-E2のinner lipoicdomain領域に対するRNAプローブ(ジゴキシゲニン(DIG)標識でハイブリダイゼーション後、免疫染色でDIGを検出した。mRNAのシグナルは、肝細胞、増生細胆管、浸潤単核細胞に明かな陽性像があったものの、小葉間肝胆管ではPBCおよび非PBC症例共に、弱陽性陰性であった。3.胆汁中のPDC-E2の検出:ウェスタンブロット法で検出を試みた。材料はPBCの胆嚢胆汁4例(肝移植時に採取)と肝内結石症の胆管胆汁4例(肝切除術時に採取)を用いて、PDC-E2の一次抗体C355.1を用いて。なお、発色はABC法で行った。PBCの胆汁では、4例全例で74kDの部位に陽性のバンドがみられた。しかし、肝内結石症例では、この部には陽性のバンドがみられなかったので、PBCに特徴的と考えられた。4.動物モデルの開発:液性免疫の異常、IL-2の産生障害を来すALYマウスを用い、PBCのモデル動物の作成を試みた。自然発生的に、肝内胆管のレベルに非化膿性胆管炎が誘導された。また、胆管上皮に従来、報告のない好酸性変性像がみられた。【考察と結論】肝凍結切片による検討で、PBCの小葉間胆管にはPDC-E2を認識するモノクローナル抗体と反応する物質の発現がみられた。他の疾患の小葉間胆管でもこの物質の発現があったが、軽度あるいは散在性に分布していた。この事より、PBCの障害胆管でのPDC-E2の発現がPBCに特異的とは言えないが、PBCでその発現が亢進していることが示唆された。しかし、PBCおよび非PBC症例において、肝細胞と増生細胆管にもPDC-E2反応性物質の発現が同様にみられた。このことは、このPDC-E2反応性物質そのものの発現は肝細胞や細胆管では非特異的なものであることを意味している。特に、増生細胆管では疾患に関係なくPDC-E2の発現が増強している現象はPDC-E2発現の実態を知る上で重要な所見の1つと思われる。次に、PBCの胆汁中にモノクローナル抗体でPDC-E2と思われる物質が検出されたが、対照例では検出されなかった。このことは、PBCの胆汁中にPDC-E2あるいはその類似物質が多く存在することを意味する。なお、PBCの小葉間胆管にはPDC-E2を認識するmRNAを検出出来なかったので、これらの物質は胆管上皮が産生している証左は得られなかった。むしろ、胆汁中のPDC-E2が吸収されている可能性も今後、検討する必要があると思われた。最後に、PBCの慢性非化膿性胆肝炎に似た動物モデルの作成に成功した。今後、種々の免疫学的操作を加え、PBCの胆肝炎により似たモデルの作成を行う。【材料・方法・結果】1.肝内小葉間胆管の胆管上皮でのPDC-E2発現の検討:PDC-E2のinner lipoic

domainを認識することが知られているモノクローナル抗体であるC355.1(米国の共同研究者が作成)を用い、材料はPBCの肝11例と慢性肝炎などの対照肝12例の凍結肝切片である。方法は酵素抗体間接法(ABC)、共焦点レーザー顕微鏡、免疫電顕である。一次抗体としてC355.1を使用した。主に肝内小葉間胆管、肝細胞、浸潤単核細胞、血管平滑筋に種々の強さで陽性像がみられた。PBCでは、小葉間胆管に強い発現がみられ、特に核上部の胞体で明瞭であった。非PBC症例の小葉間胆管では、少数の小葉間胆管が陽性であったが、弱陽性陰性の小葉間胆管が多くみられた。なお、グ鞘周囲の肝細胞と増生細胆管には、症例、疾患に関係なく、強い発現がみられた。2.肝内小葉間胆管の胆管上皮でのPDC-E2mRNAの発現:in situ hybridization法を用い検討した。材料はPBC肝11例と慢性肝炎等の対照肝12例の凍結切片を用いた。in situ hybridization法として、PDC-E2のinner lipoicdomain領域に対するRNAプローブ(ジゴキシゲニン(DIG)標識でハイブリダイゼーション後、免疫染色でDIGを検出した。mRNAのシグナルは、肝細胞、増生細胆管、浸潤単核細胞に明かな陽性像があったものの、小葉間肝胆管ではPBCおよび非PBC症例共に、弱陽性陰性であった。3.胆汁中のPDC-E2の検出:ウェスタンブロット法で検出を試みた。材料はPBCの胆嚢胆汁4例(肝移植時に採取)と肝内結石症の胆管胆汁4例(肝切除術時に採取)を用いて、PDC-E2の一次抗体C355.1を用いて。なお、発色はABC法で行った。PBCの胆汁では、4例全例で74kDの部位に陽性のバンドがみられた。しかし、肝内結石症例では、この部には陽性のバンドがみられなかったので、PBCに特徴的と考えられた。4.動物モデルの開発:液性免疫の異常、IL-2の産生障害を来すALYマウスを用い、PBCのモデル動物の作成を試みた。自然発生的に、肝内胆管のレベルに非化膿性胆管炎が誘導された。また、胆管上皮に従来、報告のない好酸性変性像がみられた。【考察と結論】肝凍結切片による検討で、PBCの小葉間胆管にはPDC-E2を認識するモノクローナル抗体と反応する物質の発現がみられた。他の疾患の小葉間胆管でもこの物質の発現があったが、軽度あるいは散在性に分布していた。この事より、PBCの障害胆管でのPDC-E2の発現がPBCに特異的とは言えないが、PBCでその発現が亢進していることが示唆された。しかし、PBCおよび非PBC症例において、肝細胞と増生細胆管にもPDC-E2反応性物質の発現が同様にみられた。このことは、このPDC-E2反応性物質そのものの発現は肝細胞や細胆管では非特異的なものであることを意味している。特に、増生細胆管では疾患に関係なくPDC-E2の発現が増強している現象はPDC-E2発現の実態を知る上で重要な所見の1つと思われる。次に、PBCの胆汁中にモノクローナル抗体でPDC-E2と思われる物質が検出されたが、対照例では検出されなかった。このことは、PBCの胆汁中にPDC-E2あるいはその類似物質が多く存在することを意味する。なお、PBCの小葉間胆管にはPDC-E2を認識するmRNAを検出出来なかったので、これらの物質は胆管上皮が産生している証左は得られなかった。むしろ、胆汁中のPDC-E2が吸収されている可能性も今後、検討する必要があると思われた。最後に、PBCの慢性非化膿性胆肝炎に似た動物モデルの作成に成功した。今後、種々の免疫学的操作を加え、PBCの胆肝炎により似たモデルの作成を行う。
AALA途上諸国の飢餓・貧困・環境破壊と日本のODAの役割に関する総合的研究

本研究においては途上国経済論を専攻する研究者集団が共同して地域研究とテーマ別研究とを行い、その研究成果を統合する中で、本研究が掲げている研究課題に接近するという方法を採っている。本年度は、次の二つの研究を行なった。ひとつは、AALA途上諸国の飢餓・貧困・環境破壊の原因と因果関係を解明することに取り組んだ。そのために、アジア(フィリピン、ミュンマー)、中東、サハラ以南のアフリカ(南アフリカ)およびラテン・アメリカ(ブラジル)の国際比較研究をおこなった。他のひとつは、1990年代から21世紀にかけて日本が、AALA途上諸国が現在直面している飢餓・貧困・環境破壊という深刻な諸問題を解決する上で、果たしうる役割をODAを中心に考察した。昨年度の研究成果と今年度の研究成果を集め、本研究の取り纏めを行なった。その結果、途上国経済論の理論的研究((1)研究方法、(2)開発経済学の新動向、(3)多国籍企業と途上国、(4)一次産品問題と国際価値論、(5)国際援助政策論-日本のODAを中心にして)と現状分析((6)韓国-財閥の形成と展開、(7)フィリピン-債務危機と貧困、(8)ミャンマー-市場経済化への苦悩、(9)中東-都市化と人口移動、(10)ブラジル-従属的発展と環境破壊、(11)南アフリカ-インフォーマル・セクターの展開)とを有機的に結合した新たな研究成果を挙げることができた。なお、この研究成果は、森野勝好・西口清勝編『発展途上国経済論』(ミネルヴァ書房)として、1994年6月に刊行される予定である。本研究においては、途上国経済論を専攻する研究者集団が共同して地域研究とテーマ別研究を行い、その研究成果を統合する中で、本研究が掲げている研究課題に接近するという方法を採っている。本年度は、地域研究として比較研究を行い、いわゆる「外向き型」(輸出指向型)経済発展戦略を採用したアジアNIEs(韓国)やSSEAN諸国(マレーシア)の経済発展の経験を、それが挫折したフィリピンや「内向型」のミャンマーやインドのそれと対比した。さらに、こうしたアジア諸国の1080年代の経済戦略を中近東やラテン・アメリカの諸国のそれと比較研究した。テーマ別研究としては、途上諸国の一次産品=交易条件の悪化の問題や債務累積問題、資金援助なかでも日本のODAの問題を取り上げ、さらに開発経済学のサーベイを行なった。本年度の研究は、次年度の成果取り槻めのための地域研究とテーマ研究の基礎的サーベイに重点を置いたものであったがそれでも、総合研究の効果が発揮され、いくつかの知見が得られた。ひとつは、1980年代と違い90年代に入って、途上国の飢餓・貧困・環境破壊からの脱出の曙光が微かながら見えてきたことである。なかでも、債務の重圧からの解散の展望を世界銀行が昨年(1992年)末に打ち出したことの意味を大きく、世界銀行が提唱してきている「市場補完型(market-friendly)アプローチ」の有効性が、ラテン・アメリカ諸国を中心に実証されてきているとわれわれは判断している。また、環境問題に関して「サスティナブル・ディベロップメント(ses tainble devolopment)の概荷の多様な解釈の中での正確な理解の必要を本研究グループが痛感していることも付言しておきたい。

他のひとつは、1990年代から21世紀にかけて日本が、AALA途上諸国が現在直面している飢餓・貧困・環境破壊という深刻な諸問題を解決する上で、果たしうる役割をODAを中心に考察した。昨年度の研究成果と今年度の研究成果を集め、本研究の取り纒めを行なった。その結果、途上国経済論の理論的研究(【.encircled1.】研究方法、【.encircled2.】開発経済学の新動向、【.encircled3.】多国籍企業と途上国、【.encircled4.】一次産品問題と国際価値論、【.encircled5.】国際援助政策論-日本のODAを中心にして)と現状分析(【.encircled6.】韓国-財閥の形成と展開、【.encircled7.】フィリピン-債務危機と貧困、【.encircled8.】ミャンマー-市場経済化への苦悩、【.encircled9.】中東-都市化と人口移動、〓ブラジル-従属的発展と環境破壊、〓南アフリカ-インフォーマル・セクターの展開)とを有機的に結合した新たな研究成果を挙げることができた。なお、この研究成果は、森野勝好・西口清勝編『発展途上国経済論』(ミネルヴァ書房)として、1994年6月に刊行される予定である。
中枢性神経障害痛モデル動物の開発と疼痛発現機序の解明

本研究は,神経障害疼痛に対する脊髄ケモカインの機能的役割と中枢性神経障害痛モデルの開発について検討しました。(1)神経障害痛モデル動物で,脊髄でケモカインCCL-1およびCCL-1受容体のCCR-8の発現が神経障害痛に関与するこを見出しました。(2)ヒトの痛を考えるために,脳内の帯状回(ACC)に注目しました。その結果,帯状回のムスカリンM1受容体が神経障害痛に関与していることを証明しました。(3)脳内GABAB受容体遮断がアロディニア発現を引き起こすことを見出し,中枢性神経障害痛モデルとして可能性を証明しました。(4)アセチルコリン分解阻害剤が末梢神経障害痛を抑制することを見出しました。本年度は、主に薬物投与による中枢性疼痛モデルの確立と炎症性ケモカインの関与について検討した。疼痛抑制に関与する脳内GAGA作動性神経路の遮断が疼痛発現を誘導すると考え、GABA受容体遮断薬の脳室内投与を行った。その結果、脳内GABA受容体の遮断が機械刺激性アロデニアを誘導した。そのアロデニアは、GABA-B受容体遮断薬で強く現れた。さらに、脳内GABA受容体遮断による中枢性疼痛はグルタミン酸NMDA受容体遮断薬によって緩和された。これらの結果から、少なくとも脳内GABA受容体遮断による中枢性疼痛発現にはグルタミン酸遊離を介したNMDA受容体活性化の関与が示唆された(投稿準備中)。一方、すでに行動実験で脊髄投与した炎症性ケモカインCCL1がグルタミン酸NMDA受容体を介し疼痛に関与することを示唆したが、新たに電気生理実験(生理研との共同実験)でそのことを明確にした(Cell Death & Disease, in press)。以上の結果は、炎症性ケモカインが脳出血より活性化されたグリア細胞から遊離されることは知られていることから、脳出血による中枢性疼痛の仕組みを考える上で重要な情報と意義を提供する。すなわち、1脳出血により活性化されたグリア細胞が炎症性ケモカインを遊離することでNMDA受容体を活性化し痛みを発現する、あるいは2脳出血により疼痛抑制に関与するGABA作動性神経活性(GABA作動性神経または受容体の損傷)低下がその痛み発現に寄与すると考えられる。一方、脳内ムスカリン受容体刺激が脳内疼痛促進経路を抑制すること(Brain Res.投稿中)やアセチルコリン分解酵素阻害剤の全身投与が中枢性ムスカリン受容体を介し疼痛緩和に有効であることを明確にした(86回日本薬理学会総会報告)。これら結果は、ムスカリン作動薬が新たな鎮痛薬として期待できる可能性を示唆する。本年度は、まず神経障害疼痛における脳内鎮痛系について検討した。神経障害疼痛はモルヒネ鎮痛に対し抵抗性を持つことが知られている。そこで、モルヒネの抗侵害効果の減弱の仕組みについ脳内モルヒネ受容体に注目し、糖尿病性神経障害疼痛モデルマウスを用い検討した。その結果、モルヒネによる抗侵害作用は非糖尿群に比べ糖尿病群で有意に減弱した。さらに、脳内PAG周囲のオピオイドμ受容体の発現量は、糖尿群で非糖尿群に比べて糖尿病マウスで約44%の減少が認められた。これらの結果から、糖尿病性神経障害疼痛におけるモルヒネ抗侵害効果の減弱は、PAG周囲のオピオイドμ受容体の減少による下行性疼痛抑制系の減弱が原因である可能性が示唆された。一方、末梢性神経障害疼痛の発現には末梢神経のミトコンドリア障害の関与が示唆されている。しかし、その詳細は明らかではない。私達は、抗がん剤パクリタキセ(PTX)の処置が、痛覚過敏発現に伴って坐骨神経組織のシュワン細胞のミトコンドリアの異形化・空洞化を引き起こすことを明らかにした。さらに、PTXによる末梢神経障害疼痛はミトコンドリア機能改善薬acetyl-L-carnitineの処置で抑制された。一方、PTX投与による運動機能障害は観察されなかった。これらの結果は、シュワン細胞のミトコンドリアの機能障害が、末梢神経障害疼痛の発現に深く関与していることを示唆する。本年度の研究結果は、神経障害疼痛発症には脳内オピオイドμ受容体の減少による脳から脊髄に投射する下行性疼痛抑制系の低下と末梢神経組織のシュワン細胞ミトコンドリアの機能不全が、深く関与することを明らかにした。また、ミトコンドリア機能改善薬の投与が神経障害疼痛の緩和に有効であることをも明らかにした。以上の研究結果は、神経障害疼痛の仕組みの解明と治療法の確立に寄与すると考えられる。

本年度は,脳出血モデルとしてラットを用い,(1)血液(尾静脈から採取)を直接脳内に注入する(2)コラゲナーゼを直接脳内に注入する,この2つの方法を用い視床内あるいは視床周辺出血による視床痛を反映する疼痛動物モデルを樹立することに焦点を当てた。その結果,コラゲナーゼの視床内投与は投与部位での脳出血が認められ,すべての動物ではないが一部の動物で仮性疼痛行動(機械刺激に対して逃げる・攻撃,鳴く)が観察された。また,採血した尾静脈血を視床内投与したモデルにおいても,一部の動物で仮性疼痛行動が観察された。一方,抗がん剤パクリタクセルを投与した末梢性神経障害モデルにおいては,疼痛発現と維持に脊髄アストログリア細胞が関与し,その活性阻害剤は疼痛を緩和することを見出した(85回日本薬理学会年会発表)。また,坐骨神経部分絞扼による神経障害モデルにおいて神経障害後に発現する炎症性ケモカインCCL-1の増加とミクログリア細胞の過剰な活性化・増殖が,疼痛の発現に深く関与することを明らかにした(Mol. Pain投稿中)。これらの結果は,中枢性神経障害による疼痛発現の仕組みを解明するうえで重要な情報を提供する。また,私達は末梢神経障害疼痛モデルを用いて大脳皮質帯状回内のムスカリンM1受容体がGABA作動性神経を介し末梢神経障害痛を抑制することを明らかにした(Brain Res投稿中,8th IBRO World Congress Neuroscience発表)。この結果は,帯状回は痛みの情動的側面に関与することが推測されることから帯状回に投射するコリン作動性神経の役割の解明は脳内の疼痛発現と疼痛抑制の仕組みに新たな知見を与えることが期待できる。目標であるヒト中枢性疼痛モデルとしての脳出血モデルの確立と評価は再現性が困難であった。その理由には、出血を誘導するコラゲナーゼ酵素の作用が不安定で、一定の局所に投与しても出血の範囲が一定でないことが考えられた。そこで、技術的に容易であり出血に依存しない、薬物(GABA受容体遮断薬)の脳室内投与による中枢性疼痛モデルの作成を試みた。その結果、再現性がよい中枢性疼痛モデルを確立することが出来た。さらに、その疼痛発現にはグルタミン酸NMDA受容体が関与することも明らかになった。一方、共同実験であるが、脳出血より活性化されたグリア細胞から遊離されると推測される炎症性ケモカインCCL1が脊髄でグルタミン酸を遊離しNMDA受容体を介して機械刺激性アロデニア発現に関与することを電気生理学実験で明確にした(Cell Death & Disease, in press)。このように、炎症性ケモカインと抑制性GABA受容体遮断がグルタミン酸NMDA受容体興奮を介して疼痛発現に関与することを明らかにしたことは、本研究目的である炎症性ケモカインの中枢性疼痛への関与を解明するの上で貴重な情報を得ることができ、今後の研究に方向性を示してくれたことは評価できる。さらに、動物実験で神経型アセチルコリン分解阻害薬が抗がん剤や糖尿病による痛みを中枢性ムスカリン受容体を介して緩和することも明らかにした(86回日本薬理学会総会発表)。この結果は、脊髄あるいは脳内ムスカリン受容体の活性化が疼痛抑制に関与することを示唆するとともに、アセチルコリン受容体作動薬が、新たな鎮痛薬となり得ることを示唆する。このことは、研究課題の一つである痛み伝達へのコリン作動神経の関与を明確にした点とアセチルコリン受容体作動薬の痛み治療への可能性を示した点で評価できる。
大脳皮質基底核系のアクション・認知機能における動機づけの役割

線条体の細胞が、行動選択肢の報酬価値を表現することを神経生理学実験と計算理論によって検証し、価値の情報が行動選択肢に連合して表現されることを示した。高い価値の選択も可能である時に低い価値の選択を求められると、視床正中中心(CM)核の細胞が活性化され、次善の策を講じるための基盤となることを示唆した。更に、ドーパミン細胞が長期的な価値とその誤差を表現することを発見し、複数ステップの行動によってゴールに到達する上で必須の役割を担うことを示唆した。1.線条体細胞による行動選択肢の価値の表現木村と上田は、人間情報通信研究所(ATR)の銅谷賢治、鮫島和行と共同研究を行い、「線条体の投射細胞が、ドーパミンによる報酬予測の誤差信号に基づいて、行動選択肢の報酬価値を表現する」という仮説を検証する研究を行った。ハンドルの右倒し、左倒し運動によって得られる報酬確率を10,50,90%の3段階で組み合わせ、試行錯誤で価値の高い選択肢を選ぶ行動課題をサルに行わせた。線条体の投射細胞の神経放電を記録したところ、右倒しまたは左倒し運動に選択的に報酬価値の高低を表現するものが39%を占めることを明らかにした。実験研究者と計算理論家が共同研究することによって強化学習仮説を客観的に証明することができた。2.視床線条体系の機能に関する実験研究南本、堀と木村は、大きな報酬を伴う選択肢も可能であるが、わずかな報酬しか得られない選択肢が要求された時には、視床正中中心(CM)核の半数以上の細胞が特異的に活性化されることを発見した。また、大きな報酬を伴う選択肢の要求の後、サルが行動を始める直前にCM核を電流刺激すると、望ましくない選択肢の行動のような行動に変った。以上の結果は、報酬の獲得に向けた望ましい意思決定や行動選択が不可能な場合に、次善の選択肢を選ぶメカニズムを示唆しており、報酬に基づく意思決定と行動選択に関する新しい包括的な理解への突破口を開いた。3.中脳ドーパミン細胞、線条体細胞の発達、形態と機能を支える分子基盤中川は、黒質のドーパミン神経細胞に対する生存維持・遅延性神経細胞死の減少、軸索再生・修復促進効果を持つ物質を探索するために胎生後期の中脳腹側の初代培養系による実験系を確立した。伏木は新規細胞接着分子Igsf4の発現をマウスの発生期脳を対象としてin situ hybridizationによって調べたところ、大脳皮質、基底核、視床、小脳等にて特有の発現を示すことを明らかにした。木村と上田らは、選択肢の中から価値の高い選択肢を判断して選択しながら複数ステップ先に予測されるゴールに到達する過程に線条体と中脳ドーパミン細胞が演じる役割を調べた。日本ザルを訓練して視覚刺激の指示に従って3つの押しボタンの中から試行錯誤によってひとつの正解を見つけ出し、一旦正解ボタンを見つけると再度そのボタンを選択することによって合計2回ないし3回の報酬を得る課題を行わせた。線条体の投射細胞は、各行動選択における報酬確率やゴールまでの各ステップに選択的な放電活動をするものが多く見られた。中脳ドーパミン細胞の約7割の細胞がゴールまでの各ステップに選択的な放電をし、ゴールまでの各ステップに選択的な放電活動が強化学習理論で用いる価値関数(ゴールまでに得られると期待される報酬で、将来の報酬は割り引いて推定する)とその予測誤差を良く反映することが明らかになった。中川と木村は、ドーパミン受容体系を障害したラットを作成し、その行動・認知機能異常の機序を学習による選択肢の報酬価値の獲得とそれに基づく行動選択に重点を置いた実験を進行中である。一方、ドーパミンの神経系の機能回復に対する持続的治療法の開発のためにマウスの胎生後期の中脳腹側の初代培養系を用いて黒質ドーパミン神経の遅発陛細胞死を阻止する実験も行った。また、パーキンソン病で蓄積しているalpha-synucleinに対するneurosin(kallikrein-6)の分解活性を検討し、neurosinによるalpha-synucleinの主たる切断部位はNAC domainの中央部に相当するK80/T81間であることを明らかにした。伏木らは、低用量ビスフェノールAの胎生期投与がマウス大脳皮質形成過程に影響を及ぼすことを明らかにした。細胞増殖への影響は見られなかったが、神経細胞分化ならびに移動に対して促進的に作用することが判明した。また低用量ビスフェノールAの胎生期から新生仔期にかけての投与によって黒質神経細胞の減少をきたすことが判明した。本研究の目的は,大脳皮質-大脳基底核系を介して実現するアクション機能と認知機能に果たす情動,特に動機づけの神経情報処理メカニズムを明らかにすることである。

木村の研究室での神経生理学研究によって大脳皮質-大脳基底核系のしくみを調べる研究が中心であるが,「統合脳」的アプローチを重視して,強化学習理論を中心とする計算論研究者との共同研究によって脳の回路・機能を反映する計算モデルを構築したり,臨床神経科学者との共同研究によって動物実験での成果をヒトの脳機能とその障害の理解に至る統合的な研究を目指している。本年度は,1)ドーパミン細胞による複数ステップ行動の価値の割り当てと,報酬の予測誤差情報の表現,2)価値判断,意志決定や行動選択のための線条体細胞の活動,3)線条体細胞の活動特性に基づく強化学習モデルの検証と,ドーパミン信号の関与,4)ヒトと実験動物のドーパミン系の障害に起因する行動・認知機能異常の神経細胞機能,形態,分子メカニズムの検証,に関する研究を推進した。このうち2)について,線条体の神経細胞が過去の履歴や現在の文脈に基づいて報酬や嫌悪などの予測と判断に関わることを明らかにした(発表論文2)。更に4)についても,レンズ核線条体梗塞,アレキサンダー病の病態生理,胎生時のビスフェノールの大脳皮質構築に及ぼす効果について成果を得て発表した(論文1,3-6)。木村は,ドーパミン細胞の機能に関する総説を発表した(論文7)。本研究の目的は、大脳皮質-大脳基底核系のアクション・認知機能における動機づけの役割を明らかにすることである。特定の'行動戦略'に基づく意志決定と行動選択に線条体が関与するかどうかを調べた。ニホンザルを対象に、3つの押しボタンの中から特定の選択肢を試行錯誤によって選択し、その後そのボタンを再度選択することによって合計2回または3回の報酬を得る行動課題を行わせた。行動選択の後、結果の正否を知らせる強化子(ビープ音)前後の線条体の投射細胞の放電を記録した。線条体には、選択肢の価値(報酬確率:第一、第二、第三選択; 33%、50%, 85%)、選択肢、そして強化子を表現する細胞が多く見つかった。更に、探索と繰り返しの戦略特異的に放電をする細胞がみられた(251個の細胞中46個)。この結果は、線条体の細胞の活動が行動戦略を表現することを初めて明らかにした。探索細胞は負の強化子に、繰り返し細胞は正の強化子に選択的に応答したので、大脳前頭前野にみられるルールや行動戦略細胞が知識を表現すると考えられることと異なり、線条体の細胞は戦略に基づく意志決定と行動選択に関与することが示唆された。木村と中川は、alpha-synucleinの分解活性を有するneurosinが、細胞内ではERに局在し、細部外でプロテアーゼとして機能する可能性を示した。また、脳脊髄液中のalpha-synucleinのoligomerとmonomerを高感度で測定できる系を確立した。木村と伏木は、ゲノムDNAのメチル化状態の変化をRestriction Landmark Genomic Scanning法によって網羅的に調べたところ、胎齢12.5日目で0.9%、胎齢14.5日目では0.7%のスポットがBPA曝露による変動を示し、DNAメチル化の減少ならびに増加が生じることを明らかにした。本計画研究課題は、以下の3点にわたって大きな実績を挙げることができた。1.線条体ニューロンによる行動選択肢の価値の表現:木村と上田は、計算論的神経科学の研究者である銅谷賢治(ATR)、鮫島和行(玉川大学)と共同研究を行い、「線条体の投射ニューロンが、ドーパミンによる報酬予測の誤差信号に基づいて、行動選択肢の報酬価値を表現する」という仮説を、サルを対象とする神経生理学実験研究と計算理論によって検証した。
アメリカ大平原オガララ帯水層地域における灌漑化の進展と持続的環境利用

アメリカ合衆国の大平原ハイプレーンズ地域では、1960年代以降、アメリカの最大の地下水資源であるオガララ帯水層からの揚水が活発化してセンターピポット灌漑が進展し、地域経済や社会に著しい変化が生じるとともに、持続的な環境利用が重要な課題となった。本研究は、地下水の利用と管理、灌漑農業、土地利用方式、肥育・食肉加工業、人口動態、民族集団、日本との経済的関係などについて現地調査に基づいて検討し、それらの作業を通じてハイプレーンズの地域生態を解明するとともに、持続的環境利用の在り方を考察することを目的とした。過去2年間の現地調査の結果を踏まえて、7月から9月にかけてカンザス州南西部とテキサス州北西部をおもな調査地域として現地調査を実施した。河川灌漑の時代に展開した甜菜糖産業、センターピポット灌漑装置の普及にともなって劇的に変化したサンドヒルズ地帯の土地所有と土地利用、1990年代中頃から急速に発展した企業的養豚業と大規模酪農、地方都市の機能と商業的土地利用、人口動態と小都市の動向、地下水面の低下と地下水管理地区の実態、日系企業の進出動向などについて、新しい調査結果を蓄積することができた。こうした研究成果の一部はすでに学術論文として公表した。今後とも研究成果を継続的に学術雑誌に投稿するようにつとめるほか、単行本として研究成果を広く公表することを計画している。また、オガララ帯水層地域で得られた知見をアメリカ西部の他の灌漑地域と比較検討する研究プロジェクトを計画しており、灌漑農業地域の持続的環境利用について今後も継続して研究するつもりである。アメリカ合衆国の大平原ハイプレーンズ地域は、1960年代以降、アメリカ最大の地下水資源であるオガララ帯水層からの揚水が活発化し、その結果、著しい地域変化が生じた。すなわち、センターピボット灌漑システムが普及して飼料作物が増産されると、肥育牧場が急速に増加して肥育業が発展し、大規模な食肉工場が集中するようになった。こうした経済活動は人口流入と人口構成の変化をもたらした。本研究は、地下水の揚水と利用、地下水汚染と地下水管理、灌漑農業、土地利用と農業経営、牛肥育業と食肉加工業、人口流入とエスニック集団、日本との経済的関係などについて現地調査に基づいて検討し、ハイプレーンズの地域生態を解明するとともに、持続的な環境利用の在り方を考察することを目的とする。本年度は研究第1年目であるので、基本的な資料の収集と所在の確認、研究者との交流を通じた情報収集を行った。このために、カンザス州立大学(マンハッタン)、カンザス大学(ローレンス)、カンザス州政府機関と州立歴史資料館(トピカ)、合衆国地質調査所(デンバー)を初めとする関係機関を訪問した。また、カンザス州南西部のガ-デンシティ地域において、灌漑農業、肥育業と食肉産業、都市構造、地下水管理などについて現地調査を実施した。さらに、広域なエクスカーション(カンザス州、ネブラスカ州、テキサス州、コロラド州)を実施して現地討議を行った。こうした作業を通じて、ハイブレーンズの地域的枠組みと地域の諸問題を把握することができた。次年度は、研究分担者の調査課題に応じて研究対象地域を設定し、本格的な調査を実施する予定である。アメリカ合衆国の大平原ハイプレーンズ地域では、1960年代以降、アメリカ最大の地下水資源であるオガララ帯水層からの揚水が活発化し、著しい地域変化が生じた。本研究は、地下水の揚水と利用、地下水管理、灌漑農業、土地利用と農業経営、牛肥育業と食肉加工業、人口流入とエスニック集団、日本との経済的関係などについて現地調査に基づいて検討し、ハイプレーンズの地域生態を解明するとともに、持続的な環境利用の在り方を考察することを目的とする。第2年目の本年度は、カンザス州南西部のガーデンシティ地域とテキサス州北部ラボック地域を主な研究対象地域として現地調査を実施するとともに、関係機関での資料収集につとめた。

その結果、センターピボット灌漑システムの普及過程、サンドヒル地帯の土地所有の変化と飼料作物栽培の進展、地下水管理の方法と組織、フィードロット(肥育牧場)の経営と増加、大規模な食肉工場の進出とその影響、ベトナム・ラオス系難民の流入とエスニック社会の特徴、農業地帯の小都市の土地利用と構造、日系企業の進出状況などについて資料を収集し理解を深めることができた。これらの研究成果のうち、フィードロットの展開と牛肉産業、および灌漑化と農業地域の変化に関しては、論文を公表することができた。次年度も、研究分担者の調査課題に応じて研究対象地域を設定し、本格的な現地調査を継続する予定である。また、研究成果を順次公表するとともに、成果を単行本として刊行する準備を始める計画である。アメリカ合衆国の大平原ハイプレーンズ地域では、1960年代以降、アメリカ最大の地下水資源であるオガララ帯水層からの揚水が活発化してセンターピボット灌漑が進展し、地域経済や社会に著しい変化が生じるとともに、持続的な環境利用が重要な課題となった。本研究は、地下水の利用と管理、灌漑農業、土地利用方式、肥育・食肉加工業、人口動態、民族集団、日本との経済的関係などについて現地調査に基づいて検討し、それらの作業を通じてハイプレーンズの地域生態を解明するとともに、持続的環境利用の在り方を考察することを目的とした。過去2年間の現地調査の成果を踏まえて、7月から9月にかけてカンザス州南西部とテキサス州北西部をおもな調査地域として現地調査を実施した。河川灌漑の時代に展開した甜菜糖産業、センターピボット灌漑装置の普及にともなって劇的に変化したサンドヒルズ地帯の土地所有と土地利用、1990年代中頃から急速に発展した企業的養豚業と大規模酪農、地方都市の機能と商業的土地利用、人口動態と小都市の動向、地下水面の低下と地下水管理地区の実態、日系企業の進出動向などについて、新しい調査結果を蓄積することができた。こうした研究成果の一部はすでに学術論文として公表した。今後とも研究成果を継続的に学術雑誌に投稿するようにつとめるほか、単行本として研究成果を広く公表することを計画している。また、オガララ帯水層地域で得られた知見をアメリカ西部の他の灌漑地域と比較検討する研究プロジェクトを計画しており、灌漑農業地域の持続的環境利用について今後も継続して研究するつもりである。
生体システムの超離散解析

1.任意のセルオートマトンの時間発展パターンを安定に保存する逆超離散化の手法として、filter函数の概念を提出し、様々なcellular automatonに適用し、その有効性を確認した。filter函数の存在によって、パターン生成に対して連立系が必然的であることのひとつの理由付けが得られた。2.宮崎医科大学で行われた実験データをもとにパラメータの値を推定して得られた方程式が,血圧の変化の効果がない場合にを再現することなど,実験結果に定性的に一致することを確認したが、思うような結果は得られなかった。そのため、3ないし5拍動の時間遅れを考慮し、過去10拍動程度の履歴まで取り入れた非線型差分方程式を提案した。3.得られた非線形離散方程式を数値シミュレーションにる血圧制御への影響を調べることを試みた。非線型方程式に対する線形安定性の議論に基づいて、安定点および定常解の安定性についての議論を行った。また、その結果と実験データの比較検討を行った。その結果、やはり、ホルモンの影響など長期的な安定性をもたらす効果を考慮しなければ定量的には良い結果は得られないことがわかった。4.有限系のセルオートマトンを解析するために、周期的境界条件を課したセルオートマトン系の性質を、数値アルゴリズムとの関係、ブール代数などの観点から議論した。その結果、箱玉系と呼ばれる単純な系では、保存量、解、などを具体的に表示することが可能であること、代数的な構造として、無限系で見られたクリスタルのintertwinerであるR行列の作用が、有限系でも別の形で表現されていることなどがわかった。1.burstによる血圧変化,血圧変化と3種類の神経束の興奮の関係(特に興奮を引き起す積分値の閾値),神経束興奮からburstまでの時間遅れなどをパラメータとして,血圧の定常値からの時間変化を満たす非線形離散方程式を求めた.そして,閾値には確率変数を導入した2.宮崎医科大学で行われた実験データをもとにパラメータの値を推定し,得られた方程式が,血圧の変化の効果がない場合にを再現することなど,実験結果に定性的に一致することを確認することを試みた。特に閾値の値の決定を試みた。3.得られた非線形離散方程式を数値シミュレーションによって,各要因(パラメータ)の血圧制御への影響を調べることを試みた。安定点および定常解の安定性についての議論を行った。4.非線形離散方程式とセルオートマトンの関係を確立するために、任意のセルオートマトンの時間発展パターンを安定に保存する逆超離散化の手法を開発し、いくつかのelementary cellular automatonに適用し、その有効性を調べた。
紫外線照射によって非等方的な強結合状態を持つ微粒子プラズマの生成とダイナミクス

平成16年度に引き続き、非等方的な結合状態を持つ微粒子プラズマを生成するために、RFプラズマ中での微粒子雲への紫外線照射に関する実験を行った。より光電子放出の効果を明確に観測するために、微粒子の粒径及び材質に関して検討を行った。シース中で捕捉された負帯電微粒子は、光電子放出により帯電量を失うため、微粒子の静電気力が重力に対抗できずに落下する可能性がある。ボーム条件より求めたイオンシース電界とイオンの軌道偏向を考慮した微粒子帯電量より微粒子の浮遊条件を評価すると、粒径が小さい微粒子では光電子放出が頻繁な条件でも安定に浮遊することができることが分かった。また、仕事関数が明確に評価できないアクリル微粒子よりも、仕事関数が4.3eV程度である酸化マグネシウム微粒子を用いることで、光電子放出が活発になると考えられる。そこで、粒径の小さな酸化マグネシウム微粒子を用いた紫外線の照射実験を行った。Arガス圧1050Paでリングアンテナを用いてRFプラズマを生成し、酸化マグネシウム微粒子を真空容器内の負バイアス電極によって静電的に捕捉した。用いた酸化マグネシウム微粒子の平均的な粒系は、粒径50nm、200nm、10μmで粒径に分散を持つものを使用した。微粒子の観測にはHe-Neレーザーによる微粒子からの散乱光を通常のビデオカメラと高速度カメラ(本申請で購入)で撮影した。アクリル微粒子(粒径10±2μm)を用いた場合と同様に、鉛直方向の規則的な配列を持った鎖状の構造を持つ微粒子雲が観測された。鉛直方向に強結合状態で、水平方向には比較的自由に緩やかに振動運動をしている。粒径の違う微粒子を用いたにもかかわらず、捕捉された微粒子雲の形状および構造はほとんど変化しない。生成した鎖状微粒子雲に重水素ランプを用いて水平方向から紫外線を照射したものの、紫外線が微粒子挙動に与える影響ははっきりと観測されなかった。これらの結果より、微粒子の近傍から協力な紫外線を当てる必要があり、実験装置の変更を行っている。以上の内容に関して、Fourth International Conference on the Physics of Dusty Plasma(Orleans, France 2005)にて発表を行い、New Vistas in Dusty Plasmas(AIP Conference Proceedings Vol. 799)に掲載された。1050Paのガス圧においてリングアンテナにRF電力(13.56MHz)を印加してArプラズマを生成し、外部から投入した帯電微粒子を静電的に捕捉した。真空容器内に微粒子閉じ込め用の負バイアスリング電極、および円板電極を設置し、シース電場中で帯電微粒子を捕捉した。微粒子の観測にはHe-Neレーザーによる微粒子からの散乱光を通常のビデオカメラ及び高速度カメラ(本申請で購入)で撮影することで行った。帯電微粒子群はプラズマ中で鉛直方向の規則的な配列を持った鎖状の構造を持っており、水平方向には鉛直方向の微粒子列の構造を持ったまま緩やかに振動している様子が観測された。微粒子雲は鉛直方向に強い結合状態を持っていると考えられる。また水平方向の微粒子の振動の相関より、鉛直方向に伝播するダスト格子波が存在すると考えられる。現在、高速カメラを用いた微粒子位置の測定によって、微粒子間の振動の相関の解析を進めている。以上の実験で生成した鎖状微粒子雲に重水素ランプ及び紫外線LEDを用いて紫外線を照射し、紫外線が微粒子挙動に与える影響の観測を試みた。重水素ランプを用いて実験を行ったが、ランプから微粒子雲までの距離が遠いことなどから、顕著な変化が観測されなかった。そこで、円板電極に紫外線LEDを埋め込み、微粒子雲の直下5mmの近距離から紫外線を照射し、微粒子雲の挙動変化の観測を試みた。紫外線LEDからの微量の熱(数十mW)による熱泳動力が原因と考えられる微粒子雲内の回転運動が観測された。これらの結果より、微粒子の近傍から熱泳動力が発生しないような形で紫外線を当てる必要があり、実験装置の変更を行っている。以上の内容をまとめ、現在論文投稿の準備中である。

アクリル微粒子(粒径10±2μm)を用いた場合と同様に、鉛直方向の規則的な配列を持った鎖状の構造を持つ微粒子雲が観測された。鉛直方向に強結合状態で、水平方向には比較的自由に緩やかに振動運動をしている。粒径の違う微粒子を用いたにもかかわらず、捕捉された微粒子雲の形状および構造はほとんど変化しない。生成した鎖状微粒子雲に重水素ランプを用いて水平方向から紫外線を照射したものの、紫外線が微粒子挙動に与える影響ははっきりと観測されなかった。これらの結果より、微粒子の近傍から協力な紫外線を当てる必要があり、実験装置の変更を行っている。以上の内容に関して、Fourth International Conference on the Physics of Dusty Plasma(Orleans, France 2005)にて発表を行い、New Vistas in Dusty Plasmas(AIP Conference Proceedings Vol. 799)に掲載された。
窒素収支からみた環境保全的農地基盤の研究

イネは用水に含まれる窒素分などを栄養分として取り込み、また土壌の吸着機能もあって、水田は水質の浄化機能を有している。しかし水管理が悪いと、肥料分を河川に流出させることもある。そこで本研究では、既に報告されている水田の窒素収支について、水田の整備水準と水管理の視点から再検討し、水田の特性(汚染型か浄化型か)が水田の整備水準および水管理でどこまで説明できるのかを明らかにすることを目的とした。(1)既往研究の再検討・水田と水質に関する既往研究について、水田基盤整備の視点から再検討した。すなわち、均平精度・給水方式・排水方式が明示されている水田については、これらをパラメータに水質浄化(あるいは汚染)を説明した。(2)窒素収支の把握・整備された水田と未整備水田とで、用水および排水の量と窒素含有量を定期的に観測した。・土壌サンプリングおよび測定により、水田土層中の窒素の吸着・脱窒・揮散の量を推定した。(3)ライシメータ試験・実圃場スケールでは、水田土層中の窒素の吸着・脱窒・揮散の量を正確に捉えることは困難なので、ライシメータにおいて連続観測した。(4)水田の整備水準を上げることが水田が浄化型としての機能を発揮することにどれだけ寄与できるかを明らかにした。
レーザー核融合のロケットの設計研究

本研究の目的は、2020年代の技術を用いて、火星まで積載貨物100トンを運ぶレーザー核融合推進の有人宇宙船を設計することである。研究内容と成果は以下のとおりである。1.核融合ロケット用DTターゲットに対して爆縮シミュレーションを行い、中性子及びα粒子が点火と燃焼に及ぼす影響を解明した。更にこの解析をもとにして、レーザーエネルギー約3MJで150以上の高いターゲット利得を実現する炉心の設計を行った。2.ロケットの推進効率を計算するため2次元電磁粒子コードを開発した。このコードを米国リバモア国立研究所から提案されている宇宙船「ヴィスタ」型の燃焼室設計計算に適用し、コイルの配置と燃焼室内プラズマ挙動の関係を解析することにより、推進効率60%を得た。3.磁気ノズルにおいて磁場との相互作用を利用してプラズマの運動エネルギーを推進エネルギー変換する際に、各種の不安定性(e.g.レーリー・テーラー不安定性)が発生する可能性がある。これを解析するため2次元並びに3次元の電磁粒子コードを開発した。コードの検証のため、茨城大学で行われた実験(磁場を横切るプラズマが引き起こす不安定性)の解析を行った。今後いくつかの改良を加え、コードを完成させる予定である。4.核融合ロケットではD-^3He燃料の使用も考えられる。比較のため、磁場反転配位に基づくD-^3燃料ロケットの基本的特性を解析した。その他、核スピン偏極燃料、ロケット構造、宇宙でのトリチウム取扱い技術と燃料系を検討した。本研究の目的は、2020年代の技術を用いて、火星まで積載荷物100トンを運ぶレーザー核融合推進の有人宇宙船を設計することである。今年度に得られた主な成果は以下のとおりである。1.核融合ロケット用左縮D-Tペレットの核燃焼シミュレーションを行い、中性子加熱が核燃焼特性に及ぼす影響を解明した。さらに、核燃焼ペレットから放出される中性子のエネルギースペクトルを評価した。これはトリチウム増殖、周辺機器の遮蔽設計上有用なデータとなる。2.燃料ペレットの核スピン偏極に関する基礎実験を行い、フォームシェル中の重陽子スピンの動的偏極の可能性を明らかにした。さらに、ペレット中心部の燃料原子核への核スピン拡散の機構について検討した。3.2次元の電磁粒子コードを用いてVISTA型ロケットの燃焼室の設計計算を行った。コイル配置の最適化によって得られた推進効率の最大値は、これまでのところ約55%である。また、プラズマの膨張過程におけるレーリー・テーラー不安定性が推進効率に及ぼす影響を解析するため、3次元コードを開発した。目下、コードの検証を行っている。その他、ロケット構造、システム設計及びトリチウム取扱い技術の検討に着手した。検討内容と成果は以下のとおりである。1.核融合ロケット用DTターゲットに対して爆縮シミュレーションを行い,中性子及びα粒子が真火と燃焼に及ぼす影響を解明した。更にこの解析をもとにして,レーザーエネルギー約3MJで150以上の高いターゲット利得を実現する炉心の設計を行った。このコードを米国リバモア国立研究所から提案されている宇宙船「ヴィスタ」型の燃焼室設計計算に適用し,コイルの配置と燃焼室内プラズマ挙動の関係を解析することにより,推進効率60%を得た。3.磁気ノズルにおいて磁場との相互作用を利用してプラズマの運動エネルギーを推進エネルギーに変換する際に、各種の不安定性(e.g.レ-ソ-・テーラー不安定性)が発生する可能性がある。コードの検証のため,茨城大学で行われた実験(磁場を横切るプラズマがひき起す不安定性)の解析を行った。今後いくつかの改良を加え,コードを完成させる予定である。4.ロケットではD-^3Hl燃料の使用も考えられる。比較のため、磁場反転配位に基づくD-^3Hl核融合ロケットの基本的特性を解析した。
蝸牛階からコルチ器へ　ー高効率な幹細胞誘導への挑戦－

4週齢のモルモットに全身麻酔下に136dBの超強大音を2時間暴露させ、高度難聴モデルを作成に成功した。組織学的にほとんどの外有毛細胞が脱落していることを確認した。音響暴露2週間後の聴力と回転毎での内・外有毛細胞の脱落率を計測し、幹細胞移植後の評価のためのコクレオグラムを作成した。移植する幹細胞はMuse細胞を用い、マイクロカテーテルを蝸牛鼓室階内に挿入して細胞を注入する方法を確立した。音響障害モデルのモルモットに対し、音響暴露翌日に10,000または30,000のMuse細胞を移植したが、細胞移植群では蝸牛内でのGFP陽性Muse細胞はほとんど確認できず、聴力の有意な改善も見られなかった。内耳はその構造的特徴から、幹細胞を内耳再生の標的部位であるコルチ器へ誘導することが困難であるため、内耳幹細胞移植により有意な機能回復が得られたという報告はない。本研究では、コルチ器への幹細胞誘導の最大の障壁である基底板に130dB超の強大音にて基底板裂隙を生じさせ、さらに強い組織傷害によって産生される幹細胞誘導因子により、鼓室階から傷害部位であるコルチ器へ幹細胞を効率的に誘導する新たな効率的組織誘導法の開発へ挑戦する。これまで内耳再生に用いられた内耳障害モデルは、115-120dBの音響暴露で作成されていた。今年度の実験で136dBの超強大音を発生させることのできる音響暴露システムの構築し、従来の音響曝露に比較してより強い内耳障害を惹起することに成功した。動物はモルモット(Hartley strain, 250g350g)を用いた。音響暴露条件は4-8kHz, band noise 136dB(A)で2時間暴露を行った。ABRにて聴力の評価を暴露前、暴露翌日、暴露後1週と2週に行った。組織学的評価はアクチン線維を染めるPhalloidinと有毛細胞マーカーであるMyosin7a、DNAを染色するDAPIを用いて三重染色を行った。基底回転第三回転の5ヶ所を観察し、外有毛細胞の平均消失率を算出した。聴力は音響暴露翌日では計測した全ての周波数でscale outとなり、その後2週までに15-25dBの閾値の改善を認めた。聴力評価後、動物を深麻酔下に安楽死させ蝸牛を摘出し組織学的評価を行ったところ、内有毛細胞は維持されていたが、外有毛細胞の多くが脱落している像が得られた。外有毛細胞の消失率は平均で92.8%(85.1100%, n=5)であった。これらの結果は、136dBの強大音による音響暴露により、従来の音響曝露に比較してより強い内耳障害を惹起したことを示している。内耳蝸牛への幹細胞移植についてはいくつか報告があるが、内耳の構造の特異性のため移植の効率は高くない。本研究の目的は内耳蝸牛への効率的な幹細胞移植方法を確立することである。RaucheggerとSpoendlinは1981年に、130dB超の強大音は基底回転の基底板に平均径90μmの裂隙が生じさせることを報告している。今回われわれは強大音により生じる基底板の裂隙を利用した幹細胞の内耳への誘導について検討した。4週齢のモルモットに全身麻酔下に125dB、130dBまたは136dBの強大音を音響暴露時間を2, 3時間と変化させた各群(各群6匹)暴露させた。136dB音響暴露群の翌日のABRでは聴力がscale outとなり、2週間後には高度難聴程度まで改善するが、それ以降は改善を認めなかった。また組織学的にも正常蝸牛有毛細胞に比べ、ほとんどの外有毛細胞が脱落していることを確認した。これらの結果をもとに音響暴露2週間後の聴力と回転毎での内・外有毛細胞の脱落率を計測し、幹細胞移植後の評価のためのコクレオグラムを作成した。移植する幹細胞はMuse細胞を用いた。Muse細胞はリポフェクションによりGFPを導入したヒトMSCから、FACSを用いてSSEA-3陽性細胞として単離した。移植方法については、当初はガラス管を用いていたが、細胞の移植をより確実にするためにマイクロカテーテルを蝸牛鼓室階内に挿入して細胞を注入する方法を確立した。この方法を用いても聴力に与える侵襲は低く、聴力は変わりないことを確認した。音響障害モデルのモルモットに対し、音響暴露翌日に左耳に10,000または30,000のMuse細胞を移植し、右耳にはPBSのみを注入した。Muse細胞移植群では蝸牛内でのGFP陽性Muse細胞はほとんど確認できず、聴力の改善傾向も見られなかった。

移植する幹細胞はMuse細胞を用い、マイクロカテーテルを蝸牛鼓室階内に挿入して細胞を注入する方法を確立した。音響障害モデルのモルモットに対し、音響暴露翌日に10,000または30,000のMuse細胞を移植したが、細胞移植群では蝸牛内でのGFP陽性Muse細胞はほとんど確認できず、聴力の有意な改善も見られなかった。内耳障害の観察今回の結果は、136dBの強大音による音響暴露により、従来の音響曝露に比較してより強い内耳有毛細胞障害を惹起したことを示している。今後は、内・外有毛細胞だけではなく、支持細胞とらせん神経節への136dBの強大音による音響暴露の影響を観察する。支持細胞マーカーとしてp27Kip1やjagged 1を用いて、cryosectionにより支持細胞の残存状況を確認する。また、らせん神経節はTuj1を用いて音響暴露の影響を観察する。内耳高度障害モデルの鼓室階へのMuse細胞移植全身麻酔下に耳胞を開放し蝸牛を確認。蝸牛開窓術を行い鼓室階にMuse細胞を移植する。移植後1週、2週、4週で聴力評価を行う。聴力評価後、動物を深麻酔下に安楽死させ蝸牛を摘出。脱灰後免疫組織学的評価を行う。免疫組織染色には有毛細胞のマーカーとしてMyosin7a、espin、Myosin6、支持細胞のマーカーとしてSox2、jagged1、有毛細胞前駆細胞のマーカーとしてPax2、Pax8、jagged2、Prox1に対する抗体を用いる。聴覚主に研究分担者の物品費で繰越金が発生し、21,150円が翌年度繰り越しとなった。実験用動物、プラスチック器具、抗体試薬その他の消耗品費にあてる予定である。さらに次年度は研究成果発表のための国内外旅費に充当する予定である。