hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
K^+チャンネルクローンを用いたK^+電流の再構築と抗不整脈薬開発への応用

心筋細胞のネイティブなK^+チャンネルとK^+チャンネルクローン(Kvファミリー)とでは、抗不整脈薬の影響は全く異なっている。その原因を明らかにすること、さらにその後クローンを用いて、ネイティブのK^+電流を発現系に再構築し色々な薬物の各種K^+チャンネルへの作用の解析を容易にすることを目的として本研究を計画した。当初Kvファミリーの薬物感受性に影響を与えるような分子が欠如している可能性を考え、その探索を試みた。しかし、暫くして家族性QT延長症候群の原因遺伝子として、心筋のI_<kr>とI_<ks>を流すチャンネルをコードする遺伝子が明らかにされた。代表的な第3群抗不整脈薬の作用対象はI_<kr>であるため、本研究においてもKvファミリーではなく、特にI_<kr>の責任分子であるHergチャンネルを扱うこととし、Herg電流に対する各種抗不整脈薬の影響を卵母細胞の系を用いて検討した。第1群薬のquinidine、第3群薬のMS-551、第4群薬のverapamilの作用を調べたが、全ての薬物は濃度依存的にHerg電流を抑制した。0mVに脱分極後-80mVに再分極した際のテ-ル電流で比較するとIC_<50>はquinidineの場合約3.2μM、MS-551で約8.8μM、verapamilでは約7.3μMであった。また、脱分極を-20mV、および20mVにした場合も検討したが、MS-551の場合のみ、その作用に若干の電位依存性が認められた。チャンネルの開・閉状態による抑制の様式にも差が見られたが、キネティクスの速さの問題だけなのかどうか詳細はまだ明らかではない。薬物による抑制からの回復の特徴的なこととして、MS-551は30μMを用いても10分間のwashoutで80%以上の回復が見られた。verapamil(30μM)の場合は20分後でも12%程度の回復しか見られなかった。これら薬物の作用部位に関してHergチャンネルの点変異体を作製して検討し、第6膜貫通領域の変異によって薬物の作用が影響されることを見ており、今後詳細な検討を行う。このようなヒト遺伝子を発現させた系はこれからますますその有用性を増していくものと思われる。1.ウサギの心筋よりクローニングした内向き整流性Kチャンネル(RBHIK1)に対する、各種抗不整脈薬の影響についてはポジティブな結果は得られていない。しかし、卵母細胞に発現させたこのKチャンネルの単一電流の記録には成功したため、さらに詳細な検討が可能になると思われる。2.これまでの検討では、ラット心筋のKチャンネル(Kv1.2、Kv1.4)に対して各種抗不整脈薬はあまり影響しないという結果であったため、電気生理学的研究により広く用いられ、その性質が良く知られているウサギの心筋からKチャンネルをクローニングしたが、得られたものはKv1.5であった。

そのKv1.5電流に対する第3群抗不整脈薬、d-sotalol、E-4031、MS-551の影響を検討したところ、E-4031、MS-551は1mMで10%程度Kv1.5電流を抑制したが、ネイティブなK電流に対する作用と比較するとこれが生理学的に意味があるとは考えにくい。3.薬物感受性に影響を与えるような分子をクローニングするために蛋白分子同士の相互作用の検出に広く用いられている酵母のTwo Hybrid Systemが利用できるかどうか検討した。具体的には、まず、機能上はβ1サブユニットと相互作用することが分かっているKv1.2、Kv1.4、Kv1.5の細胞質内領域を適当なベクターにサブクローニングし、それらとβ1サブユニットを同時に酵母に導入することによってお互いの相互作用を検討した。これまでのところ相互作用を示すレポータ遺伝子の活性がはっきりとは認められていないが、この酵母の系についてはさらに検討する予定である。4.最近QT延長症候群の原因遺伝子として注目を集めているHergの産物はKチャンネルであるが、今後、ヒトの心臓からRT-PCRによってこのKチャンネルを単離し、それに対する抗不整脈薬の影響を検討する予定である。1.現在までに電位依存性K^+チャンネルのサブユニットとしてKvβサブユニット(3種類に大別される)が報告されている。その中の1つラットKvβ1.1をプローブとして用いてウサギ心筋のcDNAライブラリーをスクリーニングし幾つかのポジティブクローンを得た。それらクローンの塩基配列の決定はまだ完了しておらず全長のクローンが得られているかどうかはっきりしないが、現在までのところ得られている配列よりKvβ1サブファミリーのうちKvβ1.1がウサギ心筋に存在することは昭らかとなっている。またKvβ2サブファミリーに属するサブユニットも得られている。これら新しく得られたKvβサブユニットのαサブユニット(チャンネル孔を形成する)に対する影響を卵母細胞ならびに培養細胞の発現系を用いて詳細に検討する予定である。これらβサブユニット存在下での各種薬剤(抗不整脈薬)に対するチャンネルの感受性についても検討する予定である。2.酵母のTwo Hybrid Systemを利用した新たな分子のクローニングには残念ながら成功していない。近年、チャンネルが種々の蛋白分子と複合体を形成しうることが明らかとなってきており、チャンネルの機能におけるそのような蛋白分子同士の相互作用の重要性に関心が集まってきている。このような現状からしても蛋白分子相互作用をもとにしたクローニングは引き続き検討していく予定である。3.QT延長症候群の1原因遺伝子であることが明らかにされたHergは1つの種類の遅延整流型K^+チャンネルをコードしている。このHergを利用できるようになり卵母細胞に発現することが出来たので、今後これまで調べてきたような各種薬剤(抗不正脈薬)のHergチャンネルに対する影響を検討する予定である。
歯列を含むダイナミックパラトグラフィーとソナグラムの同期解析

1,研究目的発音時の舌と口蓋および歯列との接触形態の適否は、調音に重要な意味がある。そこで本研究では、音声分析パターン(3D-Sonagraph)と連動するダイナミックパラトグラフィーを用いることにより、文章発音中の舌の調音運動パターンと子音産生のタイミングを正確に比較、検討した。また、無歯顎者(同意を得た)についての歯列および口蓋と舌の接触様式と経時的な推移を求め、当教室で求めた標準パターンと比較した。2,研究計画・方法(1)被検者:上下全部床義歯装着者(1名)(2)被検音;[桜の花が咲きました](3)記録解析方法:口蓋およひ歯列の基底結節および舌側咬頭に計96個の電極を配列した口蓋板を被験者の口腔内に装着し、音声と同時にPalatometer(Model 6300:KAY社)により舌接触パターンを記録する。このシステムでは即時に得られた音声のspectrogram(ソナグラム)と舌接触パターンの画面がリンクしており、カーソル位置に対応する経時的な舌接触位置の変化を観察できる。さらに、データをCSL(Computerized Speech lab,Model 4300B:KAY社)に転送し、各子音についてCSL画面のソナグラフ上で“構え",音発生,舌の最大接触、音終了点などを判別する。そして、個々の電極について全被験者での接触の頻度(%)を集計する。(4)被験音中で口蓋に調音点を持つ子音、すなわち[s,k,r,n,f,t]について、舌接触の標準パターンと音発生時点に対する最大接触時点などの時間的な関係を求める。3,結果と考察(1)無歯顎者の舌接触パターンについて:[s,f,t]では接触範囲は広いものの、有歯顎者と同様のパターンを示した。[ki]の[k]では、硬口蓋の広範囲に接触する特異なパターンであった。(2)時間的要素の比較:無歯顎煮では、[ki]の“構え"から“最大接触“までの時間が有歯顎者より短く、そのため音全体の持続時間も短い。以上のように本システムでは、パラトグラム、音声波形、ソナグラムが完全に同期し、相互の時間的関係を精密に観察でき、患者の機能評価に応用できることが示唆された。1.目的発音時の舌と口蓋のみならず歯列との接触様式の適否は,多くの語音に重要な意味がある.そのため,舌と歯列・口蓋との接触形態を調べる方法として主として静的パラトグラム法を行い,義歯設計の参考としても利用してきた.しかし,調音活動は本来,流動的なものであり,動的な経過の分析が望ましい.本研究では,音声分析パターン(3D-Sonagraph)と連動するダイナミックパラトグラフィーにより文章発音中の舌の調音運動パターンと子音産生のタイミングを比較検討した.2.方法(1)被検者:個性正常咬合を有した有歯顎者18名(男11名,女7名)と上下全部床義歯装着者(1名).(2)被検者:「桜の花が咲きました」(3)記録解析方法:口蓋および歯列の基底結節および舌側咬頭に計96個の電極を配列した口蓋板を被検者の口腔内に装着し,音声と同時にPalatometer(Model 6300:KAY社)により,舌接触パターンを記録した.このシステムでは,即時に得られた音声のspectrogram(ソナグラム)と舌接触パターンの画面がリンクしており,カ-ソル位置に対応する経時的な舌接触位置の変化を観察できる.さらに,データをCSL(Computerized Speech lab,Model 4300B:KAY社)に転送し,各子音について“構え",音発生,舌の最大接触,音終了点を判別する.そして,各時点で舌接触する電極の位置を記録し,個々の電極について接触の頻度(%)を集計した.3.結果と考察(1)有歯顎者と無歯顎者の比較:無歯顎者では,[s],[∫],[t]で舌接触のパターンは有歯顎者と同様であったが,接触範囲が広い.[ki]の[k]では,口蓋前方の広範囲に接触する特異的なパターンである.(2)粉末法とダイナミックパラトグラムの比較:[s],[∫],[t],[k]は有歯顎者の文章発音中の最大接触時に,粉末法(単音節)のパターンと同じであり,舌接触の範囲が調音に重要な役割を示すことが裏付けられた.一方,[n],[r]は,文章発音中では粉末法より舌接触が少ない.このように.連続音を動的に解析することにより,舌接触パターンが調音に本格的に重要な役割を果たす音では素早い発音中にも標準パターンになる事が裏付けられた.以上のように本システムでは,パラトグラム,音声波形,ソナグラムが完全に同期し,相互の時間的関係を精密に観察でき,顎補綴患者の機能的評価に応用できることが示唆された.1,研究目的発音時の舌と口蓋および歯列との接触形態の適否は、調音に重要な意味がある。

2,研究計画・方法(1)被検者:上下全部床義歯装着者(1名)(2)被検音;[桜の花が咲きました](3)記録解析方法:口蓋およひ歯列の基底結節および舌側咬頭に計96個の電極を配列した口蓋板を被験者の口腔内に装着し、音声と同時にPalatometer(Model 6300:KAY社)により舌接触パターンを記録する。このシステムでは即時に得られた音声のspectrogram(ソナグラム)と舌接触パターンの画面がリンクしており、カーソル位置に対応する経時的な舌接触位置の変化を観察できる。さらに、データをCSL(Computerized Speech lab,Model 4300B:KAY社)に転送し、各子音についてCSL画面のソナグラフ上で“構え",音発生,舌の最大接触、音終了点などを判別する。そして、個々の電極について全被験者での接触の頻度(%)を集計する。(4)被験音中で口蓋に調音点を持つ子音、すなわち[s,k,r,n,f,t]について、舌接触の標準パターンと音発生時点に対する最大接触時点などの時間的な関係を求める。3,結果と考察(1)無歯顎者の舌接触パターンについて:[s,f,t]では接触範囲は広いものの、有歯顎者と同様のパターンを示した。[ki]の[k]では、硬口蓋の広範囲に接触する特異なパターンであった。(2)時間的要素の比較:無歯顎煮では、[ki]の“構え"から“最大接触“までの時間が有歯顎者より短く、そのため音全体の持続時間も短い。以上のように本システムでは、パラトグラム、音声波形、ソナグラムが完全に同期し、相互の時間的関係を精密に観察でき、患者の機能評価に応用できることが示唆された。
卵成熟誘起ホルモン刺激の受容と応答によるG2/M期移行の分子機構

卵細胞では、卵成熟誘起ホルモンが卵表に作用することにより、卵内で細胞周期停止が解除されて分裂期が再開始する。これを実現するための、卵細胞内情報伝達経路の解明を目指した。その結果、卵表中に存在する卵成熟誘起ホルモン結合タンパク質の分子実体を同定した。それとともに、卵成熟誘起ホルモン刺激が不十分の場合は、卵細胞内においてその情報をノイズとして末梢して自己鎮静化をはかるシステムが機能していることを見出した。本研究では、ヒトデ卵を用いて、卵成熟誘起ホルモン(1-methyladenine, 1-MeAde)の卵表受容体を同定し、その刺激が卵細胞内でcyclin B-Cdk1の活性化に伝達される全容を明らかにすることを目的としている。本年度は、以下の点が判明した。1.これまでの1-MeAdeアフィニティービーズを用いた解析から、1-MeAde受容体はRdz(Rendezvin)-GRL(GPCRのGRL101)複合体であるという作業仮説を得ている。その確証をめざして、それぞれを特異的に認識する抗体を作製した。これらを用いて、RdzとGRLのそれぞれが卵表層に局在していることを確認した。さらにGRL抗体の卵内微小注射は、1-MeAdeによる卵成熟誘起を抑制することを示した。これらは、Rdz-GRL複合体が1-MeAde受容体であることを強く支持している。2.1-MeAde刺激により卵内ではまずAkt/PKBが活性化し、これがCdc25とMyt1を直接リン酸化して、cyclin B-Cdk1が活性化される。他方、閾値以下の1-MeAde刺激によっても、一旦、cyclin B-Cdk1は低レベルに活性化されるが、その活性に応じてフォスファターゼ(PPaseX;分子実体は不明)が活性化され、Cdc25とMyt1が脱リン酸化されて、cyclin B-Cdk1は不活性状態に戻ることが、予備的に判明していた。そこでまずは、この点を確証した。さらに、1-MeAde受容体にカップルしたGタンパク質から、PI3K-PIP3-Aktを介さずにPPaseXの抑制に向かう経路が存在する可能性が見えてきた。これらは、1-MeAde刺激における閾値設定の要に関わると期待される。本研究では、ヒトデ卵を用いて、卵成熟誘起ホルモン(1-methyladenine, 1-MeAde)の卵表受容体を同定し、その刺激が卵細胞内でcyclin B-Cdk1(Cdk1)の活性化に伝達される全容を明らかにすることを目的としている。1.これまでの1-MeAdeアフィニティービーズを用いた解析から、1-MeAde受容体はRdz(Rendezvin; p42, p92, p97から構成)-GRL(GPCRのGRL101)複合体であるという作業仮説を得ている。その確証をめざして、Rdzのそれぞれを特異的に認識する抗体を得た。現在、ヒトデ卵の単離表層を用いて、これらの抗体が1-MeAdeの結合を阻害するかを解析中である。他方、GRLについては、constitutively active変異体を作製できた。現在、そのmRNAを卵内に微小注射してタンパクを発現させ、1-MeAde刺激無し卵成熟を誘起できるかを解析中である。2.1-MeAde刺激により、卵内ではGbg-PI3K-PIP3-Akt-Cdc25 & Myt1経路を介して、Cdk1は活性化に至る。刺激レベルが閾値以下の場合は1-MeAdeの効果は"noise"として抹消されるが、このnoise抹消は、低レベルに活性化したCdk1がもたらす"self-calming"(低活性型Cdk1が未知のフォスファターゼPPaseXを活性化し、自身の活性化に関わるCdc25とMyt1を脱リン酸化して、自身を不活性型に戻す)によることが確かとなった。他方、閾値以上では、Gbgから、PI3K-PIP3-Aktを介さずにself-calmingを乗り越える("override")経路が併走することが判明した。1.これまでの1-MeAdeアフィニティービーズを用いた解析から、1-MeAde結合タンパク質はp42, p92, p97から構成される複合体であり、それらの全ては1種類のヒトデRendezvin(Rdz)中に含まれると判明している。そこで、この三つの断片がどのようにして産生されるのかを解析した。その結果、まずRdz全長をコードするmRNAが翻訳され、そのRdzタンパク質が二カ所、プロテアーゼFurinによって切断されて、p42, p92, p97が生ずることが判明した。つまり、翻訳後プロセシングによるといえる。3.Cdk1は、初期活性化したあと、autoregulatory loopを介して完全活性化に至ることが知られている。

さらに、このautoregulatory loopは、Cdk1-Gwl (Greatwall kinase)-Ensa/Arpp19-PP2A(B55)経路によるとされている。ところが、Gwlがなくても、Cdk1が直接Ensa/Arpp19をリン酸化することでもautoregulatory loopは回りうることを見出した。卵細胞では、卵成熟誘起ホルモンが卵表に作用することにより、卵内で細胞周期停止が解除されて分裂期が再開始する。これを実現するための、卵細胞内情報伝達経路の解明を目指した。その結果、卵表中に存在する卵成熟誘起ホルモン結合タンパク質の分子実体を同定した。それとともに、卵成熟誘起ホルモン刺激が不十分の場合は、卵細胞内においてその情報をノイズとして末梢して自己鎮静化をはかるシステムが機能していることを見出した。1-MeAde受容体として、Rdz-GRL複合体の必要十分性の証明については、やや苦戦中といえる。他方、閾値設定に関わる制御の解析では、self calmingについても、overridingについても新規の経路が判明してきており、予想を越えて進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学Rdz-GRL複合体の、1-MeAde受容体としての必要十分性の証明には、生きた卵細胞における効果(卵成熟の開始、あるいは抑制)の検証だけでなく、現在実施中の単離卵表層を用いた実験系など、in vitro系も活用することを考えている。閾値設定に関わる経路では、self calmingについても、overridingについても全く新規なものであり、その実体解明に全力を注ぎたい。得られた成果は、概念上の新展開をもたらすと期待している。RdzとGRLそれぞれの特異抗体、およびGRL活性中和抗体が得られたことは、1-MeAde受容体の解析にとって大きな進展である。しかし、1-MeAde受容体として、Rdz-GRL複合体の必要十分性の証明については、一部、次年度に持ち越したといえる。他方、PPaseXの抑制に向かう新規経路(1-MeAde受容体-Gタンパク質-PPaseX)の存在の可能性を見出したことは、予想を超えた新展開であり、1-MeAde刺激における閾値設定の解析に新規の視点を提供するものである。閾値設定(研究成果の項を参照)に関する論文の投稿を準備中であり、そのための経費(英文校正費、online free access費など)として使用することを予定していた。しかし、予想以上に投稿準備に手間取り、この経費の支払いは平成27年度にずれ込むこととなり、次年度使用額が生じた。Rdz-GRL複合体の、1-MeAde受容体としての必要十分性の証明に、まずは全力を注ぎたい。特に、Rdzの抑制による、1-MeAdeを介した卵成熟誘起の阻害;逆に、1-MeAdeなしでのRdzの直接刺激、あるいは1-MeAdeやRdzなしでのGRLの活性化による卵成熟の誘起、の実証が最も優先すると考えている。他方、当初予定していた、各種Qドットを活用した1-MeAdeシグナル伝達の1分子イメージング(1-MeAde / Rdz-GRL複合体/ 3量体Gタンパク質/ PIP3形成)については、新規知見として何を目指すのかを、再考する必要があると考えている。上記「理由」の項に述べたような状況であり、当初に予定した使途に使用することを考えている。
ヒト大腸電気刺激による脳・腸機能相関の生理と病態生理

研究結果これまで見出した知見を更に発展させ、正常人(生理)と過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome;IBS)患者(病態生理)を比較することによって、電気刺激下の消化管運動と脳機能検査法をヒトで確立した。広告と掲示で募集した健常成人と典型的IBS患者を対象とし、検査日の朝9:00より全例にX線透視下でOlympus社製大腸videoscope CF-200Lを用いて経肛門的にassemblyを下行結腸-S状結腸接合部に留置した。Assemblyは半導体sensorのSynectics社製silicon pressure transducer、barostat、刺激電極からなり、pressure transducerによって、肛門から約60cmの下行結腸(A)、約55cm(B)、50cm(C)のS状結腸の消化管内圧を、barostatによって約6545cmの結腸toneを測定した。右上腕に血圧カフ、前胸部に心電図電極、呼吸曲線probe、頭部に脳波電極を装着し、これらをMIC-9800システムポリグラフ、7T18型シグナルプロセッサ、XR-510型データレコーダ、Synectics Visceral Stimulator(SVS)、PC-9801RA21型コンピュータに接続し、生体信号をリアルタイムで導出かつ保存した。この手法により、barostatの膨張で電極が大腸粘膜に密着し、消化管内圧の感度が飛躍的に向上し、大腸の壁在反射を変化させることなく、これまで明らかにされなかった弛緩現象を含む結腸toneを検出し得た。また、Bに接する中央の2つの刺激電極で大腸を電気的に刺激し、結腸toneの変化と大脳誘発電位を検出した。大腸の電気刺激によって結腸toneは僅かに低下し、痛覚閾値は4-20mAであった。大腸拡張刺激による痛覚閾値は正常人よりもIBS患者で低く、大腸運動係数は正常人が拡張刺激による変化に乏しいのに対してIBS患者では亢進しており、大脳誘発電位もIBS患者で短潜時と振幅の増大が見られた。以上、わが平成7年度の課題研究は脳腸機能相関における結腸toneと末梢-中枢プロセシングの生理と病態生理を明らかにしつつあり、一定の成果をおさめることができた。この研究成果の一部は、国内の学会で発表され、国外でも発表される予定である。
応答の「時間微分」に関与するシナプス機構

網膜の重要な機能の一つである「動き」の検出や「方向選択性」応答の成立のためには、いわゆる「応答の時間微分」が必要である。網膜神経節細胞の多くは一過性の光応答を示し、こうした条件で備えている。しかし、神経節細胞へ入力する双極細胞は持続的な光応答を示す。この事実は、応答のダイナミックスの変換は双極細胞と神経節細胞間のシナプスにおいて行われていることを示すものである。そこで本研究ではマウス網膜から双極細胞を単離し、電圧固定法によってそのカルシウム電流を解析したところ、双極細胞は一過性の性質を持つT型のカルシウム電流を持っていることが明らかになった。このカルシウム電流は、-55mVよりもプラス側で活性化され、-30mVで最大値に達した。不活性化は早く、-26mVでの不活性化の時定数は約100msecであった。不活性化した電流は膜電位を-96mVに保持すると、約一秒で完全に回復した。ジヒドロピリジン化合物(ニフェディピンやBay K8644)はこの電流に対し抑制効果も増強効果も示さなかった。電流は細胞体部だけでなく、シナプス終末部にもみられたので、このカルシウム電流が双極細胞からの伝達物質の放出を制御していることが考えられる。カルシウム電流が一過性の性質を持っていることは伝達物質も一過性である可能性を示しており、それによって引き起こされる神経節細胞の光応答は一過性のものになることを示唆している。事実、マウス神経節細胞は光刺激のONとOFFに著明な一過性の光応答をしめすことが知られている。
有袋類における頭部神経堤／顎原基のヘテロクロニー的発生メカニズムの解明

ほ乳類の中で有袋類は、有胎盤類と比べて未熟な状態で生まれ、保育嚢まで移動し、母乳で成長するために、前肢や顎等の器官が早く発生する。この発生様式の時間的変更メカニズムを明らかにするため、有袋類のオポッサムを用い、顎原基を形成する頭部神経堤細胞の発生について解析した。その結果、マウスやニワトリと比較して、Sox9遺伝子の頭部神経堤領域での発現が早くから始まり、かつ顎原基で継続することがわかった(Wakamatsu et al., 2014)。また、Sox9の神経堤エンハンサーに発見された有袋類特異的変異が、頭部神経堤でのSox9の早期の発現に重要であることが示めされた。(1)前年度までにオポッサム胚の神経堤発生においてSox9遺伝子の発現がマウスやニワトリと比べて早く始まり、かつ長く続くことがわかった。今年度はさらにヤモリ胚を入手してSox9の発現を調べ、ヤモリの神経堤細胞でのSox9の発現はオポッサムよりもニワトリやマウスに近いことが明らかとなった。この結果から、オポッサム胚の神経堤発生におけるSox9の発現パターンが有袋類に特有である可能性が高まった。Sox9を含む神経堤発生関連遺伝子の発現パターンの種間比較について論文としてまとめ、現在リバイス版を再度投稿したところである。(2)今年度はオポッサム胚を十分な数入手できなかったため、培養条件検討実験はおこなうことができなかった。(3)Sox9遺伝子の神経堤特異的発現に寄与するエンハンサー配列がマウスで報告されていたため、様々な生物種間でその配列を比較検討した。その結果、オポッサムやワラビー、タスマニアデビルといった有袋類に特有の変異がみつかった。マウスSox9遺伝子の神経堤エンハンサーにEGFPレポーターをつないだプラスミドを構築し、ニワトリ胚に導入したところ、神経堤特異的なEGFPの発現を確認できた。またこのエンハンサーに有袋類に見られる変異を導入したレポーター遺伝子を構築し、ニワトリ胚に導入したところ、EGFPの発現は検出できなくなった。これらのことから、有袋類におけるユニークなSox9遺伝子の発現は、エンハンサー配列の変化とともにそれを活性化するメカニズムの変更があることが示唆された。(4)ニワトリ胚の外胚葉にSox9を強制発現させたが、顎原基が早く形成されることは無かった。遺伝子導入、発現方法に改良が必要と考えられた。(1)オポッサムゲノムDNAやcDNAを調整し、PCRによってSox9、Snail1などの神経堤形成関連遺伝子をクローニングした。それらの遺伝子のうち、Sox9、Snail1、Snail2、Msx1、BMP2、BMP4、Pax7の頭部神経堤発生過程における発現をオポッサム9-10日胚について解析し、ニワトリ、マウス胚での発現と比較検討した。その結果、とりわけSox9についてニワトリやマウスと比較して早い発現の開始と顎原基の発生にいたる長期間の発現が観察され、オポッサムにおける頭部神経堤やそれに由来する顎原基の発生の時間的な変更に対するSox9遺伝子の寄与が示唆された。(2)オポッサム胚の全胚培養条件の検討(酸素分圧、温度、培地と添加物)に取り組み、高酸素分圧(95%)、低温(35°C)の重要性を明らかにした。しかし、明らかな改善がみられたものの、まだ遺伝子導入実験などに使用するには不十分であるため、今後の改良が必要であるという結論に至った。(3)ニワトリ胚について、stage 5の予定神経堤領域を除去し、stage 8の胚から切り出した神経堤領域を移植することでオポッサム胚における頭部神経堤の発生過程の状況をニワトリ胚で再現することを試みた。しかし、頭部神経堤がより早く、より広く移動するのが観察されたが、顎原基が早く形成されることは無かった。このことから、少なくとも鳥類胚では、顎原基が通常よりも早く形成されるためには別の因子が必要であることが示唆された。すなわち、オポッサムにおいては神経堤形成プログラムが早く動くだけでなく、顎原基発生プラグラムが早く動く可能性が考えられた。(1)前年度までに、神経堤発生に関わる様々な遺伝子の発現をオポッサム胚で調べ、Sox9遺伝子の頭部神経堤での発現がマウスやニワトリよりも顕著に早く始まり、かつ頭部神経堤由来の顎原基間充織で長期にわたって持続することを見出していた。この内容について、論文をEvolution & Development誌に投稿、査読、再投稿を経て受理された。(2)前年度より継続してオポッサム胚の全胚培養に取り組んだ。

低温(35°C)と高酸素分圧(95%)での培養により一定の改善が見られたものの、発生以上は認められた。したがって、遺伝子機能の解析に供するにはまだ改善の必要があると考えられた。(3)前年度にマウスSox9遺伝子の神経堤特異的エンハンサーにGFPをつないだレポーター遺伝子を作成し、また同エンハンサーに有袋類特有の変異を入れたレポーターも作成していた。これらのレポーターを異なる発生ステージのニワトリ胚に導入したとろ、マウス型では神経堤が形成されてからGFPの発現が確認された一方で、有袋類型レポーターを用いた場合には神経堤形成よりずっと早くに予定神経堤領域でGFPの発現が確認された。このことから、エンハンサーの変異が有袋類におけるSox9遺伝子の早期の発現開始に重要な役割を持っていることが示唆された。発生生物学遺伝子発現解析をすすめ、その結果を論文にまとめる作業をおこなうことができた。またSox9遺伝子の発現が有袋類で変化していることに関連して、その分子基盤を理解するための端緒となりうる発見、すなわち有袋類特異的なエンハンサー配列の変異を発見し、その変更が意味があることをニワトリ胚への遺伝子導入実験により明らかにすることができたことは、大きな収穫であった。一方で、オポッサム胚の全胚培養系の確立は進んでおらず、最終年度における課題として残った。当初本年度に計画していた実験はほぼ予定通りおこなうことができた。とりわけ遺伝子発現解析については順調にすすめることができ、Sox9という頭部神経堤や顎原基の発生に重要な遺伝子について、オポッサムに特有の発現様式があることを発見したのは大きな進展であった。しかし、オポッサムの全胚培養法は遺伝子の解析などに用いるにはまだ不十分であり、実験条件についての今後の検討が必要不可欠である。また、ニワトリ胚での移植実験は手技的に難しかったものの、実験操作そのものはうまくいった。しかし、ニワトリ胚でオポッサムの頭部神経堤発生を再現できなかったことから、来年度以降の打開策を必要とした。(1)オポッサム胚の全胚培養系についてこれまで得られた知見をもとに、さらに方法を改良し、遺伝子導入実験ができるようにしたい。(2)Sox9遺伝子の神経堤特異的エンハンサーにおける有袋類特有の変異は、転写因子であるMybやRORの結合配列を含んでいる。これらの転写因子がこのエンハンサーの活性化にどのように寄与するのか、検討する。そのためにMybの発現ベクターは既に入手している。(3)ニワトリ胚の外胚葉にSox9発現ベクターを導入しても、顎原基が早くできなかったのは、導入遺伝子の発現を十分に制御できなかったからであると推測した。そこで今年度は、予定神経堤領域に限局したかたちで内在性のSox9よりも早く外来Sox9遺伝子を強制発現させるために、Pax7のエンハンサーにSox9遺伝子をつないだプラスミドを構築し、ニワトリ初期胚に導入し、その表現型を解析する。(1)オポッサムでの遺伝子機能解析(とりわけSox9遺伝子について)をすすめるために、全胚培養法の確立は必須である。2年目である平成25年度はこの点について、集中的におこなう予定である。(2)有袋類のゲノム情報はオポッサムに加えてワラビーとタスマニアデビルがアクセス可能となったことから、神経堤発生関連遺伝子の発現制御にかかわるcis制御領域の比較検討がより信頼性の高いものになった。したがって、有胎盤類と有袋類のゲノム配列比較をすすめ、有袋類の頭部神経堤発生に重要なゲノム配列を同定する。
連続体力学に現れる偏微分方程式の研究と数式処理ソフトの応用

この期間内に行われた主な研究は以下の通りである.・境界に接するベクトル場に対する拡張されたKorn不等式に関する以前からの研究を深めた.重要な結果として,境界に接するH^1ベクトル場に関連する領域の特異性の1つのクラスを提案したこと,等方的弾性体のエネルギーに対していわゆる「エネルギーの強凸性」が崩れる境目でのKorn型不等式の成立条件を調べた.・ベクトル値関数に対する静的エネルギー積分が,任意の有界なLipschitz領域上で「正値」となるための,係数に課される十分条件を与えた.現在,ここで得られた条件の必要性について調べている.・slab領域における弾性波動方程式に関して,詳しいスペクトルの状況を調べた.・Mathematicaの利用に関する研究として,平面から切り抜いた長方形の帯を互い違いに組んだ細長い円柱に巻きつけて得られるMobiusの帯を,Mathematicaの中で実現した.この期間内に行われた主な研究は以下の通りである.・境界に接するベクトル場に対する拡張されたKorn不等式に関する以前からの研究を深めた.重要な結果として,境界に接するH^1ベクトル場に関連する領域の特異性の1つのクラスを提案したこと,等方的弾性体のエネルギーに対していわゆる「エネルギーの強凸性」が崩れる境目でのKorn型不等式の成立条件を調べた.・ベクトル値関数に対する静的エネルギー積分が,任意の有界なLipschitz領域上で「正値」となるための,係数に課される十分条件を与えた.現在,ここで得られた条件の必要性について調べている.・slab領域における弾性波動方程式に関して,詳しいスペクトルの状況を調べた.・Mathematicaの利用に関する研究として,平面から切り抜いた長方形の帯を互い違いに組んだ細長い円柱に巻きつけて得られるMobiusの帯を,Mathematicaの中で実現した.今年度は,研究課題に関連して以下の研究を行った.●昨年からの研究の継続として,滑り境界条件(あるいはそれに共役な境界条件)に対するKorn不等式の研究を深めた.具体的には,(1)区分的にC^2級の境界の滑らかさの仮定をLipschitzクラスまで落とした.(2)Lame定数が,歪みエネルギーの非負性を保証するぎりぎりの値のとき,第2Korn不等式(通常の場合の第2Korn不等式より真に強い)がLipschitz領域で成立することを示し,対応する第1Korn不等式が成り立つための領域の満たすべき条件を調べた.特に(2)については,2次元での領域の正則自己同型群との関係,3次元以上での境界条件なしでの第2Korn不等式の証明法が興味深いと思われる.●上記の研究との関連で,一般の2階強楕円型システム(弾性体方程式)に対する滑り境界条件下でのエネルギー不等式(Korn型不等式)の最良定数を,楕円型システムのシンボルを用いて計算する手順を与えた.●以前の研究で,非等方弾性体の理論では有名な「Barnett-Lotheテンソル」に対して微分方程式論的見地による新しい導出法を与えた.これを利用して,圧電体波動方程式の混合問題に対して,関数解析的枠組みで,解の存在と一意性,エネルギー不等式などを導いた.(進行中)●内部に進展する亀裂を含む弾性波動方程式について,圧電体の場合,層状媒質の場合を含む形で,以前から進めていた研究の拡張を行っている.(進行中)今年度は,研究課題に関連して以下の研究を行った.1.境界に接するベクトル場に対する(あるいはそれに共役な境界条件をもつ)Korn不等式の研究を継続し,次の新しい結果を得た.部分積分を用いた証明法では,境界まで込めてC2級の,境界に接するベクトル場が,対応する1階のSobolev空間において稠密となることが重要である.この条件が満たされるような領域の特異性のクラス(区分的にC^2級に近い)を提案した.また,この条件を満たす領域において,境界に接するベクトル場のつくる1階のSobolev空間を,境界まで込めてC2級のベクトル場の生成する積分曲線の言葉を使って特徴づけた.2.ベクトル値関数の1階偏導関数を用いて表される,定数係数で対称形のエネルギー積分が,任意の有界なLipschitz領域上で「正値」となるための,係数に課される十分条件を与えた.(これは強い意味でK_<orn>不等式の拡張となっている. )現在,ここで得られた条件の必要性について調べている.3.必ずしも等方的でない2種類の弾性体がつくる層状媒質に対する,弾性体方程式(あるいは圧電体方程式)の解の正則性について,以前に等方的弾性体の場合に得られた清水氏の得た結果の拡張をほぼ完成した.(進行中)今年度は,研究課題に関連して以下の研究を行った1.境界に接するベクトル場に対する拡張されたKorn不等式に関する以前からの研究を深めた.等方的弾性体のエネルギーに対して、いわゆる「エネルギーの強凸性」条件が崩れる境目(nλ+2μ=0,μ>0)でのKorn型不等式の成立条件を調べた.N>2のときは,Neumann境界条件が強補完条件を満たすので比較的扱いは単純だが,n=2のときには,領域の穴の数,凸な角点の個数が影響を与える.2.平行2平面に挟まれる無限領域における弾性波動方程式に関して,スペクトルの状況を調べた。

具体的には,方程式を境界に平行な方向にFourier変換し,更に波動方程式に対応する固有値問題を考えるとき,Fourier変数をパラメータとする固有値の様子を調べた.Neumann境界条件を課した場合,いわゆるRayleigh波に対応する固有値の枝が現われ,他の枝と交わることなく挙動することが興味深い.3.これはMathematicaの利用に関する研究であるが,平面から切り抜いた長方形の帯を,互い違いに組んだ3本の同じ太さの細長い円柱に巻き付けて得られるMobiusの帯を,Mathematicaの中で実現した.数式的に扱うことにより,この作製法でMobiusの帯が実現されるための,円柱の太さ,長方形の縦横の長さの関係を明らかにすることができた.
凝縮化学系に於ける揺らぎと反応ダイナミックスの理論的研究

我々は本研究において、水に関する非常な重要な3つの問題を解決した。(b)水・氷中のプロトン移動の分子機構を解決し、(c)最近、最も注目されている5次の非線形分光法スペクトルのシミュレーションに成功し、その物理的帰属を明らかにした。(1)水の結晶化の分子機構の研究:我々は、世界で初めてシミュレーションによる純水の結晶化に最近成功した。非常に長時間のシミュレーションを行い、長い導入時間の後、結晶核が急速に生じることを見つけた。初期核の生成機構や、氷化にかかわるポテンシャルエネルギー面が大域的には漏斗型をしていることなどを見つけた。(2)水分子の集団運動を直接観測するのための新しい分光法の開発:液体の中の集団運動を観測するための実験手段として5次非線形分光法(2次元ラマン分光法)に注目し、そのスペクトルがいかなる物理的現象に対応しているかを、初めてシミュレーションを用いて明らかにした。そのスペクトルのシミュレーションを行い,それをもとに、Fleming(米国カルフォルニア大学バークレー校の)グループによる最近の実験データーの中から5次のスペクトル成分を抽出することに成功した。さらに、そのスペクトルが、どのような溶液内分子間運動の特性を反映しているかを明らかにした。(3)氷中のプロトン移動の分子機構の解明:氷中のプロトンでは、非常に長距離からの(氷の水分子からの)溶媒和が非常に重要であり、その移動のポテンシャルエネルギー面を計算するためには約10,000個の水分子を含めることが必要である。それら水分子からの溶媒和の微妙なバランスにより速いプロトン移動が起きており、このバランスは、いわゆる「氷則」から生まれているがことが分かってきた。我々は(I)水素結合ネットワークの構造変化に伴う、水分子の集団運動と揺らぎ、またそれらが実験として如何に観測され得るか、特に、超高速高次非線型分光にそれが反映されるか(II)水の氷化に伴うポテンシャルエネルギーの大域的構造。乱れた水素結合ネットワーク構造を持つ液体の水が、温度の低下とともに如何に結晶の氷に凍るかについて研究を進めている。水の中での水分子の運動は、水素結合のネットワークの影響をうけており、一般の液体の運動の様相とは非常に異なり、水には大きな構造揺らぎが存在する。従来の実験手段では分子が相関をもって「ある方向」をもって運動していること、即ち「分子の機能性、選択を生んでいる位相空間ダイナミックス」を記述また観測するのには十分とは言えない。高次非線型分光は系の位相空間ダイナミックスを捕えることが可能である実験手段である。しかし現状に用いられている5次の非線型分光ではモード間の結合によりエコーシグナルが相殺されてしまっており、位相ダイナミックスの情報がとれない。さらに高次または孤立モードの観測手段の開発の可能性を探っている。また氷化については(A)氷化に関する水の系の大域的ポテンシャルエネルギー面の様相(B)液体の水の中に1数ユニットの小さな種(たね)を入れた系の結晶の成長の様相を探っている。特に後者では、ある長さの導入時間(induction time)の後に瞬間的に大きな氷ができること、即ち或る位相が揃ったところで急激に構造化することを見つけた。現在、その位相の実体、また氷化の瞬間の熱散逸の問題などを調べつつある。このような水の氷化い関して熱力学量として充分な統計性を取り、結晶化に関する自由エネルギー面をあるオーダーパラメーターに対して求める必要があり、その研究も行っている。水と生体高分子の反応ダイナミックスを明らかにするために、特に2)3)と5)を集中的に研究を行った1)水のダイナミックス、揺らぎと緩和、またはその高次非線形分光による観測2)水の氷化過程の分子論的機構の解明

3)氷の中でのプロトン移動のダイナミックス(特に揺らぎと構造変化の影響)、4)超臨界水の非常に高い反応性の分子論的機構、5)生体高分子反応、特にバクテリオ・ロドプシンにおけるプロトン移動またイオンチャネルの選択性発現の機構を調べた。超高速高次非線型分光などの実験法により、如何に水の水素結合の集団運動、揺らぎが観測し得るかを理論的に調べた。水のなかの集団運動と揺らぎの解析を行い、水素結合ネットワーク組み替えの様相を解析し、水のミクロレベルの動力学的特性、特に集団運動、エネルギー揺らぎの様相を明らかにした。水の結晶化の機構を調べ、シミュレーションによって初めて水の結晶化に成功し、現在大きな系での結晶化を目指している。また反応座標解析を行いアモルファス状態化と結晶化の分岐を決めている分子論的機構を調べた。氷に於けるプロトン移動に関してポテンシャルエネルギー面とダイナミックスの解析を進め、その分子論的機構を解明しており、その機構の本質的部分が明らかになってきた。超臨界水の非常に高い反応性にラジカルがからんでいる可能性を見つけ、イオン化チャネルとの関係を明らかにした。生体内光反応であるロドプシン生体分子の化学反応に於ける光異性化、またそれに続くプロトン移動過程の初期段階の機構を明らかにした。以上をまとめて論文を執筆中である。またインド科学院Biman Bagchi,イリノイ大学Klaus Schulten教授らを招聘し共同研究を行った。凝縮系化学反応動力学に関して、特に次のような水と生体高分子のダイナミックスと選択性・機能性の発生機構を明らかにする研究を行った。水の氷化過程の分子論的機構の解明、特に氷化のオーダーパラメーターを探った。水のダイナミクス、揺らぎと緩和、またその物理的観測(高次非線形分光)で特に五次の非線型分光のシグナルに関する分子動力学法によるトラジェクトリー計算の実行し、エコーシグナルの様相を探っている(現在進行)。また三次の赤外についても二次元分光シグナルを解析しており、またトラジェクトリー計算行っている。この研究を通じて水のなかの集団運動と揺らぎのの様相を探るための実験方法を確立する予定である。氷の中でのプロトン移動のダイナミックスのポテンシャルエネルギーの様子を調べ、その移動に伴うエネルギー障壁が非常に小さいこと、これには四配位目の水分子の反発が効いていることを明らかにした。また反応経路に沿った水分子の運動が小さいが周りの水の協調的運動が効いていることを見つけ、プロトンの移動が高速なのかを明らかにした。さらにプロトンの水和構造が非常に長距離にわったっていることを、約一万水分子を含む系を用いて明らかにした。超臨界水の非常に高い反応性の分子論的機構を具体的な反応について解析を進めた。その水のペーハーが如何に水和の構造と関係しているかを明らかにした。生体高分子反応、特にバクテリオ・ロドプシンにおけるプロトン移動、また光合成化学反応におけるキノン分子への電荷(2つづの電子・プロトン)移動機構と蛋白質の構造変化、またその後のキノン分子の蛋白質内の移動の機構、を解析を行った。
睡眠・覚醒調節系および脳-内分泌調節系におけるピペリジンの役割に関する研究

内左性脂環状アミン、ピペリジンの脳内での生理的役割、特に睡眠-覚醒調節系および脳-内分泌調節系との関連を検討するために、GC/MS/COMシステムを用いたマスタラグメントグラフィー(MF)法によりピペリジンの脳幹網様体における動態を中脳部、橋部、延顕部に分けて定量的に解析するとともに、下垂体における分泌細胞の単一活動電位の単離とそれに対するピペリジンのイオントフォーレシス投与時の影響および作用機序について追求した。その結果次の成績を得た。1.脳幹網様体のピペリジン量は逆説睡眠(REM)を奪うと有意に減少し、REM反跳様には有意かつ著明に増加した。この変動は特に中脳から橋三又神経前部にかけて存在する網様体において著明であった。網様体周辺部においては、このようなREMに関連したピペリジン量の変動は認められなかった。2.in vivoにおける下垂体からの単一細胞活動電位記録法を確立し、この方法をピペリジンの活性評価に応用した。ピペリジンは従来報告した大脳皮質や海島におけるよりも強い作用を示し、その作用には部位特異性があることが明らかになった。特に発火の頻度に関係なく個々の発火の持続時間を延長する例が多くみられた点は興味深い。3.アプリージアニューロンを用いたconcentration clamp法において、ピペリジンはアセチルコリンによる二相性のCl^-電流に対し、ニコチン様作用によって表れる初期Cl^-電流(transient Cl^- current)にのみ影響を与えること、また、ニコチニック受容体-Cl^-チャンネル複合体のうち少なくとも2つの構成分に対し選択的な作用をもつことが分った。これらの知見は国際睡眠物質シンポジウムで招待講演として、また、論文、総説として発表した。
自己組織化を利用した高分子『トポロジー効果』の増幅

親水鎖にPEO、疎水鎖にPMAを有する直鎖状および環状ブロック共重合体を合成し、それぞれのミセルを作製した。これらのミセルの耐熱性・耐塩性を評価したところ、環状高分子から成るミセルが非常に高い安定性を示すことを見出した。また、環状ホモポリ乳酸およびhead-to-head型、head-to-tail型の連結様式を持つ環状ステレオブロックポリ乳酸を合成し、DSCを用いた融点測定により、環と直鎖といった主鎖の「トポロジー」および「主鎖の方向」が熱的性質に与える影響を検討した。環状高分子は、主鎖末端が存在しないため、同一の組成・分子量であっても『かたち』(トポロジー)の違いから直鎖状高分子とは異なった物性を示す。しかし、『かたち』に基づく物性差異(トポロジー効果)は微少なものであり、特定の分野の学術的興味の範疇を超えないと考えられてきた。そこで、本研究は直鎖状および環状の高分子を自己組織化することで分子集合体とし、トポロジー効果の増幅によって機能材料の開発を行った。また、その増幅メカニズムの解明を行い、高分子トポロジー科学と超分子化学の融合による新規複合分野の開拓を目指した。我々が発見したトポロジー効果は学術的にも産業的にも非常興味深く、様々な領域において応用展開が期待される現象ではあるが、現在のところその具体的なメカニズムは解明されていない。そこで、本研究課題において、まず、速度論的要因および熱力学的要因の調査からメカニズムの解明を行い、本方法論の基盤となる知見を蓄えることで新規融合分野の基礎の確立を行った。そして、分子量、親水・疎水セグメント比およびポリマー主鎖の変更を行い、棒状ミセルやベシクルなどの複雑な自己組織化構造を構築し、それらにおける『トポロジー効果』を調査した。また、本新規分子システムのアプリケーションの探索として環状高分子が形成するミセルの特性を活かし、ドラッグデリバリーシステムに向けた温度応答型のゲスト分子放出およびミセル触媒としての応用を試みた。環状高分子は、対応する直鎖状高分子とは『かたち』の違いから物性が異なることが知られており、学術的関心から近年様々な研究が行われている。しかし、実際のところ、『かたち』の違いによる多少の物性差(例えば、流体力学的半径比はおよそ0.9)は現れるものの、この程度の僅かな物性差異を材料分野の応用として展開するのは難しいと考えられていた。ところが一方、自然界に目をやると『環状』の高分子構造に基づく様々な機能が進化の過程で培われ、プラスミドDNAをはじめ、環状タンパク質、環状アミロースなどが、その『かたち』に基づく特異的な効果を発現することが知られている。これは、生体物質が単一分子で機能するのではなく組織を形成していることに由来する。申請者は、好熱菌と呼ばれる一部の単細胞性の古細菌がその細胞膜に環状の脂質分子を有することで海底火山や温泉など熱水環境で生息できることに着想を得、両親媒性の直鎖状ブロック共重合体を環状化し、直鎖・環それぞれの自己組織化体の特性を比較検討した。すると驚くべきことに、環状高分子ミセルは、直鎖のものと比べて構造崩壊温度(曇点)が飛躍的に上昇することを見出した。この特性を活かして、ゲスト分子の封入および温度変化による放出実験を行った。さらに、直鎖状高分子および環状高分子からゲルを作製し、水溶性のモデルドラッグとして知られるフルオレセインナトリウム塩を添加し、放出実験を行った。この特性を活かしてミセル触媒への応用を試みた。ミセル触媒は四級アンモニウム塩などの低分子相間移動触媒に比べて親水相・疎水相の界面面積がはるかに大きいため効率が良く、しかも反応系に有機溶媒を必要としないグリーンケミストリーとして注目されている。

しかし、水相中に溶解した反応試薬の濃度が高いとミセルが塩析するという問題が存在する。これに関し、環状高分子ミセルは高塩濃度中でも優れた安定性を示しており、反応時の加熱に対する耐性も相まって、ミセル触媒として高い機能性を示した。高分子化学さらに、招待講演を含む多数の学会発表を行っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。ミセル触媒として、1-ブロモアセチルピレンをミセルに内包し、水溶液中の塩化物イオンと交換するFinkelstein反応を行った。その結果、環状高分子ミセルが直鎖状高分子ミセルに比べて高い活性を示すことを見出した。本研究に関し、熱安定性と同様に直鎖状と環状の高分子を混合することで塩析濃度の制御にも成功している。これらの結果から、化学構造や分子量が同じにもかかわらず高分子の『かたち』によってミセルの水和状態が異なると考えられる。そこで、まず固体DSCを用いて、それぞれの(ミセルを形成していない)高分子が持つ水和水の量や親水部に対する相互作用の強さを調べる。さらに溶液DSCを使用し、ミセルが崩壊し溶液が懸濁する際の熱量変化を測定することで、ミセルを形成していない状態と比較し、自己組織化によってどの様な増幅効果が発現するかを調査する。一方、塩析に関して、イオン価数の変化に加えイオンサイズ依存性(LiCl vs.CsI)や疎水部であるミセルコアに接近しやすいN(Bu)_4OTsなどを使用し包括的に条件を検討する。また、一般的にコロイド粒子は帯電していると静電反発により分散状態で安定化される。この影響を調査するため、電解質溶液中でのミセルのゼータ電位測定を行う。そして、これら実験を基に熱力学的要因を明らかにする25年度が最終年度であるため、記入しない。今後、直鎖状・環状高分子の混合比を調整することでミセルサイズやポリマーの分子量、化学組成を変えることなく広い範囲で崩壊温度の制御できるという特性を活かして、ゲスト分子の封入および温度変化による放出実験を行う。まず、ゲスト分子として蛍光物質であるペリレンから着手し、抗がん剤として知られるアドリアマイシンの封入およびコントロールドリリースも検討する。
柔軟なガラス針を用いた脆弱な細胞のマニュピレートを可能にするマイクロハンドの開発

本研究の目的は、珪藻類等の脆弱な微小物体のマニピュレーションを可能にするマイクロハンドを開発することである。マイクロハンドは、物体を把持するガラス針2本と各ガラス針を動かす2組の3自由度ステージからなり、倒立顕微鏡下で操作する。研究成果を以下に示す。1.脆弱な物体を扱うには、ガラス針を細く柔軟にして把持力を抑える必要がある。そこで、太いガラス針を熱して細く引き延ばすプラーを用い、2段引き法によりガラス針を作成した。作成条件を変えて針の形状を調整し、直径約10μm以下の領域が先端から約50μmの針a、250μmの針b、500μmの針cを作成した。2.高さ調整用の手動ステージ1個と水平移動用の自動ステージ2個からなる3自由度ステージを2組製作し、それらにガラス針を取り付けてマイクロハンドを構成した。ガラス針と物体が同じ高さになるよう手動ステージを調整した後、コンピュータ制御された自動ステージを動かして物体を把持する。ガラス針を水平に近い角度で取り付けることで、従来必要だった針先の曲げ加工をせずとも物体との接触部を広くとることができた。3.針a、b、cを用いて珪藻を把持運搬する実験を行った。珪藻を破損または取り落とした場合を失敗として20回実験した結果、針aで成功3失敗17、針bで成功16失敗4、針cで成功20失敗0となった。針aではしなりが見られず、針の間隔が数μm変化すると失敗となった。一方、針b、cではそれぞれ最大25度、50度のしなり角を生じ、針の間隔や力の方向が変化しても柔軟に変形したため成功率が大幅に向上した。また、シャーレ底面に接触しても針が破損しないため、物体と底面の隙間に針を差し込んで下から力を加え、物体を回転させることも可能となった。本研究の成果により脆弱な微小物体のマニュピレーションが可能となり、バイオ分野の進展に大いに貢献するものと期待できる。