hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学校におけるいじめ問題の未然防止と早期発見に役立つ描画法の研究

そこで,「子どものストレス反応尺度」(松尾・太田・井田・竹田,2015),「学級生活満足度尺度(小学生用)」(河村・田上,1997)や「学校生活満足度尺度(中学生用)」(河村,1999)を参考に質問紙を作成した。また,児童生徒の加害性のある行動の有無を把握するための質問項目は,筆者が独自に作成した。以上の作業と並行して,児童生徒のデータを得るために,複数の小学校と中学校に調査への協力を依頼した。そして,筆者と関わりのある学校教員を窓口として,調査の実施方法や実施時期について具体的に検討する段階にまで話を進めた。また,学校現場で大規模な集団調査を実施するために,約250名分の画材を購入した。以上が,平成28年度の主な研究実績である。本研究の目的と計画を確定した。本研究では,いじめ問題の加害者や被害者になるリスクを抱えている児童生徒を投映法の1つである描画法を用いてより早い段階で把握(スクリーニング)できるようにすることを目的としている。そこで,使用する描画法としては,情緒的安定性や攻撃衝動の把握に役立つとされる「火のある風景描画法」に決定した。本研究の方法を確定した。まず,調査対象を小学1年生から中学3年生の児童生徒とした。申請時には高校生も想定していたが,これでは対象者の幅が広くなりすぎ,4年間の研究期間では実施に無理が生じるおそれがあるため,まずは小学生と中学生を対象とした。次に,これらの児童生徒に「子どものストレス反応尺度」(松尾・太田・井田・竹田,2015),「学級生活満足度尺度(小学生用)」(河村・田上,1997)や「学校生活満足度尺度(中学生用)」(河村,1999)を参考に作成した質問紙と,筆者が作成した児童生徒の加害性のある行動の有無を把握するための質問紙を実施することとした。これらによって児童生徒を群分けし,各群における「火のある風景描画法」を比較検討することで,加害者や被害者になるリスクを抱えた児童生徒の心理的徴候を把握することのできる描画特徴を見いだすこととする。調査の準備状況としては,筆者と関わりのある学校教員を窓口として,複数の小学校および中学校と調査の実施方法や実施時期について検討する段階まで話を進めた。また,学校現場で集団調査を実施できるよう,画材(画用紙,鉛筆,消しゴム,クーピーペンシル)を250名分購入した。さらに,質問紙や描画法のデータは順次パソコンに入力し,数量的に分析することになるため,統計ソフトを購入しておいた。以上の進捗状況は,4年間の研究期間の1年目になすべき作業として,順当なものであることから,<区分>(2)を選択した。本研究では,いじめ問題の加害者や被害者になるリスクを抱えている児童生徒をいじめアンケート調査のような質問紙だけでなく,投映法である描画法も用いて把握し,いじめ問題の未然防止や早期発見の一助とすることを目的としている。この目的に適した描画法としては,筆者が開発した「火のある風景描画法」を用いることとした。本法は,精神科患者の情緒的安定性や攻撃衝動のアセスメントに有用であることが示されてきたが,いじめ問題の加害者や被害者になるリスクを抱えている児童生徒のスクリーニングにも有用であることを検証するため,加害行動や被害体験との関連が想定される児童生徒のストレス反応や加害性のある行動の有無,および学校生活満足度を測ることのできる尺度と本法の描画特徴との関連を明らかにすることを計画した。
日常生活圏の視点からみた学校開放の意義とその推進方策

学校開放を推進するには,一方で, 19歳以下人工の年齢層別推移を見て,小学校・中学校・高校別に,教室等にどの程度の余裕が生じるかを予測する必要がある.他方,学校開放の必要性予測するには,とくに「日常生活圏」での社会教育サービスを必要としている高齢者人工の推移を予測する必要がある.6歳の児童が,日々「徒歩」で通学できる小学校の開放は,生活空間的に見て,高齢者の学習に不可欠の前提条件となる.まだ,核家族下の児童生徒が高齢者と接触,交流することもきわめて重要な教育的意義をもっと考えられる.このような視点から,大阪府と兵庫県で,自活体別に高齢者層(60歳以上)と,乳幼児層(4歳以下)の推移を追跡した.その結果,大阪府全体では,昭和50年から60年までに乳幼児層が10%から6%へ減少したのに対し,高齢者層は9%から12%へと増加した.とくに前者の減少傾向は著しく,比率か半分以下に低下した自活体も少なくない.兵庫県の市部についても,ほぼ同様のことがいえる.このような人口の急激な変化にもかかわらず,自活体の学校開放への取り組みは,予想以上におくれている.たしかに「学校公園方式」を積極的に推進してきた神戸市とか,条例に基づいて小学校に公民館を併設した茨木市や豊中市のような先進的事例はある,しかし,これらは,児童数の減少や高齢化の波が押し寄せる以前に提言された学校開放である.学校開放が進まない原因の一端は,一般に教育委員会内部の保守性により,とくに学校教育課の抵抗が顕著である.教育委員会内部の対応がおくれれば,財政当局から「あき教室」を放置すべきでないという批判を受けることになろう.学校開放を推進するには,一方で, 19歳以下人工の年齢層別推移を見て,小学校・中学校・高校別に,教室等にどの程度の余裕が生じるかを予測する必要がある.他方,学校開放の必要性予測するには,とくに「日常生活圏」での社会教育サービスを必要としている高齢者人工の推移を予測する必要がある. 6歳の児童が,日々「徒歩」で通学できる小学校の開放は,生活空間的に見て,高齢者の学習に不可欠の前提条件となる.まだ,核家族下の児童生徒が高齢者と接触,交流することもきわめて重要な教育的意義をもっと考えられる.このような視点から,大阪府と兵庫県で,自活体別に高齢者層(60歳以上)と,乳幼児層(4歳以下)の推移を追跡した.その結果,大阪府全体では,昭和50年から60年までに乳幼児層が10%から6%へ減少したのに対し,高齢者層は9%から12%へと増加した.とくに前者の減少傾向は著しく,比率か半分以下に低下した自活体も少なくない.兵庫県の市部についても,ほぼ同様のことがいえる.このような人口の急激な変化にもかかわらず,自活体の学校開放への取り組みは,予想以上におくれている.たしかに「学校公園方式」を積極的に推進してきた神戸市とか,条例に基づいて小学校に公民館を併設した茨木市や豊中市のような先進的事例はある,しかし,これらは,児童数の減少や高齢化の波が押し寄せる以前に提言された学校開放である.学校開放が進まない原因の一端は,一般に教育委員会内部の保守性により,とくに学校教育課の抵抗が顕著である.教育委員会内部の対応がおくれれば,財政当局から「あき教室」を放置すべきでないという批判を受けることになろう.
Alzheimer病:脳βアミロイド沈着防止方法の神経病理学的検討

本研究の目的は、Alzheimer病の原因として重要な脳βアミロイド沈着を低減する効果を示す物質を探すことにある。有望なポリフェノールとして、脳βアミロイド沈着を来すトランスジェニックマウスにタンニン酸を投与して神経病理学的行動生理学的に解析し、βアミロイド沈着の減少や認知機能低下軽減効果を示した。このほか、βタンパクの沈着病態に関して、(1)シナプスとprotofibril、(2)gangliosideとアミロイド沈着、(3)類人猿でのβアミロイド沈着などの成果を示した。老化により脳βアミロイド沈着からニューロンネットワークが崩壊してAlzheimer病発症に至る仕組みが、徐々に解明されている。その結果、Alzheimer病の成因に基づく治療法が射程に入る時代を迎え、治療に結びつく研究が社会から強く望まれている。そこで、本研究では、これまで25年に亘って培ってきた神経病理学的手法を用いた研究により、脳βアミロイド沈着を防いでAlzheimer病の発症・進行を阻止する治療法の開発を行う。脳βアミロイド沈着を防止する方法を検討するための基盤となる研究を進めた。理研の西道グループとは,βタンパク前駆体トランスジェニック+ネプリライシンノックアウトマウスでシナプスのβタンパクオリゴマーがどのように変化するか検討を続けている。19か月まで生育させ,さらに電顕所見を定量化する解析方法なので,今年度中に結果をまとめられなかった。長寿研のグループとは,ガングリオシド欠損マウスにおける脳βアミロイド沈着の変化を形態学的に検討し,興味深い結果を得て投稿準備をしている。また,βタンパク前駆体トランスジェニックマウスを使ってアストロサイトの働きを抑制する薬剤の効果も検討している。米ハーバード大との共同研究では,サルの仲間であるタマリン(寿命15年程度)の脳を検索し,12歳以上で老人斑が出現することを示した。埼玉医大の森は,トランスジェニックマウスの繁殖に成功し,ポリフェノール投与実験を行う基盤を整えた。そして,まずタンニン酸投与実験を遂行し,投与が終わったので結果を分析している。しかし,投与開始まで1年近く飼育しなければならないので,ポリフェノールの本格的な投与実験は来年度以降になる。このように本年度は開始年度なので,公表できるデータはないが,着々と研究を進めている。また,共同研究者の森は,ADの病態進展におけるアストロサイト活性化の役割を明らかにすると共に,既に部分的に有効性が確認されている新規薬剤の臨床応用を目指すtranslational researchの展開を目的とした研究を継続した。理研の西道グループとの共同研究では、βタンパクの特殊なオリゴマーであprotofibrilを特異的に認識する抗体を用いた免疫電顕を行い、シナプスに蓄積する所見を得て投稿中である。長寿研のグループとは、ガングリ、オジド欠損マウスにおける脳βアミロイド沈着の変化を形態学的に検討し、ガングリオシドのタイプが脳血管アミロイド沈着に大きく影響することがわかり投稿した。また、研究分担者の埼玉医大の森は、平成20年度は、遺伝子操作マウスを用いた研究が遂行できるように、厳格な管理体制の元で良好な飼育環境が整っている動物施設(SPF飼育施設)から動物を供する体制を確立した。即ち、Taconic社より10週齢で購入した全てのアルツハイマー病モデルマウス(Tg2576マウス)に対して、導入遺伝子の確認(genotyping)そして導入されている遺伝子コピー数の確認(Rea1-time PCR法)を行い、19ヶ月齢までの長期飼育動物を安定供給できるシステムを確立した。そして、まずタンニン酸投与実験を遂行し、投与が終わったので結果を分析している。来年度はポリフェノールの本格的な投与実験としてフェルラ酸の投与を、またアルツハイマー病治療薬として注目されている物質の投与を行う予定である。また、共同研究者の森は、ヒトS100B蛋白を過剰発現させた遺伝子改変動物とアルツハイマー病の病態モデル動物を交配させ、病態進展におけるS1OOB蛋白の関与を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、S100B蛋白の遺伝的過剰発現がアルツハイマー病の神経病理学的な病態[脳アミロイドーシス(老人斑形成)とグリオーシス]を進展(増悪)させることを明らかにした。アルツハイマー病の脳βアミロイド沈着機序を検討するため、新たに作成したβタンパクのC末断端43および38特異抗体を用いてアルツハイマー病および健常高齢者脳を検索した。βタンパク42は非認知症脳の沈着初期から蓄積することが知られているが、βタンパク43が42とほぼ同時期から一緒に沈着し始めることを4050歳代の非認知症脳で示した。また、βタンパク38が血管平滑筋で産生され、アミロイド・アンギオパチーには初期から多量に沈着することを示した。

βタンパクの長さにより、沈着開始部位が異なるので、βタンパクのγ切断部位が脳βアミロイド沈着に大きく関係することを示した。また、gangliosideのGM1を欠損しGM3が蓄積するトランスジェニックマウスをAPPトランスジェニックマウスと掛け合わせて、gangliosideがβアミロイド沈着に及ぼす効果を検討し、このGM1欠損/GM3蓄積マウスではβアミロイドが血管に多量に蓄積することを示した。さらに、タンニン酸(植物由来のポリフェノール)をアルツハイマー病の病態モデルマウス(PSAPPマウス;APP_<SW>,PSEN1dE9)に経口投与し、認知機能障害とアルツハイマー様病態(脳アミロイド症・グリオーシス)に対する効果を検討した。経口投与は、6ヶ月齢より開始し6ヶ月間行った。タンニン酸の長期経口投与により、PSAPPマウスで観察される過活動、物体認識障害、空間認知機能障害などの行動学的障害が有意に改善した。さらに、タンニン酸を投与されたPSAPPマウスでは、脳実質・脳血管のアミロイドβ蛋白沈着および脳内アミロイドβ蛋白レベルの有意な減少が観察された。タンニン酸が、脳βアミロイド沈着を押さえ、認知症の発症を遅らせる物質になる可能性を示した。βアミロイド沈着を低減するポリフェノールの投与実験を行った。脳βタンパクは、amyloid β-protein precursor (APP)と呼ばれる前駆体から作られる。このAPPに遺伝子変異を加えたトランスジェニックマウスでは加齢と共に脳βアミロイド沈着を引き起こす。このようなトランスジェニックマウスを購入・繁殖して必要数を埼玉医大の共同研究者森が担当した。PS1とAPPの二重改変マウスを飼育・繁殖し、実験に提供する体制を整えた。脳βアミロイド沈着が始まる前から沈着後の期間に、ポリフェノールとしてタンニン散を長期投与し、その効果を検討した。胃ゾンデを用いて経口投与により、6ヶ月齢より開始し6ヶ月間行い、脳病理の変化と行動の変化を解析した。タンニン散投与APPトランスジェニックマウスでは、過活動、物体認識障害、空間認知機能障害などの行動学的障害が有意に改善した。さらに、病理像を解析すると、脳内に沈着したβアミロイドが少なかった。これらから、タンニン酸がアルツハイマー病の治療薬として有効である可能性を示した。ポリフェノールとしては、さらにフェルラ酸の投与を開始している。また、アルツハイマー病の新規根本的治療薬として注目されているメチレンブルーも投与し終わり、効果を解析中である。佐々木は、アルツハイマー病の脳βアミロイド沈着防止法の発展の基礎研究として、培養ミクログリア活性化機構の解析と非Alzheimer型脳疾患でのミクログリア/脳内マクロファージの病理を含む神経病理学的検討を行い認知症発症へのミクログリアの関与を示唆する知見を示した。
熱帯アジアにおける文化遺産保存活用と地域アイデンティティ形成過程研究

本年度前半は、ヨーロッパにおける長期的な資料文献収集調査を実施し、資料読み込みのための仏・蘭語学研修を受講しながら研究を進めてきた。後半は、国内外の学会・研究会で積極的に研究発表をおこなうと同時に、上智大学において博士論文資格試験を受験し、合格した。2)海外調査:仏・蘭調査(2004年4月8月)を実施。ルメール保存研究センター(ベルギー)においてフランス革命後のフランスを中心にした遺跡保存および修復に関連する資料を収集した。また、Koninklijk Instituut voor Taal, Land en Volkenkunde(オランダ王立言語・考古研究所)資料室において、19世紀後半から1940年までのオランダ植民地期時代のボロブドゥール遺跡に関する考古発掘および修復報告書を収集した。8月から1ヶ月にわたって実施した、カンボジアおよびタイにおける現地調査では、アンコール遺跡周辺およびピマーイにおいて遺跡保存に関する最近の動きを把握するため、インフォーマルなインタビューを現地政府関係者中心に実施した。本研究課題の一部分となる前年(平成14年度)までの調査研究をまとめ論文を作成し、発表すると同時に、国内外における学会・研究会に参加することにより理論を深める。また、海外・国内調査において収集した論文・文献の徹底した読み込みを進めた。[調査・研究活動]1)学会・研究会への参加:東南アジア史学会、環境社会学会、遺産観光と文化遺産管理に関する研究会(国立民族学博物館)、クメール学研究会、文化財保存に関する研究会(東京文化財研究所)2)国内調査:国立民族学博物館図書室における資料収集(6月・1月実施)。民博所蔵の英国議会資料(BPP)を用いて英国における文化遺産保存概念の始まりと国家的な保護制度発展の歴史を考察する。また、19世紀末からの英国による東南アジア地域への政策文書から、当時のシャム(タイ)における国内情勢と遺跡保存の関係を探る。一方で、同所蔵の"Journal of Tourism Research"などにおける文化遺産観光に関する研究論文を収集し、観光学の視点から文化遺産活用の方法としてのヘリテージ・ツーリズムを検討することにより、東南アジア諸国における遺跡保存に伴う地域開発の問題を考察した。3)海外調査:フランス調査(2004年9月8日10月20日)を実施し、ユネスコ(国連教育科学文化機構)パリ本部にあるユネスコ公文書部局において世界遺産成立に関する資料を収集。1972年に成立した世界遺産条約がどのような経緯で締約されその成立過程で東南アジア諸国を代表する途上国がどのような反応をみせていったかを、条約成立前の政府間の公文書により分析。4)ギリシャ・ロドス島で開催された第7回世界遺産都市会議(9月23日26日)に出席し、世界からの遺跡保存・都市保存関係研究者、政策決定者らと交流することにより、世界全体の文化遺産保存管理の傾向を学び、そのなかでの東南アジア地域における特徴を認識できた。5)日本財団APIフェローシップ国際ワークショップ(2003年12月8日12日)における研究発表。(発表内容「文化遺産保存政策と地域アイデンティティ形成過程-東北タイにおけるクメール遺跡を事例として」)前年(平成15年度)の国内・海外調査において収集した論文・文献の徹底した読み込みを進めると同時に、国内外における学会・研究会に参加することにより理論を発展させた。また、次年度(平成17年度)予定されている現地調査にむけて、フィールド調査方法論および現地語理解を深めた。1)学会・研究会への参加:東南アジア史学会、環境社会学会、遺産観光と文化遺産管理に関する研究会(国立民族学博物館)、クメール学研究会、文化財保存に関する研究会(東京文化財研究所)、日本文化人類学会2)国内調査:国立民族学博物館図書室における資料収集(5月実施)。前年(平成15年)に引き続き、民博所蔵の英国議会資料(BPP)を用いて英国における文化遺産保存概念の始まりと国家的な保護制度発展の歴史を考察する。本年度は特に、19世紀末からの英国による東南アジア地域への文化政策を分析すると同時に、同時期の英国のエジプトへの文化政策資料との比較を試みた。3)海外調査:英仏調査(2004年8月17日9月18日)を実施。前半は、ルメール保存研究センター(ベルギー)において文化財保存学の西欧における成立背景を探るため、特にフランス革命後のフランスを中心にした遺跡保存および修復に関連する資料を収集した。同時に、同研究所が所蔵する19世紀オランダのインドネシアおよびインドシナ半島の遺跡に関する蘭語論文および調査報告書を収集し分析した。後半は、ロンドン大学考古学研究所所属図書館において、近年英国で発表されたヘリテージ研究分野の最新研究論文を収集した。また、英国遺跡保存機関(English Heritage)文書館(スウィドン)を訪れ、文化財保護法などの法律を中心として英国における遺跡保存政策成立の歴史公文書を収集した。また、滞在中に開催されていた東南アジア学会研究大会(2004年9月1日9月5日・パリ第3大学)および東南アジア考古学会研究大会(2004年9月14日9月17日・大英博物館)に参加し、西欧における東南アジア研究の研究動向を探り、西欧における東南アジア研究者およびタイを中心とした東南アジアからの参加者との交流を深める。4)旅の文化研究所主催「旅の文化研究フォーラム」に、コメンテーターとして出席。(2004年4月18日於:東京エドモンドホテル)本年度前半は、ヨーロッパにおける長期的な資料文献収集調査を実施し、資料読み込みのための仏・蘭語学研修を受講しながら研究を進めてきた。

ルメール保存研究センター(ベルギー)においてフランス革命後のフランスを中心にした遺跡保存および修復に関連する資料を収集した。また、Koninklijk Instituut voor Taal, Land en Volkenkunde(オランダ王立言語・考古研究所)資料室において、19世紀後半から1940年までのオランダ植民地期時代のボロブドゥール遺跡に関する考古発掘および修復報告書を収集した。8月から1ヶ月にわたって実施した、カンボジアおよびタイにおける現地調査では、アンコール遺跡周辺およびピマーイにおいて遺跡保存に関する最近の動きを把握するため、インフォーマルなインタビューを現地政府関係者中心に実施した。
触覚受容に必要な分子の同定と機能解析

本研究では触覚受容に必要な分子を同定し、その機能を解析することを目的としている。昨年度に引き続き順遺伝学の手法を採用して、触刺激応答に異常のあるゼブラフィッシュ変異体の単離を進めた。触刺激に対する応答以外にも光刺激、音刺激、匂い刺激、水流刺激などた他の体性感覚刺激に対する応答も観察し、触刺激応答に異常があるだけでなく、他の感覚刺激応答にも異常があるかを解析した。また、ゼブラフィッシュ稚魚の皮膚を除いて筋を露出させた状態で筋のリアノジン受容体を直接活性化するカフェインに暴露させて応答を観察することで、筋のアクチンやミオシンの変異など運動器に異常があるのか、それともそれよりも上流の神経系に異常があるのかを区別した。前者は目的とする触覚受容研究の対象ではないので、この先の解析対象から除外し、後者を解析した。次に変異体の原因遺伝子を同定するために変異のキャリア個体を遺伝的多型の多い野生型系統と交配して、変異をヘテロにもつF1個体を得て、F1同士を交配してF2世代でホモ変異体を得た。F2ホモ変異体からゲノムを抽出し、あらかじめゲノム上にデザインされたマイクロサテライトマーカーを用いたPCRによるラフマッピングで変異の乗る染色体を同定した。ゲノム中に見つかるCAリピートに注目してマイクロサテライトをデザインして、さらにマッピングを進めることで、ゲノム中の500 kb程度の領域に変異を絞ることができた。その領域には遺伝子は多くても10個程度しかないので、予想される機能に注目して優先順位を決めつつ、各遺伝子のcDNAを野生型および変異体からクローニングして、シーケンサで塩基配列を決定し、変異を探索した。これにより、本研究で得られた変異体系統のうち1つは染色体5番の中でも特定の400 kbの領域にしぼられ、その領域に存在する小胞体タンパク質をコードする遺伝子に変異があることが明らかになった。もともと予定していた研究を遂行する中で、特に当初予期していなかった実験結果は得られていない。おおむね予想通りに研究が進捗していると言える。次年度も引き続き、ゼブラフィッシュ変異体の単離を行い、それらを効率的に分類して、本研究目的に沿うものを選別して解析に回す。解析が先行している変異体については責任遺伝子の同定まで進んでいるので、発現部位の解析や機能解析を計画している。本研究では触覚受容に必要な分子の同定と機能解析を目的として、まず、触刺激応答に異常のあるゼブラフィッシュ変異体の単離を行った。ゼブラフィッシュをモデルとして順遺伝学を行い、触刺激に異常のあるゼブラフィッシュ変異体を得た。触刺激以外にも光刺激、音刺激、匂い刺激、味覚刺激、水流刺激といった他の体性感覚刺激を与えて、触刺激応答の異常と同様の感覚刺激応答の異常があるかも調べた。これにより、ゼブラフィッシュ変異体が触刺激に対する応答のみに異常があるのか、それとも感覚刺激を全般的に欠いているのかに分類することができた。さらにゼブラフィッシュ稚魚の皮膚を除いた状態でカフェインに暴露させて筋のリアノジン受容体を直接活性化して細胞質のカルシウム濃度を高めて筋収縮が起きるかどうかを調べた。これで筋収縮しないものはリアノジン受容体あるいはそれよりも下流に異常があることを示唆しており、具体的にはトロポニン、アクチン、ミオシンなどの異常による運動器の機能喪失で、そもそも運動能力を失っていることが類推される。これらの変異体を得ても本研究目的の達成にはつながらないので、これらを効率的に除外し、目的にかなう変異体を得ることができた。次に変異体の責任遺伝子を同定するためにWIKという遠系統の野生型ゼブラフィッシュと交配して、変異をヘテロにもちうるF1世代の個体をたくさん得た。F1同士を交配するとF2が得られるが、1ペアから産まれるF2個体の中で1/4にホモ変異体、すなわち触刺激応答に異常を示すものが得られるようなF1ペアをヘテロキャリアのペアとしてとして同定した。ヘテロキャリアのF1ペアを交配し、F2稚魚を得ると、その1/4は変異体なので、マイクロサテライトマーカーを用いたPCRによるラフマッピングでそれらの変異体を解析した。本研究で得られた変異体系統のうち1つは染色体5番に変異があることが明らかになった。F2

ホモ変異体からゲノムを抽出し、あらかじめゲノム上にデザインされたマイクロサテライトマーカーを用いたPCRによるラフマッピングで変異の乗る染色体を同定した。ゲノム中に見つかるCAリピートに注目してマイクロサテライトをデザインして、さらにマッピングを進めることで、ゲノム中の500 kb程度の領域に変異を絞ることができた。その領域には遺伝子は多くても10個程度しかないので、予想される機能に注目して優先順位を決めつつ、各遺伝子のcDNAを野生型および変異体からクローニングして、シーケンサで塩基配列を決定し、変異を探索した。これにより、本研究で得られた変異体系統のうち1つは染色体5番の中でも特定の400 kbの領域にしぼられ、その領域に存在する小胞体タンパク質をコードする遺伝子に変異があることが明らかになった。もともと予定していた研究を遂行する中で、特に当初予期していなかった実験結果は得られていない。おおむね予想通りに研究が進捗していると言える。次年度も引き続き、ゼブラフィッシュ変異体の単離を行い、それらを効率的に分類して、本研究目的に沿うものを選別して解析に回す。解析が先行している変異体についてはマップングまで進んでいるので、責任遺伝子の同定や発現部位の解析を計画している。解析が先行している変異体については責任遺伝子の同定まで進んでいるので、発現部位の解析や機能解析を計画している。
海馬シナプス伝達の長期増強における代謝型グルタミン酸受容体の役割

1.海馬CA1領域において、シャッファー側枝を電気刺激し、放線状層にて興奮性シナプス電位を細胞外記録した。興奮性シナプス伝達の長期増強(LTP)にどのタイプのグルタミン酸受容体が関与するかを同定するため、まず、NMDAの細胞外投与の効果を検討した。NMDAの短時間投与では、シナプス電位の短期増強が観測されたが、LTPを誘導することはできなかった。一方、グルタミン酸短時間投与では、LTPが誘導でき、NMDA受容体以外のグルタミン酸受容体の関与が示唆された。2.代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)がLTPに関与する可能性を検討するため、mGluRのアゴニストであるACPDのシナプス伝達に対する効果を観察した。ACPDの潅流投与では、短期抑圧が誘導されるのみで、LTPは誘導できなかった。CA1錐体細胞からのホールセル記録でも同様の結果を得たACPD投与とともに、細胞に繰り返し脱分極パルスを与えカルシウムチャネルを活性化させるとLTPが誘導された。したがって、細胞内カルシウム濃度上昇とmGluRの活性化が同時に起こったときにのみ、LTPが誘導される可能性が示唆された。この研究をさらに発展させるため、CA1領域に存在することが知られているmGluR5の機能ドメインに点変異を導入したものを発現する遺伝子操作マウスを現在作製中であり、mGluR5のLTPにおける役割をさらに詳細に検討する予定である。3.代謝型グルタミン酸受容体mGluR2がその誘導に関与する海馬CA3領域のシナプス伝達可塑性にカルシウム依存性のタンパクリン酸化酵素が関与することを明らかにした。CA3領域での長期抑圧の誘導にはシナプス前終末のmGluRの活性化が必要であるが、それだけでは十分ではなく、シナプス前終末へのカルシウムイオン流入とそれに引き続く生化学過程の調節が必要であることを明らかにした。興奮性シナプス伝達の長期増強にどのタイプのグルタミン酸受容体が関与するかを同定するため、まず、NMDAの細胞外投与の効果を検討した。ACPDの灌流投与では、短期抑圧が誘導されるのみで、LTPは誘導できなかった。CA1錐体細胞からのホールセル記録でも同様の結果を得たが、ACPD投与とともに、細胞に繰り返し脱分極パルスを与えカルシウムチャネルを活性化させるとLTPが誘導された。したがって、細胞内カルシウム濃度上昇とmGluRの活性化が同時に起こったときのみ、LTPが誘導される可能性が示唆された。3.グリア細胞に特異的に発現するグルタミン酸トランスポーターGLT-1を欠損したマウスでは、癲癇発作や脳損傷の憎悪が見られ、また、海馬のシナプス間隙でのグルタミン酸濃度上昇が野生型よりも大きいことを明らかにした。4.海馬および大脳より調製したシナプス後肥厚分画において、AMPA受容体がCaMKIIによりカルシウム・カルモデュリン依存性にリン酸化されることを明かにした。

5.アフリカツメガエル卵母細胞タンパク発現系および海馬の錐体細胞において、ノシセプチン受容体が内向き整流性カリウムチャネルとカップルし、受容体の活性化によりチャネルが開口することを明らかにした。1.代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)が長期増強(LTP)に関与する可能性を検討するため、入力線維を電気刺激して海馬CAl領域錐体細胞からホールセル記録を行った。mGluRのアゴニストであるACPDの潅流投与では、短期抑圧が誘導されるのみで、LTPは誘導できなかった。しかし、ACPD投与とともに、細胞に繰り返し脱分極パルスを与えカルシウムチャネルを活性化させるとLTPが誘導された。したがって、細胞内カルシウム濃度上昇とmGluRの活性化が同時に起こったときにのみ、LTPが誘導される可能性が示唆された。この研究をさらに発展させるため、CAl領域に存在することが知られているmGluR5の機能ドメインに点変異を導入したものを発現する遺伝子操作マウスを現在作製中であり、mGluR5のLTPにおける役割をさらに詳細に検討する予定である。2.海馬に存在する神経ペプチドであるノシセプチンの受容体を遺伝子ターゲッティング法により欠損したマウスでは、海馬CAl領域でのLTPが野生型の約2倍に増大していることを明らかにした。このマウスは海馬依存性の行動学習テストにおいて、記憶・学習能力が野生型よりやはり優れていることがわかった。したがって、ノシセプチンは正常動物ではシナプスの可塑的変化を抑制していることが示唆された。3.NMDA受容体のεlサブユニットを欠損したマウスでは海馬CAl領域でのLTPが減弱していることはすでに報告したが、その原因がLTP誘導の閾値上昇によることを明らかにした。このマウスでは文脈学習でも閾値が上昇していることがわかった。4.NMDA受容体ε2サブユニットのC末端の機能を検討するため、遺伝子操作により、この部分のみを欠失するε2サブユニットを発現するマウスを解析したところ、NMDA受容体のシナプス部位への輸送に障害が見られることが明らかとなった。1.代謝型グルタミン酸受容体mGluR2がその誘導に関与する海馬CA3領域のシナプス伝達可塑性にカルシウム依存症のタンパクリン酸化酵素が関与することを明らかにした。CA3領域での長期抑圧の誘導にはシナプス前終末のmGluRの活性化が必要であるが、それだけでは十分ではなく、シナプス前終末へのカルシウムイオン流入とそれに引き続く生化学過程の調節が必要であることを発表した。2.海馬CA1領域での長期増強の誘導・発現には血小板活性化因子(PAF)は必要ないことを、PAF受容体を欠損するノックアウトマウスを用いて明らかにした。3.シナプス前終末に存在し、神経伝達物質放出に関与するとされるDoc2αの機能解析をするため、この分子を欠損するノックアウトマウスを用いて電気生理学的解析を行った。通常のシナプス伝達には異常は見られなかったが、5Hz刺激による増強が変異型でより大きくなることがわかった。さらに、長期増強は野生型に比べて有意に減弱していた。したがって、Doc2αは活動依存的にシナプス伝達を調節していると結論された。
深層学習における内部状態の統計的手法による表現と新しい学習手法の構築

自然言語や運転操作の履歴など,記号化された時系列データにおいて,長短期記憶リカレントニューラルネットワーク(LSTM-RNN)や,ゲートリカレントニューラルネットワーク(GRU-RNN)などのRNNが,どのように,どの程度,長期の依存関係や,自然言語における構文情報を捉えるのかについて,近年様々な研究が行われている.しかし,実際に,内部表現にまで踏み込んで議論ができている研究例は我々の知る限りごく小数であることが現状である.近年,真相ニューラルネットワーク(DNN)を単にブラックボックスとして使うだけでなく,実際にその内部でどのような挙動をしているのかについて,人間が理解できる形で提示すること(説明可能性)が求められている.畳み込みニューラルネットワーク(CNN)については,ある程度,その内部の挙動が理解されつつある.一方で,RNNにおいては,内部の挙動について,未だ説明可能な形で解明がなされていない.そこで,我々はその初歩として,英語における句構造をあらわす構文木を線形化し文として与えて学習させたときに,RNN内で構文情報がどのようにエンコードされるかについて詳細に分析した.その結果,構文と,LSTMの状態ベクトルの間にある程度の相関関係が見られた.この結果は,構文がどのようにLSTMの内部ベクトルに埋め込まれるかを明らかにしていくベースとなる研究成果であると考えられる.また,教師なしクラスタリングのように,意味が類似している場合,ベクトルも類似することが観測されている.LSTMの内部表現の探索を行うことができている状況である.その結果,ある程度の意味の埋め込み表現を観測することができている.未だ研究は初期段階ではあるが,深層学習の内部表現の理解は,現在盛んに社会から求められている,「説明可能なAI」へ向けての礎になる可能性があり,その内部表現について,一部ではあるが,分析結果が得られたという事実は,重要である.したがって,研究はおおむね順調であるといえる.今後も引き続き,内部表現の分析を行っていく予定である.その際,より深くまで踏み込めるよう,様々な統計的手法を駆使する必要がある.そういった手法について,研究分担者と協力し,最適なものを探索していく.自然言語や運転操作の履歴など,記号化された時系列データにおいて,長短期記憶リカレントニューラルネットワーク(LSTM-RNN)や,ゲートリカレントニューラルネットワーク(GRU-RNN)などのRNNが,どのように,どの程度,長期の依存関係や,自然言語における構文情報を捉えるのかについて,近年様々な研究が行われている.しかし,実際に,内部表現にまで踏み込んで議論ができている研究例は我々の知る限りごく小数であることが現状である.近年,真相ニューラルネットワーク(DNN)を単にブラックボックスとして使うだけでなく,実際にその内部でどのような挙動をしているのかについて,人間が理解できる形で提示すること(説明可能性)が求められている.畳み込みニューラルネットワーク(CNN)については,ある程度,その内部の挙動が理解されつつある.一方で,RNNにおいては,内部の挙動について,未だ説明可能な形で解明がなされていない.そこで,我々はその初歩として,英語における句構造をあらわす構文木を線形化し文として与えて学習させたときに,RNN内で構文情報がどのようにエンコードされるかについて詳細に分析した.その結果,構文と,LSTMの状態ベクトルの間にある程度の相関関係が見られた.この結果は,構文がどのようにLSTMの内部ベクトルに埋め込まれるかを明らかにしていくベースとなる研究成果であると考えられる.また,教師なしクラスタリングのように,意味が類似している場合,ベクトルも類似することが観測されている.LSTMの内部表現の探索を行うことができている状況である.その結果,ある程度の意味の埋め込み表現を観測することができている.未だ研究は初期段階ではあるが,深層学習の内部表現の理解は,現在盛んに社会から求められている,「説明可能なAI」へ向けての礎になる可能性があり,その内部表現について,一部ではあるが,分析結果が得られたという事実は,重要である.したがって,研究はおおむね順調であるといえる.今後も引き続き,内部表現の分析を行っていく予定である.その際,より深くまで踏み込めるよう,様々な統計的手法を駆使する必要がある.そういった手法について,研究分担者と協力し,最適なものを探索していく.予定していた国際会議に参加しなかったため旅費の支出がなかった.また,今年度は,計算機を,既存のもので代用したため,購入を延期した.次年度は,国際会議に参加するとともに,古くなった計算機の更新などを予定している.
思春期女子の月経前症候群の症状軽減に向けた教育的介入プログラムの有効性の検討

月経前症候群(PMS)は、生殖年齢女性の身体的・精神的苦痛だけではなく、社会機能や対人関係にも負の影響を与える。このようなPMSは、10代の早い時期から始まると言われている。10代は心理的・生理的変化が大きい思春期として、PMSが心身健康、集中力やモチベーション、学習成績など学校生活に与える影響が大きい。一方、青少年のPMSは確立した治療方法がないため、PMSとの関連が示されたストレス、食生活、運動などに焦点をあてた他のアプローチが求められる。そこで、本研究は思春期女子を対象に、月経前症候群の症状軽減に向けた教育的介入プログラムを作成し、その有効性を調べることを目的とした。2018年度は、当初の計画通り、所属の研究倫理審査委員会から研究実施の承認を得た。また、研究対象校の選定を行い、研究対象に適している高等学校を訪問し、本研究の目的と方法について説明を行い、学校長から研究協力への承認を得た。同時に、調査票の作成、プレテスト、関連情報の収集を行った。また、第1回目の介入に用いる教育プログラムの構築を行い、現在作成したプログラムの再確認を行っている。ベースライン調査に用いる質問紙、保護者へのインフォームドコンセントに用いる説明書、対象生徒へのインフォームドアセントに用いる説明書および関連資料の準備を行った。また、対象校と話合いながら、第1回目の質問調査の日程、第1回目の介入日程の調整を行った。同時に、オリジナルPMSのダイアリー冊子の作成と編集を行った。研究計画を立てる当初は、2019年3月までベースライン時調査を実施し、早い介入群に対しては第1回目の介入を実施する予定であった。しかし、研究対象学校の都合により、新学期に入ってから第1回目の調査を行うことになったので、予定よりやや遅れている状況である。2019年度:5月中に第1回目の調査を実施し、データ分析を行い、介入群と対照群の割り付けを行う。6月中旬から介入群に対して第1目の介入を行い、9月中旬ごろに第2回目の介入を行い、12月中旬から3月には、介入群と対照群の両群に対して第2回の質問紙による調査を実施し、データ入力や分析を行う。同時に、ベースライン時調査結果をまとめ学会で発信する。2020年度:データ分析を行い、介入効果を検証し、結果をまとめ発信する。また、対照群に対して介入群と同様な教育プログラムを用いた介入を行う。理由:対象校の都合により、ベースライン時調査を新学期にする実施することになったため、調査に関する費用はすべて次年度に使用することとなった。使用計画:2018年度の助成金は、2019年度分と一緒に、調査関連資料の作成や印刷、調査実施やデータ入力などに必要な人件費、国内外の学会参加費や旅費などの諸経費に使用する。
細胞の磁気操作による毛細血管網を含む生体組織の構築

平成19年度は申請書の実験計画通り、以下の通りに進めた。1.磁力を用いた肝実質細胞一線維芽細胞からなる共培養細胞シートの構築線維芽細胞(NIH3T3細胞)と肝癌細胞(HepG2細胞)に磁性ナノ粒子を取り込ませて磁気ラベルし、それぞれの細胞を、磁石を設置した超低接着性培養皿に播種した。播種された細胞は、培養皿底面に接着することができないために、細胞間で結合・接着をはじめて、NIH3丁3細胞とHepG2細胞からなる共培養三次元組織を形成した。この三次元共培養により、HepG2の肝機能の一つであるアルブミン分泌能が向上したことから、我々の開発した「磁力を用いる細胞の磁気操作法」により、機能する三次元組織の構築に成功した。2.血管内皮細胞がパターン化された細胞シートの構築磁力を用いた細胞のパターニング技術を基盤にして、血管内皮細胞を含む細胞シートの構簗法の検討を行った。具体的には、(1)磁力を用いて線維芽細胞シートおよび筋芽細胞シートを作製し、(2)磁石をマイクロパターン化磁石(幅200μm)に取り替えて、細胞シートの上に磁性ナノ粒子で磁気標識した血管内皮細胞を播種した。結果として、それぞれの細胞シート上に、磁石の形状と同様の200μm線状に血管内皮細胞をパターンすることに成功した。このことから、我々の開発した「磁力を用いる細胞の磁気操作法」により、パターン化された血管内皮細胞を含む三次元組織の構築に成功した。以上の結果より、磁力を用いる細胞の磁気操作法は、ティッシュエンジニアリングにおける有用な技術であると考えられる。平成18年度は申請書の実験計画通り、以下の通りに進めた。1.血管内皮細胞のマイクロパターニング技術の開発Computer-aided design (CAD)により、マイクロメートルオーダーの溝をレーザーでアクリル板に刻み、その溝に磁性体を埋入することで「M」「A」「G」の形に200μmの幅でマイクロパターニングされた磁石を得た。一方、ヒト贋帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)に、カチオニックリポソームで包埋した磁性ナノ粒子(MCL)を取り込ませて、磁気ラベルした。磁気ラベルした細胞は、マイクロパターン化した磁石に沿って配列した。さらに、この方法は磁力を用いるために、培養表面の材質を選ばないことから、種々の培養表面上でパターニング可能なことを示し、マトリゲル上でパターニングされたHUVECは、管腔構造を形成した。2.各種細胞シートの構築線維芽細胞、心筋細胞、および間葉系幹細胞に、MCLを取り込ませて磁気ラベルした。磁気ラベルした細胞を、磁石を設置した超低接着性培養皿に播種したところ、培養皿底面に接着することができないために、細胞間で結合・接着をはじめて、細胞シートを形成した。線維芽細胞はI型コラーゲンやフィブロネクチンといった細胞外マトリクスを産出し、丈夫な細胞シートを形成した。心筋細胞はコネキシン43を細胞間に発現し、電気的にっながった心筋細胞シートが形成された。間葉系幹細胞シートは、線維芽細胞シートと同様に丈夫で、さらに分化誘導培地を用いて培養することで、骨芽細胞・軟骨細胞・脂肪細胞へと分化したことから、治療への応用が期待できる。
下痢性貝毒原因種Dinophysis属の増殖生理と毒生産能に関する研究

Dinophysis属の栄養生理特性、増殖・毒生産能とそれらに及ぼす環境条件の影響を調べた。国内各地における自然群集のDinophysis属各種の細胞毒量の特徴を明らかにした。本属の増殖は、クリプト藻Teleaulax amphioxeiaを餌とする繊毛虫Myrionecta rubraの存在に強く依存し、温度、光の影響を強く受け、一部の毒成分は増殖の進行と共に細胞外に活発に排出された。同じ環境下で培養された同一種の毒量や毒組成が株間で大きく違う場合があり、遺伝的要因の関与が示唆された。これまで下痢性貝毒原因プランクトンDinophysis属の培養は困難であったが、最近その一部の種の培養が成功し、その解明の糸口が開けた。本研究では、その培養手法を発展させ、Dinophysis属の増殖にかかわる栄養特性の詳細を明らかにするとともに、異なる海域から分離培養されたDinophysis属の種類、分布海域および培養条件等の違いによる毒生産能や毒成分の特徴を詳細に調べ、Dinophysis属の毒生産や毒組成に関する情報を得る。これらの成果から、Dinophysis属の増殖のカギとなる栄養的な要因を解明するとともに、毒生産や組成に及ぼす地域的、環境的な要因を明らかにし、緻密で高精度な下痢性貝毒の監視体制の確立に資する。1Dinophysis属2種の毒生産に及ぼす温度の影響Dinophysis fortiiとD.acuminataの2種に繊毛虫Myrionecta rubraをそれぞれ餌料として与えた時の増殖と下痢性毒(ディノフィシストキシン[DTX]1、オカダ酸、ペクテノトキシン[PTX]2)の生産に及ぼす培養温度の影響について検討した。各温条件区(10、14、18、22°C)においてD.fortiiは最大6504,000細胞/mLまで、D.acuminataは1,7004,200細胞/mLまで増殖した。両種とも今回設定した温度区では、高温ほど良好な増殖を示した。培養されたD.fortiiおよびD.acuminataから主要毒3成分がすべて検出され、培養日数の経過とともに指数関数的な増加が見られた。D.fortiiの場合、生産された毒濃度はPTX2で250-1,000ng/mL、オカダ酸で8.5-135ng/mL、DTX1で1.0-6.0ng/mLの範囲であった。D.acuminataの場合、PTX2で200-430ng/mL、オカダ酸で16-120ng/mL、DTX1で1.2-3.8ng/mLの範囲であり、いずれも高温ほど生産量が高くなる傾向が認められた。オカダ酸・DTX1の産生量は、両種の間に有意な差がなかったが、PTX2では約2倍程度D.fortiiの方が多かった。2北海道・東北から分離した天然のDinophysis属プランクトンの毒組成北海道・東北海域のDinophysis属プランクトンを単離し、毒組成を解析した結果、同一海域の同一種間の毒組成や毒量に大きな差異があることが明らかになった。また、培養したD.acuminataからオカダ酸やPTX群に加えて、複数のオカダ酸ジオールエステル群を検出し、LC-MS/MS分析により化学構造を解析した。Dinophysis acuminataとD.fortiiが増殖過程において生産する毒量の変化を詳細に調べた。1022°Cの範囲で両種の毒生産は温度の影響を受け、餌を活発に捕食することで毒を積極的に生産したが、生産された毒が主に細胞内に保有される成分と細胞外に活発に放出される成分があることが判明した。すなわち、毒成分であるペクテノトキシン2は増殖期間中に細胞内にほとんど存在し、培養終了時のD.acuminataとD.fortiiの本成分の細胞外放出毒量は全毒量のそれぞれ5%と2%にすぎなかったが、ジノフィシストキシン1とオカダ酸については培養時間とともに細胞外に放出する毒量が増加し、培養終了時のそれぞれの値はD.acuminata株で80%と81%、D.fortii株で80%と87%に達した。また、西日本にも高濃度で毒を産生するD.acuminataが分布することが明らかとなった。これらの成果の一部から「下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法」として特許申請を行った。また、Teleaulax amphioxeiaを餌料として培養した混合栄養繊毛虫類(Strombidium sp.)をDinophysis属にその餌料として与えたが、増殖は確認できなかった。

なお、当初計画していたT.amphioxeiaへのGFP発現ベクター遺伝子の効率的な導入法については、導入に必要なストレスに対してT.amphioxeiaが耐性をもたず、その打開策の検討には多くの時間、予算等が必要となるため実施困難と判断した。次年度からはこの研究内容を中止し、Dinophysis属の毒生産能やそれに及ぼす環境条件の検討に焦点を移す。地域個体群の違いによる毒生産能の違いについて、北日本の北海道能取湖と西日本の広島湾におけるDinophysis属2種の分離株の値を比較したところ、Dinophysis fortiiでは能取湖産株が細胞毒量で平均80倍程度高く、Dinophysis acuminataでは平均20倍程度高い値を示した。同じ培養条件下で培養を行ったので、この違いには温度や餌条件といった環境要因の違いよりも、遺伝的要因が関与する可能性が考えられた。播磨灘から分離したD.acuminata培養株を用いて、温度と毒生産の関係についての詳細な実験を行ったところ、本種の増殖は832°Cで確認され、いずれの温度でも毒生産が認められた。増殖速度および最大細胞密度は、2026°Cで見られ、毒生産は2023°Cで最大値を示したことから、毒生産に好適な温度のあることが示唆された。本年度、新たにDinophysis triposの培養に成功し、その増殖特性と毒生産能を明らかにした。Myrionecta rubra以外の餌料生物として他の繊毛虫類の培養を実施し、試験的にDinophysis属2種に給餌したが増殖せず、新たな餌料生物の発見に至らなかった。これまで二枚貝からのみ検出されていた下痢性毒類縁体であるオカダ酸ジオールエステルを国内ではじめてD.fortii及びD.acuminataの大量培養液から検出し、精製および構造解析のためにその成分を抽出した。光強度がDinophysis fortiiの密塵変化に及ぼす影響を室内半連続培養実験で検討した結果、餌料が豊富な条件でも光強度の低い時には高い密度を維持できないこと、正の増殖速度には約5μmol photon m^<-2>s^<-1>以上の光が必要となることがわかり、光条件が本種の増減に大きな影響を及ぼすことが判明した。初夏のほぼ同じ時期に東北地方の4海域から採集した天然のD.fortiiの細胞毒量と毒組成を調べ,これまで情報が少なかった日本海側におけるD.fortiiの天然個体群の細胞毒量の特徴を新たに明らかにした。特に、秋田県で採取した個体群の毒成分の一つ(ペクテノトキシン2)は太平洋側の個体群株よりも高くなる傾向が認められ、D.fortiiの毒組成や細胞毒量は同時期であっても地域によって異なると考えられた。一方、Dinophysis属の葉緑体がクリプト藻Teleaulax amphioxeiaを起源とする繊毛虫Myrionecta ruburalの葉緑体に完全に依存することを調べるため、T.amphioxeiaの餌料で1年以上継代培養したM.rubraを餌料としてDinophysis acuminataを培養し、T.amphioxeiaおよびD.acuminataからそれぞれ葉緑体画分のみを調整し、精製した葉緑体粒子からそれぞれDNA抽出を行い、次世代シーケンサーで全長解析を試みた。結果については現在解析中であり、次年度以降の他の関連研究の中で詳細を報告していく予定である。
β-シヌクレインとHSP27の相乗的神経保護作用の解析

我々は、変異型β-synがシヌクレイノパチ-において神経変性促進作用を有するのではないかという仮説を立て、変異型(V70M、P123H)β-synをB103神経芽細胞に過剰発現したところ、巨大なリソソーム様の封入体形成を認め(、これらの封入体はα-synの共発現により著しく増加することなどを観察した。さらに変異型β-synは、野生型β-synとは異なり、明らかな凝集傾向を示すことなども確認した(Wei et al,J Biol Chem 2007)。これらの結果は、変異型β-synの神経変性促進作用を支持するものであった。Thy-1プロモーターをもちいた変異型β-synP123H過剰発現型トランスジェニックマウスを作製し、解析をおこなった結果、平衡運動感覚能力の有意な低下などの行動学的所見、及び、淡蒼球や網膜などにおいて神経軸索変性を反映するような神経終末の肥大、神経軸索の拡張などの病理学的所見を得て、引き続き、詳細な解析をおこなっている。我々はパーキンソン病などの病態において、β-synがα-synの凝集を抑制し、神経保護的に作用する内因性分子ではないかという仮説を提唱してきた.I.引き続き、β-synの神経保護作用を増強する方法としてヒートショックプロテイン(HSP)との協調的作用に関して検討中である。これに関しては、i)セルフリーの条件で、β-synとHSP27が相乗的にα-synの凝集を抑制することをイミュノブロット法や電子顕微鏡を用いて確認した。ii)さらにアデノウイルス付随ベクターにβ-synとHSP27のcDNAをサブクローニングした発現ベクターを構築し、マウス、ラットのモデル系においてそれらの発現を観察中である。II.変異型β-syn(P123H,V70M)においては、野生型β-synにみられるような神経保護効果の喪失、あるいは神経変性効果の獲得が考えられる。これらの仮説をi)試験管においては、大腸菌で変異型β-synP123H,β-synV70Mのリコンビナント蛋白を作成し、これらが単独で凝集し、かつ、α-synの凝集を促進することをイミュノブロット法や電子顕微鏡を用いて確認した。ii)B103神経芽細胞にCMVpromoterを用いた発現ベクターをもちいてβ-synP123Hを過剰発現させた細胞株を作製し、解析中である。iii)トランスジェニックマウスに関しては、ゲノムDNAをPCRやサザンブロットなどを用いて、FOマウスにおけるβ-synP123Hのトランスジーンを確認し、さらに野生型マウスを交配して得られたF1(4ヶ月)に対し、β-synP123HのmRNA、及び、蛋白レベルにおける発現を、定量性PCR,ウェスタンブロット法,免疫組織化学等などにより解析し、2つの高発現ライン、4つの低-中発現ラインを系統化した。さらに、bleedingを繰り返しており、F2の老齢マウスに対しても同様の病理解析、及び、ロタロッドなどによる行動解析を行なう予定であるIII.その他、本プロジェクトに関連して1.DJ-1(Park7)の初期のパーキンソン患者の髄液における上昇2.赤血球にα-synが存在すること。3.α-synの細胞分化促進作用の機序などの知見を得ておりそれぞれ検討中である。我々はパーキンソン病などの神経変性疾患の病態において、β-シヌクレイン(β-syn)がアミロイド蛋白であるα-synの凝集を抑制し、神経保護的に作用する内因性分子ではないかという仮説を提唱してきた.この仮説を神経培養細胞、及びトランスジェニックマウスの実験系を用いて証明してきた。1.野生型、及び、変異型β-synとHSP27によるα-syn凝集抑制作用/神経保護作用を解析した。α-syn,あるいは遺伝子変異(P123H及び、V70M)による変異型β-synを発現した神経培養細胞にたいして、β-syn、及び、HSP27をそれぞれ単独、あるいは、同時に発現させ、神経細胞死や蛋白凝集を解析することにより判定することにより。これらの分子の神経変性抑制効果を判定する。特に、変異型β-synを発現した神経培養細胞において、単独、及び、α-synと相乗的にリソソーム系の封入体を形成することを見いだした(魏ら、論文投稿中,及び、特許出願中)。2.変異型β-synによるα-syn凝集抑制作用/神経保護作用を比較検討した。a)β-synP123H