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マレーシアおよび周辺の鼻笛文化：基礎調査と応用的活用

本年度は、H25年度より継続された科研費研究の最終年となるため、研究目的の一つである“鼻笛文化の広報と普及"の活動を主として進められた。鼻笛文化はその全ての地域において衰退の一途をたどり、継承者は年配者に限られるため、この特異な音楽文化の早急な調査が必須である。学術界での発表に加えて、広く人々の耳目に触れる機会を設け、ネット媒体も活用した世界に向けての情報発信の機会をつくりだすことが求められる。鼻笛文化は単にオセアニア地域、東南アジア、東アジアの海岸沿いの国々に存在するだけではなく、H29年に行ったミャンマー、チン州へのフィールドワークでは、広く認知されていなかった太平洋沿岸よりミャンマー西部山岳地域への伝播経路にも調査が及んだ。本年度の活動では、ミャンマー地域での調査も加えた発表となった。主たる活動:1」H30、5月13日、九州大学箱崎校において開催されたビルマ研究会における口頭発表。演目「ミャンマー・チン州に伝承される鼻笛文化および太平洋地域の鼻笛文化との比較調査」。2」H30、9月22日30日にかけて行われた、香港舞台芸術大学(HKAPA)リサイタルホール、香港McAulay Studio Art Centreにて開催された現代芸術祭における「アジア、オセアニア地域の鼻笛文化」解説と演奏。学界という専門的な人々の集まりではなく、広く一般への発表が行われた。3」H30、10月28日、福岡市、福岡シンフォニーホールにて開催されたフルートフェスティバルにおいて、同じ笛族であるフルートの愛好家たちへの鼻笛の演奏と解説。4」H31、2月5日16日までの期間において、米国サン・ベルナルディーノ市におけるカリフォルニア州立大学内での演奏、講演。また近郊のバニング市にて講演を行った。本研究は、平成25年度より行った、課題番号:25370189「マレーシア先住諸民族の鼻笛:基礎調査と現代的活用」の延長線上に則ったものである。諸国における鼻笛の文化は残念ながら消えゆく道をたどっており、本研究においては鼻笛に関する学術的調査に留まらず、現地及び一般の人々へ広く伝え、いかに自文化への興味、誇りに繋げるかを目的としている。加えて本調査では、ミャンマー西部チン州に伝承される鼻笛文化を調査する。太平洋地域に残された鼻笛文化と、ミャンマー山岳地域に伝承されているものとを比較検証するための基礎調査を行う。以下、本年度の渡航実績を記す。1」28年8月9日19日、マレーシア・クアラルンプールでの継続的調査、及び広報活動に対する準備。25年度から始めたクアラルンプール近郊に住む鼻笛演奏者からのライフ・ヒストリーの聞き取り。マレーシアでの普及活動に関する協力者との打ち合わせ。クアラルンプール在住Yi Kah Hoe教授より、ミャンマー調査に関する情報を収集。2」28年10月26日11月6日タイ・バンコク市にて、タイ・インドネシア・日本、合同の仮面劇(Ocean's Blue Heart)公演に笛奏者として参加。公演は10月13日タイ・プミポン国王陛下の崩御による芸能分野の自粛時期と重なり、追悼公演として公開された。アジアの鼻笛に関するレクチャーを、主に学生を対象として実施した。3」平成29年1月31日2月8日、ミャンマー・ヤンゴン市にて、ミャンマーの鼻笛文化に関する情報を収集。来るチン州でのフィールドワークに、ヤンゴン市在住の日本人写真家、後藤修身氏に同行を依頼。現地旅行社との打ち合わせ。国立博物館、元館長Nu Mra Zan博士とのインタビュー。Gitameit音楽学校校長と鼻笛文化の広報、普及などの可能性を話し合った。「研究実績の概要」に記した順に記述。1」クアラルンプール近郊Gombak村のRaman Bah Tuin氏から継続的なライフ・ヒストリーの聞き取り。鼻笛に関する公演、レクチャー活動などの計画を、国立マレーシア交響楽団フルート奏者Keiko Nakagawa女史、ラジオ・パーソナリティChong Keat Aun氏などと話し合いを持った。またミャンマーでの調査に対する情報をSEGi大学Yi Kah Hoe教授から提供を受ける。2」バンコクNikorn Sae Tang教授からの招聘事業(Ocean's Blue Heart)に、創作仮面劇に笛奏者として参加。公演の中で各種の横笛演奏に加えて鼻笛の演奏も組みこまれた。今回の特殊事情としてプミポン国王陛下の崩御により芸能活動の自粛時期と重なってしまい計画実施が危ぶまれたが、主催者の強い行動力により、追悼公演として公開される運びとなった。結果的に多くの聴衆が来場し、笛一本で演奏する「国王陛下賛歌」が始まると、全員が起立し厳粛な雰囲気に包まれた。Creative Industries会場にて「日本の笛、アジアの笛、鼻で吹く笛」という講題でレクチャーを開催した。3」28年度より、ミャンマー西部チン州に伝承される鼻笛文化の調査を開始した。山村地域での調査としては、一回のみの訪問では調査の信憑性が深められないことを考慮し、複数回の渡航を計画している。ただし調査地の村落は簡単に渡航できる地域ではなく、チームを編成した渡航が必至であった。季節的な渡航時期にも配慮が必要で、チン州各村の実力者からのアドバイスを受け、初めてのチン州渡航を29年4月とした。同ヤンゴン滞在中に国立博物館、元館長Nu Mra Zan博士、Gitameit音楽学校校長Nay Win Htun氏と鼻笛に関する広報、普及の可能性などを話し合った。諸地域における鼻笛文化は消えゆく道をたどっている。

本研究においては学術的調査だけに留まらず、現地および広く一般の人々へ情報を発信することにより、継承者が伝統に誇りを持ち、また多くの人々が鼻笛文化に理解を深める動きへと結び付けていくことを目的としている。昨年度は様々な講演、演奏の機会を得て、鼻笛文化を紹介することに努めた。またミャンマー西部チン州、ガーン族(Kaang)に伝承される鼻笛プールン(Pue Luen)の現地調査を行った。以下、29年度の渡航実績。1」29年4月:ミャンマー、チン州、ミンダ(Mindat)、ヨーポン(Yo Paun)、フラトゥイ(Hla Tui)、ジョーク(Kyuk)各村への聞き取り調査を行い、この地域に伝承される鼻笛プールンと、太平洋地域の鼻笛文化との比較検証をすることによって、どのような経路でガーンの人々がチン州へ移り住んできたか、その手掛かりを得ることができた。2」8月:the Asia-Pacific Society for the Cognitive Sciences of Music APSCOM6にて講演。3」10月:REP Heritage Hub World Music Festival, Siem Reap, Cambodiaにて講演、シンポジウムに参加。4」11月:Bangkok International Performing Meeting 2017にて講演。5」12月:Japan Culture House, Myanmar, Yangonにて演奏、講演。6」12月:Hibikiya.Pte.Ltd.,Singaporeにて講演、演奏。引き続きマレーシア、クアラルンプール近郊、ゴンバック地区(Gombak)にて、鼻笛奏者ラマン氏(Raman)のライフヒストリーを聞き取り。フィールドワーク調査の要は、何よりも「当たって砕けろ」精神だと実感する。昨年度の調査計画は、ミャンマー西部チン州、ガーン族に伝承される鼻笛プールンの現地調査であった。29年2月、ヤンゴン市に初めて渡航し、民族文化研究者、チン州在住者などから情報を収集したが、4月、実際の調査で知り得た情報、人脈は絶大であった。ヤンゴン市在住、写真家の後藤修身氏と、チン州ジョーク村出身、地域振興を推進し地方議員を志す青年Salai ThangKee氏に同道してもらい、3台のバイクで編隊を組んで調査に向かった。Thang Kee氏の人脈により、4つの村で計6名の鼻笛奏者からのインタビュー、鼻笛と歌との合奏、狩りの踊りと縦笛合奏、元シャーマンから祖先より伝えられた詩の朗詠など、ほぼ3回分の聞き取りに匹敵すると思える成果であった。鼻笛文化と共通して持ち合わせる、刺青、檳榔、過去の首狩りの風習などの文化も、大まかではあるが確認することができた。またフラトゥイ村で記録した鼻笛と歌との合奏は、太平洋地域では見られない形式で新たな発見であった。元来チン族と呼ばれる人々は、チベット、モンゴル地域から南下してきた多くの民族を包括した呼称であるが、ガーン
リンパ増殖性疾患における血中可溶性分画アミノペプチダーゼ活性の上昇機序の解明

可溶性分画アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1 C-LAP)は、肝、腎、リンパ節などの組織の可溶性分画に豊富に存在する酵素である。したがって肝炎を中心とした肝細胞の損傷で、この酵素活性が血清中で著しく上昇することが知られていた。しかし、この酵素活性の軽度の上昇が、肝由来と考えられる他のトランスアミナーゼの上昇を伴わない状態で、白血病、悪性リンパ腫などの血液悪性腫瘍の一部、麻疹、風疹などのウィルス性疾患にも認められることが明らかにされてきた。本研究の目的は、このCーLAPの上昇の機序を解明することにあった。本研究の成果は以下にまとめることが出来る。1)各種病態でのこの酵素活性の変動は電気泳動分析を中心に行われてきたが、特異性に多少の問題があることが判明し、新たな課題として他の血清中アミノペプチダーゼの阻害剤のスクリーニングを行い、この阻害剤を用いた特異性の高い測定法が開発出来たことである。これによりより確実に病態での酵素活性の変動が観察可能である(臨床病理、投稿中)2)肝障害の種類を、特に急性および慢性肝炎群、肝硬変群、原発性肝癌の3群を、このCーLAPとLDH5の比を用いることにより判別することが可能である。(臨床病理、36,1987)3)ウィルス性疾患のなかで、伝染性単核球症、麻疹では発症初期からのこの酵素活性の上昇が認められることが明かとなった。LDHのアイソザイム分析の結果などとも併せて、この上昇した酵素活性はリンパ球由来であることの可能性が考えられた。(AJDC 142,1988)4)血液悪性腫瘍でのこの酵素活性の増加がT細胞に由来する腫瘍で頻度が高いことが判明した。悪性リンパ腫などの診断、治療にこの酵素活性の測定は有効である。(準備中)可溶性分画アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1 C-LAP)は、肝、腎、リンパ節などの組織の可溶性分画に豊富に存在する酵素である。(準備中)可溶性分画アミノペプチダーゼ(C-LAP)は,肝の可溶性分画に多量に存在し,肝細胞障害で血中に著しく上昇する.しかし,明らかな肝細胞障害を伴わなくても,白血病,悪性リンパ腫などの血液悪性腫瘍,伝染性単核球症などのウィルス感染症でも血中に上昇する.本研究は,この上昇の機序を明らかにすることを目的としている.本年度は肝以外の臓器も含めて,この酵素の精製と,それに対する抗体の作成を中心とした.また,その間に,風疹,麻疹の患者を中心に時系列的な可溶性アミノペプチダーゼの血中での変動を観察した. (Clin, Chem, 34,印刷中, 1988)さらに,血液悪性腫瘍でのC-LAPの変動を症例を追加して解析した. (Clin・Chem・準備中)本年度の成果は一)肝由来の酵素に対する抗体を2種類用意することが出来た.2)この抗体を用いて,さらに肝酵素の精製を続けた.3)風疹の患者で感染初期に,発疹の出現に先立つか,出現とほぼ同時期にC-LAPは血中に著明に増加する. 3-6日を極期として酵素活性は低下するが,遷延する症例は肝細胞の軽度の障害を伴ってくる症例である.

酵素活性の低下を待って風疹の抗体価は上昇してくるので,早期診断に重要である.また,麻疹の患者ではこの酵素活性の上昇は発疹の極期でも著明ではない.4)白血病の中では,急性単球性白血病で上昇が著明であり, 90%の症例で,肝酵素の上昇なしでの酵素活性の上昇が観察される. MDSなどでも上昇する症例が存在する.可溶性分画アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1C-LAP)は、肝、腎、リンパ節などの組織の可溶性分画に豊富に存在する酵素である。したがって肝炎を中心とした肝細胞の損傷で、この酵素活性が血清中で著しく上昇することが知られていた。しかし、この酵素活性の軽度の上昇が、肝由来と考えられる他のトランスアミナーゼの上昇を伴わない状態で、白血球、悪性リンパ腫などの血液悪性腫瘍の一部、伝染性単核球症、麻疹、風疹などの一部のウィルス性疾患にも認められることが明らかにされてきた。本研究の目的は、この肝疾患以外でのこのC-LAPの上昇の機序を解明することにあった。昨年度の成果は、この酵素の精製と抗体の作成であり、抗体を用いた親知クロマトグラフィーによる酵素の精製が容易になった。一方、麻疹を中心として、ウィルス性疾患でのこの酵素活性の上昇を追跡出来た。本年度の成果は、1)各種病態でのこの酵素活性の変動は電気泳動分析を中心に行われてきたが、特異性に多少の問題があることが判明し、新たな課題として他の血清中アミノペプチダーゼの阻害剤のスクリーニングを行い、この阻害剤を用いた特異性の高い測定法が開発出来たことである。これによりより確実に病態での酵素活性の変動が観察可能である(臨床病理、投稿中)2)ウィルス性疾患のなかで、伝染性単核球症、麻疹では発症初期からのこの酵素活性の上昇が認められることが明らかとなった。LDHのアイソサイム分析の結果などとも併せて、この上昇した酵素活性はリンパ球由来であることの可能性が考えられた。(AJDC 142、1988)3)血液悪性腫瘍でのこの酵素活性の増加がT細胞由来の腫瘍で頻度が高いことが判明した。(準備中)
日本における洋服立て業の源流 : 香港・上海租界から横浜居留地への進出と技術伝播

本研究では、幕末に香港および上海租界から横浜居留地へ進出した洋服仕立て業者に着目し、営業の実態や日本人への仕立て技術伝播の実態を明らかにすることを目的とした。横浜居留地で開業した洋服仕立て業者の多くは、"香港および上海租界を経由した欧米業者"と"香港および上海租界において欧米業者から仕立て技術を習得した中国業者"である。資料は、Directoryや開港場で発行された英字新聞などを用いた。また、香港大学図書館および香港中央図書館では19世紀の香港および上海租界に関する調査を行った。その結果、欧米業者は横浜より先に開業した香港店や上海店において経験を積んだ経営者や職人を横浜店で雇用したことが明らかになった。彼らは、材料の販売から仕立てまで一貫した経営を行ったほか、部門別による経営によって服飾品から日用品まで多様な商品を扱ったうえ、現金取引や割引販売を行い、不特定多数の顧客を相手に洋服仕立て業を商業として発展させていったことがわかった。慶応の頃には、彼らから独立し開業する者が現れ始めた。これに対し、中国業者は専ら仕立て業に従事し、明治期に入ると欧米業者を上回る数の店舗を設け洋服仕立て業界に台頭していった。顧客の多くは居留する外国人をはじめ寄港する船員や商人であり、軍服の仕立ても請け負っていたことが明らかになった。また、日本人は富裕層が顧客となり得た一方で、欧米業者および中国業者に従業員として勤める者もおり、横浜居留地は洋服仕立て技術を習得する場となった。なかには、欧米業者を自らの店(横浜や東京)に雇い、仕立て技術を習得する者も認められた。以上によって、洋服仕立て業という西洋文化が中国を介して日本に持ち込まれたことを明らかにした。このことは、日本の服飾文化史のみならず中国の服飾文化史の進展にも貢献することが出来る。成果の一部は、平成25年度に博士論文にまとめ提出し、受理された(共立女子大学大学院)。
熱帯地域の農業商業化の進行下における持続的農業生産システムの確立

本研究は、現地調査・資源計測・リモートセンシングデータ解析・GIS・DNA分析等を駆使して、熱帯アフリカ・熱帯アジアを対象とし、地域ごとに土地利用・農業体系の変化、さらには自給農業から商品生産農業への変化の進行度を解析し、新たな農業生産体系の提示及びその生産力の評価、地域生態系への影響の評価を総合的に行うことを目的として実施した。具体的には、地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出、農業生産システム持続性評価法の開発、新たな農業システムの提示とその評価に関する研究を行った。本課題では、熱帯アジア・熱帯アフリカを対象に、1.地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出、2.農業生産システム持続性評価法の開発、3.新たな農業システムの提示とその評価、を中心に研究を進めるが、本年度は、主として1を中心に実施した。まず、設定した詳細調査地域で、現地調査を行った。アジア班は、東南アジア大陸部を中心に、農業に関する統計データ並びに気象データを収集した。既に、データベース化を終了している2005年以降のデータを収集した。今後、順次、データベースを進める。また、ラオス、ミャンマー、カメルーンでは、研究協力者が長期滞在して、主として、農業生産システムの現状の参与観察、過去のシステムに関する聞き取り調査を進めた。その結果、ラオスでは、焼畑の休閑期間の短縮、一部常畑化、商品作物導入の進行とともに、山地部斜面農業も大きく変容していることが明らかになった。ミャンマーのドライゾーンでは、変容の速度は緩やかであり、伝統的な農業システム・土地利用がある程度安定して見られることが明らかとなった。一方、アフリカ班のカメルーンでは、観測ステーションの設営により調査地域の気象データを実測し、作付体系や土地利用との関係の解析を進めている。来年度は、タイ・タンザニアでも同様の調査を進める予定である。2の小課題では、サトウキビの収量モデルに基づく、中部タイの土地生産力モデルを開発した。収量モデルは、圃場試験を行って、既存モデルを改良した。土地生産力モデルは、サトウキビの潜在収量と達成可能収量を推定するもので、気象、地形及び土壌特性資源データベースにより、広域(中部タイのサトウキビ生産地域全域)の生産力の推定が可能となった。今後、同様のモデルを主要な熱帯作物である、トウモロコシ、キャッサバ、イネについても開発する。1.地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出:アフリカ班・アジア班とも、広域調査地の農業統計及び都市人口の推移、森林面積及び農地面積の推移の推定・分析を続行し、農業商業化の進行程度の国レベルでの推定を進めた。また、詳細調査地(タイ北部チェンマイ県、タイ中部ラッブリ県、ロッブリ県、サラブリ県、タイ東部チャンタブリ県、ミャンマー中部サガイン管区、ラオス北部ルアンパバン県)については、地域レベルの農業商業化の進行度の推定を行った。タイ北部では、作物の種類が土壌侵食量に及ぼす影響の実測を行い、作物による大きな差異が認められないことを明らかにした。タイ中部ロッブリ県、サラブリ県では、農業生態系の機能解析のため、100軒弱のトウモロコシ農家を選定し、経営分析を行った結果、トウモロコシ農家は、比較的、技術力に差異がなく、均質な栽培・経営を行っていることを明らかにした。タイ東部チャンタブリ県では、果樹農家で調査を行い、非常に巧緻な栽培技術体系が成立していることを明らかにした。ミャンマーのドライゾーンの一画を占めるサガイン管区の南部で調査を行い、この地域の農家が、非常に厳しい環境下で、複数の作物を植えて、危険を回避し、年変動の大きい降雨に対して、技術的に適応していることを明らかにした。2.農業生産システム持続性評価法の開発:開発評価班のモデル開発・評価グループがキャッサバ、トウモロコシ生産力モデルについて確認作業を行い、タイ東北部(キャッサバ)及びタイ中部・北部(トウモロコシ)での生産力推定のために開発したモデルを、他地域で適用できることを明らかにした。また、アフリカの日単位の気象データについては、測定点が少なく、また、入手も困難であることが判明したため、少数の測定点から面的推定を行う方法を適用することを確認した。1.地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出:アフリカ班・アジア班とも、広域調査地の農業統計及び都市人口のデータを入手し、近年の推移を分析した。さらに、森林面積及び農地面積を推定し、農業商業化の進行程度の国レベルでの推定を進めた。また、詳細調査地については、地域レベルの農業商業化の進行度の推定を進めた。タイ北部チェンマイ県、タイ中部ラッブリ県、ロッブリ県、サラブリ県、タイ東部チャンタブリ県、ミャンマー中部サガイン県、ラオス北部ルアンパバン県で調査した。さらに、気象ステーションでの気温・日射量・降雨量の日データを入手した。タイ北部チェンマイ県では、土壌浸食実測のためのプロットを設定し、予備計測を行った。来年度に本格的に調査を行う。生態系機能では、ミャンマー中部での調査を中心に行い、主要な生態系機能として、生産力(全乾物生産量)・物質循環(主要要素の循環)・生物多様性(指標生物の分布密度等)を用いた。中部タイロッブリ県、サラブリ県では、農業生態系の機能解析のため、約6,000世帯の農家の、今年度の作付体系を明らかにした。なお、今年度予定していた河川水の水質・残留農薬の調査は次年度以降に延期した。調査地は、中部タイラッブリ県の予定。

2.農業生産システム持続性評価法の開発:開発評価班のモデル開発・評価グループが生産力モデル、特にサトウキビの生産力モデルの改良を行い、タイ中部のサトウキビ生産地に適用した。その結果、域内の地域差に、砂質土壌卓越地域ほどではないにせよ、土壌特性・降雨特性の影響が大きいことを明らかにした。他地域へのモデル適用のためのデータ(気象データ等)については、農業資源データベース構築グループがアフリカ・アジア両班の収集したデータに基づきデータベースを構築を進めた。今年度はアジア班のデータ入力を主体に行った。1.地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出:アフリカ班・アジア班とも、収集したデータの解析を行った。開発評価班のリモートセンシングデータ解析グループによる、リモートセンシング解析結果と農業統計解析結果を合わせ、農業商業化の進行程度の、国レベルでの推定を詳細化した。タイ・ミャンマーにおける詳細調査地については、入手した県レベルのデータを用い、地域レベルの農業商業化進行度を推定した。今年度は、タイ北部チェンマイ県メーチェム郡、タイ中部サラブリ県プラプッタバート郡及びロッブリ県パタナニコム郡、ミャンマー中部サガイン県で調査を行った。一方、資源計測・生態系機能計測・環境負荷計測グループは、タイ北部チェンマイ県メーチェム郡で、気象要素と土壌特性。地域の気象ステーションで入手可能な場合を除き気象要素(気温・日射量・降雨量)の連続計測を行った。土壌特性についても、土壌侵食を含めた実測を行い、雨季初期の降雨が土壌浸食の主因であることを見出した。生態系機能計測:ミャンマー中部において、農業生態系の機能として、生産力(全乾物生産量)・物質循環(主要要素の循環)・生物多様性(指標生物の分布密度・範囲)を計測した。現在、分析を進めている。さらに、河川水の水質と農地及び河川の環境汚染について、タイ中部ラッブリ県ダムナンサドクアク郡(集約化がある程度進行している地域)で、農家への聞き取りにより、農薬使用の実態を調査した。その結果、GAP農家と非GAP農家の間に農薬使用の差異がないことを明らかにした。2.農業生産システム持続性評価法の開発:農業資源データベース構築グループがアフリカ・アジア両班の収集したデータに基づきデータベースの構築を進めた。本研究は、現地調査・資源計測・リモートセンシングデータ解析・GIS・DNA分析等を駆使して、熱帯アフリカ・熱帯アジアを対象とし、地域ごとに土地利用・農業体系の変化、さらには自給農業から商品生産農業への変化の進行度を解析し、新たな農業生産体系の提示及びその生産力の評価、地域生態系への影響の評価を総合的に行うことを目的として実施した。具体的には、地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出、農業生産システム持続性評価法の開発、新たな農業システムの提示とその評価に関する研究を行った。1.地域による農業の商業化進行度の差異の分析と問題点抽出:収集したデータの解析を継続し、リモートセンシング解析結果と農業統計解析結果を合わせ、農業商業化の進行程度の国レベルでの推定をさらに詳細化した。詳細調査地については、入手した県レベルのデータを用い、地域レベルの農業商業化進行度を推定した。
ダイズ根皮層組織におけるプログラム細胞死の生体機能

水田転換畑におけるダイズ栽培の阻害要因である幼苗期の湿害回避のため、ダイズ不定根の皮層において組織特異的なプログラム細胞死によって生じる通気組織に焦点を当て、嫌気条件下において通気組織を形成する伊豫大豆と形成しないタチナガハ、および通気組織を形成する準同質遺伝子系統(NIL9-4-5;タチナガハを遺伝的背景として第12染色体の一部を伊豫大豆型で持つ)を供試し、通気組織形成を調節する遺伝子の同定を試みた。QTL領域(第12染色体上のSSRマーカーSat_334とSat_302間)を伊豫大豆型で持つNIL9-4-5(BC6F4)およびこの領域をヘテロで持つ150系統(BC6F4)のNILsに由来する約16000粒の種子(BC6F5)を準備し、QTL領域をヘテロで持つ個体(種子)の一部をドリルで粉砕してDNAを抽出し、多型検出を行うことにより遺伝子領域を狭めるための材料を選抜した。また、QTL領域内において両親間で多型を示す14のマーカーを見いだすとともに、この領域内で組み替えが生じ、タチナガハ/伊豫大豆型およびタチナガハ/ヘテロ型を示す種子を播種し、後代を得ることができた。さらに、タチナガハ/伊豫大豆型から得られた種子の表現型(嫌気条件下における通気組織の形成量および不定根伸長量)を調査するとともに、表現型が伊豫大豆型を示した個体から不定根をサンプリングしてRNA-seqに供する材料を選抜した。表現型の調査によって、嫌気処理開始以前に発根していた不定根は処理期間中に伸長せず、伸長した不定根はほぼ全て処理開始以降に発根したものであることが明らかとなった。また、処理開始以降に伸長しなかった不定根には通気組織の形成は認められないか、極めて微弱であった。QTL領域(第12染色体上のSSRマーカーSat_334とSat_302間)を伊豫大豆型で持つNIL9-4-5(BC6F4)およびこの領域をヘテロで持つ150系統(BC6F4)のNILsに由来する約16000粒の種子(BC6F5)から遺伝子領域を狭めるための材料を選抜することができた。また、QTL領域内において両親間で多型を示す14のマーカーを見いだすことができた。さらに、両親および、NIL9-4-5(BC6F4)を供試し、好気条件および嫌気条件下で栽培して表現型を調査するとともに、不定根を採取し、レーザーマイクロダイセクション法(LM法)によって皮層組織と他の組織に切り分け、RNAを抽出してRNA-seqを行うことが可能となった。2019年度の実験に供試した組み替え系統(タチナガハ/伊豫大豆型)の種子を播種し、得られた個体(種子)を用いて後代検定を行う。またタチナガハ/ヘテロ型系統から得られた個体(種子)からDNAを採取し、多型検出によってタチナガハ/伊豫大豆型の組み換え個体を選抜し、さらなる候補領域の絞り込みを行うとともに、候補遺伝子の発現解析を行う。これらの情報をもとに原因遺伝子を同定する。また、嫌気条件下における不定根の伸長成長を制御する遺伝子との関係を明らかにする。さらに、本遺伝子が異なる遺伝的背景(他品種;ダイズコアコレクションから選抜)のもとにおいても機能しているかどうかについて検討する。

また、QTL領域内において両親間で多型を示す14のマーカーを見いだすことができた。さらに、両親および、NIL9-4-5(BC6F4)を供試し、好気条件および嫌気条件下で栽培して表現型を調査するとともに、不定根を採取し、レーザーマイクロダイセクション法(LM法)によって皮層組織と他の組織に切り分け、RNAを抽出してRNA-seqを行うことが可能となった。2019年度の実験に供試した組み替え系統(タチナガハ/伊豫大豆型)の種子を播種し、得られた個体(種子)を用いて後代検定を行う。またタチナガハ/ヘテロ型系統から得られた個体(種子)からDNAを採取し、多型検出によってタチナガハ/伊豫大豆型の組み換え個体を選抜し、さらなる候補領域の絞り込みを行うとともに、候補遺伝子の発現解析を行う。これらの情報をもとに原因遺伝子を同定する。また、嫌気条件下における不定根の伸長成長を制御する遺伝子との関係を明らかにする。さらに、本遺伝子が異なる遺伝的背景(他品種;ダイズコアコレクションから選抜)のもとにおいても機能しているかどうかについて検討する。
肺癌における免疫染色を用いた新しいＥＧＦＲ遺伝子変異検出法の確立

非小細胞性肺癌と診断された133患者を対象に,PNA-LNA PCR clamp assay(PCR)と免疫組織・細胞化学を施行した.免疫染色の結果は,陽性判定37患者(27.8%),陰性判定85患者(63.9%)であり,不確かな判定が11患者(8.3%)みられた.PCR法との相関性は,陽性判定で94.6%,陰性判定で90.6%の一致率であった.EGFR-TKI治療がなされた42患者において,EGFR遺伝子変異抗体陽性患者は陰性患者に比べ,再発期間の延長を認めた(P = 0.002).これらの結果より,EGFR遺伝子変異抗体を用いた免疫染色は,患者治療に役立つ新しい迅速な検出方法である.本研究の主たる課題である「肺癌における免疫染色を用いた新しいEGFR(上皮増殖因子受容体)遺伝子変異検出法の確立」に関して133肺癌患者のデータ解析を行い,この研究結果を英文報告した(Kawahara et al.Lung Cancer 2012. 39-44).133患者(切除組織,生検組織,細胞診材料を使用)における免疫染色の結果は,陽性判定27.8%,陰性判定63.9%および判定不可能8.3%であった.免疫染色とDNA遺伝子変異解析の一致率は陽性判定患者94.6%および陰性判定患者90.6%であり,高い一致率を示した.さらにゲフィチニブ投与が施行された42患者の治療効果判定を行った結果,免疫染色で過剰発現した患者群は,免疫染色発現なしあるいは弱い発現患者群と比較して,優位に治療効果の延長が認められた.従って,免疫染色で明らかに陽性と判定された患者においては,ゲフィチニブ投与の迅速な対応ができると考えられた.また,肺癌の組織/細胞の形態診断と同時にEGFR遺伝子変異抗体を用いた免疫染色を併用することにより,医療費の削減にもつながる可能性が示唆された.本研究における問題点として,免疫染色で判定不可能が11患者あり,このうち細胞診材料が6患者であった.この6患者はすべてEGFR遺伝子変異陽性であるため,固定法の変更が不可欠であると思われる.この点に関しては,昨年度から引き続き追加研究を進めており,液状細胞診固定液を用いることが重要性であることが判明してきた.平成25年度にこの点を解析して,新しいEGFR遺伝子変異検出法の確立を目指したい.我々は「肺癌における免疫染色を用いた新しいEGFR(上皮増殖因子受容体)遺伝子変異検出法の確立」に関して133肺癌患者のデータ解析を行った.免疫染色とDNA遺伝子変異解析の一致率は陽性判定患者94.6%および陰性判定患者90.6%であり,高い一致率を示した.さらにEGFR遺伝子変異抗体を用いて原発巣と播種巣の解析した結果,再発肺癌患者において,(1)耐性遺伝子を伴う肺癌患者,(2)EGFR遺伝子変異のみを伴う肺癌患者,(3)EGFR遺伝子変異を伴わない肺癌患者のように3群に分けることができた.本検討の中で細胞材料の判定不可能が多いことが判明したため,固定法によるEGFR遺伝子変異およびEGFRタンパク発現の影響を調査した.15%中性緩衝ホルマリンとCytoRich Redに固定したヒト肺癌培養細胞は,EGFR遺伝子変異特異的抗体に強陽性を示したが,CytoRich Blueと95%エタノール固定液は弱陽性であった.SurePath細胞保存液のDNA保持は15%中性緩衝ホルマリンより優れていたが,EGFR遺伝子変異およびFISH解析は,すべての固定液において良好な結果を得た.胸水中の腺癌細胞において,細胞質抗原は固定後40日間経過しても比較的安定していたが,核内抗原はすべての固定液で発現率の減少を示した.CytoRich RedはEGFR遺伝子変異特異的抗体を用いた免疫細胞化学だけでなく,細胞材料を用いたDNA解析にも適していた.EGFR-TKI治療におけるEGFR遺伝子変異の検出はDNAによる解析が主流であるが,EGFR遺伝子変異抗体を併用したEGFR遺伝子変異検出アルゴリズムは,EGFR-TKI治療を迅速に投与でき,医療費の削減や患者治療に役立つ新しい迅速な検出方法である.そのためには,がん細胞の固定法に充分留意すべきである.非小細胞性肺癌と診断された133患者を対象に,PNA-LNA PCR clamp assay(PCR)と免疫組織・細胞化学を施行した.免疫染色の結果は,陽性判定37患者(27.8%),陰性判定85患者(63.9%)であり,不確かな判定が11患者(8.3%)みられた.PCR法との相関性は,陽性判定で94.6%,陰性判定で90.6%の一致率であった.EGFR-TKI治療がなされた42患者において,EGFR遺伝子変異抗体陽性患者は陰性患者に比べ,再発期間の延長を認めた(P = 0.002).これらの結果より,EGFR遺伝子変異抗体を用いた免疫染色は,患者治療に役立つ新しい迅速な検出方法である.上皮増殖因子受容体(Epidermal growth factor receptor: EGFR)の遺伝子変異の有無は、肺癌患者の治療方針決定のための重要な要素となっており,我々は1)免疫組織/細胞化学を用いて迅速なEGFR遺伝子変異検出のためのアルゴリズムの確立および2)体腔液における原発/再発肺癌患者のEGFR遺伝子変異の確認を中心に研究を進めている.

1)に関して治療効果を含めたデータ解析を行うため,時間を費やすことが予め分かっていたため,平成23年度は2)を中心に研究結果を英文報告した(Kawahara et al. Lung cancer 2011).肺癌患者においてgefitinibあるいはelrotinibを長期投与後,新たに耐性遺伝子(T790M)を獲得することが知られている.しかしながら,このような獲得変異の出現は治療耐性患者の56割程度であり,その他の再発患者がどのような遺伝子変異の変化を呈しているのか,明らかになっていない.我々は原発巣においてEGFR遺伝子変異陽性であった肺癌患者の再発腹水を用いてEGFR遺伝子変異の推移を検討した.結果は再発肺癌患者において,1.耐性遺伝子を伴う肺癌患者,2.EGFR遺伝子変異のみを伴う肺癌患者,3.EGFR遺伝子変異を伴わない肺癌患者のように3群に分けることができ,肺癌再発後の治療方法に対する重要な結果を報告することができた.また,現在EGFR遺伝子変異検索は1患者1回と定められているが,再発後のEGFR遺伝子変異検索の必要性も明らかにすることができた.今後の研究は,1)について解析を終了させ,さらに細胞検体の固定法に着目し適切なEGFR遺伝子変異検査の運用方法について追加実験を行いたい.当初計画していた研究内容は達成できた.英文論文報告もできているので順調に進展していると考える.1.免疫組織/細胞化学を用いて迅速なEGFR遺伝子変異検出のためのアルゴリズムの確立2.体腔液における原発/再発肺癌患者のEGFR遺伝子変異の確認当初計画していた研究の約半分は達成できている.論文報告もできているので順調に進展していると考える.本研究の主たる課題である「肺癌における免疫染色を用いた新しいEGFR(上皮増殖因子受容体)遺伝子変異検出法の確立」を論文報告することができた.今後は,培養細胞および臨床検体を用いて,EGFR遺伝子変異抗体の最適な染色方法について固定液における影響を中心に調査したい.主の研究課題である「免疫組織/細胞化学を用いて迅速なEGFR遺伝子変異検出のためのアルゴリズムの確立」を完結させる.データはほぼ解析し終えたので,発表・論文報告を行いたい.但し,この研究の中で,細胞検体の固定法に関する課題が出てきたので,追加実験を行いたい.培養細胞および臨床検体を用いて,EGFR遺伝子変異抗体の最適な染色方法について追加検討を行う.そのため,液状細胞診固定液や15%中性緩衝ホルマリンなどさまざまな固定液や抗体を随時購入する.また,欧州におけるEGFR遺伝子変異検出状況や再発肺癌への病理学的対応について調査し,本研究に役立てたい.EGFR遺伝子変異抗体の判定において,Positive, Negativeおよびequivocalの3つに分けけることを提唱した.その結果,EGFR遺伝子変異抗体Positive患者は,Negativeおよびequivocal患者に比べゲフィチニブの効果に大きな違いがあることが,統計学的解析により明らかになった.しかしながら,この中で細胞材料のequivocal判定が多いことが判明した.免疫組織・細胞化学の判定は固定による影響を受けるため,蛋白の保持の再検証を行わなければならない.次に我々が行う実験は,培養細胞を用いて,固定法によるEGFR遺伝子変異およびEGFRタンパク発現の影響を調査する.そのため,現在流通している液状細胞診固定液や中性緩衝ホルマリンおよびこれらの解析に必要となる消耗品を随時購入する.研究成果については,国内および国際発表する.可能ならば,欧州におけるEGFR遺伝子変異検出あるいは肺癌診断の現状について体験し,本研究に役立てたい.
不確実状況下における農業計画問題に対する意思決定手法の研究

本研究では、確率変数やファジィ数のみならず、ファジィランダム変数係数も混在する多目的農業計画問題に対して、機会制約法に基づく定式化と二段階計画法に基づく定式化を行い、複数の対話型意思決定手法を提案した。提案手法を、作物の利益係数や水供給量等の不確実パラメータを含む種々の農業計画問題に適用してその有効性を検討した。さらに、ファジィ利得を含む多目的二人ゼロ和ゲームに対して悲観的パレート解の概念を導入し各プレイヤーの満足解を導出するための対話型アルゴリズムを提案し、野菜出荷計画問題に適用した。平成26年度は、まず、ファジィ数と確率変数が混在する多目的計画問題を取り扱うための理論的研究を行った。この際、ファジィ計画法によるアプローチと確率計画法に基づく機会制約アプローチを用いて、対象とする問題を取り扱い可能な問題に変換した。また、ファジィ数と確率変数の2種類の不確実性を反映させたパレート最適解の概念を導入し、パレート最適解を求めるミニマックス問題を定式化した。定式化された多目的計画問題に対して、パレート最適解集合の中から、問題に含まれる確率的不確実さ、主観的曖昧さを考慮した満足解を導出する対話型アルゴリズムを提案した。提案した対話型アルゴリズムを野菜作経営計画問題に適用し検討した。次に、ファジィ数と確率変数のみならず、ファジィランダム変数係数が混在する多目的計画問題を取り扱うための理論的研究を行った。ファジィ数と確率変数が混在する多目的計画問題の場合と同様に、ファジィ計画法によるアプローチと確率計画法に基づく機会制約アプローチを用いて、対象とする問題を取り扱い可能な問題に変換した。また、ファジィ数と確率変数とファジィランダム変数係数が混在する多目的計画問題を取り扱うために、3種類の不確実性の影響を反映させたパレート最適解概念を定義し、パレート最適解を求めるミニマックス問題を定式化した。定式化された多目的計画問題に対して、パレート最適解集合の中から、問題に含まれる3種類の不確実性を考慮した満足解を導出する対話型アルゴリズムを提案した。前年度は、機会制約法の確率最大化モデルと満足基準最適化モデルを用いて、ファジィ係数、確率変数係数、ファジィランダム変数係数が混在する多目的計画問題に対する意思決定手法についての理論的研究を行った。平成27年度は、ファジィ係数、確率変数係数、ファジィランダム変数係数が混在する多目的計画問題に対する意思決定手法に対する、EXCEL-VBAマクロによる対話型プログラムの開発を行った。作成した対話型プログラムを日本国内の野菜作付計画問題や、フィリピンの天水農業計画問題に適用してその有効性を検討した。また、期待値モデルと分散モデルを同時に考慮した多目的ファジィランダム計画問題に対する意思決定手法に関する研究を行った。以上の意思決定手法は、作付計画の割当による結果確率に焦点を当てた機会制約法に基づく研究成果である。しかし、農業計画問題では、水資源計画問題のように、結果による影響を重視する場合も多い。そこで、ファジィランダム変数係数を含む単一目的単純リコース問題および多目的単純リコース問題に関する意思決定手法について研究を行い、フィリピンの天水農業計画問題における年間水資源供給量をファジィランダム変数として定式化した問題に適用し、検討を加えた。さらに、多目的ゼロ和2人ゲームに対して各プレイヤー(意思決定者)が、それぞれ最悪の状況を想定して意思決定を行うという前提のもとで、多目的計画問題の定式化を行い、対応する対話型意思決定手法を提案した。プレイヤー1を農民、プレイヤー2を自然と解釈することにより、提案手法を多品種野菜出荷計画問題に適用して、各野菜の最適な月別出荷量を求め、検討を加えた。平成27年度においては、結果による影響を重視する二段階計画法に基づき、多目的ファジィランダム単純リコース問題に関する意思決定手法について研究を行い、フィリピンの天水農業計画問題に適用し、検討を加えた。提案手法では、構成要素の確率変数が連続型の正規分布に従うことを仮定していた。しかし、現実の水資源計画問題等では、連続型ではなく離散型確率変数を想定する場合が多い。また、連続型確率変数を含む単純リコース問題は、積分計算を最適化問題の内部に含んであり、Mathematica等の特殊なソフトウェアを必要とするだけでなく、常に最適解を計算できる保証がない。そこで、離散型の確率変数を構成要素とする離散型ファジィランダム変数係数を含む多目的単純リコース問題の定式化と対応するパレート最適解の概念を導入し、パレート最適解集合の中から意思決定者の満足解を導出するための対話型意思決定手法の研究を行い、農業計画問題に適用し検討を加えた。また、互いに非協力的な上位レベル意思決定者と下位レベル意思決定者が各自の目的関数を最適化する2レベル計画問題に対して二段階計画法を適用することにより、2レベル単純リコース問題を定式化し、対応する解概念として単純リコース・シュタッケルベルグ解を定義し、単純リコース・シュタッケルベルグ解を導出するためのアルゴリズムを開発し数値例に適用した。さらに、ファジィ利得を含む多目的二人ゼロ和ゲームに対して悲観的パレート解の概念を導入し、悲観的パレート最適解集合の中から各プレイヤーの満足解を導出するための対話型アルゴリズムを提案した。提案手法を、農家と自然をプレイヤーとする野菜出荷計画問題に適用することにより、最悪の場合を想定した月別最適野菜出荷比率を求めた。

本研究では、確率変数やファジィ数のみならず、ファジィランダム変数係数も混在する多目的農業計画問題に対して、機会制約法に基づく定式化と二段階計画法に基づく定式化を行い、複数の対話型意思決定手法を提案した。提案手法を、作物の利益係数や水供給量等の不確実パラメータを含む種々の農業計画問題に適用してその有効性を検討した。さらに、ファジィ利得を含む多目的二人ゼロ和ゲームに対して悲観的パレート解の概念を導入し各プレイヤーの満足解を導出するための対話型アルゴリズムを提案し、野菜出荷計画問題に適用した。ファジィ数と確率変数が混在し、確率変数間の共分散を考慮した多目的計画問題を取り扱うための理論的研究と対応する凸計画法に基づく対話型アルゴリズムの提案し、多目的農業計画問題への適用に関する研究を行った(日本経営システム学会誌、31/3、pp.259-269, 2015)。ファジィ数と確率変数が混在し、確率変数間の共分散を考慮する必要のない多目的計画問題に対しては、線形計画法に基づく対話型アルゴリズムを提案した(Proc. of SCIS&ISIS2014, pp.23-28, 2014)。また、ファジィランダム変数係数を含む多目的計画問題に対する対話型意思決定手法に関する研究成果を明らかにした(Information Sciences, 272, pp.111-125, 2014)。さらに、ファジィ数と確率変数とファジィランダム変数係数が混在する多目的計画問題に対する対話型意思決定手法に関する研究成果については今後国際学会誌に掲載予定である。ファジィ変数係数、確率変数係数、ファジィランダム変数係数、ランダムファジィ変数係数を含む多目的計画問題に対する意思決定手法のみならず、複数の階層構造にある意思決定者を含む多目的計画問題に関する意思決定手法を系統的に解説した学術書を刊行した(不確実状況下における多目的計画問題に対する意思決定手法、丸善プラネット、2015年2月、428page)。2014年5月には、国際学会IMECS2014において発表したファジィランダム変数係数を含む多目的計画問題に関する論文に対して最優秀論文賞が授与された。2015年3月までの1年間において関連する研究成果は、関連論文6件、著書5件、学会発表1件であり、十分な成果があったと考えている。平成27年度においては、結果による影響を重視する二段階計画法に基づき、多目的ファジィランダム単純リコース問題に関する意思決定手法について研究を行い、フィリピンの天水農業計画問題に適用し、検討を加えた。提案手法では、構成要素の確率変数が連続型の正規分布に従うことを仮定していた。しかし、現実の水資源計画問題等では、連続型ではなく離散型確率変数を想定する場合が多い。また、連続型確率変数を含む単純リコース問題は、積分計算を最適化問題の内部に含んであり、Mathematica等の特殊なソフトウェアを必要とするだけでなく、常に最適解を計算できる保証がない。そこで、離散型の確率変数を構成要素とする離散型ファジィランダム変数係数を含む多目的単純リコース問題の定式化と対応する意思決定手法の研究を行い、農業計画問題への適用を検討する。
Wntリガンド-受容体相互作用の構造メカニズム

(項目1)各種ほ乳類WntサブタイプのAfmによる可溶化とその活性試験:平成30年度は前年度に樹立したWnt3aとAfmの安定発現株の上清およびそこから精製したWnt3a-Afm複合体を用い、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて活性を調べるとともに、上清中に存在するWnt3aの蛋白質量を定量する方法を開発した。(項目2)ほ乳類WntリガンドとAfmの複合体の結晶構造解析:平成29年度に引き続き、Wnt-Afm複合体の状態で結晶化をおこなったが、解析品質の結晶は得られなかった。(項目3)ほ乳類Wnt特異的バインダーの取得とそれらの機能解析:東京大学の菅裕明教授が開発した特殊環状ペプチドスクリーニング法「RaPIDシステム」を応用し、マウスWnt3aに対する環状ペプチドバインダーの探索を継続した結果、新たなものを含め合計13種単離することが出来た。これらペプチドの親和性をビアコアによってしらべた結果、6つは有意な結合がみられず、3つは数十マイクロモル程度の弱い親和性、5つは1マイクロモル以下の中程度の親和性を持つことがわかった。さらにはWntの生物活性に対する効果を細胞を用いてしらべたところ、一つにおいてWntシグナル伝達阻害活性が認められた。(項目4)Wnt-Fz CRD-2者、およびWnt-Fz-LRP6ec3者複合体(細胞外装置)の構造解析: Wnt-Fz CRD2者複合体については、平成29年度に得られた回折データを用いて構造精密化を行い、世界初の哺乳類Wntの立体構造解析を完了した。構造をもとにPAタグ挿入変異体を作製することで、これまで不可能だった「生物活性を100%保持したままのWnt3aタンパク質を細胞や組織中で可視化する」ことに成功した。これらの結果を合わせ、論文を執筆し、投稿した。項目1については目的を達成した。項目2については結晶が得られないという問題が解決出来なかった。項目3について、Wnt3aバインダーペプチドを複数種単離できたことは極めて重要であるが、なかでもWnt3aの生物活性を阻害するペプチドが得られたことは特筆に値する。Wntシグナルは様々な疾患に関わるので、その阻害剤は医薬品開発につながる可能性もある。項目4は前述のように世界初のほ乳類Wnt蛋白質の立体構造の取得という大きな目標を達成し、現在国際一流誌で査読中である。以上のことから、「当初の計画以上の進展」と自己評価する。項目1については目的を達成したので本年度で終了とする。項目2については結晶が得られないという問題が解決出来なかったが、項目4においてほ乳類Wntの構造決定という目的を達成したので、項目2は来年度以降は実施しないことにした。今後はこれらペプチドをさらに高親和性化し、阻害剤やバインダーとしての有用性を高めていく。項目4については2者複合体の結晶構造取得が完了したので、この論文発表を最優先でおこなう。また、2者複合体の立体構造をヒントにLRP6に結合するWnt3上の領域を予想し、その領域に相当する断片あるいは合成ペプチドを作製してLRP6との相互作用を確認しているので、上記の2者複合体結晶へのペプチドソーキングによって3者複合体結晶化を目指す。本研究は、細胞外のWntリガンドが膜受容体に認識され、その情報が細胞膜を横切って伝達されて細胞の挙動を左右する引き金を引くメカニズムを原子分解能の立体構造レベルで明らかにすることを目指し、以下の4つの業務項目に従って研究を進めた。項目1)各種ほ乳類WntサブタイプのAfmによる可溶化とその活性試験: WntとAfm(アファミン)は無血清培地中で細胞に共発現させることによって安定な複合体として培養上清中に回収することができる。平成29年度はWnt3aとAfmの安定発現株を樹立し、上記の複合体の大量精製を行った。(項目2)ほ乳類WntリガンドとAfmの複合体の結晶構造解析:Wntリガンドのもつ強い疎水性という課題を、Afm複合体化によって解決し、Wnt-Afm複合体の状態で結晶化をおこなった。またヒトAfm単独の結晶化と構造解析を達成した。(項目3)ほ乳類Wnt特異的バインダーの取得とそれらの機能解析:東京大学の菅裕明教授が開発した特殊環状ペプチドスクリーニング法「RaPIDシステム」を応用し、マウスWnt3aに対する環状ペプチドバインダーを3つ単離することが出来た。(項目4)Wnt-Fz CRD-2者、およびWnt-Fz-LRP6ec3者複合体(細胞外装置)の構造解析: Wnt-Fz CRD2者複合体については、構造解析品質の回折を見せる結晶を得ることに成功し、2.9オングストローム分解能での構造決定を達成した。上記のWnt-Fz CRD2者複合体とLRP6ecの間の相互作用解析系をビアコアを用いて確立し、安定な3者複合体を形成するLRP6変異体の単離を完了した。項目1,2,においては期待していたよりも若干進展に遅れがあるが、項目3について、すでにWnt3aバインダーペプチドを3種単離できたことは極めて重要である。ネイティブなWnt3aを認識できる試薬は、抗体を含めまだ報告されて居らず、世界初の快挙である。

また、項目4においても、Wnt3-Fz2者複合体の結晶構造が得られた。これは哺乳類のWnt蛋白質で世界初の構造となり、しかも分解能でもこれまで一つしかないツメガエルWnt蛋白質のそれを超えている。以上のことから、「当初の計画以上の進展」と自己評価する。(項目1)各種ほ乳類WntサブタイプのAfmによる可溶化とその活性試験:平成30年度は前年度に樹立したWnt3aとAfmの安定発現株の上清およびそこから精製したWnt3a-Afm複合体を用い、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて活性を調べるとともに、上清中に存在するWnt3aの蛋白質量を定量する方法を開発した。(項目2)ほ乳類WntリガンドとAfmの複合体の結晶構造解析:平成29年度に引き続き、Wnt-Afm複合体の状態で結晶化をおこなったが、解析品質の結晶は得られなかった。(項目3)ほ乳類Wnt特異的バインダーの取得とそれらの機能解析:東京大学の菅裕明教授が開発した特殊環状ペプチドスクリーニング法「RaPIDシステム」を応用し、マウスWnt3aに対する環状ペプチドバインダーの探索を継続した結果、新たなものを含め合計13種単離することが出来た。これらペプチドの親和性をビアコアによってしらべた結果、6つは有意な結合がみられず、3つは数十マイクロモル程度の弱い親和性、5つは1マイクロモル以下の中程度の親和性を持つことがわかった。さらにはWntの生物活性に対する効果を細胞を用いてしらべたところ、一つにおいてWntシグナル伝達阻害活性が認められた。(項目4)Wnt-Fz CRD-2者、およびWnt-Fz-LRP6ec3者複合体(細胞外装置)の構造解析: Wnt-Fz CRD2者複合体については、平成29年度に得られた回折データを用いて構造精密化を行い、世界初の哺乳類Wntの立体構造解析を完了した。構造をもとにPAタグ挿入変異体を作製することで、これまで不可能だった「生物活性を100%保持したままのWnt3aタンパク質を細胞や組織中で可視化する」ことに成功した。これらの結果を合わせ、論文を執筆し、投稿した。項目1については目的を達成した。項目2については結晶が得られないという問題が解決出来なかった。項目3について、Wnt3aバインダーペプチドを複数種単離できたことは極めて重要であるが、なかでもWnt3aの生物活性を阻害するペプチドが得られたことは特筆に値する。Wntシグナルは様々な疾患に関わるので、その阻害剤は医薬品開発につながる可能性もある。項目4は前述のように世界初のほ乳類Wnt蛋白質の立体構造の取得という大きな目標を達成し、現在国際一流誌で査読中である。今後は一刻も早く上記の2者複合体の結晶構造の論文を完成し、投稿することが最優先である。製薬企業を含め世界中の有力なラボが試みている構造解析なので、その競争は激烈であり、いつ抜かれてもおかしく無い状況である。一流誌に掲載される論文とするには、立体構造情報を元にした機能解析などがさらに必要であり、そのためには、4つの研究項目のうちさほど重要でない1と2については少し優先順位を下げる必要があると考えている。項目1については目的を達成したので本年度で終了とする。項目2については結晶が得られないという問題が解決出来なかったが、項目4においてほ乳類Wntの構造決定という目的を達成したので、項目2は来年度以降は実施しないことにした。
リフレクションを取り入れた看護技術演習プログラムの構築

本研究の目的は、看護学生のリフレクション能力に対して教育的支援を行うために、リフレクションを取り入れた看護技術演習プログラムを構築することである。文献検討、他大学の視察、有識者からの助言に基づいて、リフレクションを取り入れた看護技術演習プログラム案を作成し、研究代表者が所属する看護系大学の学生を対象にプログラムを展開する。科目終了後、プログラムを評価し、評価結果に基づいてプログラムを修正し、その次の年度に展開する。プログラム案の作成(修正)・実施・評価を1年ずつ3年間行った後、リフレクションを取り入れた看護技術演習プログラムについてまとめ、公表する。