hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トロンボモジュリンによる肝虚血再灌流障害の抑制効果の解明

次の解析として、TMの分画に着目し、抗炎症作用を有するとされるdomain1に焦点を置いてdomain1分画製剤(rTMD1)を用いた実験を行なっている。rTMD1製剤の純度調整に時間を要したが、マウス肝IRIモデルにおけるrTMD1投与のIRI抑制効果を確認した。rTMD1投与群と非投与群における肝機能障害、肝組織中の炎症性サイトカイン発現、アポトーシス誘導有無などを検討し、TLR-4ノックアウトマウスを用いてTLR-4との関連性を検討した。さらに、in vitroにおけるrTMD1とTLR-4経路との関連性を検討した。rTMD1と炎症関連タンパク質High-mobility group box 1(HMGB-1)との結合評価を明らかにするために、1Biacore system(分子間相互作用解析装置)2免疫沈降法を用いた2つの方法で検討している。1での結合性につき他のdomain分画との比較検討を行ない、現在2による検証に、再現性を含めて時間を要している。肝虚血再灌流障害におけるリコンビナントトロンモジュリン(rTM)による抗炎症効果の作用機序の解明を目的とし、今年度は野生型マウスとTLR-4 KOマウス(当研究所でbreeding)を用いて検討した。まず野生型マウスで60分温虚血再灌流障害モデルを作成し、コントロール(非投与)群におけるモデルの安定性を確認してから、rTM投与(投与群)によりその障害が改善されることを、再灌流6時間後の血清AST/ALT値及び組織学所見から確認することができた。再灌流6時間後の肝組織中において、サイトカイン(TNF-α、IL-6など)mRNA発現も抑制されていた。ウェスタンブロット解析では、再灌流1時間・6時間後におけるTLR-4およびHMGB-1発現に加えてTLR-4経路の下流シグナルであるNF-kB・JNKなどMAP kinase発現も抑制されていた。さらにTLR-4 KOマウスにて同モデルを作成し検討すると、肝障害は野生型に比べ抑制されたが、rTM投与では著明な改善は認められなかった。平成27年度の成果より、rTMは、TLR-4/NF-kBsignal伝達経路において直接的そして間接的に抑制作用を発揮することが推測され、中でもHMGB-1がTLR-4の内因性リガンドとして働き、HMGB-1とTLR-4間の制御作用を担うことが予想される。in vivo実験では非常に興味深いデータが得られており、概ね順調に進んでいると判断している。リコンビナントトロンボモジュリン(rTM)は、播種性血管内凝固異常症の標準治療薬であり、また抗炎症作用を持つことが報告されている。我々は肝虚血再灌流障害におけるrTMの抗炎症作用についてのメカニズム解析を行なっている。マウスのモデルとしては、70%部分肝温虚血を60分行い、再灌流後6時間を中心に各タイムポイントで解析し、また腹腔マクロファージを利用したin vitro実験を行ない、以下の結果が得られた。1野生型マウスにおける肝機能障害および炎症改善効果とtoll-like receptor (TLR)-4ノックアウト(KO)マウスにおける効果の消失2野生型とTLR-4 KOマウスにおけるNF-kBを中心としたTLR-4下流シグナル及びhigh mobility group box-1 protein(HMGB-1)発現に対するrTMの影響3野生型及びTLR-4 KOマウス由来の腹腔マクロファージをリコンビナントHMGB-1及びrTMで共刺激した場合のTNF-α産生の評価4リコンビナントトロンボモジュリンドメイン1製剤(rTMD1)投与による肝虚血再灌流障害の抑制効果である。すなわち、rTMはHMGB-1とTLR-4による炎症を惹起するシステムを抑制することで抗炎症効果示すことが証明できた。まずはこれらのデータをまとめて報告する方針とし論文化に至った(American Journal of Transplantation: 2017年1月号掲載)。昨年度には、rTMが肝虚血再灌流障害モデルにおいてTLR-4/NF-kBを抑制することを証明した。今年度は追加のin vivo及びin vitro実験を踏まえ、HMGB-1ーTLR-4経路を抑制することで、TLR-4/NF-kBのシグナル伝達を抑えることが解明でき、またこれらの結果より国際学術誌に報告することができたことは大きな成果である。リコンビナントトロンボモジュリン(rTM)は、播種性血管内凝固異常症の標準治療薬であり、抗炎症作用を持つことが報告されている。我々は肝虚血再灌流障害(Ischemia and Reperfusion Injury:IRI)におけるrTMの抗炎症作用を解明している。rTMがもつ肝IRIに対する抑制メカニズムに関して、toll-like receptor4(TLR-4)に焦点を当てた解析を行ない、その成果を国際学会誌(American journal of transplantation誌)にまとめることができ、さらには日本外科学会総会のサージカルフォーラムでの口演発表に至った。さらなる解析を進める為に、TMの分画に着目しdomain1分画製剤(rTMD1)を用いた再現実験を行い、マウス部分肝IRIモデルにおけるIRIの抑制効果を確認した。rTMD1と炎症関連タンパク質High-mobility group box 1(HMGB-1)との結合評価を明らかにするために、1Biacore system(分子間相互作用解析装置)2免疫沈降法を用いた2つの方法に注目した。

1では濃度調整などに時間を要したが、短時間の結合はあることを確認し、2においては結合能がきちんと確認できず現在検討中である。rTM製剤による肝IRIの抑制効果について、その効果はTLR-4に依存するという新知見を見いだすことができ、国際学術誌であるAmerican journal of transplantation誌に論文として発表できたことは大きな成果であった。しかし、最も重要なメカニズム解析である、rTMとHMGB-1もしくはTLR-4との結合能評価に難渋していること(結合能は短時間のため、妥当性についてはまだ評価が不十分)、出血傾向をもたない抗炎症作用のみと期待されるrTMD1製剤(さらに純度の高い製剤)の作成に時間を要している為。次の解析として、TMの分画に着目し、抗炎症作用を有するとされるdomain1に焦点を置いてdomain1分画製剤(rTMD1)を用いた実験を行なっている。rTMD1製剤の純度調整に時間を要したが、マウス肝IRIモデルにおけるrTMD1投与のIRI抑制効果を確認した。rTMD1投与群と非投与群における肝機能障害、肝組織中の炎症性サイトカイン発現、アポトーシス誘導有無などを検討し、TLR-4ノックアウトマウスを用いてTLR-4との関連性を検討した。さらに、in vitroにおけるrTMD1とTLR-4経路との関連性を検討した。rTMD1と炎症関連タンパク質High-mobility group box 1(HMGB-1)との結合評価を明らかにするために、1Biacore system(分子間相互作用解析装置)2免疫沈降法を用いた2つの方法で検討している。1での結合性につき他のdomain分画との比較検討を行ない、現在2による検証に、再現性を含めて時間を要している。平成28年度は、TLR-4 KOマウスにおけるウェスタンブロット解析を行い、細胞内伝達経路の検討を継続する。さらにrTMのドメイン製剤であるrTMD1(抗炎症作用を有するドメインと推定)を用いてvivoでの追加検討を行う。その上で、in vitroにて検証を行う。同マウスに対して、HMGB-1リコンビナント製剤を用いて刺激、腹腔マクロファージを回収して、rTMならびにrTMD1投与による上清中のサイトカイン(TNF-αなど)の推移を測定し、作用機序解明を行っていく。論文化に至ったが、rTMがいかにHMGB-1ーTLR-4経路を抑制したかという詳細な機構はまだ不明であり、rTMD1のHMGB-1刺激された腹腔マクロファージに与える影響やTLR-4 KOマウスに対する影響について検討する必要がある。また、rTMがHMGB-1ーTLR-4経路を抑制した機構を調べるため、まず共免疫沈降法を用いて、rTMとHMGB-1もしくはTLR-4との結合の評価を予定している。Biacore system(分子間相互作用解析装置)において確認された結合能の質的な評価をさらに推進する。
新奇バイオマテリアルを目指したUCST型温度応答性ポリペプチドの設計

生理的条件下においてLCST型挙動を示す高分子は多く存在するが、UCST型挙動を示す高分子は非常に珍しい。本研究ではさらに珍しい生分解性を示すUCST型ポリシトルリンペプチドの光学活性がUCST挙動に与える影響を調べた。その結果、ポリシトルリンペプチドはヘリックス構造を有しており、相転移に伴ってバンドル構造を形成することが示された。また疎水基の導入により相分離温度を上昇させることに成功した。ポリN-イソプロピルアクリルアミドに代表される低温溶解型(LCST型)合成高分子は医工学分野に革新的な進歩をもたらした。しかし、LCST型とは逆の温度応答性を示す高温溶解型(UCST型)高分子は、ほとんど報告されていない。さらには、生分解性を併せもつUCST型高分子は申請者らが報告した天然のアミノ酸から構成されるポリシトルリン誘導体のみである。本研究では、構成されるアミノ酸組成と相分離温度の関連性を評価することで、合理的なUCST型ポリペプチドの設計指針を確立することを目的とした。本年度はポリシトルリン誘導体の合理的な合成方法の確立を試みた。具体的にポリシオルニチンをウレイド化することでポリシトルリンを得るための条件検討を行った。その結果、pHのコントロールならびにウレイド化剤の濃度の選定が重要であることが示された。水中で低温溶解(LCST)型ではなく高温溶解(UCST)型高分子を開発することは、バイオマテリアル設計において、革新的な進歩が期待されている。特に生分解性のUCST型高分子の開発はそのおおきな候補である。今までに、ポリシトルリン共重合体が生理的条件下においてUCST型挙動を示すことを示してきた。平成25年度はポリシトルリン共重合体の合理的な合成方法の確立を行った。平成26年度は合成したポリシトルリン共重合体の生分解性、並びに2次構造とUCST挙動の関連性について評価を行った。平成25年度にて確立した合成方法に従って、様々な分子量、様々なシトルリン組成を有する共重合体を合成し、実験を行った。L体で構成されたポリシトルリン共重合体はDL体で構成されたポリシトルリン共重合体よりも、生分解性が早いことが示された。また、2次構造を形成している共重合体ほど、相分離温度が高いことが示された。生分解性速度の制御とその際におきる相分離温度の低下を加味することで優れたUCST型ポリペプチドの設計が可能であることが示された。さらに、合理的な合成方法の確立として、シトルリンNCAモノマーの合成の確立を試みた。学術論文1件および学会発表4件(内一件は招待講演)の成果発表を行った。また学会発表のうち一件はハイライト講演に選ばれた。生理的条件下において低温溶解型(LCST型)で相変化を示す高分子は数多く存在するが、高温溶解型(UCST型)相変化する高分子は非常に少ない。そのような高分子を開発することは新たなバイオマテリアル設計において革新的な進歩が期待される。我々は今までにウレイド基を有する高分子が生理的条件下においてUCST型相分離挙動を示すことを報告してきた。また、ウレイド基を持つ天然のアミノ酸で構成されているポリシトルリン共重合体もUCST型相分離挙動を示すことを報告してきた。平成25年度から平成26年度にかけてシトルリンの光学活性に着目し、L体、DL体で構成されるポリシトルリン共重合体の二次構造とUCST型挙動の差異について研究を行った。平成27年度はD体のNCSモノマーを合成し、D体から成るポリシトルリン共重合体の2次構造並びにUCST型挙動について調べた。作製したD体ポリシトルリン共重合体もUCST型挙動を示すことが判った。その相分離温度はL体とほぼ同じであった。また二次構造を調べるためにCDスペクトルを測定したところ、左巻きヘリックスに由来する正のシグナルを示した。さらに生分解性を調べた。プロテアーゼKによる分解挙動を調べた結果、ほとんど分解されないことがしめされた。これはL体やDL体で構成される共重合体は分解挙動を示したことと対照的な結果となった。このように、光学活性を制御することで、相分離温度や生分解性をコントロールでき、優れたUCST型ポリペプチドの設計が可能であることがわかった生理的条件下においてLCST型挙動を示す高分子は多く存在するが、UCST型挙動を示す高分子は非常に珍しい。平成26年度は、平成25年度までに確立した合成方法に従って作成したポリシトルリン共重合体を使って本研究の目的の一つである生分解性の確認および2次構造との関連性を調べることができ、当初の予定通り進行している。生体高分子化学今後は他のアミノ酸を共重合させたポリシトルリンペプチドを合成し、その生分解性およびUCST挙動について評価を行う予定である。本年度はUCST挙動を示す重要な高分子であるポリシトルリンの合成手法を確立させることができた。これは親疎水性の官能基の導入にも応用できると考えられる。

本研究の目的は様々パラメーターが生分解性UCST型高分子の挙動に与える影響が目的だあるため、当初の予定通り進行していると思われる。今後は合成したポリシトルリン共重合体の二次構造のパラメーターに主眼をおいてUCST型挙動に与える影響を評価する予定である。当初の予定よりも早く合成条件が固まったため、繰越額が生じた。繰り越した予算はウレイド化試薬の購入費に充てる。
消化器癌に対するToll様受容体活性化による新規癌ワクチン療法の開発

CpG-oligodeoxynucleotides(CpG-ODN)はToll like receptor-9(TLR-9)のligandであり、これをヒトに用いることでTLR-9を発現するPlasmacytoid DC(PDC)とB cellを特異的に活性化し、自然免疫応答を惹起すると共に獲得免疫への橋渡しとなることから、抗腫瘍ワクチン療法におけるアジュバント効果が期待できると考えた。そこで(1)ヒトin vitroでの癌抗原ペプチドを用いた特異的CTL誘導におけるCpGのアジュバント効果(2)CpG-typeによるアジュバント効果の違い、について検討した。まず、CpG-AとCpG-CをPBMCに添加すると、K562に対する非特異的細胞障害活性を誘導した。また、CpGのsupにより、MoDCにおけるCD90/86発現が上昇し、MoDCは成熟化した。次に、新規癌抗原ペプチドに特異的なCTL誘導において、CpGを添加するとCD8±effector-memory T cellの割合が増加した。特に、CpG-A/Cの添加で、より高い細胞障害活性を示すCTLが誘導された。このCTLはCpG-A/Cのsupによりさらに特異的細胞障害活性が上昇した。さらに、PDCのdepletionによりアジュバント効果が消失することより、CpGのアジュバント効果はPDC dependentであることが示唆された。以上より、CpG-ODNはヒトin vitroにおける癌抗原ペプチドを用いたCTL誘導でアジュバント効果を認めるが、その効果はCpG-AやCpG-CがCpG-Bより強力であることが明らかとなった。よって、TLR-9を活性化するCpG-ODNを併用ずることは、ペプチドを用いた癌ウクチン療法でさらに強力な抗腫瘍効果を惹起し、新たな癌免疫療法の戦略となることが示唆された。また、CpGのsupにより、MoDCにおけるCD80/86発現が上昇し、MoDCは成熟化した。次に、新規癌抗原ペプチドに特異的なCTL誘導において、CpGを添加するとCD8+ effector-memory T cellの割合が増加した。よって、TLR-9を活性化するCpG-ODNを併用することは、ペプチドを用いた癌ワクチン療法でさらに強力な抗腫瘍効果を惹起し、新たな癌免疫療法の戦略となることが示唆された。

CpG-oligodeoxynucleotides(CpG-ODN)はToll like receptor-9(TLR-9)のligandであり、これをヒトに用いることでTLR-9を発現するPlasmacytoid DC(PDC)とB cellを特異的に活性化し、自然免疫応答を惹起すると共に獲得免疫への橋渡しとなることから、抗腫瘍ワクチン療法におけるアジュバント効果が期待できると考えた。そこで(1)ヒトin vitroでの癌抗原ペプチドを用いた特異的CTL誘導におけるCpGのアジュバント効果(2)CpG-typeによるアジュバント効果の違い、について検討した。まず、CpG-AとCpG-CをPBMCに添加すると、K562に対する非特異的細胞障害活性を誘導した。また、CpGのsupにより、MoDCにおけるCD80/86発現が上昇し、MoDCは成熟化した。次に、新規癌抗原ペプチドに特異的なCTL誘導において、CpGを添加するとCD8+effector-memory T cellの割合が増加した。特に、CpG-A/Cの添加で、より高い細胞障害活性を示すCTLが誘導された。このGTLはCpG-A/Cのsupによりさらに特異的細胞障害活性が上昇した。さらに、PDCのdepletionによりアジュバント効果が消失することより、CpGのアジュバント効果はPDC dependentであることが示唆された。以上より、CpG-ODNはヒトin vitroにおける癌抗原ペプチドを用いたCTL誘導でアジュバント効果を認めるが、その効果はCpG-AやCpG-CがCpG-Bより強力であることが明らかとなった。よって、TLR-9を活性化するCpG-ODNを併用することは、ペプチドを用いた癌ワクチン療法でさらに強力な抗腫瘍効果を惹起し、新たな癌免疫療法の戦略となることが示唆された。(789字)
アディポサイトカインと下部尿路機能障害

平成30年度は、前年度の基礎実験の結果をもとに、動脈硬化モデルラット、治療介入群において、ペンシル型CCD生体顕微鏡を用いて、経時的な毛細血管の血流を測定し、組織虚血の評価を行った。実臨床においては、下部尿路症状を有する症例に対して、自覚症状だけでなく、下部尿路機能障害の程度と各種アディポサイトカインならびに酸化ストレスマーカの関連性の検討を行った。生命倫理審査委員会による研究承認ならびに、個々の患者に対する同意を得た後、下部尿路症状、具体的にはIPSS(国際前立腺症状スコア)、IPSS-QOL(国際前立腺-生活の質スコア)、OABSS (過活動膀胱症状スコア)、NIH-CPSI (前立腺炎症状スコア)の評価おこなった。また尿流動態検査を行い、蓄尿機能、排尿機能を評価した上で、下部尿路症状ならびに下部尿路機能と、血液中のアディポサイトカインならびに酸化ストレスマーカの関連性について検討した。現時点においては研究継続中であるが、中間解析の結果として、下部尿路症状に対する自覚症状(IPSS、OABSS)と血中アディポネクチン濃度については、統計学的に有意でなかったものの、負の相関性がみられた。一方、下部尿路機能評価として膀胱出口部閉塞の有無、膀胱不随意収縮の有無を中心に検討を行った。膀胱出口部閉塞のある症例群では、認めない群と比較して、血中アディポネクチン濃度は有意に低く、また膀胱不随意収縮を認める症例群では、酸化ストレスマーカレベルの増加ならびにアディポネクチン濃度の低下を認め、下部尿路機能障害とアディポサイトカインの関連性が示唆された。平成30年度は、基礎研究において、ピオグリタゾン投与群とcontrol群、動脈硬化群での膀胱組織の免疫組織学的検討、CCD生体顕微鏡による膀胱壁微小循環の評価を行う予定であり、研究を施行したが、実験手技の問題、評価時期の問題などで、きちんとした評価が行えず、当初の予定と比較して遅れている。臨床研究の面では、概ね順調に進捗している。臨床分野においては、現在進行中の検討を完遂して、ヒトにおける下部尿路機能障害に及ぼすアディポサイトカインの役割についての検討を深めていく予定である。また基礎研究においては研究分担者とも相談して、モデルの妥当性、介入開始時期、評価時期などを再考した上で、計画した研究を進めていく予定である。本研究では、メタボリックシンドロームの病態の基本であるアディポサイトカインの分泌異常が、下部尿路機能に与える影響を基礎、臨床の両側面から解明、ならびに善玉アディポサイトカイン「アディポネクチン」による下部尿路機能改善作用について、その作用メカニズムも含めて詳細に検討を行うことを目的としている。平成29年度は上記研究目的の中で、動脈硬化による下部尿路機能障害モデルとして糖尿病発症ラット、骨盤虚血ラットを用いて、ピオグリタゾン投与群と対照群で比較したところ、ピオグリタゾン投与群において、有意な排尿動態の改善が得られており、また膀胱組織学的な検討においても、ピオグリタゾン投与群において、膀胱組織の線維化の抑制がみられた。以上の結果より、アディポサイトカイン(特にアディポネクチン)の排尿動態に与える影響が確認され、メタボリックシンドロームでみられる下部尿路障害の機序解明につながるものと考えられた。当初の予定では、29年度にアディポネクチン投与群モデルの膀胱組織を用いて、線維化などの組織学的な検討以外に、ペンシル型CCD生体顕微鏡を用いて、経時的に毛細血管の血流速度の測定や、免疫組織学的染色にて炎症・線維化の程度、血管新生の評価を行う予定であったが、先の膀胱動態機能評価において、時間がかかり、当初計画よりやや遅延がみられている。

30年度は、基礎研究の分野では、29年度予定であった膀胱組織の検討に加え、アディポネクチンレセプターとそのシグナル伝達経路の解明を行う予定であり、また臨床面では、下部尿路症状を有する患者におけるアディポネクチン濃度測定をおこない、下部尿路症状の重症度とアディポネクチンの関連性を検討する予定である。現時点では、研究遂行の障害、課題とはないものと考えている。臨床分野においては、現在進行中の検討を完遂して、ヒトにおける下部尿路機能障害に及ぼすアディポサイトカインの役割についての検討を深めていく予定である。また基礎研究においては研究分担者とも相談して、モデルの妥当性、介入開始時期、評価時期などを再考した上で、計画した研究を進めていく予定である。一部予定の研究が遂行されておらず、物品費等が予定額より下回った。次年度に、29年度に計画した研究は行う予定である。基礎研究において研究手技、計画の問題できちんと評価できなかったこともあり、予定していた研究が一部実施できず、物品費において差が生じた。次年度に研究計画を見直した上で、膀胱組織血流評価、免疫学的評価を行い動脈硬化による下部尿路機能障害モデルにおけるアディポネクチンの有効性について評価を行っていく予定である。
高感度・高面分解能な有機系二次イオン質量分析の実現：新規クラスタービーム源の開発

二次イオン質量分析(SIMS)は、試料表面にイオンビームを照射し、それによって真空中に放出されたイオン(いわゆる二次イオン)を質量分析することにより、試料構成元素(あるいは分子)の同定や濃度測定を行う分析技術である。SIMSは、有望なイメージング技術として有機材料や医薬品等への応用が期待されているが、有機分子を高感度かつ高面分解能でSIMS分析することは技術的に難しく、大きな課題となっている。本研究は、プロトン性イオン液体を用いた新方式のクラスターイオンビーム源を開発するものである。本研究は、有機系試料の高感度かつ高面分解能なSIMS分析の実現に貢献するものと期待される。
Holmes失調症遺伝子座位の決定と三塩基反復配列の探索

Holmes型失調症は成年期に発症し、緩慢進行性の小脳失調を主徴とする疾患で、日本人の遺伝性脊髄小脳変性症(spinocerebellar degeneration: SCD)の約30%を占めている。SCA1、SCA2、SCA3のSCD各亜型の遺伝子が次々と同定され、遺伝子診断に応用される中にあって、Holmes型失調症の解析は遅れ、遺伝子座さえ明らかではなかった。そこで我々は本疾患の遺伝子を探索する事を目的に解析を行い、以下の点を明らかにした。2) SCA6患者では19p13に存在するα1A-電位依存性カルシウムチャンネル遺伝子(CACNL1A4)翻訳領域内にあるCAG反復配列が伸長していた。3) SCA6のCAG反復配列数は、健常人では418回、患者では2123回で、両者には重なりは無かった。5) CACNL1A4遺伝子内に存在するD19S1150は患者全員が同一遺伝子型を有し、SCA6は一人の祖先から由来すると想定された。CAG反復配列の増幅がどのような機序で選択的神経細胞死を起こすか今後明らかにする必要がある。日本人において遺伝性脊髄小脳変性症(SCD)の約30%を占めるHolmes失調症について、1)その責任遺伝子座位を決定し、その遺伝子異常を明らかにする、2)その神経病理学的、臨床症候学的診断基準を確立する、ことを目的に研究は行われた。この研究が始まってまもなく19p13に存在するα_<1A>電位依存性Ca^<2+>チャンネル遺伝子(CACNL1A4)の異常を原因とするSCDの新たな亜型SCA6が報告された。我々は日本人Holmes失調症患者について検索しSCA6と同一のものである事を確認した。すなわちHolmes失調症患者ではCACNL1A4遺伝子内に存在するCAG反復回数は全て21回を越え、健常人の18回以下に比し大幅に増している事を明らかにした。またCAG反復配列数と発症年齢、症状の重症度には逆相関が確認された。Holmes失調症はSCA1、SCA2、SCA3と同じくポリグルタミン鎖病に属するものであることが判ったが、これら3者に比し患者のCAG反復配列が際立って少ない。この事はHolmes失調症の発症年齢が高齢に偏る原因と推察された。また検索したHolmes失調症12家系全てにおいてCACNL1A4遺伝子エクソン部に存在する多型標識(D19S1150)が同一である事から日本人Holmes失調症患者は共通の祖先より派生した可能性が示唆された。この研究により鑑別が困難なSCDの診断法が樹立され、治療や予防の道が開かれた。Holmes型失調症は成年期に発症し、緩慢進行性の小脳失調を主徴とする疾患で、遺伝性脊髄小脳変性症(spincerebellar degeneration:SCD)の中で解析の最も遅れていたものである。我々は本疾患を対象に遺伝的解析を行い以下の点を明らかにした。3) CACNL1A4は小脳プルキニエ細胞および顆粒細胞に発現している。4) SCA6のCAG反復配列数は、健常人では418回、患者では2123回で、両者には重なりは無かった。6) CACNL1A4遺伝子内に存在するD19S1150は患者全員が同一遺伝子型を有し、SCA6は一人の祖先から由来すると想定された。7) SCA6のCAG反復配列数は、他の遺伝性小脳変性症と比して少なくSCA1、SCA2、SCA3では健常人にも見られる範囲であった。これはHolmes型失調症が他と比べて発症年齢が高く、症状が穏かで有る事と関連するものと思われた。
マメゾウムシ類の適応的多様化：種子毒耐性と乾燥種子利用によるジェネラリストの進化

嶋田・加藤・伊藤はメキシコ産マメゾウムシ類を系統解析し、ジャケツイバラ亜科利用とネムノキ亜科利用が系統樹基部に来て、マメ亜科利用が派生するパターンを平行進化的に見出した。毒物質カナバニン耐性のマメゾウムシ類は近縁群に固まった。藤井はイラン、中国雲南省、ロシア・コーカサス地方などでマメ科の毒物質を調査した。津田と徳永は、西部アフリカ原産であるヨツモンマメゾウムシで、系統分化の由来を分子分散分析AMOVAにより調べた。遺伝的分化は、地理的隔離を伴う異所的分化、異なる寄主植物を利用する同所的分化、さらに貯穀害虫では貿易に伴う人為的長距離移動も分化要因となる。これらの相対的重要性を地域ごとに解析した。嶋田は、加藤俊英(東大・特任助教)、清水裕矢(東大・教養学部4年)と共同して、空間構造を持つ生態系でニッチ形質を巡って種間競争する生物種群がどのように適応放散し、種多様性を高めるかの進化シミュレーションを開発した。これを植物ー植食性昆虫の食うー食われる系の多様化に適用する予定である。藤井は、ガーナ、イラン、中国雲南省、マレーシア等で採取した植物約200種のアレロパシー活性を調べたところ、特にマメ科薬用植物に強い活性があった。Tamarindusindicaに強い活性を見出し、主要活性成分として数種の有機酸を検出した。マメ科のMucuna pruriensが同じマメ科のVicia villosaの生育を促進する現象を見出し、Vicia属に含まれるcyanamideの毒性にaldehyde dehydrogenaseが関与していることを明らかにした。徳永は、コスモポリタンとして世界中に分布するヨツモンマメゾウムシの、幼虫期の壁作り行動にばらつきがあることを明らかにし、このばらつきと広食性との関係を現在調査中である。また、年度末3月に1870年代にインド移民が多数移住したフィジーにおいて豆類を食害するマメゾウムシの採集を行い、ヨツモンマメゾウムシの羽化を得た。これらの成虫から「分布の端」となる実験個体群系統を確立中である。津田は徳永と共同で、アフリカ熱帯原産ヨツモンマメゾウムシのアフリカ、アジア、オセアニア、南米の集団の分子解析により、アフリカ・アジア大陸間の遺伝的分化、アフリカでは大陸内地理的遺伝的分化、アジアでは利用寄主マメによる遺伝的分化が起きたことを発見した(Tuda et al. 2014, PLoS ONE)。一方、アジア・アフリカ間で共通のハプロタイプが一部の地域で見られ、乾燥種子の貿易による遺伝的均一化の進行も発見した。代表の嶋田は、Callosobruchus subinnotatusが多様な乾燥完熟豆種を食べて育つことを発見した。食べて育つ豆種は、Cicer属、Lens属、Phaseolus属、Vicia属、Pisum属。ただし、Phaseolus vaulgaris (金時豆)は育たない。共同研究者の松井健二(山口大学)・穴井豊昭(佐賀大学)が遺伝子組換えを用いない逆遺伝学的方法であるTilling法で育成したダイズ(Glycine max)をC.subinnotatusが食べて育つかを観測した。その結果、マメゾウムシ類の成長を抑える毒性のあるリノール酸・リノレイン酸への代謝を抑制したダイズからは、C.subinnotatusは早く大きく羽化することが分かった。分担者の藤井はロシア南部コーカサス地方、イラン東部、ペルーアマゾン、中国雲南省等においてマメ科を中心とした植物のアレロパシー活性を測定した。活性の強い植物についてはその成分を分析した。分担者の徳永はマメゾウムシ研究に必要な統計手法の特集をまとめ発表した(Popul. Ecol.誌に発表)。年度末(3/12-16)にはインドネシアのバリ島において、食用豆類を食害するマメゾウムシの採集を行った。これら成虫から「分布の端」となる実験個体群系統を確立中である。分担者の津田は欧州産Bruchus属マメゾウムシの雌を誘引・産卵誘発する化学物質を特定するため、寄主植物の莢表面に多く含まれる鎖式飽和炭化水素の化学物質種で選択行動実験を行い、滞在時間延長には2種の混合、産卵誘発には物質Aが効果を発揮することを解明した。分担者の中野は研究員・大林と共同で、京大生態研センターで所有する全国共同利用施設の高性能シーケンサーABI 3730を利用し、嶋田と特任研究員・加藤と共同で、新大陸産マメゾウムシ類のDNA配列を用いた分子系統解析を進めた。代表の嶋田は「Callosobruchus subinnotatusの乾燥完熟豆利用と毒物質耐性に伴う広食性の進化」のサブテーマを確立し、さらに嶋田は修士課程院生・萩原の研究室配属を得て、中野と協力者の大林による「サイカチマメゾウムシ(Megabruchidius dorsalis)の完熟乾燥種子利用と繁殖戦略の進化」で新たなサブテーマを進展できた。また、分担者の藤井によるマメ科植物のアレロパシーの化学分析、徳永によるマメゾウムシ類の分布周辺における戦略の実験系確立、津田によるBruchus属マメゾウムシ雌の寄主植物への誘引と産卵を促す化学物質の解明では、それぞれ新しい実験系の確立、データ取得、論文を発表し、期待以上の成果を出した年度である。一方、嶋田、と大林、加藤による当初の中心テーマである新大陸産マメ科・アオイ科の毒物質を含めた系統進化の解析については遅れており、研究の進展ではサブテーマごとに凸凹が際立った年度でもある。

一部に遅れた理由は、協力者の加藤特任助教の任期切れ退職と就職活動などで、研究時間をなかなか確保できなかったことも一因である。ただ、嶋田が大林の協力を得て、全国共同利用施設である京大生態研センターの協力研究員となり、センターの高性能シーケンサーを使える状況になったため、DNA配列が読めていなかった新大陸産マメゾウムシ類を加藤を助けて一挙に読めたことで、あとは大林と加藤とで分子系統解析を進展するところまで来たのは、明るい点である。よって、総合的に判断すると、サブテーマごとに凸凹はあるものの、全体としての平均的な評価は概ね順調と位置づけられる。代表の嶋田は、連携研究者の大林、協力研究者の東大特任研究員の加藤と共同で、新大陸でも最も多様性が高いAcanthoscelides属について分子系統解析に基づく寄主植物利用の祖先形質復元を試みた。その結果、単系統の属とされてきたAcanthoscelides属は、(1)4つの異なるグループから成る多系統群である、(2)各グループはマメ科の同じ亜科、またはマメ科以外でも類似した植物を利用している、(3)各グループは、類似した植物を利用する近縁属と単系統群を形成する、(4)代表的毒物質であるL-カナバニンを含むマメ科植物を利用する系統はAcanthoscelides属とその近縁属の中で独立に2回進化している等が示された。また嶋田は中野と大林と共同して、サイカチマメゾウムシから次世代シークエンサーによるRNAseqを行い、マイクロサテライト領域で父性解析に有効可能な12遺伝子座の多型性の確定を行った。分担者の藤井は、ケニア、スーダン、イラン、中国内モンゴル自治区等においてマメ科を中心とした植物のアレロパシー活性を測定した。植物生育阻害作用の強い成分についてはプロトプラストを用いた細胞への影響を調べた。徳永は、アカイロマメゾウムシにおいて、Wolbachiaに2重感染している細胞質不和合(CI)が、黒化変異個体の適応度を著しく下げることを国際誌で発表した。1月にブルネイにおいて、食用豆類を食害するマメゾウムシの採集を行った。津田は、種子に含まれるカナバニン濃度が高い欧州のソラマメ連Vicia属2種を利用するマメゾウムシ4種を採集し、ミトコンドリア遺伝子による系統樹から、他のソラマメ連を利用する同属他種と比して近過去に種分化したことが判明した。さらに、それら4種とも共生細菌に感染しており、寄主植物の毒物質の分解にこれらの共生菌が貢献し、毒物質適応により種分化した可能性がある。嶋田・加藤・伊藤はメキシコ産マメゾウムシ類を系統解析し、ジャケツイバラ亜科利用とネムノキ亜科利用が系統樹基部に来て、マメ亜科利用が派生するパターンを平行進化的に見出した。毒物質カナバニン耐性のマメゾウムシ類は近縁群に固まった。藤井はイラン、中国雲南省、ロシア・コーカサス地方などでマメ科の毒物質を調査した。津田と徳永は、西部アフリカ原産であるヨツモンマメゾウムシで、系統分化の由来を分子分散分析AMOVAにより調べた。遺伝的分化は、地理的隔離を伴う異所的分化、異なる寄主植物を利用する同所的分化、さらに貯穀害虫では貿易に伴う人為的長距離移動も分化要因となる。これらの相対的重要性を地域ごとに解析した。
試験管内におけるES細胞からの精原幹細胞誘導と効率的な減数分裂誘導法の開発

生殖細胞は減数分裂を経て多様な遺伝情報をもつ精子や卵子へと分化する。減数分裂に先立ち生殖細胞は体細胞分裂により数を増やすが、どのように体細胞分裂から減数分裂へと切り替わるのかについては、いまだ明らかでない部分が多い。本研究課題ではMax遺伝子を抑制したES細胞で減数分裂が開始することを見出したことを契機に、試験管内で減数分裂を効率的に誘導する系の確立および、生殖幹細胞を誘導する試みを行った。その結果、Maxを抑制したES細胞は生殖細胞系列への分化を飛び越えて、直接的に減数分裂へと移行していたことから、Maxは減数分裂開始を直接的に制御する因子であることが示唆された。これまでの生殖細胞研究ではES/iPS細胞から試験管内で精子の源である精原幹細胞を誘導する方法とそこから減数分裂を誘導する方法は確立されておらず、生体組織を利用せずに完全にIn vitroでES/iPS細胞から健常な精子や卵子を作成することは未だ成功していない。申請者らはマウスES細胞(雄由来)で薬剤依存的にMax遺伝子をノックアウトすると減数分裂様の細胞が出現することを見出した。もしMaxノックアウトES細胞が減数分裂に先立ち精原幹細胞様の状態を経ているのならば、精巣組織から樹立された生殖幹細胞(Germline Sten Cell; GS細胞)の培養条件で維持することが可能であると思われる。そこで本計画ではMaxノックアウトES細胞から減数分裂が誘導されるときにどのような細胞の状態を経ているのかを解明し、ES細胞から精原幹細胞の樹立、および効率的に減数分裂を誘導する系を確立することを目指して、以下の研究項目について取り組んだ。1)MaxノックアウトESCから減数分裂が誘導されるまでの発生系譜の解明3)効率的な減数分裂誘導系の確立4) Maxが減数分裂を制御するメカニズムの解明MaxをノックアウトしたマウスES細胞から減数分裂様の細胞が出現することを発見し、減数分裂様細胞の出現にはin vivoの減数分裂と同様にレチノイン酸によって誘導されるStra8に依存していることを証明した。興味深いことに、当初、ES細胞が減数分裂へと至るためには、通常の発生過程のように始原生殖細胞-雄性生殖幹細胞への分化を経ると仮説を立てていたが、始原生殖細胞の誘導と維持に必要なBlimp1遺伝子をノックアウトしても、Max抑制に伴う減数分裂様細胞が出現したことから、MaxをノックアウトしたES細胞はPGCへの分化を経ずに、直接的に減数分裂へと突入していることがわかった。これはMaxが減数分裂に対する直接的な制御因子であることを示唆しているだけでなく、生殖細胞分化と減数分裂はそれぞれ分化のシナリオでは密接な関係にあるが、その制御機構は独立したものであることを示唆している。さらに発生過程では減数分裂開始前にMaxタンパク質が一過的に減少していることも突き止め、そして雄の精原幹細胞由来のGS細胞でMaxをノックダウンしたところ、やはり減数分裂が誘導されたことから、フィジオロジカルにMaxは減数分裂抑制因子として減数分裂の開始をコントロールしていると思われる。MaxはHLH-zip型の転写因子であり、Mycファミリータンパク質と2量体を形成して転写促進に、Madファミリータンパク質と2量体を形成すると転写抑制に働くが、減数分裂関係遺伝子の抑制にはMadファミリーのうちMgaが重要であることを見出した。これらの研究成果はNature Communicationsに掲載された。生殖細胞の分化は減数分裂に先立ち始原生殖細胞(PGC)の状態を経て、その後精原幹細胞へと分化する。PGC分化に必須なBlimp1をノックアウトしたMaxノックアウトES細胞はPGCの状態になることができないが、にもかかわらず減数分裂を開始した。更にES細胞の分化を抑制する培地条件(2i条件)においても減数分裂開始を抑制することはできなかった。つまりMaxノックアウトES細胞は分化の過程を経ずに直接的に減数分裂へと突入している可能性が高まった。GS細胞培養条件でもやはりMaxノックアウトES細胞は減数分裂を開始してしまうことから、当初の目的のひとつである精原幹細胞様細胞の誘導は難しくなったが、逆にこれはMaxが減数分裂開始を直接的に制御する重要な因子であることを意味しているため、減数分裂開始メカニズムの解明へとつながる大きな成果と思われる。実際に遺伝子ノックアウトや薬剤添加実験によりMaxノックアウトES細胞は生体内と同様な減数分裂開始機構を備えていることがわかってきた。更に生体内の減数分裂におけるMaxタンパク質の局在を観察したところ、減数分裂直前ではMaxタンパク質の量が極めて減少していることも分かった。これらのことはMaxは減数分裂を抑制する上で極めて重要な鍵因子であることを示唆している。また生体内の生殖細胞は試料として少量しか得られないことが解析を困難にするひとつの要因であるが、MaxノックアウトES細胞はこの問題を克服できる。

今後生体内では困難な実験をこの細胞を用いることにより、これまで分からなかった減数分裂開始のメカニズムについて明らかにできるのではないかと思われる。幹細胞生物学MaxノックアウトES細胞が分化の過程を経ずに減数分裂経といたる可能性については当初から予想していたため、今後も計画書どおりにMaxが減数分裂を制御する因子であるという仮説にたって研究を進めていく。即ちMaxが生体内で減数分裂を実際に制御する可能性について明らかにしていきたい。同時にMaxノックアウトES細胞を用いて明らかになったことを、GS細胞へと応用して減数分裂開始機構の解明をvivoとvitroの両面から進めていきたい。予算の多くを占めるのはES細胞の培養に掛かるLIF及びGS細胞の培養に掛かるGDNF等多数のサイトカインである。昨年度はES細胞の培養がメインであり、これを使った遺伝子ノックアウト実験を主に進めたが、GS細胞の培養は昨年度の後半に開始したためその分次年度使用額が生じた。今後GS細胞の培養を維持する上で多額の費用が掛かると思われる。今年度はGS細胞を主に解析対象にする予定であるため、GS細胞の培養に必要なサイトカイン(GDNF, EGF, bFGF, LIF等)や各種抗体等購入する予定である。
新規開発した自然発症てんかんラットを用いた抗てんかん薬の長期摂取効果の評価法への確立

自然発症てんかんラット(SER)は二重突然変異体であり、強直性けいれんと欠神様発作を起こす。この動物が抗てんかん薬の長期摂取させた場合の臨床プロフィルを評価できるか否か、そして抗てんかん薬の長期摂取効果を評価する上で有用なモデルとなるか否かを明らかにすることが本研究の目的である。発作発現前の7週令のSERにパルプロ酸を混入させた飼料を自由摂取させ、その発育、寿命、発作の抑制程度を検討すると共にバルプロ酸の血漿中濃度を測定し、ヒトにおける有効血漿中脳度と比較検討した。初年度において0.1,1,5および10%の割合にて混入させた飼料の摂取させ、その抗てんかん作用を検討し、1および5%バルプロ酸混入飼料を使用することが適当と判断された。次年度において1および5%バルプロ酸投与効果を検討し、両投与群において用量依存性に強直性けいれんの抑制および延命効果が得られることが判明した。さらに検討した1%投与群において脳波上5ー7Hzの棘徐波複合の出現によって特徴づけられる欠神様発作も有意に抑制された。これらの抗てんかん様発作には耐性は認められなかった。対照群の寿命(メディアン)は雄および雌それぞれ16.5および17.5週であったが、1および5%投与群の寿命はそれぞれ23.5および27.0週に延長した。バルプロ酸の血漿中濃度は投与10週後(17週令)において1および5%投与群においてそれぞれ17.3±2.7および82.5±24.0μg/mlとなりほぼ定常状態が得られた。5%投与群においてGOTおよびGPT値上昇が認められたが、1%投与群では肝機能検査の異常は認められなかった。パルプロ酸の長期摂取効果としてけいれんおよび欠神様発作の両者に有効であることとこの作用に耐性を生じないことはてんかん患者に対する作用スペクトルと非耐性効果と一致し、本SERは抗てんかん薬の臨床特性の評価に有用と考えられる。抗てんかん薬は長期摂取することによりてんかん発作の発現を防止するために使用される。本研究は効果がすぐれ、副作用の少い抗てんかん薬を開発する上で必要なモデル動物として新規に開発した二重突然変異体である自然発症てんかんラット(zi/zi,tm/tm)を用い、抗てんかん薬を長期摂取させた時の効果を評価するシステムを確立することを目的に行われている。まず本動物の維持増殖のため、無菌環境下でチッタ-ホモ,トレモアヘテロ因子を有する動物(zi/zi,tm/+)同士の交配を行い、ほぼ予定通り1/4の割合でてんかんラットが得られるようになった。ついで、抗てんかん薬として臨床的に評価がほぼ確立しているバルブロ酸を5%の濃度にて飼料に混入させ、生後7週より自由摂取させ、飼料摂取量、血中濃度,体重,および血清を用いて肝機能などの生化学的検査を行うと共に、一週に一回の割合にて昼間2時間行動をビデオテ-プに記録し、けいれん発作の回数を対照群オス,メス各4匹,投与群オス,メス各4匹について検討した。この結果、この動物はバルブロ酸の味を嫌う様子で飼料摂取量は対照動物に比べて少く、従って体重増加も期待値よりも少なかった。血中バルブロ酸濃度はほぼ50μg/ml程度に維持され、発作回数も対照群の1/3以下に減少した。また延命効果も著明であり、対照群はすべて20週令までに死亡したのに対し、投与群の半数以上は25週令以上生存した。バルブロ酸5%混入飼料では摂取量が少いため、混入濃度を1%として上述と同様の実験が現在進行中である。

またバルブロ酸の血中濃度が期待値より低いため、この測定を1日3回に分けて行っているところである。さらに発作発症後(9週令)からバルブロ酸混入飼料を摂取させ、その効果を検討する予定である。強直性けいれんと欠神様発作を示す自然発症てんかんラット(SER:zi/zi,tm/tm)が抗てんかん薬の臨床特性の評価に有用か否かを明らかにするための研究を行った。このために臨床的に一次全般発作と欠神発作に有効であり、その効果に耐性を生じないバルプロ酸(VPA)を経口的に長期連続摂取させ、抗発作スペクトル、延命効果、耐性の発現、肝機能ならびに血中濃度などについて検討した。前年度にVPAの至適飼料混入濃度を検討し、1および5%の濃度が適当であったのでこの濃度の混入飼料を生後7週令より自由摂取させた。体重、摂取飼料量を毎週計量し、けいれん発作および行動を毎週2時間ビデオテ-プに録画して観察した。11週令に脳波記録用電極を埋め込み、12週令以降毎週脳波を記録し、5-7Hz棘徐波複合の出現による欠神様発作の回数と持続時間を記録した。対照群の寿命(メディアン)は雄および雌それぞれ16.5および17.5週であり、1および5%VPA投与群の寿命はそれぞれ23.5および27.0週となり有意に延長した。けいれん発作は対照群において11週令以降発現し14週令には最大(8.3±1.2回/2時間)となった。1および5%VPA群において発作回数は有意に減少し、この抑制効果は20週令以降も認められ、耐性発現は認められなかった。欠神様発作も検討した1%VPA群において、検討した12-15週令の間抑制され耐性も認めなかった。VPA血漿中濃度は投与10週後(17週令)において、1および5%投与群それぞれ17.3±2.7および82.5±24.0μg/mlとなった。5%VPA投与群ではGOT、GPTの上昇傾向が認められたが1%投与群では肝機能検査の異常は認められなかった。以上の成績から肝機能に影響しない用量のVPAの長期摂取によりSERの寿命延長、てんかん様発作の抑制が得られ、てんかん患者の場合と同様、この作用に耐性は形成されにくいことから、SERは抗てんかん薬の臨床特性の評価に有用と考えられる。
大きな乱れをもつ結晶構造の解析プログラムの開発

結晶場におかれた分子が化学変化を起こす際には、分子がある程度動けるような空間が必要である。このため結晶構造の周期性が乱れる。この動的な結晶場を立体的に解析する1つの方法としてX線構造解析がある。ところが、大きな乱れをともなう構造に関しては実験および解析方法が充分に確立されていない。そこで本研究では2種類の金属錯体を例にとり、冷却による結晶構造の周期性の改善の可能性を検討した。また、結晶内の空洞の位置や大きさを調べるプログラムAPSを開発し、構造の乱れと結晶内の空洞との関連を検討した。1.プロピオン酸銅(II)水和物のエチル基の乱れ297Kと120Kで構造再決定を行った。結晶は単斜晶系で空間群はP2_1/c、Z=8であり、末端のエチル基の方位が大きく乱れているためR因子はいずれも0.072であった。低温の方が乱れ具合は多少改善されているが、乱れは残っている。格子定数の温度変化に関してはa,c軸に比べてb軸が異常に縮む事、および銅原子のb軸方向の温度因子が低温でも減衰がにぶい傾向にある事などから、結晶全体の静的な乱れがb軸方向に存在すると推定された。本研究で開発したプログラムAPSを用いて、エチル基の乱れの温度変化と格子定数の温度変化の異方性とをある程度関連付ける事ができた。この研究を通して、結晶内の乱れの程度や方向性は、格子定数の温度変化を調べる事によって測定可能である事が示された。2.1、4、7、10-テトラアザシクロペンタデカンを配位子に含むCo(III)錯体マクロサイクリックな四座配位子(N_48)を含むCo(III)錯体、trans-〔CoCl_2(N_48)〕^+の8員キレート環にはかなり複雑な乱れが観測された。boat-boat(BB)形が40%でtwist-boat-chain(TBC)形が60%であった。ところが113KではすべてTBC形になる事が構造解析による示唆された。
ヨ-ロッパ史における北と南

平成3年度における研究計画はほぼ予定通り進行した。各研究分担者、及び研究分科会における個別の史料分析と討論を積み重ね、前年度に引き続いて各人の分担課題に基づく個別的研究が行われた。これら個別的研究課題の進展の成果をふまえて、7月、全体会が開かれ、研究分担者それぞれの立場から、率直な意見の交換が行われた。その際統一的な申し合わせ事項として取り決められたのは、「北と南」という課題を、たとえば、いわゆる南北問題というように狭い意味の概念に限る事なく、「ある一つの地域の内部における不均等発展」という広い意味で捉え、国家の枠にとらわれる事なく、地域研究としての広がりをもたせる事に意見が一致した。この申し合わせにしたがって、各人が研究成果を原稿の形で作成し、研究成果報告書の作成に当たった。まず、研究代表者(城戸)および森田・相沢・甚野・河原の各研究分担者は、ヨ-ロッパのアルプス以北の地域において、いかなる不均等発展が起こったのか、という問題に焦点を絞った。森田はスイス、相沢は中世ドイツを対象としてそれぞれの地域における地域主義と国家主義との相克の諸相を浮き彫りにした。また甚野は思想史の面からアプロ-チを行い、また河原は、貪民救済という一種の南北問題に起因する現象が、すでに中世ヨ-ロッパに存在した事を明らかにした。またアルプス以南では島田と橋場が、それぞれ古代ロ-マとアテネとを対象として、南欧型の都市とそこにおける政治形態の特質とを論じた。また安村は、はるかにグロ-バルな視点から、プロテスタンティズムを「北」、カトリックを「南」と捉え、中南米へのヨ-ロッパの拡大は、この「南」の拡大にほかならないとした。これらの意見を総合して研究成果報告書が編集された。本年度は、地域の視点に重きを置いた各国史研究や内外の関連諸資料を広く探索・収集すると共に、時代を軸とする分科会({前近代ー城戸、伊藤、相沢、河原、新井}、{近・現代ー西川、森田、網野})を中心に研究が進められ、北と南という枠組みがとりわけ時代的にみてどのような歴史的特質を帯びていたのかにつき各分科会毎に報告・討議が行なわれた。その結果、「北」と「南」という本研究上の枠組みは、対立する概念としてだけでなく、それぞれの地域の持つ歴史的固有性をそれぞれ独自に象徴するものとしても有効性を持つ概念であることがあらためて確認された。この前提のもとに時代的にみると、とりわけ前近代史における、地域の固有性の視点の必要性が指摘された。すなわち前近代ほど、地理的自然条件が規定的な作用を及ぼしていたのは勿論であるが、その「北」と「南」という地理的枠組みそれぞれにおいて、その地理的自然条件によって育まれたそれぞれの歴史的固有性が、前近代においてその地域の政治・社会・文化の中に育まれて行ったのである。それに対して近代以降になると、産業革命以来の新たな世界史の展開に伴い、「北」と「南」というファクタ-は、地理的自然条件を超越した様相を呈し始め、各国民国家内での地域間格差の象徴として「北」対「南」という意味づけがなされるようになると同時に、やがて現在も根強く残るいわゆる南北問題に連続する性格を、次第に色濃くしてゆく。このように時代によって「北」と「南」という枠組みが持つ意味あいは変化するものの、「北」と「南」の概念は、時代を通じてヨ-ロッパでは大きな重要性を持つものであったことが明らかになった。

これら個別的研究課題の進展の成果をふまえて、7月、全体会が開かれ、研究分担者それぞれの立場から、率直な意見の交換が行われた。その際統一的な申し合わせ事項として取り決められたのは、「北と南」という課題を、たとえば、いわゆる南北問題というように狭い意味の概念に限る事なく、「ある一つの地域の内部における不均等発展」という広い意味で捉え、国家の枠にとらわれる事なく、地域研究としての広がりをもたせる事に意見が一致した。この申し合わせにしたがって、各人が研究成果を原稿の形で作成し、研究成果報告書の作成に当たった。まず、研究代表者(城戸)および森田・相沢・甚野・河原の各研究分担者は、ヨ-ロッパのアルプス以北の地域において、いかなる不均等発展が起こったのか、という問題に焦点を絞った。森田はスイス、相沢は中世ドイツを対象としてそれぞれの地亦における地域主義と国家主義との相克の諸相を浮き彫りにした。また甚野は思想史の面からアプロ-チを行い、また河原は、貧民救済という一種の南北問題に起因する現象が、すでに中世ヨ-ロッパに存在した事を明らかにした。またアルプス以南では島田と橋場が、それぞれ古代ロ-マとアテネとを対象として、南欧型の都市とそこにおける政治形態の特質とを論じた。また安村は、はるかにグロ-バルな視点から、プロテスタンティズムを「北」、カトリックを「南」と捉え、中南米へのヨ-ロッパの拡大は、この「南」の拡大にほかならないとした。これらの意見を総合して研究成果報告書が編集された。