hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たな甲状腺ホルモン作用機構の解明ーーシクロヘキシミド感受性を有する甲状腺ホルモン応答性遺伝子(ZAKI-4)の調整領域を用いてーー

ZAKI-4は、我々がヒトの甲状腺ホルモン(T_3)応答性遺伝子として同定した遺伝子で、分子量約25,000の蛋白をコードしている。皮膚線維芽細胞では、ZAKI-4の転写はT_3添加により著しく促進されるが、この転写調節は蛋白合成阻害剤であるシクロヘキシミドで完全に阻害される。したがって、T_3はZAKI-4遺伝子の転写を促進する蛋白を誘導することにより作用を発揮するというこれまでに知られていないT_3作用機構が存在することが示唆された。本研究は、この新たなT_3作用機構を解明するため、ZAKI-4遺伝子の調節領域をクローニングし、T^3により誘導されZAKI-4遺伝子の転写を調節する因子を同定することを目的に計画された。平成9年度では、ZAKI-4の調節領域を含むゲノムDNAのクローニングを行い、ZAKI-4遺伝子の転写開始点を決定すると共に、転写開始点より上流約2.6kbにプロモーター活性が存在することを明らかにした。平成10年度においては、プロモーター活性を有する領域をさらに特定し、-28-4bpであることを示した。次に、この25bpのDNA断片(TFZ-1)をプローブとするゲルシフト解析で、ZAKI-4が発現し、T_3による発現調節が認められたヒトグリオーマ細胞株(U-251MG)の核抽出物中にTFZ-1に結合する蛋白が存在することが確かめられた。この蛋白はTFZ-1をプローブとするサウスウエスタン解析により分子量約45,000であり、T_3によってその発現が増加することが示された。そこで現在、酵母を用いたワンハイブリッドシステムにより、この蛋白をコードする遺伝子のcDNAのクローニングを試みている。ZAKI-4は、ヒト皮膚線維芽細胞における甲状腺ホルモン(T3)応答性遺伝子として同定された遺伝子で、分子量約2万5千の蛋白をコードしている。T3によるZAKI-4mRNAの増加はシクロヘキシミドの添加により阻害されることから、ZAKI-4遺伝子のT3による転写調節にはT3によって誘導された蛋白が介在するといった、これまでに報告されていないT3作用機構が存在することが示唆された。本研究はこの新たなT3作用機構を解明することを目的に計画された。そこで平成9年度では、PromoterFinderを用いて、ZAKI-4の5 ́-flanking regionを含むDNA断片(αE2-5,約2.8kb)をクローニングし、primer extension法を用いて転写開始点を決定した。次に、転写開始点より上流にある種々のDNA断片をレポーター遺伝子に組み込み、ZAKI-4 mRNAを発現していることが確認されたグリオーマ細胞株(U-251MG)に導入し、ZAKI-4の転写を調節する部位がどの領域にあるかを検討した。その結果、αE2-5全体を組み込むことによりレポーター遺伝子の発現は5倍に増加することが観察され、αE2-5にはプロモーター活性をもつ領域が含まれていることが明らかとなった。しかしながら、T3存在下ではこの発現はむしろ抑制されたため、U-251MGにおけるT3のZAKI-4発現調節作用をノーザンブロットにより解析したところ、皮膚線維芽細胞とは異なり、T3はZAKI-4遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった。そこでT3依存性のZAKI-4遺伝子発現抑制を担う領域がどこに局在するかを検討した結果、転写開始点より3 ́側に存在することが示された。現在、ゲルシフト法によりこの領域に結合する蛋白の存在とその蛋白の発現がT3により調節を受けているか否かを検討中である。ZAKI-4は、ヒト皮膚線維芽細胞における甲状腺ホルモン(T3)応答性遺伝子として同定された遺伝子で、T_3添加によりZAKI-

4遺伝子の転写は著しく促進される。このT_3による転写の促進は蛋白合成阻害剤であるシクロへキシミドで完全に阻害されることから、T_3はZAKI-4遺伝子の転写を促進する蛋白を誘導することにより作用を発揮するというこれまでに知られていないT_3作用機構が存在することが示唆された。本研究は、ZAKI-4遺伝子の調節領域を用いることによりT_3により誘導され、ZAKI-4遺伝子の転写を調節する因子を伺定することを目的に計画された。平成9年度の研究では、ZAKI-4の調節領域を含むゲノムDNAのクローニングを行い、ZAKI-4遺伝子の転写開始点を決定すると共に、転写開始点より上流約2.6kbにプロモーター活性が存在することを明らかにした。平成10年度においては、調節領域をさらに詳細に解析し、プロモーター活性とT_3による転写調節を担う領域が-28-4bpであることを特定した。次に、この25bpのDNA断片(TFZ-1)をプローブとしてゲルシフト解析を行うと、ZAKI-4が発現し、T_3による発現調節が認められたヒトグリオーマ細胞株(U-251MG)の核抽出物中にTFZ-1に結合する蛋白が存在することが確かめられた。この蛋白はサウスウエスタン解析により分子量約45,000であり、T_3によってその発現が増加することが示された。したがって、このTMZ45と命名した蛋白は、我々が同定しようと考えているT_3作用を媒介する蛋白である可能性が高いと考えられたので、現在、酵母を用いたワンハイブリッドシステムにより、この蛋白をコードする遺伝子のcDNAのクローニングを試みている。
強磁場を伴う軸対称回転星の平衡状態とその安定性解析を行うための数値計算法の開発

強磁場を伴う回転星の構造を求める定式化を行い、それに従った数値計算コードを作成し、多様な平衡状態を求めることに成功した。また、求められた平衡状態の安定性を調べるための定式化も行った。安定性に関しては、その定式化に基づく数値計算コードを開発中である。軸対称定常状態の磁場入り回転星の平衡状態に関しては、1950年代から研究がなされてきたが、強い磁場の影響を非摂動的に取り入れた解は、ポロイダル磁場のみのある場合にしか求めらていなかった。しかし、ポロイダル磁場のみでは不安定であり、ポロイダルとトロイダル磁場が同程度に寄与する平衡状態を求めることが必要であった。ポロイダルとトロイダル磁場の共存する磁気回転星の構造を求める数値計算コードの開発には、軸対称定常状態と両立する電流密度の形を見出すことが重要である。本研究では、軸対称定常状態での電流密度jが、磁場、渦度、質量密度、速度のφ成分を、H、ω、ρ、vとし、ベクトルポテンシャルのφ成分の任意関数をκ、φ、μ、Ωとしたときj=(κ+φ'v)H+φω+ρ(μ+Ω'v)e_φと表わされることを見出すことに成功した。ここでe_φはφ方向の単位ベクトルである。この表式を用いることで、ポロイダルとトロイダル磁場が同程度に寄与する状況で、(1)一様回転する強磁場星の平衡状態、(2)非一様回転する強磁場星の平衡状態、(3)子午面環流のある強磁場星の平衡状態、を求めることに成功した。それらの様々な平衡状態から分かる重要な結論は、「無限遠に伸びたダイポール的磁場とトロイドに巻きついたねじれたトロイダル磁場からなる構造」が一般的に現れることである。これは、Braithwaiteらがdynamicalな計算によって求めたtwisted torus structureに一致しているもので、これ軸対称定常状態での一般的な磁場構造であることを強く示唆している。強磁場を伴う回転星の平衡状態を求めるための定式化を行い、それに基づき数値計算法を開発し、これまでに求められたことのない平衡状態も計算できるようになった。強磁場の存在は恒星の形状を球から大きく変形する。特に、ポロイダル磁場のみならずトロイダル磁場も存在する場合に、球形から変形した恒星の構造を求める手法はこれまでに存在していなかった。それは、定式化の段階で支配方程式と境界条件を考えた場合に、変形した恒星の表面における電流に対する制限を課すことができないと考えられてきたからであった。そのため、従来の定式化では変形した表面で磁場がゼロになるという条件をつけるか、磁場が弱いとした摂動計算しかなされていなかった。今年度の研究では、バロトロープの仮定をした場合の電流jがHを磁場、ρを密度、Rを回転軸からの距離、eをR方向の単位ベクトル、fとgを任意関数、uは磁場のベクトルポテンシャルのφ成分にRをかけたものとするとj=f(u)H+g(u)ρReとなることを使用し、ここに現れる任意関数f(u)としてf(u)=a(u-u0)ととることで、磁場が無限遠でゼロとなり、しかも変形した恒星の表面では電流が流れないという条件を満たさせることができるようになった。これにより、自然な境界条件を満たしながら、表面に垂直な電流も存在することのない、球から大きくずれた形状の平衡状態も計算できるようになった。

現在は磁場入りの白色矮星の構造、回転が非一様になった場合の磁場入り回転ポリトロープの計算を行い、予備的な結果を得ている。本年度は非一様回転している磁気回転星の定式化を行い、その定式化にしたがって数値計算コードを開発し、その数値計算コードを利用して、非一様回転する磁気星の平衡状態を求めた。非一様回転磁気星の平衡状態の定式化については、Lovelaceら(1986)が基礎方程式を積分することで一つの手法を提示していたが、平衡状態を求めるためには利用しやすいものではなかった。それに対して、本研究では状態方程式がバロトロープの場合、運動方程式が積分できる条件を見出すとともに恒星内部での第一積分を求めることに成功した。Lovelaceらの積分はある曲面上で一定になるというBernoulliの定理の一般化であるので、流束関数に沿って一定であり、恒星全体で一定になるものではない。それに対し、今回見出された第一積分は恒星全体で一定になるというもので、平衡状態を求めるためには極めて容易に扱うことのできる定式化となっている。この新たな定式化を利用して数値計算コードを開発した。非一様回転の回転則は流束関数の任意関数で与えられるので、流束関数への依存性が大きく異なる2つの関数を選び、平衡状態の系列を求めた。その結果、磁場の分布はポロイダル磁場とトロイダル磁場が同程度の大きさで存在し、トロイダル磁場の幾何学的な形状が回転軸の周りのトーラス状であることが見出された。この磁場の形状は、Braithwaite and Spruit (2004)がdynamicalな計算により導いた準平衡状態での磁場構造に極めてよく一致している。このことは、トーラス状のトロイダル磁場とポロイダル磁場の構造がかなり一般的であり、また安定に存在する可能性を示唆したものである。一方、磁気回転星の線形安定性解析の定式化も行った。基礎方程式を線形化し、摂動量をsin(kθ)で展開するという回転星の定式化に倣ったものである。現在この定式化に沿った数値計算コードを開発中である。
脳神経賦活マンガン造影法による機能モジュール再生過程の画像化および評価法の開発

本研究の目的は「脳神経賦活マンガン造影法(AIM MRI)」、「マンガン造影経路トレース法(MnTT)」および「機能的磁気共鳴画像法(fMRI)」を使用して、大脳皮質、海馬および脊髄における神経障害の再生過程を機能的かつ形態的に評価できる新しい画像的評価方法を開発することにある。本年度は「神経再生モデル撮像のための脊髄撮像法および評価法の確立」および「神経障害・再生過程の追跡・評価のためのMnTT法およびマンガン増感磁気共鳴画像法の確立」を行った。前者に関しては、1)マウスによる再生モデル撮像のための、高分解能脊髄撮像システムの作成、2)感度を向上させるための増感技術、3)正常組織のみを増強する造影剤の検討を行った。その結果、ボリュームコイル送信、アレイコイル受信を使用することで、再生モデルが豊富なマウスの脊髄において、良好な分解能を達成した。また、マンガン増感画像法を使用することで、T1強調画像法において大きく感度を向上させる事に加えて、カルシウムイオンチャネルの活動が正常な、「健常神経組織」にのみ取り込みが行われ、信号増強が生じることが判明した。後者に関しては、1)安定したラット一過性脳虚血モデルの作成を達成し、虚血後の脳障害モデルにおいて、その再生過程の反応であり、同時に再生を阻害する2)グリオーシスのin vivoでの可視化を初めて達成し、国際学会にて報告した。また、米国国立衛生研究所のAlan KoretskyおよびAfonso Silva両博士の協力を得て、磁場強度11.7Tの高分解能MRIを用いた予備実験を行い、3)末梢神経のin vivo経路トレースに関して、良好な成果を得た。加えて、より侵襲性を減らすために、京都大学再生医学研究所の田畑泰彦教授の協力で、4)マンガン造影剤の除法化による持続的なエンドサイトーシスに関する実験を行い、良好な成果が得られた。本研究は、生体内において分子特異的なeventを画像化する分子イメージングの達成に向けた有力な候補であり、再生医療の成果や問題点を生体内で観察・評価しうる基盤技術になると考えられる。本年度は「各種神経障害モデルの確立と評価」および「マンガン細胞標識法の評価」を行った。前者に関しては、1)大脳皮質における脳虚血モデル(Longa法および酸化チタン球による手法)、2)海馬領域における一過性心停止モデル、一過性の総頸動脈・椎骨閉塞モデル、3)脊髄における挫傷モデル、切断モデルの技術を確立、独自の改良と安定化技術を考案した。加えて、a)脳神経賦活マンガン造影法、b)マンガン造影経路トレース法、およびc)機能的磁気共鳴画像法の3種類の測定・実験手法について、撮像用のRFコイルの製作と4.7T(テスラ)動物用MRIにおけるシーケンス最適化を行った。また、米国国立衛生研究所のAlan KoretskyおよびAfonso Silva両博士の協力を得て、磁場強度11.7Tの高分解能MRIを用いた予備実験を行い、一定の成果を得た。後者に関しては、MRI装置室に近い位置に細胞培養環境を整備し、1)異なる細胞種における標識時間や造影剤濃度の最適化、2)標識後の時間経過にともなう細胞活性の調査、3)標識後の時間経過にともなう造影効果の調査、4)1細胞あたりの造影効果および測定限界の評価、を行った。加えて、腫瘍細胞のin vivo標識法に関して、酸化鉄およびマンガンイオンの両面から、標識手法を含めて、その有用性と問題点を検討した。

加えて、より侵襲性を減らすために、京都大学再生医学研究所の田畑泰彦教授の協力で、4)マンガン造影剤の除法化による持続的なエンドサイトーシスに関する実験を行い、良好な成果が得られた。本研究は、生体内において分子特異的なeventを画像化する分子イメージングの達成に向けた有力な候補であり、再生医療の成果や問題点を生体内で観察・評価しうる基盤技術になると考えられる。
磁場侵入長測定でみる磁性と超伝導の共存・競合

強磁性超伝導体UCoGeについて、「どのように強磁性の内部磁場と超伝導のマイスナー効果を両立させているのか」を明らかにするため超伝導状態における低温磁化測定によりマイスナー状態や渦糸状態でどのように強磁性が観測されるのか調べた。今回、小型化した高周波発振器を組み込んだ共振回路を用いてインダクタンスを精密測定することにより交流磁化率・磁場侵入長測定を行う装置を作成することに成功した。それに加え極低温のDC磁化測定・比熱測定を行うことにより、UCoGeは超伝導転移温度Tsc以下以下で強磁性と超伝導の両方が存在していることが実験的に明らかになった。磁性と超伝導が共存・競合している磁性超伝導体では超伝導起源と結びついた新しいタイプの超伝導や磁性と深く関係した特有の新しい超伝導現象の発現が期待される。本研究課題の目的は、磁性超伝導体における「磁性と超伝導の共存・競合」の問題の中でも、「どのような形で磁性と超伝導が共存・競合しているか?」という問題に対し、磁性超伝導体の極低温における磁気測定(磁場侵入長測定)とバルクの熟測定(熱膨張測定)の実験手段・装置開発と圧力下への拡張により物理現象・状態の解明を目指すことである。小型化した高周波発振器を組み込んだ共振回路を用いて試料を入れたコイルのインダクタンスを精密測定することにより磁場侵入長測定を行う装置を作成する。希釈冷凍機温度下で安定に稼動する発振機を開発する。相補的なバルクの熱測定として熱膨張・磁歪測定を圧力下で希釈冷凍機温度まで測定することに成功した。その結果、磁性超伝導体UGe2のバルクな性質からみた「磁性と超伝導の共存・競合」について研究を現在進めている。磁性超伝導体UCoGeが新たに発見され、現在当研究室で精力的に研究している。磁性超伝導体UGe2、UCoGeの「磁性と超伝導の共存・競合」についての研究を継続予定である。本研究課題の目的は、磁性超伝導体における「磁性と超伝導の共存・競合」の問題の中でも、「どのような形で磁性と超伝導が共存・競合しているか?」という問題に対し、磁性超伝導体の極低温における磁気測定とバルクの熱測定の実験手段・装置開発と圧力下への拡張により物理現象・状態の解明を目指すことである。UCoGeはT_c3Kで強磁性に転移しT_<sc>0.8Kで超伝導に転移する強磁性超伝導体である。それに加え極低温のDC磁化測定・比熱測定を行うことにより以下の結果を得た。2.交流磁化率測定によりマイスナー効果によるシールディングを観測しH_<c2>を決定した。3. T_<sc>以下でDC磁化測定では強磁性が相対的に強く観測され、一方、交流磁化率測定では超伝導が強く観測され相補的な実験ができた。これらの実験からUCoGeはT_<sc>以下で強磁性と超伝導の両方が存在することが実験的に明らかになった。今後、UCoGeの強磁性と超伝導の住み分けや異方性に注目して極低温・圧力下の研究を進める。
異種流体混合現象の分子シミュレーションとその可視化に関する研究

1.異なった2つの液体を隔てる「2次元界面」を表面張力の持つ性質に基づいてモデル化した.更に,界面の変形時にその面積が変化する性質と,変形の途中で自分自身とは交わらないという性質を持つモデルも研究の対象とした.2.MC法で,これらのモデルに相転移があるかどうかを数値実験的に確かめるため,その計算プログラムをFORTRANで作成した.相転移の存在を確かめるため,比熱等の計算の数値実験を実行した.主な結果は次のとうりである.(a)表面張力の性質のみ持つモデルでは,比熱にピークがあること,そのピークは分子数の増加と共に大きくなることが,ある程度の分子数までは確からしいことが判った.このことから2次の相転移が起こっていると予測した.(b)分子数の変化するモデルと自己回避性を持つモデルにも,比熱のピークが見られ相転移が起こっていると予測できた.3.界面の学力変数である「3角形分割」を固定したモデルについてMC法で研究した.界面は自分自身と交わらないという自己回避性の性質を持たないものとした.4.特に,(1)計算結果が3角形分割に依存しないかどうか,(2)このモデルの相転移は,力学変数が「分子の位置」と「3角形分割」の2種類である2のモデルと同じかどうか,という2つの観点から研究を進めた.その主な結果は次のとうりである.(a)界面の3角形分割としては,各分子から出ているボンドの数が界面全体でほぼ一様であるようなもの,を対象とした.(b).(a)のような条件で作られた多数の3角形分割格子を用いて,比熱等を計算し,その結果から,2次の相転移を持つことが判った.更に,測定値は(a)の条件の3角形分割には依存しないことが予想できた.(c)臨界点と臨界指数の値を2のモデルのものと比べると,臨界点は明らかに異なっていること,臨界指数も異なっていそうなこと,が予想できた.1.異なった2つの液体を隔てる「2次元界面」をモデル化した。それは表面張力の持つ性質,即ち,界面の面積を出来るだけ小さくしようとする性質と,面積が同じならば界面を出来るだけ滑らかにするという性質を持つ。更に,界面の変形時にその面積が変化する性質と,変形の途中で自分自身とは交わらないという性質を持つモデルも研究の対象とした。2.モンテカルロシミュレーションの方法で,これらのモデルに相転移があるかどうかを数値実験的に確かめるため,その計算プログラムをFORTRANで作成した。更に,計算プログラムの特性を把握するための予備的な数値実験を完了した。比熱の計算によって相転移の存在が判るが,この比熱の計算もある程度の数値実験の規模で実行した。3.現在までに行ったことと,得られた結果を論文としてまとめて,平成7年2月末に機械学会論文集に投稿した。その主な内容は次のとうりである。(1)表面張力の性質のみ持つモデルでは,比熱にピークがあること,そのピークは分子数の増加と共に大きくなることが,ある程度の分子数までは確からしいことが判った。このことから2次の相転移が起こっていると予測した。分子数が更に大きくなっても同じことが起こっているかどうかについては今後の課題とした。(2)面積の変化が分子数の変化によって引き起こされるとするモデルにも,比熱と分子数のゆらぎにピークが見られ相転移が起こっていると予測できた。自分自身とは交わらないという自己回避性を持つモデルにも,比熱のピークが見られ相転移が起こっていると予測できた。(3)また,自己回避性を持つモデルのシミュレーションはそれを持たないモデルに比べて極端に多くの計算時間を要し,現在の計算機能力では十分な数値実験を行うのは困難であることも判った。4.以上本年度に得られた結果から,当面の大きな目標を自己回避性を持たないモデルの相転移現象を定量的に捉えることとした。1.異なった2つの液体を隔てる「2次元界面」を表面張力の持つ性質に基づいてモデル化した.更に,界面の変形時にその面積が変化する性質と,変形の途中で自分自身とは交わらないという性質を持つモデルも研究の対象とした.2.MC法で,これらのモデルに相転移があるかどうかを数値実験的に確かめるため,その計算プログラムをFORTRANで作成した.相転移の存在を確かめるため,比熱等の計算の数値実験を実行した.主な結果は次のとうりである.(a)表面張力の性質のみ持つモデルでは,比熱にピークがあること,そのピークは分子数の増加と共に大きくなることが,ある程度の分子数までは確からしいことが判った.このことから2次の相転移が起こっていると予測した.(b)分子数の変化するモデルと自己回避性を持つモデルにも,比熱のピークが見られ相転移が起こっていると予測できた.3.界面の学力変数である「3角形分割」を固定したモデルについてMC法で研究した.界面は自分自身と交わらないという自己回避性の性質を持たないものとした.4.特に,(1)計算結果が3角形分割に依存しないかどうか,(2)このモデルの相転移は,力学変数が「分子の位置」と「3角形分割」の2種類である2のモデルと同じかどうか,という2つの観点から研究を進めた.その主な結果は次のとうりである.(a)界面の3角形分割としては,各分子から出ているボンドの数が界面全体でほぼ一様であるようなもの,を対象とした.

(b).(a)のような条件で作られた多数の3角形分割格子を用いて,比熱等を計算し,その結果から,2次の相転移を持つことが判った.更に,測定値は(a)の条件の3角形分割には依存しないことが予想できた.(c)臨界点と臨界指数の値を2のモデルのものと比べると,臨界点は明らかに異なっていること,臨界指数も異なっていそうなこと,が予想できた.1.異なった2つの液体を隔てる液体界面のモデルをMC法によって数値的に研究した.そのモデル(:モデルAと呼ぶ)は,系の力学変数が界面分子の「位置」のみであるようなもので,もう一つの力学変数である界面の「3角形分割」は変化させないで1つに固定したものである.また,界面は自分自身と交わらないという自己回避性の性質を持たないものとした.2.特に,(1)計算結果が3角形分割に依存しないかどうか,(2)このモデルの相転移は昨年度研究した,力学変数が「分子の位置」と「3角形分割」の2種類であるモデル(:モデルBと呼ぶ)と同じかどうか,という2つの観点から研究を進めた.(1)は数値実験の再現性という点で,モデルが持たなければならない性質の1つである(2)は「3角形分割」という物理量が,界面の相転移という現象に絡んで,重要な役割を担うかどうかということである.3.現在までに行ったことと,得られた結果を論文としてまとめて,平成8年2月末に機械学会論文集に投稿した.その主な内容は次のとおりである.(1).界面の3角形分割としては,モデルBに於いて低温で実現されると期待される,各分子から出ているボンドの数が界面全体でほぼ一様であるようなもの,を対象とした.(2).(1)のような条件で作られた多数の3角形分割格子を用いて,比熱等を計算し,その結果から,モデルAは2次の相転移を持つことが判った.更に,臨界点の値,比熱のピーク値と分子数の関係から定まる臨界指数等は,(1)の条件の3角形分割には依存しないことが予想できた.(3).モデルAとモデルBで臨界点と臨界指数の値を比べると,臨界点は明らかに異なっていること,臨界指数も異なっていそうなこと,が予想できた.4.今後の研究としては,モデル界面の相転移と3角形分割の関係を更に詳しく調べると,MC法以外の数値的方法例えば分子動力学やLangevinシミュレーションの方法を利用すること,界面の連続的モデルの離散化法としてモデルA,Bとは異なった方法を用いて作られる離散的モデルの相転移現象を調べること等,研究すべき多くのことが残されている.
筋の収縮様式を考慮したスポーツ動作の動力学的分析

高速・高加速なスポーツ動作における筋の収縮様式を考慮した機能を定量化した結果,踵接地タイプのランナーの定速走動作では,筋張力の動作に対する変換率の大きさは筋毎に一様ではなく,水平前後方向成分よりも鉛直方向成分の方が大きいこと,特に鉛直方向成分においては,短縮性収縮時に比べて伸張性収縮時において変化率が大きいという特徴が示された.テニスサーブにおけるラケットスピード獲得メカニズムについては,上半身筋群において,表層筋と同様に,深層筋群もラケットスピード獲得に寄与していることがわかった.今年度は,まず,初年度からの対象である走動作支持期における下肢筋張力の動作への貢献について,シューズのソール条件が与える影響について検討した.すなわち,ソール厚の前後差が,走動作における支持脚筋群の動力学的な機能に及ぼす影響について明らかにするために,ソール厚の前後差が異なるシューズ着用時における走動作を対象として,筋骨格モデルを用いて推定した各筋群の筋張力を推定し,初年度に考案した筋張力の動作変換率および張力発揮負担度を指標として,各筋群の収縮様式別の値を算出することにより,各シューズの走動作支持期における支持脚各筋の役割の違いについて検討を行った.その結果,ソール厚の前後差が異なると,広筋群,腓腹筋,ヒラメ筋,および背屈筋群において,身体重心の速度変化に対する筋張力の貢献に差異がみられることが明らかとなった.つぎに,筋の収縮様式別の機能を定量化する手法を,スウィング動作の分析への拡張を試みた.具体的には,テニスサーブのスウィング動作における対象部位のスピード獲得の要因となる関節トルクを,その関節軸を跨ぐ筋の張力による筋トルクへと分配し,さらに各筋の筋腱複合体の長さ変化から筋の収縮様式を判別することによって,筋の収縮様式を考慮した筋トルクについての動力学的貢献式の定式化を行い,その定量化を試みた.その結果,三角筋鎖骨部と上腕三頭筋長頭について,収縮様式別にラケットスピードへの貢献を推定できた.高速・高加速なスポーツ動作における筋の収縮様式を考慮した機能を定量化した結果,踵接地タイプのランナーの定速走動作では,筋張力の動作に対する変換率の大きさは筋毎に一様ではなく,水平前後方向成分よりも鉛直方向成分の方が大きいこと,特に鉛直方向成分においては,短縮性収縮時に比べて伸張性収縮時において変化率が大きいという特徴が示された.テニスサーブにおけるラケットスピード獲得メカニズムについては,上半身筋群において,表層筋と同様に,深層筋群もラケットスピード獲得に寄与していることがわかった.今年度は,走動作支持期における下肢筋張力の動作への変換の様相について定量化する手法,ならびに各筋群の張力発揮負担度を定量化する指標を提案した.そして,これらの手法を用いて,踵接地タイプのランナーの定速走動作における支持脚筋群を対象とした分析を行った結果,1)各筋群の張力発揮能は,短縮性収縮局面に比べて伸張性収縮局面の方が大きいのに対して,張力発揮能に対する発揮張力量の比である発揮負担度は伸張性収縮局面の方が小さいこと,2)動力学的変換率は,筋群によらず,水平方向に比べて鉛直方向の方が大きいこと,3)身体重心の速度変化に対する貢献が大きな大腿四頭筋,下腿三頭筋,ならびに足関節背屈筋群では,伸張性収縮による筋張力が,特に効果的に鉛直上方への身体慣性力に変換されることなどが明らかとなった.さらに,張力発揮能と動力学的変換率からみた各筋群別の特徴として,1)殿筋群については,筋張力の発揮負担度は大きいが,身体重心の並進運動において動力学的変換率が非常に小さいことから,張力発揮能に対する余裕が少なく,発揮された筋張力も身体の制動および支持に対しては効果的に変換されない筋群であること,2)大腿四頭筋(広筋群,大腿直筋)についいては,両筋群の張力発揮負担度には差異がみられないが,大腿直筋よりも広筋群の方が伸張性収縮時の筋張力が身体支持に対してより効果的に変換されること,3)下腿三頭筋(ヒラメ筋,腓腹筋)については,水平方向は腓腹筋,鉛直方向はヒラメ筋の動力学的変換率が大きいことから,腓腹筋は張力が推進に対して効果的に変換され,ヒラメ筋は張力が身体支持に対して効果的に変換される特徴を有する.また,腓腹筋に比べて,ヒラメ筋は張力発揮負担度が小さく,張力発揮能における伸張性収縮時と短縮性収縮時との差異が他の筋群に比べて大きな筋であること,などが明らかとなった.まず,高速スウィング動作であるテニスサーブのフォワードスウィングにおける上肢関節トルクの役割を明らかにするために,昨年度に引き続き,上半身を10セグメントに分割し,ラケットを加えた計11セグメントの多セグメント系に対する運動依存項の生成要因までも考慮した動力学的分析により,ラケットヘッドのスピード獲得に大きく貢献する伸張性の肩内旋トルクの生成要因の定量化を行った.具体的には,伸張性のトルク発揮時には,その軸において負のトルクパワーとなっていることから,肩関節の外旋角速度に対する上半身各関節トルクの貢献を,ラケットー上半身系の運動方程式を利用して導出した動力学的貢献式によって定量化した.

この分析結果により,インパクト時におけるラケットスピードの生成に大きく貢献する,肩関節最大外旋位時点までの肩関節内旋トルクの伸張性成分は,主に肩関節水平内転トルクの短縮性成分によって引き起こされていることを明らかにした.つぎに,筋骨格モデリングソフトウェアSIMMを用いて,ラケットスピードの獲得に大きく貢献する肩関節内外旋トルクの生成に寄与する筋張力の発揮様式を考慮した動力学的分析を行った.その際,SIMM内において逆動力学計算を行って算出した各関節トルクを用いて,肩関節内旋トルクの生成に関与する筋張力の役割について定量化した結果,三角筋や大胸筋のようなアウターマッスルと同様に,肩甲下筋や棘下筋のようなインナーマッスルもラケットスピード獲得に寄与していることがわかった.スポーツバイオメカニクステニスサーブのスウィング動作における肩まわりおよび上肢の各筋張力の推定に手間取っている.定速走動作を対象として,全身の運動方程式,および筋腱複合体特性式を連立することにより,身体の推進および支持に対する支持脚筋群の貢献を,筋張力の発揮様式別に定量化することを実現した.その際,下肢筋張力の動作への変換の様相について定量化するとともに各筋群の張力発揮負担度を定量化する指標を提案することにより,各筋群の動的な特徴を明らかにしている.肩まわりおよび上肢における関節トルクの筋への分配を安定に推定できるようにして,スウィング動作の分析を進めて行く.運動依存項の発生要因を考慮した筋の動力学的貢献の定量化を行う.まず,スウィング動作における上肢筋張力の推定について,上肢各筋のモデル化を行った後に,これまでの研究にて取得しているテニスサーブおよび野球打撃動作のデータから,筋骨格モデリングソフトウェアによって上肢各筋の筋張力を推定する.その際,筋張力については,その収縮様式別に分類する.つぎに,運動依存項の発生要因となる上肢筋張力の貢献の算出について,申請者が既に提案している運動依存項の発生要因を考慮した関節トルクの貢献の算出式を筋張力の貢献の算出式へと拡張することによって,運動依存項を考慮した上肢筋張力の貢献を算出可能とする.スウィング動作における運動依存項の発生要因を考慮した筋の動力学的貢献の定量化を行う.その際,筋張力の推定のために,初年度と同様に筋骨格モデリングソフトウェアを使用するため,そのライセンス使用料を主な支出項目とする.
焼き入れによる古代凸面鏡製作の研究

古代東アジアの銅鏡の鏡面はその大部分が凸である。鏡面が凸である理由は、従来諸説はあっても、その多くは仮説に過ぎず、また立証もされてこなかった。今回の研究では、凸面鏡の形成理由を銅鏡の製作技術の一つである熱処理(焼き入れ)と関連付けて考えた。つまり、銅鏡の製作技術に熱処理が用いられているという指摘は、近年になってなされたが、この作業仮説を模造鏡を用いた熱処理実験により検討し、実際の銅鏡と同様のきれいな凸面鏡を復元製作する。熱処理実験で得た模造鏡資料と実際の銅鏡資料を破壊分析し、工学的調査を行って銅鏡と熱処理との関係の理論的裏付け、出土鏡の曲率調査なども目的とした。曲率調査については、主に中国山東省の出土鏡を500面ほど記録しており、実際の古鏡の面反りとどのように形態が異なるか比較する資料を揃えている。今年度まで4回の熱処理実験をおこなった。これまでの実験では、塩水の冷却水、均一な加熱を可能にする大型の加熱炉によりほぼ実物と差のない面反りを作りあげることができたが、若干の不陸が認められた。模造鏡と古鏡の金相断面の比較研究についても進展しており、熱処理が施された金相断面か、熱処理が施されていない金相断面か判断できるまでになっている。これ以外に熱処理と鏡面の銀白色膜層について予備実験を開始した。古鏡の鏡面は江戸時代の柄鏡のように、錫引きによる処理を行っている形跡がなく、高錫青銅の鏡胎を利用して熱処理技術を応用し白色に近い映像を作り出している可能性が想定された。今後はこの銀白色膜と熱処理の関係を重点的に追求したいと考えている。この研究は、古代銅鏡の鏡面が凸面である理由を探るものである。これには二つの大きな意見があって、一つには鋳型の段階から鋳造後凸面形状になるよう計画されているという通常の説と鋳型段階では平面鏡で製作されながら、経年変化や銅鏡自体が持つ応力と研磨によりその後凸面に変形するという説がある。これまでの予備的実験で、銅鏡の凸面形成理由は製作技術の一つである熱処理技術に密接な関係が有ることを予想している。つまり、鋳造段階では平面鏡であったものが、高錫青銅に強度、色調の変化をもたらす熱処理技術を行うことによって、平面鏡が凸面鏡に変化するものと考えている。平成12年度には次年度の熱処理実験に向けて模造鏡の作成をおこなった。模造鏡の形状については、今までの実験成果からより実物に近い形態に変更している。模造鏡はもちろん平面である。これを国立高岡短期大学の鋳造室で30面ほど鋳造した。次年度はこれを熱処理実験する予定である。この他、実際の銅鏡の断面観察、あるいは工学的分析を通して熱処理技術の構造を解明するため準備を進めている。このほか、出土鏡を観察し、特に鏡の面反りを計測することによって来年度の熱処理実験鏡の面反りと比較する計測値も収集中である。これに加えて報告書等からの面反りの形状と計測値も網羅的に収集している。平成13年度は主に熱処理実験とその結果が実際の銅鏡と一致するかに主眼を置く予定である。平成14年度は補足的な実験と研究成果のとりまとめを行いたい。今年度は2回の熱処理実験をおこなった。1回目の実験では、塩水の冷却水、均一な加熱を可能にする大型の加熱炉によりほぼ実物と差のない面反りを作りあげることができた。ところが2回目の加熱炉は模造鏡の面数が少なかったことから、各種の温度設定ができず面反り製作には失敗した。失敗した原因としては温度の問題が大きく、金属の状態がもっとも安定しないぎりぎりの低い温度(約600°C)で行っているためである。14年度についてはさらに低い温度、高い温度と各種のサンプルで行い、実物の古鏡と変わらない面反りを製作できるものと判断している。曲率調査についても主に中国山東省の出土鏡を500面ほど記録しており、実際の古鏡の面反りとどのように形態が異なるか比較する資料を揃えている。

つまり、銅鏡の製作技術に熱処理が用いられているという指摘は、近年になってなされたが、この作業仮説を模造鏡を用いた熱処理実験により検討し、実際の銅鏡と同様のきれいな凸面鏡を復元製作する。熱処理実験で得た模造鏡資料と実際の銅鏡資料を破壊分析し、工学的調査を行って銅鏡と熱処理との関係の理論的裏付け、出土鏡の曲率調査なども目的とした。曲率調査については、主に中国山東省の出土鏡を500面ほど記録しており、実際の古鏡の面反りとどのように形態が異なるか比較する資料を揃えている。今年度まで4回の熱処理実験をおこなった。これまでの実験では、塩水の冷却水、均一な加熱を可能にする大型の加熱炉によりほぼ実物と差のない面反りを作りあげることができたが、若干の不陸が認められた。模造鏡と古鏡の金相断面の比較研究についても進展しており、熱処理が施された金相断面か、熱処理が施されていない金相断面か判断できるまでになっている。これ以外に熱処理と鏡面の銀白色膜層について予備実験を開始した。古鏡の鏡面は江戸時代の柄鏡のように、錫引きによる処理を行っている形跡がなく、高錫青銅の鏡胎を利用して熱処理技術を応用し白色に近い映像を作り出している可能性が想定された。今後はこの銀白色膜と熱処理の関係を重点的に追求したいと考えている。
腎細胞癌におけるガレクチン-3の役割

ガレクチン-3はβ-ガラクトシドに親和性を持つ糖認識ドメインを1つ以上有するガレクチンファミリーの1つであり、癌細胞に血管新生を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスを制御することが報告されている。我々は癌の浸潤・転移に重要なキータンパクのひとつであり、癌細胞に血管新生を誘導し、かつT細胞にアポトーシスを誘導するガレクチン-3蛋白質が腎細胞癌細胞株に強発現していることに注目し、その発現の臨床的意義、予後を規定するバイオマーカーとしての可能性を検討した。また血管新生および癌免疫に重要なT細胞、またNK細胞に関連した細胞障害活性におよぼす影響も検討した。ヒト腎癌細胞株と、腎細胞癌組織および正常腎実質から、total RNAを抽出し、ガレクチン-3の発現をWestern blottingおよびreal-time PCR法で検討した結果、5種類のヒト腎癌細胞株すべてでガレクチン-3の発現を認め、ヒト腎細胞癌組織では、正常実質部分と比較して有意にガレクチン-3の発現が高かった。転移を有する症例では、癌組織のガレクチン-3の発現量と正常腎実質でのガレクチン-3の発現量の比が有意に高く(p=0.035)、転移の予測因子になることが示唆された。また腎細胞癌組織からCD8陽性T細胞を抽出し、ガレクチン-3のアポトーシス誘導効果をフローサイトメーターで検討した。ガレクチン-3は腎細胞癌組織から抽出されたCD8陽性T細胞に結合し、有意にアポトーシスを誘導する(p=0.039)ことから、腎細胞癌の免疫機能からのエスケープに関与していることが示唆された。ガレクチン-3の腎細胞癌、およびその転移巣における血管新生、アポトーシスへの役割を明らかにすることは、これらの癌がさまざまな治療に抵抗性である機序の解明につながる可能性があり、今後さらに新たな遺伝子治療に発展することも期待できると考えている。われわれは癌の浸潤・転移に重要なキータンパクの1つであり、癌細胞に血管新生を誘導し、かつT細胞にアポトーシスを誘導するガレクチン-3蛋白質が腎細胞癌細胞株に強発現していることに注目し、腎細胞癌におけるガレクチン-3発現と、血管新生および癌免疫に重要なT細胞、NK細胞を中心とした細胞障害活性に及ぼす影響を検討した。われわれはreal-time PCRを利用してガレクチン-3の発現を定量的に測定し、42例の淡明型腎細胞癌では正常腎実質と比較して約10.6倍のガレクチン-3の高発現を認めることを見出した。2)リコンビナントガレクチン-3蛋白質の作成とアポトーシスの評価われわれはGST-fusionsystemを利用し、リコンビナントガレクチン-3蛋白質を大量に精製した。さらに、血球凝集反応から、それらの蛋白質が活性を有することを確認した。3)腎細胞癌組織からのCTL単離および腫瘍免疫の解析腎細胞癌では、時として臨床的にリンパ球の浸潤を認める。われわれは、ヒト腎細胞癌組織から直接CD8陽性のCTLを単離しガレクチン-3のアポトーシス誘導効果をフローサイトメーターで検討した。その結果、1μMのガレクチン-3が56%の細胞にアポトーシスを誘導し、サイトクロムc放出およびカスパーゼ-3の活性を上げることを見出した。ガレクチン-3の腎細胞癌におけるアポトーシスへの役割を明らかにすることは、腎細胞癌がさまざまな治療に抵抗性である機序の解明につながる可能性があり、ガレクチン-3をターゲットにした遺伝子治療への応用を最終目標にする予定である。

ガレクチン-3は細胞の分化、接着、増殖、血管新生、アポトーシスの制御に深く関わっている癌の浸潤・転移に重要なキータンパクの1つである。今年度はわれわれが既に確立しているマウスの泌尿器科癌の転移モデルを用いることにより、ガレクチンの腫瘍制御機構を検討した。さらに転移巣に対する抗癌剤による化学療法、各種免疫療法への影響なども合わせて検討した。1)ガレクチン-3によるサイトカイン発現への影響の検討近年、ガレクチン-3がホストの免疫調節に関与することが示唆されている。ガレクチン-3刺激による細胞内サイトカイン発現、特にプロアポトーティックサイトカインであるTRAIL発現の変化、および各種抗癌剤による化学療法のTRAIL誘導性アポトーシスへの影響について検討し、低容量CDDPによる化学療法にて有意にアポトーシスが誘導される可能性が示唆された。2)マウス腎癌モデルおよび腎癌転移モデルによる抗腫瘍効果の検討BALB/cマウス由来の腎癌細胞であるRenca cellを用いて、ガレクチン-3の発現したRenca cellとsiRNAでガレクチン-3をノックアウトしたRenca cellをBALB/cマウスに移植してマウス腎癌モデルを作成し、血管新生効果および抗腫瘍効果について検討した。血管新生に関してはヒト由来の腎細胞癌細胞株をヌードマウスに移植、組織学的に詳細に検討した。またマウス腎癌転移モデルを使用し、ガレクチン-3の転移巣における血管新生効果および抗腫瘍効果の組織学的検討を行った。なお組織学的検討および解析の一部は現在も進行中であり、最終的なこれらの結果の詳細については、可及的早期に学術雑誌へのsubmissionを予定している。
カンジダの新規ストレス応答蛋白質によるクオラムセンシングを介した病原性発現制御

病原真菌Candidaalbicansは、様々な環境因子により酵母形から菌糸形へと形態変換を起こす。この形態変換は病原因子の一つと考えられている。本研究では新規ストレス応答タンパク質Msi3pの恒常発現株を構築し、本菌の病原性発現性制御における機能を解析した。Msi3pの恒常発現により、その機能に関して以下のことが明らかになった。(1)生育必須因子である(2)マウスへの病原性に関与する(3)形態変換に関与する情報伝達経路を負に制御する(4)細胞壁の統合性、酸化ストレス応答に関与する。本研究成果は新たな抗真菌薬開発につながるものと期待される。病原性真菌Candida albicansの病原性因子の一つである酵母形から菌糸形への形態変換能は、様々な環境因子の影響を受け、そのシグナルは主にcAMP-protein kinase A (PKA)経路とMitogen-activatedproteinkinase(MAPK)経路により伝達され発現する。近年、菌密度依存性の病原性発現制御であるクオラムセンシング(QS)の存在がC.albicansにおいて明らかになり、QS分子であるfarnesolが、酵母形から菌糸形への形態変換抑制など病原性発現を制御していることが示された。本研究で着目した新規ストレス応答遺伝子MSI3は、酵母形から菌糸形への形態変換初期に関与する遺伝子として単離され、菌糸形成誘導因子であるN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)やQS分子であるfarnesolにより劇的な負の制御を受ける。本研究ではC.albicansのQSシステムを介した病原性発現制御におけるMSI3の機能を解析することを目的とした。MSI3の破壊株の構築を試みたが、MSI3が必須遺伝子である可能性が示唆されたため、テトラサイクリン応答型プロモータで構成的に高発現できる株を構築した。このMSI3発現制御株を用いることで、MSI3は生育必須遺伝子であること、熱ストレス耐性には関与しないことが明らかになった。さらにcAMP-PKA経路を介して菌糸形成を誘導するGlcNAcまたはグルコースを含む最少培地を用いて菌糸形成に及ばす影響を解析した。その結果、両培地において同様に菌糸形成が観察されたが、MSI3の機能について以下のことが示唆された。(i)MSI3はGlcNAcによる菌糸形成誘導条件下でfarnesolによる菌糸形成抑制を促進する。(ii)farnesolおよびMSI3はPKAまたはその下流のシグナル伝達を負に制御している。以上のように、MSI3は生育必須因子であり、さらにGlcNAc特異的な経路およびcAMP-PKA経路を負に制御することでQSによる形態変換制御に重要な働きをしていることを新たに見出すことができた。標準株CAF2-1では菌糸形成を誘導するグルコースまたはGlcNAcに応答しMSI3の発現が強く抑制されることが明らかになった。この結果から我々は、MSI3発現量の減少がC.albicansの菌糸形への形態変換に重要な役割を果たすのではないかと仮説を立てた。そこで、MSI3の恒常発現のためにテトラサイクリン応答型プロモーターを用いてMSI3発現制御株(tetMSI3)を構築した。tetMSI3株の解析により、Msi3pは生育必須因子であることが示された。また、Msi3pの恒常発現により、以下のことが明らかになった。(1)マウスへの病原性を低下させることが示された。(2)Ras1-cAMP-PKA経路のドミナントアクティブ発現による菌糸形成を抑制したため、Msi3pは本シグナル伝達経路を負に制御することが示唆された。また、同経路を抑制するQS分子farnesolにより菌糸形成抑制が促進された。(3)細胞壁ストレス剤および酸化ストレスに対し著しい感受性を示したことから、ストレス応答にも関与することが明らかになった。以上の結果から、Msi3pは、Candida albicansの細胞増殖、Ras1-cAMP-PKA経路による菌糸形成、ストレス応答を制御する多様な機能を有していることが明らかになった。QS分子farnesolと同じシグナル伝達経路を制御することから、C.albicansのQSに重要な役割を果たすことが示唆された。
遺伝子工学的手法を利用したカイコへのDNA導入技術の開発に関する基礎的研究

前年度に引き続き研究を行った.1.注入品種については調製非休眠のN4が生存率90%以上なのでこれを使用した(蜷木・坂口). 2.P因子の注入は約300行い各幼虫の器官別にDNAを抽出しプローブとハイブリを行ったが陽性反応は検出できなかった.これは検出感度と導入率の低さによるものと考え後述するマーカー遺伝子に切り換えられた(前川・藤原・楠田).また精細胞の移殖実験は系統間で差が顕著で高いものでは14%以上である充分利用できる技術である(小林). 3.遺伝子発現の検定解析系として培養細胞及び絹糸腺におけるトランジエントな発現を確立した.マーカー遺伝子としてはショウジョウバエ熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーターとクロラムフエニコールアセチル化酵素遺伝子それにSV40のターミネーターを組合せたものを使用した.これ以外にフイプロインプロモーターの発現も両方の系で確認された(前川蜷木小林). 4卵に関係する遺伝子としてコリオンと卵特異的蛋白質(ESP)の遺伝子の単離構造解析が進められた(坂口山下).また脂肪体特異的な貯蔵蛋白質(SP)の遺伝子及び30K蛋白質遺伝子のイントロンをもつものの構造が明らかとなった(富野). 5.invitroの転写解析系は精力的に進められいくつかの分画が同定され組織特異的発現に関与する因子を含む分画及び領域も明らかになリつつある(鈴木).またラン蚕のフイブロイン遺伝子も調節領域を同定中である(田村鈴木). 6.効率的導入ベクターとしてBMCIに検索するためと染色体の利用を考えるために,カイコ染色体の分離技術の開発を行った.パルスフィールド電気泳導法による9メガベースまでの分離が確認されその条件でカイコ染色体DNAと一部分離に成功した(藤原・楠田).以上により遺伝子導入系の一部が確立され,組織特異的発現遺伝子も6種類と利用できることになり,更に一部調節領域の同定も進められた.染色体の分離技術により新しいベクターの開発も可能である.前年度に引きつづき実験を行った。1.注入品種については昨年カンボージュを選定して実験を行ったが、注入卵の生存率が低く日照条件による非休眠卵調製に変更した(蜷木,坂口)。2.注入装置は再度改良が加えられ、位相差倒立顕微鏡に微分干渉装置を設置し1plから注入できるようになった。産下後68hrに注入したプラスミッドは48hr後に胚中に検出され、産化後24hrに注入したHRPは48hr後に胚体に取り込まれていた(前川,蜷木)。また生殖細胞の移植実験を行ったところ最高10%が注入されたものがあったので、導入系として効果的方法と思われる(小林)。3.ショウジョウバエのキサンチン脱水素酵素の遺伝子と核多角体ウイルスに組み込んだものが得られたが、感染後発現しなかった。これは一部が欠損していたためと思われる(前田,田村,前川)。また有用遺伝子としてテン蚕のフィブロイン遺伝子の塩基配列を決定したところ上流部分でかなりの相同性が認められた(田村)。クワ蚕のフィブロイン遺伝子については、カイコと一部異なるものの同じであると考えられた(楠田)。さらにコリオン遺伝子についてはクワコのものが単離でき、カイコと比較したところイントロンの部分が異るが配列は保存されていた(坂口)。4.導入用ベクターは核多角体病ウイルスは7kbの断片を効率的に取り込まないため別のウイルスを検討中である(前田)。カイコ多重遺伝子族(BMC)についてはその全体構造が決定され他の遺伝子の組み込みに利用できる段階に入った。またrDNAも検討中である(藤原,前川)。コリオンについてもベクターとしての利用も考えている(坂口)。5.フィブロイン遺伝子と特異的に発現する因子が見い出されその一部が調節領域に結合していることが明らかとなった(鈴木)。30Kについてはin vitroの転写系を利用できるようになった(富野)。またテン蚕のフィブロインはカイコのin vitroの系で転写された(田村,鈴木)。前年度に引き続き研究を行った.1.注入品種については調製非休眠のN4が生存率90%以上なのでこれを使用した(蜷木・坂口). 2.P因子の注入は約300行い各幼虫の器官別にDNAを抽出しプローブとハイブリを行ったが陽性反応は検出できなかった.これは検出感度と導入率の低さによるものと考え後述するマーカー遺伝子に切り換えられた(前川・藤原・楠田).また精細胞の移殖実験は系統間で差が顕著で高いものでは14%以上である充分利用できる技術である(小林). 3.遺伝子発現の検定解析系として培養細胞及び絹糸腺におけるトランジエントな発現を確立した.マーカー遺伝子としてはショウジョウバエ熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーターとクロラムフエニコールアセチル化酵素遺伝子それにSV40のターミネーターを組合せたものを使用した.これ以外にフイプロインプロモーターの発現も両方の系で確認された(前川蜷木小林). 4卵に関係する遺伝子としてコリオンと卵特異的蛋白質(ESP)の遺伝子の単離構造解析が進められた(坂口山下).また脂肪体

特異的な貯蔵蛋白質(SP)の遺伝子及び30K蛋白質遺伝子のイントロンをもつものの構造が明らかとなった(富野). 5.invitroの転写解析系は精力的に進められいくつかの分画が同定され組織特異的発現に関与する因子を含む分画及び領域も明らかになリつつある(鈴木).またラン蚕のフイブロイン遺伝子も調節領域を同定中である(田村鈴木). 6.効率的導入ベクターとしてBMCIに検索するためと染色体の利用を考えるために,カイコ染色体の分離技術の開発を行った.パルスフィールド電気泳導法による9メガベースまでの分離が確認されその条件でカイコ染色体DNAと一部分離に成功した(藤原・楠田).以上により遺伝子導入系の一部が確立され,組織特異的発現遺伝子も6種類と利用できることになり,更に一部調節領域の同定も進められた.染色体の分離技術により新しいベクターの開発も可能である.