hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温処理自家骨同化過程の解析(画像と組織の対比)

実験1:ビーグル犬を用い、1カ月より5カ月まで1カ月おき、1年、1年半、2年を検討時期とした。脛骨内側を長さ3cm切断し、右は温度処理後に(温度処理骨)、左は切断後未処理のまま元に戻し(新鮮自家骨)ポリL乳酸ピンにて固定後、X線写真、MRI、DEXAによる骨密度測定、3点曲げ試験による強度測定、組織学的検討を行なった。実験1結果:画像では左右差を認めず、温度処理骨は新鮮自家骨を同時期に骨癒合をするとともに、MRIでの信号変化も同様であった。組織学的には骨内への血管や骨芽細胞の侵入の程度に差を認め、温度処理骨では遅れる傾向であった。骨密度については2カ月以降新鮮自家骨は温度処理骨に比較して有意に減少し、骨強度についても新鮮自家骨は早期に低下し術後6ヶ月で最低となり、術後1年以内に元の強度になった。一方温度処理骨は1年間は強度が殆ど低下せず、1年半で最低となり、2年で元の強度に回復した。実験2:ラット骨髄細胞を培養し、骨芽細胞様細胞を分離した。ラットの長管骨より調整した温度処理骨・新鮮自家骨、120度処理骨を0.010.5mmに粉砕し、これをばらまいた上で骨芽細胞様細胞を培養し、培養後3日5日7日の培養上清を採取し、1型コラーゲン産生量とオステオカルシン産生量を定量した。骨を入れないものをコントロールとした。実験2結果:120度処理骨は、70度処理骨や新鮮自家骨と比較して3日5日7日ともオステオカルシン(P<0.0001)1型コラーゲン産生量(P<0.0002)は有意に高いことがわかった。120度処理骨に暴露された骨芽細胞様細胞が産生するオステオカルシン量は徐々に減少する傾向を示したのに比して、1型コラーゲン産生量は逆に増加する傾向を示した。これは120度処理骨という非生理的な骨に暴露された骨芽細胞様細胞は、まず細胞分化をし、オステオカルシンを産生すると共に1型コラーゲンを産生して、自ら環境をなじみやすいものにしたと考えられる。一方70度処理骨や新鮮自家骨に暴露された骨芽細胞様細胞は、自然な環境の中で培養されている為、細胞分化を強制されることなく、オステオカルシンや1型コラーゲン産生量は低いままであったと考えられる。高温処理自家骨の同化過程を解析する目的で、当初家兎を予定していたが、切除骨のサイズの問題より、ビ-グル犬に変更した。平成8年9月より現在まで、10匹について手術を行った。1匹は麻酔量の問題で術後に死亡した為、以下の検討に用いた犬は9匹である。術後経過が4ヶ月の犬が2匹、以下3ヶ月・2ヶ月・1ヶ月がそれぞれ2匹ずつであり、手術直後の犬が1匹である。

1ヶ月毎にMRIと単純X-Pを撮影するとともに、DEXAによる移植骨部の骨密度測定も行った。Dynamic MRIでは当初髄内の浮腫や循環障害によって造影剤での増強硬化は認めないが、術後2ヶ月をへて次第に髄内の毛細血管網が形成されるに従い、Dynamic MRIでも早期の造影効果を認めるようになってきた。単純X-Pでは術後2ヶ月でしっかりと骨癒合を示している。高温処理自家骨とコントロールでは明らかな差を認めない。近日中に右-温度処理骨部、左-コントロールについて組織検査の目的で摘出し、強度試験・組織学的検査・オステオカルシンおよびBMP-2のmRNA発現についてRT-PCR法を用いて検討する予定としている。高温処理自家骨の同化過程について、組織(HE染色、アルシアンブルー染色、プロタゴール染色)と画像の対比、経時的な強度変化、同化過程の指標としてのオステオカルシン・BMPのmRNA発現、吸収ピンの吸収と骨への置換の速度と骨強度のそれぞれについて、検討を加えて報告する予定である。また同様の実験を繰り返し、In situ hybridizationによる同化過程の空間的立体的な進行を検討する予定である。70度加温処理自家骨移植の同化過程の検討を行う目的にて、ビ-グル犬の脛骨を用い、一側は温度処理骨を、対側は自家骨をそのまま戻すコントロールとし、X線写真・MRI・DEXAによる骨密度(BMD)・さらに3点曲げ試験による力学的強度の測定と組織学的検討を1ヶ月毎に行い、術後5ヶ月まで検討した。X線写真での骨癒合は16週で完成したが、コントロールと温度処理骨との差は認められなかった。MRIでは術後4週ではT1,T2共に低信号で、術後20週ではT1,T2共に骨髄と等信号となり、コントロールとの差を認めなかった。術後2ヶ月以降加温処理自家骨移植部に比較し新鮮自家骨移植部のBMDが有意に低下した。術後5ヶ月では加温自家骨移植部BMDは術後1ヶ月の80%であるのに、新鮮自家骨移植部では40%であった。経時的に力学的骨強度は低下していったが、新鮮自家骨の方がより強度が低下する傾向を認めた。術後20週では加温自家骨が平均67%、新鮮自家骨では平均36%で有意差を認めた。組織学的検討では、術後4週で骨接合部に仮骨形成を認め、12週では骨接合部に間葉系細胞や軟骨細胞の増生、新生骨形成が認められ、20週では骨接合部の境界は不明瞭となり骨癒合は完成した。新鮮自家骨移植部では加温自家骨移植部に比し新生血管の増生が強く、術後8週で新鮮自家骨移植部に血管の侵入や骨細胞・骨芽細胞を認めた。70度加温処理を行う操作ではコラーゲンや基質内のマトリクリン(BMP,TGF,IGF等)の変性は生じないので、骨芽細胞等との親和性に影響がなく、骨癒合過程は新鮮自家骨と同様に進行することが理解できた。しかし血管侵入の程度に差を認めた為、未分化間葉系細胞からの骨芽細胞の形成や骨髄からの破骨細胞の誘導の面で遅れることが予想され、温度処理自家骨の代謝・同化過程で遅れる結果、骨密度の低下が遅く初期骨強度が維持される結果と考えた。オステオカルシンやBMP-2のmRNAレベルの検討については、ビ-グル犬を用いた結果、プローブの作成に支障を来しており、現在方法論について検討中である。70度加温処理自家骨移植実験において、骨癒合・骨同化・骨改変の過程を検討する目的にて、ビーグル犬脛骨を用い、一例は温度処理骨を、対側は自家骨を用いて、単純X線像・MRI・骨密度・骨強度を経時的に測定した。平成9年度は術後5カ月までの骨強度についての検討を行った。加温処理自家骨移植では骨強度は維持されているのに比し、自家骨移植では骨強度は徐々に低下した。そこで長期経過を検討する目的で、術後半年・1年・1年半・2年での骨強度の検討を行ったところ、加温処理自家骨移植では1年を過ぎてから骨強度は低下し始め、2年までに元の強度に復した。自家骨移植では術後徐々に低下し始め、約1年で元の強度に回復した。
IT革命第2ステージと法制度

本年度は、以下の研究成果をあげることができた。第一に,本研究組織メンバー全員の共同執筆になる舟田・長谷部恭男編『放送制度の現代的展開』のリニューアル版のための共同研究を進め,共同討議を経た原稿を作成する作業を行なった。この作業は、放送関係の諸事情の変化があったために若干遅れているが、近くまとめる予定である。第二に,上記の放送関係の諸事情の変化とは、放送法の改正に至るいくつかの動きのことである。特に、NHKをめぐる法改正議論があり、また、民放関係では、マスメディア集中排除原則の緩和が議論され、これも法改正に結びつき、その他、地上デジタル放送のインターネットによる配信、放送番組の二次利用の促進、などが挙げられる。私たちの共同研究では、これらを研究対象とし、それらのうちのいくつかについては、各メンバーによって個別に研究成果が公開されるとともに、前記の共同執筆の単行本において成果をまとめることになっている。NHKをめぐる法改正議論については、英国のBBCとの比較研究が有益であり、本研究では長谷部がこれを担当した。マスメディア集中排除原則の緩和については、持株会社形態による集中を例外的に認めること、その際には、東京キー局が系列のローカル局とともに、傘下に入るような持株会社も許容すべきであり、ここに民放系列が放送制度において正当に位置づけられることになったと評価される。地上デジタル放送のインターネットによる配信、放送番組の二次利用の促進は、著作権の障害があるが、これは一部は著作権の改正によって対応されることとなろうが、さらに多様な問題があり、引き続き検討を要することとなろう。本研究組織は,初年度に当たる今年度に,本研究組織メンバー全員の共同執筆になる舟田・長谷部恭男編『放送制度の現代的展開』の改訂版,あるいは全く新規の出版のための共同研究を進め,共同討議を経た原稿を作成する作業を行ってきた。これは来年度に,原稿を作成し,出版する運びになっている。内容としては,放送のデジタル化,通信(特にインターネット)の発展と放送の関係の深化などの進展にともなって,各種の実態上の変化・問題点,および制度・政策における重点を洗い出しつつある。インターネットによる放送済みの番組配信サービスについては,著作権法上,個別の求めに応じて送信する場合は、電気通信であって、「自動公衆通信」に当たる。これに対し,64QAM(直交振幅変調)方式をとる場合は,同法上の「有線放送」に当たり、従来のケーブル事業者と全く同様に放送としての特別扱いが許されている。後者であれば,音楽に含まれる「実演家」(歌手、演奏家)や「レコード製作者」の持つ権利は報酬請求権だけであるので、事前に処理を必要としないが,後者であれば,事前の許諾が必要であり,この点がネックとなっている。したがって,番組制作の最初からインターネット配信が採算取れる番組である場合は別として,放送番組の二次利用は著作権法上の障害によって期待できない。また,本年度は放送・通信における「個人情報の保護」が,総務省ガイドラインの策定によって大きく進むことになった。個人情報保護法の施行される4月以降の状況も注視することとしたい。その他,本研究組織のメンバーの数人は,総務省の研究会等において,NHK,民放事業者,番組製作事業者(いわゆる番組プロダクション)や番組製作の一部だけを請け負う事業者,あるいはプラットフォーム事業者からのヒアリングを聞く機会を得た。また,本研究組織では,当初,本研究期間において海外調査も実施することにしていたが,実現には至らなかった。しかし,放送・通信につての諸外国との比較研究は,上記ヒアリングや文献調査によって進めている。第一に,本研究組織メンバー全員の共同執筆になる舟田・長谷部恭男編『放送制度の現代的展開』の改訂版,あるいは全く新規の出版のための共同研究を進め,共同討議を経た原稿を作成する作業を行なった。これは既に原稿の形でまとめられており、来年度には出版する運びとなっている。

第二に,実態調査研究は,日本については各方面の事業者や行政庁の方々からご説明を頂き,また私達もデジタル放送の視聴やインターネット放送(現在では、「ブロードバンド放送」と呼ぶ方が多いようである)の動向を実際に経験することができた。ヒアリングの対象とした事業者には,従来からのNHK,民放事業者や,NTT等の電気通信事業者だけでなく,番組製作事業者(いわゆる番組プロダクション)や番組製作の一部だけを請け負う事業者などがある。ただし、その多くは,本研究組織メンバーの数名が活動している総務省やその他の研究会でのヒアリングであり、それに基づいてメンバー間で議論をし、上記(第一)の原稿に結びついた。第三に,本研究期間は,海外調査も実施することにしていたが、メンバーのうちの一部が上記のように他のプロジェクト等で海外調査を行った以外は、本研究組織としては行うことができなかった。しかし、諸外国との比較研究が有意義であることはいうまでもなく、文献による研究を各自行った。本年度は、以下の研究成果をあげることができた。第一に,本研究組織メンバー全員の共同執筆になる舟田・長谷部恭男編『放送制度の現代的展開』のリニューアル版のための共同研究を進め,共同討議を経た原稿を作成する作業を行なった。この作業は、放送関係の諸事情の変化があったために若干遅れているが、近くまとめる予定である。第二に,上記の放送関係の諸事情の変化とは、放送法の改正に至るいくつかの動きのことである。特に、NHKをめぐる法改正議論があり、また、民放関係では、マスメディア集中排除原則の緩和が議論され、これも法改正に結びつき、その他、地上デジタル放送のインターネットによる配信、放送番組の二次利用の促進、などが挙げられる。私たちの共同研究では、これらを研究対象とし、それらのうちのいくつかについては、各メンバーによって個別に研究成果が公開されるとともに、前記の共同執筆の単行本において成果をまとめることになっている。NHKをめぐる法改正議論については、英国のBBCとの比較研究が有益であり、本研究では長谷部がこれを担当した。マスメディア集中排除原則の緩和については、持株会社形態による集中を例外的に認めること、その際には、東京キー局が系列のローカル局とともに、傘下に入るような持株会社も許容すべきであり、ここに民放系列が放送制度において正当に位置づけられることになったと評価される。地上デジタル放送のインターネットによる配信、放送番組の二次利用の促進は、著作権の障害があるが、これは一部は著作権の改正によって対応されることとなろうが、さらに多様な問題があり、引き続き検討を要することとなろう。
各種インプラント材料の歯周靭帯形成能

インプラントの理想的な支持構造は,天然歯の歯周靭帯にみられるのと同様の生理学的並びに生体力学的構築であることに違いない。しかし,今日まで天然歯歯周靭帯と同じ構造や機能にて支持されるインプラントの開発に関しての基礎的あるいは臨床的な研究報告はまったく見あたらない。そこで本研究では,Nymanら(1982)の提唱する組織再生誘導法を応用して,各種インプラント材料表面への歯周靭帯の誘導の様相を検討した。すなわち,成猫上顎犬歯の頬側歯肉を剥離後,犬歯歯根面を露出させるよう同歯槽骨を開窓し,歯根面に直径0.8mm,深さ0.3mmの窩洞を形成した後,同サイズの各インプラント材料(ハイドロキシアパタト,生体ガラス,チタン合金,ジルコニア)を充填した。次いで,ミリポア膜にて被覆後,歯肉弁を整復し材料表面への歯周靭帯の誘導を図った。その結果,すべての動物において開窓した歯槽骨は新生した骨により修復されており,材料表面と歯槽骨との間には線維性組織が介在していた。このうち,生体活性材料であるハイドロキシアパタトおよび生体ガラス表面には歯根表面に観察されるセメント質に連続して同様のセメント質様硬組織の層が形成され,この組織中には歯槽骨より連続する線維束が入り込むなど,天然歯歯周靭帯と変わらぬ組織構造を示していた。一方,生体不活性材料であるチタン合金およびジルコニア表面には,セメント質様硬組織の再生はまったく認められず,周囲の線維性組織の走行も材料表面に平行であり,歯槽骨との材料表面とを連続するような線維の走行は認められなかった。以上のことより,インプラント材料のうち生体活性材料であるハイドロキシアパタイトおよび生体ガラスにおいて,セメント質様硬組織の再生並びに同組織への歯周靭帯様組織の誘導の可能性が明らかとなった。
顎関節疾患における熱ショック蛋白(HSP)47様蛋白の生理的・病理的意義

顎関節における特徴的な疾患である変形関節症(OA)や慢性関節リウマチ(RA)では,どちらも病理組織学的には顎関節を含む多くの関節軟骨が破壊されることが観察されており,関節液中に軟骨細胞の破壊成分が放出されると思われる。さらに自己免疫疾患の一つであるRAに関しては特にその破壊軟骨に対する抗体が出現すると報告されている。本申請課題では,前半の1年目で軟骨細胞様培養細胞株HCS-2/8細胞からのRA患者血清で特異的に認識される蛋白(RA-A47)の単離精製,そのN一末端アミノ酸配列の解析を行い,ヒトコラーゲン特異的分子シャペロンHSP47遺伝子であるcolliginホモローグであるcolligin-2遺伝子から推定されるアミノ酸配列と完全に一致すること,さらにRA-A47蛋白はコラーゲン結合能を有することを見い出し,これらの結果からRA-A47蛋白が未同定のcolligin-2遺伝子の翻訳産物ではないかと仮定した。そこで後半の本年度では,さらにこのRA-A47の構造を明らかにするため,HCS-2/8からra-a47 cDNAの蛋白コード領域を単離し,塩基配列を決定した。その結果,ra-a47 cDNAはcolligin-2 cDNAと3塩基,類推されるアミノ酸配列でも2残基異なっているが,それ以外は全て一致していることから,ra-a47とcolligin-2は同一の遺伝子であると結論付けた。同時にHeLa細胞からもra-a47 cDNAの単離番行い,HCS-2/8由来のra-a47 cDNAとの比較を行ったところ,1塩基HCS-2/8に特異的な部分が存在していたが,アミノ酸配列ではHCS-2/8由来,HeLa細胞由来のra-a47 cDNAに違いは見られなかった。なお,この配列はgenomic DNAでも一致していることが確かめられ,さらにcolligin geneはいずれの細胞でも単離できなかった。このra-a47 geneは42°Cの培養で誘導を受けることも明らかとなったことから,RA-A47/Colligin-2はHSP47として機能していると考えられる。また,HCS-2/8細胞に慢性関節リウマチにおいて関節液中への放出が報告されているTNFαを作用させるとn-a47/colligin-2mRNAの発現量は減少するがtype II collagen mRNAの発現量は変化せず,合成されるコラーゲンと分子シャペロンとの産生量に不均衡が生じることを昨年度報告したが,この条件下で抗体を用いた吸収実験から細胞表面にRA-A47が出現しており,また,培養上清中にもRA-A47が存在していることが確かめられ,TNFαなどの作用により本来細胞内にしか存在しないRA-A47の局在が変化するとともに細胞外に放出されたRA-A47が自己抗原として提示されるのではないかと考えている。自己免疫疾患の一つであるRAに関しては特にその破壊軟骨に対する抗体が出現すると報告されている。申請者らはすでに軟骨細胞様培養細胞株HCS-2/8から調製した膜画分をRA患者血清と健常者血清を用いてウエスタンブロットしたところ,105k,68k,47kDaの3種の蛋白がRA患者血清により特異的に認識されることを明らかにしており,本申請課題では,このうちの47kDaの蛋白(RA-A47)を単離精製し,そのN-末端アミノ酸配列を解析したところ,N-末端の21個のアミノ酸に関しては,ヒトコラーゲン特異的分子シャベロンHSP47遺伝子であるcolliginのホモローグであるcolligin-2遺伝子から推定されるアミノ酸配列と完全に一致することが判明し,さらにRA-A47蛋白はコラーゲン結合能を有することが明らかとなり,RA-A47蛋白は未同定のcolligin-2遺伝子の翻訳産物であると考えられた。また,HCS-2/8細胞に慢性関節リウマチにおいて関節液中への放出が報告されているTNFαを作用させるとra-a47/colligin-2 mRNAの発現量は減少するがtype II collagen mRNAの発現量は変化せず,合成されるコラーゲンと分子シャベロンとの産生量に不均衡が生じること,NOの合成酵素であるiNOS mRNA,基質分解酵素であるMMP-9 mRNAの発現が誘導され,細胞外からも基質分解作用が進むことが明らかとなり,このことが慢性関節リウマチの際の関節軟骨破壊の原因ではないかと思われる。さらに,この条件下で培養上清中にRA-A47蛋白が存在していることが明らかとなり,破壊された軟骨細胞からRA-A47蛋白が放出され,自己抗原として認識されるようになるのではないかと推察される。本申請課題では,前半の1年目で軟骨細胞様培養細胞株HCS-2/8細胞からのRA患者血清で特異的に認識される蛋白(RA-A47)の単離精製,そのN一末端アミノ酸配列の解析を行い,ヒトコラーゲン特異的分子シャペロンHSP47遺伝子であるcolliginホモローグであるcolligin-

2遺伝子から推定されるアミノ酸配列と完全に一致すること,さらにRA-A47蛋白はコラーゲン結合能を有することを見い出し,これらの結果からRA-A47蛋白が未同定のcolligin-2遺伝子の翻訳産物ではないかと仮定した。そこで後半の本年度では,さらにこのRA-A47の構造を明らかにするため,HCS-2/8からra-a47 cDNAの蛋白コード領域を単離し,塩基配列を決定した。その結果,ra-a47 cDNAはcolligin-2 cDNAと3塩基,類推されるアミノ酸配列でも2残基異なっているが,それ以外は全て一致していることから,ra-a47とcolligin-2は同一の遺伝子であると結論付けた。同時にHeLa細胞からもra-a47 cDNAの単離番行い,HCS-2/8由来のra-a47 cDNAとの比較を行ったところ,1塩基HCS-2/8に特異的な部分が存在していたが,アミノ酸配列ではHCS-2/8由来,HeLa細胞由来のra-a47 cDNAに違いは見られなかった。なお,この配列はgenomic DNAでも一致していることが確かめられ,さらにcolligin geneはいずれの細胞でも単離できなかった。このra-a47 geneは42°Cの培養で誘導を受けることも明らかとなったことから,RA-A47/Colligin-2はHSP47として機能していると考えられる。また,HCS-2/8細胞に慢性関節リウマチにおいて関節液中への放出が報告されているTNFαを作用させるとn-a47/colligin-2mRNAの発現量は減少するがtype II collagen mRNAの発現量は変化せず,合成されるコラーゲンと分子シャペロンとの産生量に不均衡が生じることを昨年度報告したが,この条件下で抗体を用いた吸収実験から細胞表面にRA-A47が出現しており,また,培養上清中にもRA-A47が存在していることが確かめられ,TNFαなどの作用により本来細胞内にしか存在しないRA-A47の局在が変化するとともに細胞外に放出されたRA-A47が自己抗原として提示されるのではないかと考えている。
血管作動性ペプチドの放出機序とその受容体の免疫細胞化学

血管内皮細胞は種々の血管作動性ペプチドを産生・放出し、局所血流調節機構に関与している。我々はエンドセリン(ET)-1、ET受容体およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の免疫局在の検索から、両ペプチドの血管内皮細胞での産生・貯蔵・放出機序と、放出されたET-1のvasomotionの検索を行うべく、以下の研究を展開した。1.ラット脳硬膜静脈洞および頸動脈小体血管系の内皮細胞において、両ペプチドは粗面小胞体・ゴルジ装置系で生合成されたのち、一部は同一のWeibel-Palade(WP)小体に貯蔵されることを明らかとした。2.WP小体の脱顆粒剤であるcompound48/80を作用させたところ、両ペプチドともWP小体の脱顆粒や開口分泌に連動して細胞外に放出されることが免疫電顕で示された。3.WP小体数の一過性の増加と細胞外放出の亢進をもたらすラット急性低酸素モデルにおいて、両血管系内皮細胞とも両ペプチドの産生およびWP小体を介した細胞外放出が亢進することが証明された。4.ET受容体には血管収縮を仲介するET_A受容体と、血管拡張を仲介するET_B受容体が存在することは周知である。両受容体の免疫細胞化学的局在の検索により、ラット脳硬膜静脈洞では血管内皮細胞膜にET_B受容体が、中膜平滑筋形質膜にET_A受容体がそれぞれ分布し、両作用のバランスによってET-1は静脈洞内血流の内頸静脈への還流を調節することが示唆された。一方、頸動脈小体内血管系では内皮にET_B受容体が分布するが、ET_Aの分布はほとんどみられず、頸動脈小体内ではET-1は主にその血管拡張作用により血流保持に働くことが推察される。5.CGRPに関しては未だ受容体の同定がなされていないが、強力な血管拡張性ペプチドであることから、両血管系ともにCGRPは血管拡張に関与すると考えられる。WP小体からET-1とCGRPが個別に放出されるか同時に放出されるかの解析は血行動態の把握に必要であり、今後とも検索を続けたい。平成7年度研究計画に沿って、1)ラット脳硬膜静脈洞を試料としてエンドセリン(ET)-1とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の局在に関する光顕免疫を施行し、両ペプチド免疫陽性反応が同血管内皮細胞で観察された。さらにET-1に関しては、粗面小胞体・ゴルジ装置系で生合成されたET-1がWeibel-Palade (WP)小体に貯蔵され、内皮細胞からの傍分泌が脳硬膜静脈洞の局所血流調節機序に関することを免疫電顕によって明らかとした。CGRPについても目下、免疫電顕を展開中である。2)ラット硬膜静脈洞をWP小体脱顆粒剤であるcompound 48/80で処理し、対照群と比較した結果、WP小体貯蔵ET-1がWP小体の細胞外放出に連動して血中および内皮下層に放出されることを免疫電顕で確認し、WP小体の脳硬膜静脈洞における血流調節機構への意義を証明した。3)ラット頸動脈小体血管系の血流調節へのET-1とCGRPの関与の有無を検索した結果、両ペプチドの頸動脈小体における血流調節への関与が免疫電顕的に証明された。

4)ETの受容体にはET-1とET-3との結合性に有意差のあるET-A受容体と有意差のないET-B受容体とがある。両受容体に対する特異抗体の選定と入手が遅れたため、ラット横静脈洞の有する平滑筋細胞と内皮細胞における両受容体の局在に関する免疫組織化学的解析は平成8年度に順延して施行する。平成8年度は本年度進展できなかった研究計画4)の検索を急ぐとともに、1)および3)の実験系を低酸素状態と重金属投与後の血管について展開する予定である。平成8年度研究計画に沿って、1,ラット脳硬膜静脈洞を試料としてエンドセリン(ET)-1とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の局在に関する免疫電顕を施行し、両ペプチドが同血管内皮細胞の粗面小胞体(rER)・ゴルジ装置系で生合成され、その一部が同一のWeibel-Palade(WP)小体に貯蔵されることを確認した。2,ラット急性低酸素モデルの上記血管内皮細胞においてWP小体の増加と細胞外放出像が高頻度に観察され、また、免疫電顕所見から、両ペプチドのrERでの産生の亢進が示唆されたことと、WP小体の挙動に連動した両ペプチドの細胞外放出像が示された。3,ETの受容体には、主に血管平滑筋細胞に分布し、血管収縮に介在するET_A受容体と、主に内皮細胞に分布し、血管拡張に介在するET_B受容体が存在する。両受容体に対する抗体を用いた免疫細胞化学をラット脳硬膜静脈洞で展開し、血管内皮形質膜にET_B受容体が、血管平滑筋細胞膜にET_A受容体が局在することが確認された。したがって、WP小体から放出されたET-1は内皮細胞に作用し、ET_B受容体を介する血管拡張作用と、平滑筋細胞に作用し、ET_A受容体を介する血管収縮作用を誘発するという二種の作用のバランスによる血流調節機構の存在が示された。4,ラット頸動脈小体血管系においても両ペプチドの産生・貯蔵・放出機序にWP小体が重要な意義を有することを免疫電顕により証明した。しかし、脳硬膜静脈洞と異なり、ET受容体は頸動脈小体内の動脈系内皮細胞にET_B受容体が分布するが、血管平滑筋細胞にはET_A受容体がほとんど分布していないことから、WP小体から放出されるET-1は頸動脈小体内では主に血管拡張作用による血流保持に働くことが推察された。5,ラット急性低酸素モデルでは両血管ともにET受容体の局在性については対照群と比べて有意差がみられず、低酸素状態では内皮細胞でのET-1の産生・放出の亢進が血行動態に重要な影響を与えていることが示唆された。
原爆被爆者の被爆時所在地に基づくリスク評価に関する研究

放射線被曝はがんリスクを高める要因であり,影響の定量的な評価は重要な課題である.広島原爆被爆者のがん死亡のリスク評価は,主に原子爆弾が炸裂時に放出された放射線による直接的な外部被曝の影響評価がほとんどであり,残留放射線や内部被曝など直接被曝以外の付加的な放射線曝露の影響は十分に評価されていない.間接被曝線量の推定は難しく,これまで被曝線量に基づく方法では評価できかった.本研究では,位置情報を活用し被爆時所在地毎にリスク評価する方法を開発した.データ解析の結果から,爆心から北西地域にリスクの偏りのある円形非対称な地理分布が確認され,黒い雨などの放射性降下物による内部被曝の可能性が示唆された.放射線被曝はがん等の罹患・死亡のリスクを高める要因であり,その影響を定量的に評価することは重要な課題である.広島原爆被爆者における放射線を被曝したことに起因するがん罹患および死亡のリスク評価は,主に原子爆弾が炸裂時に放出された放射線による直接的な外部被曝の影響評価がほとんどであり,残留放射線による外部被曝や放射性物質で汚染された塵や水などを体内に取り込んだことによる内部被曝など,直接被曝以外の付加的な放射線曝露の影響は評価されていないのが現状である.間接被曝に関するリスク評価がほとんど行われていない理由の一つとして,間接被曝による被曝線量を推定することは難しく,被曝線量に基づく評価法では解析することができなかったことが挙げられる.本研究では,被曝線量に基づく従来のリスク評価法に代わる新しい評価法として,被爆時所在地毎にがん等による罹患・死亡のリスクを評価する方法を開発し,広島原爆被爆者コホートデータに適用することで新しいリスク評価法を確立した.平成24年度は死因を固形がんに絞り,がん死亡危険度の年齢依存性を導入して広島原爆被爆者のがん死亡危険度の地域差を解析を行った.解析結果から,広島原爆被爆者における死亡リスクの地理分布として,爆心周辺の同心円状に分布するリスクと,北西の郊外地域のリスクが認められた.線量による調整後もなお爆心周辺の距離依存性のあるリスクは認められた.この結果は,爆心周辺において線量では説明ができないリスクがあることを示唆するものと考えられる.また,相対的に高いリスクが推定された爆心地の西から北西の郊外領域は,黒い雨などの放射性降下物による内部被曝の可能性が示唆された.これまで,広島大学原爆放射線医科学研究所の広島原爆被爆者データベース(ABS)に基づくデータ解析を中心に行ってきたが,平成25年度は,放射線影響研究所(RERF)が管理する寿命調査コホート(Life Span Study; LSS)コホートの公開データに対しても同様な解析を行い,ABSコホートデータとの比較検討を行った.LSSコホートの公開データには,詳細な位置情報は含まれないため,主にがん死亡危険度の年齢依存性について検討し,初期線量による超過相対リスク(ERR)と近距離被爆によるERRについてポアソン回帰分析を適用することで解析を行った.その結果,初期線量に加えて非初期線量の指標として被爆距離(爆心から3km以内かどうかのダミー変数)を用いたERRモデルが最も適合した.初期線量と被爆距離に対するERRの上昇は被爆時から共に遅延して現れ,初期線量に比べて被爆距離による被爆後のERRの上昇は緩やか(ピークまでの経過時間が長い)ことが示唆された.また,被爆距離の被爆時年齢依存性は単調ではなく,ある年齢層に特異的であることが示唆された.本研究で示唆された寿命調査コホートにおける非初期線量によるERRの特徴は, ABSコホートに対する結果と類似した傾向であった.放射線被曝はがんリスクを高める要因であり,影響の定量的な評価は重要な課題である.広島原爆被爆者のがん死亡のリスク評価は,主に原子爆弾が炸裂時に放出された放射線による直接的な外部被曝の影響評価がほとんどであり,残留放射線や内部被曝など直接被曝以外の付加的な放射線曝露の影響は十分に評価されていない.間接被曝線量の推定は難しく,これまで被曝線量に基づく方法では評価できかった.本研究では,位置情報を活用し被爆時所在地毎にリスク評価する方法を開発した.データ解析の結果から,爆心から北西地域にリスクの偏りのある円形非対称な地理分布が確認され,黒い雨などの放射性降下物による内部被曝の可能性が示唆された.放射線被曝はがん等の罹患・死亡のリスクを高める要因であり、その影響を定量的に評価することは重要な課題である。広島原爆被爆者における、放射線を被曝したことに起因するがん罹患および死亡のリスク評価は、主に原子爆弾が炸裂時に放出された放射線による直接的な外部被曝の影響評価がほとんどであり、残留放射線による外部被曝や、放射性物質で汚染された塵や水などを体内に取り込んだことによる内部被曝など、直接被曝以外の付加的な放射線曝露の影響は評価されていないのが現状である.間接被曝に関するリスク評価がほとんど行われていない理由の一つとして、間接被曝による被曝線量を推定することは難しく、被曝線量に基づく評価法では解析することができなかったことが挙げられる。本研究では、被曝線量に基づく従来のリスク評価法に代わる新しい評価法として、被爆時所在地毎にがん等による罹患・死亡のリスクを評価する方法を開発し、広島原爆被爆者コホートデータに適用することで、新しいリスク評価法を確立した。平成23年度は、情報量の多い死亡に関するコホートデータに対して、確立したリスク評価法に基づき解析を行い、被爆時所在地毎に推定された死亡リスクを用いて、リスクの等値線を描くことでリスクの地理分布の視覚化を行った。

解析結果から、広島原爆被爆者における死亡リスクの地理分布は、爆心から離れるにつれてリスクは減少傾向にあるものの、爆心から北西地域にリスクの偏りのある円形非対称な地理分布が確認され、黒い雨などの放射性降下物による内部被曝の可能性が示唆された.平成24年度の研究計画の概要は,死因をがんに絞って解析することである.ただし,白血病は放射線曝露から罹患に至るまでの時間が他のがんに比べて短いことが知られており,白血病を除く固形がんに関するリスク評価を行った.これにより,がん特有の時間依存を考慮した死亡危険度の地域差の推定をすることができた。初年度の研究計画の概要は、(1)情報量の多い死亡に関するコホートデータを用いて、新しい評価法の有効性および問題点について検討し、必要に応じて評価法の修正・改良を行っていく。(2)データベースにおいて被爆時所在地が既に電子化(座標コード化)して登録されている被爆者(主に,直接被爆者)を解析対象に,被爆時所在地毎のリスク評価を行い、地理分布の視覚化を行う.(3)解析結果に対して、線量推定・評価の専門家らと共に詳細な分析を行う.であった。まず(1)については、統計関連学会等のデータ解析の手法開発に関する学会で発表し、改善点などのコメント等をもらい、評価法の修正・改良に務めた。(2)については、追跡期間が1970年1月1日から2009年の12月31日の大規模なコホートデータに対して、提案するリスク評価法に基づくリスクの地理分布の視覚化を行った。(3)については、広島大学原爆放射線医科学研究の線量測定・評価、疫学、地理学等の専門家とともに共同研究を行い、その成果をまとめ、国内外の学術雑誌に投稿し掲載された。また、原子爆弾後障害研究会を始め疫学や公衆衛生学といった実学分野に関連した国内研究集会および国際会議で発表し、実学の専門家からコメントを頂き、より詳細な検討を行うことができた。これより、研究は当初の計画通り順調に進んでいるといえる。平成24年度までの研究を引き続いて行う。平成24年度に実施した死因を固形がんに絞った解析を引き続き行う。放射線を被曝したことに起因するがん罹患および死亡のリスク評価において、初期線量のリスクへの影響を数理モデルに基づき定式化する。定式化されたモデルに基づき、リスクの地域差の時間依存性のモデリングを更新し、適合度指標などを用いてモデル選択を行う。また、初期線量で説明できないリスクがどの程度あるかを評価するかための指標として、爆心からの距離を用いた解析も導入する。直接被爆では説明できないリスクの原因として考えられている付加的な放射線曝露(放射性降下物を含んだ黒い雨、誘導放射線、内部被曝など)との関係について、広島大学原爆放射線医科学研究所の管理する原爆被爆関連図書などの資料や、広島市などが行った黒い雨の降雨領域に関するアンケート調査などの結果を参考にした検討も引き続き行う。平成23年度までの研究を引き続いて行う。平成23年度は、情報量ができるだけ多くなるように全死因をエンドポイントとしたリスク評価に焦点をあて、全体的な傾向の把握に務めた。
高速・広角度走査可能な機械振動式MEMS指向性アンテナの研究

現在、ミリ波帯電磁波の更なる活用が期待されている。ミリ波帯では指向性をもつ電磁波ビームを走査することが必須であるが、従来の機械式走査型アンテナは構造が大型かつ複雑で、走査速度が遅いという致命的な問題点があった。本研究では、微小電気機械システム(MEMS)技術を利用して機械構造体を小型化することによりアンテナの高速応答と広い角度に電磁波ビームを走査できる新規アンテナの試作評価を行った。試作したアクチュエータは±10度の角度に1kHzの速度で回転走査することに成功した。また、このアクチュエータに搭載する八木宇田アンテナをシリコンを利用して作製するための設計を行った。鋭い指向性を持つ八木・宇田アンテナを機械的に高速かつ広角度に走査することを可能にする、共振現象を利用したMEMSアクチュエータの設計・試作を行った。設計:櫛歯電極に発生する静電気力によって回転駆動されるMEMSアクチュエータは、ぜんまい型サスペンションを採用することによりリング枠の形状変化を低く抑えて広角度走査ができるように工夫されている。また、このMEMSアクチュエータの上に作製されたアンテナ支持棒は多くの八木・宇田アンテナ導波器をこの上に搭載することができるため、鋭い指向性をもつアンテナを実現することを可能にする。設計したMEMSアクチュエータは1324Hzの共振周波数をもち±40度の広い角度にアンテナビームを走査できるものである。作製:SOI基板を利用した両面のシリコンエッチング加工によってアクチュエータを作製した。試作したデバイスの評価を行った結果、設計通りの共振周波数をもって駆動していることが確認できた。設計および作製を行い、駆動を確認できた。今年度はシリコンアクチュエータの評価と無線給電技術について以下に述べる研究を行った。1.前年度に設計したシリコンアクチュエータの動作特性評価を実施した。この結果、試作したシリコンアクチュエータは、共振周波数約1kHz、走査最大角度約13度で動作することがわかった。この共振周波数は設計通りであったが、走査最大角度は設計40度に比較してかなり小さなものである。この相違を詳細に検討した結果、走査角度13度で可動櫛歯電極が固定電極にプルイン(接触)することが原因であることがわかった。また、このプルインはアクチュエータの回転ばね並進運動によって発生することが予想された。2.回転するアクチュエータ上に搭載されたアンテナにRF電力を供給するのに適した無線給電技術の研究開発を行った。二枚のアンテナを2mm程度のギャップを設けて互いに対向させた場合、40度のねじりによって電力給電が減少しないことを実際に実験治具を作製して確かめた。以上の成果によって、本研究で提案した新規アンテナ実現のための要素技術を確立することができた。今までに得られた研究成果により、本研究で提案した新規アンテナ実現のための要素技術を確立することができた。本年度は、アクチュエータとアンテナの種々の構成についてコンピュータシミュレーションによってRFアンテナ特性および機械振動特性についての評価を行った。1)機械特性では、アンテナの重量増加によってアクチュエータが下方向に変形し、アクチュエータが動作しなくなることが起こった。アクチュエータの下方向のばね定数を増大させることで対処することにしたが、全体構成を考慮してばねの数を増加させるのが適していることがわかった。さらに、昨年度までアクチュエータの回転ばねを支持枠の内部に設けた構造を採用していたが、今回、RFアンテナアレイの電磁界分布を妨害しないように、この機械構造ばねをアンテナ支持枠の外側に作製した構造の検討を行った。これにより、デバイス全体の寸法が増大するという問題が発生したが、RF設計が簡略化されるという利点があるために大変魅力的な構造であると考えられる。今期は、このような長所短所を一つずつ検討しながらアンテナ全体の設計を進めた。2)アンテナのRF特性については、アンテナをシリコンで作成したときに、シリコンの導電率を変化させた場合のRF特性変化を計算した。当然のことながらアンテナ特性は材料の導電率に大きく依存しているが、アンテナの形状を変化させることにより抵抗分布を最適化できるのではないかと期待した。いろいろとトライ&エラーを繰り返して、ひとまずの設計データを得ることができたが、さらに最適化することが必要であると考えられる。なお、アンテナをシリコンから形成することはアンテナ全体の作製方法を著しく簡略するのに役立つものである。試作したMEMSアクチュエータの駆動評価を実施して、MEMSアクチュエータの構造最適化と高速化などに役立てる予定である。また、導波器をアクチュエータに搭載したアンテナの設計、作製、および評価を実施する。a)アクチュエータの回転ばねの再設計を行って、アクチュエータの走査角度を拡大する。b)アクチュエータにアレイアンテナを搭載するプロセスの開発を行う。

c)最後に、デバイスを試作して、本研究の提案を実証する。MEMSアンテナ物品を購入する際に差額が発生して少額の予算が余ったので次年度に使用することにした。平成28年度と合わせて物品費として今年度に使用する。
陰圧損傷が死をもたらすメカニズムを明らかにする

局所への陰圧負荷に起因する死亡のメカニズムを明らかにするために,動物実験モデルを作成して研究を行った.まず、局所陰圧による筋組織の損傷は,挫滅症候群や筋虚血モデルに比較して、早期から著明となることが明らかとなった.陰圧損傷では、圧そのものが直接的に筋肉を損傷している可能性が示唆された。さらに、局所に負荷した陰圧が呼吸・循環に与える影響について検討したところ,上肢あるいは前胸部への陰圧負荷によって速やかに呼吸が停止し,死に至ることが明らかとなった。この結果は、実際例の死のメカニズムを説明する上で貴重な結果となった.これまでに局所への陰圧負荷によって生じる組織学的あるいは生理学的研究はなく,本研究は貴重な成果となった.局所への陰圧負荷に起因する死亡のメカニズムを明らかにするために,動物実験モデルを作成して研究を行った.まず、局所陰圧による筋組織の損傷は,挫滅症候群や筋虚血モデルに比較して、早期から著明となることが明らかとなった.陰圧損傷では、圧そのものが直接的に筋肉を損傷している可能性が示唆された。この結果は、実際例の死のメカニズムを説明する上で貴重な結果となった.これまでに局所への陰圧負荷によって生じる組織学的あるいは生理学的研究はなく,本研究は貴重な成果となった.本研究の目的は、局所に負荷された陰圧が生体に与える影響を明らかにすることである。当初の研究計画・方法に記載した通り、ラットの後肢に安定して陰圧(-675mmHg)を負荷できるモデルを作成した。負荷時間による変化を観察するために30、60、90、120ならびに180分群と対象群(180分麻酔のみ)を設定して比較検討した。(1)外観:損傷肢は負荷時間とともに腫大し、皮膚変色を認めた。30分程度から皮膚に水庖が形成され、次第に破裂して出血を生じた。(2)重量:30、60、90分群では時間経過とともに重量増加を認めたが、90、120、180分では重量に大きな変化を認めなかった。(3)腹部大動脈からの採血量:陰圧負荷時間とともに採血量は減少し、180分群では対象群の約50%となった。(4)生化学的検査:血清中KとCKは120、180分群で有意に上昇したが、Ca、AST、ALT、LDH、ミオグロビンは有意差なし。(5)免疫学的検査:血清中TNF-α、IL-6は上昇なし。(6)組織学的検査:一視野あたりの筋細胞数、変性筋細胞の割合について検討したところ、経時的に一視野中の筋細胞は減少し、変性筋細胞の割合は増加した。また、観察部位を浅層、中間層、深層に分けて検討したところ、深層で最も変化が著明であった。以上の結果から、局所への陰圧負荷によって比較的早期から外表の変化が出現し((1))、損傷肢の重量増加は90分程度で安定した((2))。陰圧負荷時間とともに採血量が減少したこと((3))から、全身の循環血液量が減少していることが推測される。一方、生化学的ならびに免疫学的データに変化はなかった((4))が、陰圧負荷直後に死亡させたことによるかもしれない。最後に、これまで局所的な陰圧負荷によって形成される組織学的変化についての研究はなく、本研究で明らかになった組織所見((5))は局所の陰圧損傷として貴重である。本研究の目的は、局所に負荷された陰圧が生体に与える影響を明らかにすることである。これまでの研究で作成したラット後肢への陰圧負荷モデルを使用して、陰圧負荷による(1)局所所見ならびに(2)全身所見について検討を行った。(1)局所所見:出現時間に差はあったがいずれもうっ血→腫大→水疱形成→水疱破裂→出血の経過を取った。損傷肢の重量は3090分では経時的に増加したが、90分以降は変化が見られなかった。腓腹筋・ヒラメ筋の組織学的検索では、負荷時間とともに変性筋細胞の割合が増加し、特に筋肉深層において著明な変化が認められた。筋細胞内にはIL-6が発現し、ミオグロビンの細胞外への逸脱が認められた。(2)全身所見:陰圧負荷直後に一過性の血圧低下がみられたが,数分10数分後には負荷前の状態に戻り死亡例はなかった。血清生化学的検査ではK、CK、BUN、クレアチニンは上昇したが、その他電解質aや各種逸脱酵素、サイトカインには変化は認められなかった。陰圧損傷の本態は筋肉損傷であり、その病態は挫滅症候群に類似すると推測される。本研究で行った陰圧損傷モデルでは、挫滅症候群に関する実験報告に比較して、受傷後早期から筋細胞の組織学的変性が観察された。この結果は、陰圧損傷が挫滅症候群とは異なった機序で筋損傷を引き起こしている可能性が考えられる。挫滅や虚血とは異なる「陰圧」という受傷機序によって引き起こされた筋損傷を明らかにしたことは新たな知見であり、その結果は国際誌にも掲載された[Legal Med 2012;14:21-26]。

しかし、ラット後肢への陰圧負荷では死に至るものはなく、当初の目的である陰圧損傷が死をもたらす機序を解明するには至っていない。そこで新しいモデルとして、ラットの上肢に対して同様の陰圧(1/10気圧)を負荷したところ、10数秒で血圧が低下し呼吸停止をきたして全例が死亡した。現在、その原因を明らかにするために詳細な実験を重ね、当初の研究課題である「陰圧損傷が死をもたらすメカニズムを明らかにする」ために研究を進めているところである。本研究の目的は、局所(右上肢)に高度の陰圧が負荷された直後に死亡した実際の法医解剖症例について、その死因ならびに死のメカニズムを解明することであった。併せて、局所に負荷された陰圧が生体に与える影響を解明するために実験動物を用いて局所陰圧モデルによる研究を行った。当初、ヒトの片側上肢は体重の約15%に相当することから、実験動物(ラット)では同比率に相当する片側後肢を損傷部位として、陰圧負荷による局所・全身所見について検討を行った。その結果、陰圧損傷の本態は筋肉損傷であることを示し、陰圧そのものが筋肉を損傷することを明らかにした。しかし、下肢への陰圧負荷ではラットは死亡せず、局所の吸引負荷が死を引き起こすメカニズムについては不明であった。そこで、実際の解剖症例と同部位であるラットの右上肢に陰圧を負荷したところ、10数秒程度で急激に血圧が低下して呼吸停止に至り死亡した。生理学的には、1負荷部位の圧力が1/10大気圧になった時点で血圧が急速に低下し→2血圧低下が生じてから10数秒以内に突然の呼吸停止が起こり→3呼吸停止後に血圧は一旦上昇するが次第に低下して心停止に至る、という経過が全てのラットにおいて認められた。さらに、ラットの左上肢あるいは前胸部に対しても同様の陰圧負荷を行ったところ、右上肢に陰圧負荷した場合と同じ経過を取ってラットは死亡した。この経過は、実際の解剖症例において認められた経過と非常に類似したものであった。以上の結果を総合的に判断すると、下肢に陰圧負荷した場合には死には至らず、上肢ならびに前胸部に陰圧を負荷した場合には速やかに死亡しており、局所陰圧による死には胸郭運動障害が関与している可能性が高いと考えられた。一方で、胸部周囲への陰圧負荷によって脳虚血や心臓周囲循環に変化が生じている可能性は否定できず、さらなる研究を行う予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究の最終段階として、ラットの上肢に陰圧を負荷するモデルを用いて、局所への陰圧が死をもたらすメカニズムを解明するために研究を行っている。当初、人間の上肢と同じ容積(身体の約6.2%)となるようにラットの後肢を損傷肢としたが、吸引損傷による死は陰圧が負荷される面積ではなく、部位であることが判明した。さらにその死因についても、上肢の陰圧負荷モデルで観察される速やかな血圧低下と呼吸停止を考慮すると、死因として出血性ショックは考えにくく、むしろ脳虚血や胸郭運動障害などを念頭において実験計画を立てているところである。
DNA結合蛋白質の機能解析のためのマイクロ秒時分割単分子計測技術の創出

DNA結合タンパク質は、膨大なDNAの中から標的配列を探し出し、結合する。DNA結合タンパク質の標的DNA配列の探索には、実験的に検証しにくい“ホッピング"や“セグメント間移動"などの探索機構が存在する可能性がある。本研究では、従来の装置の分解能ミリ秒以内に起こる“ホッピング"などの探索機構を検証し、DNA結合タンパク質が標的DNA配列を認識し結合する過程を明らかにした。まず、本研究で開発したサブミリ秒の時間分解能の単分子蛍光装置を用いて、がん抑制DNA結合タンパク質p53の計測を行い、“ホッピング"の定量的な解析を行った。その結果、p53は、毎秒1回程度の割合で、ホッピング運動をすることが分かった。また、p53のDNAへの結合を詳細に調べたところ、これまで知られていた数10ミリ秒程度の比較的長い結合に加えて、約1ミリ秒の素早い結合があることを明らかにした。この過渡的な結合は、DNA上をスライディング探索する前の中間体と考えられる。または、高速3次元的な標的DNA配列の探索と考えられる。次に、障害物のあるDNAにおいてp53がDNA探索時に障害物を回避する仕組みとして、あるDNAから別のDNAへ移動する“セグメント間移動"が考えられる。ストップトフロー装置を用いて、p53のセグメント間移動を調べた。その結果、p53が拡散律速に近い速度で2本のDNA間を移動できることが明らかとなった。昨年度得られた単分子計測の結果と合わせて、細胞内でp53はセグメント間移動を用いて、DNA上の障害物を避け、効率的に標的DNAの探索を行っていると結論付けた。DNA結合蛋白質は、膨大なDNAの中から標的配列を探し出し、結合する。DNA結合蛋白質の標的配列の探索には、実験的に検証しにくい“ホッピング"や“セグメント間移動"などの探索機構が存在する可能性がある。本研究では、従来の装置の分解能ミリ秒以内に起こる“ホッピング"などの探索機構を検証し、DNA結合蛋白質が標的配列を認識し結合する過程を明らかにする。まず、サブミリ秒の時間分解能の単分子蛍光装置の開発に着手した。高出力レーザーの全反射照明と高感度でマイクロ秒の分解能のラインスキャン型検出器を組み合わせた全反射蛍光顕微鏡を作成した。開発の途中であるが、500マイクロ秒の時間分解能を達成し、従来法の約50倍の時間分解能の向上に成功した。次に、単分子計測の課題であった、一度に大量のデータを取得するため、DNA整列固定法の開発を行った。MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)ポリマーによるガラス基板のコーティングとPDMS(ポリジメチルシロキサン)スタンプによるDNA接着分子のスタンプを組み合わせ、DNAの末端を一直線上に揃えて固定する方法“DNAガーデン"を確立した。開発した方法は、観測視野内のDNA数を増やし、一度に10,000分子のDNA結合蛋白質のデータを取得できるようになった。DNAガーデンを用いて細胞のがん抑制に関わるDNA結合蛋白質p53を計測したところ、p53がDNAのループを作る様子をリアルタイムで観察することに成功した。さらに、p53の標的配列への結合過程を観測したところ、約10%の分子が結合に成功したが、残りの分子は結合に失敗し通り過ぎることが明らかとなった。これまで結合の成功率は100%と考えられてきたが、p53の場合は10分の1と低いことが分かった。さらに、標的への結合の成功率がp53の転写活性と相関があることが明らかとなった。まず、サブミリ秒の時間分解能の単分子蛍光装置を開発した。実際に、p53がDNA上で動く過程を計測し、500マイクロ秒の時間分解能を達成したことを確認した。従来法と比較すると、約50倍の時間分解能の向上に成功した。次に、DNA整列固定法の開発を行った。MPCポリマーによるガラス基板のコーティングとPDMSスタンプによるDNA接着分子のスタンプを組み合わせ、DNAの末端を一直線上に揃えて固定する方法“DNAガーデン"を確立した。具体的には、DNAや蛋白質の非特異的な吸着を防ぐため、ガラス基板をMPCポリマーでコーティングする。次に、新しく設計したPDMSスタンプを用いて、DNA接着分子をガラス基板に一列に並べ固定する。最後に、DNAの末端をアビジン・ビオチンの結合を介して固定化する。コーティング剤の種類や方法、及び、コーティングとスタンプの順番などを検討した結果、DNAガーデンの開発に成功した。DNAガーデンは、観測視野内のDNA数を増やし、一度に10,000分子のDNA結合蛋白質のデータの取得を可能にした。DNAガーデンを用いてp53を計測したところ、p53がDNAのループを作る様子をリアルタイムで観察することに成功した。この成果はBull. Chem. Soc. Jpn.誌に掲載された。さらに、p53の標的配列への結合過程を観測したところ、約10%が結合に成功したが、残りの分子は結合に失敗し通り過ぎることが明らかとなった。この成果は、2016年度のJ. Mol. Biol.誌に掲載された。DNA結合タンパク質の標的配列の探索には、実験的に検証しにくい“ホッピング"や“セグメント間移動"などの探索機構が存在する可能性がある。