hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素の電子伝達の分子機構

ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素(b_5R)について以下のことを明らかにした。従来、化学修飾法により示唆されていたLys-110のNADH結合における役割について大腸菌における大量発現系を利用し、部位特異的変異法により本残基を種々のアミノ酸残基におきかえることにより、Lys-110の正電荷がNADHとの結合に重要であることを示した(Fujimoto et al.FEBS Letters)。本酵素の欠損によって起こる遺伝性メトヘモグロビン血症の重症型患者(横浜)の遺伝子解析を行ない、Phe-298をcodeするTTC3残基の欠失を見い出した。そこで部位特異的変異法を用いてPhe-298の欠失した変異酵素F298△の性質を調べた。この変異酵素の反応効率(kcat/km)は、野生型の約0.4%に低下しており、かつ熱安定性も顕著に低下していた。このことから、Phe-298の欠失が本患者における疾病の原因であると結論した。ところで本酵素と類似性がありX線回析による立体構造の明らかにされているFerredoxin-NADP^+ reductaseでは、C末端のTyr-314がFADとの結合に重要であると考えられている。そこでb_5RについてPhe-298、およびC末端のPhe-300の役割をそれぞれLeu,Alaに置換することにより検討した。その結果、F298A,F300A及びdouble mutantであるF298L/F300Lは、野生型と区別できない活性を持つことが明らかとなった。ところがF298A/F300Aのmutantのkcat/kmは低下していたことから、C末端298および300番目の残基の疎水性が、酵素活性に重要であると考えられた(Shirabeet al.J.Biol.Chem.).ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素(b_5R)について以下のことを明らかにした。ところがF298A/F300Aのmutantのkcat/kmは低下していたことから、C末端298および300番目の残基の疎水性が、酵素活性に重要であると考えられた(Shirabeet al.J.Biol.Chem.).
知的障がい者のアクティブな身体表現活動の有用性について

知的障がい者とその家族をメンバーとするダンスグループを対象に,長期にわたるダンス経験の有用性を検討した.知的障がい者を対象に心拍計と加速度計を用いて,練習中の運動強度と身体活動量を測定した.筋・腱形態を超音波装置で測定し,運動の効果を明らかにした.母親に意識調査を実施し,活動の影響を明らかにした.対象をファシリテーターとしたダンスワークショップを実施し,アクティブな表現活動を確認することができた.平成24年度は、研究実施計画に従って、ダンス指導実践とその分析を行った。大学近隣の特別支援学校と作業所2施設において、各5回ずつのワークショップを30分90分実施し、指導する場に立った知的障がい者メンバーと受講者の活動記録をすべて収集した。ワークシップ受講者へのアンケートについては、視覚的にわかり易い形式で行った。また、支援学校教員・各施設の支援員に対して、毎時のワークショップにおける対象の様子を記録してもらった。得られたすべてのデータ分析については、現在分析中である。平成23年度の研究成果の報告は、日本体育学会第63回大会において下記3件(13)ならびに第51回大阪体育学会大会において1件(4)の学会発表を行い、平成23年度に明らかになったダンスグループのメンバーの1)身体・運動面(運動能力・知覚・体型など)の変化について、2)心理面の変化について、3)行動面についての変化について(日常生活も含む)、4)コミュニケーションに関する変化について(家族を含んだ対人関係を含む)など、メンバー自身の成長とダンスの有用性について明らかにした.以下は、学会発表のタイトルである。1「知的障がい者とその家族をメンバーとするダンスグループの活動に関する質的研究」伊藤美智子・磯貝康成(大阪体育大学大学院)2「創作ダンスの作品中の運動強度に関する研究知的障がい者を対象として」磯貝康成(大阪体育大学大学院)・伊藤美智子3「ダウン症候群者とその運動プログラム参加者との筋・腱形態の違い」團野亮人(大阪体育大学大学院)・磯貝康成(大阪体育大学大学院)・伊藤美智子・石川昌紀(大阪体育大学)4「知的障がい者を対象としたダンスの身体活動量について」磯貝康成(大阪体育大学大学院)・伊藤美智子前年度に実施したDance Assembleルード・フェアリー(以下,RF)がファシリテーターとして参加したワークショップ(WS)の成果をダンス公演(「シナジーの森へ行こう」;2013年5月12日開催)で発表した.本年度は,そのワークショップでのファシリテーターと参加者の行動分析を行った.また,ダンス公演の観客を対象に,公演をどのように捉えたのかを明らかにするために,アンケートによる調査を実施し分析した.その結果,ファシリテーターとして参加した知的障がいのあるメンバーは,WS参加者に対して自らの経験を生かしたアクティブな関わりを行っており,指導者の言動に対応した積極的な発信を行っていたことを確認した.例えば,発話が困難な者は,デモンストレーションにおいて新規な動きを見せたり,WS参加者の表現を促すような動きの提示をする場面が観察された.一方のWS受講者については,初めて行う身体表現活動に見られる行動の傾向を明らかにすることができ,今後の指導に役立てることが可能となった.さらに,公演を鑑賞した観客から得られたアンケートデータの結果,障がい者のダンスという捉え方ではなく,作品に込められた思いやイメージを的確に捉えていることが明らかになった.加えて,知的障がい者の身体表現の可能性や特性を捉えていることを明らかにした.知的障がい者とその家族をメンバーとするダンスグループを対象に,長期にわたるダンス経験の有用性を検討した.知的障がい者を対象に心拍計と加速度計を用いて,練習中の運動強度と身体活動量を測定した.筋・腱形態を超音波装置で測定し,運動の効果を明らかにした.母親に意識調査を実施し,活動の影響を明らかにした.対象をファシリテーターとしたダンスワークショップを実施し,アクティブな表現活動を確認することができた.1.研究の目的:研究代表者は,11年に亘って知的障がい者とその家族を構成員とした「Dance Assembleルード・フェアリー」のダンス指導を行うことによって実践研究を行ってきた.11年に亘る活動を通じて,「Dance Assembleルード・フェアリー」のメンバーにダンスが与えた効果について,明らかにしようとするものであり,初年度は質的研究と運動強度に関する研究を行った.2.研究実施報告:対象者の知的障がい者8名とその母親8名に対して,心理面・行動面(対人関係を含む)に関する非構造化インタビューを行った.その結果を分析し,平成24年度に学会発表する.運動強度については,障がい者9名を対象として,練習中(ウォーミングアップ時)の心拍数を測定し,その結果を以下のように学会報告を行った.*大阪体育学会第50回大会「知的障がい者を対象としたダンスウォーミングアップ中の運動強度に関する報告」磯貝康成・伊藤美智子加えて,作品中の心拍数についても測定しており,平成24年度の学会において発表を予定している.また,ダウン症の6名については,腱・筋の形態測定を実施し,運動の効果について検討した.その結果は,平成24年度の学会において発表を予定している.3.研究の重要性・意義:

これまで明らかになった結果からは,運動習慣のない障がい者との比較や健常者との比較を通じて,長期に亘るダンス経験の身体・運動面,心理面,行動面,コミュニケーション活動面に与える積極的な影響が明らかになり,非常に貴重な結果を得たと考えられる.頭書の研究計画に従い、順調に進んでいると考えられる。当初の計画通り,(1)身体・運動面,(2)心理面,(3)行動面,(4)コミュニケーション活動面などについて,明らかにすることができた.また,学会発表なども順調に行っている.前年度のワークショップの成果を踏まえて、次年度には成果発表会を行い、その様子や観客がどのようにそれを受け止めるのかを明らかにし、本研究のまとめを行う。今後の研究を推進するために,WS参加対象を募るための方策として,近隣の障がい者施設や特別支援学校に協力を依頼している.ワークショップについては,週1回:6か月×3か所の予定であったが,対象となる障がい者とその関係者の負担を考えて,対象にあった期間と回数を検討する.上記のワークショップの実施方法以外では,現在のところ課題となる問題はなく,予定通り実施できると考えられる.頭書の計画通りに執行する予定である。1.次年度については,前年度の結果を原著論文としてまとめる.論文作成については,英文校正等を専門業者へ依頼する予定である. 2.WSの実施と調査:知的障がい者とその関係者を対象として,ルード・フェアリーのメンバーが指導するダンスプログラムをワークショップ形式で実施する.ワークショップの内容をすべてVTRに収録し,行動分析法を用いて分析する.また,簡便なアンケートを毎時実施し,内省についても調査する予定である.ワークショップを実施するための経費ならびにデータ分析のためのデータ整理人件費を経費として執行する予定である.3.繰越金が生じた理由として、備品が安価で購入できたことが挙げられる。繰越金については、上記WSの経費として活用する予定である。
微弱直流電気刺激療法による電気走性を利用した褥瘡局所治療に関する研究

対照群と電流刺激群を無作為に分け、二重盲検法にて電気走性に関する実験研究を実施した。電気刺激群では、白金電極(成分;白金99.98%)により微弱直流電流刺激条件(周波数;0.3Hz,電流強度;50,100μA,通電時間;4時間)にて、培養ディシュ内の線維芽細胞に通電した。尚、対照群は同様の設定をするが、通電しなかった。微弱直流電流刺激装置は、極性と通電時間を改良したTrio300(出力精度±30%以内,伊藤超短波株式会社製)を使用した。(神戸大学医学部倫理委員会で承認済)電気走性の活性度を確認するめの新しい手技を開発し、ディシュ(直径35mm)を活用して、培養デイシュ(直径100mm)内に線維芽細胞(細胞数;3×10^5)を均等に円状に播種し、両端に白金電極を置き、インキュベーター庫内(温度;36°C,CO_2濃度;5.05.5%)にて微弱直流電流刺激を実施した。通電終了直後に、蓄電効果を解消するため両極をシャントした。また、線維芽細胞凝集塊の浮遊による移動を除外するために、通電直前、直後に細胞の遊走状況を顕微鏡下で写真撮影し記録した。その結果、Scion imageソフトを活用して介入前後で移動した線に囲まれた面積を測定することにより、線維芽細胞の遊走距離を細胞群として確認することができた。線維芽細胞では、陰極側で好中球(遊走最適電流強度;60μA)より高い電流強度100μAの通電により,電気走性の亢進を推測できた。今回の実験結果から、褥瘡の治癒過程で肉芽増殖を促進する時に、創縁に設置する電極の極性と電流強度を厳密に設定する根拠を提案することができるので、今後の臨床治療研究の基盤となるデータとしての意義がある。直流微弱電流刺激装置(ES-520伊藤超短波株式会社製)の出力精度の確認実験を行い、安定した電流が得られる通電時間、周波数値を確認した。この直流微弱電流刺激装置を使用して、ドレッシング材(Tegasorb^<TM>)などの電流透過率を測定した。また、通電性が高く金属イオンが発生しない白金(成分;白金99.98%)を加工し、シャーレ(直径10cm)内で直流微弱電流刺激が可能な電極を作成した。ヒト線維芽細胞を採取し、シャーレ内に線維芽細胞の培養し、培養細胞が融合した(confluent)段階で、スクレーパー(scraper)で培地をスクラッチする。対照群と電流刺激群を無作為に分けて、研究計画を作成した。電気刺激群には微弱直流電気刺激装置により、線維芽細胞に白金電極を通して微弱直流電流刺激を段階的(1mA以下;10500μA)に通電した。(神戸大学倫理委員会で承認済)現在、実験手順を確認しながらパイロットスタディを作成している。このことは、線維芽細胞の電気的特性(電気走性)を確認し、褥瘡の治癒過程で肉芽増殖を促進する時に創縁に設置する電極の極性と電圧強度を厳密に設定する根拠を提案することができるので、今後の臨床治療研究の基盤となるデータとしての意義がある。対照群と電流刺激群を無作為に分け、二重盲検法にて実験研究を実施した。電気刺激群には白金電極(成分;白金99.98%)により直流微弱電流刺激条件(周波数;0.3Hz,電流強度;200,400,600μA,通電時間;20分間)にて、ディシュ内の線維芽細胞に通電した。出力精度の確認実験をもとに直流微弱電流刺激装置ES-520および通電時間と極性を改良したtrio300(伊藤超短波株式会社製)を使用した。(神戸大学倫理委員会で承認済)ディシュ(直径35mm)を活用して、ディシュ(直径100mm)内に線維芽細胞を均等に円状に播種し、両端に白金電極を置き、クリーンベンチ内にて直流微弱電流刺激を実施した。直流微弱電流刺激を20分間/日を1週間継続しても、遊走を十分に促進することができないことが確認できた。そこで、長時間不適切な環境下で実験を継続することができないので、インキュベーター庫内(温度;36°C、CO_2濃度;5.05,5%)にて、4時間連続して電流刺激(周波数;0.3Hz,電流強度;200,400μA)を加えた。両実験とも蓄電効果を解消するため、通電終了後に両極をシャントした。また、線維芽細胞凝集塊の浮遊による移動を除外するために、通電前に紙面に細胞の遊走状況を記録した。その結果、後者の条件の方が、遊走促進効果が高いことが確認できた。このことにより、線維芽細胞の遊走(電気走性)を促進する適切な刺激条件を確認することができる.褥瘡の治癒過程で肉芽増殖を促進する時に創縁に設置する電極の極性と電流強度を厳密に設定する根拠を提案することができるので、今後の臨床治療研究の基盤となるデータとしての意義がある。

電気刺激群では、白金電極(成分;白金99.98%)により微弱直流電流刺激条件(周波数;0.3Hz,電流強度;50,100μA,通電時間;4時間)にて、培養ディシュ内の線維芽細胞に通電した。尚、対照群は同様の設定をするが、通電しなかった。微弱直流電流刺激装置は、極性と通電時間を改良したTrio300(出力精度±30%以内,伊藤超短波株式会社製)を使用した。(神戸大学医学部倫理委員会で承認済)電気走性の活性度を確認するめの新しい手技を開発し、ディシュ(直径35mm)を活用して、培養デイシュ(直径100mm)内に線維芽細胞(細胞数;3×10^5)を均等に円状に播種し、両端に白金電極を置き、インキュベーター庫内(温度;36°C,CO_2濃度;5.05.5%)にて微弱直流電流刺激を実施した。通電終了直後に、蓄電効果を解消するため両極をシャントした。また、線維芽細胞凝集塊の浮遊による移動を除外するために、通電直前、直後に細胞の遊走状況を顕微鏡下で写真撮影し記録した。その結果、Scion imageソフトを活用して介入前後で移動した線に囲まれた面積を測定することにより、線維芽細胞の遊走距離を細胞群として確認することができた。線維芽細胞では、陰極側で好中球(遊走最適電流強度;60μA)より高い電流強度100μAの通電により,電気走性の亢進を推測できた。今回の実験結果から、褥瘡の治癒過程で肉芽増殖を促進する時に、創縁に設置する電極の極性と電流強度を厳密に設定する根拠を提案することができるので、今後の臨床治療研究の基盤となるデータとしての意義がある。
電気刺激によるABR,MLC,SVRを指標とする脳死の判定と神経病理学的研究

I)脳死を経た,側頭骨病理標本と脳病理標本は5例,集めることが出来た.現在までに1例のみすべての組織標本が完成したので,これを検索した.側頭骨では,蝸牛は,コルチ器の自己融解・血管条の別離が全回転に観察された.蝸牛神経は保存されてはいたが配列が不整であった.蝸牛神経核は,背側核も腹側核も神経細胞の消失が著明であった.上オリーブ核,下丘,内側膝状体,聴皮質のニューロンは膨化していた.したがってABRが脳死状態で,消失することは,蝸牛レベルでの障害を疑わせた.II)脳死状態の誘発反応による評価・脳波が平坦になり, ABRも消失して,脳幹死状態になっても,視覚誘発電位の網膜電位が60%は残存しており,新な脳死の判定のための指標として重要な価値があると考えられる. III)電気刺激による聴性誘発反応:ヒトでは人工内耳を移植した1例について調べた.人工内耳は米国3M社製のシングルチャンネルのものを用いた.音刺激として与えたクリックは内部レシーバーにより電気刺激に変換された.中間潜時反応と緩反応は良好に記録された.しかし,潜時20msecまでは電磁波誘導によるアーチファクトが混入し,記録としてはABRは区別できなかった.しかし,モルモットやネコでは正円窓の電気刺激でABRは記録された.したがって実験的にはABRは電気刺激によっても記録されるが患者に対してはアーチファクトの処理が難しく適当ではないと考えられた.患者にはP300のプロトコールで250Hz VS 500Hz,語音のAKA VS KUROの弁別をさせたところ, P300,N400が出現した.電気刺激の誘発反応は脳幹よりも大脳機能検査にむしろ適当と考えられた.I)脳死を経た,側頭骨病理標本と脳病理標本は5例,集めることが出来た.現在までに1例のみすべての組織標本が完成したので,これを検索した.側頭骨では,蝸牛は,コルチ器の自己融解・血管条の別離が全回転に観察された.蝸牛神経は保存されてはいたが配列が不整であった.蝸牛神経核は,背側核も腹側核も神経細胞の消失が著明であった.上オリーブ核,下丘,内側膝状体,聴皮質のニューロンは膨化していた.したがってABRが脳死状態で,消失することは,蝸牛レベルでの障害を疑わせた.II)脳死状態の誘発反応による評価・脳波が平坦になり, ABRも消失して,脳幹死状態になっても,視覚誘発電位の網膜電位が60%は残存しており,新な脳死の判定のための指標として重要な価値があると考えられる. III)電気刺激による聴性誘発反応:ヒトでは人工内耳を移植した1例について調べた.人工内耳は米国3M社製のシングルチャンネルのものを用いた.音刺激として与えたクリックは内部レシーバーにより電気刺激に変換された.中間潜時反応と緩反応は良好に記録された.しかし,潜時20msecまでは電磁波誘導によるアーチファクトが混入し,記録としてはABRは区別できなかった.しかし,モルモットやネコでは正円窓の電気刺激でABRは記録された.したがって実験的にはABRは電気刺激によっても記録されるが患者に対してはアーチファクトの処理が難しく適当ではないと考えられた.患者にはP300のプロトコールで250Hz VS 500Hz,語音のAKA VS KUROの弁別をさせたところ, P300,N400が出現した.電気刺激の誘発反応は脳幹よりも大脳機能検査にむしろ適当と考えられた.本年度は音刺激によるABR・MLC・SVRを指標として意識障害・脳死の判定のための研究と電気刺激によるABR・MLC・SVRのための予備実験をネコを用いて行った。1.ICUに入院した患者のうち急性期の意識障害患者および、脳死と臨床的に見なされる患者について、研究した。その結果、従来の脳死という概念は、脳幹死という概念にとって代わるべきであるという結論に達した。すなわち、ABRに異常波形が生じた場合、ほとんど救命されないからである。聴性誘発反応による生命予後の予測は、ABR,MLC,SVRのすべてが記録されると100%救命され、ABR,MLCだけでは90%救命され、ABRだけが正常であれば60%の救命率である。しかし、脳幹障害型のABRでは10%,ABRが無反応であれば、救命された例はなかった。ABRが無反応であった例は脳幹死と呼んで良いと考えられる。2.神経病理学的研究:ICUで脳死を判定され、その後死亡した症例は5例ある。そのうち1例は側頭骨・脳の病理標本は完成した。他の4例は現在、プロセス中である。3.クリップ型外耳道蝸電図電極の開発。脳幹死をさらに調べるためには蝸電図の記録が必要である。従来の針電極は不便であるため、先端にAg/Clの銀ボール電極をつけた、クリップ型蝸電図電極を作成し、記録を始めた。4.電気刺激によるABR。ネコの正円窓に置いた電極を用いて、麻酔下のABR記録を行った。その結果、自然刺激の【II】【III】【IV】波に相当する波形が得られることがわかった。
正常及び病的状態における硝子体中の水動態に関する系統的研究

硝子体中の水および物質の動態は、網膜色素上皮(RPE)の能動移送によるところが大きい。摘出家兎RPEを用いたfluorescein(F)のUssing型chamberを用いた検討は我々が既に報告しているが、今回我々はFに比べ血液眼柵の生体トレーサーとしてより優れているとされるcarboxy-fluorescein(CF)の移送を初めて検討した。CFのchamber内濃度が30μMのときの透過係数は、外向きが内向きの約2倍と有意に大きかったが(P<0.01)、Fの既報値では約4倍であり、差異はCFの方が小さかった。また、能動輸送の阻害剤であるProbenecid、Ouabain、24-Dinitrophenol投与時のCFの外向きの移送は、3種類とも有為に抑制されたが(P<0.02)、Probenecid投与時の内向きの移送に有為差は無かった。以上よりCFは、一部がRPEにより外向きに担体依存の能動輸送を受けるが、その割合はFより遥かに少ないことが判った。またCFのhalfsaturation consentration、maximum velocityを求めたところ、Fの既報値に比し、CFは担体との親和性、最高移送速度ともに低値と考えられた。次にCFを用いて、術中潅流液であるBSS Plusに含まれる酸化型グルタチオン(GSSG)の血液網膜柵(BRB)の保護作用を検討した。0.3mMのGSSGを含むものBSS(+)、含まないものBSS(-)、Krebs'bicarbonate Ringer液の3種類の溶液で両側chamber内を満たし、内向きの透過性を求めたところ、有意にBSS(+)が低値を示した(P<0.02)。GSSGは角膜内皮保護作用、血液房水柵保護作用があると報告されており、GSSGがBRB保護作用も有することが初めて示唆された。受動的に拡散するトレーサーの拡散係数の見かけ上の変化を測定すれば、間接的ではあるが細胞間隙を通しての水の動きを測定できるはずである。CFは今回の研究を通してその性質が明確となり、今回の実験系は硝子体中の水の動きを捉えるためにも優れていると考えられた。今回我々は、まずin vitroの実験として、Ussing型chamberにおける、carboxyflu orescein拡散を指標としたBSS PlusとS-MA_2の網膜色素上皮に対する影響の検討を行った。術中潅流液の角膜内皮や血液房水柵に対する報告は既に成されているのに対し、血液網膜柵等の網膜色素上皮機能に対する報告は未だに成されていない。今回の実験は、現在本邦で最も多用されている術中潅流液であるBSS PlusとS-MA_2の、血液網膜柵に対する透過性と網膜色素上皮活性を検討するものである。実験方法は、既に報告した自色家兎の摘出網膜色素上皮のUssing型chambersystemによる方法(日本眼科学会雑誌95;434-440、1991)に準じて行ったが、今回は従来トレーサーとして用いられてきたfluoresceinではなく、より血液網膜柵機能の評価に有用とされるcarboxyfluorescein(CF)をトレーサーに用いた。CF濃度の経時変化から、透過係数P(cm/sec)を算出したところS-MA_2群;P=1.18±0.26×10^

<-5>cm/sec (MEAN±SD)、BSS Plus群;P=0.85±0.15×10^<-5>cm/sec(MEAN±SD)と有意にS-MA_2群の方が高値を示した。(P<0.05)一方、網膜色素上皮の細胞活性を示す経上皮電位と短絡電流では両群間に有意差はなかった。このため、BSS Plusの方がS-MA_2に対し侵襲がより少ない術中潅流液と考えられた。両潅流液の成分の最も大きな差異は、酸化型グルタチオン(GSSG)がBSS Plusに含まれている事である。GSSGは角膜保護作用、血液房水柵保護作用があると報告されており、GSSGが血液網膜柵保護作用も有する可能性が示唆された。この結果は、第97回日本眼科学会総会にて発表予定である。今後は、この結果を踏まえ血液網膜柵に対する術中潅流液の影響をさらに解析するとともに、本研究のもう一つの柱であるin vivoの実験もあわせて行ってゆきたい。硝子体中の水および物質の動態は、網膜色素上皮(RPE)の能動移送によるところが大きい。摘出家兎RPE用いた、fluorescein(F)のUssing型chamberを用いた検討は我々が既に報告しているが、今回我々はFに比べ血液眼柵の生体トレーサーとしてより優れているとされるcarboxy-fluorescein(CF)の移送を初めて検討した。CFのchamber内濃度が30μMのときの透過係数は、外向きが内向きの約2倍と有意に大きかったが(P<0.01)、Fの既報値では約4倍であり、差異はCFの方が小さかった。また、能動輸送の阻害剤であるProbenecid、Ouabain、2,4-Dinitrophenol投与時のCFの外向きの移送は、3種類とも有意に抑制されたが(P<0.02)、Probenecid投与時の内向きの移送に有意差は無かった。以上よりCFは、一部がRPEにより外向きに担体依存の能動輸送を受けるが、その割合はFより遥かに少ないことが判った。またCFのhalfsaturation consentration、maximum velocityを求めたところ、Fの既報値に比し、CFは担体との親和性、最高移送速度ともに低いと考えられた。次にCFを用いて、術中潅流液であるBSS Plusに含まれる酸化型グルタチオン(GSSG)の血液網膜柵(BRB)の保護作用を検討した。0.3mMのGSSGを含むものBSS(+)、含まないものBSS(-)、Kreds'bicarbonate Ringer液の3種類の溶液で両側chamber内を満たし、内向きの透過性を求めたところ、有意にBSS(+)が低値を示した(P<0.02)。GSSGは角膜内皮保護作用、血液房水柵保護作用があると報告されており、GSSGがBRB保護作用も有することが初めて示唆された。受動的に拡散するトレーサーの拡散係数の見かけ上の変化を測定すれば、間接的ではあるが細胞間隙を通しての水の動きを測定できるはずである。CFは今回の研究を通してその性質が明確となり、今回の実験系は硝子体中の水の動きを捉えるためにも優れていると考えられた。
加齢性疾患サルコペニアと転写因子Ｎｒｆ１によるタンパク質恒常性維持の破綻の相関

サルコペニアとは加齢に伴って筋肉量が減少する疾患であり、その発症による身体機能の低下がさらに筋肉量を減少させるという悪循環に陥る。つまりサルコペニアの克服のためには、発症初期に筋肉量の減少をいかに抑えるかが重要なポイントである。しかしながら、サルコペニアの発症機構の詳細は未だ明らかにされておらず、さらには研究に有用なモデルマウスも少ないのが現状である。そのような現状において、申請者が作製した骨格筋特異的Nrf1ノックアウト(Nrf1MKO)マウスはサルコペニア様病態を呈することを明らかにした。そこで本研究では、Nrf1とサルコペニアとの関連を明らかにすることを目的とする。2018年度は以下の2点について解析し、明らかにすることができた。(1)Nrf1の標的遺伝子候補を同定するトランスクリプトーム解析Nrf1が制御する標的遺伝子候補を網羅的に同定するため、ChIP-seq解析とマイクロアレイ解析を行い、そのデータからNrf1が直接制御する可能性のある標的遺伝子候補を複数同定することができた。(2)Nrf1によるミトコンドリア恒常性に関わる遺伝子の発現制御前項で同定した標的遺伝子候補から、GABARAPL1に着目した。GABARAPL1は、エネルギー産生をおこなうミトコンドリアの恒常性維持機構である、マイトファジーに関わると考えられている。ChIP-qPCR解析およびNrf1をノックダウンした際の発現変動から、GABARAPL1がNrf1により直接制御されていることを明らかにした。これらの成果は当初の研究計画とは異なるものの、大きな展開をもたらしている。ChIP-seq解析ではNrf1が結合したゲノム領域を抗Nrf1抗体により濃縮し、次世代シークエンスによりその配列を同定した。これまで明らかにされていたプロテアソーム構成遺伝子近傍にNrf1結合領域が同定されたことから、本解析が成功していることが確認できた。またマイクロアレイ解析ではプロテアソーム阻害剤でNrf1を安定化させた条件において、Nrf1依存的に発現変動する遺伝子群を同定した。これらの解析結果を統合し、Nrf1がプロテアソーム構成遺伝子のみならず、細胞の恒常性維持に関わる遺伝子を制御している可能性を見出した。GABARAPL1はミトコンドリアの恒常性維持機構であるマイトファジーに関わると考えられている。また、ミトコンドリアはエネルギー産生をおこなう細胞小器官であり、常にエネルギーを必要とする骨格筋においてミトコンドリアは重要である。ChIP-qPCR解析およびsiRNAを用いてNrf1をノックダウンした際の発現変動から、GABARAPL1がNrf1により直接制御されていることを明らかにした。(1)Nrf1によるミトコンドリア恒常性維持機構についての精査Nrf1がミトコンドリア恒常性に関与すると考えられているGABARAPL1を制御することについて確証を得たので、果たしてその発現制御が機能的であるか検証する。実際、Nrf1が活性化するプロテアソーム阻害時にはミトコンドリアに障害が出ることが報告されている(Maharjan S. (2014) Sci. Rep.)。そのミトコンドリア障害はNrf1の活性化による遺伝子発現制御により軽減されている可能性がある。そこで、GABARAPL1ひいてはNrf1依存的なプロテアソーム阻害によるミトコンドリアの性状の変化を解析していく。(2)Nrf1関連因子Nrf3はミトコンドリア恒常性を制御しうるか?Nrf1関連因子であるNrf3は、Nrf1と同じ分子メカニズムで制御を受けている(Chowdhury AMMA. (2017) Sci. Rep.)。この知見から、Nrf1とNrf3が活性化する局面およびその機能には共通な部分があることが示唆される。さらに、報告者はNrf3もNrf1同様にGABARAPL1を制御していることも見出している。これらのことから、上記解析をNrf1とNrf3の両因子に着目しておこなう。

(2)Nrf1によるミトコンドリア恒常性に関わる遺伝子の発現制御前項で同定した標的遺伝子候補から、GABARAPL1に着目した。GABARAPL1は、エネルギー産生をおこなうミトコンドリアの恒常性維持機構である、マイトファジーに関わると考えられている。ChIP-qPCR解析およびNrf1をノックダウンした際の発現変動から、GABARAPL1がNrf1により直接制御されていることを明らかにした。これらの成果は当初の研究計画とは異なるものの、大きな展開をもたらしている。(1)Nrf1の標的遺伝子候補を同定するトランスクリプトーム解析Nrf1が制御する標的遺伝子候補を網羅的に同定するため、ChIP-seq解析とマイクロアレイ解析を行い、そのデータからNrf1が直接制御する可能性のある標的遺伝子候補を複数同定することができた。ChIP-seq解析ではNrf1が結合したゲノム領域を抗Nrf1抗体により濃縮し、次世代シークエンスによりその配列を同定した。これまで明らかにされていたプロテアソーム構成遺伝子近傍にNrf1結合領域が同定されたことから、本解析が成功していることが確認できた。またマイクロアレイ解析ではプロテアソーム阻害剤でNrf1を安定化させた条件において、Nrf1依存的に発現変動する遺伝子群を同定した。これらの解析結果を統合し、Nrf1がプロテアソーム構成遺伝子のみならず、細胞の恒常性維持に関わる遺伝子を制御している可能性を見出した。GABARAPL1はミトコンドリアの恒常性維持機構であるマイトファジーに関わると考えられている。また、ミトコンドリアはエネルギー産生をおこなう細胞小器官であり、常にエネルギーを必要とする骨格筋においてミトコンドリアは重要である。ChIP-qPCR解析およびsiRNAを用いてNrf1をノックダウンした際の発現変動から、GABARAPL1がNrf1により直接制御されていることを明らかにした。(1)Nrf1によるミトコンドリア恒常性維持機構についての精査Nrf1がミトコンドリア恒常性に関与すると考えられているGABARAPL1を制御することについて確証を得たので、果たしてその発現制御が機能的であるか検証する。実際、Nrf1が活性化するプロテアソーム阻害時にはミトコンドリアに障害が出ることが報告されている(Maharjan S. (2014) Sci. Rep.)。そのミトコンドリア障害はNrf1の活性化による遺伝子発現制御により軽減されている可能性がある。そこで、GABARAPL1ひいてはNrf1依存的なプロテアソーム阻害によるミトコンドリアの性状の変化を解析していく。(2)Nrf1関連因子Nrf3はミトコンドリア恒常性を制御しうるか?Nrf1関連因子であるNrf3は、Nrf1と同じ分子メカニズムで制御を受けている(Chowdhury AMMA. (2017) Sci. Rep.)。
小型拡散火炎の「超」安定機構：小型化に伴う超過エンタルピー燃焼の実証

火炎を小型化するだけで自動的に発現する燃焼安定化機構の存在を確認するため,低温で反応性の高い燃料(水素,DME)を考え,火炎付着のメカニズムを反応論的に検討を行った.また熱循環モデルを構築し,熱循環が発現する条件を数値的に検討した.さらにバーナ内部の改質状況の観察系としてPt-WO3によるガスクロミックセンシングを新規導入することで,極細バーナ内部のガス分布を検知できるセンサの特性に関して詳細な検討を行った.結果,ガスクロミック反応過程における温度依存性が強いため,呈色画像から濃度分布を推定するには適切な温度補正を行うが不可欠であることを明確にした.本研究は,小型バーナで実現される自立型の熱循環により,バーナ内部で反応活性をもたらし超安定燃焼が実現させる可能性について探求するものである.この実現のため,(1)バーナ内部で起き得る化学反応による燃料改質度合の予測,(2)熱循環による効果の整理,(3)改質状況の可視化を順次実践する.初年度では,(3)のための環境整備ならびに(1)(2)を数値予測するための詳細反応解析手法の確立ならびにその実施を行った.上記(3)に向けた諸検討として,当初案では外注により対応することを想定していたが,生成される薄膜の特性把握がセンシング精度に大きく依存することを勘案し,自前で薄膜生成が可能かどうかを検討した.そのための予算措置が取れないと判断し,その代案として様々な検討を行った結果,本学に所属する伊埼教授が所有する薄膜形成装置を利用させていただくことになった(伊埼教授には快諾済み).本年度はその装置利用のための準備に費やし,実際の実験実施については次年度以降に行うよう整備した.一方,(1)(2)についてはポストドクターの支援を受けながら数値計算を実施し,一定の成果を挙げることができた.本成果については次年度以降の国際会議等で公表してゆく予定である.本研究では,極細バーナ内部での反応領域を間接的に求めるために,白金酸化タングステン(Pt-WO3)薄膜が持つ特性の一つである「スピルオーバ効果」を利用することでマイクロバーナ内部の水素存在領域をセンシングすることを目指している.そのための薄膜製造法に関する知見を収集し,実際にガラス基板に対してゾルゲル法によってPt-WO3薄膜を作成し,水素応答について調べた.薄膜製造については同専攻の伊崎研究室および戸高研究室に協力いただいた(製造法のノウハウ伝授,薄膜製造装置の貸与など).まずは水素応答に与える薄膜製造過程の効果を調べるため,薄膜層数および焼きなまし温度について検討した.その結果,応答速度が積層数の増加に伴い早くなることがわかった.ただし焼きなまし期間において薄膜がひび割れるなどの問題も生じた.このような割れの原因として考えられるものに組織片のサイズがある.文献によればチタンなどを少量ドープすることで組織片を小さくすることができるとあるため,そのような工夫を凝らすことで計測に耐えうる薄膜が得られるものと考えている.元々の計画では薄膜温度に対する感度依存性などを調べる予定であったが,現時点では温調装置を配備したところまでは済んでいるものの,実験を進めるには至らなかった(上記の通り,薄膜が破損してしまうことが原因である).また,水素を安全に扱うため実験用のチャンバ設計を数回見直すなど,試験県境の整備に多くの時間を費やすこととなった.次年度はまず丈夫な薄膜製造を行うと共に,スピルオーバ効果の温度依存性について実験的に明らかにし,マイクロバーナ内部の水素検知,すなわち反応領域センサとして利用可能であることを示す予定である.年度当初は,本年度の目標として,薄膜製造,試験チャンバの設計・設置,スピルオーバ効果の温度依存性の把握という3点を掲げていたが,そのうちの2つは実施を到達目標をクリヤした.すなわち,水素漏洩のない試験チャンバを製作してスピルオーバ試験ができる環境の整備を行った.同時に実際にガラス基板に対してゾルゲル法によってPt-WO3薄膜を作成し,水素応答について調べた.感度特性として,水素への感度が薄膜の積層数の増加に伴い変化するなど貴重なデータは取得できたものの,薄膜がひび割れてしまうなどの技術的問題が解決できていないことも詳らかになった.薄膜の割れについては当初の想定外であり,実際に薄膜を製造してから明らかとなったことである.元々薄膜製造に関する知見がないところから始めているため,このような不測の事態が起きることは不思議ではない.既にどのような対策を施すのかの目処はついているため,3つ目のやり残した目標分は次年度に対応できる準備は整えている.なお,水素用の試験チャンバの開発については,水素ガス配管の工事に関する諸手続きが予想を超えた時間がかかり,そこからのチャンバ開発となったために年度後半までずれ込んだ.Pt-WO3薄膜の作成ならびに水素暴露時の変色シグナル強度の再現性の再確認を行うと共に,試験チャンバ内部の温度を制御することで,ガスクロミック反応の温度依存性について検討した.膜厚によって呈色感度の違いはあるものの,30Kの温度変化にも関わらず呈色反応強度および反応感度は著しく増加することがわかった.高温時のガスクロミック応答は(呈色反応を阻止する働きを示す)周囲酸素濃度が低い状況と酷似しており,温度依存性は狭い温度変化領域においては線形関数で近似できることが予想される.

この関係から,ガスクロミック反応過程の素過程の支配因子を調べることができる.当初試験より薄膜を施したを垂直に配置して100%の水素ガスを与えるような装置システムにしているが,このままだとチャンバ内の空間制限により室内に与えたヒータが効率的に薄膜の温度上昇に使えない.そこで現在はチャンバ内部の構造を再編し,下から上へ水素とヒータ加熱を与えることでより高温を適切な時間与えることができる系に改良し,本検討の継続を進める予定である.火炎を小型化するだけで自動的に発現する燃焼安定化機構の存在を確認するため,低温で反応性の高い燃料(水素,DME)を考え,火炎付着のメカニズムを反応論的に検討を行った.また熱循環モデルを構築し,熱循環が発現する条件を数値的に検討した.さらにバーナ内部の改質状況の観察系としてPt-WO3によるガスクロミックセンシングを新規導入することで,極細バーナ内部のガス分布を検知できるセンサの特性に関して詳細な検討を行った.結果,ガスクロミック反応過程における温度依存性が強いため,呈色画像から濃度分布を推定するには適切な温度補正を行うが不可欠であることを明確にした.上記項目9記載の通り,本課題で克服すべき課題を実現するための手順を順当に進めており,現在のところ,特段実施困難な課題も出ておらず,次年度の目標設定も明確であり,当初目標は期間内に十分達成できるものと考えている.当初予定では,初年度終了時に可視化システムの構築をあげていたが,薄膜形成対策の確定に時間を要したため,それは次年度に譲ることにした.その意味で予定通りの達成度にはなっていないものの,数値解析については予定よりも大幅に進めることが出来ているため,次年度以降はほぼ実験研究に集中することができる.その意味において,達成度は十分であると判断している.最終年度ではスピルオーバ効果の温度依存性を把握して,濃度と温度の関数化を試みる.水素を燃料とするマイクロバーナ(スロットバーナを想定)に薄膜を設置し,温度を熱電対あるいは赤外線カメラなどでモニタすることで,水素の存在領域を可視化することを試みる.このときに必要となる薄膜センサの特性とは,変動速度に対する応答速度ではなく,変動濃度に対する感度である.対象とするマイクロバーナ内部は定常系であるため,速度変動に対しては大きな問題とは考えない.また,バーナ先端付近は高温になることを想定し,高温にしてもひび割れなどがないような微細組織を持つ薄膜として仕上げることが適切であるため,そのような薄膜製造を行う.得られた結果の妥当性については,スロットバーナに対する(水素の詳細反応を含めた)数値計算を実施し,それを活用することを予定している.実験で得られるのは(熱電対などによる壁面温度と)水素濃度の分布のみであるため,反応領域については間接的にしか知ることができない.一方,数値計算では反応領域やラジカル分布などの詳細を知ることができるため,これを利用することで,バーナ内部の反応構造に関する知見を得ることができる.定量一致をさせることは表面反応モデルを加えても著しく困難であることが想定されるため,条件(バーナの熱伝導率,終始酸素濃度など)を変化させることでバーナ内部の反応領域の幅を変え,実験的に得られる水素存在領域の挙動が数値予測と合致するか否かで,実験結果の検証としたい.ただし,スロットバーナ火炎における詳細反応数値シミュレーションは容易なものではないため,本年度で完了するものとは位置づけず,次年度を超えて実施を継続することで検証へ対応することを考えている.28年度が最終年度であるため、記入しない。
慢性炎症性気道疾患における過去喫煙の影響；エピゲノム変化を介した機序の解明

喫煙喘息例の特徴である好酸球・2型炎症/好中球性炎症を惹起しうる因子に着目し、ブドウ球菌由来スーパー抗原(SE)への感作と禁煙後の炎症遷延との関係を臨床検体で明らかにした。一方SE刺激下気道平滑筋細胞でのサイトカイン発現に有意な変化はなく、この系でのエピゲノム解析候補サイトカイン同定は困難であった。次に2型炎症喘息例において、IL4RαとADAM33の多型が各々独立して高いodds比で増悪に寄与することが示された。特に後者は喫煙喘息に特徴的な混合性炎症と関連することが示された。臨床的寄与度の高いゲノム変化部位を同定し、効率的なエピゲノム解析の基盤形成に寄与したと言える。バイサルファイト処理後のDNAは脆弱になるため、臨床検体由来DNAのバイサルファイト処理は、全ての候補CpG islandのprimerとMSqPの条件設定ができた段階で一括解析する予定である。また、重症喘息、喫煙喘息、COPD例において、スーパー抗原であるブドウ球菌由来エンテロトキシン(SE)への感作増加が報告されている。我々もSEと喘息コントロール不良、喘息発症年齢、遺伝子多型との有意な関連を認めており(Matsumoto H, et al. Paper in submission)。今年度は、SE曝露後のASMも継代し、epigenome解析を追加する。我々は、喫煙喘息例では好中球性炎症に加え好酸球性・2型炎症が遷延し、アトピー素因が強調されることを示してきた。本研究では喫煙喘息例の一つの特徴である好酸球性・2型炎症/混合性炎症を惹起しうる因子に着目し、それらの因子の探索からエピゲノム解析への展開を計画した。初めに喫煙と好酸球性・2型炎症に共通する因子として、ブドウ球菌由来スーパー抗原(SE)に対する感作と禁煙後の炎症遷延との関係を臨床検体で明らかにした。一方、SE刺激下気道平滑筋細胞でのサイトカイン発現に有意な変化はなく、この系でのエピゲノム解析候補サイトカイン同定は困難であった。しかし研究期間中に、1)エピゲノム変化部位はゲノム変化部位と密に関連する可能性が示されてきたこと、2)疾患内病型への寄与遺伝子探索には、フェノタイプ_エンドタイプ別解析において、より臨床的寄与度の高い結果が得られる可能性が示されてきたため、最終年度は好酸球性・2型炎症の病態に深く関与するゲノム変化部位の同定を最優先とした。結果、2型炎症喘息例において、喘息増悪にIL4Rα[Odds比4.01 (1.47, 11.1)]とADAM33[Odds比2.81 (1.05, 7.67)]多型が各々独立して高いodds比で寄与することが示された。特に後者は喫煙喘息に特徴的な混合性炎症と関連することが示され、寄与度の高いゲノム変化部位を同定し、効率的なエピゲノム解析の基盤形成に寄与したと言える。SE-B暴露の有無により、ASMにおける候補サイトカインの有意な発現差異を認めず、epigenome解析への展開を行えなかった。呼吸器内科候補CpG islandのprimerとMSqPの条件設定を継続し、SE暴露以外の刺激を加えることで、喫煙暴露の気道系への刺激増幅系を設定する。予備実験に時間を予想よりも費やしたため、試薬の消費が予想よりも少額であった。今年度は臨床検体由来DNAのバイサルファイト処理、MSqP解析を行うとともに、SE曝露後のASMも継代し、epigenome解析を追加する。今年度はDNAのバイサルファイト処理量が増えるため引き継ぎ額は速やかに消費されると予想される。
量子化学計算によるリボソームにおけるペプチド結合形成の反応機構の解明

細胞内では、リボソームでDNAの遺伝情報に基づいて、アミノ酸をつないでタンパク質が合成される。本研究では、量子化学計算を用いてリボソームにおけるペプチド結合形成の反応機構の探索を行った。その結果、リボソームにおけるペプチド結合の形成は、中間体を経由する段階的な機構で進行すること、活性中心にある水分子を経由して水素原子が移動することで反応がスムーズに進むこと、および、反応の遷移状態が活性中心内の立体的、静電的影響によって安定化されることが明らかになった。本研究の目的は、生体内の巨大な複合体であるリボソームにおけるペプチド結合形成反応の段階的な機構を量子化学計算によって検証することである。申請者らは先に行った研究において、リボソームにおけるペプチド結合形成の段階的な反応機構として、反応基質のアミノ基からtRNAのA76へと水素結合によってプロトンが受け渡されるプロトンシャトル機構を提案した(K. Fukushima et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 2012, 85, 1093)。平成25年度は、酵素の活性中心の電子的・立体的影響をより厳密に考慮するために、申請備品のワークステーションを用いて、先の論文よりも広い領域に量子化学計算を適用してプロトンシャトル機構の再検討を行った。計算の入力構造は大腸菌リボソームの50SサブユニットのX線構造データ(PDBID:1VQP)から反応活性中心を含む半径20オングストローム以内の領域(2,354原子)を切り出して作成した。計算はgaussian09プログラムのONIOM法を用い、反応活性中心は精度が高い密度汎関数法を、周辺部は計算速度が速い分子力学法を用いて計算した。先の論文では、量子化学計算(密度汎関数法)を適用した領域は64原子を含んでいたが、本研究では181原子を含む領域を量子化学計算の対象とした。この反応の経路を計算するためには、反応物、遷移状態1、中間体、遷移状態2、生成物、の五つの状態の安定構造を厳密に求める必要がある。平成25年度には、このうち反応の性質を決める上で重要な遷移状態1、中間体、遷移状態2の粗い構造を求めることができた。今後これらの構造の精密化を行い、反応物と生成物の計算を加えてプロトンシャトル機構全体のエネルギーを求める予定である。本研究の目的は、生体内の巨大な複合体であるリボソームにおけるペプチド結合形成反応の段階的な反応機構を、量子化学計算によって検証することである。申請者らは先行研究で、リボソームにおけるペプチド結合形成について、プロトンが移動しながら反応を触媒するプロトンシャトル機構を提案した(K. Fukushima et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 2012, 85, 1093)。平成25年度に申請者は、申請備品のワークステーションを用いてプロトンシャトル機構の詳細について検討を行い、先行研究よりも広い領域に量子化学計算(B3LYP/6-31G(d,p))を適用したONIOM計算によって、二つの遷移状態と反応中間体の粗い構造を求めた。平成26年度は前年度の成果を基にさらに精密な計算を行い、プロトンシャトル機構の反応物、二つの遷移状態、反応中間体、生成物のすべてについて精密な最適化構造を求めた。先行研究で得られていた二つの遷移状態のONIOM計算によるエネルギーは、49.7 kcal/molと66.7 kcal/molであったが、本研究で得られた遷移状態のONIOM計算によるエネルギーは、それぞれ29.5 kcal/molと41.4 kcal/molであった。また、反応活性中心のみをとりだした量子化学計算(B3LYP/6-31G(d,p))による遷移状態のエネルギーは、先行研究では38.2 kcal/molと50.9 kcal/molであったが、今回の計算では、27.3 kcal/molと32.4 kcal/molであった。平成26年度に行った計算の結果、ONIOM計算において量子化学計算の適用範囲を広げることにより、先行研究よりも低い活性化エネルギーを得ることができた。本研究の目的は、生体内の巨大な複合体であるリボソームにおけるペプチド結合形成反応の反応機構を量子化学計算を用いて検証することである。平成27年度は、同じONIOM法を用いて、上記のプロトンシャトル機構とは異なる3種類の反応経路について量子化学計算を行った。計算した反応経路は、プロトンシャトル機構と異なる経路で水分子がプロトンを受け渡す段階的な機構、水分子によるプロトンの受け渡しを含む協奏的機構、水分子によるプロトンの受け渡しを含まない協奏的機構の3種類である。計算の結果、新たに見出したプロトンシャトル機構と異なる段階的機構の活性化エネルギーが29.1 kcal/molであり、他の反応機構よりも低いことを明らかにした。リボソームにおけるペプチド結合形成反応の反応機構に関する従来の研究では、活性中心付近の小さな領域のみを対象とした小規模な量子化学計算を、ある特定の反応経路についてのみ計算したものが多かった。しかし、本研究では研究機関全体を通じて、酵素内の環境による立体的、電子的な影響を考慮したONIOM法による量子化学計算を、いくつかの反応経路について行い、各反応径路のエネルギーを直接比較することができた。この成果は、この反応の機構の解明に大きな寄与をするものと考えられる。

本研究では、量子化学計算を用いてリボソームにおけるペプチド結合形成の反応機構の探索を行った。その結果、リボソームにおけるペプチド結合の形成は、中間体を経由する段階的な機構で進行すること、活性中心にある水分子を経由して水素原子が移動することで反応がスムーズに進むこと、および、反応の遷移状態が活性中心内の立体的、静電的影響によって安定化されることが明らかになった。平成26年9月に和歌山県立医科大学から兵庫医科大学へと所属を変更した。新しい所属における研究環境の整備に2ヵ月程度の期間を要し、その間研究を中断せざるを得なかったために、当初の予定よりも研究の進捗はやや遅れている。計算化学平成26年度の研究によって、先行研究よりも低い活性化エネルギーを得ることができたが、二段階目の遷移状態のエネルギーは、まだ十分に低いとは言えない。現在、反応の二段階目に関しては、他の経路を探索中である。そこで今後は、二段階目の新たな経路の探索を進めるとともに、一段階機構などの他の反応機構についての計算も行い、既に求めた反応経路とエネルギーを比較する予定である。平成25年度の研究の予定は、広い範囲に量子化学計算を適用してプロトンシャトル機構を検証することであった。現在の進行状況は、プロトンシャトル機構全体の検証までには至ってないが、反応において重要な遷移状態と中間体の粗い構造を求めることには成功している。これらの構造が明らかになっているので、プロトンシャトル機構の全体像を求めることもさほど困難ではないと考えられる。昨年度の9月に所属を変更したために研究の進捗が予定よりも遅れ、論文投稿や学会発表などの成果発表ができなかったことにより、次年度使用額を生じた。平成26年度の当初の研究計画は、申請者らが提案しているプロトンシャトル機構以外の機構についても反応経路を求め、それぞれの活性化エネルギーを比較することであった。現在プロトンシャトル機構の遷移状態の粗い構造は既に求まっているので、なるべく早い時期に経路全体のエネルギー変化を明らかにし、他の経路との比較に着手したいと考えている。他の反応機構の候補としては、反応に関与するプロトンが触媒的に受け渡されるのではなく、反応物から生成物へと順送りにされるプロトンリレー機構についてのエネルギーを求めたいと考えている。本研究の前半部分である、先行研究の検証は順調に進んだが、後半部分である他の反応機構との比較は、計画よりも遅れている。そこで、この遅れを取り戻すために、昨年度分の繰り越し金と今年度分の予算を合わせて、新たにもう一台のワークステーションを購入し、研究の速度を速める予定である。なお、科研費の残り金額ではワークステーションを購入するのに不足が生じる場合には、科研費と合算可能な予算を用いて、不足分を埋め合わせるつもりである。H25年度に備品として購入したワークステーションの金額が当初の見積もりよりも安くなったことと、この期間の研究成果については、論文投稿などの成果発表がなかったことにより、次年度使用額を生じた。成果発表や情報収集のために使用する予定である。