hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天然型ラッカーゼメディエーターの検索とグリーンケミストリーへの利用

昨年度、アントラセンを指標としたアッセイ系がラッカーゼメディエーター検索に有力であることを報告したことを受けて、本年度はそのアッセイ法を用い、白色腐朽菌であるカワラタケからのラッカーゼメディエーターを検索することを目的とした。メディエーター候補としては、カワラタケ菌体の水抽出物(F)と、ラッカーゼ調製時菌体外培養液の限外ろ液(分画分子量10,000)濃縮物(B)を用いた。ラッカーゼは部分精製したものを使用した。その結果、ラッカーゼ単独では分解されないアントラセンが、これら抽出物の添加により分解され(分解率F:10.3%,B:15.9%)、両フラクションにメディエーター存在の可能性が示唆された。また、界面活性剤Tween80の添加によりアントラセン分解がさらに促進された(分解率F:67.3%,B:75.5%)。Tween80は分子中に不飽和脂肪酸部分を有し、これがラッカーゼメディエーターとして働き相乗的に分解を促進していることが示された。両抽出物はヘキサンおよび酢酸エチルで抽出し活性成分の分画を試みた。抽出物に対するヘキサン可溶部はそれぞれF-Hex:0.2%、B-Hex:0.2%、酢酸エチル可溶部はF-EtOAc:1.2%、B-EtOAc:0.4%と極めて微量であった。各フラクションのアントラセン分解率を測定した結果、ラッカーゼメディエーターであるHBTの分解率97.3%には及ばないものの、F-Hex、F-EtOAcが共に70.0%、B-EtOAcが75.6%の分解率を示した。この結果は、これらフラクション中にメディエーターが存在することを示しているが、前述のように回収量が少なくこれ以上分画・構造決定することが困難であった。
北アメリカ北西海岸先住民諸語の自然談話にみられる複文の調査研究

研究調査対象の言語(セイリッシュ語,ハイダ語)は,いずれもいわゆる複統合的言語であり,従属節の構造も形態論的に複雑である。いずれの言語でも,構造上は従属節と考えられるものが,文法上明確な主節がなく現われることがある。日本語で言われるいわゆる言いさしの現象と類似している文法現象である。この現象がどのような使われ方をしているかという点については,通言語的に比べてみると多くの類似が見られた。すなわち,例えば,警告や注意喚起,あるいは願望などである。その一方で,より広いコンテキストに結びつけるために主節の形式ではなく,従属節の形式を取ることがあることも分かった。初年度であった2011年度には,海外現地調査は次のようにおこなった。1.渡辺:スライアモン語現地調査,2011年8月(約5週間)および2012年1月2月(約3週間)2.清沢(研究協力者):ハルコメレム語およびリルエット語現地調査,8月(約4週間)研究協力者(海外共同研究者)のマリアン・ミスンとニコラス・エバンズとはメールによって連絡を取り続けたが,ミスンとは11月と1月,エバンズとは7,月と11月に渡辺が実際に会って研究打ち合わせをおこなった。国内の研究者同士も主にメールを使っての連絡をとったが,機会を作って実際に会って,研究打ち合わせをおこなった。本研究では,特に,自然談話のなかで節と節がどのように結びつくか考察をおこなっている。参加者が取り組む対象言語はいずれも今まで収集されたテキスト(自然談話)が少なく,その採録,書き起こし,話者との発音表記(書き起こし)や媒介言語への訳の確認など,基礎的な作業を地道に続けるしかない。いずれの言語も話者数が少なく,このような資料を集めるのは緊急の課題であり,単語や単文を集める以上に労力はかかるが,後世に資料を残すためにも重要であると考えられる。特に複数の節がどのようにつながっていくか,そしてなかでも,従属節が主節なしで現われる現象は,自然談話ではなくては出てこないデータである。計画にも盛り込んだように,特に渡辺己と堀は,これまで調査で収集してきたデータをデジタル化し,整理をおこなった。2013年度は以下のとおり現地調査をおこなった。1.渡辺:スライアモン語現地調査, 2013年8月(約5週間)2.清沢(研究協力者):ハルコメレム語およびリルエット語現地調査,8月(約4週間)および2月3月(約3週間)研究協力者(海外共同研究者)のマリアン・ミスンとニコラス・エバンズとはメールによって連絡を取り続けたほか,渡辺はミスンと2014年1月に,さらに渡辺は両者と2014年2月に実際に会って研究打ち合わせをおこなった。本研究では,特に,自然談話のなかで節と節がどのように結びつくか考察をおこなってきた。そのようないわゆる言いさしの現象については,渡辺とエバンズが中心となっておこなった2011年のシンポジウムの成果論集をこの2名で編集中である。2012年度には,海外現地調査は次のようにおこなった。1.渡辺:スライアモン語現地調査, 2012年8月(約3週間)および2013年1月2月(約3週間)2.清沢(研究協力者):ハルコメレム語およびリルエット語現地調査,8月(約4週間)および2月3月(約3週間)研究協力者(海外共同研究者)のマリアン・ミスンとニコラス・エバンズとはメールによって連絡を取り続けたが,両名とも10月に渡辺が実際に会って研究打ち合わせをおこなった。

参加者が取り組む対象言語はいずれも今まで収集されたテキスト(自然談話)が少なく,その採録,書き起こし,話者との発音表記(書き起こし)や媒介言語への訳の確認など,基礎的な作業を地道に続けるしかない。いずれの言語も話者数が少なく,このような資料を集めるのは緊急の課題であり,単語や単文を集める以上に労力はかかるが,後世に資料を残すためにも重要であると考えられる。特に複数の節がどのようにつながっていくか,そしてなかでも,従属節が主節なしで現われる現象は,自然談話ではなくては出てこないデータである。現地調査による資料収集とその分析はおおむね順調に進んでいる。研究者間の連絡や実際に会っての研究討議も順調である。25年度が最終年度であるため、記入しない。2012年10月には国際シンポジウムで渡辺は非従属節について発表をおこなった。今年度も現地調査をおこない,データ収集をおこなう。参加者がデータ入力をする際に使用してきた,あるいは今も使っているフォントがユニコードではないので,データの共有などの際に問題が起こりやすいので,その点への対応を図りたいと考えている。2013年度も引き続き現地調査をおこない,データ収集をおこなう。成果として原語テキスト集を刊行することを念頭に,今年度の調査および研究討議をおこないたいと考えている。年度内の出版はむつかしいかと思われるが,安易なとりまとめではなく,海外の出版社から刊行できるレベルのものを作りたいと考えている。
遺伝子改変インスリン分泌細胞株の効率的作製法開発とインスリン分泌機構解明への応用

インスリン分泌機構やインスリン分泌細胞のストレス応答、生存のメカニズムを解明するためには、遺伝子発現を修飾する分子生物学的検討が必須であるが、インスリン分泌細胞株では核酸の導入効率が低いという難題がある。この点を克服するために、recombinase-mediated cassette exchange法を用い、インスリン分泌MIN6細胞を改変した。すなわち、外来性の遺伝子が必ず遺伝子発現効率の高いゲノム上の位置へ導入されるようにplatform遺伝子をゲノム内に設置した。この方法を用い、100種類近い遺伝子発現修飾MIN6細胞を作製し、インスリン分泌に重要な新規遺伝子を同定した。膵β細胞からのインスリン分泌機構の詳細を理解するために、インスリン分泌細胞株であるMIN6細胞に遺伝子導入し、安定細胞株を作成する方法を検討している。平成27年度には、RMCE法による遺伝子導入を可能とし、遺伝子過剰発現インスリン分泌細胞株をラージスケールで作成することを可能とする方法の第一段階を確立した。最終的に遺伝子の挿入部位を決定することができた。これまでに知られた遺伝子であり、β細胞での発現が豊富である遺伝子であった。また、この遺伝子のノックアウトで問題が生じることがないことが報告されているので、我々の作成したシステムでは、安全な場所への挿入が可能となっていると結論できた。平行して、20 mMのグルコースによるインスリン分泌応答が5 mMグルコース時の811倍になるインスリン分泌の良いクローン3つと25倍であるインスリン分泌の低下した3つのクローンの転写産物をDNA mcroarrayで比較検討した。分泌の良い3つのクローンに共通して発現が増加し、分泌の悪いクローンで共通して発現が低下している遺伝子、あるいはこの逆の関係になっている遺伝子を抽出したところ、約1,000個が存在した。これらの中で、すでに遺伝子名が付与されている遺伝子は約650であった。これらの中には、約30個のこれまでにインスリン分泌に重要な役割を果たすことが知られている遺伝子が抽出されてきており、この方法が適切なものであることを示していた。このうち、cDNA長が2500bp以下で、他のmicroarrey解析で、実際のβ細胞で発現が認められているものを中心に100個を選択し、現在74個について、遺伝子過剰発現がインスリン分泌に与える効果を検討し終えた。その結果、約10個のインスリン分泌に重要な役割を果たすと考えられる新規遺伝子を同定することができた。RMCE法による遺伝子導入を可能とし、遺伝子過剰発現インスリン分泌細胞株をラージスケールで作成することを可能とする方法の第一段階を確立した。また、100個近い遺伝子の過剰発現細胞を作成することで、新規のインスリン分泌に重要な遺伝子の同定ができた点は、順調な進捗といえる。ただし、遺伝子発現を抑制する方法の確立において、shRNAを発現する系は、確立しつつあるものの、CRISPRを利用する系が、CRISPRの遺伝子が大きく、扱いに手間どっており、遅れが生じている。本研究では、開発中のRecombinase-mediated cassette exchange(RMCE)法を用いた遺伝子改変インスリン分泌細胞株の効率的作製法を完成させ、さらにこれを利用し、ラージスケールで、蛋白発現を過剰あるいは抑制・脱落させた細胞を作製・解析し、インスリン分泌機構を詳細に理解することを、目指した。まず、RMCE法のためのplatformを構築し、インスリン分泌MIN6細胞に導入し、platformがゲノム上一か所である細胞を探索したところ、約半数のクローンで一か所に挿入されていることが示唆された。この中から、インスリン分泌応答が良く、GFP遺伝子発現が均一で高いクローンを選別することに成功した。このmaster細胞を用いて、グルコキナーゼの過剰発現および、shRNA発現による発現抑制を試みたところ、約6週間で過剰発現あるいは発現抑制クローン細胞を得ることが可能であった。クローンの細胞が実験に供することができるまで細胞数が増えるのに、さらに2ー3週間を要したが、クローンは本質的に同じplatformの位置に遺伝子が挿入されているisogenicなものなので、これらを混合してインスリン分泌応答を検討することも可能であり、予想通り、過剰発現によりインスリン分泌の増加、発現抑制によりインスリン分泌の低下を認めることができた。さらにこのmaster細胞を用い、これまにインスリン分泌に対する効果が知られていなかったが、我々の予備実験でインスリン分泌を調節する可能性が示唆された6遺伝子について、過剰発現細胞を同時に作製することを試み、成功した。このうち2つの遺伝子についてインスリン分泌の増加が認められた。RMCE法を応用した新規遺伝子改変インスリン分泌株の作製法が有用であり、今後インスリン分泌機構解明が進展すると期待される。MIN6細胞において、遺伝子発現を抑制する方法を確立することをまず第一に行う。これによって、本日までに同定されたインスリン分泌に重要な新規遺伝子をさらに検証することができる。同時に、過剰発現がインスリン分泌に変化を与える遺伝子については、細胞内代謝の流れ等を解析中であるが、さらにこれを推し進めていく。また、インスリン分泌の良いクローンと低下しているクローンの間で、発現が異なる遺伝子の中には約100個のlncRNAが存在していた。
DNA鑑定による国産銘柄鶏、特にさつま地鶏の市場価値と食の安全・安心に関する研究

さつま地鶏は鹿児島県で飼養されている国産銘柄種であり、天然記念物である薩摩鶏にロードアイランドレッドを交雑して造成された集団である。本研究では、ニワトリSNPを用いた費用効率が高くかつハイスループットな解析システムの確立とさつま地鶏の品種鑑定を目的とし、以下の研究を行った。研究1)安価で迅速なゲノムDNA抽出法の確立を目的として,植物で確立されたガラス繊維ろ紙を適用し、条件検討を行った。研究2)わが国でヒトゲノム解析用に開発され、96種類のSNPsによる遺伝子型を同時に判別できるDigiTag2法をニワトリSNP解析に応用し、ニワトリSNP検出システムの開発を行い、実際に薩摩鶏とロードアイランドレッドを含む5鶏集団89羽に利用した。研究1)ニワトリ血球の希釈倍率50倍200倍で1μg程度のゲノムDNAが得られ,LA-PCRによって約5kbの産物も確認できた.2.サンプル吸着後の保存は,室温で4週間までDNA抽出が可能であることを確認した.本法は,1サンプル当たりの費用が10円程度で,コスト面で優れ,16個体の血球からおよそ1時間でゲノムDNAが抽出できた.研究2)DigiTag2解析の結果、1)供試した全89羽の個体識別ができた。2)総合同値確率は8.00×10^<-20>と計算され、10^<19>羽程度のニワトリの識別が可能であることが示唆された。全世界のニワトリの飼養羽数が1.84×10^<10>羽(FAO,2009)であることから、現在の解析で十分な識別能を有することが示唆された。3)NJ系統樹は5集団がそれぞれ独立したクラスターを構成し、分類することが出来た。以上、SNPを用いた品種識別技術への応用の可能性が示唆された。DNA鑑定や個体識別システムの構築について、(1)安価、(2)信頼性を損なわないことに留意して、本年度は下記の2点を検討した。1)安価なゲノムDNA抽出法の検討→ガラスろ紙法1)について、ニワトリのゲノムDNA抽出法には植物のそれで成果を挙げているガラスろ紙を用いた抽出法を応用した。その結果、1検体当たり20円程度でニワトリ血液からゲノムDNAの抽出が行え、約7kbのゲノム領域をPCR法により検出できた。また、サンプルを吸着させたろ紙を1ヶ月程度保存してもゲノムDNAの抽出が可能であることが分かった。2)について、わが国で開発された安価でかつ信頼性の高いDigiTag2法による個体識別技術の開発を行った。その結果、理論上では約1京羽のニワトリの個体識別が可能な技術を開発することが出来た。現在、わが国の食鳥出荷羽数は年間約7億羽であり、全世界で約200億羽のニワトリが飼養されているが、それらを十分に識別可能であることが示唆された。本法は、1検体あたり、2000円程度で行える。以上、今回構築したシステムを利用すれば、安価にニワトリの個体識別やDNA鑑定が可能となることが示され、わが国の食の安全・安心に高く貢献できる技術であると考えている。さつま地鶏は、薩摩鶏とロードアイランドレッドを交雑して得られる銘柄鶏である。今年度は、昨年度開発したDigiTag2法によるニワトリSNPs解析システムを用いて、薩摩鶏とロードアイランドレッドを含む5鶏品種の解析を行い、品種鑑定の可能性を検討した。

供試材料は、薩摩鶏20、インギー鶏19、ロードアイランドレッド19、ブロイラー(コブ)17、レイヤー(デカルブXL)14の計5品種89羽のゲノムDNAであった。判定された遺伝子型から2個体聞の識別能力を表す総合同値確率を計算した。また、遺伝子型のデータから近隣結合法(NJ)による系統樹解析を行った。DigiTag2解析の結果、1)供試した89羽の個体識別ができた。2)総合同値確率は8.00×10^<-20>と計算され、10^<19>羽程度のニワトリの識別が可能であることが示唆された。全世界のニワトリの飼養羽数が1.73×10^<10>羽(FAO,2008)であることから、現在の解析で十分な識別能を有することが示唆された。3) NJ系統樹は5集団がそれぞれ独立したクラスターを構成し、分類することが出来たので、SNPを用いた品種識別技術への応用の可能性が示唆された。また、ブロイラーとロードアイランドレッド、薩摩鶏が遺伝的に近く、インギーとレイヤーが離れて位置づけられた。以上、ニワトリSNPs検出システムを確立し、鶏集団に利用できた。まだ供試数が少ない等の改良点があるものの、本システムを有効に利用すれば、鶏集団の遺伝構造の解析や遺伝的類縁関係、品種識別を効率的に行えるものと期待される。
掲出字画像データベースの構築による『類聚名義抄』の漢字字体規範の研究

1この研究の目的は、平安時代末期(院政期)に僧侶の手によって編纂された成立した『類聚名義抄』の唯一の完本である観智院本『類聚名義抄』にっいて、そのすべての掲出字を一文字ごとに画像情報として抜き出したデータベースを作成し、その漢字字体規範を記述することである。2この研究では、観智院本『類聚名義抄』のすべての掲出字約42,000字について、その所在情報を与えたデータベースを作成した。これによって、観智院本『類聚名義抄』の漢字字体規範を実証的に記述する土台を作ることができた。また、掲出字数と掲出項目数とについて詳細に調査・分析を加えた。3漢字字体規範の研究に資するべく、観智院本『類聚名義抄』の重要な典拠文献である、図書寮本『類聚名義抄』(約6,500字)・『篆隷万象名義』(約16,000字)とを照合して、諸橋『大漢和辞典』番号・JISコード(JIS X O 208)・UCSコード(ISO/IEC l0646)等を与えたデータベースを作成した。4古文献・古字書に関心の深い海外の研究者と意見交換を行い、杭州・ソウル・台北で開催された国際学会で研究発表を行った。あわせて関連の資料調査を行った。5古字書の漢字処理について、情報処理学会の人文科学とコンピュータ研究会において研究発表を行った。特に文字同定の問題について論じた。日本語学及びそれ以外の人文研究者、さらに情報学研究者と意見交換を行った。1観智院本『類聚名義抄』の掲出字の半分について一字ごとに切り出して画像データベースを作成した。切り出し画像と原典との照合・点検を行い、誤りを修正した。2観智院本『類聚名義抄』の掲出字の半分について,すべての所在情報をテキストデータとして入力した。所在情報の入力は、風間書房版と天理善本叢書版とについて行った。諸橋『大漢和辞典』検字番号・UCS番号等の情報は、観智院本『類聚名義抄』の法上の部分を対象として行い、入力の基本方針を固めた。3既存の『篆隷万象名義』データベースと図書寮本『類聚名義抄』データベースを点検・校正して,完成度を高めた。4原撰本系の図書寮本『類聚名義抄』(法上)に対応する観智院本『類聚名義抄』(法上)を対象として,その漢字字体規範の相違・配列順序の共通点と相違点を調査した。5 5月に台湾・台北市の台湾大学で開催された国際シンポジウム「比較語彙研究VIII」に出席し、基本漢字集合に関する研究発表を行い、あわせて観智院本『類聚名義抄』の和訓の分析方法に関して、台湾大学・林立萍助理教授と研究打合せを行った。6 9月に韓国ソウル市で開催された口訣学会国際学術会議「漢文讀法とアジアの文字」に招待されて出席し、研究発表を行うとともに、口訣学会会員との研究打合せ及び関連資料の調査を実施した。7 10月に中国・杭州市の浙江大学漢語史研究センター主催の国際会議(新世紀漢語研究及び浙江言語学研究の回顧と展望国際フォーラム)に出席し,研究発表を行い、あわせて同センターの方一新教授他と日本資料を用いた漢語史の共同研究に関して研究打合せを行った。口頭発表論文は平成18年度中に浙江大学漢語史研究センターから刊行の予定である。1観智院本『類聚名義抄』の掲出字の残り半分について1字ごとに切り出して画像データベースを作成した。切り出した画像と原典との照合を行い、誤りを修正した。2観智院本『類聚名義抄』の掲出字の残り半分について、すべての所在情報をテキストデータとして入力した。

諸橋『大漢和辞典』検字番号・UCS番号等の情報は、全掲出字約4万2千字のうち、約1万4千字について入力を行った。3『〓隷万象名義』と観智院本『類聚名義抄』とを対照して,その漢字字体規範の相違・配列順序の共通点と相違点を調査した。4韓国の李丞宰教授(ソウル大学)、台湾の張寳三教授(台湾大学)等と研究打合せを行い、あわせて関連資料の調査を行った。5研究成果の中文版を文学論を浙江大学漢語史研究中心編の『漢語史学報』第六輯に掲載した。1観智院本『類聚名義抄』の掲出字のすべてについて、1字毎に切り出した画像とその所在情報を入力し、掲出字画像データベースを構築して、その漢字字体規範の記述に資する資料を作成した。掲出字数の総数は約42,000字であった。2この研究で作成した観智院本『類聚名義抄』掲出字画像データベースと『篆隷万象名義』掲出字画像データベースとを照合して、両者の漢字字体規範を対照できるシステムを構築した。『篆隷万象名義』掲出字画像データベースの修正・整備もあわせて行った。3観智院本『類聚名義抄』と『篆隷万象名義』の掲出字とを照合・検討して、観智院本『類聚名義抄』の編纂過程の解明を進めた。その結果、『篆隷万象名義』の全掲出字約16,000字のうち、観智院本『類聚名義抄』に存在する掲出字数は約13,000字であり、その採録率は約80パーセントであることが明らかになった。これはこの研究で初めて解明された成果である。4漢字字書(画像・文字)データベースの構築手法の開発と意義について、研究成果を発表し、特に情報学関係の研究者との意見交換を行った。5韓国と台湾でそれぞれ開催された国際会議において、観智院本『類聚名義抄』データベースとそれを利用した漢字字体の研究について、発表を行った。あわせて意見交換と資料調査を行った。6研究成果をまとめ、研究成果報告書を作成し、関連の研究者に配布した。
生体系固体NMRの高感度化-光を使った汎用法の確立

固体核磁気共鳴(NMR)法は膜蛋白質など医学生理学的な重要性にも関わらず研究が遅れている非結晶性、不溶性分子系の解析を得意とするユニークな分光法であるが、低感度が最大の弱点である。電子スピンの分極を利用する感度向上法は複数知られるが欠点も多い。本研究では従来あまり利用されてこなかった、光化学的に誘起される過渡的な電子偏極を核に移す光CIDNP法に着目、従来のように蛋白質という足場に頼らない、合成や保存、取り扱いが容易な、ありふれた小分子の組み合わせだけで実現する「汎用CIDNP分極剤剤」の創出に成功した。また局所的に発生した高偏極を試料全体に配るための硬度の高い新しい有機マトリクスも開発した。常磁性ラジカル種の電子から核に分極を移す「従来の動的核分極法」に基づいたNMR感度向上法に対し、光励起した過渡的ラジカル種を用いる新手法を立ち上げるのが目的。ありふれた小分子(色素など)だけからなる「分極剤」を設計、合成し、汎用法の確立を目指す。1.光励起フラビンに発生したスピン分極を高周波マイクロ波照射(400GHz)によって核に移動するNMR実験を行ったが、移動が観測できなかった。これに基づき次を実行することを決めた。(1)マイクロ波の周波数と出力の最適条件探索。(2) LED光源より強い、レーザー光源の導入。(3)色素単体でなく、分子内で電子移動を起こして励起電子の再結合を防ぐ手を考える。つまり電子受容体-供与体の「複合分極剤」を設計、合成する。2.高出力レーザー光源を選定、購入した。高出力光をNMRプローブ中の試料まで導入する経路には新たな改造が必要と判明、実行した。3.複合分極剤の設計と合成では複数のアプローチを試みた。(1)分子の自己集合能(ミセル化)を利用する方法。ヒスチジン-PEGとトリプトファン-PEGを合成、フラビン-PEGと共に透明なミセルの形成するプロトコルを確立。蛍光測定で確かめた。NMR測定に移る。(2)フラビン-PEGミセルに疎水的電子受容体をドープする方法。Tyr(溶解度0.05g/100g), indole(0.19g), n-acetyl Tyr ethylester (0.5g)などのドープを試みた。NMR測定に移る。(3)電子供与体と受容体を直接共有結合した分極剤の有機合成。フラビン-イミダゾールを合成。フラビン-インドールの合成が進行中。NMR測定に移る。1.励起フラビンと対になる電子受容体分子の探索と、ミセル化による分子自己集合型分極剤作成プロトコルの開発。両者が接近できるコンストラクトを、蛍光クエンチングを指標に作成した。昨年度、PEG化フラビンとPEG化トリプトファンからなるミセルでは、強い蛍光クエンチから両者の接近は確認できるものの、固体CIDNP現象の観測に至らなかった。励起フラビンが集合して自己クエンチをおこしている可能性があり、今年度はSDS(負荷電)、Triton-X100(荷電無し)、CTAB(正荷電)などの種々のイナートなミセルにPEG化電子授受分子を埋め込む形式の、希釈型ミセル分極剤を作成した。具体的には、電子供与体(FMN、リボフラビン、PEG化リボフラビン)と受容体(アセチルTrp、インドール、インドールアセトアミド、PEG化Trp)の様々な組み合わせを上記のイナートミセルに埋め込み、蛍光クエンチと溶液NMR、溶液CIDNP測定で有望な者を絞り込み、CIDNP-NMR測定を行った。低温(-50°C)では明らかな分極の増大を見るに至らず、分子運動が抑えきれていない可能性がある。極低温(-160°C)条件での実験に移る。2.リボフラビンーインドール共有結合型分極剤の合成。精製度は低いものの合成に成功。極低温の固体CIDNP測定を行ったが、分極の増大を見るに至らず。DMSO/水からなるグラスマトリクスの硬度不足で核の緩和が速すぎると考えられる。種々の糖アルコールで形成する硬いマトリクスを探索する。また、電子ー核の分極移動を能動的におこすためのリカップリング(マイクロ波+ラジオ波)パルス列の設計を始めた。3.500W白色ゼノンランプを選定、購入を済ませた。プローブへの設置と光導入効率の最適化など最終的な調整が済み次第、フラビン以外の色素群に探索を拡張する。NMRプローブ内の空間制約が高く、高出力白色ランプの選定が難航した影響があり、フラビン以外の色素の探索は遅れている。その他はおおむね計画した事を実行できている。1.500W白色光Xeランプ制御系の調整とパルスの発光制御テストを実施、NMRプローブへの光導入経路を構築し、設置を終えた。これで、フラビン以外の色素群の広範な探索を可能にした。まずトリプレットDNPで実績のあるペンタセンに絞り、試料系の確立した。ペンタセン分子は高度に疎水的で水溶液中の生体試料とは相容れないと長らく考えられてきており、水溶性を増す化学修飾などが試されてきた。一方、本研究では昨年確立したミセル化法を応用し、ペンタセン分子の化学的改変を行わずに可溶化に成功した。分極実験に移る。

2.電子受容体ー供与体を共有結合した新規「分極剤」候補、フラビン-イミダゾールの蛍光クエンチング実験で、強力なクエンチングを観測し有望だと証明した。これも水難容性の分子であるが、ミセル化による可溶化法を確立した。3.昨年度までは分極剤をドープした有機マトリクスのNMR信号を頼りに分極移動の可能性を探ってきたが、本年は分極剤分子付近のよりローカルな分極現象にズームして観測できる手を開拓した。バルクな試料全体を見る従来法と違い、現象を平均化してしまわず、より確実に分極可能性を探れる利点がある。この目的で、昨年自己クエンチを避けるため導入した種々の界面活性剤分子の炭素NMR信号を直接分離観測できるパルス系列を設計、分極剤分子付近のスピン分極を直接観測できることを確かめた。昨年度蛍光クエンチング実験で見つけた複数の有望なミセルコンストラクトについて実際の極低温光照射実験を行う予定。4.分極の分配に重要な硬いマトリクスの探索では昨年に続き糖アルコールマトリクスの探索を続け、DSC(カロリメトリ)によるガラス転移点測定、NMR測定、ESR測定を組み合わせて有望候補を4種に絞り込んだ。アルドースの還元能から分極剤の寿命に与える負の効果を見つけたので、これを避ける手法を確立する必要があると判明した。固体核磁気共鳴(NMR)法は膜蛋白質など医学生理学的な重要性にも関わらず研究が遅れている非結晶性、不溶性分子系の解析を得意とするユニークな分光法であるが、低感度が最大の弱点である。電子スピンの分極を利用する感度向上法は複数知られるが欠点も多い。本研究では従来あまり利用されてこなかった、光化学的に誘起される過渡的な電子偏極を核に移す光CIDNP法に着目、従来のように蛋白質という足場に頼らない、合成や保存、取り扱いが容易な、ありふれた小分子の組み合わせだけで実現する「汎用CIDNP分極剤剤」の創出に成功した。また局所的に発生した高偏極を試料全体に配るための硬度の高い新しい有機マトリクスも開発した。計画に沿って分極移動実験と、分極剤の設計と合成を行った。分極剤の創出に関しては、3つのアプローチを同時に遂行しており、おおむね順調に進んでいる。電子から核への分極異動を能動的に行うパルス技術の開発を今年度初期に完成させる。白色ランプの運用を早期に開始し、色素探索範囲を広げる事を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理計画通りフラビン系分極剤の設計合成を進めると同時に、今年度はアセン系、ピレン系、ポルフィリン系などフラビン以外の色素群に手を広げて、分極剤の設計合成、分極移動実験を進める。高出力白色ランプの選定が、NMRプローブ内の高い空間制約から難航し、購入時期がずれ込んだ。ランプシステムの一部としてのパワーメータの選定中。今年度狭帯域レーザーを導入し、光を試料に伝送するためNMRプローブの改造を行った際、高出力光の伝送には予想以上の改造と、それに伴うレーザー伝送用その他の部品が要ることが判明した。H27年度は広帯域ランプの導入を計画しており、同様の問題で追加の出費が予想できる。高出力白色ランプシステムの一部としてのパワーメータの購入。広帯域ランプの購入と伝送系の確立に支出する。
腰痛発生における交感神経因子のメカニズム

目的ラット脊髄硬膜に知覚神経毒であるカプサイシン感受性神経ペプチド陽性線維が存在することは既に報告されている。本研究は、この神経ペプチド陽性線維に、交感神経がどのように関与しているか明らかにすることを目的とした。対象実験動物は以下の3群に分けられる。手術群:右側腰部交感神経節(L2-3)切除術施行。対照群:腰部交感神経切除せず手術のみ施行。無処置群:何の操作も施行せず。方法1.Hot plate test:Hot plateは53°Cで、処置後2週間連続測定した。2.免疫染色(脊髄硬膜):免疫染色は、ABC法(avidin-biotin complex method)で施行した。一次抗体として、抗サブスタンスP血清(SP)、抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド血清(CGRP)、抗ニューロペプタイドY血清(NPY)を用いた。ペプチド陽性線維は、100倍にて鏡検し、描画装置にてトレースした。3.免疫染色(後根神経節):後根神経節(L1-6)は、クライオスタットで15μmに薄切しCGRP免疫染色を行なった。200倍にて鏡顕し、ペプチド陽性細胞の数、大きさを計測した。結果1.手術群は対照群と比べて、術後2日目より、反応時間の有無の遅延を認めた。2.腰部脊髄硬膜の神経ペプチド陽性線維は、CGRPが最も多く、SP、NPYはあまりみられなかった。3.手術群のCGRP陽性線維の分布密度は、術側が、健側に比べて平均44.5%に低下していた。4.後根神経節のCGRP陽性細胞数と大きさは、術側と健側で違いはなかった。結論1.腰部交感神経切除ラットで侵害刺激(熱刺激)に対する反応の遅延があり、この効果は2週間持続する。2.多くの後根神経節由来の知覚神経線維が、腰部交感神経(L2-3)を経由し、脊髄硬膜に分布する。3.腰部交感神経(L2-3)は、腰部硬膜を含む腰痛に重要な役割をもつ。腰痛の責任レベルの同定下肢痛または腰痛モデルの検討により、それぞれの疼痛発症責任レベルを固定することを試みた。(1)疼痛モデル作成A.下肢痛モデル:坐骨神経に疼痛発生物質であるブラジキニンを投与することで、下肢痛モデルが作成された。しかし、このモデルで下肢痛に伴う痛覚過敏の有無は現在検討中である。B腰痛モデル:椎間板にブラジキニンを投与し、腰痛モデルを作成したが、ラットでの腰痛確認は困難であり、評価については、現在検討中である。(2)責任レベルの同定腰痛モデル作成が遅れているため、責任レベルの同定には至っていない。2.腰痛と交感神経の関係手術的腰部交感神経切除群と化学的交感神経遮断群を用い、以下の実験を行い、交感神経の腰痛への関与を検討した。(1)Hot plate test:侵害刺激(熱刺激)に対する反応時間の延長が、腰部交感神経切除群で、術語2日目から、化学的交感神経遮断群では、6-OHDA注射後24時間から認められた(p<0.05)。(2)腰部硬膜における神経ペプチド陽性線維の分布

:CGRP陽性線維の分布密度が、腰部交換神経切除群の術側で、健側と比べて平均45.5%に減少していた(p<0.05)。一方、化学的交感神経遮断群におけるCGRP陽性線維の分布密度は、無処置群と比べて平均388%と著しい上昇を認めた(p<0.05)。(3)後根神経節内のCGRP陽性細胞:腰部交感神経切除群において、後根神経節(L1-6)のCGRP陽性細胞の数や大きさは、術側と健側で差はなかった。以上の結果から、腰痛伝達経路として、交感神経幹内を走行し硬膜に分布する知覚神経の伝達経路の存在することが確認され、交感神経線維が痛覚閾値を修飾することが考えられた。目的ラット脊髄硬膜に知覚神経毒であるカプサイシン感受性神経ペプチド陽性線維が存在することは既に報告されている。本研究は、この神経ペプチド陽性線維に、交感神経がそのように関与しているか明らかにすることを目的とした。対象実験動物は以下の3群に分けられる。手術群:右側腰部交感神経節(L2-3)切除術施行。対照群:腰部交感神経切除せず手術のみ施行。無処置群:何の操作も施行でず。方法1.Hot plate test:Hot plateは53°Cで、処置後2週間連続測定した。2.免疫染色(脊髄硬膜):免疫染色は、ABC法(avidin-biotin complex method)で施行した。一次抗体として、抗サブスタンスP血清(SP)、抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド血清(CGRP)、抗ニューロペプタイドY血清(NPY)を用いた。ペプチド陽性線維は、100倍にて鏡検し、描画装置にてトレースした。3.免疫染色(後根神経節):後根神経節(L1-6)は、クライオスタットで15μmに薄切しCGRP免疫染色を行なった。200倍にて鏡顕し、ペプチド陽性細胞の数、大きさを計測した。結果1.手術群は対照群と比べて、術後2日目より、反応時間の有意の遅延を認めた。2.腰部脊髄硬膜の神経ペプチド陽性線維は、CGRPが最も多く、SP、NPYはあまりみられなかった。3.手術群のCGRP陽性線維の分布密度は、術側が、健側に比べて平均44.5%に低下していた。4.後根神経節のCGRP陽性細胞数と大きさは、術側と健側で違いはなかった。結論1.腰部交感神経切除ラットで侵害刺激(熱刺激)に対する反応の遅延があり、この効果は2週間持続する。2.多くの後根神経節由来の知覚神経線維が、腰部交感神経(L2-3)を経由し、脊髄硬膜に分布する。3.腰部交感神経(L2-3)は、腰部硬膜を含む腰痛に重要な役割をもつ。
運動器疾患におけるユビキチンシステムの関与とその制御に関する研究

破骨細胞は正常な骨リモデリングのみならず関節リウマチや骨粗鬆症などの運動器疾患における骨破壊・骨吸収においても中心的な役割を果たす細胞である。破骨細胞の特徴はきわめて生存期間が短いことであり、生体内では約2週間、in vitroでは1,2日でアポトーシスによって死滅する。このような急速はアポトーシスがどのようなメカニズムで誘導されるかは明らかではない。これまでにわれわれは、Bcl-2ファミリーのBH3-onlyメンバーに属するアポトーシス誘導分子Bimが破骨細胞のアポトーシスに重要な役割を果たしていること、その発現がユビキチン化によって調節されていることを明らかにした。本年の研究においては、このようなBimのユビキチン化が、抗アポトーシス作用を有するBcl-2との結合によって調節されている可能性についで検討した。Bimを大量に発現する細胞は細胞死を起こすが、Bcl-2と共発現させると細胞死が起こらない。またBim単独では細胞における高発現は得られないが、Bcl-2と共発現することによってBimを高発現する細胞を得ることができる。BimはBcl-2を免疫沈降すると共沈してくる。これらの事実はBimとBcl-2との結合が、Bimのタンパクの安定化に重要な役割を果たしている可能性を示唆する。本年の研究によってわれわれは、Bcl-2ファミリーのBH3-onlyメンバーに属するアポトーシス誘導分子Bimが破骨細胞のアポトーシスに重要な役割を果たしていること、その発現がユビキチン化によって調節されていることを明らかにした。マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)は破骨細胞の強力に生存期間の延長を誘導するサイトカインであるが、破骨細胞におけるBimの発現はM-CSFによって強力に抑制される。このときBimのユビキチン化が生じており、このユビキチン化はM-CSFによるERKの活性化を介していることが明らかになった。今後破骨細胞におけるBimユビキチン化の分子メカニズムを明らかにすることにより、効果的な骨代謝疾患治療薬の開発が可能であると考えられる。
新規器官培養系を用いた骨軟骨前駆細胞の分化決定制御機構の解明と骨再生療法への応用

初年度に行ったex vivo骨形成検出システムを用いた解析によりHhとBMPシグナルの組み合わせが骨形成を強力に誘導することが明らかとなった。そのため今年度は、本シグナルの組み合わせが、骨再生能を有するか検討した。まず、臨床応用に向けて、低分子化合物が蛋白質の代わりとなるか検討した。本研究室で見出したヘリオキサンチン誘導体(TH)は、BMP様の作用を有することが明らかにされている。そこで、Hhシグナルを活性化する分子化合物(SAG)とTHの組み合わせがHhとBMPシグナル活性化の組み合わせと同等の骨形成能を発揮するか、ex vivo骨形成検出システムを用いて検討した。その結果、SAGとTHの同時曝露により、骨形成がHhとBMPと同様に、顕著に増加した。次に、SAGとTHの同時曝露が骨再生にどのような効果を示すか検討した。まず、骨欠損部を充填するためのインプラントとして、本研究室で開発したテトラポッド型リン酸カルシウム人工骨を用いた。本人工骨をSAGとTH溶液に浸漬することで、これらの化合物を搭載したハイブリッド型骨再生インプラントを作製した。本インプラントから薬剤が徐放し、骨形成を促進することをin vitroの系で確認した。次に、ラット骨欠損モデルを用いて、本インプラントが骨再生能を有するか検討をした。11週齢ラットの大腿骨骨幹部に2.2mm円柱形の骨欠損部を作製し、本インプラントを充填した。14日後に骨切片およびマイクロCTを用いて骨再生能を解析した。比較群として、薬剤を搭載していないインプラントおよび薬剤一種類のみを搭載したインプラントを使用した。その結果、SAGとTHを搭載したインプラントは骨欠損部における骨量を有意に促進させた。また骨が再生された組織中には骨芽細胞の前駆細胞のマーカーであるOsterixを発現する細胞が確認された。以上より低分子化合物群と人工骨の組み合わせにより、骨欠損の再生を誘導する骨再生インプラントの開発に成功した。今年度計画された研究内容のうち主な実験は完了した。骨軟骨前駆細胞での分化決定機構におけるヘッジホッグシグナルのメカニズムの一端を明らかにした。また、本研究で得られた知見を基にした臨床応用を検討する目的で行った、ラット骨欠損モデルを用いた解析も完了した。以上より、平成25年度実験計画の目的を達成していると考えられる。本研究課題は本年度で終了となるが、更なる基礎研究と臨床応用を目指した研究を計画中である。平成23年度はまず、器官培養系を用いたex vivo骨形成検出システムにおける骨形成シグナルの網羅的探索を行う目的で、ヘッジホッグシグナル(Hh)活性化剤・阻害剤を軸とした、BMPもしくはWntシグナル活性化剤および阻害剤の同時曝露による影響を検討した。骨芽細胞前駆細胞に発現するOsterixの免疫組織化学的解析の結果、Hh活性化剤(SAG)曝露により誘導された軟骨膜における異所性Osterixの発現はBMPもしくはWntシグナル阻害剤との同時曝露により消失しなかった。一方、Hhシグナル阻害剤であるCyclopamineを曝露すると軟骨膜におけるOsterix発現は消失するが、この効果はBMPもしくはWntシグナル活性化剤との同時曝露でも回復しなかった。また、SAGとBMPを同時曝露すると骨殻形成領域が増大した。次に、軟骨膜細胞に対するGli1・Gli2・Gli3の機能解析を行う目的で、初代軟骨膜細胞を用いた解析を行った。初代軟骨膜細胞にGli1、Gli2、Gli3を発現させた後、骨芽細胞分化マーカーの発現を検討した結果、Gli1発現により骨分化マーカーの初期分化マーカーであるalkaline phosphatase(Alp)およびbone sialoprotein(Bsp)発現が上昇した。Gli1発現によるこれらの効果はshRNAを用いたGli1ノックダウンでも確かめられた。さらに、ルシフェラーゼアッセイ、EMSA法およびクロマチン免疫沈降法により、Gli1はAlpおよびBspプロモーターの特定の領域に結合し、これらの遺伝子の転写を促進することが明らかとなった。以上より骨形成制御シグナルであるHh、BMPおよびWntシグナルの中で、Hhシグナルが軟骨膜における骨形成を最も上位で制御しており、Hhシグナルの下流ではGli1が軟骨膜における骨芽細胞分化決定に関与する可能性が考えられた。また、骨形成性シグナルの中で、HhとBMPシグナルの組み合わせは骨形成を強力に誘導することが明らかとなった。前年度のin vitroにおけるGli1・Gli2・Gli3の機能解析によりGli1がヘッジホッグ(恥)シグナルの下流で骨形成に関与する可能性が示唆されたため、Gli1ノックアウトマウス(Gli1KO)を作出し、胎生17日目のマウス胎児の中足骨における骨形成を組織学的に観察した。その結果、軟骨の肥大化・石灰化には大きな変化が認められなかったのに対し、骨殻の形成がほとんど認められず、軟骨膜における骨分化マーカー(a1kaline phosphatase、bone sialoprotein)の発現領域が減少した。また、骨分化におけるマスターレギュレーターであるRunx2、Osterixの発現が軟骨膜で認められず、代わりに異所性に軟骨分化マーカー(type 2 collagen, type 10 collagen)の発現が軟骨膜において認められた。過去の報告で他の組織ではGli1とGli2は翫シグナルの下流で協調的に働くことが知られているため、Gli2KOマウスを作出し、中足骨における骨組織を解析した。

その結果、胎生17日目のGli2KOマウスではGli1KOマウスと同様に、骨殻形成が全く認められなかった。さらに、Gli1とGli2のダブルノックアウト(DKo)マウスを作出し、骨組織を解析した結果、Gli1KOもしくはGli2KOで認められた骨形成異常がDKOではさらに顕著であった。Gli1とGli2の協調作用を確認する目的でin vitroにおいてGli1とGli2を発現させると両者を発現させた細胞では一方のみを発現させた細胞と比較して、優位に骨芽細胞の分化マーカーの発現が上昇した。また、Hhシグナル活性化に対するGli1とGli2発現の応答性を検討する目的でGli1KOマウス、Gli2KOマウス胎児由来の軟骨膜細胞の初代培養を行った結果、Gli1KO細胞では恥シグナルを活性化させてもGli2発現に大きな変化が認められなかったのに対し、Gli2KO細胞ではHhシグナルにより誘導されるGli1発現が顕著に減少した。以上よりHhシグナルの下流ではGli2がGli1発現を制御しており、また両者は骨形成に対して協調的に働くことが明らかとなった。初年度に行ったex vivo骨形成検出システムを用いた解析によりHhとBMPシグナルの組み合わせが骨形成を強力に誘導することが明らかとなった。そのため今年度は、本シグナルの組み合わせが、骨再生能を有するか検討した。まず、臨床応用に向けて、低分子化合物が蛋白質の代わりとなるか検討した。本研究室で見出したヘリオキサンチン誘導体(TH)は、BMP様の作用を有することが明らかにされている。そこで、Hhシグナルを活性化する分子化合物(SAG)とTHの組み合わせがHhとBMPシグナル活性化の組み合わせと同等の骨形成能を発揮するか、ex vivo骨形成検出システムを用いて検討した。その結果、SAGとTHの同時曝露により、骨形成がHhとBMPと同様に、顕著に増加した。次に、SAGとTHの同時曝露が骨再生にどのような効果を示すか検討した。まず、骨欠損部を充填するためのインプラントとして、本研究室で開発したテトラポッド型リン酸カルシウム人工骨を用いた。本人工骨をSAGとTH溶液に浸漬することで、これらの化合物を搭載したハイブリッド型骨再生インプラントを作製した。本インプラントから薬剤が徐放し、骨形成を促進することをin vitroの系で確認した。次に、ラット骨欠損モデルを用いて、本インプラントが骨再生能を有するか検討をした。11週齢ラットの大腿骨骨幹部に2.2mm円柱形の骨欠損部を作製し、本インプラントを充填した。14日後に骨切片およびマイクロCTを用いて骨再生能を解析した。比較群として、薬剤を搭載していないインプラントおよび薬剤一種類のみを搭載したインプラントを使用した。その結果、SAGとTHを搭載したインプラントは骨欠損部における骨量を有意に促進させた。また骨が再生された組織中には骨芽細胞の前駆細胞のマーカーであるOsterixを発現する細胞が確認された。以上より低分子化合物群と人工骨の組み合わせにより、骨欠損の再生を誘導する骨再生インプラントの開発に成功した。
単純楕円型特異点と附随する周期写像のLie環論的構成

double Loop groupのdouble loop Lie algebra上へのadjoint-作用における軌道空間と楕円曲線上の正則vector束の同型類との1:1対応は既によく知られている。この対応を基礎として山田は、double loop Lie algebra上のC^*-bundleへのdouble loop groupの作用を定め、楕円曲線上の不安定vector束のLie環論的特徴付けを行なった。この結果より、単純楕円特異点のLie環論的構成が導けるのであるが、この結果はdouble loop Lie algebra上のC^*-bundleにおけるdouble Lie Group-不変な正則関数の存在を仮定しており、まだ不完全である。その存在を示すためには、無限次元における陰関数定理を使用すれば良いと思われるが、これからの進展を待ちたい。超幾何微分方程式が特異点の合流により、合流型超幾何微分方程式へ退化することは、よく知られた事実である。しかし、関数レベルでこの退化を解析接続の情報までこめて厳密に計算したものは知られていない。渡辺は、これを厳密に計算し、超幾何関数の接続公式の退化から自然に合流型関数の漸近展開が導かれることを示した。庵原は、古賀との共同研究においてN=1超Virasoro代数のVerma modulesの構造を決定し、この結果としてVerma modulesのBernstein-Gel'fand-Gel'fand型のresolutionを得た。更に、Fock modulesの構造を調べ、それに対するB-R-S-T型のresolutionを構成した。山田は、庵原、寺島(神戸大学)との共同研究により、単純特異点とパンルベ方程式の初期値空間更にパンルベ方程式の持つ対称性との関係を明らかにしつつ有る。実際、単純特異点の特異点同時解消空間Xが、初期値空間の開部分多様体となっており、Springer表現に表れるX上への有限ワイル群の作用が、パンルベ方程式に表れるベックルント変換の一部(足りないのは、平行移動分のみ)となっていることを、山田-庵原-寺島は、明らかにした。このことは、何故、リー環に表れるワイル群が、パンルベ方程式の対称性として表れるか説明する新たな知見を与えている。また、パンルベ方程式のモノドロミー多様体に関しても新たなリー群論的構成が、山田-庵原-寺島によって成された。すなわち、単純リー群GからH/Wへの随伴商写像を考え、特異点の構造を調べると、GがA_1,A_2,A_3,D_4場合パンルベ方程式のモノドロミー空間に一致することを明らかにした。また、その系としてモノドロミー空間の特異点同時解消が得られる。フローケ理論によれば、S^1上の微分方程式とそのモノドロミー対応として、アファインリー環と有限次元リー群の対応がある。この対応を用いることにより、パンルベ方程式の初期値空間と対称性が説明できると確信するが、今後の課題である。山田-庵原-寺島は、中心拡大が2-次元である楕円型リー環の商環から出発し、自然にSL(2,Z)、楕円型Weyl群が作用する空間Pを構成した。この空間は、g(E)を楕円曲線E上のG-値の関数全体の成す無限次元Lie環とする時,g(E)上のC^*-バンドルに同型である。さて,この空間には、doubleループ群が作用し、それに関する随伴軌道が、正則ループ群の中心拡大の共役類と1:1に対応している。即ち、Slodowy-helmkeの理論に従えば、空間Pを用いて単純楕円特異点が構成できるはずである。ところが、特異点は不安定正則ベクトルバンドルに対応しており、この事を接続の言葉で表さなければならない。Loop群に於いては、Atiyah-Bott pointの言葉で表現できる事は解っているが、楕円型Lie環の言葉ではまだ解っていない。さて、上記で構成したSL(2,Z)、楕円型Weyl群の作用をCartan部分群に制限すると、Maninn, Levin達がPainleve方程式の研究で用いた作用に一致する事が解った。
統合失調症における大脳基底核出力ニューロンの死後脳を用いた解析

統合失調症の症状出現に関わる神経回路を解明するため、黒質網状層の抑制性ニューロンと、それにより抑制される黒質緻密層のドーパミンニューロンで、統合失調症での遺伝子発現の変化を、14対の性別と年齢がマッチした健常例および統合失調症例から得られた脳切片を用いて調べた。網状層では、抑制性伝達物質GABAの合成酵素であるGAD67のmRNA発現には有意な変化は認めなかった。緻密層では、ドーパミン合成を行うチロシン水酸化酵素およびKNCS3カリウムチャネルサブユニットのmRNA発現が有意に低下していた。膜興奮性を抑制するKCNS3の発現低下がドーパミンの放出過剰と陽性症状に関与する可能性が考えられた。本年度は、大脳基底核出力ニューロンが存在する黒質網状層、および出力ニューロンにより活動性の調節を受けるドーパミン細胞が存在する黒質緻密層において、機能遺伝子の発現を調べた。統合失調症15例、精神神経疾患のない対照例15例から、黒質の脳組織切片を赤核よりも吻側のレベルにおいて、脳幹の長軸に垂直の面で作成し、in situ hybridization法にて、出力ニューロンの伝達物質GABAの合成酵素であるGAD67のmRNAとドーパミンニューロンに発現するドーパミン合成酵素tyrosine hydroxylase (TH)と電位依存性カリウムチャネルのKCNS3サブユニットを検出し定量した。その結果、GAD67 mRNA発現レベルの平均値(±標準偏差)は、統合失調症例で15.7±15.4 nCi/g、健常対照例で22.6±13.7 nCi/gであり、統合失調症で約30%低かったが、統計学的には有意性は認めなかった(p=0.19)。TH mRNA発現レベルの平均値(±標準偏差)は、統合失調症例で855±445 nCi/g)、健常対照例で1054±333 nCi/gであり、統合失調症で約19%の低下を認め、この差は統計学的に有意であった(p=0.03)。KCNS3 mRNA発現レベルの平均値(±標準偏差)は、統合失調症で39.2±33.5 nCi/g、健常対照例で61.4±24.9 nCi/gであり、統合失調症では約36%低く、この差は統計学的に有意であった(p=0.003)。以上より、統合失調症では、大脳基底核の出力ニューロンよりも、出力ニューロンにより抑制性の制御をうけるドーパミン作動性のニューロンに変化が顕著であることが判明した。本年度は、死後脳サンプルを採取する症例の選定を行ったうえで、ピッツバーグ大学に出張し、大脳基底核の出力ニューロンが存在する黒質の脳組織切片を作成し、金沢大学へ空輸した。黒質の切片は、赤核よりも吻側のレベルにおいて、脳幹の長軸に垂直の面で作成し、緻密層に含まれる鉄による黒い色素沈着を確認した。症例は、統合失調症15例、精神神経疾患のない対照例15例からなる。それぞれの統合失調症例は、性別が等しく、年齢がほぼ同じ対照例とペアとした。その結果、疾患群と対照群の間で、年齢(統合失調症:50±14、対照48±14)と有意差を認めなかった(t=0.33, p=0.74)。また組織におけるRNAの保存状態を示すリボゾームRNAの比率(18S/28S ratio)は、統合失調症で1.6±0.3、対照群で1.4±0.2、RNA integrity numberは、統合失調症で8.0±0.5、対照群で7.8±0.5と両者とも有意な差を認めなかった(18S/28S ratio: t=1.7, p=0.09, RIN: t=1.3, p=0.20)。以上より、得られた黒質切片を用いて、in situ hybridization法により、出力ニューロンの伝達物質であるGABAの合成や再取り込にかかわる分子、出力ニューロンからの抑制をうる黒質緻密層のドーパミンニューロンにおけるドーパミン合成や再取り込にかかわる分子の発現解析をおこなう準備が整った。当初の予定では、in situ hybridization法およびPCR法で遺伝子発現の解析に着手している予定であったが、十分数の症例を確保するまでの時間がかかった。得られた切片の一部はニッスル染色およびコリンエステレーセ染色を施し、大脳基底核出力ニューロンが存在する黒質網状層およびドーパミンニューロンが主に存在する黒質緻密層、そして黒質全体の境界を明らかにする。

そのうえで、in situ hybridization法により、GABA合成酵素GAD67およびGAD65、GABAトランスポーター1、ドーパミン合成酵素であるTyrosine HydroxylaseやドーパミントランスポーターのmRNAの発現量を定量し、統合失調症と対照例の間で比較する。平成24年度中は、脳幹のブロックより上丘のレベルで黒質を含む脳組織切片の作成を試みたが、いくつかの症例では上丘が大脳フロックに含まれ、脳幹ブロックに含まれておらず、十分な数の症例を集めるのに時間がかかったため、予定していたin situ hybridizationは行えなかった。このため、直接経費繰越額605,486円が発生した。この繰越額は、in situ hybridization法のための物品費およびデータ解析のためのパートの実験補助員の人件費に使用する。また、平成25年分の1,000,000円は、学会参加などへの旅費やin situ hybridization法、Western blot法などに必要な物品費として用いる。