hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中・高齢者のQOLの改善と転倒防止に対する体力トレーニングの有効性について

RT群およびAE群に対して5ヵ月間にわたって、運動指導を介入的に実施し、介入期間前後にQOL評価のためのアンケート調査と形態、腰椎骨密度、筋力、敏捷性、平衡性、柔軟性、有酸素性能力に関する測定を行った。介入指導期間前後で、体重はAE群においてのみ有意に低下し、RT群では主観的健康度、毎日の気分、人間関係および生活満足度で有意な改善が見られた。AE群は主観的健康度が有意に向上し、CNT群においてはいずれの項目でも有意な変化はみられなかった。また、RT群では膝伸展筋力、膝屈曲筋力、足底屈筋力、ステッピングにそれぞれ有意な改善が認められた。AE群の握力、膝屈曲筋力、足底屈筋力および長座体前屈に有意な改善が見られた。CNT群においては、いずれの項目においても有意な変化は認められなかった。同様に酸素摂取量は、3群とも介入前後で違いはなかった介入指導前に行った調査・測定から、転倒経験者群および非転倒経験者群のBMD、抑うつ度、毎日の気分、人間関係、生活満足度および主観的幸福度は、同様の値を示したが、主観的健康度は転倒経験者群で54.0であったのに対して、非転倒経験者では71.6であり、後者の方が有意に高い値を示した。筋力、敏捷性、平衡性、柔軟性および有酸素性作業能力のいずれにおいても両群間で有意な差は認められなかった。
運動惹起性アディポカインによる非アルコール性脂肪肝治療の探索

脂肪組織は様々なアディポカインを分泌する内分泌臓器としての側面を有しているが、運動によるアディポカインの変化は未知であった。運動負荷を行ったマウス皮下脂肪及びヒト皮下脂肪を採取後、マイクロアレイを行い、運動惹起性アディポカイン候補を抽出した。更に具体的なアディポカイン候補を絞り込むために、マウスの合計走行距離との相関検討を行い、Tgfb2、Gas6、Gpx3、Lpl等を運動惹起性アディポカイン候補とし、肝細胞に与える影響を検討した。TGFb2やGPX3はは肝細胞の代謝に有意な変化を認めなかったが、GAS6は肝細胞におけるミトコンドリア機能の活性化やGLUT2の増加を示す結果が得られた。消化器病学
ケニア農業地域における地形学的土地条件評価と民族土壌学的農地利用形態との相関

中央ケニアの熱帯高地と半乾燥ー亜湿潤地域においては、地形変化速度とその時間スケール、斜面プロセスなどを述べるとともに、地形変化指標の人為による消失のし易さを明らかにした。ヴィクトリア湖岸の農林漁村地域においては、日常的な地下水利用を維持する水文地形条件を検討した。半乾燥Laikipia平原牧畜地域では、大規模ガリーの発達に伴う地形変化と住民の自然資源利用の実情を明らかにした。本課題は、ケニア国内における農業生産活動中心地において、現成自然環境に応答し地形単位ごとに異なる発現形態を示す地形変化プロセスに主として着目し、農耕地の土地条件の評価手法を明らかにすることを第一の目的とする。次いで、同地域における現地農耕民の意図的あるいは無意識的な農地利用の実態を、当事者らの農地や営農形態に関わる経験的認識、土着・伝統的な知識を収集することに基づく民族土壌学的視点から明らかにし、研究者・現地農耕民間に存在する土地環境認識の差異を明示するとともに、土地条件に関わる情報を両者間で共有する意義と手法を確立することを最終目的とする。調査対象地として、当初予定していたケニア中央高地キクユ人集住地域(Nyeri, Laikipia Counties)に加えて、新たに西ケニア、ヴィクトリア湖岸ルオ/キシイ人集落(Homa Bay County)を設定し、それぞれの地域において調査を開始した。平成25年度には、Nyeri CountyおよびLaikipia Countyの調査対象集落において、1)気象データの回収と観測装置の点検更新、2)表土層の顕著な移動が想定される多重スランプ斜面のキネマティックGPS測量などを実施した。大規模ガリーの発達するケニア山山麓(Laikipa County)において、3)ガリー周辺の地形・表層地質・土壌調査、4)ガリー後退量計測の定点設置およびキネマティックGPS測量データを取得した。またHoma Bay Countyにおいては、5)気象、地下水位観測システムを構築した。また各調査地点においては農耕従事者を中心に、6)土地利用・営農形態・土地環境認識に関するインタビューを、現地共同研究者とともに行った。次年度以降も上記諸データの蓄積を図りつつ、本研究の目的達成を目指している。調査対象地として、従来から継続してケニア中央高地キクユ人集住地域(一部、マサイ人集住地域) (Nyeri, Laikipia Counties)と、近年設定された西ケニア、ヴィクトリア湖岸ルオ/キシイ人集落(Homa Bay County)において現地調査を継続実施した。平成26年度には、Nyeri CountyおよびLaikipia Countyの調査対象集落において、1)気象データの回収と観測装置の点検補修、2)大規模ガリーの発達するAberdare地域、North Laikipia地域においてキネマティックGPS測量などを実施した。またHoma Bay Countyにおいては、3)気象、地下水位観測データの回収と観測装置の点検補修、4)バッドランド化した土壌浸食地のキネマティックGPS測量などを実施した。また各調査地点においては農耕従事者を中心に、5)土地利用・営農および生計維持形態・土地環境認識に関するインタビューを、現地共同研究者とともに行った。最終年度においても上記諸データの蓄積を図りつつ、本研究の目的達成を目指している。次いで、同地域における現地農耕民の意図的あるいは鵜意識的な農地利用の実態を、当事者らの農地や営農形態に関わる経験的認識、土着・伝統的な知識を収集するkとおに基づく民族土壌学的視点から明らかにし、研究者・現地農耕民間に存在する土地環境認識の差異を明示するとともに、土地条件に関わる情報を両者間で共有する意義と手法を確立することを最終目的とする。調査対象地として、従来から継続してケニア中央高地キクユ人集住地域(一部、マサイ人集住地域)(Nyeri, Laikipia Counties)と、近年設定された西ケニア、ヴィクトリア湖岸ルオ人集落(Homa Bay County)において現地調査を継続実施した。平成27年度には、Nyeri CountyおよびLaikipia Countyの調査対象集落において、1)気象データの回収と観測装置の点検補修、2)大規模ガリーの発達するNorth Laikipia地域においてキネマティックGPS測量の継続実施、に従事した。またHoma Bay Countyにおいては3)気象、地下水位観測データの回収と観測装置の点検補修等を行った。また各調査地点においては農耕従事者、およびNorth Laikipia地域においては牧畜業従事者を中心に、4)自然資源利用と生計維持形態、土地環境認識に関するインタビューを、現地研究協力者等とともに行った。とくにNorth Laikipia地域、マサイ人居住地付近では、近年の大規模土砂採取が生計維持および地形改変に与える影響を検討するための実証的データを収集した。

ヴィクトリア湖岸の農林漁村地域においては、日常的な地下水利用を維持する水文地形条件を検討した。半乾燥Laikipia平原牧畜地域では、大規模ガリーの発達に伴う地形変化と住民の自然資源利用の実情を明らかにした。気象(気温、降水量)、地下水位に関する継続的観測データ、および地形地質調査データの入手は、おおむね円滑に実施され、各調査地域の地形学的自然地理学的土地条件の現状は把握されつつある。また相対的に急速な地形変化発現箇所においては、初年度の測量データをほぼ取得することができ、最終年度における取得データとの比較により、ガリー伸長状況、多重スランプ斜面の変位状況など評価し得るようになった。土地利用、営農形態、土地環境認識等に関わるインタビュー調査データも蓄積されつつある。しかしながら、地形変化プロセス発現状況を加味した土地条件図の図化への着手、および地域行政組織における土地環境認識や土地利用計画に関わる情報収集にやや遅れが生じており、この点の見直しが必要である。27年度が最終年度であるため、記入しない。地形学、自然地理学、環境地理学これまで得られた結果に基づき、引き続き45地域において現地調査および各種観測データの取得を行う。とくに本課題において主たる検討課題としたガリー浸食地域(熱帯高地地域および半乾燥ー亜湿潤地域)についての調査観測が、データ蓄積の上からより重要であり、同地域での作業を重点的に行う必要がある。地形変化に関わる現地調査に加えて、放射性年代測定を主とする室内土壌分析を実施し、地形変化の地史的起源やその要因等について考察する計画である。また、農耕民および非農耕民の地形変化や土地環境に情報認識の差異を明らかにするとともに、将来における土地環境条件の変化に強く寄与する環境因子を明示しつつ、本課題全体を総括することを計画する。また相対的に急速な地形変化発現箇所においては、初年度の測量データをほぼ取得することができ、平成26年度以降の取得データとの比較により、ガリー伸長状況、多重スランプ斜面の変位状況など評価し得るようになった。土地利用、営農形態、土地環境認識等に関わるインタビュー調査の端緒も開き、初年度の研究状況はおおむね順調に進展したと考えられる。気象水文観測機器の更新等、当初予定していた物品の購入計画を変更したため27年度が最終年度であるため、記入しない。これまで得られた結果に基づき、引き続き34地域において現地調査および各種観測データの取得を行う。
数理論理学と関連分野の研究

1.relevance論理の有名な未解決問題のP-W問題(BB'I論理でA→BとB→Aが証明できればA≡Bである)は,MartinとMeyerにより意味論的に,Kronにより複雑ではあるが構文論的に解かれていた。古森と永山は,構文論的なより簡明な証明を与えた。2.日本でP-W問題が知られるようになったのは,Meyerが来日し,自分たちが行なった意味論的な方法では満足できないので,ラムダ計算を使う証明を試みて欲しいと,広川に伝えたことによる。広川は試みたのであるが,うまくいかなかった。しかし,最近,古森-永山の方法を取り入れることにより,うまくいくことが分かった。しかも,その方法が最も簡明な証明を与える。3.定理自動証明プログラムotterを使って,非古典命題論理の自動証明はKalmanにより行なわれていた。古森と広川はKalmanの方法を使って,種々のコンビネーターに対応する論理式を公理とする非古典論理について自動証明を試みた.4.古森は複数の結論をもつ古典論理の自然推論体系を考案し,それとParigotのλ-μ項との関連について新しい知見を得た.1.relevance論理の有名な未解決問題のP-W問題(BB'I論理でA→BとB→Aが証明できればA≡Bである)は,MartinとMeyerにより意味論的に,Kronにより複雑ではあるが構文論的に解かれていた。古森と広川はKalmanの方法を使って,種々のコンビネーターに対応する論理式を公理とする非古典論理について自動証明を試みた.4.古森は複数の結論をもつ古典論理の自然推論体系を考案し,それとParigotのλ-μ項との関連について新しい知見を得た.
動物個体内の組織細胞への遺伝子注入法の開発とそれに基く疫病治療の基礎研究

本研究は、生きている動物の組織の細胞へ直接遺伝子を導入し安定に発現させる技術を開発することによって、遺伝子治療という新しい医療に向けてより優れた方法論を築こうという目標のもとに、大きく分けて次の3つの方向から研究を進め、以下に記す成果を得た。1.遺伝子導入をする事ができる膜融合リポソームの精製とその活性の解析。まず物理的方法で作った多重層リポソームとセンダイウイルスを反応させ、蔗糖密度勾配遠心法で部分精製し、ラットの肝臓に直接注入することで大腸菌βガラクトシダーゼやヒトB型肝炎ウイルスの表面抗原を発現できることを確認した。さらに遺伝子の導入効率をあげるために、直径200nmの1枚膜リポソームとセンダイウイルスを反応させ蔗糖密度勾配遠心法で精製し、未反応のウイルスやリポソームを含まない融合活性を持った粒子を精製した。この粒子は直径250nmで表面にウイルスのスパイク様の構造を持ち、内部は空洞であった。OD_<540>あたりの物質導入活性を細胞質への導入が10^<10>/ml、核への遺伝子の導入が10^7/mlと推定された。2.センダイウイルスの遺伝子発現機構を用いたウイルス・ベクターの開発のための基礎研究。本研究では特にウイルスの形態形成と遺伝子発現の関係について研究を進めた。そのモデルとして温度感受性変異ウイルスC1.151株を用い、その形態形成の異常がウイルスのMタンパク質の変異によること、またこの変異は遺伝子発現には影響を与えないことを発見した。3.ヒト人工染色体の構築に向けた基礎研究。DNA合成をしていない細胞で遺伝子を安定化させるために細胞内で染色体して存在できるDNA構造の研究を行った。本研究では合成したヒト・テロメアを使ってこのために必要な人工染色体クローニング・ベクターの構築に成功した。初年度はHVJを利用したDNA導入法の改良とHVJゲノムをベクタ-として利用するためのウイルス遺伝子発現機構の解明において新しい成果が得られた。まず遺伝子を動物組織に導入するための手段としてHVJーリポソ-ム複合体を用い、ヒトB型肝炎ウイルスのS抗原遺伝子等を培養細胞やラット肝細胞に導入してその発現を観察した。その結果、1ml中に細胞に遺伝子を導入し発現させることができる粒子を、10^6個以上含むリポソ-ム懸濁液を調製することに成功した。この懸濁液をラット肝臓に直接導入してやると一過性に(2ー3日間)血清中にヒト肝炎ウイルスのS抗原が発現した。これらのことからHVJーリポソ-ム複合体は遺伝子導入に十分な膜融合の活性を持っていること、さらに現在遺伝子治療のために最も有効ではないかと考えられているレトロウイルス・ベクタ-と比較して、一過性の遺伝子導入効率ではより優れていること、肝臓への遺伝子導入にも使えるなど多くの長所を持っていることが確認できた。次にウイルスのゲノム自体に外来の遺伝子を組み込んで安定に発現させる工夫を開始した。まずHVJゲノムと5'末端と3'末端が相同でかつその間に大腸菌ベ-タ・ガラクトシダ-ゼ遺伝子をネガティブ方向(mRNAと逆方向)に組み込んだRNAを試験管内で合成した。このRNAをHVJが持続感染をしている細胞に導入するとベ-タ・ガラクトシダ-ゼが発現しているのが観察された。これは導入したRNAを鋳型としてHVJ持続感染下でガラクトシダ-ゼmRNAの転写が起きたことを示している。このことからHVJの遺伝子発現機構を使って外来遺伝子を発現させるためにはウイルスゲノムRNAの5'末端と3'末端が必要であることがわかった。さらにこのRNAにトランスに働いて転写・複製を引き起こすウイルス側の因子の解析を始めている。

初年度で遺伝子を組織細胞に効率よく導入するための基礎的な条件を決定することができたので、今年度は導入した遺伝情報の安定化に向けて2つの方向から研究を進めた。<1.センダイウイルス(HVJ)の遺伝子発現機構を使ったRNAベクタ-の開発。>___ー初年度は大腸菌ガラクトシダ-ゼ遺伝子の発現を試みたが動物細胞にもこの酵素が存在するため結果が明快ではなく、外来遺伝子を確実に発現している細胞だけが生き残れるように大腸菌のHYGB耐性遺伝子の発現を試みた。まずこの遺伝子をHVJゲノムの3'および5'末端の構造と接続し試験管内でネガティブ鎖RNAを合成した。次にこのRNAをHVJが持続感染している細胞に導入したところハイグロマイシンB耐性となった細胞株が得られた。この形質は安定であり、細胞質に導入した遺伝子由来のmRNAが検出できた。このことからHVJの遺伝子発現機構を用いて安定に遺伝子発現ができるシステムが可能であることが確認できた。現在このアプロ-チをさらに進めて組換えRNAウイルスの作成を検討中である。<2.染色体の構造を使った人工染色体ベクタ-の開発。>___ー初年度の結果から、発現を安定化するためには、DNAそのものに安定化に必要な一次構造が必要であるという結論に達した。そこで既に直鎖DNAで安定な人工染色体の存在が知られている出芽酵母の例を参考にして、動物細胞で安定に存在できる人工染色体の開発を始めた。まず染色体末端のテロメアの構造と動物細胞での選択マ-カ-(HYGB耐性遺伝子およびBS耐性遺伝子)、および得られた直鎖DNAを出芽酵母で解析するために必要な遺伝子を結合したMYACベクタ-を作成した。現在ヒトゲノム遺伝子断片にこのベクタ-を結合してHVJの融合能を利用してマウス細胞に導入し、安定な人工染色体を含むクロ-ンの単離を検討中である。今年度はまず、センダイウイルスの3'および5'末端の間に大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子を接続してさらにそれをT7ファ-ジのRNAポリメラ-ゼプロモ-タ-の下流につないだ組み換えDNAを作成した。これを鋳型としてウイルスのネガティブ鎖にあたる向きのRNAを試験管の中で合成してセンダイウイルス持続感染細胞に導入したがハイグロマイシン耐性細胞は得られなかった。そこで、T7RNAポリメラ-ゼ自体を細胞内で大量にかつ安定に作っている細胞を作り、さらにそこにセンダイウイルスを持続感染させたうえで前途の鋳型DNAを導入して組み換えウイルスができるかどうかを検討している。またセンダイウイルス持続感染の機構を検討し、ウイルス礎裏側にあるMタンパク質の点突然変異によって持続感染が成立する例があることを確かめた。この時ウイルスの遺伝子発現にはなんの変化もなく、Mタンパク質を欠損させてやるだけで細胞からウイルス粒子ができるのを防ぐことができるという重要な知見が得られた。次に、ヒト人工染色体開発の基礎となるクロ-ニングのための組み換え遺伝子を作成した。このベクタ-として、ハイグロマイシン耐制遺伝子ー酵母TRP1・ARS・CENーヒト・テロメアの構造を持つpMYAC1と、ブラストサイディンS耐性遺伝子ー酵母URA3ーヒト・テロメアの構造を持つpMYAC2を完成した。
ジーンノックアウト法を用いたニワトリヒストンデアセチラーゼの機能解析

クロマチン構造変化を介したDNAの機能発現調節にコアヒストンのアセチル化が関与する。我々はニワトリから3種のヒストンデアセチラーゼchHDAC-1,2,3をクローニングし,遣伝学的解析が比較的容易なニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて、各chHDAC欠失変異株を作成することにより、これらの機能解析を試みている。chHDAC-2欠損DT40変異株において,これまで以下に示す知見を得た。1)本変異株の細胞内においてIgMの軽鎖および重鎖の量が親株のl0倍程度に増大している。また,培地中の分泌型IgMも2-3倍に増加している。2)細胞膜上に発現している膜型IgMは滅少している。3)膜型IgM重鎖のmRNA量が親株の約30%減少している。一方,分泌型IgM重鎖mRNA量は約8倍に増加している。IgM重鎖のmRNAの総量は約2.5倍になっている。4)HDACの阻害剤であるトリコスタチンAでDT40株を処理することによって,IgM重鎖の総mRNAレベルの上昇,分泌型IgM重鎖mRNA量の増加およぴ膜型IgM重鎖mRNA量の滅少を引き起こすことができる。chHDAC-3はchHDAC-1,2と比べて、C-末端側の約50アミノ酸が欠如し、さらに、N-末端およびC-末端側でのホモロジーも低い。細胞増殖に必須である本酵素に関して、tet-inducible conditional homozygous mutantの作成に成功した。本変異株はtet添加後24時間でFLAG-tagged HDAC-3が検出出来なくなり、しばらくは正常に増殖するが、以後、増殖速度が遅くなり、死滅する。増殖にはchHDAC-3のN-末瑞側およびC-末端側の各々約150個のアミノ酸、核外輸送シグナル(NES)とデアセチラーゼ活性それ自体が必須である。本変異株はHDAC1,2の過剰発現により相補されないことから、HDAC3独自の細胞増殖調節機能が明らかになった。我々はニワトリから3種のヒストンデアセチラーゼchHDAC-1,2,3をクローニングし、遺伝学的解析が比較的容易なニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて、各chHDAC欠失変異株を作成することにより、これらの機能解析を試みている。1)本変異株の細胞内においてIgMの軽鎖および重鎖の量が親株の10倍程度に増大している。2)細胞膜上に発現している膜型IgMは減少している。4) HDACの阻害剤であるトリコスタチンAでDT40株を処理することによって、IgM重鎖の総mRNAレベルの上昇,分泌型IgM重鎖mRNA量の増加および膜型IgM重鎖mRNA量の減少を引き起こすことができる。chHDAC-3については以下に示す知見を得た。2)この機能はHDAC-1やHDAC-2によってcomlementすることは出来ない。3)chHDAC-3に固有の機能領域はN末端側とC末端側の各々約150残基中に存在する。

増殖にはchHDAC-3のN-末瑞側およびC-末端側の各々約150個のアミノ酸、核外輸送シグナル(NES)とデアセチラーゼ活性それ自体が必須である。本変異株はHDAC1,2の過剰発現により相補されないことから、HDAC3独自の細胞増殖調節機能が明らかになった。
青感受性色覚タンパク質の高分解能X線結晶構造解析

本研究では、X線結晶構造解析を中心とした構造解析により、色覚視物質の原子座標を決定し、ヒトが色を識別する分子機構をより詳細に理解することに取り組んだ。具体的には、霊長類青視物質について、アナログレチナールにより視物質を再構成させ、蒸気拡散法を改良することで、短時間での結晶取得を目指した。さらに、UV-visおよびFTIR分光測定による光反応中間体の構造解析にも取り組んだ。結晶構造解析について、現状結晶を得るには至っていないが、結晶化プレート上で良好な結晶化母液との相分離が確認され、さらなるスクリーニングの余地を示唆した。また、当初アナログレチナールにより再構成された青視物質アナログは、光耐性を示したが、詳細な分光解析により、非常に遅い時間スケールで退色していくことが分かり、結晶化条件の再検討も示唆した。なお、3種(青・緑・赤)色覚視物質のうち、青視物質のみがアナログレチナールによる再構成が可能であったが、アナログレチナールの結合能を決めるアミノ酸を特定し、緑視物質変異体に対するアナログレチナールの結合を確認することに成功した。この研究成果はJ. Biol. Chem.誌に第一著者として発表した。本研究課題は青視物質を対象とした構造解析であるが、これまで申請者が研究を行ってきた緑・赤視物質について、塩化物イオン結合による波長シフトの分子機構の理解に向けたFTIR解析を進める中で、レチナールから離れた位置に存在するアミノ酸の変異によって熱安定性が劇的に向上する変異体を発見した。現在この研究成果はBiochemistry誌に投稿中である。これら色覚視物質の波長制御の理解に向けた構造解析の研究成果について7件の招待講演を国際会議を含む様々な会議で行い、1件の一般口頭発表を国内会議において行った。また平成30年度名古屋工業大学若手研究イノベータ養成センター表彰を受賞した。本研究では、1X線結晶構造解析を中心とした構造解析により、色覚視物質の原子座標を決定すること、さらに2赤外分光法を用いた振動分光解析を発展させ、光反応過程における中間体の構造解析を行い、ヒトが色を識別する分子機構をより詳細に理解することに取り組んだ。1について、光・熱異性化をブロックしたアナログレチナールにより再構成した青視物質アナログに対し、蒸気拡散法と硫酸アンモニウム沈殿法を組み合わせることで、短時間での結晶取得を試みている。結晶を得るには至っていないが、結晶化プレート上で良好な結晶化母液との相分離が確認されており、さらなるスクリーニングを進めている。一方、当初青視物質アナログは光耐性も示したことから、明るい条件下での結晶化に取り組んだが、その後の詳細な分光解析により、非常に遅い時間スケールで光退色していくことが分かったため、今後暗赤色灯下での結晶化を試みる。2について、UV-visおよびFTIR分光測定による光反応中間体の構造解析を進展させている。これまでロドプシンを含めた視物質は77 Kで生成するBatho中間体のみフォトクロミズムを示し、後続する中間体はフォトクロミズムを示さないと考えられてきた。しかし今回、UV-vis分光測定により、青視物質に対するBatho中間体以降の全ての中間体の同定に成功し、活性中間体Meta-IIを除く、BL, Lumi, Meta-I中間体はフォトクロミズムを示すことを明らかにした。今後FTIR分光測定により、構造変化の詳細について議論していく。以上のとおり、アナログレチナールを駆使することで、光および熱異性化の問題を最大限軽減させた条件下で、結晶化に向けて進行している。さらに青視物質の光反応過程で生成する全ての中間体の同定に成功し、構造ダイナミクスを明らかにするためのFTIR分光測定に向けて準備が整った。青視物質アナログの分光解析を進めていく過程で、非常に遅い時間スケールで光退色することが分かった。これは同様にしてアナログレチナールの結合能を有するロドプシンアナログ(レチナールシッフ塩基の加水分解反応は起こらず、光反応サイクルを示す)とは異なる光反応性を示している。従って、今後光退色による結晶試料中での不均一性を阻害するために、暗赤色灯下にて結晶化を行う予定である。また緑・赤視物質について、蛋白質内部への塩化物イオン結合に伴う長波長シフトのメカニズムの解明に向けた研究過程で、ロドプシンの結晶構造を基にして、レチナールから10 &Aring;以上離れた位置に存在するアミノ酸の点変異によって、熱安定性が向上することを発見した。さらに、この変異体は昆虫細胞Sf9による発現量も野生型と比較して35倍高いことを確認した。本研究課題は青視物質を対象とした構造決定を目指しているが、研究の最終目標として、“色覚視物質の原子座標を決定し、ヒトが色を識別する分子機構を理解すること"を掲げている。従って、今後緑視物質変異体も並行して結晶化させていく予定である。青視物質のFTIR分光測定も継続して行う。UV-vis分光測定によって同定することに成功した光反応過程で生成する全ての中間体の構造解析を実行する。興味深いことに、レチナールの光異性化直後に生成する初期中間体Bathoを除き、熱緩和に伴い生成する後続の中間体はフォトクロミズムを示さないことが視物質分野の常識であった。しかし今回、青視物質は活性中間体Meta-IIの前駆体、Meta-I中間体までフォトクロミズムを示すことを明らかにした。この結果は、青視物質特異的な光情報伝達機構、且つ構造ダイナミクスの存在を示唆している。

従って、確立した各中間体が蓄積する温度条件下において、高精度低温FTIR分光測定を駆使することで、構造情報を得ることを目指す。本研究では、X線結晶構造解析を中心とした構造解析により、色覚視物質の原子座標を決定し、ヒトが色を識別する分子機構をより詳細に理解することに取り組んだ。具体的には、霊長類青視物質について、アナログレチナールにより視物質を再構成させ、蒸気拡散法を改良することで、短時間での結晶取得を目指した。さらに、UV-visおよびFTIR分光測定による光反応中間体の構造解析にも取り組んだ。結晶構造解析について、現状結晶を得るには至っていないが、結晶化プレート上で良好な結晶化母液との相分離が確認され、さらなるスクリーニングの余地を示唆した。また、当初アナログレチナールにより再構成された青視物質アナログは、光耐性を示したが、詳細な分光解析により、非常に遅い時間スケールで退色していくことが分かり、結晶化条件の再検討も示唆した。なお、3種(青・緑・赤)色覚視物質のうち、青視物質のみがアナログレチナールによる再構成が可能であったが、アナログレチナールの結合能を決めるアミノ酸を特定し、緑視物質変異体に対するアナログレチナールの結合を確認することに成功した。この研究成果はJ. Biol. Chem.誌に第一著者として発表した。本研究課題は青視物質を対象とした構造解析であるが、これまで申請者が研究を行ってきた緑・赤視物質について、塩化物イオン結合による波長シフトの分子機構の理解に向けたFTIR解析を進める中で、レチナールから離れた位置に存在するアミノ酸の変異によって熱安定性が劇的に向上する変異体を発見した。現在この研究成果はBiochemistry誌に投稿中である。これら色覚視物質の波長制御の理解に向けた構造解析の研究成果について7件の招待講演を国際会議を含む様々な会議で行い、1件の一般口頭発表を国内会議において行った。また平成30年度名古屋工業大学若手研究イノベータ養成センター表彰を受賞した。本研究では、1X線結晶構造解析を中心とした構造解析により、色覚視物質の原子座標を決定すること、さらに2赤外分光法を用いた振動分光解析を発展させ、光反応過程における中間体の構造解析を行い、ヒトが色を識別する分子機構をより詳細に理解することに取り組んだ。1について、光・熱異性化をブロックしたアナログレチナールにより再構成した青視物質アナログに対し、蒸気拡散法と硫酸アンモニウム沈殿法を組み合わせることで、短時間での結晶取得を試みている。結晶を得るには至っていないが、結晶化プレート上で良好な結晶化母液との相分離が確認されており、さらなるスクリーニングを進めている。一方、当初青視物質アナログは光耐性も示したことから、明るい条件下での結晶化に取り組んだが、その後の詳細な分光解析により、非常に遅い時間スケールで光退色していくことが分かったため、今後暗赤色灯下での結晶化を試みる。2について、UV-visおよびFTIR分光測定による光反応中間体の構造解析を進展させている。これまでロドプシンを含めた視物質は77 Kで生成するBatho中間体のみフォトクロミズムを示し、後続する中間体はフォトクロミズムを示さないと考えられてきた。
下肢障害者の直立移動を可能にする新しい移動システムの開発

本研究では,車椅子生活を送っている方々が特別なインフラのない環境でも,健常者と同等の日常生活を送れるような直立移動システムを開発することが目的である.本移動システムは(1)移動台車,(2)伸縮松葉杖,(3)下肢関節駆動機,の3装置から構成される.これらの3装置のうち,本研究に先立ち申請者は伸縮松葉杖の製作を行っており,また昨年度は,旋回機能を持つ移動台車の製作,および下肢関節駆動機の設計を行ってきた.今年度は以下の研究を行った.1.下肢関節駆動機の製作,および動作確認実験を行った.2.3装置を装着し,椅子からの起立動作を行った.この動作において伸縮松葉杖と下肢関節駆動機の協調動作が必要となり,どちらの装置を主として使用するかは,杖をつく位置や動作シーケンスによりさまざまに取ることができる,昨年までは,杖を体の後方へつき,杖の伸縮駆動力に頼った動作を行ってきたが,例えば電車における長椅子等の場合は,杖を後方へつけないという問題がある.また,動作中に杖がスリップした場合には,転倒する危険をはらんでいる.そこで,今年度は,杖を体の前方へつき,腕の力を利用して,体の重心位置が常に移動台車の上に来るように変更した.実験を通して,ほぼシミュレーション通りの起立動作が実現できることを確認した.また同様の動作手法を階段昇降へも応用し,シミュレーションを通して有効性を検証した.3.これまでは,電源装置や制御装置をシステムの外においていたが,今年度は,それらをバックパックへ収納して背負い,システムの完全自立化を実現した.システムへの通信には,他のPCを用いて無線で行った.4.当初の最終実験目標として,駅から駅への電車を利用した移動を掲げていたが,今年度は,実際の駅(京王線南大沢駅)において,改札の通り抜け動作,およびエレベータへの乗り込み,乗り出し動作を実現した.本研究では,車椅子生活を送っている方々が特別なインフラがない環境でも,健常者と同等の日常生活を送れるような直立移動システムを開発することが目的である.本移動システムは(1)移動台車,(2)伸縮松葉杖,(3)下肢関節動力アシスト装置,の3装置から構成される.今年度は以下の研究を行った.1.下肢関節動力アシスト装置の設計,および実際の動作を検証するために片脚部分の製作を行った.可動関節は重量,制御面等から,なるべく少ないことが望ましいので,スノーボード用のブーツを履くことにより,足首の関節を受動的に動作させ,膝関節,および腿関節には比較的小型のモータを取り付けた,また,減速機はウォームギアから構成し,バックドライバブルな機構でなくすることにより,電源が不意に落ちたときでもフェールセーフな設計とした.2.椅子からの起立,着席動作では伸縮松葉杖と下肢関節動力アシスト装置の協調動作が必要となる.このときに,どのあたりに杖をつけばアシスト装置にかかる負担を軽減できるのかという検討を行った.今年度は,まず,数値シミュレーションにより最適点の計算を行い,その後,ロードセルを用いた荷重計測装置により足裏にかかる荷重の計測を行い,同時に杖の先端に取り付けたロードセルを用いて杖にかかる荷重を計測することにより,起立時の荷重分担の時間応答をとり,シミュレーションと実機の応答が同じであることを確認した.3.これまでに回転機能を持たない移動台車を製作していたが,今年度は,移動装置を再設計し,回転板を取り付けた装置の製作を行った.そして,伸縮松葉杖により上体のバランスを保ちながら,脚の踏み変え時に回転板を回転させ,接地後もとの角度に戻すという動作を左右の脚について順次行い,旋回動作が可能であることを確かめた.本研究では,車椅子生活を送っている方々が特別なインフラのない環境でも,健常者と同等の日常生活を送れるような直立移動システムを開発することが目的である.本移動システムは(1)移動台車,(2)伸縮松葉杖,(3)下肢関節駆動機,の3装置から構成される.これらの3装置のうち,本研究に先立ち申請者は伸縮松葉杖の製作を行っており,また昨年度は,旋回機能を持つ移動台車の製作,および下肢関節駆動機の設計を行ってきた.今年度は以下の研究を行った.1.下肢関節駆動機の製作,および動作確認実験を行った.2.3装置を装着し,椅子からの起立動作を行った.この動作において伸縮松葉杖と下肢関節駆動機の協調動作が必要となり,どちらの装置を主として使用するかは,杖をつく位置や動作シーケンスによりさまざまに取ることができる,昨年までは,杖を体の後方へつき,杖の伸縮駆動力に頼った動作を行ってきたが,例えば電車における長椅子等の場合は,杖を後方へつけないという問題がある.また,動作中に杖がスリップした場合には,転倒する危険をはらんでいる.そこで,今年度は,杖を体の前方へつき,腕の力を利用して,体の重心位置が常に移動台車の上に来るように変更した.実験を通して,ほぼシミュレーション通りの起立動作が実現できることを確認した.また同様の動作手法を階段昇降へも応用し,シミュレーションを通して有効性を検証した.3.これまでは,電源装置や制御装置をシステムの外においていたが,今年度は,それらをバックパックへ収納して背負い,システムの完全自立化を実現した.システムへの通信には,他のPCを用いて無線で行った.4.当初の最終実験目標として,駅から駅への電車を利用した移動を掲げていたが,今年度は,実際の駅(京王線南大沢駅)において,改札の通り抜け動作,およびエレベータへの乗り込み,乗り出し動作を実現した.
原子間力顕微鏡とその応用手法による蛋白質分子の構造物性機能の研究

蛋白質などで修飾したプローブを使い、試料上の相互作用や吸着のある位置をマッピングする技術を確立した。具体的には、レクチンを用いて組織上の生理機能的に重要な部位に特異的に発現している糖鎖を高分解能でマッピングできることを示した。また、カンチレバーのバネ定数を、その熱振動の大きさから検定する方法を確立しつつある。この技術は、カンチレバー・プローブの微細な振動の高精度な測定をともなっており、ここで得られた技術と先のマッピングの技術を組み合わせていくことで、物性マッピングの方法を次年度に確立する。今までの原子間力顕微鏡(AFM)によるフォース測定が試料を引き離す距離だけで制御されていたのに対し、引き離したときに掛かる力を検出して引き離す程度を調整できるようにした。この方法は蛋白質の2点間を引っ張って、どのように振る舞うかを定量的に調べる上で重要な技術になる。蛋白質1分子をいろんな程度にまで変性してはそこから巻き戻していく実験をするためには、分子にかける力をどこまでにするか決めて制御していく必要がある。現在モデル物質としてポリエチレングリコールを使い、この場合は単純なランダムコイルであることが期待されるが、その延伸・巻き戻しを試している。得られたAFMのフォースカーブの解析については、既に行っているカーボニックアンヒドラーゼ(CAB)を通常のフォースカーブを使って引き延ばしたデーターを使って検討しており、データーを積算していくことで、3段階以上の段階を経て蛋白質が1本のひもにまで引き延ばされていくことがわかってきた、ただし、CABを人工的に2個つなげた蛋白質でのフォースカーブの検討から、1番最初にカンチレバーに掛かってくる力は基板表面と探針表面の吸着である可能性がある。この技術は、カンチレバー・プローブの微細な振動の高精度な測定をともなっており、ここで得られた技術と先のマッピングの技術を組み合わせていくことで、物性マツピングの方法を次年度に確立する。得られたAFMのフォースカーブの解析については、既に行っているカーボニックアンヒドラーゼ(CAB)を通常のフォースカーブを使って引き延ばしたデーターを使って検討しており、データーを積算していくことで、3段階以上の段階を経て蛋白質が1本のひもにまで引き延ばされていくことがわかってきた。ただし、CABを人工的に2個つなげた蛋白質でのフォースカーブの検討から、1番最初にカンチレバーに掛かつてくる力は基板表面と探針表面の吸着である可能性がある。
p53ノックアウト口唇口蓋裂感受性マウスを用いた口蓋裂発生メカニズムの解明

ヒトにおいて発生率の高い先天異常である口唇口蓋裂発症メカニズムにおけるアポトーシス関連物質のp53の役割について検索することを、本研究の目的とした。口蓋は、口蓋突起のinitiationに始まり、尾側への進展、舌上への挙上、水平方向への進展、正中での癒合という5つの形態変化で形成される。それら5つ全てのステージで、口蓋突起にp53のmRNAの発現を認めた。高率で口唇口蓋裂を自然発症する近交系マウスであるCL/Fr系統マウスと、そのCL/Fr系統マウスにp53欠損をさせたCL/Fr; p53マウスで口唇口蓋裂発症率に差があり、口蓋裂、口唇裂の発生部位とp53の発現部位に関連性が認められた。がん抑制遺伝子として知られるp53遺伝子は、修復不能のDNA障害をもつ細胞が発生初期の胎児に生じると、アポトーシスを誘導して奇形の発症を防ぐことが知られている。これまでの研究にて、高い確率で口唇裂口蓋裂を自然発生する近交系マウスであるCL/Fr系統マウスのp53欠失型を作製に成功した。このCL/Fr系統p53ノックアウトマウスを用いて放射線照射実験を行い、口唇裂口蓋裂発生とp53遺伝子の関連性について解析を行ったところ、p53ノックアウトマウスにおいて有意に口蓋裂の発生が少なく、p53遺伝子は口蓋裂発症関連遺伝子であることを示した。このモデルマウスを用いて行う今回の実験の目的は大きく二つあり、口蓋裂発生に影響するp53遺伝子による細胞増殖制御に関連する遺伝子の同定と、口蓋裂発生におけるp53遺伝子による細胞増殖制御に関連する遺伝子発現の組織学的解明である。前者の遺伝子同定を、妊娠マウスに放射線照射後、胎仔を処理しp53遺伝子型を確認後、Western blottingを用いてp53遺伝子およびその下流遺伝子のタンパク発現量を定量することをすすめている。現在、使用するp53(+/-)CL/Frマウスの雌雄による凍結受精卵を胚移植し、妊娠マウスを準備し、まず放射線照射なしで、個体を発生させ、Western blottingの条件を検討しているところである。口唇口蓋裂の感受性におけるp53の機能を検索するために、口蓋形成におけるp53のmRNA発現パターンを検索した。口蓋形成に重要な5つのステップである、口蓋突起のinitiation、口蓋突起の尾側への進展、口蓋突起の舌上への挙上、口蓋突起の水平方向への進展、正中での口蓋突起の癒合の全てのステージで、p53の発現が確認された。いずれのステージでも口蓋突起の先端での発現であったが、口蓋突起のinitiationでは近心の口蓋突起に、口蓋突起の水平方向への進展時には遠心の口蓋突起に限局した発現を認めた。口唇にもp53の発現が確認され、口蓋突起での発現と同様に、胎生14.5日に限局した発現を確認した。それらの発現領域と、CL/Frマウスで認められた口唇口蓋裂発生部位との間に強い相関性が認められた。また、CL/Frマウスへの放射線照射によって引き起こる裂は、口唇裂と口蓋裂の両方が誘発されるもの、口蓋裂のみが引き起こされるものに大別された。それぞれの欠損の発生率は、p53を欠損したCL/Fr; p53(+/-)において、減少していた。以上の結果から、p53の口唇・口蓋形成における機能が確認された。倫理委員会などの実験開始までの手続きの遅延口腔外科今後は実験の遅延を取り戻すためにも、研究の大きな二つ目的である1口蓋裂発生に影響するp53遺伝子による細胞増殖制御に関連する遺伝子の同定と、2口蓋裂発生におけるp53遺伝子による細胞増殖制御に関連する遺伝子発現の組織学的解明を並行して行っていく。具体的には1を行いながら、同時に形態組織学的観察を行い口蓋裂発生の形態的観察を行う。また、TUNEL染色によってアポトーシスの発生部位を確認する。1の関連する遺伝子の同定と並行して、免疫組織学的にもp53に関連する遺伝子発現状況を確認する。2014年度は動物実験の開始が遅れたため、予定通りに予算執行できず、次年度に繰り越しとなった。今後、実験を進めるうえで、実験機材や材料の購入費や、学術大会での発表、打ち合わせなどの旅費、発表費、論文投稿費に使用を予定
ユビキタス分散システムの実行基盤の研究

本研究では、次世代の計算機環境のひとつとして、ユビキタス計算に注目している。本研究でいうユビキタス計算とは、身の回りに遍在する電子機器を随時組み合わせて、高度な計算機環境を実現できるようにしようというものである。例えば、現在では、どこへ行っても高性能な計算機環境を使えるようにするためには、高速な無線LANを装備した高機能だが重いノート型PC(パソコン)を、どこへ行くにも持ち運ばなければならない。ユビキタス計算では、重い計算機をまるごと出先へ運ぶのではなく、出先へは小さく軽い機器だけを運び、出先に存在するさまざまな機器、たとえばモニタやキーボード、それにPC、PDA等を必要に応じて随時ネットワークで組み合わせながら、高性能な「分散」計算機をその場で構築して使えるようにしよう、というものである。このようなユビキタス計算をおこなうシステムでは、処理に使われる計算機は一定でなく、ユーザの移動にともない、処理に関係する計算機が刻々と変化する。これに対応するには、従来からあるシステム故障に対する信頼性を確保する技術と同等の技術を用い、処理に関係する計算機が入れ替わった際にも、処理が途中で異常終了することなく、円滑に新しく処理に加わった計算機へ移行するようにしなければならない。我々は、ユーザが移動し、無線LANの範囲外に出るなどの理由で、通信途中にネットワーク接続が突如切断され、再び別な無線LAN経由で接続が再開された場合にも、分散アプリケーションが正しく動き続けられるような基盤ソフトウェアの開発をおこなった。
Ｒｅｔｔ症候群の革新的病態マーカーと新規治療法開発の臨床的・基礎的研究

・レット症候群(RTT)では、典型例の約15%は遺伝子異常が同定できない。次世代シークエンサーを用いたて、SHANK3遺伝子変異が原因遺伝子の一つである事を発見した。・Mecp2欠失マウスES細胞を用い、MeCP2は、心臓の種々の遺伝子の発現に関わることが判明し、特に、Tbx5については、ES細胞や心臓においても高度にCpGメチル化され、MeCP2がその発現を直接制御している可能性が示唆された。一方、モデル動物では、心臓の介在版の未熟な形成が認められ、チャンネル遺伝子の発現変化ともに不整脈の素因となる証明された。・グレリンは一部のRTT患者で臨床症状を改善させることが確認された。ヒトのレット症候群の成長に関する研究、およびモデルマウスおよびMeCP2欠損ES細胞を用いた基礎研究を行っている。1.レット症候群(RTT)における血中GH、IGF-1、ghrelinと成長との関連:RTTは成長障害や、てんかん、知的障害がみられる小児発達障害である。原因として、ghrelin/GH/IGF-1軸の関与を推定し、MeCP2遺伝子変異を有するてんかんとRTT女児22例と、てんかんと知的障害の女児14例の間で、血中GH, IGF-1, ghrelinと身体測定値(身長、体重、BMI、頭囲)の関連性を検討した。BMIと身長はRTT群の方が低かった。頭囲は両群ともに血中ghrelin濃度と正相関、血中IGF-1濃度と逆相関であった。レット症候群ではGhrelin/GH/IGF-1軸の機能不全があることがわかった。2.レット症候群モデルマウス、MeCP2欠損ES細胞における心筋細胞分化に関する検討:RTT患者では突然死の頻度が高い事が知られ健常者の300倍程度のリスクがあると予測されている。心電図でQT延長を呈することが2ー3割の患者で知られている。RTTのhemiモデルマウスの6週齢、8週齢で心電図を測定し、QT延長、RR、PQ、QRS短縮がわかった。心臓の形態的な異常は認められなかったが、心筋の構造や機能を支える骨格蛋白や分泌ペプチド、不整脈に関連するイオンチャネルの遺伝子発現を解析し、一部でWild typeと有意な相違が認められた。胚様体を介した心筋分化実験では、MeCP2欠損により心筋細胞の分化が促進され、MeCP2がES細胞の心筋分化に関わる可能性が明らかとなった。MeCP2欠損ES細胞では、心筋前駆細胞は高率に出現するものの、その心筋前駆細胞では、分化初期の心筋に発現する遺伝子群の発現が低く、不完全な心筋前駆細胞である可能性が示唆された。1.グレリンの研究:1.Rett症候群(RTT)における生物マーカーとしてのグレリン(GRL)を年齢・性別等を一致させた疾患コントロール(てんかん/精神発育遅滞症例(EP/MR症例))の空腹時GRL、GH、IGF-1の血中濃度と比較し、身体パラメーター(身長、体重、頭周囲長、BMI)との相関について比較検討した。RTT症例の体重と血中GRL濃度で負の相関が認められたが、身長、BMIとGRL濃度の間には有意な相関は認められなかった。RTT、EP/MR症例ともに、その頭周囲径はGRL濃度と正相関を、血中IGF-1濃度とは負相関を示した。前思春期では、RTT症例の活性型GRLの比率がEP/MR症例の比率より高く(p<0.05)、活性型GRL比が身体発育(低身長・小頭症)の生物マーカーとなる可能性が示唆された。2.RTTへの新規治療法の確立を目指して、RTTモデルマウスへのグレリン投与による治療効果、及び、モデルマウスへの骨髄移植(骨髄キメラマウス作成)に向けた基礎検討を施行し、グレリン投与により、発症早期のRTTマウスの死亡率が低下する可能性が示唆された。2.ES細胞、iPS細胞を用いた研究:本年度は、RTTモデルマウス脳由来のグリア細胞の分子生物学、生理学的な解析を行った。対照コントロールの正常マウス由来グリア細胞と比較して、MeCP2を欠損したグリア細胞では、細胞増殖や細胞障害、細胞毒に対する細胞生存率の有意な差が認められないものの、アストロサイト特有の遺伝子発現やグルタミン代謝の亢進が認められることが明らかとなった。現在、脳以外の発生分化の研究も遂行中である。臨床・基礎研究の両方からレット症候群の原因究明に取り組み下記の成果が得られた。・レット症候群(RTT)では、現在までにMECP2, CDKL5, FOXG1の3つの遺伝子が発見されているが、典型例RTTの約15%は遺伝子異常が同定できない。

われわれは、次世代シーケンサーを用いて、自閉症でしか報告が無かったSHANK3遺伝子変異が原因遺伝子の一つである事を発見し報告した。(Am J Med GenetPart A, 2015 in press)。・レット症候群の疾患モデルとしてMecp2欠失マウスES細胞を用いて、心臓の発生段階からの遺伝子発現、生理機能、心筋構造について解析した。MeCP2は、心臓の発生段階から成体の組織において、心臓の様々な遺伝子の発現に関わることが判明した。特に、Tbx5については、ES細胞や心臓においても高度にCpGメチル化されており、MeCP2がその発現を直接制御している可能性が示唆された。一方、モデル動物では、明らかな心機能の異常は認められなかったものの、心筋同士の刺激伝導や情報の受け渡しをする介在版の未熟な形成が認められ、チャンネル遺伝子の発現変化ともに不整脈の素因となる証明された(Sicentific Report 2015 in press)。小児神経学日本で最初に結成されたレット症候群の親の会の協力も得られ、約65家計をフォローアップ中である。モデル動物を用いた研究は7年前から開始し、実験の維持のための人材、研究環境は整備されている。UKのAdrian Bird先生のグループからおよびMeCP2欠損ES細胞を供与いただき、更に学内での共同研究体制も整備されているため、予定通り研究は進んでいる。グレリンの研究では、九州のRTT患者の親の会(さくらんぼ会)の全面的な協力が得られ、生物マーカーとしてのGRLの頭囲を含む成長発達との関係が証明されつつある。また、当施設は多くの神経発達障害の患者さんの治療、教育を行っていた実績が豊富であり、疾患コントロール(てんかん/精神発育遅滞症例(EP/MR症例))の症例も早く集める事ができた。RTTモデルマウスへのGRL投与研究も、モデル動物、コントロール動物を7年前から飼育し研究に用いてきた実績があり、予定通り研究が進んでいる。また、早くからES細胞、iPS細胞、初代培養細胞を用いる実験系を確立し、基礎の神経生理学教室とも共同研究を行ってきたため、RTTモデルマウス脳由来のグリア細胞の分子生物学、生理学的な解析をスムースに行う事ができた。脳以外の組織、細胞分化、機能解析に関する研究も進めており興味ある結果が得られつつある。レット症候群での治療戦略として、Prekiminaryの段階ではあるが、学内倫理委員会を通してヒトRTTでghrelinの静脈投与を行い、睡眠、神経症状の改善を数名で確認している。また、京都大学iPS研究所と共同研究でRTTのiPS細胞を樹立し、実験に用いる予定である。今後、第i相、第2相試験と発展させ、トランスレーショナルリサーチを目指す。モデルマウスおよびMeCP2欠損ES細胞を用いた基礎研究では、ghrelinn、その他の薬剤を用いて、治療法開発の糸口を探す。臨床ー基礎研究を今まで通り行い、更に発展させる予定である。レット症候群患者でのGRLの臨床効果を見るため、プロトコールを作成し倫理委員会に諮り、将来のトランスレーショナルリサーチへの発展を目指す。基礎研究としては、まずワイルドのC57BL/6マウスで生後発達に伴う脳内総GRL含量、アシルGRLの含有量の変動、GRLのmRNA、GRLのアシル化に関連する酵素ghrelin O-acyltransferase (GOAT)、および脱アシル化に関するAcyl-protein thioesterase 1(APT1)のmRNAを調べる。
光学顕微鏡を用いたゴルジ体-エンドゾーム-細胞膜間輸送動態の定量化とその応用

本研究では、インシュリン様成長因子2/マンノース6リン酸受容体(IGF2/M6PR)のポストゴルジ輸送、すなわちトランスゴルジネットワーク(TGN)、エンドゾーム、および細胞膜間輸送の動態を定量する方法を確立した。IGF2/M6PRと緑色蛍光蛋白(GFP)との融合蛋白(GFP-IGF2/M6PR)を細胞に発現させ、TGN領域の蛋白のみをレーザー光で消光させ、その後の同領域における蛍光の回復を測定した。この蛍光退色後回復法(FRAP法)を用いることで、GFP-IGF2/M6PRが細胞内のコンパートメント間を約40分で一巡することが分かった。また、細胞質外ドメインを欠いた融合蛋白はより短時間で一巡する傾向があることから、細胞質外ドメインの存在が正しいIGF2/M6PRの輸送に必要であることが示唆された。この結果を受けて、IGF2/M6PRの細胞質外ドメインの機能をさらに詳細に検討した。コレステロールの代謝や輸送を乱す薬物であるU18666Aを投与すると、IGF2/M6PRは細胞内の分布変化を示すが、細胞質外ドメインを欠いた変異蛋白は変化しなかった。従って、同薬剤が細胞質外ドメイン依存的な輸送経路の同定に有効であることが分かった。さらに、細胞質外ドメインのM6Pを含むリガンド群(主にリソソーム酵素)との結合部位を欠失させた変異蛋白もU18666Aの影響を受けなった。これらの結果は、IGF2/M6PRの輸送にはM6Pリガンドの結合に依存した経路が存在することを示すとともに、同経路にはコレステロールの代謝/輸送が関わることを示唆する。ゴルジ体-エンドゾーム-細胞膜間輸送動態を解析する手段として、pH変化に安定なGFP変異体であるsapphireをインシュリン様成長因子2/マンノース6リン酸受容体(IGF2/M6PR)の全アミノ酸配列あるいは細胞質ドメインのみに結合させた、2種類の融合蛋白を構築した。これらをHeLa細胞に一過性に発現させその分布を調べたところ、両者供に内在性のIGF2/M6PRの分布と大きな違いは認められなかったが、細胞質ドメインのみを有するsapphire融合蛋白は細胞末梢部においてやや異なる分布を示した。この傾向はGFP融合蛋白を用いても同様であった。次にGFP融合蛋白を発現後、生細胞においてトランスゴルジネットワーク(TGN)領域をブリーチングし、その後の蛍光シグナルの回復を定量した(fluorescence recovery after photobleaching実験;FRAP)。得られた回復曲線はGFP-IGF2/M6PRがTGNとそれ以外の領域(エンドゾームや細胞膜)を一次反応的に相互移動すると仮定した2-コンパートメントモデルによく合致した。このモデルから2つのコンパートメントをリサイクルするのに要する時間を算出したところ、全アミノ酸配列を含む融合蛋白は39.9±7.7分、細胞質領域のみを含む融合蛋白は30.2±7.7分であり。この違いは後者が末梢部で滞留している時間が短いことを反映していた。以上の結果はFRAP実験を用いてIGF2/M6PRの輸送動態の定量化に成功したことを示し、さらに同分子の細胞質外ドメインが末梢における輸送動態に影響を与えていることを示唆する。