hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オオムギの形質転換効率に関わる遺伝子座の特定と機能解析

本研究は、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な遺伝子を同定するため、形質転換が困難なオオムギ品種「Haruna Nijo」(HN)と安定して形質転換可能な品種「Golden Promise」(GP)との交配後代を用いて、(1)オオムギの形質転換に必要なゲノム領域の絞り込みならびに(2)その機能解析を行うことを目的としている。これまでに、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な3つの遺伝子座TFA(Transformation Amenability)を同定した。昨年度までに、HNまたはGPを戻し交雑親とした戻し交雑集団の中からTFA遺伝子座が分離するような個体を選抜した。一方、再分化に関わる転写因子遺伝子のBaby Boom (BBM)遺伝子およびWuschel2 (WUS2)遺伝子を単離し、それらを過剰発現する形質転換オオムギカルスを作成した。本年度は、BBMおよびWUS2遺伝子をそれぞれ過剰発現したオオムギカルスの形態的観察とRNA-seqによる遺伝子発現解析を行った。BBM遺伝子を過剰発現したオオムギカルスは、その表面に無数の茎頂分裂組織様細胞塊が形成され、WUS遺伝子の方は組織化された様な細胞塊が形成された。RNA-seq解析の結果、BBM遺伝子の過剰発現では11,704の遺伝子に、WUS2遺伝子の過剰発現では16,946の遺伝子において、それぞれ2倍以上の発現増加または発現低下が認められた。一方で、HNとGPのエキソーム配列データを解析し、TFAにおけるInDelマーカーの開発を行った。BC2F4世代の形質転換能を確認し、さらにHNを交配したBC3F1個体を作成した。また、HNを戻し交雑親としてGP由来のTFA領域を持つBC2F4世代を圃場に展開し、その生育を調査した。今後、これらを基にTFA領域のさらなる絞り込みを行う予定である。オオムギは、安定して形質転換可能な品種が「Golden Promise」(GP)に限られており、この制約が形質遺伝子の効率的な解析を妨げている。形質転換に必要な遺伝子が明らかとなれば、他の品種での形質転換も容易になると考えられる。本研究は、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な遺伝子を単離するため、形質転換が困難なオオムギ品種「Haruna Nijo」(HN)と容易な品種GPとの交配に由来する遺伝解析を用いて、(1)オオムギの形質転換に必要なゲノム領域の絞り込みならびに(2)その機能解析を行うことを目的としている。昨年度までに、HN×GPのF2から得られた形質転換体60個体(tHN×GP)を用いて、その染色体分離の歪みを検出することにより、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な遺伝子座TFA(Transformation Amenability)を3カ所検出した。本年度は、tHN×GPを用いて、Illumina社インフィニウムシステムによる高密度マーカー解析を行った。その結果、1131の新規SNPsマーカーを得ることが出来た。さらに、上記(1)(2)を遂行するための実験材料として、HNを戻し交雑親またはGPを戻し交雑親としたBC2F1世代をそれぞれ育成し、得られたSNPsマーカーを用いてTFA遺伝子座が分離するような個体を選抜した。今後、この後代を準同質遺伝子系統として展開し、(1)(2)を行う予定である。一方、GPと米国品種「Full Pint」との倍加半数体系統を用いて、TFAが形質転換に必要な遺伝子座であることを証明した。本年度は、Illumina社インフィニウムシステムによる高密度マーカー解析ならびに次年度に使用予定の実験材料の育成を行った。それぞれ研究計画の通りに進んでいる。現在、安定して形質転換可能なオオムギ品種は「Golden Promise」(GP)に限られており、この制限が重要遺伝子の効率的な解析を妨げている。形質転換に必要な遺伝子を明らかにすれば、GP以外の品種での形質転換も容易になると考えられる。本研究は、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な遺伝子を同定するため、形質転換が困難なオオムギ品種「Haruna Nijo」(HN)とGPとの交配後代を用いて、(1)オオムギの形質転換に必要なゲノム領域の絞り込みならびに(2)その機能解析を行うことを目的としている。これまでに、HNxGPのF2から得られた60の形質転換体(tHNxGP)を用いて、その染色体分離の歪みを検出することにより、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な3つの遺伝子座TFA(Transformation Amenability)を同定した。昨年度は、tHNxGPを用いて、Illumina社Infiniumによる高密度マーカー解析を行い、1131の新規SNPsマーカーを得た。さらに、上記(1)(2)を遂行するための実験材料として、HNまたはGPを戻し交雑親としたBC2F1世代をそれぞれ育成し、得られたSNPsマーカーを用いてTFA遺伝子座が分離するような個体を選抜した。本年度は、BC2F2およびBC2F3と展開し、TFAを解析するための準同質遺伝子系統として整備した。BC2F2([HNxGP] xHNxHN)において、TFA領域のみGPで、それ以外のゲノムがほぼHNに置き換わった個体で形質転換実験を行った結果、GPと同程度の効率で形質転換体を得ることが出来た。このことから、TFAが形質転換に必須であることを証明できた。一方、再分化に関わる転写因子遺伝子のBaby Boom遺伝子およびWuschel2遺伝子を単離し、それらを過剰発現する形質転換オオムギカルスを作成した。

本年度は、BC2F2およびBC2F3を展開し、準同質遺伝子系統化を進めた。その中で、BC2F2を利用した実験において、TFAが形質転換に必要なゲノム領域であることを証明できた。同時に、TFA領域の絞り込みも行った。これらは当初の計画通りに進捗している。本研究は、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な遺伝子を同定するため、形質転換が困難なオオムギ品種「Haruna Nijo」(HN)と安定して形質転換可能な品種「Golden Promise」(GP)との交配後代を用いて、(1)オオムギの形質転換に必要なゲノム領域の絞り込みならびに(2)その機能解析を行うことを目的としている。これまでに、オオムギの形質転換に必要あるいは有利な3つの遺伝子座TFA(Transformation Amenability)を同定した。昨年度までに、HNまたはGPを戻し交雑親とした戻し交雑集団の中からTFA遺伝子座が分離するような個体を選抜した。一方、再分化に関わる転写因子遺伝子のBaby Boom (BBM)遺伝子およびWuschel2 (WUS2)遺伝子を単離し、それらを過剰発現する形質転換オオムギカルスを作成した。本年度は、BBMおよびWUS2遺伝子をそれぞれ過剰発現したオオムギカルスの形態的観察とRNA-seqによる遺伝子発現解析を行った。BBM遺伝子を過剰発現したオオムギカルスは、その表面に無数の茎頂分裂組織様細胞塊が形成され、WUS遺伝子の方は組織化された様な細胞塊が形成された。RNA-seq解析の結果、BBM遺伝子の過剰発現では11,704の遺伝子に、WUS2遺伝子の過剰発現では16,946の遺伝子において、それぞれ2倍以上の発現増加または発現低下が認められた。一方で、HNとGPのエキソーム配列データを解析し、TFAにおけるInDelマーカーの開発を行った。BC2F4世代の形質転換能を確認し、さらにHNを交配したBC3F1個体を作成した。また、HNを戻し交雑親としてGP由来のTFA領域を持つBC2F4世代を圃場に展開し、その生育を調査した。今後、これらを基にTFA領域のさらなる絞り込みを行う予定である。次年度以降、育成した準同質遺伝子系統を用いて、形質転換能のQTL解析を行う。各系統ごとの(i)抗生物質耐性カルスの増殖率、(ii)その緑色シュートの再分化効率ならびに(iii)T-DNA導入効率(GFPによる一過性発現効率)などの項目を厳密に評価することにより、3つのTFAがそれぞれどのような働きをしているのかを明らかにする。同時に、TFAの原因遺伝子の絞り込みを行う。今後は、育成した準同質遺伝子系統を用いて、形質転換能のQTL解析を行う。各系統ごとの(i)カルスの増殖率、(ii)再分化効率ならびに(iii)T-DNA導入効率などの項目を厳密に評価することにより、3つのTFAがそれぞれどのような働きをしているのかを明らかにする。また、それらの表現型に関わる遺伝子の網羅的発現解析を予定している。計画では、新規マーカー作成のためのオリゴ合成に使用する予定であった。
X精子とY精子に関する基礎研究

本研究は、無担体電気泳動法等によって哺乳類のX精子とY精子をできるだけ純粋に分離し、両者の差異を生化学的・細胞生物学的・免疫学的に明らかにすると共に、半数体での遺伝子発現の有無を検討することを目的として開始された。また当初その結果を畜産・水産分野での雌雄の産み分けにも役立てる計画をたてた。上記の目的を達成するため、Hirschmann社製ACE710型の無担体電気泳動装置を購入し、キナクリン染色でX精子、Y精子の判定が可能とされるヒト精子を主な材料として、両者の分離を試みた。まず精漿、奇型精子、未成熟精子を除くために、Percoll連続密度勾配とswim down法を組み合わせた精子の調製法を開発した。また泳動液等にも工夫を加えた。その結果、比較的効率よく二峰性の精子の分離を行えるようになった。キナクリン染色法による結果は、両ピ-ク共陽極側に移動するがより移動度の高い方にX精子が、移動度の低い方にY精子が含まれていることを示した。さらにそれぞれのピ-クに含まれる精子よりDNAを抽出し、アメロゲニン遺伝子のPCR法による増巾により、X染色体とY染色体の含量を検討したところ、Y精子を含むと思われるピ-クのものは殆どYのみであったが、X精子を含むと思われるピ-クには両者が混在していた。分離後の精子をもう一度無担体電気泳動にかければ、X精子の分画についてもよい結果が得られるものと期待される。また無担体電気泳動で分離された精子について、ゼ-タ電位を測定したところX精子がおよそ-17mV、Y精子がおよそ-12mVという結果を得た。さらに精子表面物質に対するモノクロナル抗体の一つは、Y精子と反応してそのゼ-タ電位をより負の価にする結果を得た。なおヒト以外の哺乳類では、マウスで二峰性の分離がみられた。上記以外にも、今後の研究に役立てるため、精子の成熟等に関する基礎的デ-タの集積に努めた。本研究は、無担体電気泳動法等によって哺乳類や魚類のX精子とY精子をできるだけ純粋に分離し、両者の差異を生化学的・形態学的・細胞生物学的に明らかにすると共に、半数体での遺伝子発現の有無を検討することを目的としている。さらに畜産・水産の分野での雌雄の産みわけにも役立てる計画である。本年度は交付の決定がおそく、従って無担体電気泳動装置の入手がごく最近であったため、この装置を使ってのX精子とY精子の分離は、現在ヒトおよびウサギ精子を用いて、その為のよい条件を検討中である。今後共引続き実験を維持し、分離したものにつき種々検討を加える予定である。これとは別に、われわれはパーコール法を用いてヒトのX精子を選択的に分離することに成功している。X精子とY精子の両方を純粋に分離するには上記の無担体電気泳動法によらなければならないが、その際にはできるだけ状態のよい精子を用いる必要があり、また精子以外のものの混入を予め除いておく必要がある。そこでそのための予備実験をパーコールを用いておこなった。まずウサギを連続射精させ、精液性状の変化をパーコール連続密度勾配遠心法で調べたところ、性状の悪化と共に精子の細胞密度が低下することが分った。またヒト射出精子について室温保存の影響を同様に調べたところ、やはり時間経過と共に密度が低下することが観察された。

さらに精漿等の精子への混入を除くために、インナーカラム法を開発も、よい結果を得た。シアル酸含量の測定結果も、精漿等の除去を裏付けるものであった。以上の予備実験の成果をともにして、精製したよい精子を用いれば、無担体電気泳動によってX精子とY精子の効率よい分離が行われ、また正確な測定がおこなわれるのと期待される。無担体電気泳動法により,哺乳動物をはじめとする様々な動物のX精子とY精子をできる限り純粋に分離し,両者の差異を生化学的,形態学的,細胞生物学的に明らかにし,半数体での遺伝子発現の有無を検討することを本研究は目的としている.本年度は,昨年度から引き続いてX精子とY精子をできる限り純粋に分離するための条件を検討した.無担体電気泳動法は,非常に強力な分離方法であるが,その分解能は,精子の状態や泳動液の組成に左右されやすい事がいくつかの実験で確認された.また優れた分離能を得つつ分離した精子が活性を保持しているためには,様々な制約がある.本年度は,昨年度のウサギ精子での結果をふまえ,ヒト射出精子を用いて,電気泳動において好結果の得られるよい精子試料の調製をまず検討した.その結果,パーコール密度勾配法を改良し,それに精子遊泳沈降法を併用することにより,均一かつ活性の高い精子試料をうることができるめどをつける事ができた.また電気泳動にもちいる泳動液,電極液の症良も行なった.ところで電気泳動的にX精子とY精子が別れることは,細胞表面の荷電が異なることを意味している.この差異は,表層のシアル酸が寄与している事が,シアル酸分解酵素処理をほどこした精子では,分離されなくなることで確かめられた.そこでこのシアル酸含量もしくはその質的な差異を調べる目的で表層物質に対するモノクロナル抗体の調整を試みた.今回は,よく洗浄した生の精子を用い,従来の免疫法の他に試験管内免疫法を用い,モノクロナル抗体を調整した.まだX精子とY精子を識別する抗体の調製には至っていないが,精子表層と反応する抗体を得ることができた.試験管内免疫法は,抗原が微量ですむので,電気泳動法によって分離した精子を用い,効率的な抗体調製を続行していく予定である.本年度は無担体電気泳動装置によって、ヒトのXおよびY精子の分離が恒常的に行われるよう、その為の基礎的条件の設定に多くの時間を費した。その結果どうやら目的を達する域にまで到達したので、今後は分離されたものについての解析を行っていきたいと考えている。まず泳動用の材料として、成熟した運動良好な精子を選択的に調製するため、Percoll不連続密度勾配遠心法を検討したが、この方法では、X、Y精子の沈殿への回収率が異なり、電気泳動の結果も満足のいくものではなかった。つぎにPercollを用いたswim down法について検討したが、この方法により調製された試料は溶液の比重が高いため、電気泳動に際して乱れを発生し、泳動を制御するのに難点があった。そこで造影剤として用いられるNycodenzに着目し、まずPercollによる上記のような調製を行った後、Nycodenz溶液に置換して比重を調製した。その結果、泳動時の乱流の影響を抑制して分離能が向上し、2峰性をもった泳動像が得られるようになった。なお国外の研究者によりわれわれの結果と+-が逆になる結果が報告されたが、キナクリン染色等によりわれわれの結論の方が正しいことが証明された。現在分離された各画分よりDNAを抽出し、サザンブロット法によりY特異的なプローブを用いて、それぞれの画分が確かにXまたはY染色体を含むものかどうかを検討中である。
生殖細胞増殖分化におけるヒストンH2Aリン酸化およびユビキチン化の機能解析

ヒストン修飾酵素や修飾部位の変異がエピゲノム情報を攪乱し、癌化の要因になることが近年明らかにされつつある。本研究は、ヒストンH2AのC末端部分のリン酸化およびユビキチン化修飾のクロストークによる転写制御の破綻によって、細胞の癌化や生殖細胞の増殖異常・不妊が引き起こされるという仮説を証明することが最終目標である。VRK1によるH2Aのリン酸化がサイクリンD1の発現を正に制御し、この制御不全が癌化の引き金になることを証明した。さらに、腫瘍形成能を有するリン酸化およびユビキチン化部位のミスセンス変異を同定した。以上の結果は、癌エピゲノム研究分野に貢献できうる基礎的知見となることが期待される。ヒストンのメチル化、リン酸化、ユビキチン化などの化学修飾は、遺伝子発現制御に関わるエピジェネティックファクターである。近年、このヒストン修飾部位や、修飾を触媒する酵素自体のミスセンス、ナンセンス変異、すなわちエピジェネティック異常が癌化に関与することが報告されている。ヒストンH2AのC末端部位119番目のリジン残基のユビキチン化(ubK119-H2A)は、ポリコーム複合体によってなされ、転写抑制を制御している。我々は、隣120番目のスレオニン残基のリン酸化(pT120-H2A)がVRK1キナーゼによってなされ、ubK119-H2Aと拮抗し、転写活性化をもたらすことを発見している。さらにH2Aリン酸化模倣体を過剰発現させたNIH3T3細胞をヌードマウスに注射すると、腫瘍形成することも見出している。また、vrk1ノックアウトマウスでは雌雄ともに不妊であることが他のグループによって報告されている。以上のことから、ubK119-H2AとpT120-H2Aのバランス異常が癌化や不妊の原因であるという仮説を立て実証を試みた。2014年度に得られた結果は以下のとおりである。癌患者や樹立細胞の全ゲノムシーケンスを行った英国サンガーセンターのCOSMIC公開データベースを利用し、H2AのC末端部分のミスセンスおよび欠失変異体の情報を得た。これら変異体の腫瘍形成能をヌードマウスを用いて調べた結果、非ユビキチン化H2A変異体でも腫瘍形成が起きることを見出した。また、ユビキチン化、リン酸化の周辺残基の変異体もいくつか腫瘍形成を起こすことを見出した。エピゲノム調節を担うヒストンH2AのC末端部分の修飾に焦点を絞り本研究を遂行した。H2Aの120番目スレオニン(H2A-T120)は、クロマチン結合性キナーゼVRK1によってリン酸化され、その隣残基119番目リジン(H2A-K119)は、主にポリコーム転写抑制複合体PRC1によってモノユビキチン化される。両修飾間のクロストークによる転写制御ネットワークの全貌の解明および両修飾バランスの破綻が細胞癌化や生殖異常をもたらす原因を明らかにすることが本研究の目的である。VRK1によるH2A-T120リン酸化がサイクリンD1などの遺伝子転写を活性化をもたらすことは本研究開始以前に見出していたが、その詳細なメカニズムの解析を試み以下のことを明らかにした。1siRNAによるVRK1ノックダウンによってサイクリンD1発現量は低下するとともに細胞増殖率の著しい低下が様々な癌細胞で観察され、これは野生型VRK1やサイクリンD1の過剰発現によって回復できるが、キナーゼ不活性化型変異体VRK1では回復できなかった。2H2Aリン酸化模倣変異体(H2A-T120D)をNIH3T3細胞に発現させ、これをヌードマウスに移植したところ、腫瘍の形成が観察された。またH2A非ユビキチン化変異体(H2A-K119R, K119Nなど)やVRK1も同様に腫瘍形成能を持つことを確認した。3サイクリンD1遺伝子領域において、VRK1ノックダウンによるH2A-T120リン酸化レベルの低下とともにH2A-K119ユビキチン化が上昇することをクロマチン免疫沈降法で明らかにした。以上の結果は、H2Aのリン酸化・ユビキチン化両修飾制御バランスの破綻が癌化を誘導することを示唆する。また当初の計画通りvrk1およびvrk1, usp21 (H2A脱ユビキチン化酵素)ノックアウトマウスの作製したが、VRK1欠失による不妊の原因を、生殖細胞の増殖・分化の過程で特定することや、生殖系列細胞においてVRK1およびUSP21によって転写がコントロールされる標的遺伝子を同定することはできなかった。2014年度4項目の達成状況として、遅れている項目1、計画を方針転換し予想以上の結果が出た項目2、予定通りの項目3、未完了の項目4を考慮して、自己評価3とした。

1、VRK1結合因子の証明が未完了であるが、達成目標の一つ、siRNAを用いたVRK1ノックダウンによる細胞増殖低下の回復実験のため、siRNA耐性型VRK1発現ベクターを作成した。野生型VRK1により細胞増殖率は回復するが、kinase-dead型VRK1では回復しなかった。この結果は、VRK1のリン酸化活性と細胞増殖維持の関係性を示す。2、癌化を誘導するVRK1変異体の探索は、公開データベースに登録されているVRK1変異の情報を活用し、変異体の発現コンストラクトを作製した。現在、これらVRK1変異体の発癌誘導活性について、ヌードマウスを用いて確認中である。さらに発展的実験として、H2A変異体でも同様の実験を行っており、非ユビキチン化H2A変異体や周辺部位の変異体でも癌化を誘発することを確認した。この興味深い結果から、癌化誘導の分子メカニズムの解析を準備中である。3、VRK1標的遺伝子におけるChIP解析を行い、pT120-H2Aに拮抗しubK119-H2Aの修飾を担うE3ユビキチンリガーゼとしてRing1BやDZIP3を見出した。これら2つをノックダウンすると、VRK1標的遺伝子の発現が上昇することも確認した。Ring1BについてはChIP-seqも行い、現在VRK1のChIP-seqデータと合わせて解析中である。4、vrk1ノックアウトマウスの作製はできているが、このマウスが不妊であるため、vrk1およびusp21ダブルノックアウトマウスの作製には複数回の交配が必要となり、現在最終段階の交配を行っているが、ダブルノックアウトマウスの出生率が著しく低く、同腹および同性解析の困難が生じている。引き続き交配を続けることと、妊娠後に胎児の解析を行うことも検討中である。生化学2015年度は、2014年に得られた結果から、主にVRK1変異体やヒストンH2A変異体による発癌誘導の分子メカニズムの解析を以下の3つの実験系を用いて行う。1、ヌードマウスで形成された腫瘍を摘出し、タグを付加したVRK1やH2A変異体を発現させた細胞をFACSソーティングし、発現低下する癌抑制遺伝子や発現上昇する癌遺伝子をRNA-seqを用いて見出し、これらの遺伝子発現をコントロールするクロマチン修飾酵素(H2Aユビキチン化を担うポリコーム転写抑制複合体PRC1、同じくH3K27メチル化を担うPRC2、H2Aリン酸化のVRK1)やヒストン修飾に対する抗体を用いてChIP-seqを行い、VRK1やH2Aの変異体がどのように直接クロマチン上でエピジェネティクス攪乱をもたらすかを調べる。2、培養細胞を用いて、タグを付加したVRK1やH2A変異体を発現させた細胞を発現させ、上記クロマチン修飾酵素のクロマチンへのリクルートやヒストン修飾が、どのように変化するかについて、細胞全体でグローバルに、あるいは局所的な(VRK1やH2A変異体が結合する周辺のヌクレオソーム)視点で、免疫沈降やウエスタンブロット解析を用いて調べていく。3、上記1、2の実験から考察された分子メカニズムをin vitroで実証するため、精製したヒストンを用いて作製した人工的なヌクレオソームの場で、変異ヒストンH2AやVRK1がクロマチン修飾酵素のリクルートやヒストン修飾動態にどのような影響があるかを実証する。
マグネシウム合金の大ひずみ加工と超微細粒組織・集合組織の制御に関する研究

マグネシウムMg合金を高温から順次降下させながら連続的に多軸鍛造を施して得られる微細粒Mg合金から引張軸がHCP底面{0001}に平行0°,45°傾斜、90°垂直方向となる3種類試験片を切出し,引張変形性に及ぼす初期組織の影響を系統的の調査した.主な結果は次のようにまとめられる.1. 423K, 5×10^<-5>S^<-1>における引張破断伸びは材料の異方性に寄らず200%を超え,45°,90°材の全伸びは300%付近を示すのに対し,そこでの応力指数はn〓4であり,高ひずみでもほぼ等軸な微細粒組織が存在することなどから,そこでは低温超塑性が発現したと判断される.2. HCP格子底面が引張軸と45°傾斜する初期集合組織を有する45°,90°材は,変形中に底面が引張軸と平行方向へ結晶回転を起こす結果として,後者を初期集合組織とする0°材に比べてより大きな超塑性伸びを示す.3.超微細粒Mg合金の超塑性変形は,通常の粒界すべりだけでなく,連続的動的再結晶が働いて結晶粒組織の粗大化または細粒化が起こることに支配される.その結果,破断までの全伸びは結晶粒内で働く底面すべりの大きさを通して初期集合組織の影響を強く受けるものと考察される.マグネシウム合金AZ31を加工温度を高温から順次降下させながら連続的に多軸鍛造を施し,その過程で起こる微細粒組織と集合組織の形成過程を調査した.最適な組織制御のための加工熱処理条件を求めること,並びに加工誘起微細粒組織の形成機構を検討する実験研究を開始し,来日後この約半年の研究期間中に,次の諸結果を得た.1.降温中多軸鍛造の繰返しによって生じる結晶粒組織では,その平均結晶粒径は高ひずみでは加工ひずみの影響を殆ど受けないこと,その平均結晶粒径は加工温度の低下に伴い減少すること,等を明らかにした.これまでの実験では0.2μm程度の超微細粒組織の生成に成功した.2.微細新粒は初期結晶粒内をキンクバンドが微細分割することによって生成し,加工ひずみと共に初期結晶粒界付近から中心部へと微細粒組織が広がり,高ひずみではある一定の大きさを有する安定結晶粒組織が生成することを明らかにした.3.底面{0001}が圧縮方向に並行する強い初期集合組織は,圧縮変形と共に回転を起し,高ひずみでは底面が圧縮方向に垂直となるよう回転するが,その過程は3段階に分類された.すなわち,1.結晶回転が圧縮ひずみに比例して生じる初期段階(0<ε<0.4),2.回転角度が約70度で停滞する第2段階(0.4<ε<1),3.その後約80度まで回転が進み再び停滞する第3段階(1<ε),である.マグネシウムMg合金を高温から順次降下させながら連続的に多軸鍛造を施して得られる微細粒Mg合金から引張軸がHCP底面{0001}に平行0°,45°傾斜、90°垂直方向となる3種類試験片を切出し,引張変形性に及ぼす初期組織の影響を系統的の調査した.主な結果は次のようにまとめられる.1. 423K, 5×10^<-5>S^<-1>における引張破断伸びは材料の異方性に寄らず200%を超え,45°,90°材の全伸びは300%付近を示すのに対し,そこでの応力指数はn〓4であり,高ひずみでもほぼ等軸な微細粒組織が存在することなどから,そこでは低温超塑性が発現したと判断される.2. HCP格子底面が引張軸と45°傾斜する初期集合組織を有する45°,90°材は,変形中に底面が引張軸と平行方向へ結晶回転を起こす結果として,後者を初期集合組織とする0°材に比べてより大きな超塑性伸びを示す.3.超微細粒Mg合金の超塑性変形は,通常の粒界すべりだけでなく,連続的動的再結晶が働いて結晶粒組織の粗大化または細粒化が起こることに支配される.その結果,破断までの全伸びは結晶粒内で働く底面すべりの大きさを通して初期集合組織の影響を強く受けるものと考察される.
長期避難生活を送る高齢者の心理社会的影響の評価と支援方法の開発

本研究の目的は、東日本大震災により長期避難生活を余儀なくされている住民(飯舘村を中心)の心理社会的影響を評価し、得られた知見をもとに心理社会的支援のあり方を検討するものである。初年度と二年目は量的な調査を行い、1)精神的健康度の現状、2)要介護認定のリスク要因について、震災前後のコホート研究のデザインで関連要因を分析した。その結果、1)震災前に比べて震災後に抑うつ傾向の高齢者が増加したこと、そして抑うつ傾向が生じる要因として、居住環境要因が関連していることが明らかになった。つまり、仮設住宅よりも借り上げ住宅に避難している住民の方が精神的健康度は低く、ソーシャルサポートを受けにくい傾向がわかった。2)震災後の要介護認定発生は初年度に「軽度認定」が多く発生していることがわかった。避難によって身体機能が低下したこと、あるいは隣り近所のサポートが得られにくくなり、サービスを利用するニーズが高まったことが考えられる。また。震災前に「運動器の機能向上」「認知症予防・支援」「うつ予防・支援」に該当していたものが該当しないものに比べて、より震災後に要介護認定を受けていることが示されるとともに、震災後に行われた運動教室に参加することは、部分的に要介護リスク(心理的要因)を軽減することが示された。以上のことから、震災直後に、生活機能が低下しやすい高齢者のスクリーニングを行い、適切なサービスにつなげる必要性が示唆された。最終年度は、得られた成果を村保健師に報告するとともに、村の健康増進計画の「こころの健康」と「高齢者保健」の分野に反映した(第四次飯舘村健康増進計画)。これらの成果は、国内外の学会報告で報告するとともに、広く国内の雑誌(黒田.公衆衛生,2017)と、国際誌(Kuroda et al, BMJ open, 2017)それぞれに掲載され、広く知見を共有できたと考えられる。本研究の目的は、東日本大震災により長期避難生活を余儀なくされている住民の心理社会的影響を評価し、得られた知見をもとに心理的支援のあり方を検討するものである。平成27年度は、飯舘村の高齢者を対象とし、震災後の抑うつ症状の経年変化とその関連要因、そして居住環境別の抑うつ傾向の実態を明らかにすることを目的に分析を行った。また、飯舘村民の避難先の居住環境において、仮設に比べて借り上げ住宅への避難者のほうが、人とのつながりが希薄であることが報告されている。人的交流が少ないことは抑うつ症状のリスクが高まることが先行研究によって指摘されており、避難先の居住環境(仮設・借り上げ住宅)と抑うつ症状の関連を明らかにすることにより、効果的な支援方法の開発に結びつける。メインアウトカムである抑うつ状態の評価は、厚生労働省による基本チェックリストのうつ予防・支援の項目を用いて評価をした(厚生労働省, 2005)。分析の結果、震災3年後の追跡調査では37.2%が抑うつ傾向を示しており、震災前の30.7%に比べて、6.5ポイント増加していた。さらに、多変量解析を行ったところ、女性であること、糖尿病の既往歴があること、IADLの得点が低いことが、独立して抑うつ傾向の発生に関連していた。また、避難先の居住環境によりSocial Networkが異なり、Social Networkが低いことが抑うつ傾向の発生と関連していることを本研究は示した。今後の震災対応への重要な知見をもたらすと考える既存データを用いて、コホート研究デザインで、震災前後の抑うつ発生の現状とそのリスク要因を分析した。得られた結果は自治体にフィードバックをするとともに、論文投稿中である。第二研究の研究デザインについても有識者を交えて検討をしている。平成28年度は、要介護認定率が全村避難によってその傾向が促進されるかを明らかにするとともに、どのような要因が要介護状態のリスクになったかを、4年間の追跡調査で検討した。さらに、震災後に行われてきた運動教室に定期的に参加することにより、要介護状態のリスク(心理的要因)が低減されるかの介入効果を検討し、震災に伴う中長期的な介護予防事業のあり方を検討することを目的とした。対象者は、2010年3月に、飯舘村に在住する高齢者のうち、調査票を回収した1,358名(回収率84.3%)とし、欠損を除外した1,159名を分析対象とした。目的変数は新規の「要介護認定発生(認定群・自立群)」とした。説明変数として、年齢、性別、そして基本チェックリスト(KCL)を用いて「運動器の機能向上」「栄養改善」「口腔機能の向上」「閉じこもり予防・支援」「認知症予防・支援」「うつ予防・支援」の6つの下位項目を評価した。分析はCox比例ハザード回帰分析を用いて、要介護認定についてのハザード比(HR)を求めた。さらに、震災後の運動教室への参加(参加群・非参加群)ごとに解析を行った。その結果、震災前に「運動器の機能向上」「認知症予防・支援」「うつ予防・支援」に該当していたものが、該当しないものに比べて、より震災後に要介護認定を受けていることが明らかになった。また、運動教室に参加することは部分的に要介護リスク(心理的要因)を軽減することが示された。

したがって、震災などの有事に生活機能が低下している高齢者を早期に発見し、運動教室などの介入に結びつけることは、要介護リスクを減らす対策として有効であると考えられた。自治体と連携し、既存データを用いたコホート研究デザインで、震災前後の要介護認定発生の同行とリスク要因を明かにした。得られた知見は、自治体にフィードバックをするとともに、論文投稿中である。本研究の目的は、東日本大震災により長期避難生活を余儀なくされている住民(飯舘村を中心)の心理社会的影響を評価し、得られた知見をもとに心理社会的支援のあり方を検討するものである。初年度と二年目は量的な調査を行い、1精神的健康度の現状、2要介護認定のリスク要因について、震災前後のコホート研究のデザインで関連要因を分析した。その結果、1震災前に比べて震災後に抑うつ傾向の高齢者が増加したこと、そして抑うつ傾向が生じる要因として、居住環境要因が関連していることが明らかになった。つまり、仮設住宅よりも借り上げ住宅に避難している住民の方が精神的健康度は低く、ソーシャルサポートを受けにくい傾向がわかった。2震災後の要介護認定発生は初年度に「軽度認定」が多く発生していることがわかった。避難によって身体機能が低下したこと、あるいは隣り近所のサポートが得られにくくなり、サービスを利用するニーズが高まったことが考えられる。また。震災前に「運動器の機能向上」「認知症予防・支援」「うつ予防・支援」に該当していたものが該当しないものに比べて、より震災後に要介護認定を受けていることが示されるとともに、震災後に行われた運動教室に参加することは、部分的に要介護リスク(心理的要因)を軽減することが示された。以上のことから、震災直後に、生活機能が低下しやすい高齢者のスクリーニングを行い、適切なサービスにつなげる必要性が示唆された。最終年度は、得られた成果を村保健師に報告するとともに、村の健康増進計画の「こころの健康」と「高齢者保健」の分野に反映した(第四次飯舘村健康増進計画)。これらの成果は、国内外の学会報告で報告するとともに、広く国内の雑誌(黒田.公衆衛生,2017)と、国際誌(Kuroda et al, BMJ open, 2017)それぞれに掲載され、広く知見を共有できたと考えられる。本研究期間中に実施した成果を国内外の学会で発表するとともに、和文そして国際誌に発表することができた。また成果を自治体に報告するとともに、長期的な対策となるように、健康増進計画に反映することができたため、当初の研究計画通り、おおむね順調に進展したと考えられる。初年度と二年目は量的な調査を行い、1)精神的健康度の現状、2)要介護認定のリスク要因について、震災前後のコホート研究のデザインで関連要因を分析した。その結果、1)震災前に比べて震災後に抑うつ傾向の高齢者が増加したこと、そして抑うつ傾向が生じる要因として、居住環境要因が関連していることが明らかになった。2)震災後の要介護認定発生は初年度に「軽度認定」が多く発生していることがわかった。
ZnSeTe系歪超格子による光up-conversion効果

今回、DSB構造をもつZnSe-ZnTe超格子[(7,2)_6(2,5)_1]_<100>を成長し、その構造解析および波長変換効果のメカニズムを検討した。評価にはHRXD、ラマン散乱、PL励起光源依存性、PL励起光強度-発光強度依存性を行った。HRXDでは二重サブバンド超格子の結晶構造で支配的な(7,2)_6層の短周期超格子に対するサテライトピークの0次、±1次、-2次が観測された。また、(2,5)_1層からの0次のサテライトピークと思われるものも現れた。これらの回折ピークとシミュレーション値を比較した結果、ほぼ設計どおり超格子が成長していることを確認した。ラマン散乱では、ZnSeおよびZnTe likeのLOフォノンの重ね合わせによるスペクトルが観測され、2モードとしてLOフォノンを観測できたことから混晶化していないことを確認できた。また、PL励起光源依存性では長周期超格子中に存在する(7,2)_6および(2,5)_1からの発光スペクトルが、それぞれ2.2 eVと1.8 eVに見出された。前回の実験では育成した[(2,2)_<12>(2,5)_3]_<30>DSB超格子は、2.1 eVと1.9 eV付近にピークをもつ。本研究の目的の一つである波長変換を示す発光ピークのエネルギー位置を2.1 eVから2.2 eVへ約0.1 eV高エネルギー側へシフトすることができた。しかし、波長変換効果の変換効率の指標となる2つのピークの強度比(I_<2.2>/I_<1.8>)が前回よりも大幅に小さくなった。これは、励起光強度-発光強度依存性による解析の結果を支持する。強度依存性を示すべき乗nが、[(7,2)_6(2,5)_1]_<100>の超格子では波長変換を示す2.2 eVのピークに対して1.3となった。だが、前回育成したサンプルの波長変換ピークのn値は1.7であり、これら2つのn値の大きさを比較すればピーク強度比の減少も肯ける。波長変換効果はそのn値から、自由励起子発光(n=1)とは異なる発光起源をもつと推測できる。最後にHRXD、ラマン散乱、PLの測定結果も踏まえて、波長変換のメカニズムを具体化するための遷移過程モデルを提案した。前回の実験も踏まえ、波長変換効果には特殊設計超格子特有の2光子吸収のような段階的な遷移過程が生じているのではないかと考えられる。光変調(up-conversion)効果実現を目的に、同一超格子内に二重量子準位を持つ構造をMBE成長させた。

(1)成長した超格子構造は;はじめにInP(100)基板上にZnSe buffer層を1000Å成長し、ZnSe2ML、ZnTe2ML(以後(2,2)と記す)の超格子を3層、(2,6)の超格子を12層積層したものを1周期とし、これを30周期成長した。これを以後DSB(dual subband superlattices)構造と呼ぶ。(2)DSBのX線回折測定の結果は;基板であるInP(400)からの鋭い回折ピークが見られ、更にその両脇に超格子構造による複数のサテライトピークが観測されたことから、この試料が良好な界面を持つ周期的構造を有していることが確認された。また、実測値はシミュレーションによるDSB構造のX線回折スペクトルとピーク位置がほぼ一致し、試料は設計どおりの樺造を有していることが確認された。(3)DSB試料のPL測定により発光スペクトルの観測を行なった。測定は励起光源にHe-Cdレーザー(325nm、4mW)を使用し、測定温度10Kで行なった。その結果、2.1eV付近と1.9eV付近に2つのピークが観測された。ZnSeおよびZnTeの低温におけるバンドギャップはそれぞれ2.82eV、2.39eVであり、今回観測されたピークとはその位置が大きく異なる。そこでこの2つのピークがDSB中の2種類の超格子のサブバンド間遷移によるものと仮定し、それぞれの周期の短周期超格子との比較からピークの同定を行なった。そのために育成した(2,2)を100層積層した試料(2,2)_<100>および(2,5)_<100>のPLスペクトルでは、それぞれ2.1eV付近と1.9eV付近にピークが観測された。これら短周期超格子とDSBのPLスペクトルとの比較より、DSBの2つのピークがDSBを構成するそれぞれの短周期超格子からの発光であるということが確認された。Up-conversion効果の実験にはHe-Neレーザーを用いるため、詳細な知見を得るためにはDSB発光のエネルギー間隔を広げる必要がある。そこで今年度は試料構造を次のように設計し、DSB発光のエネルギーをレーザー光のエネルギーから離すことを試みた。その構造はZnSe 7MLとZnTe 2MLを6層(7,2)_6、その上に(2,5)_1を成長させ1周期とし、100周期重ねたものである([(2,5)_2/(7,2)_6]_<100>)。基板はGaAs(001)を使用し、バッファ一層としてZnSeを約2000Å成長させた。高分解能X線回折(HRXD)の結果から設計どおりの構造が育成されていることが確認された。すなわち、DSBにおけるダブルピークの発光エネルギーは試料構造の設計により制御可能であることが分かった。一方この試料のup-conversion効果による発光効率は昨年度の試料に比べ1/5程度しかなく、発光効率の向上が来年度の課題である。また、epi-readyのZnSe基板を入手できたので、この上に同様の構造を育成し、633nm線の透過量を外部から照射する325もしくは488nm線制御可能かも来年度の課題である。今回、DSB構造をもつZnSe-ZnTe超格子[(7,2)_6(2,5)_1]_<100>を成長し、その構造解析および波長変換効果のメカニズムを検討した。評価にはHRXD、ラマン散乱、PL励起光源依存性、PL励起光強度-発光強度依存性を行った。HRXDでは二重サブバンド超格子の結晶構造で支配的な(7,2)_6層の短周期超格子に対するサテライトピークの0次、±1次、-2次が観測された。また、(2,5)_1層からの0次のサテライトピークと思われるものも現れた。これらの回折ピークとシミュレーション値を比較した結果、ほぼ設計どおり超格子が成長していることを確認した。
ヒト小児咽頭扁桃における粘膜免疫誘導メカニズムの解明

小児期に最も発達を示す鼻咽腔粘膜関連リンパ組織(NALT)の構成成分であるヒト咽頭扁桃組織を用いて,ヒトNALTの機能解析を行うことを目的とした。初年度は1)ヒト咽頭扁桃組織、鼻腔洗浄液などを使用するために院内倫理委員会において本研究計画実施に関する倫理審査を受け、2)ヒト小児咽頭扁桃上皮細胞における検討の前に正常気道上皮細胞(NHBE)を購入し、NHBEによる単層培養および気液界面細胞培養系(Air-Liquid Interface: ALI)による気道上皮細胞の機能に関する予備検討を行なった。具体的には、RSウイルスやライのウイルスなどの呼吸器感染性ウイルス感染によるサイトカイン産生能力の誘導とサイトカイン産生誘導の阻害効果を持つ薬剤の気道上皮細胞における作用点の解析を行い、気道上皮細胞の果たす自然免疫の機能解析を行った。さらに3)フローサイトメトリによるcell sortingを行うための細胞接着剥離に関する予備検討をNHBEを用いて行い、接着細胞剥離に使用できかつ細胞表面抗原の活性や発現を損なわない条件・薬剤を各種検討した。NHBEと咽頭扁桃上皮細胞の反応性に大きな違いがないかをウイルス感染に伴うサイトカイン産生能力や細胞間の接着を担うタイト結合タンパク質の局在を免疫染色で比較解析を試みNHBEと咽頭扁桃上皮細胞に大きな違いがないことを確認した。また粘膜免疫に関する知識を深めるためにThe 3rd international conference on innate lymphoid cell (2018年11月29日から12月1日、東京)に参加、鼻腔から得られた組織における2型自然リンパ球に関する研究結果をまとめposter発表を行った。初代培養の確立の条件検討に時間がかかった。また接着細胞のフローサイトメトリを行うにあたっての細胞剥離の条件検討に時間がかかりまたsotingの条件設定に時間を要しているため。培養上皮細胞を無処置群,抗原としてOvalbumin(OVA)と蛍光色素を結合させた蛋白と20分間培養させた群,さらに消化管粘膜で成熟M細胞を誘導するサイトカインを24時間前に処置しM細胞の誘導を行ったのちにOVA-蛍光色素と20分間培養を行う群の3群にわける.洗浄後細胞を回収,3群について上皮系マーカーであるCD326抗体および血球系細胞マーカーであるCD45抗体で染色を行い,細胞膜を透過処理する.その後CD326陽性,CD45陰性,蛍光色素陽性および陰性細胞をcell sortingにて回収しtotal RNAを回収しRNA sequenceを行う.小児期に最も発達を示す鼻咽腔粘膜関連リンパ組織(NALT)の構成成分であるヒト咽頭扁桃組織を用いて,ヒトNALTの機能解析を行うことを目的とした。培養上皮細胞を無処置群,抗原としてOvalbumin(OVA)と蛍光色素を結合させた蛋白と20分間培養させた群,さらに消化管粘膜で成熟M細胞を誘導するサイトカインを24時間前に処置しM細胞の誘導を行ったのちにOVA-蛍光色素と20分間培養を行う群の3群にわける.洗浄後細胞を回収,3群について上皮系マーカーであるCD326抗体および血球系細胞マーカーであるCD45抗体で染色を行い,細胞膜を透過処理する.その後CD326陽性,CD45陰性,蛍光色素陽性および陰性細胞をcell sortingにて回収しtotal RNAを回収しRNA sequenceを行う.上皮細胞の条件検討に時間がかかったため、RNAsequenceが未施行であり、そのための予算を次年度使用額とした。
戦後における女子体育教員養成機関に関する歴史的研究

その大学で学ぶことにより保健体育科教員免許状を取得できる、女子が入学可能な大学・短大を女子体育教員養成機関とした。それらは国立大学教員養成大学・学部とそれ以外の国公私立大学、短期大学に大別できる。前者は戦後の新制大学発足時の昭和24年には、各都道府県に一校設置された教員養成大学・学部の小・中教員養成課程等保健体育科と金沢大学、広島大学のみに設置された高校教員養成課程体育科であった。その後、高校教員不足を補う臨時的措置として昭和27年から昭和42年までに9大学に特別教科教員養成課程保健体育科が設置された。しかし、昭和53年には広島大学で高校教員養成課程と合わせて改組による募集停止、昭和63年から平成12年までに、少子高齢化社会を迎えての教員余剰のため全大学が募集停止した。それに代わり、教員免許状取得を卒業要件としないスポーツ・健康に関するコースや専攻を持つゼロ免課程が昭和63年に7大学に設置された後,平成8年からは改組も始まり平成12年現在38大学に設置されている.ゼロ免課程は,スポーツ,健康またはスポーツ・健康の両方を専門分野として学び,生涯教育の指導者を目指す課程であるといえる.後者は昭和24年には国立6,私立3の9大学(2校は女子大)であったが,その後28大学(6校は女子大),18短期大学(11校は女子短大)の計46校(うち,私立36)が設置あるいは保健体育科教員免許状の課程認定を受けた。男子大4校,女子大1校,女子短大1校はその後共学となった。現在全校に女子は入学できる。大学学部名は改組によるものも含め21種類にも及ぶ。体育学部15校,文学部6校,教育学部5校で他はそれぞれ異なる。体育学部としての新設は昭和58年が最後で,近年は医療技術学部,環境人間学部など様々である。短大学科名は体育(学)科,保健体育(学)科が15校で最も多いが,昭和41年設置がその名称での最後であった。教員養成制度は戦前と大きく変わり、戦前の師範系諸学校を母体として男女共学の教育系大学・学部が昭和24年に全国に52校発足した。それまでの小学校教員だけでなく、中学校の教員も養成し、小中教員養成課程でも、希望すれば高校教員免許状を取得できた。さらに高校の教員不足に対して臨時の施策として特別教科教員養成課程が設置された。特教保健体育科は昭和27年から42年にかけて9大学教育学部に設置され、専門的な体育教師養成が行われ、男子より少数の女子が学んだ。しかし、これらの教員養成学部は少子化と高齢化社会の到来により、改組、再編が必要となり、教員免許の取得を卒業要件としない課程の出現を見るに至った。保健体育科からの発展では昭和63年の東京学芸大人間科学課程生涯スポーツ専攻、平成元年の金沢大のスポーツ科学課程の設置以後、「スポーツ」、「健康」、「生涯」、「人間」等をキーワードとして各大学に新課程が設置された。平成10年度に特別教科教員養成課程保健体育科は2大学に残るのみである。一方、昭和24年の教育職員免法改正により、大学による開放的養成が始まったことにより、教員養成学部以外に体育学部や他学部体育学科等で保健体育科教師が養成された。これらの学部は、戦前の高等師範から発展した大学と、その前身が旧免許法の許可校、指定校であった私立専門学校等から発展した大学と戦後に新設された大学に分類できる。

さらに昭和25年に短期大学制度が発足し保健体育科教師が養成された。短大は主として旧免許法の許可校、指定校であった私立女子専門学校等が移行したもので、これらの短大は昭和37年以後、短大併設で女子大学に発展していった。昭和24年の新制大学発足時に体育学部は国立1、私立1で両校へ女子は入学できた。さらに女高師から発展した2女子大学の体育関連学科へも入学できた。大学体育学部は昭和59年まで漸増し14校となった。近年、教員養成から生涯、健康、選手養成へ転換が始まり、学部名も平成5年以後スポーツ健康学部等、スポーツ科学部等に3大学が改称した。短大は教員養成の使命を終え、廃止も続いている。戦後、大学の多くは男女共学となり、女子体育教員養成機関とは、体育教員養成機関のほぼ全校を意味することとなった。そこで、全体育教員養成機関の変遷の概要をまとめた。国立大学教員養成学部では、小中の課程で高校の教員免許も取得できる制度であり、高校教員養成のための課程は当初、2大学のみで平成8年からは皆無となった。高校教員不足を補う臨時の施策として、特別教科教員養成課程保健体育科が昭和27年から昭和42まで全国9校に設置された。昭和63年からは免許取得を卒業要件としないゼロ免課程が特教保体に代わるものとして設置され始め、特教保体は順次廃止され、平成11年度は1大学に残すのみとなった。教員が過剰となり、社会全般の生涯体育指導者養成の必要性から起きたことである。ゼロ免でありながら、教員免許の課程認定を受けているという矛盾を呈しながら、教育学部は生涯教育の指導者養成へと変化し、学校における「保健体育」から生涯の「スポーツ」指導者養成へと変化してきた。教員養成学部以外の体育を主として学ぶ国立大学の前身は、主として高師・女高師であった。そのほかに、国公立大学の中にも開放的養成により保健体育科免許状を取得できる大学も現れたが、すでに保健体育科教員養成をやめた大学もある。新制大学発足時の体育系私立大学は1校のみで、体育を主専攻としない大学の課程認定校もあった。その後、体育系大学新設が続いた。平成2年を最後に新設は皆無で、健康、社会体育、福祉、生涯スポーツ指導者養成へ向けての学科増設や学部改組のみである。戦後、中学保健体育教師養成の任を担った短大の約半数が既に廃止した。戦後、保健体育科教員養成機関は増加したが、教員の需給関係、社会の変化から、教員免許状の課程認定は受けながらの生涯スポーツ、健康等の指導者養成へと目的を拡大した。その大学で学ぶことにより保健体育科教員免許状を取得できる、女子が入学可能な大学・短大を女子体育教員養成機関とした。それらは国立大学教員養成大学・学部とそれ以外の国公私立大学、短期大学に大別できる。前者は戦後の新制大学発足時の昭和24年には、各都道府県に一校設置された教員養成大学・学部の小・中教員養成課程等保健体育科と金沢大学、広島大学のみに設置された高校教員養成課程体育科であった。その後、高校教員不足を補う臨時的措置として昭和27年から昭和42年までに9大学に特別教科教員養成課程保健体育科が設置された。しかし、昭和53年には広島大学で高校教員養成課程と合わせて改組による募集停止、昭和63年から平成12年までに、少子高齢化社会を迎えての教員余剰のため全大学が募集停止した。
好熱性光合成生物の熱ショック蛋白質の耐熱性機構

熱ショック蛋白質は熱ショックなどによってその発現が誘導されるストレスタンパク質である。また分子シャペロンとしてタンパク質間の集合や解離を介添する一群のタンパク質でもあり、耐熱性との関係が注目される。本研究は高温に生育する好熱性ランソウに存在する熱ショックタンパク質について、耐熱性獲得の機構を分子遺伝学的及びタンパク化学的に解析しその耐熱機構を解明することを目的とする。我々は最近、常温よりはるかに高い温度に生育する好熱性ランソウでも、更に高い温度に曝すといくつかの熱ショックタンパク質が顕著に増加することを見出した。また63kDaのシャペロニンと相同性の高い蛋白を発現すると考えられる遺伝子(groEL2と命名)をクローニングし塩基配列を明らかにした。この遺伝子産物とは異なるアミノ酸配列をもつ別の63kDaポリペプチドが熱ショックにより蓄積することが分った。本研究の目的は、(1)この蛋白(GroEL1)に対応する遺伝子(groEL1)をクローニングし塩基配列を明らかにすること、(2)これら二つのシャペロニン遺伝子について、転写産物の解析と転写調節の機構を明らかにすることと、(3)発現蛋白(GroEL1及びGroEL2)の単離と性質の解析を行うことである。好熱性ランソウとして温泉由来のSynechococcus vulcanusを用い、55°Cで培養した。熱ショックは63°Cの培地に移して行った。groEL1のクローニングは以下の様に行った。まず63kDaポリペプチド(GroEL1)のN末端及びリジルエンドペプチダーゼ処理後に得られたペプチド断片のアミノ酸配列を調べそれに従ってオリゴヌクレオチドを設計し合成した。これらをプライマーにし、染色体DNAを鋳型にして、PCR法により産物を得た。塩基配列はSanger法で調べた。転写調節と産物の解析は、核酸画分を熱フェノール法により調製し、ホルムアルデヒド・アガロース電気泳動後、groEL1及びgroEL2遺伝子断片をマルチプライム法で^<32>P標識してこれをプローブとして用いたノーザンハイブリダイゼーションにより行った。蛋白の分離精製は疎水クロマト、イオン交換クロマトの他、抗体を作成し、アフィニティカラムを作って用いた。前年までにPCR法により約540bpの産物を得、塩基配列を調べたところ、熱ショック蛋白GroEL1由来のペプチド断片のアミノ酸配列と一致することからこのPCR産物は63kDaポリペプチドの遺伝子(groEL1)の一部と考え、本研究では、ショットガン・クローニング及びプラークハイブリダイゼーションによるゲノムDNAライブラリのスクリーニングを行って、この遺伝子及び周辺のDNAのクローニングを行った。その結果、この遺伝子及びその上流、下流域を含むDNA断片を単離して全構造を解明することが出来た。さらに上流域には、groES遺伝子が見いだされた。さらにこれらの遺伝子はオペロン構造をとっていることが分った。塩基配列から推定したアミノ酸配列は既にSherman等によって報告されている常温性ランソウSynechococcus sp.PCC7942のgroEL及びgroES遺伝子のそれと非常に相同性が高いことが分った。前年度までにgroEL2遺伝子の転写産物(約1.8kbpのモノシストロニックmRNA)は、熱ショック後、約6倍に増加すること、groEL1の転写産物(約2.3kbp)は63°C、15分間の熱ショックで強く誘導され、その転写量は約7倍に増加することが分ったが、本研究では、温度について詳細に検討したところ、45°Cと50°Cではほとんど発現量に差がなかったが、通常培養に用いている55°Cでは明らかに発現量の増加が見られることが分った。このことはこの菌の生育速度が50°Cから63°Cまで殆ど変わらないことと考えあわせると、熱によるストレスは既に55°Cでかかり始めることを示唆する。熱ショックをかけて大量にGroEL1蛋白を合成させた菌体から得た可溶性画分をブチルトヨパールカラムで分画すると、HSP10(GroES)を伴う画分と、GroELのみの単一バンドを示す部分とに分れた。この単一バンドの標品をウサギに注射して、抗血清を得た。またこの精製の過程で、GroELを特異的に分解するプロテアーゼ活性が可溶性画分に存在することを見いだした。この酵素の性質や単離について現在検討中である。これまで熱ショックで誘導される蛋白は、この菌でそのほか4種類ほど検知されている。そのうちN末端アミノ酸配列をデータベースで検索したDnak(HSP70)と高い相同性をもつものについては、熱耐性と特に強い関係が予想されるが、発現量が少なく定量が難しかったので、ATPアフィニティカラムを用いて濃縮精製を行い抗体作製を試みた。良質の抗体が得られたので現在これを用いて温度ストレスと発現の量的関係を検討中である。また精製の目的でアフィニティカラムも作製し、現在条件検討を行っている。