hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨置換性リン酸カルシウム・コーティング・チタンインプラントの試作と骨内反応

リン酸カルシウム(ハイドロキシアパタイトなど)によるチタンのコーティングは、現在、種々の方法で行われている。しかし、そのほとんどがその工程で、リン酸カルシウム粒に高温を加えるため、骨置換性リン酸カルシウム(低結晶性のハイドロキシアパタイト、β-型リン酸三カルシウムなど)をチタンにコーティングすることができなかった。本研究は、骨置換性リン酸カルシウムをコーティングしたチタンインプラントの試作である。実験に用いたリン酸カルシウムは、湿式合成ハイドロキシアパタイト(HAP-BN)、乾式合成(HAP-DM)、β-型リン酸三カルシウム(β-TCP)、リン酸二カルシウム無水物(DCPA)、リン酸カルシウム二水物(DCPD)の4種類である。ブラストコーティングには、Twin Blast 90N (Towagikenn)を用い、噴出圧は6Kgf/cm^2とした。圧搾空気を用いて、上記の4種類のリン酸カルシウム粒について、コーティング実験を行った。コーティング膜の生成の判定は、コーティング後、10分後の超音波洗浄を行い、その後、走査型電子顕微鏡とx線マイクロアナライザーによる元素分析によって行った。明らかなコーティング層の形成を+、++、+++とし、コーティング層の形成はないが所々にリン酸カルシウム粒の付着の認められるものを±、全く付着のないものを-として評価した。その結果、HAP-BNは+、HAP-DMは-、β-TCPは±、DCPAは++、DCPDは+++であった。この結果より、湿式合成のリン酸カルシウムがコーティング層を形成しやすいことが明らかになった(HAP-BN、DCPA、DCPD)。さらに、コーティング層形成に与える粒径について検索した結果、1-5μmの粒子ではコーティング効果が弱く、10-30μmの比較的大きなものが有用であることが判明した。さらに、ガス雰囲気のあたえる影響について検討した結果、窒素ガス、酸素ガスにおいて有為な差は認めなかった。次に、疑似体液によるスクリーニングを施行した。その結果、これらのコーティング層上にハイドロキシアパタイト結晶が析出することを確認した。現在、試料をラット脛骨に埋入し、生体内での反応を検討中である。また、噴出圧を20Kgf/cm^2に上げて、コーティング状況を再度検討している。
痴呆性高齢者の感情反応に基づく生活環境の査定方法の開発

研究成果1.痴呆性高齢者の感情反応に基づく生活環境の査定方法の開発2.開発した査定方法の有効性の評価本査定方法を中等度以上の痴呆性高齢者6名に適用し、見いだされた生活環境項目を操作した。基礎水準測定期、操作導入期、追跡期の3期についてビデオカメラを用いて観察し、ワンゼロ法によりデータ化した感情反応と行動の出現率を比較した。その結果、不適切な生活プログラムや車椅子の使用方法、人による過刺激などの課題が抽出され、これらを操作することで肯定的な感情反応や行動の出現率が有意に増加した。3.実践に向けた査定方法の改変本査定方法の実践化に向けて、簡易版観察項目リストを作成し、老人保健施設入所中の中等度以上の痴呆性高齢者4名に適用した。簡易版観察項目リストによる観察結果は一部の感情反応や行動を除き、研究者による従来の方法の結果とほぼ同様であった。簡易版観察項目リストにより、不適切な椅子の使用、生活関連行動の機会の不足、対人関係の不足などが抽出され、これらを操作した結果、肯定的感情反応や行動の出現率が有意に増加した。結論本査定方法で見いだされた生活環境の支援により、痴呆性高齢者の感情反応や行動は肯定的に変化したことから、安楽を提供できた。本査定方法は有効であると判断した。1.痴呆性高齢者の感情反応に基づく生活環境の査定方法の開発痴呆性高齢者の安楽を目的に、生活環境を刺激とし、行動や表情を反応とする痴呆性高齢者の生活環境刺激-反応モデルを作成した。このモデルに従い、次のような査定方法を開発した。・観察は撮影マニュアルに基づき、ビデオカメラを用いた直接観察とする。・映像は行動分析的手法によりデータ化し、対象毎に時系列に表す。2.開発した査定方法の有効性の評価開発した査定方法を以下のとおり実施し、その有効性を評価する。(1)対象:愛知県内某老人保健施設に入所する中等度以上の痴呆性高齢者10名(2)方法:連続した3ヶ月に月1回連続3日間撮影した。1ヶ月目(第1期)に開発した査定方法を用いて生活環境を査定、2ヶ月目(第2期)に生活環境を操作、3ヶ月目(第3期)に追跡を行った。(3)結果:第1期での査定により、不適切な生活プログラム、入所者・職員による過刺激、車椅子の不適切な使用など、痴呆性高齢者個々の生活環境の問題が考えられた。第2期では、第1期で得られた結果に基づき生活環境の操作を行ったところ、高齢者の感情反応や行動は肯定的に変化した。第3期では施設職員が第2期同様の操作を継続した対象では、より一層の肯定的変化が見られた。1.実践に向けた査定方法の改変開発した査定方法の実践化に向けて、15年度に実施した研究結果た基づき、査定方法の一部を下記のとおり改変した。観察項目:観察対象者に共通して観察された項目を抽出し、感情反応(4項目)、対人行動、不快感や痛みに伴う行動、物に対する行動、日常生活行動や生活習慣に関する行動などに整理した。生活環境の観察項目についても同様に、関与する援助者や高齢者の対人行動、周囲の人の発話や行動、小物や飾り、音楽などの音、居場所、椅子・車椅子やテーブルなどに整理した。分析方法:ビデオ映像を観察する時間間隔を1分間とする観察項目のチェックシートを作成した。2.改変した査定方法の有効性の評価1)対象:愛知県内某老人保健施設に入所する中等度以上の痴呆性高齢者5名2)方法:第1期(1ヶ月目):ビデオカメラを用いて連続3日間、観察対象者を撮影した。施設職員が改変した方法を用いて観察し、その結果から生活環境の操作内容を決定した。第2期(2ヶ月目):査定結果に基づいて生活環境を操作し、第1期同様の観察を行った。第3期(3ヶ月目):その後の状態を追跡するため、第1期同様の観察を行った。3)分析:現在、データの分析中である。実践応用に向けて改変した査定方法の有効性の評価

愛知県内某老人保健施設に入所する中等度以上の痴呆性高齢者5名に改変した査定方法(簡易版観察項目リスト)を適用し、有効なデータが得られた4名について以下のとおり検討した。1.簡易版観察項目リストと従来の方法による観察結果の比較基礎水準測定期に撮影したビデオ映像について、施設職員による簡易版観察項目リストを用いた観察結果と研究者による従来の方法での観察結果を比較した。・感情反応では他の項目と区別しにくい怒りと不安/恐れは必ずしも一致していなかった。・首を縦横に振る行動、体幹前後屈などは援助者よりも研究者が観察していた。・環境項目については、ほぼ一致していた。2.簡易版観察項目リストに基づく生活環境の操作の有効性簡易版観察項目リストに基づいて操作方法を決定し、基礎水準測定期、操作導入期および追跡期の3期(各期3日間)について、感情反応と行動の生起率を比較した。・操作導入期には肯定的感情反応が増加し、否定的感情反応は減少した。体幹前後屈や歩行(徘徊)は減少し、興味・関心のある物を持つなどアクティビティに関する行動は増加した。また、対人行動は増加した。・追跡期に操作を継続できた対象者については、操作導入期とほぼ同様の結果を得た。
分子内および分子間エキシマ-形成を用いる分子認識センサ-の開発

1.γーシクロデキストリン(τーCD)の3種の水酸基のうちの1個を1ーpyrenebutyric acid(1ーPBA)および1ーpyrenecarboxylic acid(1ーPA)で置換した化合物を合成し、それらの分子内コンプレックスの構造を明らかにした。さらに会合二量体を形合する1級水酸基則1ーPBA置換γーCDを用いて、ゲスト結合の際に観察される会合二量体由来の分子間エキシマ-蛍光の減少とモノマ-蛍光の増大がゲストの種類によって大きく異なることを利用し、新型センサ-として応用可能であることを見いだした。このセンサ-系は特に生体関連成分であるコ-ル酸誘導体をμMレベルで検出することが可能であった。また多数のゲスト分子を検索した結果から、ゲスト分子の大きさ、疎水性、形状が応答に影響をすることを明らかにした。2.2個のナフタレン残基を有する3種のβーCD誘導体と4種のγーCDを合成し、それらのナフタレン残基関の相互位置および配向を明らかにした。これらの各異性体の分子内エキシマ-形成はゲスト添加に著しくより影響される。すなわち各異性体のエキシマ-蛍光強度は同一のゲスト分子に対し増大するものと減少するものがあり、またその程度も大きく異なっていた。この結果は修飾CDを多数組みれわせて使用することによって、化合物の一斉検知や分別検知ができることを示唆するものである。3.蛍光性プロ-プとしてダンシル基、および円二色性プロ-プとしてフェロセン基を有するβーCDを合成し、それらが分子認識センサ-として特にコ-ル酸誘導体の検知に応用可能であることを明らかにした。また光により構造変化を起こすアゾベンゼン修飾γーCDを合成し、光のonーoffによるそのゲスト結合能力変化を利用したphotoswitchable分子認識センサ-系の研究を行い、一つのホストによる多重応答型センサ-系を実現した。1.目的ピレン修飾はγ-シクロデキストリン(CD)を合成し、ゲスト添加に伴なうエキシマ-・モノマ-両蛍光の強度比の変化を観察し、この系の分子認識センサ-としての特性を明かにする。分子間エキシマ-形成系として、会合体を形成しやすいピレン残基1個を有するγ-CDを合成する。分子内エキシマ-形成系としては、ピレン残基2個を有するγ-CDを合成する。両系について、ステロイドを含む様々なゲスト分子を用いて、分子識別能を検定する。2.結果と考察(1)ピレン修飾γ-CDの合成:γ-CDの1個の1級水酸基を1-ピレン酪酸、1-ピレンカルボン酸、2個の1級水酸基を1-ピレンカルボン酸(4種の異性体を単離)でエステル化し、単離精製した。(2)ピレン修飾γ-CDのコンホメ-ションと会合挙動の解析:円偏向二色性スペクトルの測定によって、ピレンのγ-CD空孔での配向を確定した。さらに、UVスペクトルの濃度依存から会合定数を決定し、また、蛍光寿命および時間分解スペクトルを測定した。(3)ゲスト添加に伴う蛍光変化による分子認識能の検定:ゲスト分子として、種々のアルコ-ル、テルペン、アルカロイド、ステロイド等46種の化合物を添加し、エキシマ-・モノマ-蛍光の変化量を測定した。本法は分光学的に不活性な化合物、特にステロイド類を誘導体化せずに直接検出することが可能であった。いくつかの幾何異性体、光学異性体に対しても検出できた。ステロイド類では分子の形状よりも官能基の数および位置によって著しく検出感度が異なり、ウルソデオキシコ-ル酸はμmolレベルでの定量が可能であった。

3.今後の計画γ-CDの2級水酸基のピレン修飾、β-CDのダンシル修飾など新しい分子認識センサ-用ホストを合成し、分子認識能を体系化するとともに、医薬品、薬物への適用を試みる。1.目的種々の1置換および2置換シクロデストリン(CD)の種々の分光学的挙動のゲスト分子包接に伴う変化を利用する、主として中性有機分子を対象とした分子認識センサ-の開発を目指した。2.方法修飾CDとしてダンシル修飾βーCD,フェロセン修飾βーCD、ナフタレン2置換βーおよびγーCD,アゾベンゼン修飾γーCDを合成し、その水溶液中に各種ゲスト分子を一定量添加し、その前後における蛍光あるいは円二色性の強度変化を測定した。3.結果と考察ダンシルおよびフェロセン修飾βーCDは,ピレン修飾γーCDと同様にコ-ル酸誘導体に対する感度が高かった。特にダンシル修飾βーCDは会合体形成を必須としないため,ピレン修飾γーCDに比べ高感度化が達成できた。ナフタレン2置換βーおよびγーCDでは、置換基であるナフタレン残基が結合しているグルコ-ス残基の配置の違いに基づき、それぞれ3種と4種の異性体が存在するが、これらの異性体間で、その蛍光パタ-ンが大きく異なっていた。このことはこれらの分子内コンプレックスの形状が異なっていることを意味する。これらにゲスト分子を添加すると、蛍光スペクトルは各異性体間で異なった変化を示した。特にエキシマ-蛍光強度の変化は、同一のゲスト分子に対し増大するものと減少するものがあり、またその変化の程度も大きく異なっていた。このことから、化合物の一斉検知や分別検知が、これら修飾CDを多数組み合わせて使用することにより可能になる、という重要な知見を得た。修飾残基の光異性化により構造変化を起こすアゾベンゼン修飾γーCDの系では、ゲスト分子の存否に対応する円二色性スペクトルパタ-ンの変化が、アゾベンゼン残基のトランス型とシス型では大きく異なっていたことから、このものが、光感応性多重応答型分子認識センサ-として機能することを明らかにした。
マウス卵割期胚におけるNC比制御と核形態・クロマチン状態変化の解析

細胞の核の形や大きさは、分化度や腫瘍の悪性度など、細胞の状態を反映する指標の一つとして長く利用されている。核は細胞の分裂ごとに一度崩壊し、分配され、コンパクトにまとまった染色体を包むように再形成され、その後拡大する。核の大きさの制御は、この拡大過程の制御になる。核の拡大に影響を与え得る要因として、内包するDNA量、核内輸送や核膜要素集積の効率、細胞の大きさ(細胞質の量)などが報告されているが最終的な核の大きさがどのように決まるかについての知見はまだ限られたものしかない。本研究では、マウス前核期胚は(1)細胞が球形であり間期に大きさがほぼ変化しない、(2)前核もほ球形である、(3)胚ごとの細胞、核の大きさのばつきが少ない、(4)細胞サイズの改変かが可能である、(5)単為発生、極体放出抑制、2つ以上の精子核の注入等により、細胞または核あたりの染色体数の改変が可能である、という特性を利用し、細胞の大きさ及び、細胞または核あたりの染色体の数と核の大きさとの相関を検討した。その結果、前核の大きさは、内包する染色体の量にはほとんど影響を受けず、卵の大きさ(細胞質量)が一定である場合には、2つ以上の前核が存在する場合にも、前核の総体積が常に一定となることがわかった。また雌雄の前核は拡大速度が異なり、これが雌雄前核の最終的な大きさの違いとなることを見出し、拡大速度の規定要因としてクロマチン状態に関するの2つの要素を同定した。さらに、正常な核形成の前提として後期に染色体が極へと分配されることが必要となるが、そのためには中期まで染色体腕部を中期板へと押すpolar ejection forceが分裂後期には解除される必要があり、そのしくみとしてKid/Kif22の脱リン酸化による機能切替があることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞における核の形状や核と細胞質の体積比は、分化度や腫瘍の悪性度など、細胞の状態を反映する指標の一つとして長く利用されている。培養細胞や様々なモデル生物を用いた研究から、核の大きさに影響を与え得る要因として、内包する染色体の数(DNA量)、核内輸送の効率、細胞の大きさ(細胞質の量)などが報告されているが、核の大きさや形態の制御機構についての知見はまだ限られたものしかない。本研究では、マウス前核期胚は(1)細胞はほぼ球形であり、細胞周期を経ても大きさがほぼ変化しない、(2)前核もほぼ球形である、(3)胚ごとの細胞、核の大きさのばらつきが少ない、(4)細胞質の吸引除去や2つの卵を電気刺激により融合することによる細胞サイズの改変が可能である、(5)単為発生、極体放出抑制、2つ以上の精子核の注入等により、細胞または核あたりの染色体数の改変が可能である、という特性に着目し、核の大きさと細胞の大きさ、及び、細胞あたり、または核あたりの染色体の数(核相)との間の相関の有無を検討した。上記(4)の方法により、体積を通常の約半分1倍および、2倍にした卵を用い、1nまたは2nを含む単一の前核を形成させた。その結果、前核の大きさは、内包するDNA量にはほとんど影響を受けないが、卵の大きさ(細胞質量)と高い相関を示した。更に、2つ以上の前核が存在する場合、細胞の大きさに対し、すべての前核の総体積または総面積が一定となることが示唆された。また、雌性単為発生胚を用いた前核形成開始タイミング制御の分子機構についても解析を進めた。研究室の温度制御の不備によりマウス胚を培養する培養装置の温度維持管理に困難が生じ、夏期の研究進捗に問題が生じたが、繰越申請をすることで計画は概ね実行できた。また、大きさを変化させたマウス卵を用いた研究からは、想定通り細胞サイズによって核サイズが決定されることが明らかにでき、更に前核サイズは内包する染色体数(DNA量)にはほとんど影響を受けないことも明確にできた。このことから、雌雄の前核サイズの違いが生じるメカニズムを明らかにすることが、本研究の目的達成のよい足がかりになるという発想が生まれ、今後の実験方針が明確になった。

その結果、前核の大きさは、内包する染色体の量にはほとんど影響を受けず、卵の大きさ(細胞質量)が一定である場合には、2つ以上の前核が存在する場合にも、前核の総体積が常に一定となることがわかった。また雌雄の前核は拡大速度が異なり、これが雌雄前核の最終的な大きさの違いとなることを見出し、拡大速度の規定要因としてクロマチン状態に関するの2つの要素を同定した。さらに、正常な核形成の前提として後期に染色体が極へと分配されることが必要となるが、そのためには中期まで染色体腕部を中期板へと押すpolar ejection forceが分裂後期には解除される必要があり、そのしくみとしてKid/Kif22の脱リン酸化による機能切替があることを明らかにした。核の大きさが、細胞の大きさに依存して決まるメカニズムを明らかにする手がかりとして、マウス受精卵では雌雄の前核の大きさに差があり、雄性前核の方が常に少し大きいことに着目し、この差が生じる過程を詳細に観察、検討する。また、前核サイズを変化させた受精卵の発生過程を追い、核の形態や発生能との関連を明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。
熱中症予防に役立つ唾液を用いた評価方法の検討

平成30年度は、研究デザインの策定、予備検討を行った。また、脱水指標の選定や試料解析業者の選定を行った。しかし、被験者を募っての本研究まで達成できなかった。研究代表者が東京オリンピック・パラリンピック競技大会開催準備に関わっているため海外出張等で多忙となり、研究が進んでいない。実験補助にアルバイトを雇用して研究を進める。被験者の募集や測定試料解析業者などの選定は進んでいる。31年度は30年度と31年度に予定していた横断的研究を進める予定である。平成30年度は、予定していた研究が進まなかったため、平成30年度の使用額を次年度使用するため次年度の使用額が生じた。平成31年度は、平成30年度に行う予定だった研究と平成31年度に行う予定の量研究を実施する。具体的には、実験補助にアルバイトを雇用して研究を進める。
進行がん患者の自覚的負担感と対処方法に着目した在宅支援の研究

本研究の目的は,進行がん患者の自覚的負担感に対する対処方法および自覚的負担感,対処方法,精神的健康の関連性を明らかにすることとした.進行がん患者のself-perceived burdenに対する15の対処方法が明らかになった.進行がん患者がself-perceived burdenに対する対処方法として最も多かった対処方法は「家族で話し合う」であったが,次に多かった対処方法は「判断は家族に任せる」であった.Self-perceived burdenと精神健康は有意な正の相関関係を示した.5つの対処方法において,self-perceived burdenの強さに有意な差を認めた.平成26年度の研究実施計画として自覚的負担感への対処方法について国内外の文献検討を行い対処方法を抽出した.次に,進行がん患者の自覚的負担感の対処方法の探求を目的とした半構成的面接を実施した.倫理審査申請を行い承認を得た研究協力施設との調整を行った.対象者として,下記の条件を満たす進行がん患者の紹介を受けた.1病名・病状告知がされている,220歳以上,3在宅療養において家族介護者から身体的介護を受けている,または受けていた,4言語によるコミュニケーションが可能である,5同意書および同意撤回書へのサインが可能であるとした.除外条件として,重篤な身体・精神障害や認知症がある者とした.倫理的配慮として,研究の目的,方法,任意性,プライバシーの保護などについて同意文書を用いて口頭で説明を行った.同意書の提出をもって同意とした.面接はプライバシーが守られる個室にて行った.面接内容は許可を得てICレコーダに録音をした.現在11名の面接を終了し,内容分析手法を用いた分析を行っている.平成27年度の研究実施計画として自覚的負担感への対処方法の探求を目的とした半構造化面接法を実施した。研究対象者は自宅において家族から何らかの身体的介護を必要とした経験をもつ緩和ケア病棟入院中の進行がん患者とした。インタビューガイドに基づいて在宅療養中に家族介護者に対して負担や迷惑をかけていると感じた経験とその時の気持ち、その経験と気持ちに対する対処方法について尋ねた。各参加者に30分の面接を1回行い、インタビュー内容は参加者の許可を得て録音し逐語録とした。分析方法は内容分析を用いた。個別分析では逐語録を繰り返し読み、自覚的負担感に関する文脈を研究参加者の言葉のまま抽出した。抽出した記述内容を内容意味ごとに分割し、研究参加者の言葉を用いて本質的な意味を表すように表現しコード化を行った。全体分析では、個別分析の結果が得られた全研究参加者のコードの意味内容が類似したものを集め、共通する意味を表すようにサブカテゴリーとした。次に意味内容が類似したサブカテゴリーを集め、本質的な意味を表すように表現しカテゴリーにまとめた。分析の際には繰り返しによる分析内容の一致を確認し、内容分析の手法に精通した看護学系大学教員のスーパービジョンを受け厳密性と妥当性の確保に努めた。なお、本研究は所属大学および、研究協力施設の倫理審査委員会の承認を得て実施した。分析対象者は研究参加への同意が得られた者14名であり、性別は男性5名、女性9名であり、平均年齢±SDは72.7±11.2歳であった。performance status(PS)は、PS4が1名、PS3が10名、PS2が3名であった。自覚的負担感への対処方法として72個のコードから13のサブカテゴリー、6のカテゴリーが導き出された。研究協力施設の協力により面接の対象者の選定がスムースに行われ実施できたため。平成28年度は,進行がん患者の自覚的負担感,精神的健康,対処方法との関連性を検証することを目的とした質問紙調査を実施した。対象は,自宅において家族から何らかの身体的介護を必要としている外来通院中の進行がん患者,または,自宅において家族から何らかの身体的介護を必要とした経験をもつ入院中の進行がん患者とした。調査は継続中であり,現段階での回答者数は23名であった。回答者の性別は,男性7名,女性14名,無回答2名であり,平均年齢は73±13歳であった。performance status(PS)は、PS4が4名、PS3が4名、PS2が4名,PS1が10名,無回答1名であった。Self-perceived burden scaleの平均得点は30.3±8.2,GHQ-12の平均得点は13.1±7.2であった。進行がん患者が自覚的負担感に対して用いている対処方法は,自分で動く努力をする(78%),反省してよりよい方法に変える(73%),家族に感謝の気持ちを伝える,(78%),医療・介護サービスを利用する(72%),身近な人に相談する(60%),要求をひかえる(63%),自分のためにお金を使わないように言う(39%),怒りの感情を抑える(70%),自分の気持ちを我慢せず言う(77%),判断は家族に任せる(78%),自分の病気や世話は家族のためになると考える(36%),家族から世話を受ける権利があると考える(43%),つらいことは考えない(73%),家族で話し合う(87%)であった。調査は継続中であり,自覚的負担感,精神的健康,対処方法についての関連性の検証を行う。なお,本調査は所属大学および,研究協力施設の倫理審査委員会の承認を得て実施した。進行がん患者を対象とした調査であり,対象者の身体的・精神的負担を考慮した選定が必要であり,時間を要している。

また,調査協力への同意後に身体状態が悪化し回答が難しい状況もあった。主治医の判断の下,慎重に対象者の選定を行っている。平成29年度は,進行がん患者の自覚的負担感,精神的健康,対処方法との関連性を検証することを目的とした質問紙調査および分析を実施した。回答者数は88名であり,有効回答者数は85名であった。回答者の性別は,男性36名,女性45名,無回答4名であり,平均年齢は73±12歳であった。performance status(PS)は,PS4が16名,PS3が26名,PS2が15名,PS1が27名,無回答1名であった。自覚的負担感の測定はSelf-perceived burden scale,精神的健康の測定はGHQ-12を用いた。Self-perceived burden scaleの平均得点は26.8±11.8,GHQ-12の平均得点は18.4±10.1であり,Self-perceived burdenと精神健康は有意な正の相関関係を示した(r=0.41,p<0.01)。対処方法は「する」:2,「どちらともいえない」:1,「しない」0で回答を得て, Self-perceived burden scaleの平均得点の差を確認した。その結果,5つの対処方法において有意な差を認めた(p<0.01)。「自分で動く努力をする」について「する:29.±12」は「しない:9±8」と比べ有意に得点が高かった。「物事を決めるときは家族で話し合う」について,「する:28±12」は「しない:20±10」と比べ有意に得点が高かった。「反省してよりよい方法に変える」について,「する:29±12」は「しない:20±9」と比べ有意に得点が高かった。「家族に感謝の気持ちを伝える」について,「する:29±12」は「しない:20±9」と比べ有意に得点が高かった。「自分の病気や世話により家族の絆が強まったと考える」について,「する:31±11」は「しない:21±11」と比べ有意に得点が高かった。本研究の目的は,進行がん患者の自覚的負担感に対する対処方法および自覚的負担感,対処方法,精神的健康の関連性を明らかにすることとした.進行がん患者のself-perceived burdenに対する15の対処方法が明らかになった.進行がん患者がself-perceived burdenに対する対処方法として最も多かった対処方法は「家族で話し合う」であったが,次に多かった対処方法は「判断は家族に任せる」であった.Self-perceived burdenと精神健康は有意な正の相関関係を示した.5つの対処方法において,self-perceived burdenの強さに有意な差を認めた.研究協力施設の協力により面接の対象者の選定がスムーズに行われ,実施できたため.自覚的負担感への対処方法尺度を完成させ、尺度の信頼性・妥当性の検証、および自覚的負担感、対処方法、精神的健康の関連性を明らかにすることを目的とした質問紙調査を実施する。現在,関東,中国,九州地方の4カ所の施設から研究協力を得ているが,研究協力施設を増やし対象者を増やせるように検討している。高齢看護学自覚的負担感への対処方法尺度の作成に向け,進行がん患者への面接をし,アイテムプールを抽出する.
屋久島の高山性ミニチュア植物の適応形質の自然選択圧特定と連鎖解析

本研究ではヒメコナスビの小型化した形質が遺伝的バックグラウンドを有するかどうかを共通圃場実験から明らかにすることを目的とした。さらにヒメコナスビの小型化した形質が適応形質かどうかを共通圃場実験より導き出されるQst及び集団遺伝学的解析より算出されるFstの比較から明らかにした。共通圃場実験からヒメコナスビの葉はコナスビより小さく、その葉は細胞サイズと細胞数の両方が減少して小型化していた。FstとQstを比較した結果、ヒメコナスビの小型化した葉は適応形質であることが明らかとなった。さらに現地集団の調査から自ヒメコナスビにかかる自然選択圧が雨であることを特定した。屋久島の山頂部では82の分類群で、祖先種と比較して植物体が1/2から1/10ほど小型化する現象が報告されている(初島,1991)。この屋久島の高山性ミニチュア植物は、わずか6000年前から分化した可能性が高いことが、屋久島の地層学的調査からわかっている(Machida & Arai, 1983; Yasuda, 1991; Kimura et al., 1996)。本研究では屋久島の高山性ミニチュア植物が、屋久島の高山帯という特殊環境に短期間のうちに適応進化した優れた研究系であることを見出し研究を行っている。本研究では特に屋久島の高山性ミニチュア植物の一種であるヒメコナスビに着目し、近縁種のコナスビとの分子レベルの比較を行った。まずヒメコナスビとコナスビそれぞれ3個体を元親として交配からF1を作製し、それらのF1を自殖させることによりF2集団を作製した。これらF2集団のもとの親であるヒメコナスビとコナスビそれぞれ3個体からメッセンジャーRNAを抽出し、それらを次世代シーケンサーで解析することでcDNAライブラリーを作製した。抽出に用いたヒメコナスビとコナスビ個体はタバコモザイクウイルスに感染していると考えられるデータセットとなったため、cDNAライブラリーをジーンバンクの相同性検索により核由来、葉緑体由来、ミトコンドリア由来、タバコモザイクウイルス由来に分類した。その上でヒメコナスビとコナスビのcDNAライブラリーの比較解析を行い、それぞれ対応するメッセンジャーRNAの対応表を作製した。ヒメコナスビとコナスビの対応表で核由来のcDNAのうち両者間にスニップが確認されたものを選び、デプスの確認から一遺伝子由来であることが予想される組み合わせのみを抽出し、プライマーを作製した。現在までに32セットのプライマーを作製した。また連鎖解析を行うためにF2集団のDNAを抽出した。平成24年度は、これまで調査されていなかった6月、9月そして3月において自然選択圧の候補を絞るためにヒメコナスビの状態を調査した。これまでの年間を通した自然選択圧の調査から、最も強い自然選択圧は雨とそれに伴う生育地の水没、及び風である可能性が高い。屋久島の高標高地域では降水量が年間1万ミリを超え、ヒメコナスビが生育する登山道沿いはしばしば水没することを確認した。また次世代シーケンサーにより解析されたメッセンジャーRNAのF2集団の親個体から採取されたメッセンジャーRNAの解析を行い、ヒメコナスビとコナスビ間で差異があるSNPを探索中である。さらに近親交配を繰り返しすべての遺伝子座をホモの状態にするinbred strainを作製するために、まず第一世代のF1集団を作製した。また申請者が研究機関を異動したために研究環境の立ち上げを行った。まず、異動先の香川大学教育学部生物学教室において、共通圃場実験用の圃場を大学構内に確保し、倉庫や栽培用の棚の設置など整備を行い、ヒメコナスビとコナスビの栽培をおこなった。また分子実験の実験設備や実験室が整備されていなかったため、必要な実験機材(サーマルサイクラー、遠心機、インキュベーター、オートクレーブ、ディープフリーザー、クリーンベンチ、分光高度計、破砕機等)と試薬の購入、そして実験室の整備(遺伝子組換え許可申請)を行った。さらに研究を遂行する補助者を雇用し、栽培実験を行う植物のメンテナンス方法及び分子実験のトレーニングを行った。ヒメコナスビにかかる自然選択圧を調べる目的で、ヒメコナスビの生育地に雨滴計と雨量計を設置するための詳細な現地調査を3回(2014年5月、8月、9月)行った。屋久島高地の複数のヒメコナスビ集団の中から、登山口からのアクセスが容易で、雨滴計と雨量計を固定できる場所がある集団を選定した。これらの集団において雨滴計及び雨量計の設置の可否について環境省屋久島自然保護官事務所に問い合わせを行った。また自然選択圧を計測するために最適な雨滴計と雨量計についてそれぞれの専門家に問い合わせ行い、設置する雨滴計と雨量計を決定した。

前年に引き続き、屋久島の高山性ミニチュア植物であるヒメコナスビとその親となるコナスビのF2集団80個体からDNAを抽出した。次世代シーケンサーによるRADシーケンス(Restriction Site Associated DNA Sequence)のサービスを行っている京都大学生態学研究センターにおいて、専門家との話し合いを行い、連鎖解析のための最適なサンプル数とサンプルの種類について決定した。F2のDNAからRADシーケンスを行うためのサンプルの調整を行った。さらに今後コナスビ類を用いた遺伝学的解析のために、コナスビ、ヒメコナスビ、F1の育成を行った。本研究によりヒメコナスビはコナスビと異なり開花に春化処理が必要であることが明らかとなった。適応進化メッセンジャーRNAの抽出に用いた葉がタバコモザイクウイルスに感染していたため質がやや悪く、十分量の遺伝マーカーを得るのに時間がかかっている。また研究代表者の異動により、異動先の研究機関での研究体制の立ち上げに時間を要したことも研究の進展が遅れている要因のひとつである。研究代表者が研究機関を異動したため、研究室の立ち上げに時間と費用を消費し、当初の計画から遅れが生じた。ヒメコナスビとコナスビのcDNAライブラリーの比較から、両者に差異がみられる遺伝子座を検出し、プライマーを作製する。十分量の遺伝マーカーが作製された段階で、連鎖地図の作製を行う。これまでに10個のマイクロサテライトマーカーの開発もおこなっており、合わせて連鎖解析を行う。また十分量の遺伝マーカーが得られない場合にはラッドシーケンスにより遺伝マーカーの補充し、高密度連鎖地図の作製を行う。現在F2を約800個体育成している。そのそれぞれの個体からDNAを抽出し、次世代シーケンサーで開発した遺伝マーカー間の相対的な位置関係を決定するための連鎖解析を行う。コナスビとヒメコナスビの染色体数は共に2n=20の2倍体であり、QTL解析では10の連鎖群それぞれに最低100個の遺伝マーカーを、全体では1万個以上の遺伝マーカーをのせることを目標としている。ダピ染色による蛍光量の比較からコナスビ類のゲノムサイズは2Gbp(ギガベースペア)程度と推定しており、1万個の遺伝マーカーでは遺伝マーカー間の平均距離は単純計算で200kbpとなる。申請者の研究機関の異動に伴い、新しい研究機関での研究環境の整備の立ち上げに1年間を要したため、屋久島の高山性ミニチュア植物であるコナスビの大量F2集団の作製及びコナスビ類のcDNAライブラリーの次世代シーケンサー解析に基づく連鎖地図作製用の遺伝子座探索が遅れている。コナスビ類の遺伝マーカーの作成とその遺伝マーカーを用いたコナスビとヒメコナスビのF2集団の解析をおこなう。屋久島の高山性ミニチュア植物を栽培するための実験用温室の建設に使用する。
ペプチド・MHCクラスI分子に対する免疫寛容の成立機序の解析

自己の抗原に対する寛容の成立は、主に胸腺において自己のMHC-自己ペプチド複合体をT細胞が認識して、ネガティブセレクションがおこることによると考えられている。この免疫寛容の成立に最も大きな影響を与えるHLAクラスI分子に結合するペプチドの解析は、きわめて限られていた。昨年、多数のHLAクラスI分子に結合する自己抗原ペプチドを分離・生成し、そのシークエンスのモチーフを決定したが、この方法では、ペプチドをHLAクラスI分子との結合を詳細に検討することができない。そこで、多数の合成ペプチドとHLAクラスI分子の結合を直接調べる系(HLA class I stabilization assay)を開発した。これを用いてHLA-B^*3501分子とモチーフ(2番目がProおよびAla、C末端が疎水性アミノ酸)をもった320種類の9-merから11-merまでのペプチドの結合を調べた。53.1%のペプチドが結合し、ペプチドの長さがながくなっても結合力の低下は見られなかった。C末端のアミノ酸がTyrおよびPheであるペプチドの方がIle,Leu,Metであるペプチドより強く結合した。このことから、HLA-B^*3501分子のFポケットは深くなっていると考えられた。同様にHLA-B^*3501分子と303種類のモチーフ(2番目がProおよびAla、C末端が疎水性アミノ酸)をもった8-merから11-merの合成ペプチドとの結合を調べたところ、16.5%のペプチドしか結合できず、また8-merおよび9-merのペプチドより10-merおよび11-merのペプチドの方が結合力が低下していた。HLA-B^*3501結合ペプチドとは逆にC末端がIle,Val,Leuであるペプチドのみが結合でき大きい分子であるTyr、PheをC末端にもったペプチドは結合できなかった。このことからHLA-B^*3501分子はFポケットが浅くなっていると考えられ、両側のB,Fポケットが浅いため長いペプチドは結合しにくいと考えられた。
分岐高分子の新規分子モデル

分岐高分子のダイナミクスは高分子科学の基礎的な興味の対象であるだけでなく,高分子材料の成形加工性を支配する工学的にも重要な課題である.本研究では我々独自の高速粗視化分子シミュレーションを分岐高分子に対して適用し,モデルの妥当性の検証と,分岐点のダイナミクスの検討を行った.その結果我々のシミュレーションは実験で得られる粘弾性を定量的に予測することが示された.また分岐点近傍における動的管膨張の重要性を示した分岐高分子のダイナミクスは高分子科学の基礎的な興味の対象であるだけでなく,高分子材料の成形加工性を支配する工学的にも重要な課題である.本研究では我々独自の高速粗視化分子シミュレーションを分岐高分子に対して適用し,モデルの妥当性の検証と,分岐点のダイナミクスの検討を行った.その結果我々のシミュレーションは実験で得られる粘弾性を定量的に予測することが示された.また分岐点近傍における動的管膨張の重要性を示した分岐高分子のからみあいダイナミクスは工業的にも重要だが定量的に記述できていない.本研究では申請者独自の粗視化モデルを,実験的な定量検証を通じて改良すること,および,結果を踏まえて新しい理論モデルを構築することを目的とする.応募者の増渕はこれまでに星型とH型高分子のダイナミクスに関する粗視化理論の提案を行っているが,実験データの不足により定量的な検証は不十分である.そこで本研究では構造の整った星型高分子やH型高分子における実験を研究グループの内部で実施する.特に本研究では非対称星形および非対称H形高分子において系統的な研究を行っている.シミュレーションと実験で分岐点と分子の運動を調べ,動的管膨張理論などを応用した高速粗視化理論を検討する.本年度はシミュレーションコードの改良と検討,動的管膨張理論の検討,実験試料の合成を検討した.分岐高分子のからみあいダイナミクスは工業的にも重要だが定量的に記述できていない.本研究では申請者独自の粗視化モデルを,実験的な定量検証を通じて改良すること,および,結果を踏まえて新しい理論モデルを構築することを目的とする.応募者の増渕はこれまでに星型とH型高分子のダイナミクスに関する粗視化理論の提案を行っているが,実験データの不足により定量的な検証は不十分である.そこで本研究では構造の整った星型高分子やH型高分子における実験を研究グループの内部で実施する.特に本研究では非対称星形および非対称H形高分子において系統的な研究を行っている.具体的にはシミュレーションと実験で分岐点と分子の運動を調べ,動的管膨張理論などを応用した高速粗視化理論を検討する.本年度は昨年度に続いてシミュレーションコードの改良と検討,動的管膨張理論の検討,実験試料の合成を行った.また実験データとシミュレーション結果との比較も実施した.Lee et al, Macromolecules 38, 4484-4494 (2005)の非対称星型高分子,対称星型高分子,および直鎖高分子の濃厚溶液に対する実験結果とシミュレーション結果を比較したところ,すべての場合において定量的な一致を見た.本研究で開発中の理論モデルにおいて分岐点周辺のトポロジカルな緩和が正しくあ使われていることの証左といえる.今後従来の理論でパラメーターとして扱われている分岐点の(トポロジカルな)拡散係数や,分岐点の拡散を抑制しているトポロジカルなケージの大きさについて定量化し議論を精密化する.分岐高分子のからみあいダイナミクスは工業的にも重要だが定量的に記述できていない.本研究では申請者独自の粗視化モデルを,実験的な定量検証を通じて改良すること,および,結果を踏まえて新しい理論モデルを構築することを目的とする.応募者の増渕はこれまでに星型とH型高分子のダイナミクスに関する粗視化理論の提案を行っている.本研究では非対称星形および非対称H形高分子において系統的な研究を行っている.具体的にはシミュレーションと実験で分岐点と分子の運動を調べ,動的管膨張理論などを応用した高速粗視化理論を検討する.本年度は昨年度に続いてシミュレーションコードの改良と検討,動的管膨張理論の検討,実験試料の合成を行った.実験データとシミュレーション結果との比較も実施した.昨年度,非対称星型高分子,対称星型高分子,および直鎖高分子の濃厚溶液に対する実験結果に対して,シミュレーションの定量的な一致を見た.本年度これを詳細に解析し,従来理論で考慮されていた分岐鎖の緩和機構の不備を指摘した.さらに非対称星型のモデルをくし型分岐に拡張し,実験データ(Kirkwood et al,Macromolecules 2009, 42, 9592)を定量予測できることを確認した.また分岐鎖の緩和機構も検討した.これらの結果は論文としてまとめ,投稿準備中である.
S.hyicusの表皮剥脱毒素産生能と滲出性表皮炎の発症との関連

Staphylococcus hyicus P-1株を用いてshET産生のための最適培養条件を調べたところ、3×10^9CFUの本菌を2,000ml三角形フラスコ中の300mlのTY brothに接種し、毎分75回振蘯下で37°C16時間培養した場合にshET活性が最大となった。本条件により分離株を培養してshET産生能を調べたところ、滲出性表皮炎(EE)罹患豚由来株の87.5%、健康豚由来株の76.1%がshETを産生した。shET産生株の培養濾液を用いて免疫拡散法およびwestern blottingを行ったところ、shETは2つの血清型に分かれた。また、shET産生株には42kbプラスミドを保有する株がみられた。50株のプラスミド非保有(PL^-)株由来の培養濾液はPL^-株由来shETに対する抗血清とのみ反応し、プラスミド保有(PL^+)27株全ての培養濾液はPL^+株由来shETに対する抗血清と反応した。そこで、PL^-株産生shETをshETA、PL^+株産生shETをshETBと分類した。shETB産生株であるP-23株の培養濾液はニワトリひなに表皮剥脱を起こしたが、プラスミド脱落株であるP-23C1およびP-23C2株の培養濾液は何の変化も起こさなかった。S.aureus表皮剥脱毒であるETAおよびETBの産生遺伝子間で高度に保存されている塩基配列を基に合成したDNA probeはPL^-株の染色体DNA、PL^+株のプラスミドDNAとのみhybridizeした。shETA産生株とshETB産生株を接種した哺乳豚には滲出物貯留、表皮剥脱、痂皮形成というEEに特徴的な症状が見られたが、shET非産生株とプラスミド脱落株(shETB非産生株)を接種した哺乳豚ではEEの症状が認められなかった。以上の結果より、shETAおよびshETB産生株のみがEEを引き起こすこと、shET産生株はshETA産生株、shETB産生株、両毒素産生株の3つに分類されること、shETAとshETBの産生はそれぞれ染色体とプラスミドに支配されることが示唆された。滲出性表皮炎(EE)罹患豚由来Staphylococcus hyicus33株と健康豚由来S.hyicus46株のshET産生能を1日齢ニワトリひな接触試験により確かめたことろ、EE豚由来株の87.5%と健康豚由来株の76.1%がshETを産生した。次に、大型プラスミドを保有せず、shETを産生するP-1株由来のshETに対する抗体(抗P-1/ET)と大型プラスミドを保有し、抗P-1/ETと反応しないshETを産生するP-23株由来のshETの対する抗体(抗P-23/ET)を用いて各々の株の培養上清との間で免疫拡散法を実施したところ、EE豚由来株と健康豚

由来株の何れにも、抗P-1/ETとのみ反応する株、抗P-23/ETとのみ反応する株および両方の抗体と反応する株が認められた。そこで、shET産生能とEEの発症との関連を明らかにするため、抗P-1/ETとのみ反応するshET(shET-A)を産生する株、抗P-23/ETとのみ反応するshET(shET-B)を産生する株、何れのshETも産生しない株をEE豚由来株と健康豚由来株からそれぞれ選択し、3週齢のブタに10^910^<10>CFU接種し、1週間観察した。shET-AおよびshET-B産生株接種豚では、接種2時間後に接種部の発赤が認められ、24時間以内に発赤部周辺に表皮の剥脱が認められた。その後、表皮剥脱部位が拡大するとともに滲出物と痂皮形成が認められた。なお、この症状は、EE豚由来株でも健康豚由来株でも生じた。shET非産生株接種豚では、接種2時間後に接種部の発赤が認められたものの、48時間以内に消失し、表皮剥脱・滲出物・痂皮形成といったEEに特徴的な臨床症状は全く認められなかった。以上の結果より、健康豚もshET産生性S.hyicusを高率に保有していること、EE豚由来株であろうと健康豚由来株であろうとshET産生株はEEを発症させ、shET非産生株はEEを発症させないこと、血清型の異なる2種のshETがともにEEの発症因子となることがしさされた。Staphylococcus hyicus表皮剥脱毒素B(shETB)産生株であるP-10株とP-23株を44°Cで5代継代培養することにより、2株ずつのプラスミド脱落(P^-)株が得られた。これらの株の培養濾液をニワトリひなに皮下接種したところ、P-23P^-株は表皮剥脱活性を消失していたが、P-10P^-株は依然として活性を示した。各々の親株ならびにP^-株の10倍濃縮培養濾液と抗shETBおよび抗shETA血清を用いてwestern blotを行ったところ、P-10株は抗shETA血清と抗shETB血清の両方と、P-10P^-株は抗shETA血清のみと、P-23株は抗shETB血清のみと反応し、P-23P^-株は何れの抗血清とも反応しなかった。次に、S. aureus表皮剥脱毒素であるETAおよびETB間で高度に保存されている活性関連領域の塩基配列を基にビオチン化DNAprobeを合成し、shETA産生株であるP-1株とshETB産生株であるP-23株の染色体およびプラスミド画分との間でDot hybridizationを行った。本probeはP-1株の染色体画分ならびにP-23株のプラスミド画分とのみ反応した。なお、ETA(染色体性毒素)産生株とETB(プラスミド性毒素)産生株を用いて同様にDot hybridizationを行ったところ、本probeはETA産生株の染色体画分ならびにETB産生株のブラスミド画分とのみ反応した。次に、3週齢のブタに10^9CFUのP-23株とP-23P^-株を皮下接種したところ、P-23株接種豚では24時間以内に皮膚への滲出物の膠着と部分的な表皮剥脱がみられ、その後剥脱部位が広範囲に拡大したが、P-23P^-株接種豚では接種7日後まで全く臨床症状が認められなかった。以上の成績より、shETAの産生が染色体DNAに、shETBの産生プラスミドDNAに支配されていること、ETとshETの毒素活性関連領域の構造が極めて類似していることならびにshETAとshETBはブタに同様な臨床症状を惹起することが示唆された。また、S. hyicusにはshETA産生株、shETB産生株、両毒素産生株ならびに毒素非産生株が存在することが明らかとなった。
コンピュータ内に形態と機能を合わせ持つ三次元構造を発生する手法の開発

(1)セルレンダリング用ソフトウエアの構築本研究の本題である生体内の生体構造を生体内の細胞の集団の集合体として構築できるシステムを作成した。コンピュータ内での最小の単位をセルとし、このセルが集合して三次元形状を構築するものとした。生体では形態が機能を決定する性質があるため、本システムでは特定の臓器を対象とできるように、MRIから得た輪郭データ群の三次元領域内にセルを充填して対象物を構築できる機能を持たせた。(2)骨格筋構築への応用本手法を骨格筋に用いるため骨格筋自身を筋束単位でセル化し、紡錘形状にセル化した筋束を束ねて骨格筋を作成する手法を開発した。さらに、CTデータより構築した上腕骨格系にこの筋束の集合体よりなる筋を三次元的に付着させ、筋を収縮拡張することにより基本的な上腕の動作を行えるようなシステムを開発した。さらに4機のPolhemusセンサを用いて上腕の生体からのデータを受け取り、これを基に骨格系を駆動させ、その際の各上腕の筋の相互作用、時空的動態を計測する手法を得た。(3)平滑筋構築への応用平滑筋の挙動を示す手法として結腸の一部(下降結腸)を筒状にモデル化し、このモデルを構築するタイル状セルの瞬間的変異に基づく収縮を与えることにより筒状モデルの蠕動運動様の動作を行わせることができた。(4)総括本研究によってセル化する最小単位の形状を球状、紡錘形状、タイル形状と変化させることにより、それぞれ目的に応じた生体の四次元的挙動を再現し、かつ解析できる手法を開発することができた。本研究では、生体の持つ形態がその機能により裏づけられていることから、コンピュータ内に生体の形を写し取るだけでなく、それがその生体と同じように機能し得る三次元構築法を作り出すことを行った。このために、生体内の細胞の集団が示すような挙動を持つコンピュータ内の細小単位(これをCellとする)を三次元的に積み上げることによって、これが生体反応を示すことができるようなシステムの製作を行った。まず、用いる開発環境の構築を行った。ある程度の細胞の集まりをセルとしてモデル化し、生体構造の構築を行えるような環境を作成した。これにより、骨格筋を対象とし、筋線維が集合して骨格筋を形成する状況を再現した。この際、筋の種類によって筋線維の結合状況が異なる様子を再現できるようなモデルとし、紡錘筋,二頭筋,羽状筋等の筋肉構成を構築できるようにした。さらに、各筋モデルを構成するセルが収縮することにより、筋全体が収縮,弛緩する様子を再現できるようにした。さらにこれを用いて、上肢骨格モデルに主要な筋肉を付加させ、基本的な動作が筋モデルにより動作するかを確認した。また、Cell自体の三次元構造ならびにこれが示す動的特性を正確に表示できる画像表示法を決定した。三次元構造を持つCellの内部の状態と運動に伴う動的特性を定量的に表現できる画像表示法を考案すると共に、四肢骨格筋群の四次元的解析のための筋線維方向の特定しやすい撮像法を決定し、筋動態の四次元情報の効率的な取得手法を考案した。
マウス未成熟卵子のゲノム再プログラム化能に関する発生工学的研究

我々は、卵核胞(GV)期の未成熟卵子にはゲノムインプリンティングを雌型に変換させる能力があるという仮説を立てている。本研究は、この仮説に基づき、発生工学的手法を用いて、GV期卵子による雄性生殖細胞ゲノムの人為的・網羅的なエピジェネティクスの操作を試みた。昨年度に、2つの円形精子細胞に由来する雄核発生胚の作成を行ったところ、胚齢7.5日の雄核発生胚を効率良く作製することに成功し、それらのインプリント遺伝子のメチル化が乱れていないことも確認した。今年度は、まず、この技術を応用して、C57BL/6xDBA/2(B6とDBA/2の円形精子細胞核1つずつからなる)胚を作製し、マイクロサテライトマーカーによる多型解析を行った。また、C57BL/6xJF1の亜種間雑種胚からはES細胞も樹立した。そして、これらの結果を論文にまとめて投稿した(現在投稿中)。本研究課題の当初の計画では、雄性生殖細胞を未成熟卵子細胞質に導入しそのゲノムの性変換を試みる予定であったが、上述の通り、円形精子細胞から効率よく雄核発生胚を作出することが行えるようになったので、先に、GV卵子から得られた抽出物で直接精細胞を処理し、その円形精子細胞を用いて、雄核発生胚を作出するという方法を試みた。まず、定法に従って、GV卵子からのタンパク質の抽出と、雄性生殖細胞膜の透過を行ったところ、それぞれ、一定量のタンパク質抽出物が得られること、円形精子細胞膜の透過が起こったことが確認された。また、実際に抽出物処理を行った円形精子細胞のエピジェネティクス変化の解析や、その細胞を用いた雄核発生胚を作製が、今後の検討課題である。我々は、卵核胞(GV)期の末成熟卵子にはゲノムインプリンティングを雌型に変換させるとの仮説を立てている。この現象を用い、本研究では、発生工学的手法による、網羅的なエピジェネティクスの人為的操作の可能性を検証する。具体的には、雄性生殖細胞を未成熟卵子細胞質に導入しそのゲノムの性変換を試みる。そして、そこから再構築した授精胚の発生を確認しそのインプリントの状態を解析する予定である。本年度は、以下の各種条件設定を行った。1.GV卵子の除核:dbcAMPによりGVBDを阻害しつつ、サイトカラシンBおよびノコダゾールの存在下によって可能であることが確認された。2.除核GV期卵子への円形精子細胞の注入:卵子生存率の低さ(20-30%)が課題として残った。3.その後の体外成熟および顕微授精:体外成熟により放出された第一極体を、HVJの注入によって卵子細胞質へ戻した後に顕微授精を行う。サイトカラシンBの存在下で第二極対の放出を阻害することで、雄性ゲノム由来の二倍体胚を作成する。4.対照区となる通常の雄核発生胚の作成:2つの円形精子細胞により、妊娠約7.5日の雄核発生胚が作成できた。また、バイサルファイとシークエンスおよびCOBRA解析により、そのインプリントは乱れていないことが確認された。このように、本研究を行うための基盤技術と情報はほぼ整えられたことから、現在は、これらの条件を元に実際に通して胚の作成を試みている。来年度は、実際にこれら再構築胚のエピジェネティクス状態の解析や、仮腹に移植した後の発生を確認まで進めることを目標に継続して行っていく予定である。