hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラビウイルス脳炎の新側面-ウイルス感染に起因する精神機能異常の病態解明-

日本脳炎ウイルス(JEV)感染ラットの脳内では低レベルのウイルスゲノムRNA複製が持続している。この感染状態に類似したin vitroシステムを確立する目的で、以下の実験を行った。ラット神経細胞由来株化細胞として、温度感受性SV40T抗原で不死化されたCSM14.1を使用した。JEVの構造蛋白遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを作製し、ウエストナイルウイルス(WNV)非構造蛋白遺伝子とEGFP発現カセットを有するWNVレプリコン(ペンシルベニア大学より分与)と共に293T細胞へ導入することにより、上清中に産生されるVLPを回収した。CSM14.1細胞にVLPを感染させた場合、31°Cにて維持した細胞では13.6%がGFP陽性を示した。一方、37°C下で72時間培養し神経系分化マーカーが発現した細胞では、VLPの感染により51%がGFP陽性を示し、37°C下での培養によってVLP感染率が低下することが明らかとなった。また、37°Cにて培養した細胞では、31°Cで維持した細胞と比較して、エンドサイトーシスによるJEV particleの取り込み効率に差異があることが示唆された。従って、レプリコンRNAの導入には31°Cにて維持した細胞を使用することが適切であることが確認された。JEV感染ラットの脳内ではセロトニン産生酵素であるトリプトファン水解酵素(TPH)の遺伝子発現が上昇している。F344ラットのTPHプロモーター配列は不明であるため、ゲノムウォーキングによりTPH1遺伝子上流(転写開始点を+1として-967から+15の領域)をクローニングし、pGL3ベクターに組み込んだ。これにより、Luciferase reporter assayを用いてVLP感染に伴うTPHプロモーター活性の変化を検索することが可能となった。JEV感染耐過ラットにみられる行動異常の本態を明らかにする目的で、平静21年度は以下の解析を行った。13日齢のF344/NSlcラットにJEV JaGAr-01株を脳内接種し、接種後24ケ月飼育した。統計的な有意差を検討するため、感染群として8匹、対照群として7匹の雌ラットを用意し、行動学的解析に供した。オープンフィールド試験(Open-field test)の結果、JEV感染耐過ラットは対照ラットに比較して自発運動量の亢進が観察された。また、高架式十字迷路試験(Elevated plus-maze test)を行った結果、オープンアームでの滞在時間の延長が観察された。これらの結果より、JEV感染耐過ラットは多動および不安水準の低下を示すことが示唆された。JEV感染耐過ラット脳内ではセロトニン産生酵素であるトリプトファン水酸化酵素の遺伝子発現が上昇しており、行動異常との関連性が推測された。そこで、JEV感染耐過ラットと対照ラットより脳を採材し、前頭前野、線条体、中脳腹側、中脳背側、脳幹、海馬、扁桃体、皮質後方、嗅球、小脳の各部位をそれぞれ部位別に急速凍結した。逆相高速クロマトグラフィーを用いて組織中のセロトニン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン量を定量した結果、JEV感染耐過ラット中脳背側組織のセロトニン量とノルエピネフリン量は、対照ラットの同部位に比較して有意に高い値を示した。
低次元トポロジーにおける代数的・圏論的構造

今年度は残念ながら論文を完成させることはできなかったが、以下の研究を行った。(論文は準備中である。)可換環上の(結合的)代数のHochschildホモロジーは、代数の森田同値の基本的な不変量であるが、この概念を線形圏に自然に一般化したHochschild-Mitchellホモロジーの概念が知られている。以前に、A. Beliakova氏, A. Lauda氏, Z. Zivkovic氏, B. Webster氏らと共同で、量子群の圏化(ある種の線形2圏でその「脱圏化」が量子群となるもの)の0次Hochschild-Mitchellホモロジーについて研究したが、この結果を一般次元のHochschild-Mitchellホモロジーに拡張する研究を行う過程で、Hochschild-Mitchellホモロジーの計算に使う手法を、stratified線形圏と呼ぶ、かなり一般的な線形圏のHochschild-Mitchellホモロジーの計算に利用できることに気づき、その一般的な理論について近年研究を行ってきた。stratified線形圏には非常に多くの例があり、これらの線形圏のHochschild-Mitchellホモロジーを研究するのに利用できると期待される。また、この理論は線形でない普通の圏にに対しても適用できるが、この場合にはstratified圏のcyclic nerveの幾何学的実現のホモトピー型を求めるのに利用することができる。たとえば、有限集合と写像の圏、有限次元ベクトル空間の圏、2次元のコボルディズム圏など、多くの自然に定義される圏にこの理論は適用できる。今年度は主にこれらの研究を発展させることに重点を置いて研究をした。5月にアメリカのCornell大学において講演を行い、この理論の概要について解説を行った。年度中に1つも論文を完成させることができなかったという点で、やや遅れているというべきであると思う。stratified(線形)圏についての論文を早急に完成させる。また、計画している他の研究についても進めていく。
セメントペーストと廃棄物処理骨材との界面構造の制御

コンクリート骨材として溶融下水汚泥、都市ゴミ焼却灰、焼結石炭灰およびガラスカレットなどの廃棄物起源材料を1m^3当たり631kg及び1519kg使用した再生廃棄物高含有コンクリート(HVRWC)を調製し、天然骨材を使用したコンクリートと比較検討した。さらに、セメントを都市ゴミ焼却灰起源のエコセメントにした場合とも比較、検討した。その結果、以下の結論を得た。(1)廃棄物起源骨材による骨材置換率が増加するとともにコンクリートの圧縮強度は低下した。これは、主に高空隙率、粗大空隙の存在による廃棄物起源骨材自身の強度が低いこと、セメントペーストとの付着強度が低いことなどに起因するものと考えられる。しかしながら廃棄物起源骨材を631kg/m^3使用したHVRWCでも材齢91日においては40N/mm^2以上の強度を発現し、構造用のコンクリートとしての使用に耐え得るものと考えられる。(2)HVRWCにおけるセメントの水和反応は天然骨材を使用したコンクリートと同様に進行し、廃棄物起源材料を使用したことによる悪影響はなかった。また、高炉スラグおよびフライアッシュを併用することにより、Ca(OH)_2の消費と、C-S-Hの量の増加を促進し、材齢とともにコンクリート組織の高緻密化が実現された。HVRWCの硬化体組織は天然骨材を使用したコンクリートと大差なく、またコンクリートより有害物質の溶出等も認められず、その耐久性も問題ないと考えられる。(3)SEM、EPMAによる観察の結果、エコセメント使用の場合はW/C=0.5においても遷移帯は生成せず、普通セメントの場合に比べ、セメントペースト・骨材間の結合は良好であった。溶融下水汚泥を骨材とした場合は、標準砂骨材を用いた場合に比べ、空隙率がやや増加し、骨材表面の平滑性に起因する付着強度の低下が認められた。(4)エコセメントのような水酸化カルシウム消費型、多結晶水水和物生成型水和反応を伴うセメントを使用することにより、セメントペーストと廃棄物骨材との界面構造の制御が可能であることが示唆された。コンクリート骨材として都市ごみ焼却灰、焼結石炭灰、溶融下水汚泥およびガラスカレットなどの廃棄物起源材料を1m^3当たり631kg及び1519kg使用した再生廃棄物高含有コンクリート(HVRWC)を調製し、天然骨材を使用したコンクリートと比較、検討した結果、以下の結論を得た。(1)本研究に用いた廃棄物起源骨材は、天然骨材より1μm以上の粗大空隙を多く含み、空隙量が多く、骨材自身の強度も低かった。また、セメントペーストと骨材の付着強度は骨材表面が平滑なガラスカレットでは天然骨材より低く、その差は材齢とともに増加した。(2)廃棄物起源骨材による骨材置換率が増加するとともにコンクリートの圧縮強度は低下した。

(3)HVRWCにおけるセメントの水和反応は天然骨材を使用したコンクリートと同様に進行し、廃棄物起源材料を使用したことによる悪影響はなかった。また、高炉スラグおよびフライアッシュを併用することにより、Ca(OH)_2の消費と、C-S-Hの量の増加を促進し、材齢とともにコンクリート組織の高緻密化が実現された。HVRWCの硬化体組織は天然骨材を使用したコンクリートと大差なく、またコンクリートより有害物質の溶出等も認められず、その耐久性も問題ないと考えられる。コンクリート骨材として溶融下水汚泥、都市ゴミ焼却灰、焼結石炭灰およびガラスカレットなどの廃棄物起源材料を1m^3当たり631kg及び1519kg使用した再生廃棄物高含有コンクリート(HVRWC)を調製し、天然骨材を使用したコンクリートと比較検討した。さらに、セメントを都市ゴミ焼却灰起源のエコセメントにした場合とも比較、検討した。その結果、以下の結論を得た。(1)廃棄物起源骨材による骨材置換率が増加するとともにコンクリートの圧縮強度は低下した。これは、主に高空隙率、粗大空隙の存在による廃棄物起源骨材自身の強度が低いこと、セメントペーストとの付着強度が低いことなどに起因するものと考えられる。しかしながら廃棄物起源骨材を631kg/m^3使用したHVRWCでも材齢91日においては40N/mm^2以上の強度を発現し、構造用のコンクリートとしての使用に耐え得るものと考えられる。(2)HVRWCにおけるセメントの水和反応は天然骨材を使用したコンクリートと同様に進行し、廃棄物起源材料を使用したことによる悪影響はなかった。(3)SEM、EPMAによる観察の結果、エコセメント使用の場合はW/C=0.5においても遷移帯は生成せず、普通セメントの場合に比べ、セメントペースト・骨材間の結合は良好であった。溶融下水汚泥を骨材とした場合は、標準砂骨材を用いた場合に比べ、空隙率がやや増加し、骨材表面の平滑性に起因する付着強度の低下が認められた。(4)エコセメントのような水酸化カルシウム消費型、多結晶水水和物生成型水和反応を伴うセメントを使用することにより、セメントペーストと廃棄物骨材との界面構造の制御が可能であることが示唆された。
上気道における難治性好酸球性炎症性疾患におけるエンドタイプの確立

慢性副鼻腔炎において、好酸球性副鼻腔炎とともに、好酸球性副鼻腔炎に続発する好酸球性中耳炎を慢性副鼻腔炎の中から一つのエンドタイプとして抽出することを目的に本研究を行った。エンドタイプの確立には大規模な症例収集が必要なため、倫理委員会承認の上多施設でコンソーシアムを組み、検体収集を行った。鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎症例を、JESREC Studyによる好酸球性副鼻腔炎の診断基準に用いられるJESREC Scoreと組織中好酸球数のカットオフポイントにより4群に分類した。これらの症例の鼻茸からmRNAを抽出し、Agilent 2100 bioanalyzerを用いてRNA Integrity Number≧7の症例を解析に用いた。対照群として鼻茸を伴わない慢性副鼻腔炎症例と副鼻腔炎を伴わない症例の鈎状突起を用いた。その結果、好酸球性副鼻腔炎の鼻茸においてCLC,IL-13,CCL26の発現がその他の群と比較して有意に高値であった。さらにこれらの遺伝子を用いて主成分分析を行ったところ、JESREC Scoreと組織中好酸球数により分類される4群はそれぞれ異なる発現パターンと示すことが明らかになった。今後、バイオマーカーとなり得る遺伝子を探索するとともに、タンパクの発現についても検討する予定である。上気道における難治性好酸球性炎症性疾患には、好酸球性副鼻腔炎と好酸球性中耳炎が挙げられる。本研究では、好酸球性副鼻腔炎とともに、好酸球性副鼻腔炎に続発する好酸球性中耳炎を慢性副鼻腔炎の中から一つのエンドタイプとして抽出することにより、その発症機序を明らかにすることを目的とした。エンドタイプを明らかにする前段階として好酸球性副鼻腔炎および非好酸球性副鼻腔炎に特徴的なバイオマーカーを明らかにすべく、JESREC score>=11および組織中好酸球数>=70の好酸球性副鼻腔炎とJESRECscore<11および組織中好酸球数<70の典型的非好酸球性副鼻腔炎の鼻茸、コントールとして鉤状突起を採取した。これらのmRNAを抽出して網羅的に遺伝子発現を検討すべく、マイクロアレイ解析を行った。現在病態間における比較検討をし、データ解析中である。さらに、マイクロアレイで明らかになったバイオマーカーのValidation studyとエンドタイプを確立するために大規模な症例収集が必要なため、多施設でコンソーシアムを組み、検体収集を行った。研究遂行にあたっての検体収集は、多施設でのコンソーシアムを形成し順調に症例登録が進んでいる。また、バイオマーカー候補遺伝子も明らかになっており、解析も順調である。また、タンパク質発現についてはマルチプレックス発現定量解析を行っている。マイクロアレイ解析で明らかになったバイオマーカー候補遺伝子について、独立集団でのValidation studyを行うとともに、これらのバイオマーカーを用いて、クラスター解析を行い副鼻腔炎におけるエンドタイプの確立を目指す予定である。
内視鏡的吸引粘膜切除の臨床応用および適応拡大

1.内視鏡的吸引粘膜切除法は消化管疾患の診断・治療法として臨床的にきわめて有用であり、一定の条例を満たす早期胃癌野根治的治療法として広く普及している。2チャンネルの処置用内視鏡を用いる従来法では切除できる大きさは15mmが限度であり、熟練した術者によっても病変の部位によっては適応できなかった。これを改善するために内視鏡吸引粘膜切除法(以下EAM)を開発した。2.先端フードと内視鏡外側に装着するスネアガイドチューブを一体化した器具を作成し臨床応用を図ってきたが、平成7年8月には市販された。メーカーは当初500セットを用意したが、短期間に1000セットが全国の病院に納入されたと聞く。我々の学会での発表が注目されていたことが示された。3.本院での過去の手術症例の検討から、高分化型腺癌では20mmの大きさでもリンパ節転移がないことを見出し、この大きさまでは病変部位に関わらず絶対的治療の適応とし、52例の治療を行なった。長径25±5mm,短径21±5mmを切除出来た。高齢者や合併症がある症例では4050mmの病変も分割切除により相対的治療の対象と出来た。4.重篤な合併症として、初期に穿孔例、出血4例を経験し、最近では出血例3例が増えた。穿孔の予防のためには粘膜下に局注後に超音波内視鏡により粘膜下層の剥離を確認するようにし、以後経験していない。大きく切除できるため、出血例は増加しており、全国の施設からも出血の合併が報告されている。今後も改善のため努力するが、いずれも内視鏡的に止血しており、開腹に至った例はない。外科手術では全例出血することから、出血を恐れる必要はないと判断するに至っている。
時間分解反射分光を用いた吸着・脱離の動的過程の研究

本研究はマルチチャンネル光反射分光法の速い時間応答性を生かして,スペクトルによって吸着状態を特定しながら固体表面での気体の吸着・脱離現象の動的過程をリアルタイムでその場観測したものである。(1) W(100)の窒素吸着過程では,β_2状態に対応する3.8eVの構造とβ_1状態に対応する2.1eVの構造が観測された.2.1eVの構造の大きさの時間変化からβ_1状態の吸着の進展状況が明らかになり、β_1状態はバルクへの窒素の吸収に対応することが示唆された。(2) Si(111)への室温における塩素吸着の研究では以下の点が明らかになった。1)主な過程は塩素原子の直接吸着であり、アドアトムのダングリングボンドへの吸着(≡SiClの形成)確率α=0.48とアドアトムのバックボンドの切断(=SiCl_2、-SiCl_3の形成)確率β=0.14が決定された。2)ホール密度の高い試料ではバックボンドの切断が速く切断数も多いという結果が得られた。これはホールによってSi間の化学結合が弱められるためと考えられる。3) 3.6eV付近にSiのバルク状態から≡SiClの反結合状態への遷移によると思われる構造が観測された。(2)室温で飽和吸着させた後740Kで熱処理して≡SiClで覆われたレストアトム表面を形成させた。この表面からの880-940KにおけるSiCl_2の脱離の研究では以下の点が明らかになった。1)観測される主な過程はバックボンドの回復であり、その速度定数の温度依存性から活性化エネルギー2.6eVが得られた。これは脱離反応SiCl+SiCl→SiCl_2+Siの障壁エネルギーと考えられる。2)ダングリングボンドの回復はごく初期にしか見られない。以上のように、スペクトルの構造のエネルギーから化学結合を特定して吸着・脱離現象を実時間観測し、その動的過程を解析できることが示された。本研究はマルチチャンネル光反射分光法の速い時間応答性を生かして,反射スペクトルによって吸着状態を特定しながら、固体表面での気体分子の吸着・脱離現象の中間過程をリアルタイムでその場観測しようとするものである。当初は高速電磁弁による分子線源の制御を計画していたが,現在の排気系では入射分子を短時間で充分排気できないことが分かったので,一定の気体圧力下での吸着過程の研究に切り替えた.1024チャンネルのダブルフォトダイオードアレイを用いて1.5-5eVの反射スペクトルの時間変化を測定する系を構築した.4x10^<-4>程度のスペクトル変化を測定するときの時間分解能は1s程度であった.今年度はW(100)の窒素および酸素吸着の過程を研究した.W(100)の窒素吸着過程では,露出量1L程度で飽和する3.8eVの反射スペクトル変化と1L以上でゆっくり増加する2.0eVでの変化が観測された.従来の報告によれば,前者はβ_2状態,後者はβ_1状態に対応すると考えられるが,両者を分離して吸着の進行をリアルタイムで観測したのは始めてのことである.この結果から,β_1状態の初期吸着速度がわかり,その起源について理解が進むと考えられる.一方,酸素吸着過程では3.8eVと2.0eVのスペクトル変化は初期から同時に起こっているように見える.

酸素吸着系でも高露出量で進展する吸着状態があるとされているが,反射スペクトル変化には現れてこない.吸着種や吸着サイトによる反射スペクトル変化の相違を解明するため,現在バンド計算を行っている.来年度は,W(100)の吸着系の研究を継続するとともに,Si(111)の塩素吸着過程の研究を進める予定である.Si(111)については最近吸着サイトと反射スペクトル変化の関係が明らかにされており,W(100)の吸着系より詳細な議論ができると期待される.平成9年度に作成したマルチチャンネル光反射分光測定装置を用いて、今年度はSi(111)の塩素吸着・脱離現象の実時間測定を行い、その中間過程を研究した。(1)室温における清浄表面への吸着の研究では以下の点が明らかになった。1)アドアトムのダングリングボンドへの吸着(≡SiClの形成)は露出量約2Lで飽和し、その後アドアトムのバックボンドの切断(=SiCl_2、SiCl_3の形成)が進行する。実時間測定からこれらの過程の確率が決定された。2)ホール密度1×10^<15>cm^<-3>と9×10^<17>cm^<-3>の試料では、後者の方がバックボンドの切断が速いという結果が得られた。これは多数のホールによってSi間の化学結合が弱められることで説明された。3) 1)のような清浄表面の化学結合の変化は水素吸着によっても観測されているが、この他に3.6eV付近に塩素吸着特有の構造が見いだされた。バンド計算、UPS、EELSとの比較から、この構造はSiのバルク状態から≡SiClの反結合状態への遷移に対応すると推定された。(2)室温で飽和吸着させた後740Kで熱処理して≡SiClで覆われたレストアトム表面を形成させた。この表面からの880-940KにおけるSiCl_2の脱離の研究では以下の点が明らかになった。1)ごく初期にダングリングボンドの回復が見られる。2)支配的な過程はバックボンドの回復である。この脱離定数の温度依存性から活性化エネルギー2.7eVが得られた。以上のように、スペクトルの構造エネルギーから化学結合を特定して吸着・脱離現象を実時間観測し、その過程を解析できることが示された。
非対称結晶面を用いたパラメトリックX線源の特性

パラメトリックX線放射(PXR)において放射源となる結晶の非対称性と形状の効果をSi(111)結晶を用いて調べたところ、端が楔状になっている結晶板をターゲットとして用いると強度と空間コヒーレンスがともに優れたX線が得られることがわかった。この結果、回折強調型位相コントラストイメージング実験において、従来よりも短時間で位相像が取得可能になり、世界で初めてPXRを線源としたコンピュータ・トモグラフィ(CT)に成功した。パラメトリックX線放射(PXR)において放射源となる結晶の非対称性と形状の効果を調べるため、端が楔状になっているSi(111)結晶板をターゲットとして準備した。まず用意したのは裏面が対称面となるように表側に1.15゚の緩やかな勾配のカットを施して楔状にしたもので、端の面から出てくるX線の影響の抑制を狙ったものであった。非対称角は僅かに1.15゚であったが、この結晶から得られるPXRの強度は対称平板結晶に比べ、X線のエネルギーにもよるがおよそ1.52倍程度増加するとともに、イメージングの際に従来見られた像のプレが抑制された。PXRビームは第2結晶による回折によって輸送されるが、その回折幅が狭くなることが確認され、スペクトル密度の向上が示唆された。この楔型結晶による強度の増加は、この効果によるところが大きく、回折強調型位相コントラストイメージング(DEI)でも良好な像が得られるようになった。さらなる非対称効果を期待して、楔面の非対称角が6.5゚となる楔型結晶を用意してターゲットに用いて実験を行った。非対称面がgrazing入射となる17.5keVでの結果は、非対称角1.15゚に比べて2030%程度の強度の増加が見られたものの、明確なgrazing入射の効果とはいえないものであった。しかしながら、空間コヒーレンスやスペクトル線幅に関しては優位性がみられ、17.5keVでは高品質なDEI測定が可能となり、実際に吸収像と位相像の分離が容易となった。また9keV付近での測定で得られたCuのX線吸収スペクトルの分解能は34eVと見積もられ、これまでSi(111)で発生したPXRを用いて得られた結果においては最も良い分解能であった。以上の結果から、PXRの高品質化と高強度化の両立には非対称角だけではなく形状の効果が重要であることが示唆される。前年度に引き続き、パラメトリックX線放射(PXR)の放射源として単結晶の非対称カット面を用いた場合に得られるx線の特性を調べた。特にSi(111)結晶平板のエッジを6.5゚の楔状に加工したターゲットでは、X線エネルギー17.5keVにおいて、空間コヒーレンスの高い状態を維持したまま、2結晶型PXR発生装置で得られるX線量を少なくとも通常の対称結晶の2倍程度にすることができた。この改善により、PXRの応用としては世界で初めて回折強調型位相コントラストイメージング(DEI)法を用いたコンピュータ・トモグラフィ(CT)に成功した。大型放射光以外の線源での実施例としても稀有であり、PXRが次世代の単色X線源の有力な候補となることを強く支持する成果である。これに続き、楔形結晶の裏面対称面にAl蒸着を施したものを用いたが、マクロな物性として導体である蒸着膜の有無では、発生するPXRの違いは認められなかった。また、カット面が非対称角6.5゚となる平板結晶も同様に試験したところ、放射源から放出される強度は増大するものの、2結晶型PXR発生装置の第2結晶によるX線ビーム輸送の効率が悪くなり、また空間コヒーレンスが大きく劣化する状態も確認された。現状では、楔形ターゲットがPXR放射源として収量・性能共に最も優れたものとなっているが、最適な楔角といった形状の条件についてはさらに実験的な研究を積み重ねる必要がある。放射源の研究に加え、PXR発生装置から得られるX線ビームを非対称角6.5゚のsi(111)分光結晶を用いて二次的に拡大・縮小することを試みた。実際にX線ビームの拡大・縮小と、それに応じた回折X線のエネルギー広がりの変化を確認した。しかしながら、最も縮小率が期待できるBragg角6.5゚周辺では回折強度が非常に小さくなり、光子密度の高い状態を作ることが困難であった。この方法で光子密度の向上を目指すためには、最適な分光結晶の厚さや形状について詳細に調べる必要がある。
体力向上と体力に関する知識を理解させることを意図した球技の指導計画の有効性

本研究では,体力向上だけでなく体力に関する知識の理解を含めた包括的な指導プログラムをゴール型球技・サッカーを例に作成するとともに,その有効性を検証することを目的とした.そのために,1年目には「関連して高まる体力」(中学校1・2年)を効果的に学習させる指導プログラムの開発とその有効性の検証,2年目には「体力の高め方」(中学校3年)を効果的に学習させる指導プログラムの開発とその有効性の検証,3年目には一連の研究成果をまとめた指導資料を作成することとした.平成28年度(1年目)には,「関連して高まる体力」を学習させることをねらいとした指導プログラムを開発し,その有効性を中学校1年生を対象に検証した.その結果,体力向上に加えて,技能と関連して高まる体力に対する理解を深めることができた.平成29年度(2年目)には,「体力の高め方」を学習させることをねらいとした指導プログラムを開発し,その有効性を中学校3年生を対象に検証した.その結果,体力向上はみられなかったものの,体力の高め方に対する理解を深めることができた.平成30年度(3年目)には,これまでの研究成果をもとに,実際の授業づくりに活用できるよう,単元計画や一単位時間の授業例を示した指導資料を作成した.今後は,県の教育委員会を通して指導現場へ周知する予定である.以上の研究成果は,ゴール型球技・サッカーを例に検証したものであるが,他の球技種目の授業づくりにも役立つものと考えられる.初年度は,体力向上と体力に関する知識を理解させることを意図したゴール型・サッカー授業を考案するとともに,その効果を検討した.そのために,石川県のU中学校に在籍する1年5組21名および1年6組20名の合計41名の生徒を対象として,体力向上と体力に関する知識を理解させることを意図した授業を実施した.単元前後に,スキルテスト(リフティング),体力テスト(150m方向変換走),および試しのゲームを実施した.また,毎回の授業後に技術面,体力面,心理面に関する生徒の自己評価による質問紙調査を,単元終了後に「技能」,「態度」,「知識,思考・判断」に関する生徒の自己評価による質問紙調査を行った.主な結果は,次のとおりである.1リフティングの成績は単元後に有意に高値を示した.2150m方向変換走の成績は,単元後に有意に向上した.3ゲーム中の移動距離は,単元前後で有意な変化は認められなかった.4毎回の授業後の生徒の自己評価による質問紙調査における技術面の質問項目「成果」(設問2),「ボールをける」(設問4),「ドリブルをする」(設問6),「ボールをうばう」(設問7),「位置どり」(設問8),および体力面の質問項目「無酸素性パワー」(設問9),「無酸素性持久力」(設問10)は単元後に有意に高値を示した.5単元終了後の「技能」,「態度」,「知識,思考・判断」に関する生徒の自己評価による質問紙調査では,「サッカーに必要な体力」(説問10)について理解できたと回答した生徒の割合は94.1%であった.以上のことから,本研究において考案した指導計画により,体力づくりはもとより技術と関連して高まる体力についても多くの生徒が理解できる可能性が明らかになった.当初の予定通り,指導プログラムを考案するとともに,その有効性を授業研究をとおして検証することができた.2年目は,石川県下のU中学校に在籍する40名の3年生男子生徒を対象にして,「体力の高め方」を理解させることを意図したサッカーの授業効果を検証した.単元前後にスキルテスト(ボールリフティング),体力テスト(150m方向変換走)を実施した.また,毎回の授業後に技術面,体力面,心理面に関する質問紙調査を,単元前後に「知識,思考・判断」に関する質問紙調査を行った.主な結果は次のとおりである.1ボールリフティングの成績は単元後に有意に高値を示した.2150m方向変換走の成績は単元前後で有意な変化は認められなかった.3毎回の授業におけるゲーム終了直後の平均心拍数は164.9±20.2拍/分,RPEは15±2であった.4毎回の授業後の質問紙調査において,成果(設問2),ボールをける(設問4)は単元前後で有意差が認められた.5「知識,思考・判断」に関する質問紙調査において,「体力の高め方」をはじめとする各質問項目は単元後に有意に高値を示した.以上から,本研究において考案した指導計画により,体力の向上は認められなかったものの,「体力の高め方」に関する理解が深まった可能性が明らかとなった.当初の予定通り,指導プログラムを考案するとともに,その有効性を授業研究をとおして検証することができた.本研究では,体力向上だけでなく体力に関する知識の理解を含めた包括的な指導プログラムをゴール型球技・サッカーを例に作成するとともに,その有効性を検証することを目的とした.そのために,1年目には「関連して高まる体力」(中学校1・2年)を効果的に学習させる指導プログラムの開発とその有効性の検証,2年目には「体力の高め方」(中学校3年)を効果的に学習させる指導プログラムの開発とその有効性の検証,3年目には一連の研究成果をまとめた指導資料を作成することとした.平成28年度(1年目)には,「関連して高まる体力」を学習させることをねらいとした指導プログラムを開発し,その有効性を中学校1年生を対象に検証した.

その結果,体力向上に加えて,技能と関連して高まる体力に対する理解を深めることができた.平成29年度(2年目)には,「体力の高め方」を学習させることをねらいとした指導プログラムを開発し,その有効性を中学校3年生を対象に検証した.その結果,体力向上はみられなかったものの,体力の高め方に対する理解を深めることができた.平成30年度(3年目)には,これまでの研究成果をもとに,実際の授業づくりに活用できるよう,単元計画や一単位時間の授業例を示した指導資料を作成した.今後は,県の教育委員会を通して指導現場へ周知する予定である.以上の研究成果は,ゴール型球技・サッカーを例に検証したものであるが,他の球技種目の授業づくりにも役立つものと考えられる.学習指導要領には,球技領域における知識の内容の1つとして,関連して高まる体力(中学1・2年),体力の高め方(3年)をそれぞれ理解することが取り上げられている(文部科学省,2008).初年度は体力向上に加えて,体力に関する知識(関連して高まる体力)を理解させることを意図したサッカーの授業成果を中学校1年生を対象にして検討した.その結果,考案した指導計画により,体力づくりはもとより技術と関連して高まる体力についても多くの生徒が理解できることを報告した.しかしながら,この研究では中学3年を対象にして,主として体力の高め方に着目した授業効果を検証していない.小澤(2008)は,わずか週23時間の体育授業では,体力要素を全般的に高めることの限界を指摘した上で,運動・スポーツの意義とその学び方を確実に学習し,身につけ,生涯にわたって活かすことができる能力を育てることの重要性を強調している.このことを考慮すると,学校の体育授業を通して,自分の体をつくる方法を身につけさせる授業展開が求められているといえるが,その成果を証明するような実践的研究はほとんどみられない.そこで2年目は,体力の高め方を理解させることを意図したサッカーの授業の効果を中学校3年生を対象にして検証する予定である.3年目は,これまで得られた子どもの体力・運動能力データを動きの観点から分析する.また,最終年度であるため,中学校の球技の授業において「体力に関する知識」をどのように効果的に指導するのか,本研究の成果を踏まえて学校現場の教員に周知する予定である.当初は本研究に係る計測機器を全て購入する予定であった.しかし,研究協力者から計測機器の一部を借用して研究遂行することができたため,経費を抑えることができた.今後は以下の理由から動作解析ソフトの購入を予定している.これまで,子どもの体力・運動能力を量的な観点(タイムや距離)から検討してきた.しかし,最近では,動きがぎこちない子どもや運動の苦手な子どもが数多く報告されてきている.このことを考慮すると,子どもの運動中の動作評価も合わせて行う必要があると考えられる.
蛋白質高次構造の蛋白質シグナル認識における役割

タンパク質高次構造のタンパク質シグナル認識における役割を解明することを目的とし、構造生物学的研究を行うと同時に新たに対象とするシグナル伝達タンパク質の大量調製系の作製を行い、構造生物学的研究の支援体制を作った。構造生物学的研究では、Grb2のnSH3とSos由来のプロリンに富むペプチドの認識機構、及びSH2とShc由来のチロシンリン酸化ペプチドとの認識についても明らかにした。これらの結果は、シグナル伝達には、特異的な相互認識機構が重要な役割を果たしていることを示している。アクチン結合タンパク質であるデストリンの立体構造を決定し、アクチン繊維切断の機構を示した。また、ヘパリン結合性の新規成長因子ミッドカインの構造を決定すると共に、レセプターへの提示には、ヘパリン上で形成された二量体が重要であることを示した。またPKCaに含まれるCRDの構造を解明し、DAG結合部位を推定した。ヒアルロン酸結合ドメインであるLinkモジュールの構造を決定した。またX線結晶構造解析としては、バクテリアの情報伝達系であるトランスミッター、レシーバーに含まれるドメインの構造を明らかにすると共に、シグナル伝達の機構を明らかにした。N-WASPの各機能ドメイン及び、Tob,CAF1について試料の大量調整法が確立された。GRB2のN端側SH3とプロリンに富んだペプチドとの相互認識GRB2はSH3-SH2-SH3のドメイン構造によりなるアダプター型の蛋白質であり、EGFレセプターからRasへシグナルを伝達するアダプター分子として働いている。我々はGRB2のSH3とSosのプロリンに富むペプチド(VPPPVPPRRR)との相互認識の機構を明らかにすることを目的として研究を行ってきた。しかしながらGRB2のC端側SH3の場合には、Sosペプチドとの結合は弱く、複合体の構造を決定するにはいたらなかった。幸いにもN端側SH3はSosペプチドと強く結合することがわかったので、NMR法によりSosペプチドとの複合体について立体構造を決定することができた。SH3は3つのβシートが互いに直交して組み合わされたβバレル構造を取っている。この構造は既に報告したPLCγやGRB2C端側のSH3と良く似ている。SH3はN末端とC末端が空間的に近接しており、タンパク質内で比較的独立したドメイン構造をとるものと考えられる。Sosペプチドは3回ラセン軸を持つ左巻きのポリプロリンヘリックス構造を取り、SH3上の浅い溝に結合しているSosペプチドのP2'、P3'はそれぞれY7とY52と相互作用し(S1)、V5'とP6'はY52、F9、W36およびP49により形成される部位(S2)に結合している。またR8'はW36、F47およびRT-srcループとn-srcループにより形成される部位(S3)に結合している。R8'に側鎖はこれらのループ上の保存された酸性残基(E16およびD33)と相互作用している。SH3はポリプロリンヘリックス上で3残基離れた二つのプロリン環(PXXP)を認識するための構造ドメインであることが明らかとなった。PI3KのSH3とプロリンに富むペプチド(RKLPPRPSK)との複合体の構造が報告されているが、結合の方向はSosペプチドの場合と比較して逆方向である。これはポリプロリンヘリックスが偽2回の対称軸を有し、いずれの配向でもカルボニルはほぼ同位置にくるためである。ポリプロリンヘリックスはPXXPの2個のプロリン残基をS1およびS2に入れ込むと同時に、S3に塩基性残基が結合できるような配向で結合していることがわかった。Grb2はSH3-SH2-SH3のモジュール構造を取り、EGFレセプターとRasとのシグナル伝達を仲介するアダプター型の蛋白質である。SH2を通してEGFレセプターのC端テ-ルのリン酸化チロシンに結合し、SH3を通してGDP-GTP交換活性を有するSosのC末端部のプロリンに富んだ部分と結合している。我々はGrb2とEGFレセプターのリン酸化チロシンを含むペプチドおよび、Sosのプロリンに富む配列との相互作用を明らかにし、認識の機構を解明することを目的として研究を行った。

相互作用部位を解明するため、ラベル蛋白質とラベルしていないペプチドを用い、NMRフィルター法により13Cと12Cに結合した1H間の相互作用を検出した。ここで得られる情報に基づき複合体の立体構造を求めた。プロリンに富むペプチドに含まれるバリン残基は特異的な相互作用をしていることが明らかとなった。SH3はプロリンに富むペプチドと双方向結合するが、結合の方向は、ペプチド上の塩基性残基と非プロリン残基の位置により決定されることがわかった。この様にして、SH3はプロリンに富むペプチドのバラエティを増している。SH2とEGFレセプター及びShcのリン酸化チロシンを含むペプチドとの相互作用を解明した。Grb2はsrcファミリーのSH2と異なり、リン酸化チロシンより2番目のアスパラギンが特異性を決定している。構造解析の結果、src型SH2と異なるループがこのアスパラギンと強く相互作用を行う事が明らかになった。さらにこのループ上の残基に変異を加えることにより、結合が弱くなることを確認した。従来とは異なる認識をしていることが結論出来た。SH3は細胞骨格の蛋白質と相互作用する。リン酸化によりアクチン結合能が制御されているデストリンの構造を三重共鳴三次元NMR法により決定した。分子量20Kと大きなため、三重共鳴三次元NMRを主に用い、立体構造を決定した。この結果、デストリンはゲルゾリンファミリーと良く似た構造を取ることが明らかとなった。1.Grb2のSH2とShcのリン酸化チロシンを含むペプチドとの結合様式を調べた。src等とは異なり、SH2上でターン構造を取ることを明らかにした。2.インタクトGrb2のNMR解析を行い帰属を終了した。シグナルは各ドメインの重ね合せからなり、インタクトなGrb2においても、ドメインは独立であることを示した。さらにX線小角散乱の実験を行ったところ、X線結晶構造解析で明らかにされたコンパクトな構造ではなく、分子全体が開いた構造を取ることが明らかとなった。この様に、シグナル伝達に含まれるモジュールは独立な構造体としてはたらくことが示された。Grb2の様に多くの標的蛋白質を持つ場合には、フレキシブルな構造は相互認識に遊離にはたらくものと考えられる。3.Grb2結合蛋白質として、新たにN-WASPを同定した。N-WASPを共発現すると、マイクロスパイクの伸長等細胞骨格系の変化雅観測される。即ち、細胞分化のシグナル伝達を担っている蛋白質と考えられる。N-WASPは多機能ドメイン蛋白質であり、PHドメイン、CDC42結合ドメイン、cofilinドメインを持つ。細胞骨格とシグナル伝達を仲介する興味深い蛋白質である。4.EGFレセプターに結合する新規蛋白質Tobを同定した。Tobは細胞周期を負に制御する蛋白質であり、サイクリン-CDKの阻害効果をもっている。現在Tobの大量調製系が作製されており、構造解析に着手する。5.原核細胞のシグナル伝達系である、Two-componentシステムのうち、Arc Bの立体構造をX線結晶構造解析により明らかにした。
高分子化合物による洗剤用酵素の安定化とそのビルダー効果に関する研究

省エネルギーと環境保全の立場より酵素配合洗剤用ビルダーを探索することを目的として、高分子化合物による酵素(プロテアーゼ、リパーゼ)活性の安定性と固体粒子汚れに対するピルダー効果について検討した。陰イオン界面活性剤(DBS)やイオン性化合物はCa^<2+>結合能の大きさに比例して酵素活性を阻害する。一方非イオン性高分子PVAやCa^<2+>はDBS共存下におけるプロテアーゼ活性の安定性に寄与し活性を向上させ、綿布からのたん白質(ゼラチン)汚れの洗浄性を高める。またプロテアーゼ活性の安定性はゼラチン/酸化鉄(III)複合汚染布からの酸化鉄粒子の除去にも影響を与える。一方アルカリ洗浴下でのリバーゼ活性の安定性は極めて低いが布上油脂汚れに対する加水分解作用の効果は明らかに認められる。酸素配合洗剤用ビルダーとしては高いキレート能よりもむしろ酵素活性の安定性を重要機能として設計することの必要性明らかになり適するビルダー構造としては、イオン性、非イオン性モノマーをバランスよく合わせもつ高分子化合物が考えられることを予測した。そこでイオン性のスチレンスルホン酸ナトリウム:メタクリル酸ナトリウム共重合体にさらに2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、ならびにビニルアセテートなどの非イオン性モノマーを共重合体させた高分子化合物を新たに設計し、酵素活性の安定性、ビルダー作用の両面より検討した。その結果2-ヒドロキシエチルメタクリレート;ナトリウムメタクリレート;スチレンスルホン酸ナトリウムの共重合化合物がビルダーとして適することが明らかになった。すなわち、イオン性基と疎水性の非イオン性基によって酵素活性への影響が少なく、かつCa^2結合能、吸着による粒子の電位効果、分散安定性などのビルダー作用をあわせもつ化合物であることを確認した。目的:プロテアーゼを始めとする酵素の加水分解作用の洗浄系への応用は界面活性剤やビルダーの界面化学作用のみに依存していた従来の洗剤に大きな変革を与え,洗剤の無リン化に大きく貢献してきた.キレートビルダーは一般にキレート作用の大きいもの程酵素活性を阻害するという精剤配合上相反する特性をもっている.したがって,洗浄系において酵素を有効利用し洗剤の性能を向上させるためには酵素系に適するビルダーの探索が必要である.本研究は高分子化合物による洗剤用酵素の安定化とビルダー効果に及ぼす影響について検討し,新しいビルダーの構造を探索することを目的とする.方法:プロテアーゼならびにリパーゼはそれぞれ起源の異る数種を用いた.高分子ビルダーは,非イオン性ではケン化度と重合度の異る各種ポリビニルアルコール(PVA),イオン性ではナトリウムメタクリレートとの共重合比が異る各種スチレンスルホン酸化合物(USと称す)およびUSに各種非イオン性ビニルモノマーを共重合させた高分子化合物を用いた.プロテアーゼではAnsonー萩原変法,リパーゼでは山田法による活性単位測定法に準じ,活性に及ぼすビルダーの影響を相対活性率として評価した.リパーゼによって遊離する脂肪酸量の測定にはOrion 960 Autochemistry System(本研究申請設備)による電位差滴定法を応用した.酸化鉄およびFerric Ovinate粒子,ゼラチン,トリオレイン汚れを単一,複合汚染し,洗浄性を検討した.結果:プロテアーゼ,リパーゼいずれの酵素も非イオン性PVAによって活性が安定化され,イオン性USでは活性が阻害される.非イオン性モノマーを共重合するUSでは活性に対する影響は小さい. PVAの活性保護の効果にはケン化度の影響が大きく,ケン化度が低い程高い安定化効果を示す.ゼラチンおよびトリオレイン汚れの洗浄性はそれぞれプロテアーゼおよびリパーゼ活性の安定性に大きく影響される.ビルダーは高いキレート能よりもむしろ酵素活性の安定性を重要機能として設計することの必要性を示唆した62年度の結果に基づき、63年度はイオン性のスチレンスルホン酸ナトリウム;メタクリル酸ナトリウム60:10共

重合体にさらに2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ビニルピロリドン、ならびにビニルアセテートなどの非イオン性モノマーをモル比約30%で共重合させた高分子化合物(イオン性/非イオン性モノマー共重合体)を新たに設計し酵素活性の安定性、ビルダー作用の両面より検証した。イオン性/非イオン性モノマー共重合体のCa^<2+>結合能、固体粒子(親水性酸化鉄(III)、疎水性フェリックオキシネート)にたいする負の電位向上効果、分散安定性などのビルダー作用をそれぞれCa^<2+>選択性電極、顕微鏡電気泳動法、自動粒度分布測定装置により測定した。またゼラチン/酸化鉄(III)トリオレイン/フェリックオキシネート複合汚染布からのそれぞれの汚れの洗浄性と酵素(プロテアーゼ、リパーゼ)の相対活性率の関係を検討した。非イオン性モノマーを共重合するビルダーはイオン性モノマー同士の共重合体スチレンスルホン酸系化合物にほぼ等しい高分子電解質としての特性を持つ。一方リパーゼ活性に及ぼす影響はイオン性共重合体と非イオン性共重合体の丁度中間的特性を示しイオン性モノマー共重合体よりも酵素疎害作用が緩和される。特に2-ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体は疎水性の非イオン性基によって吸着能(表面張力低下能)を増し、Ca^<2+>結合能、吸着による粒子の電位効果とともに立体保護作用によって粒子汚れに対する優れた分散安定性、汚染防止作用、洗浄性を示し、一方リパーゼ活性に対する阻害作用も小さいことが認められるなど多機能をあわせ持つ優れたビルダーであることが明らかになった。
父親の育児関与と夫婦関係の相互依存性に関する縦断的研究

本研究の目的は,第1に,面接調査を通じて縦断的に夫婦関係と子育て環境の関係性を質的に研究すること,第2に,育児関与尺度を改良して,夫婦ペアレンティングや夫婦満足度等との関連性および因果関係を量的に検討すること,第3に,夫婦向けの子育て支援プログラムによって育児関与等がどのように改善するか実践的に検討することである。2018年度は,第1の目的である初めて子どもをもつ夫婦への縦断的面接調査について,6組を対象者とした。出産前は6組全員に調査を実施し,出産後6ヵ月時点ではそのうち5組に調査を実施した。残り1組は出産時期が遅かったため,次年度に実施することとなった。各回のインタビューの音声データを文字起こしして,分析を進めている。以後,2時点目の1組,出産後12ヵ月時点で6組,出産後1年半時点で6組にそれぞれインタビュー調査を予定している。また,父親の育児関与尺度を作成し,信頼性と妥当性を検証した論文を査読付学術誌に投稿した。同時に,育児関与尺度を夫婦双方に測定可能なものと位置づけ,インターネット調査によって,末子が02歳または36歳をもつ夫および妻あわせて1200名に質問紙調査を計画し,実施途中である。調査内容は,育児関与に加え,夫婦満足度,夫婦ペアレンティング,ワークファミリーエンリッチメント,仕事関与,主観的幸福感等である。本調査は横断的研究であるため,これらで調査をした結果は2019年度の日本心理学会にてポスター発表を予定しており,以後の縦断的質問紙調査への土台となる知見を見出すことを目的としている。研究はほぼ計画通りに進捗している。面接調査の対象者は当初10組を予定していたが,地域的な条件から専業主婦世帯の調査対象者が少なかったことと,実際には専業主婦世帯も1組協力者が得られたことから,全体として6組の夫婦での面接調査を行うことにした。全ての夫婦が無事出産を終え,実施予定のものも含め,第2回の面接調査が終了する見通しである。また,父親の育児関与尺度は,当初,母親による配偶者としての父親の育児関与の他者評定を想定していたが,研究分担者との慎重な協議を経て,父親の育児関与に関する61項目は父親に特有ではなく母親も同様に行う内容であるという点から,夫婦に共通する育児関与尺度を作成することが望ましいとの結論に至り枠組みを再検討し,新たに夫婦に共通の育児関与尺度とした。その際,以前の研究では末子が36歳の父親で,調査地域も地方都市でしか調査できなかったことを踏まえ,今回のインターネット調査では,末子年齢が02歳,36歳の未就学児で,なおかつ全国47都道府県の全ての調査対象者から調査することとした。今後は,まず継続的に面接調査を6組に実施し,全部で4時点の調査は2020年5月頃に終了する見通しである。それぞれの調査時点が終了するごとに文字起こしを行って,それら記述データからM-GTA(修正版グランデッドセオリーアプローチ)によって理論モデルを構築し,夫婦関係と育児関与の質的モデルに関する研究をまとめ,国内の心理学会にて学会発表,査読付学術誌への投稿を行う。また,インターネット調査の結果は,2019年度の日本心理学会においてポスター発表を行う。その上で,研究としてまとめ,査読付学術誌への投稿を行う。2019年度後半には,夫婦を対象とした縦断的質問紙調査を実施する。これらの結果をまとめ,学会発表と査読付学術誌への投稿を行うのは2020年度となる予定である。

また,父親の育児関与尺度は,当初,母親による配偶者としての父親の育児関与の他者評定を想定していたが,研究分担者との慎重な協議を経て,父親の育児関与に関する61項目は父親に特有ではなく母親も同様に行う内容であるという点から,夫婦に共通する育児関与尺度を作成することが望ましいとの結論に至り枠組みを再検討し,新たに夫婦に共通の育児関与尺度とした。その際,以前の研究では末子が36歳の父親で,調査地域も地方都市でしか調査できなかったことを踏まえ,今回のインターネット調査では,末子年齢が02歳,36歳の未就学児で,なおかつ全国47都道府県の全ての調査対象者から調査することとした。今後は,まず継続的に面接調査を6組に実施し,全部で4時点の調査は2020年5月頃に終了する見通しである。それぞれの調査時点が終了するごとに文字起こしを行って,それら記述データからM-GTA(修正版グランデッドセオリーアプローチ)によって理論モデルを構築し,夫婦関係と育児関与の質的モデルに関する研究をまとめ,国内の心理学会にて学会発表,査読付学術誌への投稿を行う。また,インターネット調査の結果は,2019年度の日本心理学会においてポスター発表を行う。その上で,研究としてまとめ,査読付学術誌への投稿を行う。2019年度後半には,夫婦を対象とした縦断的質問紙調査を実施する。これらの結果をまとめ,学会発表と査読付学術誌への投稿を行うのは2020年度となる予定である。2018年度の物品費使用予定額は255,000円,使用金額は289,398円とほぼ予定通りであった。同様に旅費の使用予定額は260,000円であったが,使用金額は180,170円であり,これは研究代表者及び研究分担者ともに学会発表と研修への出張が予定より少なかったためである。同様に人件費・謝金の使用予定額は268,000円,使用金額は119,000円となったが,これは調査対象が当初の夫婦10組から6組と少なくなったこと,生後6ヵ月時点で託児環境を希望する夫婦がほとんどおらず子どもを抱いたままのインタビューとなったため,アルバイトが不要となったことが理由である。同様にその他費用の使用予定額は417,000円,使用金額は32,558円となったが,当初予定していたインターネット調査が2019年度にずれ込み,調査費用の支払いも合わせて2019年度予算より支出することになったためである。2019年度は,インターネット調査や,面接調査を3回(第2回残り1組,第3回6組,第4回5組の予定)実施するためにそれぞれ費用を要する。また,年度後半には,就学前の幼児を育児中の夫婦を対象とした2時点での縦断的質問紙調査を実施する予定にしており,調査協力先の保育施設への質問紙郵送料,データ入力のアルバイト学生への人件費として使用する。加えて,これらの研究成果を学会で発表する際に必要な旅費,参加費としても使用する予定である。
リアルタイム定量RT-PCR法を用いたオリエンチア・ツツガムシの遺伝子発現解析

ダニ細胞と哺乳動物細胞内におけるオリエンチア遺伝子の発現パターンをリアルタイム定量RT-PCR法を用いて解析し、ダニ細胞中での共生のメカニズムや哺乳動物に対する病原性に関わる遺伝子群の検索を行うのが、本研究の狙いである。ゲノムの配列決定と解析の結果、オリエンチア菌のゲノム上には約2000個のORFが同定された。近縁菌種であるリケッチア属細菌との遺伝子比較解析の結果をもとに、これらのORFのうちから、1.菌の増殖に関わる(ハウスキーピング)遺伝子群、2.菌体表層蛋白質群、3.病原性に関わる可能性の高い4型分泌装置を構成する遺伝子群、4.菌体外への分泌蛋白質群をコードする遺伝子、また、5.オリエンチアゲノム中で高度に重複して存在する遺伝子群、を中心として、発現パターンを解析する250遺伝子を選択した。菌体構成蛋白質のプロテオーム解析の結果を参照しながら、第一段として84遺伝子についてTaqMan probeを作成した。残りの約170遺伝子に関しては、まずRT-PCRにより発現を確認した後、リアルタイム定量PCRの系へ持ち込むことにしている。冷凍保存菌体から抽出した総RNAを用いた予備実験を進めているが、ランダムプライマーを用いて行う予定であったRT-PCRは、得られるオリエンチア菌由来のRNA量が少なく、培養細胞由来RNAの影響が大きいことから、特異プライマーを用いた反応系への変更を検討している。また、マウスL細胞と蚊AeA12細胞を用いて、オリエンチア菌の培養細胞への吸着・侵入・細胞質定着・細胞室内増殖・出芽の各段階に至るタイムコースと細胞内菌数の変化を明らかにすると共に、新たにダニ由来の培養細胞とヒト毛細血管上皮細胞における培養条件の検討を行っている。本研究では、偏性寄生性細菌であるオリエンチア・ツツガムシ(以下、オリエンチア)の遺伝子発現が、昆虫細胞内とホ乳類細胞内においてどのように変化するかをリアルタイムRT-PCRを用いて明らかにすることを目標としている。オリエンチアのゲノム情報をもとに「他のリケッチア属細菌と共通の遺伝子群」と「オリエンチア固有の遺伝子群」に全遺伝子を分類し、各オペロンや生体プロセス毎に12種類の遺伝子を発現解析の対象として選択する予定である。このため、申請者が中心となって進めているオリエンチアゲノムの配列決定・解析の終了が本研究の前提として必須となる。オリエンチアゲノムには重複配列が極めて多く単純なショットガンシークエンシング法では対処できないため、配列決定に多くの時間を費やしたが、平成15年の10月までに配列決定を終了した。現在、ゲノム解析を進めており、全遺伝子の同定と分類については既に終了している。解析から、オリエンチアに固有な遺伝子の大部分が接合伝達や遺伝子組み換えに関わる遺伝子で占められ、クラスターを形成してゲノム上に重複している様子が明らかになった。これらの遺伝子や特徴的なゲノム構造が、オリエンチアのヒトに対する病原性やツツガムシ(ダニ)との共生関係成立に深く関与している可能性が示唆されるため、発現解析の対象として特に注目している。現在、上記の接合伝達・遺伝子組み換え関連遺伝子群、病原性に関係する可能性のある4型分泌装置に関わる遺伝子群、ハウスキーピング遺伝子群等の中から24遺伝子を解析対象の第一段として選択し、taqManプローブのデザインを行つている。ゲノム解析の結果がまとまり次第、本菌の培養条件およびリアルタイム定量RT-PCRによる遺伝子発現定量系を確立し、これら遺伝子から順次、発現解析を行っていく予定である。