hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シベリア牧畜民の民族学的研究

シベリアの永久凍土地帯において、北方少数民族の伝統的生業の現地調査を通じて、北半球の寒極地域における人類の寒地適応文化を明らかにしつつ、ソ連邦崩壊後の北方少数民族の生き残りの可能性を探った。本研究のために協力を得たのは主としてサハ共和国科学アカデミー人文科学研究所ならびにイルク-ツク大学である。夏期に比較的広域にわたる観察を行ないながら、地域を限定してのトナカイ飼育民について厳寒期を除く四季の生業活動に関する集中的な調査を実施した。このために選定したのが、サハ共和国エヴェノ・ブイタンタイスキー地区のエヴェン人とイルク-ツク州カタンガ地区のエヴェンキ人である。平成5年度の夏期の広域調査では上記両地域の他、中央ヤク-チアのヤク-ト人の馬飼育に関連した伝統文化の調査を試みた。しかし、東シベリアにおいて少数民族とは言いがたいこの民族は、帝政ロシア・ソ連時代を通じてロシア化をともなう近代化がかなり浸透して生活様式も多様化しており、伝統文化の調査を短期間に実施することは困難であることが分かった。平成6年度の広域調査では北東シベリアのコリマ川下流地方のエヴァン人のトナカイ飼育民を調査した。低地ツンドラにおける年間の長距離移動の遊牧に狩猟と漁労をともなう生業形態、および飼育トナカイと野生トナカイとの競合関係など文献によって断片的に知られていた事象を、かなりよく残していることが明らかになり、今後集中的な調査が期待される。平成7年度には西シベリアのオビ川下流域からギダン半島にかけての地域の調査を行なった。地下資源開発による環境破壊により伝統的生業の崩壊が問題視されているが、他方、ギダン半島には、ネネツ人の伝統的な生業と文化が生き残っていることが判明し、これも今後、その実態を明らかにすべき課題である。平成57年度の集中的調査地域のうち、上記のエヴェノ・ブイタンタイスキー地区においては、夏期のヴェルホヤンスキー山脈の山岳ツンドラと冬期の山麓の森林地帯の間を往復する多頭トナカイ飼育が行なわれている。これに従事するのは大部分のエヴェン人であり、かつての民族共同体がソ連時代にほぼそのまま集団化の形態をとったため、ソ連体制の崩壊後も、かなりかつての社会環境を保持している。生業としてのトナカイ飼育に従事する者も若年から高年齢者までを含み、彼らの生業活動は当面健在であるかにみえる。しかし、歴史的に彼らはヤク-ト文化の強い影響下におかれて、言語的にはほぼ完全にヤク-ト語化しており、トナカイ飼育を営むが故にエヴェン人であるという側面がある。また、ソ連崩壊後の市場経済への対応では多大の困難に直面しており、生産性の低さ、商品としてのトナカイの毛布・肉の販路の確保が困難なこと、かつて有力な生業であった野生獣毛皮狩猟も価格低落によって成り立たなくなり、狩猟は食料自給の一手段に逆戻りしているなどの問題が表面化している。北方少数民族の生き残りをかけた市場経済への移行策がサハ共和国政府の主導の下にとられつつある。集中調査を実施したいま一方のイルク-ツク州カタンガ地区ではタイガ帯においてトナカイ飼育と狩猟の組み合わせから成る生業活動がエヴェンキ人によって続けられていることが明らかになり、その実態を詳しく記録することに努めた。森林地帯における本来の意味での自給自足ではないが、さまざまな日常の生活の習慣・技術の中に彼らの独自の民族文化が色濃く存続している。ここでもソ連時代を生き延びたエヴェンキ人の伝統が近代的な産業開発による森林破壊や市場経済化にいかに対応するかに大きな課題がある。ソ連邦崩壊後、以上のシベリア諸民族の間には民族文化の復興運動が盛んになっているが、ソ連体制下における民族固有の文化の喪失を否定できないものの、国家の経済統制による一定の生活水準の維持が可能であった。苛酷な自然環境と地理的に隔絶した地域に居住する民族の真の意味での発展がいかに計られるかは、なお詳しい調査を要する。

地下資源開発による環境破壊により伝統的生業の崩壊が問題視されているが、他方、ギダン半島には、ネネツ人の伝統的な生業と文化が生き残っていることが判明し、これも今後、その実態を明らかにすべき課題である。平成57年度の集中的調査地域のうち、上記のエヴェノ・ブイタンタイスキー地区においては、夏期のヴェルホヤンスキー山脈の山岳ツンドラと冬期の山麓の森林地帯の間を往復する多頭トナカイ飼育が行なわれている。これに従事するのは大部分のエヴェン人であり、かつての民族共同体がソ連時代にほぼそのまま集団化の形態をとったため、ソ連体制の崩壊後も、かなりかつての社会環境を保持している。生業としてのトナカイ飼育に従事する者も若年から高年齢者までを含み、彼らの生業活動は当面健在であるかにみえる。しかし、歴史的に彼らはヤク-ト文化の強い影響下におかれて、言語的にはほぼ完全にヤク-ト語化しており、トナカイ飼育を営むが故にエヴェン人であるという側面がある。また、ソ連崩壊後の市場経済への対応では多大の困難に直面しており、生産性の低さ、商品としてのトナカイの毛布・肉の販路の確保が困難なこと、かつて有力な生業であった野生獣毛皮狩猟も価格低落によって成り立たなくなり、狩猟は食料自給の一手段に逆戻りしているなどの問題が表面化している。北方少数民族の生き残りをかけた市場経済への移行策がサハ共和国政府の主導の下にとられつつある。集中調査を実施したいま一方のイルク-ツク州カタンガ地区ではタイガ帯においてトナカイ飼育と狩猟の組み合わせから成る生業活動がエヴェンキ人によって続けられていることが明らかになり、その実態を詳しく記録することに努めた。森林地帯における本来の意味での自給自足ではないが、さまざまな日常の生活の習慣・技術の中に彼らの独自の民族文化が色濃く存続している。ここでもソ連時代を生き延びたエヴェンキ人の伝統が近代的な産業開発による森林破壊や市場経済化にいかに対応するかに大きな課題がある。ソ連邦崩壊後、以上のシベリア諸民族の間には民族文化の復興運動が盛んになっているが、ソ連体制下における民族固有の文化の喪失を否定できないものの、国家の経済統制による一定の生活水準の維持が可能であった。苛酷な自然環境と地理的に隔絶した地域に居住する民族の真の意味での発展がいかに計られるかは、なお詳しい調査を要する。7月下旬8月中旬に研究代表者、研究分担者全員でサハ(ヤク-チア)共和国の3地区について天候による調査地を訪れる順番に変更はあったものの、ほぼ計画に沿った調査を実施した。ヤク-ツク市内の研究所、博物館、図書館における資料、文献調査を行ないつつ、まず、エベノ・ブイタンタイスキー地区においてサハ(ヤク-ト)人の牛、馬牧畜地域とエベン人のトナカイ遊牧地において夏の生業活動を調査し貴重な映像記録と資料収集ができた。とくにエベン人のトナカイ飼養は春秋の山地ツンドラ、冬の山麓における越冬の組み合わせによる遊牧形態は今後より詳しい調査の必要があることがわかった。これと比較するため北極圏のチェルスキー附近の低地ツンドラの調査の必要性が明らかになった。ついで、ナムスキーおよびゴールヌィの両地区においてサハ人の牧畜と伝統文化の調査を行なったが、共にロシア化と近代化が著しい都市近郊型の農牧業地区であり伝統的な習俗、技術等をより詳細に記録・収集するには本学術調査の計画とは別の計画が適当であることがわかった。
コリン作動性運動神経の発達, 分化におけるTrophic Factorの生理的役割

副腎由来の株化細胞PC12は,神経成長因子(NGF)によりアドレナリン作動性神経分化を,あるいはグリア細胞由来の蛋白性因子(GCM)によりコリン作動性神経分化を遂げることが知られている.本研究では,ビタミンA誘導体の1つであるレチノイン酸(RA)のPC12細胞の神経分化に対する作用と, RAによる細胞内情報伝達機構を解析した.培養下のPC12細胞に10^<-6>MのRAを加えると, NGFやGCMにより引き起こされるような神経突起の伸長はみられなかったが,細胞の増殖が著しく抑制された. RAにより, PC12細胞に含まれるコリンアセチル基転移酵素(ChAT)活性は約2倍に増加し,チロシン水酸化酵素(TH)活性は約50%に減少した.他のビタミンA誘導体であるレチナール,レチノールはこのような作用は示さなかった.これらの結果はRAが特異的にPC12細胞のコリン作動性神経分化を誘導することを示す.RAとGCMは共に, PC12細胞の細胞内Ca濃度を持続的に増加させた.一方, NGFはそのような作用は示さなかった. RAあるいはGCM存在下で培養したPC12のホモジネートを〔^<32>PATPとインキュベートすると,未処理あるいはNGF処理の細胞ホモジネートに比べて,分子量約27,000の蛋白質(27K蛋白)のCaに依存したリン酸化が特異的に増加していた.27K蛋白のリン酸化は, Ca依存性蛋白リン酸化酵素の阻害剤であるH7やW7により阻害され, C-キナーゼの活性化因子であるTPAにより増加した.PC12細胞にH7, W7を加えて培養すると,これら阻害剤はRAによるChAT活性の増加を特異的に抑制した.これらの結果は, RAやGCMによるPC12細胞のコリン作動性神経分化が,細胞内Caの増加およびそれに続いて起こるCa依存性蛋白質リン酸化反応によって引き起こされる可能性を強く示唆する.副腎由来の株化細胞PC12は,神経成長因子(NGF)によりアドレナリン作動性神経分化を,あるいはグリア細胞由来の蛋白性因子(GCM)によりコリン作動性神経分化を遂げることが知られている.本研究では,ビタミンA誘導体の1つであるレチノイン酸(RA)のPC12細胞の神経分化に対する作用と, RAによる細胞内情報伝達機構を解析した.培養下のPC12細胞に10^<-6>MのRAを加えると, NGFやGCMにより引き起こされるような神経突起の伸長はみられなかったが,細胞の増殖が著しく抑制された. RAにより, PC12細胞に含まれるコリンアセチル基転移酵素(ChAT)活性は約2倍に増加し,チロシン水酸化酵素(TH)活性は約50%に減少した.他のビタミンA誘導体であるレチナール,レチノールはこのような作用は示さなかった.これらの結果はRAが特異的にPC12細胞のコリン作動性神経分化を誘導することを示す.RAとGCMは共に, PC12細胞の細胞内Ca濃度を持続的に増加させた.一方, NGFはそのような作用は示さなかった. RAあるいはGCM存在下で培養したPC12のホモジネートを〔^<32>PATPとインキュベートすると,未処理あるいはNGF処理の細胞ホモジネートに比べて,分子量約27,000の蛋白質(27K蛋白)のCaに依存したリン酸化が特異的に増加していた.27K蛋白のリン酸化は, Ca依存性蛋白リン酸化酵素の阻害剤であるH7やW7により阻害され, C-キナーゼの活性化因子であるTPAにより増加した.PC12細胞にH7, W7を加えて培養すると,これら阻害剤はRAによるChAT活性の増加を特異的に抑制した.これらの結果は, RAやGCMによるPC12細胞のコリン作動性神経分化が,細胞内Caの増加およびそれに続いて起こるCa依存性蛋白質リン酸化反応によって引き起こされる可能性を強く示唆する.
遷移金属原子のレーザー冷却-光制御パターニングへの展開

光の放射圧により遷移金属のクロム原子の運動を制御、操作する方法を確立し、それを利用したナノ構造体を形成する技術の開発を行った。とくに、レーザー光源として工業的適用性に優れた半導体レーザーを用いたクロム原子の光制御、操作を実現し、クロム原子の一次元周期構造体(半値幅:150nm、高さ:6.7nm、周期:212.78nm)の作製に世界で初めて成功した。この研究成果は、アメリカの国際光工学会(SPIE)発行のSPIE's OE Magazineで紹介されるなど、実用化に向けた研究が評価されている。これだけではなく、原子の光制御で最も重要なレーザー光の周波数安定化法についても、簡便でありながら、十分な精度を実現する新規な手法を考案するなど要素技術の開発も行った。具体的には、発振周波数の変動を2MHz以下に抑制することを実現した。さらに、原子パターニング技術として、輪帯照明光学系あるいはアキシコンプリズムを用いた顕微光学技術を採用することで、1次ベッセル(J_1)光ビームを形成し、この光ビームポテンシャル内に原子をナノスケールに閉じ込め、ガイドする方法についても新たに考案し、数値解析によりその有効性を確認した。解析の結果、ナノスケールの構造体を作製するには、原子の進行方向の速度拡がりも抑える必要があることが分かってきた。原子の速度の違いによる勾配力ポテンシャル内での色収差が構造体の大きさを決めるので、速度拡がりを抑制することが重要となる。そこで、原子源として磁気光学トラップを用いることが速度拡がりの抑制に有効と考え、ゼーマン冷却法の検討、設計、試作も行った。ナノ空間においてクロム原子を制御・操作する技術の確立を図るため、現有の超高真空チャンバーの改造を行った。とくに、蒸発温度の高いクロム原子の気体を効率よく取り出せる原子源を新に導入した。クヌーセンセルを採用し、温度制御の最適化を図ったことで、原子ビーム流の安定化を図ることができた。また、真空チャンバー内に、半導体レーザーの第2高調波(λ=425.5nm:クロム原子の共鳴周波数に相当)を導入し、レーザー冷却によるクロム原子ビームのコリメーションを行い、原子ビームの発散角を0.2mrad以下に押えることができた。コリメートされたクロム原子ビームに対し、対向レーザービームの干渉パターンによる光強度ポテンシャルを与え、クロム原子による1次元周期構造を作製した。作製したナノ構造体の全治半幅は150nm、高さは6nmで、周期はレーザー光の半波長212.78nmであった。つづいて、磁気光学トラップを効率的に行うために、原子ビームの予備冷却法の検討を行った。熱蒸発させたクロム原子に対して、ゼーマン効果を利用することで光の散乱力を連続的に働かせるゼーマン冷却法が効果的であると判断し、その冷却過程を解析した。冷却器長、磁場強度分布、レーザー周波数の離調量、原子源温度等をパラメーターとして、原子の動きをシミュレートした。その結果、入射レーザー光強度をクロム原子の飽和強度(9.8mW/mm^2)、冷却長を1mとしたときに、磁場を850Gaussから0Gaussまで変化させると、磁気光学トラップ可能な速度(18m/s)にまで冷却される原子は、熱蒸発したクロム原子のうちおよそ13%となり、予備冷却を行わない場合と比べて4桁以上向上することがわかった。現在、この結果から、ゼーマン冷却部の試作を行っているところである。本年度は、磁気光学トラップおよびその前段階の予備冷却を行うためのレーザー光源の見直しを行った。これまでは、単一周波数発振かつ周波数掃引可能な半導体レーザーを用いて、その第2高調波を発生させて、クロムの共鳴波長425nmを得ていたが、出力が20mW程度であった。この出力では、磁気光学トラップ、予備冷却を同時に行うことが困難である。

そこで、100mW程度の出力を得るために、Ti:サファイアレーザーの構築を行った。出力15Wのアルゴンイオンレーザーにより、リングキャビティー共振器内のTi:サファイア結晶を励起し、レーザー発振させ、波長851.1nmで1.88Wの出力を得た。クロムの共鳴波長を得るにはこの後、リングキャビティー型の第2高調波発生装置を通す必要があるが、変換効率は10%程度であるため、180mW以上のクロムの共鳴波長を得ることができると考えている。クロム原子の飽和強度は8.5mW/mm^2であることから、100mWを予備冷却用に、80mWを磁気光学トラップ用に利用する予定である。さらに、レーザー光の発振周波数幅は1MHz以下を達成することも確認している。レーザー光の波長は波長計でモニターし、キャビティー長をフィードバック制御することで、時間的なジッターも5MHz以下に抑えることを可能とした。これら値から、クロム原子の冷却、トラップを十分に行うことができると考えている。真空排気系については、高温エフージョンセルを原子源として導入し、クロム原子の気体ガスを効率的に取り出せるようにした。光強度分布による勾配力をクロム原子に働かせ、その分布にしたがいクロム原子を基板上に堆積し、転写するには、レーザーの発振周波数の時間的ドリフトを、原子の共鳴吸収線の自然幅以下(クロム原子の場合、5MHz)に押さえる必要がある。実験で使用している半導体レーザーは外部共振器を利用することで発振周波数の狭帯域化(500kHz)を図ったうえで、半導体レーザーに印加する電流量を一定にするクローズループが働いているものの、発振周波数自体についてはオープンループとなっている。したがって、その発振周波数は半導体レーザーの周囲の環境の影響を受け一定とはならない。とくに周辺温度の変化には大きく影響を受け、発振周波数の時間変動を測定した結果、50分ほどの間に200MHzの変動があり、原子の自然幅以内の安定性にはほど遠く、発振周波数の安定化が不可欠であることが分かった。ところが、200MHzといっても、市販の波長計では検出限界以下の周波数変動である。そこで、散乱力によるコリメーション位置において、原子フローの拡がり角度によって、共鳴吸収を行うためのドップラーシフト量が異なることを利用した発振周波数の安定化を考案した。すなわち、原子源から拡がりを持って分散するフローのうち蛍光を発する位置での正弦方向の速度がレーザーの発振周波数に比例することから、蛍光の発する位置をPSD(Position Sensitive Detector)センサーによりモニターし、蛍光の発せられる位置が一定になるように、半導体レーザーの外部共振器を制御した。この結果、半導体レーザーの発振周波数の時間的ドリフトを30分以上にわたって、2MHz以下に抑制することを実現した。
フェロアロイを用いたＶ系水素貯蔵材料の創製と貯蔵水素の挙動の解明

バナジウム(V)系水素貯蔵材料実用のためには低コスト化が必要である。本研究では、Vの代わりに安価なフェロバナジウムを使用すべく、V以外に含まれる元素が水素吸蔵放出性能に及ぼす影響を明らかにした。その結果、特にFeおよび酸素がVの水素吸蔵量を低下させ、水素化物相中の水素の拡散速度を低下させることが分かった。フェロバナジウムは、金属AlによるV酸化物の還元反応にて精錬されることが一般的であるため、Al量を増やして酸素濃度を低減させ、材料コストに応じてFe量を調整することが、本研究の結果より提案された。室温付近において、V金属は低水素吸蔵量側から1水素化物および2水素化物を生成する。1水素化物の安定性は2水素化物に比べて極めて高く、大気圧から数MPaの水素圧力範囲では、1水素化物ー2水素化物間の相変態によりVは水素を吸蔵あるいは放出する。本研究では、フェロバナジウムを水素貯蔵材料に使用することを目指して、平成23年度は主に不純物酸素濃度がVの水素吸蔵放出性に及ぼす影響を明らかにした。その結果、酸素濃度が約30004000 mass ppm以上になると、水素吸蔵量が大幅に減少することと、水素化物中の水素の拡散が遅くなることが分かった。24年度は、その不純物酸素によるVの水素吸蔵量の減少は、本来2水素化物が単相で生成するような水素圧力下でも、酸素濃度が高まると2水素化物相の他に体心正方格子がひずんだ1水素化物相に近い構造の水素化物相も生成することによることが明らかになった。また23年度に、フェロバナジウムにはAlあるいはSiも数%のオーダーで含まれることが分かったため、24年度はAlがVの水素吸蔵放出性に及ぼす影響を調べた。その結果、AlをVに添加すると、水素吸蔵量が減少すること、2水素化物が生成する平衡水素圧力が上昇することがそれぞれ分かった。また、Vの1水素化物中で水素は体心正方格子の八面体サイトを本来占有するが、Al添加により水素は四面体サイトにシフトすることが分かった。現段階ではこの水素のサイトのシフトが、Vの水素化の相変態さらには水素吸蔵量に影響を及ぼしているものと推察している。他方、Vの1水素化物中の水素の拡散はAl添加により速くなることが明らかになった。今後は、本研究の本題であるFeがVの水素吸蔵放出性に及ぼす影響について詳細を調べると共に、フェロバナジウム基の水素貯蔵材料の開発を目指す予定である。V系合金は短中期的将来の燃料電池車用水素貯蔵材料としての利用が有望な材料の1つである。しかし、実用のためには低コスト化が必要である。本研究では、Vの代わりに安価なフェロバナジウムを使用すべく、V以外に含まれる元素(酸素、Al、Fe)が水素吸蔵放出性能に及ぼす影響を明らかにした。金属Vは室温付近において、体心正方構造をもつ1水素化物相および面心立方構造をもつ2水素化物相を生成する。平成23年度は、酸素濃度が約4000 mass ppm以上になると、Vの水素吸蔵量が大幅に減少することと、1水素化物相中の水素の拡散が遅くなることを明らかにした。24年度は、その酸素による水素吸蔵量の減少は、本来純Vの場合には2水素化物相が単相で生成するような高水素圧力下でも、酸素濃度が高まると2水素化物相の他に1水素化物相に近い構造の新たな水素化物相の生成によることを明らかにした。他方、AlをVに添加すると、1水素化物相中で本来八面体サイトを占有する水素が四面体サイトにシフトすることが分かった。これにより水素の拡散は促進された。25年度は、Fe添加により2水素化物相の水素吸蔵量はAl添加の場合に比べて大きく減少することが分かった。平衡水素吸蔵圧力の変化は単純ではなく、Fe添加量5at.%程度を境に平衡圧力の変化は上昇から低下に転じた。この変化の機構は現段階では明らかでない。他方、Fe添加により1水素化物相中の水素の拡散は遅くなることが分かった。以上をまとめると、フェロバナジウムに含まれるV以外の元素の中でも、特にFeおよび酸素が水素吸蔵量を低下させ、水素化物相中の水素の拡散速度を低下させることが分かった。はじめに酸素濃度が11012200 mass ppmのV金属と3規格のフェロバナジウムを準備して、それぞれの不純物濃度あるいは水素吸蔵放出性を明らかにした。

室温付近において、V金属は低水素吸蔵量側から1水素化物および2水素化物を生成する。1水素化物の安定性は2水素化物に比べて極めて高く、大気圧から数MPaの水素圧力範囲では、1水素化物ー2水素化物間の相変態によりVは水素を吸蔵あるいは放出する。本研究開始前にV中の酸素濃度が増加すると水素吸蔵量は減少すると予想していたが、約30004000 mass ppm以上の酸素濃度になると、少なくても10 MPa以下の水素圧力では2水素化物の生成はほぼ見られなくなり、水素吸蔵量が大幅に減少することが分かった。また、酸素濃度が異なる3種類のVについて、1水素化物試料を作製して固体核磁気共鳴実験を行った結果、水素の拡散の活性化エネルギーは酸素濃度の上昇によって増加することが明らかになった。これらの結果は、V中の酸素濃度がある量以上になると、水素吸蔵量が大幅に減少し、かつ、水素の拡散が遅くなることを示している。一方、3規格のフェロバナジウムには鉄および酸素以外の不純物元素として、アルミニウムあるいはシリコンも含まれていることが元素分析によって明らかになった。3規格のうち最もV量が多い組成のフェロバナジウムでも、室温および10 MPaの水素圧力下において2水素化物の生成は確認されなかった。固体核磁気共鳴実験により、1水素化物中の水素の拡散の活性化エネルギーを見積もった結果、酸素濃度110 mass ppmのVの1水素化物中のものに比べて値は大きいことが分かった。しかし、フェロバナジウムがVに比べて水素吸蔵量が少ないことおよび水素化物中の水素の拡散が遅いことに関する詳細なメカニズムについては未解明であり、研究を継続して明らかにする予定である。これまでにフェロバナジウムにはV、Feおよび酸素以外にAlおよびSi等の不純物も含まれることが分かったため、当初の研究計画にはなかったが、平成24年度は主にAlがVの水素吸蔵放出性に及ぼす影響を詳細に明らかにした。V金属は、Al金属によるV酸化物の還元(テルミット法)にて精錬されることが一般的で、酸素およびAlの両方の影響を明らかにすることは、今後フェロバナジウム基の水素貯蔵材料を設計するためには重要な情報になるものと考えられる。研究実施計画における平成23年度の計画に沿って、酸素濃度が異なるV金属およびフェロバナジウムについての水素吸蔵放出性評価および固体核磁気共鳴実験等を進めることができたため。平成25年度は、FeがVの水素吸蔵放出性に及ぼす影響を明らかにし、これまでの酸素およびAlに関する結果と併せて、フェロバナジウム基の水素貯蔵材料の開発指針を立てる。また、研究費の使用については、24年度終了時に概ね計画通りであったため問題は無いと判断される。平成23年度は請求額に対して実支出額が少なかったが、これは主に固体核磁気共鳴装置が東日本大震災後に故障した期間があったことと夏期の節電対策により装置を停止せざるをえなかったことによる。11にて述べたように研究の推進状況は、当該装置を運転できた期間に集中的に測定を行ったため支障はほぼ生じていない。同実験に関する消耗品等は平成24年度に改めて不足分を購入する予定である。平成25年度は、引き続き固体核磁気共鳴実験に関する消耗品費と、成果を学会で発表するための旅費等への支出が主に見込まれる。研究計画および研究費の使用予定には実質的な変更は無い。上述の今後の推進方策の通り、平成23年度は固体核磁気共鳴実験に関する消耗品費の支出が当初予定に比べて少額であったが、平成24年度に不足分を充てるため、研究計画および研究費の使用予定には実質的な変更は無い。
ANXA4サブタイプの機能解析に基づく卵巣明細胞腺癌の抗がん剤耐性克服戦略の研究

上皮性卵巣がんの中でも,卵巣明細胞腺癌は日本人に多く化学療法に抵抗性で予後不良であり,その治療成績の改善は喫緊の課題である.本研究代表者らが明細胞腺癌に特徴的に高発現するタンパク質として見出したアネキシンA4(ANXA4)には,抗がん剤耐性など様々な機能が報告されているがその作用機構を含めて詳細は不明である.本研究では,翻訳後修飾で生ずる2種類のANXA4サブタイプの機能が異なり,それぞれが,卵巣がん治療に使用されるパクリタキセル,カルボプラチンに対する抵抗性に関わること,その機構の一部に,細胞小器官のリソゾームが関わるオートファジーと呼ばれる自己貪食能が関与する可能性を示唆した.前年度は,annexinA4 (A4)タンパク質のうち,等電点電気泳動をすることで判別できる酸性型-annexinA4 (acidic-A4)と塩基性型- annexinA4 (basic-A4)の2種類のサブタイプのうち,acidic-A4が明細胞腺がん細胞のプラチナム系抗がん剤耐性に関わる一方で,basic-A4はパクリタキセル耐性に関与する可能性を示す結果を得た.そこで,本年度は,acidic-A4,basic-A4の質的な違いを明らかにすべく,A4-タンパク質の免疫沈降による濃縮と,質量分析によるアミノ酸配列や翻訳後修飾などの相違解析を試みた.残念ながら市販の抗A4抗体での免疫沈降や,FLAG-Tagを付加したA4タンパク質の発現と抗FLAG抗体での免疫沈降を試みたが,いずれも免疫沈降による濃縮はできなかった.そこで, A4タンパク質によるパクリタキセル耐性機能に注目して解析を進めた.これまでの我々の研究で,A4依存性にパクリタキセル耐性を示すbasic-A4優位型の明細胞腺がん細胞OVISEが, A4発現をshRNAでノックダウンされると,並行してlysosomal associated membrane protein 2 (LAMP2)タンパク質の発現が減弱することを見いだしている.パクリタキセル耐性がアポトーシスによる細胞死シグナルをオートファジーに変換することで生ずるとの結果が乳がん細胞を使ったin vitroの研究で示されていることから,外科切除卵巣がん組織を用いた免疫染色による関連タンパク質の発現解析を行った.明細胞腺がんを含む複数の組織型の卵巣がんでLAMP2の高発現が観察され,また,beclin-1,APG16Lなどのオートファジー関連遺伝子の高度な発現も認められた.現在,annexinA4発現強度との相関を解析している.上皮性卵巣がんの中でも,卵巣明細胞腺癌は日本人に多く化学療法に抵抗性で予後不良であり,その治療成績の改善は喫緊の課題である.本研究代表者らが明細胞腺癌に特徴的に高発現するタンパク質として見出したアネキシンA4(ANXA4)には,抗がん剤耐性など様々な機能が報告されているがその作用機構を含めて詳細は不明である.本研究では,翻訳後修飾で生ずる2種類のANXA4サブタイプの機能が異なり,それぞれが,卵巣がん治療に使用されるパクリタキセル,カルボプラチンに対する抵抗性に関わること,その機構の一部に,細胞小器官のリソゾームが関わるオートファジーと呼ばれる自己貪食能が関与する可能性を示唆した.婦人科腫瘍学プラチナム系薬剤と共に卵巣がん抗がん剤治療の主役であるパクリタキセルの耐性にbasic-A4が関与し,かつ,LAMP2を介する細胞死メカニズムのapoptosis to autophagy conversionが耐性機構の基礎となっている可能性が見出され,本研究の命題である明細胞腺癌の抗がん剤耐性克服戦略にsubtype特異的にannexinA4を介する新たな具体的な切り口を発見した.また,sirtuinfamilyに属するclass IIIHDACが翻訳後修飾を介してacidic-/basic-A4の成因に関与する可能性の検討は予定通りに進まなかったが,これまで不可能だったannexinA4の免疫沈降をFLAGタグ抗体で成功,shRNA抵抗性A4-FLAGの産生にも成功し,組換えタンパク質を用いた詳細な検討の準備を完了した.平成25年度に準備を終えた発現ベクターを用いて組換えannexinA4タンパク質を作製し,acidic-/basic-A4の相違を突き止める.acidic-/basic-A4両者を発現するOVISE細胞のA4-KO細胞株にshRNA抵抗性変異を導入したA4-FLAG発現ベクターを導入,恒常的にA4-FLAGを発現する細胞株を樹立する.この細胞を大量に培養し,FLAG-M2抗体カラムを用いてA4-FLAGを精製する.精製したA4-FLAGタンパク質と2D-PAGEを用いて, acidic-/basic-A4を生む様々な翻訳後修飾の可能性を詳細に解析する.また,acidic-/basic-A4 FLAGを2D-PAGEで分離後それぞれゲルから切り出して,別々に質量分析を行い両者の相違を解析する.解析には学内のプロテオミクス解析を専門とする研究室の協力を得る.相違を生む原因ペプチド配列が予想出来ればmutagenesis等の分子遺伝学的手法を用いたアプローチも考慮する.相違が明らかに出来れば,より細胞生物学的な,また,臨床病理学的な研究を展開する.また,basic-A4がLAMP2発現誘導による細胞死メカニズムの転換を介してパクリタキセル耐性に関与する可能性については,OVISE細胞でのsiRNAによるLAMP2発現抑制や,OVISE-A4-KO細胞へのshRNA抵抗性A4-FLAG導入によるLAMP

2発現とパクリタキセル耐性能の回復,などでより確実な関連性を証明する.適宜,cDNA microarray等による発現解析で抵抗性関連遺伝子のdiggingに努め,卵巣明細胞腺癌の抗がん剤耐性克服戦略の最適な分子標的を見極めるように研究を進める.研究が順調に進行しており、対象症例が増加している。当初の見積もりであると年間数例であったが、関連病院からの研究参加も増加し、現在の23倍の症例数が見込まれる。平成25年度は在庫分で当該研究は充分であった。平成26年度に増加分も見込んで試薬を補充購入する予定。ANXA4陽性/Sirt1陰性群が細胞レベルでのANXA4-acidic優位群に相当しcarboplatin耐性群となる可能性が高い点に注目して発現動態と抗がん剤感受性などの臨床病理学的なパラメーターの相関を検討する。そのための免疫組織染色をおこなう抗体の追加購入の必要性もある。
頂点代数の理論の新展開

(1)カイラル微分作用素のasymtotic algebraの概念を導入した。その上でカイラルハミルトニアン還元法を用いてSlodowy多様体上のカイラル微分作用素のasymtotic algebraを構成した。さらにその大域切断を計算し、それが臨界レベルの単純W代数に同型である事を示した。(桑原敏郎氏、Fyodor Malikov氏との共同研究)(2) Semi-infniterestriction関手の概念を導入し、これがアフィンリー環の"許容性"と整合的であることを示し,C2有限性を満たさない頂点代数の研究の一環として、アフィンリー環の許容表現に付随する頂点代数を研究し、1995年のAdamovic-Milasの予想を肯定的に解決することに成功した。また対応するZhu代数の随伴多様体を決定し、これが冪零錐に含まれる既約な代数多様体であることを証明した(arXiv:1211.7124 [math.QA])。このようなZhu代数の随伴多様体の決定は(非自明な場合には)これまでにない著しい結果だと言える。この結果及び前年度まで得られた結果についていくつかの国際研究集会及び海外のセミナーで報告し、特にロシアとフランスの国際研究集会では連続講演を行った。また平成13年度代数学賞を受賞した。Fyodor Malikov氏と桑原俊郎氏との共同研究により、以下の結果を得た.(1)漸近的カイラル微分作用素(ACDO)の概念を導入した。(2)ACDOをSlodwy多様体上のアーク空間上にカイラルHamiltonian還元法を用いて構成した。(3)(2)で得られたACDOは一般の冪零元に付随する臨界レベルのアフィンW代数をし、Beilinson-Bernsteinの意味で局所化すること、すなわりACDOの大域切断が臨界レベルの単純なアフィンW代数に同型になることを示した。また、アフィンリー環の許容表現のZhu代数の随伴多様体が対応する有限次元リー環の冪零錘に含まれる既約な代数多様体に同型になることを示した。またこれらの結果について国内外の研究集会で講演を行った。(桑原敏郎氏、Fyodor Malikov氏との共同研究)(2) Semi-infniterestriction関手の概念を導入し、これがアフィンリー環の"許容性"と整合的であることを示し,本研究課題の研究目的の一つである頂点代数の層の理論、特にシンプレクティック多様体のカイラル変形量子化の理論に関して、研究協力者の桑原敏郎氏、Feydor Malikov氏と共同研究を行い、(1)シンプレクティック多様体のアーク空間上のasymptotic chiral differential operatorの概念を導入し、その例として(2) Slodowy多様体のアーク空間上へクリティカルレベルのW代数の局所化することに成功した。またこれをプレプリントにまとめた。アフィンリー環の頂点代数に付随する許容表現Adamovic-Milasの予想の解決やZhu代数の随伴多様体の決定など著しい結果を得ている。シンプレクティック多様体のアーク空間の変形量子化の非自明かつ興味深い例を構成することに成功した。交付申請書の予定に従い研究を遂行する。国内外の研究者の招聘、研究集会への参加を通じて知見を高め研究計画通り1)頂点代数の層の理論2)C_2条件を満たさない頂点代数に対するモジュラー関手の理論の構築を目指す。関連研究者の招聘旅費に使用する。諸事情により海外研究者の招聘が予定通り行えなかった。これらの分は次年度の国内外の研究者の招聘旅費や情報収集の為の旅費に使用したい。
高速通信網におけるマルチメディアトラヒック制御法に関する研究

近年、通信ネットワークにおいて観測されている長期依存性を持つトラヒックを表現する、新しいトラヒックモデルを、M/G/c//c待ち行列システムにおける系内客数過程を用いて構築した。このモデルを用いれば、自己相関関数ならびに周辺分布が与えられたとき、これらを持つ時系列を生成することができる。このモデルは、従来提案されていたモデルと比較して、計算量が相当削減されている。また、長期依存性をもつトラヒックがネットワークの端点でリーキーバケットを通過すると、ネットワーク内ではCBRトラヒックと見なすことが出来る。そこでCBRトラヒックを多重化する交換機における遅延分布の導出を行い、得られた結果が数値的に安定であることを確認した。また、平均遅延時間の陽表現を導出し、ネットワーク内に流入するパケットに制御を加える効果を量的に示した。さらに、相関をもつ複数の到着流が収用される有限バッファ待ち行列の呼損率を、対応する無限バッファ待ち行列の裾野分布を用いて近似する新しい手法を考案した。この手法では近似制度と計算量のバランスを調整することが可能となっており、特に、呼受付制御における実時間制約にも堪え得るものとなっている。さらに評価された呼損率に基づいた呼受付制御法の提案を行った。1.長期依存性をもつトラヒックに対する新しいモデルとしてM/G/c//c型入力モデルを取り上げ、発生データ量に関する自己相関係数をオン、オフ期間が一般分布に従う場合について考察した。従来のモデルとは異なり、このモデルは入力側の帯域を明示的に指定できる利点がある。解析の結果、オンあるいはオフ期間の少くとも一方の2次積率が発散する場合、M/G/c//c型入力モデルは長期依存性を持つことが分かった。2また、各ノードで一般化プロセッサシェアリング方式を用いた統合サービスパケット網において、エンド・エンド間の最大遅延に制約のあるトラヒックを決定的帯域割り当て法を用いて収容する際に必要となる、リーキーバケットならびにノードでのバッファサイズを計算するアルゴリズムを考案した。さらに、これを用いて、有界なエンド・エンド間の遅延とパケット損失のないことを保証する呼受付制御方式を提案した。さらにGOP-CBR MPEG2を例として取り上げ、数値実験を行った。3さらに、トラヒック制御を受けることにより、長期依存性が取り除かれたトラヒックをネットワーク内で多重化した際の特性を知るための基本モデルとなる、複数のパケット長分布が異なる到着流をもつ単一サーバ待ち行列の待ち行列長分布に対する解析を行った。この待ち行列モデルは、待ち行列長がマルコフ連鎖を構成しないため、従来から解析が困難なモデルとして知られていた。今回、このモデルにおける任意時点での待ち行列長分布が満たす式の導出に成功した。さらに、この式を元に、各到着流からのパケットの結合待ち行列長分布を数値計算するためのアルゴリズムを確立した。
レーザー衝撃圧縮下の比熱比γコントロールと新物質創成

高強度レーザー衝撃でのみ実現する極超高圧環境において、従来の性能を大幅に上回る実験・計測技術を確立した。また、通常のレーザー衝撃圧縮の状態から"外れた""高圧力で且つ低温度の状態"を生成するための新制御法の開発・実証を行った。さらに、これまで全くなされてこなかったテラパスカル圧力域での高精度極超高圧試料回収実験を初めて行い、物質創成の証拠と可能性を掴むと共に、ポストダイヤモンド実現への足がかりを得た。高強度レーザーショックでのみ実現する物質極限環境において、最も単純なユゴニオ状態から外れた圧力・温度を生成するための制御法の実証と、この領域で全くなされてこなかった実圧縮中の高精度その場計測及び回収試料解析を目指して、平成18年度に以下のような研究を行った。i-1ターゲット観測用顕微鏡筒の設計・製作を行った。5軸駆動を持つ第一レンズ系を構築した。i-2 2チャンネルの時間空間分解型速度干渉計(VISAR)を構築し、ストリークカメラ(可視域)を用いて計測を行った。異なる速度感度を持った2台のVISARがうまく機能した。i-3可視ストリークを用いた放射輝度温度計の構築に成功し、VISARとの同時利用が可能となった。iiターゲット最適化ii-1ターゲットを最適化するための1次元流体シミュレーション計算を行った。また、2次元の流体コードによる計算では、衝撃波圧の収束・発散が顕著にみられ、材料や粒径の組合せ評価に有益な知見を与え得ると結論できた。ii-2製作したターゲットの密度をラザフォード後方散乱計測により定量的且つ正確に評価した。ii-3東工大応セラ研の150Jロングパルスレーザーシステムを利用したテスト実験環境整備を行った。iii高強度レーザーによる衝撃波および準等エントロピー圧縮実験iii-1固体ダイヤモンド単体に多段の衝撃波を伝搬させその状態量の計測と回収を行った。レーザー高密度物性研究に適した回収技術が確立できた。裏面計測で反射率の異常な上昇が見られた。iii-2炭素と同様の相構造を、比較的低圧で持つシリコンについて、単一ショックと等エントロピー的圧縮のテスト実験を行い、速度の時間発展を計測して不連続的な相転移境界を示すデータが得られた。この領域で初めてシリコン回収実験を実施し成功した。高強度レーザーショックでのみ実現する物質極限環境において、最も単純な"ユゴニオ状態"から外れた高圧力・低温度を生成するための新制御法の実証と、この領域で全くなされてこなかった実圧縮中の高精度その場計測及び回収試料解析を目指して、平成19年度に以下のような研究を行った。本研究で18年度に構築された、ターゲット観測用顕微鏡筒、2チャンネル速度干渉計(VISAR)、時間分解放射輝度温度計を用いて、α-Quartzを標準物質とする新しいターゲットに関する状態方程式計測実験を行い、デモンストレーションとしてポリスチレンの高精度ユゴニオを取得することに成功した。計測されるサンプルの衝撃波速度と粒子速度から、衝撃波面の前後で成り立つ質量の保存則等から圧力や密度の全ての衝撃パラメータを求めた。また、シングルフォトンカウンティングによって較正された放射温度計を用いて時間分解の衝撃温度が得られたので、圧力-体積-温度の状態方程式変数全てが完全に決定された。in-situ・in-time計測のレーザー衝撃圧縮実験系が確立されたことになる。また、これらの計測系に同期した新しい計測として、側面からのX線モノクロカメラの開発に着手した。高圧縮されたサンプルの回収実験を行った。サンプルとしては既存のデータが入手可能な鉄を用いた。X線回折構造解析をい、鉄のピークの周辺でショット前とは異なるスペクトル構造が見いだされた。詳細なXRD解析を行うと同時にSEM観察を行っている。圧縮されたサンプル内部の物質のミクロな描像を得るために、分子動力学計算を研究協力者と共に行っている。高強度レーザーショックでのみ実現する物質極限環境において、最も単純な"ユゴニオ状態"から外れた高圧力・低温度を生成するための新制御法の実証と、この領域で全くなされてこなかった実圧縮中の高精度その場計測及び試料回収・解析を目指して、平成20年度に以下のような研究を行った。衝撃波反響を用いると、物質の温度上昇を抑えて圧力を上げることができる。衝撃波を反射するためのアンビル材(窓材)に要求される特性として、衝撃インピーダンスが高いこと、内部を観察するために透明であること、が挙げられる。金属の炭素が予測されている領域までダイヤモンドを反響圧縮するためには、ダイヤモンドより硬く(高衝撃インピーダンス)透明な物質(誘電体)が必要となる。そこで、新しい高インピーダンス誘電体であるGGGの、TPaを超える衝撃圧縮曲線と光学的特性を調べると共に、ポストダイヤモンド生成のための予備実験を実施した。実験によって、TPa圧力の圧縮曲線がダイヤモンドの衝撃インピーダン琴を大きく上回ることが証明された。また衝撃波反響実験では、1回の衝撃波反射によってダイヤモンドの圧力がおよそ1.5倍に増加したことが示唆された。

この実験的知見によって、ポストダイヤモンド状態(1 TPa以上8000 K以下)を実現するための最適条件を見積もることが可能となった。加圧過程と加圧時間を変数とした試料回収実験を実施した。マイクロ秒、ナノ秒、フェムト秒の衝撃圧縮回収、とナノ秒のランプ波圧縮回収を行って、実時間のその場診断と平行しながら回収することに成功した。職回折構造解析を行い、フェムト秒衝撃圧縮とランプ波圧縮において、これまでに発見されていない結晶構造に起因する回折線を得ることに成功した。
血中安定性の向上とＥＰＲ効果を付与したヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の開発と応用

ヒドロキサム酸タイプのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDI)は、血中半減期が極めて短く、そのことが広範な固形がん等への適用を妨げている。この欠点を克服するため、ヒドロキサム酸部位をPEG化ペプチドにより保護し、さらにその分子を安定ミセル化したPEG-peptide-SAHAミセル製剤を合成した。この分子を固相法により合成した後にミセル化し、分子間SS結合で安定化し、平均直径40nmのナノ粒子とした。このミセルは高い血中安定性を示すことが示唆された。さらに、ヒト結直腸がん細胞HCT116の増殖抑制活性を有し、48時間後のその効果は、同濃度の未修飾SAHAのそれに比べて高かった。我々は抗がん剤としてのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDI)候補化合物の創製と探索を行うと同時に、HDIのエピジェネティックな遺伝子発現制御効果を利用した機能分子の創製に取り組んできた。今後HDIが固形がんを標的とした抗がん剤として広く適用されるためには、現状の問題点を克服する、新たな展開が必須となる。本研究では、本剤の弱点である血中安定性の改善とEPA効果の併授を期待した、高分子キャリアーHDI複合体を合成し、その効果を評価すること、また、その発展型として、HDIのがん細胞特異的な遺伝子発現増強効果を加味した、高分子遺伝子キャリアーHDI複合体による、がんの遺伝子治療との相乗効果の可能性を探ることを目的としている。前年度の平成24年度には高分子キャリアーHDI複合として、平均分子量が約40,000のポリエチレングリコール4arm-PEGを臨床で利用されているHDIである、Vorinostat (SAHA)に縮合させた4arm-PEG-SAHAを合成しその活性と物性を評価をした。4arm-PEG-SAHAは培養したがん細胞に対して、SAHAのみの時に比べて高い細胞毒性を示し、in vitroでの効果が認められた。しかしながら、4arm-PEG-SAHAの血清中の安定性を評価したところ、半減期1分以内で加水分解されてしまうことが明らかになり、注射剤としての本化合物の利用が困難であることが示唆された。そこで、血中安定性を増すために、加水分解の反応部位であるエステル結合を、分子集合により形成されるミセルの内側に配置できるような直鎖PEG-SAHAを合成した。さらに直鎖PEG-SAHAの限界ミセル濃度を下げるために、2分子をジスルフィド結合でつなぐ工夫を施した。その結果、血清中の半減期を12時間以上という大幅な改善に成功した。次年度は、さらに限界ミセル濃度を下げると工夫をすると共に、生理活性についても検証する。平成24年度は高分子キャリアーHDI複合として、平均分子量が約40,000のポリエチレングリコール4arm-PEGを臨床で利用されているHDIである、Vorinostat (SAHA)に縮合させた4arm-PEG-SAHAを合成しその活性と物性を評価をした。4arm-PEG-SAHAはSAHAと4arm-PEG-NHSをDMF中で縮合し、ゲル濾過で精製することにより、98.8%の収率で得ることができた。生成の確認は、NMRによるプロトン数の比の検証と、ケミカルシフトの遷移の観測により行った。4arm-PEG-SAHAの血中安定性等の物性を評価するに当たり、質量分析法(ESI-MSMS)による定量法を確立した。この手法を用いて4arm-PEG-SAHAの血清中の安定性を評価したところ、半減期1分以内で加水分解されてしまうことが明らかになり、注射剤としての本化合物の利用が困難であることが示唆された。

本研究では、本剤の弱点である血中安定性の改善とEPR効果の併授を期待した、高分子キャリアーHDI複合体を合成し、その効果を評価すること、また、その発展型として、HDIのがん細胞特異的な遺伝子発現増強効果を加味した、高分子遺伝子キャリアーHDI複合体による、がんの遺伝子治療との相乗効果の可能性を探ることを目的としている。平成26年度は、平成25年度までに作成した高分子キャリアHDI複合体の性能を向上すべく、新たな分子設計を基にした高機能分子を創製した。今年度新たに合成した分子は、これまでと同様に、PEGを親水性部位、HDIを疎水性部位とする両親媒性を持たせたもので、分子集合による複合体ミセルの形成を基本としている。今までは構成分子あたりのHDI分子数が1対1の比であったものを、1対4にすることで、ミセル当たりのHDIを4倍に増やすことにした。具体的には、構成分子の疎水性部位にペプチド鎖を配し、そこにグルタミン酸を3残基導入した。そして、その側鎖とC末端カルボキシ基に、HDI分子のヒドロキサム酸を縮合し、結果として4分子のHDIを導入した。また、ペプチド鎖にはS-アセトアミドメチルシステイン2残基を導入することにより、ミセル形成後の分子間ジスルフィド結合の形成により、ミセル安定性強化を目指した。ミセルの作成についても種々検討し、EPR効果が期待できる約40nmになるよう調整した。その結果、HDIを高濃度で内包する安定ミセルの形成に成功した。このミセル製剤のヒト血清中の安定性は格段に上昇し、静脈注射可能となった。HCT116ヒト結直腸がん細胞のマウスxenograftに対し効果が認められた。医薬品化学当初に分子設計した製剤には、中程度に有効な効果が認められたのだが、血清中での安定性が悪く、これ以上の効果の上昇は期待できないと判断した。その後、分子設計段階からの再検討を行ったことから、予定より進行が遅くなった。しかしながら、現在は血清中の安定性が格段に上昇した製剤の合成に成功しており、この製剤を用いた薬理活性試験が可能となった。また、分子のアミノ酸部分の構築からPEG化までの製剤分子の合成工程を、固相合成により行うことが可能となり、短時間で様々な誘導体が合成できるようになっている。そのため、アミノ酸配列を中心とした分子構造の最適化が迅速に行える。これらの改善点が加わったことで、今後は計画の遅れを巻き返せるものと確信している。平成24年度は高分子キャリアとして4-arm-PEGを用いた4-arm-PEG-SAHAの合成に成功し、in vitroでの活性評価と血清中の安定性などの物性評価を行うことができた。薬物動態の評価には微量の薬物の定量が欠かせないのだが、通常、高分子の製剤の定量は困難な場合が多い。今回、本薬剤の定量法として、ESI-MSMSを用いた方法を確立し、血液中等の濃度の効率的な決定を可能にすることができた。本薬剤は、培養がん細胞に対して、有意な増殖抑制活性を有し、有効であると思われたが、血清中で4-arm-PEGとSAHA間のエステル結合が容易に加水分解されることがわかり、静脈投与した場合に、SAHAが血中に速やかに放出されてしまい、期待していたEPR効果や、SAHAに対する代謝安定性の付与効果が期待できないことがわかった。実際に本薬剤のマウスXenograftモデルでのがん細胞縮退効果の評価を行ったが、SAHA投与群と比べて優位な縮退効果が認められなかった。従って、今後、化合物の設計段階から始める必要がある。平成24年度に合成した4-arm-PEG-
骨型アルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を制御する転写因子群クローニング

血清総アルカリ性ホスファターゼ(ALP)活性は以前より骨形成のマーカーとして臨床診断に用いられてきた。また、骨型ALPは骨芽細胞成熟のマーカーとされ、この活性の上昇が石灰化にとって非常に重要な意味を持つことが知られている。しかし、その機能は充分に判明しておらず、今後の研究の進展が待たれる。一方、転写因子の動向を知ることは、その転写因子が制御する遺伝子の発現を調節するシグナルを知る一つの指標となり、遺伝子の機能を知る上での手がかりとなりうる。本研究目的は、骨型ALP遺伝子を制御する新規の転写因子を調べることによって骨型ALPの機能の解析の一端を明らかにすることである。骨型ALP遺伝子のプロモーター領域からループを形成する塩基配列を検討し、この配列のオリゴヌクレオチドを用いて、マウス骨芽細胞様MC3T3-E1細胞の核タンパク質を抽出してゲルシフト分析を行ったところDNA結合活性が認められた。さらに、DNAに結合するタンパク質について明らかにするために、この配列を複数連結してアフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク質の精製を行ったところ3種類のタンパク質が精製された。今後は、この3種類のタンパク質についてアミノ酸配列の解析に充分な量が得られるまで精製を続け、アミノ酸配列を決定し、さらにDNA配列の解析を行って骨型ALPの発現を制御するシグナルの解析ならびに機能解析を行いたいと考えている。近年、骨芽細胞分化決定因子Cbfa1/Osf2が発見され、大きな反響を呼んでいる。Cbfa1ノックアウトマウスは硬組織(骨)の形成を招いた。一方、オステオカルシン、BSPなどはCbfa1により直接的に支配されているが、アルカリ性ホスファターゼ、I型コラーゲンはCbfa1をノックアウトしても骨芽細胞において発現していることが報告されている。Cbfa1の発現は、硬組織形成を担う因子の発見として決定的ではあったが、アルカリ性ホスファターゼノックアウトマウスにおいても骨の石灰化が抑制されており、硬組織形成におけるアルカリ性ホスファターゼの関与は度外視できないと考えられる。骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリ性ホスファターゼ発現を支配する転写因子は一部判明しているが、未だ不明の部分が多く、更なる転写因子の存在が推測される。現在のところ、我々はアルカリ性ホスファターゼのプロモーター領域の解析、転写因子クローニングを目的として予備実験を進めている。ALP遺伝子の5'上流域のAACAAATGAAAACAAACCCAGGCAという配列はループを形成するため、この部位にタンパク質が結合すると考えられる。MC3T3-E1細胞の長期培養時にALPmRNAの発言がconfluence後14日目にピークを迎えた。そこで、この部位のオリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアッセイを行うとDNA結合活性が認められ、その結合活性のピークはmRNA発現のピーク時期と一致する。この時期の核タンパク質を利用して、DNA親和性クロマトグラフィーを行ったところ、3種類のタンパク質が検出された。しかし、銀染色で染まる程度しか回収できなかった。そこでこの配列を数個結合させたものを作製し、この配列に結合する蛋白質を現在精製中である。
Calreticulin変異での骨髄増殖性疾患に伴う肺高血圧症のメカニズム解明

骨髄増殖性疾患は肺高血圧症を高頻度で合併し、かつ肺高血圧症合併例は予後不良であることが知られている。しかしながら骨髄増殖性疾患における肺高血圧症の病態はいまだに不明であり、詳細な機序の解明が待たれている。近年、骨髄増殖性疾患の新たな原因遺伝子変異としてcalreticulin(CALR)変異が同定された。我々は、CALR変異に着目し、CALR変異陽性患者における肺高血圧症を検討するとともに、骨髄増殖性疾患に合併した肺高血圧症の分子メカニズムを解明するため、CALR変異ノックインマウスを用いてCALR変異における肺高血圧症の病態について明らかにする。