hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Med26による新規転写制御機構と腫瘍性疾患との関わりについての解明

非常に多くのヒト遺伝子でRNAポリメラーゼII(Pol II)が転写開始直後に一時停止していることがわかり、遺伝子発現では転写開始後の転写伸長や転写終結のプロセスが重要であることが明らかになった。Pol IIが一時停止を解除され、RNA合成を再開するためには、転写伸長因子が遺伝子領域へとリクルートされる必要がある。これについて申請者は、メディエーター複合体のサブユニットMed26が、2つの異なる転写伸長因子複合体Super elongation complex(SEC)とLittle elongation complex(LEC)を、それぞれ異なる種類の遺伝子領域にリクルートすることを明らかにした。本研究では、このリクルートによって、転写開始後のプロセスがどのように制御されるのか、その分子メカニズムの解明を目指した。本研究によって、Med26はLECを特定の遺伝子領域にリクルートすることによって、転写終結のプロセスを制御することが明らかとなった。さらに、本研究では、この転写機構の細胞・組織・個体における役割を明らかにするために、Med26のコンディショナルKOマウスの作製も行っている。さまざまな組織由来のMed26ノックアウト細胞を解析することによって組織特異的にMed26によって活性化される標的遺伝子を明らかにする。さらに、この転写機構の破綻によって引き起こされる腫瘍性疾患の発症メカニズムを明らかにする。本研究によって、Med26による新たな転写制御機構が明らかとなってきている。生化学的な解析によって明らかとなってきたMed26による転写制御機構に関して、さらに細胞・組織・個体レベルで解明することによって、本機構の解明を目指す。
スピルオーバを考慮した宇宙構造物の振動最適制御

宇宙構造物の振動制御問題は,宇宙構造物が大規模化するとともに重要な課題となっているが,最適制御を行う場合観測器と制御器におけるスピルオーバ,すなわち一種のモデル化誤差による不安定化が問題となっている.この種の問題に対処するために,ローパスや櫛形などのフィルタを用いる方法,速度フィードバック制御のみを行う方法などが提案されているが,本研究では,付加的要素を一切必要とせず,また単なる速度フィードバック制御より性能がよく,スピルオーバを制御構造制約として考慮した最適化手法を提案した.これについては, 1リンク機構の場合について制御器のスピルオーバを考慮した制御手法の有効性をすでに実証したので,観測器のスピルオーバをも考慮した新しい最適化手法を提案した.この手法の有効性に関しては計算機シミュレーションと制御実験によって確認した.そして,多リンク機構やテンドン機構を用いるような場合について,本年度は主に本手法の有効性を検討した.その結果,多リンク機構やテンドン機構についても本手法は十分有効であることを理論的に確認するとともに実験的に実証することができた.特にテンドン機構の場合については,振動制御のみならず位置決め制御を行う新しい機構を考案し,この制御機構の最適制御に本手法を応用して制御系を構成し実験を行ったところ,このような機構に対してもスピルオーバを考慮する本手法が十分有効であることが明らかとなった.3リンク機構についての実験では回転軸の支持に多少問題を残しており,現在のところ十分な実験結果を有していないが,本手法の有効性の確認については十分な見通しを得ることができた.宇宙構造物の振動制御問題は,宇宙構造物が大規模化するとともに重要な課題となっているが,最適制御を行う場合観測器と制御器におけるスピルオーバ,すなわち一種のモデル化誤差による不安定化が問題となっている.この種の問題に対処するために,ローパスや櫛形などのフィルタを用いる方法,速度フィードバック制御のみを行う方法などが提案されているが,本研究では,付加的要素を一切必要とせず,また単なる速度フィードバック制御より性能がよく,スピルオーバを制御構造制約として考慮した最適化手法を提案した.これについては, 1リンク機構の場合について制御器のスピルオーバを考慮した制御手法の有効性をすでに実証したので,観測器のスピルオーバをも考慮した新しい最適化手法を提案した.この手法の有効性に関しては計算機シミュレーションと制御実験によって確認した.そして,多リンク機構やテンドン機構を用いるような場合について,本年度は主に本手法の有効性を検討した.その結果,多リンク機構やテンドン機構についても本手法は十分有効であることを理論的に確認するとともに実験的に実証することができた.特にテンドン機構の場合については,振動制御のみならず位置決め制御を行う新しい機構を考案し,この制御機構の最適制御に本手法を応用して制御系を構成し実験を行ったところ,このような機構に対してもスピルオーバを考慮する本手法が十分有効であることが明らかとなった.3リンク機構についての実験では回転軸の支持に多少問題を残しており,現在のところ十分な実験結果を有していないが,本手法の有効性の確認については十分な見通しを得ることができた.
高齢者のヘルスリテラシー向上のための教材開発と教育方法の提案

医療情報の多くがインターネット上で提供されている現在、年齢によるデジタルデバイドにより、高齢患者は、健康を維持し、医療者との協議に参加して適切な治療方法を選択する上で重要なWeb上の最新医療情報を自力で獲得することが困難である。本研究はこの点に着目し、医療情報へのアクセスにおける年齢による違いを、(1)インターネット活用の有無とアクセスできる情報の量と質、(2)病気治療における意思決定への関与の程度、について明らかにし、健康情報の検索と活用におけるデジタルデバイド低減方策の提案を目的とする。
粒子化ハイドロゲルを用いた血管網を有する脳組織の構築

中枢神経の再生は最も挑戦的な研究テーマの1つである。中枢神経組織は、神経細胞、グリア細胞の他に血管など間葉系細胞も混在し、細胞間相互作用を与えながら共存する複雑な組織構築をしている。また生体組織は100 μmに1本程度の血管を有しており、組織の生着には血管網が必須である。本研究では組織工学的アプローチから、細胞接着性を持つ粒子化ハイドロゲルをもちいて、血管構造を有する中枢神経組織の作製法を開発し、in vitroにおける生体環境を模倣したアッセイを可能にすること、そして構築した組織を生体に移植することで失われた神経機能を改善することを目的とする。
麻酔・手術侵襲による免疫変動機序の解明とその変動の人為的コントロール

今回の研究の目的の一つはヘルパーT細胞やナチュラルキラー細胞のサイトカイン発現パターン解析を行うための新しい方法の開発にあった。つまり直接的にmononucler細胞分画からフローサイトメトリーにて細胞振り分けによりヘルパー細胞やナチュラルキラー細胞を取り出し,さらにELISPOT法により当該細胞から各種サイトカインの発現細胞数を求め,Th1,Th2細胞への分化の定量とサイトカインの発現率の変化を定量するという方法を再現性のある検査法とすることにあった。1) Th1とTh2の識別にはLAG-3とCD30を用いる方法では再現性のある結果を得ることはできなかった。2)直接サイトカインに対する抗体反応を見る細胞質内サイトカインのIFNγ、TNFβでTh1をIL-4、IL-5、IL-10、IL-13でTh2振り分ける方法のうち、CD4添加の後、抗IFNγとIL-4を用いた方法を行ったが手術侵襲の前後にて検出はできなかった。3)当初予定した上記の方法では再現性のある末梢神経レベルでのTh系のサブポピュレーション変化を捉える方法は開発できなかったが、表面膜抗原を変えて施行した結果から現在臨床的に施行可能な方法が開発できそうである。4)また新たにγδ-T細胞は現在、Responding Cellとして重要視されているがこの中心的サブユニットであるαβタイプでない最前線で機能するγδタイプの末梢血液での変化をCD3とTCRγ/δを用いて検討した結果術中における変動を捉えることができた。いずれも初期のプロトコールによる結果は得られたがこれをベースに現在その結果の解析と再現性獲得のための追加実験を行っている。基礎的実験として、胃ガンに対する胃亜全滴術を対象として以下の研究を行った。1)フローサイトメトリー法を用いてCD4+抗体により術前の血液中のmonomuclear細胞分閣を取り出しhelper T Cellを振り分けた。次にTh1とTh2を識別するために表面膠原を使用する方法と、直接サイトカインに対するで振り分けるERISPOT法の両方を用いた。表面膠原はLAG-3(Th1)とCD30(Th2)を用いたが、手術侵襲という刺激の元での活性化細胞が変化として捉えられなかったために反応は認められなかった。ERISPOT法ではPermeabilizationの作業を行い、細胞内サイトカインの検出を行い、IFNγからTh1を、Il-4からTh2を振り分けることを試みたがいずれも検出できなかった。2)胸腺分化細胞はresponding cellとして重要視されてきているが、新たにCD3、TCRγ/σを用いてフローサイトメトリーにて計測するという方法を用いて術中の変動を見てみたところ、術前と術中に明らかな変動が認められ、短時間に変化を来す可能性が示された。3)この際に認められたCD3の養成率の変化は少なからずNK cell系マーカーの変動とパラレルに変化していることからこの変動の要因がNK cell系によるものと認識された。4)また術中のサイトカイン産生については、以前より脾臓の関与が示唆されており、術中に脾静脈から採血する方法を用い、IL-6が執刀2時間頃より脾臓から放出されていることを確かめた。2)直接サイトカインに対する抗体反応を見る細胞質内サイトカインのIFNγ、TNFβでTh1をIL

-4、IL-5、IL-10、IL-13でTh2振り分ける方法のうち、CD4添加の後、抗IFNγとIL-4を用いた方法を行ったが手術侵襲の前後にて検出はできなかった。3)当初予定した上記の方法では再現性のある末梢神経レベルでのTh系のサブポピュレーション変化を捉える方法は開発できなかったが、表面膜抗原を変えて施行した結果から現在臨床的に施行可能な方法が開発できそうである。4)また新たにγδ-T細胞は現在、Responding Cellとして重要視されているがこの中心的サブユニットであるαβタイプでない最前線で機能するγδタイプの末梢血液での変化をCD3とTCRγ/δを用いて検討した結果術中における変動を捉えることができた。いずれも初期のプロトコールによる結果は得られたがこれをベースに現在その結果の解析と再現性獲得のための追加実験を行っている。
地域企業における国内・外事業の関連性にかかる研究

本研究では、地域中小企業の直接投資が国内の生産にとってプラスになるか、マイナスになるか、またそれを決める要因とは何かを明らかにした。その結果、プラスになる企業は、国内外で需要先が異なる、生産財や金属品・プレスを手掛けている。また、進出目的が国内生産の代替ではなく、市場・資源獲得型であることがわかった。このなかで需要先が異なる企業は海外事業が自立しており、これにより当該企業の経営者が国内事業に注力できる環境が整い、それが国内事業の好業績につながっていることが明らかになった。長野県の中小企業の海外進出に影響を及ぼす要因として、その発注側にあたる県内大企業の動向がある。すなわち大企業の海外生産が多くなれば、その分、地域の中小企業の海外生産にも圧力がかかる。そこで、三年計画の初年度にあたる26年度は、その海外生産と国内生産の動向について、海外事業活動にかかるデータ入手が可能な県内上場企業14社を対象に明らかにした。その結果を、予め設定した国内・外の事業の関連性にかかる4ケース、「海外事業・日本事業ともに拡大」する最も望ましい状況(以下、ケース1とする)、「海外事業拡大・日本事業拡大なし」という海外事業の拡大が国内に還元されない状況(ケース2)、「海外事業拡大なし・日本事業拡大」(ケース3)、「海外事業・日本事業ともに拡大なし」(ケース4)にあてはめてみると、(ケース3)はみられなかった。一方、(ケース2・4)にあたる「国内事業拡大なし」の大企業は14社中10社確認された。すなわち、このデータからでは、地域中小企業への発注を減少させている大企業が多いことが明らかになった。海外事業との関連でみると、空洞化現象にあたる「海外事業拡大」(ケース2)がみられる企業は4社確認された。したがって海外事業の影響も確かにある。ところが「海外事業拡大なし」(ケース4)の方が6社とむしろ多く、これらは海外事業の影響ではなく、個別企業の経営上の問題であることが明らかになった。一方、海外事業拡大が国内事業にも派生する望ましい状況(ケース1)は4社確認されたが、これらの企業には市場、製品、供給方法、分業などに特性があることが明らかになった。平成27年度は本研究の分析に必要なデータ・情報の収集を、地域企業への訪問調査を中心に実施した。対象地域は長野県のみならず、多くの地域企業が進出するタイまでひろげた。これに昨年度、調査を実施した分と合わせ、収集した企業データについて横並び比較できるように整理し、その過程のなかで考えられる仮説の洗い出しを実施した。現時点の仮説として、海外事業の拡大が国内事業の拡大・縮小に影響を及ぼす要因として考えられるのは、1国内外事業との連携度合(経営の独立性)、2需要先産業、3現地経営の年数、4自社保有技術、5非製造(開発・営業)部門の有無などである。例えば1で言えば、その独立性が強く、国内事業との連携が弱いほど国内事業は拡大する。2では自動車産業は他産業に比して国内事業の安定が維持できている。3では、その年数が長いほど国内事業は縮小する。4では成形、組立事業を手掛ける企業に国内事業の縮小が多くみられる。5では非製造部門をもつ企業ほど国内事業は安定しているなどである。これらは暫定的仮説であるが、今後、企業データのさらなる収集を図るとともに、この仮説の検証に取り組んでいく。その際の分析方法について今年度、多少の(比較)検討も実施した。現時点で、経営事例の質的比較分析(Qualitative Comparative Analysis)を考えているが、その実効性や有益性、問題点などへの認識を深め、手法の適切性について判断することが必要と考えている。平成27年度に、国内調査のみならず、地域企業の海外進出国での調査も計画していたが、訪問先企業の都合と当方の都合が折り合わず、結果的に3月に実施したタイのみ(経費は平成28年度に計上)に終わったため。平成28年度は27年度に続き、本研究の分析に必要なデータ・情報を収集するために、地域企業への訪問調査を実施した。その結果、延べ39社分のデータを集めることができ、これらを使って「地域中小企業の海外事業が国内事業の拡大・縮小を決める要因分析」として日本中小企業学会東部部会ならびに全国大会で報告を行い、研究論文としてまとめ、日本中小企業学会論集に投稿した。この結果によれば、海外事業が国内事業に及ぼす効果には、パターンA(現行の生産品が海外移管されたが、その移管先に自社の生産拠点をもつため、これに代わる新規の仕事を顧客から受注)、パターンB(海外で知り合った顧客やその紹介先との新規取引が、国内で新たに始まる、パターンC(Bと同様に海外では対応困難、あるいは顧客の都合などにより海外事業の一部、具体的には開発、設計、生産準備など海外の量産にかかる仕事、もしくは部品発注が自社の海外拠点や顧客から舞い込む)、パターンD(パターンACのような直接的効果を受けていない)といった4つの効果があるが、これらの効果があっても国内売上がプラスだけでなく、マイナスの場合もみられ、これは企業の与条件、具体的には需要先、生産品・技術との関係、進出形態などによって決まってくることが明らかになった。特にプラスの効果という点で言えば、生産財を担う企業にそれが多くみられ、国内でも認知度が低かったが、海外進出により国内外の顧客に知名度を高め、新たな外需を地域にもたらしていることが明らかになった。また国内事業へのプラス効果は時間とともに変化していくことが確認された。

その際、最終的には国内外事業の関連性が希薄になっている傾向がみられたが、この関係が国内の営業力、技術力を向上させる契機にもなっており、海外事業がもつ新たな意義として注目されることが確認された。前項9で記したように、一定のデータ数を確保することで学会報告・論文作成という一応の成果をみたが、研究計画で掲げたデータ数(5060社)の確保にまで及んでいない。理由として企業訪問調査を実施したところ、既に海外事業から撤退しているといった企業も散見されたことによる。加えて平成28年度は私的事情(子供の出産とそれに伴う育児休暇の取得)を優先せざるを得ず、調査研究にあてる時間が大きく制約を受けたこと、特にまとまった期間や経費を要する海外調査の実施が年度末のフィリピン(経費は平成29年度に計上)のみにとどまるなど困難であったことを付記する。本研究の目的は、地域中小企業の海外進出が国内の売上にどのような影響を及ぼすのか、プラスかマイナスか、それを決める要因とは何か、この点を明らかにすることである。プラスの影響を与えるメカニズムには、海外に移行した生産の代替品が国内に発生(パターンAとする)、海外を起点に国内で仕事が発生(パターンB)、海外の仕事の一部を国内で代替(パターンC)があり、それ以外の直接的効果を受けていない(パターンD)の4つのパターンが考えられる。また影響を与える要因として1需要先産業の海外生産の進展度、2生産品・技術、3進出形態、4進出歴、5進出国・拠点数、6経営者の属性といった企業がもつ与条件が考えられる。この両者の関連性を古くから進出がみられ、その件数も多い長野県中小企業を調査対象にして分析した。結果として、パターンAの事例はもっとも少なく、1との関係が強い。Bは二番目に少なく、2との関係が強く、生産財ならばプラスをもたらし、プラスチック品・成形技術ならマイナスをもたらしている。Cは最も多く、2、3との関係が強い。DはBに近く2、3との相関性が強いことが明らかになった。これにより、地域にとってプラスをもたらす、より効果的な中小企業の海外進出支援策も可能になる。また、この分析を通じて一部の企業への影響が変化(パターン間を移行)していることが確認された。その際、最終的な受け皿になっているのがパターンDであるが、ここには直接的効果を受けないにもかかわらずプラスの企業が多く、その多くは海外事業の需要先が国内事業と一致していない、経営が安定しているという現象がみられた。すなわち海外事業が自立しており、これにより当該企業の経営者が国内事業に注力できる環境が整い、それが国内事業の好業績につながっていることが明らかになった。本研究では、地域中小企業の直接投資が国内の生産にとってプラスになるか、マイナスになるか、またそれを決める要因とは何かを明らかにした。その結果、プラスになる企業は、国内外で需要先が異なる、生産財や金属品・プレスを手掛けている。また、進出目的が国内生産の代替ではなく、市場・資源獲得型であることがわかった。このなかで需要先が異なる企業は海外事業が自立しており、これにより当該企業の経営者が国内事業に注力できる環境が整い、それが国内事業の好業績につながっていることが明らかになった。研究分担者として参加している他の科研費プロジェクト(2本)の立ち上げミーティングや海外・国内出張等に時間をとられたことがある。
ヒルシュスプルング病における神経堤幹細胞移植治療の可能性に関する研究

先天性の腸管神経系異常疾患であるヒルシュスプルング病およびその類縁疾患に対して、マウスおよびヒトの腸管を用いて腸管神経の起源である神経堤幹細胞を分離、回収し、これをヒルシュスプルング病モデル動物に移植してその生着、遊走、分化の能力を検証した。また、病因を明らかにする目的で、同疾患患児の血液を用いて網羅的な遺伝子解析を行い、発症のメカニズムに関係する可能性のある関連遺伝子を探索した。本研究はヒルシュスプルング病に対する神経堤幹細胞移植の可能性を検討することを目標に、3年間の研究期間内に下記の項目について明らかにする計画を立てた。(1)マウス消化管から神経堤幹細胞(NCSCs: Neural Crest Stem Cells)を分離、同定し、自己増殖能、多分化能を検証する。(2)(1)で得たNCSCsをヒルシュスプルング病モデル動物に移植し、その生着、分化を検証する。(3)ヒト消化管から同様にNCSCsの分離、同定を試みる。初年度である、平成20年度における成果をマウス、ヒトに分けて概説する。1.マウス:正常マウスおよびP0-Cre/floxP-CAT-CAG-EGFマウス胎児の腸管を用いて、分離した細胞を2週間培養したところ、細胞塊(sphere)の良好な形成を認めた。培養条件は、研究分担者である名越のプロトコールを用いた(Nagoshi et al.,2008)。得られたsphereが神経堤幹細胞のマーカーであるSox10, p75や、神経幹細胞マーカーであるNestin,Musashi1などを発現していることを免疫染色で確認し、また、神経、グリア、平滑筋の3系統に分化することを同様に免疫染色で確認している。さらに、sphereと正常マウス胎児腸管との共培養において、sphereから腸管内へ細胞が移動し、その一部が神経に分化したことを確認している。2.ヒト:平成20年度末までに臨床検体12例を用いて、ヒト腸管からのsphere形成を試み、5例でsphere形成を認めた。sphere形成を認めたのは、小児症例の筋層を用いた場合のみであり、成人症例や粘膜からの形成は、これまでのところ認められていない。これらのsphereはマウスと同様に、神経、グリア、平滑筋の3系統への分化が確認されている。(1)マウス消化管から神経堤幹細胞(NCSCs : Neural Crest Stem Cells)を分離、同定し、自己増殖能、多分化能を検証する。2年目の平成21年度における成果をマウス、ヒトに分けて概説する。1.マウス:神経堤由来の細胞がGFPでラベルされているP0-Cre/floxP-CAT-CAG-EGFマウス胎児の腸管より分離培養した神経堤幹細胞を含む細胞塊をヒルシュスプルング病モデルマウスであるRetKOマウスに移植し、移植された細胞が腸管壁内を移動、生着し、神経に分化する様子を確認した。2.ヒト:平成21年度末までに3例のヒルシュスプルング病と、4例のヒルシュスプルング病類縁疾患を含む臨床検体27例を用いて、ヒト腸管からのsphere形成を試み、12例でsphere形成を認めた。ヒルシュスプルング病の腸管においては、正常部と無神経節部の両方においてsphere形成を認めるものの、その後の神経への分化が無神経節部では障害されていることが再現性を持って確認されてきている。また、ヒルシュスプルング病類縁疾患の腸管にマウスやヒトから作成したsphereを移植し、現在、移植された細胞が腸管内に移動、生着し、神経への分化をするのかを観察中である。本研究はヒルシュスプルング病および類縁疾患の病因、病態を明らかにし、神経堤幹細胞移植の可能性を検討することを目標に3年間の研究を行ってきた。最終年度の成果をマウスとヒトに分けて概説する。1.マウス:2年目までで得られたデータ(マウス胎児腸管より分離培養した神経堤幹細胞を含む細胞塊をヒルシュスプルング病モデルマウスであるRetノックアウトマウスに移植し、細胞の移動、生着、神経への分化の様子を観察)を論文化し、現在投稿準備中である。2.ヒト:平成22年度は、4例のヒルシュスプルング病と、1例のヒルシュスプルング病類縁疾患、および4例の正常腸管をサンプルとしてヒト腸管からのsphere形成を試みた。ヒルシュスプルング病の腸管1サンプルにおいて、正常部と無神経節部から得た両方のsphereにおいて、共に神経への分化を確認した。

これまでは、無神経節腸管から得られたsphereにおいては、神経への分化が認められなかったことから、症例によって結果が異なることが確認され、その理由として各症例における病気の成因が異なる可能性が示唆された。現在、それらのヒルシュスプルング病症例において、RetおよびGdnfのヒルシュスプルング病関連遺伝子に変異を認めるかの解析を進めている。またヒルシュスプルング病類縁疾患についても、疾患の形成に関与する原因遺伝子を探索する目的で4症例と1症例の両親の血液から次世代シーケンサーを用いての網羅的遺伝子解析を行い、遺伝子レベルでの異常を調べ、ヒルシュスプルング病と同一の分子が関与しているのか、全く異なった分子が関与しているのかを調べている。
脳動脈瘤の発生、増大、破裂機構

目的:血管内膜損傷は通常同部の増殖性変化をもたらすが、脳動脈瘤においては増殖性変化よりも、退行変性優位となり血管壁の脆弱化、膨隆を来たすと考えられる。血液凝固第XIII因子は血液凝固のみならず、創傷治癒にも関与するとされており、今回脳動脈瘤発生過程がXIII因子によりどのように修飾されるかを動物モデルを用いて検討した。方法:一側総頸動脈結紮、両側腎動脈後枝結紮、1%食塩水及び0.2%βーaminopropionitrile fumarate負荷によるrat脳動脈瘤誘発モデルを作製し、処置1ケ月後よりXIII因子10i.u./100gB.W.を5日間連続投与し、1週間後に灌流固定を行った。非投与群を対照とし、脳動脈瘤性変化の好発部位である前大脳動脈ー嗅動脈分岐部の形態的変化につき比較検討した。結果:非投与群11匹中8匹に分岐部intimal patのdistal,ACA側に初期動脈瘤性変化を認め、残りの3匹では明らかな変化を認めなかった。投与群では20匹中12匹に初期動脈瘤変化に加えて同部に種々の程度の内膜肥厚増殖性変化を認めた。即ち、初期動脈瘤性変化を覆うような平滑筋細胞の増殖及びmatrixの増加から、更には動脈瘤となった内腔を埋めるような増殖性変化が認められた。残りの8匹は対応群と同様で明らかな増殖性変化は認められなかった。結論:我々がこれまで作成してきたrat脳動脈瘤誘発モデルでは動脈瘤初期病変から動脈瘤に至る種々の退行性変化を見るが、今回のような内膜肥厚増殖性変化は1例も観察されていない。以上から生体内においてXIII因子が血管壁の組織修復機構に関与している可能性が示唆されると共に、動脈瘤性病変部に対しても、その修復機能を捉進することにより、動脈瘤壁の肥厚性変化をもたらすことが確認された。SD系ラット40匹を腹腔内麻酔下に一側総頸動脈結紮,両側腎動脈後枝結紮を行い, 1週間後より1%NaClを飲料水として投与し,さらにβ-Aminopropionitrleを0.12%の割合で食餌に混じて投与した.さらに4週間後に20匹(実験群)を麻酔下に反対側総頸動脈結紮で行った.他の20匹は対照群とした.さらに4週間後に両群全例でグルタルアルデヒドで灌流固定し,脳低部脳血管を剥離,摘出後,本動物モデルにおける脳動脈瘤始発部位である前大脳動脈-嗅動脈分枝部をオスミウム酸で後固定後,エポンに包埋して, 1μの切片を作製し,染色後顕微鏡下に比較検討した. (結果)対照群頸動脈非結紮側では血管分枝部内膜把厚の遠位部に軽度の陥凹から,血管内腔の壁内陥入,さらには小動脈瘤として血管壁の外膜側への膨隆に至るまでのまさざまな脳動脈瘤初期変化を認めた.対照群結紮側ではこれらの動脈瘤初期変化病巣はほとんど認められなかった.実験群においては12例において,対照群動脈瘤発生部位に相当する部位に軽度から著しい内膜把厚を認めた.うち3例においては明らかな動脈瘤膨隆内側面が内膜把厚によって埋られていた.他の8例においては明らかな内膜把厚は認められなかった.この新たな頸動脈結紮によって生じた新たな内膜把厚は主に筋細胞様細胞成分と無構造ヒアリン様物質であった. (結論)脳動脈瘤誘発動物モデルにおける動脈瘤発生側の頸動脈結紮を行うことによって動脈瘤発生部位における内膜把厚を認めたが,これはhemodynamic stressを減することにより,一種の修復過程が出現し,動脈瘤発生に対して阻止的に働いていることを示している. (今後の展開)このエポン包埋標本を電顕的に検索し,内膜把厚の構成成分で明らかにするとともに,他の因子による動脈瘤発生阻止過程を同様の方法で実験遂行中である.目的:血管内膜損傷は通常同部の増殖性変化をもたらすが、脳動脈瘤においては増殖性変化よりも、退行変性優位となり血管壁の脆弱化、膨隆を来たすと考えられる。

結論:我々がこれまで作成してきたrat脳動脈瘤誘発モデルでは動脈瘤初期病変から動脈瘤に至る種々の退行性変化を見るが、今回のような内膜肥厚増殖性変化は1例も観察されていない。以上から生体内においてXIII因子が血管壁の組織修復機構に関与している可能性が示唆されると共に、動脈瘤性病変部に対しても、その修復機能を捉進することにより、動脈瘤壁の肥厚性変化をもたらすことが確認された。目的:血管内膜損傷は通常同部の増殖性変化をもたらすが、脳動脈瘤においては増殖性変化よりも退行変性優位となり血管壁の脆弱化、膨隆を来たすと考えられる。血液凝固第XIII因子は血液凝固のみならず、創傷治癒にも関与するとされており、今回脳動脈瘤発生過程がXIII因子によりどのように修飾されるかを動物モデルを用いて検討した。方法:一側総頸動脈結紮、両側腎動脈後枝結紮、1%食塩水及び0.2%βーaminopropionitrile fumarate負荷によるrat脳動脈瘤誘発モデルを作製し、処置1ケ月後よりXIII因子10i.u./100gB.W.を5日間連続投与し、1週間後に灌流固定を行った。非投与群を対照とし、脳動脈瘤性変化の好発部位である前大脳動脈ー嗅動脈分岐部の形態的変化につき比較検討した。結果:非投与群11匹中8匹に分岐部intimal padのdistal、ACA側に初期動脈瘤性変化を認め、残りの3匹では明らかな変化を認めなかった。投与群では20匹中12匹に初期動脈瘤変化に加えて同部に種々の程度の内膜肥厚増殖性変化を認めた。即ち、初期動脈瘤性変化を覆うような平滑筋細胞の増殖及びmatrixの増加から、更には動脈瘤となった内腔を埋めるような増殖性変化が認められた。残りの8匹は対照群と同様で明らかな増殖性変化は認められなかった。結論:我々がこれまで作製してきたrat脳動脈瘤誘発モデルでは動脈瘤初期病変から動脈瘤に至る種々の退行性変化を見るが、今回のような内膜肥厚増殖性変化は1例も観察されていない。以上から生体内においてXIII因子が血管壁の組織修復機構に関与している可能性が示唆されると共に、動脈瘤性病変部に対しても、その修復機能を促進することにより、動脈瘤壁の肥厚性変化をもたらすことが確認された。
間質性肺疾患に対する革新的分子標的治療法の確立

特発性肺線維症は根治治療が存在しない難病であり、新規治療薬開発が急務である。申請者らは、コラーゲン合成に必要不可欠な蛋白質であるHeat shock protein (HSP) 47が、各種線維化疾患においては線維化進展を促進し負の生理作用をもたらすことを実証した。本研究は、1HSP47に対するsiRNAを用いた直接的なHSP47発現抑制、2HSP47 inhibitorを用いたHSP47シャペロン機能の抑制、という2つの異なるアプローチを用い、“HSP47をターゲットとした分子標的治療"という新しい観点から線維化を抑制する治療法を創出することを目的とし研究を行った。特に組織移行に関しては、肺指向性・長時間作用持続型の新規ナノDDS製剤を組み合わせることにより、高効率にHSP47発現を制御する方法を検討した。まずin vitroにおけるHSP47 inhibitorの効果を検証した。正常ヒト成人肺線維芽細胞を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。その結果、TGF-β1はHSP47遺伝子の発現を顕著に促進すること、そして、HSP47 inhibitorはHSP47遺伝子発現を顕著に抑制することが示された。さらに、タンパク質レベルでも、TGF-β1はHSP47タンパク質の産生を促進し、HSP47 inhibitorは顕著に抑制することが示された。さらに、ブレオマイシン肺線維症モデルにHSP47 inhibitorを投与しin vivoでの抗線維化効果を確認する実験に進んでいるが、マウスの生存率を改善させ、体重減少も抑制することが見いだされた。HSP47はコラーゲン合成に必要不可欠な蛋白質であるため、HSP47を抑制することにより細胞内でのコラーゲン合成を阻害し、線維化の進行を抑制することができると考えられる。実際、これまでにHSP47に対するantisense oligodeoxynucleotidesやsmall interfering ribonucleic acid (siRNA)を用いることにより、HSP47発現を阻害し、線維化進行を抑制することができたとの報告が、特に腎臓領域の線維化疾患モデルで相次いでいる。我々もブレオマイシン肺線維症モデルマウスにてpirfenidoneがHSP47発現抑制を通して抗線維化作用を発揮することを報告した。従って、HSP47はこれまで有効な治療法がなかった難治性肺線維化疾患の新たな分子標的治療のターゲットとなるとの着想に至った。更に、本研究協力者(Ananthanarayanan教授、McMaster University)らは、約2000種類の化合物をスクリーニングし、4種類のHSP47 inhibitorを見いだした(Christy A. et al. J. Med. Chem. 2005)。このHSP47 inhibitorはHSP47蛋白の発現自体は抑制しないが、HSP47のシャペロン機能のみを特異的に抑制し、細胞内でのコラーゲン合成を抑制できる。本研究ではantisense oligodeoxynucleotidesやsiRNAだけでなく、このHSP47 inhibitorも用いることによりHSP47制御を行うことを目的として研究を進めている。本研究では、まずin vitroにおけるHSP47 inhibitorの効果を検証した。正常ヒト成人肺線維芽細胞(normal human lung fibroblasts:NHLF)を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。これらの進捗状況は、概ね当初の予定通りである。本研究ではsiRNAだけでなく、このHSP47 inhibitorも用いることによりHSP47制御を行うことを目的として研究を進めている。さらに、現在ブレオマイシン肺線維症モデルにHSP47 inhibitorを投与しin vivoでの抗線維化効果を確認する実験に進んでいる。

本研究では、まずin vitroにおけるHSP47 inhibitorの効果を検証した。正常ヒト成人肺線維芽細胞(normal human lung fibroblasts:NHLF)を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。その結果、TGF-β1はHSP47遺伝子の発現を顕著に促進すること、そして、HSP47 inhibitorはHSP47遺伝子発現を顕著に抑制することが示された。さらに、タンパク質レベルでも、TGF-β1はHSP47タンパク質の産生を促進し、HSP47 inhibitorは顕著に抑制することが示された。さらに、ブレオマイシン肺線維症モデルにHSP47 inhibitorを投与しin vivoでの抗線維化効果を確認する実験に進んでいる。現段階でHSP47 inhibitorを投与することにより、ブレオマイシン肺線維症モデルマウスの生存率を改善させ、体重減少も抑制することが見いだされている。現在、肺組織内の病理学的な評価やHSP47やコラーゲン、線維化に関与する各種メディエータのmRNAや蛋白レベルでの発現状況について詳細な検討を追加している。これらの進捗状況は、概ね当初の予定通りである。HSP47はコラーゲン合成に必要不可欠な蛋白質であるため、HSP47を抑制することにより細胞内でのコラーゲン合成を阻害し、線維化の進行を抑制することができると考えられる。従って、HSP47はこれまで有効な治療法がなかった難治性肺線維化疾患の新たな分子標的治療のターゲットとなるとの着想に至った。更に、本研究協力者らは、化合物スクリーニングにより4種類のHSP47 inhibitorを見いだした(Christy A. et al. J. Med. Chem. 2005)。このHSP47 inhibitorはHSP47蛋白の発現自体は抑制しないが、HSP47のシャペロン機能のみを特異的に抑制し、細胞内でのコラーゲン合成を抑制できる。本研究ではsiRNAだけでなく、このHSP47 inhibitorも用いることによりHSP47制御を行うことを目的として研究を進めている。まずin vitroにおけるHSP47 inhibitorの効果を検証した。正常ヒト成人肺線維芽細胞を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。
キイロショウジョウバエにおける未受精卵からの単為発生作出

有性生殖と単為生殖を決定づける遺伝的機構の解明を目的に、下記の3点に取り組んだ。1有性生殖のみを行うキイロショウジョウバエを用いて、未受精卵からの単為発生の誘導を試みた。2アナナスショウジョウバエの有性生殖系統と自然集団由来の単為生殖系統を用いて比較ゲノム解析を行い、単為生殖の成立に重要な染色体領域を特定した。3キイロショウジョウバエ新規遺伝子Elysの機能解析を行い、これが卵の核と精子の核を合体して接合子を作るために必須であることを示した。動物界には有性生殖と無性生殖の両方が存在するが、単為生殖はこれを行う動物種の有性生殖の進化の過程で新たに形成された生殖様式である。生殖様式の転換は生物種の繁殖にとって極めて重要と考えられる。しかし、これがどのような遺伝的変化によって引き起こされているのか、未解明の問題として残されている。本研究では、これに関連した2つの課題に取り組んでいる。一つは、モデル生物として遺伝的操作が容易なキイロショウジョウバエを用いた研究である。キイロショウジョウバエにおいて単為発生は強く抑制されており、この種は有性生殖によってのみ子孫をつくる。現在、このようなキイロショウジョウバエに対してさまざまな突然変異や遺伝的改変を組合せた遺伝的操作を施して、有性生殖成立のための遺伝的基盤の改変を試みている。これにより、単為生殖を誘導できる細胞学的特性をもつ未受精卵の作製を目指している。具体的には、未受精卵の卵細胞質において中心体の新規合成を誘導し、同時にその卵の一倍体の減数分裂産物の周りに中心体非依存的な紡錘体ができる突然変異を持たせる。第二に、アナナスショウジョウバエの自然集団で発見されている単為生殖系統を用いて、その単為生殖の原因となっている遺伝子の特定を試みている。現在までに、アナナスショウジョウバエの第2染色体上の特定の2領域が、この種における安定した単為生殖に重要であることを明らかにした。キイロショウジョウバエの卵形成過程において、DSas-4、DSas-6、Ana2などのタンパク質を過剰発現することで、卵細胞質に中心体の新規合成を引き起こすことができることが知られている。これらの遺伝子がユビキチンプロモーター下で過剰発現される系統を入手した。現在、未受精卵の細胞質のどこにいくつの中心体が新規合成されるか、異なる遺伝子の組合せで検討している。また、単為発生の誘発の可能性を高めるために、それらをあるチューブリン遺伝子の突然変異と組合せた系統を作製している。アナナスショウジョウバエの単為生殖遺伝子に関しては、有性生殖系統への戻し交配を繰り返して作製した単為生殖系統を多数確立し、分子マーカーを利用したマッピングを行った。この種の全ゲノム配列は過去に作成されているが、ゲノム情報が断片的で一つながりになっていない染色体領域が多数存在した。そのため、単為生殖系統の全ゲノムを長鎖リードの読めるシーケンサーを用いて解析し、新たなアッセンブリを行った。これにより、染色体のゲノムを決定することができ、より正確な遺伝子マッピングが可能になった。有性生殖を行う生物種において、未受精卵からの単為発生は一般に強く抑制されている。キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)においても、精子がまったく関与しない単為発生の例は自然界由来の系統に見つかっておらず、また実験的に誘発された例もこれまでにない。研究代表者らは、自然界由来のアナナスショウジョウバエ(D. ananassae)の単為生殖系統を用いた細胞学的研究から、このアナナスショウジョウバエにおける未受精卵からの単為発生には、有性生殖系統の卵では決して起こらない、卵細胞質中での微小管形成中心(中心体)の新規合成が必須で、それらを用いて第一回目の体細胞分裂が起こることを見いだしている。そこで当年度、このアナナスショウジョウバエ単為生殖系統の卵細胞質で起こっている細胞学的特徴を、キイロショウジョウバエの未受精卵において再現し、キイロショウジョウバエで単為発生の誘発を試みる実験を実施した。さらに、アナナスショウジョウバエの単為生殖系統のゲノム解析を進め、単為発生に必須な遺伝子の特定に向けた実験を進めた。アナナスショウジョウバエの単為生殖遺伝子を特定し、それをキイロショウジョウバエに応用することは、キイロショウジョウバエにおいて単為発生を作出するために最も有効な方法と考えられる。本研究は、有性生殖の進化の過程で出現した単為生殖が、どのような遺伝的変化によって成立したのかを理解するために重要である。これまでにキイロショウジョウバエで未受精卵からの単為発生誘発を試みた2つの実験が報告されているが、いずれも成功していない。ひとつは、本来、卵形成過程の後期に分解されるべき中心体を残留させ、未受精卵に中心体を持たせた例で、これは体細胞分裂より前の減数分裂に問題が生じ、発生しなかった(Pimenta-Marques et al., 2016)。もう一つは中心小体の構成因子または中心小体の複製に関与する因子を卵形成過程で過剰発現させ、卵細胞質に微小管形成中心を多数産生した例であるが、大量な数の微小管形成中心が合成され、有糸分裂が行われない状態で発生が停止した(Rodrigues-Martins et al, 2007)。本研究は後者の例に似ている。

ここでは、新規合成される微小管形成中心の数を少なく制限するために、強制発現系のプロモーターを変えて雌性前核の体細胞分裂を引き起こすことを試したが、単為発生は認められなかった。アナナスショウジョウバエ単為生殖系統のゲノム解析については進展がある。第2染色体の異なる2領域、計2 Mbpだけがもとの単為生殖系統由来で、残りはすべて有性生殖系統由来のDNAを持つ単為生殖系統を確立した。安定した単為生殖の成立には、この系統の2ヶ所にある単為生殖系統由来の領域がともに必要であることが分かった。アナナスショウジョウバエの単為発生に関して2点、解析を行った。単為生殖系統の有性生殖系統への戻し交配実験により、単為発生の成立に必須な染色体領域約2 Mbpが特定されている。この領域には約200個の遺伝子があると考えられている。しかし、この遺伝子の情報から単為発生と関連のある遺伝子を見いだすことは困難であった。そのため、この領域の遺伝子について、さらにタンパク質のドメイン解析を行うなどして、母性効果により中心体の新規合成を引き起こす可能性のある遺伝子を探す必要がある。第二に、単為発生に必須な、卵細胞質で新規合成される中心体と、有性生殖系統の受精卵で形成される中心体を超解像顕微鏡で解析した。卵は中心体のPCMの中核に存在するAsterlessタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色した。Asterlessの集合体は、有性生殖系統の受精卵ではほぼ一定の大きさを示した。単為生殖系統の未受精卵でもAslは認められた。しかし、有糸分裂に関わっている中心体であっても形状が有性生殖系統のように一定ではなく、長さの測定が困難であることが分かった。新規合成された中心体も微小管形成能はもつが、精子の中心小体をもとに形成された中心体と構造的に異なることが分かった。最後に、キイロショウジョウバエの新しい母性効果遺伝子Elysの細胞学的解析を行った。Elys変異は雌不妊である。これは強い母性効果により受精卵の発生が第1回目の有糸分裂で停止することによることが分かった。このとき、核膜とM期の中心体の挙動に異常が認められた。Elysの正常なはたらきは、有性生殖において、2つの一倍体核から二倍体核を形成する過程に必須である。同様の表現型が、Nup160[sim]イントログレッション雌でも認められた。本研究により、受精に関わる新しい遺伝子を2つ明らかにすることができた。有性生殖と単為生殖を決定づける遺伝的機構の解明を目的に、下記の3点に取り組んだ。1有性生殖のみを行うキイロショウジョウバエを用いて、未受精卵からの単為発生の誘導を試みた。2アナナスショウジョウバエの有性生殖系統と自然集団由来の単為生殖系統を用いて比較ゲノム解析を行い、単為生殖の成立に重要な染色体領域を特定した。3キイロショウジョウバエ新規遺伝子Elysの機能解析を行い、これが卵の核と精子の核を合体して接合子を作るために必須であることを示した。キイロショウジョウバエにおける未受精卵からの単為発生誘発では、現在作製している系統の未交尾雌に産卵を誘発し、未受精卵からの単為発生開始率を測定する。単為発生の成功には、卵細胞質中に新規合成される中心体の数が重要な要因になると考えられる。
多義構造の処理方略とは：日・英・西語における韻律の役割を中心に

本研究課題の目標は、人がどのようなメカニズムで言語を理解し、産出しているのか、また、その際の方略には、言語によってどのような類似性や多様性があるのかを解明することである。構造が2通り考えられる文(構造的多義性)の処理における方略、特に文の韻律特性の役割に焦点をあてて検証することで、この解明に近づく。より具体的には、否定と副詞節(because節)の作用域の相互作用の処理に関するこれまでの英語での結果を踏まえて、スペイン語や日本語での同種の構造を考察し、その意味・韻律・情報構造の特性や、処理プロセスを検証する。また、L2英語話者の処理プロセスとの違いも検証し、英語教育への示唆を得ることも目指す。自己ペースでの黙読・発話産出・眼球運動測定などの手法を用いて、この意味的に複雑な作用域構造の理解においてどのような処理方略の言語普遍性や多様性が観察されるのかを探求するものである。H30年度は、大きく2つの調査を行った。まず、日本語における否定と作用域の多義構造(例:タカシはマリコのように頭が良くない)について、母語話者を対象に知覚実験を行い、選好される構造を調査した。また、当該構文を文脈の中でどちらか一つの解釈になるようにして読み上げ実験も行った。もう一つは、L2英語学習者(初級者)を対象に、英語の当該構文の読み実験を行った。実験文を初級者用にシンプルにし、また2つのセッションに分けて、韻律に関するトレーニングを施したが、学習者は依然として、当該構文の韻律・語用情報的な特性を利用して理解の助けとすることができないようであることが示唆された。現在まで、日本語とL2英語学習者を対象とした実験を進めることができ、概ね予定通りに進めることができている。1.日本語における否定と副詞類の作用域の関係:「真理子は鈴木さんのように頭が良くない」の例は、否定と形容詞句「鈴木さんのように」の作用域の相互作用により「鈴木さんも真理子も頭が良くない」という解釈と、「鈴木さんは頭がいいが真理子はそうではない」という解釈が可能である。母語話者の直感では、形容詞句「鈴木さんのように」の前や、述語「頭が良く」の前に韻律境界があるかどうかによって好まれる解釈が変わるとみられる。当初の予定通り、この構文について、日本語母語話者を対象に一般的な解釈の傾向を調べた。また、この構文を文脈の中で、どちらか一方の読みにしかならないようにし、読み上げ実験も行なった。2. L2英語学習者の処理:第2言語学習者は、目標言語の節、文レベルでの韻律特性の情報をどのぐらい利用できるのだろうか調べるために、本年度は、実験文を初級者用にシンプルにし、また2つのセッションに分けて、韻律に関するトレーニングを施したものを、英語初級学習者を対象に調査した。結果、学習者は、当該構文の韻律・語用情報的な特性を利用して理解の助けとすることができないようであることが示唆された。今後は、日本語、L2英語、スペイン語の3つについて、さらに研究を進めたい。具体的には以下の通りである。1.日本語:昨年度得ることができた実験結果について詳しく分析する。昨年度は、ベースラインとなる解釈をアンケート形式という単純な方法で調べたが、より実験手法を精査して、詳細なデータを収集したい。また、解釈によって韻律特性が違うようであることが昨年度わかったが、日本語の韻律特性や情報構造について文献研究をすすめ、より詳細な分析をし、成果を学会等で発表したい。2. L2英語:昨年度得ることができた英語学習者(初級レベル)の結果を、すでにわかっている英語母語話者、英語学習者(上級レベル)の結果との比較という観点からさらに詳しく分析する。また、今回、学習者の認知的負担を和らげ、また作用域構造や韻律情報に関する意識を高めるためのトレーニングを準備したが、効果はあげられなかった。トレーニングの内容をより精査することが必要であると考えられるので、先行研究を吟味しながら、よりよいトレーニングを立案し、再実験を行いたい。3.スペイン語:スペイン語の否定とporque節の多義構造の処理について、前よりも詳細なデータを取ることができるよう実験構築を進める。まず、前回よりもデザインを改善し、直接法と接続法の違いを利用したより自然な文完成課題を構築する予定である。その後、英語と同様の自己ペース読み実験や、視線計測実験へと移行していきたい。同時に、スペイン語の否定の処理に関する文献の研究も進めたい。

まず、日本語における否定と作用域の多義構造(例:タカシはマリコのように頭が良くない)について、母語話者を対象に知覚実験を行い、選好される構造を調査した。また、当該構文を文脈の中でどちらか一つの解釈になるようにして読み上げ実験も行った。もう一つは、L2英語学習者(初級者)を対象に、英語の当該構文の読み実験を行った。実験文を初級者用にシンプルにし、また2つのセッションに分けて、韻律に関するトレーニングを施したが、学習者は依然として、当該構文の韻律・語用情報的な特性を利用して理解の助けとすることができないようであることが示唆された。現在まで、日本語とL2英語学習者を対象とした実験を進めることができ、概ね予定通りに進めることができている。1.日本語における否定と副詞類の作用域の関係:「真理子は鈴木さんのように頭が良くない」の例は、否定と形容詞句「鈴木さんのように」の作用域の相互作用により「鈴木さんも真理子も頭が良くない」という解釈と、「鈴木さんは頭がいいが真理子はそうではない」という解釈が可能である。母語話者の直感では、形容詞句「鈴木さんのように」の前や、述語「頭が良く」の前に韻律境界があるかどうかによって好まれる解釈が変わるとみられる。当初の予定通り、この構文について、日本語母語話者を対象に一般的な解釈の傾向を調べた。また、この構文を文脈の中で、どちらか一方の読みにしかならないようにし、読み上げ実験も行なった。2. L2英語学習者の処理:第2言語学習者は、目標言語の節、文レベルでの韻律特性の情報をどのぐらい利用できるのだろうか調べるために、本年度は、実験文を初級者用にシンプルにし、また2つのセッションに分けて、韻律に関するトレーニングを施したものを、英語初級学習者を対象に調査した。結果、学習者は、当該構文の韻律・語用情報的な特性を利用して理解の助けとすることができないようであることが示唆された。今後は、日本語、L2英語、スペイン語の3つについて、さらに研究を進めたい。具体的には以下の通りである。1.日本語:昨年度得ることができた実験結果について詳しく分析する。昨年度は、ベースラインとなる解釈をアンケート形式という単純な方法で調べたが、より実験手法を精査して、詳細なデータを収集したい。また、解釈によって韻律特性が違うようであることが昨年度わかったが、日本語の韻律特性や情報構造について文献研究をすすめ、より詳細な分析をし、成果を学会等で発表したい。2. L2英語:昨年度得ることができた英語学習者(初級レベル)の結果を、すでにわかっている英語母語話者、英語学習者(上級レベル)の結果との比較という観点からさらに詳しく分析する。また、今回、学習者の認知的負担を和らげ、また作用域構造や韻律情報に関する意識を高めるためのトレーニングを準備したが、効果はあげられなかった。トレーニングの内容をより精査することが必要であると考えられるので、先行研究を吟味しながら、よりよいトレーニングを立案し、再実験を行いたい。3.スペイン語:スペイン語の否定とporque節の多義構造の処理について、前よりも詳細なデータを取ることができるよう実験構築を進める。まず、前回よりもデザインを改善し、直接法と接続法の違いを利用したより自然な文完成課題を構築する予定である。その後、英語と同様の自己ペース読み実験や、視線計測実験へと移行していきたい。