hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
BARD1のSplicing variant,BARD1 Δringの機能解析

(1)BARD1 Δringはエクソン2-6を欠失したBARD1のsplicing vari antで、RING fingerの大部分とAnkyrin repeatを欠失しているがBRCT domainが保持されていた。In vivoでの発現状況を解析するため、C-末端のポリペプチド(CVMSFELLPLDS)に対するラビットポリクローナル抗体を作成したが、作成された抗体は免疫沈降には使用可能であったが、immunoblottingには使用できず、EndogenousなBARD1 Δringを検出し得なかった。現在、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システムおよびマススペクトロメーター(LCQイオントラップLC/MS^nシステム)を用いてEndogenousなBARD1 Δringの同定を試みている。一方、BARD1 Δringの機能解析はpcDNA3ベクターを用いて293T細胞内の一過性発現の系にておこなった。その結果、BARD1 ΔringはBRCA1のRINGドメインと結合せず、ユビキチンリガーゼ活性を持たないが、BRCA1およびBARD1 (full length)とともにTriple transfectionするとBRCA1-BARD1に結合しこれを安定化することによってユビキチンリガーゼ活性を高める可能性が示された。また、GFP-tagをつけたBARD1 Δringを作製して細胞内における局在を解析したところ、Full lengthのBARD1と同様に核内Dot形成をすることが判明した。このことからBARD1の核内Dot形成にはRING fingerとAnkyrin repeatが不要であることが示唆された。(2)BRCA1およびBRAD1に相同性を有するタンパク質のユビキチンリガーゼ活性ついて解析した。BRCA1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18BおよびEfp (estrogen-responsive finger protein)、BARD1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18Aを単離し、大腸菌よりrecombinantタンパク質を精製した。HR18AおよびEfpは単独にてユビキチンリガーゼ活性を認めた。特にEfpは非常に強い活性を持ち、この活性は、ユビキチン結合酵素(E2)としてUbcH5cを用いた時のみに認め、UbcH2を用いた際には活性を認めなかった。BARD1ΔringをpcDNA3 vectorにサブクローニングし、シークエンスの再確認をおこなった。その結果エクソン2-6を欠失したBARD1のsplicing variantで、RING fingerの大部分とAnkyrin repeatを欠失しているがBRCT domainが保持されていることが判明した。In vivoでの発現状況を解析するため抗BARD1抗体を作成した。市販のBARD1抗体はなく、また、これまでに報告されている抗体はエクソン2-6に存在するepitopeを認識するものであるため、C-末端のポリペプチド(CVMSFELLPLDS)に対するラピットポリクローナル抗体を作成した。しかしながら作成された抗体は免疫沈降には使用可能であったが、immunoblottingには使用不可であった。したがって、in vivoのBARD1Δringを検出し得ず、現在新たな抗体による解析を検討中である。BARD1Δringの機能解析はpcDNA3-HA-BARD1Δringを用いて293T細胞内の一過性発現の系にておこなった。その結果、BARD1ΔrinはBRCA1のRINGドメインと結合せず、ユピキチンリガーゼ活性を持たないが、BRCA1およびBARD1 (full length)とともにTriple transfectionするとBRCA1-BARD1に結合しこれを安定化することによってユビキチンリガーゼ活性を高める可能性が示された。これはおそらく最近報告されたようにBARD1のC末端に存在するBRCTdomainを介してBARD1ΔringとBARD1が結合することによるものと考えられる。一方、CstF-50との結合が保持されていることからその機能との関連を今後解析する予定である。BRCA1のRING

フィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18BおよびEfp (estrogen-responsive finger protein)、BARD1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18Aを単離し、大腸菌よりrecombinantタンパク質を精製した。HR18AおよびEfpは単独にてユビキチンリガーゼ活性を認めた。特にEfpは非常に強い活性を持ち、この活性は、ユビキチン結合酵素(E2)としてUbcH5cを用いた時のみに認め、UbcH2を用いた際には活性を認めなかった。
温熱療法とIL-1阻害薬の併用療法の開発

進行口腔癌に対する安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、サイトカインInterleukin-1(IL-1)阻害薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果を期待して研究を開始した。研究成果としてはin vitroにおいて口腔癌細胞株とOSC-19を用いてIL-1R1の発現レベルを観察したところ、細胞を加温した後、細胞のIL-1R1の発現レベルが上昇していること、また細胞の移動能については温熱療法とIL-1Ra(IL-1阻害薬)を併用した群で、有意に細胞の移動能の抑制が観察された。進行口腔癌に対する治療は外科的療法が主体となるが、術後の機能・審美障害など抱える問題は多く、新たな治療法の開発が必要とされている。平成24年12月には頭頸部癌においても抗EGFR抗体薬(セツキシマブ)が臨床に導入され、その有効性が認められている。今後も口腔癌に対して新たな分子標的薬の誕生が期待される。本研究では、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、サイトカインInterleukin-1(IL-1)阻害薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究を行う方針で取り組んでいる。平成26年度は、主にin vitroでの研究が中心となった。ヒト由来口腔癌細胞株であるOSC19, HSC-3を用いて、加温あり・なし群でIL-1Rの発現の変化を様々な条件下(時系列、温度)で検討を行った。処理をした細胞から、タンパクおよびRNAを抽出し、ウェスタンブロッティングならびにRT-PCRにてIL-1Rの発現を評価した。もともとのIL-1Rの発現が低いせいもあり、検出するに至るまでに時間を要した。結果的には、温熱処理を行った細胞において、IL-1Rの発現上昇が観察され、IL-1R阻害薬の併用効果に期待が持たれた。温熱療法にIL-1β阻害薬を用いた分子標的療法を組み合わせることにより、従来から知られている温熱療法の効果(血流上昇に起因する癌細胞へのドラッグデリバリーを高める作用)だけでなく、標的分子の発現上昇を図ることでIL-1β阻害薬に対する。癌細胞の感受性を高める効果も期待できる。これまでに頭頸部領域において温熱療法によりIL-1の発現上昇を認めた報告はなく、非常に画期的な方法であると思われる。本研究では、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、サイトカインInterleukin-1(IL-1)阻害薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究を行う。これまでの研究の成果としては、in vitroにおいて口腔癌細胞株HSC-3とOSC-19を用いて温度条件と、インキュベーションタイムを様々な条件で検討し、IL-1RIの発現量を主にウェスタンブロッティングを用いて観察した。ウェスタンブロッティングでのdetectionの条件に付いても抗体の濃度などの条件検討を行った。温熱療法は43°C、1時間のインキュベーションタイムが最適として、この条件で、IL-1Ra(IL-1阻害薬)を併用して、MTT assay, Cell motility, Invasion assayを行ったところ、Cell motility assayにおいて有意に細胞の移動能の抑制が観察された。今後は、アポトーシスの誘導の有無およびマウスを用いたin vivoでの実験を進めていく予定である。ウェスタンブロッティングによるIL-1Rの検出が非常に繊細であり、特異的なバンドを検出するための条件検討に時間を要した。IL-1Ra(アンタゴニスト)の購入について、単価が高く、販売元が変わったりなどしたために購入に関して時間を要したとともに、実験の使用方法にも慎重になったため。ウェスタンブロッティングでのdetectionの条件についても抗体の濃度などの条件検討行った。温熱療法は43°C、1時間のインキュベーションタイムが最適として、この条件でIL-1Ra(IL-1阻害薬)を併用して、MTT assay、Cell motility、Invasion assayを行ったところ、Cell motility assayにおいて優位に細胞の移動能の抑制が観察された。

今後は、アポトーシスの誘導の有無およびマウスを用いたin vivoでの実験を進めていく予定である。口腔癌のみならず、癌研究全体においても温熱療法とIL-1阻害薬を併用した研究は少なく、まだ不明な点も多い。本研究において温熱療法および分子標的治療の抗腫瘍効果に加えて、免疫活性を含め、そのメカニズムを解明することは従来の抗癌剤に比較して、より効果的で副作用が少ない治療法の確立が期待される。IL-1Ra(IL-1阻害薬)の試薬の入手が、難しくなってしまった。海外の企業へ申請書類を作成しての注文になったが、複雑な手続きであり、申請は出したものの同企業から購入することができなかった。それに伴い実験の進行が停滞した。進行口腔癌に対する治療は外科的療法が主体となるが、術後の機能・審美障害など抱える問題は多く、新たな治療法の開発が必要とされている。平成24年12月には頭頸部癌においても抗EGFR抗体薬(セツキシマブ)が臨床に導入され、その有効性が認められている。今後も口腔癌に対して新たな分子標的の誕生が期待される。本研究では、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、サイトカインInterleukin-1(IL-1)阻害薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究を行う。これまでの研究成果としてはin vitroにおいて口腔癌細胞株HSC-3とOSC-19を用いて温度条件と、インキュベーションタイムを様々な条件で検討し、IL-1R1の発現量を主にウェスタンブロッティングを用いて観察した。ウェスタンブロッティングでのdetectionの条件についても抗体の濃度などの条件検討を行った。IL-1R1の発現レベルをウェスタンブロッティングで観察したところ、細胞を41度で1時間加温した後、24時間後をピークに細胞のIL-1R1の発現レベルが上昇していることが分かった。また細胞の移動能をCell motility assayで行ったところ、温熱療法とIL-1Ra(IL-1阻害薬)を併用した群で、有意に細胞の移動能の抑制が観察された。進行口腔癌に対する安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、サイトカインInterleukin-1(IL-1)阻害薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果を期待して研究を開始した。研究成果としてはin vitroにおいて口腔癌細胞株とOSC-19を用いてIL-1R1の発現レベルを観察したところ、細胞を加温した後、細胞のIL-1R1の発現レベルが上昇していること、また細胞の移動能については温熱療法とIL-1Ra(IL-1阻害薬)を併用した群で、有意に細胞の移動能の抑制が観察された。平成26年度は、主にin vitroでの研究が中心となった。IL-1Rの発現を評価するにあたり、もともとの発現が低いせいもあり、検出するに至るまでに時間を要した。
虚血心筋への血管新生因子を用いた血管の誘導と画像三次元構築による壁構成細胞の評価

現在、増殖因子を用いた血管新生療法が臨床では期待するほどの効果が得られていない。その理由は血管新生療法で作成したと思われる血管を直接証明することが困難であり、大多数の研究では間接証明に頼っているためである。虚血心筋では血流の増加、側副血行路の増加、温度の上昇などを新生血管が起こった説明にしているが、血管は新生しなくても起こる現象である。血管新生因子の効果の評価は、(1)血管芽から成熟血管までの経過を観察、(2)血管新生速度を測定、(3)血管の無いところに血管が新生などの直接証明を用いることが好ましい。本研究において、まず、血管新生速度を動物の慢性観察窓を用いて測定した。血管新生因子が目的部位に留まり、効果が出るかは未知であった。このモデルでは厚さ50μmの厚さの間隙を血管は二次元に外から伸展する。対照として生理食塩水を用い、血管新生因子を局所1回投与したところ1週間効果が持続し、血管新生速度の測定では至適条件では100μm/dayであった。リコンビナントbFGFを局所投与にて用いたが効果が1週間あったということは因子が局所に吸着し、効果をおよぼしていたことが考えられた。虚血心筋は心筋と血管以外は結合組織が多いため、結合組織に吸着することは充分考えられる。ただし、増殖因子が虚血部に拡散するかは別の問題である。観察窓内の血管は大多数が静脈であり、動脈は僅かしかない。動脈の壁構成細胞は比較的厚く、pericyteが主であった。観察窓を開けてchamber内の血管、内皮細胞、平滑筋細胞細胞を免疫組織学的に評価を行うことを試みた。外科的に再建できない虚血心筋に新生血管を誘導するのを目的に、新しい治療法が盛んに試みられている。血管新生を促すとされている種々のサイトカインをプロテインの形で、また遺伝子の形で導入したり、未分化な細胞を含む骨髄組織の移植、さらにはtransmyocardial laser revascularization(TMLR)等が試みられてきた。最近、臨床では創傷治癒を促進するためにリコンビナントbFGFが市販され、整形外科領域では褥創治療剤として用いられている。しかし、いまだにこの薬剤により促進された血管新生の直接証明はなされていない。それほどに治療により促進された新生血管の直接証明は困難である。我々は現在、直視下経時的非侵襲的に観察可能な家兎の耳介観察窓(rabbit ear chamber)モデルにて直径6.4mmのパンチアウトした傷に血管が侵入する過程を観察している。観察窓内の血管はすべて新生で、4,5週目には完成し、その途中では血管芽の発生過程が観察可能である。実験方法は確立したため、このモデルにおいて、血管新生因子をプロテインの形で用い、血管新生の速度測定、最適条件、促進するための足場条件、動静脈の分化時期、血管芽の形成等を検討することを計画した。家兎の阻血下肢における血管新生療法は血流が増加した、側副血行路が形成された等のすばらしい成果が報告されたが、実際の臨床では安全性、効果等まだまだ不完全なのが現状である。臨床で利用可能な最適な条件を求めて進めていきたい。外科的に血行再建が不可能なほど冠動脈が細い症例に対し、虚血心筋への血管誘導がさかんに試みられている。しかし、細胞あるいは動物実験においては遺伝子導入、あるいは増殖因子は有効であっても、いざ臨床的に用いると評価できるほどの優れた血管新生が誘導されているわけではない。本年度は家兎の創傷治癒モデルを用いて血管新生因子(線維芽細胞増殖因子)の影響下における血管伸展過程の観察および血管形成面積測定を行った。

非侵襲的直視下に血管新生過程が観察可能であるrabbit ear chamberモデルにおいて血管新生因子を散布した(B)群および対照の生理食塩水を散布した(C)群では7日後にはB群の方が血管形成面積が有意に大きかった。しかし14日後になるとB群とC群では有意差が無くなった。このことから手術時1回用いた因子は術後7日目までは有効であったが、持続期間は限られていたことが明らかになった。血管形成は常に周囲に線維芽細胞と思われる多数の細胞に囲まれて起こっていた。さらに壁構成細胞の評価を試みた。新生血管が形成されて3週間後には動静脈が壁の厚さにより区別されたが、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の判定は今回の研究期間内には行えなかった。生体顕微鏡下に観察すると血管内面を被覆している細胞はすき間無く、表面には血栓はなく白血球が転がっていく様子が観察された。さらに血管新生を速やかにする条件を求めるのを目的に、細胞親和性の良好な足場(scaffold)をREC内に留置したところ、丈夫で出血しにくい血管芽が形成されることを観察した。血管新生療法では新生した血管を直接証明することが困難であり、大多数の研究では間接証明に頼っている。そのため、虚血心筋では血流の増加、側副血行路の増加、温度の上昇などを新生血管が起こった説明にしているが、血管は新生しなくても起こる現象である。血管新生因子の効果の評価は、(1)血管芽から成熟血管までの経過を観察、(2)血管新生速度を測定、(3)血管の無いところに血管が新生などの直接証明を用いることが好ましい。本研究において、まず、血管新生速度を動物の慢性観察窓を用いて測定した。血管新生因子が目的部位に留まり、効果が出るかは未知であった。このモデルでは厚さ50μmの厚さの間隙を血管は二次元に外から伸展する。対照として生理食塩水を用い、血管新生因子を局所1回投与したところ1週間効果が持続し、血管新生速度の測定では至適条件では100μm/dayであった。リコンビナントbFGFを局所投与にて用いたが効果が1週間あったということは因子が局所に吸着し、効果をおよぼしていたことが考えられた。虚血心筋は心筋と血管以外は結合組織が多いため、結合組織に吸着することは充分考えられる。ただし、増殖因子が虚血部に拡散するかは別の問題である。観察窓内の血管は大多数が静脈であり、動脈は僅かしかない。動脈の壁構成細胞は比較的厚く、pericyteが主であった。観察窓を開けてchamber内の血管、細胞を免疫組織学的評価を行うことを試みた。
多様な要求性能に対応できる鋼・コンクリート合成部材の新しい損傷限界クライテリア

普通鋼材(STKR400),高強度鋼材(H-SA700)を用いた角形CFT柱の曲げせん断実験を,軸力比(その断面が保持している圧縮耐力に対する軸力の比),コンクリート充填の有無をパラメータとして行った.実験では,損傷限界と定義づけられる部材角を示した.また,実験より得られた局部座屈発生限界部材角と,既往の高強度CFT柱の文献調査から得られた局部座屈発生限界部材角を,普通鋼材を用いたものと比較した.円形断面の場合は,実験値は普通強度の場合よりも局部座屈発生限界部材角は大きいが,角形断面の場合は,大きくなる場合も小さくなる場合もあった.実験的研究として,STKR400,□125×6を用いた試験体を製作し,油圧ジャッキおよび試験体を取り付けるための治具の製作を行った.また,H-SA700鋼材を購入し,この鋼材を用いて試験体を製作するための打ち合わせを鉄骨製作所と行い,来年度の実験スケジュールを決定した.また,後述する解析プログラムにより,試験体の予備計算を行った.本来は,高強度鋼を用いた試験体の製作を行う予定であったが,特殊な鋼材であったため,問い合わせから購入までほぼ1年を要した.解析的研究としては,コンクリート充填角形鋼管柱を対象とし,一定軸力のもとで水平荷重を受ける片持ち柱形式の荷重ー変形関係を求めることができる解析プログラムを作成した.当初の予定として,解析により実験結果の追跡を行うこととしていた.しかし,実験がやや遅れていることもあり,先にプログラム作成を終え,既往の研究との比較ならびに試験体の事前の予備計算を行った.また,追加の検討としてこの解析プログラムを用いて,軸力比,コンクリート圧縮強度,鋼管の降伏強さをパラメータとし,角形CFT柱の荷重ー変形関係を求めた.コンクリート充填鋼管構造設計施工指針には,短柱の降伏耐力が示されているが,計算が煩雑なため累加強度式を用いてもよいことになっている.許容耐力評価式は,この累加強度式となっている.この降伏耐力と許容耐力を解析によって求め,荷重ー変形関係上に示し,降伏耐力時の部材角と許容耐力時の部材角を求めた.その結果,1)降伏耐力時の部材角は,許容耐力時の部材角より小さい,許容耐力時の部材角に対する降伏耐力時の部材角の比は,軸力比が大きくなるにつれおおむね小さくなる傾向にあることを明らかにし,また,許容耐力時の部材角に対する降伏耐力時の部材角の比に及ぼす,コンクリート強度,鋼材の降伏強さの影響を示した.普通鋼材(STKR400),高強度鋼材(H-SA700)を用いた角形CFT柱の曲げせん断実験を,軸力比(その断面が保持している圧縮耐力に対する軸力の比),コンクリート充填の有無をパラメータとして行った.実験では,損傷限界と定義づけられる部材角を示した.また,実験より得られた局部座屈発生限界部材角と,既往の高強度CFT柱の文献調査から得られた局部座屈発生限界部材角を,普通鋼材を用いたものと比較した.円形断面の場合は,実験値は普通強度の場合よりも局部座屈発生限界部材角は大きいが,角形断面の場合は,大きくなる場合も小さくなる場合もあった.今年度は「文献調査」および「実験」を同時進行で行うこととしていた.まず,文献調査については,近年開発された高強度鋼を用いたCFT柱を用いた実験的研究に関する論文を2007年度以降から12編収集し,次のことを示した.1)圧縮力を受ける場合(試験体数41体)について,コンクリート充填鋼管構造設計指針(日本建築学会,以後CFT指針)に示されている既往の設計式による計算荷重に対する実験荷重の比を算出し,これらの値と鋼管の径(幅)と板厚の比である径厚比,幅厚比の関係を示した.その結果CFT指針の適用範囲外の場合,設計式は危険側の評価をする場合があることがわかった.2)軸力と曲げモーメントを同時に受ける中柱(柱の径に対する長さの比が4から12の柱,試験体数21体)については,円形断面柱の場合はCFT指針に示されている短柱の設計式と,角形断面柱の場合はCFT指針に示されている中柱の設計式と実験耐力がよく対応している.さらに,鋼管およびコンクリート強度がCFT指針の適用範囲内と範囲外について計算値と実験値との比較をすると,強度が適用範囲よりも高い場合で角形断面の場合には,危険側の評価をする場合がある.また実験については,試験装置の設計および試験体の設計を行った.実際には軸力載荷まで行う予定であったが,想定していたものよりも装置が大掛かりとなったため,検討に時間がかかってしまい,実験実施まで到達しなかった.しかし,装置ならびに試験体の設計はすべて終了し,すぐに製作にとりかかれるようになっている.文献調査では,高強度材料を用いた場合現行の設計式を単純に用いることができないという可能性を示すことができ,今後新たな設計式を考えていくための有用な資料となった.また,実験のための載荷装置および試験体の設計を丁寧に行ったことで,次年度以降速やかに実験を行うことができるようになった.実験的研究として,二つの鋼材種別,STKR400(普通鋼材),H-SA700(高強度鋼材)の短柱圧縮試験(中空,コンクリート充填鋼管(CFT)),SRKR400で断面寸法□-125×125×6を用いた

長柱CFT試験体実験を1体,H-SA700で□-125×125×6を用いた長柱試験体実験を,CFTを2体,中空を1体,合計4体の実験を行った.一定軸力と繰返し水平荷重を受ける構造実験で,実験変数は,1)コンクリート充填の有無,2)軸力比(0.15,0.3),3)鋼材種別,である.材料実験としての位置付けである短柱圧縮試験では,次のような知見が得られた.中空試験体では,H-SA700試験体のほうが,STKR400試験体と比較して,最大耐力後の荷重低下が著しい.CFT試験体では,STKR400試験体のほうが,最大荷重後の耐力低下が著しく,いずれの場合も荷重の再上昇がみられた.長柱の実験では,荷重ー変形関係,曲げモーメントー部材角関係,部材角ー軸縮関係,荷重ーひずみ関係を示し,損傷限界として位置付けられる,鋼管降伏,局部座屈発生,亀裂発生との関係を示した.実験結果からは,次の知見が得られた.1)STKR400のCFT柱並びにH-SA700鋼材の中空柱は局部座屈が進展し,耐力が低下した.H-SA700鋼材のCFT柱は亀裂により荷重が急激に低下した.2)H-SA700で軸力比0.15の試験体を除く3つの試験体において,軸縮みが0.2%を超えると急激に軸縮み量が大きくなった.3)STKR400鋼材の柱の方がH-SA700鋼材の柱よりも早く局部座屈が発生した.実験時に記録した損傷限界時の部材角と鋼材種別,軸力比との関係を,損傷限界部材角とし,既往の文献調査の結果と合わせて示した.建築構造実験的研究と解析的研究を行うこととしていた.実験的研究はやや遅れている.H24年度は,やや遅れていると評価しているが,H24年度の計画はすべて遂行できた.しかし,実績の概要に示した通り,高強度鋼材の購入にほぼ1年を要してしまったことから,試験体の製作には至らなかった.また,H24年度に設計を行っていた治具についても製作に時間がかかり,装置の組み立てまでは終了できなかった.しかし,H25年度には高強度鋼材を用いた試験体の製作方法について決定できており,H26年度すぐに製作に取り掛かれるよう段取りが終わっている.したがって,H26年度中にすべての実験を終えることができ,遅れを取り戻せると考えている.解析的研究については,当初は実験結果を追跡することのみを目標としていたが,実験が遅れていることもあり,解析プログラムを速やかに作成し,実験の準備計算を行った.また,追加の検討として,一定軸力のもと水平荷重を受ける角形CFT柱を対象とし,コンクリート充填鋼管設計施工指針に示されている,降伏耐力に達した時の部材角と許容耐力に達した時の部材角の比に及ぼす軸力比,コンクリート強度,鋼材の降伏強さの影響を示すことができた.これは,当初予定していなかったものであるが,今後損傷限界を考えるうえで有用な知見を得ることができた.したがって,総合的に判断しておおむね順調に進展していると評価した.平成24年度は,「文献調査」と「実験」を行うこととしていた.文献調査は,平成24年8月までに発表された日本建築学会の論文で,対象となる高強度材料を用いたものをすべて収集し,検討を行った.軸力のみを受ける場合,軸力と曲げを受ける場合について,既往の設計式との比較を行うことができたことから,内容としては十分であり,有用な知見を得ることができた.一方,実験のほうは,実際には普通強度の鋼材を用いた試験体を製作し,載荷を行うこととなっていた.しかし,研究実績の概要にも記したが,載荷用の装置を構成する部品が想定よりもやや大きくなってしまい,試験体の寸法(長さ)を見直す必要が生じ,試験体の設計の再検討と載荷装置全体の検討に時間を要してしまった.
ダイナミック・タッチによる把握物の知覚とそれに伴う手の運動の解析

自己の身体の方向を知覚する際の、身体部位の慣性主軸の効果について確認するための実験を行った。被験者は椅子に腰掛け、前腕に十字型の機材(前後約63cm、左右約60cm、質量約675g。アルミと樹脂製)を固定された。機材の左右に突き出た腕には、「右に200g」「左に200g」「左右に100gずつ」のいずれかの条件で重りが取り付けられた。被験者は上腕を体側に密着させ、前腕を床と平行に保つように教示された。被験者の前腕部は、高さ80cmの位置に床と平行に設置されたパネル(幅120cm、奥行48cm)で上部から覆い隠された。パネル上部の被験者に相対する位置に、横一列(10cm間隔)に並んだ目標が取り付けられ、被験者は各試行においてそのうちの1つを、前腕の水平方向の向きを調整することによって指示するように求められた。以上の実験から、被験者の前腕による方向指示は、(1)重りの位置の条件によって体系的な誤差が生じる、(2)その誤差は、十字型の機材を含めた前腕部の慣性主軸の方向と一致していることが確認された。これにより、身体方向の知覚が当該部位の慣性主軸の知覚に基づいていることが確認された。しかし、一方で(3)指示すべき目標の位置による効果があることも確認された。その原因の一つとして、肘関節の内旋/外旋にともなう筋群のバランスの変化が考えられる。そこであらかじめ被験者の前腕部に一定の負荷を加えることにより、内旋/外旋のための筋群の一部を疲労させ、そのバランスを崩した上で同様の実験を行った。その結果、とりわけ前腕部の回外運動に関わる筋群を疲労させた際に、慣性主軸の方向に関する感受性が低下することが確認された。以上の結果から、自己の身体の方向に関する触覚的な印象を支える慣性主軸の知覚が、筋群のダイナミックなバランスによって支えられていることが示唆された。(1)棒状の物体を把握している位置の違いを、目で見ることなく、しかもその物体をはじめに把握した位置から手を滑らせたり持ち替えたりすることなしに(ダイナミック・タッチによって)知覚できるかについて検討した。実験には、長さ60cmの木製の棒を使用した。この棒を被験者に手渡し(物体はカーテンで隠されており、被験者からは見えない)、その棒を把握している位置を被験者に報告させた。被験者が棒を持つ位置は5つの位置からランダムに選択し、提示した。被験者による報告は、実験材料で用いたのと同じ長さの棒を被験者から見える場所に提示し、手で棒を把握している位置を被験者によって指示させる(報告用の棒にとりつけられたマーカーを用いる)方法で行った。その結果、被験者が棒を実際に把握している位置と、報告した位置とはリニアな関係となっていることが確認された。(2)目で見えないように隠された位置で把握している棒状の物体の「向き」を知覚することができるかどうかを確認するための実験を行った。被験者の課題は、目で見ることができる目標を、手で持った、目では見えないように隠された棒で指示することとした。指示する目標の方向は5種類とし、どの目標を指示するかの順番はランダムとした。実際の目標の方向と、見えない位置で手に持った棒によって指示した方向とのずれを記録した。その結果、棒による指示が極めて正確に行なわれていることが確認された。また、実験においては、被験者が持った棒のオイラー角の変化を、ジャイロセンサーとコンピュータによって記録した。その結果から、被験者は棒によって目標を指示する際、棒を目標に向けるのとは直接関係ないと思われる「棒の方向を探るような動き」を行っていることが示唆された。次年度は、これらの結果を踏まえ、とくに手に持った棒の方向を知覚する際に行われる手の運動について、より詳細に検討してゆく。

しかし、一方で(3)指示すべき目標の位置による効果があることも確認された。その原因の一つとして、肘関節の内旋/外旋にともなう筋群のバランスの変化が考えられる。そこであらかじめ被験者の前腕部に一定の負荷を加えることにより、内旋/外旋のための筋群の一部を疲労させ、そのバランスを崩した上で同様の実験を行った。その結果、とりわけ前腕部の回外運動に関わる筋群を疲労させた際に、慣性主軸の方向に関する感受性が低下することが確認された。以上の結果から、自己の身体の方向に関する触覚的な印象を支える慣性主軸の知覚が、筋群のダイナミックなバランスによって支えられていることが示唆された。
乳腺の発達とカテコールアミン合成

ドーパミンβ水酸化酵素(DBH)類似遺伝子であるDBH-likeとモノオキシゲナーゼX(MOX)の機能解析を目的として、それぞれの遺伝子産物のC末端をHisTag標識したタンパクを薬物存在下で誘導的に発現する細胞株を構築した。細胞は、MOXおよびDBH-likeの発現により退縮や剥離がみられ、遺伝子発現誘導後4時間以内にほぼ全ての細胞がアポトーシスを起こすことが判明した。他方、DBH遺伝子を導入した細胞では、一部の細胞がアポトーシスを起こすだけであった。また、遺伝子発現誘導後の細胞からは、膜画分に約70kDaの目的産物が確認された。産物を精製し、DBH酵素活性の指標となるチラミンβ水酸化酵素(TBH)活性を測定したところ、活性が検出された。しかし、産物が分泌されず、産生すると細胞が死ぬために大量産生が難しく、より詳細なデータを得るには、今後のより大スケールでの培養実験が必要である。一方、カテコールアミン合成関連酵素群の発現に対するプロラクチン(PRL)の影響を、乳腺上皮・間質の初代培養細胞およびHC11細胞株において調べた。その結果から、PRLは乳腺の上皮細胞に働いてチロシン水酸化酵素(TH)およびMOXを発現する細胞を分化させ、その上皮細胞で産生されたカテコールアミンは、間質の脂肪分解などにはたらき、間質から上皮に脂質栄養が分配される、といった上皮・間質の相互作用が示唆された。他方、PRLは上皮・間質のDBH発現の減少に働いたことから、発達した乳腺以外の組織では、PRLはカテコールアミン産生を抑制して脂肪蓄積に寄与する可能性が示された。そのほか、本研究によりCBP90やC型アルドラーゼなど、従来は中枢神経系でのみ発現することが確認されていたタンパクが、発達した乳腺上皮で機能していることが明らかとなり、乳腺が中枢神経系で働く遺伝子セットを利用して形成された進化の歴史が示唆された。Gene Switchシステムを用いて特定の遺伝子の発現をmifepristoneにより誘導する細胞培養系を、CHO細胞において確立した。この培養実験系で、C末にtagを付したDBH-LP2(monooxygenase X ; MOX)遺伝子およびDBH、DBH-LP遺伝子を一過的に発現させ、その細胞抽出液から発現タンパクを精製し、そのDBH活性およびTBH活性の検出を試みた。DBHを発現させた細胞では両酵素活性が確認されたが、予想に反して、DBH-LP2やDBH-LP遺伝子を発現させた細胞ではDBH活性やTBH活性は検出されなかった。以上の結果から、DBH-LPおよびDBH-LP2は、DBHとは異なる機能を有する酵素タンパクであることが強く示唆された。一方、DBH-LP2の機能を推測するツールとして用いるため抗DBH-LP2抗体の作製を試みた。マウスDBH-LP2のC末付近のオリゴペプチドに対するポリクローナル抗体をウサギで作製し、アフィニティ精製を行った。得られた抗体は、ウェスタンブロット法を用いた解析により、発達した乳腺組織に含まれる約40kDのタンパクと特異的に結合した。DBH-LP2の推定分子量は約68kDであり、抗体が認識するタンパクがプロセシングにより生じたDBH-LP2の断片なのかあるいはDBH-LP2とたまたま構造が類似していた別のタンパクなのかは、今後明らかにする必要がある。また、TH・DBH・DBH-LP・DBH-LP2・AADC・PNMTのmRNAの発現をPCRにより調べた。DBH-LPを除いた他の酵素のmRNAは、乳腺での発現が確認された。このうち、乳腺組織におけるDBH-LP2・AADC・PNMTのmRNAの含量は、比較的多いことがわかった。とくに、DBH-LP2の発現は、プロラクチン刺激の前後で大きな変動をみせ、DBH-LP2遺伝子の発現がプロラクチンにより誘導されることが確認された。乳腺組織内におけるDBH-LP2発現分布を、in situ hybridization法により調べたところ、乳腺腺房の腺上皮細胞において発現していることが判明した。他のカテコールアミン合成関連酵素遺伝子の発現分布の解析については、上述したようにDBH-LP2がDBH活性を持たずカテコールアミン合成との関連が不明瞭である故、今回は実施を見送った。以上、DBH-LP2の機能は依然として不明であるが、その解明のための研究環境は整いつつある。一方、カテコールアミン合成

関連酵素群の発現に対するプロラクチン(PRL)の影響を、乳腺上皮・間質の初代培養細胞およびHC11細胞株において調べた。その結果から、PRLは乳腺の上皮細胞に働いてチロシン水酸化酵素(TH)およびMOXを発現する細胞を分化させ、その上皮細胞で産生されたカテコールアミンは、間質の脂肪分解などにはたらき、間質から上皮に脂質栄養が分配される、といった上皮・間質の相互作用が示唆された。他方、PRLは上皮・間質のDBH発現の減少に働いたことから、発達した乳腺以外の組織では、PRLはカテコールアミン産生を抑制して脂肪蓄積に寄与する可能性が示された。そのほか、本研究によりCBP90やC型アルドラーゼなど、従来は中枢神経系でのみ発現することが確認されていたタンパクが、発達した乳腺上皮で機能していることが明らかとなり、乳腺が中枢神経系で働く遺伝子セットを利用して形成された進化の歴史が示唆された。
乳癌の浸潤・転移における非線維性コラーゲンのタイプ別の役割の解明

癌は癌細胞と間質組織からつくられ、癌の進展にはその周辺環境が重要な役割を果すことが分かってきています。私たちは、浸潤性乳癌と非浸潤性乳癌ではその間質に発現する非線維性コラーゲンのタイプが異なることを発見しました。試験管下での解析により、間質線維芽細胞では癌細胞あるいは周辺環境からの刺激により14型コラーゲンの発現が低下することを明らかにし、12型コラーゲンとは発現制御機構が異なっていることが示唆されました。また、間質中の非線維性コラーゲンのタイプは乳癌の動態へ影響を与えませんでした。間質の非線維性コラーゲンタイプの変化は、癌周辺環境に存在する癌細胞以外の細胞の動態に影響するのかもしれません。1型コラーゲンゲル中、ゲル上での浸潤性、非浸潤性乳癌の細胞株の(3次元)培養の予備実験を行った。本実験では、12型、14型コラーゲンを発現する線維芽細胞との共培養を行い、特性の異なる乳癌の浸潤性への影響を解析する予定であり、解析可能な培養条件の確立が必要であるため、培養道具を工夫することで目的に沿った実験系を構築した。研究に使用する間質細胞について、購入することができる乳腺由来の細胞株は数が少なく、乳癌関連線維芽細胞細胞株は調べた限り販路にない。そこで、ATCCより乳癌関連細胞集団を取得し、そこから線維芽細胞を単離した。本細胞は今後、特性解析を行う必要はあるが、乳癌関連線維芽細胞として使用できるのではと考えている。12型、14型コラーゲンの発現ベクターの作成作業を行っている。本遺伝子の発現用ベクターとして販売されているものは未完全なcDNAをもつものがほとんどであり、唯一完全長を含むものは高額であるため、自身での作成を行っている。また、本遺伝子の大きさゆえか強制発現系を用いた報告もなく、機能解析がほとんど進んでいないため、発現系を用いた解析には意義があると考える。本年度は、乳癌組織で見られる分子状態(結果)へ至る道筋をin vitroで追うことを目標とし、研究を進めた。乳癌細胞株(MCF-7, MDA-MB-231)および乳癌組織由来線維芽細胞(Hs742-TF)について、様々な培養条件下における細胞特性(形態、運動、分子的な特徴)について解析を行った。本研究の発露は、プロテオーム解析により、浸潤癌間質で12型コラーゲンの、非浸潤癌間質で14型コラーゲンの特徴的な発現が見られたことである。本年度は、乳癌細胞-間質細胞間の作用に注視し研究を進めた。乳癌細胞のコンディション培地を用いたHs742-TFの培養を行った結果、両コラーゲンの発現が若干減少した。プロテオーム解析の結果、浸潤-非浸潤癌間質間で発現差が確認できた他の遺伝子(FN1, DCNなど)を被作用の指標とし、幾通りかの培養条件における解析を行っている。間質細胞におけるコラーゲン発現とその乳癌細胞への影響を解析する。まずshRNAにより12型、14型コラーゲン発現をノックダウンしたHs742-TFを作成した。遺伝子導入は、レトロウイルスを用い、ノックダウンの可否は、培養培地を用いたドットブロット法により確認した。12型、14型コラーゲンは線維性コラーゲンと共存することで機能性を発揮するとされている。そこで、1型コラーゲン包埋培養時の乳癌細胞に対する間質細胞からの作用を調べることにした。乳癌細胞はスフェロイドの形状で包埋培養を行うこととしたため、まずスフェロイドの形成条件を決定した。包埋培養環境下へのHs742-TF培養培地の単純添加の有無では乳癌細胞スフェロイドの振る舞いに差はなかった。現在、様々なHs742-TF培養培地の回収条件、添加条件での解析を行っている。加えて、添加培地中の12型、14型コラーゲン発現の有無による乳癌細胞への影響を調べている。当年度は、既存細胞株および、作成したノックダウン細胞株を用いて、線維芽細胞-乳癌細胞間の相互作用についてのin vitroでの解析を行った。本解析からは今のところ明瞭な結果は得られてはいないが、今後の解析の足掛かりを得られたと考えている。一方、予定していた、12型、14型コラーゲン過剰発現(線維芽)細胞の作製は、cDNA塩基長が大きく変異修正に時間がかかりすぎるため中止し、ノックダウン細胞での解析を行うことにした。また、ヌードマウスへの移植実験についても、移植予定であった細胞の作製を中止したことにより実施しなかった。全体の達成度としては6割程度であると考えている。近年、癌細胞と間質の相互作用が注目されている。我々は、浸潤性乳管癌と非浸潤性乳管癌の間質の網羅的プロテオーム解析から、浸潤癌では12型コラーゲンが、非浸潤癌では14型コラーゲンが有意に上昇していることを発見した。12型、14型コラーゲンは非線維性コラーゲンに分類される。この発現の違いは、癌細胞の周辺に存在する非線維性コラーゲンのタイプが、癌の浸潤に関与することを示唆する。

乳管癌における非線維性コラーゲンの変化が癌の浸潤を促進するという実験仮説の下、本研究では、周辺環境から癌細胞への影響、癌細胞からの間質への影響の2つのベクトルで癌浸潤と間質の関係を明らかにしようとした。12型、14型コラーゲンをノックダウンした線維芽細胞と乳癌細胞株との共培養により、周辺環境に存在するコラーゲンタイプと癌細胞の振る舞いの関係を調べた。使用した線維芽細胞は、両コラーゲンが発現していることを確認している。コラーゲンIゲルを利用した三次元培養によって様々な条件での共培養を行ったが、線維芽細胞の非線維性コラーゲンの発現の違いにより癌細胞の振る舞い(増殖、浸潤性)に違いは見られなかった。癌細胞から間質細胞への影響を考えるにあたり、調査対象を線維芽細胞の発現にしぼり解析を行った。解析には分化段階の異なる2種類の線維芽細胞を使用し、非線維性コラーゲンの発現に関わる因子の検索を行った。結果、分化段階に関わらず、ウシ胎児血清刺激により14型コラーゲン発現が抑制されること、筋線維芽細胞化が進行した細胞ではTGFB刺激により14型コラーゲン発現が抑制されることが明らかとなった。このことは、癌の発生、進展の過程で線維芽細胞の分化とコラーゲン発現制御が別のメカニズムで行われていることを示唆する。癌は癌細胞と間質組織からつくられ、癌の進展にはその周辺環境が重要な役割を果すことが分かってきています。私たちは、浸潤性乳癌と非浸潤性乳癌ではその間質に発現する非線維性コラーゲンのタイプが異なることを発見しました。試験管下での解析により、間質線維芽細胞では癌細胞あるいは周辺環境からの刺激により14型コラーゲンの発現が低下することを明らかにし、12型コラーゲンとは発現制御機構が異なっていることが示唆されました。また、間質中の非線維性コラーゲンのタイプは乳癌の動態へ影響を与えませんでした。間質の非線維性コラーゲンタイプの変化は、癌周辺環境に存在する癌細胞以外の細胞の動態に影響するのかもしれません。当年度は、乳がん手術検体の乳癌組織より乳癌細胞、間葉系細胞の初代培養を行い12型および14型コラーゲンの発現細胞の複数取得を行う予定であったが、予定を変更し細胞株を用いたin vitroでの解析を先んじて行うことにした。乳癌細胞株の2つのタイプのコラーゲンの発現を定量的PCRとウエスタンブロット法により確認し、使用する細胞株を検索し、1型コラーゲンゲル中、あるいはゲル上での(3次元)培養の予備実験を行い、その後の解析に耐えうるであろう培養法(条件)を決定した。また、研究に使用する線維芽細胞について、ATCCより取得した乳癌関連細胞集団より単離した。2種のコラーゲンの遺伝子導入を行うためのウイルスベクター作成を行っているが、その大きな遺伝子サイズによって12型コラーゲンでの作成作業が遅れ、完了していない。予定していたshRNA発現ベクターの作成は、過剰発現系の構築後に作成する。予定を変更したが、細胞に関する準備は予定通り整った。しかし、発現系の構築に手間取ってしまったため、全体の達成度としては8割程度であると考えている。これまで、乳癌組織由来の線維芽細胞を用いて、間質系細胞におけるコラーゲン発現と乳癌細胞の関係性をin vitroで解析してきた。今後は、新たに準備した正常乳腺由来線維芽細胞においても同様の目的で解析を行っていく。解析については、主として形態、行動観察を行い、分子的なアプローチとして、qPCRによる発現解析、アレイ解析を予定している。また、コラーゲンをノックダウンした線維芽細胞と乳癌細胞のヌードマウスへの共移植により、コラーゲン環境と癌浸潤の関係性を調べていきたい。発生学発現系の構築作業を終了後、1線維芽
代謝異常とエイジングを結ぶ新たな分子機序の解明-Klotho研究からのアプローチ

αKlothoはNa,K-ATPase(NaK)やFGF23・FGF受容体との結合を介して個体の体液カルシウム恒常性制御における中心的役割を担うことが明らかとなってきた。一方、αKLとアミノ酸配列上高い相同性を有するβKlotho(βKL)は、肝臓、脂肪組織、膵臓に発現を認め(Mech Dev 98:115,2000)、肝臓における胆汁酸合成酵素cyp7alの遺伝子発現調節に関わること(J Clin Invest 115:2202,2005)が知られている。本研究では、βklotho遺伝子欠損マウスを用いた実験により、FGF19による肝臓でのcyp7alの遺伝子発現抑制にはβKLが必須であることをin vivoで初めて証明し、KlothoとFGF19,23ファミリーによる協働的な代謝調節メカニズムの提唱に成功した(Tomiyama et al.in revision,2009)。さらにβKLが最も高いレベルで発現する臓器が脂肪組織であること、in vivroの分化系において脂肪細胞分化に伴いβKLの発現が著しく増加することから、マウス白色脂肪組織に着目してβKl結合分子の探索を行った。現在、脂肪組織の細胞膜分画を抗βKL抗体で免疫沈降し、共沈物を質量分析法により解析することで個体の組織においてβKLと結合している内因性膜分子の同定に成功しつつある。本研究の結果を踏まえた検討により今後Klothoファミリー分子による代謝制御システムの全貌が解明されることが期待される。
低出力CO⊆レザーの心大血管手術への応用

本研究の目的:乳幼児心血管手術後の遠隔期合併症として吻合部の瘢痕性狭窄が、体成長に伴い相対的に増強される懸念が指摘されている。これは1)狭窄の程度が心血管径の断面積に反比例して臨床像の増悪を来す。2)再手術の危険は多く、必然的に合併症、副損傷の頻度も増す。従って瘢痕化を極力防止し吻合部の成長可能な方法の開発の意義は大きいと言える。初年度:種々なレーザーが医療に導入されてきたが、最近開発された低出力炭酸ガスレーザーを吻合に用いた。【CO_2】レーザーの特徴は組織透過性が低く、理論的には血管外膜側からの照射により、内膜損傷を来さず、中膜、外膜のコラーゲン線維を変性再配列させることで吻合可能性であるとされている。組織間の接合と減張を目的とした単結節吻合を加えるのにとどめ、内膜を温存する縫合をめざした。昨年は急性実験の成果を紙上発表したが、主としてレーザー機器の一部変更と基礎的な急性実験を施行した。本年度は1)川崎病を念頭においた左冠動脈-内胸動脈吻合の生存犬の作成左冠動脈-内胸動脈の端側吻合ないしsequential bypassを施行し術後7日目から6カ月例にいたるバイパスを造影することに成功し、これら数頭に組織学的な検討を加えた。昨年5月に冠血行を再建した2頭は術後3カ月目に冠動脈造影を行いグラフトの開存を確認したが、生体の修復機転の最終像と冠動脈の流体的な変化を組織学的に検討するため、手術後1年目をめざして飼育中である。吻合部の成長に関してはratに続いて、小犬の心停止下内胸動脈・左冠動脈吻合術を施行したが、小犬は低栄養と細菌感染を併発し失った。長期生存犬作成をめざす。2)静脈系へのレーザー吻合方法の応用腎臓の移植の模擬実験として腎静脈の下大静脈へ異所性再吻合を施行した。生存犬を暫時屠殺し組織学的な検討を加えた。また門脈圧亢進症をモデルとしたsplenorenal shuntを作成した。臨床像とは血流方向は逆であるが、6カ月までの生存犬を作成検討した。結語:当施設の生存実験犬飼育限度枠の制限がありいまだ統計的な検討から臨床応用への限界、適応への明確な判断は下せない。5月末で1年生存となる実験犬の組織学所見が待たれるが、この間更に1カ月未満の生存犬を作成し統計的な検討を加える。はじめに:幼小児の川崎病などの冠動脈バイパス手術は微細血管吻合手術であり、高度な手技と熟練を必要とする。また遠隔では縫合部位の瘢痕化や成長に伴う相対的狭窄の進行が懸念されるなで成人例に比して問題も多い。

本研究は血管外膜側より低出力【CO_2】レーザー照射により生体のコラーゲン繊維が加熱により融合することを利用し、内膜側での損傷を可及的避け得る忠管縫合の研究開発を試みるもので、小児期冠動脈バイパス手術の遠隔成績向上をめざした。昭和61年度の目標と実績:1)臨床応用可能な低出力【CO_2】レザー発振装置の開発並びに改良であり試作1号機並びに2号機を作製した。先端の作業部位はマジックハンドに類似した多関節型操作端子として開発したが、新生児及び乳児の限られた胸腔内の作業空間では光えねるギー伝達に難点はあるもののファイバー端子への変換が今後の課題である。2)【CO_2】レザー照射部位の組織温度変化並びに深達度をシュミレーションから求めたデータから極細プロリーン糸の温度上昇に伴う強度変化を引っ張り試験にて検討し臨床使用での安全性を確認した。3)実験犬による冠動脈バイパス吻合(急性実験):比較的小型な成犬9頭に右冠動脈、左前下行枝に端側吻合ないし人口血管によるinterposeを行った。冠動脈径は平均1.2mmと小口径にも関らず、これらの開存率は良好であった。4)病理組織学的検索:レーザ照射による血管の組織学な変化をホルマリン固定、ギムザ染色で標本を作成した。縫合部のadaptationが不完全な場合は層々吻合とならず内膜側は血管内腔へ突出など手技上の習熟も必要とした。
培養セメント芽細胞を用いたセメント質の再生

現代の歯科医療において、全身性の基礎疾患や歯科疾患(う蝕や歯周疾患)、外傷により欠損した歯や歯質は、金属、陶材、レジンといった人工材料でできた補綴装置(クラウン・ブリッジ、可撤性床義歯、インプラント)により置換されている。しかしながら、これらの人工材料には、天然の歯の組織に比較し、生体親和性・審美性、機能性といった点において様々な課題が残されている。本研究において、我々は生体親和性の高い材料の開発とそれらの補綴歯科臨床への応用に近づけるその一歩として、細胞組織工学的手法を用いたセメント質の再生および補綴装置への利用を目的として実験を行ったので報告する。本年度はブタ智歯歯根部より単離したエナメル蛋白質(アメロジェニン、アメロブラスチンなど)を発現する上皮様細胞を培養増殖させた。同時に増殖する間葉系細胞は培養皿への接着能の差を利用し酵素処理により排除した。またこの増殖した上皮様細胞およびウィルスベクターを導入し不死化したマウスセメント芽細胞を1週間共培養した。共培養した細胞群をコラーゲン担体およびハイドロキシアパタイト担体に播種し三次元培養を試みた。上皮様細胞およびセメント芽細胞の単独培養後、担体に播種した群と共培養群における遺伝子や蛋白質の発現解析を行った結果、共培養群はセメント芽細胞の単独培養群と類似した発現パターンを示したが、上皮様細胞群とは異なった。さらなる遺伝子および蛋白質の解析が必要であると思われる。日常の歯科補綴臨床において、義歯の鈎歯、パラファンクションによる外傷歯、インプラントの対合歯に対し、異常な外力が歯根に加わり、歯周組織が損傷する症例、特にセメント質の剥離や吸収する症例によく遭遇する。そこで本研究では、歯の発生において歯胚の歯原性上皮細胞に着目し、これを利用したセメント質の組織再生に取り組んでいる。昨年度、この上皮細胞とセメント芽細胞株をコラーゲンあるいはハイドロキシアパタイトキャリアに播種し、in vitroにおける細胞の遺伝子および蛋白質発現について解析を行った。本年度はさらにこの細胞-担体複合体を免疫不全ラットの腹腔内に移植し、再生組織の組織解析を行った。HEおよび免疫組織解析の結果より、移植15週目に骨および軟骨様組織の再生が確認できた。しかしながら、象牙質やセメント質、歯根膜などの組織形成は認められなかった。このことから、細胞のキャリアの種類、キャリアへの細胞の播種方法および移植期間について更なる検討が必要であることが示唆された。日常の歯科補綴臨床において、義歯の鈎歯、パラファンクションによる外傷歯、インプラントの対合となる天然歯に対し、異常な外力が歯根に加わり、歯周組織が損傷する特にセメント質の剥離や吸収する症例によく遭遇した。そこで本研究では、エナメル上皮とも関連性の深いマラッセ上皮細胞に着目し、これを利用したセメント質の組織再生を考えている。歯のセメント質の発生起源は歯小嚢細胞であり、歯根象牙質完成ごに歯小嚢細胞が歯根象牙質上に遊走、そして接着してからセメント芽細胞に分化する。この歯小嚢細胞の遊走にはマラッセの上皮細胞との上皮ー間葉相互作用が関わっているといわれている。この時期にマラッセ上皮細胞からアメロジェニンやアメロブラスチンといったエナメル蛋白が発現していることが知られている。本年度には、まず予備実験としてヒトに極めて近い種とされるブタ智歯歯胚の組織標本を作製し、免疫染色により上皮鞘のエナメル蛋白の発現を確認した。またヒトやマウスにおいてすでに報告されている上述のエナメル蛋白遺伝子発現以外にマイクロアレイ法を行い固有な遺伝学的特徴を解析した。ブタ新鮮下顎骨から採取された歯小嚢組織から組織培養により得られた細胞コロニーは、cDNAマイクロアレイ法により間葉系幹細胞と同様な遺伝学的特徴を持つが固有の遺伝子マーカーの発現は認めなかった。またウェスタンブロット法により蛋白質発現の解析を行った結果、エナメル蛋白質の発現を認めた。智歯歯根より単離された上皮様細胞の同定および不死化したセメント芽細胞との共培養によるセメント質特異遺伝子群の解析に時間がかかっており、in vivo実験への導入が遅れている。採取された歯小嚢組織から組織培養により得られた細胞コロニーは、cDNAマイクロアレイ法により間葉系幹細胞と同様な遺伝学的特徴を持つが固有の遺伝子マーカーの発現は認めなかったため、遺伝子学的解析によるマラッセの上皮遺残細胞の単離に至っていないため。in vivo解析にスムーズに導入できるように、智歯歯根部より単離された上皮様細胞と不死化したセメント芽細胞の共培養条件(培養日数、培養システムなど)検討を行い、セメント質特異遺伝子の同定を進める。また組織再生に最適な担体(キャリア)の選択とin vivo解析を行っていく予定である。cDNA