hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオインフォマティクスに立脚したテロメア非コードＲＮＡの機能解析

一方、当初はH25年度の課題としていたテロメア伸長時のTERRA発現変化については、今年度、前倒しで基本データを取得することが出来た。したがって、現在までの達成度としては、おおむね順調に進展していると判断できる。TERRAとその他各種テロメア関連因子のfingerprintを比較し、TERRAの発現と有意な相関を示すバイオパラメータをリストアップする。テロメア関連因子以外の遺伝子・蛋白質発現のFingerprint Databaseについても相関解析を実施する。これらにより、TERRAと細胞内イベントの機能リンケージを予測する。同定されたバイオパラメータが何らかの遺伝子・蛋白質発現であった場合、siRNAの核内導入を検討したうえでTERRAの発現をsiRNAでノックダウンし、同因子(以下、X因子とする)の発現に対する影響を調べる。また、X因子を過剰発現もしくはノックダウンし、TERRA発現変化を調べる。X因子がキナーゼなどの酵素で阻害剤が入手可能な場合は、同剤によるTERRAの発現や局在への影響も調べる。本法で同定されるバイオパラメータ間の相関関係は、双方の因子の複合体形成を予見することも多いことが経験上明らかなため、RNA免疫沈降法により、TERRAとX因子の結合の有無についても検討する。結合が確認された場合は、X因子の各種欠失変異体を作製し、TERRAの結合部位を同定する。これらの検討により、TERRA結合能を消失した変異型X因子を細胞に発現させたときの形質変化を観察する。TERRAは主にテロメアで機能することが予想されるので、テロメア上でDNA損傷応答が起きていないか、免疫FISH法で調べる。このとき、前年度の検討で同定されたX因子とその機能経路の関与を勘案しながら実験を進める。さらに、細胞増殖・細胞死・細胞老化など増殖関連の形質を検討する。物品費(試薬・消耗品)100万円、旅費(学会参加費)30万円、人件費・謝金15万円、その他5万円
高度な故障耐性を有する分散システム実現のための基礎研究

分散システムの長所の一つは、一部の計算機や通信リンクが故障しても、分散システム全体の機能は停止せず、正常な部分でサービスを継続できることである。そのようなサービスを実現するためには、故障耐性のある分散アルゴリズムの設計/開発が必要である。本研究では、故障耐性のある分散アルゴリズムの中でも、一時故障に対する高い故障耐性からその実用化が期待されている自己安定アルゴリズムについて研究を行い、以下の結果を得た。1.永久故障に対する故障耐性を有する自己安定アルゴリズムに関する研究:自己安定アルゴリズムは一時故障に対する高い故障耐性を有するが、一方、永久故障に対する故障耐性を考慮していない。自己安定アルゴリズムを実用化するには、永久故障に対しても故障耐性を有する自己安定アルゴリズムの設計/開発が必要である。永久故障に対する高い故障耐性を実現する方法として、無待機アルゴリズムが有望視されている。本研究では、無待機アルゴリズムに関する研究を行い、時計合わせ問題に対して、同期時間最適な無待機アルゴリズムの設計を行った。2.小規模で局所的な一時故障からの復旧を効率よく行なう自己安定アルゴリズムに関する研究:自己安定アルゴリズムが解を求めて安定している状況で、計算機の新たな一時故障によりネットワーク状況が変動すると、自己安定アルゴリズムは、新たに解を求める。実際のネットワークでは、このような一時故障によるネットワーク状況の変動は、小規模で局所的なものがほとんどである。本研究では、小規模で局所的な変動に対して、効率よく解を求めて安定する強安定アルゴリズムに関する研究を行い、リングネットワークでの相互排除問題に対して、巡回ラウンド数最適な強安定アルゴリズムの設計を行った。
軟骨細胞分化におけるヘパラン脱硫酸酵素の役割と変形性関節症への治療応用

変形性関節症の変性軟骨でよく見られる軟骨細胞凝集塊には幹細胞の特性を有する細胞が多く含まれ、自己修復の期待が持てると考えられた。軟骨細胞が成熟していく過程(軟骨分化)で細胞凝集塊でも発現が見られたSulf-1が重要な役割を担っており、特に、軟骨変性に重要な役割を示すMMP-13の発現をin vitroで抑制していたことがわかった。マウスを用いたin vivoでも同様の結果が得られ、その機序としてはFGF2/Erkシグナルが関与している可能性が示唆された。Sulf-1は変形性膝関節症の新規治療薬として今後の検討が期待できる。本研究では、マウスOAモデルにおけるSulf-1の軟骨変性抑制の可能性を検討している。【方法】8週齢野生型マウス(C57BL/6)の右膝に処置を行った(n=60)。内側半月脛骨靭帯を切離したOAモデル(OA群)と、関節包のみ切開したコントロール群(C群)を作成した。PBS 10μl、もしくは1ng、10ng、100ngのSulf-1を含んだPBS 10μlを術後に計4回、関節内に投与した。初回投与は処置当日に行い、その他の3回は1週ごとに投与した。手術から4週間後に屠殺し、組織学的な検討を行った。軟骨変性の評価は、Safranin-O染色を用いたMankin scoreでおこなった。また、免疫染色を行い、陽性細胞率を算出することで、Sulf-1関節内投与の作用機序を検討した。【結果】C群におけるMankin scoreは、各注射間で有意差はなかった。一方、OA群ではPBS投与でMankin scoreが7.1であったのに対し、Sulf-1の投与により4.3 (1ng)、4.4 (10ng)、4.1 (100ng)とSulf-1による軟骨変性抑制効果がみられた。しかしながら、軟骨抑制効果における明らかなSulf濃度依存性はみられなかった。STRO-1、Ki67やSOX9の発現はS群、D群ともにSulf-1の投与による変化はみられなかった。OA群においてFGF2とMMP-13の発現はSulf-1の投与により、有意に抑制されていた。【まとめ】Sulf-1の投与濃度や軟骨細胞に対する作用などの更なる検討を要するが、Sulf-1関節内投与は軟骨変性抑制効果を示しており、新規OA抑制薬として期待される。マウス膝関節の靭帯を切離して変形性関節症(OA)モデルを作成しそれらにSulf-1注射を異なる3つの濃度で行った。結果、OAモデルにおいてSulfは軟骨変性を抑制していることがわかった(in vivo)。メカニズムを探るべく、Sox9, MMPー13,など免疫染色を行ったところ異化促進が見られることがわかった。現在、マウスの軟骨細胞を平面培養し、Sulf-1を添加して24-48時間後に変化している発現因子を検討してる。同時に、MMP-13が高発現している要因としてFGF2/Erk signalが亢進しSulf-1が制御していることが徐々にわかってきている。今後、Sulf-1の適正濃度、添加に伴う軟骨細胞死などの副作用、添加によるsignal変化など、上記の予備実験データを明確にしていく。ヘパラン硫酸脱硫酸酵素(Sulf)の変形性膝関節症への効果を検討するため、マウスの半月板を不安定にさせた変形性関節症モデルを作成した。そのモデルに、Sulf1を週1回関節内注射した群とPBS投与群を作成し、4週後に組織学的検討を行った。その結果、Sulf投与群では関節軟骨の維持が監察された。また、免疫染色にてMMP13の発現がSulf投与群で抑制されていることが確認できた。上記のメカニズムを探るべく、ATDC5細胞を用いて検討を行った。まず、軟骨分化を3週間誘導した際の、Sulf1の発現はreal time PCRにて分化の進行とともに減少していくことがわかった。つぎに軟骨分化した細胞にIL1刺激下にSulfを投与して、MAPK系のシグナルであるphosho-Erk1/2, P-38,炎症シグナルのNF kappaの発現をwesten blottingで行ったところ、これらのシグナルの活性抑制が軽度見られた。逆にSulfノックアウトマウスから採取した軟骨細胞にIL1を刺激して同様のシグナル伝達を検討したところSulf1KOでシグナルの活性化が顕著にみられた。これらのことから、Sulf1はMAPK,や炎症性シグナルを介して変形性関節症の抑制の可能性を秘めていることがわかり、現在、追加実験、論文報告準備中である。軟骨動物実験は順調に行われているが、western blottingなどin vitroの研究をすすめていく予定である。MSCを用いた軟骨分化については残念ながら進んでいない。

それはMSCの分化誘導が安定せず培養による分化がすすまなかったためである。しかしながら、in vivoの実験は予定以上にdataがでてきており、いい面と悪い面があった。in vitroの研究を進め、Sulf-1の関節変性抑制効果を細胞レベルで検討し、論文投稿予定である。MSCの変わりに軟骨細胞分化誘導株(ATDC5)を理化学研究所と提携して使用予定である。Sulfと細胞死(apoptosis, autophagy)についても検討を深めて、変形性関節症の病態の一つである、細胞数の減少について病態を明らかにしていく予定である。マウスへのSUlf関節内注射の実験は終了し、Sulf関節変性抑制効果が得られた。一方そのメカニズムを探るべく、軟骨分化におけるSulf発現変化を並行しているが、思うような結果が出ていなかった。また、蛋白レベルの研究でwestern blottingを行っているがMMP-13の発現の同定に難渋しており、思うようにすすんでいない。western blottingは引き続き行っている。FGF/Erkのcell signalingを焦点にMMP-13の発現を見ていたが、それと同時にIL-1/p38 MAPK pathwayも並行して確認していく。MSC使用したpellet作成に難渋している。MSCを購入して行っていくと同時に、マウス軟骨細胞永久株(ATDC5)を使用して軟骨分化を誘導した時のSulfの発現変化をrealtime PCRで検討している。それらの結果から、Sulfの軟骨変性におけるメカニズムは同定できると考えている。前年度、マウスを用いたinvivoの研究を主にすすめたために、約71万円のin vitro研究に使用予定の研究費を今年度に繰り越しを申請した。今年度は、ATDC5株を購入して軟骨分化誘導を成長因子を用いることで促進し、これらの細胞を経時的に採取して、SulfやSulfに影響を受ける因子に対してrealtime PCRを行っていく。細胞培養、成長因子、realtime PCRなどに昨年繰り越し分の費用を充てていく予定である。FGF2/Erk MMP-13のシグナル活性にSulfが関わっていることをwestern blotting、免疫染色などで明らかにする。Sulfと細胞死についてLive dead assayを用いて、apoptosis, autophagyを中心に検討を深めていく。
説明文理解過程への視覚的イメージの視点による影響に関する時系列的な検討

申請者の前研究(「物語理解過程への視覚的イメージの視点による影響に関する時系列的検討:平成7年度科学研究費補助金交付)において,物語によって喚起される視覚的イメージには個人差があり,個人内では比較的一貫性がある。また,視点を転換する際にはそれ以外よりも時間がかかり,心理的な操作がなされていることがわかった。本研究は,前研究のテキストのジャンルをかえ,より一般的な視覚的イメージの視点の影響を検討することである。予備調査として,説明文のシーン分割に関する妥当性を検討した。その結果,分割されたシーンには意味的なまとまりがあり,かつ,他シーンとは独立していることが認められた。次に,被験者として大学生を用い,1シーンの聴覚刺激を提示した後に,そのシーンに対応した視覚刺激を提示した。視覚刺激は,文章の視点がおかれている空間的位置から見た情景をコンピュータ・グラフィックス・ソフトで作成した。被験者の課題は,聴覚提示された説明文の1シーンによって喚起された自分の視覚的イメージと,提示された視覚刺激との異同を判断することである。その反応のパターンと反応時間(ミリ秒単位)を計測した。その結果,物語を材料とした実験と同様に反応パターンに個人差があり,視点の転換の際に,反応時間がそれ以外の場合よりも長くかかった。しかし,全般的に視覚的イメージの視点を操作するには,物語よりも説明文の方がより時間がかかった。テキストのジャンルによる視覚的イメージの喚起のしやすさが影響を与えていると思われる。このような談話の種類による影響について,様々な種類のテキストや会話といった幅広い材料を検討することにより,今後明らかになるであろう。
組織幹細胞におけるゲノム安定性の制御

ゲノムDNAは、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威に常に曝されている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、長い潜伏期間の後、発がん等重篤な疾患を引き起こす。損傷応答機構はDNA損傷に対抗する生体防御機構であり、ゲノム維持に本質的な役割を果たす。損傷応答研究は、生存率や特定の応答経路への作用を細胞レベルで解析するのがこれまでの常套手段であり、突然変異をそのエンドポイントとする研究はごく少なく、しかも特定遺伝子におこる変異を検出する系が用いられ、ゲノムレベルでの解析はほとんどされていなかった。本申請研究では、ゲノム変異(点突然変異及び染色体レベルでの構造変化)をエンドポイントとして内因性変異因子や環境変異原に対する細胞の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は以下の研究成果を得た。1)本申請研究においてrev3遺伝子変異体では大腸がんが年齢依存的に全個体で発症する事を見いだした。培養細胞およびがん細胞を対象に、染色体、分子およびゲノムレベルでの解析により発症のメカニズム解明を目指した。培養細胞において1通常の培養条件でDicentric-, Tricentric-, Ring染色体,クロマチドBreakeなどの染色体異常が高頻度に誘発されること、2ガンマH2AX-fociが高頻度に形成されること、を見出した。以上の結果は、本変異体では二重鎖切断が高頻度に誘発されている事が示している。また、腹腔内に播種しているがん細胞のゲノム解析を行い、3がん細胞で生じている変異を同定するとともに、4がん細胞で生じているSCNAを同定した。2)次世代DNAシークエンサー(NGS)を活用したゲノム変異解析系を樹立し、rev1遺伝子変異体においてDNA損傷によりLOHが高頻度に誘発される事を見いだした。更に、より詳細な解析を行うため単一細胞由来のLOH解析を行った。本研究の格子は,1)損傷応答機構解析系の確立、2)ゲノム変異解析系の確立,3)体組織レベルでの解析系の確立,の3点からなる。1)に関しては、TALEN, CRISPRのゲノム編集技術によりrev3を含むTLSポリメラーゼや損傷応答制御に関する遺伝子変異体を既に作製し,その表現型解析が順調に進んでいる。2)に関しては、NGSによるゲノム変異解析ツールを確立し、これを用いた解析結果からDNA損傷誘発によるゲノム変異について新たな知見が得られつつある。3)に関しては、幾つかの可視化系統を既に確立している。この様に、当初計画は順調に進められている。これに加え、rev3変異体において、年齢依存的に浸透率100%で大腸がんが発症する事を見いだした。ヒト大腸がんに於いては、ミスマッチ修復欠損等による点突然変異(PM)増大が要因となる事が知られているが、これ等はヒト大腸がんの10%程度であり、大部分を占める残りのゲノム変異は染色体レベルでの異常(CIN)であると考えられている。染色体異常を同定するとともに、二重鎖切断DSBの誘発を確認できている。また発がんに関与する遺伝子の同定も進めており、当初予定を超えた成果が得られるものと考えられる平成27ー30年度の成果の基づき,平成31年度においては以下の方針で研究を進める。1)NGSを用いたゲノム解析系を確立し,培養細胞レベルでの解析系から新たな多くの知見が得られつつある。この解析を更に押し進め,ゲノム変異誘発に関与する遺伝子の機能からメカニズム解析を進める。解析法としては、Chip-seqおよびEnd-seq法を用い、一重鎖領域および二重鎖切断場所の塩基レベルでの同定を行う。配列レベルからのメカニズム解明を行う。2)既に、体組織幹細胞可視化系統をいくつか作製している。平成30年度から継続して試みている手法であるが、これ等の系統を用い体組織細胞の分取技術の確立を行う。3)rev3変異体の大腸がん細胞のゲノム解析を行う。平成30年度で予備実験を終了しており、本年度はサンプル数をさらに増やした解析を行う。我々のゲノムDNAは,常に、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威にさらされている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、やがて長期潜伏期の後、発がん等の重篤な疾患をひきおこす。この様な晩発影響の標的細胞として「組織幹細胞」が重要な役割を果たしている。本研究では、「組織幹細胞」に誘発される「ゲノム不安定性」を直接検出するin vitro, in vivo解析系を構築し、環境変異源に対する「組織幹細胞」の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は以下の成果を得た。1)体組織レベルでの損傷応答解析には関与する遺伝子の変異体が必須である。これまで化学変異原ランダムmutagenesis (TILLING法)により変異体作製を行ってきたが、更にゲノム編集技術を導入し網羅的損傷応答関連遺伝子変異体作製を行った。損傷乗越えDNA複製酵素(TLS polymerase)は損傷応答によるゲノム変異誘発の最大因子であるが、メダカにおいてこれ等TLS pol遺伝子群(Rev3, Rev7, PolH,P oiI, PolK, PolN, PolQ)変異体を網羅的に作成した。2)損傷応答を,その最終産物である突然変異誘発としてゲノムレベルで検出する事を目指している。エキソーム解析で得られる情報には限りが有り、全ゲノム解析を行う為のアルゴリズム樹立を行い、培養細胞でのゲノム解析が可能である事を明らかにした。3)個体レベルでの組織幹細胞解析系には、高効率でしかもゲノムレベルでの遺伝子導入法の樹立が必須である。これまでに開発した遺伝子導入法を改変し,高効率遺伝子導入を可能にした。

本研究の格子は、1)体組織損傷応答解析系の確立、2)損傷応答をゲノム変異として検出する系の確立、3)新たな組織幹細胞解析系の確立、の3点からなる。1)に関しては、損傷応答に関わる遺伝子変異体の作成がまず必要となる。我々は既にTILLING法により多くの損傷応答変異体を樹立しているが、平成27年度においては、これに加えゲノム編集技術を用い網羅的変異体作成を行った。目標は充分達成できたと判断している。2)に間しては、次世代シークエンサー(NGS)による誘発突然変異解析の方法論確立となる。本申請では、メダカあるいはラット(あるいはヒト)のゲノムが対象となる。特にメダカゲノムはヒトに比べ解析データ数が少ないため、より正確な変異同定が必要となる。細胞レベルでの解析が可能になり、目標は充分達成できたと判断している。3)に関しては、トランスポゾンベクターを用いたBAC transgenesisの改良法確立が当面の目標となる。高効率TG作成方の樹立に成功しており、当初目標は達成できたと判断している。我々のゲノムDNAは,常に、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威にさらされている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、やがて長期潜伏期の後、発がん等の重篤な疾患をひきおこす。この様な晩発影響の標的細胞として「組織幹細胞」が重要な役割を果たしている。本研究では、「組織幹細胞」に誘発される「ゲノム不安定性」を直接検出するin vitro, in vivo解析系を構築し、環境変異源に対する「組織幹細胞」の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は、以下の結果を得た。1)平成27年度に作成したRev3, CPDphr, 6-4phr, CryDash遺伝子変異体の個体レベル及び培養細胞レベルの解析をおこなった。Rev3に関してはマウスと異なりviableである事が明らかになり、体組織レベルでの詳細な解析が可能になった。またphr関連遺伝子群については,紫外線応答の詳細な解析から、UV損傷修復にはCPFファミリー群の関与を示唆するデータを得た。2)全ゲノムおよびキャプチャシーケンスからの正確な変異同定に向け、新たな手法EAGLEを開発した。変異解析に広く利用されているGATKに比べて正確な同定ができることが確認できた。更に、メダカのキャプチャシーケンスに適用し、同定結果をサンガー法とPCRで確認したところ、高精度に変異が検出できていることが確かめられた。3)メダカ肝および組織幹細胞の可視化及び細胞移植技術確立のための作業をおこなった。その結果、Fabp10aの5'調節領域2kbおよび5kbを用い、肝臓特異的可視化系統を樹立した。組織幹細胞樹立のために、5種のマーカー遺伝子の5'調節領域を用いて、それぞれの可視化系統の樹立を試みており、Bmi1可視化系統をすでに樹立することに成功した。また、メダカ個体への細胞移植技術確立のために、尾静脈から細胞を注入する方法を確立した。
酵母染色体組換えにおける染色体機能装置の連携

本年は最終年度として以下の成果を得て全体のとりまとめを行った。1.分裂酵母の減数分裂期組換えホットスポットM26におけるクロマチン再編成・DNA切断に関わる因子として、新たにATP依存性クロマチン再編成因子Snf22(特許出願中)を同定した。この遺伝子を破壊すると、M26におけるクロマチン再編成と組換えホットスポット活性が消失した(Yamadaら、EMBO J印刷中)。また、ストレス遺伝子の転写活性化においても同様なメカニズムのクロマチン再編成が重要な役割を果たしていること(Hirotaら、NAR 2004)、転写抑制因子であるTup11とTup12がM26におけるクロマチン再編成の抑制を行っていること(Hirotaら、Genetics 2003)、天然のM26様部位における減数分裂期組換え開始シグナルであるDNA切断の存在、などを明らかにした。これまでの結果から、分裂酵母M26ホットスポット活性化の分子機構の大筋を明らかにした。2.出芽酵母の組換え開始に関わるMre11とSpo11の減数分裂期染色体における分布を、白髭班と共同で高密度ゲノムタイリングアレイを用いて解析した。その結果、Spo11がまずセントロメア領域に結合してからDNA複製に応じて染色体両腕部に再配置すること、Mre11がDNA複製を機にSpo11と同様の局在を示すようになること、DNA切断が導入される時期になると、減数分裂期特異的コヒーシンRec8の分布箇所(相同染色体のコア部分)の両側(ループ部分に相当)に配置されるようになること、などが初めて明らかになった。以上の結果は、これまで不明であった組換え開始のメカニズムにおいて重要な知見を与える極めて貴重な成果である。出芽酵母第3染色体の組換えホットスポット(減数分裂期DNA二本鎖切断箇所)に関するクロマチン構造解析については、今年度目標の半数程度の解析を終えた。その過程で複製開始点ARS310(第III染色体上のDNA二本鎖切断が観察されない染色体ドメイン内で例外的に二本鎖切断が生じる位置に存在)が、その周辺のヌクレオソームの配置やDNA近接性の規定に重要な役割を果たすことを見出した。分裂酵母組換えホットスポットade6M26遺伝子座は、ade6遺伝子座上の点突然変異に起因するcAMP-responsive element(CRE)様配列に、MAPキナーゼやAキナーゼの制御下で性分化誘導に関わるCREB/ATF型転写因子Atf1/Gad7-Pcr1が、配列特異的に結合する事で出現する。本年度、この転写因子がCRE様配列に結合した後、直接的に周辺のクロマチンの再編成を引き起こすことを明らかにした。またこのクロマチン再編成が、減数分裂期のade6M26においては転写の活性化を行わず、組換えの活性化のみを引き起こすことを示した。さらに、M26ホットスポットでのクロマチン再編成が、ストレス応答MAPキナーゼ経路(ヒトSAPK-p38分裂酵母ホモログSpc1)やG蛋白質-cAMPキナーゼ経路、接合型遺伝子座のヘテロ接合性と接合フェロモンシグナル伝達経路(Mei3など)、減数分裂誘起過程の初期遺伝子群(Mei2、Pat1)によって複合的に制御されていることを示した。以上の結果から、組換え活性化が細胞の性分化・ストレス応答のシステムと表裏一体の密接な関係にあることが分子レベルで初めて明らかにされた。本年度は出芽酵母第三染色体の組換え開始点と複製装置の関係、また減数分裂期組換えとDNA複製の連携について解析を行い、以下の結果を得た。出芽酵母第3染色体の複製開始点の一つであるARS310は、break-induced replication(BIR)という有糸分裂期染色体再編成や、減数分裂期組換えの制御への関与が示唆されている。BIRは、HOエンドヌクレアーゼによる染色体切断が契機となって引き起こされる組換え修復型DNA合成であり、RAD51非存在下の条件で顕著に観察される。第3染色体上のBIRの起点はARS310付近の領域になっている。ARS310を欠く場合、BIRは全く観察されなくなるが、ARS310の複製開始因子結合配列を改変してもBIRは正常に起きる。一方、ARS310領域に含まれる200塩基対の配列のみで、BIRが誘起され得る。本年度我々は、ARS310に関する種々の変異株を用いてその周辺のクロマチン構造とBIRの相関を調べた(米国Haber博士と共同研究)。その結果、組換え活性化に必要十分な200塩基対の配列のクロマチン構造における役割を明らかにした。一方、減数分裂期の組換え制御においては、ARS310を除いてもほとんど影響がないことを見出した。減数分裂期の組換え開始は、必ず減数分裂期DNA合成後に起きる。そこで、減数分裂期DNA合成に特異的欠損を示す変異体(clb5.6二重変異株など)を用いて、DNA合成と組換え開始反応の相関を調べた(フランスNicolas博士、オーストリアKlein教授、米国Lichten博士との共同研究)。その結果、減数分裂期DNA合成に依存して、ホットスポット部位におけるクロマチン構造転換やDNA二本鎖切断・シナプトネマル構造の形成が誘導されることがあきらかになった。すなわち、減数分裂期のDNA合成と組換えが共役していることが示された。1.組換え装置と複製装置の連携:複製開始点近傍に存在する組換えホットスポットのクロマチン構造を解析し、複製開始点がホットスポット周辺の開いたクロマチン構造形成に重要な役割を果たすことを明らかにした。

2.組換えとクロマチン再編成装置との関係:分裂酵母の減数分裂期組換えホットスポットade6-M26に見られるクロマチン再編成を詳しく解析し、このクロマチン再編成が有性生殖分化に関わるCREB/ATF型転写因子によって直接的に仲介されること、またストレス応答キナーゼ(SAPK)カスケードやcAMP依存性キナーゼ(PKA)経路、及び数種の減数分裂誘導因子によって制御されていることを発見した(水野ら、Genetics,2001)。またこのクロマチン再編成および組換えを開始するDNA切断反応が、Gcn5によるヒストンH3・H4のアセチル化を介して制御されている証拠を示した。3.組換え開始因子を介した遺伝子発現制御の可能性:DNAマイクロアレイを用いてmre11遺伝子破壊株における全ゲノムの転写プロファイルを分析し、Ndt80転写因子の結合配列をプロモーターに有する一部の胞子形成関連遺伝子において、Mre11組換え開始複合体が転写活性化に関わる事を見出した。また減数分裂期にそれらの転写制御配列近傍にMre11 1が結合することを、クロマチン免疫沈降法を用いてはじめて示した。4.出芽酵母組換え開始部位におけるクロマチン構造の網羅的解析:現在白髭班とともに、DNAマイクロアレイとChiIP on Chipを利用した効率的ヌクレオソーム・マッピング法の開発を進めた。5.二倍体出芽酵母における染色体再編成関連因子:二倍体出芽酵母の有糸分裂期では、DNA合成にともなってDNA損傷が生じる。今回、その損傷がRad50-Mre11複合体や、Rad51組換え酵素などによって修復され、染色体の安定化が制御されている証拠を得た。これらの染色体安定化機構には、Bloom症候群相同遺伝子Sgs1やMsh1ミスマッチ修復因子による制御が重要であることを見出した。また、複製開始因子orc1の変異体を用いた実験から、染色体の不安定化をもたらす要因として、DNA合成時に生じる内在性のDNA傷害が重要であることを示した。1.分裂酵母の減数分裂期組換えホットスポットM26におけるクロマチン再編成・DNA切断に関わるヒストンアセチル化酵素Gcn5が、局所的な組換え活性化に関与することを示した。また、M26ホットスポット周辺のクロマチン構造にRad50およびRad32(Mre11)が作用する証拠を得た。さらに、天然に存在するM26配列におけるクロマチン再編成を確認した。2.Mre11依存的な転写活性化機構が、Rad50やSpo11に依存しないことをDNAチップやレポーター遺伝子を用いて明らかにした。また、白髭班と共同で、Mre11抗体とDNAチップを用いた網羅的クロマチン免疫沈降法を行い、DNA二本鎖切断に先行した切断部位へのMre11の集積を見出した。さらに、出芽酵母ゲノムの発現プロファイル解析から、GC含量・遺伝子長と発現強度の関係を明らかにした。3.Ga14-Spo11融合タンパク質の細胞内導入により、任意のGa14結合部位で減数分裂期DNA二本鎖切断・クロマチン構造転換・組換え活性化の誘導に成功した。4.出芽酵母二倍体細胞におけるヘテロ接合性喪失を引き起こす遺伝的変化の解析を通じ、染色体異常の発生や制御に関わる因子を特定した。その結果。
メイラード反応生成物を指標とした成人病を検知する非侵襲検査システムの確立

互いが架橋関係にある二つの架橋剤を交互に反応させる「シグナル反復増幅法」を用いて,従来法では検出不可能だった一分子レベルの微量タンパク質の検出を容易にした.成人病の指標となるメイラード反応生成物を同手法を用いて効率よく検出するための条件検討を行い,検出時間の短縮化および阻害因子の無害化の手法を確立した.互いが架橋関係にある二つの架橋剤を交互に反応させる「シグナル反復増幅法」を用いて,従来法では検出不可能だった一分子レベルの微量タンパク質の検出を容易にした.成人病の指標となるメイラード反応生成物を同手法を用いて効率よく検出するための条件検討を行い,検出時間の短縮化および阻害因子の無害化の手法を確立した.本原理を用いて標的タンパク質の有無、例えば1分子レベルのアトー(10^<-18>g)を検出することは可能であるが、試験血液サンプル中の極微量の標的タンパク質定量が可能であるか検討を行った。今回、Uptima社のビオチンダイマー(Biotin-PEO6-Biotin、#Q7467A)を使用して検出の高感度化の検討を行ったところ、プレートの検討でビオチンダイマーのストレプトアビジンに対する反応性に問題の無いことが確認できた。しかし、使用したビオチンダイマーとストレプトアビジンを反応させTSKgel 3000SWxlカラムを接続した島津CL-10Aを用いて重合体形成効率を確認したところ、ビオチンダイマーを介したストレプトアビジンの定量的な重合体形成が認めなかった。この結果はビオチンダイマーの2価のビオチンが1分子のストレプトアビジンに結合(分子内架橋)し、重合体形成を阻害していると考えられた。従って本原理による高感度化の今後の課題としては、ストレプトアビジンの分子内の架橋が出来ない構造リビオチンダイマー、あるいはストレプトアビジンの分子内を架橋した場合においてもまだ他のストレプトアビジンと反応することができるビオチン分子を持つ多価ビオチンの作製が考えられる。そこで、次年度はリジッドな構造のスペーサーを有するビオチントリマーを合成し、定量的な重合体形成の改善を図る。互いが架橋関係にある二つの架橋剤を交互に反応させる「シグナル反復増幅法」を用いて,従来法では検出不可能だった一分子レベルの微量タンパク質の検出を容易にした。成人病の指標となるメイラード反応生成物を同手法を用いて効率よく検出するための条件検討を行い、AEGs関連抗体の作成、検出時間の短縮化および阻害因子の無害化の手法を確立した.検査の対象となる汗・尿・便・唾液などには阻害因子が含まれているが、単純にサンプルを希釈することで、それらの阻害因子を無害化することを明らかにした。本手法を用いれば100ヨクトグラム(yg;10×10-19g/ml)の標的タンパク質の検出が可能であった。マーカーとなる標的分子の存在の有無で確定診断が出来る検査として実用化を目指したい。今回の試験を通してストレプトアビジンの修飾により反応効率が大きく変わることを見いだした。何も修飾されていないストレプトアビジンはビオチンダイマーもしくはビオチン分子と架橋反応を起こすことが出来るが、ビオチンダイマーを用いて2回目以降の架橋反応は著しくその効率を低下させた。一方、FITCやALP標識されたストレプトアビジンは効率が悪いもののシグナル増幅反応がかかることを今回の試験で明らかにした。結果として現在、入手可能なビオチンダイマーおよびストレプトアビジンの組み合わせにおいて標的分子定量化は困難であった。本研究の目的であるAGEsを指標にした非侵襲検査の基礎である抗体の作成、および、検出する組織や分泌物に存在する阻害因子を無害化し、標的タンパク質一分子レベルでの検出技術は確立した。一方、反復増幅法を用いた定量化が本試験期間内に達成できなかったことは残念であった。しかし、定量化するための貴重な知見を得ることが出来た。これらの知見を礎に本手法の確立に向け邁進したい。
インプラントの咬合感覚に関する研究

近年歯科臨床において、Osseointegrated Implantが広く普及し、欠損補綴における有効な選択肢の一つとなっている。しかし、Implant補綴物た関する研究報告は少なく、特に、Implant補綴に与える機能的な咬合については、未だ明らかにされていない。そこで本研究の目的は、Implant補綴に与えるべき機能的な咬合の究明を目標に、第一ステップとして、Implantの咬合感覚を検索することにある。今回、Implant患者におけるゴム硬さ弁別能およびその時の咬合力と咀嚼筋筋電図を同時測定し、その特徴を検索した。被験者は、顎口腔系に異常がない正常有歯顎者20名(男性10名、女性10名、2431歳)およびImplant患者17名(男性8名、女性9名、1735歳)である。Implant患者は、いずれも口唇・口蓋裂患者で、顎裂部への骨移植術と矯正治療を行い、顎裂部骨架橋にImplant(Branemark)を単独植立した症例である。被験歯は、正常有歯顎者では両側中切歯、Implant患者ではImplant部およぴ対側同名歯とした。硬さ弁別能測定装置として、ゴム硬度35度から75度までの10度間隔・5種類の天然ゴム板を利用し、さらに、弁別時の咬合力と咬筋筋電図を同時に測定した。その結果、ゴム硬さ実験の正解率は、被験者間および左右側間において有意な差が認められなかった。一方、ゴム硬さ弁別時の咬合力は、Implant患者においてその値が有意に高く、大きなばらつきを示した。以上の結果より、Implant患者においても、正常有歯顎者と同等の硬さ分別能を有することが示された。これは、Implant対合歯における歯根膜感覚の補償効果によるものと推察される。また、同等の硬さ分別能を発揮するために、咬合力が重要に関与することが示唆された。近年歯科臨床において、オッセオインテグレーテッドインプラントが広く普及し、欠損補綴における有効な選択肢の一つとなっている。しかし、インプラント上部構造に関する研究報告は少なく、特に、インプラント上部構造に与える機能的な咬合については、未だ明らかにされていない。そこで本研究の目的は、インプラント上部構造に与えるべき機能的な咬合の究明を目標に、第一ステップとして、インプラントの咬合感覚を検索することにある。今回、インプラント患者におけるゴム硬さ弁別能およびその時の咬合力を同時測定し、その特徴を検索した。被験者は、顎口腔系に異常がない正常有歯顎者20名(男性10名、女性10名、2431歳)およびインプラント患者6名(男性1名、女性5名、1522歳)である。インプラント患者は、いずれも口唇・口蓋裂患者で、顎裂部への骨移植術と矯正治療を行い、顎裂部骨架橋にインプラント(Branemark)を単独植立した症例である。被験歯は、正常有歯顎者では両側中切歯、インプラント患者ではインプラント部および対側同名歯とした。硬さ弁別能測定装置として、ゴム硬度35度から75度までの10度間隔・5種類の天然ゴム板を利用し、さらに、弁別時の咬合力を同時に測定した。一方、ゴム硬さ弁別時の咬合力は、インプラント患者においてその値が有意に高く、大きなばらつきを示した。

以上の結果より、インプラント患者においても、正常有歯顎者と同等の硬さ分別能を有することが示された。これは、インプラント対合歯における歯根膜感覚の補償効果によるものと推察される。また、同等の硬さ分別能を発揮するために、咬合力が重要に関与することが示唆された。近年歯科臨床において、Osseointegrated Implantが広く普及し、欠損補綴における有効な選択肢の一つとなっている。しかし、Implant補綴物に関する研究報告は少なく、特に、Implant補綴に与える機能的な咬合については、未だ明らかにされていない。そこで本研究の目的は、Implant補綴に与えるべき機能的な咬合の究明を目標に、第一ステップとして、Implantの咬合感覚を検索することにある。今回、Implant患者におけるゴム硬さ弁別能およびその時の咬合力と咀嚼筋筋電図を同時測定し、その特徴を検索した。被験者は、顎口腔系に異常がない正常有歯顎者20名(男性10名、女性10名、2431歳)およびImplant患者17名(男性8名、女性9名、1735歳)である。Implant患者は、いずれも口唇・口蓋裂患者で、顎裂部への骨移植術と矯正治療を行い、顎裂部骨架橋にImplant(Branemark)を単独植立した症例である。被験歯は、正常有歯顎者では両側中切歯、Implant患者ではImplant部および対側同名歯とした。硬さ弁別能測定装置として、ゴム硬度35度から75度までの10度間隔・5種類の天然ゴム板を利用し、さらに、弁別時の咬合力と咬筋筋電図を同時に測定した。その結果、ゴム硬さ実験の正解率は、被験者間および左右側間において有意な差が認められなかった。一方、ゴム硬さ弁別時の咬合力は、Implant患者においてその値が有意に高く、大きなばらつきを示した。以上の結果より、Implant患者においても、正常有歯顎者と同等の硬さ分別能を有することが示された。これは、Implant対合歯における歯根膜感覚の補償効果によるものと推察される。
複製再開始複合体における分子集合・解離メカニズムの解明

大腸菌におけるDNA複製再開始機構は、複数のタンパク質(PriA、PriB、DnaT、PriC、DnaB)がDNA上で規律的に結合・解離する多段階の反応である。本申請ではこれらの再開始構成タンパク質群の構造および相互作用解析を行った。DnaTにおいては、N末端ドメインの多量体形成、PriBとの相互作用による一本鎖DNAを解離させる機構について調べた。さらにPriCにおいては、C末端ドメインとDnaBの相互作用に関して調べた。これらの情報は大腸菌の複製再開始機構の解明に寄与することができると考えている。紫外線や化学物質によって生じるDNA損傷によって、一時的にDNA複製は停止し、DNA修復が起こった後、複製フォーク構造が再形成されると考えられている。この複製フォーク構造の形成後にDnaBヘリカーゼが再導入され、複製は再開始される。この大腸菌複製再開始のメカニズム研究を構造生物学的観点から行うこと、また複製ヘリカーゼであるDnaBヘリカーゼ導入の共通した機構が見い出せるかどうかを目的としている。交付申請書に記載した「研究の目的」では1)PriA依存的複製開始における構造および相互作用解析における1PriBの相互作用解析および2DnaTの構造および相互作用解析、2)PriC依存的複製開始における相互作用解析をあげている。本年度はPriA依存的経路において重要であると考えられているPriB-DnaTの相互作用部位をNMR、変異体解析を中心に調べた。また、これまでわかっていないPriC依存的経路における最終ステップであるヘリカーゼDnaB-PriCの相互作用に関して、相互作用部位の解析を変異体解析、NMR解析を用いて行った。その一部は招待講演を含めた学会発表を行い、現在論文作成の準備を行っている。また、一方で本年度は申請書には記載していないが、大腸菌変異株のDNA複製に関わる細胞分裂再活性化因子CedAの構造・機能相関に関する論文を発表した(Abe Y. et al, Journal of Biochemisty)。交付申請書の目的で述べている立体構造を基盤とした相互作用解析に関しては、これまで概ね順調に進んでいる。さらにPriB-DnaT、DnaB-PriCの相互作用に関して、現在解析を進めており、順調に行けば近日論文として発表できると考えている。また立体構造解析においてもDnaTN末ドメインに関しても、変異体を作成し、現在NMRもしくはX線解析が可能になってきている。この大腸菌複製再開始のメカニズム研究を構造生物学的観点から行い、1)いまだ解かれていない複製再開始因子の立体構造を決定し、各因子同士の相互作用解析を行い、2)複製再開始複合体の分子集合・解離の過程を検出し、明らかにすることを本申請の目的とした。最終年度である本年度は、DnaT-PriBの相互作用解析を行い、PriBにおいてDnaT結合部位に存在する幾つかのアミノ酸の重要性を調べ、複製再開始における一本鎖DNAがPriBに結合し、DnaTによって解離するモデルの構築を行った。その結果に関しては、現在投稿中であり、この結果を元に、シンガポール国際大学との共同研究も始まっている。また、DnaTのN末ドメインの機能であるオリゴマー形成を調べる為、幾つかの変異体を作成し、オリゴマー形成に重要な部位を同定した。この情報を利用し、未だ判明していないDnaTN末の立体構造決定に向けて、現在検討を行っている。これらの結果は2件の国際学会を含め、本年度は6件の学会発表を行った。本申請では、複製再開始因子PriB、PriC、DnaTの構造およびそれらの間の相互作用情報、それぞれの因子とDNAとの相互作用情報を集めた。その結果は複製再開始のメカニズム解明に寄与したと自負している。期間全体として、16件の学会発表、4件の論文発表を行い、今後も本申請の結果を元に、論文を作成する予定である。交付申請書に記載した「研究の目的」では1)PriA依存的複製開始における構造および相互作用解析における1PriBの相互作用解析、2DnaTの構造および相互作用解析、2)PriC依存的複製開始における相互作用解析をあげている。これらの目的で述べた立体構造を基盤とし、アミノ酸変異など利用した相互作用解析に関しては研究実績で挙げたように、2報の論文を発表し概ね順調であると考えている。また、平成27年度の研究計画に挙げたDnaBに関しては、NMRにおいて解析可能なスペクトルを得ており、今後相互作用解析を行っていくことが可能である。ITC、Biacoreなどの速度論的、熱力学的な解析に関しては現在検討中であり、種々の方法を検討している。

一方でDnaTN末ドメイン、PriCC末ドメインのX線結晶構造解析に関しては思うように分解能が上がらず苦戦しており、以下今後の方針に示すようなNMRを用いて構造解析を行うことも考えている。研究はほぼ順調で、大腸菌複製再開始プライモソームの相互作用を含めた立体構造を基盤とした解析が進んでいる。一方で、速度論的な解析に関しては十分に進んでいるとは考えておらず、解析系の開発が必要である。これらの方法を開発し、当初の研究目的である分子集合、解離のメカニズムを調べていきたいと考えている。構造生物学、タンパク質化学研究はほぼ当初の計画通りに進んでいる。そのため概ね申請書に書いた計画に従って行う予定である。今後さらにNMRなどを駆使した詳細な相互作用部位の決定および速度論的解析を行うための方法の開発などを行い、当初の研究目的である分子集合・解離のメカニズムを調べていく。さらに大腸菌内、再構成系においてそれぞれの因子の役割を調べていく予定である。立体構造に関してはX線結晶解析だけにこだわらずNMRなどの他の構造決定法を用い、アミノ酸変異などを駆使して解析していく。物品費の利用に用いる予定が少々余剰が生じた。物品費の利用に用いる予定が、少々余剰が出てしまった。来年度の物品の購入に用いることにする。来年度の物品の購入に用いる。
シンクロナイズド・マルチメディアを用いた並列プログラミング教育の研究

本研究では、同期マルチメディアを用いた並列処理教材の作成、及びPCクラスタ上での各種問題の並列化を行った。ボーリング、陸上競技、レジメ配布の3つのモデルを用いて、負荷分散、同期、パイプラインなどの並列処理の基礎的概念に対するアニメーションを作成し、それに静止画・音声・テキストを同期させて、初心者用の分かりやすい教材を作成した。また、小規模なストリーミング実験を行って、ダウンロード方式に対するストリーミングの有用性を実験的に確認した。これにより、同期マルチメディアを用いた並列処理教材が並列プログラミングの初心者教育には十分役立つことを確認した。次に、PC16台を高速ネットワーク(ミリネット)で接続し、クラスタシステムソフトウェア(SCore)を載せて、並列プログラミング環境を構築した。そして、PCクラスタ上で各種問題の並列化を行った。JPEG/JPEG2000エンコーダ、有限要素法によるカルマン渦、組織的ディザ法、画像の3次元グラフ表示、Nクイーン、3次スプライン補間、及びガウス・ジョルダン法などの並列化をOpenMPを用いて行い、並列化による速度向上を達成することができた。また、3次スプライン曲線やガウス・ザイデル法ではパイプライン処理が必要であり、このような場合にはMPIを用いた方が適切であることか分かった。本研究では、並列処理の基盤となるPCクラスタの構築と、同期マルチメディアを用いた並列処理教材の作成を行った。PC16台を高速ネットワークカードミリネットで接続し、システムソフトウェアとコンパイラを乗せて、並列プログラミング環境を構築した。PC16台をミリネットとイサーネットで接続し、LinuxとクラスタシステムソフトウェアSCoreをインストールした。その上で、SCoreシェルと通信ライブラリをテストし、PVMとOpenMPによる並列プログラムの動作確認を行った。さらに、細線化、マンデルブロー、文字列照合(KMP法、BM法)などの並列プログラムをOpenMPで作成し、PCクラスタの動作確認と並列プログラミングのノウハウの蓄積を行った。PCクラスタ構築と並行して、アニメーション、音声、ビデオ、テキストなどを同期して表示させる並列処理教材を作成した。複数のメディアを同期して表示することにより、初心者にも分りやすい教材を提示することができる。まず、負荷分散、同期、データ分割、タスク分割、並列アルゴリズムなど、並列処理の各種キーワードを抽出した。次に、これらに対する教材をレジモデルと乗り物モデルで作成した。レジモデルでは、客の持つ品物がデータで、レジ係がプロセッサである。レジの台数が変化すると、支払いに要する時間も変わる。乗り物モデルでは、複数の人が複数の乗り物で移動する。乗り物台数が変化すると、移動時間も変化する。現在、ボーリングと相撲モデルでも、同様に教材作成を進めている。また、教材を遠隔地の各種端末にリアルタイム表示するために、ストリーミングの実験を進めている。陸上競技モデルとレジメ配布モデルを用いて、負荷分散、同期、パイプラインなどの基礎概念に対するアニメーションを作成し、それに音声やテキストを同期させて、初心者用の分かりやすい教材を作成した。今までに、ボーリングモデルと相撲モデルによる教材を作成してあるので、多様な教材を用意することができた。次に、PC16台からなるPCクラスタ上で各種問題の並列化を行った。有限要素法によるカルマン渦、組織的ディザ法、画像の3次元グラフ表示、Nクイーン、3次スプライン補間、及びガウス・ジョルダン法などの並列化をOpenMPを用いて行い、並列化による速度向上を達成することができた。また、3次スプライン曲線やガウス・ザイデル法ではパイプライン処理が必要であり、このような場合にはMPIを用いた方が適切であることが分かった。PCクラスタの構築と応用の2年間の研究を通じて、以下の点が明らかになった。・OpenMPとMPIはそれぞれの得意分野があるので、問題の特質に応じたハイブリッド並列プログラミングが有望である。・ソフトウェア分散共有メモリは使用可能なメモリ領域が制限され、その制約が大きい。今後の課題として、並列処理のより高度な概念に対する教材の作成、及びPCクラスタからグリッドコンピューティングへの展開などがあげられる。
患者の視点に基づく日本版プライマリーケア評価ツールの開発

本研究の目的は、住民側からかかりつけ医を評価する日本のツールを開発することである。実際には、まず一つ目の質問紙(PCAT)に対しては4まで作成しており、Johns Hopkins University, Bloomerg School of Public Health, The Johns Hopkins Primary Care Policy Centerに問い合わせを行うところまで到達している。もう一方の質問紙(GPAQ)に対しては、2の途中まで実行している。GPAQは原本の開発者とやりとりをしながら、内容の変更を行いながら進めている。原本開発者からの指示と、翻訳された内容、日本の専門家からの指摘された内容のすりあわせを行いながら、質問紙の修正を進めているところである。平成28年度は両者の質問紙を完成させて、現場での調査の実施(パイロットテストと本調査)を進めていく予定である。20名程度の専門家の協力のもとでアンケート作成を行ったが、意見をもらうためのwebページ作成及びその修正の作業で時間を要し、また専門家からの返信及び集計においても遅れが生じた。また翻訳の専門家の選択に時間を要したが、それは出身地及び日本での生活歴、臨床経験、翻訳経験を重視したためでもあった。また、途中での質問紙の内容の修正に伴い、国外の研究者とのやりとりを詳細に行ったことなどが研究の進行に影響を及ぼした。本研究は、住民側からプライマリーケア機能を測定するツールの作成をテーマとしている。実際には、国外のプライマリーケアを測る2種類のアンケート用紙(PCATとGPAQ)を翻訳して、作成したアンケート用紙の信頼性及び妥当性の検証を行う手順となっている。2015年度に一つ目のPCATのアンケート翻訳を行い、PCAT(日本語版)を作成した。2016年はPCATの日本語版作成手順と同様にGPAQの翻訳作業(日本人の翻訳者による順翻訳、修正式デルファイ法を用いた翻訳内容の修正、一般住民によるフォーカストグループインタビューの実施及びインタビュー結果に基づくアンケート用紙の修正、英語を母国語とする翻訳者による逆翻訳と翻訳レビュー、最終翻訳についての複数名の翻訳者及び研究者での合同レビューディスカッション)を行い、GPAQ(日本語版)を作成した。2016年度末には作成したPCAT(日本語版)とGPAQ(日本語版)のパイロットテストを行い、パイロットテスト結果を踏まえたPCAT(日本語版)とGPAQ(日本語版)の最終調整を行った。また本調査を実施するための医療機関を選択し、該当する医療機関と実施内容及びその期間についての依頼及び調整を開始した。2017年度に行う予定である本調査では、これまでの課程で作成された2種類のアンケート用紙と国内の先行研究で作成されたアンケート用紙を用いて実施する予定である。最終的に、上記の結果をまとめて、報告を行う予定である。本研究では、2016年度で終了の予定であったが、先行研究で新たな知見が得られたため、その内容も含めて研究内容を拡大した。そのため、パイロットテストを実施するまでの時間がかかり、また本調査を実施してくれる医療機関への依頼・調整に時間を費やす必要が生じた。我々の研究では、日本において住民視点からプライマリーケアを測定する評価用紙の開発及び都市部以外でのプライマリーケアの実践の評価及び患者満足度の評価を行った。上記の研究を行う上で、我々は3つの評価用紙を使用して調査を行った。1つ目は、米国で開発されたプライマリーケアを評価するPCAT(Primary Care Assessment Tool)、2つ目はPCATを日本用に開発されたJPCAT(Japanese version of Primary Care Assessment Tool)、3つ目は同様に英国で使用されているGPAQ(General Practice Assessment Questionnaire)である。それぞれの特徴があり、PCATでは幅広くプライマリーケアを測定するものであるが、JPCATは日本国内で広く使用できるように包括的な診療内容などの評価については省略されている。本研究では都市部以外での包括的なプライマリーケアの実践状況を把握するために、原本の評価用紙であるPCATを改めて翻訳して、日本におけるプライマリーケアの評価を幅広い視点から評価した。またGPAQの評価用紙の特徴は、PCATと同様にプライマリーケアのアクセス・継続性の評価に加えて、担当した医師の診察の質(コミュニケーションや診察時間の長さなど)を診療終了後に評価する点が異なるもので、より医師一人一人の診療の質を評価することが出来る。本研究ではPCAT及びGPAQを日本の現状に合うように翻訳し、妥当性と信頼性の検証を行った。共に作成された評価用紙は本調査により妥当性及び信頼性は確保されたツールであることが示された。今後は、まずは一つ目の質問紙の本調査(合計2回)を実施する。並行して、2つ目の質問視も翻訳したもののの最終版まで作成し、同様に本調査(合計2回)を実施する。初年度で苦慮した専門家の選定は終わっており、webページの作成はこれまでに作成したものを修正する程度であり、初年度と同じところでは時間は要しない予定である。2017年度の研究計画は、これまでの研究課程で作成されたアンケート用紙を実際に、本調査として実施することとしている。本調査で得られた内容を集積して、結果の公表や論文作成を行っていく。総合診療プライマリーケア初年度の研究が遅れており、2つ目の質問紙においての専門家から意見をもらうためのwebページ作成費用、翻訳に関る費用、2つの質問紙の本調査実施費用(1回目)が次年度に持ち越すことになった。先行研究の結果に基づいて、研究計画を変更する必要性が生じた。

研究計画の変更に伴って、研究の進行が遅れたため、アンケート作成及びパイロットテストに必要な費用がかかった。ただ本調査の実施が出来なかったため、本調査に関る費用は計上されず、翌年度に持ち越すことになった。下記の費用が当初の予定より追加で必要になる。専門家からの意見をもらう際に使用するwebページの作成費用、作成した質問紙を逆翻訳(日本語→英語)するための翻訳者に支払う費用、本調査実施の際の諸費用(研究者の移動費・謝金など)。2017年度は、本調査を実施する予定である。本調査に関る物品・旅費・人件費が必要となる。また本調査実施後のアンケート内容を記載する際に入力作業に要する人件費、論文作成及び発表する際の学会参加費用などの使用する予定である。