hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIVの細胞間伝播による感染性獲得メカニズム解明

これらのモデル系および研究ツールを活用し、HIVの細胞-細胞間伝播を促進または阻止する宿主因子を複数同定し、その作用分子機構について解析を行った。また、上記システムを発展させ、ウイルスの細胞-細胞間感染を阻害する薬剤剤スクリーニング系を構築することができた。これらの解析系を用いて、宿主因子APCがHIVの細胞-細胞間伝播に必須の因子である可能性が示唆された。以上により、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究では、生体に近い三次元微小環境培養モデルを用いて、HIVの細胞-細胞間感染を介したウイルス伝播の特性を明らかにする。また、それを規定する因子を特定することで、新たな感染阻止法の考案を目指すことを目標とする。本年度は、新たな試みとして、細胞-細胞間感染のリアルタイムにイメージンングおよび定量システムの構築を試みた。ウイルスゲノムに発光タグ(HiBiT)を付加したHIV-1潜伏細胞およびルシフェラーゼ断片(LgBiT)を発現させた非感染細胞をそれぞれ作製し、ハイドロゲル培養システム(セレンデス社)を用いてこれらの細胞を高密度に立体共培養する系を確立した。これにより、細胞-細胞間感染をNano-Luc発光イメージングで検出しウイルスの感染拡大を定量することが可能となった。また、バクテリオファージMS2結合配列をタンデムに24リピート挿入したHIV分子クローンをあわせて用いることで、蛍光および発光を同時に観察できる実験系を構築することができた。これらの実験系を用いて、宿主因子APCによるウイルス伝播おける役割について詳細に解析行った結果、APCはGagおよびvRNAのVSへの局在化を司ることで、HIVの細胞-細胞間感染を促進することが示唆された。また、昨年度までに同定したHIV伝播を阻止するインターフェロン関連宿主因子について、その機能および分子標的について解析を行った。これに加え、タンデムアフィニティ精製(TAP)法により精製したタンパク質複合体混合物のショットガン解析により、HIV Gag前駆体タンパク質に特異的に結合する宿主因子を複数同定した。これら因子群についてHIVの細胞-細胞間感染の役割について検討中である。我々が新たに開発した解析系を用いて、HIVの細胞-細胞間感染を阻止する新たな宿主因子の同定を試みる。また、APCによるHIV構成因子のVSへの輸送や安定化の分子メカニズムについて解析するとともに、APCのGag結合領域を模倣したペプチドや化合物、さらにはAPCとGagの相互作用を抑制する化合物などを探索することで、ウイルス-宿主間相互作用を抑制する新しいタイプの治療薬開発へ展開する。我々が新たに開発した解析系を用いて、HIVの細胞-細胞間感染を阻止する化合物を探索する。また、TAP (Tandem Affinity Purification)を用いたプロテオミクス解析を実施し、新たなGag前駆体蛋白質結合因子を探索する。
ゲノム・エピゲノム・トランスクリプトーム解析による頭頸部癌の腫瘍内不均一性の解明

予後不良頭頸部扁平上皮癌の空間的・時間的な腫瘍内不均一性を二つの観点から解析する。1再発頭頸癌のゲノム・エピゲノム・トランスクリプトームにおける空間的・時間的不均一性の検討根治治療後早期に再発を認めた65例の『初回切除標本』及び『再発病変(局所、頸部、遠隔)』から無作為に3箇所検体を採取し分子生物学的な解析を行い、時系列に比較検討する。2病理組織学的所見とゲノム・エピゲノム変化パターンの比較検討切除断端陰性ながら局所再発をきたした25例における、『切除時の腫瘍本体』、『切除断端』、『再発腫瘍』の変異ステータスを解析し、病理組織所見と比較する。
日本古代の都鄙間交通と地方官衙

本研究では、郡家・国府・城柵といった古代地方官衙の機能を、都鄙間・隣国間などの広域的な政治的交通とのかかわりに注目して再検討しようとするものである。具体的には、交通に関わる木簡・漆紙文書などの出土文字資料の分析や『朝野群載』その他の文例集に掲載された交通に係る文書の分析と、正税帳を中心とする律令公文類の分析をもとに、国府や郡家、駅家と言った地方官衙における逓送供給・使者への便宜供与の実態などの様相を、具体的な遺跡や地理的環境との関わりをも含めて可能な限り具体的かつ詳細に検討・復原する。そのことを通じて広域的な国土支配との関わりにおける古代の地方官衙の役割、その歴史的特質を明らかにしたい。
胎児下大静脈血流波形を用いた新しい胎児評価法開発のための基礎研究

【目的】胎児心拍数図に変わる新しい胎児評価法としての胎児下大静脈血流波形解析の臨床的な有用性を確立することを目的とし、臨床的に用いられている静脈血流波形の評価法であるPLI(preload index)の病態生理的な意義を実験的に明らかにする。【方法】妊胎仔下大静脈血流波形を持続的に観察する実験モデルを作成した。母獣麻酔下に胎仔を子宮外に取り出し、右前胸部に皮膚切開を加え肉眼的に確認できる心拍動より一つ尾側の肋間より開胸し、胎仔下大静脈を露出させ径6mmの超音波血流計を装着した。平成13年度はこの手術手技の確立に費やした。胎仔下大静脈血流波形以外に、下腿静脈より輸血用および中心静脈圧側定用のカテーテルを、下腿動脈より動脈圧測定用のカテーテルを挿入した。さらに脳血流測定用に右頸動脈に径3mmの超音波血流計を装着した。羊水圧測定用のカテーテルを子宮内に留置し子宮筋を縫合、すべてのカテーテルは母獣左側腹部より腹腔外に出し閉腹した。カテーテルは腹壁に固定した袋の中に収容した。実験モデル作成手術48時間後に、胎仔の血液ガスの正常化および心拍数の正常化を確認したのち、胎仔静脈カテーテルから10m/minの速度で輸血を行った。輸血中、胎仔心拍数、動脈圧、中心静脈圧、下大静脈血流、頚動脈血流を連続モニターし、容量負荷にともなう中心静脈圧の変化と下大静脈血流波形の変化を検討した。【結果】8頭の妊娠羊に手術を行い、4頭に対して胎仔輸血中の中心静脈圧と下大静脈血流波形が記録できた。胎仔輸血により胎仔中心静脈圧は上昇し、それにともない下大静脈血流波形のうち逆流波の切れ込みが大きくなっていた。これは臨床で用いられている下大静脈血流指標PLIの上昇と同じ意味を持つ。今回の動物実験により、胎児の容量負荷にともなう中心静脈圧の上昇を、胎児下大静脈の血流波形で評価できることが確認された。1.胎児下大静脈血流の実験モデルの作成各種胎児病態での胎児中心静脈圧と胎児下大静脈血流との関係を明らかにするために、超音波血流計による胎児下大静脈血流の連続測定動物実験モデルを作成した。約130日齢の妊娠羊を用い、羊胎仔慢性実験モデルを作成した。子宮切開後胎仔上半身を子宮外に取り出し、右開胸術を行い心臓直下の下大静脈を露出、超音波血流計を装着。下肢静脈より腹部大動脈に中心静脈圧計測用のカテーテルを腹部下大静脈まで挿入。子宮内に胎仔を戻し母獣腹壁を閉腹する。術翌日より中心静脈圧と胎児下大静脈血流の記録を行った。下大静脈血流はヒト胎児で認められたと同様の波動、すなわち心房収縮に一致した逆流波と心室収縮、拡張に一致した2峰性の流入波を示しており、この実験モデルがヒト臨床の検討にふさわしいことが確認された。今後この実験モデルを用い、各種病態に伴う胎仔中心静脈圧の変化と下大静脈血流との関係を明らかにする。

2.臍帯血流遮断での中心静脈圧の変化と脳血流との関係妊娠羊を用いた慢性実験モデルを用いて臍帯血流遮断実験を行い、中心静脈圧の変化と心拍数、脳血流の関係を検討した。胎仔アシドーシスの進行に伴い、中心静脈圧は軽度上昇し、同時に胎仔血圧、脳血流は低下した。【目的】胎児心拍数図に変わる新しい胎児評価法としての胎児下大静脈血流波形解析の臨床的な有用性を確立することを目的とし、臨床的に用いられている静脈血流波形の評価法であるPLI(preload index)の病態生理的な意義を実験的に明らかにする。【方法】妊胎仔下大静脈血流波形を持続的に観察する実験モデルを作成した。母獣麻酔下に胎仔を子宮外に取り出し、右前胸部に皮膚切開を加え肉眼的に確認できる心拍動より一つ尾側の肋間より開胸し、胎仔下大静脈を露出させ径6mmの超音波血流計を装着した。平成13年度はこの手術手技の確立に費やした。胎仔下大静脈血流波形以外に、下腿静脈より輸血用および中心静脈圧測定用のカテーテルを、下腿動脈より動脈圧測定用のカテーテルを挿入した。さらに脳血流測定用に右頸動脈に径3mmの超音波血流計を装着した。羊水圧測定用のカテーテルを子宮内に留置し子宮筋を縫合、すべてのカテーテルは母獣左側腹部より腹腔外に出し閉腹した。カテーテルは腹壁に固定した袋の中に収容した。実験モデル作成手術48時間後に、胎仔の血液ガスの正常化および心拍数の正常化を確認したのち、胎仔静脈カテーテルから10m/minの速度で輸血を行った。輸血中、胎仔心拍数、動脈圧、中心静脈圧、下大静脈血流、頚動脈血流を連続モニターし、容量負荷にともなう中心静脈圧の変化と下大静脈血流波形の変化を検討した。【結果】現在までに3頭の妊娠ヒツジで上記実験モデルの作成に成功し、胎仔輸血中の中心静脈圧と下大静脈血流波形が記録できた。胎仔輸血により胎仔中心静脈圧は上昇し、それにともない下大静脈血流波形のうち逆流波の切れ込みが大きくなっていた。すなわち、臨床で用いられている下大静脈血流指標PLIの上昇は、胎児の容量負荷にともなう中心静脈圧の上昇を表すことが確認された。
子宮および胎盤における時期特異的な一酸化窒素産生とその調節機構

妊娠ラットの子宮内膜と胎盤における一酸化窒素(NO)の産生を解析し、調節機構と役割を調べた。子宮内膜と胎盤ではそれぞれ妊娠17.5日と15.5日に、主に誘導型のNO合成酵素に由来する著しいNO産生ピークが認められた。このNO産生を阻害すると、子宮内膜では、活性型のカスパーゼ-3、8、9の発現量と酵素活性が増加し、さらに細胞のアポトーシスが増加したことから、NOは細胞の生存と子宮機能の維持に重要であることが示された。<研究内容>ジチオカルバメート鉄錯体であるFe-DTCSを一酸化窒素(NO)の捕捉剤としたスピントラップ・電子常磁性共鳴吸収法により、妊娠ラットを用いて、胎盤胎児部に限局したNO産生量を解析した。また、同時にNO産生に寄与する一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにて測定した。その結果、胎盤胎児部におけるNO産生は、今回解析した妊娠13.521.5日を通じて認められ、妊娠15.5日に著しい高値を示した。その後、妊娠末期の19.521.5日にはNO産生が有意に減少していた。同部位の一酸化窒素合成酵素遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにて測定したところ、NOS-3のmRNAには時期を通じて変化がなかったが、NOS-2のmRNA発現パターンは、NO産生量と非常に良く一致していた。NOS-2の発現は転写レベルで調節されていること、また、同じモル数のNOS-2およびNOS-3から産生されるNOを比較するとNOS-2はNOS-3の約1000倍であることなどから、本研究で得られた胎盤胎児部におけるNO産生にはNOS-3も関与しているものの、NOS-2の寄与が遥かに大きいことが明らかになった。<意義と重要性>本研究は、従来から妊娠中の子宮や胎盤などではNOが産生されているものの、NOが不安定であるため、産生量の変動などの詳細は不明であった。スピントラップ・EPR法を用いることにより、組織で産生されているNOを定量的に解析できることを示した本研究により、今後の胎盤機能の解析やNOの役割について基盤的な情報を提供するだけではなく、他の組織などでのNOの関与についての研究への展開が大いに期待できることを示した。本研究内容はJ.Vet.Med.Sci.,71(4):495-498,2009に掲載予定である。<研究内容>ジチオカルバメート鉄錯体であるFe-DTCSを一酸化窒素(NO)の捕捉剤としたスピントラップ・電子常磁性共鳴吸収法により、ラットの子宮脱落膜およびに胎盤に限局したNO産生量を解析した。また、一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにて測定した。子宮脱落膜と胎盤におけるNO産生は、妊娠13.521.5日を通じて認められ、胎盤では妊娠15.5日に、脱落膜では妊娠17.5日にそれぞれ著しい高値を示し、その後、妊娠末期に向けて有意に減少していた。NOSの発現を定量的RT-PCRで解析すると、NOS3のmRNAには時期を通じて変化がなかったが、NOS2のmRNA発現は、NO産生量と非常に良く一致していたことなどから、本研究で得られた胎盤と脱落膜におけるNO産生にはNOS3も関与しているものの、NOS2の寄与が大きいことが明らかになった。さらに、このNO産生を阻害すると脱落膜細胞のアポトーシスが増加することから、脱落膜で産生されているNOは脱落膜細胞の生存に必要であることが示唆された。<意義と重要性>本研究は、従来から妊娠中の子宮や胎盤などではNOが産生されているものの、NOの寿命が短く不安定であるため、産生量の変動などの詳細は不明であった。スピントラップ・EPR法を用いることにより、組織で産生されているNO量を定量的に解析できることを示した本研究により、胎盤や子宮におけるNOの機能解析について基盤的な情報を提供するだけではなく、他の組織などでのNOの機能解析についての研究への展開が大いに期待できることを示した。<研究内容>ジチオカルバメート鉄錯体であるFe-DTCSを一酸化窒素(NO)の捕捉剤としたスピントラップ・電子常磁性共鳴吸収法(EPR)により、ラットの子宮脱落膜におけるNO産生量を解析し、同時に子宮脱落膜におけるNO産生の役割を検討した。妊娠17.5日の脱落膜におけるNO産生は著しく高く、その後、妊娠末期に向けて有意に減少していた。また、このNO産生にはNOS3も関与しているものの、NOS2の寄与が大きいことが明らかになった。さらに、このNO産生を阻害すると脱落膜の間質細胞のアポトーシスが増加することから、脱落膜で産生されているNOは脱落膜細胞の生存に必要であることが示唆された。

さらに、カスパーゼカスケード-3、8、9の発現量と酵素活性も変動したことから、NOがこれらのカスパーゼカスケードに影響していることが示された(Exp.Bio.Med.,2010)。<意義と重要性>従来から妊娠中の子宮や胎盤などではNO産生が報告されているものの、NOの寿命が短く不安定であるため、産生量の変動などの詳細は不明であった。スピントラップ・EPR法を用いることにより、組織で産生されているNO量を定量的に解析できることを示した本研究により、胎盤や子宮におけるNOの機能解析について基盤的な情報を提供するだけではなく、他の組織などでのNOの機能解析についての研究への展開が大いに期待できることを示した。事実、ラット新生子においては、生後3週齢においてその前後と比べてNO産生が増加しており、この時期のNO産生は肝細胞の増殖に必須であることが示された(J.Vet.Med.Sci.,2010)。
心臓サルコイドーシスにおける遺伝的素因の探索と臨床病態層別化に関する検討

サルコイドーシスは原因不明の全身性肉芽腫性疾患である。サルコイドーシスの症状発現部位は、眼、肺、心臓、消化管などが知られており、臨床像は多彩である。発症に関わる詳細な分子機序はいまだ不明であるが、HLAタイプなどの遺伝的要因と感染などの環境要因の関与が示唆されている。サルコイドーシス発症の遺伝的要因として、第6染色体短腕上のHLAクラスII領域に位置するHLA-DRB1遺伝子が疾患発症に関わっている可能性が示されている。しかしながら、サルコイドーシスの生命予後を規定するとされる心臓サルコイドーシス(Cardiac Sarcoidosis;以下CS)を含め、症状発現部位と遺伝的要因に関する検討に関してはなされていない。そこで、本研究の目的は、1.サルコイドーシスの心病変合併及び重症化に関わる遺伝的素因を明らかにすること。CS発症の遺伝的要因として、前述したサルコイドーシスにおける免疫学的な遺伝要素に加え、心筋の脆弱さ、すなわち心筋症関連遺伝子の変異が関与しているのではないか、という仮説をたてて検証を行う。2.ゲノム情報・臨床情報を統合した心臓サルコイドーシスの層別化をおこなうこと。CSの中で予後治療法共に異なる以下の臨床病態、i)心不全型CS, ii)心室頻拍型CS, iii)房室ブロック型CSについて、臨床分類(Phenotyping)し、個々のゲノム情報を精査(Genotyping)することで遺伝的背景との関連を明らかにする。以上1、2の取り組みにより、CSの層別化と個別化医療の確立を目指すことが本研究の概要である。15症例の心臓サルコイドーシスのゲノム解析をおこなった。心臓サルコイドーシスと診断された症例の病型分類(心不全型、心室頻拍型、房室ブロック型)をおこなった。サルコイドーシスの局在、患者背景、血液検査、12誘導心電図、画像所見に関する情報を収集した。大阪大学関連施設での心臓サルコイドーシスレジストリー構築を開始している。現在は大阪大学医学部附属病院と府立急性期医療センターにて連携して症例収集をおこないはじめた。また、血液サンプルとしてサルコイドーシス40症例の検体を収集した。臨床情報プロファイルの収集およびデータベース化として、ステイロド治療を含めた集学的治療内容、治療後の生命予後、心不全再入院、致死性不整脈イベントに関して追跡する。心電図変化や心機能(左室駆出率など)変化も追跡する。疾患ゲノム解析として、収集検体のゲノム解析および変異情報との統合解析の実施をおこなう。引き続き心臓サルコイドーシスと診断された症例について全エクソン解析を実施する。65Mbの疾患変異可能性領域に対するエンリッチメントライブラリーの作成からシーケンスを実施し、専用PLを用いて変異絞り込みと同定を行い大阪大学の心筋症疾患変異情報DBを用い変異注釈付けを行う。そして、臨床情報プロファイルとゲノム情報の統合および相関解析、心臓サルコイドーシスの病型分類(心不全型、心室頻拍型、房室ブロック型)と全エクソン解析データ・心筋症関連疾患遺伝子情報に関する結びつけをおこなう。

疾患ゲノム解析として、収集検体のゲノム解析および変異情報との統合解析の実施をおこなう。引き続き心臓サルコイドーシスと診断された症例について全エクソン解析を実施する。65Mbの疾患変異可能性領域に対するエンリッチメントライブラリーの作成からシーケンスを実施し、専用PLを用いて変異絞り込みと同定を行い大阪大学の心筋症疾患変異情報DBを用い変異注釈付けを行う。そして、臨床情報プロファイルとゲノム情報の統合および相関解析、心臓サルコイドーシスの病型分類(心不全型、心室頻拍型、房室ブロック型)と全エクソン解析データ・心筋症関連疾患遺伝子情報に関する結びつけをおこなう。学会への積極的な参加ができなったこと、学会発表準備、論文発表準備をすすめていくことを本年度は目的とする。
サル前部下側頭皮質における「顔」の記憶方略のニューロン相関

動物は記憶課題を遂行する際,回顧的方略(「さきほど見たものは何であったかを覚えている」という方略)や展望的方略(「これから何を選択すべきであるかを覚えている」という方略)など,異なる記憶方略を取り得ることが知られている.したがって,記憶に関連するニューロン活動は,動物が取る記憶方略と密接に関連する可能性がある.本研究では,前部下側頭皮質腹側部(TEav野)「顔」応答ニューロンの記憶関連活動と記憶方略との相関を調べるため,「顔」を使用した非対称的対連合課題(I-APA課題:以下に説明)をサルに訓練し,学習成立後,ニューロン活動の記録・解析を行った.1.I-APA課題:課題で使用する視覚刺激は複数の無意味な「図形」とサルにとって既知の人物の「顔」を,5方向から撮影した画像である.サルが固視点に固視後,先行刺激(「図形」または「顔」)が呈示され一定の遅延期間の後,テスト刺激(先行刺激が「顔」の場合は「図形」,「図形」の場合は「顔」)が継時的に呈示される.サルは先行刺激と連合対をなすテスト刺激を同定することが要求される.2.「顔」→「図形」試行と「図形」→「顔」試行:先行刺激が「顔」でありテスト刺激が「図形」である場合(「顔」→「図形」試行),先行刺激である「顔」に対して正解テスト刺激(「図形」)が一意的に決定されるため,動物は記憶方略として展望的方略を取り易いことが予想される.逆に,先行刺激が「図形」でありテスト刺激が「顔」である場合(「図形」→「顔」試行),先行刺激である「図形」に対して正解テスト刺激(「顔」)が複数存在し,一意的に決定されないため,動物は記憶方略として回顧的方略を取り易いことが予想される.現時点でTEav野から56個の視覚関連応答を記録し,11個の特定の「顔」と「図形」の連合対に選択的なニューロン応答を記録している.これら11個の連合対選択的ニューロンのうち6個が,遅延期間中,「図形」→「顔」試行よりも「顔」→「図形」試行において優位なニューロン活動を示した.このような記憶関連活動はサルが「顔」→「図形」試行において展望的方略を取り易いことと一致し,TEav野「顔」応答ニューロンの記憶関連活動と動物の取る記憶方略が相関することを示唆する.動物は記憶課題を遂行する際,回顧的方略(「さきほど見たものは何であったかを覚えている」という方略)や展望的方略(「これから何を選択すべきであるかを覚えている」という方略)など,異なる記憶方略を取り得ることが知られている.したがって,記憶に関連するニューロン活動は,動物が取る記憶方略と密接に関連する可能性がある.本研究では,前部下側頭皮質腹側部(TEav野)「顔」応答ニューロンの記憶関連活動と記憶方略との相関を調べるため,「顔」を使用した非対称的対連合課題(I-APA課題:以下に説明)をサルに訓練し,学習成立後,ニューロン活動の記録・解析を行った.1.I-APA課題:課題で使用する視覚刺激は複数の無意味な「図形」とサルにとって既知の人物の「顔」を,5方向から撮影した画像である.サルが固視点に固視後,先行刺激(「図形」または「顔」)が呈示され一定の遅延期間の後,テスト刺激(先行刺激が「顔」の場合は「図形」,「図形」の場合は「顔」)が継時的に呈示される.サルは先行刺激と連合対をなすテスト刺激を同定することが要求される.2.「顔」→「図形」試行と「図形」→「顔」試行:先行刺激が「顔」でありテスト刺激が「図形」である場合(「顔」→「図形」試行),先行刺激である「顔」に対して正解テスト刺激(「図形」)が一意的に決定されるため,動物は記憶方略として展望的方略を取り易いことが予想される.逆に,先行刺激が「図形」でありテスト刺激が「顔」である場合(「図形」→「顔」試行),先行刺激である「図形」に対して正解テスト刺激(「顔」)が複数存在し,一意的に決定されないため,動物は記憶方略として回顧的方略を取り易いことが予想される.現時点でTEav野から56個の視覚関連応答を記録し,11個の特定の「顔」と「図形」の連合対に選択的なニューロン応答を記録している.これら11個の連合対選択的ニューロンのうち6個が,遅延期間中,「図形」→「顔」試行よりも「顔」→「図形」試行において優位なニューロン活動を示した.このような記憶関連活動はサルが「顔」→「図形」試行において展望的方略を取り易いことと一致し,TEav野「顔」応答ニューロンの記憶関連活動と動物の取る記憶方略が相関することを示唆する.
相互作用している銀河の天体物理学に関する研究

相互作用している銀河は、その周辺に分布しているマッシブ・ハローを調べるためのプローブとして、またセイファート銀河などの中心核の活動と関連して最近、大きな関心を集めている天体である。これらをテーマとして2つの研究会「相互作用している銀河の天体物理」(62年1月)と「シュミットシンポジウム1986」(61年9月)を開催し、その集録を出版した。以下、研究会での主要テーマについて報告する。1.チリ-・ラスカンパナス天文台で撮影された天体写真によるおとめ座銀河団内の矮小楕円銀河の表面測光の結果、銀河の構造に関してその環境による著じるしい差異は検出されなかった。ブヨブヨした構造の矮小楕円銀河に潮汐力の顕著な影響が出ていない事となり、相互作用を研究する上で貴重なデータが得られた。2.矮小楕円銀河の形成過程に関する"質量放出説"が詳細な計算によって示され、観測と比較され良い一致が得られた。3.銀河衝突の数値実験について、マッシブ・ハローをも考慮したモデルが計算され、ビーズ不安定性にあっては著じるしくおさえられる事が示された。なお、マッシブ・ハローを調べるに当り二重銀河の力学に関連した観測をもっと行うべきとの指摘があった。4.チリ-・セロトロロ天文台で赤外分光観測の結果、多くの相互作用する銀河から【H_2】分子線が検出され、それらは銀河中心核からの"ウィンド"による衝撃波によるものである、との知見が得られた。5.チリ-・ESO天文台での銀河中心核の分光観測の結果、HeIの輝線5016Aを銀河で初めて検出した。これは電離ガスがライマン連続光に対し不透明である事を意味しており、分光学的に重要な検出となった。近年、外国の天文台での観測が増加し、外国研究者との共同研究も盛んになってきた。日本での活発な理論的研究を基にした観測をより進めたい。
セレノおよびテルロニトロシル錯体の合成法確立と性質の解明

ニトリドレニウム錯体とセレンとの反応からセレノニトロシル(NSe)錯体が得られた。最終的に構造は予備的ではあるがX線構造解析によって確認した。ジチオカルバマト配位子をもつ求核性のニトリドモリブデン錯体とセレンとの反応では、ジチオカルバマト配位子の分解が起こる、あるいは、溶媒にもちいた二硫化炭素(CS2)が反応し、チオニトロシル(NS)錯体やイソチオシアナト(NCS)錯体を生成した。後者の反応は、金属錯体によってCS2が還元的不均化で形式的にSとCSを生成する珍しい系である。一方、テトラアニオン配位子をもつ求電子性のニトリドルテニウム錯体とイオウとの反応では、対応するNS錯体が速やかに生成した。まずCH2Cl2中、1と灰色セレン(10 equiv)を室温で反応させたが、NSe錯体の生成は確認できなかった。次に灰色セレンより反応性が高いと考えられる赤色セレンを用いる反応の検討を行った。還流条件で反応させたところ、黒黄色懸濁液から黒褐色懸濁液に変化した。反応溶液を処理しCH2Cl2/hexaneで再結晶することで橙色結晶を得たが、IR、1H NMR、X線構造解析より、NSe錯体ではなく、NS錯体[Mo(NS)(S2CNEt2)3] (2)が生成したことがわかった。すなわち、反応中に1のジチオカルバマト配位子が分解することによりイオウ源となり、もう一分子のニトリド錯体1と反応したと考えられる。赤色セレンは二硫化炭素にわずかに可溶であることから、次に二硫化炭素中での反応を検討した。CH2Cl2/CS2中、錯体1と赤色セレンを50 oCで反応させたころ、イソチオシアナート(NCS)錯体[Mo(NCS)(S2CNEt2)3] (3)とNS錯体2の生成が示唆された。本反応ではまずニトリド配位子とCS2から[(Et2NCS2)3Mo(+)-NCS2(-)]が生成した後、もう一分子の1がSを引き抜くことによって、2と3がそれぞれ形成されたと考えられる。金属錯体によってCS2が還元的不均化で形式的にSとCSを生成する珍しい系である。実際、1とCS2のみの反応を行ない、反応混合物をゲルカラムにより分離することにより、2と3をそれぞれ収率31%、18%で得ることができた。前年度までの成果を元に高原子価かつ求電子性のニトリド配位子をもつルテニウム錯体を基軸とすることとした。そのようなニトリドRu(VI)錯体としてジアニオン性のサレン型配位子もつ[RuN(salen)(MeOH)[PF6]とテトラアニオン性のビス(ヒドロキシベンズアミダト)ベンゼン配位子をもつ(NBu4)[RuN(hybeb)]をもちいることとした。まず、これらの錯体とイオウとの反応により、チオニトロシル(NS)錯体が得られるかどうか検討した。ルテニウムのチオニトロシル錯体は2例しかないものの、セレノニトロシル錯体よりも容易に生成すると考えた。その結果、これら2つとイオウの反応は進行しなかった。[RuN(salen)(MeOH)[PF6]はピリジンなどの配位性基質存在下では速やかにニトリドーニトリドカップリングにより、二量化することが知られている。そこで、4-(ジメチルアミノ)ピリジン存在下でニトリド錯体とイオウとの反応を検討した。[RuN(salen)(MeOH)[PF6]はイオウと反応するよりも自身の二量化が非常に速く、瞬時にオレンジ溶液は緑色溶液へと変化しRu(III)錯体[Ru(salen)(dmap)2][PF6]を与えた。一方、ジメチルアミノピリジン存在下、(NBu4)[RuN(hybeb)]とイオウをアセトニトリル/トルエン混合溶媒中で反応させると、オレンジ色が黒色へと変化した。黒茶色結晶のX線構造解析によってチオニトロシル錯体(NBu4)[Ru(NS)(hybeb)(dmap)]であることを確認した。これはルテニウムのチオニトロシル錯体として3例目の合成・構造解析例である。本年度は、6価ニトリドReカリックスアレーン錯体(Ph4P)[ReN{p-tBucalix[4]-(O)4}]と灰色セレンとの反応を検討した。6日の反応後、ベンゼンで抽出し、赤褐色の粉末を得た。

この粉末のIRでは1164cm-1にNSeに帰属できる吸収を示し、1H-NMRでは芳香環メタ位に帰属できるシグナルが1種類、メチレンに帰属できる二重線を2種類、t-Bu基に帰属できる一重線を1種類観測されたことから、対称の錯体の生成が示唆された。最終的に構造は予備的ではあるがX線構造解析によって確認し、(PPh4)[Re(NSe)(OH){p-tBucalix[4]-(O)4}]であると決定した。本錯体は八面体構造を持ち、Re-O結合長(1.973(9) )は、単結合の範囲であることから、NSe配位子のトランス位はヒドロキソ(OH)配位子であると決定した。これに対応して、単結晶のIR(3423 cm-1)および1H-NMR(10.37 ppm)でもOH配位子に帰属できるシグナルが観測される。NSe結合長(1.704(12) )は、Mayerらの錯体[TpOs(NSe)Cl2]におけるReN-Se結合長(1.629(10))より少し長いが、これはOH配位子のトランス影響のためである。Re-NSe結合長(1.766(11))は、類似のヒドロキソジアゼニド錯体(PPh4)[Re(NNPh)(OH){p-tBucalix[4]-(O)4}]のRe-N結合長(1.817(8))よりも短い。さらRe-N-Seの結合角(175.6(8)度)がほぼ180度であることから、本錯体におけるNSe配位子は、直線型であり、それに基づくと金属中心は形式16電子の3価のReと見なせる。NSe錯体は2例目となり、性質を明らかにするためには種々のNSe錯体を合成する必要がある。高原子価金属のニトリド錯体としてジチオカルバマト配位子を持つモリブデン錯体の反応を検討したところ、ニトリド以外の配位子の分解が起こることがあることや求核性のニトリド配位子は適切ではなさそうであることなど、セレノニトロシル錯体合成のための重要な実験結果が得られた。すなわち、補助配位子はセレン等の反応に対して不活性で、求電子性のニトリド配位子を持つ錯体を用いる必要があることがわかった。世界で2例目となるNSe錯体の合成と構造解析に成功した点は評価できるが、種類が少ないため、NSe錯体の一般的な性質を明らかにするためには種々のNSe錯体を合成する必要がある。MayerらはOs(VI)のニトリド錯体から[TpOs(NSe)Cl2]を合成している。このニトリド配位子は求電子性であるとされており、Ruにおいてはより求電子性の高いニトリド配位子が得られることが報告されている。高原子価ではあるが求核性のニトリド配位子を持つモリブデン錯体では目的のニトリド配位子のセレノ化反応が観察できなかったことから、求電子性のあるニトリド配位子が反応に有利であると考えた。そこで、前年度までの成果を元に高原子価かつ求電子性のあるニトリド配位子とセレン、テルルとの反応を検討する。本年度使用したニトリド6価Re錯体は常磁性のため、反応をNMRで追跡することが困難であることから、反磁性のニトリド錯体を用いる。Chatt、Mayerらは6価のMoやOsのニトリド錯体からそれぞれ[MoNS(S2CNMe2)3、[TpOs(NSe)Cl2]を合成している。金属の形式酸化数は、反応前後で6価から2価へと4電子還元されている。このことから、高原子価のニトリド錯体を用いた方が反応に有利であると考えられる。そこで、NS錯体への変換が達成されているジチオカーバマート配位子を持つ6価のMo錯体[MoN(S2CNEt2)3]を機軸として、セレン、テルルとの反応を検討する予定である。本研究では酸素および水分に敏感な有機金属化合物を取り扱うため、ガラス製シュレンク管(単価15,000円)を使用する必要があり、消耗品として購入する。その他のフラスコ等のガラス器具購入費用を合わせて、ガラス器具全体の購入費用は400,000円となる。
空間グラフの位相幾何学的研究

1.Fengchun Lei氏(Harbin Institute of Technology)とGengyu Zhang氏(東京工業大学)との共同研究において以下を示した。空間内の位相的円板で空間グラフに対してある種の位置にあるものに対してそれを縮約して得られる空間グラフが2-既約ならばもとの空間グラフも2-既約であることを証明した。これによって既約性によっては区別出来ない2つの空間グラフが2-既約性によって区別出来るようになった。2.本橋友江氏(関東学院大学)との共同研究において以下を示した。四角形の既約なタイリンダで2個以上のタイルからなるものには亜風車が存在することを示した。3.小沢誠氏(駒深大学)、堤幸博氏(上智大学)、新國亮氏(早稲田大学)との共同研究において、trivializabilityに関する禁止グラフを新たに9個発見した。4.郡山登美代氏(早稲田大学)との共同研究において以下を示した。handcuff graphのregular projectionsについてはTaniyama-Yoshiokaの研究によって、それがいつ、nontrivial handcuff graphのprojectionになるか、identifiable projectionであるかないか、がよく分かっていたが、今回,handcuff graphを含むgraphのある族に関して、それらのprojectionsがいつ、nontrjvial embeddingsのprojectionになるか、identifiable projectionであるかないかを決定した。5.戸田一平氏(早稲田大学)との共同研究において以下を示した。結び目$6_2$の球面への正則射影全体の集合と結び目$6_3$の球面への正則射影全体の集合の和集合の決定をした。空間グラフは分離可能であるかまたはグラフと1点で交わリグラフを2つに分ける球面が存在するとき可約であると呼ばれる。可約でない空間グラフは既約と呼ばれる。既約な空間グラフはグラフと2点で交わる非自明球面やグラフと1点で交わる非自明特異球面を持たないときに2-既約であると呼ばれる。四角形の長方形によるタイリングは、どの2つのタイルの和集合も長方形にならないときに既約であると呼ばれる。あるタイルが風車であるとは、そのタイルの4つの頂点は全て次数が3であり、それらから出る残り1本の辺の配置が風車状になっていることである。あるタイルが亜風車であるとは、そのタイルが風車であるかまたは、そのタイルの4つの頂点のうち3つは次数が3であり、それらから出る残り1本の辺の配置が風車状になっていて、残る頂点の次数が4であることである。四角形の既約なタイリングで2個以上のタイルからなるものには亜風車が存在することを示した。四角形の長方形によるタイリングはそのどのタイルのどの頂点の次数も3以下であるときにジェネリックであると呼ばれる。上記の結果の系として、四角形の既約なジェネリックなタイリングで2個以上のタイルからなるものには風車が存在することが示される。1.小沢誠氏(駒澤大学)、堤幸博氏(上智大学)、新國亮氏(早稲田大学)との共同研究において、trivializabilityに関する禁止グラフを新たに9個発見した。平面グラフの射影図は各2重点にどのように上下の情報を与えても得られる空間グラフがnontrivialであるときknottedと呼ばれる。knotted projectionを持たない平面グラフはtrivializableであると呼ばれる。trivializableでなく、どのproper minorもtrivializableであるような平面グラフは全部で有限個であることが、Robertson-Seymourの理論から分かるが、そのようなグラフは今まで7個しられていたが、今回新たに9個発見した。

他にも何個かあると思われるがそれは今後の課題である。2.郡山登美代氏(早稲田大学)との共同研究において以下を示した。handcuff graphのregular projectionsについてはTaniyama-Yoshiokaの研究によって、それがいつ、nontrivial handcuff graphのprojectionになるか、identifiable projectionであるかないか、がよく分かっていたが、今回、handcuff graphを含むgraphのある族に関して、それらのprojectionsがいつ、nontrivial embeddingsのprojectionになるか、identifiable projectionであるかないかを決定した。証明にはある種の平面グラフのtrivializabilityに関する結果を使った。戸田一平氏(早稲田大学)との共同研究において以下を示した。古典的結び目を一つ固定したときにその球面への正則射影全体の集合を考える。任意の結び目に対してその球面への正則射影全体の集合は自明結び目のそれに含まれる。また任意の非自明結び目に対してその球面への正則射影全体の集合は三葉結び目のそれに含まれる。このようにして従来最小交点数が5以下の全ての結び目に対してはその球面への正則射影全体の集合の完全な特徴付けがなされていた。最小交点数が6の結び目は鏡像の範囲で6の1、6の2、6の3とスクエア結び目、グラニー結び目と全部で5個ある。これらそれぞれの球面への正則射影全体の集合の決定が最終目標であるが、そのためのステップとして6の1の球面への正則射影全体の集合と6の2の球面への正則射影全体の集合と6の3の球面への正則射影全体の集合の和集合の決定をした。さらに6の2の球面への正則射影全体の集合と6の3の球面への正則射影全体の集合の和集合の決定もした。具体的にはこれらの集合は自明結び目の球面への正則射影全体の集合からある集合を引いた集合になっている。そのある集合は、ある具体的に表示される正則射影の可算集合からツイスティングと連結和を有限回行なって得られる集合として簡明に表示される。この結果により5の1結び目と5の2結び目をともにマイナーとする素な結び目は6の2結び目か6の3結び目の少なくとも一方をマイナーとするであろうという予想が得られた。ここで結び目Jが結び目Kのマイナーであるとは、Jの球面への正則射影全体の集合がKの球面への正則射影全体の集合を含むときをいう。
植物の耐塩性機構と膜脂質の役割に関する研究

耐塩性の異なるアツケシソウ,ハマアカザ,ワタ,ホウレンソウ,トマトおよびキュウリを材料とし、葉および根の脂質を分析した。耐塩性の強い植物と弱い植物との間で比較すると、葉の脂質組成は相対的に類似していたが根の脂質組成は大きく異なり、耐塩性の強い植物は糖脂質が多く耐塩性の弱い植物はリン脂質が多くなっており、リン脂質糖脂質の含量比が耐塩性と相関性があることがわかった。また、脂質分子種を分析すると、グリセロ糖脂質の分子種は各植物何れも18:3/19:3を多くもつ傾向があり、リン脂質では、耐塩性の強い植物と弱い植物との間で異なり、前者では18:2/16:0が多く後者では18:3/16:0が多くなっていた次にハマアカザを塩濃度の異なる培地で培養すると、根の脂質は塩濃度が高くなるほど糖脂質が多く低くなるほどリン脂質が多くなり、上記結果と一致した結果を示した。ついで、根の脂質から人工脂質膜をつくり、そのイオン透過性を調べた。耐塩性の強いハマアカザの根脂質は耐塩性の弱いキュウリの脂質より【Na^+】【Cl^-】の高い透過性を示しこのイオン透過性を高めているのは糖脂質であることがわかった。次にインタクトの根を用いてイオン透過性を比較した。ハマアカザの根は、キュウリの根の5.6倍も速い【Cl^-】透過速度また【Na^+】は6.6倍も速い透過速度を示した。次に、能動的選択的イオン吸収に重要な役割を演じている原形質膜ATPaseの活性を比較した。ハマアカザに比較してキュウリは原形質膜ATPaseの活性が強く、相対的にハマアカザは原形質膜ATPase以外のATPase(酸性ホスファターゼ等)活性が多く認められた。以上の結果より、耐塩性の強い植物は受動的イオン吸収を高めて高濃度塩環境に対する浸透圧調節をするのに対し、耐塩性の弱い植物は能動的選択的イオン吸収が強く、従って環境の塩度が少し高くなるとこれに抗しきれなくなるのであろう。
共役トリエン脂肪酸、トコトリエノール、糖化リン脂質による血管新生の調節機能と展開

血管新生は既存の血管から新たな血管ができる現象であり、内皮細胞の増殖、遊走および管腔形成の3過程を経て進む。この現象は癌、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リュウマチ性関節炎など多くの難治性疾患の発症と進展に深く関与する。たとえば癌の場合、新生血管から栄養を受け取ることで増殖し、この血管を通って転移する。したがって、血管新生をターゲットとした癌治療が近年注目を集めている。またこの様な血管新生病の食品成分・食品素材による予防は大きな社会的関心の的でもある。我々はこれまでの研究から、共役トリエン型脂肪酸やトコトリエノールに従来の既知医薬品より強力な血管新生阻害活性があることを明らかにしてきた。また、過酸化因子として糖化産物であるアマドリ型糖化リン脂質の存在を証明し、この糖化リン脂質が血管新生を強く誘発促進する因子であることを確認してきた。本研究では、1)共役トリエン脂肪酸を経口投与した癌細胞移植ヌードマウスを用い、共役トリエン脂肪酸の癌組織の退縮を確認するとともに、その血管新生阻害の機構を明らかにした。2)ビタミンE同族体のトコトリエノールの血管新生阻害の機構を培養細胞実験および動物実験を用いて明らかにした。3)血管新生促進作用を有するとして発見された糖化アミノリン脂質について、培養細胞系で血管新生の促進因子であることを明らかにすると同時に、リン脂質の糖化を阻害する食品成分のスクリーニングを行った。これらの知見を基盤とし今後さらに発展させることで、血管新生病といわれる動脈硬化症、糖尿病、癌を予防する食品成分・食材の確立につながると大いに期待される。この現象は癌、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎などの多くの難治性疾患の発症と進展に深く関与する。これまでの我々の予備実験で、(1)癌細胞を移植したヌードマウスに共役トリエン脂肪酸を経口投与すると、癌組織の著明な退縮作用をもたらすことを確認し、この癌組織退縮の機構として共役トリエン脂肪酸による血管新生阻害機能が示唆されている。(2)ビタミンE同族体であるトコトリエノールが極めて低濃度で血管内皮細胞の増殖と管腔形成を抑制することを培養細胞実験系で確認しつつある。(3)糖尿病者での過酸化因子としてアマドリ型糖化リン脂質の存在を確認しつつあり、この糖化脂質が培養細胞系で血管新生を誘発促進する因子であることがわかりつつある。そこで本研究では、血管新生阻害作用が発見された共役トリエン脂肪酸とトコトリエノールの作用機構と実用性を培養細胞実験と動物実験で明確にするとともに、逆の血管新生促進作用を有するとして発見された糖化アミノリン脂質の生成阻害物質を食品・食材から発掘することを目的とした。本年度(平成15年度)の研究成果として、(1)共役トリエン脂肪酸(とくに共役エイコサペンタエン酸)による血管新生阻害機構を培養細胞実験で明らかにした。活性の高い共役トリエン脂肪酸の有機合成に成功し、次年度の動物実験に供する準備が整った。(2)トコトリエノールによるプロティンキナーゼC阻害を介した血管新生抑制機構を培養細胞実験で解明した。(3)アマドリ型糖化リン脂質によるマトリックスメタロプロテアーゼ分泌亢進を介した血管新生促進の機構を培養細胞実験で明らかにした。上記の研究成果を基に、次年度は共役トリエン脂肪酸、トコトリエノール、糖化脂質の作用を生体モデル(in vivo)で評価する。これにより血管新生病といわれる動脈硬化症、糖尿病、癌を予防する食品成分・食材を明示する。

血管新生は既存の血管から新たな血管ができる現象で、癌、動脈硬化、糖尿病性網膜症などの発症と進展に深く関与する。血管新生病の食品成分による予防は社会的関心が極めて高い。これまでの我々の実験(平成15年度)で、1)海藻に含まれる共役トリエン脂肪酸を癌細胞移植ヌードマウスに経口投与すると、血管新生阻害を介した癌組織の退縮があること、2)ビタミンE同族体のトコトリエノールが培養細胞系で血管新生を強く抑制すること、3)糖尿病者の過酸化因子として発見したアマドリ型糖化リン脂質が培養細胞系で血管新生の促進因子であること、を解明しつつある。そこで本年度(平成16年度)は、血管新生阻害作用が発見された共役トリエン脂肪酸とトコトリエノールの作用機構と実用性を動物実験で明確にするとともに、逆の血管新生促進作用を有するとして発見された糖化アミノリン脂質の生成阻害物質を食品・食材から発掘することを目的とした。本年度の研究成果として、1)共役トリエン脂肪酸(とくに共役エイコサペンタエン酸)による内皮細胞のアポトーシス誘導を介した血管新生阻害を動物実験で明らかにした。2)腫瘍細胞をマウスの背部皮下に移植したときに形成される新生血管網(背部皮下法)を利用して、トコトリエノールのin vivoにおける血管新生阻害作用を明らかにした。3)糖化アミノリン脂質(血管新生促進因子)の生成阻害物質のスクリーニング系を構築し、ビタミンB6であるピリドキサールがリン脂質の糖化(グリケーション)を阻害する食品成分であることを明らかにした。これらの知見を基盤とし今後さらに発展させることで、血管新生病といわれる動脈硬化症、糖尿病、癌を予防する食品成分・食材の確立につながると大いに期待される。
適合的汎化に基づく情報検索システムの実験的研究

本研究では、検索意図を推定し、それをユーザにも理解しやすい形式で表現できる情報検索システムを提案する。ここでは、検索者が用いる検索語の抽象度に注目して、検索意図の推定を行う。しかし、ユーザは、検索意図を表現するのに適切な抽象度の概念を必ずしも用いない場合がある。そのため、検索意図に応じた適切な抽象度の概念を検索キーワードに用いると、ユーザにも理解しやすく効率的な検索キーワードになると考えられる。そのため、本研究では、電子化辞書やシソーラスに記述されている概念階層構造を利用し、検索意図に応じて検索キーワードを適合的に汎化し、新たな検索式を作成する情報検索システムを提案する。ここで、適切な抽象度の汎化とは、検索キーワードが持つ正解判定の分別能力に関する情報を多く保存する汎化の事である。本年度は、検索式における検索語と検索要求のミスマッチという観点から検索課題の持つ性質の分類を行うと共に、検索語拡張に与える影響を分析した。その結果、検索語と検索要求のミスマッチのタイプに応じて、検索語拡張に求められる機能も異なり、単一の検索語拡張手法では、検索性能を改善させる場合だけでなく、性能を悪化させる場合があることが確認された。よって、検索語拡張の洗練化を行うためには、検索語と検索要求のミスマッチに応じた検索語拡張の方法の提案と、ミスマッチのタイプの推定を行うことが必須であることを提案した。本年度は、この適合的汎化による検索拡張が、正解文書において補完関係にある検索語の発見を目指しているという点に注目し、適合的汎化による検索拡張の結果をBoolean式として表現する方法と確率型情報検索モデルを組み合わせた情報検索システムを作成した。本システムを用い、情報検索システムの評価型ワークショップであるNTCIR4のWebタスクに参加し、本手法で提案したBoolean式の修正と確率型モデルの組み合わせによる情報検索システムが最も良い検索性能を実現することを確認し、本手法の有効性を確認した。
tRNAへの正確な硫黄修飾を行うための機能構造基盤

tRNAはDNA上の遺伝暗号とアミノ酸を対応させるアダプター因子として働き、転写された後様々な修飾を経て成熟化し機能する。様々な修飾の中でウリジン2位の硫黄修飾(s^2U修飾)はコドン・アンチコドン塩基対やL字型の3次元構造を安定化し、正確な翻訳を行うために必要である。真核生物の細胞質ではNcs6・Ncs2複合体がアンチコドン34位のs^2U修飾を担う。Ncs6・Ncs2複合体はアンチコドンがUUX配列をもったtRNAおよび34位ウリジンを選別し修飾を行っている。その反応メカニズムや特異性を構造に基づいて明らかにするため、構造解析に取り組んだ。真核生物のNcs6・Ncs2複合体について組換えタンパク質を様々なコンストラクトで精製、結晶化を行ったが結晶を得ることができなかった。そこで古細菌において真核生物細胞質Ncs6・Ncs2複合体と同様にs2U修飾を行うと推測されるNcs6ホモログについて、組換えタンパク質の発現および精製条件を検討し、結晶化可能な純度と収量を得ることができた。得られたタンパク質について結晶化スクリーニングを行い、結晶が得られる条件を見つけた。結晶化条件の最適化を行い、放射光施設にて4オングストロームを超える分解能でX線回折データを収集することができた。得られた回折データから分子置換法を用いてNcs6ホモログの電子密度をえた。また、真核生物細胞質においてs^2U修飾と同じ部位に起こるメチルカルボキシメチル修飾について、その修飾を行う酵素群であるElp複合体についての発現条件を検討し、いくつかのサブユニットついては組換えタンパク質として可溶化する条件を確立した。本年度が最終年度であったが、当初の目的である真核生物の硫黄修飾酵素複合体についてX線結晶構造解析を進めることができなかった。一方で相同性の高い古細菌のアンチコドン34位硫黄修飾酵素Ncs6ホモログについては安定な複合体を調製し、結晶を得られる条件を見つけ、X線回折データを収集することが出来た。本年度が最終年度であった。今後は既に回折データが得られているNcs6ホモログについてより高分解能の回折データが得られるような結晶化条件およびX線回折像の測定条件をさらに検討する。またNcs6ホモログとtRNAの複合体の結晶化についてもさらに取り組んでいく。tRNAはDNA上の遺伝暗号とアミノ酸を対応させるアダプター因子として働く。tRNAはゲノムから転写された後、様々な修飾を経て成熟化し機能する。様々な修飾の中でウリジン2位の硫黄修飾はコドン・アンチコドン塩基対やL字型の3次元構造を安定化し、正確な翻訳を行うために必要である。真核生物の細胞質ではNcs6・Ncs2複合体がアンチコドン34位の硫黄修飾を担い、修飾が必要なtRNAおよび34位ウリジンを選別し修飾を行っている。その反応メカニズムや特異性を構造に基づいて明らかにするため、当該年度は試料調製に取り組んだ。Ncs6・Ncs2複合体の大量発現・大量精製の手法を確立し、調製したNcs6・Ncs2複合体はtRNAと複合体を形成することを確認した。機能解析を行うために、修飾に用いられる硫黄を輸送する際に関わる上流の因子群についても試料調製の手法を確立した。また、高度好熱菌ではNcs6と相同性の高いTtuAがTループ54位の硫黄修飾を行っている。TluAのX線結晶構造解析にも取り組み、得られた結晶から回折データを収集した。ヨウ素を加えた結晶からの回折データも収集し、単波長異常散乱法によりTtuAの構造を分解能2.1Åで決定した。TtuAは2量体構造をしており、単量体ごとに2つの亜鉛フィンガーと触媒ドメインから構成されていた。触媒ドメイン中の活性部位と予想される箇所にはATP結合モチーフと3つのシステイン残基が存在し、これらはNcs6とTtuAともに保存された配列であった。変異体解析をもとに、TtuAのATP結合部位とシステイン残基は実際に硫黄修飾に関与することが明らかになった。

得られた回折データから分子置換法を用いてNcs6ホモログの電子密度をえた。また、真核生物細胞質においてs^2U修飾と同じ部位に起こるメチルカルボキシメチル修飾について、その修飾を行う酵素群であるElp複合体についての発現条件を検討し、いくつかのサブユニットついては組換えタンパク質として可溶化する条件を確立した。真核生物細胞質のNcs6・Ncs2複合体についての試料調製に成功した。また、好熱菌の硫黄修飾に関わるTtuAについて構造を決定し、構造をもとにした変異体解析から硫黄修飾に重要な部位を明らかにした本年度が最終年度であったが、当初の目的である真核生物の硫黄修飾酵素複合体についてX線結晶構造解析を進めることができなかった。一方で相同性の高い古細菌のアンチコドン34位硫黄修飾酵素Ncs6ホモログについては安定な複合体を調製し、結晶を得られる条件を見つけ、X線回折データを収集することが出来た。真核生物細胞質のNcs6・Ncs2については、まだ得られていない構造解析のために必要な結晶を得るために、不安定な領域をなくした発現コンストラクトを作成し、結晶化スクリーニングを行う。それでも得られないようであれば、他の生物種についても試してみる、発現ホストの検討を行う。硫黄修飾の機能解析を行うための条件検討を行う。本年度が最終年度であった。今後は既に回折データが得られているNcs6ホモログについてより高分解能の回折データが得られるような結晶化条件およびX線回折像の測定条件をさらに検討する。またNcs6ホモログとtRNAの複合体の結晶化についてもさらに取り組んでいく。