hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子関包接現象による誘起振動光学活性の測定とその生体関連化合物への応用

本研究においては、第2成分の存在によって観測れさる振動光学活性の測定を左右円偏光に対するラマン散乱強度の差の測定に基くラマン光学活性法(ROA法)により試み、それにより構造化学的、生物化学的情報を得ることを目的として行なった。まず第1に、シクロデキストリンやタンパク質のようなキラルな部位をもつ分子とアソ色素との間の包接現象により色素に誘起される振動光学活性の測定に成功した。すなわち、色素とコンゴ-レッドおよびベンゾパ-プリン4B、キラリティ-を与えるものとしてγ-シクロデキストリンの包接系について色素の共鳴ラマンスペクトルについてROAを得ることができた。そして、これらの結果からこの包接系に関する情報を得ることができた。また、タンパク質として牛血清アルプミンをキラリティ-を与えるものとして選び、化学プロ-ブとしてトリパンレッドの共鳴ラマンスペクトルに対応するROAの測定に成功した。2種の色素に誘起されるROAスペクトルのバンドが異なることからシンクロデモストリンとタンパク質で色素と相互作用する部分が異なることが明瞭に分った。次に、SERS(Surface Enhanced Raman Sed#sring)とROAを結びつけて、アノミ酸-銀複合体の振動光学活性をROAで研究した。SERSにおいてはラマン強度が増大するだけでなく、左右円偏光に対するラマン散乱強度の差が大きくなるという理論があるが、実験的検討は未だなされていなかった。そこで、銀コロイド溶液中の各種アミノ酸のSERSおよびROAスペクトルを測定したところ、L-フェニルアラニンで△(=(I^R_E+E^L_E)/(I^R_E+I^L_E))が×10^-程度のROA信号が得られた。これは、稀藻溶液のROAを測定する1つの新しい方法論を提供すると同時にSERS効果により△値が増すという確証は得られなかったことを示す。なお、理論的、実験的検討が必要であろう。とにかく、これは初めての実験である。本研究においては、シクロデキストリンやタンパク質のようなキラルな部位をもつ分子とビフェニル構造をもつアゾ色素との間の包接現象により色素分子に誘起される振動光学活性の測定を、左右円偏光に対するラマン散乱強度の差の測定に基くラマン光学活性法(ROA法)により試み、それから構造化学的、生物化学的情報を得ることを目的として研究を行った。まず、色素としてコンゴーレッドとベンゾパープリン4B、キラリティーを与えるものとしてγ-シクロデキストリンの包接系について誘起ROAの測定に成功した。この系のROAでは13001450【cm^(-1)】領域に現われる、見かけ上2本のバンドに関してダブルカップレット信号が観測され、これは、以前のメチルオレンジ-α-シクロデキストリンの場合の結果と一致している。この領域にはN=N伸縮振動とベンゼン環の振動が現われ、最も強いラマンバンドが観測される。また、コンゴーレッドの場合、1155【cm^(-1)】付近(【SO_3^_】伸縮振動)にカップレット信号が見られたことは、メチルオレンジ-α-シクロデキストリンの場合に【SO_3^_】の振動について何も信号が得られなかった亊と対照的で、恐らく【SO_3^_】の空間配置が異なることに起因すると思われる。

さらに、キラリティーを与えるものとして牛血清アルブミン、色素をトリパンレッドにした場合にも、バックグラウンドが高いためSIN比は悪いが、1150【cm^(-1)】のPh-N=伸縮振動、1255【cm^(-1)】のベンゼン環の振動について比較的明瞭な信号が得られ、シクロデキストリン包接化合物の場合に最も強いROAを与えたN=N伸縮振動領域には全く信号が見られなかった。これは、この場合のキラリティーがビフェニル構造部分の捩れに基くことを示唆する。このような誘起振動光学活性の測定結果は本研究者らにより初めて観測されたものであり、本研究はその初めての研究を確認すると同時に、それを発展させたものである。
植物病原細菌である青枯病菌の感染初期における時系列素過程の解明

植物病原菌のRalstonia solanacearum(青枯病菌)はナス科植物の根から侵入し、細胞間隙で増殖したのち、導管壁を酵素により溶解し導管内に侵入する。その後、導管内で細胞外多糖を大量に分泌することで、導管を閉塞させ植物を枯死させる。我々は、導管に侵入するまでを感染初期過程と考え、その間における病原性関連遺伝子群hrpレギュロンの発現様式について研究を行った。1.感染初期過程から中期過程に移行する際に、hrpレギュロンの発現が著しく減少する。これは多機能因子であるPhcAによることを明らかにした。2.感染初期過程において、何らかのシグナルを認識しhrpレギュロンを活性化するシグナル伝達系が知られている。この系においてはPrhAによって認識されたシグナルがPrhI/PrhR-PrhJ-HrpGという伝達系を通してhrpBの発現を調節し、最終的にHrpBがhrpレギュロンを活性化する。PhcAはprhI/prhRの発現を抑制することによってシグナル伝達系を止め、hrpレギュロンの発現を抑制することをin vivo、in vitroの実験によって証明した。3.PrhAは植物シグナルではなく、未知のシグナルを認識することが明らかとなった。植物シグナルは別の受容体により認識されresponse regulatorであるHrpGをリン酸化することを証明した。4.新規遺伝子であるhrpGホモログprhGがhrpGと協調してhrpBの発現を調節していることを明らかにした。しかも、prhGの発現はPhcAによって正に制御されており、hrpB遺伝子発現に作用する時期がhrpG,prhGで異なることが示唆された。感染初期過程におけるhrpレギュロンの発現機構はほぼ解明されたため、今後は中期、後期過程の発現様式について研究し、感染機構の全容を明らかにしていく。我々は、導管に侵入するまでを感染初期過程と考え、その間における病原性関連遺伝子の発現様式について研究を行った。特に、無菌的に生育させたシロイヌナズナと青枯病菌を共培養することで、感染初期過程を再現する系を開発し、実験を行った。その結果、1.青枯病菌が植物宿主細胞とコンタクトした後、植物からの何らかのシグナルを受けて、病原性関連遺伝子の中でもHrpBによって支配されるhrpレギュロンの発現が著しく増加することが明らかとなった。2.その結果、青枯病菌の病原性因子の分泌機構であるtype IIIタンパク質分泌系が構築され、エフェクタータンパク質が分泌される。特定のエフェクタータンパク質の同定にはいたっていないが、青枯病菌の増殖を促進するものがあることが明らかとなった。3.同時に、細胞壁の分解酵素であるポリガラクチュロン酸分解酵素も増加することが分かった。4.青枯病菌の増殖の結果、菌体濃度が上昇し、quorum sensingによってhrpレギュロンの負の調節因子PhcAが活性化されることを見いだした。活性化されたPhcAはhrpレギュロンを止めてしまう。また、PhcAはポリガラクチュロン酸分解酵素遺伝子の発現も抑制する。すなわち、感染後期に移行する体制が整ったことになる。5.PhcAによるhrpレギュロンの抑制は、1で示した植物シグナル伝達系を構成する遺伝子のうち、prhIRの発現を抑制することによって起こることを明らかにした。

PhcAはprhIRのプロモーター領域に結合し転写を抑制することも見いだし結合領域を明らかにした。植物病原菌のRalstonia solanacearum(青枯病菌)はナス科植物の根から侵入し、細胞間隙で増殖したのち、導管壁を酵素により溶解し導管内に侵入する。その後、導管内で細胞外多糖を大量に分泌することで、導管を閉塞させ植物を枯死させる。我々は、導管に侵入するまでを感染初期過程と考え、その間における病原性関連遺伝子の発現様式について研究を行った。1.シロイヌナズナと青枯病菌の共培養を昨年度用いたが、培地組成を酸性にすることで、植物なしでも感染初期過程を再現できることを明らかにし、この系を用いて実験を行った。hrpレギュロンの構成オペロンのひとつpopAにレポーター遺伝子としてlacZYAをつないだpopA-lacZYA融合株を親株として、ランダムなトランスポゾン挿入によりpopAの発現が減少した変異株のスクリーニングを行った。新たに見いだした培養条件ではpopAは高い発現を示すことから活性を失った変異株を容易に選択することができた。2.約50個の変異クローンのトランスポゾン挿入部位を決定し、またそれぞれの変異株のpopA発現量を定量した。その結果、1)hrpGおよびhrpGホモログ(hrpG2と命名)に変異を持つクローン。2)芳香族アミノ酸の生合成に関係した遺伝子に変異を持ち、popAの発現が野生株の半分程度に低下したクローン。3)機能未知の遺伝子にトランスポゾンが挿入されpopAの発現が完全に無くなったクローンにおおまかに大別された。3.特に1)のタイプの変異について、hrpGとhrpG2の欠失変異株を作成しpopA、hrpレギュロン全体を支配する遺伝子hrpBの発現量を定量したところ、いずれも野生株に比べて10分の1以下に減少していた。4.それぞれの変異株の宿主植物に対する病原性を調べた。以前から知られているようにhrpG変異株はは完全に病原性を失ったのに対し、hrpG2変異株は野生株よりは弱いものの病原性を保持していた。このことは同じhrpBの発現を調節する2つの遺伝子産物の機能が異なっていることを意味している。シグナル伝達系の解析hrpレギュロン全体の発現を直接的に調節するのはHrpBである。従来PrhAによって認識された植物シグナルがPrhI/PrhR-PrhJ-HrpGという伝達系を通してhrpBの発現を調節していると考えられてきた。我々はhrpBの発現が見られない富栄養培地条件においてもprhA-prhI/R-prhJ-hrpGは高いレベルで発現していることを見いだした。また、prhA変異株では、同条件でもprhJ-prhGの発現が見られなかった。
マンノース6-リン酸非依存性のリソソーム酵素の識別機構

グルコセレブロシダーゼ/β-グルコシダーゼ(GC)は、マンノース6-燐酸受容体の認識を受けずにリソソームへと移行することが知られているが、その機構は不明である。ツニカマイシン存在下で生合成されたGCが正常に移行することから、選別輸送には糖鎖が関与していないことが予想されている。蛋白質部分を解析するため、ヒト白血病細胞株HL-60からcDNAを単離した所、正常遺伝子の他に、偽遺伝子とされているものが発現していることを見つけ、その構造と各種ヒト細胞株での発現について昨年度、報告した。今年度は、正常(18A)、および偽遺伝子型(12A)のDNAより、各種キメラを作成し、HepG2,WI-38細胞に導入し、その発現について調べた。18Aよりシグナル配列を残し、N末から337塩基を欠失したもの、12Aの対応するN末部分を欠失し、シグナル配列をつないだもの、N末側を正常、C末側を偽遺伝子型としたもの、など五種のDNAを発現ベクターに挿入し、CaPO_4法で導入した。期待通り、正常DNAを導入したものは約2倍の活性を示したが、他のいずれのDNAを導入しても、活性上昇は見られず、また、内因性のGCの活性も影響されなかった。これらキメラDNAが正常遺伝子の発現にも影響しないのか否かについて、他の細胞(COS-1など)においても、導入方法を変えて(リポフェクチン)、ノーザン、ウエスタン法で検討中である。同時に、免疫蛍光染色を行なって、発現蛋白の局在性についても調べている。
ヒト正常乳腺上皮,乳癌におけるc-kitがん遺伝子/産物の機能解析

昨年度までにc-kit mRNAとその産物が、男女の正常乳腺(管)上皮と男性の増殖性病変に広く認められる一方、女性の良悪性境界病変以上で有意に発現が抑制されることが明らかである。10年度はc-kit産物がreceptor型tyrosine kinaseであることを考慮し、乳腺増殖性病変におけるc-kit増物とphosphotyrosineの発現の相関性についても検討したところ、かなりの頻度で両者の発現が同一の局在をもって平行することから、c-kit産物が実際にtyrosine kinase activiを有する可能性も示唆された。また、乳腺上皮の悪性変化のスペクトラム(正常、良性増殖性、良悪性境界、非浸潤性悪性、浸潤性悪性)において、血管収縮ペプチドとしT同定されたendothelin(ET-1)とそのreceptor(ET-BR)の発現を免疫組織化学的に検討したところ、その発現パターンに性差はなく、ET-1は乳腺増殖性病変に広く認められ、ET-BRは正常、良性増殖性、浸潤癌において高頻度に認められたものの、異型乳管上皮過形成、非浸潤性乳管癌ではその発現が有意に抑制されることが示さた。これより、c-kitがん遺伝子とその産物の消失が女性乳腺上皮の悪性変化の初期に関与し、乳腺上皮の悪性変化の過程に性差が存在する可能性が示唆された。また、既知の乳癌関連遺伝子産物のほかにETとそのreceptorも浸潤性乳癌においてはautocrine/paracrine形式をとって作用し、異型乳管上皮過形成、非浸潤性乳管癌で抑制されていたET-BRが浸潤癌化に伴って発現することから、性差を問わず乳癌の浸潤にはET-BRの過剰発現が関与する可能性が示唆された。女性正常乳腺と良性増殖性病変にc-kit mRNAとその産物が恒常的に発現するが、良悪性境界病変以上で発現が抑制されることが既に明らかである。これより、c-kit癌遺伝子とその産物の消失が、女性乳腺上皮の悪性変化の早期に関与する可能性が示唆されるが実際の遺伝子の機能は未だ不明であり、また男性の乳腺増殖性病変における発現に関しても不明である。平成9年度は、機能解析実験のための細胞株の選択、培養条件の確立とそれぞれの細胞の発現する分子を把握するとともに、男性乳腺増殖性病変におけるc-kitの発現に関しても検討した。選択した細胞株は、ヒト正常乳腺上皮由来細胞株(HBL-100)、ヒト乳癌細胞株(ZR75-30,MCF7)である。免疫細胞化学的検索によるとc-kit産物は、HBL-100には認められず、MCF-7,ZR75-30に認められた。また、男性乳腺増殖性病変におけるc-kit産物の免疫組織化学的発現を検討したところ、正常乳管、女性化乳房と共に浸潤癌にもその発現を認めた。培養細胞株においてc-kit産物が女性外科材料における発現パターンと逆のパターンを示し、男性乳癌でc-kit産物が発現することから、c-kit遺伝子の機能の多様性が示唆された。10年度は、c-kit cDNAのHBL-100へのtransfectionあるいはMCF-7,ZR75-30のアンチセンスによるc-kit mRNAの発現制御などの分子生物学的手法を用いてc-kit遺伝子の機能解析に移る予定である。
中性子捕捉療法による血管攣縮予防と血管形成術後再狭窄予防に関する研究

昨年度に引き続き、血管壁の肥厚や攣縮の抑制に有効である可能性について検討した。320から460gのウィスターラットをペントバルビタール1-2mg静脈投与で麻酔し、大腿から外腸骨動静脈を露出した。そして、中性子補足療法による,血管反応性と血管壁肥厚抑制の検討を行った。血管攣縮予防の研究:大腿静脈より低濃度のGdDTPAを持続的に血管内投与しながら、右側の総腸骨動脈に外部より中性子線を照射する。照射後に総腸骨動脈を露出しノルアドレナリン総量10μgを直接外膜側に塗布した。収縮度は高倍率のCCDビデオカメラで血管を撮影し血管収縮度を評価した(n=14)。対照は無治療群で同様の処置を行い比較した(n=10)。また、照射1か月後のラットでも同様の実験を行った。直後の評価では両群ともに機械的刺激によりすでに血管が収縮しており、GdNCTによる収縮抑制効果は認められなかった。1月後、GdNCTの8匹(63%)と対照の9匹(89%)で、同様に血管収縮度を評価した。軽度の血管収縮度(径で70%以下)がGdNCT群の5匹と対照の8匹で認められたが、有意差はみられなかった。また、別の群では、引き続き血管壁肥厚抑制の研究を行った。16匹のラットを麻酔後に大腿動静脈を露出した。右総腸骨動脈と大動脈をガイドワイヤーで傷害し、中性子照射療法を行った。照射1月後に血管を摘出し、内膜の肥厚度を組織病理学的に評価し、血管障害のみの対照群と比較した。GdNCT10匹と対照群9匹で1月後の血管内肥厚度の評価が行えた。内膜/中膜比(I/M%)は対照群では70±29.6%、GdNCT群では13.1±8.5%であった。また、免疫組織染色で、増殖因子などの動態を検討したが、VEFGとbFGGの発現が対照血管の増殖部で認められたが、GdNCT群ではほとんど発現が見られなかった。CD68およびアクチン染色により増殖部の細胞は血管平滑筋が主であり、マクロファージはほとんど認められなかった。また、MMP-2,9、CD62P,CD63の発現はいずれにも認められなかった。以上より、GdNCTにより血管内膜増殖肥厚や血管攣縮が予防できる可能性が示唆された。本年度は中性子補足療法による血管形成術後再狭窄予防に焦点をしぼり研究を施行した。予算の関係上(250万より140万円に減額)、細胞培養実験は中止した。実験方法と結果は次のとうりである。350-450gのラットをペントバルビタール1-2mgの静脈投与で麻酔し、大腿動静脈を露出した。ヘパリン100単位/kg投与後に、右総腸骨動脈と大動脈をカイドワイヤーで傷害した。血管の障害後、原子炉内において、大腿静脈よりガドリニウム(Gd) GdDTPAを持続静脈投与しながら中性子照射療法を行った。中性子線を照射することにより血管内でのみ157Gd(n,g)158Gd中性子補足反応(Gadolinium Neutron Capture Reaction)を持続的に起こさせ内部転換電子を血管に照射できる。照射1月後に血管を摘出し、病理検索のためパラフィン切片を作り、ヘマトキシリンエオジン染色等で内膜の肥厚度を組織病理学的に評価し、血管障害のみの対照群と比較した。また、VEGE, b-FGF等の増殖因子の発現を免疫組織染色で検討した。中性子捕捉療法が行えた14匹中8匹と対照群12匹中8匹で1月後の血管内膜肥厚度が評価され比較検討された。中性子捕捉療法群では内膜肥厚が完全に抑制され内膜は修復されていなかったが、対照群では内膜肥厚と内皮修復が認められた。内膜/中膜比(I/M%)は対照群では74±31.9%(平均±標準偏差)GdDPTA投与によるGdNCT群では8±42%であった(P<0.001)。対照群の肥厚内膜ではVEGFおよびPDGFの発現が顕著にみられたが、照射群の血管では内膜側に細胞成分が乏しく増殖因子の発現は軽度であった。VCAM1には差がみられなかった。以上より、中性子捕捉療法により血管内膜増殖肥厚ひいては血管形成術後再狭窄が予防できる可能性が示唆された。

直後の評価では両群ともに機械的刺激によりすでに血管が収縮しており、GdNCTによる収縮抑制効果は認められなかった。1月後、GdNCTの8匹(63%)と対照の9匹(89%)で、同様に血管収縮度を評価した。軽度の血管収縮度(径で70%以下)がGdNCT群の5匹と対照の8匹で認められたが、有意差はみられなかった。また、別の群では、引き続き血管壁肥厚抑制の研究を行った。16匹のラットを麻酔後に大腿動静脈を露出した。右総腸骨動脈と大動脈をガイドワイヤーで傷害し、中性子照射療法を行った。照射1月後に血管を摘出し、内膜の肥厚度を組織病理学的に評価し、血管障害のみの対照群と比較した。GdNCT10匹と対照群9匹で1月後の血管内肥厚度の評価が行えた。内膜/中膜比(I/M%)は対照群では70±29.6%、GdNCT群では13.1±8.5%であった。また、免疫組織染色で、増殖因子などの動態を検討したが、VEFGとbFGGの発現が対照血管の増殖部で認められたが、GdNCT群ではほとんど発現が見られなかった。CD68およびアクチン染色により増殖部の細胞は血管平滑筋が主であり、マクロファージはほとんど認められなかった。また、MMP-2,9、CD62P,CD63の発現はいずれにも認められなかった。以上より、GdNCTにより血管内膜増殖肥厚や血管攣縮が予防できる可能性が示唆された。
炎症性サイトカインの情報伝達の分子メカニズムの解明とバイオプローブによる制御

炎症性サイトカインであるtumor necrosis factor-αやinterleukin-1は、転写因子nuclear factor κB(NF-κB)の情報伝達経路を活性化し、その遺伝子発現を介して様々な細胞機能を制御している。炎症性サイトカインは、自己免疫疾患、がん、糖尿病に関与していることが明らかになってきている。本研究では、炎症性サイトカインによって誘導されるNF-κBの情報伝達や遺伝子発現に作用する小分子化合物(バイオプローブ)の作用メカニズムを解明した。炎症性サイトカインであるtumornecrosis factor-α(TNF-α)やinterleukin-1α(IL-1α)は、転写因子nuclear factor κB(NF-κB)のシグナル伝達経路を活性化し、intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)等の様々な遺伝子の発現を誘導する。トリエン-アンサマイシン(triene-asnamycin)系化合物の一つであるマイコトリエニンII(mycotrienin II)は、ヒト肺がん腫A549細胞において、IL-1αに比べてTNF-αによって誘導される細胞表面のICAM-1発現を強く阻害した。マイコトリエニンIIは、DNA合成やRNA合成に影響しない条件下でタンパク質合成を選択的に阻害し、無細胞翻訳系においても阻害活性を示した。幾つかのトリエン-アンサマイシン系化合物は、マイコトリエニンI1と同様に、ICAM-1の発現誘導および無細胞翻訳系を阻害した。以上の結果から、トリエン-アンサマイシン系化合物は、タンパク質合成阻害剤として、炎症性サイトカインによるICAM-1発現を阻害することが明らかになった.サイトトリエニンA(cytotrienin A)は、マイコトリエニンIIの構造類縁体である。サイトトリエニンAは、マイコトリエニンIIと同様に、IL-lαに比べてTNF-αによる細胞表面のICAM-1の発現を選択的に阻害した。サイトトリエニンAは、TNFα-converting enzyme(TACE)によるTNFレセプター1のエクトドメインシェディングを誘導した。TACE阻害剤TAPI-2は、ICAM-1発現に対するサイトトリエニンAの選択的な阻害活性を抑制した。さらに、MEK阻害剤U0126およびp38MAPキナーゼ阻害剤SB203580の存在下では、サイトトリエニンAによるTNFレセブター1のエクトドメインシェディング、並びにICAM-1発現に対するサイトトリエニンAの選択的な阻害活性が抑制された。以上の結果から、サイトトリエニンAはERKとp38 MAPキナーゼの活性化を介して、TNFレセプター1のエクドドメインを誘導し、TNFαによるICAM-1発現を選択的に阻害することが明らかになった。本研究課題では、炎症性サイトカインによる遺伝子発現に対するトリコテセン系化合物の影響を検討した。デオキシニバレノールは、IL-1αに比べて、TNF-αによるICAM-1の発現誘導を選択的に阻害した。一方、3-アセチルデオキシニバレノールは、TNF-αによるICAM-1の発現誘導に対して選択的な阻害を示したが、T-2トキシンやベルカリンでは、選択的阻害がまったく観察されなかった。さらに、デオキシニバレノールや3-アセチルデオキシニバレノールがTACEを介してTNFレセプター1のエクトドメインを誘導していることを見出した。以上の結果から、特定のトリコテセン系化合物のみがTNFレセプター1のエクトドメインシェディングを誘導することによって、TNF-α応答性の遺伝子発現を選択的に抑制していることが明らかになった。本研究課題では、オイデスマン骨格を有するセスキテルペンを合成し、転写因子NF-κBシグナル伝達経路に対する構造活性相関を検討した。その結果、オイデスマン誘導体が分子構造のわずかな違いにより、TNF-αやIL-1αによって活性化されるNF-κBシグナル伝達経路において異なるステップを阻害することが明らかになった。これらの研究成果の一つとして、α-ブロモケトン構造をもつ(11S)-2α-bromo-3-oxoeudesmano-12,6α-lactoneが、IL-1αで刺激した場合、IκBαのリン酸化と分解を阻害するが、TNF-αで刺激した場合、1κBαのリン酸化と分解を阻害せず、NF-κBサブユニットp65の核移行を選択的に阻害することを見出した。以上の結果から、オイデスマン誘導体は炎症性サイトカインによるNF-κBシグナル伝達経路を解析するための有用なバイオプローブであると考えられる。トリコテセン系マイコトキシンは、真核生物の翻訳を阻害するだけでなく、MAPキナーゼスーパーファミリーの活性化を介して、遺伝子発現を調節している。ヒト肺がん腫A549細胞において、デオキシニバレノールと3-アセチルデオキシニバレノールは、TNFレセプター1のエクトドメインシェディングを誘導した。デオキシニバレノールは、添加後5分から30分にかけてERK1/2のリン酸化を亢進させた。

一方、p38 MAPキナーゼは、デオキシニバレノールの添加後5分以内にリン酸化され、2時間後までリン酸化されたままであった。さらに、MEK阻害剤U0126とp38 MAPキナーゼ阻害剤SB203580によって、デオキシニバレノールによるTNFレセプター1のエクトドメインシェディング、並びにTNF-α応答性のICAM-1の発現誘導が抑制された。以上の結果から、デオキシニバレノールは、ERKとp38 MAPキナーゼの活性化を介してTNFレセプター1のエクトドメインシェディングを誘導することが明らかになった。オイデスマン骨格を有するセスキテルペンであるsantonin-related compound 2 (SRC2)は、TNF-α刺激によって誘導されるNF-κBサブユニットp65/RelAの核移行を阻害する。p65のN末端には、DNA結合、二量体化、核内移行等に重要なRel homology domain (RHD)が存在している。p65のRHDに含まれるCys-38をSerに置換したp65(C38S)変異体を作製し、p65(C38S)を安定発現させたA549細胞を構築した。その結果、野生型p65に比較して、p65(C38S)の核移行に対するSRC2の阻害作用が低下していた。以上の結果から、SRC2はp65のCys-38に作用することによって、p65の核移行を阻害することが明らかになった。現在までに、炎症性サイトカインの情報伝達に対するタンパク質合成阻害剤(トリエン-アンサマイシン系化合物、トリコテセン系化合物)及びオイデスマン骨格を有するセスキテルペンの作用メカニズムを解明し、これらの化合物がバイオプローブとして有用であることを示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、これまでの研究成果を踏まえ、独自に同定した小分子化合物の作用メカニズムを解析する。さらに、新しいバイオアッセイ系を構築し、新規な作用メカニズムを有する小分子化合物を探索する。
唾液腺に発現するオステオポンチンの組織構築における役割と生理的意義

我々はマウス唾液腺にオステオポンチン(OPN)が発現していることを見出した。そこで、本研究では唾液腺の組織・機能の構築におけるOPNの役割を明らかにすることを目的とし、自己免疫疾患モデルマウスを用いて、野生型マウスでみられた加齢に伴うOPN mRNAの発現上昇が舌下腺と顎下腺で抑制されたこと、顎下腺ではOPNタンパクの発現量が増加し、プロセッシングを受けたと考えられる30kDaフラグメントが減少したことを明らかにしてきた。本年度はマウス唾液腺OPNの小分子(30kDaフラグメント)生成がMMP作用によるものか、またそのフラグメントの性状を解析するためその単離を試みた。30kDaフラグメントのOPNタンパクの一部分であるかを明らかにするため、組換えOPNタンパクを基質として、活性型MMP-7あるいは顎下腺ホモジネートと反応させたが、用いた実験条件下では、いずれの場合にも30kDaフラグメントや、その他の抗OPN抗体陽性フラグメントは検出されなかった。また、舌下腺ホモジネートを基質とした場合もまた、限定分解されたOPNタンパクのフラグメントは検出されなかった。おそらくMMPでの切断には組替えOPNタンパクにはない糖鎖の付加やリン酸化が必要であること、また、唾液腺抽出液中にMMPの活性抑制にかかわる分子が存在することが示唆された。30kDaフラグメンの性状をアミノ酸配列の決定から明らかにするため、プロテインGを用いた免疫沈降法により単離を試みたが精製できなかった。2次元電気泳動法により唾液腺抽出タンパクから30kDaフラグメントをシングルスポットとして分離することができたが、アミノ酸配列の決定には至らなかった。オステオポンチン(OPN)は骨マトリックスタンパクとして骨改造現象に、また、腎炎や腎結石の形成にも関与している。我々はマウス唾液腺にOPNが発現していることをRT-PCR法およびウエスタンプロット法で明らかにしてきた。本研究では唾液腺におけるOPNの生理的機能の解析を目的として、正常および自己免疫疾患モデルマウスを用いてリアルタイムRT-PCR法およびウエスタンブロット法による発現解析と免疫組織化学法による局在の検索を行った。これまでに耳下腺、舌下腺、顎下腺でmRNAの発現を明らかにし、耳下腺および舌下腺に分子量6万の、顎下腺に分子量3万の抗OPN抗体陽性タンパク質を検出した。マトリックス金属プロテアーゼ(MMP)-3/7で切断されたOPNの分子量は3万を示す。同じ抗体を用いて、免疫組織化学法で局在を検索したところ、OPNは耳下腺および舌下腺の腺房細胞の腺腔膜側に発現が認められたが、顎下腺では非常にシグナルが弱かった。また、顎下腺にはMMP-7が発現していることもウエスタンブロットにより確認された。このことより、顎下腺ではOPNがMMP-7による分解を受けている可能性が示唆されるが、分子量3万の抗OPN抗体陽性タンパク質がOPN由来であるか明らかにする必要がある。自己免疫疾患モデルマウスでのOPNの発現解析の結果、MRL/lprマウスの舌下腺でmRNAの発現量が他の系統のマウスと比べて低下していた。顎下腺では大きな変化は認められなかった。ところが、各マウス間でのタンパク質の発現量の差はウェスタンブロットでは検出できなかった。次年度以降、局在も含めた検討を行う予定である。オステオポンチン(OPN)は骨マトリックスタンパクとして骨改造現象に、また、腎炎の発症や腎結石の形成にも関与している。我々はマウス唾液腺にOPNが発現していることをRT-PCR法およびウエスタンブロット法で明らかにしてきた。本研究では唾液腺におけるOPNの生理的機能の解析を目的として、自己免疫疾患モデルマウスの唾液腺を用いてOPN mRNAおよびタンパク質の発現解析を行った。自己免疫疾患モデルマウスとして、細胞死受容体Fas遺伝子に変異をもつMRL/lpr、C3H/lprとそのリガンドFasL遺伝子に変異をもつMRL/gld、C3H/gldを用いた。対照として用いたC3Hでは加齢に伴ってOPN mRNAの発現量が上昇した。疾患モデルマウスでは加齢に伴い全身のリンパ節の腫脹が認められたが、唾液腺においてはリンパ球の集簇などの炎症反応は認められなかった。疫疾患モデルマウスの舌下腺と顎下腺では加齢に伴うOPN mRNAの発現上昇が抑制された。また、疾患モデルマウスの顎下腺ではMMP-7によってプロセッシングを受けたと考えられる30kDaの抗OPN抗体陽性バンドが減少し、正常なOPNの陽性バンドの増加が認められた。以上のことから、唾液腺炎ではOPNの発現増強によるリンパ球やマクロファージの浸潤は誘起されず、OPNの主な作用はMMPの活性の制御である可能性が示唆された。唾液中へのOPNの分泌は認められなかったが、3dkDa抗OPN抗体陽性バンドが検出された。この顎下腺から分泌される30kDaタンパクが唾石形成に関与していることも考えられ、今後、OPNのプロセッシングに注目したい。

そこで、本研究では唾液腺の組織・機能の構築におけるOPNの役割を明らかにすることを目的とし、自己免疫疾患モデルマウスを用いて、野生型マウスでみられた加齢に伴うOPN mRNAの発現上昇が舌下腺と顎下腺で抑制されたこと、顎下腺ではOPNタンパクの発現量が増加し、プロセッシングを受けたと考えられる30kDaフラグメントが減少したことを明らかにしてきた。本年度はマウス唾液腺OPNの小分子(30kDaフラグメント)生成がMMP作用によるものか、またそのフラグメントの性状を解析するためその単離を試みた。30kDaフラグメントのOPNタンパクの一部分であるかを明らかにするため、組換えOPNタンパクを基質として、活性型MMP-7あるいは顎下腺ホモジネートと反応させたが、用いた実験条件下では、いずれの場合にも30kDaフラグメントや、その他の抗OPN抗体陽性フラグメントは検出されなかった。また、舌下腺ホモジネートを基質とした場合もまた、限定分解されたOPNタンパクのフラグメントは検出されなかった。おそらくMMPでの切断には組替えOPNタンパクにはない糖鎖の付加やリン酸化が必要であること、また、唾液腺抽出液中にMMPの活性抑制にかかわる分子が存在することが示唆された。30kDaフラグメンの性状をアミノ酸配列の決定から明らかにするため、プロテインGを用いた免疫沈降法により単離を試みたが精製できなかった。2次元電気泳動法により唾液腺抽出タンパクから30kDaフラグメントをシングルスポットとして分離することができたが、アミノ酸配列の決定には至らなかった。
mRNA核外輸送と転写、翻訳との機能的カップリング

多細胞生物における転写-核外輸送(Transcription-Export)複合体(TREX複合体)を介した遺伝子発現諸過程の共役機構を解明することを目的とし、ストレス下、非ストレス下におけるヒトTREX複合体の細胞内局在や構造変化について解析した。また、TREX複合体と相互作用するタンパク質因子群の網羅的な同定を試みた。さらに、TREX複合体構成因子の翻訳過程における役割を解明するために、標的遺伝子の発現変化について解析を行なった。新たに転写されたmRNAを効率よくタンパク質に翻訳する機構は、様々な刺激に応答して活性化された遺伝子を適切なタイミングで速やかに機能させるためとりわけ重要であり、ストレス応答、多細胞生物における細胞分化や形態形成といった高次生命機能発現の基盤となる。転写の場である核と翻訳の場である細胞質とが核膜により物理的に隔てられている真核生物では、このような時空間的に制御された遺伝子発現を可能にするため、mRNAの転写、プロセシング、核外輸送、翻訳といった、核および細胞質で起こる遺伝子発現の諸段階に関わる因子が相互に緊密に連携し、各素過程が機能的に共役している。TREX複合体は、mRNAの転写、プロセシングと核外輸送の過程を機能的に共役させる因子として知られているが、翻訳過程においてどのような役割を果たしているのかは、これまでに明らかにされていない。本年度は、熱ストレス下におけるHSP70遺伝子発現におけるヒトTREX複合体の機能解析を進め、免疫沈降法により結合因子を探索するとともに、TREX複合体構成因子の細胞内動態をヘテロカリオンアッセイにより解析した。その結果、複数種のタンパク質因子がTREX複合体と共免疫沈降されることやThoc5およびhHpr1といったTREX複合体構成因子が、核細胞質間を恒常的にシャトルしていることを見出した。複合体構成因子が核と細胞質間をシャトルすることから、翻訳を含めた細胞質における遺伝子発現の過程において、TREX複合体が何らかの役割を果たしていることが推察された。今後、実験計画に示したレポーターアッセイを実施するとともに、結合タンパク質をマス解析により同定し、TREX複合体の翻訳における役割を明らかにする予定である。本年度は、免疫沈降法によりTREX複合体の結合因子を探索するとともに、結合因子の熱ショック遺伝子座における動態をクロマチン免疫沈降法により解析した。その結果、複数種のタンパク質翻訳関連因子がTREX複合体と共免疫沈降されること、タンパク質翻訳関連因子のあるものは、熱ストレスに応答して、熱ショック遺伝子に結合することを見出した。これらの結果から、TREX複合体は、転写の過程とタンパク質翻訳の過程を機能的に共役させる機能を有することが推察された。今後、タンパク質翻訳因子の熱ショック遺伝子へのリクルートに関する分子機構を解明していくとともに、レポーター系を開発し、TREX複合体の翻訳過程における役割の解明を試みる。新たに転写されたmRNAを効率よくタンパク質に翻訳する機構は、様々な刺激に応答して活性化された遺伝子を適切な時期に機能させるためとりわけ重要であり、ストレス応答、細胞分化をはじめとした多細胞生物における高次生命機能発現の基盤となる。転写の場である核と翻訳の場である細胞質とが核膜により物理的に隔てられている真核生物では、このような時空間的に制御された遺伝子発現を可能にするため、mRNAの転写、プロセシング、核外輸送、翻訳といった遺伝子発現の諸段階に関わる因子が相互に緊密に連携し、各素過程が機能的に共役している。熱ストレス下におけるTREX複合体の機能の解明を目指すとともに、新規アダプター分子として申請者が同定したTREX複合体構成因子であるThoc5の機能解析を進め、その新規機能を探索することで、mRNA核外輸送とキャップ非依存性翻訳のカップリングの可能性を解析し、TREX複合体に依存したmRNA核外輸送経路の生物学的な意義を明らかにすることを目的として、本申請研究を行なった。この目的達成のために、これまでに同定してきたTREX複合体結合タンパク質のうち、翻訳制御やmRNA

プロセシングに関わるタンパク質因子のいくつかのリコンビナントタンパク質を作成し、TREX複合体構成因子の一つであるThoc5との結合を解析した。また、クロマチン免疫沈降法により、TREX複合体結合タンパク質の熱ショック遺伝子座における動態を解析した。さらに、いくつかのTREX複合体結合タンパク質については、特異抗体を作成し、その細胞内局在を解析した。
ドイツ・モダンダンスのディスクール分析-その思想史的位置づけをめぐって-

ドイツ・モデルネにおける舞踏と文学の関係、とくに舞踏の側から見た「身体」と「ことば」との関係を考察する本研究は、昨年度までにフランク・ティース、ルドルフ・レメル、フリッツ・ベーメの舞踏評論の分析、ルードルフ・フォン・ラーバン、メアリー・ヴィグマンの舞踏思想の分析を終えている。今年度はこれらの分析の成果を論文としてまとめることにつとめた。今年度前半は上記の論文を執筆しつつ、ヴァルター・ベンヤミンにおける「言語」と「身振り」に関する二次文献、ベンヤミンと関わりのあった哲学者ルートヴィヒ・クラーゲスや教育学者グスタフ・ヴィネケンら世紀転換期の改革運動(モダンダンス運動を含む)の資料を収集した。今年度後半は前半に収集した資料をもとに、ラーバンの舞踏思想とベンヤミンの言語思想とを「言語」と「身振り」の観点から比較分析した。彼らの思想の背景として各種改革運動(芸術家コロニー、田園都市運動、田園教育舎運動、青年運動など)に注目し、これらの運動が同時代の人々の動的な言語意識や言語イメージと同じ底流をもち、舞踏の想像力・想像力にも直接つながるものであることを確認した。さらにこれらの運動に身を投じた人々のなかに、ダイナミズムへの欲求がナチズムを支持する立場へと無自覚に変容していくいくつかの契機を探り当てた。これらの成果を踏まえた論文を書くことも予定していたが、体調を崩したために十分な研究成果をあげることができなかった。この点に関しては今後の課題としたい。本年度の課題であった、ティース、レメル、ベーン、ベーメらの著書については、読解と分析を行い、ラーバン『舞踏のための人生』、ヴィグマン『生の七つの踊り』、アニータ・ベルバー『悪徳、恐怖、エクスタシーの踊り』を始めとする、ドイツモダンダンス関係の一時資料を入手することができた。これらの資料の分析を踏まえて、ワイマール時代の表現舞踏と、当時もてはやされた「新しい女性」のイメージの関わりを分析した。その結果は以下の5点である。1.表現舞踏の流行は、ワイマール時代の女性の主体性や内面性を表現したいという欲求とかかわっていることを、ヴィグマンのエッセイ『女性の舞踏表現』等を元に分析した。2.表現舞踏の担い手が市民層の女性であったことは、19世紀以来の劇場のジェンダー構造への挑戦となった。この反逆の構造と、それに対する男性側の反発を、批評家フランツ・ブライのエッセイを元に分析した。3.表現舞踏の女性舞踏家たちの活動は、身体表現と言語表現の両方を視野に入れて観察されなければならない。ヴィグマンの『生の七つの踊り』は1)男性が台本・演出を、女性が舞踏を担当したバレエとは異なり、ヴィグマンが台本・演出・舞踏のすべてを担当している。2)舞踏作品であるとともに、著書としても刊行されている。3)言葉、音楽、舞踏を結びつけた「総合芸術作品」である。4)作品の内部で、男性=声と女性=身体の闘争がテーマになっている。という四点において、言葉と身体を統一し、主体性を手に入れようとする女性舞踏家の試みと理解することができる。4.これに対してアニータ・ベルバーの舞踏は、むしろ崩壊していく主体や内面の表現として理解できる。一般にはスキャンダルとしてのみ語られてきたベルバーのヌードダンスや『コカイン』の社会批判の構造を、詩人ロホヴァンスキや振付師イェンチークの批評を元に再検討した。またベルバーと夫ドロステの共著『悪徳、恐怖、エクスタシーの踊り』を分析し、「斬首」や「絞殺」のモチーフの頻度から、言葉と身体を分割しようとする暴力性が見られることを明らかにした。以上の分析は『ベルリンのモダンガール』(仮題、共著、三修社)の中の一章にまとめた。この著書は来春刊行予定である。5.なお、今年度の課題として挙げていた、マリー=ルイーゼ・ベッカーに関しては、伝記的調査が難航し予定したほどには進まなかった。とりあえず、ベルリンの住民登録局に調査を依頼して生没年と本名を確定し、また簡単な履歴を手に入れることができた。本年度の前半は、前年度に執筆していたワイマール時代のモダンダンスと「新しい女」に関する論考を、文化史およびジェンダー論の視点を踏まえて全面的に改稿し、『ベルリンのモダンガール』の一章として刊行した。(2004年1月)この中で、モダンダンスの言説が、性差を揺るがせる側面と性差を強化する側面を持っていたこと、モダンダンスの言説への女性の参加、身体表現と言語表現の連動、個と共同体との葛藤などに触れた。その例としてダンカン、ヴィグマン、ベルバー、トリュンピ、レメル、ブライ、ロホヴァンスキ等の舞踊に関する言説を取上げている。本年度後半は、ベンヤミンについての基礎的な研究を行い、その一部を「『屑』としての詩人-ゲルトルート・コルマルとヴァルター・ベンヤミンにおける収集のモチーフ」として発表した。この論文は、コルマルの詩学とベンヤミンの歴史哲学について論じたものだが、アレゴリーの表象としての「屍体」の概念に触れている。(2004年2月)また国際コロキアム「ダンスの身体性-『身体表象』の構築、脱構築、そしてその後」にパネリストとして招聘され、ホーフマンスタールの舞踊家ルース・セント・デニスについての評論『比類なき踊り子』についてドイツ語で口頭発表を行った。(2003年10月)

この発表では、ホーフマンスタールの舞踊についての言説を分析し、様々な文化的文脈から収集された、身体、言語、西洋/東洋、ジェンダーなどについての表象が、いかに意味づけられ配置されているかを示した。そして、この評論を、マラルメのロイ・フラー論と並ぶ、モデルネの舞踊言説の原型として位置づけた。ドイツ・モデルネにおける舞踏と文学の関係、とくに舞踏の側から見た「身体」と「ことば」との関係を考察する本研究は、昨年度までにフランク・ティース、ルドルフ・レメル、フリッツ・ベーメの舞踏評論の分析、ルードルフ・フォン・ラーバン、メアリー・ヴィグマンの舞踏思想の分析を終えている。今年度はこれらの分析の成果を論文としてまとめることにつとめた。今年度前半は上記の論文を執筆しつつ、ヴァルター・ベンヤミンにおける「言語」と「身振り」に関する二次文献、ベンヤミンと関わりのあった哲学者ルートヴィヒ・クラーゲスや教育学者グスタフ・ヴィネケンら世紀転換期の改革運動(モダンダンス運動を含む)の資料を収集した。今年度後半は前半に収集した資料をもとに、ラーバンの舞踏思想とベンヤミンの言語思想とを「言語」と「身振り」の観点から比較分析した。彼らの思想の背景として各種改革運動(芸術家コロニー、田園都市運動、田園教育舎運動、青年運動など)に注目し、これらの運動が同時代の人々の動的な言語意識や言語イメージと同じ底流をもち、舞踏の想像力・想像力にも直接つながるものであることを確認した。さらにこれらの運動に身を投じた人々のなかに、ダイナミズムへの欲求がナチズムを支持する立場へと無自覚に変容していくいくつかの契機を探り当てた。これらの成果を踏まえた論文を書くことも予定していたが、体調を崩したために十分な研究成果をあげることができなかった。この点に関しては今後の課題としたい。
ニワトリにおける油脂の味覚受容機構の解明

油脂は動物にとって必須の栄養素であり、嗜好性も高い。飼料中の油脂は味覚で認識されていると予想されるが、ニワトリにおける油脂の味覚受容機構は不明な点が多い。これまでに脂肪酸受容体GPR120がニワトリの油脂の味覚受容体の一つであることを明らかにしたが、そのアゴニストは2種類しか同定されていない。また、脂肪酸トランスポーターであるCD36もニワトリの味蕾が存在する口蓋に発現していることを明らかにしてきた。ニワトリの油脂の対する嗜好性を受容体レベルで理解することは、人為的に嗜好性を制御する方法の確立に繋がり、効率的な動物生産に貢献できる。そこで本研究では、ニワトリ口腔組織における油脂の味覚受容機構を明らかにすることを目的とした。平成30年度の研究において、これまでGPR120のアゴニストとして明らかになっていたオレイン酸やリノール酸以外に、2種類の脂肪酸が新たにニワトリGPR120のアゴニストであることが示唆された。また、1種類の物質がGPR120のアンタゴニストである可能性も示唆された。以上の結果より、平成30年度はニワトリGPR120の機能について理解を深めることができた。最終年度である平成31年度は、GPR120のアゴニストの同定をさらに進めると共に、複数の食行動解析手法を用い、ニワトリが油脂に対してどのような食行動をもたらすのかについて、詳細に明らかにしていこうと考えている。受容体と行動解析の両面からニワトリの油脂の味覚受容機構に迫っていく。平成30年度はキャンパスの移動に伴う研究室の引越しを行なったため、研究が長期間停止せざるを得なかった。さらに、研究代表者の他研究機関への転出も重なったため、さらなる研究の停止を余儀なくされた。実質的に研究を行う時間が減ってしまったため、当初の予定よりもやや進捗が遅れる結果となった。平成30年度に代表研究者の異動が完了した。平成31年度は十分に実験を実施できるので、前年度分の遅れを取り戻すよう研究に取り組む。ニワトリから味蕾を単離して初代培養する実験系はスクリーニングに時間がかかるため、培養細胞を用いた実験系に絞って研究を進めていく。行動解析についても実験系をブラッシュアップして油脂の味覚特性について明らかにしていく。H29年度の研究により、ニワトリがどのようにして油脂を口腔内で感じているかについて一定の成果を得ることができた。これまでに、脂肪酸受容体であるGPR120がニワトリの味蕾が存在する口蓋に発現し、油脂の味を感じるセンサーの一つであることは明らかにしていた。H29年度の研究では、また別の脂肪酸センサーであるCD36の遺伝子をニワトリ口蓋よりクローニングし、塩基配列を同定することができた。ニワトリCD36を組込んだプラスミドを作製したので、これを用いて今後一過的発現細胞を構築することができるようになる。塩基配列はセキショクヤケイと比べて二箇所に変異が見られ、アミノ酸レベルでも二箇所の違いがあった。次に、脂肪酸センサーであるGPR120とCD36の発現部位をRT-PCRで検証したところ、いずれも口腔組織および消化管組織に幅広く発現していることが明らかとなった。面白いことに、CD36に関してはクチバシにも発現が見られ、クチバシにおいても脂肪酸を検出している可能性が推察された。上記のように、脂肪酸センサーが口腔組織に存在することはわかったが、飼料中の油脂はトリグリセリドの形をとっていることが多い。従って、トリグリセリドのままでは脂肪酸センサーには結合できないことから、口腔内リパーゼの存在が不可欠であると考えた。ニワトリのクチバシ、口蓋、舌を採取し、それらの組織ホモジネートのリパーゼ活性を検証したところ、膵臓と比べて約三分の一、ならびに腺胃と同程度のリパーゼ活性があることがわかった。また、それらの組織に各種リパーゼ遺伝子の発現が幅広く見られることをRT-PCRによって明らかにした。以上の結果より、ニワトリは飼料中のトリグリセリドを口腔内リパーゼで脂肪酸に一部消化し、脂肪酸がGPR120やCD36等の脂肪酸センサーに結合することで油脂の味を感じていることが推察された。CD36のクローニング、口腔内リパーゼ活性の解析、並びに各種リパーゼ遺伝子の発現の検証などを実施することができ、ニワトリの油脂の味覚受容機構を明らかにする上で重要な部分を解明できたと考えられる。従って、概ね順調に進展していると考えている。

また、1種類の物質がGPR120のアンタゴニストである可能性も示唆された。以上の結果より、平成30年度はニワトリGPR120の機能について理解を深めることができた。最終年度である平成31年度は、GPR120のアゴニストの同定をさらに進めると共に、複数の食行動解析手法を用い、ニワトリが油脂に対してどのような食行動をもたらすのかについて、詳細に明らかにしていこうと考えている。受容体と行動解析の両面からニワトリの油脂の味覚受容機構に迫っていく。平成30年度はキャンパスの移動に伴う研究室の引越しを行なったため、研究が長期間停止せざるを得なかった。さらに、研究代表者の他研究機関への転出も重なったため、さらなる研究の停止を余儀なくされた。実質的に研究を行う時間が減ってしまったため、当初の予定よりもやや進捗が遅れる結果となった。これまでにニワトリ口腔内にリパーゼが存在すること、並びに脂肪酸センサーであるGPR120やCD36が発現していることを明らかにしてきた。また、GPR120に関しては機能的な脂肪酸受容体であることをGPR120発現細胞を用いて示してきた。今後はニワトリ個体を用いて各種脂肪酸に対する嗜好性を検証する。また、CD36が機能的な脂肪酸センサーであるかどうか検証するため、CD36を発現させた細胞を用いて脂肪酸取り込みアッセイを行う。さらに、ニワトリから味蕾を単離し、カルシウムイメージングにて脂肪酸に対する応答性を検証することで、脂肪酸感受性細胞が味蕾に存在するか明らかにしていく。平成30年度に代表研究者の異動が完了した。平成31年度は十分に実験を実施できるので、前年度分の遅れを取り戻すよう研究に取り組む。ニワトリから味蕾を単離して初代培養する実験系はスクリーニングに時間がかかるため、培養細胞を用いた実験系に絞って研究を進めていく。行動解析についても実験系をブラッシュアップして油脂の味覚特性について明らかにしていく。当初計画よりもカルシウムイメージングによる検証実験の試行回数が少なかったことから、消耗品費の消費が抑えられた。また、購入予定だった設備が、当初見積よりも大幅に安く購入できたため差額が生じた。H30年度は実験の試行回数をH29年度よりも増やす必要があるため、消耗品費の支出が増えると予想している。平成30年度は研究代表者のキャンパスの引越し並びに他研究機関への転出が重なったため、十分に研究を実施する時間が確保できなかったため、使用額についても予定していたものより少なくなってしまった。このため、次年度に使用額を持ち越して研究を進める計画とした。