hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
培養オルガノイド由来パネト細胞を用いた口腔細菌と腸管自然免疫のクロストーク解明

本研究は、口腔細菌の腸管への影響を自然免疫の観点から検討するために、腸管自然免疫の主要エフェクターである抗菌ペプチド・α-defensinを分泌し自然免疫や腸内細菌叢の恒常性維持に寄与するPaneth細胞に焦点をあてた新規腸管自然免疫評価系を、オルガノイド培養法を応用して開発することを目的とした。平成27年度は、オルガノイドを構成する、Paneth細胞のCCh、LPS刺激によりるα-defensin分泌応答をELISAにて検討した。Paneth細胞基底膜側の刺激物と考えられるCCh処理で、培養上清中α-defensin濃度はCCh濃度依存的に上昇した。一方、内腔側からの刺激物と考えられるLPS処理では、α-defensin濃度は上昇しなかった。以上の結果より、Paneth細胞は基底膜側からの刺激物に応答する一方,内腔側からの刺激物にはオルガノイドが閉鎖構造のため刺激物が到達できず、応答できないことが考えられた。そこで、オルガノイド内腔に目的の刺激物質を到達させるために、刺激物質を添加するタイミングを、小腸陰窩内腔が閉鎖する前の、マトリゲルに包埋直後に行うことを考えた。目的の刺激物が陰窩内腔に到達しているのかを確認するために、蛍光物質をマトリゲルに添加し、蛍光顕微鏡で観察したところ、内腔に培地およびマトリゲルが進入しており、約30分70分で内腔が閉鎖した。次に、100 μM CChおよび100 μg/ml LPSをマトリゲルに添加し、培養上清のα-defensin濃度を測定したところ、それぞれ未処理と比べて有意に上昇した。本研究により、オルガノイドとELISAを用いたPaneth細胞・α-defensinを指標とした新規腸管自然免疫評価系を確立できた。この評価法を応用することで、口腔細菌と腸管自然免疫の相互作用解析が可能となる。本研究は、口腔細菌の腸管への影響を自然免疫の観点から解明するために、腸管自然免疫の主要エフェクターである抗菌ペプチド・α-defensinを分泌し自然免疫や腸内細菌叢の恒常性維持に寄与するPaneth細胞に焦点をあてた新規腸管自然免疫評価系を開発することを目的とした。本研究により、オルガノイド培養法とα-defensinを定量可能なELISAを応用することで、Paneth細胞顆粒分泌を反映した自然免疫評価系が確立できた。平成26年度は、オルガノイド培養法を応用したパネト細胞株の樹立することを目的として、最初に、マウス小腸上皮細胞オルガノイドの最適な培養条件を検討した。既に報告のある培養法を参考にして(Sato T, et al, Nature, 2011)、マウス小腸空腸より組織を切除し、EDTA溶液で処理後、陰窩を分離して細胞外基質ゲルに包埋し無血清培地にて培養を行った。培養開始から数時間で陰窩は円形状になり、2日後には陰窩構造部分の突出が観察された。培養開始5日目には、陰窩構造部分基底部にパネト細胞の特徴である、細胞質中に大きな顆粒を豊富に保持している細胞が数個観察できた。得られたオルガノイドを抗マウスαディフェンシン抗体にて免疫蛍光染色を行ったところ、陰窩構造部分基底部の細胞内に存在する顆粒が陽性だった。さらに、オルガノイドの培養中にパネト細胞顆粒分泌を刺激するこで知られているコリン作動薬カルバコールを添加し、2時間後に培養上清を回収し、sandwich ELISAを用いてαディフェンシン量を測定したところ未処理と比較して、オルガノイド1個あたり約3倍の分泌量を示した。以上より、培養条件の検討により得られたオルガノイドはパネト細胞を保持しており、顆粒分泌機能を維持していることが示された。
撥油面とソフトEHLによる超低摩擦の実現

本研究は,軟質材の形状コンフォーミティーと摩擦面の撥油性による流体の固体壁面滑りの促進効果を利用して,流体潤滑における摩擦係数を飛躍的に低下させる可能性と,その適用範囲を明らかにすることを目的としている.本年度は,ガラス円筒試験片の曲面にラングミュア・ブロジェット法(LB法)による脂肪酸吸着膜を付与し,これを用いた低面圧EHL実験行うとともに,アクリルゴム試験片を用いた潤滑膜流れの観察,及び吸着膜を有する面上での分子の挙動を分子動力学法によるシミュレーションを行った.ポリαオレフィンを潤滑剤として,ガラス円筒試験片とガラス円板試験片間の線接触純滑りEHL実験を行い,面圧20MPa程度,せん断速度が68×10^4s^<-1>のもとで,静止側試験片(円筒試験片)にステアリン酸LB膜を付与した場合に,LB膜を付与していない場合よりも流体潤滑から混合潤滑領域において摩擦係数が若干低下することを確認した.ゴム試験片を用いた実験においては,潤滑油中にミクロンオーダーのガラス粉体,ないしは蛍光粉体を混入させ,蛍光顕微鏡によって観察を試みたが,壁面滑りの有無の検出は成功していない.分子動力学シミュレーションにおいては,潤滑油としてヘキサンないしシクロヘキサンが,アルキル鎖を規則的に配置した表面と体心立方格子の鉄表面との間にはさまれせん断を受けたとき,潤滑油とアルキル鎖との間で速度が不連続となり,一様速度分布に近づくこと,またそれに伴って摩擦係数が低下すること,壁面滑りの程度はアルキル鎖の長さ及び潤滑剤分子の構造の影響を受けることなどを確認した.本研究は,軟質材の形状コンフォーミティーと摩擦面の撥油性による流体の固体壁面滑りの促進効果を利用して,流体潤滑における摩擦係数を飛躍的に低下させる可能性と,その適用範囲を明らかにすることを目的としている.本年度は,実験装置の製作,表面方法の作成,及びガラス面を用いた予備実験を行った.実験装置の製作では,既存のEHL膜蛍光観察装置に高解像度・低暗電源のデジタルCCDカメラを組み込むとともに,トラクション測定と温度制御が行えるように装置主要部の設計変更を行った.組み込んだCCDカメラにより,光干渉法と蛍光法による定常流体潤滑膜の膜厚測定と負圧領域でのキャビティー観察が可能となった.表面の作成では,ガラス円筒試験片の曲面に,単純な浸漬による吸着膜の付与,及びラングミュア・ブロジェット法による吸着膜付与を行った.また,炭素系材料とゴムを含む有機高分子材料への吸着膜付与方法について検討した.ポリαオレフィンとポリαオレフィンにステアリン酸を0.05質量%添加したものを潤滑剤として,ガラス円筒試験片とガラス円板試験片間の線接触純滑りEHL実験を行い,面圧20MPa程度,滑り速度150250mm/sのもとで,ステアリン酸を添加した場合にポリαオレフィン単体の場合よりも摩擦係数が若干低下することを確認した.また,ヘキサデカンとヘキサデカノールを用いた場合にも同様の傾向が認められた.一方,移動面側に撥油性表面膜を付与した場合には,潤滑部に流体が導入されず潤滑膜が形成されないことを確認した.本研究は,軟質材の形状コンフォーミティーと摩擦面の撥油性による流体の固体壁面滑りの促進効果を利用して,流体潤滑における摩擦係数を飛躍的に低下させる可能性と,その適用範囲を明らかにすることを目的としている.本年度は,ガラス円筒試験片の曲面にラングミュア・ブロジェット法(LB法)による脂肪酸吸着膜を付与し,これを用いた低面圧EHL実験行うとともに,アクリルゴム試験片を用いた潤滑膜流れの観察,及び吸着膜を有する面上での分子の挙動を分子動力学法によるシミュレーションを行った.ポリαオレフィンを潤滑剤として,ガラス円筒試験片とガラス円板試験片間の線接触純滑りEHL実験を行い,面圧20MPa程度,せん断速度が68×10^4s^<-1>のもとで,静止側試験片(円筒試験片)にステアリン酸LB膜を付与した場合に,LB膜を付与していない場合よりも流体潤滑から混合潤滑領域において摩擦係数が若干低下することを確認した.ゴム試験片を用いた実験においては,潤滑油中にミクロンオーダーのガラス粉体,ないしは蛍光粉体を混入させ,蛍光顕微鏡によって観察を試みたが,壁面滑りの有無の検出は成功していない.分子動力学シミュレーションにおいては,潤滑油としてヘキサンないしシクロヘキサンが,アルキル鎖を規則的に配置した表面と体心立方格子の鉄表面との間にはさまれせん断を受けたとき,潤滑油とアルキル鎖との間で速度が不連続となり,一様速度分布に近づくこと,またそれに伴って摩擦係数が低下すること,壁面滑りの程度はアルキル鎖の長さ及び潤滑剤分子の構造の影響を受けることなどを確認した.
腱再生を制御する分子制御機構の解明による腱再生能力賦活化治療の開発

腱組織の再生能力を規定する要素として、加齢により変化する“腱細胞の分化状態(エピゲノム)"と“腱損傷後の細胞応答"に着目した。本年度は加齢により変化する腱細胞の“腱損傷後の細胞応答"について網羅的遺伝子発現解析を行い、加齢により失われる腱再生シグナル伝達経路および腱再生関連遺伝子の同定を試みた。1週齢(若齢)および6ヶ月齢(高齢)のScx-EGFPマウスを用いてアキレス腱損傷モデルを作製した。損傷前、損傷5日後のアキレス腱を採取し、RNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析を行った。KEGGパスウェイ解析により、若齢マウスのアキレス腱で特異的に活性化されているパスウェイを同定した。さらに腱損傷時、そのパスウェイは若齢マウスで特異的に活性化されることが明らかとなった。同定された腱再生シグナル伝達経路に対するinhibitor, activatorを入手した。現在、in vivoにて標的パスウェイを活性化または抑制することでの、腱再生能の変化を解析している。また、標的パスウェイをCre依存的に活性化可能なマウス(geneX flox/floxマウス)を入手したため、これを既所有の腱特異的Cre誘導マウス(Scx-CreERT2)と交配し、Scx-CreERT2/geneX flox/floxマウスを作製中である。腱再生に寄与すると考えられるパスウェイを同定した。そのパスウェイに対するactivator, inhibitorを入手し得た。またパスウェイを活性化可能なCre依存的コンディショナルマウスを入手できた。予定通り、パスウェイに対するactivator, inhibitor、およびパスウェイを活性化可能なCre依存的コンディショナルマウスを使用し、in vitro, in vivoでの解析を進める。in vivo:Scx-CreERT2(既所有)/geneX flox/floxの高齢マウスにタモキシフェンを投与し、腱細胞特異的に同定パスウェイを活性化する。腱損傷モデルを作製し、免疫染色(Tnmd, Col1a1, Col3a1)、電子顕微鏡解析(コラーゲン線維数および線維径)を行い、腱再生効果を評価する。
定型表現からみた医療系談話の特徴－専門日本語教育への応用に向けて－

本研究では、場面や状況がある程度固定されている医療系談話を対象に、談話の持つ定型表現について明らかにする。その上で談話における定型表現とは何かについて考察を行い、専門日本語教育に応用する形について検討する。具体的には、各談話の定型表現をもとに「定型談話」を作成する。そして「定型談話」と実際の談話を比較し、それが専門日本語教育に応用できるのかを検証する。
存在論をてがかりとした道元の思想構造に関する総合的研究

本研究は、日本の思想書の中でも難解をもって知られている『正法眼蔵』の正確な読解を某盤として、道元の思想の全体像を解明しようとするものである。その際、道元の思想の根幹にある存在論を、自己概念や、世界観と関連させて明らかにすることによって、道元の思想の構造を総体として提示した。特に、大乗仏教で重視された「仏性」を手掛かりとして解明を行った。その際、道元の存在、自己、世界に対する把握の某底をなす「空-縁起」に着目し、それを表現する文体に焦点をあてて検討した。さらに、道元の存在把握から、存在の理法としてどのような当為、すなわち倫理が導き出されるかについても検討課題とした。特に「善悪」「因果」をめぐる道元の独自の思想を『正法眼蔵』の記述を手掛かりとして明らかにした。また、道元の存在論の日本倫理思想史上、東アジア仏教思想史上での独自性はどこにあるのかという問題についても解明をはかった。その際、前述の「仏性」を手掛かりとして考えた。そして、道元の仏性理解が、インドから東アジアへと展開する仏性観のある傾向性に対するアンティテーゼでもあることを解明し得た。道元の仏性観に対するこのような観点からの研究は従来行われておらず、宗学を離れたより広い視野からの道元研究という点で意義があるものと思われる。比較思想的な解明としては、道元と親鸞との比較研究を、「悪」の理解、「仏性」観という観点から行った。その結果、道元と親鸞の「悪」に対する考え方も、「仏性」に対する考え方も、それぞれ思想的背景は異にしつつ大枠においては同じ方向をめざしており、また、それぞれが仮想敵とした相手が、仏教思想がややもすると陥りがちな実体化傾向であったことを指摘した。これらを通じて、親鸞と道元との共通性を明らかにし、それが大乗仏教思想の透徹した理解に基づくことを示した。親鸞と道元の大乗思想家という観点からの比較、また、仏教思想史上の位置づけという観点からの比較はこれまでほとんど行われておらず、その意味で、本研究は、日本の仏教思想の意義を解明する上で一定の貢献をなしたといえよう。また、道元の「悪」についての研究に関連して、日常的世界における「悪」と宗教的世界における「悪」との関係について検討した。さらに、検討の前提として、道徳と宗教との関連について、日本思想史に即して解明をはかった。本研究は、道元の思想の根幹にある存在論を、自己概念や、世界観と関連させて明らかにすることによって、道元の思想の構造を総体として解明することを目指すものである。特に、本年度は、道元の主著である「正法眼蔵」の中でも思想的に重要な巻であり、存在論を検討するのにもっともよい題材のひとつである「仏性」巻について検討を行った。

研究にあたっては、道元の存在、自己、世界に対する把握の基底をなす「空-縁起」について、その思想の内実が、道元の「仏性」巻の文体を通して表現されているという見通しを立て、それに基づいて、道元の文体の分析を行った。その結果、道元のいくつかの特徴的な文体の類型が見られ、それぞれにおいて、道元の存在論の根幹をなす「空-縁起」が、文の独特の形式の中に表現されていることが明らかとなった。独特の形式とは、道元の文体の特徴として指摘される、矛盾表現や逆説表現、一見因果関係として把握しがたい原因-結果表現である。そして、さらに「仏性」巻に表現された道元の仏性思想の内実について、「仏性」巻の一文一文について詳細な注釈を行いながら明らかにすると同時に、本年度は、その仏性思想のもつ、東アジア仏教史上の意義、日本仏教思想上の意義を解明した。その意義とは、要点をとっていうならば、インドにおいて起こり、中国で大きく展開した仏性思想の歴史の中で、仏性を実体化して何らかの実体をもったものとしてあつかう傾向が強くなったことに対する反作用ということである。そのような実体化する傾向とは、仏教の存在論の根幹をなす「空-縁起」思想からの逸脱であるが、人間が言語を使って認識し、言語によって指示されるものが実体化されやすいという人間の認識の逃れられない傾向性によるものである。(ちなみに、仏教は、言語のもたらすこの傾向性について十分に意識的であった。)道元は、「仏性」巻の中で、この実体化傾向について批判し、仏性が「空-縁起」としてあるということはどのような事態なのかということを、その文体の中で、言語のもつ実体化傾向を破壊しながら語っているのである。つまり、内容を文体が説明するというやり方を道元はとっているのである。また本年は、親鷺の仏性論についても検討し、道元のそれとの異同を解明した。本研究は、道元の思想の根幹にある存在論を、自己概念や、世界観と関連させて明らかにすることによって、道元の思想の構造を総体として解明することを目指すものである。特に、本年度は、道元の主著である「正法眼蔵」の中でも思想的に重要な巻であり、存在論を検討するのにもっともよい題材のひとつである「仏性」巻や「諸悪莫作」巻「現成公案」巻について引き続き検討を行い、親鸞のそれとの比較を行った。(親鸞については、一般に親鸞の思想を検討する際に使用される『歎異抄』のみならず、難解をもって知られる『教行信証』についても研究した)その際、昨年度に行った道元と、親鸞の仏性論についての検討をふまえ、さらに、今年度は両者の善悪論についてそれぞれ検討し、善悪という観点から両者の思想を「存在論」「因果性」と関わらせながら解明した。それを通じて、大乗仏教の存在論の根幹である「空-縁起」思想の重大な局面が解明され、その成果の-部については、論文発表、口頭発表を行った。一般に、道元と親鸞というと、それぞれ曹洞宗と浄土真宗という別々の宗派の宗祖として理解され、また自力門と他力門というように、対照的な教義をもっととらえられがちであるが、本研究においては、両者を大乗仏教の透徹した思想家という観点から研究を遂行した。このような視点は、従来、宗学者(その宗派の信仰を前提とした教義研究者)中心に遂行されてきた仏教研究においては、貴重な論点を提供するものであり、大乗仏教思想の日本的展開という、アジア仏教思想史における日本の仏教思想の位置を確定する上でも、重要な研究である。今回、その方向性が、「空-縁起」思想の深化というかたちで、ある程度確立され、そのもとで道元と親鸞の思想の比較研究が遂行され、その一端が発表されたことの意義は大きなものであるということができる。
血小板・クッパー細胞相互作用に着目した肝虚血再灌流障害抑制法の開発

肝虚血再灌流障害においてKupffer細胞と血小板のあいだにはなんらかの相互作用が働いていることが考えられているが、その類洞内動態は明らかとされていない。生体蛍光顕微鏡を用いて虚血再灌流後の肝類洞内におけるKupffer細胞と血小板動態を検討した。その結果、虚血再灌流後に肝類洞内でKupffer細胞はZone1を中心に分布し,血流再開後120分にわたり安定してin vivoで観察することができた。類洞内皮に膠着する血小板数は再灌流時間の経過とともに増加し、そのうち約半数の血小板はKupffer細胞と直接接着することが判明した。[背景・目的]肝虚血再灌流障害は再灌流直後のKupffer細胞の活性化と、血小板と内皮細胞との相互作用による微小循環障害がその原因と考えられている。またKupffer細胞の存在下で血小板は内皮細胞と膠着して微小循環障害をきたすことより、Kupffer細胞と血小板のあいだにはなんらかの相互作用が働いていることが考えられている。ところが、実際に肝類洞内でどのような動態を示すのかはこれまで明らかとされたことはない。わたしたちは、かねてKupffer細胞の生体内蛍光染色に成功し、生体蛍光顕微鏡でリアルタイムに観察することを可能にした。本研究ではこの技術を利用して虚血再灌流後の肝類洞内におけるKupffer細胞と血小板動態を観察して、相互作用を検討した。[方法]体重250300gのSD Ratを使用した。蛍光色素をリポゾーム内に封入して貪色させることで実験に先立ちKupffer細胞を染色した。その後、全身麻酔を行い気管切開ののち人工呼吸を行った。頸部を切開剥離の後、頸部動静脈にカテーテルを挿入した。開腹し肝葉を脱転して特殊粘土上に固定し、生体蛍光顕微鏡を用いて肝微小循環を観察した。肝虚血は20分間の全肝虚血とした。生体蛍光顕微鏡による観察は再灌流後120分までとした。血小板は再灌流後30,60,120分時に蛍光標識血小板を投与し観察した。再灌流120分後の観察ののち、肝組織と血清を採取した。[結果]虚血再灌流後に肝類洞内でKupffer細胞はZone1を中心に分布し(63.7%)、血流再開後120分にわたり安定してin vivoで観察することができた。類洞内皮に膠着する血小板数は再灌流時間の経過とともに増加することが判明した。そのうち約半数の血小板はKupffer細胞と直接接着することが判明した。[内容]ラット開腹虚血再灌流モデルにおいて、血小板とクッパー細胞をそれぞれ蛍光標識してin vivoで観察できる生体蛍光顕微鏡システムを構築した。そこで肝血流再開後の血小板とクッパー細胞の類洞内動態をビデオ撮影して内皮との膠着や類洞血流について評価した。血流再開直後より類洞内皮と膠着する血小板数は再灌流時間の経過とともに増加し、その半数はクッパー細胞と膠着していることが判明した。電子顕微鏡では類洞内のクッパー細胞と血小板が膠着している姿を捉えることができた。また免疫染色ではクッパー細胞が多く存在しているZone1(pre portal area)において、他の部位よりもアポトーシスが強く誘導されていることが判った。以上より類洞内における血小板とクッパー細胞の膠着がその後の肝微小循環障害の引き金となり虚血再灌流障害の成因となることが示唆された。[意義]クッパー細胞を生体のなかで蛍光染色して、in vivoの実験モデルで観察した報告例はこれまでにない。生体蛍光顕微鏡を用いて従来の免疫染色で示されていたとおり、類洞内ではZone1を中心に蛍光染色されたクッパー細胞を確認することができた。また再灌流時間の経過とともにクッパー細胞と膠着する血小板数が増加する新しい知見が得られた。[重要性]生体顕微鏡撮影したのは血流再開直後の、クッパー細胞と血小板との相互作用が微小循環障害の引き金となっているとすると、この相互作用を防止することが効果的な肝虚血再灌流障害の抑制につながるといえる。

また免疫染色ではクッパー細胞が多く存在しているZone1 (pre portal area)において、他の部位よりもアポトーシスが強く誘導されていることが判った。以上より類洞内における血小板とクッパー細胞の膠着がその後の肝微小循環障害の引き金となり虚血再灌流障害の成因となることが示唆された。[意義]クッパー細胞を生体のなかで蛍光染色して、in vivoの実験モデルで観察した報告例はこれまでにない。生体蛍光顕微鏡を用いて従来の免疫染色で示されていたとおり、類洞内ではZone1を中心に蛍光染色されたクッパー細胞を確認することができた。また再灌流時間の経過とともにクッパー細胞と膠着する血小板数が増加する新しい知見が得られた。[重要性]生体顕微鏡撮影したのは血流再開直後の、クッパー細胞と血小板との相互作用が微小循環障害の引き金となっているとすると、この相互作用を防止することが効果的な肝虚血再灌流障害の抑制につながるといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。生体顕微鏡でも電子顕微鏡でも血小板とクッパー細胞が膠着する現象をとらえることができたが、その膠着がどのようなメカニズムで起きているのかは不明である。サイトカインや細胞表面接着分子について検索を行い明らかにしたい。
酸性多糖で被覆したＤＮＡ複合体微粒子を内包した生分解性持続型遺伝子治療製剤の創製

アルギン酸水溶液にヒアルロン酸で被覆したDNA複合体を混合することで自己硬化型核酸徐放製剤の創製を試みた。ヒアルロン酸で被覆したDNA複合体微粒子を、アルギン酸水溶液中に懸濁して生体内に投与すると、投与部位でゲルが形成された。得られたゲルは生体内で徐々に分解された。さらに低結晶性のリン酸カルシウム(ACP)を予め加えることで、ゲルの分解およびDNA複合体放出の速度が制御された。免疫活性化遺伝子を用いて調製したDNA複合体とACPを含んだアルギン酸水溶液を、担ガンマウスの傍腫瘍に投与したところ、非常に高い治療効果を示した。これらは、注射可能な長期発現型核酸徐放製剤としての応用が期待される。難病の治療法として注目を集める遺伝子治療だが、外来遺伝子は短期間で失活してしまうため有効な治療は難しい。そのため効果が持続する徐放タイプの遺伝子導入製剤が強く望まれる。しかし、DNA複合体は一般に分散安定性が悪いため有効な徐放手段がなく、長期安定発現の可能な製剤の成功例や、放出制御の報告がなかった。一方我々は、ヒアルロン酸で表面を被覆したDNA複合体が極めて高い分散安定性を示すことを見出した。本研究では注射投与可能な生分解性自己会合型基材に酸性多糖被覆DNA複合体を内包することで注射型核酸徐放製剤を創製することを試みた。生分解性自己会合型基材としてアルギン酸ゲルを用いた。ヒアルロン酸被覆DNA複合体を添加したアルギン酸水溶液を、マウスの皮下に移殖した腫瘍内に注射投与すると生体内のカルシウムイオンによって投与部位でゲルが形成された。形成したゲルは腫瘍組織中の低pH環境下で徐々に分解された。また、pHコントロール剤として非晶質リン酸カルシウム(ACP)をアルギン酸ゲルに添加すると、緩衝効果によってゲル中のpH低下を抑制し、ゲルの溶解を制御することが認められた。また、ACPを添加したアルギン酸ゲルからは、ゲルの分解に応じてスムーズなDNAの放出が観察された。放出したDNA複合体は分散性を保ち、また、DNAの損傷もなく、腫瘍細胞での遺伝子発現が観察された。免疫活性化遺伝子を用いて調製したDNA複合体内包ACP含有アルギン酸水溶液を、皮下腫瘍モデルマウスの腫瘍内に投与したところ、単回投与で劇的な治癒効果を示し、60%のマウスで腫瘍の完全消失が認められた。アルギン酸水溶液を生体内に注射投与すると生体内のカルシウムイオンによって投与部位でソフトなゲルが形成された。得られたゲルは腫瘍組織中の低pH環境下で徐々に分解した。また、pHコントロール剤として非晶質リン酸カルシウム(ACP)をアルギン酸ゲルに添加するとゲルの分解速度が遅延し、内包したDNA複合体の放出速度を制御できることが示された。抗腫瘍効果を評価するため、免疫活性化遺伝子をコードしたプラスミド複合体を内包したACP含有アルギン酸水溶液を調製し、皮下腫瘍モデルマウスの腫瘍内に投与した。未治療のマウスでは腫瘍が著しく早く成長した。一方、ゲルに内包していないDNA複合体は、投与後約2週間は抗腫瘍効果を示したが、その後急激に腫瘍が大きくなった。DNA複合体を内包したアルギン酸水溶液を投与したマウスにおいては、生体内で形成したアルギン酸は1か月以上にわたって徐々に溶解し、DNA複合体粒子を放出し続け、完治を含む非常に高い治療効果を示した。以上のように、DNA複合体微粒子を内包したACP含有アルギン酸ゲルは、注射可能な長期発現型核酸徐放製剤としての応用が期待される。

一方我々は、ヒアルロン酸で表面を被覆したDNA複合体が極めて高い分散安定性を示すことを見出した。本研究では注射投与可能な生分解性自己会合型基材に酸性多糖被覆DNA複合体を内包することで注射型核酸徐放製剤を創製することを試みた。生分解性自己会合型基材としてアルギン酸ゲルを用いた。アルギン酸水溶液を生体内に注射投与すると生体内のカルシウムイオンによって投与部位でゲルが形成された。アルギン酸ゲルは酸性条件下で分解・溶解することが知られており、生体内で形成したゲルは、腫瘍組織中の低pH環境下で徐々に分解されることが期待される。そこでゲルの分解速度を制御するために、pHコントロール剤として非晶質リン酸カルシウム(ACP)をアルギン酸ゲルに添加した。ACPを含まないゲルは酸性下に置くと、12時間でゲル内のpHが低下し、数時間で崩壊・溶解した。一方、ACPを含有したアルギン酸ゲル内ではpHの低下がほとんど無く、ゲルは数日にわたって徐々に溶解した。これらのゲルにヒアルロン酸被覆DNA複合体を含有するとゲル内で分散し、ゲルの分解に応じてDNA複合体が放出された。同様に調製したDNA複合体含有アルギン酸ゲルをマウスの皮下に投与して、そのゲルの溶解挙動を評価したところ、ゲルは経時的に分解し、その分解速度はACPの含有量に依存した。これらの結果から、ヒアルロン酸被覆DNA複合体をアルギン酸ゲルに含有させることで、その条件によって、DNA複合体の放出速度を制御できることが示された。研究実施計画に基づいて、高い発現効果を持つDNA複合体の徐放システムを構築し、小動物における良好な治癒の結果が得られた。交付申請書に記載した研究実施計画に基づいて、高い発現効果を持つDNA複合体を徐放させる自己会合型デバイスを創製し、そのデバイスの分解速度およびDNAの放出速度を詳細に評価することで、23年度に達成するDNA複合体の放出速度の制御が可能な調製条件が確立した。小動物における治療効果の経過観察、およびその効果の解析。DNA複合体内包自己凝固型デバイスの安全性、毒性の検討及び発現効率を調べるとともに、免疫活性化遺伝子を用いて調製したDNA複合体内包自己凝固型デバイスによる治癒効果を評価する。結果を複合体調製やデバイス調製、さらにDNA複合体内包デバイスの調製条件に再びフィードバックし、システムの最適化を図り、臨床応用の可能な新しい遺伝子デリバリーシステムを構築する。治癒の実験やその抗腫瘍効果の解析に必要な試薬等を購入する。得られた研究成果の発表のため、学会への参加旅費に使用する。マウスを用いて評価するため、小動物及びベクター用の試薬やレポーター遺伝子を購入する。また治癒効果を見るためには新たに治療用遺伝子をコードしたDNAも購入する。研究成果の発表、議論のため、国内外の学会への参加旅費および研究成果を発表する論文の別刷り代に使用する。
PKCη分子種を介した毛髪再生機構の解析とその特異的活性化物質の探索

protein kinase C η(PKCη)は、著しい発毛促進能を持つCキナーゼである。本研究の最終目的は、PKCηに特異的な活性化剤を見出し、毛髪発生を促す物質を同定し、体毛の再生法を確立することである。本年度までに、1)PKCηを分子標的とした発毛誘導物質の探索システムの構築、2)既知活性化物質の発毛作用の検討、3)毛髪再生の分子機構の解析を行った。その結果、2.試験管内タンパクリン酸化実験によって、PKCηを特異的に活性化する脂質として、コレステロール硫酸(cholesterol sulfate: CS)、サルファチド(sulfatide)を見い出した。これらの脂質は皮膚で合成される硫酸基を有するステロイド脂質群である。しかしながら、これらの脂質は溶解性が低く、また経皮吸収効率が極めて低いため、発毛には至らなかった。今後は皮膚選択的ナノ技術を用い、これらの脂質を皮膚内に到達させる技法を検討したい。3.PKCηトランスジェニックマウスの解析から、PKCηの下流のシグナル伝達分子として、TNFα,IL-12,IL-18等のサイトカイン、MIP3等のケモカインが見出された。本年度は、主にスクリーニング系の確立を行った。放線菌培養上清や海洋生物由来物質、既知の脂質等を材料として、PKCη特異的な酸素活性化物質やmRNA発現促進物質の探索を進める。その際、in vivoで有効な候補物質を見出すために、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)法やルシフエラーゼレポーターアッセイを用いたスクリーニング系を構築した。1)活性化物質探索のためのPKC活性化検出分子プローブとして、PKCη蛋白質のN末端側にYFPを、C末端側にCFP蛋白質を配した融合蛋白質を発現するベクターを構築した。これをHela細胞に導入し、既知のPKC活性化剤:TPAによって生じるFRETを測定した。また、感度やS/N比の向上のために、YFP-PKC間のアミノ酸欠失や、PKC-CFP間のスペーサーペプチドを挿入による影響を検討した。2 )転写活性剤の探索のために、PKCηの上皮特異的な発現に関与するヒトPKCηのプロモーター領域(-2.4kb)をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポータープラスミドを構築した。これを不死化ヒト表皮ケラチノサイトHacaTに導入し、stable transformantを作製した。細胞内で有効に作用する物質を見出すために、上記のスクリーニング系の確立を進めた。しかしFRET系は、スクリーニングに耐える感度が現在のところ得られていない。今後PKCη融合蛋白質向上を進め、高効率で正確な系の確立を目指す。protein kinaseCη(PKCη)は、著しい発毛促進能を持つCキナーゼである。その結果、2.試験管内タンパクリン酸化実験によって、PKCηを特異的に活性化する脂質として、コレステロール硫酸(cholesterol sulfate : CS)、サルファチド(sulfatide)を見い出した。
ｄ電子系強相関薄膜・へテロ構造における新奇量子相の開拓

本研究では「d電子系強相関薄膜・へテロ構造における新奇量子相の開拓」という研究題目のもとエピタキシャル薄膜をベースにヘテロ構造・ゲートデバイスを作製し、新奇量子相を開拓することを目的とする。平成30年度は、申請書に記載した研究計画に従い分子線エピタキシー法を用いて層状カルコゲナイド薄膜を作製し、低次元物性を探索した。層状カルコゲナイドはグラフェンと同様のファンデアワールス層状物質であり、その結晶構造の強い二次元性から良質な低次元物性が発現することが近年大きな注目を集めている。これまでは機械的な剥離法による層状カルコゲナイドの超薄膜作製が主なアプローチであったが、本研究では分子線エピタキシー法による超薄膜作製という独自のアプローチによって二次元物性のエンジニアリングに迫った。具体的に以下に述べる。1エピタキシャルな結晶成長の利点として、基板による格子ひずみを用いた物性の変調がある。本研究ではこれをTaSe2薄膜に適用した。通常のエピタキシャル成長で印加できる格子ひずみは1%程度であり、それ以上の格子ひずみでは結晶成長が損なわれてしまうが、TaSe2薄膜においては結晶性を損なうことなく4%の巨大な格子ひずみを与えることができた。これは本研究における薄膜成長が一般的なエピタキシャル成長ではなく、ファンデアワールス・エピタキシーという特殊なメカニズムに基づいていることによる。また、その結果としてTaSe2の超伝導異方性を大幅に増大させることに成功した。2分子線エピタキシー法は異なる物質を積層させ界面を作製することに非常に適している。本研究では、独特な結晶構造とそれに起因するスピン軌道相互作用を持つNbSe2と二次元磁性体V5Se8を接合させ、全く新しい磁性制御の手法を示すことに成功した。この結果は対称性制御が強磁性変調へのアプローチとして非常に有力であることを示したという点で興味深い。平成30年度の計画では銅酸化物高温超電導体と層状カルコゲナイドの二種類の物質を研究対象に据えていたが、申請者は上記「研究実績の概要」に報告したように、主に層状カルコゲナイドを対象とした研究に注力し申請書に記載した研究計画に従って研究を遂行した。予定していたスケジュールでは二次元超伝導・二次元磁性体薄膜の作製とその物性探索を挙げていたが、今年度はそれらを実現しただけではなく、加えて基板-薄膜界面や異なる物質の薄膜-薄膜界面を用いた物性変調において予想を超える結果が得られている。そしてこれらの結果は、機械的な剥離法が主なアプローチとして席巻している当分野において、本研究が分子線エピタキシー法による層状カルコゲナイド薄膜作製という独自なアプローチによってその独自性を生かした新奇な物性開拓に成功したことを意味している。以上の結論を以て、計画以上に研究が進展したと評価する。平成30年度の実験結果は国内外の学会にて報告してきた。また、この研究課題で得られた結果を、出来る限り論文および学会で報告する予定である。また、銅酸化物高温超電導体を対象とした研究は論文で出版済みである。さらに、本研究成果を利用した共同研究が申請者と他の研究グループとの間で開始された。上記「研究実績の概要」および「現在までの進捗状況」で報告したように、平成30年度は順調に研究を進めることができ、予想していた以上の成果を達成することができた。特に大きな成果としては、分子線エピタキシー法による層状カルコゲナイド薄膜の作製を通じて薄膜-基板間や薄膜-薄膜間の良質な界面が形成でき、そこにおいて新奇な物性が開拓できることを示したことが挙げられる。これは層状カルコゲナイドが極めて強い結晶の二次元性を有しており、格子の不整合によって結晶性が損なわれることなく界面が形成できることを反映している。今後の研究では、この界面形成による物性探索を推し進めていく予定である。特に、本研究では種々の二次元超伝導体や二次元磁性体を得ることに成功しており、それらの組み合わせによって自由度の高い物性開拓を行う予定である。例えば、NbSe2のスピン軌道相互作用が強磁性を劇的な変調させることが明らかになったが、対象を金属強磁性薄膜などに変えるとより応用に即した研究が可能となる。さらに、強磁性だけでなく反強磁性などに与える影響を探索することも予定している。また、平成30年度において得られた結果はさらに論文および学会で報告したいと考えている。

通常のエピタキシャル成長で印加できる格子ひずみは1%程度であり、それ以上の格子ひずみでは結晶成長が損なわれてしまうが、TaSe2薄膜においては結晶性を損なうことなく4%の巨大な格子ひずみを与えることができた。これは本研究における薄膜成長が一般的なエピタキシャル成長ではなく、ファンデアワールス・エピタキシーという特殊なメカニズムに基づいていることによる。また、その結果としてTaSe2の超伝導異方性を大幅に増大させることに成功した。2分子線エピタキシー法は異なる物質を積層させ界面を作製することに非常に適している。本研究では、独特な結晶構造とそれに起因するスピン軌道相互作用を持つNbSe2と二次元磁性体V5Se8を接合させ、全く新しい磁性制御の手法を示すことに成功した。この結果は対称性制御が強磁性変調へのアプローチとして非常に有力であることを示したという点で興味深い。平成30年度の計画では銅酸化物高温超電導体と層状カルコゲナイドの二種類の物質を研究対象に据えていたが、申請者は上記「研究実績の概要」に報告したように、主に層状カルコゲナイドを対象とした研究に注力し申請書に記載した研究計画に従って研究を遂行した。予定していたスケジュールでは二次元超伝導・二次元磁性体薄膜の作製とその物性探索を挙げていたが、今年度はそれらを実現しただけではなく、加えて基板-薄膜界面や異なる物質の薄膜-薄膜界面を用いた物性変調において予想を超える結果が得られている。そしてこれらの結果は、機械的な剥離法が主なアプローチとして席巻している当分野において、本研究が分子線エピタキシー法による層状カルコゲナイド薄膜作製という独自なアプローチによってその独自性を生かした新奇な物性開拓に成功したことを意味している。以上の結論を以て、計画以上に研究が進展したと評価する。平成30年度の実験結果は国内外の学会にて報告してきた。また、この研究課題で得られた結果を、出来る限り論文および学会で報告する予定である。また、銅酸化物高温超電導体を対象とした研究は論文で出版済みである。さらに、本研究成果を利用した共同研究が申請者と他の研究グループとの間で開始された。上記「研究実績の概要」および「現在までの進捗状況」で報告したように、平成30年度は順調に研究を進めることができ、予想していた以上の成果を達成することができた。特に大きな成果としては、分子線エピタキシー法による層状カルコゲナイド薄膜の作製を通じて薄膜-基板間や薄膜-薄膜間の良質な界面が形成でき、そこにおいて新奇な物性が開拓できることを示したことが挙げられる。これは層状カルコゲナイドが極めて強い結晶の二次元性を有しており、格子の不整合によって結晶性が損なわれることなく界面が形成できることを反映している。今後の研究では、この界面形成による物性探索を推し進めていく予定である。特に、本研究では種々の二次元超伝導体や二次元磁性体を得ることに成功しており、それらの組み合わせによって自由度の高い物性開拓を行う予定である。例えば、NbSe2のスピン軌道相互作用が強磁性を劇的な変調させることが明らかになったが、対象を金属強磁性薄膜などに変えるとより応用に即した研究が可能となる。さらに、強磁性だけでなく反強磁性などに与える影響を探索することも予定している。また、平成30年度において得られた結果はさらに論文および学会で報告したいと考えている。
極低しきい値半導体レーザの基礎研究

本研究は、極めて低い発振しきい値電流が得られるレーザとして、当該研究者らが提案している、ポテンシャル制御構造(POCO)レーザの動作特性の理論解析と設計方法の確立を目指してものである。本年度は、POCOレーザにおける発振しきい値電流の温度特性と、キャリア数や利得変動に伴う屈折率変化の比(いわゆる・αパラメータ)を理論解析した。POCOレーザは高温になったも、通常のダブルヘテロ接合構造を量子井戸構造よりも低い発振しきい値電流を維持できる事が確認できた。またαパラメータは、ダブルヘテロ接合構造レーザの1/10程度に減少することもわかった。屈折率変化は、発振線幅を増大させるだけでなく、発振モードを不安定にし、モードホッピング雑音を大きくする。したがってPOCOレーザは、従来のレーザよりもかなり安定な動作が期待できる。当初の予定では、本年度はPOCOレーザの電磁界閉じ込め層のバンドギャッププロファイルの最適化等を行う予定であったが、上記の課題の方が、重要であると判断し変更した。また、計画では、理論解析をパソコンを用いたCADとして統合化する予定であったが、計画量が膨大なため、大型計算機を主体に用いる必要があり、大型計算機を主として、パソコンを補助に使う方法を用いた。当該研究者らは、半導体レ-ザの活性領域において、価電子帯のホ-ル数を過剰にすると、帯間遷移による光吸収が減少し発振しきい価電流が減少する原理を見出しており、この原理によるレ-ザ構造をポテンシャル制御構造レ-ザと命名した。なお、同じ時期に他研究機関からは、選択ド-プや変D2As調ド-プという名で類似の構造が提案されている。今年度は、Al_XGa_1-X系を材料としたポテンシャル制御構造レ-ザについて、層厚や昆晶比などについての最適値を理論的に検討した。しきい値電流が最少になる構造は、純粋のGaAsによる層厚4nmの活性層(量子井戸層)を、両側からx=0.8で層厚12nmのポテンシャル制御層で挟み、さらにその外側にx=0.3で層厚60nmの光導波層をつけ、その外側をx=1.0のクラッド層とした構造である。活性層と光導波D1以上の層は真性半導体とするが、ポテンシャル制御層にはN_A=10^<13>cm^<-3>以上の多量のアクセプタ原子を添加する。レ-ザのストライプ幅を3μmとすると、端面反射率が33%の場合は共振D2=0.器長180μmで、発振しきい値電流I_th96mA、反射率が90%では共振器長1D2=897μmでI_thμAと、非常に低い値が得られた。また、このポテンシャル制御構造を面発光レ-ザに適用する場合についても理論解析を行なった。面発光レ-ザ用には層厚5nmの活性層D2thDと層厚16nmのポテンシャル制御層を84対重ねた構造が最適であり、しきい値電流密度はJ13.2KA/cm^2になった。この値は、通常のダブルヘテロ接合を用いた場合の約1/3である。次年度は,光とじ込め層のバテンドギャップ形状についての最適化,および計算プログラムの統合化を行なう予定である.本研究は、極めて低い発振しきい値電流が得られるレーザとして、当該研究者らが提案している、ポテンシャル制御構造(POCO)レーザの動作特性の理論解析と設計方法の確立を目指してものである。
内部転換電子及びα線による環境中のプルトニウム同位体比測定の基礎的研究

環境中のプルトニウムなどの超ウラン元素の分析は,その微弱な放射能強度と高価な装置を必要としない等の理由でα線スペクトロメトリ-によって行われている。原子炉中での生成量を考慮すると240Pu/239Pu同位体比はその発生源や環境中での挙動を知る上で極めて大切な知見である。しかし、α線スペクトロメトリ-では^<239>Puと^<240>Puの和が定量できるに過ぎない。微弱な放射能強度の環境試料中の同位体比^<240>Pu/^<239>Puの測定法として既に、これらの核種ではα線に対するウランのLX線の放出率が異なることに着目したものが提案されている。本研究では、これまでの内部転換電子測定装置の開発研究の成果を基にして、α線に対する内部転換電子の放出率の違いから同位体比^<240>Pu/^<239>Puのより高感度な測定法の開発を行った。本法の基本的な有効性を確認するため、プルトニウムほど同位体組成の複雑でない^<243>Cmと^<244>Cmの混合物について最初に検討した。その結果、本法が超ウラン元素の同位体比の測定に有効であり、従来の方法と比較して感度よく測定ができた。更に、238から242までの同位体を含み異なった同位体組成をもつプルトニウムについて、精製直後の試料と精製後約1年を経た試料で検討を行った。これは試料に含まれている^<241>Puの娘核種である^<241>Amの影響を調べるためである。いずれの試料でも本法により同位体比の測定ができた。従って、内部転換電子とα線を同時に測定する方法は、環境中のプルトニウム・キュリウムの同位体比を定量するのみに有効であることが判明した。環境中のプルトニウム等の超ウラン元素の分析は、その放射能が微弱であることや測定装置が高価ではないなどの理由で、α線スペクトロメトリーによって行なわれている。しかし、この方法では原子炉で生成される最も重要なプルトニウムに関する同位体比^<240>Pu/^<239>Puさえも測定できない。この同位体比はその発生源を特定したり、環境中での挙動を知る上で極めて大切な知見である。これまでの研究では、α線スペクトロメトリーに代る^<240>Pu/^<239>Pu同位体比の測定法として、内部転換電子スペクトロメトリーを開発してきた。しかし、この方法を微弱な環境試料に適用することは困難である。そこで本研究では、核種によってα線に対する内部転換電子の放出率が異なることに注目して、微弱な試料でも同位体比を測定する方法の開発を行なうこととした。環境中の^<240>Pu/^<239>Pu同位体比を、α線の放出率に対するウランのLX線の放出率の比が^<239>Puと^<240>Puで異なることに着目した測定法についての報告がある。しかし、LX線の蛍光収率が低いため、LX線の放出率の変りに内部転換電子の放出率を用いる方がより高い感度で同位体比の測定が可能であると期待される。本研究では同位体組成の複雑なプルトニウムではなく^<243>Cmと^<244>Cmについて検討した。

同位体比の異なる3種類のキュリウム試料を作製し、内部転換電子スペクトロメトリーによって同位体比を測定した。次に、α線の放出率に対する内部転換電子の放出率の比と同位体比(放射能比)との相関は1次式であることが判明し、同位体比の測定が可能であることが示された。また、本法をLX線の放出率を用いる方法と比較したところ、期待通り約2倍程度の感度で測定が可能であることがわかった。これまでに開発した内部転換電子測定装置では、内部転換電子の測定と同時にα線及びX線も測定可能なため、長時間の測定が必要な微弱な放射性試料の測定には有利である。環境中のプルトニウムなどの超ウラン元素の分析は、その微弱な放射能強度と高価な装置を必要としない等の理由でα線スペクトロメトリ-によって行われている。原子炉中での生成量を考慮すると240PU/239Pu同位体比はその発生源や環境中での挙動を知る上で極めて大切な知見である。しかし、α線スペクトロメトリ-では239Puと240Puの和が定量できるに過ぎない。微弱な放射能強度の環境試験料中の同位体比240Pu/239Puの測定法として既に、これらの核種ではα線に対するウランのLX線の放出率がことなることに着目したものが提案されている。本研究では、これまでの内部転換電子測定装置の開発研究の成果を基にして、α線に対する内部転換電子の放出率の違いから同位体比240Pu/239Puのより高感度な測定法の開発を行った。プルトニウムは通常238から242までの同位体を含むため、昨年度は同位体組成のより単純な243Cmと244Cmの混合物について検討した。その結果、本法が超ウラン元素の同位体比の測定に有効であり、従来の方法と比較して感度よく測定ができた。これに引続き本年度は3種類の異なった同位体組成を持つプルトニウムについて、精製直後の試料と精製後約1年を経た試料で検討を行った。これは試料に含まれている241Puの娘核種である241Amの影響を調べるためである。いずれの試料でも本法により同位体比の測定ができた。従って、内部転換電子とα線を同時に測定する方法は、環境中のプルトニウム・キュリウムの同位体比を定量するのに有効であることが判明した。
魚類繁殖機構に及ぼす地球温暖化・気候変動影響の早期警戒指標の構築に向けて

本年度は、気候変動等に起因する水温異常が魚類生殖機構に与える影響評価系確立へ向け、1魚類野生集団の生息環境履歴推定技術の確立、2リモートセンシングを用いた異常水温監視システムの構築、3対象指標種の捕獲調査に取り組んだ。1に関しては、生体鉱物である耳石に着目し、耳石に蓄積される情報(含有微量元素)と外部環境(水温・塩分)の関係性を検証した。その結果、水温変動実験では高水温区では耳石Sr量が高く低水温区では低くなる傾向が、塩分変動実験では、高塩分区で耳石Sr量が高く低塩分区で低くなることが明らかとなった。さらに、耳石Sr値の各外部環境要因応答速度を調査した結果、水温変動は日単位で検出することが困難であったが、塩分変動は変動後約1日で耳石Sr量に反映されることが明らかとなった。2に関しては、衛星情報からの水温情報抽出技法の高精度化へ向け、正規化水指数(NDWI)を用いた水域抽出を行った。人工衛星Landsat8のデータから特定の湖(アルゼンチンの複数の湖)周辺における水域エリアを抽出し、水域インベントリを作成した。補正したデータと水域インベントリをもとにヒートマップを作成し、湖の氾濫や干ばつ時の水域変化を反映させることに成功した。これにより、変化する気象状況を考慮しつつ、湖の表面温度の推移を高精度にモニタリング可能な水温監視システムの基礎が構築できた。3に関しては、アルゼンチンのパンパ地方における複数の湖(モナステリオ湖、チャスコムス湖等)にて、対象指標種ペヘレイを捕獲し、経験環境履歴推定のための耳石調査を行なった。輪紋および微量元素解析の結果から、明確に異なる耳石Sr分布パターンを示す個体が集団内に存在することが明らかとなり、微量元素組成の違いにより経験環境(水温、塩分)の異なる野生個体を区別可能であること、また、これらの個体は他の湖からの移入個体である可能性を示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2014年度は、南米原産トウゴロウイワシ目魚類Odontesthes hatcheriのY染色体上に存在する雄性決定遺伝子amhyが、同属のO. bonariensisにも存在することを明らかにした。本種は、性決定機構が強い温度依存性を示すため、南半球における本研究の指標生物の第一候補である。この発見により、amhy遺伝子の有無を指標に個体の遺伝的性(XYかXX)を判別し、表現型性(精巣か卵巣)と照合することで、これまで不可能だった性転換個体(XY-雌、XX-雄)を検出することが可能となった。さらに、ゲノムDNA上におけるamhy遺伝子のコピー数の差をqPCRで定量することで、XYとYY(超雄)個体を判別する方法を開発した。これら開発した性転換・超雄個体検出法を用いて、実際にアルゼンチン(チャスコムス湖、フニン湖、他3つの湖正式名?)における野生集団のフィールド調査を行ったところ、チャスコムス湖のペヘレイ野生集団(n=158)から、12尾のXX-雄(出現率:8%)、4尾のXY-雌(4%)、2尾のYY-個体(1%)、105尾のXY-雄(66%)、35尾のXX-雌(22%)を検出し、本湖では、低出現率ながら、性転換個体および超雄が存在することが明らかとなった。一方、北半球における指標種確立へ向けた研究では、日本沿岸に生息する海産トウゴロウイワシ目魚類であるギンイソイワシHypoatherina tsurugaeに着目し、本種が温度依存型性決定機構を持ち、性決定時期に経験した水温に依存して高温では雄へ、低温では雌へ性が大きく偏ることを明らかにした。さらに、amhy遺伝子が、ギンイソイワシにも存在することを見いだし、本種においても性転換個体を検出することが可能となった。魚類耳石は、日周性の輪紋を刻みながら体長に比例して成長し、その化学組成が生息環境の水温と水質に影響される。この特徴を利用すれば、個体の年齢、日齢、孵化日のみならず、個体が生涯に渡り時系列的に体験した水温履歴を推定でき、過去に各個体が経験した異常水温と生殖障害の因果関係を明らかにすることが可能となると期待される。そこで2015年度は、本研究のモデル魚である南米原産ペヘレイO.bonariensisの耳石を用いた経験水温履歴推定技術の確立に取り組んだ。まず、アルゼンチンのチャスコムス湖にて捕獲した野生個体の耳石を、電子プローブマイクロアナライザで分析し、生息環境水温の指標となる元素の探索を行った。その結果、耳石内微量元素であるストロンチウム(Sr)量に明確な季節性が確認され、Sr値と捕獲時の環境水温との間には正の相関が認められた。これにより、耳石の日輪解析とSr解析を組み合わせることで、その個体が過去に経験した水温を推定することが可能であることが示された。さらに、耳石上のSr値を核から辺縁部まで線状に測定し、Sr値の増加のピークを夏、減少のピークを冬と推定した。このSr値の季節変動を利用すれば、捕獲時期からの逆算により、個体ごとの年級・孵化時期の推定ができ、ペヘレイ野生集団のより詳細な資源量調査が可能となった。