hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケイ酸トランスポーター遺伝子の単離と解析

ケイ素は植物の有益元素で、植物の複合ストレスを軽減することができる。本研究では、植物のケイ酸の吸収、分配に関与するトランスポーターを同定した。イネから同定したLsi1とLsi2は根で発現し、根の外皮と内皮細胞に極性をもって偏在し、根によるケイ酸の吸収に重要な役割を果たしている。またLsi6は葉の維間束木部や第I節で発現し、ケイ酸の分配に関与している。トウモロコシやカボチャからも同様のトランスポーターを同定しているが、イネと比べ、発現レベルや細胞局在性が異なっていた。1.イネケイ酸吸収遺伝子Lsi1の機能解析Lsi1遺伝子の細胞局在性を調べた。まずはin situ hybridizationを行った結果、Lsi1のmRNAは根の外皮と内皮細胞に局在していることを明らかにした。またLsi1の抗体を作成し、抗体染色した結果、同じく外皮と内皮、しかも外側の細胞膜に局在していることがわかった。RNA干渉法(RNAi)でLsi1の発現を抑制した形質転換植物体では、ケイ酸吸収量も減少した。さらに、Lsi1にコードされたタンパクにケイ酸の輸送活性があるかどうかを調べるために、Lsi1のcRNAを作成し、それをアフリカツメガエルの卵細胞に注入し、ケイ酸の輸送活性を測定した。その結果、水のみを注入したコントロールに比べ、野生型のcRNAを注入した場合、ケイ酸の輸送活性は3倍増加した。また変異体のcRNAを注入した場合、ケイ酸の輸送活性は野生型と比べ、かなり低かった。2.新規ケイ酸吸収に関与する遺伝子のクローニング新規ケイ酸吸収欠損突然変異体lsi2を用いて、原因遺伝子のファインマッピングを行った。その結果、候補領域を106kbpまで絞り込んだ。次に候補領域の遺伝子予測を行った結果、17個の遺伝子が予測された。その中の一遺伝子(putative anion transporter)の塩基配列を野生型(T-65)と変異体とで比較した結果、一塩基置換が起きており、その一塩基置換がアミノ酸をセリンからアスパラギンに置換していた。この遺伝子の全長cDNAは2085bpであり、472のアミノ酸のタンパク質をコードしていた。次にこの遺伝子を変異体に導入し、相補性試験を行った。その結果、遺伝子を導入した変異体ではベクターコントロールより明らかに高いケイ酸吸収を示した。以上のことからLsi2遺伝子がケイ酸吸収に関連する遺伝子であることを明らかにした。1.ケイ酸吸収遺伝子Lsi1の機能解析アフリカツメガエル卵母細胞のアッセイ系を用いて他のNIPのケイ酸輸送活性をまず比較した。その結果、イネNIP1:1とNIP3:1は輸送活性を示さなかったが、ケイ酸吸収遺伝子Lsi1と同じNIP2に属するLsi6はLsi1と同様ケイ酸の輸送活性を示した。またLsi1の基質特異性を調ぺたところ、グリセロールに対して輸送活性を示さなかったが、尿素やホウ酸に対して輸送活性を示した。しかし、ケイ酸と等モルの尿素の共存下でケイ酸の輸送活性が影響されなかった。また等モルのホウ素の共存下で、ケイ素の輸送活性は20%減少した。これらのことはLsi1がケイ酸に対して高い親和性を持っていることを示している。さらにLsi1のケイ素輸送活性は水銀により阻害されたが、低温では阻害されなかった。生育時期別にLsi1の発現量を調ぺたところ、出穂前後一時的に発現量の増加が見られ、ケイ酸の吸収量と一致していた。また明確な発現量の日周変動は見られなかった。2.ケイ酸吸収遺伝子Lsi2の同定新たに単離されたケイ酸吸収欠損変異体(lsi2)物を用いて、その原因遺伝子のマッピングと機能解析を行い、原因遺伝子の特定に成功した。この遺伝子の塩基配列を野生型(T-65)と変異体とで比較した結果、一塩基置換が起きており、その一塩基置換がアミノ酸をセリンからアスパラギンに変化させていた。この遺伝子の全長cDNAは2085bpであり、472アミノ酸のタンパク質をコードしていた。またこの遺伝子を変異体に導入し、相補性試験を行った結果、遺伝子を導入した変異体では野生型と同程度にケイ酸吸収能が回復していた。この遺伝子は主に根に構成的に発現し、その発現量はケイ酸の存在下で四分の一程度に減少した。この遺伝子にコードされているタンパク質はLsi1と同様、根の外皮と内皮に局在していた。しかし、Lsi1とは異なり、外皮と内皮の向心側に偏在していた。以上のことからLsi2遺伝子は細胞内のケイ酸を細胞外に輸送する過程に関与していることと推測される。1.トウモロコシのケイ酸トランスポーターの同定トウモロコシのケイ酸吸収のkineticsを調べたところ、イネと同様飽和型の吸収パターンを示した。

また、導管液中のケイ酸濃度は外液より数倍高かった。これらの結果はトウモロコシにもケイ酸吸収トランスポーターが介在していることを示唆している。そこで、イネLsil、Lsi6、Lsi2の相同遺伝子ZmLsi1、ZmLsi6、ZmLsi2をそれぞれクローニングした。その結果、いずれの遺伝子もアミノ酸レベルでイネと80%以上の高い相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞を用いてケイ酸輸送活性の測定を行なったところZmLsilとZmLsi6はケイ酸の内向きの輸送活性を示した。これに対して、ZmLsi2は外向きのケイ酸輸送活性を示した。また部位別の発現量を調べると、ZmLsi1とzmLsi2は主に種子根で、ZmLsi6は主に地上部で発現していた。抗体染色で局在性を調べたところZmLsi1は根の表皮細胞にZmLsi2は内皮細胞に、ZmLsi6は葉鞘と葉身の導管周辺の細胞で発現していた。これらの結果はZmLsi1とZmLsi2が根からのケイ酸吸収に、ZmLsi6は地上部のケイ酸の分配に関与していることを示している。2.イネのヒ素吸収におけるケイ酸輸送体の関与ケイ酸吸収欠損変異体lsi1、2を用いてケイ酸輸送体のヒ素吸収への関与について検証した。水耕栽培による短期間のAs(III)吸収実験では、lsi1、lsi2変異株ともに地上部へのヒ素蓄積量が野生型の半分程度に低下した。またケイ酸の添加によって野生型のヒ素集積量は減少したが、変異体は影響を受けなかった。Lsi1を発現させた酵母とアフリカツメガエル卵母細胞はAs(III)の輸送活性を示したが、As(V)の輸送活性は認められなかった。これらの結果はLsi1、Lsi2がケイ酸だけでなくAs(III)の吸収にも関与していることを示唆している。1.カボチャからのケイ酸吸収関連遺伝子の単離と機能解析ウリ科のカボチャは中程度のケイ素集積性を示すが、その吸収機構についてはまだ明らかにされていない。本研究ではブルームきゅうりとブルームレスきゅうりを作るための台木として使われているカボチャ2品種、新土佐2号(ST)とスーパー雲竜(SU)を用いて、ケイ酸吸収の生理学的解析と吸収関連遺伝子の同定を行った。ケイ酸吸収量を経時的に調べた結果、3時間でSTの吸収量はSUを大きく上回った。ケイ酸吸収に関わる遺伝子として、イネのケイ酸吸収関連遺伝子Lsilのホモログを2品種のカボチャから単離した。推定アミノ酸配列において品種間で2つの残基の違いが見られた。アフリカツメガエルを用いたケイ酸輸送活性の測定によりST由来のLsi1は活性が認められたが、SU由来のものは活性が認められなかった。更なる解析から、242番目のアミノ酸置換がケイ酸輸送活性の有無に影響を与えていることが分かった。2.イネ生殖成長期におけるLsi6の役割解析Lsi6は内向きケイ酸トランスポーターLsi1の相同タンパク質で、Lsi1と同様ケイ酸の内向き輸送活性を持つ。今年度はLsi6の生殖生長期のケイ酸分配における役割を解析した。Lsi6は出穂期以降の上位の節で著しく発現が増大し、特に大維管束の周縁部の木部柔組織において導管に面した極性局在がみられた。Lsi6のT-DNA挿入変異株では穂(籾、穂軸、穂首)のケイ素蓄積量が約1/3に低下し、逆に止め葉の葉身には2倍の蓄積が見られた。
胎生期における母親の生活習慣が、小児の健康に及ぼす影響の検討-胎生期コホート-

近年、妊娠中の喫煙が、出生した子どもの肥満と関連していることが示唆され、さらに、この関連には性差があることも推測されていたが、実際に検討されたことはほとんどなかった。本研究では、日本の一地域において、約20年にわたって妊娠中から子どもの発育を追跡してきたデータを用いて解析を行った結果、妊娠中の喫煙が小学生の肥満と関連していることを明らかにした。さらに、これらの関連には性差が存在することを示した。本研究は、胎生期における母親の生活習慣が、出生時のみならずその後の児の健康(特に小・中学生における肥満、こころの健康など)においてどのように影響するかを、妊娠初期からのコホート研究(胎生期コホート)によって明らかにすることを目的としている。平成20年度は、甲州市の小学校4年生から中学校3年生までの全児童・生徒を対象に、アンケートを用いて子どもの生活習慣を調査した。さらには、身長・体重・う蝕のデータ収集を、各小中学校を訪問して行った。これらのデータを、これまで20年間継続してきた、母子保健長期縦断研究データと連結することにより、妊娠初期から、最長で15歳までの発育・発達を検討するデータセットを作成した。本データセットの一部である、約1300人のデータを用いて、平成20年度は、妊娠中の喫煙が、小中学生の肥満と関連があるかどうか、さらには5歳までの肥満とその後の肥満に関して、あるいは男児と女児で妊娠中の喫煙の影響に違いがあるかどうかを検討した。その結果、妊娠中の喫煙は小学4年生の肥満と関連があることがわかり、原著論文として発表した。また、5歳までの肥満には妊娠中の喫煙の影響があるが、その後の肥満についてはあまり影響がないことを明らかにし、各1回の国際学会、国内学会で発表した。さらには男児と女児で妊娠中の喫煙がその後の発育に及ぼす影響に差がある可能性を明らかにし、こちらについても各1回の国際学会、国内学会で発表を行った。平成21年度は、平成20年度と同様、甲州市の小学校4年生から中学校3年生までの全児童・生徒を対象に、アンケートを用いて子どもの生活習慣を調査した。本データセットの一部である、約1500人のデータを用いて、平成21年度は、妊娠中の喫煙が、小中学生の肥満と関連があるかどうかを、生存曲線を用いた解析により検討し、また、男児と女児で妊娠中の喫煙の影響に違いがあるかどうかについては、マルチレベル分析を行って検討した。さらには、リスクである妊娠中の喫煙について、2000年前後の5年間で、関連する因子に違いがあるかどうかを検討した。その結果、妊娠中の喫煙率はここ10年間で微増であるが、その関連する因子については変化がみられることを明らかにし、原著論文として発表した。また、生存曲線による解析により、喫煙による影響が小中学生に及んでいることを明らかにし、国際学会で発表した。さらには男児と女児で妊娠中の喫煙がその後の発育に及ぼす影響に差がある可能性を明らかにし、こちらについても国際学会で発表を行った。平成22年度は、平成20、21年度と同様、甲州市の小学校4年生から中学校3年生までの全児童・生徒を対象に、アンケートを用いて子どもの生活習慣を調査した。本データセットの一部を用いて、今年度は、妊娠中の喫煙が5歳までに肥満となることと関連していたが、5歳以降に肥満となることには関連を認めなかったこと、さらには男児のみでこの関係が認められ、妊娠中の喫煙が子どもの肥満に与える影響に、性差が存在する可能性を明らかにした。また、妊娠中の喫煙状況が、産後どのように変化するのか、この変化に関連している妊娠中の生活習慣が何であるかを検討した。さらに、妊娠初期に禁煙することが、出生体重にどの程度影響しているかどうかを、重回帰分析を用いて検討したところ、妊娠初期に禁煙すれば、出生体重に与える喫煙の影響がほとんどないという可能性を示した。これらは国際学会(2回)および国内学会(1回)でそれぞれ発表した。

また、昨年度国際学会で報告した、妊娠中の喫煙が子どものBMIの推移に与える影響について、マルチレベル解析で解析し、この影響には男女差があることを明らかにし原著論文として欧文誌に発表した。
デトネーション共振機構を用いた推進システムの実証

パルスデトネーションエンジン(以下、PDE)は、間欠的な燃焼サイクルであるため推力密度が小さく、高周波数作動化が必須である。高周波数作動デトネーション共振エンジンの実現には、推進剤を高周波数で間欠的に燃焼器内へ供給する「バルブシステム」の開発が必須である。本研究は既に、デトネーション共振用バルブ[申請者ら,JPP,2011]の開発を完了している。本バルブは、推進剤のエンタルピーとバネによって間欠流を生成するため、外部制御装置や外部駆動源が必要ない。本研究は、高周波数間欠流生成バルブとして、新たに多気筒PDE適用型回転バルブ[申請者ら,日本航空宇宙学会誌,2012]を開発した。本回転バルブは、回転バルブのメリットである高推力化(大流量)および高周波数化と同時に、単一回転バルブでの多気筒化(作動周波数=単気筒周波数×気筒数)が可能である.上記のデトネーション共振用バルブは、回転バルブの駆動源(モータ)に応用可能であり、PDEに適したデトネーション共振エンジン用のバルブシステム(回転バルブ+共振用バルブ)となる.本研究は、本回転バルブを用いた単気筒パルスデトネーションロケットエンジン(以下、PDRE)を構築し、160Hz(世界最高)でのPDRE連続作動時の燃焼器内を高時間分解能(3.33μsec)で可視化した[申請者ら,C&F,2012]。その結果、PDE連続作動時の流体挙動の完全可視化に世界で初めて成功した。また、デトネーション遷移(以下、DDT)過程を詳細に解析し、DDTに至る時間を定量的に評価した(連続作動では世界初)。さらに、本回転バルブ式四気筒PDREを構築した[申請者ら,The ISTS Special Issue, 2012]。回転バルブ式四気筒PDREを用いた推力測定実験を行い、最高作動周波数640Hz(160 Hz/tube×4 tubes)を達成した。また、520Hz(130 Hz/tube×4 tubes)の条件において、242Nの最大時間平均推力および251secの最大比推力を得た。パルスデトネーションエンジン(以下,PDE)は,デトネーション波(爆轟波)を繰り返し燃焼器内で発生させることで推力や動力を取り出す内燃機関である.圧縮機やノズルスロートが必要なく,従来の推進器と比較して,極めて単純な構造となる.さらに,デトネーション燃焼サイクルの理論熱効率は定圧燃焼サイクルよりも高いことが示されている.構造が単純でありながら,間欠的な燃焼サイクルであるため,推力密度が小さいことが最大の問題点である.また,パルスデトネーションタービンエンジン研究においても,定常流に近い連続的作動(高周波作動)条件下でタービン仕事を取り出すことが,最大の課題となっている.つまり,高周波作動なくしてPDEの実用化はあり得ない.高周波作動には推進剤を間欠的に燃焼器内へ供給する「バルブ機構」が最も重要である.回転バルブは,高推力化(大流量化)および高周波数化(燃焼器軽量化)が可能であり,高推力重量化に適している.本研究では,回転バルブを用いてPDEの高推力重量比を達成する.また,高周波数化することで,燃焼器内の非定常な流体運動と回転バルブの周波数を一致させ共振させることで非常に高い周波数でのPDE作動を目指す.当該年度は,回転バルブの基本特性を調査するため,PDE作動時の燃焼器内の可視化および推力測定実験を行った.可視化実験では,高時間分解(3.33μsec)で,160Hz作動時のPDEサイクル(推進剤充填・点火・デトネーション伝播・不活性ガスによる燃焼器内のパージ)を連続して可視化し,燃焼器内の複雑な流体場を理解した.推力測定実験では,幅広い作動周波数領域(40Hz160Hz)での安定したPDE作動および推力を確認した.なお,71Nの最大時間平均推力および231secの最大比推力を得た.パルスデトネーションエンジン(以下、PDE)は、間欠的な燃焼サイクルであるため推力密度が小さく、高周波数作動化が必須である。

また、デトネーション遷移(以下、DDT)過程を詳細に解析し、DDTに至る時間を定量的に評価した(連続作動では世界初)。さらに、本回転バルブ式四気筒PDREを構築した[申請者ら,The ISTS Special Issue, 2012]。回転バルブ式四気筒PDREを用いた推力測定実験を行い、最高作動周波数640Hz(160 Hz/tube×4 tubes)を達成した。また、520Hz(130 Hz/tube×4 tubes)の条件において、242Nの最大時間平均推力および251secの最大比推力を得た。
吸入麻酔薬による興奮の分子機構の解明

本研究の目的は、吸入麻酔薬による興奮の分子機構を解明することである。スライスパッチにによりセボフルレンによって誘発されるラット青斑核の興奮にPKCが関与していることが示された。また、行動実験解析装置を作成し、ラットの行動を数値化した。各吸入麻酔薬に対するラットの興奮反応と誘発される青斑核の興奮の強度はセボフルレンで最も高度であったことから、吸入麻酔薬の興奮に青斑核が関与している可能性が示唆された。本研究の目的は、吸入麻酔薬による興奮の分子細胞機構を解明することである。具体的には現在までに証明した吸入麻酔薬によって誘発される青斑核の興奮が、行動上の興奮を引き起こすという新たな事実を証明することにある。以上の目的を遂行するために、本年度は以下の実験を行った。行動実験:実際に青斑核の興奮が動物個体の興奮の原因となるかを直接的に検証するための準備段階として動物の行動を計測するための実験装置の開発と解析プログラムの確立を行った。方法として、まず2軸加速度センサをアクリル板に設置した。アクリル板に各動物の重量に応じたバネを設置した。アクリル板をファンの付いた箱の内部に設置した。箱は充分な大きさとした。流量計と気化器を接続した回路に箱を接続した。箱の中のアクリル板上に動物を入れた。一定時間空気又は酸素で環流し、動物を慣れさせた。行動は2軸加速度センサを通じて記録装置に入力された。麻酔ガスを投与し際、箱内の麻酔ガス濃度はファンを用いて一定に保ち、麻酔ガス解析器を用いて濃度を測定した。余剰ガスはガス吸着装置を用いて排気した。一定時間麻酔ガスを投与し中止した。以上の実験の間、2軸加速度センサから入力された記録を解析した。解析にはノイズの除去等を考慮したプログラムを作成した。結果として、動物の行動を計測するための実験装置は完成し、動物の行動をデジタル信号に変換することに成功した。麻酔ガス投与による動物の行動変化は観察されるものの、行動変化を反映したデジタル信号解析プログラムは現在作成中である。スライスパッチ:セボフルレンによって誘発される青斑核の興奮は、cyclic AMPを増加させるforskolin存在下でも非存在下同様に誘発された。それに対し、protein kinase C(PKC)を活性化するPhorbol-12-myristate-13-acetate存在下では、非存在下と異なり、青斑核の興奮を誘発しなかった。セボフルレンによる青斑核の興奮にはPKCが関与していると考えられた。行動実験:前年度に作成した行動計測実験装置を用い、ラットの吸入麻酔薬に対する反応を記録した。2軸加速度センサから入力された記録を解析した。結果として、動物の行動をデジタル信号に変換することに成功した。麻酔ガス投与による動物の行動は吸入麻酔投与後、有意に増加した。各吸入麻酔薬間での差は有意差はないもののセボフルレン、イソフルレン、ハロタンの順序に吸入麻酔薬に対する反応が大きかった。また、反応の順序は各吸入麻酔薬によって誘発される青斑核の興奮の強度と同じ順序であったことから、吸入麻酔薬の興奮に青斑核が関与している可能性を示唆するものであると考えている。それに対し、protein kinase C(PKC)を活性化するPhorbol-12-myristate-13-acetate存在下では、青斑核の興奮は誘発されなかった。行動実験:前年度までに確立した実験系での測定により、麻酔ガス投与によるラットの行動は吸入麻酔投与後、有意に増加した。人間で観察されているような覚醒時の興奮は観察されなかった。吸入麻酔薬に対する反応は各吸入麻酔薬によって誘発される青斑核の興奮の強度と同じ順序であったことから、吸入麻酔薬の興奮に青斑核が関与している可能性を示唆するものであると考えている。脳内薬物注入による青斑核の破壊は今後の実験課題として残された。
魚骨ヒドロキシアパタイトの吸着構造解明と吸着シート開発に関する研究

本研究は,3つの目的で構成されている.第一に,魚骨由来のヒドロキシアパタイト(以降FbA(Fishbone Absorber))がどのような物質,特に環境中で有害とされる物質に対して高い吸着特性を持つのかを実験的検討により明らかにすること,第二に,分子動力学シミュレーションを用いた数値解析によって吸着構造・メカニズム等を明らかにすること,第三に,他の吸着材料,あるいは他の吸着材料とのハイブリッドの可能性を検討し,吸着性能について検証を行うことである.第1年度目では,主に第一の目的と第三の目的を達成するために研究を遂行した.重金属に対する吸着特性を,FbAと新たな吸着材料として選択したもみ殻のそれぞれに対して実験により明らかにし,その成果を国際学会でポスター発表した後に,Journalに投稿した.現在は,重金属以外の有害物質に対する吸着特性の解明と,両材料をベースにした新規のハイブリッド材料を開発中である.また,本研究では,セシウム,ストロンチウムのような放射性物質の環境中からの除去もあわせて行っており,森林斜面の表土に沈着したセシウム,あるいはフレコンバッグに封入されたセシウムを含む汚染土壌に対する除去・回収手法を提案した.森林斜面の汚染土壌に対しては,傾斜を利用して流水によってセシウムを除去した上で,回収した汚染水に含まれるセシウムをゼオライトによって吸着した.フレコンバッグ中の汚染土壌に対しては,電気泳動とゼオライトを組み合わせることで土壌中のセシウム濃度を低減した.これらの成果は,前者に対しては国際学会でポスター発表後,Journalへ投稿し,後者については国内学会で口頭発表を行った.フレコンバッグ中の汚染土壌からのセシウム抽出と吸着に関する研究については,研究内容とプレゼンテーションのクオリティが認められ,地盤工学会より優秀論文発表者賞を頂戴した.第1年度目では, FbAが環境中で有害とされる物質に対して高い吸着特性を持つか否かを実験的検討により行った.また,本研究では,廃棄物の再資源化も目的の一つとしており,FbAに加えて大量廃棄されるもみ殻を吸着材として再資源化できるか否かを検討した.研究計画に基づき,重金属に対する吸着実験を実施し,両材料の実験結果を比較した.実験の結果,両材料の吸着能は類似しており,2価の陽イオンを吸着しやすく,六価クロムとヒ素はほとんど吸着しなかった.そこで,六価クロムおよびヒ素に対する吸着性能の向上を目的として,FbAともみ殻を軸とした材料開発に着手した.現在,両材料と水酸化鉄を水熱合成することによって新規性のある吸着材料を開発し,それぞれの吸着性能について振とう実験にて検証を行っている.この成果については第2年度で学会誌に投稿予定である.また,FbAについては重金属のみならず,アンモニアに対する吸着特性も検証した.市販のエアレーション装置を用いて,吸着性能について活性炭と比較し,淡水・塩水の両環境において,性能が維持できるか否かを検討した.現段階で,淡水環境で,活性炭よりも優れた吸着性能を示した.さらに,既往研究にてもみ殻灰がセシウムに対して吸着能を有していることが明らかになっており,この特性を利用して,セシウムを含む土壌からのセシウム抽出ともみ殻による吸着を試みた.フレコンバッグに封入された汚染土壌を想定し,電気泳動と吸着材を組み合わせた実験を実施した.電気泳動の有用性を検討するために,セシウムの吸着材として一般的なゼオライトを用いて電気泳動実験を行った結果,汚染土壌から20%程度のセシウムを抽出し,その内の半分以上が吸着された.現在,もみ殻を用いて同実験を実施しており,ゼオライト同様の性能を示した.それらの成果は,学会誌に投稿中である.今後の方針として,FbA,あるいはFbP(FbAを粉末化したもの)における吸着材としての能力を精査することを主眼に,室内実験と数値シミュレーションの2つのアプローチにより検討を行う.第一に,FbAあるいはFbPの吸着効果が低かった物質に対しては,他の吸着材料の模索,あるいはその吸着材料とFbA,FbPとのハイブリッド材の開発を行う.研究成果にて述べた通り,FbAやFbPは2価の陽イオンやアンモニアに対しては活性炭などと比較しても高い吸着効果を持つことが明らかになった.一方で,六価クロムとヒ素に対しては十分な吸着効果を示さなかった.そこで,その両物質に対して新規材料,あるいはハイブリッド材を用いて吸着実験を行うことを考えている.吸着実験はカラム試験と振とう試験を採用して平衡吸着濃度と吸着量を調査した上で,それらの値を基に吸着等温線を作成する.また,新規材料やハイブリッド材の物理的特性を把握するためにBET法による比表面積や細孔分布の測定,XRDやSEM-EDXによる元素分析を行う.六価クロムとヒ素に対して十分な吸着効果を持つ吸着材料が得られるまでそれらの作業を繰り返し実施する.第二に,吸着できない物質に対してその原因を解明するために,分子動力学を用いた数値シミュレーションを行い,実験結果との比較を通して原因解明を図る.分子動力学では,原子間の相互作用の計算を行い得られた原子の動きから,統計熱力学をベースに様々な数値解析を行い,実現象のメカニズムの解明や予測を行うことが可能であることから,吸着材料の構造内での各物質の動きをシミュレーションし,かつ,実験で得られた知見と統合して吸着構造を明らかにする.吸着材料の開発が完了し,吸着メカニズム等が明らかになった暁には,実際の汚染水や汚染土に適用することを念頭に,FbAやFbP等を軸にしたハイブリッド材を用いた吸着シートの開発を行う.

本研究は,3つの目的で構成されている.第一に,魚骨由来のヒドロキシアパタイト(以降FbA(Fishbone Absorber))がどのような物質,特に環境中で有害とされる物質に対して高い吸着特性を持つのかを実験的検討により明らかにすること,第二に,分子動力学シミュレーションを用いた数値解析によって吸着構造・メカニズム等を明らかにすること,第三に,他の吸着材料,あるいは他の吸着材料とのハイブリッドの可能性を検討し,吸着性能について検証を行うことである.第1年度目では,主に第一の目的と第三の目的を達成するために研究を遂行した.重金属に対する吸着特性を,FbAと新たな吸着材料として選択したもみ殻のそれぞれに対して実験により明らかにし,その成果を国際学会でポスター発表した後に,Journalに投稿した.現在は,重金属以外の有害物質に対する吸着特性の解明と,両材料をベースにした新規のハイブリッド材料を開発中である.また,本研究では,セシウム,ストロンチウムのような放射性物質の環境中からの除去もあわせて行っており,森林斜面の表土に沈着したセシウム,あるいはフレコンバッグに封入されたセシウムを含む汚染土壌に対する除去・回収手法を提案した.森林斜面の汚染土壌に対しては,傾斜を利用して流水によってセシウムを除去した上で,回収した汚染水に含まれるセシウムをゼオライトによって吸着した.フレコンバッグ中の汚染土壌に対しては,電気泳動とゼオライトを組み合わせることで土壌中のセシウム濃度を低減した.これらの成果は,前者に対しては国際学会でポスター発表後,Journalへ投稿し,後者については国内学会で口頭発表を行った.フレコンバッグ中の汚染土壌からのセシウム抽出と吸着に関する研究については,研究内容とプレゼンテーションのクオリティが認められ,地盤工学会より優秀論文発表者賞を頂戴した.第1年度目では, FbAが環境中で有害とされる物質に対して高い吸着特性を持つか否かを実験的検討により行った.また,本研究では,廃棄物の再資源化も目的の一つとしており,FbAに加えて大量廃棄されるもみ殻を吸着材として再資源化できるか否かを検討した.研究計画に基づき,重金属に対する吸着実験を実施し,両材料の実験結果を比較した.実験の結果,両材料の吸着能は類似しており,2価の陽イオンを吸着しやすく,六価クロムとヒ素はほとんど吸着しなかった.そこで,六価クロムおよびヒ素に対する吸着性能の向上を目的として,FbAともみ殻を軸とした材料開発に着手した.現在,両材料と水酸化鉄を水熱合成することによって新規性のある吸着材料を開発し,それぞれの吸着性能について振とう実験にて検証を行っている.この成果については第2年度で学会誌に投稿予定である.また,FbAについては重金属のみならず,アンモニアに対する吸着特性も検証した.市販のエアレーション装置を用いて,吸着性能について活性炭と比較し,淡水・塩水の両環境において,性能が維持できるか否かを検討した.現段階で,淡水環境で,活性炭よりも優れた吸着性能を示した.さらに,既往研究にてもみ殻灰がセシウムに対して吸着能を有していることが明らかになっており,この特性を利用して,セシウムを含む土壌からのセシウム抽出ともみ殻による吸着を試みた.フレコンバッグに封入された汚染土壌を想定し,電気泳動と吸着材を組み合わせた実験を実施した.
BSE検査システムと連携したウシの脳ドックの試み

山口県のBSE検査システムと連携し、MRI装置を使ったウシの頭部疾患の生前診断法「脳ドック」を発展させ、以下の結果が得られた。(1)安全で確実なウシ脳のMRI診断システムの確立とその利用。(2)ウシの頭部や脳疾患への応用。(3)MRI撮像や麻酔時間の短縮による「脳ドック」の診断技術の向上。(4)飼育牛を用いた継時的なMRI検査(5)BSE発症年齢牛に対する生前と死後のMRI検査所見の比較、(6)BSE疑似患畜に対するMRIの臨床応用と鑑別診断法の確立。本研究の目的は,全国の自治体で展開されているBSE検査システムと連携し,最新のMRI装置を使ってウシの頭部疾患の生前診断法(いわゆる「脳ドック」)を研究発展させることてせあるが,21ヵ月齢以上およびBSE疑似患畜に対して非侵襲的画像診断法であるMRIを積極的に臨床応用し,以下に示すような、生前における頭部診断や病態解析および診断技術の向上,鑑別診断法の確立,牛脳のMRIデータの蓄積なども併せて行っている。1.安全で確実な動物のMRI診断システムの開発と利用に努めた。2.動物用永久磁石型MRI診断システムを用いたウシの撮像のシミュレーションを実施し,MRI画像の質向上や撮像時間等の改善を図った。3.BSE以外の牛の頭部や脳の疾患の研究。4.ウシの「脳ドック」実施準備のために,当該システムと健常牛を用いて,撮像や麻酔時間を短縮し,生前における病態解析や診断技術向上に努めた。5.簡易パドックを作製し,一時的に牛を飼育し,MRI検査に供した。6.BSEの発症症年齢とされる21ヵ月齢以上の牛に対して生前MRI検査と死後MRI検査を実施し、生前と死後のMRI検査所見を比較した。7.BSE疑似患畜に対して積極的にMRIを臨床応用し,その鑑別診断法の確立に努めた。8.MRI検査した牛脳は死後に組織学的に検査し例数を増やしている。これらの研究目的の実現に向けて,研究代表者が中心となって,共同研究者や連携研研究者および山口県家畜保健衛生所(BSEの確定診断等)や山口県家畜共済組合連合会の臨床獣医師(検査牛の搬入や臨床診断など),山口大学農学部獣医学科等と協力・連携しながら,研究を計画し実施してきた。しかし,昨年,官崎県で発生した口蹄疫の影響により,ウシの材料が当初の予定より劇減し,研究遂行に支障が生じた。本研究の目的は,山口県で実施されているBSE検査システムと連携し,最新のMRI装置を使ってウシの頭部疾患の生前診断法(いわゆる「脳ドック」)を研究発展させることである。,21ヵ月齢以上およびBSE疑似患畜に対して非侵襲的画像診断法であるMRIを積極的に臨床応用し,以下に示すような、生前における頭部診断や病態解析および診断技術の向上,鑑別診断法の確立,ウシ脳のMRIデータなどを蓄積してきた。(1)動物用永久磁石型MRI診断装置を用いたウシ脳の撮像のシミュレーションを実施し,MRI画像の質向上や撮像時間等を改善した結果、安全で確実なウシ脳のMRI診断シス.テムが立ち上がり、その利用が可能となった。(2)BSE以外のウシの頭部や脳の疾患の研究に応用できた。(3)ウシの「脳ドック」実施準備のために,当該システムと健常牛を用いて,撮像や麻酔時間を短縮し,生前における病態解析や診断技術向上に努めた。(4)簡易パドックを作製し,一時的にウシを飼育し,MRI検査に供した。(5)BSEの発症年齢とされる21ヵ月齢以上のウシに対して生前MRI検査と死後MRI検査を実施し、生前と死後のMRI検査所見を比較した。(6)BSE疑似患畜に対してMRIを臨床応用し,その鑑別診断法の確立に努めた。(7)MRI検査したウシ脳は死後に開頭して脳を摘出し、組織学的検査用に保存している。とれらの研究目的の実現に.向けて,研究代表者が中心となって,共同研究者や連携研研究者および山口県家畜保健衛生所(BSEの確定診断等)や山口県家畜共済組合連合会の臨床獣医師(検査牛の搬入や臨床診断など),山口大学農学部獣医学科等と協力・連携しながら,研究を計画し実施してきた。しかし,一昨年,宮崎県で発生した口蹄疫の影響により,ウシの材料が激減し,今後の研究遂行に支障が生じている本研究の目的は,山口県で実施されているBSE検査システムと連携し,最新のMRI装置を使ってウシの頭部疾患の生前診断法(いわゆる「脳ドック」)を研究発展させることである。21ヵ月齢以上およびBSE疑似患畜に対して非侵襲的画像診断法であるMRIを積極的に臨床応用し,以下に示すような、生前における頭部診断や病態解析および診断技術の向上,鑑別診断法の確立,ウシ脳のMRIデータなどを蓄積してきた。

1動物用永久磁石型MRI診断装置を用いたウシ脳の撮像のシミュレーションを実施し,MRI画像の質向上や撮像時間等を改善した結果、安全で確実なウシ脳のMRI診断システムが立ち上がり、その利用が可能となった。2BSE以外のウシの頭部や脳の疾患の研究に応用できた。3ウシの「脳ドック」実施準備のために,当該システムと健常牛を用いて,撮像や麻酔時間を短縮し,生前における病態解析や診断技術向上に努めた。4簡易パドックを作製し,一時的にウシを飼育し,MRI検査に供した。5BSEの発症年齢とされる21ヵ月齢以上のウシに対して生前MRI検査と死後MRI検査を実施し、生前と死後のMRI検査所見を比較した。6BSE疑似患畜に対してMRIを臨床応用し,その鑑別診断法の確立に努めた。7MRI検査したウシ脳は死後に開頭して脳を摘出し組織学的検査用に保存している。これらの研究目的の実現に向けて,共同研究者や連携研究者および山口県家畜保健衛生所(BSEの確定診断等)や山口県家畜共済組合連合会の臨床獣医師(検査牛の搬入や臨床診断など),山口大学共同獣医学部獣医学科等と協力・連携しながら,研究を計画実施し,山口県産業動物臨床研究会等や山口県家畜衛生業績発表会等で紹介してきた。宮崎県で発生した口蹄疫の影響により,ウシの材料が激減し,本研究の遂行に支障が生じたが,これまで蓄積されたデータの分析等から今後も継続研究する予定である。一昨年,宮崎県で発生した口蹄疫の影響により,ウシの材料が劇減し研究遂行に支障が生じているのと、山口県との連携研究が軌道に乗った時点で研究者等の異動があり、研究の継続性が断たれたために、研究が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。BSE検査を実施している山口県との共同研究に目途がついたので、最終年度は例数を増やせると期待される。研究推進するために、アカバネ病やビタミン欠乏症牛等についても積極的にMRI検査を実施し、現在保存している脳について組織検査を実施し、研究を期日までに終了したい。
古代東北の製鉄遺跡と出土品による鉄文化の材料学的研究

平成89年度の2年間、計画に沿って以下の研究を遂行し、一部は図書、学術誌等で公表した。1.奈良平安時代にかけての、東北地方の鉄生産の代表的な遺跡として、青森県の杢沢、宮城県柏木、福島県武井の各遺跡に着目し、現地での文献調査や出土資料収集も行った。2.古代からの日本周辺地域との交流の歴史の中で、朝鮮半島からの九州および畿内、日本海沿いへの影響、特に伽耶地方の古代製鉄遺跡遺構のの分布・立地状況の確認、文献資料収集と現地研究者との討論を行い、東北への鉄文化や製鉄技術の移入の経緯を探った。3.鉄器文化の中で、近世まで継続してきた「刃物」に着目し、古来の「鉄系クラッド材」として、種々の鉄と鋼について、鍛造および圧延による接合加工(鍛接)を行った。結果として、接合界面に微細な動的再結晶の形成と鍛錬組織の繰り返しなどの、変形特性や接合性に及ぼす加工率、温度、強度差、含有成分等の効果について系統的な金属学的依存性が認められた。4.上記1、2、の基盤を背景に、遺構の製鉄関連出土の鉄滓について、地理的・歴史的特徴をふまえ、化学成分関係、顕微鏡組織など、材料工学的見地から、比較・検討を行った。その結果、各地域での製鉄技術や炉内反応の共通点、相違点を明らかにすることができた。すなわち、鉄かんらん石の存在は、鉄収率は大幅に低減させていること、酸化チタンも、スラグに移行するときにウルボスピネル(Fe_2TiO_4)やイルメナイト(FeTiO_3)などを形成し、これらの化合物の形態と分布の相異に関連性があること、などが明らかになった。さらに、出土層位が異なる鉄滓組織の比較によって、酸化チタンの含有量の比較ができ、たたら製鉄の操業レベルが時代とともに向上していること、が確認できた。平成8年度は、実験計画に沿って、以下の研究を遂行し、一部を図書の一部で公表した。1.鉄器出土跡および製鉄遺跡に関する調査東北の遺跡遺構の調査は、多賀城はじめ胆沢秋田払田などの城柵、宮城の柏木、茂庭嶺山B、C、青森杢沢などの古代製鉄遺跡について情報資料の収集をするとともに、これらの現地に赴き、鉄関連出土品の多くを観察した。その結果、製鉄の遺跡からの出土土器・鉄器および関係する資料の中から、鉄器生産に至った時期とその直接の原因、および背景が明らかになった。それぞれの組織、成分分布については、すべに詳細に調べられているが、加工履歴や錆の評価については未だ不明であり、この件については、東北以外の地域の出土品の特性とも比較し、因果関係やたたら製鉄技術と歴史的位置づけについて検討する予定である。2.近世のたたら製鉄技術について材料、地域別に調査し、形態、還元鉄の組成、強度による年代考証、因子をおおよその整理が可能であることが分かった。すなわち、日本海の海路による、大陸文化および九州・幾内・北陸から経路とシベリアやオホーツクからの経路が別個にあって、それらが東北独特の形式に淘汰されているように思われる。このことについては、平成9年度に詳細に考察する。3.鉄の鍛治については、塑性加工学から詳細に検討した。特に古代製鉄および鍛治技術では、道具の生産には「塑性加工による接合」が重要な役割を果たしてきている。このことから、鍛造およびクラッド圧延による、熱間および冷間接合加工を行なった。

高炭素の刃物鋼として(SK-3)、合金工具鋼としてCr-Wを含む(SKD-4)、Si,Mn,Mo,Vを含む(SKT-5)について、極低炭素鉄および一般構造用鉄(SS41)との鍛接における変形を詳細に調べた。鍛接の加工率、温度および含有元素により接合性は大きく変化した。特に鍛接界面の光学および電子顕微鏡観察では、狭い領域に微細な動的再結晶が並んでいる。このことは、古代から近世までの刃物や各種鉄製品の加工にはかなり高度の加熱設備と成分調整技術が東北地方に流入してきていたことを示唆している。平成9年度は、実験計画に沿って以下の研究を遂行し、一部は学術誌等で公表した。1.奈良平安時代にかけての、東北地方の鉄生産の代表的な遺跡として、青森県の杢沢、宮城県柏木、福島県武井の各遺跡に着目し、現地での文献調査や出土資料収集も行った。2.古代からの日本周辺地域との交流の歴史の中で、朝鮮半島からの影響、特に伽耶地方の古代製鉄遺跡遺構の研究がここ1、2年高まってきている。そこで、現地に赴き、立地条件の調査と考古文献資料収集と現地研究者との討論を行い、東北への鉄文化や製鉄技術の移入の可否を探った。確証を得るまでには至らないが、製鉄原料の砂鉄と鉄鉱石、木炭原料の樹木種などの相異はあっても、日本の東北地方にかなりの影響を与えている事象が少なからず感じられた。特に、伽耶や慶州地方の遺構出土品での、馬具、農耕具、祭祀のための鉄への執着は、武具、貨幣を主体とする律令体制の流れとは別に、日本海に沿った流れが、意外に速やかに津軽に及んだ理由として、よく窺われた。3.上記1、の遺構の製鉄関連出土の鉄滓について、地理的・歴史的特徴をふまえ、化学成分関係、顕微鏡組織など、材料工学的見地から、比較・検討を行った。その結果、各地域での製鉄技術や炉内反応の共通点、相違点を明らかにすることができた。すなわち、鉄かんらん石の存在は、鉄収率(鉄鉱石が金属鉄になる率)は大幅に低減させていること、酸化チタンも、スラグに移行するときにウルボスピネル(Fe_2TiO_4)やイルメナイト(FeTiO_3)などを形成し、これらの化合物の形態と分布の相異に関連性があること、などが明らかになった。さらに、出土層位が異なる鉄滓組織の比較によって、酸化チタンの含有量の比較ができ、たたら製鉄の操業レベルが時代とともに向上していること、が確認できた。
コホート研究に基づくがん関連生体マーカーの検討とがん予防の研究

ヒトの発がんを理解するためには多様な宿主因子を個体レベルで検討し、発がんにおける宿主と環境の相互作用を明らかにする必要がある。宿主因子は様々な生体マーカーを用いて測定されるが、多くの生体マーカーは担がんの影響を受けるため、発がんとの関連はコホート研究によってのみ検討が可能である。このため我々は1986年より地域一般住民を対象としたコホート研究を進めてきた。40才以上の地域一般住民3,625人について,末梢血サンプルを用いて30種の免疫・生化学マーカーを測定した。1997年までの追跡調査により192人のかん罹患が見出されており、基礎調査で測定した様々な生体マーカーと発がんの関係を検討した。その結果、標的細胞としてK562を用いた末梢血リンパ球(PBL)のナチュラルキラー(NK)活性が、測定後の追跡調査で見出されたがんの発生と負の相関を示した。コホート研究の対象者のNK活性を3分位により、高活性、中活性、低活性群に等分すると、低活性群と比較して高活性及び中活性群の発がんの相対危険は、女性でそれぞれ0.56(95%信頼区間、0.31-1.01)、0.52(0.28-0.95)、男性で0.62(0.38-1.03)、0.72(0.45-1.16)、また男女計で0.59(0、40-0.87)、0.63(0.43-0.92)であった。すなわち、NK活性の低い群での発がんはより高い活性の群に比べて発がんリスクが約2倍であり、PBLのNK活性は発がんに対する宿主の免疫的防御因子であると考えられる。コホート研究で用いたNK活性は、Granule-dependentな細胞障害性を表わすと考えられるが、MHC class Iの拘束を強く受けるとするとコホート研究で観察された全がんに対する関係の強さを説明することは困難である。さらに、NK活性の個人差を決定するメカニズムが何か明らかにする必要がある。そこで、健常者105人を対象とした実験医学的検討を行った。まず、FasL-depe ndentな細胞障害性を測定する系を開発した。次に、病歴・生活習慣などの疫学調査と並行し、(1)PBLのGranule-dependentなNK活性、(2)PBLのFasL-dependentなNK活性、(3)CD16+/CD56+細胞でのNK活性を制御するレセプターKIR及びKARの発現、(4)CD3-/CD56+細胞におけるサイトカインの発現を測定した。その結果、PBLはMHC class Iを強く発現している標的細胞をFasLに依存しないで強く傷害するNK活性を持ち、このNK活性はコホート研究で測定したNK活性と強く相関することが示された。それぞれのNK活性とNKレセプター及び生活習慣との関連については現在解析中である。次に、病歴・生活習慣などの疫学調査と並行し、(1)PBLのGranule-dependentなNK活性、(2)PBLのFasL-dependentなNK活性、(3)CD16+/CD

56+細胞でのNK活性を制御するレセプターKIR及びKARの発現、(4)CD3-/CD56+細胞におけるサイトカインの発現を測定した。その結果、PBLはMHC class Iを強く発現している標的細胞をFasLに依存しないで強く傷害するNK活性を持ち、このNK活性はコホート研究で測定したNK活性と強く相関することが示された。それぞれのNK活性とNKレセプター及び生活習慣との関連については現在解析中である。ヒトの発がんを理解するためには多様な宿主因子を個体レベルで検討し、発がんにおける宿主と環境の相互作用を明らかにする必要がある。宿主因子は様々な生体マーカーを用いて測定されるが、多くの生体マーカーは担がんの影響を受けるため、発がんとの関連はコホート研究によってのみ検討が可能である。このため我々は1986年より地域一般住民を対象としたコホート研究を進めてきた。40才以上の地域一般住民3,625人について,末梢血サンプルを用いて30種の免疫・生化学マーカーを測定した。1997年までの追跡調査により192人のがん罹患が見出されており、基礎調査で測定した様々な生体マーカーと発がんの関係を検討した。その結果、標的細胞としてK562を用いた末梢血リンパ球(PBL)のナチュラルキラー(NK)活性が、測定後の追跡調査で見出されたがんの発生と負の相関を示した。コホート研究の対象者のNK活性を3分位により、高活性、中活性、低活性群に等分すると、低活性群と比較して高活性及び中活性群の発がんの相対危険は、女性でそれぞれ0.56(95%信頼区間、0.31-1.01)、0.52(0.28-0.95)、男性で0.62(0.38-1.03)、0.72(0.45-1.16)、また男女計で0.59(0.40-0.87)、0.63(0.43-0.92)であった。すなわち、NK活性の低い群での発がんはより高い活性の群に比べて発がんリスクが約2倍であり、PBLのNK活性は発がんに対する宿主の免疫的防御因子であると考えられる。コホート研究で用いたNK活性は、Granule-dependentな細胞障害性を表すと考えられるが、MHC class Iの拘束を強く受けるとするとコホート研究で観察された全がんに対する関係の強さを説明することは困難である。さらに、NK活性の個人差を決定するメカニズムが何か明らかにする必要がある。そこで、健常者105人を対象とした実験医学的検討を行った。まず、FasL-dependentな細胞障害性を測定する系を開発した。次に、病歴・生活習慣などの疫学調査と並行し、(1)PBLのGranule-dependentなNK活性、(2)PBLのFasL-dependentなNK活性、(3)CD16+/CD56+細胞でのNK活性を制御するレセプターKIR及びKARの発現、(4)CD3-/CD56+細胞におけるサイトカインの発現を測定した。
タウ凝集と細胞死のメカニズムの解明

アルツハイマー病(Alzheimer's disease, AD)の神経病理学的特徴は、老人斑と神経原線維変化であり、これらは、神経細胞死と深い関わりがあると考えられている。近年、タウのアミノ酸の置換やスプライシング異常が神経原線維変化の形成の必要十分条件であることが明らかとなった。変異型タウ蛋白が如何にして神経原線維変化につながるかを解明するため、下記のA、B2つの手法を用いてモデルマウスを作製し、その解析を行っている。A.ヒトの変異型タウcDNAをマウスのタウ遺伝子座に導入する。現在、ヒトのタウcDNAを両方のタウ遺伝子座に導入したマウスを長期飼育、解析中であるが、現在まで病理的変化は認められていない。症状を促進するため、このマウスを変異型APPのトランスジェニックマウス等と交配中である。将来的には、(1)このマウスの神経病理学的所見を光学、電子顕微鏡的観察により解析する(2)神経細胞数を定量的に計測してPHFと細胞死の関連を解析する(3)神経病理学的変化の前後における遺伝子の発現の違いや、それと細胞死などとの関連をDNAマイクロアレー法によって解析する予定である。B.変異を持つヒトのタウcDNAを神経細胞特異的に過剰発現させるマウスを作製する。Aでは病理症状が出ない可能性もあるため、ヒトのタウcDNAの発現レベルをさらに上げるために、Cre recombinaseを発現する組織や細胞だけでヒトのタウcDNAを過剰発現できるマウスを作製し、そのマウスと神経細胞特異的にCre recombinaseを発現するマウスをかけ合わせて神経細胞特異的に変異型タウを過剰発現させることも試みている。前者は既に作製が終了し、現在、後者を作製中である。作製が終わり次第、Aと同様の手法を用いて解析する予定である。
哺乳類精子鞭毛における分子アーキテクチャーの研究

申請者がクローニングしたTektin5およびGcl-2は蛋白質の局在と特徴から、軸糸周辺構造体を統合して機能的な鞭毛構造を作り出すための細胞骨格として働くことが推測された。さらにTektin5をbaitとした酵母Two-Hybrid法によって単離したTektin5と相互作用する分子、Tektin4およびOdfl、およびGcl-2をbaitとした酵母Two-Hybrid法によって単離したGcl-2と相互作用する分子、Gcl-2BP1はこれらの分子間結合によって、哺乳類精子鞭毛の構造維持や運動の増幅に関与していると考えられる。そこでTektin4、Odf1およびGcl-2BPIについて、1、遺伝子の発現解析および蛋白質の発現・局在解析、2、分子間相互作用の解析、を行った。1、Tektin4、Odf1は既知遺伝子であり、論文等により、Tektin4についてはmRNAは4週齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛中片・主部のODF皮質に局在する、Odf1についてはmRNAは30日齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛の中片に局在することが分かった。Gcl-2BP1については、臓器別RT-PCRの結果、mRNAは精巣・肺・心臓で発現が見られ、週齢別RT-PCRの結果、3週齢以降で発現が見られた。さらに、1%S-EDTAで処理を行った精子のウエスタンブロットの結果、Gcl-2BP1は1%S-EDTAでは溶出しない分画に検出された。また、精子の免疫染色の結果、精子鞭毛中片に局在することが確認された。2、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1について、哺乳類培養細胞を用いて発現解析を行ったところ、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の細胞内における局在が一致した。さらに哺乳類培養細胞をもちいたTwo-Hybrid法によってTektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の分子間相互作用の解析を行った結果、これらが細胞内において相互作用していることが確認された。このように得られた分子について解析することで、Tektin5およびGcl-2の精子鞭毛における存在意義、即ち生理的機能を解明することが出来る。申請者がクローニングしたTektin5およびGcl-2は蛋白質の局在と特徴から、軸糸周辺構造体を統合して機能的な鞭毛構造を作り出すための細胞骨格として働くことが推測される。そこでこれらの分子について、1、相互作用する分子の探索、2、単離した遺伝子の発現解析、3、分子間相互作用の解析、4、単離した蛋白質の発現・局在解析、を行った。1、Tektin5およびGcl-2をbaitとした酵母Two-Hybrid法によって相互作用する分子を単離し、それぞれTektin4とOdf1、Gcl-2 BP1であると同定した。これらの遺伝子の全長配列をpreyとして再度酵母Two-Hybridを行い、これらの分子の酵母内での相互作用を再確認した。2、および4、Tektin4、Odf1は既知遺伝分であり、論文等により、Tektin4についてはmRNAは4週齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛中片・主部のODF皮質に局在する、Odf1についてはmRNAは30日齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛の中片に局在することが分かった。Gcl-2 BP1については、臓器別RT-PCRの結果、mRNAは精巣・肺・心臓で発現が見られ、週齢別RT-PCRの結果、3週齢以降で発現が見られた。さらに、1%S-EDTAで処理を行った精子のウエスタンブロットの結果、Gcl-2 BPIは1%S-EDTAでは溶出しない分画に検出された。3、Gcl-2およびGcl-2 BP1について、プルダウンアッセイによって分子間結合を再確認している。Gcl-2 BP1について目的の蛋白質が大腸菌において作成されていることをクーマシー染色によって確認した。

Gcl-2BP1については、臓器別RT-PCRの結果、mRNAは精巣・肺・心臓で発現が見られ、週齢別RT-PCRの結果、3週齢以降で発現が見られた。さらに、1%S-EDTAで処理を行った精子のウエスタンブロットの結果、Gcl-2BP1は1%S-EDTAでは溶出しない分画に検出された。また、精子の免疫染色の結果、精子鞭毛中片に局在することが確認された。2、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1について、哺乳類培養細胞を用いて発現解析を行ったところ、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の細胞内における局在が一致した。さらに哺乳類培養細胞をもちいたTwo-Hybrid法によってTektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の分子間相互作用の解析を行った結果、これらが細胞内において相互作用していることが確認された。このように得られた分子について解析することで、Tektin5およびGcl-2の精子鞭毛における存在意義、即ち生理的機能を解明することが出来る。