hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リサイクル社会構築のための廃棄物発生量削減の方策とその効果の研究

本研究では、以下に示す廃棄物発生量削減のための取り組みについて調査、解析した。1)リサイクル2)事業者による製品、商品の使用後や使用過程での発生廃棄物の減量化、再資源化のしやすさに係る取り組み3)事業者による商品・製品の低負荷型、リサイクル型への変換への取り組み4)行政による廃棄物処理・処分プロセスにおける廃棄物減量化、再資源化への取り組み(資源ごみの分別収集、収集処理の有料化)紙や空き缶などの分別、リサイクルの実施による天然資源消費量の削減、エネルギーなどの消費量や大気汚染物質排出量の削減の効果について定量化した。得られた知見を元にして、これらの対策実施による廃棄物発生量の減少化を予測・評価するモデルを構築した。その際、これらの対策を実施している自治体に、実施対策の内容と廃棄物発生量抑制効果等に関するアンケート調査を実施し、モデル構築の参考とした。そして、構築したモデルにより、分別の細分化とごみ収集有料化によるごみ減量効果を予測した。これより、(1)分別の細分化は市民のごみの排出の仕方が変化するだけで、ごみ排出量全体を抑制する効果は少ないこと(2)一方、ごみ収集の有料化は、適正な価格設定を行えば、ごみ排出量の減量化に大きな効果を発揮することが明らかになった。本年度は以下に示す資源・エネルギー消費量の抑制と廃棄物発生量削減のための各種の対策、取り組みの実態の把握と、これら取り組みによる廃棄物発生量の削減割合の把握を、数多くの文献、資料の収集とその解析により行った。1)リサイクルの実施2)適正処理困難物の不買、廃棄物となり易い商品の不買活動3)廃棄物の分別収集4)事業者による製品、商品の使用後や使用過程での発生廃棄物の減量化、再資源化のしやすさに係る取り組み5)事業者による商品、製品の低負荷型、リサイクル型への変換への取り組み6)行政による廃棄物の減量化、再資源化への取り組み7)行政による廃棄物処理・処分プロセスにおける廃棄物減量化、再資源化への取り組みこれらの取り組みの実態については、様々な論文や資料、さらには新聞、雑誌の記事等の収集と解析によりほぼ把握できた。しかし、廃棄物減少量については、具体的な各種取り組みの実施効果について記述しているものが少ないことから、すべての調査項目について定量化は行えなかったものの、その減少傾向については把握できた。これらの研究成果については、学会などでの発表を現在考えている。本年度は前年度に引き続いて資源・エネルギー消費量の抑制と廃棄物発生量削減のための各種の対策、取り組みの現状の把握と定量化を文献などを通じた事例研究を実施した。これにより、前年度以上に新たな知見を得ることができたとともに、前年度に問題であった流通段階での資源・エネルギー消費量の抑制や事業者による商品・製品の低負荷型、リサイクル型への変換への取り組みについての事例についても把握できた。このため、得られた知見を元にして、各種対策と廃棄物発生量の減少化にもとづく廃棄物発生量予測・評価モデルの構築に取り組んだ。紙や空き缶などの分別、リサイクルの実施による天然資源消費量の削減、エネルギーなどの消費量や大気汚染物質排出量の削減の効果について定量化できた。しかし、これら対策実施による廃棄物発生量予測については、まだ検討すべき課題が残り、リサイクル等の廃棄物発生量削減のための代替案別の廃棄物発生量の予測シミュレーションとその評価を十分に検討するまでには至らなかった。このため、次年度においてまず、モデルの再検討を行い、そのうえで当初予定している研究課題に取り組んでいく必要がある。なお、本年度の研究成果については、学会などでの発表を現在考えている。本年度は前年度までの各調査を継続しつつ、3年間の研究の集大成を行った。まず、各種対策毎の資源・エネルギー消費量抑制と廃棄物発生量予測・評価モデルについては、各種対策を実施している自治体に実施対策の内容と廃棄物発生量抑制効果等に関するアンケート調査を実施し、モデル構成の再検討を行った。さらに調査結果に基づいて、モデル中のパラメータを各自治体の特性と実施対策の内容より推定する方法を提案した。

その上で、この構築したモデルを用いて、モデル地域での資源・エネルギー消費量の抑制を考慮した廃棄物発生量削減計画代替案を立案し、廃棄物発生量削減計画実施による廃棄物減少化の将来予測と評価を行った。そして、資源・エネルギー消費量の抑制を考慮した廃棄物発生量削減計画についての一提案を示した。廃棄物発生量削減対策としては、分別の細分化とごみ有料収集を取り上げたが、分別の細分化は市民のごみの排出の仕方が変化するだけで、ごみ排出量全体を抑制する効果は少ないこと、一方、ごみ収集の有料化は適正な価格設定を行えばごみ排出量の減量化に大きな効果を発揮することを明らかにした。得られた廃棄物発生量削減効果予測モデルでは、排出ごみの分別種間の移動や自家処理の可能性等までは評価できなかったため、ごみの総量としての削減効果を検討した。なお、3年間の研究成果については、学会などで発表する予定である。
骨髄由来線維芽前駆細胞Fibrocyteは気管支肺異形成における肺線維化源か？

在胎28週未満の超早産児の慢性期合併症である新生児慢性肺疾患(CLD)は未だに原因不明で、早産児死亡の最大の原因となっている。CLD増悪因子の一つは肺の線維化である。線維化を主導するのはmyofibroblastで,Fibrocyteはその起源であるfibroblastの前駆細胞で、肺の線維化を来たす成人疾患では高頻度に血中で検出され、重症度とも関連する。CLDを発症する早産児の血中にはfibrocyteが存在し、CLD重症度と相関するという仮説を立て、血液を用いて検証した。flow cytometryを用いての測定を検討したが、末梢血からfibrocyteを検出することは困難と判断した。当初の計画通り、まず早産児の血液、気管肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavagefluid:BAL)にfibrocyteが含まれるかを確認するために、当院で在胎28週未満で出生した早産児より検体の採取と保管を開始した。またそれと同時に、fibrocyteのpositive controlの採取を行った。Fibrocyteは健常成人の流血中にはほぼ存在しないが、特発性肺線維症、強皮症関連間質性肺疾患、重症気管支喘息など、macrophageによる慢性炎症とfibroblastの慢性的活性亢進を来たし肺の線維化を呈する疾患の患者血中において高頻度に検出されることが分かっている。そのため、ヘビースモーカーや気管支喘息を患っている成人ボランティアより血液を採取した。そのため、赤血球除去後にCD34+、CD45+、collagenIでの染色下でflow cytmetryを行った。結果、fibrocyteの分離は出来なかった。蛍光試薬の選択の問題とも考えられたため、コンペンセーションを何度か行ったが実現できなかった。65歳以上の健康成人でもfibrocyteが多く認められるとの論文もより同様に行ったが、検出できなかった。また、健常成人でも65歳以上の高齢者には存在していることが分かっている。しかし、それらの論文にはFibrocyteの検出に用いた試薬名、詳細な方法が記載されていない。その方法の確立を現在試行中である。Fibrocyteは1白血球系マーカーCD45+2幹細胞系マーカーCD34+3ECM protein=collagen(≒pro-collagenI)の3つを共発現する細胞と定義されている。65歳以上の健康成人でもfibr ocyteが多く認められるとの論文もより同様に行ったが、検出できなかった。positive controlの採取に難渋した。1在胎28週未満で出生した早産児の血液、BAL検体の採取と保管の継続:当院では在胎28週未満の早産児は年間に5-10名の出生のみである。引き続き検体の確保を継続する。2positive controlの検出方法の確立:Fibrocyteは、前述のとおり、白血球系マーカー、幹細胞系マーカー、及びECM proteinの3つを共発現する細胞と定義され、検出のためにはFlow Cytemetryや免疫染色において、3種類の抗体による3重染色を行う必要がある。このため、当初より多重染色を行う上での技術的な問題により研究計画の遅滞が生じる可能性が高いと考えられていた。今年度は免疫組織学染色に習熟する本学病理学教室や中央検査室に協力を要請し、技術的問題の解決に努める。複数の試薬を用いてpositive controlの検出方法の確立を推進するよう努める。

新生児今回の助成金の大部分をFlow Cytometryに使用する蛍光試薬に用いる予定である。使用する試薬の種類、量により差額が発生した。本年度も蛍光試薬を購入予定であり、前年度分も合わせて使用する予定である。
ミトコンドリア病としての細網異形成症の分子機序の解明と新規栄養療法の考案

エネルギー代謝関連酵素であるアデニル酸キナーゼ2(AK2)の欠損が、細胞異形成症における好中球分化障害を引き起こす機序について検討した。HL-60細胞を用いたマクロファージ分化・好中球分化の解析で、AK2およびミトコンドリア由来のATP供給が好中球分化に必須であり、AK2をノックダウンすることでROSの産生が上昇することを示した。また、分化中には分化系統特異的かつ時期特異的なUnfoldedprotein response活性化が起こっており、これらが分化に必須であることも明らかにし、分子機序の一端を解明した。これらの成果は、新規治療標的の探索に重要なヒントを提示することになった。細網異形成症(RD)は重症複合型免疫不全症の亜型であり、致死的な感染症を起こす。近年、原因遺伝子としてエネルギー代謝酵素アデニル酸キナーゼ2(AK2)が報告された。AK2はATPとADPを相互変換し、ミトコンドリア膜間におけるATP濃度の恒常性を維持している。しかし、ミトコンドリア膜間ではミトコンドリアクレアチンキナーゼ(CKMT)やヌクレオシド二リン酸キナーゼも同様にATP代謝に関与しており、なぜAK2変異単独でRDを引き起こすのか不明であった。また、リンパ球、好中球、マクロファージ等の免疫細胞は造血幹細胞から分化するがRDではこのうちTリンパ球と好中球の分化が特異的に障害されており、AK2と細胞特異的分化障害との関連も未解明であった。今回、AK2や他のエネルギー代謝酵素と血球系細胞分化との関係について検討した。まず、マウス各臓器の酵素発現を調べたところ、造血系組織である骨髄でAK2発現が極めて優位であることが確認された。さらに血球系分化について、好中球およびマクロファージへ分化可能なHL-60細胞を用い、分化時の酵素発現を調べた。その結果、好中球分化ではAK2のみが発現しているが、マクロファージ分化ではAK2とCKMT1が発現しており、系統による酵素発現の違いが観察された。また、AK2ノックダウンによるRDモデルHL-60細胞を作製し分化への影響を検討したところ、マクロファージ分化効率は変化しなかったが、好中球への分化効率は有意に減少した。その際、酸化ストレスの有意な上昇が認められた。以上より、RDにおける免疫細胞の特異的分化障害は血球細胞のミトコンドリア膜間酵素発現の違いに起因し、好中球の正常分化にはAK2が必須であることが示された。RDではAK2欠損によるATP-ADPの濃度バランス異常や、それに伴う酸化ストレスの上昇により好中球分化が障害されると考えられた。近年、原因遺伝子として、エネルギー代謝酵素アデニル酸キナーゼ2(AK2)が報告された。また、リンパ球、好中球、マクロファージ等の免疫細胞は造血幹細胞から分化するが、RDではこのうちTリンパ球と好中球の分化が特異的に障害されており、AK2と細胞特異的分化障害との関連も明らかとなっていなかった。これまでに、AK2が好中球分化に必須であることを示した。一方で、RDで障害されないマクロファージにおいては分化時にAK2だけでなくCKMT1も発現していることがわかった。それによりRD患者ではAK2欠損によるミトコンドリア膜間でのATP-ADPの濃度バランス異常や、それに伴う酸化ストレスの上昇により好中球分化が障害されると考えられた。今回、T細胞分化障害の発症機序については明らかとするため、T細胞におけるエネルギー代謝酵素の発現を検討した。ヒトT細胞株Jurkat細胞で、ミトコンドリア膜間エネルギー代謝関連酵素の発現をWBで調べたところ、AK2が優位に発現していることがわかった。このことから、RD患者のT細胞も、好中球同様にミトコンドリア膜間でのヌクレオチドバランスの異常によって分化障害を引き起こす可能性が示唆された。細網異形成症は好中球とT細胞が欠損した免疫不全症で、その原因遺伝子としてエネルギー代謝関連酵素アデニル酸キナーゼ2(AK2)が明らかになっている。しかし、その発症機序は未だ不明である。従って、本疾患の治療法開発のため、好中球分化障害の病態発症機序の解明を目指した。まず、モデル細胞としてはAK2ノックダウン(KD)したHL-60細胞を用いた。ノックアウト細胞の作製は、AK2偽遺伝子の存在や血球系細胞ゆえの遺伝子導入効率の低さ・ダメージへの脆弱さのため困難を極めているが、現在も挑戦中である。好中球分化障害の機序に関しては、これまでにAK2 KD HL-60細胞を好中球分化させるとROSが増加することを見出している(PLoS ONE, 2014)。今年度はAK2欠乏状態での好中球分化時に、ミトコンドリア膜電位が一過的に上昇することを確認した。このことはATP合成や、電子のリークによるROS産生に関与すると考えられるが、病態形成との関連についてはさらなる検討が必要である。

また、血球分化時の小胞体ストレスおよびUnfolded protein response(UPR)の役割を検討したところ、分化前のHL-60細胞に存在した小胞体ストレスが好中球分化に伴い減弱することが観察された。UPRに関しては、分化前に発現が強く、分化に伴い発現が減少するものと分化後期に一過性の発現を示すものが観察された。また、各UPRを抑制すると、好中球分化が阻害された。従って、分化中の細胞は小胞体ストレスから分化特異的なUPR経路により保護されており、それが阻害されると分化特異的な障害が起こる可能性が示唆された。よって、細網異形成症ではAK2の欠損によりATP供給が低下し、UPRが障害される可能性が示され、病態形成の一因となり得ることが示唆された。本研究成果は論文作製中であり、また学会発表の予定である。エネルギー代謝関連酵素であるアデニル酸キナーゼ2(AK2)の欠損が、細胞異形成症における好中球分化障害を引き起こす機序について検討した。HL-60細胞を用いたマクロファージ分化・好中球分化の解析で、AK2およびミトコンドリア由来のATP供給が好中球分化に必須であり、AK2をノックダウンすることでROSの産生が上昇することを示した。また、分化中には分化系統特異的かつ時期特異的なUnfoldedprotein response活性化が起こっており、これらが分化に必須であることも明らかにし、分子機序の一端を解明した。これらの成果は、新規治療標的の探索に重要なヒントを提示することになった。平成26年度は、1) AK2欠損T細胞・好中球モデル細胞の樹立、2) T細胞株Jurkat細胞を用いた血球系分化機構、および細網異形成症の発症機序の解明、3)栄養素・薬剤等による治療法の開発を行う予定であった。1)については、AK2 KD HL-60細胞をすでに利用しているが、新たにAK2 KO HL-60細胞とAK2 KD Jurkat細胞を樹立することにした。Jurkat細胞に関しては、AK2 siRNAをNucleofector II (Lonza)で導入しAK2 KDを行うプロトコールを樹立した。AK2 KO HL-60細胞に関しては、AK2の偽遺伝子を考慮した上で、Zinc finger nucleaseシステムを用いて、KO株を樹立している最中である。作製したKO株は、今後、さらなる好中球分化障害機序の検討や、治療法開発に使用する予定である。2)においては、ヒトCD4+T細胞株Jurkat細胞でAK2が発現していることを確認した。さらに分化させるときにAK2の欠損が分化障害や機能障害を引き起こすかどうか検討中である。3)では、AK2やエネルギー代謝関連酵素のプロモーター領域をクローニングし、治療に使用できる候補薬剤・栄養素の検討準備を行っている。栄養学、生化学、細胞生物学今年度は、(1) RDでのT細胞分化障害の発症機序解明と、(2) RDの治療法開発についての計画を推進する。1) T細胞分化方法の確立とAK2欠損による分化障害の確認...Jurkat細胞を用いた検討で、Jurkat細胞ではミトコンドリア膜間エネルギー代謝関連酵素としてAK2のみが優位に発現していることから、好中球同様、T細胞でもAK2欠損により分化障害や機能障害が起こることが示唆された。そのため、まず、naïveと考えられているJurkat細胞を成熟T細胞へと分化させる方法の確立を行う。
パルス電界法を応用した新規消毒技術の確立とその消毒メカニズムの解明に関する研究

本研究は、既存の消毒技術の欠点を補完できる技術の開発と導入に向けて、インパルス電圧印加技術を応用した新たな消毒技術の確立を目指すものである。さらに本技術では、単なる微生物細胞の不活化だけでなく、細胞内部の遺伝子をも破壊(不活化)可能な技術としての確立を考えている。これによって、近年、新たな水環境問題である薬剤耐性菌とその耐性遺伝子の不活化が可能になるため、これらの水環境中への拡散の抑制に大きく寄与できるものと考えている。本申請研究では、下水二次処理水を対象に、最適な消毒処理条件、およびその消毒機序に関わる知見・情報を明らかにし、実証実験に関する研究に発展させたいと考えている。
ニホンウナギ卵黄形成の分子機構

本研究ではニホンウナギの卵黄形成の分子機構の解析を通して、健全な稚魚の発生のためのビテロゲニンの合成を統御することを目的とした。本研究ではまず、サケ脳下垂体投与により人為催熟された雌ウナギを材料として、肝臓でのエストロゲン受容体量の変化を結合実験により調べた。その結果、肝臓でのエストロゲン受容体量の変化は血中エストラジオール-17β(E2)量の変化によく相関し、成熟に伴い増加した。次に、肝細胞で発現しているエストロゲン受容体とビテロゲニン遺伝子のcDNAクローニングを試み、蛋白質翻訳領域の全体を含むエストロゲン受容体cDNAおよびビテロゲニンcDNA断片のクローニングに成功した。ニホンウナギエストロゲン受容体は573個のアミノ酸からなり、他種と比較して、DNA結合領域で約80%、ホルモン結合領域で約55%と高い相同性を示した。これらcDNAを用いてエストロゲン受容体およびビテロゲニンの成熟に伴う肝臓での発現変化も調べ、血中E2量の変化とよく相関することも明らかにした。肝細胞培養系の確立およびビテロゲニンの微量測定系(ELISA法)の確立にも成功し、雄よりも雌の肝細胞の方がはるかに高いビテロゲニン合成、分泌能を有することも明らかにした。さらに、卵巣の器官培養系を確立し、卵母細胞のビテロゲニンの取り込みに及ぼす各種ホルモンの影響も調べ、ビテロゲニンの取り込みに脳下垂体ホルモンおよび甲状腺ホルモンが関与することを示唆した。これまでの申請者らの研究で、肝臓における卵黄前駆タンパク質のビテロゲニンの合成には卵巣から分泌されるエストラジオール-17β(E_2)だけではなく、脳下垂体から分泌されるプロラクチンや成長ホルモンが関与していることがわかってきた。また、E_2は肝臓に作用する際、肝細胞核に存在する特異的な受容体(E_2レセプター)に結合し、その作用を発現させるが、E_2レセプター自身もE_2により発現が誘導されることも知られている。従って、上述の結果はE_2レセプターの発現に、脳下垂体ホルモンも関与していることを示唆している。このことを明らかにするためには、E_2レセプターcDNAをクローニングし、肝細胞培養系を用いてその発現機構を詳細に調べる必要がある。これまで、申請者らはニホンウナギのE_2レセプターcDNA断片をクローニングできていた。本年度は全翻訳領域を含むE_2レセプターcDNAをクローニングすることに成功し、全塩基配列を決定した。また、得られたcDNAを培養細胞に導入し、E_2との結合実験を行い、E_2レセプターcDNAであることを確認した。さらに、E_2レセプターおよびビテロゲニンの発現機構を調べるための肝細胞培養系も開発した。その結果、肝臓でのエストロゲン受容体量の変化は血中エストラジオール-17β(E_2)量の変化によく相関し、成熟に伴い増加した。これらcDNAを用いてエストロゲン受容体およびビテロゲニンの成熟に伴う肝臓での発現変化も調べ、血中E_2量の変化とよく相関することも明らかにした。

さらに、卵巣の器官培養系を確立し、卵母細胞のビテロゲニンの取り込みに及ぼす各種ホルモンの影響も調べ、ビテロゲニンの取り込みに脳下垂体ホルモンおよび甲状腺ホルモンが関与することを示唆した。
未解明の妊娠レストレスレッグス症候群のスクリーニングと周産期アウトカムへの影響

目的は1.妊婦のレストレスレッグス症候群(RLS)について、生理学的データと主観的データによるスクリーニングを行い、その頻度を把握する。2. RLSのある妊婦の母児への影響について関連性を記述するの2点であった。対象は、1ローリスク後期妊婦140人2ハイリスクで入院中の後期妊婦81名であった。RLSスクリーニングによる有病率は日本語版TDIで、ローリスク群22人(15.7%)、ハイリスク群14人(17.3%)であった。血液生化学検査(Hb値・血清鉄値・血清フェリチン値・葉酸値)や周産期アウトカムについてもローリスク群、ハイリスク群ともに、RLSの有無による差は認められなかった。本研究の目的は、以下の2点である。1.これまでに解明されていない妊婦のレストレスレッグス症候群(RLS)について、生理学的データ(血液学的データ・末梢身体活動量)と主観的データによるスクリーニングを行い、その頻度を把握する。2. RLSのある妊婦について妊娠中から産褥まで縦断的フォローアップを行い、母児への影響(睡眠、胎児の発育等、周産期の母児アウトカム)について関連性を記述する。初年度は、上記の目的にそって1)2)を実施した。1)妊娠後期のレストレスレッグス症候群の発生頻度を調べた。研究協力施設を開拓し、ローリスクの妊婦(妊娠30週前後)におけるRLSのスクリーニングを実施した。インタビュによるThe Johns Hopkinstelephonediagnostic interview(TDI)、質問紙は日本語版single RLSスクリーニング質問紙、日本語版IRLS ver2.2、RLS-QOLの3つを使用した。血液データの測定では、妊娠末期健康診査時の採血時に血清フェリチン・血清鉄・ヘモグロビンを同時に採取し、検体は検査会社にて測定した。下肢活動量測定ではアクチグラフを使用し、周期性四肢運動インデックス値を測定した。研究の対象はリクルート対象者51名中、50名から研究協力の承諾を得た。RLSスクリーニングでは、本研究では日本語版TDIからRLS陽性・陰性の2群に分けて判定を行い、7名が陽性、2名が偽陽性と判定された(有病率18%)。RLS陽性群、陰性群において、年齢、血清フェリチン値、血清鉄値、Hb値との間に有意差はみられなかった。引き続き、研究協力者を募り、データを蓄積している。2)レストレスレッグス症候群と周産期アウトカムの関連を把握した。先にリクルートした研究協力者の周産期アウトカムを順次集積し、RLS陽性・陰性の2群間で比較検討中である。本研究は、以下の2点を目的としている。本年度は初年度に引き続き、上記の目的にそって1)2)を実施した。1)妊娠後期のレストレスレッグス症候群の発生頻度・血液生化学データ・夜間の下肢の活動量を調べた。初年度からの研究協力施設に依頼し、ローリスクの妊婦(妊娠30週前後)におけるRLSのスクリーニングを実施した。インタビュによるTDI、質問紙は日本語版single RLSスクリーニング質問紙、重症度として日本語版IRLSver2.2、生活の質としてRLS-QOLを使用した。血液生化学データの測定では、妊娠末期健康診査時の採血時に血清フェリチン・血清鉄・ヘモグロビン・葉酸を同時に採取し、検体は検査会社にて測定した。下肢活動量測定ではアクチグラフを使用し、分析についてはソフト開発中である。研究の対象はリクルート対象者141名中、140名から研究協力の承諾を得た。RLSスクリーニングでは、本研究では日本語版TDIからRLS陽性・陰性の2群に分けて判定を行い、11名が陽性、11名が偽陽性と判定された(有病率15.7%)。RLS陽性群、陰性群において、年齢、血清フェリチン値、血清鉄値、Hb値・葉酸値との間に有意差はみられなかった。先にリクルートした研究協力者の周産期アウトカム、新生児のアプガー等について、いずれもRLS群と非RLS群の両群間に有意な差は認めなかった。1.妊婦のレストレスレッグス症候群(RLS)について、生理学的データと主観的データによるスクリーニングを行い、その頻度を把握する。2. RLSのある妊婦の母児への影響について関連性を記述する。最終年度として昨年に引き続き、1)2)を実施した。1)妊娠後期のレストレスレッグス症候群の発生頻度・血液生化学データ・夜間の下肢の活動量、妊婦の睡眠を調べた。ハイリスク妊婦を対象として地域周産期医療センターに依頼し、入院中の妊婦(妊娠30週前後)におけるRLSのスクリーニング(TDI)・重症度(日本語版IRLS, ver2.2)、QOL(RLS-QOL)を測定した。血液生化学データでは、血清フェリチン・血清鉄・ヘモグロビン・葉酸を同時に測定した。下肢活動量測定と睡眠状況の把握はアクチグラフを使用し、分析した。

研究の対象はリクルート対象者99名中、81名から研究協力の承諾を得た。RLSスクリーニングでは、陽性(definite)5人(6.2%)、疑陽性(probable)9人(11.1%)、それらを合わせRLS/WED群は14人(17.3%)であった。RLS陽性群、陰性群において、年齢、血清フェリチン値、血清鉄値、Hb値・葉酸値との間に有意差はみられなかった。下肢活動量では、RLS/WED群8人と非RLS/WED群34人でPLM indexの中央値(25%値-75%値)はそれぞれ11.7(4.0-18.7)、6.9(4.5-13。1)/hrと統計学的有意差は認めなかった(p = 0.421)2)レストレスレッグス症候群と周産期アウトカムの関連を把握した。対象施設で出産した妊婦55人の産婦の年齢、分娩歴、分娩様式、分娩時の在胎週数、分娩時間、出血量、新生児のアプガー等、いずれもRLS/WED群と非RLS/WED群の両群間に有意な差は認めなかった。目的は1.妊婦のレストレスレッグス症候群(RLS)について、生理学的データと主観的データによるスクリーニングを行い、その頻度を把握する。2. RLSのある妊婦の母児への影響について関連性を記述するの2点であった。対象は、1ローリスク後期妊婦140人2ハイリスクで入院中の後期妊婦81名であった。RLSスクリーニングによる有病率は日本語版TDIで、ローリスク群22人(15.7%)、ハイリスク群14人(17.3%)であった。血液生化学検査(Hb値・血清鉄値・血清フェリチン値・葉酸値)や周産期アウトカムについてもローリスク群、ハイリスク群ともに、RLSの有無による差は認められなかった。定期的にミーティングを開催し、進捗状況や分析方法の確認、発表、論文投稿の計画を話し合っているため。母性看護・助産学新たに睡眠研究者に加わってもらい、毎月定期的にRLSミーティングを行い、進捗状況の確認や研究発表に向けた準備を行う。次年度の研究費の使用計画については、本年度と同様に、[旅費]として、調査交通費、学会参加の費用をあてる。[謝金]として、研究補助謝金、研究協力者への謝金、[その他]として、血液検査料、英語論文校閲費を計上している。研究協力施設や研究協力者のリクルートはおおむね順調で、データ収集を進めている。本年度中(2015年2月)に、データ収集をしている病院施設の検査部で血液生化学検査(葉酸、フェリチン、血清鉄)を行うための試薬の購入や人件費として231,832円の見積を受けていた。しかし、同病院内で発生したカルバペネム耐性菌により検査部が対応しなければならなくなり、検査は次年度に持ち越すこととした。(今後の推進方策)今後も対象数を増やすために、研究協力施設を検討し、データ収集を進めていく。また、妊娠中のRLS症状の変動と妊娠への影響を検討することを目的とし、対象者(妊娠初期・RLSあり)をリクルート後、妊婦の下肢活動、Actigraphによる睡眠状況の把握、および胎動(静電容量型加速度センサー)、周産期のアウトカムについてのデータ収集を行う。(次年度の研究費の使用計画)対象者をローリスクに限らず、ハイリスク妊婦へも拡大するため、Actigraphのソフトを購入し、睡眠(活動量)及び下肢活動量の測定を積極的に行う。
ヒトにおける1-ブロモプロパン中枢神経毒性と量-反応関係に関する疫学的研究

1-ブロモプロパンに曝露された中国労働者の個人曝露量、曝露期間を調べるとともに、健康調査を行った。健康調査は、下肢の運動神経伝導速度、感覚神経伝導速度、遠位潜時、F波伝導速度、WHO神経行動学的検査、血球検査、生化学検査、振動覚検査であった。その結果、1-ブロモプロパン曝露が遠位潜時を延長することがわかった。一方、同時に調査した米国の重症1-ブロモプロパン症例は中枢神経系障害を示した。中国山東省にある1-ブロモプロパン製造に従事する25人(男性17人、女性8人)の労働者および、対照群として、製鉄工場労働者25人の健康調査を行った。具体的には、運動神経伝導速度、遠位潜時測定、血液学的、生化学的検査(総蛋白、コレステロール、ALT、AST、LDH、ALP、CK、テストステロン、エストラジオール、LH、FSH、クレアチニン、フェリチン、フルクトサミン)である。健康調査は、名古屋大学医学部倫理委員会の承認を受け、文書によるインフォームドコンセントを得た後に行った。その中から性年齢をマッチさせた18人ずつを選び出し結果を解析した。男性でplt分布cv、女性でMCH、MCHC、RBC分布SDにおいて有意に減少していた。その他の指標について有意差は認められなかった。検知管による各場所での1-ブロモプロパンの濃度測定では、平均、標準偏差がそれぞれ、反応釜(左)では6.83、5.16、反応釜(右)では1.1、2.2、操作台(左)では4,52、2,84、操作台(右)では2.62、2,63であった.調査を行った工場での曝露濃度は10ppm以下であった。今回の結果から、下肢の運動神経については電気生理学的には異常が認められなかった。過去の論文によると、50ppm以下の濃度での影響が報告されている。今回は濃度が低いため影響が出なかったと考えられる。人体への影響を及ぼす濃度の閾値についてはさらなる調査が必要である。中国の1-ブロモプロパン製造工場の女性曝露労働者82人と年齢をマッチングさせた非曝露女性労働者82人(ビール工場及び機械組立工場)の健康指標(下肢の神経伝導速度、神経行動検査、生化学的な指標)を対応のあるt検定により比較した。さらに、1-ブロモプロパン製造工場労働者のみを対象に、曝露濃度と遺伝子多型(GSTT1、GSTM1)を独立変数として、生体指標を従属変数とした共分散分析を行った。FCV、SCV、Benton、WBC、LY、CKの項目で曝露群の数値は非曝露群を下回り、Distal latency、TP、GOT、LDHの項目で上回った。また、曝露濃度とGSTT1とを独立変数とし、各生体指標を従属変数とする共分散分析では曝露濃度と遺伝子多型GSTT1との交互作用が、Left Foot及びRight Handで有意であった。その後の遺伝子型ごとの曝露濃度と生体指標との単回帰分析においては、有意な曝露濃度による影響は見られなかった。曝露濃度と遺伝子多型GSTM1とを独立変数とする共分散分析では、いずれの生体指標に関する分析においても交互作用は有意でなく、加法的modelが成立することが分かり、FCV、Digit span reverse、LDHの項目において曝露濃度が有意な影響を示していることが分かった。(FCV, Digit span reverseでは負の影響、LDHでは正の影響)曝露群ではDistal latency及びTPの増加とともにCKの著しい減少が見られる。特にCKの減少は先行する動物実験で明らかになっていたが、本研究によって人でも初めて確認された。SCVの著しい減少は、米国症例における、感覚神経障害と関連しているかもしれない。また、共分散分析により、曝露濃度と生体指標との有意な関係が明らかにされ、本研究は初めて、人における曝露量依存的な生体影響を明らかにした。1-ブロモプロパン(1BP)は動物とヒトにおいて神経毒性を有することがわかっている。本研究では、より多くの労働者について健康影響と曝露濃度との関係を調べた。中国の1BP製造工場の女性曝露労働者71人と年齢をマッチングさせた非曝露女性労働者71人に対し、質問紙法に基づく面接、WHO神経行動学コア検査、神経伝導速度測定、頚骨神経、腓腹神経伝導速度検査を行った。振動覚、血液学的検査、生化学検査も行った。労働環境中1BP濃度は検知管により測定するとともに、活性炭PassiveDiffusionSamplerを用いて個人曝露濃度を求めた。各健康指標を対応のあるt検定により比較するとともに、量依存的な変化の検索においては、曝露群を個人曝露量および個人曝露量と従業期間の積に従ってそれぞれ3つのグループに分けて、比較した。環境中の1BP濃度は0-80ppm(平均6.4ppm)であった。8時間の個人曝露量は0.07-106.4ppm(mean2.8ppm)であった。

1BP工場に働く労働者は、対照群に比して有意に長い遠位潜時(DL,7.5±2.1msec)、低い運動神経伝導速度(44.8±8.7m/sec)、感覚神経伝導速度(45.5±4.9m/sec)をしめした。振動覚閾値も有意に上昇していた。曝露群はさらに有意に低い神経行動学的検査スコア(Sarta Ana,digit symbol, Benton test, POMS tension, vigor and fatigue)を示した。また、有意に低い白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、クレアチンキナーゼ活性を示す一方、有意に高い血清総蛋白、LDH活性、TSH、FSHレベルを示した。量-依存的変化解析においては、量依存的な遠位潜時延長、赤血球数低下、CK活性減少、高いPOMS項目(Fatigue)および高いTSHレベルが示された。こうして量依存的な神経、血液系への影響が示唆された。我々は、すでに中国における1-ブロモプロパン曝露労働者の調査の報告を行っているが^6、その後、調査対象を拡大し、87名の女性と29名の男性を調べた。対応のあるt-検定によって、下肢遠位潜時の延長、運動神経伝導速度の低下、感覚神経伝導速度の低下が観察された。神経行動学的検査では、Santa Ana、Digit Symbol, Bentonの各検査でスコアの有意な低下が見られた。白血球、赤血球、ヘモグロビンの減少、総蛋白上昇、クレアチニンキナーゼ減少、LDH増加、TSH、FSH減少が観察された。また、量反応関係に関しては、遠位潜時、クレアチニンキナーゼ,TSHが量依存的な変化を示した。さらに、加えて、グロビン蛋白付加物と末梢白血球数の間に負の相関があることが明らかとなり、蛋白付加物が長期曝露マーカーとして有用であることがわかった。また、我々は、新たに米国ミシシッピー州において、より重症の1-ブロモプロパン中毒症例を発見した。37歳女性、2003年10月に1-プロモプロパンを含んだ溶剤を使用し始めた。2003年12月、1-ブロモプロパン曝露開始後2ヶ月目で下肢の無感覚、チクチク感、灼熱感に気づく。同時に臀部と陰部の無感覚に気づく。2004年1月、腰から下肢にかけての感覚の異常に気づく。歩行障害発生。初診1週間前から足部に灼熱感あり。溶剤を使用しているとき、吐き気を感じた。1月28日に内科家庭医受診。1月29日歩行障害が悪化し、病院に搬送された。Tupeloに3, 4日入院し、検査をしたが、診断がつかなかった。深部反射亢進、下肢両側性の感覚低下、足の挙上不可。2段脈。上肢および、脳神経の異常は見つからなかった。入院中は理学療法を受けた。車椅子にて退院する。新しい症例は連続するアンクルクローヌスを示し、1-ブロモプロパンが中枢神経系に強い傷害作用を有することがわかった。
制癌剤のリンパ管内注入に関する実験的研究

抗癌剤を直接リンパ管内へ注入する治療法の有用性と、それに適した薬剤の条件を検討するため、健常家兎(62年度実験)と、VX_2癌細胞浮遊液によって腸骨リンパ節内に癌転移を作成した家兎(63年度実験)を用いて、その鼠径リンパ管内に抗癌剤として、分子量、殺細胞作用に違いのあるFutraful(FT)あるいは、Neocarzinostatin(NCS)を注入した。注入後、血中と組織内濃度を経時的に測定し、静注群の場合と比較検討した。その結果、次の事柄が示唆された。(1)高分子量の制癌剤は、リンパ管外漏出の傾向がなく、かつ、リンハ節内停留の傾向が強いため、低分子量制癌剤よりもリンパ管内注入に適していると思われた。(2)転移リンパ節への抗癌剤の移行性は、リンパ管内注入、静注群とともに、正常リンパ節(62年結果)に比較すると、低いが、リンパ管内注入の場合は、静注群に比較して、従来いわれている様に、移行性が、癌の転移の程度に左右される傾向が少ないと思われた。(3)リンパ管内注入の方が、静注群の場合よりも、注入直後から転移リンパ節のみが他臓器に比較して、高値を示し、急激に半減、その後漸減するも、その間、他臓器よりも高めの値を示した。以上の事より、リンパ管内注入療法が、臨床における投与法等の問題点は別にして、癌の転移リンパ節に対して有効であると同時に他臓器に与える副作用の軽減という面からも有利であると思われた。しかし、さらに、抗癌剤の癌転移リンパ節への移行性いについては、薬剤の濃度の面だけでなく、転移の程度との関係を組織学的に比較検討する必要があると思われる。制癌剤を直接リンパ管内へ注入する治療法の有用性と,それに適した薬剤の条件を検討するため,分子量と作用機序に大きな違いのある制癌剤(1)FT(Futraful)(2)NCS(Neocarzinostatin)を家兎の下腹壁リンパ管および静脈,動脈へ各々注入し,その後の組織内(肺,肝,腎,大腸,リンパ節)や血中内濃度の経時的変化を,各投与経路について比較検討した.その結果, 1)低分子量のFTをリンパ管内に注入すると,大部分は胸管を経て,大静脈系へ流れるが,一部はリンパ管外へ漏出し,腸管で吸収され,門脈へ流れると思われた.2)高分子量のNCSは,リンパ管外漏出が少なく,かつリンパ節内停留の傾向が強いと思われた.3)リンパ管内注入療法には,水溶制,脂溶制ということよりも,高分子量の抗癌剤が適している事が示唆された.以上の事をふまえて,担癌動物について,さらに高分子量抗癌剤のリンパ管内投与における有効性を検討するため,家兎のVX_2癌腫瘍を用いて,本実験に適当な,リンパ節移転実験モデルの作成をこころみた.方法は,家兎の大腿部皮下に移植発育させたVX_2癌腫瘍を移植後4週で摘出し, VX_2癌細胞浮遊液(10^7個/ml)をハンクス液を用いて作成,その0.10.2ccを,下腹壁から鼠経部へ走るリンパ管内へ注入した.その結果,注入後12週では,注入部の腫瘍発育は認められるが,リンパ節転移は非常に小さいかはっきりせず, 34週で,外腸骨動脈周囲に, 0.51cm大の転移巣が確認された.しかし,肺転移や縦隔転移を起こすまでにはいたらなかった.以上の結果より,注入後3週目のVX_2腫瘍転移家兎を用いて,現在, FTリンパ管注入群, NCSリンパ管注入群, FT静注群, NCS静注群の4群について,組織内濃度,特に,転移リンパ節内濃度の経時的変化を,比較検討中である.抗癌剤を直接リンパ管内へ注入する治療法の有用性と、それに適した薬剤の条件を検討するため、健常家兎(62年度実験)と、VX_2癌細胞浮遊液によって腸骨リンパ節内に癌転移を作成した家兎(63年度実験)を用いて、その鼠径リンパ管内に抗癌剤として、分子量、殺細胞作用に違いのあるFutraful(FT)あるいは、Neocarzinostatin(NCS)を注入した。

しかし、さらに、抗癌剤の癌転移リンパ節への移行性いについては、薬剤の濃度の面だけでなく、転移の程度との関係を組織学的に比較検討する必要があると思われる。抗癌剤を直接リンパ管内へ注入する治療法の有用性とそれに適した薬剤の条件を検討するため、健常家兎を用いて行った実験(62年度)で、本法には、高分子量の抗癌剤が適している事を示唆する結果がえられた。これをふまえて、63年度は、担癌動物を用いて検討した。実験動物として、家兎の可移植性腫瘍であるVX_2癌の細胞浮遊液(10^7個/ml)をハンクス液を用いて作成し、その0.20.3ccを下腹壁から鼠経部に走るリンパ管内へ注入して、腸骨リンパ節内に癌転移巣を作成した担癌家兎を使用した。抗癌剤として、濃度依存型で、高分子量薬剤のNeocarzinostatin(NCS)を、静注(I群)、下腹壁動静脈に沿うリンパ管内へ注入(II群)し、その後の組織内濃度、(肺、大腸、腎、肝、転移リンパ節)と、血中内濃度を経時的(60、120、180、240、300分)に測定した。そして、投与経路について比較検討すると同時に、NCSすなわち、高分子量抗癌剤のリンパ節内停留性やその有効性について検討した。その結果、(1)静注群では、転移リンパ節内濃度は、60分から上昇し、120分でピークに達するが、その値は、他の臓器の濃度とほとんど差が無かった。(2)リンパ管内注入群では注入直後から転移リンパ節のみが他臓器に比較して高値を示し、120分では半減し、その後は漸減する傾向を示したが、その間他臓器の濃度よりも高めの値を示した。転移で侵されているリンパ節内に抗癌剤が流入するかという点に関しては、従来から疑問視されているが、転移リンパ節への移行性は、リンパ管注入、静注ともに、正常リンパ節(62年結果)に比較すると、低いが、リンパ管注入の場合、静注に比較して、転移の程度に左右される傾向が少ないと思われた。さらに、濃度と転移の程度との関係を組織学的に比較検討する必要があるが、リンパ管内注入療法の有用性が示唆されたと考える。
カルシウム添加梅漬けにおける食塩およびカルシウムの拡散係数算出

漬物製造の工程の中心となる、食塩およびカルシウムの食素材への浸透・拡散を速度的および定量的に求めることを目的として、硬化梅漬け(`白加賀'種(Japanese Apricot,Prunus Mume Sieb.et Zucc.)、山梨県塩山市、韮崎市、八代町、高根町の4ヶ所で平成6年5月24日に採取したもの)における食塩およびカルシウムの拡散係数を以下に示すような球状形における拡散方程式の解を用いて算出した。C1漬け込み液の食塩およびカルシウム塩濃度[mol/ml]、C0梅果実中の漬け込み前の食塩およびカルシウム塩濃度[mol/ml]、C梅果実中の漬け込み中の食塩およびカルシウム塩濃度[mol/ml]、a梅果実の半径[cm]、n級数(1,2,3...)[-]、t漬け込み時間[s]、D拡散係数[cm^2/s]漬け込みの結果、水酸化カルシウム低濃度添加区(梅重量に対して0.15%)では萎縮が認められたが、高濃度添加区(0.3%)では充分硬度が保持された。食塩の拡散係数は添加した水酸化カルシウム濃度にかかわらずほぼ一定であった(0.9×10^<-5>cm^2/s)のに対し、水酸化カルシウムは異なっており、低濃度添加区での値が著しく低かった。低濃度添加区梅の硬度(不動工業レオメータにより340g/φ)は、高濃度添加区(820g/φ)に比べ低く、水酸化カルシウムが梅組織に充分拡散していないことが推察された。また、求められた高濃度区における水酸化カルシウムの拡散係数を用いることにより、梅漬けの漬かりの終点を正確に予測することが可能となった。
新型のゼ－タ電位の粒子径依存測定装置及び分級機の創生

粒子の帯電状態を測定するために市販の装置では、ゼータ電位の粒子径依存性を測定することはできなかった。本研究では沈降天秤法を改良して、ゼータ電位の粒子径依存性を詳細に知る方法を開発した。この装置を使用して、サブミクロンのシリカ粒子の測定結果より、ゼータ電位は粒子径の変化により変わることが明確になった。またゼータ電位の絶対値は粒子分散直後において最大となり、時間の経過とともに小さくなり最終的には一定値となった。またこの特性を利用すると、サブミクロンのシリカ粒子を高精度で分級することが可能であることがわかった。さらに電場を印加できる湿式分級装置も試作して良好な粒子分級が可能であるとの知見を得た。平成25年度は昨年度試作した装置における下記の改良を実施した。1検出皿側壁に付着した小さな泡が消失することによる、急激な質量増加を補正するための処理ソフトの改良;2沈降部内径を大きくして2次流の発生を可能な限り低減するための最適な沈降部内径の検討;3沈降部内部の2次流れを数値シミュレーションを利用して検討;4連続型の分級装置によるシリカ粒子を利用した分離性能の確認実験;まず装置検出皿側壁に付着した小さな気泡が消失すると浮力の減少による急激な質量増加が発生する。よってこの質量変化が発生しても、データ処理ソフトを改良することで、正確な電気移動度の算出が可能になった。またソフトの改良により、実験で得られた沈降質と理論的沈降質量がほぼ一致することがわかった。次に沈降部内径の最適構造に関してはCFDシミュレーションを実施した。その結果、沈降部の内径が小さいと内部で発生する2次流れが大きく測定値に影響することがわかった。よってこの2次流れ効果を最小限に評価するための沈降部内径を実験的に検討して決定することができた。分級実験ではシリカ粒子を使用して、また粒子の液中分散手法として超音波を利用した。その結果、今年度改良した装置を使用することで、ゼータ電位の粒子径依存性を昨年度よりも高精度に評価できることがわかった。また2種類の連続型の湿式分級実験の結果は本年度改良した装置から得られた測定値を使用することで、実験値と計算値がほぼ一致することがわかった。平成24年度は液体中の粒子沈降法を利用した新型のゼータ電位測定装置を試作した。また試作した装置によるゼータ電位測定結果と現在市販されている測定装置を利用した計測結果を比較することで、信頼性のある装置ができたことを確認した。試験粒子として球形のシリカ粒子を使用して、また粒子の分散方法としてビーズミルを利用した場合と超音波分散を利用した場合のゼータ電位の計測を実施した。その結果、開発したゼータ電位測定装置は、ゼータ電位の粒子径依存性を正確に測定できることがわかった。シリカ粒子のゼータ電位は粒子の分散直後においてその絶対値が最大となり時間の経過に従い絶対値が小さくなることがわかった。シリカ粒子のゼータ電位に関しては、従来の理論では粒子径依存性がないといわれていた。しかしながら今回開発した新型のゼータ電位測定装置を利用することで、粒子の分散直後においてはゼータ電位は粒子径が大きいと負の絶対値が大きくなる場合と、逆に粒子径が小さいと負の絶対値が大きくなる場合が存在することが新たに確認することができた。次にゼータ電位の粒子径依存性を利用した湿式分級装置を新たに試作してその特性を評価した。その結果、従来は困難とされていたサブミクロン領域で粒子径分布の幅が極めて小さい粒子でも分級操作が可能となる新たな知見を得た。液体中の粒子は一般に正または負に帯電している。液体中の粒子の帯電状態を計測すはゼータ電位計が利用されている。しかしながら市販の装置ではゼータ電位の粒子径依存性を測定することはできない。本研究では粉体の粒子径測定に利用されている沈降天秤法に改良を加えて新型のゼータ電位計を試作した。昨年度の研究では、データ解析ソフトに改良を加えて、沈降曲線が急激に上昇した場合でも信頼性の高い測定値が推算が可能なようにした。さらに1ミクロン以下の粒子である、シリカやポリスチレンにおいて、ゼータ電位の粒子径依存性に関する再現性の高い測定値を得ることができた。次に連続型の湿式分級装置を利用して、サブミクロンのシリカ粒子の分級実験を実施した。その結果、装置内部の電位強度を増加すると、分離径が小さくなり、その移動範囲は1ミクロンから0.6ミクロン程度になることがわかった。また粒子の分散をするための前処理としては、超音波よりもビーズミルの方が効果的に分散することがわかった。

その理由は開発したゼータ電位計を利用してゼータ電位を評価するとビーズミル利用の方がゼータ電位の負の絶対値が大きかったためである。さらに電場印加の回分沈降装置も新規に作成してその粒子分離性能を評価した。その結果、電場強度や待ち時間を変化させることで、分離径を0.8から2ミクロン程度の範囲で可変にすることが可能であることが明確になった。化学工学粉体工学平成25年度予定していた装置の改良及び分級実験に関する研究は予定どうり達成されました。ゼータ電位の粒子径依存性を正確に測定できる装置が完成して、測定結果がほぼ信頼できることが明確となったことで初年度の研究目的をほぼ達成している。新規に提案する装置はかなり改良を実施していますが、測定結果の変動が若干存在します。そこで今年度は測定値の変動を最小限にするための装置改良について検討したい。また連続式及び回分式の湿式分級装置における高精度な分級を達成するための装置改良も実施したい。試作した測定装置の内部の構造を更に改良して、測定値の信頼性を向上させたい。また沈降曲線からゼータ電位を推算するデータ処理ソフトの改良を実施したい。次に湿式の電気泳動を利用した分級装置を3種類(連続式水篩装置、回分式水篩装置及び電場印加式の液体サイクロン)について試作してその特性を正確に評価したい。沈降天秤装置の改良のため、外注での部品購入をH25年度実施しなかったので繰り越しとなった。H26年度の予算と合わせて、装置の改良、データ処理用の計算機購入、学会発表の旅費予算を使用する。電気泳動を利用した分級装置を3種類(連続式水篩装置、回分式水篩装置及び電場印加式の液体サイクロン)試作するのに研究費を使用予定
慢性腎臓病の進行阻止のためのアンドロゲン系およびアンジオテンシン系阻害薬の検討

HPRTの活性が低いC57BL/6Jとは異なり、B6-ChrXCMSMはHPRT活性が高いタンパクが発現していると考えられる。尿酸値は、採血直後のB6/Uox-KOにおいてC57BL/6Jより約10倍高いことが認められた。30分放置およびアロプリノール添加30分後ではC57BL/6JマウスとB6-ChrXCMSMマウスのように尿酸値の増加は認められなかった。マウス血漿尿酸値のin vitro上昇はマウス赤血球のHPRT活性が低く、血中尿酸値が低いためにヒポキサンチンが放出され、血漿内のキサンチンオキシダーゼ活性が高いために尿酸に変換されることが原因であると考えられた。本研究は、高尿酸血症から慢性腎臓病(CKD)になる家族性若年性高尿酸血症性腎症(FJHN)のモデルマウスと、CKD進行要因であるウロモジュリン排泄増加モデルマウスのどちらも尿酸トランスポーターSlc22a12遺伝子発現が亢進し、アンドロゲン作用を増強するSrd5a2遺伝子の発現が前者では亢進、後者では不変であった研究結果を発展させ、2つのモデルマウスのSlc22a12発現亢進に対してアンドロゲン系とアンジオテンシン系阻害薬を用いた抑制効果について明らかにすることを目的としている。しかし、上記のモデルマウスにおいて、Slc22a12遺伝子が発現亢進するにもかかわらず、URAT1分子の発現は亢進しなかったことから、URAT1とは別のSlc22a12遺伝子の転写産物が存在する可能性が考えられた。従って初年度は、Slc22a12の未知の転写産物のクローニングを試み、Slc22a12の転写産物をすべて明らかにした上で、当初の計画であるアンドロゲン系とアンジオテンシン系阻害薬を用いた抑制効果について検討することにした。野生型マウスとURAT1ノックアウトマウスの腎total RNAを材料として、Northern blottingおよびRT-PCR法により検討したところ、URAT1とは別のmRNA発現を確認することができた。常法通りにPCRクローニングを行い、この新規転写産物のcDNAクローンが得られた。マウス腎臓ミクロソーム分画のWestern blottingにより、新規転写産物の予想分子量に近似するモノマーおよびダイマーとしてマウス腎臓に発現していることが示された。今後は新規転写産物が尿酸トランスポーターとしての機能を持つかどうか検討する予定である。今年度においては、C57BL/6J, B6-ChrXCMSMマウスのHPRT遺伝子をゲノムシークエンスにより、HPRTaアレル、HPRTbアレルをもつ2つの対立遺伝子間の分離が出来、ワイルドタイプ、ヘテロタイプ、ホモタイプに分離することが確認できた。さらに3種類のC57BL/6Jマウス, B6-ChrXCMSMマウス, B6/Uox-KOマウスにおいて血漿中尿酸値の偽上昇のメカニズムに関し検討を行った。その結果として、コントロールマウスであるC57BL/6Jマウスと比較して、B6-ChrXCMSMマウスは血漿尿酸値が低い傾向であり、B6/Uox-KOマウスでは10倍高いことが認められた。また、C57BL/6Jマウスと比較して、B6-ChrXCMSMマウスの血漿中ヒポキサンチンン濃度は有意に有意に抑制され、B6/Uox-KOマウスでは有意に低いことが認められた。これらのことから、in vitroにおけるマウスの血漿中尿酸値の偽上昇は、マウス赤血球のHPRT活性が低く、血漿中尿酸値レベルが低いことに起因することであることが考えられた。当初計画していた内容より若干遅れている。しかし、血漿中尿酸値の偽上昇のメカニズムを検討することにより、アンドロゲン系とアンギオテンシン系阻害薬を用いた抑制効果についても明らかにする目的を達成できるものと考えている。今年度においては、C57BL/6J、B6-ChrXCMSMマウスにおいて、HPRT遺伝子をゲノムシークエンスにより、Hprt bアレルは低い活性のHPRT Bタンパクを発現するC57BL/6Jとは異なり、B6-ChrXCMSMはHprt