hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両親媒性物質を用いた細胞内への物質の取り込み

両親媒性物質の添加によって引き起こされるヒト赤血球の形態変化とテトラエチルアンモニウムイオンの取り込みの関係について検討した。取り込み量はテトラエチルアンモニウムイオン選択性電極を用いて定量した。電極法は、溶液の濁り・色にはまったく影響を受けず、目的とする物質の定量を抽出・分離操作なしに行うことができる簡便な測定方法である。テトラエチルアンモニウムイオンはヒト赤血球の形態が円盤状のディスコサイト型からカップ状のスタマトサイト型に変化したときに優先的に取り込まれることがわかった。これはアセチルコリンエステラーゼの遊離がコンペイトー状のエキノサイト型変形のときに引き起こされたのと対照的であった。赤血球がスタマトサイト型になると、赤血球内部に空胞が生成し、そのなかには外液中に存在するテトラエチルアンモニウムイオンが封入されていたために、取り込みが起こったものと考えられた。本法は細胞内への物質導入法の新しい方法となり、より大きな分子であるβガラクトシダーゼ等の酵素もスタマトサイト型変形時に赤血球内部に取り込まれることがわかった。さらに本研究を通じて、両親媒性構造をもつ生理活性ペプチドにより引き起こされる赤血球の形態変化の機構、アデノシン-5′三リン酸(ATP)等の生理活性物質の電極法による定量、細胞膜に形成されたイオンチャンネルサイズの電極法による定量法の確立等の幅広い成果も得られた。これらについては、11.研究発表の項で示した論文を参照してほしい。ヒト赤血球の形態は両親媒性物質を添加すると,通常みられる円盤状のディスコサイト型からコンペイトウ状のエキノサイト型あるいはカップ状のスタマトサイト型に変化することが知られている。そして,エキノサイト型およびスタマトサイト型変形により,それぞれ細胞外部・内部へ膜ペシクルが遊離することが電子顕微鏡により観察されている。本研究では特に,スタマトサイト型変形によって細胞内部にベシクル遊離が起こることに注目した。このベシクルのサイズが比較的大きかったことから,膜ベシクル内には外液中に溶解させておいた物質がトラップされ,その結果,細胞内へ物質を取り込ませることも可能になると予想した。我々は,この取り込み量をテトラエチルアンモニウムイオンをマ-カ-として,イオン選択性電極を用いて定量した。電極法は,溶液の濁り,着色などに影響されないため,経測が容易な点が長所である。マ-カ-はスタマトサイト型変形のときのみ取り込まれ,本法は細胞内への物質の新しい導入法になることがわかった。本研究では更に,より大きな分子である酵素の取り込みも電極法により検討した。その結果,例えば,βーガラクトシダ-ゼ等の酵素もスタマトサイト型変形をひき起こす物質添加により赤血内に導入されることがわかった。この研究を通じて,電極法での酵素の定量(例えば,アセチルコリンエステラ-ゼあるいはβーガラクトシダ-ゼ)および形態変化を起こす種々の生理活性ペプチドの作用機構についても成果が得られた(11.研究発表を参照して下さい)。種々の両親媒性物質の添加により,ヒト赤血球の形態は円盤状のディスコサイト型からコンペイトー状のエキノサイト型あるいはカップ状のスタマトサイト型に変化することが知られている。昨年度の研究実積報告書で,スタマトサイト型変形が引き起こされると,細胞外液中に溶解させておいた物質が細胞内へ取り込まれることを報告した。この取り込み実験は,マーカーとしてテトラエチルアンモニウムイオンを用い,反応後,赤血球を溶血させ,細胞外へ流出したマーカー量をイオン選択性電極を用い定量することにより行なった。イオン選択性電極は溶液の濁り・色にはまったく影響を受ず,目的とする物質の定量を抽出・分離操作なしに行なうことができる簡便な測定方法である。そこで,テトラエチルアンモニウムイオン以外に有用な生理活性物質の導入実験にも,電極法を用いて定量できるようにすることも重要と考え,生理活性物質に応答する電極の開発研究を進めていった。ここでは字数の関係上,アデノシン-5'-三リン酸(ATP)の定量に電極法を応用した例についてのみ記述する。

ATPはコリン選択性電極と酵素コリンキナーゼを用いて高感度で定量可能であった。コリンはATPと定量的に反応し、コリン電極に対して不感受性のコリンホスフェートに変化するため,酵素反応で消費したコリン濃度を電極法で定量することは,そのままATP濃度を定量することに対応した。本法はATPを定量する新しい方法となり,例えば赤血球内に含まれるATP含量(1.2mM)も定量することができた。さらに本研究を通じて,両親媒性構造をもつ生理活性ペプチドにより引き起こされる赤血球の形態変化の機構,電極法による細胞膜に形成されたイオンチャンネルサイズの定量法,またATP以外の物質の電極法による定量の確立等の幅広い成果も得られた。これらについては11.研究発表の項で示した論文を参照してほしい。
高温高圧下におけるポリマー中の気体の溶解度および拡散係数

1.ポリマー中への気体の溶解度の測定ポリスチレンに対する二酸化炭素及び窒素の溶解度を圧力降下法により温度100,140°C、圧力20MPaまでの範囲で測定した。溶解度を算出する際に必要なポリマーの体積は気体の溶解に伴うポリマーの膨潤のために変化するが、高温高圧下においては膨潤量の測定が非常に困難であるため、状態式により膨潤量を推算し溶解度の実験値を補正した。その結果、難溶性の窒素に関しては膨潤量が非常に少量であるために補正の影響は小さいが、二酸化炭素に関しては高圧力域において非常に補正の影響が大きく、この補正が絶対に必要であることが分かった。測定結果から温度依存性を検討したところ、二酸化炭素については高温ほど溶解度が低くなるという一般的な傾向がみられたが、窒素については高温の方が溶解度が高いという結果が得られ、臨界温度の低い物質にしばしば観察される逆溶解性を示した。またどの等温線においても溶解度は圧力に対してほぼ直線的に増加した。2.ポリマー中への高圧ガスの溶解度の推算法の確立溶解度の測定値に対して溶液論に基づく状態式により相関を行った。状態式としてはSanchez-Lacombeの式とSimha-Somcynskyの式の修正式を用いた。これらの式を用いてポリスチレン中の二酸化炭素及び窒素の溶解度を相関したところ、両式共に良好な相関結果が得られた。従来、Simha-Somcynskyの式は分子サイズのよく似た系に対する気液平衡関係は良好に表現することができたが、本測定系の高分子+低分子系の様な分子サイズの大きく異なる系の気液平衡関係を良好に表すことができなかった。しかし今回修正を加えたところ、高分子+低分子系の帰気液平衡関係も良好に表すことができた。
エバネッセント場を利用した単分子膜中の色素会合構造の研究

有機超薄膜の微視的な構造やその領域での光学物性の解明は,基礎物性の探求に不可欠であるばかりでなく,それらを分子エレクトロニクスやバイオエレクトロニクスデバイスに応用する場合にも重要である.本研究の主な目的は光の回析限界を越える微視的な領域での光学物性の解明することである.そのため,表面プラズモン顕微鏡(SPM)と走査型ニアフィルド顕微鏡(SNOM)の試作及びそれによって得られる像の理論計算を行った.SNOMを用いて試料近傍に局在するエバネッセント光をプローブすることによって光の回折限界を越えた解像度を得ることができた.本研究の特色は以下の通りである(1)SPMによる巨視的な領域とSNOMによる微視的な領域の観察を同時に行うことが可能な光学系を作製した.633nmの波長のHeNeレーザーの他に543nmの縁,612nmのオレンジおよび594nmの黄色のレーザーを購入し利用できるようにした.各々の色素の会合体にあわせて波長を選択し観察を行うことができるようになった.(2)SPMとSNOMを用い基板に吸着した粒上の金の粒子を観察し原子間力顕微鏡で得られた像と比較を行った.(3)SPMとSNOMを用いて,表面プラズモン共鳴条件下でその表面近傍に発生している高揚されたエバネッント光の散乱を像として捕らえた.これは,走査型ニアフィルド顕微鏡の新しい増感方法として用いられることができる.また,この方法における散乱強度の計算も行い実験結果と比較した.(4)SNOMで直接測定を行うことができると期待される局所場因子の計算を様々な試料及び光学配置で計算をした.その結果,分子の相互配置が局在場因子に大きな影響を及ぼすことがわかった。
がん抑制遺伝子INPP4Bの抗がん機構の解明

ホスファチジルイノシトール-3,4,5,ー三リン酸(PIP(3,4,5)P3)は細胞増殖制御において中心的な役割を果たすリン脂質シグナル分子である。我々は、ホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸(PI(3,4)P2)の脱リン酸化酵素と考えられてきたがん抑制遺伝子産物INPP4Bが、PI(3,4,5)P3をも基質とすることを独自に見出し、報告した。本研究ではこのINPP4Bの脂質リン酸化活性によって担われる抗がん作用の機序を、培養細胞および病態モデルマウスを用いて明らかにすることを目的としている。特に、種々のがんで高頻度に欠失しているPI(3,4,5)P3脱リン酸化酵素PTENの機能をINPP4Bが代替しうる可能性に着目している。平成30年度には、非アルコール性依存性肝炎(NASH)モデルとして知られる肝特異的PTEN欠損マウスを用いたin vivoでの検証を行った。本モデルではPTEN欠損による前がん病変(脂肪肝・線維化)が顕著であり、PI(3,4,5)P3の過剰な蓄積によるAkt経路の活性が認められる。肝臓は外来遺伝子導入が容易な臓器であり、目的外来遺伝子をアデノウイルスベクター用いて尾静脈から投与することで、組織における効率的かつ持続的な発現を導くことが出来る(目的遺伝子の下流にIRESーEGFPを挿入しておくことで、外来遺伝子の発現を抗GFP抗体による免疫染色により確認できる)。本手法を用いて、アデノウイルスベクターに野生型および脱リン酸化活性を完全に消失させたC842S変異体のINPP4Bを組み込み、それぞれ4週齢の肝特異的PTEN欠損マウスに投与して、前がん病変の一つである10週齢時の脂肪肝への影響を検討した。しかしながら、野生型のINPP4B遺伝子発現によって統計的に有意な脂肪肝の抑制は認められなかった。研究計画に従って、まず、肝特異的PTEN遺伝子欠損マウスにおける前がん病変(脂肪肝)を指標とした検討を行った。肝特異的PTEN欠損マウスにアデノウイルスベクターを用いて、野生型もしくは活性消失型のINPP4Bを発現させたが、期待していたようなINPP4BによるPTENの機能代替を示すような結果は認められなかった。アデノウイルスベクターによる遺伝子導入効率が問題となった可能性が考えられる。研究計画時より懸念していた問題点であり、全ての細胞でINPP4Bを発現させるためのトランスジェニックマウスを作製するため、胚性幹細胞(ES細胞)の相同組換え法による組換え体のスクリーニングを実施している。研究計画に従って、組織特異的なINPP4B過剰発現トランスジェニックマウスを作製する。本トランスジェニックマウスと、各組織特異的なPTEN欠損マウスを交配することで、種々のがんにおいて、INPP4BがPTENの機能を代替しうる可能性を探る。加えて、細胞レベルでの解析によって、PTEN欠損をINPP4Bの過剰発現で代替出来るか検証する。

研究計画に従って、組織特異的なINPP4B過剰発現トランスジェニックマウスを作製する。本トランスジェニックマウスと、各組織特異的なPTEN欠損マウスを交配することで、種々のがんにおいて、INPP4BがPTENの機能を代替しうる可能性を探る。加えて、細胞レベルでの解析によって、PTEN欠損をINPP4Bの過剰発現で代替出来るか検証する。3月に購入依頼した試薬が輸入扱いとなり4月の納品予定となってしまったため。次年度の同試薬の購入に充てる計画である。
寝たきり予備群としての虚弱老人の肺炎を予防するための肩護介入

【目的】;老人保健施設入所者に監視下に呼吸訓練を行わせ、呼吸器感染による発熱が減るかを検討した。【対象者と介入方法】;入所者に、入所順に、改訂長谷川式簡易知能評価スケール(HDS-R)による知能評価を実施した。22点以上の者を対象者とし、封筒法により無作為に、呼吸訓練実施群(訓練群)と対照群に振り分けた。施設で実際に訓練を指揮する職員は看護婦(士)に限り、事前に教育をした。訓練群に該当した入所者は、教育を受けた看護婦の指揮の下で、(呼吸筋力増強プログラム+持久力増強プログラム+咳嗽・去痰訓練)を1セットにして、1回30分、週3日、12週間継続して行った。訓練効果の判定に使うデータとして、体温を毎日、最大呼気流量を訓練回毎、最大呼気および呼気圧を訓練開始時と、以後4週毎に記録した。これらの諸データと医師の診断を総合して訓練の効果を判定した。【結果】;訓練群(男5、女20名)、対照群(男6、女24名)の基本データの平均±SDは、それぞれ、年齢80.0±7.2、79.7±7.3歳、HDS-Rは26.5±2.5、25.7±2.4点、全期間を通しての体温は36.3±0.4、36.4±0.4°Cであった。呼吸機能は対照群の4名で研究開始時に測定できなかったので、データ数は訓練群N=25、対照群N=26であった。開始時、訓練群の最大呼気流量は対照群のそれよりも有意に大きかった(P<0.05)が、最大吸気圧、最大呼気圧は両群で有意差が見られなかった。全研究期間(84日)の2/3以上体温が測定されていた人だけを体温関連指標の分析対象者とした。各人の研究期間中の平均体温+2SD以上を発熱とし、(発熱した日数)/(全体温測定日数)の両群での差を検討した。その結果、発熱日数は両群間で差が見られなかった。分析に際して、明らかに発熱の原因が呼吸器以外にあると思われた場合は除外した。【結論】この訓練では、老人保健施設入所者の呼吸器感染によると思われる発熱回数を減少させることができなかった。一老人保健施設(以下施設と略記)の入所者を対象にして本研究を継続中である。昨年5月より9月まで、研究の意義と方法、研究に必要な知識を施設介護職員に教育した。同年10月より看護介入を開始した。【介入方法】;10月以降の入所者に長谷川式簡易知能評価スケールによる知能評価を実施し、22点以上の者を封筒法により、無作為に、呼吸訓練実施群(訓練群)と対照群に振り分けた。訓練群に該当した入所者は、看護婦の指導の下で、(呼吸筋力増強プログラム+持久力増強プログラム+咳嗽・去痰)訓練を1セットにして、1回30分、週3回、3ヶ月間行った。

訓練効果の判定に使う客観データとして、バイタルサインを毎日、ピークフロー(PEFR)を訓練回毎、最大吸気および最大呼気気道内圧を訓練開始時と3ヶ月後に記録した。これらの諸データと呼吸器感染症の発生頻度、発症した場合の重症度を合わせて訓練の効果を判定することとした。【結果】;1997年2月末時点で、訓練群22人、対照群20人の入所者を研究に組み入れた。訓練群の平均年齢±SDは80.3±6.1歳(男7人、女15人)、対照群のそれは78.8±7.7歳(男5人、女15人)であった。訓練群で発熱を呈して薬物療法を行った者は5人、対照群では14人であった。他の機能的データはバラツキが大きいため、本研究申請書に記載した目標数(各群40)に達した時点で詳細な分析を行う予定である。【問題点】;1年間の研究の結果下記の点に気づいた。発熱を判断する上で必須の"毎日の体温"が一定時刻に職員の監督の下に測定されるにも拘わらず、きわめて大きく変動し(朝9時の体温の平均±SDは36.3±0.4°C、変動係数は1.0%であった)、どの日から発熱したかの判断が困難であった。今後、どの時刻にどのような方法で体温を計るべきかの検討が必要である。昨年と同じ老人保健施設(従って協力する職員は方法につき習熟済)の入所者を対象に、同じ方法で本研究を実施した。昨年度に研究に組み入れられた入所者は今年度の対象から除外した。また、継続研究期間の最終年度にあたるため、前年度のデータを合わせ、総合的に解析した。【97年度の結果】;1997年度は訓練群11人、対照群12人の入所者を研究に組み入れた。訓練群の平均年齢±SDは79.5±8.2歳(男2人、女9人)、対照群のそれは81.2±6.8歳(男1人、女11人)であった。彼等の長谷川式簡易痴呆スケールは訓練群で25.9±2.8、対照群で25.8±2.7であった。【96、97年度総合結果】;訓練群(男5、女20名)、対照群(男6、女24名)の基本データの平均±SDは、それぞれ、年齢80.0±7.2歳、79.7±7.3歳、長谷川式簡易痴呆スケールは26.4±2.7点、25.7±2.4点であった。呼吸機能は対照群の4名で研究開始時に測定できなかったので、データ数は訓練群N=25、対照群N=26であった。開始時、訓練群のピークフロー値は対照群のそれより有意に大きかった(p<0.05)が、最大吸気圧、最大呼気圧は両群で有意差が見られなかった。各人の研究期間中の(平均体温+2SD)以上を異常体温とし、(異常体温を呈した日数)/(全体温測定日数)に両群での差の有無を検討した。全研究期間(84日)の2/3以上体温が測定されていた人だけを分析対象者とした。その結果、有熱日数は両群間で差が見られなかった。分析に際して、明らかに発熱の原因が呼吸器以外にあると思われた場合は除外した。【結論】この訓練では、老人保健施設入所者の呼吸器感染によると思われる発熱回数を減少させることができなかった。
放射線肺臓炎に対する幹細胞移植療法の開発

放射線肺臓炎は放射線治療を受けている患者にとって重要な合併症となっている。本研究において放射線肺臓炎に対する細胞移植治療の有効性を検討した。本研究では肺への分化能を有する間葉系幹細胞を用いて移植療法の有効性を検討した。その結果、幹細胞の肺への分化率は低かったが、放射線肺臓炎の急性炎症及び慢性炎症の抑制には一定の治療効果が得られた。放射線肺臓炎を制御することは、放射線治療を受けている患者にとって重要な問題である。本研究では、ラット放射線肺臓炎モデルを利用して、遺伝子を導入した肺の幹細胞シートの放射線照射肺への移植により、1)遺伝子を導入した幹細胞シートが、肺に接着し、肺の各種細胞に分化誘導され、2)放射線肺臓炎の発症を抑制し治療効果があることを明らかにすることを目的とする。方法と結果:骨髄幹細胞および脂肪由来間葉系幹細胞の分離同定(in vitro)1.骨髄幹細胞の分離同定骨髄幹細胞は、フィッシャーラットより採取した。ラットを全身麻酔下で大腿骨を切除し、骨髄液を採取した。採取した骨髄液はそれぞれ抗体ビーズ法及びFACS装置を用いてCD34陽性細胞あるいはCD34陰性細胞にそれぞれ分離し、培養した。培養時各細胞は、DiIを取り込ませておきマーカーとした。2.脂肪由来間葉系幹細胞の分離同定脂肪由来間葉系幹細胞は、フィッシャーラットから採取した。ラットを全身麻酔下で鼠径部を切開し、脂肪組織を採取した。採取した脂肪組織はコラーゲン処理を行った後、ストレーナーを用いて濾過し、濾過液を培養した。これまでの我々の研究で、3回継代培養した細胞がCD29、CD90陽性であり、CD34、CD45、αSMA陰性の多分化能を持つ間葉系幹細胞であることがわかっており、FACS装置を用いて間葉系幹細胞を分離した。分離した細胞は、骨髄幹細胞と同様にDiIを取り込ませておきマーカーとした。細胞シートの作製は、上述した方法で分離同定した骨髄幹細胞および間葉系幹細胞をトリプシン処理にて分離し、セルシード社の温度応答性培養皿を用い再培養することにより行った。また、細胞シートへの遺伝子導入も行った。放射線肺臓炎を制御することは、肺癌、乳癌や前立腺癌などの疾患により、放射線治療を受けている患者にとっては予後を左右する重要な問題であり、これまで、様々な治療法が検討されてきた。しかしながら、放射線肺臓炎の発症を予防、または完全に治療させることはなかなか困難であり、現在でも世界中で新たな治療法の模索が行われている。中でも、線維化を発症する中心的なサイトカインであるTGF-βの制御に関わる研究は直接的に線維化に関与するため、その治療効果が期待されたが、TGF-βを抑制しても、その作用が特異的ではなく、また、放射線照射によって障害を受けた肺組織が再生することはなく、治癒させることはできなかった。そのため、本研究では、放射線肺臓炎における肺組織の再生を目的とした研究を行った。ラット放射線肺臓炎モデルを利用して、肺の幹細胞移植により、1、遺伝子を導入した幹細胞が、肺に接着することを明らかにし、2、放射線肺臓炎の発症を抑制し治療効果があることを明らかにする。そのため、昨年度には脂肪由来間葉系幹細胞を分離培養し、本年度には、ラット放射線肺臓炎モデルを作成し、脂肪由来間葉系幹細胞の移植を行い、予定通りに、放射線肺臓炎における急性炎症に対する治療効果を検討した。その結果、炎症部位におけるタンパクの滲出やLDHの漏出など急性炎症を急性炎症を軽減する効果が、まだ十分なn数はそろっていないものの確認され、次年度以降の研究に期待できる結果が得られた。目的:放射線肺臓炎を制御することは、放射線治療を受けている患者にとって十分な放射線治療を受けることができるかどうかを決定する重要な問題となっている。そのため、多施設において新たな治療法の検討が行われたが、未だ満足する治療法は開発されていない。方法及び結果:本研究では、ラット放射線肺臓炎モデルを利用して、遺伝子を導入した肺の幹細胞シートの放射線照射肺への移植により、1)遺伝子を導入した幹細胞シートが、肺に接着し、肺の各種細胞に分化誘導され、2)放射線肺臓炎の発症を抑制し治療効果があることを明らかにすることである。そのため、本年度は昨年度作製法を確立した細胞シートを用いて、細胞シートを肺に直接、貼付することにより、治療効果が得られるかどうか、急性期肺障害や慢性期肺障害に対する治療効果の検討を行った。また、どの程度の期間、細胞シートが生着することが可能であったかなども併せて検討した。急性期肺障害に関しては、胸部CT検査所見上、通常認められる肺水腫が、また、気管支肺胞洗浄検査では、肺障害が発生することにより生じる炎症細胞数の増加などが今回の治療により改善することが明らかとなり、また、組織学的にも有意に治療効果が認められることが明らかとなった。慢性肺障害に関しては、現時点で全ての解析が終わっていないが、組織学的にも胸部CT検査所見的にも治療効果を認めているようである。上記のようにほぼ予定した通りに研究を行った。
電子レンジ・携帯電話にみる電磁波体験型科学創造性育成法の開発

平成18年度では、携帯電話を使った通信実験の指導方法や教材開発を行った。平成17年度と同様に、県内の小学校6年生に対して、携帯電話に関する事前調査を行った。その結果を踏まえて、携帯電話を「電気を通すもの」、「通さないもの」で包むと、通話できるかどうかの実験を行った。(a)「土鍋、金属の鍋のどちらが電話は通じるでしょうか。」の問いに対して、約80%が「金属鍋だけが通じる」と答えた。実験で通じたのは、「土鍋」だけであったので、生徒のほとんどの予想を覆す結果となった。その結果を踏まえて、生徒が考えた「土鍋だけ通じる理由」として、「金属が電波を通さなかったから。」、「金属は電波を反射して通じなかった。土鍋は電波を反射するものがなかった。」などの回答であった。(b)「携帯電話は、「紙のお皿と紙のお椀」、「アルミホイルをはった紙のお皿とお椀」、「アルミホイルをはった紙のお皿と金網ザル」の組み合わせで通じるものはどれか」の質問に対して、生徒の予想は、それぞれとも3分の1ずつ意見が分かれた。実験では「紙のお皿と紙のお椀」であった。その理由として、「紙はうすいから。」、「アルミは電波をはねかいすから。」などの回答が生徒から得られた(c)「水の中、食塩水の中では通じるでしょうか?」の問いに対して、生徒の予想では、70%が「水は通じる」と回答した。実験結果では「水だけ」であった。生徒が考えたその理由として、「食塩水は、食塩が電波を邪魔する。」、「水が電気を通すから。」、「食塩水は電気を通すから。」の意見があった。この実験の感想として、「電話が通じるのは電気を通さないものであることがわかった。」「今日の実験は、授業とは思えないくらいワクワクしました。」、「思っていることが反対だったのがビックリしました。」などが寄せられた。よって、本教材を通じて、小学生高学年に対して電磁波に関する興味を持たせることができた。近年,将来の科学技術を担う児童生徒に科学技術や理科に対する興味・関心を培い,知的好奇心を高め,論理的思考力や創造性を伸ばす教育指導法や教材の開発が求められている。一方,衛星放送,携帯電話など電磁波を使った通信技術は,我々の環境に必要不可欠な技術になっている。その中で,電子レンジ・携帯電話などは身近な電磁波を使った電子機器である。電子レンジ内では,マイクロ波の電磁波が発生している。誰しも電子レンジは,「なぜ,短時間で食品を温めることができるか」という疑問を持つ。しかしながら,電磁波は目に見えないので,その理由を簡単に理解することは難しい。これまで,電子レンジを用いた教材はいくつか開発されている。しかしながら,その疑問に答える教材は開発されていない。本研究では,実際に小学校教諭,児童との密接な連携を図ることで,身近な道具(インク,ビーカー,金網など)を使って,電子レンジ加熱の仕組みを考える教材開発を行った。具体的には、(1)体験前の児童生徒による電子レンジ認識調査、(2)電子レンジの教材開発、(3)出前授業での教材を用いた児童生徒の体験学習を実施した。電子レンジの認識調査結果では、電子レンジ内での加熱は光や熱対流によると考える生徒がほとんどであることが分かった。この調査結果を基に、非光加熱実証実験と非対流加熱実証実験に関する2つの教材を開発した。この2つの電子レンジ教材を通して、体験後の生徒のアンケート結果から、この教材を通して,体験前と後で,児童生徒の電子レンジに対する認識が大きく変わった。」の意見があった。」

「今日の実験は、授業とは思えないくらいワクワクしました。」、「思っていることが反対だったのがビックリしました。」などが寄せられた。よって、本教材を通じて、小学生高学年に対して電磁波に関する興味を持たせることができた。
蛍光偏光を用いた感染性を有する水系感染症ウイルスの迅速且つ簡便な新規定量法の開発

本研究では,従来から医学・薬学の分野においてタンパク質間相互作用の評価等に広く用いられている蛍光偏光の原理を応用し,感染性を有する水系感染症ウイルスを迅速且つ簡便に高感度で定量可能な新たなウイルス定量法を開発することを試みた.結果として,蛍光偏光法に使用するマイクロプレートの種類,抗体の種類,抗体濃度,反応時間といった条件の最適化を図ることにより,ノロウイルス粒子を30分以内に簡便に検出することに成功した.病原性ウイルスによる水系感染症の制御には,水中の感染性を有するウイルスの存在を迅速に捉え,感染症拡大前に事前策を講じることが重要である.しかしながら,既存のウイルスの感染力価を評価する手法は,熟練された技術が必要であり,定量に数日間かかるといった問題がある.また,ノロウイルスに代表される培養不可能なウイルスに関しては,人体実験以外に感染力価を評価する手法が確立されていないのが現状である.そこで,本研究では,従来から医学・薬学の分野においてタンパク質間相互作用の評価等に広く用いられている蛍光偏光の原理を応用し,感染性を有する水系感染症ウイルスを迅速且つ簡便に高感度で定量可能な新たなウイルス定量法を開発することを目的とした.本年度は,蛍光偏光法によるノロウイルスのカプシドタンパク質検出の高感度化を図るため,FITC標識化IgG抗体に加え,IgM抗体をビオチン標識したビオチン化IgM抗体,ビオチンとの高い結合力を有するストレプトアビジンを金コロイドに結合させたストレプトアビジン結合金コロイド,更には,ビオチンに対する抗体を結合させた抗ビオチン3DNAを検出・定量に用いることにより,ノロウイルス粒子の見かけ分子量を大きくすることを試みた.その結果,FITC標識化IgG抗体のみをノロウイルス粒子検出に用いた場合に比べ,FITC標識化IgG抗体-ノロウイルス粒子-金コロイド結合IgM抗体の複合体を形成させることにより,幾分検出感度が向上した.また,FITC標識化IgG抗体-ノロウイルス粒子-3DNA結合IgM抗体の複合体を形成させた場合においても同様の傾向が見られた.しかしながら,検出感度の飛躍的な向上は見られなかったことから,FITC標識化IgG抗体のみを蛍光偏光法に用いた場合が最も迅速且つ簡便にノロウイルス粒子を検出できることが明らかとなった.本研究では,従来から医学・薬学の分野においてタンパク質間相互作用の評価等に広く用いられている蛍光偏光の原理を応用し,感染性を有する水系感染症ウイルスを迅速且つ簡便に高感度で定量可能な新たなウイルス定量法を開発することを試みた.結果として,蛍光偏光法に使用するマイクロプレートの種類,抗体の種類,抗体濃度,反応時間といった条件の最適化を図ることにより,ノロウイルス粒子を30分以内に簡便に検出することに成功した.病原性ウイルスによる水系感染症の制御には,水中の感染性を有するウイルスの存在を迅速に捉え,感染症拡大前に事前策を講じることが重要である.しかしながら,既存のウイルスの感染力価を評価する手法は,熟練された技術が必要であり,定量に数日間かかるといった問題がある.また,ノロウイルスに代表される培養不可能なウイルスに関しては,人体実験以外に感染力価を評価する手法が確立されていないのが現状である.そこで,本研究では,従来から医学・薬学の分野においてタンパク質間相互作用の評価等に広く用いられている蛍光偏光の原理を応用し,感染性を有する水系感染症ウイルスを迅速且つ簡便に高感度で定量可能な新たなウイルス定量法を開発することを目的とした.本年度は,ノロウイルスを研究対象とし,ノロウイルスのカプシドタンパク質との反応特異性が最も高いIgG抗体及びIgM抗体を選定した.選定したIgG抗体には,蛍光色素であるFITCを標識化し,FITC標識化IgG抗体を作製した.作製した抗体を蛍光偏光法に用い,使用するマイクロプレートの種類,抗体濃度,反応時間,反応温度といった測定条件の最適化を図った結果,ノロウイルス粒子を30分以内に検出することに成功した.また,従来から広く用いられているELISA法と同等以上の検出感度が得られた.加えて,FITC標識化IgG抗体-ノロウイルス粒子-金コロイド標識化IgM抗体の複合体の形成による検出感度の更なる向上を図るため,選定したIgM抗体をビオチン標識したビオチン化IgM抗体,ビオチンとの高い結合力を有するストレプトアビジンを金コロイドに結合させたストレプトアビジン結合金コロイドを作製した.本年度は,ノロウイルスを研究対象に,使用抗体の選定・蛍光標識化,測定条件の最適化に加え,検出感度の高感度に向けた準備にも取り掛かることができたことから,研究計画は順調に進展している.特に,ノロウイルス粒子を30分以内に検出することに成功し,また,従来から広く用いられているELISA法と同等以上の検出感度が得られたことは特筆すべき成果と考えられる.来年度は,当初の計画通り,検出感度の高度化及び多項目同時検出/定量化,環境水及び浄水処理水への適用性の評価を実施する.また,ノロウイルスに加えて,培養可能なポリオウイルスを研究対象とする.該当なし.
がん幹細胞を標的としたがん治療を実現するための新しいｍｉＲＮＡデリバリー法の開発

microRNA(miRNA)はがんの発生や抑制に関与しており、血中ではエキソソームによって運ばれている。また、がん幹細胞は現在の治療法では残存し再発や転移を起こす可能性がある。我々はがん幹細胞に結合する分子をエキソソーム膜上に発現させ、がん幹細胞の増殖を抑制するmiRNAをエキソソーム中に取り込ませて血中に投与することで、がん幹細胞を標的とした治療法を確立できると考えた。乳がん細胞のEGFRに結合するペプチド(GE11)を発現させたエキソソームにlet-7aを内包させ(let-7a/GE11エキソソーム)、担がんマウスに尾静脈接種すると効率よくがん細胞へ到達し増殖抑制効果を示した。応募者らはがん幹細胞の増殖を抑制するmiRNAをエキソソーム中に取り込ませ、血中に投与することによってがんの治療ができると考えた。さらにがん幹細胞に結合する分子をエキソソーム膜上に発現させることにより、miRNAががん幹細胞内へ高率に侵入可能となると考えた。本研究ではエキソソームによるmiRNAの新しいデリバリー法を確立し、がん幹細胞を標的とした治療への応用を目指している。これまでに乳がん細胞膜に存在するEGFRに対するリガンド(EGFR結合ペプチド:GE11)をエキソソーム膜上に発現させることことができた。このGE11ペプチドはEGFRに結合するが、下流のシグナルを活性化させないことが報告されている。GE11発現エキソソームは、より効率よく乳がん細胞(HCC-70)に接着し、取り込まれることをin vitroで確認した。今年度はin vivoにおいて蛍光標識したGE11発現エキソソームが、コントロールエキソソームに比べてより効率よく乳がん細胞(HCC-70)に接着し、取り込まれることを確認した。さらには乳がん幹細胞の維持に関与していることが報告されているlet-7aを内包したGE11発現エキソソームを作製することができた。マウスにヒト乳がん細胞(HCC-70)を移植し、作製したエキソソーム(let-7a/GE11/HEK293エキソソーム)を尾静脈より投与すると、がん細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。以上の結果より、がん幹細胞の維持に関与しているmiRNAをエキソソームに内包し、血中に投与することによってがんの治療への応用が可能であると考える。これまでに乳がん細胞膜に存在するEGFRに対するリガンド(EGFR結合ペプチド:GE11)をHEK293細胞に発現させ(GE11/HEK293細胞)、GE11/HEK293細胞の培養上清よりエキソソームを超遠心法によって精製したところ、GE11をエキソソーム膜上に発現させることことができた。GE11発現エキソソームは、より効率よく乳がん細胞(HCC-70)に接着し、取り込まれることを確認した。さらには乳がん幹細胞の維持に関与していることが報告されているlet-7aをGE11/HEK293細胞に導入することにより、let-7aを内包したGE11発現エクソソームを作製することができた(let-7a/GE11/HEK293)。マウスにヒト乳がん細胞(HCC-70)を移植し、作製したエキソソーム(let-7a/GE11/HEK293)を尾静脈より投与すると、がん細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

さらにがん幹細胞に結合する分子をエキソソーム膜上に発現させることにより、miRNAががん幹細胞内へ高率に侵入可能となると考えた。本研究ではエキソソームによるmiRNAの新しいデリバリー法を確立し、がん幹細胞を標的とした治療への応用を目指している。今年度は乳がん細胞株に結合可能な分子をエキソソーム膜上に発現させることによって、がん細胞内へのmiRNAの導入効率が高まるかどうかの検討を行った。乳がん細胞膜に存在するEGFRに対するリガンド(EGFR結合ペプチド:GE11)をHEK293細胞に発現させ(GE11/HEK293細胞)、培養上清よりエキソソームを超遠心法によって精製したところ、GE11をエキソソーム膜上に発現させることことができた。このGE11ペプチドはEGFRに結合するが、下流のシグナルを活性化させないことが報告されている。GE11発現エキソソームは、より効率よく乳がん細胞(HCC-70)に接着し、取り込まれることを確認した。さらには乳がん幹細胞の維持に関与していることが報告されているlet-7aをGE11/HEK293細胞に導入することにより、let-7aを内包したGE11発現エクソソームを作製することができた(let-7a/GE11/HEK293)。マウスにヒト乳がん細胞(HCC-70)を移植し、作製したエキソソーム(let-7a/GE11/HEK293)を尾静脈より投与すると、がん細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。当初の予定ではがん細胞移植モデルにおけるがんの増殖抑制効果については平成25年度に行う予定であったが、1)エクソソームにがん細胞特異的なリガンドを発現させることができたこと、2)さらにはがん幹細胞の維持に関わっているlet-7aをエクソソームに内包することができたこと、3)このエクソソームは血中投与でも効果的にがんへmiRNAを到達させることができ、かつがん細胞増殖抑制効果を得ることができたため、予定を前倒しして論文を発表した。23年度はEGFまたはGE11発現を発現するHEK293細胞の作製とこれらの細胞の培養上清から精製したエキソソームの膜上へのEGFまたはGE11の発現確認までを行う予定であったが、膜上へEGFまたはGE11を高発現したエキソソームの作製に成功したと同時に、エキソソーム内にlet-7aを内包させることができた。さらにはlet-7aを内包したGE11発現エキソソーム(let-7a/GE11/HEK293)が、in vivoにおいてがん増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。in vivoでのがん増殖抑制効果の検討は25年度に予定していたが、当初の計画以上に研究が進展しており、今年度行うことができた。実際に臨床応用する際には、免疫反応が問題となる可能性がある。エキソソームは細胞膜成分などの蛋白質から構成されているため拒絶反応が起こる可能性があるが、これは患者自身の細胞よりiPS細胞を作製しエキソソームを精製することによって解決できると考えている。さらに将来的には、これまでのホルモン療法や化学療法で効果が得られなかったタイプのがんについても、がん幹細胞上のレセプターに結合できる分子をエキソソーム上に発現させた患者由来iPS細胞を作製し、精製したエキソソームを投与することによって治療効果が得られることが期待できる。本研究成果は個々のがん細胞のタイプに対応するオーダーメイド医療への発展性をも想定できるものである。
水銀同位体分析法を用いた大気中水銀の沈着メカニズム調査

水銀は化学形態を変化しながら全球的に汚染域を拡大する。水銀の放出から沈着に至る挙動の解明は、今後拡大するかもしれない水銀汚染を防ぐ上で極めて重要である。これまで大気中水銀の動態を理解するために、モデル研究や室内実験、さらには環境の異なる様々な地点で観測が実施されてきたが、化学種の形態変化を生じる反応プロセスについて不明な点が多い。本課題では、大気中水銀の動態理解に向けた「天然の実験室」であるマウナ・ロア観測所でサンプリングを実施し、精密水銀同位体分析を行う。水銀は光化学反応によって特異的に同位体分別を生じる。これを指標として考察することで、大気中水銀の化学的挙動について新たな知見を得る。
脳梗塞後の嗅球における内因性神経幹細胞による構造修復に関する研究

中枢神経系においては、幼少期のみでなく、成人(獣)においても神経幹細胞が存在する。本研究ではこの神経幹細胞から常に新生細胞が供給される嗅覚系において、器質的障害時に神経幹細胞がどのような動態を示すのかを明らかにした。結果、Adultラットでは一度嗅球全体に障害が及と神経幹細胞があっても機能が回復しないことが明らかとなった。一方、幼少期ラットの場合は嗅球全体が除去されても供給された神経幹細胞が断端付近で嗅球の糸球体様構造を新たに構築し、嗅覚機能が再生することが明らかとなった中枢神経系においては、幼少期のみでなく、成人(獣)においても神経幹細胞が存在する。一方、幼少期ラットの場合は嗅球全体が除去されても供給された神経幹細胞が断端付近で嗅球の糸球体様構造を新たに構築し、嗅覚機能が再生することが明らかとなった中枢神経系において,発生段階や幼少期のみでなく,成人(獣)においても神経幹細胞が存在することが近年発見され,海馬および側脳室周囲に多く存在することが明らかになっている。また,げっ歯類では側脳室周囲からは嗅球に向ってRostral Migratory Stream:RMSと呼ばれる神経幹細胞の移動が起こっていることも明らかになっている。(1)嗅球の微小梗塞モデルの作成と検討:大脳とは異なり,嗅球では常に神経幹細胞の移動が起こっているため,嗅球における脳血管障害と神経幹細胞による修復に関する検討を行うため嗅球の微小梗塞モデルを,レーザー光を用いて開発した。同モデルでAdultラットの嗅球に対し微小梗塞を作成し,BrdUを投与し種々の生存期間の後,脳の切片を作成した。現在,BrdUと組み合わせて,神経細胞マーカーや炎症細胞マーカーを用いて免疫組織化学法を用いた二重染色を行い形態学的変化を解析中である。(2)他の嗅球障害との比較検討:神経幹細胞の移動と脳障害の回復に関する関係を解析するため,神経幹細胞の移動経路であるRMSの近傍(外側嗅索)をさまざまな程度に傷害したモデルを,Adultと新生児期で作成した。その後BrdUを投与し,脳切片を作成し,現在神経細胞マーカーを用いて免疫組織化学法を用いた二重染色を行い,神経幹細胞の動態を形態学的に解析中である。これらを用いて,嗅球における脳血管障害時に常に移動してきている神経幹細胞がどの様な働きをするのか,細胞の働きを担宗している因子は何であろのかを,Adultステージと新生児期の相違も含めて明らがにしたい。中枢神経系においては、発生段階や幼少期のみでなく、成人(獣)においても神経幹細胞が存在し、海馬および側脳室周囲に多く存在することが近年明らかになっている。また、げっ歯類では側脳室周囲からは嗅球に向ってRostral Migratory Stream : RMSと呼ばれる神経幹細胞の移動が存在し、これが生涯を通じて嗅球の神経回路の構築に携わっていることが知られている。本研究ではこの神経幹細胞から常に神経が供給される嗅覚系の特徴を利用し、梗塞等の器質的障害時に神経幹細胞がどのような動態を示すのかを明らかにしようとしたものである。(1) Adultラットでは一度嗅球全体に障害が及び神経回路が障害を受けるとRMSを通じて供給された神経幹細胞があっても機能が回復しないことが明らかとなった。一方、嗅球の微小梗塞モデルでRMSにまで障害が及ばない嗅球一部障害の際には嗅球の他の部位に大きな変化が認められなかった(2)幼少期ラットでは嗅球に対して一定の梗塞を構成することが難しく、嗅球除去後の神経幹細胞の動態を観察したが、幼少期の場合は嗅球全体が除去されてもRMSから供給された神経幹細胞が断端付近で嗅球の糸球体様構造を新たに構築し、嗅覚機能が再生することが明らかとなった。また嗅球除去の際、RMSにまで障害が及ばない不完全除去の場合には、正常と同様の嗅球内構造を示すものがあった。これらのことより、嗅球の微小な部分的障害では嗅球内の構造に大きな変化は認められないが、嗅球全体に障害が及ぶ場合には新生児期のラットでは嗅覚機能が再生する可能性があることが明らかとなった。
霊長類頭頂弁蓋部・後部島皮質における自己意識の表象

今年度は昨年度の電気生理学実験-1を引き続き進めるとともに、視覚刺激を種々の複雑な条件下で実施する電気生理学実験-2の準備を進めることを目的とした。また、皮質間連絡を明らかにするトレーサー実験を継続して行った。昨年度自己鏡映認知訓練を行なったサルに対して、引き続き電気生理学実験-1を実施した。その結果、新たに自己と他者の区別に関係する可能性のあるニューロン活動を記録した。具体的には、たとえば、サルの右前腕に触覚受容野を持つニューロンで、サルが自分の手で受容野に触ったときの活動が、実験者が触ったときより、有意に大きいもしくはその逆、というように、自己と他者で違った応答を示すニューロンである。昨年度の結果と合わせると、ニホンサルは訓練により自己鏡像認知が可能であること、頭頂弁蓋部第二体性感覚野には、視覚応答を示すbimodalニューロンが存在すること、これらの中には、自己身体周辺に視覚受容野を持つニューロン、自己と他者による自己身体への刺激に対し異なる応答を示すニューロンが存在すること、などが明らかになった。さらに、これらの自己身体意識に関係する可能性の神経応答をより詳細に検討するため、鏡像ではなく、モニター上にサルの自己像を映すことでより複雑な刺激を可能とする電気生理学実験-2のために必要な装置の準備を進め、ほぼ目途を立てることができたので、次年度には実験が開始できると思われる。トレーサー実験に関しては、第二体性感覚野の皮質間結合を2頭で行った。その結果、運動前野、頭頂連合野との連絡があることがわかった。今後、解析をさらに進め、詳細な検討をする必要がある。申請書に記載した実験計画をおおよそ遂行することが出来た。計画は、1)電気生理学実験-1の継続、鏡映を用いたbimodalニューロンの記録とその性質の解析、2)電気生理学実験-2の準備、モニターを用いた自己鏡像への視覚刺激を可能とする装置の開発、3)皮質間連絡を調べるトレーサー実験の継続、を主な内容とするが、「研究実績の概要」で記述したように、おおよそ目標を達成することができた。2)の電気生理学実験-2の準備は、当ラボの移設に伴う機器類の移動作業や新しい実験室立ち上げに必要な工事等があり、やや遅れたが、次年度に実験を開始する目途を立てることができた。トレーサー実験の目的は、自己身体認知に関わるニューロンが記録される部位に特徴的な皮質間連絡を明らかにすることにある。今年度までの実験では、記録部位を明らかにすることを優先させたため電気生理学実験に用いた個体を対象にしていない。次年度以降では、自己身体意識に関わるニューロン活動が記録された領域を対象にしたトレーサー実験を実施する必要がある。以上のように、本年度の実験の進行はほぼ計画に沿って進行しており、「順調に進展している」と評価した。次年度以降に関しては、準備を進めた電気生理学実験-2の装置を完成させ、実験を開始すること、これに並行して皮質間神経連絡を調べるトレーサー実験をさらに行うことを目標とする。これまで実施した電気生理学実験-1では、自己鏡映像を介した身体周辺の視覚刺激への応答を示す神経活動、自己身体と他者の刺激で異なる応答をする神経活動を記録することが出来た。今後は次の2点に注目して、電気生理学実験-2を進める。第一は、モニター上に自己像を映し、自己身体周辺に対する視覚刺激と触覚刺激のタイミングをずらすことで自己鏡像認知の成立を人為的に制御し、神経活動に対する影響を調べる。第二は、自己身体の大部分を占めるような大きな受容野を持つニューロンを対象に、身体部位によらず自己身体意識に関わる神経活動を示すニューロンの探索である。我々はすでに第二体性感覚野には全身を覆う大きな触覚受容野を持つニューロンがあることを報告した。このようなニューロンが自己身体意識に関わる神経活動を示すことが明らかになれば、身体部位によらない応答すなわち、「概念的自己意識」に関わる神経活動と考えることが可能になる。これらの特徴を持つニューロンの記録部位に特徴的な皮質間神経連絡を調べる神経解剖学実験を並行して行う。初年度は1頭のニホンザルに鏡映認知訓練を施し、自己鏡映像を介した視覚的応答と体性感覚的応答の両方を示すbimodalニューロンを頭頂弁蓋部で記録し、その性質を調べる事を主な目的とした。頭部に神経活動記録用チェンバー設置手術を施したサルに対して自己鏡映認知訓練を行なった。術後回復期に術部を盛んに手で触れる行動が見られた。飼育ケージ内に金属製鏡を設置したところ、数日後には、鏡を見ながら、頭部の記録チェンバーを触る行動が見られるようになった。また、全身が映る鏡の前に置いたチェアーにサルを座らせ、自己身体に対する接触を体性感覚と鏡像を介した視覚の両方で検出可能にする条件を創出した。この状態で、実験者がサルの種々の身体部位に接触刺激を加える訓練を行ったところ、約4週間後に、サルは身体に照射された赤色LEDを自己鏡映像を見ながら手で追いかける行為を示す様になると同時に、鏡映像を注視しながら、自己の口唇や胸部のグルーミングを自発的に行うようになったことから、自己鏡映認知が成立したと判断した。このサルの頭頂弁蓋部より無麻酔下で単一神経活動を記録し、身体刺激に対して視覚的体性感覚的に応答するbimodalニューロンの性質を調べた。記録されたbimodalニューロンのうち、最も多く観察されたのは身体周辺の動き刺激に対する視覚応答をしめすものであった。

これらの中には、頭部など鏡を介して初めて確認できる身体部位に受容野を持つニューロンがあった。また、自身の背後の動きに特異的に応答するニューロンなども見つかった。これらの視覚応答は自己鏡映像を介したものであるから、自己鏡映認知に関わる神経活動と推測できる。これらについては、学会発表を行った。上記サルとは別の1頭に対して、皮質間神経連絡を調べる目的で第二体性感覚野の違う場所に2種類の逆行性トレーサーを注入した。この結果に関しては現在解析中である。申請書に記載した初年度実験計画をほぼ遂行することが出来た。初年度の計画は、以下の3つに内容からなっている。1)自己鏡映像認知の訓練、2)電気生理学実験-1鏡映を用いたbimodalニューロンの記録とその性質の解析、3)皮質間神経連絡の解明。1)、2)は1頭を対象にほぼ計画通りに進行した。自己鏡映像訓練では、頭部記録チェンバー設置手術の術後個体を対象にしたことが効果的であったことから、サルが自己身体へ自発的に注意を向けることの重要性を確認することが出来た。また、鏡を介した自己身体へのグルーミングが頻繁に見られたことは、大変興味深いことであった。また、電気生理学実験の対象とした領域は第二体性感覚野を中心とした頭頂弁蓋部である。我々は従来視覚応答がない領域と考えられていた第二体性感覚野から視覚応答をするニューロンがあることをすでに報告している。今回、両半球の第二体性感覚野を含む領域から多くのbimodalニューロンが記録されたことから、改めて第二体性感覚野が多感覚領域であることが確認された。更に、鏡映像でしか確認できない身体部位周辺や自身の背後などへの視覚刺激への応答は、「自己意識」に関わる神経活動である可能性が高く、この領域が「自己意識」の成立に関わる領域である事を示唆していると考えることが出来る。神経解剖学実験の目的は、自己身体認知に関わるニューロンが記録される部位に特徴的な皮質間連絡を明らかにすることにある。今回電気生理学実験に供した個体については、記録部位を明らかにすることを優先させたため、トレーサー注入は行わなかった。皮質間連絡を調べる実験は、次年度以降の電気生理学実験と並行して進めていかなくてはならない。以上のように、本年度の実験の進行はほぼ計画に沿って進行しており、「順調に進展している」と評価した。今年度は昨年度の電気生理学実験-1を引き続き進めるとともに、視覚刺激を種々の複雑な条件下で実施する電気生理学実験-2の準備を進めることを目的とした。また、皮質間連絡を明らかにするトレーサー実験を継続して行った。昨年度自己鏡映認知訓練を行なったサルに対して、引き続き電気生理学実験-1を実施した。その結果、新たに自己と他者の区別に関係する可能性のあるニューロン活動を記録した。具体的には、たとえば、サルの右前腕に触覚受容野を持つニューロンで、サルが自分の手で受容野に触ったときの活動が、実験者が触ったときより、有意に大きいもしくはその逆、というように、自己と他者で違った応答を示すニューロンである。
精神的ストレスによる腸内細菌叢の変動はうつ様症状の原因となるか？

我々はこれまでに社会的敗北ストレスマウスにおいて、腸内の胆汁酸濃度が増加すること、および腸内細菌叢が変動することを見出している。本研究では、これら腸内の変動がマウスのうつ様行動に影響を及ぼすかどうか検討した。胆汁酸吸着レジンの投与および胆汁酸の投与試験の結果から、予想外に胆汁酸が社会性行動を向上させる可能性があることを見出した。また、社会的敗北ストレスマウスの糞便を移植した実験から、マウスの腸内細菌叢が社会性行動に影響していることを示唆する結果を得た。以上、本研究により、社会的敗北ストレスマウスにおいて胆汁酸および腸内細菌叢が社会性行動に影響を与えていることが示唆された。脳と腸は神経系や液性因子を介して機能的に相互に影響を及ぼすことが知られており、この相互作用は脳腸相関と呼ばれる。我々はこれまでに社会性の低下を示す社会的敗北ストレスモデルマウスにおいて、社会的敗北ストレスの負荷により盲腸内の胆汁酸濃度が上昇することを報告している。本申請課題では、腸内での胆汁酸の増加がうつ様行動の誘導に寄与しているという仮説をたて、胆汁酸吸着レジンであるコレスチラミンの投与がマウスの行動に与える影響を調べた。C57BL/6Jマウス(雄性7週齢)にコレスチラミンを含むAIN-93G固形飼料を自由摂取させた。その後、オープンフィールドテストおよび高架式十字迷路により不安行動を評価し、social interaction testにより社会性を評価した。さらに、強制水泳テストおよびtail suspension testにより、うつ様行動を評価した。コレスチラミンの投与は、マウスの不安行動に影響を与えなかったが、社会性を低下させる傾向を認めた。我々は、胆汁酸の主要成分であるコール酸の投与がマウス社会性行動を向上させることを明らかにしていることから、胆汁酸が脳腸相関を形成する一つの有力な因子である可能性が示唆された。当初は、腸内細菌の移植実験を行う予定だったが、アイソレーターが購入できなかったため、次年度に予定していたコレスチラミンの投与試験を先に実施した。脳と腸は神経系や液性因子を介して機能的に相互に影響を及ぼすことが知られている。これまでに社会性の低下を示す社会的敗北ストレスモデルマウスにおいて、盲腸内の胆汁酸濃度が上昇することを報告している。昨年度、胆汁酸吸着レジンであるコレスチラミンの投与により社会性行動が影響を受ける傾向を示すことを報告した。本年度は、胆汁酸の経口投与および腹腔投与が、記憶と情動に関係する海馬や自律神経機能を調節している視床下部における遺伝子発現に与える影響を解析した。C57BL/6Jマウス(雄8週齢)に0.1%のコール酸を含むAIN93G飼料を10日間自由摂取させた。マウスの脳から海馬および視床下部を摘出し、セロトニン受容体、神経栄養因子(BDNF、GDNF、FGF2、NGF)、消化管ホルモン(CCK)、胆汁酸受容体(TGR5、FXR、VDR)のmRNA発現量をリアルタイムRT-PCRで解析した。その結果、視床下部において2回の試験でそれぞれBDNFもしくはGDNFの発現量の増加が観察されたが、海馬においては有意な差は認められなかった。次に胆汁酸の腹腔投与効果を検討した。C57BL/6Jマウス(雄8週齢)にケノデオキシコール酸(CDCA)溶液とリトコール酸(LCA)溶液をそれぞれ100マイクロリットルずつ腹腔投与し、マウスの脳から海馬および視床下部を摘出し神経栄養因子のmRNA発現をリアルタイムPCRにより解析した。その結果、LCAの投与は視床下部のBDNFの発現量を有意に増加させ、CDCAの投与も、視床下部におけるBDNFおよびGDNFを有意に増加させた。一方で、これらの投与は海馬の遺伝子発現においては有意な影響を与えなかった。これらの結果から、胆汁酸は生体内への直接の投与により、視床下部のBDNFを上昇させることが示された。出産に伴う病気休暇、産後休暇、育児休業取得のため、研究の進行に若干遅れが生じている。我々はこれまでにうつ様行動を示す社会的敗北ストレスマウスにおいて、腸内細菌が変動すること、また、盲腸内において胆汁酸が増加することを明らかにしている。本研究は、社会的敗北ストレスマウスの腸内におけるこれらの変化が行動に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、社会的敗北ストレスにより変動する腸内細菌がマウスの行動に及ぼす影響を調べるため、糞便移植試験を行った。C57BL/6JマウスをICRマウスの居住スペースにいれることで10分間攻撃を受けさせた後、同じケージで、ICRマウスとしきりを挟んで隣り合わせて飼育した。これを10日間繰り返し、C57BL/6Jマウスに社会的敗北ストレスを負荷した。高架式十字迷路と社交性テストを実施し、社交性テストにおいて社会性行動が低下した個体をsusceptible、社会性行動が低下しなかった個体をresilienceとし、2群に別けた。社会的敗北ストレスを負荷しなかった対照マウスを含め3群のマウスから糞便を採取し、10%グリセロールに懸濁後、ー80°Cで保存した。移植先のマウスを準備するため、C57BL/6Jマウスに抗生物質水溶液を20日間自由飲水させ、腸内細菌を殺菌した。