hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳児期の睡眠習慣と睡眠パターンが小児の認知行動面に与える影響

小児において、睡眠は脳の発達に重要な生理機構である。縦断的調査によると、3歳までに短時間睡眠だった小児では、後年の認知行動面の問題のリスクが高まるとされている(Touchette E, et al., 2007)。しかし、乳児期のどのような睡眠の問題が後年の発達に影響を及ぼすかについては明らかとなっていない。海外では乳幼児期の睡眠習慣を評価する養育者自記式の質問紙としてBrief infant sleep questionnaire(BISQ)(Sadeh A, 2004)があるが、BISQには睡眠習慣や睡眠パターンに影響する睡眠環境や、入眠の困難さや睡眠の質に影響するレストレスレッグズ症候群やアトピー性皮膚炎等の疾患の有無等を評価する項目がない。そのため、日本人乳幼児の睡眠を総合的にスクリーニングするツールの開発が必要である。そこで本研究では、日本人の乳児期の睡眠の問題をスクリーニングする質問票を開発し、その標準化を行う。現在、日本人乳幼児の睡眠の問題を総合的にスクリーニングするツールの開発のために、大阪大学医学部附属病院小児科発達障害外来を受診され、睡眠障害と診断された7歳未満の神経発達症児のカルテから睡眠の問題をピックアップしている。加えて、乳幼児期の睡眠習慣を評価する養育者自記式の質問紙であるBISQを基に、日本の添い寝文化等の睡眠習慣、住環境を反映したインタビューガイドに沿って、3歳までに、睡眠で養育困難を引き起こしていたケースなど、その時期の問題の内容や月齢による変化等を詳しく聞き取り調査をし、睡眠の問題を拾い上げている。本学の倫理委員会の承認が遅くなったことに加え、対象年齢の小児の受診者数が、当初想定していたよりも少なく、また診察終了後のインタビューのため、対象児の負担を考慮してインタビューを延期する事があるため。カルテ情報、およびインタビューデータを基に、睡眠の問題のリスト「乳児期の睡眠の問題リスト」を作成し、そのリストを基に「乳児版睡眠質問票」を作成する。続いて、「乳児版睡眠質問票」の標準化を行う。臨床群として、大阪大学医学部附属病院小児科で睡眠障害と診断された3歳未満の児200名の養育者に「乳児版睡眠質問票」の記入を依頼する。加えて、発達に関する調査と行動に関する調査を行う。コミュニティー群として、1歳6か月児乳幼児健康診査受診児、もしくは保育所、こども園に通う3歳未満の児とその養育者に「乳児版睡眠質問票」の記入を依頼する。すべての質問票は無記名で行う。必要ソフト購入額に、今年度残金では満たなかったため、次年度に繰り越した。次年度交付金と合わせて必要ソフト購入予定。
果樹農業地域における肥料成分循環利用の可能性とその評価

本年は甲府盆地東部の果樹地帯をモデルケースとして、ハイドロタルサイト系化合物を用いることによる肥料成分の循環使用の可能性や、その効果の評価を行うことを試みた。無機イオン交換体はその原料が天然由来であるために、土壌に還元された場合も吸着剤そのものに起因する二次的な汚染の心配はない。そこでこのような特性を利用すれば、一つは土壌中の窒素残留成分を吸着して次に作物がそれを必要とする間その肥料効果を亡流させないようにするためのある種の土壌改良材として、一つは農村や周辺の市街地、畜産業から排出される排水中のリンや窒素を農地に還元するための吸着剤としての機能が期待できると考えた。前者については各種のイオン溶液を用いた実験や、この地域の土壌にハイドロタルサイト系化合物を添加したカラム実験などにより、ほぼ当初の狙いを満たす機能が確認された。土壌への使用についてはまだ検討の余地は残っているものの、この地域の施肥量をJA販売実績から求めた83Kg/haとし、その50%が土壌に残留するとしてその除去に必要なハイドロタルサイト系化合物量を試算すると、理論イオン交換容量2.4meq/gのハイドロタルサイト系化合物では約1.2t/haとなり、これは一般的な土壌改良剤の投入量のレベルにある。この地域の土地利用特性を調べた結果と併せると、河川に近い灰色低地土への使用が最も効果的であろう。一方後者の使用方法は、ハイドロタルサイト系化合物を媒体とすることにより、地域全体の窒素循環を促すことになろう。無機イオン交換体への吸着対象は硝酸イオンのみであるが、これの作用は化学肥料と同じとみなせるために、実質的な化学肥料使用量の削減につなげることが可能であるように考えられる。
学校場面における非行・メンタルヘルスの包括的アセスメントツールの開発と臨床活用

本研究の成果として大きく「包括的アセスメントツールの作成」「アセスメントツールの実践的活用」「国際比較」「国際シンポジウムの開催」が挙げられる。平成16年度は、予備調査を経て包括的アセスメントツールの作成を行い、[学校メンタルヘルス、非行傾向、学級風土、簡便型ロールシャッハテスト]からなる「学校生活質問票」を作成した。このツールを用いることにより、個と集団という次元から生徒理解を深めることができる。また、国際比較のため、フィンランド語版学校メンタルヘルス尺度を作成した。平成17年度には「学校生活質問票」を公立中学校を対象に実施し、データから複合的にまとめたアセスメント結果と介入プランについてフィードバックを含めたコンサルテーションを行った。また、日本とフィンランドとの国際比較調査を行ない、男女ともに日本の生徒のほうがフィンランドの生徒よりメンタルヘルスが全体的に悪い傾向であり、背景となる教育体制の違いが影響を与えているのではないかと考えられた。平成18年度は、前年度の調査結果から、学校メンタルヘルスと非行傾向からタイプ分けを行い、典型例を抽出した。非行傾向がある生徒の中でも学校メンタルヘルスの良し悪しによって介入プランを立てる必要性が見出された。また、教師への聞き取り調査も含めてフォローアップ調査を行ない、典型例の縦断データを収集した。また、国際シンポジウムを開催し、米国の学校心理学の専門家を招き研究発表と討議を行った。スクールカウンセラーの位置づけは両国で異なるが、実証的なアセスメントツールを活用した実践の狙いは共通点があり、本研究の一連の包括的アセスメントルールの作成とその実践的活用は国際的にみて評価されるものであった。平成16年度は、包括的学校生活・メンタルヘルス質問票の作成を目的とし、主として4つの質問票[学校メンタルヘルス、学級風土、非行、簡易版ロテスト]についての尺度検討、予備調査を行った。まず、学校メンタルヘルス尺度の採用項目決定、および標準化を目的とし、質問紙調査を実施した[東京・沖縄・神奈川・北海道・名古屋の小学校高学年計1306名;中学校2313名]。分析の結果、中学・高校生用尺度の標準化が完了し、これに準じて確認的因子分析を行い、小学校高学年版採用項目を決定した。さらに、国際比較のため、フィンランド語版学校メンタルヘルス尺度を作成した。次年度4月、小学校高学年、中学生各300名に対する調査を行う予定である。次に、学級風土質問票については、東京・北海道・新潟の中学校計54学級を対象とし、尺度検討を行った。同時に簡易版学校メンタルヘルス尺度・学級風土質問票の開発を行った。簡易版ロテストは、名古屋の小学校高学年294名;中学校330名を対象に調査を実施。非行尺度の予備調査を東京の中学校653名に実施。採用項目を検討した。以上の尺度検討、予備調査を経て、包括的学校生活・メンタルヘルス質問票を作成した。さらに、これらのアセスメント・ツールを用い、包括的発達支援モデル開発の一環として、(1)フィードバック、(2)カンファレンス、(3)予防授業を行った。東京・神奈川・沖縄・名古屋・北海道の各学校に対して、児童・生徒への個別フィードバック、および教師へのフィードバックを行い、教師とのカンファレンスでは、具体的な介入・予防プランを検討した。これらの支援効果については、児童・生徒、教師へのアンケートを用いて検討し、アクションリサーチにより、効果的なモデルを引き続き開発していく。平成17年度は、平成16年度に作成した国際比較のための、<包括的学校生活・メンタルヘルス質問票>をフィンランド(小学校6年生310名程度、中学校2年生380名程度、計700名程度)において実施した。そのデータについては、日本の標準化データとの比較を含め、現在解析中である。さらに、平成16年度に作成した、包括的学校質問票[構成尺度:学校メンタルヘルス、学級風土、非行、簡易版ロールシャッハテスト]を公立中学校4校(東京2校・神奈川・沖縄)において実施した。

調査対象者は全1870名であった。実践活動として、これらの結果を、各学校に青木・伊藤、青木・松本が赴き、データから複合的にまとめたアセスメント結果と介入プランについてフィードバックを行った。このうち、フィードバックの過程で、公立中学校(1学年250名)について、性格特性、家族背景、メンタルヘルス、学級風土、非行傾向に関する包括的かつ詳細なデータを収集することができた。現在、典型事例の抽出中であり、今後、典型例のフォローアップを行っていく予定である。また、メンタルヘルスと非行傾向の関連について、および性格特性を検討するロールシャッハテストに関しては、今年度学会発表を終えている。来年度以降、包括的アセスメントの手続きや過程について、また、実践活動について、発表予定である。さらに、ハンドブックの作成、専門家を招致したシンポジウム開催を予定しており、それに向けた準備を行っている。本研究の最終年度となる平成16年度の研究実績の概要は、以下の通りである。(1)国際比較日本とフィンランドの学校メンタルヘルスの現状について比較調査を行い、今後の学校メンタルヘルスの支援に活かす視点を検討した。その結果、男女ともに日本の生徒の方がフィンランドの生徒よりメンタルヘルスが全体的に悪い傾向であった。また、両国において、ともに男女差が見られ、女子の方が全体的にメンタルヘルスが悪い傾向が見られた。これらの結果には、背景となる教育体制の違いが影響を与えているのではないかと考えられた。なお、成果の一部は今年度発表を行い、今後も学会誌などに発表を予定している。(2)包括的アセスメントツールを用いたアセスメントとコンサルテーションの実践平成16年度に作成したアセスメントツールを用いて、現場の教員がツールからどう生徒像を読み取り、結果をどう活用するか、という点も含めて、生徒への介入のコンサルテーションを行った。(3)実践研究部門の成果発表国際シンポジウムの開催:米国の学校心理学会の次期会長を招き、研究発表と討議を行った。スクールカウンセラーを教育職として位置づける米国と、あくまでも生徒のメンタルヘルス支援の専門家として位置づける日本のスクールカウンセラー制度の背景は異なる。しかし、実証的なアセスメントツールを活用した実践の意義は、それぞれが独自に掲げるものがあり、また、実践の狙いとするところは共通点が多くみられた。本研究の一連の包括的アセスメントツールの作成とその実践的活用は概ね国際的にみて評価されるものであった。
薄い布地を介した素材の摩擦感と摩擦挙動

実際の衣服の着用状態を考えると、皮膚面と単一な布素材との摩擦も重要であるが、複数枚積層された布との総合的な摩擦現象も着心地や素材の触感を把握する上で検討しておかなければならない問題と考えられる。以上の点から、本研究では重ね布の複合的な摩擦感特性について、単独の布特性を踏まえ検討を行う。試料は、織物とニットをあわせて32種類の布地(以下試料A群と呼ぶ)と、上に重ねる布地として裏地のように使用されるものから厚地のものまでの織物計13種類の布地(以下試料B群と呼ぶ)を選択した。これらの試料について、SMDも測定できるように改造した摩擦感テスター(KES-SE:カトーテック製)を用い、単独およびA群の試料の上にB群の試料を重ねた状態でMIU、MMD、SMDを測定した。MIU、MMD測定時の摩擦子には、指紋をシミュレートしたもの(摩擦子A)と試料群Bを取りつけたもの(摩擦子B)を使用した。摩擦子Aによる重ね布のMIUおよびMMDは、上に重ねたB群の布の摩擦特性の影響が表れる傾向がみられた。SMDの場合もMIUと同様、上側の布の影響が認められたが、SMDの大きな布地の上に重ねた場合、下側の布地の影響が現れ、上側の布地のSMDより高い値となる。摩擦子Bの場合はAと比べてMIUは高くなる。重ね布の摩擦感特性は、MIU、MMD、SMDだけでは評価しきれないと思われたため、MMD、SMD測定時に得られる波形信号を使用して周波数解析を行った。単独布と重ね布のMMD、SMD測定時に得られた波形信号のパワースペクトルから、重ね布と上側の布のパワースペクトルの形状が非常に類似している場合と、A群、B群両方の試料のMMD、SMD変動における特徴的なピークが共存している場合がみらた。試料は、織物とニットあわせて32種類の布地(以下試料A群と呼ぶ)、上に重ねる布地として裏地や比較的薄地の織物計13種類の布地及びストッキング地とタイツ地(以下試料B群と呼ぶ)を選択した。これらの試料についてKES-FBシステムにより生地物性を把握した。その結果、せん断特性については、せん断剛性Gが0.18g/cm6.56g/cm、2HGが0.083.38g/cm、圧縮特性については圧縮特性の直線性LCが0.152.35、圧縮仕事量WCが0.121.061g/cm^2、引張特性は伸び率EMTが1.3780.51%、引張仕事量WTが4.3144.93g・cm/cm^2と幅広く分布していた。これらの試料について単独の平均摩擦係数(MIU)、摩擦係数の変動(MMD)、表面粗さの変動(SMD)を測定し、さらに、A群の試料の上にB群の試料を重ねた状態でMIU、MMD、SMDを測定した。MIUとMMDの測定用の摩擦子には指紋をシュミレートしたもの、ストッキング地、タイツ地を付けたものの3種類を使用した。重ね布のMIUは、A群とB群の試料のそれぞれ単独のMIU値の間で変化することが多いが、強いていえば上に重ねたB群の布の摩擦特性の影響の方が大きく表れていた。ここで、B群の布の圧縮特性に着目すると、圧縮仕事量の大きい布地を重ねた場合、重ね布全体としてのMIUが高くなる傾向がみられ、重ね布全体のMIUと上に重ねた布地の圧縮仕事量との間には相関があることがわかった。また、摩擦子に特にB群の中からストッキング地、タイツ地を選択して用いると、MIUは高くなる傾向がみられた。SMDの場合もMIUと同様、表地の上に裏地を重ねることにより、それぞれ単独のSMDと比較すると様々に変化するが、B群の布のSMDの影響だけでなく、圧縮特性の直線性との間に密接な関係があることがわかった。

重ね布の摩擦感特性は、MIU、MMD、SMDだけでは評価しきれないと思われたため、MMD、SMD測定時に得られる波形信号を使用して周波数解析を行った。単独布と重ね布のMMD、SMD測定時に得られた波形信号のパワースペクトルから、重ね布と上側の布のパワースペクトルの形状が非常に類似している場合と、A群、B群両方の試料のMMD、SMD変動における特徴的なピークが共存している場合がみらた。
大規模なセンサネットワーク位置推定問題の数値解法に関する研究

センサネットワークは,環境モニタリング,構造物管理,交通制御などのさまざまな分野で使われている.アンカーと呼ばれるその位置が既知のm個のセンサとネットワーク上で隣接するセンサ間の距離の情報からその位置が未知のn個のセンサの位置を推定する問題は最も基本的で重要な問題の1つである.理論的にはNP困難な難しい問題として知られており,さまざまな分野で研究が行われている.この研究課題では,センサネットワーク位置推定問題に対する半正定値計画緩和を中心に研究を進めた.半正定値計画緩和は精度の良い推定位置を生成することが知られているが,センサネットワーク位置推定問題の規模の増加に伴って,計算コストが急速に増加する欠点を有している.この欠点を解消するためにネットワークの構造的な疎性の有効利用および半正定値計画問題を解く主双対内点法ソフトウェアSDPAの高速化をおこなった.この研究課題の主たる研究成果として大規模な問題を高速に解くソフトウェアパッケージSFSDPを開発・公開した.センサネットワークは,環境モニタリング,構造物管理,交通制御などのさまざまな分野で使われている.アンカーと呼ばれるその位置が既知のm個のセンサとネットワーク上で隣接するセンサ間の距離の情報からその位置が未知のn個のセンサの位置を推定する問題は最も基本的で重要な問題の1つである.理論的にはNP困難な難しい問題として知られており,さまざまな分野で研究が行われている.この研究課題では,センサネットワーク位置推定問題に対する半正定値計画緩和を中心に研究を進めた.半正定値計画緩和は精度の良い推定位置を生成することが知られているが,センサネットワーク位置推定問題の規模の増加に伴って,計算コストが急速に増加する欠点を有している.この欠点を解消するためにネットワークの構造的な疎性の有効利用および半正定値計画問題を解く主双対内点法ソフトウェアSDPAの高速化をおこなった.この研究課題の主たる研究成果として大規模な問題を高速に解くソフトウェアパッケージSFSDPを開発・公開した.22年度当初にあげた目的に沿って,以下の2つの研究課題(I)および(II)に関する研究を行い,それぞれについての研究成果を得た.(I)センサネットワークの位置推定問題に対する計算効率のよい半正定値計画緩和の構築.距離推定に誤差を含まない理想的なセンサネットワークの位置推定問題は多変数の2次方程式系として記述出来る.半正定値計画緩和手法はその2次方程式系を数値的に解く強力な手法であるが,大規模なセンサネットワーク問題では多くの計算時間と大量のメモリーを必要とする.この欠点を補うためには2次方程式系から冗長な式を削除することが有効である.削除方法は自明ではなく,冗長でない式を取り除いてしまうと位置推定に大きな誤差を生じる.2次方程式系から冗長な式を削除する2つの方法を実装し計算実験を行った.その結果,センサネットワークのコーダルグラフ疎性に基づいて冗長な式を削除する方法がグラフのtrilaterationに基づく方法よりも優れていることが分かった.今後はこの2つの方法の長所を組み合わせた方法等の開発を考えている.(II)センサの位置推定計算.半正定値計画緩和手法は計算時間とメモリー消費の2つの点で大規模なセンサネットワークの位置推定問題への適用が困難になる.この困難を解消するために,センサネットワークの位置推定問題に連続変形法を適用する方法の研究を開始し,その理論的な枠組みを構成した.今後はこの方法を実装し,上述の半正定値計画手法との比較を含む計算実験を行う予定である.本年度の研究の主目的は以下の2つであった。(A)計算効率を高め大規模な問題をさらに高速に解けるように改良。(B)精度の評価および向上。(A)に関しては以下の2つ新たな手法を開発した。(A-1)大規模なセンサネットワーク位置推定問題に対するホモトピー法。この開発にはすでに終了しており,論文を投稿して受理されている。この方法はその位置が分かっているアンカーの個数が比較的多い大規模なセンサネットワークに極めて有効であり,センサの個数が数万の問題を高速にとくことに成功している。この手法に関してはその骨格をすでに構築しており,パラメータの調整およびプログラムの細部の整理の段階にある。上記の(A-1)とは逆にアンカーの個数が少ない場合に有効に働く。特に,アンカーが無い3次元の問題に対して極めて有効であることを予備実験により検証している。本格的な実験および論文としてまとめるのは次年度の課題となる。(B)に関してはこれまでに開発した多項式最適化問題における誤差評価手法をSFSDPに組み込んだ成果が挙げられる。もう1つは上記の(A-2)の枠組みのなかで1つのセンサの位置推定が多く(たとえば,40個)与えられたときに,そこから真の解に近い推定値を合成する統計的な方法を研究中である。この方向に沿っても成果を挙げつつあるが結論を出すまでには至っていない。これも次年度に引き継ぐ課題となる。年度当初の研究目的にあげたのは次の5項目である. (I)数理最適化問題への定式化.(II)数理最適化問題の求解によるセンサの位置推定.(III)

計算速度および推定位置の精度の向上. (IV)モデルの拡張.(I)に関しては前年度までに行った半正定値計画緩和問題をその基本的な枠組みとして採用している.(II)に関しては,従来の半正定値計画緩和手法に加えて,前年度に開始した大規模なセンサネットワーク位置推定問題に対するホモトピー法の研究を継続し,アンカーの個数が比較的多い大規模なセンサネットワークに極めて有効であることを再検証している.また,前年度の後半から開始した逐次半正定値計画緩和法の研究を行い,計算手法として完成させ論文を投稿した.(III)の計算速度の向上に関しては,主として半正定値計画問題に対する主双対内点法SDPAおよびその並列版SDPARAの計算効率の改善を行った.(III)の推定位置の精度の向上に関しては,1つのセンサに関してその推定位置が複数個(例えば20個)得られたとき,それらからより精度の良い推定位置を合成する方法を提案し,その有効性を計算実験により検証した.(IV)に関しては,Euclidean Distance Geometry Problemへとモデルを拡張した.この問題は3次元空間でのアンカー(その位置が固定されたセンサ)のないセンサネットワーク位置推定問題として定式化され,Molecular Conformation Problem等への応用がある重要な問題である.この問題に対して上述の逐次半正定値計画緩和法および推定位置の精度の向上を組み込んだアルゴリズムを構築し,計算実験を行い,その成果を論文として投稿した.以上に加えて,最終年度の研究の取りまとめを行った.上記の(A)および(B)で新しい手法を提案しそれらの効果が十分に見込まれることを検証している。詳細な計算実験し,ソフトウェアとして完成するまでの時間は取れなかったが十分な成果が順調にあがっていると評価している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度はこの研究課題の最終年度にあたる。上述した(A)および(B)の目的に沿って研究を進めるとともに3次元でアンカーがない場合を含むさまざまな大規模センサネットワーク問題を精度よく高速に解く手法を完成させソフトウェアとして提供することを目指す。
ラット細胞核内DNA中に組み込まれたミトコンドリアゲノムの発現に関する研究

目的;近年、色々な種において核内DNA中にミトコンドリアDNAとホモロジーを有するsequenceの存在が報告され、この近傍にrepetitive sequenceが存在している事がヒト、酵母等で明らかになっている。しかし、この核内DNAに組み込まれたミトコンドリアDNAとホモロジーを有するsequenceの機能あるいはRNAとして転写されるかどうかについてはいまだ情報が得られていない。そこで、我々はラット腹水肝癌AH60C細胞由来のcDNAライブラリーよりミトコンドリアDNAとホモロジーを有するcDNAクローンを単離し、その構造を解析することにより、上記の問題にアプローチしようとするものである。研究実績;ラット腹水肝癌AH60C細胞からTotal mRNAを抽出し、これに対応するcDNAライブラリーをLandらの方法で作製し、ミトコンドリアDNAをプローブとして、ハイブリダイズするcDNAクローンを得た。このcDNAクローンは癌細胞で特異的に発現されるrepetive sequenceともホモロジーを持つ事を明らかにした。次いで、このcDNAクローンのcDNA部分355bpの塩基配列を決定した。5′側約200bpが上記癌細胞で特異的に発現されるrepetitive sequenceと約90%のホモロジーを持ち、その3′側約350bpが、ミトコンドリアゲノムDNAと約90%のホモロジーを有していた。ラット腹水肝癌AH60C細胞より調整したゲノムDNAを、このcDNAクローンのミトコンドリアゲノムDNAとホモロジーを有する部分をプローブとして、サザーンブロッティング法により解析したところ、このcDNAに対応するDNAフラグメントが、ラットのゲノムDNAに組み込まれている事が明らかとなった。現在、このcDNAクローンに対応するゲノムクローンを単離し、解析を試みている。
臨床サンプルを用いたヒトキマーゼ測定系の開発

本研究の当初の目的は以下の項目であった。1.血中ヒトキマーゼのWesternblotによる測定法や生化学的処理による活性測定法を開発。2.その結果と生検組織中のキマーゼ活性と比較することにより血中キマーゼ測定の是非を判定する。3.大量の検体処理の可能なラジオイミュノアッセイを開発。4.各疾患群(高血圧、虚血性心臓病、心筋疾患)の病期別のキマーゼレベルの変化を測定。5.血中キマーゼレベルと疾患別の関連を検索であった。この内、1.と2.は予定どうり終了したが、3.は^<125>I-ラベルのキマーゼが抗体と結合せず断念した。作成したキマーゼ特異的なモノクローナル及びポリクローナル抗体を用いてdouble sandwich ELISA法を確立した.この測定法を用いて種々の臨床検体を測定し、血中キマーゼ濃度は全身性炎症疾患(肺炎、自己免疫疾患等)で高値を示した。軽度の上昇は動脈硬化や虚血性心疾患等で観察され、血中キマーゼ濃度とCRPやフィブリノーゲンとの間には正相関が観察された。したがって、血中キマーゼ濃度は組織炎症の度合を反映するものと考えられた。これらの結果はExperimental Biology'99(Washington DC,USA)にて発表した。(Okamoto T & Urata H etal.Development and clinical application of ELISA for human chymase FASEB J13:A482,1999)現在論文投稿中である。今後は開発されたキマーゼ特異的ELISA法の感度を上昇させ、さらに広く臨床応用が可能になるようにしていきたい。平成10年度の研究予定としてI.検体収集、II.キマーゼ測定法の確立が目的であった。I.内科のみならず心臓外科、病理等幅広い協力を得て平成9年度より続行されており分析可能な検体は200例近くになっている。検体としては血液、心血管組織等を収集している。II-1.Westernblot法による分析は定性的には可能になり実際応用可能な段階まで来ている。しかし、定量性には多少問題があり現在検討中である。II-2ヒトキマーゼRIA法の確立:スタンダードを作成するためリコンビナントヒトキマーゼを発現、精製、放射線ラベルしたところ、抗体と結合せず、断念した。代わって、ELISA法の確立を目指した。現在までに、一応測定可能になっており、組織抽出液やホモジネートでは容易に測定でき、そのデータを今年の第63回日本循環器学会や米国FASEB Meeting等にて発表予定である。今後血液検体や尿検体の測定確立が必要である。平成11年度の研究予定はELISAによるキマーゼ測定法の確立が目的であった。スタンダードを作成するためリコンビナントヒトキマーゼを発現、精製し、ヒトキマーゼに対するモノクローナル、ポリクローナル抗体を作製した。上記抗体を用いて酵素免疫測定法(ELISA)を作製した。ヒトキマーゼELISAの特異性を剖検より得られたヒト組織の検体を用いて従来の酵素活性測定法と比較し確認した。ヒトキマーゼELISA法で測定した、動脈組織中のキマーゼ濃度は血清総コレステロール値やCRP値と良い正相関を示した。腹部大動脈中のキマーゼ濃度は剖検時に腹部大動脈に肉眼的な動脈硬化が高度な患者が軽度な患者に比べ統計学的に有意に上昇していた。血漿中のヒトキマーゼ濃度は高血圧患者において血漿フィブリノーゲン濃度と良い正相関を示した。これらの結果は昨年の第63回日本循環器学会や米国Experimental Biology Meeting等にて発表した。

平成12年度の研究予定はELISAによるキマーゼ測定法の確立が目的であった。スタンダードを作成するためリコンビナントヒトキマーゼを発現、精製し、ヒトキマーゼに対するモノクローナル、ポリクローナル抗体を作製した。上記抗体を用いて酵素免疫測定法(ELISA)を作製した。ヒトキマーゼELISAの特異性を剖検より得られたヒト組織の検体を用いて従来の酵素活性測定法と比較し確認した。ヒトキマーゼELISA法で測定した、動脈組織中のキマーゼ濃度は血清総コレステロール値やCRP値と良い正相関を示した。腹部大動脈中のキマーゼ濃度は剖検時に腹部大動脈に肉眼的な動脈硬化が高度な患者が軽度な患者に比べ統計学的に有意に上昇していた。血漿中のヒトキマーゼ濃度は高血圧患者において血漿フィブリノーゲン濃度と良い正相関を示した。
モンゴロイドに多発する難治性ぶどう膜炎の人類遺伝学的、分子生物学的発症機構の解析

我々はモンゴロイドに多発する難治性ぶどう膜炎の人類遺伝学的、分子生物学的発症機構の解析を進めてきた。ヒトの主要組織適合抗原であるHLA抗原遺伝子群は特異的免疫応答を遺伝的に規定する重要な遺伝子群である。我々はこれまでモンゴロイドに多発する難治性ぶどう膜炎の多くがこのHLA遺伝子と密接に相関することを世界に先がけて明らかにしてきた。ベ-チエット病は人種を越えてHLA-B51抗原と相関する疾患である。ベ-チット病の分布はHLA-B51抗原の分布と一致していることから、シルクロード周辺諸国に多いことが想定されてきたが、これまでシルクロード周辺諸国におけるHLAの解析は行われておらず、我々の研究はベ-チエット病の解析のみならずこられ少数民族の遺伝的位置づけを行う上からも重要である。昨年採取した漢民族、ウイグル族、カザフ族のHLA解析を行った結果、HLA-B51抗原頻度は健常人では711%に認められたのに対しベ-チエット病患者では30%と有意に増加していた。本年調査した回族では、ベ-チエット病患者は認められなかったが、健常人43人についてのHLA解析を行っている。本年度はさらに中近東のサウジアラビア、ヨーロッパ地中海沿岸のギリシャ、イタリアにおいて、ベ-チエット病患者の調査、診察を行い、HLAクラスI抗原の血清学的タイピングを行った。今後もシルクロード周辺諸国の少数民族について検索してゆく予定である。原田病はメラノサイト特異的自己免疫疾患の一つと考えられているぶどう膜炎である。原田病は我々東洋人、インディオに多く見られるが白人には稀であり、発症頻度に民族的偏りが認められる。これまでは日本を中心に臨床基礎研究が進められてきた。原田病もHLAとの強い相関を示し、血清学的HLAタイピングではHLA-DR4,DR53との相関が明らかにされてきた。我々はさらにDNAレベルでの解析を行った結果、日本人患者においてはHLA-DRB1*04(0405/0410)、HAL-DQB1*04(0401/0402)との強い相関を認めた。日本人以外の民族での初めての原田病のHLA解析として、昨年度調査を行ったアルゼンチンの原田病患者のHLA遺伝子解析では、DRB1遺伝子では、HLA-DRB1*04(0404)という日本人と共通の遺伝子相関を認めたのに対し、DQ遺伝子ではDRB1*0302という異なる相関が認められたことから原田病の疾患感受性遺伝子としてDRB1*04遺伝子の可能性が示唆された。ブラジルの原田病患者については現在解析中である。本年はさらに中近東のサウジアラビア、ヨーロッパ地中海沿岸のギリシャ、イタリアにおいても患者診察および調査を行い、HLAクラスI抗原の血清学的タイピングを行った。原田病の民族学的発症頻度の偏りからすると、これらの国々では原田病の発症そのものが非常に稀であることから、この結果は疾患感受性遺伝子の解析において重要な手がかりになると期待される。今後はさらに、人種の坩堝であるアメリカとの共同研究を予定している。さらにわれわれは国際学術研究の足がかりとして、サルコイドーシスとHTLV-I associated uveitis(HAU)についても、日本人患者のHAL解析を行った。サルコイドーシスでは血清学的レベルではHLA-DR52関連抗原であるHLA-DR5、DR6、DR8が、DNAレベルではDRB1*1101,1201,1401,0903が患者群で有意に増加していた。これらはDRB1遺伝子に共通のアミノ酸配列を持つグループであり、サルコイドーシスの疾患感受性に関連していることが示唆され。今後、同じ東洋人である中国やサルコイドーシスの多い北欧諸国でのHLA相関についての検討が望まれる。一方、HAUは全身的には健康なHTLV-Iキャリアーにぶどう膜炎を伴う疾患である。HTLV-Iの感染は西南日本、沖縄に多い他、世界各地に広がっており、とくにカリブ海諸国、中央アメリカ南米諸国にendemic areaがある。現在日本人患者についてHLAの解析を行っており、将来的にはこれらの諸国での調査も行いたいと考えている。

今後もシルクロード周辺諸国の少数民族について検索してゆく予定である。原田病はメラノサイト特異的自己免疫疾患の一つと考えられているぶどう膜炎である。原田病は我々東洋人、インディオに多く見られるが白人には稀であり、発症頻度に民族的偏りが認められる。これまでは日本を中心に臨床基礎研究が進められてきた。原田病もHLAとの強い相関を示し、血清学的HLAタイピングではHLA-DR4,DR53との相関が明らかにされてきた。我々はさらにDNAレベルでの解析を行った結果、日本人患者においてはHLA-DRB1*04(0405/0410)、HAL-DQB1*04(0401/0402)との強い相関を認めた。日本人以外の民族での初めての原田病のHLA解析として、昨年度調査を行ったアルゼンチンの原田病患者のHLA遺伝子解析では、DRB1遺伝子では、HLA-DRB1*04(0404)という日本人と共通の遺伝子相関を認めたのに対し、DQ遺伝子ではDRB1*0302という異なる相関が認められたことから原田病の疾患感受性遺伝子としてDRB1*04遺伝子の可能性が示唆された。ブラジルの原田病患者については現在解析中である。本年はさらに中近東のサウジアラビア、ヨーロッパ地中海沿岸のギリシャ、イタリアにおいても患者診察および調査を行い、HLAクラスI抗原の血清学的タイピングを行った。原田病の民族学的発症頻度の偏りからすると、これらの国々では原田病の発症そのものが非常に稀であることから、この結果は疾患感受性遺伝子の解析において重要な手がかりになると期待される。今後はさらに、人種の坩堝であるアメリカとの共同研究を予定している。さらにわれわれは国際学術研究の足がかりとして、サルコイドーシスとHTLV-I associated uveitis(HAU)についても、日本人患者のHAL解析を行った。サルコイドーシスでは血清学的レベルではHLA-DR52関連抗原であるHLA-DR5、DR6、DR8が、DNAレベルではDRB1*1101,1201,1401,0903が患者群で有意に増加していた。これらはDRB1遺伝子に共通のアミノ酸配列を持つグループであり、サルコイドーシスの疾患感受性に関連していることが示唆され。今後、同じ東洋人である中国やサルコイドーシスの多い北欧諸国でのHLA相関についての検討が望まれる。一方、HAUは全身的には健康なHTLV-Iキャリアーにぶどう膜炎を伴う疾患である。HTLV-Iの感染は西南日本、沖縄に多い他、世界各地に広がっており、とくにカリブ海諸国、中央アメリカ南米諸国にendemic areaがある。現在日本人患者についてHLAの解析を行っており、将来的にはこれらの諸国での調査も行いたいと考えている。ベーチェット病はモンゴロイドに多発する代表的な難治性ぶどう膜炎のひとつであり、人種を超えて同一のHLA抗原(HLA-B51)と相関する疾患として注目されている。われわれは、中国シルクロード周辺諸民族のベーチェット病患者をスクリーニングし、患者群および健常群において、HLA遺伝子の解析、各種ウイルス検査を行った。その結果1)疑い例を含め24例の本病患者を見出した。2)HTLV-1,一II抗体,HIV抗体は全例陰性であった。3)HBs抗原,HBs抗体は高頻度に見られた。
卵母細胞によるメラトニン合成とその意義

メラトニンは松果体等においてセロトニンからarylalkylamine N-acetyltransferase(AANAT)とacetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)の作用によって合成されることが知られている。この研究においてラット成体卵巣においてAANATとASMTが発現していることを明らかにした。AANATは卵母細胞に局在していた。また卵母細胞をセロトニン存在下で培養すると、メラトニンが合成された。卵母細胞で合成されたメラトニンは自身の成長や成熟に関与している可能性がある。次の2点を明らかにした。(1)思春期(3週齢)のWistar-Imamichiラットに生殖腺刺激ホルモン(pregnant mare serum gonadotropin)を投与して卵胞の発育を促進した後、卵巣から成熟卵母細胞と卵丘細胞の複合体を得た。次に、この成熟卵胞-卵丘細胞複合体をヒアルロニダーゼで処理し、成熟卵母細胞を単離した。成熟卵母細胞がメラトニン(5-メトキシ-N-アセチルトリプタミン)を合成及び放出しているのかどうかを明らかにするために、セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン)を含む培養液で成熟卵母細胞を一定時間培養した後、成熟卵母細胞及び培養液中のN-アセチルセロトニン(メラトニン前駆体)とメラトニンをHPLC-蛍光検出で同定及び定量した。その結果、卵母細胞がセロトニンからN-アセチルセロトニンを経て、メラトニンを合成することと、メラトニンが卵母細胞から放出されることを明らかにした。その合成量と放出量が培養時間とセロトニン用量に依存して増加した。(2)成熟(10週齢)Wistar-Imamichiラットから卵巣を摘出し、そのパラフィン組織切片を作成した。次にメラトニン合成過程における律速酵素であると主張されているarylalkylamine N-acetyltransferase(AANAT)に対する抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、卵母細胞、卵巣間質、卵巣内に侵入していたマスト細胞においてAANATが発現していることを明らかにした。ラットの卵巣において、松果体と同様に、メラトニン合成過程における律速酵素であると主張されているarylalkylamine N-acetyltransferaseが存在するのかどうかを確認することを目的とした。そのために、成熟(10週齢)Wistar-Imamichiラットから、卵巣と松果体を摘出し、これらの抽出物を用いて、arylalkylamine N-acetyltransferaseに対する抗体を用いたWestern blottingを行った。その結果、卵巣と松果体の両者の抽出物において分子量24kDaのタンパク質が検出された。従来の報告から、この24kDaのタンパク質はarylalkylamine N-acetyltransferaseである。従って、卵巣にarylalkylamine N-acetyltransferaseが存在することが立証され、卵巣でメラトニンが合成されている可能性が示唆された。次に、arylalkylamine N-acetyltransferaseの卵巣における存在部位を明らかにすることを目的とした。そのために、成熟(10週齢)Wistar-Imamichiラットから、卵巣を摘出し、パラフィン組織切片を作成した。次にarylalkylamine N-acetyltransferaseに対する抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、卵母細胞、卵巣間質、卵巣内に侵入していたマスト細胞においてarylalkylamine N-acetyltransferaseが存在していることを明らかにした。従って、卵巣におけるこれらの部位でメラトニンが合成されている可能性が示唆された。2.10週令Wistar-Imamichiラット卵巣の切片を作成し、AANATに対する抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、卵母細胞、卵巣間質卵巣内に侵入したマスト細胞においてAANATが発現していることを明らかにした。3.卵母細胞はセロトニンを取り込むことが知られている(Amireault and Dube, 2005)。この報告と上記1と2の結果から卵母細胞はセロトニンからメラトニンを合成している可能性が示唆される。この可能性をさらに検討した。具体的には、思春期(3週令)Wistar-Imamichiラットにpregnant mare serum gonadotropinを投与して卵胞の発育を促進した後、卵巣から成熟卵母細胞と卵丘細胞の複合体を得た。次に、この複合体をヒアルロニダーゼで処理し、成熟卵母細胞を単離した。そして成熟卵母細胞をセロトニンを含む培養液で培養し、培養液と卵母細胞中のメラトニン前駆体とメラトニンをHPLC-蛍光検出とELISAにより同定・定量した。その結果、卵母細胞はセロトニンからN-アセチルセロトニンを経てメラトニンを合成することと、メラトニンが卵母細胞から放出されることを明らかにした。メラトニン合成における最終ステップに関与する酵素であるacetylserotonin O-methytransferaseタンパク質を検出する方法を確立できず、卵母細胞におけるメラトニン合成過程を明らかにすることができなかったので。25年度が最終年度であるため、記入しない。卵母細胞においてメラトニンが合成されていることを示す直接的な証拠を得る必要がある。
ヒト精巣精細管精系細胞の障害と周囲因子との関係についての研究

ヒト精巣の器官培養系およびセルトリ細胞培養系を用いて、種々の環境変化(具体的には2842°Cの温度環境,ゴナドトロピンやエストロゲン添加による内分泌環境)による胚細胞分化能と周囲支持細胞であるライディッヒおよびセルトリ細胞機能との関係を知ることを目的とする。胚細胞機能は光顕電顕観察による形態学およびDNA、RNA、蛋白合成に関する機能学的レベルで、周囲細胞機能はゴナドトロピン受容体および蛋白合成のレベルで把握し、次に列挙する成果を得た。1.幼少時から成人に至る正常および病的精巣の器管培養から、正常胚細胞分化の至的温度は3132°Cであり、高温環境は障害的に作用する。また、病的精巣では温度環境による障害パタ-ンが正常精巣と相違する。支持細胞の受容体は温度環境の影響を受けない。このため、温度環境は支持細胞を介することなく、直接胚細胞に作用し、分化に関与することが推測された。2.セルトリ細胞培養系よりヒトにおいても実験動物同様ウロキナ-ゼタイプのプラスミノ-ゲンアクティベ-タ-が産生されており、FSHに依存性を有しており、胚細胞分化能に相関性を示すことが判明した。
木材の直接発酵によるエタノール生産技術の開発

1.木材チップの脱リグニン直接発酵の原料として木材チップを用いるときは、脱リグニン処理が不可欠である。脱リグニンを効果的に行うためには、さらに脱脂前処理が必要であるが、これは水洗,1%NaOH液洗浄,及び水洗の3処理を行えばよい。また、生物的脱リグニンの前段階に軽度の亜塩素ナトリウム処理も有効であることがわかった。省エネルギー的脱リグニン法のひとつであるリグニン分解菌生菌を使用する方法について実験を行い、カワラタケ菌が最も有望であることを明らかにした。工業的規模での生菌による脱リグニン度を簡単に測定する一法として、【TS_(50)】という概念を導入した。各種の実験条件を検討した結果、CMC添加通気の条件下において【TS_(50)】を引き下げること、すなわち、脱リグニン率の向上をはかれることがわかった。本法は、次の酵素的脱リグニン法が工業的規模にまで成長するまでの間、使用する価値があるものと思われる。酵素的脱リグニンは、将来最も期待のもてる脱リグニン法であることに鑑み、われわれが先に発見したラッカーゼ型リグニン分解酵素を用いての、リグニン分解について基礎的知見を蓄積する方向で実験を行った。この研究の中で、とくにラッカーゼ【III】と分類したもののうちに、リグニン分解能力のある酵素活性を見出だした。ラッカーゼ【III】の酵素的特性を調べるとともに、リグニン及びそのモデル物質を用いての脱リグニン機構を明らかにした。2.脱リグニン木質試料を原料としたときの直接発酵及びそのシステム化今までに知られている直接発酵菌は、脱リグニン木質試料用には不適であるので、新たにそれに適した菌の探索を行った。ある程度の資化菌は得たが探索は引き続き実施している。なお、前処理-脱リグニン-直接発酵の3工程からなるシステム試案を作成した。昭和60年度は、【◯!1】木材チップの微生物的脱リグニン(酵素的脱リグニンを含む)、【◯!2】直接発酵の諸条件検討、及び【◯!3】スケールアップの問題点の3項目について研究を実施した。木材を出発物質として嫌気性細菌を培養し、エタノールを直接生産させる場合もっとも重要なことは脱リグニンであるので、昨年度はそれに重点をおき、主として生菌による脱リグニンについて研究を進めたが、本年度は、さらに効率的と考えられるリグニン分解酵素による脱リグニンを検討した。1.リグニン分解酵素による脱リグニンラッカーゼ【III】酵素はリグニン分解能力を有するので、これを木材試料の脱リグニンに応用することを企てた。その第1段階として木材の超薄切片にこの酵素を作用させたところ、紫外顕微鏡的にリグニン部分に変化が見られた。また、単離リグニンについても分解能力を検し、木材中の抽出残渣部分のリグニンに対して低分子化作用を呈すことを再確認した。さらにモデル化合物として、シリンギルグリセロール-β-グアイアシルエーテルを用い、側鎖のα-β結合を切断することを明らかにした。これらのことは、今後の酵素的脱リグニンの実用化にとって期待のもてる事実と受けとめている。2.直接発酵条件の検討あらたに堆肥中より分離し、ロールチューブ法で単離した嫌気性菌数種について、基質濃度,培養温度,pH等がエタノール生産に及ぼす影響を調べたところ、基質濃度は比較的稀薄な場合が、温度は一部の菌株を除き37°Cが、pHは中性付近に調節を連続的に行う場合が良好なことを確認した。3.スケールアップの問題点

嫌気条件の設定に脱酸素剤の使用、攪拌の程度等について予備的試験を行った。1.木材チップの脱リグニン条件について:この基礎となるリグニンの酵素的分解について、種々のモデル物質を用いて反応機構の解明を行った。その一例を示すと次のようである。シリンギルグリセロール-β-シリンギルエーテルに対して、ラッカーゼ【III】を作用させると、ベンゼン核と側鎖α位との間で切断が起こり、さらに反応が進んで、β-0-4エーテル結合が切れることがわかった。他のモデル物質では側鎖のα-β間結合が切れる例もみとめられた。これらのことから、この酵素は、リグニンの化学構造に対して幅の広い分解活性を有することがわかる。それは、ラッカーゼ【III】が、フェノール性水酸基の脱水素によるラジカルの生成とその移動によってひき起こされるからであろう。このように幅広い分解活性が認められたことは、木材質資源を原料とする直接発酵の前処理としては、甚だ都合のよいことである。ただし、通常の培養法では、この酵素の分泌量が少ないので、実用化するには、遺伝子工学的手法の適用が必要と思われる。2.直接発酵条件の検討とスケールアップについて:既存の直接発酵菌は、木質原料ではたとえ脱リグニンをかなりやった場合でも、エタノール生産に不適であったので、新たに木質原料に適する発酵菌を自然界から探索し、温度、pH、添加物等の諸条件を調べた。まだ十分なエタノール生産量を示す菌は得られていないが、これまでに分離された嫌気性菌の中、比較的よいものにつき、やや規模を大にした実験を行った。これまでのところ、発酵のきわめて初期にエタノールを生産し、その後の生産量は緩漫であった。本件についてはなお実験を続行している。3.直接発酵システムの設計:前処理-生物的脱リグニン-直接発酵の3I程から成るシステム試案を作成した。
昆虫由来生理活性物質を利用した新規抗ガン剤開発のための基礎的研究

昆虫由来抗微生物タンパク質を改変したペプチドが正常細胞には作用せず一部のがん細胞を破壊する機序を明らかにする目的で研究が行われた。改変ペプチドはがん細胞表面のマイナス電荷をもつホスファチジルセリンとペプチドのプラス電荷との静電的引き合いに起因する細胞膜の膜破壊が起きることが証明された。一方、タカサゴシロアリからがん細胞増殖抑制活性を示す新規化合物1,1'-biphenyl-3,3',4-triolが分離・同定された。この物質は既知の抗がん剤とは異なる作用メカニズムを有することを示唆する結果が得られた。本研究の目的は、従来の抗ガン剤とは全く作用機構の異なる新規抗ガン剤開発のための基礎的知見を得ることである。そのために(1)昆虫由来抗微生物タンパク質改変ペプチドの抗ガン作用の解明と(2)昆虫由来新規抗ガン活性物質の探索の二つの課題について研究を進めている。この二課題の研究遂行を通じ、新規抗ガン剤開発のためのシーズを得る。本研究は、従来の抗ガン剤とは全く作用機構の異なる新規抗ガン剤開発のための基礎的知見を得ることを目的とする。その目的を達成するため昆虫由来抗微生物タンパク質改変ペプチドの抗ガン作用の解明及び昆虫由来の抗ガン物質の探索を通じ、新規抗ガン剤開発のためのシーズを得ることを具体的目標とした。平成20年度は改変ペプチドのガン細胞増殖抑制と形態変化に与える影響の解析をまず行った。6種類の培養ガン細胞(ヒト子宮頚ガン、ヒト肺ガン、ヒト扁平上皮ガン、マウス骨髄腫、マウス神経膠腫、アフリカミドリザル腎臓ガン)をA,B,C,Dの4種類のD型改変ペプチドを用いスクリーニングした結果、ペプチドBがマウス骨髄腫に対し強い抗ガン活性を示すことが明らかとなった。ペプチド濃度が高くなるにつれ細胞内から酵素の漏出が増えガン細胞の生存率が低下することからその抗ガン作用はペプチドによる細胞膜の破壊に起因することが示唆された。また電子顕微鏡による形態学的観察により明らかな細胞膜の破壊が観察された。次に、改変ペプチドBがマウス骨髄腫の細胞膜に直接作用しているかどうかを調べるため膜電位感受性の蛍光色素であるDioC_2を用い細胞を標識し、改変ペプチドによるガン細胞の脱分極の可能性について調べた。その結果、ペプチドBはマウス骨髄腫細胞膜の脱分極を引き起こすことが明らかとなりその作用標的が細胞膜であることが実証された。一方、改変ペプチドは骨髄腫には強い抗ガン活性を示すのに、なぜ他のガン細胞には効果がないのかについて調べてみた。その結果、ガン細胞表面に存在するマイナス電荷をもつホスファチジルセリンの量に抗ガン活性が依存していることが判明し、プラスに帯電した塩基性アミノ酸に富む改変ペプチドのホスファチジルセリンとの静電的引き合いがペプチドの細胞表面への吸着に重要であることが明らかとなった。本研究は従来の抗ガン剤とは全く作用の異なる新規抗ガン剤開発のための基礎的知見を得ることを目的とする。その目的を達成するための昆虫由来抗微生物タンパク質改変ペプチドの抗ガン作用の解明及び昆虫由来の抗ガン物質の探索を通じ、新規抗ガン剤開発のためのシーズを得ることを具体的目標とした。平成21年度は新規改変ペプチド(D-ペプチドC2)を合成し、6種類のガン細胞(ヒト子宮頚ガン、ヒト肺ガン、ヒト扁平上皮ガン、マウス骨髄腫、マウス神経膠腫、アフリカミドリザル腎臓ガン)に対する抗ガン活性を測定し、従来のペプチド(D-ペプチドC)と比較を行った。D-ペプチドC2はD-ペプチドCのC末端にアルギニン残基を8個付け加え細胞膜を通過し細胞内へ移行できることを目指したものである。D-ペプチドC2はD-ペプチドCに比べいずれのガン細胞にも低いIC_<50>値(3.426.4μM)を示し強い抗ガン活性を示した。また、D-ペプチドC2が細胞内へ移行することを実証するため、ペプチドを蛍光色素で標識しヒト白血病細胞(Jurkat cells)を用いて調べた結果、細胞内へ移行できることが明らかになった。一方、D-ペプチドC2が細胞内のミトコンドリア膜に直接作用しているかどうかを蛍光色素JC-1を用いて調べたところ、このペプチドが膜を破壊し膜ポテンシャルを消失させていることが明らかとなった。さらに、電子顕微鏡を用いた調査からこのペプチドがJurkat細胞内のミトコンドリアに形態変化を引き起こすことが分かった。またマウス肝臓よりミトコンドリアを抽出し、in vitroにおけるD-ペプチドA,B,C,D及びD-ペプチドC2の影響を540nmにおける吸光度の変化を測定したところ、いずれかのペプチドもミトコンドリア膜の破壊を引き起こす結果となったが、その中でもD-ペプチドC2は一番強い活性を示すことが明らかとなった。ドラッグデリバリーシステムを用いて、改変ペプチドに膜透過機能とガン細胞指向機能を付与し、ガン細胞特異的な薬物輸送と抗ガン活性を調べることを本年度の目的とした。

ガン細胞や血管上皮細胞において過剰発現しているインテグリンαVβ3に対して指向性を持ち、さらに細胞内移行機能を持つ環状型RGD配列をドラッグデリバリー配列として用いた。カブトムシディフェンシン由来改変ペプチドのN末端にシステインを含んだ環状型RGD配列(CfRGD)とジスルフィド結合を形成させることにより複合体を合成した。環状型RGD-改変ペプチド複合体は、細胞表面のインテグリンαVβ3の発現が多いヒト血管上皮細胞(HUVEC)内に取り込まれ、ミトコンドリアの膜電位の消失を引き起こすのに対し、インテグリンαVβ3の発現が少ないCos-1細胞には取り込まれず、ミトコンドリアは正常状態を保った。このことから、環状型RGD-改変ペプチド複合体はインテグリンαVβ3発現依存的な細胞内移行とアポトーシスを誘導することで、インテグリンαVβ3発現細胞特異的な細胞毒性を示すことが明らかとなった。改変ペプチドと細胞内ミトコンドリアとの電気的相互作用をさらに高めるために、環状型RGD-改変ペプチド複合体のC末端に静電荷を持つアミノ酸であるアルギニンを付加したところ、インテグリンαVβ3発現細胞に対する細胞毒性の上昇が観察された。しかしながら、アルギニンを6残基含む複合体{cRGD-cys-D-peptide C(R6)}では細胞選択性が維持されていたのに対して、アルギニンを8残基含む複合体{cRGD-cys-D-peptide C(R8)}の非選択的細胞毒性は抑制されなかったことから、{cRGD-cys-D-peptide C(R6)}の選択的細胞毒性はインテグリンαVβ3指向的な環状型RGDに依存している一方、{cRGD-cys-D-peptide C(R8)}の非選択的細胞毒性は無差別的な細胞内移行配列であるオクタアルギニン(R8)に依存している可能性が示唆された。本研究により作出された{cRGD-cys-D-peptide C(R6)}は、一部のガン細胞に加え、血管内皮細胞に対しても高い細胞毒性・細胞選択性を示すことから、治療薬としての可能性をもつことが分かった。新規の昆虫由来がん細胞増殖抑制物質の同定を目的として、昆虫を出発材料にスクリーニングを行った。タカサゴシロアリ磨砕液の上清を逆相カートリッジSep-Pak C_<18>に吸着後、アセトニトリルの濃度を変えて溶出することにより、粗精製を行った。溶出画分のがん細胞増殖抑制活性は、ヒト由来細胞7種、マウス由来細胞2種、アフリカミドリザル由来細胞1種を用い、培養正常細胞のマウス線維芽細胞NIH3T3と比較することにより測定した。スクリーニングの結果、タカサゴシロアリ磨砕液のアセトニトリル30%溶出画分はNIH3T3に対する増殖抑制活性は弱かったが、ヒト由来の悪性リンパ腫DAUD1,線維肉腫HT-1080,白血病細胞Jurkat及びKG-1,肺がん細胞VA13及びマウスT細胞ハイブリドーマDO-11に対してより強い活性を示すことが明らかとなった。この30%溶出画分を出発材料としてJurkat細胞に対する増殖抑制活性を指標に、逆相HPLCを用いてさらなる精製を行った。単離された活性物質のFT-ICR-MS,^1H-NMR,^<13>C-NMR,NOESY,COSY,HMBC,HMQC