hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
感染細胞におけるリステリア主要病原因子依存的なインフラマソーム形成機構の解析

細菌感染においてインフラマソーム応答は、プログラム細胞死pyroptosisやIL-1betaおよびIL-18などのサイトカイン産生を誘導する宿主免疫応答である。我々の実験結果から、AIM2がリステリア(Listeria monocytogenes)感染で誘導されるインフラマソーム応答に関与していること、またSykなどのキナーゼシグナルや1型IFNがその制御機構として働いていることが明らかとなった。一方、菌側の要因としてリステリアの主要病原因子listeriolysin Oの204番目から254番目のアミノ酸配列内にインフラマソーム活性化に関わる責任領域が含まれていることが示唆された。インフラマソーム形成はIL-1やIL-18を含む様々な炎症誘導因子を細胞外へと分泌し、宿主の炎症や細胞死、免疫応答などの生体反応を惹起することから感染症や自己免疫疾患などの病態に関わる重要なプロセスとして知られている。感染症においては、宿主が細胞内受容体であるNLRs(Nod-like receptors)を介して病原体由来のリガンドを認識することで感染を察知し、IL-1やIL-18の成熟化に必要なcaspase-1の活性化を促すが、その多くの反応にはアダプター分子であるASCが必須であることが報告されている。代表的な細胞内寄生菌であるリステリア(Listeria monocytogenes)感染でもASCを介したインフラマソーム形成は報告されているがNLRについては不明であった。今回我々の実験からDNAセンサーであるAIM2がリステリア感染を検知していることが明らかとなった。さらにNLRを介したリガンドの認識以外にもSykなどのキナーゼがインフラマソーム形成を制御する機構として働いていることが示唆された。一方、菌側の要因として主要病原因子であるlistedolysin O (LLO)がcaspase-1活性化に関与することを我々は2008年に報告した。そこで、このLLO分子内のcaspase-1活性化に重要な責任領域を絞り込んだところ、4つのドメインから構成されるLLOのうち、膜傷害活性に重要なドメイン4は不要であることが明らかとなった。現在ドメイン1-3内に変異のある株を作製し、さらに責任領域を絞り込んでいる最中である。以上の結果から、リステリア感染において細菌由来のDNAが細胞内で検知され得ること、またインフラマソーム形成が単にNLRを介したシグナルだけでなく他の細胞内シグナルや細菌由来の分子によって複雑に制御されていることが示唆された。現在、他の病原体やリガンド刺激でも同様の制御機構が働いているか、もしくはリステリア特異的なものなのか検討している。インフラマソーム形成は、様々な炎症誘導因子の分泌を促すことで感染症や自己免疫疾患などの病態に関わる重要な生体応答である。感染症においては、宿主が細胞内受容体を介して病原体由来のリガンドを感知することでインフラマソームを形成し、細胞死やIL-1betaなどのサイトカインの成熟化に必要なcaspase-1の活性化を誘導するが、その多くの反応はアダプター分子であるASCを必要とする。代表的な細胞内寄生菌であるリステリア(Listeria monocytogenes)もASCを介したインフラマソーム形成を誘導するが、昨年度我々はDNAセンサーとして知られているAIM2がリステリア感染を検知していることを明らかにした。今年度さらに検討を行い、Sykなどのキナーゼや1型IFNシグナルがインフラマソーム形成を制御する機構として働いていることを明らかにした。一方、我々は菌側の要因としてリステリアの主要病原因子であるlisteriolysin O (LLO)がインフラマソーム形成に関与すること、また4つのドメインから構成されるLLOのうち、膜傷害活性に重要なドメイン4は不要であることを2008年に報告している。そこで、このLLO分子内のインフラマソーム形成に重要な責任領域をさらに絞り込んだところ、LLOのドメイン1-3のうち、204-254番目のアミノ酸配列内に責任領域が含まれていることが示唆された。なお、マウス感染モデルではASCを欠損するとリステリア感染抵抗性が亢進することから、LLOを介したインフラマソーム形成は感染宿主全体で見た場合にはリステリアの病原性に寄与していると考えられる。
微生物の16S類似rRNAデータベースによるコンピュータ同定システムの作製

この研究は微生物をいかに簡単に同定するか、その手法を確立することを目指したものであり、研究グループは総勢20名からなり、リボソームのスモ-ルサブユニットRNA(SSU rRNA)に着目して結成された。東京大学応用微生物研究所の山里は細菌の非硫黄光合成細菌、Flavobacterium-Cytophaga、東京大学農学部の小柳津は細菌のプロテオバクテリア群、野田産業科学研究所の亀倉は好塩性古細菌、岐阜大医学部の江崎は嫌気性グラム陽性球菌、東京大学海洋研究所の清水、大和田は海洋性のプロテオバクテリア、静岡大学農学部の山田は子のう菌類、京都女子大の高桑は無色硫黄細菌、農林水産省食品総合研究所の森は乳酸菌、発酵研究所の長谷川は放線菌、発酵研究所の横田はアクチノバクテリア全般、東北大学遺伝生態研究センターの服部は低栄養細菌、東京大学応用微生物研究所の杉山は原始的な高等菌類、理化学研究所の中瀬は酵母、同鈴木はアクチノバクテリア、東大農学部の五十嵐は水素資化細菌を担当し、それぞれ膨大なデータを得た。また、国立遺伝学研究所の斉藤は系統樹作製法の開発にあたり、パソコンで簡便に使用できるNJ法のプログラムを作製した。1.供試株の収集,分離とsmall rRNA部分塩基配列の決定2.分子系統と種の同定VibrioとCytophagaは系統的に極めて多様で、それぞれ属レベルで数群に分かれた。海洋性のCytophagaの7種および3種はそれぞれ一つの属を形成した。AgrobacteriumとRhizobiumは近縁であることが確認された。光合成細菌は、分子系統と細胞内膜構造が一致しないことが明かとなった。乳酸菌では、3属、14種が塩基配列によって同定可能であるとこが示された。Sporopachiderma,Bulleraは、塩基配列により、2つの分類群に分かれた。Taphrinaは担子菌、子のう菌と並ぶ第三の高等菌類であることが示唆された。3.系統解析プログラムの作成パ-ソナルコンピュ-タ-で使用できる、能率的な近隣結合法のプログラム、および系統解析のための4つの機能を備えたプログラムを作成した。4.塩基配列決定法の検討PCRを用いてsmall rRNAのcDNAを増幅し、これをtemplateとして用いるRIまたは非RI標識塩基配列決定方法を確立した。5回の塩基配列決定法実技講習会を行った。16S rRNA塩借配列の決定.前年度に引き続き、各分類群の16S/18S rRNAの塩基配列の決定を行った。これらにより次のような系統的知見を得た。1)Flavobacterium-Cytophga Complexは12のクラスターに分かれた。そのうち、4クラスターはMK-6、8クラスターはMK-7で、キノン系は系統を反映していた。Sphingobacterium属は系統的に独立していた。3)光合成細菌は系統的にdiverseであり、非光合成細菌と互いに混在していた。特にRhodopseirillum属はdiverseであり、R.fulvumはMagnetospirillum属と近縁であった。6)射出胞子形成酵母は系統的に属としてまとまらなかった。よってこの結果は、分生子形成様式が系統的な類縁関係を反映していないことを示唆している。7)Proteobacteriaについてsequence signatureを求め同定指針をまとめることができた。2.塩基配列決定法の検討.より迅速な塩基配列決定のための、PCRーシーケンサー法の改良を行った。3.分子系統解析プログラム.塩基配列データから分子系統樹を作成するための、パスカル言語で書いたコンピュータープログラムパッケージ(平成3年度に開発)の改良を行った。改良点:比較可能な塩基配列データ数の上限が70から100に増加。塩基の挿入・欠失による進化距離も計算される。1.供試菌株の収集、分離とssu rRNA塩基配列の決定これらの決定された配列の大部分は、EMBL,DDBJなどに保存されて利用可能となっている。2.系統樹プログラムの改良パーソナルコンピュータで使用可能な系統樹解析プログラムをより簡単に利用できるように改良した。3.微生物の分類・同定の将来展望に関する勉強会を開催研究分担者および各種微生物群の分類の専門家およびコンピュータ利用の専門家を招き勉強会を開催し、将来の展望を討論した。
薬剤耐性肺炎桿菌感染症の制御を目指した耐性菌出現機構の解明

本研究では臨床で問題となっているカルバペネム耐性腸内細菌科(CRE)について、どのような耐性機構を持っているのか、またその耐性菌がどのような要因(背景)で出現するのか明らかにする事を目的としている。耐性化しやすい耐性菌の特徴や、耐性菌が出現する抗菌薬の投与法を解明することで、耐性菌感染症の蔓延を制御することが期待できる。昨年度は収集したCREについて詳細な遺伝学的背景の解明を行った。さらに報告例の少ないNmcA産生菌についてその特徴を考慮した検出法の開発も行った。1本邦分離CREの遺伝学的背景の解明CREの主な耐性機構としてカルバペネマーゼの産生が挙げられるが、分離されたカルバペネマーゼ産生大腸菌はいずれもIMP型を産生していた。ゲノム型はST131がそのほとんどを占め、プラスミド型はIncN型が多く、またその伝達頻度が高い特徴が判った。一方カルバペネマーゼ産生肺炎桿菌はいずれもIMP型であったが、IMP-6がそのほとんどを占める大腸菌に比べIMP-1ならびにIMP-6が混在している特徴があった。多種多様なCREが検出される海外とは異なる特徴を見出せた。またゲノム型は多様であることなどから大腸菌とは特徴が異なっていた。これらのCREの一部に治療中に感性株から耐性化したものも数株検出できた。遺伝子解析の結果、これら一部についてはCTX-M型酵素産生株がポーリンを欠損することで耐性化したものと推測された。2カルバペネマーゼNmcA産生菌の検出法の開発NmcA産生菌はカルバペネマーゼ遺伝子の中で唯一調節遺伝子を保有しており、その産生機構は誘導型である。この特徴を利用して従来のディスク法を改良した検出法の開発を行った。また迅速検出法としてLAMP法を利用した方法の開発も行った。いずれも感度・特異度ともに高く臨床現場で応用できるものと思われた。本研究で行った1本邦分離CREの遺伝学的背景の解明、ならびに2カルバペネマーゼNmcA産生菌の検出法の開発について順調に進めることができた。大腸菌ならびに肺炎桿菌についてカルバペネマーゼ産生株の遺伝学的背景を解明することで注目すべき特徴が明らかになった。本年度行う予定であるカルバペネマーゼ非産生菌の耐性獲得機構の解明に向けたカルバペネム感性株ならびに耐性株も臨床現場より収集することができた。またNmcA産生菌の検出法も開発できた。ディスク法を利用した手法ではさらに発展させることができ、Enterobacter属についてカルバペネム耐性株を検出しつつ、その耐性機構を識別するように改良することができた。本邦におけるCREはEnterobacter属が多いため、臨床現場で有効活用が見込まれる。これら研究成果の一部について国内外の学会にて発表しており、論文投稿に向けデータの最終調整中である。カルバペネマーゼ産生株については予定通り研究を進めることができた。今後はカルバペネマーゼ非産生CREについて耐性獲得機構の解明を目指す。臨床現場より抗菌薬治療後に感性株が耐性化した株を得ることができたので、これらを用いてどのような条件下において耐性化が起きるか解明を目指す。判別が難しいNmcA産生菌の検出法の開発については、予定通りに進めることができた。データを整理し、学術論文にその内容を投稿する予定である。また本法を応用したCREの検出・識別法の開発も行っていく。これまで本邦で報告例の多いEnterobacter属で識別可能であったため、今後は他の菌種についてもその可能性を探っていく予定である。臨床現場で問題となっている耐性菌については、各医療機関の細菌検査部や検査会社の協力を得ながら引き続き注目して行く予定である。昨年度は本邦におけるCREの収集ならびにその耐性機構の解明を行った。さらにこれまで本邦における報告例のないNMC-A産生菌を初めて分離したためその特徴についても明らかにした。1本邦におけるCREの分離培養ならびにその耐性機構の解明カルバペネム耐性株600株を収集し、その耐性機構を解明した。カルバペネマーゼ産生株について、大腸菌、肺炎桿菌ともそのほとんどがIMP型遺伝子を保有している事が判った。最も多かったIMP-6産生株は、そのほとんどがゲノム型、プラスミド型ともに共通性が多かった。カルバペネマーゼ非産生株について解析したところ、セファロスポリナーゼ(CTX-M型βーラクタマーゼやプラスミド性AmpCβ-ラクタマーゼ)を産生するポーリン欠損株が30株存在することが判明した。大腸菌、肺炎桿菌ともその欠損様式(点変異、IS挿入によるフレームシフトなど)は多様で、ゲノム型も同様に様々なタイプが存在していることが判った。2カルバペネマーゼNMC-A産生菌の分離とその耐性機構の解明CREの中からこれまで本邦での報告例のないNMC-A産生菌を分離した。本菌は欧州での報告があるが、アジア圏において初めての検出例であることが判った。

菌種はEnterobacter cloacae complexであり、調節遺伝子NMC-Rも同時に保有していた。誘導実験から、このNMC-RによってNMC-Aの発現量が調節されており、中でもカルバペネム薬が高い誘導能を持つことが明らかとなった。予定していた菌株を収集し、順調に耐性株の解析を進めることができた。カルバペネム耐性肺炎桿菌について、分子遺伝学的解析ならびに生化学的解析を行うことで耐性株の特徴を明らかにすることができた。またカルバペネマーゼ産生株についても分子疫学解析により、本邦における耐性遺伝子の特徴も解明できた。さらに本邦で初めての検出例となるカルバペネマーゼNMC-A産生菌を分離する事ができたため、さらに進展してこの耐性機構の解明も進めているところである。これら研究成果の一部について国内外の学会にて発表しており、論文投稿に向けデータの最終調整中である。本研究では臨床で問題となっているカルバペネム耐性腸内細菌科(CRE)について、どのような耐性機構を持っているのか、またその耐性菌がどのような要因(背景)で出現するのか明らかにする事を目的としている。耐性化しやすい耐性菌の特徴や、耐性菌が出現する抗菌薬の投与法を解明することで、耐性菌感染症の蔓延を制御することが期待できる。昨年度は収集したCREについて詳細な遺伝学的背景の解明を行った。さらに報告例の少ないNmcA産生菌についてその特徴を考慮した検出法の開発も行った。1本邦分離CREの遺伝学的背景の解明CREの主な耐性機構としてカルバペネマーゼの産生が挙げられるが、分離されたカルバペネマーゼ産生大腸菌はいずれもIMP型を産生していた。ゲノム型はST131がそのほとんどを占め、プラスミド型はIncN型が多く、またその伝達頻度が高い特徴が判った。一方カルバペネマーゼ産生肺炎桿菌はいずれもIMP型であったが、IMP-6がそのほとんどを占める大腸菌に比べIMP-1ならびにIMP-6が混在している特徴があった。多種多様なCREが検出される海外とは異なる特徴を見出せた。またゲノム型は多様であることなどから大腸菌とは特徴が異なっていた。これらのCREの一部に治療中に感性株から耐性化したものも数株検出できた。遺伝子解析の結果、これら一部についてはCTX-M型酵素産生株がポーリンを欠損することで耐性化したものと推測された。2カルバペネマーゼNmcA産生菌の検出法の開発NmcA産生菌はカルバペネマーゼ遺伝子の中で唯一調節遺伝子を保有しており、その産生機構は誘導型である。この特徴を利用して従来のディスク法を改良した検出法の開発を行った。また迅速検出法としてLAMP法を利用した方法の開発も行った。いずれも感度・特異度ともに高く臨床現場で応用できるものと思われた。本研究で行った1本邦分離CREの遺伝学的背景の解明、ならびに2カルバペネマーゼNmcA産生菌の検出法の開発について順調に進めることができた。大腸菌ならびに肺炎桿菌についてカルバペネマーゼ産生株の遺伝学的背景を解明することで注目すべき特徴が明らかになった。本年度行う予定であるカルバペネマーゼ非産生菌の耐性獲得機構の解明に向けたカルバペネム感性株ならびに耐性株も臨床現場より収集することができた。またNmcA産生菌の検出法も開発できた。
皮下脂肪を介したCOPD併存症の新規治療の開発

目的1:COPD症例と非COPD症例の皮下脂肪組織の脂肪細胞面積は同様だが皮下脂肪量はCOPD症例は非COPD症例と比べ減少し、COPDでは皮下脂肪の脂肪細胞数の減少によるエネルギー貯蔵能力の低下が推察された。内臓脂肪量はCOPD症例は非COPD症例と比べ変わらないものの内臓脂肪組織の脂肪細胞面積はCOPDで増大する傾向であった。よって、1:COPD症例では皮下脂肪と同様に内臓脂肪の脂肪細胞数の減少がおこる、2:COPD症例における皮下脂肪のエネルギー貯蔵能力の低下に伴い異所性エネルギーは内臓脂肪に蓄積され内臓脂肪のhypertrophy亢進(面積の増大)がおこることが推察された。目的2:豚膵エラスターゼを経気道的に注入された肺気腫モデルマウスの皮下脂肪量は投与1週後に有意差をもって減少し、投与2週後に回復する。エラスターゼ投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)では対照群と比べEP3 receptor mRNA発現は増加した。一方、エラスターゼ投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)ではEP3 receptor免疫組織学的検討によりCOPD症例では非COPD症例に比べ皮下脂肪組織のEP3発現は亢進していた。以上より、皮下脂肪改善を目的としたEP3発現を低下させる治療介入が期待された。目的3:テオフィリンの全身投与は内臓脂肪にも脂肪細胞内cAMP上昇が誘導され皮下脂肪とともに内臓脂肪量の増加が懸念される。一方、肺気腫モデルマウスで内臓脂肪にEP3 receptor mRNA発現変動を認めなかったことから、皮下脂肪改善を目的としたEP3発現を低下させる治療介入は内臓脂肪蓄積をきたさないことが示唆される。このため皮下脂肪改善を目的としたEP3発現を低下させる治療介入の検討を目的3に代わり行った。目的1:血管新生低下による皮下脂肪量の減少が内臓脂肪蓄積や糖代謝異常などCOPD併存症の原因になることの証明本研究の根幹仮説である、COPDでは皮下脂肪量の減少によるエネルギー貯蔵能力の低下から異所性脂肪が蓄積しエネルギー代謝は非効率となり、やせにもかかわらず内臓脂肪蓄積や糖代謝異常を合併する、の仮説の傍証として、高脂肪食投与下の肺気腫モデルマウスにおいて、内臓脂肪蓄積や糖代謝異常を認めること、血管刺激物質の全身投与による皮下脂肪量の改善に伴い内臓脂肪蓄積や糖代謝異常が改善することを論文報告した(Tsuji T,et al. Prostaglandins Other Lipid Mediat 130:16-22, 2017)。目的2:血管新生以外の皮下脂肪改善の因子の探索肺気腫モデルマウスとして、豚膵エラスターゼを経気道的に注入されたマウスの皮下脂肪量は投与1週後に有意差をもって減少し、投与2週後に回復することを確認した。このエラスターゼ投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)とエラスターゼ投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)を各々対照群(生理食塩水の気道内投与1、2週後のマウス)の皮下脂肪と遺伝子発現を比較し、血管新生以外の皮下脂肪改善の因子を探索していく。目的3:肺気腫モデルマウスに対し、テオフィリン投与が皮下脂肪量及び全身併存症を改善しうるかの検討本研究の根幹仮説の傍証として目的1の検討、また血管新生以外の皮下脂肪改善の因子の探索として目的2の検討、を優先して行い目的3の検討は未施行となっている。テオフィリンの全身投与により、脂肪細胞内cAMP上昇から皮下脂肪量の増加と同時に内臓脂肪量の増加も懸念される。目的2の検討において内臓脂肪は増加させず皮下脂肪量を増加させる因子が同定出来れば、肺気腫モデルマウスへその因子の投与実験を優先していく。目的1:血管新生低下による皮下脂肪量の減少が内臓脂肪蓄積や糖代謝異常などCOPD全身併存症の原因になることの証明高脂肪食投与下の肺気腫モデルマウスにおいて、内臓脂肪蓄積や糖代謝異常を認めること、血管刺激物質の全身投与による皮下脂肪量の改善に伴い内臓脂肪蓄積や糖代謝異常が改善することを論文報告し(Tsuji T,et al. Prostaglandins Other Lipid Mediat 130:16-22, 2017)、本研究の根幹仮説を強固にした。COPD症例10例、非COPD症例10例の皮下及び内臓脂肪組織切片に対する免疫染色による検討も進行中であり、目的1への達成度は順調に進展している。このエラスターゼ投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)とエラスターゼ投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)を各々対照群の皮下脂肪の遺伝子発現を比較することで、血管新生以外の皮下脂肪改善の因子を同定中であり、目的2への達成度は概ね順調に進展している。目的3:肺気腫モデルマウスに対し、テオフィリン投与が皮下脂肪量及び全身併存症を改善しうるかの検討

本研究の根幹仮説の傍証としての目的1の検討、また血管新生以外の皮下脂肪改善の因子の探索として目的2の検討、を優先して行っており、また、目的2において内臓脂肪は増加させず皮下脂肪量を増加させる因子が同定出来れば、肺気腫モデルマウスへその因子を投与実験を方向性として考えており、目的3の検討は未施行となっている。このため、達成度は十分とはいえない。目的1:COPDでは皮下脂肪量の減少によるエネルギー貯蔵能力の低下から異所性脂肪が蓄積しエネルギー代謝は非効率となり、やせにもかかわらず内臓脂肪蓄積や糖代謝異常を合併する、の本研究の根幹仮説の仮説のヒトにおける立証として、COPD症例と非COPD症例の皮下脂肪組織の脂肪細胞面積を検討した。COPD症例と非COPD症例の皮下脂肪組織の脂肪細胞面積は同様であった。一方、胸郭レベルのCT画像から算出した皮下脂肪量はCOPD症例は非COPD症例と比べ減少した。以上よりCOPDでは皮下脂肪量の脂肪細胞数の減少によるエネルギー貯蔵能力の低下が推察された。目的2:豚膵エラスターゼを経気道的に注入されたマウスの皮下脂肪量は投与1週後に減少し投与2週後に回復する。この投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)と投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)を各々対照群(生理食塩水の気道内投与1、2週後のマウス)の皮下脂肪と遺伝子発現を比較した。エラスターゼ投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)ではEP3 receptor mRNA発現は増加し、エラスターゼ投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)ではEP3 receptor mRNA発現は減少した。内臓脂肪では同様なEP3 receptor mRNA発現変動は認めなかった。EP3は脂肪組織において炎症に関与し脂肪分解抑制にシフトする作用をもち、カテコラミンによるcAMPを介した脂肪分解に対して拮抗する。このため、皮下脂肪改善を目的としたEP3発現を低下させる治療介入は内臓脂肪蓄積をきたさないと推察される。目的3:テオフィリンの全身投与は皮下脂肪のみならず内臓脂肪にも脂肪細胞内cAMP上昇が誘導され内臓脂肪量の増加も懸念される。このためテオフィリン投与されたCOPD患者の内臓脂肪量を後ろ向き研究で検討する。目的1:高脂肪食投与下の肺気腫モデルマウスにおいて、内臓脂肪蓄積や糖代謝異常を認めること、血管刺激物質の全身投与による皮下脂肪量の改善に伴い内臓脂肪蓄積や糖代謝異常が改善することを論文報告し本研究の根幹仮説を強固にし、ヒトにおける立証としてCOPD症例10例と非COPD症例10例の皮下脂肪組織の脂肪細胞面積の検討からCOPDでは皮下脂肪量の脂肪細胞数の減少によるエネルギー貯蔵能力の低下が推察され、内臓脂肪蓄積や糖代謝異常に相関するか検討を進めており、目的1への達成度は順調に進展している。目的2:エラスターゼ投与1週後のマウスの皮下脂肪(減少時の皮下脂肪)とエラスターゼ投与2週後のマウスの皮下脂肪(増加時の皮下脂肪)を各々対照群の皮下脂肪の遺伝子発現を比較し、減少時の皮下脂肪でEP3 receptor mRNA発現は増加し増加時の皮下脂肪でEP3 receptor mRNA発現は減少することを同定し、内臓脂肪では同様なEP3 receptor mRNA発現変動は認めないことから、COPDの皮下脂肪におけるEP3発現を低下させる治療介入により内臓脂肪蓄積をおこさず皮下脂肪減少を改善させることが示唆される。ヒト組織において非COPD症例に比べCOPD症例の皮下脂肪内にEP3発現上昇があれば、EP3発現を低下させる治療が介入しうる可能性があり検討を進めている。目的2への達成度は概ね順調に進展している。
金属原子導入による有機化学物質の毒性修飾とその分子機構

我々は,有機ビスマス化合物の血管内皮細胞に対して高い毒性を発現することを明らかにしている。そこで本研究の目的はその毒性発現機構を明らかにするために,有機ビスマス化合物に対する耐性細胞を獲得し,変動のあった遺伝子を探索し,遺伝子を同定し,有機ビスマス化合物の毒性発現を担う分子標的を明らかにすることである。ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーからCHO-GT細胞を有機ビスマス化合物(PMTABi,TDPBi,DAPBi)で処理し,感受性の低下した細胞を97クローン獲得した。5'RACE法にて感受性低下細胞においてトラップ(破壊)された遺伝子を増幅し,感受性低下を担う候補遺伝子を同定した。平成24年度では以下の成果を得た。1.細胞内への蓄積性:ウシ大動脈内皮細胞だけでなく,ウシ大動脈平滑筋細胞,ヒト胎児肺由来IMR-90線維芽細胞,およびブタ腎由来LLC-PK1上皮細胞についても有機ビスマス/アンチモン化合物に対する細胞毒性を調べたところ,スマスを導入した場合は毒性を示すがアンチモンを導入した場合では毒性を示さなかった(PMTABiおよびPMTASならびにDAPBiおよびDAPSb)。そこで,これらの細胞種についても,有機ビスマス/アンチモン化合物の細胞内蓄積量をICP/MSを用いてビスマスおよびアンチモン量として測定したところ,有機ビスマス化合物であるPMTABiおよびDAPBiは細胞内に高く蓄積したが,有機アンチモン化合物であるPMTASおよびDAPSbの蓄積はわずかであり,内皮細胞と同様の結果を得た。すなわち,細胞種が異なっても細胞内への蓄積が毒性の強さを決定する有力な要因の1つであることが示唆された。2.DNAマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析:有機ビスマス/アンチモン化合物に曝露したヒト冠動脈内皮細胞についてDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行った結果,DAPBiとPMTABiは共通して,p57Kip2など約1,000遺伝子が発現上昇し,CDK1など約700遺伝子が発現低下していた。3.ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーを用いた解析:ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーからPMTASに対しては抵抗性を示すが,PMTABiに対しては感受性である細胞のクローニングを行い,現時点で75のCHO-RPB1細胞の単離・獲得に成功した。樹立したPMTABi耐性RPB-1細胞系はDAPBiにも交差耐性を示すことが分かった。PMTABi耐性細胞から,有機ビスマス化合物耐性責任候補遺伝子の1つとして,LMNA遺伝子が示唆された。平成25年度はこれまでに引き続き,毒性発現を担う責任遺伝子の探索を行った。CHO-GT細胞を有機ビスマス化合物(PMTABi,TDPB,DAPBi)で処理し,感受性の低下した細胞を97クローン獲得した。これまでのLMNAの他に,TNS1,PPARγ,Adapt15,CD34,Zfp280c,LOC100762940,KIF4,Eno2などの候補遺伝子を見出すことに成功した。現在これらの遺伝子の発現をノックダウンすることで責任遺伝子を検討中である。上記の97クローンよりPMTABiに対する感受性低下細胞を3株樹立した。この感受性低下細胞について,その感受性の低下と細胞内蓄積量の関係について検討したところ,親株であるCHO-GT細胞に比べ,いずれの感受性低下細胞においてもPMTABiの細胞内蓄積量は増加していた。従って,感受性の低下は,有機ビスマス化合物の細胞内への蓄積の低下によるのではなく,細胞内での代謝あるいはそれを含む防御機構の変化に起因することが推測された。有機ビスマス化合物は有機アンチモン化合物に比べ顕著に細胞内に蓄積しやすく,同じ分子構造であるにもかかわらず導入金属がビスマスからアンチモンに置換されることによって細胞内に蓄積しなくなる。このメカニズムの同定には至らなかったが,今後,感受性低下細胞を多く樹立していくことで解決できると思われる。1.ビスマスおよびアンチモン導入による有機化合物の毒性修飾:有機ビスマス/アンチモン化合物ライブラリーを構築し,ウシ大動脈内皮細胞に対する毒性を調べ,ビスマスを導入した場合は毒性を示すがアンチモンを導入した場合では毒性を示さない化合物(PMTABiおよびPMTASならびにDAPBiおよびDAPSb)の抽出に成功した。アンチモンを導入した場合は毒性を示すがビスマスを導入した場合では毒性を示さない化合物は存在しなかった。この2組の化合物対の細胞毒性をウシ大動脈平滑筋細胞,ヒト胎児肺由来IMR-90線維芽細胞,およびブタ腎由来LLC-PK1上皮細胞についても調べたところ,内皮細胞と同様の結果を得た。2.細胞内への蓄積性:有機ビスマス/アンチモン化合物の細胞内蓄積量をICP/MSを用いてビスマスおよびアンチモン量として測定した。

有機ビスマス化合物であるPMTABiおよびDAPBiは細胞内に高く蓄積したが,有機アンチモン化合物であるPMTASおよびDAPSbの蓄積はわずかであった。すなわち,細胞内への蓄積が毒性の強さを決定する有力な要因の1つであることが示唆された。3.X線結晶構造解析: X線結晶構造解析の結果,上記有機ビスマス化合物とそれに対応するアンチモン置換体の三次元構造の違いはわずかであることが分かった。したがって,ビスマスおよびアンチモン化合物の血管内皮細胞に対する毒性の差が,三次元構造の違いによるものではないことが示唆された。4.ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーを用いた解析:ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーからPMTASに対しては抵抗性を示すが,PMTABiに対しては感受性である細胞のクローニングを行い,CHO-RPB1細胞の単離・獲得に成功した。クローニングに時間はかかったが,それ以外の実験に関しては,ほぼ予定通り進行している。有機ビスマス/アンチモン化合物ライブラリーから,ビスマスを導入した場合は毒性を示すがアンチモンを導入した場合では毒性を示さない化合物(PMTABiおよびPMTASならびにDAPBiおよびDAPSb)の抽出に成功した。また,ジーントラップ挿入変異細胞ライブラリーを用いた解析において,PMTASに対しては抵抗性を示すが,PMTABiに対しては感受性であるCHO-RPB1細胞のクローニングに成功した。これらは重要な研究成果であったが,クローニングの実験に予想以上に手間取り,DNAマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析に至らなかった。平成25年度の予定通り研究計画にしたがって進める。1.毒性発現を担い得る責任遺伝子の探索:LMNA遺伝子以外にも責任遺伝子の存在の可能性があるので、さらにクローニングを行い,耐性細胞から有機ビスマス化合物耐性責任候補遺伝子を探索する。見いだされた遺伝子を高発現させ,あるいはRNA干渉法でノックダウンさせ有機ビスマス/アンチモン化合物に対する感受性を調べる。2.有機ビスマス化合物の毒性評価系の構築:以上の検討によって同定した有機ビスマスの選択的分子標的の遺伝子を高発現したCHO細胞を作製する。この細胞を申請者らが有する有機ビスマスライブラリー(約50化合物)の毒性評価に適用し最も優れた毒性評価系を構築する。3.有機ビスマス化合物の毒性評価スキームの確立:以上の検討を通じて,有機ビスマスの毒性評価スキームの確立を試みる。1)予定通り,内皮細胞(ヒト冠動脈内皮細胞)について,DNAマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析を行う。2)CHO-RPB1細胞について,その特性を調査する。具体的には,親株(CHO-K1細胞)と比較しながら,他の有機ビスマス化合物に対する交差耐性や有機ビスマス化合物の細胞内蓄積性などを解析する。3)CHO-RBP1細胞より,トラップ(同時に破壊)された遺伝子の同定を行う。クローニンに時間がかかったので,高額な試薬類の購入回数が少なかったた研究費の使用が若干遅れた。
網膜層形成における細胞体移動を制御する遺伝子のスクリーニング

網膜の層形成期には、最終分裂を終えた神経細胞は移動を開始し、特定の細胞層に位置するようになる。このような細胞タイプに特異的な振る舞いを制御する遺伝子を同定するため、網膜の2つの細胞タイプである、神経節細胞と光受容細胞に着目し、まず、両者で異なって発現する遺伝子を得ることに当たった。そして、これまでに両細胞タイプの一方にのみ発現する遺伝子を11同定した。神経節細胞に特異的に発現する遺伝子として同定されたものの一つは、全長8.7kbにわたってタンパク質の読み枠を持たないmRNA様noncoding RNAであり、それがドット状の核内ドメインを形成していることから、Gomafuと命名した。一般的なmRNAが転写後すぐに細胞質へと搬出され、ほとんど核に局在しないことを考えると非常に興味深い性質であると言える。本年度は、Gomafuを強制発現させた培養細胞を用いて、そのようなユニークな核局在のメカニズムの解明を試みた。その結果、スプライシング因子であるSF3b複合体を標的とした薬剤であるスプライソスタチンAを作用させるとGomafu RNAが一部核外移行することが明らかになった。今後、RNA干渉法を用いてSF3b複合体に関連する遺伝子を機能阻害することで、Gomafu RNAの核局在の分子機構を明らかにすることができると期待される。さらに、Gomafu遺伝子を完全欠損させたノックアウトマウスを用い、マイクロアレイ解析や標準組織染色によりGomafuが遺伝子発現の制御や組織形成に関わる可能性について検証した。残念ながら、そうした解析によってぐ通常の環境下ではノックアウトマウスにおいて野生型と比べて顕著な差を見出すことが出来なかった。しかしながらストレス環境下でGomafuが機能を果たす可能性は十分に考えられ、今後の検証に値する。脊椎動物の中枢神経系組織に特徴的な層構造は高度な情報処理に重要な役割を果たしている。層構造の形成期には、最終分裂を終えた神経細胞は移動を開始し、特定の細胞層に位置するようになる。このような細胞タイプに特異的な振る舞いを制御する遺伝子を同定するため、網膜の2つの細胞タイプである、神経節細胞と光受容細胞に着目し、以下のようなスクリーニングを行った。マウス胚の網膜をばらばらにし、RT-PCR法により単一の細胞からランダムにcDNAを合成し、各種マーカー遺伝子の発現をサザンハイブリダイゼーションによって調べたところ、神経節細胞と光受容細胞それぞれについて単一細胞由来のcDNAを同定できた。次にこれらのcDNA間でサブトラクションを行い、in situハイブリダイゼーションによって、発現パターンを調べたところ、2つの細胞タイプの一方にのみ発現する遺伝子を11同定した。神経節細胞に特異的に発現する遺伝子として同定されたものの一つは、核に局在する、全長8.7kbにわたってタンパク質の読み枠を持たないnoncoding RNA(ncRNA)であった。本年度は、このようなユニークな特徴を持つRNAの機能を解析するため、まず、蛍光in situハイブリダイゼーションにより、その細胞内局在について詳細に調べたところ、このncRNAは核内でスペックル状のドメインを形成しており、それは既知の核内ドメインとは異なるものであった。さらに、マウスneuroblastoma由来の細胞株N2a cellにこのncRNAを遺伝子導入したところ、個体組織で見られるような核内スペックル様の局在が観察された。このncRNAを発現する細胞株は神経突起を盛んに伸長する傾向があるという予備的観察を得たので、追試を行うとともに、そのメカニズムを解明する方法としてmicro arrayを検討している。このような細胞タイプに特異的な振る舞いを制御する遺伝子を同定するため、網膜の2つの細胞タイプである、神経節細胞と光受容細胞に着目し、まず、両者で異なって発現する遺伝子を探索した。神経節細胞に特異的に発現する遺伝子として同定されたものの一つは、全長8.7kbにわたってタンパク質の読み枠を持たないmRNA様noncoding RNA (ncRNA)であり、それがドット状の核内ドメインを形成していることから、Gomafuと命名した。本年度はその核局在化のメカニズムの解明を中心に据えて研究を進めた。Gomafuが核と細胞質の間をシャトリングしていることが考えられたので、その可能性を以下のように検証した。Gomafuを過剰発現させた細胞株とGomafuを発現しない親株をフユージョンさせ、heterokaryon assayを行ったところ、Gomafu RNAが親株の核に移らなかったことから、Gomafuは核に保持されたまま搬出されないことが示唆された。また、Gomafuを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいてin situ hybridizationにより細胞内局在について調べると、大部分の組織ではGomafuは核内にドット状のシグナルとして観察されたが、表皮においてはGomafu RNAの一部が核外にも存在することが明らかになった。一方、ヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞に過剰発現させると、Gomafu RNAが分解されることを見出し、Gomafuの核局在化や安定化といった作用がある種の細胞では欠けているか弱いということが明らかになった。今後、遺伝子発現ライブラリーをHeLa細胞に導入し、Gomafuを安定に核内保持するのに必要な遺伝子のスクリーニングを行う予定である。また、Gomafuノックアウトマウスの作製が完了したので、microarrayを用いて遺伝子の発現変化を解析する。

このような細胞タイプに特異的な振る舞いを制御する遺伝子を同定するため、網膜の2つの細胞タイプである、神経節細胞と光受容細胞に着目し、まず、両者で異なって発現する遺伝子を得ることに当たった。そして、これまでに両細胞タイプの一方にのみ発現する遺伝子を11同定した。神経節細胞に特異的に発現する遺伝子として同定されたものの一つは、全長8.7kbにわたってタンパク質の読み枠を持たないmRNA様noncoding RNAであり、それがドット状の核内ドメインを形成していることから、Gomafuと命名した。一般的なmRNAが転写後すぐに細胞質へと搬出され、ほとんど核に局在しないことを考えると非常に興味深い性質であると言える。本年度は、Gomafuを強制発現させた培養細胞を用いて、そのようなユニークな核局在のメカニズムの解明を試みた。その結果、スプライシング因子であるSF3b複合体を標的とした薬剤であるスプライソスタチンAを作用させるとGomafu RNAが一部核外移行することが明らかになった。今後、RNA干渉法を用いてSF3b複合体に関連する遺伝子を機能阻害することで、Gomafu RNAの核局在の分子機構を明らかにすることができると期待される。さらに、Gomafu遺伝子を完全欠損させたノックアウトマウスを用い、マイクロアレイ解析や標準組織染色によりGomafuが遺伝子発現の制御や組織形成に関わる可能性について検証した。残念ながら、そうした解析によってぐ通常の環境下ではノックアウトマウスにおいて野生型と比べて顕著な差を見出すことが出来なかった。しかしながらストレス環境下でGomafuが機能を果たす可能性は十分に考えられ、今後の検証に値する。
江戸期の万葉博物学についての研究

万葉集所載の動物・植物を本草学の知識を応用して解釈する研究法を万葉博物学と称している。その研究の代表的な著書としては小林義兄「万葉集中禽獣虫魚草木考」、伊藤多羅「万葉動植考」、春登「万葉集名物考」、荒木田嗣興「万葉品類鈔」、やや遅れて鹿持雅澄「万葉集品物解」などが挙げられる。上記5書は万葉集所載の動物・植物を鳥・獣・虫・魚・草・木の6種類に分類し、「本草綱目」を中心とする本草書を参考に品物(ひんぶつ)解釈を試みている。本研究では、動物・植物語彙(同一物に対する異表記も含めて)約900語を対象に、著者別に品物解釈が比較・対照できるデータベース「万葉和歌博物語彙管理システム」を作成(業者に協力を依頼)し、入力した。このデータベースの和歌は塙書房刊のCD・ROM万葉集を底本とした。なお、データベースには現代の解釈も入力した。現代の解釈としては新編日本古典文学全集(小学館)「万葉集」の解釈を主に採った。入力は当初学生アルバイトを予定したが、語彙の扱いや訓読において万葉集を専攻する学生でなければ困難であることが判明し、すべて研究者一人でやった。(データが膨大な為、現段階では小林義兄、伊藤多羅まで入力し終えたが、残る三人については今後も継続する予定である。)万葉集所載の動物・植物を本草学の知識を応用して解釈する研究法を万葉博物学と称している。)江戸期の万葉博物学書、小林義兄「万葉集中禽獣虫魚草木考」・伊藤多羅「万葉動植考」・春登「万葉集名物考」・荒木田嗣興「万葉品類鈔」・鹿持雅澄「万葉集品物解」の5書中の博物語彙を抽出し、それらの語彙の解釈に関する5人の著者の意見を関連付けて検索できるデータベースを業者(江守商事)の協力により構築した。現在、その博物語彙と博物学者の解釈を入力中である。一方、鹿持雅澄「万葉集品物解」は大著「万葉集古義」の付録として編纂されたものであり、「品物解」の解釈の原点をたどるためには、「万葉集古義」そのものを参照する必要がある。平成15年度は版本「万葉集古義」(大阪府立中ノ島図書館蔵)の第十巻までをコピーした。残り十巻は16年度コピーの予定である。また、雅澄の学問は土佐の国学の流れを引くものであり、とりわけ教授館の先輩谷真潮の影響を受けているといわれる。高知県立図書館は谷真潮書写の契沖「『万葉代匠記』を所蔵(山内文庫)している。「品物解」の中に引用されている『万葉代匠記』の本文と谷真潮本の本文とを比較検討してみると完全には一致しないが、両本の間には密接な関係があることが確認された。今日、我々が見ることができる「万葉集古義」は稿本「万葉集古義」(高知県立図書館・山内文庫蔵)を除けば、すべて宮内庁書陵部本を底本としている。この本は雅澄の死後清書されて宮内省に納入されたものである。したがって清書の過程での字句の多少の改変も予想されるので完全な一致は望めない。谷本との比較には慎重でなければならない。江戸期の万葉博物学書は多かれ少なかれ「本草綱目」の説を基盤にし、「本草綱目」を引用している。江戸時代の学者が中国書の「本草綱目」の内容をどの程度正確に理解していたかを知ることも必要である。そのためには国訳の「本草綱目」を手元におく必要がある。これは古書で購入した。

上記5書は万葉集所載の動物・植物を鳥・獣・虫・魚・草・木の6種類に分類し、「本草綱目」を中心とする本草書を参考に品物(ひんぶつ)解釈を試みている。本研究では、動物・植物語彙(同一物に対する異表記も含めて)約900語を対象に、著者別に品物解釈が比較・対照できるデータベース「万葉和歌博物語彙管理システム」を作成(業者に協力を依頼)し、入力した。このデータベースの和歌は塙書房刊のCD・ROM万葉集を底本とした。なお、データベースには現代の解釈も入力した。現代の解釈としては新編日本古典文学全集(小学館)「万葉集」の解釈を主に採った。入力は当初学生アルバイトを予定したが、語彙の扱いや訓読において万葉集を専攻する学生でなければ困難であることが判明し、すべて研究者一人でやった。このデータベースは江戸時代の万葉研究を解明するための基礎研究である。本研究によって、江戸時代に難解であった品物、また、本草学の応用の実態などが明瞭になった。彼等が難解とした品物は今日も問題をはらんでいる。本研究によって、江戸時代の誤謬を訂正し、正しい品物解釈へと進むことが万葉研究の今後の課題である。
早期変形性関節症の関節軟骨破壊機構解析とそれに基づく診断・治療法開発の基礎研究

1OA関節軟骨でのHYBIDの発現とヒアルロン酸分解における役割解析:OA関節軟骨組織におけるHYBIDの発現、ヒアルロン酸分解への関与、遺伝子発現調節因子について検討した結果、OA関節軟骨のヒアルロン酸消失部位の軟骨細胞で強く発現し、HYBIDの免疫染色陽性細胞率は関節軟骨破壊スコアと正の相関を示し、HYBID mRNA発現はOA関節軟骨組織において正常関節軟骨組織より約4倍高値を示した。培養OA関節軟骨細胞におけるHYBIDに対するsiRNA処理でヒアルロン酸分解活性は完全に消失した。8種類のサイトカインや増殖因子のうち、TNF-αのみがHYBIDの発現を亢進し、ヒアルロン酸分解活性の上昇を示した。以上より、HYBIDはOA関節軟骨組織でのヒアルロン酸分解・消失に関わり、TNF-αを標的とした生物学的製剤はHYBID発現抑制を通してOA関節軟骨破壊抑制に有用な作用をもつ可能性が示唆された。2光老化皮膚症状におけるHYBIDの役割およびゲンノショウコのHYBID誘導性ヒアルロン酸分解抑制と皮膚シワ抑制効果:日本人と白人女性の露光部顔面皮膚(目尻部)におけるHYBID発現、ヒアルロン酸量と分子量、真皮乳頭層でのヒアルロン酸染色性の解析データから、HYBIDによるヒアルロン酸分解亢進が真皮乳頭層でのヒアルロン酸減少と皮膚のシワやたるみに関わることを明らかにした。また、ゲンノショウコ抽出エキスがヒアルロン酸分解活性を抑制し、同抽出エキス塗布群で皮膚弾力性とシワの改善が認められた。以上の結果より、HYBIDはヒアルロン酸分解を介して光老化皮膚症状形成に関わり、HYBID抑制作用を持つゲンノショウコ抽出エキスは光皮膚老化症状の改善に役立つ可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1ADAMTS4/5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 and 5)活性阻害性ヒト型抗体の開発:ヒト型抗体ライブラリーから、ADAMTS4とADAMTS5の両方に反応しアグリカン分解活性を阻害する抗体を得た。本抗体はADAMTS4活性を完全に阻害し、ADAMTS5活性を部分的に阻害し、これら酵素に対するKD値は11.7 nMと1.46 nMであった。本抗体はIL-1刺激した変形性関節症関節軟骨細胞由来アグリカナーゼ活性を濃度依存的に阻害し、EC50は5.4 nMであった。本抗体は変形性関節症関節軟骨破壊抑制剤として有用と期待される。2HYBID(Hyaluronan binding protein involved in HA depolymerization)遺伝子欠損マウスの開発と表現系解析:ヒアルロン酸分解に中心的な働きをするHYBID遺伝子の生体内での機能解析のため、Cre/loxPシステムを用いて同遺伝子を全身で欠損するマウスを作製した。野生型マウスではHYBID遺伝子は長管骨と脳で高発現しており、骨端板の軟骨ー骨結合部位の肥大軟骨細胞で発現していた。HYBID欠損マウスでは、四肢の長管骨に短縮がみられ、生後1-4週の時点において骨端板の肥大軟骨層の延長、同部における高分子ヒアルロン酸の貯留、肥大軟骨層の軟骨ー骨結合部位での血管新生と破骨細胞数の減少が認められた。In vitroの実験により、高分子ヒアルロン酸はVEGF刺激された血管内皮細胞の増殖とチューブ形成を抑制することを証明した。これらのデータから、HYBIDは発育時に骨端部肥大軟骨細胞で発現し、高分子ヒアルロン酸分解により血管新生と破骨細胞動員を促進して内軟骨性骨化に働いていることが示された。平成28年度交付申請で提案した研究課題のうち、1ADAMTS4/5アグリカナーゼ活性阻害性ヒト型抗体の開発、2HYBID遺伝子ノックアウトマウスの開発と表現系解析、の2研究課題については論文として発表することができ、全体としての研究進捗状況は順調である。OA関節軟骨におけるHYBIDの発現と機能解析研究については、一部を残して大部分の実験が終了しており、平成29年度には論文として発表する予定である。また、早期OAの画像診断法開発研究については、第一報の論文を投稿しており、現在論文のリバイス中である。1早期膝OA患者における内側半月板逸脱(medial meniscal extrusion=MME)とT2マッピングMRIで検出された脛骨内側骨軟骨棘距離との相関解析:骨軟骨棘の軟骨部がレントゲンやconventional MRIでは十分に検出されないのに対しT2マッピングMRIでは描出できることを利用して、早期膝OA患者を解析した。その結果、脛骨内側骨軟骨棘の出現頻度は、conventional MRIでは48%なのに対しT2マッピングMRIでは98%の患者で検出され、T2マッピングMRIによる脛骨内側骨軟骨棘距離はMMEと最も強く相関し、内側半月板T2値は3 mm以上のMMEを持つ早期膝OA患者において正の相関をもって増加した。これらのデータから、骨軟骨棘は早期膝OA患者で高頻度に出現しており、骨軟骨棘がMMEの発症と半月板変性に関わる可能性が示唆された。2HA減少およびHYBID発現亢進と光老化皮膚症状との関連解析:光老化皮膚におけるHA代謝と光老化皮膚症状(シワやたるみ)との関係を解析した。

露光部皮膚(目尻部)のシワの最大深さとたるみ値を測定した後に、同部と非露光部皮膚(前腕内側部)を同一の提供者(65-72歳の女性10名)より採取・解析した結果、露光部皮膚HA量は非露光部皮膚と比較して有意に減少しており、HAの分子量も低下していた。一方、真皮乳頭層でのHA染色性は露光部皮膚で減少しており、HYBID遺伝子発現とは負の相関を示すとともに、露光部皮膚でのHYBID発現はシワの最大深さおよびたるみ値と正の相関を示した。さらに、露光部皮膚乳頭層でのHA染色性の減少はシワの最大深さとたるみ値と正の相関を示した。これらのデータから、露光部皮膚真皮でのHYBIDによるHA減少は皮膚の光老化に関わることが示唆された。平成29年度交付申請で提案した研究課題のうち、1早期OAの画像診断法開発研究については論文として発表することができ、2HYBIDによるHA分解が光老化皮膚の症状に関与することを証明することができた。膝OA関節軟骨におけるHYBIDの発現と機能解析研究に関しては、一部の実験を残して大部分が終了しており、論文作成準備中である。また、OA滑膜組織におけるHYBIDの発現と関節液中HAの解析研究については、引き続き実験を継続しており、平成30年度には論文として発表する予定である。これらのことから、全体としての研究進捗状況は順調である。1OA関節軟骨でのHYBIDの発現とヒアルロン酸分解における役割解析:OA関節軟骨組織におけるHYBIDの発現、ヒアルロン酸分解への関与、遺伝子発現調節因子について検討した結果、OA関節軟骨のヒアルロン酸消失部位の軟骨細胞で強く発現し、HYBIDの免疫染色陽性細胞率は関節軟骨破壊スコアと正の相関を示し、HYBID mRNA発現はOA関節軟骨組織において正常関節軟骨組織より約4倍高値を示した。培養OA関節軟骨細胞におけるHYBIDに対するsiRNA処理でヒアルロン酸分解活性は完全に消失した。8種類のサイトカインや増殖因子のうち、TNF-αのみがHYBIDの発現を亢進し、ヒアルロン酸分解活性の上昇を示した。以上より、HYBIDはOA関節軟骨組織でのヒアルロン酸分解・消失に関わり、TNF-αを標的とした生物学的製剤はHYBID発現抑制を通してOA関節軟骨破壊抑制に有用な作用をもつ可能性が示唆された。2光老化皮膚症状におけるHYBIDの役割およびゲンノショウコのHYBID誘導性ヒアルロン酸分解抑制と皮膚シワ抑制効果:日本人と白人女性の露光部顔面皮膚(目尻部)におけるHYBID発現、ヒアルロン酸量と分子量、真皮乳頭層でのヒアルロン酸染色性の解析データから、HYBIDによるヒアルロン酸分解亢進が真皮乳頭層でのヒアルロン酸減少と皮膚のシワやたるみに関わることを明らかにした。また、ゲンノショウコ抽出エキスがヒアルロン酸分解活性を抑制し、同抽出エキス塗布群で皮膚弾力性とシワの改善が認められた。以上の結果より、HYBIDはヒアルロン酸分解を介して光老化皮膚症状形成に関わり、HYBID抑制作用を持つゲンノショウコ抽出エキスは光皮膚老化症状の改善に役立つ可能性が示唆された。本研究においては、早期OAの病態解明と早期OAの診断・治療法開発を目的としている。