hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
同種靭帯移植材料の放射線滅菌処理に関する生化学・生体力学的研究

同種腱移植のモデルとして我々が確立したラット膝蓋腱の外側1/2を移植するモデルで,移植材料の新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法による違い,また,放射線照射の滅菌方法による移植腱の術後経過の違いを生化学的,生体力学的に,比較検討した.新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法では,移植後2週間で移植腱内のコラーゲン量は減少し,その後移植後4週から12週にかけてコラーゲン新生がおこり,移植腱全体として20%から40%コラーゲン含量が増加した.凍結乾燥のほうが移植後4週で移植腱内の繊維のコラーゲンのターンオーバーが促進されていた.放射線照射を行った群では,移植腱内のコラーゲンは放射線照射を行わない群より減少した.放射線滅菌により移植腱内のコラーゲンのターンオーバーは促進され,その効果は新鮮凍結した群より凍結乾燥した移植群でより顕著であった.移植後4週の移植腱内にはレシピエントからの細胞侵入が確認されたが,凍結乾燥と放射線照射した移植腱は,コラーゲン線維間の間隙が新鮮凍結保存した移植腱に比べて大きかった.同様のモデルを用いて,移植後の膝蓋腱を採取し,その力学的特性を検討した.新鮮凍結と凍結乾燥に放射線滅菌を施した移植腱は,後者の方が移植後早期の力学的な材料特性が弱かったが,移植後両者ともその材料特性は脆弱化するため,両処理群間には優位差はなく,6週以降力学的に強度が増していた.以上の結果より,同種移植腱は,放射線照射により力学的強度が低下する問題点が指摘されたが,移植後のリモデリングの過程でホストより細胞浸潤を受けて移植腱内での基質合成が行われ,力学的強度が回復し,自家腱移植と同等の強度を得ることが明らかとなった.術後に負荷をさけるとリハビリテーションプログラムを実施することにより,ウイルス感染などに対し安全で,かつ,保存のより簡便な,凍結乾燥,放射線滅菌処理同種腱の利用が可能であることを示した.同種腱移植のモデルとして我々が確立したラット膝蓋腱の外側1/2を移植するモデルで,移植材料の新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法による違い,また,放射線照射の滅菌方法による移植腱の術後経過の違いを生化学的,生体力学的に,比較検討した.新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法では,移植後2週間で移植腱内のコラーゲン量は減少し,その後移植後4週から12週にかけてコラーゲン新生がおこり,移植腱全体として20%から40%コラーゲン含量が増加した.凍結乾燥のほうが移植後4週で移植腱内の繊維のコラーゲンのターンオーバーが促進されていた.放射線照射を行った群では,移植腱内のコラーゲンは放射線照射を行わない群より減少した.放射線滅菌により移植腱内のコラーゲンのターンオーバーは促進され,その効果は新鮮凍結した群より凍結乾燥した移植群でより顕著であった.移植後4週の移植腱内にはレシピエントからの細胞侵入が確認されたが,凍結乾燥と放射線照射した移植腱は,コラーゲン線維間の間隙が新鮮凍結保存した移植腱に比べて大きかった.同様のモデルを用いて,移植後の膝蓋腱を採取し,その力学的特性を検討した.新鮮凍結と凍結乾燥に放射線滅菌を施した移植腱は,後者の方が移植後早期の力学的な材料特性が弱かったが,移植後両者ともその材料特性は脆弱化するため,両処理群間には優位差はなく,6週以降力学的に強度が増していた.以上の結果より,同種移植腱は,放射線照射により力学的強度が低下する問題点が指摘されたが,移植後のリモデリングの過程でホストより細胞浸潤を受けて移植腱内での基質合成が行われ,力学的強度が回復し,自家腱移植と同等の強度を得ることが明らかとなった.術後に負荷をさけるとリハビリテーションプログラムを実施することにより,ウイルス感染などに対し安全で,かつ,保存のより簡便な,凍結乾燥,放射線滅菌処理同種腱の利用が可能であることを示した.靱帯損傷に対する外科的再建術として靱帯移植術が広くおこなわれているが,本研究は同種腱移植術をさらに広く安全に確実に行うために,生物学的,力学的により優れた同種靱帯移植材料の開発を目的に,移植腱の新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法にさらにガンマ放射線滅菌による腱の移植後の特性を,生化学的,生体力学的方法を用いて研究した.1.同種腱移植のモデルとして我々が確立したラット膝蓋腱の外側1/2を移植する方法を用いて,移植材料の各種保存方法,滅菌方法による移植腱の術後経過の違いを生化学的に比較検討した.同種移植腱は,その保存方法によらず,放射線滅菌を行わないと移植2週でコラーゲン量は減少し,その後,移植後4週から12週にかけてコラーゲン新生がおこり移植腱全体として20%から40%コラーゲン含量が増加した.凍結乾燥保存し放射線欠勤を行うと,移植腱内のコラーゲンは移植後より多く減少,結果として移植腱内のコラーゲン含量は放射線滅菌を施さない群より少なかった.移植腱の保存方法として,新鮮凍結と凍結乾燥では,凍結乾燥の方が移植後4週で移植腱内の線維のコラーゲンのターンオーバーが促進されていた.また,放射線滅菌により移植腱内のコラーゲンのターンオーバーが促進され,その効果は凍結乾燥した移植材料でより顕著であった.移植後4週の移植腱内にはレシピエントからの細胞侵入が確認されたが,凍結乾燥と放射線滅菌処理を施行した移植腱は,コラーゲン線維間の間隙が新鮮凍結保存した移植腱に比べて大きかった.2.同様のモデルを用いて,同種腱移植を行ったのち移植後の膝蓋腱を採取し,その力学的特性を検討した.

生体力学的には,新鮮凍結と凍結乾燥にガンマ放射線滅菌を施した移植腱は,後者の方が弱かったが,移植後両者ともその材料特性は脆弱化するため,両処理群間に有意差はなかった.靭帯損傷に対する外科的再建術として靭帯移植術が広くおこなわれているが,本研究は同種腱移植術をさらに広く安全に確実に行うために,生物学的.力学的により優れた同種靭帯移植材料の開発を目的に,移植腱の新鮮凍結保存法と凍結乾燥保存法にさらにガンマ放射線滅菌による腱の移植後の特性を,生化学的,生体力学的方法を用いて研究した.1.同種腱移植のモデルとして我々が確立したラット膝蓋腱の外側1/2を移植する方法を用いて,移植材料の各種保存方法,滅菌方法による移植腱の術後経過の違いを生化学的に比較検討した.同種移植腱は,その保存方法によらず,放射線滅菌を行わないと移植後2週でコラーゲン量は減少し,その後.移植後4週から12週にかけてコラーゲン新生がおこり移植腱全体として20%から40%コラーゲン含量が増加した.凍結乾燥保存し放射線滅菌を行うと.移植腱内のコラーゲンは移植後より多く減少,結果として移植腱内のコラーゲン含量は放射線滅菌を施さない群より少なかった.移植腱の保存方法として,新鮮凍結と凍結乾燥では,凍結乾燥の方が移植後4週で移植腱内の線維のコラーゲンのターンオーバーが促進されていた.また,放射線滅菌により移植腱内のコラーゲンのターンオーバーは促進され,その効果は凍結乾燥した移植材科でより顕著であった.移植後4週の移植腱内にはレシピエントからの細胞侵入が確認されたが,凍結乾燥と放射線滅菌処理を施行した移植腱は,コラーゲン線維間の間隙が新鮮凍結保存した移植腱に比べて大きかった.2.同様のモデルを用いて,同種腱移植を行ったのち移植後の膝蓋腱を採取し,その力学的特性を検討した.生体力学的には,新鮮凍結と凍結乾燥にガンマ放射線滅菌を施した移植腱は,後者の方が弱かったが,移植後両者ともその材料特性は脆弱化するため,両処理群間に有意差はなかった.
有害・有毒プランクトンへの高効率な新奇遺伝子導入系の開発

ノリの色落ちの原因藻として知られる珪藻Rhizosolenia属に感染するウイルスおよび魚類の斃死を引き起こすラフィド藻Heterosigma akashiwoに感染するウイルスのゲノムDNAの配列を解析し,それらに含まれる遺伝子領域を推定し、その上流に位置するプロモーター領域を分離した。さらに、上記2種の有害藻の固相培養系について検討した結果、混釈固相培養によりこれらの培養が可能であった。前述したウイルス由来プロモーターを用い、これらの有害藻の形質転換を試みた結果、Rhizosolenia属の形質転換に成功した。本結果は、海産有害・有毒藻の形質転換系の確立事例として、世界初の成果である。有害・有毒プランクトンの固相培養系の確立Rhizosolenia属藻およびHeterosigma属藻の固相培養法を検討した。その結果、いずれのプランクトンも、超低濃度(0.150.20%)のアガロースを用いた混釈固相培養を行うことにより、コロニーが得られた。後者の種については、再現実験によりコロニー形成が認められたが、前者の種については、その後行った再現実験により追試が出来なかった。パーティクルガンを用いた有害・有毒プランクトンへの遺伝子導入法の検討前年度作製した藻類ウイルスのプロモーターを含む遺伝子導入用プラスミドを用いて、パーティクルガン法(Miyagawa et al. 2009)により、Rhizosolenia属藻およびHeterosigma属藻に対して遺伝子導入を試みた。その結果、前者の種について形質転換体と思われる、抗生物質ゼオシンに耐性を示す株を取得することが出来た。一方、後者の種についてはパーティクルガン法による撃ち込み後の細胞回収の際に、細胞が凝集することから、その後の塗抹の操作が困難であり、形質転換体の取得が出来なかった。導入遺伝子の発現量解析ならびにプロモーターの適用範囲の検討導入を図った抗生物質耐性遺伝子が細胞に導入されたか推定するために、ゲノミックPCRを実施した結果、Rhizosolenia属藻については、野生株には見られない増幅産物が認められたため、遺伝子は導入されたと考えられた。そこで、これが発現しているか確認するために、RT-PCRを実施した。その結果、野生株には見られない抗生物質耐性遺伝子に由来すると考えられる増幅産物を確認出来たことから、導入遺伝子は発現していると考えられた。以上の結果により、これまで遺伝子導入に関する報告が全く無い上記2種の有害藻のうち、ノリの色落ちなど引き起こすRhizosolenia属藻の遺伝子導入に成功した。1、プランクトン感染性ウイルス由来のプロモーターの分離ノリの色落ちの原因藻の1種として知られる珪藻Rhizosolenia属に感染するウイルスさらには魚類の斃死を引き起こすラフィド藻Heterosigma akashiwoに感染するウイルスに注目し、連携研究者から分譲を受けたこれらのウイルス粒子より、ゲノムDNAをそれぞれ抽出した。同時に、提供を受けたウイルスのゲノムDNAの部分配列を解析した。その際、DNA配列の精度を高めるために繰り返し配列決定を行った後に、これらに含まれる遺伝子領域を特定することに成功した。これを踏まえて、プロモーター(遺伝子のスイッチの役割を果たす)を含むその上流領域を、PCR法により増幅することに成功した。2、各種ウイルスプロモーターを組み込んだ遺伝子導入用プラスミドの構築遺伝子導入用プラスミドの構築のために、MultiSite Gateway Proシステム(invitrogen社製)を用いることにより、抗生物質耐性遺伝子と、上記のウイルス由来のプロモーターとターミネーターをそれぞれプラスミドに組み込むことに成功した。3、有毒・有毒プランクトンの抗生物質感受性試験上述したプランクトンについて感受性試験を行った結果、いずれの藻も抗生物質ノールセオスリシンに対して感受性を示すことが明らかとなった。以上の結果により、これまで全く報告の無い上記の有害藻への遺伝子導入を行う際に必須となるツールならびに情報が取得出来た。よって、これら有害プランクトンへの遺伝子導入法を世界に先駆けて確立するための基盤が整った。有害・有毒プランクトンに適用可能な優良プロモーターの選抜ノリの色落ち原因藻の1種である中心目珪藻Rhizosolenia属に対し、有効に働くウイルスプロモーターを検討した結果、本属藻に感染するウイルスであるRsRNAVに由来するプロモーターが、本藻の形質転換に有効であることが明らかとなった。また、記憶喪失性貝毒(ASP)の原因藻として知られ、羽状目珪藻の1種であるPseudo-nitzchia属藻の形質転換を視野に入れて、同じく羽状目珪藻のモデル種と知られるPhaeodactylum tricornutumを用いて、本種にも適用可能なウイルスプロモーターについて検索した結果、中心目珪藻Chaetoceros属藻に感染するウイルス由来プロモーターがP. tricornutumにも適用可能であることが判明した。人工的プロモーター創生の可能性の検討

上記の解析により得られた各種の珪藻感染ウイルス由来プロモーターに関して、Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements (PLACE)を用いて、それらの塩基中に存在するモチーフ配列を検索した結果、導入遺伝子を強く発現するプロモーターにはMyb motifと思われる配列が見られた。本結果を踏まえ、今後他のモチーフの配列情報も抽出し、これらを組み合わせるなどして、さらに強く導入遺伝子を発現させるものや、生物の綱を越えるなどしてより広範囲の生物種に適用可能な、人工的`スーパープロモーター'の創生の実現が期待される。水産学・水産学一般「有害・有毒プランクトンの固相培養系の確立」に関しては、交付申請書に記載したノリの色落ちの原因藻の1種として知られる珪藻Rhizosolenia属と、魚類の斃死を引き起こすラフィド藻Heterosigma akashiwoとを用いて検討した結果、いずれもコロニーを得ることが出来た。後者の種については、再現実験によりコロニー形成が認められたが、前者の種については、その後行った再現実験により追試が出来なかった。さらに、「パーティクルガンを用いた有害・有毒プランクトンへの遺伝子導入法の検討」については、前者の種について形質転換体を取得することが出来た。一方、後者の種については形質転換体の取得が出来なかった。また、「導入遺伝子の発現量解析ならびにプロモーターの適用範囲の検討」については、前者の種については、細胞内への遺伝子の導入を確認することが出来た。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると判断した。「1、プランクトン感染性ウイルス由来のプロモーターの分離」に関しては、交付申請書に記載したノリの色落ちの原因藻の1種として知られる珪藻Rhizosolenia属に感染するウイルス、魚類の斃死を引き起こすラフィド藻Heterosigma akashiwoに感染するウイルス、さらに貝類の斃死を引き起こす渦鞭毛藻Heterocapsa circularisquamaに感染するウイルスのうち、前2者についてそのプロモーターを含む領域の分離に成功した。また、「2、各種ウイルスプロモーターを組み込んだ遺伝子導入用プラスミドの構築」についても、得られた2種のプロモーターのいずれについても、これらを組み込んだ遺伝子導入用ベクターの構築に成功することが出来た。さらに、「3、有毒・有毒プランクトンの抗生物質感受性試験」についても、いずれの藻についてもその感受性を明らかにすることが出来た。今年度得られた結果に基づき、次年度は以下の研究項目について検討する。1、パーティクルガンを用いた有害・有毒プランクトンへの遺伝子導入法の検討Heterosigma属藻については、形質転換時の細胞回収時に、細胞が凝集しないように、走光性を利用するなどして遠心分離を行わずに細胞を集める手法について検討した上で、形質転換が可能か検討する。
内耳発生における幹細胞・前駆細胞の増殖・分化制御機構の解明と再生医療への応用

我々は今回の科学研究費補助金の給付を受けて、マウスを用いて哺乳類内耳発生における幹細胞・前駆細胞の増殖・分化制御機構の解明を試みた。まず平成20年度には我々はHes1と活性化Notch1(actN1)の胎生期マウス内耳における詳細な発現パターンを示し、加えてHes1KOマウスを解析することで、Notch伝達系がHes1をエフェクターとしてp27Kip1の発現を抑制することでSensory precursor cellの増殖維持に寄与していることを示した。この結果をは英文論文として発表した(Murata et al.,J Neurosci Res,2009)。平成20年度から平成21年度にかけてリン酸化Akt(pAkt)とPI3K-Akt伝達系の拮抗因子であるPTENの発現パターンを検討し、胎生期ではPTENは感覚上皮予定領域にほぼ一致して発現が開始し、胎生後期では蝸牛上皮の中では有毛細胞に限局して陽性となるという特徴的な発現パターンが観察されることを明らかにし、国内外の学会で発表した。この結果からPI3K-Aktシグナル伝達系はSensory precursor cellの増殖制御や未分化性の維持に関連した機能を持つ可能性が推察され、平成21年度からは実際にPI3K-Akt伝達系の内耳発生における機能を解析するための研究を開始した。具体的にはPTEN-floxマウスをカナダトロント大学のTak Mak教授のラボより導入し、一方でJackson LabよりCre-Foxg1マウスを購入して繁殖させた上で交配し、内耳特異的なPTENコンディショナルノックアウト(cko)マウスの作製を開始した。このマウスではPI3K-Akt伝達系が持続的に活性化されることになるが、過去の他臓器での同様の実験の報告や、我々の検討したPTENの内耳発生での発現パターンの結果から、Sensory precursor cellの分裂がwild typeに比して長期にわたって継続することと未分化性の維持が継続することで有毛細胞の分化が遅れること等が観察されるのではないかと考えている。平成22年度は年度半ばの7月に研究代表者が大阪大学より順天堂大学へ異動となったため、研究の主な対象であり、また作成過程であったPTENコンディショナルノックアウト(cko)マウスを凍結受精卵として移動させた。凍結受精卵は順天堂大学動物実験施設で固体化することができ、現在繁殖、解析中である。今年度我々はほ乳類内耳発生における感覚上皮予定領域決定におけるNotchシグナル伝達系の機能を他のシグナル伝達系との関連を含めて検討することを目的としていた。Notchシグナル伝達系が細胞分化のみならず感覚上皮予定領域の決定に関与している可能性については我々の報告も含めて既にいくつかの結果が報告されているが、そのエフェクターについては未だに決定的な報告がないのが現状である。我々はエフェクターとしてHeslに注目しHeslがmRNAレベルでも蛋白レベルでも細胞分化以前の段階で活性化Notchlと非常に密に関連した形式で発現していることを示した。

一方でHeslKOマウスを解析し、胎生期蝸牛上皮においてp27Kiplがより早期に発現しBrdU陽性の増殖細胞数が減少していることを観察し論文とした(投稿中)。一方Notchシグナル伝達系と他のシグナル伝達系の感覚上皮予定領域決定における相互作用の可能性について検討するために今年度はまずPI3K-Aktシグナル伝達系に注目し、研究の第一歩としてリン酸化AktとPTER(PI3K-Aktシグナル伝達系の拮抗因子)の発現について検討した。その結果リン酸化Aktが胎生期マウス蝸牛上皮において発現していること、およびPTENが感覚上皮予定領域決定の直後からこの領域に特異的に発現し以降徐々に有毛細胞に限局していくことを観察した。この結果から予想してきたようにPI3K-Aktシグナル伝達系が感覚上皮予定領域を形成する細胞の増殖および未分化性維持に関与している可能性が示唆されたので次年度は器官培養を用いての機能解析を予定している。我々は平成20年度にリン酸化Akt(pAkt)とPI3K-Akt伝達系の拮抗因子であるPTENの発現パターンを胎生期と生後のマウス内耳で明らかにした。胎生期ではPTENは感覚上皮予定領域にほぼ一致して発現が開始し、胎生後期では蝸牛上皮の中では有毛細胞に限局して陽性となるという特徴的な発現パターンが観察され、この結果を国内外の学会で発表した。この結果からPI3K-Akt伝達系はSensory precursor cellの増殖制御や未分化性の維持に関連した機能を持つ可能性が推察された。本年度はこの結果をもとにさらに発現パターン解析を詳細に行うことと、実際にPI3K-Akt伝達系の内耳発生における機能を解析するための研究実施を予定していた。発現パターンについてはこれまでの蝸牛上皮における発現のみでなく、蝸牛神経節細胞における発現も検討し、神経細胞に発現が観察されるがこれも生後14日目までにはほぼ消失し有毛細胞の場合と同様に一過性の発現であることを確認した。機能解析については、一つはpAktを強制発現可能なAkt-Merを発現するトランスジェニックマウスの胎生期蝸牛の器官培養系用いてPI3K-Akt伝達系の阻害因子、または40HTを器官培養に添加することで同伝達系をoffにした場合とonにした場合の両方の蝸牛発生における影響を検討する予定であったが、現在は器官培養系の確立のための準備実験中である。もう一つの方法としてはPTEN-floxマウスとCre-Foxglマウスを交配し内耳特異的なPTEN-CKOマウスを作製・解析することを予定していた。今年度はカナダトロント大のTak Mak教授とMTAをかわしてPTEN-floxマウスを導入し、一方Jackson Labより科研費からの支出でCre-Foxglマウスを購入した。両系統とも順調に繁殖し近くCKOマウスの解析を開始する予定である。我々は平成20年度から平成21年度にかけてリン酸化Akt(pAkt)とPI3K-Akt伝達系の拮抗因子であるPTENの発現パターンを検討し、胎生期ではPTENは感覚上皮予定領域にほぼ一致して発現が開始し、胎生後期では蝸牛上皮の中では有毛細胞に限局して陽性となるという特徴的な発現パターンが観察されることを明らかにした。
半導体ナノ粒子への高密度キャリアドープによる局在プラズモン‐励起子協奏現象の研究

ナノメートルサイズの金属微粒子に可視光を照射すると自由電子の集団振動が励起され、これに伴って微粒子近傍に巨大な光電場が発生する。この現象は局在プラズモン共鳴と呼ばれ、光が関係する様々な技術の効率を向上させるのに役立つと考えられている。本研究では、金属とは異なり局在プラズモンの周波数を赤外光領域でチューニングできるとされている半導体ナノ粒子に着目した。硫化銅ナノ粒子の基礎光学特性を詳細に調べ、局在プラズモン共鳴の特徴を明らかにした。また、その共鳴周波数の制御法を開発した。高密度キャリアドープ半導体ナノ粒子を得るため、硫化銅ナノ粒子を選んだ。銅欠損を導入すると硫化銅ナノ粒子に正孔をドープできる。このような硫化銅ナノ粒子を化学的に合成する方法を開発し、サイズと銅欠損の量を精密に制御することに成功した。Cu/S比は2.01.8の範囲で変化し、粒径は45 nmでほぼ一定であることを確かめた。これらの硫化銅ナノ粒子は近赤外域にブロードな吸収帯を示した。硫化銅ナノ粒子を分散させる有機溶媒を交換すると吸収ピーク波長は変化し、溶媒の屈折率が大きいとピークが長波長に現れる特徴を示した。この特徴は吸収帯の起源が局在プラズモン共鳴であることを示している。しかし、溶媒の屈折率への依存性が理論的な予測よりもはるかに小さかった。原因として硫化銅ナノ粒子の表面配位子の影響が考えられるため、配位子の交換法の検討を開始した。局在プラズモンによる吸収帯のピーク位置は硫化銅ナノ粒子のCu/S比に依存して異なった。銅欠損が多いほどピークは短波長にあった。Mie理論により局在プラズモン吸収帯を解析してキャリア密度を見積もった結果、キャリア密度は1cm3当り10の21乗程度で、銅欠損が多いほどキャリア密度が高いことがわかった。銅欠損の少ない硫化銅ナノ粒子は近赤外発光を示し、銅欠損が増加すると発光は弱くなった。キャリア密度の違いが励起状態に影響していると考えられるので、励起緩和ダイナミクスを調べるため発光寿命測定装置を組み立てた。また、欠損、キャリア密度、発光に関する知見を得るため、同じカルコゲナイド半導体であるカルコパイライトのナノ粒子の発光特性を調べ、発光機構が欠損に関係することを示した。硫化銅ナノ粒子の場合は一つのナノ粒子におけるプラズモンと励起子の相互作用が研究対象であるが、比較のために励起子とプラズモンを独立に制御できる貴金属ー半導体複合ナノ粒子の合成に着手した。1.硫化銅ナノ粒子のバンド間遷移の吸収端のエネルギーは、キャリア密度が高い試料ほど高エネルギーにシフトした。硫化銅の自由キャリアは正孔であり、銅空孔の存在によりフェルミ準位が価電子帯内に下がり、正孔が増加することが理論計算により指摘されている。このとき光学バンドギャップは広がることになる(バースタイン・モス効果)。今回、硫化銅ナノ粒子において、この現象を観測することができた。これは金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴とは異なる半導体ナノ粒子の特徴である。2.一般に局在表面プラズモンの共鳴周波数はナノ粒子の周囲の媒質に敏感で、媒質の屈折率の変化に伴って周波数は変化する。しかし硫化銅ナノ粒子は、共鳴周波数の屈折率依存性がMie理論により予測されるよりも小さかった。これがナノ粒子の表面配位子が存在するためであることを、ナノ粒子サイズと配位子の長さを変化させて調べ、初めて明らかにした。3.硫化銅ナノ粒子の三次非線形感受率を測定した。非線形感受率は局在表面プラズモンに対して共鳴増大した。また粒子サイズに依存して値は変化した。これらの特徴は定性的に金属ナノ粒子のそれを一致しており、本質的に同様のプラズモン特性を示すことがわかった。しかし、同じサイズの金ナノ粒子と比較すると、非線形感受率は一桁小さいことを見出した。これはプラズモン励起の際にナノ粒子の感じる局在光電場が、半導体ナノ粒子では金ナノ粒子よりも小さいことを示唆している。この理由は未解明であるが、キャリア密度に差があることが関係する可能性がある。4.局在プラズモンと励起子のクロスオーバーを広い範囲で調べるため、硫化銅ナノ粒子よりも低キャリア密度の硫化物半導体ナノ粒子であるカルコパイライトのナノ粒子の光物性を調査した。5.プラズモンと励起子を独立に制御できる貴金属ー半導体複合ナノ粒子の作製に成功した。本研究では半導体ナノ粒子のキャリア密度を制御して、光学応答の主体が低キャリア密度の励起子から、高キャリア密度での局在プラズモンにクロスオーバーする過程を調べ、両者が共存する領域で両者の相互作用によって発現する現象を明らかにする。平成27年度には、キャリア密度を制御した硫化銅ナノ粒子を対象に研究を実施したが、キャリア密度が高いため局在プラズモン共鳴が主体であり、励起子を観測するに至っていない。キャリア密度をより減少させたナノ粒子を準備する必要があり、そのために硫化銅ナノ粒子の作製法を改善すると同時に、低いキャリア密度が実現できるカルコパイライトナノ粒子の準備と研究を平行して進めている。一方、硫化銅ナノ粒子の局在表面プラズモンに関しては、先行して研究を進め、従来から良く知られている金属ナノ粒子のプラズモンとは異なる、半導体ナノ粒子の局在表面プラズモンの特徴を幾つか見出すことができた。その中には、フォトニクス応用に重要な、半導体ナノ粒子のプラズモンについては局在電場効果が小さいことがある。

また、励起子応答と局在表面プラズモンの協奏現象を研究する場として金属ー半導体複合ナノ粒子を取り上げ、金属コア-半導体シェルの構造を持つ複合ナノ粒子を準備した。コアの局在表面プラズモンとシェルの励起子の相互作用を研究する準備を進めている。1.高濃度にキャリアをドープした半導体ナノ粒子は近赤外領域に局在表面プラズモン共鳴を示す。局在表面プラズモンを共鳴励起したときに発生する近接場光の強さを評価するため、非線形分光をおこなった。同じサイズの球形の硫化銅ナノ粒子と金ナノ粒子を準備し、共鳴条件下で三次非線形感受率を測定した。非線形感受率から見積もった硫化銅ナノ粒子の局所電場増強の大きさは、金ナノ粒子の半分程度であることがわかった。この結果は、半導体ナノ粒子によって発生する近接場光が金属ナノ粒子よりも弱いことを示唆しており、半導体ナノ粒子のプラズモニクス応用において欠点となることを意味している。2.平らな円板状の硫化銅ナノ粒子の合成法を開発し、これらをアスペクト比の異なるナノ粒子群に分離することに成功した。従来から観測されてきた面内方向にキャリアが振動するプラズモンモードに加えて、面直方向に振動するモードを初めて観測した。共鳴波長の示す溶媒の屈折率依存性とアスペクト比依存性を調べて、局在表面プラズモンであることを確認した。平板状のナノ粒子に特有の異方的な局在表面プラズモンを半導体ナノ粒子において実証したのは本研究が初めてである。3.硫化物半導体と銀で構成された複合ナノ粒子を開発した。銀を核として硫化物半導体で周囲を覆ったコアシェル型ナノ粒子と、銀と硫化物半導体がhead-to-tailに結合したヤヌス型ナノ粒子を合成した。このような複合ナノ粒子は、太陽電池の増感剤や光触媒への応用が期待されてきた。励起子応答と局在表面プラズモンの協奏現象を観測するため、銀の局在表面プラズモンと半導体の励起子吸収バンドの波長を近づけて、吸収スペクトルを観測した。その結果、コアシェル構造に対して電磁場解析により予測したよりも共鳴波長が大きくシフトすることがわかった。これは、両者の間に何らかの相互作用が働くことを示唆している。ナノメートルサイズの金属微粒子に可視光を照射すると自由電子の集団振動が励起され、これに伴って微粒子近傍に巨大な光電場が発生する。この現象は局在プラズモン共鳴と呼ばれ、光が関係する様々な技術の効率を向上させるのに役立つと考えられている。本研究では、金属とは異なり局在プラズモンの周波数を赤外光領域でチューニングできるとされている半導体ナノ粒子に着目した。硫化銅ナノ粒子の基礎光学特性を詳細に調べ、局在プラズモン共鳴の特徴を明らかにした。また、その共鳴周波数の制御法を開発した。本研究では半導体ナノ粒子のキャリア密度をコントロールして、光学応答の主体が低キャリア密度での励起子から、高キャリア密度での局在プラズモンにクロスオーバーする過程を調べることと、両者の相互作用によって発現する現象を明らかにする。平成26年度には、まず本研究の試料として必要である局在プラズモン共鳴を示す高密度にキャリアをドープした硫化銅ナノ粒子を作製する方法を開発した。
細胞のダイナミクスに対応した動的なネットワーク解析システムの構築

ヒト間葉系幹細胞(MSC)は脂肪細胞や骨芽細胞への分化誘導が可能である。この分化をモデルにした細胞分化過程におけるダイナミックな転写制御ネットワークを解析する実験系の構築が、本研究課題の目標である。本研究によって、以下の成果を得ることが出来た。1)、脂肪分化、骨芽細胞分化に置ける網羅的な遺伝子発現プロファイルデータの取得。2)、それぞれの分化に特異的な役割を果たすと考えられる転写因子の絞り込みを行い、その転写因子リストを作成した。3)レンチウィルスshRNA発現ベクター及び、siRNAによるMSCに対する発現抑制系の構築。一方で、誘導型のshRNAの発現系の構築を試みたが、shRNAの発現調節の制御が想定通り機能しなかったため断念した。また、当初の目標であるネットワーク構築には至っておらず、今後の検討が必要である。本研究の計画段階ではCell Dynamicsに対応したネットワーク解析を行う為に、発現調節が可能な発現誘導システム-テトラサイクリン(TET)on/offシステム-とレンチウィルスベクター系に組み合わせて用いることを計画した。本年は,その計画に従って,研究対象となる細胞の培養条件に付いて検討と、(TET)on/offシステム-とレンチウィルスベクター系について検討を行った。研究対象となる細胞については,脂肪細胞、骨芽細胞に分化させる条件に付いて検討を行った。脂肪細胞に分化については,分化過程の網羅的な遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ解析によって取得した。骨芽細胞についても、同様のデータを得る為の実験が現在進行中である。一方、(TET)on/offシステムについては,実験の簡便性を考えて1ベクターの形質転換で、shRNAの発現を調節できるレンチウィルスベクター系の構築を試みた。しかしながら、shRNAによる効率的な遺伝子の発現抑制が行なわれていることは確認できたが,(TET)on/off調節システムが想定通りに機能していない。この打開策として,化学合成のsiRNAや調節システムのないshRNA発現レンチウィルスベクターを用いた実験系についても検討した。その結果,どちらの発現抑制系も,分化前の細胞と分化後の細胞で、標的遺伝子の発現抑制が可能であることを確認することが出来た。これらの検討によって,Cell Dynamicsに対応したネットワーク解析を行なう為の、基本的なデータと知見が得られた(一部進行中のものを含む)。来年度は,これを元に本格的な動的な転写制御ネットワーク解析を行う予定である。本研究では、間葉系幹細胞から脂肪細胞、骨芽細胞への分化を対象にして、その分化過程の転写制御ネットワークのダイナミクスを解析する手法を確立することが目標である。そのため、これまでに開発したMatrix RNAi法を動的な時間軸の中でも解析できるように改良すること、分化過程の網羅的な発現プロファイルを得ること、発現プルファイルデータからより有用な解析対象遺伝子を選択すること、解析対象遺伝子に対する有効なshRNA(もしくはsiRNA)を取得すること、さらにそれらを用いてネットワーク解析を行うことが必要になる。昨年度は、Matrix RNAi法の改良に必要な条件検討を行い、間葉系幹細胞の分化条件の検討、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化過程の網羅的な遺伝子発現プロファイルデータのマイクロアレイ実験及び解析からの取得が完了した。本年度は、引き続きMatrix RNAiの改良に必要な遺伝子発現抑制法の検討を行うとともに、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化過程の網羅的な発現解析プロファイルデータを取得し、脂肪細胞への分化のデータを会わせて解析した。その解析から15種類の解析対象の転写因子を選抜し、shRNAのデザインを行った。遺伝子発現抑制法の検討に付いては、当初計画していた誘導型の(TET)on/off調節システムを試みたが、想定通りの発現調節が出来ずに断念し、レンチウィルスのshRNAベクターを解析対象時間点に導入する方法に切り替えた。また、動的ダイナミックスを解析する為の解析の時間点を、発現プロファールデータをもとに、刺激応答初期段階の刺激後12時間、分化過程中期の7日目、分化課程後期21日目に決定した。
遺伝性洞性徐脈の新規因子同定および予防医学への応用

昨年度の段階で、洞性徐脈家系を用いた解析を行ったところ、ある種のカリウムチャネルをコードする遺伝子Xの変異の同定に成功し、電気生理学的解析により遺伝子Xの産物である変異チャネルの異常活性化が示された。また遺伝子Xのヒトの変異を導入したトランスジェニックゼブラフィッシュを作成し、病態の再現性について検討したところ、心房が肥大し、心拍数が減少する、という結果を得た。本年度は、上記のチャネルに対して選択的阻害活性を持つ化合物Yに着目し、薬理学的解析を行った。また、疾患モデル動物における生体内薬効解析を行うため、化合物Y投与前後での心拍解析を行った。電気生理学的実験の結果、チャネルの異常活性化が見られる変異チャネルは、化合物Yの作用によりその電流が強く抑制された。なお、化合物Yは変異型チャネルのみならず野生型に対しても高い親和性と濃度依存性の阻害効果を認めた。続いて、in vivoにおける化合物Yの効果をみるため、水溶液中に化合物Yを入れて心拍解析を行った。その結果、変異型ゼブラフィッシュの心拍数を有意に上昇させることができた。遺伝性洞性徐脈の新たな原因として、ある種のカリウムチャネルをコードする遺伝子Xの新規遺伝子変異を同定し、本チャネルの異常活性化が洞性徐脈の原因となることを見出した。本チャネルの選択的阻害薬は異常活性化を示す変異型チャネルに対しても高い阻害活性を示し、同チャネル変異を導入した疾患モデル動物においても有効性を示したことから、洞性徐脈に対する新規の分子標的治療薬になり得ることが示唆された。本年度は、新規洞性徐脈家系の遺伝子変異を同定するために、以下のことを行った。全exomeシークエンスはすでに得られていたので、配列情報から頻度の高いバリアントは取り除き、続いてin silico(計算機)をベースにした、バイオインフォーマティックスの情報を組み合わせて障害度の予測を行った。実際には、GO(ジーンオントロジー)やPubMedなどの知識情報の検討、ヒト遺伝子のアレイなどの発現情報(GEO)やOMIMのヒト疾患情報、マウスのknock outおよび変異体の表現系のデータ、さらにタンパク質のタンパク-タンパク相互作用(PPI)ネットワーク、ランダムウォーク(確率的な変動)を考慮した情報を検討した。その結果、この段階で8個の遺伝子に絞り込むことができた。これらの候補遺伝子には、トランスポーター、Zincフィンガードメインを有する転写因子をコードする遺伝子などが含まれていた。さらに、臨床症状と候補遺伝子のアレルの伝達を確認するために、候補遺伝子のexon間にprimerを設計し、家系構成員12人についてPCR産物をSanger法により直接シークエンスすることにより、cosegregation解析を行った。その結果、すべての遺伝子で伝達を確認することができた。なお、これらの変異については、我々の所有している洞性徐脈の別家系および日本人ゲノムのデータベースと照合したが、候補遺伝子のうち2つについては、既存のバリアントが存在する結果となった。候補遺伝子の絞り込みについては、計画通りに進めることができた。また、Sanger法によるcosegregation解析により、全exomeシークエンスの信頼性も併せて確認することができた。当初の予想と異なる点は、候補遺伝子がやや多くなったことである。その為、機能解析による絞り込み段階まで到達していないが、これは頻度の少ない変異がgenome中に潜在的に多い可能性、あるいは多因子ではないが、複数の遺伝子座の相互作用の可能性を反映していることが考えられる。全exonシークエンスはすでに得られていたので、配列情報から頻度の高いバリアントは取り除き、続いてin silico(計算機)をベースにした、バイオインフォーマティックスの情報を組み合わせて障害度の予測を行った。その結果、この段階で8個の遺伝子に絞り込むことができたが、当初の計画よりも候補遺伝子が多くなってしまったため、上記の課題を改善するために、遺伝学的なアプローチを適用することを計画した。実際には、全エクソン解析により検出されるバリアントの情報を用いたHamming DistanceRatio(HDR)法、あるいは家系を用いたマイクロサテライト解析を試みた。その結果、これらのアプローチでさらに数個の遺伝子を除外することはできたが、ゲノムレベルで遺伝子変異を絞りこむにはまだ充分とはいえなかった。一方、これまでとは別家系の洞性徐脈家系を用いた解析を行ったところ、ある種のチャネルをコードする遺伝子Xの変異の同定に成功した。この変異については、in vitroにおいては、細胞を用いた電気生理学的な解析により再分極の活性化、あるいは静止膜電位の維持に関わる電流を構成するチャネルの電流量の増加が示唆された。さらに、in vivoにおける解析を行うために、遺伝子Xのヒトの変異を導入した、トランスジェニック動物を作成した。これまでの家系の候補遺伝子の絞り込みについては、遺伝学的なパラメータを入れたものの、候補遺伝子を充分に絞り込むことができていない。これは頻度の少ない変異がgenome中に潜在的に多い可能性、あるいは多因子ではないが、複数の遺伝子座の相互作用の可能性を反映していることが考えられる。その為、並行して別家系の遺伝子変異を解析したところ、原因となる遺伝子Xの変異の同定に成功した。この遺伝子はチャネルタンパクであるため、直接電気を測ることにより変異の機能を予測できる結果となった。

これまでとは別家系の洞性徐脈家系を用いた解析を行ったところ、ある種のカリウムチャネルをコードする遺伝子Xの変異の同定に成功し、in vivoにおける解析により変異体において過剰に電流を流すことが明らかになった。続いて、この過剰な電流のメカニズムの解明を行うために、パッチクランプ法を用いてシングルチャネルの電流を測定した。その結果、野生型に対して変異体では、1つのチャネルに流れる電流量はかわらないが、チャネルの開口時間が延長していることが、明らかになった。次に、遺伝子Xのヒトの変異を導入したトランスジェニックゼブラフィッシュを作成し、病態の再現性について検討した(導入した遺伝子は、心房筋に特異的に発現するように操作し、mCherryという蛍光タンパクの発現をモニターする形で、確認した)。実際には、ゼブラフィッシュのembryo(3日後胚)を用いて、心拍数の測定を行った(この動物は透明で心臓にはGFPが発現するような操作をしているので、in vivoで連続的に測定可能である)。その結果、ゼブラフィッシュの野生型に対して、ヒトの変異を導入したゼブラフィッシュでは心房が肥大し、心拍数が減少した。一方、ヒトの正常遺伝子を導入したゼブラフィッシュでは、心拍数に変化はなかった。なお、神経系に影響は見られなかったので、導入した変異遺伝子の効果は、心臓に特異的であり、病態は再現される結果であった。別家系の遺伝子Xの変異については、電気生理学的な解析をさらに詳細に行うことにより、この変異の機能障害のメカニズムを明らかにすることができた。またトランスジェニック動物の作成は予定通りに進み、ヒトの変異を導入した動物個体において、病態再現性を確認することができた。昨年度の段階で、洞性徐脈家系を用いた解析を行ったところ、ある種のカリウムチャネルをコードする遺伝子Xの変異の同定に成功し、電気生理学的解析により遺伝子Xの産物である変異チャネルの異常活性化が示された。また遺伝子Xのヒトの変異を導入したトランスジェニックゼブラフィッシュを作成し、病態の再現性について検討したところ、心房が肥大し、心拍数が減少する、という結果を得た。本年度は、上記のチャネルに対して選択的阻害活性を持つ化合物Yに着目し、薬理学的解析を行った。また、疾患モデル動物における生体内薬効解析を行うため、化合物Y投与前後での心拍解析を行った。電気生理学的実験の結果、チャネルの異常活性化が見られる変異チャネルは、化合物Yの作用によりその電流が強く抑制された。なお、化合物Yは変異型チャネルのみならず野生型に対しても高い親和性と濃度依存性の阻害効果を認めた。続いて、in vivoにおける化合物Yの効果をみるため、水溶液中に化合物Yを入れて心拍解析を行った。その結果、変異型ゼブラフィッシュの心拍数を有意に上昇させることができた。遺伝性洞性徐脈の新たな原因として、ある種のカリウムチャネルをコードする遺伝子Xの新規遺伝子変異を同定し、本チャネルの異常活性化が洞性徐脈の原因となることを見出した。
アンシァン・レジーム期フランスの財政・金融と経済変動の数量的研究

コルベールからジョン・ロー・システムにいたるアンシャン・レジーム期フランスの財政・金融ならびに国民経済の動向を数量的研究にもとづいて、マクロ動態的に把握しようとするのが本研究の目的である。本研究の担当者は、すでに、コルベール期の経済政策と経済変動、17世紀後半の貸幣政策と経済変動、ルイ14世末期の財政・金融危機とデマレ財務総監の経済政策、リヨン金融恐慌(1709年)ノアーユ期の財政再建と金融情勢について分析を行ってきたが、昭和61-62年度は、とくに、ジョン・ロー・シスラム期と同期のフランススの経済発展に焦点をあてて研究を進めた。近代フランスの最も重要な金融事件のひとつとされるジョン・ロー・システムの展開と坐析は、熱狂的な株式投機や異常なほどの銀行券発行、膨大な額にのぼる累積国家債務償還策の推進等、その虚栄的特徴によってよく知られているが、しかし、シュムペーターが金融の思惑師と称しつつも、その反面で、管理通貨思想の祖先として高く評価したジョン・ローの実施した多様な金融・経済政策は、それが実際にどのような意義と実効性を有したのかという点を含めて、われわれの関心をつよく引きつけるものである。本研究では、ジョン・ロー・システム下の経済政策の諸相や局面の展開過程の分析を試み、銀行券の市場価格と流通正貨量とその相場とのあいだの相関関係をあきらかにすることができた。また、これらの分析をつうじて、この時代フランス経済におけるジョン・ロー・システムの意義、ジョン・ローの経済理念(信用創造や成長通貨供拾)の近代的性格をあきらかにしようと努力した。なお、本研究の推進にあたっては、文献・資料の収集に関して、パリ第4大学ジャン・クロード・ペロー教授および社会科学高等研究院ピエール・ジャナン教授の協力をえることができた。(注:当初の研究分担者佐村明知が外国出張のため、廣田誠に交代した。)コルベールからジョン・ロー・システムにいたるアンシャン・レジーム期フランスの財政・金融ならびに国民経済の動向を数量的研究にもとづいて、マクロ動態的に把握しようとするのが本研究の目的である。)
唾液腺におけるIP_3/Ca^<2+>シグナリングの時空間パターンの可視化解析

1.唾液腺導管細胞のカルシウム応答を可視化し、アゴニストに対する感受性を調べた。その結果、導管細胞には低濃度のアゴニストに反応する高感受性細胞が存在することが明らかになった。また、低濃度のフェニレフリン、カルバコール、ATPはそれぞれ異なる細胞を活性化することがわかった。2.唾液腺細胞のIP_3動態を調べるため、IP_3分子センサーLIBRAの改変を試みた。蛍光アクセプターであるYFPをVenusに置換し、pHに安定なLIBRAを作成した。さらに、CFPとIP_3結合部位をつなぐ部分、およびVenusとIP_3結合部位をつなぐ部分の最適化を行った。また、VenusおよびCFPを、それぞれ円順列変異体に置換した。3.改変したLIBRAを培養細胞に発現させ、サポニン処理後IP_3刺激による蛍光変化を測定した。その結果、改変したLIBRAでは約40%の蛍光変化率の増加が認められた。4.ラット耳下腺腺房細胞の初代培養を試みた。酵素処理によって単離耳下腺細胞を調製し、DMEM-F12培養液で培養した。培養6時間までは単離直後と同様の形態的極性を有していた。培養2日目では多くの細胞は極性を失っていたが、正常な形態を保持した細胞も少数みられた。カルシウム応答を測定したところ、2日目の細胞でもアゴニストに十分反応することがわかった。5.耳下腺初代培養細胞にGFPおよびPKC-GFP遺伝子の細胞内導入を試みた。遺伝子導入にはレポフェクトアミン2000とOpti MEM培養液を用いる方法が最も効果的であった。イオノマイシン刺激によりPKC-GFPが細胞膜にトランスローケーションすることが示された。6.唾液腺培養細胞に改変LIBRAを発現させ、アゴニスト刺激によるIP_3産生をモニターした。IP_3とCa^<2+>の同時測光を行い、その相関性を調べた。我々は、FRETを利用したIP_3蛍光分子センサーLIBRAを開発し、IP_3の細胞内動態の解析を試みている。本年度は改良型LIBRAを作成すると共に、唾液腺細胞におけるLIBRA遺伝子の導入を試みた。1.改良型LIBRAの作成。従来型のLIBRAはFRET効率が小さく、pHによって蛍光強度が変化するなどの欠点がある。そこで、蛍光アクセプターであるEYFPをよりpHに安定なVenusに置換し、蛍光ドナーであるECFPをより蛍光強度が強いCeluleanに置換した。また従来型はタイプ3のIP_3受容体リガンド結合ドメインを使ったが、改良型ではIP_3感受性がより大きいタイプ2のリガンド結合ドメインを使った。さらにCeluleanあるいはVenusとリガンド結合ドメインをつなぐリンカーの長さを調節し、蛍光変化率の向上を試みた。その結果、蛍光変化率は約50%上昇し、従来型に比べて約3倍の蛍光変化率を有する改良型LIBRAを作成した。2.ラット耳下腺腺房細胞の初代培養の試み。トリプシン及びコラゲナーゼ処理によりラットの単離耳下腺細胞を調製した。DMEM-F12メデイウム中で培養した。培養6時間では形態的変化はほとんど見られず、単離直後と同様の形態的極性を有していた。培養2日目では多くの細胞が極性を失っていたが、比較的正常な形態を保った細胞も少数見られた。fura-2を使って[Ca^<2+>]iを測定したところ、2日目の細胞でもアゴニストに十分反応することがわかった。

3.培養した耳下腺細胞におけるEGFPの発現。LIBRA導入の予備実験として、EGFPおよびPKCα-EGFP遺伝子の細胞内導入を試みた。ベクターの導入には複数のリポフェクション試薬を用い、細胞のダメージやGFPの発現効率などを比較した。その結果、リポフェクトアミン2000とOpti MEMメディウムを用いる方法が最も効果的であることが明らかになった。イオノマイシンで刺激したところ、細胞質に発現していたPKCα-EGFPが細胞膜へトランスローケーションすることが確認された。この結果は、培養耳下腺細胞がEGFP発現後も十分反応性を保持していることを示している。1.唾液腺細胞におけるIP_3の細胞内動態を解析するために、FRETを応用したIP_3感受性蛍光センサーLIBRAのリンカー部位の最適化を行った。蛍光ドナーであるCFPとIP_3受容体の結合ドメインを繋ぐリンカー部位をアミノ酸10個からなるαヘリックス構造あるいはアミノ酸3個からなる最短構造にしたところ、蛍光変化率が有意に増大した。蛍光アクセプターであるYFPとIP_3結合ドメインとを繋ぐリンカー部位は直鎖状にした場合のみ蛍光変化率が増大した。3.改変したLIBRAを培養細胞に発現させ、サポニン処理後IP_3刺激による蛍光変化(CFP/Venus)を測定した。円順列変異体を用いた3種類の改変体において約40%の蛍光変化率の増大が認められた。4.唾液腺導管細胞のカルシウム応答を多光子レーザー顕微鏡を用いて可視化し、アゴニストに対する感受性を調べた。その結果、導管細胞には低濃度のエピネフリンに反応する高感受性細胞が存在することが明らかになった。また、低濃度のフェニレフリン、カルバコール、ATPはそれぞれ異なる細胞を活性化することがわかった。5.改変LIBRAを唾液腺培養細胞に発現させ、アゴニスト刺激によるIP_3産生をモニターした。IP_3産生とカルシウム応答との相関性について調べた。
合成ペプチドを用いた歯周病の免疫療法確立のための基礎的研究

歯周病に対して合成ペプチドを用いたP.gingivalis感染に対する免疫療法を導入する試みの第一歩として,Ag53に対するT細胞応答性(T細胞認識部位,HLA拘束性,リンフォカイン産生性および抗体産生への関与)を歯周病に対する疾患感受性の異なるグループ間で比較し,分子レベルでその違いを把握することを行った。その結果は以下の通りである。1) Ag53を特異的に認識するT細胞株を早期発症型歯周病(EOP)患者6名および健常者16名の被験者から樹立し,それらT細胞株のAg53上の認識部位を調べた結果,EOP患者由来のT細胞株の多くは,Ag53の特定の領域Ag53p141-161をT細胞エピトープとして認識した。それら被験者は共通したHLAハプロタイプを有さなかった。2) Ag53に対するT細胞応答は,多くの被験者でHLA-DRBl分子拘束性であった。3)すべてのT細胞株は,Thlタイプのサイトカインであるインターフェロン-γ(IFN-γ)を産生した。Th2タイプのサイトカイン(IL-4,5,6,10)の産生様態は各株ごとに異なった。4) T細胞が産生するサイトカインがIgG抗体産生にどのように影響するかを評価した結果,Th1に対するTh2タイプのサイトカイン産生量の比率(Th2/Th1)が高いT細胞株は,強いAg53特異的IgG抗体産生を誘導した。しかし,Th2/Th1が低いT細胞株は,抗体産生を誘導しなかった。5) Ag53特異的IgG抗体産生が誘導された系の培養上清に含まれるIL-5量は,産生のなかった系に比較して多かった。以上の結果は,T細胞株が産生するIL-5が,Ag53特異的なIgG抗体産生に影響を与えることを示唆するものである。以上の結果から,Ag53p141-161に対するT細胞応答性の違いはP.gingivalis感染に対する感受性を反映する可能性がある。歯周病に対して合成ペプチドを用いたP.gingivalis感染に対する免疫療法を導入する試みの第一歩として,本年度はP.gingivalis由来の53kDa外膜蛋白(Ag53)に対するT細胞応答性の個体間での差異を評価することを目的に,以下のことを行った。1,Ag53を認識するT細胞株の樹立抗原蛋白となるAg53リコンビナント蛋白およびAg53蛋白のアミノ酸配列をもとに同蛋白を網羅するオーバーラップペプチドを作製した。これらを用いて,早期発症型歯周病(EOP)患者6名および健常者16名の被験者からAg53を特異的に認識するT細胞を樹立した。2,Ag53を認識するT細胞株の応答性の評価得られたAg53蛋白特異的なT細胞株すべての1)Ag53認識部位2)HLA拘束性3)リンフォカイン産生性について患者群と健常者群との間で比較し,疾患感受性を規定するTCRリガンドの決定および各群におけるT細胞応答性の特徴をリンフォカイン産生性によって評価することを行った。1,EOP患者由来のT細胞株の多くは,Ag53の特定の領域Ag53pl41-161をT細胞エピトープとして認識した。

2,Ag53に対するT細胞応答は,多くの被験者でHLA-DRB1分子拘束性であった。3,全ての被験者由来T細胞株はインターフェロンγを産生した。また,患者由来株に比べ,健常者株はIL-5を産生する傾向にあった。以上のことから,Ag53p141-161に対するT細胞応答性の違いは,P.gingivalis感染に対する感受性の個体差を反映する可能性があることが分かった。今後このペプチドを認識するT細胞クローンを作製し,そのリンフォカイン産生に代表される応答性を調節することの可能性について申請通り行う予定である。ヘルパーT細胞には,様々な外来の異物に対して反応できるように多種のクローンが存在する。そのため,全T細胞から見ればごく一部のT細胞のみが特定の抗原蛋白に対して反応するという事実が生ずるので,抗原特異的なヘルパーT細胞の応答性を評価することが困難であった。そこで我々は,歯周病細菌のうちPorphyromonas gingivalis(P.gingivalis)の分子量53kDaの外膜蛋白(Ag53)を特異的に認識するヘルパーT細胞株を患者および健常者の末梢血単核球から樹立し,ある程度均一化したヘルパーT細胞集団を実験系に用いた。これらT細胞株を用いて,(1)Ag53蛋白上のT細胞認識部位,(2)HLA拘束性,(3)リンフォカイン産生性について,各T細胞株間での応答性の違いを比較した。また,Ag53は歯周病患者に血清IgG抗体産生を誘導する蛋白であることから,我々はこの蛋白に対する,歯周病患者のIgG抗体産生様態(抗体認識部位およびIgG抗体サブクラス)の個体差について調べてきた。Ag53に対するIgG抗体産生は,ヘルパーT細胞が産生するリンフォカインによって制御されていることが予想される。このことを明らかにすることは,T細胞応答性を調整することが,IgG抗体産生にどのように影響するかを評価することにつながり,P.gingivalis感染に対する歯周病の免疫療法の確立において不可欠である。