hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床看護師のキャリア発達を促す実習指導者のための教育支援プログラムの開発

実習指導の体験は,『自己の成長を実感』させるものであった。影響要因として,学生指導に付随する『戸惑いから脱却』『自己を見つめ直す』『後輩育成』『教員との相互関係の成立』『他者からの支援』が抽出された。看護師のキャリアの促進要因として,良い看護が提供できた体験,職場内で承認,自己の成長を実感できる体験,意欲的に学習や職務に取り組むモデルの存在が挙げられるが,本研究では,それに加えて教員との相互関係が影響していることが明らかとなった。結果として,臨床看護師のキャリアを促進する教育支援プログラムの開発には,学生の実習指導を行う教員と現場の実習指導者のコラボレーションが重要であることが示唆された。本研究は、実習指導者の語りと看護管理者の語りから、臨床看護師のキャリア発達を促す実習指導者のための教育支援プログラムを開発することを目的としている。平成26年度は、看護大学生の実習を受け入れている病院3施設の看護部長または教育担当者から、実習指導者の教育・支援の実態(実習指導者へのサポート体制や教育プログラムの内容等)に関するヒヤリングを行った。また、実習指導者に対する教育支援体制に関する文献を検討した。3施設と少ないヒヤリング調査の結果では、看護管理者や教育担当者は、臨床看護師として成長を期待し実習指導者の役割を任命しているのにも関わらず、院内研修で行われている臨地実習指導者研修にはキャリア発達を視野に入れた内容が組み込まれていないことがわかった。今後は、実習指導者および看護管理者に対するインタビュー調査を実施し、データー収集と分析を行う計画である。本研究は、臨床看護師のキャリア発達を促す実習指導者のための教育支援プログラムを開発することを目的としている。平成27年度は、これまでの研究者のインタビュー内容をさらにテキストマイニングにより分析し学会発表を行った。学会発表時に多くの臨床看護師と実習指導に携わる看護教員とのディスカッションができ、新たな知見も得られた。平成28年度はテキストマイニングによる分析結果と文献を基にアンケート項目の精選を行い、アンケート用紙の作成と実施、分析を計画している。また、3年間の研究成果を国外の学会で発表し、更なる課題の発見に努めていきたいと考えている。文献検索や学会発表、ヒアリング調査をしていく中で、研究の方向性がインタビュー調査に加えアンケート調査を行う必要性が生じたため。本研究は、実習指導者の実習指導における体験の語りから、臨床看護師のキャリアを促進させるための教育プログラムの構築を目的としている。平成28年度は、初年度に学会発表をした、基礎看護実習を担当する実習指導者の実習指導の実際を明らかにした研究と研究者のこれまでの研究成果による実習指導者が実習指導においてどのような体験をしているかを明らかにした内容を網羅し、中国にて「臨床と大学の連携の実際」というテーマをいただき講演を行った。対象は、中国の大学病院の看護師長、看護学生、看護教員100名程度である。講演後、活発なディスカッションを行い、中国との基礎教育や看護師教育体制との違いや社会背景の違いなど新しい知見や研究への示唆が得られた。最終年では、実習指導者に対しインタビュー調査を実施し、データ解析・論文作成を行う予定である。インタビュー調査を実施する計画は概ね完成している。しかし、平成28年度に中国での講演依頼があり、これまでの研究成果を講演する機会をいただき、中国での基礎教育や実習指導体制や看護師の役割を知ることができた。さらに、ディスカッションを行うことで、他国と自国を比較することで研究遂行にとても有効であると判断した。インタビュー調査前に講演会を優先することによって、インタビュー調査の内容も中国での新しい知見も取り入れることが可能と判断し、遅れながらの研究遂行となっている。本研究は、指導者としての体験の語りから,臨床看護師としての成長に影響を及ぼす要因を明らかにした。臨床看護師としての成長に影響する要因として、【教員との相互関係の成立】、【教員の指導からの学び】、【他者からのサポート】、【自己の指導の振り返り】、【戸惑いから脱却】、【関わることによる患者の変化】の6カテゴリーが抽出された。指導者の体験による臨床看護師としての成長に及ぼす影響要因は、研修会のタイミングや教育的な教員との関わり、他者からのプラスのフィードバック、関わることによる患者の変化によって促進されている。また,指導者の体験は自己を見つめ直す機会になっておりタイミングの良い研修会も促進要因となっていた。また、自分が体験するだけでなく、実習指導を後輩に体験させて、学ぶきっかけを与えたいという後輩育成の視点を培う機会にもなっており、継続的に指導者の成長を促進する教育支援プログラム開発のための基礎的資料として示唆を得ることができた。看護大学生の臨地実習を受け入れている病院3施設の看護部長または教育担当者から、実習指導者の教育・支援の実態(実習指導者へのサポート体制や教育プログラムの内容等)に関するヒヤリングを行った。

しかし、それぞれの施設に所属している臨地実習指導者を対象にフォーカスグループインタビューを実施する予定であったが、インタビュー協力者の確保が難しい状況であった。その理由として、学生の実習サイクルが各施設異なるため、実習指導者とのインタビュー日時の設定が難しかったことがあげられる。インタビュー調査に加えアンケート調査も実施するため、新たに倫理審査を通す。研究協力施設は、医学部附属の関連病院への依頼を考えているため、順調に研究遂行ができると考えている。今年度は、最終年度となるため、早急にインタビュー調査を実施し、分析考察、論文作成を行う。計画書の作成はできているため、直ぐにインタビュー調査に取り掛かれる体制である。役割分担も確認済みである。看護教育平成27年度は、5月に研究計画書を倫理審査委員会に提出し、看護学生の実習が組まれていない8月9月にインタビュー調査を実施する予定である。すでに、研究計画書の準備は整っており、インタビュー調査が実施できる器材や物品は準備ができている状況である。また、インタビュー調査の第1報をまとめ、学会発表も予定している。インタビュー調査を実施を計画していたが、研究計画の変更により、アンケート調査を加えることになった。それにより、インタビュー調査のための費用捻出がなくなった。さらに、今年度は、これまでのインタビュー調査の内容を分析するためにテキストマイニングの分析ソフトを購入した。インタビュー調査と学会発表を予定していたが、中国での招聘によりインタビュー調査が次年度へ繰り越されたことと、招聘であったため、現地への旅費の計上の必要がなかったため次年度への使用額が生じてしまった。研究環境を整えるために、データ分析およびインタビュー調査時の撮影に使用するパソコン・カメラ等を購入した。また、日本看護教育学学会へ参加をし、本研究に関する情報収集およびヒヤリング調査を実施したため旅費として使用した。そのほか、データ保存に必要な文房具や本研究に関連する書籍の購入をした。平成27年度に捻出しなかった費用は、平成28年度のインタビュー調査費にあてることとする。最終年度のため、研究成果の発表及び論文作成のための費用とする。今年度は、インタビュー調査にかかる費用(調査旅費、謝礼、テープ起こし、テキストマイニング分析コンサルト料)に経費を使用し、さらに学会発表に係るポスター作成料や学会旅費に費やす予定である。また、論文掲載料や英語論文作成も考えているため、翻訳代に費やしたいと考えている。データ収集のためのICレコーダーやマイクや、インタビューデータのテープ起こし費用が必要になる。また、学会発表を予定しているため、旅費が必要となる。
核酸医薬品創製のための新素子と新戦略の開発

本研究では高いヌクレアーゼ抵抗性とハイブリダイゼーション能を有する新しい核酸素子を創出し、それをスプライシング異常のエディット能をもつ核酸分子として機能させることを目的とした。まずバイブリッド型4'-チオ核酸を合成したところ、望みとする性質を有していることが明らかとなった。それを用いてU1 snRNAのリクルート能を評価したところ2'-F-4'-チオRNAが期待した性能を発揮し、U1i効果を示した。最終目的を達成するためにhead-to-head型オリゴの合成法を検討した。平成23年度、ハイブリッド型化学修飾核酸(2'-OMOE-4'-チオRNAならびに2'-F-4'-チオRNA)を合成し、U1 snRNAのリクルート能を、まずU1i機構による遺伝子発現抑制効果を測定することで評価した。その結果、2'-F-4'-チオRNAは、濃度依存的にルシフェラーゼの発現を抑制することを明らかにした。平成24年度は、まず上述の遺伝子発現抑制効果が、U1i活性によるものかを確認する目的で、pre-mRNA結合配列とU1snRNA結合配列に分割した配列を合成し、活性の評価を行った。その結果、両者は全く活性を示さず、これにより高い二本鎖形成能を持つ2'-F-4'-チオRNAが、U1 snRNAをmRNA上の任意の位置にリクルートすることで遺伝子発現抑制が誘起されていることを確認できた。平成24年度は、この2'-F-4'-チオRNAをスプライシング異常の校正能を持つアダプター分子として利用するために、head-to-head型オリゴマーの合成法を検討した。その結果、5'末端にエチニル基を有するオリゴマーを用いて、1,5-ジアジドペンタンを用いてCuAAC反応を行なうことで望みとするアダブター分子を合成することに成功した。また、pGL3-Cのコード領域にpRL-Tkのイントロン配列を導入した評価用ベクターの構築を行なった。この評価用ベクターを細胞にトランスフェクションした場合、野生型イントロン挿入配列ではスプライシングが起こったが、変異イントロン挿入配列ではスプライシングが起こらなかった。しかし変異イントロン挿入ベクターと変異型U1snRNA発現プラスミドをコトランスフェクションしスプライシングの正常化を種々検討したが望みとする現象は観察されなかった。平成23年度は、1.新規核酸素子の基本骨格となる2'-置換-4'-チオリボヌクレオシド類の合成法を確立し、さらにそれらの大量合成を行なった。2.また合成したヌクレオシドユニットを用いて15merのハイブリッド型化学修飾核酸(2'-OMOE-4'-チオRNAならびに2'-F-4'-チオRNA)を合成し、それらの性質解析を行なった。その結果、2'-OMOE-4'-チオRNAは50%ヒト血漿中、半減期48時間以上となり、既に申請者が開発した2'-OMe-4'-チオRNAよりも遥かに高いヌクレアーゼ抵抗性を示した。この値は、核酸分子として驚異的な値である。一方、2'-F-4'-チオRNAは、RNAに対して高い二本鎖形成能を示し、これらハイブリッド型化学修飾核酸が核酸医薬品創製のための新素子となり得ることが示唆された。続いて、合成したハイブリッド型化学修飾核酸のU1snRNAのリクルート能を、まずU1i機構による遺伝子発現抑制効果を測定することで評価した。その結果、2'-F-4'-チオRNAは、濃度依存的にルシフェラーゼの発現を抑制し、これにより高い二本鎖形成能を持つ2'-F-4'-チオRNAが、U1 snRNAをmRNA上の任意の位置にリクルートする能力を有することが示唆された。この評価用ベクターを細胞にトランスフェクションした場合、野生型イントロン挿入配列ではスプライシングが起こるが、変異イントロン挿入配列ではスプライシングが起こらない。このベクターを用いることで合成したアダプター分子によるスプライシング異常の校正能を評価できると考えている。本研究課題の目標の一つである核酸医薬品創製のための新素子の開発については、それらの性能評価の結果からも、その目標を達成できたと判断できる。一方、スプライシング異常の校正能を目指した新戦略については、今後様々な検討が必要と思われるが、平成24年度の研究実施期間をほぼそのために充てることが可能であり、研究は概ね順調に進展していると考えている。U1i機構による遺伝子発現抑制効果を指標として、アダプター分子が最も効果的なU1snRNAリクルート能を有するような修飾様式を検討する。Clickケミストリーによりhead-to-head型アダプター分子を合成し、評価用ベクターを用いたルシフェラーゼアッセイにより、スプライシング異常の校正能の評価を行う。さらに、その結果をもとにリアルタイムでアダプター分子の構造最適化を行ない、スプライシング異常の校正を目指す。

本課題の研究成果発表と研究についての情報収集を年度を越えて行なったために繰越金(61,840円)が発生した。その他の研究費については、平成23年度とほぼ同様に、殆どを核酸合成試薬ならびに生化学試薬などの消耗品費に充てる。残りについては、研究成果発表のための学会参加費や旅費に使用する予定であり、当初計画から大きな変更はない。
上肢における非侵襲的in vivo3次元キネマティクス解析システムの開発

1.Volume registrationを用いたin vivoキネマティクス解析ソフトウエアの開発。生体の関節運動を3次元的に解析することができるin vivo3次元運動解析システムを完成させた。生体MRI画像より各骨要素の3次元モデルを作成し、2つの異なるポジションでのボリュームデータをマッチングさせる新しいシステムを開発した。またその精度検証も行った。proximity mapping法を用いて肘関節のcontact areaを調査した。上腕尺骨関節では、すべてのポジションでcontact areaは滑車の中央部でなく、内側寄りに位置していた。また、上腕橈骨関節では、伸展位から120°屈曲位までは橈骨頭中央部が上腕骨小頭と接触していたが、最大屈曲位では橈骨頭の前方にcontact areaが移動していた。手関節掌背屈、擁尺屈運動における手根中央関節のキネマティクスを解析した。橈尺屈:橈骨に対し近位手根列は橈尺屈だけではなく掌背屈方向に大きく動いていた。近位手根列の手根骨間運動は比較的小さかった。手根中央関節は橈背側/掌尺側方向への有頭骨腰部を中心とする回転運動であった。掌背屈:橈骨に対し、舟状骨の方が月状骨より大きく掌背屈していた。近位手根骨間では、舟状骨月状骨間は大きく動いたが月状骨三角骨間の動きは小さかった。手根中央関節では、遠位手根列は月状骨三角骨に対し大きく掌背屈していたが舟状骨との動きは小さかった。生体MRI画像より各骨要素の3次元骨髄表面モデルを作成し、2つの異なるポジションでのデータの変化より、各骨要素の相対的位置関係を空間座標でのx, y, z軸に対する角度(Eular angle)、Translationの距離、回転軸で評価できるソフトウエアを開発した。2.正常肘関節in vivoキネマティクス研究A.上腕尺骨関節:健常者の肘関節の上腕尺骨関節における瞬間回転軸は外側では屈曲するに従い前下方へ偏移していたが、内側では内上顆の前下方に収束していた。この位置はMCLの近位付着部と一致し、内側ではMCLの前斜走線維のisometricな制動効果を示唆するものと考えられた。B.近位橈尺関節:回内回外運動における瞬間回転軸はすべて橈骨頭中心部に収束しており回転軸の偏移はほとんど無いものと考えられた。3.手関節in vivoキネマティクス研究A.正常遠位橈尺関節、三角骨有鉤骨関節についても肘関節と同様に調査した。・遠位橈尺関節:DRUJの平均回転軸は尺骨頭のfoveaを通っていた。・三角骨有鉤骨関節:手関節掌背屈では三角骨は有鉤骨に対してほぼ前後方向に回転していたが、橈尺屈では近位橈側-遠位尺側方向へ回転していた。有鉤骨-三角骨関節は少なくとも2つの自由度を持つ鞍状関節であると考えられた。橈骨骨折後変形治癒の患者を対象に遠位橈尺関節の病的キネマティクス調査した。その結果、患側DRUJでは関節裂隙の開大を認めるも、橈骨は尺骨頭の周りをcongruentに回転していた。DRUJの回転軸は全例で橈骨頭の中心からfovea中心を通っていた。また回転軸は回外から回内するに従い約2mm掌側から背側へ移動していたがこれも患側と正常とは差はなかった。
肝臓におけるアルドラーゼB遺伝子の摂食による転写調節機構

解糖系の酵素で肝特異的に発現するB型アルドラーゼ(AldB)の遺伝子発現は糖質摂取によって大きく誘導された。即ち糖質摂取によってラット肝のAldB mRNAレベルは大きく上昇した。面白いことに、このとき肝特異的分泌タンパク質であるアルブミンの遺伝子発現はほとんど変動しなかった。このAldB遺伝子発現の誘導はAldB遺伝子の転写誘導であるということがrun-on assayによって確かめられた。そしてこの誘導には肝の糖代謝に影響するホルモンの関与が考えられた。そこで誘導時のラット血中ホルモン濃度を測定したところ、インスリン濃度は上昇し、グルカゴン濃度は低下していた。コルチコステロン濃度には大きな変動がなかった。このことから糖質摂取により血中インスリン、グルカゴン濃度が変動し、そのことが肝におけるAldB遺伝子の発現を変動させていることが考えられた。このことを証明するために、初代培養肝細胞を用いて、これらのホルモンのAldB遺伝子発現に対する直接効果を検討したところ、インスリンはAldB遺伝子発現に対して促進的に、グルカゴンは抑制的に作用することが確認された。糖質摂取による誘導では特にグルカゴンによる抑制が低下することがインスリンによる促進と相まって重要であることが認識された。そこでグルカゴンによる抑制機序について解析した。AldB遺伝子発現に対するグルカゴンの抑制作用は濃度依存的であり、10nM以上で著明に有効であった。また、培養液に100nMグルカゴンを添加すると26時間でAldB mRNAレベルは著明に低下することがわかった。その作用機序を明らかにする目的でforsk olinを投与するとグルカゴン同様にAldB遺伝子発現は抑制された。dibutylyl-cAMP投与でも同様であった。そして、このAldB遺伝子発現に対するグルカゴンの抑制作用はA-kinase阻害剤であるH-7によって濃度依存的に減弱した。これらの結果はこの抑制作用がA-kinase→cAMP→CREBを介する系を経るものであることを示していた。本研究でこれまでに明かとなったことは以下のことである。(1)高グルコース食投与で見られるラット肝AldB遺伝子の発現誘導はホルモンの協調的作用の結果である。ラットを絶食後、高グルコース食を投与すると肝AldB遺伝子の転写誘導が起こる。我々は、この場合血中コルチコステロン濃度は変化せず、血中インシュリン値は誘導と平行して上昇し、グルカゴン値は逆比例的に低下することを確かめた。別の解糖系酵素glyceroaldehyde-phosphate dehydrogenase(GAPDH)遺伝子も同様に誘導されたが、面白いことに分泌タンパク質のアルブミン遺伝子は全く誘導されなかった。そこでこれらのホルモンの直接効果が初代培養肝細胞で検討したところインシュリン、デキサメサゾンは促進的に、グルカゴンが抑制的に作用することを確認した。(2)高グルコース食投与で見られるラット肝AldB遺伝子の発現誘導は転写効率の促進である。ラット絶食群、高グルコース投与群より肝単離核を調製しrun-on assayで肝AldB遺伝子の転写効率の違いを検討した。その結果、高グルコース食投与で見られるラット肝AldB遺伝子の発現誘導は転写効率の促進であることが証明された。そこで、高グルコース食投与前後のラット肝核抽出液を用いて、-210bpと-92bpのAldB遺伝子5′上流領域をつないだG-freecassetteの転写効率の比較をおこなったところ、-92bpまでが重要であることが明らかとなった。解糖系の酵素で肝特異的に発現するB形アルドラーゼ(AldB)の遺伝子発現は糖質摂取によって大きく誘導された。

即ち糖質摂取によってラット肝のAldB mRNAレベルは大きく上昇した。面白いことに、このとき肝特異的分泌タンパク質であるアルブミンの遺伝子発現はほとんど変動しなかった。このAldB遺伝子発現の誘導はAldB遺伝子の転写誘導であるということがrun-on assayによって確かめられた。そしてこの誘導には肝の糖代謝に影響するホルモンの関与が考えられた。そこで誘導時のラット血中ホルモン濃度を測定したところ、インスリン濃度は上昇し、グルカゴン濃度は低下していた。コルチコステロン濃度に大きな変動がなかった。このことから糖質摂取により血中インスリン、グルカゴン濃度が変動し、そのことが肝におけるAldB遺伝子の発現を変動させていることが考えられた。このことを証明するために、初代培養肝細胞を用いて、これらのホルモンのAldB遺伝子発現に対する直接効果を検討したところ、インスリンはAldB遺伝子発現に対して促進的に、グルカゴンは抑制的に作用することが確認された。糖質摂取による誘導では特にグルカゴンによる抑制が低下することがインスリンによる促進と相まって重要であることが認識された。そこでグルカゴンによる抑制機序について解析した。AldB遺伝子発現に対するグルカゴンの抑制作用は濃度依存的であり、10nM以上で著明に有効であった。また、培養液に100nMグルカゴンを添加すると26時間でAldB mRNAレベルは著明に低下することがわかった。その作用機序を明らかにする目的でforskolinを投与するとグルカゴン同様にAldB遺伝子発現は抑制された。dibutylyl-cAMP投与でも同様であった。そして、このAldB遺伝子発現に対するグルカゴンの抑制作用はA-kinase阻害剤であるH-7によって濃度依存的に減弱した。これらの結果はこの抑制作用がA-kinase→cAMP→CREBを介して系を経るものであることを示していた。
活性酸素種によるJNK,p38MAPK情報伝達系活性化と遺伝子発現の解析

本研究は脳虚血・再灌流障害や老化過程に関与すると考えられるラジカル反応性の高い活性酸素種の作用メカニズムとそれによるDNA傷害からの修復機構を解明することを目的としている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNAの断片化に代表されるDNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すこと、H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジンではなくチミジンの取り込みを促進し、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存すること、さらに、チロシンキナーゼやp38MAPK情報伝達系も影響を及ぼし、遺伝子発現に影響を与えることを明らかにしてきた。そこで本研究の2年目は、p38MAPK情報伝達系の下流域にあたる転写因子の活性化をリン酸化を指標としてウエスタンブロツト法を用いて、チミジン取り込みや遺伝子発現との関連を検討した。アストロサイトのH_2O_2による処置は短時間においては転写因子ATF-IIを活性化した。p38MAPK阻害薬はこのリン酸化を抑制した。前年度までの研究からp38MAPK阻害薬はH_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死を抑制したことより、p38MAPKの活性化とそれにより活性化される転写因子ATF-IIの活性化は、H_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死に関与し、遺伝子発現との関連性が示唆された。これらの遺伝子発現がアストロサイトの機能障害、または、修復機構に関与する可能性のあるタンパク質の発現であるかが重要となるので、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて検討することとしている。中枢神経系においてアストロサイトは各種の障害に対して抵抗性が高く、また、多くの栄養因子などを分泌することにより神経細胞の保護を行うなど重要な役割を果たしているので、障害時においてアストロサイトの機能を高めることにより神経細胞死から保護するというコンセプトのもとに研究を進めている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNAの断片化に代表されるDNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すこと、H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジンではなくチミジンの取り込みを促進し、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存すること、さらに、チロシンキナーゼやp38MAPK情報伝達系も影響を及ぼすことを明らかにしてきた。そこで本研究の1年目は、遺伝子発現におけるp38MAPK情報伝達系の関与をディファレンシャル・ディスプレイ法により検討した。アストロサイトをH_2O_2により処置したところ、遺伝子レベルでいくつかの差異遺伝子を検出した。また、p38MAPK情報伝達系の関与も特異的阻害薬の効果により示された。これらの差異遺伝子がアストロサイトの機能障害、または、修復機構に関与する可能性のあるタンパク質の発現であるかが重要となるので、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて検討することとしている。
低体力者向け動作筋力改善トレーニングシステムの構築と動作の質的評価方法の開発

高齢化社会の進行にともなって、低体力状態にある高齢者数が急速に増加している。本研究は、動作姿勢を支える働きを持つ体幹深部筋に着目し、低体力状態にある高齢者が無理なくトレーニングすることが出来るマシン5機種(パワーアシスト式歩行動作トレ-ニングマシン、パワーアシスト付き舟漕ぎマシン、パワーアシスト式体幹底部筋群トレーニングマシン、パワーアシスト付き自転車漕ぎトレーニングマシン、簡易型体幹トレーニングマシン)を新しく開発し、これらを用いて介護施設の入所者を始め.高齢者を対象にトレーニングし、その成果を動作の質の変化からとらえた。高齢化社会では、最も基本的なことは、高齢者が自立した歩行能力を保持できることである。低体力状態にある人を対象に、歩行運動に必要な筋力をつけると同時に、歩行動作がスムーズに行なうことができるための「パワーアシスト式低体力者歩行動作トレーニングマシン」を開発した。このトレーニングマシンは、座位姿勢で、腕と上体を使った「和船漕ぎ運動」と、両足での「ペダル踏み込み運動」を組み合わせて運動を行なう構造になっている。座位の和船漕ぎ運動は、オールの部分に当たるアームが、体幹の近位方向または遠位方向にパワーアシスト方式で、約30度の角度で自動的に周期的に移動する。トレーニングをする人は、シートに腰掛け、手でアームを握り、パワーアシストに任せて上体をリラックスさせて和船漕ぎ運動を行なうか、力を発揮する場合は、パワーアシストによるアームの動きを加速させたり、減速させたりする。両足は、フットペダルの上に置き、ペダルを踏み込む動作を行なうが、踏み込んだペダルにかかる力をぬけば、ペダルはパワーアシストによって、元の位置に戻る。ペダルの踏み込み動作は、両足同時でも良いが、片足交互の踏み込み動作でも良い。歩行訓練の場合には、両足踏み込みより、片足交互踏み切り動作が効果的である。『和船漕ぎ運動』と『ペダル交互踏みこみ運動』の組み合わせでは、動作の組み合わせが複雑になり、このことが歩行動作に関わる神経支配を刺激して、自立歩行能力を高める。本研究で開発されたマシンを用いて、トレーニング実験を行い、3次元ビデオ装置を用いた動作解析によって、動作の改善課程をとらえつつある。知的障害児についてもトレーニング動作分析を進めた。本研究では,低体力高齢者の健康づくり方法として,体幹深部筋(腸腰筋など)をはじめ,体幹部および四肢の筋群を無理なく強化することができ,動作の学習および動作の質(QOM)を高める内容をもったパワーアシスト型トレーニングマシンを新たに開発し,低体力状態にある人にとって実行できる新しい形のトレーニングシステムを開発すると共にこれらのトレーニングシステムを用いた時の効果を評価する方法を開発することに主眼をおいた。今年度新たに開発したトレーニングマシンは,(1)パワーアシスト式体幹底部筋群強化トレーニングマシンと,(2)パワーアシスト式舟漕ぎマシンである。また,体幹筋力を測定する装置として,(3)QOM体幹筋力評価測定装置を開発した。(1)は骨盤底部筋および骨盤周辺に付着する筋群を前後関脚運動および左右開脚運動によって各個人の可能な最大開脚角度まで開脚し,スムーズに脚を閉じる運動を繰り返しリズミカルに実施できる装置である。脚の開閉運動の速度および運動範囲(角度)があらかじめ調節可能でおり,無理な動きが生じないようにパワーアシスト装置によってコントロールされる。(2)は,座位および立位姿勢で和舟漕ぎ運動が可能なものであり,自動的にコントロールされた取っ手(アーム)の動きに合わせて両手でアームを引いたり押したりする運動を繰り返すもので,自分自身で歩行することができない状態にある人にも運動が可能なように考慮されたトレーニングマシンである。(1),(2)を用いてトレーニングを実施した低体力高齢者を対象にして,その効果を(3)によって評価した。また,動作の改善効果についてはビデオ解析を実施した。一般に、健康状態の改善や基礎的体力の向上をめざす運動として、「有酸素運動」と「レジスタンストレーニング(筋トレーニング)」が推奨されているが、要介護予防や、すでに要介護状態にある低体力高齢者を対象として運動を推奨する場合には、生活上の動作能力の改善をめざすといった新しい視点からの運動様式が開発される必要がある。本研究では、介護施設の入居者でも利用可能なトレーニングマシンの開発を試み、体幹深部筋(腸腰筋など)をはじめ、体幹部および四肢の筋群を無理なく強化でき、歩行動作の質(QOM)を改善させる内容を持った「パワーアシスト式楕円軌道型自転車トレーニングマシン」(マシン(1))および「簡易型体幹トレーニングマシン」(マシン(2))の2機種を開発した。マシン(1)はペダルの回転軸が楕円軌道を描いて移動するもので、座席位置が周期的に上下移動し、ハンドルも座席の移動に合わせて周期的に変化する。利用者は遊園地の乗り物に乗った感覚で自転車漕ぎ運動を行なうことができる。

ただし、利用者は、徐々に自分の意思を用いてハンドルの回転操作を行なうことができ、体重の左右方向への移動など、からだのバランス感覚を高めていくことが出来る。マシン(2)は座位姿勢で様々に肩関節を回転させることによって、体幹部の筋群の運動への参加度合いを高めていくことを目的として制作された。これらの機種を用いて介護施設入所者10名を対象に3ヶ月間のトレーニングを実施したところ、立位姿勢バランスや歩行動作能力の改善が図られ、自立した行動の割合が増加する結果を得た。低体力状態にある高齢者を対象としたトレーニングを評価する方法として、従来のように最大筋力やパフォーマンスの最大値を測るのではなく、歩行動作の質や、動作の中で発揮される筋力の改善効果を評価する方法が実際的であり、ビデオカメラなどを用いた動作評価や姿勢の変化の評価することが有効である。
テトラヒドロビオプテリンの褐色脂肪分化・増殖への関与因子の解明と移植医療への応用

テトラヒドロビオプテリン(BH4)はチロシン水酸化酵素(TH)や一酸化窒素合成酵素(NOS)の酵素反応に必須の共因子として作用する物質である。NOやノルアドレナリン(NA)は褐色脂肪組織の発生・分化にも関与することが知られている因子であるが、BH4がBATの発生・分化機構において与える影響を検討した報告はない。BH4産生能の低下したhph-1マウス及びそのバックグラウンドマウスを用い、その新生児期におけるBAT重量や機能を評価した。またマウス由来の不死化褐色脂肪前駆細胞及びhph-1マウスから単離した褐色脂肪前駆細胞を用い、薬理学的・遺伝子工学的操作を行い、褐色脂肪細胞分化への影響について検討を行った。マウス由来の不死化褐色前駆脂肪細胞に分化誘導を行い、分化に伴う経時的な遺伝子発現の変化を追ったところ、熱産生遺伝子の代表であるUCP1とGCH1及びeNOSの発現レベルが正に相関することが示された。同様の細胞を用い、薬理学的にGTPCH1の阻害を行ったところ、褐色脂肪分化が用量依存性に障害されることを観察した。またhph-1マウスから単離した褐色脂肪細胞の初代培養系でもバックグラウンドマウスと比して分化能の低下が観察され、BH4の欠乏による褐色脂肪細胞分化への影響が示唆された。また、新生児期におけるBATをhph-1マウス及びバックグラウンドマウスから単離し評価を行ったところ、hph-1マウス由来のBATの重量がより小さく、熱産生関連遺伝子の発現がより低下しており、胎生期におけるBATの分化にBH4が関与している可能性が示された。褐色脂肪組織の分化機構にBH4が関与している可能性が示された。褐色脂肪組織の発生・分化・増殖にBH4がどのように関与しているかについて詳細に検証し、移植・再生医療の基盤を確立するための研究を行う。nitric oxide (NO)およびノルアドレナリン(NA)の合成の補酵素として作用するテトラヒドロビオプテリン(BH4)がBATを介して糖・エネルギー代謝を制御する所見について、BH4欠乏マウスを用いて検討した。また、BH4欠乏マウスに対するバックグラウンドマウスのBATの移植実験により、高脂肪食による体重増加、内臓脂肪蓄積の抑制、血糖値の低下を認め、BH4が制御するBATが糖・エネルギー代謝に中心的な役割を果たしている重要な所見を得ており、論文発表を行った(Y. Oguri, Y. Fujita, N. Inagaki. et al. JCI Insight. 9: 91981. 2017)。BATの移植技術を用いた肥満・糖尿病に対する新規治療法の確立に向けて動物実験を行い系の確立を行っている。褐色脂肪細胞の移植の方法、有効性を動物モデルで確認した。褐色脂肪組織の発生・分化・増殖に関与する因子のスクリーニングを行い、移植・再生医療の基盤を確立する。
線形制約条件下での統計的推測

1。研究代表者が今回の研究目標として掲げたものは、線形制約条件下での統計的推測問題であった。多変量正規分布における線形制約条件下での平均ベクトルの検定では、その検定統計量の帰無仮説での分布の実際的計算法が残された課題である。その分布は重みつきカイ2乗分布になるのであるが、重みは象限確率として計算される。今回はこの象限確率の計算法に焦点を絞って研究した。この一年間を通して、いくつかの文献にあたり、現在も引き続き研究中であるが、一般的で画期的な計算法というものはまだ見出すことはできていない。そこでという訳ではないが、特殊な分散構造を持つような象限確率の、その特殊性を利用した計算法から手を付けなければならないのだろうと考え、ある種の結果は得ることができた。それはあるタイプの象限確率の母関数を求めたもので、数学的な結果であるとはいえるが、これが計算法に結びついていくかはまだ不明である。結果は近々、論文として発表される予定である。2。共同研究者の研究結果について述べると、加藤和久は解析学的立場から研究し、2次写像F_μ(x)=μx (1-x),(μ>4)がC^2構造安定であることを証明した。新関章三は実測度の収束列が与えられたとき、収束先の測度のHahn分解を収束列のHahn分解で表現できることを示した。また、大坪義夫は協力型Dynkin停止問題を研究し、停止時間の組に制約を課したときのPareto最適解の解析を行った。1。2。
様々な大規模データを用いた高齢者心臓手術の現状とリスクの可視化

高齢者の手術では術前状態や余命の考慮は重要な課題であるが依然不明な点が多く緊急例の過剰医療など問題が多い。本研究課題では「どのような状態の高齢者にどのような手術を実施するとアウトカムがどうなるのか」について、我が国の様々な大規模データベースを用いて、特にこれまで情報の少ないADLを中心として解析する。本研究課題により、医療者・患者双方にとって高齢者手術の意思決定の重要な情報が得られること、今後の介護データを含むNDBの利活用時に想定される課題に迫ること、が期待される。
DNAおよびRNAにおける未知変異検出・単離法の開発

我々は、Muファージの転移を利用してDNAの点変異を検出できることを示していたが、実験操作が煩雑なため一般的に用いられるに至っていない。これまで、転移反応は各試料ごとにトランスポゼース(転移酵素)やMu DNAを始め複数の試薬を混合して行なっていたが、この場合転移反応に1時間かかる。そこで我々は転移反応系を改変し、転移反応の律速となっていた転移複合体形成を不活性な状態であらかじめ調整し、そこに活性化緩衝液を加えるようにした。また、反応条件に対する要求性の高い転移複合体形成を予め行なうことで、ミスマッチへの転移特異性を高める実験条件の検討が行えるようになった。その結果、反応時間が5分で良好な結果の得られる、長期保存可能な転移反応系を構築することができた。また、Muが通常転移標的として利用できないDNA : RNAヘテロ二重鎖に塩基ミスマッチ依存的に転移することを発見した。この反応におけるミスマッチ依存性は非常に高く、ミスマッチのないDNA : RNAヘテロ二重鎖に対する転位は検出限界以下であった。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5'側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出/単離する方法を開発した。これは野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA : RNAヘテロ二重鎖に変換してMuにより検出するものである。利点は非常に高い特異性と、変異部位に挿入されたMuDNAを利用した変異DNAの単離である。これらについて現在特許を出願している。
ペプチド系界面単分子膜の調製と発振現象

ゲスト分子添加に伴ないポリペプチド単分子膜が油/水界面で振動することを見出した。用いた単分子膜成分は、疎水性ポリペプチドであるポリ(γ-メチルL-グルタメート)(PMG)の分子鎖末端に、親水性および分子認識能を有するβ-シクロデキストリン(β-CyD)を配した両親媒性ポリペプチド(PMG-CyD)である。n-ヘキサン/水界面にPMG-CyD単分子膜を形成し、β-CyDのゲスト分子である2-p-トルイジニルナフタレン-6-スルホン酸カリウム(TNS)を水相に加えたところ、1分以内に同単分子膜が振動を開始し、これを界面圧の周期的な変化として捉えることができた。さらにこの振動はPMG-CyD単分子膜の構造に強く依存し、PMG鎖が油相に配向した限られた個体膜状態のときにのみ発現することも確認された。さらにCyDのゲスト分子であるアダマンタンカルボン酸(ADC)を新たに添加したところ、やはり、自発的に界面圧の周期的な振動が発生した。これらの結果より、この振動現象は、ゲスト分子の濃度勾配の基に、その結合に伴なう膜の疎水化に始まり、油相でのゲストの放出をネガティブフィードバックとする膜のリズム運動であることがさらに明確になった。これらの現象は、ヒトの味覚・臭覚の受容機構を重なるものがあり、新規化学センサーへとしての応用の可能性を示した。疎水性ポリペプチドの分子鎖末端に、分子認識能を有するβ-シクロデキストリン(β-CyD)を配した両親媒性ポリペプチドが、油/水界面で単分子膜を形成することにより、β-CyDのゲスト分子を刺激源として発振する現象を定量的に解析し、その分子機構を明確にするとともに、新規情報変換分子システムとしての工学的応用を目的とした。モノアミノ化したβ-CyDを開始剤として用い、γ-メチルL-グルタミンN-カルボキシ酸無水物の重合を行い、分子認識能を有するCyDを分子鎖末端に配した両親媒性ポリペプチドを調製した(PMG_n-CyD;n=19,24,34)。また、ペプチド尾部の二次構造を、円二色性(CD)測定により評価した。その結果、すべてのPMG_n-CyDにおいて、α-ヘリックス構造をとっていることが明らかとなった。次に、n-ヘキサン/水界面におけるPMG_n-CyD界面単分子膜の形成と構造評価を行った。単分子膜の形成をテフロン製トラフに形成したn-ヘキサン/水界面に、PMG_n-CyDのDMF溶液を逐次展開して行い、その時の界面圧を、Wilhelmy法により測定し、表面圧-面積(π-A)等温線を作成した。その結果、一分子当たりの面積Aの減少に伴い、界面圧が急激に上昇する領域が2ケ所存在した。各々の界面圧が上昇する領域の直線部分をπ=0に外挿して、面積A_L、A_sを得た。各々のサンプルで広い面積A_Lは大きく異なっており、重合度の差を反映していたが、狭い面積A_sはPMG主鎖の重合度が異なるにも関わらず各試料とも同一の値であった。これは、A_s以下の面積ではα-ヘリックスが界面に対して垂直方向に配向しているためと考えられた。次に、ゲスト分子導入に基づく分子膜システムの運動リズムの発生について検討した。n-ヘキサン/水界面でのPMG_<19>-CyDの分子配向を制御した状態でCyDのゲスト分子である2-p-トルイジニルナフタレン-6-スルホン酸(TNS)添加し、その時の界面圧の時間変化を測定した。TNS添加の30秒後から自発的に界面圧の周期的な振動が発生した。この振動現象は、添加するゲストの濃度および種類に左右されるためCyDとゲストの錯体形成が主たる要因と考えられた。
子宮における着床成立に関与する新規因子の同定

胚における着床因子の同定に関しては、以前から着床に重要であるといわれているLifについて着目している。自作したLif-loxpマウス用いて、子宮特異的(PR-cre)および、子宮内膜上皮特異的(Ltf-cre)にLifをノックアウト(Lif-epiKO)すると不妊になることから、子宮内膜上皮のLifが重要であるため、子宮内膜上皮を起点とする、胚への影響を解析することにした。まず、WTマウスの着床前から、着床後の時系列(Day3, Day4am, Day4pm, Day5)の4点における、それぞれの子宮内膜上皮をレーザーマイクロダイセクションによって、RNAを回収し、RNA-seqによって網羅的解析を行った。また、胚側においては、着床直前のDay4pmのコントロールマウス、Lif epiKOマウス、Lif-epiKO+LIF(着床がレスキューできる)マウスそれぞれの胚のRNAを回収し、RNA-seqを行った。子宮側からのインプットと、胚側からのアウトプットが合致するようなパスウェイを探索したところ、着床に向けて、胚のAKTシグナルに関与するFGFRが高発現しており、そのリガンドとなるCTGFが子宮内膜上皮において、着床期に向けて発現が上昇していることが見出された。実際のCTGFの発現をDay4pmのコントロールマウス、Lif epiKOマウス、Lif-epiKO+LIFマウスの子宮を用いてqPCRで確認したところ、コントロールマウスと比較して、Lif epiKOマウスで発現が低下し、Lif-epiKO+LIFでは、発現が回復していた。以上のことから、一つの可能性として、着床期に向けて、LIFのシグナルがCTGFのような液性因子の発現を促し、それが胚のインテグリン等の接着因子に作用して下流のAKTシグナルを活性化させ、着床、その後の浸潤を促すことが考えられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。マウスやヒトにおいて、着床時には妊娠ホルモンといわれるプロゲステロン(P4)の濃度が上昇し、子宮がそれに応答して、子宮内膜の上皮の増殖が停止し、子宮内膜間質が増殖し始める。この変化がないと、着床不全が生じる。こういった変化には、P4が核内受容体のプロゲステロン受容体(PR)に結合し、プロゲステロンシグナル(PRシグナル)が活性化することにより、このスイッチングがおこることが知られているが、その現象が胚を受容するためのどういったメカニズムにつながるかは不明である。これを明らかにするために、P4を制御する上流のメカニズムとして、miRNAのアレイを着床準備期前のマウスの子宮(Day3)と着床準備期の(Day4)の子宮を用いて、マイクロアレイ解析を行った。Day3と比較してDay4のmiRNAの発現低下がみられたもののうち(15遺伝子)、マウスとヒトで保存されていたものは2遺伝子存在した。その2遺伝子を、各個体の子宮を用いて、Day3とDay4でRNAの発現定量したところ、確実に発現がDay4で低下していたものは1遺伝子に絞られた。PRシグナルと着床との詳細な関係を明らかにするために、着床に重要なLif-LifR-STAT3シグナルにおける子宮内膜上皮、および子宮内膜間質特異的欠損マウスを作製したところである。今後は、これらのマウスの着床時期における表現系を解析し、子宮内膜の増殖と着床との関係を解析していく予定である。miRNAのアレイにより、Day4で発現低下していたものが15遺伝子取り上げられ、そのうち詳細な発現定量解析により1遺伝子まで絞られた。当初予定していたFKBP52欠損マウスの解析に関しては、マウスの増えが悪いため、切り替えてPR阻害剤であるRU486を投与して着床を阻害するモデルを用いて、子宮内膜上皮をレーザーマイクロダイセクションにより回収し、RNA-seqを行い、PRシグナル阻害による発現変化を見出しているところである。また、Lif,LifR,STAT3の子宮特異的遺伝子欠損マウスは、おおむね順調に作成できた。胚側からの着床因子の同定に関しては、以前から着床に重要であるといわれているLifについて着目した。自作したLif-loxpマウス用いて、子宮内膜上皮特異的にLifをノックアウトすると不妊を示した。さらに、子宮内膜上皮Lifノックアウトマウス(Lif d/dマウス)の着床時期Day5の着床部位をブルーダイで染色したところ、コントロールマウス(Lif f/fマウス)では、着床部位が青く染めだされるのに対し、Lif d/dマウスでは全く認められなかった。Lif d/dマウスのDay4にLIFを投与したところ、Day5の午後には着床部位が認められ、着床がレスキューされ、出産できた。このことから、着床直前の子宮内膜上皮のLIFが着床を誘導していることが明らかとなった。今年度はLif d/dマウスとLif d/dマウス+LIFレスキューマウスの胚における詳細なメカニズムを解析する予定である。子宮側からの着床因子の同定に関しては、マウスでの着床前(Day3),前受容期(Day4 am)と着床直前(Day4 pm)の子宮を継時的に回収し、凍結切片を作製した。さらに、着床期に胚と接着する子宮内膜上皮を、凍結切片上でのレーザーマイクロダイセクションにより回収し、そこからRNAを抽出し、次世代シークエンスにかけて、大規模データを回収した。

また、3種類の着床不全モデルを用いて、着床できない子宮内膜上皮を回収し、同様に大規模データを回収した。今年度は、これらの遺伝子発現プロファイルから、胚受容能に必要な遺伝子群を抽出する予定である。Lif-loxpマウス作成も進み、表現型まで確認できた。Lif-loxpマウスの増えが悪いこともあったが、今後はさらに詳細な解析ができる段階まで進められた。また、子宮内膜上皮における大規模データも回収でき、今後はヒトの細胞も回収して、解析する準備ができている。胚における着床因子の同定に関しては、以前から着床に重要であるといわれているLifについて着目している。自作したLif-loxpマウス用いて、子宮特異的(PR-cre)および、子宮内膜上皮特異的(Ltf-cre)にLifをノックアウト(Lif-epiKO)すると不妊になることから、子宮内膜上皮のLifが重要であるため、子宮内膜上皮を起点とする、胚への影響を解析することにした。まず、WTマウスの着床前から、着床後の時系列(Day3, Day4am, Day4pm, Day5)の4点における、それぞれの子宮内膜上皮をレーザーマイクロダイセクションによって、RNAを回収し、RNA-seqによって網羅的解析を行った。また、胚側においては、着床直前のDay4pmのコントロールマウス、Lif epiKOマウス、Lif-epiKO+LIF(着床がレスキューできる)マウスそれぞれの胚のRNAを回収し、RNA-seqを行った。子宮側からのインプットと、胚側からのアウトプットが合致するようなパスウェイを探索したところ、着床に向けて、胚のAKTシグナルに関与するFGFRが高発現しており、そのリガンドとなるCTGFが子宮内膜上皮において、着床期に向けて発現が上昇していることが見出された。実際のCTGFの発現をDay4pmのコントロールマウス、Lif epiKOマウス、Lif-epiKO+LIFマウスの子宮を用いてqPCRで確認したところ、コントロールマウスと比較して、Lif epiKOマウスで発現が低下し、Lif-epiKO+LIFでは、発現が回復していた。以上のことから、一つの可能性として、着床期に向けて、LIFのシグナルがCTGFのような液性因子の発現を促し、それが胚のインテグリン等の接着因子に作用して下流のAKTシグナルを活性化させ、着床、その後の浸潤を促すことが考えられた。研究はおおむね順調に進展しているため、今後の研究は、アプローチ方法を少し変えながらも、当初の目的を達成するには、問題がないため、予定通り進めていく。研究は順調に進んでいるため、今後の研究は研究計画に沿って進めていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
家・野蚕の脳における神経伝達物質による前胸腺刺激ホルモンの分泌調節

昆虫の脱皮・変態・蛹休眠覚醒を上位で制御する前胸腺刺激ホルモン(PTTH)は、脳内神経分泌細胞の細胞体で合成されアラタ体まで伸びた軸索末端から分泌されるので、カイコ(Bombyx mori)幼虫5令3日目及び柞蚕(Antheraea pernyi)蛹の脳-側心体-アラタ体複合器官を用い、PTTHの分泌調節機構の解明を試みた。まず、Ca^<2+>-ion存在下、Ca^<2+>-ionophoreにより細胞内Ca^<2+>-ion濃度を高めるとPTTH分泌が促進されることから、この分泌は、Ca^<2+>-ionが関係する「刺激-分泌連関」であることを明確にした。そこで、細胞内Ca^<2+>-ion濃度を上昇させる神経伝達物質の効果を調べ、Carbachol、Serotoninが分泌を促進することを明示した。さらに、Carbacholの促進効果について、i)複合器官によるPTTH分泌に、Muscarineによって促進され、Atropine (Muscarine antagonist)によって抑制されるMuscarine受容体介在細胞内シグナル伝達が関与していること、ii)Phospholipase C、Protein kinase C (PKC)、Calmodulin (CaM)に対する特異的阻害剤が分泌を阻害することから、このシグナル伝達系に、Phosphatidylinositol-diPの分解産物であるDiacylglycerolとIP_3が活性化するPKC及びCa/CaM-PKによるタンパク質のリン酸化が関与していることを明確にした。さらに、CarbacholによるPTTH分泌促進に際し、32kDと21kDのタンパク質がCa/CaM-PKにより、また、25kDのそれがPKCによりリン酸化されることが明らかになった。このうち、25kDと21kDのリン酸化タンパク質は、PTTH-神経分泌細胞の軸索末端部位に局在し、PTTH分泌において、生理的に重要な役割を果たしていることを推定した。一方、昆虫の蛹の休眠覚醒の調節機構を明らかにするため、柞蚕休眠蛹について、明16時間-暗8時間の光周期条件下で、覚醒に至るまでの間、体液中のPTTH力価およびエクダイソン量の変動と、PTTH分泌を調節すると予測される神経伝達物質に対する脳-側心体-アラタ体複合器官の応答能の変動を調べた。その結果、セロトニン→神経内分泌細胞→PTTH分泌→前胸腺→エクダイソン分泌のカスケード系が蛹の休眠覚醒を調節していることが明らかとなった。家蚕の幼虫5令期(3日目明期)の安定な脳-側心体-アラタ体複合器官を用いて、既に明らかにした「アセチルコリン→→PTTH-神経分泌細胞→PTTH分泌」に関わるシグナル伝達系の詳細を検討し、新たに以下の結果を得た。i)PTTH-及びムスカリン性アセチルコリン受容体(Subtype M_1)-特異抗体を用いた免疫組織化学染色より、PTTH-

脳神経分泌細胞にM_1受容体が発現されていることと、PTTH分泌がM_1受容体特異的アンタゴニストにより阻害されることを見出し、PTTH分泌促進が、アセチルコリンによるPTTH-神経分泌細胞内の直接刺激によることを実証した。ii)アセチルコリンにより、PTTH-神経分泌細胞に誘起されるシグナル伝達:Muscarnic acetylcholine receptor →GTP binding protein →Phospholipase C →IP_3+Diacylglycerol →Ca^<2+>-CaMkinase+Proteinkinase Cのうち、両酵素が共役して蛋白質を燐酸化することが必須であること、iii)この際、Ca^<2+>-CaMkinaseによって脳部に位置するPTTH-神経分泌細胞の32kDとアラタ体に位置するPTTH-神経分泌細胞軸索末端の21kDの蛋白質が、また、Proteinkinase Cによって同じ軸索末端の25kD蛋白質が特異的に燐酸化されることを確認した。なお、燐酸化される蛋白質の生理的役割については、研究を継続中である。他方、さく蚕(野蚕)休眠蛹の光周性依存覚醒[長日処置(L18:D6)による覚醒]に関して次の新知見を得た。i)体液中へ2回のPTTH分泌(610日目,1722日目)と1回のエクダイゾン分泌(2022日目)を経て、3032日で覚醒成虫化した。この間、ii)脳内でドーパミンとノルエピネフィリンの量は2025日にピークを示し、セロトニン量は1525日にわたり漸時増大した。iii)しかし、PTTH分泌器官である脳-側心体-アラタ体複合器官は、2022日にセロトニンにだけ応答してPTTHを分泌する能力を発現した。これらのことから、セロトニンが、休眠蛹の覚醒を誘導する内分泌カスケード(PTTH分泌→エクダイソン分泌)のPTTH分泌を調節するものと推定した。他方、昆虫の蛹の休眠覚醒の調節機構を明らかにするため、柞蚕(Antheraea pernyi)の休眠蛹について、明16時間-暗8時間の光周期条件下で、覚醒に至るまでの間、体液中のPTTH力価及びエクダイソン量の変動と、PTTH分泌を調節すると予測される神経伝達物質に対する脳-側心体-アラタ体複合器官の応答能の変動を調べた。その結果、環境情報である光刺激からPTTHを分泌する神経細胞へ至る細胞外情報伝達系に神経伝達物質であるセロトニンが関与していたことから、柞蚕休眠蛹の覚醒が、光刺激--⇒神経分泌細胞⇒セロトニン分泌--⇒神経内分泌細胞⇒PTTH分泌⇒前胸腺⇒エクダイソン分泌のカスケード系によって調節されていることが明らかとなった。