hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関節リウマチの滑膜細胞増殖情報伝達機構解明とその制御によるアンチセンス療法開発

慢性関節リウマチ(RA)患者由来の滑膜細胞と骨芽細胞における腫瘍壊死因子(TNF)による細胞増殖とそのシグナル伝達を解析した。その結果、高濃度(500U/ml)TNFの存在下では、骨芽細胞の細胞増殖は抑制され最終的にはアポトシスが誘導された。一方、滑膜細胞は強い増殖を示した。転写因子活性をゲルシフト法で検討すると、滑膜細胞は非刺激時でNF-_KBが活性化をうけており、骨芽細胞はAP1活性が認められた。アンチセンスNF-_KB,アンチセンスc-junの処理により、NF-_KB活性化はTNF-α刺激による細胞死に対して抑制的に作用していることが明らかになった。また、RAに対するアンチセンス療法を開発するため、アンチセンス核酸やリボザイムを滑膜細胞に導入する方法として、不活性型センダイウイルス(HVJ)-リポソーム法を検討した。その結果、培養細胞において、従来のアニオン型よりもHVJ-カチオン型リポソーム法が細胞内導入効率が高いことが判明した。さらに、本方法を用いてHTLV-I tax mRNA切断リボザイムにより,HTLV-I型関節症の滑膜細胞増殖を抑制することに成功した。以上、当初予定した実験をすべて終了し、滑膜細胞における転写因子の役割と遺伝子治療に対する遺伝子導入法の検討により、期待すべき成果を得ることができた。本年度は、当初の実験計画に従い、トロンビン、TNF-αによる慢性関節リウマチ(RA)の滑膜増殖のシグナル伝達の分子機構を中心に研究を行った。まず、RA患者の血清、関節液中のサイトカインとトロンビン/ATIII複合体(TAT)の検討を行った。その結果、RA患者は変形性膝関節症(OA)患者と比較して血清、関節液中のIL-6,IL-8,TNF-α,TATが有意に上昇しており、とくにTATは関節液が血清に比べ10倍以上高いことを認めた。次にRA患者の膝関節より滑膜組織を採取し滑膜細胞を得た。この滑膜細胞はトロンビン受容体を高発現していることを免疫染色とRT-PCR法にて確認した。トロンビンおよびトロンビン受容体活性化ペプチドで滑膜細胞を刺激すると細胞のチミジン摂取率は約2.5倍上昇した.次にトロンビン受容体を介する滑膜細胞のシグナル伝達を解析した。トロンビン刺激により約3分以内に細胞内カルシウムが上昇し同時にプロテインC活性が上昇した。さらにトロンビン刺激によりNF-kBは細胞質より核へ移行し活性化されることを認めた。以上の結果より、トロンビンの刺激を受けた滑膜細胞はNF-kBの活性化を通じてTNF-α,IL-6,IL-8,GM-CSFの産生を誘導する機構が明らかになった。平成9年度は、プロテオソーム阻害剤、カルパイン阻害剤やNF-kB,AP-1などの転写因子活性化抑制剤、さらにHVJ-cationicリポソーム法の遺伝子導入法を用いたアンチセンス法を利用して、滑膜細胞の細胞内シグナル伝達機構の詳細な検討と選択的特異的増殖抑制法の検討を行う予定である。
PPAR-γ核内受容体分子を標的にした新しい膵癌治療

[材料と方法]代表的なヒト膵菅癌細胞株であるBxPC-3および大腸癌細胞株HT-29(これらはいずれもp53 statusがmutant typeである)を使用した。これら細胞株に対して、TZD処理することで、分化誘導のマーカーであるE-cadherin, differentiation-related gene-1(Drg-1)の発現の推移を遺伝子および蛋白レベルで、またE-cadherin発現増強に伴って推移すると思われるβ-cateninの蛋白量や細胞内局在の異常(主に細胞質内での蓄積と核内移行)の有無を蛍光抗体法で詳細に観察し、核内でβ-catenin遺伝子の下流にあるc-Myc、MMP-7, cyclin D1遺伝子の推移についても観察した。また、浸潤能をマトリゲルinvasion assay法で評価した。[結果]BxPC-3およびHT-29癌細胞はいずれもTZDを処理によりE-cateninおよびDrg-1の発現が著増した。そして、蛍光抗体法では、TZD処理前ではβ-catenin蛋白は細胞膜よりも細胞質内および核内に局在していたが、TZD処理ではE-cadherinの細胞膜での発現増強に伴ってβ-catenin(蛋白量には変化なし)も局在が細胞膜へ移行した。そして、癌細胞間の接着脳は亢進し、マトリゲルinvasion assayでも浸潤能は低下した。しかし、今回の実験でc-Myc、MMP-7, cyclin D1遺伝子の推移には大きな変化がみられなかった。[まとめ]PPAR-γ発現癌細胞に対してTZDは、分化誘導を介して細胞間接着脳の亢進を惹起し、cytostaticな増殖抑制と浸潤抑制効果を示した。PPAR-γは、retinoid X receptor (RXR)と二量体を形成し、それぞれのリガンド結合に依存してPPAR応答性部位と呼ばれる特異的なDNA塩基配列に選択的に結合して転写を制御する核内受容体である。我々はこれまでに、1)消化器癌のなかでも膵癌や大腸癌では高率にPPAR-γ蛋白が過剰に発現していること、2)PPAR-γの特異的リガンドであるthiazolidinedione (TZD)処理によりcell cycle調節因子であるp21Waf-1蛋白が強く誘導され、cytostatic(G1 arrest)に癌細胞の増殖が抑制されること、3)TZD処理でE-cadherinの細胞膜での発現増強(分化誘導)に伴って、細胞質内のtyrosine phosphorylationを受けたβ-catenin(蛋白量には変化なし)が減少し、β-cateninの局在が細胞質から細胞膜(細胞骨格系蛋白)へとtranslocationすること、さらに4)癌細胞間の接着能亢進により、in vitro(マトリゲルinvasion assay)での運動・浸潤能が低下することを報告してきた。最終年度である今年度は、TZDの転移抑制効果についてin vivoの実験を行い、本研究の総括をおこなった。実験には、PPAR-γ強陽性BxPC-3膵癌細胞株およびHT29大腸癌細胞株を使用し、転移実験モデルは教室で確立した方法(ヌードマウスの直腸粘膜下にそれぞれの癌細胞を移植し、6週後に屠殺して各臓器やリンパ節内でのヒト由来β-globinDNAをプライマーとしてReal time PCR法で増幅し、癌転移を高感度かつ定量的に評価する方法)を用いて詳細に検討した。その結果、両細胞株において、いずれもTZD治療群での直腸原発巣の腫瘍重量は有意に少なく、リンパ節転移や肺転移は完全に抑制された。[まとめ]以上の成績より、PPAR-γ核内受容体を標的にしたTZDによる癌治療は、PPAR-γ蛋白過剰発現膵癌細胞や大腸癌細胞に対して、癌細胞の分化を誘導すると共に、その増殖をcytostaticに抑制し、効率よくmetastatic phenotypeを減弱させることから、tumor dormancyを誘導する有用な治療法であると思われた。
緑色葉菜類の弱光照射CA貯蔵法の提案とその実証試験

トマト接ぎ木セル苗を供試植物として、気温10±0.5°C(低温貯蔵用気温)、O_2濃度21±1%(通常大気濃度)下において、CO_2交換速度が0、すなわちCO_2収支が0となるCO_2濃度および光強度(光合成有効光量子束密度)の組み合わせを策定する試験を行った。なお、O_2濃度を通常大気程度としたのは、O_2濃度制御を必要としない実用的な貯蔵システムの開発を念頭に置いたためである。光源には赤色発光ダイオード(ピーク波長:690nm)を用いた。その結果、CO_2濃度をx[%]、光強度をy[μmol・m^2・s^<-1>]とすると、その組み合わせは、y=0.42949+0.37475/x(r^2=0.98)で近似できる曲線上に位置することがわかった。次に、この曲線上からCO_2濃度と光強度の組み合わせを5組選び出し、その環境条件下で、それぞれ4週間の貯蔵試験を行った。その結果、貯蔵後の外観品質の主観評価および移植後の生育調査から、CO_2濃度0.5%+光強度1.9μmol・m^2・S^<-1>の組み合わせが、1.0%+0.5μmol・m^2・s^<-1>、0.05%(通常大気濃度)+1.6μmol・m^2・S^<-1>などよりも有意に適していることが明らかとなった。このことは、光補焦点付近の弱光照射単独よりも、それにCAを加えて呼吸抑制をした上で弱光照射を行う弱光照射CAの方が、緑色葉菜類の低温貯蔵に有効な貯蔵法であること、さらにはCO_2交換速度を0とするようなかなり限定された環境条件下にあっても、さらに最適なガス組成と光強度の組み合わせが存在することを示している。続いて、貯蔵期間中のCO_2収支をつねに0に維持するために、CO_2濃度をある一定値とするよう光強度をPID制御する低温貯蔵システムを構築して貯蔵試験を行い、そのシステムの有効性を確認した。この試験とこれまでの成果から、光強度を制御するよりもむしろ、光強度をある一定値とするようCO_2濃度を制御してCO_2収支をつねに0とする低温貯蔵システムの方がより有効である可能性のあることを見い出した。収穫後のチャービル(生食用ハ-ブの一種)株を供試植物として、気温5±0.5°C(低温貯蔵用気温)、O_2濃度21±1%(通常大気濃度)下において、CO_2交換速度0、すなわちCO_2収支が0となるCO_2濃度および光強度(光合成有効光量子束密度)の組み合わせを策定する試験を行った。その結果、CO_2濃度をx[%]、光強度をy[μmol・m^2・s^<-1>]とすると、その組み合わせは、y=0.2784+0.0657/x(r^2=0.9678)で近似できる曲線上に存在することがわかった。次に、この曲線上からCO_2濃度と光強度の組み合わせを3組選び山し、実際にその環境条件下で、それぞれ4週間の貯蔵試験を行った。その結果、貯蔵後の色差および外観品質の主観評価値から、CO_2濃度0.5%+光強度0.5μmol・m^2・s^<-1>の組み合わせが、1.0%+0.2μmol・m^2・s^<-1>および0.05%(通常大気濃度)+1.6μmol・m^2・s^<-1>よりも収穫後のチャービル株の貯蔵に適していることが明らかとなった。このことは、CO_2交換速度を0とするようなかなり限定された環境条件下にあっても、さらに最適なガス組成と光強度の組み合わせが存在することを示すものである。また同時に、光補焦点付近の弱光照射により乾物重維持を行う弱光照射貯蔵法よりも、それにCAの考えを導入した弱光照射CA貯蔵法の方が、緑色葉菜類の低温貯蔵に有効な貯蔵法であることを示すものである。次年度は、貯蔵蔵期間中の緑色葉菜類のCO_2収支を常に0に維持するために光強度をPID制御した貯蔵試験など、より効果的な弱光照射CA貯蔵法の開発へ向けた試験を行う。

次に、この曲線上からCO_2濃度と光強度の組み合わせを5組選び出し、その環境条件下で、それぞれ4週間の貯蔵試験を行った。その結果、貯蔵後の外観品質の主観評価および移植後の生育調査から、CO_2濃度0.5%+光強度1.9μmol・m^2・S^<-1>の組み合わせが、1.0%+0.5μmol・m^2・s^<-1>、0.05%(通常大気濃度)+1.6μmol・m^2・S^<-1>などよりも有意に適していることが明らかとなった。このことは、光補焦点付近の弱光照射単独よりも、それにCAを加えて呼吸抑制をした上で弱光照射を行う弱光照射CAの方が、緑色葉菜類の低温貯蔵に有効な貯蔵法であること、さらにはCO_2交換速度を0とするようなかなり限定された環境条件下にあっても、さらに最適なガス組成と光強度の組み合わせが存在することを示している。続いて、貯蔵期間中のCO_2収支をつねに0に維持するために、CO_2濃度をある一定値とするよう光強度をPID制御する低温貯蔵システムを構築して貯蔵試験を行い、そのシステムの有効性を確認した。この試験とこれまでの成果から、光強度を制御するよりもむしろ、光強度をある一定値とするようCO_2濃度を制御してCO_2収支をつねに0とする低温貯蔵システムの方がより有効である可能性のあることを見い出した。
白内障の発生要因に関する研究-異物代謝酵素系の遺伝的多型性との関連-

試料としては、発生原因不明の白内障患者(138名)及び、同地域、同年齢域の白内障非発生者(62名)合計200名を対象とした。対象者の血液よりDNAを抽出し上記の異物代謝系酵素の遺伝的多型性と白内障発生との相関の解析をPCR法、PCR-RFLP法,Aso-primer-PCR法を用いて行った。GST1に関して昨年度と異なるexon部分を増幅したが、昨年度と同様な結果つまり、白内障患者には有意にGST1遺伝子の欠損者が多いことが判明した(p<0.001)。ALDH2に関しては、白内障患者にはwild typeの表現型の比率が多い傾向にあったが、有意差は無かった(p=0.19)。このことは飲酒が白内障発生を助長している可能性があることを示唆しており、今後も追加研究の必要性があると思われる。ALADとCYP1A1に関しては、その遺伝的多型性と白内障発生について相関性は認められ無かった。(ALAD;P=0.34,CYP1A1;P=0.98)試料としては、発生原因不明の白内障患者(138名)及び、同地域、同年齢域の白内障非発生者(62名)合計200名を対象とした。(ALAD;P=0.34,CYP1A1;P=0.98)
レトロウイルス発現ライブラリーを利用したイヌ肥満細胞腫新規腫瘍化メカニズムの解析

イヌ肥満細胞腫において、腫瘍化メカニズムとして報告されているc-kit遺伝子の変異率を解析し、レトロウイルス発現ライブラリー法を利用してc-kit遺伝子以外の腫瘍化メカニズムを探索した。イヌ肥満細胞腫では、半数以上でc-kit遺伝子に変異が検出されなかった。次に、レトロウイルスを作製しイヌ骨髄由来肥満細胞へ感染させたが、感染効率が悪く、本方法を用いてc-kit遺伝子以外の肥満細胞腫瘍化メカニズムを同定することは出来なかった。本研究の目的は、イヌにおいて多発する肥満細胞腫において、c-kit遺伝子の特性を解析するとともに、転移、再発および腫瘍化メカニズムをレトロウイルスcDNA発現ライブラリーを用いた腫瘍化遺伝子スクリーニング法を応用することで、網羅的かつ効率的に解析することである。1.イヌ肥満細胞腫におけるc-kit mRNA全長の塩基配列解析:肥満細胞腫19症例および肥満細胞腫細胞株2種類の計21検体を用い、c-kit遺伝子全長の塩基配列を解析した。c-kit遺伝子の主要な変異であるエクソン11の変異は5検体(23.8%)で認められ、他の部位におけるアミノ酸置換を伴う点突然変異は4検体(19.0%)で認められたが、残りの12検体(57.1%)においてはアミノ酸置換を伴う変異は確認されなかった。解析した症例の半数以上でc-kit遺伝子の変異が確認出来なかったことから、c-kit遺伝子の変異以外の肥満細胞腫瘍化機構が存在することが示唆された。2.肥満細胞種の転移・再発メカニズムの解析:肥満細胞腫12症例において、末梢血液中の循環肥満細胞を細胞表面マーカーを用いて高感度に検出した。その結果、4症例(33.3%)において末梢循環肥満細胞が検出され、治療により細胞数の変動が認められた。3.イヌ骨髄細胞および骨髄由来肥満細胞へのレトロウイルス感染:イヌ骨髄細胞を分離し、骨髄由来肥満細胞を培養した。分離後の骨髄細胞および骨髄由来肥満細胞に初年度に作成したレトロウイルスを感染させたが、ほとんどの細胞に対し遺伝子導入が認められなかった。一方、肥満細胞腫細胞株に対しては、約20%の細胞においてレトロウイルスによる遺伝子導入が認められた。これらの結果から、イヌ骨髄細胞および骨髄由来肥満細胞に対しては、レトロウイルスよりもレンチウイルスを用いた遺伝子導入の方が効率的である可能性が考えられた。本研究の目的は、イヌにおいて多発する肥満細胞腫の新規腫瘍化メカニズムを、レトロウイルスcDNA発現ライブラリーを用いた腫瘍化遺伝子スクリーニング法を応用することで、網羅的かつ効率的に解析することである。本年度は、レトロウイルスcDNA発現ライブラリー法をイヌ肥満細胞に応用するために以下の実験を行った。1.イヌ骨髄由来肥満細胞培養方法の確立:造血幹細胞および血液前駆細胞のマーカーの1つであるCD34を指標に、正常犬から採取した骨髄細胞中のCD34陽性細胞を磁気細胞分離法を用いて分離した。その結果、90%以上の精製度でCD34細胞を分離することができた。分離したCD34陽性細胞を、イヌ組み換えstem cell factor(cSCF)存在化で4週間以上培養することで、イヌ骨髄由来肥満細胞を培養することに成功した。2.レトロウイルスの作製:パッケージング細胞株に、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパクプラスミド(pVSV-G)とGFP発現プラスミドを遺伝子導入して、イヌの細胞にも感染可能なGFP発現レトロウイルスを作製した。接着細胞を用いてレトロウイルスの感染効率を算出した結果、高力価のウイルスを作成することに成功した。現在、上記イヌ骨髄由来肥満細胞へレトロウイルスを感染させ、最適感染時期および感染効率を調べている。3.cDNAライブラリーの作製: c-kit遺伝子に変異を有するイヌ肥満細胞腫細胞株およびc-kit遺伝子に変異を認めないイヌ肥満細胞腫細胞株からRNAを抽出し、レトロウイルスcDNA発現ライブラリーを現在作製している。高純度のイヌ骨髄由来肥満細胞の培養方法を確立するのに時間を要したため。1.腫瘍化クローンの選択・増殖:イヌ骨髄由来肥満細胞にレトロウイルスを感染させた後、cSCFの非存在下で限界希釈法またはメチルセルロース培地で細胞を培養し、腫瘍化クローンを選択・増殖させる。2. cDNAライブラリー(レトロウイルス発現ライブラリー)由来遺伝子の増幅・同定:得られた腫瘍化クローンからゲノムDNAを抽出し、アダプター配列特異的プライマーを用いて再度PCRを行う。DNAシークエンサーによりPCR産物の遺伝子配列を決定し、遺伝子データベースと比較することで、遺伝子の種類および変異の有無を解析する。3.腫瘍化の再現および腫瘍化原因遺伝子の特定: In vitroおよびin vivoの評価系により、肥満細胞の腫瘍化を再現し腫瘍化原因遺伝子を決定する。In vitroにおいては、目的遺伝子をクローニングし、再度レトロウイルスを用いてイヌ骨髄由来肥満細胞に遺伝子を導入する。cSCFの非存在下で遺伝子導入した肥満細胞を培養することにより、肥満細胞の腫瘍化を評価する。In vivoにおいては、目的遺伝子を導入した肥満細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍形成の有無を評価する。

4.臨床サンプルの解析:イヌ肥満細胞腫の臨床サンプルにおいて、新たに同定された腫瘍化原因遺伝子の発現およびその変異を解析すると同時に、c-kit遺伝子の変異の有無、肥満細胞腫の病理学的グレードおよび症例の予後についても調べる。これらを総合的に評価することにより、肥満細胞腫における腫瘍化原因遺伝子の臨床的重要性を検証する。研究費の多くは、in vitroおよびin vivoの実験のために必要な試薬や実験器具などの消耗品購入にあてる予定である。本研究においては、イヌ肥満細胞腫からcDNAライブラリーを作製し、レトロウイルスを用いて正常なイヌ骨髄由来肥満細胞に遺伝子導入後、腫瘍細胞への形質転換を起こさせる。そのため消耗品費を用いて、細胞培養試薬、遺伝子・タンパク質発現解析用試薬、遺伝子導入用試薬、腫瘍細胞同定・分離用抗体などを購入する予定である。本研究においては、イヌおよびマウスを用いた研究が必須であるため、研究費の一部を実験動物の購入および維持・管理費として計上する。また、研究効率を上げるため、実験補助謝金を用いて、実験補助者に実験動物の管理補助および研究実施補助を依頼する予定である。さらに、得られた研究成果を広く一般に公開するために、研究費の一部を学会発表のための国内および外国旅費として計上する。
養護教諭の健康相談活動スキル向上のためのプログラムの開発

本研究の目的は養護教諭の行う健康相談活動のスキル向上を目指した参画型プログラムの開発である。健康相談活動のスキルとして改訂版生活分析的カウンセリングとコラージュ技法に焦点をあて研修会を開催し、養護教諭は勤務校でスキルを活用した健康相談活動を実践した。その結果、プログラムに対する評価は高く、スキルを適用された児童生徒の自己肯定度インベントリー得点が有意に上昇していた。このことから、本プログラムの有用性が示唆された。養護教諭の健康相談活動スキル向上のためのプログラム開発を目指して、小学校の養護教諭を対象に参画型研修を実施した。参画型のプログラムのなかで、養護教諭は、児童の健康調査と健康課題の明確化を行い、健康課題解決のためのスキルとして改訂版生活分析的カウンセリング(LAC-R)を実践した。【結果】小学校の養護教諭15名を対象に2010年7月2011年2月の間の土曜日に5回の研修会を開催した。研修会の内容は、午前は児童生徒の発達課題や健康課題を理解することを目的とした講義、午後は理論やモデルに基づいた健康相談活動の演習で構成した。評価は、毎回の研修修了時および最終研修修了時にアンケートにより行った。その結果、「プログラムとして適切である・ほぼ適切である」と回答した割合は、講義では92.3%100%、演習では76.9%100%と高い評価が得られた。5回の研修全体の評価は、「良かった・ほぼ良かった」と回答した割合は、「内容」100%、「期間」77%、「時期」53.9%であった。本プログラムは参画型であるので、養護教諭は児童の健康実態調査を行い、その結果をもとにLAC-Rによる介入を実施した。児童の健康実態調査は小学4年生6年生1786人に行い、有効回答1682を分析した。自覚症状で訴えの多い項目は、男女ともに「横になって休みたい」「目が疲れる」「おなかが痛い」であった。そこで、自覚症状の訴えの多い児童を中心に、養護教諭によるLAC-Rの介入を実施した。LAC-R実施前後のデータが得られた195人を分析した結果、自覚症状尺度得点では有意な差は認められなかったが、自己肯定度インベントリーの下位尺度の「家庭場面での自己(p=0.012)」と「学校場面での自己(p=0.016)」で有意差が認められ、LAC-R実施後は高かった。これらの結果から、本プログラムは養護教諭の健康相談活動スキル向上に貢献できることが示唆された。次年度は小学校・中学校・高等学校共通のプログラムの精選を行う予定である。本年度は、小学校、中学校、高等学校の養護教諭に共通して必要な健康相談活動スキルの向上を目指した参画型プログラムの内容としてコラージュ技法を取り上げ、養護教諭が勤務校において児童生徒にコラージュ技法を導入、実践した。そして1年間を通じて行った5回の研修会でコラージュ作品を通した事例検討を行い健康相談活動スキルの向上を目指した。対象は小学校養護教諭7名、中学校養護教諭3名、高等学校養護教諭3名の計13名である。平成23年6月11日(土)に第1回目の研修会を開催し、本年度の研究目的と今後の進め方について共有した。その後各学校において、養護教諭が児童生徒の健康相談活動の一環としてマガジン・ピクチャー・コラージュによるコラージュ技法を実践した。そして平成23年10月、11月、平成24年2月、3月に開催した研修会で事例検討を行った。事例検討を行った件数は、小学生14名、中学生12名、高校生6名の合計32名であった。そのうち15名は2回以上継続してコラージュを作成していた。コラージュを作成した児童生徒の感想は、「眠れるようになった」「完成出来てうれしかった」「すっきりした」などが記述されていた。また、養護教諭のコラージュ作成中の観察では、児童生徒は自分の好きな切片を雑誌などのなかから捜して切って貼るという一連の作業を夢中になって楽しそうに行っていた、集中していたなどの肯定的な言動が観察されている。コラージュの特徴として、材料さえそろえばどこでもいつでもだれでも簡便に出来るという特徴がある。今回は、小学校1年生から高校3年生まで、幅広い年齢層で実施できた。また、養護教諭はコラージュ作品を児童生徒理解に活用し、コラージュを媒介として養護教諭と児童生徒とのコミュニケーションが促進されでいた。本研究の目的は、養護教諭の健康相談活動スキルの向上を目指したプログラムの開発である。最終年度の平成24年度は、平成22年度と平成23年度に実施したプログラムの効果検証を行った。平成22年度は小学校の養護教諭15名を対象に改訂版生活分析的カウンセリング(LACーR)に焦点をあてた参画型プログラム、平成23年度は平成2022年度に実施した健康相談活動スキル向上プログラムに参加した小・中・高等学校の養護教諭のうち13名を対象にコラージュ技法に焦点をあてた参画型プログラムを実施した。これら平成22年度、平成23年度のプログラム参加者全員でプログラムの効果検証を行った。

開催回数は適切100%、開催時期は適切94.1%、研修は役に立った94.1%、研修内容が現在の活動に活かされている88.2%であった。プログラムで習得したスキルを実践で活用している養護教諭の割合は、コラージュ技法52.9%、構成的グループエンカウンター(SGE)41.2%、LACーR 35.3%であった。コラージュ技法、LACーRとも保健室頻回来室者、保健室登校や不登校傾向の児童生徒への適応が多かった。SGE、LAC-Rは学級活動としての導入や健康教育活動などの集団活動にも活用されていた。本プログラムの受講感想として、「保健室での対応や保健指導として、LACーRやコラージュ技法を活用している」「受講者が多すぎず意見の交換もできて良かった」「コミュニケーションをとることが下手な子どもが多く、色々なスキルを学んで役に立つ」などの意見がみられた。以上のことから、LACーR、コラージュ技法、SCEは養護教諭の健康相談活動スキルとして、児童生徒の健康増進、健康相談活動に活用できること、さらにプログラムの内容、時程は適切であることも示唆された。継続したスキルの活用と習熟のためのフォローアップ研修が今後の課題である。本年度の研究目的である小学校・中学校・高等学校の養護教諭を対象に、健康相談活動スキルの一環としてコラージュ技法を取り上げ、コラージュ技法を小学生.中学生・高校生に適用して実践できたこと、そして、そのコラージュを通して事例検討を行い、児童生徒の健康相談活動について検討出来たことは、概ね予定通りの進捗である。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22年度に小学生を対象に実施した改訂版生活分析的カウンセリング、平成23年度に小学生・中学生・高校生を対象に実施したコラージュの評価から、養護教諭の健康相談活動スキル向上のためのプログラムを構築する。(1)小学校、中学校、高等学校の養護教諭に共通して必要な健康相談活動スキルを開発する。(2)小学校、中学校、高等学校の養護教諭に共通して必要な健康相談活動スキルと児童生徒の発達段階に対応した健康相談活動スキルからなる、小学校、中学校、高等学校それぞれの養護教諭に求められる健康相談活動スキル向上のためのプログラムを開発する。
機械受容チャネルの構造と機能

機械受容(Mechanosensitive,MS)チャネルは、1984年に発見された新しい型のチャネルである。細胞の機械刺激感知を担う重要な分子であるが、その実態と構造が不明なために研究の進展が大きく阻まれている。現在、真核生物のMSチャネル遺伝子として最有力なのが、線虫の機械受容ミュータントの研究から分離されたmec遺伝子である。それは、mecと相同な遺伝子(rENaC)がラット腎細胞でアミロライド感受性イオンチャネルをコードすることが分かった(1993)からである。しかし実験材料の制約から、これらの遺伝子が機械受容チャネルをコードしているという直接証明がなされていない。本計画の目的は、電気生理学や遺伝学の実験に有利な材料(例えばショウジョウバエや腎細胞cell line,A6)から機械受容チャネルの遺伝子(例えばmecに相同な遺伝子)をクローニングし,MSチャネルの分子生物学と生理学がより広範に発展するための基盤を確立しょうというものである。本年度の成果は以下の通りである。(1)ショウジョウバエの遺伝子ライブラリィから機械感覚受容に関連する可能性のある新しい型のcGMP作動性イオンチャネルと思われる遺伝子がクローニングされ、約70%の配列が決定された。現在配列決定の完成と抗体の作成が進行しており、今後その機能や発現パタンの解析を行う予定である。(2)ゼノパス腎上皮由来のcell line(A6)において、アミロライド感受性Naチャネル(ENaC)が細胞体積調節に重要であることを発見した。これまでにゼノパス遺伝子ライブラリィからENaCのサブユニット(全部で3種類)のクローニングが終了し、今後強制発現やアンチセンスなどにより機能解析を行いこの遺伝子と機械受容の関連を明らかにする予定である。
スパイキングニューロンによる群知能の実現と新展開

本研究では,群知能によって様々な問題の最適化を行うための非線形手法を開発し,スパイキングニューロンによるハードウェア化を目指し,工学的応用へ向けた考察を行うことを目的とした.そこで,決定論的力学系に支配される粒子による群知能最適化手法をスパイキングニューロンで実現し,群知能による最適化手法をモデル化した.本システムは非同期型の離散時間ニューロンモデルを基礎としおり,カオスダイナミクスを利用した探索動作により,従来よりも簡素な系で高性能な最適化手法の実現に成功した.さらにFPGA等での実装を容易にするための整数型の決定論的粒子群最適化手法を実現し,高速に動作させれることを示した.本研究では,高次元のスパイキグニューロンを利用し,従来では対処不可能であった複雑な情報処理に取り組むものである.群知能を利用して,様々な問題の最適化を行うための非線形手法を開発し,スパイキングニューロンによるハードウェ化を目指し工学的応用へ向けた考察を行うことを目的としている.そのために,粒子群最適化手法をスパイキングニューロンで実現するためのモデルを確立して,システム設計への応用例を示すことを目指す.これに対して平成24年度は,前年度までにモデル化を行った群知能による最適化手法の評価を詳細に進めて,その見地からハードウェア化に適したシステム設計の着想に至った.本システムは非同期型の離散時間ニューロンモデルで粒子の動きを制御しており,カオスダイナミクスを利用した探索動作の実現により確率要素を利用しなくても従来の粒子群による最適化手法と同等以上の性能を発揮できることを示すことに成功している.前年度に購入したクラスター計算機および今年度に購入した数値計算専用機を利用した並列計算によって詳細な性能評価および安定性の解析を進めて定量的にその有効性や安定性を示すこと成功した.ハードウェア化に向けては,用いているダイナミクスの基本的性質を明らかにすることが出来たので,その見地のもとに探索性能とパラメータの関係を明らかに出来た.この結果は,離散状態型の群知能モデルの構築が可能であることを示すものであり,次年度に取り組む予定である.この離散状態離散時間非同期モデルの群知能はFPGAなどで実装可能であるので,大きな成果と言える..本研究では,群知能によって様々な問題の最適化を行うための非線形手法を開発し,スパイキングニューロンによるハードウェ化を目指し,工学的応用へ向けた考察を行うことを目的としている.そのために,決定論的力学系に支配される粒子による群知能最適化手法をスパイキングニューロンで実現するためのモデルを確立して,システム設計への応用例を示すことを目指した.最終年度である本年度はまず,ハードウェア化に適した簡素化された最適化手法を構築した.本システムは前年度までに開発した非同期型の離散時間ニューロンモデルで粒子の動きを制御する機構を本質的に簡略化したものである.カオスダイナミクスを利用した探索動作の実現で確率要素を利用しなくても従来の粒子群による最適化手法と同等以上の性能を発揮できることを示すことに成功した.さらにFPGA等でのシステマティックな実装を容易にするための整数型の決定論的粒子群最適化手法を提案するに至った.この手法は,離散粒子群最適化よりも高速に動作させることを示した.また,確率要素を利用した従来手法を離散化した手法よりも大域探索において高い性能を示すことが明らかになった.本年度前で提案した2つのモデルについては,前年度までに本課題研究の予算で購入したクラスター計算機および数値計算専用機を利用した並列計算によって詳細な性能評価を行い,定量的にその有効性を示すこと成功した.また,安定性の解析に関しては簡素な力学系特徴を利用して非線形力学系の解析手法に基づいた手法で安定性を解析的に示すこと成功した.本研究では,群知能によって様々な問題の最適化を行うための非線形手法を開発し,スパイキングニューロンによるハードウェア化を目指し,工学的応用へ向けた考察を行うことを目的とした.そこで,決定論的力学系に支配される粒子による群知能最適化手法をスパイキングニューロンで実現し,群知能による最適化手法をモデル化した.本システムは非同期型の離散時間ニューロンモデルを基礎としおり,カオスダイナミクスを利用した探索動作により,従来よりも簡素な系で高性能な最適化手法の実現に成功した.さらにFPGA等での実装を容易にするための整数型の決定論的粒子群最適化手法を実現し,高速に動作させれることを示した.本研究では,高次元のスパイキグニューロンを利用し,従来では対処不可能であった複雑な情報処理に取り組むものである.群知能を利用して,様々な問題の最適化を行うための非線形手法を開発し,スパイキングニューロンによるハードウェ化を目指し工学的応用へ向けた考察を行うことを目的としている.そのために,粒子群最適化手法をスパイキングニューロンで実現するためのモデルを確立して,システム設計への応用例を示すことを目指す.

これに対して平成23年度は,先行研究で実現している高次元スパイキングニューラルネットワークを基にして,群知能による最適化手法をモデル化した.本システムは非同期型の離散時間ニューロンモデルを基礎としおり,カオスダイナミクスを利用した探索動作の実現により,従来よりも簡素なモデルで高性能な最適化手法の実現への可能性を示すことに成功した.基本ダイナミクスの確認のために回路実験でのデータ収集をミックストシグナルオシロスコープ(当研究経費によって購入)によって行い,非線形力学系の呈するカオス解析,カオスシステムの合成,安定性評価,分岐解析等に使われる技術を利用して有効性を裏付ける解析結果を得ることが出来た.また,最適化のために必要なスパイク信号の時間による変調方式を実現するためのスパイク間隔密度スペクトルを制御する新しい手法の開発に成功し,実装回路に検証実験やクラスター計算機を利用した大規模計算によってその有効性を示すことに成功した.当初予定通り,本研究の最も重要な部分であるスパイキングニューロンによる群知能による最適化手法のモデル化は達成している.カオスダイナミクスを利用することで確率項を含まないにも関わらず多様な探索を可能にしており,その有効性や安定性を本研究で導入した備品を利用した大規模計算によって明らかに出来ている.本研究モデルは申請時に想定していたモデルとは異なっているが,それよりも有効であることが定量的に示されている.また,ハードウェア化に適したモデル構築の着想に至っており,次年度に実現出来ると思われる.よって,順調に進展している.当初予定通り,本研究の最も重要な部分であるスパイキングニューロンによる群知能による最適化手法のモデル化は達成した.想定していたスパイク密度変調による結合形態とは異なるモデルとなったが,カオスダイナミクスを利用することで確率項を含まないにも関わらず多様な探索を可能にし,想定していたモデルよりも有効と思われるモデルを提案することが出来た.また,スパイク密度変調に関する新しいスパイク間隔密度スペクトルの制御手法の開発に成功し,順調に進展している.基本的には,前年度に引き続き,当初予定通りのハードウェア化を念頭においた実験および解析を進めることで目標達成可能である.前年度までの成果により決定論ダイナミクスによる多様な探索が可能になったため,ハードウェア化に対してのアドバンテージを有していることは明らかである.さらに,現在進めている離散状態離散時間非同期モデルはハードウェア化に非常に適しているので,このまま進める予定である.申請時に想定していたモデルとは異なるダイナミクスのモデルであるため,大域的な検証を行うためには当初計画のディジタル回路による実装のみでは不十分な可能性は引き続き残るが,アナログ回路による検証実験を実施することで問題なく解決できる.基本的には,当初予定通りハードウェア化を念頭においた実験および解析を進めることで目標達成可能である.昨年度までの成果により決定論ダイナミクスによる多様な探索が可能になったため,ハードウェア化に対してのアドバンテージを有している.また,スパイク間隔密度スペクトルの制御手法の開発に成功したため,この知見を応用してシステムの改良も進めることが出来る.想定していたモデルとは多少異なるダイナミクスのモデルであるため,大域的な検証を行うためには当初計画のディジタル回路による実装のみでは不十分な可能性があるが,アナログ回路による検証実験を実施することで問題なく解決できる.該当なし前年度の成果を受けてシステムを実装し実験を行う.
溶けた金属に吹き込むだけ！超音波マイクロバブルを用いたポーラス金属の革新的生成法

本研究は,研究代表者が有する超音波を用いたマイクロバブル発生技術の液体を問わない長所を生かし,溶融金属中にマイクロバブルを発生させることによるポーラス金属の直接生成の可能性および最適条件の検証を目的としている.平成30年度の研究では,適用金属の融点を上げた環境でのポーラス金属の生成確認と機能検証を中心に研究をおこなった.その結果,平成29年度の研究で用いていた融点78°Cの低融点金属から,中空超音波ホーンに冷却水を循環させる冷却ユニットを取り付けることで,融点138°Cの低融点金属までポーラス化を達成することに成功した.融点138°Cのポーラス金属についても,圧縮試験を行い応力ひずみ曲線の測定をした結果,衝撃吸収特性を有するポーラス金属固有のプラトー領域の形成が確認できており,100°C以上の環境においてもマイクロバブル法によるポーラス金属が生成可能であることが裏付けられた.また、音響管を用いた吸音効果についても計測を始めており,サンプル数はまだ少ないものの中実構造に比べ広い周波数範囲で優れた吸音特性を有していることを確認した.また,初年度の研究において,差込深さを浅くするとポーラス金属ではなく,金属ナノ粒子が生成することが明らかとなっていたが,本年度の研究により,金属ナノ粒子の収量は超音波の振幅に依存し,振幅の増加に伴い収量も増加することが分かった.なお,これらの成果については,国際会議および国内会議においてそれぞれ発表を行った.初年度の研究においてポーラス金属の生成がすることが可能となっており、平成30年度では、より高融点の金属でのポーラス化にも成功した。また,ホーンの差込深さを浅くすることによって金属のナノ粒子を簡易に生成する方法についても初年度からの収量増加が達成できており,予想以上の研究成果を残していると考えている。現状融点138°Cの金属までポーラス化に成功している適用金属の範囲を更にあげるべく200°C以上の融点の金属でのポーラス化の可否検討に着手し,ポーラス化が確認された条件で生成したポーラス金属をサンプルとして圧縮試験を行い、プラトー領域の幅・領域の確認・評価を行う.また,音響管を用いた振動吸収特性の計測も行う予定である.また,より多量のポーラス金属の生成にむけてステージを動かしながら広範囲でのフォーム形成およびポーラス化領域の増加を達成できる実験系の構築にも着手する予定である.本研究は,研究代表者が有する超音波を用いたマイクロバブル発生技術の液体を問わない長所を生かし,溶融金属中にマイクロバブルを発生させることによるポーラス金属の直接生成の可能性および最適条件の検証を目的としている.平成29年度の研究では,マイクロバブルの溶融金属中での吹き出し位置,供給気体の種類,溶融金属の粘度が生成するポーラス金属に及ぼす影響を中心に検証を行った.まず,ホーン先端の吹き出し位置に関しては,ある閾値以上の深さとしない場合,超音波の音響流に随伴して溶融金属の上部の流体を巻き込んでしまい溶融金属中に気体をマイクロバブルとして供給できないため,効果的な金属フォームの形成に至らなかった.ホーンを深く差し込んだ場合には,溶融金属中へのマイクロバブル供給が安定化し,ポーラス金属の生成が確認された.なお,ホーンが浅い場合にはポーラス金属はできないものの,金属のナノ粒子の生成が確認されたため,この新しい金属ナノ粒子の製法について論文発表を行った.供給気体の影響については,窒素,空気,乾燥空気のマイクロバブルを用いてポーラス金属の生成を試みた.窒素を用いた場合にはほとんどポーラス金属の生成がおこらず,空気・乾燥空気の場合にはポーラス金属の生成が確認された.また,金属の体積は未乾燥の空気が乾燥空気よりも多かったことから,ポーラス金属の生成には,溶融金属中に供給されたマイクロバブルに含まれる酸素に起因した溶融金属の酸化による気液界面の安定化および周囲流体の増粘に加え,気泡内部の水分が気泡内の圧力変動により音響化学反応を起こし酸化を促進したことなどが要因と考えている.溶融金属の粘度については,マイクロバブルが発生可能な粘度範囲であれば粘度が高いほうが気泡同士の物理的な合体が抑制されることに加えて,気泡の浮上速度が小さくなるため,気孔がポーラス金属に分散していることが確認された.初年度の研究でポーラス金属の生成はほぼ安定的に達成することが可能となっており、ポーラス化の可否条件についてはほぼ明確となっている。生成条件の最適化に関しても、差込み深さ、気体の種類、溶融金属の粘度などのパラメータが生成するポーラス金属に及ぼす影響について明らかとなってきており、おおむね順調な研究進捗と判断している。また、差込位置の実験の副産物として、金属のナノ粒子を簡易に生成する方法を見出しており、この点については予想以上の研究成果を残していると考えている。本研究は,研究代表者が有する超音波を用いたマイクロバブル発生技術の液体を問わない長所を生かし,溶融金属中にマイクロバブルを発生させることによるポーラス金属の直接生成の可能性および最適条件の検証を目的としている.平成30年度の研究では,適用金属の融点を上げた環境でのポーラス金属の生成確認と機能検証を中心に研究をおこなった.

その結果,平成29年度の研究で用いていた融点78°Cの低融点金属から,中空超音波ホーンに冷却水を循環させる冷却ユニットを取り付けることで,融点138°Cの低融点金属までポーラス化を達成することに成功した.融点138°Cのポーラス金属についても,圧縮試験を行い応力ひずみ曲線の測定をした結果,衝撃吸収特性を有するポーラス金属固有のプラトー領域の形成が確認できており,100°C以上の環境においてもマイクロバブル法によるポーラス金属が生成可能であることが裏付けられた.また、音響管を用いた吸音効果についても計測を始めており,サンプル数はまだ少ないものの中実構造に比べ広い周波数範囲で優れた吸音特性を有していることを確認した.また,初年度の研究において,差込深さを浅くするとポーラス金属ではなく,金属ナノ粒子が生成することが明らかとなっていたが,本年度の研究により,金属ナノ粒子の収量は超音波の振幅に依存し,振幅の増加に伴い収量も増加することが分かった.なお,これらの成果については,国際会議および国内会議においてそれぞれ発表を行った.初年度の研究においてポーラス金属の生成がすることが可能となっており、平成30年度では、より高融点の金属でのポーラス化にも成功した。また,ホーンの差込深さを浅くすることによって金属のナノ粒子を簡易に生成する方法についても初年度からの収量増加が達成できており,予想以上の研究成果を残していると考えている。引き続き最適条件の抽出に向けて、1超音波の周波数および音圧がポーラス金属に及ぼす影響、2ガスの供給流量、が生成するポーラス金属に及ぼす影響について評価する。最適条件が明らかとなり次第、適用金属の融点を上げた環境でのポーラス金属の生成確認に着手し、ポーラス化が確認された条件で生成したポーラス金属をサンプルとして圧縮試験を行い、プラトー領域の幅・領域の確認・評価を行う。同様に、音響管を用いた振動吸収特性の実験にも着手する予定である。また、初年度の研究において見出した中空ナノ粒子の製法についても、いまだ中空化/中実化の判定要因が不明確な部分も残されており、中空化メカニズムの解明も引き続き行う予定である。現状融点138°Cの金属までポーラス化に成功している適用金属の範囲を更にあげるべく200°C以上の融点の金属でのポーラス化の可否検討に着手し,ポーラス化が確認された条件で生成したポーラス金属をサンプルとして圧縮試験を行い、プラトー領域の幅・領域の確認・評価を行う.また,音響管を用いた振動吸収特性の計測も行う予定である.また,より多量のポーラス金属の生成にむけてステージを動かしながら広範囲でのフォーム形成およびポーラス化領域の増加を達成できる実験系の構築にも着手する予定である.粘度が学内設備にて測定可能になったことなどにより、粘度計の購入予算などにおいて差額が生じた。本年度は当初の研究計画の予算使途に加え、昨年度の成果によりポーラス金属と金属ナノ粒子の差込深さによるスイッチングができることが明らかとなったことから、そのメカニズム解明の実験に必要な低融点金属や超音波ホーンなどの消耗品に本差額を使用する予定である。吸音率測定を前倒しで開始したため,垂直入射吸音率計測システムのレンタル料など支出が増えたが,高温度処理用超音波分散器が学内設備にて利用可能になったことなどにより,結果としては繰り越しが生じた.本年度は当初の研究計画の予算使途に加え,より高融点の金属や高温環境下で使用で損耗が目立つ超音波ホーンなどの消耗品に本差額を充当する予定である.
リポソームを担体とする薬剤投与法の開発とそれを用いての難治性疾患治療の試み

1.強毒腸炎菌300個のi.v.感染マウスは5-7日で感染死する。感染1日後にstreptomycin(SM)20mg/kg i.v.投与しても死期を延長できないが、liposome封入SM(L-SM)では15日以上マウスを生存させた。SM80mg/kg i.v.投与はマウスに著しい毒性を示すが、L-SMは毒性は認められなかった。感染1日、6日の2回、L-SM20mg/kg投与すると80%のマウスは55日以上生存した。L-SM投与後、SMは肝、脾に大量に分布、保持され、腸炎菌の増殖を著しく阻止した。3.糖尿マウス(血糖380mg/dl)にinsulin(ins)封入リポソーム(L-ins)を胃内投与すると、血漿中総ins、遊離insとも30分後に最大値を示し60分後に半減したが120分後にもその値は保持された。血糖低下は4匹中1匹に認められた(292mg/dlの減少)が、血漿ins濃度との関係は認められなかった。糖尿マウスにL-insをi.p.投与すると6匹中4匹に血糖低下(263mg/dlの減少)が認められ、この場合は血糖低下と血漿中遊離ins量との相関が認められた。以上の結果から、経口用L-insの開発には、リポソームの消化管からの吸収や体内でのinsの動態の面からリポソーム作製に工夫が必要と思われる。
末梢神経損傷後に認められる脊髄後根神経節ニューロンの自発活動発現の機序

1目的:末梢神経が損傷を受けると、脊髄後根神経節(DRG)ニューロンを起源とした自発放電が発現することが知られている。この自発放電は、神経損傷後の持続性の自発痛の一因と考えられている。さらに、交感神経系の活動が、このDRGニューロンを起源とする自発放電を変調(増加または減少)することが明らかにされている。しかし、交感神経節後線維の終末から放出されるノルアドレナリンが、DGRニューロンに及ぼす作用機序は明らかにされていない。そこで、今回の研究では、ノルアドレナリンがDRGニューロンの興奮性をどのように修飾するのか、Whole-cell patch clamp法を用いてイオンチャンネル機構のレベルで解析検討した。2結果と考察:平成8年度の奨励研究(A)の交付を受け、上記の問題について以下の点を明らかにした(平成8年日本疼痛学会にて口頭発表)。(1)α2受容体のアルゴニストであるclonidineは、DRGニューロンに認められるH-current(K^+とNa^+の電流)を抑制した。(2)H-currentの抑制により、DRGニューロンのスパイク発火頻度が低下した。この結果から、神経損傷を伴ったDRGニューロンのに対する交感神経系の作用の一つとして、ノルアドレナリンがα2受容体を介してH-currentを抑制し、DRGニューロンの起源とする自発活動の発火頻度を低下させることが示唆された。しかし、ノルアドレナリンにはDRGニューロンに対して、抑制作用とは逆に興奮性促進作用もあることがわかっている。今後の課題として、ノルアドレナリンによる種々のイオンチャンネルへの修飾作用を解明する必要があると考える。
メチル化PCAFの機能に関する研究

ヒストンメチル化酵素(HMTase)がこれまでに多数同定されている。我々は、Set9分子がp300/CBP-associated factor (PCAF)の複数のリジン残基をメチル化することを同定し報告した。本研究ではこれをさらに発展させ、リジンメチル化によるPCAFの機能変化を解析した。その結果、PCAFの安定性は変化しないこと、自己アセチル化には影響しないこと、そして、P53やH3を基質としたアセチル化活性を低下させること、を見出し、メチル化を介したSet9-PCAF系による新たな転写制御系の存在が示唆された。一部の非ヒストンタンパクの分子機能がヒストンメチル化酵素によるリジン残基のメチル化修飾により制御を受けることが知られている。p300/CBP-associated factor (PCAF)は多くの細胞機能にかかわるアセチル化酵素である。申請者は,PCAFがメチル化酵素Set9の基質となることを見出し速報として報告した("Multiple lysinemethylation of PCAF by Set9 methyltransferase." BBRC 2009)。本研究ではこの成果をさらに発展させ,リジン残基メチル化によるPCAFの分子機能変化ならびに生物学的意義を解明する。本年度は,PCAFがP53分子をアセチル化することから,PCAFのメチル化がそのアセチル化活性にどう影響するかを検討した。U20S細胞をSET9に対するsiRNAでノックダウンするとメチル化PCAFが減少する。この時,P53分子K320およびヒストンH3K9のアセチル化を解析したところ,ともにアセチル化の程度が減少していた。さらに,PCAFのメチル化部位を変異(KをRに置換)させた変異PCAFを強制発現し,アドリアマイシンにてP53分子を誘導した際のアセチル化P53 (K320)をウエスタンブロットにより解析したところ,変異PCAFを強制発現した細胞においてはP53 (K320)のアセチル化が低下していた。以上の結果は,メチル化PCAFがP53 (K320)のアセチル化を正に制御している可能性を示唆している。一方,PCAFの細胞内安定性やユビキチン活性はメチル化によって左右されなかった。一部の非ヒストンタンパクの分子機能がヒストンメチル化酵素によるリジン残基のメチル化修飾により機能制御を受けることが知られている。p300/CBP-associated factor (PCAF)は多くの細胞機能にかかわるアセチル化酵素であり転写制御因子として機能している。申請者はPCAFがメチル化酵素Set9の基質となることを見出し報告した("Multiple lysinemethylation of PCAF by Set9 methyltransferase. "BBRC 2009)。本年度は,メチル化PCAFを細胞より精製し,in vitroでのメチル化PCAF分子の機能を検討した。HEK293細胞に,Mycタグを付加したPCAFを導入し,それに加えて,メチル化を促進する目的で野生型SET9を導入した。メチル化PCAFを抗PCAFメチル化抗体および抗Myc抗体の2段階で精製した。コントロールとして,MycPCAFとメチル化活性部位に変異を有する変異SET9を導入した細胞より,抗Myc抗体によって精製したPCAF分子を準備した。それぞれにおいて精製されたPCAFを抗PCAF抗体および抗メチル化PCAF抗体を用いて確認した。大腸菌にて作成したGST融合p53分子とメチル化PCAFあるいはコントロールPCAFを反応させp53分子のアセチル化を検討したところ,メチル化PCAFにおいてはアセチル化活性が減少していた。さらにGST融合ヒストンH3を基質として検討したところ同様の結果が得られた。以上の結果は,メチル化によってPCAFのアセチル化活性が,少なくともP53やH3に対して低下することをin vitroで示したものである。ヒストンメチル化酵素が非ヒストンタンパクを修飾してその機能を制御することが報告されており、リジン残基メチル化に対する関心はヒストンだけに留まっていない、我々は、SET9がp300/CBP-associated factor(PCAF)の複数のリジン残基をIn vitroおよびIn vivoでメチル化することを明らかにし報告した。その機能的意義を明らかにするための研究を進め、これまでに、PCAFが有するp53やヒストンH3に対するアセチル化活性がK89のメチル化によって阻害されること、一方、このメチル化はPCAFの自己アセチル化には影響しないこと、などをIn vitroにおいて明らかにした。また分担研究者らは、MIBP1(別名HIVEP2, Schnurri2)の発現調節機能をマイクロアレイで解析した結果NF-kBパスウェイ遺伝子の抑制が最も顕著であり、また、発現抑制される遺伝子の転写開始点上流にはNF-kB認識配列が有意に多く含まれていることを明らかにした。MIBP1がNF-kBサイトに結合することをゲルシフト実験によって確認し、さらに、内在性MIBP

1発現をRNAiで抑制することにより、NF-kB認識配列を持つ遺伝子群の発現上昇が起こることを見出した。これらの結果より、MIBP1がNF-kBパスウェイの抑制因子であると結論し、さらに糖転移酵素OGTによる本因子の修飾の影響も検討し。論文発表した。これまでの2年間で、メチル化PCAFと非メチル化PCAFの機能差が、PCAFが有するアセチル化活性の変化として捉えられたから。24年度が最終年度であるため、記入しない。PCAFが有する機能の最終的なアウトプットは遺伝子発現制御である。今後は、遺伝子発現がどのようにメチル化の影響を受けるかを明らかにする。