hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たな気候帯への適応進化機構の解明：半砂漠地帯のキューバアノールトカゲを用いて

森林集団と半砂漠集団の個体での温度耐性や温度選好の違いについての検出についての実験成果が得られた。また、ゲノム解析のためのサンプル収集が成功し、現在、ゲノム解析の準備、試行段階である。27年度が最終年度であるため、記入しない。進化が生態学森林帯と半砂漠灌木帯のA. homolechisの温度代謝の違いを検出するために、異なる温度での酸素消費量を測定する。酸素消費量測定には、小動物用代謝測定装置を用い、チャンバー内の酸素消費、二酸化炭素排出量をセンサーにより測定する。これにより、2種の温度パフォーマンスカーブの違いを検出する。異なる温度への適応に関わる遺伝子を検出するために、森林帯と半砂漠灌木帯のA. homolechisを2つの異なる温度環境で飼育し、肝臓、脳、皮膚のRNAを抽出する。RNA-seqを行い、2つの温度環境で異なる発現を示す発現変動遺伝子を検出する。発現変動遺伝子のなかで、2種で異なる反応をする遺伝子を検出する。これにより、どの遺伝子の発現の変化が高温耐性・適応に関わったかが検出できる。森林帯と半砂漠灌木帯のA.homolechis間で異なる自然選択を受けた領域の検出、およびA. jubarとの交雑浸透の可能性を調べる。そのために、ゲノムサンプルを用いて、ゲノムワイドなSNPを検出できる次世代シークエンサーを用いたRAD-seq解析を行う。検出されたSNPマーカーを用いて、遺伝構造を解析し、森林のA. homolechis集団にA. jubarの遺伝子が浸透交雑しているかどうかを調べる。また、検出されたSNPのうち、BayeScan, LOSITAN, Bayenv2というprogramを用い、2つの環境下で異なる選択をうけて分化したSNPを検出する。前述のRNA-seqにより検出された種間で異なる発現変動遺伝子とRAD-seqで検出された選択を受けた遺伝子が一致した場合、その遺伝子が、半砂漠地帯の高温環境への適応進化に影響した遺伝子であると推測できる。予定どおりサンプル採集、飼育、輸入、環境データの収集が行え、次年度の行動実験およびゲノム解析の準備が整った。次世代シークエンサーにかけるためのサンプル調整が遅れて、次年度使用することになったため。また、実験補助の謝金が本年度計画より多く必要になるため。今後は、環境データをとると同時に、高温適応している別の集団の調査を実施する。さらに大量のSNPを得るために、マイクロサテライト領域を挟んだ領域を増幅し、次世代シークエンサーによって配列を解読するMIG-seqを行う。これにより、A. homolechisとA. jubarの雑種形成度合いと適応に関する遺伝子の検出を行う。サンプルのRAD-seqおよびRNA-seqを次世代シークエンサーを使って実施するために使用する。また、そのためのサンプル調整およびデータ解析のための実験補助のための謝金に使用する27年度が最終年度であるため、記入しない。
音響交信およびDNA塩基配列法によるヤマトクサカゲロウの種内変異解析

ヤマトクサカゲロウの交尾時の腹部振動音の解析については、昨年度購入した機材により良好な解析を行うことができるようになった。これを受けて本年度は新たに採集した西日本個体群(京都および熊本)についても解析を行いこれまでのデータと共に幼虫の形態により分けられているタイプおよび地域個体群間の比較を行った。この結果これまでに得られた結果と同様、タイプAとタイプBの個体は大きく異なる音響交信を行っていることが確認できた。タイプAについては個体群による違いは少なく、北海道から九州まで広く同じ振動波形を示し、タイプBについても採集できた長野県内の数カ所で同じ波形を示した。今後は長野県でしか得られていないタイプB個体の詳細な分布調査などが望まれるところであり、実際に調査を行う計画を立てている。両タイプ間のDNA塩基配列については、様々な昆虫で有効な結果が得られているミトコンドリア遺伝子のチトクロームオキシダーゼ領域部位を用いて、PCR産物のダイレクトシークエンス法により比較および解析を行った。シークエンスを行った結果、両タイプについては異なる配列部分が多くみられ、得られた配列から最節約法による系統樹を作成したところ、両者は遺伝的に異なるという傾向が認められた。塩基配列からアミノ酸の配列に変換したところ、置換が起きている部位はすべて同義置換であり、アミノ酸の配列は変わらなかった。また、系統樹から両タイプが必ずしもきれいに分かれるのではなく、同一地域(長野県伊那郡)における異なるタイプの個体が同じクラスターを形成することから、少なくとも一部地域についてはタイプ間でミトコンドリアの遺伝子の交流が起きている結果が得られた。このことから今後は核遺伝子の領域を調査する必要があると考えられた。しかしながら両タイプは総合すると異なる生物種に属する可能性も示唆され、大変興味深い結果となった。ヤマトクサカゲロウの音響交信解析について、これまでに行ってきた基礎的実験ではノイズの混入など改良すべき点が残されていた。今年度の新たな機材の購入により、よりノイズの少ない録音系の確立を目指したが、発生していたノイズを完全におさえることは出来なかった。これについては現在の環境では限界でもあるので、ノイズの除去についてはある程度のところで打ち切った。しかしながら以前に比べれば良好な解析を行うことができるようになり、各個体群の比較を行い種内タイプ間の違いについては確認できた。すなわちタイプAとタイプBの個体は異なる音響交信を行っており、個体群による違いは少なく、タイプの違いというものは安定した形質を示すことが示唆された。これまでデータの無かった南方個体群の採集を試みたが、時期や天候の不運により多く採集できなかったため、西日本を中心とした個体群の解析は次年度に持ち越された。DNAの塩基配列の比較解析については、ミトコンドリアにコードされているチトクロームオキシダーゼIおよびIIの領域部位のクローニングを行って、塩基配列を調べた。しかしながらクローニングによる解析は手順に手間がかかり、費用もかかるため多くの個体数を解析するのには不適当であった。講座で新規購入したDNAオートシークエンサーの性能が良かったために、途中からPCR産物のダイレクトシークエンス法に切り替えて解析を行った。シークエンスの結果はまだ一部の個体群でしか行っていないため、タイプ間の違いについては言及できないが、タイプの違いが遺伝的にも認められる傾向を示している。これについては来年度解析する領域をさらに増やすので、総合的に判定する予定である。
スフィンゴシン-1-リン酸による新規インスリン抵抗性改善機序の解明

多機能性生理活性脂質であるスフィンゴシン1ーリン酸(S1P)、およびそのHDL上の輸送体、かつ代謝調節因子であるアポ蛋白M(ApoM)の糖尿病との関連について検討し、マウスにおいては、ApoM, S1Pには肝臓におけるインスリン抵抗性改善作用、および膵β細胞からのインスリン分泌促進作用があること、また、脂肪肝、高血糖ではApoM、S1Pが増加することを発見した。本研究より、ApoM、S1Pは糖尿病の新しい検査・治療に応用できる可能性があることが示唆された。多機能性生理活性脂質であるスフィンゴシン1ーリン酸(S1P)、およびそのHDL上の輸送体、かつ代謝調節因子であるアポ蛋白M(ApoM)の糖尿病、特にインスリン抵抗性との関連について検討し、以下の結果を得ている。1)ApoMの過剰発現により、通常食マウス、高脂肪食負荷マウス、db/dbマウス、いずれのマウスにおいても、血漿および肝臓中のS1Pが増加した。高脂肪食負荷マウス、db/dbマウスでは、インスリン抵抗性がApoMの過剰発現により改善していた。これらの作用はS1P1, 3受容体阻害薬によって部分的に阻害された。また、臓器別には、特に、肝臓、骨格筋のインスリン抵抗性が改善していた。さらに、ApoM群では、肝臓の糖新生が抑制されていた。一方、通常食マウスでは、インスリン感受性には相違が認められなかったが、ApoM群にて、インスリン分泌が増強され、この効果はS1P1, 3受容体阻害薬によって阻害されることがわかった。2)マウスモデルを用いて糖代謝関連因子のApoM, S1Pに対する影響を検討したところ、高脂肪食負荷、ストレプトゾトシン投与にてApoM, S1Pが増加していた。培養細胞を用いた検討では、脂肪酸投与にてApoMが増加し、一方、インスリン投与、培養液中からのグルコース除去によってApoMが低下することがわかった。以上の結果よりApoMがS1Pを増やすことにより、インスリン抵抗性を改善させ、またインスリン分泌を増強させる可能性が示唆された。また、糖代謝関連因子のApoMに対する影響を考えると、インスリン絶対的不足、および内臓脂肪蓄積によるインスリン相対的不足の病態において、肝臓はApoM産生を増やすことにより、末梢臓器におけるインスリン感受性を亢進、および、膵β細胞のインスリン分泌能を増強させることにより、糖代謝の恒常性維持に寄与していることが考えられる。(1)ApoMの発現抑制による糖代謝の変化については、shApoMがうまく働かなかったため、in vivo siRNAの手法を用いて検討した。食餌誘導肥満マウスにsiApoMあるいはcontrol siRNAを投与し、4日後インスリン負荷テストを施行し、5日後、マウスをサクリファイスして検討した。その結果、siApoM群では、血漿、肝臓S1Pを40%程度、ApoMを50%程度抑制することができた。空腹時の血糖は変わらなかったが、自由摂食下の血糖の上昇がみられた。一方、インスリン値に関しては有意な差は認められなかった。インスリン負荷テストでは、siApoM群にてインスリンによる血糖低下の減弱が認められた。また、肝臓のAkt, AmpKのリン酸化の減弱がみられたが、骨格筋、脂肪組織には変化がみられなかった。(2)STZマウスにApoMをコードするアデノウイルスあるいはコントロールアデノウイルスを投与させたが、有意な血糖の低下、インスリン分泌能の改善などは認められなかった。(3)HepG2細胞と標的組織の細胞株の共培養系は、HepG2細胞にアデノウイルスを用いてApoMを過剰発現させると、共培養先の細胞にもウイルスが感染することがわかったため、当初の計画通り進まなかった。(4)当初予定していなかったが、「様々な糖尿病マウスモデルを用いたスフィンゴシン1-リン酸の糖代謝に対する影響の解析」をヒントに、LDL受容体がApoM、S1Pの血中からのクリアランスに重要な働きをしていることを発見した。代謝学平成25年度に終わらせる予定であった、様々な糖尿病マウスモデルを用いたスフィンゴシン1-リン酸の糖代謝に対する影響の解析が順調に終了しており、おおむね当初の計画通りに進んでいる、と考えられる。一方、平成26年度に用いる予定であるApoMに対するshRNAアデノウイルスベクターの作成は、うまくいかなかった点が、計画通りに行かなかった。平成26年度は、当初の予定通り、in vitroにおけるApoM, S1P, S1P受容体のインスリン抵抗性改善作用への関わりについての検討を行う予定である。また、前述のとおりApoMに対するshRNAアデノウイルスの作成が難航しているため、in vivo siRNA導入システムを用いて、ApoMの発現低下による、糖代謝への影響の検討を行う予定である。

また、当初の予定にはなかったが、ApoM過剰発現によるS1P増加により、通常食マウスにてインスリン分泌能を亢進させることがわかったため、STZ誘発糖尿病マウス、NODマウスといった1型糖尿病モデルマウスにおいて、ApoM、S1Pの糖代謝に対する影響の検討も行う予定である。
DO-stat流加培養に基づく組換え大腸菌を用いた単鎖抗体の高濃度菌体外生産

申請者らはペリプラズム分泌シグナルを導入した組換え大腸菌を用い、DO-stat流加培養を行うことにより、医療診断に用いる単鎖抗体(scFv)を活性型のまま数g/Lのオーダーで菌体外に分泌生産できることを報告した。この手法が確立できれば遠心分離した培養液から直接タンパク質を精製することが可能となり、高コストな分離・精製プロセスを大幅に簡素化できる。本申請ではこの培養手法を確立するため、組換え大腸菌における単鎖抗体等の菌体外分泌メカニズムを明らかにすること及び安定的な菌体外生産を実現するための培養条件の最適化を目的とする。
学習者の問いを喚起する教養教育の理論と実践に関する研究

本研究では、ガダマーの哲学的解釈学と一般教養論に依拠しつつ、学習者の問いを喚起する教養教育の可能性を提示する。ガダマーによれば、教養教育は自由と連帯を希求する対話の過程とみなすことができる。このような対話を促すためには、学習者にとって問いとなるテクストや事物を提示する必要がある。この観点から、テクストとの対話、他者との対話、自己自身との対話から成る解釈学的な研究実践は教養教育の議論において示唆に富む。本研究は、ガダマーの哲学的解釈学を中心とした一般教養の理論に依拠しつつ、学習者の問いを喚起する教養教育の可能性を提示するものである。その主要な論点は次の二点である。一、グローバル化した社会で学習者が自ら問いを立て、その答えを模索していくための教養教育はどのような理念、内容、方法を持つのか。二、ガダマーが一般教養の教育の拠点として重視した、ハイデルベルク大学におけるストゥディウム・ゲネラーレの理念と実態はどのようなものか。本研究は、これらの点を解明することにより、異なる文化的背景を持つ他者と対話しつつ共生していく社会を実現するための教養教育の可能性について、理論と実践の両面から検討する。平成27年度は、学習者の問いを喚起する教養教育の理論と実践に関する先行研究を国内外から収集し、検討した。一般教養に関するガダマーの論文については、二年前にマールバッハで入手した未刊の講演記録や遺稿を引き続き解読・精査した。ハイデルベルク大学におけるストゥディウム・ゲネラーレの理念と実態については、運営スタッフのM.コンラート氏からメールで次のような回答を得ることができた。一、ストゥディウム・ゲネラーレは大学に所属する人たちばかりでなく、一般市民も対象とした連続講義である。二、受講者は100人から300人で、そのうちの多くの人たちは規則的にすべての学期に参加している。三、連続講義としてのストゥディウム・ゲネラーレが今日の形で実施されるようになったのは1980年からである。ただし、1980年以前のストゥディウム・ゲネラーレに関する情報は得られなかった。現在は、E.ヴォルガスト『ハイデルベルク大学1386ー1986』(1986)を手がかりに、ストゥディウム・ゲネラーレの成立過程を調べているところである。ハイデルベルク大学のストゥディウム・ゲネラーレの成立過程については現在のところわずかな情報しか得られていない。ガダマーのインタビュー記録「ストゥディウム・ゲネラーレ」(1956年に録音され、2011年に公表されたCD)、ガダマーの自伝(1977年に出版された『哲学修業時代』)、ハイデルベルク大学の歴史に関する文献でわずかに言及されているのみである。したがって、ガダマーの哲学的解釈学を中心とした一般教養の理論とストゥディウム・ゲネラーレの実践との関連が不明なままである。本研究の目的は、ガダマーの哲学的解釈学を中心とした一般教養の理論に依拠しつつ、学習者の問いを喚起する教養教育の可能性を提示することである。二、ガダマーが一般教養の教育の拠点として重視した一般教養講座「ストゥディウム・ゲネラーレ」(Studium Generale)の理念と実態はどのようなものか。本研究は、これらの点の解明により、異なる文化的背景を持つ他者と対話しつつ共生していく社会を実現するための教養教育の可能性について、理論と実践の両面から検討するものである。二年目の本年度は、一年目に収集した情報・資料をもとに日本ディルタイ協会関西研究大会で「学習者の問いを喚起する教養教育の可能性ーガダマーの哲学的解釈学と一般教養論の検討からー」と題する発表を行い、同協会の学会誌『ディルタイ研究』第27号に論文を公表した。その後、ドイツ・ミュンスター大学教育学研究科のヘレカンプス(Hellekamps, S.)教授を訪問し、解釈学の新たな展開可能性について意見を交換した。さらに、ハイデルベルク大学図書館でストゥディウム・ゲネラーレの理念と歴史についての資料を収集し、マールバッハのドイツ文学資料館ではガダマーがストゥディウム・ゲネラーレに宛てた書簡を収集した。未公刊の遺稿を含むこれらの資料はいずれも日本国内では入手困難な貴重な資料である。これらの資料から明らかになったことは、解釈学が学習者の日常生活に対する鋭敏な感覚を養い、問いを喚起することに寄与するという点である。そのことが一般教養の理論と実践にもたらす意義は、自由と連帯を目指す対話という理念と、学際的な探究を可能にする文化内容と教育方法を検討することの重要性である。ドイツでの情報・資料収集については、ハイデルベルク大学図書館でストゥディウム・ゲネラーレの理念と歴史に関する研究書や講義目録を収集した。さらに、マールバッハのドイツ文学資料館ではガダマーがストゥディウム・ゲネラーレに宛てた書簡を4通入手した。これらはいずれも一般教養の教育がどのような理念を持ち、それがストゥディウム・ゲネラーレでどのように実践されてきたのか、さらにガダマーの哲学的解釈学が一般教養の教育の理論と実践にどのようにかかわってきたのかを知るうえで貴重な資料である。

ドイツで入手した情報・資料は学習者の問いを喚起する教養教育の考察に次の点で寄与した。一、ガダマーの方法主義批判の意義と、哲学的解釈学と一般教養論における「自由と連帯を希求する対話」の理念が再確認された。それによって一般的に保守的であると批判されてきたガダマーに対する見方が修正され、ディルタイ以降の解釈学の新しい展開の可能性が示された。二、解釈学の研究実践によって養われる「精神の特別な繊細さ」は教養教育の文脈で重要な意味を持つことが示された。日常の現象に対する鋭敏な感覚を持つ学習者は自ら問いを立て、解釈学的対象と解釈学それ自体に対する批判的考察が促されるのである。三、それゆえ、解釈学的な研究実践を積み重ねつつ、学習者にとっての問いとなるようなテクストや事物を提示することが教養教育における重要な課題となる。しかし、学習者の問いはどのようにして喚起されるのか。学習者の判断形成を促す教授法はどのようなものか。こうした教授学的問題が未解決のまま残されている。このようにいくつかの点で検討すべき課題が残されているものの、本研究はおおむね順調に進展していると評価できる。本研究の目的は、ガダマーの哲学的解釈学を中心とした一般教養の理論に依拠しつつ、学習者の問いを喚起する教養教育の可能性を提示することである。その主要な論点は次の二点である。一、グローバル化した社会で学習者が自ら問いを立て、その答えを模索していくための教養教育はどのような理念、内容、方法を持つのか。二、ガダマーが一般教養の教育の拠点として重視した一般教養講座「ストゥディウム・ゲネラーレ」(Studium Generale)の理念と実態はどのようなものか。これらの点の解明により、本研究は異なる文化的背景を持つ他者と対話しつつ共生していく社会を実現するための教養教育の可能性について、理論と実践の両面から検討するものである。最終年度は、テクストとの対話、他者との対話、自己自身との対話から成る解釈学的な研究実践の意義と、そのような研究実践を可能にする教育空間の可能性を検討した。ガダマーにとって解釈学的な研究実践は、伝承や翻訳によって時代の隔たりや異文化間の差異を媒介し、新しい意味地平を形成していくプロセスである。このプロセスは自由と連帯を実現していく社会的実践でもある。このことから、解釈学的な研究実践は自由と連帯を希求する対話の理念を目指しつつ、学習者の問いを喚起するような文化内容を選択・提示することによって、学習者に市民的公共圏への参加を促していくような教養教育の可能性を示唆している点が明らかになった。そのような教養教育を成立させる空間として構想されたストゥディウム・ゲネラーレは、学問の統一性を実現し、学生の政治的教養や社会的責任の意識を形成するため、教師と学生を結びつける学問共同体、学生同士を結びつける生活共同体、大学と社会を結びつける市民的公共圏となることが目指されていた。しかし、理念と実態の間には乖離もみられたため、教育空間の成立条件を提示することは今後の研究課題となった。本研究では、ガダマーの哲学的解釈学と一般教養論に依拠しつつ、学習者の問いを喚起する教養教育の可能性を提示する。ガダマーによれば、教養教育は自由と連帯を希求する対話の過程とみなすことができる。このような対話を促すためには、学習者にとって問いとなるテクストや事物を提示する必要がある。この観点から、テクストとの対話、他者との対話、自己自身との対話から成る解釈学的な研究実践は教養教育の議論において示唆に富む。
テスト支援回路の故障影響度解析と耐故障設計に関する研究

LSIの組込自己テスト(Built-in Self Test: BIST)のための,耐故障性をもつ新しい応答圧縮器(BISTを行うための構成要素であり,テスト結果を保持する回路)である符号化応答圧縮器を提案した.符号化応答圧縮器は壊れている状態でも,テスト対象回路の故障は必ず検知でき,さらにテスト対象回路が正常である場合は高い確率で応答圧縮器の故障を検知できる.また,必要なハードウェアサイズは従来の耐故障性を考えない応答圧縮器に比べて1.6倍程度であった.LSIの組込自己テスト(Built-in Self Test: BIST)のための,耐故障性をもつ新しい応答圧縮器(BISTを行うための構成要素であり,テスト結果を保持する回路)である符号化応答圧縮器を提案した.符号化応答圧縮器は壊れている状態でも,テスト対象回路の故障は必ず検知でき,さらにテスト対象回路が正常である場合は高い確率で応答圧縮器の故障を検知できる.また,必要なハードウェアサイズは従来の耐故障性を考えない応答圧縮器に比べて1.6倍程度であった.本年度はテスト支援回路の耐故障設計を行うために,1)組込自己テスト(BIST)手法の解析および耐故障設計手法の提案,2)テスト圧縮・展開手法の解析を行うことが研究計画であった.1)のBIST手法手法に関しては.論文調査を行い,本手法と関連が深いと思われる手法をピツクアップし,その中でも効果の高いと思われる故障検出機能付きテスト生成器(EBIST)に関するに着目した.この手法はBIST回路のテスト発生回路に故障が発生したとしても,その故障を簡単な検出器により発見できる手法であり,十分に本研究に応用できることが考えられる.そこでこの手法を実装し,BIST回路自身の故障耐性と従来のテスト能力の関係について考察を行い,計算機実験によりその具体的な関係を調べた.これにより,具体的なEBIST設計方法とEBISTの有効性を確認できた.この結果は学生の卒業研究としてまとめている.これにより,耐故障BISTを提案するための基本的な準備はほぼ整ったと考えている.2)に関しては論文調査を行ったものの,十分な解析までは進んでいない状態である.これは1)で着目したEBISTという手法を利用することが研究上とても興味深く,また実用的でもあるため,こちらの解析およびこれを用いた耐故障設計手法に研究の重きを置いたためである.当初の計画とは変わっているものの,質の高い成果が得られると判断できた場合は一方の手法に重点を置くことは,最初の研究計画にも示しているとおりである.本年度はLSIの組込自己テスト(Built-in Self Test : BIST)の耐故障設計手法を確立することが目的であったが,耐故障性をもつ新しい応答圧縮器(BISTを行うための構成要素の1つであり,テスト結果を保持する回路)である「符号化応答圧縮器」を提案することで,目的であるBIST手法の耐故障設計手法を確立できた.前半では,耐故障テスト生成器であるEBIST手法の数学的解析結果を応用することで,符号化応答圧縮器の原理を導いた.この原理に基づいて応答圧縮器を設計すれば,応答圧縮器が壊れていていたとしても, BIST手法によるテスト対象回路が故障した場合は必ずそのテスト結果が不良となることを,さらにテスト対象回路が正常である場合は高い確率で応答圧縮器だけが壊れているというテスト結果を保持することが保証できる.後半では,提案した符号化応答圧縮器を用いたBIST手法のための対故障設計手法を確立し,提案した符号化応答圧縮器の評価を行った.評価はロジックBISTとオンラインテストを対象に計算器実験により行った.評価結果からは,提案した符号化応答圧縮器はほぼ100%の耐故障性を,従来の耐故障性を考えない応答圧縮器に比べて1.6倍のハードウェアサイズで実現できることがわかった.なお,メモリBISTなどの他の環境を対象とした評価も計画として挙げていたが,これらは今後の課題である.今後は符号化応答圧縮器の能力に関する確率モデルによる解析的評価を行い,上記計算機実験による評価と併せて,国際会議での発表,論文誌への投稿を予定している.
免疫走査電顕法を用いたヒト乳歯象牙質における小管内コラーゲン線維の観察

本研究では、ヒト乳歯歯冠象牙質の切端直下に出現する象牙細管に類似の太い管状構造物(large tubules)の本体ならびに出現経緯を明らかにするため、内部を占めるコラーゲン線維の微細構造を詳細に観察すると共に、コラーゲン線維の性状(タイプ)を特定物質の三次元的局在を知る上で有用なコロイド金標識の免疫走査電顕法を用いて検索した。【方法】交換期にあるヒト乳歯を抜去後、直ちに4%パラフォルムアルデヒド溶液で4°C、24時間浸漬固定したものを研究材料とした。歯牙は歯髄腔側から切縁に向かって近遠心的に凍結割断を行った。一部の試料は、通法に従い走査型電顕観察用試料とした。免疫電顕用試料として、唇側の象牙質片はタイプIコラーゲン抗体(rabbit anti-bovine type I collagen,1:200)、舌側の象牙質片はタイプIIIコラーゲン抗体(rabbit anti-bovine type III collagen,1:80)で4°C、12時間反応させた。その後、20nmのコロイド金と結合した二次抗体(goat anti-rabbit IgG,1:50)と4°C、12時間反応させ、通法に従いSEM観察用試料とした。観察に際しては、同部位の二次電子像と反射電子像を撮影した。【結果】小管構造物内部に出現したコラーゲン線維は、太さ50150nmで、6070nm間隔の周期構造を有し、小管長軸に平行するものであった。コラーゲン線維の太さにかかわらず、コラーゲン線維上にタイプIコラーゲン標識金粒子およびタイプIIIコラーゲン標識金粒子が特異的に観察された。これらの金粒子は反射電子像によってさらに明瞭に認めることができた。ヒト乳歯歯冠象牙質の切端直下には通常の象牙細管の数数十倍の径(直径1050μm)を有した太い小管状の管が出現する。この管の走行と壁構造は象牙細管と類似しているが、管腔内には象牙芽細胞の突起は観察されず、コラーゲン線維で充塞されていた。このことから小管構造物の本態を解明するためには、コラーゲン線維の出現経緯を知ることが必要であると考えた。そこで、小管の内部構造を走査型電顕で詳細に観察するとともに内部を埋めるコラーゲン線維の性状(タイプ)をコロイド金標識の免疫走査電顕法を用いて検索した。免疫走査電顕的検索に先立ち免疫染色観察のための条件確立を試み、次の条件で良好な成績をえた。1.固定液の種類と固定時間:抜歯後直ちに4%パラフォルムアルデヒド溶液で4°C24時間浸漬固定を行った。以上の条件で免疫染色を行った結果、小管内のコラーゲン線維上に特異的にタイプIコラーゲン,タイプIIIコラーゲン標識金粒子を認めた。これらの金粒子は反射電子像によってさらに明瞭に観察された。さらに小管内の形態観察においては,太さ50150nm,間隔6070nmの典型的な周期構造を有するコラーゲン線維から構成される線維束が小管の長軸とほぼ平行に走行するのが認められた。ヒト乳歯歯冠象牙質の切端直下に通常の象牙細管の数数十倍の径を有する太い小管状の管(large tubules)が出現する。この管の走行と壁構造は象牙細管と類似しているが、管腔内には象牙芽細胞の突起は観察されず、コラーゲン線維で充塞さるている。

このことから小管構造物の本体を明らかにするためにはコラーゲン線維の出現経緯並びに性状を知る必要が有ると考えた。そこで、小管の内部構造を走査型電顕で詳細に観察すると共に、内部を埋めるコラーゲン線維の性状(タイプ)を免疫走査電顕法を用いて検索した。免疫走査電顕的検索は前年度(平成8年度)に確立した条件に従って行った。【結果】小管構造部内に出現したコラーゲン線維は太さ50150nmで、6070nm間隔の周期構造を有し、小管長軸に平行するものであった。このコラーゲン線維状にタイプIコラーゲン標識の金粒子が特異的に多数観察された。さらに、タイプIIIコラーゲン標識金粒子もコラーゲン線維上に認めた。これらの金粒子は反射電子像によってさらに明瞭に認めることができた。
部分多様体の幾何学を用いた四元数多様体の研究

当初の予定通り,所属研究機関のサバティカル研修制度を利用しドイツ・ハンブルク大学に滞在しVicente Cortes氏と共同研究を行った.本年度はある種のU(1)作用が与えられた四元数多様体から超複素多様体を構成することを試みた.これを四元数多様体に付随するSwann束とよばれる(概)超複素多様体を考え,その上でJoyceによって導入された超複素運動量写像を構成することにより行った.本研究ではまずSwann束上の概超複素構造の可積分性をPedersen, Poon, Swannによる結果よりも詳細に調べ,彼らの結果を一般化した.この一般化により,Joyceの結果をより広い対象に適用することができた.次にその超複素運動量写像を用いて,元の四元数多様体と同次元の超複素多様体を得ることができた.この構成は,四元数構造や超複素構造と適合した計量をもった四元数ケーラー多様体と超ケーラー多様体に対する結果であるQK-HK対応(quaternionic Kaehler-hyperKaehler対応)とよばれているのもの一般化となっている.また,コンパクトな等質四元数Hopf多様体の例も構成したが,位相的な制限のよりこの例はQK-HK対応ではあらわれない多様体であることが分かるので,当研究結果は既知の結果であるQK-HK対応を真に含むものと考えられる.今後は,この構成法によって新しい超複素多様体を得ることも考えていく.当初計画通り,ある種のU(1)作用が与えられた四元数多様体から超複素多様体を構成することができた.次年度はまず逆の構成すなわち超複素多様体から四元数多様体を構成することを考える.当初の予定通り,所属研究機関のサバティカル研修制度を利用しドイツ・ハンブルク大学に滞在しVicente Cortes氏と共同研究を行った.本年度はある種のU(1)作用が与えられた四元数多様体から超複素多様体を構成することを試みた.これを四元数多様体に付随するSwann束とよばれる(概)超複素多様体を考え,その上でJoyceによって導入された超複素運動量写像を構成することにより行った.本研究ではまずSwann束上の概超複素構造の可積分性をPedersen, Poon, Swannによる結果よりも詳細に調べ,彼らの結果を一般化した.この一般化により,Joyceの結果をより広い対象に適用することができた.次にその超複素運動量写像を用いて,元の四元数多様体と同次元の超複素多様体を得ることができた.この構成は,四元数構造や超複素構造と適合した計量をもった四元数ケーラー多様体と超ケーラー多様体に対する結果であるQK-HK対応(quaternionic Kaehler-hyperKaehler対応)とよばれているのもの一般化となっている.また,コンパクトな等質四元数Hopf多様体の例も構成したが,位相的な制限のよりこの例はQK-HK対応ではあらわれない多様体であることが分かるので,当研究結果は既知の結果であるQK-HK対応を真に含むものと考えられる.今後は,この構成法によって新しい超複素多様体を得ることも考えていく.当初計画通り,ある種のU(1)作用が与えられた四元数多様体から超複素多様体を構成することができた.次年度はまず逆の構成すなわち超複素多様体から四元数多様体を構成することを考える.研修受け入れ機関(ハンブルク大学)において文具等は使用できたので購入する必要がなかったため次年度使用額が生じた.また,これを含め成果発表や研究打合せ等の旅費に充当する予定である.
酵母遺伝子発現に及ぼす諸因子の研究

酵母を宿主として有用物質を生産する際,目的の遺伝子のプロモーター領域に効率のよいものを使用することに研究の主力がおかれてきた.本研究では,遺伝子発現に影響を及ぼすベクターの安定保持に関与する宿主因子について研究する目的で,核性変異株を単離し,その性格づけを行った.1.map遺伝子(maintenance of plasmid)酵母に内在する2μプラスミドの安定保持には,プラスミドがコードするSTB機構と,コピー数を高めるInversion機構が働いている.これに対し,宿主因子の変異株を単離する為, 2μのORIとLEu2を含むプラスミドを指標とし, Leu^-を放出しやすくなった変異株(mapl)を単離した.この株では, 2μばかりでなく, ARS1とCEN4を持つミニ染色体も不安定であった.map1で比較的安定に保持されるプラスミドを, YEp13をベクターとした遺伝子バンクより, 2種,単離した. 1つは, Insert内にARSを持つもので,同一のプラスミド上に複数のARS1が存在すると,より安定になることが示された.もう1つは, 2μのInverted Repeatを持つもので,このタイプは, invivoでも生じ, papillaeより単離された.これらの結果から, map1では,複製能が低下したため,核外因子が不安定になると解釈された.2.gst1遺伝子(G1-to-Sfransition)ミニ染色体のコピー数調節機構を利用して単離された高温感受性変異株の中に,ミニ染色体や, 2μの安定保持に,温度依存性のある株を見つけた.この株では,温度を36°Cにすると, G1よりS期への移行がブロックされている.ts性を相補するDNA断片をクローンし,構造解析した結果,遺伝子産物は,部分的に,翻訳に必須なEF1αとのホモロジーが存在する,分子量7万6千の蛋白であることが判った.又, OFAGE,四分子解析により,染色体4番cdC37近傍にマップした.酵母を宿主として有用物質を生産する際,目的の遺伝子のプロモーター領域に効率のよいものを使用することに研究の主力がおかれてきた.本研究では,遺伝子発現に影響を及ぼすベクターの安定保持に関与する宿主因子について研究する目的で,核性変異株を単離し,その性格づけを行った.1.map遺伝子(maintenance of plasmid)酵母に内在する2μプラスミドの安定保持には,プラスミドがコードするSTB機構と,コピー数を高めるInversion機構が働いている.これに対し,宿主因子の変異株を単離する為, 2μのORIとLEu2を含むプラスミドを指標とし, Leu^-を放出しやすくなった変異株(mapl)を単離した.この株では, 2μばかりでなく, ARS1とCEN4を持つミニ染色体も不安定であった.map1で比較的安定に保持されるプラスミドを, YEp13をベクターとした遺伝子バンクより, 2種,単離した. 1つは, Insert内にARSを持つもので,同一のプラスミド上に複数のARS1が存在すると,より安定になることが示された.もう1つは, 2μのInverted Repeatを持つもので,このタイプは, invivoでも生じ, papillaeより単離された.これらの結果から, map1では,複製能が低下したため,核外因子が不安定になると解釈された.2.gst1遺伝子(G1-to-Sfransition)ミニ染色体のコピー数調節機構を利用して単離された高温感受性変異株の中に,ミニ染色体や, 2μの安定保持に,温度依存性のある株を見つけた.この株では,温度を36°Cにすると, G1よりS期への移行がブロックされている.ts性を相補するDNA断片をクローンし,構造解析した結果,遺伝子産物は,部分的に,翻訳に必須なEF1αとのホモロジーが存在する,分子量7万6千の蛋白であることが判った.又, OFAGE,四分子解析により,染色体4番cdC37近傍にマップした.遺伝子工学の開発により、酵母を宿主として有用物質を生産することが実用化されている。今まで、目的の遺伝子のプロモーター領域に効率のよいものを使用することに主力がおかれてきた。しかし、宿主側についての検討はほとんどなされていない。遺伝子発現に直接、又は、間接的に関与する諸因子例えば、ベクターのコピー数,安定性,DNAの高次構造,転写,翻訳と各々のレベルにおける改良が期待される。本研究では、1)酵母Schizosaccharomyces pombeの宿主ベクター系のマーカーとなるLEU1遺伝子のクローニングと、その遺伝子の構造解析、及び、2)ベクターの安定性に関わる宿主変異株の解釈を行った。1)Sch.pombeの遺伝子バンクより、大腸菌leuBを相補できるDNA断片をクローンした。サブクローニングにより、大腸菌内での機能領域を求めた後、自律複製能を持つ配列とつないで、酵母に導入し、機能領域を決定した。さらに、ダイデオキシ法により、DNA一次構造を決定した。アミノ酸配列は、酵母LEU2遺伝子と高いホモロジーを示したがコードの使われ方は、S.cerevisiaeに比べ、特に、Arg(CGT)がよく使われて居り、その点では、prokaryote型であった。2)ベクターの安定性に関する核性変異株の解析。2μプラスミドDNAがよく脱落する変異株について、種々のハイブリッドプラスミドを作製して、その安定性を検定した。その結果、複製機能の低下が予想された。

又、この変異株内で、より安定に存在するプラスミドを遺伝子バンクより検索したところ、(1)ARS配列を持つDNA断片,と(2)逆位機構に必要な部位を含むDNA断片を持つ2種のプラスミドが高頻度で単離された。(1)は複製開始のチャンスが増大する為、(2)は、逆位による遺伝子増幅の可能性が考えられ、どちらも複製開始に働くステップの能力低下がプラスミドの不安定性をひき起すと推論された。
軟部悪性腫瘍の抗癌剤感受性試験に関する研究

骨軟部悪性腫瘍に対する化学療法感受性試験は予め有効な薬剤を選択できる点で非常に期待される。これまで我々は、細胞採取法に関する基礎的な検討研究に加え、更に軟部悪性腫瘍における組織学的な差による相違に付いて検討を加えてきた。またflowcytometryによる抗腫瘍効果判定の為の基礎的なデーターを得るため一部の軟部腫瘍のploidy patternの検討を行い、これらの結果と臨床的な予後との相関を含め日本整形外科学会基礎学術集会に報告した。従来の組織亜型診断、組織学的悪性度、腫瘍の大きさに加え、aneuploidは生命予後不良の因子であることを証明することはできたが、これらの結果と化学療法に対する感受性との相関を示すには至らなかった。また薬剤と腫瘍との接触法に関しては、適切な薬剤濃度および接触時間などを検討するため骨肉腫のcell lineを使用し、methotrexate、adriamycin、ifosfamideなどの主要な薬剤にて抗腫瘍効果を判定する実験を行った。更にポリアミン合成阻害剤であるmethylglyoxalbis(cyclopentylamidinohydrazone)(以下MGBCPと略す)との併用効果を検討し日本ポリアミン研究会にて報告した。結果としては、作用機序の異なるMGBCPとadriamycinなどの薬剤と併用することにより骨肉腫細胞株に対して相加的な抗腫瘍効果が得られることが証明された。今後は5-Bromodeoxyuridine(以下BrdU)とfluoresceinisothiocyanate標識抗BrdUモノクローナル抗体およびpropidium iodideにて二重染色を行い抗癌剤の影響を細胞周期レベルで分析した結果を日本整形外科学会にて報告する予定である。【軟部悪性腫瘍の感受性試験に必要な腫瘍細胞を採取する最適な方法の検討】腫瘍組織より腫瘍細胞を採取する方法として、移植片法、トリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼなどの酵素による化学的分散法、ホモゲナイザーあるいはメスによる細切などの機械的分散法を行い、各々一定量の組織から得られる浮遊細胞の数、その細胞の光顕的・電顕的形態観察、flow cytometryによる細胞学的な検討をおこなった。結果としては機械的分散法では腫瘍細胞の比率が高いが、採取できる細胞数に限りがあった。また形態上比較的腫瘍細胞が豊富な初代培養が継代中に線維芽細胞優位になることはこれまでにも知られているが、この変化が感受性試験に与える影響に関しても検討中である。更に各々の方法で採取した細胞で二重軟寒天培地内のコロニー形成率を測定、同時に感受性試験を施行し、結果を比較検討している。【コロニー形成細胞の分離と性格】コロニー形成細胞の分析は、それを分離・増殖させる適切な培養条件を見いだすことができず、なお達成されていない。平成5年度は、conditioned mediumを使用するなどのの方法でこれを分離培養し、平顕的・電顕的形態観察および免疫組織学的な検討、flow cytometryによる細胞学的な検討、nude mouseへの移植を行い、非腫瘍細胞がどの程度含まれているかの検討を継続する。今年度は、細胞採取法に関する基礎的な検討研究において、更に軟部悪性腫瘍における組織学的な差による相違に付いて検討を加えてきた。またflowcytometryによる抗腫瘍効果判定の為の基礎的なデーターを採取する目的で一部の軟部腫瘍のploidy patternおよび計測における精度との関連でCV値の検討を行い、これらの結果と臨床的な予後との相関を含め日本整形外科学会基礎学術集会に報告した。従来の組織亜型診断、組織学的悪性度、腫瘍の大きさに加え、aneuploidは生命予後不良の因子であることを示した。また薬剤と腫瘍との接触法に関しては、適切な薬剤濃度および接触時間などを検討するため今回は骨肉腫のcell lineを使用し、methotrexate、adriamycin、ifosfamideなどの主要な薬剤にて抗腫瘍効果を判定する実験を行った。

これは更にポリアミン合成阻害剤であるmethylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)(以下MGBCPと略す)との併用効果を検討し日本ポリアミン研究会にて報告した。結果としては、作用機序の異なるMGBCPとadriamycinなどの薬剤と併用することにより骨肉腫細胞株に対して相加的な抗腫瘍効果が得られることが証明された。今だ軟部悪性腫瘍の薬剤感受性を臨床応用するには至っていないが、基礎的な方法、技術は確実に向上しており、その実現に際し問題となる事項を徐々に解決している。昨年度はflowcytometryによる軟部腫瘍のploidy pattern、PCNA標識率、組織亜型診断、組織学的悪性度と化学療法感受性についての検討を行い、本年度はこの結果を論文として投稿した。また昨年度の骨肉腫細胞株を使用したポリアミン合成阻害剤であるmethylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)(以下MGBCPと略す)とmethotrexate、adriamycin、ifosfamideなどの主要な薬剤との併用効果に関する研究の成果を本年度は論文として投稿した。また本年度はこれらの基礎的研究をもとに更にMGBCPのHOS、KHOS-240S、MG-63、C-292などの骨肉腫細胞株において腫瘍細胞の細胞周期に対する影響をfluorescein isothiocyanate標識bromodeoxyuridineとpropidiumiodideの両者のflowcytometryによる蛍光量測定によりついて詳細な検討を行った。また骨軟部悪性腫瘍の抗腫瘍剤として最も一般的な薬剤であるadriamycinに対する耐性に関与するとされるP糖蛋白に関し実際当科にて化学療法で治療した骨肉腫患者の腫瘍細胞の遺伝子学的な検討も行い、臨床的な抗癌剤の抗腫瘍効果、臨床成績と比較検討した。これらの結果は今後学会で報告し、また論文として投稿する予定である。
多精受精モデル、鳥類の新規卵子活性化機構の探索とクローン鳥類創出への挑戦

本研究では、精子200個分相当のタンパクを含む精子抽出物(spem extract : SE)を単一精子とともにウズラ卵へ顕微注入し(intracytoplasmic sperm injection : ICSI)、その卵を体外培養することによって、ウカ個体を得ることに成功した。この体外受精・培養による鳥類孵化個体の育成は、世界でも初めてとなる成果である。また200個分の精子によって惹起される、鳥類に特異な一過性Ca^<2+>波とスパイラル様のオシレーション波は、雛の孵化個体に必須な別々の異なった細胞内イベントを誘起することが分かった。さらに一過性とスパイラル様のCa^<2+>波は、精子由来の卵賦活化因子(speml-bome oocyte-activating factor : SOAF)によって惹起されることがプロテーム解析から判明した。またSEでは無くて、これらのSOAFを単一精子とともにウズラ卵へ顕微注入・培養することで、雛を得ることにも成功した。またこのSOAFによる卵賦活化機構を利用して、胚盤葉細胞あるいはprimordial geml cellの核を核破壊したウズラ卵に移植したところ、それぞれ15%前後の卵で胚盤葉発生が確認されるとともに、一部の胚は、胚盤葉ステージを完了した。本研究の成果は、これまでに全く手がけることが不可能であったクローンウズラ作出に向けての大きな飛躍と言える。また受精と胚発生を全て体外で行えることが可能になったことも、野生種や絶滅危惧種の救済に直接応用が可能であり、社会的にも大きなインパクトを有した研究と位置づけられる。昨年度のプロテーム解析から単離した新規SOAFのみを用いて、ICSIウズラ胚の孵化に成功しただけでなく、核移植胚の発生も胚盤葉ステージを完了させることに成功したため。ICSIや核移植ウズラ胚の半分は、初期の胚盤葉発生で停止するため、その発生停止の原因を追及する必要かある。また分化した細胞の核移植ウズラ卵に発生能力が備わっているのか調査するとともに、核移植胚を孵化育成できる培養システムを確立する必要がある。顕微授精(ICSI)法および体外培養によって得られたウズラ胚は、原条が観察される胚ステージ6までの育成が最高であり、未だ個体孵化には至っていない。多精子侵入が関与する卵子活性化を体外で再現できていないことが最大の要因である。そこで鳥類の精子由来卵子活性化因子(SOAF)を網羅的に解析することを目的に、ウズラ卵細胞質内のCa^<2+>濃度測定法を確立した。単一射出精子を注入したウズラ卵子において、細胞質内Ca^<2+>の増加は観察されなかった。その後の発生率も16%と非常に低く、卵割ステージのVIIで全ての卵子が発生を停止した。一方、SOAFの一つとして既に単離されているphospholipase Cζ(PLCζ)cRNAまたはPLCζの代謝産物であるIP3を単独投与すると、注入部位から一過性のCa^<2+>増加が観察され、生殖盤にのみCa^<2+>波が伝搬した。またPLCζcRNAまたはIP3を顕微授精した卵子は、それぞれ50、82%と高い発生率を示し、両群ともに胚ステージ6まで進行した。次いで、精子抽出物(SE)の単独投与あるいはSEとIP3の同時投与を行うと、一過性のCa^<2+>増加反応が観察された後に、哺乳類と全く異なった連続的なCa^<2+>オシレーションが観察された。IP3、SEとともにICSIしたウズラ卵子では、80%の発生率を示しただけでなく、発生が孵化直前(胚ステージ45)まで進行した。SEのCa^<2+>オシレーションに対するこの効果は、レクチンで処理することで中和されることが分かり、これらの分子をLC-MS/MSで解析した。38個の遺伝子がヒットし、現在卵子活性化にのみ効果のある遺伝子を選抜中である。さらにSEに対するモノクローナル抗体ライブラリーを作成するとともに、この内SEの発生に対する効果を中和する2つのライブラリーを得た。これらのライブラリーからSOAFを認識する抗体を選抜していく予定である。顕微授精(intracytoplasmic sperm injection:ICSI)法および体外培養によって得られたウズラ胚は、原条が観察される胚ステージ6までの育成が最高であり、未だ個体孵化には至っていない。精子抽出物(sperm extracts:SE)を応用してICSIウズラ胚の孵化育成を行うとともに、それに関与する卵細胞質内Ca^<2+>波を時空間的に観察した。SEの投与はphoshpohpase Czetaによる一過性のCa^<2+>上昇を誘起するだけではなく、その後に他動物では全く観察されていないスパイラルCa^<2+>オシレーションが観察され、それが1時間以上継続した。またこのスパイラルCa^<2+>オシレーションを誘起できたICSI卵は、発生した5割以上の胚が胚ステージ6を超えて発生し、その内の1個体が孵化した。これまでに卵管から取り出した1細胞期の受精卵を、体外培養のみで孵化させることは可能であったが、体外受精と培養を全て体外で行って孵化に成功した例は世界でも初めてとなる。またスパイラルCa^<2+>オシレーションを誘起する生理活性物質(sperm-borne oocyte-activating factor:SOAF)を同定する目的で、SEをゲル濾過クロマトグラフィーにより分離した。

30-90kDaの画分に新規SOAFが含まれていることが分かり、SDS-PAGEおよびLC-MS/MS解析によってその新規SOAFは2つ必要であることが分かった。さらにこの2つの新規SOAFの発現解析を行なった結果、2つのタンパクとも精子特異的なアイソフォームトして存在していることが分かった。本研究では、精子200個分相当のタンパクを含む精子抽出物(spem extract : SE)を単一精子とともにウズラ卵へ顕微注入し(intracytoplasmic sperm injection : ICSI)、その卵を体外培養することによって、ウカ個体を得ることに成功した。この体外受精・培養による鳥類孵化個体の育成は、世界でも初めてとなる成果である。また200個分の精子によって惹起される、鳥類に特異な一過性Ca^<2+>波とスパイラル様のオシレーション波は、雛の孵化個体に必須な別々の異なった細胞内イベントを誘起することが分かった。さらに一過性とスパイラル様のCa^<2+>波は、精子由来の卵賦活化因子(speml-bome oocyte-activating factor : SOAF)によって惹起されることがプロテーム解析から判明した。またSEでは無くて、これらのSOAFを単一精子とともにウズラ卵へ顕微注入・培養することで、雛を得ることにも成功した。またこのSOAFによる卵賦活化機構を利用して、胚盤葉細胞あるいはprimordial geml cellの核を核破壊したウズラ卵に移植したところ、それぞれ15%前後の卵で胚盤葉発生が確認されるとともに、一部の胚は、胚盤葉ステージを完了した。本研究の成果は、これまでに全く手がけることが不可能であったクローンウズラ作出に向けての大きな飛躍と言える。また受精と胚発生を全て体外で行えることが可能になったことも、野生種や絶滅危惧種の救済に直接応用が可能であり、社会的にも大きなインパクトを有した研究と位置づけられる。当初の計画通り、ウズラの卵細胞質内Ca^<2+>濃度の計測技術を確立することができ、ウズラの受精に、そしてその後の発生に必要なCa^<2+>パターンが区分化することができたため。さらにそれらに関与する新規なSOAFもある程度選別することに成功しているほか、ウズラICSI胚の発生ステージも大幅に改良できたからである。当初の計画通り、ウズラICSI胚を孵化させることに成功した。さらにその発生を誘起する新規SOAFの同定に成功したため。昨年度のプロテーム解析から単離した新規SOAFのみを用いて、ICSIウズラ胚の孵化に成功しただけでなく、核移植胚の発生も胚盤葉ステージを完了させることに成功したため。既に選別されている2つのモノクローナル抗体ライブラリーから、またLC-MS/MS解析から選別された遺伝子の双方からウズラ卵細胞質内Ca^<2+>オシレーションを誘起する新規SOAFを同定する。またこのSOAFを利用して、ウズラICSI卵の孵化育成を行う予定である。さらにこのSOAF抗体を作製した後、Ca^<2+>オシレーションの抑制実験を行う。