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新規アミノ酸栄養学の構築とその応用に関する研究

群飼状態の卵用種雄ヒナの側脳室にストレス反応の起点となる副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンとLーまたはD-アスパラギン酸を投与し、その直後から単離ストレスを負荷し、行動に及ぼす影響を調べた。両アスパラギン酸に鎮静効果は認められるものの催眠効果はL-アスパラギン酸のみに認められ、作用機序が異なる可能性が示唆された。一方、Lーセリンの経口投与により脳内のLーセリンが増えるばかりか、D-セリンも徐々に増加することが確認された。このLーセリンがうつ様行動において重要な鍵を握ることも明らかになった。それは、うつ病モデル動物であるWistar Kyotoラット(WKYラット)とその対照群であるWistarラット(WISラット)を比較したところ、多くの脳部位と血漿においてWKYラットでLーセリンが低いことである。さらに、セリンとホモシステインから合成されるシスタチオニンもWKYラットで低いことが確認された。現在、うつ病の発症原因としてモノアミンの代謝異常が注目されているが、アミノ酸代謝の側面からも原因追及をする必要性が提示できた。また、現在アトピー性皮膚炎などにおいて引っ掻き行動が皮膚の状態をさらに悪くするという点が問題とされているが、引っ掻き行動の緩和と脳内のアミノ酸代謝に一部関連がある可能性が示唆された。新規アミノ酸栄養学の構築という点で、遊離アミノ酸ならびにその代謝産物の機能の解明を進めている。今年度の課題に並行して、L-セリンやL-アスパラギン酸の機能を探索した。L-セリンに関しては脳細胞外液のL-アラニンを高め、タウリンを減少させる作用があることが見出された。また、L-セリンにはうつ状態発症との関連が示唆された。L-アスパラギン酸とその異性体であるD・アスパラギン酸には強いストレス化においても鎮静効果を発揮することが明らかとなった。このように多くの知見を得ることが出来たため、当初の計画以上に進展していると判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度のキヌレン酸の課題に並行して、L-セリンやL-アスパラギン酸の機能を探索した。L-セリンに関しては経口投与により血漿と脳の水準が増加するが、その際にグルタミン酸受容体の一つであるNMDA受容体に結合するD-セリンに一部が代謝されることが見出された。また、L-セリンに関連したアミノ酸代謝がうつ状態発症との関連が示唆された。L-アスパラギン酸とその異性体であるD-アスパラギン酸には強いストレス化においても鎮静効果を発揮するが、催眠作用において機能が異なることも明らかとなった。現在、トリプトファン代謝において重要なカギを握ることが判明したキヌレン酸の測定技術の確立を進めている。方法が確立することにより、ストレス化における脳のトリプトファン代謝の全容が明らかになる。特に、うつモデルラットに鶏卵を与えることで、うつ状態が改善し、その際、前頭前野のトリプトファンが増加することを見出している。セロトニン含量に違いがなかったことから、キヌレン酸への代謝が重要と考えている。一方、リシンの代謝産物であるサッカロピンとアミノアジピン酸に関しては溶解度が非常に低いために投与実験が出来ない状況にある。現在溶解度を高める方法を模索中である。
時計タンパク質ＫａｉＣによる細胞分裂制御機構の解析

シアノバクテリアの概日リズム発生には、時計タンパク質KaiCが中心的役割を担っていることがわかっている。本研究ではKaiCに結合するタンパク質であり、DNA複製開始因子として知られるDnaAの解析を行った。dnaAを破壊しても細胞は生育が可能であったが,その概日リズムの周期が短周期になり、さらに、変異体において細胞分裂異常がおこることが示唆された。DnaAは、KaiCと相互作用して概日時計を調節するとともに、概日時計による細胞周期の調節機構の一部として働いているのではないかと考えられる。細胞周期が、概日時計に制御されていることは広く知られており、細胞周期が時刻依存的に制御されることは、紫外線によるDNA損傷の抑制や、発生や成長を環境に適応して調整するなど、生物にとって重要な役割を持つと考えられている。本研究は、概日時計による細胞周期調節の分子機構解明のために、シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942をモデル系として、概日時計の中心タタンパク質KaiCが細胞分裂を時間的に調節する分子機構を明らかにすることを目的とした。Synechococcus elongatus PCC 7942では、概日時計による細胞周期の調節機構において、FtsZリング形成が時間依存的に抑制されることが明らかとなっていること、KaiCがRecA/DnaB superfamilyに属するATPaseでありDNA結合能を持つこと、ヌクレオイド構造が約24時間周期で変化を繰り返していることなどから、KaiCはDNAに結合しヌクレオイド構造を制御することによって、DNAの複製分配とある程度協調してFtsZリンク形成を制御するのではないかと考えた。平成25年度に実施した研究により、DNA複製開始因子であるDnaAが概日時計の周期を調節していることを明らかにした。また、DnaAによる周期調節はKaiCを介していることもわかった。Synechococcus elongatus PCC 7942のDnaAは原核生物に保存されている複製開始因子DnaAと相同性が高く、同様の機能を持つと考えられるが,破壊しても生育に影響はなかった。そこで、時計における機能がDNA複製や細胞分裂制御とは独立か、もしくは分裂制御を通した二次的なものかを、DnaAの解析を通して明らかにするため、大腸菌発現系を用いたSynechococcus elongatus PCC 7942 DnaAの精製、抗体の作製、kai遺伝子との二重変異体の作製、発現解析、相互作用の検討を行った。本研究は概日時計による細胞周期調節の分子機構解明のために、シアノバクテリアをモデル系として、概日時計タンパク質KaiCが細胞分裂時に現れるZリング形成を時間的に調節する分子機構を明らかにすることを目的としている。シアノバクテリアでは概日時計による細胞周期のGatingにおいてZリング形成が抑制されることが明らかであるが、大腸菌や枯草菌の研究から、Zリングを細胞の中央に正確に形成するためにMinシステムとNucleoid Occlusionという二つの機構があることがわかっている。KaiCはRecA/DnaB superfamilyに属するATPaseであり、DNA結合能を持つことや、Nucleoid構造は概日振動することから、KaiCはDNAに結合しNucleoid構造を制御することによってDNAの複製分配とある程度協調してZリンク形成を制御するのではないかと考えられる。予備実験の結果からKaiCは時刻依存的にDnaAと結合することが明らかとなったためKaiC-DnaAの相互作用とNucleoid構造に着目し,KaiCによる、遺伝子発現調節を介さない細胞周期のGating機構の検証を行った。平成24年度はDnaAの細胞内での機能を細胞周期と概日時計の両面から解析するために大腸菌発現系を用いたシアノバクテリアDnaAの精製方法の検討、DnaA抗体の作製、エピトープタグを付加したdnaAのシアノバクテリアでの発現系の構築などを行い、dnaAの機能を分子遺伝学的、生化学的に解析することができるようになった。本研究は、概日時計による細胞周期調節の分子機構解明のために、シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942をモデル系として、概日時計が細胞分裂を時間的に調節する分子機構について、時計タンパク質が直接関与するのか、または細胞分裂装置の発現等を介して間接的に制御するのかを検証することを目的とした。平成26年度に実施した研究により、時計タンパク質とDNA複製に関わる因子についてシアノバクテリア細胞内における相互作用を詳細に調べたところ、これらの相互作用していること、また、概日時計と細胞分裂がこれらの相互作用によって調節されていることが示唆された。DNA複製は生物にとって必須機能であるが,シアノバクテリアではDNA複製開始因子を破壊しても生育に影響はなかった。これらの結果から、シアノバクテリアにおいては、概日時計本体である時計タンパク質が、直接的に細胞周期を調節している可能性が示唆された。

細胞分裂装置と時計タンパク質との相互作用について、今後さらに調べることが必要である。また、概日時計による転写制御が基になり細胞周期が調節されている可能性についても、解析を進めることが重要である。分子遺伝学本研究の目的は、細胞分裂時のFtsZリング形成場所の決定機構における、KaiCおよびDNA複製開始因子DnaAの相互作用を解明することである。大腸菌や枯草菌の研究から、FtsZリングを細胞の中央に正確に形成するためには、MinシステムとNucleoid Occlusionという二つの機構があることがわかっている。そこで、KaiCとDnaAの相互作用とヌクレオイド構造に着目し,KaiCによる、遺伝子発現調節を介さない細胞周期のGating機構の検証を行う計画である。平成24年、25年度の結果をふまえ、KaiCとDnaAの細胞内での複合体形成を詳細に調べた。ところが、新たに作製したDnaAの特異的な抗体を用いて免疫沈降実験を行ったところ、その結果が以前の観察と一部矛盾するものだったため、再検討を要するため。本研究は概日時計による細胞周期制御の分子機構を解明するため、Nucleoid構造とそのダイナミクスに着目し、シアノバクテリアの時計タンパク質KaiCが出力系の遺伝子発現を介さずにDNA複製開始因子DnaAと協調的に働くことで分裂装置(Zリング)形成を調節する機構について解析を行っている。そのために以下の3点の研究を行う計画であるが、[1. Nucleoid構造やダイナミクスがZリングの形成を制御するかを検証する。2. DnaAの細胞内での機能を細胞周期と概日時計の両面から解析する。3. DNAへの結合に基づくKaiCによる細胞周期制御機構を調べる。]平成24年度の研究によってDnaAの機能について解析する礎ができ順調に進んでいるといえるだろう。これまでの研究からDNA複製開始因子のホモログであるSynechococcus elongatus PCC 7942のDnaAが概日時計タンパク質KaiCとなんらかの相互作用によって概日時計を調節していることが明らかとなった。今後は、KaiCとDnaAの相互作用の実体を明らかにして行くことで、DnaAの作用機構を明らかにする。そのためには平成25年度の研究結果をうけて、KaiCとDnaAの細胞内での複合体形成の詳細を再検討するとともに、in vitroでの相互作用解析と細胞内での局在解析を行う。また、KaiC-DnaA複合体のヌクレオイドへの結合について解析をおこなうことで、概日時計と細胞分裂のカップリング機構におけるヌクレオイド構造の関与を明らかにする。
歯の移動中の歯根膜領域の血液量変化・および代謝活性の計測について

スタンダードエッジワイズ法による矯正治療を行っている被験者の、下顎犬歯の遠心移動の際のTotal Hb、Oxy-Hbの変化について近赤外光計測装置(島津無侵襲酸素モニタOM-100A島津社製)を用いて計測を行った。遠心移動は、パワーチェインによって行い初期荷重150gになるように調節した。移動開始前、移動後14日目、28日目に荷重による圧迫側歯根膜血液量変化を計測した。14日目で移動前と比べて変化量が減少しているが、28日目では、移動前の変化と同程度まで回復していることが観察された。この理由として、圧迫されている歯根膜で、組織の修復が盛んに行われ、歯根膜の生理的状態が維持されていたためと思われる。これに対して、Oxy-Hbは、14日目、および28日目に移動前よりも大きな変化を示した。Oxt-Hb量の変化は、局所酸素分圧を反映するするため、その部位での代謝活性を直接反映しているものと思われる。以上これらの2つの計測結果は、本計測システムの至適矯正力を知るためのモニタリングシステムとしての可能性を示唆するものと思われる。今後はさらに、より細かな組織の代謝活性を知るために、動脈血および静脈血の動態をそれぞれ分けて把握することも重要になってくる。本システムでは、Oxy-Hb、Deoxy-Hbについても計測が可能であることから、様々な条件下でデータを採取し、Total Hb、Oxy-Hb、Deoxy-Hb三者間の関係を明らかにすることが、至適矯正力を知るための今後の課題となると思われる。
金属エノラートを鍵とする新規アフィニティー精製法の開発

本研究では生物活性化合物の結合蛋白質・結合部位同定を目指して、カルボニル化合物と金属錯体より生成する「金属エノラート」を利用した新規アフィニティー精製法の開発を目指した。その結果、固相に担持したパラジウム錯体を用いることで、カルボニル化合物をタグ分子として持つアミノ酸誘導体を水系溶媒中でも捕捉・精製することに成功した。さらにこれに蛍光団を持つ求電子剤を反応させることで、固相担体からの溶出と蛍光標識化を同時に行うことにも成功した。ケミカルバイオロジー分野において、低分子化合物の結合タンパク質・結合部位の同定は非常に重要な命題の一つである。しかしながら、その手法はいまだ発展途上であり、様々な実験系で用いることできる一般性の高い方法論の開発が望まれている。本研究では、金属エノラートを基盤として新しいペプチド修飾反応・精製方法を検討し、結合タンパク質・結合部位同定に応用できる新規アフィニティー精製法を開拓することを目指す。前年度において水存在下でも安定に存在できる金属エノラートの探索を行い、固相担体上で安定にエノラート形成が可能な金属錯体を見出すことに成功している。そこで本年度はアミノ酸をベースにしたモデル化合物を合成し、固相上で金属エノラートを反応させた上で種々の求電子試薬と反応条件を検討した。その結果、金属エノラートを反応させると同時に固相担体から溶出させることに成功した。一方で、求電子試薬に対して各種タグ分子の導入を検討し、固相担体より溶出させると同時にタグ分子の導入も可能な系へと展開することにも成功した。最後に、モデル化合物としてエノール化できない基質をネガティブコントロールとして混合物をモデルとして、金属エノラート形成を利用してターゲット分子を精製後、溶出と同時にタグ分子を導入する実験を試みた。その結果、当初の計画通り極めて高収率でターゲット分子だけを精製・修飾することができ、本研究のコンセプトを実証することができた。しかしながら、その手法はいまだ発展途上であり、様々な実験系で用いることができる一般性の高い方法論の開発が望まれている。前年度までにアミノ酸をベースにしたモデル化合物を用いて、金属エノラートとしての固相担体への捕捉(キャッチ)と求電子試薬との反応による固相からの溶出(リリース&リアクション)に成功した。本年度はこのコンセプト実証に続き、目的とする結合タンパク質・結合部位の同定により近い実験系での検討を行った。まず、前年度で行ったコンセプト実証実験を様々なアミノ酸の共存下行い、アミノ酸側鎖が本反応に与える影響を調べた。その結果、システインを除き大半のアミノ酸は影響しないことが明らかとなった。この結果を受け、前年度で合成したモデルアミノ酸をペプチドへと組み込み、モデルとなるペプチドを作製した。これを用いて、ペプチドを用いて金属エノラートによる精製、求電子試薬との反応を検討した。その結果、モデルアミノ酸を用いた時と同様に極めて効率的な捕捉(キャッチ)に成功した。しかしながら、固相担体からの溶出(リリース&リアクション)に関しては、モデル化合物に比べると反応効率が低く、さらなる検討が必要であることが明らかとなった。まず本研究の最初の課題として、水存在下でも安定に存在できる金属エノラートの探索を開始した。生体成分の反応・精製において水の存在は必須であり、水溶液中でも壊れることのない金属エノラートが本研究の要になる。そこで本年度は、まず水と有機溶媒が共存する液相系で、種々の基質と様々な金属錯体を反応させ、その金属エノラート形成を検討した。しかしながら、水存在下では金属錯体の溶解性に問題があるケースが多く、基質・金属錯体共に詳細な条件検討が困難であることがわかった。そこで溶解性の影響を受けない系として、固相担体に金属錯体を固定化した固相系での反応に焦点を絞り、種々の基質を用いて条件検討を行うこととした。この際、反応の進行はNMRでモニターし、エノラート形成が起きているかどうかをケミカルシフトの移動をもとに調べた。その結果、水存在下でも壊れることのない金属エノラートが形成される条件を見出した。今後はこの条件をもとに汎用性の高い基質・標識タグの探索に入る予定である。

当初計画では、液相系で詳細な条件検討を行ったうえで固相反応に展開する予定であったが、前年度の検討において液相系で触媒の溶解性に問題があることがわかったため、固相系の検討を前倒しで行った。そのため、今年度は前年度行う予定であった、金属エノラートの反応条件検討をメインに行った。その結果、昨年度・今年度で合わせて当初の計画通りコンセプト実証を2年で行うことができた。以上から、年度ごとの計画の前倒し・後倒しはあったが、全体としては計画通り進んでいると考えている。当初計画では、液相系で詳細な条件検討を行ったうえで固相反応に展開する予定であったが、液相系で触媒の溶解性に問題があることがわかったため、固相系の検討を前倒しで始めた。その結果、今年度の目標であった反応条件の検討はできなかったが、次年度の目標であった固相系への展開に成功した。さらに、今年度の最大の目標であった水存在下でも安定に存在する金属エノラートを見出すことができた。以上から、年度ごとの研究計画の前倒し・後倒しはあったが、全体としては計画通り進んでいると考えている。本年度でコンセプト実証ができたので、この条件をもとに実際のペプチド・タンパク質の系へと展開することを計画する。具体的にはペプチド混合物より修飾されたペプチドを精製することを目的として条件検討を行う。この際には帰属エノラートが影響を受けるアミノ酸残基を考慮し、種々条件を検討したいと考えている。さらに最終的には、阻害剤で修飾された酵素をモデルタンパク質としてその修飾ペプチドを精製・同定することを目指す。本年度見出すことのできた金属エノラートを基盤にして、反応条件の検討を行い、目的とする標識反応の開発を目指す。特に、モデル基質や標識反応の選択においては詳細に検討を行う予定である。今年度は金属試薬の購入を予定していたが、研究の中心が金属錯体よりもモデル基質に集中したので、金属試薬に関しては次年度購入することにした。次年度はさらに各種固相担体の購入も計画している。また、モデル化合物の合成原料やモデルタンパク質の購入も計画する。今年度に引き続き、金属触媒の原料である金属試薬、固相担体などに研究費を使う。また、次年度ではモデル化合物の原料として種々の合成試薬も購入する予定である。
肝移植実験における再潅流現象による肝及び胃損傷に関する研究

肝移植の前段階としてラット肝阻血・下大静脈クランプモデルを用いて、肝虚血・再潅流による組織障害とフリーラジカル産生および微小循環との関連について検索し、これらに対するサイトカイン(IL-1)の関与ならびにPGE1の効果について検討した。次にラット肝移植モデルを用いて、Primary graft nonfunction(PGN)と肝微小循環とくに白血球膠着現象との関連を検索し、IL-1 receptor antagonist(IL-1ra)およびPGE1のPGNに対する予防効果を検討した。1)肝阻血・再潅流:肝阻血(30分)・再潅流後60180分では、肝細胞の萎縮・変性を認めた。フリーラジカル(Chemiluminescence)は肝上部下大静脈血で増加を認め、肝から流出した好中球のフリーラジカル産生増加が示唆された。同時に、肝組織血流量の低下および肝組織CuZn-SOD,Mn-SODの減少を認め、またfluorescence microscopy(FM)で観察すると、白血球の血管内皮への膠着が見られた。一方、肝阻血中に門脈よりIL-1raを投与すると、上記の組織障害、フリーラジカル産生増加、白血球の膠着が抑制された。同様にPGE1の門脈内投与によっても肝阻血・再潅流障害が抑制された。すなわち、フリーラジカル産生には、白血球膠着などの微小循環障害が関与し、IL-1はそのmediatorであり、IL-1raおよびPGE1はその障害防止に有用であると考えられた。2)肝移植:FMで測定した肝内白血球血流速度および白血球膠着数とgraft survivalとは相関した。肝潅流液および保存液にIL-1raまたはPGE1を添加すると、白血球血流速度、膠着数は改善し,survival rateも向上した。また肝移植後にPGE1を投与すると血流速度は増加し、微小循環の改善が見られた。すなわち移植肝のviabilityは微小循環と密接な関連を有しており、IL-1raやPGE1は微小循環を改善させ、PGNの予防に有用であることが示唆された。肝移植の前段階としてラット肝阻血・下大静脈クランプモデルを用いて、肝虚血・再潅流による組織障害とフリーラジカル産生および微小循環との関連について検索し、これらに対するサイトカインとくにIL-1の関与について検討した。フリーラジカル(Chemiluminescence)は60分をピークに肝下部に比べ、肝上部下大静脈血で増加を認め、肝から流出した好中球のフリーラジカル産生増加が示唆された。同時に門脈血流量、肝組織血流量の低下および肝組織CuZn-SOD,Mn-SODの減少を認め、またfluorescence videomicroscopyで観察すると、白血球の血管内皮への膠着が見られた。一方、肝阻血中に門脈よりIL-

1raを投与すると、上記の組織障害、フリーラジカル産生増加、白血球の膠着が抑制された。すなわち、阻血・再潅流時の組織障害機転として重要なフラーラジカル産生には、白血球膠着などの微小循環障害が関与し、IL-1はそのmediatorであり、IL-1raはその障害防止に有用であると考えられた。2)肝移植:fluorescence videomicroscopyで測定した肝内白血球血流速度および白血球膠着数とgraft survivalとは相関した。肝保存液にIL-1raを添加すると、白血球血流速度、膠着数は改善し、survival rateも向上した。また肝移植後にPGE1を投与すると血流速度は増加し、微小循環の改善がみられた。すなわち移植肝のviabilityは微小循環と密接な関連を有しており、IL-1raやPGE1は微小循環を改善させ、PGNの予防に有用であることが示唆された。昨年度に引き続いて肝阻血・下大静脈クランプモデルを用いて、肝虚血・再灌流による肝臓および胃の組織障害とフリーラジカル産生および微小循環との関連についての検討を進めた。とくに今年度はスーパーオキサイド発生の基質となりうるCoQ10アニオンラジカルおよびスカベンジャーであるsuperoxide dismutase(SOD)の肝臓および胃における組織内動態を測定した。電子スピン共鳴装置を用いて測定したCoQ10アニオンラジカルは再灌流後に肝、胃のいずれにおいても阻血中に低下し、再灌流後上昇する傾向を認め、スーパーオキサイドの発生と平行することが示唆された。ラジオイムノアッセイ法による肝組織CuZnSOD、MnSOD活性の測定では、虚血前に比べ再灌流後3時間まで両者ともに減少したが、前者が再灌流1、2日後も減少を示したのに対し、後者は虚血前よりも増加を示した。前者は主としてcytosolに存在し、後者はミトコンドリアに存在するが、これらの減少は細胞からの逸脱、増加はinductionと考えられ、両者のinductionの様式には差があると推察された。肝移植実験ではPGE1投与がgraft viavilityに与える効果について、トランジットタイム血統計により測定した動・門脈血行動態および蛍光顕微鏡ビデオモニターを用いた微小循環動態の面より検討した。PGE1門脈内投与により肝動脈血統量は有意に増加し、また蛍光ラベルした白血球の類洞内血流速度、膠着数は著明に改善し、graft survival rateも向上した。すなわちPGE1は移植肝の微小循環を改善し、viabilityを向上させ、primarygraft nonfunctionの予防に有用であることが示唆された。
レトロトランスポゾンがもたらす非コードＤＮＡ領域のクロマチン構造変化

レトロトランスポゾンの新規転移をゼブラフィッシュ生体内で人工的に誘導できる実験系を開発した。本実験系を用いて、生体内で新規転移したレトロトランスポゾンの転写が抑制されていないことを発見した。内生の変異原であるレトロトランスポゾンは、その転写および転移が高度に抑制されていると考えられていたが、本発見はこれまでの考えを覆す成果である。更に、新規転移したレトロトランスポゾンDNAの低メチル化状態および転写の活性化が、ゼブラフィッシュの世代を超えて引き継がれることを発見した。ゼブラフィッシュのゲノム中には数十種類の転移因子(LINE)配列が存在する。これらの転移因子は、それぞれのコピー数が数個から数十個のものが多く、多いものでも数百コピー程度である。この少ないコピー数は、転移因子のクロマチン構造解析に適している。また、これらの転移因子配列は、それらのコンセンサス配列に非常によく似たグループ(ごく最近に増幅した配列である)と、コンセンサス配列とかなり異なるグループ(以前に増幅した配列である)が存在する。これを利用して、転移因子の増幅時期と、クロマチン構造に及ぼす影響の解析が可能となる。本年度は、これらゼブラフィッシュのゲノム中に存在する転移因子が宿主ゲノムのクロマチン構造に及ぼす変化を解析することを目的とし、ゼブラフィッシュ転移因子のクロマチン構造を解析するため解析系をゼブラフィッシュの培養細胞を用いて構築した。この解析系を用いて、培養細胞内での転移因子のクロマチン状態を解析して、ごく最近転移した転移因子グループは、大部分が抑制性のクロマチン状態を保持していることを明らかにした。しかし一方で、抑制性のクロマチン構造をしていないであろうグループの転移因子も存在することが示唆された。今後、これらの違いが何によってもたらされているのか解明を目指す。転移因子の発現は様々なストレスと関与していることが指摘されている。したがって、様々なストレスが転移因子のクロマチン構造変化に影響を及ぼす可能性がある。本年は上記の解析系を用いて、熱ストレスとクロマチン構造変化の解析を行った。その結果、本研究の培養細胞においては、熱ストレスでクロマチン構造の変化が引き起こされる結果は観察されなかった。次年度は、その他のストレスに関する解析を行う計画である。レトロトランスポゾンは自身のRNA配列を逆転写反応でコピーし宿主ゲノムに挿入することでそのコピー数を増幅する寄生性の配列である。レトロトランスポゾンの転移・増幅は、宿主ゲノムの立場に立てば挿入変異である。すなわちレトロトランスポゾンは、内生のゲノム変異原である。そのような危険な存在であるにもかかわらず、転移因子はほぼすべての真核生物のゲノム中に存在し、宿主生物ゲノムと共に存在している。加えて、高等真核生物ゲノムにおいては、そのかなりの領域(たとえば哺乳類においてはその約半分)がレトロトランスポゾンで構成されている。我々は、これらレトロトランスポゾンが宿主ゲノムの遺伝子発現制御やその成り立ちにどのような影響を及ぼしているのか明らかにすることを目的としている。本年度は、これまでに構築した、ゼブラフィッシュ生体内でのレトロトランスポゾン新規転移検出系を用い、新規転移LINE配列のヒストン修飾がどのようなものであるか、また、DNAのメチル化状態がどのようなものであるのかに着目し解析を行った。その結果、抑制性のヒストン修飾は、配列の新規転移とともに(あるいは直後)に導入されるのに対して、DNAメチル化はすぐには導入されないことを明らかにした。このことは、レトロトランスポゾンの転移抑制がまずヒストン修飾を介したクロマチン構造によってなされ、それがDNAメチル化で強化されることを示しているのかもしれない。現在、これらのエピジェネティック情報が発生時期あるいは世代を超えてどのように受け継がれるのかに着目して解析中である。レトロトランスポゾンは自身RNA配列を逆転写反応でコピーし宿主ゲノムに挿入することでそのコピー数を増幅する寄生性のDNA配列である。このような危険な存在であるにもかかわらず、レトロトランスポゾンはほぼすべての真核生物のゲノム中に存在し、宿主生物ゲノムと共に存在している。加えて高等真核生物においては、そのかなりの領域(例えば哺乳類ではその約半分)がレトロトランスポゾンで構成されている。我々は、このレトロトランスポゾンが宿主ゲノムの遺伝子発現制御やその成り立ちにどのような影響を及ぼしているのか明らかにすることを目的にしている。本年度は、ゼブラフィッシュ生体内でのLINEレトロトランスポゾンの新規転移配列のエピゲノム情報を、新規転移の起こった世代(F0世代)からその子世代(F1)にわたって解析した。その結果、新規転移LINEのDNA配列のCpGメチル化は、そのプロモーター領域で起こらないこと、このCpGの非メチル化はF1世代へ引き継がれること、を見出した。これと一致して、新規転移LINEのプロモーター領域のヒストン修飾は、新規転移LINEからの転写がオンの状態であり、その状態がF1世代へも引き継がれることを示すパターンであった。一方、内生LINEのプロモーター領域のDNAのCpGは高度にメチル化されており、LINE転写が抑制されていることが示唆される。ほぼ同一配列であるにもかかわらず、内生LINEと新規転移LINEのエピゲノム情報が異なることは非常に興味深い。来年度は、このエピゲノム情報の違いを生み出す分子メカニズムの解明を目指す。

すなわちレトロトランスポゾンは、内生のゲノム変異原である。このように危険な存在であるにもかかわらず、レトロトランスポゾンはほぼすべての真核生物のゲノム中に存在し、宿主ゲノムと共に存在している。加えて高等真核生物においては、そのかなりの領域(例えば哺乳類ではその約半分)がレトロトランスポゾンで構成されている。我々は、このレトロトランスポゾンが宿主ゲノムの遺伝子発現制御やその成り立ちにどのような影響を及ぼしているのか明らかにすることを目的にしている。本年度は、ゼブラフィッシュ受精卵のゲノムDNA中に人工転移させたレトロトランスポゾン配列のエピゲノム情報を世代を超えて解析した。その結果、新規転移したレトロトランスポゾン配列が抑制性のエピゲノム修飾を受けないことを発見した。これは、内生に既に存在するレトロトランスポゾンがエピゲノム修飾により抑制されているのとは対照的である。我々は、この新規転移レトロトランスポゾンの転写活性化状態が、世代を超えて、子および孫世代に伝わること、この転写活性化には、自身配列のプロモーター領域配列が必須であることを見出した。また、内生レトロトランスポゾンの転写が、ある特定の組織で高くなる現象も発見した。これらの知見は、レトロトランスポゾンが宿主ゲノムの発現制御に及ぼす影響を解析する上で有用である。レトロトランスポゾンの新規転移をゼブラフィッシュ生体内で人工的に誘導できる実験系を開発した。本実験系を用いて、生体内で新規転移したレトロトランスポゾンの転写が抑制されていないことを発見した。内生の変異原であるレトロトランスポゾンは、その転写および転移が高度に抑制されていると考えられていたが、本発見はこれまでの考えを覆す成果である。更に、新規転移したレトロトランスポゾンDNAの低メチル化状態および転写の活性化が、ゼブラフィッシュの世代を超えて引き継がれることを発見した。レトロトランスポゾンは自身のRNA配列を逆転写反応でコピーし宿主ゲノムに挿入することでそのコピー数を増幅する寄生性の配列である。レトロトランスポゾンの転移・増幅は、宿主ゲノムの立場に立てば挿入変異である。そのような危険な存在であるにもかかわらず、転移因子はほぼすべての真核生物のゲノム中に存在し、宿主生物ゲノムと共に存在している。加えて、高等真核生物ゲノムにおいては、そのかなりの領域(たとえば哺乳類においてはその約半分)がレトロトランスポゾンで構成されている。我々は、これらレトロトランスポゾンが宿主ゲノムの遺伝子発現制御やその成り立ちにどのような影響を及ぼしているのか明らかにすることを目的としている。これまで、レトロトランスポゾンの一種LINE(哺乳類の主要なレトロトランスポゾン)の生体内での転移・増幅の解析系はほぼ存在していなかった。
超安定、迅速反応性MRIおよびアルファ線核医学治療用キレート剤の開発

本研究では、MRIで使用されているガドリニウム及びアルファ線核医学治療研究で用いられているアクチニウムのキレート剤であるDOTAを超える安定性と迅速反応性をもつ超安定キレート剤を開発する。迅速反応性の獲得のためにキレートの構造に部分的に剛直な部分を取り入れつつ、柔軟にフィット出来る部位も取り入れたキレート剤を合成する。また、超安定性獲得のためにキレート内に金属イオンを閉じ込める工夫をする。錯形成反応の反応速度の決定、得られたガドリニウムおよびアクチニウム化合物の安定性を評価する。
膝前十字靱帯断裂後の自然治癒機構の解明とその臨床応用

ラットを対象の関節包外関節制動モデルを用いてACLの自然治癒を力学、組織学、免疫組織学的に観察し、靱帯の連続性、コラーゲンの発現、力学的強度変化を検討した。すべてのラットでACLが治癒し、連続性が確認された。切断8週後、治癒靱帯にコラーゲンType IIIの増加が認められた。ACL切断8週後および40週後の靭帯強度は正常靱帯の約半分であった。また,靭帯治癒炎症期におけるタンパク質分解酵素の変化について検討した. ACL切断による細胞外マトリクスやコラーゲン分解に関与する酵素、MMP-1, MMP-13、拮抗作用を持つTIMP-1の発現を観察した。関節非制動群はACL切断直後より半月におけるMMP-13の発現が高かったが、関節制動群では発現が抑制されていた。ACL切断による荷重下の異常な関節運動がタンパク質分解酵素を発現させ、靱帯の治癒を抑制させる可能性が示唆された。前十字靭帯損傷(以下ACL)はスポーツ損傷の中で発生頻度が高く、保存療法では靭帯の治癒は起こらないと考えられてきた。ヒトを対象とした保存療法の報告は少なく、ACLの治癒はほとんど考えられていない。井原らとの研究において,特殊な装具による関節制動により損傷したACLが治癒することを報告し、ACL再生の可能性が示唆された。本研究では、膝関節制動を制動することにより断裂ACLがどのように変化するかを研究するための動物実験モデルを考案し、靭帯再生について観察することであった。膝関節制動モデルとして、膝蓋腱貫通モデル、下腿前方筋貫通モデル、大腿骨後方-脛骨前方モデル、大腿骨前方-脛骨前方モデルの計4方法を考案し、8週齢と30週齢ラットのオスを対象とした。ACL切断から8週間後の断裂ACLの変化と差異について比較した。結果、8週齢のラットでは膝関節内に廠痕組織・嚢胞形成・膝関節の変形性関節症所見がみられ、一部のラットでは人工靱帯が関節内に侵入していた。成長に伴う膝関節の膨大化により、人工靱帯に過剰なテンションが発生し、張力に耐えられず関節内に人工靱帯が侵入したと考えられる。30週齢で脛骨面に人工靱帯を固定した大腿骨後方-脛骨前方モデル、大腿骨前方-脛骨前方モデルでは比較的良好なACL様の軟部組織の増殖が認められた。大腿骨後方-脛骨前方モデルでは3例全てに脛骨前方引き出しが制動され、ACLの再生治癒の可能性が示唆された。1匹に軽度の伸展制限と軽度の変形性関節症所見(瘢痕化組織の増加)を認めたものの,他の2匹に関しては伸展制限・変形性関節症所見ともに認めなかった。一方、大腿骨後方-脛骨前方モデルでは同じく顆間窩に瘢痕組織が充満し、一部線維性組織が肉眼的に観察されたが、関節の動揺が認められた。正常な関節運動を繰り返すことで靭帯治癒を促し、変形性膝関節症を予防する可能性が示唆された。膝前十字靭帯損傷は発生頻度が高いスポーツ損傷で、手術を行わず自然治癒を期待する保存療法では靭帯の治癒は起こり難いと考えられている。しかし、これまでの臨床研究によって、正常な関節制動により靱帯が治癒する可能性が示された。我々はこれまでに、前十字靭帯切断に対する自然治癒の動物モデルを考案し、前十字靱帯の治癒の可能性を確認した。4種の保存療法モデルの中で、大腿骨後方の軟部組織を貫通させ、脛骨の中枢側前方の骨孔を開けてそこにナイロン糸を廻して関節制動をしたモデルの靱帯の治癒が優れていた。今回の研究はラットを用いて、治癒靱帯の強度およびコラーゲン組成について検討することを目的とした。結果は、8週後および40週後にすべての前十字靱帯の連続性が肉眼的に認められた。ACL切断8週後および40週後の治癒靭帯の強度は、正常靱帯がそれぞれ2。8±2。9N(平均±標準偏差)、24。2±4。0Nに対して、10。2±4。2N、11。2±4。2N(p<0。01)で、約半分の強度であった。組織学的には連続した靱帯が認められたが、靱帯の径は大きく、顆間窩に瘢痕組織が増殖していた。8週後と40週後の靱帯強度に差が認められなかったことより、靱帯強度は8週以前にはほぼ決定していることが示唆された。

正常に近い関節運動は損傷した靭帯の治癒を促し、変形性膝関節症を予防する可能性が認められたが、治癒靭帯は8週以内に強度が決定する可能性が示唆された。今回の研究結果により靱帯修復過程の解明と靱帯強度を高める方法の検索が新たな課題となった。膝前十字靭帯(ACL)損傷は発生頻度が高いスポーツ損傷で、手術を行わず自然治癒を期待する保存療法では靭帯の治癒は起こり憎いと考えられている。しかし、これまでの臨床研究によって、正常な関節制動により靱帯が治癒する可能性が示された。我々はACL切断に対する自然治癒の動物モデルを考案し、ACL治癒の可能性と治癒靭帯の強度について検討した。異常運動を制動し、自然飼育することにより、ACLの治癒が促進され、正常強度の4050%であることを明らかにした。本研究の目的は、新たな靭帯損傷モデルを考案すること、およびACL治癒要因の解明のひとつとして、損傷ACLの早期の関節制動の有無によるタンパク質分解酵素の動態を明らかにすることであった。結果は、ACLの組織像として関節制動群、非制動群ともに術後5日の時点でACLの断端が確認され、連続性は共に認められなかった。リアルタイムPCR法によるmRNA発現量は非制動群が1、3、5日と時間経過とともにMMP-L13mRNA発現量が増加し、関節制動群に比べて有意に発現量の増加が認められた(ρ<0.05)。TIMP-1 mRNA発現量は関節制動群と非制動群共に全ての時期にて有意な増加は認められなかった。本研究結果より、損傷直後、損傷ACLおよび関節内組織から発現するMMP-13のmRNAを関節制動により抑制させることが明らかになった。非制動群では、関節内組織の協調的なMMP-13mRNA発現が増加し、拮抗的に作用するTIMP-1 mRNA発現量が少ないことによりACLを退縮・消失させ、同時に二次的に発生する変形性関節症の誘因となることが示唆された。関節制動はACL損傷により発生する細胞外マトリクスやコラーゲンの分解や吸収を抑制する可能性が考えられ、損傷ACLの保存的治癒に繋がることが示唆された。
正則アソシエーション・スキームの表現の研究

有限群のある種の一般化であるアソシエーション・スキームの中でも,有限群に近い性質を持つ正則アソシエーション・スキームを調査することが研究の目的である.昨年度は,一つの正則元によって生成される閉部分集合を研究し,その応用として,有限群の指標理論においてよく知られているBurnsideの定理の正則アソシエーション・スキームへの拡張を得た.この結果を,第35回代数的組合せ論シンポジウムにて報告し,論文を投稿中である.有限群の場合に,Burnsideの定理の応用としてBrauer-Wielandt-Haradaの定理が得られるので,その類似として,Brauer-Wielandt-Haradaの定理を群的な正則アソシエーション・スキームに拡張することができた.この結果は投稿準備中である.また,正則アソシエーション・スキームはresidually thinであるかという問題に関連して,アソシエーション・スキームの関係全体の集合のある部分集合列を定義し,その列が関係全体に達することとそのアソシエーション・スキームがresidually thinであることとの関係を考察した.特に,この集合列が関係全体に達しているとき,この列を構成している集合がすべて閉部分集合であるならば,そのアソシエーション・スキームはresidually thinとなることが分かった.この結果も投稿準備中である.年度当初の計画は少し停滞している.しかし,昨年度得られたBurnsideの定理の拡張の応用として,Brauer-Wielandt-Haradaの定理の拡張が得られた.また,計算機を用いた調査から,residually thinなアソシエーション・スキームに関する研究に進展があった.昨年度からの継続として,(1)位数が3つの素数の積である正則アソシエーション・スキームの決定(2)正則アソシエーション・スキームの複素指標の重複度の研究に加え,(3)Wedge積と高次指標との関係の研究を行う予定である.アソシエーション・スキームは有限群のある種の一般化として考えられる.本研究では,そのようなアソシエーション・スキームの中でも,有限群に近い性質を持つ正則アソシエーション・スキームを調査する.有限群やホップ代数では,高次フロベニウスーシューア指標や高次指標が研究されているが,アソシエーション・スキームにおいては,Higmanによる2次フロベニウスーシューア指標や2次指標の研究にとどまっていた.これらの研究をもとに,アソシエーション・スキームに対する高次フロベニウスーシューア指標や高次指標を定義した.研究実施計画の通りに,正則アソシエーション・スキームの高次指標による特徴付けに関する結果が得られた.一つの正則元によって生成される閉部分集合の研究により,正則元のgirthはそのアソシエーション・スキームの位数を割ること,また正則アソシエーション・スキームのexponentはその位数を割ることが分かった.この応用として,有限群の指標理論において,2次以上の既約指標は必ずその値が0になる元が存在するというBurnsideの定理が知られているが,この定理の正則アソシエーション・スキームへの拡張が得られた.実施計画のうち,正則アソシエーション・スキームの高次指標による特徴付けについて結果が得られた.また,31年度に予定していたBurnsideの定理の正則アソシエーション・スキームへの拡張,正則アソシエーション・スキームのexponentはその位数を割ることなどが得られた.有限群のある種の一般化であるアソシエーション・スキームの中でも,有限群に近い性質を持つ正則アソシエーション・スキームを調査することが研究の目的である.昨年度は,一つの正則元によって生成される閉部分集合を研究し,その応用として,有限群の指標理論においてよく知られているBurnsideの定理の正則アソシエーション・スキームへの拡張を得た.この結果を,第35回代数的組合せ論シンポジウムにて報告し,論文を投稿中である.有限群の場合に,Burnsideの定理の応用としてBrauer-Wielandt-Haradaの定理が得られるので,その類似として,Brauer-Wielandt-Haradaの定理を群的な正則アソシエーション・スキームに拡張することができた.この結果は投稿準備中である.また,正則アソシエーション・スキームはresidually thinであるかという問題に関連して,アソシエーション・スキームの関係全体の集合のある部分集合列を定義し,その列が関係全体に達することとそのアソシエーション・スキームがresidually thinであることとの関係を考察した.特に,この集合列が関係全体に達しているとき,この列を構成している集合がすべて閉部分集合であるならば,そのアソシエーション・スキームはresidually thinとなることが分かった.この結果も投稿準備中である.年度当初の計画は少し停滞している.しかし,昨年度得られたBurnsideの定理の拡張の応用として,Brauer-Wielandt-Haradaの定理の拡張が得られた.また,計算機を用いた調査から,residually thinなアソシエーション・スキームに関する研究に進展があった.今後の研究として,(1)位数が3つの素数の積である正則アソシエーション・スキームの決定(2)正則アソシエーション・スキームの複素指標の重複度の研究を行う予定である.また,引き続き,ベキ零群や可解群に関する結果の正則アソシエーション・スキームへの拡張の調査を計算機を用いて行う予定である.昨年度からの継続として,(1)位数が3つの素数の積である正則アソシエーション・スキームの決定(2)正則アソシエーション・スキームの複素指標の重複度の研究に加え,(3)Wedge積と高次指標との関係の研究を行う予定である.研究打合せの日程が調整ができなかったため,次年度使用額が生じた.
変形性粒子を含む混合土の力学特性に関する実験的研究

本研究では,変形性粒子として廃棄発泡プラスチック破砕片を用いた混合土を対象に,変形特性を中心とした基本的な力学特性について検討した.具体的には,まず,一次元圧密試験によって得られた結果をもとに,土粒子骨格中に変形性粒子が含まれた際の一次元圧縮メカニズムの相違について検討した.その結果,混合土としての圧縮には通常の骨格変形による体積変化に,変形性粒子の圧縮に起因する成分が新たに付加されることがわかった.また,この成分はさらに,変形性粒子自身の圧縮と,これによって引き起こされる骨格のさらなる変形による体積変化とに分類できる可能性も見えてきた.よって,X線CTを用いて混合土の圧縮状態を微視的に観測し,変形性粒子自身の変形量を求めて圧縮のメカニズムを検討したところ,このような分類が妥当であることが定量的に確認された.また,これらの検討と並行して二重セルを用いた三軸圧縮試験も行い,混合土の圧縮ひずみを破砕片粒子自身の圧縮によるものと間隙部分の体積変化によるものとに分離して計測することを試みた.しかしながら,破砕片粒子表面の空隙に入り込んだ水分の扱いが難しく,残念ながらそれぞれの成分を明確に分離して計測することはできなかった.従って,最終年度の後半には,この破砕片を用いた軽量混合土の実用化を考えていく際に必要となるクリープ特性や透水性・保水性といった土壌物理特性についての実験を行い,検討を加えた.その結果,クリープ特性については混合土の二次圧密量がほぼ破砕片の混合割合に比例して発現することが明らかになった.また,土壌物理特性については透水試験や保水性試験を行って実験結果を検討した結果,土にこの破砕片を混合することにより軽量化の効果に加えて透水性や保水性を改善させる効果も有することが明らかになった.本研究では,変形性粒子として廃棄発泡プラスチック破砕片を用いた混合土を対象に,変形特性を中心とした基本的な力学特性について検討した.具体的には,まず,一次元圧密試験によって得られた結果をもとに,土粒子骨格中に変形性粒子が含まれた際の一次元圧縮メカニズムの相違について検討した.その結果,混合土としての圧縮には通常の骨格変形による体積変化に,変形性粒子の圧縮に起因する成分が新たに付加されることがわかった.また,この成分はさらに,変形性粒子自身の圧縮と,これによって引き起こされる骨格のさらなる変形による体積変化とに分類できる可能性も見えてきた.よって,X線CTを用いて混合土の圧縮状態を微視的に観測し,変形性粒子自身の変形量を求めて圧縮のメカニズムを検討したところ,このような分類が妥当であることが定量的に確認された.また,これらの検討と並行して二重セルを用いた三軸圧縮試験も行い,混合土の圧縮ひずみを破砕片粒子自身の圧縮によるものと間隙部分の体積変化によるものとに分離して計測することを試みた.しかしながら,破砕片粒子表面の空隙に入り込んだ水分の扱いが難しく,残念ながらそれぞれの成分を明確に分離して計測することはできなかった.従って,最終年度の後半には,この破砕片を用いた軽量混合土の実用化を考えていく際に必要となるクリープ特性や透水性・保水性といった土壌物理特性についての実験を行い,検討を加えた.その結果,クリープ特性については混合土の二次圧密量がほぼ破砕片の混合割合に比例して発現することが明らかになった.また,土壌物理特性については透水試験や保水性試験を行って実験結果を検討した結果,土にこの破砕片を混合することにより軽量化の効果に加えて透水性や保水性を改善させる効果も有することが明らかになった.本年度は,まず,供試体の体積変化を直接測定できるよう,用いる三軸試験システムの改良を行った.二重セルの製作や計測・制御プログラムの作成に多少時間がかかったが,意図するシステムが構築できたので,このシステムの性能評価も兼ねて土のみの供試体を用いた圧密排水三軸試験を行った.その結果,二重セルと差圧計を用いた体積変化の測定精度にやや不安は残ったものの,ほぼ期待どおりの性能を有することが確認できた.従って,まずは土粒子と変形性粒子である発泡プラスチック破砕片を1:1で混合した供試体を作製し,圧密排水三軸試験を行って供試体全体の体積変化量と排水量を個別に計測しながらデータの収集を行った.現時点までに得られている結果を見ると,予想以上に発泡プラスチック破砕片の圧縮量が大きくなっているように感じられるが,この原因が対象とする混合土の本質的なものか試験システムの精度によるものかを検討しているところである.また,デジタルカメラを用いた画像撮影・解析については,細かい粒子を含んでいる上に個々の粒子の圧縮量も比較的小さく,現段階では定量的な評価には結びついていないが,次年度さらに検討を進める予定である.なお,本年度は,幸運にもX線CTによって混合土の内部構造を撮影できる機会を得たため,圧縮による変形性粒子の体積変化量を画像解析によって定量的に評価することを試みた.これまでの研究で,混合土の圧縮は通常の骨格変形による体積変化と変形性粒子の圧縮に起因するさらなる体積変化に分類できる可能性を示してきたが,X線CT解析によりこれを定量的に裏付けることができた.

なお,X線CT解析の結果を中心に本年度の研究成果をとりまとめて国際会議の論文として投稿したところ,アブストラクト審査をパスして最終論文審査に付されることとなった(結果は平成16年6月に通知される予定).今年度も,廃棄発泡プラスチック破砕片混合土の変形特性についての検討を進めるため,引き続き二重セルを用いた三軸圧縮試験を行って破砕片粒子自身の圧縮が混合土全体の圧縮性に及ぼす影響を調べた.具体的には,破砕片混合比が異なる供試体をいくつか作製して拘束圧を変えた実験を繰り返し行い,得られた結果を詳細に検討した訳であるが,最終的には,破砕片粒子自身の圧縮量を定量的には評価できないことが判明した.その理由は,用いた破砕片粒子の表面に存在する微細な孔隙に予想以上に水分が入り込んだためである.従って,今年度の後半においては,この破砕片を用いた軽量混合土の実用化を考えていく際に必要となるクリープ(二次圧密)特性や透水性・保水性といった土壌物理特性についての実験を行い,検討を加えることとした.その結果,クリープ特性については混合土の二次圧密量がほぼ破砕片の混合割合に比例して発現することが明らかになり,変形性粒子のみの供試体についてそのクリープ特性を把握しておけば,混合比から混合土全体のクリープ特性が推定可能であることがわかった.また,土壌物理特性に関する検討については,透水試験や保水性試験を行って実験結果を検討した結果,土にこの破砕片を混合すると軽量化の効果に加えて透水性や保水性を改善させる効果も有することが明らかになった.これは,この破砕片を用いた軽量混合土が,軟弱地盤における排水改良や盛土などにおける軽量な植生基盤として利用可能であることを示すものとして重要である.以上のように,今年度は当初の研究目的から軌道修正した部分はあったものの,今後の研究に発展させられる重要な結果や成果が得られた.