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麻酔薬と心筋カリウムチャネルとの相互作用-麻酔時致死的不整脈および心筋虚血悪化の予防のために-

1制吐薬オンダンセトロンとメトクトプラミドのモルモット乳頭筋活動電位に及ぼす影響近年心筋活動電位第三相を形成する遅延整流カリウム電流の抑制がリエントリー型の不整脈に対して抗不整脈作用を発揮するのであるが、逆にその作用により致死的不整脈が誘発されることが明らかとなり注目されている。5-HT3受容体遮断薬であるオンダンセトロンとドパミン受容体遮断薬であるメトクトプラミドはいずれも術後の制吐剤として使用されるが、オンダンセトロンはイヌの心室筋細胞で遅延整流カリウム電流を抑制することが示されている。そこでモルモット乳頭筋の活動電位に対する両薬物の作用を検討した。その結果オンダンセトロン3uMおよび10uMは刺激頻度0.2,0.5,1.0,2.0Hzのいずれにおいても90%再分極における活動電位持続時間APD90を、濃度依存性に延長した。一方メトクトプラミド3uM、10uMは同様の刺激頻度において、APD50,APD90に対し明らかな延長作用は示さなかった。2炭酸水素ナトリウムのモルモット乳頭筋活動電位に及ぼす影響心肺蘇生時にはしばしば大量の炭酸水素ナトリウムが、代謝性アシドーシスの補正のために投与されるが、本科学研究費に基づく研究で、炭酸水素ナトリウムがモルモット乳頭筋のAPDの延長と静止膜電位の過分極を生じることが明らかになった。種々の薬物を用いた検討から、APDの延長にはナトリウムイオンの増加が、過分極には炭酸水素イオンの増加が関与していることが明らかになってきている。3冠動脈血流量に対する二酸化炭素分圧の影響冠動脈攣縮等による心筋虚血も麻酔中の致死的不整脈を誘発しうる。本研究ではモルモットLangendorff心を用いて、定圧潅流を行い冠潅流量を測定した。潅流液中の二酸化炭素分圧を40mmHgから80mmHgに上昇させると、血管内皮依存性に一酸化窒素の作用を介して潅流量が増加した。一方二酸化炭素分圧を20mmHgに低下させると、潅流量は約10%減少したが、一酸化窒素合成酵素阻害薬を前処置しておくと、その減少は増強された。平成8年度の設備備品費を用いて、心筋活動電位測定のための微小ガラス電極電位測定装置一式を完成させ、正常に作動することを確認した。近年心筋活動電位第三相を形成する遅延整流カリウム電流の抑制が一方では抗不整脈作用を発揮するが、他方では逆説的に致死的不整脈を誘発するために注目されている。またこの電流は一見心臓の電気生理とは関係のなさそうな種々の薬物によって抑制される。麻酔科領域では近年周術期の制吐薬として、5-ハイドロキシトリプタミン(セロトニン)3受容体遮断薬であるオンダンセトロンが使用されはじめた。この薬物はイヌの心室筋細胞を用いた実験で、やはり遅延整流カリウム電流を抑制することが報告されている(Br.J.Pharmacol.113:527-535)。周術期の制吐薬として従来から使用されている薬物にはドロペリドール、メトクトプラミドがあるが、ドロペリドールにも活動電位持続時間の延長作用があることが知られている。従ってこれらの薬物の、特に併用された場合の安全性については十分な検討が必要と考えられる。本研究では第一段階として、現在上記3種の薬剤が単独で心筋活動電位持続時間にどのような影響を与えるのかを検討している。モルモット乳頭筋を0.5Hzの頻度で電気刺激し、微小ガラス電極を心筋細胞内に刺入して活動電位を測定する。その結果メトクトプラミドには活動電位持続時間の延長作用は認められず、むしろ軽度短縮した。一方ドロペリドール3μMは活動電位持続時間を約15%延長した。またオンダンセトロン10μMは活動電位持続時間を約25%延長することがわかった。今後はさらに例数を増やすとともに、併用した場合にどのように変化するか、β-アドレナリン受容体刺激作用が加わった場合に、これらの薬物によって早期後脱分極が誘発されるかどうかについて検討を加えていく予定である。1)平成8年度にひき続き、三種類の制吐剤オンダンセトロン、ドロペリドール、メトクトプラミドのモルモット乳頭筋の活動電位に及ぼす影響について検討した。10μMドロペリドール、10μMメトクトプラミドは刺激頻度0.2,0.5,1Hzのいずれにおいても、20%再分極時間(APD20)、APD50、APD90を約10-20%延長した。これに対し10μMオンダンセトロンは0.2,0.5Hzの低頻度刺激ではAPD20、APD50、APD90を約30%延長したが、1Hzの刺激頻度ではAPD90は依然として40%延長したが、APD20、APD50における延長作用は消失した。致死的な心室性不整脈を生じることでしられている抗ヒスタミン薬テルフェナジン1μMは0.2HzではAPD20のみを約15%短縮したが、0.5,1HzではAPD20、APD50、APD90の全てを約15%短縮した。2)今年度新たに、高炭酸ガスのモルモット乳頭筋の活動電位に及ぼす影響について検討を開始した。灌流液の二酸化炭素分圧を40mmHgから80mmHgに上昇させると、APD20、APD50、APD90はいずれも約20%延長した。

また静止膜電位は5.2mV過分極した。この過分極は3μMウアバインあるいは1mMバリウムによって抑制された。一方APDの延長はI_<Kr>lの遮断薬であるE4031存在下でも認められた。また二酸化炭素分圧を40mmHgから80mmHgに上昇させると、バリウムによる自動能誘発作用が増強された。今後さらに心房筋の活動電位に対する高炭酸ガスの影響、また逆に二酸化炭素分圧を減少させたときの活動電位の変化、二酸化炭素分圧の変化と不整脈発生との関連について検討する。1制吐薬オンダンセトロンとメトクトプラミドのモルモット乳頭筋活動電位に及ぼす影響近年心筋活動電位第三相を形成する遅延整流カリウム電流の抑制がリエントリー型の不整脈に対して抗不整脈作用を発揮するのであるが、逆にその作用により致死的不整脈が誘発されることが明らかとなり注目されている。5-HT3受容体遮断薬であるオンダンセトロンとドパミン受容体遮断薬であるメトクトプラミドはいずれも術後の制吐剤として使用されるが、オンダンセトロンはイヌの心室筋細胞で遅延整流カリウム電流を抑制することが示されている。そこでモルモット乳頭筋の活動電位に対する両薬物の作用を検討した。その結果オンダンセトロン3uMおよび10uMは刺激頻度0.2,0.5,1.0,2.0Hzのいずれにおいても90%再分極における活動電位持続時間APD90を、濃度依存性に延長した。一方メトクトプラミド3uM、10uMは同様の刺激頻度において、APD50,APD90に対し明らかな延長作用は示さなかった。2炭酸水素ナトリウムのモルモット乳頭筋活動電位に及ぼす影響心肺蘇生時にはしばしば大量の炭酸水素ナトリウムが、代謝性アシドーシスの補正のために投与されるが、本科学研究費に基づく研究で、炭酸水素ナトリウムがモルモット乳頭筋のAPDの延長と静止膜電位の過分極を生じることが明らかになった。種々の薬物を用いた検討から、APDの延長にはナトリウムイオンの増加が、過分極には炭酸水素イオンの増加が関与していることが明らかになってきている。3冠動脈血流量に対する二酸化炭素分圧の影響冠動脈攣縮等による心筋虚血も麻酔中の致死的不整脈を誘発しうる。本研究ではモルモットLangendorff心を用いて、定圧潅流を行い冠潅流量を測定した。潅流液中の二酸化炭素分圧を40mmHgから80mmHgに上昇させると、血管内皮依存性に一酸化窒素の作用を介して潅流量が増加した。一方二酸化炭素分圧を20mmHgに低下させると、潅流量は約10%減少したが、一酸化窒素合成酵素阻害薬を前処置しておくと、その減少は増強された。
放射線化学療法におけるタキソテール併用時期に関する実験的研究

非小細胞肺癌に対するタキソテール同時併用放射線治療において重篤になりうる副作用として放射線肺炎が挙げられる。肺癌をふくめた胸部への放射線治療において放射線肺炎の重症度は照射線量、および照射される正常肺組織の体積に関連すると言われている。腫瘍の制御のためには照射線量を減らすことはできないため、重篤な放射線肺炎の危険を減らすためには照射される正常肺組織の体積を減らすのが理想である私たちはこのことを目的として"患者自身による吸気呼吸停止下の照射"を考案し、その精度を検証し、臨床への応用について検討した。対象となる患者20人にこの照射法の意義(重篤な放射線肺炎の危険を減らしながら、腫瘍に対し十分量の放射線照射を行う)を説明し、透視の画像を見せながら練習を行った。その後、患者自身による吸気呼吸停止下にてCTを3回撮像し、その際のずれを測定した。その結果年齢にほぼ関係無く照射法を理解・実行でき、その誤差は5mm以内であった。このことから"患者自身による吸気呼吸停止下の照射"の精度は許容範囲内であり、胸部放射線照射において有用であると考えられた。このことから私たちは胸部放射線照射の患者には原則として"患者自身による吸気呼吸停止下の照射"を施行している。また、吸気呼吸停止下の照射の導入による放射線肺炎のリスクの低下により、照射線量を増加できるとの考えから現在照射線量の増加についても検討中である。
アルキルシリルペルオキシドをアルキル化剤として利用する新規分子変換法の創出

現代の有機合成化学においてラジカル反応は幅広く用いられる分子変換法の一つである。その中の一つにジアルキルペルオキシドと金属触媒によりアルキルラジカルを発生させる手法がある。しかし、この手法には100度以上の高温が必要であり、また取り扱いなどの観点から、利用できるジアルキルペルオキシドや発生可能なアルキルラジカルの種類には限りがあった。このような背景の下、申請者は様々なアルキルラジカルの発生を可能にする新たなペルオキシドの開発とその利用法の確立を指向した研究を行っており、過酸構造の一方に炭素、もう一方にケイ素が結合したアルキルシリルペルオキシドが銅触媒存在下、5060度という温和な反応条件下でアルキルラジカル発生源となることを見出し、それを利用したアミドやアリールアミンのモノ-N-アルキル化反応の開発に成功していた。今回申請者はこのアルキルシリルペルオキシドと銅触媒を組み合わせた反応系において、触媒量のDMAPを追配位子として用いたり、溶媒としてアセトニトリルを用いることで室温下においてもアルキルラジカルが発生することを見出した。また、リモネンのような天然物からもコバルト触媒を用いた空気酸化によりアルキルシリルペルオキシドが合成できることも見出した。本手法はカルボン酸のエステル化反応にも適用可能であった。さらに申請者はアルキルシリルペルオキシドを用いた有機ホウ素化合物や有機ケイ素化合物の合成法の開発にも成功した。当初計画していたアルキルシリルペルオキシドと有機ケイ素化合物を用いたカップリング反応の開発には至らなかったものの、かねてより研究課題としていたアルキルシリルペルオキシドのライブラリー構築もコバルト触媒を使った空気酸化法を取り入れることで順調に進展している。さらに銅触媒存在下、アルキルシリルペルオキシドとジボロンを反応させることで、有機ホウ素化合物が得られることは既に見出していたが、ジボロンをシリルボランに変えることで有機ケイ素化合物が得られることも併せて見出した。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。今後はアルキルシリルペルオキシドと有機ホウ素化合物を組み合わせた更なる反応開発に取り組むと共に、アルキルシリルペルオキシドをアルキル化剤とするアルキル化反応がどのような反応に適用可能であるか検討を行っていく予定である。
14族元素を含む新規パイ共役高分子の開発

シロール(シラシクロペンタジエン)環は、環内のσ^*-π^*共役に起因した著しく低いLUMOレベル,すなわち,高い電子受容性をもつ特異なパイ電子系である.これまで,シロール環を基本構成単位とする種々のパイ電子系化合物の開発を行ってきた.特に,電子供与性のチオフェンとの組み合わせから成る2,5-ジチエルシロールおよびその共重合体は,特異な光学特性および高い電子輸送特性を有することを明らかにしている.本研究では,2,5位にチエニル基を有する一連の14族メタロール(シロール,ゲルモ-ル,スタンノール)の合成を行い,新規パイ共役高分子のモノマーユニットとしての可能性について検討した.本研究で得られた成果は以下のようにまとめられる.1.2,5-ジチエニルメタロールの合成チエニル基を末端に持つ1,6-ヘプタジイン誘導体とヒドロジシランとのニッケル触媒環化反応により2,5-ジチエニルシロールを,また,相当するジルコナシクロペンタジエンからのトランスメタル化により2,5-ジチエニルゲルモ-ルおよびスタンノール合成することに成功した.2.2,5-ジチエニルメタロールの結晶構造解析2,5-ジチエニルゲルモ-ルおよびスタンノールの結晶構造解析により,いずれの場合も,チオフェン-メタロール-チオフェンの3つの環は,高い共平面性を持つことが明らかになった.2,5-ジチエニルメタロールの光学特性および酸化還元特性得られたメタロールについて,紫外可視スペクトル,蛍光スペクトル,および酸化還元電位の測定を行った.いずれのメタロールも400nm付近および480nm付近に強い吸収および蛍光を有しており,これらの値は,類似した骨格を持つ1,4-ジチエニルブタジエン誘導体と比較して約30nmも長波長の値となっている.このことから,パイ電子構造に対して14族中心元素が大きく寄与していることがうかがえる.しかし,ケイ素,ゲルマニウム,およびスズの与える影響の差は小さいと言える.この結果と一致して,いずれのメタロールもほぼ同様の酸化還元特性を示した.シロール(シラシクロペンタジエン)環は、環内のσ^*-π^*共役に起因した著しく低いLUMOレベル,すなわち,高い電子受容性をもつ特異なパイ電子系である.これまで,シロール環を基本構成単位とする種々のパイ電子系化合物の開発を行ってきた.特に,電子供与性のチオフェンとの組み合わせから成る2,5-ジチエルシロールおよびその共重合体は,特異な光学特性および高い電子輸送特性を有することを明らかにしている.本研究では,2,5位にチエニル基を有する一連の14族メタロール(シロール,ゲルモ-ル,スタンノール)の合成を行い,新規パイ共役高分子のモノマーユニットとしての可能性について検討した.本研究で得られた成果は以下のようにまとめられる.1.2,5-ジチエニルメタロールの合成チエニル基を末端に持つ1,6-ヘプタジイン誘導体とヒドロジシランとのニッケル触媒環化反応により2,5-ジチエニルシロールを,また,相当するジルコナシクロペンタジエンからのトランスメタル化により2,5-ジチエニルゲルモ-ルおよびスタンノール合成することに成功した.2.2,5-ジチエニルメタロールの結晶構造解析2,5-ジチエニルゲルモ-ルおよびスタンノールの結晶構造解析により,いずれの場合も,チオフェン-メタロール-チオフェンの3つの環は,高い共平面性を持つことが明らかになった.2,5-ジチエニルメタロールの光学特性および酸化還元特性得られたメタロールについて,紫外可視スペクトル,蛍光スペクトル,および酸化還元電位の測定を行った.いずれのメタロールも400nm付近および480nm付近に強い吸収および蛍光を有しており,これらの値は,類似した骨格を持つ1,4-ジチエニルブタジエン誘導体と比較して約30nmも長波長の値となっている.このことから,パイ電子構造に対して14族中心元素が大きく寄与していることがうかがえる.しかし,ケイ素,ゲルマニウム,およびスズの与える影響の差は小さいと言える.この結果と一致して,いずれのメタロールもほぼ同様の酸化還元特性を示した.
腎症候性出血熱ウイルス感染の血清診断法と検査システムの確立に関する研究

1.バキュロウイルス発現ハンタウイルス組み換え核蛋白(Bac.HTN-NP)を用いたELISAとWestern blotting法による感度と特性を感染細胞を抗原とする従来のIFA法と比較・検討した。ラット、ヒト血清いずれにおいても感度はIFA法と同等であった。しかし、陰性血清におけるバックグランドの発色のレベルが比較的高く、発色の程度から肉眼判定するには問題点が残った。2.上記1.で明らかとなったバックグランド発色は、抗原の精製の不十分さが原因と考えられた。しかし、Bac.HTN-NPは、ELISA抗原として使用するための穏やかな条件下では可溶化されづらくこれ以上の精製が困難でることが判明した。そこで、次に、大腸菌中に同様のHTN-NPを発現させる系を構築した。この系では発現蛋白にビオチンが融合蛋白として結合しているためにアビジンを用いてcapture ELISAを確立した。3.本capture-ELISAの実験諸条件を検討し、至適抗原固相化時間ならびに抗原濃度を決定した。この条件下で本ELISAはIFAに比べ安全で同等の検出感度と特異性を有することが示され実験用ラット等を対象とする標準スクリーニングにも応用可能であると考えられた。4.Bac.HTN-NPをWestern blotting法に応用した場合、感度はラット血清、ヒト血清いずれにおいてもIFA法とほぼ同等であった。しかし、陰性血清群を用いた特異性の検討では、IFA法で非特異反応や紛らわしい蛍光像を示す検体でもWestern blotting法では非特異反応が全く認められなかった。すなわち、Western blotting法は、IFA法に比べ特異性が高いことが判明し、確定診断法として有用であると考えられた。5.今後、本法のキット化のための基礎的条件の決定が必要である。1.カイコ2,000匹にハンタウイルスの核蛋白遺伝子を挿入した組み換えバキュロウイルスを接種し、その体液(ヘモリンフ)を得た。そのヘモリンフ中には、診断用抗原として応用するに充分な量の組み換え抗原が存在していることをWestern blotting法によって確認した。これによって、組み換え抗原の大量発現が可能となった。2.ヘモリンフを低速遠心(5000xg30min)して得られる不溶性沈降画分に組み換え抗原の大部分が存在していることを明らかにした。さらに、この不溶性の性質を利用し、沈降画分をPBSで遠心洗浄することによってWestern blottingならびにELISA用抗原として使用可能なまでの部分精製が可能であることを明らかにした。3.組み換え抗原をELISAへ応用するために不可欠な可溶化の条件を検討し、0.1%SDS-Tris bufferと2%2ME処理2時間によって完全に溶解されることを確認した。さらに、その可溶化抗原を用いてELISAを実施したところ、10μg/ml蛋白濃度で使用可能であった。4.ヒトとラット血清における本診断法の感度・特異性を検討するために血清検体の収集を開始した。とくに、ヒト血清については、研究分担者の所属する国立予防衛生研究所の血清バンク保有のものを利用出来ることとなった。1.ハンタウイルス組み換え核蛋白をバキュロウイルスを発現ベクターとし、カイコ虫体内に発現させた。不溶性画分に主に存在する発現蛋白を、初年度までに開発した低速遠心法で分離・精製したあと、各研究分担者に供給し、ELISAとWestern blotting法による感度と特性をIFA法と比較・検討した。2.バキュロウイルス発現ハンタウイルス組み換え核蛋白(Bac.HTN-NP)を用いたELISAでは、ラット、ヒト血清いずれにおいても感度はIFA法と同等であった。

しかし、陰性血清におけるバックグランドの発色のレベルが比較的高く、発色の程度を肉眼判定するには問題点が残った。3.上記2.で明らかとなったバックグランド発色は、抗原の精製の不十分さが原因と考えられた。しかし、Bac.HTN-NPは、ELISA抗原として使用するための穏やかな条件下では可溶化されづらくこれ以上の精製が困難であった。そこで、次に、大腸菌中に同様のHTN-NPを発現させる系を構築した。この系では発現蛋白にビオチンが融合蛋白として結合しているためにアビジンを用いてcapture ELISAを確立した。現在、本法での感度・特異性を検討中である。4.Bac.HTN-NPをWestern blotting法に応用した場合、感度はラット血清、ヒト血清いずれにおいてもIFA法とほぼ同等であった。しかし、陰性血清群を用いた特異性の検討では、IFA法で非特異反応や紛らわしい蛍光像を示す検体でもWestern blotting法では非特異反応が全く認められなかった。すなわち、Western blotting法は、IFA法に比べ特異性が高いことが判明し、確定診断法として有用であると考えられた。これまでの研究で、大腸菌発現組み換え核蛋白を抗原とするcapture-ELISAがバキュロウイルス発現蛋白を抗原とする場合よりもはるかに非特異反応が軽減することが判明し、この抗原を用いた解析を継続している。本年度では以下の知見が得られた。1.大腸菌発現組み換え核蛋白を抗原としてcapture-ELISAへ応用する場合の実験諸条件を検討し、至適抗原固相化時間ならびに抗原濃度を決定した。2.抗体検出感度を検討するため、実験感染ラットの経過血清を用い、40倍希釈血清における本ELISAの抗体検出感度を間接蛍光抗体法(IFA)と比較した。その結果、ELISAでは感染後7日目(吸光度1.356)から抗体が検出出来、以後、実験終了時の28日目(吸光度2.187)まで検出された。この結果はIFAと一致した。3.抗体検出における特異性を検討するため非汚染施設由来ラット血清110検体の40倍希釈血清における組み換え抗原と抗原を発現していない大腸菌をコントロール抗原として反応性を検討した。その平均吸光値は組み換え抗原に対しては0.060±0.036、コントロール抗原に対する吸光値(0.056±0.039)とほぼ同程度の低い値を示した。また、IFAで判定が困難であったが中和試験およびウエスタンブロッティング法により陰性と判定されたラット血清25例においてELISAを実施したがいずれも陰性範囲の吸光度しか示さなかった。4.以上の成績により本ELISAはIFAに比べ安全で同等の検出感度と特異性を有することが示され実験用ラット等を対象とする標準スクリーニングにも応用可能であると考えられた。今後、本法のキット化のための基礎的条件の決定が必要である。
アデノウイルスEIA遺伝子によるアポトーシスの誘導とEIB遺伝子によるその抑制

デキサメタゾン(dex)投与で活性化するプロモーターにE1Aの12ScDNAをつないでヒト上皮様癌細胞株KBに導入し、dex投与でE1Aを発現しアポトーシス起こす細胞株MA1を樹立した。またMA1細胞にE1B19kまたはBcl-2を構成的に発現するプラスミドを導入してそれぞれの発現レベルが高い細胞と低い細胞株を樹立した。dex投与後いずれの細胞も12時間でE1Aの発現が最高レベルに達し、p53レベルは24時間で約10倍となった。MA1細胞では48時間後にアポトーシスの開始を始め、72時間後には90%以上が死滅したが、E1B19kまたはBcl-2の発現レベルが高い細胞株ではこの細胞死が強く抑制され、低い細胞株では細胞死の抑制が弱かった。これらの細胞を用い、アポトーシスにおける細胞核の異常凝縮に注目してDNAトポイソメラーゼ(Topo)I、IIα、IIβの量の変動を解析した。その結果、核マトリックス構成成分でG2/M期における娘染色体形成に必須のTopoIIαのみが生存率低下やDNA断片化に先行して減少することが分った。この減少はアポトーシスの抑制と同様にE1B19kやBcl-2の発現レベルに応じて抑制された。TopoIIαの減少機構をMA1細胞の抽出液(S10)とMA1細胞より抽出したTopoIIαを用いて解析した。TopoIIαはS10中でATPとユビキチン依存的に分解された。この分解活性はプロテアソーム阻害剤で抑制されたがICEの阻害剤では抑制されず、アポトーシスの誘導で上昇したがこの上昇はTopoIIα特異的ユビキチン化酵素の活性化によることが分った。以上より本研究で、TopoIIαがE1A誘導アポトーシス進行の決定に関わる標的因子として特異的ユビキチン化酵素の活性化により分解されることを示した。この他、E1B19kと結合する未知の因子B5のcDNAをアポトーシス誘導MA1細胞のcDNAライブラリーより単離した。現在その機能を解析中である。1.アポトーシスに伴う細胞核構造の変化の解析;dex投与によるE1A遺伝子の発現誘導後72時間で約90%がアポトーシスで死滅する細胞株MA1と、MA1由来細胞株でE1B19k発現レベルが高くアポトーシス誘導に強い抵抗性を持つMA1B17細胞株、発現レベルが低く弱い抵抗性を持つMA1B3細胞株を用いてアポトーシスに伴うクロマチンの異常凝縮との関連からDNAの高次構造を維持するトポイソメラーゼ(Topo)I、IIα、IIβの量的変動を解析した。その結果、(1)E1A誘導アポトーシスの潜伏期にTopoIIαが特異的に減少し、その減少に伴って細胞核の構造異常が誘導される(2)TopoIIαの減少はposttrans criptionalレベルで制御されている(3)その減少およびアポトーシスの誘導はE1B19kの発現レベルに相関して抑制される(Oncogene10,651-662(1995))ことが明らかとなった。これらの結果はE1A誘導アポトーシスにおける細胞内標的因子TopoIIαを初めて明らかにし、未解明のE1B19k蛋白質の機能を解析する上で重要な知見となるものである。

15EA02:2.アポトーシスの進行過程に関与する細胞核内因子(apo因子)の遺伝子単離;大腸菌で発現させたGSTとE1Aの1-86アミノ酸部分の融合蛋白質(GST-E1A_<1-86>)が、大腸菌で発現させたヒト転写制御因子IdやE12とニトロセルロース膜上で結合することを確認した。このGST-E1A_<1-86>をプローブとし、West-Western法により結合因子のcDNAを検索したが該当するクローンは得られなかった。そこで検索方法をTwo-hybrid system法に変更し、現在までにE1A_<1-86>と結合する因子のcDNAを数クローンを得た。その塩基配列等を解析するとともに新たなcDNAクローンを検索中である。(1)E1A誘導アポトーシスにおけるトポイソメラーゼ(topo)IIαの分解機構;免疫沈降により、または核マトリックスとして調製したtopoIIαを基質とし、アポトーシスを誘導したMA1細胞抽出液(S10)中での分解機構を解析した結果、以下のことが分かった(論文投稿中)。(1)TopoIIαはATPとユビキチン(Ub)依存性に分解される。(2)この分解活性は、S10を70,000xg,6時間遠心して上清(S70)と沈澱(プロテアソーム濃縮画分、P70)に分けると失われるが、再混合により回復する。(3)S10およびS70にはTopoIIαにUbおよびGST-Ub融合タンパクを重合して付加する活性が存在する。(4)TopoIIαにUbを付加するS10中の活性はアポトーシスの誘導により4倍以上上昇する。(5)TopoIIαのペプチド断片を用いた解析から、1198アミノ酸領域にUb付加部位が存在するが、効率的な分解にはTopoIIαのペプチド全長が必要である。この結果は、TopoIIαがUbタンパク分解系により分解されること、E1A誘導アポトーシスの過程でTopoIIαに対するUb付加酵素群が活性化しTopoIIαの分解が亢進することを示唆する。(2)E1B19k結合性細胞内タンパクのcDNA単離;Two-hybrid system法によりE1B19kと結合するタンパクのcDNAを、アポトーシス誘導後0,6,12,24,36および48時間のMA1細胞の混合より調製したcDNAライブラリーから検索した。その結果、すでにE1B19kとの結合が報告されているラミンA,C,Nip3,Bakとともに未知遺伝子B5のcDNAを単離した。B5のアミノ酸配列と結合特異性を解析した結果、(1)膜貫通領域を持つ、(2)膜貫通領域のアミノ酸配列がNip3と高い相同性をもつが、N末端領域では全く相同性がない、(3)E1B19kとの結合にはE1B19kのN末端側のdestruction boxを含む領域が必要である、(4)Bcl-2とは結合しないことが分かった。またデータベース検索の結果、B5は中枢神経系の構築に伴う細胞死が起こる幼児の脳で強く発現していることが分かった。
骨特異的新規分泌タンパクHA4の基礎研究および臨床応用

我々は骨形成因子の下流因子としてHA4を同定した。HA4ノックアウトマウスは生後の骨量の減少を認め、骨特異的にHA4を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは骨量の増加を認めた。このトランスジェニックマウスは卵巣摘出骨粗鬆症モデルマウスの骨量減少を抑制した。これらの結果よりHA4が生後骨量を調節する骨分泌タンパク質である事が明らかとなった。HA4をターゲットとした骨粗鬆症薬の開発のため、HA4受容体の探索も実施した。またHA4は血清中にも検出できることから、血清HA4値を測定し骨疾患の病態進行の指標をするためサンドウィッチELISAシステムを構築した。骨軟骨前駆細胞株ATDC5より骨形成因子BMPによって発現が誘導される新規遺伝子をサブトラクション法にてクローニングし、HA4と命名した(未発表)。インビトロ細胞株ではMC3T3-E1細胞およびATDC5細胞に発現がみられ、生後マウスの臓器では骨組織にのみ遺伝子の高発現がみられた。HA4の生体内での機能を明らかにするため、ES細胞での相同組み換え技術をもちいて遺伝子欠損マウスを作製した。HA4遺伝子欠損マウスの成長は野生型と変わりなく、外見上は明らかな異常はみられなかった。しかし、第4腰椎および脛骨をマイクロCTで精査したところ、遺伝子欠損マウスでは骨量の減少をみとめた。骨形態計測では、骨果幅の減少と骨芽細胞数の減少を認めた。次に2.3Kb骨特異的I型コラーゲンプロモーターにHA4 cDNAを繋げたトランスジーンを受精卵前核に打ち込み、骨特異的HA4過剰発現トランスジェニックマウスを作製した。このトランスジェニックマウスの成長は野生型と変わりなく、外見上は明らかな異常はみられなかった。しかし、第4腰椎および脛骨をマイクロCTで精査したところ、トランスジェニックマウスでは骨量の増加をみとめた。骨形態計測では、骨梁数、骨梁幅と骨芽細胞数の増加を認めた。遺伝子欠損マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離しBrdUのとりこみで細胞増殖を調べたところ、遺伝子欠損マウス由来の骨芽細胞の増殖が低下していた。しかし、アルカリフオスフアターゼ活性やアリザリンレッド染色による基質石灰化には有意な違いを認めなかった。以上の結果から、HA4は骨によって分泌され、骨芽細胞の増殖を介して骨形成を亢進させることによって骨量を増加させる分泌蛋白質であることが明らかとなった。よって、HA4は骨同化作用を持つ因子として、骨粗鬆症などの骨疾患の治療に寄与することが期待される。1)recombinantタンパクの作製ELISAシステムの確立のためのモノクローナル抗体作製のためrecombinant HA4タンパクを作製した。6xHisタグーHA4cDNAをpBACgusベクターに組み込み、このベクターを昆虫細胞(Sf9insect cell)に導入し、HA4タンパク発現バキュロウイルスを作製した。このバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞にHA4タンパクを発現させ培養上清を回収し、培養上清中に分泌された6xHisタグーHA4タンパクをTALONメタルアフィニティーレジンを用いてアフィニティー精製を施行。この方法により培養上清1Lあたり約500ugのrecombinantタンパクを得られた。2)モノクローナル抗体の作製バキュロウイルスによって作製したrecombinantタンパクを用いてマウスに免疫をした。今回はHA4ノックアウトマウスに免疫を行い、抗体産生細胞を脾臓より取り出し、in vitroでミエローマ細胞と融合さHATセレクションを行った。現在得られたハイブリドーマクローンの上清とrecombinantタンパクを用いたELISA法およびウエスタンブロットにより、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを実施してる。HA4 recombinantタンパク質を用いてマウスを免疫し脾臓を取り出し、脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合させハイブリドーマを作製し、HAT選択を施行した。20個のハイブリドーマの抗体産生能をその培養上清を採取しELISAで確認した後、ウエスタンブロット解析でrecombinantタンパクを検出できるかどうかでスクリーニングし、高い抗体産生能を認めた5個のハイブリドーマを限界希釈法でクローニングし、それぞれの抗体産生能を同様にウエスタンブロット法で確認した。5種類のモノクローナル抗体より2個ずつを選び、HA4 recombinantタンパク質を用いてサンドイッチELISAの予備実験を行った。一方の抗体をビオチン標識したのちサンドイッチELISAを行ったが、どの組み合わせにおいてもHA4 recombinantタンパク質の特異的検出感度が低く、実用に耐えるものではなかったため、市販のHA4(Cthrc 1と同一のタンパク質であった)ポリクローナル抗体とビオチン標識モノクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAを施行したところ、ng/mlオーダーの検出感度でHA4タンパク質を検出する事が可能であった。

現在、野生型マウス、HA4ノックアウトマウス(ネガティブコントロールとして)およびHA4トランスジェニックマウスの血清を採取し、血清中のHA4濃度を測定するための予備実験を実施しているところである。
キャリア形成のための外国語教育研究―動画制作を用いたフランス語教育

主体性・コミュニケーション能力・協調性など将来社会に出てから必要な能力を育む外国語教育を行う為に、2018年5月に東北大学において動画作成チームを結成した。これは文学部、経済学部、工学部、大学院工学研究科の学生から成る約30名のグループである。5月の連休明けより毎週金曜日の夕方に会合を持ち、探偵を主題としたフィクション短編映画をYouTubeにシリーズ化して発表することが決定された。その後、フランス語圏からの留学生の助けも借りながら日本語の脚本、脚本のフランス語への翻訳を行い、8月・9月の撮影・編集を経て、10月5日にシリーズ『わたしはだれだ?』の第一作「突然、もう一つの人生が始まる」を公開した。また、10月12日にはフランス留学局、キャンパスフランスのフランス留学フェアと連動させて映画出演者によるトークイベントを行い、多くの学生が参加してくれた。10月以降は第2作の制作に取り掛かり、12月までの脚本、冬休み期間中の撮影、2月の編集を経て2019年3月23日に第2作「クリスマスは何色だ?」を発表した。また、映画の主要メンバーが2019年2月に渡仏し、グルノーブル大学ヴァランスキャンパスにおいて映画製作にかかわる発表をフランス語で行った。成果として、現在まででシリーズ2作の視聴者数が7000人近くおり、動画制作プロジェクトを2015年に開始してからの合計視聴者数は53000人を超えた。またフランス大使館、アンスティチュフランセをはじめとする国内外の機関から注目を集め、SNS上でも情報を共有、拡散していただいた。東北大学からフランスに留学を希望する学生が大幅に増加するとともに、フランス語の履修者自体も増加し、本研究を実施した良い影響が学内外に見られ始めている。研究計画で示したように、年間2本の動画作品を完成させ、発表することを目標としてきたが、計画通りに実現できた。また、関西フランス語教授法研究会の発表のみならず、映像メディア英語学会での発表など他の外国語教育研究分野との意見交換も行うことができた。さらに、本研究においては学生の主体性を促すことを重視しているが、映画製作の中心メンバー2名が京都外国語大学において行われた「第50回全日本学生フランス語弁論大会」大会に出場し、優勝と準優勝をとるという快挙を成し遂げた。更に、同じく主要メンバーの4名が2019年2月に渡仏し、グルノーブル大学において動画制作の内容・方法・成果に関する研究発表をフランス語で行った。参加学生の多くが学部2年生で、フランス語学習歴が2年ほどであることを考えると、かなり大きな成果と言えるだろう。動画視聴者も現在のところ7000名を超え、予想以上の結果を得られていることから当初の計画以上に進展していると言える。本年度は東北大学高度教養教育・学生支援機構の英語教員と共に、学生による外国語短編映画祭を実施する予定で、全国の各大学の外国語教員に働きかけ、動画プロジェクトを全国規模に拡大していきたいと考えている。また、東北大学グローバルラーニングセンターのFL(ファカルティーレッド)という授業も開始する。これは8月ないし3月の授業が行われていない期間中に海外に2週間滞在し、そこで外国語による研修・授業を受けることによって単位が認定される制度である。本研究課題を発展させる為、研究代表者はスイス、ローザンヌ大学と提携を結び、スイスにおいてフィクションの短編映画を撮影する計画を実施することにした。具体的には2020年3月初旬からの2週間を利用して、事前に作成した脚本・ストーリーボードを元に撮影し、帰国後編集してから発表する予定である。尚、昨年から開始し、次回作が第3話になるフランス語による動画シリーズ『わたしはだれだ?』に関しては、参加学生の授業の関係で、全員が揃うことが難しくなってきた為、昼休みにランチミーティングを行うなど空き時間を有効活用して柔軟に対応していく。

研究計画で示したように、年間2本の動画作品を完成させ、発表することを目標としてきたが、計画通りに実現できた。また、関西フランス語教授法研究会の発表のみならず、映像メディア英語学会での発表など他の外国語教育研究分野との意見交換も行うことができた。さらに、本研究においては学生の主体性を促すことを重視しているが、映画製作の中心メンバー2名が京都外国語大学において行われた「第50回全日本学生フランス語弁論大会」大会に出場し、優勝と準優勝をとるという快挙を成し遂げた。更に、同じく主要メンバーの4名が2019年2月に渡仏し、グルノーブル大学において動画制作の内容・方法・成果に関する研究発表をフランス語で行った。参加学生の多くが学部2年生で、フランス語学習歴が2年ほどであることを考えると、かなり大きな成果と言えるだろう。動画視聴者も現在のところ7000名を超え、予想以上の結果を得られていることから当初の計画以上に進展していると言える。本年度は東北大学高度教養教育・学生支援機構の英語教員と共に、学生による外国語短編映画祭を実施する予定で、全国の各大学の外国語教員に働きかけ、動画プロジェクトを全国規模に拡大していきたいと考えている。また、東北大学グローバルラーニングセンターのFL(ファカルティーレッド)という授業も開始する。これは8月ないし3月の授業が行われていない期間中に海外に2週間滞在し、そこで外国語による研修・授業を受けることによって単位が認定される制度である。本研究課題を発展させる為、研究代表者はスイス、ローザンヌ大学と提携を結び、スイスにおいてフィクションの短編映画を撮影する計画を実施することにした。具体的には2020年3月初旬からの2週間を利用して、事前に作成した脚本・ストーリーボードを元に撮影し、帰国後編集してから発表する予定である。尚、昨年から開始し、次回作が第3話になるフランス語による動画シリーズ『わたしはだれだ?』に関しては、参加学生の授業の関係で、全員が揃うことが難しくなってきた為、昼休みにランチミーティングを行うなど空き時間を有効活用して柔軟に対応していく。
人力小規模金採掘が農水産物に与える水銀汚染の時空間的影響評価と対策手法

フィリピン、カマリネスノルテ州における小規模金採掘(ASGM)サイトで鉱石から金を取り出す際に使用されている水銀による環境汚染の実態を、山地に位置する発生源から海まで調査し、地元にリスク低減のための対策法を提言することを目的としている。今年度は、昨年度に引き続き、ホセパンガニバン市において金製錬所からの水銀汚染を、周辺・森林・流域・海に至るまで調査を行った。また、山火事の影響も調べた。製錬所周辺における土壌中水銀レベルは、バックグラウンド値よりも明らかに高く、その主な汚染源は、製錬所から揮発した水銀の大気由来の水銀、および、鉱石を処理する際の尾鉱に由来する懸濁態水銀の排出であることが示唆された。森林においても大気由来と考えられる高濃度の水銀が確認された。また、植物によって吸着・吸収された水銀がリターによって土壌への供給されることが確認された。森林土壌中の水銀の深度分布は、表層で高い傾向が見られ、これは有機物の存在と関連していることが示唆された。さらに、山火事により土壌およびリター中の水銀の損失が確認された。山火事による土壌の水銀形態の変化として、山火事により有機物結合態水銀の減少および水溶性・残渣中水銀の増加が確認された。このことから、山火事は水銀の動態に大きな影響を与えていることが明らかとなった。精錬所からの水銀は、灌漑水に運ばれ水田内に堆積すると共に田越し灌漑や上流の水田排水の下流水田における再利用などを通してこの地域の水田土壌に広く分布していることが推測された.さらに、河川輸送された水銀が、マンブラオ湾へと流入し、懸濁物質に吸着して拡散していること、その沈降により海底質の水銀濃度が上昇していることを明らかにした。湾岸域の水銀汚染の影響を受けた魚の摂取による健康被害が懸念されていた村において、漁業活動と資源利用、環境認識を明らかにした.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。人力小規模金採掘(Artisanal Small-Scale Gold Mining; ASGM)は、水銀に関して最大の人為起源の排出源であるが、ASGMから排出された水銀の環境中・人への拡散・影響について調べた研究は少ない。そこで本研究では、フィリピン・カマリネスノルテ州のLabo市とJose Panganiban市を対象に、ASGMから排出された水銀の環境および人への拡散・影響を明らかにすることを目的とした。2016年度はJose Panganiban市を中心に調査を行った。環境試料としては金の精錬作業所を中心に、植物試料と土壌試料を採取し、還元気化冷原子吸光光度法によって水銀濃度を定量した。また、人への汚染を調査するために現地の女性の毛髪試料を採取し、PIXEにより水銀を含む元素濃度を測定した。毛髪試料採取の際に、食生活に関するアンケート調査もおこなった。ASGMが行われている精錬所内では、土壌試料、植物試料ともに高濃度の水銀が検出されたため、水銀汚染が確認された。特に、シダ植物(Davallia sp.)で高い濃度(34 ppm)が検出された。しかしながら、それらの水銀濃度には試料間でのばらつきが大きく、水銀は精錬所内の環境中に偏在していることが示唆された。精錬所以外の地点では、比較的低い水銀濃度ではあるものの、いわゆる非汚染地の平均値よりは高い試料があり、ASGMを起源とする広域的な水銀汚染の可能性も否定できない結果であった。毛髪試料の水銀濃度の分析結果では、ASGMの有無による違いは見られなかったが、魚を食べる頻度・魚の入手方法による違いが認められた。このことから、人への水銀の影響としては、食生活による影響が大きいと考えられた。計画とおりに、ひとつの地域(Jose Panganiban市)において、環境中の試料の水銀濃度の測定と、毛髪試料の測定を実施することができ、水銀汚染の人への経路について、概ね推測することが可能であった。次年度以降での調査計画も順調に立案・実施できる状況である。2017年8月にCamarines Norte州のHose Panganiban市において調査を行った。Luklukan Surの製錬所回りの土壌のHg濃度を調べた結果、表層は非常に高いのに対し、50cm深まで浸透していな事例が多く、流出については、表層土壌に焦点をあてる必要があることが明らかとなった。また、精錬所周辺では、葉の大きい植物のHg濃度が高く、表面沈着の影響が大きいことが推測された。また、シアン化処理をおこなっているCyanide Stationの周辺ではHg濃度のばらつきが大きく、植物中濃度は低いことが明らかとなった。Hose Panganiban市の湾周辺における大気、土壌、水、懸濁物質中のHg濃度調査では、東海岸側が高いことが明らかとなり、市東部のバランガイにおける金精錬所からのHgの流入が大きいことが推察された。また、魚中のHg濃度は、最大値で4.46 mg kg-1であり、有機水銀の割合は約80%であった。一昨年の毛髪調査の結果で、女性の毛髪中のHg濃度が最も高かったサルバシオンでは、漁業依存性高く、魚食の頻度も高いことが明らかとなった。また漁場は、湾内だけでなく外洋にも広がっており、魚の汚染についての調査は広域的に行う必要があることが示唆された。

稲作は二期作であり、湧水の引き込みによる天水田がほとんどであることが明らかとなった。稲作では肥料・農薬使用しており、自家消費と売却の両方に出している。精錬所が多く地形的にも急峻なLuklukan Surでは、かつて稲作をおこなっていたようであるが、現在は労働は鉱業のほうに偏っており、休耕田となった場が存在することが明らかとなった。Camarines Norte州のHose Panganiban市では、当初の計画とおりに、女性の毛髪試料の分析結果から環境調査へ進展させており、ほぼ予定とおりに進んでいる。しかしながら、当初の計画書にあった雨季・乾季による違いを明らかにする調査は実施できていない。その原因として、調査における現地スタッフの人件費が予定よりもかなり高く、年に2回の現地調査ができない状況となったことが挙げられる。フィリピン、カマリネスノルテ州における小規模金採掘(ASGM)サイトで鉱石から金を取り出す際に使用されている水銀による環境汚染の実態を、山地に位置する発生源から海まで調査し、地元にリスク低減のための対策法を提言することを目的としている。今年度は、昨年度に引き続き、ホセパンガニバン市において金製錬所からの水銀汚染を、周辺・森林・流域・海に至るまで調査を行った。また、山火事の影響も調べた。製錬所周辺における土壌中水銀レベルは、バックグラウンド値よりも明らかに高く、その主な汚染源は、製錬所から揮発した水銀の大気由来の水銀、および、鉱石を処理する際の尾鉱に由来する懸濁態水銀の排出であることが示唆された。森林においても大気由来と考えられる高濃度の水銀が確認された。また、植物によって吸着・吸収された水銀がリターによって土壌への供給されることが確認された。森林土壌中の水銀の深度分布は、表層で高い傾向が見られ、これは有機物の存在と関連していることが示唆された。さらに、山火事により土壌およびリター中の水銀の損失が確認された。山火事による土壌の水銀形態の変化として、山火事により有機物結合態水銀の減少および水溶性・残渣中水銀の増加が確認された。このことから、山火事は水銀の動態に大きな影響を与えていることが明らかとなった。精錬所からの水銀は、灌漑水に運ばれ水田内に堆積すると共に田越し灌漑や上流の水田排水の下流水田における再利用などを通してこの地域の水田土壌に広く分布していることが推測された.さらに、河川輸送された水銀が、マンブラオ湾へと流入し、懸濁物質に吸着して拡散していること、その沈降により海底質の水銀濃度が上昇していることを明らかにした。湾岸域の水銀汚染の影響を受けた魚の摂取による健康被害が懸念されていた村において、漁業活動と資源利用、環境認識を明らかにした.2017年度は、Jose Panganiban市においてさらに詳細な水銀汚染の拡散ルートの調査を行う。Jose Panganiban市は湾に面しており、漁業が盛んなため、ASGMから河川を介して海までの汚染経路、さらに海産物の汚染の状況を明らかにし、Jose Panganiban市における水銀摂取低減のための方策についてまとめる。また、Labo市において、昨年と同様に予備調査と毛髪採取を行う。Labo市は農業が盛んな地区であるため、農産物の汚染に焦点を当てて調査する。
ニホンナシにおける属間交雑によるアポミクシス誘発に関する研究

ニホンナシ'二十世紀'とリンゴとの間で属間交雑を行うと低頻度であるがアポミクシス様実生の発生が報告されている.本年度は'二十世紀'と遺伝的背景がほぼ同じと考えられる'ゴールド二十世紀'を母本として,リンゴ'ふじ'との間で属間交雑を行い,実生へのRAPDマーカーの遺伝を指標としてアポミクシス実生の発生を明らかにした.ニホンナシ'ゴールド二十世紀'を母本として,リンゴ'ふじ'の貯蔵花粉を交配し,55粒のF_1種子を得た.これらのF_1種子を播種して,温室で育成し,生存状況とRAPDマーカーの遺伝を調査した.致死性を示した実生については枯死する前の子葉から,生存個体および交雑親については本案から,いずれも改変CTAB法によってDNAを抽出した.各々の個体について全DNAを鋳型として10種類の10塩基ランダムプライマーを用いてPCRを行った.55粒の属間交雑種子のうち53粒を播種したところ,2週間後には全ての種子が発芽した.播種してから約1ヶ月後にはこれらの約半数が致死した.さらに,播種してから約1年後の生存個体は1個体のみであった.対照としたニホンナシ'ゴールド二十世紀'放任受粉とリンゴ'つがる'放任受粉由来の実生では致死性は観察されなかった.致死した52個体の属間交雑実生のうち29個体について交雑親からのRAPDマーカーの遺伝を調査した結果,全ての致死実生において両親由来RAPDマーカーが47100%の確率で遺伝していた.これに対して致死せず生き残った1個体には,母本由来のRAPDマーカーだけが遺伝していた.以上の結果から,属間交雑実生のうち,致死した個体は両親のゲノムを合わせ持つ属間雑種であることが明らかになった.一方,生き残った個体は母本組織から単為発生したアポミクシス実生であると推察された.ニホンナシにおけるアポミクシス実生の発生は新規の発見である.今後は,アポミクシス実生の効率的な誘導方法を検討する予定である.ニホンナシを母本としてガンマ線を照射したリンゴ花粉を用いて属間交雑を行った結果,生存能力のある5個体の交雑実生を得ている.これらの交雑実生では母本由来のRAPDマーカーの遺伝しか確認されなかったことから,父本であるリンゴのゲノムが伝達していないアポミクシス由来の偽雑種である可能性が示唆された.そこで,交雑実生の雑種性を検討するための更なる情報を得るために,フローサイトメーターを用いてニホンナシとリンゴのゲノム当たりのDNA量と交雑実生のそれとを比較した.ニホンナシとリンゴの間で相対的DNA量を反映する蛍光量について比較したところ,リンゴはニホンナシの約1.35倍の蛍光量を持つことが明らかになった.従ってリンゴとニホンナシは蛍光量によって明確に分類することが可能であった.一方,ニホンナシとリンゴそれぞれに由来するゲノムを一つずつ持っているはずの属間交雑実生は交雑親の中間の蛍光量を示すと期待された.しかしながら,ガンマ線照射花粉を用いて得られた5個体の属間交雑実生はいずれもニホンナシとほぼ同じ蛍光量を示した.本手法により測定した蛍光量には試料間および反復間において高い再現性が得られているので,供試した5個体はいずれもニホンナシとほぼ同じDNA量であると推定された.この結果はRAPD分析による雑種性の検討結果を裏付けるものである.従ってこれら5個体は偽雑種であると考えられた.このような偽雑種はガンマ線照射花粉を用いた属間交雑において特異的に得られているのでニホンナシではまだ報告のないアポミクシス実生の可能性が高いと考えられた.次年度はGISH法を用いてゲノム構成を明確にすると同時に偽雑種の起源についても検討する予定である.ニホンナシ'二十世紀'とリンゴとの間で属間交雑を行うと低頻度であるがアポミクシス様実生の発生が報告されている.本年度は'二十世紀'と遺伝的背景がほぼ同じと考えられる'ゴールド二十世紀'を母本として,リンゴ'ふじ'との間で属間交雑を行い,実生へのRAPDマーカーの遺伝を指標としてアポミクシス実生の発生を明らかにした.ニホンナシ'ゴールド二十世紀'を母本として,リンゴ'ふじ'の貯蔵花粉を交配し,55粒のF_1種子を得た.これらのF_1種子を播種して,温室で育成し,生存状況とRAPDマーカーの遺伝を調査した.致死性を示した実生については枯死する前の子葉から,生存個体および交雑親については本案から,いずれも改変CTAB法によってDNAを抽出した.各々の個体について全DNAを鋳型として10種類の10塩基ランダムプライマーを用いてPCRを行った.55粒の属間交雑種子のうち53粒を播種したところ,2週間後には全ての種子が発芽した.播種してから約1ヶ月後にはこれらの約半数が致死した.さらに,播種してから約1年後の生存個体は1個体のみであった.対照としたニホンナシ'ゴールド二十世紀'放任受粉とリンゴ'つがる'放任受粉由来の実生では致死性は観察されなかった.致死した52個体の属間交雑実生のうち29個体について交雑親からのRAPDマーカーの遺伝を調査した結果,全ての致死実生において両親由来RAPDマーカーが47100%の確率で遺伝していた.

これに対して致死せず生き残った1個体には,母本由来のRAPDマーカーだけが遺伝していた.以上の結果から,属間交雑実生のうち,致死した個体は両親のゲノムを合わせ持つ属間雑種であることが明らかになった.一方,生き残った個体は母本組織から単為発生したアポミクシス実生であると推察された.ニホンナシにおけるアポミクシス実生の発生は新規の発見である.今後は,アポミクシス実生の効率的な誘導方法を検討する予定である.