hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＮＡ二本鎖損傷依存性ヒストンユビキチン化による複製転写制御とゲノム安定性

DNA二本鎖損傷部位では、損傷部位にある様々な分子がユビキチン化され、クロマチン構造の変換やシグナルの伝達などが行われている。ユビキチン化を行うE3 ubiquitin ligaseはRNF8,RNF168であり、E2 ubiquitin conjugating enzymeはUBC13-UEV1a(もしくはMMS2)複合体である。UBC13-UEV1a複合体は、脱ユビキチン化酵素OTUB1が結合するとOTUB1の脱ユビキチン活性非依存性に活性が抑制される。OTUB1の発現を抑制するとDNA損傷応答が促進される。この知見は、OTUB1とUBC13との結合部位を標的とする化合物があれば、細胞内のDNA損傷応答を人為的にコントロールすることが可能であることを示している。そこで、UBC13-MMS2-Ubiquitin-OTUB1が結合した結晶の構造解析を行った。その結果OTUB1のF133,F138、M211がUBC13との結合に重要なアミノ酸であることを見いだした。細胞生物学および分子生物学の手法を用い、これらの部位のアミノ酸がDNA損傷応答にも重要であることを確認した。RNF168と結合する分子を質量分析法で解析したところ、RNF168はヒストンメチル化酵素の活性制御因子とDNA損傷依存性に結合することが示された。53BP1がDNA損傷部位へと局在するためになぜRNF168依存性のユビキチン化が必要なのかはこれまで判明していなかったが、本知見はこれを解明するための大きな手がかりになると考えられる。また、本研究における実験結果を手がかりとして、OTUB1とは異なるDNA損傷応答を抑制的に制御する分子が存在することを発見した。これらの分子は他のDNA損傷応答分子のDNA損傷部位への局在を間接的に制御しており、クロマチンユビキチン化にも影響を及ぼすことを示す結果が集積しつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。脱ユビキチン化酵素OTUB1はE2ユビキチン結合酵素と結合してそのE2活性を抑制することにより,DNA二本鎖損傷部位でのクロマチンユビキチン化を抑制している.OTUB1によるUBC13の抑制機構について詳細に検討するため,OTUB1-UBC13/MMS2からなる複合体の構造解析を行った.これにより,OTUB1とUBC13との結合に重要な3つのアミノ酸が同定されるとともに,OTUB1のN末がUBC13にチャージしたユビキチンとの結合に重要な役割を果たしていることが示された.この結果は細胞生物学的な実験によりDNA損傷応答においても重要であることが示された.また,UBC13/MMS2によるユビキチン鎖形成において,OTUB1はジユビキチン形成をあまり抑制しないにもかかわらず,トリユビキチン化を強く抑制するという生化学実験データを得たが.これはOTUB1-UBC13/MMS2の構造によりうまく説明できることも示された.DNA二本鎖切断時に起こるヒストンH2Aユビキチン化はUBC13とともに働くE3ユビキチンリガーゼであるRNF8およびRNF168によって行われている.RNF8やRNF168をノックダウンした細胞では放射線感受性が増強するが,これには相同組換え経路の抑制によるものではないことが示された.一方,BRCA1が存在しない状況ではヒストンH2Aのユビキチン化は相同組換え修復に重要であることも示された.RNF8とRNF168はヒストンH2Aをユビキチン化するが,両遺伝子がどのように役割を分担しているかについては,未だ明らかとなっていない.そこで,エトポシドによるDNA損傷の存在・非存在下においてRNF168を培養細胞から免疫沈降し,その免疫複合体に含まれる分子を解析したところ,DNA二本鎖切断との関連が知られていないDNA損傷応答因子が複数検出された.DNA二本鎖損傷部位では、損傷部位にある様々な分子がユビキチン化され、クロマチン構造の変換やシグナルの伝達などが行われている。

53BP1がDNA損傷部位へと局在するためになぜRNF168依存性のユビキチン化が必要なのかはこれまで判明していなかったが、本知見はこれを解明するための大きな手がかりになると考えられる。また、本研究における実験結果を手がかりとして、OTUB1とは異なるDNA損傷応答を抑制的に制御する分子が存在することを発見した。これらの分子は他のDNA損傷応答分子のDNA損傷部位への局在を間接的に制御しており、クロマチンユビキチン化にも影響を及ぼすことを示す結果が集積しつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。実験結果が予想に反する内容もあったが,それを代替する研究を予定通りに行い,新たな知見を得ている.来年度に向けて,今年度中に行うべき実験を行い,発展を期待しうる結果を得ている.24年度が最終年度であるため、記入しない。OTUB1ノックアウト細胞の作成がうまくいかなかったが,他の研究者からOTUB1ノックアウトマウスが胎生致死であるという情報を得ており,その点からOTUB1ノックアウト細胞の作成する研究方法は避けた方がよいと思われる.研究を遂行する上ではノックアウト細胞を使用することが理想的であったが,研究がうまくいかなかった際の対策通り,今後はsiRNAによるノックダウンにより転写複製修復とユビキチン化の関連を解明する研究を遂行していく.RNF168のマススペクトロメトリー解析の結果は,領域班の中で検討しうる価値のあるものであり,領域内の研究者との共同研究を介して来年度にさらなる発展をめざしたい.
英国国立劇場構想の形成過程における「国家」の概念

本研究の目的は、英国国立劇場誕生の端緒となったハーリー・グランヴィル・バーカーの「国立劇場構想」の形成過程を明らかにし、英国近代演劇史における「国家」の概念を補完することである。20世紀初頭において活発に議論された「国民が共有する文化」が、バーカーの「国立劇場構想」の背景にあるのは間違いない。しかしその一方で、当時の移民の演劇の発展や来英公演の増加による演劇の国際化が「国民が共有する文化」をどれほど揺さぶり、また相対化したかについては未だ十分に考察されていない。バーカーの「国立劇場構想」に多大な影響を及ぼしたと考えられる「国民が共有する文化」のコンテキストを再検証し、英国近代演劇史研究のなかで欠如している「国家」の概念を明らかにすることが本研究の目的である。平成30年度は、「国民」をバーカーがいかに多様な視点から想定したかを考察するために、『あるべき演劇』発刊前後の英国演劇の位相を概観することをおもな目的として進めた。具体的にはすでにこれまで注目してきたレパートリー・シアター・ムーブメントの詳細をさらに検討し、コミュニティ演劇における共同体意識の生成について地方演劇の拠点であったバーミンガム、マンチェスター、グラスゴーの上演資料をレビューした。「国民が共有する文化」は、英国における移民グループの演劇によって、絶えず問い直され変容し続ける。よってすでに研究の進んでいる英国のユダヤ人演劇、中国人演劇、イタリア人演劇などについて再考するとともに、日本演劇の位置づけについても同時に考察を進めた。ここまでにすでに得られた知見については、国内外の学会で口頭発表を行い、論文執筆の準備を進めている。しかしその一方で、当時の移民の演劇の発展や来英公演の増加による演劇の国際化が「国民が共有する文化」をどれほど揺さぶり、また相対化したかついては未だ十分に考察されていない。「国民が共有する文化」のコンテキストを再検証し、「国家」の概念を明らかにするべく相対化の視点を導入することは、これまでの英国近代演劇研究においては例をみないものである。これによって従来の歴史的視点を重視しながらも、空間的視座を導入することで、通時的、共時的視座の両方を獲得することが可能になると考えられる。また、本研究は、演劇研究、空間史、都市論の接点に注目することで、演劇研究の方法を用いながらも、総合的な文化史研究となり、英国のみならず日本を含めた他国の国立劇場のあり方についての議論を促すものとなるだろう。28年度は「観客にイメージされる『国家』ー国際化への直面」という課題のもと、一方ではバーカーが特に多様な観客と接した時期の一次資料、二次資料のレビューに取り組み、他方では20世紀初頭の英国演劇の国際化の文脈を整理し、また「国立劇場構想」を相対化して捉えるるべく影響関係にある基礎資料の収集をおもに行った。28年度課題:観客にイメージされる「国家」ー国際化への直面(1)20世紀初頭のイギリス演劇、グランヴィル・バーカー研究についての文献は、一次資料、二次資料を含めてすでに広い範囲でレビュー済であるが、28年度引き続き行われている議論についてもさらに検討した。(2)19世紀末のバーカーの1896年1901年の商業演劇の俳優としての活動期の海外の翻訳戯曲上演に焦点をあて、上演台本、上演プログラム、上演批評などの上演関係の資料、書簡、劇作などはレビュー済みであるが、同時期のバーカーの出演以外の関連上演についても検討した。(3)観客論についての一次資料については、特にエンターテイメントのジャンルに焦点をあて可能な限り広く精査した。また、観客論の二次資料にも広くレビューする必要がある。(4)英国近代演劇に焦点をあてたインターカルチュラル研究、ディアスポラ研究の基本文献を一次資料は28年度にレビューしたが、二次資料は29年度にレビューする予定である。(5)「英国国立劇場構想」を相対的にとらえる課題は、おもに29年度に取り組む予定であるが、これに先駆けて28年度に基礎資料の収集を行うことにした。具体的にはアイルランド、スコットランド、フランス、イタリア、オーストリア、オランダなど、イングランドの国立劇場構想へ直接、間接の影響関係のある国立劇場(または公共劇場)の一次資料を収集した。これらのレビューについては29年度に行う予定である。20世紀初頭に「民衆演劇」の概念が広まり、「国民が共有する文化」を大きく変容しようとするなか、バーカーがいかに英国国立劇場を構想したかについては、そのプロセスの詳細な検討によってようやく包括的な考察が可能になるだろう。H29年度についてはおもに「国立劇場構想」の揺らぎと再構築について、当時国際的に影響を及ぼした「民衆演劇」の文脈に照らしながら、バーカーの異文化接触に焦点をあてることにした。

すでにレビュー済みバーカーのアメリカ公演19141915年およびアメリカの国立劇場の議論の一次資料をもとに、H28年度に収集したアイルランド、スコットランド、イタリア、オーストリア、オランダなど、バーカーが直接、間接的に参照した他国の国立劇場構想の資料の精査を中心に行った。また、1911年のバーカーによるドイツ演劇報告にある上演演目やフランスの演出家ジャック・コポーとの関わりに着目し、それらが「国立劇場構想」の相対化の視点の生成にどのような役割を果たしたかについても引き続き一次資料をもとにレビューを進めたが、H30年度にも資料精査は引き続き行う予定である。なお、近代演劇における「民衆演劇」の国際的な文脈を整理、確認する内容については、当該年度に研究発表済みである。H29年度課題:「国立劇場構想」の揺らぎと再構築ーハーリー・グランヴィル・バーカーの異文化接触民衆演劇の国際化の文脈を確認するため、ロマンロランの「民衆演劇論」を中心にその関連文献を収集、精査し、25年度、26年度にすでに収集したインターカルチュラル研究、ディアスポラ研究の基本文献を再度レビューした。当該年度に引き続き行われている議論についてはデータベースを利用している。上記の基本文献を踏まえつつ、バーカー関連の一次資料およびバーカーが直接、間接的に参照した英国以外の国立劇場構想の資料については、H29年度に進めた。しかし一次資料がきわめて広範囲にわたるためこの作業についてはH29年度内には終了しておらず、H30年度も引き続きレビューを継続する必要があるだろう。本研究の目的は、英国国立劇場誕生の端緒となったハーリー・グランヴィル・バーカーの「国立劇場構想」の形成過程を明らかにし、英国近代演劇史における「国家」の概念を補完することである。20世紀初頭において活発に議論された「国民が共有する文化」が、バーカーの「国立劇場構想」の背景にあるのは間違いない。しかしその一方で、当時の移民の演劇の発展や来英公演の増加による演劇の国際化が「国民が共有する文化」をどれほど揺さぶり、また相対化したかについては未だ十分に考察されていない。バーカーの「国立劇場構想」に多大な影響を及ぼしたと考えられる「国民が共有する文化」のコンテキストを再検証し、英国近代演劇史研究のなかで欠如している「国家」の概念を明らかにすることが本研究の目的である。平成30年度は、「国民」をバーカーがいかに多様な視点から想定したかを考察するために、『あるべき演劇』発刊前後の英国演劇の位相を概観することをおもな目的として進めた。具体的にはすでにこれまで注目してきたレパートリー・シアター・ムーブメントの詳細をさらに検討し、コミュニティ演劇における共同体意識の生成について地方演劇の拠点であったバーミンガム、マンチェスター、グラスゴーの上演資料をレビューした。「国民が共有する文化」は、英国における移民グループの演劇によって、絶えず問い直され変容し続ける。よってすでに研究の進んでいる英国のユダヤ人演劇、中国人演劇、イタリア人演劇などについて再考するとともに、日本演劇の位置づけについても同時に考察を進めた。ここまでにすでに得られた知見については、国内外の学会で口頭発表を行い、論文執筆の準備を進めている。29年度課題:「国立劇場構想」の揺らぎと再構築ーバーカーの異文化接触
サル感染モデルによるエイズ病原性の分子基盤

【目的と意義】エイズの原因ウイルスであるHIV-1は、ヒトとチンパンジーにしか感染しないことから、アカゲザルに感染するSIVmacとHIV-1を組み合わせたウイルス(SHIV)とアカゲザルを用いたエイズの感染モデル系が確立されている。これまでにアカゲザルに種々の病態を呈するSHIV株が得られているので、強毒・弱毒SHIV分子クローンについて遺伝子レベル・培養細胞レベル・感染個体レベルで統合的に比較解析することによりSHIVの病原性に関与する素課程を明らかにし、エイズの感染病態への理解を深める事を目的とする。【材料と方法】強毒SHIV分子クローンと弱毒SHIV分子クローンの塩基配列を比較し、変異部位を部分的に交換した分子クローンを作製し、培養細胞レベルでの性状および感染サルでの病態やゲノム変異について比較解析を行なった。【結果】培養細胞レベルでの性状解析結果からウイルスゲノムの5'側と3'側に独立にウイルス増殖を増強させる変異が存在することが示された。弱毒・強毒クローンについて5'側と3'側の約半分ずつを組み換えたウイルスをサルに接種したところ、各々1/2頭で強毒型の病態が観察され、強毒型を示したサルの血漿中のウイルスの全ゲノム解析から、5'LTR下流の非翻訳領域の1ケ所の塩基置換とenv-gp41領域の2カ所のアミノ酸変異がin vivoでの病原性に重要と考えられた。さらに、nef遺伝子領域の特定の2ヶ所に新たな変異が起こることが発症に向かって重要であることが示唆された。【考察】今回、SHIVの病原性に影響を及ぼすウイルスゲノム上の変異が3つの素課程としてクローズアップされたと考えられる。今後、それぞれの素課程が感染個体レベルでの病原性に与えるメカニズムの解明に向けて研究を進めたい。エイズウイルスの感染・増殖に各種サイトカイン・ケモカインなどの液性免疫因子が重要な影響を及ぼすことが培養細胞レベルで明らかとなっているが、実際の感染個体における病態との関係は未だ不明な点が残されている。そこで、液性免疫因子によるウイルスの増殖・病態への関与を個体レベルで実験的に解析することを目的として、Th2系サイトカインであるIL-5遺伝子をnef部位に組み込んだSHIV-IL5を作製した。培養細胞における増殖能を調べたところ、親株であるSHIV-NM3rNが一番よく増殖し、nefを削ったSHIV-NIは、増殖が悪くなったが、IL-5を組み込んだウイルスは、NM3rN程ではないが、良く増殖する傾向が見られた。また、培養上清中に産生されたIL-5を階段希釈してIL-5依存性に増殖するTF-1細胞株でチェックしたところ、濃度依存性にTF-1が増殖することが確認された。そこで、この増殖がよくなったSHIV-IL5のサル感染実験を行った。末血中のCD4陽性細胞やB細胞マーカーであるCD20での顕著な動きはなかったが、血漿中のIL-5レベルは、感染2週後に一過性の明らかな上昇が認められた。血漿中のウイルス量は、感染1週後に、親株のNM3rNと同程度にウイルス量が上昇し、その後急速に減少するといったプロファイルで、nef欠失ウイルスに比べると明らかにウイルス増殖が良くなっていた。PA法により感染サルの抗HIV-1抗体を測定したところ、感染後2,4、6週で、IL-5を組み込んだウイルスを接種したサルの方が、nef遺伝子欠失ウイルスを接種したサルよりも抗体レスポンスが有意に早いことがわかった。以上のように、IL-5の組み込みによってウイルスの個体レベルでの感染・増殖に明らかな影響を及ぼすことがわかった。
In situでの炎症性サイトカイン発現状況

申請者は、in vitroにおいて既にリンパ球と歯肉線維芽細胞との相互作用において細胞接着分子が重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。そこで本研究では、in vivoにおけるこれら細胞接着分子の発現状況を検討した。具体的には、歯周外科手術時に採取した炎症歯肉組織から凍結切片を作製し当研究室にて樹立された抗-CD44抗体OS/37および抗-β1インテグリン抗体4-145にて免疫組織染色することにより、組織切片上でのこれら接着分子を検出しその局在を検討した。その結果、CD44分子は上皮角化層を覗き上皮層、結合組織中の線維芽細胞、血管内皮細胞、浸潤細胞が染色されており、β1インテグリンに関しては上皮においては基底細胞以外は染色されなかったものの上皮下ではCD44と同様の結果であった。このように歯肉組織にはCD44、インテグリンが広範囲に発現されており歯周病の病態形成にこれら接着分子が深く関わっていることが示唆された。また、In situハイブリダイゼーション法を用いて歯肉組織でのサイトカインmRNAを検出する系を確立するために、IL-1αに対するアンチセンスおよびセンスRNAプローブを作製しDigoxigenin(DIG)にて標識した。このプローブを用いて培養歯肉線維芽細胞上でIL-1αmRNAの検出を試みたが、アンチセンスとセンス・プローブで傾向が異なるもののはっきりとしたシグナルは現在のところ検出されていない。また、歯肉切片上でもハイブリダイゼーションを行っているが、歯肉線維芽細胞内にIL-1αmRNAと思われるシグナルが認められるものの非特異的呈色が認められ実験系が確立していない状態である。今後、さらに実験方法の条件を検討し実験系の確立を目指すと共に、各種サイトカインmRNAに対するプローブを作製して培養細胞に関しては細胞を刺激することによる各種サイトカインmRNA発現パターンの検討を行う予定である。
膵腺房細胞における細胞内メッセンジャーの相互作用

膵腺房細胞からの酵素分泌には細胞内メッセンジャーとしてCa^<2+>が重要な役割を果たしている。細胞内メッセンジャーのレベルではA23187により細胞内カルシウム濃度を上昇させたり、TPAによりCキナーゼを直接活性化させたりすることによりアミラーゼ分泌を刺激することができる。一方、cAMP系についても、膜透過性のあるcAMPの誘導体(dbcAMP)によって分泌は刺激される。これらの細胞内メッセンジャーの相互作用について検討すると、A23187とdbcAMPとを同時に加えるとアミラーゼ反応は増幅される。またCa^<2+>系の中でもA23187とTPAとを同時投与するとアミラーゼ分泌は増幅され、Ca^<2+>とCキナーゼ、cAMPという細胞内メッセンジャーのレベルで相互作用がみられるのである。このことはpermeabilized aciniでも同様で、Ca^<2+>に他の細胞内メッセンジャーであるTPA,GTprs,cAMPを同時投与するとアミラーゼ分泌はpotentiateされる。しかしながらCa^2の存在しない状態ではアミラーゼ分泌は刺激されない。したがって膵腺房細胞における細胞内メッセンジャーの相互作用ではCa^<2+>が中心的役割を果たしていることがあきらかになった。カルモデュリンは代表的な細胞内カルシウム受容蛋白質であり,Ca^<2+>と結合して活性化され,カルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素(カルモデュリンキナーゼ)を活性化する。CCKやカルバコールによるアミラーゼ分泌反応はカルモデュリン阻害剤であるW7やカルモデュリンキナーゼII阻害剤であるKN62により有意に抑制された。W7,KN62はA23187およびTPAによる単独刺激については有意の抑制は示さなかったが、A23187+TPAによるsynergisticなアミラーゼ分泌を有意に抑制した。permeabilizedaciniではアミラーゼ分泌はCa^<2+>の濃度依存性に増加し、Ca^<2+>濃度を1μMにするとアミラーゼ分泌は最高に達した。W7,KN62はこのCa^<2+>依存性のアミラーゼ分泌に影響は与えなかった。ところがCa^<2+>存在下(1μM)でのTPA,GTPγS,cAMPなどによるアミラーゼ反応の増強作用は有意に抑制した。このことからカルモデュリンはCa^<2+>と他の細胞内メッセンジャーとの相互作用に重要な役割を果たしていることが示唆された。膵腺房細胞からの酵素分泌には細胞内メッセンジャ-としてCa^<2+>が中心的な役割を果たしている。カルモデュリンは代表的な細胞内カルシウム受容蛋白質であり、Ca^<2+>と複合体を形成して蛋白質リン酸化酵素を活性化する。膵腺房細胞からの分泌反応におけるカルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素の役割については十分に解明されていなかった。

そこでカルモデュリンの阻害剤(W7)、およびカルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素(CaM Kinase II)の阻害剤(KN62)をもちいて膵腺房細胞からの酵素分泌反応に対する作用について検討した。Ca^<2+>とCキナ-ゼを細胞内メッセンジャ-とするCCK8やカルバコ-ル刺激下の酵素分泌反応はW7やKN62により抑制された。permeabilized cellを用いた実験では、Ca^<2+>単独刺激による酵素分泌反応はW7やKN62により影響を受けなかったが、Ca^<2+>とCキナ-ゼを刺激するTPAによる分泌反応およびCa^<2+>とG蛋白質を刺激するGTPγSによる分泌反応は抑制した。従って、膵腺房細胞からの分泌反応において、カルモデュリンはCa^<2+>と他の細胞内メッセンジャ-であるCキナ-ゼやG蛋白質との間の協調作用に重要な役割を果たしているものと考えられた。またCaM kinase IIは膵腺房細胞の分泌反応においても直接関与していることが示唆された。今年度は細胞内メッセンジャーの分泌反応への関与を詳細に検討するために,細胞膜に小さな穴を開けて,膜不透過性の物質を細胞内に導入して細胞内メッセンジャーの濃度を直接コントロールするためpermeabilizationをおこなった。permeabilizationの方法には電気ショックによるものやジギトニン,サポニンなど界面活性剤によるものがあるが、われわれは溶連菌の毒素であるStreptolysin O(SLO)を用いて膵腺房細胞でpermeabilized cellのシステムを確立した。この系ではメディウム中のCa^<2+>濃度をCa^<2+>/EGTA bufferにより調節し,細胞内のCa^<2+>濃度を直接コントロールすることが可能である。またSLO投与後10分以内に細胞内のLDHの90%以上が細胞外に漏出することから,膜不透過性の物質,さらには高分子の蛋白質も細胞内に直接入れることが可能であると思われる。今年度は正常膵腺房細胞とpermeabilized aciniの両者の実験系を用いて,特にCa^<2+>-カルモデュリン系を中心に細胞内メッセンジャーの相互作用につき検討した。カルモデュリンは代表的な細胞内カルシウム受容蛋白質であり,Ca^<2+>と結合して活性化され,カルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素(カルモデュリンキナーゼ)を活性化する。正常細胞ではCCKやカルバコールによるアミラーゼ分泌反応はカルモデュリン阻害剤であるW7やカルモデュリンキナーゼII阻害剤であるKN62により有意に抑制された。このことからCa^<2+>系を介する分泌反応ではカルモデュリンが重要な役割を果たしていると考えられる。permeabilized aciniではアミラーゼ分泌はCa^<2+>の濃度依存性に増加し,Ca^<2+>濃度を1μMにするとアミラーゼ分泌は最高に達した。W7,KN62はこのCa^<2+>依存性のアミラーゼ分泌には影響は与えなかった。
水酸アパタイトマイクロチューブの創製

水酸アパタイトの特徴を活かす材料として、チューブ状の水酸アパタイトを創製できれば、従来にないDrug Delivery System(DDS)や高効率の化学物質回収材料等として応用展開できる可能性がある。昨年度までに、アナターゼのナノ粒子をリン酸三カルシウム粉末と混合し、この混合粉末からなるペレットを水熱蒸気処理すると、柱状の水酸アパタイト粒子に混ざって、水酸アパタイトマイクロチューブが生成していることを発見した。本年度は、水酸アパタイトマイクロチューブの生成メカニズムの解明を目指し、まず添加するアナターゼの粒径や量の影響について調べた。その結果、ある特定の粒径でしかも特定の量のアナターゼを添加した場合にのみ、水酸アパタイトマイクロチューブが生成することを明らかにした。さらに、水酸アパタイトマイクロチューブが生成する系においてマイクロチューブ生成過程を詳細に調べたところ、まずリン酸三カルシウムと水が反応し、チューブ形状を取らない水酸アパタイトが生成し、その後結晶成長の段階でチューブ状になっていることが示唆された。すなわち、アナターゼが結晶成長に影響を与え、これにより水酸アパタイトマイクロチューブが生成している可能性を明らかにした。さらに、透過型電子顕微鏡観察により、生成した水酸アパタイトマイクロチューブは、c軸方向に成長し、a面と呼ばれる特定の結晶面を露出していることが示唆された。特定の結晶面の露出は、水酸アパタイトに吸着特性の選択性を付与する可能性がある。これらの成果は水酸アパタイトマイクロチューブの生成メカニズムの解明や大量生産につながるものと期待できる。水酸アパタイト(Ca_<10>(PO_4)_6(OH)_2)の特徴を活かす材料として、内側も外側もa面と呼ばれる特定の結晶面を露出したチューブ状の水酸アパタイトを創製できれば、従来にないDrug Delivery System(DDS)や高効率の化学物質回収材料等として応用展開できる可能性がある。本年度は、結晶面を制御した水酸アパタイト粒子の合成に適した方法である水熱法を用い、水酸アパタイトマイクロチューブの創製を試みた。これまでにリン酸三カルシウム(Ca_3(PO_4)_2)を水熱処理することにより、柱状の水酸アパタイトが得られることを明らかにしている。この知見を基に、この反応系において水酸アパタイトの結晶核生成を誘起する物質を共存させ、その物質上での核形成をコントロールすることによって、チューブ状の水酸アパタイトを合成することを試みた。ある一定量の酸化チタンのナノ粒子をリン酸三カルシウム粉末と混合し、この混合粉末からなるペレットを水熱蒸気処理した。水熱処理後のペレット表面を観察すると、柱状の水酸アパタイト粒子に混ざって、水酸アパタイトマイクロチューブも生成していることを発見した。この結果は、本方法が水酸アパタイトマイクロチューブの合成方法の一つとなりうることを示している。さらに、混合粉末からなるペレットに対して、紫外線照射を予め施してから水熱蒸気処理を行うことによって、マイクロチューブの生成量が増大した。これは、酸化チタンの光触媒活性がマイクロチューブの生成を促進したことを示し、この成果はマイクロチューブの大量生産や、生成メカニズムの解明につながると期待できる。
酸化物高温超伝導体の磁気的電気的特性と希土類イオンの電子状態

1希土類イオンと銅イオンを含む層状化合物の伝導特性と磁性層状構造を有するオキシ硫化物ROCuS(R:希土類イオン)において、Rを^-2価のアルカリ土類イオンで置換したR_<1-x>M_xOCuS(R:La,Nd,M:Ca,Sr)系、およびRをMでCuをNiで同時置換したR_<1-x>M_xOCu_<1-x>Ni_xS系の電気伝導度および磁性の研究をおこなった。後者はx=0.03付近で半導体-金属転移を起こしx=0.2の固溶限界まで金属的伝導を示す。XPSの測定によると、両系とも置換によりCuの2p準位のピークにはCu^<2+>に対応するサテライトピークが現れ、(La,M)(Cu,Ni)系においてより顕著である。CuのNMRの測定によると金属的伝導を示す系においても緩和時間T_1はKorringa則に従わず伝導電子系は縮退していないことを示す。また金属的伝導を示す場合でもNdイオンの磁性には変化が見られず伝導電子の分布はCu面に限らた2次元的なものであることを示している。このオキシ硫化物系では希土類イオンを置換するのみではCu面に正孔は導入されるが金属的伝導は起こらずCuをNiで置換しフェルミ準位を価電子帯の非局在状態にまで下げることにより初めて金属的伝導を生じる。このことは酸化物高温超電導帯の場合と対照的である。2ペロブスカイト型酸化物中のPrイオンの電子状態Aサイトに3価のPrイオンを含むPrScO_3のScをMgで置換したPrSc_<1-x>Mg_xO_3系の試料の作製に成功し、Mg量に対応したPr^<4+>イオンをAサイトに導入することができた。x=0.2の試料の磁化の温度依存性はPrBa_2Cu_3O_yのものに非常に近い。このことからPBCO中のPrイオンの状態は3価にわずかに4価が混じったものに近いことが推論される。3単結晶作製LaOCuSの単結晶の作製を沃素輸送法で、BaPrO_3の単結晶をFZ法で試み100μおよび1mm大のものをそれぞれ得た。
分子イメージング手法を用いるアルツハイマー病におけるグリア細胞の役割に関する研究

本研究はアルツハイマー病の病的分子アミロイド及びグリア細胞の活性化の生体イメージング及び摘出脳の免疫染色により、アミロイドの産生・除去とグリア細胞の活性化との関連を調べた。その結果、ポジトロン断層撮影(PET)を主なる手法とする分子イメージングはアミロイド沈着と炎症性反応を臨床研究においても応用できることを明らかにし、グリア細胞活性化の指標である末梢性ペンゾジアゼピン受容体(PBR)は単なるグリア細胞のバイオマーカーでなく、グリア細胞の機能をも制御しうる機能性分子であることを見出した。特に中枢神経の免疫を担うグリアの亜種ミクログリアにおいて、PBR分子は非炎症性ミクログリア細胞が炎症性ミクログリアに変化する際に、その発現が高くなり、活性化ミクログリア細胞全般よりも、むしろ炎症性ミクログリアの挙動を特異的に反映するものと考えられる。また、PBR結合性薬剤はこれらの炎症性ミクログリアによる炎症性サイトカインの放出を制御しうることを明らかにした。株化ミクログリア細胞Ra2をAlzheimer病動物モデルAPP23マウスに脳内移植し、経時的にアミロイドイメージング放射標識リガンド[^<11>C]PIBにより、モデルマウス脳内アミロイド沈着をin vivoにおいて定量検出した結果、ミクログリア細胞移植により、アミロイド沈着は明らかに軽減した。同時に行った末梢性ペンゾジアゼピン受容体(PBR)放射標識リガンド[^<18>F]FEDAAを用いた画像解析より、Ra2移値による脳内のPBRの上昇が認められなかった。また、これらのマウスの剖検脳を種々染色法により調べた結果、in vivoにおける所見と一致した結果が得られた。また、PBRリガンドであるPK11195とRo5-4864を顔面神経切断モデルに投与し、神経軸索損傷によるミクログリア細胞の活性化に及ぼす影響を調べた。その結果、いずれのPBRリガンドもミクログリア細胞の活性化及びPBRの誘導に対して、著しい効果がなかったことを確認した。以上の結果より、株化ミクログリア細胞の脳内移植はAlzheimer病の原因物質と考えられるアミロイドの沈着を炎症反応を引き起こすことがなく除去できることを示唆し、その抗アミロイド効果はPET技術により、非侵襲的に経時的にモニタリングすることができた。[^<11>C]PIBと[^<18>F]FEDAAを用いるPET技術は新薬の治療効果の客観的な定量評価と治療過程における脳内炎症反応の把握に非常に有効な手段であることが示された。また、ミクログリア細胞の活性制御は脳内アミロイド沈着の除去に有効な手段であるものの、PBRリガンドを用いるミクログリア活性の制御は少なくとも既存したPBRリガンドでは難しいことが示唆された。本研究において、研究代表者らは市販抗体より遙かに特異性の高い抗末梢性ベンゾジアゼピン受容体(PBR)抗体の作製に成功した。このオリジナル抗体を用いて、種々神経変性疾患動物モデルにおける脳内グリア細胞のPBRを調べた結果、神経変性の種類により、グリア細胞におけるPBRの発現パターンが大きく異なることが明らかになった。可逆的な神経障害において、PBRは主にアストロサイトに神経栄養因子GDNFと共に強く誘導され、神経組織の修復・再生に働くが、ミクログリアには、その発現が非常に低い。不可逆な神経障害において、PBRは主にミクログリアに発現し、障害された神経細胞を排除するに働くことを明らかにした。以上の研究結果により、ミクログリア活性化に伴う活性酸素の生産や炎症性サイトカインの分泌はPBRの誘導発現に関わる可能性が示唆されたため、研究代表者らは炎症性サイトカインの生産の低いと高い株化ミクログリア細胞を、それぞれAlzheimer病モデルマウスAPP23に移植し、経時的にアミロイド放射線標識トレーサー^<11>C-PIB、及びPBR放射線標識トレーサー^<18>F-FEDAAで、モデル動物を生かしたまま、アミロイドの沈着をPBR発現を画像化し、炎症性因子の生産能の低いと高いミクログリアによるアミロイド沈着への影響を調べた。その結果、炎症性因子産生能の低いミクログリアの移植により、APP23マウスの脳内アミロイド沈着が軽減されたのに対して、炎症性因子産生能の高いミクログリアの移植はマウスの脳内アミロイド沈着に影響しなかった。

更に、炎症性の低いミクログリアのPBR発現は炎症性の高いミクログリアに比べ、遙かに低いこととアミロイド沈着を除去すると考えられた内因性ミクログリアに発現するPBRは極めて低いことから、PBRは単なるミクログリア細胞の活性化を反映するバイオマーカーよりも、むしろ炎症性ミクログリアを反映する機能性指標であることを示唆した。本研究により得られた知見は臨床研究で得られる所見を新たな視点から解析することに実験的根拠を提供した。
介護市場における情報の非対称性がサービスの質と量に及ぼす効果についての経済分析

本研究は、介護保険によって市場化された介護サービスの供給において、サービス事業者等に関する情報をほとんど持たず、また、それらが提供するサービスの質を正確に評価できない消費者(要介護者)が市場に一定割合存在するとき、それでも市場に出回る介護サービスの質は十分高い水準が確保されるか否かについての分析であり、また、それらサービスの質を正確に評価できない消費者たちが市場から排除されること(未利用者問題)がないのかについての研究であった。さて、本研究は、なお研究途上であるが、3カ年の研究期間内の研究成果は次の通りである。情報の不足が要介護者を市場から排除する可能性についての理論分析ならびにその実験経済学的検証については、その成果の一部を第20回生活経済学会大会(平成16年6月7日)で口頭報告した。平成17年度には、市場に出回るサービスの質が、たとえ市場の競争を踏まえても必ずしも高くならない場合があることに対して、有効な対策を模索し、かっ20人を被験者とする実験に実験環境を拡張し、その有効性を確かめた。また、平成17年度と18年度にはCS分析を利用した第三者評価制度に向けて、顧客満足度情報が果たして本当に介護サービスの消費者行動に本当に影響を及ぼすのか、そして、影響を及ぼすのなら、どんな情報が介護サービスの質や量に好影響をもたらすのか等を研究した。しかし、これらの諸課題のうち、限られた研究期間の中で我々が最終的に明らかにできた部分は、「事業者が誇大広告や過小広告など故意に歪めた情報を利用者に流布させることによって、市場に出回るサービスの量を増やすことが可能であり、しかも、この場合にも顧客満足度は必ずしも悪化しない」ことだけであった。この結論は、理論上の先験的帰結ではなく、実験によって得られた現実的結果であり、予期しなかった結果であることから、現在も分析結果を吟味中であり、研究結果は刊行してない。本研究は介護サービス市場における情報不足が消費者である要介護者の経済行動に及ぼす効果を理論的実証的に探求し、介護保険制度ならびに介護サービス市場の設計に向けた具体的な政策提言を行うことを目的としている。介護サービス市場は介護保険制度導入と同時に大量の新規事業者が参入し、また、従来の措置制度と違って、要介護者は合理的な消費者として自ら事業者やそのサービス内容を選択することが求められている点で、現在までのところ非常に不確実性の高い市場である。同市場における情報不足の弊害は、要介護認定申請者数が措置時代に立てられた推計値を下回ること、また、要介護認定を受けながら実際には介護サービスを全く購入しない未利用者の安定的な存在などの現象に見て取れる。そこで、本研究では、まず、情報の不足(不確実性)がなぜ消費者である要介護者を市場から排除するかについての因果関係を理論モデルで説明し、その再現を経済実験で確かめ、次に、介護サービス市場における情報不足を補って、利用者の事業者やそのサービス内容の選択を補佐するために整備が進められている外部評価制度のあり方たついて顧客満足分析の視点から政策提言をすることにしていた。本年度は、3年間の研究計画の初年度であり、初年度の研究目標に対して次のような研究実績をあげた。まず、情報の不足が要介護者を市場から排除する可能性についての理論分析ならびにその実験経済学的検証については、その成果の一部を第20回生活経済学会大会(平成16年6月7日)で口頭報告したものの、初年度計画の目標に掲げていた経済実験の規模拡大(被験者10人→30人へ)が遅れ、本年度は機材の導入までで時間切れとなったため、刊行していない。

次に、顧客満足度分析の視点から望ましい外部評価制度を構築するという研究目標については、当初から初年度の研究目標は顧客満足度分析に関する文献を調査することであった。現在、ある程度文献は収集し,経済需要との概念上の整合性を検討しているが、まだ、完全には文献の収集が終わっておらず、次年度も引き続いて文献調査を行う予定である。全体として、研究は計画に対して遅れ気味であり、本研究の困難さを改めて認識しているが、まったく独創的な研究であり、他に先行研究がないことから地道に研究を続けていく以外に方法はないと考えている。また、研究期間の延長も視野に入れて始めている。本研究の全体テーマは、介護保険によって市場化された介護サービスの供給において、サービス事業者等に関する情報をほとんど持たず、また、それらが提供するサービスの質を正確に評価できない消費者(要介護者)が市場に一定割合存在するとき、それでも市場に出回る介護サービスの質は十分高い水準が確保されるか否かについての分析であり、また、それらサービスの質を正確に評価できない消費者たちが市場から排除されること(未利用者問題)がないのかについての研究である。もしそうした現象が発生する可能性があるのなら、理論的にその因果関係を明らかにするだけでなく、実験経済学的手法をもちいて、その状態を再現することが本研究の第1テーマであり、そうした因果関係を取り除くための政策を導出し、やはり実験経済学的手法を用いてその有効性を実証することが第2テーマである。さて、平成17年度は研究期間の2期目であり、1期目(平成16年度)までに明らかになった市場に出回るサービスの質が、たとえ市場の競争を踏まえても必ずしも高くならない場合があることに対して、有効な対策を模索し、かつ実験によって、その有効性を確かめた。介護サービス市場は、介護報酬単価を政策的に決められた固定価格市場であるが、その報酬単価を引き上げることはサービスの質を引き上げるのに有効である。また、高い質のサービスを提供する事業者の生産コストを引き下げるために、介護分野の有資格者を多く養成することも有効である。反対に、低い質のサービスを提供する事業者を抑制するために、サービスの基準化や規制を強化することも市場に出回るサービスの質を高めるのに有効である。しかし、そもそも市場に低い質のサービスが出回る根本的な原因は、同市場にある情報の非対称性にあることから、抜本対策は第三者評価など事業者の情報を分かり易く消費者に流すことにあると思われる。顧客満足度はこの手の情報の1つであり、CS分析を第三者評価の手段として用いることは有効である。本年度のもう1つの研究実績は、このCS分析を経済学的に解釈し直し、介護サービス分野での第三者評価制度に適用する可能性を考察したことである。本研究の全体テーマは、介護保険によって市場化された介護サービスの供給において、サービス事業者等に関する情報をほとんど持たず、また、それらが提供するサービスの質を正確に評価できない消費者(要介護者)が市場に一定割合存在するとき、それでも市場に出回る介護サービスの質は十分高い水準が確保されるか否かについての分析であり、また、それらサービスの質を正確に評価できない消費者たちが市場から排除されること(未利用者問題)がないのかについての研究であった。
数理科学と生体生命情報科学との連携による生命知の基本アルゴリズムの探求

単細胞レベルで実現される生命知のパフォーマンスを運動方程式により数理モデル化し、そこから高等動物に至る生命情報処理の共通則を探索した。単細胞生物である粘菌や繊毛虫をモデル生物として、ネットワーク最適化、学習、行動選択について成果を得た。特に、ネットワーク最適化現象については、輸送ネットワーク、力学構造物に関する種々の具体事例(単細胞の循環系から人の社会運動にまで)において、用不用則アルゴリズムが共通して作用していることを示した。本研究では、単細胞レベルで実現される生命知のパフォーマンスを物質レベルの物理的な運動方程式により数理モデル化し、そこから高等動物に至る生命情報処理の共通則を探索する。単細胞生物には神経系という情報処理器官がないので、体の運動方程式を書き下せば、そこには情報処理のアルゴリズムが自ずと付いてくる。これまでの数年間にわたり研究分担者(数理科学者)らと共同で押し進めてきた単細胞生物粘菌の情報処理アルゴリズム(ネットワーク最適化、時間学習、行動選択)から、アメーバからヒトにいたる広い生物種に共通する情報処理アルゴリズムの存在を予見した。この着想を本研究助成により展開する。本年度では以下の二つの項目について取り組んだ。1、細胞レベルの迷いと意思決定における個性の検証と人との比較:人間の行動を思い返してみると、いくつかの選択肢の中から迷ったあげくに一つを選び取るような時、知的であるとか心理的であると見なすことが多い。粘菌は、弱い忌避物質(低濃度のキニーネ)に出会った時、同じ条件であっても個体により、乗り越えたり引き返したりする。さらに光刺激を加えると、乗り越える場合により早く乗り越えるグループとよりもたつくグループとにあたかも両極分解した。また、より詳細に行動パタンを観察すると、さらに多様に類型化できることがわかった。環境が行動パタンの多様性を生み出すと思われた。このしくみを解明するために、細胞運動の力学模型を構成した。2、細胞の空間認知と記憶:繊毛虫が狭い空間でしばらく遊泳すると、より広い空間に出ても以前の狭い空間の形に似た軌跡で自由遊泳することを実験的に示し得た。このしくみを、繊毛運動を支配する膜電位方程式の立場から提案した。繊毛虫の空間形状適応能:ゾウリムシを転回できないほど細いキャピラリー空間に閉じ込めると,それまで見られなかった長期後退遊泳等を示すことを発見した.また、ゾウリムシがキャピラリー空間をしばらく遊泳すると,その後,広い空間においても直線的な遊泳を示すことを発見した.さらに、テトラヒメナが球状の狭い空間を遊泳していると、壁に添って円形軌道を描くようになり、その後広い空間に出ても円形軌道を描くことを発見した。以上の三つの学習行動のメカニズムを解明するために,従来のゾウリムシ膜電位方程式と繊毛打調節の関係を再検討し,新たな膜電位方程式を構成した.その結果,ゾウリムシの学習行動には繰り返し起こる壁との衝突刺激とCa2+チャネルの遅い反応が重要であることが示唆された.また,短時間の学習行動が膜電位の挙動として理解することができた.この研究により,我々は学習機構の新規概念を提供することができた.ほぼ計画通りである。本研究では、単細胞レベルで実現される生命知のパフォーマンスを運動方程式により数理モデル化し、そこから高等動物に至る生命情報処理の共通則を探索した。どのサブテーマでも論文発表ないし論文投稿まで到達できた。以下では、特にネットワーク最適化についてより詳細に述べる。ネットワーク最適化:粘菌の体内循環系である管ネットワークでは、「よく使われる部分は強化され、そうでない部分は弱化される」という用不用則が作用している。この粘菌法則に倣って、北海道地域の「交通路と町の共発展現象」を数理モデル化し、北海道の主な交通路と人口上位30都市ほどの地理分布を概ね再現できた。粘菌の輸送系構築は、人の集住運動と思わぬ類似性があると示唆された。次にこの用不用則を構造物の形成に適用した。ヒト大腿骨におけるリモデリング現象では、骨粗しょう症に特徴的な骨の構造パタンを再現できた。輸送系と構造系でも、同様の用不用則モデルで記述できることがわかった。これらの発見を受けて、片持梁のデザインに用不用則を適用した。「どれほど使われるとどれほど強化されるか」を定める関数形(さじ加減)によって、多様なトポロジーをもつ形状が生み出された。また、初期状態をあえて一様でなくして、偏りをつけておくことによっても、多様さが生じた。用不用則の運動方程式に基づくアルゴリズムで構造物を設計する方法を提案できた。

単細胞生物である粘菌や繊毛虫をモデル生物として、ネットワーク最適化、学習、行動選択について成果を得た。特に、ネットワーク最適化現象については、輸送ネットワーク、力学構造物に関する種々の具体事例(単細胞の循環系から人の社会運動にまで)において、用不用則アルゴリズムが共通して作用していることを示した。年度計画にあげた重点研究項目2つ((1)細胞レベルの迷いと意思決定における個性の検証と(2)細胞の空間認知と記憶)に関して概ね予定通りの進捗が見られ、それぞれ個別の論文として投稿準備中にまでこぎつけられたから。繊毛虫の空間学習について、どれほど複雑な形状まで学習できるのか、数理モデルの観点から一般的なしくみへと理論的展開をはかる。粘菌行動の多様性とその選択機構についても、粘菌に個別的な数理モデルができているので、行動選択一般の機構として抽象化する。環境適応的なネットワーキングについては、ヒトの社会現象との類似性を、数理モデルの観点から吟味して、共通のネットワーク構成アルゴリズムとして定式化する。来年度は最終年度であるので、これまでの成果を誌上発表できるように論文化作業に注力する。特に、個別的な数理モデルからより一般化されたアルゴリズムへと昇華させることがポイントである。28年度が最終年度であるため、記入しない。頭初計画に掲げた5つの研究項目のうち2つについて成果を得ることができたので、残りの3項目について取り組む予定である。計画では、博士研究員を雇用する予定であったが予算減額の都合により、それがかなわなくなったので、あらたに研究分担者2名(エフォート5%)を追加し、さらにリサーチアシスタントと研究補助員を雇用して、研究のテコ入れを行う。このような新体制で残りの研究計画を完遂する予定である。論文取りまとめに関して、当初の予定より時間を要して英文校正や投稿作業が年度をまたいだので、次年度使用とした。博士研究員雇用の予定であったが計画予算より減額しての交付決定であったため、人員計画を練り直し次年度に繰り越して研究補助者等を増員することにした。論文発表のための、英文校正や投稿料の支弁にあてるとともに、最終年度を迎えて研究分担者とより密な打ち合わせに要する国内旅費にあてる。研究補助者2名の雇用、かつ新たに追加した研究分担者2名の旅費等にあてる。
JNK活性化酵素MUK、MSTによるシグナル伝達調節機構

我々はこれまでにMLKに属するタンパク質リン酸化酵素MUKが、MKK7,SEK1をリン酸化/活性化することにより主にJNKの活性化を誘導する事を明らかにしており、この度はこのシグナル伝達系の生理機能を明らかにする目的で結合タンパク質の同定と発現パターンの解析を中心とした研究を計画した。MUK結合タンパク質の同定はYeasttwo-hybrid法を用いたスクリーニングにより行い、MUKのJNK活性化能を抑制するタンパク質MBIP(MUK binding inhibitory protein)をコードするヒトcDNAクローンを同定した。MBIPは既知のタンパク質と一次構造上の相同性を示さないが、タンデムに2個並んだロイシンジッパー様の構造を持ち、この部分でMUKのロイシンジッパー様構造を持つ部分と結合し、活性を抑制する事を明らかにした。MBIPのキナーゼ阻害活性はMUKに対して特異的で、他のMAPKKKであるMEKK1やMUKと同じMLK関連酵素でロイシンジッパー様構造を持つMSTによるJNK活性化を阻害するものではなかった。MUK発現パターンに関しては、今回発生途中の大脳において脳室帯のすぐ外側に位置するintermediate zoneに主に発現しており、この部分でJNKの活性も高いことを見い出した。この事はMUKが神経細胞分化の特定の段階で一時的に発現する事を示すもので、MUKが神経細胞の分化の過程で何らかの役割を担っている事が考えられた。この生理的意義をを明らかにする目的で、MUKのアデノウイルスベクターをマウス胚の側脳室に導入し、脳室帯細胞におけるMUKの異所的発現の効果を検討した。その結果、MUKの発現は神経細胞分化の初期段階を阻害するものでは無いが、その恒常的な発現は脳室帯を離れたあと脳膜側へ向かっての移動(radial migration)を途中で停止させることが明らかになった。これらの結果から、MUK-JNK経路は大脳皮質における未分化神経細胞の移動/分化の制御に関わると考えられた。MUK、MSTはMAPキナーゼ関連酵素であるJNKを活性化するMAPKKKであることを我々はこれまでに明らかにしてきた。JNKはc-Junを始めとする転写因子の活性をリン酸化を介して調節することにより、広く細胞分化やアポトーシスを制御するタンパク質リン酸化酵素である。MUKは脳に、MSTは脳と横紋筋に多く発現していることから、これらの組織における細胞の分化やアポトーシスの制御に関わるものと考えられる。このうちMUKの活性調節機構を探る目的で、Yeast Two Hybrid Systemを用いてこれと結合するタンパク質の同定を試みた結果、MUK特異的な結合タンパク質であるMBIPを同定した。これはロイシンジッパー様のモチーフを持つ分子量約45kDのタンパク質で、MUKの持つロイシンジッパー様構造を介して直接MUKと結合し、MUKの活性を抑制するものであった。MBIPはMEKK1、Cot等他のJNK活性化MAPKKKとは結合せず、MUK同様ロイシンジッパー様構造を持つMLK関連酵素であるMSTとの結合も非常に弱いものであった。よってMBIPのMUKとの結合は極めて特異性の高いものであるといえる。この特異性はMAPKKKとしての活性に対する抑制効果に対しても認められ、調べた範囲ではMUKの活性のみを抑制するものであった。よってMBIPはMUKの活性を特異的に制御するタンパク質と考えられる。MBIPを293T細胞に高発現させることにより、高浸透圧によるJNK活性化が部分的に抑制されたことから、MUK、MBIPが浸透圧の変化に対応したJNKの活性調節に関与している可能性が考えられた。

Mixed lineage kinase(MLK)と呼ばれる一群のタンパク質リン酸化酵素はキナーゼドメインのC末端部に隣接してロイシンジッパー様の構造を持っており、この部分はホモ複合体の形成や他のタンパク質との相互作用を司る部位であると考えられる。我々はこれまでにMLKがMAPキナーゼ、中でもJNK、p38の活性化を引き起こすMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)として機能することを報告してきた。しかしMLKの活性調節メカニズム及び、これがどのような場面でのJNKやp38の活性化に関わっているのかという点については不明であった。我々はMLKの一つMUKのロイシンジッパー部位に結合するタンパク質をYeast two-hybridsystemを用いたスクリーニングにより複数同定し、その中の一つでMBIP(MUK binding inhibitory protein)と名付けたものがMUKの活性を強力に抑制することを見い出した。MBIPはそのC末端部位にロイシンジーッパー様の構造を持ち、このC末端部分がMUKとの結合及び活性抑制に必須であったことから、MLKの他のメンバーにもMBIPは同様の作用を及ぼすことが予想された。しかしMIBPの抑制効果はMLKの他のメンバーであるMSTやMLK以外のMAPKKKであるCotに対しては見られず、MUKに特異的なものであった。そこでこのMBIPを293T細胞に高発現させ、どのような刺激によるJNK活性化がこれにより抑制されるか検討した結果、紫外線、タンパク質合成阻害剤、TNFによるJNK活性化は影響を受けなかったが、高浸透圧によるJNK活性化は、MBIPの量依存的に抑制されることを見い出した。この結果はMUKが浸透圧ショックによるJNK活性化に関与していることを示唆するもので、その生理的意味合いについてさらに検討を加えて行きたい。一方マウスの胚発生期の神経組織においてMUKの高い発現が見られることを手がかりに、神経分化との関連についても研究を進めている。胚にMUKのアデノウイルスベクターを導入する実験等から、これが中枢神経系における神経細胞の移動、分化に関与している可能性を見い出しており、この点についても今後さらに検討を加えて行きたい。これまでにMLKに属するタンパク質リン酸化酵素MUKが、MKK7,SEK1をリン酸化/活性化することにより主にJNKの活性化を誘導する事を明らかにしている。このMUKの活性を調節機構及び生理機能を明らかにする目的で結合タンパク質の同定と発現パターンの解析を目的とした研究を計画した。MUK結合タンパク質の同定はYeasttwo-hybrid法を用いたスクリーニングにより行い、MUKのJNK活性化能を抑制するタンパク質MBIP(MUK binding inhibitory protein)をコードするヒトcDNAクローンを同定した。