hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GIST培養細胞のマイクロRNA解析による新規バイオマーカー探索と薬剤感受性予測

1)GIST症例手術切除標本からのマイクロRNAを解析しImatinib投与前後にてmiR146b-5pとmiR335の2つのマイクロRNAが亢進していることが解析できた.2)GIST培養細胞の樹立が可能となった.3)GIST細胞株をnude mouse皮下へ移植し,作成したマウス皮下移植モデルから血液サンプルを採取しマイクロRNAの発現変化を確認することができた.4)GIST患者の血液サンプルを採取し,マイクロRNAの検出を行った.しかしながら,切除標本から得られたマイクロRNAの結果と,血液サンプルから検出されたマイクロRNAの発現に一致がみられなかった.1)GIST症例手術切除標本からのマイクロRNAを解析しImatinib投与前後にてmiR146b-5pとmiR335の2つのマイクロRNAが亢進していることが解析できた.2)GIST培養細胞の樹立が可能となった.3)GIST細胞株をnude mouse皮下へ移植し,作成したマウス皮下移植モデルから血液サンプルを採取しマイクロRNAの発現変化を確認することができた.4)GIST患者の血液サンプルを採取し,マイクロRNAの検出を行った.しかしながら,切除標本から得られたマイクロRNAの結果と,血液サンプルから検出されたマイクロRNAの発現に一致がみられなかった.1) GIST症例手術切除標本からのマイクロRNAの発現解析:Imatinib投与前後にてmiR146b-5pとmiR335の2つのマイクロRNAが亢進していることが解析できた.今後は組織標本での発現をRT-PCRおよびin situ hybridizationで確認する.2)培養細胞株を用いたマイクロRNAの機能解析:培養細胞の樹立は可能となっているが,長期での継代が困難であるため,今後は培養条件を検討し,安定株を確立する.3) GIST患者の血液サンプルからのマイクロRNAの解析:血液サンプルを採取し,マイクロRNAの検出まで確立した.今後は目的のマイクロRNAの変化を解析する.我々は、世界でも希少なGISTの培養細胞株とマウス皮下移植腫瘍モデルの樹立に成功し、飛躍的にそのメカニズムが解明できる状態となっている。今回の研究ではGIST症例の手術材料からマイクロRNA解析を行い、GISTの薬剤感受性に関する新たなバイオマーカーを探索し、培養細胞にてその機能を検証し、さらに、マウス皮下移植腫瘍モデルにて血液からヒト由来マイクロRNAを検出するシステムを確立し、ヒトでの薬剤感受性試験、予後因子の予測に応用することを目的として研究を行った。1) GIST症例手術切除標本からのマイクロRNAの発現解析:Imatinib投与前後にてmiR146b-5pとmiR335の2つのマイクロRNAが亢進していることが解析できた。2)培養細胞株を用いたマイクロRNAの機能解析:培養細胞の樹立は可能となった.しかし、長期での継代が困難であることがわかり、培養条件の調整により安定株の確立を行っている。3) GIST患者の血液サンプルからのマイクロRNAの解析:GIST症例患者の血液サンプルを採取し、マイクロRNAの検出を行った。しかしながら、切除標本から得られたマイクロRNAの結果と、血液サンプルから検出されたマイクロRNAの発現に一致がみられなかった。4)マウス皮下移植モデルを用いた血液サンプルからのマイクロRNAの解析:GIST細胞株をnude mouse皮下へ移植しin vivoでの薬剤耐性の変化を検討した。作成したマウス皮下移植モデルから血液サンプルを採取しマイクロRNAの発現変化を確認することができた。消化器外科培養細胞の遺伝子導入安定株の樹立に難渋しており,現在遺伝子導入方法と培養条件の検討を行っている.マウス皮下移植モデルを用いた血液サンプルからのマイクロRNAの解析に関しては,細胞株の樹立が遅れているため,解析がまだ始められない.遺伝子導入方法を検討し,最も効率のよい条件を決定し,さらに,長期継代ができるような培養の至適条件を検討し,Imatinibに対する感受性の変化を検討する.マウス皮下移植モデルを用いた血液サンプルからのマイクロRNAの解析に関しては,細胞株の樹立が可能となり次第研究を行う予定である.昨年度は遺伝子導入安定株が樹立できなかったため,マウス皮下移植モデルの作成ができず,マウスを用いた研究が次年度へ持ち越された.また,成果の発表ができなかったため,発表に関連する交通費などが次年度へ持ち越された.遺伝子導入安定株を樹立し,マウスを用いた研究をすすめ,マウスからの血液サンプルを採取し,マイクロRNAの発現変化を解析する.結果が得られ次第,成果発表を行う.
層状遷移金属酸化物におけるスピン・電荷・軌道秩序

本研究で対象とした層状ニッケル酸化物は母物質において反強磁性絶縁体であり、ホールドーピングにより反強磁性的スピンドメインとホール(ドメインウォール)がホール濃度xの逆数の周期で縞状に並ぶ(変調波数x)スピン・電荷ストライプ秩序を示すことでよく知られている。また、この系におけるストライプ秩序はx=1/3において非常に安定であり、様々な物性において特異的振る舞いが観測されている。本年度は、高波数分解能を持つ放射光X線回折実験を用いてx=1/3近傍のストライプ秩序形成過程を詳細に調べると同時に、抵抗や比熱、磁化などの基礎物性を測定し、その関連を調べた。1)1/3近傍でホール濃度をずらした系では、ストライプ周期が温度に対して変化する整合・不整合クロスオーバーが観測される。ストライプの変調波数は低温では従来理論的に示唆される通りほぼXに等しいが、温度上昇に伴い1/3に近づく。このような温度変化によるクロスオーバーは、ハーフ・フィルド(half-filled)なストライプである基底状態に、有限エネルギーでドープされる電子、ホールを考慮したモデルにより定性的に説明できる。また、そのクロスオーバー的振る舞いはx<1/3側で顕著に観測されるものの、x>1/3側では非常に小さい。これは電子のみが励起されやすいことを示唆している。2)以上、整合・非整合クロスオーバーの際には、余剰キャリア(電子)が励起されることになる。上のモデルではその余剰キャリアによって生じる電荷自由度エントロピー項を計算することにより、変調波数の温度変化を算出した。実際にこの系で比熱測定を行った結果、モデルで見積もられる計算値と半定量的に一致する異常エントロピー成分が転移温度以下で観測された。また、転移温度近傍の比熱、抵抗、磁化率に見られるピークは、x<1/3では転移温度直下の余剰キャリアの存在によりなまっており、臨界現象のx=1/3に関する非対称性として観測される。本研究で対象とした層状ニッケル酸化物は母物質において反強磁性絶縁体であり、ホールドーピングにより反強磁性的スピンドメインとホール(ドメインウォール)がホール濃度xの逆数の周期で縞状に並ぶ(変調波数εx)スピン・電荷ストライプ秩序を示すことでよく知られている。本年度は、高波数分解能を持つ放射光X線回折実験を用いてx=1/3近傍のストライプ秩序形成過程を詳細に調べた。1)1/3近傍でホール濃度をずらした系では、ストライプ周期が温度に対して変化する整合・不整合クロスオーバーか観測された。ストライプの変調波数ε(周期の逆数)は低温では従来通りほぼxに等しいが、温度上昇に伴い1/3に近づくという温度変化を示す。このような温度変化によるクロスオーバーは、x=1/3を基準として電子、ホールをドープした際のエントロピー項を考慮することにより定性的に説明できる。これは電子の方がホールより低エネルギーでドープされることを示唆しており、1/3を基準とした電子・ホール非対称性の顕れとみなすことができる。2)x=1/3ではストライプ秩序の振幅及び面内相関が最大となるが、その一方で面間の相関は周辺の組成に比べて弱くなっており、最低温(10K)でも2次元的な成分が明瞭に残っている。これよりこのfixed pointでは、準2次元的な準長距離秩序という特殊な状態が実現されていることが分かった。

また、転移温度近傍の比熱、抵抗、磁化率に見られるピークは、x<1/3では転移温度直下の余剰キャリアの存在によりなまっており、臨界現象のx=1/3に関する非対称性として観測される。
炉材料及びプラズマ・壁相互作用(総括班)

第1班の研究課題は炉材料およびプラズマ・壁相互作用であり、今年度は61、62、63年度3年計画の最終年度としてまとめを強く意識すべき年であったので、第1サブ班の構造材料、第2サブ班の炉内材料というサブテーマを元来の課題からもう一度原点にもどって反省しつつ研究の進展を推進することを第1班総括班の活動の主な目的として実施した。総括班会合は昭和63年4月25日、昭和63年9月12日、昭和63年12月19日、平成元年3月4日の4回にわたって行い、課題採択の状況、計画研究の進行、関係する国際的会合などの情報の交換を行うと共に、炉材料・炉内材料の両サブ班に共通する課題である低放射化材料の研究現状およびそもそも低放射化材料とは何かという問題にもさかのぼって議論を行った。さらに炉内材料については従来プラズマ粒子の負荷を主に考えていたが、次段階の研究は当然14MeVの中性子負荷が加ってくるので、その照射による材料の性質の劣化がどのような点で予想されるかということを分科会を編成して討議し、今年の研究方向を判っきりとさせた。さらに来年度は10年間にわたる核融合特別研究の最終年度であるので、10年間の活動を炉材料のデータベース確立という観点からみたとき、どのような項目を充足しなければならぬかという観点に立っての議論を行った。この議論の結果は、昭和64年(平成元年)度の核融合特別研究の応募に反映されていると共に、昭和63年度の第1班所属の研究者に周知させ、データベースとして意識をもっていただくことを要請した。
階段を用いた運動プログラム作成のための基礎的研究

階段を用いた運動プログラム作成の基礎的研究のために、(1)従来広く用いられている運動様式であるトレッドミル走・歩と階段式トレッドミル昇行時の生理学的応答に関する比較研究(2)階段式トレッドミルを用いて、各種スピ-ド(20、30、40m/min)における階段昇降運動時の休息欲求とその時の生理学的応答あるいは個人の性格との関連性を究明することを目的とした。なお、最大および最大下作業中のVo_2はダクラスバッグ法で、また心拍数(HR)は日本電気三栄製の心電図モニタ-で測定した。その結果、次のような知見が得られた。(1)Vo_2-HR直線はトレッドミル走・歩行および階段式トレッドミル昇行の三運動様式にほとんど差がなかった。なお、階段式トレッドミル昇行時のVo_2とHRとの回帰直線はHR(beats/min)=66.3+2.46Vo_2(ml/kg・min)(γ=0.77)であった。(2)Vo_2max改善の下限の運動強度が4050%Vo_2maxであることが知られているが、それは階段式トレッドミル昇行時では心拍数が120135拍/分に相当する。ただし、HR-%Vo_2maxの直線は、HR(beats/min)=69.76+1.27%Vo_2max(%)(γ=0.72)となった。(3)階段式トレッドミル昇行中に生ずる休息欲求はSteppingスピ-ドと密接な関係がある。すなわち、steppingスピ-ドが速くなくにつれて、休息欲求が生じた時点の%Vo_2maxが高い。(4)各stepping・スピ-ドにおける作業時間は作業回数が増えるにしたがって短縮した。これらの作業時間の長さと休息欲求が生じた時の%Vo_2max、%HRmaxなどとの間に密接な相関関係が認められなかった。(5)これらの作業時間の長さと個人のモ-ズレイ性格検査における外向性尺度(E)との間に統計的に有意な負の相関関係が認められた。
日英語韻律特徴の分析と発音学習

本研究は、5章に分けられる。第1章、日本人学生の英語文章音読の特性分析、第2章、日本語文章音読の特性分析、第3章、日本語文章音読と日本人学生の英語文章音読における鼻音率の比較対照、第4章、吃音者の日本語音読における緊張と基本周波数(ピッチ)の関係、第5章、A1-B1-A2-B1パラダイムを用いた緊張の吃音に及ぼす効果の事例研究である。第1章では、日本人の英語音読がフラットになる傾向を指摘した。これは、緊張状態のひとつの表れと見ることができるかもしれない。この可能性の追究は今後の課題である。第2章では、プロの範読者の日本語音読のピッチ変化を求めた。自己相関分析の結果、任意の文節のピッチは後続2文節まで影響することが明らかになった。このようなパタンが英語範読者の場合どうか、日本人が英語を音読する場合にどうなるかが今後の重要な課題として残る。第3章は、大学生を対象に、日英語音読における鼻音率を測定した。日本人は鼻音の使い方で2群に分けられる可能性を示唆した。第4章と第5章は、日本人吃音者を対象とした事例研究である。これは、音読における緊張度の及ぼす効果を求めることを目的とした。それは、健常者に比べて緊張度の効果が大きいことがあり、そこで得られる変数は健常者にも多かれ少なかれ問題となりうると考えられるからであった。第4章では、緊張条件では、基本周波数が平静条件に比べて、平均5Hz高くなるという結果を得た。第5章では、さらに厳密に条件を統制してA-B-A-Bパラダイムを用いて基本周波数を測定し、第4章の結果を確認した。これらから音読学習および発音学習の部分的な示唆が得られるが、韻律のみならず、子音と母音の音響的、音声的な特徴の分析も必要となることが研究の過程で明らかになった。研究目的の中で、(1)日本語文章音読の特性分析、(3)日本人学生の英語文音読の特性分析、(5)日本語文章音読と日本人学生の英語文章音読の比較対照、(6)英語文章音読と日本人学生の英語文章音読の比較対照をおこなった。(1)については、最小句の持続時間および基本周波数の測定をおこない、現在、論文の修正中である。(3)については、基本周波数、鼻音化の測定をおこない、分析中である。(5)は、(3)の結果に基づき、持続時間については、日英語の句末と文末の延長化現象の比較を含めて、発展的な分析を試みている。また、鼻音化現象については、日英語において語レベルと文レベルでおこなった。(6)は、テキストレベルの比較で、英語母語話者の英語文章音読は、文音読の単なる集合でないことが先行研究で示唆されたが、これを確認し、日本人学生がそのような特徴を有しているかどうかを検証した。これについては、現在、作成した論文の修正中であり、新情報と旧情報が持続時間と基本周波数に反映されない傾向が示された。なお、日本語の音読について、吃音者を新たに被験者として得た。この被験者の事例研究として、聴衆(1名)の有無および間投詞の有無の効果を検討し、とくに聴衆の有無が音読速度、吃音頻度、基本周波数におよぼす効果を確認した。これは、Medical Hypothesesに投稿し、現時点で採択された。

ここでは、このパラダイムを展開して、吃音に新たな治療法が提供できるかどうか、また、この緊張度効果が健常者にも当てはまるかどうか、といった新たな問題が提起されている。18年度では、日本語文章音読の特性分析、日本人学生の英語文章音読の特性分析、日本語文章音読と日本人学生の英語文章音読の比較対照、英語文章音読と日本人学生の英語文章音読の比較対照をおこなったが、それぞれをまとめ文章化した。また、18年度末に実施した吃音者の日本語音読における緊張と基本周波数(ピッチ)の関係について、本年度は、その展開研究として、同じ吃音者を対象に、A1-B1-A2-B1パラダイムを用いて、緊張の吃音に及ぼす効果の事例研究をおこなった。ここでは、A条件は、聞き手あり、B条件は、聞き手なし条件であり、それぞれの条件で日本語文章の音読が5回なされ、それぞれテープに録音された。録音された音読を16ビット、サンプリング22,000Hzでデジタル化し、スピーチアナライザーで、それぞれの文章における文節の基本周波数と吃音の有無を計測した。その結果、平均吃音数は、聞き手ありのA条件で高く、平均基本周波数は5Hz高いことが明らかになった。したがって、聞き手存在が吃音生起率を高めると同時に、吃音のない流暢発話においてもピッチを高くすると解釈できる。なお、予備的研究として、非吃音者を対象にしたA-Bパラダイムにおいて聞き手あり、なし条件と基本周波数の関係を調べたが、聞き手ありでは、逆に基本周波数が低くなる傾向を確認した。これら相反するように見える結果は、緊張、感情、基本周波数、吃音の関係が複雑であることを示唆し、今後の新たなテーマを提供することになる。これらから音読学習および発音学習の部分的な示唆が得られるが、韻律のみならず、子音と母音の音響的、音声的な特徴の分析も必要となることが研究の過程で明らかになった。
新規シクロデキストリン二量体の合成及びそれを用いた閂型ロタキサンによる情報発信

前年度、世界に先駆けヘテロジーニアスなシクロデキストリン二量体(1a, b)の合成に成功した。これらは連結部位の構造は同じで、シグロデキストリンの種類が異なるだけという非常に特異な化合物であり、その疎水場に由来する包接能を利用して閂型ロタキサンの合成に関する本年度研究を行った。まず糸としてアクリジンを末端に持った化合物、2a及び2bの合成を行った。まずピレンのモノ臭素化とジ臭素化化合物をそれぞれほぼ定量的に合成できることを明らかにした。その部位をリチオ化してDFMと反応させることによりアルデヒド基を導入するごとが出来た。(収率(2a;65%,2b;43%))また、NaBH_4でほぼ定量的にアルコールへ還元し、ピレン部分の構築の基本的部位の構築を行った。2aはアルコール部を臭素化した後ヘキサエチレングリコールの末端をTHP保護した化合物と塩基性条件下で反応させることにより鎖の導入を行った。その後脱保護、ヨウ素化を経て、アクリジンと反応させることにより総収率10%で閂の働きをする化合物3を得た。2bは同様に臭素化した後鎖の導入を行った。種々の検討の結果、閂と同じ長さの鎖を用いることが機能発現に必要不可欠であることが分かった。まず、一方だけ脱保護後ヨウ素化しアクリジンと反応させた。次に脱保護後ヨウ素化しジピリジル基の導入を行い総収率2%で糸の働きをする化合物4を得た。各々の構造決定は、MassスペクトルおよびNMRスペクトルにより確認した。実際糸4とヘテロジーニアスなシクロデキストリン二量体1aをDNA共存下反応させた後、透析することでロタキサンを得ることが出来た,この溶液に閂である3を加えていくことで、ピレンエキシマーの蛍光が現れ、閂型ロタキサン構造体が生成していることが明らかになった。また、ヘテロジーニアスなシクロデキストリン二量体1bをかわりに用いた場合は、ロタキサンが生成しないと言う非常におもしろい結果が得られた。研究課題である擬似ロタキサン構造体を構築する上で必要不可欠なシクロデキストリン二量体として、二位二級水酸基と六位一級水酸基が直接結合した新たな化合物の合成に世界に先駆け成功した。この合成方法を用いると一般に入手しやすい3種類のシクロデキストリンから類似構造を持った様々なシクロデキストリン二量体が合成できることを明らかにした。今年度は、六位水酸基をトシル化したγ-シクロデキストリンとα-シクロデキストリンモノオキシアニオンとの反応によりγ^6,α^2-ヘテロジニアスシクロデキストリン二量体(1a)が合成できることおよびその構造決定を主に行った。あわせて異性体であるα^2,γ^6-ヘテロジニアスシクロデキストリン二量体(1b)を、六位水酸基をトシル化したα-シクロデキストリンとγ-シクロデキストリンモノオキシアニオンとの反応により行った。合成した化合物の精製には今年度導入したHPLC(逆層カラム使用)により展開溶媒を水から水:アセトニトリル9:1に変化することにより、効率良く単離できることを明らかにした。各々の構造決定はTof-Massスペクトルの結果から(1a, b)ともに同じ分子量(m/z=2276[M+Na]^+,C_<84>H_<138>O_<69>Na=2274.4)であることをまず確認した。また、^<13>C NMRの測定結果から、得られた化合物がシクロデキストリンの二位二級水酸基と六位一級水酸基間で直接結合していることが、置換されたグルコース炭素のケミカルシフト変化から明らかになった。次に、これらの化合物の機能評価をSodium6-(4-t-butylanilino) naphthalene-2-sulfonate(BNS)で行った。その結果から、1a, bともにそのキャビティー内に取り込まれることが明らかになったが、その包摂能は共同的でなく、平衡定数を算出すると10^3程度であることを明らかにした。以上の結果から次年度新たな擬似ロタキサン構造体が構築可能であると考えられる。

2bは同様に臭素化した後鎖の導入を行った。種々の検討の結果、閂と同じ長さの鎖を用いることが機能発現に必要不可欠であることが分かった。まず、一方だけ脱保護後ヨウ素化しアクリジンと反応させた。次に脱保護後ヨウ素化しジピリジル基の導入を行い総収率2%で糸の働きをする化合物4を得た。各々の構造決定は、MassスペクトルおよびNMRスペクトルにより確認した。実際糸4とヘテロジーニアスなシクロデキストリン二量体1aをDNA共存下反応させた後、透析することでロタキサンを得ることが出来た,この溶液に閂である3を加えていくことで、ピレンエキシマーの蛍光が現れ、閂型ロタキサン構造体が生成していることが明らかになった。また、ヘテロジーニアスなシクロデキストリン二量体1bをかわりに用いた場合は、ロタキサンが生成しないと言う非常におもしろい結果が得られた。
木質系廃材を原料とした酸加水分解リグニンからの新規機能性材料の創製

バイオマスは再生可能な資源であることに加え、カーボンニュートラルという特徴を持つことから、バイオマスの利用は地球温暖化ガスの排出削減に大きく貢献することが考えられている。木質系資源はその存在量からバイオマス利活用の中心を担うものとして期待されているが、経済性などの問題から、間伐剤・被害木を含む林地残材や建築廃材などの利用が十分でない。これら木質系廃材の化学的高度利用には酸加水分解法による糖化・醗酵によるエタノール生産が有効な手段であるが、副産物として多量に産出する酸加水分解リグニンの有効な利用方法がない。しかしながら、酸加水分解リグニンはフェノール性の高分子であることから、効率的な化学変換により、高付加価値の製品を生み出すことが可能であり、さらに、酸加水分解糖化法は「エネルギー利活用」だけでなく「製品利活用」にも有効な手段となり得る。前年度は、硫酸を用いて得られた酸加水分解したリグニン(硫酸リグニン;SAL)をフェノールと反応させることにより、反応性の高い高分子へと変換しうることが分かり、アニオン性およびカチオン性の水溶性高分子やイオン交換樹脂に変換することに成功した。本年度は、広葉樹と針葉樹との反応性の違いについて調べた。ブナのSALはアカマツのものと比べて容易にフェノールと反応し、高い割合で可溶性フェノール化硫酸リグニンを生成した。フェノール化におけるシリンギル核とグアイアシル核との反応性の違いを調べるため、ブナからシリンギル核リッチのSAL(S-rich-SAL)およびグアイアシル核リッチのSAL(G-rich-SAL)を調製し、各々をフェノール化に供した。その結果、S-rich-SALの反応性がG-rich-SALよりも高く、S-rich-SALは、より少ないフェノール導入量で可溶性フェノール化硫酸リグニンに変換されることが分かった。モデル化合物による検討結果も、上記検討結果を支持した。本研究にて、酸加水分解リグニンの構造および反応性に関する研究を進めるうちに、硫酸を用いて得られた酸加水分解したリグニン(硫酸リグニン)をフェノールと反応させることにより、反応性の高い高分子へと変換しうることが分かった。このフェノール化硫酸リグニンにスルホン酸基、カルボキシメチル基、アミノメチル基などを導入することにより、アニオン性およびカチオン性の水溶性高分子への変換に成功した。このアニオン性水溶性高分子は、市販のリグニン製品であるリグノスルホン酸よりも高い分散性能を示し、また、カチオン性水溶性高分子は、紙へのロジンサイズ剤定着剤として、酸性から中性までの広い範囲で優れた能力を有することが明らかとなった。イオン交換樹脂は、フェノール化硫酸リグニンへの親水基導入とホルムアルデヒドによる樹脂化を組み合わせることにより、誘導に成功した。これら変換物は高分子電解質という性質を持つことから、上記性質のほかにも、様々な機能を有することが期待される。その結果、S-rich-SALの反応性がG-rich-SALよりも高く、S-

rich-SALは、より少ないフェノール導入量で可溶性フェノール化硫酸リグニンに変換されることが分かった。モデル化合物による検討結果も、上記検討結果を支持した。
原因腸内細菌抗原特異的自己免疫慢性大腸炎モデルと発症抑制プロバイオティクスの開発

炎症性腸疾患慢性化永続化における腸内細菌の関与を追究する目的にてCD4^+CD45RB^<high>細胞を免疫不全マウス(Rag-1^<-/->マウス)へ移入する慢性大腸炎モデルを用いて追究した。(2)(1)にて腸炎発症(-)の腸炎惹起性免疫メモリー細胞移入無菌-Rag-1^<-/->マウスには、脾臓、リンパ節、骨髄にCD4+メモリー細胞が腸炎発症(+)の移入SPF-Rag-1^<-/->マウスに比し少数(20-35%)ながら存在していた。(3)(2)(1)にて腸炎発症(-)の腸炎惹起性免疫メモリー細胞移入無菌-Rag-1^<-/->マウスをSPF環境下へ移行すると短期間に再び類似大腸炎を発症した。以上の結果より、腸炎惹起性CD4^+メモリーT細胞は腸内細菌のTLR刺激による直接的なシグナルによって調整を受けるものの、無菌下においても生存し得ることを明らかとした。このことは腸炎惹起性免疫メモリー細胞は腸内細菌以外の因子(例えばIL-7)によって生体内で維持される機構の存在が示唆された。さらに、いかなる腸内細菌が大腸炎慢性化に関わり、いかなる腸内細菌が大腸炎抑制に関わるかを追究することにより今後の炎症性腸疾患の治療戦略において極めて重要と考えられた。本研究では腸内細菌がどのような分子メカニズムに基づき、炎症性腸疾患発症のどの過程に関与するのかを明らかにすることを目的として、1)細菌に共通する認識機構であるToll-like受容体刺激が慢性大腸炎病態に必須であるか否かを明らかとし、2)最近、我々が開発した同一免疫記憶細胞継代自己免疫マウス家系システムおよびSingle PathogenicColiticT Cell Clone Transfer Colitisモデルを用いて慢性大腸炎責任腸内細菌特異的抗原の同定を検討した。(1)自然免疫系が著しく障害されているMyD88欠損マウスおよびlittermate controlマウスにDSSを投与したところ、予想に反しMyD88欠損マウスにより重篤な大腸上皮細胞の障害を伴うDSS大腸炎が惹起された。以上より、自然免疫系はマクロファージ・樹状細胞を介した免疫系への亢進シグナルばかりではなく上皮細胞系への再生亢進シグナルにも関与することが示唆された。(2)一方、MyD88欠損マウスより分離したCD4^+CD45RB^<high>細胞をSCIDマウスへ移入したところ、コントロールCD4^+CD45RB^<high>細胞同等の腸炎を惹起し、さらに、MyD88欠損マウス由来CD4+CD25+制御性T細胞はコントロールCD4+CD25+細胞同等に腸炎の発症を抑制したことにより、慢性大腸炎発症制御には獲得免疫系T細胞のToll-like受容体の関与は少ないことが予想された。(3)無菌下(GF)マウスより分離したCD4^+CD45RB^<high>細胞移入SCID腸炎モデルはGFSCIDマウスの調整を終え実施予定である。さらにはGFマウスのプロバイオティクス投与実験を行う予定である。炎症性腸疾患における腸内細菌の関与を追究する目的にてCD4+CD45RBhigh細胞を免疫不全マウス(Rag-1-/-マウス)へ移入する慢性大腸炎モデルを用いて追究した。(1)本モデル炎症大腸局所には腸炎惹起性CD4+CD44highCD62L-IL-7Rhighメモリー細胞が存在し、再びSPF-Rag-1-/-マウスに移入すると約5-6週で大腸炎を発症したのに対して、無菌-Rag-1-/-マウスの場合は移入後大腸炎を発症しなかった。以上より、腸炎の慢性化には腸内細菌の存在が必要であると示唆された。(2)(1)にて腸炎発症(-)の腸炎惹起性免疫メモリー細胞移入無菌-Rag-1-/-マウスには、脾臓、リンパ節、骨髄にCD

4+CD44highCD62L-IL-7Rhighメモリー細胞が腸炎発症(+)の移入SPF-Rag-1-/-マウスに比し少数(20-35%)ながら存在していた。(3)(1)にて腸炎発症(-)の腸炎惹起性免疫メモリー細胞移入無菌-Rag-1-/-マウスを再びSPF環境下へ移行すると約2-3週の短期間に再び類似の大腸炎を発症した。以上の結果より、大腸炎慢性化には腸内細菌の存在が必須であるが、腸炎惹起性免疫メモリー細胞は腸内細菌以外の因子によっても生体に維持される機構の存在が示唆された。さらに、いかなる腸内細菌が大腸炎慢性化に関わり、いかなる腸内細菌が大腸炎抑制に関わるかを追究することにより今後の炎症性腸疾患の治療戦略において極めて重要と考えられた。
現代の生活環境における行動履歴が生理的多型性に及ぼす影響、及びその適応性評価

本研究では光、温度、重力の各ストレスが及ぼす生理反応への影響から現代生活における適応性を評価した。その結果以下のことがわかった;1)朝の十分な光曝露と夜の電球色照明の選択は、概日リズムを調整し夜型化を抑制する。2)身体の運動不足や冬季暖房の慢性的利用は基礎代謝量を低下させ、耐寒性、耐暑性を低下させる。身体的運動はこれらの低下を向上させる。3)立ちくらみ頻度は夜型に多く、夜型は重力負荷に対する心拍応答が大きく直立耐性を低下させる。基盤研究S(H15-19年度)の成果から、場合によっては個々の計測値自体から個体固有の意味のある差を検出するよりも、個体内の計測値間で構成される協関反応のパターンにその特徴をみる方が適応性評価の観点から優れていることが明らかになった。本研究ではこの成果を踏まえ、現代の物理的・文化的環境における行動履歴が生理的多型性に及ぼす影響として、特に光、温度、重力の要因に対する日常の行動履歴を抽出し、それに関連する特徴的な生体反応として全身的協関反応のパターンに注目して、現代の生活環境における適応性を評価する。(1)光要因に対する行動履歴として目中の光曝露量に注目し、季節による日照量の差や個人の光曝露量の差による光反応の違いを夜間のメラトニン分泌と体温を含む生体リズムから解析し、光に対する適応性を評価する。(2)現代社会で問題になっている生体リズムの夜型化に対して、内因性(生理)要因と外因性(環境)要因の関連性を検討し、光に対する適応性を評価する。(3)温熱要因に対する行動履歴として身体活動度、食行動、栄養バランス、空調機利用度など生活習慣に注目し、これと寒冷と暑熱ストレス下の体温調節協関反応の関係から温熱に対する適応性を評価する。(4)重力要因に対する行動履歴として身体活動度、暑熱曝露歴に注目し、血圧調節(直立耐性)の協関反応から潜在機能の顕在化を含む適応性を評価する。日中の異なる光曝露履歴が夜間の光刺激によるメラトニン分泌抑制反応に与える影響を冬季(12月)で検討した。実験は連続する4日間を1セットとし、2目目4日目までの09:0012:00を約150luxの照度環境下で過ごす暗条件と、約12000luxの照度環境下で過ごす明条件の2セットを行った。現在、夏季・冬季それぞれでの実験を完了し、冷凍保存してある唾液と尿から分析用キットを用いて唾液中メラトニン濃度及び尿中6-sulfatoxymelatonin濃度を分析し、得られたデータの解析を進めている途中である。(安河内)。若年成人男子14名を対象に日中の光曝露履歴と夜間のメラトニン分泌の関係を調べた。起床後6時間の間に500ルクス以上の光を浴びた時間とメラトニンの分泌開始時刻の問に負の相関があった。日中の光曝露履歴とメラトニン分泌量の問には有意な相関はなかった(樋口)。冬季寒冷下の体温調節にみられる協関反応パターンと生活行動履歴の関係を明らかにするために、北海道出身の健康な20歳代の男性7名を対象に、寒冷曝露実験、最大酸素摂取量測定、行動量調査、食物摂取頻度調査、基礎代謝量測定を行った。データは現在解析中である(前田)。行動履歴と直立耐性協関反応の関係について、大学生男女あわせて約500名を対象に立ちくらみの頻度と生活履歴についてアンケート調査を行った。生活履歴に関する調査項目は普段の食事運動習慣、朝型夜型質問紙、およびアルバイトの形態についてであった。現在データを解析中である(石橋)。午前中の異なる照度条件が夜間のメラトニン分泌、体温リズムに及ぼす影響と季節差を検討するため、夏季実験を昨年の冬季実験と同様の方法で夏至前後に実施した。その結果、夜間メラトニン分泌に対する午前中の光条件の影響について明確な季節差はなかった。一方、午前中の強い光曝露は、夜間の光による位相後退を緩和し、体温リズムを前進させた。冬季の光に対する感受性の増大により、体温リズム調整を安定化させる効果がみられた(安河内)。夏季暑熱負荷時の体温調節反応における協関パターンと生活行動履歴の関係を明らかにするために、北海道出身の健康な20歳代の男性15名を対象に、下肢温浴実験、最大酸素摂取量測定、行動量調査、食物摂取頻度調査、基礎代謝量測定を実施した。最大酸素摂取量の増加は、暑熱下の発汗開始の遅延、発汗上昇の抑制、発汗開始時の皮膚血流の増加をもたらすことが示唆された。また、昨年度実施した冬季寒冷下における一連の実験を6名について追加実施した。冬季データおよび冬季と夏季の類似性については現在解析中である(前田)。若年成人男子14名を対象に、慨日リズム位相と夜に光曝露(1000lux,4時間)を行ったときのメラトニン抑制率の関係を調べた。

その結果、両者の間には負の相関関係が認められ、光に対するメラトニン抑制の反応性が高い個体ほど慨日リズム位相が早いことが分かった。光に対する非視覚系の反応の個体差が慨日リズム位相に影響している可能性が示唆された(樋口)。直立耐性の個人差に関連して、高齢者約200名を対象に生活習慣と立ちくらみに関するアンケートとを実施した。大学生を対象とした昨年度の結果と同様に高齢者においても夜型志向と立ちくらみの頻度の関係に有意な関係が認められたが、大学生で認められた身体活動の有無と立ちくらみの頻度との関係について、高齢者では認められなかった。また直立耐性の潜在機能の顕在化について電子制御型下半身陰圧刺激装置を製作し性能評価実験を実施した(石橋)。LED3000K、蛍光灯3000K及び蛍光灯5000Kを夜間の照明光として、午前1時から2時30分までの光曝露による体温リズム位相への影響を検討した。その結果、直腸温、皮膚温の変化には光条件間の差が見いだされなかったが、LED3000Kの条件下で直腸温の最低時刻が他の光条件よりも早くなる傾向がみられ、LED3000K光曝露下の小さいメラトニン分泌抑制に関連していることが示唆された(安河内)。若年成人男子14名を対象に、慨日リズム位相と夜に光曝露(1000 lux,4時間)を行ったときのメラトニン抑制率の関係を調べた。暑熱負荷および寒冷暴露時の体温調節反応と身体活動量の関係を詳細に検討するために、成人男性を対象に、暑熱負荷実験、寒冷暴露実験、最大酸素摂取量測定、行動量調査、食物摂取頻度調査、基礎代謝量測定、血管機能検査を、8週間の運動トレーニング後に実施した。トレーニング後では、暑熱時の発汗開始時皮膚血流増加及び寒冷時の皮膚血流低下増大がみられ、これらは最大酸素摂取量や血管機能とそれぞれ正相関及び負相関が認められた。身体活動量増加は体温調節協関反応パターンを変化させ、耐暑性および耐寒性を向上させることが示唆された(前田)。電子制御型下半身陰圧装置を用いて周波数領域での起立性循環調節の応答特性を探るため正弦波様の陰圧負荷をかける制御方法を開発した。これにより直立時の血管収縮反応の周波数領域での応答の測定が可能となった。また人工気象室が使用できない状況での暑熱負荷方法として水循環スーツをもちいた温熱曝露装置を導入した。これら最終年度にむけて測定環境の整備を行った(石橋)。オフィスワークを想定した実験室実験において、東日本大震災以降実施されることが増大したオフィスの推奨照度(750 lx)以下の節電照度水準の妥当性を、オフィス生産性、主観、サーカディアンリズムの観点から検討した。その結果、朝9時から750 lx、色温度6000Kで維持したのち、午後2時から5時にかけて400 lx及び4000Kに漸減する照明制御方法が750 lx(5000K)一定条件よりサーカディアンリズムにおいて優れていることが明らかになった。また節電照度となる400 lx一定条件では生産性及びサーカディアンリズムにおいて問題が残ることが示唆された。
虚血・低酸素により誘導される新生期の脳障害への小胞体ストレス反応の関与の検討

新生期に生じる虚血・低酸素が引き起こす脳障害への、小胞体ストレス反応の関与を検討することが主目的であるが、本年度は初代細胞培養系(神経・グリア共培養)による低酸素・無糖負荷モデルを用いて、虚血性脳細胞死と小胞体ストレス反応の関係を検討した。本培養系ではツニカマイシン(糖鎖修飾阻害剤)処置により、核の凝集・断片化を伴うアポトーシス様の細胞死が起こり、同時に小胞体分子シャペロンの発現が免疫細胞染色により認められた。低酸素・無糟負荷(1%O_2・4時間)では同様の所見が認められた。長時間の低酸素・無糖負荷(1%O_2・12時間)および低酸素・無糖・2-deoxy-D-glucose負荷(1%O_2・4時間・2-deoxy-D-glucose25mM)では、小胞体分子シャペロンの発現を示すが、核染色・死細胞染色により判断した細胞死の形態は、アポトーシスとネクローシスの混在を呈していた。細胞に対するストレスの程度(低酸素暴露時間等)と細胞死および小胞体分子シャペロンの発現程度を定量化することが今後の課題となる。現時点では、遺伝子変異マウスを用いた培養実験は施行されていない。今後の研究では、細胞レベルでは虚血性神経細胞死の病態における、小胞体ストレス反応と低体温の影響を明らかにするとともに、個体レベル(新生ラット虚血・低酸素モデル、成熟ラット脳虚血モデル)の実験を組み入れていくことを理想としている。
非コンパクト多様体上の幾何構造を保つ同相写像のなす群の研究

幾何学において,多様体(局所的にユークリッド座標系を持つ空間)は最も重要な研究対象となっている.多様体Mの連続変換全体は同相群と呼ばれ,その性質の解明は多様体Mの幾何的性質の理解にとって重要である.本研究では,特に,ユークリッド空間のように無限に伸びた開多様体の場合に,体積を保つ変換全体のなす同相群を中心に考察し,その性質を解明した.幾何学において,多様体(局所的にユークリッド座標系を持つ空間)は最も重要な研究対象となっている.多様体Mの連続変換全体は同相群と呼ばれ,その性質の解明は多様体Mの幾何的性質の理解にとって重要である.本研究では,特に,ユークリッド空間のように無限に伸びた開多様体の場合に,体積を保つ変換全体のなす同相群を中心に考察し,その性質を解明した.多様体M上で,与えられた幾何構造を保つ(微分)同相写像の成す群の位相的・代数的性質の解明は,幾何学の研究において重要なテーマの1つである.この研究は,コンパクト多様体に関して進展し,多くの重要な結果を生み出すと共に,その理論が体系化されてきた.しかし,非コンパクト多様体に関しては部分的な結果に留まり,その理論的な枠組みは整理されていない.本研究では,非コンパクトな多様体の(微分)同相群に関する体系的な研究を目標としている.本年度の研究成果は,次の様に要約される.多様体M上で測度mが与えられたとき,mを保存する同相写像全体の成す群の内部構造を解明することは,幾何・力学系の分野で興味のある問題である.Mが非コンパクト多様体のときには,mを保存しエンド(無限遠点)を固定する同相写像hに対しては,hにより各エンドに向かう測度の移動量(エンド・チャージ)sを測る事が出来る.我々は,移動量sを与えたときに,この移動量を持つ同相写像hが実現できるかという問題を考察し,sに対してhを連続的に構成できる事を示した.すなわち,mを保存しエンドを固定する同相写像h全体の成す群Gからエンド・チャージs全体の成す位相線形空間Vへのエンド・チャージ準同型と呼ばれる連続準同型cが連続なセクションを持つことを示した.これにより,準同型cの核が群Gの強変形レトラクトとなることがわかり,Gの構造の理解が1歩前進した.次の問題は,準同型cの核とmを保存するコンパクト台を持つ同相写像全体の成す群G_cの関係の解明であり,準備として,非コンパクト多様体におけるmを保存する同相写像に関する拡張定理に関しての研究が前進している.また,非コンパクト多様体上の(微分)同相写像の成す群にWhitney位相と呼ばれる位相を入れた場合の,この位相群の位相型の研究も共同研究により進展している多様体上の与えられた幾何構造を保つ(微分)同相写像の成す群の位相的・代数的性質の解明は,幾何学の研究において重要なテーマの1つである.本年度も,非コンパクト多様体の(微分)同相群,測度保存同相群,体積形式保存微分同相群を中心に,コンパクト-開位相及びWhitney位相の下での同相群の位相的性質の研究を進めた.研究方法の進展として,同相群にとらわれず,まず,無限次元の位相群・変換群に関する研究を進め,その理論を構築する事を第一目標とし,同相群はその重要な例であると捉えて研究を進めた.(前年度から進展した研究も含め)本年度得られた研究成果は,以下の項目に要約される:(1)無限次元の位相群・変換群及びLF空間をモデルとする無限次元位相多様体に関する基礎的な研究(2)変換群に関する埋め込みの拡張性についての研究(3) Whitney位相を入れた同相群,微分同相群の位相型の研究(4)位相群への連続写像のなす空間の位相型の研究(5)測度保存埋め込みの測度保存同相写像への拡張に関する結果とその測度保存同相群への応用(6)非コンパクト多様体の体積形式保存微分同相群の位相的・代数的性質の研究(7)開曲面の微分同相群と体積形式保存微分同相群の位相型の研究さらに,研究分担者福井氏主催の研究集会の開催に協力した.
アロメラニンの構造研究

菌類のアロメラニンは、1,8ージヒドロキシナフタレン(DHN)から生合成されるメラニンである。本研究はその構造解明を目指しているが、未だその解明には至っていない。今回、本研究を実施した結果、いもち病菌によるアロメラニンの生産について重要な知見を得た。いもち病菌の培養ろ液中には、生体内基質であるDHNやその類似構造の1-ナフトール(1-NP)を、それぞれ黒色のメラニンや紫色のポリマーに変換する酵素活性があることが分かった。DHNを培養ろ液中に添加して反応させることにより、黒色のアロメラニンを有機溶媒に不溶性のポリマーとして得ることができた。このもののFT-IRは、腐植酸類似のメラニン特有のスペクトルを示すことが分かった。また、培養ろ液中の変換活性は、醤油ー砂糖培地、ジャガイモ-砂糖培地、イナわら-砂糖培地で培養した場合、ジャガイモ培地の培養初期から変換活性が高かった。醤油ー砂糖培地で培養した培養ろ液を凍結乾燥し、セファデックスのカラムクロマトグラフィーを繰り返して、変換活性を示す分画を得た。この分画を用いてDHN、1-NPやその他のフェノール類に対する変換反応を、UVスペクトルにより追跡した。また、これらのフェノール類の塩化第二鉄、フェリシアン化カリウムにより得られるポリマーと色調が類似していた。菌類のアロメラニンは、1,8-ジヒドロキシナフタレンから生合成されるメラニンであり、本研究は、その化学構造の解明を目的としている。今年度の研究では、菌類として農業上重要な菌類として、いもち病菌(イネ菌とミョウガ菌)について、それらのアロメラニンの培養による蓄積の様子とその化学的な抽出方法について検討した。イネ菌は、振盪培養によるメラニン化は遅いのに対して、ミョウガ菌は振盪培養でも菌体の黒色化が良好であることが分かった。そこでアロメラニンの抽出材料として、ミョウガ菌を用いることにした。ミョウガ菌を寒天培地または液体培地による振盪培養により、いずれも培養後期(10日以上)に菌体の黒色化がしたものを材料に用いた。この黒色菌体を、様々な条件(熱水抽出、超音波破砕、濃アルカリ、強酸処理など)で色素の抽出を試みた。その結果、熱水抽出、超音波、強酸処理では、まったく抽出されず、アロメラニン構造はこれらの化学的処理では破壊されず極めて安定なものであることが判明した。唯一、黒色色素の一部と思われるものが遊離したのは、濃アルカリ条件(ガラス器具洗浄用)下に沸騰水中での加熱により、アロメラニンの一部のフラグメントと思われるものが溶液中に分解遊離することが分かった。今後、徹底的な化学的処理による夾雑物の除去方法を確立し、アロメラニン構造を走査型プローブ顕微鏡などを用いて、その解析を進める予定である。また合成アロメラニンの調整とその解析についても実施する計画である。
胚性幹細胞の未分化性を規定する膜タンパク質の機能的ダイナミクスに関する研究

膜4回貫通型蛋白質テトラスパニンファミリーに属するCD9は、マウス及びヒト胚性幹(ES)細胞において高発現していることが報告されており、ES細胞の未分化性の維持に何らかの強い関与が示唆されている。そこで本研究では、マウスES細胞未分化維持機能に及ぼすCD9の関与を明らかにする目的で、CD9遺伝子欠損(CD9-/-)マウス由来の内部細胞塊(ICM)よりES細胞が樹立可能であるかを検討した結果、CD9はES細胞の未分化性評価に関わる因子の1つではあるが、ES細胞の機能性の維持においては必須の因子でないことが判明した。マウスES細胞未分化維持機能に及ぼすCD9の関与を明らかにする目的で、CD9遺伝子欠損(CD9-/-)マウス由来の内部細胞塊(ICM)より、ES細胞が樹立可能であるか検討した。(実験1:CD9-/-ES細胞樹立)受精過程において、CD9は精子が卵細胞膜と融合するために必須な分子であるため、CD9-/-マウス由来の受精卵を卵細胞室内精子注入法(ICSI)により獲得し、胚盤胞期まで培養した。次に、CD9-/-胚盤胞よりICMを単離培養し、ES細胞様の形態を示した細胞を3株樹立することに成功した。これら3株のCD9-/-ES細胞における細胞増殖速度は野生型ES細胞と同等であり、また核型の状態も正常に維持されていた。(実験2:CD9-/-ES細胞における未分化マーカーの評価)CD9-/-ES細胞がES細胞未分化マーカーを発現しているかを、以下の解析により評価した。(i)未分化時に特異的に発現する遺伝子(Oct3/4、Sox2、Nanog、Rex1)を、RT-PCR法により解析した結果、野生型ES細胞と同等の発現が確認された。(ii)上述の未分化マーカータンパク質の発現を、免疫組織化学法により解析した結果、野生型ES細胞と同等の発現が確認された。(iii)未分化時に特異的に活性が認められるアルカリフォスファターゼ(ALP)の活性化状態を、高感度の化学発光基質を用いて解析した結果、CD9-/-ES細胞のすべてのコロニーにおいてALP活性が陽性であった。以上の結果より、CD9はES細胞の未分化維持にとって必須の分子でないことが示唆された。前年度までに樹立したCD9-/-ES細胞がES細胞の特性の一つである「多分化能」を保持しているかを、以下の解析により評価した。(1)分化誘導三次元培養法により、胚様体(EB : embryoid body、三胚葉[内胚葉・中胚.葉・外胚葉]が誘導された状態)の形成を行ったところ、得られたCD9-/-EBはCD9+/+EBと同様な形態を示し、CD9-/-ES細胞は効率的に分化誘導されたことが確認できた。(2)CD9-/-EBにおいて三胚葉の分化マーカーとなる遺伝子発現(外胚葉マーカー: Nestin、中胚葉マーカー:Brachyury、内胚葉マーカー:Gata6)をRT-PCR法および定量的PCR法により確認した結果、CD9-/-ES細胞は野生型ES細胞と類似の遺伝子発現パターンを示し、CD9-/-ES細胞は三胚葉系列への分化能を保持していることが確認できた。一方で、未分化マーカー(Oct3/4、Sox2、Nanog、Rex1)の発現が減少していることも同時に観察された。(3)CD9-/-EBを特定の細胞種へ分化誘導するための培養環境下でさらに培養を行った結果、Tuj1(神経系細胞マーカー)、cTnT(心筋系細胞マーカー)、AFP(肝臓系細胞マーカー)の発現が免疫組織化学法により観察できた。以上の結果より、CD9-/-ES細胞は三胚葉それぞれに由来する細胞へと分化する能力を持つ多能性幹細胞であることが示唆された。現在までの本課題における研究では、未分化ES細胞に特異的に発現している膜タンパク質分子CD9は、マウスES細胞の未分化維持において機能的に必須でないことを示してきた。加えて、CD9分子はES細胞の分化能にも関与していないことが、in vitro分化誘導実験に基づいて明らかとなった。そこで本年度では、分化多能性の評価を、in vivo解析系により実施した。免疫不全マウスの皮下にCD9-/-ES細胞を移植し、一ヶ月後に腫瘤を摘出し、テラトーマ形成能を評価した結果、三胚葉系列の各組織へCD9-/-ES細胞が分化したことが観察された。次に、CD9-/-ES細胞が多能性を保持しているかを証明するために、CD9-/-ES細胞に由来するキメラマウスの作製を行った。まず、正常マウスの胚盤胞に緑色蛍光たんぱく質EGFPで標識したCD9-/-ES細胞を注入し、仮親の子宮へ移植した後、新生児を解析した。

その結果、一様にEGFP陽性細胞の分布がマウス新生児において認められ、CD9-/-ES細胞は十分に分化多能性を保持していることが判明した。以上の結果より、CD9はES細胞の分化系譜を規定する分子ではないことが示唆された。また、CD9-/-ES細胞と野生型ES細胞における遺伝子発現レベルの違いを網羅的に解析した結果、CD9遺伝子の欠損がES細胞における遺伝子発現動態に顕著な変化をもたらさないことが示された。即ち、CD9-/-ES細胞においては、CD9の働きを他の分子が補填することで、未分化性および分化多能性の性質が維持されているものと推測された。CD9-/- ES細胞を用いた解析から、膜タンパク質CD9分子はES細胞の特性評価に関わる1つの因子であることを前年度までに明らかにした。一方で、CD9はES細胞の機能性の維持においては必須の因子でないことが示唆された。つまり、CD9-/- ES細胞においては、CD9の働きを他の分子が補填することで、未分化性および分化多能性の性質が維持されているものと推測された。そこで、本年度では、CD9-/- ES細胞と野生型ES細胞における遺伝子発現レベルの違いを網羅的に解析することにより、CD9-/- ES細胞においてCD9分子の機能を補填する因子の同定を試みた。マイクロアレイの解析結果をもとに、CD9-/- ES細胞において野生型ES細胞よりも高く発現している遺伝子について考察した結果、CD9-/- ES細胞において膜タンパク質関連遺伝子の発現が、主に上昇していることが示された。そこで、一部の膜タンパク質関連遺伝子について、定量的PCR法によりその発現量を詳細に解析した結果、細胞膜関連遺伝子群(Adm、Ptprc、Itga4、Tspan11、Pou4f3、Zdhhc1、Ptger4、Zdhhc7)に関しては、CD9-/- ES細胞において大きな発現上昇は見られないものの全体的に上昇傾向にあることが観察された。しかしながら、以上の結果がCD9-/- ES細胞の生存維持に直接関与しているとは考えにくく、その詳細については不明であり、今後さらなる解析を進める必要があると結論づけた。本年度は、「CD9欠損ES細胞における分化多能性評価をin vivo解析系により実施する」ことを主な研究計画として掲げ、本計画をすべて遂行することができ、CD9分子のES細胞の分化に関わる役割を明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、ES細胞の未分化・分化という現象に関し、CD9分子がどのような役割を果たしているかを明らかにすることができた。以上の研究成果をさらに発展させる目的で、今後はCD9分子から派生する未分化維持メカニズムを詳細に解明したいと考えている。さらに、CD9分子の類縁膜タンパク質群についても、ES細胞未分化維持との関連性について検証を行う予定である。
強制発現系を用いた足細胞分化転換の試みと治療応用を目指した移植アッセイ法の確立

腎臓は尿管芽の周りに後腎間葉と呼ばれる前駆細胞集団が凝集し、糸球体、近位尿細管、遠位尿細管へと分化していくことで形成される。この間葉を増幅させ、特定の細胞腫へと分化させることは腎臓再生にむけて大きな意味を持つ。特に糸球体を構成するポドサイト(足細胞)は腎臓前駆細胞に由来する最終分化細胞であり、慢性腎不全の際、最初に障害を受けることが報告されていることから、足細胞の誘導法開発は臨床的にも非常に意義のあることだと考える。そこで本研究ではまず、足細胞に発現している転写因子群に着目し、レンチウィルスによる強制発現系を立ち上げ、後腎間葉の培養系での足細胞への分化転換に挑戦した。インディケータマウスとして、ポドシンプロモーター下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス(podocin-Cre)とCre-loxPシステムで組み替えが起こるとGFPが発現するマウス(CAG-loxP-stop-loxP-GFP)とを掛け合わせた胎児の使用を考えた。このPodocin-GFPマウスはE14.5以降の糸球体細胞でGFPが発現し始めることを確認した。次に11種類の糸球体特異的転写因子を単離、導入細胞の同定が出来るようにしたtagをつけたウィルスベクターに組み込み、ウィルスを産生させて、タイターチェックを行った。しかしながら理想とされるタイターまで十分にあげることができず。感染効率が非常に低かった。現在濃縮方法や、遺伝子導入の条件を検討中である。高タイターのウィルス産生の条件検討を行っている間に、時期特異的足細胞特異的腎障害マウスの作成を行った。ポドシンプロモーター下にテトラサイクリンアクチベーター(podocin-rtTA)を繋げたトランスジェニックマウスと、テトラサイクリンアクチベーターに反応するプロモーター制御下にジフテリア毒素Aサブユニットを発現するマウス(tetO-DTA)をかけ合わせることで、それぞれの遺伝子をヘテロにもつ組織及びマウスはテトラサイクリンを培養液に添加or経口投与することで時期特異的に足細胞に障害を与えることができると考えられた。そこで経口投与による足細胞障害過程を発生期、成体期で観察したが、糸球体疾患が見られなかった。しかしながらE13.5からの後腎間葉の器官培養では、テトラサイクリンを培養液に添加することで、糸球体の発生が阻害された。現在個体内でのテトラサイクリンの有効濃度の条件を検討中である。