hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化管ホルモン遺伝子の発現量を健康診断へ応用したサケ稚魚の抗病性向上技術の開発

サケ稚魚では、消化管ホルモンのうちコレシストキニン-L型の脳での遺伝子発現量が細菌性鰓病(鰓病)の早期診断指標になることがわかった。この指標を用いて、北海道内の10箇所のふ化場で飼育された稚魚の診断を行った結果、全てのふ化場で鰓病発症の前兆はなかった。亜麻仁油を添加した市販配合飼料を、1週間以上継続して給餌すると、鰓病の発症が抑制される可能性が示された。平成25年度は、サケ稚魚の細菌性鰓病早期診断技術の開発と、この技術を用いたふ化場産稚魚の鰓病診断を行った。稚魚の脳コレストキニン遺伝子(CCK)の発現量は、体重1g以上、水温515°C、絶食72時間未満の時、稚魚の成長、飼育水温および絶食の影響を受けないことがわかった。この条件下で、稚魚の高密度飼育試験を行ったところ、飼育水立米当たり40kgの飼育密度により、稚魚に細菌性鰓病が発症した。この鰓病発症に至るまでに、稚魚の脳CCKの発現量は有意に増加し、発症後に低下した。一方、飼育水立米当たり10kgの低密度では、この発現量が0.020.04(比較相対値)の間で比較的安定した値を示した。以上の結果から、脳CCK発現量の値を指標として、サケ稚魚の鰓病発症を予兆できる可能性が示された。北海道内10箇所のふ化場で飼育されている稚魚の脳CCK発現量を調査した結果、それらの値は0.0270.040を示した。脳CCK発現量の基準値を、前述の低密度飼育された稚魚の値(0.020.04)と仮定すると、各ふ化場の稚魚は全て健康だと推察される。平成24年度は、シロザケ(サケ)稚魚の消化管ホルモンであるコレシストキニン(CCK)およびグレリンのcDNAクローニングを行い、リアルタイムPCRによる各遺伝子の発現量測定系を確立することを目的とした。サケ稚魚の脳および腸からpoly(A)+RNAを調整し、Olygo(dT)プライマーを用いた逆転写を行った。このcDNAを鋳型として、既知のタイセイヨウサケCCKおよびプレプログレリン(pGHRL) cDNAの塩基配列をもとに設計したプライマーを用いてPCRを行い、各ペプチドのcDNA断片を得た。このcDNA断片をもとに5'および3'-RACEを行い、CCKおよびpGHRLcDNAの全塩基配列を決定した。また、稚魚の各組織におけるCCKおよびpGHRL遺伝子の発現量をリアルタイム定量RT-PCR法により測定した。cDNAクローニングの結果、3種類のCCKと2種類のpGHRLのcDNAを得た。cDNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれタイセイヨウサケCCKまたはpGHRLと比較したところ、3種類のCCKはそれぞれL、N、Tタイプと、2種類のpGHRLはそれぞれI、IIタイプと相同性が高かった。定量PCRの結果、CCKについては3タイプとも脳、胃および腸で、pGHRLについては2タイプとも胃および脳で遺伝子の発現量が多かった。本成果により、平成25年度に予定しているサケ稚魚健康診断の指標候補であるCCKまたはpGHRL遺伝子発現量を測定できるようになった。平成26年度は、植物性油脂添加餌料を用いた稚魚の鰓病発症抑制飼育技術の開発を行うことを目的とした。サケ稚魚を用いて、細菌性鰓病(鰓病)の発症抑制に与える植物性油脂添加飼料給餌の効果を検討し、どの油脂を、どれぐらいの量添加し、どのぐらいの期間、稚魚に給餌すれば、鰓病発症を抑制できるかを調べた。その結果、亜麻仁油を23%添加した市販配合飼料を、少なくとも1週間以上継続して給餌すれば、鰓病の発症が有意に抑制されることがわかった。水産増殖学年度計画どおり順調に研究が進展しており、当初の研究目的を全て達成できると考えられるため。当初予定した平成24年度に行うべき研究課題を全て達成した。計画どおりの進捗が見込まれるため、計画変更を行わず、研究遂行上の課題も存在しない。平成24年度に開発したシロザケコレシストキニンおよびグレリン遺伝子発現量測定系を用いて、平成25年度予定している細菌性鰓病の早期診断技術の開発、孵化場産稚魚の鰓病診断実施を計画どおり行う。該当なし
近距離通信ネットワークによる24時間体制の服薬サポートシステムの開発

本研究の目的は、研究代表者らが開発した分散型服薬モニタリングシステムを改良して、24時間体制の服薬サポートシステムを実現して評価することである。このシステムを構築するためには、患者の服薬行動を確実に検出できる医薬品パッケージの開封センサーが必要になる。まず従来利用していた銀ナノ粒子を使用したインキに代えて、樹脂の保護層と持つアルミニウム蒸着箔を利用した開封センサーを開発し、保護層を維持したままでセンサーの断線を電気的に検出する手法を開発した。その後、新しく開発した開封センサーを、国内での医薬品の交付時に広く利用されている分包紙等の医薬品のパッケージに圧着して、電気的性質と物理的性質を測定した。その結果、開封を検出する機能は優れているものの、物理的な曲げに弱く、扱い方によっては意図せず破断してしまうという問題が明らかになった。本研究で開発中の機器は、患者が携帯して利用することを想定しているため、高い安定性が求められる。そこで、アルミニウム蒸着箔を利用した開封センサーの圧着条件を変更することにより、破断を防ぐ改良を進めている。また、その後の研究によって、カーボンを含む導電性インキを医薬品のパッケージにシルクスクリーン印刷することで開封センサーを作成する手法も有力であることが明らかになった。そこで、両方の方式で作成したセンサーの特性を比較し、本研究の目的にどちらがより適しているかを比較する実験を行っている。上記の開封センサーの開発と並行して、システムを構成するソフトウェアの開発を行った。現在、患者が携帯するデバイスからの服薬情報を受信して、服薬状況を医療機関サーバに通知するパーソナルサーバと、パーソナルサーバからの情報を集約し、データベースへの記録/服薬状況の可視化/患者へのフィードバックを行う医療機関側のサーバの開発を進めている。研究計画では、本年度は服薬サポートシステムを構成するソフトウェアの開発を行う予定であった。開発するソフトウェアは(1)開封センサーを駆動して患者の服薬行動を検出し、近距離無線通信ネットワークを通して通知するデバイスのファームウェア(2)デバイスからの服薬情報を受信して、服薬状況を医療機関サーバに通知するパーソナルサーバ、(3)パーソナルサーバからの情報を集約し、データベースへの記録/服薬状況の可視化/患者へのフィードバックを行う医療機関側のサーバの3種類が連携して動作する。(1)は初年度に作成したが、上記の開封センサーの改良に伴い、単純な通電の有無だけでなく、パルスを発生して静電容量の変化を検出する機能、A/D変換を用いて抵抗値の変化を検出する機能の追加が必要になったため、修正を行った。(2)と(3)は従来の研究で利用していたJAVA, PHP言語を用いたソフトウェアを修正する方法で現在開発中である。これらに加えて、若干の機能の追加を予定しているため、まだ完了してはいないが、おおむね順調に進展していると言える。今年度はハードウェアとソフトウェアの両方の開発を完了させ、24時間体制の服薬サポートシステムを実装する。また実装したシステムを用いて、研究協力者と共同で医療機関での実証試験を行う。ハードウェアの面では、アルミニウム蒸着箔を利用する方法と、カーボンを含む導電性インキを利用する方法で作成した開封センサーの特性を比較し、今回の実証実験により適していると判定された方式で患者の服薬行動を検出する機構を実装する。ソフトウェアの面では、ファームウェア、パーソナルサーバ、医療機関側のサーバの3種類のソフトウェアを連携させて、患者の服薬状況を記録・可視化する。開発したシステムを使用して、学内での動作検証を行う。その後、宮城県内の薬局と連携して、定期的な服薬が必要な患者に対する服薬モニタリング実験を実施し、開発したシステムの評価を行う予定である。本研究の目的は、24時間体制の服薬サポートシステムを実現するため、従来の分散型服薬モニタリングシステムを改良して、家庭での継続的な服薬治療に適用できるような実用的なシステムを構築し評価することである。今年度はこの目的を達成するため、専用の医薬品パッケージを使わずに、国内で一般に使用されているPTPシートや分包紙を用いて医薬品を交付する場合でも患者の服薬行動を検出できるように、医薬品の包装部分と一体化した開封センサーの開発・改良を行った。これまで学生を被験者として行ってきた実験では、被験者が医薬品を携帯して外出した時に、振動や曲げによってセンサーが断線して誤検出が発生した事例があり、センサーの物理的な安定性を向上させる必要があった。また、従来の研究で開封センサーを作成するために使用した銀ナノ粒子を含む導電性インキは、印刷できる対象がインキの吸収層を持つ専用の用紙に限られているため、市販の分包紙に適用することは困難だった。そこで、導電性インキの代わりに、表面に樹脂の保護層を持つアルミニウム蒸着箔を圧着することで、物理的な安定性が高く、かつ幅広い対象に適用できる開封センサーを開発した。また、保護層を維持したままで、開発したセンサーの断線を電気的に検出する手法を開発した。現在、開発した開封センサーを分包などの実際に使用されている医薬品の包装部分に圧着して電気的な性質を測定し、最適な構造と検出方式を決めるための実験を進めている。研究計画では、本年度は実際の医薬品パッケージに適用できる開封センサーを開発し、近距離無線モジュールを内蔵したマイクロコントローラーを接続できるように電子回路を改良する予定であった。今回開発したアルミニウム蒸着箔を使用したセンサーが幅広い対象に利用できることが分かったため、開封センサーの開発についてはおおむね目標が達成できたと言える。

また、このセンサーが利用できるように、マイクロコントローラに接続する電子回路の改良を行ったが、その結果、電源の変更や回路への大幅な改良を行わなくても、数ヶ月程度の動作が可能であると見込まれるため、電子回路の改良についてもおおむね目標が達成できたと言える。本研究の目的は、研究代表者らが開発した分散型服薬モニタリングシステムを改良して、24時間体制の服薬サポートシステムを実現して評価することである。このシステムを構築するためには、患者の服薬行動を確実に検出できる医薬品パッケージの開封センサーが必要になる。まず従来利用していた銀ナノ粒子を使用したインキに代えて、樹脂の保護層と持つアルミニウム蒸着箔を利用した開封センサーを開発し、保護層を維持したままでセンサーの断線を電気的に検出する手法を開発した。その後、新しく開発した開封センサーを、国内での医薬品の交付時に広く利用されている分包紙等の医薬品のパッケージに圧着して、電気的性質と物理的性質を測定した。その結果、開封を検出する機能は優れているものの、物理的な曲げに弱く、扱い方によっては意図せず破断してしまうという問題が明らかになった。本研究で開発中の機器は、患者が携帯して利用することを想定しているため、高い安定性が求められる。そこで、アルミニウム蒸着箔を利用した開封センサーの圧着条件を変更することにより、破断を防ぐ改良を進めている。また、その後の研究によって、カーボンを含む導電性インキを医薬品のパッケージにシルクスクリーン印刷することで開封センサーを作成する手法も有力であることが明らかになった。そこで、両方の方式で作成したセンサーの特性を比較し、本研究の目的にどちらがより適しているかを比較する実験を行っている。上記の開封センサーの開発と並行して、システムを構成するソフトウェアの開発を行った。現在、患者が携帯するデバイスからの服薬情報を受信して、服薬状況を医療機関サーバに通知するパーソナルサーバと、パーソナルサーバからの情報を集約し、データベースへの記録/服薬状況の可視化/患者へのフィードバックを行う医療機関側のサーバの開発を進めている。研究計画では、本年度は服薬サポートシステムを構成するソフトウェアの開発を行う予定であった。開発するソフトウェアは(1)開封センサーを駆動して患者の服薬行動を検出し、近距離無線通信ネットワークを通して通知するデバイスのファームウェア(2)デバイスからの服薬情報を受信して、服薬状況を医療機関サーバに通知するパーソナルサーバ、(3)パーソナルサーバからの情報を集約し、データベースへの記録/服薬状況の可視化/患者へのフィードバックを行う医療機関側のサーバの3種類が連携して動作する。(1)は初年度に作成したが、上記の開封センサーの改良に伴い、単純な通電の有無だけでなく、パルスを発生して静電容量の変化を検出する機能、A/D変換を用いて抵抗値の変化を検出する機能の追加が必要になったため、修正を行った。(2)と(3)は従来の研究で利用していたJAVA, PHP言語を用いたソフトウェアを修正する方法で現在開発中である。
病原ビブリオにおける鉄欠乏ストレス応答の分子遺伝学的並びに病原学的研究

1.V.parahaemolyticusの臨床分離株、食品由来株、環境由来株について、vibrioferrinの産生量を鉄制限下で分析した。その結果、臨床分離株が他と比べて有意にvibrioferrin産生量が多いことが判明した。ヒト腸管のように鉄欠乏下における生存、増殖に対してvibrioferrin産生性が選択的有利性を与え、本菌の病原性発現と密接煮関連している可能性が示唆された。2.V.parahaemolyticusのマンガン耐性株について、そのfur遺伝子を解析し、4種のアミノ酸置換を伴う塩基変異を見出した。これらのアミノ酸残基がFurの機能に重要であることを明らかにした。さらに、Fur大量発現クローンを作成し、Furを精製して、その抗体を調製した。この抗体を用いて、Western blottingにより、鉄豊富下でも鉄欠乏下と同程度のFurが産生されており、本蛋白の多機能性が示唆された。3.FUR TA法によって、病原ビブリオ3菌種より鉄制御遺伝子群を単離した。塩基配列の解析の結果、Fur boxを有する多数の興味深いクローンが得られた。それらの内、V.parahaemolyticusより3種の鉄輸送キレーターの外膜レセプター遺伝子および生合成遺伝子を全長クローニングし、解析した。さらに、V.mimicusの2種の鉄獲得系オペロン遺伝子、aerobactionオペロン(4種の生合成遺伝子と1種の外膜レセプター遺伝子)および輸送系オペロン(3種の遺伝子)を全長クローニング、解析した。これらオペロンはタンデムに存在しており、腸内細菌科の菌種におけるaerobactinを介する鉄獲得系には見られない珍しい遺伝子構成であることが判明した。また、heme receptorのクローニングにも成功した。4.病原ビブリオ3菌種より、鉄制御の新規MnSODをコードする遺伝子をクローニンし、解析した。5.Suicide vectorを用いて上記遺伝子群の挿入変異体を作成し、当該遺伝子の機能を解明した。また、同法によって、V.parahaemolyticusのvibrioferrin生合成遺伝子を見出した。1) FURTA法によるFUR制御遺伝子の単離と解析:腸炎ビブリオ、Vibriomimicus,V.vulnificusより鉄制御遺伝子(Fur boxを有する遺伝子)を単離し、得られたクローンの塩基配列を決定した。大腸菌consensus Fur box(19 bp)に対して11-18bpの一致を示すクローンが腸炎ビブリオでは14種、V.mimicusでは8種、V.vulnficusでは12種得られた。いずれの菌株からも既にFur boxの存在の知られているMN-SOD,IrgAB,fumaraseが得られた。さらに、鉄獲得系遺伝子に相同性の高い遺伝子がそれぞれから数種づつ得られた。これらの中に鉄制御外膜蛋白N-末端アミノ酸配列と完全に一致する遺伝子が見つかった。これら以外に鉄含有蛋白であるフェリチンやバクテリオフェリチンの遺伝子も単離できた。2)pETsystemによるFur蛋白質大量発現クローンの確立と抗体の調製:腸炎ビブリオfur遺伝子をNdeI-BamHI-tag primerを用いてPCR増巾後、pET1laにサブクローニングし、大量発現クローンを得た。Fur蛋白をイオン交換およびアフィニテイークロマトグラフィーで精製し、抗体を調製した。

3)腸炎ビブリオマンガン耐性株のfur遺伝子とFur蛋白質の解析:マンガン耐性株は高率にfur遺伝子に変異を持っていることが示されている。そこで、WP-1株から単離した11種マンガン耐性株(いずれも鉄豊富下でも本菌が産生する鉄輸送キレーター、ビブリオフェリンを産生し、またその外膜レセプター蛋白を発現する)について、PCR direct sequenceを行なった。G12S,H71P,D89N,D104Gのアミノ酸置換変異が見出され、これらアミノ酸残基がFur蛋白の機能発現に重要であることが判明した。Westernblottingによって、Fur産生性の低下している株が見つかり、プロモーター領域の変異の可能性が示唆された。(これらの研究成果は現在論文投稿準備中である)1.FURTA法によって単離し、ホモロジー検索によって有望と思われた腸炎ビブリオ(VP)、Vibrio mimicus(VM),Vibrio vulnificus(VV)遺伝子断片には鉄制御遺伝子に特徴的なFur box配列が認められ、さらに精製Fur蛋白質を用いてのgel mobility shift assayでシフトバントbを確認した。2.鉄獲得に関与すると思われる遺伝子断片からDig-標識プローブを作成し、当該遺伝子全長をクローニングした。現在迄に、VPよりvibrioferrin(VPの産生する鉄輸送キレーター),ferrichromeおよびaerobactinに対する外膜レセプター蛋白を、またVMからhemeに対する外膜レセプター蛋白をコードする遺伝子の解析を行なった。興味深いことに、VPでは自身の産生する鉄キレーターに加えて、他の細菌の産生する鉄キレーターを利用する系を持っており、しかもオペロンを構成していることが判明した。VMのhemeレセプタ一遺伝子にはFur boxを共有して逆方向に転写活性化蛋白をコードする遺伝子が見つかった。このような例は今だ報告がない。これら遺伝子産物の機能をより明確にするため、自殺ベクターでの相同組替えによる遺伝子破壊法や蛋白大量発現系の確立を行なっている。3.VP,VM,VVよりそれぞれのMn-SOD遺伝子(sodA)をクローニングし、解析した。いずれもFur boxを持つ鉄制御遺伝子であり、Mn-SOD酵素は鉄欠乏下にのみ発現した(投稿準備中)。4.以上の遺伝子の外に、二成分制御系、鉄キレーターの生合成系や輸送系の遺伝子などもクローニングを完了し、只今解析中である。1.鉄制御遺伝子群の全長遺伝子クローニングと解析:V.parahaemolyticusより3種の鉄輸送キレーターの外膜レセプター遺伝子および生合成遺伝子をクローニングし、解析した。いずれもプロモーター領域にFur box(鉄制御に関わる特異的DNA配列)を持っており、鉄欠乏に応答して転写されることが示された。自身の産生しない鉄輸送キレーターを利用できることは本菌の色々な局面での増殖に有利に働くと考えられる。
後期更新世火山岩のK-Ar年代測定に関する研究

若い火山岩のK-Ar年代測定の目的は火山岩の噴出年代を知ることにある.微量アルゴン定量分析技術の確立はそれを可能にして来た.しかし,火山岩のK-Ar年代は必ずしもその噴出年代を示さないらしいいくつかの事実も知られて居り,微量アルゴン分析技術の確立のみが天然試物に対して充分に応用できる状態を確立することにはならないことも知られて来た.このギャップを埋めるためには,火山層序が詳しく検討されている火山体で,つまり噴出順序がはっきり区別されている火山岩類を最新の分析技術でK-Ar年代測定し,その噴出順序を確認する手順を踏む必要がある.それをいくつかの火山体で実行し,最新のアルゴン分析装置及び技術によるK-Ar年代測定の検出限界や分配能を天然試物を使って検証する必要がある.そこで本年度は中部地方白山火山,九州阿蘇火山,伊豆大島三原山火山,関東塩原火山について試物採集とK-Ar年代測定して来た.現在までに三原山火山を除く3火山体について検討が終った.その結果,我々が開発したK-Ar年代測定装置及び技術では,分解能が数万年であった.カリウム濃度が3wte%程度あるとき数万年前に噴出した溶岩類まで適用できることが明らかになった.それとともに,火山岩が持つ様々な特性(K-Ar年代測定おける)が整理されて来た.その特性はマグマの性質に深くかかわっている可能性があり,希ガス同位体分析からの解析からマグマの成因やマグマリザーバーでのマグマの状況等が議論できるようになりつつある.若い火山岩のK-Ar年代測定の目的は火山岩の噴出年代を知ることにある.微量アルゴン定量分析技術の確立はそれを可能にして来た.しかし,火山岩のK-Ar年代は必ずしもその噴出年代を示さないらしいいくつかの事実も知られて居り,微量アルゴン分析技術の確立のみが天然試物に対して充分に応用できる状態を確立することにはならないことも知られて来た.このギャップを埋めるためには,火山層序が詳しく検討されている火山体で,つまり噴出順序がはっきり区別されている火山岩類を最新の分析技術でK-Ar年代測定し,その噴出順序を確認する手順を踏む必要がある.それをいくつかの火山体で実行し,最新のアルゴン分析装置及び技術によるK-Ar年代測定の検出限界や分配能を天然試物を使って検証する必要がある.そこで本年度は中部地方白山火山,九州阿蘇火山,伊豆大島三原山火山,関東塩原火山について試物採集とK-Ar年代測定して来た.現在までに三原山火山を除く3火山体について検討が終った.その結果,我々が開発したK-Ar年代測定装置及び技術では,分解能が数万年であった.カリウム濃度が3wte%程度あるとき数万年前に噴出した溶岩類まで適用できることが明らかになった.それとともに,火山岩が持つ様々な特性(K-Ar年代測定おける)が整理されて来た.その特性はマグマの性質に深くかかわっている可能性があり,希ガス同位体分析からの解析からマグマの成因やマグマリザーバーでのマグマの状況等が議論できるようになりつつある.
ナトリウム利尿ペプチドファミリーの分子と機能の相関

ナトリウム利尿ペプチド(NP)は、体液調節に重要な役割を果たすホルモンファミリーであり、これまで硬骨魚類以降で最大7つのタイプ(ANP,BNP,VNP,CNP-1CNP-4)が同定されている。いっぽう、軟骨魚類にはCNP-3のみ存在する。このことから、NPファミリーは、CNP-3を祖先分子として脊椎動物の進化の過程でその分子種を多様化させたと考えられていた。しかしながら、近年私は、最も原始的な脊椎動物である円口類のメクラウナギから、CNP-3ではなく、アミノ酸のC端末にユニークな配列(テール配列)をもつNP(hfNP)を同定した。私はNPファミリーの祖先分子を明らかにするため、さらに3種のメクラウナギと、円口類のもうひとつの現存するグループであるヤツメウナギから3種と用いてNP cDNAと同定した。その結果、メクラウナギ類では、hfNPはテール配列をふくめ、前駆体レベルでアミノ酸配列が保存されていることが分かった。いっぽう、ヤツメウナギ類ではテール配列をもたないCNPのみが同定された。しかし、ヤツメウナギCNPは、その前駆体構造にメクラウナギ特有だと考えられていたプロセシング配列を持っていた。この円口類NPにみられる特徴は、CNP-4の前駆体にも共通して存在することがわかった。分子系統解析により、円口類のNPは、前駆体レベルでCNP-4と最も相同性が高いことがわかった。これらの結果より、NPファミリーは、軟骨魚類にみられるようなCNP-3ではなく、CNP-4を起源として、硬骨魚類や陸上脊椎動物にみられる多様な分子種を獲得していった可能性が高い。海という高浸透圧環境に適応するために、脊椎動物は進化の過程で血液中のイオン濃度や浸透圧を海水よりも低く抑えるメカニズムを獲得してきた。原始的な脊稚動物である軟骨魚類では、血液中のイオン濃度は海水の2分の1に調節し、浸透圧は血液沖に尿素を蓄積させることで海水にあわせている。一方、硬骨魚類や四肢動物では血液中のイオン濃度と浸透圧をともに海水の約3分の1に保っている。ナトリウム利尿ペプチド(NP)は、血液の水や電解質バランスに関与するホルモンファミリーであり、海へ適応する際の血液の浸透圧調節にも重要な役割を果たしている。硬骨魚類や四肢動物にはANP,BNP,VNP及びCNPが同定され軟骨魚類にはCNPしか存在しない。このことから、NPファミリーの祖先分子はCNPであり、血液中のイオン濃度と浸透圧の調節機構とともにその分子種を多様化させていったと考えられてきた。最も原始的な脊椎動物の内口類のメクラウナギ類は、血液中のイオン濃度及び浸透圧は海水とほぼ等張である。しかし、円口類でもNPの存在が免疫組織化学的手法により示唆されていた。そこで、メクラウナギ類から4種(Myxine glutinos a, Paramyxine atami, Eptatretus cihhratus, Eptatrerus burgeri)、また現存するもうひとつの円口類のグループであるヤツメウナギから3種(Geotria australis, Petromyzon marinus, Lampetra japonica)を選び、PCR法によるNPのcDNAクローニングをおこなった。その結果、ヤツメウナギ類には軟骨魚類と同様にCNPが存在したが、メクラウナギ類にはCNPは存在せず、その代わり全てのNPの特徴を兼ね備えた新規NP (hagfish NP, hfNP)を同定した。しかし、前駆体構造を解析すると、hfNPはCNPの特徴的なプロセシング部位が存在した。またhfNP前駆体は分子系統解折からもCNPに最も類似することがわかった。これらの結果からNPの祖先分子はCNPであることを更に強く示唆することができた。今後は、メクラウナギにhfNPを投与して、hfNPがどのような作用を示すのかを追っていくことを計画している。血液の浸透圧を調節していないメクラウナギにおけるNPの作用を調べることで、NPが本来もっていた機能を明らかにしたいと考えている。

これらの結果より、NPファミリーは、軟骨魚類にみられるようなCNP-3ではなく、CNP-4を起源として、硬骨魚類や陸上脊椎動物にみられる多様な分子種を獲得していった可能性が高い。
顎下腺の自律神経刺激における細胞内pH上昇に及ぼす陽イオンの影響

我々は顎下腺の唾液分泌やイオン輸送機構に関連して,顎下腺細胞のpH上昇に及ぼす陽イオンの影響を検討するための基本的な研究として,自律神経刺激による細胞内pHの上昇(アルカリ化)機構について、HSGヒト顎下腺由来細胞とA-431ヒト類表皮癌細胞の比較を行った。まず始めに細胞内pHと細胞内Ca^<2+>の同時測定法を考案し,すなわち,Fluo-3とSNARF-1で共染色を行い,ACAS570レーザーサイトメーターで二波長測定を行って,ATP刺激による両細胞は異なるpH上昇機構を示すことを明らかにした。続いて,両細胞をβ-adrenergic作動薬のisoproterenolで刺激するとアルカリ化は全く認められなかった。また,α一adrenergic作動薬のnoradrenaline刺激の場合は,HSG細胞A-431細胞ともに,また,muscarinic作動薬のcarbacho1で刺激の場合では,A-431細胞において一定の範囲内でアルカリ化が認められた。一方,HSG細胞におけるcarbachol刺激では,高濃度においてもアルカリ化が認められた。このアルカリ化はCa^<2+>channe1拮抗剤のnifedipineによる前処理によっても失われず,また,microsomal Ca^<2+>-ATPaseの阻害剤であるthapsigargin処理によっても失われなかった。これらのことから,HSG細胞には高濃度carbacho1刺激によるアルカリ化機構が存在し、これはCa^<2+>independentであると推定された。このことより唾液を産生する唾液腺における神経作動薬による反応はその他の上皮細胞とは異なる機構を持っていると推定される。我々は顎下腺の唾液分泌やイオン輸送機構に関連して,顎下腺細胞のpH上昇に及ぼす陽イオンの影響を検討するために,まず,手始めとしてHSGヒト顎下腺癌由来細胞を用いて,種々の自律神経作動約薬で刺激して細胞内pH(pH_i)の上昇を測定した.すなわち,muscarinic作動薬のcarbachol(10^<-3>M以上)で刺激した場合およびα-aderenergic作動薬のnornepinephirine(10^<-5>M以上)で刺激した場合において,pH_iの上昇が認められた.この上昇はそれぞれの阻害剤であるatropineまたはphentolamineで抑制され,Na^+/H^+exchangerの阻害剤であるdimetylamilorideでも抑制され,protein kinase C (PKC)の阻害剤であるH-7でも抑制された.また.PKCの活性化剤であるTPAおよびphosphatesの阻害剤であるokadaic acidでpH_iは上昇した.また,上記のpH_i上昇はβ-aderenergic作動薬のisoproterenolでは全く認められなかった.また,細胞外液にCa^<2+>が存在しないときには,ほとんどpH_iの変化は認められなかった.これらの結果から,HSG細胞においてはmuscarinicおよびα-adrenergic受容体刺激により,情報伝達系が駆動され,PKCによりNa^+/H^+exchangerが活性化され,pH^iの上昇が生ずるものと考えられた.また,この際細胞外液のCa^<2+>が必至であると考えられた.我々は顎下腺の唾液分泌やイオン輸送機構に関連して,顎下腺細胞のpH上昇に及ぼす陽イオンの影響を検討するための基本的な研究として,自律神経刺激による細胞内pH(pH_i)の上昇についてHSGヒト顎下腺由来細胞とA-431ヒト類表皮癌細胞の比較を行った。すなわち,muscarinic作動薬のcarbacholで刺激した場合,HSG細胞では10^<-2>-10^<-4>Mの範囲で,およびA-431細胞では10^<-4>-10^<-6>Mの範囲でpH_iの上昇が認められた。

また,α-aderenergic作動薬のnornepinephirineで刺激した場合,HSG細胞では10^<-5>-10^<-6>Mの範囲,およびA-431細胞では10^<-4>-10^<-7>Mの範囲でpH_iの上昇がみとめられた。この上昇はそれぞれの阻害剤であるatropine (10^<-4>M)またはphentolamine(10^<-4>M)で抑制され,Na^+/H^+ exchangerの阻害剤であるdimetylamiloride(10^<-4>M)でも抑制され,protein kinase C(PKC)の阻害剤であるH-7(10^<-4>M)でも抑制された.また,PKCの活性化剤であるTPAおよびphosphataseの阻害剤であるokadaic acidでpH_iは上昇した.また,上記のpH_i上昇は両細胞において,β-aderenergic作動薬のisoproterenol(10^<-3>-10^<-7>M)では全く認められなかった.これらの結果から,両細胞ともmuscarinicおよびα-adrenergic受容体刺激によりPKCが活性化された結果,Na^+/H^+exchangerが作動し,pH_iの上昇がおこると推定された。しかし,両細胞においてpH_iの上昇に効果ある刺激濃度範囲が異なるので,それらの受容体数等が異なると予想される。我々は顎下腺の唾液分泌やイオン輸送機構に関連して,顎下腺細胞のpH上昇に及ぼす陽イオンの影響を検討するための基本的な研究として,自律神経刺激による細胞内pHの上昇(アルカリ化)についてHSGヒト顎下腺由来細胞とA-431ヒト類表皮癌細胞の比較を行った。すなわち,β-adrenergic作動薬のisoproterenol(10^<-3>-10^<-7>M)で刺激した場合,両細胞ともアルカリ化は全く認められなかった。また,α-adrenergic作動薬のnoradrenaline刺激の場合は,HSG細胞では10^<-6>M3×10^<-3>Mの範囲内で,およびA-431細胞では10^<-7>M2×10^<-4>Mの範囲内でアルカリ化が認められ,高濃度刺激ではエルカリ化しなかった。一方,muscarinic作動薬のcarbacholで刺激した場合では,両者におけるアルカリ化の様式は異なり,A-431細胞では7×10^<-5>M10^<-4>Mの範囲内でアルカリ化が認められたのに比べ,HSG細胞では,6×10^<-5>M以上で常にアルカリ化が認められ,その濃度の上限はなかった。上記の高濃度carbachol刺激によるHSG細胞のアルカリ化はCa^<2+>channel拮抗剤のnifedipineによる前処理によっても失われず,また,microsomal Ca^<2+>-ATPaseの阻害剤であるthapsigargin処理によっても失われなかった。これらのことから,HSG細胞には高濃度carbachol刺激によるアルカリ化機構が存在し,これはCa^<2+>independentであると推定される。このことより唾液を産生する唾液腺における神経作動薬による反応はその他の上皮細胞とは異なる機構を持っていると推定される。
子どもの言語機能はどのように形成され修復されるのか？－脳磁図による検討－

言語遅滞児に対し、言語機能発達段階を脳磁図によって検討し定量化・比較を行う為に、昨年度に引き続き5名の患児に対して、複数回の検討を行なった。北海道大学病院に設置されている306ch脳磁計を使用し、独自に開発した文字情報混合装置を用いて、患児の好む任意のDVD画像に文字情報を組み込み、これを約10分間の時間を単位として約40分間視聴することによって、文字刺激を行った。刺激情報は、遠距離焦点の強化プロジェクターを用いて眼前に置いたスクリーンに直接投影し、この画像を患児に見せた。言語刺激に対する、事象関連脱同期反応を検討した。独自に開発した、Matlab toolを用いた、解析ソフトウエアを用いて、任意の時間範囲、周波数、脳の部位における、事象関連脱同期反応を、図示した。この検討の上で、ヒトの基本的な基礎活動である、10Hz帯域の基礎活動(α律動)周辺の515Hzの基礎活動に特に注目した。経年的変化を観察している急性脳症後に言語を獲得しつつある患児、Angelman症候群で発語はないものの、言語理解が進んでいる兄弟例、先天性筋症で発語はないものの言語理解が予想される患児に関して、検討を行なった。いずれかの時期で、言語優位半球の分化が得られてくるのではとの予想を立てていたが、急性脳症後の11歳患児(脳症罹患後10年)において、昨年から左半球優位の、10Hz帯域における有意な事象関連脱同期が見出されるようになったが、この結果は安定していた。他の症例に関しては、まだ、両側性の反応があるが、検査に順応して来たため、安定した結果が得られるようになった。今後も、縦断的な研究の継続が望まれた。研究の進捗により、言語発達過程において言語優位半球が決定される前に、両側大脳半球が連関して活動し、両側性の活動を示す可能性がある事を、また、本研究で用いている刺激は、片側性だけでない刺激応答を示す事が示された。本研究の進捗を踏まえ、論文作成を行なう予定である。引き続き、追跡を行なっている患児に関して、言語機能獲得のプロセスを追跡していく。正常対照被験者のデータを蓄積し、年代階層別の刺激応答傾向を蓄積していく。言語遅滞患児に関して、新規の被験者を募り、データの蓄積を行なっていく。また、言語訓練における到達目標を提示できることを目指す。言語優位半球の分化が得られてくるのではとの予想を立てていたが、急性脳症後の11歳患児(脳症罹患後10年)において、左半球優位の、10Hz帯域における有意な事象関連脱同期が見出されるようになった。本研究の成果を、第45回日本臨床神経生理学会にて発表した。

経年的変化を観察している急性脳症後に言語を獲得しつつある患児、Angelman症候群で発語はないものの、言語理解が進んでいる兄弟例、先天性筋症で発語はないものの言語理解が予想される患児に関して、検討を行なった。いずれかの時期で、言語優位半球の分化が得られてくるのではとの予想を立てていたが、急性脳症後の11歳患児(脳症罹患後10年)において、昨年から左半球優位の、10Hz帯域における有意な事象関連脱同期が見出されるようになったが、この結果は安定していた。他の症例に関しては、まだ、両側性の反応があるが、検査に順応して来たため、安定した結果が得られるようになった。今後も、縦断的な研究の継続が望まれた。研究の進捗により、言語発達過程において言語優位半球が決定される前に、両側大脳半球が連関して活動し、両側性の活動を示す可能性がある事を、また、本研究で用いている刺激は、片側性だけでない刺激応答を示す事が示された。本研究の進捗を踏まえ、論文作成を行なう予定である。引き続き、追跡を行なっている患児に関して、言語機能獲得のプロセスを追跡していく。正常対照被験者のデータを蓄積し、年代階層別の刺激応答傾向を蓄積していく。言語遅滞患児に関して、新規の被験者を募り、データの蓄積を行なっていく。また、言語訓練における到達目標を提示できることを目指す。次年度に、大型の機器を購入する予定があったため、次年度に持ち越した。年度またぎの支出が生じたために、支出を留保した。来年度は最終年度であるため、学会発表、論文作成のために費用を拠出する。
ヒトES細胞からの脂肪血管前駆細胞の同定と脂肪細胞機能異常の発生細胞学的解析

脂肪細胞の肥大増殖に伴う形質転換のプロセスの理解において脂肪細胞の起源発生分化の正確な把握が不可欠である。無限の増殖能と全能性を有するES細胞は、細胞分化解析の好適のマテリアルである。我々は、VEGF受容体の一つであるFlk1陽性細胞を純化し、Flk1陽性細胞が血管前駆細胞(ES cell-derived vascular progenitor cells ; ES-VPC)であることを発見した。更に我々は、日本初のヒトES細胞を用いた研究を開始した。本研究課題はヒトES細胞由来間葉系前駆細胞、更に脂肪血管前駆細胞を同定し、脂肪細胞の発生分化をin vitroで単一細胞レベルでトレースし脂肪細胞分化因子を網羅的に探索するとともに、その成果をメタボリックシンドロームの成因解明及び脂肪細胞機能是正治療法への応用を目指すものである。我々は、ヒトES細胞を用い、TRA-1-VEGFR-2+PDGFR+VEカドヘリン-分画が血管前駆細胞(hES-VPC)であることを明らかにした。hES-VPCに対してインスリン、デキサメサゾン、IBMX、ピオグリタゾンを用いた脂肪細胞分化を行っても脂肪細胞への分化は認められなかったが、コラーゲンIV上hES-VPCを低血清、PDGF-BB刺激下で30日間培養した細胞では、ある程度脂肪滴を有した細胞に分化した。またこの細胞群に骨分化刺激を行ったところ、アルシアンブルー陽性細胞の出現が認められた。この細胞の約70%では間葉系細胞マーカーであるCD90等が陽性であった。またこれら未分化hES、hES-VPC、およびhES-VPCより分化させた内皮細胞、血管平滑筋細胞よりmRNAを回収し、アフィメトリックス社のジーンチップを用い、マイクロアレイ解析を行った。その結果、hES-VPCの遺伝子発現は最近報告されたhES由来間葉系前駆細胞のそれとの間にある程度の相同性が認められた。脂肪細胞の肥大増殖に伴う形質転換は、メタボリックシンドロームの成因、病態において中心的意義を有するが、そのプロセスの理解において脂肪細胞の起源発生分化の正確な把握が不可欠である。無限の増殖能とほとんどすべての臓器細胞に分化し得る全能性を有するES細胞は、細胞分化解析の好適のマテリアルである。本年度は、ES細胞由来の脂肪血管前駆細胞の同定を試み、以下の研究成果を得た。未分化マウスES細胞をコラーゲンIVディッシュもしくはOP9ストローマ細胞上で分化させ、Flk1陽性細胞を純化した。得られたFlk1陽性細胞を用いて、5μg/mlインスリン、0.5μMデキサメサゾン、50μMインドメサシン、0.5mM IBMX、1μMピオグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地で14日間培養を行い脂肪滴の出現を評価した。その結果、脂肪の蓄積を認める細胞を認めたもののその数は少数であった。一方、Flk1陽性細胞を血清存在下で3日間培養し血管平滑筋へと分化させた後に、PPARγアゴニストである1μMピオグリタゾン、PPARδアゴニストである50nM GW501516を添加し、血管平滑筋細胞の形質変換を検討したところ、血管平滑筋細胞のα平滑筋アクチン染色性は減弱し、脂肪を蓄積する前脂肪細胞の分化が認められた。以上より、マウスES細胞VPC由来の血管平滑筋においてPPARδ、PPARγの活性化により脂肪蓄積が促進されることから、血管平滑筋細胞においてもPPARfamilyの転写調節により脂肪細胞への分化誘導の可能性が示された。

またこの細胞群に骨分化刺激を行ったところ、アルシアンブルー陽性細胞の出現が認められた。この細胞の約70%では間葉系細胞マーカーであるCD90等が陽性であった。またこれら未分化hES、hES-VPC、およびhES-VPCより分化させた内皮細胞、血管平滑筋細胞よりmRNAを回収し、アフィメトリックス社のジーンチップを用い、マイクロアレイ解析を行った。その結果、hES-VPCの遺伝子発現は最近報告されたhES由来間葉系前駆細胞のそれとの間にある程度の相同性が認められた。
数値流体力学による乱流噴流の組織的構造と乱流拡散機構の解明

1.時間発展乱流混合層時間的に発達する対向平行乱流混合層に関しては、ランダムな微小じょう乱を含む17の場合についてLESを用いた数値計算を行い、運動量厚さが時間に対してほぼ線形に成長し、周期的に励起された場合に観察される凹凸は観察されないこと、初期速度場がランダムな変動を含む場合にも、大規模渦構造やリブ構造が形成されることを明らかにした。また、乱流の組織構造を明らかにするために、三次元グラフィックスを用いた渦度の可視化を行い、乱流混合層のブレイド領域に三次元リブ構造が形成されること、コア領域において三次元リブ構造はつながっている事を明らかにした。2.空間発展乱流混合層レイノルズ数の比較的高い乱流境界層を流入境界条件とする空間的に発達する乱流混合層を対象として、LESを用いた数値計算を行い、モデル定数の影響、初期乱れの影響、壁面近傍での減衰関数の効果、流出境界条件について検討を行い、流入境界条件が速度変動を含む場合には大規模渦が形成され、運動量厚さも急激に増大すること、壁面近傍で減衰関数を用いることにより、壁面近傍における乱流粘性を適切に評価することができ、乱流混合層の発達を正しく予測することができること、モデル定数がC=0.15とC=0.18の場合では計算結果にほとんど差異がないこと、X方向の速度を領域内の二点を用いて外挿することにより、適切な流出境界条件を与えることができることを明らかにした。また、Osterらの実験結果との比較から、現象が二次元的と考えられる領域において、運動量厚さの空間的な発達、平均速度分布およびX方向変動速度成分の最大値は実測値と計算値がよく一致することが明らかとなった。
真空紫外マイクロビームを用いた円二色性計測による隕石中のキラリティ分析手法の検証

本提案は隕石試料などに含まれる有機分子のキラリティを直接分析する手法として、紫外真空紫外線領域における円二色性スペクトル計測によるものを提案し、その有効性を検証することを最終目標としている。そのために紫外真空紫外線領域における円二色性スペクトル計測装置の高度化、特にマイクロビーム化などによる高感度化や二次元分布計測システムの開発などを行うともに、テスト試料を用いた本装置・手法の評価を行い、実際の計測の可能性や必要な要素技術・計測法などに関する指針を明らかにする。本年度はまず前年度開発したシュバルツシルトミラーを用いたマイクロビームによる円二色性、光吸収の二次元分布計測システムの高度化を行った。光学系の慎重な調整により、光スポット径を40μm×60μm程度にまで縮小化することに成功した。さらにピンホールを用いた2次元分布計測より、マイクロビームの形状が楕円に近いものであることも明らかにした。L-チロシンの薄膜をメッシュパターン状に真空蒸着した試料を用いて、真空紫外領域での吸収と円二色性の二次元パターンを計測したところ、前年度のものよりも鮮明な画像の観測に成功した。またベースライン計測を行わずとも、円二色性スペクトルを計測可能な方法の開発にも成功した。更に研究協力者の協力を得て、隕石試料の吸収、円二色性、直線二色性スペクトルの測定を試みた。その結果、直線二色性由来の成分を正確に考慮する必要が有ること、円二色性計測の場合はできる限り薄い試料にしないと計測が困難であること、円二色性だけでなく光学活性の計測も有用であるという指針を得ることができた。光学活性計測では円二色性より試料厚さを厚くできるので試料準備が容易になるなどの利点がある。今後これら指針を基に手法開発を進めていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。そのために紫外真空紫外線領域における円二色性スペクトル計測装置の高度化、特にマイクロビーム化などによる高感度化や二次元分布計測システムの開発や理論計算との比較によるキラリティ・分子構造予測手法の開発を行うともに、テスト試料を用いた本装置・手法の評価を行う。本年度はシュバルツシルトミラーを用いたマイクロビーム光の発生とそれによる円二色性、光吸収の二次元分布計測システム、および得られた円二色性スペクトルから観測分子のキラリティや分子構造を予測するための理論計算システムを構築した。円二色性スペクトル計測システムは光源である重水素ランプ、前置鏡、分光器、後置鏡、直線偏光子、光弾性変調子、試料ステージなどから成る。本年度はまず前置鏡、後置鏡を中心した光学配置の最適化と光弾性変調子と試料ステージ間にシュバルツシルトミラーを組み込むことで光スポット径を約7mm角から40μm×70μm程度にまで縮小化することに成功した。また円二色性ならびに光吸収の単一波長での二次元分布を自動計測するプログラムを開発した。また理論計算システムは重要な凝縮系での光吸収・円二色性スペクトルの計算が実用的に可能な性能のものを構築した。模擬試料としてアミノ酸の一種であるL-チロシンの薄膜をメッシュパターン状にフッ化カルシウム基盤上に真空蒸着したものを作製した。この試料の光吸収・円二色性スペクトルと二次元分布を開発したシステムを用いて計測したところ、1mm角程度の領域において使用したメッシュのパターンと同等な二次元イメージングを観測することなどに成功した。本研究計画の基礎となるマイクロビーム光を用いた円

二色性計測システムの開発とその端緒の二次元分布と100μm以下の試料径でのスペクトル計測に初年度で成功しており、概ね順調に研究目的を達成しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は装置の計測感度・空間分解能の高度化を進めていき、実際の隕石試料で予測されうる円二色性強度・空間分布でも計測可能か、理論計算システムでどこまで観測したスペクトルを再現できるかなどを検証する。また円二色性だけでなく光学活性計測による分析手法も同様に検証する。これらにより本手法の隕石試料のキラリティ直接観察における有用性を評価する。
Wnt/平面細胞極性経路のコア分子によるアクチン細胞骨格および細胞接着の制御機構

初期形態形成の分子機構を明らかにするため、集団的細胞運動に関わる細胞接着の制御を担うと考えられるparaxial protocadherin(PAPC)の調節の詳細を解析した。その結果、PAPCはリン酸化とそれに依存したユビキチン化を受け、これらの修飾がPAPCタンパク質の局在と安定性を制御することが明らかになった。このPAPC制御のシステムは、ツメガエルの初期発生に必須な役割を果たしている。PAPCの修飾に必要な領域は進化的に保存されていることから、このシステムはほかの様々な系においても重要な役割を果たしていることが推測される。研究期間全体を通じて,初期形態形成における細胞運動に必須のはたらきを持つと考えられる,paraxial protocadherin(PAPC)の制御機構の詳細とその役割を明らかにした。初年度では,PAPCがリン酸化とユビキチン化を受けること,それらの修飾がPAPCの正常な局在と安定性に必要であることを見いだした。最終年度はさらに詳細な解析を進め,valosin-containing protein(VCP)がユビキチン化されたPAPCのリサイクリングと分解の振り分けを担うこと,PAPCが直接的に同種親和性の細胞接着を媒介し,細胞運動に関与することなどを発見した。これらの結果をもとに,現在論文を執筆中であり,近日中に投稿の見込みである。以上のように,掲げた研究課題のうち,「細胞接着の分子機構」について,大きな成果を得た。しかしながら,申請時から所属が異動になり,適切なモデルシステムの利用が困難になったことなどが原因となり,「Wnt/平面細胞極性経路とアクチン細胞骨格の関係」については,計画通りの成果を得られなかった。そこで最終年度は,小型魚類飼育システムの立ち上げを行った。具体的には,最大で約600個体,80系統のゼブラフィッシュを維持することのできるシステムを構築した。ゼブラフィッシュは遺伝学・発生工学・イメージングに適したモデル生物であり,形態形成・細胞の振舞い・分子機構の関係の探求に力を発揮すると考えられる。研究目的として掲げた「アクチン細胞骨格および細胞接着の制御機構」のうち,細胞接着に関与すると考えられるparaxial protocadherin (PAPC)に関する研究から,「細胞接着の制御機構」の詳細を明らかにした.まず,アフリカツメガエル胚でPAPCの蛋白質レベルでの調節を調べたところ,原腸胚初期ではPAPCは中軸中胚葉の細胞膜上に存在したが,初期神経胚までに分解を受け,中軸中胚葉の細胞膜から排除されることが分かった.そこで,このPAPCの調節の分子機構をさらに解析した.その結果,PAPCはGSK3によるリン酸化と,beta-TrCPによるリン酸化依存的なユビキチン化という修飾を受けることを見いだした.PAPCはエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれるが,原腸胚初期の中軸中胚葉では,脱ユビキチン化酵素であるTNFAIP3がPAPCを脱ユビキチン化し,その結果PAPCは細胞膜にリサイクルされ,細胞膜に局在することを観察した.一方で,神経胚初期では,TNFAIP3の働きが抑制されており,ユビキチン化されたPAPCはリソソームによる分解を受けることを発見した.このようなPAPCの巧妙な制御機構を通した細胞接着の調整は,アフリカツメガエルの初期発生に必須な役割を果たしている.さらに,予備的なデータとして,PAPCとGSK3,beta-TrCPの会合を促進する分子として,Wnt/平面細胞極性(PCP)経路のコア分子であるPrickleを見いだした.Wnt/PCP経路は様々な生物学的局面で細胞運動を制御することが分かっているが,その詳細な分子機構は不明である.このデータは,Wnt/PCP経路による細胞接着分子の直接的な調節という,まだあまり知られていない機構を明らかにする糸口となるであろう.平成23年度より自然科学研究機構・基礎生物学研究所から大阪市立大学大学院・医学研究科へと所属が変更になり,その結果研究のスタートはやや出遅れた.しかしながら,旧所属との連係により,課題として掲げている「アクチン細胞骨格および細胞接着」のうち,「細胞接着」についてまとまったデータを得ることが出来ている.この結果はすでに論文の形にまとめつつあり,近日中に投稿予定である.一方,「アクチン細胞骨格」の方の研究はやや遅れており,また「Wnt/平面細胞極性のコア分子」の関与についても,現在極めて興味深い予備的なデータを得て,その検証を行っている段階である.

従って,現在のところ課題に対する達成度は5割弱といったところであるが,今年度はより整った環境でより精力的に研究が進められると期待されるため,おおむね順調に進展していると考える.今年度はまず,新たにゼブラフィッシュ飼育環境を立ち上げることを迅速に行う.そして,培養細胞を用いた細胞生物学的手法から得たデータについて,ゼブラフィッシュを用いて実際のin vivoでの機能を検証して行く形を基本とする.具体的には,まず,現在予備的なデータを得ているPrickleの細胞接着への関与について,さらなる検証を行う.培養細胞を用いて,PrickleがPAPC,GSK3,beta-TrCPの会合をどのように調節しているかを検討する.そして,その機構が初期発生,特に細胞運動において果たす役割を,ゼブラフィッシュにおいて観察する.また,Prickleに存在する様々な分子内ドメインとアクチン細胞骨格との関係を,培養細胞を用いて詳細に観察する.現在までに,PrickleのN末端が糸状仮足様の突起を誘導することを観察しており,関連蛋白質などから,その分子機構を明らかにする.そして,そのようなアクチン細胞骨格がin vivoでどのような細胞の挙動に関与しているかを,ゼブラフィッシュを用いた系で調べる.平成23年度より所属が変更になり,それまで使っていた系であるアフリカツメガエルなどが現在手近にない状況である.現在は主に培養細胞を用いて細胞生物学的解析を行っているが,その結果を初期胚で検証する系が必要である.そのため,基金化による弾力的な研究費運用の利点を生かし,150万円程度を目処にゼブラフィッシュ飼育環境を立ち上げる予定である.ゼブラフィッシュは胚操作が簡便な上,胚が透明で観察に適する,トランスジェニック系統や多様な変異体なども扱える,といった点で,この課題に適切なモデル生物である.その他必要な消耗品や,海外での学会発表などのための旅費などを使用する計画としている.