hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属/固(液)体界面分子の選択的測定による界面相互作用の研究

この研究では金属一固(液)体界面に存在する分子の選択的測定法としてプリズム反射面に金属薄膜のある赤外ATR分光法を開発するのを目的とした。研究の結果つぎの成果が得られた。1.赤外吸収強度増大の機構:この方法では赤外吸収強度が少なくとも数百倍増大する。この機構について理論的に考察した結果、金属を含む界面薄層内の電場により金属薄膜の微細な凹凸部に誘起される強い振動電場がその原因である事を結論した。2.金属電極表面に吸着したイオンの挙動:金および銀電極表面に吸着した【SCN^-】,【CN^-】イオンの電極電位の変化に伴なう挙動をin-situ測定した。その結果、【SCN^-】イオンはS原子で金属と結合する事、【Cl^-】イオンの共存によってその銀電極への吸着が阻害される事が見出された。また、【CN^-】イオンの挙動は平滑な電極表面について外部鏡面反射法で測定されたものに一致する。しかし、測定されるのは金属と直接結合する化学種のみであり、外部鏡面反射法では重複して測定される溶存化学種の信号は存在しなかった。その上、外部反射法のように溶液層を薄くする必要がなく、またSERSのように測定対象が特定の状態に存在する限定された化学種に限られる事も無い。すなわち、この方法が電極表面化学種の振動スペクトルの測定に最適であると結論出来る。3.ニッケル表面化学種の測定:この測定法の貴金属以外への応用の可能性を探るため、ニッケル薄膜を用いた測定を行なった。その結果、ニッケルでは赤外吸収強度の増大は貴金属にくらべ小さいが、金属表面近傍に存在する分子が測定されることは同様である事が分った。なお、赤外吸収はこの場合、反射率の増加として測定される。
絵画表現に躓きを見せ始める子どもの描画発達を促進する教育実践学研究

本研究では、輪郭線を利用した活動の開発を目指し、臨床応用するための検証を行った。まず幼稚園教諭と研究者との連携により造形プログラムを計画立案・実施し、次にデータ整理と分析を行った。結果、鑑賞活動と表現活動が自然に融合することにより子どもの絵画表現への内発性に刺激を与え、その活性化を促す傾向が見られると判断された。現在まで特に教育的な価値が与えられていなかったが普及率は高く、子どもに好まれる塗り絵遊びに着目し、輪郭線を取り入れた教育実践を検討することは、幼児教育・美術教育において未開拓の領域であると言える。したがって教育現場にとって、新しい指導援助の方法として大きな意味を持ち得ると考えられる。1内容平成25年度は、平成24年度の研究で得られた知見をもとに、幼稚園教諭と連携しながら輪郭画用紙を用いた造形遊びを5月から7月に亘って実施し、発達的変化と効果について考察した。調査・観察を実施した対象者は、大学附属幼稚園年長児で、あらかじめ設定されていた「分析の視点」と「分類項目」にしたがって、結果を整理・分析・検証している。2意義当該年度に進めた研究の意義は、美術作品やその鑑賞を取り入れた新しい造形カリキュラムを、教育現場と連携する中で保育者の人的環境としてのあり方・役割に関する考察を行いながら実践して、その効果を導きだしたことである。また輪郭線を幼児の多面的な生活環境と関連させた造形遊びとして取り入れることは、子どもの「表現したい」という内発的欲求を引き出す働きかけをする点で、これまでにない新しい援助の方法であると言える。3本研究の重要性芸術作品とタイアップした表現活動の開発に加え、芸術に触れる機会を活動前に用意することで、今まで省みられなかった分野に意味を見いだし、わが国における幼児期の美術教育の新しい可能性を探求してくものである。造形的な躓きを持つ子どもが輪郭線という手がかりを得ることにより、白紙に対する不安を解決するだけでなく、さらに絵を描くことに積極的な子どももそうでない子どもも、画用紙を選択することで共に楽しく活動することができるため、今後現場での支援の手段としてバリエーションを得るための実践力が高い。4本年度研究成果の発表成果をまとめ、研究論文「3つの輪郭線が及ぼす絵画表現への影響と比較」として平成26年3月発行の学会誌(査読有)にて発表した。平成24年度は、文献研究と並行して、子どものための体験型芸術教育の実態や動向を現地で調査し、その後幼稚園教諭との連携のもとで、保育者の役割を含めた新しい造形活動カリキュラムを策定し、その展望について検討した。1内容フランスでは、約412歳の子ども達が遊びながら学べる体験型のワークショップを主に国立美術館で提供している。そこでは作品を取り上げながら様々な技法での制作が行われ、芸術に関心を持つ手がかりになるような工夫がされている。特に作品鑑賞を基盤とした表現活動は、1990年にルーブル美術館において「子どものアトリエ」が始まったことを通じてよく知られる教育分野であるが、日本においてはその受容が進んでいるとは言えない。そこでこのような背景およびこれまでの研究成果をもとに、芸術作品を用いた教育実践について、吟味・検討・論述した。2意義本年度に進めた研究の意義は、美術作品やその鑑賞を取り入れた新しい造形カリキュラムを開発、5歳児のための活動の計画・立案をし、同時に教育現場と連携しながら、保育者の人的環境としてのありかた・役割に関する考察を幼稚園での実践に向けて行ったことである。3本年度研究成果の発表平成24年度の研究成果をまとめ、「V.Gogh 'La Chambrede Van Gogh a Arles'を用いた絵画プログラムの検討と意義」として平成25年3月発行(印刷中)の査読付学会誌にて発表した。本研究は、一枚の絵画とそれに関連した輪郭線を用いる活動により,子どもの絵画表現を活性化させる教育実践の試行と結果の整理を目的としている。これまでに,何かを見立てそれを手がかりに描画活動を始めることが出来るよう,あらかじめ画用紙にものの形の一部である輪郭線の入っている画用紙(輪郭画用紙と呼ぶことにする)を使用して,輪郭画用紙と白色画用紙を選択出来るようにし,子どもの描画発達の変化を調査してきた。幼年造形教育における実践研究の第1段階として,輪郭線を効果的に使用することが特定の年齢の子どもにとって有効であることを解明した。第2段階として,幼児教育への効果的な導入方法を検討するために,絵本を用いた活動によって検証を試みて,絵画活動に積極的な子どももそうでない子どもも共に楽しみながら,輪郭線を手がかりとして表現を広げることが出来ることを明らかにしている。第3段階として本年度は,これまで研究を進めた輪郭線を用いた活動を応用して芸術に触れる機会を用意することで,表現活動と鑑賞活動が無理なく融合される造形プログラムの実施と結果の検証を行った。

芸術作品とタイアップした表現活動の開発と、調査実施によって明らかになった結果にもとづき、原著論文を学術雑誌に積極的に発表している。本年度研究成果として、研究論文「芸術作品の導入を緒に考察する絵画的表象の位相」を平成27年3月発行の学会誌(査読有)にて発表した。社会科学平成24年度からの継続研究である平成25年度は、当該年度の研究計画・方法に即して、幼児教育・描画心理学に関連した文献の検索・収集・複写・分類と資料整理を継続的に行いながら、研究目的2(幼稚園での保育実践...研究目的1で得られた結果をもとに、美術作品に関連した輪郭線を用いた造形遊びの観察と考察を実施し、子どもの絵画表現の発達的変容を実証する)を達成するために、大学附属幼稚園児でデータを収集し、その整理・分析・考察を行い、研究論文を発表していることから、研究の進捗状況は良好であると判断する。結果の整理方法として、「分析の視点」と「分類項目」を設定しているが、幼児の作品の分析を進めている中で、色彩表現方法の診断と表現内容のカテゴリー分析に関して、もっと詳細な指標に改良することによって、さらに具体的な有効性を明らかにできる可能性が出てきた。したがって、その点に関して専門知識の提供と指導助言を必要としている。平成24年度は文献研究と並行して子どものための体験的芸術教育の実態や動向を現地で調査する予定であったが、当初の計画よりも進展があったため、翌年2月の現地調査出張を9月に早めることが出来た。この時期は、ハイシーズンにあたるので航空運賃等の上昇が挙げられ従来の予算より数万円の不足が確認され、前倒し請求を願うことになった。しかし現地調査の実施月が早くなったことで、調査結果をまとめた論文を本年度中に投稿、掲載発表することが出来た。同時に教育実践に向けての準備を行う時間をより充実させることが可能になったことからも、当初の計画以上に進展していると言える。平成26年度は、調査実施によって明らかになった結果にもとづき、緻密なデータの上に立脚した教育実践方法を論述する。これまでに得られた知見から、実証資料にもとづく原著論文を執筆し、学術雑誌に積極的に発表することによって、わが国の幼児教育・保育者養成・教育実践学研究の発展に寄与したい。研究をまとめる作業に際し、国内外の研究者から指導および助言を受ける予定である。実施計画に記している大学教員・小学校教諭・国内美術館学芸員に加えて、研究計画の変更点として「L'Atelier pour enfants」(ルーブル美術館)の講師が、`activites jeune public et familles'という子どもを対象としたワークショップで行っている方法を見学・調査し、指導・助言をあおぐ。現地での仏語の通訳として三島和美氏に協力を依頼している。平成24年度の研究で得られた知見をもとに、幼稚園と連携しながら輪郭線を用いた造形遊びを実施し、その発達的変容と効果について考察する。調査・観察を実施する対象者は、ノートルダム清心女子大学附属幼稚園年長児で、分析の視点と分類項目にしたがって整理・分析・検証していく。
プロスタノイド受容体欠損マウスを用いた高血圧と血管合併症の発生機序に関する検討

目的:プロスタノイドは種々の生物活性を有し、それぞれの分子種固有の受容体を介してトロンボキサン(TX)A2は血管平滑筋の緊張を、プロスタサイクリン(PGI2)は血管平滑筋の弛緩作用を持ち、血圧、臓器血流量の調節に関与することが知られている。従来プロスタノイドの生体における機能は、アゴニスト、アンタゴニストを用いた実験によることが多く、分子構造が近似するプロスタノイドの作用を厳密に評価することが困難であった。本研究は腎の受容体ノックアウトマウスを用いてプロスタノイドの血圧調節ならびに、腎血流の変化に対する臓器保護における生理学的意義を解明することを目的とした。方法:マウスTX受容体遺伝子(TP)およびPGI2受容体遺伝子(IP)ノックアウトマウス(KO)をそれぞれ作成し、食塩負荷による血圧の変動を測定した。さらに虚血性急性腎不全モデルを作成し、腎機能と腎組織の変化をコントロールとして用いたワイルドタイプマウス(WT)と比較検討した。結果:TPKOはWTと比較して正常食塩食、食塩負荷食ともに有意な血圧の変化を認めなかった。一方、IPKOではWTに比較し正常食塩食では平均血圧の低下を認め、食塩負荷によってWTとほぼ同等に血圧上昇を認めた。虚血再還流モデルにおいてはIP, TPKOともにWTと較べて、急性賢不全発症後の腎機能、腎組織に有意な変化を認めなかった。考案:TP, IPは急性腎不全の病態に関与する可能性が少ないことが示された。またIPは食塩感受性の血圧変化に何らかの関与をしている可能性が示され、同病態の理解と臨床的な応用に対する可能性が考えられた。Prostanoidsは急性腎不全での進展に関与している可能性が示唆されている。しかし、Prostaglandin(PG)I_2とThromboxane(TX)A_2の急性腎不全での役割は未だ確立していない。本研究ではPGI_2レセプター(IP)あるいはTXA_2レセプター(TP)遺伝子が急性腎不全に影響するかどうかをIP、あるいはTPノックアウトマウスにて検討した。(1)TP(-/-)IP(-/-)のBUN、CreaはWild typeと変化がなく、Prostanoidレセプター遺伝子による腎機能への影響はないと思われる。(3)虚血再潅流腎症24時間後の尿細管壊死の程度を検討した。TP(-/-)、TP(+/+)では有意な変化を認めず、P(-/-)はIP(+/+)よりも組織障害度がわずかに軽い傾向であった。以上の結果よりTPは虚血再潅流腎症を軽減させ、IPは増悪させる傾向であったが、有意な差は認められなかった。この原因としては、20分の虚血がマウス急性腎不全モデルでは負荷が強すぎたためとも思われ、虚血時間を短くし再度検討が必要と思われる。本年度は新規ノックアウトマウスの供給が不可能となったため、前年度までにおこなったIP,TPノックアウトマウスの血圧に対する食塩摂取の影響に関する検討、および虚血再潅流による急性腎不全におけるIP,TP受容体の役割に関する検討の追加実験をおこなった。前者の検討では食塩摂取によりIPノックアウトマウスでは血圧上昇が見られ高血圧の病態生理に関与している事が示唆された。後者では虚血再潅流によっても腎の器質的、機能的な変化はIP,TPノックアウトマウスとワイルドタイプマウスでは差が見られず。少なくともマウスのこの実験系においては急性腎不全の病態にプロスタノイド受容体の関与は否定的であると考えられた。これらの結果は現在投稿中である。前年度までに、私たちはプロスタノイド受容体欠損マウスにおける食塩感受性の血圧変化および急性腎不全モデルの虚血再灌流を用いた検討を行った。本年度も新規ノックアウトマウスの供給が不可能であったため、前年度までの追加実験と、ヒトの糸球体疾患患者での尿中プロスタノイド産物の検討を行った。

マウスによる検討では虚血再潅流によりIP, TP欠損マウスともにコントロールのワイルドタイプ(WT)マウスと比較して、病理組織学的検討において腎の糸球体、尿細管間質に有意な変化を認めなかった。また機能的にもIP, TPノックアウトマウスはWTと有意な差を示さなかった。これは従来の急性腎不全においてTP受容体の関与を示唆する、TP阻害薬を用いた成績と異なる結果であった。これらの結果は、Clinical and Experimental Nephrologyに掲載予定である。またこのことから、種差によるプロスタノイドの関与の相違が示唆されたため、これを検討するために、急性腎不全を含む種々の腎臓病患者の尿中のプロスタノイド代謝産物を測定した(結果解析中)。
血管の緊張異常を阻害する新規の細胞膜脂質成分の同定と細胞内情報伝達機構の解明

合計すると我が国死因の第1位となる血管病(心筋梗塞や脳卒中など)の原因として、血管平滑筋のCa^<2+>非依存性収縮(すなわち、[Ca^<2+>]i増加の程度だけでは説明できない異常に大きな収縮)による血管の緊張異常が注目されている。このCa^<2+>非依存性収縮を引き起こすメカニズムを解明し、また、その機能分子を同定することによって、死因第1位である血管病の予防法や治療法を早急に開発することが、国民衛生上の最重要課題である。したがって、本研究の目的は、申請者らが独自に開発した分子細胞生理学的手法を駆使して、1)血管平滑筋のCa^<2+>非依存性収縮を引き起こす情報伝達因子の相互関係、およびそれらの上流・下流の情報伝達機構(因子)を明らかにすること、2)血管平滑筋のCa^<2+>非依存性収縮を特異的に抑制する新規の細胞内情報伝達因子の同定・クローニングを行い、3)これらの情報伝達系のヒトにおける生理的・病態的役割について明らかにすること、その細胞内情報伝達機構を明らかにすること、にある。初年度は、主として薬理学的手法を用いて、Rhoキナーゼとスフィンゴ脂質の相互関係について検討を行い、スフィンゴ脂質の中でもSPCの下流にRhoキナーゼが作用していることが示唆された。最終年度は、シグナル伝達機構を直接的に証明するために、スキンド血管平滑筋を用いて、リコンビナント蛋白、分子内阻害ペプチドなどを細胞内へ導入することによって詳細に検討し、以下のような結果を得た。1)スフィンゴ脂質の1つであるSPCは、Rhoキナーゼの活性化を介してCa^<2+>非依存性収縮を引き起こす細胞内シグナル分子である。2)SPCは、G蛋白の活性化を必要としないため、GPCRの関与は可能性は低い。3)SPC経路は、Cキナーゼ系とのクロストークがほとんどない。4)SPCは、脳血管平滑筋の持続的な異常収縮を引き起こす。合計すると我が国死因の第1位となる血管病(心筋梗塞や脳卒中など)の原因として、血管平滑筋のCa^<2+>非依存性収縮による血管の緊張異常が注目されている。従って、このCa^<2+>非依存性収縮を引き起こすメカニズムとその原因因子を解明することによって、血管病の予防法や治療法を開発することが、国民衛生上の緊急・最重要課題である。したがって、本研究では、1)血管平滑筋のCa^<2+>依存性の正常収縮には影響を与えず、Ca^<2+>非依存性異常収縮を特異的に抑制する新規の細胞内情報伝達因子、MLDRFの最終精製を行い、MLDRFを同定すること、2)申請者らが独自に開発した細胞分子生物学的手法を駆使して、血管内皮・平滑筋細胞の機能制御における、MLDRFの役割とその上流・下流の細胞内情報伝達機構を明らかにすること、3)単なる動物実験にとどまらず、ヒト正常・病的血管の実験も行い、新しい血管病治療法(薬)としてのMLDRFおよびその関連因子の可能性を追求すること、を目的とする。初年度は、新規の細胞内情報伝達因子、MLDRFの最終精製を行うとともに、これまで阻害薬を用いて検討してきたRhoキナーゼとスフィンゴ脂質の相互関係について、より直接的に証明するために、リコンビナント蛋白、分子内阻害ペプチドを用いて、さらに詳細に検討した。以下のような結果を得た。1)スフィンゴ脂質は、Rhoキナーゼの活性化を介してCa^<2+>非依存性収縮を引き起こす細胞内情報伝達因子であることが証明された。2)このスフィンゴ脂質/Rhoキナーゼ情報伝達系は、Cキナーゼ系とは異なる経路である事も示された。
トランスカルチャー的舞台としての東アジア研究―自己像と亡命者のアジア像を通して

1)本研究で明らかにする「トランスカルチャー(越境文化)的舞台」の例については、欧州における日本の戦争観に関する言説(新渡戸稲造の『武士道』に体現されている)と、19181939年のドイツにおけるイデオロギー的全体主義化の関連からトランスカルチャーについて考察し、その成果を2018年12月にベルリンの森鴎外記念館にて報告した。なお、トランスカルチャーについては、前科研プロジェクトの成果として複数の文化の混合が特徴的である中間的空間に関する諸研究を論集Wohnen und Unterwegsseinとして2019年1月に出版した。2)独語圏から東アジアへの亡命者が自身の経験などを記したテキストの分析に関しては、ナチス支配下のドイツから上海に亡命した重要人物A.J.Storferと彼が発行した雑誌について論文を執筆し刊行した。日本ならびに上海における亡命については、研究者が2020年に東京にて国際シンポジウムを開催する予定であり、同テーマで研究している管野賢治教授(東京理科大学)らと共に準備を始めた。また、Marbach文書館にて、ドイツから日本へ亡命したKarl LoewithならびにKurt Singerの未だ出版されていない手書きの手紙を調査し、これらの出版に向けて館長と意見交換を行った。これまでの東アジア研究とAGSとの関連、またAGSとトランスカルチャーの結びつきについては、様々な学会の口頭発表ならびに論文において中心的に取り扱うことができた一方で、亡命・移住との関連に関する分析はやや遅れている。AGS、トランスカルチャー研究、亡命研究という3つの重点を結びつけて研究を進めていく必要がある。日本ならびに上海への亡命をテーマとし、2020年に開催する国際シンポジウムのため、引き続き、国内外の研究者と意見交換を行い、準備を進めていく必要がある。今後、シンポジウムの具体的なコンセプトを完成させ、参加者リストを作成していく。また、過去の科研プロジェクト同様、ゲーテ・インスティトゥートと連携して開催できるよう、館長Peter Andersと計画を進める。b) 2019年8月に札幌で開催されるアジアゲルマニスト学会に参加し、東アジアの自己像と、それに共感した西欧のテキストについて口頭発表を行う。本発表にて東西の言説形式が多層的に相互に依存し合っていることを指摘する。最終的には、両言説が二分されるのではなく、共通のトランスカルチャー的言説形式として考察できると考えている。理由:(1)予定した研究旅費は科研をしようせず、自費で対応したため。科研研究目的と他の目的を行う一つの出張への使用がルール上できないため。(2)希望していた条件にあう研究助手が見つからずその分の使用がなかったため。使用計画:今年度複数回の海外における学会発表を予定しており、それに使用する。また、次年度に開催するシンポジウムへ海外から招聘する予算として残しておく。
組織特異的ペプチドマトリックスの創製-人工基底膜をめざして-

長年にわたり我々が発見してきたラミニン由来の機能ペプチドを組み合わせてキトサン膜に固定化することによって、再生医学や組織工学分野に応用可能な医用生体材料を創製することを目的に研究を行った。基底膜の主要な糖タンパク質・ラミニンは、細胞の接着や浸潤、神経突起伸長、血管新生、創傷治癒などを促進することが知られている。我々が見出した約20種類の細胞特異的に作用するラミニンの機能ペプチドをキトサン膜に固定化したところ、ペプチドの作用が増強されることをみいだした(Mochizukiら、FASEB J.,17:875-877,2003)。本年度は、シンデカンあるいはインテグリンに特異的に結合する2種類の機能ペプチドを組み合わせてキトサン膜に結合させた膜を用いて細胞の接着や神経突起伸長促進作用を検討し、シンデカンとインテグリンの相互作用を検討した。その結果レセプターの異なるペプチドを組み合わせてキトサン膜に結合することにより効率的に細胞に作用できることが明らかになった。さらに、AG73ペプチド(LQVQLSIRT)を固定化したペプチド-キトサン膜を用いてin vivoでの効果を検討した。ペプチド-キトサン膜を直接マウスに処置することにより創傷治癒効果が確認された。また、ペプチド-キトサン膜にヒト表皮細胞を接着させて、ヌードマウスに移植することにより、ヒト表皮細胞をマウスに移植できることがわかった。また、移植された細胞は分化することがわかった。これらの研究結果は、我々が同定したラミニン由来の機能ペプチドを化学的にキトサン膜に結合することにより、基底膜様の作用をもったペプチドマトリックスが作成できることを示すものである。本研究において開発したペプチド-キトサン膜は、上記のin vitroとin vivoの実験結果からわかるように、実際の再生医学や組織工学分野への応用が期待できるものである。ラミニンの機能ペプチドを化学的にキトサン膜に結合し、基底膜様の作用をもったペプチドマトリックスの創製を目的に研究を遂行中である。本年度は主に、機能ペプチドを単独あるいは組み合わせてキトサン膜に結合させ、その上に表皮、神経、血管内皮、線維芽細胞など異なった由来の株細胞を加え生物活性を測定した。ラミニン-1のペプチドスクリーニングから同定された約20種類の中で、A13, A99, C16, AG73など活性の強いペプチドをキトサン膜に化学的に固定化したところ、A99を結合させたキトサン膜上ではインテグリンを介して、AG73を結合させたキトサン膜上ではシンデカンを介して細胞に接着することが分かった。つぎに、これらのペプチドの複合体を作成することによって細胞接着や神経突起伸張などの作用が増強されると考え、複数のペプチドを結合させた複合体を作成したが、顕著な増強効果は得られなかった。しかし、キトサン膜上に複数のペプチドを結合させたペプチド-キトサン膜を作成したところ、1種類のみのペプチドを結合させたものに比べ、細胞接着や神経突起伸張の顕著な増強効果がみられた。これは、各々のペプチドがそれぞれ特異的なレセプターを介して細胞に対して作用することにより、活性が増大されたことによると考えられる。これらの研究によって、人工基底膜としてのべプチド-キトサン膜の創製のための基礎が確立できつつある。これらの研究結果は、Katoら、Biochemistry, 41 : 10747-10753, 2002 ; Yamadaら、FEBS Letters, 530, 48-52, 2002 ; Mochizukiら、FASEB J.印刷中(2003)に報告した。今後、複数のペプチドを結合させたペプチド-キトサン膜を用いて、細胞膜上の種々のレセプターに及ぼす影響を測定していく予定である。ラミニンの機能ペプチドを化学的にキトサン膜に結合し、基底膜様の作用をもった人工マトリックスの創製を目的に研究を継続中である。本年度は主に、機能ペプチドを単独あるいは組み合わせてキトサン膜に結合させ、その上に表皮、神経、繊維芽細胞など異なった由来の株細胞を加え、生物活性を測定した。ラミニン-1由来のペプチドスクリーニングから同定された約20種類の中でも、A13、A99、C16、AG73など活性の強いペプチドをキトサン膜に化学的に固定化したところ、A99を結合させたキトサン膜上ではインテグリンを介して、AG73を固定化させたキトサン膜上ではシンデカンを介して、それぞれ細胞に接着することがわかった。次に、これらの2種類のペプチドを固定化したキトサン膜を作成したところ、1種類のみのペプチドを結合させたものに比べて、細胞接着や神経突起伸長の顕著な増強効果がみられた。これは、各々のペプチドがそれぞれ特異的なレセプターを介して細胞に対して作用することによって活性が増大されたことによると考えられる。現在、このペプチド-キトサン膜のin vivoでの作用をみるために、マウスでの創傷治癒に対する影響を検討中である。また、アミロイド様繊維を形成するペプチドであるA208とフィブロネクチンの細胞接着部位であるRGDペプチドを利用して、多機能性ペプチドフィブリルの創製をめざした研究も行った。A208はIKVAVレセプターを介して、RGDはインテグリンを介して細胞と接着することがわかっている。これらの配列を組み合わせたペプチドであるFN-A208を合成し、その生物活性を測定した。

細胞の形態観察などの結果からFN-A208はインテグリンとIKVAVレセプターの両方が細胞に作用していることが示唆された。これらの結果はKasaiらBiopolymers印刷中(2004)に報告した。長年にわたり我々が発見してきたラミニン由来の機能ペプチドを組み合わせてキトサン膜に固定化することによって、再生医学や組織工学分野に応用可能な医用生体材料を創製することを目的に研究を行った。基底膜の主要な糖タンパク質・ラミニンは、細胞の接着や浸潤、神経突起伸長、血管新生、創傷治癒などを促進することが知られている。我々が見出した約20種類の細胞特異的に作用するラミニンの機能ペプチドをキトサン膜に固定化したところ、ペプチドの作用が増強されることをみいだした(Mochizukiら、FASEB J.,17:875-877,2003)。本年度は、シンデカンあるいはインテグリンに特異的に結合する2種類の機能ペプチドを組み合わせてキトサン膜に結合させた膜を用いて細胞の接着や神経突起伸長促進作用を検討し、シンデカンとインテグリンの相互作用を検討した。その結果レセプターの異なるペプチドを組み合わせてキトサン膜に結合することにより効率的に細胞に作用できることが明らかになった。さらに、AG73ペプチド(LQVQLSIRT)を固定化したペプチド-キトサン膜を用いてin vivoでの効果を検討した。ペプチド-キトサン膜を直接マウスに処置することにより創傷治癒効果が確認された。また、ペプチド-キトサン膜にヒト表皮細胞を接着させて、ヌードマウスに移植することにより、ヒト表皮細胞をマウスに移植できることがわかった。また、移植された細胞は分化することがわかった。これらの研究結果は、我々が同定したラミニン由来の機能ペプチドを化学的にキトサン膜に結合することにより、基底膜様の作用をもったペプチドマトリックスが作成できることを示すものである。本研究において開発したペプチド-キトサン膜は、上記のin vitroとin vivoの実験結果からわかるように、実際の再生医学や組織工学分野への応用が期待できるものである。
分子内シャペロン改変によるタンパク質のフォールディングメモリーの解明とその応用

プロペプチド変異体CPY(カルボキシペプチダーゼY)を酵母分子ディスプレイ法を用いて調製し、活性を測定したところ、成熟体のアミノ酸配列は同一であるが活性が変化しているCPY成熟体が得られた。精製したこれらのCPYを速度論的解析により比較したところ、触媒効率の上昇が認められた。活性化エネルギーにも変化が認められることから、プロペプチドへの変異導入が成熟酵素の機能や構造の改変を誘導した可能性が示唆された。これらの結果は、「プロテインフォールディングメモリー」として、分子内シャペロンが関わるタンパク質構造形成について新たな知見となった。タンパク質の構造はその一次構造により一義的に決定されるというアンフィンセン理論がある。しかし、その理論に当てはまらない興味深い例が見つかってきた。多くのプロテアーゼはN末端にプロペプチドと呼ばれる分子内シャペロンを有した不活性な前駆体として合成される。プロペプチド自身は活性を持たず、タンパク質の成熟化に伴い除去されてしまうが、成熟体のフォールディングに必須な部位となっている。出芽酵母由来のカルボキシペプチダーゼY(CPY)もN末端にプロペプチドを有する前駆体として生合成される。分子ディスプレイ法を用いてプロペプチドへの変異導入による成熟体の活性変化を解析することにより導き出した「プロテインフォールディングメモリー」というタンパク質構造形成の新規な現象に関して解明した。CPYのプロペプチドは成熟体を不活性な前駆体として維持することから阻害剤としても機能するが、CPYには別にCPY特異的阻害タンパク質ICが存在する。プロペプチドとICの相同性検索により、両者の配列には相同性が認められた。更に、相同性のあるICの配列はCPYと相互作用するのに必須な部分であることがCPY-IC結晶構造より明らかとなり、プロペプチドの成熟体への結合様式が推察された。これらの情報を基に作製したプロペプチド変異体CPYを酵母分子ディスプレイ法を用いて調製し、活性を測定したところ、成熟体のアミノ酸配列は同一であるが活性が変化しているCPY成熟体が得られた。更に、精製したこれらのCPYを速度論的解析により比較したところ、触媒効率の上昇が認められた。これらの結果をプロテインフォールディングメモリーとして、分子内シャペロンが関わるタンパク質構造形成について新たな知見となった。
夜間多尿動物モデルの確立と塩分負荷による膀胱求心性神経亢進の機構解明

夜間頻尿は罹患率が高く、下部尿路症状の中で最もQOLを低下させる。夜間頻尿患者の大多数は夜間多尿である。夜間多尿の治療は、既存の抗コリン剤やβ3アドレナリン受容体作動薬、飲水制限などの生活指導が行われるが、いずれも治療効果は乏しく、新規の治療戦略が切望されている。夜間多尿の治療や、その原因を考える上でモデル動物による基礎実験が欠かせないが、未だ夜間多尿動物モデルは確立されていない。そこでまず、夜間多尿動物モデルの確立に取り組んだ。ヒトにおいて夜間多尿は夜間高血圧と塩分摂取過剰と関連することが報告されている。われわれは夜間頻尿で通院中の患者の、塩分摂取量と血圧、夜間尿量の関係を検討した。その結果、高血圧のない症例では塩分摂取量と夜間多尿の関連は認められなかったが、高血圧を有する症例では塩分摂取過剰で夜間多尿となることを見出した。この結果をもとにわれわれは、様々な高血圧モデル動物にたいして塩分を過剰摂取させることで夜間多尿モデルの作成を試みることとした。そして現在、新規夜間多尿モデルを確立できつつある。また最近、夜間多尿の患者にたいする塩分制限成功群は失敗群と比較して、夜間多尿が改善するだけでなく、尿意切迫感も改善したと報告された。われわれはその報告からNa負荷が膀胱知覚神経の過敏性を亢進させるのではないかと仮説を立てている。それを検証するために、われわれが作成する新規夜間多尿モデルを使って、塩分負荷と膀胱知覚神経亢進との関連を検証する予定である。夜間多尿の動物モデル確立に難渋していたため。様々な高血圧モデルに対して、塩分過剰摂取させ、夜間多尿となるかを検討して来たが、ある高血圧モデルにおいて、塩分過剰摂取で夜間多尿となることを見出すことが出来た。このモデルを新規夜間多尿モデルとして確立し、今後の研究を進めていく予定である。研究を進めていくうえで必要に応じて研究費を執行した為、当初の見込み額と執行金額が異なった。
嗅覚高次中枢の細胞構成及び嗅球とのシナプス結合関係の形態学的解析

嗅球内には多様ないわゆるGABA作動性"短軸索ニューロンshort axoncell SA"が存在し、数の上では比較的少数であるが機能的には重視されている。以前の検討では明らかに従来投射ニューロンとされてきたmitral/tufted cellsと異なるNOS陽性ニューロンの一部が投射ニューロンに含まれることを明らかとした。本研究では更に、"短軸索ニューロン"と分類されてきたcalbindin陽性ニューロンの一部も同様に投射ニューロンであることを明らかにした。このことから我々は嗅球における"非主投射ニューロンNPP"を提唱した。しかし、重要なことは、嗅覚関連高次脳領域である島皮質,嗅結節,視床下部等に逆行性トレーサーfluorogoldを注入し標識されるニューロンの大部分は嗅球ニューロンの化学的マーカーでは染色されなかった。このことは"非主投射ニューロンNPP"は化学的性質の面から多様であり、これまで同定したNOS陽性、calbindin陽性"非主投射ニューロンNPP"はむしろごく一部であることが明らかとなった。一方、連合ニューロンについて逆行性及び順行性トレーサーで検討した結果、嗅球内、特に、糸球体層には主として大型のdopaminergic-GABAergic neuronsが担っている抑制性連合性結合IJGA(inhibitory juxtaglomerular association system)とexternal tufted cellsが担っている興奮性連合性結合EJGA(excitatory juxtaglomerular association system)の2種の連合性結合が存在すると考えられる。本年度は以下の4点について解析及び標本作製を進めた。1)前嗅核の形態学的解析のため脳全体の前頭断、矢状断、水平断の方向で50ミクロン厚の連続切片を作成しカルシウム結合蛋白、parvalbumin, calbindin, calretininに対する抗体で免疫組織化学染色標本を作製した。これらを用いて細胞構成の解析を開始した。2)我々が発見したdopaminergic-GABAergic periglomerular cellsの多様性、特に糸球体問の結合に関係している大型のdopaminergicニューロンとそれ以外の小型dopaminergicニューロンについてさらに解析を進めた。特に発生時期との関係について細胞分裂期にDNAに取り込まれるtymidine analog BrdUを用いた解析を進め、両者が発生の時期を異にすることを示唆する所見を得た。興味深いことに現在注目されている成体期での神経新生はおそらく小型のニューロンのみであろうと思われる所見が得られた。3)以前我々はこれまで介在ニューロンとされてきたニューロン群のあるものは投射ニューロンの可能性があることを発見した。この所見をさらに明らかにするために、これまでの所見で投射ニューロンを含んでいる可能性が高いと考えられるカルシウム結合蛋白calbindin陽性ニューロンについて形態学的詳細の解析を進めた。4)逆行性トレーサーFluorogold,及び順行性トレーサーPHA-Lを用いて嗅球内及び嗅球と他の脳部位との結合関係を共焦点レーザー顕微鏡で検討した。以前、我々は、従来介在ニューロンと考えられていた一酸化窒素合成酵素(NOS)含有ニューロンの一部が逆行性トレーサー実験で高次嗅覚中枢に投射していることを示した。この所見を更に広げるため、逆行性トレーサーフルオロゴールド(FG)を数か所の嗅覚高次中枢に脳定位固定装置を用いて、電気泳動的に注入し、嗅球内で標識されるニューロンを解析した。この実験によりかなり特異的に主嗅球顆粒細胞層で比較的大型のおそらくこれまでdeep short-axon cellsとされてきたニューロン群が標識される場合があることがあきらかになり、その投射部位の特異性の検討をすすめた。これについては、この投射ニューロンの化学的性質も含めてより詳細の解析を継続して進めている。一方、カルシウム結合蛋白calbindinD28k(CB)

陽性ニューロンの解析も進め、一部でのCB陽性大型ニューロンの軸索が外側嗅索(LOT)に伸びていることが確認できた。これらのCB陽性大型ニューロンはその樹状突起の構造等から従来、介在ニューロンに含まれるdeep short-axon cellsとされてきたニューロンであると思われる。このことから、NOS含有ニューロン以外でも従来いわゆる介在ニューロンと考えられてきたものに,投射ニューロンが存在することを示した。一方、嗅球後部に存在する前嗅核の解析も進めた。従来から検討しているカルシウム結合蛋白CB、パルブアルブミン(PV)、カルレチニン(CR)に加えて、最近発見されたカルシウム結合蛋白secretagoginの抗体が使用できるようになったので、この4種のカルシウム結合蛋白による細胞構成の検討を開始した。嗅球内には多様ないわゆるGABA作動性"短軸索ニューロンshort axoncell SA"が存在している。このようないわゆる"短軸索ニューロン"は数の上では比較的少数であるが、機能的に重視されている。これらは従来軸索が嗅球内で終わっている介在ニューロンと考えられてきた。しかし、我々の一連のトレーサー実験等で"短軸索ニューロン"の一部は嗅球外に投射していることが明らかとなった。このことから我々は嗅球における"非主投射ニューロンNPP"を提唱した。以前の検討では"非主投射ニューロンNPP"にはNOS陽性ニューロン、calbindin陽性ニューロンの一部が含まれていることが示された。嗅覚関連高次脳領域である島皮質,嗅結節,視床下部等に逆行性トレーサーfluorogoldを注入し標識されるニューロンの化学的性質を検討した。しかし、逆行性トレーサーで標識されたニューロンの大部分はparvalbumin,calretinin,secretagogin等の嗅球ニューロンの化学的マーカーでは染色されなかった。このことは"非主投射ニューロンNPP"は化学的性質の面から多様であり、これまで同定したNOS陽性、calbindin陽性"非主投射ニューロンNPP"はむしろごく一部であることが明らかとなった。更に、嗅球外の異なった部位にトレーサーを注入した時、それぞれ嗅球内の異なったニューロン群が逆行性に標識される所見を得た。このことは特定の"非主投射ニューロン"はそれぞれ異なった嗅覚関連高次脳領域に投射している可能性を示唆している。このような所見は、今後、体系的なトレーサー実験で異なった部位に投射している"非主投射ニューロンNPP"の違いを明確にする必要性を示している。
三塩基繰り返し配列異常を来す神経・筋疾患の新しい遺伝子診断システムの開発

筋緊張性ジストロフィー症や脆弱X症候群などの三塩基繰り返し配列異常で発症する疾患の新しい診断法の研究を行った。まず、これらの疾患の診断がPCR法で可能になるようにシステムを作成した。このシステムは、PCR産物をアガローズゲルにて電気泳動した後にナイロンメンブランに固定する。次にこのナイロンメンプランをビオチンラベルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする。最後にこのオリゴヌクレオチドを非アイソトープ法で検出するものである。この方法により、筋緊張性ジストロフィー症、脆弱X症候群、Huntington舞踏病、DRPLAの解析が可能となり、数多くの臨床検体の診断が可能であった。しかし、Huntington舞踏病やDRPLAではさらに詳細な繰り返し配列数を検討する方が望ましいと考えられた。そのためにHuntington舞踏病やDRPLAに関しては、オートシークエンサーにて詳細な繰り返し配列の数の検討を試みたが、延長したアレルは検出が困難になる欠点が明らかになった。これらの検討から、さらに生体分子間物質相互作用検出装置を用いて、簡便に診断する研究を進めた。まず、センサーチップにビオチンラベルしたオリゴヌクレオチドを固定させる条件を検討した。現在、PCR産物をこの装置にて解析する条件について検討を行っている。PCR産物を一本鎖にし、ハイブリダイゼーションが可能になる条件を、詳細に検討する必要があることが明らかになってきた。この条件の設定を詳細に行うには、装置に用いる溶液を根本的に見直し、さらに検討する必要がある。また、この生体分子間物質相互作用検出装置は、1サンプルの検討に1時間程度を要し、時間がかかる欠点も明らかになってきた。このような状況から、生体分子間物質相互作用検出装置のみでなく、様々な角度から診断する方法を検討することが今後必要であると考えられた。
ＭＲＩ検査時に生じるストレスに関する生理・心理学的研究

MRI検査の時に被験者がどの程度ストレスを感じるかについて検討した。客観的ストレスの指標として心拍間隔の時系列データから得られる周波数領域指数に着目し、LF/HF値とHF値を計測することによりストレスとの関係を検討した。さらに主観的ストレス(VAS)についても比較検討した。LF/HF値、HF値の結果から過半数が検査中にストレスを感じているという結果になった。検査前後よりも検査中にLF/HF値が低い値になった被験者もいたが、VASの結果よりほとんどの人が検査中にストレスを感じていたことから、MRI検査時には患者のストレスに注意する必要がある。周波数領域指数とVASとの相関性は確認できなかった。平成25年度は、前年度の解析評価結果を確認するとともに必要に応じて見直し作業を行い、アンケート調査および主観・認知系指標である状態ー特性不安尺度STAIを利用してストレスに伴う不安状態を検討した。(1)生理指標と主観・認知系指標の相関関係および因果関係の解明前年度得られた成果を基に、本研究課題の目標であるMRI検査時のストレスの解明の中核となる部分である。アンケート調査および主観・認知系指標であるSTAIの結果と生理的指標である心拍変動や唾液に含まれるアミラーゼの測定結果より相関関係および因果関係を調べることによりストレスを客観的にとらえた。(2)心理的苦痛を緩和して検査を実施可能とする方法の構築上記(1)で得られた結果をもとに、任意記述形式のアンケート調査からストレスの状況を明らかにし有効な予防策を検討した。平成24年度は心拍変動を解析するためのシステムを構築し、解析方法の妥当性を検証した。心拍変動を測定・解析するためのシステムの構築:1MRI検査時の心拍変動を有線あるいは無線でメモリ心電計(ジー・エム・エス:LRR-03)に取り込むための生体信号計測システムを構築し検証した。2データを自動的に解析を行うために、時系列データ解析プログラム(ジー・エム・エス:MemCalc/Tarawa)とそれらを動作させるパーソナルコンピュータによる解析システムを構築した。3上記1及び2で作成した測定システムと解析システムを用いて、被験者に対して心拍変動の低周波成分(LF)および高周波成分(HF)、さらにLFとHFの比率を求めた。また、1/fゆらぎやアトラク等の新しい解析方法を導入して、その有効性を検証した。研究上の問題点として、MRI検査に伴うRFパルスは生体信号に影響を及ぼすため、心拍変動の収集データは大きなノイズを伴い、メモリー心電計に取り込んだR波を正しく認識できず、解析システムが正しく動作しなかった。フィルターやケーブルのシールド等によりノイズ除去を行うことにより、信頼性のあるデータ収集を試みる必要がある。1MRI検査時の心拍変動を有線あるいは無線でメモリ心電計(ジー・エム・エス:LRR-03)に取り込むための生体信号計測システムを構築し検証した。3上記1及び2で作成した測定システムと解析システムを用いて、被験者に対して心拍変動の低周波成分(LF)および高周波成分HF)、さらにLFとHFの比率を求めた。そこで、生体信号測定システムを指尖脈波収集ツール(シー・シー・アイ:BACS Advance)に変更し、心拍変動を捉えた。平成25、26年度は、前年度の解析評価結果を確認するとともに必要に応じて見直し作業を行い、アンケート調査および主観・認知系指標である状態ー特性不安尺度STAIを利用してストレスに伴う不安状態を検討した。1前年度得られた成果を基に、本研究課題の目標であるMRI検査時のストレスの解明の中核となる部分である。2上記1で得られた結果をもとに、任意記述形式のアンケート調査からストレスの状況を明らかにし有効な予防策を検討した。放射線技術学心拍・唾液等の生理指標とSTAI、単一選択形式または任意記述形式のアンケートの調査等の主観・認知系指標の測定は予定通り行い分析することができた。しかし、心理的苦痛を緩和して検査を実施可能とする方法の構築には至っていない。MRI検査時の心拍変動の収集データには大きなノイズを伴い、メモリー心電計に取り込んだR波を正しく認識できず、解析システムが正しく動作しなかった。

フィルターやケーブルのシールド等によりノイズ除去を行うことにより、信頼性のあるデータ収集を試みる必要がある。さらに、ノイズに影響されない測定システム(指尖脈波収集を含む)を検討中であり、それらのため測定システム構築が遅れている。今後は、さらに被験者を増やし測定を継続するとともに、前年度の解析評価結果を確認し必要に応じて解析手法を改善する。研究対象者の経時的な特性も合わせて確認するため引き続き実験を定期的に継続する。さらに心理的苦痛に対する有効な予防策を検討し構築する。平成25年度は心拍変動解析システムの測定システム構築を継続するとともにその妥当性を検証する。測定システム構築が完了した後、被験者に対して心拍・唾液・皮膚温等の生理指標によるMRI検査に伴うストレスの定量化を行う。また、アンケート調査および主観・認知系指標である状態ー特性不安尺度STAIを利用してストレスに伴う不安状態を検討する。「次年度使用額」が発生したが、高額備品が定価より安価に購入できたため発生したものであり、研究計画の変更を伴うものでない。被験者数が少なかったため、消耗品(心電図用電極等)の経費を要しなかった。可能な限り被験者数を増やすことを予定しているが、小額であるため使用計画の変更はない。平成25年度も心拍変動解析システムの測定システム構築を継続するが、その際MRI検査時のノイズを除去するため、被験者から測定器までの入力ケーブルを延長しシールドを行うための費用として「次年度使用額」を使用予定である。また、研究成果を発表するために学会参加費、旅費等に使用する予定である。
母体および胎児に及ぼす必須微量元素栄養状態の影響

食餌性の母体の必須金属欠乏や過剰状態が,胎児の発育に及ぼす影響を,ヒト胎盤および卵巣細胞株と妊娠マウスを用いて調べた.その結果,女性ホルモン合成酵素の発現が亜鉛欠乏で増加し,亜鉛過剰で減少した.また,鉄欠乏は,小腸と同様に胎盤における鉄輸送系の発現増加と,胎児重量の減少をもたらした.よって,亜鉛や鉄の母体栄養状態が胎児の発育に重要であり,特に,妊婦には鉄の十分な摂取が不可欠であることが明らかになった.食餌性の母体の必須金属欠乏や過剰状態が,胎児の発育に及ぼす影響を,ヒト胎盤および卵巣細胞株と妊娠マウスを用いて調べた.その結果,女性ホルモン合成酵素の発現が亜鉛欠乏で増加し,亜鉛過剰で減少した.また,鉄欠乏は,小腸と同様に胎盤における鉄輸送系の発現増加と,胎児重量の減少をもたらした.よって,亜鉛や鉄の母体栄養状態が胎児の発育に重要であり,特に,妊婦には鉄の十分な摂取が不可欠であることが明らかになった.我が国ではライフスタイルの変化によって食生活が多様化し,その結果不足してしまう栄養素を補う目的で,健康食品やサプリメント等の需要が急速に高まっている.一方,妊娠中の母体は,自身の体調維持のみならず,胎児の正常な発育を促すために,非妊娠時とは生理的・生化学的に異なった状態となる.そこで,鉄,カルシウム,亜鉛,銅,マグネシウムといった必須微量元素の栄養状態が,母体と胎児を結ぶ胎盤の機能にどのような影響を及ぼすのかを調べ,妊娠時の栄養状態,ひいては現在の食生活が,母体および胎児にどのような影響を及ぼすのかを調べることを本研究の目的とする.平成20年度は,ヒト胎盤絨毛細胞株JEG-3,およびヒト卵巣顆粒膜細胞株KGNを用い,必須微量元素の欠乏および過剰状態での各種金属トランスポーター,および性ホルモンバランスの維持に重要な働きをするアロマターゼや17β-HSD Iの発現量を,リアルタイムRT-PCRにより測定した.さらに, ^3H_2O遊離アッセイ法によりアロマターゼ活性を測定した.その結果,必須微量元素の栄養状態により,鉄代謝に関連するDMT1およびTfR1,亜鉛代謝に関連するZnT1,さらにアロマターゼの発現量が有意に変動し,また,アロマターゼ活性も有意に変動することが明らかになった.これらのことから,妊娠時の必須微量元素の栄養状態が,母体および胎児に重大な影響を及ぼす可能性が示唆された.平成21年度は,妊娠マウスを用い,栄養状態による各種必須微量元素の臓器分布等を検討する.我が国ではライフスタイルの変化によって食生活が多様化し,その結果不足してしまう栄養素を補う目的で,健康食品やサプリメント等の需要が急速に高まっている.一方,妊娠中の母体は,自身の体調維持のみならず,胎児の正常な発育を促すために,非妊娠時とは生理的・生化学的に異なった状態となる.そこで,鉄,カルシウム,亜鉛,銅,マグネシウムといった必須微量元素の栄養状態が,母体と胎児を結ぶ胎盤の機能にどのような影響を及ぼすのかを調べ,妊娠時の栄養状態,ひいては現在の食生活が,母体および胎児にどのような影響を及ぼすのかを調べることを本研究の目的とする.平成21年度は妊娠マウスを用い,必須微量元素の欠乏および過剰摂取が,母体,胎盤,胎児の必須微量元素代謝に及ぼす影響を,臓器および胎児の必須微量元素濃度や,各種金属トランスポーター等のmRNA発現量を測定することにより検討した.その結果,特に食餌からの鉄摂取量を増減させると,臓器および胎児鉄濃度も同様に増減し,二価金属トランスポーターDMT1の発現量は,胎盤および小腸で鉄摂取量に対し負の相関を示した.さらに,鉄摂取量を減少させると,胎児重量が有意に低下し,母体が鉄欠乏状態に陥ると胎児の発育にも影響が及ぶことが示唆された.この他に,FPN1,CaT1,メタロチオネイン等の発現量が,必須微量元素の栄養状態により大きく変動した.これらのことから,妊娠時における必須微量元素摂取量の変動に応じて,胎盤では小腸と同様に金属トランスポーターやメタロチオネインが必須微量元素の恒常性維持を行っており,また,その栄養状態が,母体および胎児に重大な影響を及ぼす可能性が示唆された.