hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
科学技術分野における教育・学習貢献型CSR活動のコミュニティ関与の研究

本研究の独自性は,CSRを科学技術という観点から,あるいは科学技術をCSRという観点から捉えるという,これまで見過ごされてきた研究領域に焦点を当てるものだが,国際会議での海外の研究者との議論において,海外においてもこの観点は欠落の傾向にあることが示唆された.本研究の3年間の成果として,科学技術をドメインとする企業のCSR活動の可能性と重要性に着目し,1製造業を中心に多くの企業で科学技術分野での地域社会貢献型CSR活動が広がりを見せていること,2もともとは研究開発をめぐる社会的責任活動や科学技術広報活動からの歴史的経緯や必然性があること,21世紀に入って地域社会のミクロなステークホルダーを見据えた科学教育への貢献活動が見られることを,事例研究から明らかにしたといえる.地域社会における科学教育の学校教育以外の担い手として近年注目されているのが,科学館や教育研究機関の専門家らが主導する科学コミュニケーションであるが,もう1つ見逃せないのが,企業の社会的責任(CSR)活動(工場見学や出前講義等の市民向けプログラム,従業員参加等)である.本研究では前者の文脈における後者のCSR活動の可能性と重要性に着目し,1製造業を中心に科学技術分野での地域社会貢献型CSR活動が広がりを見せていること,2研究開発をめぐる社会的責任や科学技術広報などの歴史的経緯から,地域社会のミクロなステークホルダーを見据えた活動への展開が見られることを,事例研究から明らかにした.初年度の最重要課題であった調査対象企業層のデータベースをほぼ完成させることができた。また、CSR理論の先行理論研究や、科学技術教育活動に取り組んでいる企業の先行調査から、次年度以降の調査活動のベースとなる仮説構築作業の見通しを得ることができた。最終年度は、はじめに国際会議での発表を行い、研究者や専門家らとの仮説モデルに関するディスカッションを得て、これを反映させながら理論構築を改善するとともに、最終的な実証研究のための調査分析を行う。島津製作所をはじめ、(産業)科学を基盤とする代表的あるいは特徴的な企業を数社ピックアップし、一次資料や関係者へのインタビューを実施して実証分析を行い、成果を原著論文としてまとめる。知識社会学,科学コミュニケーション,知識経営次年度は、調査活動のための仮説モデルを完成させ、その枠組みのもとでアンケートやインタビューを設計し、具体的な調査活動へ入る。課題として、仮説枠組みに照らしながら、より適切な調査計画を構築することが必要である。初年度に構築した対象企業データベース約250社のすべてにサーベイを実施するか、あるいは絞り込んでより深く構造化されたサーベイやインタビューを行うかを決定していくことが必要と考えている。当初計画では、本年度に海外での国際会議で発表する計画であったが、翌年度始めの国際会議での発表になったため、海外出張旅費分を翌年に繰り越すこととした。差額は少額であるが、消耗品等に使うため繰り越した。海外(トルコ、オーストリア)での国際会議への海外出張旅費として使用する予定。本年度の予算と合わせて消耗品等に使う計画である。
分裂組織からの器官分化過程におけるシスタチオニンγ-シンターゼmRNA安定性制御

シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS) mRNAの安定性制御機構を解明する目的で、この制御のエフェクター分子の同定を行った。小麦胚芽由来のin vitro翻訳系を用いたアッセイによって、メチオニンの代謝産物についてエフェクターとしての効果を調べたところ、S-アデノシルメチオニン(SAM)のみが効果を示し、SAMがCGS mRNA安定性制御のエフェクター分子であることが強く示唆された。また、SAMを基質とするメチル基転位酵素の競争阻害剤であるS-アデノシルホモシステインは、SAMの効果を阻害しなかった。このことから、SAMの効果はメチル基転位反応によるものではないことが示唆された。また、SAMのアナログについても、同じin vitroアッセイを用いて、CGS mRNA安定性制御のエフェクターとしての効果を調べた。その結果、SAMのメチル基をエチル基に置換したS-アデノシルエチオニン(SAE)も、SAMと同様の効果を示した。一方、SAMからメチル基を除いたS-アデノシルホモシステインは効果を示さなかった。したがって、SAMとSAEに共通する構造的特徴あるいは硫黄原子にアルキル基が付加することによって生じる正電荷が重要である可能性が考えられる。また、in vitro翻訳系を用いて、翻訳反応後のRNA分解中間体の解析を行った。これまでにin vivoの実験系でみられたのと同様の5'側を400塩基ほど欠いたRNAがノーザン解析により検出され、また、5'側領域のハイブリッドセレクションにより、350塩基程度の短いRNAがSAM存在下で特異的に検出された。これらの結果から、エンドリボヌクレアーゼがこの制御に関与することが示唆される。
ロココ時代のフランス宮廷衣裳の復元的研究ー欧州種の養蚕からドレス制作までー

18世紀のロココ時代のフランス宮廷衣裳の美意識を明らかにすることを目的とし、長年、絹生地の風合いを求めてドレスのフォルムの素材に拘り探していたが現存しないため、往時の欧州の蚕品種を研究調査したところ、蚕業技術研究所に研究のため遺伝資源として保存されていることが判明した。その蚕を9万頭まで増やし養蚕して、往時の方法で生繭から座繰りで製糸し製織し、ドレスを制作した。この生地は、輝く白さをもち、軽く、立体を保つ張りがあるが柔らかい特徴があった。次に、西陣の最後の摺り込みの伝統工芸士に天然染料で絣染を依頼し、その技術をビデオ撮影を行って記録し、手織りで製織し宮廷ドレスを制作し、美意識を検証した。本研究は、18世紀のロココ時代のフランス宮廷衣裳の美意識を明らかにすることを目的とし、往時の欧州の蚕種を調査研究し、遺伝資源として保存されていた蚕種を飼育した。復元的研究では、オリジナルドレスのパターン、サイズ、縫製技法を再現するだけでなく、織物の風合いが、ドレスのフォルムに関係することから、衣裳の生地の風合いや美意識に拘り、蚕品種、製糸、染色、製織などの復元的研究を行った。研究代表者の伊豆原月絵は、1.平成25年4月から8月にかけて、神戸ファッション美術館の織物について確認調査を行った。2.平成25年5月の春蚕期と初秋蚕期に、蚕業技術研究所の協力を得て、蚕種(卵)を育成し蚕の養蚕を行った。この蚕種は、現行の改良された蚕種に比べ、原原種で小さく弱いため、環境の僅かな変化にも反応するなど、繊細で弱く、育成が難しい。養蚕グループの長年に亘り蓄積した養蚕に関する知力(温度・湿度管理や飼料など)に加え、上蔟の際は、小さい蚕のため、自然上蔟ができず、蔟に入れる手作業を行うなど、熟練の技術と細やかで多大な労力の協力から、優れた研究成果が得られた。5.製糸は特殊蚕種を扱う製糸業者が生繭から座繰りで繰糸をし、代表者と研究協力者が検討を行い、温度、速度について記録した。6.研究代表者は、8月9月にかけ、フランスに於いて織物および養蚕についての調査を行い、現状と往時の資料を入手した。7.織物の研究協力者が広幅の製織機を新たに考案し作成し、数種類の製織試験を行った。8.研究代表者は、フランスで得られた資料から染色試験を行い、染料を選定し、京都の染色研究機関の協力を得て、染色についても詳細な試験を行った。このように、原原種の蚕種の養蚕および製糸、染色には、種々の問題が発生し、時間と高い技術力を要した。しかし、各研究機関および専門家の方々の協力を得られ、研究の進捗状況は、概ね順調であることを報告する。本研究は、18世紀のロココ時代のフランス宮廷衣裳の美意識を明らかにすることであり、方法として、往時の欧州の蚕種を調査研究し、遺伝資源として保存されているその蚕種を選び飼育し、往時の製糸、製織などの素材とその技法に踏襲したドレス制作の復元的研究を試みている。研究代表者の伊豆原月絵は、1.平成24年4月から5月にかけて、神戸ファッション美術館のドレスの織物をマイクロスコープで撮影した。2.平成24年5月には、欧州の蚕種についての文献調査から蚕種を想定した。3.平成24年6月には、蚕業技術研究所の協力を得て、蚕遺伝資源として保存されているフランス在来品種を調査した。その結果、明治末、大正、昭和初期にフランスから輸入された蚕遺伝資源の在来品種は、5種類であることが判明した。4.蚕業技術研究所の指導を仰ぎ蚕種を検討した結果、ピンク色の繭を作る「ローザ」と白い繭を作る「セヴェンヌ白」の2種類の蚕種を候補にし、3万粒の飼育を計画した。蚕糸科学研究所の検査結果から、「ローザ」の繭から繰糸するには、技術を要し、採取可能な糸が少ないことが予想され最終的には、往時に最も多く用いられていた「セヴェンヌ白」を飼育することとした。5.平成24年7月2日の初秋蚕期から蚕品種「セヴェンヌ白」の蚕種卵の製造を蚕業技術研究所に於いて開始した。6.平成24年9月の晩秋蚕期に蚕業技術研究所において「セヴェンヌ白」2千頭を試験飼育した。7.10月は、生繭と乾燥繭を座繰りし、繰糸の状況と製糸の状態について検討を行い、製糸方法について長野県の岡谷市にて、研究調査を実施した。8.12月は、製織方法について機物業社を訪ね、検討を行った。9.平成25年3月には、カンボジア蚕種の養蚕農家を調査し、入手した繭の試験を研究機関に依頼し、蚕品種の検討を行った。以上のように、研究計画の進捗状況は、極めて順調であることを報告する。本研究は、ロココ時代の宮廷衣裳の復元的研究のために、欧州蚕品種の養蚕から製糸し、2種類の方法で考察した。1.無精錬で白生地を製織し、ドレス制作を行い、絹織物の風合いやフォルムについて検討を行った。2.往時の「シネ(絣)」の織物の復元を行い、その精緻な技法を再現し、記録映像資料を作成した。

1ー1欧州蚕品種は、大日本蚕糸会蚕業技術研究所が保存している欧州蚕の原原蚕種(卵)を大日本蚕糸会の協力を得て、1年半かけて9万頭に育種した。2繰糸には、岡谷蚕糸博物館館長の高林千幸氏の協力を得て繰糸温度・速度について試験を行い検討した。3復元衣裳との比較検討に際しては、研究協力者の神戸ファッション美術館の主席学芸員の浜田久仁雄氏の協力を得られた。4製織は、研究協力者の吉田紘三氏が織り機を制作し、欧州蚕品種を用いて予備試験を行い、2014年7月、ドレス用の白生地を製織した。5その白生地の織物を用いて、ロココ時代の宮廷衣裳を元に伊豆原月絵がデザインし、高木麻里、澁谷麻耶がドレスを制作した。考察及び結果:往時の手法の生繭の座繰りで繰糸をした糸は、現代の蚕に比べ白く艶と光沢があり、張りがあるため、ドレスの腰部分は、ふんわりと膨らみ曲線を描き、往時の宮廷衣裳のフォルムに近似した。2ー1シネの復元に際し、天然染料の調合・制作には、((株))田中直染料店の協力を得られた。2シネの織物復元は、京都・西陣にて、括りと摺り込みの技法を用いて行った。この糸は、染色・発色性に優れ、精緻な染織に適していた。成果発表:2014年8月には、代表者の伊豆原月絵が国際服飾学術会議に於いて欧州の蚕品種と養蚕について発表した。また、2014年11月28日29日のシルクサミットに於いて代表者の伊豆原月絵がこの復元研究の成果について招待講演した。その際、縫製したドレスを展示公開し、広く一般に研究成果を公開することができた。本研究は、18世紀のロココ時代のフランス宮廷衣裳の美意識を明らかにすることを目的とし、往時の欧州の蚕種を調査研究し、遺伝資源として保存されていた蚕種を飼育した。復元的研究では、オリジナルドレスのパターン、サイズ、縫製技法を再現するだけでなく、織物の風合いが、ドレスのフォルムに関係することから、衣裳の生地の風合いや美意識に拘り、蚕品種、製糸、染色、製織などの復元的研究を行った。研究代表者の伊豆原月絵は、平成25年と26年の春蚕期と初秋蚕期に、蚕業技術研究所の協力を得て、欧州種(卵)を9万頭育成し蚕の養蚕を行った。この蚕種は、現行の改良された蚕種に比べ、原原種で小さく弱いため、繊細で弱く、育成が難しい。長年に亘り蓄積した養蚕に関する知力(温度・湿度管理や飼料など)に加え、熟練の技術と細やかな技術協力から、優れた研究成果が得られた。製糸は生繭から座繰りで繰糸をし、本研究の代表者と協力者が温度、速度について検討し、最も適する方法で行い記録した。また、代表者は、本研究の知見について、2015年6月にシルク学会に於いて、口頭発表を行った。フランスで得られた資料から染色試験を行い、染料を選定し、京都の染色研究機関の協力を得て試験を行い、西陣の伝統工芸士に摺り込みの技法による絣染を依頼し、天然染料で染織を行った。2015年秋からその糸を用いて、手機でシネを織り上げた。その絣織を用いて、ローブ・ア・ラ・フランセーズを制作した。科研の成果報告会を2016年2月に国際服飾学会と共催で開催し、服飾の専門家および一般の方々に向けて発表を行い、摺り込みの技法で染色されたローブ・ア・ラ・フランセーズ(ドレス)を展示し、公開した。このように、原原種の蚕種の養蚕および製糸、染織には種々の問題が発生し、時間と高い技術力を要したが、各研究機関および専門家の方々の協力を得られ、当初の計画以上の成果を得られたことを、ここに報告する。18世紀のロココ時代のフランス宮廷衣裳の美意識を明らかにすることを目的とし、長年、絹生地の風合いを求めてドレスのフォルムの素材に拘り探していたが現存しないため、往時の欧州の蚕品種を研究調査したところ、蚕業技術研究所に研究のため遺伝資源として保存されていることが判明した。その蚕を9万頭まで増やし養蚕して、往時の方法で生繭から座繰りで製糸し製織し、ドレスを制作した。
災害時の空間総合管理システムの開発

研究の最終年度にあたる本年度は,宇治市を事例として総合空間管理システムのプロトタイプの構築を行い,開発にあたっての問題点を抽出した.最大の問題点はディジタル基盤図の確保である.精度の高いディジタルマップを完備した自治体は少なく,作成費用も膨大となるため,そこがボトルネックとなって開発を阻むことが多い.それに対する対処策として,大阪府が行ったカ-ナビゲーション用に開発された地図の基盤図としての利用がある.情報の詳細度と入手の容易さを考えると,今後有望な試みであると考える.第2の問題点は,既存の情報システムあるいはその整備方針と全庁的な電子情報化の流れが整合していないことである.空間管理システムの構築には,空地に関するデータベースの構築とその維持管理の必要性が発生する.現状の慣行では,データベースの整備は専門部局の仕事するか,あるいはその部局を通しての外注という形態が普通である.しかし,それでは,作業そのものがコストが高くなること,仕事としてのスピードが低下することなど,システム開発にとって阻害要因となっている.この点に関してはリレーショナルデータベースの考え方をより積極的に導入し,個々の要素に緯度経度情報を持たせたデータベースを整備し,そこと共通のキ-でデータベース間を関連づける体制を整備することで,現在の業務体系を破壊することなしに,職員自身で更新可能な空間管理のためのデータベースの構築が可能になることが明らかになった.最後に残された課題はこうしたデータベースと地理情報システムとをリンクさえるインターフェースの開発である.本研究は災害対応に関わる情報処理にGIS技術を援用し,災害発生後に空間総合管理による効果的な災害対応を可能にし,応急対策面へのリアルタイム地震防災の拡張を目的としている.阪神淡路大地震の被災地では,公園,学校園庭,運動施設などのオープンスペースがさまざま目的に利用された.そこで本研究ではオープンスペースの規模や付帯建築物の種類や規模および震災発生からの時間的経過に応じて,被災地内の空間が担った用途とその際に生じた問題点を,西宮市を対象として被災者及び各種機関の災害対策担当者とのグループディスカションを通じて明らかにした.その結果,利用可能な空間データベースが未構築であった点.空間利用に関する調整をはかる機関が存在していなかったことが問題点として明確化できた.ついで,総合的な空間情報管理システムのプロトタイプ,システムの構築を京都府宇治市を対象として開始した.プロトタイプシステムの構築にあたっては,対象となる空間データベースの完備と,それらをGISによって統合的に可視化するための基盤としてデジタルマップの存在を前提とする.宇治市では紙ベースではあるが「都市情報ファイル」として市域内の空間データベースが管理しており,デジタルマップも大阪ガスが自社システム用に市域の大部分についてデシタルマップを作成している.宇治市・大阪ガスの協力の下,プロトタイプの構築を行い,GISによる総合的な表示機能の開発を終了した.同時に,今後のデータ更新体制のあり方についても検討を加え,行政当局者の持つ縦割り体制がこうした試みのボトルネックであることが明確化できた.研究の最終年度にあたる本年度は,宇治市を事例として総合空間管理システムのプロトタイプの構築を行い,開発にあたっての問題点を抽出した.最大の問題点はディジタル基盤図の確保である.精度の高いディジタルマップを完備した自治体は少なく,作成費用も膨大となるため,そこがボトルネックとなって開発を阻むことが多い.それに対する対処策として,大阪府が行ったカ-ナビゲーション用に開発された地図の基盤図としての利用がある.情報の詳細度と入手の容易さを考えると,今後有望な試みであると考える.第2の問題点は,既存の情報システムあるいはその整備方針と全庁的な電子情報化の流れが整合していないことである.空間管理システムの構築には,空地に関するデータベースの構築とその維持管理の必要性が発生する.現状の慣行では,データベースの整備は専門部局の仕事するか,あるいはその部局を通しての外注という形態が普通である.しかし,それでは,作業そのものがコストが高くなること,仕事としてのスピードが低下することなど,システム開発にとって阻害要因となっている.この点に関してはリレーショナルデータベースの考え方をより積極的に導入し,個々の要素に緯度経度情報を持たせたデータベースを整備し,そこと共通のキ-でデータベース間を関連づける体制を整備することで,現在の業務体系を破壊することなしに,職員自身で更新可能な空間管理のためのデータベースの構築が可能になることが明らかになった.最後に残された課題はこうしたデータベースと地理情報システムとをリンクさえるインターフェースの開発である.
食品成分による免疫細胞のエピジェネティック変化

細胞間相互作用に関わるタンパク質の役割を解明しながら、種々の疾患の発症がどのようにして制御されているのかを明らかにした。さらにDアミノ酸を含む食酢やその他の発酵食品の成分が、細胞内受容体を介して主にBリンパ球や神経系細胞の遺伝子発現調節に機能していることを予想している。そして、株化細胞や実験動物を用いて実際にそれらの細胞内発現を制御できることをin vitro、in vivoの実験系を用いて検証するとともに、従来解析してきているAKTやp38MAPKなどのシグナル伝達系においても解析を進めている。特定食品に多く含まれるDアミノ酸は、アレルギーなどの免疫疾患のほか、精神疾患や生殖系疾患との関連が指摘されているが、本年度の研究ではこの細胞内情報伝達系における役割を細胞膜受容体の観点から明らかにしてきた。同様にして、現在、認知症や生活習慣病で分子栄養学的情報伝達系が果たす役割を解明している。また、クルクミンなどの香辛料成分や魚油の不飽和脂肪酸、そしてDアミノ酸が細胞内情報伝達分子の機能制御に働く場合の至適濃度や量対効果の組み合わせを決定した。種々の細胞刺激によって発生するゲノム全体のメチル化状態も、メチル基受容体アッセイやメチル化DNAのELISA法を用いて測定し、特定の分子や遺伝子についてはマイクロアレイアッセイを含めて網羅的に解析した。リアルタイムPCRを用いた検討も行った。さらに、破骨細胞におけるTob関連分子の発現シグナル伝達系には食成分が細胞内受容体を介して機能していることが判明しているので、本年度の研究では免疫細胞や破骨細胞におけるサイトカイン産生に関連するmRNAやmiRNAの発現を重点的に調べ、AKT/p38MAPKを機能調節する要因を決定した。結果的に、特にRANKLの発現に関わるのがTob及びその関連分子(Tob2やAKT、p38)であることが判明した。28年度が最終年度であるため、記入しない。ハーブ・香辛料・漢方薬によって起こるエピジェネティック修飾や遺伝子発現の解析そしてマイクロRNAの解析を行い、食成分がサイトカインやがん抑制遺伝子やDNA修復分子群などの遺伝子発現の調節を介して免疫系にも作用していることを明らかにした。具体的には、柿渋成分やブレファリズミンなどを用いて、DNA修復分子群の遺伝子特異的なメチル化を解析するために、メチル化特異的ゲノムシーケンスPCRなどの方法で、免疫機能に関係するNFkBやAKT、遺伝子修復系分子などの遺伝子産物の変化を解析した。また、未知のメチル化ホットスポットやメチル化CpGアイランドを同定するために、マイクロアレイによる解析も行った。クロマチン修飾を解析するために、クロマチン免疫沈降によって生細胞の刺激からクロマチン修飾に関与する遺伝子を標的としてChIPーPCRで解析を進め、アイクロアレイ結果との相関を解析した。生細胞を紫外線や活性酸素で刺激してその変化を確認した他、種々の食成分による影響も検討した。さらに、種々の細胞刺激によってゲノム全体のメチル化状態がどのように変化するか、メチル基受容体アッセイやメチル化DNAのELISA法を用いて測定を試みた。特定の分子や遺伝子については、メチル化以外の修飾(アセチル化やリン酸化)の状態についても今後解析する予定である。修飾が確認された一部の遺伝子は、細胞内シグナル伝達系の位置づけを明確にして生理作用を議論した。エピジェネティックな変化は遺伝子変化と異なり可逆的であるため、エピジェネティックな変化がもたらした免疫系の異常状態は回復できる可能性がある。このため、特定の食品成分刺激がもたらす遺伝子発現を解析することによって新たな食品の機能性が明らかになるはずで、こうした技術理論の基礎を構築した。遺伝子発現調節にはポリフェノールやイソフラボンなどの食品成分も細胞内受容体を介して重要な役割を担っていることが明らかになっている。例えばTIMP-1遺伝子発現が食物成分刺激によって変化することが示されている。そこで本年度の研究では、一般に使用される香辛料や魚油の不飽和脂肪酸などをターゲットとして、各種免疫系標的細胞からどのような遺伝子発現誘導を引き起こすのか、刺激時に発現してくるmRNAやmiRNAそしてたんぱく質分子を調べた。さらに、活性酸素や炎症性サイトカインの誘導を解析して、免疫系細胞の発達やアポトーシスにどのように働くのかを分子生物学的に探究した。アレルギー系疾病発症メカニズムを解析すると共に、効果的な食健康的予防法を構築するためである。これらのために、特にPI3K/AKTからのシグナル伝達系からの発現調節が起こりうる遺伝子発現系の転写調節機構とそこに至る細胞内シグナル伝達系を中心に解析してきた。その他の種々の食成分(例えばDアミノ酸)が生細胞に与える影響についても検討した。この場合、種々の細胞刺激によって発生するゲノム全体のメチル化状態(網羅的メチル化解析)も、メチル基受容体アッセイやメチル化DNAのELISA法を用いて測定し、さらに、メチル化以外の修飾(アセチル化やリン酸化)の状態についても、特定の分子や遺伝子についてはマイクロアレイアッセイを含めて網羅的に解析した。申請した研究計画を基本として着実に進行させたうえ、発展的な実験なども含めてほぼ順調に進展してきている。成果として、これまでに査読付き英語論文を4報も学術雑誌に発表している。

そして、株化細胞や実験動物を用いて実際にそれらの細胞内発現を制御できることをin vitro、in vivoの実験系を用いて検証するとともに、従来解析してきているAKTやp38MAPKなどのシグナル伝達系においても解析を進めている。特定食品に多く含まれるDアミノ酸は、アレルギーなどの免疫疾患のほか、精神疾患や生殖系疾患との関連が指摘されているが、本年度の研究ではこの細胞内情報伝達系における役割を細胞膜受容体の観点から明らかにしてきた。同様にして、現在、認知症や生活習慣病で分子栄養学的情報伝達系が果たす役割を解明している。また、クルクミンなどの香辛料成分や魚油の不飽和脂肪酸、そしてDアミノ酸が細胞内情報伝達分子の機能制御に働く場合の至適濃度や量対効果の組み合わせを決定した。種々の細胞刺激によって発生するゲノム全体のメチル化状態も、メチル基受容体アッセイやメチル化DNAのELISA法を用いて測定し、特定の分子や遺伝子についてはマイクロアレイアッセイを含めて網羅的に解析した。リアルタイムPCRを用いた検討も行った。さらに、破骨細胞におけるTob関連分子の発現シグナル伝達系には食成分が細胞内受容体を介して機能していることが判明しているので、本年度の研究では免疫細胞や破骨細胞におけるサイトカイン産生に関連するmRNAやmiRNAの発現を重点的に調べ、AKT/p38MAPKを機能調節する要因を決定した。結果的に、特にRANKLの発現に関わるのがTob及びその関連分子(Tob2やAKT、p38)であることが判明した。申請した研究計画を基本として、発展的な実験などもほぼ順調に進展している。成果として、これまでに申請者を筆頭著者とする査読付き英語論文を3報学術雑誌に発表している。今後は、細胞間相互作用に関わるタンパク質やアダプター分子の役割を解明し、目的とする疾患の発症がどのようにして制御されるのかを明らかにする。さらにクルクミンなどの香辛料成分や魚油の不飽和脂肪酸の神経系細胞の小胞輸送に働く場合の量対効果と至適濃度の組み合わせを決定していく。修飾が確認されたDNA修復分子遺伝子はその塩基部位を決定していきたい。さらに、株化細胞や実験動物を用いて実際にそれらの細胞内発現を制御できることをin vitro、in vivoの実験系を用いて検証していくとともに、RNA干渉を分子機能解析に応用し、キー分子を標的としたノックダウン細胞を作製することを試みて、AKTやp38MAPKなどの遺伝子発現においてももれなく解析を進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。食成分によるエピジェネティックな遺伝子発現調節の結果を踏まえて、アレルギー疾患などの予防のための食事のデザインを考案する。例えば、免疫疾患関連遺伝子のSNP解析結果や本研究成果を踏まえて方向性を探索する。さらに、株化細胞や実験動物を用いて実際にそれらの細胞内発現を制御できることをin vitro、in vivoの実験系を用いて検証していく。
カルシウム依存性アダプター蛋白質ALG-2による選択的スプライシング制御

ALG-2はアポトーシス関連遺伝子にコードされる約20 kDaの蛋白質として同定され、分子内にCa^<2+>結合モチーフであるEF-handが5つ連続したpenta-EF-handドメインをもつ。Ca^<2+>が結合することによってALG-2の構造が変化し、様々な蛋白質と相互作用することが知られている。研究代表者のこれまでの研究から、ALG-2がCa^<2+>に応答して、相互作用因子CHERPと共に様々な核内現象に関与する可能性が考えられた。そこで、今年度はCa^<2+>依存的な選択的スプライシング制御におけるCHERP、ALG-2の関与を明らかにすることを目的とし、研究を行った。Ca^<2+>依存的な選択的スプライシングはその大部分が神経組織で行なわれることから、ヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Yを用いて、NMDA receptor 1およびPMCA2 pre-mRNAのCa^<2+>依存的な選択的スプライシングに対するALG-2、CHERPの発現抑制の影響を調べた。しかし、発現抑制の著しい影響は観察されなかった。また前年度の研究により、小胞体ストレスによるXBP1の細胞質スプライシングに対してALG-2が関与する可能性を見出したため、小胞体ストレス応答におけるALG-2の役割についても解析を行った。タプシガルジンにより小胞体ストレスを誘導し、XBP1のスプライシングに対するALG-2の影響を調べた。その結果、ALG-2発現抑制により、スプライシングされるXBP1 mRNAの割合(spliced XBP1 mRNA/unspliced XBP1 mRNA)が減少すると思われた。しかし実際には、ALG-2発現抑制により、spliced XBP1 mRNAの量はあまり変化せず、一方ストレス応答と共に増加するunspliced XBP1 mRNAの転写量の増加率は高くなっていた。spliced XBP1 mRNAがコードする転写因子(pXBPI(S))はストレス応答に必須な遺伝子の発現誘導を担うが、unspliced XBP1 mRNAの翻訳産物(pXBPI(U))はストレス回復時にpXBP1(S)の負の制御因子として働くことが知られている。また最近、pXBP1(U)ががん細胞においてオートファジーを抑制することが報告された。このことから、ALG-2が小胞体ストレスからの回復時やpXBPI(U)によるオートファジー制御に関与する可能性が新たに見出された。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。ALG-2はアポトーシス関連遺伝子にコードされる約20kDaの蛋白質として同定され、分子内にCa^<2+>結合モチーフであるEF-handが5つ連続したpenta-EF-handドメインをもつ。そこで、今年度はALG-2のCa^<2+>依存的な核スペックル(多くのスプライシング因子の貯蔵・修飾の場と考えられている核内の非膜構造体)への移行の詳細なメカニズムおよび生理的意義、Ca^<2+>依存的な選択的スブライシング制御におけるCHERP、ALG-2の関与を明らかにすることを目的とし、研究を行った。さらに、CHERPがRNA polymerase II (Pol IIと相互作用することを見出したため、CHERPにおけるPol II結合領域やその相互作用に対するALG-2やCa^<2+>の影響を調査した。CHERP発現抑制HeLa細胞を用いて生細胞観察を行い、核内ALG-2の局在に対するCa^<2+>動員誘導剤thapsigargin添加の影響を調べた。その結果、ALG-2のCa^<2+>依存的な核スペックルへの移行にCHERP依存性はみられなかった。Ca^<2+>依存的な選択的スプライシングが起こるcaspase-2やPMCA2遺伝子に対するCHERP、ALG-2発現抑制の影響を調べたところ、コントロールと比較して顕著な変化は観察されなかった。共免疫沈降法によりCHERPとPolIIの相互作用解析を行ったところ、CHERPがCIDではなくProに富む別の領域を介して、リン酸化状態のPol IIと相互作用することが明らかとなった。さらに、Ca^<2+>存在下では抗Pol II抗体の免疫沈降産物中にALG-2が検出された。この研究結果より、CHERPおよびALG-2が選択的スプライシング制御に関与する可能性が強く示唆された。Ca^<2+>

依存的な選択的スプライシングはその大部分が神経組織で行なわれることから、ヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Yを用いて、NMDA receptor 1およびPMCA2 pre-mRNAのCa^<2+>依存的な選択的スプライシングに対するALG-2、CHERPの発現抑制の影響を調べた。しかし、発現抑制の著しい影響は観察されなかった。また前年度の研究により、小胞体ストレスによるXBP1の細胞質スプライシングに対してALG-2が関与する可能性を見出したため、小胞体ストレス応答におけるALG-2の役割についても解析を行った。タプシガルジンにより小胞体ストレスを誘導し、XBP1のスプライシングに対するALG-2の影響を調べた。その結果、ALG-2発現抑制により、スプライシングされるXBP1 mRNAの割合(spliced XBP1 mRNA/unspliced XBP1 mRNA)が減少すると思われた。しかし実際には、ALG-2発現抑制により、spliced XBP1 mRNAの量はあまり変化せず、一方ストレス応答と共に増加するunspliced XBP1 mRNAの転写量の増加率は高くなっていた。spliced XBP1 mRNAがコードする転写因子(pXBPI(S))はストレス応答に必須な遺伝子の発現誘導を担うが、unspliced XBP1 mRNAの翻訳産物(pXBPI(U))はストレス回復時にpXBP1(S)の負の制御因子として働くことが知られている。また最近、pXBP1(U)ががん細胞においてオートファジーを抑制することが報告された。このことから、ALG-2が小胞体ストレスからの回復時やpXBPI(U)によるオートファジー制御に関与する可能性が新たに見出された。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。研究の目的である、ALG-2のCa^<2+>依存的な核スペックルへの移行の詳細なメカニズムおよび生理的意義、Ca^<2+>依存的な選択的スプライシング制御におけるCHERP、ALG-2の関与を明らかにするための手がかりを得ることができなかったため。Ca^<2+>依存的な選択的スプライシング制御におけるCHERP、ALG-2の関与を明らかにするため、報告されている標的についてCHERP、ALG-2発現抑制や過剰発現の影響を調べる。SH-SY5Y細胞の発現抑制効率が低いため、発現効率を高める条件も検討する。研究代表者は小胞体ストレスによるXBP1のスプライシングに対するALG-2の関与を見出したため、小胞体ストレス応答でのALG-2の役割についても解析を進める。
イソカルバサイクリンおよびロイコトリエン類の超効率的不斉全合成

α鎖に不飽和結合、特にアレニル結合を有するイソカルバサイクリン誘導体の不斉合成を指向し、プロキラルな共役イナ-ルを親エン体とする新規カルボニールエン反応の不斉触媒化を検討した。ω側鎖をもつ光学的に純粋なエン基質と1位(prostaglandinnumbering)のエステル官能基を有する共役イナ-ルとの不斉触媒的エン反応を行った結果、この共役イナ-ルは高いエン反応性を有し、対応するエン生成物を高収率で与えた。しかも、99%とほぼ完璧な6,9α-位置選択性、さらには96%という高い4R選択性が見られた。得られたエン生成物は4位に水酸基を有し、共役するアセチレン構造を有する新規なイソカルバサイクリン誘導体となり、それ自体の生理活性にも興味がもたれるが、さらに以下に述べる方法により望むアレニル側鎖へと変換した。すなわち、エン生成物のアルコールを、リン酸エステル変換し、以下に述べるPd(O)触媒、SmI2、t-BuOH還元反応により望むアレニル側鎖に高収率で変換した。さらにMg/MeOHでアレンの還元反応を試みたところ、β,γ・不飽和側鎖が選択性に得られた。現在さらに、アレンより通常のイソカルバサイクリン側鎖、またα,β-不飽和側鎖への直接的な変換についても検討中である。九州大学、稲永らによって報告されていたアレニル、プロパルギルパラジウム中間体を経るヨウ化サマリウム(II)還元反応において、従来基質として用いられていた酢酸エステルに代わって、リン酸エステルを用いることにより、アレン型生成物が圧倒的に高い位置選択性で得られることを見に出した。また、1級のリン酸エステルを用いる場合には、今度は逆にアセチレン生成物が高位置選択的に得られることも明らかにした。一方、ノンプロキラルなアルデヒドであるホルムアルデヒドを親エン体とするホルムアルデヒド-エン反応の不斉触媒化を行い、(3-オキサ)イソカルバサイクリンの不斉合成も報告した。
自閉症児の対人調整を目的とした運動プログラムの開発

本研究では、自閉症のある子ども(自閉症児)の運動面における調整機能が結果的に対人面に影響するものと仮定し、この関連性について実証することを目的とした。そのために1)対人調整課題における自閉症児の運動特徴を分析した。その結果、個体内運動調整の特性が、従来、指摘されていたものとは異なる可能性が指摘された。2)そこで私たちは自閉症児の不器用さの特性を分析したところ、投動作において特異的な動きや運動学習方略が観察された。3)支援方法について、課題志向性アプローチが、運動パフォーマンスの向上に影響することが示唆された。その一方で自閉症児の認知-運動特性についてはさらなる検討が必要と考えられた。本研究の目的である自閉症児の対人調整を目的とした運動プログラムの開発の基礎的資料となる自閉症児の運動面と対人面の「調整」的関連性を明らかにするために、本年度は、4歳から13歳までの合計15名の自閉症スペクトラム障害児に対して、アセスメントを行い、そのアセスメント結果をもとに、個別の対人的運動調整課題を試行的に策定し実施した。その課題前後の評価として、昨年度までに検討されたMovment-ABC2と動作模倣課題、即時運動調査課題、日常生活動作課題を実施した。そのうち、動作模倣課題では、対象児童の動作を録画し、約1/60秒コマごとに動作分解し、その反応速度を分析した。また、即時運動調査では、対象児の跳躍動作の高さを指標にし、動画記録をもとに高さを算出した。また対象児によっては、その認知的特性が(介在要因)として考えられることが予想されたため、DN-CASやWISC、または田中ビネーなどを実施した。加えて、社会性認知特性を明らかにするためにT0M検査を行った対象児もいた。個別の対人的運動調整課題内容は、研究者間の協議をもとに策定し、主に動作即時模倣課題やキャッチボールなどの対人調整を必要とする課題に加え、運動調整を促すために多様性運動課題(距離、移動、ボール種類などを変えた課題)を実施した。実施の結果、対人的運動調整課題の直接的影響を明らかにするまでには至っていない。今後、対象児に対する継続的課題実施が必要である。また多様性運動課題を実施した対象児において、国際的に研究や臨床で使用されている協調運動テストであるMovement-ABCによる評価結果において、想定されたものと異なる結果がみられた。それは運動調整の個人内メカニズムにとっては貴重な知見であったため、その検討を行う必要性が生じた。本研究では、自閉症スペクトラム障害(ASD)児の運動調整と対人調整を取り上げ、運動面における「調整」機能が結果的に対人面に影響するものと仮定し、この関連性について実証することを目的とした。その結果をもとに自閉症児の対人調整を目的とした運動プログラムを開発することとした。その目的を達成するため、まずは対人調整を必要とする課題におけるASD児の運動特徴を分析した(澤江,2011、澤江・中村,2011、澤江,2012など)。その結果、そもそも個体内で起こっている運動調整の特性が、従来、指摘されていたものとは異なる視点の必要性が指摘された。そこで私たちはASD児の「不器用さ」の特性をあらためて分析することを試みた(竹内・澤江・齊藤,2012、澤江・柄田,2013、澤江,2013、澤江・村上・杉山・土井畑,2013、澤江・藤井,2013、七木田・増田・澤江,2012など)。そこでは、投動作においてASD児の特異的な動きや運動学習方略が観察された。データ数の関係から、必ずしも定説的な特性を明らかにするまでには至らなかったものの、実際の支援に結びつく知見を得た。そこで私たちは、それらの知見を検証するための実践的取り組みを行った(村上・澤江・齊藤,2012、齊藤・澤江・松元,2013、齊藤・澤江,2013など)。それらの結果、課題志向性アプローチを実施することで、物的環境に対する個人内の運動調整は可能であること、パフォーマンスとの因果を明確にしたKR(結果の知識)をもとにフィードバックすることで、運動への主体的取り組むがみられるなどの示唆を得た。その一方で、ASD児の認知-運動特性についてはさらなる検討が必要と考えられた。また対人運動調整の困難さは、いわゆる身体動作模倣場面で強く現れ、そこでも認知-運動の困難さが示唆された。今年度は、本件休養のテスト作成に多く時間を費やした。我が国には本研究の目的を達成するための既存の運動テストはない。また既存のものを複数使用した場合、対象児に対して時間的に多大な負担がかかる。そこで短時間で測定を完了できるように独自にテストバッテリーを構成することとした。

加えてこの期間に調査協力者に対するテストトレーニングを行うこととした。具体的には、運動調整力テストとして、協調運動の関する国際レベルの研究で世界的標準である一方で日本では標準化されていないMovement-ABC2にある項目と、肢体部位の協調運動を把握するためのNeck Warmer TestとQuick Gloves Test、即時運動調整の指標を得るための連続長なわとび課題、身体動作模倣による身体表現の正確性と反応性を知るためのTSUKBA模倣テストを考案した。実際、実践フィールドにおいて、予備調査を実施し、その項目に対する子どもの反応や手続きの修正などを行った。それに加えて、対人的運動調整課題として「ボール運び課題」や「2人で同時の長なわとび課題」を構成し、その実施方法について検討した。加えてその実施によって得られた結果についての検討を行った。一方で、プログラミングや実行機能についての認知力テストについては、DN-CASやWISC-IVの項目をもとに検討を試みたが、妥当なテストを構成するに至っていない。また社会性テストは、国際的学術誌に社会性の指標として使用されているADOSやADI-Rは、その使用に何重ものの制限が加えられており、国内の研究で使用することは難しい状況であることがわかった。そこで現在、DECSなど国内でも使用可能なテスト項目をもとチェックリストを考案している。今年度予定していた実践的調査は計画通り実施するに至った。そして当面予定したサイズまでには至っていないが、示唆に富んだマルチケースを着実に得てきた。しかしその成果を論文として報告できていない点で「おおむね」と判断した。当初、今年度中に、本研究用のテストを作成することを目標としていた。認知力テストと社会性テスト以外は、おおむね順調に考案し、予備調査も実施している。認知力テストについては、今後の調査において、個々の問題事象に則し適時実施し、帰納的に必要とされる認知力とは何かを明確にしていきたい。加えて、社会性テストについては、現在、チェックリスト作成段階である。本年度の調査において、運動調整の個人内メカニズムにおいてしなければならない課題が生じたため、まずそれについての研究調査を行うこととした。その結果も加えて、現在までの調査の結果から考案されたキャッチボールをベースとした介入活動(playing catch based intervention)の妥当性を検討し、対人調整運動プログラムとして作成する。最後に調査結果全体に対する考察内容を「エビデンス解説」に上記の対人調整運動プログラムに付記する。これらの内容を冊子にし、学校教育関係、療育・障害児保育関係機関等に配布し、他の研究者や指導者と意見交換できる環境を整える。本研究の目的を達成するため、本研究の目的に理解と協力を示し参加してくれた自閉症児個々に対して、その特性に応じてアダプテッドされた対人調整を必要徒とされる運動課題を実施するとともに、指導前後に運動調整および日常的な対人調整についてテストすることを計画している。すでに、自閉症児をもつ保護者を含めた地域活動グループに、協力の同意を得ている。加えて、個々の問題事象に応じて認知力を調べると同時に、介在要因のひとつである対人調整運動に関する指導内容および学習環境等について記録することとしている。こうした実践的事例を集積し分析を行うこととしている。
ウェブ2.0時代のITツールが新製品開発に与える影響に関する国際比較研究

本研究課題では、欧米の先行研究を参考に、ITツールが新製品開発に与える影響について、日本企業を対象とした定性的・定量的研究を通じ、国際比較研究のための概念モデルを提示した。さらに、新製品開発の各段階(発見・開発・市場化)におけるIT利用の頻度や熟達度が新製品の成果に与える影響について、日本企業203社から得られたデータを分析し、CIOの存在、グローバル化への対応、利用容易性の重要性を明らかにした。以上のように,平成21年度には,定性的な情報収集を行うとともに,その情報を分析した結果に基づく論文の執筆と成果報告を行ってきた。これらの探索的な研究を通じて,日本企業の新製品開発におけるITツールの利用状況の現状を理解しただけではなく,その導入を促進・阻害する要因に関して,欧米諸国とは異なる興味深い発見事項があった。執筆した論文では,それらの要因を,タスク要因・財務的要因・技術的要因・組織的要因といった複数の視点で検討し,概念的整理を行った。今年度に実施した,こうした一連の定性的研究と考察によって得られた概念モデルと仮説を,大規模サンプルを対象とした質問票調査のデータで検証することが次年度以降の研究課題となる。また、2009年度に執筆し、Product Development Management Association Research Forum 2010に投稿した論文も採択され、2010年10月にアメリカ合衆国フロリダで行われたカンファレンスで報告した。このカンファレンスでは、共著者であるGloria Barczak, Serdar S.Durmusogluと現地で研究打合せを行い、実施予定日本企業を対象とした質問票調査の概念モデルと仮説およびデータ収集方法について議論した。その後、11月から12月にかけて、調査対象先のサンプリングと企業送付先データの整備、概念モデルと仮説の内容に基づく質問項目の収集と確定、質問票の原案作成と双方向翻訳といった一連の作業を経て、2011年1月に日本企業約1,100社を対象に質問票を送付した。質問票は2011年2月から3月にかけて回収され、集計と分析の作業を進めている。この調査の内容は、2011年4月の日本商業学会関西部会および2011年6月にオランダ(デルフト)で開催されるInternational Product Development Association Conference 2011で報告することが予定されている。本研究課題では、新製品開発に用いるITツールをコミュニケーションおよび協働のためのツール、情報・知識管理ツール、市場調査・分析ツールの3つに分類したである。そして、これらのITツールが新製品開発に与える影響を発見段階・開発段階・市場化段階というフェーズ毎に詳細に検討してきた。本研究期間の最終年度である平成23(2011)年度には,平成22(2010)年度に実施した、日本企業を対象とした質問票調査のデータを基に実証研究を行い、平成23(2011)年6月にオランダ(デルフト)で開催されたInternational Product Development Management Conference 2011(IPDMC2011)で論文を報告した。さらに震災でいったん中断されていたフォローアップ調査を再開し、追加されたデータを分析して新たな論文を執筆した。この論文はIPCMD2012に採択され、平成24年(2012)年6月にイギリス(マンチェスター)で報告予定である。平成23(2011)年11月には、Journal of Product Innovation Managementで日本企業を対象とした事例研究論文が刊行された。現在展開中の実証研究は、この事例研究論文で提示した概念モデルに依拠するものであり、本研究期間の初年度に行った定性的研究がその後の研究の方向性を決定づけたと言える。ICTの技術が急速に進歩する一方で、それを新製品開発にどのように活用するかに関する研究は、本研究課題の成果が当該分野のトップジャーナルに掲載されたことに鑑みても、未だ端緒についたばかりである。とりわけ、欧米を中心とした実証研究は散見されるものの、日本およびアジアに関する研究は、本論文が世界初の成果であった。この点において、本研究課題が関連研究分野に与えた貢献は大きいと思われる。
特定ゲノム領域の可視化とエピゲノム操作を用いた遺伝子発現制御の動態解析

ヒストンの翻訳後修飾は遺伝子発現制御に重要な役割を果たしており、細胞の形質発現制御の基盤として働いている。本研究は、従来の細胞を固定するようなスナップショット的な解析では明らかにできていない、環境応答や細胞分化の際に、生きた細胞核内でクロマチン構造がどのように変化し、遺伝子発現が制御されているのかという問題に挑む。熱ショック応答において、マスター転写因子であるHSF1が活性化し、標的遺伝子の転写を誘導する。ヒトではHSF1結合配列が、Satellite 3 (Sat3)リピート配列内にも存在し、熱ショックに応答してSat3 RNAの転写が観察される。クロマチンの運動様式と遺伝子発現の相関が報告されているが、その因果関係やヒストン修飾がどのように影響するのかは分かっていない。今年度はCRISPR/dCas9システムを応用した特定ゲノム領域の可視化技術とヒストン修飾の人為的操作(エピゲノム編集)を組み合わせ、クロマチンの運動性を測定した。Sat3リピート配列を標的とするsgRNAとともにdCas9-3xsfGFP、またはヒストンアセチル化酵素の1つであるp300の酵素活性ドメインを融合させたものを発現させ、Sat3クロマチン領域の運動性をMSCD (Mean Square Change in Distance)で評価した。その結果、p300酵素活性ドメインを融合させた場合に、クロマチンの運動性が増加していることが分かった。このことから、ヒストンのアセチル化がクロマチンの運動性を上昇させ、RNA Polymerase 2(RNAPol2)活性化因子との衝突頻度を亢進することで、転写活性化に寄与している可能性が示唆された。CRISPR/dCas9によるゲノム領域の可視化、およびヒストン修飾酵素・脱修飾酵素の機能付加において、蛍光タンパク質のコンストラクトを再検討したところ、3つタンデムにsfGFP(super folder GFP)を融合することで、安定発現株においても長時間での生細胞イメージングが可能になった。リピート配列ではなく、内在性ゲノム配列での一遺伝子領域の可視化を行うためには、比較的に狭い領域に多数のsgRNA配列をデザインしなくてはならない。Streptococcuspyogenes Cas9を用いた場合にはPAM配列(NGG)の制限があるため、限定された領域しか可視化することができない。そこでPAM配列の制限をNGGからNGに緩和した改良型SpCas9NGを用いることにした。酵素活性を失活させたdCas9NGに3xsfGFPを融合させたコンストラクトを作成し、今後NGG, NGA, NGT, NGCいずれの配列でも機能するかを確認し、一遺伝子領域の可視化へと応用する。クロマチンの運動様式と転写活性化の関係性、およびヒストン修飾の寄与を明らかにするために、熱ショック応答時の各タイムポイントでのSat3領域のMSCDを測定する。クロマチン運動性の変化に必要な要素を抽出するために、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、アセチル化を認識するBRDの結合阻害剤、またRNAPol2活性化リン酸化酵素の各種阻害剤を添加した条件でも測定を行う。哺乳類の雌の体細胞では、遺伝子量補正のために、2本あるX染色体のうち片方の転写が不活性化されている。分化過程で、片方のX染色体から非コードRNAであるXistが発現し、そのX染色体全体を覆い、H3K27トリメチル化など、ヒストン修飾を介して、高度に凝集したゲノム3次元構造をとるようになる。この不活性X染色体形成過程における、Xsit RNAの挙動、ヒストン修飾やクロマチン構造がどのように変化していくのかについて理解するために、効率の良い内在性Xist RNAの可視化系を構築する。RNAをターゲットとするclass 2 type VICRISPR/Cas13システムの比較解析を参考し、Ruminococcus flavefaciens由来のCas13(CasRX)を用いる。マウスES細胞の分化誘導時に、Xistの発現とヒストン修飾の変化を生細胞イメージングを組み合わせて解析する。本研究は、従来の細胞を固定するようなスナップショット的な解析では明らかにできていない、環境応答や細胞分化の際に、クロマチン構造がどのように変化し、遺伝子発現が制御されているのかという問題に挑む。本年度は熱ショック応答での転写活性化に着目し、研究室独自の翻訳後修飾可視化系に、CRISPR/Cas9を応用した特定ゲノム領域の可視化技術とヒストン修飾の人為的操作を組み合わせることで、生きた細胞内でクロマチン構造の変化と遺伝子発現の動態を明らかにすることを目指した。HSF1は熱ショックにより活性化し、標的遺伝子の転写を誘導する。生細胞イメージング計測の結果、Sat3では熱ショックに応答したRNAPol2活性化に先立ってヒストンH3 Lys9、H3 Lys27のアセチル化(H3K9ac、H3K27ac)が上昇した。RNA Pol2活性化を阻害した場合にもH3K27acは上昇したことことから、先行して独立に起こるヒストンのアセチル化が転写活性化に重要であることが示唆された。次に、ヒストンアセチル化酵素の1つであるp300の酵素活性ドメインをdCas9に融合することで、Sat3領域のH3K27acレベルが上昇し、熱ショック前からSat3転写が亢進していた。一方、ヒストン脱

メチル化酵素のKDM4DをdCas9に融合することで、Sat3領域のH3K9メチル化レベルを減少させると、熱ショック時のSat3転写量が増加した。このことから、H3K27acはRNAPol2の活性化を促進し、H3K9メチル化は転写レベルの上限を規定していると考えられる。CRISPR/dCas9によるゲノム領域の可視化、およびエピゲノム操作において、現在のコンストラクトでは蛍光強度が弱く、長時間での生細胞イメージングが困難である。生細胞イメージング計測によるダイナミクス解析を行うためには、dCas9に付加する蛍光タンパク質の変更・追加、guide RNAをaptamerとする蛍光シグナルの増幅系を検討する必要があると考えられる。また、RNAをターゲットとするclass 2 type VICRISPR/Casシステムを応用することで、内在性RNAの生細胞イメージング系の構築に取り組んでいる。Leptotrichia shahii (Lsh)由来のCas13aに、酵素活性失活変異を導入し、sfGFPを融合した発現系(dLshCas13a-sfGFP)を構築し、Sat3 RNAをターゲットとするLshのguide RNAとともに発現させ、熱ショック時の生細胞イメージングを行ったところ、一部の細胞で、HSF1の集積箇所にdLshCas13a-sfGFPの共局在が観察された。しかし、dLshCas13a-sfGFPタンパク質が細胞質や核小体にドミナントに存在するため、核内でのターゲティング分子の識別が難しい。これを克服するために、NLSの追加、他のCas13オーソログの検討など、内在性RNAの生細胞イメージングに適したCRISPR/dCas13システムの構築を行う必要がある。ヒストンの翻訳後修飾は遺伝子発現制御に重要な役割を果たしており、細胞の形質発現制御の基盤として働いている。本研究は、従来の細胞を固定するようなスナップショット的な解析では明らかにできていない、環境応答や細胞分化の際に、生きた細胞核内でクロマチン構造がどのように変化し、遺伝子発現が制御されているのかという問題に挑む。熱ショック応答において、マスター転写因子であるHSF1が活性化し、標的遺伝子の転写を誘導する。ヒトではHSF1結合配列が、Satellite 3 (Sat3)リピート配列内にも存在し、熱ショックに応答してSat3 RNAの転写が観察される。クロマチンの運動様式と遺伝子発現の相関が報告されているが、その因果関係やヒストン修飾がどのように影響するのかは分かっていない。今年度はCRISPR/dCas9システムを応用した特定ゲノム領域の可視化技術とヒストン修飾の人為的操作(エピゲノム編集)を組み合わせ、クロマチンの運動性を測定した。Sat3リピート配列を標的とするsgRNAとともにdCas9-3xsfGFP、またはヒストンアセチル化酵素の1つであるp300の酵素活性ドメインを融合させたものを発現させ、Sat3クロマチン領域の運動性をMSCD (Mean Square Change in Distance)で評価した。