hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
障害者の歯科診療時のリラキゼーションについて

症患者、自閉症患者として選定し、患者および保護者からの同意を得ることができた。ダウン症患者5名、自閉症患者7名とした。ダウン症患者で、歯科治療時においてビデオによる映像や音楽を流し、その際の患者の血圧(最高、最低)、心拍数や酸素飽和濃度の測定を行ない、パルスオキシメーターで安定したデーターが得られた。しかし、自閉症患者は、知的障害のため状態が安定しておらず、そのデーターには再度検討を行うことの必要性が伺えた。そのため、知的障害の程度での区分けを検討し、被験者をさらに増加して行う事とした。なお、患者の行動調整等についてもそれぞれの患者の障害の種類や程度により区分けして、術式等と関連させて検討を加える予定である。本研究において、広島大学歯学部付属病院におとずれる障害者の歯科の実態を明らかにし、その歯科治療における患者のリラキゼーションが得られる方法の検討を行った。広島大学歯学部付属病院では、障害者手帳(療育手帳、身体障害者手帳)の交付を受けた方を対象として歯科治療を行っている。患者の障害の種類では精神発達遅滞が54.2%ともっとも多く、自閉症20%、脳性麻痺18.0%と続いていた。これを処置内容で検討すると保存処置が57.8%%でもっとも多く、補綴処置22.7%口腔外科処置19.5%と続いていた。これらの処置を行う上で、体動抑制が必要な困難な患者を、少しでもリラックスして診療できるようにするために、テレビや音楽テープによる試みを行った。実際、歯科診療場面でテレビによりアニメなどの番組を流し、血圧やSpO2などの計測を行った。また、患者が好んで聞いている童謡などの音楽テープを聞かせ、血圧やSpO2などの計測を行った。結果として、知的障害者が多い当治療室では、患者がテレビにまったく関心を示さず、歯科治療による恐怖心や疼痛による刺激で血圧やSpO2などの変動を認めた。音楽テープでは、歯科恐怖心はあるが、少しリラックスする反応があり、体動が和らいだ症例も認められた。しかし。血圧やSpO2などの計測では、その効果は言及できないが、歯科治療時におけるリラキゼーション効果を推測できるものと考えられる。今後、これら歯科治療時における知的障害患者のリラキゼーションを得るためには、音楽テープの検討がさらに必要と考えられた。テレビによるリラキゼーション効果についても、今回はほとんど認めなかったが、診療全体の流れにおいて、患者の行動に何らかの影響を及ぼしていると考えられる。
メチローム・クロモゾーム解析に基づく肝癌転移関連分子の同定と臨床応用

本年度は、既知の遺伝子変異、メチル化の状況、染色体異常の包括的解析から肝癌組織を分類し、背景の臨床病理学的因子と比較し、生物学的悪性度の高いサブグループの抽出を試みた。125例の肝癌切除組織を用い、以下の解析を行った。(1)肝癌の代表的な遺伝子変異であるCNTTB1遺伝子、p53遺伝子、TERTプロモーターの変異の解析、(2)肝癌で高メチル化が報告されている8種の癌抑制遺伝子プロモーターメチル化の定量、(3)3種のDNA繰り返し配列の脱メチル化の定量、(4)200種のマイクロサテライト領域における染色体コピー数変化の解析。上記の結果を基に、対応分析とクラスター解析により、肝癌をA1, A2, B1, B2の4種のサブグループに分類した。この内、サブクラスA1、B1に分類される例ではHBV陽性、腫瘍マーカー高値、脈管侵襲あり、中低分化の割合が有意に高かった。サブクラスA1、B1に共通して認められる変化は、CNTTB1遺伝子変異なし、p53遺伝子変異あり、繰り返し配列における脱メチル化進行、及び広範囲な染色体異常であった。次に25例の肝癌肝移植例を用い、移植後の肝癌再発と遺伝子、染色体変化との関連を解析した。上記の肝癌切除例での解析を基に、CNTTB1遺伝子変異なし、p53遺伝子変異あり、繰り返し配列における脱メチル化進行、及び広範囲な染色体異常の有無により、上記の変化が2種以下の群と、3種以上の群に分け、Kaplan-Meyer解析を行った。上記の変化が3種以上の群では、有意に肝癌再発までの期間が短かった(p = 0.048)。なお肝癌移植後の再発例は全例肝外再発であった。上記の結果より、CNTTB1遺伝子変異なし、p53遺伝子変異あり、繰り返し配列における脱メチル化進行、及び広範囲な染色体異常は、肝癌の転移再発を予測する因子になりうることが示唆された。上記で記載したように、CNTTB1遺伝子変異なし、p53遺伝子変異あり、繰り返し配列における脱メチル化進行、及び広範囲な染色体異常の組み合わせが、肝癌転移再発のリスクであることを明らかにした。現在は、さらに肝癌再発転移に関わる遺伝子変異の絞り込みを行っている。具体的には、上記の肝癌症例のうち、56例ではHumanMethylation450 BeadChip arrayを用いたmethylomeの解析、及び、Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel上の、次世代シークエンサーを用いた409遺伝子の遺伝子変異の解析をすでに終了している。またデータベースで公開されている情報を参照し、ヒト胎児肝と成人肝でメチル化、発現に差をある遺伝子を抽出し、それらの遺伝子群の遺伝子メチル化の変化を肝癌で定量化し、胎児肝に似たメチル化、遺伝子発現パターンを示すサブグループを絞り込んでいる。同様の症例で、肝癌幹細胞マーカーであるEpCAM, CK19, SALL4の免疫染色にて発現解析も終了し、これらの胎児肝の性質を示す肝癌は肝幹細胞マーカーを発現し、転移再発を来し易く、予後不良であることも見いだしている。現在、症例数を増やして解析している。また、詳細なクロモゾーム変化に関しては、現在解析中である。本年度は、肝癌の主要な遺伝子変化に基づいた分類による転移再発予測の可能性を検討した。1. 125例の肝癌を用い、TP53、CTNNB1、TERT promoterの変異を解析、8種のpromoterメチル化を定量し、promoter高メチル化群を分類、ゲノムワイド脱メチル化状態を3種の反復配列のメチル化レベルにより、ゲノム脱メチル化群を分類した。microsatellite解析により、fractional allelic loss (FAL)スコアを算定し、染色体不安定群と安定群に分類した。結果を基に、対応分析とクラスター解析により肝癌を亜分類し、進行癌の特徴を有するsubgroupの特徴を抽出した。2.肝癌移植例を用い、1.で抽出した遺伝子変化のスコアを基に、移植後の転移再発が予測できるかを検証した。3. The Cancer Genome Atlas (TCGA)より367例の肝癌データを参照し、遺伝子変異、DNAメチル化、染色体コピー数、及び肝癌切除根治性と無再発生存期間が確認可能な168例を対象として、解析を行った。1.の解析により、肝癌が4つのサブグループに分類され、転移との関連が知られている背景を持つsubgroupの特徴として、TP53変異あり、CTNNB1変異なし、ゲノムワイド脱メチル化あり、染色体不安定あり、の4種の分子リスクが抽出された。2.肝移植例の肝癌で分子リスク>3をaggressive molecular typeと定義した。このtypeは有意に再発のリスクであった(p = 0.0090; log-rank test)。3. TCGAより抽出した肝癌初発切除性でも、このtypeは肝癌再発と有意に関連した(p = 0.0076)。肝癌のcommonな遺伝子変化を検索することにより再発リスク群を同定でき、その群はアジュバントの検討余地がある125例の肝癌、非癌部の切除と凍結標本を用い、体細胞遺伝子変異(TP53, CNTTB1, TERT promoter)をdirect sequenceで解析し、がん抑制遺伝子(TSG)プロモーター異常メチル化レベル(APC, CDKN2A, RASSF1A, HIC-1, GSTP

1, RUNX3, SOCS1, PRDM2)、ゲノムワイド脱メチル化レベル(Alu, LINE1,Sat2)をCOBRA, MethyLight法で定量、さらにゲノムワイドの染色体コピー数変化をABI PRISM Linkage Mapping Set Ver. 2にて定量した。それらの各パラメーターを、体細胞遺伝子変異の有無、TSGプロモーター高メチル化、ゲノムワイド脱メチル化レベルの有無(階層クラスター解析により判定)、染色体不安定性の有無(染色体コピー数変化を基にしたFALスコアで判定)にカテゴリー化し、対応分析とクラスター解析により、肝癌をsubgroupに分類し、各subgroupの腫瘍の臨床病理学的特徴と遺伝子変化と特徴を検討した。上記の結果を基に、スコアリングシステムを構築し、25例の肝癌移植例の遺伝子解析を行い、移植後の肝癌再発が予測しうるかを検討した。さらにvalidationとして、公共データベース(TCGA)より、376例の肝癌切除例のexsome sequencing, HM450によるmethylome, Affymetrix SNP6による染色体コピー数解析結果をダウンロードし、治癒切除後の無再発期間(PFS)を検討した。これらの結果より、構築した分子スコアリングの転移予測には有意な結果が得られ、目的とする転移予測と、その関連遺伝子の絞り込みに進展が見られたと考えられる。25例の肝癌肝移植例の癌組織を用い、術後に肝外転移で再発した例、および肝癌肝移植後で4年以上の無再発例のエピゲノム変化をmethylome解析にて検討する。両者の間でメチル化レベルに差のある遺伝子を明らかにする。同様に、肝癌の肝移植例で、術後に肝外転移で再発した例の染色体変化を検討し、転移を生じた肝癌での共通変化領域を求める。同様の解析を4年以上の無再発の肝癌肝移植例で行ない、転移を生じた肝癌にユニークな異常染色体領域を求める。さらに125例の肝癌の治癒切除検体を用い、上記で選択した異常染色体領域、および異常メチル化を示す遺伝子の内で、治癒切除後の早期再発と相関する変化をさらに絞り込む。これにより、肝癌根治治療後の転移再発と関連する遺伝子変化を絞り込む。加えて、データベースを参照に、胎児肝特有の遺伝子メチル化パターン、遺伝子発現パターンを抽出し、ヒト肝癌の網羅的メチル化解析、遺伝子発現解析から胎児肝の性質を持つ肝癌を遺伝子メチル化と発現パターンから絞り込む。これらの胎児型肝癌の遺伝子変異、クロモゾーム変化のパターンを明らかにし、転移再発との関連を検討する。肝癌肝移植例の癌組織を用い、術後に肝外転移で再発した例、および肝癌肝移植後で4年以上の無再発例のゲノム、エピゲノム変化を包括的に検討する。さらに、肝癌の肝移植例で、術後に肝外転移で再発した例の染色体変化を検討し、転移を生じた肝癌での共通変化領域を求める。また、肝癌の治癒切除検体を用い、上記で選択した異常染色体領域、および異常メチル化を示す遺伝子の内で、治癒切除後の早期再発と相関する変化をさらに絞り込む。
サケ皮由来伸縮性コラーゲンを用いた生体置換型人工血管の開発

サケ皮由来伸縮性コラーゲンチューブは、伸縮性に優れた生体置換型人工血管としての利用が期待できるが、縫合性と生体置換性に課題があった。そこで、コラーゲン線維の密度増加、高分子の混合、フィブロネクチンの固定化を検討した結果、引裂強度(縫合性)、内皮細胞接着性(生体置換性)を改善した。本研究の目的は、これまでの研究で明らかとなった伸縮性サケコラーゲンゲル(e-Gel)製人工血管の3つの課題、(1)抗血栓性メカニズムの解明、(2)移植時縫合性の改善、(3)内皮細胞接着性の改善、を解決し、世界初の小口径-生体置換型人工血管の実用化を目指すことである。H20年度は(2)を解決するために、コラーゲンの重合反応促進とエラスチン混合を検討し、e-Gelチューブの引裂強度改善検討を行った。コラーゲンの重合反応促進では、コラーゲンの重合(線維化)における温度、塩濃度、コラーゲン濃度、架橋剤濃度の最適化を行った。その結果、コラーゲン濃度を従来の0.2%から1.2%に増加することによって約4倍引裂強度が増加した。このとき架橋剤を入れるタイミングをコラーゲン重合前から重合後に変更することによって1.2%e-Gelチューブを作成できることがわかった。また、温度と塩濃度は従来条件が最適であることを確認した。次にエラスチン混合では、まずエラスチンの重合(コアセルベーション)条件を検討した。その結果、エラスチンはコラーゲン重合と同じ線維化バッファーで重合することがわかった。次にコラーゲンとエラスチンの共重合を検討した結果、コラーゲン:エラスチン=1 : 3.2以上で混合するとコラーゲンの重合が阻害されることがわかった。最適な混合比1 : 0.8で作成したコラーゲン/エラスチン共重合チューブの引裂強度を測定した結果、エラスチン混合によって引裂き強度が低下することがわかった。また、血小板接着がエラスチンによって促進されるという課題が残った。以上より、引裂き強度改善にはコラーゲン濃度アップが効果的であることがわかった。今後は移植による縫合性の確認を行う予定である。2年目となるH21年度はH20年度から引き続き(2)の検討に加えて、(3)の検討を行った。(3)について、細胞接着の改善法として細胞接着性タンパク質のフィブロネクチン(FN)のe-Gel上への固定化を検討した。免疫染色法によってe-GelへのFN固定を確認した後、臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)の接着数を評価した結果、100μg/mlのFNを固定化したときに細胞接着性プラスチック培養プレート(TCP)と同程度まで改善できることがわかった。また増殖性もTCPと同程度まで改善できた。さらにラット全血から分離した血小板の接着性を評価した結果、FN固定化e-Gelへの血小板接着数は小さく、抗血栓性を維持したままHUVECの接着性を改善することに成功した。また、H20年度に検討したエラスチン混合e-GelはHUVECの増殖性が低下した。エラスチン混合は強度改善効果が小さいことはH20年度に報告済みであり、他の高分子と混ぜる検討を行っている。次に(2)の縫合性の改善について、H20年度で得られたコラーゲン濃度アップの効果に加えて、コラーゲン線維化条件と架橋剤濃度を最適化することによって、ラット腹部大動脈に縫合可能なe-Gelチューブの作成に成功した。しかし、いまだ引裂強度は十分といえず縫合数を増やさざるを得なかった。さらなる強度改善を目指し、HUVECの接着・増殖を妨げないような高分子と混合する検討を行っている。前年度まで、FNコートによる内皮細胞の接着性改善および、コラーゲン濃度アップ/架橋剤濃度最適化による引き裂き強度改善を報告した。H22年度はさらなる強度改善・縫合性改善を目指し、コラーゲン線維の配向制御、および有機ナノチューブの混合化を検討した。コラーゲン線維の配向制御は、コラーゲンゲルを作成する際に、流れを付加することで流動方向への線維配向を促進した。さらに、そのゲルの上に90度傾けた垂直方向に流れを付加し、最初の配向と垂直方向に配向させた。これを数回繰り返し、ラメラ構造を持つコラーゲンチューブを作成した。

電子顕微鏡観察の結果、コラーゲン線維の配向が90度ずつ交互に向きを変えたラメラ構造を有していることを確認した。さらに、引張強度試験の結果、配向制御していないものと比較して高いことを確認した。次にゲルの作製前に有機ナノチューブ(NT)を混合する検討を行った。NT混合はコラーゲン線維化を抑制しないことを確認した。また、混合によって引き裂き強度を改善することができた。NTは官能基を有するため、架橋剤によってコラーゲンと架橋を形成していることが示唆された。一方、血小板接着試験を行った結果、NT混合によって若干の血小板接着増加を認めた。従って、血小板接着を増加させない程度に混合することにした。以上の強度改善を行ったチューブをラット腹部大動脈に移植し、長期の開存性を観察中である。
ショウジョウバエ味覚受容機構の分子神経生物学的解析

ショウジョウバエの1本の味覚感覚子には、水(W)、糖(S)、塩(L1、L2)に応答する4個の味細胞が存在する。本研究によって、フ節と唇弁の特定の感覚子が苦味物質に応答することを電気生理学的に初めて明らかにした。感覚子によって最も良く応答する物質は異なっていた。高濃度の塩に応答するL2細胞が苦味物質に応答する。唇弁には片側31本の味覚感覚子が存在し、1、s、iタイプに分類される。それぞれのタイプ別に糖に対する神経応答を調べたところ、1タイプの感覚子が最も感度が高く、iタイプの感覚子は1タイプの半分ほどの応答であった。sタイプの感覚子ではショ糖に対してはLタイプと同等に応答するが、他の糖に対しての応答は弱かった。i-タイプの感覚子は、水に応答しないが、糖、塩、苦味物質には応答し、2個の味細胞しかもたたない。生理学的な解析により、糖と低濃度の塩は一つの味細胞で受容されており、高濃度の塩と苦味物質は別の味細胞で受容されていることがわかった。ショウジョウバエのゲノムには、3量体Gタンパク質をコードする遺伝子は16個予測されている。味覚器における発現をRT-PCRを用いて調べたところ、α、β、γサブユニットで各1個が主に発現していた。Gγ1遺伝子に対する2本鎖RNAを発現するUAS-RNAi系統を用いて味覚神経応答を調べたところ、糖応答が低下していた。Gγ1遺伝子のnull突然変異体を用いて糖受容細胞の神経応答を調べた。FLP/FRTシステムを用いて任意のタイミングで体細胞組換えを起こし、Gγ1遺伝子のnull突然変異ホモ接合体の細胞を生じさせた。その味細胞の糖に対する神経応答は低下していたが完全には消失していなかった。Gγ1遺伝子は糖受容細胞で発現しており、糖受容シグナルトランスダクションに関与していると考えられる。ショウジョウバエの味細胞は脚と唇弁にある感覚子に存在する。1本の味覚感覚子には、それぞれ水(W)、糖(S)、塩(L1、L2)の味質に応答する4つの味細胞が存在することが知られているが、これは唇弁の特定の感覚子の解析結果によるものであった。感覚子によって味覚応答に違いがあるのかを検証するために、唇弁の全ての感覚子から4種類の糖に対する神経応答を電気生理学的手法によって記録した。ショウジョウバエの唇弁には片側31本の味覚感覚子が存在し、場所や長さによってL、S、Iタイプの3つに分類される。実験の結果、それぞれのタイプ別に糖に対する神経応答が違うことが確認された。Lタイプの感覚子が最も感度が高く、Iタイプの感覚子はLタイプの半分ほどの応答であった。Sタイプの感覚子ではショ糖に対してはLタイプと同等に応答するが、他の糖に対しての応答は弱かった。これまで、ショウジョウバエではショ糖とグルコースは同じ受容体で受容されていると考えられてきたが、この2つの糖に対する受容体が独立に存在する可能性が示された。また、Iタイプの感覚子では、1つの味細胞が、糖(S)と低濃度の塩(L1)の2つの味質に応答することを確認した。味覚受容体候補遺伝子Grの発現細胞をGFPによって同定したが、我々が明らかにした糖に対する感度に対応したGrの発現は認められなかった。数種類の苦味物質を用いた行動実験によりショウジョウバエは苦味物質を忌避することが明らかになった。

しかし、これまで苦味物質に応答する感覚子の存在は報告されていなかった。そこで、フ節の感覚子が苦味物質に応答するかを調べたところ、特定の感覚子が応答することを初めて確認した。応答は低濃度でおこり、刺激開始後、50ミリ秒の遅れでインパルスが生じた。苦味物質は、糖の応答を阻害することも確かめられた。ショウジョウバエの味覚受容機構を解明するには、それぞれの味細胞の生理学的な性質を明らかにして、受容体遺伝子の発現パターンとの対応づけることに加えて、それぞれの味細胞の中枢への機能的な投射パターンを明らかにする必要がある。ショウジョウバエの脚と唇弁にある1本の味覚感覚子には、それぞれ水(W)、糖(S)、塩(L1、L2)の味質に応答する4つの味細胞が存在する。昨年度の研究によって同定された2個の味細胞しかもたないI-タイプの唇弁の感覚子の味細胞の性質を明らかにした。Iタイプの感覚子は、糖(S)、低濃度の塩(Ll)、高濃度の塩(L2)、苦味物質の4種類の味質に応答した。このうち、糖と低濃度の塩は一つの味細胞で受容されており、この2種類の味質を同時に刺激物質として与えると単一の味物質で刺激したときよりも相乗効果があることがわかった。これは、これまでに発見されている糖受容体・塩受容体の受容メカニズムに新たな見解を示すものである。また、高濃度の塩と苦味物質は別の味細胞で受容されており、この味細胞からの情報は摂食行動に対して抑制的にはたらくものと考えられる。このような応答性に対応した味覚受容体候補遺伝子の発現は見いだすことができなかった。今後、これらの細胞を分子遺伝学的な手法により細胞死をおこさせ、摂食行動にどのように寄与しているのかを解明する。味細胞からの投射パターンを同定するため、様々なGal4系統を用いると共に、Yellow-Cameleonを用いたカルシウムイメージングによって、各味細胞からの投射パターン同定を試みる実験は進行中である。ショウジョウバエの1本の味覚感覚子の基部には通常4個の味細胞がある。それぞれの味細胞は、糖、低濃度の塩、高濃度の塩や苦味物質、水のいずれかに応答する。味細胞の軸索は、唇弁からは脳の食道下神経節に、フ節や翅からは胸部神経節に直接伸びている。特定の味細胞の機能を調べ、投射パターンを同定するため、Gal4エンハンサートラップ法、GAL4/UAS系を用いた。これらの手法を用いることで、特定の細胞をラベルし、その細胞で任意の遺伝子を発現させることができる。特定の味細胞でGAL4が発現しているGal4エンハンサートラップ系統をスクリーニングし、唇弁の感覚子に接続する1個の味細胞でGAL4が発現しているNP1017系統を得た。GAL4発現細胞の機能を調べるため、シナプス小胞のリサイクルに重要な遺伝子であるshibireの変異体や神経毒素をコードするTNT、細胞死遺伝子であるreaperをGAL4/UAS系を用いGAL4発現細胞において発現させた。GAL4発現細胞の機能阻害により生じる味覚応答の変化を、吻伸展反射テスト、電気生理学的解析により調べた結果、NP1017系統の唇弁でのGAL4発現細胞は水受容細胞であることがわかった。
変異ホスホランバン・トランスジェニックマウスを用いた慢性心不全の病態解析

心筋小胞体膜蛋白質ホスホランバン(PLN)がカルシウムATPase(SERCA)の特異的阻害蛋白質であることを利用して心不全モデルマウスを作成するため、まず、両蛋白質間の相互作用部位の同定及び強力なSERCA2a活性抑制作用を有するPLN変異体のスクリーニングを行った。PLN細胞質ドメイン(domain I)及び膜貫通ドメイン(domain II)にSERCAとの相互作用に関わる残基が存在することを既に明らかにしてきたが、domain IIを欠失したキメラPLNはSERCA抑制能を失なうため、domain Iを介する相互作用は直接のSERCA抑制活性を持たない調節的作用と考えられた。しかしながら、domain IとIIの境界領域(domain Ib)の変異体の中に強力なSERCA抑制能を示すものがあり、これらはdomain IIの抑制能増強変異体と異なりPLN多量体の安全性には影響しないため、これら両domainは異なった様式でSERCA活性を抑制していると考えられた。PLNdomain IIが相互作用を営むSERCAの膜貫通helixの検索を行った結果、SERCAの相互作用部位は6番目の膜貫通helix(M6)に存在する4アミノ酸残基で、それらはM6のCa結合部位の反対側に位置し、SERCA分子の外側に面していることが明らかになった。従って、ホスホランバンはSERCAのM6が形成している溝に位置してSERCAと会合し、直接蛋白質相互作用によってSERCA活性を制御していると考えられる。以上の検討により得られた機能増強変異体のうち、L37AとI40Aを過剰発現するtransgenic mouseを作成した。これらは、外見上は異常所見を認めなかったが、心肥大および収縮・拡張能の低下を呈し、ストレスにさらされると死亡する個体がみられ、さらに詳細な観察を行っているところである。本研究は、心筋小胞体膜蛋白質ホスホランバンがカルシウムATPaseの特異的阻害蛋白質であることを利用して、変異ホスホランバンを用いて心筋小胞体機能が特異的に障害された心不全モデルマウスを作成することを第一の目標としている。そのためにまず、心筋小胞体カルシウムATPase(SERCA2a)活性を強力に阻害するホスホランバン変異体をスクリーニングした。既にホスホランバンの部分欠失変異体や膜貫通ドメイン(ドメインII)の変異体のなかに野生型以上にSERCA2aを抑制するものがあることを明らかにしているので、これらより強力な抑制活性を有する変異体を検索した。細胞質ドメイン(ドメインI)はSERCA2aと直接蛋白質間相互作用を営むことが知られているが、この部分と他の膜蛋白質とのキメラはSERCA2a抑制活性を示さなかったことから、ドメインIは直接の抑制活性を持たない制御領域と考えられた。しかし、この一部であるドメインIbの変異体のなかにSERCA2a活性を強く抑制するものがあり、特に、N27Aは、これまでに作成したなかで、もっとも強力なSERCA2a活性抑制を示した。ドメインIbの抑制活性増強変異体は、ドメインIIの変異体と異なりホスホランバンの多量体構造の安定性には影響しないため、ドメインIbとドメインIIとはSERCA2aに対する制御機構が異なることが予想される。従って、ドメインIbとIIの変異を合わせ持つ変異体は相乗的な抑制効果をもつことが期待されるため、2残基変異体を作成し、検討している。以上の結果に基づいて、ドメインIIのSERCA2a抑制作用増強変異体であるL37AとI40Aについてまずトランスジェニックマウスの作成に着手した。さらに、N27Aや、N27Aと他の変異との組み合わせについて、引き続き有用性を検討している。

心筋小胞体膜蛋白質ホスホランバン(PLN)がカルシウムATPase(SERCA)の特異的阻害蛋白質であることを利用して心不全モデルマウスを作成するため、平成10年度に引き続き、両蛋白質間の相互作用部位の同定及び強力なSERCA活性抑制作用を有するPLN変異体のスクリーニングを行った。前年度までの検討で、PLN膜貫通ドメイン(domainII)がSERCAとの相互作用に重要であることが明らかになっていたため、SERCAの膜貫通helixに存在するPLN相互作用部位の検索を行った結果、それは6番目の膜貫通helix(M6)に存在する4アミノ酸残基で、M6のCa結合部位の反対側に位置し、SERCA分子の外側に面していることが明らかになった。従って、ホスホランバンはSERCAのM6が形成している溝に位置してSERCAと会合し、直接蛋白質間相互作用によってSERCA活性を制御していると考えられる。両蛋白質間の物理的会合の親和性を検討したところ、物理的会合の親和性とPLNのSERCS抑制能は概ね相関した。しかし、従来、抑制能の増強は質量作用の法則によると考えられてきたdomainIIの変異体の中にも両蛋白質間の親和性を増加させるものがある等、これまで想定されていた機序とは別な作用様式の存在を示唆する所見もあり、さらなる検討を要する。これまでの検討により得られた機能増強変異体のうち、L37AとI40Aを過剰発現するtransgenic mouseを作成した。これらは、外見上は異常所見を認めなかったが、心肥大および収縮・拡張能の低下を呈し、ストレスにさらされると死亡する個体がみられ、さらに詳細な観察を行っているところである。
中国出土銅鏡の地域別鏡式分布に関する研究

本研究の目的は大きく2項目に分けられる。第1は山東省全省の鏡(隋唐以前の鏡および出土鏡を中心とする)に関する資料収集を皆悉的に行ったことである。第2は鏡録研究である。第1については、中国国家文物局、山東省文化庁・文物局、山東省博物館の支持と支援のもとに現地調査を実施し、およそ山東省におけるすべての鏡の資料を収集することができた。収集した資料の大部分は未報告資料である、中国の規定に従い中国での図録と研究書の刊行を予定している(2004年中国文物出版社より刊行予定)。また本調査においては、鏡の法量・銘文・写真撮影などの調査を行うだけではなく、工学と鋳造技法の調査を合わせて行い・各鏡に鋳造技法の分析を加えた。これは鏡の調査において、まったく新しい試みであったといえる。第2の目的である鏡録調査については、宋代から中華民国時代にかけて金石学や碑帖、印譜、彝器款識などのいわゆる図録が多く刊行された。そのうち鏡を収録した図録(ここでは鏡録とよぶ)の収集をおこなった。その結果16種の鏡録を収集し、1000面近い鏡図の研究をおこなった。作成した鏡録図版は最終年度の実績報告書に収録している本研究によって、現在の考古学における鏡の研究ではほとんど活用されることがなかった鏡録(青銅鼻器の研究では古くから金石録の利用は多い)が鏡の考古学史的研究、銘文研究に大きな意義をもち、中国に多く存在する伝世鏡の鏡式やその出所を明らかにすることができると考えている。山東省文物考古研究所と、山東省博物館出土鏡の基本的調査を終了し、現在、撮影した銅鏡の写真整理とカード作成をおこなっている。また、威海、蓬莱各市の鏡の調査も終えることができた。本年度までで、山東省の公的機関所蔵鏡の80%は調査を終了し、めざましい成果を上げることができた。平成14年度末には、これらの鏡の報告をする予定である。他に、新中国になって以来の報告された鏡の調査も、70%終了した。中国・南北朝以前の銅鏡の製作地は、ほとんど判明していず、わずかに画像鏡のものが呉越地方で製作されたことが鏡背の銘文から判明していたのみである。これは中国において鋳鏡遺構から検出されていなかったことに起因している。ここ数年の山東省を中心にわれわれの研究グループの研究によって草葉文鏡の製作地が、山東半島中部の博市の斉故城の大城東北側において草葉文鏡笵、トリベ破片などが集中して出土する地域を特定することができた。この地点は従前から知られていた煉銅遺跡2ヶ所とは異処である。このことによってすくなくとも、中・小径の草葉文鏡の一部が確実に斉故城で鋳造されたことが判った。ところが、草葉文鏡には胎の厚薄2種類があり、今日の鋳造遺構からは厚胎の笵が検出されていて、薄胎のものは見出していない。広範囲の調査を続けている山東省では、魯南地域では、二重の郭線で表現する小形画像鏡があり、日照市までの海岸帯で出土している。現在までの資料では、江蘇地域では報告されていないので、地域性の強い鏡といえよう。山東半島と大陸部の山東省では中形以下の内行花文鏡、大形の方格規矩鏡が少ない。重圏銘文鏡も大形のものは、極めて少ない。大型の画像鏡、中・小形の画文帯神獣鏡も少ない。このことは、目本の北九州出土の大形で精良な銅鏡の将来地の推定とも関わってくる重要な問題点であるといえよう。

これらの鏡式の山東省内での地域的分布の変異も複雑なものであるが、2003年に予定している曲阜の調査を終了することには、全体の確実な見通しがたてられるであろう。本研究の目的は大きく2項目に分けられる。第1は山東省全省の鏡(隋唐以前の鏡および出土鏡を中心とする)に関する資料収集を皆悉的に行ったことである。第2は鏡録研究である。第1については、中国国家文物局、山東省文化庁・文物局、山東省博物館の支持と支援のもとに現地調査を実施し、およそ山東省におけるすべての鏡の資料を収集することができた。収集した資料の大部分は未報告資料である、中国の規定に従い中国での図録と研究書の刊行を予定している(2004年中国文物出版社より刊行予定)。また本調査においては、鏡の法量・銘文・写真撮影などの調査を行うだけではなく、工学と鋳造技法の調査を合わせて行い、各鏡に鋳造技法の分析を加えた。これは鏡の調査において、まったく新しい試みであったといえる。第2の目的である鏡録調査については、宋代から中華民国時代にかけて金石学や碑帖・印譜・彝器款識などのいわゆる図録が多く刊行された。そのうち鏡を収録した図録(ここでは鏡録とよぶ)の収集をおこなった。その結果16種の鏡録を収集し、1000面近い鏡図の研究をおこなった。作成した鏡録図版は最終年度の実績報告書に収録している。本研究によって、現在の考古学における鏡の研究ではほとんど活用されることがなかった鏡録(青銅彝器の研究では古くから金石録の利用は多い)が鏡の考古学史的研究、銘文研究に大きな意義をもち、中自に多く存在する伝世鏡の鏡式やその出所を明らかにすることができると考えている。
セントロメア領域のクロマチン構造基盤の解析

ゲノムDNAは、遺伝情報を担う重要な物質である。細胞の分裂に伴い、ゲノムDNAは正確に継承されなくてはならない。そのため、S期で複製され倍加したゲノムDNAを、2つの娘細胞に均等に分配する機構が存在する。この均等分配機構の詳細は明らかとなっていないが、ゲノムDNA上の領域であるセントロメア領域が重要な役割を果たしている。セントロメア領域のクロマチン構造が、セントロメア領域の機能発現に重要であると考えられている。本研究では、セントロメア領域に形成されるクロマチンの構造の解析を行った。セントロメア領域は、染色体の均等分配に必須なゲノムDNA上の領域である。セントロメア上に集積したキネトコア複合体に紡錘糸が結合し、両極に引っ張ることにより染色体の均等分配は行われる。このような重要な領域にも関わらず、セントロメア領域の形成および維持機構は明らかとなっていない。セントロメア領域の形成に必須の因子として、ヒストンH3バリアントであるCENP-Aが存在する。真核生物のゲノムDNAは、各2分子のヒストンH2A、H2B、H3およびH4からなるヒストン八量体にDNAが左巻きに結合したヌクレオソーム構造を基本単位とし、それらが数珠上に連なったクロマチン構造を形成している。CENP-Aは、セントロメア領域において、他のヒストンH2A、H2B、H4と共にヌクレオソームを形成することが知られている。セントロメア領域に形成されるCENP-Aヌクレオソームは、その立体構造が特徴的であり、それを目印として、他のセントロメアタンパク質が集積することで、セントロメア領域が形成されると考えられている。これまでにCENP-Aヌクレオソームの立体構造は明らかとなっていなかった。我々は、ヒトのCENP-Aヌクレオソームを試験管内において再構成し、X線結晶構造解析により、その立体構造を明らかにした。構造解析の結果、CENP-Aヌクレオソームに特徴的な構造を明らかにすることに成功し、2011年8月にNature誌にて発表した。CENP-Aヌクレオソーム構造の次の階層の高次構造として、セントロメア特異的なDNA結合タンパク質であるCENP-Bが結合したCENP-Aヌクレオソームが存在する。2011年度は、この複合体の試験管内再構成系の確立を行った。その後、X線結晶構造解析を行うために、結晶化条件の検討を行った。真核生物のゲノムDNAは、遺伝情報を担う重要な物質であるため、細胞分裂を繰り返しても、正確に継承される必要がある。S期で複製し倍加したゲノムDNAは、M期において凝縮した染色体を形成し、2つの娘細胞に均等に分配される。この倍加および均等分配機構により、ゲノムDNAの継承は行われている。染色体の均等分配は、両極から伸びてきた紡錘糸が染色体上に形成されているキネトコア複合体と結合し、引っ張ることにより行われる。このキネトコア複合体が集積するゲノムDNA上の領域がセントロメアである。セントロメア領域は、特異的なタンパク質が集積することが知られている。その中の一つにヒストンH3バリアントであるCENP-Aが存在する。これまでの解析によりCENP-Aは、セントロメア領域の形成および維持に中心的な役割を果たしている必須の因子であることが分かっている。CENP-Aは、セントロメア領域においてヒストンH4,H2A,H2Bと共にヌクレオソームを形成しており、このCENP-Aヌクレオソームが目印となり他のセントロメア特異的な因子が集積していると考えられている。本研究では、セントロメア領域に特異的なDNA結合タンパク質であるCENP-BとCENP-Aヌクレオソームに着目して、これらの複合体の形成機構および構造について解析した。その結果、CENP-BはCENP-Aヌクレオソームに適切に結合するためには、ヒストンシャペロンNap1が必要であることが明らかとなった。その作用機序は、CENP-Bの非特異的なDNA結合をNap1が阻害することにより、特異的な結合を促進していることが分かった。さらに、CENP-Bが結合したCENP-Aヌクレオソームの調製も行い結晶構造解析を行うための、結晶化を行った。2011年度は、セントロメア領域を形成しているクロマチン構造の基本単位であるCENP-Aヌクレオソームの立体構造を決めることに成功した。セントロメア領域のクロマチン構造を明らかにするためには、CENP-Aヌクレオソームの次の階層の高次構造を理解する必要があり、セントロメア特異的なDNA結合タンパク質であるCENP-BがCENP-Aヌクレオソームに結合した複合体が、次の階層の高次構造である。

2011年度中に、この複合体の再構成系を確立しており、立体構造を決定すべく結晶化条件の検討を行った。サンプルを調製するという第一段階は、達成しているので、おおむね順調に進展していると言える。2012年度は、再構成したCENP-Bが結合したCENP-Aヌクレオソームの結晶化条件の精密化を行う。得られた結晶を用いて、X線結晶構造解析法により、その立体構造を決定する。また、ヌクレオソームが二つ連なったダイ・ヌクレオソームも再構成し、ダイ・ヌクレオソームにCENP-Bが結合した複合体の構造解析も行う。2012年度の研究費は、主に結晶化試薬、再構成に用いるDNAを調製するための酵素類、リコンビナントタンパク質を精製するための生化学用試薬に使用する予定である。
体節形成における分節化開始機構の解析

われわれはすでに、Mesp2ノックアウトマウスを作製し、その解析を進めているが、さらに、その発現部位の同定、およびMesp2-nullマウスにおける発現細胞の挙動を調べる目的で、LacZを導入したマウスを作製しその解析をおこなった。Mesp2ノックアウトマウスでは、体節の前後の極性が失われ、特に、前部の特徴が失われることが脊椎骨のパターンをはじめいくつかの分子マーカーをもちいた解析によりあきらかになっている。そこで、Mesp2発現細胞が体節の前部を規定する遺伝子ではないかと推測されたが、Mesp2の発現はRNAレベルでは、分節前にのみ観察されるため、それらの細胞が分節後に前後どちらの細胞を形成するかは明らかにできていなかった。ところが、このMesp2-LacZマウスにおいては、LacZ活性がある程度持続的に観察されるため、Mesp2発現細胞の追跡が可能になった。その結果、LacZの発現は明らかに分節後の体節の前方に局在しストライプパターンを形成し、Mesp2発現細胞が体節の前方を形成することが明らかになった。さらに、Mesp2-LacZホモマウスにおけるLacZの発現を調べたところ、その発現ドメインがRNAの発現レベルで広がっていることが示され、Mesp2の発現は自分自身の発現ドメインを規定する役割をもつことも、あきらかになった。また、Mesp2ノックアウトマウスにおいてはNotch1の発現が著しく減少することがわかっているのでそこに活性型のNotch1を発現することにより表現型を改善できるか否か検討した。現在すでにマウスが作製されているがその表現型はMesp2-nu11マウスと全く同じであり、Notch1によってMesp2の欠損は補うことができないことがわかった。したがって以前考えていたように、Mesp2の下流にNotchが位置しているという単純なスキームはあやまりであり、Mesp2の上流にNotchのシグナル系が存在しており、Mesp2とのフィードバックループを形成していることが考えられた。これは最近Notch1やその下流で働くRBP-Jkの欠損マウスにおいてMesp2の発現が著しく低下しているという事実と合致する。
バゾプレシン・ニューロフィジンII遣伝子の転写制御および発現に関する研究

1.我々は先に、家族性中枢性尿崩症の1家系(第1家系)でバゾプレシン-ニューロフィジンII(VP-NP)遣伝子の異常を報告しているが、今回新たに別の3家系について解析を行った。第2家系ではexon1に1塩基置換があり、signal peptideのC端のAlaがThrに置換されていることが判明した(J.Clin.Invest.In press)。第3,4家系では第1家系と同様に、NPの中央部分をコードしているexon2に遣伝子異常が見い出された。第3家系では3塩基欠失のため1アミノ酸が欠損し、第4家系では1塩基置換の結果stop codonが出現する(いずれも投稿準備中)。2.第2家系でsignal peptideに見い出された異常は、翻訳後初期の段階に影響を及ぼす可能性が高いため、無細胞系を用いた発現実験を行った。正常および異常mRNAを兎網赤血球のライセートにより翻訳すると、19kDaのpreproVPが産生された。正常のpreproVPは、犬の膵臓のrough microsomeを添加することにより21kDaのproVPに変換された。しかしながら、異常preproVPへのprocessingは著しく低下しており、signal peptideが切断されないままにglycosylationだけを受けた23kDaの異常前駆体が産生されていた。したがってこの家系においては、signal peptidaseによるprocessingが障害されproVPの産生が低下することが、尿崩症の発症に関与しているものと考えられた(J.Clin.Invest.In press)。3.正常のVP-NPcDNAを組み込んだ発現ベクターを種々の細胞に導入し検討することにより、VP-NP遣伝子の発現実験系を確立した。今後この系を用いて、第1,3,4家系における尿崩症の発症機序を検討していく予定である。(1)今回の研究で新たに検討した家族性中枢性尿崩症の第2家系において、バゾプレシン・ニュ-ロフィジンII(AVPーNPII)遺伝子のexon1に1塩基置換の異常が見い出された。その結果、シグナルペプチドのCOOH末端(positionー1の位置)のアミノ酸であるアラニンがスレオニンに置換することが予想された。正常AVPーNPIIcDNAおよびprimerーdirected mutagenesisにより作製した異常AVPーNPIIcDNAから、in vitro transcriptionによりそれぞれのmRNAを合成した。兎の網状赤血球のライセ-トを用いて、マイクロゾ-ムメンブラン存在および非存在下においてmRNAを翻訳した結果、遺伝子異常によりシグナルペプチデ-スによるシグナルペプチドの切断効率が著しく低下していることが判明した。現在、シグナルペプチデ-スによるプレプロホルモンの切断部位を明らかにするため、プロホルモンのアミノ酸配列の同定を行っている。(2)正常AVPーNPIIcDNAの発現系としてchinese hamster ovary細胞、AtTー20細胞を選び、遺伝子導入を行い、ネオマイシンのアナログであるG418を用いて選別の後、pulse chase analysisによりAVPーNPIIcDNAの導入されたクロ-ンをスクリ-ニングした。こうして得られたstably transfected clonesを用いて、前駆体のプロセッシングおよびプロセッシング後のAVP・ニュ-ロフィジン・糖蛋白の分泌機序について現在解析を行っている。一方、既に我々が検討を行った第1家系においては、AVPーNPII遺伝子のニュ-ロフィジンをコ-ドする領域に塩基置換が認められ、この異常に基づき正常とは異なるプレプロホルモンの産生が想定されている。現在、異常AVPーNPIIcDNAの導入されたクロ-ンのスクリ-ニングを行っている。

1.我々は先に、家族性中枢性尿崩症の1家系(第1家系)でバゾプレシン-ニューロフィジンII(VP-NP)遺伝子の異常を報告しているが、今回新たに別の3家系について解析を行った。第2家系ではexon1に1塩基置換があり、signal peptideのC端のAlaがThrに置換されていることが判明した(J.Clin.Invest.In press)。第3.4家系では第1家系と同様に、NPの中央部分をコードしているexon2に遺伝子異常が見い出された。第3家系では3塩基欠失のため1アミノ酸が欠損し、第4家系では1塩基置換の結果stop codonが出現する(いずれも投稿準備中)。2.第2家系でsignal peptideに見い出された異常は、翻訳後初期の段階に影響を及ぼす可能性が高いため、無細胞系を用いた発現実験を行った。正常および異常mRNAを兎網赤血球のライセートにより翻訳すると、19kDaのpreproVPが産生された。正常のpreproVPは、犬の膵臓のrough microsomeを添加することにより21kDaのproVPに変換された。しかしながら、異常preproVPのproVPへのprocessingは著しく低下しており、signal peptideが切断されないままにglycosylationだけを受けた23kDaの異常前駆体が産生されていた。したがってこの家系においては、signal peptidaseによるprocessingが障害されproVPの産生が低下することが、尿崩症の発症に関与しているものと考えられた(J.Clin.Invest.In press)。3.正常のVP-NPcDNAを組み込んだ発現ベクターを種々の細胞に導入し検討することにより、VP-NP遺伝子の発現実験系を確立した。今後この系を用いて、第1,3,4家系における尿崩症の発症機序を検討していく予定である。
microRNAとエクソソーム解析によるメカニカルストレスの関節軟骨への作用解明

関節液を遠心(低速、高速)、酵素処理し滑液からのエクソソーム(EVs)を精製法を確立した。精製した粒子については粒子径分布分析をおこない直径が30-200nmであること、電子顕微鏡観察を行い脂質2重膜構造を持つ球状構造であること、マーカータンパクをウェスタンブロット分析を行いCD9を含有すること、RNA含量測定を行いRNAを含有することを確認した。軟骨細胞培養上清からもEVs回収を行った。既報の情報と比較・検討し精製された粒子がEVsであることを確認した。軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを用いてまたEVsの軟骨細胞への添加試験を行い、必要な培養上清量、添加時間を検討しEVs添加試験系を確立した。サイトカイン処理した培養軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを軟骨細胞に添加し、マトリックス成分(アグリカン、2型コラーゲン)、マトリックス分解酵素(ADAMTS4、5、9、MMP-13)、ヒアルロン酸分解酵素(KIAA1199)mRNAの発現変化をRT-PCR法を用いて解析した。ラット変形性関節症モデルを用いたEVs解析の結果から滑液量、滑液中のEVs量が共に非常に少なく、現時点の検出感度では解析に供することが困難と判断した。そこでラットOAモデルの血液を用いて解析を行うことにした。血液由来EVsからはRNAを回収し、EVs含有RNAの概算が出来るようになった。軟骨細胞に対しメカニカルストレスを与え、炎症性サイトカインで誘導されるマトリックス分解酵素発現を抑制する可能性のあるmicro RNAを複数同定した。これらmicro RNAのアナログ、阻害剤で軟骨細胞を処理し、タンパクレベルでのプロテオグリカン分解酵素産生抑制、ヒアルロン酸分解因子産生抑制を確認している。マトリックスのメジャーな成分であるプロテオグリカン、ヒアルロン酸の代謝に関与するmicro RNAを同定した。今までの我々の研究によりメカニカルストレスにより軟骨細胞においてマトリックス分解酵素の発現抑制が誘導出来ること、また適度なメカニカルストレスを与えることでマトリックス成分の発現誘導を行えることを見出している。これらのことを踏まえ軟骨様細胞株OUMS-27に対し種々のメカニカルストレスを負荷、細胞からmicroRNAを回収し、microRNAアレイ解析を行った。メカニカルストレス負荷によりその発現が上昇しtargetScan、PITA、DIANAなど複数のアルゴリズムを用いてそのターゲットがADADMTS、MMPなどのマトリックス成分分解関連因子である可能性の高いmiRNAを複数選択した。これら候補miRNAに対し、それぞれの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の経時的発現変化をタンパクレベルで解析した。複数のmiRNAにおいて標的タンパクの発現上昇を確認した。またメカニカルストレスを添加することにより標的タンパクの発現上昇がみられた。軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームを超遠心法、カラム法で回収し比較した。超遠心法は収量が少なく、逆に行程数、時間も多い為カラム法で今後は回収することとした。メカニカルストレスの個体レベルの解析としてラットOAモデルのトレッドミルによる走行負荷試験を行った、現時点では十分な個体数になっておらず統計的有意な差ではないが適度な走行負荷条件では軟骨の損傷抑制傾向がみられた。軟骨様細胞株OUMS-27でメカニカルストレスにより変動するmiRNAでありそのターゲットがマトリックス成分関連因子であるmiRNAを見いだした。更にmiRNAの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の発現変化をタンパクレベルで抑制した。ある条件下で変動するmiRNAを見出すのは比較的容易であるがそのmiRNAが制御する遺伝子を見出すことは非常に困難であることが多い。今年度標的タンパクまで解析できたことは大きな進展であると考えている。また、マトリックス成分制御miRNA候補も検出できている。軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームの調製方法の検討を終えた。メカニカルストレスの個体レベルでの解析を行い、試験数は少ないながらも今後の方針決定を行うに足る結果を得ている。関節液を遠心(低速、高速)、酵素処理することにより滑液からエクソソームを精製する方法を検討・確立した。精製した粒子については粒子径分布分析をおこない直径が30-100nmであること、電子顕微鏡観察を行い脂質2重膜構造を持つ球状構造であること、マーカータンパクをウェスタンブロット分析を行いCD63を含有すること、RNA含量測定を行いRNAを含有することを確認した。軟骨細胞培養上清からも同様にエクソソーム回収を行った。既報の情報と比較・検討し精製された粒子がエクソソームであることを確認した。軟骨細胞の培養上清から回収したエクソソームを用いてまたエクソソームの軟骨細胞への添加試験を行い、必要な培養上清量、添加時間を検討しエクソソーム添加試験系を確立した。サイトカイン処理した培養軟骨細胞の培養上清から回収したエクソソームを軟骨細胞に添加し、マトリックス成分(アグリカン、2型コラーゲン)、マトリックス分解酵素(ADAMTS4、5、9、MMP-13)、ヒアルロン酸分解酵素(KIAA1199)mRNAの発現変化をRT-PCR法を用いて解析した。ラットOAモデルを用いたエクソソーム解析の結果から滑液量、滑液中のエクソソーム量が共に非常に少なく、現時点の検出感度では解析に供することが困難であると判断した。

血液由来エクソソームからはRNAを回収した。本試験からエクソソーム含有RNAの概算が出来るようになった。軟骨細胞に対しメカニカルストレスを与え、炎症性サイトカインで誘導されるマトリックス分解酵素発現を抑制する可能性のあるmicro RNAを複数同定した。これらmicro RNAのアナログ、阻害剤で軟骨細胞を処理し、タンパクレベルでのプロテオグリカン分解酵素産生抑制、ヒアルロン酸分解酵素産生抑制を確認している。マトリックスのメジャーな成分であるプロテオグリカン、ヒアルロン酸の代謝に関与するmicro RNAを同定していることとなる。滑液からのエクソソーム回収の方法を確立し、滑液にも他の血液、組織液、細胞、組織と同様なエクソソームが存在することを確認した。エクソソームを培養細胞に添加する試験系も確立し、エクソソームの細胞、組織への作用を今後は解析することが可能な段階まで進展した。関節液を遠心(低速、高速)、酵素処理し滑液からのエクソソーム(EVs)を精製法を確立した。精製した粒子については粒子径分布分析をおこない直径が30-200nmであること、電子顕微鏡観察を行い脂質2重膜構造を持つ球状構造であること、マーカータンパクをウェスタンブロット分析を行いCD9を含有すること、RNA含量測定を行いRNAを含有することを確認した。軟骨細胞培養上清からもEVs回収を行った。既報の情報と比較・検討し精製された粒子がEVsであることを確認した。軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを用いてまたEVsの軟骨細胞への添加試験を行い、必要な培養上清量、添加時間を検討しEVs添加試験系を確立した。サイトカイン処理した培養軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを軟骨細胞に添加し、マトリックス成分(アグリカン、2型コラーゲン)、マトリックス分解酵素(ADAMTS4、5、9、MMP-13)、ヒアルロン酸分解酵素(KIAA1199)mRNAの発現変化をRT-PCR法を用いて解析した。ラット変形性関節症モデルを用いたEVs解析の結果から滑液量、滑液中のEVs量が共に非常に少なく、現時点の検出感度では解析に供することが困難と判断した。そこでラットOAモデルの血液を用いて解析を行うことにした。血液由来EVsからはRNAを回収し、EVs含有RNAの概算が出来るようになった。これらmicro RNAのアナログ、阻害剤で軟骨細胞を処理し、タンパクレベルでのプロテオグリカン分解酵素産生抑制、ヒアルロン酸分解因子産生抑制を確認している。マトリックスのメジャーな成分であるプロテオグリカン、ヒアルロン酸の代謝に関与するmicro RNAを同定した。今回見いだしたmiRNAの発現ベクターを軟骨細胞に導入、過剰発現を行い標的遺伝子産物の変化をmRNA、タンパクレベルで確認する。
メラノーマ自然発症マウスを用いたCTL免疫誘導促進性抗がん物質の新規探索法の開発

1.薬物のがん特異的CTL免疫誘導促進活性のスクリーニング系の樹立:(1)出生して各時期のメラノーマ自然発症系(304系または192系)RETトランスジェニックマウスに、代表的な漢方補剤として知られる十全大補湯を各種条件で経口投与するか、有効成分の一つであると先に同定している精製化学物質グリチルリチンを各種条件で腹腔注射した。これらのマウスから腹腔細胞を採取し、これをRETトランスジェニックマウスに発生したメラノーマから分離し維持しているメラノーマ細胞株(Mel-RET)と薬物を添加して混合培養し、培養系に出現する腫瘍特異的CTL活性を51Cr放出試験で測定し比較した。その結果、先に予備的に検討した結果を裏付けるように、担癌の304系トランスジェニックマウスに十全大補湯を4週間経口摂取させた場合に最も明確に抗腫瘍CTL活性の増加が見られた。一方、グリチルリチン腹腔注射による誘導はいずれの条件のもとでもより軽微であった。このため、前者の条件がスクリーニングに適していると結論された。(2)新規簡易型の開発:腫瘍の発生に伴って免疫系のTh1/Th2バランスがTh2にシフトするという成績を確認しつつあるが、十全大補湯やグリチルリチンが示す抗腫瘍活性がCTL免疫の誘導に関わるTh1シフトを強める活性とリンクしているかどうかについては、なお結論を得ていない。このため、この結果を利用した新たなスクリーニング系の開発は残された課題である。2.各種薬物のがん特異的CTL免疫誘導促進活性の検定:強い抗酸化活性を持つとされるカレー粉の成分であるクルクミン(名古屋大学生命農学研究科大澤教授から分与)を304系RETトランスジェニックマウスに出生の1か月後から終生経口的に摂取させて、メラノーマの発生と増殖への影響を観察した。その結果、実験開始後1年半の観察で推計学的に有意の腫瘍抑制効果が観察された。今後、直接的にまたは上記のスクリーニング系を用いてこの薬物の抗腫瘍CTL免疫誘導活性を解析嚇する予定である。