hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学習場面における児童の努力に対する肯定的感情の獲得に関する研究

昨年度までに作成された児童の努力に対する感情尺度の2つの下位尺度(向上性尺度と感情性尺度)と児童の友人関係・規範遵守についての態度との関連性を、小学校5年生135名を対象に検討した。なお、友人関係については、(1)相互交流、(2)交流不振体験、(3)友人批判、および(4)自己閉鎖の4つの側面が取り上げられた。その結果、向上性尺度得点と友人との相互交流・規範遵守についての態度の間に正の関連のあることが明らかにされた。感情性尺度得点については、規範遵守との間に正の関連のある可能性が示された。また、児童の努力に対する感情尺度と生徒の数学の好き・嫌いの関連性についても、中学生198名を対象にして検討された。その結果、全体として、努力に対する感情と数学の好き・嫌いが関連していることが示されたが、とりわけ、向上性尺度得点との間に明確な正の関連が認められた。その他、本年度の中心的検討課題については、以下のような進行状況にある。児童の努力に対する感情尺度と学習意欲尺度を測定用具として、授業実践の展開に伴うこれらの尺度の変化については、現在分析している途上にある。授業実践が多岐にわたるため、尺度上の変化と授業実践の対応づけに苦慮している。また、研究遂行上の基本的問題として、個人差や場面差などのため、行動的資料と表情的資料を学習意欲測定のための指標として確立することの困難さが明らかにされた。さらには、多岐にわたる資料の統合的把握が困難であるため、これらの資料と学習意欲の客観的な対応づけも必ずしも明確に示すことができていない。資料の量的処理自体が誤りである可能性もあり、事例研究的な質的処理の方向をも探究する必要がある。1.研究成果の公表:本年度は、これまでの研究結果をまとめて、報告書として公表した。そこでは、努力に対するイメージ尺度作成の試み、努力に対するイメージ尺度を用いてその発達的変化・学習意欲や学業成績との関連の検討、教師の努力に対するイメージと児童の努力に対するイメージの関連、努力に対するイメージと教科の好悪との関連、努力に対するイメージの生成過程に関する検討など、が取り上げられている。2.努力を想起する場面と努力に対するイメージの関連性の検討:昨年度までの研究から、(1)努力に対するイメージが、向上性尺度と感情性尺度の2つから構成され、(2)感情性尺度の年齢に伴う急激な低下が認められたため、(3)感情性尺度の低下が、学習意欲の低下へ導くのではないかと考えた。その上で、(4)感情性尺度の友人関係との関連を想定して検討したが、必ずしも明確な関係を見つけることはできなかった。本年度は、感情性尺度の生成過程の再検討を行うこととし、努力を想起する場面と感情性尺度の関係を検討した。小学生・教師・大学生の資料を得て、現在分析中であるが、大学生については、努力を想起する場面として、勉強場面と運動場面が多いこと、男子に運動場面が多く、女子に芸術場面が多いことなどの結果が示されている。3.今後の課題-教育実践の展開と努力に対するイメージの肯定的方向への転換-:本研究の最終的な研究目的の一つが、上記の内容であった。
イネいもち病菌における非病原力RNAの探索

本研究では、イネいもち病菌の非病原力遺伝子座として知られるAvrCo39における非病力遺伝子産物の同定を目的としている。AvrCo39座に存在する小さな4つのORFおよびステムループ様のRNA分子を転写可能な領域を候補として、点突然変異体を作製し、それらの変異遺伝子を導入したいもち病菌の病原性を検定することにより、AvrCo39における非病力遺伝子産物の同定を試みた。これらの4つのORFおよびステムループRNAの点突然変異体を持つAvrCo39遺伝子を導入したいもち病菌を、抵抗性遺伝子Co39を保有するイネ品種に接種し、その病原性の変異を検定した。その結果、ORF3の変異体では、強い病原性を示すようになり、同遺伝子がAvrCo39の非病力遺伝子産物と同定できた。当初の予想した非病原力RNAの発見には至らなかったが、非病原性産物の同定ができた意義は大きいと考えている。AvrCo39座に存在する小さな4つのORFおよびステムループ様のRNA分子を転写可能な領域を候補として、点突然変異体を作製し、それらの変異遺伝子を導入したいもち病菌の病原性を検定することにより、AvrCo39における非病力遺伝子産物の同定する予定である。本年度は、これらの4つのORFおよびステムループRNAの点突然変異体の作製を完了させた。これらの変異AvrCo39遺伝子を、抵抗性遺伝子Co39を保有するイネ品種に本来親和性であるイネいもち病菌に導入し、その病原性の変異を検定したが、本来、親和性である野生株が、充分に宿主イネにおいて病原性を発揮しないという現象に陥り、変異AvrCo39遺伝子の効果を明確に検定できなかった。ORF3の変異体が最も病原性が強く、AvrCo39の非病力遺伝子産物の候補として考えられたが、親菌系を変更して、より正確に検定する必要があると考えられ、現在、その実験を行っている。
シナプス伝達の長期促進とアラキドン酸カスケードとの関係

ウシガエルの交感神経節では、節前線維の頻回刺激により興奮性後シナプス電位(fast EPSP)が長時間増大し、シナプス伝達の効率が長期促進(LTP)される。このLTPの発現に関わる機序について調べてきた。その結果について,既に以下のことを報告してきた。このLTPは、節前神経終末に由来し、伝達物質(アセチルコリン)放出量の持続的な増大により起きる。またLTPの発現とその維持には、神経終末内のCa^<2+>濃度の持続的増大が必要である。更にLTPの発現に関わる細胞内情報伝達系を検索した結果、カルモジュリンに依存した代謝経路の活性化が、LTPの発現に必要である。今回、LTPに対するアラキドン酸カスケード系の関与の有無を調べた結果、次のことが明らかとなった。1.phospholipideからアラキドン酸を遊離させるphospholipase A2の活性を阻害する4-bromophenacyl bromide(10μM)はLTPの発生やその維持に何の作用も与えなかった。2.cyclooxgenaseの阻害剤であるaspirin(50μM)とindomethacin(2μM)は、共にfast EPSPの振幅を減少させたが、LTPの発現と維持には影響を与えなかった。3.lipoxygenaseの阻害剤であるnordihydroguaiaretic acid(20μM)はLTPに何の作用も与えなかった。4.アラキドン酸(20μM)はニコチン受容体を介する応答を減少させ、ムスカリン受容体を介する応答を促進したが、LTPの発生とその維持には無関係であった。以上の結果より、アラキドン酸およびそのカスケード系は、ウシガエルの腰部交感神経節におけるLTPの発現やその維持には関与しない、と結論された。一方、アラキドン酸のコリン作動性応答に対する興味ある作用については、今後更に詳しく検討していく。
魚類の性決定と性分化機構の生理学的、分子生物学的研究

魚類では、雌雄異体現象の他に雌雄同体現象が知られている。雌雄同体現象には一個体の生殖腺内に成熟した卵巣と精巣を同時に持つ種、雌から雄、または雄から雌に性転換する種、雄、雌どちらに何度でも性転換する種などが知られている。このことから、魚類の性決定、性分化機構は、他の高等な脊椎動物と異なり、多様で可塑性に富んでいるのが特徴である。本研究では魚の性の多様性と可塑性を支える機構を解明するために、はじめに雌雄異体魚の性分化機構、即ち、発生に伴い未分化生殖腺が卵巣又は精巣に分化する機構を形態学的、生理学的、分子生物学的手法を用いて解明に取り組んだ。次に性転換機構の解明にも取り組んだ。性分化機構の解析のために、遺伝的に雌雄産み分けられたティラピアを用いて卵巣分化時に発現が増加、減少する遺伝子を調べた。その結果、発現が増加するものとしてFox12が同定された。Fox12は、アロマターゼ発現の転写調節活性化能を促進することが明らかとなった。一方、精巣分化に発現が増加、減少する遺伝子の検索を行い、発現が上昇するもの6個、低下するもの21個を得て現在解析中である。性転換機構については主に雌から雄へ性転換するミツボシキュウセンとカンモンハタを使い調べた。両種ともにアロマターゼ・インヒビターにより雌は雄へと性転換することを明らかにした。アロマターゼ・インヒビターと女性ホルモンと同時に処理すると性転換が抑制されることが明らかになった。このことから性転換には、女性ホルモンが低下することが重要であるかことが示された。卵巣の生体外器官培養による精巣への転換、成熟精子形成と言う今後の性分化、性転換機構の解明に有効な手段となる画期的方法を確立した。哺乳類を除くいくつかの脊椎動物で報告されているような芳香化酵素阻害剤(ファドロゾール)による精巣への性転換は、エストロゲンが卵巣分化/発達に関与することを示している。しかし、エストロゲンが卵巣分化のどのステップに関与するのかは不明なままである。本研究では、エストロゲンが魚類生殖腺分化過程にどのような作用機序で卵巣分化に関与するかを明らかにするための基礎的知見を得るために、遺伝的雄であるXYティラピアのエストロゲンによる性転換卵巣分化誘起過程で発現の変化する遺伝子を検索した。方法卵巣分化過程におけるエストロゲンの下流遺伝子の検索XY個体を孵化後4-6日にエストロゲンで処理すると、機能的な雌への完全な性転換が誘起できる。この系を用いて孵化後15日の対照個体、処理個体から生殖腺を単離し、total RNAを抽出した。これを材料として、サブトラクション法、reverse-ノーザン法及び、in situ hybridizationを用いて発現促進、あるいは発現抑制を受ける遺伝子産物を検索した。結果卵巣分化時のエストロゲンの下流遺伝子カスケードを明らかにするために、エストロゲンによるXY個体の性転換卵巣分化の誘起に伴って特異的に発現する遺伝子産物をサブトラクション法により検索した。現在までに、エストロゲン依存性の性転換卵巣分化の誘起において、発現の変化する遺伝子産物を10個、得た。この中、発現の増加するもの、減少するものは、それぞれ、7、3個であった。In situ hybridizationによって、発現の増加するものの中で2個は生殖細胞特異的に発現することがわかった。その他は体細胞に特異的な発現を示した。現在、生殖腺分化過程におけるこれらの遺伝子産物の発現プロファイルを調べている。

しかし、エストロゲンが卵巣分化のどのステップに関与するのかは不明なままである。本研究では、エストロゲンが魚類生殖腺分化過程にどのような作用機序で卵巣分化に関与するかを明らかにするための基礎的知見を得るために、遺伝的雄であるXYティラピアのエストロゲンによる性転換卵巣分化誘起過程で発現の変化する遺伝子を検索した。方法卵巣分化過程におけるエストロゲンの下流遺伝子の検索XY個体を孵化後4-6日にエストロゲンで処理すると、機能的な雌への完全な性転換が誘起できる。この系を用いて孵化後15日の対照個体、処理個体から生殖腺を単離し、total RNAを抽出した。これを材料として、サブトラクション法、reverse-ノーザン法及び、in situ hybridizationを用いて発現促進、あるいは発現抑制を受ける遺伝子産物を検索した。結果卵巣分化時のエストロゲンの下流遺伝子カスケードを明らかにするために、エストロゲンによるXY個体の性転換卵巣分化の誘起に伴って特異的に発現する遺伝子産物をサブトラクション法により検索した。現在までに、エストロゲン依存性の性転換卵巣分化の誘起において、発現の変化する遺伝子産物を10個、得た。この中、発現の増加するもの、減少するものは、それぞれ、7、3個であった。In situ hybridizationによって、発現の増加するものの中で2個は生殖細胞特異的に発現することがわかった。その他は体細胞に特異的な発現を示した。現在、生殖腺分化過程におけるこれらの遺伝子産物の発現プロファイルを調べている。これまでにティラピアの生殖腺分化過程における性分化に関連した遺伝子を明らかにするために、エストロゲンあるいはアンドロゲンによる性転換誘起によって発現の増加、減少する遺伝子産物を最終的に18個、得た。精巣、卵巣分化誘起に伴って発現の増加するものとして、DMRT1、アロマターゼを同定した。さらに、卵巣分化に伴って発現の増加する遺伝子として新たにFoxl2が同定された。Foxl2の発現は、卵巣に特異的にみられ、卵巣分化に伴って間充織細胞、ステロイド産生細胞に局在した。また、濾胞形成にともなって顆粒膜細胞にもみられた。Foxl2によるアロマターゼ発現の転写調節活性化能を調べたところ、その発現が促進されることが明らかとなった。遺伝的全雌群に対して合成雄性ホルモン(MT)ならびに雌性ホルモン合成阻害剤(Al)を投与し、雄への性転換を誘導する際に発現が変化する遺伝子を改変ディファレンシャルディスプレー法により検索した。発現遺伝子の比較は性分化途上と考えられる処理開始12日目と、性決定直後と考えられる30日目の試料について行った。その結果、処理開始12日目で両薬剤処理とも発現が低下する遺伝子を21個、上昇するものを16個単離した。一方、処理開始30日目では低下するものを19個、上昇するものを14個単離した。さらに合成雄性ホルモンと雌性ホルモン合成阻害剤に対して異なる反応を示した遺伝子も単離した。
高速シーケンサーを用いた遺伝子制御ネットワーク解析技術の開発

近年発展の目覚ましい高速シーケンサーによる遺伝子発現量の測定データと、従来のマイクロアレイによるデータとを組み合わせて遺伝子制御ネットワーク解析を方法を開発した。実際にマウスの褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞に対して寒冷曝露刺激を与えた際の遺伝子発現プロファイルにこの方法を適用し、脂肪細胞の褐色化に関連する候補遺伝子を抽出した。RNA-seqとマイクロアレイ、miRNAアレイによる発現プロファイルを用いて、遺伝子制御ネットワーク推定を行うアルゴリズムのプロトタイプ開発を行った。本研究課題において開発するアルゴリズムは大別して2つの要素技術からなっており、各要素技術は相互依存的であるため、並行して開発を行っている。1発現量の定量化:従来の発現解析の中心であったmRNAの定量化に加え、lincNRAやmicroRNAの定量化を行うための方法を開発し知見を得た。遺伝子制御ネットワークを推定する際に、microRNAの遺伝子発現量と通常の遺伝子の発現量を同様に扱うことは困難であり、機能性の違いを考慮した定量化法が必要となる。2制御関係の推定:数千,数万の遺伝子数に対して測定は数回程度しか行うことができず、そのため遺伝子発現プロファイルの情報量不足を原因とした遺伝子制御ネットワーク推定の精度低下が問題点となる。この情報量の不足を軽減するために複数の時系列遺伝子発現プロファイルを利用し,より精度の高い遺伝子制御ネットワークを推定するための方法論の開発を行った。RNA-seqによる発現プロファイルを用いて、数十ノードの小規模なネットワークを対象としたアルゴリズムのプロトタイプ開発を行った。1発現量の定量化:RNA-seqのデータを数値化し、多変量データとして扱うことを可能とするための方法論の開発を行った。従来の発現解析の中心であったmRNAの定量化に加え、lincNRAやmicroRNAの定量化を行うための方法を開発し知見を得た。2制御関係の推定:遺伝子発現プロファイルから遺伝子制御ネットワークを推定する方法論の開発を行った。マイクロアレイにより測定された発現プロファイルから制御ネットワークを推定する方法については既に多くの研究がなされている。このため本年度には、同一の現象を観測したマイクロアレイによる発現プロファイルとRNA-seqによる発現プロファイルを入手し、従来法との比較検討を行いつつ開発を行った。制御関係の推定にはベイジアンネットワークを元にした手法や、より単純な相関係数によるネットワーク推定(Relevance network)を元にした方法を用いている。脂肪細胞には白色と褐色の2種類があり,前者は脂肪滴の形でエネルギーを貯蔵するのに対し,後者は体温の維持のため脂肪を燃やして熱を発生させる.ある種の白色脂肪細胞は、寒冷条件下では褐色脂肪細胞のように熱を発生するベージュ脂肪細胞に転換することが知られている.本研究では,寒冷曝露下でのマウスの各脂肪組織において計測した時系列のRNA-seqとマイクロアレイ,miRNAアレイによる発現プロファイルを用いて,遺伝子発現解析を行った.RNA-seqによる発現プロファイルを用いて、数十ノードの小規模なネットワークを対象としたアルゴリズムのプロトタイプ開発を行った。本研究課題において開発するアルゴリズムは大別して2つの要素技術からなっており、各要素技術は相互依存的であるため、並行して開発を行った。従来の発現解析の中心であったmRNAの定量化に加え、lincNRAの発現量の定量化を行うための方法を開発した。同一の現象を観測したマイクロアレイによる発現プロファイルとRNA-seqによる発現プロファイルを入手し、従来法との比較検討を行いつつ開発を行った。最終年度には、白色脂肪細胞が褐色脂肪細胞へ分化転換する現象を観測した発現プロファイルに対して開発した方法を適用し知見を得た。RNA-seqとマイクロアレイ,miRNAアレイによる発現プロファイルを用いて解析を行ってきたが,さらなる時系列データの取得を行う必要が生じた.研究協力者によりデータを取得したが成果をまとめた学会での発表や論文化のスケジュールに遅れが生じた.情報学平成27年度には成果のとりまとめと成果発表を行うこととする.同一の現象を観測したマイクロアレイによる発現プロファイルとRNA-seqによる発現プロファイルに加えて、miRNAアレイの時系列データも入手し、当初の予定通りに要素技術の開発に着手することが出来たため。同一の現象を観測したマイクロアレイによる発現プロファイルとRNA-seqによる発現プロファイルを入手し、当初の予定通りに要素技術の開発に着手することが出来たため。RNA-seqとマイクロアレイ,miRNAアレイによる発現プロファイルを用いて解析を行ってきたが,さらなる時系列データの取得を行う必要が生じた.研究協力者によりデータを取得したが,成果をまとめた学会での発表や論文化のスケジュールに遅れが生じた.当初の予定通りに推進する。当初の予定通りに推進する。

成果のとりまとめと成果発表を次年度に行うこととし,最終年度に計上していた旅費,論文の校正費用,論文の印刷費用をその経費に充てることとしたい.国際会議での発表回数が予定より少なくなったため。別の国際会議での報告を行う。2年目である平成25年度には、主に中間成果報告用の機材や旅費、校正費用として研究費を使用する。
アンジオテンシン変換酵素I遺伝子多型性の日本人冠動脈疾患発症における意義

[目的]本研究は分子生物学的手法でアンジオテンシンI変換酵素(ACE)遺伝子多型を解析し、虚血性心疾患者での発症と二次予防に関わる意義と考察するものである.平成8年度は、引き続き、健常コントロールと心筋梗塞症例を対象に、心室遅延電位を指標として左室再構築過程(リモデリング)および初回心筋梗塞の予後におけるACE遺伝子多型の意義について検討した.[方法]白血球よりDNAを採取し、PCR法でACE遺伝子多型を判定した。加算心電図で心室遅延電位の有無を判定した.又、手紙によるアンケート調査を行い、初回梗塞後の心事件および心室遅延電位の有無とACE遺伝子多型との関連についてKaplan-Meier法で解析した.[研究実績](1)アンジオテンシンI変換酵素(ACE)遺伝子多型DD型は、日本人虚血性心疾患でも新たな冠危険因子になりうる(Circulation、1994).(2)low risk(TC<260mg/dl,HbAlc<9.0%,BMI<26)の心筋梗塞症における初回梗塞後の心事件の総頻度は、II型群34例中7例(20.6%)、ID型群71例中15例(21.1%)、DD型群58例中21例(36.2%)であった.Kaplan-Meier法による解析で、ACE遺伝子型DD型群の心事件の発生はII型群とID型群に比べて多い傾向にあった(武者毅彦と共著、岩手医誌1997,in print).(3)ACE遺伝子多型DD型で心室遅延電位陽性例は多く、ACE遺伝子多型は左室モデリングに関連した(Nakai K et al.A.N.E.1:405-410,1996.[考案]ACE遺伝子多型DD型は、心筋梗塞症の発症や初回梗塞後の心事件の発生および左室リモデリングに関わる新しい因子となりうると考えられた.[目的]本研究は分子生物学的手法でアンジオテンシンI変換酵素(ACE)遺伝子多型を解析し、虚血性心疾患者での発症と二次予防に関わる意義と考察するものである.平成8年度は、引き続き、健常コントロールと心筋梗塞症例を対象に、心室遅延電位を指標として左室再構築過程(リモデリング)および初回心筋梗塞の予後におけるACE遺伝子多型の意義について検討した.[方法]白血球よりDNAを採取し、PCR法でACE遺伝子多型を判定した。加算心電図で心室遅延電位の有無を判定した.又、手紙によるアンケート調査を行い、初回梗塞後の心事件および心室遅延電位の有無とACE遺伝子多型との関連についてKaplan-Meier法で解析した.[研究実績](1)アンジオテンシンI変換酵素(ACE)遺伝子多型DD型は、日本人虚血性心疾患でも新たな冠危険因子になりうる(Circulation、1994).(2)low risk(TC<260mg/dl,HbAlc<9.0%,BMI<26)の心筋梗塞症における初回梗塞後の心事件の総頻度は、II型群34例中7例(20.6%)、ID型群71例中15例(21.1%)、DD型群58例中21例(36.2%)であった.Kaplan-Meier法による解析で、ACE遺伝子型DD型群の心事件の発生はII型群とID型群に比べて多い傾向にあった(武者毅彦と共著、岩手医誌1997,in print).(3)ACE遺伝子多型DD型で心室遅延電位陽性例は多く、ACE遺伝子多型は左室モデリングに関連した(Nakai K et al.A.N.E.1:405-410,1996.[考案]ACE遺伝子多型DD型は、心筋梗塞症の発症や初回梗塞後の心事件の発生および左室リモデリングに関わる新しい因子となりうると考えられた.[背景]アンギオテンシン-I変換酵素(ACE)遺伝子多型DD型は、日本人虚血性心疾患でも新たな冠危険因子になりうると報告した(Circulation 1995)。今回、心筋梗塞症205例(平均年齢59歳)と健常コントロール100例(平均年齢56歳)を対象に、心筋梗塞症の予後および心室遅延電位発生におけるACE遺伝子多型の意義について検討した。[方法]白血球よりDNAを採取し、Polymerase chain reaction (PCR)法でACE遺伝子多型を判定した。加算心電図で心室遅延電位の有無を判定した。また、手紙によるアンケート調査を行った。初回梗塞後の心事件[(再梗塞、心不全、経皮的冠動脈形成術(PTCA)、冠動脈バイパス術(CABG)、心臓死)]とACE遺伝子多型との関連についてKaplan-Meier法で解析した。[結果]1)心筋梗塞症例のACE遺伝子多型の頻度は、II型53例(26%)、ID型79例(39%)、DD型73例(35%) (I-allele 0.45、D-allele 0.55)であり、健常群に比べD-alleleの頻度が高かった(p<0.05)。2)心室遅延電位陽性例は、ACE遺伝子多型DD型で多かった。3)心臓死の頻度は、II型1例、ID型2例、DD型2例で、ACE遺伝子多型間で差はなかった。Kaplan-Meier法による解析でみると、ACE遺伝子多型DD型では、初回梗塞後の再梗塞・心不全・PTCA・CABGなどの心事件が多い傾向にあった。[考察]

ACE遺伝子多型DD型は、心筋梗塞症の発症と予後に関わる新しい因子となりうると考えられた。[目的]本研究は分子生物学的手法でアンジオテンシンI変換酵素(ACE)遺伝子多型を解析し、虚血性心疾患者での発症と二次予防に関わる意義と考案するものである.平成8年度は、引き続き、健常コントロールと心筋梗塞症例を対象に、心室遅延電位を指標として左室再構築過程(リモデリング)および初回心筋梗塞の予後におけるACE遺伝子多型の意義について検討した.[方法]白血球よりDNAを採取し、PCR法でACE遺伝子多型を判定した.加算心電図で心室遅延電位の有無を判定した.又、手紙によるアンケート調査を行い、初回梗塞後の心事件および心室遅延電位の有無とACE遺伝子多型との関連についてKaplan-Meier法で解析した.[考案]ACE遺伝子DD型は、初回梗塞後の心事件の発生および左室リモデリングに関わる新しい因子となりうると考えられた.
メガネザルの系統的位置に関する分子細胞遺伝学的研究

メガネザルはインドネシアとフィリピンに分布する小型で極めて特異的な原猿である。メガネザルの系統的位置づけは形態学的研究では決め手がない。そこで分子生物学的研究が必要である。本研究では、新しい分子細胞遺伝学的手法を用いて染色体レベルでの研究を行い、次のような研究成果を得た。(1)インドネシアに生息するニシメガネザル(T.bancanus)雄の血液細胞の培養により、複製バンド染色体標本を作製し、ニシメガネザルの染色体模式図を作成した。(2)腎臓細胞の初代培養から2年間継代を続け、増殖を続ける細胞系(Tm)を得た。染色体構成は80-120で、3倍体とおもわれる細胞が占める割合が多い。(3)ヒト各染色体特異的ペインティング・プローブを用いて、Zoo-FISH法によりヒトの各染色体に対応する染色体を特定した。ヒトのX染色体ペインティング・プローブによりメガネザルのX染色体全体がペイントされ、この染色体の保存性が確認できた。(4)ヒトやマウスの新規遺伝子のcDNAの位置を決定し、これらのプローブを用いてメガネザル染色体上に相同遺伝子の位置を探索した。また、Y染色体の長腕部分にヒトY染色体の特異的反復配列(DYZ1)とは異なる種類の多量の反復配列が存在することがわかった。(5)腎細胞より抽出したDNAを使用し、ラムダファージベクターに組み換え挿入したライブラリーを作製した。今後のDNAレベルでの解析に有用である。メガネザルはインドネシアとフィリピンに分布する小型で極めて特異的な原始的サル(原猿)である。形態的には多くの点で他の原猿と真猿類との中間的存在であるとの説が提唱されている。メガネザルの染色体数は80もあり、霊長類の中でも最高の値を示す。本研究では、この種の染色体学的な特徴をとらえ、ヒトや他のサルとの染色体での対応を明らかにすることを通して、その系統的位置関係を明らかにすることを目的にする。本年度は、1996年8月にインドネシア・ボゴールの霊長類研究センターとの共同研究により得た、ニシメガネザル(Tarsius bancanus)血液培養による染色体標本の分析ならびに、腎臓と肺よりえた培養細胞を用いた染色体標本の新たな作製を行った。ブロモデオキシウリジン(BrdU)を培養液に添加し、染色体上に特徴的複製バンドパターンを呈させて、核型の標準化をまず行った。次いで、性染色体に注目し、ヒトX染色体特異的DNAライブラリーをプローブとした蛍光In situ hybridization(FISH)を行った。これにより、X染色体の進化的保存性が明らかにされた。一方、Y染色体は特徴的な形態を示し、大きな後期複製の部分をもつことがわかった。このY染色体の特異性は予期外のものであったので、その反復配列の特徴を調べることとした。ヒトのY染色体に存在するDYZ1という反復配列をプローブとしてFISHを行ったところ、全く異なったクラスの反復配列であることが判明した。このように種特異的に進化した塩基配列を分析することにより、この種の系統的位置が明かにされることが期待される。メガネザル(Tarsius)の系統的位置ならびに分類に関しては、長い間定説がなく現在でも議論の的である。メガネザルの形態に関する見解は多様であるため、その系統的位置付けには分子生物学的研究が鍵となる。本研究では、分子細胞遺伝学的な方法を用いたメガネザル染色体の研究を行った。メガネザルは染色体数が80もあり、霊長類の中で最高の値を示す。そこでまず染色体構成を調べる基礎となるバンドパターンを明らかにし、次いでヒトの染色体特異的ペインティング・プローブを用いて染色体の種間でのおおよその相同関係(シンテニー)を調べた。また、遺伝子レベルでの染色体座の他の霊長類との対応を明確にするため、比較マッピングを行った。

すなわち、ヒトやマウスにおいてcDNAクローン多数につき染色体上の位置を決め、そのうちの保存的とおもわれるものについてメガネザルについても比較マッピングを行った。これらの研究の結果、以下のことがわかった。(1)インドネシアのニシメガネザル(T.bancanus)の血液リンパ球培養により、複製バンドパターンを明らかにした。ただし、形態的に類似した小型染色体群(第33-39番染色体)についての識別は困難であった。(2)Y染色体は大型で、後期複製の反復配列DNAの大きな領域があり、この部分はヒトのY染色体の反復配列(DYZ1)とのホモロジーはなかった。(3)培養細胞からDNAを抽出し、ゲノムDNAライブラリーを作製した。(4)染色体ペインティングにより、フィリピン・メガネザル(T.Syrichta)との染色体レベルでの高度の類似性が示唆される結果をえた。現在、メガネザルは3種に分けられているが、これらを一種3亜種とする可能性を示唆する結果である。
島皮質-扁桃体間の神経ネットワークの電気生理学的解析

ラット島皮質の前方部は味覚、後方部は自律機能に関する中枢と考えられている。これまでに我々は電気生理学的研究により島皮質後方部に舌後方部や咽頭・口頭領域からの化学感覚情報、動脈圧受容器及び化学受容器からの内臓感覚情報、更に、tail pinch等による痛覚情報が入力することを明らかにした。本補助金では多種の感覚情報が入力する島皮質後方部の神経回路の詳細を明らかする事を目的としている。平成12年度において、脳の前方一後方軸で、bregmaから1-4mm後方の様々な深さの脳部位を電気刺激し、島皮質ニューロンの順行性及び逆行性活動電位を電気生理学的方法により細胞外記録した。視床網様核や内包の電気刺激に逆行性にあるいは順行性に応答する島皮質ニューロンが見い出された。このことは、視覚や聴覚等で考えられていると同様に、島皮質・後方部に入力する感覚情報も視床網様核により調節されている可能性を示している。平成13年度では扁桃体と島皮質後方部の神経連絡について調べた。島皮質後方部から扁桃体へ直接連絡するニューロンは実験例数が少なく、今のところ同定されていない。しかし、シナプスを介した間接酌な入力による島皮質後方部ニューロン活動に対して上喉頭神経と扁桃体の電気刺激間の干渉効果が見られた先行する上喉頭神経刺激(あるいは、扁桃体刺激)が後続する扁桃体刺激(あるいは上喉頭神経刺激)による応答を抑制した。この抑制が10分近く続く場合も見られた。扁桃体と島皮質は情動および記憶に関係すると考えらている。両刺激間の干渉効果がこれらの機能に関連しているのか更に研究を進めている。前方部と後方部の明確な解剖学的境界線は明らかでないが、味の感覚に最も重要な働きを示す鼓索神経が投射する島皮質の前方部を味覚野と定義し、それより後方部を島皮質後方部と便宜的に定義することができる。これまでの我々の電気生理学的研究から島皮質後方部は舌後方部や口腔後方部からの味覚やその他の感覚情報を伝える舌咽神経や上喉頭神経が投射すること、又動脈圧受容器及び化学受容器刺激などの内臓感覚刺激にも応答を示し、更に、tail pinch等の痛覚刺激にも応答するmuliti-modalなニューロンが多数見られる。このように島皮質後方部に多種の感覚情報が入力することが明らかとなったが、島皮質後方部の機能及びその神経回路の詳細は明らかでない。島皮質への入力系及び出力系については神経解剖学的研究により、視床、視床下部、橋、弧束核、分界条床核、辺縁下皮質、扁桃体など多数の部位が報告されている。我々は島皮質後方部の神経回路を電気生理学的に明らかにすることを目的としている。平成12年度において、脳の前方-後方軸で、bregmaから1-4mm後方の様々な深さの脳部位を電気刺激し、島皮質ニューロンの順行性及び逆行性活動電位を電気生理学的に細胞外記録した。視床網様核や内包の電気刺激に逆行性にあるいは順行性に応答する島皮質ニューロンが多数みられ、これらの部位を経由する島皮質後方部への入力あるいは島皮質後方部からの出力があることが示された。

平成12年度において、脳の前方-後方軸で、bregmaから1-4mm後方の様々な深さの脳部位を電気刺激し、島皮質ニューロンの順行性及び逆行性活動電位を電気生理学的方法により細胞外記録した。視床網様核や内包の電気刺激に逆行性にあるいは順行性に応答する島皮質ニューロンが見い出された。このことは、視覚や聴覚等で考えられていると同様に、島皮質後方部に入力する感覚情報も視床網様核により調節されている可能性を示している。平成13年度では扁桃体と島皮質後方部の神経連絡について調べた。島皮質後方部から扁桃体へ直接連絡するニューロンは実験例数が少なく、今のところ同定されていない。しかし、シナプスを介した間接的な入力による島皮質後方部ニューロン活動に対して上喉頭神経と扁桃体の電気刺激間の干渉効果が見られた:先行する上喉頭神経刺激(あるいは扁桃体刺激)が後続する扁桃体刺激(あるいは上喉頭神経刺激)による応答を抑制した。この抑制が10分近く続く場合も見られた。扁桃体と島皮質は情動および記憶に関係すると考えらている。両刺激間の干渉効果がこれらの機能に関連しているのか更に研究を進めている。
魚鱗の再生と両生類変態期の後肢形成を骨形成モデルとしたメラトニンの制御機構の解明

多くの硬組織には、約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が知られているが、その日周輪形成の制御機構を明らかにした研究は無い。そこで、キンギョの再生鱗に1日1本ずつできる隆起線(成長線)の形成と時計遺伝子や破骨細胞・骨芽細胞関連遺伝子の発現がどのように関連しているのかを明らかにするための実験を行った。その結果、時計遺伝子であるper3, bmal1,clock, cry1a遺伝子の発現に明瞭な日周リズムを観察するとともに、骨芽細胞遺伝子のdlx5とtypeIcollagen遺伝子や破骨細胞遺伝子のCath K, mmp9の発現も時計遺伝子と関連した日周リズムを示していた。本研究は、骨形成の2大様式である「膜性骨化」と「軟骨性骨化」に対するメラトニンによる制御機構を解明するものである。昨年度は、キンギョの再生鱗を「膜性骨化」のモデルとして用いて、概日時計による制御機構を明らかにするための実験を行った。本年度は、変態期両生類幼生の後肢(骨)形成を「軟骨性骨化」のモデルとして用い、その形成過程の詳細を調べるとともに、メラトニンによる制御機構を明らかにすることを目的とした基礎実験を行った。まず、ウシガエルおよびアフリカツメガル幼生の後肢形成に伴う骨形成過程を、透明標本と組織切片を作製して観察した。次いで、ウシガエル幼生後肢(骨)における、メラトニン受容体(Mel1b)のmRNA発現ならびに骨芽細胞のマーカーであるOsteocalcinのmRNA発現をReal-Time PCR法を用いて検討した。透明標本と組織切片を観察した結果、両生類幼生の後肢は、前変態期ではほぼ全てが軟骨よりなり、変態始動期の初期から骨化が進んでいくことが明らかとなった。ウシガエル幼生後肢(骨)におけるメラトニン受容体(Mel1b)mRNAの発現は、前変態期では高く、変態始動期の初期に低くなり始め、その後のステージでは発現は低いままであった。一方、骨芽細胞のマーカーであるOsteocalcinのmRNA発現は、前変態期から変態始動期の前半までは低く、変態始動期の後半から変態最盛期にかけて高くなっていた。この結果は、組織標本の結果を支持するものであった。以上の結果より、メラトニンは、骨芽細胞だけでなく軟骨細胞も制御している可能性が示された。本研究は、骨形成の2大様式である「膜性骨化」と「軟骨性骨化」に対するメラトニンと時計遺伝子による制御機構を解明するものである。本年度は、「膜性骨化」に対する概日時計による制御機構を明らかにするための実験を行った。これまでの研究において、12時間明:12時間暗の24時間周期や恒明条件下においては、再生鱗に存在する隆起線(成長線)は、1日に1本ずつ外側に形成されることを明らかにしており、またその時、少なくとも再生鱗のper-3の遺伝子発現に明瞭な概日リズムを観察している。そこで、本年度は、再生鱗における概日リズムに関与する時計遺伝子として、per13と骨芽細胞関連遺伝子(dlx5、typeIcollagen、osteocalcin、ALP)の発現リズムをリアルタイムPCRで調べた。再生14日目においては、時計遺伝子のper3と骨芽細胞関連遺伝子のdlx5、typeIcollagenの発現が明瞭な概日リズムを示した。次に、10L10D(20時間周期)と14L14D(28時間周期)の24時間以外の日周期で飼育した時の隆起線形成状態を観察した。その結果、20時間及び28時間周期に同調した個体の隆起線の本数は、24時間周期の本数と比較すると、20時間周期では約2本多く、28時間周期では約1本少ないことが明らかとなった。また、一部を切除した鱗を自家移植し、切除された部分に形成される再生鱗を観察すると、通常形成される再生鱗の構造と同じ、中央部では亀甲様構造が、端では隆起線が再生されることが明らかとなった。これらの結果は、時計遺伝子per3と骨芽細胞関連遺伝子のdlx5、typeIcollagenが隆起線形成の日周性を制御している可能性を示すものである。本研究は、骨形成の2大様式である「膜性骨化」と「軟骨性骨化」に対する時計遺伝子とメラトニンによる制御機構を解明するものである。本年度は、初年度からの継続課題である「膜性骨化」に対する概日時計による制御機構を明らかにするための実験を行った。これまでの研究において、12時間明:12時間暗の24時間周期や恒明条件下においては、再生鱗にできる隆起線(成長線)は、1日に1本ずつ外側に形成されることを明らかにした。また本科研費の初年度には、少なくともper3時計遺伝子の発現に明瞭な日周リズムを観察するとともに、骨芽細胞遺伝子のdlx5とtypeIcollagen遺伝子の発現にも日周リズムを認めた。そこで本年度は、再生鱗形成の日周性に関与する時計遺伝子として、per遺伝子以外に、bmal1,clock,cry,Npas2の各時計遺伝子の発現リズムを調べるとともに、隆起線形成には破骨細胞の関与も考えられるため、破骨細胞遺伝子として、cathepsin K (Cath K)の発現リズムをリアルタイムPCR法で調べた。再生14日目から15日目においては、時計遺伝子のbmal1,clock,cry1aと破骨細胞遺伝子のCath Kの発現に明瞭な日周リズムが認められた。

Cosinor法により周期解析をした結果、各時計遺伝子の発現周期はbmal1:23.1+1.2時間、clock:23.9+1.9時間、per3:24.2+0.3時間、cry1a:24.9+2.3時間であったが、Npas2については18.9時間と周期が短かった。今回の結果は、4種類の時計遺伝子と少なくとも破骨細胞遺伝子の1つであるCath K遺伝子が隆起線形成の日周性に関与している可能性を示すものである。本研究は、骨形成の2大様式である「膜性骨化」と「軟骨性骨化」に対する時計遺伝子とメラトニンによる制御機構を解明するものである。本年度は、昨年度にやり残した「膜性骨化」に対する概日時計による制御機構を明らかにするための実験を行った。これまで本研究において、まず、12時間明:12時間暗の24時間周期や恒明条件下においては、再生鱗にできる隆起線(成長線)が、1日に1本ずつ外側に形成されことを明らかにした。次いで、時計遺伝子であるper3, bmal1,clock, cry1a遺伝子の発現に明瞭な日周リズムを観察するとともに、骨芽細胞遺伝子のdlx5とtypeIcollagen遺伝子の発現にも日周リズムを認めた。そこで本年度は、再生鱗の隆起線形成に関わると考えられる破骨細胞の関与に関して検討を行った。再生14日目から15日目において、破骨細胞遺伝子として、cathepsin K (Cath K), mmp9の発現リズムをリアルタイムPCR法で調べた。また、Cath Kの活性染色を行い、再生鱗のどの部位の細胞で強く発現しているかを調べた。その結果、時計遺伝子であり、かつ転写調節因子でもあるbmal1,clockと破骨細胞遺伝子のCath K, mmp9の発現に明瞭な関連性と日周リズムが認められた。また、Cath Kの活性染色では、再生鱗の最外層の23層の細胞層にのみ陽性像が認められた。以上のことから、再生鱗の隆起線(成長線)形成は、時計遺伝子によって制御された骨芽細胞と破骨細胞の遺伝子発現の日周変動が関与している可能性が高いこと、また、特に最外層に近い場所において、骨芽細胞と破骨細胞の活性が高いことから、骨芽細胞によって形成されたI型コラーゲン層を層状に並んだ破骨細胞が吸収(破壊)することで形成されている可能性が示された。多くの硬組織には、約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が知られているが、その日周輪形成の制御機構を明らかにした研究は無い。そこで、キンギョの再生鱗に1日1本ずつできる隆起線(成長線)の形成と時計遺伝子や破骨細胞・骨芽細胞関連遺伝子の発現がどのように関連しているのかを明らかにするための実験を行った。その結果、時計遺伝子であるper3, bmal1,clock, cry1a遺伝子の発現に明瞭な日周リズムを観察するとともに、骨芽細胞遺伝子のdlx5とtypeIcollagen遺伝子や破骨細胞遺伝子のCath K, mmp9の発現も時計遺伝子と関連した日周リズムを示していた。本年度の目標の一つである再生鱗形成の日周性に関与する時計遺伝子を同定することは、ほぼ達成できた。一方、隆起線形成に破骨細胞が関与する可能性と破骨細胞遺伝子と時計遺伝子との関係を調べる研究は、まだ初期段階で止まっている。また、20時間周期や28時間周期のように24時間以外の日周期で飼育した時の隆起線形成に関わる遺伝子群の同定に関しても、各個体のアクトグラムを取る方法を導入することにより、同調した個体だけを選ぶことができるようになったが、さらなる克服すべき実験手技上の問題点が浮上してきた。
負の情動における他者存在効果に関する社会神経科学的研究

昨年度までに実施した研究1・2・3ではそれぞれ、見知らぬ他者の存在(実験参加者が情動喚起画像注視課題を遂行中に見知らぬ他者が隣にいる/いない状況での比較)・他者との経験の共有(実験参加者と他者が同じ/異なる課題を遂行する状況での比較)・他者存在の視覚的認知(実験参加者と同じ部屋にいる他者を、実験参加者が見ることができる/できない状況での比較)・他者の親近性(実験参加者と他者が親しい/親しくない状況での比較)に焦点を当てて行われた。その結果、研究1で観察されたLPPに対する他者存在の影響が研究2・3では観察されず、研究間で一貫した結果が得られなかった。そこで本年度は、実験刺激や条件設定を見直すと共に、脳波データ解析方法の再検討に取り組んだ。上記の研究に加えて、新たな側面から本研究課題にアプローチし、他者存在と個人の心的プロセスに関する研究も実施した。具体的には、複数の他者から仲間外れにされる社会的排斥場面における、被排斥者の脳内処理を検討した。社会的排斥は、社会的動物である人間にとって大きな脅威であり、負の状況である。その際、被排斥者が排斥を示すシグナルをどのように処理するかについて、ERP成分のP300などを中心に検討した。本研究の目的は、他者の存在が負の情動抑制に与える影響を明らかにすることである。具体的には、事象関連脳電位のLPP成分を用いて情動生成と制御プロセスを個別に検討し、他者との経験共有、他者存在の視覚的認知、そして他者との心的距離といった社会的文脈要素との関わりも検討する。平成28年度は、研究計画書に示した通り研究1を実施した。研究1は、社会的文脈効果を出来る限り排除したミニマムな社会的状況において他者の存在が情動生成と制御に及ぼす影響を明らかにするため、実験参加者にとって見知らぬ他者が参加者との相互作用を一切持たずに隣に存在する場面を設定した。北海道大学の学部生が参加し、国際情動刺激セット(IAPS:International Affective Picture System)から選別した不快画像(怪我人や暴力場面など)および中立画像(タオルや人の真顔)を提示する画像注視課題を遂行した。実験条件は、実験参加者が単独で課題を行う単独条件と、見知らぬ他者と隣合わせに座り、2人で画像を見る他者条件を設定した。画像刺激と条件を組み合わせた4試行タイプに対して生じるLPPを検討した結果、情動生成を反映するLPP頂点振幅は中立刺激よりも不快刺激に対して有意に大きかったが、条件の差は見られなかった。一方、情動制御を反映するLPPの減衰は、単独条件と比較して他者条件で促進された。本研究の結果から、見知らぬ他者の存在が情動生成ではなく制御に影響を与えることが示された。当初の計画通り実験を実施し、他者存在の効果が情動制御に影響を与えるという結果を得ることができた。また得られた知見は国際学会で発表し、現在論文としてまとめている。よってこのように判断した。本研究の目的は、脳内情動処理を反映する事象関連脳電位成分のLPP(Late Positive Potential)を用いて、他者存在が負の情動処理へ与える影響を明らかにすることである。昨年度に実施した研究1では、見知らぬ他者の存在が個人の情動制御を促進させることを明らかにした。平成29年度は、研究1で得られた他者存在の効果について、背景にある社会的文脈要素が情動制御プロセスにどのように作用するかを明らかにするため、経験の共有(同じ課題を遂行するか否か)・他者存在の視覚的認知(同じ場に存在する他者を視認できるか否か)・親近性(見知らぬ他者か親しい他者か)の3要素に焦点をあてた研究2および研究3を開始した。研究2は、見知らぬ他者との課題の一致性および他者存在の視覚的認知に関する検討を行った。その結果、不快画像に対する主観的評価には他者存在および課題一致性の効果が見られたが、事象関連脳電位のLPP成分による情動制御プロセスには有意な効果が見られなかった。研究3では親しい他者との課題の一致性および他者存在の視覚的認知に関する検討を行ったが、研究2と同様に他者存在の効果は見られなかった。研究2および研究3を実施した結果、研究1で得られた効果が追試できなかったため、実験パラダイムの見直しと脳波データ解析方法の再検討が必要である。そのため、研究期間を延長し、刺激の選別や条件設定を見直すと共に、脳波データは事象関連脳電位だけでなく周波数解析などを実施する予定である。研究2および研究3の実施により、研究1で得られた知見を追試することができなかったため、その原因特定と実験デザインおよび脳波データ解析方法の改善が必要となる。

上記の研究に加えて、新たな側面から本研究課題にアプローチし、他者存在と個人の心的プロセスに関する研究も実施した。具体的には、複数の他者から仲間外れにされる社会的排斥場面における、被排斥者の脳内処理を検討した。社会的排斥は、社会的動物である人間にとって大きな脅威であり、負の状況である。その際、被排斥者が排斥を示すシグナルをどのように処理するかについて、ERP成分のP300などを中心に検討した。計画通り、研究2および3を実施する。研究2では、見知らぬ他者との課題の一致性および他者存在の視覚的認知に関する検討を行う。また研究3では、親しい他者との課題の一致姓および他者存在の視覚的認知について検討する。さらに、研究1で得られた成果を論文として発表する。研究期間を延長し、実験デザインおよび脳波データの解析方法を再検討する。具体的には、刺激の選別や条件設定を見直し、脳波データは事象関連脳電位だけでなく周波数解析などを実施する予定である。研究代表者の妊娠・出産のため、予定していた海外開催の国際学会への参加ができなかったため、次年度使用額が生じた。研究2および研究3において、研究1で得られた知見を追試することができなかったため、研究期間を延長した。次年度は、実験デザインや脳波データの解析方法を再検討し、改めて研究2及び研究3を実施する予定である。未使用額は、実験実施にかかる費用(準備、実施および解析)や学会発表旅費、論文の英文校閲に充てる予定である。
内分泌撹乱物質による生殖毒性発現機構の解明

胎児への胎生期暴露により生殖器の発生異常、生殖能力の低下等の影響及ぼす可能性のある内分泌攪乱化学物質として、工業製品などに使用されている人工化学物質の他に、一連の天然化学物質が指摘されている。その代表的な物質が植物エストロゲンである。本研究においては、食品中に含まれる植物エストロゲンの内分泌攪乱作用を予測するための基礎的な知見を得ることを目的として、種々の動物細胞および酵母を用いたエストロゲン転写活性測定系における、植物エストロゲンのエストロゲン活性の検索を試み、さらに内在性のエストロゲンとの間の相互作用に関して検討を加えた。その結果(1)ブドウ果皮等に含まれる植物エストロゲンであるレスベラトロールはMCF-7細胞ではエストラジオールの場合よりも高い最大活性を示す「スーパーアゴニスト」である一方、他の細胞では部分的なアゴニスト活性しか示さず、またエストロゲンとの相互作用についても、用いた測定系によって異なった挙動が観察された。それに対して(2)柑橘類に含まれる植物エストロゲンであるナリンゲニンは用いたどの測定系においても、エストロゲンとの間に相加作用が観察された。(3)ビールの原料であるホップおよび市販のハーブティーの抽出液について、エストロゲン活性を示す植物エストロゲンを含む成分の検索を試み、ホップおよびカンゾウにエストロゲン活性を示す成分が含まれることが示された。これらの結果から、植物エストロゲンのエストロゲン活性およびエストロゲンとの相互作用は、用いた測定系の様々な条件によって異なった挙動を示す場合があることが明らかになった。今後は、従来の測定系によるin vitroでの植物エストロゲンの活性測定の問題点を克服した、新たな測定系の開発に取り組まねばならない。今年度は内分泌撹乱物質の作用機構についての基礎的知見を得るために、ヒトのエストロゲン受容体を発現させた酵母および動物細胞を用いた転写活性の測定系において、異なる挙動を示すことが報告されている天然化学物質等について、その原因解明への手掛かりを得るために、様々な検討を加えた。その結果1)ブドウ果皮等に含まれる天然化学物質であるレスベラトロールが、動物細胞においては10μMでエストラジオールと同等以上の最大活性を示すが、酵母においては100μMでもエストラジオールの20%程度の低い活性しか示さず、2)単独では全く活性が認められない低濃度において、エストラジオールの共存下では相加性以上の活性を示すことを見出した。さらに、3)ジエチルスチルベストロール(DES)の共存下でも同様に相加性以上の活性を示し、4)ビスフェノールAもレスベラトロールと同様に、DESの共存下で相加性以上の活性を示すことが明らかになった。しかしながら、5)酵母において観察された相加性以上の活性は、動物細胞においては認められなかった。これらの結果より、酵母において観察された相加性以上の活性は、動物細胞においては認められなかったことから、エストロゲン受容体そのものの普遍的性質によるのではなく、エストロゲン受容体を介した転写活性化に関る転写共役因子の種類および性質が、動物細胞と酵母の間で異なることに由来する可能性が示唆された。昨年度は、ヒトのエストロゲン受容体を発現させた酵母および動物細胞を用いた転写活性の測定系を用いて、エストロゲン様活性を示すことが報告されている天然化学物質等について様々な検討を加えた結果、ブドウ果皮等に含まれる天然化学物質であるレスベラトロールが、単独での活性およびエストラジオール共存下での相加性について、酵母と動物細胞においてでは、異なる挙動を示すことを見いだした。この現象はエストロゲン受容体そのものの普遍的性質によるのではなく、エストロゲン受容体を介した転写活性化に関る転写共役因子の種類および性質が、動物細胞と酵母の間で異なることに由来する可能性が示唆されたため、今年度は各種動物細胞を用いてさらに詳細な検討を加えた。

その結果、エストラジオール共存下でのレスベラトロールの挙動は動物細胞によって異なり、相加性を示すものとエストラジオールの活性を低下させるものが認められた。さらに、内分泌撹乱物質の作用機構についての解析を、より簡便に行うための手段として、分泌型アルカリ・フォスファターゼをレポーターに用いた転写活性の測定系の確立を試みた。従来より一般に用いられているルシフェラーゼをレポーターに用いた転写活性測定系に比べて、多数の検体の測定を容易に行うことが可能であった。一方、転写活性の連続的かつ経時的に追跡することを目的として、GFP(Green Fluorescence Protein)を組み込まれたレポーター遺伝子を動物細胞株に導入し、その染色体に組み込まれた細胞を選択・単離を試みた。これにより、ホルモン依存的なGFP発現の観察が可能な解析系の確立を目指している。今年度は植物エストロゲンの内分泌撹乱作用についての基礎的知見を得るために、1)ヒトのエストロゲン受容体を発現させた酵母および動物細胞を用いた転写活性の測定系を使用し、種々の植物抽出液のエストロゲン活性を検索した。さらに、2)エストロゲン様の作用を示したものについて、そこに含まれる天然化学物賀とエストロゲンとの相互作用の有無およびその作用機構について種々の検討を加えた。その結果、1)酵母を用いた転写活性の測定系における植物エストロゲンのエストロゲン活性には(1)エストラジオールと同等の最大活性を示すもの(ホップ等に含まれるナリンゲニン)、(2)エストラジオールの50%程度の最大活性を示すもの(カンゾウ抽出液)、(3)エストラジオールの10%程度の低い活性を示すもの(ブドウ果皮等に含まれるレスベラトロール)に大別され、(3)については動物細胞を用いた転写活性の測定系ではエストラジオールと同等以上の最大活性を示した。2)エストロゲンとの相互作用についても、酵母および動物細胞においての相加性の有無に差異が認められた。これらの結果より、酵母と動物細胞を用いた転写活性の測定系において認められた、エストロゲン活性およびエストロゲンとの相互作用に関する差異は、エストロゲン受容体そのものの普遍的性質によるのではなく、エストロゲン受容体を介した転写活性化に関る転写共役因子の種類および性質が、動物細胞と酵母の間で異なることに由来する可能性が示唆された。さらに、動物細胞を用いた転写活性の測定系として、新たにGFP(Green Fluorescent Protein)をエストロゲン依存的に発現する動物細胞株を作製し、上記の項目について詳細な検討を加えた。今年度は、日本人の日常生活において食事を通して摂取している植物エストロゲンの内分泌撹乱作用についての基礎的知見を得るために、ヒトのエストロゲン受容体を発現させた酵母および動物細胞を用いた転写活性の測定系を使用し、各種飲料およびその原料の抽出液のエストロゲン活性を検索した。その結果、1)酵母を用いた転写活性測定系で、市販の15種類のハーブ・ティー・ミックスから調製した抽出液のエストロゲン活性を測定したところ、4種類のハーブ・ティー・ミックス抽出液のみがエストラジオールの10%程度の最大活性を示し、それ以外のものは全くエストロゲン活性が認められなかった。