hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二成分系を介したイネ花芽形成信号情報伝達経路の解明

我々は、新規なイネ花芽形成関連遺伝子Ehd1遺伝子を単離し、二成分系信号伝達系で働くと考えられるBタイプレスポンスレギュレータ(B-RR)をコードしていることを明らかとした(Doi et al.,2004)。イネとシロイヌナズナのゲノム上にあるすべてのB-RRを使い、系統樹を作成したところ、Ehd1はイネに特異的なB-RRで、シロイヌナズナには対応する遺伝子が存在しないことが明らかとなった。また、Ehd1遺伝子は進化上保存された花芽形成調節キー遺伝子であるHd1が欠損した遺伝背景であるT65でも機能することを証明した。これらのことから、イネにはシロイヌナズナにはない光周性花芽形成経路が存在することが示唆された。さらに、これまでに同定された花芽形成関連遺伝子の発現を解析し、マイクロアレイ解析も行い、Ehd1の下流で働く遺伝子を約20個、同定した。その中には花芽形成に関与すると考えられるFT相同遺伝子が4つ、MIKCタイプのMADSbox遺伝子が3つ、含まれていた。加えて、機能的なHd1により、短日条件でのEhd1の発現が部分的にではあるが、正に制御され、逆に、長日条件では負に制御されることが明らかとなり、Ehd1遺伝子はHd1の下流に存在し、Hd1以外の経路とHd1経路の両方の信号を受けて発現することが示された。また、フィトクロム系によって、短日、長日共に、発現抑制をうけ、赤色光下ではEhd1が発現しないことや、さらに、イネの開花を促進する能力のある青色光下でEhd1の発現が誘導され、Ehd1を介して、青色光が、花芽形成スイッチ遺伝子であるHd3aを誘導することも明らかにした。本研究では、BタイプのレスポンスレギュレーターであるEhd1遺伝子を含む、花成関連二成分信号伝達系の全貌を明らかとし、短日植物イネの花成に関する新規な情報の流れの解明を研究目的としている。1.Ehd1の各ドメインを欠失したタンパク質を過剰発現するイネ形質転換体を作成し、その開花への影響を短日条件・長日条件で確認した。Ehd1全長を過剰に発現する形質転換体当代は短日条件下で極端な早咲きを示した。また、レシーバードメインを欠失したタンパク質の過剰発現体(IGR-ox)も短日条件下で形質転換体当代が早生となった。その他の一部ドメインを欠くコンストラクトは、顕著な早咲きを示す個体はなく、むしろ、遅咲きの傾向が確認できた。この結果より、Ehd1遺伝子のレシーバードメインは花芽促進には必須ではなく、Ehd1がもつ花芽促進能を調節する機能を有すると考えられる。IGR-oxの後代を短日条件、長日条件で生育したところ、短日条件では期待通り、早咲きを確認したが、長日条件では確認できなかった。このことは、長日条件ではEhd1の花芽形成促進機能が働かないことを示している。2.T65と機能型Ehd1遺伝子をT65に導入した1-16系統で、マイクロアレイ解析を行い、Ehd1遺伝子の下流の遺伝子の同定を試みた。22Kのマイクロアレイを用いて、約30個の候補クローンを得、RT-PCRにより、Ehd1による発現への影響を確認した。その結果、12の遺伝子がEhd1により、誘導され、5の遺伝子が抑制されることが明らかになった。誘導される遺伝子の中に、花芽形成に関連のあるMADSbox遺伝子が二つあったので、残りの花芽形成関連MADS遺伝子に関しても、マイクロアレイ、RT-PCRで確認したところ、Ehd1により誘導がかかるMADSbox遺伝子を3つ同定した。3.イネも青色光による花芽形成促進効果があるので、赤色光、青色光の効果をEhd1遺伝子やFT相同遺伝子の発現を指標に解析した。その結果、Ehd1遺伝子はHd1欠損バックグランドで青色で誘導されることが明らかとなった。この結果は、イネに特異的な青色を介した花芽促進が存在することを示唆している。

加えて、機能的なHd1により、短日条件でのEhd1の発現が部分的にではあるが、正に制御され、逆に、長日条件では負に制御されることが明らかとなり、Ehd1遺伝子はHd1の下流に存在し、Hd1以外の経路とHd1経路の両方の信号を受けて発現することが示された。また、フィトクロム系によって、短日、長日共に、発現抑制をうけ、赤色光下ではEhd1が発現しないことや、さらに、イネの開花を促進する能力のある青色光下でEhd1の発現が誘導され、Ehd1を介して、青色光が、花芽形成スイッチ遺伝子であるHd3aを誘導することも明らかにした。
Bcl-2ホモロジードメイン3(BH3)を介したアポトーシス制御に関わる細胞性因子の同定とその機能解析

アポトーシスにおける中心的な制御因子であるBcl-2ファミリー蛋白質によるアポトーシス誘導の分子機構を明らかにするため、アポトーシス誘導に重要とされるBH3(Bcl-2 Homology)ドメインに相互作用する細胞性因子の探索を行った。方法としては、BH3を含む最小のアポトーシス誘導性Bcl-2ファミリー蛋白質であるHrkをbaitとし、yeast two-hybrid法によりヒト胎盤cDNAライブラリーのスクリーニングを行った。スクリーニングによって得られた陽性クローンに対しさらにHrkに対する特異性の検討を行った結果、in vivoにおいてHrkに結合していると考えられるcDNAクローン8種類を得た。次にこれらcDNAクローンについてin vitroでのHrkとの特異的相互作用について調べたところ、少なくとも1つのcDNAクローンがin vitroにおいてもHrkと特異的に結合していることが明らかとなった。このクローンがコードする蛋白質はp32と呼ばれHrkと同様にミトコンドリアに局在する蛋白質であるが、その生理機能はいまだ解明されていない。最近このp32の構造が解かれ、3量体からなるドーナツ状のリングを形成していることが明らかとなり、ミトコンドリア内膜においてpermeability transition pore(PTP)と相互作用することによりアポトーシス制御に関わっている可能性が提唱されている。我々の結果はp32がHrkの直接の標的としてアポトーシス制御こ関わっている可能性を強く示唆するものであり、現在p32の種々の変異体を用いてHrk誘導アポトーシスにおけるp32の役割を検討している。BH3ドメインを介するアポトーシス制御の分子機構を理解する目的で、悪性神経膠腫(グリオーマ)細胞に対して強力なアポトーシス誘導能を発揮するMycファミリー蛋白質MycL2に存在しBH3様モチーフを有するアポトーシス増強ドメイン(DcathEnhancer/Augmention Domain:DEAD)に結合する細胞性因子のyeast two-hybrid systemによる単離、同定を試みた。MycL2のDEADをbaitとしてヒト胎盤由来のcDNAライブラリーをスクリーニングし、得られた陽性cDNAクローンのなかからあらためてtwo-hybridanalysisによりMycL2アポトーシス増強ドメインに特異的に結合するもの(真性陽性クローン)を選びだし、塩基配列を決定した。その結果真性陽性クローンは2種類の遺伝子に由来することが判明した。ひとつはRNAスプライシングを触媒するスプライソソームの構成成分であるSmD3であり、もうひとつは解糖系酵素であるトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)であった。それぞれについてin vitro bindingアッセイ,哺乳動物細胞を用いたcoimmunoprecipitationアッセイによってMycL2との結合を調べたところ、SmD3に関しては両アッセイにおいて結合が確認され、TPIはin vitroでの結合が確認された。SmD3はSMN(Spinal Muscular Atrophyの原因遺伝子産物)との結合を介して、また、TPIはポリグルタミン(ポリグルタミン性神経変性疾患の原因とされる)との結合を介して神経系細胞の細胞死の制御における役割が示唆されており、現在MycL2によるグリオーマ細胞の細胞死誘導にこれらの因子がどのように関わっているかを検討している。
同変有限性障害と代数的K-理論の研究

Gをコンパクトリー群、XをG-空間、Wa^G(X)を同変有限障害群とする。Siebenmannの示した積の拡張になっているWa^G(X)の上の積Wa^G(X)×Wa^G(X)→Wa^G(X)は一般には構成できず、各固定点集合が連結で、その基本群が可換群の場合には構成できる。これは、各固定点集合のシステムを実現する同変Hopf空間の積構造を用いて表わせる事を示した。Gが自明群で、連結空間Xの基本群が簡単な群の場合、この積は自明である事が知られているが、Gが一般の場合にどうであるかが問題であるが、まだその解決までは至っていない。
角膜血管新生におけるアンジオテンシン系の役割

本研究では角膜血管新生におけるレニンアンジオテンシン系の分子の発現をmRNAレベル、蛋白レベル、組織レベルで検討し、その関与を明らかにした。次にアンジオテンシンI型受容体のアンタゴニスト(ARB)をマウス角膜血管新生モデルに投与することにより、角膜血管新生、角膜炎症が抑制され、様々な血管新生促進因子や炎症性サイトカインの発現が減弱した。以上からARBは角膜血管新生という角膜の透明性を脅かす重篤な病態の新たな治療法になると考えられた。今年度は角膜血管新生の過程におけるアンギオテンシン糸(RAS)の関与を検討した。手術用顕微鏡下でマウスに10-0nylon糸を角膜実質内にかけることにより、角膜血管新生を誘導し、術後1,3,7日後の眼球から角膜を摘出した。摘出した角膜はからmRNAを抽出し、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシン受容体に対する特異的プライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、これらの分子は血管新生を誘導した角膜で正常角膜と比較してmRNAレベルでの発現が亢進していた。アンギオテンシン2、アンギオテンシン受容体に対する抗体を用いて摘出した角膜より蛋白成分を抽出したサンプルからウエスタンブロッティングを行い、蛋白レベルにおいてもこれらの分子が血管新生誘導角膜において発現が亢進していることを確認した。これら分子の発現の局在を確認するために、免疫組織染色を行ったところ、アンギオテンシン2、アンギオテンシン受容体ともに正常角膜にはほとんど発現を認めないものの、血管新生角膜においては、角膜上皮細胞や実質細胞に発現が認められた。これらの実質細胞は白血球マーカー(CD45)や血管内皮マーカー(CD31)との二重染色により、炎症細胞浸潤としての白血球と侵入した血管内皮細胞であることが示された。またこれらの現象はin situ PCRにおいても同様なパターンを示した。以上から炎症性角膜血管新生においてRASが関与していることが明かとなった。現在その機能解析を行っている。角膜感眼球最表層に位置する透明な組織であり良好な視力や視機能を維持するためには、角膜が無血管であることが必須条件である。しかしさまざまな刺激や侵襲によって病的な血管が角膜内へ侵入してしまうことがある。このような角膜血管新生では炎症、免疫が関与した病態であることが解明されつつあるが、現在までに完全に角膜血管新生を抑え込む治療法が存在せず、新たな視点での治療法開発が望まれている。今回我々は抗炎症作用を有する物質である、アンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)に注目した。近年レニンアンジオテンシン系(RAS)は局所で炎症性メディエーターとして様々な炎症過程に関与していることが報告されており、病的な炎症性血管新生との関連が示唆されている。そこで本研究では角膜血管新生おけるRASの関与とARBの効果について検討した。平成19年度ではマウス角膜血管新生モデルにおけるRASの発現を分子レベル(RT-PCR)、蛋白レベル(western blotting)、組織レベル(insitu PCR、免疫染色)で検討した。するとRASの最終産物であるアンジオテンシンIIやアンジオテンシンI型受容体の発現が角膜血管新生過程で上昇することを突き止めた。平成20年度ではARBと用いて角膜血管新生におけるRASの機能を検討した。平成19年度と同様マウスの角膜血管新生モデルにARBを全身投与すると、コントロール群に比べ、炎症細胞浸潤や炎症関連因子の発現、さらに血管新生が抑制された。これら一連の研究により、無血管透明組織である角膜においても炎症が生じた場合、角膜局所でRASが活性化し、過剰発現したRASの因子は血管新生促進、炎症促進として機能することが示された。さらにARBは角膜血管新生抑制に有効な薬剤である可能性を示唆し、今後の臨床応用が期待されると考えられた。
進行子宮頸癌に対する体外循環下活性炭吸着法併用・経皮的骨盤潅流高用量化学療法

FIGO臨床進行期III期以上の子宮頚癌の予後改善を目的として1995年より経皮的骨盤灌流化学療法(PPPEG : percutaneous pelvic perfusion with extracorporeal chemofiltration)の臨床応用を行ってきた。PPPECとは左右子宮動脈内カテーテルより通常の3-5倍の抗癌剤を投与し、子宮頚癌灌流後の高濃度の抗癌剤含有静脈血を下大静脈で分離し、体外活性炭吸着装置で抗癌剤を除去後、下大静脈に戻すとするもので、子宮頚癌への抗腫瘍効果を最大に、副障害は最小にしたシステムである。投与抗癌剤の80-90%のが除去され、吸着し得なかった10-20%の抗癌剤の副障害は軽微で概ねG2以下となる。術前化学療法として2週間隔で2回施行を原則とし、2回目施行後2週目で病期縮小(ダウンステージング)の効果判定を行い、主治療へ移行する。検討対象は23例で平均年齢:56.2歳、平均子宮頚部癌腫径:4.9cmであった。PPPEC2回目2週後での腫瘍縮小率は平均76%,奏効率は87%、組織学的奏効率は96%であった。ダウンステージングを認めたのは23例中19例であった。このうち18例が広汎子宮全摘術を受け、治癒切除率は89%であった。予後はPPPEC施行群の5年無病生存率は47%で、当科の過去の同様患者の単独放射線療法群の28%より改善した。PPPEC施行群の5年生存率は74%で、当科における同様の症例に対する単独放射線療法群の58%および他の姑息治療群の43%に比し改善を認めた。FIGO臨床進行期III期以上の進行子宮頚癌はすでに主病巣と転移巣を持つ全身疾患で、本法の高用量動注化学療法は主病巣に対する局所効果と吸着し得ない20%の抗癌剤の静脈循環による全身効果からくるdual targetingは本病態に対する癌化学療法の有用なコンセプトになると考えられる。根治的治療が不能な進行子宮頚癌患者において通常の3倍量のプラチナ系抗癌剤を標的腫瘍に動脈投与して腫瘍縮小を図り、根治治療が遂行可能な病期にダウンステージングを行う。この際、発生する致死的抗癌剤毒性は体外循環内の活性炭吸着器により浄化するが、この高用量抗癌剤投与サポートシステムが経皮的骨盤灌流化学療法(PPPEC : percutaneous pelvic perfusion with extracorporeal chemofiltration)である。本法では先ず、大腿静脈より挿入した3チャンネル・バルーンカテーテルで下大静脈を閉塞しつつ、別途、Seldinger法で上・下臀動脈を塞栓した後、左右子宮動脈より高用量CDDP:140-250mg/m^2と通常量のMMC, PEP,5-FUの投与を行う。1995年より現在までに23名の進行子宮頚癌症例に対し、本法を2週間隔で計2回施行しており、腫瘍縮小率は76.4%、奏効率は87.0%であった。有害反応は体外循環回路に於ける失血からくる貧血、シスプラチン毒性による嘔吐、クレアチニン上昇等を認めたが、概ね軽微であった。本法後の主治療は子宮頚癌根治術または放射線治療を施行し、現在のところ、5年生存率は72.1%と放射線単独療法の32.7%に比し有意な改善を認めている。

これらの成果に関しては現在、Gynecologic Oncologyに投稿中である。また、投与抗癌剤に関して高用量抗癌剤投与法の新しい在り方を計画中で、Imatinib(Gleevec)をCDDPのsensitizerとしたcombined regimenを検討で、そのための分子生物学的基礎研究の成果を平成16年4月の日本産科婦人科学会で発表予定である。一方、子宮頚癌発生と関連した子宮頚部HPV感染の状況、感染HPVのサブタイプと前癌病変の関連についても検討を行っている。さらに本法施行時の手技、使用機器稼働、主治療に関する全記録をDVD映画として編集した。体外循環下活性炭吸着法併用・経皮的骨盤灌流高用量化学療法(PPPEC)の臨床応用における基礎的課題は平成16年までに達成されたと考えられる。他方、PPPEC施行時使用の中心抗癌剤のシスプラチン耐性機序に対する分子生物学的な機序解明や本法施行後患者の癌再発阻止のための基礎研究に着手し、その研究成果は平成17年度の第57回日本産科婦人科学会学術集会において発表してきた(本山、濱名、丸尾)。今後は本法の一般的臨床稼動を見据えた必要機材の低価格化や調達製の容易性等の検討も必要かと考えられる。
ブロッキング型及びアンチブロッキング型整数多面体の類似性についての研究

1:Cornuejols, Guenin and Margotの予想を解くためのスキームを提示し、Cornuejols,Guenin and TuncelのOpen Problemの類似を証明した。当該論文は、Springer monograph(Indean Statistical Institute Series)として出版予定である。2:コードダイアグラムの展開式を用いてTutte polynomialの(x,y)=(2,-1)における値の組合せ論的意味付けを与えた。3:グラフにおける新しいパラメータである安全数を定義し、その様々なグラフ理論的性質および計算量的評価について明らかにした。研究費が採択されて後、国際論文誌に関連業績が毎年コンスタントに国際論文誌に掲載され、当該研究業績について、日本数学会の招待講演を行うなど、実績を積み重ねている。さらに、今後に成果として進展するであろう結果も、それぞれの研究区分について得られている。まず、Grinsteadの予想については、篠原氏との共同研究により、これまでの複数の結果を包含する一般化が得られ、目下論文を執筆中である。Conforti and Cornuejolsの予想に関しては、等価な予想の言い換え、およびそれを包含する強い形の予想が得られた。目下この結果を下に、今後のさらなる研究を進めようとしている。毎年コンスタントに2本以上の査読付き学術論文が出版され、2016年3月には日本数学会年会、本年1月には数理最適化に関する国際会議において招待講演を行なっている。更に、現在も複数の論文を国際論文誌と組合せ論に関するトップ国際会議に投稿中である。また、現在取り組んでいる予想の一つであるConforti and Cornuejols's conjectureに関して、この予想と等価な新しい予想の言明を発見した。この言明は、既存の定式化とは異なるもので、この予想の解決に大変大きく貢献するものと思われる。現在、共同研究者と本質的な分析が始まっている。1:東京大学の柏原氏との共著で、MFMCclutterとPacking Propertyをもつclutterのクラスの等価性を主張するConforti and Cornuejolsの予想を包含する予想である、Cornuejols, Guenin and Margotの予想を解くためのスキームを提示し、Cornuejols, Guenin and Tuncelの未解決問題のidealpacking clutterにおける類似(「Fano Plane以外の射影平面は、ideal minimally nonpacking clutterのtilde coreにならない。」)を証明した論文が、Springer monograph(Indean Statistical Institute Series)として出版予定である。2:湘南工科大学の中上川氏との共著において、コードダイアグラムの展開式を用いてTutte polynomialの(x,y)=(2,-1)における値の組合せ論的意味付けを世界で初めて与えた。当該論文はDiscrete Mathにおいて出版された。3:ハンガリー国レニー研究所のZsolt Tuza氏等7名の共著において、「ネットワーク構造における多数決概念」を安全集合というグラフ理論上の概念を用いて定式化することに成功し、このパラメタの計算量的な解析を行った。当該論文はNetworksにおいて出版された。4:インド統計学研究所のR.B.Bapat氏、ハンガリー国レ二ー研究所のZsolt Tuza氏や九州大学の大舘氏等13名の共著において、グラフのパラメタである安全数が木幅が制限されたグラフの族において多項式時間で計算可能であることなどを証明した。当該論文は、Journal of Combinatorial Optimizationにおいて出版された。研究代表者の業績として、当該研究課題に寄与する研究論文が、国際論文誌(査読付)に2本掲載され、国際会議論文(査読付)として1本が採択された。更に、研究代表者と篠原氏との共同研究が進展している。また、研究分担者においても、当該研究課題に寄与する研究論文が、国際論文誌(査読付)に1本掲載された。今後に成果として進展するであろう結果が、それぞれの研究区分について得られている。この方針をさらに推し進めることで、予想の解決に近付くことができるものと考えている。目下この結果を下に、ブロッキング数の小さいときに、予想の成立を証明するなど、今後のさらなる研究を進めている。現在取り組んでいる予想の一つであるConforti and Cornuejols's conjectureに関して、この予想と等価な新しい予想の言明を発見した。今年はこのテーマを中心に、山形大学でクローズドな研究集会を開き、さらなる大きな進展を推進する予定である。Grinsteadの予想およびそのideal clutterに関する類似については、これまでに得られた複数の結果を論文にまとめる作業を推進する。

組合せ最適化、離散数学本研究では下記の2つの予想の完全解決を究極の目標として、計算機による数値実験、super-conjectureやsub-conjectureの定式化及びその証明を行い、Anti-Blocking型とBlocking型の双方の整数多面体に普遍する新たな構造定理を抽出するなど、関連する様々な取り組みを行う。Conjecture 3 (Cornuejols, Guenin and Margot 2000)クラッターがminimally non-packing(packing propertyを持たないという意味で極小)かつidealならば、そのブロッキング数は2である。Conjecture 2について(担当:佐久間(主)、篠原(研究協力)):平成27年度以降も、理論的アプローチと計算実験とを並行して進めていく。Conjecture 3について(担当:柏原(主)、佐久間(副)):平成27年度以降も平成26年度に引き続き、柏原&佐久間(2012年:arXiv:1210.4753 )の方針に従って、いわゆる「第2の部分問題」についての考察を進めていく。研究が予想外に進展し、複数の研究結果を分けて投稿する必要が出てきたため、平成28年度に複数の国際会議に採択される可能性がある。そのため、平成28年度に足りなくなるであろう海外出張費用の一部を平成27年度の分から移し替えて補うべきであるという結論に達した。残額が8千円程度と少額であるため、翌年度に繰り越した方が効率的に使用できるため。出張を予定していたが、予定より研究が進展したので、研究成果をさらにまとめるために、発表の時期を延期することにした。そのため、予定していた出張が取りやめになった。そのため、平成28年度に足りなくなるであろう海外出張費用の一部を平成27年度の分から移し替えて補う予定である。なお、このことを踏まえ、得られた成果の一部は、既に本年3月に、Discrete Mathematics Daysという国際会議(本年度7月開催予定)に向けて投稿済みであり、採択されるか否かを待っている状況である。書籍購入費用に充てる。2014年度に行えなかった、国内外の学会においての研究成果の発表を2015年度に行う。更に、今後の研究計画を遂行するために必要な書籍や物品の購入費用にも充てる。
理論計算機科学における数理論理学の応用

本研究の目標は、計算機科学に現われる数理論理学の問題を理論と応用の両面から解明しようとするものである。本年度に得られた成果のうちの主要なものを以下にあげる。1.代数的手法による縮約のない部分構造論理の一般論の展開(小野)2.部分構造論理におけるMaksimovaの変数分離の原理の研究(小野)3.直感主義的様相論理の研究(青戸、小野)4.項書き換え系における停止性および合流性に関する研究と関数型プログラム言語への応用(外山、青戸)5.弱い含意命題論理に対する証明論(鹿島)6.構成的数学の展開(石原)1)の縮約規則をもたない論理の一般論については、小野はその成果をポーランド、スウェーデン、スペイン、ドイツで発表した。また北陸先端科学技術大学院大学において、オーストラリアのM.Bunder博士、R.Gore博士およびアメリカのA.Scedrov教授とそれぞれ部分構造論理に関する共同研究をおこなった。2)については、いくつかの部分構造論理に対しMaksimovaの原理を証明論的手法により証明した。このようなアプローチはこの研究が始めてである。3)の直観主義様相論理については、青戸がその有限モデル性についての興味深い結果を示した。4)の項書き換え系とその応用については、外山と青戸が精力的に研究をおこない、優れた成果をおさめている。弱い含意論理におけるcut elimination theoremについては鹿島が、また構成的数学については石原がいくつかの成果をあげた。今年度において得られた成果のうちの主要なものを以下にあげる。1.部分構造論理、とくに縮約のない論理の一般論への試み2.様相論理および時間論理の研究の展開、とくに直観主義的様相論理の研究3.弱い含意命題論理と型つきラムダ計算の関係の究明4.項書き換え系における停止性および合流性に関する研究部分構造論理に関する研究はこれまで特定の論理の性質を調べることが中心であったが、小野は縮約のない論理について代数的手法により一般論を展開することを試みている。また、様相論理と時間論理についてはヴォルターが非常に精力的に研究をおこない、決定問題などにおいて著しい結果をあげた。また、外山と酒井はさまざまな項書き換え系における停止性および合流性についての優れた結果を得た。これらの研究を推進するために、国内の研究者との研究連絡、来日したポーランドの論理学者であるマリノフスキ教授との共同研究、本学に滞在中の様相論理に関する著名な研究者であるザハリャ-シチェフ客員助教授との共同研究を行ない、非常に実りある研究成果を得ることができた。これらの成果の一部は、千葉で行なわれた国際会議Logics for Linguistics,Philosophy and Cognitive Scienceにおいて、小野およびヴォルターにより招待講演の形で発表された。1.代数的手法による縮約のない部分構造論理の一般論の展開(小野)2.部分構造論理におけるMaksimovaの変数分離の原理の研究(小野)3.直観主義的様相論理の研究(青戸、小野)4.項書き換え系における停止性および合流性に関する研究と関数型プログラム言語への応用(外山、青戸)5.弱い含意命題論理に対する証明論(鹿島)6.構成的数学の展開(石原)1)の縮約規則をもたない論理の一般論については、小野はその成果をポーランド、スウェーデン、スペイン、ドイツで発表した。このようなアプローチはこの研究が初めてである。弱い含意論理における。cut elimination theoremについては鹿島が、また構成的数学については石原がいくつかの成果をあげた。
mRNA翻訳効率に対する転写過程での刷り込み現象

PP1の結合タンパクに関して以下の研究を行った。1.PP1/NIPP-1の遺伝子発現における機能(1)レポーター遺伝子(beta globin gene/BGG)と共にNIPP-1を細胞内に発現させ、クロマチン免疫沈降法で調べたところ、スプライシング前後のBGGmRNAと結合することが明らかとなった。(2)Lys-rich配列を欠損したNIPP-1は、共発現させたレポーター遺伝子のスプライシングを阻害する作用があることを見出した。(3)(2)の現象にはPP1結合ドメイン、FHAドメインが必須であった。したがって、NIPP-1がPP1と未同定のリン酸化タンパクとの結合を介して、スプライシング制御に働くこと。その機能にはLys-rich配列が重要であることが示唆された。(4)次にNIPP-1大量発現の翻訳への影響を調べたところ、BGG遺伝子の翻訳を抑えることが分かった。核蛋白であるNIPP-1は、細胞質イベントである翻訳を制御する機構をもつことが明らかとなった。以上、NIPP1は遺伝子のスプライシングから翻訳まで遺伝子の発現制御に関わる。2.アストロサイトにおける、PP1-ビメンチン結合の意味アストロサイトをイオノマイシンで処理すると、CaMKII依存性のビメンチンSer38とSer86のリン酸化が認められる。そのうちのSera38はすぐ脱リン酸化されるが、Ser86はリン酸化が維持されることを見出した。そのメカニズムを解析し、PP1がビメンチンのVal83-Asp84-Phe85部位と結合し、Ser38を効率よく脱リン酸化する一方で、空間的阻害により、ホスホSer86の脱リン酸化をブロックすることが明らかとなった。2.細胞分裂におけるPP1-オーロラA結合の意味PP1がオーロラAと結合して、スレオニン320を脱リン酸化することを見出した。1.pp32の遺伝子発現への影響pp32は、セリン・スレオニンプロテインボスファターゼ2型(PP2A)の阻害蛋白として同定されたタンパクであるが、近年、クロマチンリモデリング活性を介して遺伝子発現調節をする因子としての機能を持つことが示唆された。我々は、PP32がRaf/MEK/ERK経路に対して、促進的にではなくむしろ抑制的に働くことを明らかにした。このことは、細胞内においては、クロマチンリモデリング活性もしくはINHAT活性により、ある種の遺伝子発現を調節し、結果としてRaf/MEK/ERKの活性化を抑制することを意味した。2.NIPP-1のmRNA翻訳効率への影響・NIPP-1を細胞内に発現させたところ、核内においてspeckle様の局在を示したため、遺伝子発現の制御に関与すると考えられた。・遺伝子発現への影響を解析したところ、核蛋白であるNIPP-1が、細胞質イベントである翻訳を制御していることが明らかとなった。・制御機構を明らかにするために、イースト2ハイブリッド法によるNIPP1の結合蛋白の探索を行った。その結果UPF1が同定された。UPF1との結合部位を欠いた変異型NIPP1を細胞に発現させたところ、転写およびスプライシングが抑制され、細胞が死滅したことから、この変異体がドミナントネガティブに作用したものと考えた。・以上のNIPP1の機能には、PP1との結合が必須であった。これらをまとめると、UPF1との結合を介してNIPP1はPP1をmRNA-蛋白複合体へリクルートされ、PP1により翻訳に重要な蛋白の脱リン酸化をしていることが考えられた。
時空間信号処理に基づく集束超音波ビーム強度分布の３次元可視化

強力集束超音波治療は、切開を必要とせず、腫瘍のみを物理的に加熱凝固治療できるため、次世代の低侵襲治療技術として一部臨床応用されている。しかし、超音波は組織の音響特性等の不均一性により、集束超音波発生装置の幾何学的焦点とは異なる部位にエネルギーが集束する可能性および、超音波強度が治療計画時の予測値と大きく異なる可能性がある。このため集束部位の治療効果をモニタリングする技術が重要である。本研究は、超音波モニタリングに基づいた集束超音波ビームの強度分布推定手法の開発を目指した。前年度においては、(1)集束超音波が形成する音場推定を目的とした時間反転法を用いた手法、および(2)集束部位での音響強度推定を目的とした音響放射圧を用いた手法を提案した。しかし、(1)、(2)各々に問題点があることが明らかであった。したがって、本年度はこれらの問題点を克服する方針で研究を実施した。i. (1)に関して、受信機口径の狭小による推定誤差、および推定可能な音場が2次元空間に制限されている問題があった。そこで、仮想的に受信機の口径を広げる工夫をし、また受信機の素子配列を2次元にすることで、3次元音場を高確度に可視化する手法を提案した。本手法の有効性を、均質かつ無減衰な媒質で数値的かつ実験的評価により確認した。ii. (2)に関して、生体組織特性の不均一性によって、焦点部位での超音波強度推定値がロバストではない問題があった。そこで、不均一性を除去するアルゴリズムを提案した。これは、焦点部位のローカルな領域の組織情報のみから超音波強度を推定し、その周りの領域の影響を差っ引く処理を施している。本アルゴリズムの有効性は、均質な粘弾性媒質モデルでの数値的評価により確認した。以上の研究成果は、前年度の研究成果の問題点を改善し、集束超音波治療の有効性・安全性を向上させるうえで重要かつ臨床応用性の高いものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。強力集束超音波治療は切開を必要とせず腫瘍の焼灼治療を行うことが可能な次世代の低侵襲治療技術として研究開発が行われ、一部臨床治療技術として実用化されている。超音波は組織の音速・減衰特性等の不均一性により、集束超音波発生装置の幾何学的焦点とは異なる部位にエネルギーが集束する可能性や集束部位における超音波強度の制御性が大幅な低下するといった課題がある。本研究では、強力集束超音波治療技術において重要な組織に対する熱的効果を示す指標であるサーマルドーズ量推定技術の開発を目的とし、超音波撮像を用いた強力集束超音波治療の焦点定位および強度推定手法に関して、以下の研究成果を得た。(1)透過系計測システムにおいて、集束超音波が形成する音場の推定問題に対して、時間反転法を拡張し、ビームフォーミングを活用することで、高速かつ簡便に同定する手法を提案し、妥当性を検証した。(2)散乱系計測システムにおいて、集束超音波が形成する音場を推定問題に対して、生体組織の散乱不均一性の影響を補正して集束状況を正確に推定する手法を提案し、ex vivo系において有効性を確認した。(3)集束部位での音響強度の推定問題に対して、音響放射圧で組織が変位する現象を利用し、その変位計測および組織力学モデルを仮定した理論計算から強度推定する手法を提案し、妥当性を実証した。以上の研究成果は、強力集束超音波治療の有効性・正確性・安全性を向上する上で重要となるサーマルドーズ量推定のための基盤要素技術を与えるものであり、臨床応用への有用性が高い研究である。強力集束超音波治療におけるサーマルドーズ量推定のための音場・強度推定技術の開発に関して、透過系および散乱系計測システムの各々について、集束超音波が形成する音場を高精度に推定できることを、ファントム実験において、実証することができた。また、数値計算により、手法の制限についてより詳細な議論が可能となった。さらに、音響放射圧で組織が変位する現象により、集束部位での音響強度を推定する手法を提案し、その妥当性の実証に成功した。以上の研究成果は、当初の予定に十分値するものであり、研究が順調に進展していると判断した。

そこで、仮想的に受信機の口径を広げる工夫をし、また受信機の素子配列を2次元にすることで、3次元音場を高確度に可視化する手法を提案した。本手法の有効性を、均質かつ無減衰な媒質で数値的かつ実験的評価により確認した。ii. (2)に関して、生体組織特性の不均一性によって、焦点部位での超音波強度推定値がロバストではない問題があった。そこで、不均一性を除去するアルゴリズムを提案した。これは、焦点部位のローカルな領域の組織情報のみから超音波強度を推定し、その周りの領域の影響を差っ引く処理を施している。本アルゴリズムの有効性は、均質な粘弾性媒質モデルでの数値的評価により確認した。以上の研究成果は、前年度の研究成果の問題点を改善し、集束超音波治療の有効性・安全性を向上させるうえで重要かつ臨床応用性の高いものである。超音波治療として近年注目されている強力集束超音波治療の信頼性と有効性の向上に貢献する医用画像技術を用いた定量的な音場推定法の開発を目的とし、(1)時間反転法を応用した2次元透過音場推定法の提案と実証、(2)集束点付近で誘起される力学的応答量の実測に基づいた音響強度推定法の提案と初期検討に関して得られた研究成果について、以下のような今後の研究推進方策をとる。(a)上記(1)の展開: (a-1)超音波撮像素子キャリブレーション手法の適用による透過音場推定法の定量化、(a-2)2次元音響アレイを用いた振幅・位相計測による透過音場推定法の3次元化(b)上記(2)の実証と改良:(b-1)種々の粘弾性特性を持つ生体模擬材料を用いた音響強度推定法の実証、(b-2)音波の非線形性および生体不均質性を考慮した推定手法の改良とその実証(c)新手法の探索・検証:音響経路上に障害物(頭蓋、肋骨等)が存在する場合においてもモニタリング性能が担保され、かつ3次元描出性に優れる磁気共鳴画像化技術(MRI)を用いた音響強度推定法の検証等29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
閉塞性睡眠時無呼吸症の夜間血圧サージに対する口腔内装置の治療効果

閉塞性睡眠時無呼吸症患者では、睡眠中に周期的に繰り返される低酸素血症が引き金となり、急峻で甚大な血圧サージ(スリープサージ)を引き起こし、脳卒中や心筋梗塞をはじめとする脳心血管イベントの発生に関わると言われている。本研究では、閉塞性睡眠時無呼吸症のスリープサージに対する口腔内装置の治療効果を心拍ごとの血圧測定技術を用いて評価し、その有効性について明らかにすることを目的とする。口腔内装置治療のスリープサージに対する効果を明らかにすることで、心血管疾患・脳血管疾患の進行や心臓突然死のリスクを下げるなど生命予後に対しても効果が期待できると考えている。
糖質の消化・吸収遅延による小腸の遺伝子発現と生活習慣病発症リスクとの関連

糖質の消化吸収遅延による小腸における転写補因子Spot14の遺伝子発現抑制メカニズムを解析するため、難消化性デンプン(レジスタントスターチ)を成熟ラットに1週間与え、空腸を採取した。レジスタントスターチ摂取により、空腸Spot14の遺伝子発現が著しく低下した。このSpot14の遺伝子発現低下のメカニズムを転写レベルで明らかにするため、クロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)により、Spot14遺伝子上のヒストンH3、H4のアセチル化ならびにSpot14の遺伝子発現に重要な転写因子ChREBPの結合を解析した。その結果、レジスタントスターチ摂取によるSpot14遺伝子上のプロモーター領域におけるヒストンH3、H4のアセチル化ならびにChREBPの結合が低下することが明らかとなった。また、糖質の消化吸収遅延による血糖上昇の抑制が末梢血白血球の炎症性サイトカインの遺伝子発現に及ぼす影響を調べるため、12週間の高脂肪食負荷により中程度のインスリン抵抗性を発症させたラットに、α-アミラーゼ阻害剤小麦アルブミンを含む飼料を3週間与え、末梢血白血球のRNAを採取した。小麦アルブミン添加食摂取により、インスリン抵抗性が改善しただけでなく、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αならびにIFN-γの遺伝子発現量が顕著に減少した。したがって、末梢血におけるこれらのサイトカインを遺伝子発現レベルで測定することは、インスリン抵抗性をモニターするバイオマーカーとしての役割が期待できると思われる。糖質の消化・吸収遅延による小腸の消化・吸収関連遺伝子ならびに消化管ホルモン遺伝子の発現変動メカニズムを解析するため,難消化性デンプンであるレジスタントスターチを通常ラットに1週間与え,空腸・回腸を採取しそれぞれ4分割した.レジスタントスターチ摂取により,小腸管腔側に存在し主要な糖輸送担体であるSGLT1の遺伝子発現ピークは空腸上部から回腸側へとシフトした.この空腸・回腸軸に沿った遺伝子発現変動のメカニズムを転写レベルで明らかにするため,クロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)により,ヒストンH3およびH4のアセチル化に焦点をあてて解析を行った.その結果,レジスタントスターチ摂取によるSGLT1遺伝子上におけるヒストンH3,H4のアセチル化も空腸上部から回腸側ヘシフトとすることが明らかとなった.また,糖質の消化・吸収遅延による小腸の消化・吸収関連遺伝子ならびに消化管ホルモン遺伝子の発現変動と糖尿病改善との関連を調べるため,レジスタントスターチを2型糖尿病モデルラットに12週間与え,空腸・回腸を採取した.通常ラットと同様に2型糖尿病モデルラットでも,SGLT1遺伝子発現ピークが空腸上部から回腸側へとシフトし,GIP遺伝子発現も,空腸・回腸軸に沿って全体的に抑制された.さらに小腸吸収細胞の側面底面側に存在するもう一つの重要な糖輸送担体であるGLUT2の遺伝子発現も空腸で抑制された.また,糖尿病ラットでは病態改善もみられた.それゆえ,小腸におけるGIP,SGLT1およびGLUT2遺伝子の発現減少は,血糖上昇や過剰なインスリン分泌の抑制をもたらし,病態改善につながる可能性が示唆された.糖質の消化吸収遅延による小腸における転写補因子Spot14の遺伝子発現抑制メカニズムを解析するため、難消化性デンプン(レジスタントスターチ)を成熟ラットに1週間与え、空腸を採取した。
細菌性歯周炎保存治療における骨吸収抑制剤としてのlimitinの基礎的検討

歯周病では、感染に対する免疫反応の結果として産生される因子によって、破骨細胞の形成が促進され、その結果、骨吸収・歯槽骨が喪失することが明らかにされている。歯周病治療によって歯の保存をはかるためには、感染因子の除去と共に、感染免疫能を抑制することなく骨吸収を抑制することが重要である。本研究では、免疫促進作用を持つlimitnに着目した。Limitinは、B系細胞の増殖抑制因子としてクローニングされた因子である。近年、破骨細胞前駆細胞とB系細胞が非常に近い関係にあり、B系細胞増殖抑制が、破骨細胞前駆細胞増殖抑制につながる可能性があることが報告された。このことは、B系細胞増殖抑制効果を持つlimitnが、破骨細胞形成を抑制する可能性を示唆している。さらに、免疫促進作用を持つlinitnが破骨細胞形成を抑制することが可能であるならば、歯周病治療における骨吸収抑制薬として用いることの可能性も考えられる。前年度までの研究研究成果の1つとして、limitinは破骨細胞形成に必須の因子であるc-fosの蛋白質合成阻害によって破骨細胞形成を抑制することを明らかにした。本年度は、そのc-fos蛋白質合成阻害のメカニズムを明にすることを試みた。その結果、linitinは、ウイルス感染時等において蛋白質翻訳阻害をもたらすPKR遺伝子の発現を促進することを明らかにした。Limitinの持つPKR遺伝子発現促進、c-fos合成阻害及び破骨細胞形成抑制効果との関係を検討するため、siRNAを用いたPKR mRNA阻害実験を行った。その結果、linitinは、PKR mRNAの発現を介しc-fos蛋白質を抑制、その結果、破骨細胞形成が抑制されることが明らかとなった。歯周病では、感染に対する免疫反応の結果として産生される因子によって、破骨細胞の形成が促進され、その結果、骨吸収・歯槽骨が喪失するということが明らかにされつつある。そのため、歯周病治療によって歯の保存をはかるためには、感染因子の除去と共に、感染免疫能を抑制することなく骨吸収を抑制することが重要であると考えられる。さらに、免疫促進作用を持つlimitnが破骨細胞形成を抑制することが可能であるならば、歯周病治療における骨吸収抑制薬として用いることの可能性も考えられる。そこで本年度では、歯周病における骨吸収抑制薬としてのlimitinの可能性の検討を行った。その結果、(1)RANKL、TNFαによってin vitroで誘導される破骨細胞形成を、limitinは強力に抑制する、(2)CD3抗体で活性化したT細胞による炎症性サイトカイン産生を、limitinは促進する傾向を示す、(3)活性化していないT細胞による炎症性サイトカイン産生を、limitinは促進しない、(4)Limitinは破骨細胞前駆細胞における、RANKL誘導性NFATcl mRNA産生を強力に抑制する、(5)Limitinは破骨細胞前駆細胞における、c-Fos含有量を減少させること、などが明らかになった。これらの結果は、limitinが、免疫反応を抑制することなく、破骨細胞形成を抑制することを示唆するものである。Limitinの破骨細胞形成抑制機構について実験を行った。Limitinは、type-Iinterferon様因子でありIFNα/βレセプターに結合することが報告されている。破骨細胞前駆細胞上のIFNα/β

レセプターにIFNβが作用すると、蛋白質合成阻害効果を持つPKR mRNAの発現を介し破骨細胞形成に必須の因子であるc-fosのmRNAからの翻訳が阻害され、破骨細胞の形成が抑制される。そこでlimitinにおいてもPKRが関与しているのか否かについて種々の検討を行った。Limitinを破骨細胞前駆細胞に作用させると、IFNβの場合と同様PKR mRNA発現が有意に増加した。LimitinによるPKR mRNA発現とc-fos蛋白質翻訳阻害との関係を調べるため、siRNAを用いた実験を行った。PKRに対するsiRNAを破骨細胞前駆細胞に導入すると、limitinによるPKR mRNAの発現は80-90%抑制された。一方、コントロールとして用いたscrambled siRNAの導入ではPKR mRNA発現は影響を受けなかった。c-fos mRNA発現はどちらのsiRNAの導入によっても影響を受けなかったが、limitinにより減少したc-fos蛋白質の発現はPKR-siRNAによって回復した。また、limitinによる破骨細胞形成の抑制は、PKR-siRNAによって一部回復した。以上の結果から、limitinによる破骨細胞形成抑制効果の一部は、PKR mRNA発現を介したc-fos蛋白質の翻訳阻害によりc-fos蛋白質量が減少した結果であることが考えられた。
新しい分子設計概念に基づく高性能糖質系ホスト分子の開発と再生医療への応用

本研究は、シクロデキストリン(CD)環骨格に刺激応答性ユニットを挿入し、外部刺激によりゲスト包接能を制御できる新しい刺激応答性CD誘導体の開発および再生医療への応用を目的としており、1.刺激応答性CD誘導体の合成と包接能制御、2.刺激応答性CD誘導体を利用したハイドロゲルの作成と再生医療への応用という2段階から構成されている。S-S結合をもつスペーサーをCD環骨格に挿入した刺激応答性CD誘導体の合成をα-CDだけでなくβ-CDを用いても行い、環サイズの違いによる環の開裂や包接挙動の変化について検討した。その結果、合成したCD誘導体は還元剤で処理すると、S-S結合が開裂し、その開裂速度は環サイズの違いにより大きく異なることが分かった。また、CD誘導体の包接能の違いをゲストにBasic Blue7(BB7)を用いて検討した結果、α-CD誘導体のほうがβ-CD誘導体よりもBB7に対して高い包接能を示すことが明らかとなった。また、S-S結合の開裂に伴うBB7の放出挙動をNMR測定により観測した結果、β-CD誘導体のほうが内包していたゲストをより長期間放出可能であった。次に再生医療へと応用するために、刺激応答性CD誘導体を内包させたキトサンゲルを作成した。しかし、ハンドリングが悪く、また弾力性に乏しかったため、ポリビニルアセトアミドとポリアクリル酸からなる相互侵入高分子網目(IPN)ゲルを作成し、これらの問題点を解決した。さらにポリアクリル酸は皮膚接着性を有するので、作成したIPNゲルを経皮吸収製剤へと応用するため、BB7を用いて放出実験を行った。その結果、刺激応答性CD誘導体とBB7を同時に内包させたIPNゲルのほうが、BB7単独のものよりも長期的に徐放できることが確認できた。以上の結果から、この刺激応答性CD誘導体は再生医療への応用が期待できるものであると考えられる。平成18年度は1段階目の遂行を試みた。刺激応答性CD誘導体の合成は、完全メチル化CDのグルコシド結合の一点開裂反応により得られる直鎖オリゴ糖誘導体の末端水酸基をアミノ基へと変換した後、S-S結合をもつ3,3'-ジチオジプロピオノイルジクロライドとの環化反応により行った。また、合成したCD誘導体を還元剤であるジチオスレイトール(DTT)水溶液で処理すると、ジスルフィド結合(S-S結合)の開裂が認められ、その濃度を変化させることにより、開裂の速度を制御することができた。次に開裂生成物をヨウ素により酸化すると、元の環状化合物が約40%再形成することも確認された。また、合成したCD誘導体の包接能をゲストにBasic Blue 7(BB7)を用いて検討した結果、環状生成物ではBB7に対して高い包接能を示したが(18000 M^<-1>)、開裂生成物ではその包接能が低下した(7000 M^<-1>)。この包接能の差を利用して、S-S結合の開裂に伴うBB7の放出挙動をNMR測定により観測した。その結果、S-S結合の開裂に伴うシフト変化から、内包されていたゲストの放出を確認できた。これらの内容については、第52回高分子研究会、第1回ホストゲスト化学シンポジム(優秀ポスター賞受賞)、第45回日本油化学会年会(ヤングフェロー賞受賞)にて発表し、高い評価を受けた。また、Angewandte Chemie International Editionに論文を投稿中である。
小脳皮質の微細分画地図の作製

研究の初年度である昨年度は、小脳皮質の微細分画地図の作製についての基礎的所見として、小脳皮質が多数の微細な細い縦の帯状の構築区画に区分され、近傍の下オリーブ核ニューロンの軸索の枝は、単一の構築区画内のある範囲(セグメント)に投射することを明らかにして発表した。本年度は、それを発展させ、小脳皮質の特定領域に注目して、セグメントの構築を完全に明らかにして小脳皮質の微細分画地図を作製することに取り組んだ。これまでの研究により確立している方法に従い、ラットの下オリーブ核内に、順行性ニューロン標識物質であるビオチン化デキストランを微量、局所注入し、延髄と小脳の連続切片を作り、標識物質発色のための組織反応を行い、単一軸索の投射を解析した。注入箇所の微妙な違いに依存した投射パタンの違いを解析して小脳皮質の微細構築区画を決定した。まず、前庭動眼反射に関与する小脳の片葉において、地図を完成した。片葉は、これまで、5個のゾーンに分かれると言われていたが、本研究では更に細かく12個の細いバンド状の区画に分かれることが判明した。その細いバンドは、互いに完全に平行になっていた。下オリーブ核の中で、背帽部(DC)、腹側突出部(VLO)および内側副核(MAO)の最吻側部が片葉に投射することが分かった。DCの吻側と尾側、VLOの吻側と尾側、そしてMAOの最吻側部は、それぞれ1から4個の異なる区画に投射していた。単一軸索は、平均5.5個の登上線維を持ち、通常1個の区画内に投射していた。以上の本研究は、小脳皮質が地図状に多数の微細構築区画から構成されることを始めて具体的に示し、さらに、登上線維系の投射が、各微細区画(小脳皮質のモジュール)の機能決定に本質的な役割を持っていることを示唆する。まず、小脳皮質の微細分画地図の作製についての基礎的所見として、小脳皮質が多数の微細な構築区画に区分されることを明らかにし、米国の専門誌に発表した。これは、下オリーブ核ニューロンの小脳投射様式に、非常に細かい部位対応関係があり、それにより、小脳皮質は「登上線維系微小投射領域」とでも呼ぶべき200程度の微小構築単位に区分けされるという仮説に合う結果であった。具体的には、ラットの下オリーブ核にビオチン化デキストランを細胞外微小注入して投射軸索を標識し、単一軸索を連続切片から再構築し、その枝(平均7本と判明した。)の投射様式を細かく解析した。近傍の下オリーブ核ニューロンの軸索の枝は、単一または複数個の、正中線からの距離がほぼ同じ、細い縦の帯状の範囲(「セグメント」)に投射した。やや離れたニューロンは、同一の縦の細いバンド上において、吻尾側方向にずれた別のセグメントに投射した。これまでに良く知られているA, B, C, D等と呼ばれる小脳皮質の縦のゾーンは、幾つかの縦の細いバンドで構成され、ここのバンドはさらに複数のセグメントで構築されていると考えられた。ここで明らかにされたセグメントは、小脳皮質の機能単位を表す可能性のある小脳皮質の微細な構築区画である。次いで、小脳皮質の特定領域において、セグメントの構築を完全に明らかにして「地図」を作成することに取り組んだ。交付申請書に記述した小脳虫部については現在進行中であるが、小脳片葉については、現在実験データがまとまったところで、論文作成に取り組んでいる。
モノクローナル抗体を応用した内分泌悪性腫瘍抗原の組織化学的・生化学的解析.

各種モノクローナル抗体(A2B5,4F2,PKK-1,HISL-19)を用い、内分泌腫瘍および非内分泌腫瘍の免疫組織化学的、生化学的検討を行った。このうちA2B5,HISL-19は内分泌腫瘍に特異的に組織化学的に陽性所見を呈した。特に、HISL-19は、Formalin固定、Paraffin切片標本に応用でき、多くの研究成果が得られた。HISL-19を中心に研究結果を報告する。【材料と方法】1)組織化学的研究の材料と方法:材料は主に内分泌及び非内分泌腫瘍のformalin固定、paraffin切片標本。染色方法は、間接蛍光抗体法、またはSAB法を使用。2)生化学的研究の材料と方法:材料は、手術時得られた標本を実験使用時まで凍結保存。標本約1gから蛋白を抽出。HISL-19抗原分子量検索にはWestern Blotting法を用いた。3)免疫電顕法:材料は、formalin固定、paraffin切片標本に対し光顕的組織化学染色を施行し、陽性部位を選択し、電顕標本とした。組織化学的染色にはpre-embedding法を用い、鉛染色または未染色標本を検鏡した。【結果】1)組織化学的研究結果は、甲状腺腫瘍の中で髄様癌、副腎腫瘍の中では褐色細胞腫、膵腫瘍の中では膵内分泌腫瘍、消化管腫瘍の中のカルチノイド、胃内分泌細胞癌、胆嚢内分泌細胞癌対し特異的に陽性所見が得られ、非内分泌腫瘍は殆ど陰性であった。また、褐色細胞腫では良性に比べ、悪性褐色細胞腫で明らかに強陽性所見を得た。2)Western blotting法の結果は、HISL-19陰性の乳頭癌、クッシング症候群に見られない共通の抗原蛋白と思われるバンドが42kDa付近に認められ、更に髄様癌のみに見られる抗原が55および65kDa付近に認められた。3)免疫電顕法の結果、悪性内分泌腫瘍の甲状腺髄様癌において、細胞質内分泌顆粒にのみ陽性所見を得た。更に、この所見は核周囲に強く見られ、apical surfaceに向かって減少していく傾向を示した。【まとめ】HISL-19は、上述した神経内分泌腫瘍の特異的腫瘍マーカーとして有用性がある。更に、組織化学的に強陽性所見を呈した内分泌悪性腫瘍は、生化学的および免疫電顕的検討結果からHISL-19抗原となる新生蛋白の合成が、細胞質分泌顆粒内にて旺盛に行われていることが判明した。術前、HIS-19を応用したこれらの疾患の組織化学的診断は、悪性度の判定、予後の予測、切除範囲、リンパ節郭清を含めた術式の決定に有効と考えられた。