hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
N_2とCH_4の発生機構と制御

1)亜酸化窒素(N_2O)の発生機構と制御N_2Oの主な発生源は燃焼、硝化と脱窒が考えられているが、その収支はいまだ不確かなものとなっている。東部熱帯北太平洋から溶存N_2Oを抽出し、そのδ^<15>N値の測定を行った。結果、硝化系と脱窒系の駆動する層の存在を示していた。地下水からのN_2Oのδ_<15>N値は硝化系で期待される低い値を示していた(和田英)。我国沿岸・近海域の堆積物表層でのN_2Oを含む間隙水成分の鉛直微細構造を測定したが、表面から20mmと40mmのところに明らかなピークを持ち、これらは硝酸、亜硝酸各イオンのピークともほぼ一致していた(小池)。同化的と異化的硝酸還元能を有する大豆根粒菌について、どのような条件で異化的硝酸還元を行うかを、特にN_2Oの発生を中心に検討した。微好気または密閉培養条件下で亜硝酸還元酵素(NiR)が急速に誘導され、密閉培養の場合NO_2^-とN_2Oの蓄積が認められた(丸山)2)メタンの発生機構と制御水田に鋤込まれる稲ワラによるメタン発生量の最大値は年間58万トンと試算された(和田英)。水田からノメタンの発生に対する重金属、特にカドミウム(Cd)の影響を調べた。その結果Cdは堪水初期のメタン生成を抑制した(犬伏)。日本の水田土壌のタイプからメタンの総発生量を計算した。またメタン生成を制御するため、BESとモリブデン酸の影響を調べ、制御が可能であることを示した(和田秀)、滋賀県内の広い地域において採取した大気試料のメタン濃度を9月と11月に計測し、興味ある結果を得た(依田)。北海道の大気試料中のメタン濃度を南極氷床コア試料中のメタン濃度を精密に測定した(巻出)。水田におけるCH_4とN_2Oの同時測定が可能であるような装置を作製した(古賀)。
食後のエネルギー消費量を増大させる食べ方の探索

平成28年度は2つの研究を行った.研究1では,咀嚼および味覚に伴う口腔刺激が食事誘発性体熱産生(DIT)に与える影響を検討した.実験は2015年度に行い,データ解析を2016年度に行った.普通体重の健常成人男性に,200 mL(200 kcal)の飲料を一口20mLに分け,3通りの飲み方で5分間かけて摂取させた.すなわち,1対照試行:30秒毎に一気に嚥下する試行,2味覚試行:30秒間口に含んでから嚥下する試行(対照試行に味覚刺激が加わる),3咀嚼試行:1秒に1回の頻度で30秒間咀嚼してから嚥下する試行(対照試行に咀嚼と味覚の刺激が加わる)を行わせた.ガス分析装置にて酸素摂取量を食後90分まで測定し,食後90分間の累計のDITを算出した.味覚試行の累計のDITは対照試行と比べて有意に増大し,咀嚼試行の累計のDITはさらに増大した.咀嚼および味覚の両方の口腔刺激によって,DITが増大することが明らかになった.研究2では,食べる速さが食後長時間にわたるDITに及ぼす影響について検討した.実験は2016年度に行った.普通体重の健常成人男性に,734 kcalの食事(スパゲティ,ヨーグルト,オレンジジュース)をできるだけ速く(早食い試行)あるいはできるだけゆっくりよく噛んで(遅食い試行)摂取させた.ガス分析装置にて酸素摂取量を食後7時間まで測定した.遅食い試行のDITは早食い試行よりも食後2時間まで有意に増大した.食後7時間まで早食い試行と遅食い試行のDITの応答は逆転しないことが確認された.食後7時間の累計のDITは早食い試行よりも遅食い試行の方が有意に増大した.研究2の知見は,ゆっくりよく噛んで食べることが肥満を予防するよい習慣であることの裏づけとなろう.研究実施計画のとおりにおおむね順調に実施できた.今後,研究1および研究2について論文を執筆し,学術ジャーナルに投稿する。28年度が最終年度であるため、記入しない。研究1(DITを増大させる食べ方を検討する)および研究2(DITを増減させる要因を明らかにする)を行った.研究1では,食後のガム咀嚼が食後のエネルギー消費量(DIT:diet-induced thermogenesis)に及ぼす影響について検討した.2014年度に実験を行い,データを収集し終えた.普通体重の健常成人男性12名が実験に参加し,621 kcalの試験食を早食いまたはよく噛んで摂取した.その後,食後にガムを噛む試行では,試験食を食べ終えた直後にガム(3 kcal)を15分間咀嚼した.ガムを噛まない試行では,試験食に3 kcalの砂糖を加えた.食後のガム咀嚼はDITを増大させたが,ゆっくりよく噛むことの代替になる程度のDITは生じないという結果が得られた.DITは消化管における消化吸収と関連があるため,消化管の血流の測定も行った.2015年度は消化管の血流のデータ解析行った.消化管の血流は早食いに比べよく噛むことによって増大した.しかし,食後のガム咀嚼は消化管の血流に影響しないという結果が得られた.研究2では,DITを増減させる要因について検討した.2015年度に実験を行い,データを収集し終えた.普通体重の健常成人男性11名が実験に参加し,200 mlの飲料(200 kcal)を3通りの飲み方で摂取させた.1対照試行:一口20 mlを30秒毎にすぐ摂取する試行,2時間試行:一口20 mlを30秒間口に含んでから摂取する試行(口腔刺激:対照試行+味覚),3咀嚼試行:一口20 mlを1秒に1回の頻度で30秒間咀嚼してから摂取する試行(口腔刺激:対照試行+味覚+咀嚼)を別の日にランダムに行った.飲料摂取後90分間のDITの累計は咀嚼試行で最も増大し,対照試行で最も小さくなった.咀嚼および食事時間の両方の要因によってDITを増大させることが明らかとなった.平成27年度科学研究費助成事業(科学研究費補助金)交付申請書の研究実施計画のとおりに研究を実施できた.平成28年度は2つの研究を行った.研究1では,咀嚼および味覚に伴う口腔刺激が食事誘発性体熱産生(DIT)に与える影響を検討した.実験は2015年度に行い,データ解析を2016年度に行った.

普通体重の健常成人男性に,200 mL(200 kcal)の飲料を一口20mLに分け,3通りの飲み方で5分間かけて摂取させた.すなわち,1対照試行:30秒毎に一気に嚥下する試行,2味覚試行:30秒間口に含んでから嚥下する試行(対照試行に味覚刺激が加わる),3咀嚼試行:1秒に1回の頻度で30秒間咀嚼してから嚥下する試行(対照試行に咀嚼と味覚の刺激が加わる)を行わせた.ガス分析装置にて酸素摂取量を食後90分まで測定し,食後90分間の累計のDITを算出した.味覚試行の累計のDITは対照試行と比べて有意に増大し,咀嚼試行の累計のDITはさらに増大した.咀嚼および味覚の両方の口腔刺激によって,DITが増大することが明らかになった.研究2では,食べる速さが食後長時間にわたるDITに及ぼす影響について検討した.実験は2016年度に行った.普通体重の健常成人男性に,734 kcalの食事(スパゲティ,ヨーグルト,オレンジジュース)をできるだけ速く(早食い試行)あるいはできるだけゆっくりよく噛んで(遅食い試行)摂取させた.ガス分析装置にて酸素摂取量を食後7時間まで測定した.遅食い試行のDITは早食い試行よりも食後2時間まで有意に増大した.食後7時間まで早食い試行と遅食い試行のDITの応答は逆転しないことが確認された.食後7時間の累計のDITは早食い試行よりも遅食い試行の方が有意に増大した.研究2の知見は,ゆっくりよく噛んで食べることが肥満を予防するよい習慣であることの裏づけとなろう.研究実施計画のとおりにおおむね順調に実施できた.今後,研究1および研究2について論文を執筆し,学術ジャーナルに投稿する。DITは消化管における消化吸収と関連があることから,研究2では消化管の血流を測定した.現在,消化管の血流のデータ解析を行っており,2016年度も引き続き行う.解析終了後,論文を執筆する.2016年度の10月までに受理を目指す.また,修士課程における研究成果(食べる速さと体型との関係)について論文を執筆し,平成28年度10月までに受理を目指す.研究2の成果の一部は2016年4月に行われたExperimental Biology 2016(国際学会)で発表した.国内学会では,第71回日本体力医学会大会(岩手)および第94回日本生理学会大会(浜松)で発表する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
Ni-Mn-In合金のメタ磁性相転移

報告者等はNi-Mn-In合金に磁場を作用すると合金の形状が変化することを世界に先がけて報告した。見出されて間もないため磁場で誘起される形状変化の機構は不明であった。本研究により、Ni-Mn-In合金の相図と合金内の磁気特性が明らかになり、同合金の相転移の機構のモデルを提案することが可能となった。Ni-Mn-In合金は温度の低下に伴いルテンサイト(M)変態を起こす。このM相の磁化の値は母相のそれに比べて著しく小さい。Ni-Mn-In合金のM相に磁場を作用させると逆マルテンサイト変態が現れ、形状が変化する。すなわちメタ磁化相転移が現れる。このようにNi-Mn-In合金は磁場誘起形状記憶合金の有力な候補であるが見出されて間もなたいめに磁気相転移の機構については全く不明である。本研究はNi-Mn-In合金のM変態に伴う結晶学的及び磁気的特性の変化を詳細に調べ、上記合金に現れるメタ磁気相転移の機構を解明することを目的にしている。今年度はNi50断面すなわちNi_<50>Mn_<50-x>In_x合金の温度-組成状態図の作成に研究の焦点を絞った。研究成果は以下の通りである。1.磁気測定、X線、中性子回折実験により上記合金の温度-組成状態図を作成した。2.メスバウワー分光実験により、上記合金のマルテンサイト相に現れる非磁性状態が常磁性状態であることを明らかにした。3.上記合金のマルテンサイトに現れる強磁性相の自発磁化は母相のそれに比べ著しく小さいことがわかった。4.上記合金内のMn-Mn原子間距離の組成および温度変化を詳細に調べた。同合金に現れる多彩な磁気特性の出現がMn-Mn原子間距離に敏感であることがわかった。(1)Ni-Mn-In合金の組成-温度、圧力-温度及び磁場-温度状態図の作成メタ磁性相転移を示すNi-Mn-In合金の磁化測定、初透磁率測定、X線構造回折実験を行い、組成-温度状態図を作成した。更に、上記合金のキュリー温度、マルテンサイト(M)変態温度の圧力効果の実験をAC法で行い圧力-温度状態図を作成した。また、強磁場下でM変態温度の磁場依存性の実験を行い、M変態を示す上記合金の磁場-温度状態図を作成した。Ni-Mn-Inメタ磁性合金のメスバウワー分光実験を行った。種々の温度におけるメスバウワー分光スペクトルを解析した結果、M変態温度直下における磁気特性が常磁性状態であることがわかった。M相の低温における小さな自発磁化を持つ状態は磁化測定、メスバウワー分光測定の結果から推定して、リエントラントスピングラス相であると予想した。即ち母相強磁性相の中に反強磁性的クラスターが存在すると予想される。M相における常磁性出現の起因を調べる目的で、上記合金の格子定数の温度変化をX線回折実験により調べた。温度下降におけるM変態に伴い、最隣接Mn-Mn原子問距離は急激に減少し、第2隣接Mn-Mn原子間距離が急激に増加した。上記合金内で主なる磁気交換相互作用は最隣接Mn-Mn原子間及び第2隣接Mn-Mn原子間に働く相互作用である。これらのMn-Mn原子間距離の急激な変化により、Mn原子間に働く磁気交換相互作用が急激に減少し、M相において常磁性が現れたと推定される。従って、M変態温度直下で磁場を作用するとゼーマンエネルギーの利得によりメタ磁性転移が出現すると推定される。
コンビネーション保湿による新規保湿方法の開発とその有効性に関する多軸的評価

本研究は,リキッド保湿剤とジェル保湿剤を混合するコンビネーション保湿の有効性を評価した.市販保湿剤のカンジダ菌に対する抗真菌性を網羅的に調査した結果,抗真菌性を有するリキッド保湿剤とジェル保湿剤の混合は,高濃度の抗真菌剤と同程度の抗真菌性を有することが明らかになった.官能試験の結果,男女ともに総合点と味の評価の間で強い相関関係が得られたが,多くの評価項目において男女間でVAS値に有意差が認められた.そこで,各保湿剤とその混合における糖度を評価した結果,保湿剤の混合によりその糖度が変化することが明らかなった.以上の結果より,保湿剤の混合は,抗真菌性や嗜好性において有効であることが示された.本研究は,これまで申請者らが行った口腔乾燥ならびに保湿剤に関する一連の研究成果をもとに,リキッド保湿剤とジェル保湿剤を混合して使用するコンビネーション保湿による新規保湿法を開発し,その有効性について多軸的に評価するものである.平成27年度は,主に以下の点について検討を行った.1)保湿剤の計測システムの構築.各保湿剤の性状について,理工学的,細菌学的手法で評価する各種計測機器と計測結果を一元管理するPCのシステムの構築ならびに管理方法とセキュリティーシステムの導入を行った.2)各種保湿剤の比較検討.保湿剤の粘度と蒸散性の測定は,口腔内を想定した温度と湿度とし,インキュベーターを購入して湿度管理が行えるよう設定した.口腔乾燥患者から頻繁に検出されるCandida albicansを対象に,培地に培養した後に各保湿剤を用いた拡散法により発育阻止帯を評価した.その結果,わずかにリキッド保湿剤とジェル保湿剤の数種類のみ抗真菌性を有することが確認された.3)効果的な保湿方法のデータ収集と分析.コンビネーション保湿に必要な組み合わせの検討として,市販の保湿剤(ジェル,リキッド)を用いて能試験を行い,主観的評価結果についても検討を行った.その結果,VASを用いた保湿剤の主観評価は製品によってさまざまであったが,総合評価点に対して,香り,味,舌触り,潤い感,塗りやすさといった項目が相関を認め,中でも味に関する評価が最も強い相関を示した.保湿剤の粘度,重量変化,抗菌性について測定を行った.保湿剤を組み合わせた場合の抗菌性は,抗菌性のある製品の組み合わせで,高濃度の抗真菌剤と同程度の抗菌性を得られることが確認された.また,保湿剤の官能試験を行った結果,保湿剤の評価は,味の評価結果と強い相関関係が認められることが確認された.結果の分析中,性差についても結果に影響を及ぼす可能性が示唆されたため,今後は,適用量や適用回数を設定する場合,これらの条件を考慮する必要がある.本研究は,これまで代表者らが行った口腔乾燥ならびに保湿剤に関する一連の研究成果をもとに,リキッド保湿剤とジェル保湿剤を混合して使用するコンビネーション保湿による新規保湿方法を開発し,その有効性について多軸的に評価するものである.平成28年度は,コンビネーション保湿に必要なリキッド保湿剤とジェル保湿剤の組み合わせの検討と効果的な保湿を行うために必要な条件の検討を行った.コンビネーション保湿に必要な組み合わせについては,市販のリキッドとジェル保湿剤を用いて検討した.まず,リキッド保湿剤7種とジェル保湿剤10種の抗菌性を調査した結果,多くの保湿剤で黄色ブドウ球菌に対する抗菌性が認められたが,カンジダ菌に対する抗真菌性を有する保湿剤は,わずかリキッド保湿剤2種とジェル保湿剤1種であることを明らかにした.そこで,これらのリキッド保湿剤とジェル保湿剤の混合における抗菌性を評価した結果,高濃度の抗真菌剤(アンホテリシンB)と同程度の抗真菌性を有することを明らかにした.VAS値を用いた官能試験を行った結果,保湿剤の主観的評価である味,潤い感,塗りやすさ,総合点など多くの評価項目において男女間でVASの値に有意差が認められ,効果的な保湿を行うためには性差の考慮が必要なことが示された.また,男女ともに総合点と味の評価の間で最も強い正の相関関係が得られたことから,保湿剤を選択する上で味が重要な要因であることが示された.官能試験を用いた保湿剤の主観的評価を行った結果から,男女ともに全ての評価項目間で有意な正の相関を示したが,中でも総合点と味の評価の間で最も強い正の相関関係が得られ,保湿剤を混合した場合の味についても主観的ならびに客観的評価が必要である.しかしながら,官能試験の結果からは,味,潤い感,塗りやすさ,総合点など多くの評価項目において男女間でVAS値の値に有意差が認められ,今後,保湿剤の主観的評価を行う場合には性別ごとの評価を行う必要性が考えられる.口腔乾燥の治療には保湿剤が用いられ,多くのジェル保湿剤やリキッド保湿剤が販売されているが,その選択根拠となる研究はわずかである.我々は,口腔乾燥患者は口腔粘膜における水分量の分布が不均一となり,舌粘膜の水分量の低下が口腔乾燥の自覚症状と強く関係していることを明らかにした.これらの結果は,舌粘膜における薄く均一な保湿の重要性を示唆しているが,リキッド保湿剤は,低粘度のため流動性が大きく,水分含有率は高いが経時的な蒸散も大きいため保湿効果が短く,対するジェル保湿剤は,高粘度のため薄く均一な塗布が困難なうえ,水分含有率が低い.

そこで,水分含有率の高いリキッド保湿剤で口腔粘膜に均一な保湿を行った上に高粘度で停滞性のあるジェル保湿剤を蒸散・流動防止のため重ね塗りをするコンビネーション保湿を着想した.本研究の目的は,コンビネーション保湿による新規保湿法を開発し,その有効性について評価するものである.平成29年度は,コンビネーション保湿に有効な組み合わせの検討として,リキッド上にジェルを重ね塗りした場合の味覚の観点から検討を行った.カンジダ菌に対して抗真菌作用を有するリキッド保湿剤(a,f)とジェル保湿剤単体(F)ならびにその組み合わせにおける糖度を測定した結果,27°Cにおける保湿剤の糖度(Brix値)は,リキッド保湿剤単体のaは10.2,fは15.5であり,ジェル保湿剤単体(F)は39.2であった.一方,リキッド保湿剤とジェル保湿剤の混合の糖度は,a+Fで23.2,f+Fで29.4とリキッド保湿剤単体より増加し,ジェル保湿剤単体と比べると低下した.また,リキッド保湿剤同士の混合a+fでは12.7とほぼ両者の中間値となった.これらの結果より,混合する保湿剤の種類を選択することで,抗真菌性を保ちながら様々な嗜好性に対応できる可能性が示唆された.本研究は,リキッド保湿剤とジェル保湿剤を混合するコンビネーション保湿の有効性を評価した.市販保湿剤のカンジダ菌に対する抗真菌性を網羅的に調査した結果,抗真菌性を有するリキッド保湿剤とジェル保湿剤の混合は,高濃度の抗真菌剤と同程度の抗真菌性を有することが明らかになった.官能試験の結果,男女ともに総合点と味の評価の間で強い相関関係が得られたが,多くの評価項目において男女間でVAS値に有意差が認められた.そこで,各保湿剤とその混合における糖度を評価した結果,保湿剤の混合によりその糖度が変化することが明らかなった.以上の結果より,保湿剤の混合は,抗真菌性や嗜好性において有効であることが示された.今後は,保湿剤の官能試験における性差の結果を検討しつつ,適用方法や代表的な組み合わせについて検討を行う必要がある.今後は,抗真菌性を有することが確認できたリキッド保湿剤とジェル保湿剤の組み合わせにおける味の評価について,客観的評価として糖度計を用いた測定とVAS蒸散値による主観的評価を行い,両者の結果を検討する.歯科補綴学物品の一部の購入について,研究計画の変更により次年度に購入予定となったため.研究計画の変更に従って,平成28年度に購入予定だった物品は,平成29年度に購入する.
冬暖かい省エネ型住宅「京町家」の可能性検討

本研究では、a)京町家の伝統的な形式・形態を維持した上での断熱、b)土壁、坪庭の熱容量と開口部の開閉による室温制御、c)縁側の開閉調整による日射と外気の取入れ・遮断による室温制御、d)坪庭への散水による蒸発冷却効果、e)室温に対する個人の好みの違いを許す暖房の考え方、f)ライフサイクルにわたるエネルギー使用への助成制度の可能性について検討することを目的とした。京都市に建つ京町家モデル住宅を対象として種々の測定と解析を行い、夜間蓄熱の効果、ドラフトの関係、通風に及ぼす建具の影響、散水冷却効果などを明らかにした。(1)京町家モデル住宅の熱特性測定と種々の制御実験:京都市塩小路河原町に建設された京町家実験棟および西陣の京町家を測定対象として、京町家モデル住宅の熱特性測定と種々の制御実験、特に吹き抜け空間がコールドドラフトと通風に及ぼす影響の測定、坪庭および通りへの散水・通風実験、井戸水を利用したヒートポンプによる暖房、省エネ性・室内環境性能を比較評価を行った。(2)シミュレーションプログラムの作成:典型的な京町家を想定し、縁側、土壁、土間、坪庭など京町家の温熱環境上キーとなる要素を組み込んだ温湿度解析用シミュレーションプログラムを作成した。土壁の熱容量の効果、隣家との境界壁の断熱性が及ぼす影響の評価を行った。(3)縁側の最適制御(窓開閉)の効果を、測定値をベースに評価した。(4)京町家の設計、建設などの専門家を対象として、助成制度の在り方に関する調査・ヒアリングを行った。本研究では、a)京町家の伝統的な形式・形態を維持(積極的に利用)した上での断熱、b)土壁、土間、坪庭の熱容量と開口部の開閉による室温制御、c)縁側の開閉調整による日射と外気の取入れ・遮断による室温制御、d)坪庭や通りへの散水による蒸発冷却効果、e)室温に対する個人の好みの違い、部分暖房を許す暖房の考え方、f)ライフサイクルにわたるエネルギー使用への助成制度の可能性、について検討することを目的とした。a)d)では、冬の寒さおよび中間期拡張・一日の中で冷暖房時間の短縮化による省エネ基準クリアの可能性を検討した。e)f)では省エネルギーな室使用法に向けた「自然な」および「自覚的な」ライフスタイルの形成を目的とした。具体的には、(1)シミュレーションプログラムの作成(担当:鉾井・伊庭・学生2名):典型的な京町家を想定し、縁側、土壁、土間、坪庭など京町家の温熱環境上キーとなる要素を組み込んだ温湿度解析用シミュレーションプログラムを作成した。(2)京町家モデル住宅の熱特性測定と種々の制御実験(担当:鉾井・伊庭・学生2名):実施場所:京都市塩小路河原町に建設された京町家実験棟を主たる測定対象とした。最近の在来住宅についても適宜測定を行い、省エネ性・室内環境性能を比較評価した。・京町家モデル住宅の熱特性測定と種々の制御実験、床下地盤への蓄熱と空気循環による蓄熱制御、坪庭、前面広場への散水・通風実験を行った。(3)シミュレーションにより得られる縁側の最適制御(窓開閉)に合わせた生活実験を行った。(4)助成制度の在り方に関する調査・ヒアリングを行った。工学京都市や京町家保存活動を推進している団体などとの協力関係が予定以上に順調に構築されたため、調査や測定が順調に進められた。基本的には当初の計画通り進めるが、京町家の改修物件の調査をする機会にも恵まれそうであり、検討対象として改修も含めたいと考えている。
慢性覚醒剤投与ラットにおける海馬および黒質神経細胞内のCa応答に関する研究

慢性覚醒剤投与ラットにおける海馬及び黒質神経細胞内のCa応答に関する研究を行った。まず脳検索に先立って、前回の科研費研究における慢性覚醒剤投与ラット膵病変部の小血管変性部の電子顕微鏡所見を明確にとらえる事が出来た。その所見をふまえて、同上ラットとコントロールラットにおける海馬及び黒質神経細胞スライスにおける組織所見及び、電子顕微鏡所見を検討した。まず組織所見については、海馬と思われる部位、中脳黒質部位について、コントロールに比し、神経細胞の萎縮、壊死が認められ、グリア細胞の増殖が見られ、各細胞個々については、細胞内[Ca2+]濃度変動を、明確にすることが困難であった。しかし、コレシストキニンを用いた、コレシストキニン・レセプターBに対する細胞内[Ca2+]増加動態については、コントロールに比し、明らかに反応の低下が認められた。しかし同時に行ったコレシストキニン・レセプターB免疫反応性については、抗体調製が困難で、コントロール、慢性覚醒剤投与ラットとの間で、共に、非特異的染色が強く、有意な差は認められなかった。また、上記のスライスについて、前記膵病変部小血管と同様の電子顕微鏡所見は明確にとらえられているので、今後は、別の方法(一例を挙げれば脳灌流法)等を用いて各神経細胞内[Ca2+]の動態を検索することができれば、覚醒剤が、小血管内皮損傷にひきつづいて、神経細胞周囲のコレシストキニン・レセプターBに対する反応性を恐らく低下させている動態が、より直接的にとらえられる事が、間接的ながら示唆された。慢性覚醒剤投与ラットにおいては高頻度に、脳に小出血を生じ、神経細胞の同定、組織摘出に困難を生ずる為、今後は覚醒剤投与量の調節にも留意したい。慢性覚醒剤中毒患者における脳・神経障害・錯乱・幻聴等を検討するきっかとしてラットに覚醒剤の慢性投与をおこない、そのラットにおいて海馬および黒質神経細胞内のCa応答に関して研究をおこなった。本年度においてはまずラット慢性覚醒剤投与群より大脳、脳幹、中脳より神経細胞を摘出し、その一部においてはコレシストキニンBの局在を免疫組織学的に検討した。その結果コントロールに比し特に海馬神経細胞においてコレシストキニンの染色性の増加が顕著であった。また、この海馬神経細胞の中でもほとんど染色性を示さない細胞が混在して認められた。更に中脳においては黒質の神経細胞の周囲の小血管内皮細胞周囲において強陽性所見が散在性にみられており次年度において更に検討を行う予定である。ついで上記神経細胞内の{Ca2+}の動態についてであるが、パパイン処理によりdissociateした後培養を試み、Ca感受性色素fura-2を投与し細胞内の濃度変化による蛍光変化の測定を試みた。しかし明らかにCa濃度の増加傾向を、コントロールに比しとらえることが出来たのは上記の部位と同じく海馬神経細胞の一部においてのみであり、ほかの部位においては結果が不安定であるので今後共焦点レーザー顕微鏡を用いるか、あるいは蛍光色素の種類及び濃度を変化させて、より非特異的な値の増加を抑制し、覚醒剤の実質的な反応性を検討する必要性が明らかとなった。また、神経細胞が高度に変性、壊死に陥っている場合のCa濃度の測定方法についてもより詳細な検討が必要であることが示された。

まず組織所見については、海馬と思われる部位、中脳黒質部位について、コントロールに比し、神経細胞の萎縮、壊死が認められ、グリア細胞の増殖が見られ、各細胞個々については、細胞内[Ca2+]濃度変動を、明確にすることが困難であった。しかし、コレシストキニンを用いた、コレシストキニン・レセプターBに対する細胞内[Ca2+]増加動態については、コントロールに比し、明らかに反応の低下が認められた。しかし同時に行ったコレシストキニン・レセプターB免疫反応性については、抗体調製が困難で、コントロール、慢性覚醒剤投与ラットとの間で、共に、非特異的染色が強く、有意な差は認められなかった。また、上記のスライスについて、前記膵病変部小血管と同様の電子顕微鏡所見は明確にとらえられているので、今後は、別の方法(一例を挙げれば脳灌流法)等を用いて各神経細胞内[Ca2+]の動態を検索することができれば、覚醒剤が、小血管内皮損傷にひきつづいて、神経細胞周囲のコレシストキニン・レセプターBに対する反応性を恐らく低下させている動態が、より直接的にとらえられる事が、間接的ながら示唆された。慢性覚醒剤投与ラットにおいては高頻度に、脳に小出血を生じ、神経細胞の同定、組織摘出に困難を生ずる為、今後は覚醒剤投与量の調節にも留意したい。
口腔自然免疫MPIの歯周病原性細菌感染制御に関する解析

成人性歯周炎の罹患率のピークは50-60歳にあるが,Porphyromonas gingivalisを含む種々の歯周病原性細菌は,歯周疾患の見られない小児や20歳代の成人の口腔にも比較的高頻度で定着していることを我々は見出し報告した.従って,本疾患の発症には歯周病原性細菌の定着,増殖,およびプロテアーゼやリボ多糖などの細菌由来病原因子による組織障害や炎症反応の惹起だけでなく,宿主側の要因,特に自然免疫系の関与とそれらの間でのバランスが疾患の発症に関与しているものと考えられた.本年度は前年の研究成果に基づき,口腔細菌由来プロテアーゼ活性発現の分子機構の詳細と,各種プロテアーゼに対する自然免疫担当因子と考えられる粘液プロテアーゼインヒビター(MPI)の作用について以下の検討を行い成果を得た.1、MPIのリコンビナントタンパク質発現系:Hisタグを有するMPIリコンビナントタンパク質の大量発現系について種々の検討の結果,rMPIは誘導により封入体を形成し,大腸菌発現系からの封入体の回収と可溶化により精製が可能であることが明らかとなった.2、口腔細菌由来プロテアーゼ活性に対するMPIの効果:口腔細菌由来プロテアーゼとしてグルタミン酸特異的プロテアーゼ(GluSE)を取り上げ,V8プロテアーゼ,トリプシン他のプロテアーゼに対するMPIの活性阻害作用を測定した.その結果,MPIはGluSE他のプロテアーゼに対してin vitro反応系では顕著な阻害活性を持たないことが明らかとなった.さらに,GluSE分子種についての2次元電気泳動と質量分析,N末端アミノ酸分析による解析から,シグナルペプチドおよびプロ配列を決定した.セリンプロテアーゼであるGluSEでは,プロ配列の存在によりプロテアーゼ活性の顕著な阻害が見出され,細菌性セリンプロテアーゼの成熟過程についての新たな知見が得られた.成人性歯周炎の罹患率のピークは50-60歳にあるが,Porphyromonas gingivalisを含む種々の歯周病原性細菌は,歯周疾患の見られない小児や20歳代の成人の口腔にも比較的高頻度で定着していることを我々は見出し報告した.従って,本疾患の発症には歯周病原性細菌の定着,増殖,およびプロテアーゼやリボ多糖などの細菌由来病原因子による組織障害や炎症反応の惹起だけでなく,宿主側の要因,特に自然免疫系の関与とそれらの間でのバランスが疾患の発症に関与しているものと考えられた.本年度は前年の研究成果に基づき,口腔細菌由来プロテアーゼ活性発現の分子機構の詳細と,各種プロテアーゼに対する自然免疫担当因子と考えられる粘液プロテアーゼインヒビター(MPI)の作用について以下の検討を行い成果を得た.1、MPIのリコンビナントタンパク質発現系:Hisタグを有するMPIリコンビナントタンパク質の大量発現系について種々の検討の結果,rMPIは誘導により封入体を形成し,大腸菌発現系からの封入体の回収と可溶化により精製が可能であることが明らかとなった.2、口腔細菌由来プロテアーゼ活性に対するMPIの効果:口腔細菌由来プロテアーゼとしてグルタミン酸特異的プロテアーゼ(GluSE)を取り上げ,V8プロテアーゼ,トリプシン他のプロテアーゼに対するMPIの活性阻害作用を測定した.その結果,MPIはGluSE他のプロテアーゼに対してin vitro反応系では顕著な阻害活性を持たないことが明らかとなった.さらに,GluSE分子種についての2次元電気泳動と質量分析,N末端アミノ酸分析による解析から,シグナルペプチドおよびプロ配列を決定した.セリンプロテアーゼであるGluSEでは,プロ配列の存在によりプロテアーゼ活性の顕著な阻害が見出され,細菌性セリンプロテアーゼの成熟過程についての新たな知見が得られた.本研究課題では,口腔における自然免疫系の1つと考えられる粘液プロテアーゼインヒビター(MPI)に着目し,MPIの口腔細菌感染の制御機構と加齢による口腔MPI量の変動について明らかにすることを目的とし,以下の検討を行い成果を得た.1.リコンビナントMPI発現系の構築ヒトおよびマウス培養細胞よりRNA分画を精製し,MPI遺伝子をRT-PCRで増幅した.ついで,それぞれのプロタンパク質及び成熟タンパク質に対応するDNA断片を精製し,発現プラスミドに組み込み,pQE32-hMPI及びpQE32mMPIを作成した.これらのプラスミドでEcherichia coli BL21株をトランスフォーム後,0.2mM IPTG,30°C,6時間の誘導条件によりリコンビナントタンパク質を発現するE.coli菌株を選択した.培養後,菌体を凍結・融解サイクルにより溶菌し,その可溶性画分からTalonアフィニティクロマトグラフィー,たいでMono Sを用いたFPLCによりリコンビナントタンパク質を精製した.可溶性画分からの収量はおよそ1mg/L cultureであったが,発現タンパク質の多くは封入体を形成することが明かとなった.2.細菌に対するMPIの作用の検討歯周病原性細菌に対する作用を検討するに先立ち,まず,E.coli及びStaphylococcus epidermidisに対するMPIの作用を検討した.一定量のこれら細菌と各種濃度の精製rMPIを37°C,30分間インキュベートし,生菌数を測定した.その結果,これらの細菌の生菌数はrMPIの濃度に依存して3040%減少した.また,その抑制効果はグラム陰性菌であるE.coliでより顕著であった.これらの結果より,MPIは未知の機構による静菌的あるいは殺菌的作用を有することが示唆された.

成人性歯周炎の罹患率のピークは50-60歳にあるが,Porphyromonas gingivalisを含む種々の歯周病原性細菌は,歯周疾患の見られない小児や20歳代の成人の口腔にも比較的高頻度で定着していることを我々は見出し報告した.従って,本疾患の発症には歯周病原性細菌の定着,増殖,およびプロテアーゼやリポ多糖などの細菌由来病原因子による組織障害や炎症反応の惹起だけでなく,宿主側の要因,特に自然免疫系の関与とそれらの間でのバランスが疾患の発症に関与しているものと考えられた.本年度は前年の研究成果に基づき,口腔細菌由来プロテアーゼ活性発現の分子機構の詳細と,各種プロテアーゼに対する自然免疫担当因子と考えられる粘液プロテアーゼインヒビター(MPI)の作用について以下の検討を行い成果を得た.1、MPIのリコンビナントタンパク質発現系:Hisタグを有するMPIリコンビナントタンパク質の大量発現系について種々の検討の結果,rMPIは誘導により封入体を形成し,大腸菌発現系からの封入体の回収と可溶化により精製が可能であることが明らかとなった.2、口腔細菌由来プロテアーゼ活性に対するMPIの効果:口腔細菌由来プロテアーゼとしてグルタミン酸特異的プロテアーゼ(GluSE)を取り上げ,V8プロテアーゼ,トリプシン他のプロテアーゼに対するMPIの活性阻害作用を測定した.その結果,MPIはGluSE他のプロテアーゼに対してin vitro反応系では顕著な阻害活性を持たないことが明らかとなった.さらに,GluSE分子種についての2次元電気泳動と質量分析,N末端アミノ酸分析による解析から,シグナルペプチドおよびプロ配列を決定した.セリンプロテアーゼであるGluSEでは,プロ配列の存在によりプロテアーゼ活性の顕著な阻害が見出され,細菌性セリンプロテアーゼの成熟過程についての新たな知見が得られた.
学習システムにおけるゲーミフィケーションの動機づけ効果の再考

近年,学習にゲーム要素を取り入れる手法が注目されている。これには,学習者の関心・意欲を高める効果が期待されている。一方で,これまでの心理学の理論や研究を踏まえると,すべてのゲーム要素が関心・意欲を高めるわけではないことが予想される。本研究では,第一に,行動実験を行うことで,学習者の関心・意欲を本当に高めるゲーム要素とそうではないゲーム要素があることを明らかにする。第二に,質問紙調査によって,一般的に認識されているゲーム要素の効果が,実際の行動実験でみられる効果とは異なることを明らかにする。これによって,真に学習者の関心・意欲を高める学習システムの構築に向けた指針を提示することを目的とする。社会活動にゲームデザインのノウハウを取り入れるゲーミフィケーションは,学習システムにも活用されており,学習者の内発的動機づけを高める手段として注目されている。一方で,ゲーム要素のような外的要因によって学習者を動機づけることの是非に関して,心理学においては議論が分かれている。それにもかかわらず,ゲーム要素を活用した学習システムが普及している背景として,ゲーム要素がもたらす動機づけ効果に対して,開発者や利用者が誤った認識を持っている可能性が考えられる。本研究では,行動実験でゲーム要素の内発的動機づけ効果を明らかにし,質問紙調査でゲーム要素の内発的動機づけ効果に対する認識を明らかにする。そして,実験と調査の結果を比較することで,実際の内発的動機づけ効果と一般に認識されている内発的動機づけ効果との間にずれがあることを明らかにする。これによって,心理学の観点からゲーム要素の内発的動機づけ効果を再考し,真に学習者の内発的動機づけを向上させる学習システムの構築に向けた指針を提示することを目的とする。本年度は,行動実験の実施に向けて,パソコンやソフトウェア,周辺機器等を購入し,研究環境の整備を行い,書籍の購入や学会参加による情報収集を行なった。また,実験に用いるゲーム要素を検討するための予備的な実験を行った。さらに,申請者がこれまでに実施した,本研究計画と関連する研究について,論文の執筆・投稿を行った。実験と調査の実施に向けて,研究環境の整備や情報収集,予備実験等を実施することができた。また,本研究関連する研究について論文の執筆・投稿をすることができた。昨年度の準備を踏まえて,今年度は実際に実験と調査を実施する。また,一連の成果をまとめ,学会や論文誌への投稿を行う。
3次元声道形状と声帯音源の高精度抽出が可能な高品質音声分析変換合成方式の開発

音声信号から1次元の声道形状を推定する手法として、音声信号から抽出したPARCOR係数を用いる方法がある。本研究ではこれを発展させ、音声信号から3次元声道形状を推定する手法について検討している。PARCOR係数により1次元の声道形状を推定する手法には誤差があることから、まずはこの誤差を小さくする必要がある。平成30年度は、3Dプリンタを用いて1次元の声道模型を造形した上でその音響特性を測定し、この誤差を小さくすべく検討を進めた。最初に、音響特性の測定において、測定方法による音響特性の違いについて検証を行った。ここでは、声帯側から音源を入力した場合と、口唇側から音源を入力した場合の比較を行い、口唇側からの入力の方が安定して測定できることが明らかとなった。次に、3Dプリンタ造形時の精度に相当する積層間隔を変え声道模型を造形した結果、積層間隔による音響特性の違いはわずかであり、第4フォルマントに相当するスペクトルのピークなど、2kHz以上の高域に違いが出るのみであることが分かった。一方、積層間隔が異なる声道形状の情報から音響特性をFDTD法によって模擬したところ、同様に2kHz以上の高域に違いが見られたが、特に第4フォルマントに相当するスペクトルのピークに違いが見られ、3Dプリンタによる声道模型の場合と異なることが分かった。この原因については、現在調査中である。また、FDTD法による音響特性が声道模型の音響特性とどのように異なるか調査したところ、第4フォルマント以降のピークに大きく違いが見られることが分かった。さらに、3Dプリンタによる声道模型は、造形時に膨張して内径が小さくなっており、この影響で第2フォルマントにおいてもずれが見られることが分かった。現在、PARCOR係数を用いて算出される1次元の声道形状との違いについても分析を進めている。平成30年度は、平成29年度に当初の予定よりも早く3Dプリンタを導入できたこともあり、3Dプリンタを用いた研究が想定したよりも進捗した。3Dプリンタを用いて1次元の声道模型を造形し、その声道模型を用いて測定した音響特性と、1次元の声道形状からFDTD法によって模擬した音響特性の違いについて明らかとなった点は大きな進展である。また、3次元声道形状データを可視化したりそのデータからPARCOR係数を算出するツールの開発・改良については順調に進捗している。一方で、平成29年度より検討を進めている声道断面積関数と声帯音源の推定精度向上に関する検討については、ある程度想定はしていたものの、十分な進捗が見られていない。この点については、現在、深層学習を利用する方法について検討を進めている。全体としては、一部十分な進捗が見られていない部分があるものの、想定したより早く進捗している部分もあり、全体的として見れば概ね順調に進捗していると考えている。平成29年度より検討している声道断面積関数と声帯音源の推定精度向上に向けた検討をさらに推し進めていく。平成29年度・平成30年度に検討を進めた結果は必ずしも望ましいものではなかったものの、その場合には当初より深層学習を利用することを想定しており、現在、実際に深層学習を利用すべく準備を進めている。深層学習においては、入力データと正解データのペアを大量に用意する必要があるが、ここでは次のような手順によりこれを作成する。1)基準となる音素の1次元声道形状を作成した後、それに乱数による微少変動を加え、多くの声道形状のバリエーションを作成する。2)この1次元声道形状から、FDTD法により音響特性(フィルタのインパルス応答)を算出する。3)このフィルタに対し、パラメトリックに制御可能な人工的な声帯音源信号を入力し、合成音声信号を生成する。この手順により作成した合成音声信号とこの信号に対するPARCOR係数を深層学習への入力、元の1次元声道形状と人工的な声帯音源信号のパラメータを正解データとして学習を行う。適切に学習ができれば、音声信号とそれに対応するPARCOR係数を入力として、1次元声道形状と声帯音源信号のパラメータが推定できることになる。これをさらに推し進め、声道形状を3次元に拡張した場合にも同様のことが可能かについても検証する。また、検証用に用いる声道形状のMRI撮像データについては、今年度前半に研究代表者1名と学生1名のデータを収録予定である。平成29年度は、PARCOR係数による声道断面積関数の精度向上に取り組んだ。精度を評価するためには、まず、正解として利用する声道断面積関数が必要であり、以下の2種類を用意した。(a)3次元声道形状データから直接算出される声道断面積関数。これは3次元声道形状の本来の声道断面積関数に相当するため、物理的な形状としての正解と言って良い。ここでは、すでに研究室で作成済みであった3次元声道形状データを可視化するツールを改変し、中心線を自動算出するようにした上で、必要に応じて修正を行えるよう改良を行った。(b)3次元声道形状データを用い、FDTD法によって算出された伝達特性からPARCOR係数を求めた後、計算される声道断面積関数。音声の合成を行うことを考えた場合には、この声道断面積関数が最良ということになる。(a)と(b)の形状の比較から、ケリーの声道モデルによる声道断面積関数がどの程度本来の声道断面積関数に近いのかを評価した。その結果、ある程度の形状の一致はあるものの、異なっている部分も多いことが明らかとなった。次に、正解の声帯音源のデータとなる様々な周波数特性を持つ人工的な声帯音源信号を作成した。

ここでは、声帯音源信号としてインパルス列、三角波、鋸歯状波などを用いた。FDTD法で算出した声道フィルタに対し、この声帯音源信号を入力することで音声が合成できるため、この合成音に対し、適応逆フィルタ法を用いて、PARCOR係数による声道断面積関数と残差信号を算出する実験を行った。そして、得られる声道断面積関数が正解にどの程度近いのか、残差信号のスペクトルがどの程度入力した声帯音源信号のスペクトルに近いかを評価した。その結果、適応逆フィルタ法による方法である程度の抽出は可能であるものの、精度は十分であるとは言えないことが明らかとなった。PARCOR係数による声道断面積関数の精度向上に関する検討については、評価実験の結果が必ずしも望ましいものではなかった。具体的には、まず、ケリーの声道モデルによる声道断面積関数がどの程度本来の声道断面積関数に近いのかを評価した結果は、ある程度の形状の一致はあるものの、異なっている部分も多いというものであった。そして、人工的な声帯音源信号を用いて、声道断面積関数が正解にどの程度近いのか、残差信号のスペクトルがどの程度入力した声帯音源信号のスペクトルに近いかを評価した結果は、適応逆フィルタ法による方法である程度の抽出は可能であるものの、精度は十分だとは言えないというものであった。これらの結果は、必ずしも望ましいものではないものの、研究前にある程度想定していたものであり、今後、これらの結果を望ましいものに変えるべく研究を進めていく。一方で、3次元声道形状データを可視化するツールの改良や、3Dプリンタで声道模型を作成する準備等、想定したよりも早く研究が進捗している部分もあり、全体的として見れば概ね順調に進展していると考えている。音声信号から1次元の声道形状を推定する手法として、音声信号から抽出したPARCOR係数を用いる方法がある。本研究ではこれを発展させ、音声信号から3次元声道形状を推定する手法について検討している。PARCOR係数により1次元の声道形状を推定する手法には誤差があることから、まずはこの誤差を小さくする必要がある。平成30年度は、3Dプリンタを用いて1次元の声道模型を造形した上でその音響特性を測定し、この誤差を小さくすべく検討を進めた。最初に、音響特性の測定において、測定方法による音響特性の違いについて検証を行った。ここでは、声帯側から音源を入力した場合と、口唇側から音源を入力した場合の比較を行い、口唇側からの入力の方が安定して測定できることが明らかとなった。次に、3Dプリンタ造形時の精度に相当する積層間隔を変え声道模型を造形した結果、積層間隔による音響特性の違いはわずかであり、第4フォルマントに相当するスペクトルのピークなど、2kHz以上の高域に違いが出るのみであることが分かった。一方、積層間隔が異なる声道形状の情報から音響特性をFDTD法によって模擬したところ、同様に2kHz以上の高域に違いが見られたが、特に第4フォルマントに相当するスペクトルのピークに違いが見られ、3Dプリンタによる声道模型の場合と異なることが分かった。この原因については、現在調査中である。
心筋ミトコンドリアNa^+/H^+交換系とCa^<2+>イオン動態、redox状態との関連

Na^+/H^+交換系(NHE)は細胞外のNa^+と引き換えに細胞内H^+をくみ出すことにより細胞内pHを調節する重要な糖蛋白でほとんどの哺乳類の形質膜に存在する。これまで6つのisoformがクローニングされ心臓にはNHE-1が存在し,pH調節以外にも虚血再灌流傷害に重要な役割を果たすと考えられている。クローニングされたばかりのNHE-6は他の5つと異なり細胞形質膜でなくミトコンドリア内膜に存在すると考えられミトコンドリア内のpHや容量の調節に関係しているとされるがその役割は十分解明されていない。本研究の当初の目的は,このNHE-6の細胞内pH, Ca^<2+>動態,ミトコンドリアredox状態に及ぼす影響を研究することであった。NHE-6ノックアウトマウス,NHE-6過剰発現マウスの入手・作成が困難であり,H_2O_2やperoxynitrateを用いた心筋細胞傷害モデルの作成に1年半かけても成功しなかったなどの理由により目的を変更し,NHEと同様にミトコンドリアに存在しミトコンドリア容積の調節や心筋保護に重要とされるミトコンドリアK_<ATP>チャンネル(mitoK_<ATP>)に関する2つの実験を行った。用いた手法は,FAD関連フラボ蛋白のredox状態がmitoK_<ATP>開口活性の指標となることより,単離心室筋細胞を480nmの光で励起し530nmでの自家蛍光高度を測定した。薬剤の心筋梗塞サイズに対する影響はdual perfusionによるラット低流量虚血モデルを,虚血後の心機能回復の実験ではランゲンドルフ灌流心を30分虚血にし45分後の左室収縮圧の回復を指標とした。1つめの実験では,ニコランジルがmitoK_<ATP>を開口することを示し,梗塞サイズ縮小効果が5HD(mitoK_<ATP>ブロッカー)でブロックさせることを示した。2つめの実験では心筋保護薬として開発されたJTV-519(心筋保護効果の機序不明の新薬)がmitoK_<ATP>を開口させ心筋保護効果を有すること,またNHEの阻害薬(cariporide)と相乗効果を有し臨床上併用効果が期待されることを示した。ミトコンドリア内膜Na^+/H^+交換系は、ミトコンドリアの容積やCa^<2+>の恒常性維持に重要な役割を果たすことが示唆されている。ミトコンドリアは心筋細胞が生存するためのATPの供給源である一方、フリーラジカルの発生源としても重要で、この細胞内小器官の生理的機能やredox状態の維持は虚血再灌流などのストレスに対して細胞が生き残るために極めて重要と考えられる。平成11年度の研究目的は,ラット単離心筋細胞におけるミトコンドリアredox状態の測定法を確立し外因性酸化ストレスによるミトコンドリア障害モデルを作成することであった。PTI社製細胞内イオン検出装置を用いミトコンドリア内のフラボ蛋白の酸化還元状態に応じて480nmの励起光により発生する波長530nm付近の弱い蛍光を検出するため適切なdischroicmirror,bandpassfilterを設定し測定を試みた。

蛍光をうることは可能となったが、減衰の問題があり断続的に励起するプログラムを作成する必要があった。キャリブレーションも非常に難しく測定系の確立にほぼ1年を要した。つぎに、酸化ストレスとしてH_2O_2とperoxynitrite溶液をさまざまな濃度で細胞灌流液中に投与しフラボ蛋白の酸化還元状態の変化を上記方法にて検討中であるが,H_2O_2,peroxynitriteともに濃度設定が難しく試行錯誤の最中である.(濃度が高すぎると細胞収縮がおき,生き残ってもNa/H交換性阻害薬でブロックできる程度のミトコンドリア機能障害をうることができない.)平成12年度の研究目標は(1)ラット単離心筋細胞におけるミトコンドリアredox状態の測定法を確立すること、(2)外因性酸化ストレスによるミトコンドリア傷害モデルを作成し、Na^+/H^+交換系(NHE)阻害薬の効果を評価することであった。ミトコンドリア内フラボ蛋白の酸化還元状態をモニターするため,PTI社製細胞内イオン検出装置を用い,480nmの励起光により発生する波長530nm付近の弱い蛍光を検出した。単離直後の心筋細胞では細胞分離自体が酸化還元状態に強く影響するため、一定の結果が得られず。12時間24時間の培養が必要となった。Redox状態の評価は細胞10に1つ程度しか成功せず、また(2)のミトコンドリア傷害モデルの作成は困難であった(毎回細胞の状態が異なるため可逆的傷害を与えるための酸化ストレスの程度を決めることができなかった)。そこで目的を変更し、NHEと同様ミトコンドリアに存在し心筋保護に関係するとされるATP感受性Kチャンネル(KATP)の開口とフラボ蛋白のredox状態への影響とNHEとの関係を調べることにした。現在KATP開口薬がフラボ蛋白のredoxを約40%酸化へシフトするこという結果が得られた。現在はこのシフトに対するNHEの影響を検討中である。また、付随実験としてミトコンドリアKATP開口作用のあるされるニコランジルの梗塞縮小効果をラット低流量虚血モデル(5%の血流にて虚血状態を作製)にて検討。対象では23±5%から6±4%へと有意な梗塞縮小効果が認められ、その効果はミトコンドリアKATP阻害薬5HDにてほぼ遮断された。平成13年度の研究目的は,(1)ミトコンドリアATP感受性Kチャンネル(mitoK_<ATP>)の開口の状態を評価する方法を確立し,Na^+/H^+交換系(NHE)活性との関係について検討すること。(2) mitoK_<ATP>開口薬とNHE阻害薬の心筋保護に関する相乗効果を検討することであった。ラット単離心室筋細胞を用い,mitoK_<ATP>の開口度の指標とされるフラボ蛋白のredox状態を480nmの励起光により発生する波長530nm付近の蛍光強度を測定することにより評価した.mitoK_<ATP>開口作用をもつとされるニコランジル,ジアゾキシド,JTV-519は濃度依存性にフラボ蛋白のreaox状態を酸化し,その効果はmitoK_<ATP>ブロッカーである5-HDにより相殺された。カリボライド(NHE阻害薬)はこの結果に影響を与えなかったが,ミトコンドリアNHEに対するmitoK_<ATP>開口の影響は評価不可能であった。次にラット摘出心臓を用い,30分虚血後の左室機能の回復を指標とし,新薬JTV-519とカリボライド(0.13μM)の相乗効果の有無を検討した。
分子生物学的手法を用いた骨折偽関節の早期発見法と新規治療法の開発-

分子生物学的手法を用いた骨折偽関節の早期発見法と新規治療法の開発1.骨折治癒治癒において重要な役割を演じていると考えられる骨形成性因子ファミリーの遺伝子の誘導メカニズムと骨軟骨形成における役割について、動物モデルを用いた解析を行った(J Neurosurg.,2001)。その結果、BMP-4の遺伝子はメカニカルストレスに反応してそのレセプターであるALK-6と共に誘導され、その後軟骨形成がすすむ頃には、GDF-5がそのレセプターであるALK-6と共に、また、内軟骨性骨化期にはBMP-6が誘導され、これらのBMPが相互的に内軟骨性骨化を制御している可能性が示唆された。2.骨折で重要なステップとしての内軟骨性骨化や石灰化に関連する遺伝子について、ヒトの手術試料を用いて解析を行った。研究の遂行には、患者に十分な説明を行い、同意を得た上で行った。まず。内軟骨性骨化の過程で、カテプシンが特に軟骨から骨に置換される部位で重要な役割を果たしているであろう所見を得た(Histochem Cell Biol 2000)。また、石灰化の調節因子といわれるオステオポンチンも異所性石灰化部位で特異的な発現様式を呈していた(Virchows Arochive,2001)。これらの知見は、偽関節の原因の一つとしてのBMP-4の発現抑制機序の関与と、偽関節の新規治療法としてBMP-4の遺伝子導入の有用性を示唆するものであり、同時に今後ヒトの骨組織試料における分子生物学的解析への可能性を示したデータといえる。難冶性偽関節の分子生物学的治療を考える上で、我々が以前に報告した骨折仮骨形成の鍵を握る因子である骨形成因子について着目し、その遺伝子誘導のメカニズムについて解析した。骨形成因子の遺伝子発現は骨折治癒の初期に著名に誘導されることを我々は以前に明らかにしているが(J Bone Miner Res,1994)、その誘導のメカニズムについては明らかでは無い。本研究では骨形成因子遺伝子の誘導因子のひとつとしてメカニカルストレスに着目し、特にメカニカルストレスの影響を受けやすい支持器官としての脊椎に着目して脊椎不安定性をきたす動物モデルを用い、メカニカルストレスにもっともよく反応する部位である靭帯付着部の細胞における骨形成因子およびレセプターの遺伝子発現様式について検討した。その結果不安定性の強い早期において靭帯付着部の細部において骨形成因子およびそのレセプター遺伝子が誘導され、その結果その後に続く添加性の内軟骨性骨化が生じることを示した(Bone,2000)。さらにこのような添加性内軟骨性骨形成の過程で骨形成因子の遺伝子発現に引き続き、骨軟骨基質蛋白遺伝子の発現が著明に増加し、メカニカルストレスによる骨形成因子の遺伝子誘導というひとつの手法が、その後の骨軟骨形成を分子生物学的レベルにおいても促進する可能性を示唆した。これら一連の研究結果は、難治性偽関節においてもメカニカルストレスを有効に活用することにより局所での骨形成因子の遺伝子発現を高め、新たな骨軟骨形成を誘導しうる可能性を示すものである。まず。