hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子プローブによる構造と電子状態

電子顕微鏡法を用いて構造・組成評価を行った良質な試料領域から構造・電子状態の研究を行い、ボロンナノベルト、ゼオライトカーボン、ポリマー重合C_<60>、LiドープαボロンおよびMgB_4の特徴的な電子状態の存在を明らかにした。また、分光CBED法による価電子分布の異方性検出、EELSによるナノ粒子の近赤外応答の解析、異方的SXES計測による価電子分布の異方性の検出などの解析手法の高精度化を実現した。我々が開発し世界をリードしてきた、電子顕微鏡法に基づいた1)収束電子回折(CBED)法による精密結晶構造解析法、2)電子エネルギー損失分光法/X線発光分光法(EELS/XES)による電子状態解析手法を、いち早くユビキタス元素のナノ空間配列物質群に適用し、「ユビキタス元素のナノ空間配列構造の精密構造解析とそれに伴う特異な電子状態の解明」を行う事が目的である。したがって、従来のマクロな測定からナノを議論してきたこれまでの新規材料開発とは異なった展開が本特定領域研究では期待できる。これらの応用研究を通して、「ナノスケール構造・物性解析手法の更なる高精度化」を行うことも目指す。(1)ボロンナノベルトは、α-tetragonal-boron構造を有すると推測されている。これを明らかにするため、電子顕微鏡像と電子回折図形により結晶性の評価を行ったところ、α-tetragonal-boron構造と明らかに異なる結晶も含まれているものの、大半の領域はα-tetragonal-boron構造として回折波の指数付けが可能であることが明らかになった。次に、結晶対称性に最も感度が高い収束電子回折法を用い、単結晶領域から[010]入射の回折図形の取得を行った。回折強度分布を詳細に調べたところ、ほぼ2回回転対称および2種の鏡映対称を示していることから、ボロンナノベルトの大半の領域は、α-tetragonal-boron構造と結論づけた。(2)ゼオライトを鋳型として合成されたゼオライトカーボンは、作製条件によっては窒素吸着に対し炭素材料としては最大の3000m∧2/g以上の表面積を有する。電子顕微鏡でゼオライト様の周期チャンネル構造を確認した後、電子励起X線発光スペクトルの測定を行った。ゼオライトカーボン材料から得たC-K発光スペクトルのσ発光ピークおよびπ発光ピークの強度分布を、同条件で測定した炭素同素体(ダイヤモンド、C60、グラファイト)のスペクトルと比較した結果、グラファイトとC60の両方の特徴を有していることが明らかになった。これはゼオライトカーボン材料が曲率を持ったグラフェンシートからなっていることを示唆しており、X線回折、ESRなどの他の測定結果らの予想と一致することが確認された。(1)ボロンナノベルト:収束電子回折法により構造の対称性を詳細に調べた結果、c軸入射で期待された4回回転対称性観察されないだけでなく、場所により回折強度分布が異なることが明らかとなった。この事実は、X線回折での平均構造解析から、サイト占有率が100%でない、すなわち確率的に欠陥が分布しているという結果が得られていることと符合すると解釈できることがわかった。(2)ゼオライトカーボン:電子エネルギー損失分光により炭素K殻励起スペクトルを測定した結果、炭素原子のsp2混成軌道によるネットワーク構造からなっていることが明らかとなった。また、軟X線発光分光法により炭素K発光を測定した結果、照射ダメージを抑えた実験を行うとC60結晶と似た構造が価電子帯に存在することが明らかとなってきた。さらに照射ダメージを抑えた実験により、価電子のエネルギー状態の特徴を明らかにする可能性がある。(3) C60ポリマー:電子回折で単結晶性を確認した試料片からの軟X線発光分光スペクトル測定に初めて成功した。得た炭素K発光スペクトルを、C60単結晶、グラファイト、ダイヤモンド、アモルファスカーボンから得たスペクトルと比較したところ、どれとも異なる価電子エネルギー分布の特徴を有することが明らかとなった。理論計算から期待された微細構造が観察されておらず、試料結晶の品質および実験条件を再検討し、理論と比較することとなった。(4)角度分解軟X線発光分光:単結晶領域の特定がよういであるという電子顕微鏡の特徴を生かし、単結晶領域からの角度分解軟X線発光分光のテストをグラファイトで行ったところ、π電子帯とσ電子帯のエネルギーバンド部の分布書独立に抽出できることを示した。これにより、大きな単結晶が得られなくとも、価電子の異方性分布解析が可能であることを明らかにした。(1)MgB4:電子回折で単結晶性を確認した領域からの価電子励起スペクトル測定から約0.5eVにプラズモン励起が観測され、低密度キャリアーの存在が示唆された。ボロンK殻励起スペクトルからは、伝導帯のエネルギー位置がボロン同素体に比べ約1.8eVも低いことが明らかになった。

ボロンK発光スペクトル測定からは、価電子帯の上端のエネルギーが、他のボロン同素体とほぼ同じエネルギー位置であることがわかった。伝導帯および価電子帯のスペクトルを比べた結果、エネルギーギャップの大きさを0.6eVと実験的に見積もることに成功した。(2)C60ポリマー:本特定領域研究で合成された3次元C60ポリマーだけでなく、すでに合成が報告されている2次元C60ポリマーに関しても測定を行った。その結果、C60分子の重合度が進むにつれて、価電子帯上端に位置するπバンドのプロファイルに系統的な変化が生じていることが明らかになった。しかしながら、価電子バンドのエネルギー幅はモノマーC60と変わらずダイヤモンドよりも少し小さいままであった。これらは、3次元C60ポリマーは、sp3結合というよりも曲率を持ったsp2結合ネットワークの特徴を有していること示唆している。(3)角度分解軟X線発光分光:単結晶領域の特定が容易であるという電子顕微鏡の特徴を生かし、単結晶領域からの角度分解軟X線発光分光のテストをグラファイトおよび六方晶BNで行ったところ、π電子帯とσ電子帯のエネルギーバンド部の分布を独立に抽出できることを示した。これにより、大きな単結晶が得られなくとも、価電子の異方性分布解析が可能であることを明らかにした。さらに、この手法をαボロンのB12クラスター間に存在する異方的3中心結合の計測に適応し、理論計算との比較検討をおこなった。(1)ゼオライト鋳型カーボン:これまでで最高の37wt%の炭素をYゼオライトに詰めて作成したゼオライト鋳型カーボン(領域内のA05班で合成)に関し、電子顕微鏡観察、電子エネルギー損失分光(EELS)測定および炭素K発光スペクトルの測定を行った。その結果、1)電子顕微鏡像および電子回折図形の観察から、電子線照射によるダメージがほとんど無くこれまでよりもずっと強固な炭素原子のネットワークが形成されている、2)EELSスペクトル(伝導体状態密度分布)はsp2結合の特徴を示していた、3)炭素K発光スペクトル(価電子帯状態密度分布)はsp2結合からなる炭素ネットワーク物質であることを示すと同時にグラファイトよりもC60に近い特徴を有することを示唆した、などが明らかとなった。(2)角度分解軟X線発光分光:単結晶領域の特定がよういであるという電子顕微鏡の特徴を生かし、マキシマムエントロピー法を用いたX線構造解析により異方的な電荷分布が報告されており、かつ、大きな単結晶が合成できないαボロン単結晶(領域内のA01班で合成)を用い、異方性計測による価電子分布の異方性計測を行った。その結果、発光主ピークの両側に異方的発光強度の存在を確認した。計算(Wien-2k、クラスター計算)と比較した結果、1)価電子帯上端の発光強度の異方性はクラスター間2中心結合(B12クラスター軌道のt_<1u>,t_<2u>の異方性)に帰属し、2)主ピークより低エネルギー側の肩状構造付近がクラスター間3中心結合(B12クラスター軌道のsgの異方性)に対応するのではないかと同定した。(1)ゼオライト鋳型カーボン:1)
円柱列を過ぎる流れの合流現象と乱流への遷移

本研究計画では円柱列を過ぎる流れが振動流へ遷移し,カオス的な状態を経て乱流に遷移する道筋を明らかにすることを目的としている.レイノルズ数が小さいとき,流れは円柱列の周期と同じ周期をもつ定常な流れである.レイノルズ数が大きくなると定常流の不安定性によって振動流へと遷移する.不安定モードには,円柱列の周期と同じ周期をもつモード,2倍周期,3倍周期などをもつモードがあり,これらの不安定性により流れは複雑な乱流へと遷移する.2002年度においては角柱列を過ぎる流れの不安定性と乱流への遷移について重点的に調べ,流れが振動しているときにもウェイクの非線形相互作用により,隣り合う角柱から同期して渦が放出される現象を発見し,その発生機構の物理的な説明を行った.その研究成果を2003年にFluid Dynamics Researchに発表した.2003年度と2004年度においては,主に、流れと平行におかれた2本の円柱を過ぎる流れについて実験と数値シミュレーションおよび流れの安定性理論により調べ,2本の円柱に働く抵抗も特異的なふるまいをすることを見いだした.この成果は2005年にPhysics of Fluidsに発表した.2005年度には,2本の円柱が流れと垂直に並べておかれているとき、無限個の円柱が並んだ円柱列を過ぎる流れとほぼ同様の遷移を行うことが見いだした.また、円柱の間隔によっては、2本の円柱後方流が同位相で非線形共鳴をする場合と逆位相で非線形共鳴する場合だけでなく、定常な偏向流が生じることを発見し、その物理的な成因を明らかにした。さらに、円周上に円柱列が等間隔で並んでおかれており,円の中心から流体が半径方向に吹き出すときの流れの安定性と遷移を調べ,乱流に至る道筋を明らかにした。この成果をPhysics of Fluidsに投稿した.2005年度が本研究計画の最終年となったが,これまでの研究成果でまだ発表していない事柄を精査し,今後とも逐次論文に発表を行う予定である.本研究計画では円柱列を過ぎる流れが振動流へ遷移し,カオス的な状態を経て乱流に遷移する道筋を明らかにすることを目的としている.レイノルズ数が小さいとき,流れは円柱列の周期と同じ周期をもつ定常な流れである.レイノルズ数が大きくなると定常流の不安定性によって振動流へと遷移する.不安定モードには,円柱列の周期と同じ周期をもつモード,2倍周期,3倍周期などをもつモードがあり,これらの不安定性により流れは複雑な乱流へと遷移する.2002年度においては角柱列を過ぎる流れの不安定性と乱流への遷移について重点的に調べ,流れが振動しているときにもウェイクの非線形相互作用により,隣り合う角柱から同期して渦が放出される現象を発見し,その発生機構の物理的な説明を行った.その研究成果を2003年にFluid Dynamics Researchに発表した.2003年度と2004年度においては,主に、流れと平行におかれた2本の円柱を過ぎる流れについて実験と数値シミュレーションおよび流れの安定性理論により調べ,2本の円柱に働く抵抗も特異的なふるまいをすることを見いだした.この成果は2005年にPhysics of Fluidsに発表した.2005年度には,2本の円柱が流れと垂直に並べておかれているとき、無限個の円柱が並んだ円柱列を過ぎる流れとほぼ同様の遷移を行うことが見いだした.また、円柱の間隔によっては、2本の円柱後方流が同位相で非線形共鳴をする場合と逆位相で非線形共鳴する場合だけでなく、定常な偏向流が生じることを発見し、その物理的な成因を明らかにした。この成果をPhysics of Fluidsに投稿した.2005年度が本研究計画の最終年となったが,これまでの研究成果でまだ発表していない事柄を精査し,今後とも逐次論文に発表を行う予定である.本研究計画の目的は円柱列を過ぎる流れが振動流へ遷移し,カオス的な流れを経て乱流に遷移する道筋を明らかにすることである.レイノルズ数が小さいとき,流れは円柱列の周期と同じ周期をもつ定常な流れである.レイノルズ数が大きくなると定常流の不安定性によって振動流へと遷移する.不安定モードは,円柱列の周期と同じ周期をもつモードによる不安定性,2倍周期,3倍周期などをもつモードの不安定性がある.2002年度においては円柱列ではなく,角柱列を過ぎる流れの不安定性と乱流への遷移について重点的に調べた.特に,角柱列を過ぎる流れにおいて,以前申請者が見いだした定常合流現象だけでなく,流れが振動しているときにもウェイクの非線形相互作用により,隣り合う角柱から同期して渦が放出される現象を発見し,その発生機構の物理的な説明を行った.このとき,渦放出には同位相渦放出と反位相渦放出の2つの非線形干渉があることを明らかにした.この研究成果はFluid Dynamics Researchに投稿し,受理されたので近く出版される予定である.また,流れと平行におかれた2本の円柱を過ぎる流れについて実験と解析および数値シミュレーションにより調べ,物理的に興味ある結果を得ている.来年度以降の研究において,最終的に円柱列を過ぎる流れの分岐ダイアグラムを求め,乱流への遷移の道筋を明らかにする.

本研究計画の目的は円柱列を過ぎる流れが振動流へ遷移し,カオス的な状態を経て乱流に遷移する道筋を明らかにすることである.レイノルズ数が小さいとき,流れは円柱列の周期と同じ周期をもつ定常な流れである.レイノルズ数が大きくなると定常流の不安定性によって振動流へと遷移する.不安定モードには,円柱列の周期と同じ周期をもつモードによる不安定性,2倍周期,3倍周期などをもつモードの不安定性がある.2002年度においては角柱列を過ぎる流れの不安定性と乱流への遷移について重点的に調べた.特に,角柱列を過ぎる流れにおいて,以前申請者が見いだした定常合流現象だけでなく,流れが振動しているときにもウェイクの非線形相互作用により,隣り合う角柱から同期して渦が放出される現象を発見し,その発生機構の物理的な説明を行った.このとき,渦放出には同位相渦放出と反位相渦放出の2つの非線形干渉があることを明らかにし,その研究成果をFluid Dynamics Researchに発表した.2003年度においては,流れと平行におかれた2本の円柱を過ぎる流れについて実験と数値シミュレーションおよび流れの安定性理論により調べ,この流れは2本の円柱の間隔がある範囲にあるときにはその分岐構造が亜臨界ホップ分岐となり,円柱に働く抵抗も特異的なふるまいをすることが判明した.また,2本の円柱が流れと垂直に並べておかれているときには無限個の円柱が並んだ円柱列を過ぎる流れとほぼ同様の遷移を行うことが見いだされた.来年度以降の研究において,最終的に円柱列を過ぎる流れの分岐ダイアグラムを求め,乱流への遷移の道筋を明らかにする.本研究計画では円柱列を過ぎる流れが振動流へ遷移し,カオス的な状態を経て乱流に遷移する道筋を明らかにする.レイノルズ数が小さいとき,流れは円柱列の周期と同じ周期をもつ定常な流れである.レイノルズ数が大きくなると定常流の不安定性によって振動流へと遷移する.不安定モードには,円柱列の周期と同じ周期をもつモード,2倍周期,3倍周期などをもつモードがあり,これらの不安定性により流れは複雑な乱流へと遷移する.2002年度においては角柱列を過ぎる流れの不安定性と乱流への遷移について重点的に調べた.特に,角柱列を過ぎる流れにおいて,以前申請者が見いだした定常合流現象だけでなく,流れが振動しているときにもウェイクの非線形相互作用により,隣り合う角柱から同期して渦が放出される現象を発見し,その発生機構の物理的な説明を行った.このとき,渦放出には同位相渦放出と反位相渦放出の2つの非線形干渉があることを明らかにし,その研究成果をFluid Dynamics Researchに発表した.2003年度と2004年度においては,流れと平行におかれた2本の円柱を過ぎる流れについて実験と数値シミュレーションおよび流れの安定性理論により調べ,2本の円柱の間隔がある範囲にあるときにはその分岐構造が亜臨界ホップ分岐となり,円柱に働く抵抗も特異的なふるまいをすることが判明した.この成果はPhysics of Fluidsに投稿するための原稿を執筆中である.また,2本の円柱が流れと垂直に並べておかれているときには無限個の円柱が並んだ円柱列を過ぎる流れとほぼ同様の遷移を行うことが見いだされた.この成果は今年5月にJournal of the Physical Societyに論文として掲載される予定である.来年度は本研究計画の最終年であるため,これまでの研究成果でまだ発表していない事柄を精査し,逐次発表を行う.また,最終的に円柱列を過ぎる流れが,乱流へ遷移する道筋を明らかにする.
オートファジー阻害剤による大腸癌微小血管転移根治療法の開発

細胞周期停止を誘導するCDK阻害剤を固形癌細胞株および正常ヒト線維芽細胞株に投与したところ、オートファジーが誘導されるものと誘導されないものに分類された。CDK阻害剤によりオートファジーが誘導された細胞株群にオートファジー阻害処理を加えたところアポトーシスの誘導が観察されたが、オートファジーが誘導されなかった細胞株ではオートファジー阻害処理によりアポトーシスは観察されなかった。これらの結果から一部の固形癌細胞株においてはCDK阻害剤の投与で細胞保護機能を有するオートファジーが誘導され、このような固形腫瘍においてCDK阻害剤とオートファジー阻害剤の併用は新たな治療戦略になりうると考えられた。ドキシサイクリン存在下でオートファジー関連遺伝子を安定的に発現抑制できる細胞株の樹立のために、ATG7, BECN1 shRNAが組み込まれているBiosettia社のpLV RNAisystemの発現カセットを利用した。樹立細胞株についてはHCT116を選択したが、IRES配列下での発現制御を受けるためか、セレクションマーカーの一つであるGFP, RFPの発現が目視レベルで困難であった。そのためマウス実験への移行は遅れている状況である。一方、in vitroの実験では血管新生阻害剤投与状態を代用するものとして、飢餓状態、CDK阻害剤投与状態でのオートファジー誘導能の変化とオートファジー阻害(ATG5, BECN1 siRNAまたはクロロキンを使用)による細胞状態の発現状況について確認実験を行った。用いた培養細胞株はヒト乳癌細胞株のBT474、MCF7、MDA-MB231、MDA-MB435S、SKBr3、ヒト肺腺癌細胞株のA431、ヒト胃癌細胞株のNCI-N87、ヒト大腸癌細胞株のSW480、および正常細胞株としてヒト線維芽細胞株のKMST-6を用いた。飢餓状態では、すべての細胞株においてオートファジーが誘導され、その状態でオートファジーを阻害するとアポトーシスが観察された。一方、CDK阻害剤処理では、一部の細胞株にのみオートファジーが引きこされ、オートファジー阻害するとこれら細胞株ではアポトーシスが引き起こされたが、オートファジーが誘導されなかった細胞株においては、オートファジー阻害でもアポトーシスは誘導されなかった。正常細胞株のKMST-6はCDK阻害剤によるオートファジー誘導は観察されなかった。これらの結果から、CDK阻害剤によるオートファジー誘導能の有無はオートファジー阻害の併用療法の抗腫瘍効果に関するバイオマーカーと考えられた。樹立細胞株についてはHCT116を選択したが、セレクションマーカーの一つであるGFP, RFPの発現が目視レベルで困難であった。これらはIRES配列下での発現制御を受けるため、工夫の余地が必要であると考えられた。同時に行った予備実験としてin vitroでの血管新生阻害剤投与状態を代用するものとして、飢餓状態、CDK阻害剤投与状態でのオートファジー誘導能の変化とオートファジー阻害(ATG5, BECN1 siRNAまたはクロロキンを使用)による細胞状態の発現状況について確認実験を行った。培養細胞株はBT474、MCF7、MDA-MB231、MDA-MB435S、SKBr3、(いずれもヒト乳癌細胞株)、A431(ヒト肺癌細胞株)、NCI-N87(ヒト胃癌細胞株)、SW480(ヒト大腸癌細胞株)、KMST-6(ヒト線維芽細胞株)を用いた。その結果、飢餓状態に置いた場合、すべての細胞株においてオートファジー阻害は細胞にアポトーシスを誘導したが、CDK阻害剤においてはオートファジー阻害は一部の細胞株にのみアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。これら細胞株におけるアポトーシス誘導能の違いは、オートファジー誘導能の違いに起因し、CDK阻害剤でオートファジーが誘導される細胞株についてはオートファジーが細胞生存に寄与することが明らかになった。このことは、今後予定しているマウスをもちいたin vivoでの実験への展開を支持する結果と考えている。ドキシサイクリン存在下でオートファジー関連遺伝子(ATG7, BECN1 shRNA)を安定的に発現抑制できるRNAi発現プラスミドを数種類入手し、HCT-116, SW480に導入してノックダウン細胞株の樹立をはかったが、セレクションマーカーとなるGFP, RFPの発現が低く樹立を確認する事ができなかった。そのためin vivoでの研究は困難と判断、in vitroでの研究を中心にデータの蓄積を行なった。

血管新生阻害剤投与状態を代用するものとしての低血清培地条件下や、フラボピリドールに加え、CDK4阻害剤を用いて細胞周期を止めた状態で、オートファジー阻害(ATG5およびBECN1 siRNA、クロロキン、3-メチルアデニン)のon/offでのオートファジー発現状況と細胞表現形の変化について追加実験を行った。前年度同様に培養細胞株はBT474、MCF7、MDA-MB231、MDA-MB435S、SKBr3、(いずれもヒト乳癌細胞株)、A431(ヒト肺癌細胞株)、NCI-N87(ヒト胃癌細胞株)、SW480(ヒト大腸癌細胞株)、KMST-6(ヒト線維芽細胞株)を用いた。CDK4阻害剤使用下においてもオートファジー阻害剤との併用により一部の細胞株にアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。これら表現系の違いを規定する因子について、オートファジー関連遺伝子の発現との関連を軸に、現在in silicoでの解析を進めている。臨床腫瘍学各種培養細胞株を用いたin vitroでのオートファジー関連遺伝子の発現抑制した際のオートファジー阻害剤との併用効果についてのデータは順調に収集できており、これまで国内外の学会で発表を行ってきた。in vitroの実験については、さらに培養細胞株の種類を増やしてデータの収集を図るとともに、CDK阻害剤によるオートファジー誘導能が引き起こされる細胞株と引き起こされない細胞株の差異についての分子メカニズムの解析について着手している。一方、これらin vitroでの研究成果を元に、in vivoでの実験に着手するため、蛍光蛋白質(GFP, RFP)マーカーとした安定的オートファジー関連遺伝子発現抑制細胞株の樹立を試みているが、現在のところ樹立に成功していない。ドキシサイクリン存在下でオートファジー関連遺伝子(ATG7, Beclin-1)のsiRNA発現誘導とIRESプロモーター下でマーカー蛋白質(GFP, DsRed)の発現を確認できるベクター複数種類を用いたが、オートファジー関連遺伝子の発現抑制とマーカー蛋白質の発現誘導が確認できていない。さらにレトロウィルス(lentivirus)を用いて安定的オートファジー関連遺伝子発現抑制細胞株の樹立も試みたが、やはりマーカーの確認が目視で難しい状況であり、現在はin vitroの解析を中心に研究を行っている状況であるオートファジー関連遺伝子の発現抑制した際のオートファジー阻害剤との併用効果についてのvitroでのデータは順調に収集できており、予備データとして国内外学会で発表をしている。当初の予想通り、vitroでの血管新生阻害疑似条件下でのオートファジー阻害剤投与効果は、個々の細胞が有するオートファジー誘導能に依存することが判明したため、予定通りin vivoでの実験に着手する予定である。しかし安定的オートファジー関連遺伝子発現抑制細胞株の樹立の進捗がやや遅れている。蛍光蛋白質(GFP, RFP)の発現を目視で確認する予定であったが、IRES配列を用いているためか発現が弱く困難であることが一因であると思われる。またHCT116細胞株特有の問題も考えられたため、今後他の細胞株も用いて検討する予定である。また当初レトロウィルスを用いることは予定していなかったが、今後はlentivirusを用いて安定的オートファジー関連遺伝子発現抑制細胞株の樹立を急ぐ予定である。
製剤‐病原体間相互作用評価に基づく分子標的指向型有機無機複合製剤の設計

本研究の目的は、基課題である「高分子ナノ粒子キャリアの病原体との相互作用の可視化のための電子顕微鏡評価法の開発」研究を発展させ、1バイオフィルム感染症治療のための有機無機複合製剤の設計をするとともに、2作製した製剤の最適化のため最先端の電子顕微鏡群及び放射光を用いた評価系の確立を進めるものである。2019年度に予定している海外における研究を進める準備として、2018年度は国内でバイオフィルム感染症治療のための有機無機複合製剤の設計を行った。これまでの高分子基剤を用いたドラッグデリバリーシステム用粒子製剤の設計の知識を活かし、種々の無機材料粒子を含有した高分子製剤の調製のために、材料比や攪拌速度、遠心速度、分散剤などの条件を検討した。抗菌活性評価の結果から、ほとんどの有機無機複合製剤において高い抗菌活性効果を確認している。また、調製した製剤の物性評価や電子顕微鏡(イオン液体を応用した微細形態観察手法及びナノ領域からの蛍光可視化手法)による形態観察、放射光を用いた構造評価(大気圧における液体試料の測定)を実施し、無機材料がバイオフィルム形成菌に及ぼす抗菌メカニズムの解明を試みている。最終的な目的である副作用を示すことなく高い治療効果を示す製剤を設計するために、上記の評価結果に基づき製剤設計の最適化を行った。調製に成功した製剤は、2019年度に予定している海外機関における最先端の電子顕微鏡群を用いた評価を行う予定である。本年度は、(1)複合用無機材料粒子の合成法の最適化、(2)種々の無機材料粒子を含有した高分子製剤の調製、(3)調製した製剤の抗菌活性効果の確認、(4)電子顕微鏡を用いた製剤の形態・局所分析評価、(5)放射光を用いた製剤の構造評価を行った。上記の研究を通じて、いくつかの成果を得ることができた。【具体的な進捗状況】複合用無機材料粒子(銀、金、銅、亜鉛、酸化鉄粒子)の合成法を最適化し、基課題で調製に成功している高分子製剤の調製法を利用して、無機材料粒子を含有した高分子製剤の調製を行った。材料比や攪拌速度、遠心速度、分散剤などの条件探索を行い、調製法の最適化が可能となった。抗菌活性評価の結果、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対して高い効果を示すことが明らかとなった。電子顕微鏡を用いた評価から、銀・金・銅・酸化鉄粒子を複合した製剤の形態を明らかにしている。また、局所分析を行うことで、銀ナノ粒子を複合した高分子製剤中における銀ナノ粒子の存在状況を明らかにした。放射光を用いた評価では、高分子製剤と各種金属粒子の化学結合状態を明確にした。これらの評価結果から、金属粒子がバイオフィルム形成菌に対し、どのように抗菌活性を発揮するのかを検討している。これらを踏まえて、次年度以降には、海外機関においてその場液中観察が可能な透過型電子顕微鏡を用いた評価を行い、様々な環境下における種々の無機材料粒子を含有した高分子製剤の挙動を明らかにする。その結果に基づき、ターゲットに対してより製剤効果を発揮しうる製剤設計を試みる。現在、実験としては概ね順調に進んでいる。次年度は、2019年4月よりフランスのパリディドロ大学にて1年間研究を行う予定である。次年度は、(1)無機材料粒子を含有した高分子製剤の液中における挙動の可視化、(2)細胞または菌中における無機材料粒子を含有した高分子製剤の相互作用の可視化、(3)電子顕微鏡液中状態における無機材料粒子を含有した高分子製剤の分解挙動の可視化の研究を進めていく。海外滞在中は、国内の研究協力者に複数種の菌からなるバイオフィルムに対する無機材料粒子を含有した高分子製剤の抗菌活性評価、無機材料粒子を含有した高分子製剤の電子顕微鏡を用いた形態・局所分析評価、放射光を用いた無機材料粒子を含有した高分子製剤の構造評価を依頼する。得られた成果は、随時、論文および学会にて発表する予定である。内定年度:2017本研究の目的は、基課題である「高分子ナノ粒子キャリアの病原体との相互作用の可視化のための電子顕微鏡評価法の開発」研究を発展させ、1バイオフィルム感染症治療のための有機無機複合製剤の設計をするとともに、2作製した製剤の最適化のため最先端の電子顕微鏡群及び放射光を用いた評価系の確立を進めるものである。本年度は、(1)複合用無機材料粒子の合成法の最適化、(2)種々の無機材料粒子を含有した高分子製剤の調製、

(3)調製した製剤の抗菌活性効果の確認、(4)電子顕微鏡を用いた製剤の形態・局所分析評価、(5)放射光を用いた製剤の構造評価を行った。上記の研究を通じて、いくつかの成果を得ることができた。【具体的な進捗状況】複合用無機材料粒子(銀、金、銅、亜鉛、酸化鉄粒子)の合成法を最適化し、基課題で調製に成功している高分子製剤の調製法を利用して、無機材料粒子を含有した高分子製剤の調製を行った。材料比や攪拌速度、遠心速度、分散剤などの条件探索を行い、調製法の最適化が可能となった。抗菌活性評価の結果、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対して高い効果を示すことが明らかとなった。電子顕微鏡を用いた評価から、銀・金・銅・酸化鉄粒子を複合した製剤の形態を明らかにしている。また、局所分析を行うことで、銀ナノ粒子を複合した高分子製剤中における銀ナノ粒子の存在状況を明らかにした。放射光を用いた評価では、高分子製剤と各種金属粒子の化学結合状態を明確にした。これらの評価結果から、金属粒子がバイオフィルム形成菌に対し、どのように抗菌活性を発揮するのかを検討している。これらを踏まえて、次年度以降には、海外機関においてその場液中観察が可能な透過型電子顕微鏡を用いた評価を行い、様々な環境下における種々の無機材料粒子を含有した高分子製剤の挙動を明らかにする。その結果に基づき、ターゲットに対してより製剤効果を発揮しうる製剤設計を試みる。現在、実験としては概ね順調に進んでいる。次年度は、2019年4月よりフランスのパリディドロ大学にて1年間研究を行う予定である。次年度は、(1)無機材料粒子を含有した高分子製剤の液中における挙動の可視化、(2)細胞または菌中における無機材料粒子を含有した高分子製剤の相互作用の可視化、(3)電子顕微鏡液中状態における無機材料粒子を含有した高分子製剤の分解挙動の可視化の研究を進めていく。海外滞在中は、国内の研究協力者に複数種の菌からなるバイオフィルムに対する無機材料粒子を含有した高分子製剤の抗菌活性評価、無機材料粒子を含有した高分子製剤の電子顕微鏡を用いた形態・局所分析評価、放射光を用いた無機材料粒子を含有した高分子製剤の構造評価を依頼する。得られた成果は、随時、論文および学会にて発表する予定である。
3次元X線分析顕微鏡の開発と実環境下でのマイクロ〜ナノ解析

「X線ポリキャピラリーレンズ」という新規な光学素子を用いて微小部蛍光X線分析装置組み立てることができた。ポリキャピラリーX線レンズは、微細なガラス管を数10万本以上束ね、X線集光レンズとして成形したものであり、X線の取り込み角度を大きく取れるため、X線を効率良く利用でき、かつ微小領域に集光することが可能となる。まず、ポリキャピラリーX線レンズの性能を評価するために、ビームサイズを計測した。集光の焦点において約48ミクロンであったが、焦点距離に強く依存することが分かった。この装置を利用して以下の実験を行った。(1)視野可変元素マッピングビームサイズが焦点位置に応じて数10ミクロンから数100ミクロンに変化することを利用して、試料に応じて視野を変えながら、効率よく元素マッピングを得ることを提案し、電子部品材料に対して実証した。(2)キノア種子の元素マッピングキノアと呼ばれる1mm程度の種子の内部の元素分布の測定を行った。蛍光X線は大気圧下で非破壊的に測定できるので、この特徴を生かして成長過程の種子、及び、芽や根の内部の元素分布(K, Cl, Fe, Cu,など)を測定した。この結果はTXRF2003国際会議でポスター発表し、ベストポスター賞を受賞した。(3)原子間力顕微鏡との組み合わせ実験原子間力顕微鏡のカンチレバーに非常に小さい穴を設けることにより、物理的にX線ビームサイズを絞ることを検討した。これにより、原子間力像とX線元素分布像の同時観測が可能となった。(4)3次元X線分析顕微鏡の設計・試作研究期間の最後、および研究終了後、引き続いて3次元X線分析顕微鏡の設計・試作を行っており、H17年8月現在、装置の試作を終えつつある。2つのポリキャピラリーX線レンズをX線入射励起側と蛍光X線の検出側に用いる共焦点型の配置を採用した。15年度の目標は第一に微小部蛍光X線分析装置の実験装置を組み立てることであったが、平成15年10月までには一応の装置の組み立てが終了した。この装置にはまだ日本では使用例が少ない「X線ポリキャピラリーレンズ」を利用した。これは、微細なガラス管を数10万本以上束ね、1つのX線集光レンズとして成形したものであり、X線の取り込み角度を大きく取れるため、X線を効率良く利用でき、かつ微小領域に集光することが可能となる。X線ポリキャピラリーと細孔付きカンチレバーを有するAFMユニットを設計・購入し、現有のX線発生装置の架台に取り付ける。CCDカメラ、試料ステージ、X線検出器などを配置した。まず、このX線レンズの特性を評価する実験を行った。直径10ミクロンのタングステンワイヤーを3次元的にパソコンにより制御可能な試料ステージに取り付け、ワイヤーからの蛍光X線強度を測定することにより評価した。その結果、焦点位置において約50ミクロンであり、焦点から離れるに従い、ビーム径も広がることが分かった。このように、X線レンズは非常に試料-レンズ間の距離依存性が強いことが明らかとなった。デモンストレーションとしてキノアと呼ばれる1mm程度の種子の内部の元素分布の測定を行った。蛍光X線は大気圧下で非破壊的に測定できるので、この特徴を生かして成長過程の種子、及び、芽や根の内部の元素分布(K,Cl,Fe,Cu,など)を測定した。この結果は昨年のTXRF2003国際会議でポスター発表し、以下のように、ベストポスター賞を受賞した。X線発生装置の作動に必要な冷却水システムに問題が生じたので今年度の助成金で冷却装置を購入した。

さらに、「X線ポリキャピラリーレンズ」という新規な光学素子を用いて微小部蛍光X線分析装置組み立てることができた。ポリキャピラリーX線レンズは、微細なガラス管を数10万本以上束ね、X線集光レンズとして成形したものであり、X線の取り込み角度を大きく取れるため、X線を効率良く利用でき、かつ微小領域に集光することが可能となる。まず、ポリキャピラリーX線レンズの性能を評価するために、ビームサイズを計測した。集光の焦点において約48ミクロンであったが、焦点距離に強く依存することが分かった。この装置を利用して以下の実験を行った。(1)視野可変元素マッピングビームサイズが焦点位置に応じて数10ミクロンから数100ミクロンに変化することを利用して、試料に応じて視野を変えながら、効率よく元素マッピングを得ることを提案し、電子部品材料に対して実証した。(2)キノア種子の元素マッピングキノアと呼ばれる1mm程度の種子の内部の元素分布の測定を行った。蛍光X線は大気圧下で非破壊的に測定できるので、この特徴を生かして成長過程の種子、及び、芽や根の内部の元素分布(K,Cl,Fe,Cu,など)を測定した。この結果は昨年のTXRF2003国際会議でポスター発表し、以下のように、ベストポスター賞を受賞した。(3)原子間力顕微鏡との組み合わせ実験原子間力顕微鏡のカンチレバーに非常に小さい穴を設けることにより、物理的にX線ビームサイズを絞ることを検討した。これにより、原子間力像とX線元素分布像の同時観測が可能となった。
機能性消化管障害の新規治療標的の探索－粘膜内微小炎症による知覚受容の増強－

機能性胃腸障害の原因には生活上のストレスなどの心理的・社会的要因が病態に影響を及ぼしていると言われている.実際に動物実験では,出生直後に母親から分離し母子間の接触が断たれる母子分離(Maternal Separation: MS)ストレスにより,成長後に大腸知覚過敏を生じることから,MSストレス負荷ラットは過敏性腸症候群(IBS)モデルとして知られている.MSストレス負荷ラットでは,大腸のみならず上部消化管の知覚過敏も生じていることが想定されるが,胃の知覚に与える影響に関しては知られていない.今回、ラットを用いてMSストレスにより,成長後に胃知覚過敏が生じるのかどうかにつき検討した.結果として新生仔期のMSストレス負荷が,成長後の機械刺激に対する胃知覚過敏の発症に影響を与えることが判明した.MSストレス負荷ラットは,機能性ディスペプシアの患者に類似した胃知覚過敏を示す有用な病態モデルであると考える.母子分離ストレスを加えることで胃知覚過敏動物実験モデルの作成に成功した.同モデルを用いることで,今後計画している研究を問題なく遂行可能と考える.この胃知覚過敏モデルラットを用いて,内臓知覚過敏の分子メカニズムの解明を目指す.具体的には,末梢神経や中枢神経内,あるいは十二指腸粘膜内での疼痛関連神経伝達物質の関与につき詳細に検討を加えていく予定である.機能性胃腸障害の原因には生活上のストレスなどの心理的・社会的要因が病態に影響を及ぼしていると言われている.実際に動物実験では,出生直後に母親から分離し母子間の接触が断たれる母子分離(Maternal Separation: MS)ストレスにより,成長後に大腸知覚過敏を生じることから,MSストレス負荷ラットは過敏性腸症候群(IBS)モデルとして知られている.MSストレス負荷ラットでは,大腸のみならず上部消化管の知覚過敏も生じていることが想定されるが,胃の知覚に与える影響に関しては知られていない.今回、ラットを用いてMSストレスにより,成長後に胃知覚過敏が生じるのかどうかにつき検討した.結果として新生仔期のMSストレス負荷が,成長後の機械刺激に対する胃知覚過敏の発症に影響を与えることが判明した.MSストレス負荷ラットは,機能性ディスペプシアの患者に類似した胃知覚過敏を示す有用な病態モデルであると考える.母子分離ストレスを加えることで胃知覚過敏動物実験モデルの作成に成功した.同モデルを用いることで,今後計画している研究を問題なく遂行可能と考える.この胃知覚過敏モデルラットを用いて,内臓知覚過敏の分子メカニズムの解明を目指す.具体的には,末梢神経や中枢神経内,あるいは十二指腸粘膜内での疼痛関連神経伝達物質の関与につき詳細に検討を加えていく予定である.次年度では内臓知覚過敏の分子メカニズム解明にあたり,各種抗体や試薬購入のため相当額の出費を予定しているため,当該年度では,動物実験モデル作成に焦点を当てることで支出額を抑えた.
磁性流体に作用する磁気力の変化を利用した流体運動駆動源への応用

磁性流体に作用する磁気力の変化によって誘起される磁性流体液柱の運動を流体運動の駆動源とするための基礎研究として、モデル管内の液柱の運動について実験的ならびに理論的な検討を行った。得たる結果を要約すると次のようになる。(1)磁性流体を希釈することなく原液のまま用いることにより、これまでよりも大きな駆動力が得られ、低い磁場でも十分に大きな液柱変位が得られることを明らかにした。(2)変動磁場を大きくするとより大きな液柱変位が得られる可能性はあるが、条件によっては被駆動液体との境界が分離し、被駆動液体部に十分な変位を伝達できなくなる場合もあることを明らかにした。また、装置の小型化と省電力化の観点から、磁性流体に磁場を印加するソレノイドを小型化し、断面積の変化に基づく損失を考慮する必要がない内径が一様なU字管内の液柱運動について検討を行った結果より、(3)損失を小さくすると小さな変動磁場でも大きな変位が得られるが、変位が大きな場合には乱れも減衰せず、変位波形に乱れが残ったままになる場合もあることを明らかにした。したがって、滑らかな変位波形を得るにはある程度の適切な抵抗も必要であると考えられる。(4)磁性流体液柱長さを短くしたことにより、最大の変位振幅が得られる振動数は従来のモデル管のほぼ2倍となった。さらに、装置の小型化に伴い液柱運動に及ぼす影響が大きくなると考えられる管内磁性流体の表面張力についての毛管現象を利用した測定から、(5)磁性流体液柱の表面張力の管軸方向成分は、印加する磁場の強さが増大すると減少するようになることを明らかにした。
遺伝性末梢神経障害におけるPMP-22遺伝子の異常と発症メカニズムの検討

2.極めて稀にPMP-22の点変異があり、我々も1例のみ確認した。この症例の臨床症状はPMP-22の重複よりも重く、他の文献例と併せて、PMP-22点変異の臨床症状は重複例よりも重症である可能性を示した。4. PMP-22の重複を認めるCMT、PMP-22の半減を認めるHNPP、それぞれの患者の線維芽細胞でPMP-22mRNAの発現を検討したところ、遺伝子量(gene dosage)に比例してCMTでは増加し、HNPPではほぼ半減していることがわかった。従って他のミエリン蛋白の発現とのアンバランスが臨床症状を招いていると考えられるが、その詳細なメカニズムは不明である。5. CMTの中でPMP-22遺伝子異常以外にconnexin 32(以下Cx32)の点変異を示すものがかなり(我々の確認し得たのは3家系)存在することがわかった。6. Cx32はミエリンの膜蛋白と考えられ、末梢ミエリンの代表的蛋白質であるPoとほぼ同じ発現コントロール下にあることがわかった。ただしPoはミエリン形成が活発な時期(ラットの生後12週)に発現が増えるが、Cx32は成長とともに増加する点が異なっていた。7.末梢ミエリンにはCx32以外にCx43が存在することを確認した。Cx43の存在意義については検討中である。Charcot-Marie-Tooth病(CMT)の本邦における遺伝子解析と発症メカニズムについて検討した。type1は諸外国と同様PMP-22遺伝子の重複例が大多数を占めることがわかった。稀とされるPMP-22の点変異例が1例みつかった。また、type Xが2家系あり、connexin32の新たな点変異を見いだした。点変異の位置と臨床症状に相関があることが推定された。1.CMTの中でPMP-22遺伝子異常以外にconnexin32(以下Cx32)の点変異を示すものがかなり(我々の確認し得たのは3家系)存在することがわかった。2.Cx32はミエリンの膜蛋白と考えられ、末梢ミエリンの代表的蛋白質であるPoとほぼ同じ発現コントロール下にあることがわかった。ただしPoはミエリン形成が活発な時期(ラットの生後12週)に発現が増えるが、Cx32は成長とともに-増加する点が異なっていた。3.末梢ミエリンにはCx32以外にCx43が存在することを確認した。
家族の生活様式と地域社会変容のダイナミズムに関する実証的研究-伝統的地場産業地域における自営業世帯を事例として-

本研究では、伝統的な地場産業の集積地域における零細な自営業世帯の生活実態調査を実施して、家族構造の変化と生活様式の変容の過程を明らかにし、これらと地域社会との相互連関について検討した。わが国の伝統的な地場産業集積地域では、これまで自営業経営者とその家族が地域を支える力となってきたが、近年、自営業世帯における生活様式は大きく変容し、これによって地域社会の変容をもたらしている。事例としてとりあげた伝統的地場産業である備前焼窯元集積地域、門前町である金刃比毘羅宮表参道について、自営業世帯における営業と家庭生活の双方について実証的に分析した。その結果、伝統的な地場産業の集積地域における自営業経営者とその家族の生活様式は大きく変容しており、零細な自営業に支えられていた地域社会の変容ひいては衰退をもたらしているという実態が明らかにされた。一方で、まちの変化や地域社会の変容が顕在化することによって、自営業の経営状況に深刻な影響をもたらし、家族の生活形態を変容させ、結果的に自営業の継承にも影響を及ぼすといった循環が生じていることが指摘された。自営業経営者とその家族の生活が、自営業の経営を活性化させる方向に変容していくことで、地域の活性化を促す可能性があるというケースが認められたことから、今後は、地域やまちの活性化に向けて、生活者の立場から有効な提言を行うことによって、生産活動と家族の居住機能が共生できる将来像の構築についても考究していく必要がある。今後さらに多様な地域の自営業世帯における生活様式の継承と変化の過程について、生産活動を含む家族の生活全体を視野にいれて把握し、地域社会の変化とのダイナミズムについての理論的検討をすすめることによって、生活を総合的に把握する理論としても精緻化を図ることが、課題として残されている。わが国の産業構造では零細自営層の果たす役割が大きく、伝統的な地場産業集積地域では、これまで、自営業経営者と家族が地域を支える力となってきた。近年の家族構造の変化によって、自営業世帯における生活様式は大きく変容し、これによって地域社会の変容をもたらす側面がみられる。本研究で事例調査を実施した2つの地区、すなわち、地場産業の備前焼窯元が集積する地域である備前市伊部地区、ならびに、小零細規模の旅館やみやげもの店が集積する地域である金刀比羅宮表参道においても、自営業経営者と家族の生活様式は大きく変容しており、零細な自営業に支えられていた地域社会の変容や衰退をもたらしている。一方で、まちの変化や地域社会の変容が顕在化することによって、自営業の経営状況に深刻な影響をもたらし、家族の生活形態を変容させ、結果的に自営業の継承にも影響を及ぼすといった循環が生じていることが示唆された。しかし、家族の生活様式の変容によって経営者の妻(すなわち、自営業世帯における「女将」)が、従来以上に積極的に経営に参加するようになり、経営面の活性化をもたらし、ひいては地域の活性化の推進役となった事例もみられた。これらの結果をふまえて、今後、さらに実態調査を重ねて、自営業経営者世帯の生活様式の変容と、これらが地域社会に及ぼす影響について検討することによって、家族の生活様式と地域社会変容のダイナミズムについて明らかにしていきたい。事例としてとりあげた伝統的地場産業である備前焼窯元集積地域、門前町である金刀比羅宮

表参道について、自営業世帯における営業と家庭生活の双方について実証的に分析した。その結果、伝統的な地場産業の集積地域における自営業経営者とその家族の生活様式は大きく変容しており、零細な自営業に支えられていた地域社会の変容ひいては衰退をもたらしているという実態が明らかにされた。一方で、まちの変化や地域社会の変容が顕在化することによって、自営業の経営状況に深刻な影響をもたらし、家族の生活形態を変容させ、結果的に自営業の継承にも影響を及ぼすといった循環が生じていることが指摘された。自営業経営者とその家族の生活が、自営業の経営を活性化させる方向に変容していくことで、地域の活性化を促す可能性があるというケースが認められたことから、今後は、地域やまちの活性化に向けて、生活者の立場から有効な提言を行うことによって、生産活動と家族の居住機能が共生できる将来像の構築についても考究していく必要がある。今後さらに多様な地域の自営業世帯における生活様式の継承と変化の過程について、生産活動を含む家族の生活全体を視野にいれて把握し、地域社会の変化とのダイナミズムについての理論的検討をすすめることによって、生活を総合的に把握する理論としても精緻化を図ることが、課題として残されている。
高選択的新規抗生物質開発を目指した特殊制限酵素の構造基盤解明と薬剤探索

本研究では、ヘリコバクター属やカンピロバクター属に特異的なhalf pipe型制限酵素に着目し、その構造と機能の解析をおこなった。超好熱古細菌Pyrococcus abyssi由来half pipe型制限酵素とDNAの複合体構造をX線結晶構造解析法で決定することにより、half pipe型制限酵素が、DNAグリコシラーゼ活性によって作用する酵素(制限DNAグリコシラーゼ)であることを世界で初めて明らかにした。また、病原菌由来half pipe型制限酵素の構造決定にも成功した。本研究では、R.PabIに代表されるhalf pipe型制限酵素によるDNA認識及び切断機構の構造基盤解明を通じて、それらの酵素活性を狂わすような化合物を構造情報に基づいて設計することを目的としている。そのような化合物は、half pipe型制限酵素を持つHelicobacter属及びCampylobacter属に対して非常に選択性の高い抗生物質となりうる。そこで本年度は、half pipe型制限酵素のモデルタンパク質である古細菌由来half pipe型制限酵素R.PabIを研究対象とし、そのDNA認識及び切断機構の全様を解明すべくX線結晶構造解析法による構造決定を行った。その結果、R.PabIと認識配列を含む二本鎖DNAの複合体構造及び、R.PabIと認識配列を含まない二本鎖DNAの複合体構造を、それぞれ、3.0Å及び1.9Åの分解能で決定することに成功した。R.PabI-配列特異的二本鎖DNA複合体構造解析の結果、R.PabIは、5'-GTAC-3'という認識配列のうちグアニン及びアデニン塩基をDNA二重鎖から排出することにより特異的な配列認識を行い、そのうちのアデニン塩基を保存された二つの残基(Y68, D214)による触媒作用によって加水分解する活性(DNAグリコシラーゼ活性)を持つことを明らかにした(Nat Commun. 5:3178 (2014))。一方、R.PabI-配列非特異的二本鎖DNA複合体構造解析の結果からは、R.PabIは二本鎖DNA依存的に四量体様の構造を形成し、二本鎖DNA上を効率よくスライドしながら認識配列を探索する機構をもつことが示唆された。これらのR.PabI-DNA複合体の構造解析から得られた知見は、他の制限酵素では全く見られなかった、非常に特徴的な機構であった。本研究では、超好熱古細菌Pyrococcus abyssi由来のR.PabIに代表される「half pipe」型制限酵素の構造と機能を理解すること、また、「half pipe」型制限酵素を有する病原菌(Helicobacter属・Campylobacter属)の生育を制限するシステムを、「half pipe」型制限酵素の機能調節を通じて行うことを目標としている。平成27年度は、R.PabIが目的配列を探索する際に、二本鎖DNA依存的な4量体構造を形成すること、および二本鎖DNA依存的な4量体構造が、効率的に認識配列を探索するために重要であることを解明した。また、これまでに構造が決定できていないR.PabI-基質DNA複合体の構造解析に着手し、結晶を得ることに成功した。また、平成27年度では、病原菌由来R.PabIホモログタンパク質の大量発現・精製・結晶化実験も行った。制限酵素の大量発現は、その細胞毒性により困難である場合が多いが、先行するR.PabIの構造・機能解析の結果得られた知見をうまく活用することにより、Helicobacter属由来ホモログタンパク質の大量調製及び、Campylobacter属由来ホモログタンパク質の大量調製・結晶化・X線回折実験を行うことに成功した。Campylobacter属由来ホモログタンパク質は、R.PabIと同様にDNAグリコシラーゼ活性を有しており、PEG 6000を沈殿剤とする条件で良質な結晶を得ることに成功した。この結晶を用いて、大型放射光施設Photon FactoryでのX線回折実験を行ったところ、最高分解能が2.6ÅのX線回折データを取得することに成功した。本年度の研究では、食中毒の病原菌として知られるCampylobacter coli由来のR.PabIホモログタンパク質の大量調製系を確立することに成功し、得られた高純度タンパク質を用いることにより、X線回折実験に適した高品質の結晶を得ることに成功している。R.PabIとのアミノ酸配列上の類似性があまりないため、分子置換法による構造決定はできなかったが、重原子同型置換法や異常分散法などを用いることにより、早期に構造を決定できるであろうと考えている。また、Helicobacter pylori由来のR.PabIホモログタンパク質に関しては、収量が少ないものの、大量調製系を確立することに成功しており、得られた高純度タンパク質を用いた結晶化スクリーニングを進めている段階にある。Campylobacter属及びHelicobacter属由来のR.PabIホモログタンパク質のX線結晶構造解析実験は、おおむね当初の研究計画通りに進捗しており、このまま研究を進めていけば、病原菌由来「half pipe」型制限酵素の機能を調節しうる化合物のin silicoスクリーニングを行う環境が整いつつある。また、R.PabIがDNAを切断する機構の更なる解明を目指した、不活性型R.PabI-基質DNA複合体のX線結晶構造解析実験に着手しており、重要な構造情報が得られるであろう結晶の作出に成功するなど、研究は順調に進捗している。以上の理由から、本研究の達成度を「おおむね順調に進展している」とした。