hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
LINC複合体を介した細胞内力学伝達が細胞応答に及ぼす役割の解明

細胞核とアクチンフィラメントを結合するLinkerofnucleusandcytoskeleton(LINC)複合体構成タンパク質の一つであるNesprinの細胞核への力学伝達における力学的役割を調べた.その結果,Nesprinを介したアクチンフィラメント〓細胞核間の力学伝達は内皮細胞の形態応答に対して必須の働きを持つことが明らかになり,細胞核も力覚機構において重要な役割を持つことが示唆された.1.細胞核と細胞骨格を結合するLINC複合体の内,ネスプリンをRNA干渉法により発現抑制した内皮細胞の繰り返し伸展刺激に対する形態応答を評価した.伸展刺激負荷後,無処理の細胞は伸展方向に対して垂直方向への配向性を示し,細胞内においても垂直方向へ太いアクチンフィラメント構造の形成が見られた.一方,ネスプリン-1またはネスプリン-2の発現を抑制した内皮細胞では伸展刺激負荷前に比べ細胞形態およびアクチンフィラメント構造に変化は見られなかった.この結果はネスプリンを介したアクチンフィラメントから細胞核への力学伝達が内皮細胞の形態応答に必要であることを示す.2.細胞核への力学伝達を評価するため,伸展負荷前後の細胞核形状を調べた.静置培養状態においてネスプリン-1発現抑制細胞の細胞核の幅は無処理の細胞に比べ減少していた.細胞核高さには変化が見られなかった.ネスプリン-1を発現抑制した細胞では,無処理の細胞に比べ伸展負荷時の水平方向ひずみが有意に増加した.一方,伸展負荷により細胞核には圧縮変形を生じる傾向がみられたが,無処理の細胞およびネスプリン発現抑制細胞間での差は見られなかった.3.原子間力顕微鏡を用いてアクチンフィラメントと細胞核の結合力の評価を行った.その結果ネスプリンの発現抑制により細胞核とアクチンフィラメントの結合力は大きく減少した.これらのことからアクチンフィラメントを介した細胞核への力学伝達は内皮細胞の形態応答に対して必須の働きを持つことが明らかになり,細胞核も力覚機構において重要な役割を持つことが示唆された.細胞核とアクチンフィラメントを結合するLinkerofnucleusandcytoskeleton(LINC)複合体構成タンパク質の一つであるNesprinの細胞核への力学伝達における力学的役割を調べた.その結果,Nesprinを介したアクチンフィラメント〓細胞核間の力学伝達は内皮細胞の形態応答に対して必須の働きを持つことが明らかになり,細胞核も力覚機構において重要な役割を持つことが示唆された.LINC複合体を介した力学刺激の伝達が力の感知および細胞応答に果たす役割を検討することを目的として以下の研究を実施し,LINC複合体発現を抑制した細胞実験系の確立を行った.1.RNA干渉法によるネスプリン発現抑制:3種類存在するネスプリンの内,アクチン細胞骨格と直接結合するネスプリン1の発現抑制させるため,内皮細胞へsiRNA(small interfering RNA)の遺伝子導入を行った.遺伝子導入後,ウェスタンブロッティング法により300kDaから500kDaの間の分子量を有するネスプリン1の発現量の減少を,免疫染色法によりネスプリン1の細胞核周囲の局在の減少をそれぞれ確認した.また他のLINC複合体要素であるSUN1/2およびLaminA/Cそれぞれの免疫染色を行い,RNA干渉法によるネスプリン1の発現抑制がこれらのタンパク質発現に影響を与えていないことを確認した.2.細胞形態応答の評価:内皮細胞に繰り返し伸展刺激を負荷すると通常伸展方向に対して直交方向に配向し,伸長した形態を示す.一方でネスプリン1を発現抑制した内皮細胞に対して伸展刺激を負荷したところ,刺激負荷前の比較的丸い形態を維持したまま,伸長・配向現象が見られなかった.また伸展刺激負荷により通常観察されるアクチンストレスファイバの形成もネスプリン1発現抑制により観察されなくなった.この結果は細胞核への力学伝達が細胞の力学刺激感知および細胞形態変化に重要な役割を持つことを意味している.RNA干渉法によるネスプリン発現抑制を行う為に必要な遺伝子導入条件の設定および発現抑制の確認に必要な抗体の選定過程において,当初の計画に比べ時間を要した.その後に予定していた細胞の形態応答評価は順調に行えたが,細胞核変形評価について更に実験方法確立に時間を要してしまった.しかし,平成23年度中に方法確立の目処がたったため,研究全体の進行に問題は無いと考えられる.細胞核変形の評価:細胞核および細胞質または細胞骨格を蛍光色素で可視化し,力学刺激負荷前後の画像を取得する.可視化には蛍光タンパク質融合ベクターの遺伝子導入,または生細胞挙動観察用の蛍光指示薬を用いる.画像解析により刺激負荷前後での細胞核および細胞質の変位を解析する.磁気ピンセットシステムによる局所刺激負荷:細胞に作用した力学刺激は細胞膜から細胞骨格を介して核へと伝達されると想定している.細胞骨格は焦点接着斑,細胞間接着部および細胞上面の細胞膜レセプタに発現する膜タンパク質にそれぞれ結合しているため,様々な方向から伝達される可能性が考えられる.それぞれの伝達経路が細胞核変形および細胞応答に対する寄与を明確にするため,磁気ピンセットシステムを用い細胞膜タンパク質に対して張力を直接負荷する.この刺激負荷実験をLINC複合体発現抑制した細胞に対して行い,核変形に対するLINC複合体の種類および細胞骨格の役割をより明確にする.細胞核変形の細胞機能に対する役割の検討:細胞核へ伝達された力学刺激の細胞機能への役割について,当初の予定より更に本質的な検討を行う為,細胞核変形と遺伝子発現との関係について検討を行う.細胞核変形による遺伝子発現活性の変化および転写因子等の細胞核内への移動現象を免疫蛍光染色法やライブイメージング法による評価を行う.

次年度使用額は当初予定していた細胞核変形評価を次年度に延期することにより生じたものであり,延期した研究に必要な経費として平成24年度請求額と合わせて使用する予定である.
骨格筋由来のGas6は損傷筋におけるマクロファ-ジのスイッチングを制御するか?

本研究では、損傷骨格筋におけるGas6発現とマクロファージ機能調節作用について検討した。その結果、カルディオトキシン誘発性損傷筋において、Gas6発現亢進すること、Gas6刺激によりマクロファージフェノタイプのスイッチングに影響することが明らかとなった。本年はまず、損傷骨格筋におけるGas6発現変化について経時的に検討を行った。その結果、カルディオトキシン(CTX)により誘発させた損傷骨格筋において、Gas6 mRNA発現およびタンパク質産生が損傷後3日目以降に増強し、少なくとも損傷後10日目まで継続されることを観察した。この結果は、本研究における仮説を支持するものであった。さらに、この損傷骨格筋におけるGas6増加の機序について、損傷初期に浸潤が観察される好中球の有無が損傷筋におけるGas6発現亢進に及ぼす影響について検討した。まず、マウスにおける好中球除去効果を評価した。その結果、好中球除去抗体(抗Gr-1抗体)投与により、末梢血中の好中球減少を観察し、さらに損傷筋においても好中球マーカーであるミエロペルオキシターゼ(MPO)が顕著に低下した。このことから、本抗体処置マウスを好中球除去マウスとしてGas6発現について検討した。その結果、好中球除去マウスの損傷筋におけるGas6発現が、好中球非除去マウスの損傷筋に比べ有意に低値を示した。一方で、好中球除去マウスの損傷筋Gas6発現は、非損傷筋に比べると有意な高値であった。この結果は、損傷筋におけるGas6発現増強に好中球を介した免疫応答が関与していること示す結果であると同時に、好中球非依存的な産生経路が存在する可能性も残すものであった。次年度では、この点についてさらに詳細に検討する予定である。以上の結果は、マクロファージ機能修飾因子であるGas6が損傷筋内において、免疫応答を介して、顕著に増加していることを示すものであり、Gas6が骨格筋におけるマクロファージスイッチングに及ぼす影響について、さらに検討する価値があることを示すものである。H22年度の成果をふまえ本年度は、損傷骨格筋に対するGas6中和抗体投与の影響を組織染色(HE、TUNEL、脂肪滴)から検討した。合わせて,Gas6発現増強メカニズムの解明を目的として好中球除去マウスおよび、筋芽細胞株(サテライト細胞モデル細胞)を用いた検討を行った。その結果,以下の知見を得た。(1)損傷骨格筋に対するGas6中和抗体および遊離型Gas6レセプター投与は、免疫細胞の組織への浸潤を阻害しない(2)損傷骨格筋に対するGas6中和抗体および遊離型Gas6レセプター投与によりアポトーシス細胞(自発的に行われる細胞死,細胞自殺とも呼ばれる)の組織からの除去が遅延する(3)損傷部位へ浸潤する好中球(免疫細胞の一種)を生体より除去しても、Gas6発現は完全には抑制されない(4)筋芽細胞株は分化(細胞同士の融合、筋管形成)する際にGas6産生を有意に亢進し,その産生は時間依存的に増強する(1)および(2)の結果は、損傷骨格筋で強発現するGas6は免疫細胞の誘導(組織へ呼び寄せる)には影響していないが、死細胞除去には関与している可能性を示すものであった。また、(3)および(4)は損傷骨格筋におけるGas6産生の一端を組織に常在するサテライト細胞が担っている可能性を示唆するものであった。これらの知見は、損傷筋修復においてGas6が一定の関与をしている可能性を示すものであり、他に報告のない新規性の高いものであった。H22・23年度の成果をふまえ本年度は、損傷骨格筋に対するGas6 siRNA投与の影響を組織染色(マクロファージ免疫染色)から検討した。合わせて,サテライト細胞におけるGas6分泌とその役割の解明を目的として筋芽細胞株(サテライト細胞モデル細胞)を用いた検討を行った。1Gas6 siRNA投与により損傷骨格筋におけるCD206陽性細胞(M2マクロファージ)は減少する2筋芽細胞株が分化する際に産生するGas6は、オートクリン(自己分泌による自己への作用)に作用し、自身の細胞死を抑制する3筋芽細胞株におけるGas6のオートクリン作用は、炎症誘導分子による炎症性サイトカイン産生(TNF-alpha,MCP-1)を抑制する1の結果はGas6発現をsiRNAにて抑制することによりマクロファージにおけるM1からM2へのスイッチングを阻害する可能性が示唆された。このことは,損傷組織の修復に重要なM2マクロファージの出現について、Gas6がその一部を調節している可能性を示唆するものであった。また、2および3は損傷骨格筋におけるサテライト細胞が細胞死(アポトーシス)することなく、分化/融合し骨格筋組織を修復している過程に、Gas6が貢献している可能性を示唆するものであった。また、炎症反応の収束について、Gas6がその一端を担っている可能性を示唆するものであった。これらの知見は、損傷筋修復においてGas6が重要な関与をしている可能性を示すものであった。

本研究は損傷骨格筋におけるマクロファージのスイッチングに対するGas6の影響について検討するものであり,H22年度から3年計画で実施している。当初予定通り,H22年度およびH23年度の研究活動で,(1)損傷筋において,Gas6は強発現する(生体内実験)(2)Gas6はマクロファージのサイトカイン産生パターンを変える(試験管内実験)(3)筋芽細胞は増殖停止時にGas6発現を増強する(試験管内実験)という成果が得られた。またH24年度に計画している,生体内Gas6阻害実験も一部前倒しで開始しており,当初予定通り計画が遂行される予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までの研究進捗状況を踏まえ,本年度はGas6阻害モデルを中心として,より生体に近い形でのGas6の影響について検討する予定である。具体的には,Gas6の遺伝子干渉法を用いて,Gas6の影響を観察する予定である。また,本年で計画最終年度であることから,これまでの学会発表活動とともに,国際雑誌へめ論文投稿を準備している。なお,現在まで研究の大幅な変更および解決困難な問題は生じていない。
糖鎖調節による肝細胞癌治療の試み

本研究では,α1-6フコース転移酵素,III, IV, V型グルコサミン糖転移酵素のアンチセンスオリゴヌクレオタイドなどの糖鎖転移酵素阻害剤の組み合わせを用いた肝癌細胞biological behaviorの調節手技を確立し,これらの手技を用いて癌細胞の分化誘導ならびに脱悪性化を目的とした肝細胞癌の治療を試みることを目的とした.はじめに,α1-6FTフコース転移酵素(α1-6FT)活性の抑制による糖鎖構造の変化と,それに伴う肝癌細胞の浸潤動態の変化を,α1-6FTのノックダウンされた細胞系列を樹立することによって評価することを試みた.α1-6フコース転移酵素(α16FTのアンチセンスRNAによる発現抑制実験として,本酵素のmRNA(GenBank Accession No.D89289)の861874塩基,5'-CACTCATCTTGGA-3',に対するセンスならびにアンチセンス合成RNAを用いた.各RNAは,リボースの2'位のOHに対し2-methoxyethylを結合させ,また,ヌクレオチドのリン酸基の非結合酸素をS原子に置き換えるphosphorothioate修飾を加えた.HepG2細胞を48時間培養した後の培養上清中のアルファーフェトプロテイン(AFP)濃度とそのフコシル化分画は,2.8±0.29ng/ml,84.6±3.4%であった.FuGENE6(Roche, USA)を用いて上記のセンス,あるいはアンチセンスRNAをHepG2細胞にリポフェクションにより導入し,24時間後に培養上清を回収,さらに培養を続け48時間後に培養上清ならびに細胞を回収した.センス,アンチセンス,ならびにFuGENE6単独の各群を調整し,各培養上清中のAFP濃度とフコシル化分画を測定した.各群における24時間後,48時間後のAFP濃度はそれぞれ,5.2ng/ml,2.4ng/ml(センス),3.6ng/ml,1.8ng/ml(アンチセンス),7.6ng/ml,3.7ng/ml(FuGENE6)であった.次にAFP濃度を20ng/ml程度まで濃縮し,フコシル化分画を測定した.各群のフコシル化分画は,77.4%,79.7%(センス),80.4%,70.1%(アンチセンス),79.0%,80.8%(FuGENE6)であり,アンチセンス導入群の48時間後に採集された培養上清中でフコシル化分画が低下している事が示唆された.α16FTに対するアンチセンスRNA導入によりAFPのフコシル化が抑制されることが示唆されたので,次にα16Frに対するsmall interfering RNA(siRNA)の持続発現により,AFPのフコシル化が安定して抑制されるsiRNA持続発現株の樹立を試みた.α16FTmRNAの1002塩基のAA配列に続く19塩基配列からなる配列を,polymerase-III H1-RNA gene promotorの制御下に,ポリA配列を欠き3'端にUU突出を有するRNAが転写されるベクターであるpSUPER.retro(Oligo Engine, USA)にクローニングした.また,配列特異的発現抑制を確認するため,19配列の第9塩基をGからAに置換した変異配列も同時にクローニングした.現在これらのベクターをHepG2細胞に感染させ,持続発現株を樹立している.本研究では,α1-6フコース転移酵素,III, IV, V型グルコサミン糖転移酵素のアンチセンスオリゴヌクレオタイドなどの糖鎖転移酵素阻害剤の組み合わせを用いた肝癌細胞biological behaviorの調節手技を確立し,これらの手技を用いて癌細胞の分化誘導ならびに脱悪性化を目的とした肝細胞癌の治療を試みることを目的とした.はじめに,α1-6FTフコース転移酵素(α1-6FT)活性の抑制による糖鎖構造の変化と,それに伴う肝癌細胞の浸潤動態の変化を,α1-6FTのノックダウンされた細胞系列を樹立することによって評価することを試みた.α1-6フコース転移酵素(α16FTのアンチセンスRNAによる発現抑制実験として,本酵素のmRNA(GenBank Accession No.D89289)の861874塩基,5'-CACTCATCTTGGA-3',に対するセンスならびにアンチセンス合成RNAを用いた.各RNAは,リボースの2'位のOHに対し2-methoxyethylを結合させ,また,ヌクレオチドのリン酸基の非結合酸素をS原子に置き換えるphosphorothioate修飾を加えた.HepG2細胞を48時間培養した後の培養上清中のアルファーフェトプロテイン(AFP)濃度とそのフコシル化分画は,2.8±0.29ng/ml,84.6±3.4%であった.FuGENE6(Roche, USA)を用いて上記のセンス,あるいはアンチセンスRNAをHepG2細胞にリポフェクションにより導入し,24時間後に培養上清を回収,さらに培養を続け48時間後に培養上清ならびに細胞を回収した.センス,アンチセンス,ならびにFuGENE6単独の各群を調整し,各培養上清中のAFP濃度とフコシル化分画を測定した.各群における24時間後,48時間後のAFP濃度はそれぞれ,5.2ng/ml,2.4ng/ml(センス),3.6ng/ml,1.8ng/ml(アンチセンス),7.6ng/ml,3.7ng/ml(FuGENE6)であった.

次にAFP濃度を20ng/ml程度まで濃縮し,フコシル化分画を測定した.各群のフコシル化分画は,77.4%,79.7%(センス),80.4%,70.1%(アンチセンス),79.0%,80.8%(FuGENE6)であり,アンチセンス導入群の48時間後に採集された培養上清中でフコシル化分画が低下している事が示唆された.α16FTに対するアンチセンスRNA導入によりAFPのフコシル化が抑制されることが示唆されたので,次にα16Frに対するsmall interfering RNA(siRNA)の持続発現により,AFPのフコシル化が安定して抑制されるsiRNA持続発現株の樹立を試みた.α16FTmRNAの1002塩基のAA配列に続く19塩基配列からなる配列を,polymerase-III H1-RNA gene promotorの制御下に,ポリA配列を欠き3'端にUU突出を有するRNAが転写されるベクターであるpSUPER.retro(Oligo Engine, USA)にクローニングした.また,配列特異的発現抑制を確認するため,19配列の第9塩基をGからAに置換した変異配列も同時にクローニングした.現在これらのベクターをHepG2細胞に感染させ,持続発現株を樹立している.α1-6フコース,転移酵素のアンチセンスRNAによる発現抑制実験として、本酵素のmRNA(GenBank Accession No.D89289)の861874塩基、5-CACTCATCTTGGA-3'、に対するセンスならびにアンチセンス合成RNAを用いた。各RNAは、リボースの2'位のOHに対し2-methoxyethylを結合させ、また、ヌクレオチドのリン酸基の非結合酸素をS原子に置き換えるPhosphorothioate修飾を加えた。HepG2細胞を48時間培養した後の培養上清中のアルファーフェトプロテイン濃度とそのフコシル化分画は、2.8±0.29ng/ml、84.6±3.4%であった。FuGENE6(Roche、USA)を用いて上記のセンス、あるいはアンチセンスRNAをHepG2細胞にリポフェクションにより導入し、24時間後に培養上清を回収、さらに培養を続け48時間後に培養上清ならびに細胞を回収した。センス、アンチセンス、ならびにFuGENE6単独の各群を調整し、各培養上清中のアルファーフェトプロテイン濃度とフコシル化分画を測定した。各群における24時間後、48時間後のアルファーフェトプロテイン濃度はそれぞれ、5.2ng/ml、2.4ng/ml(センス)、3.6ng/ml、1.8ng/ml(アンチセンス)、7.6ng/ml、3.7ng/ml(FuGENE6)であった。次に、Microcon(Millipore、USA)を用いアルファーフェトプロテイン濃度を20ng/ml程度まで濃縮し、フコシル化分画を測定した。各群のフコシル化分画は、77.4%、79.7%(センス)、80.4%、70.1%(アンチセンス)、79.0%、80.8%(FuGENE6)であり、アンチセンス導入群の48時問後に採集された培養上清中でフコシル化分画が低下している事が示唆された。現在、同様の検討を多系列で行うと伴に、細胞内のα1-6フコース転移酵素活性の定量的評価を行っている。また、同様の実験をIII, V型グルコサミン糖転移酵素に関しても施行していく予定である。α1-6フコース転移酵素(A16FT)のアンチセンスRNAによる発現抑制実験として、本酵素のmRNA (GenBank Accession No.D89289)の861874塩基、5'-CACTCATCTTGGA-3'、に対するセンスならびにアンチセンス合成RNAを用いた。
直接体験を伴わない知識獲得の認知的特徴

次の諸点を中心に並行して研究が行われた。1)知識獲得に関する知見の収集と「新しい学力観」における知識獲得評価の検討直接体験しない知識獲得の際に大きな変動要因となる学習者側の認知特性についての諸知見を収集、整理した。特に問題解決における概念バグの出現に影響すると考えられる信念システムについて、心理学の隣接諸領域の文献・記録資料からの知見が収集できた。これらを基礎に、学校教育の現場において現在解明が急がれている「新しい学力観」に対して、知識獲得特性の視点から検討を加えた。2)社会事象に対する説明論理の実験的調査日常身近ではあるが直接関与していない社会的な事象についての説明のあり方について、実験的な調査を行った。今回は、直接の関与を持たない存在でありかつ知識獲得の途上にある児童に対する資料を収集した。田丸(1989)の対話法を発展させた個別面接によるデータ収集とするため、都内2ヶ所の児童館において小学校各学年児童を対象として、お金の流通に関する題材を取り上げ、対話的な回答の収集を行い、結果を記録した。子どもの社会認識と説明論理との心理学上の両研究課題に関わる資料が収集でき、特に「わからない」と戸惑いを示した被験児の分析から発達的傾向が示唆されている。継続した追加調査が計画されている。3)自動化された解答に対する説明論理の実験的調査既習の人にとっては解答や解決手続きが自動化されているものを題材に、その根拠について説明を求めた。今研究では初段階として題材の吟味を行い、数学的関係や自然事象、社会事象のいくつかについて有効性が認められた。
産官学の地域連携をめぐる「失敗」事例の比較経営史

1.総括:科学研究費に基づく産官学連携の実地調査の方法論としていま、最も期待されているANT(アクターネットワーク理論)について、その理論・応用研究のあり方について集中的に研究をおこなった(成果は、まだ最終的にまとまっておらず、次年度以降に集中的に刊行される予定である。)とくに当該分野の研究が最も進んでいる人類学者との共同研究ディスカッションをおこなった。なお、これは東京外国語大学アジア・アフリカ言語文化研究所における共同プロジェクトにおいて共同研究員としての活動とも一部共通しているテーマである。同様に企業活動への人類学的接近を行っている国立民族学博物館における共同研究において共同研究員としての活動において、科学研究費の成果となる研究の一部をもとに共同研究に参画した。2.報告・講演:1)9月30日中小企業の企業活動について京都のPHP総研において講演(中小企業の連携・産学連携、経営理念などについて)をおこなった。2)2008年1月24日に中央大学企業研究所において研究員として産学連携とビジネス教育との連関について報告をおこなった。3.実地調査1)2007年9月23-30日:ドイツ(ミュンヘン周辺、ベルリン地区、バーデンビュッテンベルク州)3地域における産学連携とビジネス教育への新しい取り組みについての調査、研究者とのディスカッション、国際シンポジウムの計画について議論をかわした。2)7月30日-8月4日:中国における企業調査・産学連携の実態調査(夏2007年7月30日(月)・8月4日(土))北京では、流通業、天津においては自動車産業に焦点をあてて数社の聞き取りをおこなった。3)2007年11月30日-12月3日:沖縄における醸造業と畜産業における中小企業の新しい取り組み(品種改良、ブランド戦略、産学の関係)についての調査を行った。4)2008年2月24-27日東大阪におけるベンチャー企業の産学連携、東大阪の産業集積調査を行った。衰退産業における事例研究という逆説的方法を用いて、始原・能力・知識アプローチと企業者活動論を結びつけ、新規事業創造を捉える枠組みを構築することを行った。とくにそれが見落としてきたものについて、資源・能力・知識アプローチと中小企業研究の親和性の観点から検討した。少なくともこの枠組みでは経営資源の優劣や多寡は、企業規模の大小だけからは単純には論じられない。また現在の資源・能力アプローチの研究では、組織の能力は、経路依存性や競争圧力、外在的な技術環境、組織ルーチンなどに還元されてしまう。最近では、希少資源の保有問題や市場での取引可能性が焦点化する。またこの枠組みにおいて、企業は、ただ環境変化に対応するために資源の開発をおこなうという図式を暗黙のうちに前提している。その結果、資源の開発と駆動のメカニズムを解明する具体的なプロセスを示さない限り、自己循環的論理のそしりを免れ得ない。また、希少な資源を保有し、それが、ある時点での競争力の源泉になっていたとしても、長期的には顧客の嗜好の変化や技術革新といった外部環境の変化によって、その資源の経済的・技術的価値は変化する。しかし、競争優位性の源泉となる知識や経験は、新たな企業成長・多角化のボトルネックともなりうる両義性を持つ。その可能性を検討するために資するのは、アプローチの始原にあった問い-変化の説明理論としてのペンローズ理論である。後継者たちは、資源と競争優位との間にあるギャップの等閑視してきた。しかしペンローズは、経営資源と区別し、生産用役を考える。そうすれば、資源を、事業活動にいまだ貢献することのない「未利用で潜在的な」生産用役と、「顕在化した」生産用役との束として定義できる。そこで新たな課題を考えることができる。まずイノベーションの源泉としての未利用で潜在的な生産用役を考えれば、そこでの未利用な生産用役が引き出されるプロセスの解明である。またプロセスにおいて、企業家の知識や経験にもとづく「直感」や「想像力」まで含めた主観的な判断や認識、あるいは経営チームの主体的な活動があってはじめて潜在的な用役が顕在化することの焦点化である。これは、仲介人として企業家を捉える系譜(Marshall 1890,Menger 1871)につらなる。同一の資源を保有し、同一の需要条件に直面していても成長速度や方向性は、異なりうる。経営資源の潜在的用役の多様性と、それが人間の知識や信念によって発見・顕在化されるという側面を考慮にいれると、保有する経営資源の開発と利用を構想することじたいが研究の対象となる。このように経営資源の生産性の不確定性、両義性に着目することで、中小企業の経営資源の制約を動かしがたい宿命とする既成概念に風穴を開けることができる。自社資源の機能の維持、増進、生産性向上に資するものへと製品コンセプトを変更し、絞り込むことによって事業機会は拡大する。資源が機能するような活動を支援する資本財や、サービス、場作りの提供という事業展開を構想することができる。しかもそれがビジネスとして、企業にとっての新たな市場、新たな事業機会になるのである。

なお、これは東京外国語大学アジア・アフリカ言語文化研究所における共同プロジェクトにおいて共同研究員としての活動とも一部共通しているテーマである。同様に企業活動への人類学的接近を行っている国立民族学博物館における共同研究において共同研究員としての活動において、科学研究費の成果となる研究の一部をもとに共同研究に参画した。2.報告・講演:1)9月30日中小企業の企業活動について京都のPHP総研において講演(中小企業の連携・産学連携、経営理念などについて)をおこなった。2)2008年1月24日に中央大学企業研究所において研究員として産学連携とビジネス教育との連関について報告をおこなった。3.実地調査1)2007年9月23-30日:ドイツ(ミュンヘン周辺、ベルリン地区、バーデンビュッテンベルク州)3地域における産学連携とビジネス教育への新しい取り組みについての調査、研究者とのディスカッション、国際シンポジウムの計画について議論をかわした。2)7月30日-8月4日:中国における企業調査・産学連携の実態調査(夏2007年7月30日(月)・8月4日(土))北京では、流通業、天津においては自動車産業に焦点をあてて数社の聞き取りをおこなった。3)2007年11月30日-12月3日:沖縄における醸造業と畜産業における中小企業の新しい取り組み(品種改良、ブランド戦略、産学の関係)についての調査を行った。4)2008年2月24-27日東大阪におけるベンチャー企業の産学連携、東大阪の産業集積調査を行った。
ロマン主義時代の女性文学と福音主義的背景 - 歴史学的考証にもとづいた言説の研究

本科研2年目そして最終年度にあたる本年は、それまでの研究成果を公表していくことが目標であり、一応その目標達成することはできたと判断する。女性が十八世紀末において福音主義を受容していく過程で、宗教的な要素ばかりではなく、感受性文化の中で受容し、さらに慈善活動や消費活動といった社会行動へと応用し、さらには日記や詩、小説といった文学においても宗教的感性を発露させていったことは重要な意義を持つことを確認した。文学において宗教的要素は軽視される傾向が強いが、とくに十八世紀後半からのイギリスにおいて福音主義の及ぼした影響は広範囲かつ甚大であり、それが行動様式のみならず言説上にもはっきりとした痕跡を残しているのは当然といえば当然なのだが、クエーカーの女性はもちろんのこと、ユニタリアン派の女性の言説においても露骨に政治的な意味をもってその痕跡が残っているのは学術上新しい発見であったと言ってよい。また、ハナ・モアのような国教会福音主義者たちの言説には、福音主義が単に慈善や政治イデオロギーと結びついているのではなく、女性たちを「公共圏」へと参画させる推進力を保持していることが証明できた。一年のほとんどを国内における資料調査を行いながら、学会発表は論文執筆に費やした。ノリッジの女性たちの文学作品と福音主義の影響、およびフランシス・バーニーの小説における慈善と福音主義の関係については、12月末から調査・研究をはじめ、2月に3週間にわたる海外資料調査を行って国内にない資料調査を行った。それらについての論考は現在投稿中であり、来年度に公表される予定である。本年度の研究は、奴隷貿易廃止運動に貢献したCatherin Clarksonおよび国教会福音派の女領袖とも言うべきHannah Moreの活動と著作を中心にしながら、福音主義について基礎的な調査を進めた。福音主義は18世紀において領域横断的に浸透した宗教精神であり、基本的には聖書(福音)の教えに立ち返って信仰心を復興しようという運動である。しかし、それは商工業が発達し、消費主義的な経済が社会にひろがった時代において、感受性の文化とあいまって多様な側面を見せることになった。Mary WollstonecraftやAnna Laetitia Barbauldのような非国教徒女性においても福音主義的態度は見られるが、奴隷貿易廃止運動の立役者Thomas Clarksonの妻になったCatherine Clarksonには女性と福音主義の結びついたより一般的な態度が考察できる。急進主義的な思想の影響を受けながらも、女性として夫の影に隠れながらも奴隷貿易廃止運動に尽力し、後年はクエーカーへと改宗した彼女の生涯は福音主義の一つのパターンを見せている。その一方で、国教会内の福音主義を統率したのがHannah Moreである。彼女の著作には非国教徒や革命支持者への反駁が盛り込まれているが、"practical piety"および"the sober virtues of domestic economy"をキリスト教的美徳として掲げることで、家庭的美徳を遵守しながら女性が福音の教えにしたがって慈善活動を行い、社会、さらには政治活動へと活躍していく機会を与えた。女性の慈善における「家庭性」と「社会性」という矛盾を解消し、社会における風俗改善や教育改善、奴隷貿易廃止といった領域で貢献を果たし、福音主義をヴィクトリア朝へ浸透させていったのがMoreの福音主義なのである。
プロテアソームによる異常mRNA由来の異常タンパク質分解機構の解析

異常mRNAにより生じた異常タンパク質は、正常なタンパク質の発現量や活性の低下を介して、様々な悪影響を細胞にもたらす可能性がある。そのため、細胞は、遺伝子発現の正確性を保証する品質管理機構を保持している。これまで、連続した塩基性アミノ酸配列が翻訳伸長の一時停止(翻訳アレスト)と、それに伴って翻訳途上のペプチド鎖がプロテアソームによって分解されることを明らかにしてきた(J.Biol.Chem.2009)。本年度、特に新生ポリペプチド鎖依存的な翻訳アレストと異常mRNA由来のタンパク質分解機構に焦点をあてて解析を行った。その結果、翻訳アレストに必須な因子として40Sリボソーム結合因子RACK1を同定し、さらにRACK1の40Sリボソーム結合活性が翻訳アレストに必須であることを明らかにした(論文投稿中)。また、多くの遺伝病の原因変異である未成熟終止コドンを持つmRNAはNonsense-mediated mRNA decay(NMD)によって分解されることが知られているが、このNMD経路においても、異常mRNA由来の異常タンパク質がプロテアソームによって迅速に分解されることを見いだした(EMBO Rep 2009)。また異常mRNAの翻訳についても解析し、終止コドンを持たないmRNAが効率よく翻訳され(Genes to Cells, 2009)、かつDom34/Hbs1が必要であることを見いだした(論文投稿中)。我々は、特にプロテアソームによる異常mRNA由来の異常タンパク質分解機構に焦点をあて解析を行った。その結果、連続した塩基性アミノ酸配列が翻訳伸長の一時停止(翻訳アレスト)とそれに共役したプロテアソームによる異常タンパク質の分解を引き起こすことを明らかにした。また、翻訳アレストに伴ったタンパク質分解に必須な因子Not4を同定し、ユビキチン化に関与するE3酵素として機能することを見いだした(J.Biol.Chem.2009)。また、多くの遺伝病の原因変異である未成熟終止コドンを持つmRNAはNonsense-mediated mRNA decay(NMD)によって分解されることが知られているが、このNMD経路においても、異常mRNA由来の異常タンパク質がプロテアソームによって迅速に分解されることを見いだした。この異常タンパク質の分解は、異常に長い3'非翻訳領域とNMDに必須な因子であるUpf1pに依存していた(EMBO reportin revision)。さらに、大腸菌における異常mRNAの翻訳についても解析し、終止コドンを持だないmRNAが効率よく翻訳されることを見いだした(Genes Cells,in press)。
革新的キノキサリノン骨格合成法の開発と創薬テンプレート構築への応用

キノキサリノン骨格は様々な医薬品や天然物に見られる重要な骨格であるが、その効率的かつ多様性を志向した合成法の確立が今尚求められている。申請者は、容易に入手可能であるシアノ酢酸アニリドからキノキサリノン骨格を効率的に合成できる方法論を確立した。また、本反応を応用して抗HIV活性を有するオパビラリン、耳鳴り治療薬であるカロベリン、喘息の治療薬として期待されているアタキマストなどの生物活性化合物合成へと応用することができた。キノキサリノン骨格は様々な天然物や医薬品に見られる重要な骨格であるが、その効率的かつ多様性を指向した合成法はこれまでに報告されていない。昨年度、申請者はシアノ酢酸アニリドのアセトニトリル溶液に空気雰囲気下、亜硝酸ナトリウム(5当量)及び硫酸(5当量)を作用させると、2位にシアノ基を有するキノキサリノンー1ーオキシドが収率良く得られることを既に見出している。今年度は得られた生成物の誘導化および医薬品類合成への応用を中心に検討を行った。種々の検討の結果、2位にシアノ基を有するキノキサリノンー1ーオキシドのテトラヒドロフラン溶液に低温下様々なグリニャール試薬を反応させることで、2位のシアノ基を様々な置換基(フェニル基、pーメトキシベンジル基、エチル基、nードデシル基)へと変換できることを見出した。エチル基が導入された生成物を用いて、抗HIV活性を有するオパビラリンへと誘導することが可能であった。すなわち、1ーオキシド部位を亜鉛、酢酸条件下にてジヒドロキノキサリノンへと還元した後、ベンジル基の脱保護によりオパビラリンの合成を達成した。また、pーメトキシベンジル基が導入された生成物からは耳鳴りの治療薬として用いられているカロベリンを迅速に合成することができた。すなわち、1ーオキシド部位を亜ジチオン酸ナトリウムによってキノキサリノンへと還元した後、ジエチルアミノ基を導入することによって、カロベリンの合成を達成することができた。上記のように試薬によって還元の選択性を制御できることは、様々な誘導体合成をする上で重要な知見であると考えられる。また、本手法は様々な置換基を合成の終盤で導入できるため、多様性を指向した合成に非常に有効である。キノキサリノン骨格の効率的かつ多様性を指向した合成法は、これまで報告されていない。本年度は、本骨格の革新的な合成法の開発を目指し検討を行った。また、開発した反応を種々の置換基を有する基質に適用し、反応の基質一般性を調べるだけでなく、反応のメカニズムを解明することを目的とした。シアノ酢酸アニリドを空気雰囲気下にて亜硝酸ナトリウム及び硫酸と作用させると、活性メチレン部位のニトロソ化とそれに続く酸化的C-N結合形成反応が一挙に進行しキノキサリンが高収率で得られることを見出した。反応は芳香環上及び窒素原子上に種々の置換基を有する基質にも適用可能であった。芳香環上にはハロゲン原子(Br, Cl, F)だけでなくアルキル置換基の共存が許容であり、窒素原子上の置換基はメチル、エチル、ベンジル基が反応条件に適応可能であった。いずれの場合も5時間で反応が完結し、高収率で目的物を与えた。また、反応機構の機構解明のため、以下の検討を行った。すなわち、反応をアルゴン気流下で行うと望みのキノキサリンはほとんど得られず、ニトロソ化体が優先的に得られた。このことから酸化的C-N結合形成反応には空気中の酸素が関係していることが示された。また、単離したニトロソ化体を同反応条件に付したところ、キノキサリンが収率良く得られたことからもニトロソ化体が反応中間体であることがわかる。さらに、この反応は2,6-bis(t-butyl)hydroxytoluene(BHT)のようなラジカル補足剤によって阻害されることからも明らかとなった。以上の結果より、シアノ酢酸アニリドからキノキサリンへの環化反応はニトロソ化体を経由して進行しており、酸化的な環化反応は空気中の酸素による一電子酸化が関与していることを明らかにした。申請者は、昨年度までにシアノ酢酸アニリドに5当量の亜硝酸ナトリウムと硫酸を作用させると、酸化的なC-N結合形成反応を経てキノキサリノン骨格が得られることを見出している。また、シアノ基を炭素求核剤によって置換することで、抗HIV作用を有するオパビラリンや、耳鳴りの治療薬として既に使用されている(日本では承認されていない)カロベリンなどの多様な医薬品に誘導できることも見出している。そこで、今年度は(1)反応生成物であるキノキサリノン2位(または3位)のシアノ基の更なる誘導体化、

(2)生物活性化合物・医薬品合成への更なる応用、(3)キノキサリノン骨格合成の触媒化、(4)キノキサリノン骨格以外の骨格合成への応用について検討した。その結果、(1)について炭素求核剤以外に、アミドなどの窒素求核剤を導入できることを見出した。また、それを利用して(2)の喘息治療剤としての応用が期待されるアタキマストの合成へ応用できることを見出した。残念ながら、(3)の触媒化には至らなかったものの、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシルラジカル(TEMPO)が反応を促進することを見出した。また、種々検討したものの(4)の他の骨格合成への応用についても良好な結果を得ることはできなかった。しかしながら、研究期間全体を通して概ね計画通りの成果が得られたと考えている。有機化学今年度は、以下の3つの検討項目を計画した。(1)2位のシアノ基の変換、(2)キノキサリノンー1ーオキシドの化学選択的還元、(3)更なる官能基の導入。(1)(2)についてはそれぞれグリニャール試薬、亜鉛・亜ジチオン酸ナトリウムを用いることで達成できることを見出した。(3)についても1例ではあるが、予備的な知見を得ることができた。以上の結果より本年度は順調に進展したといえる。今年度は、以下の3つの研究課題を計画した:(1)キノキサリン骨格の高効率的合成法の開発、2)基質一般性の検討、3)反応機構の解明。(1)についてはシアノ酢酸アニリドから簡便に合成できることを見出した。(2)(3)についてはまだまだ課題は残るものの、予備的な知見を得ることができたので、当初の計画を十分達成したと考えており、今後のブレークスルーに繋がると期待できる。以上の結果を総合すると概ね順調に進展したと言える。今後は、これまで検討してきた課題をさらに発展させる。(1)2位への炭素求核剤以外の求核種の導入(2)医薬品類、天然物合成への応用(3)キノキサリノン骨格合成の触媒化(4)キノキサリノン以外の骨格合成への応用今後も、これまで検討してきた課題を継続して進展させる予定である:(1)キノキサリン骨格の高効率的合成法の開発、2)基質一般性の検討、3)反応機構の解明。さらに、得られる生成物の応用や、キノキサリン骨格以外の含窒素複素環合成も視野に入れ検討を行う予定である。消耗品等で調整を試みたが、どうしても1円余ってしまった。消耗品の購入に充てる。本年度と同様に、主に試薬類やガラス器具などの消耗品に使用する予定である。旅費については、国内の学会発表を2件ほど予定している。
特発性男性不妊症患者に対するY染色体パリンドローム複合体の分析と多型性検索

Y染色体のゲノム塩基配列が公開されると、相同性の高い反復配列とパリンドローム構造であることが明らかとなった。Y染色体上の大きなパリンドローム構造は8種あり、精子形成候補領域のひとつであるAZFcにはふたつのパリンドローム複合体が存在している。我々は、パリンドローム単位で欠失が生じているという仮定のもとに、無・高度乏精子症患者ゲノムDNAを用いて、AZFcパリンドローム複合体の有無について検討した。まず、現在多用されている多コピー遺伝子や反復・繰返し配列の多いAZFc内部の欠失を確認することは従来のSTS-PCR法では理論的に不可能である。したがって、ゲノム塩基配列から、それぞれのプローブに対応するコピー数をreal-time quantitative PCR (RTQ PCR)によって確認し、特発性男性不妊症との関係について検討した。まず、定量化するために内部標準DNAを鋳型にして標準曲線を作成した。この鋳型は常染色体上の単一遺伝子であるRNAase P遺伝子を使用し、各サンプルのゲノムDNA量のばらつきを補正した。各患者サンプルの鋳型DNA量を10ngとし、RTQ-PCRを40サイクル行った。RTQ-PCRより算出できるコピー数比から、パリンドローム内部における微小欠失を検出することが可能となった。特に、パリンドローム部分欠失の検出は理論上無理とされていたが、ゲノムデータベースを基礎に男性不妊症でその部分欠失の存在を証明した。AZFc領域にあるP1+P2欠失のみならず、P1部分欠失の方法を確立した。今回使用したRTQ-PCR法において、従来のSTS-PCR法では欠失を認められない症例にも、AZFc領域内部に微小欠失が存在していることが明らかとなった。従来考えられていたよりも多くの特発性男性不妊症患者にAZFc領域の微小欠失が存在している可能性が考えられた。Y染色体の長腕上には精子形成遺伝子が存在している。多コピー遺伝子や反復・繰返し配列の多いAZFc内部の欠失を確認することは従来のSTS-PCR法では理論的に不可能である。この鋳型は常染色体上の単一遣伝子であるRNAase P遺伝子を使用し、各サンプルのゲノムDNA量のばらつきを補正した。RTQ-PCRより算出できるコピー数比から、パリンドローム内部における微小欠失を認めた。今回の検討では4種類のパリンドローム部分欠失様式を認めた。P1+P2欠失は一般に全AZFc領域欠損であり、20例を認めました。P1部分欠失は、従来のSTS-PCR法では検出できない欠失様式で7例を認めた。P1欠失は最大のパリンドローム欠失であり、STS法では、P1部分欠失として検出され,4例をみとめた。P2欠失はSTS-PCRでは欠失が確認できない。3例を認めた。

従来のゲノムSTS-PCRで検出できるのはゲノム配列の有無のみであり、パリンドローム複合体内部の部分欠失は検出できない事がわかった。今回使用したRTQ-PCR法において、従来のSTS-PCR法では欠失を認められない症例にも、AZFc領域内部に微小欠失が存在していることが明らかとなった。従来考えられていたよりも多くの特発性男性不妊症患者にAZFc領域の微小欠失が存在している可能性が考えられました。さらに、次年度には症例を増やし、多型性についての分析もおこなう予定である。Y染色体のゲノム塩基配列が公開されると、相同性の高い反復配列とパリンドローム構造であることが明らかとなった。Y染色体上の大きなパリンドローム構造は8種あり、精子形成候補領域のひとつであるAZFcにはふたつのパリンドローム複合体が存在している。我々は、パリンドローム単位で欠失が生じているという仮定のもとに、無・高度乏精子症患者ゲノムDNAを用いて、AZFcパリンドローム複合体の有無について検討した。まず、現在多用されている多コピー遺伝子や反復・繰返し配列の多いAZFc内部の欠失を確認することは従来のSTS-PCR法では理論的に不可能である。したがって、ゲノム塩基配列から、それぞれのプローブに対応するコピー数をreal-time quantitative PCR(RTQ PCR)によって確認し、特発性男性不妊症との関係について検討した。まず、定量化するために内部標準DNAを鋳型にして標準曲線を作成した。この鋳型は常染色体上の単一遺伝子であるRNAase P遺伝子を使用し、各サンプルのゲノムDNA量のばらつきを補正した。各患者サンプルの鋳型DNA量を10ngとし、RTQ-PCRを40サイクル行った。RQ-PCRより算出できるコピー数比から、パリンドローム内部における微小欠失を検出することが可能となった。特に、パリンドローム部分欠失の検出は理論上無理とされていたが、ゲノムデータベースを基礎に男性不妊症でその部分欠失の存在を証明した。AZFc領域にあるP1+P2欠失のみならず、P1部分欠失の方法を確立した。従来考えられていたよりも多くの特発性男性不妊症患者にAZFc領域の微小欠失が存在している可能性が考えられた。
広葉樹の道管相互壁孔に常在する抽出成分の同定と通水への影響解析

これまでごく一部の広葉樹において水分通導に寄与する辺材部の道管相互間の壁孔壁に常在することが確認されている抽出成分について知見を得ることを目的とした。11科13種について存否を調べた結果、3科3種で認められ、決して稀なものではないことが示された。また、その存否は科レベルではなく、もっと小さな分類単位ごとの特徴であることが示された。化学組成について組織化学的に調べた結果、糖類や脂質のような貯蔵物質ではないことが明らかになった。本課題の目的は、一部の広葉樹において水分通導に寄与する辺材部の道管相互間の壁孔壁に常在する抽出成分について、(1)その化学組成を解明すること、(2)どのような植物群に存在するのかを明らかにすること、(3)立木木部内における通水制御にどのように関与しているかを解明すること、である。項目(1)に関しては、前年度までに得られた知見に基づき、シラカンバを材料として実験を進めた。心材が形成されていない若齢木を伐採し、二次木部より長さ10 cmの小材片を多数採取して凍結乾燥の後、切削時の摩擦熱による成分の変性を防ぐために機械によらず手作業によりチップ化した。現在、ヘキサン画分から単離を試みている。項目(2)に関しては、ヤナギ科、カバノキ科、モクセイ科、ブナ科の数群を対象として、抽出成分の存否を、エタノールによる溶媒置換乾燥した試料と未抽出で凍結乾燥した試料を走査電子顕微鏡的に比較することにより調べた。その結果、道管相互壁孔における抽出成分の存否は、属内で一致し、おそらく科レベルの特徴であることが示唆された。さらに、この抽出成分は道管相互壁孔に限らず、道管壁の内腔側表面、放射柔細胞内にも存在し、せん孔板に液滴状に凝集していることもあることが明らかになった。項目(3)に関しては、重力を利用して試験体を装着した配管内に圧力差を与えて透水度を計測する実験装置を新たにカスタムメイドで組み上げ、抽出処理の前後間での透水度の比較を進めている。本課題は、これまでごく一部の広葉樹において水分通導に寄与する辺材部の道管相互間の壁孔壁に常在することが確認されている抽出成分について、(1)その化学組成を解明すること、(2)どのような植物群に存在するのかを明らかにすること、(3)立木木部内における通水制御にどのように関与しているかを解明すること、を目的にしている。最終年度(H25年度)は、項目(1)(3)について優先的に進め、(2)についても引き続き検討を進めた。(1)に関しては、前年度までの研究により抽出成分が存在することが明らかになっており、なおかつ道管相互壁孔が頻出しそのサイズも大きいゆえ解析しやすいことから、オニグルミとシナノキを試料として用い、組織化学的な検討を新たに実施した。糖染色や脂質染色、あるいはポリフェノールの存否を検討するために顕微分光光度計による紫外線吸収スペクトルの測定を試みたが、抽出処理前後のサンプル間で明瞭な違いが観察されなかった。(3)に関しては、"single vessel method"により道管相互壁孔の通水性(または通水抵抗)をより直接的に計測することを試みた。項目(2)に関しては、この抽出成分の存否がどのような分類単位で決まっているのかを検討するため、新たに8樹種について抽出成分の存否を調べた。その結果、カバノキ科の中ではカバノキ属には存在するがアサダ属には存在しなかった。このことから、抽出成分の存否は科レベルで共通する形質ではなく、属以下のレベルで存否が異なる形質であることが明らかになった。広葉樹の中には、通水機能を有する辺材部において道管相互間の壁孔壁が電子顕微鏡で抽出できるほどに厚く抽出成分に覆われている樹種がある。本課題の目的は、(1)この抽出成分の組成を解明すること、(2)どのような植物群に存在するのかを明らかにすること、(3)この抽出成分が通水制御にどのように関与しているかを解明すること、である。H23年度は、このうち(1)と(2)に関する研究を進め、以下の知見を得た。(1)組成の解明:材料として抽出成分の存在が確認されているシラカンバを選び、溶媒の極性により抽出挙動に違いがあるかを調べた。その結果、この抽出成分は、極性の低いヘキサンでも極性の高いエタノールと同様に抽出されることが明らかになった。(2)抽出成分が存在する植物群:北大研究林札幌実験苗畑や同苫小牧研究林にて採取した9科10種の試料を使用した。生材状態でトリミングの後、各樹種につき凍結乾燥およびエタノールによる溶媒置換乾燥の2通りの乾燥法により試料を乾燥させ、走査電子顕微鏡観察をおこなった。道管相互間の壁孔壁を覆う抽出成分の存在は、オニグルミ、シナノキ、ヤマナラシで確認された。

また、この抽出成分は放射柔細胞や軸方向柔細胞中にも存在するのが観察された。これに対して、キハダ、ノリウツギ、ハリギリ、ハリエンジュ、ハルニレ、ブナ、ミズナラでは、凍結乾燥した試料と溶媒置換した試料との間で、道管相互間の壁孔壁や放射柔細胞の内容物の微細形状に電子顕微鏡的にはっきりした違いが観察されず、抽出成分は存在しないか、存在するとしてもきわめて微量であることが示唆された。3つの検討項目のうち、成分分析が遅れている。分析に必要な大量の試料の準備を手作業で行う必要があったため、および非常に多種の雑多な成分から目的物質を特定するのが難しったためである。組織化学的方法も併用して候補物質を絞り込む必要がある。H23年度の研究により、研究対象の抽出成分が極めて限られた樹種だけではなく、身近で入手できる複数種にも存在することが明らかになり、今後の解析にあたって樹種選定の幅が拡がるなど、研究を効率的に進めるための有益な知見が得られた。1年目の成果として、満足できる内容である。成分の組成に関しては、選択性の高い組織化学的方法により目的物質を標識し、光学顕微鏡的に可視化することを試みる。この結果に基づいて抽出分離した成分の中から候補物質を絞り込むことにより、組成分析を効率的に進めることが期待できる。また、樹木の二次木部細胞壁の微細構造や機能に興味をもつ学部の専攻生1名が卒業研究として本課題の一部を行うことになった。現況ではやや遅れているが、その挽回に貢献してくれることが期待される。H24年度以降、まず成分組成の同定に関しては、H23年度の成果に基づき、ヘキサン画分から単離、精製、同定を進める予定である。通水制御機構の検討については、H23年度の成果に基づき、オニグルミのような道管の径が小さく密度が疎な樹種をモデルとして解析に着手する。また、どんな分類群で見られる現象なのか、さらに調べてみたい系統群がまだまだあるので、時間が許す限り対象を広げて試料採取観察を進めたい。化学分析に必要な試薬類・消耗品・機器使用料、顕微鏡関係の道具・試薬類・機器使用料、透水性解析用の器具・消耗品類・ソフトウェアのために使用する。また、研究試料の採取、成果発表の旅費にも費やす予定である。平成23年度の未使用額(納品は年度内で支払いが次年度にずれ込んだ分)に関しては、同年度に実施した試料の調製、および成分の抽出、単離、精製実験のために使用する。H24年度配分予算に関しては、顕微鏡観察関係および化学分析関係の試薬・消耗品類に加え、今年度から着手する透水性解析用の器具類に使う予定である。また、多様な植物群からの試料採取のために旅費を使う予定である。
フーリエ変換赤外分光分析法を用いた細胞内化学反応の直接定量法の開発

有機化合物は赤外波長領域(2.5-25μm)において、官能基等に依存した固有の吸収スペクトルを持つ。本研究では、(1)細胞内シグナル伝達の中心をなすキナーゼとホスファターゼの活性を、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)を用いて簡便にin vitro測定する手法を確立する、(2)これを発展させ、大腸菌内で非破壊的に、すなわちin situでキナーゼの変異と活性相関を解析するシステムを開発する、ことである。(1)に関しては、キナーゼ反応に共役して起こる「ATP→ADP+リン酸」の反応を利用した.リン酸基に帰属する特有のスペクトルが1200cm^<-1>以下の波数領域に現れ、リン酸基を3つ持つATPと2つ持つADPの間で、明らかに異なるスペクトルが観察され、ATPからADPの変化を定量化することに成功した。この系を用い、微生物由来の可溶性ATPaseとその基質であるATPを反応させると、リアルタイムで「ATP→ADP+リン酸」の変化が観察され、少なくとも、様々な生化学反応に連動しておこるATPase活性のFT-IRを用いた定量の基本形が確立された。現時点での感度は200μM程度であり、感度を上げるために検出器を改良中である。また、より少量での測定を可能にするためセルも改良中である。さらに、上記は赤外線の透過を測定しているが、感度および測定の簡便さを追求するため、同時に半導体を用いた多重反射によるスペクトル観察も行っている.現在のところ透過に比べ感度が落ちるが、セルや半導体の材質を変えるなど検討中である。