hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神分裂病の分子病因に関する小脳モジュール構造解析からのアプローチ

1)小脳のPurkinje細胞は特異的にZebrin(Aldolase C, Aldoc)抗体で矢状ストライプ(Zebrin band)に染色され、これが概能的なモジュール構造と推測されている。先に精神分裂病様症状を引き起こす覚醒剤メタンフェタミン(MAP)投与で誘導される小脳虫部でのc-fos mRNAシグナルが、反復投与により減少する領域としない領域とに分けられることを見出した。MAP投与によるc-fos mRNAとZebrin bandとの関係を見るために、MAP投与後のAldoc mRNAのストライプの挙動をNIH Imageを用いて計測した。その結果c-fos mRNA減少領域ではAldoc mRNAストライプ数が増加し、非減少領域ではストライプ数が減少していることが分かった。細分化の強いところでは、正中からのストライプの相対位置が外側に移動した。また、我々はc-fos mRNAの発現がPurkinje細胞と頼粒細胞で観察されることから、反復MAP投与により観察された概能的なモジュール構造の選択的な細分化と移動は、両細胞の神経活動の変化に依存して生じるものと結論した。2)昨年度MAPの慢性投与により、シナプス小胞のリサイクリングに関与するamphiphysin I遺伝子の発現が上昇する事を報告した。そこで今回amphiphysin I遺伝子を精神分裂病の候補遺伝子として関連解析を行った。遺伝子の全長約250kbをカバーする7つのSNPを約50kbの間隔でdbSNPから選択し(平均hetrozygosity 34.3%)、日本人精神分裂病罹患群100検体、及び健常群100検体を用いて各SNPのタイピングを行った。その結果、各SNPの両群間での遺伝子型頻度やアレル頻度には有意な差は認められなかった。またSNPよるハプロタイプを構築し連鎖不平百解析を行ったが有意な差は認められなかった。3)MAP投与ラットの小脳試料につきdiffcrcmtial displayを用いてUbe1xを単離し、in situ hybridizationでMAP投与前後の発現変化を確認した。精神分裂病のモデルとして、メタンフェタミン(MAP)反復投与による逆耐性現象に注目し、MAP投与と前初期遺伝子群発現との関連を解析した。すでにMAP投与によりc-fos mRNAシグナルが小脳でZebrin band様の矢状バンドを形成し、反復投与によりそれが抑制されることを報告している。前葉のZebrin bandは小脳脊髄路投射と、また後葉のZebrin bandは機械的感覚入力と一致するとされているので、本年度は小脳脊髄路投射を刺激し熱感覚を起こするキャブサイシンの後ろ足への投与の効果と、また胃の機械的伸展により迷走神経を介するシナプス入力を脳幹に送るコレシストキニン(CCK8)投与の効果を、in situ hybridization法を用いて解析した。CCK8をラットに投与後1時間でc-fos mRNA、fra-2 mRNAの発現が虫部、片葉、外側辺葉に限局し観察されたが、junD mRNAは変化しなかった。キャブサイシンを投与したところ、junD mRNAシグナルのみ小脳全体で均一に上昇し、他は変化しなかった。MAP反復投与後、CCK投与で誘導されるc-fos mRNAとfra-2 mRNAシグナルは完全に抑圧されたが、junD mRNAシグナルは抑圧されなかった。以上から、MAP反復投与は選択的にCCK投与によって誘導される小脳のc-fos mRNAとfra-2 mRNA発現を抑圧すると考えられた。さらに、MAP反復投与が、機械的感覚を小脳に運ぶシナプス入力を抑圧している可能性が示唆された。また逆耐性現象に関わる後期遺伝子群を検索するため慢性MAP投与ラットを用いたディファレンシャルディスプレイを行い、アンフィフアイシンIの発現が誘導されることを見いだし、in situ hybridizationにより大脳前頭野、側頭葉前部や小脳顆粒細胞でのmRNAシグナルの上昇を確認した。

その結果、各SNPの両群間での遺伝子型頻度やアレル頻度には有意な差は認められなかった。またSNPよるハプロタイプを構築し連鎖不平百解析を行ったが有意な差は認められなかった。3)MAP投与ラットの小脳試料につきdiffcrcmtial displayを用いてUbe1xを単離し、in situ hybridizationでMAP投与前後の発現変化を確認した。
VHLペプチドを用いた脊髄変性疾患に対する脊髄神経再生の研究

細胞膜透過性VHLペプチド(VHL-TATペプチド)を開発し、慢性脊髄圧迫モデルで検討した。しかし、脊髄変性変化および運動機能変化に有意な差をもたらさなかった。そこで、非骨傷性脊髄損傷モデルを作成し、再度その損傷状態、変化、神経再生を検討することとした。一方、非骨傷性損傷モデル自体が新規の独自モデルとして注目されることになり、多くの成果を発表した。このモデルにおいて、VHLペプチド導入し、研究継続中である細胞膜透過性VHLペプチド(VHL-TATペプチド)を開発し、慢性脊髄圧迫モデルで検討した。このモデルにおいて、VHLペプチド導入し、研究継続中である脊髄神経再生の研究は脊髄損傷を中心に多方面でなされている。しかし、倫理上問題、複雑な細胞調製、生着性の問題、腫瘍性変化の可能性、移植そのものの侵襲的行為など、実用面でのハードルは極めて高い。私たちは腫瘍抑制遺伝子であるVHL遺伝子が神経再生に大きく関与していることを発見し、VHL蛋白による神経再生の現象を証明してきた(Murata,Cancer Res, 2002,Kanno, Cancer Res, 2000)。今回、細胞膜透過性VHLペプチド(VHL-TATペプチド)を開発し、他家細胞の移植を行わず自己内在する脊髄ニューロンを再生させる方法を検討している。生理的な脊髄変性病態を示すラット脊髄症モデルを用いてこの神経再生の現象を証明すれば、脊髄変性疾患、脊髄損傷において不可能であった神経再生治療が可能となる。平成19年度の初期検討において、ペプチド投与群とコントロール群とでは生理学的脊髄変性変化および運動機能変化に有意な差をもたらさなかった。病理学的変化も有意な変化をもたらさなかった。これは、神経再生の誘因として再生・修復機能が恬性化されるべき損傷部位を要するためと考えられた。そこで、内在性に脊髄損傷状態を誘発させる方法を見いだし、非骨傷性脊髄損傷モデルを作成した。その損傷状態、変化、神経再生を検討することとした。非骨傷性脊髄損傷とは、骨傷を伴うような外傷を引き起こさず、脊髄損傷を誘発するものである。用いている慢性圧迫モデルでは、非骨傷性損傷の誘発が可能なことが判明し(脊髄脊椎21(5)2008,日本脊髄障害医学会雑誌21,2008)、神経再生モデルとしても有用である。脊髄露出に伴う人為的操作もなく、直接的外傷を伴わない。内在する脊髄変性疾患の病態としての理解にも流用しえた。このラットに対し、ペプチド投与群、PBS投与群(コントロール)、非投与群にわけ、検討進行中である。脊髄神経再生の研究は脊髄損傷を中心に多方面でなされている。平成19年度の慢性圧迫モデルでの検討において、ペプチド投与群とコントロール群とでは生理学的脊髄変性変化および運動機能変化に有意な差をもたらさなかった。これは、神経再生の誘因として再生・修復機能が活性化されるべき損傷部位が必要であるためと考えられた。用いている慢性圧迫モデルでは、非骨傷性損傷の誘発が可能なことが判明し、そのモデル自体が新規の独自モデルとして大きく注目されることとなった。神経再生モデルとしても活用できる。内在する脊髄変性疾患の病態にも流用しうる。結果として平成20年度はこのモデルの確立に時間を費やし、再現性をもって作成可能となり、多くの成果を発表した。このラットに対し、ペプチド投与群、PBS投与群(コントロール)、非投与群にわけ、研究継続中である
Anomalous U(1)A理論における超対称性の破れ

超対称anomalous U(1)A大統一理論と矛盾することのない、現象論的に満足する超対称性を破る模型を研究しました。もし、この模型が完成すれば、この一つの統一理論で過去の様々な統一理論が抱えていた問題点を体系的に説明する事ができます。平成22年度は、平成21年度まで行ってきた研究のつづきをやりました。特に今年度は、平成21年度まで研究した模型の問題点を1つ解決することを考えました。問題点とは、力を媒介する粒子の超対称性パートナー(ゲージーノ)の質量を実験と矛盾しないように大きくするには、理論のパラメータを大きく微調整しなければならないという点です。この問題点を解決するために新しい場を模型に導入することを考えました。ただし、新しい場を導入することでゲージ結合定数の発散が起きては困るため、まず、そのことを調べる必要がありました。比較的計算の簡単なSO(10)×U(1)A大統一理論を使って計算しました。結果、繰り込み群の計算を行ったところ、新しい粒子(10表現の粒子)を1つ入れても、カットオフのスケールでゲージ結合定数は発散しないことが分かりました。そして、この新しい場を使い、ゲージーノの質量を計算したところ、パラメータの微調整無しで、十分な重さの質量が得られることが分かりました。また、この模型にも、超対称標準模型に存在する2つのヒッグス、アップビッグスとダウンヒッグスの各質量(μ項)の生成に関係する問題が残っている。この問題を解決するためには、離散対称性を模型に導入すれば解ける可能性があり、この研究の将来の課題となっている。超対称性E_6×SU(2)_H×U(1)_A大統一理論と矛盾することのない、現象論的に満足する超対称性を破る模型を研究しました。もし、この模型が完成すれば、この一つの統一理論で過去の様々な統一報論が抱えていた問題点を体系的に説明する事ができます。21年度は、以下のこの模型の問題点を解決できる現実的な模型を1つ、創る事に成功しました。問題点(1)力を媒介する粒子のスーパーパートナー(ゲージーノ)の質量が実験と矛盾するほど小さい。問題点(2)超対称標準模型に存在する2つのヒッグス、アップヒッグスとダウンヒッグスの各質量(μ項)に比べて、これらのヒッグスの混合質量(Bμ項)が大きすぎる。これらの問題点を今ままで、独立に解いていたのですが、研究をしてみると、独立な問題点ではないことに気づきました。問題(1)と(2)を同時に解く事を考えた結果、超対称性を自発的に破る場の真空期待値(VEV)を大きくすれば良い事に気づきました。もし、このVEVを大きくできれば、アップヒッグスとダウンヒッグスの各質量(μ項)を大きくし、ヒッグスの混合質量(Bμ項)を相対的に小さくできます。また、このVEVを大きくする事によって力を媒介する粒子のスーパーパートナー(ゲージーノ)の質量を大きくできる事も分かりました。このように、本質は、超対称性の破れを伝える場の質量を小さくするのではなく、VEVを大きくする事である事が分かりました。このVEVは、超対称性を自発的に破る場の質量の2乗に反比例するので、質量を小さくなるように微調整しました。この微調整は、0.0001程度なのですが、この微調整をすれば、問題点(1)と(2)が同時に解ける事が分かりました。
抗第VIII因子インヒビター存在下における第VIII因子活性発現に関する研究

インヒビター存在下での第VIII因子活性(FVIII:C)の発現状況を解析する目的で、凝固波形解析装置(MDAII)およびトロンビン生成測定システムを用いた検討を行った。抗第VIII因子同種抗体(AlloAb)は7種、モノクローナル抗体(MoAb)は4種を使用した。AlloAbのうち3種が第VIII因子のA2ドメインを、4種がC2ドメインを認識するインヒビターであった。一方、MoAbはA1とA2ドメインを認識する抗体が各1種、C2ドメインを認識する抗体が2種であった。AlloAbおよびMoAbをIgGに精製した後、第VIII因子欠乏血漿で希釈し、10および20BU/mlのインヒビターを有する第VIII因子欠乏血漿を作製した。それらを正常血漿と等量混合後の検体を経時的に凝固波形解析とともにFVIII;Cおよび最大凝固加速度(|Min2|)を計測した。さらに、トロンビン生成能を評価するパラメーターとしてPeakHeight(Nm)とEndogenous Thrombin potential ETP(Nm×min)を測定した。その結果、終濃度5BU/mlを超えるインヒビター存在下では通常、正常血漿中のFVIII:Cは完全に失活するはずであるが、実際には120分後でも微量のFVIII:Cおよび|Min2|が検出された。とくにA2ドメインを認識する抗体では凝固波形の改善も良好でFVIII:Cもより残存する傾向を示した。同様に、20BU/mlの高力価でもほとんどのインヒビター存在下で微量のトロンビン生成が確認された。とくにA2ドメインを認識するAlloAb存在下では、C2ドメインを認識する抗体の場合よりトロンビン生成が上回る傾向を示した。これらの知見は高力価インヒビター存在下でのFVIII : Cの発現の可能性を示唆するものであり、インヒビター存在下の第VIII因子定期投与で経験する予防的止血効果を裏付けるものと思われた。今年度はインヒビター存在下での第VIII因子活性(FVIII:C)の発現状況を解析する目的で、微量のFVIII:Cを検出することが可能な凝固波形解析装置(MDAII)を用いた検討を行った。イムノブロットによるエピトープ解析ではAlloAbのうち3種が第VIII因子のA2ドメインを、4種がC2ドメインを認識するインヒビターであった。AlloAbおよびMoAbをIgGに精製した後、第VIII因子欠乏血漿で希釈し、10 Bethesda単位(BU)/mlのインヒビターを有する第VIII因子欠乏血漿を作製した。それらを正常血漿と等量混合後1、10、30、60、120分の検体の凝固波形解析とともにFVIII:Cおよび最大凝固加速度(|Min2|)を計測した。120分反応後、A2ドメインを認識する2種のAlloAbでそれぞれ0.6、1.1U/dlのFVIII:Cを検出し、3種でそれぞれ0.128、0.141、0.152の|Min2|を認めた。

同様にc2ドメインを認識する2種のAlloAbで0.4、0.5u/dlのFVIII:Gを検出したが、|Min2|はいずれの抗体も検出されなかった。一方、A1とA2ドメインを認識するMoAbのFVIII:Cはそれぞれ0.9、5.7U/dlであり、|Min2|もそれぞれ0.146、0.367であった。C2ドメインを認識するMoAb2種のFVIII:Cはそれぞれ<0.2と0.2U/dlであり、|Min2|はそれぞれ0.117と0.102であった。終濃度5BU/mlのインヒビター存在下では通常、正常血漿中のFVIII:Cは完全に失活するはずであるが、実際には120分後でも微量のFVIII:Cおよび|Min2|が検出された。とくにA2ドメインを認識する抗体では凝固波形の改善も良好でFVIII:Cもより残存する傾向を示した。これらの知見は高力価インヒビター存在下での第VIII因子活性の発現の可能性を示唆するものである。目的:前年度はインヒビター存在下での第VIII因子活性(FVIII:C)の発現状況を解析する目的で、凝固波形解析装置(MDAII)を用いた微量のFVIII:C測定を行った。今年度はインヒビター存在下での正常血漿のトロンビン生成能を自動型のトロンビン生成測定システムを用いて解析した。方法:認識部位の明らかな各種抗第VIII因子同種抗体(AlloAb)7種とモノクローナル抗体(MoAb)4種を用いた。IgGに精製したAlloAbおよびMoAbを第VIII因子欠乏血漿で希釈し、10および20Bethesda単位(BU)/mlのインヒビターを有する第VIII因子欠乏血漿を作製した。それらを正常血漿と等量混合し、30、60、90、120分後の検体についてトロンビン生成能を検討した。パラメーターとしてPeak Height(nM)とEndogenousThrombin potential ETP(nM×min)を計測した。成績:20BU/mlの高力価でもほとんどのインヒビター存在下で微量のトロンビン生成が確認された。特に重鎖A2ドメインを認識するAlloAb存在下では、軽鎖C2ドメインを認識する抗体の場合よりトロンビン生成が上回る傾向を示した。また、同じC2認識抗体でも、von Willebrand因子およびリン脂質との結合をともに阻害しない抗体存在下では、それらを阻害する抗体の場合よりトロンビン生成が上回っていた。考案および結語:インヒビターの認識部位や阻害様式によってトロンビン生成に差がみられたが、いずれの抗体存在下でも、微量のFVIII:Cとともに一定のトロンビン生成がみられた。これらの知見は、インヒビター存在下の第VIII因子定期投与で経験する予防的止血効果を裏付けるものと思われた。
WT1ナチュラルアンチセンスRNAの発現と破骨細胞分化制御:骨破壊制御の新戦略

WT1は小児腎癌Wilms'腫瘍に於ける癌抑制遺伝子の産物として発見されたZinc finger型転写因子であり、マクロファージ分化能を有することが分かっているが、破骨細胞分化における働きは不明であった。新生仔下顎骨のパラフィン切片を用いたRNA in situ hybridization法により、破骨細胞がWT1アンチセンスRNAを高発現することを見出した。ノーザンブロット法及びアンチセンス特異的rtPCR法を用いることにより新生仔下顎骨でWT1アンチセンスRNAが豊富に発現していることを確認した。RAW-D細胞を用いた破骨細胞分化系におけるWT1蛋白質の発現を経時的に解析したところ、未分化な段階で発現されるWT1の発現が破骨細胞分化に伴って著しく抑制されることが分かった。更にWT1-アンチセンスRNA発現ベクターをRAW-D細胞に導入しWT1の発現をノックダウンすると破骨細胞の形成が顕著に促進されることが分かった。これらの結果よりWT1蛋白質が破骨細胞分化の発現を制御する機能を持つことが示唆され、分化に伴うWT1の発現抑止に特異的アンチセンスRNAの発現が関与する可能性が強く示唆された。近年、制御性RNAであるナチュラル・アンチセンスRNAがヒトを含む哺乳動物でも広く発現されており、生体防御等において重要な制御的役割を演ずることが明らかにされてきた。申請者は骨吸収担当細胞である破骨細胞か癌抑制遺伝子の産物でありZincフィンガー型の転写因子であるWilms' Tumor 1 (WT1)のアンチセンスRNAを高発現していることを見出した。本研究ではWT1アンチセンスRNAの破骨細胞分化に於ける機能を解明するとともに炎症性骨破壊の場での発現を解析し、WT1アンチセンスRNAの発現を制御することにより骨破壊を抑制することを目的とする。WT1は小児腎癌Wilms'腫瘍に於ける癌抑制遺伝子の産物として発見された転写因子であるが、マクロファージの分化にも誘導的な役割を演ずることが知られている。破骨細胞はマクロファージと共通の分化単位から派生する骨吸収細胞であるが「分化振分け機構」については不明の点が多い。WT1の破骨細胞分化に於ける役割を解析する目的で骨組織に於ける遺伝子発現を特異的RNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーション法により検討したところ、新生仔ラット下顎骨に存在する成熟破骨細胞かWT1-アンチセンスRNAを高発現することを見出した。ノーザンブロット法を用いて新生仔下顎骨でWT1-アンチセンスRNAが豊富に発現されていることを確認した。前破骨細胞株RAW-D細胞を用いた破骨細胞分化系を用いてWT1蛋白質の発現を経時的に解析したところ、未分化な段階で発現されるWT1の発現が破骨細胞分化に伴って著しく抑制された。WT1-アンチセンスRNA発現ベクターをRAW-D細胞に導入するとWT1の発現がノックダウンされ、破骨細胞分化が顕著に亢進された。これらの結果よりWT1蛋白質が破骨細胞分化を抑制する機能を持つことが明らかとなり、アンチセンスRNAによるWT1の発現調節がマクロファージと破骨細胞の「分化振分け」や「破骨細胞分化状態の維持」において重要な役割を演じている可能性が示唆された。
酸化・還元反応を利用するディーゼルエンジン排ガスの高度浄化と熱回収システムの開発

1.触媒粒子の作成とその性状評価:脱硝触媒粒子の作成を目的として、申請者らが開発したバインダレス造粒法により酸化チタン超微粒子の造粒を行った。具体的には、テーパ付き流動層造粒器内に酸化チタン原料粉末10gを供給して所望のガス流速で流動化させた。その結果、平均粒径が150800μmの球状の頼粒が得られる、原料粉体を篩を用いて篩うと得られる顆粒の粒度をコントロールできる、操作時間とともに、また造粒器への供給空気の流速とともに平均粒径が増大する、空気流速が大きい場合、2分布になる、などの知見が得られた。また、これらの結果から、本造粒法における造粒機構としては原料粉体中に存在する凝集体がテーパ部壁面上で会合する凝集体生長過程と凝集体が転勤作用により球状化(shaping)する過程が競合して造粒が進行すると示唆された。また、顆粒の強化については、上記の造粒器とほぼ同様のテーパ付き流動層内でバインダレス造粒で得られた顆粒を流動化させ、これにPVA水溶液を噴霧し、乾燥することによって、顆粒の強化試験を行った。尚、顆粒の圧壊強度の評価には粒子硬度測定装置を用いた。その結果、顆粒の強度は液の噴霧時間とともに増大し、FCC粒子と同程度の強度になる、特に粗粒部分の強度の増大が著しいなど、有用な知見が得られた。2.流動化特性に関する研究:希薄流動層内の脱硝特性と密接な関係を有する流動層内フリーボード粒子の流動化特性、特に粒子ホールドアップと粒子飛び出し速度の測定を模擬粒子(FCC呼子とチャー粒子)を用いて行い、飛び出し速度定数は同一終末速度を有する粒子の場合では粒子によらない、粒子ホールドアップは粒子クラスターの存在形態によって異なることが明らかになった。3.脱硝特性に関する研究:現時点では、酸化チタンの顆粒を流動層脱硝装置に利用できる程度に大量に作成できないため、酸化チタン原料粉末を篩により造粒し、これを装置に供給して脱硝試験を行った。その結果、層がチャネリング傾向を示して層が不安定であるにも拘らず、フリーボード部には比較的濃厚な希薄流動層が出現し、紫外光照射(ブラックライト、出力8W)下で、100ppmの層入口濃度に対して出口濃度が85ppm程度にまで低減し、かつこの状態が数分間持続することを確認した。フリーボード内粒子濃度の増大や紫外光源の能力アップを図れば、脱硝率90%は容易に達成されると示唆される。具体的には、テーパ付き流動層造粒器内に酸化チタン原料粉末5gを供給して所望のガス流速で流動化させた。

その結果、平均粒径が150800μmの球状の顆粒が得られる、原料粉体を篩を用いて篩うと得られる顆粒の粒度をコントロールできる、操作時間とともに、また造粒器への供給空気の流速とともに平均粒径が増大する、粒度分布は対数正規分布に従う、などの知見が得られた。また、これらの結果から、本造粒法における造粒機構としては原料粉体中に存在する凝集体がテーパ部壁面上で会合する凝集体生長過程と凝集体が転動作用により球状化(Shaping)する過程が競合して造粒が進行すると示唆された。また、顆粒の強化については、上記の造粒器とほぼ同様のテーパ付き流動層内でバインダレス造粒で得られた顆粒を流動化させ、これにPVA水溶夜を噴霧し、乾燥することによって、顆粒の強化試験を行った。尚、顆粒の圧壊強度の評価に粒子硬度測定装置を用いた。その結果、顆粒の強度は液の噴霧時間とともに増大し、FCC粒子と同程度の強度になる、特に粗粒部分の強度の増大が著しいなど、有用な知見が得られた。2.流動化特性に関する試験:濃厚流動層内の脱硝特性と密接な関係を有する層内流動化特性の測定を常温用の流動層を用いて開始している。ただし、現在のところ、作成された酸化チタンの顆粒の量が十分でないため、酸化チタンと光学的性質が類似している珪砂を用いて、気泡径、気泡頻度、気泡上昇速度等気泡諸量測定用の気泡検知・解析システムの受光強度に対するしきい値(threshold)の調整を行った。その結果、気泡の諸量の測定精度が最大となるしきい値が存在することがわかった。1.触媒粒子の作成とその性状評価:脱硝触媒粒子の作成を目的として、申請者らが開発したバインダレス造粒法により酸化チタン超微粒子の造粒を行った。具体的にはテーパ付き流動層造粒器内に酸化チタン原料粉末10gを供給して所望のガス流速で流動化させた。その結果、平均粒径が150800μmの球状の顆粒が得られる、原料粉体を篩を用いて篩うと得られる顆粒の粒度をコントロールできる、操作時間とともに、また造粒器への供給空気の流速とともに平均粒径が増大する、空気流速が大きい場合、2分布になる、などの知見が得られた。また、これらの結果から、本造粒法における造粒機構としては原料粉体中に存在する凝集体がテーパ部壁面上で会合する凝集体生長過程と凝集体が転動作用により球状化(shaping)する過程が競合して造粒が進行すると示唆された。また、顆粒の強化については、上記の造粒器とほぼ同様のテーパ付き流動層内でバインダレス造粒で得られた顆粒を流動化させ、これにPVA水溶液を噴霧し、乾燥することによって、顆粒の強化試験を行った。尚、顆粒の圧壊強度の評価には粒子硬度測定装置を用いた。2.流動化特性に関する試験:希薄流動層内の脱硝特性と密接な関係を有する流動層内フリーボード粒子の流動化特性、特に粒子ホールドアップと粒子飛び出し速度の測定を模擬粒子(FCC粒子とチャー粒子)を用いて行い、飛び出しは同一ガス流速では粒子によらない、ホールドアップは粒子によって著しく異なることが明らかになった。3.脱硝特性に関する試験:現時点では、酸化チタンの顆粒を流動層脱硝装置に利用できる程度に大量に作成できないため、酸化チタン原料粉末を篩により造粒し、これを装置に供給して脱硝試験を行った。その結果、層がチャネリング傾向を示して層が不安定であるにも拘らず、フリーボード部には比較的濃厚な希薄流動層が出現し、紫外光照謝(ブラックライト、出力8w)下で、100ppmの層入口濃度に対して出口濃度が85ppm程度にまで低減し、かつこの状態が数分間持続することを確認した。
認知症の人と家族に対する地方型サポートネットワーク形成の研究

本研究の成果は、(1)高齢化の進む6地域を対象とした認知症サポートネットワークに関する研究、(2)杵築市の施設を中心とした認知症フォーマルサポートネットワークの研究、(3)大分県市町村・宝塚市を対象とした認知症医療連携の研究、(4)杵築市・大分市・宝塚市を対象とした地域包括支援センターにおける認知症支援の研究といった4つの比較調査研究に分けられる。これらの調査に基づき、地方における認知症サポートネットワーク形成の実態と課題を明らかにした。本研究は、高齢化の進む地方都市における認知症の人と家族のQOL向上に資するため、大分県の過疎地域・市街地と大都市圏に位置する郊外住宅地域(宝塚市)を対象として認知症サポートネットワーク形成に関する比較調査研究を実施することにより、大都市とは人間生態学的状況(高齢化率・近隣関係・親子の距離等)や福祉資源の立地状況が異なる、地方に適合した認知症サポートネットワーク形成の支援指針モデルを構築することを目的としている。認知症サポートネットワークは大きく、(1)地域ネッート、(2)医療ネット、(3)施設ネット、(4)家族ネットに分けられる。本年度はこれらネットワークの様態を明らかにするため、調査対象地区として杵築市の大田地区と中心市街地、大分市の郊外団地と中心市街地の4地域を選定した。杵築市大田地区は平成12年国勢調査においては大分県において最も高齢化率が高い村(42.9%)であった。また、他の調査対象地区はいずれも高齢化率が30%を越えている地区を選定した。質問票の回収率は、杵築市大田地区83.2%、杵築市中心市街地81.5%、大分市郊外団地78.0%、中心市街地65.7%である。これらの調査結果を統計分析した。回答者めうち認知症めいる人の比率は杵築市大田地区8.9%、杵築市中心市街地8.1%、大分市郊外3.9%、大分市中心市街地6.4%となっている。質問項目は認知症の家族を介護している人といない人に分けて作成し、いない人に対する質問項目は、(1)心配の有無(2)心配の内容、(3)相談先、(4)病院の所要時間、(5)介護を受けたい場所、(6)診療科、(7)徘徊行動への対応、(8)地域住民の協力、いる人に対する質問項目は、(1)認知症の人の年齢、(2)介護の仕方、(3)心配事、(4)自宅介護の状況、(5)徘徊したときの対応、(6)施設への見舞い頻度からなっている。このほか比較対象地域の宝塚市において同様な調査を実施する準備と資料収集を行った。本年度は、地方の調査対象地域の認知症サポートネットワークの特色を明らかにするため、大都市圏郊外(高齢化率30%以上の宝塚市山手住宅地と昭和30年代後半に開発され高齢化率が特に高い仁川団地)を調査し、集計作業を実施した。山手住宅地の調査対象世帯は4539世帯で回収率は37.7%、仁川団地の調査対象世帯は298世帯で回収率36.2%となった。これら2地域の集計結果を昨年調査した4地域(高齢化率50%以上の集落を多く含む杵築市大田地区、城下町から発達した杵築市中心市街地、県庁所在都市大分市の中心市街地と郊外住宅地)の集計結果と比較分析した。調査結果の分析を全体的視点からの分析と地域間比較からの分析に大きく分け、全体的視点からの分析をさらに(1)各調査項目において共通する傾向、(2)大都市郊外(宝塚市)と地方(杵築市・大分市)との違い、(3)高齢化率が特に高い杵築市大田地区と宝塚市仁川団地の共通点に注目して分析した。調査結果の詳細は2009年5月の西日本社会学会で報告するが、認知症サポートネットワークについて見出された基本的知見は以下のとおりである。(1)地方(大分県)4地域は大都市郊外(宝塚市2地域)と比較して、「家族や親族」との結びつきや近隣、氏子組織、消防団、民生委員といった「コミュニティ」との結びつきが強く、市役所の窓口・地域包括センター・警察等の「公的機関」との結びつきが弱い、(2)大分県4地域でもそれぞれの地域によりネットワークの違いがあり、大分市郊外は宝塚市住宅地に近い傾向を示し、過疎地域の大田地区はコミュティや社会福祉協議会との結びつきが特に強くなっている。年度は、19年度から20年度にかけて実施してきた認知症サポートネットワーク調査の結果を取りまとめ、西日本社会学会で報告し、論文として発表した。また、施設利用アンケート調査、医療機関アンケート調査、包括支援センターヒアリング調査を実施し、その調査結果を取りまとめた。施設利用調査においては、認知症のサービスネットワークが機能しているか否かについて,生活圏域外サービス利用率から明らかにすることを試みた。在宅調査と施設調査を実施し、両者とも杵築市を対象とした。在宅調査で特徴としてあらわれたのがデイサービスとデイケアで,圏域内外含めた利用率は,旧杵築市はデイサービスが高く,デイケアが低かった。旧山香町は,反転した結果となった。

両地域とも,高齢者人口あたりの利用定員に相関した。一方で,デイケアとデイサービスは機能代替性があり,上記利用率の逆転はこれが影響していることが考えられた。しかし,両地域とも,高齢者人口あたり利用定員が多いサービスが,圏域外利用率も高いという矛盾した結果となった。医療機関アンケート調査では、認知症治療においては認知症の早期発見・早期治療が大切であり、そのためには「かかりつけ医」を中心とした認知症医療システムの構築が求められという考えのもとに、大分県と宝塚市の診療所を対象として実態調査を実施した。その結果、大分県においては認知症の診断をしていない「かかりつけ医」が多いことや専門医との連携に問題があることが明らかになった。地域包括支援センターヒアリング調査は、宝塚市・大分市・杵築市において実施した。宝塚市・大分市は民間委託で実施しているが杵築市は市の直営で実施している。認知症相談事業における地域社会への働きかけは宝塚市が積極的であったが、大分市・杵築市においては弱いことが判明した。
励起状態の化学結合とクラスター間相互作用

非局在電子を有するナノメートル金属粒子や多環芳香族分子系においては電子系の共鳴周波数に同期する外部電磁波を照射すると粒子の大きさを反映した巨大な振動双極子が生じる。この振動双極子は中性粒子間に働くファンデルワールス力と同様に粒子間に引力として作用する事が期待される。この引力は振動双極子の大きさが粒子のサイズを反映するため通常のファンデルワールス力と比べると数nmサイズの粒子ではゆうに数万倍に上り、かつ粒子間距離が数十nm以上からはたらく遠距離力である事が見いだされた(K.Kimura,J.Phys.Chem.98(1994)11997)。分子の立場で見るとこれは励起状態の物質と基底状態の物質間の相互作用とみなせる。この相互作用を励起状態での粒子間力ととらえ、更に詳細な理論的研究を進めこれを実験的に見いだすことが本研究の目的である。本年度においては実験系として清浄な金属コロイドが得られるガス中蒸発法によるナノコロイド作成法としてガスフロー法を採用した。この方法はナノ粒子を分散させるのに界面活性剤やポリマーを必要としない今の所唯一のナノコロイド作成法である。大きさ8nmの金超微粒子の2-プロパノール分散系においては514.5nmのアルゴンイオンレーザー光照射により粒子が更に分散する傾向のある事が見いだされた。これは予想に反したことであった。分散と共に2-プロパノールからのアセトンとプロトンが生じ、電子が粒子に移行して粒子の電荷量が増加していることがゼータ電位の測定、紫外スペクトル、NMRの測定より分かった。すなわち本システムはコロイド系において帯電量が電子的な機構で決定されている極めて希なケースである。更に上記の系において粒子密度を更に高濃度で行ったところ理論予想の通りに凝集が進行した。粒子濃度に対するこの様な依存性はまだ正確には理解されていないが、一つには粒子間引力のおよぶ範囲の問題(高濃度では平均粒子間隔が短縮される)、または単純な温度効果による可能性もあり、今後の課題として残された。
医薬シーズとしての活性天然物の探索とその標的分子の解析

がんや結核の治療に有効な新しい医薬シーズを独自に構築した活性試験法を指標にして海綿などの海洋医薬資源から探索し、複数の活性天然物を見出した。見出した微量活性天然物を医薬リードとして発展させるため、全合成やアナログ合成研究を展開して構造と活性の相関を解析するとともに、プローブ分子を合成して標的分子を解析した。さらに、活性天然物の標的分子を解析するための簡便な方法がないことから、微量活性天然物の標的分子を解明するための汎用性の高いプローブ分子の設計・合成法を確立し、形質転換微生物を用いる手法やファージディスプレイを用いる手法を構築した。本年度は研究計画に基づき、まず、様々な活性物質に簡便に適用できる系統的かつ一般的なプローブ分子の合成法の確立を目指した検討を行い、システインを母核とするプローブ分子素子を創製することに成功した。マレイミドに対するチオールの付加という官能基選択性の非常に高い反応を利用することで、種々の官能基を有する活性天然物についても簡便に誘導化してプローブ分子を合成することが可能な汎用性の高い手法である。一方、プローブ分子にタンパク質とより強固に相互作用するための捕捉補助基としてボロン酸を分子中に組み込んだ次世代型プローブの開発を検討した。生体内ペプチドであるグルタチオンを活性物質のモデル化合物として用い、今回開発した系統的合成法により、構造を種々変換したプローブ分子を簡便に合成することができたので、これに結合するグルタチオンSトランスフェラーゼとの親和性を基準にプローブ分子の性能評価を行った。その結果、活性物質(グルタチオン)と捕捉補助基(ボロン酸基)との距離が、標的分子(グルタチオンSトランスフェラーゼ)との親和性に大きな影響を及ぼすことを明らかにすることができた。また、以前より我々は、化合物の標的分子を高発現させた形質転換細胞は、化合物に対して耐性を示すという考えのもと、cDNAライブラリーを利用する動物細胞に作用する活性天然物の標的分子の解析を検討しているが、今回、これをさらに効率良く標的分子の解析が行える方法論に発展・改良させるため、動物細胞内でも複製され、安定形質転換細胞が簡便に作成できるepisomal型発現ベクターでcDNAライブラリーを作成した。1)がん血管新生を強力に阻害するcortistatin Aアナログの標的分子の同定を目的に、昨年度、研究代表者らが開発に成功した、ビオチン標識活性アナログプローブおよび活性を保持しない類似構造のアナログプローブを利用して、血管内皮細胞から調製した細胞破砕液でのプルダウンアッセイを行った。その結果、タンパク質電気泳動のゲル染色画像において、活性アナログプローブに対して選択的に結合する複数のタンパク質の存在が確認された。2)活性天然物の標的分子を捕捉・同定するための次世代型高機能プローブ分子の開発を目的に、緩和な条件で切断可能なジオール構造をプローブ中に組み込んだcortistatin Aアナログのビオチン標識プローブの合成を試み、それに成功した。また実際に、過ヨウ素酸ナトリウムで処理することにより、プローブ分子の切断が可能であることを明らかにした。さらに、微量の活性物質に対しても適応でき、官能基非依存的にプローブ分子化を可能にする機能素子として、ジアジリンを高反応性化学種として導入したプローブ素子の開発にも成功した。3)潜在性結核菌に有効な抗菌物質として見出した、海綿由来のテルペノイド化合物の標的分子の同定を目的に、本活性物質に対して、研究代表者らが確立しているゲノムDNAライブラリーを利用する標的分子解析法を適応し解析を実施した。その結果、その標的分子が、dioxygenaseと予想されるタンパク質であることを明らかにした。今年度は、研究計画に従い以下の検討を実施した。1.がん血管新生を強力に阻害するcortistatin Aアナログの標的分子の解析については、前年度、細胞破砕液からのビオチン標識活性アナログプローブを使用するプルダウンアッセイにより、複数の結合タンパク質の存在を確認していた。今年度はLC-MSによるタンパク質の同定を行い、それに成功した。現在、同定したタンパク質が、実際にcortistatin Aアナログの血管新生阻害作用に関与しているか否かの検討を進めている。2. Cortistatin Aアナログの構造活性相関研究の過程で、活性アナログ化合物と非常に類似した化学構造を有しながら、活性を保持しない不活性アナログ化合物を見出した。そしてこれを、標的分子解析の比較実験に用いるためにプローブ化を行い、これに成功した。3.新たな結合タンパク質の解析手法として、ペプチド提示型phage libraryから、プローブ分子を用いて結合タンパク質候補を探索するPhage display法の確立を行い、これに成功した。現在、研究代表者が保有する活性天然物を利用して、確立した手法の有用性についての検証実験を進めるとともに、本手法の最適化を行っている。3.潜在性結核菌に有効な抗菌物質として見出した新規aaptamine類に関しては、標的分子解析を実施するための化合物供給を目的として、その全合成研究を進め合成ルートの確立に成功した。現在、簡便かつ高収率な合成ルートとすることを目指して、反応条件の最適化等を実施している。今年度は、研究計画に従い以下の3つの検討を実施し成果を得た。1.がん血管新生阻害物質cortistatin Aアナログの標的分子解析について、前年度合成した活性を保持するプローブ分子および活性持たないダミープローブ分子の2つを利用して、血管内皮細胞の細胞破砕物から結合タンパク質の同定を試みた。その結果、cortistatin Aアナログの結合タンパク質候補を約10種類に絞り込むことに成功した。2.潜在性結核菌に有効な海綿由来のアルカロイド化合物については、前年度確立した全合成ルートを参考にして、標的分子解析に向けた化合物のプローブ化を試みた。

その結果、活性を保持するプローブ分子の合成に成功した。また、合成したプローブ分子を用いて、Mycobacterium属細菌の菌体破砕物から標的分子解析を開始した。また、遺伝子変異解析による標的分子同定を平行して進めた。活性物質に対する自然耐性株の分離をM. bovis BCG株を用いて実施した結果、遺伝子変異解析可能な複数の化合物自然耐性株を得ることに成功した。3.昨年度の研究で見出した、低栄養環境に適応した膵臓がん細胞選択的に増殖阻害活性を示す海綿由来のセスキテルペンについては、その作用メカニズム解析を目的として、化合物処理により変動する遺伝子の解析をRT-PCRアレーを用いて進めた。その結果、本化合物で処理した低栄養環境適応膵臓がん細胞では、ヒートショックプロテインファミリー群が大きく変動することを見出した。がんや結核の治療に有効な新しい医薬シーズを独自に構築した活性試験法を指標にして海綿などの海洋医薬資源から探索し、複数の活性天然物を見出した。見出した微量活性天然物を医薬リードとして発展させるため、全合成やアナログ合成研究を展開して構造と活性の相関を解析するとともに、プローブ分子を合成して標的分子を解析した。さらに、活性天然物の標的分子を解析するための簡便な方法がないことから、微量活性天然物の標的分子を解明するための汎用性の高いプローブ分子の設計・合成法を確立し、形質転換微生物を用いる手法やファージディスプレイを用いる手法を構築した。1)プローブ分子にタンパク質とより強固に相互作用するための捕捉補助基としてボロン酸を分子中に組み込んだ次世代型プローブの有用性をさらに高めるため、ボロン酸基の構造を種々変換したプローブを合成し、より捕捉能の高いプローブ分子の創成を目指した検討を行った。前年度で確立したプローブ分子の系統的合成法を用いて、生体内ペプチドであるグルタチオン由来のプローブ分子について、種々のボロン酸誘導体を導入し、標的分子であるグルタチオンSトランスフェラーゼとの親和性を検討した結果、ボロン酸よりルイス酸性の高いboroxole基を導入することで捕捉能が大きく向上することを見出した。2)以前に我々が見出した、低酸素環境選択的がん細胞増殖阻害物質furospinosulin-1の標的分子の同定に向けて、フォトアフィニティープローブ分子の合成を検討した。系統的合成法を用いて標的分子と共有結合を形成するための光反応性基の導入位置を種々変換したプローブ分子を合成し、これを用いて、結合タンパク質同定に向けた基礎検討を行った結果、標的分子との親和性を保持したプローブ分子を見出すことに成功した。3)強力な血管新生阻害作用を有する新規アルカロイドcortistatin Aの標的分子の同定に向けて、アフィニティープローブ分子の合成を検討した。以前に開発した、天然物をモチーフにして設計・合成した、同等の活性を有する構造単純化
脂肪細胞の脂肪滴形態とエネルギー代謝特性を繋ぐオートファジー機構の研究

エネルギーを貯蔵する白色脂肪細細胞は単房性巨大脂肪滴形態をとり、エネルギーを消費する褐色脂肪細胞は多房性小脂肪滴形態を示す。細胞内の脂肪滴の形態は、その細胞のもつエネルギー特性に合目的に適合していると推測しており、それぞれの脂肪滴形態の維持に関わる分子メカニズムにつきFSP27を中心に明らかにしてきた。その過程で、従来の細胞質リパーゼによる脂肪分解に加え、オートファジーによる脂肪分解機構すなわちリポファジーが共存することに注目し、その意義や分子レベルでの制御機構につき明らかにするべく検討をすすめている。我々は、白色脂肪細胞において、脂肪滴の単房巨大化に重要なFSP27αがオートファジーの活性化を抑制することで、より効率的な脂肪貯蔵を可能にすることを明らかにした。野生型マウスの褐色脂肪細胞およびFSP27ノックアウトマウスの白色脂肪細胞では、いずれもオートファジーの亢進を認め、リポファジーは多房性小脂肪滴形態を示す脂肪細胞に特徴的な機構であることが示唆された。さらに、オートファジー抑制薬であるロイペプシン投与によって、これらの多房性小脂肪滴において絶食により生じた脂肪滴サイズや脂肪重量の低下が減弱することを示した。また、実際に細胞レベルにおいて、COS細胞にFP27αを過剰発現させ、FSP27αがオートファジーを抑制することを明らかにした。これらの結果から、FSP27αは、巨大脂肪滴形成に重要であるだけでなく、オートファジー(リポファジー)の抑制を介して、白色脂肪細胞における脂肪貯蔵に寄与しているものと考えている。白色脂肪細胞において、脂肪滴の単房巨大化に重要なFSP27αがオートファジーの活性化を制御していることを明らかにした。しかし、FSP27αの結合蛋白であるAMPKやPRMT1などの候補因子を絡めたオートファジーの活性化機構については、培養細胞レベルの検討で未だ明らかにできていない。またFSP27βとオートファジーに関連については不明である。今後、褐色脂肪細胞において小脂肪滴形態の維持に重要なFSP27βとオートファジーの関連についても検討したい。FSP27β特異的ノックアウトマウスの作成なども検討している。今年度は国際学会へ未参加であり、旅費などに関しては次年度に使用予定である。また、次年度の新規マウス作成に充てることも検討している。
表皮中スフィンゴミエリンの皮膚ラメラ構造と化合物の皮膚浸透性に対する影響

スフィンゴミエリン(sphingomyelin: SM)の皮膚バリア機能に対する役割を明らかにすることを研究の目的としている。2018年度はSMS2KOマウスの皮膚バリア機能に関して検討を行った。体内から体外への水分バリア(inside to outside barrier, IOB)および体外からの体内への物質バリア(outside to inside barrier, OIB)を測定したところ、水分のIOBとOIBはSMS2KOマウスで増加(すなわち悪化)していることがわかった。一方、脂溶性化合物を用いたOIBは野生型マウスと比較してSMS2KOマウスでは差がなかった。さらに、角層を剥離した皮膚の水溶性化合物の皮膚浸透性は、SMS2KOマウスとWTマウスで差がなかった。このことから、表皮中のSMS2は角層の水溶性の化合物または水の透過バリアに関与していることが示唆される結果が得られた。次にSMS2KOマウスの角層構造に変化があることを想定し、2019年度から実施予定のSMS2KOマウス角層のFTIRをもちいた分子振動解析を前倒しして行った。その結果、通常の皮膚温度ではSMS2KOマウスとWTマウスでは差がなかったが、温度上昇によってCH2対称性、逆対称性伸縮振動シフトの大きさが異なった。このことからも、SMS2KOマウス角層はWTマウスのそれと比較し、微細構造が異なることが示唆された。これまでに申請者は、SMS2KOマウスの表皮中スフィンゴミエリンや角層中セラミドはWTと比較し減少していることを報告してきたが、今年度は体内から体外への水分バリア、体外からの体内への物質バリアについて明らかとし、FTIR解析で角層構造変化がある可能性を示した。これらが明らかとなればアトピー性皮膚炎など皮膚疾患患者のバリア機能低下機構の一端がわかるかもしれない。本年度はまず、本課題で利用するスフィンゴミエリン合成酵素2欠損マウス(SMS2KOマウス)の遺伝子型をPCR法で確認し、SMS2が欠損されていることを明らかとしました。このマウス(SMS2KO)の皮膚を剥離し、水溶性化合物であるフルオレセインナトリウム(水溶性化合物)の皮膚透過性を行ったところ、SMS2KOマウスの皮膚透過性はWTマウスと比べて有意に高値を示した。さらに、脂溶性化合物であるナイルレッドで同様の検討を行ったところSMS2KOマウスの皮膚透過性はWTマウスと同程度であった。角層剥離皮膚を用いて水溶性化合物の皮膚透過性を確認したところ、SMS2KOとWTマウスで差がなくなった。また、SMS2KOマウスの経表皮水分損失量は、WTと比較して有意に高値を示した。次に、皮膚表面温度である32°Cの角層脂質の分子振動を全反射型FTIRで確認した。その結果、SMS2KO、WTマウスのCH2対称性伸縮振動とCH2逆対称性伸縮振動には差がなかった。さらに皮膚温度を40, 50, 60°Cとして測定したところ、32°CにおけるCH2対称性伸縮振動数とCH2逆対称性伸縮振動数との差は、SMS2KOマウスで大きくシフトしていた。これらの結果から、SMS2KOマウス角層バリア機能はWTマウスと比較して、低下傾向にあった。皮膚透過試験の結果からバリア機能低下は水のルートが関与していることや角層の構造が関与していることが示唆された。FTIRで分子振動を確認したところ、温度変化によってSMS2KOマウス角層のCH2対称性、逆対称性伸縮振動が影響を受け易いことが示唆され、角層ラメラ構造がWTとは異なる可能性が示された。基本的なバリア機能特性が把握できたので、今後は以下のことを検討することでより詳細に明らかにしていく予定。1角層中脂質の定量(LC/MS):SMS2KOマウスは皮膚または角層中スフィンゴミエリン、セラミドが減少していることを報告している。現在はTLCでの定量であったので、より高精度・高感度なLC/MSでの検討を行う予定。2皮膚温度変化による水溶性・脂溶性化合物の皮膚浸透試験:SMS2KOマウスの角層脂質のCH2対称性、逆対称性伸縮振動はWTマウスと比較して温度の影響を受けやすかったので、40, 50, 60°Cで水溶性・脂溶性化合物の皮膚浸透性を行う予定。温度変化によって水溶性化合物の皮膚透過性は増加することが想定される。3角層の熱分析(DSCとTG):角層中セラミド量が減少しているのであれば、角層中に保持できる水分量も減少している可能性があるので、熱分析によって確認する。4放射光X線を用いた皮膚ラメラ構造、炭化水素差充填構造の解析:放射光X線を用いた実験は、昨年度にも検討をしてきたが、解析に時間を要している。今年度は更なるデータ収集と、データ解析を行うことで、SMS2KOマウスの皮膚ラメラ構造や炭化水素差充填構造を明らかにする予定。

体内から体外への水分バリア(inside to outside barrier, IOB)および体外からの体内への物質バリア(outside to inside barrier, OIB)を測定したところ、水分のIOBとOIBはSMS2KOマウスで増加(すなわち悪化)していることがわかった。一方、脂溶性化合物を用いたOIBは野生型マウスと比較してSMS2KOマウスでは差がなかった。さらに、角層を剥離した皮膚の水溶性化合物の皮膚浸透性は、SMS2KOマウスとWTマウスで差がなかった。このことから、表皮中のSMS2は角層の水溶性の化合物または水の透過バリアに関与していることが示唆される結果が得られた。次にSMS2KOマウスの角層構造に変化があることを想定し、2019年度から実施予定のSMS2KOマウス角層のFTIRをもちいた分子振動解析を前倒しして行った。その結果、通常の皮膚温度ではSMS2KOマウスとWTマウスでは差がなかったが、温度上昇によってCH2対称性、逆対称性伸縮振動シフトの大きさが異なった。このことからも、SMS2KOマウス角層はWTマウスのそれと比較し、微細構造が異なることが示唆された。これまでに申請者は、SMS2KOマウスの表皮中スフィンゴミエリンや角層中セラミドはWTと比較し減少していることを報告してきたが、今年度は体内から体外への水分バリア、体外からの体内への物質バリアについて明らかとし、FTIR解析で角層構造変化がある可能性を示した。これらが明らかとなればアトピー性皮膚炎など皮膚疾患患者のバリア機能低下機構の一端がわかるかもしれない。スフィンゴミエリン(sphingomyelin: SM)の皮膚バリア機能に対する役割を明らかにすることを研究の目的としている。本年度はまず、本課題で利用するスフィンゴミエリン合成酵素2欠損マウス(SMS2KOマウス)の遺伝子型をPCR法で確認し、SMS2が欠損されていることを明らかとしました。このマウス(SMS2KO)の皮膚を剥離し、水溶性化合物であるフルオレセインナトリウム(水溶性化合物)の皮膚透過性を行ったところ、SMS2KOマウスの皮膚透過性はWTマウスと比べて有意に高値を示した。さらに、脂溶性化合物であるナイルレッドで同様の検討を行ったところSMS2KOマウスの皮膚透過性はWTマウスと同程度であった。角層剥離皮膚を用いて水溶性化合物の皮膚透過性を確認したところ、SMS2KOとWTマウスで差がなくなった。また、SMS2KOマウスの経表皮水分損失量は、WTと比較して有意に高値を示した。次に、皮膚表面温度である32°Cの角層脂質の分子振動を全反射型FTIRで確認した。その結果、SMS2KO、WTマウスのCH2対称性伸縮振動とCH2逆対称性伸縮振動には差がなかった。さらに皮膚温度を40, 50, 60°Cとして測定したところ、32°CにおけるCH2対称性伸縮振動数とCH2逆対称性伸縮振動数との差は、SMS2KOマウスで大きくシフトしていた。これらの結果から、SMS2KOマウス角層バリア機能はWTマウスと比較して、低下傾向にあった。皮膚透過試験の結果からバリア機能低下は水のルートが関与していることや角層の構造が関与していることが示唆された。FTIRで分子振動を確認したところ、温度変化によってSMS2KOマウス角層のCH2対称性、逆対称性伸縮振動が影響を受け易いことが示唆され、角層ラメラ構造がWTとは異なる可能性が示された。基本的なバリア機能特性が把握できたので、今後は以下のことを検討することでより詳細に明らかにしていく予定。