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チベット系仏教及び上座部仏教の洞穴僧院に関する比較研究

ブータン高地では崖寺が各地に造営されており、本堂ラカンから離れた崖にの瞑想洞穴を営む。17世紀の国家形成以前、僧院に本堂は存在せず、ただ瞑想洞穴だけがあって、僧侶たちは長期間の瞑想修行に没頭していた。その伝統は今も受け継がれている。こうした瞑想洞窟の実態を理解するため計15ヶ寺で調査した。ソンツェンガンポ王による7世紀の吐蕃建国時に創建したと伝承される中央ブータンのジャンバラカンでは、本堂内陣中央柱から放射性炭素年代測定サンプルの採取に成功した。その成果は1632-1666 cal AD (信頼限界74.4%)である。吐蕃の年代ではなく、ドゥック派による国家形成期を示した点、大変興味深い。初年度(2013)は前期に「めざせ、ブータン」という演習を組織し、学生とともにブータンの自然と文化の基礎を学び、その成果をもとに教員3名、学生10名でブータンを訪問した。調査期間は9月の10日間で、対象はゾンドラカ寺、タクツォガン寺、ダカルポ寺、チェリ寺、タンゴ寺、タクツァン僧院などパロ/ティンプー地区の山寺であり、とりわけ瞑想修行をおこなう洞穴僧院ドラフに注目した。内部の調査を許されない寺院が大半を占めるので、寺院全体の配置図測量に重心をおき、調査が許される場合、本堂ラカンやドラフの平面図・断面図を実測し、通訳を介して住職等からヒアリングした。聞き取りによれば、チベット仏教諸派がブータンに南下してきたのは1114世紀のことであり、この当時は本堂がなく、崖上洞穴での瞑想修行に専心していた。14世紀になってチベット僧、パジェドルガンシンポが西ブータンでラマ教赤帽子派(ドゥルク・カギュル派)の布教を進め、17世紀に諸派を排してブータンの国教になり、サブドルン・ナワン・ナムキュルがチェリ、ゴンパ、ドレイの3寺に本堂を建立した。以後、各地の僧院に本堂が築かれるようになった。この伝承を確かめるため放射性炭素年代測定の部材サンプルを20点以上採取した。予算の関係上、まだ1点しか測定していないが、その年代は18世紀を示しており、伝承との不一致はみられない。2013年12月にはミャンマーのインレー湖周辺を1週間踏査した。おもな関心は湖畔に分布する洞窟僧院であり、マンダレーとカロで視察できた。ミャンマーの洞窟僧院は巨大なストゥーパを中心におき、周辺に夥しい寄進仏を配するもので、石窟寺院の分類に従う場合、「礼拝窟」の系統である。一方、ブータンの洞穴僧院は明らかに「僧房窟」であり、チベット系仏教の方が上座部仏教より古式を維持していると言える。2014年は東ブータンと中央ブータンで調査した。東ブータン高地メラ(標高34004000m)では、定住化したヤク放牧民の集落と放牧地を調べた。集落からヤク放牧地に至る途中、山道で何度もヤクの群れに出会った。森林で大量の薪(イトスギ)を集め、ヤクに担がせて戻る。薪の確保が住民の生活の生命線であり、どの家にも垣根や軒下に大量の薪を積み上げている。牛飼いはメラに集住し、放牧地には山小屋が1棟建っているだけで、テントは消え失せている。かれらがテントを捨て定住を開始したのは80年ばかり前からであり、築後40年前後の住宅が多かった。住宅は木造と石造の折衷で、居間にはストーブがあり、その部屋にベッドや多くの家具を置く。隣に必ず仏間があり、複数の仏像・タンカを配するが、中心にダライ・ラマの写真を貼って祭る。メラ・サクテン地方ではゲルク派が浸透しており、ダライ・ラマを崇拝している。町外れにメラ寺があり、調査中に儀式(プージャ)をおこなっていた。50年遡れば、この村には遊牧民のテントと寺院しかなかった。その後、タシガン経由でブンタンまで移動し、中央ブータンのシュクドラ寺、チュウドラ寺、クンザンドラ寺、ウラ寺などの僧院を調査した(標高31003600m)。いずれもドゥク派の僧院で、本堂ラカンは17世紀以降の建立だが、瞑想洞穴チャムカンの成立は13世紀に遡る。中央ブータンを代表するウラ村の集落はわずか50年の歴史しかなく、以前は遊牧民の放牧地であった。ただし、ウラ寺の成立は13世紀に遡る。当初の瞑想洞穴は寺院から2キロ離れた山頂崖上にあり、その崖を登り切ると鳥葬の儀場がある。帰国後、ブータン民話の翻訳にも着手した。クンザン・チョデンの著した『炎たつ湖』は完訳、続く『ブータンの民話』を翻訳中である。ブータンではチベット系仏教の崖寺が各地に造営されており、中心的礼拝施設ラカン(本堂)から離れた崖の洞穴に瞑想施設を営む。規模の小さい洞穴を利用し、その正面に懸造の掛屋を設けるだけの素朴な施設だが、密教修行の根幹をなす場として現在なお重要な意味を担っている。そもそもドゥック派が全土を制圧して国家形成がなされる17世紀以前、瞑想場に本堂ラカンは存在せず、ただ瞑想洞穴だけがあって、僧侶たちは長期間の瞑想修行に没頭していたとされる。

現在でも、若手の僧侶は修学時に3年3ヶ月3日の瞑想を窟内で続けることが必須とされる。こうした瞑想と瞑想洞窟の実態を理解するため、初年度は西ブータン、2年度は東ブータンと中央ブータン、3年度は中央ブータンと西ブータンで計15ヶ寺の調査をおこなった。昨年度(2015)の対象はダカルポ・ヨウト寺(パロ)、ケラ尼寺(パロ)、タンディネ寺(ティンプー)、レモチェン寺(タン)の4寺である。ブータンでは仏堂の内部の撮影等が原則禁止されているので、2014年までと同様、おもに崖寺境内の屋根伏配置図の測量をメインにおき、必要に応じて、内部の略測等もおこなった。2014年までと異なるのはヒアリング内容である。従来は崖寺の縁起等の聞き取りにとどまったが、昨年は瞑想体験を中心とする僧侶のライフヒストリーについての長時間の聞き書きをおこなった。このほか、ソンツェンガンポ王による吐蕃建国時(78世紀)に造営したと伝承される中央ブータンのジャンバラカンで、本堂内陣中央柱から放射性炭素年代測定サンプルの採取に成功した。その成果は1632-1666 cal AD (信頼限界74.4%)である。吐蕃の年代ではなく、ドゥック派による国家形成期を示した点、大変興味深い。かりに瞑想場としての成立が吐蕃時代にまで遡るにしても、現在の本堂は国家としてのブータンが誕生して以後のものである可能性が高まった。ブータン高地では崖寺が各地に造営されており、本堂ラカンから離れた崖にの瞑想洞穴を営む。17世紀の国家形成以前、僧院に本堂は存在せず、ただ瞑想洞穴だけがあって、僧侶たちは長期間の瞑想修行に没頭していた。その伝統は今も受け継がれている。こうした瞑想洞窟の実態を理解するため計15ヶ寺で調査した。ソンツェンガンポ王による7世紀の吐蕃建国時に創建したと伝承される中央ブータンのジャンバラカンでは、本堂内陣中央柱から放射性炭素年代測定サンプルの採取に成功した。1)ブータン高地の洞穴僧院については、西ブータン、中央ブータンですでに10ヶ所以上の調査を終えている。2)東ブータンではヤク遊牧の高山地域における仏教の様相を調査しようとしたが、雨が連続し、また高山病に悩まされ、測量等はおこなっていない。ヒアリングの成果は十分ある。3)ミャンマーの洞窟僧院・仏教遺産については、2013年度に調査をおこなった。また、2011年度訪問時のデータもある。4)2014年までの調査成果は浅川研究室の吉田健人が卒業論文でまとめ、鳥取環境大学学科賞金賞を受賞した。今年度、鳥取環境大学に審査論文として投稿する予定。5)クンザン・チョデン女史の民話(仏教説話)に関する著作の翻訳にとりかかり、1冊は完訳し、さらに1冊の翻訳を進めている。「スケッチ・オブ・ゴンパー第4次ブータン調査」連載はさらに(6)(10)まで続く。いずれも公立鳥取環境大学保存修復スタジオのブログLABLOG2G(http://asaxlablog.blog.fc2.com/)に掲載している。建築史・建築意匠1)2015年も夏にブータンを訪問し、洞穴僧院の測量を続けるが、今回の調査はむしろ仏僧の人生・生活に係わるヒアリングに重心をおく。パロ地区で親しくなったダカルポーゲムジャロ寺住職のライフヒストリーの聞き書きに時間を割く予定。2)ブータン民話(仏教説話)の第一人者クンザン・チョデン女史の面談し、民話・民俗に関する情報を収集する。3)西インドの最初期石窟寺院も冬に訪問したいが、予算が十分ではないので、12の調査で浪費した場合は断念せざるをえないかもしれない。
高齢患者における前向き介入研究と説明用可視化システムの開発

超高齢社会を迎えた本邦では,部分歯列欠損患者も増加の一途を辿り,口腔機能改善によるオーラルフレイルの防止とQOLの向上は歯科医師の急務である.欠損歯列への固定性インプラント補綴の有用性は既に認識されているが、高コストで高齢者にはメインテナンスが難しく侵襲も大きいのが難点である.近年,少数のインプラントにより低侵襲に義歯の安定を図るインプラント支持部分床義歯(IARPD)の臨床報告がある.本研究では,咬合支持域喪失患者を対象に,部分床義歯・固定性インプラント義歯・IARPDによる治療効果に関して,臨床的・患者立脚型アウトカムによる評価をデータベース化して比較検討し,高齢者により効果的に予知性の高い補綴歯科治療を提供することを目標に,現在の状態・期待できる効果を解り易く可視化する患者説明システムの開発を行う.今年度は患者基本情報,OHIP-J,SF-36などのデータ採取と共に,治療を進めた.多数歯欠損の固定性インプラント義歯33人,IARPDは19人の被験者を集めることができた.また,アンケート方法に関してもiPadでの手法を確立し可視化データ化することができた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ベースラインの患者収集をおこなっており,インプラント支持部分床義歯(IARPD)11人,固定性インプラント義歯21人の被験者を集めることができた.やはり,インプラント補綴治療希望者は固定式を希望する患者が多く被験者数が伸び悩んでいる.可視化システム開発においては,順調に進んでおり,一部実施をしている.超高齢社会を迎えた本邦では,部分歯列欠損患者も増加の一途を辿り,口腔機能改善によるオーラルフレイルの防止とQOLの向上は歯科医師の急務である.欠損歯列への固定性インプラント補綴の有用性は既に認識されているが、高コストで高齢者にはメインテナンスが難しく侵襲も大きいのが難点である.近年,少数のインプラントにより低侵襲に義歯の安定を図るインプラント支持部分床義歯(IARPD)の臨床報告がある.本研究では,咬合支持域喪失患者を対象に,部分床義歯・固定性インプラント義歯・IARPDによる治療効果に関して,臨床的・患者立脚型アウトカムによる評価をデータベース化して比較検討し,高齢者により効果的に予知性の高い補綴歯科治療を提供することを目標に,現在の状態・期待できる効果を解り易く可視化する患者説明システムの開発を行う.今年度は患者基本情報,OHIP-J,SF-36などのデータ採取と共に,治療を進めた.多数歯欠損の固定性インプラント義歯33人,IARPDは19人の被験者を集めることができた.また,アンケート方法に関してもiPadでの手法を確立し可視化データ化することができた.今後,治療介入後のデータ取集,解析をおこなう.インプラント治療に関しては,研究期間内にエンドポイントに至らないケースが想定される.インプラント義歯による治療群において長期予後の調査が遂行できなかった場合,研究期間内に得られたデータの比較・解析を行い研究期間後も継続して調査を行う.また,データ解析後の結果を解り易く可視化するシステムの確立を行う.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
光相互配線網形成を目指した半導体導波路アレイ型高速光偏向素子の開発

本研究は光通信および光情報処理等・光関連分野への幅広い応用が可能である高速光偏向技術の開拓を目指している。本年度助成期間に以下の結果を得た。1.GaAs/AlGaAs導波路アレー型光偏向素子を用いた光スイッチ、光分波器を提案し、数値シミュレーションにより基本動作特性を明らかにした。(1)挿入損失3-8dB、クロストーク35dB以上の入力ポート32対出力ポート32のロータリ型の光スイッチが構成可能である。また、(2)1素子で、光分波型のスイッチを構成することが可能である。これは、波長間隔5nmで16波を波長多重した光を16の入力ポートに入れることにより、16の出力ポートに入力ポートのそれぞれ異なる16波長を組合わせた出力を得ることができる。これらは波長多重光通信の光交換機への応用が期待される。現在、最適な素子構造の検討を行っている。2.高速偏向を行うためには、低電圧で、位相制御導波路の大きな屈折率変化を得ることが必要である。このため、GaAlAs多重量子井戸構造を有する位相制御導波路の製作を行った。導波路内での透過光領域での光の位相変化量はマッハツェンダー干渉計を用いて測定した。その結果、変化量はバルクの導波路に比較し3倍程度であった。これは予測した値より1桁程度小さい。これは、各層の膜厚のバラツキおよび急峻な境界が得られないことによる。3.光分岐部に高分子2次元導波路を有する光偏向素子を製作した。製作した素子のGaAs/AlGaAs位相制御導波路は9本とした。この素子にパソコンにより制御した制御電圧を印加したが、偏向動作の確認が得られていない。導波路間の電気的絶縁が不十分であり、製作プロセス改善が必要である。
アルコール-水混合溶液中でのペプチドモデル分子のコンフォメーションとその圧力効果

本研究は、アルコール誘起によるタンパク質のフォールディングのメカニズムを分子レベルで明らかにすることを目的とした。まず、X線および中性子散乱法により、各種アルコールと水との混合溶液中に形成されるクラスターの構造ならびにサイズを明らかにした。大きな疎水基サイズのアルコールほど低アルコール濃度で水の氷類似構造を破壊し、アルコールクラスターを形成しやすいことがわかった。特に、小角中性子散乱実験の結果は、フッ素化アルコールであるトリフルオロエタノール(TFE)やヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)が水溶液中でクラスターを形成しやすいことを示した。この結果とエタノール(EtOH)や2-プロパノール(2-PrOH)などの脂肪族アルコールよりもフッ素化アルコールの方がタンパク質のフォールディングを強化することを合わせると、クラスター形成とフォールディングとの関連性が考えられた。次に、各種アルコール-水混合溶液中にペプチドモデル分子として炭素鎖の疎水部と水酸基の親水部をもつ1,4-ペンタンジオールを溶解し、その溶存挙動を赤外分光法ならびにNMR法により研究した。エタノールおよび2-プロパノールは、1,4-ペンタンジオールの水酸基を脱水和する効果が強く、TFEやHFIPでは1,4-ペンタンジオールの疎水部に強く相互作用することがわかった。また、アルコール分子と1,4-ペンタンジオールとの疎水性相互作用の強さは、HFIP>TFE>EtOH【approximately equal】2-PrOHの順であることが明らかになった。これは、タンパク質のフォールディングに対する効果の順と一致していた。本研究により、アルコールクラスターとタンパク質との相互作用がフォールディングに大きく寄与していることが示唆された。ペプチドモデル分子として1,4-ペンタンジオール(1,4-PD)を用い、エタノール(EtOH)およびトリフルオロエタノール(TFE)と水との混合溶液中における溶存挙動を研究した。1,4-PDは、疎水部として炭素鎖と親水部として2つの水酸基をもつ鎖状分子であることから、ペプチドモデル分子として用いた。1,4-PDの溶存挙動は、^1Hおよび^<13>C-NMRケミカルシフトを測定し(25°C)、その溶媒組成依存性を観測することで議論した。この測定では、基準物質に対する試料溶液の磁気遮蔽を正確に補正するために外部複基準法を用いた。EtOH-水ならびにTFE-水混合溶液の組成はアルコール体積分率で、0,1,2,3,5,10,20,30%v/vとした。^1H-NMR測定では、溶媒分子のピークに1,4-PDのピークが重なってしまうこと、1,4-PDのピークが観測されたとしても^1H核の電子密度が本来低いことから、それらのケミカルシフトの溶媒組成依存性を明確にとらえることが困難であった。これに対し、^<13>C-NMRでは、1,4-PD分子中の炭素部位により興味あるケミカルシフトの組成依存性が観測された。EtOH-水混合溶液中では、水酸基が結合した1および4位の炭素原子の^<13>C-NMRピークはEtOH濃度増加にともない高磁場シフトし、末端にある5位炭素原子は低磁場シフトした。これは、水酸基に水和していた水分子がEtOH濃度増加とともに脱水和されたことにより1および4位炭素原子の電子密度が増加したためと考えられた。さらに、これの影響を受けて5位炭素原子の電子密度が減少したと考察した。これに対し、TFE-水混合溶液の場合、1および4位炭素原子のケミカルシフトの組成依存性は極めて小さかった。これはTFE濃度が増加しても水酸基を水和している水分子が脱水和されにくいため、炭素原子の電子密度が大きく変化しなかったことによると考えられた。

EtOH系とTFE系で最も顕著な相違が観測されたのは5位炭素原子であった。EtOH系では5位炭素原子はアルコール濃度増加にともない低磁場シフトしたのに対し、TFE系では大きく高磁場シフトした。この結果は、疎水性の高い5位メチル基がEtOH分子より疎水性の高いTFE分子と強く相互作用していることを示唆している。こられのことから、1,4-PDの溶存挙動は、水酸基に対する水和のみではなく疎水性部位に対するアルコール分子の相互作用にも影響されることが考察された。これをアルコール誘起によるタンパク質のフォールディングに置き換えれば、タンパク質の親水部への水和と疎水部に対するアルコール分子の相互作用がフォールディングをコントロールしているといえる。今後は、1,4-PDの濃度依存性やコンフォメーション変化およびそれらの圧力変化を研究していく。赤外分光法および^1H-,^<13>C-NMR法により、2-プロパノール(2PrOH)-水ならびにヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)-水混合溶液中においてペプチドモデル分子としての1,4-ペンタンジオール(1,4-PD)の溶存状態を研究した。これらの結果と平成15年度に実施したエタノール(EtOH)-水およびトリフルオロエタノール(TFE)-水混合溶液中の1,4-PD分子の溶存挙動からアルコール添加の効果を考察した。EtOH系と2PrOH系では、1,4-PD分子の4位炭素原子の^<13>C-NMR化学シフトはアルコールモル分率の増加にともない高磁場シフトし、5位炭素原子は低磁場シフトした。このとき、5位のC-H伸縮振動は低波数シフトした。これらのモル分率依存性には、1,4-PD分子の脱水和が寄与していると考えた。すなわち、脂肪族アルコール分子の場合、アルコール添加によって1,4-PD分子の水酸基に水素結合している水分子が脱水和され、4位炭素原子の電子密度が増加すると考察した。この影響を受けて5位炭素原子の電子密度が減少する。^1H-NMR化学シフトもこれらのことを支持する結果であった。これに対し、TFE系とHFIP系では、モル分率の増加にともない5位炭素原子は高磁場シフトした。また、5位のC-H伸縮振動は高波数シフトした。これらの結果には、疎水性の高いTFEおよびHFIP分子と1,4-PD分子のCH_3基(5位)との疎水性相互作用が寄与していると考えた。すなわち、ハロゲノアルコール分子との疎水性相互作用により電子密度が高くなったCH_3基では、5位炭素原子は高磁場シフトし、C-H結合は強化される。一方、4位炭素原子の化学シフトは、モル分率増加に対してTFE系ではほとんど変化しないのに対し、HFIP系では大きく低磁場シフトした。これはCH_3基(5位)やCH_2基(2,3位)に対するHFIP分子の疎水性相互作用の影響が4位炭素原子まで及んだことによると考えた。この研究から、脂肪族アルコール系では、1,4-PDに対する脱水和が強く起こり、ハロゲノアルコール系では1,4-PDとの疎水性相互作用が強く起こっていることが結論された。
膵β細胞機能調節に関するｅＩＦ２αキナーゼＧＣＮ２の機能解析

HFD GCN2-/-マウスは膵β細胞量の減少を示し、mTORC1シグナルの恒常的亢進によるネガティブフィードバックが、インスリンシグナルの低下から膵β細胞量を引き起こす一因であると考えられた。HFDでインスリン需要が増加し、相対的に膵β細胞内のアミノ酸の濃度が低下することによりGCN2が活性化され、膵β細胞量の維持に関与していることが示唆された。HFD GCN2-/-マウスは、GCN2にSNPを有する2型糖尿病患者における過食、インスリン過剰合成を背景とした膵β細胞不全、糖尿病発症機構のモデルの一つとなる可能性が期待される。背景・目的日本人においてGCN2のSNPと2型糖尿病に有意な相関が報告された。GCN2はアミノ酸欠乏時にfree tRNAの増加をリガンドとして活性化される分子である。我々の検討ではGCN2は膵島に強く発現しており、膵β細胞におけるGCN2の役割と2型糖尿病発症の関与を考え解析を開始した。方法全身性GCN2ホモ欠損マウス(GCN2-/-マウス)を作製し解析した。結果113人の被験者でOGTT、クランプを行い評価したところ、GCN2のSNPを有する群でインスリン分泌の指標が有意に低下していた。高脂肪食(HFD)下飼育GCN2-/-マウスの耐糖能は悪化し膵β細胞量は減少した。膵島ではmTORC1活性の亢進とインスリンシグナルの減弱化が認められた。その機序を明らかにする為、通常食(NCD)とHFDで飼育したマウスの膵島で比較すると、HFD下の膵島でGCN2が有意に活性化しており、複数のアミノ酸の濃度が有意に低下していた。結論HFDGCN2-/-マウスは膵β細胞量の減少を示し、mTORC1シグナルの恒常的亢進によるネガティブフィードバックが、インスリンシグナルの低下から膵β細胞量を引き起こす一因であると考えられた。高脂肪食飼育下24週齢GCN2-/-マウス(HFD GCN2-/-マウス)の耐糖能は野生型と比べて有意に悪化し、膵β細胞量は有意に減少した。HFD GCN2-/-マウスの膵島では、mTORC1シグナルの亢進により、ネガティブフィードバックを介したインスリンシグナル低下をきたし、膵β細胞量が減少していると考えられた。HFD GCN2-/-マウスの膵島におけるmTORC1シグナル亢進の機序を明らかにするため、通常食(NCD)もしくは高脂肪食で飼育したC57BL/6Jマウスの膵島でGCN2の活性を比較したところ、HFDマウスの膵島で有意な活性化が認められた。HFDマウスにおいてはインスリン需要の亢進により、膵β細胞でインスリンの翻訳が亢進していると考えられる。膵β細胞にグルコース刺激を行うと、プロインスリンの翻訳が著明に増加することが知られているが、グルコース刺激INS-1細胞ではGCN2が活性化され、その活性化はシクロホスファミドによる蛋白翻訳阻害で、打ち消されることが確認された。これらの結果を考慮すると、膵β細胞ではインスリンの翻訳が亢進することで、GCN2が活性化するのではないかと考えられた。そこで我々は、HFDマウスではインスリンの需要が高まり、膵β細胞におけるインスリンの翻訳が亢進しているためにGCN2が活性化しているという仮説を構築した。その仮説を検証するため、NCDとHFD下に飼育したマウスの膵島内におけるアミノ酸濃度を測定したところ、HFDマウスの膵島ではアミノ酸全般の濃度低下が認められた。したがって、膵β細胞でインスリン蛋白の翻訳が亢進し、膵β細胞内のアミノ酸濃度が低下することにより、free tRNAの増加をリガンドとしてGCN2が活性化していることが示唆された。現在までの解析にてHFD GCN2-/-マウスは膵β細胞量の減少を示すことが明らかとなり、mTORC1シグナルの恒常的亢進によるネガティブフィードバックが、インスリンシグナルの低下から膵β細胞量を引き起こす一因であると考えられた。今後、現在作製済の膵β細胞特異的GCN2欠損マウスを用いて、解析を続ける予定である。

1マウス膵β細胞株におけるGCN2の発現・活性化、およびmTORC1活性化の検討マウス膵β細胞由来であるMIN6細胞に各種刺激を与えることによって、GCN2の発現および活性化に及ぼす影響を検討する。具体的には、ロイシン・バリン・イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸のいずれかを添加しない培地にてMIN6細胞を培養し、GCN2の発現・活性化を比較検討する。また活性化されたGCN2はmTORC1活性を抑制することが報告されていることから、各種刺激時のインスリンシグナル、特にTSC2/mTOR経路に関しての評価を行う。2マウス膵β細胞株におけるアミノ酸誘導性インスリン分泌能の検討MIN6細胞を用いて、各種アミノ酸の濃度勾配を変化させた条件下でインスリン分泌能の評価を行う。また、アミノ酸欠乏により活性化されるGCN2がインスリン分泌能に関与しているかを確認するために、siRNAを用いてGCN2ノックダウンMIN6細胞を作製し、アミノ酸含有培地および不含培地それぞれについてインスリン分泌量を測定する。3高脂肪食負荷全身性GCN2欠損マウスにおける血中アミノ酸濃度の測定高脂肪食負荷全身性GCN2欠損マウスの血中アミノ酸濃度を測定し、有意に減少しているアミノ酸を抽出する。また膵β細胞に対する直接的な影響を考慮するため、単離膵島中のアミノ酸濃度も測定する。4膵β細胞特異的GCN2ヘテロ欠損マウスにおけるアミノ酸投与が膵β細胞量に及ぼす影響の検討上記で得られた結果をもとに、濃度の減少が有意であったアミノ酸多く含有する食餌を膵β細胞特異的GCN2ヘテロ欠損マウスに投与する。日本人2型糖尿病患者モデルをより忠実に再現するために、GCN2ヘテロ欠損マウスにアミノ酸含有食を投与することで、mTORC1活性が適度に抑制され、インスリンシグナルが回復し膵β細胞量が維持されると予想される。上記34に関しては、既にマウスを作製済であり次年度は主にマウスや培養細胞を用いた各種負荷実験やインスリン分泌能評価やアミノ酸濃度測定、ウェスタンブロット法やリアルタイムPCRなどの実験が主となる。そのための一般試薬代に研究費を充てる予定である。また、次年度に学会発表・論文発表を予定している。
ヘムオキシゲナーゼ1による炎症制御機構の解析と新しい炎症治療戦略に関する研究

重症感染症やショック症候群など、強い生体反応を伴う急性炎症性疾患では単球活性化に伴うサイトカイン産生がショック症状や全身臓器傷害など、いわゆるマクロファージ活性化症候群と呼ばれる病態を惹起することが知られている。病原体の侵入に伴うこのような致死的な生体反応を防ぐためには、過剰な炎症反応を制御し、感染の終息に向かう免疫応答が正常に機能することが必要とされる。また種々の炎症性疾患では、組織や臓器にマクロファージが浸潤、これが病態形成に積極的に関与していることが想定されているが、一方でマクロファージ自身が炎症を制御する役割を果たしている可能性も示唆される。このような単球・マクロファージ由来の炎症制御因子として注目されるのが、ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)ならびにその代謝産物である。HO-1の産生は種々のストレス刺激により速やかに誘導されること、我々が報告したHO-1欠損症では恒常的に強い炎症反応が観察されたことなどから、本酵素が単球を中心とした免疫応答の調節機構として決定的な働きをしている可能性が示唆される。またHO-1遺伝子上流のpromotor領域にあるGTくり返し配列の多型がHO-1発現レベルと関連し種々の炎症性疾患の発症に関与している可能性が報告されている。このことは、HO-1欠損例でなくても、HO-1遺伝子あるいはpromotor領域の遺伝子多型によりHO-1発現の量的な変化が起こり、炎症病変の増悪に関与する可能性を示唆している。本研究では末梢血単核球によるHO-1産生調節機構を解明し種々の炎症疾患の病態形成におけるHO-1産生細胞の関与を明らかにすること、さらにHO-1を利用した新たな炎症制御戦略の開発を目的として、種々の検討を行った。今回の検討では、末梢血白血球の内、単球がHO-1産生の主体であること、種々の急性炎症性疾患では単球のHO-1産生が亢進することが示された。また、このような単球によるHO-1産生の亢進が種々の単球表面抗原発現の変化を伴う、単球活性化により誘導されることが示唆された。さらに、HO-1産生が単球の一部の分画に選択的に認められることから、これらの単球亜群を標的として、抗炎症剤による治療戦略の開発をすすめることが可能であると考えられた。本年度は主として、川崎病、インフルエンザウイルス感染症などの急性熱性疾患を中心に、末梢血単球の表面抗原発現ならびにHO-1産生を検討した。正常対照に比べ川崎病急性期では、単球の一部が強く活性化、CD16抗原ならびにHLA-DR抗原を強く発現していた。しかし、大部分の単球は正常対照に比べこれらの抗原発現が低下していた。これらの結果は、川崎病急性期における単球活性化が一部の分画に限定されていることを示唆していた。一方、同様に急性熱性疾患であるインフルエンザウイルス感染症では、単球の大部分が活性化形質を示し、軽快と共に活性化単球は減少した。

川崎病急性期に認められたような、抗原発現の低下は観察されなかった。一方、HO-1産生を単核球を用いたreal time PCR法により定量した。正常対照末梢血単核球においても低レベルのHO-1 mRNAが常に観察された。急性感染症の多くでは、末梢血単核球のHO-1 mRNA発現は増加、特にインフルエンザウイルス感染症では明らかにHO-1 mRNA発現が増強していた。末梢血単核球のうち、HO-1産生細胞は単球の一部であることが免疫組織染色で明らかにされた。また、HO-1産生細胞は単球の一部であり、この分画はCD16陽性、HLA-DR強発現細胞であると推定された。これらの結果から、単球中のCD16陽性、HLA-DR強発現細胞は炎症抑制機能を有し、生体にとって有害な炎症反応を制御するために、種々の急性炎症性疾患において重要な機能を発揮している可能性が示唆された。今後は、これら炎症制御機能を有する単球分画の機能的役割についてさらに検討する予定である。重症感染症やショック症候群など、強い生体反応を伴う急性炎症性疾患では単球活性化に伴うサイトカイン産生がショック症状や全身臓器傷害など、いわゆるマクロファージ活性化症候群と呼ばれる病態を惹起することが知られている。病原体の侵入に伴うこのような致死的な生体反応を防ぐためには、過剰な炎症反応を制御し、感染の終息に向かう免疫応答が正常に機能することが必要とされる。また種々の炎症性疾患では、組織や臓器にマクロファージが浸潤、これが病態形成に積極的に関与していることが想定されているが、一方でマクロファージ自身が炎症を制御する役割を果たしている可能性も示唆される。このような単球・マクロファージ由来の炎症制御因子として注目されるのが、ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)ならびにその代謝産物である。HO-1の産生は種々のストレス刺激により速やかに誘導されること、我々が報告したHO-1欠損症では恒常的に強い炎症反応が観察されたことなどから、本酵素が単球を中心とした免疫応答の調節機構として決定的な働きをしている可能性が示唆される。またHO-1遺伝子上流のpromotor領域にあるGTくり返し配列の多型がHO-1発現レベルと関連し種々の炎症性疾患の発症に関与している可能性が報告されている。このことは、HO-1欠損例でなくても、HO-1遺伝子あるいはpromotor領域の遺伝子多型によりHO-1発現の量的な変化が起こり、炎症病変の増悪に関与する可能性を示唆している。本研究では末梢血単核球によるHO-1産生調節機構を解明し種々の炎症疾患の病態形成におけるHO-1産生細胞の関与を明らかにすること、さらにHO-1を利用した新たな炎症制御戦略の開発を目的として、種々の検討を行った。今回の検討では、末梢血白血球の内、単球がHO-1産生の主体であること、種々の急性炎症性疾患では単球のHO-1産生が亢進することが示された。また、このような単球によるHO-1産生の亢進が種々の単球表面抗原発現の変化を伴う、単球活性化により誘導されることが示唆された。さらに、HO-1産生が単球の一部の分画に選択的に認められることから、これらの単球亜群を標的として、抗炎症剤による治療戦略の開発をすすめることが可能であると考えられた。
B細胞におけるCD14発現の検討

グラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖(lipopolysaccharide:LPS)はB細胞をはじめ種々の生体細胞に対して強い生物学的活性を有するが,生体細胞側のLPS受容体に関しては不明な点が数多く残されている.単球/マクロファージにおいては,細胞表面のCD14が,血清中のLPS結合蛋白(LBP)と結合したLPS,すなわちLPS-LBP複合体に対する受容体として働くことが明らかにされているが,リンパ系細胞,特にB細胞での発現については明らかではない.本研究では,マウスB細胞由来培養細胞株CH12.LX,種々のマウスmyelona細胞株および精製マウス脾臓B細胞を用いて,B細胞でのCD14発現について検討を行った.その結果,マウスマクロファージで報告されているCD14に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法およびNorthernblot法の成績から,CH12.LXにおいてCD14mRNAの発現が認められた.さらに,このCD14mRNAのcDNAのシークエンスの結果は,マクロファージで報告されているCD14遺伝子のそれと完全に一致した.しかし陽性対照のマクロファージ由来株化細胞であるJ774.1と比較して,CH12.LXでのCD14mRNAの発現程度は低いことが明らかとなった.CH12.LXにおける細胞表面へのCD14分子の発現については,抗マウスCD14モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析した結果,mRNAレベルでの成績に一致して,CH12.LXの細胞表面にCD14分子が発現していること,しかしその発現程度はJ774.1と比較して低いことが認められ,少なくとも特定のB細胞株においてはCD14分子が発現することが明らかとなった.しかし,今回調べたかぎりにおいては,マウスmylona細胞株および精製BALB/cマウス脾臓B細胞での細胞内のCD14mRNA発現および細胞表面上でのCD14分子の発現はともに認められなかった.グラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖(lipopolysaccharide:LPS)はB細胞をはじめ種々の生体細胞に対して強い生物学的活性を有するが,生体細胞側のLPS受容体に関しては不明な点が数多く残されている.単球/マクロファージにおいては,細胞表面のCD14が,血清中のLPS結合蛋白(LBP)と結合したLPS,すなわちLPS-LBP複合体に対する受容体として働くことが明らかにされているが,リンパ系細胞,特にB細胞での発現については明らかではない.本研究では,マウスB細胞由来培養細胞株CH12.LX,種々のマウスmyelona細胞株および精製マウス脾臓B細胞を用いて,B細胞でのCD14発現について検討を行った.その結果,マウスマクロファージで報告されているCD14に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法およびNorthernblot法の成績から,CH12.LXにおいてCD14mRNAの発現が認められた.さらに,このCD14mRNAのcDNAのシークエンスの結果は,マクロファージで報告されているCD14遺伝子のそれと完全に一致した.しかし陽性対照のマクロファージ由来株化細胞であるJ774.1と比較して,CH12.LXでのCD14mRNAの発現程度は低いことが明らかとなった.CH12.LXにおける細胞表面へのCD14分子の発現については,抗マウスCD14モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析した結果,mRNAレベルでの成績に一致して,CH12.LXの細胞表面にCD14分子が発現していること,しかしその発現程度はJ774.1と比較して低いことが認められ,少なくとも特定のB細胞株においてはCD14分子が発現することが明らかとなった.しかし,今回調べたかぎりにおいては,マウスmylona細胞株および精製BALB/cマウス脾臓B細胞での細胞内のCD14mRNA発現および細胞表面上でのCD14分子の発現はともに認められなかった.
統合型減揺フィンの基礎研究

船体の左右に一対のフィンを船首あるいは船尾付近に装備し、このフィンの角度を効果的に制御することによって、横揺れだけでなく、縦揺れ、および船首揺れをも減少させようとする新しい統合型減揺フィンの開発をめざして研究を行い、本年度は以下の成果を達成した。1)既存の漁業調査船を供試模型船(全長:約2m)とし、フィンの取付け位置を前年度の理論検討結果を用いて、より効果的な場所に変更し、水槽実験を実施した結果、縦揺れ・横揺れの双方に有効な結果が得られた。2)上記の模型実験は、20年度と同様、船を曳航する方式で減揺性能を確認したが、最終年度にあたる21年度は、模型船に舵・プロペラを装備して模型船を波浪の中を自走させ、向波だけでなく、横波斜波中の実験を実施した。使用した水槽は(株)IHI横浜研究所の大型角水槽である。また、模型船は無線操縦によって操船を行った。この実験の結果本減用システムは、種々の波向きの航走でも有効なことが確認できた。3)上記の実験を行う中で、減用フィンが操縦性能に及ぼす影響についても調査した。その結果、船首フィンの場合は、波浪中を直進するに際して、舵角を大きくとり、やや操船しにくいが、逆に船尾フィンの場合は、保針に要する舵角も小さく、操船し易いことが明らかとなった。4)以上の実験結果から、統合型の減用フィンは船尾に装備することが望ましいことが判明した。5)上記の研究成果は総合的に評価を行い、その結果を21年度の北海道大学の修士論文1件、および卒業論文1件としてまとめた。一対のフィンを船首あるいは船尾付近に装備し、このフィンの角度を効果的に制御することによって、横揺れだけでなく、縦揺れ、および船首揺れをも減少させようとする新しい統合型減揺フィンの開発をめざし、本年度は、以下の成果を達成した。1)既存の漁業調査船を供試模型船(全長:約2m)とし、標準フィンの設計を行って製作した。2)上記の模型船用のフィンの駆動装置(サーボ式)を設計し、それを外注製作した。また、フィン取り付け場所を任意に選択できるよう工夫した。3)フィンを取り付けた場合の減揺メカニズムについて、それぞれ縦揺れ・横揺れの物理モデルを作成し、減揺効果の理論的検討と減揺効果の概算を行った。また、フィン制御方法については、このモデルを適用して最適な制御方法を検討した結果、横揺れ・縦揺れの角速度に比例する方式がシンプルで効果的と判断され、これを以下の実験に使用した。4)上記の模型船とフィンを使用して、波浪中(向かい波)の実験を実施し、縦揺れ減衰効果について解析した。縦揺れの減揺はフィンを船尾より船首に取り付けた方が効果の大きいことが確認された。5)横揺れの減揺については、平水中の自由横揺れ試験を行い、減衰効果を解析した。その結果、船首フィンでは減揺効果が小さいことが確認された。6)上記の研究成果は総合的に評価を行い、その結果を中間報告として、20年度の北海道大学の修士論文1件、および卒業論文2件としてまとめた。
スタッキングナノワイヤーにおけるスピン液体状態のNMR・μSRによる研究

最近、堀[1]らによって合成された金属ナノワイヤーはその1本1本が独立した錯体鎖であり、その物性に興味が持たれている。構造的には、酸素が四配位したCu原子の周りに四つの六員環が対称的に配置した二種類の平板状分子が、静電相互作用によって交互にスタックしたものであり、空気中で安定に存在する。またCu-Cu間の距離はおよそ3.61Åである。本研究は、Cu一次元鎖(C60H24CuF20O8Cu)について、低温での磁気物性を明らかにすることが目的である。磁化率の温度依存性は2Kまで異常はなく、最低温を除いてほぼキュリーワイス則に従う。ワイス温度は0.8(1)K程度であることがわかった。よって本系はスピン間に弱い反強磁性相互作用が働いていることになる。次に1H核のNMR緩和率の結果について、高温での測定から、超微細結合は異方成分(Aan = 60 Oe)が支配的であり、Cu原子の磁性を良くプローブ出来ることが分かっている。縦緩和率は温度のべき乗に従って低温で減少しており、磁場を上げると緩和率の絶対値は小さくなるものの、べき指数の値(0.4)は測定磁場12Tの範囲で変わらない。これがラッティンジャー液体による振る舞いであるとするとより低温で再び上昇するはずである。今後、広範囲での温度域で測定を行い、本系の基底状態を明らかにして行く。単鎖試料について、磁化率とNMRスペクトル、緩和率の温度依存性の測定を終えている。反強磁性相互作用が1K以下と極めて小さいことが明らかになった。また、NMRは適度な超微細相互作用を有し、磁性プローブとし良く機能することが確かめられた。次のステップとしての2足、3足試料については前者は既に合成に成功し、現在、磁化測定の準備中である。2足、3足試料についての磁化測定を行い、反強磁性相互作用の大きさを見積もり、また基底状態の磁性をNMRとともに明らかにして行く。一方、ミュオンラベリング電子法によって、鎖上を動く電子拡散が存在するかどうかを調べ、本系の伝導性について議論することも検討中である。大型の備品代金に端数が生じたため,残額が残ることとなった。次年度は、液体ヘリウムが申請時に比べて大幅に値上がりしているため、その埋め合わせに利用する。
光配向性分子で構造制御した高分子材料の開発

高分子ネットワークの架橋構造を制御し、本来は均質な特性と構造が特徴の高分子ゲルに異方的な特性を与えることを目的とした。配向方向を制御するために設計・合成した重合反応および光二量化反応を示すアゾベンゼン架橋剤は高分子中で光配向し、重合あるいは光二量化により高分子ネットワークに固定でき、配向性も保持できる事を明らかとした。しかし、マクロ物性である膨潤挙動への架橋剤の配向性の反映はわずかであり、高分子ネットワークの膨潤による乱れの影響が強いことがわかった。本研究では、光配向性の架橋剤を用い、光配向状態で架橋反応を起こし、分子配向性を付与した高分子ゲルを作製することを目的としている。予備検討で用いたアゾベンゼンの両末端に光二量化性のシンナモイル基を有する光配向性架橋剤は、プレポリマーや溶媒への溶解性が低く、製膜時に析出する問題があった。そこで、本年度は溶解性の向上を目的として、分子設計・合成を行った。シンナモイル基を有するアゾベンゼンの溶解性が低いのは、疎水性と高い平面性に基づくπスタッキングによる結晶性のためと考えた。そこで、平面性を乱し、非対称となるような構造を分子計算により推測し、ベンゼン環の側鎖にメチル基またはメトキシ基を有するアゾベンゼン架橋剤の合成を試みた。いくつかの合成方法を試したが、メチル基型はシンナモイル基の導入反応が進行しづらく、合成を断念した。また、メトキシ型の合成は達成したが、溶解性に顕著な向上は認められず、さらに疎水性が高いために親水性高分子ゲルの架橋剤としては適していない事、非対称であるために、複雑な位置異性体が生じ、解析が困難になる事が明らかとなった。一方、アゾベンゼンの両末端に重合性のビニル基を有する光配向性架橋剤を合成し、反応性プレポリマーとの光重合を試みた。その結果、得られた高分子ゲルに配向構造は確認できず、ラジカル重合では配向性を保ったまま重合させる事は困難である事が明らかとなった。以上の結果より、今後はより極性の高い官能基を導入し、親水性の光二量化型光配向性架橋剤を新たに設計・合成し、検討を行う事とした。本研究では、光配向性の架橋剤を用い、光配向状態で架橋反応を行うことで、分子配向性を有する高分子ゲルを作製することを目的としている。昨年度までに設計・合成した光応答性架橋剤は、プレポリマーおよび製膜用溶媒への溶解性が低いことが課題であった。本年度は、基本的な構造はそのままで、結合基を変更して合成を行った。その結果、アゾベンゼンの両末端に光二量化性のシンナモイル基を有し、プレポリマーおよび溶媒への溶解性の良好な光配向性架橋剤を得ることが出来た。この光配向性架橋剤をプレポリマーに混合して成膜したところ、均一で良好な薄膜を形成することができた。得られた薄膜を用い、含まれるアゾベンゼン側鎖の光配向性を確認したところ、照射した直線偏光に対して垂直に配向することが確認できた。そこで、光配向に続けてシンナモイル基が光二量化する紫外光を照射したところ、光二量化反応の進行が確認できた。配向状態で光二量化を行った後、光配向挙動を観察した結果、アゾベンゼン側鎖は固定を行ったときの配向方向に向きやすいことが確認され、配向方向が高分子ネットワークに固定され、かつ高分子としての自由度を保てることが確認できた。しかし、得られた高分子ゲルを水に浸し膨潤させようとしたが、粉々に崩壊してしまった。これは、架橋密度が高すぎるために高分子ネットワークの自由度が低く、膨潤に伴う高分子ネットワークの拡張が出来なかったためと考えられる。しかし、架橋剤量を減らすと水に溶解する事から、架橋剤とプレポリマーの反応率が低い事が予測され、未反応の架橋剤や片末端のみ反応した架橋剤、架橋剤同士の反応が起きていることも予測された。次年度以降は、配向性と架橋性を側鎖に有するモノマーを合成し、側鎖に配向性架橋基を有するプレポリマーを作製し、その配向性と反応性、配向固定能力を検討する。本研究では、光配向性の架橋剤を含む重合性組成物中で架橋剤を光配向した状態で固定化反応を行い、分子配向性を付与した高分子ゲルを作製することを目的としている。これまでの検討で、高分子中でアゾベンゼン架橋剤の光配向制御および固定を達成した。しかし、アゾベンゼン架橋剤の高い疎水性により、高分子は水に膨潤しなかった。本年は昨年度に引き続き親水性向上を狙い、アミド結合を有するアゾベンゼン架橋剤を用い、ラジカル重合によるネットワークの固定を試みた。マトリックスとして、感温性のN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)ポリマーに重合性を付与した高分子(プレポリマー)を合成して用いた。

アミド型アゾベンゼン架橋剤は光異性化性を示し、従来のエステル型と同様に高分子フィルム中で光配向制御が可能であった。さらに紫外光重合開始剤を加え、光重合を行ったが重合は進行しなかった。これは、アゾベンゼン架橋剤の自己吸収により光強度が不足したため、また反応性のビニル基濃度が低すぎたと考えた。ここで、これらのビニル基濃度を高めると、光学密度・架橋密度が過大となり、適さなかった。そこで、プレポリマーを用いず、低分子モノマー+アゾベンゼン架橋剤を母体高分子に加え、光配向後に重合を行いsemiIPNの構築を試みた。検討の結果、母体高分子にPVA、低分子モノマーにNIPAAm、アゾベンゼン架橋剤、光重合開始剤を混合して作製したフィルムに紫外光を照射したところ、水に不溶で感温性を示すゲルが得られた。さらに、光配向処理と光重合によりゲルを作製したが、その膨潤挙動の異方性はわずかであった。一方、PVA+モノマーを延伸して重合したゲルは大きな膨潤異方性を示し、高分子ネットワークの配向方向が重合で固定できることが明らかとなった。
ゲノム分子進化を用いた弱毒ウイルス作出法の開発

シロイヌナズナやそれ以外の植物種においてコドンの調査を行い、コドン頻度やレアコドンについての傾向を掴んだ。またいくつかの植物ウイルスにおいても同様の調査を行い、コドン頻度についての類似性が示唆された。レアコドンに対するtRNA遺伝子を植物において過剰発現させる系の検討を行い、通常の形質転換系で問題ないことが分かり、またウイルスを定期的にサンプリングしたのちその塩基配列を解析する系を検討した。近年考案されたレアコドンウイルスは、従来の弱毒ウイルス(生ワクチンウイルス)の問題点の多くを克服した次世代の弱毒ウイルスとして期待されているが、ウイルスゲノムを人工合成して作製するため遺伝子組換えウイルスとなってしまう点が問題である。本研究は、遺伝子組換えを用いることなくレアコドンウイルスを作出する新たな手法を植物ウイルスに対して応用することで、遺伝子組換えでないレアコドン弱毒ウイルスの作出を行うことを目的とする。レアコドンは、細胞内におけるtRNAの存在量が少ないことに起因すると言われている。あるコドンに対するtRNA量が少ない場合、そのコドンを持つ遺伝子の翻訳速度が低下し、タンパク質の発現量が制限される現象が起こる。大腸菌において外来の遺伝子を発現させる際には、導入する遺伝子のコドンを大腸菌ゲノムのコドン頻度に従って最適化するような手法も広く利用されており、加えて、大腸菌のレアコドンに対するtRNA遺伝子を過剰発現させることで、レアコドンを含む遺伝子でも高発現が期待できるように改変された大腸菌株も多数市販されている。従って、コドン頻度による発現量の制御は多くの生物に共通した性質である。また多くのウイルスでは、宿主内におけるウイルスの複製量を最大にするため、ウイルスゲノムのコドン頻度が宿主のコドン頻度に対して最適化されていることが知られている。本年度は、シロイヌナズナやそれ以外の植物種においてレアコドンの調査を行った。その結果、多くの植物ではコドン頻度やレアコドンの種類が比較的似ていることが分かった。加えて、いくつかの植物ウイルスにおけるコドン頻度を調べたところ、宿主である植物ゲノムのコドン頻度とある程度の相関関係にあることがわかった。これは宿主内におけるウイルス遺伝子の効率的な転写翻訳を考えると、妥当な結果だと思われた。本年度は、レアコドンについての調査を行った結果を踏まえ、レアコドンに対するtRNA遺伝子を植物において過剰発現させる系の検討を行った。その結果、通常のアグロバクテリウムによる形質転換系で問題なく行うことが出来ることが分かった。本年度は、昨年度に行ったレアコドンについての調査を行った結果を踏まえ、レアコドンに対するtRNA遺伝子を植物において過剰発現させる系の検討を行った。その結果、通常のアグロバクテリウムによる形質転換系で問題なく行うことが出来ることが分り、多くの知見が得られたと同時に、来年度への研究の展開に向けた準備段階を遂行することができたことから、おおむね順調に進展していると思われる。

本研究ではこれらの知見に基づき、植物および植物ウイルスのコドン頻度について徹底的に調査し本アプローチの有効性を検討した。またその結果を踏まえ、レアコドンに対するtRNA遺伝子を植物において過剰発現させる系の検討を行った。その結果、通常のアグロバクテリウムによる形質転換系で問題なく行うことが出来ることが分かった。またウイルスの経代を繰り返し定期的にサンプリングしたのちその塩基配列を解析する系を確立した。シロイヌナズナやそれ以外の植物種においてコドンの調査を行い、コドン頻度やレアコドンについての傾向を掴んだ。またいくつかの植物ウイルスにおいても同様の調査を行い、コドン頻度についての類似性が示唆された。レアコドンに対するtRNA遺伝子を植物において過剰発現させる系の検討を行い、通常の形質転換系で問題ないことが分かり、またウイルスを定期的にサンプリングしたのちその塩基配列を解析する系を検討した。本年度は、植物ゲノムにおけるコドン頻度やレアコドンを調査し、レアコドンに対応するtRNA遺伝子をシロイヌナズナへと導入するための系を検討し、その後の研究も進展中である。その結果、多くの知見が得られたと同時に、来年度への研究の展開に向けた準備段階を遂行することができたことから、おおむね順調に進展していると思われる。レアコドンに対応するtRNA遺伝子を植物へと導入するための系を検討したため、これを用いて形質転換体を選抜し、レアコドンウイルスの作出系を確立する。tRNA遺伝子を導入するための系としてアグロバクテリウムによる系を検討したが、本年度の成果により追加でプロモーター配列の差異を検討する必要性が生じたため、次年度はこれも含めた研究を実施する。生物学本年度の成果を踏まえ、来年度は研究を大きく進展させる予定である。具体的には、レアコドンに対応するtRNA遺伝子をシロイヌナズナへと導入するための系を検討したため、これを用いて形質転換シロイヌナズナを作出し、レアコドンウイルスの作出系を確立する。tRNA遺伝子をシロイヌナズナへと導入するための系としてアグロバクテリウムによる系を検討したが、本年度の成果により追加でプロモーター配列の差異を検討する必要性が生じたため、次年度はこれも含めた研究を実施する。プロモーターの差異を検討するため、複数のベクター系を構築し、植物における発現量の差異を検討する。これに関わる消耗品費として使用する予定である。