hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
物質代謝からみた青果物の鮮度評価

その他のトマト果実、ナシ果実、ジャガイモ、ホンレンソウなど青果物を用いた実験結果から、老化促進物質であるエチレン生成、クロロフィルやカロチノイドの消長、栄養学的要素や生体調節作用をもつ物質の消長、酸化還元に関する比率や酵素活性の変化、果実では甘味形成に関係するショ糖合成酵素活性、細胞壁や生体膜の構成要素の変化やそれらの変化に関係する酵素活性の変化などを基本としたものが、鮮度評価のための指標に適しているものと思われた。またこれらの組み合わせによる指標作成を試みる必要性があるが、青果物の特長ある品質特性は二次代謝によって支えられ発現されるので、本研究で用いられた研究方式をもとにさらに改善を加え、個々の青果物について品質特性を支える代謝活性と鮮度との関係およびその制御段階を明らかにすることが必要であると考えられる。本年度の各分担研究者の研究成果を研究計画に従いまとめると次ぎのようである。1.基礎代謝の調査:ブロッコリー花蓄において、収穫後の鮮度低下、クロロフィル(Ch1)が顕著に減少し黄化する現象に伴いエチレン生成系の活性化が起こり、エチレン生成を抑制する高温処理やエチレン作用抑制剤の処理はエチレン生成を抑制し、かつ黄化を抑制した。また花蓄の黄化に伴いビタミンCの減少や呼吸作用に関係する脱水素酵素の補酵素のNDA/NADH比の急激な低下が認められ、生体内の酸化還元バランスのくずれと鮮度変化との関係が示唆された。さらに花蓄の黄化に伴い遊離酸の増加と遊離糖の減少が認められる。またミツバチの黄化に伴うCh1の分解過程には、まずCh1にクロロフィラーゼが作用しクロロフィライドを生産し、次いでこの物質がリポキシゲナーゼあるいはペルオキシダーゼの作用により酸化分解される様式が示された。青果物の細胞内構造の維持と関係が深い脂質の脂質酸組成に対する環境温度の影響を調べ、その飽和化、あるいわ不飽和化が青果物の種類によってかなり異なることを認め、今後、鮮度変化との関係を解析する予定である。2.嗜好性成分の調査:トマト果実について、追熟に伴うグルタミン酸の増加にはエチレン作用が密接に関係していることが認められた。3.生体調節機能成分の測定:ブロッコリーの花蓄と茎部における食物繊維は、鮮度変化に関係なく水溶性、不溶性成分とも収穫時点の含量が保持された。また日本ナシについて、食物繊維を含む細胞壁成分の分解にbeta-ガセクトシダーゼ、alpha-アラビナーゼなどが関与し、これら酵素の作用と果肉軟化との関係が示唆された。平成6年度は本研究の最終年度で、各分担研究者がそれを踏まえて行った本年度の研究結果は次のようである。1.基礎代謝の調査:呼吸活性と環境湿度との関係は一定でなく、呼吸活性が低湿度で高くなるものと、高湿度で高くなるものがあり、呼吸活性が高いものではエチレン生成も高いことを認めた。糖代謝においては日本ナシ果実について未熟果より成熟果でスクロース合成に関する酵素に対する基質の親和性が増大することが認められた。生体内における酸化に関するペルオキシダーゼ活性は、ジャガイモについて20°C貯蔵のものより1°C貯蔵のもので高い傾向があったが、アスコルビン酸はいずれの温度区でも減少した。青果物の不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸の比はいずれも低温で高くなる傾向であった。ブロッコリーを45°C・14分処理で緑色が保持され、老化促進に作用するエチレン生成も抑制されることが認められた。2.嗜好性成分の調査:トマト果実では熟成に伴いグルタミン酸が増加したが、NH_3の直接的な同化によるものではないことが分かった。食材としての切断タマネギにおいて細菌の作用が加熱褐変の原因となることが知られた。
寝具-人体熱収支モデルの構築による寝床内温熱環境予測手法の開発

本研究は、人体と環境変化に対して体温調節を補う役割を果たす寝具を1つの系とした寝具-人体熱収支モデルを構築することにより、睡眠時の人体周りに形成される寝床内温熱環境を予測・評価する手法を開発することを目的としている。平成23年度は、寝具の使用量が少なく変数が単純な夏季を対象として、サーマルマネキンを用いた測定を実施した。実験条件は、実生活に即した環境温度、空調制御の方法および寝具と着衣を用いた既往の睡眠に関する被験者実験を参考に、寝具としてベッドの上に敷布団とタオルケット、着衣は夏用のパジャマ、空調制御はエアコンとパネル冷房および冷房なしの組み合わせで設定した。測定項目は、マネキンの皮膚表面温度および発熱量、寝具や着衣の表面温度と表面熱流とした。マネキンによる計測データと、先に行われた被験者実験の結果と比較して用いることにより、モデル構築の一段階において、皮膚温や深部温のセットポイントや代謝量、寝具の総合的な断熱性能等の変数や係数をチューニングすることが可能である。本研究は、事業機関の初年度早期に廃止となったため、サーマルマネキンを用いた基礎的データの測定実験を行うに止まったが、得られた計測データは、寝具-人体熱収支モデル構築の基礎資料として有用である。今後、設定する条件を拡大して測定を行うことで、モデルの適用範囲を拡大するとともに、被験者実験の結果と比較検討することにより再現性を確認し、精度の高い有用なシミュレーションモデルを構築し、健康で快適な睡眠環境の形成に資することが出来ると考える。
均質化された電磁機器の低次元モデル生成による高速時間応答解析法の開発

本研究ではインダクタや変圧器,モータといった複雑な形状の電磁機器を高速に解析するための手法を研究している.一般的に複雑な形状の電磁機器を解析するには,数万から数百万次元の連立方程式を解く必要があり,現在の計算機性能をもってしても非常に時間がかかる.本研究の手法を用いることで,そのような大規模な連立方程式の解を小さな次元の空間に射影することで等価回路化することが可能である.得られた等価回路は数十次元程度の大きさであるので非常に高速に解くことが可能である.現在,この等価回路にインダクタやモータに使われる電磁鋼板の非線形な特性を導入する手法について研究を行っている.本研究ではインダクタや変圧器,モータといった複雑な形状の電磁機器を高速に解析するための手法を研究している.一般的に複雑な形状の電磁機器を解析するには,数万から数百万次元の連立方程式を解く必要があり,現在の計算機性能をもってしても非常に時間がかかる.本研究の手法を用いることで,そのような大規模な連立方程式の解を小さな次元の空間に射影することで等価回路化することが可能である.得られた等価回路は数十次元程度の大きさであるので非常に高速に解くことが可能である.現在,この等価回路にインダクタやモータに使われる電磁鋼板の非線形な特性を導入する手法について研究を行っている.
可変拘束機能をもつ超冗長系のダイナミクスベースト制御

本年度は,可変拘束機能をもつ超冗長機械システムに関する研究における第2年度に当たり,非ホロノミック拘束をもつ超冗長機械システムであるヘビ型ロボットを対象として,非接地部の導入および非接地部の動的変化を考慮した可変拘束機能をもつヘビ型ロボットの制御について研究を行った.まず拘束条件の変化を考慮したヘビ型ロボットのモデリングを行なった.体幹の持ち上げをロボット体幹と環境の間の速度拘束式の有無に置き換えることで3次元運動を2次元運動として扱った.本年度は,車輪と環境との間に存在する速度拘束の有無が動的に変化するような,拘束可変機能をもつヘビ型ロボットのモデリングを行なった.この際,接地部分の動的変化を新たな冗長性である「モード選択」という自由度として表現することでロボットをハイブリッドシステムとして定式化している.導出したモデルに対して,まずは非接地部を導入した場合に生じる冗長性の特徴の解析とそれを利用することで推進時に生じる諸問題を解決するような制御則を提案した.この際,ヘビ型ロボットの実機を製作し,実機を用いた実験によって制御則の有効性を検証した.次に接地点,すなわち車輪と環境との間に存在する速度拘束の有無が動的に変化するような,拘束可変機能をもつヘビ型ロボットの制御について研究を行った.拘束の動的な変化によって生じる新たな冗長性である「モード選択」を利用した制御方策を提案し,モード選択によって評価関数の最小化が実現できることをシミュレーションによって示した.さらに,体形曲線を生物規範であるserpenoid曲線,モード選択の評価関数を車輪の拘束力とした場合の推進形態について,生物のsinus-lifting滑走との比較を行なった.その結果,生物のヘビのsinus-lifting滑走は拘束力だけでなく,他の要因も考慮した適応推進である可能性があることがわかった.本年度は,非ホロノミック拘束をもつ超冗長機械システムであるヘビ型ロボットを対象として,平面環境における動力学モデルの導出と冗長性の特徴の解析,これを利用した制御則の提案,シミュレーションによる検証を行った.さらにアプリケーションとして,複数台が協調して物体を運搬する協調制御における新たな冗長性の利用法の提案や,環境を曲面に拡張した円柱環境におけるヘビ型ロボットの運動学モデルの導出と制御則の提案を行い,シミュレーションにより制御則の有効性を確認した.ヘビ型ロボットは,生物のヘビが行っているように体幹の一部を宙に浮かせ,接地点を動的に変化させながら推進する場合,可変拘束機能をもつ超冗長機械システムとして扱う必要がある.このようなシステムは拘束状態によって対象のダイナミクスが変化するため,各拘束状態におけるダイナミクスや冗長性の特徴の解析を行った.まず動力学モデルを導出し,冗長性が運動に及ぼす影響を解析することで冗長性の特徴を明らかにした.これにより先頭の浮上リンクは後続の浮上リンクの影響を全く受けないということがわかった.このような冗長性の特徴をうまく利用することで,従来はトレードオフとなっていた複数のサブタスク,例えば可操作度増大化と特異姿勢の回避を同時に実現する制御則を新たに提案した.そして計算機シミュレーションによりその有効性を確認した.協調制御においても冗長性を利用することで対象物の把持を維持するように接触力を制御する方法を提案した.また,環境を平面から円柱曲面に拡張した場合の運動学モデルの導出を行い,冗長性を利用することで軌道追従制御則の提案とシミュレーションによる検証を行った.その結果,円柱曲面環境においても特異姿勢回避に関する評価関数を増大化することで,平面環境の場合と同様に自然にうねり運動が発生することがわかった.本年度は,可変拘束機能をもつ超冗長機械システムに関する研究における第2年度に当たり,非ホロノミック拘束をもつ超冗長機械システムであるヘビ型ロボットを対象として,非接地部の導入および非接地部の動的変化を考慮した可変拘束機能をもつヘビ型ロボットの制御について研究を行った.まず拘束条件の変化を考慮したヘビ型ロボットのモデリングを行なった.体幹の持ち上げをロボット体幹と環境の間の速度拘束式の有無に置き換えることで3次元運動を2次元運動として扱った.本年度は,車輪と環境との間に存在する速度拘束の有無が動的に変化するような,拘束可変機能をもつヘビ型ロボットのモデリングを行なった.この際,接地部分の動的変化を新たな冗長性である「モード選択」という自由度として表現することでロボットをハイブリッドシステムとして定式化している.導出したモデルに対して,まずは非接地部を導入した場合に生じる冗長性の特徴の解析とそれを利用することで推進時に生じる諸問題を解決するような制御則を提案した.この際,ヘビ型ロボットの実機を製作し,実機を用いた実験によって制御則の有効性を検証した.次に接地点,すなわち車輪と環境との間に存在する速度拘束の有無が動的に変化するような,拘束可変機能をもつヘビ型ロボットの制御について研究を行った.拘束の動的な変化によって生じる新たな冗長性である「モード選択」を利用した制御方策を提案し,モード選択によって評価関数の最小化が実現できることをシミュレーションによって示した.さらに,体形曲線を生物規範であるserpenoid曲線,モード選択の評価関数を車輪の拘束力とした場合の推進形態について,生物のsinus-lifting滑走との比較を行なった.その結果,生物のヘビのsinus-lifting滑走は拘束力だけでなく,他の要因も考慮した適応推進である可能性があることがわかった.
培養過程を要しない脂肪由来幹細胞移植による骨軟骨組織の修復・再生への応用

骨芽細胞への分化に関する研究(方法)培養した脂肪組織由来前駆細胞にBMPまたはデキサメタゾンを作用させた。これらの細胞に対しアルカリフォスファターゼ染色を行った。また細胞よりmRNAを抽出し、RT-PCRにより骨芽細胞のマーカー遺伝子の発現を調べた。(結果)bFGFを添加した細胞では、無添加の細胞に比べ、アルカリフォスファターゼ染色陽性細胞が多数みられ、骨芽細胞のマーカー遺伝子の発現が増加していた。またBMPまたはデキサメタゾンを加えることにより、さらにこれらの効果は増強した。In vivoでの骨・軟骨形成(方法)培養した脂肪組織由来前駆細胞にBMPを作用させ、骨芽細胞へ分化させた細胞または培養せずに抽出した細胞を多孔性ハイドロオキシアパタイトと混和し、マウスの皮下に移植し、組織学的に評価した。培養せずに抽出した細胞とコラーゲンゲルをラットの大腿骨関節面に作成した骨軟骨欠損部に充填し組織学的に評価した。(結果)両細胞ともにハイドロオキシアパタイト内に新生骨組織と思われる組織が形成されていた。また大腿骨関節面に作成した骨軟骨欠損部は肉眼的に瘢痕組織様であり、組織所見には線維軟骨様組織であった。1)脂肪組織由来前駆細胞の培養(方法)脂肪吸引手術時に採取した脂肪吸引物を処理することにより、脂肪組織由来前駆細胞を分離し、bFGF添加または無添加で継代培養を行った。2)骨芽細胞への分化に関する研究(方法)培養した脂肪組織由来前駆細胞にBMPを作用させた。またBMPを加えることにより、さらにこれらの効果は増強した。3)軟骨細胞への分化に関する研究(方法)脂肪組織由来前駆細胞を遠心管培養法にて成長因子(BMP、TGF-b)を作用させ、3週まで培養した。これらの細胞を包埋切片とし、アリューシャンブルーにて染色し、軟骨基質の産生について組織学的に評価した。(結果)脂肪組織由来前駆細胞ではこの培養法により、アリューシャンブルーにて染色される基質を有する軟骨様の組織がみられた。bFGFを添加した細胞では、無添加の細胞に比べ、これらの効果は増強していた。(方法)培養した脂肪組織由来前駆細胞にBMPを作用させ、骨芽細胞へ分化させた細胞を多孔性ハイドロオキシアパタイトと混和し、SCIDマウスの皮下に移植した。8週後に摘出し、孔内の骨形成量について評価した。(結果)BMPを作用させ、骨芽細胞へ分化させた細胞は、多孔性ハイドロオキシアパタイト内にマッソントリクロール染色で濃染される新生骨組織が形成されていた。それに対し脂肪組織由来前駆細胞をそのまま移植した組織では線維性組織のみで骨形成はみられなかった。(方法)脂肪組織由来前駆細胞をコラーゲンゲル内で培養した細胞をSCIDマウスの大腿骨関節面に作成した骨軟骨欠損部に充填した。術後6週後に修復組織を摘出し、トルイジン青染色、Safranin-O染色を行い、組織学的に観察した。(結果)大腿骨関節面に作成した骨軟骨欠損部は肉眼的に瘢痕組織様であった。組織所見では、線維軟骨様組織であり、トルイジン青染色、Safranin-O染色でわずかに染色されていた。
ルテニウム(II)錯体の光誘起配位子置換反応機構

〔Ru(bpy)_2L_2〕^<2+>錯体の光配位子置換反応について、以下のことが明かになった。1.L=置換ピリジン(Xpy;X=H、3ーCH_3、4ーCH_3、3,4ー(CH_3)_2、3,5ー(CH_3)_2)の錯体:(1)反応の量子収率は[Cl^-]に依らなかった。反応は解離機構で進んでいると結論される。(2)Xpyの種類の違いによってpKa(σ反結合性の尺度)は5.2ー6.6まで変化するが、φはあまり変化しなかった。(3)Xpy系ではφが[H^+]を依存性を示した。反応の活性化状態として、RuーN(py)軸から配位py平面が傾く変位をしたpyのNにH^+が付加することによりRuーN結合の切断が促進されると考えられる。このH^+付加の平衡定数とXpyのpKaとの間には良い相関が見られた。2.L=NH_3、en/2(エチレンジアミン)の錯体:(1)L=NH_3ではφは水中(φ=0.0083)、NaCl中、HCl中でほぼ同一であり反応は解離機構で進むと結論された。(2)NH_3系のφはpy系よりも1桁小さい。両者におけるσ反結合性の大きさの違い(従って^3dーdenergy levelの高低)に由来している。(3)L=en/2では一つ目のRuーN(en)結合切断のφはNH_3の場合より2桁小さい。これはσ反結合性の違い、キレ-ションの効果を反映していると思われる。3.L=pyNH_2/2(2ーピコリルアミン)錯体:この錯体の量子収率φは中性溶液中で3.3X10^<-3>、0.01ー0.5M HCl中で、(7.1-7.8)X10^<-3>であった。酸性溶液中のφ値は、RuーN(py)結合の切断のφに等しいと考えられるが、この値はXpy錯体のφより1桁小さい。これはσ反結合性の違い、キレ-ション、の効果であると考えられる。4.L=dmbpy/2(3,3'ージメチルー2,2'ービピリジン),bpy/2の錯体:dmbpy錯体のφの1/50であるが、この違いはキレ-ションの効果に、bpy錯体のφはpy錯体のφはpy錯体のφの1/50であるが、これはキレ-ションの効果、及びπ結合性の違いに基づいていると考えられる。
哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの病原性獲得機構の解明

ヒト由来のインフルエンザウイルスA/WSN/33株の糖蛋白質ノイラミニダーゼ(NA)は生体内に広く分布するプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する。プラスミンは、もう一つのウイルス糖蛋白質である赤血球凝集素(HA)を開裂してウイルスの感染性を増強する。プラスミノーゲンは、NAのカルボキシル末端リシン残基を介して結合することにより活性化される。また、NA146番目のアミノ酸に付加する糖鎖は立体構造上カルボキシル末端リシン残基の近傍に位置し、NAとプラスミノーゲンの結合を阻害することがわかっている。本研究では、糖鎖欠損という単純な機構でインフルエンザウイルスは強い病原性を獲得できるか否かを調べる。本年度はA/WSN/33株と同じくカルボキシル末端にリシン残基を持つA/Puerto Rico/8/34株のNAを用い146番目の糖鎖欠損変異NAを作製し、リバース・ジェネティクス法で組換えウイルスを合成した。前年度合成したA/WS/33株の糖鎖欠損変異NAを持つ組換えウイルスとともに、それらの生物活性を検討した結果、以下の結果を得た。(1)146番の糖鎖付加はNAの合成、細胞内輸送、そしてシアリダーゼ活性に不可欠ではなかった。(2)糖鎖欠損によりA/WS/33株のNAはプラスミノーゲンを活性化できるようになったが、A/Puerto Rico/8/34株のNAは糖鎖の有無に関係なくプラスミノーゲンを活性化できなかった。(3)A/WS/33株の糖鎖欠損変異NAを持つ組換えウイルスは、感染性が増強されなかった。以上の結果より、カルボキシル末端リシン残基を持つNAは潜在的にプラスミノーゲンを活性化する機能を持つわけではなく、さらにNAによりプラスミノーゲンが活性化された場合でも、ウイルスの病原性は必ずしも増強されないことが明らかとなった。すなわち、インフルエンザウイルスの病原性獲得には糖鎖欠損に加え、さらにほかの要因が必要である。ヒト由来のインフルエンザウイルスA/WSN/33株は、マウスに対し強い病原性を発揮する。この病原性は、ウイルス粒子表面に存在するノイラミニダーゼ(NA)が生体内に広く分布するプロテアーゼ前駆体のプラスミノーゲンを活性化し、もう一つのウイルス表面蛋白質である赤血球凝集素(HA)を開裂することでウイルスの感染性を増強することで発揮される。プラスミノーゲンの活性化はNAとプラスミノーゲンの結合が重要であり、NAのカルボキシル末端リシン残基の存在はその結合に必須である。また、NAの146番目のアミノ酸に付加する糖鎖は立体構造上カルボキシル末端リシン残基の近傍に位置し、NAとプラス.ミノーゲンの結合を阻害することがわかっている。A/WS/33株はA/WSN/33株の親株でマウスに対し病原性は示さず、そのNA146番には糖鎖が付加される。そこで、A/WS/33株NAの146番目に1アミノ酸変異を導入し糖鎖結合シグナルを欠損させた。この糖鎖欠損によりNAのシアリダーゼ活性はおよそ50%低下したが、A/WSN/33株のNAと比べると高い活性であった。したがって、糖鎖の存在はNAの機能に影響するが、その欠損は致死的なものでないことがわかった。次に、A/WSN/33株のNAを糖鎖欠損NAと入れ換え、リバース・ジェネティクス法で組換えウイルスを作製した。この組換えウイルスはプラスミノーゲン存在下の培養細胞において増殖性を示さず、トリプシンに依存した。これらの結果は、A/WSN/33株の病原性は糖鎖欠損という単純な機構で獲得できたものでなく、病原性のないA/WS/33株からA/WSN/33株に変異するには、より複雑な因子が関与することを示した。

(3)A/WS/33株の糖鎖欠損変異NAを持つ組換えウイルスは、感染性が増強されなかった。以上の結果より、カルボキシル末端リシン残基を持つNAは潜在的にプラスミノーゲンを活性化する機能を持つわけではなく、さらにNAによりプラスミノーゲンが活性化された場合でも、ウイルスの病原性は必ずしも増強されないことが明らかとなった。すなわち、インフルエンザウイルスの病原性獲得には糖鎖欠損に加え、さらにほかの要因が必要である。
キラルホスフィンライブラリーを活用した新規第四級ホスホニウム塩触媒の創製

不斉相間移動反応は実用的反応系として注目を集め、本反応系のための様々なキラル第四級アンモニウム塩触媒が開発されてきた。一方、キラル第四級ホスホニウム塩を触媒とした不斉合成反応の例は非常に限られており、その開発が強く望まれていた。そこで本研究では、新規キラルホスホニウム塩触媒の開発に取り組んだ。この際、様々な構造を有するキラル触媒ライブラリを効率的に構築するため、市販のキラルホスフィン化合物を前駆体として利用した。これにより、効率的な触媒探索が可能になり、本法を利用する事で高立体選択的反応を実現する新規ホスホニウム塩触媒の開発を達成することができた。不斉相間移動反応は、水溶液中、温和な条件下で実施可能な工業化に適した反応系として注目を集め、本反応系のための様々なキラル第四級アンモニウム塩触媒が開発されてきた。一方、キラル第四級ホスホニウム塩を相間移動触媒とした不斉合成反応の例は非常に限られていた。この原因の一つとして、第四級ホスホニウム塩の強塩基性相間移動条件下での不安定さが挙げられる。そこで近年我々が見出した、中性条件下で進行する新たな相間移動反応系へホスホニウム塩触媒を適用すれば、触媒の分解は問題にならないと考え、中性相間移動条件下で有効に機能するキラルホスホニウム塩触媒の開発に取り組んだ。この際、様々な構造を有するキラル触媒ライブラリを効率的に構築するため、市販のキラルホスフィン化合物を触媒前駆体として利用した。これにより、効率的な触媒探索が可能になり、本法を利用する事で、中性相間移動条件下で効果的に機能する新規触媒の開発を達成することができた。本触媒は非常に高い活性を示し、基質に対しわずか1/1000等量の触媒を用いるのみで反応を効率的に促進した。また、本触媒デザインを基に、水素結合供与基として、アミド部位を有する新規二官能性キラル第四級ホスホニウム塩触媒の創成に取り組んだ。アミド部位の、電子的および立体的環境をファインチューニングすることで、様々な不斉反応に適用可能な新規二官能性キラル第四級ホスホニウム塩触媒の創製を達成した。前年度に設計・開発したアミド部位を有する新規キラル第四級ホスホニウム塩触媒のデザインを基に、水素結合供与部位としてウレア基を有する新規二官能性ホスホニウム塩触媒を設計し、一連の触媒ライブラリを合成した。本触媒を相間移動条件下でのオキシインドール誘導体の不斉芳香族求核置換反応に適用し、その触媒能を検討した。本不斉芳香族求核置換反応は、これまでに開発した水酸基やアミド基を有するキラル第四級ホスホニウム塩触媒を用いた場合には中程度のエナンチオ選択性の発現にとどまる。そこで、今回開発した新規ウレア型触媒ライブラリを本反応に適用し、有効な触媒の探索を行った。その結果、エナンチオ選択性の大幅な改善を達成することができ、高収率および高エナンチオ選択的に、目的のアリール化生成物を与える触媒の創出に成功した。また、触媒のもつウレア基の役割について考察し、基質との相互作用による反応空間制御の重要性に関する知見を得ることができた。本触媒反応を利用することで、不斉第四級炭素を有するトリアリールメタン化合物という、他の合成法では構築困難な骨格を高立体選択的に構築でき、一連の有用な化合物群を効率的に合成できた。本反応は、不斉反応としてはその成功例が極めて限られている、高エナンチオ選択的芳香族求核置換反応の貴重な例である。また、ここで得られた生成物の変換反応についても検討し、さらに有用な化合物へと変換可能であることも明らかにしている。有機合成化学当初の計画通り、市販のキラルホスフィン化合物を触媒前駆体として利用することで、効率的な触媒探索の方法論を確立し、非常に効果的に機能する新規触媒の開発を達成することができた。昨年度の研究は、当初の計画通り順調に進んでいるため、本年度も当初の計画通り研究を進めていく予定である。平成25年度は、既に所有していた試薬、器具および分析機器の使用で、研究を遂行することができたため、予定よりも少ない予算の中で、順調に研究を推進することができた。平成25年度に得た研究成果をさらに発展させるため、器具や分析機器をさらに充実させ、研究を強力に推進する。また、これまでに得られた研究成果を国内外の学会で発表する予定である。
筋萎縮および筋損傷の修復・再生メカニズムの解明と伸張刺激の効果に関する研究

骨格筋は非荷重や安静・固定など刺激減少,不活動により速やかに萎縮することが知られているが,近年,不活動によって対象筋のみならず離れた部位・組織に痛覚過敏が生じ,長期間持続することが報告されている。不活動による筋萎縮ならびに痛覚過敏に対する伸張刺激はじめ理学療の効果については不明な点が多い。そこで,最終年度である平成19年度には,筋萎縮や慢性痛の予防,治療法の開発からメカニズムを探るべく,不活動モデル動物を用いて,筋障害に対して理学療法で頻繁に行われる運動療法(伸張刺激,運動負荷)と温熱療法の影響について組織学的,行動学的に調べた。マウスを後肢懸垂のみ,または後肢懸垂にそれぞれ足関節背屈位,底屈位でギプス固定し,2週間後に前脛骨筋とヒラメ筋を剖出し組織学的に観察した。結果,特に短縮位で固定された筋の筋湿重量と筋線維横断面積が有意に減少し,特にタイプI線維よりもタイプII線維において著明であったことから,筋萎縮は非荷重のみならず伸張性の欠如によっても促進され,ギプス固定というphasic contractionを阻害されることで速筋に有意な萎縮変化をもたらすことが明らかとなった。一方,2週間の後肢懸垂とギプス固定を行った不活動モデルに対し,不活動前に温熱刺激またはトレッドミル走行を2時間負荷し,痛覚過敏や筋萎縮の進行抑制"先取り効果"について,ヒラメ筋の組織学的解析ならびに後肢足底皮膚の痛覚閾値をもとに調べた。その結果,2週間の不活動により,ヒラメ筋の筋線維直径,タイプI線維比率,筋線維あたりの毛細血管数,足底の痛覚閾値のすべてにおいて低値を示したのに対し,不活動前に温熱刺激または運動負荷を行った群ではそれらはすべて高値を示した。このことより,神経損傷を伴わない不動化により筋萎縮はもとより筋以外の広範な組織に痛覚過敏をも呈すること,また温熱療法や運動療法によってそれらを改善しうる先取り効果をもたらすことができる可能性が示唆された。筋細胞への伸張刺激は,筋の成長や肥大を促進し,筋萎縮の進行を抑制することが知られている。骨格筋の再生は発生や成長とよく似た過程をたどるといわれているが,正常筋の成長を促進させる伸張刺激が,傷害された筋の再生にどのような効果をもたらすのか,これまで不明であった。平成17年度には,マウスヒラメ筋の微細損傷モデルに対して伸張刺激を加え,形態学的変化を経時的に観察して筋再生に及ぼす影響を調べた雄マウス133匹に下り坂走行を90分間課し,ヒラメ筋に伸張性筋活動による筋傷害を誘発させ,直後に30分間の伸張刺激を加えた群(RS群:n=47)と加えない群(R群:n=47)に分け,運動12時間,1,2,3,5,7,14日にヒラメ筋を採取し,光学および電子顕微鏡で観察した。なお,運動負荷や伸張刺激を加えない群(n=34)を対照とした。また,事前にエバンスブルーを数匹のマウスに腹腔内投与し,運動12時間,1,2,3時間後にヒラメ筋を採取し蛍光顕微鏡で筋細胞膜損傷の有無を調べた。さらに,筋線維断面積と壊死線維数スケールの定量解析を行った。運動12時間後からRS,R群ともに筋線維の蛇行や筋原線維の乱れがみられたが,筋細胞膜の破壊や炎症細胞の浸潤はほとんど観察されなかった。また,事前に投与したエバンスブルーに染色された筋線維はほとんど観察されなかった。3群のどの時期にも壊死線維はほとんど観察されなかった。RS群では運動12時間後,R群では1日後に,筋線維周辺部にフレア状に拡張した細胞質領域が出現した。これらの領域はミトコンドリアとリボゾームで満たされ,筋線維の核は明るく著明な核小体を備えていたことから,細胞内修復に必要な線維構造タンパク合成の場である可能性が示唆された。また,RS群の方が修復タンパク合成細胞質領域が早期より出現し,早く消失して,筋線維の内部構造や筋束の正常化が早まった。さらに,RS群の方が,早く断面積が回復した。これらの結果から,伸張刺激は運動や外傷で生じる筋損傷を軽減し,さらに,その後に生じる筋の再生を促進している可能性が示唆された。骨格筋は非常に再生能力の高い組織である。しかし,一側腓腹筋へのLPS(lipopolysaccharide ; L)と高張食塩水(H)の複合投与(LH)による筋障害性慢性痛症モデル動物では,足底のvon Freyテスト(VFT)により,長期にわたる足底の痛み行動亢進を示す。一方,このモデルにおいて急性期坐骨神経ブロック処置によりその長期亢進は減弱傾向を示し,LやHの単体投与,針刺しのみでは痛み行動長期亢進はみられないことが明らかとなった。次に,種々の刺激によってさまざまな痛み行動パターンを示す筋障害性モデル動物を用いて,痛み行動と末梢障害筋の傷害・再生プロセスとの関係を組織学的に検討した。adult SDラットの一側腓腹筋に2μg/kgのL投与24時間後にH(100μl×5回,90分間隔)を投与(LH群),LH処置1日後に坐骨神経ブロック処置(LH-B群;

長期痛み行動亢進が減弱),Lのみ投与(L群;長期痛み行動亢進なし),生理食塩水(S)投与24時間後にH投与(SH群;長期痛み行動亢進なし),Sのみ投与(SS群;長期痛み行動亢進なし)し,1,3,7,14日後(急性期)と6,16週後(慢性期)に未固定の下腿三頭筋を取り出して凍結切片を作成しH-E染色後に光学顕微鏡で検鏡した。その結果,投与後6,16週目ではLH群だけに両側の痛み行動亢進が持続していたが,処置側のみに一般的には痛みを生じないとされる再生像(大小不同の中心核線維)を示した。その所見は痛み行動の亢進減弱を示すLH-B群でも同様であった。急性期では,L群,SH群,SS群に局所的な炎症がみられ,LH群では著明な浮腫と広範な筋線維壊死に至る炎症増強がみられた。また,急性,慢性期ともすべての群で対側筋や同側異名筋には組織学的変化がみられなかった。つまり,1)長期的な痛み行動亢進の有無に関わらず慢性期の障害筋組織像に違いが認められなかった(いずれも筋は再生に至っていた),2)両側の痛み行動亢進が生じたにもかかわらず,一側の筋組織変化しかみられなかったことから,慢性期の痛み行動亢進は末梢障害筋からの直接的なシグナルによって起こっているものではないことが示唆された。しかし,筋障害が慢性的な痛み行動を誘起するきっかけとなったことは確かであるため,傷害急性期の炎症部位から発せられるメッセンジャーとなるべき物質がトリガーとなり,何らかの中枢機序が関与して慢性痛を引き起こしたと考えられる。現在,不活動後の筋再生メカニズムの解析についても組織学的に検討をすすめている。骨格筋は非荷重や安静・固定など刺激減少,不活動により速やかに萎縮することが知られているが,近年,不活動によって対象筋のみならず離れた部位・組織に痛覚過敏が生じ,長期間持続することが報告されている。不活動による筋萎縮ならびに痛覚過敏に対する伸張刺激はじめ理学療の効果については不明な点が多い。そこで,最終年度である平成19年度には,筋萎縮や慢性痛の予防,治療法の開発からメカニズムを探るべく,不活動モデル動物を用いて,筋障害に対して理学療法で頻繁に行われる運動療法(伸張刺激,運動負荷)と温熱療法の影響について組織学的,行動学的に調べた。マウスを後肢懸垂のみ,または後肢懸垂にそれぞれ足関節背屈位,底屈位でギプス固定し,2週間後に前脛骨筋とヒラメ筋を剖出し組織学的に観察した。結果,特に短縮位で固定された筋の筋湿重量と筋線維横断面積が有意に減少し,特にタイプI線維よりもタイプII線維において著明であったことから,筋萎縮は非荷重のみならず伸張性の欠如によっても促進され,ギプス固定というphasic contractionを阻害されることで速筋に有意な萎縮変化をもたらすことが明らかとなった。一方,2週間の後肢懸垂とギプス固定を行った不活動モデルに対し,不活動前に温熱刺激またはトレッドミル走行を2時間負荷し,痛覚過敏や筋萎縮の進行抑制"先取り効果"について,ヒラメ筋の組織学的解析ならびに後肢足底皮膚の痛覚閾値をもとに調べた。その結果,2週間の不活動により,ヒラメ筋の筋線維直径,タイプI線維比率,筋線維あたりの毛細血管数,足底の痛覚閾値のすべてにおいて低値を示したのに対し,不活動前に温熱刺激または運動負荷を行った群ではそれらはすべて高値を示した。このことより,神経損傷を伴わない不動化により筋萎縮はもとより筋以外の広範な組織に痛覚過敏をも呈すること,また温熱療法や運動療法によってそれらを改善しうる先取り効果をもたらすことができる可能性が示唆された。
東中欧諸国の政治発展のヨーロッパ史への統合-政治体制・政党制・政治動員

本研究は、東中欧諸国(ハプスブルク君主国とその継承諸国を中心とする)の歴史を政治学的に分析する幾つかの方図を探り、これを通して現代政治学がこれまでに描いてきたヨーロッパ全体の歴史像に当該諸国の歴史をも位置づけることを目的とし、具体的には、1)議院内閣制化と選挙権拡大の観点から見た政治体制の民主化、2)農民政党を中心に見た政党システム形成、3)ハンガリーを事例とする農民と労働者の政治動員のそれぞれの過程を政治学的なアプローチを用いて分析することを意図している。上記の目的に沿って、当該期間内に必要な文献資料(単行本・博士論文・雑誌論文)の収集に努め、現在その整理・分析を行っている。予定していたマイクロ資料が購入できなかったため、上記テーマ3)に関する20世紀初頭のハンガリーにおける労使紛争の統計分析の作業は中断を余儀なくされたが、その代わりに各種雑誌バックナンバーを購入することができ、国内の文献・雑誌所蔵機関での文献資料収集も精力的に行った。平成18年1月19日にはハンガリーを訪れ、議院内閣制・選挙権改革・政治体制をめぐって一次世界大戦前から戦間期にかけて雑誌上などで展開された議論、同時代の政治学文献についての資料収集を行った。収集した文献・資料に基づいて、テーマ1)に関しては、東欧地域全体の政治発展・政治体制に関する研究動向紹介と自分なりの中間考察をまとめ、研究成果報告書に収めた。同テーマに関連して、第一次世界大戦前までの時期のハプスブルク君主国の、共通制度・シスライタイニア・ハンガリーの3つのレヴェルにおける政治制度面での発展の隘路についての中間的な考察もまとめつつある。テーマ2)に関しても、農民の政治動員と農民政党形成に関する考察を進める準備を整えつつある。上記の目的に沿って、当該年度には必要な文献資料(単行本・博士論文・雑誌論文)の収集に努め、現在その整理・分析を行っている。予定していたマイクロ資料の購入が当該年度中に実施できなかったため、上記テーマ3)に関する20世紀初頭のハンガリーにおける労使紛争の統計分析の作業は中断を余儀なくされたが、その代わりに雑誌バックナンバーの購入と精力的に行った国内の文献・雑誌所蔵機関での文献資料収集とによって上記テーマ1)2)についての予備的な考察を進めることができた。最終的には社会連合アプローチの適用を目指しているテーマ1)に関しては、その前提として、1860年代から第一次世界大戦前までのハプスプルク君主国の、共通制度・シスライタイニア・ハンガリーの3つのレヴェルにおける政治制度面での発展の隘路についての中間的な考察をまとめつつある。テーマ2)3)に関しては、ハンガリーとの比較対象として予定しているチェコ・ポーランドのうち、ガリツィア(ポーランド)地方における農民政党研究の蓄積の薄さに困惑させられているものの、チェコ農業党の豊富な研究蓄積に助けられて、農民の政治動員と農民政党形成に関する考察を進める準備を整えつつあり、さらにドイツやオーストリア(世襲諸邦)にまで視野を広げながら比較考察を進める予定でいる。

本研究は、東中欧諸国(ハプスブルク君主国とその継承諸国を中心とする)の歴史を政治学的に分析する幾つかの方図を探り、これを通して現代政治学がこれまでに描いてきたヨーロッパ全体の歴史像に当該諸国の歴史をも位置づけることを目的とし、具体的には、1)議院内閣制化と選挙権拡大の観点から見た政治体制の民主化、2)農民政党を中心に見た政党システム形成、3)ハンガリーを事例とする農民と労働者の政治動員のそれぞれの過程を政治学的なアプローチを用いて分析することを意図している。今年度は、いずれのテーマに関しても、独英仏語およびハンガリー語の史料・文献(博士論文・雑誌論文を含む)の収集を継続して行った。平成18年1月19日にはハンガリーを訪れ、議院内閣制・選挙権改革・政治体制をめぐって一次世界大戦前から戦間期にかけて雑誌上などで展開された議論、同時代の政治学文献についての資料収集を行った。この時に収集したものも含めて、前年度から今年度にかけて収集した文献・資料の整理・分析を進め、東欧地域全体の政治発展・政治体制に関する研究動向紹介と自分なりの中間考察をまとめつつあり、これは研究成果報告書に含める予定でいるほか、近く東欧史研究会でこれに基づいた報告を行って当該地域を対照とする研究者たちの批判を仰ぐ予定でいる。また、とりわけテーマ1)に関しては、その前提として一次大戦前までの時期のハプスブルク君主国の、共通制度・シスライタニア・ハンガリーの三つのレヴェルにおける政治発展の隘路についての中間考察をまとめつつある。テーマ2)3)に関しても、農民政党関連を中心に、収集した文献資料の整理・分析を進めた。
骨基質蛋白デコリンを用いた老人性骨粗鬆症の新しい治療法の開発

骨基質中デコリンはTGF-βに高い親和性をもって結合し、TGF-βのデコリンとの結合によりTGF-β受容体との結合能が高まる結果その作用が増強されることを見出した(Takeuchi et al.JBiol Chem 269:32634,1994)。これらの成績から、デコリンはTGF-βの骨基質における結合蛋白、或いはその作用の調節因子として骨形成の維持に関与する可能性が考えられた。老人性骨粗鬆症では、加齢によるTGF-βなどの成長因子作用の低下が骨形成の抑制をもたらす可能性が考えられている。そこで、TGF-βの骨への蓄積およびその作用の調節因子としてのデコリンの役割、およびTGF-β作用の調節機序を解明すると共に、recombinantデコリンを作成し、その骨への選択的投与法を確立することにより老人性骨粗鬆症の予防・治療への応用を試みた。骨芽細胞膜にはデコリンの特異的受容体が存在し、デコリン受容体はデコリンの細胞内への取り込みと代謝に関与することが明らかとなった。TGF-βと結合したデコリンのデコリン受容体との結合は、TGF-βのTGF-β受容体への提示を促進することにより受容体との結合を高め、その結果TGF-β作用の発現を高める可能性が示された。更に、デコリン受容体が活性型ビタミンDにより増加することも明らかとなった。一方、加齢に伴う骨基質内のデコリン含量の変化をウシ骨を用いて検討したが、明らかな変化は認められなかった。また、ヒトデコリンcDNAをCHO細胞にtransfecしrecombinantデコリンを調製したが、in vivoでの投与を可能とするだけのデコリンを得ることができず、加齢に伴う骨形成の低下に対する防止効果など、生体における投与効果や作用を検討することができなかった。しかし、本研究により明らかにされたTGF-βのデコリンとの結合および作用への影響は、骨における成長因子作用の調節機構の解明の上で今後重要と思われる。骨基質中デコリンがTGF-βに高い親和性をもって結合すること、デコリンとの結合によりTGF-βの受容体との結合能が高まりその作用が増強されることなどから、デコリンはTGF-βの骨基質における結合蛋白として、またその作用の調節因子として骨形成の維持に重要な役割を演じている可能性を示してきた。一方、加齢に伴う骨形成の低下にはTGF-βなどの成長因子作用の低下が深く関与する可能性が考えられている。そこで、TGF-β作用の調節因子としてデコリンの役割およびその作用機序を更に解明すると共に、recombinantデコリンを作成し、その骨への選択的投与法を確立することにより老人性骨粗鬆症の予防・治療への応用を試みた。1.デコリンによるTGF-β作用の調節機構の解明:デコリンによるTGF-β作用の調節機能を解明する一環として、TGF-βの受容体への結合能の促進作用の発現機序について検討を加えた。その結果、一定の分化段階にある骨芽細胞表面にはデコリンに対する特異的結合部位が存在し、TGF-βと結合したデコリンはこの結合部位への結合を介してTGF-βの受容体への提示を促進するものと考えられた。一方、デコリン結合部位を持たない細胞では、デコリンはTGF-βと結合することにより逆にTGF-β受容体への結合を低下させ、その作用を抑制することも示された。

2.Recombinantデコリン及びビスフォスフォネート複合体の作成:ヒトデコリンcDNAを用いrecombinantデコリンの調整を進めている。既にCOS細胞での発現を確認し、精製を進めると同時大量発現系での調整に着手している。ビスフォスフォネートは石灰化骨に高い親和性で付着し、破骨細胞による骨吸収を強力に抑制する。このビスフォスフォネートとデコリンとの複合体を合成し、骨に選択的に集積させると共にビスフォスフォネートの骨吸収抑制作用とデコリンによる成長因子作用の促進を介する骨形成促進作用を合わせ持つ治療薬の開発をはかる。骨基質中デコリンはTGF-βに高い親和性をもって結合し、TGF-βのデコリンとの結合によりTGF-β受容体との結合能が高まる結果その作用が増強されることを既に見出した。これらの成績から、デコリンはTGF-βの骨基質における結合蛋白として、またその作用の調節因子として骨形成の維持に重要な役割を演じている可能性が示された。老人性骨粗鬆症では、加齢によるTGF-βなどの成長因子作用の低下が骨形成の抑制に深く関与する可能性が考えられている。そこで、TGF-β作用の調節因子としてのデコリンの役割、およびそのTGF-β作用の促進機序を更に解明すると共に、recombinantデコリンを作成し、その骨への選択的投与法を確立することにより老人性骨粗鬆症の予防・治療への応用を試みた。1.デコリンによるTGF-β作用の調節機構の解明:デコリンによるTGF-β作用の調節機構を解明する一環として、デコリンがTGF-βの受容体との結合能を促進する機序について更に検討を加えた。骨芽細胞系細胞の中には、細胞表面にデコリンの特異的受容体を有する細胞が存在し、これらの細胞ではデコリンの受容体との結合を介してデコリンと結合したTGF-βのTGF-β受容体への提示が促進されるものと考えられる。デコリン受容体は、デコリンの細胞内への取り込みと代謝に関与し、活性型ビタミンDにより増加することも明らかとなった。今後そのTGF-β作用の発現に及ぼす影響について更に検討を進める必要がある。2.Recombinantデコリン及びビスフォスフォネート複合体の作成:ヒトデコリンcDNAをCHO細胞にtransfecしrecombinantデコリンの調製を進めてきた。しかし技術的な問題から十分量のデコリンが得られず、ビスフォスフォネートとデコリンとの複合体の合成には未だ至っていない。骨基質中デコリンはTGF-βに高い親和性をもって結合し、TGF-βのデコリンとの結合によりTGF-β受容体との結合能が高まる結果その作用が増強されることを見出した(Takeuchi et al.J Biol Chem 269:32634,1994)。これらの成績から、デコリンはTGF-βの骨基質における結合蛋白、或いはその作用の調節因子として骨形成の維持に関与する可能性が考えられた。老人性骨粗鬆症では、加齢によるTGF-βなどの成長因子作用の低下が骨形成の抑制をもたらす可能性が考えられている。そこで、TGF-βの骨への蓄積およびその作用の調節因子としてのデコリンの役割、およびTGF-β作用の調節機序を解明すると共に、recombinantデコリンを作成し、その骨への選択的投与法を確立することにより老人性骨粗鬆症の予防・治療への応用を試みた。骨芽細胞膜にはデコリンの特異的受容体が存在し、デコリン受容体はデコリンの細胞内への取り込みと代謝に関与することが明らかとなった。
ストレスセンサーKeap1による転写因子Nrf2活性制御機構の解明

Nrf2は酸化ストレス・異物代謝に関わる遺伝子群を統一的に制御して、生体防御に働く転写因子である。Nrf2は、非刺激下ではKeap1-Cul3を構成因子とするユビキチンリガーゼ複合体によりユビキチン化され、プロテアソームにより迅速に分解されている。Keap1はセンサー分子として機能し、酸化ストレス刺激を感知するとNrf2のユビキチン化反応を停止する。その結果、安定化したNrf2は核内に蓄積して種々の標的遺伝子の転写を活性化する。Keap1分子は複数のシステイン残基をセンサーとして保持し、それらを使い分けて多様なストレス刺激に対する応答を可能にするが、これらのシステイン残基の使い分けの分子機構の詳細はよくわかっていない。本研究では、ストレス応答におけるNrf2活性化の分子基盤、特にKeap1によるユビキチン化反応の調節機構の解明を目指す。Nrf2誘導剤の供与およびその化学的性質について助言を頂くため、また、発がん実験とその解析方法について助言をいただき共同研究を実施するため、当該年度は、共同研究者に連絡を取り、渡航スケジュールについてメールにて打ち合わせを行った。詳細な実験計画の打ち合わせを行うため、今年度中に渡航を予定している。2018年度中に打ち合わせを行うため短期渡航を予定していたが、共同研究先の都合とスケジュールを合わせることが難しかったため、実施することができなかった。Dinkova-Kostova教授には、Nrf2誘導剤(TBE-31やイソチオシアネート化合物など)の供与およびその化学的性質について助言を頂き、共同研究を実施する。渡航前に私たちの研究室で各種Keap1変異体を発現する細胞株やNrf2、Keap1、Cul3の精製タンパク質を調整する。国内で調整した細胞株や精製タンパク質をUniversity of Dundeeへ持参し、Dinkova-Kostova教授から供与頂くNrf2誘導剤を添加することで、Nrf2活性に与える影響や三者複合体の構造変化を調べる。必要であれば、帰国後も実験を継続する。特に、Nrf2誘導剤の種類による違いがあるのか否かを明らかにする。その他の遺伝子発現解析などは国内に持ち帰り解析を実施する。実験の詳細について事前打ち合わせや準備を行うための渡航も計画している。Kensler教授には、発がん実験とその解析方法について助言をいただき、私たちの研究室で作成した活性酸素種センサー欠失Keap1を発現するマウス由来の細胞を用いて発がんによる影響を協力して調べる。渡航前に、私たちの研究室で活性酸素種センサー欠失Keap1発現マウスからMEF細胞を調整する。これをKensler教授の研究室へ持参して、Kensler教授から供与いただく各種の発がん物質(ベンツピレンやアフラトキシンなど)を暴露し、その影響を調べる。具体的には、発がん物質によるDNA障害やDNA修飾体の測定、細胞死などを調べる。また、必要であれば、帰国後も実験を継続する。特に、遺伝子発現解析などは国内に持ち帰り解析を実施する。内定年度:2017Nrf2は酸化ストレス・異物代謝に関わる遺伝子群を統一的に制御して、生体防御に働く転写因子である。

これをKensler教授の研究室へ持参して、Kensler教授から供与いただく各種の発がん物質(ベンツピレンやアフラトキシンなど)を暴露し、その影響を調べる。具体的には、発がん物質によるDNA障害やDNA修飾体の測定、細胞死などを調べる。また、必要であれば、帰国後も実験を継続する。特に、遺伝子発現解析などは国内に持ち帰り解析を実施する。実験の詳細について事前打ち合わせや準備を行うための渡航も計画している。
ヒト白血病細胞における癌退縮遺伝子(MAGE)の発現と診断・治療における意義

白血病、なかでも成人性T細胞白血病はHTLV-1感染によりその極く一部に発症することが明らかにされているものの、化学治療や放射線治療の成績は余り良くない。そこで、診断への応用の可能性および癌退縮抗原ワクチンの対象となり得るかどうかの基礎研究として、MAGE遺伝子の血液細胞における発現とその役割を調べ、MAGE遺伝子産物に対する特異的細胞性および液性免疫応答について解析した。各分化段階での白血病細胞株、および白血病患者由来の骨髄細胞・末梢血白血球でのMAGE遺伝子の発現をRT-PCRで決定し、各種刺激や分化段階との関連を解析したところ、リンパ性、特にT細胞性白血病細胞でMAGE-1が高頻度に発現することが分かった。さらに、タンパク質レベルでもウサギ抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。用いた抗体は合成ペプチドによりエピトープを決定し、対応する他のMAGEファミリーとは反応しないことを確認した。サンドイッチELISAの系を確立するために、マウスモノクローナル抗体の作製を試みたが、特異的な抗体が得られなかった。診断目的にも本法(ELISA)は重要であると考えられることから、抗体の作製をさらに試みる予定である。他方、脱メチル化剤で、抗癌剤として治療にも使われているDACで処理すると、正常細胞も含めて増殖細胞ではMAGE遺伝子を発現するようになる事が分かった。白血病細胞では、他の癌に比べて発現頻度が少ないことから、MAGE-1抗原を標的とする免疫療法を試みる場合は、DACなどの薬剤等によるMAGE遺伝子発現誘導が可能であるという知見は重要であると考えられた。
腫瘍マーカーＣＥＡにおける臓器特異性の検証

代表的な腫瘍マーカーの1つ、癌胎児性抗原CEAに着目し、その臓器特異性の検証を行った。数種類の臓器由来の培養癌細胞を用いて、CEAの発現様式、糖鎖修飾部位について検証した。その結果、CEAは由来臓器や細胞株ごとに異なった糖鎖修飾を有することが示唆された。さらに、LC-MS/MS解析により、CEAのN結合型糖鎖修飾予測部位のうち、新たに7箇所の同定に成功した。また、消化器癌由来細胞株において新規のCEAスプライスバリアントおよびバリアント由来CEAアイソフォームたんぱく質が存在すること、そしてCEA関連分子の1つCEACAM4が甲状腺髄様がん由来細胞株特異的に発現することを発見した。平成24年度は、数種類の臓器由来の培養癌細胞を用いて、CEAの発現様式、糖鎖修飾部位について検証した。さらに、LC-MS/MS解析により、CEAのN結合型糖鎖修飾予測部位のうち、新たに6箇所の同定に成功した。また、消化器癌由来細胞株において新規のCEAスプライスバリアントおよびバリアント由来CEAアイソフォームたんぱく質が存在すること、そしてCEA関連分子の1つが甲状腺髄様がん由来細胞株特異的に発現することを発見した。最終年度となる平成25年度は、CEAの培養上清中への分泌型に着目した研究を行った。前年度に新たに同定した2種類の新規CEAアイソフォームは、野生型と同様、培養上清中へと分泌されていることが明らかとなった。また、同時に、ある種の臓器癌では、野生型に対するアイソフォームの発現・分泌量が多いことが確認されており、CEAアイソフォームの発現・分泌量のバランスが癌種ごとで異なる可能性が予測された。CEAアイソフォームは、細胞接着や他分子との相互作用に重要なドメインの一部が欠損しているため、癌細胞における機能が、野生型と異なると考えられる。CEAを発現する多くの細胞株では、野生型とアイソフォームを共発現・共分泌しているものがほとんどであるため、今後は、それぞれを単独に発現する安定発現株を構築し、機能への影響を検証していく予定である。CEAの臓器特異性を検証するにあたり、当初は糖鎖修飾に焦点をあて、研究を行っていたが、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾だけでなく、CEAアイソフォームや相同性の高いCEACAMファミリー分子の発現・分泌、それら全てを検証する必要性があることが明らかとなった。今後、CEAの腫瘍マーカーとしての新たな局面を切り開くことを目標として、さらなる研究を行っていきたい。初年度となる平成24年度は、数種類の臓器由来の培養癌細胞を用いて、CEAの発現・分泌様式、糖鎖修飾部位について検証した。CEAが高発現・分泌していると言われている、大腸癌、胃癌、膵臓癌、甲状腺髄様がん由来の細胞株を選択し、選択した細胞株におけるCEAの遺伝子、たんぱく質レベルでの発現確認を行った。遺伝子レベルでの発現確認は、CEA特異的なprimerによるPCR法により行い、またたんぱく質レベルでの発現確認は、調製した細胞可溶化液に対し、CEA特異的な抗体によるウェスタンブロットおよび質量分析装置を用いたMS/MS解析により行った。得られた結果を基に、CEAを遺伝子・たんぱく質レベルで高発現する細胞株を選択し、CEAにおける糖鎖修飾の多様性の検証を行った。ウェスタンブロットにより検出されるCEAの分子量の位置が細胞株ごとで異なっており、しかしながら糖鎖修飾切断処理後では、CEAを発現する全ての細胞株で同じ位置(アミノ酸数から計算される理論分子量の位置)に検出された。CEAは由来臓器や細胞株ごとに異なった糖鎖修飾を有することが示唆された。さらに、LC-MS/MS解析により、CEAにおけるN結合型糖鎖修飾予測部位のうち、これまで実験的に証明されていた3箇所に加え、新たに6箇所の同定に成功した。一方で、消化器癌由来細胞株において新規のCEAスプライスバリアントおよびバリアント由来CEAアイソフォームたんぱく質が存在すること、そしてCEA関連分子の1つが甲状腺髄様がん由来細胞株特異的に発現することを発見した。CEAは広範囲の癌で産生、血中に分泌されているが、全ての癌で産生されているCEAが同じ分子型をとっているとは考えにくい。CEAが多数の糖鎖を有することから、糖鎖修飾にCEAの臓器特異性が見いだせるのではないかとの予測のもと研究をスタートさせた。培養癌細胞株におけるCEAの発現様式の検証、糖鎖修飾部位の同定においては、おおむね計画通り研究が進んでおり、細胞株ごとのCEAの糖鎖修飾部位の比較も行った。