hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
知的障害者のメンタルヘルスの評価方法の開発に関する研究

知的障害者の雇用環境が充実されることに伴い、知的障害者の就労継続支援が、重要な課題となっている。本研究は、その対応方法の1つとして、知的障害者のメンタルヘルス評価について検討した。他者が知的障害者のメンタルヘルスに関して評価する方法を用い、その経年的変化を事例的に検討した。評価項目は、抑うつ気分に関する項目と興味または喜びの喪失に関する項目で構成された。得点の著しい変化が見られた者と精神的な不調の観察が見られた者が一致した事例があった。メンタルヘルスの変化を捉えることに役立てることができると考えられ、就労継続支援のための実践活動にも活用できると考えられる。本研究は、成人期の知的障害者のメンタルヘルスに関して、その評価方法を開発することを目的としている。具体的には、1知的障害者のメンタルヘルスを評価する質問紙の作成、2特例子会社、就労支援事業、生活場面等におけるメンタルヘルス評価の信頼性と妥当性、3特例子会社、就労支援事業、生活場面等におけるメンタルヘルス評価の経年的変化の3点を課題としている。また、質問紙の作成として、先行研究により作成された評価法(MIPQ-J)に関して、質問項目の改訂・精選をした。知的障害の程度に対応することが可能になることをめざし、現在、修正を行っている。質問紙は、抑うつ気分、興味・関心・喜びの喪失の2次元で構成することを想定し、作成を行っている。作成した質問紙の信頼性と妥当性の検証、および経年的変化の分析のために、質問紙調査を実施する予定である。現在、研究・調査協力者のリストアップを行っている。成人期における知的障害者のメンタルヘルスの評価法を開発し、就労支援、生活支援の一助とすることが特色である。質問紙の作成として、先行研究により作成された評価法(MIPQ-J)に関して、知的障害の程度に対応することが可能となるように、質問項目の改訂・精選をした。質問紙は、抑うつ気分、興味・関心・喜びの喪失の2次元で構成する。成人期知的障害者のメンタルヘルスの評価においては、日本においてはまだ初期の試行段階であると言えるため、項目の作成にあたっては、海外の文献を収集し、研究動向を整理した。また、国内の関連学会において、情報を収集した。さらに、特例子会社のスタッフに専門的見地から助言をいただきながら検討した。研究・調査協力者のリストアップを行い、特例子会社で就労している知的障害者に対して研究協力を依頼した。近年、特例子会社制度の活用などにより、知的障害者の雇用が増加している現状がある。知的障害者のメンタルヘルスを評価することは、就労の継続・安定において、重要である。知的障害者における就労場面の動向として、一般就労者数が年々増加している。知的障害者の雇用環境が拡大することに伴い、その課題も顕在化し、中でも、知的障害者の就労継続支援は重要な課題である。本研究は、対応方法の1つとして知的障害者のメンタルヘルスの評価法の開発を試みた。イギリスで開発されたThe Mood, Interest & Pleasure Questionnaire(Ross and Oliver,2003)を参考とし、他者評定による質問項目を作成した。質問項目は全25項目からなり、「抑うつ気分サブスケール」12項目、「興味または喜びの喪失サブスケール」13項目で構成された。また、対象者のプロフィール(年齢,性別,業務内容等)、メンタルヘルスの問題や精神的不調の有無、評定者との関係に関する質問項目も設定した。関東地方にある特例子会社に協力を依頼し、知的障害のある社員のうち、本人または保護者に承諾が得られた者を対象とした。評定者は、対象者とともに働くスタッフ(指導員やマネージャー等)とした。最終年度は、経年変化を検討するために、全25項目による総得点、抑うつ気分サブスケール得点、興味または喜びの喪失サブスケール得点について、X年とX+5年時点で比較した。その結果、対象者全員の得点が低下していた。また、総得点が30点以上低下した対象者が2名いた。2名は、抑うつ気分サブスケール得点と興味または喜びの喪失サブスケール得点のどちらにも低下がみられた。また、そのうち1名は、評定者より、ここ1年の間で精神的な不調が観察されたという報告がある事例であった。本研究で作成した質問項目は、知的障害者のメンタルヘルスの変化を評価することに役立てることができると考えられる。就労継続支援のためのメンタルヘルス管理の実践活動に活用できる。

平成26年度は、質問紙を作成し、特例子会社、就労支援事業、生活場面等におけるメンタルヘルス評価の信頼性と妥当性を検討する予定であったが、やや遅れている。理由は、研究・調査協力者のリストアップや調査協力の依頼に時間がかかったためである。障害者心理学特例子会社に就労している知的障害者に対する調査を実施し分析する。メンタルヘルス評価の経年的変化の分析を中心とする。本研究にかかわる研究は、日本国内においては初期の段階であるため、継続的に海外の文献を収集し、研究動向の整理も行っていく。平成25年度は、質問紙を作成し、調査の実施を行う予定であったが、質問紙の作成に時間がかかり、やや遅れている。理由は、知的障害の原因によりメンタルヘルスの低下症状の現れ方が異なることが想定され、対象者の実態把握および心理アセスメントを行ったり、原因と障害の程度の二つに対応した質問紙を作成しようと試みているためである。調査協力を依頼し、調査を実施はじめたところであるため、データの収集・処理に関わる「人件費・謝金」の支出予定の一部を次年度に繰り越した。まず、質問紙を作成し、特例子会社、就労支援事業、生活場面等におけるメンタルヘルス評価の信頼性と妥当性を検討する。次に、メンタルヘルス評価の経年的変化分析のためのデータ収集を行う。本研究にかかわる研究は、日本国内においては初期の段階である。継続的に海外の文献を収集し、研究動向を整理していく。次年度においては、データの収集・処理、調査協力に関わる「人件費・謝金」の支出を増額した使用計画を立てている。研究初年度の本年度は、質問紙の作成に時間をかけた。質問紙を作成するために、対象者の実態把握および心理アセスメント、ならびにインタビューを行った。そのため、「物品費」の支出が予定よりも多くなった。データの収集、処理、調査協力に関わる「人件費・謝金」および「旅費」の支出予定の一部を次年度に繰り越した。次年度においては、データ収集、データの処理、調査協力に関わる「人件費・謝金」、「旅費」の支出を増額した使用計画を立てている。また、調査の実施にあたり、印刷費、複写費、郵便費等に関わる費目「その他」の使用を増額する予定である。
センサー型ロドプシンの分子科学:機能と構造変化の連関性

ロドプシン類は、光で反応のオン・オフを容易に調節できる点から、現在の生命科学研究の主題である構造-機能相関を分子論的に理解できる有用なツールである。本研究では微生物の光センサー型ロドプシンに着目し、機能と構造変化の連関性を明らかにすることを目的とした。当該年度の主な研究成果は以下の通りである。[1]新しいロドプシン類の単離・同定・発現・精製不安定で解析が困難だった誘因光受容体・センサリーロドプシンI(SRI)について、安定な分子を見いだした。また、新規ロドプシン分子を見いだしミドルロドプシン(MR)と名付けた。さらに、これら光センサータンパク質の下流分子(情報伝達に関わる分子群)についても単離・同定に成功し、発現・精製系を構築した。これにより、これまで困難であった測定が可能となった。[2]構造・構造変化・機能解析SRIや忌避光受容体・センサリーロドプシンII(SRH)を中心に、種々の分光法や生化学的・生物物理学的・分子生理学的手法を駆使して、タンパク質分子の形(構造)、やその変化(構造変化)を明らかにし、機能との連関性をアミノ酸レベルで明らかにした。SRHのTyr174の構造変化、SRIの体積変化など、物理化学的性質から、細菌運動解析など細胞生物学的解析までをうまく融合することができた。MRについては、光反応が極めて特徴的であることを見いだし、さらに光反応中における構造変化を時間分解分光法により明らかにした。ロドプシン類は、光で反応のオン・オフを容易に調節できる点から蛋白質研究をリードするすぐれた成果を生み出し続けている。また、高分解能構造や反応中間体構造が既知であるなど、現在の生命科学研究の主題である構造-機能相関を分子論的に理解できる有用なツールである。本研究では微生物の膜貫通型光センサー型ロドプシンタンパク質群に着目し、機能と構造変化の連関性を明らかにするものである。以下に今年度の成果を挙げる。忌避応答光センサー蛋白質、SRIIの機能発現分子メカニズム:阪大/水谷グループと共同で、機能・構造変化に必須のアミノ酸残基(Tyr174)の変化を時間分解紫外共鳴ラマン測定法により捉えることに成功した[Biochemistry 2011]。2)デュアル光センサー蛋白質、SRIの機能発現メカニズム:色制御メカニズムを明らかにした[J.Biol.Chem.2011b]。Asp 102の構造変化を見出した[投稿中]。新規光受容分子を発見し、ミドルロドプシン(MR)と名付けた[J.Biol.Chem.2011a]。このように光センサータンパク質の機能発現機構について、順調に研究が進んでいる。
微小重力環境を用いた胃癌オルガノイドの確立と新規治療開発のための基盤的研究

計画している研究題目は、1微小重力環境下での胃癌オルガノイドモデルの確立2胃癌オルガノイドにおけるCD24の機能解析3胃癌オルガノイドに対するCD137誘導による新規ADCC誘導法の検討である。昨年1年間の研究において,1樹立したオルガノイドを用いて微小重力環境下での培養の条件設定を行った。昨年度時点ではマトリゲル存在下での樹立には成功していたが,本年度は,培養条件を工夫し,マトリゲル存在下で,さらに免疫細胞接触を可能とし得る培養条件での樹立にまで成功した。更に2微小重力環境のみでなく,過重力環境下での培養にも成功し,重力変化による増殖マーカーなどの発現変化について検討を行った。昨年度も報告したが,概ね微小重力環境下においては,幹細胞マーカーの発現上昇を認め,過重力環境下では,増殖能の上昇をみとめ,培養速度も約1.5倍になることが判明した。これらの結果から重力変化により細胞の幹細胞性や増殖速度などの変化を生じることが明らかとなった。現在,網羅的な発現変化に関する検討を進めている。過重力環境下でのオルガノイド培養の樹立とその結果,従来1.5ヶ月2ヶ月を要していた患者検体からの癌オルガノイド培養がその後の様々な検討に使用できるまでの期間を短縮できる可能性があることは,将来的にリアルタイムに患者への治療などに還元できる可能性も秘めているという点で意義が高いと考え,過重力環境下での研究についても合わせて今後行っていく予定である。微小重力環境下での胃癌オルガノイド培養については,概ね計画通りに進んでいると考える。しかしながら,培養条件設定に時間を要したため,機能解析の検討はまだ十分に進んでいるとはいえず,今後検討を加速していく予定である。さらに,当初予定していなかった過重力環境下でのオルガノイド培養は,培養速度の向上がみられ,癌オルガノイド培養の欠点ともいえる培養時間の短縮を図れる可能性が期待される。この点は,今後の癌オルガノイドを用いたテーラーメイドの薬物感受性試験を行う上でも非常に魅力的であると考え,微小重力環境下での免疫細胞を介した癌研究ならびに,過重力環境下での薬物感受性試験の両面で研究を進めたいと考えている。昨年度,今年度の研究結果から,今後の推進方向として,1微小重力環境下での胃癌オルガノイドを用いた新規免疫細胞療法のための検討2過重力環境を用いた胃癌オルガノイドによるテーラーメイド薬物感受性試験のための基盤的研究の2テーマとして進めていく。具体的には,1樹立した細胞接触可能なオルガノイドモデルを用いて免疫細胞,抗がん剤,免疫チェックポイント阻害剤などと接触させ,疲弊マーカーの発現変化など検討することで,新たなバイオマーカー探索につながる可能性があると考える。さらに新規細胞療法開発につながるマーカーの探索など行っていく。2得られた癌オルガノイドに対する抗がん剤感受性と実臨床での感受性の違いなど今後検討していき,既知の感受性マーカーとされる分子発現変化や新規のマーカー候補などについても今後検討を行っていく予定である。昨年、1年間の研究において、樹立したオルガノイドを用いて微小重力環境での培養について条件設定を行なった。その結果、微小重力環境下でもマトリゲル存在下において継続的な培養は可能となった。また、マトリゲル非存在下での培養も試みているが、ある条件では培養可能であるが、いまだ不安定だあるため最適な培養条件を現在、検討中である。さらに、通常重力と微小重力培養における各オルガノイドのprofileについても現在確認中であるが。微小重力環境下オルガノイドにおいて幹細胞マーカー発現変化が認められており、概ね幹細胞マーカーの高発現を認めていた。また、増殖に関わる遺伝子発現については、微小重力環境下では抑制される傾向が認められた。しかしながら、オルガノイド株によっても違いがあり、癌そのものの特性による違いか条件による違いかを明らかにするため複数のオルガノイド株において現在検証中である。これらの検討を進めていき、最適な癌オルガノイド微小重力培養の条件設定を行っていく予定である。現在、作成した微小重力下オルガノイドを用いて化学療法感受性変化などを計画中であり、これらの検討の後にADCCなどの細胞障害活性などについても検討していく予定である。微小重力環境下でのオルガノイド培養については、概ね順調に計画通りに進んでいるかと考える。しかしながら細胞発育速度は比較的緩徐で、マトリゲルの有無や増殖因子などもう少し条件検討が必要である。これらが概ねクリアできれば、実際の細胞傷害試験などに移行していけるものと考えており、進捗を進めていきたいと考えている。

昨年度も報告したが,概ね微小重力環境下においては,幹細胞マーカーの発現上昇を認め,過重力環境下では,増殖能の上昇をみとめ,培養速度も約1.5倍になることが判明した。これらの結果から重力変化により細胞の幹細胞性や増殖速度などの変化を生じることが明らかとなった。現在,網羅的な発現変化に関する検討を進めている。過重力環境下でのオルガノイド培養の樹立とその結果,従来1.5ヶ月2ヶ月を要していた患者検体からの癌オルガノイド培養がその後の様々な検討に使用できるまでの期間を短縮できる可能性があることは,将来的にリアルタイムに患者への治療などに還元できる可能性も秘めているという点で意義が高いと考え,過重力環境下での研究についても合わせて今後行っていく予定である。微小重力環境下での胃癌オルガノイド培養については,概ね計画通りに進んでいると考える。しかしながら,培養条件設定に時間を要したため,機能解析の検討はまだ十分に進んでいるとはいえず,今後検討を加速していく予定である。さらに,当初予定していなかった過重力環境下でのオルガノイド培養は,培養速度の向上がみられ,癌オルガノイド培養の欠点ともいえる培養時間の短縮を図れる可能性が期待される。この点は,今後の癌オルガノイドを用いたテーラーメイドの薬物感受性試験を行う上でも非常に魅力的であると考え,微小重力環境下での免疫細胞を介した癌研究ならびに,過重力環境下での薬物感受性試験の両面で研究を進めたいと考えている。微小重力培養条件が確立できれば、1微小重力下オルガノイドの遺伝子発現の違いなどphenotype解析を引き続きおこなう。2抗がん剤感受性変化についての検討を行い、重力変化による感受性変化について検討を行う。3Graviteでは最大3Gまでの過重力実験が可能である。腫瘍増殖の観点からは過重力での培養が有利である可能性もあり、腫瘍のpheotypeに大きな違いがなければ、実臨床での感受性試験への応用にも有用と考えている。よって過重力下での培養およびphenotype解析も同様に行い、培養条件設定を試みる。その上で薬剤感受性試験も同様に行う予定である。4これらの基礎検討を行った後にCD137等を標的とした細胞傷害性試験について検討を行う予定である。昨年度,今年度の研究結果から,今後の推進方向として,1微小重力環境下での胃癌オルガノイドを用いた新規免疫細胞療法のための検討2過重力環境を用いた胃癌オルガノイドによるテーラーメイド薬物感受性試験のための基盤的研究の2テーマとして進めていく。具体的には,1樹立した細胞接触可能なオルガノイドモデルを用いて免疫細胞,抗がん剤,免疫チェックポイント阻害剤などと接触させ,疲弊マーカーの発現変化など検討することで,新たなバイオマーカー探索につながる可能性があると考える。さらに新規細胞療法開発につながるマーカーの探索など行っていく。2得られた癌オルガノイドに対する抗がん剤感受性と実臨床での感受性の違いなど今後検討していき,既知の感受性マーカーとされる分子発現変化や新規のマーカー候補などについても今後検討を行っていく予定である。
Laser-induced self-written waveguides with complex structure on polymer nanocomposites containing lanthanides doped nanocrystals

Er3+を添加したフッ化物ナノ結晶において、より高い量子効率を得るために粒径、配位子および添加物を最適化した。Er3+添加ナノ結晶において、Yb3+を除く他のランタノイドイオンの添加では量子効率の増加を確認できなかった。ナノ結晶を含む透明ポリマー複合体の作製に成功した。添加したナノ結晶に起因する散乱損失を低減した。複合材料による光導波路を、正常レーザ誘起自己形成技術を用いて作製した。自然放出増幅を確認した。合成ポリマーによる2つの光導波路を、X型構造で製作した。新しいナノ結晶添加の導波路を作製するこの手法は将来の光デバイス開発に期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。工学27年度が最終年度であるため、記入しない。
看護婦の透析患者に対する援助姿勢とアサーティブネス・トレーニングの効果

目的:看護婦が対応困難と感じる透析(HD)患者に対する援助姿勢がアサーティブネス・トレーニングによりどのように変化するか,その効果を明らかにする.対象及び方法:1.透析施設4ヵ所において,透析看護経験半年以上の看護婦36名を対象として面接調査を行い,対応困難と感じるHD患者の特徴とそれらの患者への援助姿勢を明らかにした.2.2日間にわたるアサーティブネス・トレーニング研修会参加者23名(14ヵ所の透析施設に勤務する看護婦)に対して,1の結果を元に作成した「HD患者に対する援助姿勢」に関する調査をトレーニング前後に行った.また,トレーニング前にはアサーティブ度テストNurses Assertiveness Inventory(NAI)及び東大式エゴグラムテスト(TEG)等についても調査した.3.研修会終了13か月後に,参加者のうち,調査に同意した22名に対して,対応困難と感じるHD患者に対するトレーニング参加前後の援助姿勢の変化状況,およびNAIについて聞取りによる面接調査を行った.結果及び結論:1によると看護婦が対応困難と感じる患者は,攻撃的,穿刺が困難,自己表現が少ない,なげやりな態度の患者等であった.2では,対応困難と感じるHD患者の割合が多いのは攻撃的な患者,なげやりな態度の患者であった.また,技術的な問題も対応上重要な要素であった.研修会前後で,対応困難と感じる度合いを比べると,研修後は対応困難の程度を低く答えた者が増加した.また研修会に参加したことにより,対応困難な患者を援助できない自分に対して罪悪感を抱かないでいられる,積極的に関わっていこうという気持ちになれた,気持ちが楽になったと答えた者も数名ずついた.アサーティブネス・トレーニングは,短期的には,対応困難な透析患者に対する看護婦の援助姿勢を前向きに変える効果があると思われたが,今後その効果が持続するかどうか,また,追加トレーニングをした場合の変化も見ていく必要があると考える.目的:看護婦が対応困難と感じる透析(HD)患者に対する援助姿勢がアサーティブネス・トレーニングによりどのように変化するか,その効果を明らかにする.対象及び方法:1.透析施設4ヵ所において,透析看護経験半年以上の看護婦36名を対象として面接調査を行い,対応困難と感じるHD患者の特徴とそれらの患者への援助姿勢を明らかにした.2.2日間にわたるアサーティブネス・トレーニング研修会参加者23名(14ヵ所の透析施設に勤務する看護婦)に対して,1の結果を元に作成した「HD患者に対する援助姿勢」に関する調査をトレーニング前後に行った.また,トレーニング前にはアサーティブ度テストNurses Assertiveness Inventory(NAI)及び東大式エゴグラムテスト(TEG)等についても調査した.3.研修会終了13か月後に,参加者のうち,調査に同意した22名に対して,対応困難と感じるHD患者に対するトレーニング参加前後の援助姿勢の変化状況,およびNAIについて聞取りによる面接調査を行った.結果及び結論:1によると看護婦が対応困難と感じる患者は,攻撃的,穿刺が困難,自己表現が少ない,なげやりな態度の患者等であった.2では,対応困難と感じるHD患者の割合が多いのは攻撃的な患者,なげやりな態度の患者であった.また,技術的な問題も対応上重要な要素であった.研修会前後で,対応困難と感じる度合いを比べると,研修後は対応困難の程度を低く答えた者が増加した.また研修会に参加したことにより,対応困難な患者を援助できない自分に対して罪悪感を抱かないでいられる,積極的に関わっていこうという気持ちになれた,気持ちが楽になったと答えた者も数名ずついた.アサーティブネス・トレーニングは,短期的には,対応困難な透析患者に対する看護婦の援助姿勢を前向きに変える効果があると思われたが,今後その効果が持続するかどうか,また,追加トレーニングをした場合の変化も見ていく必要があると考える.
スペイン語文法課題の検索データバンク

本課題は概略,わが国のスペイン語学研究に関してこれまで主としてわが国で蓄積された研究成果をテーマやキーワードごとに分類し,研究課題・文法項目別の情報検索を可能にするデータバンクを構築することを当初め目的とするものである.2年にわたる予備的研究の結果,スペイン語学研究の多くの問題は言語の地理的バリエーションを考慮することによって,スペイン語文法現象の本質をより正確に捉えることができるのではないかとの認識にいたった.本来のプロジェクトの目的からの逸脱を前提に,より学問的進展が望めると期待できる方向に軌道修正をすることになった.すなわち空間的・地理的パラメーターがどのように文法説明に関わっているのかを実地調査から得られたデータによって確かめ,それらを包括する方法論を追求する方向に研究の照準を合わせることにした.最終成果報告書ではこの目的で実施したスペインにおける現地フィールドワークから得られたデータおよび分析をまとめた.これまで言語現象を地理的観点から扱ったものは,主に音声,形態面での研究が中心であった.語彙のバリエーションについても先行研究は少なくない.日本を拠点とする世界的プロジェクト「VARILEX(スペイン語の語彙バリエーション)」(http://gamp.c.u-tokyo.ac.jp/ueda/varilex/index.html)などにより得られた成果もその一例である.しかしながら本プロジェクトが対象とするような「統語的・文法的」側面からの地理的バリエーション調査・研究はスペインを含めて類を見ない.本成果が文法研究に新たな視点,ベクトルを与え,ここに収められたデータや分析を出発点として,従来懸案となっているさまざまな個別の文法課題についてこれまでとは異なった角度から新たな成果が生まれることを期待する.最近20年に急速に蓄積されたわが国におけるスペイン語の言語学的研究の成果を検討し,これまで明らかになった事項と未解決事項をテーマ別に整理し,ついで未解決事項をスペインの研究者の協力を得てその最前線を探りつつ明示化させ,最終的に,今後の研究・教育の課題もしくは指針としてデータバンクの形で提示することが本研究の目的である.平成13年度はこの趣旨に合わせて,第1段階としてわが国のスペイン語学研究者のリストを作成,その論文,著作などの業績をテーマ別・キーワード別に整理し分類する作業に取り組んでいる.2度の会合をもち,作業分担,作業方法などの調整を行った.調査の現段階で約100名の研究者リストと1000近い研究著作リストを作成することができた.来年度以降,これらの著作を精査を通じてキーワードを抽出し,これによる検索システムを作成することを一つの課題とする.また第2の力点を非文の抽出に向ける方針を決めた.正しい文と非文との対比において文法研究・分析のための新たな視点が与えられるはずである.正文・非文のコーパス作成がもう一つの課題となる.このようなキーワードおよび正文・非文コーパスの中から得られる数項目の主要な文法課題については平成15年度において現地調査によって確認作業をする予定である.上記のスペイン語に関する研究・教育課題に対し理論ばかりではなく実際の使用、地域のバリエーションをも考慮してより明示的にデータバンクに盛り込めることを期している.本課題は概略,わが国のスペイン語学研究に関してこれまで主としてわが国で蓄積された研究成果をテーマやキーワードごとに分類し,研究課題・文法項目別の情報検索を可能にするデータバンクを構築することを当初め目的とするものである.2年にわたる予備的研究の結果,スペイン語学研究の多くの問題は言語の地理的バリエーションを考慮することによって,スペイン語文法現象の本質をより正確に捉えることができるのではないかとの認識にいたった.本来のプロジェクトの目的からの逸脱を前提に,より学問的進展が望めると期待できる方向に軌道修正をすることになった.すなわち空間的・地理的パラメーターがどのように文法説明に関わっているのかを実地調査から得られたデータによって確かめ,それらを包括する方法論を追求する方向に研究の照準を合わせることにした.最終成果報告書ではこの目的で実施したスペインにおける現地フィールドワークから得られたデータおよび分析をまとめた.これまで言語現象を地理的観点から扱ったものは,主に音声,形態面での研究が中心であった.語彙のバリエーションについても先行研究は少なくない.日本を拠点とする世界的プロジェクト「VARILEX(スペイン語の語彙バリエーション)」(http://gamp.c.u-tokyo.ac.jp/ueda/varilex/index.html)などにより得られた成果もその一例である.しかしながら本プロジェクトが対象とするような「統語的・文法的」側面からの地理的バリエーション調査・研究はスペインを含めて類を見ない.本成果が文法研究に新たな視点,ベクトルを与え,ここに収められたデータや分析を出発点として,従来懸案となっているさまざまな個別の文法課題についてこれまでとは異なった角度から新たな成果が生まれることを期待する.本研究の目的の一つは,我が国でこれまでに刊行・発表されてきたスペイン語言語学における既刊論文の著者、テーマ、使用データなどによる検索データバンク作成であるが,平成14年度は,研究代表者および分担者の既刊の業績をサンプルとしてコーパス化するための試みを行った.とくにスペイン語学習者が遭遇すると思われる文法および語法上の疑問点に対する回答となりうる可能性のある例(文)が検索できるような工夫を行ってきた.この試みをもとに,さらに主要な研究者の著作まで拡張し,コーパスを蓄積していくことになる.

このコーパスを利用してスペイン語学習者および研究者が具体的な疑問を解決したり,スペイン語の言語学研究への導入となることを最終的に目指している.さらに平成14年度は,平成15年に予定しているスペインにおける実地調査に向けての準備を部分的に行ったスペイン語学習者が疑問として抱くような文法、語法上の典型的な問題点を100程度の選択肢問題として準備した.今後実地調査までにこれを国内の若干名のインフォーマントで試行し,より効率よい問題形式へと洗練させていかねばならない.平成14年度は,また実地調査のための現地研究者ともコンタクトをとり始めた.現在までに,マドリード,セビリア,アンダルシアのさらに2地点オビエド,パンプローナ,バルセロナなどから調査協力を約束されている.今後,日程を調整し,被験者を大量に依頼する作業が残っている.このような文法課題の支柱となる理論的研究も各分担者の平成14年度の実績であることはいうまでもない.これについては添付の業績表を参照されたい.本課題は概略,わが国のスペイン語学研究に関してこれまで主としてわが国で蓄積された研究成果をテーマやキーワードごとに分類し,研究裸題・文法項目別の情報検索を可能にするデータバンクを構築することを当初の目的とするものである.2年にわたる予備的研究の結果,スペイン語学研究の多くの問題は言語の地理的バリエーションを考慮することによって,スペイン語文法現象の本質をより正確に捉えることができるのではないかとの認識にいたった.本来のプロジェクトの目的からの逸脱を前提に,より学問的進展が望めると期待できる方向に軌道修正をすることになった.すなわち空間的・地理的パラメーターがどのように文法説明に関わっているのかを実地調査から得られたデータによって確かめ,それらを包括する方法論を追求する方向に研究の照準を合わせることにした.最終成果報告書ではこの目的で実施したスペインにおける現地フィールドワークから得られたデータおよび分析をまとめた.これまで言語現象を地理的観点から扱ったものは,主に音声,形態面での研究が中心であった.語彙のバリエーションについても先行研究は少なくない.日本を拠点とする世界的プロジェクト「VARILEX(スペイン語の語彙バリエーション)」(http://gamp.c.u-tokyo.ac.jp/ueda/varilex/index.html)などにより得られた成果もその一例である.しかしながら本プロジェクトが対象とするような「統語的・文法的」側面からの地理的バリエーション調査・研究はスペインを含めて類を見ない.本成果が文法研究に新たな視点,ベクトルを与え,ここに収められたデータや分析を出発点として,従来懸案となっているさまざまな個別の文法課題についてこれまでとは異なった角度から新たな成果が生まれることを期待する.
市場化過程における保育労働とヴォイス・メカニズムの日・米・豪の国際比較研究

本研究は日本・アメリカ・オーストラリアを対象に、保育労働者の労働実態と発言(ヴォイス)メカニズムの比較を通じ、以下についての研究調査を遂行することを目的としている。本年は、第一に、保育分野への市場原理の適用過程と適用程度の相違からケアの市場化の多様性の現状把握を目的に、オーストラリア、アメリカの市場体制に関する歴史的経緯に関し、海外の文献を中心に検討を進めた。あわせて、労働社会学の視点からの「ケア労働」の分析枠組みの動向に関する文献サーベイを進めた。第二に、準市場概念に基づくサービス購入と契約関係のもとでの保育所における労働編成の現状と、労働組合運動あるいは組織化されたヴォイスの現状・影響力を焦点として、日本を中心に二つの点からアプローチした。まず男女雇用平等法制定運動を分水嶺とする日本の女性労働運動の再評価である。1950年代から現在までの代表的な女性ユニオンリーダーのインタビューと資料から、労働、生活、ケアにまつわる運動実践の特徴をとらえ、労働運動におけるケア・生活の傍流化過程に対抗する実践を後付けた。その成果は『労働運動を切り拓く』(共著)にまとめた。もうひとつは経済的社会的な困難が歴史的に蓄積されてきた地域における保育所の労働編成の現状からのアプローチである。保育サービスの市場化過程は90年代以降の新自由主義改革による家族生活の不安定化の過程と軌を一にしている。保育労働者、利用者、コミュニティからのヴォイスはナショナルな制度改革のもとで無効化され、現場の保育労働・保育実践が個別の防波堤になっていることをフィールドワークの分析から論じた。この成果を「貧困対策の蹴る保育の最低位に向けて」(『シリーズ子どもの貧困2・遊び・育ち・経験』所収)として発表した。家族が重篤な病状に陥り、退院後、集中的な在宅介護が必要となったため、その対応により、研究計画全体が遅れることとなった。まずは前年度の研究計画で不十分となった文献研究の検討を急ぎ、本年はオーストラリアを中心に現地調査及び情報収集を実施することを第1の目的とする。まず本年度前半に、より確実な調査設計に向けて、ケア・ケア労働をテーマとする国際研究会に参加し、オーストラリア、カナダの公共部門関連労組が提供する情報を収集するとともに、北米地域、オーストラリアでの研究動向を把握する。その知見とネットワークをもとに、調査設計を精緻化し、本年度後半に現地調査を実施する。これら研究、調査については、まず国内での発表を進め、次年度における海外報告へとつなげる。交通費、書籍等物品購入において、見積もりと実費との間で、若干のずれが生じたため。次年度使用額については当初予算において購入を見送った書籍の購入費として使用する計画である。
ラオスにおける科学教育研修成果の教員養成校への浸透・波及効果の研究

SMATTプロジェクトの波及効果として次の様に指摘できる。1.全国の多くのTTS/Cの授業においては板書中心の座学から生徒の理解を中心にした授業方式に変化している。2.授業では教科書の適正な使用と共に自作の教材の活用もなされている。3.TTS/Cの教官は小中学校の教員のために小研修会を企画し,講師として彼等の力量アップに貢献している。主要な目的は20042007年度にわたり、実施されたラオス教員養成機関における理数科教育研修(SMATT)の実施効果を教育省(MOS)と協力して現地の学校等で調査することである。今年度は4月より現地訪問調査のための調査項目を英語、ラオス語アンケート形式で準備し、9月7日9月17目に第1回訪問調査を行った。実施に先立ってMOS教員養成局長に研究の趣旨と全体計画についての説明を行い理解を得た。第1回目の調査は首都ビエンチャン市郊外のドンカムサン教員養成学校(TTS)を訪問して、校長、教員、生徒へのインタヴューとアンケート調査を行った。そして、研修生であった教員が新しく作成し、授業に活用している教材についての説明を受けた。数学、生物学教材をはじめ自発的に多様な教材が持続して作成されていることを確認した。また、この近くの小中学校をこの後、訪問し教員研修の状況を調べた。また、ビエンチャン市から50km程の距離があるバンクン教員養成短期大学(TTC)においてドンカムサンと同様な調査を行った。ここでは、授業が実施されていたので授業観察も行った。第2回訪問調査は3月2日-3月15日の期間にラオス北部のルアンナムタTTSを訪問し、行った。ここは中国、ミャンマーにも近く、また少数民族の多い地域であるので教育に特別に少数民族の教員を養成している。TTSでの教員、生徒へのインタビュー、アンケート調査、授業観察、近郊の小中学校訪問を行い教育の実情を調べた。現在、回収アンケート調査内容のラオス語から英語への翻訳作業を行っている。アフリカ・アジア地城において開発途上国への支援・協力活動で日本が当事国や国際的に期待されている日本が得意とする分野は基礎教育や理数科教育である。このよう状況の中でJICAを始め様々な機関,NGOがその教育の内容についての改善をプロジェクト活動で実現しようとしている。しかし,その活動量に比べその効果への評価の活動量が十分とは言えないのが現状であろう。特教育は本質的で基本的な援助・支援活動であり,地味であるのでその効果が顕蓍に見えにくいところがある。しかし,良い支援活動を強化し,展開するするためには研修会等の成果がどのように教充の現場に波及・浸透しているのかを見定める必要がある。この研究はにのために現地で実施した研修会活動の結果がどのように各学校現場で現れているのかを明らかにしようとしている。この年度の研究実施計画に沿って21年度は現は(ドンカムサンTTS,バンクンTTCそしてルアンナムタTTS等)での調査(調査期間:2008年9月2009年3月)結果を整理・検討した。実施調査は1)TTSとTTCにおける教員と生徒に対して行ったアンケート調査2)また,同様の対象へのインタビュー3)校長へのインタビュー4)教材等の成果物の調査5)授業観察等である。これ等の内容のデータを紙の媒体からパソコンに入力する作業を行った。更に,各調査項目とアンケート項目の表や図の作成をほぼ終了したところである。又,現地で撮影した写真記録の整理も行った。この調査はプロジェクト直後に行ったものでなく、以上SMATTプロジェクトから1年以上経過した後で実施されたものである。様々なプロジェクトの中でも教育関係の場合,直後の調査では結果が現れやすいが,時間の経過とともに効果が見えにくくなる。このことを考慮して時間経過をかれて得た調査結果が今回得られたものである。逆にあまりにも時間を経過した後の調査データは研修後の様々なプロジェクト以外の効果が反映してくる可能性がある。今回の調査時期はその点をみながら決めた。但し,3年近く経過した結果も見たいので今後の調査も予定している。今回整理した一部は日本教育実践学会や国際理数と技術教育学会で発表した。ラオス国教育省の要請で,約10年間試行も含めて主に現地で実施してきた理数科教育研修会(SMATT)の教員養成校等におけるその効果の浸透・波及効果を調査して,今年度で3年度目となる。このことから研修生であった教員の教員養成学校(TTC, TTS)での研修に基づく教育活動は一応なされていると考えることができる。この年度の研究計画に沿って3回目の現地での調査(調査期:2010年8月28日9月3日)を行った。調査場所は,首都ヴィエンチャン郊外にある3種の学校と市内の教育省教員養成局で行った。Tanhmixay地区にある私立小学校(Nakhoneheuang Sch.)はSMATTに参加した関係者が触発されて,これからのラオスに必要な学校を設立したものである。このことから,研修の波及効果をここに見ることができた。

また,この近くの国立ラオス大学教育学部附属小学校(ブンタン・ブンシャボン校長)も研修を受けた教員が指導している附属校でここでも研修の影響を調べた。更に,SMATTの研修効果が反映しないTanhmixay地区の公立中学校(ペッサラ・シンマウンサ校長)を比較のために訪問調査した。これ等3校では校長へのインタビューと児童・生徒への算数問題のテストを実施した。研修効果の調査結果に加えて,私立校,附属校,公立校それぞれの特徴を掴むことができて,ラオスの教育のおかれている現状やその問題点が明らかになってきた。最後の訪問は教育省教員養成局に最近新設された教師教育評価部門の副部長(SMATT研修のラオス側リーダーの一人)に会い,これまでの調査結果を示し,SMATT研修参加者の全員と全教員養成校による更なる教育改善を進めていくことを確認し,現状の問題点を明らかにした。これまでの調査結果の一部は『理科,数学と技術教育に関する国際会議(SMTE2010)』で発表し,また一部は審査付欧文論文としてまとめて国際誌に発表することができた。今後も更に調査結果をまとめて発表していく予定である。
膵β細胞の新生・増殖を標的とする新規糖尿病治療法を指向した細胞内脂質シグナル研究

これまでに、siRNA導入によりジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)δをノックダウン(KD)したβ細胞株MIN6B細胞を用いた解析により、BrdU取り込みの増加、及びcyclin B1の発現の増加を確認した。そこで、さらにその機序について解析を行った。β細胞では核内に局在するDGKδが抑制されると、核内にジアシルグリセロール(DAG)が蓄積することが予想される。そこで、DAGにより活性化されるプロテインキナーゼC(PKC)の関与を検討した。PKCの核内発現量を検討した結果、PKCαがcontrol細胞に比べてDGKδKD細胞で増加していることが示された。すなわち、DGKδ欠損により核内DAG量が増加し、PKCαの核移行が促進されることで、cyclin B1発現が増加する可能性が示された。一方、DGKδ抑制による糖尿病改善効果に関しては、これまでに、β細胞特異的DGKδ欠損マウスにストレプトゾトシン(STZ)を投与すると、投与60日目において、ヘテロ欠損マウスの随時血糖値がcontrolマウスと比べて有意に低値であることを示した。そこで、STZ投与11及び60日目のcontrolマウス、ヘテロ欠損マウス、ホモ欠損マウスを用いて更なる検討を行った。血清インスリン濃度及び膵臓インスリン含量を測定した結果、STZ投与11日目では3群間で差は認められなかったが、60日目ではヘテロ及びホモ欠損マウスにおける血清インスリン濃度及び膵臓インスリン含量がcontrolマウスと比べて有意に高値であった。すなわち、DGKδ欠損による血糖値の低下は膵臓由来のインスリンによることが示唆された。以上の結果から、β細胞におけるDGKδ発現の低下により、STZによる破壊後のβ細胞の回復が促進され、インスリン含量及び分泌量が増加して血糖値が改善する可能性が示された。飼養環境が原因と考えられるマウスの繁殖障害が生じており、膵β細胞特異的DGKδ欠損マウスの十分な出生数が得られず、研究計画に影響が出ている。こうした飼養状況であることから、誘導型β細胞特異的DGKδ欠損マウスの作製も遅れている。環境の改善に直ちに対応することは難しい状況であることから、in vivoでの検討については研究計画の見直しを考えている。一方、当初予定していたDGKδ欠損Sox9LacZ/+マウスの作製は、DGKδ欠損によりβ細胞の新生が誘発されることを示唆する結果が得られなかったことから、中止することとした。以上のように、in vivo検討は、当初の予定よりもかなり遅れている。一方、細胞レベルでの解析は順調に進んでおり、シグナル伝達系の解析を進めている。なお、MIN6B細胞のDGKδノックダウンにより、増殖に関与する因子の変化は確認できた一方、新生に関与する因子の変化は認められなかった。そこで、今後はDGKδ発現低下によるβ細胞の増殖を介した細胞量の増加の機序にターゲットを絞って、今後の解析を行っていく予定である。引き続き、DGKδ抑制により変化が認められるシグナル関連分子について詳細な解析を行う。特に、PKCαの関与が示唆されたことから、PKCαを介するシグナル伝達系に焦点を当てて解析を行う。さらに、当初は予定していなかった、増殖により増えたβ細胞の成熟度等の特性を評価する実験も開始した。STZ処置を施した膵β細胞特異的DGKδヘテロ欠損マウスでの検討により、DGKδ欠損はβ細胞の増殖を促進し、β細胞量を回復させ、血糖上昇を抑制することが示唆された。今年度は、この改善効果について更なる検討を行う。まず昨年度に引き続き、治療効果をより適切に評価するため、RIP-CreERマウスをDGKδ-loxPマウスと交配し、タモキシフェン投与によりDGKδ欠損が誘発されるマウスを作出して、ストレプトゾトシン投与によりβ細胞量を減少させた状態でタモキシフェンを投与してDGKδ発現を低下させた場合の効果を検証する。また、増殖したβ細胞が成熟β細胞であるかを、単離膵島を用いたインスリン分泌解析や成熟β細胞の分子マーカー(MafAなど)の免疫染色などにより確認する。また、DGKδ欠損マウス膵島ではcyclin B1の発現上昇が認められたことから、DGKδ欠損によるβ細胞量増加にcyclin B1が関与していることを検証するとともに、その上流シグナルについて解析する。DGKδKD MIN6B細胞での検討を行うことにより、DGKδ発現低下で変化するシグナル関連分子の同定を目指す。これまでの検討により、DGKδKD MIN6B細胞において、核内のPKCαが増加することを見出している。そこで、DGKδーPKCαーcyclin B1ーβ細胞増殖の連関を検証する。PKCα阻害薬やPKCαKD MIN6B細胞を用いることにより、cyclin B1の発現や細胞周期、増殖の変化をフローサイトメトリーやBrdU取り込み測定により評価する。関与が示唆された他の因子についても同様の検討を行い、β細胞量の増加を引き起こす細胞内シグナル伝達系を明らかにする。膵β細胞特異的ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)δ欠損(βDGKδKO)マウスではβ細胞量の増加が認められる。そこで本研究では、DGKδ抑制によるβ細胞増殖機序の解明、及びDGKδ抑制による糖尿病改善効果の検証を目的とした。初年度は、β細胞株MIN6B細胞を用いて、DGKδ発現抑制の影響を調べた。siRNA

導入によりDGKδをノックダウン(KD)したMIN6B細胞を用いたBrdU取り込み解析により、control細胞に比べてDGKδKD細胞では、約1.6倍のBrdU取り込み量の増加、及び細胞周期関連因子であるcyclin B1の全発現量及び核内発現量の有意な増加が認められた。すなわち、β細胞株においても、DGKδの抑制により増殖が亢進することが確認された。今後、この系を利用することで、さらにそのシグナル伝達系を解析していく。一方、DGKδ抑制による糖尿病改善効果の検証に関しては、streptozotocin(STZ)投与によりβ細胞を破壊する糖尿病モデルを利用して解析を行った。βDGKδKOマウス、heteroマウス、controlマウスにSTZを投与し、投与後11日目の随時血糖値が300 mg/dL以上のマウスを糖尿病発症として実験に供した。各マウス間で体重推移には差が見られなかったが、controlマウスが経日的に血糖値が上昇するのに対し、heteroマウスは20日目程度から血糖値上昇が見られなくなった。また、STZ投与60日目のheteroマウスでは、controlマウスと比べて、血清インスリン濃度、膵臓内インスリン含量、膵臓内β細胞量の有意な増加が認められた。なお、こうした変化は、STZ投与11日目では認められなかった。以上の結果から、β細胞におけるDGKδ発現の低下により、STZによるβ細胞破壊後の回復が促進され、血糖値が改善する可能性が示された。ほぼ計画通りに進んでおり、おおむね順調に進展している。ただし、βDGKδホモKOマウスの繁殖に関して問題が生じており、十分な出生数が得られておらず、検討が遅れている。また、βDGKδホモKOマウスでは、STZ投与により著しく体重が低下する個体が見られ、その原因を明らかにする必要が生じている。状況によっては、βDGKδホモKOマウスにおける検討に関しては、実験計画の見直しが必要かもしれない。一方、細胞レベルでの解析は順調に進んでおり、解析を行える系を確立することができたことから、既にシグナル伝達系の解析を進めている。ただし、β細胞株MIN6B細胞のDGKδノックダウンにより、増殖に関与する因子の変化は確認できている一方、新生に関与する因子の変化はまだ認められていない。さらなる検討を行っていきたい。なお、実験経費及び飼育スペースの問題により、当初予定していた誘導型βDGKδ-/-マウス作製、及びDGKδ欠損Sox9LacZ/+マウス作製はまだ開始できていない。前者は、平成30年度に開始する予定である。後者は、DGKδ欠損によりβ細胞の新生が誘発されることを示唆する結果がまだ得られていないことから、その結果を待って開始するか否かを決定する。これまでに、siRNA導入によりジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)δをノックダウン(KD)したβ細胞株MIN6B細胞を用いた解析により、BrdU取り込みの増加、及びcyclin B1の発現の増加を確認した。そこで、さらにその機序について解析を行った。β細胞では核内に局在するDGKδが抑制されると、核内にジアシルグリセロール(DAG)が蓄積することが予想される。そこで、DAGにより活性化されるプロテインキナーゼC(PKC)の関与を検討した。
3’-UTR異常によって破綻するPD-L1の転写後調節メカニズムの解明

様々な腫瘍において、PD-L1 3'-UTRの短縮・喪失する例が見出され、それらの異常によりPD-L1 mRNAの安定性が高まりタンパク発現も亢進することが明らかになっている(Kataoka et al. Nature 2016)。そこで、RNA結合タンパク(RBP)による転写後調節に着目してPD-L1高発現の機序について検討した。これまで実施したPD-L1 3'-UTR配列を約500 bpずつ5つのセグメントに分割したdeletion mutantを用いたレポーターアッセイにより、どのセグメントが転写後調節に重要であるか明らかにした。また、これらの3'-UTRを分割したセグメントそれぞれに対し結合するRBPを、mass spectrometryで網羅的に解析するiSRIM法を実施した。iSRIM法の結果より、PD-L1 3'-UTRの各セグメント及びハウスキーピング遺伝子であるβ-actinの3'-UTRに結合するRBPを比較することで、iSRIM法によってRBPが濃縮されていることを確認した。また、これらのPD-L1 3'-UTR特異的なRBP遺伝子のGene ontology(GO)解析を行うと、RNA結合のGOがエンリッチするだけでなく、最も3'-端に位置する第5セグメントに特徴的にmRNA 3'結合のGOがエンリッチすることも判明し、このこともRBPを正しく評価できていることを示唆した。これらのRBPのうち、PD-L1 3'-UTRの転写制御に関与している可能性が高い候補RBPを抽出した。候補タンパクのPD-L1発現量に対する寄与を評価するため、siRNAを用いたRBPのノックダウン実験を行い、PD-L1の発現量上昇をRQ-PCRにて評価し、候補の遺伝子を更に絞り込んだ。まず、iSRIM法で得られたデータの妥当性を検討することとした。そのために、PD-L1 3'-UTRの各セグメント及びハウスキーピング遺伝子であるβ-actinの3'-UTRに結合するRBPを比較した。まず、PD-L1の各セグメントに非特異的に結合するRBPは、β-actinの3'-UTRにも結合することが明らかになった。すなわち、これらのRBPは多くの遺伝子に対して非特異的に結合ことが示唆された。一方で、PD-L1 3'-UTRの第2・第5セグメントのみに特異的に結合するRBPは、β-actinの3'-UTRには結合しなかった。また、これらの特異的結合遺伝子のGO解析を行うと、RNA結合のGOがエンリッチすることも明らかになった。特に、最も3'-端に位置する第5セグメントに結合するRBPにはmRNA 3'結合のGOがエンリッチすることも判明した。このことにより、iSRIM法で同定された遺伝子の多くがRBPであることを確認した。また、PD-L1の各セグメント特異的に結合するRBPはPD-L1の転写後制御をspecificに制御している可能性が示唆された。これらの候補RBPの機能を確かめるために、siRNAと293T細胞株を用いて、候補遺伝子について網羅的にRQ-PCRにて評価することとした。各候補遺伝子のノックダウンにより、PD-L1のmRNA発現量は上がるものもあれば下がるものもあり、RBPによる転写後調節の存在を示唆した。また、スクリーニングの結果として、PD-L1のmRNAを負に制御しているRBPの候補を更に抽出できた。候補RBPを異なる系により吟味するため、siRNAによるノックダウンの他に、細胞株にてCRISPR/Cas9システムによる候補RBPのノックアウトを行ってPD-L1の発現量に与える影響を評価する。その後、RNA免疫沈降法やlocked nucleic acid (LNA)など、PD-L1 3'-UTRのmRNAと候補RBPとの相互作用を評価する。また、マウス移植モデルを用いて生体内でのRBPのPD-L1制御作用および免疫微小環境に与える影響を評価する。腫瘍細胞は、免疫チェックポイント分子であるPD-L1を発現することにより活性化T細胞を抑制し免疫を回避する。様々な腫瘍において、PD-L1 3'-UTRの短縮・喪失する例が見出され、それらの異常によりPD-L1 mRNAの安定性が高まりタンパク発現も亢進することが明らかになった。同機序によりin vivoでの免疫回避が生じることも明らかになり、これが腫瘍の増殖にとって重要であることが示された(Kataoka et al. Nature 2016)。RNA結合タンパク(RBP)による転写後調節に着目してPD-L1高発現の機序を明らかにするため、まずPD-L1 3'-UTRのどの部位が転写後調節に重要であるかという点について、(1)レポーターアッセイ(2)CRISPR/Cas9 saturation mutagenesisライブラリーの2つを用いて検討した。(1)について、様々なdeletion mutatntを用いて、500 bp程度の範囲で転写ご制御に重要な部位を決定した。(2)については、PD-L1 3'-UTRをコードするゲノム領域を網羅的に欠損させる手法(Canver et al. Nature 2015)を取り入れた。しかし単一のgRNAが細胞に導入できる数塩基規模のdeletionによる発現変化は、3'-UTR全体の欠失によるPD-L1発現量亢進に比べて小さいことが分かった。そのためライブラリの効果を精密に検出するのが困難であり、この系での評価は難しかった。そこで、(1)の結果を採用して次のステップに進むことにした。

RNA結合分子をmass spectrometryで網羅的に解析するiSRIM法を実施し、mRNAとRBPの結合を直接的かつunbiasedに評価した。(1)PD-L1 3'-UTR領域のdeletion mutantを用いたレポーターアッセイでは、PD-L1の転写後調節に重要である領域を500bp程度の範囲まで絞り込むことができた。この長さの領域まで絞り込むことで、次ステップであるiSRIM法によるスクリーニングが効率的に行えるようになった。(2)については、PD-L1 3'-UTR領域の数bp単位の欠失によるPD-L1発現変化(想定していた効果)に比して、数百から数千bp単位の構造異常による発現亢進(検出系にとってのノイズ)が大きかった。この想定外の結果により、本検出系でのPD-L1 3'-UTRの機能詳細は難しいと考えた。しかしながら、(1)レポーターアッセイによる絞り込みの結果を用いることで、iSRIM法を実施し、その結果を解釈をすることは十分に可能であると考えられ、計画に大きな遅滞を生じなかった。様々な腫瘍において、PD-L1 3'-UTRの短縮・喪失する例が見出され、それらの異常によりPD-L1 mRNAの安定性が高まりタンパク発現も亢進することが明らかになっている(Kataoka et al. Nature 2016)。そこで、RNA結合タンパク(RBP)による転写後調節に着目してPD-L1高発現の機序について検討した。これまで実施したPD-L1 3'-UTR配列を約500 bpずつ5つのセグメントに分割したdeletion mutantを用いたレポーターアッセイにより、どのセグメントが転写後調節に重要であるか明らかにした。また、これらの3'-UTRを分割したセグメントそれぞれに対し結合するRBPを、mass spectrometryで網羅的に解析するiSRIM法を実施した。iSRIM法の結果より、PD-L1 3'-UTRの各セグメント及びハウスキーピング遺伝子であるβ-actinの3'-UTRに結合するRBPを比較することで、iSRIM法によってRBPが濃縮されていることを確認した。また、これらのPD-L1 3'-UTR特異的なRBP遺伝子のGene ontology(GO)解析を行うと、RNA結合のGOがエンリッチするだけでなく、最も3'-端に位置する第5セグメントに特徴的にmRNA 3'結合のGOがエンリッチすることも判明し、このこともRBPを正しく評価できていることを示唆した。これらのRBPのうち、PD-L1 3'-UTRの転写制御に関与している可能性が高い候補RBPを抽出した。候補タンパクのPD-L1発現量に対する寄与を評価するため、siRNAを用いたRBPのノックダウン実験を行い、PD-L1の発現量上昇をRQ-PCRにて評価し、候補の遺伝子を更に絞り込んだ。まず、iSRIM法で得られたデータの妥当性を検討することとした。そのために、PD-L1 3'-UTRの各セグメント及びハウスキーピング遺伝子であるβ-actinの3'-UTRに結合するRBPを比較した。