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近赤外光による非侵襲的腫瘍内酸素濃度測定とその画像診断システムの開発研究

【目的】放射線治療の抵抗性因子として腫瘍内の低酸素性細胞がある.これをターゲットとした低酸素性細胞増感剤あるいはNicotinamide(NA)とCarbogen(95%O_2,5%CO_2)を併用した放射線治療の臨床試験が進行中である.これらの療法は低酸素性細胞が有意に存在する腫瘍に用いてこそ真の有用性が認められる.そこで我々は腫瘍内酸素濃度測定を目的として,近赤外レーザー光を用いた非侵襲的な腫瘍組織酸素代謝測定装置の導入を認めている.今回は3波長の近赤外光を用いた光CT法について報告する.【方法】腫瘍:8週令Ba1b/cマウス下腿部に移植したEMT6腫瘍および8週例C3H/Heマウス下腿部に移植したSCCVII腫瘍を用いた.腫瘍体積は約9002700mm^3.マウスはウレタン/クロラロースによる麻酔施行後腫瘍に測定装置を取り付けた.測定は(1)Air吸入下,(2)Carbogenガス吸入下,(3)ネンブタール過剰投与による屠殺後の3条件で行った.測定:腫瘍部に12本の光ファイバーを接触させ半導体レーザー,ストリークカメラを用いて時間ゲート法により各点の信号強度を測定し,CT画像を作成し,一方,時間分解曲線(TRS曲線)のfitting処理により吸収係数を求め酸化および還元ヘモグロビン(Hb),全Hb及び酸素飽和度を求めた.【結語・結論】酸素飽和度は腫瘍体積の増加と共に減少し,腫瘍が比較的小さい内はCarbogen吸入により酸素飽和度は有意に増加するが腫瘍が大きくなるとCarbogenの効果は減少した.腫瘍体積とHb量の変化との関係ではCarbogen吸入によるHb量の変化は腫瘍の大きさに関係なくばらばらであった.さらに腫瘍組織像と対比させて行ったデータ処理結果およびCT画像(酸素飽和度とHb量)から吸気酸素濃度の変化に対応した腫瘍内酸素飽和度の変化を認め,本法の病態生理学的有用性が示唆された.【目的】放射線治療の抵抗性因子として腫瘍内の低酸素性細胞がある.これをターゲットとした低酸素性細胞増感剤あるいはNicotinamide(NA)とCarbogen(95%O_2,5%CO_2)を併用した放射線治療の臨床試験が進行中である.これらの療法は低酸素性細胞が有意に存在する腫瘍に用いてこそ真の有用性が認められる.そこで我々は腫瘍内酸素濃度測定を目的として,近赤外レーザー光を用いた非侵襲的な腫瘍組織酸素代謝測定装置の導入を認めている.今回は3波長の近赤外光を用いた光CT法について報告する.【方法】腫瘍:8週令Ba1b/cマウス下腿部に移植したEMT6腫瘍および8週例C3H/Heマウス下腿部に移植したSCCVII腫瘍を用いた.腫瘍体積は約9002700mm^3.マウスはウレタン/クロラロースによる麻酔施行後腫瘍に測定装置を取り付けた.測定は(1)Air吸入下,(2)Carbogenガス吸入下,(3)ネンブタール過剰投与による屠殺後の3条件で行った.測定:腫瘍部に12本の光ファイバーを接触させ半導体レーザー,ストリークカメラを用いて時間ゲート法により各点の信号強度を測定し,CT画像を作成し,一方,時間分解曲線(TRS曲線)のfitting処理により吸収係数を求め酸化および還元ヘモグロビン(Hb),全Hb及び酸素飽和度を求めた.【結語・結論】酸素飽和度は腫瘍体積の増加と共に減少し,腫瘍が比較的小さい内はCarbogen吸入により酸素飽和度は有意に増加するが腫瘍が大きくなるとCarbogenの効果は減少した.腫瘍体積とHb量の変化との関係ではCarbogen吸入によるHb量の変化は腫瘍の大きさに関係なくばらばらであった.さらに腫瘍組織像と対比させて行ったデータ処理結果およびCT画像(酸素飽和度とHb量)から吸気酸素濃度の変化に対応した腫瘍内酸素飽和度の変化を認め,本法の病態生理学的有用性が示唆された.【目的】放射線治療の抵抗性因子として腫瘍内の低酵素性細胞がある.近年血管の閉塞により生じる一過性の低酸素性細胞(acutely hypoxic cells)にNicotinamide (NA)が有効であることが報告され,欧米ではこのNAにdiffusion-limited chronically hypoxic cellsに有効であるとされるCarbogen (95%O_2,5%CO_2)を併用した放射線治療の臨床試験が進行中である.腫瘍内酸素濃度は組織に微小酵素電極を刺入しポーラログラフィー法により測定されているが,このような侵襲的測定法の国内での普及性は乏しいと考える.そこで我々は,悲侵襲的な腫瘍組織酸素代謝測定を目的として近赤外レーザー光を用いた測定装置の導入を試みている.基礎実験としてマウスにおけるNA, Carbogen投与時の腫瘍内酸素代謝変化を本装置を用いて検討した.【方法】8週令C3H/Heマウスの下腿皮下にSCC VII腫瘍を移植し腫瘍径が約20mmのものを実験に用いた.NAは生理食塩水に溶解し腹腔内投与後、直ちに専用アクリル箱にマウスを固定し,島津無侵襲酸素モニタOMllAを腫瘍部に装着し3波長の近赤外レーザー光(780, 805, 830nm)を照射した.ガス吸入群ではアクリル箱にCarbogenガスを9l/minで流した.

3波長の透過光量より演算式にて酸素化ヘモグロビン(oxy-Hb),脱酸素化ヘモグロビン(deoxy-Hb),総ヘモグロビン(total-Hb)の量的変化を求めた.【結果】(1)Carbogen吸入に対する腫瘍内Hbの反応性:7例中5例でoxy-Hbの増加を示した.その内の4例で血液量(total-Hb)の増加を伴っていた.(2)NA投与に対する腫瘍内Hbの反応性:NA, 500mg/kgの投与後,3例全例で血液量の増加を示した.oxy-Hbは(↑)か(-)であった.NA, 1000mg/kgの投与では血液量,oxy-Hb共に増加は認められなかった.(3)NA投与1時間後に行われたCarbogen吸入に対する腫瘍内Hbの反応性:前投与されたNAの投与量に関係なく全例が血液量(total-Hb) (-), oxy-Hb(↑), deoxy-Hb(↓)のパターンを示した.【結論】NAあるいはCarbogenに対する腫瘍の反応は様々であったがNAとCar-bogenの両者併用では例外なく一定の腫瘍組織の酸素代謝変化が誘導された.放射線照射にNAあるいはCarbogenを併用する場合、2者併用の方が,はるかに大きな腫瘍細胞致死が得られることが動物実験で示されている.今回の結果が細胞致死効果とどう関連するのか否かは今後の研究課題である.【目的】放射線治療の抵抗性因子として腫瘍内の低酸素性細胞がある.これをターゲットとして低酸素性細胞増感剤或いはNicotinamide(NA)とCarbogen(95%O_2,5%C_2)を併用した放射線治療の臨床試験が進行中である.これらの療法は低酸素性細胞が有意に存在する腫瘍に用いてこそ真の有用性が認められる.そこで我々は腫瘍内酸素濃度測定を目的として近赤外レーザー光を用いた光侵襲的な腫瘍組織酸素代謝測定装置の導入を試みている.今回は3波長の近赤外光を用いた光CT法について報告する.【方法】腫瘍:8週令Balb/cマウス下腿部に移植したEMT6腫瘍および8週令C3H/Heマウス下腿部に移植したSCCVII腫瘍を用いた.腫瘍体積は約9002700mm^3.マウスはウレタン/クロラロースによる麻酔施行後腫瘍に測定装置を取り付けた.測定は(1)Air吸入下,(2)Carbogenガス吸入下,(3)ネンブタール過剰投与による屠殺後の3条件で行った.測定:腫瘍部に12本の光ファイバーを接触させ半導体レーザー,ストリークカメラを用いて時間ゲート法による各点の信号強度を測定し,CT画像を作成し,一方,時間分解曲線(TRS曲線)のfitting処理により吸収係数を求め酸化及び還元ヘモグロビン(Hb),全Hb及び酸素飽和度を求めた.【結果・結論】SCCVII腫瘍では5匹中3匹で,EMT6腫瘍では,5匹中4匹でCarbogenガス吸入により酸素飽和度の有意な増加が認められた.増加率はSCCVII腫瘍の方がEMT6腫瘍より高い傾向であった.吸気酸素濃度の変化に対応した腫瘍内酸素飽和度の変化を認め,本法の病態生理学的有用性が示唆された.【目的】放射線治療の抵抗性因子として腫瘍内の低酸素性細胞がある.
deltaNp63発現誘導による新規肺扁平上皮癌モデルの確立と癌発症機序の解明

【目的】本研究は、肺扁平上皮癌におけるdeltaNp63の役割を検討することを目的とした。【研究結果】TET/onシステムを用いた肺上皮特異的にdeltaNp63蛋白の発現を誘導するマウスを開発したが、解析に十分なdeltaNp63蛋白の発現を誘導するマウスを作製することができなかった。一方、発がん物質で誘発したマウス肺扁平上皮癌においてdeltaNp63陽性癌細胞は、腫瘍辺縁部において、腫瘍関連マクロファージとニッチを形成し、CD44v及びリン酸化Stat3蛋白の発現、及びEGF-EGFRシグナルを介して増殖し、肺正常組織への浸潤を行っている可能性が示唆された。肺特異的deltaNp63 inducible (iPDN63)マウスを用いてdeltaNp63蛋白発現の予備検討試験として、iPDN63マウスに1週間のドキシサイクリン0.2%飲水投与を行い、動物を剖検後、肺の病理組織学的解析を行った。deltaNp63及びpan p63抗体を用いた免疫組織化学染色の結果、肺上皮細胞において、十分なdeltaNp63蛋白の発現が認められなかった。この結果を踏まえて、投与経路の変更を行い、ドキシサイクリンの混餌投与(自由摂取)及び腹腔内投与(2mg/mouse,週2回)も合わせて検討を行ったが、免疫組織化学染色において十分なdeltaNp63蛋白の発現が認められなかった。これらの結果より本マウスはターゲット遺伝子の挿入部位になんらかの問題があり、deltaNp63蛋白発現を解析する上で十分なモデルでないと考えられた。現在は、iPDN63マウスの作製を再度行っている。一方、短期間のdeltaNp63蛋白の発現を検討するための代案として、肺におけるin vivo transfectionの系を構築した。pCAG-EGFPベクターを100 ug/mouseの容量で気管内投与後、針電極を用いエレクトロポレーションを行った後、48時間後に解剖を行った。肺を摘出後実体蛍光顕微鏡下で観察した結果、肺の電極穿刺部位におけるGFP発現を認めた。さらにGFP抗体を用いた組織評価の結果、穿刺部位周囲の細気管支上皮及び肺胞上皮におけるGFP発現を認めた。現在、同方法を用いてpTRE-3G Zsgreen1-Ires-deltaNp63コンストラクトのin vivo transfectionを行っている。本研究は肺上皮細胞特異的にdeltaNp63蛋白質の発現誘導を行うことで、肺上皮細胞における扁平上皮癌への発がん機構及び分化誘導について研究を行うことを目的とした。昨年度より引き続き行った肺特異的deltaNp63 inducible (iPDN63)マウスの作製では、再度作製したマウスにおいてもspc-rtTAマウスとの交配後、double transgenicマウスを作製し、Dox投与による肺でのdeltaNp63蛋白発現を検討した結果、deltaNp63の免疫染色における発現量を認めることができなかった。その原因として、Zsgreen1-Ires-deltaNp63コンストラクトのIres以降の発現が低下するためと考えられた。現在は再度コンストラクトを作製しなおしており、deltaNp63-Ires-mCherryの順番にすることで、in vitroにおける遺伝子導入の結果、mCherryの発現を観察することに成功した。現在、本ベクターを用いて再度トランスジェニックマウスの作製を行っている。さらに、昨年度から開発したin vivo transfectionの系においても、コンストラクトの問題が継続して起こり、in vivoでdeltaNp63及びZsgreen1の発現をIHC及びWBにて検討した結果、確認することが出来なかった。こちらも現在再度作製した上記コンストラクトを用いて実験を継続している。最後に肺発がん物質n-nitroso-tris-chloroethylureaを処置したマウス肺サンプルにおいて、誘発された扁平上皮化生から癌におけるp63陽性細胞についてCD44v蛋白の発現について検討した。その結果、扁平上皮化生の非常に早期から癌部にかけて、p63陽性細胞にCD44v蛋白の共局在が認められた。実験病理学作製したマウスにおけるdeltaNp63蛋白が十分な発現を示しておらず、現在再度マウスを作製している。代案として、spc-rtTAマウスの肺でin vivo transfectionを行い、検討用のプラスミドの肺への発現を認めている。現在、再度作製したマウス約90匹からターゲットコンストラクトが導入されたマウスが3匹とれている。現在、本マウスとspc-rtTAマウスとの交配を行い、F1マウスにおけるDox投与による肺でのdeltaNp63蛋白発現の確認を行う予定である。

合わせて、新たに開発したマウス肺でのin vivo transfectionの系を用いて、マウス作製の際に使用したプラスミドを気管内投与し、肺上皮におけるdeltaNp63発現による初期影響を検討する予定である。
カルシウム感知受容体による新たな内耳カルシウム調節機構の解明とその応用

本研究の端緒は、聴覚系は恒常性の維持のために様々なメカニズムが発達しているが、生理学的な重要性にもかかわらずCa2+の恒常性維持のメカニズムが十分解明されていないことに着目し、体液のCa2+濃度の恒常性維持にも利用されるCa2+センサーを用いたフィードバックメカニズムの候補を検討したところ、内耳でのCaSRの機能発現を示す知見を得た。その機能の詳細を検討する。
生体関節における多モード適応潤滑と自己組織化・修復機構の解明

超高齢化社会における関節症患者の急増を防ぐために,変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,関節の潤滑機構と変性・修復機構の関連を解明することを試みた.とくに,多モード適応潤滑機構の視点にたって関節摩擦面の損傷進行・修復を左右する吸着膜・ゲル膜形成における自己組織化現象や軟骨組織の圧縮ひずみ挙動に着目して,原子間力顕微鏡,共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡,全反射(エバネッセント)蛍光顕微鏡を駆使して系統的な観察研究を行った.代謝挙動を支配する軟骨細胞の力学的環境に対する応答を探求するために,新鮮な軟骨組織の圧縮試験や,軟骨表面の摩擦や透過性を考慮した軟骨モデルに対する3次元有限要素応力解析とともに,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験を実施した.軟骨組織用の圧縮試験機を開発し,固液二相体における応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動を観察し,細胞をマーカとして軟骨内部における局所ひずみの変化を観測した.また,有限要素解析により表面境界条件の影響を評価するとともに,弾性率の局所物性値を導入し試料の変形への影響を確認できた.生体軟骨の摩擦試験では,リン脂質や蛋白成分から構成される吸着膜およびプロテオグリカンから構成される表面層ゲル膜が低摩擦・低摩耗機能を有することを示した.混合吸着膜やゲル膜形成では,自己組織化が重要な役割を演じるものと推測され,LB(ラングミュア・ブロジェット)膜を作成し,潤滑液成分の最適組成による摩擦低減を確認するとともに,全反射顕微鏡により吸着状態の変化を観察できた.人工軟骨材料(PVAハイドロゲル)の往復動試験により関節液構成成分の有効性を探求した.とくにヒアルロン酸と蛋白成分の共存下で,アルブミンとγグロブリンの最適組成(1:2または2:1)時に最も良好な耐摩耗性を確認し,対応する吸着膜形成や脱離を蛍光観察動画により確認できた.超高齢化社会における関節症患者の急増を防ぐために,変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,関節の潤滑機構と変性・修復機構の関連を解明することを試みた.とくに,多モード適応潤滑機構の視点にたって関節摩擦面の損傷進行・修復を左右する吸着膜・ゲル膜形成における自己組織化現象や軟骨組織の圧縮ひずみ挙動に着目して,原子間力顕微鏡,共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡,全反射(エバネッセント)蛍光顕微鏡を駆使して系統的な観察研究を行った.代謝挙動を支配する軟骨細胞の力学的環境に対する応答を探求するために,新鮮な軟骨組織の圧縮試験や,軟骨表面の摩擦や透過性を考慮した軟骨モデルに対する3次元有限要素応力解析とともに,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験を実施した.軟骨組織用の圧縮試験機を開発し,固液二相体における応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動を観察し,細胞をマーカとして軟骨内部における局所ひずみの変化を観測した.また,有限要素解析により表面境界条件の影響を評価するとともに,弾性率の局所物性値を導入し試料の変形への影響を確認できた.生体軟骨の摩擦試験では,リン脂質や蛋白成分から構成される吸着膜およびプロテオグリカンから構成される表面層ゲル膜が低摩擦・低摩耗機能を有することを示した.混合吸着膜やゲル膜形成では,自己組織化が重要な役割を演じるものと推測され,LB(ラングミュア・ブロジェット)膜を作成し,潤滑液成分の最適組成による摩擦低減を確認するとともに,全反射顕微鏡により吸着状態の変化を観察できた.人工軟骨材料(PVAハイドロゲル)の往復動試験により関節液構成成分の有効性を探求した.とくにヒアルロン酸と蛋白成分の共存下で,アルブミンとγグロブリンの最適組成(1:2または2:1)時に最も良好な耐摩耗性を確認し,対応する吸着膜形成や脱離を蛍光観察動画により確認できた.超高齢化社会における関節症患者の急増を防ぐために,変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,関節の潤滑機構と変性・修復機構の関連を解明することを試みた.とくに,多モード適応潤滑機構の視点にたって関節摩擦面の損傷進行・修復を左右する吸着膜・ゲル膜形成における自己組織化現象や軟骨組織の圧縮ひずみ挙動に着目して,原子間力顕微鏡,共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡,新規購入の全反射(エバネッセント)蛍光顕微鏡を駆使して系統的な観察研究を行った.代謝挙動を支配する軟骨細胞の力学的環境に対する応答を探求するために,新鮮な軟骨組織の圧縮試験や,軟骨細胞の存在を考慮した軟骨モデルに対する3次元有限要素応力解析とともに,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験を実施した.軟骨組織用の圧縮試験機(マイクロ位置制御可能)を開発し,固液二相体における応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動を観察し,細胞をマーカとして軟骨内部における局所ひずみの変化を観測した.また,有限要素解析に基づき経時的挙動の機構を提案した.軟骨の弾性率については,原子間力顕微鏡による押込み試験により,各種の軟骨試料について評価を行った.生体軟骨の摩擦試験では,リン脂質や蛋白成分から構成される吸着膜およびプロテオグリカンから構成される表面層ゲル膜が低摩擦・低摩耗機能を有することを示した.混合吸着膜やゲル膜形成では,自己組織化が重要な役割を演じるものと推測され,各種のLB(ラングミュア・ブロジェット)膜を作成し,評価を試みている.人工軟骨材料(PVAハイドロゲル)の往復動試験により関節液構成成分の有効性を探求した.

とくにヒアルロン酸と蛋白成分の共存下で,とくに,アルブミンとγグロブリンの最適組成(1:2または2:1)時が最も良好な耐摩耗性を示したことより,自己組織化と潤滑性との関連を総合的に考察した.超高齢化社会における関節症患者の急増を防ぐために,変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,関節の潤滑機構と変性・修復機構の関連を解明することを試みた.とくに,多モード適応潤滑機構の視点にたって関節摩擦面の損傷進行・修復を左右する吸着膜・ゲル膜形成における自己組織化現象や軟骨組織の圧縮ひずみ挙動に着目して,原子間力顕微鏡,共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡,全反射(エバネッセント)蛍光顕微鏡を駆使して系統的な観察研究を行った.代謝挙動を支配する軟骨細胞の力学的環境に対する応答を探求するために,新鮮な軟骨組織の圧縮試験や,軟骨表面の摩擦や透過性を考慮した軟骨モデルに対する3次元有限要素応力解析とともに,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験を実施した.軟骨組織用の圧縮試験機(マイクロ位置制御可能)を開発し,固液二相体における応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動を観察し,細胞をマーカとして軟骨内部における局所ひずみの変化を観測した.また,有限要素解析に基づき表面状態の影響を評価できた.生体軟骨の摩擦試験では,リン脂質や蛋白成分から構成される吸着膜およびプロテオグリカンから構成される表面層ゲル膜が低摩擦・低摩耗機能を有することを示した.混合吸着膜やゲル膜形成では,自己組織化が重要な役割を演じるものと推測され,各種のLB(ラングミュア・ブロジェット)膜を作成し,摩擦低減を確認するとともに,全反射顕微鏡により吸着状態の変化を観察できた.人工軟骨材料(PVAハイドロゲル)の往復動試験により関節液構成成分の有効性を探求した.とくにヒアルロン酸と蛋白成分の共存下で,とくに,アルブミンとγグロブリンの最適組成(1:2または2:1)時に最も良好な耐摩耗性を確認し,対応する自己組織化を蛍光観察により確認できた.超高齢化社会における関節症患者の急増を防ぐために,変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,関節の潤滑機構と変性・修復機構の関連を解明することを試みた.とくに,多モード適応潤滑機構の視点にたって関節摩擦面の損傷進行・修復を左右する吸着膜・ゲル膜形成における自己組織化現象や軟骨組織の圧縮ひずみ挙動に着目して,原子間力顕微鏡,共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡,全反射(エバネッセント)蛍光顕微鏡を駆使して系統的な観察研究を行った.代謝挙動を支配する軟骨細胞の力学的環境に対する応答を探求するために,新鮮な軟骨組織の圧縮試験や,軟骨表面の摩擦や透過性を考慮した軟骨モデルに対する3次元有限要素応力解析とともに,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験を実施した.軟骨組織用の圧縮試験機を開発し,固液二相体における応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動を観察し,細胞をマーカとして軟骨内部における局所ひずみの変化を観測した.また,有限要素解析により表面境界条件の影響を評価するとともに,弾性率の局所物性値を導入し試料の変形への影響を確認できた.生体軟骨の摩擦試験では,リン脂質や蛋白成分から構成される吸着膜およびプロテオグリカンから構成される表面層ゲル膜が低摩擦・低摩耗機能を有することを示した.混合吸着膜やゲル膜形成では,自己組織化が重要な役割を演じるものと推測され,各種のLB(ラングミュア・ブロジェット)膜を作成し,摩擦低減を確認するとともに,全反射顕微鏡により吸着状態の変化を観察できた.
プロセッサ・メモリ融合ユニット高密度分散配置型新アーキテクチャ・マイクロプロセッサ

従来のノイマン型マイクロプロセッサとは構造がまったく異なる,“演算ユニット・メモリ一体分布型ニューハードウェア"により,しなやかで,かつ瞬時応答性を兼ね備えた知能集積回路を実現するための要素技術に関して研究を実施した。“やわらかい論理回路"(Flexware)からなる論理演算機能にメモリ機能を付与したユニットを分散配置し,機能的にネットワークを構成することにより,ボトルネックの無い理想的なデータフローが実現でき,瞬時応答性が実現できる。実時間で機能可能なFlexwareは,高機能4端子デバイスのνMOSを用いることにより,非常に少ない素子数が実現できた。超高速のチップ動作のためのセルフタイミング機構も,νMOSにより簡単に実現できた。クロック制御のフローティングゲートスイッチを付加したνMOS回路形式により,演算精度と信頼性が向上した。さらに,フローティングゲートレベルでの減算機構が実現できた。この技術は,スイッチトキャパイタ技術と,νMOS技術を融合させた新しい回路技術である。センスアンプ技術を応用することにより,νMOS回路の低消費電力化が実現できた。以上の技術を集結することにより,極低消費電力のA/D変換器と非常に高速な乗算器を実現した。試作した4ビット一括加算A/D変換器は,6MS/sの変換速度で1.2mWしか消費せず,従来形式の1/10以下の低消費電力化が実現された。また,一括加算原理を用いた64ビット乗算器は,3nsのスループットで動作可能であることがシミュレーションにより明らかになった。また,これらの高機能νMOS回路を実現するために必要なデバイス製造プロセスの精度に関して考察し,要求精度として提示した。50値多重化を実現するためには,主要デバイスパラメータを数パーセントの精度に保たなければならないことが明らかになった。平成6年度は,主にプロセッサ・メモリ融合ユニット単体の開発を行った。ニューロンMOSトランジスタのフローティングゲートにクロック制御スイッチを付加して構成する基本演算部に関しては,スイッチの付加により素子の閾値ばらつき等がキャンセルされ演算精度が向上することを確認した。さらに,このとき演算精度を制限するのがスイッチの制御信号に付随するクロックフィールドスルーであることをシミュレーション等により明らかにした。なお,クロック制御スイッチを設けたニューロンMOS基本論理演算回路に関しては,東北大学スーパークリーンルーム棟における2層ポリシリコン標準CMOSプロセスを用いたテストチップの試作や,ブレッドボードテスト回路により,XOR論理回路,実時間ルール可変データマッチング回路等を実現し,測定・解析を通して基本動作を確認した。基本論理演算回路で必須のメモリ機能に関しては,従来のラッチ回路をそのままニューロンMOS演算部に付加する形式と,ニューロンMOS演算部自身がラッチ機能を持った新しい形式の2通りについて検討を行った。後者の新形式は,制御が若干複雑になる反面,演算・記憶機能とも定常的な電力消費を全く必要としないため,回路の消費電力を激減できることをシュミレーションにより確認しており,本研究の新アーキテクチャマイクロプロセッサチップ中で高密度に分散配置されるプロセッサ・メモリ融合ユニットの基本回路形式として非常に有望であることを明らかにしている。プロセッサ・メモリ融合ユニット単体の構成に関して,前年度に引き続き検討を進めた。ニューロンMOSトランジスタのフローティングゲートにスイッチを設けて演算の精度を高めると共に,演算部自身にデータラッチ機能を持ち,消費電力低減も可能な,新しいセンスアンプニューロンMOS回路形式に関して試作検討を実施した。3μmルールのCMOSプロセスで試作を行ったが,ニューロンMOSのフローティングゲート電位の10mV以下の変位を正確に判断できることが実証された。これは,ニューロンMOSが,フローティングゲート上で50値以上の多値レベルを扱うことができる事に相当し,ニューロンMOSによる演算の多様性を格段に向上できることが分かった。新しい演算回路の消費電力低減効果を実証するために,センスアンプニューロンMOS回路技術を用いてA/D変換器を設計し,試作チップを作製して検討を行った。試作した4bit一括

A/D変換器は,6MS/sの変換速度で1.2mWの電力しか消費せず,従来方式に比べて1/10以下の低消費電力化が可能であることが実証された。これらの技術を用いることによって,プロセッサ・メモリ融合ユニット高密度分散配置型の新アーキテクチャのための高精度低消費電力基本ユニットの回路形式が確定した。ニューロンMOSによる演算においては,フローティングゲート上で多値電圧レベルを切り分けることがその原理であるため,切り分けできる多値レベルの数が大きくなればなるほど,基本ユニット当たりに実現できる機能が高くなる。そこで,より多くの多値レベルを切り分けるために,デバイス製造プロセスに要求される精度に関して検討を行った。50値を切り分けるためには,ゲート電極加工寸法や酸化膜厚等の主要パラメータに2%以下の精度が要求される事を明らかにした。以上の研究により,大規模なマイクロプロセッサを開発するための基礎技術が確立できた。今後は,分散配置したプロセッサ・メモリ融合ユニットを有機的に結び付けるためのアーキテクチャ,さらに有効に動作させるためのプログラム体系に関してより一層の研究を進めることが必要である。
福井の気象災害の教材化と学習プログラムの開発

1研究目的(1)福井の気象災害を教材化した学習プログラムを開発し,環境教育カリキュラムとして位置づける。(2)学習プログラム「福井の気象災害の科学」を活用することで,地域の自然や然災害に対する科学的な見方や考え方を育てるとともに,災害に対する備えや奉仕の精神を培うようにする。2研究方法(1)気象災害に対する生徒の認識を調べるために,アンケート調査を行う。(2)福井の気象災害を教材化した学習プログラム「気象災害の科学」を開発する。(30のプログラム開発)(3)福井の気象災害を教材化した学習プログラムを環境教育として位置づけ,実践する。理科3年「自然と人間」・福井豪雨,豪雪,福井地震などの福井の気象災害を科学的に分析し,気象災害の要因やメカニズムを考え,自然災害の驚異と対策の在り方を考える。2年「天気の変化」・天気図,気象衛星のシミュレーション画像や実験から,福井豪雨や豪雪の原因となった前線,気圧配置とそのメカニズムを探る。1年「大地の変化」・地震計の記録を分析し,地震発生のメカニズムを知る。道徳社会奉仕活動・ボランティア活動に参加した方々のインタビューを教材化し,社会奉仕活動の重要性を認識する。特別活動避難訓練マニュアル・福井の気象災害に対して,私たちはどのような備えと準備が必要なのかを討論しあう。(4)実践後の事後評価を行い,学習プログラムの有効性を分析する。(5)学習プログラム「気象災害の科学」を製本するとともに,デジタルコンテンツにし,教育活動で活用できるように理科室に設置する。成果と課題福井豪雨,56豪雪,福井地震など郷土の自然災害を中心に「気象災害の科学」として製本し,福井の気象災害を教材化することができた。それに,製本と共に30の学習プログラムも開発し,教育実践することができた。実践後の事後評価によると、防災教育の必要性、国土の保全、地球環境の保護、地域の愛着度などの内容で認識と意識の高まりがみられた。また、気象災害の発生のしくみ、理科学習への興昧・関心など、科学学習に関する内容でも有用感を高めることができた。
イネ籾殻におけるシリカ集積と熱変換処理による籾殻灰の高度化利用

イネの籾殻はコメに付随して毎年確実に生産されるバイオマス資源であるが、重量比で20%もの植物シリカが問題となる。本研究では籾殻の有効利用のため、その基本構造を解明した。化学成分処理としては、脱リグニン・脱多糖類の細胞壁形態を観察し、またフッ化水素(脱シリカ)を走査電顕して詳細に検討した。細胞壁-シリカの形態を精査したところ、数次の規則正しい多層構造が解析された。具体的には数ミリメータの複雑な組織構造、ミクロな蜘蛛状かつ縫合状の複雑な湾入構造、細胞壁実体と表層のシリカとのミクロなサンドイッチ構造、そしてシリカの数ナノメータの超多孔構造まで詳細に解析できた。籾殻の利用については、籾殻表面のクチクラ層を簡単な熱処理(ロースト処理)で除去することにより籾殻の活性を向上できた。籾殻の灰の利用については、籾殻から燃焼エネルギーを回収できると同時に、広くCO2環境に有効であるが、籾殻の灰(結晶質シリカへの懸念)が二次公害を引き起こすこともある。そこで、新規セラミック焼成の機能化を実現した。多孔性の粉末から操作性のよい粒状化へと、製品の作業性が改善できた。燃焼後には微量の炭化により、多孔性(空隙性)や強度、またカーボン表面の物性が向上した。これらは多孔性の環境保全材料として、琵琶湖などのヨシの育成、磯焼けの防止としての青さの育成、汚水浄化、道路・建築面での打ち水効果として利用できた。一方、酸による前処理と低温焼成により非晶質の純粋シリカからなる白色灰を作製することに成功した。化粧品や化成品としての応用が期待できる。また研究目的に応じて、セラミックに加工できた。本研究では1:シリカで覆われたイネ籾殻自体の基本構造の解明、2:籾殻灰の微細な多孔性を演出する立体的ナノ構造の創出、3:製品開発のための標準籾殻灰の選定と入手、4:植物・微生物培養基材の試作、の4段階で研究を進めたので、各々の成果を順に示す。1:日本産イネ籾殻(ジャポニカ種)を育成し、籾殻の発達過程とシリカ堆積を経時的に追跡調査した。そして籾殻組織の基本構造が開花直後に整えられ、種子よりも短期間で成熟することをたしかめた。とくに焼成時の温度・酸素供給・時間により薄いガラス状籾殻のシリカ層に30ナノメートル程度の細孔を発見した。これを含めて籾殻由来の各種原料の形態および物性を解析して、ナノポア構造がバイオリアクター機能に大きく影響することを見いだした。そして焼成条件の調製で100ナノの細孔を穿つことに成功し、籾殻焼却灰の化学反応性を向上させた。3:燻炭は別として籾殻の焼却灰は国内では生産されていない。そこでタイ国の精米工場など、インディカ種の籾殻灰生産状況を現地調査し、シリカとカーボンの含有量や形状から臨海地の特定のプラントで生産された籾殻灰を標準籾殻灰として選定した。そしてこれを約10トン購入し、成形加工する段取りを整えた。この標準試料は籾殻灰からの環境修復材料の試作に使用し、また国内での籾殻灰供給のプラント設計のたたき台とする。4:国内での籾殻灰生産には大量消費が必須となる。

そこで籾殻灰を主原料とし、大量に消費するする製品開発について、セラミックの高温焼成に加えて、セメントや石膏、また生分解性プラスチックを用いた安価な湿式成形に着手した。そしてヨシなどの湿性植物の苗の入手や育成場所を整備した。イネ科植物であるモウソウチク(Phyllostachys pubescens)を用いて、シリカの形成過程を調べた。2005年4月から9月にわたり定期的にモウソウチクの稈を採取し、無酸素条件化で過熱して炭化させ、走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。稈の表皮には直径10μm程度の画鋲状あるいは円錐状の構造物が観察された。表皮細胞は上下に並ぶように配列しているが、画鋲状あるいは円錐状の構造物は上下に並ぶ表皮細胞間の細胞間隙に分布していた。この構造物の元素分析を行うと、ケイ素が検出された。したがって、この構造体はシリカでできているものと思われる。画鋲状あるいは円錐状のシリカは地上稈や地下茎に存在し、地上稈においては高さに関係なく存在した。一節間内においては、上部の節の直下でシリカの密度が高かったが、それ以外の部分ではほぼ同じ密度で存在した。タケノコの段階でのシリカの集積状況も、同様の方法で調べた。シリカはタケノコの段階でもいずれの稈の表皮に存在しており、大きさも成熟した稈表皮のものとほぼ同じであった。このことは、シリカの集積が稈の成長段階の極めて早い時期から起こっていることを示している。比較のためにタケ亜科から5種、イネ科多年生草本数種の試料を得て、同様の方法でそれらの表皮を観察した。その結果、すべての試料でモウソウチクと同様に画鋲状あるいは円錐状のシリカが観察された。そのため、このシリカはイネ科植物の一般的な特徴と推察された。今後は、イネ科植物におけるシリカの集積メカニズムを調べ、あわせてシリカの利用法に関し研究を進めていく予定である。イネの籾殻はコメに付随して毎年確実に生産されるバイオマス資源であるが、重量比で20%もの植物シリカが問題となる。籾殻から燃焼エネルギーを回収できると同時に、広くCO2環境に有効であるが、非常には嵩張る籾殻の灰(粉末や非晶質シリカへの懸念)が二次公害を引き起こすこともある。そこで嵩張ったシリカの原因と、新規に比較的低温度でのセラミック焼成に活用できた。(1)籾殻を出発として、まず籾殻表面のクチクラ層を簡単な熱処理(ロースト処理)で除去できた。目的に応じて籾殻の活性が向上できた。(2)化学成分処理としては、脱リグニン・脱多糖類の細胞壁形態を観察し、またフッ化水素(脱シリカ)を走査電顕して詳細に検討した。(3)細胞壁-シリカの形態を精査したところ、数次の規則正しい多層構造が解析された。具体的には数ミリメータの複雑な組織構造、ミクロな蜘蛛状かつ縫合状の複雑な湾入構造、細胞壁実体と表層のシリカとのミクロなサンドイッチ構造、そしてシリカの数ナノメータの超多孔構造まで詳細に解析できた。(4)籾殻の灰の利用については、新規セラミック焼成の機能化を実現した。多孔性の粉末から操作性のよい粒状化へと、製品の作業性が改善できた。(5)燃焼後には微量の炭化により、多孔性(空隙性)や強度、またカーボン表面の物性が向上した。(6)一方、白色の純粋シリカも調整できた。化成品としての応用が期待できる。また研究目的に応じて、セラミックに加工できた。(7)多孔性の環境保全材料として、琵琶湖などのヨシの育成、磯焼けの防止としての青さの育成、汚水浄化、道路・建築面での打ち水効果などに取り組んでいる。
天然セルロース崩壊能をもつ新規エンドグリカナーゼの生産と作用機構

Aspergillus ficum No.9の〓培養から調製した粗酵素を, DEAE-Sephadex A-50カラムで分画し, CMCを分解せずアビセル及びセロオリゴ糖を糖化する画分及びCMCとアビセルを分解せずセロオリゴ糖を糖化する画分とを分取し,次いでSephacryl.s-300カラムで電気泳動的に単一と認められるまで精製し,それぞれセロビオヒドラーゼC1及びセロビオヒドラーゼCxと名づけた.セロビオヒドラーゼC1は分子量が128,000,至適温度50°C,至適pH5.0で,アビセルに吸着能を示した.セロビオヒドラーゼCxは低分子量(50,000)で,アビセルに対し吸着能及び分解能を示さなかった.しかし,両酵素は免疫的に相同性を示した.精製された二種のセロビオヒドラーゼ(IとII)を用いて,セロトリオース,セロテトラオース,セロペンタオース及びセロヘキサオースに作用させ,その産物を高速液体クロマトグラフィーによって経時的に定量した.その結果,両セロビオヒドラーゼともexo型作用を示した.また,セロビオヒドラーゼIでセロトリオース及びセロペンタオースに作用させたところ,中間産物,セロテトラオースが検出されたので,セロビオヒドラーゼIはグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することを示した.また,セロビオヒドラーゼIはNaBH4によって還元されたセロトリオースに作用したとき,中間産物セロテトラオースが見い出されなかった.これによりセロビオヒドラーゼIはグルコースを転移するのに還元末端を必要としている.両セロビオヒドラーゼは非還元末端からセルロースを厳密にセロビオース単位に切ることが明確となった.N-ブロモクシイミドでセロビオヒドラーゼIを酸化したところ,セロビオヒドラーゼIのアビセラーゼ活性は失活したが,アビセルに対する吸着能は残っていた.その結果,セロビオヒドラーゼIには糸状菌アミラーゼと同様に,アビセルに対する親和部位と活性部位が共存することが示唆された.Aspergillus ficum No.9の〓培養から調製した粗酵素を, DEAE-Sephadex A-50カラムで分画し, CMCを分解せずアビセル及びセロオリゴ糖を糖化する画分及びCMCとアビセルを分解せずセロオリゴ糖を糖化する画分とを分取し,次いでSephacryl.s-300カラムで電気泳動的に単一と認められるまで精製し,それぞれセロビオヒドラーゼC1及びセロビオヒドラーゼCxと名づけた.セロビオヒドラーゼC1は分子量が128,000,至適温度50°C,至適pH5.0で,アビセルに吸着能を示した.セロビオヒドラーゼCxは低分子量(50,000)で,アビセルに対し吸着能及び分解能を示さなかった.しかし,両酵素は免疫的に相同性を示した.精製された二種のセロビオヒドラーゼ(IとII)を用いて,セロトリオース,セロテトラオース,セロペンタオース及びセロヘキサオースに作用させ,その産物を高速液体クロマトグラフィーによって経時的に定量した.その結果,両セロビオヒドラーゼともexo型作用を示した.また,セロビオヒドラーゼIでセロトリオース及びセロペンタオースに作用させたところ,中間産物,セロテトラオースが検出されたので,セロビオヒドラーゼIはグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することを示した.また,セロビオヒドラーゼIはNaBH4によって還元されたセロトリオースに作用したとき,中間産物セロテトラオースが見い出されなかった.これによりセロビオヒドラーゼIはグルコースを転移するのに還元末端を必要としている.両セロビオヒドラーゼは非還元末端からセルロースを厳密にセロビオース単位に切ることが明確となった.N-ブロモクシイミドでセロビオヒドラーゼIを酸化したところ,セロビオヒドラーゼIのアビセラーゼ活性は失活したが,アビセルに対する吸着能は残っていた.その結果,セロビオヒドラーゼIには糸状菌アミラーゼと同様に,アビセルに対する親和部位と活性部位が共存することが示唆された.既往のすべてのエンドグルカナーゼは、微結晶構造をもつ天然セルロースに対し、分解能及び吸着能を示さない。本研究は、α-アミラーゼの生澱澱分解機構に関する知見に基づき、アビセル分解能及び同吸着能を有するエンドグルカナーゼの存在を予見して、自然界から多数のセルラーゼ産生菌を分離検索し、プロテアーゼ低産生変異株を育成して、強力なアビセル崩壊能を有する親規なエンドグルカナーゼを見出し、その特性を決定し、糸状菌エンドグルカナーゼがアビセル崩壊能及び同吸着能の有無によって、【C_1】及びCxに二大別されることを明らかにし、次いで強力な天然セルロース分解能をもつ酵素製剤の調製に及んだものである。1.高温糸状菌Humicola grisea var.thermoidea YH-78のプロテアーゼ低産生変異株No.140は、アビセル崩壊能を示すが還元糖を生成しない、分子量128,000のエンドグルカナーゼ【C_1】を産生した。一方、同菌株のプロテアーゼ高産生変異株No.191は、アビセル崩壊能及び同吸着能を示さない分子量63,000の従来型エンドグルカナーゼCxを産生した。両酵素ともCMCase活性を示した。つまり、糸状菌エンドグルカナーゼは【C_1】とCxに二大別された。

2.Geotrichum sp.は、著量のエンドグルカナーゼ【C_1】(分子量117,000)と少量のCx(分子量57,000)を産生した。【C_1】はプロテアーゼの作用によりアビセル吸着能を有する低分子のグリコペプチドを遊離して、Cxへと変換した。つまり、【C_1】には基質親和部位の存在が推定された。この親和部位の有無によって、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドラーゼをそれぞれ二つのグループに分ける新分類体系を呈示した。3.エンドグルカナーゼ【C_1】とセロビオヒドラーゼ【C_1】を混合して、強力な酵素製剤を調製し、好結果を得た。
スマートパーティクルセンシングデバイスの開発

大気中の浮遊粒子状物質(SPM)について水晶振動子を利用した微量天秤測定手法(QCM)を応用して、特別な付加装置を使用することなくSPMを電極表面へ付着させるリアルタイム計測手法を開発した。SPMが付着しやすい高分子膜を検討し、プラズマ重合膜などの利用が可能であることを明らかにした。また、これらの素子を活用して、有効な測定流量と測定時間の関係を明らかにした。吸着したSPMを走査型電子顕微鏡での表面観察とエネルギー分散型X線分析による組成分析で特性を明らかにした。大気中の浮遊粒子状物質(SPM)、特にPM2.5などについて水晶振動子を利用した微量天秤測定手法(QCM)を応用して、特別な付加装置を使用することなくSPMを電極表面へ付着させるリアルタイム計測手法の検討を行った。今年度は、引き続きSPMが付着しやすい高分子膜の作成とその評価を行った。検知膜を成膜するベースとなる電極金属の種類の違いによっても成膜が異なることから、金電極以外の各種電極を利用しプラズマ重合やディップ法、スピンコート法などで作成して吸着検知特性を求めた。今年度は2,3,4,5,6-ペンタフルオロスチレン膜を中心に試験を行った。その結果、昨年度実施したポリテトラフルオロエチレン膜との差はあまりなく、プラズマ重合膜の有効性が示された。この2,3,4,5,6-ペンタフルオロスチレン膜もエタノール、アセトンなどのVOCに対する検知感度は比較的小さく、湿度に対する影響も比較的小さいことが分かった。これらの結果をもとに、SPMが多い作業環境に自然通気状態で一定期間放置し、その吸着特性について調査を始めている。SPM測定では測定流量が重要な要素となっている。一般的には500ml1000ml/minが主である。このようにサンプル量が多い場合は問題ないものの、少ないサンプルの場合は課題が考えられるため、測定流量が少ない場合の吸着特性についても検討を行った、その結果、500ml以下では吸着量がかなり少なく、QCM検知が難しいことが示された。測定に利用しているガスセルは、従来のパーティクル測定用のものをQCMで使用できるように改造したものであることから、通気上の流路特性が異なっている可能性もあるため、この点を中心に調査検討する必要がある。大気中の浮遊粒子状物質(SPM)、特に「PM2.5」などについて水晶振動子を利用した微量天秤測定手法(QCM)の応用を行い特別な付加装置を使用することなくSPMを電極表面へ付着させるリアルタイム計測手法の検討を行った。今年度は、SPMが付着しやすい高分子膜の作成とその評価を行った。SPMが吸着しやすい高分子薄膜をプラズマ重合やスピンコート法などで作成して成膜条件を求めた。膜厚が厚くなるほど吸着表面積が大きくなるが、湿度に対する影響も大きくなるため、約10000ng程度(ポリテトラフルオロエチレン)が本条件では最適であることを明らかにした。エタノール、アセトンなどのVOCに対する検知感度は小さく、湿度に対する影響も小さいことが分かった。測定流量に対する影響も小さかった。走査型電子顕微鏡(SEM)での表面観察の結果、小さな凸凹はあるが全体を見ると比較的フラットな形状が確認された。この他に、スピンコート法による成膜も同様な特性であった。この結果から標準的なSPM試料(中心粒径4.754μm:90%)を利用してQCM検知特性を求めた。試料を単独で発生させた実験では、SPMの付着によって生じる周波数変化は、発生量と正の相関関係を明らかにした。表面に付着したSPMをSEMで観察した結果、2.5μm程度以下の粒子も付着しており、本測定法の有効性が確認された。付着割合と検出感度の関係では、市販のレーザ式粉じん計の測定結果とQCM周波数変化もほぼ正の相関関係が示された。高感度検知では、逓倍波を利用しなくても基本周波数の高周波数化(9→20MHz)により、約5倍程度高感度化が可能なことが分かった。大気中の浮遊粒子状物質(SPM)について水晶振動子を利用した微量天秤測定手法(QCM)を応用して、特別な付加装置を使用することなくSPMを電極表面へ付着させるリアルタイム計測手法の検討を行った。引き続きSPMが付着しやすい高分子膜の作成とその評価を行った。従来の重合膜と平行して、SiO2や酸化鉄、炭素などの無機系物質についても検討を進めた。無機系物質は、従来のポリテトラフルオロエチレン膜やプラズマ重合膜と比較して、エタノールやアセトンなどのVOCに対する検知感度は比較的小さいものの、湿度に対しては同等程度であることが分かった。QCMを利用したSPM測定の場合、測定流量と測定時間の関係は重要である。今回の測定原理は、表面吸着質量を増加させる必要から流量を増やすことによって、吸着量を増やす手法を利用した。

なお、一般的な質量測定の場合は濾紙等フィルターに吸着させるため、吸引ポンプの負荷が大きくなるが、QCMの場合は表面に衝突させるような形式での吸着を利用しているため、従来法と比較してポンプへの負荷も小さく、小型のポンプの利用が可能であることが分かった。これらの結果をもとに、実験室以外のSPMが多い作業環境一定期間放置し、その吸着特性等の調査を行い、自然通気方式でも一定上のSPM吸着を確認し、本手法の有効性を明らかにした。また、吸着したSPMをSEMでの表面観察とEDXによる組成分析を行い明らかにした。これらの基本的なデータを元に、個人曝露測定用システムについて検討を行った。人体やマスク内に装着可能なQCM測定器を試作し、温度や湿度、圧力(気圧)も同時に記録できるため、環境の影響評価も可能である。この試昨器を個人曝露測定目的に人体やマスク内に装着し、一定時間経過後のQCM測定結果を求めたところ、微量ながらSPM吸着を確認し、本測定システムの有効性を明らかにした。センシングデバイス開発検知膜作成とその特性評価では、SPMを付着しやすい高分子膜の作成とその評価を行っている。今年度も昨年度に引き続き高分子薄膜(2,3,4,5,6-ペンタフルオロスチレン)をプラズマ重合で作成し、その付着特性を各種実験とSEMの観察で求めた。異なる材料によるプラズマ重合膜の吸着検知特性については、明確な差異は示されなかった。これから、この程度の膜厚レベルでは膜材料の違いが物理吸着や表面形状に現れないことが考えられる。また、使用したSEMによる観察でも同様に表面状態の違いは明確に示されたかった。このよう結果から、今回使用したサンプルや実験条件下では膜材料の影響は明確に示されず、膜表面状態が吸着特性に影響していることが予想される。今回の成膜では膜厚についてはある程度制御できるものの、表面形状を変えることは基本的には難しいため、この点については引き続き調査検討を行う。このようなことから、成膜可能な検知膜の材料についてはある程度の傾向を確認できている。また、干渉ガス等についても同様である。表面形状について異なる条件下での確認が必要となっている。SPM測定では測定流量が重要な要素である。一般的な測定では500ml1000ml/minで行うが、QCM測定では高感度検出が可能と考え、QCM測定手法が広く利用されることを想定し、できるだけサンプル流量を少なくして検討を進めてきた。しかしながら、QCMについても流量が少ないほど吸着量が少ない傾向が示された。これから、QCMによるSPM検知でも一定以上の流量での測定が必要であることが示された。この結果は、現在測定実験で使用しているガスセルが既存のSPM測定用のものを改造して利用しているため、QCMに最適な通気構造の測定用セルの必要性が考えられ、引き続き調査検討を行う。検知膜作成とその特性評価では、SPMを付着しやすい高分子膜の作成とその評価を行ったが、当初検討していたポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルアルコール等の高分子薄膜をプラズマ重合で作成し、その付着特性を各種実験とSEMの観察で求めることができた。また、この他にスピンコート法による成膜後焼成した膜の検知特性やセルロースを主成分とした検知膜についても検知特性評価を行い、それぞれの比較検討を行った。
聴・平衡覚器官のイメージング解析～１分子から個体レベルまで～

内耳有毛細胞特異的Cdc42 KOマウスが、1)「正常聴覚獲得後に多彩な聴毛の形態異常による緩徐進行性の75dB程度の高度難聴を呈する」、2)「Cdc42は聴毛の形成過程よりむしろ維持期に機能する」、3)「Cdc42は聴毛膜に局在する」、4)「その活性化は聴毛の上半(先端)部の方が下半(基)部よりも強い(FRET法により証明)」等の4つの事実を世界に先駆けて明らかにした。聴毛の形態異常については、欠損・短縮・伸長・癒合など所見を電子顕微鏡(図中矢印)にて明らかにした。このような聴毛の形態変化を引き起こす原因として、正常では聴毛及び頂側結合複合体(apical junctional complexes)に局在・活性化して、アクチン代謝を巧妙に調節しているCdc42が機能しないため、N-WASPによるアクチン重合とcofilinによるアクチン脱重合の両者が障害され、アクチン代謝が非常に低い状態で保たれるようになるためであることを証明した。26年度が最終年度であるため、記入しない。老人性難聴など原因不明の聴・平衡覚障害に苦しむ人々は、驚くほど多い。にもかかわらず、内耳が微細構造体(聴・平衡毛や耳石)であることなどから、治療法開発が十分に進んでいない。本研究は、内耳研究を発展させる一手段として、内耳(聴・平衡覚)有毛細胞特異的に種々の分子をノックアウトしたマウスを用い、さらに、イメージング手法を駆使することにより、内耳疾患の新規治療法の開発に繋がるような新しい研究手法を確立しようというものである。本年度の研究において、Cdc42を内耳有毛細胞特異的にノックアウト(KO)したマウスを用いた研究を重点的に行った。Cdc42 KO聴覚有毛細胞の電子顕微鏡解析では、聴毛(不動毛)の欠落・癒合が認められた。初代蝸牛器官培養内の有毛細胞に発現させたアデノウイルスGFP-Cdc42は、聴毛を覆う形質膜と頂側に近い側壁に局在した。微絨毛(不動毛)を有するMDCK細胞を聴覚有毛細胞のモデル細胞として用いると、1) GFP-Cdc42安定発現細胞株のcyst形成条件下の培養では、GFP-Cdc42はcyst管腔に面する頂側面と頂側に近い側壁に局在し、2) Cdc42-ノックダウン(KD)安定細胞株のインサート膜上培養では、微絨毛の減少や癒合とTight junction (TJ)のマーカーであるZO1の細胞内停留が認められた。Cdc42 FRET biosensorTG miceの聴覚有毛細胞を用いた二光子蛍光顕微鏡観察では、Cdc42は、聴毛膜の先端部で強い、頂側に近い側壁で弱い活性化を示した。Cdc42-KD細胞株における細胞内シグナルに関しては、CofilinとMyosin phosphatase 1 (MYPT1)のリン酸化亢進に代表されるアクチン代謝障害と代償経路の活性化(RhoA→ROCK→LIMK2→Cofilin, RhoA→ROCK→MYPT1→MLC)が観察された。以上より、Cdc42 KOマウスの進行性難聴は、聴覚有毛細胞内の聴毛及びTJでのアクチン代謝障害に起因することを明らかにした。研究計画にあげたほぼすべての研究が順調に進み、満足できる結果が得られた。この結果は論文としてJ. Cell SCi誌に発表した。当初は予定していなかった他のRho family分子の働きについても、細胞接着部位や微絨毛における働きの解析を開始している。本年度の研究により、内耳有毛細胞のモデルとしてMDCK細胞の管腔形成を伴う3D培養が有用であることを明らかにした。このモデルを用いて、他のRho familyタンパク質の微絨毛の発生・維持、さらにはtight junctionでの働きを明らかにする。このモデル系を駆使することにより、内耳有毛細胞の生理的な機能を明らかにできるだけではなく、今まで混沌としていたRho familyに属する多くの分子の特異的な機能の解明の糸口となりうる。