hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タイ国・アユタヤ遺跡の保存修復に関する研究

・ラチャブラナ寺院に設置した無電源(電池稼働)自動環境計測システムにより環境条件(大気温度、大気湿度、雨量、日照強度、レンガ表面温度、レンガ内部温度)の継続計測を行った。1年中最高気温が30°Cを越えること、雨は雨期の末期に多く、しかも短時間に集中して降ることが明らかに確認された。但し、月毎の平均気温、雨量は年によってかなり異なることも明らかとなった。・マハタート寺院近くの一角に設置したレンガ造柱によって、雨量および地中水分量の変化とレンガの含有水分量の変化について測定を行った結果、表面漆喰モルタルの存在がレンガの吸脱水の抑制にきわめて効果的であることが明らかとなった。・マハタート寺院の一角の特にレンガの劣化の激しい部分において、詳細な観察と含有水分の変化についての測定を継続的に行った。この部分における水分の動きについて、コンピュータによるモデル解析の結果、部分的に水分量が高まることが確認された。これを防止するために上層部分を撥水処理すること検討され、その効果を確認するための実験用レンガ構築物に水分センサーを取り付けての測定を行った。その結果、上層部の撥水処理によって、含有水分量が大幅に低下することが確認された。・マエナンプルエム寺院の修復パイロット事業を開始し、現在、屋根部分の修復を終えたところであり、引き続いて壁体の補強と修復を行うことになっている。・アユタヤ遺跡において今までに行われた保存修復対策についての資料収集と追跡調査を行った。1960年代に多く用いられたセメントが、すでに劣化し始めている点が大きな問題となっていることが明らかとなった。・関連調査として、スコータイ遺跡の劣化と保存修復についての調査ならびに関連の文献資料等の収集を行った。アユタヤとスコータイの遺跡は一見類似しているが、詳細に見ると異なる点がかなりあり、あらためての調査、研究が必要と考察される。本年度行った調査研究活動は下記の通りである。・アユタヤ遺跡において、日・タイ共同で協議を行い、具体的な調査研究の進め方を決定した。実験サイトとして、マハタート寺院とラチャブラナ寺院を選定した。・ラチャブラナ寺院に無電源(電池稼働)自動環境計測システムを設置し、計測を開始した。計測項目は大気温度、大気湿度、雨量、日照強度、レンガ表面温度、レンガ内部温度の6項目で、1時間毎(24回/日)の計測データをデータ集積機のメモリーに保存している。・マハタート寺院近くの一角にシミュレーション実験用のレンガ造柱を設置した。1柱はレンガ積みのものであり、もう1柱はそれにモルタル被覆したものである。これら構築柱の含有水分量の測定を開始した。また併せて、土中水分量および地下水位の測定も開始した。・マハタート寺院の一角の特にレンガの劣化の激しい部分について、詳細な観察と含有水分の変化についての測定を開始した。・アユタヤ遺跡において今までに行われた保存修復対策についての資料収集と追跡調査を行っている。・関連調査として、スコータイ遺跡および東北部のクメール石造遺跡の劣化と保存修復についての調査も行った。また併せて、関連の文献資料等の収集も行っている。以上の調査研究により、アユタヤ遺跡のレンガ造遺構の劣化は主に雨水によるものであり、雨水に対する対策が、保存の基本であることが明らかになりつつある。来年度以降はこの線に沿って、より具体的な調査、研究を進める予定である。・ラチャブラナ寺院に設置した無電源(電池稼働)自動環境計測システムにより環境条件(大気温度、大気湿度、雨量、日照強度、レンガ表面温度、レンガ内部温度)の計測を継続的に進めており、1999年のデータの解析処理を行った。

その結果、1年中最高気温が30°Cを超えること、雨は雨季の末期に多く、短時間に集中して降ることなどが明らかとなった。・マハタート寺院近くの一角に設置したレンガ造柱を用いたシミュレーション実験を継続的に行った。構築柱の含有水分量と土中の水分量および地下水位の変化を測定し、その結果を解析中である・マハタート寺院近くの一角の特にレンガの劣化の激しい部分において、詳細な観察と含有水分の変化についての測定を継続的に行っている。また、この部分における水分の動きについて、コンピュータによるモデル解析を行い、部分的に水分量が高まることが確認された。この現象を防止するために上層部分を撥水処理することを検討中である。この目的のために、マハタート寺院内に新たに実験用レンガ構築物を造り、水分センサーを取り付けての測定を開始した。・来年度にマエナンプルエム寺院の修復パイロット事業を行うべく、各種の調査を行った。特に当初の漆喰が残っている獅子像の保存方法について検討し、防水性漆喰による保存法をテストする予定である。・アユタヤ遺跡において今までに行われた保存修復対策についての資料収集と追跡調査を行っている。・関連調査として、スコータイ遺跡および東北部のクメール石造遺跡の劣化と保存修復についての調査も行った。また併せて、関連の文献資料等の収集も行っている。・ラチャブラナ寺院に設置した無電源(電池稼働)自動環境計測システムにより環境条件(大気温度、大気湿度、雨量、日照強度、レンガ表面温度、レンガ内部温度)の継続計測を行った。1年中最高気温が30°Cを越えること、雨は雨期の末期に多く、しかも短時間に集中して降ることが明らかに確認された。但し、月毎の平均気温、雨量は年によってかなり異なることも明らかとなった。・マハタート寺院近くの一角に設置したレンガ造柱によって、雨量および地中水分量の変化とレンガの含有水分量の変化について測定を行った結果、表面漆喰モルタルの存在がレンガの吸脱水の抑制にきわめて効果的であることが明らかとなった。・マハタート寺院の一角の特にレンガの劣化の激しい部分において、詳細な観察と含有水分の変化についての測定を継続的に行った。この部分における水分の動きについて、コンピュータによるモデル解析の結果、部分的に水分量が高まることが確認された。これを防止するために上層部分を撥水処理すること検討され、その効果を確認するための実験用レンガ構築物に水分センサーを取り付けての測定を行った。その結果、上層部の撥水処理によって、含有水分量が大幅に低下することが確認された。・マエナンプルエム寺院の修復パイロット事業を開始し、現在、屋根部分の修復を終えたところであり、引き続いて壁体の補強と修復を行うことになっている。・アユタヤ遺跡において今までに行われた保存修復対策についての資料収集と追跡調査を行った。1960年代に多く用いられたセメントが、すでに劣化し始めている点が大きな問題となっていることが明らかとなった。・関連調査として、スコータイ遺跡の劣化と保存修復についての調査ならびに関連の文献資料等の収集を行った。
直鎖状ユビキチン鎖を生成するLUBACリガーゼの統括的研究

研究代表者らが発見した直鎖状ユビキチン鎖は現在では刺激依存的なNF-kappaB活性化、プログラム細胞死抑制に寄与する刺激伝達系として世界的に認知されている。さらに、直鎖状ユビキチン鎖を選択的に生成するLUBACユビキチンリガーゼ(HOIL-1L、HOIP、SHARPINから構成される)の機能亢進、低下がガン、自己炎症性疾患と免疫不全の合併疾患の発症に関与することも報告され、臨床的にも注目を集めている。研究代表者は発見、命名者であることを意識し、かつ、サブユニットのコンディショナルKO、Tgマウスを作出しているメリットを生かし、本提案ではその普遍化と疾患研究の基礎を築くことを目指す。具体的には、機能解析を中核に置きつつ、LUBACリガーゼ複合体の構造、活性調節に加え、創薬研究も展開し、直鎖状ユビキチン鎖の統括的理解とLUBACの新機能の解析を進めている。本年度は以下の研究を行なった。1. LUBACの直鎖状ユビキチン鎖を生成する活性中心はHOIPが有しているが、HOIL-1Lにもユビキチンリガーゼの活性中心が存在する。代表者らはすでにHOIL-1Lのユビキチンリガーゼ活性がLUBACの直鎖状ユビキチン鎖生成能を負に制御することを明らかにしていたが、本年度はHOIL-1Lリガーゼの欠失マウスを用いて個体レベルでも直鎖状ユビキチン鎖生成能を抑制し、同リガーゼ欠損によりサルモネラ菌の感染を抑制できることを示した。2.代表者らはLUBACは制御性T細胞の機能発現に必須であることを明らかにしてきた。本年度は異なるサブユニットの欠損マウスを用いて解析を進めた。なぜなら、LUBACは欠損するサブユニットの違いによって残存活性が異なるので、表現系が異なる可能性が想定されるからである。その結果、制御性T細胞でLUBACの機能が完全に廃絶すると自己免疫、機能が若干残存していれば自己炎症性疾患様症状と異なる症状を示すことを発見した。ほぼ順調に推移しているので、一層の研究の進捗を図る。当初の計画に則って研究を推進する。さらに、直鎖状ユビキチン鎖を選択的に生成するLUBACユビキチンリガーゼ(HOIL-1L、HOIP、SHARPINから構成される)の機能亢進、低下がガン、事故炎暑末井疾患と免疫不全の合併疾患の発症に関与することも報告され、臨床的にも注目を集めている。研究代表者は発見、命名者であることを意識し、かつ、サブユニットのコンディショナるKO、Tgマウスを作出しているメリットを生かし、本研究提案ではその普遍化と疾患研究への展開の基礎を築くことを目指す。具体的には、機能解析を中核に置きつつ、LUBACリガーゼの構造、活性調節の解析に加え、創薬研究も展開し、直鎖状ユビキチン鎖の統括的理解とLUBACの新機能の解析を進めている。本年度は以下の成果を上げた。1.遺伝子改変マウスを用いて、LUBAC活性の欠損でTLR4刺激依存的な細胞死が亢進すること、ネクロトーシスを抑制することでB細胞亜群の1つであるB1-bの生成に寄与していることを示した(J. Immunol. In press)2.3サブユニットが存在することで、LUBACは安定な複合体を形成するので、構造生物学的手法を用いてそのメカニズムを解明した(Cell Reports In press)。3.LUBACの機能亢進はB細胞リンパ腫の発症などに関与するので、LUBACは優れた抗がん剤のターゲットである。2.の成果に基づいて、LUBAC阻害剤開発のスクリーニング系の構築に成功し、次年度からスクリーニングに着手する。当初の研究計画はおおよそ順調に推移しており、LUBACの活性調節機構、制御性T細胞、B細胞リンパ腫への寄与など成果は今年度中に投稿できる予定である。

代表者らはすでにHOIL-1Lのユビキチンリガーゼ活性がLUBACの直鎖状ユビキチン鎖生成能を負に制御することを明らかにしていたが、本年度はHOIL-1Lリガーゼの欠失マウスを用いて個体レベルでも直鎖状ユビキチン鎖生成能を抑制し、同リガーゼ欠損によりサルモネラ菌の感染を抑制できることを示した。2.代表者らはLUBACは制御性T細胞の機能発現に必須であることを明らかにしてきた。本年度は異なるサブユニットの欠損マウスを用いて解析を進めた。なぜなら、LUBACは欠損するサブユニットの違いによって残存活性が異なるので、表現系が異なる可能性が想定されるからである。その結果、制御性T細胞でLUBACの機能が完全に廃絶すると自己免疫、機能が若干残存していれば自己炎症性疾患様症状と異なる症状を示すことを発見した。ほぼ順調に推移しているので、一層の研究の進捗を図る。当初の計画に則って研究を推進する。
膜蛋白質および関連高分子におけるエネジェテックスとダイナミクスの物理化学的基礎

本年度は総研の最終年にあたるので、研究の論点を限定し、レビュ-と総合討論を中心に行った。レビュ-の題目は次の通りである。1.色覚に関与する光受容蛋白質の一次構造からみた視覚進化系統樹。2.FTIRの原理と応用。3.分子内光誘起電子移動のピコ秒・フェムト秒ダイナミクス。4.蛋白質内電子移動のPathーKuki.Wolynessのモンテカルロシミュレ-ション及びBerratanの理論の紹介。5.熱測定で観たタンパク質熱力学。6.光吸収スペクトルのフ-リエ変換法による励起状態ダイナミクスの解析。これらの講演から、膜蛋白質の研究の現状と今後の可能性について討論が重ねられ、3年間の班員の研究討論を通して、生物・化学・物理にわたる研究者間に共通の問題意識がかなりの程度定着してきたことが明らかになった。総合討論では本研究班の成果のsurveyが行われた。1.膜蛋白質の特質。globular proteinと対比して研究を進めた。helixの折れたたみ構造の安定性と機能における役割を明らかにした。解離アミノ酸残基の熱力学的安定性と反応性について考察を深めた。2.エナジェティクス。蛋白構造緩和を制御する因子としてエナジェティクスをとらえた。高効率エネルギ-変換及び特異的反応機構をエネジェティクスの観点から考察した。3.ダイナミクス。レチナ-ル蛋白質の光異性化のダイナミクスについてフェムト秒・ピコ秒分光の応用及びフ-リエ変換法の適用。膜蛋白質の構造変化における環境ゆらぎとダイナミクスの役割。これらの議論をもとに生命体の素材となる蛋白質の構造と動的機能ーそれにかかわるエナジェティクスとダイナミクスの物理化学的研究がその基礎として今後もますます重要であることの認識を深めた。1.膜蛋白質の特質。3.ダイナミクス。本年度は昨年7月と今年1月の2回にわたり班会議をもった。班員各自の研究内容を紹介していただく一方、当面集約されつつある問題点について、班員以外の専門家もお呼びしてテ-マ毎に2時間4時間の特別セッションを設け、十分な討論を行った。まず、電子移動反応のエネルギ-・ギャップ則が誘電媒体の誘電飽和の非線形効果によってどのように影響を受けるのかについて、厳しい議論がなされた。その結果、エネルギ-・ギャップ則は、非線形効果によって巾広くなったり(電荷分離反応)、狭くなったり(電荷再結合反応)するが、inverted regionはすべての場合に存在するという結論を得た。これは生体エネルギ-変換を支える酸化・還元反応の1つの基本法則になりうる。次に集中的に討論された課題は光合成系熱発光の機構である。熱発光は酸素発生系のS状態について極めて重要な情報をもたらすが、その発光の過程の詳細はいまだ十分に明らかにされていない。これまで、光化学系IIの電荷分離後の電子と空孔が互いに酸化還元電位のエネルギ-勾配を下って移動し、互いに遠く離れてしまうが、熱励起によって、互いにエネルギ-勾配を登ってPの位置で再結合し、P^*を生成し蛍光を出す機構が想像されている。しかし、そのkineticsとenergeticsについて、物理化学的に解析する余地のあることが議論され、次回もう一度集中討議することとなった。この他に、レチノイド・カロテノイドの三重項状態及び一重項第一励起状態の共鳴ラマン・スペクトルが測定され、励起状態における分子変形に関する精密な情報を得ることが出来たので、今後これを基にシス-トランス光異性化についての励起状態ダイナミクスの議論が進展するものと思われる。

また、粘性溶媒中の酵素の非熱平衡反応の理論モデルが提案され、多くの実験家の注目を集めた。本年度は平成2年11月15日17日に京都平安会館で班会議をもち、研究成果の発表と討論を行なった。総研の2年次にあたるので、広い範囲の課題に対して徹底的な議論を行ない、生体機能の物理化学的側面を明確化するよう努めた。また、20名を越える班員外の若い研究者にも班会議に参加していただき、研究体制における世代間の継承性にも配慮した。今年度に得られた研究成果のいくつかは以下の通りである。1.電子移動反応における適切な反応座標を定義し、それに基づき、環境が非線形分極応答する場合に成り立つエネルギ-・ギャップ則を求めた。2.色覚色素アイオドプシンの光異性化と緩和の過程とダイナミクスを明らかにした。3.紅色光合成細菌のアンテナ系におけるエネルギ-転移過程の詳しい解析を行なった。4.高等植物の光化学系IIの熱発光のBバンドとZバンドの発光スペクトルの測定に成功した。5.光化学系Iの反応中心で電子受容体として働くキノン(ビタミンKー1)を分子構造及び酸化還元電位の異なる他のキノンに置きかえた系を作り、結合定数の変化および電子移動速度の変化を測定した。6.バクテリオクロロフィルのT_1状態の共鳴ラマン散乱スペクトルの測定に成功した。7.アイオドプシンの1次構造を決定した。本年度は総研の最終年にあたるので、研究の論点を限定し、レビュ-と総合討論を中心に行った。レビュ-の題目は次の通りである。1.色覚に関与する光受容蛋白質の一次構造からみた視覚進化系統樹。2.FTIRの原理と応用。3.分子内光誘起電子移動のピコ秒・フェムト秒ダイナミクス。4.蛋白質内電子移動のPathーKuki.Wolynessのモンテカルロシミュレ-ション及びBerratanの理論の紹介。5.熱測定で観たタンパク質熱力学。6.光吸収スペクトルのフ-リエ変換法による励起状態ダイナミクスの解析。これらの講演から、膜蛋白質の研究の現状と今後の可能性について討論が重ねられ、3年間の班員の研究討論を通して、生物・化学・物理にわたる研究者間に共通の問題意識がかなりの程度定着してきたことが明らかになった。総合討論では本研究班の成果のsurveyが行われた。1.膜蛋白質の特質。globular Proteinと対比して研究を進めた。helixの折れたたみ構造の安定性と機能における役割を明らかにした。解離アミノ酸残基の熱力学的安定性と反応性について考察を深めた。2.エナジェティクス。蛋白構造緩和を制御する因子としてエナジェティクスをとらえた。高効率エネルギ-変換及び特異的反応機構をエネジェティクスの観点から考察した。3.ダイナミクス。レチナ-ル蛋白質の光異性化のダイナミクスについてフェムト秒・ピコ秒分光の応用及びフ-リエ変換法の適用。膜蛋白質の構造変化における環境ゆらぎとダイナミクスの役割。これらの議論をもとに生命体の素材となる蛋白質の構造と動的機能ーそれにかかわるエナジェティクスとダイナミクスの物理化学的研究がその基礎として今後もますます重要であることの認識を深めた。
視交叉上核でのラット時計遺伝子の同定とバソプレシン遺伝子の発現様式

課題のテーマを遂行する一環として、視交叉上核(SCN)中のArg-vasopressin(AVP、ペプタイド)とそのmRNAリズムの頂値出現時刻の生後発達過程を調べた。、明暗周期下ではアダルトになるまで各々明期開始時刻に一致していた。この事はAVPペプタイドの頂値出現時刻に先行して17-20時間前に、AVPmRNAの頂値が出現するとするのではなく、ほぼ同時刻に出現する説(LArsen,et al,1994)を支持するものと考えた。これらの事は転写-翻訳過程完了後もペプタイド含量に何らかの調節が働いていると考えざるを得ない。以前、AVPmRNAのpolyA tailの長いほうが安定性がよく効率良くリボソーム上でペプタイド合成が行われるとの説があった、しかし翻訳の速度はかなり早く、20-60秒で完成することが常識となりつつある。この事を確かめるのはNorthern-blottingでわかるはずであるが、無細胞(核の無い条件)でペプタイド合成を行ってみたいと今は考えている。SCN内でのAVP含有ニューロンの活動性を出力系の要素としてSCN内在の伝達物質やGABAによるAVP放出の面を特に視床下部-下垂体-副腎系と活動のリズムリズム関連とから調べ報告した。AVPリズム発現の源となるAVP遺伝子から転写-翻訳過程をへる合成系の解明をめざし、視索上核(AVP産生をするが主に浸透圧調節に関連し時計機構には関連性は不明)中でのAVP遺伝子との差異をみたところ5`上流のプロモーター領域に異なる配列のある可能性を見い出された。現在、この事の確認と意義について検討中である。生物リズムの発現機構を解析する目的で、ラットの視交叉上核(哺乳動物の生物時計の中枢)でのArg-vasopressin(AVP)ペプタイドとこれをコードするmessengerRNA(AVPmRNA)の挙動を検討した。AVPは視交叉上核(SCN)中で、時刻を知る手がかりのない条件下で自由継続リズムを示すことを私共も今まで報告してきた。mRNAの量的解析には多数個体からののSCNのmRNAを必要とし、一個体から得られたmRNAの量で比較することが切望されてきた、そこでmRNAからリバーストランスクリプターゼを用いcDNAを作成しこれを鋳型としてPCRを行ない増幅産物の量の多少は始めにSCN中に存在していたAVPmRNA量を反映したものと考えた。別に同一のcDNAから別種のプライマーを用いてPCRを行なって得られたβactinのmRNA由来のPCR産物の量をコントロールとして定量した。AVPmRNAの発現は光反応やメラトニンに対して10分以内に増加する傾向で、AVPペプタイド合成のためだけにAVPmRNAが存在するとは考えにくいことが推測された。以上とは別に他の時計関連遺伝子(per1,per2,per3,CLOCK,BMALl,TIM)との相互作用を調べる一助として、AVPmRNAの5'末端領域の解析を試みた。視床下部の室傍核や腹内側核にあるAVPは浸透圧で増加するがSCNのAVPは浸透圧に応答しないしcAMPで増えない。室傍核や腹内側核でのAVPgeneの転写領域にはcAMPレスポンシブルエレメントが配座するが、SCN由来のAVPgeneはこれを欠損している可能性を調べた。5'-RACE法でSCNmRNAの非転写領域を腹内側核由来のものと比較している。PCR産物をクローニングしたところ、SCNと腹内側核由来の領域は約200base異なることが推察でき、今、塩基配列を解明している段階。

課題のテーマを遂行する一環として、視交叉上核(SCN)中のArg-vasopressin(AVP、ペプタイド)とそのmRNAリズムの頂値出現時刻の生後発達過程を調べた。、明暗周期下ではアダルトになるまで各々明期開始時刻に一致していた。この事はAVPペプタイドの頂値出現時刻に先行して17ー20時間前にAVPmRNAの頂値が出現するとするのではなく、ほぼ同時刻に出現する説(Larsen,et al,1994)を支持するものと考えた。これらの事は転写-翻訳過程完了後もペプタイド含量に何らかの調節が働いていると考えざるを得ない。以前、AVPmRNAのpolyA tailの長いほうが安定性がよく効率良くリボソーム上でペプタイド合成が行われるとの説があった、しかし翻訳の速度はかなり早く、20ー60秒で完成することが常識となりつつある。この事を確かめるのはNorthern-blottingでわかるはずであるが、無細胞(核の無い条件)でペプタイド合成を行ってみたいと今は考えている。SCN内でのAVP含有ニューロンの活動性を出力系の要素としてSCN内在の伝達物質やGABAによるAVP放出の面を特に視床下部ー下垂体ー副腎系と活動のリズムリズム関連とから調べ報告した。AVPリズム発現の源となるAVP遺伝子から転写ー翻訳過程をへる合成系の解明をめざし、視索上核(AVP産生をするが主に浸透圧調節に関連し時計機構には関連性は不明)中でのAVP遺伝子との差異を見たところ5上流のプロモーター領域に異なる配列のある可能性が見い出された。現在、この事の確認と意義について検討中である。
尾部アンカー型膜タンパク質の小胞体への配向性膜挿入と膜構造制御に関する研究

尾部アンカー型膜タンパク質(テイルアンカー型タンパク質とも呼ばれる)は様々な細胞内膜系に局在し、真核細胞の生命機能に必須の役割を担っている。尾部アンカー型膜タンパク質は小胞体へ膜挿入され、その後小胞輸送により適切な内膜系へと運ばれるが、膜挿入の分子機構については不明な点が多い。本研究では、尾部アンカー型膜タンパク質の小胞体膜挿入装置の分子実体がCAML-WRB複合体であることを世界に先駆けて発見した。さらに、CAMLに結合する膜挿入制御タンパク質、小胞体の膜形態を制御する新しい膜変形タンパク質とその活性調節機構を明らかにした。このように本研究により膜挿入機構についての理解が大きく進んだ。尾部アンカー型膜タンパク質は細胞内膜系の至る所に局在し、細胞内小胞輸送、タンパク質の合成と分解、シグナル伝達、オルガネラ形成、脂質代謝など様々な重要な機能を担っている。尾部アンカー型膜タンパク質は生合成過程において、シグナル配列がリボソームの外へ出てくる前に翻訳が終了するため、トランスロコンによる翻訳と共役した小胞体膜への挿入が物理的に不可能である。このため必然的に翻訳後に膜挿入されなければならないが、膜挿入装置の実態は長い間不明のままであった。これに対し私どもは昨年度、非トランスロコン型膜挿入装置としてCAML複合体を発見した。本年度は、CAML複合体の機能解析をさらに推し進め、翻訳後に膜タンパク質を小胞体膜に配向挿入する原理の解明を試みた。その結果、CAMLに結合する膜挿入制御候補分子として細胞膜受容体型タンパク質と小胞体膜タンパク質の2つを同定した。これらの膜挿入反応における役割を生化学的に検討した結果、細胞膜受容体型タンパク質は膜挿入を負に制御し、小胞体膜タンパク質は正に制御していた。このように膜タンパク質の配向挿入原理の理解に不可欠な小胞体膜挿入の活性調節因子を解明しつつある。また、膜挿入装置の活性は小胞体の膜形態により物理的に調節されていることが予想され、私どもは新しい小胞体膜変形タンパク質としてArl6IP1を同定した(Yamamoto et al., Biochem. J. (2014))。このため、必然的に翻訳後に膜挿入されなければならないが、その分子機構については不明な点が多く、とりわけ高等真核細胞における非トランスロコン型膜挿入装置の実態は長い間不明のままである。そこで本研究では、尾部アンカー型膜タンパク質の膜挿入装置の分子実態を世界に先駆けて解明し、膜挿入装置の駆動機構を解析することで、翻訳後に膜タンパク質を小胞体膜に配向挿入する原理を解明することを目的とする。本年度は、細胞質において翻訳直後の尾部アンカー型膜タンパク質のC末膜貫通領域を認識するASNA1(TRC40) ATPaseをプローブにして、尾部アンカー型膜タンパク質の膜挿入装置を生化学的に精製、同定することを試みた。その結果、ASNA1(TRC40)結合タンパク質として2つの小胞体膜タンパク質CAMLとWRBを精製、同定し、CAMLとWRBがASNA1(TRC40)と3者複合体(CAML複合体)を形成して尾部アンカー型膜タンパク質を小胞体膜へ挿入していることを明らかにした。従って、長年不明であった高等真核細胞における尾部アンカー型膜タンパク質の非トランスロコン型膜挿入装置の分子実態が、CAML複合体であることが明らかとなった(Yamamoto et al., Molecular Cell (2012))。尾部アンカー型膜タンパク質(テイルアンカー型タンパク質とも呼ばれる)は様々な細胞内膜系に局在し、細胞内小胞輸送、タンパク質の合成と分解、シグナル伝達、オルガネラ形成、脂質代謝などの重要な機能を担っている。尾部アンカー型膜タンパク質は翻訳終了後に小胞体膜へ挿入され、その後、小胞輸送により適切な内膜へ配置される。しかしながら、その膜挿入機構については不明な点が多い。本研究課題で私どもは、尾部アンカー型膜タンパク質の小胞体膜挿入装置の分子実体がCAML複合体であることを発見した。さらに、その活性制御分子として細胞膜受容体型タンパク質と新規小胞体膜タンパク質を同定した。細胞膜受容体型タンパク質は細胞膜に発現することで、細胞内シグナルを伝達する。そこで、最終年度では細胞膜受容体型タンパク質の解析を推し進めた。その結果、細胞膜受容体型タンパク質は小胞体でCAML複合体と結合することで膜挿入を抑制するとともに、細胞膜への輸送が阻害されていた。

このことから、尾部アンカー型膜タンパク質の膜挿入と細胞内シグナル伝達がCAML複合体を介して機能的に結びついていることが示唆された。膜挿入装置の活性は小胞体の膜形態により物理的に調節されていることが予想されるが、その詳しいメカニズムは不明である。本研究課題で私どもは、新しい小胞体膜変形タンパク質としてArl6IP1を同定した。最終年度ではArl6IP1の解析をさらに推し進めた結果、小胞体膜タンパク質TMEM33がArl6IP1と結合し、膜変形活性を制御することを明らかにした。今後、明らかにした分子をツールにすることで、膜挿入装置の制御機構のみならず、膜挿入を作用点とする細胞内シグナル伝達制御という概念の提示、膜挿入制御の視点による小胞体の膜形態の生理的意義の解明に繋がる可能性があると考えられる。生化学本年度はCAML複合体の活性を正負に調節する2つの異なる分子を同定し、その機能解析を行った。同定した活性制御分子は膜挿入の観点から新規のタンパク質であり、本解析を推し進めることで膜挿入の制御機構の新しい概念を提示できると考えている。また、活性調節分子の1つは細胞膜受容体型タンパク質であることから、小胞体膜挿入制御と細胞内シグナル伝達の新しい機能関係の発見につながると予想している。さらに膜挿入制御の物理要因の1つとして小胞体膜変形があるが、私どもは新しい小胞体膜変形タンパク質としてArl6IP1を報告した(Yamamoto et al., Biochem. J. (2014))。このように、同定した分子の生理機能解析を推し進めることで、膜挿入を作用点とする生命の恒常性維持の機構について全く新しいメカニズムの発見に繋がる可能性が高い。従って、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本年度は長年不明であった高等真核細胞における非トランスロコン型膜挿入装置としてCAML複合体を世界に先駆けて発見することに成功し、その成果を学術論文として発表した(Yamamoto et al., Molecular Cell (2012))。さらにCAML複合体の発見を契機に、膜挿入を制御する可能性がある分子を幾つか既に同定するに至っている。今後、これらの候補分子の生理機能の解析を推し進めることで、膜挿入の制御機構および膜挿入を作用点とする生命の恒常性維持の機構について全く新しいメカニズムの発見と概念の確立に繋がる可能性が高い。従って、本研究は当初の計画以上に進展していると考えている。発見した活性制御分子をツールにして、膜挿入装置CAML複合体の駆動機構の解析を推進し、翻訳後に膜タンパク質を小胞体膜に配向挿入する原理の解明を行う。具体的な方策は以下の3つである。1膜埋め込み制御の分子機構:発見した活性制御分子をプローブにして、CAML複合体を含む活性制御分子タンパク質複合体をミクロソームより生化学的に精製、同定し、膜挿入制御に関与する分子群を網羅的に明らかにする。さらに、複合体中における各構成因子の構成比を明らかにし、膜挿入と活性制御に必要な分子複合体の実態を明らかにする。
DNAのCpG配列とサイトカインによる緑膿菌に対する細胞性免疫の増強と感染防御

緑膿菌感染症の問題はこれからの高齢化社会において、ますます重要になると考えれらる。現在、緑膿菌の肺感染に対して有効なワクチンは開発されていない。緑膿菌ワクチンの抗原としていくつかの候補があげられている。しかし、単独に抗原タンパク質による免疫では十分な感染防御免疫が得られていない。そこで我々は、細胞性免疫の上昇が期待でき、しかも、様々な抗原を混合して用いることが可能な抗原遺伝子の発現プラスミドを直接生体に投与し、免疫する新しい方法の開発をめざした。まず緑膿菌の鞭毛抗原遺伝子を動物細胞で発現するようにサイトメガロウイルスのプロモーターを接続し、動物細胞での発現プラスミドを作製し、このDNAを直接生体に投与し、免疫する方法について検討を行った。(Jun Fukusima, etal.,Cellula Microbiology.発表予定)。この方法で免疫すると、鞭毛抗原特異的な抗体が産生され、また、抗原特異的な細胞性免疫の活性が検出された。免疫したマウスの感染実験を行い免疫の効果を検討したところ、鞭毛抗原遺伝子によるDNAワクチンは感染防御能を増強させる可能性が確認された。そこで次に、細部性免疫に対してアジュバンド効果のあるものについて、様々な検討を行い、CpG配列を多く含み、最も効果が期待されたIL-2の発現プラスミドの同時投与による影響について検討を行った。またこの際、新たな線毛抗原遺伝子発現プラスミドの構築を行った。その結果、まず、線毛抗原遺伝子発現プラスミドは鞭毛抗原遺伝子発現プラスミドより抗原性が強いこと、また、IL-2の発現プラスミドは、抗体産生にはほとんど影響を与えずに、細胞性免疫のみを増強させうることが確認され、予防効果のあるワクチンの構成要素として利用できる可能性が強く示唆された。今後はさらに抗原を増やし、感染防御効果があるかどうかを検討する必要がある。緑膿菌に対する、ワクチン開発はこれからの高齢化社会において、ますます重要になっている。鞭毛抗原遺伝子に動物細胞で発現するようにプロモーター等を接続したプラスミドを作製した。そのプラスミドDNAを動物生体に直接投与し、異物抗原を発現させることにより免疫するDNA免疫法を開発した。この方法で免疫すると、体液性免疫と細胞性免疫の両者とも上昇する。このDNAワクチン接種の際、CpG配列を含む合成DNAやIL-12、GM-CSFの発現プラスミドを同時投与することにより緑膿菌に特異的な細胞性免疫を増強させうるかどうかを検討した。その結果、CpG配列を含む合成DNAやGM-CSFの発現プラスミドを同時投与で細胞性免疫が若干増強されうることがわかった。一方、IL-12の発現プラスミドの同時投与では、細胞性免疫が顕著に増加したが、抗体産生は強く抑制された。次にそれらのマウスにおいて感染防御能が上昇するかどうかを調べ、実際の緑膿菌に対するワクチンへの応用の可能性を検討した。その結果、CpG配列を含む合成DNAやGM-CSFの発現プラスミドの同時投与では感染防御能は若干上昇した。また、IL-12の発現プラスミドの同時投与では、防御能が低下した。いままでの結果より、、鞭毛蛋白質による免疫で、体液性免疫のみが上昇したマウスでほとんど感染防御能がみられないことから、鞭毛抗原を使った感染防御においては、体液性免疫が主要に関与するが、ある程度の細胞性免疫も必要であることが示唆された。今後さらに別の抗原を使って、防御能をたかめる研究を行う。昨年度は、鞭毛抗原遺伝子の発現プラスミドを直接マウス生体に投与し、免疫する方法を開発した。

この方法で免疫すると、鞭毛抗原特異的な血清中のIgG抗体、糞便中のIgA抗体が産生された。また、抗原特異的な遅延型過敏症反応、細胞障害性T細胞の活性が検出され、さらに、感染防御能もある程度上昇した。本年度は、感染防御能を高めるために、線毛抗原遺伝子の発現プラスミドを構築した。このプラスミドをマウスに経鼻的に投与すると、抗原特異的な抗体および細胞性免疫活性が検出された。また、このさい、投与量は、鞭毛抗原プラスミドの1/5程度で同等以上の遅延型過敏症反応が観察され、より強い抗原性を持つことが確認された。また、鞭毛抗原遺伝子の研究から、細胞性免疫を低下させると感染防御能が低下することから、細胞性免疫が感染防御にある程度の役割を演じている可能性が示唆されていた。そこで本年度は細胞性免疫活性の増強を目的に、CpG配列を持つIL-2発現プラスミドの同時投与を行った。その結果、線毛抗原プラスミドの単独投与にくらべて、抗体産性にはほとんど影響がなく、遅延型過敏症反応のみを約1.5倍に増強させることができ、感染防御機能の強化に繋がると考えられた。これら二つのプラスミドとIL-2発現プラスミドなどを組み合わせることにより、さらに強い免疫効果が得られることが期待された。また、細胞表面抗原についても同様の発現プラスミドの構築をすすめていて、これらの組み合わせで、緑膿菌感染症に対する防御効果がさらに高まると考えている。
突然変異体を利用したイノシトールミリン酸受容体の機能解析

味覚トランスダクション機構にどのようなセカンドメッセンジャーに関わっているかはまだ解明されていない。これまでのショウジョウバエを用いた研究によって、norpA視覚突然変異体において味覚異常がみられることから、イノシトール3リン酸(IP_3)がセカンドメッセンジャーとして機能していることを明らかにした。ショウジョウバエのIP_3受容体遺伝子は感覚器において高い発現があることから、トランスダクション機構にIP_3受容体が関与していることが示唆される。本研究では、IP_3受容体の突然変異体を分離することによって、IP_3の味覚受容における役割を解明することが目的であった。IP_3受容体遺伝子が位置する座位にはこれまで分離されている突然変異体は報告されていない。近傍にP因子が挿入された複数の系統についてサザン解析を行ったが、IP_3受容体遺伝子内へのP因子の挿入は確認できなかった。そこで、IP_3受容体遺伝子座の近傍にP因子が挿入された3系統を用いて、local jump法により多数のP因子挿入致死系統を分離した。また同時に、imprecise exicisionによる欠失系統を分離した。これらの系統がIP_3受容体遺伝子内にP因子の挿入あるいは欠失があることを確認している。
やわらかい分散システムの構成に関する研究

「やわらかい分散システム」を実現するには、やわらかい情報ネットワークとこれを用いた分散マルチメディア知識ベースシステムの研究が必要である。やわらかい情報ネットワークでは、グループ通信、高速マルチメディア通信、モーバイル通信の研究が重要であり、分散マルチメディア知識ベースシステムでは、分散協調システム、複数のマルチメディア知識ベースシステムの統合化、信頼性と安全性等についての研究が肝要となる。本研究では、以上の種々の分野の研究が必要であり、国内の研究者だけでなく海外の専門家も加えて総合的に調査研究を推進した。国内の分担研究者による成果としては、本概念に基づいて、やわらかい分散システムの基礎となる研究として、滝沢による複数のプロセス間での新しい通信としてグループ通信の結果が得られ、国際的に注目されている。また、やわらかい分散システムの情報ネットワークの通信の基礎となるマルチメディア通信については、ATMを用いた高速な通信方式とその応用について理論及び実験の両面から研究を推進した柴田が重要な結果を得ている。海外の分担者の成果としては、米国のLiuとGerlaが移動体通信のための新しいプロトコルを提案し実証実験を通してその有効性を示した。また、分散協調システムについては、オーストラリアのPapazoglouの協調方式に関する成果があり、分散協調システムに関する国際会議を主催する等により、この分野での研究をリードしてきている。やわらかい分散システムでは、やわらかい情報システムにより相互接続された複数のマルチメディア知識ベースを共有できることが必要であり、英国のDeenがその効果的な方式を提案した。また、オーストリアのTjoaは、特にシステムの信頼性と安全性についての研究を進めており、これらの統一的な実現方式の成果を得ている。やわらかい情報ネットワークでは、グループ通信、高速マルチメディア通信、モ-バイル通信の研究が重要であり、分散マルチメディア知識ベースシステムでは、分散協調システム、複数のマルチメディア知識ベースシステムの統合化、信頼性と安全性等についての研究が肝要となる。また、分散協調システムについては、オーストラリアのPapazoglouの協調方式に関する成果があり、分散協調システムに関する国際会議を主催する等により、この分野での研究をリ-ドしてきている。
経口トレランスによる抗原特異的調節性T細胞株の樹立と自己免疫疾患の治療への応用

経口トレランスは抗原特異的な免疫療法を行う上で理想的な方法の一つとされている。特にこれにより誘導される抗原特異的な調節性T細胞が主要な役割を担うと考えられている。そこで本研究ではそのようなT細胞株の樹立を最終目的として、まず、作用メカニズムを追求した。通常経口トレランスは、抗原量の違いによりそのメカニズムに違いがあるといわれている。すなわち、少量の抗原量では調節性T細胞によるActive suppressionが誘導され、大量の抗原量ではClonal deletionもしくはAllergyが誘導されるが、両方の要素が混在することも多い。そこで、経口トレランスが誘導されているマウスの腸管、リンパ節、脾臓などからT細胞亜分画を分離し、それと免疫された正常マウスの脾細胞との共培養を行い増殖反応の抑制を調べることにより、移入実験などの複雑な実験系なしにActive suppressionの存在を確認した。すなわち、調節性T細胞の分析システムが確立できた。次に、調節性T細胞の代表的な細胞であるTh3/Tr1への分化誘導因子の解析を行った。経口投与された抗原が腸管粘膜においてT細胞に提示される際に、抗原特異的な調節性T細胞が生成され、それが炎症局所へ到達しTGF-βなどの抑制性サイトカインを放出することがトレランス誘導の機序とされる。TGF-β分泌細胞(Th3)細胞の分化因子としてIL-4、TGF-βなどが、またネガティブな因子としてIL-12が重要であるとの報告がなされているが定見として確立していない。そこで本研究では、OVA特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスからナイーブなT細胞を分離し、様々なサイトカインのもとで抗原刺激を行いその分化を解析すると同時に、抗原提示細胞の条件を変化させることにより、分化後のT細胞のTGF-β分泌能を検証した。これらの検討から調節性T細胞株樹立への条件設定がほぼ決まりつつある。経口トレランスにおいては投与する抗原量の違いによるそのメカニズムに違いがあるといわれ、少量の抗原量では、免疫寛容が誘導されたマウスの脾細胞をadoptivetransferすることによりsuppressionが移入できることがいくつかの系において示されているが、誘導に使う系によってどの細胞が重要なのかは一定した見解は得られていない。そこで、経口トレランスが誘導された未免疫Balb/cマウスの腸管、リンパ節、脾臓などからT細胞、non-T細胞を分離し、それとOVAにより免疫されたBalb/cマウスの脾細胞との共培養を行い増殖反応の抑制を調べたところ、T細胞分画のみならずnon一T細胞分画によってもトレランスの移入がみられた。これは抗原提示細胞が腸管において抗原を取り込むことで、トレランス誘導能を獲得したということが示唆される。そのメカニズムの一つとして、腸管粘膜の特殊に分化したリンパ組織において、樹状細胞などの特化された抗原提示細胞が調節性T細胞への分化を誘導している可能性がある。そこでOVAを経口投与したマウスの小腸パイエル板から樹状細胞を分離し、OVA特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスから分離したナイーブなT細胞と抗原とともに共培養し、分化したT細胞のIL-10産生能を調べた。OVA非投与群と比べて、経口投与群からのパイエル板樹状細胞はよりIL-10産生T細胞の誘導を促した。一方脾臓の樹状細胞においては差はみられず、これによりパイエル板樹状細胞が経口トレランス誘導に大きな役割を果たしていることが示唆された。現在さらにパイエル板樹状細胞の亜分画によるT細胞分化能の違いと、それを利用した樹状細胞の移入による関節炎モデルマウス治療実験をすすめている。

まず経口トレランスのメカニズムを検討した。通常経口トレランスは、抗原量の違いによりそのメカニズムに違いがあるといわれている。すなわち、少量の抗原量では調節性T細胞によるActive suppressionが誘導され、大量の抗原量ではClonal deletionもしくはAnergyが誘導されるが、両方の要素が混在することも多い。そこで本研究では、経口トレランスが誘導された未免疫マウスの腸管・リンパ節、脾臓などからT細胞亜分画を分離し、それと免疫された正常マウスの脾細胞との共培養を行い増殖反応の抑制を調べることにより、移入実験をすることなくActive suppressionの存在を確認した。この系をDBA/1マウスに誘導したコラーゲン誘導関節炎に適用し、抗原としてはII型コラーゲンのみならず、軟骨に存在する自己抗原であるgp39についても分析し、抑制効果を確認した。次に、Th3/Tr1への分化誘導因子の解析を行った。経口投与された抗原が腸管粘膜においてT細胞に提示される際に、抗原特異的な調節性T細胞が生成され、それが炎症局所へ到達しTGF-βなどの抑制性サイトカインを放出することがトレランス誘導の機序とされる。TGF-β分泌細胞(Th3)細胞の分化因子としてIL-4、TGF-などが、またネガティブな因子としてIL-12が重要であるとの報告がなされているが定見として確立していない。そこで本研究では、OVA特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスからナイーブなT細胞を分離し、様々なサイトカインのもとで抗原刺激を行いその分化を解析すると同時に、抗原提示細胞の条件を変化させることにより、分化後のT細胞のTGF-β分泌能を検証した。
微生物酵素による新しい物質変換系の開発

本研究では、微生物酵素を用いる物質の合成、変換法を画期的に発展させるべく、各種酵素が人為的制御条件下で発現する合成活性、非天然合成化合物に対して示す変換活性、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンなどの代謝に関与する多機能的作用などを解析するとともに、それらの酵素の力価増大を図ることによって種々の有用物質の工業的生産方式の基礎を確立する。さらにキラルな有機化合物を創り出す微妙な酵素機能を精密合成法と組み合わせた独創的生産分野を開拓することを目的とする。本年度の研究実績は以下の通りである。(1)メタノール資化性細菌を用いるセリンの酵素的合成の反応条件と合成に関与する酵素を精製し性質を明らかにした。(2)好熟菌の耐熱性ロイシン脱水素酵素遺伝子をクローニングし、構造遺伝子を解析し、酵素の一次構造を究明した。(3)カルボキシペプチダーゼYおよびPによるジヘプチド合成の反応条件と反応機構を究明した。(4)微生物リパーゼによる油脂のグリセロシス反応によって新規な組成の油脂の合成に成功した。また微生物ホスホリパーゼDによりレシチンからホスファチジルコリンを高純度で得るプロセスを確立した。(5)食用糸状菌のγ-グルタミルトランスペプチダーゼを用いて種々の生理活性をもつγ-グルタミンタウリンの合成を行った。(6)メタン生成細菌よって分泌されたコリノイドの主成分、ゴビンアミド(FB)の微生物活性を調べ、さらにFBのB-12への微生物変換をおこなった。(7)エステラーゼを用いて生理活性物質、1β-メチルカルバペネム、ビタミンD関連物質および抗腫瘍抗生物質リゾキシンの各合成中間体を合成した。(8)酵母およびエステラーゼを用いて抗生物質ペンタレノラクトンメチルエステル、かび胞子形成因子スポロゲンAO1などを合成した。(9)キレート形成に基づくタンパク質の修飾法を開発し、この原理に基づいて、修飾タンバクのリシン-セファデックスへの固定化を実現させた。
マイクロバブル内包ベシクルの超音波マニピュレーションに関する研究

本研究では,マイクロバブルDDSへの応用を目指し,マイクロバブル内包型ベシクルを効率よく作成,さらに超音波により,その位置を制御,膜を破壊する技術について,実験およびシミュレーションによる検討を行った.その結果,油水界面通過法の導入により,従来の静置水和法と比べ,格段に収率のよりマイクロバブル内包ベシクルの生成に成功し,さらに,実験より集束超音波によりベシクルの捕捉と膜の破壊を達成できる可能性を示すことに成功し,シミュレーションにより,効率よく膜の破壊を達成するための条件について調べ,ベシクル動かさずに膜破壊を達成していくための気泡サイズの条件などについて知見を得た.本研究では、マイクロバブルドラッグデリバリーシステムの開発と関係し、マイクロバブル内包型ベシクルの作成技術の確立と超音波音場によるベシクルの制御と破壊を目指している。平成27年度は、超音波音場によるマイクロバブルおよびマイクロバブルクラスターの制御技術を開発した。特に、従来の定在音場による制御方法ではなく、集束超音波による制御技術を中心に開発した。その結果、集束超音波の焦点にマイクロバブルを捕捉することに成功し、さらに焦点において多数のマイクロバブルを捕捉することによりマイクロバブルクラスターを形成することができること、このマイクロバブルクラスターのサイズには上限があり、最大サイズは照射する超音波の周波数で制御できることなどを示すことに成功した。ここで得られた実験結果を、個々の気泡の体積振動の固有振動数と気泡クラスターの固有振動数の関係に関するOmta(1987)の理論と比較した結果、気泡径と気泡クラスター径の比が、気泡の固有振動とクラスターの固有振動の比に反比例する関係については両者が定量的に良好な一致を示すことがわかった。一方、実験で利用されたマイクロバブルはシェルでコーティングされたものであり、シェルの効果を考慮していないOmata(1987)の理論に対し、反比例の関係を示す定数に違いが現れることを示した。すなわち、シェルでコーティングされたバブルでは、固有振動数が高くなる効果が現れることを実験的に示すことに成功した。得られた成果は、体外から超音波を照射して、血流内を移動するマイクロバブルの位置を制御する技術に対して重要な知見を与える。集束超音波を用いて、気泡の並進運動および気泡クラスターのサイズを制御する方法を開発し、実験により実証することに成功した。特に集束超音波によりマイクロバブルを捕捉する場合に、超音波の焦点で捕捉できる気泡クラスターサイズに上限があり、このサイズを超えると気泡クラスターにとって焦点は不安定位置となり、クラスターが逃避する現象の観測に成功した。また、このクラスターサイズの上限は、照射する集束超音波の周波数で制御できることを実験的に示した。以上の技術は、平成28年度のベシクル内包型マイクロバブルの制御と破壊に向けて、重要な意味をもち、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。液体中に存在する微細な気泡(マイクロバブル)は、超音波血管造影剤としての医療応用技術から水処理技術まで幅広い応用がある。本研究では、著者らがこれまで開発を進めて来たマイクロバブル内包ベシクルを集束超音波を用いて捕獲し、目的部位まで移動させ、破壊する技術を確立することを目的としている。本研究課題で開発される手法により、薬剤をはじめとする化学物質を、脂質分子膜を有するベシクル(リポソーム)内に気泡とともに封入し、遠方から照射する超音波で、ベシクルの挙動を制御することが可能となり、マイクロバブルドラッグデリバリーシステムやマイクロTASの分野など様々な用途への応用が期待できる。最終年度である平成28年度は、マイクロバブル内包ベシクルの生成法に関して,これまで行ってきた静置水和法による方法に加え、収率を上げるために、新しく油水界面通過法を導入した。油水界面通過法では,リン脂質を溶解させたミネラルオイルとグルコース水溶液で容器内に油水界面を形成させる.この油水界面にはリン脂質が吸着し,単分子膜が形成されることになる.これに対し,超音波血管造影マイクロバブルであるSonazoidを多数含んだリン脂質溶解ミネラルオイルを用いて油中水滴を形成し,その水滴の自重落下を持ちいて,マイクロバブル内包ベシクルの生成を行った.この手法により,従来の静置水和法による手法に比べ,格段に効率よくマイクロバブル内包ベシクルを生成することに成功した.さらにここで生成されたマイクロバブル内包ベシクルを、流路内に導入し、超音波音場にて,捕捉,破壊することための実験を実施した.また、実験に対応するシミュレーションモデルを構築し、超音波音場により、マイクロバブル内包ベシクルの位置制御を行い、ベシクル膜の破壊を効率よく行うための手法の検討を行った。本研究では,マイクロバブルDDSへの応用を目指し,マイクロバブル内包型ベシクルを効率よく作成,さらに超音波により,その位置を制御,膜を破壊する技術について,実験およびシミュレーションによる検討を行った.その結果,油水界面通過法の導入により,従来の静置水和法と比べ,格段に収率のよりマイクロバブル内包ベシクルの生成に成功し,さらに,実験より集束超音波によりベシクルの捕捉と膜の破壊を達成できる可能性を示すことに成功し,シミュレーションにより,効率よく膜の破壊を達成するための条件について調べ,ベシクル動かさずに膜破壊を達成していくための気泡サイズの条件などについて知見を得た.平成28年度は、平成27年度の成果を受けて、マイクロバブル内包ベシクルに対して集束超音波によりベシクルの位置制御および膜破壊を行うためのシステムを構築する。

具体的には、マイクロチャネルで生成されたマイクロバブルを静置水和法により生成するベシクル内に内包し、多数のマイクロバブル内包ベシクルを生成する。さらに、小サイズのもののみを選択的に抽出するために、定在音場中における第一ビヤクネス力を利用する。選択的に抽出された5ミクロン以下の小サイズのマイクロバブル内包ベシクルを血管を模擬した流路内に流し、集束超音波による捕捉を行う。最後に捕捉されたベシクルに対し、別の超音波トランスデューサより、パルス的に強力集束超音波の照射を行い、ベシクル内気泡の並進運動によりベシクルの膜破壊を達成する。流体工学
感光性複合材料を用いた微小管運動の制御と分子輸送システムへの応用

該当年度において、本研究では銅と感光性材料(SU-8)を混ぜ合わせた複合材料の加工特性、および光照射に対する温度上昇(光熱効果)の変化量を評価するとともに、生体試料を用いたバイオ応用への展開を試みた。複合材料の加工特性については、2050μmの規定パターンを有するフォトマスクを用いてフォトリソグラフィによる加工を行い、加工後のパターン寸法値を計測した。その結果、直径約5μmの銅粒子が70wt%となる複合材料を用いたとき、加工できる最小線幅は約25μmであることを確認した。また、あらかじめ作製しておいたマイクロ温度センサの周囲に同条件で調製した複合材料をパターニングし、光照射に対する温度変化を評価した結果、最大約17°Cの温度上昇量を計測した。生体試料を用いたバイオ応用への試みとして、複合材料で形成されたマイクロ構造の周囲に生体試料であるキネシンと微小管の運動系を構築し、光を照射したときの運動を観察した。移動する微小管は、照射する光の強度に応じて移動速度が変化する様子を示した。上記の結果より、作製したマイクロ構造は微小管運動の速度制御機構として有用であることを実証した。平成30年度においては、研究計画にて予定していた課題1をおおむね達成し、その成果が得られている。複合材料の加工性および光熱効果の評価については、加工できる最小線幅を明らかにするとともに、照射する励起光の強さによって周囲の温度が上昇することを確認した。微小管運動の制御機構として機能させるマイクロデバイス開発においては、光熱効果によってマイクロ構造周囲の微小管速度が変化する様子を観察した。また、微小管運動の不規則な移動方向をマイクロ構造によって物理的に制御する様子も一部の微小管で観察できた。このような状況から、本研究は次年度に計画している微小管運動による分子輸送システムの構築へと展開でき、おおむね順調に進展していると考えられる。今後は研究計画にて予定していた課題2の達成に向けて研究を遂行する。複合材料で形成されたマイクロ構造を用いて微小管運動の方向制御機構を作製するとともに、速度制御機構との融合によって効率的な輸送システムの構築を図る。また、微小管運動による分子輸送を実証するために、DNA相補結合系を用いた対象分子(Qdot)の輸送技術を確立する。上記の要素技術をオンチップ化し、分子輸送システムとしての有用性を実証するために、微小管運動による輸送効率をQdotの濃縮に伴う輝度値変化から定量的に評価する。また、高い輸送効率を得るために、適宜マイクロ構造の寸法や形状を最適化する計画である。当初の計画において設備備品費として計上していた落射蛍光装置の購入が不要となったため、次年度使用額が生じた。翌年度において当該助成金は物品費として使用する計画である。