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パーキンソン病関連内在性脳内アミンをリ-ド化合物とする抗パーキンソン病薬の開発

おそらくチロシン水酸化酵素に対する賦活効果あるいはその後のグルタミン酸作動系ニュ-ロン等に活性を有している可能性がある。そこで本年度の購入備品であるストップドフロ-装置を用いて、チロシン水酸化酵素に対するTIQ類の作用を検討すべく装置等の測定条件設定を行なった。従来では検出することが不可能であったTIQ類と活性酸素種及びチロシン水酸化酵素とのミリ秒以下での反応が追跡可能となり、現在抗パ-キンソン病薬に対する評価システムを構築中である。今後は合成した化合物群の中から更に薬効の著しい化合物を見いだし、より精緻な構造活性相関を展開して行きたいと考えている。前年度に引き続き、抗パーキンソン病薬候補としてアルキル基の種類、位置、個数の異なるテトラヒドロイソキノリン骨格を有する化合物を新たに化学合成し、光学分割が必要なものに関しては光学活性カラムを用いて高速液体クロマトグラフにて分取を行なった。上記化合物群を用いて抗パーキンソニズム活性を検討している際、予期に反して1-ベンジル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン(1BnTIQ)に極めて強い神経毒性が見いだされた。そこで1BnTIQ毒性を詳細に検討する目的でカニクイザルに皮下投与を行った。20mg/Kg程度の量で顕著な急性毒性を示し、66日間の連続投与を行い5日間休薬した際においても明らかな自発的運動量の低下が認められパーキンソニズム様症状を呈した。更に1BnTIQをマウス脳内から検出することに成功し、本化合物は内在性脳内アミンであることが明らかとなった。またパーキンソン病患者、脳室液中にも本化合物の存在を確忍した。これらの研究により、1BnTIQは真の内在性パーキンソン病発症物質である可能性が示された。今後は1BnTIQの構造類縁体にターゲットを絞り化学合成を行い、1BnTIQが有している毒性を防御する化合物のスクリーニングを行うことで、更に薬効の著しい化合物を見いだし、より精緻な構造活性相関を展開して行きたいと考えている。本年度はTIQ誘導体の中でとくにメチル基の置換位置と活性の関係について検討を加えた。(1R,3S)-1,3-DiMeTIQ及び(1S,3S)-1,3-DiMeTIQをそれぞれ不斉合成を行った。続いて両化合物それぞれの薬理作用を比較する目的でddY系雄性マウス(5週齢)に腹腔内投与後の自発的運動量の変化をOpen FieldTestを用いて検討した。その結果、いずれも用量依存的に移動量(ambulation)を増加させ、持続性も増大させたが、作用としては(1S,3S)体の方が強かった。以上述べたように、メチル基の有無や置換位置、立体配置の違いによりTIQ類の活性は大きく変わる。このことは、TIQ誘導体の構造活性相関を考える上で重要な知見であると思われる。今後上記の知見を踏まえて抗パーキンソン病薬の開発に向け研究を継続したい。
体内時計システムを応用した薬物誘発性うつ病を予測する評価系の構築

うつ病の発症に体内時計障害が関与することが指摘されている。本研究において、臨床上うつ病の発症が問題となるインターフェロンは、培養細胞において時計遺伝子の転写活性リズムを障害することが明らかとなった。また、体内時計システムは、うつ病と関わりの深いセロトニントランスポーターや薬物の体内動態を調節するP糖タンパク質の発現リズムを制御していることが明らかとなった。薬物誘発性精神疾患の原因薬物として知られるインターフェロンは、マウスの生体時計機能を障害することが知られている。この事象が培養細胞を用いたin vitro研究でも認められるか否かを明らかにするため、ルシフェラーゼ発現ベクターを用いた検討を行った。培養細胞に主要時計遺伝子(Per2)の転写調節領域を組み込んだプラスミドをトランスフェクトし、既報の手法を用いて培養細胞内でその転写活性に日内リズムを形成させ、次いで、そこにインターフェロンを添加するとルシフェラーゼの転写活性リズムの振幅が減少することを見出した。以上より、本システムを用いることにより薬物誘発性精神障害が予測できるものと考えられる。また近年、オセルタミビルによる小児患者における行動異常が社会問題となった。そこでオセルタミビルが時計遺伝子発現を変化させるか否かをBalb/cマウスを用いて検討したところ、若齢マウスでは視交叉上核における時計遺伝子(Per1)の発現量が増加したが、成熟マウスではそのような変化は認めなかった。さらに種々の拮抗薬を用いた検討により、若齢マウスにおけるオセルタミビルの影響はNMDA受容体を介していることが明らかになった。NMDA受容体は、一般に脳の発達、学習、記憶、神経情報処理に重要な役割を果たしている。NMDA受容体の発現分布は発生から成熟の過程で変化し、視交叉上核が存在する視床下部では出生後に発現量が減少することが知られている。したがって、NMDA受容体が発現している培養細胞系を用いることにより、小児に特異的に生じる薬物誘発性精神障害の発現リスクが予測できるものと考えられる。平成22年度より引き続き、in vitroバイオイメージングを利用して薬物誘発性うつ病に対する効果的な薬物の検討を行った。これまでの基礎研究により、インターフェロン(IFN)はヒストンアセチル基転移酵素活性を有するCLOCK遺伝子の発現を低下させ、Per2遺伝子の転写活性ズムに異常を来たすと考えられる。そこでHDAC阻害薬を用いて検討したところ、IFNによるPer2遺伝子のリズム障害を改善することを見出した。これらの成果から、エピゲノムレベルでのうつ病薬物療法の展開が期待される。オセルタミビルを用いた検討では、NMDA受容体が発現しているC6細胞およびNMDA受容体が発現していないNIH3T3細胞を用いて、時計機能に及ぼすオセルタミビルの影響を検討した。C6細胞において、オセルタミビルはERKや転写因子のリン酸化を促進し、Per2遺伝子の転写活性を上昇させた。しかし、オセルタミビルはNIH3T3細胞におけるPer2の転写活性に影響しなかった。NMDA受容体の発現分布は発生から成熟の過程で変化することが知られている。これらの細胞系を用いることで小児に特異的に発現する薬物有害反応を評価する予測系の構築が可能であると考えられる。セロトニントランスポーター(5-HTT)は細胞外セロトニン濃度を調節する因子の1つであり、うつ病発症のモノアミン欠乏仮説における重要な因子である。5-HTTは中脳縫線核に最も高発現しており、マウス中脳における5-HTTの発現量は日内リズムを示す。この日内リズム形成の分子メカニズムを検討したところ、マウス中脳内5-HTT発現の日内リズムは体内時計システムの制御下にあり、activating transcript ion factor4を介して形成されていることを明らかにした。したがって、体内時計とうつ病発症が密接に関与していると考えられる。
水面・緑地が都市の熱環境におよぼす効果の定量化に関する総合的研究

(1)人工衛星ランドサットTMデータを用い、人口60140万人の日本と韓国の8都市における土地被覆や土地利用の分布を解析し、その特徴を把握した。例えば福岡市における都心から郊外に向かう緑被率の上昇傾向は、他の都市に比較してなだらかである。また、熊本市の緑地面積比率は他の都市に比べて高い。(2)都市の気温分布を夏季、冬季の早朝と昼間に測定し、主成分分析を行った。その結果、早朝の気温分布に影響が大きい第1主成分としてエネルギー消費量、道路率、建物高さ、非木造面積がプラスの要素、緑地率、空地率、海岸距離、風速がマイナスの要素として挙げられる。昼間の気温分布に影響が大きい第2主成分として建物率、道路率、空地率、海岸距離がプラスの要素、水面率がマイナスの要素となる。(3)都市内緑地の日射遮蔽と蒸散による冷却効果に着目し、面的緑地として規模の緑被状況の異なる公園、緑的緑地として両側からの街路樹の樹冠がシェルターとなる道路、スポット的緑地として建物周囲に配置された緑群落などを採り上げ、気温、風速などの実測調査を行い、日向舗装面などとの比較を通じて解析した。街路樹の緑量の違いによって、最大2°Cの気温差が生じ、また同じ街路空間でも、その方位、風向などによって局所的な気温分布が生じる。樹冠による日射遮蔽は、日向のSET*の値より10°Cも低下させる。(4)都市空間の空気分布シミュレーションモデルのための資料として、地表面付近における熱流の渦相関法による実測を行った。舗装面では100W/m^2程度の熱流が測定され、対流熱伝達率として約10W/m^2°Cの値が得られた。1.ランドサットTMデータを利用して、熊本市での都市域の土地利用状況の把握を行い、国土数値情報の土地利用データの更新手法を検討した。その結果、更新期間の長い且つ若干古い土地利用情報となっている国土数値情報の土地利用データの更新・補間手法としてランドサットTMデータの利用は有効なものであることを確認した。2.福岡市における夏季の早朝静穏時と昼間海風発達時の気温分布を詳細に実測した。一方、細密な地図から福岡市の土地利用とエネルギー消費密度の分風図を作成した。早朝静穏時には建物が密集し、エネルギー消費密度の大きい都心部が高温となり、重相関係数も大きな値を示すのに対し、昼間の海間発達時には高温域が風下測に移行し、気温分布と土地利用の分布が対応しなくなることを明らかにした。3.福岡市の5点において気温分布の実測を行った。この5点は福岡地方の海陸風の主風向NNW-SSE方向に約12kmの長さにわたって直線的に並んでおり、建物屋上での気温と同時に各建物近傍の地上付近の気温測定を行った。その結果、海陸風による気温分布の影響が地上付近にも若干あること、建物密度が低いところはその影響が強いことを明らかにした。4.上記3.の実測結果に関連し、海陸風の主風向の方向に約12kmの長さに互る実測対象地域をモデル化して風速及び気温分布に関するK-ε2方式モデルによる2次元数値計算のプログラムを作成した。現在、実測値との照合を行いつつ、地表面温度などの境界条件に関して検討を行っている。5.都市公園緑地の気候緩和効果に関連して、樹陰の裸地と日向の砂地における気温,湿度,グローブ温度及び風速などの比較実測を行った。それ等の実測値を用いてWBG及びPMVなどの熱環境指標を算出し、樹陰内外の放射環境が非常に大きく異なることを明らかにした。

例えば福岡市における都心から郊外に向かう緑被率の上昇傾向は、他の都市に比較してなだらかである。また、熊本市の緑地面積比率は他の都市に比べて高い。(2)都市の気温分布を夏季、冬季の早朝と昼間に測定し、主成分分析を行った。その結果、早朝の気温分布に影響が大きい第1主成分としてエネルギー消費量、道路率、建物高さ、非木造面積がプラスの要素、緑地率、空地率、海岸距離、風速がマイナスの要素として挙げられる。昼間の気温分布に影響が大きい第2主成分として建物率、道路率、空地率、海岸距離がプラスの要素、水面率がマイナスの要素となる。(3)都市内緑地の日射遮蔽と蒸散による冷却効果に着目し、面的緑地として規模と緑被状況の異なる公園、線的緑地として両側からの街路樹の樹冠がシェルターとなる道路、スポット的緑地として建物周囲に配置された緑群落などを採り上げ、気温、風速などの実測調査を行い、日向舗装面などとの比較を通じて解析した。街路樹の緑量の違いによって、最大2°Cの気温差が生じ、また同じ街路空間でも、その方位、風向などによって局所的な気温分布が生じる。樹冠による日射遮蔽は、日向のSET*の値より10°Cも低下させる。(4)都市空間の空気分布シミュレーションモデルのための資料として、地表面付近における熱流の渦相関法による実測を行った。舗装面では100W/m^2程度の熱流が測定され、対流熱伝達率として約10W/m^2°Cの値が得られた。
傾斜機能HA-G-Ti複合体の生体活性と骨結合

本研究では、ハイドロキシアパタイト含有ガラス-チタン傾斜機能複合体(HA-G-Ti複合体)と骨との早期結合(骨の初期固定)を促進するための生体活性表面の改質を主目的に、生体外(in vitro)及び生体内(in vivo)の実験を行った。成果の概要は以下のようにまとめられる。(1)各種HAと複合体形成用ガラスとの焼成時における反応性が、HAの性状(性質、形態、結晶化度、気孔率等)と焼成温度によって異なること、又用いるHAによってHA-ガラス(G)セラミックにおけるホウ素含有アパタイト成分の生成が確認された。(2)疑似体液(Simulated body fluid:SBF)組成を改良した電解液を(modified SBF)を用いて、(a)電気化学的並びに(b)水熱・電気化学的手法により、炭酸アパタイトを主成分とする骨類似アパタイトを合成した。(a)電解液温度492゚C、電流密度1.3及び13mA/cm^2で生成されたアパタイトの組成形態及び微構造を系統的に調べた。(b)電解液温120200゚C、高圧水熱下で合成されたアパタイトの析出・成長挙動と、粒子形態(針状、板状及び顆粒状)並びに棒状単結晶に関する結晶学的知見を得た。(3)生体活性リン酸カルシウム塩、OCP、TCP及びTTCPの合成、SBF中及び生体内での相転移と生成物の同定、及びこれらとガラスとの複合物質TTCP-G、TTCP+TCP-Gの性質を調べ、その複合インプラントを用いた動物実験を行った。(4)(2)の(a)により針状炭酸アパタイトを析出被覆して表面改質を行ったHA-G-Ti複合体を作製した。それを日本白色ウサギ及び成犬大腿骨に埋入して、骨との結合強さ(引き抜き法による)の評価・解析及び生体硬組織(皮膚骨及び海綿骨)との結合界面の電顕観察を行った。引き抜き結合強さの平均値で比較すると、電気化学的表面処理をした複合体では、3週及び6週経過後では無処理の場合よりも、それぞれ約1.5及び1.3倍大きな値を示した。すなわち、HA-G-Ti複合体への針状炭酸アパタイトの電気化学的析出は、早期に新生骨の生成を促進する効果があることが実験的に明らかとなった。生体硬組織中にインプラント(埋植)されたHA-G-Ti複合体の固定は、第一義的にはその生体活性表面と皮質骨との強固な直接接合によってもたらされる。それゆえ早期結合の促進には、用いる生体活性物質、各種リン酸カルシウム塩の性質や形状・形態が著しく影響するとともに、焼成時におけるガラスとの反応性の問題も考慮する必要がある。かかる現点から以下の実験を行った。(1)4種類の合成ハイドロキシアパタイト(HA)と複合体用ガラスとの焼成時における反応性が、HAの性状(性質・形態、結晶化度、気孔率等)により異なって認められ、高い温度ではガラス中のB_2O_3成分との結合が示唆された。(2)HA-G-Tで複合体、プラズマスプレー-HA-Tiで及びTiインプラントの骨付着性を実験・検討した。

(3)疑似体液及びその改質電解液を用いて、電気化学的方法により、性状の異なるアパタイトをTi基材及びHA-G-Ti複合体上に電析・成長させ、電析条件{電流密度、液温度(592°C)、液組成}と生成アパタイトの組成、微構造と形状、電着組織との関係が詳細に調べた。(4)針状骨類似アパタイト(生成分は炭酸アパタイト)をHA-G-Ti複合体に被覆した表面改質複合体を、3、6及び9週間インプラントした実験により、著しい早期固定効果のあることが明らかとなった。(5)HAと吸収性リン酸カルシウム塩(α-TCP、β-TCP及びOCP)をラット体内の2カ所(体液量の豊富な腹直筋膜上と比較的少ない背部皮下間葉系結合組織)に埋入し、体液との溶解・析出反応による炭酸アパタイトへの相変化を調べ、α-TCP及びOCPの早期相変化を明らかにした。また、これらリン酸カルシウム塩を填塞した部位へのHA-G-Ti複合体インプラント実験では、α-TCP及びOCPが骨との結合強化に効果的であることが明らかになった。(6)高温高圧下(水熱合成)での電気化学的手法による生体活性アパタイトの合成に成功し、その構造と物性の解明が進んでいる。これらの研究成果は、口頭発表7、論文7編(含印刷中3、審査中1)にまとめられている。HA-G-Ti複合体を基本とした成犬用インプラントと骨との早期固定(生体硬組織で皮質骨との直接結合だけでなく海綿骨の石灰化をも含む)を実現するために、in vitro(生体外)及びin vivo(生体内)について実験を行った。(1)体内で析出・生成するアパタイトと性状(組成・性質・形態)が似た骨類似アパタイトを、改良疑似体液(modified SBF)を電解液として、電気化学的方法によりTi基板及びHA-G-Ti基板上に作製した。(a)電解液温492°C、電流密度1.3及び12.9mA/cm^2で生成されるアパタイトの種類、形態と微構造を系統的に調べ、生体類似針状アパタイト作製の条件とその結晶学的解析を電顕及びFT-IRを中心に行った。(b)オートクレーブによる液温度120200°Cでの高圧水熱合成下での電気化学的析出によって、生体骨類似炭酸アパタイトの結晶を効果的に析出・成長させることができた。生成量は、約140°Cで最も多く、液温の上昇とともに針状から棒状結晶になり、電流密度が比較的低い場合にその変化が顕著に認められ、単結晶の形で成長した。(2)(1)の結果とともに、HA-G-Ti複合体表面を改質したインプラントを作製し、成犬に埋入した結果、早期固定効果のあることが明らかとなった。(3)生体活性リン酸カルシウム塩、TTCP及びTCPのSBF中での転移と生成物の固定を行い、さらに、ガラスとの複合物質TTCP-G、TTCP+TCP-Gの性質を調べるとともに、その複合インプラントを用いた動物実験を行った。インプラントとその周辺組織との適合性に関し貴重な知見が得られた。(4)HA-G-Ti複合体及び表面改質複合体のインプラントの骨との結合を、特に結合界面に注目して解析し、インプラント最表面の生体活性層の状態により結合様式に違いのあることが明らかとなった。なお結合組織周辺での微小圧子法[荷重50mN(5g)]による弾塑性変形では、充分に再現性のある結果を得るに到らなかった。本研究成果は(1996年分)口頭発表16(うち国際会議及び海外講演6)、論文8(うち国際会議記録を含み欧文8)にまとめられ発表された。
分子標的治療薬による皮膚障害発症メカニズムに基づく新規予防・治療法の探索

分子標的治療薬による皮膚障害の発症機構としてSTAT3の活性変動に着目し、発症メカニズムに基づいた皮膚障害予防・治療法をin vitroで探索することを目的とした研究を実施した。HaCaT細胞においてソラフェニブによるSTAT3のリン酸化低下に抵抗する化合物のスクリーニングにより、P-VC-MgおよびPGE1を選定した。両化合物はSTAT3を介したアポトーシスの誘導に抵抗し、皮膚3次元モデルにおいても両化合物の皮膚障害に対する有用性が認められたため、これらの化合物が分子標的治療薬による皮膚障害の治療薬または予防薬として適応可能であることを示唆した。分子標的治療薬による皮膚障害は患者の60%以上に発症し、治療の中断やQOLを低下させる要因となっているため、臨床上重要な課題となっている。既に我々はSignal Transducer and Activator of Transcription (STAT)3が分子標的治療薬による皮膚障害の発症に大きく関与している可能性について報告している。本研究では、皮膚障害の治療メカニズムとしてSTAT3の活性変動に着目し、in vitroで候補化合物の探索を行うとともに、患者に適応することで有用性を確立することを目的とした。STAT3活性化スクリーニングを実施し、IN Cell Analyzerによるイメージングサイトメトリー法によりSTAT3の活性を維持する化合物を評価した。抗酸化物質や各種ビタミンから5種類の候補化合物を選出した。さらに、候補化合物を用いて皮膚角化細胞に対する細胞増殖アッセイを行い、マルチキナーゼ阻害薬による増殖抑制作用を減弱させる3つ(プロスタグランジンE1、ビタミンC誘導体、ビタミンB1)の化合物を最終候補化合物とした。その内、2種の候補化合物について、アポトーシスおよび関連因子の評価を行った。分子標的治療薬による皮膚障害において認められるSTAT3の活性低下に伴う各種アポトーシス関連因子の変動は、選出した2種の化合物(プロスタグランジンE1、ビタミンC誘導体)の共存により回復することが示された。また、そのメカニズムがSTAT3に寄与している可能性についても見出している。今後はさらなる詳細な基礎的検討を実施し、有効性のデータを蓄積すると同時に、これらの候補化合物を製剤化し、臨床試験により有効性を評価していく必要がある。当研究室では分子標的治療薬による皮膚障害の発症メカニズムにSignal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3)が寄与することをこれまでに報告している。これらの情報を基に分子標的治療薬によるSTAT3の活性低下を阻止する化合物のスクリーニングを行った。スクリーニングはイメージングサイトメトリーを用いてハイスループットに行い、化合物と分子標的治療薬をヒト表皮角化細胞(HaCaT細胞)に同時処置した際のSTAT3の核移行率を定量することで評価した結果、数種類の候補化合物を特定した。プロスタグランジンE1 (PGE1)は、分子標的治療薬であるソラフェニブのHaCaT細胞に対する増殖抑制作用を顕著に軽減させた。また、この現象は、Gsタンパク質共役型受容体-PKAカスケードから刺激を受けたCyclic AMP responsive element binding protein (CREB)を介したSTAT3の活性保護作用に基づく可能性を示唆した。ビタミンC誘導体であるMagnesium ascorbyl phosphate (P-VC-Mg)についても、ソラフェニブの増殖抑制作用を軽減させた。P-VC-MgについてもSTAT3のリン酸化を保護することにより、増殖抑制作用を軽減させる可能性を見出したが、STAT3の保護メカニズムについては分子生物学的な解明に至らなかった。以上より、分子標的治療薬による皮膚障害の発症メカニズムに基づく克服法の候補化合物を複数特定することができた。今後、臨床応用に向けた検討を行うことが必要である。平成26年度の研究実施計画に列挙したSTAT3活性化スクリーニング、候補化合物による生存試験およびアポトーシスの評価は概ね完了した。候補化合物のうちの一部は現在解析中であるが、計画項目の多くを実施できているため、順調に進展していると判断可能である。遺伝子導入法を用いた治療メカニズムの裏付けを実施する必要があるが、タンパク発現制御モデルの確立から評価まで、次年度の課題とする。ヒトを対象とした臨床研究については、倫理委員会の書類申請を進める必要があり、準備も含めて次年度の項目である。また、皮膚3次元モデルを用いた評価においては予備検討を進めており、被験物質の処置から、細胞増殖アッセイ、パラフィン包埋、免疫染色等の評価法を既に確立している。これらの全体の進捗を評価して概ね順調に進展していると判断した。臨床薬学皮膚3次元モデルを用いた評価については既に細胞増殖アッセイと組織免疫染色の最適化した評価系を確立しているため、それに基づいて検討を実施する。さらに、分泌タンパクの定量や経皮吸収量の測定等も適宜評価系を確立し、取り組んで行きたい。これらの評価系については当院皮膚科や病理部がノウハウを有しており、想定通り進まない場合の相談先として活用する。その他、基礎研究における技術面では、連携先である岡山大学薬学部や神戸薬科大学などから有益な助言を得る事が可能である。

臨床試験においては、対象患者の主科である泌尿器科、皮膚科と共同で行うことで、不測の事態に備える事とする。また、臨床試験における試験デザイン、サンプルサイズ、解析計画などの立案については、当院の臨床研究推進センターから助言を受けることが可能である。予定の出張に経費を使用することができず、旅費申請分を物品費として請求したため、差額が生じてしまった。少額であるため、次年度に物品費として使用することとする。平成26年度の研究費は多少の残余が生じたため、平成27年度の消耗品などに充填することとする。消耗品として細胞培養器具・試薬類(500,000円)、3次元モデル(200,000円)、抗体等(100,000円)を計上する。また、旅費として学会参加費用(100,000円)を予定している。さらに、その他の費用として成果投稿料・英文校正料(100,000円)などを予定している。
海洋生命系のダイナミクス

5年間の研究活動により,次の研究成果を得た.【総括班】海と陸の物理・化学的環境特性と生物の生活史特性を比較することにより,陸の生命について得られた従来の生命観とは異なる「海の生命観」を考察した.【生命史班】魚類全体の大規模分子系統樹を構築した.DNAデータの時間較正を行い,条鰭類の根幹を構成する主要な系統間の分岐年代を解明した.深海化学合成生物群集の主要な固有動物群について,生態学的調査と分子系統学的解析によって,それらの進化過程の全貌を明らかにした.【機能系班】心房性ナトリウム利尿ペプチドが新しいウナギの海水適応ホルモンであることを生理実験で証明すると共に,その分子進化を明らかにした.アコヤ貝の貝殻形成に関わる新規基質タンパク質を同定し、そのアミノ酸およびcDNA配列を決定すると共に,その発現部位を明らかにした.ワムシの個体数変動過程に密接に関わる遺伝子を同定し,高感度定量法を確立して個体数変動に伴う遺伝子発現パターンの変動を明らかにした.【連鎖系班】海洋生態系の生物・非生物粒子の分布,動態を定量的に解明するための高精度解析系を整備した.非生物態有機物と微小生物群集の鉛直分布を明らかにすると共に,それらの相互の動的平衡メカニズムを解明した.植物プランクトンの色素組成,動物プランクトンの微細構造,細菌群集の系統群別の増殖特性の解明を通じ,海洋生物のミク仁な連鎖過程を解明した.【変動系班】高緯度水域において海洋生物資源が大きく変動する理由は,初期生活史パラメタの変動がその後の大きな加入量変動を引き起こしているためと明らかになった.化学物質による海洋汚染は海洋動物の生理や繁殖機能に障害を与えており,汚染の国際監視体制を構築することが重要であると指摘した.非定常性,複雑性,不確実性という特性を持つ海洋生物資源は,MSY理論に代わって順応的理論で管理されるべきであると結論した.以下の4班に分かれて研究を進め、次の研究成果を得た。【生命史班】1.海水湖における海洋生命系の固有進化の研究に着手するとともに、2次共生光合成生物における細胞内の遺伝的・超微形態的制御のメカニズムを解析した。2.深海化学合成生物群集の主要な動物群であるハオリムシ類のほぼ全ての種、腕足動物門の高次分類群、およびラクエウス上科の全ての属の進化過程を明らかにした。3.主要分類群の代表魚種250種のミトコンドリアゲノム全塩基配列分析を達成し、真骨魚類の主要グループ間の系統関係の大枠を明らかにした。【機能系班】1.ワムシの個体数変動過程におけるストレスタンパク質の発現様式を明らかにするとともに、珪藻に高温ストレスを与えた際に発現する遺伝子を同定した。2.魚類の浸透圧調節に関わるホルモンのうち、作用時間の異なる心房性ナトリウム利尿ペプチドとコルチゾルの分泌協関および作用協関を明らかにした。【連鎖系班】1.懸濁物のサイズ分布を沿岸域で測定し、密度躍層で不連続な大型懸濁物の蓄積を見いだし、その生成プロセスについて検討した。2.分子微生物生態学的な手法によって沿岸における細菌群集の系統群別の酵素活性などが環境によって著しく異なることがわかり、微生物の多様性と機能の関係について理解を深めた。3.海洋表層におけるシアノバクテリアのフィコエリスリン(PE)の定量法を開発し、赤道域と東シナ海で深度とともに細胞内のPEが増加することを見いだした。【変動系班】1.宮古湾ニシンにおいて2000年と2001年の新規加入量が約2桁違うことを観測し、原因の特定を進めた。亜寒帯のニシンと温帯のマイワシで、成長速度の経年変動のしくみが異なっていることを明らかにした。2.有害化学物質による海洋汚染がカスピ海アザラシに与える影響を、妊娠率低下や免疫力低下によるウィルス症感染率の増加によって明らかにした。5年間の研究活動により,次の研究成果を得た.【総括班】海と陸の物理・化学的環境特性と生物の生活史特性を比較することにより,陸の生命について得られた従来の生命観とは異なる「海の生命観」を考察した.【生命史班】魚類全体の大規模分子系統樹を構築した.DNAデータの時間較正を行い,条鰭類の根幹を構成する主要な系統間の分岐年代を解明した.深海化学合成生物群集の主要な固有動物群について,生態学的調査と分子系統学的解析によって,それらの進化過程の全貌を明らかにした.【機能系班】心房性ナトリウム利尿ペプチドが新しいウナギの海水適応ホルモンであることを生理実験で証明すると共に,その分子進化を明らかにした.アコヤ貝の貝殻形成に関わる新規基質タンパク質を同定し、そのアミノ酸およびcDNA配列を決定すると共に,その発現部位を明らかにした.ワムシの個体数変動過程に密接に関わる遺伝子を同定し,高感度定量法を確立して個体数変動に伴う遺伝子発現パターンの変動を明らかにした.【連鎖系班】海洋生態系の生物・非生物粒子の分布,動態を定量的に解明するための高精度解析系を整備した.非生物態有機物と微小生物群集の鉛直分布を明らかにすると共に,それらの相互の動的平衡メカニズムを解明した.植物プランクトンの色素組成,動物プランクトンの微細構造,細菌群集の系統群別の増殖特性の解明を通じ,海洋生物のミク仁な連鎖過程を解明した.【変動系班】高緯度水域において海洋生物資源が大きく変動する理由は,初期生活史パラメタの変動がその後の大きな加入量変動を引き起こしているためと明らかになった.

化学物質による海洋汚染は海洋動物の生理や繁殖機能に障害を与えており,汚染の国際監視体制を構築することが重要であると指摘した.非定常性,複雑性,不確実性という特性を持つ海洋生物資源は,MSY理論に代わって順応的理論で管理されるべきであると結論した.計画の初年度にあたる本年は研究体制の整備,分析法の検討など種々の準備と実験・調査研究のサウンディングを行い,以下の成果を得た。【生命史班】1.藻類の進化について,紅色植物の多様化を共生生物との関わりを軸に解析を行っており,いくつかのグループについて,分子系統解析を完了した。2.海産無脊椎動物の遺伝的分化と種分化,ならびに深海生物の起源や後生動物の高次分類群間の系統関係について,浅海と深海の比較を軸にDNA解析を進めている。3.魚類を中心とした脊椎動物の系統進化について,新たに開発したロングPCRと魚類汎用プライマーを活用した方法を用いて,ミトコンドリアDNA全塩基配列分析を軸に研究を進めている。魚類の主要分類群の代表種250種を目標にしていたところ,既に100余種の解析を終えることができた。4.海洋の生物多様性の創出機構について,深海底における人為撹乱や環境の季節変動と種多様性の関連などを手がかりに研究を始めた。【機能系班】1.生物個体数の大変動の機構を明らかにするモデル動物としてシオミズツボワムシの培養系を確立し,変動と同期して発現するいくつかの遺伝子を同定した。2.バイオミネラルに含まれる有機基質の精製と,その役割を明らかにするためのアッセイ系を確立した。3.魚類の海洋における浸透圧調節を司るいくつかの輸送体遺伝子を同定した。4.インド洋において初めて深海底の化学合成生態系を発見した。【連鎖系班】1.コロイドサイズの粒子分布を新たな手法で解析し,その分布および特性が生産性の異なる海域によって明らかに違うことを見いだした。2.海洋の食物連鎖系の中で基部を占める微生物と溶存有機物とのリンクを解析するために,RIを用いた定量的実験手法を開発した。3.植物プランクトンの増殖と現存量との関係を検討したところ,限られたグループのプランクトンのみが海洋表層で著しい現存量を示しうることを見いだした。4.中・深層のデトリタスに依存する食物連鎖について、各生物群の相互関係を明らかにするために免疫学的手法を開発した。【変動系班】1.シン,ギビナゴ,マイワシなどの多獲性浮魚類の仔稚魚期の成長率を耳石日周輪の解析から推定した。同時に成熟体長,齢などの生活史パラメータの推定も行った。2.有害化学物質による海洋汚染と生物への影響をイルカ,ワレカラなどを用いて研究を進めた。3.マサバの資源量と漁獲量について,現状の漁獲を継続した場合と漁業管理を実施した場合の2ケースについて,今後の動向を予測した。また,1989年から実施されている漁獲管理下でのミナミマグロ資源の今後の動向を予測した。本年度は新たに総括班を設けて従来の4班に加えて計5班で研究を進め,以下の研究成果を得た。・ウナギの回遊行動の進化過程について分子系統学的解析を行った結果,ウナギは約1億年前の白亜紀に現在のインドネシア海域の海産魚として起源し,当初局地的小規模回遊をおこなっていたものと推測された。
気候変化が地域農業用淡水資源としての湖水環境に及ぼす影響評価

池田湖の底層は19902010年の21年間無酸素状態にあったが,2011年1月2月の平均気温が8°C(1987年以来最低)となり,表層水の冷却に起因して鉛直混合が生じ,2月中旬に一様な溶存酸素(4.5 mg/L)鉛直分布となった。この全循環は12月2月の約50日間で達成された。鉛直1次元数値モデルにより,温暖化傾向下における湖水温と溶存酸素の動態を検討した。数値解析の結果,1984,1986,2011年の湖の安定度指標は負値になり,全循環の年と一致した。本研究では,地域の農業用淡水資源である池田湖の水質について,特に水温と溶存酸素の時空間変化を観測データに基づいて明らかにすることを目的とする.長期的な変化としては,気候変化が湖水質に及ぼす影響を検討するために,池田湖の水質に関する過去の観測データを収集・整理し,長期の水質変化特性について考察を加える.この目的のため,今年度は,湖面上の養殖漁場筏を利用した気象観測システムの構築を行い,周辺の気象庁観測気象データとの比較対比を行った.また,筏を利用して溶存酸素の時空間変化の観測を行った.これらの観測は次年度以降も継続し,水温と溶存酸素の時空間変化特性を検討する数理モデルの構築のための基礎資料とする.長期的な観測結果のとりまとめにより,世界の湖沼の温暖化傾向と同様に,近年の気温と湖水温の上昇は対応している.また,溶存酸素は,1980年以降,水深100m,200mで減少傾向にあり,近年では,貧酸素状態にあることが分かった.また,2010年8月から2011年2月の月1回の現地観測結果によれば,夏から冬にかけての水温躍層の下層への移行とともに,溶存酸素の高い層が下層に移行するが,水温躍層以下では低い溶存酸素の値となっている.これは,水温躍層が溶存酸素の鉛直混合に対する抑制効果をもつためと推察される.数理モデルに関しては,水温の再現性を向上させるために,湖水の鉛直混合に影響を及ぼす湖面上の風速について検討した.日平均風速が4m/s以下の場合には,池田湖周辺における気象庁観測風速データと線形関係が認められたが,風速4m/s以上では両者の相関は低い結果となった.この点を考慮して,池田湖の水温解析モデルを再構築した結果,比較的よい鉛直水温分布を再現できることが分かった.今後水温及び溶存酸素の時空間変化を再現するための数理モデルの構築に有用と考える.本研究では,地域の農業用淡水資源である池田湖の水質に関し,主に水温と溶存酸素(DO)を対象に,これらの時空間変化を,鹿児島県による1980年以降の観測データ及び本研究による短期集中観測データに基づいて明らかにすることを目的とする.まず,気温と水温に関して,この地域の年平均気温の上昇率は,最近の30年間で0.032°C/年であり,これを反映して池田湖の深層の水温上昇率は0.030°C/年である.水深200mの水温は,1980年代において10.2°Cであったが2011年では11.0°Cである.この温暖化傾向下で,19812011年において深層までの全循環が生じたのは,1984,1986,2011年の2月の3回と推察される.2011年2月の全循環は,本研究で集中観測したDOのデータによれば,2010年12月末,湖の水温成層がなくなり鉛直混合抑制効果が減少するとともに,表層のDOが下層に供給され,水深40m付近までのDOが飽和値近くまで上昇する.次に2011年1月,積雪とともに気温が低下し,表層から深層までの水温が一様(約11°C)になる2月中旬には,鉛直混合により深層DOも4mg/Lまで上昇する.一方,この鉛直混合により,深層から上層に輸送される貧酸素水塊により表層のDOは低下し,DOも水温と同様に概ね一様化(45mg/L)する.34月にかけて,上層のDOは,再曝気により上昇,かつ光合成により過飽和状態も出現するが,水温の成層化につれて,水深50mより深い層では,鉛直混合が抑制され,生物化学的分解による酸素消費とともにDOが徐々に減少する傾向が観測された.ここでのDO動態の再現のため,生物・化学・物理的過程を考慮した数理モデルの構築を行う.すなわち,再曝気による酸素の供給,光合成による酸素生成,生物化学的分解による酸素消費,底質による酸素消費,鉛直渦動拡散混合のモデリングを行った.

本年度は,予備的検討として過去(2004年)の水温とDOの再現計算を行い,概ね妥当な結果を得た.本研究では,農業用水資源としての池田湖の水温と溶存酸素(DO)の時空間変化に及ぼす気候変化の影響について,水温,DO,気象の観測資料に基づいて検討を加え,さらに数理モデルにより水温とDO動態について考察した。まず,研究開始初年度(2011年2月)に,湖水の全循環が,25年ぶりに観測されたため,最終年度も引き続き,水温とDOの変化を11月から3月末まで,水深1, 10, 15, 30, 50, 60 mにおいて,1時間間隔で連続観測した。この短期集中観測データは,今後の数理モデルの精緻化や池田湖固有のパラメータ同定に活用できる貴重な観測資料となる。次に,鉛直1次元モデルにより,全循環の生じない時期(2004年)のDO濃度分布は比較的よく再現できた。全循環が生じた場合(2011年)では,表層-底層間の密度逆転の判別をモデルに組み込み,その場合に渦動拡散係数を大きくすることで,全循環過程を概ね再現できることを確認した。また,本モデルによれば,表層では光合成と鉛直混合,中層では鉛直混合,呼吸,BOD,及び深層ではBODが,DOの濃度変化に影響を及ぼす要因といえる。今後,観測データに基づいて,数値計算精度の向上が必要である。気候変化との関係を評価するために,1981年2011年までの水温解析を行った。1980年代後半の気温の上昇は,湖水安定度指標から判断すると,湖水の安定性を増大させ,その結果,全循環の喪失,さらに1990年以降の21年間の深層無酸素化を引きおこしたと推察される。以上の研究成果は,水文学に関する国際会議(フィンランド,2012年8月)で発表し,また湖水管理に関わる行政等(鹿児島県池田湖低層水質改善方策検討会,2012年12月;農林水産省農村工学研究所農工研気候変動定例研究会,2013年2月)に対しても情報発信を行った。当初計画した観測機器の設置,データ収集,整理,解析及び数理モデルの構築ともに遅滞なく進行している.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後,本研究で観測した2011年冬の鉛直循環におけるDO動態の再現に向けて,本研究で新たに構築した数理モデルを適用し検討する.また,研究成果を国際的視野で判断するために,次年度,水文学に関する国際会議に参加し,研究発表を行う.計画の大きな変更はないが,湖水中の溶存酸素のデータをさらにきめ細かく取得するために,観測機器を増やし,次年度も現地観測を継続する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
コムギの避陰反応の抑制による収量ポテンシャル向上の可能性の検証

赤色/遠赤色光比(R/FR比)の変化がコムギの生育や収量に及ぼす影響を調査し,避陰反応の抑制による収量ポテンシャル増加の可能性の検証を試みた.光質制御フィルムやLED光源を用いたR/FRの変化に対する反応を単一品種による2回の圃場試験で調査したが,いずれも生育および収量への明確な影響は認められなかった.続いて光質に対する生育反応の品種間差異について国内約50品種を用いて2回のポット試験を実施した結果,多くの品種で高R/FR環境で茎数増加と草高の低下という避陰反応と同様の形態反応が認められた.全品種の平均値では光質変化への反応に有意差が認められたが,2回とも同様に反応する品種はみつからなかった.26年度前半において,まず,圃場条件下でR/FR比を変化させる処理方法の検討を行った.光質の制御方法として,特定波長域の光を吸収する光質コントロールフィルムを利用する方法,およびLED等の光源による特定波長照射による用いる方法が考えられる.そこで,圃場環境下で使用できる全天候型のLEDおよび蛍光灯照明装置の既製品の探索とカスタマイズを行った.さらに26年度前半には,光質を測定するシステムの構築をおこなった.当時まで使用していた波長別光エネルギー分析装置がメーカーの保守対象外となり測定値の校正ができなくなった.このため赤色660nmおよび遠赤色720nmの2つの単波長のみを測定するセンサーと光量子センサーをコンパクトにまとめてロッドの先端に固定し,そのロッドを群落内に挿入することで,群落内の任意の位置のPARとR:FRの瞬間値を測定・記録できるシステムを新たに構築した.以上で完成した全天候型の赤色LED照明および対照区としての白色蛍光照明をダイズ圃場に設置し,約2ヶ月ほど実際に光質処理を実施して,計画している光質処理が可能であること,台風等の悪天候下でも浸水や破損せず,安定して使用できることを確認した.また,光質を測定するシステムを試用して定期的にダイズ群落内の光質の変化を測定した.その結果,従来の波長別光エネルギー分析装置でよりも短時間で多点の測定が可能であり,より平均的な測定結果が得られることが判明した.26年11月からはコムギの試験を実施中である.光質処理として,遠赤色光をカットする光質コントロールを用いた高R/FR処理,赤色LED照射による高R/FR処理,遠赤色LED照射による低R/FR処理を実施しており,発育形態に関する指標(最大茎数,出葉間隔,相対分げつ増加率)に対する影響を中心に調査を行っている.26年11月から27年6月にかけてコムギの圃場試験を実施した.条間25cm,株間3cmで条播したコムギ品種“さぬきの夢2009"に対し,光質処理として,遠赤外線域を吸収する光質コントロールフィルムおよび透明農業用ポリフィルムを畝の中央1条を挟むように屏風状に設置した.さらに,植物育成用660nm赤色LED(長さ1m,4本連続設置),730nmの遠赤色LED(長さ1m×1本設置)および植物育成用白色蛍光灯(長さ1m×1本設置)を地上10cmの高さに設置し中央1条に対して水平に照射した.無処理の対照区を含めて処理区数6,反復数は3とした.毎週,660nmと730nmの光量子量を同時に測定するセンサーを用いて群落内地上部のR: FRを測定した.温度の影響を評価するため,各処理区の地上10cmの高さの気温を熱電対で記録した.分げつ数,葉齢,草高を毎週,地上部乾物重と葉面積指数(LAI)を隔週,成熟期に収量および収量構成要素を調査した.本試験の結果,高R/FR比条件(遠赤外線吸収フィルムおよび赤色LED)は開花期を遅らせたが,個体あたりの茎数についてはいずれの処理も有意な効果はなかった.なお,収量および収量構成要素では穂数および一穂粒数は赤色LEDで高かったが,遠赤外線吸収フィルムが最も低かったことから,高R/FR比処理による収量への影響に一定の傾向はみられなかった.過去の試験では,遠赤色LEDによる茎数減少(2324年),赤色光LEDによる茎数増加(2526)を確認したが,いずれも僅かな差であり,本試験でも有意な効果はなかったことから,品種間差についての試験を開始した.27年11月に開始した試験では圃場試験で2つの栽植密度と赤色LED照射の影響を調査しているほか,ポット栽培した国内47品種による赤色LEDおよび遠赤色LEDによる茎数への影響の品種間差を調査している.初年度には計画どおりに圃場条件下で使用できる全天候型の光質処理システムを構築し,また,従来の波長別光エネルギー分析装置に変えて,データロガー,単波長センサーおよび光量子センサーを組み合わせた新しい光質測定システムを構築した.これにより機動性が高く,短時間で多点測定が可能となったことで,従来よりも信頼性の高い測定が可能となった.光質変化による茎数への影響について,申請者による過去の試験では遠赤色LEDによる茎数減少と赤色光LEDによる茎数増加を確認したものの,本研究課題での試験(2627年)では有意な影響は観察されていない.現在,2728年の圃場試験として2つの栽植密度と赤色LED照射の処理を実施しているが,今のところ大きな変化は観察されていない.

一方,ポット栽培した国内47品種による赤色LEDおよび遠赤色LEDによる茎数への影響については解析途中ではあるが,光質による分げつ性の品種間差が観察されている.なお,本研究課題の対象作物ではないが,ダイズにおいても圃場試験およびポット試験を実施し,栽植密度や赤色LED,遠赤色LEDによる光質変化による分枝の発生および成長に品種間差が認められる結果が得られている.26年と27年の11月6月に2回の圃場試験を実施した.条間25cm,株間3cmで条播したコムギ品種“さぬきの夢2009"に対し,光質処理として,遠赤外線域を吸収する光質コントロールフィルムおよび透明農業用ポリフィルムを畝の中央1条を挟むように屏風状に設置した.さらに,植物育成用660nm赤色LED(長さ1m,4本連続設置),730nmの遠赤色LED(長さ1m×1本設置)および植物育成用白色蛍光灯(長さ1m×1本設置)を地上10cmの高さに設置し中央1条に対して水平に照射した.毎週,660nmと730nmの光量子量を同時に測定するセンサーを用いて群落内地上部のR: FRを測定した.温度の影響を評価するため,各処理区の地上10cmの高さの気温を熱電対で記録した.分げつ数,葉齢,草高を毎週,地上部乾物重と葉面積指数(LAI)を隔週,成熟期に収量および収量構成要素を調査した.本試験の結果,高R/FR比条件(遠赤外線吸収フィルムおよび赤色LED)は開花期を遅らせたが,個体あたりの茎数についてはいずれの処理も有意な効果はなかった.なお,収量および収量構成要素では穂数および一穂粒数は赤色LEDで高かったが,遠赤外線吸収フィルムが最も低かったことから,高R/FR比処理による収量への影響に一定の傾向はみられなかった.圃場試験では以上のように光質処理による明確な影響はみられなかった.しかし,27年11月から圃場試験と並行して実施したポット試験において,高および低R/FR処理がコムギ分げつ性に及ぼす影響の品種間差を国内47品種を用いて調査したところ,光質に対する分げつ性の反応に明瞭な品種間差が認められた.光質に対する分げつ性反応の品種間差については再現性を確認し,さらに詳細を解明するため, 28年11月から前年同様のポット試験を実施している.圃場条件下で光質を変化させる実験システムと群落内の光質を迅速に多点測定する手法は計画どおり確立した.計画どおり2回の圃場試験を実施したが,いずれの圃場試験でも分げつ性に明確な反応はみられなかった.しかし,47品種を用いたポット試験(平成27年11月平成28年6月)では光質に対する分げつ性の反応に明瞭な品種間差が認められた.現在,同じポット試験を28年11月から再試験している最中である.具体的なデータの解析はこれからであるが,現在までのところ,昨年度と類似した品種反応が得られている.なお,本研究はコムギにおける分げつ性と光質との関係を明らかにすることを目的としているが,同じく圃場栽培したダイズの腋芽の発生・発育と光質との関係についても並行して試験を実施した.分枝特性の異なるダイズ2品種の群落内R:FR比の経時変化と群落内垂直方向におけるR:FR比との関係を調査した結果,ダイズの分枝特性の品種間差あるいは栽植密度間差とR:FR比の変化と関係には特定の因果関係は見られなかったという結果が得られ,論文で発表した.圃場条件下において光質を変化させる実験システムと群落内の光質を迅速に多点測定する手法は計画どおり確立した.
新規仮説に基づいたCOPDの発症機序の解明

COPDの発症機序を解明するために、「細胞死と老化仮説」に基づいてCOPD患者の肺組織、培養細胞、マウスを用いた検討を用いた検討を行った。その結果、COPD患者ではクララ細胞の老化のために末梢気道の傷害の修復が抑制されているとともに、老化細胞から産生されたメディエータを増強する機序が示唆された。したがってCOPD患者においては気道上皮の老化が気道の修復障害や慢性炎症の一因である可能性が示された。1.COPD患者の肺組織を用いた検討:COPD患者の末梢気道では健常喫煙者や非喫煙者と比べて老化関連cyclin-dependent kinasase inhibitorであるP16蛋白が陽性の老化したクララ細胞が増加していることが知られた。末梢気道における老化クララ細胞の割合と1秒率の間には負の相関関係が観察された。2.培養クララ細胞を用いた検討:培養したクララ様(NCI-H441)細胞にテロメラーゼ阻害剤(MST-312)を添加して細胞老化を誘導した。老化させたNCI-H441細胞からは非老化細胞に比べて多量のTNFα、TGFβ、sICAM-1が上清中に産生されていた。3.気道老化動物モデルを用いた検討:末梢気道のクララ細胞を特異的に傷害するナフタレンとBrdUを3週間反復与したマウスではsenescence-associated β-glactosidase陽性の老化クララ細胞が増加し,気道上皮の再生が抑制されていた。このクララ細胞老化マウスでは末梢気道周囲に白血球が浸潤していた。以上の結果から、COPD患者ではクララ細胞の老化のために末梢気道の傷害の修復が抑制されるとともに、老化細胞から産生されたメディエータが気道炎症や線維化を促進する機序が示唆された。したがって気道上皮の老化がCOPDにおける慢性気道炎症やリモデリングを促進する可能性が示された。老化はCOPDの重要な危険因子であるが、肺の老化がCOPDの発症を促進する機序は不明である。そこで前年度に引き続き、細胞死と老化仮説に基づいたCOPDの発症機序について、ヒト肺組織、培養細胞、マウスを用いた実験を行った。その結果、以下の3点の成績が知られた。1)COPD患者の末梢気道では、老化関連サイクリン依存性キナーゼ阻害蛋白であるp16を発現した老化クララ細胞が増加していた。これらの老化細胞では、リン酸化p38-MAPKを共発現していたことから、クララ細胞の老化が気道炎症の悪化の原因となることが示唆された。2)培養クララ様(NCI-H441)細胞にテロメラーゼ阻害薬やBrdUを添加して老化させたところ、培養上清中にTNFa、IL-6、IL-8などの炎症性サイトカインが増加し、ウエスタンブロッティング法ではp38-MAPKのリン酸化が確認された。3)末梢気道のクララ細胞を傷害するナフタレンと細胞老化を誘導するBrdUをマウスの腹腔内に1ヶ月間反復投与してクララ細胞が老化したマウスモデルを作成した。その結果、クララ細胞老化マウスでは、気道上皮の再生が抑制され、気道壁の白血球(CD45陽性)浸潤が増加していた。免疫染色では、老化したクララ細胞にリン酸化p38-MAPKが陽性に染色された。以上のヒト肺組織、培養細胞、動物を用いた実験から、COPD患者では末梢気道のクララ細胞が老化していること、さらに老化したクララ細胞ではp38MAPKが活性化して気道炎症の原因となる可能性が示された。今年度の成果とこれまでの研究成績を総合すると、気道や肺の老化が組織の再生障害と炎症をもたらし、COPDの発症を促進すると考えられた。
高等植物葉緑体のチオレドキシンカスケードの解明

本研究では、まず、標的酵素(ATP合成酵素)とチオレドキシン(Trx)との相互作用の解析を行った。ATP合成酵素では、複合体の中心部分のサブユニットγがTrxの標的を持っているため、このサブユニットを中心に変異導入を行った。調節に直接関与するCys(ホウレンソウ由来のATP合成酵素γサブユニットの^<199>Cysと^<205>Cys)近傍に、アミノ酸側鎖の電荷の変更、アミノ酸数残基の削除などの変異を導入したが、Trxとの相互作用に直接影響を与えるような変異は見つからなかつた。葉緑体由来のATP合成酵素とTrx(f型とm型)との相互作用については、葉緑体から直接単離精製したATP合成酵素とリコンビナントのTrxf型とm型を用いて検討した。両者の相互作用を調べているが、今のところ両者の親和性の違いを示す積極的なデータは得られていない。次に、植物葉緑体内のTrxと相互作用する標的タンパク質の全容を解明するために、実験系の整備を行った。植物葉緑体内にTrxがどの程度含まれているかを抗Trxポリクローナル抗体染色法を用いて評価した。さらに正確な定量を目指して、現在合成ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作成している。また、アフィニティークロマトグラフィーにより、標的となるタンパク質の探索を進めている。活性調節の分子機構の研究では、葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの回転を蛍光顕微鏡下で直接観察することに成功した。γサブユニットの調節部位近傍については、調節機能を担う二つのCysの近傍に変異を導入することで、調節機能に直接関与するアミノ酸配列の同定を試みた(投稿準備中)。さらに、γサブユニットの調節領域を含む150アミノ酸残基を安定に複合体が得られる好熱菌複合体の発現系に導入した。得られた好熱菌複合体は、酸化還元や阻害サブユニットであるεサブユニットによって調節され葉緑体酵素よりも安定で遺伝子操作も容易であり、非常に有用なモデル実験系である(J.Biol.Chem.in press)。
ASDの心理的・社会的葛藤場面での意思決定障害に関する神経経済学的研究

本年度は、研究開始に伴う手続き(被験者への説明文書、同意書、必要書類の準備、作成など)を行い、自閉スペクトラム症(ASD)群および健常対照群のリクルート体制を構築した。ASD群に関しては、昭和大学発達障害専門外来を受診された方に、研究の概要を説明し、参加募集を開始した。また、ASDの意思決定に関する先行研究をまとめること、関連学会に参加することで、他の精神疾患(統合失調症、強迫性障害、うつ病など)の意思決定パターンと比較し、ASDの病態理解に重要な意思決定課題、結果に応じた効果的介入方法について考察した。その上で、多様な葛藤場面での意思決定に関するパソコン課題、質問紙などを作成、準備した。さらに、予備実験を行うことで、ASD被験者の課題理解を高める方策についても検討し、課題内容を洗練した。加えて、予備実験を繰り返し、本研究課題における至適なMRI撮像パラメータを選定した。これまでの研究で、ASDにおいて、不確実な状況下での意思決定の特徴と社会技能との間に関連性を示唆する結果があり、同疾患の社会技能を向上する上で手掛かりとなる可能性がある。行動経済学的な観点から、不確実な状況を、確率がわかっている状況とわかっていない状況に区別すること、多様な文脈から評価することが、ASDの意思決定の特徴を客観的に評価する際に重要であることもわかってきた。また、意思決定パターンから、ASDのsubtypeについて検討することも、有効な個別化治療の確立のために重要であることも示唆される。今後、このような視点から、多角的検討を行っていく予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。