hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
開発早期におけるソフトウェア機能規模見積に関する研究

本研究では,開発の上流工程において精度の高い機能規模計測手法の確立を目指した.先ず,開発初期に作成されるユースケースモデルに基づいて機能規模(ユースケースポイント)を計測し,その値に基づいて工数見積りを行うユースケースポイント法の自動化について研究を行った.本研究では,同一のこのような計測者による誤差をなくすことを目的として,ユースケースモデルに幾つかの制限を設けた上で,ユースケースポイント計測で行われるアクタとユースケースの自動分類手法を提案し,その手法に基づくユースケースポイント計測システムを開発した.更に,計測システムをある企業で行われた5つのソフトウェアプロジェクトで作成されたユースケースモデルへ適用した.その結果,従来専門家が手作業で計測していた機能規模とほぼ同じ値を自動的に計測することが確認された.次に,ソースコードからの機能規模(ファンクションポイント)計測の自動化に関する研究を行った.本研究では,ソースコードの実行履歴に基づく動的解析結果を用いた機能規模計測と静的解析結果を用いた機能規模計測の2つのアプローチを行った.動的解析結果に基づく手法に関しては,機能規模計測の一部であるトランザクションファンクションの抽出を精度良く行うことができた.また,静的解析結果に基づく手法に関しては,計測対象を典型的なWebアプリケーションプログラムに限定することで,機能規模を精度高く計測することが確認できた.本研究では,開発の上流工程において精度の高い機能規模計測手法の確立を目指した.先ず,開発初期に作成されるユースケースモデルに基づいて機能規模(ユースケースポイント)を計測し,その値に基づいて工数見積りを行うユースケースポイント法の自動化について研究を行った.本研究では,同一のこのような計測者による誤差をなくすことを目的として,ユースケースモデルに幾つかの制限を設けた上で,ユースケースポイント計測で行われるアクタとユースケースの自動分類手法を提案し,その手法に基づくユースケースポイント計測システムを開発した.更に,計測システムをある企業で行われた5つのソフトウェアプロジェクトで作成されたユースケースモデルへ適用した.その結果,従来専門家が手作業で計測していた機能規模とほぼ同じ値を自動的に計測することが確認された.次に,ソースコードからの機能規模(ファンクションポイント)計測の自動化に関する研究を行った.本研究では,ソースコードの実行履歴に基づく動的解析結果を用いた機能規模計測と静的解析結果を用いた機能規模計測の2つのアプローチを行った.動的解析結果に基づく手法に関しては,機能規模計測の一部であるトランザクションファンクションの抽出を精度良く行うことができた.また,静的解析結果に基づく手法に関しては,計測対象を典型的なWebアプリケーションプログラムに限定することで,機能規模を精度高く計測することが確認できた.今年度は主に以下の項目について実施した.1)ユースケースポイント計測ツールの試作・改良ユースケースモデルからのユースケースポイント計測手法について検討した.ユースケースポイントとは,ユースケースモデル中のアクタとユースケースを,それぞれ3種類の複雑さ(複雑,平均,簡単)に分類し,重みを掛けて総和をとったものである.ユースケースポイント計測ツールを試作し,ある協力企業におけるユースケースモデルから実際にユースケースポイントの計測を行った.更に,専門家による計測結果の比較を行い,自動計測結果の問題点を確認した.この結果に基づいて,ユースケースポイント自動計測ルールの改良を行った.2)ソースコードからのファンクションポイント計測のための指針の検討ソースコードからのファンクションポイント計測を行うために利用できる技術の検討を行った.具体的には,オブジェクト指向プログラムの実行中に動作するオブジェクト群の変化に着目することで,実行履歴を意味のある機能単位で複数ブロックに分割する手法を提案し,その適用事例を示した.提案手法はプログラムの各機能を実現するオブジェクト群が異なることを想定しているため,今回紹介した解析系プログラムや,あるいはエンタープライズ系プログラムのような,各オブジェクトの役割が明確な「オブジェクト指向プログラムらしい」プログラムに対しては適用が容易である.分割された機能単位が,ファンクションポイント計測で必要なトランザクションファンクションに対応すると考えられる.本研究では,開発の上流工程において精度の高いファンクションポイント計測手法の確立を目指している.ファンクションポイント(FP)法とは,ソフトウェアの持つ機能数を基に規模を測定する手法である.通常,ファンクションポイント値は仕様書から計測されるが,FPの測定では測定者の判断が入るため,同一の仕様書からの計測であっても誤差が出ることが指摘されている.また,FPを工数見積等に利用するためには,過去に開発されたソフトウェアからのFP計測を行う必要があり,最終的に実装されたプログラムからファンクションポイント値を計測する手法が求められている.そこで,今年度は上流工程で得られたFP値を最終的に開発されたプログラムから得られたFP値と比較することにより,上流工程で得られたFP値がどの程度最終的なFP値と関係があるかどうかを評価するために,FP値を自動的にプログラムから計測する手法について検討する.ファンクションポイント値を計測するには,そのソフトウェア中で利用されるデータを表すデータファンクションと,データファンクションへの入力またはデータファンクションからの出力処理を表すトランザクションファンクションの特定が必要である.そこで今年度は,データファンクションと必要なテストデータが与えられるという前提で,プログラムの実行履歴とデータ依存関係解析結果を組み合わせることによってトランザクションファンクションを特定する方法を提案した.更に実際のWebアプリケーションに提案手法を適用し,有用性の確認を行った.今年度は主に以下の項目について実施した.1.ユースケースポィント計測ツールの開発平成17年度,18年度で検討してきたユースケースモデルからのユースケースポイント計測手法に基づいて計測ツールを開発し,評価実験を行った.

ユースケースポイントとは,ユースケースモデル中のアクタとユースケースを,それぞれ3種類の複雑さ(複雑,平均,簡単)に分類し,重みを掛けて総和をとったものである.ユースケースポイント計測ツールを開発し,ある協力企業におけるユースケースモデルから実際にユースケースポイントの計測を行った.更に,専門家による計測結果の比較を行い,自動計測結果の評価と計測ツールの改良を行った.2.Webアプリケーションのソースコードからのファンクションポイント計測手法の開発Strutsに基づいて開発されたWebアプリケーションのソースコードからのファンクションポイント計測手法を開発し,その計測ツールを試作した.提案手法では,トランザクションファンクションを画面遷移時に実行されるメソッドを解析することで抽出し,データファンクションはデータベース上のテーブルから抽出する.開発したツールを同一の仕様書から独立して開発された7種類のWebアプリケーションに適用してファンクションポイントを計測し,設計仕様書から得られたファンクションポイントとの比較を行った.比較の結果,ツールが計測した値は熟練者の測定した値に近い値であり,7種類のアプリケーション個々の値も近いものとなっていた.
骨代謝調節機構-とくに細胞間相互作用による調節

当研究課題で過去三年間で以下の研究成果を得たので報告する。1.PGE_2、IGFおよびTGF-βの骨細胞を介した破骨細胞形成および活性化への作用^<1,2)>(1)PGE_2は間質または骨芽細胞を介して破骨細胞を形成および活性化するが、破骨細胞の前駆細胞へは抑制的に働く。(2)IGFは直接、間接的に破骨細胞の形成および活性化を促進する。(3)IGF-βはPGE_2とほぼ同様の作用を示す。2.破骨細胞の分離と破骨細胞に特異的に発現している遺伝子^<4)>の分離と抗体の作製:Osteopontin,OC-II,MMP-9などを分離3.骨細胞の分離と骨細胞と破骨細胞の前駆細胞または破骨細胞との相互作用骨細胞は破骨細胞の形成およびその活性を抑制することを明らかにした。我々は骨細胞群に対するホルモン・サイトカインの作用を調べ以下の結果を得た。(1)LIFは1,25(OH)_2D_3のMC3T3ーE1への作用を抑制した。すなわち、1,25(OH)_2D_3は本細胞のALP活性、コラ-ゲンの合成を抑制するが、LIFはその1,25(OH)_2D_3の作用を弱めた。(2)LIFはMC3T3ーE1の1,25(OH)_2D_3へのリセプタ-数を減少させた。以上の結果から、LIFは1,25(OH)_2D_3のリセプタ-数を減少させることにより、1,25(OH)_2D_3のMC3T3ーE1の作用を軽減させる可能性が示唆された。[II]プロスタグランディン(PG)の骨芽細胞への作用(J.Biol.Chem)今回はとくにPGF_<2α>のMC3T3ーE1の増殖への作用について下記の結果を得た。(1)PGF_<2α>はMC3T3ーE1産生のIGF量には影響しなかった。(2)PGF_<2d>はMC3T3Eー1のIGFへの応答能を高めた。すなわち、IGFーIのリセプタ-数を増加させた。(3)PGF_<2α>はIGFーIの結合タンパク量を増加させた。以上の結果からIGF_<2α>はIGFーIへの応答能を高めるとともに、IGFーIの結合タンパクを増加させることによりMC3T3ーEI細胞の増殖を高めることが明らかとなった。[III]PGE_2の骨吸収への作用。PGE_2は間質細胞を介して破骨細胞の形成を促進することにより骨吸収を高めるが、前駆細胞への直接作用は逆に抑制的に作用することが明きらかとなった。[IV]IGFの骨吸収への作用(Endocrinology投稿中)。IGFは破骨細胞の形成を直接、間接的に促進し、骨吸収を促進することを明らかにした。以上ホルモン・サイトカインはお互いに協合しながら骨代謝に深くかかわっていることが明かになったI.全身性ホルモンとサイトカインの相互作用についてtransforming growthfactor-β(TGF-β)は骨吸収促進因子と考えられているがその作用機構について調べた。TGF-βは骨組織においては既存の破骨細胞による骨吸収を抑制するが、破骨細胞の形成は促進することがin vitroの骨吸収評価系を用いて明らかとなった。その破骨細胞の前駆細胞への作用はstromal cellsを介した間接作用であることが明らかとなった(1992年アメリカ骨代謝学会で発表)。II.均一な破骨細胞の分離我々は2週令の家兎長骨および肩甲から骨細胞群を分り、プラスチックディッシュで培養、破骨細胞と他の骨構成細胞とのプラスチックへの接着性との差を利用して、均一な破骨細胞を分離することに成功した。一匹の家兎から約20万個RNA量で約10μgを得ることができた^<1)>。(1)この破骨細胞からcDNA libraryを調整、破骨細胞にのみ産生される因子をcodeしたcDNAを脾臓とのdifferential hibridizationにより分離した。その1つはosteopontinであり、他の1つはcathepsin-L様proteaseであることを明らかにした^<2)>。(2)この破骨細胞を用いて破骨細胞に特有な単抗体を調整した。本年度は主として以下の四項目について結果を得たので報告する。

1.破骨細胞の分離とその特異蛋白をコードしている遺伝子の分離:この成果とししてOsteoponitin^<4)>、Oc-II^<4)>、破骨細胞に存在する特異的なたんぱく分解酵素、MMP-9が分離された。その他数個の遺伝子を分離、現在解析中である。2.この分離破骨細胞を用いて破骨細胞に特異的な単抗体の確立:この抗体は融合過程の破骨細胞にのみ存在する抗原を認識することから、融合因子である可能性もあり、現在抗原を精製中である。分子量12万位の抗原分離に成功しており、sequence中である。3.骨細胞の分離の破骨細胞形成への作用:骨組織中に多数存在している骨細胞に焦点をあて、この分離法を確立した。純度95%以上の細胞を16日齢ニワトリ胚頭頂骨から分離した。この細胞が破骨細胞の形成を促進することを明らかにした。この研究については現在論文作成中である。またこの骨細胞を中心課題とした科学映画を制作した(ヨネプロ制作)。4.骨細胞が産生している破骨細胞活性の抑制因子の分離と精製:分離骨細胞が産生している破骨細胞の活性抑制因子を我々の教室で確立した骨吸収活性の評価系を用いて分離精製に成功、現在そのアミノ酸構成についてsequence中である。
数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムの開発に関する基礎的研究

本研究は、各学校段階の児童生徒の発達段階や学習内容の適時性などに配慮しつつ、数学的活動(以下、数学的活動には算数的活動も含めた総称とする)をコアに据えて、その基本を「算数・数学をつくる」ことと「算数・数学をつかう」ことに置くとともに、学校数学の内容を「数学的内容」と算数。・数学をつくったりつかったりするための「ブロセス・スキル」に視点を置いて学校数学にこでは、主として小・中学校の算数・数学科を視野に入れている)の教育内容を構成する原理を明らかにし、それに基づいて数学的活動をコアとしたカリキュラムを提案することを目的として展開された。平成16年度は関係資料の収集及び分1斤を中心に、平成17年度は先行研究を踏まえ、授業実践を加えて、数学的活動を授業で展開する試行を繰り返し、それらに基づいて基本的な枠組みを構成した。平成18年度は、平成17年度までに設定した数学的活動をコアとした学院数学カリキュラムを構成するための基本枠組みにもとづき、小学校算数料及び中学校数学科の指導内容から素材を取り上げ、実践的検討を行った。その際、諸外国の情報や実践事例なども参照した。具体的には、まず、これまでに案として設定されている数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムを構成するための基本枠組みについて、関連する文献や授業実践を踏まえて精査検討し、基本格組みを確定した。次いで、東京都品川区立戸越小学校の算数料の授業実践を通し、これまでの実践事例の改善と新たな実践事例の開発を行った。最後に、実践事例の分脈に基づいて、数学的活動をコアとしたカリキュラムの基本枠組みを再検討し、学校数学カリキュラムの改善の方向を明らかにした。とりわけ、授業改善においては、単位時間を大きく4つの段階、つかみ・見通す、調べ・確かめる、話し合いまとめる、振り返り発展させるに区分し、それぞれの段階でなすべきことを明らかにできた。本研究では、各学校段階の児童生徒の発達段階や学習内容の適時性などに配慮しつつ、数学的活動をコアに据え、その基本を「算数・数学を創る」ことと「算数・数学を使う」ことに置くとともに、学校数学の内容を「数学的内容」と算数数学を創ったり使ったりするための「プロセス・スキル」に視点をあてて学校数学の教育内容を構成し、提案し、わが国の将来の学校数学カリキュラム改善への示唆を提案することを目的とする。本研究は、大きく三つ研究課題を順次解決しながら進める。すなわち、第一の研究課題は「数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムの『基本枠組み』としての『算数・数学を創る』と『算数・数学を使う』の二つの視点に関する先行研究や関連研究をレビューし、二つの視点を定立する」ことであり、第二の研究課題は「『基本枠組み』に、下位の視点『数学的内容』と『プロセススキル』を加え、学校数学カリキュラムの骨組みを構成する」ことであり、第三の研究課題は「構成された学校数学カリキュラム案について事例研究を通してのその妥当性や実現可能性等についての確認しつつ、カリキュラム案を精緻化する」ことである。平成16年度は、第一の研究課題「数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムの『基本枠組み』としての『算数・数学を創る』と『算数・数学を使う』の二つの視点に関する先行研究や関連研究をレビューし、二つの視点を定立する」ことを主たる研究目的とし、諸外国の先進的な学校数学カリキュラムの分析やそれらに関する先行研究の検討、わが国の戦後学校数学の変遷を辿り二つの視点から見ての諸知見の抽出をそれぞれ行い、「基本粋組み」を構成する原理・原則を抽出し、それに基づいて学校数学カリキュラムの「基本枠組み」を構成した。

本研究では、各学校段階の児童生徒の発達段階や学習内容の適時性などに配慮しつつ、数学的活動をコアに据えて、その基本を「算数・数学を創る」ことと「算数・数学を使う」ことに置くとともに、学校数学の内容を「数学的内容」と算数・数学を創ったり使ったりするための「プロセス・スキル」に視点を当てて学校数学の教育内容を構成し、提案し、わが国の将来の学校数学カリキュラム改善への示唆を提案することを目的とする。平成17年度は、平成16年度に文献研究を中心として抽出した学校数学カリキュラムの「基本枠組み」を参照しつつ、数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムを構成するための「基本枠組み」を設定し、学校数学カリキュラムの記述を試みた。次いで、諸外国の実践事例を新しい基本枠組み及び記述された学校数学カリキュラムから分析検討し、それらを踏まえて、新たな実践事例の開発を行った。具体的には、1年間を3期に分けて、それぞれ、4月9月において、数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムを構成するための「基本枠組み」を設定し、学校数学カリキュラムの記述を試み、10月12月において、カリキュラムの実現可能性を確認するための実践事例の開発のため、諸外国の関連する事例の収集と分析、その成果及び「基本枠組み」を踏まえた新たな実践事例の構成に取り組み、「算数・数学を創る」視点からの事例と「算数・数学を使う」視点からの事例をそれぞれ作成し、1月3月において、実践事例の分析を基とに、それらを精緻化し、それらに基づいて、数学的活動をコアとしたカリキュラムの基本枠組みの検討及び学校数学カリキュラムの改善の方向を抽出した。本研究では、各学校段階の児童生徒の発達段階や学習内容の適時性などに配慮しつつ、数学的活動(以下、数学的活動には算数的活動も含めた総称とする)をコアに据えて、その基本を「算数・数学をつくる」ことと「算数・数学をつかう」ことに置くとともに、学校数学の内容を「数学的内容」と算数・数学をつくったりつかったりするための「プロセス・スキル」に視点を当てて学校数学(ここでは、主として小・中学校の算数・数学科を視野に入れている)の教育内容を構成する原理を明らかにし、それに基づいて数学的活動をコアとしたカリキュラムを提案し、わが国の将来の学校数学カリキュラム改善への示唆を提供することを目的とする。平成18年度は、平成17年度までに設定した数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムを構成するための基本枠組みにもとづき、小学校算数科及び中学校数学科の指導内容から素材を取り上げ、実践的検討を行った。その際、諸外国の情報や実践事例なども参照した。具体的には、まず、これまでに案として設定されている数学的活動をコアとした学校数学カリキュラムを構成するための基本枠組みについて、関連する文献や授業実践を踏まえて精査検討し、基本枠組みを確定した。次いで、東京都品川区立戸越小学校及び埼玉県上尾市立尾山台小学校において、小学校算数科の授業実践を通し、これまでの実践事例の改善と新たな実践事例の開発を行った。最後に、実践事例の分析に基づいて、数学的活動をコアとしたカリキュラムの基本枠組みを再検討し、学校数学カリキュラムの改善の方向を明らかにした。
１９世紀ドイツ哲学史の再検討―批判主義の徹底化の系譜とその現代的意義の解明

本年もまた、(1)J.F.フリースの哲学の解明と再評価、(2)ショーペンハウアーの哲学の再構成、(3)19世紀ドイツ哲学史の再検討、の三つの柱に基づいて、以下の通り課題を遂行した。(1)フリース第一に、「物自体」概念の検討を行った。具体的には、『知識・信仰・予感』の記述に着目することで、フリースに認められるべき「物自体」に対する態度の両義性のうちに、フリースによる本概念の読み替えの試みと、「知的直観」の概念に対する批判的論点の存在を指摘した。第二に、「真理感情」の概念の検討を行った。フリースは、「哲学的認識」の発見を支える契機として、「真理感情」という契機を重視するようになる。本研究では、哲学の対象の実践哲学への拡張に応じて、本概念に担わされるべき役割の見直しと重点化が図られていることを指摘した。(2)ショーペンハウアー「物自体としての意志」を原理とした形而上学の成立を主題的に取り上げて、ショーペンハウアー哲学において「主観-客観-関係」という図式に認められる限界と、「物自体」概念に担わされている役割の変化を、テキストの記述に即して再構成した。(3)19世紀ドイツ哲学史ヘーゲル学派や新カント派に対する対立軸を形成していた「フリース学派」および「新フリース学派」の内実に光を当てた。「フリース学派」の活動は、E.F.アーペルト(1812-1859)の活動によって代表されるが、その「哲学と自然科学の架橋」に重点を置き「帰納」の役割を重視した解釈姿勢は、同時代および後世のフリース理解に対して、一定の影響を残した。「新フリース学派」の活動は、レオナルト・ネルゾン(1882-1927)によって代表され、近年は科学思想史上の影響関係が指摘されている。ネルゾンの解釈は、フリースの「理性の自己信頼」という概念に光を当てて、形而上学的認識の根拠づけにおける主観的な側面を前景化させた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、19世紀ドイツ哲学史における批判主義の徹底化の系譜の再検討であり、より具体的には、(1)J.F.フリースの哲学の解明と再評価、(2)A.ショーペンハウアーの哲学の再構成、(3)以上を踏まえた19世紀ドイツ哲学史の再検討、の三つの柱からなる。本年は、おもに「哲学方法論」の問題へと着目することで、各々へのアプローチを試みた。(1)フリース「理性批判」の諸問題に主眼を置いた研究を行った。現代にいたるフリース理解の基本線をなしているのは、ヘーゲル学派のクーノ・フィッシャーがフリースに対して行った一連の批判である。フィッシャーはフリースの立場を「理性批判が探究するものはア・プリオリだが、探究それ自体はア・ポステリオリである」というテーゼに集約したうえで、「ア・プリオリな原理はア・ポステリオリには認識されえない」と主張することでフリースを斥ける。そこで本研究では、フィッシャーによる批判への応答を行うことで、フリースの哲学的立場の独自性に光をあてた。(2)ショーペンハウアー第一に、ショーペンハウアー哲学の方法論を主題的に取り上げた。とりわけ本研究では、上記の研究課題を視座として設定することで、従来看過されがちであったショーペンハウアー哲学における哲学方法論の意義を、フリースとの関わりにおいて捉えなおすことを試みた。第二に、ショーペンハウアーの倫理思想についても研究を行い、主に「想像力」が倫理学において果たす役割へと着目することで、彼の「想像力」概念に認められる従来看過されてきた側面へと光を当てた。(3)19世紀ドイツ哲学史ショーペンハウアーとフリースが位置する19世紀ドイツ哲学史の思想的布置に対して、上記の哲学者ごとの研究に加えて、おもに概念史的な視点を設定することで、従来看過されがちであった哲学史的側面へと光を当てることを試みた。上に示した三つの主題について、下記の通り、概ね計画通りに課題を遂行した。(1)フリース本研究では、ネルゾンに代表される従来のフリース研究のもつ問題点を指摘するとともに、フリース自身における思想の発展に着目することによる応答を行った。フリースは主著『新理性批判』以降になると、「ア・プリオリな原理」の担い手としての「理性」と、それを発見する主体である「思惟的な反省能力」としての「悟性」のあいだの区別を強調することで、「ア・プリオリな原理」の成立可能性を模索するようになる。この事実へと着目することで、「哲学すること(philosophieren)」の射程と方法を主題的に扱うという、従来看過されがちであったフリース哲学の独自性が明らかとなった。(2)ショーペンハウアー第一に、「帰納」概念の位置づけの変遷に着目することで、哲学方法論に関する諸概念の洗練化の過程と、そのフリースからの影響を指摘した。さらに、「抽象」という方法論をめぐるフリースとのあいだの親近性を明らかにすることで、ショーペンハウアー哲学の方法論の狙いを見定めるための新たな視座を切り開いた。第二に、彼の「共苦」および「良心」に関する記述を手掛かりとして、「想像力」の変容の可能性が認められていることを指摘した。これによって、彼の倫理思想が含意する「哲学すること」との関わりを明らかにするための着手点が得られた。

(3)19世紀ドイツ哲学史「一元論(monism)」概念の用例史の検討を通じて、フリースにならぶカント主義者であるヘルバルトから、ロッツェ、ハルトマンを経て英語圏へと至る思想的潮流の一端へと光を当てた。また、J.レマンスキーによるヴィトゲンシュタインとショーペンハウアーの比較研究の紹介と検討を通じて、分析哲学史におけるショーペンハウアーおよび19世紀ドイツ哲学史の位置づけを見直すための視座がもたらされた。本年もまた、(1)J.F.フリースの哲学の解明と再評価、(2)ショーペンハウアーの哲学の再構成、(3)19世紀ドイツ哲学史の再検討、の三つの柱に基づいて、以下の通り課題を遂行した。(1)フリース第一に、「物自体」概念の検討を行った。具体的には、『知識・信仰・予感』の記述に着目することで、フリースに認められるべき「物自体」に対する態度の両義性のうちに、フリースによる本概念の読み替えの試みと、「知的直観」の概念に対する批判的論点の存在を指摘した。第二に、「真理感情」の概念の検討を行った。フリースは、「哲学的認識」の発見を支える契機として、「真理感情」という契機を重視するようになる。本研究では、哲学の対象の実践哲学への拡張に応じて、本概念に担わされるべき役割の見直しと重点化が図られていることを指摘した。(2)ショーペンハウアー「物自体としての意志」を原理とした形而上学の成立を主題的に取り上げて、ショーペンハウアー哲学において「主観-客観-関係」という図式に認められる限界と、「物自体」概念に担わされている役割の変化を、テキストの記述に即して再構成した。(3)19世紀ドイツ哲学史ヘーゲル学派や新カント派に対する対立軸を形成していた「フリース学派」および「新フリース学派」の内実に光を当てた。「フリース学派」の活動は、E.F.アーペルト(1812-1859)の活動によって代表されるが、その「哲学と自然科学の架橋」に重点を置き「帰納」の役割を重視した解釈姿勢は、同時代および後世のフリース理解に対して、一定の影響を残した。「新フリース学派」の活動は、レオナルト・ネルゾン(1882-1927)によって代表され、近年は科学思想史上の影響関係が指摘されている。ネルゾンの解釈は、フリースの「理性の自己信頼」という概念に光を当てて、形而上学的認識の根拠づけにおける主観的な側面を前景化させた。これまでの研究成果を踏まえて、今後は哲学方法論と哲学体系のあいだの関係を扱うことで、フリースおよびショーペンハウアーの哲学プログラムの全体像へと光を当てるとともに、これを踏まえて、引き続き19世紀ドイツ哲学史の再検討を行うことを目指す。具体的には、以下の課題の達成を目標とする。(1)フリース(A)真理感情、(B)物自体、という二つの概念に着目して、哲学方法論と哲学体系のあいだの接続関係へと光を当てる。(A)フリースは、哲学的探究を支える契機として、上述した論点に加えて、「真理感情」という概念を導入する。本研究では、時期に応じた本概念の発展から、フリース哲学の企図の捉え返しを試みる。(B)上述の哲学方法論の帰結として、フリースは特に主著以降になると、哲学的な諸認識の種類を、「知識」「信仰」「予感」の三種類へと区分するが、その帰結として、「物自体」に関する記述に両義性が認められるようになる。
脳卒中に伴う摂食嚥下障害発生機構の神経解剖学的解明

脳卒中により「咬む」機能や「飲み込む」機能に障がいを認めることがある。本研究は脳虚血による「咬む」機能や「飲み込む」機能への影響を神経解剖学的に解明することを目的とした。本研究により、意識下での運動を制御する大脳皮質から「咬む」機能や「飲み込む」機能を制御する領域に多くの情報伝達があることが明らかになった。しかし、脳卒中の発生場所や重症度がこれらの機能にいかに影響するかについては、更なる検討が必要である。本研究課題は脳卒中に伴う摂食嚥下障害発生機構の神経解剖学的解明を試みるものである。平成24年度は1一過性脳虚血モデルラット作出のプロトコールの作成、および2三叉神経運動核、顔面神経核、舌下神経核、疑核へ入力するニューロンの分布様体を解明することを目指して研究計画をスタートした(昨年度の「研究実施状況報告書」に記載の通り)。1のテーマについて、その第一段階として、脳組織の標本作成を行う際の組織の変形について検討を行った。これは脳虚血が生じたときにその影響範囲を定量的に評価するときの基礎的データを得るために実施した。脳の組織標本作製に当たって、固定→切片薄切→免疫組織化学的反応→乾燥→包埋という多くのステップが必要になる。その過程で組織の変形が生じる可能性があるが、どのような変化が起こるかについての詳細な検討はなされていない。本研究での検討の結果、ラットを用いての標本作成時、特に「乾燥」のステップで大きな収縮が生じることが明らかとなった。さらに、標本(切片)の厚さが厚いほど収縮の程度が大きくなることが明らかとなった。これらのことから、虚血による脳組織の変化を評価する際には、厚さ30マイクロメートル以下の切片薄切を行えば、生体の脳組織からの収縮が5%以内に抑制できることが示唆された。また、2のテーマについて、脳への神経トレーサー注入法を用いて、ラット大脳皮質(2次感覚皮質)と口腔顔面領域の2次感覚ニューロンプールとの線維連絡について検討した。その結果、2次感覚皮質と反対側の三叉神経感覚群との間に密接な線維連絡があることが明らかとなった。このことは、大脳皮質2次感覚皮質に虚血が生じた際に、口腔顔面領域からの感覚入力に何らかの変化が生じ、摂食嚥下機能に影響をもたらすことが示唆された。本研究課題は、脳卒中に伴う摂食嚥下障害発生機構を神経解剖学的手法により解明することを目的としたものである。平成25年度は、「再現性」が高い脳卒中モデルラットの作出を試みた。「再現性」を高めるためには、動物の死亡率が低いこと、手技が複雑でないこと、梗塞(虚血)の範囲が一定になること、などが必要となってくる。平成25年度は、大脳半側局所虚血モデルとして多く利用されている中大脳動脈(middle cerebral artery, MCA)閉塞モデルの作出を試みた。このモデルでは、線条体(大脳基底核)や大脳皮質の広い領域に虚血を生じることもあり、ヒトの脳虚血の臨床的モデルとしてしばしば利用されている。筆者らは、Ulu&ccedilら(2011)の方法を参考に、現在多くの研究者により用いられる血管内閉塞モデル(intraluminal MCAO model)による虚血モデル作成を実施した。しかし、虚血範囲を一定にすることは非常に困難であった。そのため、摂食嚥下機能を含む口腔顔面機能への影響が不定となり、機能の異常が虚血によるものか、それ以外の因子によるものかの考察が極めて困難であった。しかしながら、本研究で作成したモデル動物の一部で、手術前に比べた手術後の食餌量の減少を確認しており(未発表)、摂食嚥下機能に何らかの影響が生じている可能性がある。また、正常ラットを用いた実験結果から、大脳皮質の運動野のみならず感覚野からも顎運動を制御する線維連絡があることを明らかにした。したがって、大脳皮質の広い領域が顎運動をはじめ、口腔顔面機能の制御に関わっており、脳虚血が直接的に摂食嚥下障害をもたらす可能性が高いことが示唆された。今後は、脳卒中モデル動物の作出方法にさらなる改良を加え、摂食嚥下機能への影響を検討する必要がある。当初計画において、平成23年度は2つのテーマを設定していた。1つは「一過性脳虚血モデルラットの作成」で、もう一つは、摂食嚥下機能の制御に関わる三叉神経運動核、顔面神経核、舌下神経核、疑核へ入力するニューロン、すなわち「運動前ニューロンの分布の様態の解明」である。脳虚血モデルラットの作成については、縫合糸による血管結紮のみならずステンレスビーズを用いた血管梗塞による手法も試用し、我々の目的に合致するプロトコールを開発中である。

モデルラットの作成に当たっては、同一の手法を用いても、それによる影響の出現(梗塞が発生する範囲、運動障害など発生する症状、死亡率など)が変動し、「再現性」の確立が大きな課題であることが分かってきた。平成24年度はこの問題点の克服に重点を置いて計画を進行する。また、脳虚血により変性したニューロンの同定を行う手法を併せて検討する。運動前ニューロンの分布様態については、三叉神経運動核に対する運動前ニューロンの分布を詳細に検討中である。三叉神経運動核は、開口筋運動ニューロンが分布する領域と閉口筋運動ニューロンが分布する領域とに分かれており、それぞれについて運動前ニューロンの分布を検討した。その結果、三叉神経感覚核群、三叉神経上核、脳幹網様体など様々な領域からの入力を受けていることが明らかとなった。その成果の一部は第47回日本理学療法学術大会(神戸)などの学会で報告予定である。平成24年度は三叉神経系に加えて、舌下神経核について詳細に運動前ニューロンの分布を解明する予定である。一方、我々の研究では脳組織の標本作成が不可欠であるが、標本作成に伴う組織変形については検討されていない。我々はこれについて検討を行い、(1)切片の乾燥に伴って組織収縮が生じること、(2)切片の厚さが厚いと収縮量が大きくなることを明らかにした。成果の一部を日本医学写真学会雑誌にて報告した。【研究実績の概要】に記載した通り、平成24年度の研究計画実施当初に計画していた内容につき、着実に成果を上げている。脳虚血モデルラットの作出を実施するとともに、脳虚血による脳組織の変性の影響が、生体(intact animal)に対して組織標本上でいかに再現されているかを検討した。このことは、血管を結紮するという客観的に安定した処置効果(再現性)を期待しがたい方法論の下で実施する脳虚血モデル作成において、標本上での影響範囲と生体での影響範囲を対応させるための基礎的なデータを提供できた点で評価できる成果である。また、大脳皮質の2次感覚皮質と三叉神経感覚核群との直接の線維連絡を解明できた点も評価出来る。三叉神経感覚核群は口腔顔面領域の様々な感覚情報を中継する領域である。三叉神経感覚核群の中でも特に三叉神経主感覚核や吻側核は、感覚情報を上位中枢(視床など)に送るのみならず、三叉神経運動核に入力して運動制御を行っている。本研究では中大脳動脈を結紮することによる脳虚血モデルラットの作成を目指しているが、中大脳動脈により栄養されている2次感覚皮質が虚血に陥った際に、顎運動や舌運動など摂食嚥下機能への影響を検討する上で、2次感覚皮質と三叉神経感覚核群の線維連絡が明らかになったことは大きな意義がある。平成24年度は以上のような実績を上げたことに加え、脳虚血モデルラット作出のための手技も向上してきた。本研究課題の最終年度となる平成25年度研究計画の順調な遂行に向けての準備も整いつつあり、平成24年度の達成度は「おおむね順調に進展している」と評価できる。平成23年度は2つのテーマを設定していた。一つは「一過性脳虚血モデルラットの作成」である。当初計画では、縫合糸を用いて血管結紮を行い脳虚血を引き起こしてモデルラットを作成することを目指していた。しかし、結紮の強度を個体ごとに統一することが極めて困難で、その結果として生じる影響(梗塞が発生する範囲、運動障害など発生する症状など)も個体ごと変動し、「再現性」の確立が大きな課題であることが分かってきた。そのため、縫合糸による結紮のみならず、ステンレスビーズを用いた血管梗塞による手法も試用し、我々の目的に合致するプロトコールを開発中である。
転座型白血病のDNAチップを用いた分子機構の解析

転座型白血病細胞の新規転座関連遺伝子を単離して、その遺伝子の発生と分化における役割およびキメラ遺伝子の標的遺伝子を検索した。我々はこれまで11q23転座型白血病のMLL遺伝子の相手遺伝子をCBP, P300,ABI1,AF5q31など8種単離した。今年度は転座型急性リンパ性白血病(ALL)の新鮮検体を用いて、転座の相手による発現の相違をDNAChipを用いて検索した。t(4;11)15検体、t(11,19)6検体、t(5;11)2検体および対照としてt(12;21)6検体、t(1;19)3検体をAffymetrix社のDNA Chip(12,600個)により発現プロファイルの解析を行った。t(4;11)とt(11;19)の両方に共通して発現がみられる遺伝子がFLT3,HOXA9,HOXA10等50種にみられた。MLL再構成のある21検体中予後による発現パターンの相違がみられ(P=0.01)、転写因子のCBF2遺伝子が予後良好群で、CDP遺伝子が予後不良群で高発現を示した。また21例で共通して発現が高かったFLT3遺伝子の変異を調べたところ、乳児ALL 44例中8例(18%)で変異がみられた。また小児ALL 112例では、高2倍体ALL 19例中4例(21.5%)に変異がみられたが、TEL-AML1、E2A-PBX1、BCR-ABL例では変異はみられなかった。これらの遺伝子の発現を定量reverse transcriptase(RT)-PCRでチェックしたところ、ほぼアレイの発現と一致していた。これらの遺伝子を詳細に検討し、共通する下流遺伝子をしぼる作業を進めている。現在、昨年単離したMLL-SEPT6融合cDNAを導入した細胞をマウスに移植し、増殖や造腫瘍性の検討も行っている。
特定神経細胞特異的プロモーターの大規模スクリーニングとそれを用いた脳高次機能解析

革新的技術である定量deepCAGE法による特異的プロモーターを精度高く同定する技術と、トランスジェニックマウスを用いた回路遺伝学の技術連携で、「脳における任意の神経細胞機能をノックダウンする基盤技術パイプライン」を構築することに成功した。パイプラインで同定した特異的プロモーターを用いたCreトランスジェニックマウスは標的領域特異的な組み換えを示しており、標的脳3領域の機能解析に有用であることが示された。本研究は、特異的プロモーター同定の革新的技術である「ライフサイエンスアクセラレーター(LSA)」と、回路遺伝学の技術連携で、「脳における任意の神経細胞機能をノックダウンする基盤技術(パイプライン)」を構築し、さらに同定した標的脳領域(視床の三種の神経核)に特異的なプロモーターを用いて標的脳領域を機能解析する。この目的のため、2つ戦略をスタートさせた。一つは、ゲノムワイドに標的脳領域に特異的なプロモーターを同定・確認し、そのプロモーターエレメントを単離して、Creトランスジェニックマウス(tgm)を作成する。今年度は、標的脳領域周辺で当該領域のみが蛍光タンパク質でラベルされたtgmを作成し、マイクロダイセクションと蛍光FACS分離法との併用で解析に必要な神経細胞試料の作製を試みた。種々の試みを行った結果、切片を乾燥せず手動でマイクロダイセクションにする手法がRNA劣化を最小限に抑えることがわかった。この場合、得られる微量RNAには劣化はほとんどないが、精製試薬の残留が認められる。そこで、標的脳領域とその対照試料の各1サンプルについて、nano deepCAGE法の予備実験を試みている。二つ目は、Allen Brain Atlasを使って候補遺伝子を選択し、その細胞特異的プロモーターを5'RACEで確認した後、Cre tgm作製に早期着手する戦略である。まず、Allen Brain Atlasにより、候補遺伝子のリストを作成し、既に公開されている転写開始点情報、cDNA情報との比較検討により、転写開始点を推測した。そこで、第一戦略ほどの厳密性を問わずに、標的領域を含む視床組織とその対照として皮質領域を切り出してRNAを調製した。現在、上記の推測情報をもとに、5'RACE法を用いて転写開始点およびその近傍の近位プロモーターの位置の同定を行っている。また、得られたRNAを用いてdeepCAGE法による転写開始点の探索、マイクロアレイ法で発現差がある遺伝子の同定も行ったので、第1戦略と統合して解析する予定である。本研究は、特異的プロモーター同定の革新的技術である「ライフサイエンスアクセラレーター(LSA)」と、回路遺伝学の技術連携で、「脳における任意の神経細胞機能をノックダウンする基盤技術(パイプライン)」を構築し、同定した標的脳領域に特異的なプロモーターを用いて同領域を機能解析する。まず、昨年度確立した微量RNA調製法により得た脳の対象領域由来RNAを用いて、小スケールのnanoCAGE法を試みたが、十分に定量性のあるデータを得ることができなかった。そこで、同じ領域から独立した3つの試料を解析すること当面あきらめ、各領域からできる限り多くのRNAを合わせ集めて(数百ng-数ug)、定量性の高いHeliscope CAGEによる解析を行った。その結果、視床網様核、不確帯をはじめ背側視床、室傍核、尾状核被殻において有意な発現があり、かつ、対照である大脳皮質および各標的間において特異性が高いCAGEタグ(プロモーター)をリストアップすることができた。これらプロモーターの中には既存の公共データで特異性が示されていたプロモーターも含まれており、解析結果の妥当性を裏付けた。また、既存の遺伝子モデルに対応しないnon-coding RNAに対応するプロモーターも含まれている。これらのデータから、すでに価値が明確な2つのプロモーターについてはCreトランスジェニックマウス作成の準備にかかっている。さらに、in situ hybridizationでの確認実験のため、データからさらに選別したプロモーターリストの作成を急いでいる。上記の試みと並行して、Allen Brain Atlasから選択された遺伝子について5'RACEにて、プロモーターの位置確認と特異性の再確認を行う実験も行った。優先度が高いトップ20の遺伝子について解析した結果、既存の主要プロモーターからの転写は確認されたが、これと活性において匹敵し、特異性の異なる第2のプロモーターは見つからなかった。しかしながら、上記in situでの確認実験のために選択すべきプロモーターの基準作成に有用な情報を与えた。今年度はレム睡眠に関わると考えられている候補二領域において20-50ng量のRNAを調製し、微量サンプル適応のマイクロアレイ法による解析を行った。コントロールと比較してターゲット領域で発現が高い遺伝子数十個についてAllen Brain Atlasでのシグナルと比較解析してみたところ、多くの遺伝子で選択的な発現が確認された。

また、CAGEからエンハンサー領域を特定する手法を開発したので、これを用いて特定遺伝子のエンハンサー領域同定を試みたが、明らかな同定には至っていない。In situ hybridizationによる解析結果は、ノンレム睡眠中枢およびレム睡眠中枢を標識する可能性を示唆した。上記遺伝子は、それら自身が睡眠調節に直接関与する可能性を持つので、それらの機能を個別に明らかにする必要が有るとともに、それらの転写調節領域は今後の睡眠中枢の遺伝学的機能操作法の確立に資するツールとして期待される。視床核解剖用プロモーター候補として選択した遺伝子のBACベクターを用いて作成したCreマウスの一つは、視床網様核および不確帯特異的組み換えを誘導した。もう一つは束傍核選択的組み換えを誘導した。一方、広範な脳領域で組換え活性を誘導したベクターも有った。後者のベクターは発生初期に多様な細胞系譜で転写活性を持つと考えられた。視床束傍核特異的Creマウスを用いてNMDA受容体遺伝子に条件変異を導入した。このマウスは過活動性と協調運動の不全を示した。最大の難点は、特異性が非常に高い領域特異的プロモーターを微量のRNAから信頼性高く同定できるのかという点であった。これについてnanoCAGEでの解析に早期に見切りをつけ、biological replicatesを取ることを当面あきらめ、RNAをできる限り寄せ集めて定量性の高いHeliscope CAGEで解析することにより、成功を収めた。以降に技術的障害はないため、今後、一定の成果が期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。得られたデータから、すでに有用性が十分に期待できる特異的プロモーターを用いて、Creトランスジェニックマウス作成の準備に取り掛かっている。今後この取り組みに精力を注ぐ。また、得られたプロモーターデーターにはbiological replicatesがないため、有用性が示唆されるプロモーターについてはin situ hybridizationでの検証実験をおこない、視床の分子解剖学的論文へつなげてゆきたい。
絶縁膜上シリコン光モジュレータの研究

本研究の目標たる光モジュレータは、シリコン中自由電子による赤外光の吸収を利用する新しい挑戦的な試みである。実現の要は、光と相互作用する自由電子の量をいかに確保するかというもので、このため櫛形MOSトランジスタによる光モジュレータの試作とその評価を行った。最初の櫛形トランジスタによる光スイッチ実現の試みは、(1)入射した直径10μmの平行赤外光(波長,λ=1.55μm)は高さ1μm、長さ1mmの櫛形Siビーム中に留まらず、基板のSi中に抜ける、(2)櫛形Siの隙間に埋め込まれた不純物を10^<21>/cm^3程度含む多結晶Siが入射赤外光を強く吸収する、などの理由により光のスイッチ動作は確認できなかったが、(3)実効チャネル長2μm、高さ1μm、幅50nmのマルチSiビームMOSトランジスタが正常に動作し、同一平面面積のトランジスタの数倍以上の駆動電流が実現できた。ここに、新しいマルチチャネルMOSトランジスタ構造の提案ができた。その後,上記(1)および(2)の課題の解決を意図したSOI (Silicon-On-Insulator)基板上Si光モジュレータを試作し評価した結果、(a)入射した波長1.55μmの赤外光は大部分透明なSi基板内を透過し,測定には有害な迷光となった。迷光強度はモジュレータ導波路を通過する赤外光の1000倍以上であることがわかった。このため,モジュレータ内を透過した光のゲート電圧による変化を確認できなかった。この解決のため、Si基板に透過光を遮断する溝を形成し、波長1.55μmの赤外光を遮断するカーボンブラックを塗布した構造を試作し評価した結果、極めて有効な構造であることが確認できた。本研究期間内ではこの改良した構造での光モジュレータの試作はできなかったが、現在その試作・評価を継続している。本研究の目標たる光モジュレータは、シリコン中自由電子による赤外光の吸収を利用するまだ世界にその例を見ない挑戦的な試みである。実現の要は、光と相互作用する自由電子の量をいかに確保するかというもので、このため櫛形MOSトランジスタによる新たな光モジュレータの試作とその評価を実施している。最初の櫛形トランジスタによる光スイッチ実現の試みは、(1)入射した直径10μmの平行赤外光は高さ1μm、長さ1mmの櫛形Siビーム中にとどまらず、基板のSi中に抜ける。(2)櫛形Siの隙間に埋め込まれた不純物を10^<21>/cm^3程度含む多結晶Siが入射赤外光を強く吸収する。などの理由により光のスイッチ動作は確認できなかったが、(3)実効チャネル長2μm、高さ1μm、幅50mmのSiビームMOSトランジスタが正常に動作した。(4)ビームを31本備える櫛形MOSトラシジスタは同じ平面面積の5倍の駆動能力を有すること。などを確認した。その後の実験、解析により(6)ゲートにITOなどの透明電極を月いる予定だが、理論解析により導電率の低い方が赤外光吸収が少ないことが判明した。従って、ゲート電極としての導電率には最適値が存在することが予想できた。(7)Alなどの反射率の高い金属をゲートに用いる可能性が解析により示唆された。などが判明したので、これらの実験・解析結果に基づき、まずは櫛形ではない平面のAlゲート光スイッチMOSトランジスタを試作する。その結果をふまえてより効率的に光強度を変調できると考えられるITOゲートの櫛形光モジュレータMOSトランジスタの実現に挑戦する。

本研究の目標たる光モジュレータは、シリコン中自由電子による赤外光の吸収を利用するまだ世界にその例を見ない挑戦的な試みである。実現の要は、光と相互作用する自由電子の量をいかに確保するかというもので、このためMOSトランジスタによる新たな光モジュレータの試作とその評価を実施している。最初の櫛形トランジスタによる光スイッチ実現の試みは、(1)入射した直径10μmの平行赤外光は高さ1μm、長さ1mmの櫛形Siビーム中にとどまらず、基板のSi中に抜ける。(2)櫛形Siの隙間に埋め込まれた不純物を10^<21>/cm^3程度含む多結晶Siが入射赤外光を強く吸収するなどの理由により光のスイッチ動作は確認できなかった。これらの実験結果を踏まえ、高さ1μm、幅10-100μmのSiビームのMOSトランジスタのモジュレータを試作した。このモジュレータの光吸収実験により、(3)入射光が迷光となってnW以下のきわめて小さい出射光の測定を妨げている。ことがわかり、曲がり部分の損失が最も少ない形状を見出し、現在直角に曲がったモジュレータを試作し、測定を計画している。いっぽう、導波路の解析により、Alなどの反射率の高い金属をゲートに用いることができることがわかり、ITO(Indium-Tin Oxide)のゲート利用と同時に試作を行っている。本研究の目標は、Si中自由電子による赤外光の吸収を利用する新しい光モジュレータの実現である。実現の要は、光と相互作用する自由電子の量をいかに確保するかというもので、このため櫛形MOSトランジスタを試作し、光吸収特性を評価した。そのため、まず下記の基本構造を検討し、最適なデバイス構造パラメタを設定した。(1)光導波路を90度屈曲した場合に、もっとも伝播損失の少ない構造を実験により選定した:具体的には三段階に屈曲した構造が最適であることを見出した。(2)櫛形Siの間隙に埋め込む多結晶Siの最適不純物濃度を選定した:不純物濃度を10^<18>/cm^3程度含む多結晶Siが伝播損失の低減と、ゲート電極として動作をともに満たすことを実験によって確認した。これらの実験結果を踏まえ、SOI(Silicon-On-Insulator)基板上に、高さ1μm、幅10-100μm、長さ1-3mmの櫛形SiビームのMOSトランジスタのモジュレータを試作した。このモジュレータの光吸収実験を評価中である。今までにわかったことは、(1)mW級の入射光がほぼ1/1000のμW級となって出光することを確認した。(2)まだ迷光が多く、明らかな光吸収特性は得られていない。今後は、とくに迷光の遮断を行い、光吸収特性の評価を行う。
花き老化についての分子生物学的解析と制御に関する研究

花きの老化は、1)エチレンに依存して進行する場合と、2)エチレンに非依存的に進行する場合の2つに類別される。前者は現在までに多くの研究が行われ、多くの関連遺伝子が単離・解析されている。しかし、後者の老化関連遺伝子はあまり研究が行われていない。エチレン受容体は、花きの老化に関連する遺伝子と考えられているが、エチレン非感受性花きからは単離されておらず、その老化における役割も不明である。また、花きの老化過程でタンパク質分解酵素の活性が上昇すること、特にシステイン・プロテアーゼの活性が上昇することが知られている。本研究では、エチレン非依存的に老化が進行する花きとしてグラジオラスを対象に、エチレン受容体とシステイン・プロテアーゼ遺伝子を単離し、この構造および機能の解析を行うこと、及び花きを発達中のそれらの発現解析を行い、老化における役割を推定することを目的とする。1)エチレン受容体遺伝子の単離・解析:植物の既知のエチレン受容体遺伝子の配列情報に基づいて、RT-PCRとRACE-PCRを行い、2種類のエチレン受容体遺伝子の全長cDNAを単離することに成功した。これらの配列と構造解析の結果、ERS1型エチレン受容体であると考えられ、GgERS1a及びGgERS1bと命名した。GgERS1bは、GgERS1aのGAFドメインをコードする配列の一部が欠落した新規のエチレン受容体遺伝子であった。メロンのERS1受容体の特異抗体を用いた実験から両遺伝子ともタンパク質に翻訳されていることが示唆された。グラジオラス花きの発達に伴う両遺伝子の発現解析を行った結果、GgERS1aは、花器官の発達と老化に伴って発現が増減すること、GgERS1bはそれらの期間に渡って一定の割合で発現していた。従って、GgERS1aがグラジオラスの花き老化に関与している可能性が高いと考えられた。GgERS1bは新規のエチレン受容体であるので、この成果を中心に投稿論文を作成している。2)システイン・プロテアーゼ遺伝子の単離・解析:単子葉植物の既知のシステイン・プロテアーゼ遺伝子の情報に基づいて、RT-PCRとRACE-PCRを行い、グラジオラスから1種類のシステイン・プロテアーゼ遺伝子を単離し、構造解析を行った。グラジオラスでは新規の遺伝子であったのでGgCYP1と命名した。花き発達に伴い発現解析を行った結果、老化に先立って発現しており、花きの老化に関連する遺伝子であると考えられた。本成果についても投稿論文を作成している。前者については現在までに多くの研究が行われ、多くの関連遺伝子が単離・解析されている。本研究では、エチレン非依存的に老化が進行する花きとしてグラジオラスを対象に、エチレン受容体とシステイン・プロテアーゼ遺伝子を単離し、この構造及び機能の解析を行う。さらに、花き発達中のそれらの発現解析を行い、その遺伝子の老化における役割を推定する。1、エチレン受容体遺伝子の単離・解析:既に単離されているエチレン受容体遺伝子から混合プライマーを設計した。グラジオラスの蕾ステージから調整したcDNAを鋳型にRT-PCRを行い、約1kbのcDNA断片を増幅した。シークエンスの結果、2つのクローンが同定され、ともにETR1サブファミリーのエチレン受容体遺伝子と80-86%の相同性を示し、GGER1及びGGER2と命名した。GGER1を用いてゲノミックサザン解析を行ったところ、ゲノム中には2つの類似遺伝子があるものと推定された。GGER1については、RACE-PCRを行い、3'側全ての配列を得ることができた。2、システイン・プロテアーゼ遺伝子の単離・解析:既に単離されている単子葉植物のシステイン・プロテアーゼ遺伝子から混合プライマーを設計した。グラジオラスの蕾ステージから調整したcDNAを鋳型にRT-PCRを行い、約380bpのcDNA断片を増幅した。シークエンスの結果、この配列は、ヘメロカイス、カーネーション、シロイヌナズナから単離されているシステイン・プロテアーゼの塩基配列と65-75%の相同性を示し、また推定アミノ酸配列よりパパイン型システイン・プロテアーゼの特徴を保存しており、パパイン型のシステイン・プロテアーゼであると推定され、GGCYP1と命名した。