hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属炭化物粒子表面の酸塩基・荷電特性と捕収剤の炭化物親和性に関する基礎的研究

研磨剤として大量に使用されてい金属炭化物、特に今回は炭化ケイ素を対象とし、炭化ケイ素粒子の浮選特性を界面化学的見地から把握することを目的に、陰イオン性捕収剤を添加した系において溶液pHを種々変化させて浮選基礎試験を行った。同時に、使用した捕収剤の粒子表面への吸着特性について検討を行い、その吸着挙動についてSurface Complexation Model(SCM)を用いて解析を行った。まず、炭化ケイ素粒子の浮選について、陰イオン捕手剤の1-ドデカンスルホン酸ナトリウム(NaDS)を5×10^<-5>M存在下で浮選を行ったところ、pH6以下の酸性になるにしたがい回収率は著しく増加した。本実験で用いた炭化ケイ素の等電点がpH5.6付近であることから、NaDSの静電的な吸着が粒子表面の疎水性化に寄与しているものと考察した。次いで、炭化ケイ素表面へのNaDSの吸着量を、浮選が顕著に認められたpH2.5の一定条件下で、NaDS平衡濃度の関数として求めた。3×10^<-4>M以上にNaDS濃度が増加すると吸着量は著しく増加した。この現象は粒子表面におけるヘミミセルの形成であることを指摘した。最後に、本吸着等温線の低濃度領域の直線から、粒子表面への捕収剤の反応性をSCMを用いて検討を行った。得られたNaDS-炭化ケイ素間の表面反応定数と、従来の研究で得られた炭化ケイ素表面水酸基の酸解離定数から表面化学種濃度分布図を作成し、NaDSの浮選最適pH領域の推定の指針になることを示唆した。本研究では、まず、研磨剤として用いられている炭化ケイ素の微粒子を含有した切削・研磨屑から炭化ケイ素を分離回収する浮選プロセスの構築を将来の目標とし、炭化ケイ素浮選における金属イオンの役割を検討した。まず、炭化ケイ素粒子の陰イオン性捕収剤を用いた場合の浮選における金属イオンの影響を検討した。用いた金属は,銅、マンガン、マグネシウムなどである。金属イオン無添加の場合、炭化ケイ素の浮遊は酸性pH領域でのみ認められるが、金属イオンを添加すると、添加した金属イオンによりあるpH域で活性効果が認められた。次いで、上記浮選現象について、粒子表面と捕収剤などの浮選剤との反応性を把握するうえで最も重要と考えられる粒子表面の酸塩基特性・反応性と関連づけ、表面錯体形成反応モデル(Surface Complexation Model,SCM)を用いて検討を行った。界面動電位の測定、酸ー塩基滴定、及び、金属イオン吸着量測定などの結果から、SCMパラメータとして、K^S_<a1>(int)=2.0、K^S_<a2>(int)=9.6、K^S_<M(Mg)>(int)=10.0及びK^S_<M(Cu)>(int)=2.6の各定数が得られた。本パラメーターを用いて、粒子表面化学種の濃度-pH図を作成し、上記浮選活性現象の認められるpH領域において、金属イオンとSiC表面シラノールとが表面化合物を形成するpH域と一致していることを確認できた。
ゾル-ゲル生体機能性薄膜に基づくマイクロアレイバイオセンサーの研究

本研究では,ガラスやセラミクスの低温合成法として知られているゾル-ゲル法により,生体機能性分子(酵素など)を包括した薄膜をマイクロアレイ電極に作製する方法について検討した.オルトケイ酸メチル(TMOS)など種々のケイ素化合物を用い,ゾル-ゲル反応の速度とpHとの関係などについて検討し,バイオセンサー作製のためのゾル-ゲル反応の作製条件を明らかにした.しかし,酵素分子がゲル格子から脱離しやすく,長期安定性に問題があった.そこで,作製した酵素含有ゾル-ゲル被膜をグルタルアルデヒド蒸気の中で2日間乾燥させ,包括された酵素分子を橋架けして高分子化することで,安定性が改善され,迅速な応答(応答時間:数秒)を与えるセンサーが得られたが,酵素の種類によっては活性が著しく低下した.そこで,アビジン分子がビオチン標識酵素と強固な複合体を形成することを利用し,TMOSをゾル-ゲルマトリックスとして,アビジン-ビオチン標識酵素複合体をシリカゲル薄膜中に包括したバイオセンサーを開発した.このセンサーでは,複合体が3次元的な立体構造をもつ巨大分子であるため,シリカゲル格子から抜け出さないことと,酵素分子に共有結合を導入せず生物親和力で複合体を形成しているので,高活性(高感度)で長期にわたり安定なセンサーが得られた.この方法で種々のマイクロアレイ電極に酵素レセプター薄膜を作製し,分子ふるい機能を持った有機電解重合膜をハイブリッド化して,グルコース,コレステロール,総コレステロール,尿酸などを検出できる医療計測用アレイセンサーや,オルトリン酸,総リン酸,アンモニアなどを計測できる環境計測用アレイセンサー,さらに魚肉や畜肉の鮮度センサーなどに応用した.本研究では,ガラスやセラミクスの低温合成法として知られているゾル-ゲル法により,生体機能性分子(酵素など)を包括した薄膜をマイクロアレイ電極に作製する方法について検討した.オルトケイ酸メチル(TMOS)など種々のケイ素化合物を用い,ゾル-ゲル反応の速度とpHとの関係などについて検討し,バイオセンサー作製のためのゾル-ゲル反応の作製条件を明らかにした.しかし,酵素分子がゲル格子から脱離しやすく,長期安定性に問題があった.そこで,作製した酵素含有ゾル-ゲル被膜をグルタルアルデヒド蒸気の中で2日間乾燥させ,包括された酵素分子を橋架けして高分子化することで,安定性が改善され,迅速な応答(応答時間:数秒)を与えるセンサーが得られたが,酵素の種類によっては活性が著しく低下した.そこで,アビジン分子がビオチン標識酵素と強固な複合体を形成することを利用し,TMOSをゾル-ゲルマトリックスとして,アビジン-ビオチン標識酵素複合体をシリカゲル薄膜中に包括したバイオセンサーを開発した.このセンサーでは,複合体が3次元的な立体構造をもつ巨大分子であるため,シリカゲル格子から抜け出さないことと,酵素分子に共有結合を導入せず生物親和力で複合体を形成しているので,高活性(高感度)で長期にわたり安定なセンサーが得られた.この方法で種々のマイクロアレイ電極に酵素レセプター薄膜を作製し,分子ふるい機能を持った有機電解重合膜をハイブリッド化して,グルコース,コレステロール,総コレステロール,尿酸などを検出できる医療計測用アレイセンサーや,オルトリン酸,総リン酸,アンモニアなどを計測できる環境計測用アレイセンサー,さらに魚肉や畜肉の鮮度センサーなどに応用した.本研究では,ガラスやセラミクスの低温合成法として知られているゾル-ゲル法により,生体機能性分子(酵素など)を包括した薄膜をマイクロアレイ電極に作製する方法について検討し,以下の結果が得られた.オルトケイ酸メチル(TMOS)など種々のケイ素化合物を用い,ゾル-ゲル反応の速度とpHとの関係などについて検討し,バイオセンサー作製のためのゾル-ゲル反応の作製条件を明らかにした.センサーはTMOSと酵素のリン酸緩衝液(10mM,pH5.5)のゾル溶液に,白金ファイバー電極の先端部を浸して引き上げた後,グルタルアルデヒド蒸気の中で2日間乾燥させて作製した.得られたグルコースセンサー,コレステロールセンサー,ガラクトースセンサーの応答時間は数秒と早く,感度も良好であった.さらに,ビオチン標識酵素とアビジンとの生物親和力による複合体をゾル-ゲル法によりトラップした薄膜は長期にわたり良好な安定性を示した.しかし,これらのセンサーは対応する基質に対して高い感度を示したが,通常の試料中に含まれるL-アスコルビン酸や尿酸などの被酸化性物質とタンパク質による妨害を受けた.そこで,ゾル-ゲル酵素薄膜に分子ふるい薄膜をハイブリッド化し,酵素反応で生成した過酸化水素だけを透過する薄膜について検討した.種々のフェノールとアニリンの誘導体の電解酸化重合膜の分子ふるい機能について検討した結果,1,2-ジアミノベンゼンの電解重合膜は,分子量100以上の化合物をほとんど透過せず,過酸化水素を選択的に透過できることが分かった.そこで,ゾル-ゲル薄膜にこの電解重合膜をハイブリッド化したセンサーを作製したところ,対応する基質に対して特異的に応答することが分かった.ゾル-ゲル法は無機材料の低温合成法として知られているが,方法の簡便さから,マイクロアレイ電極のレセプター薄膜の作製方法として適していると考え,酵素分子を包括したゾル-ゲル薄膜をレセプター部とするバイオセンサーの研究を行った.しかし,酵素分子がゲル格子から脱離しやすく,長期安定性に問題があった.そこで,ゾル-ゲル被膜をグルタルアルデヒド蒸気にさらし,包括された酵素分子を架橋して高分子化することで,安定性は改善されたが,酵素の種類によっては活性の低下が認められた.

そこで,アビジン分子がビオチン標識酵素と強固な複合体を形成することを利用し,オルトケイ酸メチル(TMOS)をゾル-ゲルマトリックスとして,アビジン-ビオチン標識酵素複合体をシリカゲル薄膜中に包括したバイオセンサーを開発した.このセンサーでは,複合体が3次元的な立体構造をもつ巨大分子であるため,シリカゲル格子から抜け出さないことと,酵素分子に共有結合を導入せず生物親和力で複合体を形成しているので,高活性(高感度)で長期にわたり安定なセンサーが得られた.この方法で種々のマイクロアレイ電極に酵素レセプター薄膜を作製し,分子ふるい機能を持った有機電解重合膜をハイブリッド化して,グルコース,コレステロール,総コレステロール,尿酸などを同時に検出できる医療計測用センサーや,オルトリン酸,総リン酸,アンモニアなどを計測できる環境計測用センサー,さらに魚肉や蓄肉の鮮度センサーなどに応用した.
脳の左右差の形成機構と生理的意義の解明

脳の構造的・機能的非対称非対称性がどのようにして形成されるのか。また脳の様々な非対称性は、機能的にどのような意味があるのかを明らかにすることを目的として研究を行った。我々は、免疫系の機能分子が非対称な脳神経回路の形成に重要であることを明らかにするとともに、脳の非対称性に異常を持つ変異マウスが、空間記憶の保持において著しく劣ることを明らかにした。我々は内臓逆位を示す自然突然変異であるivマウスの海馬が右側異性を示すことを明らかにした。そこで、我々はivマウスの行動を解析する事によって脳の左右差の異常が動物の行動にあたえる影響を明らかにできるのではないかと考えた。我々は空間学習ならびに参照記憶を調べるために乾燥型迷路課題を、また作業記憶を調べるには遅延非見本あわせ課題を用いて解析した。その結果ivマウスは空間学習ならびに作業記憶の保持に関して劣っている事が明らかになった。これにより、我々が発見した海馬神経回路の構造的非対称性は脳の高次機能において意味のある機能的な非対称性である事が確認された。(投稿中,共蓍伊藤&渡辺)次にivマウス海馬における遺伝子発現の特徴を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、ivマウスにおいて著しく発現が低いいくつかの遺伝子が明らかになった。現在これら遺伝子をノックアウトしたマウスの海馬神経回路を解析中である(担当、伊藤)。また、そのうちの一つの遺伝子に関してノックアウトマウスを作成中である(担当、野村)。これにより、我々が発見した海馬神経回路の非対称性は脳の高次機能において意味のある回路特性である事が確認された(PLoS ONE, 2010.伊藤&渡辺共著)。次にivマウス海馬における遺伝子発現の特徴を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。その一つは、Major Histocompatibility complexクラス1(MHC-1)遺伝子である。MHC-1は免疫系において、特異的な抗原認識機構に関与する重要な因子であることはよく知られている。しかし最近、脳神経細胞においてもMHC-1分子の発現が確認され、脳の発達、分化および可塑的性質の発現など、主要な脳機能にも密接に関与することが示唆されている。そこで、我々はMHC-1のβサブユニット(β2m)をコードする遺伝子をノックアウトしたマウス(β2mノックアウトマウス)を用い、このマウスの海馬神経回路の特性を生理学的に解析した。その結果β2mノックアウトマウスの海馬は神経回路の非対称性を完全に消失しており、シナプス可塑性に関しても野生型マウスとは異なる特性を示す事が明らかになった。非対称な海馬神経回路の形成にMHCクラスI(MHCI)が関与している可能性を検討するために、MHCIの構成因子の一つであるβ2マイクログロブリン(β2m)をノックアウトしたマウス(β2mKOマウス)を用いた解析を行った。その結果、β2mKOマウスの海馬ではε2-nondominant型のシナプスが消失して全てのシナプスがε2-dominant型に変化しており、その結果、海馬神経回路の非対称性が完全に失われている事が明らかになった。この事実は、非対称な海馬神経回路の形成にMHCIが関与している可能性を強く示唆するとともに、免疫系タンパク質の中枢神経系における新たな非免疫的機能の存在を示している。これ等の結果はすでに生理学会等で報告して高い評価を受けるとともに、現在論文投稿を準備中である(担当、伊藤)。また、β2mKOマウスの行動解析が進行中であり、予備的解析の結果β2mKOマウスは空間記憶の保持において劣る事を示唆する結果が得られている。今後さらに精度の高い解析を計画している(担当、渡辺)。さらに、本年度から広島大学の坂田が共同研究者に加わり、海馬θ波の解析を開始した。これによってこれまで手つかずであった、脳の非対称性に関するネットワークレベルの解析が可能になった。本年度は、無拘束マウスから安定にθ波を計測する測定系の技術確立を行った(担当、坂田)。また当初計画にはなかった2系統の遺伝子改変マウスの生理学的な分析を開始した(担当、伊藤)。MHCクラスI(MHCI)の構成因子であるβ2マイクログロブリン(β2m)をノックアウトしたマウス(β2mKOマウス)を用いた解析を行い、β2mKOマウスの海馬では海馬神経回路の非対称性が完全に失われている事が明らかになった。

この事実は、海馬神経回路の非対称性形成にMHCIが関与している可能性を強く示唆するとともに、免疫系タンパク質の中枢神経系における新たな非免疫的機能を示すものである。これ等の結果はすでに国内外の学会において報告し、高い評価を受けるとともに現在論文を投稿中である(担当、伊藤)。また、β2mKOマウスの空間認知をタッチスクリーンのついたオペラント実験装置で検討した。その結果、左右の位置の弁別自体は野生型マウスとほぼ同様に学習できるが、位置の遅延非見本合わせでは全く学習が出来なかった。このノックアウトマウスは視力、明度弁別とも障害がないので、空間情報の短期的保持に特化した障害を持つと考えられる(担当、渡辺)。さらに、坂田等はマウス海馬θ波の解析を開始した。無拘束状態のマウスから安定にθ波を計測する測定系の技術確立するとともに、行動課題遂行中の海馬θ波をivマウスと野生型マウスで比較した。解析は現在進行中であるが、これによってこれまで手つかずであった、脳の非対称性に関するネットワークレベルの解析が可能になった(担当、坂田)。また伊藤等は海馬の非対称性形成におけるMHCIの受容体を明らかにする目的でPirBのノックアウトマウスを用いた解析を行い、β2mKOマウスと同様の結果が得られた。すなわち、MHCI-PirB系が海馬の非対称性形成に関与している可能性がが強く示唆された。計画した研究課題のうち、ivマウスの行動解析に関してはすでに一昨年論文発表した。β2mノックアウトマウスの解析に関しても本年度に学会報告を行い、現在論文を執筆中である。また、当初予定していたノックアウトマウスの作製は中止したが、かわりに平成23年度から海馬θ波の解析を新たに検討課題に加え、本年度内にマウスを用いた測定系を確立した。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していなかった2系統の遺伝子改変マウスを分析する必要が生じたため、新たな遺伝子改変動物の作製は中止した。このために共同研究者を1名削除した。また、当初は検討課題に挙げていなかった海馬θ波の解析を実施する事とし、このために共同研究者を1名追加した。来年度は、現体制のまま予定通りの研究を実施する。
イソニトリル架橋型多岐高分子錯体の合成と物性

本研究目的は、機能単位を適当な相互作用のもと組織化させることにより、個々の機能単位の単なる足し合わせでは得られない組織体機能(ここではインタラクティブ機能)を実現することにある。特にここでは機能単位を共役系で連結する共役組織化を採用した。これは、数多くのナノメーターレベルの特異な構造体を創製してきた超分子化学を合目的に展開するアプローチと考えられる。ビオローゲンは適度な還元電位を持つアクセプターであり、光・電気化学的な還元によりイオンラジカルを生成し、エレクトロクロミズム・フォトクロミズムを示す。このような電子的に特徴ある機能単位をπ共役系によって連結し、組織化した場合、多段階の酸化還元挙動、電子スピンの整列による多重項種の生成、その光電気化学的な制御など、興味深い物性の発現が期待される。本研究では、モデル系として2個のビオローゲンをπ共役系で連結した以下のようなダイマー分子について、光・電気化学的性質と、多段階還元過程において生成するイオンラジカルの磁気的性質を検討した。以上の結果から、ビオローゲンダイマー〓においては、光・電気化学的に生成したラジカル間の磁気的相互作用を、カプラーであるπ共役系の置換位置によって制御できることが明らかになった。また、ユニット間のπ共役系のねじれが小さく、相互作用が大きいため、より大きな共役組織体を合成した場合でも、十分に相互作用の伝達が期待できる。
軽度認知障害の高齢者とその家族を対象とした認知行動療法プログラムの効果

平成30年度は軽度認知障害(以下MCI)高齢患者への認知行動療法(以下CBT)に基づいた介入(介入1)、その介護家族へのCBT介入(介入2)それぞれへのリクルートを開始した。これまでMCI、およびMCI疑いのあるうつ傾向の高い高齢患者3名が研究参加への意思を示したものの、現時点で介入プログラムを完遂した高齢患者は1名(事例A)、残りの2名は通院負担や時間的な拘束などを主な理由として研究には参加されなかった。また、事例Aの家族が介入に参加できないとのことで介入2は実施できなかった。事例Aに関しては、気分や健康に関連した生活の質(QOL)などにおいて介入後に改善がみられており、プログラム参加への満足度も非常に高かった。介入2については、本研究ではMCI高齢患者本人が介入1への参加を拒否しても、介護負担を訴える家族のみが参加可能な介入プログラムを用意しており、平成30年度は11名のMCIおよび認知症の家族を抱える介護家族が本研究に参加し、11名全員がプログラムを完遂した。全体的に、うつ気分や健康に関連したQOLの改善がみられており、またプログラムへの参加満足度も高かった。介入2の評価については、現在6ヶ月フォローアップ評価が未実施の事例もあり、継続中である。介入1および2において、現時点では有害事象は発生しておらず、毎回のセッションで評価している気分のモニタリングの結果からも介入による状態悪化は特に認められなかったことから、本研究で実施している介入プログラムはいずれも安全に実施することができるものであると考えられる。介入1において、MCI高齢患者の研究参加者数が少なく、研究に遅れが生じている。介入2については概ね順調に進んでいる。次年度も両介入プログラムについての安全性、実施可能性、および効果についての検討を進めていく。前述した通り、介入1のMCI高齢患者の参加者数が少なく、研究に遅れが生じてしまっている。参加しにくい主な理由として通院負担や時間的な拘束などが挙げられているが、これは研究計画当初からわかっていたことでもあり、この課題を解消するためにもリクルートの強化と実施方法の柔軟な変更が求められる。リクルートについては現在実施している2機関以外にも協力を要請することで課題の解消が期待でき、また実施方法の変更については対面式の介入にこだわりすぎず、電話やオンライン会話などの通信機器を補助的な手段として活用しながら進めていく必要もあると考えられる。本研究ではMCIの高齢患者とその家族への介入を行うことを計画しているが、先述の通り両者がともに参加を表明されることはよほど参加へのモチベーションが高い方々ではない限り、非常に難しいことがわかってきている。これについても、平成30年度で柔軟に実施してきたように、介入1あるいは2のいずれかだけの参加も良しとする形で、参加者数の確保を図っていきたいと考えている。

これについても、平成30年度で柔軟に実施してきたように、介入1あるいは2のいずれかだけの参加も良しとする形で、参加者数の確保を図っていきたいと考えている。研究参加リクルートが遅れてしまったため、参加者に支払う予定であった謝金や交通費などの分が余剰してしまった。次年度はリクルートの強化と実施方法の変更の工夫などを通し、研究参加者数を増やしていく予定であり、差額に関しては解消されると考えている。
2成分液体からの固体表面への液体の吸着の表面力測定によるナノ評価

(1)親水性ガラスを固体試料とし、シクロへキサン-メタノール(全濃度領域では自由に混合しない系)、シクロへキサン-エタノール(全濃度領域で混合)など二成分液体中でのガラス粒子及びガラス板間の相互作用、およびその濃度依存性を、コロイドプローブ原子間力顕微鏡(現有設備)で測定した。表面力曲線の変化と、バルク測定による吸着等温線を比較し、固一液界面でのアルコールあるいはシクロヘキサンの選択吸着層や境界の構造、ならびにそのバルク濃度依存性を明らかにする。吸着等温線は、屈折率変化(現有設備)と表面積測定(申請設備)により決定した。(2)疎水性ガラス表面について評価を行った。シクロヘキサンあるいはアルコールの表面への親和性と構造形成の関係について評価した。(3)極性-非極性二成分液体の組み合わせを変化させメタノールからプロパノールまで(2)と同様の評価を行った。1-プロパノールと2-プロパノールでは、実測した相互作用曲線に大きな違いが見られた。これらの測定からアルコールガラスの表面への吸着構造を議論した。
ユニークな特異性と構造を持つプロリン特異性ペプチダーゼの構造解析

本研究の目的は、生理学的興味のあるプロリン特異性ペプチダーゼの立体構造をX線結晶解析により明らかにし、医薬品の開発に役立てることにある。これまで種々のプロリン特異性ペプチダーゼについて、酵素化学的研究と遺伝子のクローニングを行ってきた。本年度の成果は、(1)プロリルアミノペプチダーゼ(PAP)についてAbu, Nva-bNAの合成基質を用い、5員環認識ポケットが存在することを推定した。更に、PAPの基質特異性に関与すると推定されるPhe139, Tyr149,にF236を対象に加え。一方、Glu204にE232を対象として選び変異を導入し、大腸菌で過剰発現させて精製し変異体酵素を得た。その結果、このことから、Phe236とGlu232はピロリジン環や、そのアミド基との相互作用することにより基質認識に関与すると推定された。次いで立体構造から明らかにする目的で、PAP阻害剤Pro-5-tert-Butyl-[1,3,4]oxadiazole-2-yl)-pyrrolidin-2-yl-methanone (Pro-TBODA)とAla-TBODAを合成し、酵素との複合体の結晶解析を行った。ソーキング法により得られた阻害剤複合体結晶のX線解析を行った結果、プロリンのピロリジン環が疎水ポケットに入ることと、プロリンのアミノ基とGlu204, Glu232との塩結合により本酵素がプロリンを認識する機構がより明らかになった。(2)クレアチニナーゼのX線結晶解析を行った。クレアチニンはアミノ酸ではないが、プロリンと同様5員環を構成することから、プロリンの基質認識機構と比較研究することを行った。その結果、疎水ポケットへのはまり込みと水素結合により基質の5員環が認識されるkとが推定された。本年度の成果は、(1)プロリルアミノペプチダーゼについて精製酵素をPEG6000を沈殿剤として結晶化し、X線結晶解析により立体構造を解明した。酵素は、Ser113,His296,Asp268のCatalytic triadを構成する活性ドメインと、エキソペプチダーゼ作用を示すヘリックスドメインから成っていた。プロリンへの基質特異性発現機構として、Phe139がピロリジン環とスタッキングし、Glu204がプロリンのアミノ基とイオン結合することによりS1特異性を出していることが明らかになった。更に、Arg136がS1'のカルボニル酸素を認識することが明らかになった。(2)ジペプチジルアミノペプチダーゼIVについては、酵素遺伝子をクローニングし大腸菌で発現させ、大量培養の後酵素を単一に精製した。現在、PEG400を用いハンギングドロップ蒸気拡散法で結晶化中である。(3)プロリルエンドペプチダーゼについては、Flavobacterium meningosepticum由来の酵素を大腸菌で発現させる系を構築し、酵素を精製して、ハンギングドロップ蒸気拡散法で結晶化を行った。(4)ピログルタミルペプチダーゼの疎水ポケットにおける3つのフェニルアラニンの重要性、特にPhe-10の役割が大きいことが明らかになった。更に、ピロリドン環カルボニル酸素との相互作用本酵素のGlu16,Gln175及びLys179は、基質ピログルタミル残基結合部位近傍に存在し相互作用していると予想された。

本研究の目的は、生理学的興味のあるプロリン特異性ペプチダーゼの立体構造をX線結晶解析により明らかにし、医薬品の開発に役立てることにある。これまで種々のプロリン特異性ペプチダーゼについて、酵素化学的研究と遺伝子のクローニングを行ってきた。本年度の成果は、(1)プロリルアミノペプチダーゼ(PAP)について種々の合成基質を立体構造からPAPの基質特異性に関与すると推定されるPhe139、Tyr149、Glu204を選び変異を導入し、大腸菌で過剰発現させて精製し変異体酵素を得た。その結果、Phe139Ala変異体とGlu204Gln変異体でkcat/Kmが大きく減少したが、Tyr150Ala変異体では野生型酵素と大きな差は見られなかった。このことから、Phe139とGlu204はピロリジン環や、そのアミド基との相互作用することにより基質認識に関与すると推定された。次いで立体構造から明らかにする目的で、PAP阻害剤5-tert-Butyl-[1、3、4]oxadiazole-2-y1)-pyrrolidin-2-y1-methanoneを合成し、酵素との複合体の結晶解析を行った。ソーキング法により得られた阻害剤複合体結晶のX線解析を行った結果、Phe139とプロリンのピロリジン環がスタッキングを取り、Glu204がアミド基と結合することにより本酵素がプロリンを認識する機構がより明らかになった。(2)ピログルタミルペプチダーゼについて、サブユニット間ジスルフィド結合を形成しているCys190と同じ位置に存在するSer185をCysに置換した変異体を作成した。その結果、野生酵素と変異酵素の間のKm, Kcat,最適pHに違いは見られなかったが、耐熱性は約30°C上昇することが分かった。さらに、変異酵素の還元型、非還元型のSDS-PAGEからBPGPサブユニット間にジスルフィド結合が形成されていることが確認された。本年度の成果は、(1)プロリルアミノペプチダーゼ(PAP)についてAbu,Nva-bNAの合成基質を用い、5員環認識ポケットが存在することを推定した。更に、PAPの基質特異性に関与すると推定されるPhe139,Tyr149,にF236を対象に加え。一方、Glu204にE232を対象として選び変異を導入し、大腸菌で過剰発現させて精製し変異体酵素を得た。その結果、。このことから、Phe236とGlu232はピロリジン環や、そのアミド基との相互作用することにより基質認識に関与すると推定された。次いで立体構造から明らかにする目的で、PAP阻害剤Pro-5-tert-Butyl[1,3,4]oxadiazole-2-yl)-pyrrolidin-2-yl-methanone(Pro-TBODA)とAla-TBODAを合成し、酵素との複合体の結晶解析を行った。ソーキング法により得られた阻害剤複合体結晶のX線解析を行った結果、プロリンのピロリジン環が疎水ポケットに入ることと、プロリンのアミノ基とGlu204,Glu232との塩結合により本酵素がプロリンを認識する機構がより明らかになった。(2)クレアチニナーゼのX線結晶解析を行った。
心臓ステロイド合成系の研究

心不全や高血圧において、循環Aldosteroneのみならず心血管組織でのAldosterone合成が病態生理学的意義を有すると思われるようになってきた。我々は、ヒト心臓におけるSteroid合成系に注目して検討を進めた結果、健常心からはDehydroepiandrosterone(DHEA)が、不全心や高血圧心からはAldosteroneが合成されていることを示した(Circulation 2004)。この2つのステロイド合成のカスケードが心臓の状態によって切り替えを起こすことは、ある意味では心臓組織が健常な時は副腎の網状層としての特徴を有するが、不全心になるといわゆる球状層の様相を呈することを意味する。これは心臓と副腎の概念を重ね合わせるという一つの大きな挑戦でもある。我々は、更なる心臓の可能性を探る為にホルモン臓器としての心臓研究を続けた結果、ヒト心臓(高血圧心)からのACTH分泌を確認した(J Hypertens 2005)。心室からのACTHの分泌量は血圧の程度と有意に相関していることから、本態性高血圧の成因に何らかの関与が示唆される。また、心臓ACTH合成と心臓Aldosterone合成は正の相関関係にあり、心臓では副腎と異なり、ACTHはAldosteroneの合成を促進し続ける可能性がある。総じて、当該研究によって心臓RAA系研究からさらに心臓HPA系研究という新たなる道筋が確立された。一方、Aldosteroneの作用に関して、我々は以前にAldosteroneがACE遺伝子を発現亢進させることを報告しているが、本研究においてAldosteroneがMR受容体を介してACE2遺伝子発現を抑制することを確認した。ACEの亢進およびACE2の抑制はAIIの生成を上げ、Ang1-7の生成を抑制する。つまり、RAA系における更なる悪循環系の存在を示している。我々はこれまでにヒト心臓でのアルドステロン(Aldo)の合成・分泌を報告してきた。Aldoは不全心のみならず高血圧の心臓からも分泌されていることを示している。心臓からのAldoの分泌は、心臓でのステロイド合成系の存在を意味するものであり、心臓病学に新たなる概念を齎している。副腎においては、球状帯においてAldoが合成され、束状帯においてCortisolが合成される。網状帯においては、Dehydroepiandrosterone (DHEA)が合成されることより、心臓におけるこれらの一連のステロイド合成系の存在を想定し、その合成酵素の遺伝子発現とともに検討した。まず、剖検心を用いて、心臓死と非心臓死におけるCYP17の酵素の遺伝子発現をreal-time PCR法で検討した。今までヒト心臓ではCYP17は発現しないと言われてきたが、今回の検討で間違いなくCYP17の発現を認め、心臓でのDHEAまたはcortisolの発現の可能性が高まった。次に、実際に心臓カテーテル検査にてAldoとDHEAを大動脈基部と冠静脈洞にて同時測定した。その結果、DHEA濃度が心臓の入り口であるAoと出口であるCSにおいてステップアップしていることが示された。更に興味深いことに、心機能が保たれている心臓と不全心においては、AldoとDEHAの分泌パターンは全く逆転しており、不全心でAldoが、健常心でDHEAが分泌されることが明らかとなった。Cortisolに関しては、今回の検討では心臓からの分泌は認めず、また、剖検心においてもCortisol合成酵素であるCYP11B1の遺伝子発現は認めなかった。Aldoが酸化作用を有するホルモンであるのに対して、DHEAは抗酸化作用を有するホルモンであり、その対比は興味深い。

Angiotensin IIはCYP17の持つ2つの酵素活性のうちP450 reductase活性化を抑制する可能性があり、DHEA合成への道を遮断し、逆にCYP11B2の活性を亢進させると想像できる。よって、結果的にAldo合成が亢進するが、そうすることで更にACE遺伝子発現が亢進し(既報)、組織RAAS活性は悪循環を形成する。つまり、心臓においては、ステロイド合成系の中に組織RAASの悪循環系が存在するという極めて興味深い結果が導かれた。この新しい発想に基づくと、全く新規の心不全治療法が浮上する。心不全や高血圧において、循環Aldosteroneのみならず心血管組織でのAldosterone合成が病態生理学的意義を有すると思われるようになっている。我々は、ヒト心臓におけるSteroid合成系に関して、健常心からはDehydroepiandrosterone (DHEA)が、不全心や高血圧心からはAldosteroneが微量ながら合成・分泌されることを示した(Circulation 2004)。この2つのステロイド合成カスケードが心臓の状態によってスイッチングを起こすことは、ある意味では心臓組織が健常な時は副腎の網状層としての特徴を有しているが、不全心になるといわゆる球状層化することを意味する。これは心臓を副腎の特徴に重ね合わせるという大きな概念の変化を齎すものである。我々は更なる心臓の可能性を探る為に、ホルモン臓器としての心臓研究を続けた結果、ヒト心臓(高血圧心)からのACTH合成能を確認した(J Hypertens 2005)。心室からのACTHの分泌量は血圧の程度と有意に相関していることから、本態性高血圧の成因に何らかの関与が示唆される。また、心臓ACTH合成と心臓Aldosterone合成は正の相関関係にあり、心臓では副腎と異なり、ACTHはAldosteroneの合成を促進し続ける可能性がある。総じて、当該研究にて心臓RAA系研究のみならず心臓HPA系研究という新たなる道筋が確立された。一方、Aldosteroneの作用に関して新知見が得られた。我々は以前にAldosteroneがACE遺伝子を発現亢進させることを報告しているが(Circulation 2001)、本研究においてAldosteroneがMR受容体を介してACE2遺伝子発現を抑制することを確認した。ACEの亢進およびACE2の抑制はAIIの生成を上げ、Ang1-7の生成を抑制する可能性がある。つまり、RAA系における更なる悪循環系の存在を示しており、ACE2は今後の治療の介入ポイントになる可能性がある。
すす生成に関わる不飽和炭化水素ラジカルの反応に関する研究

不飽和炭化水素ラジカルが関与する反応素過程について、実験及び計算化学に基づく検討を以下の通り行い、燃焼における芳香族環形成の反応機構を明らかにした。1.アリル、プロパルギル、ベンジル、及びオルトキシリルラジカルといった、共鳴安定化ラジカルを対象として、それらの再結合反応の速度定数を、パルスレーザー光分解-キャビティリングダウン吸収分光法装置を用いて、295-800Kにおいて測定した。個々の反応速度定数を正確に決定し、それぞれ負の温度依存性を示すことを明らかにした。また、測定された速度定数を比較することによって、異種のラジカル同士の交差再結合反応における幾何平均則や、ラジカルのサイズと再結合反応速度定数の関係についての経験則を実証することができた。2.量子化学計算を用いて、共鳴安定化ラジカルの再結合反応や、共鳴安定化ラジカルと炭化水素分子との反応によって、新たな環が形成される反応経路を明らかにした。また、それぞれの反応の速度定数を統計理論に基づく解析によって求め、定量的な反応機構を構築した。その結果、ベンジルラジカルとプロパルギルラジカルの反応や、共鳴安定化ラジカルとオルトベンザインとの反応が、燃焼における重要な環成長ステップであることが示唆された。3.上記素反応に関する研究結果を元に、芳香族環生成・成長過程の詳細な化学反応モデルを構築し、トルエン熱分解からの芳香族成長過程をシミュレートした。その結果、二環及び三環化合物の生成過程に関する既報の実験結果を再現することができた。また、反応経路を解析することによって、共鳴安定化ラジカルの反応が、芳香族環の成長に主要な貢献をしていることを明らかにした。本年度は、燃焼における芳香族環成長過程において重要であると考えられている、不飽和炭化水素ラジカルの反応に関する研究を行った。実験と計算化学の両面から解析を行い、その結果、当初の目的であった、不飽和炭化水素ラジカルからの芳香族形成過程の定量的な反応機構を構築することができた。さらに、詳細な燃焼化学反応モデルを用いて、芳香族燃料の燃焼における芳香族成長過程をシミュレートした結果、不飽和炭化水素ラジカルの関わる反応が、芳香族環の成長に主要な貢献をしていることを明らかにした。これまでは、2環および3環の芳香族化合物の生成を主なターゲットとして、研究を行った。今後の課題としては、これら少数環化合物から、すすの生成へ至る化学反応機構を解明することが挙げられる。そのためには、芳香族成長過程の反応機構を系統的に組み立てる必要がある。また、多環芳香族化合物から、すすの核が生成するメカニズムに関しても未解明であるため、計算化学および化学反応モデリングによって反応機構を検討することが求められる。
近代初期日本における美術・文化愛好者の再生産過程―学校外での教習活動に着目して―

本研究の目的は、近代初期日本における美術・文化愛好者の再生産過程を、学校外での教習活動に着目して解明することにある。学術的独自性は1中上流階級文化のあり方が確立していなかった近代初期日本に着目する、2「西洋/漢学/日本」という観点から美術・文化愛好について考察するために学校外の教習活動に着目する、といった点にある。また、美術史、教育史、社会史を包括する学際的テーマとなっている。研究計画として1愛好者の整理とその分析、2民間の特定の団体、会、社中等の活動実態の掘り起こしと通史の作成、3美術・文化愛好に関わる学校外教育メディアの分析、4中・高等諸学校の校友会・同窓会雑誌の分析、を想定している。
なぜ赤ちゃんは抱っこすると泣きやむのか：乳幼児と仔マウス輸送反応の比較生理学

母子間の結びつきは、ほ乳類の子どもにとって最も早くかつ重大な社会的関係である。今回のプロジェクトで、乳幼児が母親に運ばれる時に示す輸送反応を明らかにできた。6か月以下の乳幼児は、母親に運ばれている時に即座に大人しくなり、泣きやみ、心拍数の低下が顕著であった。マウスの子でも同様である。マウスの子に薬理学的、遺伝学的な阻害してTR反応が失われると母親が子供を救出するのを阻害する。これはTR反応がいかに機能的に重要かを指し示す。この研究によって初めて、TR反応は中枢、身体運動、心機能の総合的な調節を含み、これらはほ乳類の母子間相互関係において保存されていることが示された。健常乳幼児(06か月)の25組の親子に以下の2種類の行動を交互に行ってもらった。1)椅子に腰かけた状態で母親が抱っこする(座って抱っこ)2)歩いている状態で母親が抱っこする(歩いて抱っこ)そしてこの間の乳幼児の発声、泣き声、体の動きを、2台のビデオカメラと高品位マイクで記録録画し、乳幼児の心拍数をホルター心電図(EKG)で記録した。解析すると、乳幼児は座って抱っこされているよりも歩いて抱っこされている時の方がよりリラックスしている状態にあることが行動学的だけでなく生理学的にも示された。重要性:母と子の相互関係は児の神経発達に非常に重要である。早期の母子相互関係が幼少期から成年期への発達にどのように影響を与えるかを調べることにより自閉症や脳性まひの早期発見や予後診断などの臨床的応用も可能である。またこれらの研究結果は、乳幼児の生理学的状態を養育者に知らせる機器の開発という技術的応用の可能性も秘めている。この研究はまた一般的な養育行動にも応用できる。今回判明したこの歩いて抱っこすると副交感神経の活性化を抑え泣くことが減少するという現象は、ワクチン接種や大きな音に驚くと言った一時的な刺激により泣いた子どもを短時間で泣きやませるのに効果的である。こうした乳幼児の生理学的反応とその即効的(Esposito et al 2013)かつ長期的な効果を科学的に理解することにより、親が子供の泣き声に過剰反応することを防ぎ、親のフラストレーションを減少させる。泣きやまないことは児童虐待の主要な要因の一つだからである。この研究はまた神経科学分野においても密接な関連がある。我々の研究は、ほ乳類全体における社会的結びつきと協力を決定づける神経生物学的メカニズムの解明に役立つかもしれない。健常乳幼児(06カ月)のTRについて系統的な研究を行った。20組の健常乳幼児(06カ月)とその母親について実験を行うことができた。実験の手順として、以下の2種類の行動を交互に乳幼児の母親に行ってもらった。(1)椅子に腰掛けた状態で母親が乳幼児を抱っこする。(座って抱っこ)(2)歩いている状態で母親が乳幼児を抱っこする。(歩いて抱っこ)。そしてこの間の乳幼児の発声、泣き声、体の動きを、2台のビデオカメラと高品位マイクで記録録画した。また、乳幼児の心拍数をホルター心電図(EKG)記録装置を用いて観察した。歩きながらの抱っこをしている状態の乳幼児のデータを集積し解析した。母親が立ち上がって歩き始めると、乳幼児の動きは顕著におとなしくなり(t, Student's ttest: t(11) = 5.21, p < 0.001)また泣きやんだ。(t(11) = 4.01, p < 0.001)さらに、乳幼児の心拍間隔が抱っこして歩き始めるとすぐに増大することが分かった。(increase (mean ±SEM) = 7.39% ±0.04%, time constant = 3.16 s; corresponds to eight heartbeat counts; t(11) = 5.08, p < 0.01)その後、副交感神経の活動を見るために、rMSSD(隣り合ったRR間隔の差の二乗の平均値の平方根)を計算することにより心拍変動解析を行った。その結果、座って抱っこされているよりも歩いて抱っこされている方が明らかにrMSSDの値が高くなることが分かった。(t(12) = 2.07, p < .001)これらのデータにより、乳幼児は座って抱っこされているよりも歩いて抱っこされている時の方がよりリラックスしている状態にあることが行動学的だけでなく生理学的にも示唆された。ヒト乳幼児とマウスの仔に対する様々な実験を実行できた。

また、2013年度に行う実験の予備実験も行えた。TRの制御機構を明らかにするため、近交系C57BL/6マウスを用いて実験を行う。マウスTRは母親の輸送を真似て、実験者が指で仔マウスの首背部の皮膚を軽くつまみあげることでも簡単に誘導できる。("TRの手動的誘導"(ウィルソン他2002年)そこで本研究では実験者が仔マウスをつまみTRを誘導する。TRは離乳前に一過的に見られる反応であるため、生後4日から14日齢のマウス(40匹:オス20匹、メス20匹)を使って実験を行う予定である。ヒト乳幼児のデータと比較するたため、TR中の心拍数、姿勢や動きについても記録する。加えて、自閉症障害などのような疾患モデル動物についても実験を試みる。2012年度内に、研究に有意義と思われるいくつかの主要な国際会議・ワークショップに参加することができなかった。また、予定していたPCの購入も見合わせた。繰り越した研究費は、2013年度初頭に使用予定である。集積したデータの成果発表をするための旅費、及びより多くの被験者に対する実験を行うために使用する。
未分化型精原細胞特異的遺伝子ネットワークによる幹細胞維持機構の解明

これまで確立してきたMACSとFACSを組み合わせる表面抗原に基づいた未分化型および分化型精原細胞純化法をもとにして、これら各分画のトランスクリプトーム解析を行った。得られた結果を基に未分化型精原細胞由来遺伝子サブセットの発現遺伝子のプロモーター解析を行った。この際、単なる発現変動解析やGO解析、Pathway解析だけでなく、上流解析とモデリングを施行し、プロモーター内に濃縮されている転写応答配列のカタログ化を進めた。また、マイクロアレイのデータについては定量的PCR法および免疫組織化学的解析、さらに膜表面抗原についてはFACS解析を行って得られたデータの妥当性を検討した。既に既存の未分化型精原細胞特異的抗原だけでなく、機能未知のマーカーの発現を見出している。この際、興味深いことに表面マーカー上、未分化型精原細胞と同一の分画にごく少量ながらセルトリ細胞が混入することを見いだした。混入によりトランスクリプトームに及ぼす影響の防止のために。これまでの3色から表面抗原数を増やし、さらなるマルチカラー解析法の検討を行った。一方、セルトリ細胞をこの方法論で予期的に単離できる可能性を見出しており、成体精巣のニッチ解析の有用なツールとなると考えられる。また、未分化型精原細胞純化法をより向上させ、ニッチ細胞単離法を確立するために、セルトリ細胞特異的にEGFPを発現するトランスジェニックマウスを既に作出し、ニッチ細胞の混入を防ぐ方法となるかの妥当性の検討を施行した。本年度は細胞純化後にマイクロアレイにより同定した未分化型精原細胞と分化型精原細胞特異的遺伝子サブセット候補の、精巣内での実際の発現を定量的PCR、免疫組織化学、さらにFACSを用いて検討を行った。その結果、各サブセット特異的と考えられる遺伝子群を同定することができた。とりわけ、表面抗原遺伝子ではFACSで未分化型精原細胞が単離できることが示唆された。現在、これらの遺伝子サブセットの上流プロモーターを解析して、未分化型精原細胞の遺伝子特性を規定する転写因子の検索と精巣での発現の確認を進めている。一方、これまで報告した未分化型精原細胞サブセット純化法には非生殖細胞がまだ混入しており、これらが各サブセットの遺伝子発現プロファイルを撹乱していることも確認できた。そこで、これら非生殖細胞を除去するために、非生殖細胞をMACSとFACSを組み合わせて除去する方法の検討を進めている。主に表面抗原で非生殖細胞の除去を試みたが、E-cadherinなど、未分化精原細胞に比較的発現が高いとされる表面抗原も実際は非生殖細胞にも発現しており、表面抗原からのアプローチは困難であることが明らかとなった。そこで現在、生殖細胞、あるいは非生殖細胞特異的遺伝子プロモーター下で蛍光蛋白を発現するマウスラインを用いてさらなる未分化型精原細胞の純化を試みている。この方法を確立することで、本課題の目標である精原細胞サブセットを包括的に制御する因子のより鋭敏な同定が可能になると考えられる。
嫌気環境の微生物ループ：嫌気性従属栄養性鞭毛虫の生理・生態

水月湖の酸化還元境界層から通性嫌気性の従属栄養性微小鞭毛虫を分離し、分子系統解析と微細構造観察による同定を行った。その結果、分離株を新属新種Suigetsumonas clinomigrationis gen. etsp.nov.として記載することを提案した。この株の増殖速度と細菌捕食活性の速度論的解析を行ったところ、分離株の増殖や細菌捕食活性はエサ密度の影響を受けていると示唆された。この分離株を特異的に検出する遺伝子プローブを作成し、CARD-FISH法によって水月湖水柱の分布を調べたところ、酸化・還元境界層に最も多く存在することが明らかとなった。部分循環湖である水月湖から、集積培養ならびにキャピラリーアイソレーション法を用いて3株の細菌捕食性・嫌気性微小鞭毛虫の分離培養に成功した。各株の18S rDNAの塩基配列を決定し、分子同定を行ったところ、いずれも既存の種とは相同性が低く、新種の可能性が示された。このうち1株については、電子顕微鏡を用いて微細構造を詳しく観察したところ、Wobblia属の新種であることが明らかとなった。また、このWobblia属の株については、Arcobacter sp.との二者培養系を確立することができた。この株は通性嫌気性で、酸素のある条件下でも増殖がかのうであった。増殖の温度範囲は1030°Cで、至適温度は25°Cであった。至適塩分濃度は7.8 psuで、全く塩分を含まない培地なら。びに海水の塩分濃度以上で増殖しなかった。好気的な条件でも嫌気的な条件でも細菌捕食は認められたが、その活性は好気的な条件のほうが高かった。他の2株は偏性嫌気性で、それぞれMastigamoeba scholaiaおよびPseudotrichomonas keiliniにもっとも近縁であった。18S rDNAの塩基配列をもとに各株に特異的な遺伝子プローブの設計を行った。既存のDNAデータベースと比較したところ、各株に特異的な配列が2か所以上存在することから、この領域にPCRプライマーあるいはFISHプローブを作成できる可能性が示唆された。部分循環湖である水月湖から分離した嫌気性の鞭毛虫の微細構造を、電子顕微鏡を用いて詳細に観察したところ、鞭毛小毛、ミトコンドリアクリステ、鞭毛装置の基本構造がPlacididea綱と共通していることが明らかとなった。一方で、paranuclear bodyの有無や、鞭毛装置の微小管の本数など、LSccTR-1株の微細構造は近縁種のWobblia lunataとPlacidia cafeteriopsisとは異なっていた。これらの結果から、LSccTR-1株は新属新種であるのが妥当であると考えられる。昨年度に確立した単一の細菌株との二者培養系を用いて、増殖速度と細菌捕食速度の速度論的解析を行った。その結果、増殖速度に関しては、好気条件よりも嫌気条件の最大比増殖速度は低かった。また、嫌気条件における最大細菌捕食速度は好気条件よりも低かった。分離した鞭毛虫の18S rDNA塩基配列情報から、ARBソフトウェアを用いてFluorescence in situ hybridization(FISH)法で用いる遺伝子プローブを設計・作成した。なお、プローブはPlacididea綱の鞭毛虫に特異的なものとして作成した。様々な湖にこのプローブを適用したところ、Placididea鞭毛虫は、水温躍層が発達する深い湖に生息していることが示唆された。部分循環湖である福井県の水月湖の酸化・還元境界層から通性嫌気性の細菌摂食性微小鞭毛虫を3株分離した。このうち1株について、電子顕微鏡を用いて細胞の微細構造を詳細に観察したところ、系統的に近縁な種類の鞭毛虫とは異なっていることが明らかとなった。また、18S rDNAの分子系統解析でも、近縁種とは異なることが示された。これらの結果から、本研究で分離した鞭毛虫を新属新種のSuigetsumonas clinomigrationisとして提案し認められた。なお、本株は国立環境研究所微生物系統保存施設(NIES)に寄託した。この新種の鞭毛虫と細菌株の二者培養系を確立し、増殖におよぼす水温と塩分の影響を調べたところ、水温は1030°C、塩分は3.936.9psuで増殖することができ、分離した水月湖のすべての水深で生存できることが示された。至適温度は25°C、至適塩分は7.8 psuであった。増殖速度の速度論的解析を行った結果S. clinomigrationisは好気条件下では最大比増殖速度を高くして他者よりも増殖し、嫌気環境では半飽和定数を低くすることによって競合に打ち勝つ増殖戦略をとっていると推察された。また、細菌摂食の速度論的解析から本株は、水月湖に存在する他の微小鞭毛虫よりも高い細菌摂食活性を持つと考えられた。さらに、増殖と細菌摂食の速度論的解析から増殖効率を推定したところ、ミトコンドリアの電子伝達系を利用する嫌気呼吸を行っていることが示唆された。S. clinomigrationisを特異的に検出するため、18S rDNAを標的とした蛍光in situハイブリダイゼイション(FISH)の遺伝子プローブを設計・作成した。

このプローブを用いたCARD-FISH法によって水月湖水柱のPlacididea綱鞭毛虫を計数したところ、密度躍層に多く存在することが明らかとなった。水月湖の酸化還元境界層から通性嫌気性の従属栄養性微小鞭毛虫を分離し、分子系統解析と微細構造観察による同定を行った。その結果、分離株を新属新種Suigetsumonas clinomigrationis gen. etsp.nov.として記載することを提案した。この株の増殖速度と細菌捕食活性の速度論的解析を行ったところ、分離株の増殖や細菌捕食活性はエサ密度の影響を受けていると示唆された。この分離株を特異的に検出する遺伝子プローブを作成し、CARD-FISH法によって水月湖水柱の分布を調べたところ、酸化・還元境界層に最も多く存在することが明らかとなった。分離した鞭毛虫株の18S rDNAの塩基配列を用いた系統解析を行った結果、これまでに2種しか認められていないPlacididea綱に属することが明らかとなった。この系統解析に加えて、細胞内の微細構造を詳細に調べ、分離した鞭毛虫が新種である可能性を示した。また、当初予定していた遺伝子プローブの設計を行い、Placididea綱に特異的なプローブの作成に成功した。さらに、実際にこの遺伝子プローブを現場に応用することも可能であることが示された。微生物生態学遺伝子プローブの開発に成功したので、これを用いて、密度成層湖における嫌気性鞭毛虫の分布を明らかにする予定である。さらに、平成26年度までに分離した鞭毛虫株の分類学的位置を明らかにしたうえで、新種登録の手続きを行う。一方、鞭毛虫株の酵素活性については、共存する細菌との区別が困難で、実験手法を新たに開発する必要性があることが問題点として浮かび上がってきた。平成25年度の本研究の目的は水月湖の嫌気環境から細菌捕食性鞭毛虫を分離培養し、増殖と細菌捕食に関する生理学的知見を得ることであった。嫌気性の鞭毛虫の培養は極めて難しいが、嫌気性細菌の分培養法を応用して集積培養を可能とした。また、鞭毛虫の分離法で用いられるキャピラリーアイソレーション法を応用して、種類の異なる3つの嫌気性鞭毛虫のクローン株を樹立することに成功した。得られたクローン株のうち1株については、鞭毛虫の餌となる細菌を1種類だけにした二者培養系を確立し、増殖の至適温度、至適塩分濃度を明らかにした。細菌捕食活性を調べたところ、嫌気条件下よりも好気的な条件での活性が高いことを明らかにした。平成26年度に予定していた鞭毛虫株の系統学的解析も、平成25年度中に完了した。酵素活性を測定するための方法に問題が生じたため、次年度に実験を繰り越した。また、平成26年度に引き続き、遺伝子プローブを用いた鞭毛虫の分布を調査する。得られた3株のうち偏性嫌気性の2株について、単一種の細菌との二者培養系を確立したうえで、増殖生理と細菌捕食活性を明らかにする。また、3株の有機物分解特性を明らかにするために、蛍光人工基質を用いた各種酵素活性を明らかにする。平成25年度で設計した遺伝子プローブの特異性を、培養細胞を用いて調べるとともにFISHあるいはPCRの最適条件を検討する。最終年度には遺伝子プローブを用いて、水月湖水柱の嫌気性鞭毛虫の分布および動態を明らかにする、酵素活性の測定と設計したプローブ作成に充てる。