hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極限環境下の生物多様性－モデルサイトとしての南極湖沼

現在の南極湖沼生態系の全体像が明らかになりつつあると同時に、湖底堆積物を用いた古環境変遷解析、生物相変遷の解析の準備が進み、湖沼研究へ時間軸を取り込む試みが行われた。最終年度の四年目となる26年度は、クマムシやセンチュウを中心とした微小動物の分類・生態に関する解析が進み、着実に成果を上げることが出来た。特にクマムシについては多様性の概要に関する論文が出版されたほか、飼育系を確立して繁殖生態に関するデータについても投稿が受理され、極限環境下での多様性と生態の総合理解が進みつつあることは画期的な成果であるといえる。またバクテリアに関しては、コケ坊主をモデル生態系とした物質循環経路の再構築が完了し、メタゲノムなどによる全体像の解析が進んだことに加え、微生物種間の遺伝子水辺伝播が広く頻繁に起こっていることが明らかとなり、新たな視点での研究展開が期待される状況となっている。コケ植物については湖底に生育する水生蘚類の分布について、大気循環からの起源地解析が進展し、南極全体の蘚類相の起源の検討に向かう研究の展開が見られた。菌類については、地上および湖底の蘚類と共存する菌類の生態学的な意義の検討が進められ、極限関係における種間関係について研究が進みつつある。南極湖沼生態系の生物多様性の全体像が次第に明らかになると共に、湖底堆積物を用いた古環境および古生物相の変遷解析が進み、湖沼研究へ時間軸を取り込む試みが進められた。特に、各生物の南極への侵入時期の特定、侵入イベントの推定、新入起源地の特定については、生物、地学、大気などの幅広い分野からの検討によりその状況が明らかになった。極限環境における生物の定着過程について、新たな視点からの研究分野開拓に向けた芽が生まれつつあり、本課題終了後の研究展開が期待されるものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。コケ植物、微小動物、バクテリアに関連する研究は順調に進んだが、珪藻類を除く藻類、地衣類に関しては準備段階にとどまった。藻類についての試料分与、培養系の確立は終了しているが、分子系統解析をはじめるまでに至らなかった。地衣類についての遅れは、今年度後半に第54次日本南極観湖隊による現地でのデータ取得とサンプル回収を予定しており、この準備に専念したためである。コケ植物、微小動物、バクテリア,菌類に関連する研究は順調に進んだが、菌類に関しては形態・分子系統解析を始めるまでに至らなかったため,次年度の集中課題と位置づけている。生物多様性データベースの構築に向けては,基本設計の検討に留まり,具体的なコンテンツの検討には至らなかった.コケ植物、微小動物、バクテリアに関連する研究は順調に進んだが、藻類に関しては分子系統解析をはじめるまでに至らなかった。地衣類に関しては24年末に南極昭和基地周辺から採取されたサンプルが入手できたため、現在解析が進みつつある。本研究課題は、対象生物群毎に研究チームを組織して研究活動を行っているが、多様性解明という大きなテーマでは研究の動機付けに問題がある。そこで今年度からは、それぞれの分類群毎により具体的な到達目標を設定して研究の推進を図ることとする。また単なる多様性解明にとどまらず、生物間の相互作用、物質循環にまで踏み込んだ生態系のネットワーク解明を視野に入れた研究テーマへと拡張する。
電気比抵抗による土壌・土層調査法の開発

大地の電気抵抗を測定し、それを分析して地下の状況を把握しようとする技術は電気探査法としてしられており、現在、弾性波探査とともに、地下センシング技術の重要な柱となっている。近年、コンピュタ、各種のセンサ-類や測定機器類の急速な進歩によって、電気探査法も大きな発展を遂げている。本研究はこの電気探査技術を応用し、土壌調査用の新しい方法の開発を試みたものである。その研究成果の概要は以下の通りである。1.土壌の電気比抵抗は、土壌の物理・化学性と密接な関連を持っている。とくに、間隙の構造、粒子の大きさ、粒子表面の物理・化学性、粒子の配列、構造などによって電気比抵抗が変化する機構について整理し、電気比抵抗は土壌調を行なう上での指標としてきわめて有用であることを明らかにした。2.地層の電気比抵抗を測定、解析する方法として、従来からウエンナ-法とシュランベルジャ-法がよく用いられてきている。従来の解析法では、測定結果を見かけ比抵抗の形で整理し、標準曲線との比較によって、地層の変化深さと各地層の比抵抗を解析する方法が取られるが、解析には勘と経験が必要であり、主観が大きく入る。そこで、自動的かつ客観的に解析が行える方法について検討し、いくつかの方法を考案した。3.土壌調査では浅い土層が対象となることを考慮して、土壌調査に適した新しい電位法を考案した。従来の方法では主として電流電極間隔を変えるのに対して、この方法は電流電極を固定し電位分布の測定から、表層近くの比抵抗分布を求める方法である。理論上の特徴を、解析解とシミュレ-ションによって明らかにした。4.上記の電位法による具体的な調査システムを組み立て、現地測定の適用を通して、従来の方法との比較検討を行なって、この方法が持つ特徴を整理した。本年度は電気探査法が土壌・土層調査に適用可能がどうか、および適用できるとすればどのような調査ができるかについて、現地及び実験室レベルでの調査・実験を行った。あわせて、近年の探査技術の開発状況についての資料を収集した。その結果、次のような成果が得られた。1.中海干拓地における現地調査で、電気比抵抗とあわせて行った土壌調査、植生調査との対比から、比抵抗法は数メートル程度の深度の土壌調査にきわめて有効であることが判明した。2.笠岡湾干拓地内における現地調査及び室内実験から、自然電位測定により粒度及び塩分集積状況の調査の可能性が確認できた。しかしながら、定性的な可能性の確認にとどまり、引続き研究を続けてゆく必要のあることが分かった。3.市販の比抵抗・自然電位測定装置とマイクロコンピュータを組み合わせることによって、きわめて簡便・迅速に土壌調査ができることが実証できた。しかし、これら地質調査用の測定装置は、土壌調査専用装置としては若干の改良の余地のあることが判明した。4.現地測定装置とパーソナルコンピュータの組み合せによって、調査結果をビジュアルに表現し、かつ比抵抗の逆解析法を適用することにより、解析作業が自動化できる見通しを得た。しかしながら、自動解析法については数値計算上の不安定性が強く、改良の余地が残された。以上の本年度の研究結果から、電気探査法により土壌・土層調査がきわめて簡便・かつ迅速に行える見通しを得た。次年度は残されたいくつかの問題点を解決すると共に、実用化へ向けての研究を進めたい。1.水平方向の土壌調査について:水平方向の調査は、中海干拓地彦名工区をモデルに選び現地測定を実施した。延長600mの測線を2ヵ所設定し、測定深度を5mとして大地の電気比抵抗を測定するとともに、土壌サンプルを採取した。それらの調査結果から、土壌の物理性を表わす最も基礎的な指標である。粒度、土壌水分、間隙率の水平方向の変化

情報が電気比抵抗測定からうまく検出でき、また数メ-トル程度の比較的浅い部分の土壌の状況も把握できることが確認できた。2.垂直方向の土層調査について:垂直方向の調査は、千葉県北総東部に広がる関東ロ-ム層対象に、深度10mを目標に現地測定を実施した。各種の電極配置、比抵抗解析法を適用した。その結果、表面から数メ-トル程度の深さにある、表土層、ロ-ム層凝灰質ロ-ム層、砂層の存在を明確に確認することができた。すでに実施されているボ-リング調査結果ともよい対応が得られた。3.採取土壌、ボ-リングコサンプルによる室内実験:本年度は実験装置の組立と予備実験を中心に研究を進めたために、本格的実験は次年度に持ち越した。しかしながら、予備実験の結果からいくつかの興味ある現象が観察され、土壌・土層調査法への新しい応用が期待できることがわかり、次年度の課題とした。4.今後の展開:基礎的な実験は一応終わり次年度以降、実用に向けた具体的なシステムの組立が必要となる。なお、この方法では土壌の相対的分布状況の把握はきわめて容易であるが、絶対的な調査法としては、他にボ-リングや直接採土法を組み合わせた方法が必要と思われる。また、電気比抵抗測定への自然電位の影響、あるいは自然電位情報の利用など、土壌・土層の電気化学的観点からの基礎研究を併せて進める必要があるといえる。最近急速な発展を遂げた新しい地下探査技術ならびにコンピュ-タによる逆解析手法を活用して、農業土木工事が主として対象とする、比較的地表近くの土壌層の物理的・化学的特性の調査法の開発が本研究の目的である。最終年度である本年度は、前年度までの調査・実験の補完と、土壌調査に適した新しい調査法の開発を行った。本年度に行った研究の概要は次の通りである。(1)現地における調査結果を総合的に検討して、電気比抵抗による土壌・土層の調査法はきわめて有効であることが結論づけられた。しかしながら、従来の電気探査法は、比抵抗の測定法ならびに解析法のいずれも、土壌調査用に改良を計る必要があることが明らかになった。(2)土壌の化学特性調査の代表例として酸性硫酸塩土壌を取り上げ、その生成メカニズムならびにその調査への電気比抵抗法の応用について検討を進めた。その結果、直接pHの値を計ることは出来ないが、酸性硫酸塩土壌の生成環境を総合的に反映する指標として、電気比抵抗は植生分布とともに有用であることが明らかになった。(3)従来の方法は地質調査を主目的にしており、分解能の点で土壌調査法としては改良しなければならないことがわかった。そこで分解能を向上のための電極配置ならびに解析理論の検討を行い、土壌調査に適した新しい方法を開発した。今後、この方法の適用事例をさらに積み重ね改良を図って行く必要がある。(4)見かけ比抵抗を解析する作業を自動化するために前年度に新しく開発した逆解析手法については、改良を加えたがその安定度には問題を残しており、今後も引き続いて改良して行く必要がある。(5)本研究の遂行過程で、電気比抵抗のみならず電位も土壌調査に対してきわめて有効であることが判明した。
運動刺激負荷下でのハーブ創傷治癒活性検出法の新規開発

我々が新規に開発した創傷治癒モデルを活用することで効率的に創傷治癒活性をもつ生理活性物質を検出する系の構築を目指した。ハーブ類及び生物由来の資料より成分を抽出し、創傷治癒モデルにおいてその効果を検討した。まず、すでに先行していたセントジョーンズワート抽出物を用いて繊維芽細胞、貪食能を持つ細胞株を用いて運動制御に関わる機能検出系を開発した。この結果、免疫系細胞の増殖および活性化誘導能をもつハーブ抽出物成分を見出すことに成功した。さらに海綿から単離したバクテリアを用い、新規貪食および増殖制御活性の検出に成功した。今後、この検出系をさらに先鋭化する。本研究の目的は、我々が開発した信州区運動家での創傷治癒モデルとその知見を基盤として活用し、ハーブ、薬藻類から効率的に創傷治癒活性を持つ生理活性物質を検出する系を構築することである。本年度は、3つの点からシステム開発を進めた。(1)細胞運動の観測によるハーブ生理活性物質検出システムでは、まず(1-1)細胞運動持続観察システムを用いた不死化細胞株でのメデイカルハーブによる細胞運動抑制活性の検出を行った。RAW263細胞にハーブ(S)抽出物を添加するとその細胞運動の抑制が観測された。(1-2)また温度制御系の連動により、細胞運動の温度依存性変化を確認した。(2)ファゴサイトーシスのハーブ生理活性物質検出システムとしては、ヒト正常多核白血球および不死化細胞株を用いた系構築を行った。(2-a)市販のラテックスビーズに代わる貪食ターゲットとして酵母および大腸菌を用いたFITC標識人工貪食標的を作成した。この過程で標識に用いる細胞の固定方法(試薬、濃度、時間、温度)、蛍光試薬の種類、クエンチング剤とその方法を検討した。この結果、蛍光顕微鏡およびフローサイトメーターでハイスループット解析可能な実験系の基盤材料開発を行った。(2-b)またルミノビーズを用いた多核白血球の貪食能検出システムを開発した。現在ヒト不死化細胞株への応用系構築に取り組んでいる。(3)ハーブ生理活性物質による2次変化検出系の構築に関しては(3-a)プロテインアレイ系の開発をELISAベースの方法とビーズを用いたフローサイトメトリー法の2点について行った。この結果セントジョーンズワートによるサイトカイン産生能の変化を示唆するデータを得た。(3-b)RealtimePCRを用いたmRNAレベルでのサイトカイン産生能の変化を観測するシステムについても開発に着手し、変動を認めるデータが一部得られてきている。我々が新規に開発した伸縮運動下での創傷治癒モデルを活用し、ハーブ・薬草類から効率的に創傷治癒活性をもつ生理活性物質を検出する系を構築することである。本研究では、種々のハーブを用いこの力学ストレス負荷皮膚細胞培養系での創傷治癒活性検出の妥当性をさらに検討する。我々は今までにはない力学的ストレス環境下という観点から新規創傷治癒モデルを構築してきた。創傷治癒過程における運動(機械刺激)により創傷治癒過程がモディファイされる点に着目し、周期性培養細胞伸展装置を用いた解析により、分子レベルでの変化を明らかにしてきた。この結果、創傷治癒過程の異常であるケロイドではメカニカルストレス負荷時に正常皮膚線維芽細胞とはMAPキナーゼファミリー(シグナル伝達分子)のセリン・スレオニンリン酸化パターンの差を見出した。したがってこのモデル系を使用することでより今までにない観点から効率的にハーブなどから薬効成分を抽出することが可能と考えられる。今回、市販の乾燥ハーブ類及び国内で栽培されているハーブよりその成分を抽出し、創傷治癒モデルにおいてその効果を検討した。現在この成分のさらなる分離と創傷治癒系に及ぼす影響について解析を進めている。さらに、新規創傷治癒活性検出のためにヒト及びマウス不死化培養細胞株を用いた免疫細胞貪食能測定システムの開発を進めている。現時点においてすでに一部のハーブの持つ貪食能検出が可能となっており、さらに精度を上げるために改良を進めている。本研究の目的はわれわれが開発した伸縮運動下での創傷治癒モデルによる知見を基盤としてハーブ薬藻類などから効率的に創傷治癒活性を持つ生理活性物質を検出する系を構築することである。本年度は、昨年度までに本研究の中で開発した検出形を活用し、実際のハーブなどさまざまな自然産物から新規創傷治癒関連生理活性の検出を試みた。この結果、海綿由来の抽出物から白血球系ヒト培養細胞株の運動性を上昇させる活性を見出すとともに、マクロファージ系細胞の増殖抑制活性を検出することに成功した。現在この祖抽出物の分離を進めている。また、アロエ皮から好中球運動の活性化誘導作用を見出すことに成功している。

このためさらにさまざまな自然産物への適応を進めるとともにそれぞれの活性物質の単離抽出を進めている。総合領域本年度は(1)細胞運動の観測によるハーブ生理活性物質検出システムでは、細胞運動持続観察システムを用いたヒトおよびマウス不死化細胞でのメデイカルハーブ由来成分による細胞運動抑制活性の検出を行った。(2)ファゴサイトーシスおよび細胞内取り込みからのハーブ生理活性物質検出システムとしては、ヒト正常多核白血球、単核球およびヒト不死化細胞株を用いた系構築を行った(3)ハーブ生理活性物質による2次変化検出系の構築に関しては(3-a)プロテインアレイ系の開発を行った。(3-b)RealtimePCRを用いたmRNAレベルでのサイトカイン産生能の変化を観測するシステムについても開発に着手した。このようにハイスループット検出系の開発は順調に進んでいる。今年度はこの成果を正式に公表するに至らなかったので「おおむね順調」と評価する。平成24年度においては市販の乾燥ハーブ類及び国内で栽培されているハーブよりその成分を抽出し、創傷治癒モデルにおいてその効果を検討した。この結果、免疫系細胞の増殖および活性化誘導能をもつハーブ抽出物成分を見出すことに成功している。現在この成分のさらなる分離と創傷治癒系に及ぼす影響について解析を進めている。また、この生理活性検出にあたり新規創傷治癒活性検出としてヒト及びマウス不死化培養細胞株を用いた免疫細胞貪食能測定システムの開発を進めており現在一部ハーブにおいて貪食能促進効果を検出することに成功している。この系により新規検出系の基礎データが収集されてきている。今後この検出精度の向上に努め実用的な検出系構築を目指す。H26年度は、現在進行中の(1)細胞運動の観測によるハーブ生理活性物質検出システム、(2)ファゴサイトーシスおよび細胞内取り込みからのハーブ生理活性物質検出システム、(3)ハーブ生理活性物質による2次変化検出系の構築をさらに推進する。特に(4)組成生物の分画および精製系の開発に着手し、より詳細な活性評価システムを構築することが本年度の目標である。(1)に関してはさらに長時間での解析を可能にする。(2)に関してはフローサイトメトリーを活用したエフェクターの分画を行い、効果発現系についてさらに詳細な解析を可能とする。またルミノビーズを用いた細胞運動およびファゴサイトーシス活性検出系は、ヒト不死化細胞株での検出を可能にすることが大きな目標である。これは研究成果の普遍性を高めるうえでも欠かせない改良である。(3)に関しては特にRealtimePCRを用いたmRNAレベルでのサイトカイン産生能の変化の検出系を拡張し、サイトカインパネル解析を目指す。新規(4)に関してはpH依存性分離技術などを基盤として開発を進める。最終的にこのプロジェクトで開発した系を総合的に組み上げ、生理活性物質ハイスループット系開発を行う。ヒト及びマウス不死化培養細胞株を用いた免疫細胞貪食能測定システムの開発を進めており現在一部ハーブにおいて貪食能促進効果を検出の基礎データの集積を進める。
PKC活性化剤グニディマクリンの制癌活性とその作用機序に関する研究

我々が瑞香狼毒という中国産の植物から単離したグニディマクリンはマウス白血病や固形癌に強い制癌効果を示し、ヒト癌細胞の増殖をピコモルの濃度で抑制する。その作用は癌細胞の蛋白質リン酸化酵素(PKC)に結合し活性化するPKCアクチベーターであり、細胞周期に関わるサイクリン依存性リン酸化酵素Ccdk2活性を阻害して細胞の増殖をG_1期に停止させる。グニデェマクリン感受性のK562ヒト白血病細胞などではPKCアイソフォームのbetaIIの発現が強く見られたのでbetaIIのグニディマクリン感受性における重要性を検討した。PKCに強く作用するブライオスタチン1をK562細胞に24時間前処理すると、濃度依存的にPKCのalphaとbetaIIの発現が低下した。この発現低下に比例してグニディマクリンへの耐性が見られた。一方本質的にグニディマクリンに耐性のHLEヒト肝癌細胞にbetaII遺伝子導入を試みた結果、PKCbetaIIの発現が見られるクローンにおいてグニディマクリンによる細胞増殖の抑制が見られるようになり、betaII発現量と感受性とで相関する結果が得られた。cdk2活性阻害のメカニズムを検討した結果、K562細胞をグニディマクリン存在下で培養すると4時間後cdkに阻害因子であるp21WAFl/CIP1の発現が誘導され、そしてcdk2に強く結合していることが見い出された。さらに24時間後にはcdk2の160番目のスレオニンが脱リン酸化状態になり不活性化されていることも明らかにされた。これらの結果からグニディマクリンは癌細胞のPKC特にbetaIIに作用して細胞周期制御因子に働き、細胞増殖を抑制していると思われる。グニディマクリンは現在米国の国立癌研究所においても制癌効果が調べられ、大腸癌などに効果が見られたのでヒトの癌細胞のヌードマウスの実験系で制癌効果が調べられている。中国産の植物、瑞香狼毒(S.chamaejasmeL.)より単離され、ルイス肺癌、B16メラノーマ、コロン26大腸癌などマウスの固形癌に強い制癌効果を示し、ヒトの癌細胞株に対しても10^<-10>のオーダーのモル濃度で増殖を抑制する新制癌剤グニディマクリンの作用の検討した結果、蛋白質リン酸化酵素PKCを直接活性化する作用が見いだされた。K562細胞の膜の水泡化現象、そして蛋白質リン酸化酵素阻害剤の添加による水泡化現象の消滅、フォルボールエステル(PDBu)のPKCへの特異的結合の阻害、ヒトの血小板凝集作用などがグニディマクリンの添加によって見られたことから、グニディマリンは細胞レベルでのPKCに作用していることが確かめられた。次にこのグニディマクリンによる細胞増殖抑制作用とPKC活性化作用との関係を検討した結果、グニディマクリンに対して低感受性のH69ヒト小細胞肺癌細胞株ではPKCの活性化が30分の1以下と低く、PKCの細胞での発現を抗体を用いて免疫染色で調べた結果、PKCのアイソフォームβIIの発現が感受性細胞では強く見られ、H69低感受性では弱く、HLE肝癌細胞など耐性細胞ではまったく見られなかった。PKCのアイソフォーム発現の違いによる感受性の違いの可能性が考えられた。HLE細胞はPKCのα型のアイソフォームは強く発現していたが、グニディマクリンとの接触によるPKCのダウンレギュレーションが強く見られた。PKC活性化後の細胞質から細胞膜へのPKCのトランスロケーションでは感受性の違いによる差は見られなかった。現在細胞周期を制御する酵素の一つcdk2をグニディマクリンが細胞増殖を抑制する濃度で完全に阻害し、細胞の周期をG1に停止させることが明らかになり、グニディマクリンによる細胞周期制御因子を介した細胞増殖抑制機構とその感受性との関係についてさらに研究中である。我々は、マウス白血病や固形癌に強い制癌効果を示し、ヒト癌細胞の増殖をピコモルの濃度で抑制する新制癌剤グニディマクリンを単離した。グニディマクリンの作用を検討した結果、培地中で添加されている血清アルブミンと結合、活性を保持し、安定性も保っていることが見い出された。グニディマクリンは癌細胞の蛋白質リン酸化酵素(PKC)に結合して、活性化するPKCアクチベータ-であった。次にグニディマクリンによる細胞増殖抑制作用とPKCへの結合と活性化との関係を検討した。K562ヒト白血病細胞などグニディマクリンに感受性を示す細胞ではPKCのβIIの発現が強く見られた。一方、HLE肝癌細胞など耐性細胞ではPKCαは強く発現していが、βIIの発現は見られず、PKCアイソフォームの発現の違いが感受性を異にする可能性が示唆された。増殖を抑制する濃度(0.0005μg/ml)のグニディマクリン存在下でK562細胞を培養すると、24時間後に細胞はG_1の細胞周期に蓄積され、細胞周期G_1からS期への移行を制御する酵素の一つcdk2の活性が阻害された。より高濃度では、cdk2の活性はほぼ完全に阻害され、最高のG_1細胞周期蓄積率が見られたが、0.05μg/mlまで濃度を増加した時細胞のPKCの発現とその機能は十分の一以下にダウンレギュレーションされた。そしてcdk2活性の阻害と細胞周期G_1への蓄積が逆に低下した。

cdk2活性の阻害のメカニズムを検討した結果、K562細胞をグニディマクリン存在下で培養すると4時間後にcdkの阻害因子p21(WAF1/CIP1)の発現が誘導されることが明らかとなった。これらの実験結果からグニディマクリンは細胞のPKCを介して細胞周期制御因子に働き、細胞増殖を抑制していると思われる。グニディマクリンは現在米国の国立癌研究所においても制癌効果が調べられ、大腸癌などに効果が見られたのでヒトの癌細胞のヌードマウスの実験系に入ることが決定された。我々が瑞香狼毒という中国産の植物から単離したグニディマクリンはマウス白血病や固形癌に強い制癌効果を示し、ヒト癌細胞の増殖をピコモルの濃度で抑制する。その作用は癌細胞の蛋白質リン酸化酵素(PKC)に結合し活性化するPKCアクチベーターであり、細胞周期に関わるサイクリン依存性リン酸化酵素Ccdk2活性を阻害して細胞の増殖をG_1期に停止させる。グニデェマクリン感受性のK562ヒト白血病細胞などではPKCアイソフォームのbetaIIの発現が強く見られたのでbetaIIのグニディマクリン感受性における重要性を検討した。PKCに強く作用するブライオスタチン1をK562細胞に24時間前処理すると、濃度依存的にPKCのalphaとbetaIIの発現が低下した。この発現低下に比例してグニディマクリンへの耐性が見られた。一方本質的にグニディマクリンに耐性のHLEヒト肝癌細胞にbetaII遺伝子導入を試みた結果、PKCbetaIIの発現が見られるクローンにおいてグニディマクリンによる細胞増殖の抑制が見られるようになり、betaII発現量と感受性とで相関する結果が得られた。cdk2活性阻害のメカニズムを検討した結果、K562細胞をグニディマクリン存在下で培養すると4時間後cdkに阻害因子であるp21WAFl/CIP1の発現が誘導され、そしてcdk2に強く結合していることが見い出された。さらに24時間後にはcdk2の160番目のスレオニンが脱リン酸化状態になり不活性化されていることも明らかにされた。これらの結果からグニディマクリンは癌細胞のPKC特にbetaIIに作用して細胞周期制御因子に働き、細胞増殖を抑制していると思われる。グニディマクリンは現在米国の国立癌研究所においても制癌効果が調べられ、大腸癌などに効果が見られたのでヒトの癌細胞のヌードマウスの実験系で制癌効果が調べられている。
iPS細胞を用いた新規動脈硬化抑制因子の探索

動脈硬化の進展には糖尿病などの環境リスク因子が大きな影響を及ぼすが、患者の遺伝的要因も同様に重要である。中には大変稀であるが、動脈硬化リスクが非常に高いにもかかわらず動脈硬化の進展が全く認められない患者(抗動脈硬化患者)が存在する。そのような患者は内因性の非常に強い抗動脈硬化機構を有しているはずである。本研究では抗動脈硬化患者より作成した疾患iPS細胞を用いて内因性の抗動脈機構を解明し、根治を目指した新規治療法開発を行いたいと考えた。本研究では動脈硬化リスクが非常に高いにもかかわらず動脈硬化が全く存在しない、「抗動脈硬化」患者より人工多能性幹(iPS)細胞を樹立し、動脈硬化病態の首座である血管内皮細胞に分化させることで、内因性の抗動脈硬化機序を解明し、根本的治療に結びつく創薬を行うことを目的とする。今までに抗動脈硬化患者よりiPS細胞を樹立し、血管内皮細胞に分化誘導を行い解析を行った。酸化ストレスを血管内皮細胞に加えた際に、炎症惹起、アポトーシス、内皮機能などに差異があるか検討を行った。コントロール群の血管内皮細胞に酸化ストレスを加えると、老化関連因子であるp21の発現上昇、p53の活性化を認め、またBガラクトシダーゼ染色陽性の老化細胞を多数認めるようになる。ところが、抗動脈硬化群の血管内皮細胞では、これら老化関連の表現型が抑制されていることが分かった。また老化細胞は組織の炎症惹起を引き起こすことで組織ダメージを与えることが知られている。そこで、炎症惹起因子であるMCP-1, ICAM1, IL6などのmRNAがどの程度誘導されるか検討を行ったところ、抗動脈硬化群において有意に抑制されていた。以上の結果より、抗動脈硬化群では老化および炎症惹起が抑制されていることが分かった。次にMicro arrayを用いて、表現型の差異をもたらす因子の検索を行いX因子を同定した。血管内皮細胞においてX因子の強制発現を行い、酸化ストレスを加えることで抗動脈硬化群の表現型が再現できるかどうか検討を行った。酸化ストレス誘導性の老化、炎症惹起について検討を行ったところ、X因子を強制発現させることで有意に抑制できることが分かり、抗動脈硬化作用をもたらす一因であると考えられた。現在日本における心・脳血管障害などの動脈硬化性疾患の死亡数は悪性腫瘍より多い。しかし動脈硬化治療は危険因子管理が主体であり、根本的治療は存在しない。動脈硬化の進行は糖尿病、高血圧などの様々な危険因子によって規定されるが、日常臨床において動脈硬化リスクが非常に高いにもかかわらず動脈硬化が全く存在しない症例を時折経験する。そのような症例では遺伝的に非常に強力な抗動脈機構を有していると考えられる。本研究ではそのような抗動脈硬化患者より人工多能性幹(iPS)細胞を樹立し、動脈硬化病態の首座である血管内皮細胞に分化させることで、内因性の抗動脈硬化機序を解明し、根本的治療に結びつく創薬を行うことを目的とする。まず最初に抗動脈硬化患者の選定を行った。糖尿病患者は通常であれば血管障害が強力に促進されているはずであるが、大血管障害(動脈硬化)や細小血管障害(網膜症、腎症、神経障害)が全く存在しない患者を抗動脈硬化群として選定した。これらの患者よりiPS細胞を樹立し血管内皮細胞へ分化誘導を行った。誘導された血管内皮細胞で表現型の確認を行うと、酸化ストレスに誘導される炎症惹起、老化が抑制されることが分かった。次にMicroarrayによる網羅的解析を行い、抗動脈硬化患者において新規因子FactorX発現が上昇していることが分かった。FactorXを血管内皮細胞に強制発現させることにより、炎症・老化が抑制されることが分かった。また炎症促進させる因子として知られるNFkBの活性化も抑制した。次にFactorXを血管内皮細胞特異的に強制発現させるトランスジェニックマウスの作成を行い、急性血管障害モデルで動脈硬化類似病変が抑制されるかどうか検討した。結果、血管障害に誘導される内膜肥厚、および炎症惹起、NFkBの活性化が抑制されており、in vivoでもFactorXが炎症抑制に有用であることが判明したiPS細胞に誘導される血管内皮細胞を用いた実験においては、当初計画していた通り、抗動脈硬化患者においては炎症惹起、老化が抑制されていることが分かった。またMicroarrayを用いた網羅的解析によりFactorXを同定し、強制発現を行う細胞実験において、炎症・老化を抑制できることが分かった。また抑制の機序としてNFkBの関与が考えられた。以上細胞系を用いた実験としては予想通りの結果を得ることができた。次に動物を用いた実験に関してであるが、当初はFactorXを強制発現させたトランスジェニックマウスと、動脈硬化モデルマウスのAPOEノックアウトマウスを交配させることで実験を行う予定であったが、交配に予想以上の時間がかかり、またその後の解析にも多くの時間を必要とすることから予定を変更し、急性血管障害モデルにおいて炎症の評価を行うこととした。予定外の変更ではあったが、血管障害モデルに落ちてFactorXが炎症を抑制できることを証明することができ、結果として予定通りの進捗状況となった。現在先進国を中心として、動脈硬化を基盤とする心血管疾患や脳血管疾患は増加の一途をたどっている。動脈硬化に対する治療法としてはリスク管理が主流であるが、ひとたび進行した動脈硬化を治療することは非常に難しい。今後の長寿社会を迎える日本において新しい根本的治療の開発が必須である。動脈硬化の進行には糖尿病や肥満などのリスク因子が非常に重要である。

ところが、臨床的に、動脈硬化リスクが非常に高いにもかかわらず動脈硬化を全く有しない患者(抗動脈硬化患者)が時折存在し、内因性の強い抗動脈硬化因子を持っていると考えられる。我々は抗動脈硬化患者からiPS細胞を樹立し血管内皮細胞に誘導すると、酸化ストレスに誘導される抗老化・抗炎症を明らかに抑制されていることが明らかにした。さらに鍵となる因子として網羅的トランスクリプトーム解析により霊長類特異的遺伝子POTEEを同定し、POTEEを強制発現させることにより抗老化・抗炎症効果を有することを細胞レベルにおける強制発現モデルで証明した。また抗炎症の機序として、核内外輸送に携わるRAN familyと直接的に相互作用することを、質量分析法を用いた網羅的プロテオーム解析により発見し、炎症惹起の鍵となる転写因子であるNFkBの核外排出を促進することでNFkB活性を抑制していることを発見した。また、POTEEを血管内皮細胞特異的に強制発現させたマウスではNFkBを介した炎症が抑制され、生体内においてもPOTEEが抗炎症に働くことが証明された。動脈硬化の進展には糖尿病などの環境リスク因子が大きな影響を及ぼすが、患者の遺伝的要因も同様に重要である。中には大変稀であるが、動脈硬化リスクが非常に高いにもかかわらず動脈硬化の進展が全く認められない患者(抗動脈硬化患者)が存在する。そのような患者は内因性の非常に強い抗動脈硬化機構を有しているはずである。本研究では抗動脈硬化患者より作成した疾患iPS細胞を用いて内因性の抗動脈機構を解明し、根治を目指した新規治療法開発を行いたいと考えた。現在までの研究計画は、おおむね研究計画の記載通り進行していると考えられる。現在までの実験計画において、実際に抗動脈硬化患者より作成したiPS細胞由来血管内皮細胞が、抗老化・抗炎症の表現型を示すことが分かった。これは今までに動脈硬化進行に非常に重要であるといわれていた事であり、これらの表現型が抑制されていることから、目的通り抗動脈硬化因子を探索する上で適切なモデルの形成に成功したと考えられる。実際にMicroarrayによる探索で、抗動脈硬化患者においてX因子が有意に上昇していることを発見し、抗動脈硬化作用をもたらす原因ではないかと考え、強制発現による実験で検討を行った。すると、抗動脈硬化患者と同様の表現型を示すことが分かり、新規の動脈硬化抑制因子の可能性があると考えられた。昨年度までは、以上のように新規のX因子が抗動脈硬化作用を示すかどうか証明するところまでを目標としており、しっかりと目標を達成できたと考えられる。現在までのところで、本研究の大まかな方向性が確定してきたことになる。現時点でも論文発表しうる状態となっていると考えられるが、より有用な研究にするために以下に示したような事項を追加で実験を行う予定である。現在までに、上記の通りiPS細胞より誘導した血管内皮細胞を用いた実験により、抗動脈硬化患者では炎症・老化が抑制されることが分かり、そのKey factorとしてFactorXを得ることができた。またFactorXの抗炎症効果がin vivoの実験でも示すことができた。
マルチプルスライスCTによる内臓脂肪及びアデポネクチンなどと大腸腺腫との関連

2004年2月から2005年2月の間にがん検診のために大腸内視鏡およびPET-CT(positron emission tomography/computed tomography)を受診した中高年の男女1205名についてPET-CTで内臓脂肪体積を測定し、男女共に、BMIとは独立に大腸腺腫と正の関連があることを確認した。また男性において、Cペプチド及びIGFBP1は大腸腺腫と関連していたが、女性においては関連は見られなかった。血漿アディポネクチン濃度は大腸腺腫と負に、レプチン濃度は大腸腺腫と正に関連していた。マルチプルスライスCTで測定した内臓脂肪体積と大腸腺腫との間に、男女ともに量反応的な正の関連がみられた。内臓脂肪体積が最も小さい群の大腸腺腫を発症するオッズ比を1として基準とすると2番目、3番目、4番目に大きい群の調整オッズ比は男性においてそれぞれ1.3、1.1、及び2.0であった(トレンドp=0.002)。女性においてはそれぞれ1.9、1.7、及び2.6であった(トレンドp=0.01)。なお、体脂肪率を反映するBMIで層別化しても、内臓脂肪が蓄積している人でリスクが上昇する傾向が見られた。今回の結果から、内臓脂肪蓄積が大腸腺腫の発生に重要な役割を果たしているということだけが示された。また、BMIによる層別化解析の結果から、肥満と大腸腺腫リスクを考えるとき、BMIだけでなく内臓脂肪蓄積を考慮することが重要であると考えられた。インスリン関連マーカーやアディポネクチンといった内臓脂肪蓄積と関連するバイオマーカーを測定した結果も、男性においては内臓脂肪蓄積の重要性を更に支持するものであった。男性において、C-peptide及びIGF-Iと大腸腺腫との間に正の関連が見られた一方、IGFBP-1との間には負の関連が見られた。女性においては、いずれも関連が見られなかった。また、男性において、総アディポネクチン及び高分子アディポネクチンと大腸腺腫との間に負の関連が見られたが、女性においては、いずれも関連が見られなかった。本研究で見られたインスリン関連マーカーやアディポネクチンと大腸腺腫との関連は、これまで示唆されてきたメカニズムと一致するものであり、男性においては内臓脂肪蓄積の重要性を更に支持する結果であったと考えられる。平成20年度までに行った研究において、内臓脂肪体積と大腸腺腫との間に正の関連がみられ、内臓脂肪蓄積が大腸発がんにおいて重要な役割を果たしている事が示唆された。平成21年度は、内臓脂肪体積と大腸腺腫との間にみられた関連のメカニズムを検討するため、バイオマーカーを用いた研究を行った。初めに、内臓脂肪蓄積はインスリン抵抗性と関連している事が知られているため、インスリン関連マーカーと大腸腺腫との関連を検討した。男性において、膵臓からのインスリン分泌の指標であるCペプチドと大腸腺腫との間に正の関連が見られた(傾向性p<0.001)。また、生体内でインスリン様成長因子の調整を行っている結合因子1との間に負の関連が見られた(傾向性p=0.001)。一方、女性においては、男性で見られたような関連は見られなかった。これまでの研究においても、肥満が大腸発がんに与える影響には男女差が見られているため、今回の結果はこの知見を支持するものであると考える。次に、脂肪細胞から産生される生理活性物質であるアディポネクチンおよびレプチンに注目し、大腸腺腫との関連を検討した。血漿アディポネクチン濃度は大腸腺腫と負に関連しており(傾向性p<0.001)、血漿レプチン濃度は大腸腺腫と正に関連していた(傾向性p<0.001)。アディポネクチンおよびレプチンと大腸腺腫との関連は、インスリン抵抗性の指標で調整すると弱まったが、傾向は変わらなかった。興味深い事に、アディポネクチンとレプチンとの間には交互作用が見られた(交互作用p=0.007)。今回の結果は、アディポネクチンとレプチンが大腸発がんにおいて密接に関連している事を示唆するものであると考える。平成21年度に行った研究から、内臓肥満が大腸発がんに及ぼす影響は、複数のメカニズムを介している可能性が示唆された。
ナノ制限空間内分子集団の特異な圧力と相挙動

ゼオライト,シリカ,活性炭などの多孔体はナノオーダの細孔を有するが,ナノ制限空間では「相図」に相当する基礎的情報すら未確立である.本研究では,分子シミュレーションと原子間力顕微鏡(AFM)によりナノ空間内液体の相挙動特性に関する直接的知見を得るとともに,分子集団が「感じる」圧力の観点からの,ナノ空間内相挙動の体系化とモデル化を目指して研究を遂行し,以下の研究成果を得た.1.分子シミュレーション代表者が開発した独創的MD手法(Miyahara et al.,J.Chem.Phys.,1997)を活用し,固体表面相互作用強度と分子集団の密度・圧力との因果関係を主眼に,種々の系でのシミュレーションをパーソナルスーパーコンピュータで行い,気液および固液間の相転移挙動を分子レベルで詳細に観測した.2.実験的検討凝固点が常温付近にある有機液体を対象に,制限空間内の相転移現象を直接的に切り出すべく,以下のような独創的実験手法を確立した.AFM装置(現有)に温度制御オプションを組み,またできるだけグラファイト化度の高いカーボン微粒子(粒子径510ミクロン)をAFMのカンチレバーに接着し,コロイドプローブを作成することに成功した.劈開グラファイト基板とカーボン粒子間の有機液体中でのフォースカーブ測定を種々の温度下で行った結果から,この,有機液体にとってfavorableな擬似スリット状制限空間内で,凝固点が上昇していることを明らかにし,表面間距離と凝固点上昇の関係を見出した.3.モデル検証固体表面からの相互作用力と,ナノ空間ゆえのバルクと異なる物性に立脚し,制限空間内流体が「感じる」圧力の概念を新規に提案し,相挙動を定量的に予測可能なモデルを構築した.本モデルは分子シミュレーションによる結果と,AFMによる測定結果の両系において,任意パラメータをいっさい含まずに,極めて良好に現象を予測することに成功し,その概念の妥当性,定量的健全性,実用的有用性を明らかにすることに成功した.ゼオライト,シリカ,活性炭などの多孔体はナノオーダの細孔を有するが,ナノ制限空間では「相図」に相当する基礎的情報すら未確立である.本研究では,分子シミュレーションと原子間力顕微鏡(AFM)によりナノ空間内液体の相挙動特性に関する直接的知見を得るとともに,分子集団が「感じる」圧力の観点からの,ナノ空間内相挙動の体系化とモデル化を目指して研究を遂行し,以下の研究成果を得た.1.分子シミュレーション代表者が開発した独創的MD手法(Miyahara et al.,J.Chem.Phys.,1997)を活用し,固体表面相互作用強度と分子集団の密度・圧力との因果関係を主眼に,種々の系でのシミュレーションをパーソナルスーパーコンピュータで行い,気液および固液間の相転移挙動を分子レベルで詳細に観測した.2.実験的検討凝固点が常温付近にある有機液体を対象に,制限空間内の相転移現象を直接的に切り出すべく,以下のような独創的実験手法を確立した.AFM装置(現有)に温度制御オプションを組み,またできるだけグラファイト化度の高いカーボン微粒子(粒子径510ミクロン)をAFMのカンチレバーに接着し,コロイドプローブを作成することに成功した.劈開グラファイト基板とカーボン粒子間の有機液体中でのフォースカーブ測定を種々の温度下で行った結果から,この,有機液体にとってfavorableな擬似スリット状制限空間内で,凝固点が上昇していることを明らかにし,表面間距離と凝固点上昇の関係を見出した.3.モデル検証固体表面からの相互作用力と,ナノ空間ゆえのバルクと異なる物性に立脚し,制限空間内流体が「感じる」圧力の概念を新規に提案し,相挙動を定量的に予測可能なモデルを構築した.本モデルは分子シミュレーションによる結果と,AFMによる測定結果の両系において,任意パラメータをいっさい含まずに,極めて良好に現象を予測することに成功し,その概念の妥当性,定量的健全性,実用的有用性を明らかにすることに成功した.ゼオライト,シリカ,活性炭などの多孔体はナノオーダの細孔を有するが,ナノスケール分子集団の持つ,単一分子とバルク流体との中間的性質の解明が不十分で,ナノ制限空間では「相図」に相当する基礎的情報すら未確立である.本研究では,分子シミュレーションと原子間力顕微鏡(AFM)によりナノ空間内液体の特性に関する直接的知見を得るとともに,分子集団が「感じる」圧力の観点からの,ナノ空間内相挙動の体系化とモデル化を目指している.本年度結果概要は以下の通りである.1.分子シミュレーション代表者が開発した独創的MD手法(Miyahara,et al.,J.Chem.Phys.1997)を活用し,固体表面相互作用強度と分子集団の密度・圧力との因果関係を主眼に,種々の系でのシミュレーションをパーソナルスーパーコンピュータで行った.2.実験的検討凝固点が常温付近にある有機液体を対象に,典型的制限空間における相転移現象を直接的に切り出すべく,以下のような独創的実験手法の確立に尽力した。AFM装置(現有)に温度制御オプションを組み込んで温度制御を可能とした。できるだけグラファイト化度の高いカーボン微粒子(粒子径510ミクロン)を探索し、これをAFMのカンチレバーに接着し、コロイドプローブを作成することに成功した。劈開グラファイト基板とコロイドプローブ間のフォーカスカーブ測定を、有機液体中で、種々の温度下で行った。本系では有機液体にとってfavorableな空間である。

温度とフォーカスカーブとの相関を検討した結果、グラファイト基板とカーボン粒子から構成される擬似スリット状制限空間内で、凝固点が上昇している可能性を見出した。詳細な検討は今後に負うところが多いが、これはシミュレーションによる予測と極めて良好に符合する結果であり、本研究の基礎概念の妥当性を示唆するものである。ゼオライト,シリカ,活性炭などの多孔体はナノオーダの細孔を有するが,ナノ制限空間では「相図」に相当する基礎的情報すら未確立である.本年度は,分子シミュレーションと原子間力顕微鏡(AFM)によりナノ空間内液体の相挙動特性に関する直接的知見を集積するとともに,分子集団が「感じる」圧力の観点からの,ナノ空間内相挙動のモデル化を目指し,以下の結果を得た.1.分子シミュレーション(理想実験系)固体表面相互作用強度と分子集団の密度・圧力との因果関係の把握を主眼に,種々の系でのシミュレーションを行い,気液および固液間の相転移挙動を分子レベルで詳細に観測した.2.実験的検討(実在系)昨年度確立した実権手法を活用し,制限空間内の相転移現象を直接的に切り出すべく,以下のような測定を行った.グラファイト化度の高いカーボン微粒子(粒子径510ミクロン)をAFMのカンチレバーに接着し,コロイドプローブを作成した.劈開グラファイト基板とカーボン粒子間で,弱い相互作用を示すアルコールと,強い相互作用を示すアルカン類を対象に,有機液体中でのAFMフォースカーブ測定を種々の温度下で行った結果から,強い相互作用系において,擬似スリット状制限空間内で,凝固点が上昇していることを明らかにし,表面間距離と凝固点上昇の関係を見出した.3.モデル検証固体表面からの相互作用力と,ナノ空間ゆえのバルクと異なる物性に立脚し,制限空間内流体が「感じる」圧力の概念を新規に提案し,相挙動を定量的に予測可能なモデルを構築した.本モデルは分子シミュレーションによる結果と,AFMによる測定結果の両系において,任意パラメータをいっさい含まずに,極めて良好に現象を予測することに成功し,その概念の妥当性,定量的健全性,実用的有用性を明らかにすることに成功した.
心肥大及び血管新生・増殖の機序解明と治療的電気刺激血管新生法の確立

(1)ラットの両大腿動脈を結紮して虚血肢を作製し、両側の前脛骨筋に対して電極を挿入し、筋収縮閾値以下の電気刺激を与えた際の虚血肢骨格筋における血管新生を観察し、その機序についいて研究した。その結果、電気刺激は微弱でも虚血肢に対するVEGF増加に効果的であり、その増加は炎症、低酸素といった生体に不利な現象が関連している可能性は低いことが推定された。また持続的微弱電気刺激は筋収縮を与える刺激と比べてより早期にVEGFが誘導されると考えられた。さらに筋収縮閾値以上・以下での電気刺激の違いにより、HGFの反応に違いがあることから、虚血骨格筋の血流改善に関わる血管新生因子に相違がある可能性が示唆された。電気刺激という主にリハビリテーション分野で用いられてきた治療法が、虚血肢に対する新しい血管新生療法として役立つ可能性をも示唆し、今後の研究の発展が期待される。(2)WKYでの心筋虚血再潅流時の心筋でのHIF発現レベルに対する長期間の運動の効果を検討した。運動(-)虚血(-)群に比較して運動(-)虚血(+)群では心筋HIFmRNA発現は有意に増加していた。運動(+)虚血(+)群では、運動(-)虚血(+)群と心筋HIFmRNA発現レベルに差異は認めず、本モデルにおいての虚血に対する長期的運動の効果はあきらかとはいえなかった。(3)5/6腎摘SHRに運動を長期的に行わせた際に尿蛋白減少作用、腎組織保護作用が認められることをあきらかにした。また、本モデルにおいて運動の腎機能保護作用およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬enalaprilやアンジオテンシンII受容体拮抗薬losartanと運動の相乗作用が確認された。(4)慢性ネフローゼモデルラットにおいては長期的運動とenalaprilはそれぞれ単独でよりも併用により明らか腎保護作用を呈することが腎組織学的に示され、これらの腎組織保護の機序として血清脂質の改善が強く関与していることが示唆された。虚血肢に電気刺激を与えると血流が増加することが報告されている。しかし筋収縮を最大あるいは亜最大レベルで与えている報告ばかりであり、患者に不快感を与えることや長期間行うと筋疲労を起こし筋の萎縮を引き起こす可能性があり解決すべき問題点も多い。一方in vitroにて筋収縮閾値以下のレベルでの持続的電気刺激で骨格筋VEGFmRNAが増加したことを報告した。さらに、われわれはラットを用いて筋収縮を引き起こさないレベルでの電気刺激を行いin vivoでの効果の有無を調べた。その結果、虚血肢に持続的微弱電気刺激を行うとVEGF蛋白の増加を認め、そのことが血管新生を引き起こす可能性が推定された。このように、筋収縮閾値以下のレベルでの電気刺激でもVEGFは増加し、血管新生が生じている可能性が推定され、持続的微弱電気刺激を用いて虚血肢に対する新しい血管新生法が開発される可能性が示唆された。一方、強い電気刺激による筋収縮の際には筋および周囲組織の低酸素状態が引き起こされ、VEGFの産生が誘導すると報告されている。筋収縮閾値以下の場合でも1)低酸素状態が引き起こされているのかどうか、また2)VEGF以外の他の血管新生関連因子も血管新生に関与しているのかを確認するため、免疫染色法を用いて以下の検討を行った。

その結果、抗HIF抗体および抗FGF抗体を用いた染色では、ともに電気刺激群とcontrol群では差異を認めなかった。従って、本条件下の持続微弱電気刺激で認められたVEGFの増加は低酸素を介しておらず、VEGFに特異的な現象である可能性が示唆された。(1)ラットの両大腿動脈を結紮して虚血肢を作製し、両側の前脛骨筋に対して電極を挿入し、筋収縮閾値以下の電気刺激を与えた際の虚血肢骨格筋における血管新生を観察し、その機序についいて研究した。その結果、電気刺激は微弱でも虚血肢に対するVEGF増加に効果的であり、その増加は炎症・低酸素といった生体に不利な現象が関連している可能性は低いことが推定された。また持続的微弱電気刺激は筋収縮を与える刺激と比べてより早期にVEGFが誘導されると考えられた。さらに筋収縮閾値以上・以下での電気刺激の違いにより、HGFの反応に違いがあることから、虚血骨格筋の血流改善に関わる血管新生因子に相違がある可能性が示唆された。電気刺激という主にリハビリテーション分野で用いられてきた治療法が、虚血肢に対する新しい血管新生療法として役立つ可能性をも示唆し、今後の研究の発展が期待される。(2)WKYでの心筋虚血再灌流時の心筋でのHIF発現レベルに対する長期間の運動の効果を検討した。運動(-)虚血(-)群に比較して運動(-)虚血(+)群では心筋HIFmRNA発現は有意に増加していた。運動(+)虚血(+)群では、運動(-)虚血(+)群と心筋HIFmRNA発現レベルに差異は認めず、本モデルにおいての虚血に対する長期的運動の効果はあきらかとはいえなかった。(3)5/6腎摘SHRに運動を長期的に行わせた際に尿蛋白減少作用、腎組織保護作用が認められることをあきらかにした。また、本モデルにおいて運動の腎機能保護作用およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬enalaprilやアンジオテンシンII受容体拮抗薬losartanと運動の相乗作用が確認された。(4)慢性ネフローゼモデルラットにおいては長期的運動とenalaprilはそれぞれ単独でよりも併用により明らかな腎保護作用を呈することが腎組織学的に示され、これらの腎組織保護の機序として血清脂質の改善が強く関与していることが示唆された。
歯根膜由来細胞に対する機械的外力反復負荷の影響

細胞が生理的に受ける外力に近いモデルとして,ナイロンメッシュに支持されたコラーゲン薄層に包理した培養細胞に機械的外力を反復負荷する装置を用いて実験を行って来た。今回はヒト歯根膜由来細胞を用いて,包埋するゲル濃度,ゲル変形量および外力の負荷期間を変えた場合の外力に対する応答性を,新生ラット頭蓋冠由来骨系細胞と比較した。コラーゲンゲルは新田ゼラチン社製0.3%セルマトリックスタイプIAを用い,最終濃度0.21または0.24%に調整した。厚さ約1mmのコラーゲンゲル薄層に包埋したそれぞれの細胞は,装置にセットし24時間静止状態で前培養した後,1Hzの反復周期でゲルを10%または15%伸展させる外力を,24時間から168時間負荷した。外力の負荷に伴う培養液攪拌の影響を除外するために,コラーゲンゲルを伸展させずに培養液中を水平移動するサイクリックコントロール群を設けた。実験終了後,一定面積のゲル薄層中のDNA量(Meyerらの方法),アルカリフォスファターゼ活性(Bessy-Lowry法)を測定した。また,細胞の形態と配列状態は通法に従って樹脂(JB-4)包理した2mum切片をトルイジンブルー染色して観察した。さらに,一部の試料ではナイロンメッシュの変形量と細胞の形態変化の関係を明らかにするために,外力負荷前後の状態を直接,微分干渉倒立顕微鏡を用いて観察した。外力の反復負荷により,両細胞とも分裂活性の上昇とアルカリフォスファターゼ活性の低下が見られ,また細胞は方向性をもって配列し,長い突起を伸ばしているのが観察された。しかし,歯根膜由来細胞の方がより強い外力の負荷を必要とする傾向にあった。微分干渉倒立顕微鏡による観察では,細胞がメッシュの伸展に伴って変形している様子が見られたが,メッシュ繊維との位置関係により伸展,圧縮,回転といった複雑な力が働いているため,今回は定量的に測定することはできなかった。
LP-MOCVDによる高耐食性人工不働態皮膜の形成

有機金属化合物を原料とする化学気相析出法であるMOCVD(metalorganic chemical vapor deposition)によって各種の組成を持つ人工不働態皮膜を作製し、その耐食性を調べることにより、高耐食性防食被覆への適用および自然不働態皮膜のモデル皮膜として応用について検討した。得られた重要な成果は以下の通りである。1.装置の作製: 3元系までの複合酸化物を合成することが可能なMOCVD装置を作製した。装置に回転アナライザ方式の自動エリプソメータを組込むことにより、成膜過程のin-situモニタが可能になった。3.Fe_2O_3-Cr_2O_3-NiO複合酸化物薄膜の合成と耐食性評価:ステンレス鋼上の自然不働態皮膜を模擬したFe_2O_3-Cr_2O_3-NiO系複合酸化物薄膜の5M-HCl中での溶解速度と組成との関係を調べた。溶解速度は薄膜のCr_2O_3含有量の増加と共に指数関数的に減少し、このような挙動は自然不働態皮膜と類似していることが分かった。4.Ta_2O_5-ZrO_2複合酸化物薄膜の合成と耐食性評価:自然には生成することがないTa_2O_5-ZrO_2系複合酸化物薄膜を合成し、HClおよびNaOH溶液中での耐食性と皮膜組成の関係を調べた。その結果、Ta(V)カチオン分率0.30.5のTa_2O_5-ZrO_2薄膜は5M-HClおよび5M-NaOH溶液の両方に対して最も良い耐食性を示すことが分かった。5.人工不働態皮膜被覆Feおよびステンレス鋼の耐食性評価:純FeおよびSUS304ステンレス鋼上にSiO_2薄膜を形成して耐食性の変化を調べた結果、SiO_2被覆によって耐食性を大幅に改善できることが分かった。1.研究目的有機金属化合物を原料とする化学気相析出法であるMOCVDによって各種の組成と構造を持つ人工不働態皮膜を作製し、皮膜の組成・組織・構造と耐食性の関係を明らかにすることを目的とする。2.研究成果(1)LPーMOCVD装置の作製:3元系までの複合酸化物を合成することが可能な低圧(LP)ーMOCVD装置を作製した。本装置には回転アナライザ方式の自動エリプソメ-タを組み込んだ。これにより、成膜中に膜厚をinーsitu測定して、皮膜の構造を任意に制御することが可能になった。1.研究目的有機金属化合物を原料とする化学気相析出法であるMOCVDによって各種の組成と構造を持つ人工不働態皮膜を作製し、皮膜の組成・組織・構造と耐食性との関係を明らかにすることを目的とする。2.研究成果(1)耐食性に及ぼす成膜温度の影響:前年度の研究によって同一の成膜温度(350°C)におけるAl_20_3とTi0_2の耐食性はZrO_2およびTa_2O_5に比べて劣ることが分かった。そこで、Al_2O_3とTiO_2の成膜温度を550°Cまで上昇させて耐食性の変化を関係を調べた結果、成膜温度が高いほど耐食性は増加するが、Ta_2O_5やZrO_2ほどの高耐食性は得られないことが判明した。