hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳虚血患者におけるフローサイトメトリーによる血小板活性化と抗血小板療法の評価

虚血性脳血管障害(ICVD)患者においてフローサイトメトリー(FC)により血小板フィブリノーゲン(Fbg)結合陽性率と血小板P-セレクチン発現陽性率を測定した。ICVD患者とICVD以外の神経疾患よりなる患者対照から採取したクエン酸Na加静脈血にFITC標識抗Fbg抗体またはPE標識抗P-セレクチン(PS)抗体を反応させ、パラホルムアルデヒドで固定し、FCにより対数前方散乱と対数側方散乱から血小板集団を同定し、血小板5,000個について対数蛍光強度のヒストグラムを描出し、FITCまたはPE標識IgGを用いた陰性対照から陽性部分を設定して全血小板に占めるFbg結合血小板とPS発現血小板の比率を算定した。血小板Fbg結合陽性率は対照群に比しアテローム血栓性梗塞(AT)群、心原性脳塞栓症群、ラクナ梗塞群、TIA群でいずれも高値を示したが、AT群ではラクナ梗塞群と比べても有意に高率であり、抗血小板薬投与群で抗血小板薬無投与群より有意に低率であった。また、血小板PS発現陽性率はAT群でのみ対照群より有意に高率であった。血小板Fbg結合陽性率と血小板PS発現陽性率はADP、アラキドン酸、血小板活性化因子惹起血小板凝集能のいずれとも有意な相関を示さなかった。in vitroにおいて、血小板Fbg結合は生理的範囲でのFbgの変動による影響を受けず、PGI2誘導体やFbg受容体拮抗薬により抑制された。以上の結果より、FCによる血小板Fbg結合陽性率と血小板PS発現性率の測定はICVD患者において血小板凝集能よりも生体内での血小板活性化を反映し、感度と特異生に優れた活性化血小板検出法であり、抗血小板療法の適応決定や効果判定に有用であると考えられた。細胞機能測定法としてflow cytometry(FC)が盛んに用いられるようになったが、研究代表者らは全血においてFCを用いて蛍光色素を標識した抗接着分子抗体により血小板膜機能を測定する系を確立し、脳虚血患者における活性化血小板の検出と抗血小板療法の効果を検討した。方法はクエン酸ナトリウムを用いて採取した静脈血に蛍光色素FITCを標識した抗フィブリノゲン(Fbg)抗体を反応させて固定し、FCにより前方散乱と側方散乱から血小板集団を同定して蛍光強度のヒストグラムを描出し、対照(FITC標識IgG)を用いて陽性部分を設定し、血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIaへのFbgの結合陽性率を測定した。正常対照に比し脳虚血患者では高率にFbg結合陽性率の増加が認められた。また、脳虚血患者のうち、抗血小板薬、とくにチクロピジンを内服している患者群では抗血小板薬未投与群よりもADP刺激によるFbg結合率の増加が有意に低値であった。同様な方法により、蛍光色素phycoerythrin(PE)標識抗CD62p抗体を用い、PE標識IgG1を対照として、血小板膜上のP-selectin発現陽性率を検討した。P-selectinの発現は対照に比し脳虚血患者で高率で認められた。こちらの結果より、FCによる全血中の血小板膜表面へのFbgの結合やP-selectin発現の定量的測定は脳虚血患者における生体内活性化血小板の検出と抗血小板療法の効果判定に有用な検査法であると考えられた。脳梗塞、一過性脳虚血発作(TIA)、対照(脳血管障害以外の神経疾患患者)において、フローサイトメーターによりFITC標識抗フィブリノゲン抗体を用いて血小板

GPIIb/IIIaへのフィブリノゲンの結合能を測定したところ、アテローム血栓性脳梗塞群、心原性脳塞栓症群、ラクナ梗塞群、TIA群ではいずれも対照群より血小板フィブリノゲン結合率が有意に高値であり、アテローム血栓性脳梗塞群では心原性脳塞栓症群、ラクナ梗塞群、TIA群と比べても有意に高値であった。また、フローサイトメーターによりPE標識抗P-セレクチン抗体を用いて血小板膜表面へのP-セレクチンの発現率を測定したところ、心原性脳塞栓症群ではアテローム血栓性脳梗塞群、ラクナ梗塞群、TIA群、対照群に比し有意に高値であった。さらに、血小板フィブリノゲン結合率と血小板P-セレクチン発現率を抗血小板薬投与群と非投与群の間で比較したところ、血小板フィブリノゲン結合率はアテローム血栓性脳梗塞群では抗血小板薬投与群で非投与群より有意に高値であった。以上の結果より、虚血性脳血管障害患者では血小板フィブリノゲン結合能が亢進しており、特にアテローム血栓性脳梗塞で著明であり、抗血小板療法により抑制されると考えられた。また、心原性脳塞栓症では血小板フィブリノゲン結合率よりも血小板P-セレクチン発現率が他の患者群より顕著であったことから、不応状態にある血小板が増加していると考えられた。フローサイトメトリーによる血小板のフィブリノゲン結合率とP-セレクチン発現率の測定は脳虚血患者において特異的で、高感度の血小板活性化検出法であり、抗血小板療法の効果判定にも有用であると考えられた。脳虚血患者においてフローサイトメトリーにより血小板フィブリノゲン結合陽性率と血小板P-セレクチン発現陽性率を測定した。脳虚血患者と脳虚血以外の神経疾患よりなる患者対照から採取したクエン酸Na加静脈血にFITC標識抗フィブリノゲン抗体またはPE標識抗P-セレクチン(CD62p)抗体を反応させ、パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターにより対数前方散乱と対数側方散乱から血小板集団を同定し、血小板5,000個について対数蛍光強度のヒストグラムを描出し、FITCまたはPE標識IgGを用いた陰性対照から陽性部分を設定して全血小板に占めるフィブリノゲン結合血小板とP-セレクチン発現血小板の比率を算定した。血小板フィブリノゲン結合陽性率は対照群に比しアテローム血栓性梗塞群、心原性脳塞栓症群、ラクナ梗塞群、TIA群でいずれも高値を示したが、アテローム血栓性梗塞群はラクナ梗塞群と比べても有意に高率であった。血小板P-セレクチン発現陽性率はアテローム血栓性梗塞群でのみ対照群より有意に高率であった。また、血小板フィブリノゲン結合陽性率は、アテローム血栓性梗塞群では抗血小板薬投与群で抗血小板薬無投与群より有意に低率であった。抗血小板薬無投与群において血小板フィブリノゲン結合陽性率と血小板P-セレクチン発現陽性率はADP、アラキドン酸、血小板活性化因子惹起血小板凝集能のいずれとも有意な相関を示さなかった。以上の結果より、フローサイトメトリーによる血小板フィブリノゲン結合陽性率と血小板P-セレクチン発現陽性率の測定は脳虚血患者において血小板凝集能よりも生体内での血小板活性化を反映し、感度と特異性に優れた活性化血小板検出法であり、抗血小板療法の適応決定や効果判定に有用であると考えられた。
高地環境における生体適応及び体力医学的研究

医学研究については,北八ヶ岳に医学生5名をつれて登山し,出発地点(海抜600m),途中(1800m),到着点(2400m)で,検討を行った.登山,下山中の心電図は連続的に記録し,その比較解析を行った.また,高校生,主婦等を対象として,トレッドシル走行(心拍180回/分以下)の心拍,換気,酸素摂取量,炭酸ガス排出量等を記録し,此等の値から,最大酸素摂取量を計算することを試みた.なお,この値が,どの程度心拍に依存し,どの程度換気に依存するかについては,従来と異なる知見すなわち,換気依存性が大であるとの所見を得ることができた.動物実験ではネズミの低圧耐性実験を心電図を指標としてしらべ,生存時間が室温によっても左右され,高温では弱く,低温では長期間生存することを認めた.なお,高地適応動物, Pikaの肺高血圧はみられず,そのヘマトクリットも少いことを酒井らは測定し,非適応ラットの肺動脈圧亢進と異なるとの結果を得た.なお,高地環境で適応不全を起すと,高山病,高地肺水腫等を起こすが,その際DB-cAMPは症状を寛解され,この事は〓出肺灌流標本によっても証明される.また,高地の低温環境に対し,ネズミは始期には考熱量を増加させ,長期間の曝露で次第に予熱的な面が発達するとの所見も得られた.なお,産熱の部位として褐色脂肪組織の関与は大であるが,この組織は栄養状態がよいと増殖することも柳平らが明らかにした.寒冷が局所に作用する場合,たとえば兎の耳を強く冷却すると,耐寒性の血管運動性反応が起る.その際,血管に針で刺傷を与えると,反応は巨大化する傾向を竹岡は見出した.この反応は登山時の凍傷発生の前の段階のモデルとも考えられる.此等を総括し,昭和62年11月に松本で国際高地医科学シンポジウムを開催し,外国人及び,国内の参加者と,高地医学,生物学の問題の総合討論を展開した.医学研究については,北八ヶ岳に医学生5名をつれて登山し,出発地点(海抜600m),途中(1800m),到着点(2400m)で,検討を行った.登山,下山中の心電図は連続的に記録し,その比較解析を行った.また,高校生,主婦等を対象として,トレッドシル走行(心拍180回/分以下)の心拍,換気,酸素摂取量,炭酸ガス排出量等を記録し,此等の値から,最大酸素摂取量を計算することを試みた.なお,この値が,どの程度心拍に依存し,どの程度換気に依存するかについては,従来と異なる知見すなわち,換気依存性が大であるとの所見を得ることができた.動物実験ではネズミの低圧耐性実験を心電図を指標としてしらべ,生存時間が室温によっても左右され,高温では弱く,低温では長期間生存することを認めた.なお,高地適応動物, Pikaの肺高血圧はみられず,そのヘマトクリットも少いことを酒井らは測定し,非適応ラットの肺動脈圧亢進と異なるとの結果を得た.なお,高地環境で適応不全を起すと,高山病,高地肺水腫等を起こすが,その際DB-cAMPは症状を寛解され,この事は〓出肺灌流標本によっても証明される.また,高地の低温環境に対し,ネズミは始期には考熱量を増加させ,長期間の曝露で次第に予熱的な面が発達するとの所見も得られた.なお,産熱の部位として褐色脂肪組織の関与は大であるが,この組織は栄養状態がよいと増殖することも柳平らが明らかにした.寒冷が局所に作用する場合,たとえば兎の耳を強く冷却すると,耐寒性の血管運動性反応が起る.その際,血管に針で刺傷を与えると,反応は巨大化する傾向を竹岡は見出した.この反応は登山時の凍傷発生の前の段階のモデルとも考えられる.此等を総括し,昭和62年11月に松本で国際高地医科学シンポジウムを開催し,外国人及び,国内の参加者と,高地医学,生物学の問題の総合討論を展開した.1.医学的研究としては、長野県の高校生、主婦等を対象として、最大下のトレッドミル走行(心拍数毎分180拍以下)で、最大酸素摂取量を推定した。酸素摂取量は運動中の換気量の増加に依存する所が大であり、呼吸筋の中で、吸気力訓練の効果が重要であるとの仮定のもとに、その訓練前後の変化を検討した。酸素のぬきとり効率のよい場合には、登山活動中も、有利である。また、主婦等の検査には、コレステロール、中性脂胞、遊離脂胞酸等の血液成分分析を行い、運動がどのような影響を与え、運動処方の効果がどのようにしてトレッドミル走行の成績に反映されるかについて検討した。2.ネズミを低圧暴露し、その耐性を、心停止の時間の測定によって推定した。一部のネズミには低圧耐性を増加させる可能性のある物質Xを投与し、対照群と比較した。その結果、低圧耐性はかなり、室温条件によっても左右されることが判明した。即ち30°Cをこす高温では低圧耐性は弱くなり、低室温群では強化される。一方、八ケ岳をフィールドとして、対照群WKYと自然発症高血圧ラットSHR群を、飼育し、その成長過程における右心室、左右心室の肥大の度合の測定を行った。また、研究分担者の一人、酒井は中国の青海省で海抜4000m前後の高地での高地適応ラットPikaの肺動脈圧の測定を行い、特徴のある所見が求められた。

この日中共同研究の前提として昭和61年46月には中国の研究者2名を環境生理学教室のプロジェクトに参加させた。なお、此等の研究には米国からも一名参加し、特に高地をシミュレートした低圧室での高山病治癒の研究も進行した。3.高地環境では上記の低圧低酸素の他に、低温も重要な因子であるが、局所低温暴露による家兎の耳の寒冷血管反射の左右差の検討も、多数行われた。
糖鎖機能の統合的把握:グライコミクス

本研究は、組織や細胞における生命活動に必須な糖鎖機能を解明するために、糖鎖遺伝子改変マウスおよび細胞を用いて、糖転移酵素標的分子を臓器レベルあるいは細胞レベルで同定し、その分子の機能発現に糖鎖がどのように関わるかを明らかにすること(機能グライコミクス)を具体的目標としている。以下に、糖転移酵素GnT-III, GnT-V, GnT-IXおよびFut8と癌・疾患との関わりについて、これまで得られた主な成果は以下に要約される。糖転移酵素N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV(GnT-V)の産物であるβ1,6GlcNAc分枝型糖鎖は癌の転移・浸潤との深くかかわりが予測されていたが、その分子メカニズムをマトリプターゼという標的分子を同定し、証明した。すなわち、GnT-Vによって糖鎖修飾を受けたマトリプターゼは、分解されにくく蓄積され、uPAやHGFを活性化することで転移を促進する。GnT-IIIはバイセクテイング(bisecting)GlcNAcを持つユニークな分枝型糖鎖構造形成を触媒する糖転移酵素である。bisecting GlcNAcが付加されるとほかの分枝型糖転移酵素(例えば、GnT-V)が立体障害により、このbisected糖鎖を基質としないため、糖鎖の伸長反応ができなくなる。このユニークな糖鎖の機能をインテグリンやカドヘリンなどの接着分子に焦点を絞り、精製したタンパク質のレベルで証明した。α1,6フコースは糖蛋白質のN-結合型糖鎖の根元のN-アセチルグルコサミンにα1,6フコース転移酵素(Fut8)によって作られる構造である。Fut8のノックアウトマウスを作成し、その生理機能を検討した。Fut8が欠損すると様々な増殖因子の受容体の機能が低下し、特に肺においてはTGFbeta受容体の異常によりMMP群(マトリクスメタロプロテアーゼ)が活性化され、肺気腫様の病理像を呈する。申請書の計画に従い糖鎖機能の統合的解析を行うシステム作成をめざした。in vivoでの解析のため、硫酸転移酵素とα1-6フコース転移酵素のノックアウトマウスを作成した。それぞれの表現形としては、前者では行動異常と精子形成不全(PNAS, in press)、後者では成長障害と90%以上のマウスが生後1月以内の死亡を確認した(un published data)。一方、細胞レベル、分子レベルのシステム開発としては、糖転移酵素GnT-IIIの活性部位変異遺伝子を細胞に遺伝子導入するとGnT-IIIのドミナントネガティブ効果を認めることを発見した(Eur. J. Biochem269,193-201)。さらに可溶型GnT-Vに糖転移酵素本来の機能以外の生物機能(血管新生作用)の存在することを発見し、種々のサイズのGnT-Vを分泌する細胞を作成した(JBC276,759-765;JBC277 in press)。これらの系を用いて、次年度以降の糖鎖機能の統合的解析が可能と考えられる。一方、がん転移などの種々の生命現象を担う糖鎖改変分子として、カドヘリン/βカテニンの系(JBC276,475-480)、新しいセリンプロテアーゼとして注目されているマトリプターゼ(JBC277 in press)、糖鎖によるhigh/Low affinity EGF受容体のモジュレーションの研究(JBC276,11956-11962)なども行った。

さらに、これまでGnT-IIIによる糖鎖改変が異種移植における超急性期拒絶反応を抑制するという基礎データを元に、GnT-IIIのトランスジェニックブタの作成とサルへの移植実験を行った(JBC276,39310-39319)。また、そのブタの詳細な糖鎖構造の解析を酵素学的に検討した(JBC276,32867-32874)。近年、50%以上のタンパク質には糖鎖がついており、これらタンパク質の機能高度化に糖鎖が重要な役割を担っていることが明白となってきている。糖鎖は細胞表面に発現されていることから、細胞間や細胞外基質との相互作用や細胞外との情報交換に関与することが多い。本研究は、このような糖鎖機能を解明するために、糖鎖遺伝子改変マウスおよび細胞を用いて、糖鎖標的分子を臓器レベル、細胞レベルで同定し、その分子の機能発現に糖鎖がどのように関わるかを明らかにすることを目的としている。既に昨年度までの研究で、α1,6-フコース転移酵素の全身型ノックアウトマウスの作製と個体レベルでの表現型解析は一通り終了したので、今年度は、異常のみられた肺と小腸におけるα1,6-フコース転移酵素の標的分子の探索に着手した。方法としては、各臓器から膜画分を調製して、AALレクチンを用いてフコシル化タンパク質を濃縮する方法を開発した。野生型とノックアウトマウスで明らかな差異がみられたので、フコシル化タンパク質を抽出し、マススペクトロメトリーでタンパク質を同定する計画である。一方、がんの転移に関与するN-アセチルグルコサミン転移酵素GnT-Vの標的分子として膜結合型セリンプロテアーゼのマトリプターゼを同定し、マトリプターゼの772番目のアスパラギンに結合する糖鎖のβ1,6GlcNAc分岐化により、トリプシン様プロテアーゼに対する抵抗性を獲得することを証明した。また、GnT-V自体が糖転移酵素活性とは無関係に血管新生作用を呈することを発見した。さらに、N-アセチルグルコサミン転移酵素GnT-III導入Hela細胞における過酸化酸素に対するアポトーシス抵抗性獲得の原因を明らかにした。生体内のタンパク質はその50%以上に糖鎖がついており、これらタンパク質の機能高度化に糖鎖が重要な役割を担っていることが明白となってきている。糖鎖遺伝子改変マウスのモデルとしてα1,6-フコース転移酵素の全身型ノックアウトマウスの作製を行い、個体レベルでの表現型解析を行った。その結果、この変異マウスは生後3日以内に70%が死亡し、生き残ったものも野生型と比べて小さく、生後3週間で殆どが死亡することから、アスパラギン結合型糖鎖のα1,6-フコース構造は個体機能にとって必須の構造であることが明らかとなった。病理組織学検査では肺気腫がみられ、これは生理学的解析でも確認され、早期死亡の原因の一つと思われた。また、神経細胞由来のPC12細胞にN-アセチルグルコサミン転移酵素GnT-IIIのドミナントネガティブ変異体を強制発現すると、野生型GnT-IIIを強制発現した場合と反対にニューライトがより伸長することがわかった。同様にHeLaS3細胞にGnT-IIIを高発現すると、インテグリンの機能が変化し細胞-基質間の接着が低下することが明らかとなった。また、α1,6-フコース転移酵素を昆虫細胞で大量発現させ、結晶化することに成功した。
ヒストンのアセチル化を介した免疫グロブリン発現制御機構の解明のための研究

真核細胞の染色体はヒストンの化学修飾によりクロマチン構造の動的変動を生じ、特にアセチル化および脱アセチル化と遺伝子発現変化との密接な関連が以前より示唆されていた。現在までにヒトのヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)はこれまでに11種報告されており、更にこれらは細胞内で複数の蛋白質と複合体(Sin3-HDAC, NuRD-HDAC, SNRT-HDAC, N-CoR-HDAC等)を形成することも多数の研究者の貢献により明らかにされた。しかしながら、複数種存在するHDAC酵素複合体の機能解析並びに制御遺伝子群のネットワークの詳細な解明は未だ不十分である。一方、B細胞におけるイムノグロブリン産生は複雑な多段階制御を受け、ヒストンのアセチル化もその一翼を担うと示唆されていた。また、私共の研究室で独自にニワトリB細胞株DT40からHDAC2(chHDAC2)の欠失変異株を作製し、変異株でIgM発現が増加することを発表していた。この知見をもとに、本研究課題はニワトリ免疫グロブリン(IgM)遺伝子をモデルとして、HDACによるクロマチン構造変化を基盤とした転写制御機構を分子レベルで解明することを目的とし実施された。本研究で得られた主な知見、成果を以下に要約する。1)ニワトリ由来B細胞特異的転写コアクチベーター、chOBF-1をクローニングした。chOBF-1はそのパートナーであるアクチベーター、chOct-1と結合することを、並びにこの両者は協調してIgM-L鎖の転写を活性化することを明らかにした。この事により脊椎動物細胞ではIgM-L鎖の転写制御が高度に保存されている事が示唆された。2)chOBF-1とchOct-1によるIgM-L鎖の転写活性化は、chHDAC2により完全に抑制される事を明らかにした。この抑制はchHDAC1やchHDAC3では生じなかった事からchHDAC2に特異的であることが示唆された。真核細胞のクロマチン構造は様々な要因により多様な動態を取り得ることができ、この動態を規定する要因としてコアヒストンのアセチル化などの化学修飾がある。本研究課題は、高等真核細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)によるクロマチン構造変化に基づく転写制御機構を、ニワトリBリンパ細胞株DT40における免疫グロブリン(IgM)重鎖(H-鎖)発現制御機構をモデルシステムとして、分子レベルで解明することを目的とする。本研究で本年度得られた知見、成果を以下に要約する。1)chHDAC-2欠失ホモ変異株(ΔchHDAC-2)におけるIgM-H鎖転写制御領域のクロマチン構造変化を野生型DT40とΔchHDAC-2の間でのnuclease高感受性の変化を解析した。両者で僅かな差が認められたことから、chHDAC-2によるin vivoでの当該領域のクロマチン構造変化は非常に限定的かつ過渡的である事が示唆された。2)ΔchHDAC-2の2D-PAGEパターンで著しく増加した蛋白質がIgM-H鎖とL鎖であることから、IgM-L鎖の転写量もchHDAC-2により制御される可能性があり、IgM-H鎖とL鎖の転写を同時に制御する転写制御複合体の存在が示唆された。これを検証するためにin vivo並びにin vitroでの両者の複合体形成能をchHDAC-2特異抗体を用いた免疫沈降法により解析する。

クロマチン構造は多様な動態を取り得ることができ、この動態を規定する要因がコアヒストンのアセチル化等の化学修飾である。本研究課題は、高等真核細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)によるクロマチン構造変化に基づく転写制御機構を、ニワトリBリンパ細胞株DT40における免疫グロブリン(IgM)軽鎖(L-鎖)発現制御機構をモデルシステムとして、分子レベルで解明することを目的とする。本研究で本年度得られた知見、成果を以下に要約する。1)ニワトリ由来B細胞特異的転写コアクチベーター、chOBF-1をクローニングした。chOBF-1はそのパートナーであるアクチベーター、chOct-1と結合することを、並びにこの両者は協調してIgM-L鎖の転写を活性化することを明らかにした。この事により脊椎動物細胞ではIgM-L鎖の転写制御が高度に保存されている事が示唆された。2)chOBF-1とchOct-1にようIgM-L鎖の転写活性化は、chHDAC2により完全に抑制される事を明らかにした。この抑制はchHDAC1やchHDAC3では生じなかった事からchHDAC2に特異的であることが示唆された。今後は、これを更に検証するためにin vivo並びにin vitroでの転写制御領域での転写因子複合体の解析をchHDAC-2特異抗体を用いた免疫沈降法により解析する。真核細胞の染色体はヒストンの化学修飾によりクロマチン構造の動的変動を生じ、特にアセチル化および脱アセチル化と遺伝子発現変化との密接な関連が以前より示唆されていた。ヒトのヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)はこれまでに11種報告されており、これらは細胞内で複数の蛋白質と複合体(Sin3-HDAC, NuRD-HDAC, SNRT-HDAC, N-CoR-HDAC等)を形成することも報告されている。しかしながら、複数種存在するHDAC酵素複合体の機能解析並びに制御遺伝子群のネットワークの詳細な解明は未だ不十分である。一方、B細胞におけるイムノグロブリン産生は複雑な多段階制御を受け、ヒストンのアセチル化もその一翼を担うと示唆されていた。また、私共の研究室で独自にニワトリB細胞株DT40からHDAC2(chHDAC2)の欠失変異株を作製し、同変異株でIgM発現が増加することを発表していた。この知見をもとに、本研究課題はニワトリ免疫グロブリン(IgM)遺伝子をモデルとして、HDACによるクロマチン構造変化を基盤とした転写制御機構を分子レベルで解明することを目的とし実施された。本研究で前年度までに、1)ニワトリ由来B細胞特異的転写コアクチベーターchOBF-1をクローニングし、chOBF-1はそのパートナーであるアクチベーターchOct-1と結合すること、並びにこの両者は協調してIgM-L鎖の転写を活性化することを明らかにした。2)chOBF-1とchOct-1によるIgM-L鎖の転写活性化は、chHDAC2により完全に抑制される事を明らかにした。本年度は、HDAC酵素複合体の解析に取り組み、ニワトリ由来のSin3-HDAC複合体構成因子SAP18(chSAP18)をクローニングした。これまでに報告されているSAP18オルソログとの比較により、脊椎動物由来のSAP18は高度に保存されていることが判った。chSAP18の転写抑制能を一過性転写発現系を用い検討したところ、chSAP18がIgM-L鎖の転写をchHDAC2同様、完全に抑制する事を明らかにした。
ミトコンドリア選択的ナノ薬物送達による虚血ー再灌流傷害に対する革新的ナノ医療開発

臨床試験で用いられた2.5 mg/kgシクロスポリンを封入したナノ粒子のマウス心筋虚血-再灌流モデルへの投与で梗塞サイズの縮小効果を認めた。シクロスポリン単独を2.5 mg/kg投与した場合は梗塞サイズの縮小は確認されなかった。シクロスポリン封入ナノ粒子の梗塞縮小効果がミトコンドリア選択的DDSに起因するかどうかを明らかにした。さらにナノ粒子の組織分布を明らかにするために、心筋虚血-再灌流後にFITCナノ粒子を投与し、心筋組織を単離してミトコンドリア画分を回収すると、FITCシグナルが細胞質分画と比較してより強く検出されたことから、ミトコンドリア選択的DDSが示唆された。また、シクロスポリン封入ナノ粒子投与実験において、シクロスポリン濃度がミトコンドリアにおいて高いことが明らかになった。さらに、ラット胎児心筋細胞において、膜電位、mPTP開口の分子イメージング(共焦点レーザー顕微鏡)や電子顕微鏡解析を行ったところ、膜電位の変動に依存してナノ粒子がミトコンドリアに集積、拡散するという現象が認められた。このことから、再灌流時にナノ粒子がミトコンドリアに集積しシクロスポリンが放出され、薬効を発揮する事が明らかになった。さらに、シクロスポリン封入ナノ粒子がミトコンドリア経路を介して効果を発揮することを分子レベルで明らかにするために、シクロフィリンD欠損マウスを用いた治療実験を行ったところ、シクロフィリンD欠損マウスは野生型マウスと比べ、治療効果が高いことが明らかになった。このことからシクロスポリン封入ナノ粒子はミトコンドリアに局在するシクロフィリンDに直接作用して、虚血再灌流傷害を抑制することが示された。
エジプト・ナイル川流域都市における地震動予測

地中海東部一帯では3つのプレートが会合しており,地震活動が極めて活発な地域に当たる.地中海の北部一帯に比べるとエジプト国内の地震活動度は高いとはいえないが,紅海,シナイ半島近傍及びナイル川流域には規模の大きな地震が発生している.エジプトの国土は日本の約2.3倍の面積があるが大部分は砂漠が占め,主な居住区はナイル川流域の3パーセントに過ぎない.そのため人口の超過密な地域が存在する.またこの地には人類全体の遺産とも言うべき古代エジプトの遺跡が数多く存在する.本研究の目的は,このような地域の地震災害軽減をめざして,ナイル川流域の大地震を想定した強震動予測を行うことである.平成18年度本研究の最終年度であり,特別研究員期間終了までの7ヶ月半で以下の項目を実施した.(1)地震動シミュレーションのため,1992年カイロ地震の震源とカイロ全域を含む広域にわたる領域について3次元不均質構造モデルを構築した.これは,地形,地球物理学的及び地質学的データから推定された表層基盤面分布,モホ面の深度分布等の広域データ及びカイロ周辺のより詳しい表層地盤構造の情報を基に作成した3次元不規則成層構造(層内均質)モデルである.(2)それを基に1992年カイロ地震時のカイロ周辺の長周期地震動(地動速度)を3次元数値シミュレーション手法(spectral element method)を用いて求めた.その結果を基に,1992年カイロ地震の震源断層の延長上に推定されている伏在断層で想定される地震における地震動に性状について考察した(3)また,収集した表層地盤情報を基にナイル流域のカイロ南西域における液状化の可能性について検討した.地中海東部一帯では3つのプレートが会合しており,地震活動が極めて活発な地域に当たる.地中海の北部一帯に比べるとエジプト国内の地震活動度は高いとはいえないが,紅海,シナイ半島近傍及びナイル川流域には規模の大きな地震が発生している.エジプトの国土は日本の約2.3倍の面積があるが大部分は砂漠が占め,主な居住区はナイル川流域の3パーセントに過ぎない.またこの地には人類全体の遺産とも言うべき古代エジプトの遺跡が数多く存在する.本研究の目的は,このような地域の地震災害軽減をめざして,ナイル川流域の大地震を想定した強震動予測を行うことである.平成16年度は4ヶ月間で以下の2項目を実施した.(1)ナイル川流域における地球物理学的及び地質学的構造情報の文献調査を行い,ナイル川流域都市部に影響を与える周辺域の地震活動についてレビューした.ナイル・ヴァレーは,紅海に沿って発生する地震同様にリフティングによって生じる中小規模地震の活動が活発な地域に位置している.(2)1992年カイロ地震(M5.9)について複数提案されている断層モデルを検討するために1-7Hz帯域の波形記録の予備解析を行った.検討した断層モデルの中には水平最大加速度の空間分布と調和的なものも存在するが,モデルを1つに絞り込むためには,さらに波形やスペクトルなどの検討が必要である.地中海東部一帯では3つのプレートが会合しており,地震活動が極めて活発な地域に当たる.地中海の北部一帯に比べるとエジプト国内の地震活動度は高いとはいえないが,紅海,シナイ半島近傍及びナイル川流域には規模の大きな地震が発生している.エジプトの国土は日本の約2.3倍の面積があるが大部分は砂漠が占め,主な居住区はナイル川流域の3パーセントに過ぎない.そのため人口の超過密な地域が存在する.またこの地には人類全体の遺産とも言うべき古代エジプトの遺跡が数多く存在する.本研究の目的は,このような地域の地震災害軽減をめざして,ナイル川流域の大地震を想定した強地震予測を行うことである.平成17年度は以下の2項目を実施した.(1)1Hz以上の帯域の地震動は確定論的に合成するのが困難で実地震動記録を用いる経験的グリーン関数法や確率論的に波形を合成する統計的グリーン関数法等が用いられている.本研究では,後者の統計的手法に属するBaresnev and Atkinson (1998a)のstochastic simulation methodを適用する.この手法の有効性及びその限界をについて調べるため,2005年3月20日に起きた福岡県西方沖地震の強震動記録のモデリングを試みた.その結果,精度の良いサイト特性が強震動のスペクトルを再現するのに非常に重要であり,さらに時刻歴の再現のためにはアスペリティーのある程度正確な位置情報も重要であることがわかった.また,現方法のままでは断層延長破壊進行方法の狭い地域におけるforward rupture directivity効果の再現は困難であることもわかった.この成果の一部は,日本地震学会の秋季大会及び米国地球物理学連合(AGU)の秋季大会で発表した.(2)1Hz未満の帯域の地震動は確定論的なシミュレーションを用いて予測する.計算手法にはspectral element methodを用いる.この手法をカイロ周辺に適用するための準備をした.試験的に2次元構造断面による2次元波形計算も行った.地中海東部一帯では3つのプレートが会合しており,地震活動が極めて活発な地域に当たる.地中海の北部一帯に比べるとエジプト国内の地震活動度は高いとはいえないが,紅海,シナイ半島近傍及びナイル川流域には規模の大きな地震が発生している.エジプトの国土は日本の約2.3倍の面積があるが大部分は砂漠が占め,主な居住区はナイル川流域の3パーセントに過ぎない.そのため人口の超過密な地域が存在する.またこの地には人類全体の遺産とも言うべき古代エジプトの遺跡が数多く存在する.

本研究の目的は,このような地域の地震災害軽減をめざして,ナイル川流域の大地震を想定した強震動予測を行うことである.平成18年度本研究の最終年度であり,特別研究員期間終了までの7ヶ月半で以下の項目を実施した.(1)地震動シミュレーションのため,1992年カイロ地震の震源とカイロ全域を含む広域にわたる領域について3次元不均質構造モデルを構築した.これは,地形,地球物理学的及び地質学的データから推定された表層基盤面分布,モホ面の深度分布等の広域データ及びカイロ周辺のより詳しい表層地盤構造の情報を基に作成した3次元不規則成層構造(層内均質)モデルである.(2)それを基に1992年カイロ地震時のカイロ周辺の長周期地震動(地動速度)を3次元数値シミュレーション手法(spectral element method)を用いて求めた.その結果を基に,1992年カイロ地震の震源断層の延長上に推定されている伏在断層で想定される地震における地震動に性状について考察した(3)また,収集した表層地盤情報を基にナイル流域のカイロ南西域における液状化の可能性について検討した.
超微粒を利用するレ-ザ-ウラン濃縮プロセスの基礎研究

(1)昨年度は、実験装置を完成し、様々な金属の超微粒子を発生させ、マルチ測光システムによる光学測定、SEM写真やX線マイクロ分析による捕集微粒子の平均粒径、粒径分布、組成分布等の測定を行い、超微粒子生成の特性を解析した。この結果から、平均粒径、粒径分布及び組成を制御するのに必要な因子を明らかにした。また、SF_6分子の超微粒子への吸着試験を行ない吸着特性を測定した。これにより、吸着量などの吸着特性に対する超微粒子特性の及ぼす影響を明らかにした。平成2年度は、(1)平成元年度に明らかになった問題点を解明するとともに、(2)得られた成果を基に、金属超微粒子に吸着した分子の振動バンドシフトの解明を目的とした実験を行なうことを主眼とした。このためにまず金属超微粒子に吸着させたSF_6分子の赤外吸収スペクトルをフロ-セルを用いて流動状態で測定する方法を開発した。(2)活性水素金属反応法によりNi,Co,Fe,Mn、Cr、Cu,Zn、Pb等の金属及びそれらの合金の超微粒子を発生させた。これらの金属超微粒子に吸着させたSF_6分子の〈赤外吸収スペクトル〉を観測し、金属の種類及び粒径を変化させたときの振動バンドシフトを測定した。また、吸着温度、吸着量等の因子が振動バンドシフトに与える効果を調べた。種々の金属超微粒子に吸着させたSF_6分子の振動シフトの測定はフ-リエ変換赤外分光器で行なった。これにより、振動バンドシフトが確認され、シフト幅は金属、粒径などにある程度の依存性は認められるものの、分光器の精度から定量的な検討は困難である。(5)赤外多光子解離のマスタ-方程式を吸着分子の取り扱いに適した形に発展させ、EGME法によりこれを解き、実験デ-タの総合的評価を行ない、十分な粒径の制御が可能となれば実際の同位体分離に応用可能であることが示唆された。本年度は「金属超微粒子に吸着したSF_6分子の光化学的特性研究」を課題として、実験装置の完成させるとともに、その特性を明らかにする目的でいくつかの実験を行った。以下にその概要を述べる。まず、金属超微粒子を発生させるための「プラズマ超微粒子発生装置」の制作・据え付け、調整を行った。また発生部で起る現象を光学的に測定するための「マルチ測光システム」の制作・据け付け・調整を行った。これを用いていくつかの予備試験を行い、当初の予想と一致する計画通りの実験装置が完成したことを確認した。次に、活性水素金属反応による超微粒子発生試験により、様々な金属の超微粒子を発生させ、マルチ測光システムによる光学測定、SEM写真やX線マイクロ分析による捕集微粒子の平均粒径、粒径分布、組成分布等の測定を行い、この方法で発生した超微粒子の特性を解析した。この結果から超微粒子の発生条件を検討し、平均粒径、粒径分布及び組成を制御するのに必要な因子を摘出した。また、これらの超微粒子の存在する系に、SF_6分子を導入することによりSF_6分子の超微粒子への吸着試験と吸着特性を測定した。現在、金属超微粒子に吸着させたSF_6分子の赤外吸収スペクトルをフロ-セルを用いて流動状態で測定する方法を開発中であり、測定試験を行っている。これにより金属の種類及び粒径を変化させたときの振動バンドのシフト量の測定が可能となり、吸着温度及び吸着ガス量等の因子が振動バンドシフトに与える効果の解明が可能となる。
カシ類（ブナ科）の樹木の多くはなぜ開花から二年がかりで結実するのか？

本研究では、摘果実験の手法により、当年枝上の幼果の除去が翌年の新梢伸長と開花に及ぼす影響を明らかにすること、また、ハイイロチョッキリの枝切り行動と二年成ブナ科樹種の繁殖特性の関係を解明することを目的とした。摘果の効果については個体差が大きく、今後のさらなる検討の必要性が示された。ハイイロチョッキリによる被害の程度と二年成ブナ科樹種の繁殖特性には明瞭な対応関係がみられ、カシ類の隔年結果にはハイイロチョッキリの枝切り行動による損失を低減する効果がある可能性が示唆された。二年結実性(二年成)カシ類において、開花後1年もの期間を新梢の枝先で休眠状態のまま過ごす幼果の生態学的役割を解明するため、摘果実験の手法を用いて幼果の除去が翌年の新梢伸長に及ぼす影響の調査を開始した。平成25年度は、これらのカシ類の特徴である隔年結果性から、主な調査地である春日山原始林(奈良市)では、アカガシ、ウラジロガシ、ツクバネガシの開花がほとんどみられない年であった。一方、成熟途上の幼果(前年に開花)が多数観察され、堅果の成り年となることが予想できたため、摘果実験は次年度の実施とし、今年度は昆虫による堅果への産卵の調査を重点的に行うこととした。この調査は、摘果実験と並び、二年結実性カシ類の生活史特性の適応的意義を探る本研究の重要なアプローチのひとつである。春日山原始林とその周辺地域、大阪市立大学理学部附属植物園(大阪府交野市)、三重大学附属演習林(津市)、伊勢神宮周辺地域(三重県伊勢市)を主な調査地とし、ルートセンサス法を用いて、二年結実性カシ類と他のブナ科樹種の堅果に対する昆虫による産卵の有無とその程度を記録した。生育地が日本のごく一部(九州南部や奄美・琉球諸島)に限定されるハナガガシとオキナワウラジロガシを除く20種のブナ科樹種(アカガシ、ウラジロガシ、ツクバネガシ、イチイガシ、アラカシ、シラカシ、ウバメガシ、コナラ、ミズナラ、クヌギ、アベマキ、カシワ、ナラガシワ、マテバシイ、シリブカガシ、スダジイ、ツブラジイ、クリ、ブナ、イヌブナ)から計638の調査個体を得て、昆虫による堅果への産卵の有無とその程度について、各個体3回のモニタリングを行った。また、産卵がみられた堅果の一部をサンプリングして持ち帰り、昆虫の種同定のため個別に羽化まで飼育することとした。なお、この調査は平成26年度も継続した後、種間比較等の分析を行う予定である。平成26年度には、前年に開花がほとんどみられなかったために延期することとなった、カシ類の摘果を実施することができた。大阪市立大学理学部附属植物園(大阪府交野市)、三重大学附属演習林(津市)、伊勢神宮周辺地域(三重県伊勢市)等において、ウラジロガシ5個体、ツクバネガシ3個体、アカガシ4個体を実験個体として選定し、各個体の開花後、個体ごとに、処理群(摘果群)と対照群(非摘果群)の2群の繁殖枝を設定し、各枝に識別テープを取り付けた。当初の計画では、摘果時期が及ぼす効果も明らかにするために、摘果時期の異なる3つの処理群を設定することとしていたが、いずれの個体でも繁殖枝数を十分に確保することが困難であったため、開花直後の摘果の効果を正確に評価するためにも1つの処理群内の枝数が多い方が良いと判断し、処理群数は1(開花直後に摘果する群のみ)とした。6月から7月にかけて、各個体の処理群の枝上の雌花を雌花序ごと除去した。その際、枝上の雌花序数も記録した。平成27年度には、それぞれの枝からの新梢伸長の有無と新梢での開花の有無を調査し、処理群と対照群間での結果を比較し、新梢伸長と開花に及ぼす成熟途上の幼果の影響を分析する。これにより、二年結実性カシ類における幼果の生態学的役割を明らかにすることができると期待される。また、平成25年度に引き続き、昆虫による堅果への産卵調査を実施し、二年結実性カシ類を含むブナ科樹種の堅果に対する昆虫の産卵の有無とその程度の記録(各個体3回のモニタリング)を実施した。平成25年度と合わせ、ブナ科19種より合計779個体のデータを得ることができた。このデータの分析により、現在、昆虫のブナ科堅果への産卵における寄主選択性が明らかになりつつある。平成27年度には、ブナ科樹種の繁殖特性との関連において、より詳細な分析を行い、その成果をまとめて公表に繋げる計画である。アカガシでは調査地周囲の工事の影響で平成27年度にはデータを得ることができなかった。ウラジロガシとツクバネガシでは、摘果群における新梢伸長率の個体差が大きく、個体によっては摘果群が対照群よりも有意に高い伸長率を示したものの、現時点では摘果が翌年の新梢伸長に重要な効果を持つかどうかについては判断が難しく、さらに検討が必要であることが示唆された。一方、種子散布前捕食昆虫の一種であるハイイロチョッキリによる被害の程度と、二年結実性ブナ科樹種の繁殖および新梢伸長特性の間には、明瞭な対応関係がみられた。ハイイロチョッキリによる被害はコナラ属で全般的にみられ、特にアカガシ亜属(アカガシ、ウラジロガシ、ツクバネガシ)では被害個体の割合が極めて高かった。

対照的に、マテバシイ属では全く枝切りはみられず、シイ属でもほぼ全個体で被害はなかった。さらに、アカガシ亜属では切り落とされた枝のほとんどが新梢を伸ばしていなかったのに対し、切り落としのなかったマテバシイ属とシイ属で樹冠の繁殖枝を観察したところ、そのほとんどが新梢を伸ばし、かつ新梢の多くで開花がみられた。以上のことから二年結実性カシ類の隔年結果はハイイロチョッキリの枝切り行動による損失を低減する効果を有する可能性が示唆された。本研究では、摘果実験の手法により、当年枝上の幼果の除去が翌年の新梢伸長と開花に及ぼす影響を明らかにすること、また、ハイイロチョッキリの枝切り行動と二年成ブナ科樹種の繁殖特性の関係を解明することを目的とした。摘果の効果については個体差が大きく、今後のさらなる検討の必要性が示された。ハイイロチョッキリによる被害の程度と二年成ブナ科樹種の繁殖特性には明瞭な対応関係がみられ、カシ類の隔年結果にはハイイロチョッキリの枝切り行動による損失を低減する効果がある可能性が示唆された。平成27年度の、摘果実験の処理群と対照群における新梢伸長率および開花率の測定に向けて、アカガシ、ウラジロガシ、ツクバネガシの3種いずれにおいても、実験の設定を完了することができた。また、昆虫による堅果への産卵の調査については、平成25年度と合わせ、779個体(19種)の調査個体が得られ、種間比較を行うのに十分なデータを得ることができた。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると考えている。植物生態学平成27年度には、前年に実験設定を施したそれぞれの枝からの新梢伸長の有無と新梢での開花の有無を調査し、処理群と対照群間での結果を比較し、新梢伸長と開花に及ぼす成熟途上の幼果の影響を分析する。これにより、二年結実性カシ類における幼果の生態学的役割を明らかにすることができると期待される。また、これらと並行して、昆虫のブナ科堅果への産卵における寄主選択性を、各樹種の繁殖特性との関連において分析し、成果をまとめて学術雑誌や学会での公表に繋げる。隔年で繁殖を行う二年結実性カシ類の性質から、摘果実験は平成26年度の実施事項になったが、摘果に適した個体(樹冠の繁殖枝群へのアクセスが容易な個体)の選定は済んでおり、実施に向けて十分な準備ができている。また、その一方で、昆虫による堅果への産卵の調査については、20種から638個体の調査個体が得られ、各個体につき3回のモニタリングを行うことができた。平成26年度も継続して行うことで、種間比較を行うに十分なデータが得られると期待できる。前年度の観察から、平成26年度は、調査地において二年結実性カシ類のアカガシ、ウラジロガシ、ツクバネガシの大量の開花が見込まれる。4月から5月の雌花の開花直後に、各調査個体の樹冠で、雌花のついた新梢(当年枝)30本の群を4つ設定する。そのうちひとつを摘果(幼果を除去)しない群(対照群)とし、残りの3つは摘果する群(処理群)とする。3つの処理群は、開花直後に摘果する群、開花後の夏季(8月)に摘果する群、冬季(12月)に摘果する群とする。もし開花枝数が予想よりも少ない場合、処理群の数を減らすなどして実験を遂行する。各枝には標識テープをつけて区別する。摘果後、経過を観察し、翌年の春に各枝からの新梢伸長の有無を記録する。これらと並行して、平成25年度から引き続き、昆虫による堅果への産卵の調査を行う。
klotho遺伝子のステロイドに対する制御機構への関与

(1)klotho遺伝子ノックアウトマウス野生型マウスとでNa-K ATPase活性に差異があるのか。klotho遺伝子発現細胞は腎臓皮質に限局し、一方、Na-K ATPase遺伝子発現細胞は、腎臓髄質および皮質でも見られるが、in situ hybridization法により、腎臓皮質においてのみ、両遺伝子発現細胞の一致が見られることを考えれば、腎皮質におけるNa-K ATPase機能こそがklotho遺伝子の影響下にあると考えられたので、両マウス腎臓から皮質のみを単離し、vanadate-facilitated[^3H]ouabain binding sitecontent analysisにより、Na-K ATPaseの密度(含有量)が異なるかを検討したところ、ノックアウトマウスの腎臓で優位に上昇しており、さらに、^<86>Rb摂取率によるNa-K ATPase活性についても同様で、ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、Na-K ATPase活性も優位の上昇を認めた。ただし、マウス腎臓での髄質と皮質の分離にかなりの時間を要し、これからはpreliminary dataである。論文投稿には再現性が必要であることは強調しておく。(2)klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでNa-K ATPaseを介するステロイドシグナルカスケードに違いがみられるか。前年度報告したように、野生型マウス腎臓を用いたnorthern-blot法により、ouabain投与により、klotho遺伝子の有意の発現上昇が認められた。Na-K ATPaseがステロイドのsignal transducerとして機能する際、内因性のcardiac glycosideであるouabainからの入力シグナルが最たるものであり、膜型KLOTHO蛋白はNa-K ATPaseと結合することでこのシグナルを制御していると考えられる。従って、klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでは、ouabainに対する反応が異なり、これが表現型に寄与していることが予想され、ouabain投与後の両マウスから腎臓を摘出、さらに皮質を単離、これらよりmRNAを調整し、subtraction PCR hybridization法により、両者間で発現差異の著しい遺伝子群を見出す予定であったが、前述したように腎髄質と皮質の分離に時間を要し、結果は得られていない。(1)klotho遺伝子ノックアウトマスと野生型マウスとでNa-K ATPase活性に差異があるのか。まず、両マウスの腎臓を用い、vanadate-facilitated[^3H]ouabain binding sitecontent analysisにより、Na-K ATPaseの密度(含有量)が異なるかを検討したところ、実験毎にばらつきがあり確証が得られない状況である。これは、^<86>Rb摂取率によるNa-KATPase活性についても同様で、両マウス間で明らかな差異を認められていない。これは、Na-K ATPase遺伝子発現が、ノックアウトマウスの腎臓で優位に上昇しているのと様相を別にしている。しかし、klotho遺伝子発現細胞は腎臓皮質に限局し、一方、Na-K ATPase遺伝子発現細胞は、腎臓髄質および皮質でも見られるが、in situ hybridization法により、腎臓皮質においてのみ、両遺伝子発現細胞の一致が見られることを考えれば、腎皮質におけるNa-K ATPase機能こそがklotho遺伝子の影響下にあると考えられた。そこで、両マウス腎臓から皮質のみを単離し、上述の方法により、Na-K ATPase活性を測定し結論を急いでいる。Na-K ATPaseがステロイドのsignal transducerとして機能する際、内因性のcardiac glycosideであるouabainからの入力シグナルが最たるものであり、膜型KLOTHO蛋白はNa-KATPaseと結合することでこのシグナルを制御していると考えられるが、今回、新たに、野生型マウス腎臓を用いたnorthern-blot法により、ouabain投与により、klotho遺伝子の有意の発現上昇が認められた。これより、klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでは、ouabainに対する反応が異なり、これが表現型に寄与していることが予想され、ouabain投与後の両マウスから腎臓を摘出、さらに皮質を単離、これらよりmRNAを調整し、subtraction PCR hybridization法により、両者間で発現差異の著しい遺伝子群を見出している最中である。

前年度報告したように、野生型マウス腎臓を用いたnorthern-blot法により、ouabain投与により、klotho遺伝子の有意の発現上昇が認められた。Na-K ATPaseがステロイドのsignal transducerとして機能する際、内因性のcardiac glycosideであるouabainからの入力シグナルが最たるものであり、膜型KLOTHO蛋白はNa-K ATPaseと結合することでこのシグナルを制御していると考えられる。従って、klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでは、ouabainに対する反応が異なり、これが表現型に寄与していることが予想され、ouabain投与後の両マウスから腎臓を摘出、さらに皮質を単離、これらよりmRNAを調整し、subtraction PCR hybridization法により、両者間で発現差異の著しい遺伝子群を見出す予定であったが、前述したように腎髄質と皮質の分離に時間を要し、結果は得られていない。
連続時間領域における実時間プログラムの離散実行モデル

本年度は、前年度に検討したYampaプログラムに対するモデルの形式化およびその検証手法について検討を行った。YampaプログラムのサブクラスであるSimple Yampaを定義し、ハイブリッドオートマトンがテンプレートを満たすSimple Yampaプログラムに対応することを定義した。さらに、Simple Yampaプログラムのサンプリング実行モデルを定義した。ハイブリッドオートマトンに対応する連続的な意味と、サンプリング実行による離散的な意味とを定義し、その性質の違いについて研究を行った。連続的な意味に基づくYampaプログラムでは、ハイブリッドオートマトンの離散遷移が必ず可能であることが保証されるが、Yampaの実行環境は連続意味を実現することはできず、一定間隔でプログラムを少しずつ実行することで、離散的に時間遷移を発生させて連続変数の変化を計算する。Yampaの実行環境は抽象度が高く、通常では、実行の実時間性を保証することができない。このため、サンプリング周期に一定の揺れがあり、このような時間環境の不安定性を前提にプログラムを設計する必要がある。本年度は、前年度の研究をもとに、具体的な定義とモデル検査器Uppaalを用いた検証手法を示した。結果として、Uppaalによる定義によって、サンプリング意味によって発生するエラーを実行前に指摘することができた。例として、枠内で反射するボールの振る舞い、自由落下するボールの振る舞いにおいて、初期値、サンプリングから、本来、枠や地面で反射しなければならないにもかかわらず、すり抜けていく場合が存在するかどうかということの自動チェック、また、サンプリングによる時間区切りの定数限界による無限ループの発生をモデル化することができた。実時間性の研究では、再帰構造を含めた実時間プログラム実行における到達可能性問題について研究を行った。2018年度で、形式モデルの定義を示すことができ、初歩的な自動検証の枠組みについて定式化ができ、Uppaalによる自動検証手法を具体的に示すことができた。コミュニケーションを基本とするモデルにおける時間の導入を目標として研究を進めているセッション型の実現についても基本的な結果を得ることができた。2018年度において、モデル検証器としてはUppaalを用いた。Uppaalはデータ型として16bitサイン付き整数しか用いることができないこと、データ構造が貧弱であることといった制約がある。このため、固定小数点構造をエンコードして検証を実施した。その一方で、制御構造を可視化する点で優れており、Yampaの離散意味による実行の問題点を指摘しやすいことを示すことができた。2019年度では、バックエンドに浮動小数点値を直接用いるような検証器を用いた検証系を導入して、Yampaプログラムの安全性について自動的に検証できる枠組みを研究する。さらに、対象となるYampaプログラムの対象を拡張して、プッシュダウンオートマトンを利用した検証手法について、研究を進める。さらに、セッション型に対する時間経過を導入する枠組みついても引き続き、研究を進める計画である。本研究では、連続的な時間経過に対して動作意味が定義されているプログラムを離散的な実行環境で正しく実行できる条件について研究する。平成29年度は、ハイブリッドオートマトンのHaskell言語のドメイン固有言語であるYampaの離散時間動作意味を定義し、Yampaの実行において離散動作環境が与える振舞いの特性を定式化した。ここでは、Yampaプログラムの連続意味では発生しない現象が離散時間意味で発生することを示した。Haskell言語の実行環境では、一定時間のサンプリングが保証されない。一般には、連続時間の実行意味を一定時間のサンプリングによる離散時間で十分に実行することは不可能であり、実用上の観点でも効率よく離散時間で十分な精度で連続時間意味を実現することは困難である。本研究においては、サンプリング時間をプログラムの連続意味に対応して変化させることによって効率的に精度の高い連続意味の実現を目指している。本年度は、基本的な意味を定義して全体の枠組みに対する知見を得た。本年度で対象としたYampaプログラムは末尾再帰のみに限定されており、ハイブリッドオートマトンのモデル化を対象としたため、振舞いについては有限な状態によってモデル化できるクラスである。離散時間意味は離散時間の振舞いをするオートマトンと有限のロケーションに限定したハイブリッドオートマトンのYampaプログラムとの並行合成に基づいて離散時間意味を定式化した。Haskell言語による記述とその実現意味について検討し、離散的な実行環境における問題点について整理し、通信プロセスモデルに基づいた基本的な実行モデルを構築したという点で概ね予定どおりである。Haskell言語ではランタイムのデバッグについてはさらに検討が必要である。