hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＦＧＦシグナルを軸とした細胞間相互作用による肝臓の再生と病態の制御機構の解明

重篤な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な幹/前駆細胞(肝前駆細胞)が出現して、再生過程に寄与すると考えられている。しかしながら、肝前駆細胞の誘導・増殖・分化を制御する分子機構の詳細や、これと肝線維化や肝がん等の病態との関連の実態や機序は不明である。種々のマウス肝障害モデルを用いた、FGF7を中心とする細胞間相互作用に着目した解析により、肝前駆細胞の動態を制御する新たなシグナル伝達経路や転写因子の存在を明らかにした。また、肝前駆細胞と肝線維化との相互連関の基盤を成すメカニズムの一旦を明らかにした。重篤な障害を受けた肝臓では、未分化な肝前駆細胞(オーバル細胞)が活性化して再生に寄与すると考えられている。本研究課題では、種々のマウス肝障害モデルを用いて、肝前駆細胞の誘導・増殖・分化を制御する分子機構を解明すること[課題1]、および、肝前駆細胞と肝線維化や肝がん等の病態との関連の実態や機序を明らかにすること[課題2]、を目的としている。平成25年度は、[課題1]については、肝前駆細胞の誘導に関わると想定される新規因子として前年度に同定した炎症性サイトカイン分子についての詳細な解析を行った。この分子をコードする遺伝子の欠損マウスでは、障害時における肝前駆細胞の誘導および肝線維化の発症に、共に影響があることが明らかとなった。肝前駆細胞反応と線維化との相互連関の基盤を成すシグナルの候補と考えら、その作用機序についての解析を進めた。一方で、肝前駆細胞の誘導に関わる重要な転写因子を新たに同定した。この転写因子は肝前駆細胞自身に発現していること、その遺伝子欠損マウスでは肝前駆細胞の誘導に顕著な影響があり、肝障害の増悪化と個体の致死がもたらされることが明らかとなった。さらに、この転写因子によって発現制御される何らかのシグナル分子が、肝前駆細胞と炎症性細胞(血液細胞)との相互作用を介して肝前駆細胞反応の維持に重要である可能性を見出した。同じく、[課題2]については、マウス肝臓でのFGF7の持続的強制発現系(Tgマウス)による肝がん誘導モデルの作製と解析に取り組んだ。当該マウス系統の繁殖状態の影響により、当初の想定よりもモデル作製に時間を要したが、翌年度に解析を行うためのモデルマウスの準備が整った。本研究課題では、種々のマウス肝障害モデルを用いて、肝再生に寄与する成体肝前駆細胞(オーバル細胞)の誘導・増殖・分化を制御する分子機構を解明すること[課題1]、および、肝前駆細胞と肝線維化や肝がん等の病態との関連の実態や機序を明らかにすること[課題2]、を目的としている。平成24年度は、[課題1]については、肝前駆細胞の誘導に関わると想定される因子として新たに炎症性サイトカイン分子を見出した。この分子の発現は、種々の肝障害時に上昇し、しかも障害部位に局在していることが認められた。また、この分子を生体肝臓内で過剰発現させることで、肝前駆細胞を誘導可能であることも見出した。このとき、肝前駆細胞のニッチを構成すると想定されるThy1陽性細胞の顕著な増幅も認められたことから、このサイトカインは肝障害に対する初期応答シグナルとして、肝前駆細胞ニッチの制御に関与する可能性が強く示唆された。また、肝前駆細胞に対して作用する既知のシグナル経路のうち、Notchシグナルは増殖を、Wntシグナルは肝細胞への分化を、それぞれ促進する可能性が新たに示された。同じく、[課題2]については、特にFGF7と肝線維化との関連に注目した解析を行った。マウス生体肝臓でFGF7を強制発現させることで肝前駆細胞の誘導・増殖を促進可能であることが既に明らかとなっているが、このとき、誘導された肝前駆細胞の周囲ではコラーゲン線維の集積が認められた。これにより、肝前駆細胞が自身の周辺微小環境を自律的に構築・制御している可能性が示唆された。一方で、肝臓全体では線維の有意な蓄積は認められなかったことから、将来的にFGF7の治療への応用を進める上では線維化誘導への副作用は回避できると考えられた。重篤な障害を受けた肝臓では、未分化肝前駆細胞(オーバル細胞)が活性化して再生に寄与すると考えられているが、そのメカニズムについては不明な点が多い。平成26年度は、[課題1]については、肝前駆細胞の誘導に関わる重要な因子として前年度に新たに同定した転写因子についての解析を重点的に行った。

この転写因子を欠損するマウスの詳細な解析の結果、特定の肝障害モデルにおいては肝前駆細胞の誘導が完全に抑制されて障害の増悪化と個体の致死がもたらされた。このときの転写因子の機能として、肝前駆細胞の増殖に関与することが明らかとなった。また、肝前駆細胞を含む胆管上皮組織の構造変化にも関与する可能性が見出された。一方で、異なる種類の肝障害モデルにおいては、この転写因子を欠損しても肝前駆細胞の誘導には顕著な影響が無かった。以上のことから、肝障害の種類に応じて、「肝前駆細胞」と呼ばれる細胞集団の性状・誘導機構が異なることを明らかにした。同じく、[課題2]については、線維化の誘導に関わる炎症性サイトカイン分子についての解析を継続して行った。遺伝子発現パターンの詳細な検討から、このサイトカイン分子は、肝前駆細胞の誘導に関わる重要な増殖因子FGF7と同一の細胞種により産生されることを見出した。すなわち、肝前駆細胞反応誘導と線維化誘導の両者を同時に制御する細胞種の存在を明らかにした。肝臓における障害と再生の制御メカニズム[課題1]では、新規分子の同定と機能解析を通じて、肝前駆細胞の制御に関わる新たなシグナルネットワークの存在を見出すことが出来た。今後さらに解析を進めることで、FGF7を中心とした制御ネットワークの全貌解明、病態との関連の理解につながると期待できる。[課題2]については、Tgマウス系統の繁殖状態の影響で当初の想定よりもモデル作製に時間を要したが、翌年度に解析を行うための準備が整った。[課題1]、[課題2]共に、「FGF7を中心としたシグナルネットワークによる細胞間相互作用」という視点に基づく、新たな分子機構・生理機能についての知見を得ることができ、今後さらに解析を進めることで、肝前駆細胞の制御機構や病態との関連の理解につながることが十分に期待できる。当初の研究実施計画に加えて、平成24年度に同定した炎症性サイトカイン分子、平成25年度に新たに同定した転写因子、およびその標的遺伝子についての機能解析にも特に重点を置き、推進する。当初の研究実施計画に加えて、平成24年度に肝前駆細胞制御に関わる新規因子として同定した炎症性サイトカイン分子についての機能解析にも特に重点を置き、推進する。該当なし
音声言語障害のリハビリテ-ション支援システムの高度化

成人音声言語障害者のためのリハビリテ-ション支援システムの現状の把握音声障害、言語障害、聴覚障害、構音障害の各分野において現在適用が可能と考えられているリハビリテ-ション支援システムについて内外の情報を検索し、とくに外国文献を中心とした資料を作製した。2.成人音声言語障害のリハビリテ-ション支援システムの高度化に関する試案の提案パ-ソナルコンピュ-タを用いた言語学習プログラムの試案をまとめた。またリハビリテ-ション機器についての基礎的考察について意見をまとめ発表した。3.リハビリテ-ション支援システムの高度化についての具体的提案と検討1)音声障害:診断規準の合理化を重視し、嗄声の評価記録法、ストロボスコピ-の評価規準などについて指針を明らかにした。代用音声の問題を整理し、シャント発声における支援システムの高度化について提案を行った。2)聴覚障害:語音地図による補聴効果評価の追跡調査を行った。またデジタル処理による補聴の高度化についての指針を明らかにした。さらに人工内耳の適応と評価に関連して人工内耳装用患者の音声言語聴取の実際を詳細に検討し、その現状と高度化について報告した。3)失語症:パソコンを利用した語彙訓練装置の試作を完成させ、実際の臨床場面での試用を促進した。4)構音障害:病態について総括的な考察を行い、そのリハビリテ-ション支援システムの検討を進めた。とくにモ-ラ指折り法の適応を検討した。また発話代行装置の高度化について考察を行った。1.成人音声言語障害者のリハビリテ-ション支援システムの現状の把握と情報交換のための連絡会議の開催音声障害、言語障害、聴覚障害、構音障害の各分野において、現在適応が可能と考えられているリハビリテ-ション支援システムについての情報を、諸外国の文献等も参照して収集につとめた。これらの結果を総合して、文献集を作製した。ついでわが国における無喉頭音声の支援システムの現況について調査を施行した。また、わが国の各施設において音声障害の評価システムとして現在どのようなものがあるかについて広汎な調査を実施し、それぞれの評価項目がどのように病態を記述しうるものであるかについて検討を行った。さらに感音難聴者のリハビリテ-ション支援に関連して、音声情報加工を行った場合の受聴能力の変化を中心とした調査を実施した。これらの研究の成果は、平成3年1月に開催された講演会ならびに連絡会議に提出され、活発な討論が行われた。またこのほかにも、各領域における支援システムの現状の認識を深め、分担者相互の理解を高めることによって今後の研究の進展をはかるために、2回の連絡会議を開催して研究分担者の意見の交換を行った。2.成人音声言語障害のリハビリテ-ション支援システムの高度化に関する試案の提案上に述べた連絡会議を基盤として、リハビリテ-ション支援システムの具体的な提案を行うために、本年度はパ-ソナルコンピュ-タを用いた言語学習プログラムの試案をまとめた。さらにこのシステムに対応するビデオ教材の開発を行った。また、これらに関連して、リハビリテ-ション機器についての基礎的考察についての意見をまとめて講演会の席上で公表した。本年度はリハビリテ-ション支援システムの高度化について次の各項目別に具体的提案ないし検討を行った。1.音声障害:診断規準の合理化を重視し、とくに基礎的側面として嗄声の評価記録法、ストロボスコピ-の評価規準などについて指針を明らかにした。また喉頭摘出者の代用音声の問題を整理し、なかでもシャント発声における支援システムの高度化について提案を行った。2.補聴:語音地図による補聴効果評価の追跡調査を行って異聴傾向からみた質的評価が補聴効果についての満足度と相関が高いことを見いだし、異聴の分析、表記によって最適な補聴器選択がえられることを示唆した。また感音難聴者のための音声加工、とくに非線形振幅処理を検討し、デジタル処理による補聴の高度化についての指針を明らかにした。さらに人工内耳の適応と評価に関連して人工内耳装用患者の音声言語聴取の実際を詳細に検討し,その現状と高度化について報告した。

3.失語症:各種の失語症の病態に関する詳細な検討を積み重ね、とくに読み書きの問題とそのリハビリテ-ション支援について考按した。さらに具体的な訓練、支援システムの足掛りとして仮名文字訓練法を提案し、また語彙訓練装置の試作を完成させた。4.構音障害:その病態について総括的な考察を行ったのちリハビリテ-ション支援システムの検討を進めた。とくにモ-ラ指折り法の適応を検討した。また発話代行装置の高度化について考察を行った。以上の成果を中心に講演会を開催し、その報告資料を広く国内の音声言語障害研究に関与する諸施設に配布し、本研究の主題に関する国内各組織の認識の向上を図った。今後は本研究の成果をもとにして、さらに成人音声言語障害のリハビリテ-ションプログラムの体系化に向けての研究の発展が望まれる。
多機能癌抑制分子CXCL14の頭頸部癌幹細胞の分化促進による癌抑制機構の解明

今後の癌治療において、治療法(薬)による副作用の軽減、および癌の再発と転移の阻止が患者にとって重要です。癌幹細胞の存在が癌の再発と転移の原因と考えられ、癌幹細胞を制御する方法の開発が望まれています。我々は副作用のない癌抑制法開発の研究過程で、ケモカインCXCL14が生体内に存在する副作用のない多機能癌抑制分子であることを明らかにしてきました。本申請ではCXCL14が癌幹細胞の最終分化を促進して癌の進展抑制をする機構を癌幹細胞を含む口腔癌(頭頸部癌)細胞と遺伝子を改変した癌細胞を用いて明らかにする。口腔癌細胞(HSC-3)とおよびCXCL14遺伝子を導入したHSC-3-CXCL14細胞、CXCL14遺伝子発現を欠損させたHSC-3-1A細胞を播種し、RNAを採取、精製後RT-PCR法を用いて種々の遺伝子の発現量を比較した。また、一部の細胞についてはヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍の増殖と癌幹細胞マーカーの発現を検討した。HSC-3-CXCL14細胞において幹細胞(分化多能性)マーカーNANOGの発現レベル、及び癌幹細胞マーカーのCD44v3、CD44v6、CD44v9の発現はHSC-3細胞およびHSC-3-1A細胞より有意に低い値を示した。一方、ヌードマウス皮下における移植実験では、HSC-3ー1A細胞はHSC-3細胞より大きな腫瘍を形成し、腫瘍内のNANOG、KLF4、及び癌幹細胞マーカーCD44v3、CD44v6、およびCD44v9の発現量も高かった。HSC-3細胞においてCXCL14は幹細胞マーカーおよび癌幹細胞マーカーの発現などを介して癌幹細胞性を制御している可能性が示された。本研究結果により、将来、生体内の癌抑制機構の活性化による、副作用のない、廉価で種々の癌に適用可能な、患者に優しい、画期的な癌抑制法および予防法開発ためのデーターを提供できる。今後の癌治療において、再発と転移の阻止が患者にとって重要です。我々は副作用のない癌抑制法開発の研究過程で、ケモカインCXCL14が生体内に存在する多段階多機能癌抑制分子であることを明らかにしてきました。本申請において29年度はCXCL14の発現レベルの異なる頭頸部癌細胞を用いて、細胞培養系におけるCXCL14の発現増加と幹細胞マーカー、および癌幹細胞マーカーの発現量との関係をRT-PCR法を用いて検討した。T細胞を欠損するヌードマウス、あるいはT細胞とB細胞を欠損するSCIDマウス皮下にCXCL14の発現量が低いHSC-3-MOCK細胞を移植すると、移植腫瘍の増殖が起こるが、HSC-3細胞にヒトCXCL14遺伝子を導入し、CXCL14の発現量が高いHSC-3-CXCL14細胞の移植では腫瘍の増殖抑制が起こる。HSC-3-MOCK細胞および、HSC-3-CXCL14細胞を種々の細胞密度で培養し、遺伝子の発現をRT-PCR法で比較すると、HSC-3-CXCL14細胞では癌幹細胞マーカーのCD44v3、CD44v6、CD44v9の発現が低下していたが、正常細胞でも発現しているCD44standardの発現レベルには両者で差がなかった。また、幹細胞マーカーのNANOG、KLF4、OCT4の発現もHSC-3-CXCL14細胞で低下を示した。正常細胞としてヒトiPS細胞を用いて調べると、NANOG、KLF4、OCT4は高い発現を示したが、CD44v3、CD44v6、CD44v9の発現はほとんど検出されなかった。これらの結果からHSC-3細胞において、CXCL14の発現は癌細胞の癌幹細胞マーカー、幹細胞マーカーの発現を制御していることが考えられた。口腔癌細胞においてケモカインCXCL14を強制発現させたHSC-3-CXCL14細胞とコントロールのHSC-3-MOCK細胞を種々の条件で培養し、細胞の遺伝子発現をRT-PCR法により調べることにより、ケモカインCXCL14を強制発現させたHSC-3-CXCL14細胞では癌幹細胞マーカーと幹細胞マーカーの発現が抑制されることが明らかになった。これらの結果により多段階癌抑制分子CXCL14の作用が癌幹細胞を標的としていることが考えられた。

また、一部の細胞についてはヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍の増殖と癌幹細胞マーカーの発現を検討した。HSC-3-CXCL14細胞において幹細胞(分化多能性)マーカーNANOGの発現レベル、及び癌幹細胞マーカーのCD44v3、CD44v6、CD44v9の発現はHSC-3細胞およびHSC-3-1A細胞より有意に低い値を示した。一方、ヌードマウス皮下における移植実験では、HSC-3ー1A細胞はHSC-3細胞より大きな腫瘍を形成し、腫瘍内のNANOG、KLF4、及び癌幹細胞マーカーCD44v3、CD44v6、およびCD44v9の発現量も高かった。HSC-3細胞においてCXCL14は幹細胞マーカーおよび癌幹細胞マーカーの発現などを介して癌幹細胞性を制御している可能性が示された。本研究結果により、将来、生体内の癌抑制機構の活性化による、副作用のない、廉価で種々の癌に適用可能な、患者に優しい、画期的な癌抑制法および予防法開発ためのデーターを提供できる。昨年度の研究から口腔癌細胞においてCXCL14を発現させると幹細胞マーカー、および癌幹細胞マーカーの発現低下が起こることが示された。これらの結果をさらに他の細胞で確認するために、HSC-3細胞の内在性CXCL14遺伝子をCRISPR/Cas9法で欠損させた細胞クローン(HSC-3-1A)を作成した。30年度は1.HSC-3-1A、HSC-3-MOCK、HSC-3-CXCL14細胞をヌードSCIDマウスの皮下に移植し、腫瘍形成能を調べると共に、2.形成した腫瘍を取り出して、CD44v3、CD44v6、CD44v9、CD44standardの発現レベル、および幹細胞マーカーのNANOG、KLF4、OCT4の発現レベルをRT-PCR法を用いて調べる。また、上記の細胞の癌幹細胞マーカーなどについてウェスターンブロット法を用いてタンパク質の発現レベルがRT-PCR法の結果と相関することを確認する。3.さらに、癌細胞から癌幹細胞を分離する方法を確立し、3つの系統の癌細胞から癌幹細胞を分離し、CXCL14の発現が、癌幹細胞数を減少させるのか、癌幹細胞の遺伝子発現活性を抑制するのかを明らかにする。RT-PCR法によりCXCL14が幹細胞因子と癌幹細胞因子の発現に関与している可能性が明らかになったので、ウェスターンブロット法などを用いて幹細胞マーカーと癌幹細胞マーカーの発現をタンパク質レベルで明らかにする。また、結果をまとめて論文の発表を行うので、論文の校閲と投稿料に使用する。
低コストで耐震性強化・環境配慮対策可能なため池改修技術の研究

1.加古川市峠池の池底泥改良土の締固め供試体に対して中空ねじり試験と三軸試験を行い,設計に必要な強度特性や強度異方性を定量的に明らかにした。さらに,大型三軸・大型土槽透水試験を行った結果,土粒子移動がある場合にはジオグリッド敷設により土粒子移動が起こりにくくなることがわかった。2.加古川市峠池中堤に試験堤を施工し,挙動計測を行った結果,ジオグリッドため池新工法の安全性や施工時問題点の抽出など,有益な情報を得た。供用後に開削を行って目視観察した結果,ジオグリッド周辺や柔構造底樋周辺などで異常箇所は全くないことがわかった。3.ゼオライト質凝灰岩を廃セメントスラリーコーティングした水質浄化パネルを作製し,窒素・リン除去性能および窒素除去メカニズムを実験的に明らかにした。試験堤に水質浄化パネルを施工して夏期2ケ月にわたり水質測定を行うとともに,現地回収パネルと未使用パネルの全窒素・全リンの成分分析を行った結果,水質浄化機能が有効に働いていることが確認できた。4.4種類の洪水吐模型(Case A:従来型の鋼板製矩形断面,CaseB: PVC(ポリ塩化ビニル)製軽量矩形断面+両壁ジオグリッド,CaseC: PVC軽量半円形断面,Case D: Case C+両壁ジオグリッド)の大型振動台模型試験を行い,重量と断面形状および補強材の有無に着目して検討した結果,水平変位に関しては,補強材を用いたCase B,Dが加振中に小さい応答変位および残留変位を示す優位性を示したが,鉛直変位に関してはCase Bで大きな応答変位を,Case Dで大きな残留変位を示すことがわかった。5.等価線形化法による3次元FEM動的応答解析の結果,洪水吐材料の違いによって応答変位分布が大きく異なり,PVCのような剛性の小さい材料では曲げによる大きな鉛直応答変位に注意する必要があること,およびジオグリッドによる補強効果は引張力によって生じることが解明された。1.試験土採取や試験堤施工の対象となるため池として加古川市峠池を選び,管理者や県関係者の許可を得た。2.峠池の池底泥土を採取し,物理特性を明らかにした。セメント系固化材やベントナイトの混台割合を変えた場合の締固め特性や透水性・強度変形特性の変化を三軸試験装置により明らかにした。この結果,(1)セメント系固化材を80kg/m^3配合した場合の締固め特性や強度変形特性が最も優れ,透水係数も10^<-6>cm/sオーダが得られ,CU強度定数はC'=OkN/m2,φ'=37.8°となり,ランダム材やコア材として利用できる基準にあること,(2)さらにベントナイトを湿潤重量比で5%配合した場合には,透水係数が5×10^<-6>cm/s, CU強度定数はC'=10.5kN/m2,φ'=31.8°となり,さらに優れたコア材の特性が得られることがわかった。3.堤体内浸透流解析に必要な二次元・軸対称自由水面追跡用FEM浸透流解析プログラムを開発した。現在、三次元解析プログラムの開発中である。これらを用いることにより実験結果との比較考察が可能となる。本年度は、浸透流現象及び浸透破壊現象に及ぼす異方透水係数の効果について理論解析を行った。4.フィルダム堤体内の浸透流特性および浸透破壊特性を明らかにするための浸透模型試験装置(2Dflow-B400/H1500/W3300×2)を設計・試作した。

現在、間隙水圧測定用のピエゾメーター式、水頭負荷装置など実験に必要な装置の製作中である。5.ゼオライト質凝灰岩に廃セメントスラリーをコーティングした水質浄化濾材について,窒素・リン除去性能および窒素除去メカニズムを実験的に検討した。この結果,(1)本濾材は活性炭よりも優れた窒素・リン除去性能を有し,ほぼ4時間後には富栄養化基準をクリアできること,(2)本濾材のアンモニア態窒素の除去メカニズムは濾材吸着か微生物吸収によること,(3)少なくとも試験機関の5ヶ月以上は水質浄化機能が維持されること,などがわかった。1.加古川市峠池の中堤を選定し,試験堤の設計や挙動計測計画等を管理者と県関係者に説明した。2.試験堤築造に用いる峠池の池底泥改良土(底泥土と砂質土を体積比3:1で混合し,セメント固化材を80kg/m^3配合した改良土)を採取し,物理試験と締固め試験を行って最適含水比を求めた。室内試験には,最大粒径2mmに調整した試料を締固め度D_cが湿潤側90%以上となるように締固めて作製した供試体を用いた。3.三軸セルを用いた156.4mm立方体型大型供試体透水試験装置を試作し,異方透水性の影響を検討した。三軸当方圧密試験・K_0圧密試験による透水係数と比較した結果,(1)鉛直透水係数は9×10^<-6>cm/sが得られ,水平方向透水係数は約10倍の値をとる,(2)三軸圧密試験の結果から求めた透水係数は4×10^<-6>cm/s程度で,ため池遮水材の基準5.0×10^<-6>cm/s^<2)>を満たしている,等の結論を得た。4.締固め供試体の中空ねじり試験と三軸試験を行い,強度特性を比較した結果,(1)三軸等方圧密,三軸K_0圧密のいずれの場合においても内部摩擦角φ_dは30°以上で,粘着力cdも大きな値となっており,ため池改良鷹泥土は十分な強度をもっている,(2)締固め供試体では,三軸試験結果の強度のほうが大きく評価されるが,内部摩擦角はねじりせん断試験の方が大きい,(3)三軸試験とねじりせん断試験の比較より底泥改良土の強度異方性が確認された,などの結論を得た。5.ゼオライト質凝灰岩に廃セメントスラリーをコーティングした水質浄化濾材を実用化するためのパネル作製工程を検討し,峠池試験堤に適用し,6ヶ所で水質を実測する予定である。6.2月25日より試験堤施工を開始し,現在築造中である。土圧計・間隙水圧計・沈下棒を設置し,挙動計測を約10ヶ月行う予定であり,12月には開削して内部を目視観察する予定である。1.加古川市峠池中堤に昨年度3月に施工した試験堤の沈下量・間隙水圧・土圧に関する挙動計測を行った結果,ジオシンセティックスため池新工法の安全性ならびに施工時の問題点の抽出など,極めて有益な情報を得た。供用後に開削を行い,内部目視観察した結果,ジオシンセティックス周辺や柔構造底樋周辺などで異常箇所は全く観察されなかった。2.ゼオライト水質浄化パネルを性能評価するために夏期2ヶ月にわたり水質測定を行った。また,試験施工期間終了後に現地から回収した凝灰岩ポーラスパネルと未使用のパネルの全窒素・全リンの成分分析を行った結果,水質浄化機能が有効に働いていることが確認できた.3.ジオシンセティックスを用いたため池
アスパルターゼ機能発現部位における構造変化機構の解明

中等度好熱菌Bacillus sp.YM55-1由来アスパルターゼの精密分子構造と類縁酵素の分子構造とを局所構造比較の手法により比較し、検出した構造差異領域についての検討を行った。大腸菌由来アスパルターゼにおけるアスパラギン酸とマグネシウムイオンによる酵素反応へのアロステリック効果発現に関与している可能性が示唆された2箇所の領域については、具体的な構造変化機構の詳細は不明ではあるが、構造変化の活性部位への伝搬や、活性部位クレフトの空間体積の増減などが関与していると推定される。さらに、Bacillus sp.YM55-1由来アスパルターゼの基質分子結合モデルと類縁酵素の基質フリー構造および基質類似物結合複合体構造との詳細な構造比較を行うことにより、酵素反応遂行のために重要な役割を担っていると示唆されるフレキシブルなループ中のセリン残基が、活性部位中での基質分子との相互作用に重要な働きを担っている可能性が強く示唆された。また、基質結合状態の疑似構造を形成していると期待される基質類似物複合体結晶を得ることを目的として、基質類似物十数種類との共存下での結晶化の条件検索の検討を行った。局所構造比較手法の妥当性の検討のため、他の幾つかのマルチサブユニット形態のタンパク質について、状態の異なる同一分子の結晶構造での構造差異に対して同様の手法による局所構造比較を行ったところ、局所的な構造変化部位を明確に検出することが可能であるという予備的な結果を得ることができた。中等度好熱菌Bacillus sp.YM55-1由来アスパルターゼの分解能2.5Åでの精密分子構造と類縁酵素とを局所構造比較の手法により検討し検出した構造差異領域のうち、Gly223Glu241とVal265Asp272の2箇所の領域が、大腸菌由来アスパルターゼにおけるアスパラギン酸とマグネシウムイオンによる酵素反応へのアロステリック効果発現に関与している可能性が示唆された。これらの領域の構造変化がどのようにアロステリック効果の発現に作用しているかは不明であるが、今後これらの部位に着目した生化学的実験を行う指針となりうる。さらに、Bacillus YM55-1由来アスパルターゼの基質分子結合モデルと類縁酵素の基質フリー構造および基質類似物結合複合体構造との詳細な構造比較を行うことによって、フレキシブルなループであるGly317Pro322の領域が反応遂行のために重要な役割を担っていることが示唆された。類縁酵素での部位特異的変異体実験の結果を考え合わせることで、特にこのループ中のSer318とSer319が、活性部位に結合した基質分子に相互作用することが示唆されることが判明した。より良質で高分解能の回折強度データを得るため、結晶化条件検索の検討をさらに広範囲の条件で行った。また、基質類似物複合体結晶を得ることを目的として、基質類似物数種類との共存下での結晶化の条件検索の検討を行った。
神経原性気道炎症の慢性モデルによる検討とヒト気道でのAxon reflexの証明

I.神経原性気道炎症の調節気道の神経原性炎症は、知覚神経末端からのサブスタンスP(SP)等のペプタイド放出によっておこる。我々はモルモットを用い、頚部迷走神経電気刺激及び外因性SP投与を行い神経原性炎症を惹起した。Neuropeptide Y(NPY)、Ibudilastは、両者とも神経刺激による炎症反応は抑制したが、外因性SPによる炎症に対しては無効であった。よって両薬剤は、神経末端からのペプタイド放出を調節し、炎症を抑制したと考えられた。さらに、NPYの効果はATP感受性Kチャンネル阻害剤存在下でも有効であったが、Ibudilastの効果はATP感受性Kチャンネル阻害剤で消失した。よって、NPYの効果はこのKチャンネルを介さないがIbudilastはこのチャンネルを開口することで作用すると考えられた。II.慢性気道炎症モデルによる検討慢性気道炎症を、IL-5の連日吸入(4週間)あるいは感作モルモットに対する抗原連日吸入(4週間)にて惹起した。IL-5連日収入モデルでは、気道への好酸球集積は認められたが、気道の神経性反応の異常は認められなかった。一方、抗原連日吸入モデルにおいては、4週間後に、気道のコリン作動性神経、及び興奮性非コリン非アドレナリン作動性神経(e-NANC)の機能元進が認められた。しかし、外因性アセチルコリン、NKAによる気道収縮反応は、抗原連日吸入后も変化しなかった。以上より以下のことが示唆された。1)好酸球の気道内集積のみでは、気道の神経原性炎症は増強しない。2)抗原慢性吸入は、気道の神経原性炎症を増強するが、この機序としては、神経伝達物質の生産能増加あるいは、放出能増加が考えられる。I.気道炎症慢性モデルによる検討。1) IL5を、4週間吸入させたモルモットモデルを作成した。本モデルにおいて、気管支肺胞洗浄液及び組織固定により、気道への好酸球の浸潤が認められた。しかし、気道上皮の剥離や、気道壁の浮腫は認められず、好酸球のみでは、喘息に見られるような形態的変化はおこらないことが推察された。又、神経刺激による気道収縮反応及び、アセチルコリン、NKAによる反応に日変化が認められなかった。2)感作したモルモットに、4週間連続して抗原を吸入させ、慢性アレルギー性気道炎症モデルを作成した。本モデルにおいて、知覚神経電気刺激による気道収縮反応が、有意に亢進した。一方、外国性NKAによる気道収縮反応は変化しなかった。さらに、肺組織に含有されているSP量をRIA法により測定したところ、慢性炎症群では、コントロール群に比べ、SP量が有意に上昇していた。以上より、アレルギー性慢性気道炎症は、知覚神経由来のペプタイド含量を増加させる、つまり、神経原性気道炎症を増強すると考えられた。II.ヒト気道でのAxon reflexの証明喘息患者10名に対し、ブラディカイニン吸入による気道収縮及び咳に対するタヒキニン拮抗剤の効果を検討した。気道収縮は体プレチスモグラフを用い、特異的気道コンダクタンスにより評価シた。タヒキニン拮抗剤は、ブラディキニンによる気道収縮及び咳を全例で抑制した。このことから、ヒト気道においても、Axon reflexによる反応が起り、喘息の病態に関与している可能性が示唆された。I.神経原性気道炎症の調節気道の神経原性炎症は知覚神経末端からのサブスタンスP(SP)等のペプタイドの放出によっておこる。我々は、この反応が最もよく観察できるモルモットを用いて検討した。頚部神経電気刺激及び外因性SP投与を行うことにより神経原性炎症を意起した。

この両者に対してある薬物が効果を示せばその作用局在はSP受容体であり、又神経刺激にのみ有効であれば神経末端からのペプタイド放出を抑制していると評価できる。この方法により今年度は、NPY及びIbudilastについて検討した。両薬剤とも神経刺激に対する抑制効果は認められたがSPによる炎症に関しては無効であった。よって両薬剤は神経末端からのペプタイド放出を抑制しているものと考えられた。さらにNPYの効果はATP感受性Kチャンネル阻害剤存在下でも有効であったが、Ibudilastの効果は、ATP感受性Kチャンネル阻害剤で消失した。よってNPYの効果はこのKチャンネルを介さないがIbudilastはこのチャンネルを開口することで作用すると考えられた。II.慢性気道炎症モデルによる検討我々は慢性気道炎症を好酸球遊走能をもつIL-5の連日吸入あるいは感作モルモットに対する抗原連日吸入にて惹起した。IL-5連日吸入モデルでは気道への好酸球の集積は認められたが、気道の神経系の異常は認められなかった。一方、抗原連日吸入モデルにおいては1ケ月後に気道のコリン作動性神経、及び、非コリン非アドレナリン作動性神経(e-NANC)の機能元進が認められた。しかしこれら神経の伝達物質であるアセテルコリン,NKAの反応は抗原連日吸入何も変化しなかった。以上より以下のことが示唆された。1)好酸球の集積のみでは気道の神経原性炎症は増強しない。2)気道の抗原抗体反応が持続性におこるとコリン作動性神経による気道収縮反応のみならずe-NANC神経による気道炎症も増強する。この機序としては神経伝達物質の生産能増加あるいは、放出能増加が考えられる。
血液細胞の高精度遺伝子発現解析による骨肉腫バイオマーカーの探索研究

骨軟部腫瘍の有用バイオマーカーを開発するために、骨肉腫罹患者血液細胞を用いて、血液細胞の遺伝子発現状態の変化を調べた。必要検体数を確保するために対象疾患を骨肉腫に加えて脊索腫にまで拡張した。罹患者6名と健常者4名の白血球画分から得たRNAを試料として高精度大規模遺伝子発現解析を行った結果、罹患者群と健常者群の遺伝子発現パターンを互いに区別することができた。これは末梢血液を用いた罹患者スクリーニングの可能性を示唆する。測定対象を群間差の大きい転写産物に絞り込むことで、弁別精度を保ちつつ解析作業の簡便化を進めている。2013年4月に科学研究費補助金の交付内定通知を受け本研究の予算根拠を得た段階で、ただちに機関内研究倫理審査委員会に研究計画を申請した。同年5月29日開催の研究倫理審査委員会にて審査を受け、同6月7日付にて一部修正での本研究承認通知を受領した。修正指示(説明文書および同意書の改訂)に対応し、同7月より重粒子線治療のため来院する骨肉腫罹患者への研究協力依頼活動を開始した。同疾患では薬物療法を先行させてから重粒子線治療に入る罹患者が多く、1ヶ月以内に薬物療法を実施した症例が続き、多くは採血まで至らなかった。現時点で研究参加要件に適合する罹患者2名からの検体採取が実現している。2014年度は、目標症例数5名を目指して引き続き検体採取に取り組む。遺伝子発現解析の測定精度を確保するため、核酸抽出以降の作業は目標症例数を確保した段階で全検体を同時処理する計画である。目標症例数5名を目指して骨肉腫罹患者への研究協力依頼をおこなったが、2014年度の受診者すべてが化学療法実施済みで研究用血液の採取要件を満たさなかった。そこで機関内研究倫理委員会の承認を得て脊索腫を対象疾患に追加して協力罹患者を募り、化学療法未実施の罹患者血液3検体を得た。先年度最終済みの骨肉腫検体を合わせて骨軟部腫瘍5検体を確保し、血漿画分と白血球画分それぞれからRNAを分取した。白血球画分RNAの発現解析用測定機が故障し長期間稼働困難となったため、血漿からmiRNA画分を調製しマイクロアレイ法による発現解析を優先実施した。健常人対照と比較して骨軟部腫瘍で高発現傾向を示すmiRNA群を見出した。また深刻な故障に陥っていた測定機の修理も完了したため、2015年度に白血球画分RNAのトランスクリプトーム解析を実施予定である。肉腫は癌腫と比べて発生頻度は低いものの、切除に伴うQOL低下が著しい症例や切除不能症例、および化学療法および通常の放射線療法が奏功しない症例が多い。臨床現場では肉腫の治療効果判定および早期発見に役立つバイオマーカーが求められており、その開発を期して本研究を実施した。当初は骨肉腫のみを対象疾患としたが、当院受診者すべてが化学療法実施済みで研究用血液の採取要件を満たさなかったため、機関内研究倫理委員会の承認を得て脊索腫を対象疾患に追加した。その結果、要件を満たす骨軟部腫瘍罹患者6名の協力を得て、目標症例数を確保した。最終年度、骨肉腫罹患者2名と脊索腫罹患者4名および健常者4名の白血球画分からRNAを調製し、cDNA-AFLP変法による高精度大規模遺伝子発現解析を実施した。計画の目標症例数は5名であるが、治療経過によっては解析対象外となる被験者が生じうるため上記症例数を解析した。8919種類のmRNA型転写産物の量測定(トランスクリプトーム解析)をおこない、各検体の転写産物発現パターンを距離法にて系統評価すると、健常者群は罹患者とは明確に異なる単一クラスタを形成した。罹患者群は、健常者群と大きく異なる亜群と相対的に健常者群に近い亜群の二つのクラスタに分離した。特に群間差の大きい100転写産物に着目することで、罹患者群と健常者群をより高精度に弁別可能と考えられた。本年度の結果は、前年度に実施した血漿由来miRNA解析による罹患者群検出能力よりも高感度であった。前年度解析はがん細胞そのものから放出される特異的miRNAの捕捉を期待したものであり、本年度解析は骨軟部腫瘍組織が血液細胞へ及ぼす遺伝子発現変化を捉えようとしたものである。両解析を通して得られた結果から、罹患者血液細胞を試料としてバイオマーカーの開発研究を進めることの重要性が判明した。対象疾患を拡張し目標症例検体数を確保した。いっぽう本研究実施に必須の測定機に予想外の故障が発生し、白血球由来RNAの発現解析に遅れを生じている。そのため本研究の目的に沿う他の解析活動として、血漿エキソソーム由来miRNAの発現解析を実施した。

この解析を加えることで、血液検体からのバイオマーカー開発可能性をより広く検討することとなる。血漿miRNAを3D-Geneシステムによる発現解析に供し、骨軟部腫瘍とりわけ脊索腫に特徴的な発現増加傾向を示すmiRNA分子種を複数見出している。分子遺伝学2014年度途中から対象疾患に追加した脊索腫罹患者から、2015年度には重粒子治療後の血液検体が得られるので、健常人と罹患者との比較解析に加えて、同一罹患者の治療前と治療後の比較解析が実施可能となる。いっぽう、故障していた測定機の修理が完了したので白血球RNAの発現解析を進めることで、がん側(miRNA)と宿主側(白血球RNA)の重層トランスクリプトーム解析による多面的バイオマーカー探索をおこなう。本実施状況報告書作成時点において、採取した研究用検体数がまだ目標症例数に達していない。これまでの当所重粒子医科学センター病院での骨肉腫治療実績数に基づき、平成25年度に同罹患者5名から検体提供を受ける研究計画を策定した。しかしながら当病院重粒子線による治療適応となり、かつ研究参加要件に適合した罹患者数が、同年度2名にとどまったためである。予想外の測定機故障が生じたため白血球RNAの発現解析が未実施となり、未使用額が発生した。予算の一部は血漿miRNAの3D-Gene解析委託費として活用したが、残りは測定機修理後に実施する白血球RNA発現解析に備えて次年度予算として繰り越すこととなった。本研究を推進するためにまず解決すべき課題は、研究参加要件に適合する骨肉腫罹患者の症例数を確保することである。骨肉腫はもともと稀少疾患であり、研究参加症例数を増やす方策をすぐに講じる目途は立たないが、化学療法剤の体内半減期などを精査して血液細胞への影響が及ばない範囲で適合要件の変更を検討しつつ、目標症例数5名を目指して引き続き検体採取に取り組むこととする。2015年度すみやかに白血球RNAの発現解析をおこない、その消耗品試薬経費として使用する。「研究実績の概要」にて述べたとおり、研究参加要件に適合する罹患者数が目標症例数に達せず、遺伝子発現解析作業を開始できなかった。同作業用消耗品は分子生物学用の各種酵素類が主であり、所期活性を担保して使用できるよう次年度購入としたため、次年度使用額が生じることとなった。次年度使用額は2014年度に、当初予定していた消耗品の購入費にすべて充てる予定である。
糖転移酵素遺伝子欠損マウスを用いた発癌・転移における糖鎖機能の解析

癌細胞の表面には特徴的な糖鎖構造が見い出されており,それらが細胞のがん化と浸潤,転移に関連していると言われている。実際,癌細胞特異的な腫瘍抗原の多くは糖鎖抗原であり,腫瘍マーカーとして診断にも利用されている。本研究では,我々が作製したGalT-I欠損マウスを用いて,これらの腫瘍抗原,特にシアリルLe^xなどの糖鎖構造が,細胞のがん化と形成された腫瘍細胞の増殖や浸潤,転移などの性質に与える影響を明らかにする。そのために,本年度は化学発がん剤による発がん実験及び腫瘍細胞株の単離とその性質の解析を行った。GalT-Iホモ欠損マウスとヘテロ欠損マウスの皮膚に0.5%メチルコラントレン(MC)を0.05mlずつ週2回計10回塗布し,経時的に腫瘍形成を観察した。塗布終了後140日後まで観察したところ,どちらのマウスにおいても60日から100日後ぐらいから乳頭腫様の腫瘍形成が認められ,腫瘍の数には有意な差は認められなかった。しかし140日後までに直径10mm以上の腫瘍を形成したマウスは,GalT-I欠損マウスの方が少なく,GalT-I欠損マウスでは腫瘍の増殖速度が遅い傾向が見られた。次にこれらの腫瘍から細胞の調製を行い,現在までのところ,GalT-I欠損マウスより2系統,コントロールマウスより1系統の腫瘍細胞を単離した。GalT欠損マウス由来腫瘍細胞のin vitroでの倍加速度は,コントロールの約2倍であり,マウス皮膚での増殖速度を反映する結果が得られた。まだ例数が少ないので各々のマウスから10系統ぐらいの腫瘍細胞を単離して,増殖速度はもとより,フォーカスの形成能,軟寒天培地でのコロニー形成能,細胞外基質に対する接着能,ヌードマウスに移植した時の生着率や他の臓器への浸潤,転移能などを詳細に解析する予定である。また,マウス後肢に1mgのMCを投与して肉腫形成を誘導したり,胎仔由来の初代繊維芽細胞から株化細胞の樹立も進行しており,それらについてもGalT-I欠損の影響を解析する。
PDAにおける手書き数式入力対応数式処理システムの開発に関する研究

本研究の3年間の研究期間を通しての目的は、次の3点であった。1.PDA用の手書き数式入カインターフエースを開発する。2.数式処理ソフトと連携し、手書き入力された数式の計算を行うシステムを開発する。3.教育現場で使用するためのインターフェースについて教育的視点から研究する。1年目に、PC用数式エディタInftyEditorの手書き数式インターフェースをPDAに移植し、さらに数式処理ソフトRisa/Asirとの通信機能を実装することで、PDA用の手書き数式入力に対応した数式処理システムAsirPadを開発した。また、RSA暗号に関する中学生用教材を作成し、福岡県内の中学校において、この教材を利用した実践授業を行った。2年目には、1年目で得られた成果を元に、AsirPadの数式エンジン部の改良とグラフ描画機能の実装を行った。本研究の最終年度となる今年度は、前半にAsirPadの数式フォントやインターフェースのカスタマイザビリティの調整を行い、後半に実践授業を行う計画を立てて研究を行った。その結果、ユーザの使用言語や年齢などに合わせて、インターフェースを変更するためのカスタマイザビリティの向上を行うことができた。以上によって、本研究の目的は概ね達成できたといえる。9月以降は、本研究成果の実用化のために、NintendoDSの教育利用についての調査を行った。本研究の成果を生かして数学教材を作成し、福岡県内の2つの小学校で実践授業を行った。その結果、教育現場におけるPDAの有効性について検証できた。PC用手書き数式入力対応エディタInftyEditorの手書き数式インターフェースをPDAに移植し、オープンソースの数式処理ソフトRisa/Asirとの通信機能を実装し、PDA上で手書きで入力した数式に対して計算を行うシステムのプロトタイプAsirPadを作成した。内部的には、エラーが起きても復帰できるように例外処理の機能を追加した。また、様々なユーザーに対応するために、ボタン及びメニューの日本語と英語の切り替えや、扱う数式のレベルに合わせて手書き辞書を変更できるようにソースの構造を変更した。インターフェースについては、何度も同じ数を入力しなくてもよいように、変数への数の代入機能も用意した。さらに、実際の教育現場で使用できるように、インターフェースの仕様とデザインについて教育的視点から検討し、若干の変更を行った。以上の成果を2004年9月にポーランドで開かれたワークショップWorkshop on Mathematical User Interfacesにおいて発表を行った。同時に開催されたデモセッションにおいても、AsirPadのデモを行った。さらに、AsirPadの問題点を探るために、AsirPadを用いてRSA暗号について体験し、その仕組みを学習する中学校・高等学校用教材を作成し、2005年3月に田川市立弓削田中学校において、この教材を利用した実践授業を行った。この実践授業によって、現状のAsirPadの問題点、及び今後改良すべき点を明らかにすることができた。これと同時に、教育現場におけるPDAと手書き数式インターフェースの有効性についても検証できた。この研究成果は、2005年3月に神戸大学で開催された研究集会Risa/Asir Conference 2005において発表した。昨年度は、PC用数式エディタInftyEditorの手書き数式インターフェースをLinux搭載PDAのZaurusに移植し、さらにオープンソースの数式処理ソフトRisa/Asirとの通信機能を実装することで、PDA用の手書き数式入力に対応した数式処理システムAsirPadを開発した。本年度は、このAsirPadに対して、次の2点の改良を行った。1.数式エンジンとの通信部の改良現在のAsirPadは、起動時に計算サーバーであるAsirを呼び出して通信を確立するのであるが、この通信確立に失敗することが非常に多かった。この原因を調査したところ、PDAの処理速度の低さが主な原因であることが判明した。そこで、クライアント(AsirPad)とサーバー(Asir)の負担を折半させるために、通信の確立方法を変更し、サーバー側からAsirPadに接続させるようにした。これによって、起動時の通信確立の失敗を無くすことができた。2.グラフ描画機能の実装数学の学習において、関数のグラフを描く作業は非常に重要な学習活動である。そこでAsirPadにもグラフ描画機能を追加した。グラフ描画機能の仕様については、既存のPC用のグラフ描画ソフトのインターフェースを調査した上で、ペンベースインターフェースであることを考慮して、(1)パラメータ付きの陽関数の描画、(2)複数の関数グラフを同じダイアログ内に表示、(3)グラフの拡大・縮小、を実装した。結果的に、すべての操作をペンだけで行えるようにできた。また、グラフ描画用の計算エンジンは、Asirだけでなく、UNIXアプリケーションとして定評のあるgnuplotとの通信もできるように工夫した。以上の成果は、数式処理の応用に関する2つの国際会議ACA2005(奈良)・ASCM2005(韓国)において発表を行った。

また、RSA暗号に関する中学生用教材を作成し、福岡県内の中学校において、この教材を利用した実践授業を行った。2年目には、1年目で得られた成果を元に、AsirPadの数式エンジン部の改良とグラフ描画機能の実装を行った。本研究の最終年度となる今年度は、前半にAsirPadの数式フォントやインターフェースのカスタマイザビリティの調整を行い、後半に実践授業を行う計画を立てて研究を行った。その結果、ユーザの使用言語や年齢などに合わせて、インターフェースを変更するためのカスタマイザビリティの向上を行うことができた。以上によって、本研究の目的は概ね達成できたといえる。7月には、韓国で開催された国際ワークショップ「KIAS-RIMS joint workshop on Computer Algebra」において、本研究の研究成果を招待講演として発表した。また、8月に開催された情報処理学会情報教育シンポジウムにおいて、実践報告を行い、プレゼンテーション賞を受賞した。9月以降は、本研究成果の実用化のために、NintendoDSの教育利用についての調査を行った。本研究の成果を生かして数学教材を作成し、福岡県内の2つの小学校で実践授業を行った。その結果、教育現場におけるPDAの有効性について検証できた。
初期原腸胚の細胞運命を制御するNotchシグナルの役割に関する研究

本研究では原腸胚期の胚葉形成におけるNotchシグナルの役割を明らかにするために、Notchシグナルの構成因子が及ぼす原腸胚形成への影響と、その過程で明らかになったNotchシグナルの新規標的遺伝子の機能を解析し、以下の研究成果を得ることができた。1.原腸胚期におけるXSu(H)2の役割Notchシグナルのもとで働く転写因子XSu(H)2の機能欠損実験から、XSu(H)2は既知標的遺伝子であるXESR-1とは異なる遺伝子を介して原腸形成に関わることがわかった。原腸胚期にザイゴティックに発現する遺伝子群の中でXSu(H)2に応答性を示す遺伝子を検索した結果、POUクラスV転写因子をコードするXoct25およびXoct91がXSu(H)2に対する応答性を示すことがわかった。Xoct25のプロモーター解析より、XSu(H)2はXoct25のプロモーター上にあるSPS配列に直接結合して転写制御していることが明らかになった。2.原腸胚期におけるXMam1の役割Mastermindは転写因子Su(H)と共に働いてNotchシグナルの標的遺伝子を活性化する転写補助因子とされている。ツメガエルのMastermindホモログであるXMam1の初期発生における機能解析を行った結果、XMam1は神経胚期において一次神経形成を抑制する一方、神経誘導に必須の因子として働き、神経分化の初期マーカーであるSoxDやNRP1の転写を誘導することがわかった。神経誘導制御シグナルとの関係を検討した結果、BMPシグナルではなくFGFシグナルと密接に関わる可能性が示唆された。3.Notchシグナル標的遺伝子の網羅的解析Notchシグナルの標的遺伝子を明らかにするためにマイクロアレイによりXSu(H)2の標的遺伝子を網羅的に検索した。NotchシグナルとXnr2に応答性を示し、原腸胚期にザイゴティックに発現する新規遺伝子の全長を単離・同定し、XenopuslaevisATF1(XIATF1)と名付けた。機能阻害実験から、XIATF1は原腸胚期の中胚葉形成に必須の転写因子であることがわかった。本研究によりNotchシグナルの構成因子であるXSu(H)2およびXMam1はNotchシグナル依存的経路と非依存的経路の分岐点において原腸胚期の細胞の発生運命を制御することを示すことができた。ツメガエル初期原腸胚におけるNotchシグナルの役割を調べるために、本年度はNotchシグナルの下で働く転写因子XSu(H)2に着目してノックダウン実験とマイクロアレイ検索を行い、以下の成果を得た。2.マイクロアレイを使ったXSu(H)の標的遺伝子の網羅的解析Engrailed Repressor(EnR)をN末端に付加したXSu(H)2-EnRを作製し、このmRNAを注入したアニマルキャップを未注入のアニマルキャップと比較し、遺伝子発現が有意に抑えられる遺伝子群をマイクロアレイにより網羅的に検索した。原腸胚期に発現する3694クローンの中から転写が顕著に抑制される21個の候補遺伝子を絞り込んだ。3.原腸胚期に作用するXSu(H)2標的遺伝子の絞り込み上記21個の候補遺伝子について遺伝子発現とXSu(H)2に対する応答性を検討した結果、原腸胚期に応答するXSu(H)2の標的遺伝子候補として、転写因子をコードする4個の遺伝子を絞り込むことができた。

これらの遺伝子はXSu(H)2の新規標的遺伝子と考えられ、原腸胚期の胚葉形成との関係を今後検討する予定である。尚、遺伝子増幅器の購入に際しては、ABI社2720モデルと同水準の安価なASTEC社PC708モデルが発売されたため、機種変更をして購入した。使途は同じであるため、目的に沿った研究を実施することができた。平成17年度はマイクロアレイ法を用いて、Notchシグナルの下で働く転写因子XSu(H)2の新規標的遺伝子21個を検出した。平成18年度は、これらの遺伝子のNotchシグナルに対する応答性と原腸胚期の機能を解析した。1.Notchシグナルに応答性を示す新規標的遺伝子の原腸胚期における機能の解析XSu(H)2に応答性を示した21遺伝子のうち、Notchシグナルに応答しXnr2により転写誘導を受ける転写因子は4個であった。このうち原腸胚期に必須の転写因子をコードする遺伝子を同定し、ホモロジー検索の結果に基づきXenopus laevis ATF1(XlATF1)と名付けた。XlATF1の転写活性化部位を欠損したドミナントネガティブ分子は原腸形成を阻害し、中胚葉形成不良を引き起こした。これらの結果は、原腸胚期のNotchシグナルが新規標的遺伝子であるXlATF1を介して中胚葉形成に寄与していることを示唆している。2.Notchシグナルに応答性を示さない新規標的遺伝子の原腸胚期における機能の解析XSu(H)2に応答性を示した21個の新規標的遺伝子のうち、Notch非依存的でXnr2により転写誘導を受ける遺伝子としてXoct25およびXoct91を見いだした。Xoct25のプロモーター解析およびChiPアッセイにより、Xsu(H)2はXoct25のプロモーター上にあるSPS配列に直接結合して転写制御していることが明らかになった。これらの結果は、転写因子XSu(H)2がNotchシグナルとは別の因子と相互作用することにより、原腸胚期のXoct25/91の転写制御に関わり、原腸胚期の細胞の多能性制御に関わることを示唆している。以上の結果は、XSu(H)2はNotchシグナル依存的および非依存的経路を経て、初期原腸胚期の細胞の発生運命を制御するという重要な役割を演じていることを示している。