hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膨大な知識を有するニューラルネットワーク型自然言語処理システムに関する研究

連想層と抑制層を導入した自然言語を扱うニューラルネットワークの提案を行った。これは以下の3つの特長を持つ。まず第一に、同義語辞書、Nグラム類似度を用いた情報の正規化である。これにより、同義語を1つのニューロンで表現することが可能となった。第二に、単語共起頻度データベースを元にした連想層の導入である。この層が加わることにより、学習文に存在しない単語間の連想が可能になった。そして第三に、抑制性ニューロンを有する抑制層の導入である。これにより質問応答への応用の際、質問文と関係が低いニューロンの膜電位を抑えることが可能になった。評価実験により、優れた特性が確認されている。平成25年度における課題は「時系列処理により、思考を扱えるネットワークの基本的な枠組みの構築である。思考は時系列的に扱われるものであり、予定通り時系列信号の扱いに優れたESN (Echo State Networks)というニューラルネットワークを用いた研究を行った。構築したネットワークは、概念ネットワークと時系列ネットワークの2つのネットワークから構成される。概念ネットワークでは、単語を一つのノードとみなし、ノードを4つの層に階層的に保存する。4つの層とは、文層、知識層、深層格層、そして辞書層である。ノード間の結合に値を与えることで単語間の意味的構造、概念を保存することができる。時系列ネットワークはESNに複数のワーキングメモリが導入された構造を持ち、文の語順情報を記憶する。ESNのリザーバ(中間層)には複数の時定数を持つ機構が導入され、時系列信号中の長周期成分、短周期成分それぞれに合わせた学習が効率的に行えるようになっている。さらに、ワーキングメモリの導入により語順情報のみでなく入力文の文法情報をネットワークに保持することができる。さらに構築したネットワークの応用としてファクトイド型質問応答を行った。質問応答では、質問文の単語からWeb検索を行い、得られた文群を用いてネットワークの構築・学習を行う。学習されたネットワークを用いて解答候補を単語列として出力する。後処理を行うことで文としての回答が可能となっている。評価実験により提案ネットワークが100文のテスト文に対して十分な連想機能を持つことが示された。また質問応答の精度はMRR値0.55と従来の人工知能に基づく質問応答システムに接近する結果であった。平成24年度における課題は「言語資源を用いたニューラルネットワーク形式長期記憶部の構築」である。ここでは、複数の膨大な情報量を有する言語データベース(シソーラス)の利用によるニューラルネットワーク長期記憶部の構築が重要な課題である。高度な情報処理には知識の扱いが不可欠であり、知識表現は従来の人工知能でも重要な研究分野として扱われてきた。申請者は、日本語語彙体系を用い関連する単語間にリンクを張ることによりニューラルネットワーク化し、三段論法などの推論を可能としている。本研究では、より高いレベルでの情報処理を可能とするために、実用レベルをめざした膨大数の単語の意味の考慮を行う。具体的には、人工知能においてニューラルネットワークに近い意味ネットワークをさらに発展させた形での表現をめざしている。そのために膨大な情報量を有する言語データベース(シソーラス)として、日本語WordNet、日本語語彙体系、および京都大学格フレームを用いて、これらの統合を行った。その結果、1)日常頻出する固有名詞への対応を行い、概念辞書へWikipediaに登録されている固有名詞を追加することで、扱う事のできる単語量を大幅に増加させた。2)概念と用言の結合に関して、京都大学格フレームのコーパスを基に概念辞書における概念と用言の結合を行った。3)名詞カテゴリと用言の結合に関して、名詞概念と用言の結合を基に、名詞概念を汎化させた名詞カテゴリと用言の結合を行った。4)単語の親密性スコアの付与に関して、概念辞書に新規に追加した単語の中には馴染みが少ない単語について、概念辞書の各単語に親密性スコアを付与することで新規単語の意味のおおまかな推定が可能となった。昨年度構築した概念ネットワークと時系列ネットワークの2つのネットワークから構成されるニューラルネットワークでは、膨大な知識を扱うための知識層がまだ不十分であることが問題点としてあった。そこで今年度は、ニューラルネットワーク型概念ネットワークを自動的に構築する研究を重点的に行った。その結果として、日本語WordNetにおける語(word)と概念(synset)、及びそれらの関係を基に繋がりの強さ(結合荷重)を有する概念ネットワークを構築した。具体的には、語と概念間では日本語WordNetのリンクをそのまま利用し、ニューラルネットワークとするために結合荷重の自動的な付与を行った。概念と概念間に関しては新たに結合荷重を有するリンクを生成した。さらに、コーパスを用いた構築手法と共起辞書を用いた構築手法の2つの手法を考案し、それぞれから得られたネットワークの統合を行った。最終的に構築されたニューラルネットワーク型概念ネットワークにおける概念数は35,126(日本語WordNetでは57,238)、リンク数は142,573(日本語WordNetでは158,058)、単語数は72,305(日本語WordNetでは93,834)であり、日本語WordNetにほぼ匹敵するものとなっている。しかしながら実際にニューラルネットワークとして統合し実験を行ってみると、実世界での応用を考慮すると、これでもまだ不十分であることが判明した。そこで現在、複数の言語資源を統合するというアイデアの着想により、概念数を大幅に増やし、膨大な知識の扱いに耐えられるようなニューラルネットワーク型概念ネットワーク生成の研究を継続して行っている。

本研究は膨大な知識を有し、優れた思考機能を持つニューラルネットワーク型の自然言語処理システムの構築である。従来の自然言語を扱うニューラルネットワークにおいては,以下の3つの問題点があった。まず第一に、同義語を判定する機構が存在しない点である。そのため、同義語が別々のニューロンとして表現されてしまう。第二に、辞書層が日本語語彙体系であるため学習文に存在しない単語間の連想が困難であるという点である。そして第三に、ネットワーク上には興奮性ニューロンしか存在しないという点である。これにより、質問応答への応用の際に質問文と関係が低いニューロンの膜電位が高くなることが起こり得る。そこで本研究では、連想層と抑制層を導入した自然言語を扱うニューラルネットワークの提案を行った。提案ネットワークには以下の特長がある。まず第一に、同義語辞書,Nグラム類似度を用いた情報の正規化である。これにより、同義語を1つのニューロンで表現することが可能となる。第二に、単語共起頻度データベースを元にした連想層の導入である。この層が加わることにより、学習文に存在しない単語間の連想が可能になる。そして第三に、抑制性ニューロンを有する抑制層の導入である。抑制性ニューロンは他のニューロンの膜電位を抑える働きを持つ。これにより質問応答への応用の際、質問文と関係が低いニューロンの膜電位を抑えることが可能になる。評価実験では、提案ニューラルネットワークを用いた質問応答の精度の評価を行った。その結果、MRR(mean reciprocal rank)値0.58がとなった。これは従来の自然言語処理ニューラルネットワークを用いた場合の精度よりも高い値であり、また人工知能に基づく従来の日本語質問応答システムにも大きく接近する結果となった。連想層と抑制層を導入した自然言語を扱うニューラルネットワークの提案を行った。これは以下の3つの特長を持つ。まず第一に、同義語辞書、Nグラム類似度を用いた情報の正規化である。これにより、同義語を1つのニューロンで表現することが可能となった。この層が加わることにより、学習文に存在しない単語間の連想が可能になった。これにより質問応答への応用の際、質問文と関係が低いニューロンの膜電位を抑えることが可能になった。評価実験により、優れた特性が確認されている。特に膨大な知識を扱うための知識層の構築に予想外の時間がかかっている。一度構築したニューラルネットワーク型概念ネットワークでは、実世界での応用を考慮すると、これでもまだ不十分であることが実験により判明した。
情報共有を中心とするイノベーションケイパビリティに関わる実証的国際比較研究

イノベーションケイパビリティの視点から実証的国際比較研究を試みた結果、我が国特有のイノベーション成功のための組織能力醸成の枠組みを提示できる可能性を示した。また、より具体的なイノベーション成功方策を指示するオペレーションズマネジメント方法論構築のため、イノベーションプロセスを明確にする研究を行い、イノベーション成功のプロセスとそれを遂行するために必要となる組織能力醸成の方法論の有り様を提示できた。組織文化、風土、社会環境などの経営環境の特殊性を考えて我が国企業のイノベーションを誘発するには、オペレーションのレベルに近いイノベーション誘発のフレームワークおよび方法論研究が肝要である。本研究は、イノベーションを誘発するオペレーションレベルの方法論提示の枠組みを提供するものと期待されるイノベーションケイパビリティ(以下、IC)の視点に立って、その実証的国際比較研究を行い、我が国企業のICの優位、劣位に関わる特徴を明らかにすること、さらにイノベーションを推進する上で最重要課題である情報共有について、それを中心とする実行可能で具体的なオペレーションレベルの方法論の提示を試みること、そして得られた研究成果を用いて個別企業のイノベーションの誘導を支援する企業診断システムを構築することを目的としている。本年度は、平成18年度施行プリ調査結果の再検討を行い、考えられる新たな仮説を研究代表者、共同研究者が協力して導出した。プリ調査結果を基に、ICの視点から、関係者が分担して複数の企業について徹底したインタビュー調査を行った。またプリ調査結果を海外の専門を同じくする研究協力者に示し、その意見、特色ある国内および海外企業の調査結果を反映させて、国内および海外に対して行う本格的アンケート調査票を研究代表者、共同研究者、研究協力者、大学院博士課程学生が一丸となって作成した。それらについて、本年度は、台湾、フランスに焦点を当て、翻訳し、それら国々の研究協力者に調査を委託した。現行でそれらの調査結果待ちの状態にある。また、より広く国際調査を実施するために、米国に本拠を置き研究代表者も席を置く国際的な製造業研究グループであるGMRG(Global Manufacturing Research Group)のWebサイトに調査項目をアップして、調査協力者を募り、調査を委託する準備を行った。組織文化、風土、社会環境などの経営環境の特殊性を考えて我が国企業のイノベーションを具現化するには、オペレーションのレベルに近いイノベーションの方法論研究が肝要である。本研究は、それらを後押しするものとして期待されるイノベーションケイパビリティ(以下、IC)の視点に立って、その実証的国際比較研究を行い、我が国企業のICの優位、劣位に関わる特徴を明らかにすること、さらにイノベーションを推進する上で最重要課題である情報共有について、それを中心とする実行可能で具体的なオペレーションレベルの方法論を提示すること、そして得られた研究成果を用いて個別企業のイノベーションの誘導を支援する企業診断システムを構築することを目的としている。本年度は、平成19年度に引き続き、特に台湾、中国、フランスなどでの調査研究、国内個別企業の事例調査を実施した。また昨年度の調査結果を学会や実務関係会議で報告した結果、特段の評価を得るとともに、研究を遂行していく上での課題等を明らかにすることができた。また、研究をさらに深め、よりオペレーションのレベルでのイノベーション誘発の方法論構築につながるイノベーションプロセスの研究や科学技術論を用いて包括的イノベーションプロセスを明らかにする研究に踏み込み、新規のイノベーションプロセスモデルやイノベーション研究の新たな視点を提言するとともに、その検証を昨年度行った調査データを用いて行い有益な結果を得ることができ、これら成果を平成21年度において主に国際学会にて報告する。また、この結果を受けて企業がイノベーションを具現化する上での方法論の提言を行った。一つの重要な目的である企業診断システムの構築であるが、先の実務界への紹介から得た評価を受けて、その基本フレームワークを構築することができた。平成21年度においては、それを具体的なシステムとして構築し、公開等に踏み切る予定である。本研究は、イノベーションを誘発するオペレーションズ・マネジメント(以下、OM)の枠組みを提供するものと期待されるイノベーションケイパビリティ(以下、IC)の視点に立ち、その実証的国際比較研究を行い、我が国企業のICの優位、劣位に関わる特徴を明らかにすることを目的とした。さらにイノベーションを推進する上で最重要課題である情報共有について、それを中心とする実行可能で具体的なOMの提示を試みること、そして得られた研究成果を用いて個別企業のイノベーションの誘導を支援する企業診断システムを構築することを目的とした。本年度は、昨年度の研究成果から明らかとなったイノベーションプロセス(以下、IP)を援用するOMを明らかにするとともに、その中でも特に情報共有の方法論について研究を行い、一応の結論を得た。それらから得られた概念、知見をもって、海外研究協力者の支援を得て、我が国企業、フランス、台湾などの複数の代表的企業を選び、インタビュー調査等を行い、その結果を分析し、ICおよびIP、そしてそれを援用するOM、情報共有方策を一応、確定した。並行して、イノベーションマネジメント(以下、IM)のための企業診断システムの基本設計を行った。しかし当初予定していた、サーバー上でそれを運営するためのシステム構築には予算上不可能であることから、予算の模索を今後、行っていくこととした。

但し、設計したIMのための企業診断システムについて、その概念は書籍に、またそのシステムの是非について学会報告を行うべく準備を進めている。また得られた研究成果についてこの分野で先行する海外研究者にレビューして、その評価を仰ぎ、十分な評価を得た。また、本研究の締めくくりとして、IC、IPとそれに関わる調査結果、分析結果、IMのための企業診断システム、その運用方法と実績、イノベーション誘発のためのIT利用およびOM検討とためのフレームワーク、具体的なIT利用方法およびOM方策の事例について、平成22年度末に書籍等にまとめて出版することとした。
Purα-mRNAに含まれる新規RNA結合タンパクの構造と機能

Purα-mRNPに含まれる新規タンパクC9orf10のポリソーム結合領域を解析するため、RNA結合性があると予測されるC端側のグリシンリッチな部分(GFP-GG)とその領域を除いた部分(GFP-delta GG)のGFP融合タンパク質を作製した。これらtruncateをNG108-15細胞内で発現させ、sucrose gradientにより解析したところ、GFP-C9orf10はポリソームの遠心パターンと同様の挙動を示した。一方で、GFP-GGとGFP-delta GGについては、リボソームサブユニットに結合している遠心パターンであった。この結果から、C9orf10は全長がないとポリソームには結合しないことが示唆された。これまでに、C9orf10がpoly(A)mRNAを介してポリソームに結合していることを報告しているが、C9orf10にはC端側のグリシンリッチな部分(Gly-rich)のほかに膜結合モチーフ(TM)が4箇所存在する。そこで、これらの構造が細胞内分布にどのように関係するかを調べた。その結果、C9orf10のN末端側にあるTM1、TM2のみを融合したGFPタンパク質は、シスゴルジ領域に局在し、いくつかのマーカータンパク質と共局在した。また以前に、C端側のグリシンリッチな部分は核に集積することを観察したが、この領域にあるRGG配列あるいはGRG配列のR(リジン)をA(アラニン)に変換したところ、核への集積は抑制された。このことは、核への集積にRが必要であることを示唆している。Purα-mRNPに含まれる新規タンパクC9orf10の構造と機能について解析するため、まずマウス脳における発現を免疫組織染色により解析した。その結果、海馬(錐体細胞層、網状分子層に限局)、大脳皮質のIIIV層の特定の神経細胞や小脳プルキンエ細胞の細胞質に発現していた。脳の他の領域ではほとんど検出されなかった。また、脳の成長過程における発現パターンをWestern blot法により調べた結果、誕生直後から増加し、生後15日目からは大きな変化は見られなかった。また、細胞分画を行ったところ、大きな膜構造体やポリソームが含まれるP100画分に最も濃縮された。そこで、C9orf10がどのような構造体に結合しているかをsucrose gradientにより解析したところ、ポリソームの遠心パターンと同様の挙動を示した。また、EDTAでポリソームをリボソームサブユニットに解離させると、C9orf10はリボソームサブユニットの位置にシフトした。このことから、C9orf10のポリソーム結合性が示唆されたので、このタンパクがmRNAを介してポリソームに結合しているかDOCを用いて解析した結果、C9orf10Oはポリソームから解離した。(ポリソームをDOCで処理すると、ポリソームに結合しているmRNA結合タンパクは解離する。)更に、C9orf10の特異抗体を用いてP100画分を免疫沈澱し、得られたRNAをNorthern blot法により解析した結果、リボソームならびにpoly(A)mRNAが免疫沈澱した。また、免疫沈澱時にEDTAを共存させると、poly(A)mRNAだけが免疫沈澱した。そこで、Oligo(dT)カラムによりpoly(A)mRNAを精製したところ、その中にC9orf10が検出された。
骨・血管連関の解明を目指したＬＤＬコレステロールが骨に及ぼす影響の検討

動脈硬化性疾患と骨粗鬆症が併存することから、骨-血管連関が注目されている。動脈硬化をきたす高LDLコレステロール(LDL-C)血症がこれを介する因子である可能性を考え、LDL-Cの骨への影響について検討した。閉経後女性での検討において、LDL-C高値が骨代謝マーカーや骨密度とは独立した非椎体骨折のリスク因子であることを明らかにした。高LDL-C血症は骨ー血管相関に関与する因子のひとつである可能性が示唆された。臨床研究においては、骨粗鬆症健診受診者のうち本研究に対して同意の得られた閉経後女性を対象に横断検討にて、動脈硬化に関わる脂質異常症と骨代謝の検討を行った。LDLコレステロール(LDL-C)、HDL-C、中性脂肪は、骨代謝マーカー、骨密度のいずれとも相関を認めなかった。LDL-Cは椎体骨折の有無で差を認めなかったが、非椎体骨折では骨折有群で有意に高値を示した。さらにロジスティック回帰分析にて、年齢、BMI、骨吸収マーカー、25位水酸化ビタミンD[25(OH)D]、大腿骨頚部骨密度、脂質治療薬の有無で補正後もLDL-C上昇は有意な非椎体骨折のリスク因子として選択された。この結果を論文に投稿するも、受理されず、機序についてのさらなる検討が必要であると考えられた。そこで、近年、動脈硬化に関与するとされるリン調節因子のFGF23およびKlothoの血中濃度を測定した。LDL-CはFGF23やKlothoと相関を認めなかった。また、LDL-Cと非椎体骨折の関係はこれらで補正後も有意であった。LDL-Cと骨の関係はFGF23やKlothoとは独立したものであることを明らかにした。これらの検討結果をふまえて、現在再投稿中である。基礎実験では10T1/2マウス未分化間葉系細胞を用いて、酸化LDL-Cが骨芽細胞への分化に影響を及ぼすかを検討した。増殖能は細胞数カウント、分化能はアルカリフォスファターゼ(ALP)活性、type I collagenとosteocalcinの発現を検討したが、有意な影響を認めていない。酸化LDL-CはPTHの骨作用を抑制するとの報告もあり、PTH投与下での酸化LDL-Cの作用について検討する予定である。臨床研究においては、閉経後女性211名を対象に横断検討にて、脂質異常症と骨代謝の関係について検討を行った。次に骨折の有無と脂質代謝指標との関係の検討において、LDL-Cは椎体骨折の有無で差を認めなかったが、非椎体骨折では骨折有群で有意に高値を示した。さらにロジスティック回帰分析にて、閉経後年数、身体活動度、心血管イベント歴、骨吸収マーカー、血中Ca、P、Cr、25位水酸化ビタミンD[25(OH)D]、大腿骨頚部骨密度、握力、つぎ足歩行能、脂質治療薬の有無で補正後もLDL-C上昇は有意な非椎体骨折のリスク因子として選択された。この結果をWorld Congress on Osteoporosis - International Osteoporosis Foundationの国際学会において発表し、さらにEndocrineに投稿し、受理された。基礎実験ではMC3T3E1マウス骨芽細胞様細胞、および10T1/2マウス未分化間葉系細胞を用いて、酸化LDL-Cが骨芽細胞への分化に影響を及ぼすかを検討した。増殖能は細胞数カウント、分化能はアルカリフォスファターゼ(ALP)活性、type I collagenとosteocalcinの発現を検討したが、有意な影響を認めなかった。次にマウスstromal ST2細胞、骨髄間質細胞を用いて、これらの細胞の石灰化能におよぼす酸化LDLの影響を検討したが、影響を認めなかった。今回の実験系ではLDL-Cおよび酸化LDL-Cの骨芽細胞様細胞、未分化間葉系細胞、骨髄間質細胞への影響は認めず、LDL-Cの骨におよぼす作用の機序について明らかにすることはできなかった。骨粗鬆症健診を実施し、健診受診者のうち本研究に対して同意の得られた閉経後女性211名を対象に統計学的検討を行った。骨折の有無での検討において、HDL-C、中性脂肪は差を認めなかった。一方、LDL-Cは椎体骨折の有無で差を認めなかったが、非椎体骨折では骨折有群で有意に高値を示した。

さらにロジスティック回帰分析にて、年齢、BMI、骨吸収マーカー、大腿骨頚部骨密度、脂質治療薬の有無で補正後もLDL-C上昇は有意な非椎体骨折のリスク因子として選択された。閉経後女性においてLDL-C高値が骨代謝マーカーや骨密度とは独立した非椎体骨折のリスク因子であることを明らかにした。高LDL-C血症は骨ー血管相関に関与する因子のひとつである可能性が示唆された。さらに、我々はこれまでにビタミンD不足つまり、25位水酸化ビタミンD[25(OH)D]低値が骨粗鬆症性骨折のリスク因子であることを示してきたが、LDL-C高値による骨折リスクは25(OH)Dとは独立したものであることも明らかにした。基礎実験ではMC3T3E1マウス骨芽細胞様細胞を用いて、酸化LDL-Cが骨芽細胞増殖、分化および石灰化に影響を及ぼすかを検討した。増殖能は細胞数カウントとBrdUアッセイ、石灰化はvon Kossa染色、Arizarin Redにて検討を行ったが、有意な影響を認めていない。酸化LDLには様々な種類があるため、種類をかえ、再度検討予定である。臨床検討にてLDL-Cが骨脆弱性に関わることを示しため、今後基礎実験にてその機序の一部を明らかできる可能性を考えている。日本人の閉経後女性ではLDL-C高値が骨密度や骨代謝マーカー、25(OH)Dとは独立した非椎体骨折リスクとなりうることを横断的検討で明らかにした。このことを論文投稿するも受理されず、当初の予定よりは遅れている。LDL-Cが骨折リスクに関わる機序に関わる検討を要すると考え、当初予定していなかったが、FGF23やKlothoの関係について検討を行った。FGF23やKlothoはリン調節因子であるが、動脈硬化に関与することや、FGF23高値が骨折リスク因子であることが報告されている。LDL-Cによる骨脆弱性の機序にこれらは関与しないことを明らかにした。また、LDL-CとFGF-23、Klothoは相関を認めなかったが、HDL-CはKlothoと有意な正相関を認めることが明らかとなった。骨-血管連関の解明にあたり、FGF-23やKlothoも加えた検討ができたことは当初の予定以上の結果が得られていると考えている。基礎研究では、LDL-Cが酸化し、酸化LDL-Cとなることで、骨芽細胞の増殖、分化、石灰化、あるいは未分化間葉系細胞から骨芽細胞への分化に影響をおよぼす可能性を考えたが、影響を認めなかった。いずれもnegative findingであり、関与があった場合には情報伝達系の検討に進む予定であったが、そこに至っていない。臨床検討で、LDL-Cが非椎体骨折のリスク因子であるとの結果であり、皮質骨の脆弱化に関与する可能性が考えられる。皮質骨に影響をおよぼすのはPTHであり、骨芽細胞におけるPTH作用に対して酸化LDL-Cが影響をおよぼす可能性を考え、検討を進める予定である。臨床検討において、日本人の閉経後女性ではLDL-C高値が非椎体骨折リスクとなりうることを横断的検討で初めて明らかにした。さらに、LDL-C高値は骨密度や骨代謝マーカーのみならず、25(OH)Dとは独立した危険因子であることを世界に先駆け明らかにすることができた。LDL-C高値はこれまでに骨粗鬆症のリスク因子であるとされるものとは全く異なるリスク因子であり、かつ臨床上容易に測定できる検査法であるため、今後の骨粗鬆症診療に有用な臨床指標確立につながる成果であると考えている。
シスチン尿症を発症するAMSH-LPノックアウトマウスの解析

我々は、AMSH-LPの生体内における作用を解析するために、AMSH-LPコンディショナルノックアウトマウスを作成した。全身でノックアウトを誘導したところ、意外なことに生後1年ほど経過したノックアウトマウスが水腎症を発生することを見いだした。。解剖の結果、水腎症マウスはいずれも尿路結石を伴っており、結石成分分析の結果シスチンが95 %以上であった。尿中アミノ酸を定量したところ、cystine, ornithine, lysine, arginineの濃度が明瞭に上昇しており、ヒトにおけるシスチン尿症に一致する表現型であることが判明した。全身マウスのCT画像所見では、意外なことに生後1年ほど経過したノックアウトマウスが水腎症を発生することを見いだした。本研究は、シスチン発症がマウス生後約1年たたないと引き起こされないため、多数のノックアウトマウスの長期維持が必要となる。しかし、東日本大震災により動物センターの電源・管理が中断され、多くのマウスを犠死せざるを得なかった。現在ふたたびマウスの交配を進めている。また、in vitroでAMSH-LPがシスチンのトランスポーターであることを証明するために、発現ベクターの準備を進めている。さらに、シスチン尿症患者におけるAMSH-LPの遺伝子変異を検索し、シスチン尿症を引き起こす新規責任遺伝子であることを証明するために、患者検体の収集を準備中である。。シスチン尿症は、常染色体劣性遺伝であり、腎尿細管におけるシスチンの再吸収異常により尿中のシスチン濃度が上昇し、尿中排泄が増加する結果、尿路内にシスチン結石の形成を来す。シスチン尿症は、二塩基性アミノ酸輸送システムの先天的な欠損による疾患である。近年、塩基性アミノ酸輸送担体遺伝子(rBAT/SLC3A1)の異常がシスチン尿症の原因であることが報告された。また、rBATとヘテロ二量体を形成しするB(0,+)AT/ SLC7A9も原因遺伝子として同定されている。我々のグループは以前に、脱ユビキチン化酵素であるAMSH-LPを単離した。その後、AMSH-LPはLys63のユビキチン鎖を切断することがin vitroで判明したが、何をターゲットとして脱ユビキチン化を行うのか、どの臓器で主要な役割を果たすのか等、生体内での機能は全く不明のままであった。全身マウスのCT画像所見でノックアウトを誘導したところ、意外なことに生後1年ほど経過したノックアウトマウスが水腎症を発生することを見いだした。解剖の結果、水腎症マウスはいずれも尿路結石を伴っており、結石成分分析の結果シスチンが95%以上であった。東日本大震災により、マウス実験棟も大きな被害をうけ、再交配せざるをえなくなったため。AMSH-LPがアミノ酸トランスボーターの輸送を制御するという仮説をノックアウトマウスおよび細胞株を用いて検証する。さらに、シスチン尿症患者におけるAMSH-LPの遺伝子変異を検索し、シスチン尿症を引き起こす新規責任遺伝子であることを証明する。細胞培養と遺伝子導入、ノックアウトマウスの解析を中心として分子生物学的、病理学的手法を駆使するので、研究費の大半を薬品、細胞培養用器具、マウスなどの消耗品として使用する。
魚類における蛋白質経口投与法に関する研究

1.前年度の予備的実験に引き続き、キンギョに対する抗サケGtHウサギ血清投与実験を行ない、血中抗サケGtH抗体活性の時間経過を検討した。抗サケGtH血清(100%または1%)は0.2ml/100gBW投与した。血中抗体活性は^<125>I標識したサケGtH、抗ウサギ1gGヤギ血清を続けて試料に添加し、遠心後沈澱の放射活性を測定して行い、結果は段階希釈した投与血清を標準にして、その希釈率(%)で表わした。100%血清投与キンギョ血漿中の活性は612時間後に約1.3%に達し、投与量の20%以上が血中移行したことが示された。1%血清投与では血中活性がほぼ1/100で、変化のパターンは酷似していることから血中移行は過剰の蛋白に対する一時的な備蓄ではないと考えられる。投与後の血漿を電気泳動、抗ウサギ1gGヤギ1gGを用いたイムノブロッティング法で分析したところ、血中移行1gGと元のウサギ血清1gGとで泳動像に差がなく、血中移行に伴う分子変化は極めて小さい。2.ニジマスに対し鶏卵免疫グロブリン(1gY)の血中移行についてアガロースゲル化などの促進効果を調べた。1gYの測定はアルカリフォスファターゼ標識抗1gYウサギ1gGを用いた酵素免疫測定法によった。卵黄の水溶性蛋白画分を低融点アガロースでゲル化して投与したところ、個体によっては明らかな血中移行があり促進効果が見られたが、結果は一定せず今後の検討課題となった。海水浸漬、食塩添加は効果がなかった。3.消化器系の発達が未熟なシラスウナギに対し1gYの経口投与を試みた。餌付け前の魚に胃内投与するとかなり急速な血中移行が見られるが、餌付け1ケ月の魚では移行はほとんど見られず、2ケ月では全く認められなかった。現在消化管の発達と、血中移行能の変化、特に移行能消失過程との関係について継続調査中である。1.成熟したキンギョにサケ脳下垂体抽出液を経口的に消化管内に投与し,経時的に採血し血中サケ生殖腺刺激ホルモン(GtH)量,テストステロン量をラジオイムノアッセイで測定し,さらに精液量の変化を調べた.投与後サケGtH量の急速な増加が見られ,それに伴ないテストステロン量,精液産生量の増加が認められたが,キンギョGtHの増加はなかった.このことからキンギョでは経口投与したGtHが活性を保ったまま血中に移行することが明らかとなった2.1.と同様雌キンギョに対するサケ下垂体投与では排卵誘発が認められ,経口法によるホルモン処理が可能なことが明らかとなった.3.キンギョと異なり有胃で動物食であるカレイに対して同様の実験を試みたが, GtHの血中移行,成熟促進効果は全く認められなかった.4.キンギョに抗サケGtHウサギ血清を投与したところ,血漿中に抗サケGtH活性が認められ,ウサギIgG活性の血中移行も明らかとなった.これにより血清療法への応用が期待される.5.ニジマスに対して4と同様の実験を行なったが,血中への移行は全く認められず,有胃魚への経口法の適用には工夫が必要である.6.蛋白吸収機構解明のため,投与後消化管組織標本に対する免疫組織化学的染色(PAP法)を試みた. 1つのキンギョでは消化管全域で上皮細胞内に投与した蛋白が証明された. 5.のニジマスにおいても,後部腸上皮細胞内に蛋白が認められた.7.投与法改善の試みとして, 1.のキンギョで蛋白をポリアクリル酸ゲル化による投与を行なったが吸収促進効果はなかった.またカレイに対しても無効であった.現在マイクロカプセル化したウサギIgG投与を検討中で,キンギョにおける血中移行は確認された.1.前年度の予備的実験に引き続き、キンギョに対する抗サケGtHウサギ血清投与実験を行ない、血中抗サケGtH抗体活性の時間経過を検討した。

卵黄の水溶性蛋白画分を低融点アガロースでゲル化して投与したところ、個体によっては明らかな血中移行があり促進効果が見られたが、結果は一定せず今後の検討課題となった。海水浸漬、食塩添加は効果がなかった。3.消化器系の発達が未熟なシラスウナギに対し1gYの経口投与を試みた。餌付け前の魚に胃内投与するとかなり急速な血中移行が見られるが、餌付け1ケ月の魚では移行はほとんど見られず、2ケ月では全く認められなかった。現在消化管の発達と、血中移行能の変化、特に移行能消失過程との関係について継続調査中である。
ピロリ菌と胃炎起因菌の共存が胃癌細胞の増殖に与える影響

ピロリ菌は胃潰瘍や胃癌の原因菌であるため、多くの研究者によって炎症機序などが精力的に調べられているが、その多くはピロリ菌と宿主細胞のみが存在するとの条件下で行われている。しかし実際の胃内では、ピロリ菌以外のウレアーゼ産生菌が胃炎起因菌として共存しており、これらが慢性胃炎等に関与していることが報告されている。そこで、本研究ではピロリ菌の毒性因子は胃内共存菌が存在することで減弱されるのか、または増強されるのかという点に注目した。先行研究により、ピロリ菌が宿主のTLR4を刺激し、胃癌細胞の増殖を促すと共に細胞性免疫を活性化させないことが明らかとなっている。本研究では、まず胃内起炎菌のひとつであるProteus mirabilis(プロテウスミラビリス菌)と共存した時に癌細胞を増殖させるのか、また宿主癌細胞のシグナリングの上流であるTLR4と、更に鞭毛にあるフラジェリンタンパクの受容体で病原菌細菌の侵入を感知する重要なセンサーであるTLR5への刺激が増強されるのか、といった点について検討した。ピロリ菌とプロテウス菌の生長速度の違いもあり、2菌共存下における癌細胞の増殖はうまく結果を得られなかったが、ピロリ菌単独感染で胃癌細胞の増殖を確認した。この条件下では、ピロリ菌単独感染でTLR4のmRNA発現は、刺激なしの群と比較して高い傾向を示し、プロテウス菌共存下では更に高くなる傾向がみられた。一方、TLR5のmRNA発現は、ピロリ菌単独感染ではTLR4のように発現が高くなかったが、プロテウス菌と共存することにより高くなる傾向を示した。ピロリ菌は、他の胃炎起炎菌と共存するとTLR4およびTLR5への宿主細胞への刺激が高まる傾向があることが示唆された。ピロリ菌(Helicobacter pylori)は、萎縮性胃炎や胃癌の原因菌とされているが、胃は、胃酸のために強酸性(pH2前後)で、細菌であっても生育するには容易な条件ではない。ピロリ菌は、ウレアーゼ分泌によりウレアを加水分解し、産生したアンモニアで局所的に胃液を中和する事で強酸性条件下を緩和している。しかし、実際のヒトの胃内にはピロリ菌以外にもウレアーゼ産生菌が存在する。これらが胃炎発症に関与しているという報告もあり、またアンモニアは、ピロリ菌の走化性因子でもある。ピロリ菌以外のウレアーゼ産生菌との共存によって、ピロリ菌の胃癌への病原性も憎悪することが予想される。そこで、本研究では、複数細菌との相互関係を考慮した上でピロリ菌の胃癌細胞への影響を検討した。胃癌細胞へ共感染させる細菌として、まずウレアーゼ産生菌で胃炎起因菌の1つであるプロテウス・ミラビリス菌(Proteus mirabillis)を用いた。胃癌細胞は、AGS細胞(6x10^5 cells/plate)を用い、細菌は液体培地で感染前日に前培養を行ったものを使用した。ピロリ菌感染(8x10^6 cells/plate)、プロテウス菌感染(3x10^7 cfu/plate)、2菌による共感染(ピロリ4x10^6 cells/plate,1.5x 10^7 cfu/plate)をさせ(2時間)、感染後のTLR4およびTLR5へのmRNA発現量を定量PCRで測定した。相対定量の結果、感染なしに比較し、ピロリ菌感染、プロテウス菌感染では、TLR4,TLR5それぞれ、発現量が増加したが、2菌感染で最も発現量が増加した。ピロリ菌は、ピロリ菌以外の胃炎起因菌と共存するとき、宿主にピロリ菌単独よりもvirulence factorが増強する可能性があることが示唆されたが、今後更に検討が必要である。

ピロリ菌は、他の胃炎起炎菌と共存するとTLR4およびTLR5への宿主細胞への刺激が高まる傾向があることが示唆された。平成23年度の研究実績は以下のとおりである。1)ピロリ菌と胸像した場合に胃がん細胞の増殖を促す細菌のスクリーニングについて。ピロリ菌は、東京大学大学院医学系研究科畠山教授にNCTC11637株、胃がん関連タンパク質cagA欠損株を譲渡していただいた。urease-positive bacteriaで、胃炎起因菌のひとつであるProteus mirabilis(P. mirabilis)は理研バイオリソースセンターよりJCM 1169株を取り寄せた。胃がん細胞はMKN45を使用し、CO2 5%、37°C条件下で培養したものを5 x 100,000 cells/wellとなるように96 well plateに播種した。ピロリ菌を含む3種の細菌は、アネロパック微好気システムを用いてBurucellabrothに10%FBSを加えたものを用いて培養し、試験には生理食塩水でA600 0.01に調整したものを10マクロL/well接種し、40時間後の胃がん細胞増殖をcell proliferation assay systemで測定した。CagA欠損株では、胃がん細胞増殖を促進しなかった。一方、NCTC11637株は、この試験系で細菌自体が生育することができず死滅してしまい、胃がん細胞増殖に関する検討が十分にできなかった。P.mirabilisでは、この試験系で増殖することが可能であったが、細菌が増殖しすぎてwell内環境が劇的に変化(pHの低下)してしまい、胃がん細胞の生育条件としては不適となり死滅してしまい、胃がん細胞増殖因子となるか否かの検討についての正確なデータは得られなかった。本試験により、cagA欠損株ではピロリ菌であっても胃がん細胞MKN45の細胞増殖を促進することはないが、そのほかの菌の影響についてはさらなる検討が必要である。平成23年度の試験は、胃がん細胞の増殖を促進する胃内環境に生育する細菌のスクリーニングとして、ピロリ菌とcagA欠損株、P.mirabilisを胃がん細胞MKN45を用いて検討した。しかしながら、胃がん細胞の最適培養条件と、ピロリ菌および、P.mirabilisの培養最適条件が異なるため、条件を変えていくつか検討したが、最適条件を見出すことができなかったため、進まなかった。本研究において、胃がん細胞増殖を促進する細菌のスクリーニングは重要であるため、今後改善策を検討し、進める必要がある。平成23年度は、胃がん細胞の培養条件と、扱う細菌の培養条件が異なるために、目的とする胃が細胞増殖を促す細菌の最適条件が見いだせなかったために、研究計画に遅れが生じた。今後は、これを解消するために、最適化の条件を引き続き試すとともに、胃がん細胞の種類を変えたりすることも考慮にいれる必要があるかもしれない。また、生体内胃内環境を試験管レベルで再現することが難しく、上記検討に打開策が見つけられない場合は、本研究目的の抜本的な改変を必要とするかもしれないが、マウスを使ったin vivoでの研究展開も視野にいれることも必要となるかもしれない。平成24年度の研究費の使用計画は以下の通りである。1.胃がん細胞増殖を促す細菌のスクリーニングにおいて、培養細胞の培地とそれに必要な試薬、使い捨てシャーレやピペットなどのウエア。細菌を培養するためのアネロパック微好気パックなどの購入。2.Toll様受容体の発現検討のための抗体購入(TLR4, TLR5, TLR9)とフローサイトメトリーを運用するための試薬や緩衝液の購入。
MEMSと透過型電子顕微鏡その場観察によるナノ構造の物性評価

本年度は,昨年度までに完成させたTEM内においてナノスケール単結晶シリコン構造の変形・破壊挙動観察する試験デバイスに,2点の改良を加えた.一つ目は作製した試験デバイスにおいて生じた,実際のドライエッチングによるシリコン加工において,マスクの開口幅の違いに対してエッチング速度が変化するマイクロローディングにより設計通りの構造とならない問題を解決するため,形状の変更である.二つ目は力を計測する機能としてピエゾ抵抗素子を試験片の両側に配置し,またその計測精度を向上させるため試験デバイス構造の再設計である.まず一つ目の形状変更により,試験デバイスの歩留まりが昨年度の20%程度から80%程度へと大幅に向上した.一方で観察用デバイスでは2マスクプロセスであったものが,ピエゾ抵抗素子を付加することにより5マスクプロセスとなったため,力計測用のデバイス作製の歩留まりは非常に悪くなり,数個程度を完成させるに留まった.変形・破壊観察用のピエゾ抵抗素子のない試験デバイスを用いて,引張試験を実施した.シリコン試験片の厚さを薄くするため,TMAH水溶液でエッチングを行っている.このとき試験材料の幅方向({110}面)のエッチングを防ぐためにTroton-X100を添加した.TEM内で引張試験の様子を観察したところ,側面から侵入したき裂が成長を停止する様子が観察された.したがって引張変形の過程においてき裂進展方向の前方に転位が発生し,発生した転位が及ぼすき裂先端の力がき裂の成長を妨害したものと考えている.今後はこの現象の再現実験を行うこと,さらに力計測による数値的な評価を加えていくことを研究目標としている.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,単結晶シリコンのナノ薄膜・ナノワイヤに引張荷重を与えたときの変形・破壊挙動を透過電子顕微鏡(TEM)内で実観察するためのデバイスを開発した.まず1軸駆動のTEMホルダを本研究用に改良し,TEMホルダ内にピエゾアクチュエータを導入して,200V程度の電圧印加で100ミクロン程度の移動を可能にする駆動系へと発展させた.これでシリコンデバイスへのTEM内での荷重負荷が可能となった.また,高分解能観察時において引張荷重を徐々に負荷していったとき,観察位置が移動しないようにする構造を実現するために,まずは解析を用いて,一点に荷重を1軸方向に与えることで両側引張状態とし,さらに試験片中央がXY軸ともに移動しない構造を設計した.また,マイクロマシニング技術を利用してシリコンチップを微細加工することで,設計したデバイスの製作を行った.製作したデバイスの動作確認を,まずは走査型電子顕微鏡(SEM)内で行った.TEMホルダの駆動系とデバイスをSEM内に導入し,実際に電圧を印加して試験片が引張状態により破断に至ることを確認した.一方で両側引張は問題なく確認できたが,試験片の幅方向に移動してしまうことも明らかとなったため,シリコンの加工条件,とくにドライエッチングの条件を最適化し,製作したデバイスがより設計したものに近くなるようにした.引張試験用の実験以外では,荷重計測用の構造をより精度よく設計するために,単結晶シリコンおよび多結晶シリコンのピエゾ抵抗効果のテンソル解析理論を新たに考案し,簡易実験によりその理論がほぼ実際のピエゾ抵抗素子からの結果と一致することを確認した.実際には平成28年度の研究計画は下記の通り順調に進行していた.TEM内引張試験を実施するために必要なTEMホルダを改良した.実際には保有するTEMホルダに内蔵するピエゾアクチュエータ2つに増やし,直列に並べることで200V程度の電圧印加で50ミクロン程度,TEMホルダ先端のエンドエフェクタが移動するようにした.一方で,荷重点に最大50ミクロンの変位が与えられることで,単結晶シリコンが両側引張となるようにする構造を設計することにした.設計のポイントは,1軸方向の力を反対向きの2つの力に変換すること,それにより両側に引っ張られたとき試験片が長軸方向だけでなく幅方向にも変位しないようにすることの2点である.簡易モデル構造から,有限要素解析を利用して各部位の寸法を決定し,最終的に上記2点を満たす最適な構造を設計した.設計した構造を実現するためにマイクロマシニング技術を利用した微細加工によりシリコンデバイスチップを完成させた.またTEM観察を可能とするために試験片の厚さを200 nm以下にする必要があったため,化学機械研磨(CMP)とアルカリ溶液エッチングの併用を試験片部分を薄化する手法とした.実際に実現したデバイスはSEM内での予備試験を行い,シリコンエッチング等に課題があることを確認した.これまでのTEMホルダ改良や試験デバイスの開発は,名古屋大学の共用施設であるTEM(H800,日立ハイテク)で実験を行うことを前提に進めてきたが,平成29年度より共用TEMが変更(JEM-2100,日本電子)に変更することが3月に明らかとなった.したがって平成29年度の初期に改めてTEMホルダの製作や開発したデバイスをそのまま利用できるか等の確認が必要となる.

このため,研究に若干の遅れを来している.本研究では,代表寸法が10 nmから1 umの単結晶シリコンナノ構造体を対象としてナノ構造の変形・破壊挙動を評価できる実験方法を開発し,開発した手法を用いてナノ構造の変形・破壊挙動を明らかにするとともに,ナノ構造の変形が単結晶シリコンの電気物性に及ぼす影響も調べることにより,MEMS部品としての強度や実用性を阻害するメカニズムを解明することを目的としている.本年度はまず使用する透過型電子顕微鏡(TEM)が日立ハイテク製(H800)から日本電子製(JEM-2100)へ変更することになったため,改めてTEM観察用の1軸駆動試験装置を製作した.試験装置製作時と同時に,厚さ80150 nmのシリコン薄膜に対して集束イオンビーム(FIB)を用いて切欠きを導入した試験片を用いて大気環境下での試験を実施し,膜厚や試験温度が破壊挙動に及ぼす影響を調べた.その結果,常温では膜厚による変化を観測することはできなかったが,450°Cに加熱した際に,厚さ90nmの薄膜はそれより厚い薄膜より,先端半径の小さい切欠きに対する破壊の耐性が増加する様子を観察することができた.またTEM内で荷重を測定する機構として,シリコンデバイス上にひずみゲージを設けることとし,さらに,ドライエッチングにより設計形状と異なる最終形状になってしまう点についても設計形状を修正することで対応することができた.一方でシリコンのピエゾ抵抗効果は,本研究において(1)荷重を測定する要素,(2)ナノ構造の変形による影響を調査する対象として重要である.そこで単結晶シリコンのピエゾ抵抗とその方位依存性について明確に解析できるようにするために,テンソル表記したピエゾ抵抗効果の式について結晶方位に依存しない項と結晶方位に依存する項に分解できることを示し,また結晶軸から特定の角度のピエゾ抵抗について数式で明確に表した.平成29年度の当初の研究計画では(1)ナノ構造の引張試験の実施,(2)ナノ構造の電気物性評価を行うこととしていた.ただし平成28年度末に生じた,実験に用いる共用施設のTEM装置の変更を受けて,TEM内試験用の1軸駆動ホルダや試験デバイスの再製作が必要となった.試験用TEMホルダの製作では,もともと駆動変位が10umと不十分であったため,再製作にあたって駆動量を倍程度に増加させる改良を加えながら製作を進めた.製作したホルダはSEM内でのその場観察などを用いて駆動量の確認を行った.また試験デバイスに関しては,新しいホルダに適用するように寸法を変更するだけでなく,前年度に問題となった設計値と製作後の寸法誤差を小さくするために,リンク機構に相当する構造の形状変更を行った.さらに本申請課題の当初の目的である荷重測定のために,ピエゾ抵抗素子を有する構造としたため,改めてFEMを用いる最適設計を実施してデバイスの開発・製作を行った.また当初計画予定の(1)ナノ構造の引張試験の実施に関しては,一旦大気圧環境下での試験を行うこととした.シリコン薄膜にFIBを用いて先端半径の異なる2種類の切欠きを導入した試験片を作製し,引張試験を行ったときの破壊の様子について観察を行った.膜厚を変化させると同時に,大気圧環境下では加熱も可能であるため,450°Cまでの温度環境下で試験を実施し,90nm以下の試験片で先端半径の大きな切欠きから破壊が生じるという,通常とは異なる破壊の様子を観測することができた.さらに(2)ナノ構造の電気物性評価では,単結晶シリコンのピエゾ抵抗の寸法依存性について評価するための試験片製作を行った.
動体追尾強度変調照射に対応した高精度四次元線量計算システムの開発

呼吸性移動のある領域に対して選択的に線量集中可能な動体追尾強度変調照射に対応した四次元線量計算システムの開発を行った。開発したシステムを用いて膵臓がんに対して四次元線量を算出した。従来法の照射と比較し、ターゲットへの線量を担保したまま、危険臓器である胃への平均線量を40%、十二指腸への平均線量を20%低減することを定量的に評価した。正常組織への線量を抑制し、腫瘍への高線量を確保する強度変調照射法は理想的な線量を投与可能であるが、呼吸性移動が大きな肺や腹部ではその限りではない。この欠点を補うため、腫瘍を動体追尾し強度変調照射を行う「動体追尾強度変調照射法」に対応した放射線治療装置が申請者の所属する研究室と三菱重工株式会社との共同研究により開発された。本研究ではモンテカルロ法を用いた「動体追尾強度変調照射法」に対応した高精度四次元線量計算システムの開発を行う。平成25年度はこれまでに構築した、(a)強度変調照射に対応した高精度四次元線量計算システム、および、(b)動体追尾照射法に対応した高精度四次元線量計算システム、この二つの機能を組合せ動体追尾強度変調照射に対応したシステムを構築した。(a)における可動コリメータ位置、および、(b)における腫瘍移動量をもとにビーム照射方向を追尾させた位置、この二つの情報に対して時間軸を統一しシミュレーション上で同期させる。これにより動体追尾強度変調照射法を再現した。さらに、動体ファントムを用いて動体追尾強度変調照射を行い、フィルム測定にて特定の断面の線量を取得し、構築した動体追尾強度変調照射モデルと実測との比較検討を行った。その後、同条件にてシミュレーションを行い2.5%以内の精度で一致するモデルを構築した。モデル精度を向上させるため、シミュレーションにおける同期条件を適時調整しモデルの最適化を行った。前年度において構築した線量計算システムを用いて、床症例への適応を行った。実際に動体追尾強度変調照射を行った、膵臓がんに対して四次元線量を算出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。医学物理学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は申請書に記載した研究計画通り、(a)強度変調照射に対応した高精度四次元線量計算システム、および、(b)動体追尾照射法に対応した高精度四次元線量計算システム、この二つの機能を組合せ動体追尾強度変調照射に対応したシステムを構築した。また、構築したシステムの精度検証を行い、臨床使用において十分な精度を担保していることを実証した。そのため、現在の進捗状況は概ね順調に進展していると評価できる。平成26年度は構築したシステムを用いて「動体追尾強度変調照射法」における四次元線量計算手法の確立を行う。まずはじめに、4DCTより各位相における腫瘍位置を算出し、腫瘍移動量に対応したビーム入射条件、および強度変調パターンの線源データを作成する。次に、各位相のCTを基準位相に非剛体レジストレーションを用い合わせこみ、基準位相へのベクトルマップを作成する。最後に、各位相に対して作成した線源データを用い、患者体内線量計算を行う。その後、作成したベクトルマップをもとに基準位相へ線量を合算し四次元線量分布を算出する。線量合算に用いる位相数の違いによる線量計算結果を検証し、「動体追尾強度変調照射法」における四次元線量計算に最適な位相数を決定する。