hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たな環境標準生物の探索に関する調査研究

福島第一原発からの放射能漏れによる環境影響を科学的に評価することは、生態系の頂点に位置する人類の放射線防護という観点から極めて重要である。わが国では環境標準生物としてメダカが用いられてきたが、今回の事故を契機に改めてメダカの生息数の減少が確認され、新たな環境標準生物の探索が喫緊の課題となった。そこでわれわれは福島県内に生息する水生生物について調査を実施し、コイが次世代の環境標準生物として最も有望である可能性が示唆された。平成25年度は、初年度に実施した予備実験のデータを基盤に、とくにコイ細胞において、6-チオグアニン耐性変異形質の獲得を利用したコロニーアッセイシステムを確立することに成功した(原著論文作成中)。コイは世界的にも生息範囲が広く、相当に劣悪な環境下でも生息可能であり、また寿命の長さは人間と同様であり、捕獲も比較的容易であることから、新たな環境標準生物としての有用性が期待されている。さらに、モツゴ細胞についても初代細胞培養に成功し、本研究室において初代細胞培養が可能となった淡水魚種は、昨年度に成功したフナ、タナゴ、ドジョウとあわせて5種類となった。また、同時並行的に淡水生性節足動物(ザリガニ、テナガエビ、スジエビ)を捕獲することに成功し、これらの初代細胞培養を試みたが、こちらの実験はまったく成功しなかった。昆虫細胞用培地により培養可能な節足動物細胞はきわめて限定的である可能性が示唆された。また、エアレーションを用いない淡水魚の飼育方法については、昨年度に引き続き良好に推移していると思われる。しかしながら、飼育水の交換ナシでの飼育が長期にわたり始めており、飼育水中のミネラルバランスの調整が課題となってきている。ミネラルバランスの調整に関しては、平成26年度に類似のシステムを利用している養魚施設の現地訪問調査を実施する予定である。福島県いわき市内において試料の採集を実施し、コイ、フナ、タナゴ、ヨシノボリ、ドジョウ、カダヤシ、ブラックバス、ブルーギル等の個体を捕集した。外来生物法により生体の移動や飼育が禁止されているカダヤシ、ブラックバス、ブルーギルについては、採取現場において頸椎を切断し、死亡を確認したうえで氷水中に浸漬し、研究室に持ち帰り、初代細胞培養に供した。その他の魚種については、生息水域ごとに現地の水を用いて、堅牢なビニル袋に酸素封入して研究室に持ち帰り、飼育ならびに初代細胞培養に供した。節足動物については生体の捕獲に成功しなかった。初代細胞培養は、コイ、フナ、タナゴ、ドジョウについては成功したが、ヨシノボリ、カダヤシ、ブラックバス、ブルーギルについては成功しなかった。また、われわれはエアレーションと水循環を組み合わせる従来法による魚の飼育方法を改良し、水草の繁茂による水質浄化と酸素供給を目指す新たな飼育方法を確立しようとしている。コイヘルペス等のウイルス汚染が懸念される自然環境から採取した淡水魚を同一施設内において飼育する際には、エアレーションや水循環によるエアロゾルの発生を抑え、ウイルス伝播の可能性がより低い半閉鎖系として個別に飼育する必要があると考えるからである。そこで、より自然環境に近い環境における淡水魚の繁殖に先進的な英国の養魚施設を訪問調査することにより、飼育環境や魚種に応じて水草の種類を適宜変更する等の様々なノウハウを習得することができた。東日本大震災に起因する福島第一原発からの放射能漏れによる人的な影響に加えて、自然環境への影響も同様に懸念されている。野生環境において生息するさまざまな生物に対する放射線影響を把握することは、生態系の頂点に位置する人類の放射線防護という観点から、きわめて重要な課題である。しかしながら、わが国においてこれまで環境標準生物として用いられてきたメダカは環境の変化に適応できずに絶滅危惧種となり、新たな環境標準生物を設定する必要がある。本研究ではわれわれは現在の福島県内に生息する淡水魚の環境標準生物としての適性を調べた。その結果、コイは生育環境が広く、さまざまな環境によく適応できており、また初代培養細胞を用いたコロニーアッセイ法を実施できることなどが明らかになり、次世代の環境標準生物としてきわめて有望であることが示唆された。東日本大震災に起因する福島第一原発からの放射能漏れによるヒトへの健康影響に加えて、事前環境に対する影響も同様に懸念されている。生態系の頂点に位置するといわれる人類に対する放射線防護の観点から、野生動物に対する放射線の影響を把握することは非常に重要である。わが国では、水生生物の環境標準としてメダカが用いられてきたが、昨今の環境の変化により現在では絶滅危惧種となっており、新たな環境標準生物を対策する必要性に迫られていた。そこで、我々は本研究計画において、福島県内に生息する水生生物について調査を実施し、コイが次世代の環境標準生物として最も有望である可能性を見出した。われわれの開発した評価方法は、コイのヒレの一部を用いて細胞を初代培養し、従来から環境影響の評価に用いられてきたコロニーアッセイ法により、放射線や化学物質による影響を評価しようとするものである。コイは水質の汚染に強く、様々な環境に適応して生育するだけでなく、その寿命も50年以上と人類に匹敵する長さである。われわれの開発した方法では、試料を採取する個体を殺傷する必要がないため、同一の個体を経時的に追跡して反復的に解析することも可能であり、環境影響の蓄積を評価する目的にも利用できる可能性がある。コイ以外の水生生物では、フナ、モツゴ、ドジョウなどの日本に固有の淡水魚においても同様に有望な結果を得ている。

一方、外来種であるオオクチバスやカダヤシ、ブルーギルなどについては、ヒレ細胞の初代培養は全く成功しなかった。これら外来種に由来するヒレ細胞を培養できなかった理由については現時点では不明である。福島第一原発からの放射能漏れによる環境影響を科学的に評価することは、生態系の頂点に位置する人類の放射線防護という観点から極めて重要である。わが国では環境標準生物としてメダカが用いられてきたが、今回の事故を契機に改めてメダカの生息数の減少が確認され、新たな環境標準生物の探索が喫緊の課題となった。そこでわれわれは福島県内に生息する水生生物について調査を実施し、コイが次世代の環境標準生物として最も有望である可能性が示唆された。新たな環境標準生物を探索する本研究の実施により、コイが次世代の環境標準生物として極めて有望であることを実験科学的に示すことができたので、本研究計画の達成度はほぼ100パーセントであったということができる。しかしながら、本研究を実施した中で発生してきた様々な疑問点については、たとえばコイ個体から採取した初代培養細胞の突然変異率の多様性の幅の程度などについては、主に経費的な制約のために、十分に検討を重ねることができなかったため、計画以上に進展したとはいえないと考えた。放射線生物学今後は、福島第一原発から漏出した放射性物質により高度に汚染された地域を含むいろいろな地域で採取したコイ個体に由来する細胞を用いて、コロニーアッセイ法による生物影響の有無やコロニーアッセイ法を用いた解析より得られる結果の多様性の程度について解析研究を実施していきたいと考えている。淡水魚の捕獲や初代細胞培養方法の確立に関しては、当初の計画以上に進展し、コイ細胞を用いたコロニーアッセイ法を確立することができた。さらに、新たにモツゴの初代細胞培養にも成功した。さらに、平成25年度には複数種類の節足動物(ザリガニ、テナガエビ、スジエビ)の捕獲にも成功した。しかしながら、これら節足動物の細胞培養には成功しなかったため、平均点として「おおむね順調に進展している」と判断した。淡水魚の捕獲や、新たな飼育方法の開発、さらには初代細胞培養方法の開発においては、当初の計画以上に進展しているが、節足動物の捕獲に成功しなかったため、節足動物については飼育も細胞培養も試みていない現状であるため、平均点として「おおむね順調に進展している」とした。最終年度の終わりの3か月に業務補助をお願いしていた者が体調を崩し、前後して研究代表者はISO国際会議TC94/SC13の日本代表に推挙され、本時期に実施予定であった科研費研究成果の取りまとめ業務を3か月間先送りせざるを得なかったため。コイ細胞を用いたコロニーアッセイ法はほぼ確立したと言えるが、実験1サイクルが数か月にわたるため、実験室環境や初代細胞培養技術の習熟度によっては雑菌混入などのリスクが高くなるなど、汎用性に問題を生じる可能性が懸念される。そこで、最終年度となる平成26年度は、コイ細胞を用いたコロニーアッセイ法の時間短縮を試み、本法確立の仕上げとしたい。また、水草を用いて酸素の供給と水質の浄化を図る新たな飼育方法におけるミネラルバランス維持調整方法を確立したい。
ソフト&ウェット型人工筋肉の創出と生体代替運動システムへの応用

(I)ソフト&ウエット人工筋肉となるゲル基本素材の創成基本素材とする高分子ゲルにダブルネットワーク-(DN)構造を導入することで、圧縮強度、引張り強度が数メガパスカル(MPa)に達する超高強度ゲルの合成法を発見した。さらに、DNゲルの第一網目における数10nm数μmスケールのVoid構造を系統的に変化させることで、ゲルをBrittleからDuctile的な振る舞いまで系統的に制御することに成功した。DuctileのDNゲルがNecking現象を示し、20倍までも伸びることを発見した。この優れたゲル材料を人工関節軟骨へ応用するために、低摩擦性、高強度性を併せ持ったゲルの創製を図り、その結果、破壊強度数十メガパスカル、破壊エネルギーが1000J/cm^2以上、表面摩擦係数10^<-5>10^<-4>という従来にないゲルの創成に成功した。(II)ゲル基本素材の生体代替運動システムへの応用展開(I)で創製したゲルは固体素材では実現不可能な柔軟性と運動性、そして耐衝撃性を併せ持つ。このゲルを人工軟骨、人工半月板に応用するために、その耐摩耗性、生体内耐久性、および生体親和性を評価した。数種類のDNゲルは100万回、走行距離延べ50kmのPinonFlat型摩耗試験で、摩耗率10^<-8>10^<-7>mm^3/N・mに達する高い耐摩耗性を示し、これは超高密度ポリエチレン(摩耗率10^<-7>mm^3/N・m)を凌駕する結果であり、ゲルの特性としては驚異的なものである。DNゲルのBlock皮下埋め込み試験、ペレット筋内埋め込み試験を行い、数種ゲルの中、PAMPS/PDMAAmゲルが人工軟骨の素材に最も有望であることを明らかにした。さらに、PAMPS/PDMAAmゲル人工軟骨を試作し、関節内埋植試験を行った結果、関節内異物特性は低く、使用した人工軟骨研究用標準動物モデルでは、明らかな有害性は検出されなかった。さらに、PAMPS/PDMAAゲル人工軟骨を関節表面から数mmのギャップを作るように埋植すると、この表面である生体内局所(ln situ)に正常関節(硝子)軟骨を自然再生することが出来るという、これまでの世界の常識を覆す発見をした。本研究の生物の動きに着想を得たソフト&ウェットアクチュエータは生体適合性・自律応答性などの特徴を有しており、医学・福祉面で飛躍的発展をもたらす21世紀の重要課題である。本研究の推進により、新しい医療用材料としてのソフト&ウェット材料が創成されるだけでなく、人工筋肉や生体代替組織運動システムを得ることができる。筆者らはソフト&ウェットの材料開発と生体代替運動システムの開発とその臨床試験を行うことを目的として、以下の成果を得た。・筆者らが開発したダブルネットワーク化の手法により得た超高強度ゲルの超低摩擦化を達成した(摩擦係数10^<-4>)。さらにゲルの最適作成法を発展させ、生体適合性が期待できる超高強度超低摩擦ゲルを作製した。・超高強度超低摩擦ゲルの動的および静的摩擦特性評価を行った。さらに約500万回の往復滑り運動による摩擦試験を表面性試験機(新東科学株式会社製HEIDON・形式14DR)を用いて行い、超高強度超低摩擦ゲルが優れた摩耗耐性を有することを明らかにした。

・筋肉蛋白アクチンおよびミオシンを用いた新しいゲルマシンの運動方向制御をアクチンの巨大化あるいは基板の制御により達成した。また、さまざまなカチオン性ゲル上でのアクチンファイバー形成要因を明らかにした。さらに、ポリカチオンの濃度・種類を変化させることで巨大アクチンファイバーの形状、およびコンプレックス形成に関するパラメータを算出しファイバー形成の熱力学的過程について知見を得た。本研究は世界に先駆けて推進してきたゲル運動素子を更に発展させ、ソフト&ウェット型人工筋肉を創製し、それを生体代替材料に応用することを目的とする。そのために、含水合成高分子ゲルおよびタンパクゲルによるソフト&ウェット運動素子を高機能化すると同時に人工筋肉としてシステム化し、高性能生体組織代替材料への展開を計った。基本素材とする高分子ゲルの強度と柔軟性を制御する方法は高分子ネットワークを二重にすることによって実現した。それによって、弾性率0.01MPa10MPa、破壊エネルギー1000J/m^2、生体の軟骨や血管などの代替器官として十分の力学物性を示す人工筋肉のような物質を創成できた。このような高強度ゲルに高分子自由を導入したことで、摩擦係数10^<-4>の超低摩擦特性を賦与することに成功した。これらのゲルをウサギ体内に埋植し、生体内におけるゲルの安定性、生体への安全性を生体医工学的に評価した。その結果、3種類のサンプルともよい結果を示した。また、超低摩擦・高強度ゲルの摩耗特性、繰り返し圧縮および剪断力に対する高靭性(耐疲労性)を生体状態に近い条件で定量的に評価した。実用性に極めて近い結果を得た。平行して、アクチン-ミオシン自己組織化過程を制御し、人工的に再構築した化学架橋筋肉蛋白ゲルを開発した。安定で制御可能な流動場発生装置を設計し、自作することにより、様々なせん断応力場でミオシンを配向させることに成功した。最適化された架橋条件で配向性ミオシンゲルを作成した。これまでにアクチンとポリカチオンとのポリイオンコンプレックス形成により通常のF-アクチンの数十倍も大きな巨大アクチンファイバーが形成され、それが高い運動性を持つことを報告した。今回は我々の作成した高分子とアクチンの巨大コンプレクスの極性を評価し、運動性との相関を検討した。アクチンと高分子が相互作用し、自己集合的に極性をそろって、コンプレクスを形成していて、この極性がコンプレクスの運動性や運動の方向性を与えていることを明らかにした。本研究はゲルを生体代替材料に応用することを目的とする。そのために、合成高分子ゲルおよび蛋白ゲルによるソフト&ウェット運動素子を高機能化し、高性能生体組織代替材料への展開を計る。高強度DNゲルの力学応答とその階層構造高分子電解質ゲルに中性な高分子網目を導入し、その2重網目構造を持つゲル(DNゲル)は含水率が90%以上にもかかわらず、初期弾性率0.3MPa、圧縮破壊応力20MPaを示す。DNゲルの高強度化メカニズムを研究するために、様々な重合条件で合成したDNゲルの破壊エネルギーGを測定し、ゲルの構造との相関を検討した。重合条件が最適化されたDNゲルは1000J/m^2を超える強度を示し、高強度ゴムに匹敵する。従来の高分子材料の破壊理論では高分子密度がゴムの十分の一しかないゲルのこの強度を説明できない。
トマト草型制御因子の解析－発現量的形質遺伝子座解析の受光態勢研究への利用－

トマトの受光態勢や収量に大きな影響を及ぼすと考えられる草型に関わる量的形質遺伝子座(QTL)を検出した。草冠サイズに関わるQTLは葉長、下垂角度に関わるQTLと同一の領域にクラスター状に検出され、草冠サイズは下垂角度や葉長の影響を受けていることが明らかになった。また、地上部窒素濃度、硝酸トランスポーター、葉長のQTLも同一の領域に検出されたことから、窒素の体内での分布パターンが葉の成長に影響を及ぼしていることが示唆された。葉の着生角度(出葉角度)や葉長は植物の受光態勢に影響を及ぼす重要な要因であるが、出葉角度や葉長に及ぼす遺伝的要因や遺伝子型×環境交互作用についての研究はほとんど行われていない。そこで、窒素施用濃度を224ppmと22.4ppmに変えてトマトの栽培種と近縁野生種の交配に由来する組換え近交系(BC_1F_7)111系統を2011年初夏と秋に栽培し、最大葉の出葉角度や葉長に関わるQTLを明らかにしようとした。初夏には播種後30日目、秋には38日目に最大葉について出葉角度、葉長、葉先端から茎までの垂線長(葉の水平方向への広がりの尺度)を測定したところ、相加効果を示すQTLが11検出された。出葉角度に関わるQTLは第1、7染色体にそれぞれ2と1検出され、いずれも栽培種の対立遺伝子が角度を小さくする方向に働いた。垂線長に関わるQTLは第2染色体に2つ検出され、いずれも栽培種の対立遺伝子が垂線の長さを小さくする方向に働いた。このQTLについては初夏、秋ともに窒素との交互作用が認められ、高窒素条件下で垂線長が小さくなった。葉長に関して相加効果を示すQTLが第2、3、4、9染色体にそれぞれ2、2、1、1検出された。このうち、第2染色体TG608近傍のQTLは初夏と秋ともに検出され、栽培種の対立遺伝子が葉長を小さくする方向に働いた。秋の実験においてはQTL×窒素交互作用が認められ、高窒素条件で葉長を小さくする方向に作用した。初夏の実験で第2染色体に存在する垂線長と葉長に関わるQTLはいずれも第9染色体のQTLとエピスタシスを示し、第2染色体が栽培種、第9染色体が近縁野生種由来の対立遺伝子の組み合わせの時に値が小さくなった。以上、高窒素条件下で葉の水平方向の広がりを抑える上で第2染色体のTG608近傍と第9染色体のLEOH84近傍のQTLが重要な役割を果たしていることが示唆された。これまで栽培種と近縁野生種Solanum pimpinellifoliumの組換え近交系BC1F7の111系統について、106マーカーを用いて作成した連鎖地図を利用し、QTL解析を行ってきたが、マーカー間の距離が大きく、QTLの位置を正しく推定できていない可能性が考えられた。そこで、マーカー数を162に増やした連鎖地図を作成し、再度QTL解析を行った。次に、栽培種と近縁野生種のF1に栽培種を2回戻し交配したBC2F1の256系統から31系統を選抜した。この系統の中から、第3または第12染色体の草冠サイズに関わるQTLをカバーする領域に近縁野生種の染色体断片を持つ系統を選抜したが、目的とする領域以外に5か所、野生種の断片が残っていたので、さらに戻し交配し、断片数を減らした系統を選抜した。これらの系統は目的とする領域がヘテロであるため、その自殖系統を播種してQTL領域が近縁野生種ホモになった固定系統を選抜した。栽培種との比較試験を行うため、この固定系統の採種を行っている。昨年度行ったmRNAの発現差解析から、転写物量が栽培種では窒素施肥に反応して大きく上昇するが、近縁野生種では低窒素でも転写産物量が高く維持される遺伝子群が認められた。このクラスターには第3染色体に座乗するグルタミン酸合成酵素、硝酸トランスポーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼの遺伝子が含まれることが明らかになった。そこで、組換え近交系111系統を異なる窒素施肥条件下で栽培し、処理後15日目の葉からRNAを抽出してリアルタイムPCRを行った。しかし、グルタミン酸合成酵素遺伝子のmRNA発現量についてのeQTL解析でQTLは検出できなかった。現在、硝酸トランスポーターとグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子についてmRNAの発現量を測定している。草型に関わるQTLを葉の大きさ,垂線長,屈曲程度,出葉角度,節間長,草冠サイズに関わるQTLに分解し,これらQTLの相互関連を明らかにするため,栽培種とSolanum pimpinellifoliumの組換え近交系111系統を用いて春と秋にQTL解析を行った。

葉長に関わるQTLは第1,2,3,10染色体にそれぞれ1,2,2,2個,葉の下垂角度に関わるQTLは第2,4,12染色体にそれぞれ2,1,4個,葉の垂線長に関わるQTLは第3,7,12染色体にそれぞれ4,1,3個,草冠サイズに関わるQTLは第4と第12染色体に各1個検出された。第3染色体上の葉の垂線長に関わるQTLは春と秋の両方で検出され,同じ領域には葉長に関わるQTLが座乗していた。第12染色体上の葉の下垂角度に関するQTLは春と秋の両方で検出され,同じ領域には草冠サイズに関わるQTLや葉の垂線長に関わるQTLがクラスター状に座乗していた。これとは別に,幼植物を用いて窒素利用効率(乾物重/乾物重当りの窒素濃度)についてQTL解析を行ったところ,窒素利用効率に関わるQTLは第2,3,10,12染色体に座乗しており,このうち第3染色体の窒素利用効率に関わるQTLは,葉長や垂線長に関わるQTLがクラスター状に座乗する部位と同じ位置に座乗していた。窒素施用量を変えて栽培種とS. pimpinellifoliumを栽培し,RNA-Seq法によりmRNAの発現差解析を行った。発現差がみられた681種の転写物を発現プロファイルに基づいて12クラスターに分類したところ,第6クラスターに分類された転写物量は栽培種では窒素施肥に反応して大きく上昇したが,S. pimpinellifoliumでは反応の程度が小さかった。また,第3染色体に座乗するグルタミン酸合成酵素がこのクラスターに含まれることが明らかになった。草型に関わるQTLを検出し、その中で窒素と交互作用を示すQTLを検出できたという点では順調に進展している。しかし、マイクロアレイを実施して生理的機能を示す遺伝子群を明らかにするという点では、やや遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。草型に関わるQTLを葉の大きさ,葉の水平距離,草冠サイズ,出葉角度に分解し,それら要因に関わるQTLを見つけることができた。また,窒素利用効率に関わるQTLを見出し,窒素利用効率に関わるQTLと草型に関わるQTLとが関連している可能性を示した。さらに,草型や窒素利用効率に関わるQTLの中には,窒素施用量によって発現が異なるQTLがあることも明らかにした。これらの点で研究は順調に進んでいるが,草型や窒素利用効率に関わるQTLがクラスター状に座乗している部分だけを含む染色体断片置換系統の作成が予定より遅れている。これは,染色体断片置換系統を育成するために戻し交配を行っているが,栽培時期の関係で採種量が少なく,単一染色体断片を含む個体を十分に作りだせなかったことが原因と思われる。現在,新たに戻し交配を行っているが,育成系統を用いて群落状況で受光量を比較する実験の実施は早くても今年末になる見込みである。幼植物段階と生育後期とでは、草型、特に葉の大きさや出葉角度に差があることが明らかになったので、多窒素条件下でトマト栽培種と野生種の組換え近交系統群BC_1F_7を栽培し、播種後3カ月目に草型に関連する形質を測定し、QTL cartographerによる解析を行って、幼植物で得られたQTLとの比較を行う。また、マイクロアレイ解析については、栽培種と野生種を異なる窒素施肥条件下で栽培し、播種後1ヶ月後に葉からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行い、発現に大きな差がみられた遺伝子群について、GOマッピングを行って変化の見られる生理的機能を探索するとともに、それに関連した遺伝子の中にQTL解析によって特定された位置に近いものがあるか、否かを調べる。戻し交配を繰り返して染色体断片置換系統の育成を進め,草型に関わるQTLがクラスター状に座乗している第3染色体あるいは第12染色体の断片だけを含む置換系統を育成する。
マンモグラフィで発見された非触知乳癌の増殖能の解析

[はじめに]マンモグラフィ(マンモ)で発見された非触知乳癌病変の増殖能を解析し、非触知乳癌の今後の治療方法の方向付けを行うため、細胞周期のG2M期へ誘導するprotein kinaseであるp34^<cdc2>、細胞増殖遺伝子であるc-erbB-2、癌抑制遺伝子p53の発現を検討した。[研究対象および方法]western blottingで、凍結組織がある触知乳癌58例(正常乳腺12例)のp34^<cdc2>の発現を検討した。免疫染色を用いて、マンモで非触知乳癌を凝った良性病変(乳腺症)、マンモで発見された非触知乳癌、触知乳癌病のp34^<cdc2>、c-erbB-2、p53発現を検討した。[結果]western blotting上p34^<cdc2>が検出できたのは触知乳癌58例中14例(24.1%)、正常乳腺組織12例中0例(0%)であった。p34^<cdc2>染色陽性細胞率が2%以上であったのは、良性(乳腺症)6例中1例(16.7%)、非触知乳癌16例中16例(100%)、触知乳癌8例中8例(100%)であった。4%以上であったのは、良性(乳腺症)6例中1例(16.7%)、非触知乳癌16例中6例(37.5%)、触知乳癌8例中7例(87.5%)であった。c-erbB-2の免疫染色が陽性であったのは、良性4例中0例(0%)、非触知乳癌16例中8例(50%)であった。p53の免疫染色が陽性であったのは、良性4例中1例(25%)、非触知乳癌16例中3例(18.8%)であった。p34^<cdc2>染色陽性細胞率は、良性<非触知乳癌<触知乳癌の順であった。c-erbB-2の増幅が、非触知乳癌に認められた。一方、p53の増幅は認められなかった。以上より、マンモ発見の非触知乳癌は、良性に比較して高い増殖能を有し、治療の対象になると考えられた。[はじめに]非触知乳癌病変の増殖能を解析し、非触知乳癌の今後の治療方法の方向付けを行うため、細胞増殖遺伝子であるc-erbB-2、癌抑制遺伝子p53、非浸潤癌から浸潤癌の移行に関与する可能性のあるカテプシンDなどの増幅、過剰発現や異常を検討した。[研究対象および方法]1989年1月以降、教室で発見された非触知乳癌22例(非浸潤癌が13例、浸潤癌が9例)を研究対象とした。また、同時期に非触知乳癌を疑ったが生検で良性であった症例の一部も対象とした。

これらの症例のパラフイン標本から連続切片を作成した。c-erbB-2、p53、カテプシンDを免疫染色した。使用した抗体はc-erbB-2はニチレイ(polyclonal)、p53はDAKO(D0-7)、カテプシンDはDAKO(polyclonal)である。今回、実際に検討したのは、良性病変4例、非浸潤性乳管癌10例、非浸潤性小葉癌1例、浸潤性乳管癌5例である。その他、乳癌症例ではあるが、癌組織が小さ過ぎたため癌組織は検索できず、周囲の非悪性部分のみを検索した症例が4例ある。[結果]良性病変で免疫染色が陽性であったのは、c-erbB-2が0/4例、p53が1/4例、カテプシンDが4/4例であった。非浸潤性乳管癌症例で陽性であったのは、c-erbB-2が7/10例、p53が0/10例、カテプシンDが9/10例であった。非浸潤性小葉癌小例では、c-erbB-2が0/1例、p53が0/1例、カテプシンDが1/1例であった。浸潤性乳管癌で陽性であったのは、c-erbB-2が1/5例、p53が3/5例、カテプシンDが3/5例であった。癌組織周囲の非悪性部分のみを検索した症例で陽性であったのは、c-erbB-2が0/4例、p53が1/4例、カテプシンDが3/4例であった。[考察および結語]非浸潤性乳管癌症例ではc-erbB-2の増幅があり、増殖能が高いことが示された。また、浸潤性乳管癌ではp53の増幅があり、癌抑制遺伝子の異常が示唆された。カテプシンDは特異的結果がでなかった。[はじめに]マンモグラフィ(マンモ)で発見された非触知乳癌病変の増殖能を解析するため、細胞周期のG2M期へ誘導するprotein kinaseであるp34^<cdc2>の発現状態を、正常乳腺組織、乳腺症組織、非触知乳癌組織、触知乳癌組織で検討した。[研究対象および方法]凍結組織がある触知乳癌58例でp34^<cdc2>の発現をwestern blottingを用いて検討した。コントロールは同じ症例の正常乳腺組織(12例)とした。ケミコン社(monoclonal)の抗体を使用した。次ぎに、マンモで非触知乳癌を疑ったが生検で良性(乳腺症)であった6例、マンモで発見された非触知乳癌16例(非浸潤癌が8例、浸潤癌が8例)、触知乳癌8例のパラフイン標本を用いて、p34^<cdc2>(抗体、Santa Cruz Biotechnology Inc社)を免疫染色した。染色陽性細胞の率(染色陽性細胞数/腺細胞数あるいは癌細胞数×100、400倍、5視野)でp34^<cdc2>の発現程度を評価した。[結果]western blotting上p34^<cdc2>が検出できたのは触知乳癌58例中14例(24.1%)、正常乳腺組織11例中0例(0%)であった。p34^<cdc2>陽性とn、ly、v、には相関がなかった。p34^<cdc2>染色陽性細胞率が2%以上であったのは、良性(乳腺症)6例中1例(16.7%)、非触知乳癌16例中16例(100%)、触知乳癌8例中8例(100%)であった。p34^<cdc2>染色陽性細胞率が4%以上であったのは、良性(乳腺症)6例中1例(16.7%)、非触知乳癌16例中6例(37.5%)、触知乳癌8例中7例(87.5%)であった。p34^<cdc2>染色陽性細胞率は、良性<非触知乳癌<触知乳癌の順であった。以上より、マンモ発見の非触知乳癌は、良性に比較して高い増殖能を有し、治療の対象になると考えられた。
閉鎖陰圧療法における神経の役割に関する研究及び臨床への応用

ラットより採取した皮膚線維芽細胞及び交感神経細胞様に分化させたPC12細胞の各種陰圧環境下での動態変化を調査した。結果、線維芽細胞単独培養の場合では大気圧下に比べ間欠的陰圧下で細胞増殖能、遊走能が促進された。また持続的陰圧下にてコラーゲンゲルの収縮能が促進された。PC12細胞と共培養したコラーゲンゲルは大気圧下に比べ間欠的陰圧下にて収縮能が促進された。これらの結果より間欠的陰圧環境がより効果的に創傷治癒を促進する可能性が示唆された。ラットより採取した皮膚線維芽細胞を用いて各種閉鎖陰圧環境下において動態変化を調査した。グループ1は大気圧、グループ2は100cmH_2Oの持続陰圧、グループ3は100cmH_2Oの1分吸引1分休止の間欠的陰圧、グループ4は100cmH_2Oの3分吸引3分休止の間欠的陰圧で培養した。結果、細胞増殖に関してはグループ4、3、2、1の順に増殖能を示した。遊走に関してはグループ3、4、2、1の順に遊走能を示した。コラーゲンコントラクションに関してはグループ2、3、4、1の順に収縮を示した。これらの結果から陰圧環境下の方が大気圧より創傷治癒を促進する可能性が示唆された。ただし、in vitroでの結果がin vivoで反映されるとは限らず、これらの結果を今後in vivoでも検討する必要があると思われた。次に、局所閉鎖陰圧療法時は創を閉鎖することで感染の増悪が懸念されるが、抗菌性のある創傷被覆材を併用することでそのリスクを減らすことが予想される。そこで各創傷被覆材の抗菌性について調査した。日常の創傷処置で用いられる創傷被覆材を用いて液体LB培地中の大腸菌に対する抗菌力を調査した。結果、ゲーベンクリーム、アクアセルAgが速効性があり、強い抗菌力を持ち、持続性を認めた。次にゲンタシン軟膏、ユーパスタ軟膏、ヨードホルムガーゼの順で抗菌力を認めた。また各創傷被覆材の浸透性による抗菌力も調査した。LB寒天培地の内部も含めて全体に大腸菌を培養し、寒天培地表面に創傷被覆材を貼付することで浸透による抗菌力を評価した。結果、ヨードホルムガーゼが一番強い浸透性と抗菌力を持っていた。次にゲーベンクリーム、アクアセルAg、ゲンタシン軟膏、ユーパスタ軟膏の順で浸透性による抗菌力を示した。今後、ラットの後根神経節細胞および褐色細胞の株化細胞であるPC12cellを用いて神経細胞の閉鎖陰圧環境下での動態変化と線維芽細胞との相互作用を検討していく予定である。線維芽細胞と神経細胞の閉鎖陰圧環境下での相互作用を調査するためにラットの皮膚線維芽細胞及びラットの副腎褐色細胞腫の細胞株であるPC12細胞を用意した。PC12細胞はNGF刺激により交感神経細胞様に分化する。線維芽細胞とNGF刺激をしたPC12細胞を共培養の状態でコラーゲンゲル内に包埋し、コラーゲンゲルコントラクションアッセイを施行した。結果、グループ4>グループ3>グループ1=グループ2の順で収縮を示した。グループ4のみがグループ1に対し有意に収縮を示した。これらの結果より間欠的な閉鎖陰圧環境の方が大気圧下の環境より線維芽細胞及びPC12細胞を刺激しそうコラーゲンゲルの収縮を促進することが分かった。次に、閉鎖陰圧環境下での細菌の増殖能について調査した。閉鎖陰圧環境は創部の健康な細胞のみでなく細菌にとっても増殖しやすい環境である可能性がある。閉鎖陰圧療法を施行するときには創部はフィルムで閉鎖されるため創内の細菌が閉鎖環境下で増殖する危険性がある。そこで上記の各種閉鎖陰圧環境下における細菌の増殖速度を非病原性大腸菌を用いて調査した。大腸菌を液体LB培地内で培養し、細胞増殖試薬WST-1を用いて経時的に液体LB培地内の大腸菌の相対量を測定した。結果、反応開始から4時間、5時間の段階でグループ3、グループ4、グループ2、グループ1の順で大腸菌は有意に増殖していた。これにより閉鎖陰圧環境は創治癒に関わる健康な細胞にだけ影響するわけでなく、創部に存在する細菌にも影響し、増殖を促進する可能性が示唆された。しかし、大腸菌は通性嫌気性菌であるため、黄色ブドウ球菌、緑膿菌など他の細菌では結果が異なる可能性があるため更なる調査が必要であると思われた。
表在性膀胱癌における全Genome領域のAllelotypingとホモ欠失の解析

1.方法2.結果3.まとめGeneChipとSTRを併用することで、より解像度の高いAI解析結果が得られた。Ta表在性膀胱癌における全染色体領域のAIは異型度および予後と関連しており、悪性進展する腫瘍を判別する一助となる可能性が示唆された。今後GeneChip解析において、両alleleのコピー数測定を行い、ホモ欠失候補領域を同定していく予定である。
片麻痺患者への理学療法士の介入の解明とリハビリテーションシステムへの応用

我が国の高齢者の割合は25%を超え,超高齢社会となっている.高齢者になると脳卒中で脳が損傷する割合が増え,その後遺症で片麻痺となると身体機能が低下する.そして片麻痺になるとリハビリテーションを受け,運動機能の改善が図られる.これに対して我々の先行研究から,健常者の起立動作には4つの筋シナジーが存在するものの,片麻痺になると筋シナジーの活動が適切に調整できないことが分かっている.しかし一方でリハビリテーションにおいて筋シナジーの活動がどのように変化しているのか分かっていない.またリハビリテーションではその介入を理学療法士の技能や経験に依存しており,定量的な評価が難しかった.そこで本研究では,理学療法士の介入を定量的に評価する手法を構築し,異なる症状をもつ患者に対する介入動作を計測し,それによって運動が改善する効果を調べる.片麻痺患者の症状に対する個々の介入手法が分かれば効果的なリハビリテーション手法の設計が可能となる.本年度は具体的には,理学療法士の上肢に表面筋電計を貼り付け,筋活動を計測することで肩や肘,手首,母指の運動を定量的に評価した.また同時に片麻痺患者の運動中の筋活動を計測することで筋シナジーを算出し,リハビリ前後の変化を調べた.その結果,理学療法士は主に片麻痺患者が離臀する前に膝部を引き,離臀のタイミングに合わせて膝や臀部の伸展を促していることが分かった.またその結果として,片麻痺患者は介入前は離床に寄与する筋シナジーの活動を適切に調整できていなかったのに対して,介入を受けると活動タイミングが改善するということが分かった.本研究では,片麻痺患者の起立動作に介入をする理学療法士の技能を定量的に評価し,異なる患者の症状に対する介入手法を明らかにし,それらをリハビリテーションシステムに応用することを目指している.本年度は理学療法士の技能を定量的に計測する手法を構築し,それらを使うことで介入動作の評価が可能なことを示した.また実際に片麻痺患者に対する介入動作とそれに対応する身体機能の変化を調査することで,理学療法士の介入によって片麻痺患者の運動が改善していることが調べられた.今後の研究方針の1つは,より多くの異なる症状をもつ患者の運動およびそれに対する理学療法士の介入動作の計測を行う.片麻痺患者の症状は脳の損傷部位や回復の程度によって異なるため,それらの異なる症状に対応する介入動作を明らかにすることが重要である.またこれらの介入動作をリハビリテーション装置に実装することで,効果的なリハビリを実現するシステムの構築を図る.我が国の高齢者の割合は25%を超え,超高齢社会となっている.高齢者になると脳卒中で脳が損傷する割合が増え,その後遺症で片麻痺となると身体機能が低下する.そして片麻痺になるとリハビリテーションを受け,運動機能の改善が図られる.これに対して我々の先行研究から,健常者の起立動作には4つの筋シナジーが存在するものの,片麻痺になると筋シナジーの活動が適切に調整できないことが分かっている.しかし一方でリハビリテーションにおいて筋シナジーの活動がどのように変化しているのか分かっていない.またリハビリテーションではその介入を理学療法士の技能や経験に依存しており,定量的な評価が難しかった.そこで本研究では,理学療法士の介入を定量的に評価する手法を構築し,異なる症状をもつ患者に対する介入動作を計測し,それによって運動が改善する効果を調べる.片麻痺患者の症状に対する個々の介入手法が分かれば効果的なリハビリテーション手法の設計が可能となる.本年度は具体的には,理学療法士の上肢に表面筋電計を貼り付け,筋活動を計測することで肩や肘,手首,母指の運動を定量的に評価した.また同時に片麻痺患者の運動中の筋活動を計測することで筋シナジーを算出し,リハビリ前後の変化を調べた.その結果,理学療法士は主に片麻痺患者が離臀する前に膝部を引き,離臀のタイミングに合わせて膝や臀部の伸展を促していることが分かった.またその結果として,片麻痺患者は介入前は離床に寄与する筋シナジーの活動を適切に調整できていなかったのに対して,介入を受けると活動タイミングが改善するということが分かった.本研究では,片麻痺患者の起立動作に介入をする理学療法士の技能を定量的に評価し,異なる患者の症状に対する介入手法を明らかにし,それらをリハビリテーションシステムに応用することを目指している.本年度は理学療法士の技能を定量的に計測する手法を構築し,それらを使うことで介入動作の評価が可能なことを示した.また実際に片麻痺患者に対する介入動作とそれに対応する身体機能の変化を調査することで,理学療法士の介入によって片麻痺患者の運動が改善していることが調べられた.今後の研究方針の1つは,より多くの異なる症状をもつ患者の運動およびそれに対する理学療法士の介入動作の計測を行う.片麻痺患者の症状は脳の損傷部位や回復の程度によって異なるため,それらの異なる症状に対応する介入動作を明らかにすることが重要である.またこれらの介入動作をリハビリテーション装置に実装することで,効果的なリハビリを実現するシステムの構築を図る.
アプラタキシン欠失による一本鎖核酸損傷修復障害と神経変性の関連についての解析

「眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早発型失調症(EAOH/AOA1)」は発症初期に眼球運動失行を伴い,進行期に低アルブミン血症・末梢神経障害を伴う常染色体劣性遺伝性脊髄小脳変性症の一型である。病因蛋白Aprataxin(APTX)は一本鎖DNA修復に関連した機能が推定されている。しかしながら一本鎖DNA修復(SSBR)障害とEAOHでの神経変性メカニズムの関連に関しては、明らかにされていない。SSBR関連蛋白であるXRCC1,PNKP, PARP, LigIII, PolβおよびAPTXのGFP融合蛋白を作成し、SSBR関連蛋白の細胞内局在の確認ならびにDNA損傷ストレス後の細胞内局在の変化を共焦点レーザー顕微鏡ならびに蛍光顕微鏡を用いて比較検討した。APTXは核に局在し、特に核小体に強い局在を認めた。また、PARPも同様の局在を示した。PNKPとPolβは核に局在を示し、XRCC1は核にびまん性の局在を示したが、核小体への発現は認められなかった。LigIIIは核質での発現はXRCC1と同じびまん性の局在を示し、核小体への移行も認められた。APTXはTopoisomerese I阻害剤(CPT)刺激により経時的に核小体から核質への移行が確認された。またXRCC1は経時的に核質にて点状の集積形成を示した。しかしながらPARPやPNKPについては明らかな局在の変化は認められなかった。過酸化水素刺激により、APTXは局在の変化はを認められなかった。また、PARPやLigIII, Polβも明らかな局在の変化を認められなかったが、一方、PNKPは核小体から核質への移行がみられた。
線虫C.elesansのSRC-1は細胞移動と神経軸索の投射を制御する

Srcファミリーチロシンキナーゼ(SFK)は、細胞外情報を細胞内シグナルに変換することで、細胞の増殖、分化、接着、運動性を制御する重要な役割がある反面、その機能はがんと密接に関わっている。我々は、SFKの線虫オーソログであるSRC-1が、細胞移動の指揮に不可欠な役割を果たしていることを明らかにした。またこれまでに、胚発生における内胚葉誘導においてSRC-1がWntシグナルと並行して機能していることが示されている。しかし、SRC-1がどのようにして細胞極性を制御するのかは不明である。そこで、恒常的活性化型SRC-1をbaitとして、Yeast two-hybrid法を用いてSRC-1結合タンパク質として新規にPRKL-1を同定した。PRKL-1はショウジョウバエPrickle、ヒトPrickle1-3のオーソログであり、WntシグナルのPlaner cell polarity経路に関連していることが知られている。しかし、線虫での機能については全く分かっていない。本年度は、線虫prkl-1の機能を解析するために、deletion mutantを作製した。TMP/UVで変異を導入したライブラリーからスクリーニングを行い、PRKL-1のC末端に欠損を生じるようなov2 alleleを得ることが出来た。このprkl-1(ov2)mutantを観察したところ、目立った表現型は観察されなかった。しかし、src-1(cj293)とのdouble mutantを作製したところ、4細胞期におけるEMS割球の分裂軸に顕著な異常が生じることが分かった。このことから、胚発生期における細胞極性の制御にPRKL-1が関与していることが示唆された。PRKL-1が、線虫においてもPlaner cell polarityで重要な役割を果たしていることを明らかにすることができ、またSRC-1とともに機能していることを示唆するようなデータが得られた。src-1は線虫におけるSFKのオーソログと考えられており、私はこれまでに、src-1変異体ではdistal tip cellsと神経細胞の移動において異常を示すことを報告した。また、SRC-1の下流で機能する分子としてCED-2,CED-5,CED-10,CED-12を同定したが、これらがSRC-1によってどのように制御されているかは不明である。そこで、本研究では、細胞移動に関するシグナル伝達経路において、SRC-1の上流・下流に含まれる因子の同定及びその作用機序を解析することとした。SFKには、キナーゼ活性の制御機構が存在し、シグナルのON-OFFスイッチとして機能している。活性型のSFKは分子間結合に関わるSH2、SH3ドメインが外側に向いたコンフォメーションをとることが知られている。そこで、恒常的活性化型SRC-1をbaitとし、yeast two-hybrid法を用いて、活性依存的にSRC-1に結合する分子をスクリーニングした。それにより、WntシグナルのコンポーネントであるPRKL-1/Prickleを新たに同定した。PRKL-1は、SRC-1のキナーゼ活性依存的にSRC-1と結合することを見いだした。Prickleはがん細胞で発現が低下しているという報告もあり、SrcとPrickleの関係を解析することで、がんのシグナルメカニズムをより詳細に明らかにすることができると考えられる。
不眠障害の生理‐心理‐発達的観点からの病態の解明と心理療法の反応性に関する研究

本年度は、不眠障害の病態を生理-心理-発達的側面から検討するために、以下の2つの研究立案および実施を行った。1つ目の研究は、大学生を対象とした不眠に関連する要因を明らかにするための横断調査である。本調査では、都内大学生を対象に不眠の重症度と関連する要因として近年注目されているスキーマ(非機能的なパーソナリティ)を測定し、それと不眠重症度の関連について検討した。その結果、大学生においてはスキーマが不眠重症度と関連を示すことが示された。本研究成果は、第9回世界認知行動療法会議(2019年7月17ー20日,ドイツ)にて発表予定である。2つ目は、不眠症者の不眠重症度を発達的側面から検討することを目的とした2070代の年齢の者を対象にしたインターネット調査に関する研究である。近年、不眠症状は年齢層によってその重症度と寄与する要因が異なる可能性が指摘されている。本研究では、それらを明らかにするために2070代の男女800人程度を10歳ごとの年齢層に区分し、年代毎による不眠重症度と関連する要因を検討する。具体的にはインターネット調査会社に登録されている一般モニターに対し、研究の説明を行い、同意が得られた者に対して睡眠や抑うつ、不安、スクリーンタイム等を測定する質問項目への回答を求め、不眠の重症度と関連する要因を検討する。現在、これらの研究は倫理審査委員会に申請中であり、倫理審査委員会の承認を得次第、調査を実施する予定である。当初の予定では、睡眠外来の患者を対象に不眠の重症度を生理-心理-発達的観点から明らかにする研究1つを実施する予定であったが、実施上の制約から研究計画を修正した。一方、その結果、生理的側面から不眠の重症度を検討することは難しくなったものの、大学生を対象とした調査をすでに終了し、現在2070代といった年齢を対象とした研究の倫理申請中である現在の進捗状況は当初の計画より進展していると考えられる。今後は、現在学会発表予定の研究を国内外の主要雑誌に投稿し、現在倫理申請中のインターネット調査は調査の実施を行う予定である。その後は、当初の計画通り、これまでに得られた知見を活かし、不眠症に対する認知行動療法の治療反応性に関する要因を明らかにする研究を実施予定である。本年度に当初予定していた研究計画の見直しを行った。その結果、研究に使用予定だった金額も変更となったため、次年度使用額が生じた。
膜蛋白質OmpAが形成する立体構造の熱力学的安定性の評価

本研究の目的は、陰イオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と非イオン性界面活性剤オクチルグルコシド(OG)の二種類の界面活性剤の混合系に可溶化した大腸菌外膜蛋白質OmpAを対象とし、膜蛋白質の安定性を実験的に評価することである。これまでに、サイズ排除クロマトグラフィーに、低角レーザー光散乱測定を組み合わせた測定システムにより、様々なSDSとOGの組成におけるOmpAの溶存状態の評価を行い、上記界面活性剤の混合系の組成の変化に伴う、この蛋白質の集合状態、および比屈折率増分の変化の測定を行った。これらの研究により、SDS存在下で変性した膜蛋白質OmpAが、OGの添加によって、おもに2つの協同的転移を通じて変性前の構造に復元することを明らかにし、この膜蛋白質の構造変化を、両者の界面活性剤の結合の観点から解析する段階にある。■この界面活性剤存在下での膜蛋白質の構造変化の過程は、一般の蛋白質の場合についての「溶媒変性」のモデルにしたがって考察することが可能であると考えられる。そこで、本年度には、水溶性蛋白質であるリボヌクレアーゼのSDS変性ならびに上記混合系における構造変化の検討を行い、在来の「溶媒変性」のモデルによる解析を行ったところ、SDS変性に対する蛋白質の安定性は、尿素変性に対する安定性の半分程度に見積られることが示された。しかしながら、SDS濃度の変化に伴うSDSの結合量の変化は、在来のモデルに従わない。このことは、界面活性剤による蛋白質の変性の機構が、尿素などの水溶性の変性剤によるものとは異なっていることを示す。■膜蛋白質のSDS存在下での変性ならびに安定性の評価においては、この界面活性剤と蛋白質の相互作用の特殊性を考慮することが必要であり、当初の目的を達成するには、この系における水溶性蛋白質の挙動についての知見も平行して検討していく必要性が示唆された。本研究では、蛋白質に対する変性作用が異なる、陰イオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と非イオン性界面活性剤オクチルグルコシド(OG)の二種類の界面活性剤の混合系に可溶化した大腸菌外膜蛋白質OmpAを対象とし、膜蛋白質の安定性を実験的に評価することが目的である。本年度には、まず、ハイドロキシアパタイトによるクロマトグラフィーを導入することにより、約10mgのOmpAの精製標品を得、サイズ排除クロマトグラフィーに、低角レーザー光散乱測定を組み合わせた測定システムにより、様々なSDSとOGの組成におけるOmpAの溶存状態の評価を行い、上記界面活性剤の混合系の組成の変化に伴う、この蛋白質の集合状態、および比屈折率増分の変化の測定を行った。さらに、上記界面活性剤混合系自体の熱力学的性質を明らかにするために、種々の塩濃度での、SDS-OG混合水溶液の表面張力の測定を行い、この界面活性剤混合系の界面活性剤単量体濃度(臨界ミセル濃度)とミセル組成の関係の決定を行い、この界面活性剤混合系のほぼ全組成にわたる、両成分の活動度の決定を行った。これらの研究により、界面活性剤存在下での膜蛋白質の変性-復元の過程を「溶媒変性」のモデルにしたがって考察するための基礎的知見を得ることができた。ただし、現時点では、両界面活性剤の結合量の総量に相当する比屈折率増分の測定に留まり、具体的な個々の成分の結合量の測定には至っていない。今後は、それぞれの成分の結合量の決定によって、この系におけるOmpAの構造変化に関する熱力学的な過程をさらに定量的に考察できる知見を集積することが課題である。

本研究の目的は、陰イオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と非イオン性界面活性剤オクチルグルコシド(OG)の二種類の界面活性剤の混合系に可溶化した大腸菌外膜蛋白質OmpAを対象とし、膜蛋白質の安定性を実験的に評価することである。これまでに、サイズ排除クロマトグラフィーに、低角レーザー光散乱測定を組み合わせた測定システムにより、様々なSDSとOGの組成におけるOmpAの溶存状態の評価を行い、上記界面活性剤の混合系の組成の変化に伴う、この蛋白質の集合状態、および比屈折率増分の変化の測定を行った。これらの研究により、SDS存在下で変性した膜蛋白質OmpAが、OGの添加によって、おもに2つの協同的転移を通じて変性前の構造に復元することを明らかにし、この膜蛋白質の構造変化を、両者の界面活性剤の結合の観点から解析する段階にある。■この界面活性剤存在下での膜蛋白質の構造変化の過程は、一般の蛋白質の場合についての「溶媒変性」のモデルにしたがって考察することが可能であると考えられる。そこで、本年度には、水溶性蛋白質であるリボヌクレアーゼのSDS変性ならびに上記混合系における構造変化の検討を行い、在来の「溶媒変性」のモデルによる解析を行ったところ、SDS変性に対する蛋白質の安定性は、尿素変性に対する安定性の半分程度に見積られることが示された。しかしながら、SDS濃度の変化に伴うSDSの結合量の変化は、在来のモデルに従わない。このことは、界面活性剤による蛋白質の変性の機構が、尿素などの水溶性の変性剤によるものとは異なっていることを示す。■膜蛋白質のSDS存在下での変性ならびに安定性の評価においては、この界面活性剤と蛋白質の相互作用の特殊性を考慮することが必要であり、当初の目的を達成するには、この系における水溶性蛋白質の挙動についての知見も平行して検討していく必要性が示唆された。
郷土作家から学ぶ「環境・道徳教育」研究

(研究目的)本研究は<ESD>を基盤として、社会教育と学校教育の両領域において、郷土岡山関連の作家の作品背景から、「自然」と「地域共同体の活動の側面」を読み解き、現代社会における「環境問題」と「道徳問題」を言語によって論理的に考察させるための教育研究である。(研究方法)2014年に岡山市が開催地のひとつとなる「国連ESDの10年最終年会合」を一視座として、「岡山地域資源・ESD研究会」を立ち上げ・郷土作家の作品から「環境・道徳教育」について学ぶ公開市民講座を6回開催した。この講座は、「おかやま県民文化祭」・「岡山市ESDウィーク」参加事業に登録された。講座内容は、岡山県出身の作家正宗白鳥・坪田譲治・木山捷平が愛着を示し、その作品中に何度となく描き出した明治・大正・昭和初期の「里山・里地・里海」から、自然と地域共同体のあり方を学ぶものであった。そして、公開講座資料を応用して、現代の高校生達が自然環境・地域社会とのよりよい関係を築く「基礎力-生きる力」を培う端緒となるための教材開発をめざした。教材化した資料を、高校国語授業に「協働学習」の形態で応用した。別に、「道徳的基盤」に関する資料は再構築し、特別活動の時間の投げ込み教材に利用した。また、ESD研究会との連携で高校部活動の一環として、生徒の公開市民講座への参加を呼びかけ、ボランティア活動として、岡山市立公民館のESD関連行事に関わらせることで、学校教育と社会教育の接点を探った。公民館活動では、研究成果の発表機会も与えられた。さらに、「おかやま古写真DB委員会」と「岡山シティミュージアム」との共催企画「知らない岡山天神山界隈1891」に協力、研究発表者として参加した。(研究成果)「生きる力」の学習を基盤として、社会教育と学校教育の接点を活用した高校国語教材の開発・体験型学習のプロトタイプの策定・「協働学習」の可能性の模索・郷土地域資源の顕彰等に一定の成果があったと同時に、2014年度に岡山市で開催される「国連ESDの10年最終年会合」に向けた啓蒙・広報活動に微力ながら寄与したものと考える。(なお、本研究に係る研究集録を現在編集中である。)(研究目的)本研究は<ESD>を基盤として、社会教育と学校教育の両領域において、郷土岡山関連の作家の作品背景から、「自然」と「地域共同体の活動の側面」を読み解き、現代社会における「環境問題」と「道徳問題」を言語によって論理的に考察させるための教育研究である。)