hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔疾患における免疫補助シグナル分子の機能解析とその臨床応用にむけた展開

興味深いことに,B7hは上皮系腫瘍細胞株,角化細胞,血管内皮細胞において,サイトカイン刺激により速やかに発現誘導あるいは制御されることから,T細胞上のICOSはこれらの組織細胞上のB7hと何らかの相互反応に関与している可能性が示唆された.以上の結果から,免疫応答においてPD-1およびICOSは,CD28/CTLA-4とはかなり異なる役割を担っている可能性が示唆された.口腔免疫反応および口腔疾患におけるPD-1: PD-L1/PD-L2およびICOS-B7h経路補助シグナル分子の機能を明らかにするために,2年目である本年度は,作製した抗ヒトPD-1,PD-L1,PD-L2,B7h抗体を用いて,様々な組織および細胞における発現を検討した。興味ある知見としては,PD-L1は口腔扁平苔癬における上皮下および上皮内浸潤T細胞において発現が認められ,また,リンパ球浸潤の多く見られる領域の上皮細胞において発現誘導が認められた。このことは,サイトカイン刺激後の培養細胞においても確認された。さらには,PD-L1はかなりの頻度で口腔扁平上皮癌細胞上に発現が認められ,組織においても,培養癌細胞においても確認された。上皮や癌細胞におけるPD-L1発現が免疫寛容誘導に関与しているのかどうかについてさらに検討中である。Project2:樹状細胞/マクロファージ・破骨細胞・T細胞の3者間相互作用における補助シグナル分子の解析(RANKL/RANK経路)歯周病などの炎症性骨吸収における上記細胞間相互作用に関わるRANK-RANKL経路の関与を明らかにするために,膜型RANKL(mRANKL)と結合可能でフロサイトメトリーに適応可能な抗ヒトRANKL抗体を樹立した。mRANKLは,未刺激末梢血T細胞においては発現が認められず,意外なことに抗CD3+CD28およびIL-2存在下の培養系においては,刺激培養10日以降にはじめて発現が認められた。T細胞におけるmRANKL発現に必要な因子に関して検討中である。口腔粘膜上皮および口腔扁平上皮癌に発現誘導される抑制分子PD-1のリガンドB7-H1の発現制御とその機能について検討した。角化上皮細胞および癌細胞上のPD-L1は、IFN-・刺激により誘導され、培養上皮細胞上のB7-H1は、T細胞の増殖反応およびIFN-・産生抑制に働いていることが示された。また、癌細胞上にde novoで誘導されるB7-H1は、抗腫瘍反応抑制に働いているが、遺伝子導入により過剰発現させたB7-H1は、抗腫瘍免疫強化に働いていることが示された。上皮や癌細胞におけるB7-H1は、免疫寛容誘導に関与していることが示唆されたが、相反する機能も想定されることから、PD-1以外の第2レセプターの関与も示唆された。Project2:樹状細胞/マクロファージ・破骨細胞・T細胞の3者間相互用における補助シグナル分子の解析(RANKL-RANK経路)歯周病や関節リウマチなどの炎症性骨吸収性疾患の病態発生における、T細胞におけるRANKL発現の関与を検討するために、膜型および可溶型RANKLに結合可能な抗ヒトRANKLモノクローナル抗体を作製した。膜型RANKLは、活性化T細胞においても僅かしか発現が認められず,その多くはメタロプロテアーゼによる分解をうけて、可溶型RANKLとして、細胞外へ分泌されることが明らかになった。関節リウマチ患者滑液あるいは慢性歯周病炎症歯肉に浸潤するT細胞にRANKLの発現が認められた。活性化T細胞から産生される可溶型RANKLが、慢性炎症性疾患における骨代謝に関与している可能性が示唆された。
CBP/p300を含む新規複合体のクロマチン高度再構成転写系を用いた機能解析

細胞内で観察される転写活性化を反映する核抽出液の調製法と試験管内転写系を用いて、強力なVP16活性化ドメインに特異的なコアクチベーターの精製を試みた。従来のDignam法によらずLow Salt法(Ikeda, K. & Meisterernst, M)により調製されたHeLas核抽出液にVP16H1ドメイノ(転写活性化ドメインN末部分)に依存的な活性が再現性よく観察された。コンベンショナルなカラムとアフィニティカラムを使用し、その活性を担う因子を同定、PC6-MOVE(Positive Cofactor No.6-Mediator of VP16 enhancer)と名付けた。PC6-MOVEは既知のgenaral positive cofactor (USA fractionから精製、クローニングされたPC1, PC2, PC3, PC4, PC5, NC1, NC2)ではないこと、SRC-1等の既知の転写因子特異的コアクチベーターやコアクチベーター複合体であるARCおよびTRAP/SMCC6との異同を生化学的・免疫化学的に明らかにした。一方、VP16H2ドメイン(転写活性化ドメインC末部分)にはヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するコアクチベーターp300/CBPが直接相互作用することにより、特異的転写活性化がおこることを明らかにした。p300/CBPとの相互作用に必須のVP16側の3つのアミノ酸と、VP16H2ドメイノとの相互作用するp300/CBP側の部位を同定した。P300/CBPはクロマチン鋳型DNAからの転写に必須であることを確認した。以上の結果よりVP16の強力な転写活性化は、従来報告されている基本転写因子とPC6-MOVE、p300/CBPとの協同作用によると結論した。
好酸球性気道炎症におけるTh2サイトカインとTLR3受容体のクロストーク

RNAウイルス複製時に生じる二本鎖RNAを認識する膜受容体Toll-like receptor 3(TLR3)の気管支平滑筋における発現を確認し、Th2サイトカイン優位な微小環境下では、dsRNA刺激により好酸球遊走性ケモカイン(eotaxin-1,RANTES)が産生され、強力な好酸球遊走活性が認められることを確認した。また、培養ヒト気道上皮細胞(BEAS2B)/気管支平滑筋細胞(BSMC)にRNAウイルスであるヒトコロナウイルス株CoV229Eが感染・増殖することを確認した。さらにBEAS2Bにはウイルスレセプターaminopeptidase Nが構成的に発現しており、その発現は合成二本鎖RNAであるpolyI:CとIL-4により相乗的に増強された。Th2サイトカイン優位な環境下ではTLR3シグナルを介してウイルスレセプターの発現が亢進し、ウイルス感染・増殖を増幅する可能性があると考えられた。ウイルス感染は喘息の増悪因子として重要であるが、ウイルス感染時の気道上皮細胞や気管支平滑筋細胞から大量のケモカインが放出され好酸球性気道炎症を惹起することが、急性増悪の原因の1つと考えられている。今年度の研究ではウイルス複製時の産物である二本鎖RNA(dsRNA)が気道細胞に作用し、好酸球遊走性ケモカイン産生を促進する可能性について検討した。次にBSMCがdsRNAを認識する機構について検討した。BSMCはdsRNA受容体Toll like receptor-3(TLR3)mRNAを発現しており、TLR3 siRNAの存在下ではpolyI : Cによるeotaxin-1発現誘導は有意に抑制された。一方、フローサイトメトリー法ではBSMC表面のTLR3発現が確認できたが、中和抗体によりTLR3を阻害してもpolyI:Cによるeotaxin-1発現誘導を全く抑制できなかった。そこでTLR3の細胞局在を免疫蛍光染色法により検討したところ、polyI:Cの存在下ではTLR3が細胞内で凝集していることが確認された。さらに蛍光標識polyI:Cを用いた検討により、polyI : CとTLR3が細胞内で共局在すること、そのときTLR3はエンドソームマーカーEEA1と共在し、エンドソームの酸性化抑制剤であるBafilomycin A1がpolyI:Cによるeotaxin-1発現誘導を有意に抑制することを確認した。以上より、喘息気道のようにTh2サイトカイン優位な環境下では、ウイルス由来二本鎖RNAが気管支平滑筋細胞に作用し、エンドソーム内のTLR3と会合することでeotaxin-1などの好酸球性ケモカインの産生を誘導し、好酸球性気道炎症を悪化させる可能性が示唆された。RNAウイルス感染は喘息の急性増悪の誘因の80%を占める。昨年度までの研究で、RNAウイルス複製時に生じる二本鎖RNA(dsRNA)を認識する膜受容体Toll-like receptor 3(TLR3)が気管支平滑筋にも発現していることを確認し、喘息患者の気道のようにTh2サイトカイン優位な微小環境下では、dsRNA刺激により培養上清に好酸球遊走性ケモカイン(eotaxin-1,RANTES)が産生され、強力な好酸球遊走活性が認められることを確認した。これらの実験結果を踏まえ、今年度の研究では実際のRNAウイルス感染でも同様な現象が認められるかどうかをコロナウイルスを用いて検証することとし。培養ヒト気道上皮細胞(BEAS2B)/気管支平滑筋細胞(BSMC)にコロナウイルス株CoV229Eが感染しうることを確認し、ウイルス感染におけるTh2サイトカインの影響について検討した。BEAS2B、BSMCにウイルスを接種し、34°C/CO2 5%で45分インキュベーションの上感染させた。ウイルス接種後24-48時間後に細胞を固定し、免疫蛍光法(rabbit抗229E抗体)で感染を確認した。感染後24時間、48時間の細胞ではウイルス同様のN蛋白、M蛋白が増殖していることをウェスタンプロット法で検討した。また、感染細胞とその上清中のウイルスtiterをHela細胞を用いたウイルス量定量(タイトレーション)法で検討したところ、感染後24時間の時点で接種ウイルス量を超えており、感染後ウイルスが細胞内で増殖していることが確認された。また.CoV229Eのレセプターであるaminopeptidase NがBEAS2Bにおいて発現していることをリアルタイムRT-PCRで確認した。

以上よりヒト気道上皮細胞、気管支平滑筋細胞にRNAウイルスであるヒトコロナウイルス229Eが感染し、細胞内でウイルス蛋白が増殖することが確認された。また、ウイルスのレセプターであるaminopeptidase Nがヒト気道上皮細胞にも発現しており、ウイルス感染経路である可能性が示唆された。RNAウイルス感染は喘息の急性増悪の誘因の80%を占める。昨年度までの研究で、RNAウイルス複製時に生じる二本鎖RNAを認識する膜受容体Toll-like receptor 3(TLR3)が気管支平滑筋にも発現していることを確認し、喘息患者の気道のようにTh2サイトカイン優位な微小環境下では、dsRNA刺激により培養上清に好酸球遊走性ケモカイン(eotaxin-1, RANTES)が産生され、強力な好酸球遊走活性が認められることを確認した。また、培養ヒト気道上皮細胞(BEAS2B)/気管支平滑筋細胞(BSMC)にRNAウイルスであるヒトコロナウイルス株CoV229Eが感染し、細胞内でウイルス蛋白が増殖することを確認した。今年度の研究ではコロナウイルス感染におけるTh2サイトカインの影響についてBEAS2Bを用いて検討した。BEAS2BにはウイルスレセプターaminopeptidaseNが構成的に発現しており、その発現は合成二本鎖RNAであるpolyI : Cにより有意に亢進した。polyl : Cによるaminopeptidase N発現誘導はIL-4の存在下でさらに相乗的に増強されたことから、IL-4で24時間インキュベーション後にヒトコロナウイルスを感染させたところ、aminopeptidase Nの発現亢進と、感染細胞および上清中のウイルス量の増加傾向が確認された。以上の実験結果から、Th2サイトカイン優位な環境下ではTLR3シグナルを介してウイルスレセプターの発現が亢進し、ウイルス感染・増殖をさらに増幅する可能性があると考えられた。
非骨髄由来抗原提示細胞によるT細胞活性化機構の研究

T細胞を活性化する抗原提示細胞として骨髄由来の樹状細胞、活性化B細胞がよく知られている。これらの細胞は生体内で比較的に短命である。しかし、移植された組織、慢性GvH病において免疫反応は長期に亘って継続される。その機構として、骨髄由来でない細胞のT細胞活性化の役割が注目される。そこで、骨髄由来細胞になく、非骨髄由来細胞にのみアロ主要組織適合抗原が発現されるモデルマウスが不可欠である。そのために、超致死線量の放射線照射により骨髄(BM)キメラマウスを作成した。(a)BM->13Gy(axb)F_1,(下線はThy1.1コンジェニック)このキメラマウスに(a)のT細胞を新たにトランスファしたところ、T細胞は非骨髄由来細胞のbアロ抗原を認識し、その結果として、リンパ組織に停留した。後に、少ない数の活性化T細胞を産出した。次に、IL2トランスジェニックマウスの骨髄細胞をうえのモデルマウスの系に加えた。(a)+(a.IL2transgenic)mixed BM->3Gy(axb)F_1を作成し、(a)由来のT細胞のbアロ抗原に対する寛容を解析した。その結果、ともに存在するIL2を持続的に産生するtransgenic T細胞は、nontransgenicの(a)由来の細胞の寛容誘導に影響を与えなかった。従って、この系で見られる自己寛容は、IL2(他の細胞からのヘルプ)の欠乏に困らないことが、示唆された。加えて、活性化されたT細胞のcell-cycle理解のために、他のタイプのsomatic細胞も含めて未成熟染色体凝縮(PCC)を解析した。オカダ酸等のセリン/スレオニンホスファターゼ阻害剤により、M,G2のみならず広範なステージでPCCが誘導できた。これにより正常の染色体凝縮の要求性を探ると同時に染色体の動態を研究するうえでの重要な方法となる。
染色体の分子構成

大腸菌の染色体分配機構を明らかにするため、加藤は広田幸敬らのミュータントバンクから見いだした高温感受性parC変異株についてparC遺伝子の塩基配列を決定し、精製したParCタンパクのDNAおよび膜への結合能を明らかにした。平賀は染色体DNAが細胞内に不規則に分布するため、細胞分裂の際、2核の娘細胞と無核の娘細胞を出現する変異株3株について解析を進め、mukA遺伝子は外膜タンパクをコードするtolC遺伝子であり、mukB、mukCは新しい遺伝子であることを明らかにした。小椋はFプラスミドの分配機構に関与する宿主変異株hopA変異株を解析し、hopA変異はgyrB遺伝子に起こった変異で、変異株中ではFプラスミドDNAのrelaxationが起こり、分配に必須なSopBタンパクの産生が異常に増加していることを見いだした。今本はヒストン様タンパクのHU1、HU2の二重欠失変異株を分離し、種々の細胞機能への影響を調べ、Fプラスミドの複製開始の阻害、Muファージの増殖阻害等のあることを明らかにした。柳田は分裂酵母の染色体分配制御因子の変異株を多数分離解析して、nuc2遺伝子をクローニングし、この遺伝子が76kcのタンパクをコードすることを明らかにし、このタンパクが核骨格に存在するDNA結合タンパクであることを見いだした。堀内は先にプラスミドR6Kの終結部位をクローン化し、方向性のある終結DNA配列を明らかにしたが、大腸菌染色体にも同様な機構を持つDNA配列が複製終結点近傍に4箇所存在していることを明らかにした。また、この配列を識別するタンパクも同定した。西村はKプロジェクトによる多数の大腸菌高温感受性変異株のコレクションについて染色体断片のクローンバンクによる相補テストを行い、細胞分裂に関与する全fts遺伝子群の染色体地図を作製した。
モバイルデバイスを活用した下肢リンパ浮腫セルフケア支援システムの開発

本年度は、支援システム構築に向けての情報収集を中心に研究活動を展開した。まず、リンパ浮腫学会、リンパ浮腫治療学会、ILFJ(国際リンパ浮腫フレームワーク研究協議会)、日本がん看護学会に参加し、研究者たちがリンパ浮腫セルフケア支援についてどのような問題が生じており、どのような支援が必要だと考えているかを聞き取り調査した。その結果、特に弾性着衣や弾性包帯の装着について、適切にセルフケアを継続できず、医療機関を離れてしまう患者が多く、問題であると感じている医療者が多かった。さらに患者会(あすなろ会)の会長・副会長ら役員に聞き取り調査を行い、セルフケアを確立するまでの間に、どのような障害があるかを聞き取り調査した。その結果、セルフケアを行っていても、リンパ浮腫の症状が悪化したり、蜂窩織炎などの合併症やスキントラブルを生じたりすることも多く、「がんばっても無駄」と感じてしまう。また、日常生活の細々した注意事項について相談する人がいないことが多く、勝手な自己判断をしてしまい、症状を悪化させてしまうケースもあり、患者会が相談に応じる意義は大きいとのことであった。一方、モバイルデバイスの活用に関する件について、NTTドコモのコンサルタントに相談を開始した。セルフケア状況を尺度化しアプリにすることや端末で処理してデータ蓄積することは比較的簡単にできるとのことであった。セルフケア状況・リンパ浮腫の症状に応じて生活上の気を付けるべきことを、アプリ上に示すのは、パターンが幾種類も必要であるため簡単ではないとのことであった。セルフケアをすでに確立しているリンパ浮腫患者への半構成的面接に向け、リンパ浮腫の概念分析を実施した。今年度の聞き取り調査と概念分析により、半構成的面接への準備がほぼ整った。本年度は、セルフケア確率途上にある患者にインタビュー調査を行う予定であった。それは実施せず、予定を変更して、研究者が何を問題とし、どのような支援が必要であると捉えているのか、聞き取り調査を実施することが出来た。リンパ浮腫関連の学術大会に複数参加し、そこで情報収集を行えたことも、大きな収穫であった。またすでにセルフケアを確立し、しっかりセルフケアを継続している患者たちは、そこまでの経過の中でどのような問題に直面し、そのような支援を必要としたのか、聞き取り調査を実施することが出来た。それらの内容とリンパ浮腫セルフケア関連の用語の概念分析結果を踏まえ、リンパ浮腫セルフケア確立への問題点と必要な支援を明確にするための、半構成的面接を行う準備が整った。聞き取るべき内容を十分に検討することが出来たため、本年度の研究の基盤が出来た。さらに、セルフケア状況の尺度を作成しアプリ化する方向性が見えたことも、収穫であった。本年度は、リンパ浮腫患者会「あけぼの会」及び「ばらの会」のメンバーで研究協力の承諾が得られた者からインタビューを行い、リンパ浮腫セルフケア内容・方法、療養生活の中の不安・セルフケアに関する悩み等の抽出を行う予定である。アプリ化への方策も継続して検討を続ける。研究はほぼ順調に進展している。今年度も予定通り計画を実施していく予定である。既存のアプリについて、またモバイルデバイスについて、知識が豊富な助言者が得られれば、さらに研究が充実するものと考える。NTTドコモだけでなく、助言を得られる者を検討する。

またすでにセルフケアを確立し、しっかりセルフケアを継続している患者たちは、そこまでの経過の中でどのような問題に直面し、そのような支援を必要としたのか、聞き取り調査を実施することが出来た。それらの内容とリンパ浮腫セルフケア関連の用語の概念分析結果を踏まえ、リンパ浮腫セルフケア確立への問題点と必要な支援を明確にするための、半構成的面接を行う準備が整った。聞き取るべき内容を十分に検討することが出来たため、本年度の研究の基盤が出来た。さらに、セルフケア状況の尺度を作成しアプリ化する方向性が見えたことも、収穫であった。本年度は、リンパ浮腫患者会「あけぼの会」及び「ばらの会」のメンバーで研究協力の承諾が得られた者からインタビューを行い、リンパ浮腫セルフケア内容・方法、療養生活の中の不安・セルフケアに関する悩み等の抽出を行う予定である。アプリ化への方策も継続して検討を続ける。研究はほぼ順調に進展している。今年度も予定通り計画を実施していく予定である。既存のアプリについて、またモバイルデバイスについて、知識が豊富な助言者が得られれば、さらに研究が充実するものと考える。NTTドコモだけでなく、助言を得られる者を検討する。
Suffix Arrayを利用した全部分文字列による情報検索

昨年度は、ユーザによって入力された検索要求文のすべての部分文字列と、検索対象となる文書集合のすべての文字列をマッチングさせるシステムの構築・評価を行った。その結果、従来法からの精度向上を確認したが、さらなる精度向上と高速化が課題であることが明らかになった。今年度は、まず、全部分文字列を利用することによって性能が上がる理由、およびその限界を検討した結果以下のことが分かった。(1)品詞ごとの検索性能への寄与を調べたところ、従来法ではstop wordとして省かれる助詞や助動詞が以外に性能向上に寄与していることが分かった。これは、助詞等によって接続された複合語も1つの長い単語として扱う方がよいことを示している。(2)検索要求文の中では助詞で接続された長い複合語が、検索対象文献では助詞を省略した名詞連続で表現されている場合、昨年度提案した方法では長い複合語のままではマッチしないため、自動的に短い単語に分割されてしまう。その結果、検索精度が低下している。以上の2点より、部分的に異なってもできるだけ長い単語列でマッチングするシステムが性能・検索速度の面で有利であると考えた。これを反映させるために、マッチングの単位は単語であるが、マッチした単語が近傍に複数存在するときに類似度を上げるような検索システムを構築した。NTCIR-1の評価データを使って、条件を揃えて評価した結果、11pt平均適合率で、従来法が0.38、昨年度作成したシステムが0.40、今年度の提案システムが0.41の性能であり、精度面の向上を確認した。速度の面でも、昨年度より10倍程度の高速化を達成した。ユーザによって入力された検索要求文のすべての部分文字列と、検索対象となる文書集合のすべての文字列をマッチングさせて、検索要求に適合する文書に順位を付けて出力する検索システムの構築・評価を行った。具体的には以下の2つのシステムの開発を行った。1.すべての部分文字列をキーワードとして、Vector Spaceモデルを適用したシステム。この方法は、非常に多くのマッチングが必要であり、検索対象が制限されることが懸念されたが、Suffix Arrayとビタービアルゴリズムを併用する方法を開発したことにより、数十万件の検索対象に適用できることが明らかになった。2.IDF(Inverse Document Frequency)と呼ばれるキーワードの重要度を示すメジャーを用い、入力検索要求を最も重要な部分文字列から構成されるように分割した後に、Vector Spaceモデルを適用するシステム。これは、上記1のシステムの近似手法と考えられ、若干の精度低下をきたすが、10倍程度高速な検索を行うことができた。この手法は辞書構築等の人手の作業は必要なく、検索対象の文書集合そのものを辞書として日本語を単語分割する方法であり、自然言語処理の観点からも興味深い分割結果が得られた。公開の評価データであるNTCIR-1を用いて以上2つのシステムに加え、標準的な2つの手法を用いたシステムの検索精度評価を行った。標準的なシステムとは、Vector Spaceモデルの単位を単語あるいはバイグラムとしたシステムである。結果として、上記1の手法(0.34)、上記2の手法(0.31)、単語を単位とした手法(0.29)、バイグラムを単位とした手法(0.26)の順で精度がよいことが分かった(括弧の中は11ポイント平均適合度で、大きいほどよい結果である)。さらなる高速化が今後の課題である。
希少細胞の磁気分離に向けた機能性微粒子の開発

全血試料から高効率で血中循環腫瘍細胞を回収でき、かつ細胞にストレスを与えない条件下で磁性粒子と細胞を分離できる磁気細胞分離プロセスの開発を目指した。フェライトナノ粒子と温度応答性高分子から磁性集積体を作製し、その表面に生体分子認識性を持つタンパク質を吸着させることで、細胞分離用磁性粒子を作製した。粒子表面のタンパク質量を制御することで細胞回収率を25%程度から最大で60%まで増加させた。光学顕微鏡を用いたその場観察により、37°Cから4°Cの温度変化で粒子が吸着脱離している様子が観察され、本研究で作製した細胞分離用磁性粒子が低ストレスの磁気細胞分離プロセスに応用できる可能性を見出した。本研究では全血試料から95%以上の効率で血中循環腫瘍細胞を回収できる磁気細胞分離プロセスの開発を目指している。磁性体であるフェライトナノ粒子と温度応答性高分子から磁性集積体を作製し、その表面に生体分子の認識が可能なタンパク質(ストレプトアビジン)を吸着させることで温度により細胞との吸着・脱離が制御可能な機能性磁性粒子を作製した。集積体表面にストレプトアビジンを修飾する際に、温度を4°Cから37°Cまで変えたところ、高温にするほどストレプトアビジンの結合量が増大することがわかった。集積体表面のストレプトアビジン結合量を増大させることで、磁気細胞回収率は25%程度から最大で60%まで増加した。この結果から、生体分子を認識するタンパク質の結合量が細胞回収率の向上に強く関係していることがわかった。また、細胞を磁性集積体で標識する際に、添加する磁性集積体量を10マイクロgから40マイクロgまで調整したところ、20マイクロgの時に細胞回収率が極大を示すことがわかった。集積体表面に高密度で温度応答性高分子を修飾するために、アモルファスシリカから成るシェルを磁性粒子集積体に形成させた。この時、それぞれの粒子の磁気特性(体積当たりの磁気モーメント量)を均一にするために、サイズの揃った鋳型粒子表面に酸化鉄ナノ粒子を均一に集積させる手法を検討した。結果として、300 nm程度の粒子径を持つシリカ粒子表面に酸化鉄ナノ粒子が均一に集積した担持粒子を作製し、さらにその担持粒子表面にゾルゲル法を用いてシリカシェルを形成させ、シリカー酸化鉄ナノ粒子ーシリカ三層構造を得た。得られたコアシェル粒子表面とモノマーからサイズの揃った温度応答性磁性粒子の作製を検討している。生体分子認識性タンパク質の結合量を変えた実験から、タンパク質の結合量が細胞回収率の向上に強く関係していることを明らかにし、粒子表面にタンパク質を高密度で結合させる重要性を改めて示した。95%以上の回収率には至らなかったが、最大で60%と高い細胞回収率が得られている。また、細胞を磁気標識する際に添加する磁性粒子の添加量によって、細胞回収率が変化し、ある値で極大を示すことを明らかにした。これは、今後の磁気細胞分離実験をする際に極めて重要な知見となった。当初予定していたタンパク質の高密度集積には至らなかったが、その前段階であるコアシェル粒子の作製においては、新規プロセスを検討し、シリカと酸化鉄ナノ粒子から成る均一な三層構造を得ている。本研究では全血試料から95%以上の効率で血中循環腫瘍細胞を回収でき、かつ細胞にストレスを与えない条件下で磁性粒子と細胞を分離できる磁気細胞分離プロセスの開発を目指した。磁性体である酸化鉄ナノ粒子と温度応答性高分子から磁性集積体を作製し、温度応答性高分子上にストレプトアビジンを吸着させることで、抗原抗体反応を介した細胞認識性を持つ温度応答性磁性粒子を作製した。磁気細胞回収率の向上に寄与するストレプトアビジン結合量を増大させるために、ストレプトアビジンと磁性集積体を反応させる際の濃度、温度、時間の最適化を行い60%の細胞回収率を得ることができたが、それ以上の増大は確認できなかった。ストレプトアビジン結合量の増大(細胞回収率の増大)を目的に、シリカー酸化鉄ナノ粒子ーシリカ三層構造を持つコアシェル粒子を作製し、その表面に温度応答性高分子を結合させた。結果としてストレプトアビジン結合量の増大は確認されたが、細胞回収率は40%に留まった。この原因として体積当たりの磁化値が低い(粒子の磁気応答性が低い)ことが考えられる。作製した温度応答性磁性粒子と肺がん細胞の吸着脱離反応を、光学顕微鏡を用いてその場観察した結果、37°Cから4°Cの温度変化で磁性粒子が吸着脱離している様子が観察された。また、磁性粒子と細胞の吸着脱離反応は、数サイクルまで可逆性を示した。これらの結果から、ストレプトアビジンを結合させた温度応答性磁性粒子の体積当たりの磁性体量、表面のアビジン量を増大させることで、高効率で細胞に対して低ストレスの磁気細胞分離プロセスとなることを示した。

フェライトナノ粒子と温度応答性高分子から成る集積体においても、表面のタンパク質量を調整することで60%と高い細胞回収率が得られたが、さらに高い細胞回収率を得るためには構造の見直しが必要である。細胞回収率に最も影響する要因を今回の実験結果から生体分子を認識するタンパク質の結合量だと考え、モノマー重合による高分子合成を試みる。既にシリカと酸化鉄ナノ粒子から成るコアシェル粒子を得ているが、コアシェル粒子表面での均一なモノマー重合は成功していない。粒子の分散性を維持しつつモノマー重合を行うには濃度の調整や反応速度の制御が必要であるが、専門的な知識と経験が必要である。そこで、高分子化学を専門とする教員に助言を求め、共同で実験を進めることでモノマー重合を行うこととした。次年度は細胞分離にさらに適したナノ構造体を作製し、95%以上の細胞回収率を得るために、高分子重合度や末端の構造について検討を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
木質構造躯体の劣化に与える水分停滞と温湿度環境の影響

本研究では木質構造躯体の腐朽劣化を発生させ促進させる水に関する影響を調査し,その対処法となる木造住宅の構工法を開発することを目的とした。本研究では(1)現存する木造住宅の劣化調査および文献調査による腐朽発生条件の絞り込み,(2)現場調査にて得られた腐朽した木質部材の強度試験を行い,腐朽度と部材強度との関係を明らかにすること,(3)現場調査で得られた周囲環境を実験室にて再現し,温湿度設定による木質部材の腐朽促進試験方法を確立すること,(4)水蒸気と液体の水の木造壁体内での移動をシミュレートし腐朽可能性を判断すること等を具体的な小課題とした。以上の一部は,文部科学省「大都市大震災軽減化特別プロジェクト」の一環で行われており,同プロジェクトに参画し協力を得ていたものである。(1)腐朽発生条件の絞込み現存する木造住宅の調査として,新潟県与板町の町営住宅,静岡県島田市の市営住宅および神奈川県横浜市の個人宅について劣化調査と壁体内外の温湿度測定を行った。文献調査の結果と比較すると,腐朽劣化は雨仕舞を含む外壁ディテールの違いに大きく起因するものと判断された。材料腐朽は台所,風呂場といった水回りに多く,おおよそ予測できるものでありその分布は数的に評価できた。(2)腐朽した木質部材の強度試験劣化調査の際いくつかの劣化部材を得ることができたが強度試験については試験中である。部材腐朽度の指標となる物理量を調査するため超音波伝播速度,ドリル穿孔抵抗値の測定を行い,現場での測定を想定した可搬型機器による腐朽評価法を検討した。(3)木造壁体内における水分移動シミュレーション壁体の仕様と与えられた温湿度変動との関係から,壁体内の木質部材の腐朽可能性を検討した。実測された調査物件での温湿度および部材含水率のデータは対象物件の管理機関との兼ね合いから測定期間が最長でも1ヶ月と短く,より長期のデータ収集が必要となることが確認された。本研究では(1)現存する木造住宅の劣化調査および文献調査により腐朽の発生に関する条件を絞り込むこと,(2)現場調査にて得られた腐朽した木質部材の強度試験を行い,腐朽度と部材強度との関係を明らかにすること,(3)水蒸気と液体の水の木造壁体内での移動をシミュレートし腐朽可能性を判断すること等を具体的な小課題としている。それぞれの小課題について研究実績を示す。(1)腐朽発生条件の絞込み現存する木造住宅の調査として,新潟県与板町の町営住宅,静岡県島田市の市営住宅および神奈川県横浜市のSH邸について劣化調査と壁体内外の温湿度測定を行った。確認された腐朽劣化は外壁仕様の違いに起因するものと判断された。現存する住宅の劣化調査はケーススタディとして重要であり今後も調査を行いデータの収集を続ける予定である。(2)腐朽した木質部材の強度試験劣化調査の際,いくつかの劣化部材を得ることができた。強度試験については今後の課題としているが,部材腐朽度の指標となる物理量を調査するため超音波電波速度,ドリル穿孔抵抗値,釘圧縮抵抗値の測定を行い,現場での測定を想定した可搬型機器による腐朽評価法を検討している。(3)木造壁体内における水分移動シミュレーション室内外の温度変動から壁体内の温湿度および壁体を構成する木質部材の含水率を予測するシミュレーションを行う。条件として与える温湿度データは(1)において実測された値を用いる予定である。本シミュレーションにより,壁体の仕様と与えられた温湿度変動との関係から,壁体内の木質部材の腐朽可能性を検討する。これまで実測された温湿度および部材含水率のデータは対象物件の管理機関との兼ね合いから測定期間が最長でも1ヶ月と短く,シミュレーションには1年程度の期間の測定を必要としており,適当な調査物件を探索中である。

部材腐朽度の指標となる物理量を調査するため超音波伝播速度,ドリル穿孔抵抗値の測定を行い,現場での測定を想定した可搬型機器による腐朽評価法を検討した。(3)木造壁体内における水分移動シミュレーション壁体の仕様と与えられた温湿度変動との関係から,壁体内の木質部材の腐朽可能性を検討した。実測された調査物件での温湿度および部材含水率のデータは対象物件の管理機関との兼ね合いから測定期間が最長でも1ヶ月と短く,より長期のデータ収集が必要となることが確認された。
鳥類胚消化管内胚葉は胚盤葉下層により胚盤葉上層から誘導されるか

鳥類胚では,将来消化管内胚葉になる細胞は胚盤葉期には胚盤葉上層に存在し,続く原条期において原条を通って上層より下層へ陥入してくることにより生ずるが,消化管内胚葉が成立する機構については不明である。本研究では,胚盤葉期鶏胚を用い,本来と異なる位置に実験的に2次胚の形成を誘導し,消化管内胚葉の形成が起こるか検討した。胚盤葉期における予定消化管内胚葉細胞の局在:胚の微小領域を蛍光色素(CM-DiI等)で標識しインビトロで原条期まで発生させ標識細胞の運命を追跡することにより,胚盤葉上層後部の細胞が中胚葉が消化管内胚葉に寄与し前半の細胞は主に外胚葉と胚外内胚葉になることを明らかにし,これまでの報告を確認した。2次胚における胚内内胚葉の形成:胚盤葉期鶏胚の前半部を後半より切り放し,その明域前縁部に鶉胚より切り出した胚盤葉下層後部(Koller's sickleを含む)を移植して培養し,その影響により本来生ずることのない2次的な原条を形成させた。この時胚盤葉上層の一部を標識しておくことにより,本来胚内の内胚葉にはならないはずの上層前部の細胞が形成された2次胚の原条近傍の胚内内胚葉に寄与することを確認した。2次胚胚内内胚葉の消化管内胚葉への分化:2次胚の原条を含む範囲を切り出し鶏3日胚体腔内に移植して長期間培養し,2次胚が本当に胚体を形成するか検討した。表皮・神経などの外胚葉組織や軟骨・筋などの中胚葉組織の他,胃・腸などの消化管内胚葉が分化し,さらにこれらの組織が移植片由来(鶉細胞)でなく胚盤葉上層前部の(鶏)細胞由来であることを確認した。以上より,本来外胚葉と胚外内胚葉になる胚盤葉上層前部の細胞は胚盤葉下層後部の影響により消化管内胚葉になり得ることが示された。
アポトーシス阻害因子であるPI-9の細胞内他因子との相互作用の解析

PI-9は免疫細胞からの攻撃、特にCTLやNK細胞からのGrBによる攻撃に抵抗性とするために役立っていることがわかっている。PI-9はcaspaseI、elastaseなどの因子とも相互作用することが知られてきており、多くの細胞内因子と相互作用をし、生理的に重要な働きをしていると考えられる。Tet-offシステムを用い、PI-9を細胞内に発現制御し、細胞内の他因子との相互作用を検討できる系を構築した。この系を用いて実際、NK細胞、GrBからの攻撃をPI-9が防ぐことを確認した。今後、この培養細胞系を用いてPI-9と他の細胞成分との相互作用を検討することが可能となった。Biotin化したPI-9を大腸菌に発現させ高純度に精製する系を構築し、recombinant PI-9を得た、phage display法を用いて3サイクルのセレクションでPI-9に高親和性で結合するペプチドを選別することに成功した。同一のアミノ酸配列「LLADTTHHRPWT」を含むクローンを3クローン得て、この配列をPI-9認識配列と考えた。データベース・サーチを行なったところ複数の既知及び未知の蛋白にこの配列と相同な配列が存在し、これまで未知であったPI-9結合蛋白が複数存在することが示唆された。今後、これらのPI-9結合候補蛋白の個々の解析を行ない、生理的に重要なPI-9との相互作用を検討していくことが可能となった。1.有核細胞発現プラスミドの作成tetracycline(Tet)で発現誘導のできる強力なブロモーターの下流にProteinase inhibitor-9(PI-9)cDNAを構築した。エストロゲン受容体を恒常的に発現するHepG2細胞HepG2-ER7(J Biol Chem275, 5867-5873, 2000)を24時間エストロゲンにて刺激することにより、PI-9mRNAの発現誘導を行なった。細胞よりRNAを回収し、RT-PCR法にてPI-9cDNAを得た。PCR産物をSacII-NotIで消化し、pUHD10-3(Science248, 480-483, 1990)のSacII-XbaI siteに構築した。このプラスミドをpTRE-PI-9とした。導入したDNA断片の配列は両向きから塩基配列を読むことにより確認した。また、pTRE-PI-9が機能するPI-9を発現することを、HepG2細胞を用い、一過性遺伝子導入を行ない、細胞より蛋白を回収し、ウェスタンブロット法を行なうことにより確認した。2.PI-9ステーブル発現細胞の樹立ヒト肝細胞株HepG2にtransactivatorであるVP16/tetO発現プラスミドをG418をselection markerとし導入した細胞株HY-ToffにpTRE-PI-9をHindIIIで消化後、遺伝子導入し、Puromycineで選択することにより、ステーブル発現細胞を樹立した。これらのステーブル発現細胞のRNA、蛋白をそれぞれRT-PCR法、ウェスタンブロット法で解析し、RNAレベル、蛋白レベルで高レベルのPI-9の発現を認め、Tetにより、その発現が抑制されることを確認した。1.大腸菌発現プラスミドの作成および大腸菌でのProteinase inhibitor-9(PI-9)発現、精製PromegaのPinPoint XaProtein Purification Systemを用いてPI-9の発現、精製を試みた。大腸菌発現プラスミドであるPinPoint ExpressionvectorにPI-9cDNAを構築した。大腸菌に同プラスミドを導入し、Biotin化したPI-9融合淡白を発現させた。Avidin resinを用いて蛋白を精製し、Biotin標識されたtag蛋白を切断した。蛋白の同定は電気泳動後の銀染色、また、ウエスタンプロット法を行なうことにより試みた。2.PI-9ステーブル発現細胞の樹立昨年度樹立したPI-9ステーブル細胞株をさらに樹立し、より効率の良いPI-9の発現の見られる細胞株を得た。ヒト肝細胞株HepG2にtransactivatorであるVP16/tetO発現

プラスミドをG418をselection markerとし導入した細胞株HY-ToffにpTRE-PI-9をHindIIIで消化後、遺伝子導入し、puromycineで選択することにより、ステーブル発現細胞を得た。これらのステーブル発現細胞のRNA、蛋白をそれぞれRT-PCR法、ウェスタンブロット法で解析し、RNAレベル、蛋白レベルで高レベルのPI-9の発現を認めた。今年度はPI-9発現量が多く、tetracyclineにより発現調整をより効率良く受けるクローンを同定した。PI-9は免疫細胞からの攻撃、特にCTLやNK細胞からのGrBによる攻撃に抵抗性とするために役立っていることがわかっている。PI-9はcaspaseI、elastaseなどの因子とも相互作用することが知られてきており、多くの細胞内因子と相互作用をし、生理的に重要な働きをしていると考えられる。Tet-offシステムを用い、PI-9を細胞内に発現制御し、細胞内の他因子との相互作用を検討できる系を構築した。この系を用いて実際、NK細胞、GrBからの攻撃をPI-9が防ぐことを確認した。今後、この培養細胞系を用いてPI-9と他の細胞成分との相互作用を検討することが可能となった。Biotin化したPI-9を大腸菌に発現させ高純度に精製する系を構築し、recombinant PI-9を得た、phage display法を用いて3サイクルのセレクションでPI-9に高親和性で結合するペプチドを選別することに成功した。同一のアミノ酸配列「LLADTTHHRPWT」を含むクローンを3クローン得て、この配列をPI-9認識配列と考えた。データベース・サーチを行なったところ複数の既知及び未知の蛋白にこの配列と相同な配列が存在し、これまで未知であったPI-9結合蛋白が複数存在することが示唆された。今後、これらのPI-9結合候補蛋白の個々の解析を行ない、生理的に重要なPI-9との相互作用を検討していくことが可能となった。
海洋生物の生活史進化の理論的研究:空間的・時間的に大きく変化する環境への適応

時間的・空間的に不均質な環境条件に対する海洋生物の生活史戦略を研究するための対象として、潮間帯に棲むハナビラダカラMonetaria annulusを扱っている。変態後の決定成長を示す本種では、波あたりの強い生息地では弱い生息地に比べて体サイズの大きな個体が多く見つかる。第一の課題として、この空間パターンが個体群間での遺伝的差異に基づくのかどうかを明らかにするために、サイズの差が著しい沖縄本島の二個体群から採集した幼貝を実験室内の同一環境で飼育した。このCG実験(common-garden experiment)の結果、野外で観察される体サイズの差異は、遺伝的差異に基づく変態サイズの違いを反映したものではないことが実証された。第二の課題として、野外で上述の空間パターンが生じるメカニズムの解明がある。必要な情報を集めるために野外調査を実施した結果、(1)波あたりの弱い生息地では夏季に水温が上がり大量死が起こる;(2)両生息地で変態サイズは冬に大きく夏に小さくなる;(3)変態後の死亡率にサイズ依存性はないことが判明した。以上の結果を前提として、サイズ構造を伴う個体群モデルを解析したところ、変態サイズに季節性がある場合には夏季の大量死が波あたりの弱い生息地の平均体サイズを小さくする効果を持つことが証明された。一方、最大尤度に基づくノンパラメトリック回帰分析の結果、表現型可塑性を介した変態サイズの群間変異は夏季に限って観察され、上述のパターンを単独で説明するには不十分な規模であることが判明した。以上の結果は、「海洋性ベントスで広く見られる形態形質の種内空間変異は表現型可塑性を反映したものである」という従来の予測に反するものである。本研究の目的は、時間的に大きく変動し、また空間的に著しく不均一な生息地の環境に対する海洋生物の適応を、数理モデリング・野外調査・飼育実験によって研究することである。本年度は特に環境の季節的・確率的変動に対する適応を研究する上での第一歩として、沖縄本島で野外調査と飼育実験を実施し、タカラガイの生活史に関するデータを収集した。その結果、古くから知られていたCypraea annulusハナビラダカラの貝殻形態の空間変異は、成長期以後の形態依存的な選択の結果として形成されるのではなく、成長期が終了した時点ですでに確立することが判明し、このことから形態の違いは環境の違いに基づく表現型可塑性の結果である可能性が濃厚となった。夏期の高温で大量斃死が生じる潮間帯上部の個体群では、成長後の体サイズが小さく、殻が薄いというデータを得た。すでに発表している数理モデルに基づき最適生活史を計算した結果、夏期の高い死亡率はこれらの形態の空間変異を有利にする選択圧として説明できることが判明した。夏期に大量斃死の起こる環境では、体サイズの増大と殻の厚化をあきらめて早期に繁殖を開始する戦略が有利となる。しかしながら、成長期は晩秋から春にかけてであるため、タカラガイは自分の生息地が夏期に温度の上がる場所であるかどうかをあらかじめ予測しなければならない。タカラガイが環境を予測するために用いているキュー(環境シグナル)が何であるかを明らかにするために、異なった条件下でハナビラダカラを稚貝から育てる飼育実験を行った。その結果、捕食者の臭いを加えたり、同種個体密度を上げて飼育した場合に最終体サイズが小さくなることが判明した。この結果は、潮間帯上部ほど干潮時のタイドプール内の臭い物質濃度が高くなるため、タカラガイが生物由来の臭いを環境予測のためのキューとして用いているという仮説に整合するものである。入江は沖縄本島を基点に、潮間帯棲腹足類タカラガイ(Cypraea属)に見られる体サイズやそれ以外の生活史形質に関する集団間表現型地理的変異を進化生態学の観点から研究している。2005年度までに繰り返し実施されている野外調査によって、沖縄本島においてはハナビラダカラの体サイズは水深の浅い生息地ほど小さく、また同種個体密度の高い場所ほど小さくなることが判明している。2006年度上半期には、ハナビラダカラの成貝に関して、野外において体サイズ依存的な死亡率の違いが存在するかどうかを直接的に検証するために、夏をはさんだ標識再捕調査を行った。また11月からは体サイズのまったく異なる個体を産する沖縄本島の2個体群から得られたハナビラダカラの稚貝を室内の同一環境で飼育する実験を行った。その結果として、少なくとも沖縄本島内で観察される体サイズの個体群間変異は、空間的な環境の違いを反映した表現型可塑性の産物であることが判明した。対外的な活動としては、2006年度はアメリカ合衆国のStony Brook大学で開催された「Evolution2006」と、九州大学で開催された「数理生物学会日韓合同大会」というふたつの国際学会で、研究成果を発表した。また国内の学会では、4月に東京で開催された日本貝類学会大会と8月に東京で開催された日本進化学会大会において研究成果を発表した。また、3月に松山で開催された日本生態学会大会では、「生活史研究における問題点:海洋性ベントスの場合」というシンポジウムをオーガナイズし、海洋性ベントスの生活史進化を研究する上での理論的研究の重要性を訴えた。

第一の課題として、この空間パターンが個体群間での遺伝的差異に基づくのかどうかを明らかにするために、サイズの差が著しい沖縄本島の二個体群から採集した幼貝を実験室内の同一環境で飼育した。このCG実験(common-garden experiment)の結果、野外で観察される体サイズの差異は、遺伝的差異に基づく変態サイズの違いを反映したものではないことが実証された。第二の課題として、野外で上述の空間パターンが生じるメカニズムの解明がある。必要な情報を集めるために野外調査を実施した結果、(1)波あたりの弱い生息地では夏季に水温が上がり大量死が起こる;(2)両生息地で変態サイズは冬に大きく夏に小さくなる;(3)変態後の死亡率にサイズ依存性はないことが判明した。以上の結果を前提として、サイズ構造を伴う個体群モデルを解析したところ、変態サイズに季節性がある場合には夏季の大量死が波あたりの弱い生息地の平均体サイズを小さくする効果を持つことが証明された。一方、最大尤度に基づくノンパラメトリック回帰分析の結果、表現型可塑性を介した変態サイズの群間変異は夏季に限って観察され、上述のパターンを単独で説明するには不十分な規模であることが判明した。以上の結果は、「海洋性ベントスで広く見られる形態形質の種内空間変異は表現型可塑性を反映したものである」という従来の予測に反するものである。
多様な送粉動物の利用における開花時刻の適応的意義（国際共同研究強化）

2017年10月1日からドイツ・ダルムシュタット工科大学に滞在し、本研究の課題遂行を開始した。まず、渡航直後から滞在中をつうじ、花が多様な訪花動物との相互作用に適応する際の制約となる「表現型トレードオフ」と「機会トレードオフ」について、共同研究者のユルゲンス博士と議論を重ねた。その結果、これらのトレードオフの成因とその進化的帰結を正しく理解することが、生物間相互作用における「特殊化」に関する既存の概念の混乱の解決につながることに気づいた。さらに、トレードオフの存在下で多様な動物を送粉に利用するための「適応的一般化」が、花の形質の多様化、あるいは送粉シンドロームと呼ばれる特定の形質の進化的むすびつきをもたらしたのではないか、というアイデアに至った。これらの議論を土台に、現在、トレードオフの概念を整理し、かつ新しい仮説を提唱する総説論文を、2本分の内容に分けて執筆中である。また、2018年3月から5月にかけて、ヘッセン州オーデンバルド郡の4つのバッコヤナギ自生地において、昼夜の送受粉に関する野外調査を実施した。調査では、昼夜の送受粉の成否を左右しうるパラメータとして、花粉の寿命と温度の関係、開花時刻、雄株と雌株の距離を計測するとともに、風による送受粉、昼行性の昆虫(ハナバチ類、チョウ類)による送受粉、夜行性の昆虫(着花性ガ類)による送受粉が、それぞれ結実率にどれだけ貢献するかを定量的に明らかにするため、袋がけ実験をおこなった。袋がけ実験の結果は、2019年3月までに結実率の計測を終え、現在データ解析中である。解析を終了次第、原著論文にまとめて国際誌に発表する予定である。また、滞在中にはスマートフォンを用いた簡易UV写真撮影法を考案し、現在これについても、国際誌への発表のため論文を執筆中である。以上のように、本計画の実績として、4本の原著論文を国際誌に発表する予定である。内定年度:2015当該年度の前半は、共同研究先の独ダルムシュタット工科大学ユルゲンス教授と、次年度からの渡航に向けて綿密な打ちあわせを行った。これにより、2017年10月初旬から2018年9月末までのあいだ現地に滞在し、本研究計画を遂行することについて、最終的な合意に至った。また、滞在中の研究計画についても検討し、本計画に含まれる複数の植物種(ヤナギ属3種およびマンテマ属3種)の調査が可能な自生地が利用可能であることを確認した。さらに議論を重ねるうち、開花時刻の適応的意義に関する申請者の仮説を直接的に確かめるための、チャンバーを用いたマンテマ属の室内実験を新たに発案し、研究内容に追加することとなった。これらの計画に加え、生物間相互作用における「特殊化」に関する既存の概念に混乱があるとの共通認識に基づき、明確に定量できる「特殊化」の指標の提案をめざした論文執筆を共同で行うことにも合意した。滞在期間中のこれらの研究成果が計画通り遂行できれば、少なくとも3本の原著論文を国際誌に発表できると見込んでいる。当該年度の後半は、渡航日程を含めた上記の合意に基づき交付申請書を立案提出すると共に、VISAの取得、滞在中の住居探し、滞在中の国内勤務先における非常勤講師の手配など、必要な諸手続きを開始した。なお交付申請が認可されたのが2017年1月であったため、当該年度に交付となった本計画のための研究費は未使用である。渡航は次年度の10月であるため、現時点における実績としては、渡航滞在に必要な諸手続についての情報収集、購入すべき物品リストの積みあげなど、研究の準備段階における進展に留まっている。しかしながら、これらは交付申請書で計画した準備作業の着実な遂行であり、今のところすべて予定通り、順調に進展していると言ってよい。当該年度10月の渡航後から1月にかけて、渡航先の独ダルムシュタット工科大学ユルゲンス教授と共同で執筆する総説論文のための議論を重ねた。その結果、異なるタイプの送粉者がもたらす淘汰圧のちがいと、それによって形質にはたらくトレードオフは、特定の送粉者に対する花形質の「特殊化」だけでなく、幅広い種類の送粉者に対する「一般化」においても、重要な進化的駆動力になりうるとの推論に至った。この仮説の妥当性を示唆する先行研究の概説と、仮説を直接検証する方法の提案を軸に、花の形質進化における特殊化と一般化に関する統合的な理論的枠組みを提供する総説論文の執筆を開始した。また2月より、ヤナギ属2種の自生地(4集団)における野外調査を開始した。デジタルカメラのインターバル撮影により、いずれの種も葯の裂開や柱頭の成熟は主に日没前後に起こることがわかった。この原因を、物理環境と送粉環境の両面からさぐるため、まず早春における気温の激しい変動がヤナギの繁殖におよぼす影響を、人工授粉と花粉生存率の両面から評価する実験をおこなった。さらに、昼の送粉者であるハナバチ類と夜の送粉者であるガ類がそれぞれもたらす受粉の量と質を評価するため、昼間のみ袋がけ、夜間のみ袋がけの野外実験をおこなった。花期が終了次第、これらの処理間で結実率と種子発芽率を比較する予定である。結果をもとに、受粉への貢献において昼夜の送粉者間で生じうる負の相互作用が、日没時の開花によって緩和されていること、これによってヤナギの「昼夜の送粉者への一般化」が可能となっていることを示唆したい。