hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト胎盤栄養膜細胞における酸化ストレス負荷によるメタボローム解析

妊娠高血圧症候群は重症度の差はあるが高頻度に認められる産科合併症である。妊娠高血圧症候群の発症には種々の要因が関わっているが、その病態は胎盤虚血による低酸素、低栄養が影響していると考えられている。この研究ではヒト胎盤絨毛を構成する栄養膜細胞を用いて種々の手法により胎盤虚血モデルを作成し、代謝産物の網羅的解析を行う。虚血に陥った胎盤絨毛細胞ではどのような代謝経路の変化が起こっているのかを明らかにすることで、病態の更なる解明を目的としている。解析にはガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)を用いて胎盤虚血モデルにおける代謝産物の変化について測定し、またその結果について多変量解析を行う。
白血球細胞骨格系のダイナミクスに基づく感染防御機構の解明

申請者が同定したp65/L-plastinは,白血球に特異的に発現され,アクチン細胞骨格の再構築(p65-actin-scaffold)に関与している。p65-actin-scaffoldは菌体刺激によって随時形成され,これを中心に形成される高次タンパク質集合体が,感染防御的細胞応答の基盤として機能すると想定している。p65/L-plastinとともに細胞骨格のダイナミクスに関与するタンパク質,およびp65-actin-scaffoldと高次タンパク質集合するタンパク質としてNADPHオキシダーゼp47^<phox>などについて,特異抗体を用いてp65-actin-scaffoldとの共存関係を調べた。また,マクロファージ内でのそれらの局在変化と貪食・細胞接着や殺菌活性の増強との関連を評価した。ルミノール結合ビーズを用いて,貪食依存性の活性酸素酸性定量法を確立し,細胞骨格の再構成が活性酸素産生において重要であることを明らかにした。p65/L-plastin, WASP, VAVに関して,それぞれの欠損は貪食・細胞接着依存性の活性酸素産生の障害をきたすことを考え合わせ, p65-actin-scaffoldを中心とする細胞骨格系のダイナミクスが,白血球の感染防御活性の発現において重要な役割を担うと考えられた。申請者が同定したp65/L-plastinは、白血球に特異的に発現され、アクチン細胞骨格の再構築(p65-actin-scaffold)に関与している。p65-actin-scaffoldは菌体刺激によって随時形成され、これを中心に形成される高次タンパク質集合体が、細胞接着・活性化や殺菌活性の増強などの感染防御的細胞応答の基盤として機能すると想定している。細胞骨格のダイナミクスに関与する候補タンパク質と、さらに、形成されたp65-actin-scaffoldと高次タンパク質集合する候補タンパク質を選択した。マクロファージcDNA libraryからPCR法で全長のcDNAを調製し、本学の無細胞生命科学研究センターに既設のタンパク質自動合成システムを用いて、各タンパクの調製をすすめた。特異抗体を用いて、これらのタンパクとp65-actin-scaffoldの共存関係について蛍光顕微鏡を用いて観察した。また、細胞接着や細菌殺菌活性の増強との関連を評価した。ルミノール結合ビーズを用いて、貧食依存性の活性酸素酸性定量法を確立した。この系で、細胞骨格の再構成が活性酸素産生において重要であることを明らかにした。白血球の重要な感染防御反応を、p65-actin-scaffoldを中心とする細胞骨格系のダイナミクスに基づいて解明することは、細胞レベルと分子レベルを結ぶもので、感染制御への応用発展につながる点で重要である。p65-actin-scaffoldは菌体刺激によって随時形成され,これを中心に形成される高次タンパク質集合体が,細胞接着・活性化や殺菌活性の増強などの感染防御的細胞応答の基盤として機能すると想定している。p65/L-plastinとともに細胞骨格のダイナミクスに関与するタンパク質としてWASP, VAV,および,形成されたp65-actin-scaffoldと高次タンパク質集合するタンパク質としてNADPHオキシダーゼp47phoxなどについて,マクロファージcDNA libraryからPCR法で全長のcDNAを調製し,タンパク質合成・精製をすすめた。特異抗体を用いて,これらのタンパクとp65-actin-scaffoldの共存関係について調べた。また,マクロファージ内でのそれらの局在変化と貧食・細胞接着や殺菌活性の増強との関連を評価した。ルミノール結合ビーズを用いて,貧食依存性の活性酸素酸性定量法を確立し,アクチン骨格系の阻害剤の効果を調べ,細胞骨格の再構成が活性酸素産生において重要であることを明らかにした。p65/L-plastin, WASP, VAVに関して,それぞれ欠損は貧食・細胞接着依存性の活性

酸素産生の障害をきたすことを考え合わせ,p65-actin-scaffoldを中心とする細胞骨格系のダイナミクスが,白血球の感染防御活性の発現において重要な役割を担うと考えられた。
神経芽種における癌抑制遺伝子に関する研究

小児固形悪性腫瘍のうちで最も頻度の高い神経芽種は,集学的治療の導入にも拘わらず,1歳以上進行症例は予後はいまだ不良である.従って,その発癌のメカニズムの解明が急がれている.神経芽種に関しては1歳以上の進行症例ではN-myc癌遺伝子の増幅は認められるが,1歳未満の予後良好例では進行症例であってもN-myc癌遺伝子の増幅は認められない.1歳未満症例の腫瘍においてどのような遺伝子の欠失ないし突然変異がおこっているかはいまだ明らかでない.本研究の目的は,神経芽種について(1)H-ras癌遺伝子の増幅,発現および点突然変異(2)癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現および点突然変異の有無を検討し,神経芽種の発生,進展に関する遺伝子を明らかにすることであり,大阪大学小児外科および関連施設で経験した神経芽種に関して以下の検討を行った.Ha-rasの遺伝子産物であるp21の発現を検討したところ,予後良好である早期症例および1歳未満症例に発現が見られるのに対し,1歳以上の進行例では発現が認められず,この結果は成人の腫瘍と反対である.現在このp21の発現が遺伝子の変異に起因するものかどうか検討中である.癌抑制遺伝子のひとつであるp53の発現に関しても,免疫組織染色では発現頻度は5.9%と低率であり,PCR-SSCP法では明らかな点突然変異は認められなかった.以上の結果より,神経芽種の悪性化にはp53の関与は低いものと考えられた.小児固形悪性腫瘍のうちで最も頻度の高い神経芽種は,集学的治療の導入にも拘わらず,1歳以上進行症例は予後はいまだ不良である.従って,その発癌のメカニズムの解明が急がれている.神経芽種に関しては1歳以上の進行症例ではN-myc癌遺伝子の増幅は認められるが,1歳未満の予後良好例では進行症例であってもN-myc癌遺伝子の増幅は認められない.1歳未満症例の腫瘍においてどのような遺伝子の欠失ないし突然変異がおこっているかはいまだ明らかでない.本研究の目的は,神経芽種について(1)H-ras癌遺伝子の増幅,発現および点突然変異(2)癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現および点突然変異の有無を検討し,神経芽種の発生,進展に関する遺伝子を明らかにすることであり,大阪大学小児外科および関連施設で経験した神経芽種に関して以下の検討を行った.Ha-rasの遺伝子産物であるp21の発現を検討したところ,予後良好である早期症例および1歳未満症例に発現が見られるのに対し,1歳以上の進行例では発現が認められず,この結果は成人の腫瘍と反対である.現在このp21の発現が遺伝子の変異に起因するものかどうか検討中である.癌抑制遺伝子のひとつであるp53の発現に関しても,免疫組織染色では発現頻度は5.9%と低率であり,PCR-SSCP法では明らかな点突然変異は認められなかった.以上の結果より,神経芽種の悪性化にはp53の関与は低いものと考えられた.小児固形悪性腫瘍のうちで最も頻度の高い神経芽腫は、集学的治療の導入にも拘らず、1才以上進行症例の予後はいまだ不良である。従って、その発癌のメカニズムの解明が急がれている。神経芽腫に関しては1才以上の進行症例ではN-myc癌遺伝子の増幅は認められるが、1才未満の予後良好症例では進行症例であってもN-myc癌遺伝子の増幅は認められない。1才未満症例の腫瘍においてどのような遺伝子の欠失ないし突然変異がおこっているのかはいまだ明かでない。本研究の目的は、神経芽腫について(1)癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現および点突然変異,(2)第1染色体短腕におけるヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity)の有無(3)H-ras癌遺伝子の増幅、発現および点突然変異を検討し、神経芽腫の発生・進展に関与する遺伝子を明かにすることである。平成5年度においては大阪大学小児外科および関連施設で経験した神経芽腫症例に関して以下の検討を行った。N-rasの遺伝子産物であるp21の発現を検討したところ予後良好である早期症例および1才未満症例に発現がみられるのに対し、1才以上の進行例では発現が認められず、この結果は成人の腫瘍と反対である。したがってこのp21の発現は成人の腫瘍と同じ様にpoint mutationによるものかどうかを検討中である。癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現に関しても免疫組織染色では発現頻度は11%と低率であり、PCR-SSCP法では明かな点突然変異は認められなかった。以上の結果より、神経芽腫の悪性化にはP-53の関与は低いものと考えられた。小児固形悪性腫瘍のうちで最も頻度の高い神経芽腫は,集学的治療の導入にも拘わらず,1歳以上進行症例の予後はいまだ不良である.従って,その発癌のメカニズムの解明が急がれている.神経芽腫に関しては1歳以上の進行症例ではN-myc癌遺伝子の増幅は認められるが,1歳未満の予後良好例では進行症例であってもN-myc癌遺伝子の増幅は認められない.1歳未満症例の腫瘍においてどのような遺伝子の欠失ないし突然変異がおこっているかはいまだ明らかでない.本研究の目的は,神経芽腫について(1)H-ras癌遺伝子の増幅,発現および点突然変異(2)癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現および点突然変異,(3)第1染色体短腕におけるヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity)の有無を検討し,神経芽腫の発生,進展に関する遺伝子を明らかにすることである.

平成5年度において,大阪大学小児外科および関連施設で経験した神経芽腫に関して癌抑制遺伝子のひとつであるp53の発現に関して,免疫組織染色による発現の検討および,PCR-SSCP法による点突然変異の検討を行い,神経芽腫の悪性化にはp53の関与は低いものとの結論を得たが,平成6年度は新たに発見された癌抑制遺伝子p16について点突然変異の有無を検討した.現在のところ明らかな変異は検出されておらず,p16に関しても神経芽腫の悪性化における関与は低いものと考えられた.
CDKによるDNA複製開始制御機構の解明

真核細胞の細胞周期の進行はサイクリン依存性キナーゼ(CDK)によって制御されており、S期のイベントであるDNA複製もその例外ではない。G1期には複製起点上に複製前複合体(pre-RC)が形成されて細胞にDNA複製能を与え、S期にはCDKの働きにより、pre-RCが活性化され、DNA複製が始まる。最近、申請者が所属する荒木研究室は、S期CDKによるSld2のリン酸化がこの過程で重要な役割を果たすことを報告した。本申請研究では、S期CDKによるDNA複製開始の制御機構を解明することを目的とし、解析を行った。CDKによるリン酸化可能部位のアミノ酸残基をアスパラギン酸で置換し、リン酸化型Sld2を模倣型Sld2変異体(Sld2-D)を作製したところ、この変異体は生育できることから、Sld2-Dがリン酸化型Sld2を置換できることがわかった。さらに、Sld2-DでもS期CDK活性がない状態ではDNA複製開始が起きないことがわかったため、Sld2のリン酸化はDNA複製開始に必要ではあるが十分ではなく、Sld2以外にもS期CDKの必須な基質があると結論した。その上で、Sld2以外のCDKの必須な基質に関する情報を得ることを目的とし、Sld2-D変異存在下でCDKの活性がなくてもDNA複製が起きてしまうような変異の単離を試みた。約2万クローンをスクリーニングしたところ、ただひとつ、CDKの活性がなくてもDNA複製を行うような変異体(JET1-1)が得られた。このJET1-1変異によるDNA複製には、通常の複製同様、pre-RCの形成とCdc7キナーゼ活性が必要であった。このことから、CDKはSld2とJet1を介してDNA複製開始を制御していることが示唆された。現在その詳細な制御機構を解析中である。最近、申請者が所属する荒木研究室は、Sld2のS期CDKによるリン酸化がこの過程で重要な役割を果たすことが報告した。本申請研究では、S期CDKによるDNA複製開始の制御機構を解明することを目的とし、解析を行ってきた。CDKによるリン酸化型Sld2を模倣すると考えられる、リン酸化可能部位のアミノ酸残基のアスパラギン酸/グルタミン酸置換型Sld2変異体を作製したところ、アスパラギン酸置換型(Sld2-D)は成育できるものの、グルタミン酸置換型(Sld2-E)は生育できないことがわかった。さらに、Sld2-DでもS期CDK活性がない状態ではDNA複製開始がないことがわかったので、このことから、Sld2-DでもS期CDK活性がない状態ではDNA複製開始がないことがわかったので、このことから、Sld2のリン酸化はDNA複製開始に必要ではあるが十分ではなく、Sld2以外にもS期CDKの必須な基質があると結論した。その上で、Sld2以外のCDKの必須な基質に関する情報を得ることを目的とし、Sld2-D変異と合成致死となる変異のスクリーニングをおこなった。これまでに約4万の変異体をスクリーニングし、複数の変異体が得た。これまでに得られた変異のほとんどは、S期進行に欠損を示し、CDK活性なしでも顕著なDNA複製を行うようなものではいものの、変異遺伝子を決定したところ、ほとんどのものが複製フォークで働くことが示されている因子の変異であったため、引き続きスクリーニングを継続するとともに、得られた変異の詳細な解析も同時に行っている。
喫煙の分子機構と遺伝学的感受性解析に基づいた子宮頸がん発症予防の確立に関する研究

新潟県において行った腫瘍登録の成績を1988年から1992年の5年間と1999年から2003年の5年間で比較すると、10万人対の子宮頸がんの罹患率は全年齢の女性では18.6から12.9へと減少しているが、30才代では12.0から22.4と増加、若年女性における本疾患の罹患率の増加が憂慮されている。子宮頸がん発症にかかわるコファクターとして、多産、経口避妊薬の服用、喫煙などが挙げられているが、近年若年女性に喫煙が蔓延していることおよび喫煙の影響による発ガンが広く知られていることより、喫煙と子宮頚がん発症とのかかわりについて研究を行った。子宮頸がん患者143名、対象127名の解析において喫煙率は57.3%とHPVの陽性率と同様に高率であった。次いで患者群を40歳以上の高齢群、以下の若年群に分け喫煙率の解析を行ったところ、HPV陽性率は両群間に差を認めないにもかかわらず喫煙率は若年群においてのみ有意に高率であった。喫煙により体内に吸収されるベンゾピレン、NNK等の発癌物質の代謝、解毒に関与するとされている5個の遺伝子、CYP1A1、CYP2A6、CYP2E1、GSTM1、GSTT1の多型解析の結果、CYP1A1、CYP2A6、CYP2E1、GSTT1の4遺伝子では子宮頸がん患者群、対象群間で遺伝子多型の偏移は認められなかった。一方GSTM1遺伝子の解析では遺伝子が組み替えにより欠失、その結果機能を消失するといわれているnullタイプを持つ頻度が40才以下の若年患者群(59.7%)で対象群(44.4%)に比較し高率に認められた。各群における子宮頚がん発症危険率を推定したところ、若年喫煙者でGSTM1多型のnullタイプがOR=5.77,95%CI:1.28-26.09で最も高い危険率を示した。
糖鎖認識を介したタンパク質社会の秩序維持機構の構造基盤の解明

積荷輸送体の超分子形成と糖タンパク質の秩序制御の連関の解明積荷輸送体の超分子形成メカニズムを解明するために、酵母のERGIC-53ホモログにあたるEmp46pとEmp47pのヘテロ多量体を研究対象とした。Emp46pおよびEmp47pのレクチン様ドメインと膜貫通領域の間に位置するコイルドコイル領域に着目し、超遠心解析等の手法を用いて溶液pHに依存した分子集合の様式を解析した。これにより、Emp46p/47pのコイルドコイル部位にはpHを感知する部位が備わっていることが示され、pH変化に応じてヘテロ多量体からホモ多量体へと変化する仕組みを明らかとすることができた。ERADマシーナリーにおける標的糖タンパク質捕捉ユニットの分子間相互作用解析ミスフォールド状態にある糖タンパク質は小胞体から細胞質へと逆行輸送されたのち、ユビキチンプロテアソームシステムによって分解される。糖タンパク質のERADに関わるタンパク質は、相互作用することにより超分子複合体を形成し、システムとしての作動効率を高めていると考えられる。ERADマシーナリーの構成因子の一つであるpeptide:N-glycanase(PNGase)は、プロテアソームによる分解に際して立体障害をもたらす糖鎖を、タンパク質から切除する酵素である。PNGaseは活性ドメインのN末端側にPUBドメインを有しているが、本ドメインがERADにおいていかなる役割を果たしているのか、その実体は不明であった。MRおよびフロンタルアフィニティークロマトグラフィー法を用いた相互作用解析の結果、PUBはHR23のUBLに対して特異的に結合することが明らかとなった。HR23はユビキチン鎖およびUBLと結合することができるUBAドメインを有しており、このドメインはUBLと分子内で相互作用している。このことから、PNGase-PUBがHR23のUBLを捕捉することにより、HR23のUBAがERAD基質のポリユビキチン鎖と結合することが可能な活性型へ変換されるものと考察される。積荷輸送体の標的糖タンパク質結合様式の解明小胞体-ゴルジ体間における標的糖タンパク質の輸送は、細胞内レクチンERGIC-53による糖鎖認識と、Ca^<2+>結合型EFハンドタンパク質MCFD2によるポリペプチド鎖認識が協働することにより担われていると想定している。H22年度はERGIC-53とMCFD2の複合体による標的糖タンパク質との相互作用の実体を明らかにすることを目指した。ERGIC-53とMCFD2複合体は血液凝固因子第VIII因子(FVIII)の輸送に関わることが知られている。そこで、ERGIC-53・MCFD2複合体と、FVIIIの部分ペプチドとの間の相互作用をNMRを用いて解析した。その結果、ERGIC-53との結合に伴って、MCFD2のFVIIIとの結合能が上昇することが示唆された。また、FVIII上のERGIC-53とMCFD2複合体が結合する領域を明らかにすることにも成功した。高マンノース型ライブラリーを用いた糖鎖分解酵素の糖鎖認識メカニズムの解析糖タンパク質の細胞内運命決定機構の仕組みを理解するためには、糖鎖のプロセシングに関わる酵素の分解特性を明らかにすることが重要である。糖タンパク質の小胞体関連分解に関わる糖分解酵素EDEM1の基質特異性を明らかにするために、本酵素を過剰発現させた細胞に発現する糖鎖の構造解析を行った。その結果、EDEM1は、高マンノース型糖鎖のCアーム末端に存在するα1-2結合のマンノース残基を切除する特異性を有することが明らかとなった。EDEM1により産生された糖鎖の構造は、分解レクチンであるOS-9が特異的に結合するものである。このことから、糖タンパク質を小胞体関連分解へと導く高マンノース型糖鎖の中間体構造は、EDEM1によって産生されることが示された。

HR23はユビキチン鎖およびUBLと結合することができるUBAドメインを有しており、このドメインはUBLと分子内で相互作用している。このことから、PNGase-PUBがHR23のUBLを捕捉することにより、HR23のUBAがERAD基質のポリユビキチン鎖と結合することが可能な活性型へ変換されるものと考察される。
誘起CD励起子法の簡略化とその有用生理活性天然物の絶対配置決定への応用

1)新規CD発色試薬3-cyanocarbonyl-3'-methoxycarbonyl-2,2'-binaphthalene 1を用いて種々のキラルアミンを誘導体化したものについて、CD測定、次いで分子力場計算(CONFLEX-MM2)による構造最適化を行い、ナフタレン発色団間の"ねじれ"の方向と励起子カイラリティーの符号との相関について検討した。得られたアミドのCDスペクトルにおいて、240nm付近のUV吸収領域で分裂型CDを示した。各誘導体の立体配座解析において、励起子カイラリティーの符号と2つの2-naphthoyl基の"ねじれ"の方向との間に良い相関が認められた(正/時計回りのねじれ;負/反時計回りのねじれ)。また、誘導体の半経験的分子軌道計算により、分子内水素結合の存在が示唆された。各誘導体をN-メチル化したところ、CDスペクトルに大きな変化が見られた。即ち、225nmを中心とする分裂型CDへと変化した。更に、N-メチルアミドにおけるビナフチル系の電子遷移モーメント間の"ねじれ"の方向と励起子カイラリティーから予測される"ねじれ"の方向とが一致することが明らかとなった。よってキラル2級アルコールのみならずキラル1級アミンの場合にも誘起CD励起子法が適用できることが明らかとなった。2)β位に不斉炭素を有する1級アルコールをCD発色試薬1で誘導体化し、得られたエステルについてCDスペクトルを測定した。その結果、240nm付近のUV吸収領域で分裂型CDを示した。次いで各誘導体について立体配座解析(CONFLEX-MM2)を行なったところ、最安定配座における二つの2-naphthoyl基の長軸方向の電気遷移モーメント間の"ねじれ"の方向と計算で求めた全ての安定配座に基づく優先"ねじれ"との間に相違が認められるケースに遭遇した。この原因として次のことが考えられた。即ち、以前検討したキラル二級アルコールの場合、立体障害が支配的であるのでCONFLEX-MM2による計算が有効であった。しかし、キラル一級アルコールの場合においては、エステルのメトキシ基と他の置換基との相互作用が重要となり,この相互作用の評価がCONFLEX-MM2による計算では設定パラメータの問題等で満足のゆくものではなかったと考えられた。この問題を解決するためにはより精度の高い密度汎関数計算レベルの解析が必要と考えられた。そこで予備試験としてモデル化合物について密度汎関数法による電子円二色性(ECD)計算を行なった。その結果次のことが明らかとなった。1.ビナフチル基の"ねじれ"の方向が反時計回りでは必ず短波長側から正と負のカプレットになる。即ち、励起子キラリティーの符号は(-)となる。2.各安定配座のエネルギー差は僅かであることから、実際の化合物の立体配座解析がかなり複雑になってくることが示唆された。

1.ビナフチル基の"ねじれ"の方向が反時計回りでは必ず短波長側から正と負のカプレットになる。即ち、励起子キラリティーの符号は(-)となる。2.各安定配座のエネルギー差は僅かであることから、実際の化合物の立体配座解析がかなり複雑になってくることが示唆された。1)新規CD発色試薬3-cyanocarbonyl-3'-methoxycarbonyl-2,2'-binaphthalene1を用いて種々のキラルアミンを誘導体化したものについて、CD測定、次いで分子力場計算(CONFLEX-MM2)による構造最適化を行い、ナフタレン発色団間の"ねじれ"の方向と励起子カイラリティーの符号との相関について検討した。各種キラルアミンを試薬1とCH_3CN中で反応させたところ、何れの場合もほぼ定量的に対応する誘導体を与えた。得られたアミドのCDスペクトルにおいて、240nm付近のUV吸収領域で分裂型CDを示した。各誘導体の立体配座解析において、励起子カイラリティーの符号と2つの2-naphthoyl基の"ねじれ"の方向との間に良い相関が認められた(正/時計回りのねじれ;負/反時計回りのねじれ)。また、誘導体の半経験的分子軌道計算により、分子内水素結合の存在が示唆された。各誘導体をN-メチル化したところ、CDスペクトルに大きな変化が見られた。即ち、225nmを中心とする分裂型CDへと変化した。更に、N-メチルアミドにおけるビナフチル系の電子遷移モーメント間の"ねじれ"の方向と励起子カイラリティーから予測される"ねじれ"の方向とが一致することが明らかとなった。よってキラル2級アルコールのみならずキラル1級アミンの場合にも誘起CD励起子法が適用できることが明らかとなった。2)β位に不斉炭素を有する1級アルコールを上記CD発色試薬1で誘導体化し、得られたエステルについてCDスペクトルをCH_3CNおよびcyclohexane中で測定した。その結果、CH_3CN中とは異なりcyclohexane中では何れの場合も240nm付近のUV吸収領域で分裂型CDを示し、更に一対のエナンチオメリックなアルコール間では、x軸に関して対称なスペクトルが見られた。3)スギヒラタケに含まれる成分の加水分解物として得られたα-hydroxypalmitic acid methyl esterの絶対配置決定に申請者らの絶対配置決定則を適用した。試薬1で誘導体化して得られたエステルについてCDスペクトルを測定したところ、240nm付近のUV吸収領域で正の励起子カイラリティーが認められた。よって、絶対配置決定則より"R"と決定した。β位に不斉炭素原子を有するキラル一級アルコールをCD発色試薬3-cyanocarbonyl-3'-methoxycarbonyl-2,2'-binaphthalene 1を用いて誘導体化したところ,何れからも対応するエステルが高収率で得られた。得られた全ての誘導体において,240nm付近で誘起CDカプレットが観察された。
眼調節機能の加齢変化に対する機能形態学的研究

1)眼調節機能を10ー70歳代男女眼について眼調節パタ-ンから解析すると、ステップ刺激による方が調節幅が広く、連続刺激では45歳以上なると殆ど測定できず、35ー39歳と40ー44歳の間で調節幅が大きく低下することが明らかになった。2)ヒト眼の調節緊張、弛緩(緊張、弛緩)時の水晶体厚、前房深度に付いては緊張、弛緩時共に水晶体厚は年齢とともに増加し前房深夜は減少したが、その差は年齢が高いほど小さくなり、特に50才代の弛緩時の水晶体厚は殆ど20歳代の緊張時の厚さに達して、加齢により緊張、弛緩時の厚さの差が著名に減少して、調節幅(力)の減少に直接関係していることを示唆した。3)毛様体筋はヒト眼でもサル眼でも加齢と共に矢状断面積は縮小する傾向と筋線維が減少して結合織が増加する傾向が見られた。毛様体筋輪状線維の割合もヒト眼では70歳迄サル眼では20歳迄年齢とともに増加し、それ以降の調節幅(力)低下が著名な時期に明瞭に減少した。4)サル眼にピロカルビルおよびピロカルビン点眼すると毛様体筋は調節緊張時には矢状断面では筋全体としては筋幅を拡げ前方へ移動し、20歳までは年齢が高いほどその変化が著名で、水晶体の弾性低下の依る調節幅(力)の低下にたいして水晶体がその厚さを変えやすい様な状況を形成することを示唆した。5)ヒトおよびサル毛様体筋にはリポフスチン顆粒で見られ、年齢と共に増加傾向が見られて、毛様体筋の加齢の評価の指標となることが明かになった。6)サル毛様体筋細胞をフリ-ズフラクチュア、ディ-プエッチング法で電顕的に観察すると筋原線維が筋細胞の長軸方向の走行を取りつつその経過中に互いに交叉し、細胞膜、核膜ともに直接接して筋細胞の骨格を形成していた。7)水晶体線維の走査電顕的観察から新しく形成された皮質線維の増加により水晶体中心部線維の割合が低下し、それが弾性低下の一因と考えられた。1)加齢による眼調節機能の変化の関しては10-70歳代男女の調節幅を屈折、調節測定装置(AR3-SV6)で得られた眼調節パターンから解析すると、ステップ刺激と連続刺激でパターンに相違がありステップ刺激による方が調節は幅が広く、連続刺激では45歳以上になると殆ど測定できず、35-39歳と40-44歳の間で調節幅が大きく低下することが明らかになった。2)毛様体筋はヒト眼ではその矢状断で断面積が加齢とともに縮小する傾向と筋繊維が減少して結合織が増加する傾向が画像解析的に明らかになった。経線繊維(Bruche筋)と輪状筋(Muller筋)では高齢者眼の輪状筋に明らかな萎縮が見られた。サル眼でも加齢とともに毛様体筋筋繊維間に結合織が増加する傾向や毛様体筋に占める輪状筋の割合が減少する傾向が見られた。3)ヒト毛様体筋には自発蛍光顆粒が見られ加齢とともに増加する傾向が見られた。

自発蛍光顆粒は組織化学的に酸フォスファターゼ陽性で超微形態学的にはファゴゾームやリポフスチン顆粒で、毛様体筋の加齢の評価の際の一つの指標が得られた。4)凍結資料作成装置JFD7000(日本電子KK)を用いてフリーズフラクチュア・ディープエッチング法でサル眼毛様体筋筋細胞のレプリカ膜を作成してその立体的微細構造を検討中である。5)サル眼毛様体筋の加齢による機能的変化を検討する目的でピロカルピンやアトロピンなどの瞳孔薬に対する毛様体筋の収縮、弛緩の量を電気生理学的に測定することを試みて居るが結果が不安定で再現性に問題がある現在その解決にむけて検討中である。1)加齢によるヒト眼の調節緊張・弛緩(緊張・弛緩)時の眼軸長・前房深度・水晶体厚の変化に関して20ー68歳の男女眼について超音波眼軸測定装置(Alpha20/20)で測定した結果、眼軸長は緊張・弛緩時共に年齢による差は見られなかった。緊張・弛緩時共に水晶体厚は年齢とともに増加し、前房深度は減少したが、その差は年齢が高いほど小さくなり、特に50歳代の弛緩時の水晶体厚は殆ど20歳代の緊張時の厚さに達して、加齢により緊張、弛緩時の厚さの差が著名に減少して、調節幅(力)の減少に直接関係していることを示唆した。2)サル眼毛様体筋のアトロピンおよびピロカルピンにより作られた調節緊張・弛緩(緊張・弛緩)の状態を画像解析によりその矢状断で比較検討すると、緊張時には毛様体筋筋細胞間の間隙は殆ど見られず、筋全体としては筋幅を拡げ、前方へ移動し、しかも20歳までは年齢が高いほどその変化が著名で、水晶体の弾性低下に依る調節幅(力)の低下に対して水晶体がその厚さを変えやすい様な状況を形成することを示唆していた。3)毛様体筋における輪状繊維の割合はヒト眼では70歳まで、サル眼では20歳迄は年齢とともに増加する傾向にあるが、それ以降の調節幅(力)が極度に低下する時期には輪状繊維の割合も著名な低下が見られた。サル眼に置けるアトロピンおよびピロカルピン点眼後の輪状繊維の割合を比較すると1歳以後20歳迄その割合は増加し、特に10ー20歳の群でそれが著名で調節緊張の際は本来の輪状繊維に調節弛緩時放射状走行の線維も輪状走行を取ってその機能を増加して毛様体筋の収縮力を強める、調節作用における非常に重要な役割を示唆した。4)フリ-ズエッチング法によるサル眼毛様体筋のmiofilamentを細胞内で立体的に現在検討中で結果は平成2年5月の第94回日眼総会で報告の予定である。1)サル眼毛様体筋細胞をフリ-ズフラクチュアおよびヂュ-プエッチング法で電顕的に観察すると細胞質中には無数の筋原線維が見られ、筋原線維は筋細胞の長軸方向の走行を取りつつ、その経過中に互いに交叉し、細胞膜とも核膜とも直接に接合し、ミトコンドリア限界膜とも接合して、筋細胞の骨格を形成し、同時に筋細胞の収縮・弛緩にはこれら筋原線維の収縮・弛緩が直接反映されることが示唆された。しかしながら今回の実験では加齢に伴う変化、自律神経作働薬による影響を超微形態的に明らかにすることは出来なかった。2)毛様体筋の強膜との唯一の接合部位であり、毛様体筋の収縮・弛緩時の支点となることが推測される強膜岬についてサル眼毛様体筋について形態計測を行ったところ、強膜岬とシュレム氏管後端間の長さは年齢に増加と共に短縮する傾向が見られ、強膜岬が前方へ移動することが示唆された。これは年齢と共に毛様体筋が前方へ移動することを示唆しており、加齢に伴う水晶体硬化による調節時の水晶体の変形を可及的容易にするための生理的代償的変化と考えられた。3)ヒト眼毛様体筋の強膜岬起始部における形態を連続切片により画像解析に手技を用いて三次元的に構築するために、経線・放射状・輪状の3線維が同一切片に見られる毛様体筋の最も前のレベルから強膜岬へ向けて前方へ毛様体筋を追跡した。特に経線線維は前方への経過中に同一層内の隣接筋線維束のほかに上下の筋線維束とも合体、分離を繰り返して複雑な走行を示した。また強膜岬では走行が斜め、または経線方向の菲薄な層状の線維層としてその基質間に終り、筋細胞先端には横紋筋筋腱構造と基本的に類似の構造が見られ、周囲基質との強固な結合が示唆されると同時に加齢に伴う結合織の増加は筋細胞の収縮・弛緩に、マイナス的影響を与えることが推測された。
初級日本語学習者の漢字運用能力の養成と、その評価法を開発するための予備調査

研究目的:研究代表者が担当する初級日本語の漢字クラスでは、非漢字圏学習者を対象に、総合的な「漢字運用能力の向上」(柳町1999)を目指して、漢字の構成要素・部首・音符等を体系的に学習し、その知識を活用して漢字辞書検索の技術を身に付ける活動を取り入れている。この技能の習得により、学習者は漢字の体系を把握し、来日直後から未習漢字語への対応が可能となる。しかし、現時点では漢字語彙の記憶を測る評価(テスト)が主流で、総合的な漢字運用能力を評価測定する有効な方法がないこが問題点となっている。そこで、漢字の運用に関する能力を広く検討し、これを評価する方法の開発を目指して予備調査を行った。研究方法:1.日常の言語使用場面で学習者が未知の漢字語にどう対応しているか、実態を調査する。具体的には、印刷物、Web、携帯メール、店頭の商品、手書きメモ等の中に未習漢字語を設定し、それを理解することで遂行されるタスクを課す。その際、日常生活に近い環境として、インターネット・携帯電話・辞書が使える状況、他者に尋ねることができる状況等を設定し、その課題遂行過程を詳細に観察する。2.面談と質問紙により課題遂行時の判断過程や困難点について確認する。3.1,2の結果を基に漢字運用能力とその評価項目を抽出する。研究成果:上記の結果、漢字運用能力の主要なものとして、1.記憶している漢字語彙・既知の文字からの類推仮意語、接辞、部首等から)2.電子/紙/携帯電話/PCの辞書検索技術(画数や部首の判断、各種機能の効果的な使用等)3.字体認識力(各種フォント、携帯電話の簡略文字、手書き)4.翻訳サイト/ソフトの使用(その不完全性を補完する能力を含む)5.口頭で他者に尋ねる口頭表現能力、などが抽出された。本研究では、文脈に影響を受けない漢字語の把握を調査の対象としたが、今後、文脈や状況が漢字語の把握にどのように関わるかを含めて幅広く観察し、総合的な漢字運用能力の評価の開発に結びつけていく。
いわゆる可分債権の準共有法理

従来、共同相続が行われた場合、預貯金債権は、共同相続人に当然分割帰属するとされていた。しかし、近時、最高裁はこれを否定した。また、他のいくつかの場面でも、金銭債権などの可分債権の分割帰属が否定されている。そこで、本研究は、従来の裁判例を分析し、その規律を整理・分析したうえで、可分債権が分割帰属しない場合に用いられるべき法理を明確にすることを試みる。具体的には、準共有法理とは何か、それがどのような場面で、どのようにして、複数債権者のいる可分債権に適用されるべきなのかを明確にすることを目指す。
リポタンパク粒子表面の膜構造変化による代謝調節と動脈硬化の発生

カイロミクロンレムナントは、粒子表面にコレステロールを多く含み、動脈硬化の発生に関わると考えられている。このメカニズムを調べるために、カイロミクロンレムナントのモデルとしてコレステロールを含む脂質エマルション粒子を用いた。その結果、J774マクロファージによるエマルション粒子の取り込みは、apoEの添加により増加したが、その増加はエマルション粒子表面にコレステロールを含むことで大きく現れた。また、阻害剤を用いた実験より、apoE存在下でのエマルション粒子のJ774マクロファージへの取り込みには、主にヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)とLDL受容体関連タンパク(LRP)が寄与していることが明らかとなった。そして、トリパンブルー染色から、apoEにより増加したコレステロール含有エマルションの取り込みは、J774マクロファージの細胞死を誘導することが示された。次に、apoEのエマルション粒子への結合を調べたところ、粒子表面のコレステロールによって、apoEの結合親和性は変化せずに最大結合量が著しく増加した。蛍光標識脂質DPH-PCを用いた蛍光異方性測定とdansyl-PEの蛍光寿命測定から、コレステロールは、粒子表面のリン脂質アシル鎖を整列させ、リン脂質頭部基の水和度を増加させることが示された。しかし、apoEの最大結合量は、DPH-PCの蛍光異方性とは相関せず、dansyl-PEの蛍光寿命と高い相関を示したことから、apoEの結合にはリン脂質頭部基の水和度すなわち頭部基の間隔が重要である。以上のことから、カイロミクロンレムナント中のコレステロール増加は、粒子表面の膜構造を変化させ、apoEの結合を増加させることにより、マクロファージへの取り込みを促進し、さらに細胞死を導くことで、動脈硬化の発生につながると考えられる。近年、血漿スフィンゴミエリン(SM)濃度の上昇は、動脈硬化の進行と関連し、冠動脈疾患の危険因子であることが提唱されている。スフィンゴミエリナーゼ(SMase)は、リポタンパク中のSMを分解し、セラミドを生成させる。動脈硬化病変部から単離したリポタンパクは凝集しており、SMおよびセラミドを多く含んでいる。SMaseによりできたリポタンパク粒子中のセラミドは、マイクロドメインを形成し、粒子表面の疎水性部位として粒子同士の凝集と融合を導くと考えられている。また、動脈硬化病変部において、マクロファージが産生したアポEはリポタンパクに結合している。そこで、SMやセラミドを含むエマルション粒子を用いてアポEとセラミドリッチドメイン間の相互作用について調べた。SM含有エマルション粒子のSMaseによる凝集は、アポEにより阻害された。また、セラミド含有エマルションはSM含有エマルションと比べて、アポEの結合が増加した。次に、セラミドリッチドメインの存在を確認するために、2種類の蛍光プローブ、BODIPY-PCとDiI-C_<18>を含むエマルションの共焦点顕微鏡による観察を行った。BODIPY-PCは流動相に、DiI-C_<18>はゲル相に分布しやすいことから、粒子中の相分離を検出できる。その結果、セラミド含有エマルションでは、DiI-C_<18>は粒子コアから表面にわたる塊状の分布を示し、BODIPY-PCは粒子表面でDiI-C_<18>と分離するように分布した。このことから、エマルション粒子中のセラミドは三次元のマイクロドメインを形成していることが明らかになった。また、SMase処理による三次元セラミドリッチドメイン形成の誘導も確認された。以上のことから、アポEは粒子表面のセラミドリッチドメインに結合しやすく、それにより粒子の凝集や融合を防いでいることが示唆された。
マイクロ波直接変調を可能とする超薄膜構造の活性光共振素子(レーザ)の基礎的研究

1.積層量子井戸中の電子-正孔対の発光再結合寿命非発光性再結合を避けるよう製作されたGaAs-AlGaAs試料のフオトルミネッセンス時間経過の測定を行い,発光再結合係数B(B=1/Nsτr,τrは発光寿命,Nsは結合の相手となる電子数)を実驗的に定め,従来の理論で説明し得ることを示した。2.積層量子井戸のヘテロ界面の絶対平坦性の達成とその発光スペクトルに及ばす効果分子線エピタキシー法によるGaAs-AlGaAs積層量子井戸構造の成長過程において、反射型高エネルギ電子回折像の強度変化を用いた原子層数確定と絶対平坦性達成手法を案出し、0.2原子層相当の平坦さとそれにより鋭い発光スペクトルが得られることを示した。3.多層量子井戸内における電界効果による負性微分抵抗積層量子井戸構造上にショトキー接合を作りつけた素子に逆バイアスを印加したとき、電子-正孔の分離のため発光が弱められるばかりでなく、電界効果により隣接量子井戸間の電子状態に結合を生じ、そのためフォトルミネッセンススペクトルが僅かな分裂を起こし、同時に共鳴トンネル電流のため負性微分抵抗が現れることを明らかにした。4.超格子擬似合金層を降壁とした量子井戸の電子状態電子波長より短周期の超格子(擬似合金)を障壁層とした場合の多層量子井戸構造の量子状態につき分光学的実驗結果と理論とを対比し、擬似合金層内の波動状態は変形クローニヒ-ペニイのモデルで良く説明されることを明らかにした。5.共振器長が極めて短い光能動共振器の製作とその特性評価GaAS-AlGaAs超格子層を活性層とし、光波に対する多層反射膜の低屈折率層にも短周期のGaAs-AlAs超格子を用いて、厚さ23μmの光能動共振器を試作し、その設計方法を示し、実験的にこのような共振器中のモード結合の存在を明らかにした。
卵蛋白質に対するモノクロ-ナル抗体の作製とその応用

1.VMOI(Vitelline Membrane Outer I)は鶏卵卵黄膜を構成する分子量17000の蛋白質である。まず,卵黄膜からのVMOIの純化法を確立し,その全一次構造を決定した。円二色性分析の結果,本蛋白質はαーヘリックスをほとんど含まない特徴的な高次構造をとっていることが判明した。かかる構造上の特性を免疫学的に解析する目的で,常法に従いVMOIに対するモノクロ-ナル抗体を作製した。得られた6つの抗体のうち1つのエピト-プがVMOIのN末端から7093番のアミノ酸残基内にあることを決定した。今後他の抗体も同様に解析し,これらの部位がVMOIの高次構造上どのような意味を持つかを変性との関連において解析する予定である。2.オボトランスフェリン(OTF)に対しては5つのモノクロ-ナル抗体が得られた。OTFは,各々1つの鉄結合部位をもち構造的にもよく似た,Nー末端側,Cー末端側の2つのドメインからなっているが,5つの抗体ともNー末端側ドメインしか認識しなかった。また,これらの抗体の認識部位はトリプシン処理に対して高い感受性を有していることも判明した。OTFのNー末端側には構造上何らかの突出した部位があるのかもしれない。3.オボアルブミン(OVA)に対してはその疎水的吸着変性状態,熱変性状態を認識するモノクロ-ナル抗体が得られたが,未変性状態を認識するものは現在のところ得られていない。これはOVAが非常に変性し易い蛋白質であることから,免疫操作(アジュバンドの作製)中に変性してしまうためと考えられる。
神経発生分化因子による神経芽細胞腫株の分化誘導機構の解析

神経芽細胞腫は小児特有のがんで、近年、集学的治療が発達してきたにも関わらず、その予後は不良である。その発症は、胎生期に生じた分化関連遺伝子の発現変異あるいは翻訳された蛋白質の機能異常が蓄積した結果とも考えられる。神経芽細胞腫の発生は、交感神経節細胞と副腎髄質細胞に由来する。この両者の細胞は神経堤細胞から分化する。近年、これら神経細胞の発生に関与するいろいろな神経発生分化因子が、同定されてきた。神経発生分化因子として、BMP (bone morphogen protein)、MASH1、Phoxなどの転写因子があげられる。さらにこれらの下流には、神経栄養因子の受容体であるGDNF受容体、NGF受容体が存在する。特に下流の遺伝子群は神経芽細胞腫の予後を決定する上で非常に重要な因子である。このような神経発生分化の側面から、神経芽細胞腫の分化を促す研究も必要と思われる。レチノイン酸耐性株にレチノイド化合物Am80を添加し、下記の項目について検討する。1.培養細胞株の形態学的変化(分化の有無について)2.神経発生分化に関係する因子の発現(Nothern blot法)3.癌遺伝子、癌抑制遺伝子の発現(Northern blot法およびWestern blot法)その結果、形態学的に分化傾向がみられた。また神経発生分化因子の発現上昇も確認できた。レチノイド化合物Am80は、神経芽細胞腫の分化誘導剤として有望と考えられる。神経発生分化因子として、BMP(bone morphogen protein)、MASH1、Phoxなどの転写因子があげられる。レチノイン酸は、神経細胞分化を促す作用を有する。一般的に神経芽腫はレチノイン酸により分化することが知られて.いる。しかしレチノイン酸により分化しない細胞株も存在する。我々は、レチノイド化合物を用いてレチノイン酸耐性培養株を分化させ、それにより発現する遺伝子を網羅的に解析することを試みる。レチノイン酸耐性株にレチノイド化合物Am80を添加し、細胞が分化するか否かを検討した。そしてDNAマイクロアレイを利用して、レチノイン酸により誘導される遺伝子群を解析する。現在いつくかの分化に関係する候補遺伝子の発現を検討中である。1.培養細胞株の形態学的変化(分化の有無について)2.神経発生分化に関係する因子の発現(Northern blot法)3.癌遺伝子、癌抑制遺伝子の発現(Northern blot法およびWestern blot法)その結果、形態学的に分化傾向がみられた。1.培養細胞株の形態学的変化(分化の有無について)

2.神経発生分化に関係する因子の発現(Nothern blot法)3.癌遺伝子、癌抑制遺伝子の発現(Northern blot法およびWestern blot法)その結果、形態学的に分化傾向がみられた。また神経発生分化因子の発現上昇も確認できた。レチノイド化合物Am80は、神経芽細胞腫の分化誘導剤として有望と考えられる。
レーザー光音響イメージング・イムノアッセイ法および装置の開発

1)レーザー光音響イメージングアナライザーの製作:レーザー光源として従来のHe-Ne(633nm)と,本研究費で購入したArイオン(514.5-488nm)を必要に応じて切り替えられるようにしたレーザー顕微光学システムを完成させ,セル内焦点面で12μmの集光を可能とした.光走査のためのX-Yステップ走査,光音響信号取り込みはマイクロコンピューターで行った.データ処理系:この様にして捉えた光音響信号のデータ点数1万から3万からなる信号像を,検量線を基に,物質量の像に変換する事に成功し,定量範囲も限定出来るように,また色調から一目で各々の領域での微小域の量が分かる様,改良を加え,イメージングアナライザー装置は完成した.2)本装置を用いた新しいイムノアッセイの開発:(1)顕微光音響イムノアッセイの開発:酵素免疫染色法によるアッセイ系を確立し,ヒト胎児組織(脾臓,膵臓切片(5μ厚))中成分定量へ応用した.レーザーの分解能40μmφでのヒトλ型L鎖の検量線は0.1-100pgでS字型となり,これを逆に用い,光音響信号像から物質量の像へ変換演算イメージ化する事に成功した.各微小領域の量も色調で分かるようプログラムを改善した.3)多項目光音響イムノアッセイの開発:対照をヒトλ型L鎖, κ型L鎖, lgGとし,サンドイッチ法の原理を応用した多項目光音響イムノ方式験紙を開発した.最終の染色反応の後これを乾燥させ,光音響イメージングアナライザーで測定し,それぞれ100ng/ml-100μg/mlの領域で定量,予想した結果を得た.これで一度に多項目の選択的な検出ができ,当初の目的を果たす事が出来た.今後キット化を含め実用化の推進が待たれる.4)付帯的な発展:X線光音響イメージング法の開発装置は,フォトンファクトリーで進めているX線光音響法によるイメージングにも適用され,世界初の成功を見た.1)レーザー光音響イメージングアナライザーの製作:レーザー光源として従来のHe-Ne(633nm)と,本研究費で購入したArイオン(514.5-488nm)を必要に応じて切り替えられるようにしたレーザー顕微光学システムを完成させ,セル内焦点面で12μmの集光を可能とした.光走査のためのX-Yステップ走査,光音響信号取り込みはマイクロコンピューターで行った.データ処理系:この様にして捉えた光音響信号のデータ点数1万から3万からなる信号像を,検量線を基に,物質量の像に変換する事に成功し,定量範囲も限定出来るように,また色調から一目で各々の領域での微小域の量が分かる様,改良を加え,イメージングアナライザー装置は完成した.2)本装置を用いた新しいイムノアッセイの開発:(1)顕微光音響イムノアッセイの開発:酵素免疫染色法によるアッセイ系を確立し,ヒト胎児組織(脾臓,膵臓切片(5μ厚))中成分定量へ応用した.レーザーの分解能40μmφでのヒトλ型L鎖の検量線は0.1-100pgでS字型となり,これを逆に用い,光音響信号像から物質量の像へ変換演算イメージ化する事に成功した.各微小領域の量も色調で分かるようプログラムを改善した.3)多項目光音響イムノアッセイの開発:対照をヒトλ型L鎖, κ型L鎖, lgGとし,サンドイッチ法の原理を応用した多項目光音響イムノ方式験紙を開発した.最終の染色反応の後これを乾燥させ,光音響イメージングアナライザーで測定し,それぞれ100ng/ml-100μg/mlの領域で定量,予想した結果を得た.これで一度に多項目の選択的な検出ができ,当初の目的を果たす事が出来た.今後キット化を含め実用化の推進が待たれる.4)付帯的な発展:X線光音響イメージング法の開発装置は,フォトンファクトリーで進めているX線光音響法によるイメージングにも適用され,世界初の成功を見た.1)レーザー光音響イメージングアナライザーの試作本年度は高速化を目指す前段階として、中速でのイメージングアナライザーの設計、製作を行った。走査手法として、1)ミラー角度変化法と、2)ステージ移動法を検討したが、1)では走査速度に角度依存性があり、その補正が必要であるなどの問題があった。2)ではその問題はないが、セル台の振動に技術的問題があった。インシュレーターを用い、後者を最終的に採用した。A/Dコンバーターを通して得た光音響信号の位置依存性から、カラーディスプレイに2次,3次元の表示が可能なソフト開発も順調に進んだ。同時にマイクロコンピューターをフルに使用する為、画像の演算(バックグラウンドの消去、信号値から量への変換)も出来るようにした。分解能は計画より進んで3眼式顕微鏡の導入を図る事により、直視で評価可能とした。信号積算値の再現性は単一走査繰り返しで3%以下の誤差を得た。2)顕微光音響イムノアッセイ法の確立多発性骨髄腫のマーカーである入鎖に対し、ニトロセルロース上での固相イムノアッセイ系を確立した。無関係吸着サイトのブロック,発色,抗原-抗体反応等の条件設定(濃度,pH,時間等)に多くの時間を割いた。3mmφに標準物貭を均一に吸着させる為の濾過器も自作した。

この標準物貭の顕微像の積分信号値から、微小域各スポット当りの検量線を得、その関数関係も求め、各種試料の定量化の為の手法確立はほゞ完了した。左図は、骨髄細胞(フィルターへ固着)群の2,3次元画像の1例である。また本研究で開発した測定システムを用いると、X線の光音響分光法が可能である事が分り、発表した。本研究成果を日本薬学会(京都4月)、光音響法の国際会議(ハイデルベルグ,7月)で発表する。
癌腫に対するエンドスタチン療法の効果増強のために:鍵となる血管新生促進因子の解明

我々は強力な内因性血管新生抑制因子であるエンドスタチンを発現する遺伝子ベクターを作成し、形質導入の実験系を確立し、その有効な腫瘍増殖抑制効果を証明してきた。この強力なエンドスタチンの腫瘍抑制効果は持続性が乏しく、我々が施行してきた実験系でも腫瘍増殖抑制効果が証明されたが、その効果は持続せず、実験動物は腫瘍死となり、我々が理想とするtumor dormancy、つまり癌との共存には至らなかった。また実際の臨床試験でも現在まで良好な報告はない。この原因として、エンドスタチンのもつ強力な血管新生抑制効果を打ち消すような何らかの血管新生促進因子の代償的発現亢進が予想される。本研究ではマウス肺にエンドスタチン遺伝子を形質導入し、代表的な血管新生因子であるVEGFに着目し、その発現の程度を検討した。VEGF mRNAは定量的RT-PCR法でGAPDHを内因性コントロールとして定量した。今回の実験では、エンドスタチン形質導入群(n=6)では肺内のVEGF遺伝子発現はエンドスタチン形質導入後早期(24時間後)から認めており、その発現はコントロール群(n=6)に比べて高かった(ANOVAのScheffe法ではp=0.0755、Mann-Whitney Utestでp=0.055)。この機序の詳細は不明であるが、エンドスタチン形質導入とVEGFの抑制が可能であれば、強力な血管新生抑制が持続的になる可能性が示唆された。エンドスタチンはコラーゲン18のC末端の20KDaのペプチドで、マウスの肝臓のRNAを抽出しエンドスタチンに特異的なプライマーを設定しRT-PCT法を用いてPCR産物を作成し、エンドスタチンcDNAを作成した。このエンドスタチンcDNAを発現ベクターであるpST2に組み込みエンドスタチンを発現できるpST2-Endoを作成した。このpST2-Endoのシークエンスを確認し、エンドスタチンの発現をウエスタンブロッチング法を用いて確認した。このpST2-Endoを大腸菌コンピーテント細胞に導入し大量培養を行い、プラスミド回収キットで回収している。in vivo実験で上記pST2-Endoをcationoc lipidであるGL67/DOPEを用いて行う予定であったがGL67/DOPEの供給ができなくなり、尾静脈からの急速大量プラスミド投与によって形質導入を試みているが、十分なレベルでの安定した形質導入が出来ていないのが現状である。その後経静脈的に作成した肺腫瘍モデルの腫瘍部やその周辺部のVEGF、VEGF受容体の発現の程度や局在、VEGF発現、インテグリンα_vβ_3、α_vβ_5発現について解析する予定である。エンドスタチンを発現遺伝子を作成し、形質導入の実験系を確立し、その有効な腫瘍増殖抑制効果を証明してきた。エンドスタチンを用いた臨床試験で良好な報告がないのは、エンドスタチンのもつ強力な血管新生抑制効果を、打ち消す血管新生促進因子の代償的発現亢進が、予想される。本研究では、in vivoでマウス肺腫瘍モデルにエンドスタチンを形質導入し、VEGF、VEGF受容体の発現の増強の有無について解析する。エンドスタチン発現で導だされる血管新生因子の関係が明らかになれば、エンドスタチン療法の効果の増強、持続が可能になる。エンドスタチン遺伝子の作成:エンドスタチンはコラーゲン18のC末端の20KDaのペプチドで、マウスの肝臓RNAを抽出し、エンドスタチンプライマーを設定し、RT-PCT法を用いてPCR産物を発現ベクターであるpST2に組み込み、エンドスタチンを発現できるpST2-Endoを作成する。pST2-Endoのシークエンスを確認後、エンドスタチンの発現を確認し、このpST2-Endoを大量培養を行う。in vivo実験では、上記pST2-EndoをGL67/DOPEを用いて行う。

形質導入効率は、24時間後または72時間後がピークになるため、形質導入後24時間及び72時間にマウスを犠牲死させて、形質導入肺を摘出し、直ちにホモジナイズし、RNAを抽出し、エンドスタチンとVEGF、VEGF受容体遺伝子の発現を定量し、これらの関係を検討した。