hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞における直鎖状ユビキチン鎖形成を介した新規NF-κB活性化機構の解析

CRISPR/Cas9システムによりHOIP欠損Jurkat細胞を作製し、TCR刺激に伴うNF-κB活性化を解析した。その結果、LUBAC活性はTCRを介したNF-κB活性化に必須であることが分かった。さらに、LUBACはTCR刺激依存的にCARMA1-BCL10-MALT1から成るCBM複合体と相互作用し、MALT1→CARMA1→BCL10の順に直鎖状ユビキチン鎖を付加することが明らかとなった。また、数理シミュレーションを用いた解析により、CBM複合体の直鎖状ユビキチン化は相互に影響を与え、CBM複合体とNEMOの直鎖状ユビキチン化がIKK活性化を導くことを見出した。また、脱ユビキチン化酵素であるOTULIN、CYLDの関与を調べた結果、OTULIN欠損により顕著なNF-κB活性亢進が認められた。これらの結果は、TCR刺激を介したNF-κB活性化経路における直鎖状ユビキチン鎖形成の関与を示した重要な知見であり、将来的に、NF-κBの活性化が関与する様々な疾患発症機構の解明にも繋がるものと考える。
ホストポリマー中での長鎖DNA分子のダイナミクス

私達は、長鎖DNA分子のコイル-グロビュール転移は著しい不連続性を示し、各々の鎖について「一次相転移」であることを、最近明らかにした。この転移において、分子鎖のアンサンブル(集団)平均は、連続的な変化を示す。このことは、光散乱や粘度測定など、アンサンブルの性質を調べる実験手段では、コイル-グロビュール転移は緩慢転移のように"見える"ことを意味している。本年度は、ホストポリマー中での長鎖DNA分子のダイナミクスに注目して、さらに研究を進めた結果、次のような成果が得られた。高分子のかたさ(stiffness)とファンデルワールス力を考慮した簡単なモデルで、ホモポリマーの単分子凝縮モンテカルロ・シミュレーションを行った。そして、計算の結果、トロイドやロッド等の構造体が自発的に生成することを明らかにした。この理論計算の結果は電子顕微鏡によって観察されるDNA分子の凝縮体とよく対応している。エネルギーを比較するとトロイド状態の方が低く、ロッド状態は準安定な状態でトロイド状態は熱力学的安定状態に対応している。このショミュレーションの結果から、DNAに限らず、一般的に硬いポリマーは次のような性質を示しているものと予測される。i).高分子鎖がstiffなとき、コイル-グロビュール転移は、各々の鎖について、all-or-noneの一次相転移となる。(DNAに限らず、十分に固い鎖であれば、一般的に一次相転移となる。)ii).コイル-グロビュール転移には、有限の幅の共存領域は存在する。このため、高分子鎖のアンサンブルは、緩慢転移を示す。実験、理論的解析の結果から得られてきた、各々の孤立高分子鎖の高次構造のall-or-none的変化は、溶液中に存在する各の鎖について相の異なる状態、すなわち、一種の相分離であるとみなすことができる。鎖の相転移は一次であるので、ゆらぎの相関が有限の値に留まる。そこで、鎖のサイズよりも相関長が短くなったときには、単一鎖について複数のグロビュールとコイルが出現する分子内相分離現象がおこることが予想される。実際、高分子量(Mw220,000)のPVP水溶液中では、単一のT4DNA分子が分子内の相分離を示すことが、蛍光顕微鏡観察により確認された。
メカニカルストレスによる血液凝固反応抑制メカニズムの粘弾性学的定量評価

平成28年度は、せん断応力に対する「ヒト血液を使用した血液凝固」に関する因子についての研究、平成29年度は、せん断応力に対する「ヒト血液を使用したフォンビル・ブランド因子」に関する因子についての研究に従事した。その結果、血液凝固第V因子が、せん断応力に対してメカノケミカルに反応して反応活性を下げ、結果として血液凝固反応速度をさせることで、血栓形成を防ぐ働きをしていることがわかった。一方、せん断速度がさらに大きくなると、血液凝固第V因子の活性低下に加えて、フォンビル・ブランド因子が同じくメカノケミカルに分解し、血栓形成抑制過剰となり、出血現象を呈する状態になることがわかった。この結果は、ヒト血液を使用したことにより、臨床検査試薬を使用したために、血栓の形成過程を正確に分析することに成功した。しかしながら、循環器系医療機器の開発時における動物実験では、ウシ血やブタ血を使用することが一般的であり、せん断応力に対する血栓形成挙動が、ヒト血液と同じであるかを比較することが重要である。最終年度である平成30年度は、この比較実験を実施する予定であった。しかしながら、本年度5月に、所属機関内の異動により、研究部署から離れて事務職を主務とする業務を命ぜられた。予期できない異動であった。元の研究部署に兼務がかかっていたものの、研究業務へのエフォートは激減し、計画通りに研究を進めることができなかった。しかしながら、遅々としてではあるが、ヒト血液を使用した、血栓形成を抑制する血液凝固第V因子およびフォンビル・ブランド因子の定量評価法の一部を構築できた。本年度までに得られた成果をもとに、論文投稿の準備はできつつあるが、残る実験計画を遂行するためには、さらなる緻密な計画を立てて実施することが重要である。そこで、本来、平成30年度で終了であった本研究計画を延長し、令和元年度も引き続き、実験を実施する。上記の通り、平成30年度は、所属期間内の異動により、昨年度までの研究部署から離れて事務職を主務とする業務となったため、研究計画に記載の実験スケジュールで研究を進めることができなかった。また、事務職勤務は令和元年度も継続となり、引き続き研究業務へのエフォートは低い状態ではあるが、時間調整を行いつつ、研究計画を遂行する予定である。昨年度まではおおむね計画通りに実験を進めることができており、計画から遅れている実験を実施していきたい。令和元年度も事業期間延長承認申請を行い、引き続き研究することとなった。本来平成30年度に実施する予定であった、ヒト血以外のウシおよびブタ血を使用したせん断応力に基づく血栓形成特性の定量評価を完成させ、論文発表の形で成果を発出していきたい。平成28年度は、試験検体としてクエン酸ナトリウム抗凝固ヒト血液、およびヒト血液を遠心分離して採取したヒト血漿を使用した。これらのヒト試料を使用した実験は、産業技術総合研究所生命倫理員会の承認を得て行った。メカニカルストレスを血液および血漿に負荷する方法として、せん断負荷装置である外筒回転式二重円筒型レオメータを使用した。試験血液5.00 mLをせん断負荷部に入れ、せん断速度2,880 s-1(8.6Pa)で3時間、37°Cでせん断負荷を加えた。その結果、せん断速度負荷後のヒト血液のAPTTはせん断速度負荷前と比較して有意差は見られず、PTは14.8%有意に延長した。また、血液凝固第5因子の反応を特異的に反映するPTが1.3%有意に延長した。一方、せん断速度負荷後のヒト血漿のAPTTはせん断速度負荷前と比較して118.8%延長し、PTは74.9%延長した。これに伴い内因系に関与する血液凝固因子のうち、第9因子の反応を反映するAPTTは2.9%延長、第8因子では13.5%延長、第10因子では3.7%延長、第5因子では48.7%延長、および第2因子では3.0%延長した。外因系に関与する凝固因子のうち、第V因子の反応を反映するPTは52.4%延長し、第2因子では1.7%短縮した。また、せん断負荷前の反応時間から、外因系に関与する血液凝固因子は第10と5、2、7因子の順に外因系全体の反応に影響することが分かった。これらの結果から、特に血球を含まない血漿の結果から、ヒト血液にせん断速度を負荷すると、主に血漿中の血液凝固第5因子の反応が抑制されることで、血液凝固因子全体の反応が抑制されることが分かった。また、このせん断負荷条件は、フォンビル・ブランド因子マルチマーが分解されるメカニカルストレスであることを確認した。計画通りの成果を得られたと痛感している。それは、本実験計画の最も重要なポイントである、「メカニカルストレス、すなわちせん断応力が、どの血液凝固因子に関与しているか?それは、血液凝固第5因子が、その一つである。」という命題を解決することに成功したからである。本実験は、血液ポンプ内を流れる血液について、せん断応力によって、血液凝固反応が抑制されるメカニズムを定量評価するために計画されたものである。これまでの準備実験によって、ウシ血液ではせん断応力によって、内因系凝固反応が抑制されることがわかっており、このことから次の血液凝固因子、すなわち血液凝固第12因子、同11、9および8因子のいずれかがせん断応力に対して大きく関与することが予想されていた。

しかし、しかしながら、これらの血液凝固因子活性を計測するには、臨床用のヒト血液試薬を使用した実験であり、定量評価するには限界があった。しかしながら、上記の通り1年目の実験において、ヒト血液を扱う環境が整ったことにより、ヒト血液を試料として、臨床試薬を用いて分析を行ったところ、血液凝固第5因子が最も顕著なメカノケミカル現象を示すことがわかった。また、血小板系においても、この血液凝固第V因子が抑制される2,880s-1、3時間のせん断負荷条件では、フォンビル・ブランド因子マルチマーが分解を生じる、すなわち、血栓形成反応とは逆の出血反応を促進する条件でもあり、血栓形成/出血の拮抗反応が生じる条件での複雑な生化学反応であることも明らかとなった。仮定と異なっていたのは、内因系凝固因子ではなく、血液凝固第5因子、すなわち内因系/外因系の共通因子がメカニカルストレスに対して必須の因子であったことである。平成28年度は、せん断応力に対する「血液凝固」に関する因子について研究を進めたが、平成29年度は、せん断応力に対する「出血」に関する因子について焦点を当てた。試験検体としてクエン酸ナトリウムを主成分とする抗凝固剤で抗凝固したヒト血液(日赤提供の献血血液、全血)、およびヒト血液を遠心分離したヒト血漿を使用した。これらのヒト血液試料を使用した実験は、産業技術総合研究所生命倫理委員会の承認を得て行った。メカニカルストレス、すなわちせん断応力を血液および血漿に負荷する方法として、新規に製作したせん断負荷装置である内筒回転式二重円筒型レオメータを使用した。試験血液3.6 mLをせん断負荷部に注入し、せん断速10,000 s-160,000s-1で30秒間、37°Cでせん断負荷を加えた。その結果、全血でも血漿でも、せん断速度の増加に伴って、出血に係る血液凝固因子であるフォンビル・ブランド因子(vWF)高分子マルチマーが分解されることが定量的に見いだされた。粘度で補正したせん断応力に基づくvWF高分子マルチマーの分解量、すなわち保存率は、全血と血漿でほぼ同量であることがわかった。また、血液型に依存する傾向は見られなかったが、健常者であっても、vWF保存率は大きく異なることがわかった。これらのことから、臨床検査の観点では、全血でなく血漿状態でもせん断応力に対するvWF保存率を計測することができ、人工心臓や体外循環ポンプのようなせん断応力を発生する循環器系デバイスの装着に先立ち、患者の保存血漿を用いて、デバイスに対する出血耐性を事前評価することが可能であると期待できた。計画通りの成果を得られたと考えている。平成28年度は、血液凝固反応抑制において、メカニカルストレス、すなわちせん断応力による血小板凝集反応を介さない「凝固系反応」の抑制における定量評価を行った。血液凝固第5因子が、せん断応力によって構造変化を起こすことに起因するものと考えている。この反応は非常にユニークであり、今後も反応メカニズムの詳細を明確化していく必要があるが、一方でせん断応力による血液凝固反応抑制過多、すなわち出血現象に係るメカニズムについてもその定量評価が求められている。これまで臨床現場では、経験的にせん断応力が負荷されるデバイスを装着した患者においては、出血合併症を併発することがしばしば見られたが、どの程度のせん断応力を負荷した時に、どの程度のvWFが破壊せずに保存されるかについては、明らかでなかった。vWFの保存率に基づく出血、すなわち血液凝固反応抑制は、血小板凝集を介する反応である。
ユニバーサル段階における"大学第一世代"への学習支援に関する基礎的研究

本研究は、(1)大学第一世代の階層的特徴と、彼らが大学入学後に直面するであろう諸問題の分析を担当する"第一世代"班と、(2)多様な学生の社会的背景に対応した学生支援の方法論、なかでも学生のカレッジポートフォリオの開発とその有効性についての分析を課題とする"ポートフォリオ"班のふたつに分かれて進められた。"第一世代"班は、アメリカと日本の大学第一世代の先行研究の収集、既存の大学生調査やSSM調査、またJGSS調査の再分析、オーストラリアの初年次教育プログラムの実際に関する実地調査、さらに第一世代学生の保護者に対するインタヴュー調査を行った。その結果、第一世代学生の大学入学後の適応プロセスを明らかにすることができ、留学生を含めた大学への適応に困難を抱える可能性の高い学生に対する、実際の学習支援方法の開発に関して基礎資料を得ることができた。"ポートフォリオ"班は、初中等教育及び高等教育でのポートフォリオ活用に関する資料の収集、アメリカのとくに初年次教育での学生支援方法としての事例の収集、アメリカの研究者、実践者を招聘しての淡路と本学での研究会の開催を行った。また関西国際大学の学生に対し、実際にポートフォリオを試行的に作成させ、さらにその効果的な導入に際して、あわせて必要となる方法論を検討し開発した。今後さらに大学教育のなかで実践を重ね、ポートフォリオの効果的な活用とその効果を検証していくことが課題として確認された。これらの成果をとりまとめ、報告書を作成した。本研究は、(1)大学第一世代の階層的特徴と、彼らが大学入学後に直面するであろう諸問題の分析を担当する「第一世代」班と、(2)多様な学生の社会的背景に対応した学生支援の方法論、中でも学生のカレッジポートフォリオの開発とその有効性についての分析を課題とする「ポートフォリオ」班のふたつに分かれて進められている。「第一世代」班は、来年度の大学生調査に向け、アメリカと日本の第一世代研究の先行研究の収集、既存の大学生調査の再分析、さらに日本のSSM調査、JGSS調査を用いた両親学歴と子世代の教育・社会経済的地位達成の関係に関する分析を行った。その結果大学第一世代の入学後の学生生活への満足度、大学生活の過ごし方は、第一世代ではない学生に比べ困難を抱える比率が高く、また教育達成への親学歴の効果も根強いことが認められた。このことから、"親学歴""第一世代"という研究の視点が日本においても重要であり、来年度この分析視点に立った学生調査を実施してく際の課題も検出された。「ポートフォリオ」班は、初中等教育および高等教育でのポートフォリオの活用に関する資料を収集し、併行してアメリカのとくに初年次教育での学生支援方法としての事例を検討した。カナダで7月に行われたFYE(初年次教育)会議に出席し、各国のFYEの実践事例を収集した他、2月末から3月にかけてアメリカのFYEでのポートフォリオ活用の第一人者である2人の研究者を招聘して研究会をもち、学生支援におけるポートフォリオ活用の具体的な実践例を学んだ。これらの成果は、今年度関西国際大学で試行的に作成させているポートフォリオの効果を検証し、今後日本版カレッジポートフォリオのプロトイタイプを作成していく際の留意点を示唆するものとなった。本研究は、(1)大学第一世代の階層的特徴と、彼らが大学入学後に直面するであろう諸問題の分析を担当する"第一世代"班と、(2)多様な学生の社会的背景に対応した学生支援の方法論、中でも学生のカレッジポートフォリオの開発とその有効性についての分析を課題とする"ポートフォリオ"班のふたつに分かれて進められている。"第一世代"班は今年度、昨年度のアメリカに加え、オーストラリアの初年次教育プログラム、とりわけ支援を必要とする第一世代や留学生への移行プログラムに関する情報収集を行った。またWilliamsと飯島は、関西国際大学の留学生を対象に、自国の教育システムからの移行に際し、どのような困難を感じているかに関するインタヴュー調査を行い、その結果を、第8回Pacific Rim First Year in Higher Education Conference(於:オーストラリア、モナシュ大学)においてIntegrating International Students into a host culture : Aim forsuccessというタイトルの学会発表を行った。

さらに河野、西村、井上は、第一世代に関するこれまでの調査の再分析を行うことにより、第一世代学生の大学入学後の適応のプロセスを明らかにし、これらの学生に対して必要な学生支援のあり方を示唆した。この結果をもとに井上は、大学教育学会2004年度課題研究集会シンポジウム(於:立教大学)において、「大学教育における第一世代問題の徴候」というタイトルの報告を行った。"ポートフォリオ"班は今年度、引き続き海外のポートフォリオ活用の事例を収集した他、学生のモティベーションを向上させる上で、ポートフォリオ作成と平行して必要となる方法論、手法にっいて、初中等教育や企業研修にも広げて収集し、カレッジポートフォリオとグループワーク手法を同時に活用した初年次教育のモデル開発を行った。本研究は、(1)大学第一世代の階層的特徴と、彼らが大学入学後に直面するであろう諸問題の分析を担当する"第一世代"班と、(2)多様な学生の社会的背景に対応した学生支援の方法論、なかでも学生のカレッジポートフォリオの開発とその有効性についての分析を課題とする"ポートフォリオ"班のふたつに分かれて進められた。最終年度となる今年度、"第一世代"班は、大学第一世代の保護者に対してインタヴューを実施した。またこれまでの研究成果のまとめを行い、第一世代学生の大学入学後の適応プロセスとそこでの課題を明らかにした。"ポートフォリオ"班は、大学教育においてポートフォリオを有効活用していくための具体的手法に関し、アクティブラーニングの導入やベンチマークの設定と関連づけて実践していく方法論をまとめ、一部大学教育のなかで実践し、その成果を検証した。3年間の最終成果をとりまとめるため、報告書を作成した。
多価不飽和脂肪酸による動脈硬化抑制機序の研究〔ヒトとサルの比較〕

Dyebergらによるグリーンランドエスキモーの臨床疫学研究により.多価不飽和脂肪酸(Polyunsaturatedfatty acids=PUFA殊にEicosapentaenoic acid=EPA)の摂取が虚血性心疾患の発症を抑制することが明らかにされてい以来.種々の動物実験によってその作用機序の解明や動脈硬化の予防研究が進められ多くの成果が報告されている。しかし.これらの動物実験成績がヒトにおいても同様の成績を示すとは限らず.その臨床応用にあたっては.動物とヒトでのPUFA投与の成績を詳細に比較検討し.その差異を明確にしておく必要がある。このような観点から.実験動物としてはヒトに最も近いサルと.虚血性心疾患患者および高脂血症患者にPUFA等を投与して.脂質代謝および動脈硬化症発症・進展に及ぼす影響を詳細に比較し.PUFA投与の臨床的有用性を検討した。(2)Fish oil投与の兼漿リポ蛋代謝.動脈硬化病巣への影響(1)とほぼ同条件でアフリカミドリザルに.Fish oil(PUFAとして)またはLard(SFAとして)投与し血漿リポ蛋白値への影響をみると.Fish oil群はLard群と比べTCは投与後5カ月より低値.TGは投与後5カ月より高値を示し.またHDL-Cは投与開始直後より低値を示した。LDL粒子サイズはより小さかった。2.5年間投与後屠殺し単離した肝臓を用いた灌流実験により.Fish oil群はLard群と比較して肝臓のTGの分泌は少なかったが.Apo-Bの分泌には差は見られず.TG含有率の少ない超低比重リポ蛋白(VLDL)をほぼ同じ数を分泌することが判明した。冠動脈内膜の動脈硬化病巣は両群とも少なかったが.Fish oil群のほうがLard群よりも有意に軽度であった。胸部大動脈・頸動脈さらに腹部大動脈においてもFish oil群のほうが軽度であった。2.臨床研究成績(1)EPA投与の兼漿脂質.リポ蛋白値への影響虚血性心疾患患者および高脂血症患者36名にEPA(etuyl esterの軟カプセル)を毎日0.92.7g.12週間投与したところ.高脂血症タイプによって多少異なるがTC.LDL-CおよびTGの減少.HDL-Cの不変増加.ApoBの減少を認めた。HDL亜分画では大きなHDL_2が多くなり.LDL粒子サイズは小型のものが多くなった。LCAT活性.Lipoprotein lipase(LPL)および肝性TGリパーゼ活性はに変動はなかった。リポ蛋白a〔LA(a)〕にも変動は認めなかった。(2)PTC後再狭窄に及ぼす影響虚血性心疾患患者でPTCA施行成功例55名を対象としてEPA投与群.非投与群に別け6ケ月後の再狭窄率を比較したところ.前者は15例16部位.後者は18例19部位でそれぞれ50.0%と47.4%で両群間に差は認めなかった。

リポ蛋白a〔LA(a)〕にも変動は認めなかった。(2)PTC後再狭窄に及ぼす影響虚血性心疾患患者でPTCA施行成功例55名を対象としてEPA投与群.非投与群に別け6ケ月後の再狭窄率を比較したところ.前者は15例16部位.後者は18例19部位でそれぞれ50.0%と47.4%で両群間に差は認めなかった。1.虚血性心疾患研究班(1)脂質分析法の確立:本臨床研究において測定する各事項のうち、未確定であったコレステロ-ルエステル転送活性測定法および食事負荷テスト法の検討を行い、全分析法を確立した。(2)虚血性心疾患々者おける脂質代謝異常の基礎的検計:上記脂質分析事項につき、対象患者の特徴的変化を検討し基礎デ-タを得た。(3)臨床症例の選択:臨床試験に適しかつ同意の得られた症例について、試験開始時の採血および脂質分析を行うとともに、多価不飽和脂肪酸としてエイコサペンタエン酸(EPA)の投与を開始した。現在までに5例がエントリ-し、経過観察中である。2.動物実験班: African Green Monkeyを3群(各群12匹)に分け、飽和脂肪酸、1価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸を投与し、経時的にリポ蛋白代謝への影響を分析中である。3.研究会議:(1)1990/9、動物実験班の2名を招聘し両班の研究の基礎デ-タの交換や研究法の検討を行った。また、公開シンポおよび大学主催の講演会に演者として参加発表してもらった。(2)1991/1、虚血性心疾患研究班の2名を派遣し、両班の研究結果の中間検討会を行った。また、大学主催の講演会にて発表した。初年度の研究から、African Green Monkeyでの動物実験では、投与する脂肪酸(Fish oilなど)の違いによって血清リポ蛋白の濃度、粒子サイズ、化学組成に大きな違いが認められ、これらの違いが動脈硬化の進展と密接に関連していることが推測されていたが、屠殺剖見による冠動脈と大動脈の動脈硬化性変化の検討によりこのことが確認された。その成立機序は明らかではないが、リポ蛋白の質的変化がその分泌速度、代謝速度あるいは動脈組織との結合親和性に影響を与えていることなどが報告された。臨床研究では虚血性心疾患者に脂肪酸の一種のEPAを投与して血清リポ蛋白の濃度、粒子サイズ、化学組成、脂質転送蛋白(LTP)およびLp(a)への影響を検討し、また、PTCA(Percutaneous transluminal coronory angioplasty)実施例についてはEPA投与群と非投与群間の再狭窄の頻度への影響を検討した。現時点では症例数がまだ少なく確定的なことは言えないが、血清リポ蛋白は個人差はあるがサルでの報告とはほぼ同様の変化が認められた。PTCA後の再狭窄はEPA投与群でやや軽度であった。また、LTPおよびLp(a)への影響は認められなかった。これらの臨床デ-タはいくつかの研究会で報告した。平成4年2月2日から2月5日には本研究代表者の五島雄一郎教授、研究分担者の椎名豊助手の2名が渡米し、ウェイク・フォレスト大学ボ-マン・グレイ医学部にて研究成果の相互発表と次年度研究計画の打合せ、講演を行った。
胎仔型ライディッヒ細胞による精子形成幹細胞ニッチ形成機構の解明

胎仔型ライディッヒ細胞特異的にジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックマウスの成獣オス個体に対してジフテリア毒素を投与し、投与直後から3か月後までの個体から精巣を順次採取し、組織学的検討を行ったところ、投与後2か月以降に精細管構造の不整、間質のライディッヒ細胞の減少および一部の精細管で精子形成の異常が認められた。このことは、胎仔型ライディッヒ細胞が生後の精巣においても固有の機能を有していることを示唆するものであったため、現在、精巣内テストステロン濃度やセルトリ細胞・ライディッヒ細胞の遺伝子発現を詳細に解析中である。より早期の毒素投与に関しては、毒素に対する感受性に起因すると思われるが、正常の個体でも毒素投与によって死亡ないし衰弱することが多く、至適な投与量を決定するのが困難であり、現在も投与量の検討を引き続き行っている。胎仔型ライディッヒ細胞の遺伝子発現に関しては、胎仔期(胎齢14.5日、18.5日)および生後10日、21日、56日(成獣期)の全てのステージでの解析を終了した。その結果、胎仔型ライディッヒ細胞の性質が出生後に劇的に変化していること、また成獣期においても成獣型ライディッヒ細胞とは異なる性質を有していることを示唆した(投稿準備中)。上記の結果に加えて、胎仔型ライディッヒ細胞の一部の細胞群が、出生後にステロイド産生能を失い、扁平な形状へと変化して精細管周囲に存在することを初めて明らかにした(投稿準備中)。これらの細胞が精子形成幹細胞のニッチ形成に関与している可能性を検討するために、扁平な細胞の細胞系譜追跡実験および遺伝子発現プロファイルの解析を開始した。24年度が最終年度であるため、記入しない。胎仔型ライディッヒ細胞特異的にジフテリア毒素の受容体(ヘパリン結合性EGF様増殖因子、HB-EGF)を発現するトランスジェニックマウス系統を複数作出した。In-situ hybridizationによる発現解析の結果をもとに、これらの系統のうちHB-EGFが胎仔型ライディッヒ細胞に特異的に、かつ強く発現している系統を選び、毒素投与実験を行った。毒素の投与回数・投与量を検討した結果、50μg/kgを1回投与することで十分に胎仔型ライディッヒ細胞を破壊できることがわかった。生後8週齢の成熟オスマウスに毒素を投与し、投与後1週間1か月の範囲で精巣組織を採取し形態学的解析を行った。その結果、いずれの時期においても有意な形態学的な変化は認められなかった。一方、生後3週齢で1回毒素を投与した場合には、一部の精細管で精子形成の異常が認められたことから、胎仔型ライディッヒ細胞が時期特異的に機能を発揮する可能性があると考えられた。現在、より若い週齢のマウスに毒素投与を行い、時期特異的な影響をより詳細に解析している。胎仔型ライディッヒ細胞の遺伝子発現プロファイルに関しては、胎齢18.5日、出生後10日に関しては、既にセルソーティングによりサンプルを調製し、解析が進行中である。一方、生後21日と生後56日の細胞に関しては、ソーティングの過程での精細胞の混入が問題となることが判明したため、現在は新たなキットを購入し、より少数の純粋な細胞(1001000個)をスタートとして用いる解析系を立ち上げ、条件検討を行っている。ジフテリア毒素の受容体を発現するマウスを作出し、発現解析によって胎仔型ライディッヒ細胞特異的に受容体が発現していることを確認した。

当初の期待と異なり、性成熟期のオスマウスに毒素を投与しても影響はなかったが、より若い週齢のマウスに毒素投与した場合に、精子形成の以上が認められた。胎仔型ライディッヒ細胞の遺伝子発現プロファイルに関しては、胎仔期および幼若期に関しては既にサンプルを調製し解析を進行中である。思春期以降のサンプル調製に際して、精細胞の混入を避けるために新たな手法を導入している途中だが、おおむね順調に進展していると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の期待と異なり、幼若期のみ毒素投与による影響が認められたことから、胎仔型ライディッヒ細胞が時期特異的な機能を持つと推測される。このことから、より細かく時期を振って検討する必要性がある。また、各発生段階における胎仔型ライディッヒ細胞の遺伝子発現プロファイルと照らし合わせることで、時期特異的な機能の実体の解明が期待できる。遺伝子発現プロファイルに関しては、既に一部はサンプル調製が終了し、残りのサンプルに関しても間もなく終了すると予想される。今後は、シークエンスによって得られたデータの統計学的解析に力点を移し、胎仔型ライディッヒ細胞の機能が時期によってどのように変化するかを明らかにする予定である。
宇宙環境下における血管内皮前駆細胞培養の効率化と糖尿病性潰瘍への治療応用

微小重力環境下培養群では、対照群と比較してEPCマーカーCD34陽性細胞の発現割合が有意に増加した。EPC-Colony forming assayの結果、微小重力環境下培養後に通常環境下培養を行った群でコロニー数の有意な増加を認めた。また、EPC-culture assayの結果から、両重力環境下での培養群において、対照群と比較して有意にEPCの数が増加していた。更に、VEGF-A遺伝子は対照群と比較して両環境下培養群で有意に発現の増加が認められた。本結果から、通常、微小重力環境の培養期間の組み合わせを検討することで、既存法より更に高い血管再生能を有する細胞集団を増幅する可能性が示唆された。本研究は、血管内皮前駆細胞(EPC)など血管再生能を有する細胞集団の質と量を増幅させる培養方法であるMNC-QQ法(Tanaka.R. et al. Diabetes .(2013))を微小重力環境下において実施することで、既存の培養技術の効果を更に向上させ、既存法では培養効率が悪い症例においても高い培養効率と機能を有する細胞を増殖させる培養方法の確立を目的としている。平成28年度において申請者は、宇宙航空研究開発機構(JAXA)より貸与されている3D-クリノスタット(模擬的無重力発生装置)、JAXA開発の培養用デバイス(DCC)を用いて微小重力環境下におけるMNC-QQc法の確立を目指し、微小重力環境下、通常環境下でMNC-QQ法を行った。各培養条件下で得られたMNC-QQc細胞の機能評価を行うために、1細胞の増幅率,2発現している細胞集団のフローサイトメトリー解析、3EPCの血管再生能を表すColony formation assay,4EPCの数を表すEPC Culture assay, 4EPCの管腔形成補助能を表すTube formation assayを行った。これまでの結果から、通常環境下でMNC-QQc法を行った群と比較して、微小重力環境下培養群ではEPCマーカーの一つであるCD34陽性細胞数が有意に増加していることがFACS解析から明らかになった。また、EPCの血管再生能を表すEPC-Colony forming assayの結果、7日間通常環境もしくは微小重力環境下において培養を行った群と比較して、微小重力環境下培養後に通常環境下培養を行った群ではコロニー数の有意な増加を認めた。以上の結果から、通常環境と微小重力環境の各培養期間の組み合わせを検討することで、従来法より更に高い血管再生能を有する細胞集団を増幅する新規培養方法を確立できる可能性が示唆された。平成28年度研究結果から、対照群と比較して微小重力環境下ではMonocyteの発現領域が増加傾向にあり、この領域に発現しているEPCマーカーの一つであるCD34陽性細胞の発現率は、微小重力環境下における培養後に対照群と比較して有意に増加することがFACS解析から明らかとなった[MG vs対照群(4.37 ±2.65 vs 1.32 ±0.31, p <0.05)、ME vs対照群(4.74 ±2.96 vs 1.32 ±0.31, p <0.05)]。また、EPCの血管再生能を表すEPC-Colony forming assay (EPC-CFA)の結果から、微小重力環境下培養の後、通常環境下で培養したME群においては、対照群と比較して血管内皮細胞への分化能が高いEPCコロニー(Definitive EPC (dEPC)-CFU)の発現量が有意に増加していた(1329.1 ±573.4 vs 688.3 ±513.0, p <0.05)。一方で、EPCの数を検討した結果、全群において有意差は認められなかった。以上の結果から、通常環境と微小重力環境の各培養期間の組み合わせを検討することで、従来法より更に高い血管再生能を有するEPCを増幅する新規培養方法を確立できる可能性が示唆された。前年度では、EPCの血管再生能を表すEPC-Colony forming assayの結果、単一環境下で培養した群と比較して、微小重力環境下培養後に通常環境下培養を行った群ではコロニー数の有意な増加を認めた。また微小重力環境下群では、対照群と比較してEPCマーカーの一つであるCD34陽性細胞の発現割合が有意に増加することを明らかにした。更に、炎症性マクロファージのマーカーであるCCR2陽性細胞は、対照群と比較すると微小重力環境下培養群では更に発現が低い傾向にあることが明らかになった。最終年度では、EPCの数を示すEPC-culture assayの結果から、微小重力環境下培養後に地球重力環境下培養を行った群で、対照群と比較して有意にEPCの数が多いことが明らかになった。更に、微小重力環境下でMNC-QQc法を行うことで、血管新生関連因子のVEGF-B遺伝子とVEGF受容体であるKDR遺伝子の発現が対照群と比較して有意に増加することを明らかにした。また、VEGF-A遺伝子は対照群と比較して両環境下培養群で有意に発現の増加が認められた。

以上の結果から、MNC-QQc法における培養重力環境の変化が、培養効率と血管再生能をさらに向上させることが明らかとなり、通常環境と微小重力環境の各培養期間の組み合わせを検討することで、従来法より更に高い血管再生能を有する細胞集団を増幅する新規培養方法を確立できる可能性が示唆された。微小重力環境下培養群では、対照群と比較してEPCマーカーCD34陽性細胞の発現割合が有意に増加した。EPC-Colony forming assayの結果、微小重力環境下培養後に通常環境下培養を行った群でコロニー数の有意な増加を認めた。また、EPC-culture assayの結果から、両重力環境下での培養群において、対照群と比較して有意にEPCの数が増加していた。更に、VEGF-A遺伝子は対照群と比較して両環境下培養群で有意に発現の増加が認められた。本結果から、通常、微小重力環境の培養期間の組み合わせを検討することで、既存法より更に高い血管再生能を有する細胞集団を増幅する可能性が示唆された。平成29年度は、引き続き各培養条件下におけるMNC-QQc細胞の血管再生能・創傷治癒効果に関する機能評価を行う共に、血管再生関連、糖尿病関連、炎症制御関連因子などの遺伝子発現変化を検討する。さらに、微小重力環境下において発現が変化する遺伝子が、MNC-QQ細胞の血管再生、創傷治癒メカニズムに関与しているかを検証し、微小重力環境下MNC-QQ法は既存法と比較して培養効率・機能が向上することを実証する。形成外科学平成28年度に実施予定であったELISAや動物実験に関して、実施期間を平成29年度に変更したため。また、本研究の実施に必要不可欠である消耗品が世界的に欠品し、購入が困難であったため。申請書に記した実験を行うと共に、平成28年度の研究予定から移行させた機能解析、タンパク発現解析や動物実験を行う予定である。
ハイブリッド体(培養細胞+生体新素材)のinvivoにおける生体内挙動

我々は骨誘導能を有する骨移植材の開発を目的として、骨芽細胞やセメント芽細胞に分化することが考えられる歯根膜細胞と、多孔性ハイドロキシアパタイト(PーHAP)とのハイブリッド体を作製した。歯根膜細胞はウサギ(日本白色種)の切歯の歯根中央1/3よりバイオクリ-ンベンチ内で採取した。これをCO2培養器内にて培養、コ-ルタ-カンタ-にて細胞数の調整を行った。歯根膜を得た同一のウサギの下顎骨側面に歯根に達する直径5mmの円筒状骨欠損を2箇所作製し、この一方に作製したハイブリッド体を、もう一方にコントロ-ルとしてPーHAPのみを填塞した。手術後、3週、6週後に屠殺し10%ホルマリンにて固定、5%トリクロル酢酸にて脱灰の後、通法に従ってパラフィン包埋を行った。切片は厚さ6μの連続切片を作製し、ヘマトキシリンーエオジン染色を行い光顕下で組織学的検索を行った。術後3週経過の所見ではテスト側及びコントロ-ル側との間に特徴的な差異は認められず、両者とも顆粒周囲に多核巨細胞などの貪食細胞の付着が認められ、母床骨に接した部分より新生骨の形成が始まり一部新生骨に取り囲まれた顆粒も認められた。術後6週経過の所見ではテスト側顆粒周囲に石灰化物と思われるオステオイド様の所見が認められた。また、この部位においては細胞が垂直に顆粒内に進入しており、明らかに周囲組織とは形態を異にしていた。一方、コントロ-ル側においてはこのような所見は認められず、顆粒は線維性結合組織により取り囲まれていた。このような顆粒周囲に形成された石灰化様構造物は、付着させた歯根膜細胞が何らかの形で影響していると考えられるが、顆粒に付着させた歯根膜細胞によるものかどうかについては今後の研究によるところが大きいと考えられる。我々は骨誘導能を有する骨移植材の開発を目的として、骨芽細胞やセメント芽細胞に分化することが考えられる歯根膜細胞と、多孔性ハイドロキシアパタイト(PーHAP)とのハイブリット体を作製した。歯根膜を得た同一のウサギの下顎骨側面に歯根に達する直径5mmの円筒状骨欠損を2箇所作製し、この一方に作製したハイブリット体を、もう一方にコントロ-ルとしてPーHAPのみを填塞した。手術後、3週、6週後に屠殺し10%ホルマリンにて固定、5%トリクロル酢酸にて脱灰の後、通法に従ってパラフィン包理を行った。切片は厚さ6μの連続切片を作製し、ヘマトキシリン-エオジン染色を行い光顕下で組織学的検索を行った。術後3週経過の所見ではテスト側及びコントロ-ル側との間に特徴的な差異は認められず、両者とも顆粒周囲に多核巨細胞などの貧食細エの付着が認められ、母床骨に接した部分より新生骨の形成が始まり一部新生骨に取り囲まれた顆粒も認められた。術後6週経過の所見ではテスト側顆粒周囲に石炭化物と思われるオステオイド様の所見が認められた。

一方、コントロ-ル側においてはこのような所見は認められず、顆粒は線維性結合組織により取り囲まれていた。このような顆粒周囲に形成された石灰化様構造物は、付着させた歯根膜細胞が何らかの形で影響していると考えられるが、顆粒に付着された歯根膜細胞によるものかどうかについては今後の研究によるところが大きいと考えられる。
ウイルスはいかにして宿主の行動を制御するのか：バキュロウイルスを用いたアプローチ

変異ウイルスライブラリーを用いた行動スクリーニングから、新たな行動関連遺伝子arif-1を同定した。この遺伝子に変異をもつBmNPVは、ほとんど徘徊行動を起こさない。arif-1欠損ウイルスは培養細胞では顕著な表現型を示さないが、感染カイコにおいては全身感染が起こりにくく中枢への感染が遅れることで、徘徊行動が低下することが明らかになった。一方、ウイルス感染脳を用いたRNA-seqにより、徘徊行動時に発現が変動する宿主遺伝子を数10個同定することに成功している。現在、それらの機能解析をするために、遺伝子組換えウイルスの作成を行っているところである。昆虫病理学の分野では、「Wipfelkrankheit (梢頭病)」と呼ばれる病気が100年以上前から知られている。これは、昆虫ウイルスの一種であるバキュロウイルスに罹患したチョウ目昆虫の幼虫が木の枝の先でぶら下がって致死する病気である。バキュロウイルスは、その感染末期に宿主の行動を活発にし、寄主植物の上方に移動させ、その場で致死させる。その結果、鳥などへの補食や風雨による死体からのウイルスの飛散が促進され、次代が広範囲に伝播する。つまり、ウイルスの利己的な行動制御であると考えられている。私たちのグループは、カイコとそのバキュロウイルスを用いて、ウイルスの脱リン酸化酵素が行動制御に関わることを明らかにしている。また、このタンパク質が、酵素としてではなくウイルスの病原性を高めるために必要なウイルス粒子の構造タンパク質であり、宿主脳への感染に必須であるという驚くべき結果を得ている。本申請は、分子ウイルス学とトランスクリプトーム、および電気生理実験技術を組み合わせて、ウイルス・宿主両面からウイルスの行動制御に迫ることを目的としている。今年度は、変異ウイルスライブラリーのスクリーニングにより同定した新規行動関連遺伝子に関して、詳細な機能解析を行った。また、ウイルス感染脳のRNA-seqを行い、異常行動と関連がある可能性がある宿主遺伝子候補のピックアップに成功した。電気生理実験に関しては、現時点では安定した実験結果を得ることはできていない。私たちのグループは、カイコとそのバキュロウイルスを用いて、ウイルスの脱リン酸化酵素(PTP)が行動制御に関わることを明らかにしている。また、このタンパク質が、酵素としてではなくウイルスの病原性を高めるために必要なウイルス粒子の構造タンパク質であり、宿主脳への感染に必須であるという驚くべき結果を得ている(Katsuma et al., PLoS Pathog., 2012)。今年度は、変異ウイルスライブラリーのスクリーニングにより、異常行動に関る候補領域を新たに発見した。また、ウイルス感染脳のRNA-seqを行い、異常行動と関連のある宿主遺伝子のスクリーニングを開始した。一方、電気生理実験に関しては、系のセットアップを完了し、次年度の研究の準備を整えることができた。変異ウイルスの行動スクリーニングにより、異常行動に関る候補領域を新たに同定できたことは、新たなツールを手に入れたという点で非常に大きな成果であると考えている。また、RNA-seqの結果からは、プレリミナリーではあるが、異常行動と密接に関連した挙動を示す遺伝子の取得に成功している。一方、電気生理実験に関しても、研究室での系の立ち上げに成功しており、次年度から実際のサンプルを測定する予定である。以上のことをふまえると、これまでの研究はおおむね順調に推移していると考えられる。(1)行動異常に関わるウイルス遺伝子の同定とその機能解析研究室で保有している変異ウイルスライブラリー(マーカー挿入型、および点変異導入型)を用いた行動スクリーニングを継続し、新たな遺伝子ローカスの同定を試みる。また、前年度に同定した新規遺伝子に関して、その機能解析を行い、他の行動異常関連遺伝子との関連を調査する。(2)異常行動に関与する宿主遺伝子の探索、および機能解析前年度に行ったウイルス感染脳を用いたRNA-seqのデータ解析を詳細に行い、候補遺伝子を絞り込む。qRT-PCRでの確認実験により、RNA-seqでの結果が支持された遺伝子に関しては、実際に、RNAiや組換えタンパク質を用いた機能解析へ移行する。(3)電気生理によるウイルス感染個体の神経活動の解析

ウイルス感染、非感染時における神経活動を計測し、双方に顕著な差異が認められるかを検討する。また、異常行動を惹起しない変異ウイルスを感染させたカイコについても同様の実験を行う。RNA-seqを想定よりも少ないサンプル数で行ったこと、また、その確認実験としてのqRT-PCRが完了していないことが次年度使用分が発生した原因である。次年度は、これらの実験を完了させるとともに、研究計画に沿って研究を実施する。
錯体を用いる分子ストレスナノ空間の機能化学

本研究の目的は、第一に「弱いストレス」を与える空間(凝縮、クラスター化などの特異的集団現象の創出)、第二にゲスト分子に、「強いストレス」を与え活性化や変換を行う空間(効率変換材料)、最後にゲスト分子により、空間を構築する枠組みがストレスを受けて変形または活性化する動的フレーム空間(ゲスト応答材料、双安定性による環境応答材料)の創出である。2,5-ジヒドロキシ安息香酸(dhba)、4,4'-bipyridine(bpy)およびCu(NO_3)_2・3H_2Oを用いて、2次元シートがdhba部位でπ-πスタッキングをすることによって積層した3次元構造を持つ銅錯体[Cu_2(dhba)_2bpy]_nを合成することに成功した。この配位高分子は合成時に細孔に取り込まれている水分子を取り除くとπ-πスタッキングがずれることによって、2次元シート間が劇的に収縮することが明らかとなった。この錯体の298Kにおけるメタン吸着等温線は、8atmまではまったく吸着が起こらないのに反して、まるで閉じていたゲートが開いたかの様に8atmを境に急激な吸着を示すことが明らかとなった。また、配位方向に対して非対称に置換基を導入した配位子を用いて、数種の新規配位高分子を合成し、その構造決定に成功した。その非対称部位に由来する特徴的な構造と性質を確認できたことから誘電物性などの物理的機能や細孔の形状、サイズによる化学機能などのさらに進化した新しい機能を研究する上で有用な指針も得られた。本年度はゲスト応答機能をもつ多孔性錯体固体の基礎合成化学をすすめた。具体的には、アミド結合を持つ架橋配位子を用いて配位高分子フレームワーク{[Co(NCS)_2(3-pia)_2]・2EtOH・11H_2O}_n (1a)、{[Co(NCS)_2(3-pia)_2]・4Me_2CO}_n (1d)、{[Co(NCS)_2(3-Pia)_2]・4THF}_n(2a)、[Co(NCS)_2(3-pna)_2]_n (3)を合成した。1a、1d、2aはゲストであるTHF分子の吸脱着により、構造が変化することを粉末X線により確認した。ゲスト分子脱着により1aはアモルファス(1b)に、1dと2aは新しい結晶質(2b)に変化した。興味深いことに、1bはアセトンとTHFを取込み、それぞれ1dと2aへ構造を再構築することがわかった。さらに、2a(1d)【double arrow】2bはゲスト分子(アセトンまたはTHF)の吸脱着により、構造を可逆的に変化することが明らかとなった。ゲストフリーの1bと2bを水にさらす(浸す)とコバルト(II)に水分子が2つトランス配位した単核構造、[Co(NCS)_2(3-Pia)_2(H_2O)_2]_n (1c)へと変化することも明らかにした。またその非対称部位に由来する特徴的な構造と性質を確認できたことから誘電物性などの物理的機能や細孔の形状、サイズによる化学機能などのさらに進化した新しい機能を研究する上で有用な指針も得られた。

本研究の目的は、第一に「弱いストレス」を与える空間(凝縮、クラスター化などの特異的集団現象の創出)、第二にゲスト分子に、「強いストレス」を与え活性化や変換を行う空間(効率変換材料)、最後にゲスト分子により、空間を構築する枠組みがストレスを受けて変形または活性化する動的フレーム空間(ゲスト応答材料、双安定性による環境応答材料)の創出である。2,5-ジヒドロキシ安息香酸(dhba)、4,4'-bipyridine(bpy)およびCu(NO_3)_2・3H_2Oを用いて、2次元シートがdhba部位でπ-πスタッキングをすることによって積層した3次元構造を持つ銅錯体[Cu_2(dhba)_2bpy]nを合成することに成功した。この配位高分子は合成時に細孔に取り込まれている水分子を取り除くとπ-πスタッキングがずれることによって、2次元シート間が劇的に収縮することが明らかとなった。この錯体の298Kにおけるメタン吸着等温線は、8atmまではまったく吸着が起こらないのに反して、まるで閉じていたゲートが開いたかの様に8atmを境に急激な吸着を示すことが明らかとなった。また、配位方向に対して非対称に置換基を導入した配位子を用いて、数種の新規配位高分子を合成し、その構造決定に成功した。またその非対称部位に由来する特徴的な構造と性質を確認できたことから誘電物性などの物理的機能や細孔の形状、サイズによる化学機能などのさ進化した新しい機能を研究する上で有用な指針も得られた。
病原細菌溶菌バクテリオファージを用いた安全なコンポスト生産

【目的】バクテリオファージ(以下ファージ)は細菌に感染するウイルスであり、種類によって宿主とする細菌が異なり、高い宿主特異性を示す。ファージはその増殖形態から、テンペレートファージとビルレントファージに大別されるが、とくに後者は宿主細菌内で増殖した後に細菌を溶かしてファージ粒子を放出する。現在、家畜排泄物の多くはコンポスト化され、農地に還元されている。コンポスト化は有機物の分解を促進して堆肥化するとともに、発酵によりコンポスト温度を上昇させることにより病原菌を死滅させる。しかし、製品コンポストからのサルモネラの検出報告があり、コンポスト化は病原菌を完全に殺滅できるわけではない。そこで、コンポストやラグーンなど実規模の家畜排泄物処理過程から、病原性大腸菌やサルモネラなどの病原微生物を宿主とするファージを分離、性状解析を行い、これら病原微生物のファージによるコントロールを試みることとした。【方法】東北大学大学院農学研究科附属複合生態フィールド教育研究センター内の牛ふんコンポストおよび畜産排水の処理過程からサルモネラを宿主とするファージを分離し、得られたファージの宿主域や溶菌細胞数などを決定して、性状解析を行った。【結果】フィールドセンター内の牛ふんコンポスト及び畜産排水処理過程からサルモネラの検出を行い、2株のサルモネラを得た。その分離サルモネラおよびサルモネラ標準株を用いてサルモネラ溶菌性ファージの分離を試みた。その結果、ファージ23株を分離した。得られた23株の宿主域の調査の結果、13パターンに分けられたことから、少なくとも13株を得ることができたと考えられたげその中の1株について性状解析を行った結果、40kbpのゲノムをもち、バーストサイズは92、感染サイクルは約60分であった。
遠隔操作式後充填法による高線量率組織内照射に関する研究

組織内照射において線源の管理を完全にして紛失事故を解消し、医療従事者への放射線被爆を皆無にするためには、遠隔操作式後充填法による高線量率組織内照射法の採用が必要である。この方法によれば,短い照射時間で患者の負担が少なく、外来通院で安全に治療できる利点がある。線源強度の高いIr-192のミクロな線源を用い、コンピュ-タ制御によって線源の空間的、時間的配置を正確に制御すること、さらに緊急処置の必要な場合の照射中断および照射再開を正確に制御することが可能な方法を検討した。Ir-192線源のガイド管を兼ねたアプリケ-タは固い癌組織を穿通可能な硬性のものでなければならない。特に最も適応症例が多い口腔癌、咽頭癌の治療には、口腔内からの刺入操作が容易で、しかも確実に固定できるものとするために、適度な曲線型をもった、一平面刺入用と二平面入用のそれぞれに適したステンレス製でガイド管兼用のアプリケ-タを曲率の異なる3種類のものを試作した。舌癌に対する組織内照射例について、これらのアプリケ-タの組み合わせによる線源の適正配置と線量率分布について検討した。高線量率組織内照射における適正線量は従来用いられている低線量率組織内照射のそれとは異なると考えられ、放射線生物学的には線量率による効果比は1.5-2.0とされるが、臨床例おにいてはさらに検討を加える必要がある。組織内照射において、線源の管理を完全にし、医療従事者への放射線被爆を避けるためには、遠隔操作式後充填法による高線量率組織内照射法の採用が必要である。密封小線源の配置が正確にでき、短い照射時間で患者の負担が少なく、外来通院で安全に治療できる利点がある。高線量率組織内照射に適用できる線源強度の高いミクロなサイズのIrー192の線源を用いた、コンピュータ・コントロールによる照射装置(マイクロセレクトロン)が開発されている。遠隔操作式後充填法による組織内照射に用いられる線源のガイド管を兼ねたアプリケータは硬い癌組織を穿通可能な硬性のものでなければならない。特に最も適応症例が多い口腟癌・咽頭癌の治療には、口腟内からの刺入操作が容易で、しかも確実に固定できるものとするために、適度な曲線型で、一平面刺入用と、二平面刺入用のそれぞれに適したステンレス製でガイド管兼用のアプリケータを曲率の異なる3種類のものを試作した。舌癌に対する組織内照射例について、これらのアプリケータの組み合わせによる線源の適正配置と線量分布について検討した。高線量率組織内照射における適正線量は従来用いられている低線量率組織内照射のそれとは異なると考えられ、放射線生物学的には線量率による効果比は1.52.0とされるが、臨床例においてはさらに検討を加える必要がある。線源強度の高いIrー192のミクロな線源を用い、コンピュ-タ制御によって線源の空間的、時間的配置を正確に制御すること、さらに、緊急処置の必要な場合の照射中断および照射再開を正確に制御することが可能な方法を検討した。この目的にそってすでに開発されている装置のながで最も適切と考えられるのはマイクロセレクトロンである。この装置を用いての口腔癌、咽頭癌の組織内照射用に、口腔内からの刺入操作が容易で、しかも確実に固定できる形で、適度な曲線型をもった、一平面刺入用と二平面刺入用のそれぞれに適したステンレス製でガイド管兼用のアプリケ-タを曲率の異なる3種類のものを試作した。

高線量率組織内照射における適正線量は従来用いられている低線量率組織内照射のそれとは異なると考えられ、放射線生物学的には線量率による効果比は1.5ー2.0とされるが、臨床例においてはさらに検討を加える必要がある。
クロマチンの構造変化を誘導する組換え蛋白質の同定と機能の解明

真核生物では、DNAは折り畳まれ、クロマチン構造を形成している。クロマチン構造は複製、転写、組換え等の生物機能を制御しており、また、上記の生物機能を担う因子はクロマチン構造の変化を誘導することがある。本研究ではクロマチン構造の変化を誘導する因子を減数分裂期組換え機構を主として検討する。減数分裂期において、組換えとは関係のないクロマチン構造変化がおきる可能性がある。この可能性を二重鎖切断が殆ど起こらないURA3遺伝子を用いて検討した。その結果、URA3遺伝子は5'と3'のヌクレアーゼ感受性領域の間に6つのpositioningしたヌクレオソームをもち、プロモーター領域に隣接するヌクレオソームは2つのポジションをもつクロマチン構造をとることが分かった。URA3遺伝子をヘテロクロマチン領域であるテロメア近傍に導入したときには、構造変化が観察された。また、培地の組み合わせにより、このクロマチンの構造変化が転写と関係しているかとが示唆された。一方、減数分裂の過程においては、クロマチンの構造変化は見られなかった。二重鎖切断が蓄積されていく、rad50s変異株を用いて、組換えのホットスポットの一つであるYCR47c-YCR48w領域のクロマチン構造をprimer extentionを用いて解析した。その結果、この二つの遺伝子の間のヌクレアーゼ感受性領域に両遺伝子のプロモーターが存在し、28箇所の二重鎖切断部位の全てがこの領域に存在することがわかった。このことは、二重鎖切断はクロマチン構造をとっている領域には起きず、ヌクレオソームの無い領域に起きることを示唆している。primer extention法はバックグランドのノイズが高く、微妙なクロマチンの構造変化の検出には不向きである。ノイズのほとんど無いsequence gelでのsouthern hybridazation法を用いて、解析を行っている。