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重症患者の血糖コントロールのためのインスリン治療支援システムの試作

重症患者の治療において血糖値を適正な値に維持することは重要である。この治療にはインスリン療法が効果的であるが、この方法は頻繁な血糖モニタリングと適切な量のインスリンを適当なタイミングで投与する必要がある。最近、古典的な制御理論に基づいたアルゴリズムによってインスリン投与を投与するフィードバック制御システムが開発された。本研究では、インスリン投与のために多変数自己回帰モデルを用いた新しいアルゴリズムを開発した。我々は血糖動態のシミュレータを用いたシミュレーション実験によりシステムの有効性を確認した。最近、血糖コントロールの方法として、インスリン投与量の調整を古典的な制御理論であるPID制御の概念に基づいたコンピュータによる補助を試みた報告がある。血糖コントロールの厳密化には、必然的に血糖測定とインスリン投与速度の調整が必修になるが、実施には医療現場の負担の増加も無視できない点が問題である。本研究では、インスリン投与量設定のアルゴリズムの開発とそれを応用した支援システムの試作を目的として投与量算定のためのシステムを試作した。最終的には、重症患者の治療開始直後の急性期と安定状態への移行期及び安定期の3フェーズに分けて、支援・自動化アルゴリズムを開発した。急性期は、患者の状態として初期の血糖値とそれに対する医師の指示によるインスリン投与量の情報収集を行うとともに、短期間に得られた血糖値データに基づいて投与量を設定する方式とした。次に必要なデータ蓄積ができた段階から、収集した血糖値、及びインスリン投与量を用いて血糖動態を推定する回帰モデルを逐次的に作成して、血糖動態の予測を行ったうえで、インスリン投与量の算定を行うアルゴリズムを作成した。回帰モデルは、血糖測定ごとに更新して、血糖動態の変動に追従可能なシステムとしている点に特色がある。血糖動態を模擬するモデルを用いてシミュレーションによる模擬実験を実施した。その結果、従前の血糖コントロールアルゴリズムと同様な血糖コントロールが可能であることが分かった。近年、救急患者など重症者の血糖コントロール方法として、インスリン投与量の調整を古典的な制御理論であるPID制御の概念に基づいたコンピュータによる補助を試みた報告がある。血糖コントロールの厳密化には必然的に血糖測定とインスリン投与速度の調整が必修になるが、実施には医療現場の負担の増加も無視できない点が問題である。本研究では、インスリン投与量設定のアルゴリズムの開発とそれを応用した支援システムの試作を行った。試作システムは重症患者の治療開始直後の急性期と安定状態への移行期及び安定期の3フェーズを対象として構成し、それらに適用した支援・自動化アルゴリズムを開発した。第一段階の急性期は、患者の状態として初期の血糖値それに対する医師の指示によるインスリン投与量の情報収集を行うとともに、短期間に得られた血糖値データに基づいて投与量を設定した。次に必要なデータ蓄積ができた時点で、第二段階として安定期に移る移行期には、これまでに収集した血糖値、及びインスリン投与量を用いて血糖動態を推定する回帰モデルを逐次的に作成して血糖動態の予測を行ったうえで、インスリン投与量の算定を行うアルゴリズムを作成した。さらに第三段階の安定期については、血糖動態の回帰モデルに基づいた血糖コントロールアルゴリズムを試作した。血糖動態を模擬するモデルを用いてシミュレーションによる模擬実験を実施するとともに、最終年度は、動物実験による試行を試み、プログラムの実用性について検討し、システムの有用性を確認した。医用生体工学計画に従って、アルゴリズムの開発、シミュレーションスタディーを実施してきた。試作システムを使用した、急性腎不全モデル動物による血糖コントロール実験による検討と臨床での検討を実施する計画である。当該年度末までに予算は執行したが、支払が本年度に延期されたためである。本年度早期に昨年度分が支出される。
真空下における人工衛星用のマイクロハイブリッドロケットの作動実験及び性能評価

○研究目的小型衛星用の推力1N級ハイブリッド推進機(燃焼室圧10気圧以下)の実現である。そこで、今年度は、真空用超小型ハイブリッド推進機・性能評価装置の試作を行い、真空下での実験環境の構築と固体燃料の配合や添加剤の粒径をパラメーターとする先述の試作機の性能評価の二つを実施する。○研究成果:推力1N級の超小型ハイブリッド推進機の設計する上で、NACAの化学平衡計算プログラムソフトCEA(Chemical Equilibrium with Applications)を用い、最適な酸化剤と燃料の割合を算出し、推進機の推進剤流量等の検討を行った。試作機の材質はSUS303を使用し、酸化剤供給・点火部と燃焼・ノズル部の2部品を製作した。また、試作機の性能を評価するため、推力測定装置を試作した。試作した推力測定装置は、弾性ヒンジを軸にした振子に推進機、オイルダンパ(減衰装置)、変位計が取り付けられており、振り子の変位が外力の大きさに比例することを利用して変位を測定することで、推力を評価するものである。以上より、真空雰囲気圧下においての実験環境を構築することができた。また、性能評価においては、先述の試作機を使用し、燃料は、HTPB/APコンポジット推進剤(30:70)を作製し、酸化剤は、乾燥空気(dry Air)を使用し、大気圧下で作動を確認したが、設計圧力よりも高い値となってしまった。そのため、今後は、推進剤の添加剤等の配合の調整を行うとともに、推進機等の遂次改良を図り、超小型衛星用の推力1N級ハイブリッド推進機(燃焼室圧、10気圧以下)の実現に向け研究を進めていく予定である。
うつ病の再発予防を目的とした新しい精神療法の意義-UCLAとの共同研究から-

追跡調査が可能であった対象の特性は男性9例、女性22例の計31例、平均年齢は48.7歳±11.2歳であった。罹患期間は25ケ月から60ケ月(つまり25年間)が最も多く、全体の35.5%を占めた。平均罹患期間は、48.9ケ月間であった。コントロール群との比較だが、コントロール群は男性8例、女性14例の計22例、男性対女性は1:1.8であった。平均年齢は、47.3±11.4歳であり、対象群と比較して、統計学的有意差は認めなかった。平均罹患期間は38.9ケ月間であり、対象群との統計学的有意差はなかった。ICD-10での診断基準で分類すると、Depressive Episode16例(男性11例、女性5例)、Recurrent Depressive Disorder6例(男性3例、女性3例)であり、対象群と比較してRecurrent Depressive Disorder例統が多い傾向が見られた。1年後の転帰は、完全寛解10例、不完全寛解9例、不変2例、悪化1例であり、対象群と比較して有意差はなかった。(1)対象:外来うつ病患者のうち,寛解期で維持療法中の患者を対象として,このたび導入した新しい精神療法を計4クール施行した。それと同時に現在までこの療法を受けた患者群に対して,追跡調査を引き続き行った。また,一方で,対照群として,外来うつ病患者のうち,この精神療法に導入しなかった患者群を対象に,抑うつ状態の評価を随時行っていった。(2)方法:スクリーニングで得られた患者群を対象に講習(精神療法)を行った。また,一方で,既にこの講習を受けた患者群のうち,外来通院中の患者に対しては定期的(1回/12週)に面接を行い,随時抑うつ状態を評価していった。(3)使用教材:患者配布用のテキスト作成と,患者の提出したホームワークを記録として複製した。また,自律訓練方法の内容をコピーしたオーディオテープの作成,配布も行った。(5)結果:統計学的有意差はまだ明らかではないが,講習を受けた患者群は対照群と比較して,うつ状態の再発率が低い傾向にある。また,うつ状態が再発した症例も,従来と比較して抑うつ状態の軽症化,短期間化の傾向が認められた。患者各々が学習・習得した技法を用いて,講習後でも自己治癒的取り組みがなされていたことが,定期的面接からも窺われた。講習で用いられている認知行動療法の有意性の統計学的立証が今後の課題である。
老化関連因子のイメージングによる細胞分裂寿命リセット機構の解析

出芽酵母において、細胞分裂寿命に関わると考えられる種々のオルガネラそれぞれについて、特異的に局在するタンパク質のC末端を緑色または赤色の蛍光タンパク質でタグ付けすることにより、その挙動を追跡できる出芽酵母株を作出し、撮影条件の最適化を行った。長時間の経時生細胞イメージングを実施するため、マイクロ流路を用いた顕微鏡ステージトップ培養装置を導入し、装置上での胞子形成誘導条件を検討し、高効率かつ短時間で胞子形成を誘導できる条件を確立した。高輝度の新規蛍光タンパク質のBiFC化を行い、Sir2(出芽酵母の分裂寿命に強く関与していることが既知のタンパク質)を含むRENT複合体の可視化を実現した。多くの生物は老化する。単細胞生物であっても、個々の細胞は分裂回数に限界がある。この限界を規定しているのは細胞に蓄積する何らかのダメージ因子であると考えられており、その候補としてERCs (Extrachromosomal Ribosomal DNA Circles)、タンパク質凝集体、膜電位の低下したミトコンドリア、pHの上昇した液胞などが考えられている。出芽酵母では、胞子形成過程を経ることで、娘細胞の細胞分裂寿命のリセットが生じることが既知であり、このときERCsの消失が起こることが分かっている。本研究では、これらの老化関連ダメージ因子とともにオートファジー関連タンパク質を可視化し、胞子形成過程における動態を観測し、細胞分裂寿命のリセットが生じる機構を解明することを目的とする。細胞の老化と関連した因子として、本研究においては、ERCs (Extrachromosomal Ribosomal DNA Circles)、タンパク質凝集体、ミトコンドリア膜電位、液胞内腔のpHの4つに注目する。ERCsを可視化するにあたっては、lacOアレイとlacI-GFPの組み合わせを用いるとともに、ERCsの供給源であるrDNA領域の局在箇所である核小体についても可視化をおこなう。ミトコンドリアについては、その分布のみならず、膜電位の高低についても情報を得る必要がある。液胞についても、ミトコンドリア同様、その分布だけではなく、液胞内腔のpHの変動を調べる必要がある。各老化関連因子を可視化した酵母細胞株を作成し、タイムラプスイメージングを実施し、胞子形成過程での各老化関連因子の動態を観測する。本年度は、核小体(rDNAと関連するオルガネラ)、ミトコンドリア、液胞のそれぞれを可視化した酵母細胞株を作成し、タイムラプスイメージングの撮像条件の検討を実施した。当初計画にしたがって、核小体、ミトコンドリア、液胞について、各オルガネラ特異的に局在するタンパク質を蛍光タンパク質でタグ付けすることで可視化した酵母細胞株を作成した。波長の異なる2種類の蛍光タンパク質を使用することにより、ミトコンドリアと液胞の組み合わせについて同時に可視化した菌株も作成した。これらの酵母細胞株について、栄養増殖条件において、アガロース包埋法を利用したタイムラプスイメージングを実施し、長時間の撮像が可能な実験条件を検討した。さらに長時間のイメージングを実施するため、マイクロ流路を用いた培養装置の使用条件についても検討を実施した。本研究では、これらの老化関連ダメージ因子とともにオートファジー関連タンパク質を可視化し、胞子形成過程における動態を観測し、細胞分裂寿命のリセットが生じる機構を解析することを目的とした。細胞の老化と関連した因子として、本研究においては、核小体(rDNA/ERCsに関連したオルガネラとして)、ミトコンドリア、液胞に注目した。昨年度までに、核膜、核小体、ミトコンドリア、液胞のそれぞれについて、各オルガネラ特異的に局在するタンパク質を蛍光タンパク質でタグ付けすることで可視化した酵母細胞株を作成した。今年度は、長時間のライブセルイメージングを実施するためにマイクロ流路を用いた胞子形成誘導条件を検討し、胞子形成誘導開始から24時間以内に約70%の細胞で減数第二分裂が完了する条件を確立した。ここで確立した胞子形成誘導法を用いて、出芽酵母の胞子形成過程のタイムラプスライブセルイメージングを実施した。特に核膜・核小体については、野生型株および核膜のオートファジーに関連する変異株の比較を試みた。前年度に可視化した核小体、ミトコンドリア、液胞に加えて、タンパク質凝集体、ミトコンドリア膜電位、液胞内腔pHを可視化した菌株を作成する計画である。

また、栄養増殖条件での長時間イメージングのための撮像条件を最適化した上で、これらの酵母細胞株について、胞子形成過程全体をカバーする長時間イメージングを実施する。さらに、老化関連因子に加えて、オートファジー関連因子も同時に可視化することにより、老化関連因子の排除過程とオートファジーとの時空間的関連性を明らかにすることを目指す。加えて、各老化関連因子の排除過程に特異的に作用すると考えられる変異を導入した酵母細胞株を作成し、これらの細胞について、それぞれの老化関連因子の胞子形成過程における振る舞いを可視化する。細胞生物学研究代表者の所属する研究室にマイクロ流路利用型ステージトップ培養装置が導入され、部局共通機器室の顕微鏡機材を使用する必要がなくなり、共通機器利用料の支払い経費分のコストを削減できたため。マイクロ流路利用型ステージトップ培養装置に関わる消耗品(主にマイクロ流路を形成してあるガラスボトムプレート)の購入に充てる計画である。
ユビキチン-プロテアソーム系を利用したタンパク質ナノキャリアの分解制御と薬物放出

本研究ではウイルス構造体を模したタンパク質ナノカプセルを構築し、これを細胞内シグナルによって崩壊させるシステムの創製を目指した。そのために利用したのが細胞内に普遍的に存在するタンパク質分解システムである。我々はナノカプセルの表面にある種の分子を最適配向させることによって、このナノカプセルを分解させることに成功した。この時、カプセルの内孔に小分子量の薬剤を封入しておくと、分解と協奏的に薬物が放出されることも確認した。この原理を用いることで、特定の薬剤を特定の細胞へ送り込むことも可能になる。本研究ではHSP16.5が自己組織化によって形成するナノ構造体に着目し、その機能化を目的とする。この構造体は内孔(径7nm)を有する球状構造(24量体、外径12nm)を構築することが知られている。我々の予備実験において、マウスに投与したこのナノカプセルは急性毒性を示さず、特定の臓器や組織に対する指向性も確認されなかった。またX線結晶構造解析の結果、このタンパク質のC末端はカプセルの外表面に露出していることが明らかとなっており、遺伝子組み換えによりこの領域に標的細胞に対するアンテナ分子を組み込むことが可能である。本年度は多くの膵がんにおいて高発現していることが明らかとなっているVEGFに対するコレセプターの一種、Neuropilin-1に対するアンテナ分子であるiRGDペプチドをナノカプセル表面に提示することを試みた。具体的には、ナノカプセルの外表面に配向するC末端にNeuropilin-1に特異的なiRGDペプチドを組み込んだ融合タンパク質を新たに設計し、大腸菌から大量発現させた。クロマトグラフィーによって精製したナノカプセルは、動的光散乱法(DLC)と透過型電子顕微鏡(TEM)観察によって、期待どおり球状構造体を形成していることを確認した。このiRGDナノカプセルの特異性をin vitroで評価したところ、Neuropilin-1高発現株の膵がん細胞に高いと親和性を示し、合成iRGDペプチドの添加によって濃度依存的に阻害された。iRGDナノカプセルのNeuropilin-1特異性の発現に際しては、ナノカプセルとiRGDペプチドの間に配置したフレキシブルリンカーの存在が重要であり、より長いリンカーがレセプターとの結合に有利であった。さらにiRGDナノカプセルの内孔に抗がん剤を内封することによって、より効率的にがん細胞にアポトーシスを誘導することに成功した。当初の計画に沿って実験を遂行しており、期待どおりの成果が得られている。本研究ではウイルスカプシドをモデルとする新しいナノドラッグキャリアを開発する。これをベースとして様々に機能化し、1分子標的による組織・細胞への侵入、2細胞シグナルによるカプセル崩壊、さらに3内包薬物の放出を実現する。これまでに類例のないこの次世代インテリジェント型ナノカプセルの内孔には、遺伝子、抗癌剤、MRI造影剤、生理活性ペプチド、あるいはNO放出剤など多様な薬剤を固定することが可能であり、特定の分子を標的とする分子イメージングから副作用を極限まで抑えた薬物治療を実現する。本年度は、前年度までに作成した膵がん特異性を有するiRGDナノカプセルと細胞内分解性のODDナノカプセルの二つの性質を併せ持つナノカプセルを作成した。母体となっているHSP16.5ナノカプセルは、24個のサブユニットから構成されており、これらは加熱によって容易にサブユニット交換されることが明らかとされている。そこで同様に、iRGDナノカプセルとODDナノカプセルを混合し、55°Cで加熱することによって両者のヘテロ型ナノカプセルを構築した。サブユニット交換によってヘテロ型ナノカプセルとなっていることは、近接した蛍光分子(ドナー)の蛍光スペクトルと、もうひとつの蛍光分子(アクセプター)の励起スペクトルに重なりを利用した蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)を用いて評価したところ、期待どおりに2つのサブユニットがヘテロな複合体を形成していることが確認できた。さらにこの複合型ナノカプセルは、in vitroにおいてタンパク質分解シグナルであるユビキチン化されることも確認できた。ユビキチン化等のナノカプセルの変化を確認するため抗ナノカプセル抗体の作成が必要となったが、その作成に時間を要しておりスケジュールに遅れが生じた。そのため一部基金を繰り越しており、抗体が出来次第実験を再開する計画である。なお、最終目標には変更はない。本研究ではタンパク質ナノカプセルを構築し、これを細胞内シグナルによって崩壊させるシステムの創製を目指した。申請者らが着目したのは、病原性の観点からウイルスそのものではなく、それと非常によく似た構造体を形成するsmall heat shock protein(HSP16.5)である。このタンパク質は分子量16.5KDaのタンパク質24個が自己組織化することにより、内孔(内径7nm)を有する球状構造体(外径15nm)を形成している。9個のβシート構造による厳格な立体構造と、隣接するタンパク質との強固な疎水性相互作用のために、このナノ構造体は非常に安定であり、60°Cにおいても安定にその構造を維持することができる。また構造体の内孔は疎水性のアミノ酸残基が配向しており、抗癌剤を含む多くの疎水性薬物を内包することが可能である。そこで本研究ではこのナノ構造体をドラッグキャリアとして利用し、Neuropilin-1を分子標的とする膵がん特異的ナノカプセルを開発した。そのアンテナ分子としてiRGDペプチド(CRGDKGODC)をコードする遺伝子を、ナノカプセル外表面に配向するC末端に様々な長さのアミノ酸リンカー組み込んだ。

この膵がん特異的ナノカプセルはNeuropilin-1高発現株(膵がん)に高い親和性を示し、配列依存的かつリンカー長が長いほど取り込まれやすくなる傾向を示した。そこで様々な癌細胞に細胞死を誘導することが知られている薬剤OSU03012とカプセルを共存させ、55°Cで30分間加熱振とうしたところ、カプセル1つあたりに4050分子のOSU03012が内包されていることが明らかとなった。このOSU03012を内包した膵がん特異的ナノカプセルは、Neuropilin-1高発現株をより効果的にアポトーシス誘導することが示された。本研究ではウイルス構造体を模したタンパク質ナノカプセルを構築し、これを細胞内シグナルによって崩壊させるシステムの創製を目指した。そのために利用したのが細胞内に普遍的に存在するタンパク質分解システムである。我々はナノカプセルの表面にある種の分子を最適配向させることによって、このナノカプセルを分解させることに成功した。この時、カプセルの内孔に小分子量の薬剤を封入しておくと、分解と協奏的に薬物が放出されることも確認した。この原理を用いることで、特定の薬剤を特定の細胞へ送り込むことも可能になる。当初の計画を着実に遂行するとともに、臨床的により価値のある成果をめざす。複合機能を持ったナノカプセルは臨床的に非常に非常に有用である。本研究から派生した膵プロテアーゼ応答型ナノカプセルは、重篤な術後合併症である膵液瘻のセンサーとして臨床研究を開始している。薬物送達システム外部に依託合成する生理活性ペプチドの納期が年度末までに間に合わない可能性が生じたため、次年度に繰り越した。ナノカプセルの動態や構造を明らかにするために抗体が必要となったが、市販のものは存在しない。そこでウサギを使ってナノカプセルを免役し、独自の抗体を作成することにしたが、精製までを含めると4ヶ月を要することが分かり、やむなく繰り越すことにした。ペプチド合成の遅延による研究計画の見直しはなく、当初の計画通りに研究を遂行できる見込みである、研究の基本計画は見直さず、抗ナノカプセル抗体が完成次第、研究を再開する計画である。
過食症への遠隔認知行動療法の有効性及び費用対効果の検討

過食症に有効性が認められている認知行動療法は、治療者が都市に集中しているため、治療を受けられない患者も少なくない。そこで、研究1では、過食症の女性に対するテレビ電話による認知行動療法(以下vCBTと略記)の症状改善効果を検証するとともに、vCBTに伴う治療同盟、及びvCBTの安全性と満足感からvCBTの実用可能性を検証することを目的とした。研究2では、臨床試験を終了した研究協力者を対象に追跡調査を行い、QOL、過食症状の推移や再発率について観察し、費用対効果や長期的な有効性について検討することを目的とした。研究プロトコルを作成し、千葉大学医学部附属病院の臨床研究倫理審査委員会の承認を得た上で(承認番号G29028)、登録および介入を開始した(UMIN000029426)。本研究は、非対照試験であり、神経性過食症、過食性障害の16歳以上65歳までの女性を対象とした。vCBTを1回50分、週1回で16回の介入を行った。有効性・安全性評価のための主要評価項目に関する検査及び副次評価項目に関する検査は、介入開始日、介入中期、介入終了後に実施しており、症状の主要評価として、摂食障害評価尺度(Eating Disorder Examination (EDE))における28日間の客観的過食エピソードの回数・排出行動エピソードの回数・客観的過食エピソードと排出行動エピソードの合計回数とした。累計8名の研究教職者を登録し、介入を終えたため、データを固定した。研究プロトコルを作成し、千葉大学医学部附属病院の臨床研究倫理審査委員会の承認を得た上で、登録および介入を開始した(UMIN000029426)。当初予定していた臨床試験の登録人数よりやや少ないが、既にデータを固定し、臨床試験を終了したため、おおむね順調に進展しているといえる。今後は、データ解析を行なっていく。有効性の評価は、患者の主診断に沿って、摂食障害評価Eating Disorders Examination(EDE)を用い、治療開始時と治療終了時のEDEにおける客観的過食エピソードと排出行動の変化量により、実用可能性と治療効果を明らかにする。また、臨床試験に参加した研究協力者を対象に、費用対効果や長期的な有効性について検証するために、追跡調査を行う。追跡調査の研究に関しては、千葉大学医学部の倫理審査委員会の承認を得ている(承認番号3175)。貸し出し予定のタブレット等を購入予定であったが、既に研究協力者が持っている物を使用したため、購入に至らなかった。そのため、次年度の研修を受けるための旅費と消耗品の使用を予定している。
日本とEU諸国における短期留学の特徴と高等教育の国際化に果たす役割の比較研究

非英語圏として英語による授業という弱みを有する日本の短期留学を強化するには、縦横2つの軸からの拡充を検討する必要がある。縦とは、留学前、留学中、留学後の3つの時間軸にそった拡充策で、特に「留学前」の海外における日本語・日本文化普及活動、「留学後」のキャリア形成支援活動との連携が必要である。横とは、企業、自治体、他大学、研究助成機関、国際協力機関、国際機関等との連携で、日本留学の魅力を高めることが可能になると考えられる。ドイツ、スペイン、スウェーデンにおける短期留学生の受入れ状況と英語による授業の開講状況について調査を行うとともに、日本とEUの短期留学を比較するフレームワークを作成した。訪問した三カ国とも修士レベルの英語によるプログラム開発に力をいれているが、学部の3年間は、母国語による教育が中心である。Erasmus MundusというEUの複数大学による共同大学院コースでは、大学間の調整にかなりの労力がかけられているが、奨学金供与もあり、EU外からの優秀な留学生の獲得に成功している。ドイツでは、ECTSを採用した単位制度を使っているのは、全体の3分2にとどまっていた。スペインでは、スペイン語もまた国際言語であるため、すべてのカリキュラムについて英語化圧力が働くわけではない。特に英語圏からスペイン語・スペイン文化に魅力を感じて留学をしてくる学生も多い。スウェーデンでは、留学生からの学費徴収に向けての議論が、盛んに行われていた。日本とEUの短期留学の強みと弱みについて、比較フレームワークから下記のような点が明らかになった。<EUの強み>ボローニャ・プロセスを通じて、共通の学位システムや教育の質保証制度、単位互換制度を整備し、域外との学生交流においても、これらの諸制度の利点を大いに活用<EUの弱み>国・分野によって、教育の英語化の程度が異なる<日本の強み>教員がプログラムコーディネータとして配置され、異文化理解、日本人学生との交流、課外活動などがバランスよく組入れられる。<日本の弱み>(1)英語による講義確保の困難さ、(2)単位互換制度が定着していない、(3)短プロが「出島」となってしまい、学内の他の部局に国際化が十分に波及していない。日本に短期留学した学生222名(学部生72%、修士28%、出身:欧州95、アジア45、北米36、オーストラリア21、中東2)と非英語圏EUに短期留学した学生28名(行先:フランス10、スペイン8、ドイツ7、スウェーデン2、学部生85%、修士15%、出身:米国人12日本人16)に対するオンライン調査を分析した結果、日本の短期留学では「英語による専門教育の質」が最も大きな問題として認識され、次いで「英語による日本人との意思疎通」であるのに対し、非英語圏EUの短期留学では、「人的ネットワークの拡大の困難さ」と「資金支援不足」が問題として認識されていた。また、日本留学では、見学・文化体験などの「その他活動」と「他国の留学生とのネットワーク機会」が非英語圏EUへの留学よりも評価が高かった(有意差)。このことより、日本の短期留学の改善のためには、英語による授業の質の向上と、日本人学生の英語による意思疎通能力の強化が重要であることがわかる。また、スペイン語やスペイン文化を強みとしてラテンアメリカ諸国から多くの留学生を受入れているスペインの事例分析を通じ、日本の短期留学でも、日本語や日本文化をよりアピールすること、また、海外における日本語教育や日本文化広報を強化し、日本への短期留学に関心を持つ若者を増加することが、必要と考えられる。更に、日本への短期留学が、その後のキャリア形成につながるように、インターンシップなどの企業と連携を推進する必要があると考えられる。(1)非英語圏EU諸国と日本への短期留学がどのように評価されているのかを、両地域への短期留学生や大学関係者のオンライン調査回答421件の分析、米国、オーストラリア、EUの関係者へのインタビューや資料分析等から解明し、各々の強み弱みを分析した。日本では「英語による専門分野の授業の質と量」「日本人の英語力のなさによるコミュニケーション不足」の2つが大きな問題として挙げられた(2)非英語圏EU諸国と日本における短期留学による高等教育国際化の促進状況と課題を、政策比較、EU及び日本の国公私立大学における事例分析、インタビュー等に基づいて解明した。(3)非英語圏EU諸国と日本の短期留学における企業等との連携の現状と課題について、EU委員会でのインタビューに基づく政策比較、日本、EU、韓国での連携事例分析等を通じて解明した。(4)以上の分析を通じ、今後の日本の学生交流の拡充に向け、「縦」「横」2つの軸から検討する必要を指摘した。「縦」とは、留学前、留学中、留学後という留学生の3つの時間軸にそった拡充策の検討である。「留学前」の海外における日本語・日本文化普及活動を強化する必要がある。「留学後」のキャリア形成を支援する活動をプログラムに組入れることも、日本の短期留学の魅力を高めることになる。

「横」とは、企業、地方自治体、国内外の大学、国際機関等と互いの強みを持ち寄り、弱みをカバーし合う連携スタイルである。このような「縦」「横」を視野に入れつつ、アジアにおける魅力ある持続可能な学生交流のビジョンを策定することが必要である。
離散転位動力学法によるき裂先端近傍の欠陥分布と延性ぜい性遷移メカニズムの研究

き裂先端近傍に形成される転位の分布構造とそれによる応力拡大係数の遮蔽による見かけの破壊じん性値の変化、および、延性ぜい性遷移といった破壊様式の変遷のメカニズムの解明、疲労破壊の散逸構造としてのモデル化を目的として、離散転位動力学法(Discrete Dislocation Dynamics;DDD)に基づいた多数の個別の転位のダイナミクスの直接シミュレーションを実施し、以下のような知見を得た。(1)転位運動の素過程を適切にモデル化することを通じて、結晶塑性論に基づく有限要素法による解析結果と、原子モデルを用いた分子動力学法による解析結果の両方を説明できるメゾスケールのモデルが構築できることがわかった。(2)結晶の配向の違いによってき裂先端の転位パターンとその形成過程に顕著な違いが現れることがわかった。これは、Riceらによって予言されている転位組織の形成とマクロ変形との関わりに対する実証になっていると考えられる。(3)繰り返し負荷過程で、転位の生成消滅が起こるが、転位の総数はほぼ一定に維持されることがわかった。これは、生成消滅系における動的定常状態の実現の結果であると結論づけられる。(4)繰り返しによるき裂先端場の転位構造の形成により、先端のへき開応力値が増大し、局所応力拡大係数の増加がみられた。これは、転位組織形成に伴う材料の延性ぜい性遷移メカニズムの解明の一助となるものと期待できる。き裂先端近傍に形成される転位の分布構造とそれによる応力拡大係数の遮蔽による見かけの破壊じん性値の変化を調べ、さらに、延性ぜい性遷移といった破壊様式の変遷のメカニズムを解明することを目的として,離散転位動力学法(Discrete Dislocation Dynamics; DDD)によるシミュレーションを実施した結果,以下のような独創的知見を得た.1.き裂を導入したモデルに対するシミュレーションの結果,転位分布によって応力拡大係数が遮蔽される場合と増幅される場合があることを明らかにした.さらに,混合モードが形成される可能性について示唆した.2.転位の運動から塑性ひずみを評価する方法を提案し,シミュレーションに適用した.その結果を,結晶塑性論に基づく有限要素シミュレーション,および,分子動力学シミュレーションの結果と比較し,き裂先端近傍に形成される塑性域について定性的に良い一致が見られることを明らかにした.3.繰り返し荷重を与える問題に適用した.その結果,転位の生成と消滅により,転位分布に動的なパターン形成が見られ,統計的定常状態がき裂先端場に実現されることが明らかになった.また,き裂先端のへき開応力が増大し,延性ぜい性遷移メカニズムの出現可能性を示唆する結果を得た.これらの成果から,転位分布のダイナミクスによる延性ぜい性遷移メカニズムの解明に一歩近付いたと考えられる.引続く計画中の研究の展開によって,これらの現在未解決の問題に対して工学的に有益な成果をもたらすことが期待できる.き裂先端近傍に形成される転位の分布構造とそれによる応力拡大係数の遮蔽による見かけの破壊じん性値の変化、および、延性ぜい性遷移といった破壊様式の変遷のメカニズムの解明、疲労破壊の散逸構造としてのモデル化を目的として、離散転位動力学法(Discrete Dislocation Dynamics;DDD)に基づいた多数の個別の転位のダイナミクスの直接シミュレーションを実施し、以下のような知見を得た。
外部磁場による磁性カーボンナノチューブのマニピュレーション

磁性カーボンナノチューブ(CNT)に回転磁場を印加し、ナノ・マイクロ領域で操作する手法を開発した。磁性CNTは鉄原子がCNT内に内包されているため、磁場により、運動を付加することが出来る。本研究ではこの磁性CNTに回転磁場を印加した。その際発生する回転運動を利用し、磁性基板上の磁性CNTを二次元的に操作することに成功した。また、蛍光分子によるCNTの可視化に成功し、その運動を観察した。カーボンナノチューブ(CNT)はその特異な性質からナノエレクトロニクスなど多岐にわたる応用が期待されている。しかし、ナノ・マイクロ領域中では正確な運動・位置の制御(マニピュレーション)は技術的に困難である。そこで、本研究はCNTの内部に鉄原子が内包された"磁性カーボンナノチューブ"に着目し、外部磁場による磁性CNTのマニピュレーション手法の開発を目的とした。本手法の原理は以下の通りである。磁性基板上に磁性CNTがあるとき、回転磁場を印加すると磁性CNTは磁場に追従し回転運動をする。ここで、磁性CNTと磁性基板間に磁気的相互作用が働き、磁性CNTは磁性基板に引き寄せられる。磁性CNTは回転しながら基板と接触するため、その摩擦が十分ある場合、磁性CNTは回転運動をしながら基板上を移動する。磁性基板はガラスにスパッタリング装置を用いてクロムと金を堆積させたあと、電解メッキ法によりニッケル膜を作製した。磁性CNTは界面活性剤(SDS)を加えた水に混合した後、超音波分散機を用いて水に分散させた。ここに蛍光試薬であるFluoresceinsodium saltを混合した。これにより溶液全体が発光するため、磁性CNTは影になり観察が可能となる。この磁性CNT溶液を磁性基板のセルに封入し倒立落射蛍光顕微鏡でその運動を観察した。磁性基板上の磁性CNTに回転磁場を印加すると、磁性CNTは磁場に追従しながら回転運動をし、基板上を転がりながら移動することが明らかとなった。また、印加する磁場の向き、周波数を変えることにより、その移動方向・速度を制御できた。本手法により、磁性体基板上における磁性CNTの二次元的マニピュレーションが可能になった。カーボンナノチューブ(CNT)はその特異な性質から材料科学・ナノエレクトロニクスなど多岐にわたる応用が期待されている。しかし、ナノ・マイクロ領域では溶液に分散されたCNTの正確な運動・位置の制御(マニピュレーション)は技術的に困難である。昨年度まではCNTが分散されている溶液に蛍光試薬を混合し、落射顕微鏡で溶液を発光させ、CNTの運動の様子を観察していた。しかし、S/N比が低く、CNTの運動を鮮明に観察できなかった。そこで本年度は、磁性CNT表面へ直接、蛍光分子である1-pyrenebutanoic acid,succinimidyl ester(以下PSE)を吸着させ、CNTの観察を試みた。この蛍光分子は4つの芳香環から成るピレンブタン酸部分がCNT表面へ、π-π相互作用により吸着することが知られている。このPSEを磁性CNTに吸着させた分散溶液を磁性基板のあるセルに封入した。ここに、回転磁場を印加し、落射蛍光顕微鏡で観察したところ、昨年度の結果より鮮明に磁性CNTの運動の様子を可視化することが可能となった。また、PSEの、スクシンイミジルエステル部分はアミド結合を介し種々のタンパク質を固定化することが出来る利点もある。このことから、磁性CNTの表面修飾が容易に行えるため、CNTを利用したドラッグデリバリーやバイオセンサーなどへの応用の可能性も考えられる。
Vitamin K2 による白血病細胞のアポトーシス誘導効果の検討とその臨床応用

今回、白血病と骨髄異形成症候群(MDS)を対象とし、臨床検体および細胞株を用いVK2の白血病細胞に対するapoptosis誘導効果および機序の検討を行った。その結果以下の知見を得た。(1)VK2はMDS芽球を含む白血病細胞に対してapoptosisを選択的に誘導した。(2)白血病細胞株の細胞周期解析では、VK2によりG1arrestが誘導され、mitosisを阻害するVP16との併用によりapoptosisは増強した。(3)VK2処理によりp27^<KIPI>は増強しており、そのためG1arrestが誘導されると考えられる。また、G1arrestが誘導された細胞の分化抗原が増強し、VK2にはapoptosis以外に分化誘導効果があることが確認された。(4)Apoptosisの機序として、VK2処理によりミトコンドリアの膜電位は、経時的に低下しBcl-2の発現低下、Baxの発現増強が認められる。これらよりVK2はミトコンドリアに作用することが示唆された。(5)G-CSF等の細胞増殖因子によりVK2のapoptosis誘導活性は一部抑制されることより、両者のシグナルのcross talkが想定される。(6)臨床的には、骨髄線維症を伴なったMDS患者に対し、本人の同意後VK2を経口投与したところ、芽球の減少および血小板減少の改善を認めた。(7)MDS患者に対するVK2療法について全国にアンケート調査を行い、30%以上の有効率を得ている。この結果を踏まえ、今後は多施設治験を予定している。今回、臨床的に難治性であるMDSを対象とし、臨床検体およびcell line MDS-KZを用いVK2のMDS芽球に対するapoptosis誘導効果および機序の検討を行った。MDS15例の芽球をin viboで培養後、CD34抗体などで分画し、さらにAPO2.7というapoptosisの際にミトコンドリア膜に発現する蛋白を認識する抗体を用いて多重染色し、フローサイトメトリーで測定した。その結果、VK2はMDS芽球に対すapoptosisを選択的に誘導した。MDS-KZでの検討では、VK2によりapoptosisが誘導されBcl-2の発現低下、Baxの発現増強が認められた。さらに、caspase-3活性が増強しており、特異的阻害剤によりapoptosisは抑制された。これらよりVK2によるapoptosisは、いわゆるcommon pathwayを介していると推察された。白血病cell lineの細胞周期解析では、VK2によりGl arrestが誘導され、mitosisを阻害するVP16との併用によりapoptosisは増強した。最近、ミトコンドリアからチトクロームCが放出され、それがcaspaseなどを活性化しapoptosisに至るとされており、ミトコンドリアが注目されている。そこで、VK2によるミトコンドリアの膜電位を検討したところ、経時的低下を認めた。Bcl-2の発現低下、Baxの発現増強とあわせVK2はミトコンドリアに作用することが示咳された。臨床的には、骨髄線維症を伴なったMDS患者に対し、本人の同意後VK2を経口投与したところ、芽球の減少および血小板減少の改善を認めた。現在、白血病モデルマウスを用いin vivoでのVK2の効果を検討中である。その結果、以下の知見を得た。(2)白血病細胞株の細胞周期解析では、VK2によりG1 arrestが誘導され、mitosisを阻害するVP16との併用によりapoptosisは増強した。

(3)VK2処理によりp27^<KIP1>は増加しており、そのためG1 arrestが誘導されると考えられる。また、G1 arrestが誘導された細胞の分化抗原が増強し、VK2にはapoptosis以外に分化誘導効果があることが確認された。(4)Apoptosisの機序のとして、VK2処理によりミトコンドリアの膜電位は、経時的に低下しBcl-2の発現低下、Baxの発現増強が認められる。これらよりVK2はミトコンドリアに作用することが示唆された。(5)G-CSF等の細胞増殖因子によりVK2のapoptosis誘導活性は一部抑制されることより、両者のシグナルのcross talkが想定される。(6)臨床的には、骨髄線維症を伴なったMDS患者に対し、本人の同意後VK2を経口投与したところ、芽球の減少および血小板減少の改善を認めた。(7)MDS患者に対するVK2療法について全国にアンケート調査を行い、30%以上の有効率を得ている。この結果を踏まえ、今後は多施設治験を予定している。
房室結節と心室における後脱分極・撃発活動とこれに対する抗不整脈剤の効果

心筋細胞における遅延後脱分極の発生機序とI群抗不整脈剤の遅延後脱分極抑止機序を調べるため、犬Purkinje線維およびウサギ房室結節細胞に微小電極法を応用して、活動電位とイオン電流の測定を行った。遅延後脱分極は、強心配糖体(acetylstrophanthidin)、低K^+濃度、高┣D32+ (/)a┫D3濃度といった潅流条件下で、Purkinje繊維を高頻度刺激した後、あるいは房室結節では拡張期脱分極相の盆状低下として発現、自動能を促進した。房室結節微小標本(0.2×0.2×0.1mm)を用いてイオン電流の解析を行うと、遅延後脱分極の本態は一過性内向き電流であった。本電流は0.1MNCd┣D12+┫D1で緩徐な内向き電流を遮断すると消失、I群抗不整脈剤のmexiletineでNa┣D1+┫D1電流を遮断しても消失、更に筋小胞体へのCa┣D12+┫D1の取り込みみを抑制するcaffeineを作用しても消失した。従って、一過性内向き電流の成因として、細胞内Ca┣D12+┫D1の加飽和が示唆され、その発生機序として、(1)細胞内Ca┣D12+┫D1イオンが非特異的な陽イオン・チャンネルを活性化することと、(2) Na┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系が細胞内Ca┣D12+┫D1の増加により賦活されること、が考えられた。両者を判別するため、細胞外Na┣D1+┫D1が非特異的な陽イオン・チャンネルのユンダクタンスを変化させないのに着目して、0.5mNK┣D1+┫D1潅流により生じた一過性内向き電流に及ぼす低Na┣D1+┫D1の効果を観察した。外液Na┣D1+┫D1の50%をLi┣D1+┣D1あるいは蔗糖で置換すると、一過性内向き電流は消失した。次に、0.2mMK┣D1+┫D1により誘発された一過性内向き電流に、Na┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系の遮断剤である50uML┣D33+ (/)a┫D3を作用させると、本電流は減少ないし消失した。以上の成績より、房室結節における一過性内向き電流は、細胞内Ca┣D12+┫D1濃度の増加によるNa┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系の賦活により生じること、更にI群抗不整脈剤は急速なNa┣D1+┫D1電流を遮断することにより、細胞内Na┣D1+┫D1負荷を軽減、その結果Na┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系を抑制することにより、一過性内向き電流を遮断することがあきらかとなった。

次に、0.2mMK┣D1+┫D1により誘発された一過性内向き電流に、Na┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系の遮断剤である50uML┣D33+ (/)a┫D3を作用させると、本電流は減少ないし消失した。以上の成績より、房室結節における一過性内向き電流は、細胞内Ca┣D12+┫D1濃度の増加によるNa┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系の賦活により生じること、更にI群抗不整脈剤は急速なNa┣D1+┫D1電流を遮断することにより、細胞内Na┣D1+┫D1負荷を軽減、その結果Na┣D1+┫D1-Ca┣D12+┫D1交換系を抑制することにより、一過性内向き電流を遮断することがあきらかとなった。(1)ウサギ房室結節の微小標本(0.2×0.2×0.2mm)に二重微小電極法を用いて細胞膜活動電位記録と電圧固定実験を行った.低K^+濃度,高Ca^<2+>濃度あるいは強心配糖体(acetylstrophanthidin)の灌流により,最大拡張期電位は浅くなり,活動電位振幅は減少,最大脱分極速度は低下し,また第4相の電位は通常の右上がりの拡張期脱分極でなく,全体に盆状の低下を示して,活動電位は振動様となった.自発興奮頻度は明らかに増大した.電圧固定実験で-40mVの保持電位から-20,-10および0mVへ300または500msecの脱分極パルスを与えた後, -40mVに再分極させると,約200msec後,膜電流記録に内向きの屈曲が生じて,一過性内向き電流の発生を示した.更に活動電位再分極終了時に膜電位を-65mVに固定すると,対照灌流時に滑らかなペースメーカー電流が記録されるのに対して,上記3條件では一過性内向き電流が発生し,この時に上述の如き活動電位波形変化と自発興奮頻度増大が見られたことから,一過性内向き電流がこれらの活動電位変化の原因であることが証明された.こうした一過性内向き電流は緩得な内向き電流を遮断するCD^<2+>や,筋小胞体へのCa^<2+>取込みとそれからの律動的放出を抑えるCaffeineの添加によって抑制され,これが細胞内Ca^<2+>負荷に依存することが判明した.(2)イヌPurkinje心室筋標本を組織浴中で灌流し,低K^+または低K^++高Ca^<2+>濃度の影響を見た.標本に周期800300msecで1020発の電気刺激を与えると,活動電位終了後に低K^++高Ca^<2+>灌流時には高率に一過性脱分極を生じ,時にこれから立上がる自発活動電位(撃発活動)をも認めたが,低K^+単独ではこうした現象の発生は稀であった.一過性脱分極発生後に灌流液にI群Bの抗不整脈剤mexiletine(2μg/ml)を加えると,一過性脱分極は抑制された.抑制が著明でない場合に薬剤濃度を5μg/mlに増すと一過性脱分極は消失し,撃発活動への本剤の有効性が示された.昨年度は、主としてウサギ房室結節細胞として犬Purkinje線維における遅延後脱分極(一過性内向き電流)の誘発条件と、I群Bの抗不整脈剤であるmexiletineの遅延後脱分極に及ぼす効果を検討した。本年は一過性内向き電流の発生機序とI群坑抗整脈剤の作用機序を調べるため、房室結節の微小標本(0.2×0.2×0.1mm)に電圧固定を応用して、以下の成績を得た。一過性内向き電流は、強心配糖体(acetyl strophanthidin)、低k^+濃度、高Ca^<2+>濃度懽流により誘発され、0.1mMのCd^<2+>で緩徐な内向き電流を遮断すると消失、更に筋小胞体へのCa^<2+>の取り込みを抑制するcaffeineを作用しても消失した。従って一過性内向き電流の成因として、細胞内Ca^<2+>の加飽和が示唆され、その発生機序として、(1)細胞内Ca^<2+>イオンが非特異的な陽イオン・チャネルを活性化することと、(2)Na^+-Ca^<2+>交換系が細胞内Ca^<2+>の
口腔癌における腫瘍血管内皮細胞の多様性解明と新規分子標的薬への応用

我々は口腔癌における低酸素状態と腫瘍血管の多様性の関係について研究を行った。PETで低酸素の状態を解析された症例で解析した。1低酸素腫瘍での微小血管密度は、非低酸素腫瘍に比べて高かった。2PETでの低酸素状態、HIF-1α陽性腫瘍、微小血管密度が相関が認められた。3低酸素腫瘍での腫瘍近傍では、形態的に非機能的で未熟な血管が多く認められたさらに新規腫瘍血管内皮マーカーの発現解析のために、ケモカインレセプターであるCXCR7に着目した。口腔癌部のCXCR7陽性血管の割合は、非癌部の腫瘍血管に比べて割合が高かった.腫瘍血管のCXCR7発現は患者の予後予測マーカーとして応用できる可能性が示唆された。口腔癌において低分化型口腔癌は浸潤性・悪性度が高く急速に転移を起こすことがある.一方,腫瘍血管新生は癌の浸潤性や悪性度と相関があり,高分化型に比べ中・低分化で有意に高いとする報告が散見される。腫瘍血管新生は口腔癌においても浸潤や悪性化にも重要な役割を果たしているものと思われる.我々は分化度や浸潤様式の異なる口腔癌において腫瘍血管内皮細胞の特性が異なると仮説をたて、研究を行った。本年度(H26年度)は、低分化口腔細胞株をヌードマウスに皮下移植し、それらのマウス皮下および同所移植腫瘍から血管内皮細胞を分離・培養し,血管内皮の特性解析を行った。また、コントロールとして正常マウスの皮膚由来の血管内皮細胞を分離・培養した。H27年度は高分化型の口腔癌細胞株をヌードマウスに皮下移植し、得られた腫瘍塊から腫瘍血管内皮細胞を分離・培養予定である。また、これらのin vitroの実験と平行して、我々が日常臨床で治療を行った口腔癌患者の切除組織切片において、血管の未熟性と低酸素状態と悪性度との関連についても免疫染色を行った。癌の進行に伴い癌組織では酸素が不足し、癌の一部は低酸素に曝されている。低酸素が腫瘍細胞の1アポトーシスの回避、2薬剤抵抗性の獲得、3転移能の亢進などを誘導し,がんの悪性度と関連していることが近年明らかになってきている。しかしながら、口腔癌においてこのような仮説に対しての研究報告は見られない。我々は現在、このような仮説に対して、口腔癌患者の切除組織切片において、CD31、αSMA、デスモグレイン3、HIF-1αを既に染色し、現在評価中である。本年度は口腔癌の1腫瘍血管の形態的構造と2腫瘍微小環境における低酸素の関連について解析した。具体的には、1「FMISO-PETで描出される腫瘍微小環境内の低酸素領域における腫瘍血管がどのような形態構造を呈しているか?」について検討を行った。「低酸素に曝されている癌症例やHIF-1αが高い癌の症例では、腫瘍血管が未成熟(immature:血管内皮細胞に壁細胞がカバーされておらず、漏れやすいのではないか」との仮説のもと、いくつかの血管内皮関連マーカーで免疫組織染色を行った。すでのFMISO-PETでSUV値を計測した口腔癌症例(22例)に対して検討を行った。計測した血管内皮関連マーカーは以下である:CD31、αSMA、claudin 5。非癌部ではほとんど血管がcoverageされていた。一方SUVが低値を示し、低酸素に曝されていると考えられた口腔癌症例の血管内皮では、未成熟な血管が多く観察された。現在、口腔病理医に腫瘍血管の成熟度をスコアリングしてもらい(0:未成熟、1:0と2の中間、2:成熟)と定性的に評価して、低酸素(SUV値が低い考えられる)との関連現在解析中である。H28年度の実績として報告できるよう鋭意研究中である。もう一点、我々は血管新生阻害因子として知られるvasohibin1の発現解析をすすめている。北海道大学病院で切除した口腔扁平上皮癌33症例をもちいて,CD31とVASH1の組織免疫染色を行い、VASH1発現をImage Jにより算出した。各症例におけるVASH1の発現と臨床病理学的因子や予後との関連について検討を行った。まず,第一に非がん部血管ではVASH1は染色されなかったのに対し,腫瘍血管内皮ではVASH1が強く染色された。本解析において腫瘍組織におけるVASH1は腫瘍血管内皮細胞だけではなく、血管以外の間質細胞にも染色された。腫瘍血管内皮マーカーとしてのVASH1の可能性についてもH28年度は解析をすすめたいと考えている。免疫染色は染色抗体の染色抗体の予備実験で時間を費やしたが、染色条件が確立した後は予定通り、進展している。今後、染色した標本のスコアリングと臨床的パラメーター(低酸素状態と腫瘍血管の成熟度、予後、転移の有無、再発の有無)との関連について検討したい。われわれはこれまで腫瘍血管内皮細胞には正常血管内皮細胞と比較して発現の高い分子が複数あることを報告してきた.その1つであるC-X-C chemokinereceptor type 7 (CXCR7)は腎癌など幾つかの癌の腫瘍血管において発現していることを報告してきた。しかし口腔扁平上皮癌の血管内皮細胞におけるCXCR7の発現については未だ不明である.北海道大学病院にて切除された口腔扁平上皮癌の組織検体のうち,HE染色,CD34免疫染色による解析が可能な症例を用いた。

ランダムに選択した10視野からhot spot (CD34陽性血管が特に多い領域)を5視野選択し,連続切片でCXCR7抗体による免疫染色を行い,CXCR7陽性血管の割合を算出して評価した.癌部のCXCR7陽性血管の割合は41.9%,非癌部における陽性血管の割合は18.8%で,非癌部に比較し癌部の血管では有意にCXCR7発現の割合が高かった.腫瘍血管におけるVasohibin、CXCR7発現は患者の予後予測マーカーとして応用できる可能性が示唆された。さらに我々はPentraxin3という分泌タンパクに注目した。腎がんを始めとする複数の癌腫において発現を確認した。血管内皮マーカーであるCD31とPentraxin3の蛍光2重免疫染色において、正常な部位の血管に比べて、腫瘍血管において、Pentraxin3が強発現している血管が多く認められた。Pentraxin3が血管新生阻害療法のTarget分子になりうることが示唆された。我々は口腔癌における低酸素状態と腫瘍血管の多様性の関係について研究を行った。PETで低酸素の状態を解析された症例で解析した。1低酸素腫瘍での微小血管密度は、非低酸素腫瘍に比べて高かった。2PETでの低酸素状態、HIF-1α陽性腫瘍、微小血管密度が相関が認められた。3低酸素腫瘍での腫瘍近傍では、形態的に非機能的で未熟な血管が多く認められたさらに新規腫瘍血管内皮マーカーの発現解析のために、ケモカインレセプターであるCXCR7に着目した。口腔癌部のCXCR7陽性血管の割合は、非癌部の腫瘍血管に比べて割合が高かった.腫瘍血管のCXCR7発現は患者の予後予測マーカーとして応用できる可能性が示唆された。本年度は低分化口腔細胞株をヌードマウスに皮下移植しそれらのマウス皮下および同所移植腫瘍から血管内皮細胞を分離・培養し,血管内皮の特性解析を行った。また、コントロールとして正常マウスの皮膚由来の血管内皮細胞を分離・培養した。また、我々は口腔癌の臨床サンプルを用いて口腔癌において、現在、口腔癌患者の切除組織切片において、CD31、αSMA、デスモグレイン3、HIF-1αを既に染色し、血管の未熟性と低酸素状態と悪性度との関連について現在評価中である。免疫染色は染色抗体の染色抗体の予備実験で時間を費やしたが、染色条件が確立した後は予定通り、進展している。今後、染色した標本のスコアリングと臨床的パラメーター(低酸素、腫瘍血管の成熟度、転移の有無、再発の有無)との関連について検討したい。腫瘍血管新生我々は現在、口腔癌患者の切除組織切片において、HE染色、CD31、αSMA、デスモグレイン3、HIF-1αを既に染色し、現在評価中である。口腔癌組織で低酸素にさらされている症例やHIF1αが高い癌の症例では、腫瘍血管が未熟(CD31陽性の血管内皮細胞が、αSMA陽性の壁細胞でカバーされていない。)であるのかなど口腔癌におけるがんの悪性度と関連のある低酸素状態と血管構造の未熟性との関連について検討をしたいと考えている。αSMAの染色条件の検討の予備研究に必要と考え、数本の抗体検討を予定していた。実験が順調にすすみ、抗体を購入の必要がなくなったため。研究費の使途はほとんどが消耗品、共同研究での免疫染色での費用である。免疫染色が予想以上に円滑に進展し、予備実験で必要と考えていた抗体の消費量が少なくすんだため、次年度使用額が生じた。