hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁気脳波・電気脳波による大脳皮質四次元機能地図の作成と疾患脳の機能評価

本研究では,磁気脳波と電気脳波を用いて大脳機能地図を作製し,これをMRI上に表示するシステムを構築した.これによって脳の機能を各被験者ごとの脳の構築と対応させて表示することを可能とした.すでに100例を超える症例で脳の機能評価を行えた.体性感覚誘発磁界においては,正中神経・後脛骨神経の刺激後の反応により中心溝同定が可能となった.その精度は標準偏差約3mmで,腫瘍や脳出血による脳溝偏位が存在しても精度の高さを維持できた.これによって開頭手術に先立って病変と中心溝の位置関係を把握でき,血管内外科手術やガンマナイフ治療にも有用であった.開頭手術の際,誘発磁界で推定した部位を脳表電極で確認することもできた.聴覚誘発皮質反応では,左右聴覚野を標準偏差2mmの精度で推定可能となり,これも開頭手術,血管内外科手術,ガンマナイフ治療の際に役立てることができた.側頭葉腫瘍例で,聴力テスト正常と診断されても一側聴覚野からの反応消失例や同側耳刺激反応のみの消失例をとらえることができた.交通事故による遷延性意識障害患者においては,挫滅した左側頭葉からの聴覚反応を検出でき,その後の言語訓練へと結び付けることができた.視覚誘発反応においては,パターンリバーサル反応を用いることにより,刺激視野と反対側のcalcarine fissureを精度良く推定できた.てんかんの棘徐波の信号源を推定することにも成功した.特に左右の大脳半球から独立した棘徐波信号をはじめてとらえ,これが一側半球から急速に両側大脳に広がる様子も観察できた.以上,多機能4次元野機能地図と3次元MRIとの統合が可能となり,疾患脳における機能の部分消失・機能局在の偏位・残存機能の評価などを評価することができた.当初の研究計画に比べて,はるかに臨床応用に適した本格的なシステムを構築することに成功し,研究成果は脳磁計の設計に携わる理工系の研究者へフィードバックされている.本研究では,磁気脳波と電気脳波を用いて大脳機能地図を作製し,これをMRI上に表示するシステムを構築した.これによって脳の機能を各被験者ごとの脳の構築と対応させて表示することを可能とした.すでに100例を超える症例で脳の機能評価を行えた.体性感覚誘発磁界においては,正中神経・後脛骨神経の刺激後の反応により中心溝同定が可能となった.その精度は標準偏差約3mmで,腫瘍や脳出血による脳溝偏位が存在しても精度の高さを維持できた.これによって開頭手術に先立って病変と中心溝の位置関係を把握でき,血管内外科手術やガンマナイフ治療にも有用であった.開頭手術の際,誘発磁界で推定した部位を脳表電極で確認することもできた.聴覚誘発皮質反応では,左右聴覚野を標準偏差2mmの精度で推定可能となり,これも開頭手術,血管内外科手術,ガンマナイフ治療の際に役立てることができた.側頭葉腫瘍例で,聴力テスト正常と診断されても一側聴覚野からの反応消失例や同側耳刺激反応のみの消失例をとらえることができた.交通事故による遷延性意識障害患者においては,挫滅した左側頭葉からの聴覚反応を検出でき,その後の言語訓練へと結び付けることができた.視覚誘発反応においては,パターンリバーサル反応を用いることにより,刺激視野と反対側のcalcarine fissureを精度良く推定できた.てんかんの棘徐波の信号源を推定することにも成功した.特に左右の大脳半球から独立した棘徐波信号をはじめてとらえ,これが一側半球から急速に両側大脳に広がる様子も観察できた.以上,多機能4次元野機能地図と3次元MRIとの統合が可能となり,疾患脳における機能の部分消失・機能局在の偏位・残存機能の評価などを評価することができた.当初の研究計画に比べて,はるかに臨床応用に適した本格的なシステムを構築することに成功し,研究成果は脳磁計の設計に携わる理工系の研究者へフィードバックされている.初年度は健常者を対象にした脳の4次元機能地図の作成を行った.パタ-ンリバ-サル視覚誘発反応においては,刺激後時間100msにピ-クを有する反応の信号源を,磁気脳波を用いて3次元的に推定することに成功し,結果をMRI画像上にス-パ-インポ-ズできた.特に1/2視野刺激に関しては,信号源を視野と反対側の後頭葉に安定して推定することが可能であった.さらに,左右の後頭葉の形態が非対象的な被験者において推定された信号源は同様に左右非対象であり,脳の機能と脳の形態との対応を考える上で興味深い知見であった.次いで1/4視野刺激に関しての反応から脳内の信号源を推定にも成功したが,興味深いことに,隣あった二つの1/4視野刺激に対する反応の総和は必ずしも該当する1/2視野刺激の反応とはならないことが示された.これに関しては,脳における視野の解釈が単により小さな視野の集合として示されるようなものではない可能性があり,あるいはまた信号源が拡張している場合の磁気信号の解釈のしかたに問題点がある可能性も示唆された.異常の視野刺激の他に,赤および緑の異なった色刺激による誘発反応も時空間的に行ったが,色による反応の違いは明白であり,さらに実験を発展させる予定である.これに対し,電気脳波を用いた視覚誘発反応も,多チャンネル脳波計を用いて測定し頭皮上の2次元マップとして表示することが可能であった.

しかしながら電気脳波の場合はReference Electrodeをおく位置によって電流源推定が影響を受け,磁気脳波の様に空間位置推定を行うには問題点が多く,今後さらに解析が必要である.さらに現在,運動準備反応などの測定も開始しており,脳の4次元機能地図作成に向けてmodalityの拡張を進めている段階である.本年度は多機能に及ぶ脳の4次元機能地図の作成を行った。昨年度より継続中の視覚誘発反応においては、パターンリバーサル反応のみならず、パターンオンセット反応に関しても異なる視野刺激に対応する脳機能地図の作成を行った。さらには、新しく光ファイバーを用いた刺激装置を工夫し、刺激の効果を高めるとともに磁気雑音の低減化をはかった。新たに、聴覚誘発皮質反応においては、トーンバーストから約100ミリ秒後に出現する反応をとらえ、MRI画像上の第一次聴覚野に正確に重ね合わせることに成功した。この反応は、刺激した耳と反対側の脳にわずかに早く到達し、約10ミリ秒遅れて同側の聴覚野にも応答があることを見出した。さらに、周波数の異なった2つの音刺激を用い、一方の音の出現頻度を低すると極めて大きな信号が出現することをとらえた(mimatch field)。これも左右両側の聴覚野から由来することが伴明した。さらに、体性感覚誘発反応においては、まず手の正中神経刺激後の反応をとらえ、これを正確に中心溝後部の第一次知覚野の手の領域に同定することに成功した。続いて、足の後けい骨神経刺激後の反応をとらえ、これが大脳半球間に面した中心溝最頂部の第一次知覚野足領域に存在することを同定した。このときの電流源は、左足刺激では反時計まわりに、右足刺激では時計まわりに数ミリ秒の間に回転することを初めて突止め、これが大脳知覚野での興奮の伝播に関与することを示した。以上、本年度は視覚・聴覚・体性感覚の3つの刺激系を用いた多機能4次元機能地図を完成させることができた。今後、最後年度では多チャンネルの磁気脳波装置を用いる予定であり、さらなるmodalityの拡張とともに、本格的な臨床応用を目指す予定である。本年度は,脳機能地図をMRIの上に表示するシステムが完成し,脳の機能を各被験者ごとの脳の構築と対応させて表示することが可能となった.すでに100例を越える症例で脳の機能評価を行えた.体性感覚誘発磁界においては,正中神経・後脛骨神経の刺激後の反応により中心溝同定が可能となった.その精度は標準偏差約3mmで,腫瘍や脳出血による脳溝偏位が存在しても精度の高さを維持できた.これによって開頭手術に先立って病変と中心溝の位置関係を把握でき,血管内外科手術やガンマナイフ治療にも有用であった.開頭手術の際,誘発磁界で推定した部位を脳表電極で確認することもできた.聴覚誘発皮質反応では,左右聴覚野を標準偏差2mmの精度で推定可能となり,これも開頭手術,血管内外科手術,ガンマナイフ治療の際に役立てることができた.側頭葉腫瘍例で,聴力テスト正常と診断されても一側聴覚野からの反応消失例や同側耳刺激反応のみの消失例をとらえることができた.交通事故による遷延性意識障害患者においては,挫滅した左側頭葉からの聴覚反応を検出でき,その後の言語訓練へと結び付けることができた.視覚誘発反応においては,パターンリバーサル反応を用いることにより,刺激視野と反対側のcalcarine fissureを精度良く推定できた.本年度は,てんかんの棘徐波の信号源を推定することにも成功した.
世代会計の政策的応用のための条件に関する研究

本研究は、財政政策から生じる将来の世代間の経済的な不均衡の状況をよりわかりやすく提示するために、世代会計の果たす役割や指標提示の条件について明らかにすることであった。本研究では、世代間の不均衡の最も大きな要因の1つである年金財政の評価について、平成26年財政検証報告を用いて、その提示されている代替率の指標は代表的な年金受給世帯の評価としては適切性に欠くことを定量的に明らかにした。また、地方財政の評価としても、現状の財政評価指標は不十分さを持っていることを明らかにした。1.社会保障制度(年金)政策への世代会計の応用世代にかかわる政策課題として、「世代会計の視点から見た平成26年財政検証結果の再検証」と題し、日本経済新聞2014年9月30日号に世代会計を用いた、現在の年金政策の状況についての検証結果を公表した。そこでは、年金財政検証結果の検討は受給者の視点からなすべきであり、政策の本質を国民側から数値化する世代会計で評価すべきあり、そして年金の支給の削減を急ぎ「小さな社会保険」を目指すべきことを主張している。2.世代会計の地方財政政策への応用『東北自治81号』(東北自治研修所)に「市町村財政における将来世代への負担の考え方」の論文を公表した。当該論文では、地方公共団体財政健全化法における将来負担の比率の指標は当該自治体の直面する負担に関して事実を示してはいるものの、当該自治体の将来の住民にとっての実質的な負担を適切に示しているかといえば、必ずしも十分ではないことを指摘し、地方財政の分野においても適切な運営指標としての世代会計が有用であることを主張している。本年度は、世代間不均衡の定量分析のうち、地方財政にかかわる研究と公的年金にかかわる研究をおこなった。1)地方財政にかかわる研究:本研究では,高齢化によって将来生じる財政上のリスクを評価するため,政策的に応用可能な指標について検討を行った。その結果,将来負担比率は従来の実質公債費比率よりもより多くの情報を含んでいるものの,高齢化によって生じる未実現の財政リスクは反映しきれていないことがわかった。このため,本稿では全国の都道府県財政を題材に「高齢化資金過不足率」を試算した。高齢化資金過不足率と将来負担比率の相関は0.229でありここから,将来負担比率の指標では高齢化によって将来生じる財政リスクの2割程度しかわからないことになる。また,現在の高齢化率と将来の高齢化率を比較して,高齢化の進行を示した高齢化倍率でも,4割程度の情報しか反映されておらず,冒頭に示した高齢化の人口予測だけでは,地方自治体の将来直面する財政リスクを十分に表してはいないことがわかった。2)公的年金にかかわる研究:本研究の目的は、「平成26年財政検証結果レポート」を年金政策評価において適切な報告であるかという観点から再評価を行うことである。当該レポートは国民年金及び厚生年金に係る財政の現況及び見通しを示した国の公式報告であり、年金政策を評価するうえで重要な報告である。レポートでは、最も良好な給付が見込まれるシナリオにおいて、2043年以降は所得代替率51.0%が確保されるとしている。しかし、当該ケースは将来では代表的でない専業主婦世帯の受給ケースであり、本研究で試算した共働き世帯では、所得代替率は40.0%となり、政府公約が満たされないことを指摘した。世代間不均衡を表す指標としての世代会計よりも、世代間不均衡を通じて現行の財政政策の問題点を明らかにするという世代会計の「目的」に沿った推計と結果公表を行い、本研究の趣旨である政策的に有効な指標の条件の研究が進んでいるため。本年度の研究では、世代会計の政策的応用のための条件として、国民が現在および将来の経済行動を決定するために適切な情報が提供されているかという観点から以下の2つの研究を行った。第1には、世代会計の世代間不均衡の大きな割合を占める、公的年金の通じた世代間所得再分配の状況について取り上げた。ここでは厚生労働省の示している年金の財政検証報告の妥当性を検討した。当該「財政検証レポート」では夫が勤労者で妻は専業主婦という退職世帯をモデル受給者として、現役男子1人賃金に対する所得代替率50%が維持されるという試算が公表されている。しかし、実際には将来世代が受給を始める頃には、専業主婦世帯はマイナーである。本研究ではレポートのもっとも高い所得代替率が実現できるケースを前提として独自に試算した結果、実現されるであろう所得代替率は共働き世帯で、41.1%、また単身世帯世帯では37.9%とかなり小さくなることが分かった。この意味で、世代間不均衡を正しく国民が理解できるための条件を満たしていないと評価される。第2には、政府や公的な機関の提供する情報が、どの程度国民に信頼され、経済行動の決定に影響を及ぼすかという観点から、全国の成人男女2000名を対象とした意識調査を行ったた。このうち、「厚生労働省は年金財政検証で今後100年間は年金の破たんはないとしているので、ある程度老後の経済生活の心配はないだろう。」という見解に対して、30歳代、50歳代の割が「同意しない」と回答し、60歳以上も77%が同意しないという結果が得られ、世代間公平に関する政府の情報の信頼性が低いことが明らかとなった。

本研究では、世代間の不均衡の最も大きな要因の1つである年金財政の評価について、平成26年財政検証報告を用いて、その提示されている代替率の指標は代表的な年金受給世帯の評価としては適切性に欠くことを定量的に明らかにした。また、地方財政の評価としても、現状の財政評価指標は不十分さを持っていることを明らかにした。研究の目的の第1段階である、経済政策における現行の各種指標の問題点や限界を明らかにしつつ、世代会計の有用性を整理するステップは順調に推移している。特に、今年度はマクロの視点から公的年金会計、地域の視点から地方財政と生さればルのバランスにも配慮し、世代会計の有用性を公刊論文として示しているので。現実の政策的問題点を国民に分かりやすく示し、政策選択の情報提供に資するため、ホットなイシューである「消費税増税のタイミング」や「年金支給開始年齢引き上げ」などの具体的な政策について世代会計を通じて評価する。加齢経済学今後については、昨今の経済学的・政策的なイシューである所得再分配政策について、世代間の所得再分配政策の問題点を、世代会計の視点から明らかにする応用的研究に着手したい。
アミド型窒素原子の1、3-相互作用--その可能性と限界

アミド型窒素の1、3-相互作用が可能であると思われるいくつかの系を合成し、その構造を検討した。特に1、3、5-トリベンゾイルペルヒドロ-1、3、5-トリアジン(A)は検討に最も適した系であった。AのX線結晶解析の結果、分子構造は対称的で、窒素原子はほぼ平面構造を持ち、通常のアミドに他ならないことが分かった。窒素原子が正四面体構造に近い構造を持つ1、2-ジアシルアミン(B)とは異なり、(A)では各窒素がほとんど独立であることを示唆している。X線結晶解析の詳細は既に論文発表した。結晶内では、アミド型窒素の1、3-相互作用を検出出来なかったが、溶液中での検出を期待して、(A)の温度可変C-13NMRスペクトルを測定した。もし、(B)でのような窒素の反転を観測できれば、1、3-相互作用によって本来アミド型であるべき窒素がアミン型の性格を帯びてきたと言える。(A)の重アセトン溶液の温度可変C-13NMRスペクトルを広い範囲で測定した。予期通り、低温になるにつれて交換が遅くなることが観測された。これはアミドの束縛回転によるものである。温度を-100°C以下に下げると第二の速度過程が起こり始めた。これは窒素の反転によると考えられるが、温度をそれ以上下げられないので、この過程を厳密に窒素の反転に帰属するには至らなかった。しかし、アミド型窒素の1、3-相互作用の存在の証明の手がかりは得られたと結論出来る。本研究の目的は、近接する窒素原子間の相互作用が、たがいに1,3位の関係にある2個のアミド型窒素原子の間に、何らかに相互作用が存在するかいなかを検討することにある。そのためのモデル化合物として、トリベンゾイルー1,3,5ートリアザシクロヘキサン(1)を選んだ。窒素原子間の相互作用は、主として非共有電子対の間に起こると考えられるので、その点を明らかにするために、以下の研究を行った。A DNMR法による分子(1)の運動の解析(1)では二つの速度過程が、そのメチレンプロトンDNMRで観測された。第1の速度過程のエネルギ-障壁は約14kcal/molであり、これはアミドの束縛回転の障壁に対応する。第二の障壁は8kcal/mol程度の低いもので、六員環の反転ないし、窒素の反転のどちらかに帰属できるが、X線結晶解析の結果を考えると六員環の反転に帰属される。B X線結晶解析による分子(1)の構造これによると、窒素原子はほぼ平面構造をとり,固相においても、窒素はほぼ完全にアミド型であることが分かった。今後に残された問題は、アミド型の窒素においてもアミン型窒素の示す様な相互作用が可能なのか、可能であるとすれば実験的に検証する方法は何かを検討することである。平成3年度は、アミド型窒素の1、3ー相互作用が可能な系をもう少し増やしてみたいと考え、1、3ージアザシクロヘキサン(A)、1、3ージアザシクロペンタン(B)などを予定していた。しかし、結局本年はこれらの化合物に関しては合成したのみにとどまり、X線結晶解析による構造解析、ダイナミックNMRによる動的挙動の追跡と、速度過程の障壁の評価を行ったのは、1、3、5ートリベンゾイルー1、3、5ートリアザシクロヘキサン(C)についてのみであった。結果は既に論文として発表した(雑誌論文参照)。X線結晶解析の結果、窒素まわりの立体化学はほとんど平面構造であり、1、3ー関係ではアミドの平面性におおきなずれはないようである。しかし、ダイナミックNMRでは、障壁の高いアミドの束縛回転の他に、第二の速度過程が観測された。これは僅かに非平面性を残すアミド窒素の反転または環の反転と考えられるが、障壁が低く、-100°Cでも完全には凍結しなかったので、はっきりと速度過程の原因を帰属することは出来なかった。

この点については、さらに量子力学計算等の方法で明かにしたい。その他に、研究の基礎を固める目的で、窒素を含む環式化合物の動的過程を追跡する方法としての動的NMRに関する総説を執筆した。これは、この分野の最新の総説であり、今後多くの化学者の利用するところとなろう。平成4年度は、アミド型窒素の1、3ー相互作用が可能な系をもう少し増やしてみたいと考え、1、3ージアザシクロヘキシン(A)、1、3ージアザシクロペンタン(B)などを予定していた。本年はこれらの化合物の合成を行う予定であったが、合成上の困難のため方針を変更して、キノリジジン、インドリジジンにおいて窒素に対してγ位、もしくはγ位とγ'位にに酸素または硫黄を1個または2個導入した化合物(C)、(D)を合成し、量子化学計算による立体エネルギーの評価、ダイナミックNMRによる動的挙動の追跡と、速度過程の障壁の評価を行った。キノリリジン化合物ではトランス:シス比は約3:1で、トランス体が安定であるのに対して、インドリジジンでは二つのシス形の平衝混合物であった。MNDO法による各化合物の存在比の評価は、NMRから求められたものと必ずしも一致しなかった。問題点はMNDO法の限界であり、高度の基底関数を用いるab initio法を用いれば、より精度の高い結果が得られるだろう。これは今後の課題としたい。ダイナミックNMRでは、興味深いことに、キノリジジン系化合物のトランス(] SY.dblharw. [)シス反転と、インドリジジン系化合物のシス(] SY.dblharw. [)シス反転の障壁の間に大きな差を認めることは出来なかった。これは反転の障壁が窒素原子の近傍の立体化学的環境だけに依存していることを示唆している。
気液海面単分子膜を鋳型とする光誘起無機合成・ナノ構造制御システムの開発

本研究は、気液単分子膜表面における光誘起無機合成プロセスを開発することを目的とした。得られた成果は、以下のとおりである。1)Fe^<3+>/Fe(CN)_6^<3->錯体水溶液中にカチオン性両親媒性化合物を展開し、反射スペクトルを測定した。単分子膜が凝縮膜状態にあるときは、700-800nmに極大を有するFe(II)-Fe(III)混合原子価錯体のスペクトルが照射時間とともに増大した。この結果は、結晶状態の単分子膜界面に、界面近傍で光生成した混合原子価錯体が吸着・生長していることを示す(photodeposition)。次に、この光生成反応はFe(III)種の光還元に基づくものであるため、犠牲的電子供与試薬としてフルクトースを共存させた。フルクトース存在下では効率の良い光生長が観測され、有機分子膜結晶を鋳型として光反応により有機-無機複合体を作製できることが明らかとなった。2)さらに、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを吸着させたスライドガラスをFe^<3+>/Fe(CN)_6^<3->水溶液に浸せきして光照射すると、Fe(II)-Fe(III)混合原子価錯体の薄膜が形成された。この薄膜は水に不溶であり、有機ポリマーフィルム上にも光生長できた。さらに、Fe(II)-Fe(III)薄膜上にFe(II)-Cr(III)薄膜をヘテロ積層できることも明らかとなった。以上より、本手法は電気化学的手法等他の手法では得られない、有機-無機複合薄膜の新規作製手法として位置づけることができる。
神経管形態形成運動に関与するグアニン交換因子のマウスモデルを用いた遺伝学的解析

神経管の形態形成運動の異常は、二分脊椎症や無脳症といった神経管閉鎖障害と深く関連している。これまでの研究により、WGEFという新規の遺伝子が、Wnt-PCP経路を仲介することによって、両生類胚の神経管の形態形成運動を制御することを明らかにしてきた。本研究ではマウスWGEF遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作出を行った。ES細胞にターゲティングベクターを導入し、スクリーニングすることにより、WGEF遺伝子のコンディショナルノックアウトアリルをもつES細胞が得られた。さらに、このES細胞を用いてキメラマウスを作成した。本年度はWGEF遺伝子の相同組み替え用ターゲティングベクターの作成を行った。ターゲティングベクターはWGEFの遺伝子配列をもとに、Exon2の下流に選択マーカーとしてLoxPサイトをもつneoカセットを導入し、上流側にLoxPサイトを組み込むことによってCreによるWGEFのコンディショナルな遺伝子破壊を起こさせるようデザインした。ターゲティングベクターの作成は、BACの修飾法を用いて行った。薬剤選択のカセットを含む、BAC修飾用のベクターにWGEFの配列を組み込み、修飾用ベクターの配列とBACの配列で組み換えを起こすことによって、BAC cloneに目的のLoxPサイトと、neoカセットを組み込んだ。最終的にDTAを含むES細胞導入用のベクターに目的の断片を挿入し、WGEFコンディショナルノックアウトマウスのターゲティングベクターを作出することに成功した。また、ES細胞の相同組み替え体のスクリーニング条件を検討するため、スクリーニングに使うPCR領域を含む断片をクローニングしたコントロールベクターを作製し、ES細胞に導入して、実際にスクリーニングに用いるプライマーでPCRを行った。その結果、スクリーニングに最適なprimerペアとPCR条件が決定できた。この条件をもとに、ターゲティングベクターをES細胞に導入して、neomycin耐性クローンを選択し、相同組み替えESクローンのスクリーニングを行った。PCR法により、全400クローンをスクリーニングしたが、組み替えクローンを得ることはできなかった。今年度はクローン数をスケールアップすることにより、組み替えESクローンを取得した後ノックアウトマウスを作出し、交配によってノックアウトマウスを得る。本年度はWGEF遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを作出するため、相同組み替えESクローンのスクリーニングを行った。前年度作成したターゲティングベクターをES細胞に導入し、neomycin耐性クローンを選択した。さらに組み替えによってWGEF遺伝子座にneomycin耐性遺伝子のカセットが組み込まれているクローンを3'側のWGEF遺伝子特異的プライマーとneomycin耐性遺伝子プライマーとのPCRによって確認した。800クローンのスクリーニングから、1クローンのWGEF相同組み替えクローンを得ることができた。さらに、このESクローンのゲノムPCRによって、LoxPサイトの組み込み、および5'側の組み替えが正しく行われていることを確認し、WGEFコンディショナルノックアウトアリルを持つES細胞(WGEF(flox/+))を得た。そこで、このWGEF(flox/+)ES細胞をマウス胚盤胞に微量注入し、キメラマウスの作成を試みた。しかし、このクローンからは1個体のキメラマウスが生まれたものの、2週齢で死亡したため、交配可能なキメラマウスを得ることができなかった。そこで、再度相同組み替えESクローンのスクリーニングを行い、全600クローンをスクリーニングした。2クローンの5'および3'相同組み替えクローンを得ることができたが、このうちの1クローンではloxPサイトの正しい組み替えが起こっていなかった。このため、新たに得られたWGEF(flox/+)ES細胞クローンは1クローンであった。現在、このクローンと以前のスクリーニングで得られたクローンの計2クローンのWGEF(flox/+)ES細胞をマウス胚盤胞に顕微注入し、キメラマウスの作成を試みている。
各種近交系由来ES細胞の樹立

現在使用されているES細胞のほとんどは免疫学的、神経科学的あるいは発生学的なデータが少ない129系統マウス由来のものである。そのため多くの場合、遺伝的背景が異なり、あらゆる情報の整った近交系マウスに2年近い歳月を費やしてバッククロスしている。そこで、遺伝子改変マウス作出時から遺伝的背景のしっかりした近交系マウス由来のES細胞を用いることができればあらゆる点で有利である。しかし、取り扱いが容易であり、多くの遺伝子改変動物を生み出した実績のある129系統由来のES細胞を使用した場合でも、短期バッククロスの方法が取り入れられれば、129系統由来ES細胞の不利な点を解消することができる。そこで、その改善方法を検討している。我々がすでに樹立しているES細胞のうち、BALB/c系統由来ES細胞(ST/c)について、その性状を確認し、生殖系列であることが確認されている細胞を用いて遺伝子改変マウスの作出を試みキメラマウスの作出に成功した。また、同じ遺伝子を用いて129系統由来のES細胞(E14.1)を用いて遺伝子改変マウスを作出し、短期間でのバッククロスの方法(体外授精)により従来の方法の1/3の期間で遺伝的背景を変えることに成功した。また、現在C57BL/6系統由来ES細胞について我々が樹立したST/b細胞およびBruce4細胞を用いて遺伝子改変マウスを作出し、その性状を検討しているところである。現在使用されているES細胞のほとんどは免疫学的、神経科学的あるいは発生学的なデータの少ない129系統マウス由来のものである。そのため、多くの場合、遺伝的背景がことなりあらゆる情報の整った系統マウスに永い歳月を費やしバッククロスを行っている。そこで、遺伝子改変動物を作出する時から、遺伝的は背景のしっかりした系統動物由来のES細胞を用いることができればあらゆる点で有利になる。1我々がすでに樹立したES細胞のうち、BALB/c系ES細胞(ST/c)について、その性状を確認した。その結果、長期間凍結保存しておいたが、正常に生殖系列系のキメラマウスを得ることができた。3匹の100%キメラマウス全てが生殖系列系であり、そのうちの1匹は100%生殖系列系にトランスミットしていた。この結果から129/SvJ由来のES細胞E14.1およびBALB/c由来ST/cESを用いてノックアウトマウスの作出を試みた。E14.1ESでは2つの陽性クローンのうち、1つのクローンのみ生殖系列系キメラマウスが得られた。ST/cについては多数の陽性クローンが得られたので、現在キメラマウスの作出を試みているところである。2その他、C57BL/6J系ES(ST/b)についても129系統のESと比較しながら、ノックアウトマウスの作出を計画中である。3本年はNZB系統のES細胞の作出をこころみた。その結果、60個の8細胞期胚から、1つのES様細胞の樹立に成功した。現在この細胞が生殖系列系であるかどうかの確認を行っているところである。そのため多くの場合、遺伝的背景が異なり、あらゆる情報の整った近交系マウスに2年近い歳月を費やしてバッククロスをしている。我々がすでに樹立しているES細胞のうち、BALB/c系統由来ES細胞(ST/c)について、その性状を確認し、生殖系列系であることが確認されている細胞を用いて遺伝子改変マウスの作出を試み

キメラマウスの作出に成功した。また、同じ遺伝子を用いて129系統由来のES細胞(E14.1)を用いて遺伝子改変マウスを作出し、短期間でのバッククロスの方法(体外受精)により従来の方法の約1/3の期間で遺伝的背景を変える事に成功した。また、現在C57BL/6系統由来ES細胞について我々が樹立したST/b細胞とブルース4細胞とで遺伝子改変マウスを作出し、その性状を検討しているところである。
ストレスホルモン曝露に伴うシナプス形成・可塑性障害の分子メカニズム

ストレスに伴うHPA系恒常性破綻に起因するストレスホルモン(グルココルチコイド)曝露は、シナプス形成・可塑性から大脳構築に至る障害を来たし、うつ病・不安障害・PTSDなど感情障害発症の要因となっている。本研究では、ストレスホルモン曝露に伴うシナプス形成・可塑性障害の分子メカニズムを、アクチン細胞骨格群・PSD蛋白質群およびシグナル伝達分子による制御から解析を行った。ストレスホルモンを全く含まない長期神経細胞(分散・スライス)培養系用の完全合成培地を開発し、ストレスホルモン濃度依存的にカルデスモン発現が減少し(転写と蛋白質レベル)、スパイン脆弱化を来たすことを見出した。FRAPおよびLifeAct法を用いたスパイン内のアクチンダイナミクスの解析により、カルデスモンはアクチンフィラメントの安定化を介してスパイン形成と可塑性を制御していること、ストレスホルモン依存的なカルデスモン発現減少はアクチンフィラメント不安定化を来たしスパイン脆弱化を起こすことを明らかにした(J. Neurosci, 32, 14583, 2012)。24年度が最終年度であるため、記入しない。1)ストレスホルモン(グルココルチコイド)曝露に伴うスパイン脆弱化の分子メカニズム我々は、ストレスホルモンを全く含まずシナプス形成に至る完全合成培地を用いた長期神経細胞培養系を開発した。この培養系を用いて、ストレスホルモン(濃度依存性)がスパイン脆弱化を惹起することを見い出した。さらにこれは、ストレスホルモンによるカルデスモン発現抑制がアクチンフィラメント不安定化を来たすことによることも明らかにした。次いで、ストレスホルモンによるカルデスモン発現抑制はMRTF/SRF系の負の転写制御と同時にカルデスモン蛋白質分解系の亢進によることを見い出した(submitted)。2)胎生後期のストレスホルモン曝露による後交連形成障害の分子メカニズム胎生後期のラットのストレスホルモン曝露は、大脳発達の一過性遅滞を来たすが、この遅滞は思春期以降に回復することが知られている。我々は11.3テスラMRIを用いたトラクトグラフィー解析で、海馬・前頭葉などの神経回路網形成障害を見い出した。殊に、後交連形成不全は著明であった(in preparation)。これに関連して、in vitro培養系で神経軸索の伸展に新たなミオシン・カルデスモンの相互作用が必須であることを報告しており(J.Biol.Chem,287,3349-3356,2012)、ストレスホルモンによるカルデスモン発現抑制が神経軸索伸展抑制により後交連形成不全を起した可能性が強く示唆するに至った。現在、後交連を始めとしてストレスホルモンによる神経回路網形成障害に伴なうシナプス形成不全の分子メカニズムを解析中である。ストレスによって引き起こされる神経細胞におけるスパイン形成およびシナプス可塑性障害の分子機構について、解析を進めた。ストレスホルモンによって生じる神経機能の障害のメカニズムについて、アクチン細胞骨格制御蛋白質の発現・機能制御の観点よりその一端を明らかにする結果を得ることができた。ストレスホルモンが神経細胞のスパイン形成およびシナプス可塑性に与える障害性について、よりその神経伝達機能に与える影響を明らかにするため、電気生理学的手法を用いた解析および動物モデルを用いた実験系によって、組織レベル、個体・行動レベルでの解析を実施していく。
14世紀日本の社会秩序形成・維持過程における在野の法知識・法技能に関する研究

日本における社会秩序構造の転換期と目される14世紀において、在野の法知識・法技能が、社会秩序の形成・維持に果たした役割を実証的に解明することを目的として、野にありながら、高度な法知識・法技能を有し、訴訟の場で法を利用して活動する者達、地頭代および沙汰雑掌について、関連史料を収集し、検討した。また、14世紀の訴訟関係史料として貴重でありながら未紹介のままであった紙背文書を中心とした諸史料について、史料紹介を行った。1.個別主体・個別訴訟事例検討のため、研究代表者が所属する東京大学史料編纂所架蔵の原本・写本・刊本を対象として、代表者がこれまでの研究過程で見出した、薩摩国の御家人山田道慶、および頼憲をはじめとする光信・頼勝等東寺雑掌(沙汰雑掌)について、史料収集作業を開始した。このうち、沙汰雑掌については、訴訟の場において仮名を使用しており、「東寺雑掌」等のように名前が記されない場合も多く、訴陳状の執筆や証拠文書の案文作成等を行っている可能性も高いので、作業に際しては、単なる名前の表記によるだけでなく、花押や筆跡等についても留意し、関連史料を抽出するように努めている。2.史料編纂所未調査の関連史料について、大覚寺所蔵聖教紙背文書・陽明文庫所蔵洞院家旧蔵記録典籍類紙背文書・毘沙門堂門跡所蔵洞院家旧蔵史料を対象として、調査を実施し、必要な史料についてはデジタルカメラによる撮影も行った。いずれも学界未紹介の史料を多数含んでおり、特に重要なものについては、翻刻・検討の上、論文ないし史料紹介のかたちにまとめるよう作業を行っている。また、陽明文庫および毘沙門堂門跡所蔵の洞院家旧蔵史料は、元来一体のものであり、両者を併せて検討することによって、本来のかたちを復元し、一つの訴訟事例として理解が可能となる史料も存在する。今後、各所に散在する洞院家旧蔵史料を調査することによって、さらに多くの関連史料を見出し得ることが期待されるので、来年度以降も調査を継続したい。14世紀の社会秩序構造変化において、野にありながら、高度な法知識・法技能を有し、訴訟の場で法を利用する者達が果たした役割を、実証的に解明することを目的として、以下の作業を行った。1.個別主体事例検討のため、昨年度に引き続き、薩摩国御家人山田道慶、および東寺雑掌(沙汰雑掌)頼憲・光信・頼勝について、東京大学史料編纂所架蔵の原本・写本・刊本を対象とした史料収集作業を行った。2.個別訴訟事例検討のため、昨年度の成果を踏まえ、本来一体のものでありながら、陽明文庫所蔵洞院家旧蔵記録典籍類紙背文書・毘沙門堂門跡所蔵洞院家旧蔵史料に分散して伝来した訴訟事例について、両史料をあわせて検討し、復元する作業を行った。さらに、同事例の関連史料を求めて、京都国立博物館寄託毘沙門堂門跡所蔵洞院家旧蔵史料・国立歴史民俗博物館所蔵高松宮家伝来禁裏本・内閣文庫所蔵洞院家旧蔵史料の調査を実施したが、直接関連するものは見出せなかった。3.史料編纂所未調査の関連史料について、神宮文庫所蔵史料・大覚寺所蔵聖教紙背文書の調査を実施し、必要なものは、デジタルカメラによる撮影および焼付の購入を行った。いずれも学会未紹介の史料を多数含んでおり、成果は、翻刻・検討の上、順次論文ないし史料紹介のかたちで公表する予定である。なお、大覚寺所蔵聖教紙背文書については、「大覚寺所蔵「儼避羅抄」紙背文書」として、『室町時代研究』第3号(2011年夏刊行予定)に掲載の予定である。1-個別主体事例検討のため、昨年度に引き続き、薩摩国御家人山田道慶、および東寺雑掌(沙汰雑掌)頼憲・光信・頼勝について、東京大学史料編纂所架蔵の原本・写本・刊本を対象とした史料収集作業を行った。また、東寺雑掌の関連史料を求めて、京都府立総合資料館において、東寺観智院金剛蔵聖教等の調査を実施した。2.個別訴訟事例検討のため、昨年度までの成果を踏まえ、本来一体のものでありながら、陽明文庫所蔵洞院家旧蔵記録典籍類紙背文書・毘沙門堂門跡所蔵洞院家旧蔵史料に分散して伝来した訴訟事例について、両史料をあわせて検討し、復元する作業を行った。3.史料編纂所未調査の関連史料について、鹿王院所蔵史料・大覚寺所蔵聖教紙背文書等の調査を実施し、必要なものは、デジタルカメラによる撮影を行った。

このうち、学会未紹介の史料は、翻刻・検討の上、順次論文ないし史料紹介のかたちで公表する予定であるが、まず、大覚寺所蔵聖教紙背文書を、「大覚寺所蔵「嚴避羅抄」紙背文書」として、『室町時代研究』第3号に紹介'した。なお、本研究の大まかな見通しを、2012年3月21日、南京大学(中華人民共和国)における東京大学リベラルアーツ・プログラムの特設講演「14世紀日本における社会秩序形成・維持構造の変化」として発表した。14世紀の社会秩序構造変化において、野にありながら、高度な法知識・法技能を有し、訴訟の場で法を利用する者達が果たした役割を、実証的に解明することを目的として、以下の作業を行った。1関連史料の網羅的収集を試み、訴訟に於いて代理を務める地頭代・雑掌に注目して作業を行った。その結果、個々の地頭代・雑掌について、所領支配ではなく、訴訟を目的とした代官であるか否かの確定には、個別事例に則した検討が不可欠であることが再認識された。2個別主体事例検討のため、史料収集を継続するとともに、収集した史料の検討を行った。地頭代の事例として、薩摩国御家人山田道慶について検討し、自身の訴訟と並行して、他者の訴訟を請け負い、京都や鎮西探題で活動したことを明らかにした。また、雑掌の事例として、東寺の雑掌について検討し、鎌倉時代末には、もっぱら訴訟を請け負う雑掌の存在が確認できた。東寺以外にも、高野山・近衛家等の訴訟においても同様な雑掌の活動がみられた。これ等によって、地頭代や雑掌の中に、所領支配を行う者とは別に、訴訟のための代官が存在することを確認でき、その結果、雑掌をめぐる研究史上の混乱を整理する見通しを得た。3個別訴訟事例検討のため、昨年度までの成果を踏まえ、本来一体のものでありながら分散して伝来した訴訟事例について、陽明文庫・毘沙門堂門跡所蔵史料に加え、陽明文庫での補充調査・慶應義塾大学文学部所蔵文書の調査を行い、三史料をあわせて検討し、復元作業をほぼ完了できた。鎌倉時代の訴訟・安堵に関する興味深い事例であり、近日中に翻刻および検討結果を公表する予定である。4史料編纂所未調査の関連史料について、石川県立図書館・金沢市立玉川図書館等の調査を実施し、必要なものは、デジタルカメラによる撮影を行った。このうち、学会未紹介の史料は、翻刻・検討の上、順次論文ないし史料紹介のかたちで公表する予定である。個別主体および個別訴訟事例に関する史料収集・検討作業はおおむね順調に進展している。学会未紹介の関連史料については、雑誌論文のかたちで発表することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までに行った史料収集作業を総括し、それを踏まえて補足調査を実施する。学会未紹介の史料については、順次個別の史料紹介として報告する。収集した史料に基づいて、個別主体・個別訴訟事例としての検討を行い、必要に応じて、原本の実見、高精細画像データの収集等、補足調査を実施して、分析の精度を上げ、結果を順次事例報告としてまとめる。あわせて、個別事例相互間の比較等、総合的な検討を行い、研究を総括する。
哺乳類体内時計中枢の領域間および細胞間同期ー構造多様性をふまえてー

視交叉上核発振細胞間の同期機構と位相波現象の機序の解明を目指した。視交叉上核の腹側部と背側部にて包括的遺伝子発現解析を行った。その結果、腹側ではVip遺伝子が背内側部ではVpac2遺伝子が最も特異性が高く、またおのおのの局在を形態学的に確認した。これはVIP/VPAC2受容体の視交叉上核内部における同期維持に対する重要性が示唆する。一方でラット視交叉上核のスライス培養を用いForskolinを加えて細胞間同期を破壊することができた。それによって異なる固有周期を持つ2領域を視交叉上核背内側部でつきとめることができた。さらに数値的シミュレーションにてこの領域周期差が位相波を作ることが示唆された。同期機構の解明のためにForskolinを加えて恣意的に同期を破壊する方法を開発するなど一昨年度までに大きな進展があった。昨年度は非同期となった視交叉上核における微少領域の解析によって周期の短い発振子の存在する領域をつきとめることができた。これを短周期領域(SPR)と名付けた。Per2::dlucラットによって発光をモニターすることによって微少領域ごとの概日リズムの採取を行ったところ、視交叉上核の内側に周期の遅い領域がクラスターを作り、その部分から外側に伝播する位相波が出現することが明らかになった。この領域を短周期領域(short period region; SPR)と名付け、それより外側の周期の長い領域を(long period region; LPR)とした。この時点でこのSPRが位相波を作り出す仕組みを明らかにするために数値的シミュレーションにて再現しようとした。視交叉上核画像を格子上に細分化しおのおののグリッドに振動子を一つずつ配置した。すなわち、格子を仮定し、おのおののグリッドに振動子を配置する。短い周期の振動子を集めた領域を仮定した。また、おのおのの振動子は蔵本らが提唱するリミットサイクルを表現可能な位相方程式によって表現された。その結果、位相波が再現できた。この場合ある程度以上の結合の強さがないと位相波は現れない。また、短周期領域をランダムに配置しても生体で見られるような内側から外側に至る位相波は現れない。これらの内容をまとめ、学会での発表を三回行った。うち一回はシンポジウムでの発表である。また、論文を投稿し現在査読者から良好な反応を得ている。改訂について対応しておりまもなく論文が受理される見込みである。視交叉上核発振細胞間の同期現象と視交叉上核に現れる位相波現象の機序の解明のためにラット視交叉上核のスライス培養を用い、Forskolinを加えて恣意的に同期を破壊する方法を開発した。その技術的進展を基盤とし、非同期となった視交叉上核における微少領域の解析によって周期の異なる2領域を視交叉上核背内側部でつきとめることができた。内側の短周期領域(short period region; SPR)、それより外側の周期の長い領域を(long period region; LPR)とした。この時点でこのSPRが位相波を作り出す仕組みを明らかにするために数値的シミュレーションにて位相波の再現に成功した。振動子間の強度を変えて検討をさらに加えると、振動子間にある程度以上の結合強度がないと位相波が現れないことが明らかになった。また、短周期領域をランダムに配置しても生体で見られるような内側から外側に至る位相波は現れないことも明らかにした。別の方向性での成果があった。長日条件と短日条件でin situ hybiridizationを用いて、Per1遺伝子の発現領域を時系列で観察すると、SPR、LPRに相当する領域間の位相差が拡大する所見を得た。視交叉上核内部にて、日長情報が認識されていることを意味する。よって、このSPR, LPRが日長を認識する振動子であるmorning oscillator, evening oscillatorであることを示唆している。最終的に成果論文(Koinuma et al. 2013 EJN)の発表にいたった。また、本プロジェクトを中心として著作を発表した。また、多くの学会におけるシンポジウム、研究会おける招待講演などにおいて成果を発表することができた。おおむね目標を達成できたと考える。視交叉上核における発振細胞間の同期機構を探ろうとする研究課題である。記載して計画に従って発光によって概日リズムを検出できるPer2プロモーター::ルシフェラーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックラットの視交叉上核のスライス培養を用いて検討を行った。今回、我々はいくつかの方法によって視交叉上核内部の発振細胞間の同期を破壊することに成功した。その結果、領域間に周期差が存在し、短周期から長周期にいたるグラデーションが存在することを明らかにした。

視交叉上核の発振細胞間においてはアデニレートサイクレースによって産生されるcAMPが同期達成のために必要とされるシグナル伝達の中核であることが知られている(Maywoodらによる。)。よって、cAMPをもちいたシグナル伝達系の操作によって同期を破壊することを考案した。Forskolin(FK)はアデニレートサイクレースの活性を上昇させてcAMPを弛張的に上昇させる。そこでFKを投与して領域を細分化して周期を計測すると、視交叉上核内部の同期が破壊され、内側に短周期の領域が外側に長周期の領域が存在することが明らかになった。さらに、FKを用いない状態で領域間に周期差が存在するかを明らかにするために視交叉上核を細説して切片ごとの周期を捉えた。この周期差は吻尾側では尾側に24時間より短い領域が吻側に24時間より長い領域が存在した。また内外側方向では内側に短周期の領域が外側に長周期の領域が存在した。CCDカメラでの観察では細切された小領域のすべてが同期していることが明らかになり、視交叉上核の同期が非常に局所的な結合によって成り立っていることが示された。これらの局所的同期に関与する可能性のあるVIP/VPAC2以外のリガンド、リセプターについてはすでにin situ hybiridizationを用いて平行して検出作業を行っている。視交叉上核内部の同期機構にせまることを目的とする課題である。FKの投与によってcAMPの細胞内濃度を上昇させることによって視交叉上核における細胞間の同期を断ち切ることができた。そのことによって内側の小領域に短周期の発振細胞がそれより外側を占める比較的大きな領域に24時間より長い周期の発振細胞が存在することが明らかになった。数値的シミュレーションを行う事によって、これらのクラスター化した短周期発振細胞と長周期発振細胞によって位相波が生み出されることが示された。これは視交叉上核研究において大きな進展である。とくに視交叉上核に観察される伝達される波、位相波の形成機構について明らかにしたのは初めてであり大きな評価を得た。この点で当初の目的である同期機構の解明についてはかなり充足していると考える。一方では、局所における同期の達成がどのような機構で行われているのか、とくに領域特異的に発現するペプチドなどのリガンドがどのような役割を果たすかについて実際の組織を用いた検討については予定通りに進展していない。昨年と同様、発光モニターが可能な機器が不足していることによるものであり、本年度は視交叉上核におけるFKによる脱同期状態の観察に時間と資金を投入せざるを得なかった。高額な機器であり、資金が必要である。また、明暗周期シフト後のin vivoで認められた脱同期(J. Neurosaci. Nagano, shigeyosni et al. 2003)の再現についても良好な結果を得られなかった。すでにVpac2,カルシトニン受容体、RGS16遺伝子などの視交叉上核内部局在の検討を終了している。これらのいずれの遺伝子も背内側部に高発現していた。
ラット肺静脈心筋細胞における新規Cl-チャネルの多層階生理機能研究

本研究の研究目的は申請者がラットの肺静脈心筋において発見した過分極活性型Cl-電流の心房細動への関与を多角的に検討することである。そのために先ず、このCl-電流の分子実態を同定し、続いてモデル細胞や数理モデルならびにモデル動物の作成を検討してた。第一に,目的のCl-チャネルのメインサブユニットは,発現クローニングの結果CLCN2であった.CLCN2抗体で沈降させたタンパクをトリプシン処理して得られたペプチドの質量分析の結果,HSPAタンパクをCLCN2の調節タンパクとして新規に同定した(論文改訂中).心房・肺静脈組織において局所的に発現の高いアデニリル酸酵素を同定し,これが不整脈発生に寄与する機序をCa2+イメージングで観察した(論文投稿中).学外共同研究者が,ラット肺静脈において持続性不整脈(自動能)が発生する現象を,コンピューター上で定量的に再現した(論文投稿中).齧歯類において心房細動リモデリングを独自に再現し,諸々の薬剤の心房細動への効果を検証中である.以上の研究中にマウス・ラットのマイクロアレイ解析,ヒトサンプルのRNA-seq解析で,肺静脈を特徴づける転写因子群を同定してある.研究計画の目的はほぼ達成している.今後は独自に開発した病態モデルをさらに精力的に利用し,橋渡し研究につなげていく.また,今回の研究過程で取得した技術を使って,イオン電流の未知の分子実態を同定していきたい.目的のイオンチャネルを同定し,数理モデルの作成に成功し,病態モデルの開発に成功している.国際学会で3演題をポスター発表するに至ったものの,投稿論文受理に時間がかかっている.研究計画の目的はほぼ達成している.今後は独自に開発した病態モデルをさらに精力的に利用し,橋渡し研究につなげていく.また,今回の研究過程で取得した技術を使って,イオン電流の未知の分子実態を同定していきたい.本研究の研究目的は申請者がラットの肺静脈心筋において発見した過分極活性型Cl-電流の心房細動への関与を多角的に検討することである。初年度の目標であった分子実態の同定は、イオンチャネルの遺伝子クローニングとプロテオミクスを組み合わせることでほぼ終了しており、現在論文執筆中である。研究過程で、肺静脈におけるあるリン酸化酵素が不整脈を促進していることが判明した。こちらも論文執筆中である。また、所属教室が学外との共同研究で肺静脈異所性自動能の数理モデル作成を進めており、基盤となるモデルは既に完成している。この数理モデルによる定量的な解析により、研究対象である過分極活性型Cl-電流の不整脈への関与は限定的であることが分かった。こちらは学外研究者が論文執筆中である。モデル細胞の作製は、当初マウス拍動心筋を利用することを検討していたが、ラット肺静脈のマイクロアレイデータを獲得したため、心筋前駆細胞に転写因子を導入することで、肺静脈心筋を誘導できる可能性が出てきた。今後は肺静脈心筋の分化誘導研究も視野に入れていく。さらに、ラットの心房を局所的に高頻度ペーシングすることで人為的心房細動を形成する技術を完成させた。研究対象である心房細動は後天的な慢性疾患であるため、今後はこの心房細動モデルを使って、種々のイオンチャネルのリモデリングやそのエピゲノム過程を研究し、抗不整脈薬の薬理学的作用機序や効果を研究していく予定である。初年度の目標であった過分極活性型Cl-電流の分子実態同定は、イオンチャネルの遺伝子クローニングとプロテオミクスを組み合わせることでほぼ終了している。現在論文執筆中である。次のステップとしてCaチャネルやCaポンプのリン酸化過程を研究したが、これも半ば実験が終了しており論文執筆中である。数理モデルによる定量的な解析は学外共同研究者により基盤となるモデルが完成している。ラット肺静脈のマイクロアレイデータを獲得したため、心筋前駆細胞に転写因子を導入することで、肺静脈心筋を誘導できる可能性が出てきた。最終的な目標である、モデル動物を使った橋渡し研究は、既にデータの量産体制が整っている。研究目標の大半が2年目に終了する見通しである。第一に,目的のCl-チャネルのメインサブユニットは,発現クローニングの結果CLCN2であった.CLCN2抗体で沈降させたタンパクをトリプシン処理して得られたペプチドの質量分析の結果,HSPAタンパクをCLCN2の調節タンパクとして新規に同定した(論文改訂中).心房・肺静脈組織において局所的に発現の高いアデニリル酸酵素を同定し,これが不整脈発生に寄与する機序をCa2+イメージングで観察した(論文投稿中).学外共同研究者が,ラット肺静脈において持続性不整脈(自動能)が発生する現象を,コンピューター上で定量的に再現した(論文投稿中).

齧歯類において心房細動リモデリングを独自に再現し,諸々の薬剤の心房細動への効果を検証中である.以上の研究中にマウス・ラットのマイクロアレイ解析,ヒトサンプルのRNA-seq解析で,肺静脈を特徴づける転写因子群を同定してある.研究計画の目的はほぼ達成している.今後は独自に開発した病態モデルをさらに精力的に利用し,橋渡し研究につなげていく.また,今回の研究過程で取得した技術を使って,イオン電流の未知の分子実態を同定していきたい.目的のイオンチャネルを同定し,数理モデルの作成に成功し,病態モデルの開発に成功している.国際学会で3演題をポスター発表するに至ったものの,投稿論文受理に時間がかかっている.今後は、いくつかの論文発表ののち、完成させた心房細動モデルの活用に重点をおいていく。数理モデル解析の結果、研究対象の中心だった過分極活性型Cl-チャネルは異所性自動能への関与は限定的であることが判明したため、心房細動の病態として重要な分子を改めて検索していく。種々のイオンチャネルの発現量を測定するための抗体は既に購入済みである。心房細動は後天的に発症する慢性疾患であるため、固有の遺伝子変異に注目するのではなく、エピゲノム過程を考慮して研究を進める。また、ラット肺静脈のマイクロアレイデータを獲得したため、心筋前駆細胞に転写因子を導入することで、肺静脈心筋を誘導できる可能性が出てきた。肺静脈心筋の分化誘導研究も視野に入れていく。研究計画の目的はほぼ達成している.今後は独自に開発した病態モデルをさらに精力的に利用し,橋渡し研究につなげていく.また,今回の研究過程で取得した技術を使って,イオン電流の未知の分子実態を同定していきたい.生じた差額は実際に購入するまで価格が分からなかった物品の消費税分である。次年度の研究遂行上問題ない。