hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植肺肺動脈内皮細胞採取法による肺移植急性拒絶反応診断の可能性の検討

肺移植において,レシvoエントの血液と最も多く接する機会を持つ移植肺の血管内皮細胞は拒絶反応の初期より何らかの徴候が現れる可能性を持っている。この点に立脚し、同種肺移植における移植肺血管内皮採取による急性拒絶反応診断の可能性を検討することを目的とした。Brown-Norway系ラットをドナー、Lewis系ラットをレシvoエントとした同種肺移植を行い、1)組織診による拒絶反応の程度(JOCHUMPROP等の分類に準ずる),2)免疫染色組織診による血管内皮の接着因子ICAM-1の発現率,3)フローサイトメトリーにて定量化した血管内皮擦過法による採取血管内皮細胞のICAM-1発現率を比較する予定であったが、施行した11組の移植中3組が術死、8組が術翌日に死亡した。死因は出血,血管吻合部狭窄,窒息で手技上の問題であった.術翌日死亡例の組織所見では軽度の細胞浸潤と強い浮腫が認められる傾向があった。一方、免疫染色組織診でのICAM-1発現はあまり染まらないものから軽度に染まるものまで種々あり、全体的に染まりの悪い傾向が見られた。この所見は、死後時間を経過してからの検体だったことに起因すると考えられた。また、フローサイトメトリーによる定量化も検体が不適当だったため、測定ができなかった。今後も引続き同研究を改良し,継続し、本研究課題の解明および経皮的移植肺血管内皮細胞採取法による急性拒絶反応診断を確立していくつもりである。
交直変換器を含む電力系統の2時間軸並列シミュレーション手法の研究

本研究では、電力系統に導入されたパワーエレクトロニクス応用システムの動特性シミュレーションにおいて、交直交換器におけるサイリスタ・バルブの速い動特性と、発電機・ネットワーク側におけるゆっくりした電気・機械動特性を、効率的に数値解析するために、時間刻みを交直交換器側の高速モデルでは短く、発電機ネットワーク側の低速モデルでは長く設定する2時間軸並列シミュレーション手法を開発し、その実用可能性について研究を行った。得られた成果をまとめると次のとおりである。(1)SMESを含む多機系統の動特性解析アルゴリズムに2時間軸並列シミュレーション手法を適用し、系統側の低速モデルとSMES側の高速モデルの境界におけるデータ処理法とシミュレーション精度との関連性を明らかにした。(2)2時間軸並列シミュレーション手法の高速化を実現するために、トランスピュータ・ネットワークで構成した並列計算システムを開発した。(3)東北電力株式会社のSMES実証試験モデルについて、2時間軸並列シミュレーション手法を適用し、シミュレーションの精度、実用可能性を明らかにした。SMESの有効/無効電力制御について、変換器の非線形な出力特性、時間応答特性を考慮する場合のシミュレーション精度について、SMESの簡易モデルによる従来のシミュレーションと2時間軸並列シミュレーションの差違を明らかにした。本研究では、電力系統に導入されたパワーエレクトロニクス応用システムの動特性シミュレーションにおいて、交直変換器におけるサイリスタ・バルブの速い動特性と発電機・ネットワーク側のゆっくりした電気・機械動特性を効率的に数値解析するために、交直変換器側の高速モデルでは時間刻みを短く、発電機ネットワーク側の低速モデルでは長く設定する2時間軸並列シミュレーション手法を開発する。また、シミュレーションの高速化を図るために、高速モデルと低速モデルの計算処理プロセスをトランスピュータネットワーク上の複数プロセッサに割り当て高速に処理する並列計算システムを構成し、その実用可能性を検討する。本年度は多機系統における超電導エネルギー貯蔵(SMES)の動特性解析に2時間軸並列シミュレーション手法を展開し、以下の研究を行った。(1)SMESを含む3機10母船系統の動特性解析アルゴリズムに2時間軸並列シミュレーション手法を適用した。(2)系統側の低速モデルとSMES側の高速モデルの境界となる接点の取り方について、シミュレーション精度との関連性を検討した。(3)トランスピュータ・モジュール5ユニットの並列計算ネットワーク・システムを構成し、2時間軸並列シミュレーション手法のハードウエアーによる高速化について実験準備を完了した。本研究の目的は、電力系統に導入されたパワーエレクトロニクス応用システムの動特性シミュレーションにおいて、交直変換器におけるサイリスタ・バルブの速い動特性と、発電機、ネットワーク側のゆっくりした電気・機械動特性を効果的に数値解析する2時間軸並列シミュレーション手法を開発することにある。平成7年度は以下の研究成果を得ている。1.本研究で開発した2時間軸並列シミュレーション手法を東北電力株式会社のSMES実証試験モデルに適用し、数値解析結果についてはシミュレーションの精度、スケーラビリティを明らかにした。2.2時間軸並列シミュレーション手法により、交直変換によるSMESの有効・無効電力制御について、超電導コイルの充電電流に依存するSMESの非線形な出力特性、変換器の応答時間特性を検討し、従来法によるシミュレーションとの差違を明らかにした。3.SMESによる系統安定化制御について、系統構成に依存する効果、発電機のAVRとの協調制御の効果を明らかにした。4.発電機の界磁回路時定数Tdo'が系統の安定性、SMESによる系統安定化制御に及ぼす効果を検討し、Tdo'が大幅に小さい発電機を利用するSMES実証試験について、実機の場合との差違を明らかにした。
パストランジスタ多値論理回路の自動合成に関する研究

1.4値n変数関数を関数値毎に、4つの部分関数に分け、各部分関数をリテラル、max,minを用いて簡単化を行った後、しきい値の異なるパストランジスタに置き換え、最大6個の逆流阻止トランジスタと組合せることにより、任意の関数が直接駆動パストランジスタ4値論理回路として構成できるようになった。又、4値負関数を直接駆動パストランジスタ回路で構成すると、素子数が少なく、逆流阻止トランジスタもいらず、極めて良好に動作する。2.研究成果の1つとして、新しい型の4値論理ゲ-トM-OR,M-AND及びUゲ-トがある。前2者の回路は12個のMOS-FET中2個のFETのしきい値電圧とサイズが異なる同一回路構成となっている。又、Uゲ-トは8個のMOS-FETからなる可変しきい値ゲ-トである。Uゲ-トと定数0、1、2、3で完全系をなす。3.任意の4値論理関数は共通関数を用いた合成法で、Uゲ-ト回路網、CPゲ-ト回路網及びTゲ-ト回路網等へ系統的で高速に合成できると共に、CRT上に回路図が自動合成できるようになっている。4.4値Uゲ-トの可変しきい値特性を生かした応用面の拡大をはかるため、3個のUゲ-トからなる4値1変数回路を構成し、4つの入力端子を0、1、2、3に固定し、各ゲ-トのしきい値制御端子の値を変えたとき、その回路で表現できる4値1変数の数は全体の60%となる。又、全ての4値1変数関数をこの回路1個で表現するには、4つの入力値の組合せの数は7種あれば良いことが分かった。Uゲ-トのしきい値制御入力を4値信号で直接駆動する方式の4値Uゲ-ト回路網の合成法は、今後の課題として残っている。5.直接駆動のパストランジスタ回路網とリテラル駆動パストランジスタ回路網を比較すると、後者の方が動作速度と消費電力の面で優る。1.しきい値ゲートを用いず,しきい値電圧の異なるパストランジスタのみを用いて1変数4値論理回路を構成すると, 4値インバータ回路以外では少なくとも2個以上の逆流阻止トランジスタが必要である.いま,ある任意の二つの出力電圧V^1_0とV^<11>_0,そのときの入力電圧V^1_1とV^<11>_1(但し, V^1_1>V^<11>_1)がV^1_0-V^<11>_0≧V^1_1とV^<11>_1となる関係があるとき,パストランジスタ間で短絡が起きる.この場合, V^1_0とV^<11>_0のうち,低電位を出力する所にNMOSの短絡阻止トランジスタが,高電位を出力する所にPMOSの短絡阻止トランジスタが必要であることがわかった.2.従来のメイク・ブレイク演算子回路のアナログスイッチ部分を通る信号によりパストランジスタにPMOS-FET又はNMOS-FETの一つを用いることにより素子数を減らすことができ,更に,しきい値電圧の異なるパストランジスタを用いることによりしきい値ゲート数を減らすことができるようになった.この場合,しきい値ゲートも使用しているため,短絡阻止トランジスタを必要とせず,回路構成法が簡単になっている.更に,合成される多値論理回路で用いる同一出力をですしきい値ゲートを共用することにより素子数を大幅に軽減できるようになった.3.パストランジスタ4値論理回路の合成法がパーソナル・コンピュータで処理できるようになった.

この処理では,メイク・ブレイク演算子及び4値論理関数はリスト形成で表現している.又,その出力結果を作図するため,リスト形成の4値論理関数式を入力し,その関数のワイヤードOR接続の数及びメイク・ブレイク演算子の直列接続の数によりCRTディスプレイの行方向及び列方向の分割数を決め,格子状分割された面面の一つのセルにこれらの演算子を配置するようにしてパルストランジスタ4値論理回路図が描けるようになった.1制御信号により回路しきい値が変えられる新しい型のリテラル回路を提案し、このリテラル回路でPMOS及びNMOSトランジスタを駆動することにより構成されるイニバーサルゲートと多値定数のみで任意の多値論理回路が構成できることを示した。このユニバーサルゲートで構成された多値論理回路をFSPICEを用いてシミュレーションしたところ、極めて良好に動作することが分かった。2ユニバーサルゲートやTゲート多値論理回路網の簡単化法に、共通な部分関数を有効に利用する方法を導入し、系統的で高速に処理できるようになった。この多値論理回路網の簡単化法は準最適な合成法で、素子数が最小になるという保証はない。3簡単化された多値論理関数式を入力し、メイク・ブレイク演算子やTゲートの記号図を用いた多値論理回路図を描くプログラムは開発された。CRTディスプレイ上に全回路図が一度に表現できないような大きな回路図の場合には、XYプロッタで作図できるようになっている。各ゲート間の配線の交叉数を最小にするようなゲートの最適配置法については現在検討中である。4多値入力でしきい値の異なるパストランジスタを直接駆動することにより構成される多値論理回路において、各信号レベルとパストランジスタのしきい値電圧の関係や逆流阻止トランジスタの挿入位置並びにそのしきい値電圧の決定ができるようになった。5多値入力で直接パストランジスタを制御する多値論理回路の合成が行えるようになっているが、パストランジスタの基板効果の影響を阻止するトランジスタを決める部分の改良とその合成法をパーソナルコンピュータで行えるように現在検討している。1.アナログ加算回路の出力をレベルシフトした後、4値反転量子化回路に通すことにより、新しい型の4値論理ゲ-トM-ANDとM-OR回路が構成できた。これら2種の回路は、12個のMOS-FET中2個のMOS-FETのしきい値電圧とサイズが異なっている。2.4値n変数関数を関数値毎に、4つの部分関数に分け、各部分関数をリテラル、max、minを用いて簡単化を行った後、リテラルをしきい値の異なるパストランジスタに、minを直列接続に、maxをワイヤ-ドOR接続に置き換え、最大6個の逆流阻止トランジスタと組合せることにより、任意の関数が直接駆動パストランジスタ4値論理回路として構成できるようになった。また、4値負関数を直接駆動パストランジスタ回路で構成すると、素子数が少なく、逆流阻止トランジスタもいらず、極めて良好に動作する。3.任意の4値論理関数は共通関数を用いた合成法で、Uゲ-ト回路網、CPゲ-ト回路網及びTゲ-ト回路網等へ系統的で高速に合成できると共に、CRT上に回路図が自動合成できるようになっている。4.4値Uゲ-トの可変しきい値特性を生かした応用面の拡大をはかるため、3個のUゲ-トからなる4値1変数回路を構成し、4つの入力端子を0、1、2、3に固定し、各ゲ-トのしきい値制御端子の値を変えたとき、その回路で表現できる4値1変数関数の数は全体の60%となる。又、全ての4値1変数関数をこの回路1個で表現するには、4つの入力値の組合せの数は7種あれば良いことが分かった。
トンネル電流による１分子シークエンシング法

DNAシークエンサー開発の大きなマイルストーンの1つであるバクテリオファージPhiX174の全ゲノム解析に成功した。5386塩基から構成されるPhiX174を、60塩基、120塩基の部分配列に断片化し、60塩基と120塩基の部分配列を1分子シークエンシング法で決定後、アセンブル法により全塩基配列を決定した。1分子シークエンシング法の実証と同時に、1分子シークエンシング法の動作原理を解明するため、1分子の大きさは同程度だが、最高占有分子軌道(HOMO)のエネルギーが異なる分子を用いて、1分子電気伝導度とHOMOのエネルギーの相関を詳細に調べた。その結果、1分子電気伝導度が、電極のフェルミエネルギーとHOMOのエネルギーの差の逆二乗に比例するランダウアー理論に沿うことを明らかにすることが出来た。電流ー時間波形の情報量を増加させて、機械学習による両末端の高精度識別を実現するため、電流計測の時間分解能を10KHzから100KHzまで向上させた計測システムを開発した。この計測システムを用いて、2塩基分子から構成されるDNAオリゴマーの1分子識別を機械学習により行った。機械学習を用いない統計解析法では、DNAの3'末端と5'末端の識別ができなかった。機械学習を用いて、全16種類のDNAオリゴマーの電流ー時間波形を解析したところ、3'末端と5'末端の識別できることに成功した。開発した計測システムを用いて、20種類のアミノ酸の1分子識別を行った。溶液のpH、印加電圧、および電極間距離の制御を行ったところ、電極間距離の最適化を行うことで、全20種類のアミノ酸の1分子電気伝導度ー時間波形を取得できた。各アミノ酸分子の1分子電気伝導度の確率密度関数を用いた統計解析により、全20種類のアミノ酸の1分子識別に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究開始当初、ナノギャップ電極を作る機械的破断接合(MCBJ)の機械的安定性が十分ではないため、一定のナノギャップを長時間保持することが困難であり、シリコン基板上の固定ナノギャップ電極の開発を計画していた。しかし、MCBJの破断・接合の制御アルゴリズムとMCBJチップの絶縁膜材料を再検討したところ、溶液中におけるナノギャップ保持時間が25分以上の安定性が得られた。このMCBJの改良により、高い信頼性・再現性の電流ー時間プロファイルを計測できるようになった。そこで、π電子系アミノ酸分子、σ電子系アミノ酸分子、およびリン酸化チロシンの1分子電気伝導度を決定するため、MCBJを用いて作製した0.5nmと0.7nmのナノギャップ電極により、1種類のアミノ酸分子のみが溶解した水溶液の電流ー時間プロファイルを計測した。いずれのナノギャップ電極でも全てのアミノ酸分子で電気シグナルが得られたが、電流ヒストグラムに1つのピーク電流が得られたのは、0.5nmで9種類、0.7nmで9種類であり、全部で13種類のアミノ酸が1つのピーク電流を示した。チロシンとリン酸化チロシンは、0.7nmのナノギャップ電極で識別され、チロシンの1分子電気伝導度が大きいことが分かった。さらに、成長因子であるペプチドとリン酸化チロシンを持つ修飾ペプチドの電流ー時間プロファイルを0.7nmのナノギャップ電極で計測した。得られた電流ー時間プロファイルを、アミノ酸の1分子電気伝導度を用いて解析したところ、アミノ酸の部分配列を決定することができ、修飾・非修飾ペプチドの識別に成功した。また、修飾・非修飾ペプチドの混合溶液の電流ー時間プロファイルを計測し、チロシンとリン酸化チロシンのシグナル強度を比較することで、エラー率は大きいものの混合比を求めることができ、定量解析の可能性を見出した。遺伝子機能をスイッチし、疾病マーカーや細胞分化の決定因子となる修飾塩基分子の中で最も重要であるメチル化シトシンを含むDNAの塩基配列決定を、1分子シークエンシング法を用いて行った。特に、疾病マーカーとなるメチル化シトシンは、グアニン・シトシンのリピート配列に発現することが知られているため、このリピート配列を持つ合成DNAを計測対象にして計測を行ったところ、メチル化・非メチル化の識別に成功した。また、トンネル電流が電極間を通過する分子数をカウントできる機能を利用して、計測サンプル中における修飾・非修飾DNAの存在比を求め、塩基配列と存在比を決定する定量解析を行ったが、十分な定量解析には至らなかった。がんの予防・予後診断への応用が期待されているマイクロRNAの塩基配列決定を、1分子シークエンシング法を用いて行った。がんマーカーとして知られるLet7ファミリーのうち2種類のマイクロRNAの混合溶液を計測対象として、塩基配列と存在比を同時に決定する定量解析を行った。7塩基以上の断片配列を用いて塩基配列は決定することが出来たが、十分な定量解析には至らなかった。開発してきた1分子シークエンシング法では、ブラウン運動で確率的にナノ電極間に進入する1分子を計測するため、単位時間当たりのシグナル頻度が極めて低い。この課題を解決するため、ナノデバイス構造に電圧印加できる1対のナノ電極を追加し、電気泳動により、DNAを効果的にナノ電極間に引き入れることで通過確率を増加させる1分子速度制御技術の開発を行った。電気泳動電極と流路の構造の最適化により、センシング電極領域に電気泳動電圧を効果的に印加できるようになった。配列決定と定量解析を行える限界濃度を明らかにするため、シグナル頻度のサンプル濃度依存性を評価したが、明確な濃度依存性が観察されなかった。

当初、2年次に計画していたペプチドの部分アミノ酸配列決定と、3年次に計画していた疾病マーカーである修飾アミノ酸分子の1分子識別に成功し、2種類の混合ペプチドの定量解析は予想外の進展であった。本年度、DNAにおけるメチル化シトシン等の修飾塩基分子の1分子識別と、疾病マーカーとなるマイクロRNAの塩基配列決定に成功した。さらに、検体のシグナル頻度を増加させるために、電気泳動機構を導入したナノデバイスの開発を行い、センシング電極が設置されたナノ流路に効果的な電気泳動電圧を印加することに成功した。一方、化学修飾・非修飾DNAと2種類のマイクロRNAの塩基配列と分子数を決定する定量解析を行ったが、十分な定量解析には至らなかった。また、1分子シークエンシング法の課題であったシグナル頻度とサンプル濃度依存性を研究したが、明確な濃度依存性が観察されなかった。高いシグナル頻度と明確な濃度依存性が観察されなかったのは、センシング電極に導入される検体が、センシング電極近傍のわずかな検体のみであり、大多数の検体がマイクロ流路内に留まっているため、十分なシグナル数が得られなかったことが原因であると流体シュミレーションから示唆された。また、流体力学、電磁気学、およびイオン輸送を含むマルチフィジックスシュミレーションを用いて、センシング電極が設置されたナノ流路内の電場および流体を解析したところ、多くの検体がセンシング電極直下のナノ流路内を流動していることが示唆された。サンプル中の検体をマイクロ流路からナノ流路、センシング電極へと連続的に輸送する方法の開発とその学理構築が、検体のシグナル頻度を増加させる重要な課題であることが明確となった。マイクロ流路とナノ流路の体積比を小さくするため、マイクロ流路の長さ・断面積を縮小するとともに、ナノ流路の入り口付近にナノピラー等のコレクター用のナノ構造を設置し、入り口付近で検体の濃縮を行うマイクロ・ナノ流路を開発した。一方、ナノ流路の入り口付近の検体を電気泳動でナノ電極に効果的に導入するため、断面積を縮小させたナノ流路を開発した。さらに、電気泳動電圧による電界で検体を一定方向に流動させるため、ナノ電極を絶縁体で被覆し、センシング電圧と電気泳動電圧による電界干渉を最小化することに成功した。さらに、ナノ電極間を流れるトンネル電流をプローブとして1分子のスナップショットを連続的に取り、水溶液中の1分子の流動ダイナミクスを計測・評価するため、開発した絶縁被覆電極を用いて、計測電流に含まれるイオン電流の最小化と電流計測の高速化を行った。その結果、従来のイオン電流値を10%以下に低減し、50 kHzの高速で7.6 pArmsの低ノイズを実現した。この低ノイズ・高速計測技術を用いて、ベンゼンジアミンの3つの異性体の1分子識別を水中で行ったところ、異なる3つの1分子電気伝導度が得られ、化学の基本であるオルト、メタ、パラ異性体の1分子識別に成功した。さらに、機械学習を用いて、塩基分子の識別を行ったところ、高い精度で1分子識別できることを発見した。
有理関数空間の完備化の位相幾何

Instantonsのmoduli空間にはそれを開集合として含むUhlenbeck completionがあり,gauge理論において1つの中心的研究手段である.本研究の目的はS^2から複素多様体Vへの有理関数空間に同様の完備化を定義し,その位相幾何を調べることである.次にCP_nをloop群ΩGに一般化したときの有理関数空間(これは正にinstantonsのmoduli空間である)の完備化を研究した.研究過程で次のことも分かった.SU(2)のGにおける中心化群を0とおきJ : G/C→Ω^3_0GをJ(gC)(x)=gxg^<-1>x^<-1>とおく.このときJ_*:H_*(G/C; Z/2)→H_*(Ω^3_0G ; Z/2)は単射である.この結果はBottによるΩGのgenerating mapsに関する定理の一般化でありこれ自身大変興味あるものである.Instantonsのmoduli空間にはそれを開集合として含むUhlenbeck completionがあり,gauge理論において1つの中心的研究手段である.本研究の目的はS^2から複素多様体Vへの有理関数空間に同様の完備化を定義し,その位相幾何を調べることである.次にCP_nをloop群ΩGに一般化したときの有理関数空間(これは正にinstantonsのmoduli空間である)の完備化を研究した.研究過程で次のことも分かった.SU(2)のGにおける中心化群を0とおきJ : G/C→Ω^3_0GをJ(gC)(x)=gxg^<-1>x^<-1>とおく.このときJ_*:H_*(G/C; Z/2)→H_*(Ω^3_0G ; Z/2)は単射である.この結果はBottによるΩGのgenerating mapsに関する定理の一般化でありこれ自身大変興味あるものである.平成13年度はinstantonsのmoduli空間の完備化から定義される空間のhomologyを決定することに成功した.GをSU(n), Sp(n), Spin(n)の何れかとし,M(k,G)でS^4上のinstanton numberがkのG-instantonsのなすframed moduli spaceとする.M(k,G)のUhlenbeck completionとはM^^-(k,G)=U^k_<i=0>SP^i(R^4)×M(k-i,G)で定義される空間のことである.M^^-(k,G)は可縮でありそのhomologyはtrivialである.ところがその始めの2つのstrataであるX(k,G)=M(k,G)UR^4×M(k-i,G)を考えると,この空間は興味あるものであることが分かった.pをnに対して大きくとり,Gがp-regularであるとする.平成13年度はX(k,G)のmod p homologyを決定することに成功した.このための手段としてM(k,G)およびM(1,G)を含むhomology完全列を構成し,この完全列からM(k,G)を決定するためには包含写像i:(M1,G)→Ω^3_0Gを詳しく理解することに帰着されることが分かった.他方X(∞,G)のhomologyが,あるhomotopy fiberのhomologyと一致することも分かった.ここでいうhomotopy fiberとは,<ad>^^^(i):ΣM(1,G)→Ω^^^2Gのhomotopy fiberのことである.このhomotopy fiberのhomologyの決定は,やはり上記の包含写像i : M(1,G)→Ω^3_0Gの考察に帰着される.Gがp-regularであるとき,この考察はBott periodicityを経由することにより本質的に包含写像j : BU(1)→BSUなどを考察することになり包含写像での挙動の決定が可能になった.同様の考察をPが小さいときに行うことも非常に興味ある問題である.これに関してM(1,Spin(n))のmod2 cohomologyおよびcohomology operationsを決定することにも成功した.平成14年度はmonicな実有理関数空間の完備化の安定ホモトピー型を決定することに成功した.Rat_k(CP^n)でS^2からCP^nへの基点を保つdegree kの正則写像空間を表す.S^2の基点を∞,CP^nの基点を[1,...,1]と取ることによりRat_k(CP^n)は共通根を持たないmonicな複素k次多項式の(n+1)(p_0(z),...,p_n(z))と表示される.平成13年度の研究成果により,Rat_k(CP^n)の完備化X^l_k(CP^n)は高々l個の共通根を持つmonicな複素k次多項式のn+1組であることが解明され,更にX^l_k(CP^n)の安定ホモトピー型が決定された.平成14年度は同様の考察を実多項式に対して行うことに成功したのである.詳しくは以下の通りである.Rat_k(CP^n)のreal versionとはmonicな実k次多項式のn+1組(p_0(z),...,p_n(z))で共通根に関する条件を課したものであるが,この共通根の条件には次の2通りが考えられる.(i)p_0(z),...,P(z)には実共通根は無い.
有機オキシド化合物を触媒とした立体選択的連続反応の開発

これまでに、アルドール供与体に同じ受容体が2度反応する連続的二重アルドール反応を開発してきたが、今年度はそれを生物活性物質の合成へ応用した。例えば、受容体が同じカルボニルα位に2回反応して分岐型二重アルドール体が得られる反応では、適切な脱離基を導入しておくと、アルドール反応後に脱離反応が起こり2,3位に不斉を有する4-ピラノン誘導体が得られることが分かった。これは多くの生物活性物質の合成原料となりうるもので、現在、ザナミビル誘導体への変換を検討中である。また、受容体が2つの異なるカルボニルα位に1度ずつ反応して直鎖型二重アルドール体が得られる反応では、アセトンにシンナムアルデヒド誘導体を2度反応させ、数工程を経て、抗腫瘍活性が期待されるエリカノンの史上最短工程数で不斉合成することができた。この時、受容体の水酸基の保護基が電子供与性を有すると基質が分解してしまうため、保護基に電子求引性を導入することにより、高収率で目的物が得られることが分かった。さらに、受容体がα位とγ位に反応するビニロガス型の二重アルドール反応では、予め導入していたβ-メトキシ基が脱離して環化し、2,6位に不斉を有する4-ピラノン誘導体が得られることが分かった。本反応を利用して抗酸化活性を有するクルクミン誘導体の不斉合成に成功した。本反応のさらなる有用性を実証中である。また、嵩高い3級アミンにシアノ基を導入し、嵩高さの解消が反応の駆動力となる新しいシアノ化反応を開発することができた。本有機分子触媒反応は、シアン化水素が発生しにくいという利点を有するため、工業的にも注目を集めるであろう。27年度が最終年度であるため、記入しない。立体選択的連続反応の高効率化に向けて、新触媒の開発を行った。当研究室では、キラルなホスフィンオキシドを触媒とする不斉アルドール反応の開発を行ってきた。最近、BINAPOを触媒、四塩化ケイ素を反応剤とすると、ジケトンの分子内不斉アルドール反応が進行することを見出した。本反応では、それまで利用していたトリクロロシリルトリフラートに代え反応性の低い四塩化ケイ素を用いることにより、脱プロトン化しうる3ヶ所のカルボニルα位のうち、アセチル部位のみが選択的に脱プロトン化されたことにより達成されたものである。そこでさらに高効率な触媒の設計・合成を行い種々スクリーニングした結果、BINAPOの4,4'位に置換基を導入した新たな触媒4,4'-TMS2-BINAPOが、より高いエナンチオ選択性を与えることを見出した。本反応で得られるキラルなβヒドロキシβ置換シクロヘキサノンは、他手法では合成が困難なことから、今後の展開が期待できる。本反応の有用性を実証するために、本法を利用した抗菌活性を持つタニコライドの不斉全合成を行った。ヘプタデカンジオンを分子内不斉アルドール反応で環化した後、バイヤービリガー酸化を行うと、目的のタニコライドが高選択的に得られた。これは、(R)-タニコライドの不斉全合成としては最短経路での合成例となる。これまでに、アルドール供与体の2ヶ所に同じ受容体が反応する連続的二重アルドール反応を開発してきたが、今回、異なる2つの受容体が反応する二重アルドール反応が進行することを見出した。新たに設計・合成した4,4'-Br2-BINAPOは、従来のBINAPOに比べて反応性がマイルドなため、アルドール受容体の僅かな反応性の差を認識することができた。いまだ条件の最適化が不十分で、収率は満足の行くものではないが、初めての3成分連結型アルドール反応であることから、今後の展開が期待できる。

本有機分子触媒反応は、シアン化水素が発生しにくいという利点を有するため、工業的にも注目を集めるであろう。当初の目的である「高効率な新規ホスフィンオキシド触媒の創製」と「アルドール反応を基軸とする新規連続反応の開発」はいずれも達成できたので、研究は順調に進展していると判断する。高効率な新規ホスフィンオキシド触媒の創製:申請者がその有用性を見出した触媒であるBINAPOの誘導体合成は、リン上のフェニルの修飾に限られてきた。最も効果的な修飾と期待できるナフタレン3,3'位の修飾は、その合成が困難であるが、4,4'位の修飾は、合成上は比較的容易とはいえ、その触媒活性の調整には不向きと思われていた。ところが実際に合成して活性を調べてみると、驚いたことに、非修飾のBINAPOとは反応性・選択性が大きく変化した。それは、置換基の立体的および電子的性質が、触媒の活性や選択性を調節したためと考えられる。この結果は、BINAPO型ホスフィンオキシド触媒の今後の修飾に、大きな進展をもたらした。アルドール反応を基軸とする新規連続反応の開発:申請者は、アルドール供与体の2ヶ所に同じ受容体が反応する連続的二重アルドール反応を開発してきた。これを発展させたのが、異なる2つの受容体が反応する二重アルドール反応であり、これは、新たに設計・合成した4,4'-Br2-BINAPOにより達成できた。いまだ条件の反応条件の最適化が不十分で、生成物の化学収率は満足の行くものではないが、直裁的アルドール反応として初めての3成分連結型アルドール反応として意義深い。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究はおおむね順調に進展しているので、この路線でこれからも研究を進める予定である。BINAPO骨格に置換基を導入してその活性や選択性を調整しようという試みは、リンに結合する炭素に隣接する3,3'位への修飾が長らく試みられてきたが、その合成の困難さから、これまでうまく進展していなかった。ところが最近、BINAPOの類縁体であるBINAPの場合、4,4'位への修飾が効果を表すことがあることが報告されたため、申請者らも類似の検討を行ったところ、BINAPOにおいても、4,4'位への修飾が効果的であることを見出した。4,4'位への置換基導入による化学修飾という、新たなホスフィンオキシド触媒開発の糸口が掴めたので、今後も、様々な置換基を導入してその触媒活性を調べてみたい。導入する置換基の立体的大きさを調整することで、リン上のフェニル基の反応部位への張り出しを調節し、エナンチオ選択性向上を目指す。また、置換基の電子的要因を変化させることにより、反応性を調節して化学収率の向上を目指す。特に電子的要因の変化により、新反応の開発が期待できる。現に、本研究期間に、従来の反応の選択性を向上させたり、新たな反応を開発することができており、今後も多くの発展が期待される。また、これらの新反応を、生物活性物質の短段階合成に応用し、その有用性をアピールしたい。現段階では、これといった問題点を見出すことはできないが、万一、触媒の4,4'位への修飾に限界を見出した時は、リン上のフェニル基の修飾に立ち戻り、検討を続けたい。
パーリ語註釈文献綱要sarasangahaのデータベース構築と思想的研究

本研究は、パーリ仏教教義集成Sarasangaha(以下<Ss>)のデータベース構築とその思想的研究についての昨年度からの継続研究である。本年度は、研究代表者と研究分担者(柏原)以外に、山本和彦(大谷大学特別研究員)、茨田通俊(東方研究会専任研究員)両名の協力を得て、次のような研究成果を得た。1)昨年度作成された<Ss>のデータベースを再点検して、完全なテキスト・データベースとして、完成した。2)上記データベースを基にして、パーリ語による一語索引を作成し、索引・データベースを構築した。3)パーリ語によるデータベース構築の方法とその問題点について、口頭及び論文で研究発表した(分担者:柏原)。4)<Ss>校訂出版の意義、著者と成立地・年代及び思想的特質、さらに、上記索引・データベースにより、<Ss>における他のテキストからの出典一覧を作成し、論文として発表した(代表者:吉元)。5)上記出典一覧を分析し、出典の特質とその思想的背景について、口頭及び論文として研究発表した(代表者:吉元)。<Ss>のテキスト・データベースの公開については、版権所有者英国PTS協会の許可が困難であるとのことで、その索引公開についてのみの許可を求めたところ、少数で、販売しないという条件付きで許可されたので、上記成果論文以外に索引・データベースを報告する。ただし、これを印刷すると膨大な紙数になるので、フロッピ-ディスクのテキストデータとして添付する。13世紀頃、セイロンのBuddhapiya長老によって執筆されたS〓rasa〓gaha(以下SS.)は、紀元前2世紀から紀元後5世紀頃にかけて成立した膨大なパーリ語註釈文献(Atthakath〓及びT〓k〓)の中から、仏教学の重要な教義・トピックに応じて引用・編集した綱要書である。したがって、SS.にはパーリ語註釈文献における重要な教義・思想・語〓等が集約されている。この度、久しく嘱望されていたSS.の校訂出版が佐々木現順博士によって完成され、英国のPTS協会よりようやく出版された。代表者は、当初よりパソコンを活用して上記の校訂作業に携わってきたので、その作業の資産を最大限活用して、分担者・協力者の協力の下に本研究を行うことになった。1.SS.のワープロ・ファイルをテキスト・ファイルに変換して、索引作成用にデータベース化を行った。2.イメージスキャナを使用して、関連パーリ語文献のデータを読み込み、それをテキスト・ファイル化しつつある(イメージ・データのテキスト・ファイル化には様々な問題があり、作業は次年度に継続される。)3.本年度は、上記1.のデータベースを活用して、SS.所引文献一覧を完成し、そのデータを分析検討中である。この資料は次年度に「大谷学報」に発表し、その分析結果は、日本印度学仏教学会において報告する予定である。本研究は、パーリ仏教教義集成Sarasangaha(以下〈Ss〉)のデータベース構築とその思想的研究についての昨年度からの継続研究である。1)昨年度作成された〈Ss〉のデータベースを再点検して、完全なテキスト・データベースとして、完成した。4)〈Ss〉校訂出版の意義、著者と成立地・年代及び思想的特質、さらに、上記索引・データベースにより、〈Ss〉における他のテキストからの出典一覧を作成し、論文として発表した(代表者:吉元)。

〈Ss〉のテキスト・データベースの公開については、版権所有者英国PTS協会の許可が困難であるとのことで、その索引公開にいてのみの許可を求めたところ、少数で、販売しないという条件付きで許可されたので、上記成果論文以外に索引・データベースを報告する。ただし、これを印刷すると膨大な紙数になるので、フロッピ-ディスクのテキストデータとして添付する。
新たなヒト多能性幹細胞(iMuse細胞)の人工的作成

癌化のない新しい自己由来多能性幹細胞を誘導・作成(iMuse細胞)。この細胞はiPS細胞(induced pluripotent stem cells ;人工的誘導型万能細胞)とは異なる。最近ヒトの皮膚や骨髄の組織中に含まれる新しい「多能性幹細胞(Muse細胞)」が発見され、多分化能を持つが癌原性(癌化の危険性)が極めて低く、天然型の観点から再生医学に優れた可能性を秘めるものとして注目される。しかしこのMuse細胞は増幅困難であり、再生医療に必要な細胞数を確保する上でそのままでは使用できない。従って増幅技術の開発が必須であり、本申請では、このMuse細胞をゲノムに優しい特殊な方法で誘導し(iMuse [induced-Muse]細胞)、将来の臨床応用に向けて基盤を構築した。この細胞はiPS細胞(induced pluripotent stem cells;人工的誘導型万能細胞)とは異なる。本年度は正常の体性幹細胞の研究から派生したSSEA3陽性細胞を用いて、その特徴を明らかにした。(1)大腸癌細胞株数例を用いて、SSEA3養成及び陽性癌細胞の文画に分けた。SSEA3の文画は複数の細胞株において、細胞周期及び、免疫ぶぜんマウスを用いた移植実験において、癌の悪性度と相関する結果が得られた。(2)SSEA3陽性細胞は、癌細胞及び、SSEA3細胞の両者において、細胞周期の点から、共通点が見出された、創薬の標的になると考えられる。(3)独創性:iPS細胞とは相違する新しい方法で誘導(特許出願済)。新規性:癌化のない幹細胞の作成例は皆無。有用性:自己組織(末梢血等)から誘導可能となり、免疫・倫理・感染の諸問題に加えて、癌化の問題を解決。先進性:理想的な再生医療の具現化に向けて基盤構築。正常の体性幹細胞の研究から派生したSSEA3陽性細胞としての特徴を指標に、大腸癌細胞を探索した。その結果、DLD、HCT等複数の大腸癌細胞株において、SSEA3の存在が認められた。細胞周期解析及び免疫不全マウスを用いた移植実験により、SSEA3陽性癌細胞の癌幹細胞としての潜在的増殖能は高いことが明らかとなった。現在中和抗体や各種阻害剤での実験を継続しており次年度に向けて展開中である。独創性:iPS細胞とは相違する新しい方法で誘導(特許出願済;Nature in revision)。革新的なリプログラミングにおいて要となる体性幹細胞(Muse)及び癌細胞の研究に発展し、効率的な細胞の分化誘導方法のための画期的な制御方法の開発に成功しつつある。【再生医学への応用】iMuse細胞シートで欠損組織を補填する基礎実験を実施。【非癌原性の詳細な検討】試験管内および動物実験を実施。

各細胞(iMuse, Muse, ES, iPS, miPS)を免疫不全マウスを使用し、iMuseやMuseでは癌原性の無い事を確認。作製された細胞のゲノムを次世代シークエンサーにて、遺伝子転写を網羅的発現解析にて検討し、再生医学ツールとして非癌原性が担保されている事を解析する。【技術の発展】他の細胞ルールへ技術の発展を図る。ゲノムを守りながらiMuse細胞を誘導することに焦点を当てるので、この技術を他の幹細胞(肝臓、膵臓等の体性組織幹細胞)の誘導に応用する。他の細胞ルールへ技術の発展を図る。
脂質二分子膜でのドラッグの分配と会合のMDとNMRによる研究

脂質二分子膜へのドラッグ・機能性分子の結合様式は、薬理作用や麻酔作用を理解するための必須の情報である。本研究では、理論的手法(大規模分子動力学シミュレーションとエネルギー表示溶液理論)を主とし、実験的手法(NMR-NOE法)を相補的に用いることで、官能基を系統的に変えた小分子から麻酔剤や20残基程度の膜貫通タンパク質までの、結合量・結合配置・大域的運動様式を、全原子レベルで解析した。膜貫通タンパク質の脂質膜結合の自由エネルギー解析を行った。膜貫通タンパク質として、glycophorin Aの膜貫通ドメインを検討した。23残基からなり、ヘリックスを形成することが知られている。膜貫通型の配置(垂直配置)と、タンパク質が膜に埋め込まれた配置(水平配置)の2つを比較検討した。水平配置では、水との直接接触はほとんどない。タンパク質の溶媒和自由エネルギーの計算には、エネルギー表示法を用いた。ここでの溶媒和とは、タンパク質の真空から膜内の上記2つの配置への移行である。溶媒和自由エネルギー計算において、溶媒種と扱われるのはDMPCと水、溶質はタンパク質そのものである。溶媒和自由エネルギーは、垂直配置で-133kcal/mol、水平配置で-113kcal/molであった。実験に符合して、垂直配置がより安定であることが分かる。自由エネルギー値を、DMPCからの寄与と水からの寄与に分割した。垂直配置ではDMPCと水からの寄与は、それぞれ、-76と-57kcal//mol、水平配置では、それぞれ、-85と-28kcal//molであった。脂質からの寄与は、水平配置でより安定である。疎水効果は、タンパク質が膜に埋め込まれた時の方が、強く効いている。水平配置でも、水からの寄与は無視できない。膜内部は、疎水環境であり、タンパク質に接触する水分子は事実上存在しない。10A以上離れた水分子との静電相互作用によるものである。分子間の水素結合は、垂直配置の方が、水平配置より圧倒的に多い。トータルで垂直配置が有利となっているのは、水の効果である。生体膜のような不均一系における分子結合とダイナミクスを原子レベルで議論するには、溶液NMR法やMD計算が強力である。これらの相補的な組み合わせで、静的な情報と動的な情報の分離が可能となる。本年度は、異なる曲率の生体モデル膜に対し、核オーバーハウザー効果(NOE)を測定した。さらに、大規模MD計算をミセルおよび平面二分子膜に対して行い、NOE実験の結果と組み合わせて、モデル膜の構造・ダイナミクスについて議論した。dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)二分子膜(直径30-800 nm)、1-palmitoyllysophosphatidylcholine (PaLPC)ミセル(直径5 nm)の2種の系に対し、親水基末端のPCγを選択的に照射するtransient NOE測定(最近、我々が開発)を行った。NOE強度は核間距離rの6乗に反比例し、相関プロトン対の回転相関時間τcに比例する。また、PaLPCミセルとDPPC平面膜の20 nsのMD計算を行った。NOE実験において、直径800 nmにおいても分子の末端同士であるPCγとPC16との大きなNOEが観測された。このNOEの起源を明らかにするため、PCγおよびPC16について、PCγとの距離rおよび回転時間相関関数をMD計算により求めた。NOE観測強度を組み合わせることにより、各τ_cを見積もった結果、曲率が小さくなるほどτ_cのサイト依存性が大きく、NOEは主にτ_cにより決定することが分かった。また、コレステロールを含む系では、コレステロールが脂質のゆらぎに及ぼす影響は、膜の曲率によって異なることを見出した。溶液NMR法およびMD計算は,膜中の小分子の位置やダイナミクスの原子レベル解析に適した手法である。本年度は,異なる極性の小分子を含む生体モデル膜について核オーバーハウザー効果(NOE)測定とMD計算を行った。これらを相補的に組み合わせることにより,脂質膜中における小分子の位置やダイナミクスを議論した。昨年度と同様に、リン脂質はDMPCを、小分子として,疎水性である1-methylnaphthaleneおよび親水基をもつ1-naphtholを用いた。NOE測定には,直径の大きい膜のブロードなプロトンシグナルを減衰させるtransient NOE-SE法を用いた。これによって、溶液状態の数百nm直径のLUV中における疎水性小分子の幅広い分布の直接観測に成功した。NOE測定によって、親水基末端照射と疎水基末端照射の場合の、1-naphtholおよび1-methylnaphthaleneの各プロトンサイトの緩和速度定数値を決定し、疎水性小分子がリン脂質親水部とも近接するという結果を得た.これは、以前のMD研究による指摘と一致した。これらのナフタレン誘導体の膜結合モードのより詳細な解析を行うため、MDシミュレーションを相補的に組み合わせ、NOE緩和速度定数に対する距離と相関時間の寄与を分割した。

親水基をもつ1-naphtholは、親水基をもたない1-methylnaphthaleneよりも膜中の運動が遅く、そのOH基をリン脂質の親水基側に向ける弱い配向性をもつことが明らかになった。一方で、親水基をもたない1-methylnaphthaleneの配向性については、本研究から明らかな結論は下せなかった。脂質同士のNOEとは異なり、NOE緩和速度定数は距離情報を主に反映することが分かった。つまり、小分子の運動のタイムスケールは、リン脂質の運動に比べてサイト依存性が弱く、均一である。タンパク質のフリップーフロップ運動に関連した膜内配置をいくつか用意し、全原子型のシミュレーションを行って、それぞれの配置における自由エネルギーを計算した。フリップーフロップ運動に関して、2つの経路を考えた。一つは膜内にタンパク質全体が埋まる経路であり、もう一つはタンパク質がいったん膜外に出る経路である。1次元配列がTLIIFGVMAGVIGTILLIである膜貫通ペプチドのDMPC膜への結合自由エネルギーを計算対象とした。自由エネルギー計算は、全原子分子動力学シミュレーションとエネルギー表示法によって遂行した。その結果、膜内経路の方が自由エネルギー障壁の低いことが明らかになった。自由エネルギーをDMPCからの寄与と水からの寄与に分割し、水の役割について論じた.次いで、添加物の無い二種の脂質混合系について、ディスク状バイセルやひも状ミセルが形成する領域を、NMRを用いて探索した。混合比(=[長鎖脂質]/[短鎖脂質])が2程度の系では、広い温度範囲にわたって、また、混合比3程度の系では室温で、球状の混合ミセルや等方的回転を行う小バイセルの形成を示した。1Hおよび31Pシグナルがシャープであり、NOE交差緩和速度定数が、直径約3050 nmの球状LUVと同程度の大きさであることによる。混合比が3程度で温度を上げると、1Hスペクトルは非常にブロードになり、31Pシグナルが2本にスプリットした。磁場配向性の大バイセルの形成を示す。さらに数十度C以上では、1Hおよび31Pシグナルがシャープになり、NOE交差緩和速度定数から、集合体の曲率がLUVよりも高いことが観測された。混合脂質の集合体の曲率がLUVよりも高いことを示す。ひも状ミセルの形成を支持する結果である。球状ベシクル系の曲率依存性の知見を元に、研究例の少ない脂質混合系の形状についての基礎的な知見が得られた。transient NOE-SE法は、前年度までに開発した手法である。直径の大きい膜のブロードなプロトンシグナルを減衰させることで、これまで定量的なデータを得ることが難しかった平面膜系のNOEシグナルを得ることができる。この手法を、低分子と脂質膜の相互作用解析に適用することは、当初の予定通りである。シグナルが弱いために、多くの積算時間が必要とされたが、概ね当初のスケジュールに沿って、実験が進行した.さらに、実験結果とMDシミュレーションを相補的に組合せることで、曖昧さのない分子レベル情報を取得することは、本研究の主題の一つである。
肝細胞死亢進マウスを用いた非アルコール性脂肪性肝炎のバイオマーカーと治療法の開発

非アルコール性脂肪性肝疾患は、飲酒量が少ないにも関わらず肝臓に脂肪が蓄積する疾患であり、世界的に増加傾向にある。患者の一部は慢性炎症により肝細胞の細胞死と線維化が進行した非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を発症し、やがて肝硬変や肝がんに至るが、その発症メカニズムは不明な点が多い。またNASHの確定診断に用いられる肝生検は侵襲性が高いことから、血液などを用いたより侵襲性の低い診断法が求められている。一方でNASHにおける肝細胞の喪失を代償するために、肝前駆細胞もしくは肝細胞自身が増殖することが知られている。この視点に基づいて我々は、NASH肝における細胞増殖の誘導機構および関与する増殖因子を解明することにより、NASHの新たな診断法および治療戦略の開発を目指している。細胞死阻害タンパク質であるcFLIPを肝細胞特異的に発現低下させたマウスは、様々な肝障害に対する感受性が亢進しており、各種肝疾患の病態モデルとして有用である。我々はこのマウスに対して、実験的NASH誘導モデルであるコリン欠乏エチオニン添加食を4週間投与したところ、対照マウスと比較して肝細胞死の亢進と血清ALTの上昇、さらに慢性肝障害に伴い出現する肝前駆細胞の著明な増加や肝線維化の亢進など、NASHの増悪が認められた。我々はこのモデルを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行い、NASH増悪肝で発現が上昇する増殖因子を複数同定した。現在はこのうち線維芽細胞増殖因子ファミリーに属するFGF18に着目して、NASH増悪肝における機能解析を行っている。さらに我々は、NASH増悪マウスのみならずヒトNASH患者においても血清中のFGF18濃度が上昇することを見出しており、FGF18はNASHの診断に利用できる新規血清バイオマーカーとしても有用であることが示された。FGF18を全身で欠損したマウスは胎生致死となることが報告されていたため、成体肝におけるFGF18の機能解析には組織特異的欠損マウスの作成が必要であった。我々はin situハイブリダイゼーションおよび免疫組織染色によって、NASH増悪肝におけるFGF18産生細胞が肝細胞であることを同定した。そこで我々は肝細胞特異的FGF18欠損マウスおよび肝細胞特異的cFLIP/FGF18二重欠損マウスを作成して、コリン欠乏エチオニン添加食を投与し詳細な解析を行っている。またFGF18を肝細胞特異的に過剰発現するマウスも作成中である。また東邦大学医療センター大森病院消化器センター内科と共同で臨床研究に着手し、健常者ボランティア・単純脂肪肝患者・NASH患者の血清ELISA解析を行った。その結果、FGF18はNASH患者血清において高値を示し、既存の血清バイオマーカーであるサイトケラチン18切断断片よりも優れているという有望な結果を得ることができた(特許出願中)。さらにヒト肝臓組織におけるFGF18の免疫染色を行ったところ、正常肝ではほとんど発現が見られず、脂肪性肝疾患患者および肝硬変患者の肝細胞において発現が上昇することを見出した。したがって我々がマウスにおいて見出したNASH増悪肝におけるFGF18の発現上昇は、ヒトNASH患者においても起こる普遍的な現象であることが明らかになった。マウス実験においては、肝細胞特異的FGF18欠損マウス、肝細胞特異的cFLIP/FGF18二重欠損マウスおよび肝細胞特異的FGF18過剰発現マウスを用いて解析を進め、NASHの病態形成におけるFGF18の機能的役割を解明する。さらにFGF18組換えタンパク質をマウスに投与することでNASHの増悪を抑制できるかどうかを検討し、NASH治療薬としてのFGF18の可能性を探る。なお肝細胞特異的cFLIP/FGF18二重欠損マウスを用いた予備的な解析から、肝細胞でFGF18を欠損させても血清FGF18濃度はあまり低下しないことが判明した。したがって血清FGF18は肝臓以外の他臓器からも由来する可能性が示唆された。実際に我々は、各種肝障害の際にFGF18の発現が上昇する他の臓器を見出している。これは肝障害を他の臓器が感知して応答する「臓器間連関システム」の存在を示唆するものであり、現在検討を進めている。また我々は、ヒト肝がん由来細胞HepG2においてFGF18の発現を一過的に誘導する薬物を2種類同定している。今後はこれらの薬物を用いて、ヒト培養細胞およびマウス単離肝実質細胞におけるFGF18の発現誘導機構をin vitroで解明するとともに、NASH肝におけるin vivoでの発現誘導との関連を明らかにする。臨床研究においては、さらに症例数を増やして解析を進め、非アルコール性脂肪性肝疾患の鑑別診断に利用できる新規血清バイオマーカーとしてのFGF18の有用性を検証し実用化を目指す。

この視点に基づいて我々は、NASH肝における細胞増殖の誘導機構および関与する増殖因子を解明することにより、NASHの新たな診断法および治療戦略の開発を目指している。細胞死阻害タンパク質であるcFLIPを肝細胞特異的に発現低下させたマウスは、様々な肝障害に対する感受性が亢進しており、各種肝疾患の病態モデルとして有用である。我々はこのマウスに対して、実験的NASH誘導モデルであるコリン欠乏エチオニン添加食を4週間投与したところ、対照マウスと比較して肝細胞死の亢進と血清ALTの上昇、さらに慢性肝障害に伴い出現する肝前駆細胞の著明な増加や肝線維化の亢進など、NASHの増悪が認められた。我々はこのモデルを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行い、NASH増悪肝で発現が上昇する増殖因子を複数同定した。現在はこのうち線維芽細胞増殖因子ファミリーに属するFGF18に着目して、NASH増悪肝における機能解析を行っている。さらに我々は、NASH増悪マウスのみならずヒトNASH患者においても血清中のFGF18濃度が上昇することを見出しており、FGF18はNASHの診断に利用できる新規血清バイオマーカーとしても有用であることが示された。FGF18を全身で欠損したマウスは胎生致死となることが報告されていたため、成体肝におけるFGF18の機能解析には組織特異的欠損マウスの作成が必要であった。我々はin situハイブリダイゼーションおよび免疫組織染色によって、NASH増悪肝におけるFGF18産生細胞が肝細胞であることを同定した。そこで我々は肝細胞特異的FGF18欠損マウスおよび肝細胞特異的cFLIP/FGF18二重欠損マウスを作成して、コリン欠乏エチオニン添加食を投与し詳細な解析を行っている。またFGF18を肝細胞特異的に過剰発現するマウスも作成中である。また東邦大学医療センター大森病院消化器センター内科と共同で臨床研究に着手し、健常者ボランティア・単純脂肪肝患者・NASH患者の血清ELISA解析を行った。その結果、FGF18はNASH患者血清において高値を示し、既存の血清バイオマーカーであるサイトケラチン18切断断片よりも優れているという有望な結果を得ることができた(特許出願中)。さらにヒト肝臓組織におけるFGF18の免疫染色を行ったところ、正常肝ではほとんど発現が見られず、脂肪性肝疾患患者および肝硬変患者の肝細胞において発現が上昇することを見出した。したがって我々がマウスにおいて見出したNASH増悪肝におけるFGF18の発現上昇は、ヒトNASH患者においても起こる普遍的な現象であることが明らかになった。細胞死抑制タンパク質であるcFLIPを肝実質細胞特異的に発現低下させたマウス(肝細胞死亢進マウス)は、通常の飼育環境では正常に生育するが、様々な肝障害に対する感受性が亢進しており、成体における各種肝疾患の病態モデルとして有用である(Piao et al.,Sci. Signal 2012, Piao et al., Hepatology 2017)。マウスに対するコリン欠乏エチオニン添加食(CDE)投与は脂肪肝を誘導することから、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の病態モデルとして広く用いられている。今回研究代表者らは、対照マウスにCDEを4週間投与すると単純脂肪肝(SS)が誘導されるのに対して、肝細胞死亢進マウスにCDEを4週間投与すると非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に類似した病態を示すことを見出した。