hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高濃度N・P含有農業排水の浄化に有用なタバコ属ファイトレメデエーション植物の開発

1.エチレン非感受性タバコ遺伝子組換え体のN・P吸収特性の解析前年度に一次選抜した,高P吸収量特性を示す変異エチレンレセプター遺伝子(mNT-ERS1)導入タバコ(Nicotiana tabacum cv.Ky57)系統(No.14-12,-14)の特性を再評価した。67葉期の幼植物を,550mlの培地(MS培地にPO^<-4>を添加して1mMにしたもの)で連続明条件下8日間水耕栽培し,NO_3-N,NH_4-NとPO_4-の吸収量を測定した。結果:NO_3-N,NH_4-NとPO_4-の吸収量は,対照(Ky57)では17.7±3.4,3.86±0.47,1.51±0.16mg gFW^<-1>,No.14-14系統では20.4±2.8,4.31±0.52,1.57±0.16mg gFW^<-1>で,組換え系統はP・Nの吸収量の上昇傾向は有意な差でなかった。塩ストレス(50,100mM NaCl添加)下におけるP・Nの吸収量にも,Ky57とNo.14-14系統の間で有意な差がなかった。結論:エチレン非感受性形質転換系統から高P・N吸収能を獲得した系統を選抜することはできなかった。2.水耕栽培適性付与遺伝子の水生植物からの検索非常に強い嫌気耐性を示す水生単子葉植物ヒルムシロ(Potamogeton distinctus)の殖芽で,無酸素条件で発現する遺伝子群から嫌気的ストレス耐性付与遺伝子を探索した。3.タバコへの遺伝子導入1)アグロバクテリウムによる,ヒルムシロ由来遺伝子の導入を開始した。2)タバコ培養細胞BY-2への導入を目指し,嫌気耐性の評価法を検討した。3)SAG12::IPT遺伝子を導入した環境ストレス耐性タバコの作出を開始した。1.タバコ属植物のファイトレメデエーション植物(ファイトレメデエーター)としての特性解析栽培タバコ(品種,Ky57)の6葉期の幼植物を1週間水耕栽培して,タバコ植物が根から吸収する窒素量(N)を測定した.水耕栽培液は,NとしてNO_3-NとNH_4-Nを等量ずつ含み,かつ,Total-N濃度が10mM,および50mMの試験液を用いた.さらに共存する高濃度塩類のN吸収に対する影響をみるために,上記のTotal-Nを含む水耕栽培液に0,50,100mM NaClを添加した.以下の点を明らかにした.(1)タバコ植物は,N濃度が高い水耕栽培液から効率よくNを吸収した.50mMTotal-Nの水耕栽培液から吸収されたN量は約0.30.4nmol/g新鮮重量であり,10mMTotal-Nの水耕栽培液から吸収されたN量0.05nmol/g新鮮重量の68倍であった.(2)タバコ植物のN吸収に対する高濃度NaClの抑制効果は小さかった.すなわち,50mMTotal-N水耕栽培液を用いた場合,50または100mMNaClを添加した場合のN吸収量は,それぞれ,およそ0.31,0.23nml/g新鮮重量となり,NaClを添加しない場合(0.35nml/g新鮮重量)の89%,66%であった.これらの結果から,タバコ植物は高濃度塩類を含む農業・畜産排水のファイトレメデエーターとして有効であることを推察した.2.タバコ植物に水耕栽培適性を付与する遺伝子の探索植物に水耕栽培適性を付与する遺伝子のクローニングの準備のため,クローニング材料に用いる水棲植物としてウリカワとヒルムシロを選び,栽培増殖に着手した.1.エチレン非感受性を付与したタバコ遺伝子組換え体のN・P吸収の調査と解析栽培タバコ(Nicotiana tabacum cv.Ky57)に変異エチレンレセプター遺伝子(mNT-ERS1)を導入した組換え体の中から,強いエチレン非感受性を示す5株を選定し,連続通気水耕栽培でのリン酸吸収能を検討した。67葉期の幼植物の場合,4日間で1.0mM PO_4^-を含む培養液から,野生株(Ky57)は1.20±0.20mg gFW^<-1>,変異体No.11-21,No.44-12,No.44-14,No.32-19,No.32-25株では,それぞれ1.40±0.25,2.36±0.39,1.97±0.36,1.37±0.39,1.31±0.38mg gFW^<-1>のPO_4^-を吸収した。その結果,エチレン非感受性変異体より,リン酸吸収能が高い表現型を獲得した,No.44-12,-14株を分離することに成功した。2.タバコ植物に水耕栽培適性を付与する遺伝子の検索(1)ヒルムシロ殖芽で,2つのsucrose synthase(SySy)遺伝子を単離し,その一つの遺伝子の発現上昇が嫌気条件でのエネルギー代謝に深く関わることを明らかにした(第16回日本植物学会東北支部福島大会)。(2)ウリカワ塊茎から,細胞壁成長に関連した4つのexpansin遺伝子と5つのキシログルカン転移酵素遺伝子を単離し,各々一つの遺伝子の発現が嫌気条件で高まることを明らかにした(第67回日本植物学会札幌大会)。

(3)3時間の無酸素処理で特異的に発現する遺伝子群を,ヒルムシロ殖芽からsubtraction法で単離する試みを行い,現在まで19種の遺伝子の部分塩基配列を決定した。解糖系に関わる酵素の遺伝子に加え,液胞膜に存在するinorganic pyrophosphatase遺伝子を同定した(第45回日本植物生理学会年会発表予定)。1.エチレン非感受性タバコ遺伝子組換え体のN・P吸収特性の解析前年度に一次選抜した,高P吸収量特性を示す変異エチレンレセプター遺伝子(mNT-ERS1)導入タバコ(Nicotiana tabacum cv.Ky57)系統(No.14-12,-14)の特性を再評価した。67葉期の幼植物を,550mlの培地(MS培地にPO^<-4>を添加して1mMにしたもの)で連続明条件下8日間水耕栽培し,NO_3-N,NH_4-NとPO_4-の吸収量を測定した。結果:NO_3-N,NH_4-NとPO_4-の吸収量は,対照(Ky57)では17.7±3.4,3.86±0.47,1.51±0.16mg gFW^<-1>,No.14-14系統では20.4±2.8,4.31±0.52,1.57±0.16mg gFW^<-1>で,組換え系統はP・Nの吸収量の上昇傾向は有意な差でなかった。塩ストレス(50,100mM NaCl添加)下におけるP・Nの吸収量にも,Ky57とNo.14-14系統の間で有意な差がなかった。結論:エチレン非感受性形質転換系統から高P・N吸収能を獲得した系統を選抜することはできなかった。2.水耕栽培適性付与遺伝子の水生植物からの検索非常に強い嫌気耐性を示す水生単子葉植物ヒルムシロ(Potamogeton distinctus)の殖芽で,無酸素条件で発現する遺伝子群から嫌気的ストレス耐性付与遺伝子を探索した。3.タバコへの遺伝子導入1)アグロバクテリウムによる,ヒルムシロ由来遺伝子の導入を開始した。2)タバコ培養細胞BY-2への導入を目指し,嫌気耐性の評価法を検討した。3)SAG12::IPT遺伝子を導入した環境ストレス耐性タバコの作出を開始した。
ラドン変換と弾性マッチングによる斜め撮影に頑健な形状認識

被写体の歪みに頑健な物体認識技術について検討する.ラドン変換と非線形マッチング(ダイナミック・タイム・ワーピング)を用いることによって,被写体の回転・拡大縮小・平行移動・せん断に不変な認識方法を提案する.さらに,文書認識において,行から生成される消失点を用いた射影歪みの補正方法についても提案する.消失点検出の障害となりうる線分ノイズをRANSACアルゴリズムによって除去する方法についても提案する.本研究の目的は,ラドン変換と弾性マッチング(動的計画法)とを組み合わせたアフィン変形不変なマッチングにより,傾斜撮影に頑健なパターンマッチング方法を提案することである.平成26年度末までに,被写体の回転,拡大縮小,平行移動,せん断に頑健な方法を,国内学会2件(電子情報通信学会研究会と電子情報通信学会総合大会)で発表した.国内学会で発表することの意義を考慮し,日本語文字認識を対象にした結果について言及した.更に,海外のジャーナル雑誌(Neurocomputing,ELSEVIER)に論文1篇の採録が決定した.現在,掲載される号の決定を待っている状況である.平成26年度の研究実施計画に3つの課題を挙げていたが,検証および発表にまでは至らなかった.射影変形への頑健性を検討に関しては,平行線の被写体を射影変形させながらラドン変換したところ,平行線が射影変形して交差する点(消失点)の位置を算出できることが明らかとなった.この消失点の位置を用いて,射影変形を補正する方法を検討している状況である.また,ハフ変換を用いて消失点を算出する方法が提案されていることを知り,これらの研究との融合,および差別化について検討している.雑音対策については,ラドン変換をフーリエ変換で算出する際に雑音を除去できることを国内学会で発表する予定である.オクルージョン対策に関しては,方法を考案し,数学的に検証している状況である.弾性マッチングの高速化については,音声認識への応用などと異なり,探索範囲が狭く,高速化による効果が小さいと判断し,課題から除外することにした.ラドン変換と弾性マッチング(動的計画法)とを組み合わせたアフィン変形不変なマッチングにより,被写体の回転,拡大縮小,平行移動,せん断に頑健な方法を提案し,この成果を海外のジャーナル雑誌(Neurocomputing,ELSEVIER)に2016年1月発表した(掲載済み).射影歪みについては,ラドン変換を用いて消失点を検出し補正する方法を提案,国内学会3件(映像情報メディア学会冬季大会,電子情報通信学会東京支部研究発表会,電子情報通信学会総合大会)で発表した.なお,現在,国際会議2件(ECCV:European Conference on Computer Vision,ICPR2016:International Conference on Pattern Recognition)に投稿中であり,結果待ちの状況である.フランスとの研究交流(S.タボーン教授)については,国際会議論文の執筆にあたり,電子メールやテレビ電話を用いて毎週打ち合わせをしている状況である.研究計画における1射影変換への頑健性検討,4アルゴリズムとアフィン行列との関係明確化についての検討が進み,現在,国際会議,閣内会議での発表を進めている段階にある.5ローカルディスクリプタ化については,射影歪みの補正を全文字で実施した方が良い判断となり.必要に応じて検討することにした.なお,2雑音・オクルージョン対策については検討継続,3弾性マッチングの高速化については昨年度の報告通り検討項目から外すことにしている.国際会議など海外での発表に至らなかった.また,研究交流のためにフランスで検討することを計画していたが,テロ等の事件があり,平成28年度に延ばすことにした.従って,上記の通り達成度を「やや遅れている」としている.画像中の線分から消失点を算出し,この消失点を用いて射影補正する方法について検討した.画像中の平行な線分をラドン変換すると,これらの線分は一連の点列となる.ラドン変換結果を二値化し,パディングによってドメインの拡大後,逆ラドン変換することにより消失点が検出できる.消失点と射影変換を用いて射影補正する方法を提案した.この成果は国際会議ICPR2016(メキシコ・カンクン)で発表した.雑音対策については,消失点を構成しない線分を雑音と位置づけ,RANSACアルゴリズムを用いて除去するアルゴリズムについて数種類提案した.この成果は国内学会(研究会1件,全国大会3件)で発表した.また,現在,国際会議ICDAR(京都)に原稿を投稿し,採録結果待ちの状況である.ローカル・デスクリプタ化,実証実験については検討しているものの,成果発表にまでは至らなかった.今後,科研費の成果として,国内外の学会,ジャーナル論文で発表する予定である.数学的な考察については成果が得られていないが,今後も継続して検討する.被写体の歪みに頑健な物体認識技術について検討する.ラドン変換と非線形マッチング(ダイナミック・タイム・ワーピング)を用いることによって,被写体の回転・拡大縮小・平行移動・せん断に不変な認識方法を提案する.さらに,文書認識において,行から生成される消失点を用いた射影歪みの補正方法についても提案する.消失点検出の障害となりうる線分ノイズをRANSACアルゴリズムによって除去する方法についても提案する.被写体の回転,拡大縮小,平行移動,せん断に頑健な方法については,今年度,国内の学会発表2件,海外ジャーナル1編の採録決定にまで達成した.しかし,平成26年度研究実施計画の課題に関する発表ができなかった.射影変換に頑健な方法については,構想段階に留まっており,更なる検討の必要がある.従って,上記の通り達成度を「やや遅れている」とした.平成28年度が最終年度である.

この2年間で得られた研究成果を発表することに重点を置き,検討が遅れている項目について再検討する.研究計画における6ビックデータによる実証実験については,紙に印刷された日本語文字を斜めから撮影し,その文字列を認識する実験に着手する.研究分担者,および,国内外の研究協力者との連携を密にして解析を進める.情報工学平成26年度研究実施計画で達成できなかった2つの課題を優先させる.射影変換に頑健な方法の検討に関しては,ラドン変換で算出可能な消失点の位置を活用して提案する計画である.国内外の学会で発表する.また,雑音除去・オクルージョン対策については,再度,検証し,国内の学会で発表する予定である.平成27年度の研究実施計画では2つの課題(アルゴリズムとアフィン行列との関係明確化,ローカルディスクリプタ化)がある.研究分担者,および,国内外の研究協力者との連携を密にして解析を進める.フランス在住の研究協力者との連携のために渡仏する予定であったが,テロ等の情勢不安で実現しなかったことと,国際会議による海外発表が実現できなかったことが主な理由である.また,国内学会の発表,研究打ち合わせの回数も少なかったために旅費の使用が少なかった.フランス在住の研究協力者との連携のために渡仏する予定であったが,それが実現できなかったことと,国際会議による海外発表が実現できなかったことが主な理由である.また,国内学会の発表,研究打ち合わせの回数も少なかったために旅費の使用が少なかった.平成28年度は,国際会議発表を計画しているために,旅費の支出が多くなる.これまで使用できなかった旅費を充当する.また,フランス在住の研究協力者との連携のために渡仏する予定である.平成27年度は,平成26年度の成果発表も含まれるために,旅費の支出が多くなる.平成26年度で使用できなかった旅費を充当する.また,フランス在住の研究協力者との連携のために渡仏する予定である.
CAD/CAM硬質レジン大臼歯クラウンの臨床応用に向けた長期安定性評価

これまでの研究で、CAD/CAM硬質レジンクラウンは、サーマルサイクリングによって影響を受け、クラウン脱離力が低下するというデータを得ている。そこで、平成30年度の研究では、サーマルサイクリングによるクラウン脱離力低下のメカニズムを調べるために、クラウン材料、セメント材料および支台歯材料を用いたせん断応力試験、熱膨張係数測定、弾性率測定、を行った。クラウン材料としてはセラスマート(GC社製CAD/CAM用硬質レジン)とGN-セラム(GC社製CAD/CAM用ガラスセラミック)を用い、セメント材料としてはパナビア(クラレノリタケ社製レジンセメント)を用い、支台歯材料としてはユニフィルコア(GC社製支台築造用レジン)を用いた。せん断試験の結果、各材料に対するパナビアの接着強度は、ユニフィルコア>セラスマート>GN-セラムの順であった。熱膨張係数は、セラスマート:33.4E-6/K、GN-セラム:12.4E-6/K、パナビア:37.9E-6/K、ユニフィルコア:29.8E-6/Kであった。また、ナノインデンテーション法で測定した弾性率は、セラスマート:8.9GPa、GN-セラム:57.5GPa、パナビア:10.5GPa、ユニフィルコア:13.1GPaであった。これらの結果より、レジンセメントはCAD/CAM硬質レジンクラウンに対して十分な接着を示すが、サーマルサイクリングの過程で接着界面が影響を受けてクラウン脱離に至ることが分かった。その原因としては、レジンクラウンでは、ガラスセラミッククラウンに比べて熱による影響で生じる微小変形が大きいため接着界面に発生する応力が増大することが示唆された。平成28年度の研究では、当初の計画通り大臼歯クラウンの材料としてCAD/CAM硬質レジンを使用することを想定し、先行研究の文献値より口腔内で5年間機能した状態に相当するサーマルサイクリング試験(5ー55°を5万回)と繰り返し荷重試験(50 MPa,120万回)を実施した。試験試料としては、Lava Ultimate(CAD/CAM硬質レジン)とIPS e.max press(二ケイ酸リチウムガラスセラミック)の棒状試料(各群n=20)を用いた。両方の材料ともサーマルサイクリング、繰り返し荷重、およびそれらの組み合わせによる疲労で10%程度曲げ強度が低下することが分かった。次に、支台歯模型をLava Ultimateで、クラウンをLava UltimateとIPS e.maxを用いて作製し、クラウン強度試験を行った。各クラウンを支台歯模型にレジンセメントで合着した(各群n=6)。その後、上記の試験と同様にサーマルサイクリングおよび繰り返し荷重試験を実施した。疲労試験においていずれのクラウンでも破折やクラックは認められなかったため、すべての試料をクラウン強度試験に用いた。結果として、疲労試験を行った群では、最終的にクラウンが破折する前にクラック(亀裂)が生じる頻度が高いことが分かった。疲労試験の影響は、IPS e.maxクラウンで顕著に認められたが、Lava Ultimateクラウンでは影響は限定的であった。従って、CAD/CAM硬質レジンクラウンを大臼歯部で用いることは、疲労およびそれに関連した強度の観点からは問題はないことが示唆された。当初予定していた棒状試料を用いた実験および平成29年度に予定してたクラウン試料を用いた実験を実施することができた。これまでの研究で、サーマルサイクリングや繰り返し荷重がCAD/CAM硬質レジンクラウンの強度低下に及ぼす効果は限定的であることが示唆されている。また、対照群として用いた二ケイ酸リチウムガラスセラミッククラウンと同程度の耐疲労性を有していることから、強度の観点からは臨床使用に問題ないことが示唆された。そこで、平成29年度の研究では、サーマルサイクリングや繰り返し荷重がCAD/CAM硬質レジンクラウンの脱離に及ぼす影響を調べた。支台築造に用いられるコンポジットレジン(ユニフィルコア)を用いて支台歯模型を作製した。この支台歯模型を歯科用光学スキャナーを用いてスキャンし、歯科用CAD/CAMを用いて硬質レジンクラウン(Cerasmart)を作製した。レジンセメント(Panavia F2.0)を用いてクラウンを支台歯模型に合着し、サーマルサイクリング(5-55°Cを5万回)および繰り返し荷重試験(200 Nで120万回)を行った。疲労試験後に、クラウン引き抜き試験を行い、脱離力を評価した。対照群としては、CAD/CAMガラスセラミッククラウン(GN-Ceram)を用いた。その結果、CAD/CAM硬質レジンクラウンでは、サーマルサイクリングおよび繰り返し荷重によって、クラウン脱離力が有意に低下することが分かった。特にサーマルサイクリング中に10試料中7試料でクラウンの脱離が認められれた。対照群のCAD/CAMガラスセラミッククラウンでも、サーマルサイクリングによるクラウン脱離力の低下が認められたが、CAD/CAM硬質レジンクラウンのクラウン脱離力の方がより疲労試験によって影響を受けることが分かった。当初予定していたCAD/CAM硬質レジンクラウンのクラウン脱離に関する研究を実施し、結果を得た。しかし、支台歯形態がCAD/CAM硬質レジンクラウンの脱離力に及ぼす影響の検討は完了しておらず、継続して実施することとなった。

そこで、平成30年度の研究では、サーマルサイクリングによるクラウン脱離力低下のメカニズムを調べるために、クラウン材料、セメント材料および支台歯材料を用いたせん断応力試験、熱膨張係数測定、弾性率測定、を行った。クラウン材料としてはセラスマート(GC社製CAD/CAM用硬質レジン)とGN-セラム(GC社製CAD/CAM用ガラスセラミック)を用い、セメント材料としてはパナビア(クラレノリタケ社製レジンセメント)を用い、支台歯材料としてはユニフィルコア(GC社製支台築造用レジン)を用いた。せん断試験の結果、各材料に対するパナビアの接着強度は、ユニフィルコア>セラスマート>GN-セラムの順であった。熱膨張係数は、セラスマート:33.4E-6/K、GN-セラム:12.4E-6/K、パナビア:37.9E-6/K、ユニフィルコア:29.8E-6/Kであった。また、ナノインデンテーション法で測定した弾性率は、セラスマート:8.9GPa、GN-セラム:57.5GPa、パナビア:10.5GPa、ユニフィルコア:13.1GPaであった。これらの結果より、レジンセメントはCAD/CAM硬質レジンクラウンに対して十分な接着を示すが、サーマルサイクリングの過程で接着界面が影響を受けてクラウン脱離に至ることが分かった。その原因としては、レジンクラウンでは、ガラスセラミッククラウンに比べて熱による影響で生じる微小変形が大きいため接着界面に発生する応力が増大することが示唆された。平成29年度は、当初の計画に従ってCAD/CAM硬質レジンクラウンの色調安定性および摩耗試験を実施する。支台歯形態がCAD/CAM硬質レジンクラウンの脱離力に及ぼす影響に関する研究を引き続き行う。すでに支台歯のシャンファー幅、軸面高さ、テーパーが異なる支台歯のCADデータを作製し、4つのタイプの支台歯模型の試作まで終えている。この試作支台歯とCAD/CAM硬質レジンクラウンを用いた予備実験を行い、実験系の検証を行う。予備試験でクラウン引き抜き試験に関する問題が認められた場合には、試験治具の改良を行って対応する。予備試験終了後に、支台歯模型およびCAD/CAM硬質レジンクラウンを1群当たり10個ずつ作製して本試験を実施する。また、当初の研究計画に則って、CAD/CAM硬質レジンに対する細菌付着様相の解析を実施する。実験に使用する菌種は、当初計画していたStreptococcus mutansに加えて、デンタルプラークを構成する細菌の中でも初期定着菌として知られるS. mitis, S. salivarius, S. oralisも用いることで、より臨床に関連したデータを得る計画である。平成28年度の実験では、当初の計画よりも実験群(使用する材料の種類)を限定することとした。そのため、それらの実験に係る費用を使用しないこととなった。(理由)平成29年度の実験では、支台歯形態がCAD/CAM硬質レジンクラウンの脱離力に及ぼす影響に関する研究を完了することができなかった。(使用計画)
皮質アクチンに捕捉された分泌顆粒の開口放出機序

刺激に応じて生理活性物質を放出する調節性分泌経路において、分泌小胞膜の細胞内輸送を制御している単量体GTPase Rab27のエフェクター・タンパク質の一つMelanophilinは、皮膚色素細胞内のメラノソームの皮膚角化細胞での転送を制御していることが知られているが、他の細胞における役割は知られていない。本研究では、Melanophilinをコードする遺伝子が変異しているleadenマウスで、耐糖能が低下し、単離膵島におけるグルコース依存性インスリン分泌能が減弱していることを明らかにした。また、Melanophilinは、膵β細胞に発現し、インスリン顆粒膜に局在していた。インスリン顆粒の開口放出を全反射顕微鏡で直接観察すると、leadenマウス膵β細胞では、刺激前に細胞膜近傍に局在していなかった顆粒からの開口放出頻度が、野生型膵β細胞に比べて、特異的に減弱していた。膵β細胞内で、Melanophilinは、膵β細胞内で、Rab27a、Myosn-Vaの他に膜融合装置SNAREに結合しており、そのいずれかの結合を失わせたMelanophilin変異体は、野生型と異なり、leadenマウス膵β細胞におけるインスリン分泌能低下を回復させないことかった。以上のことから、Melanophilinがこれら分子との複合体形成を介して、分泌顆粒が安定的な細胞膜ドッキングを介さずに膜融合を起こす機構を仲介している可能性が示唆された。これまで分泌小胞膜の細胞膜ドッキングに関わる分子はいくつか報告されてきたがが、あらかじめ細胞膜にドッキングしていない分泌小胞の開口放出に関する分子基盤はほとんどわかっていなかった。本研究によって、その分子基盤の一端が明らかになったと考えられる。データの蓄積が順調に進んでおり、次年度中に論文投稿できる予定である。Melanophilinとインスリン顆粒を二重蛍光標識して、生細胞で全反射顕微鏡を用いて開口放出現象を観察するという実験に取り組んでいるが、観察可能なレベルまでに蛍光標識したMelanophilinを高発現させると、本来局在する分泌顆粒膜以外にも局在してしまうことから、Melanophilinタンパク質をより強い蛍光を発するタンパク質と融合させるなどの工夫をする必要がある。(理由)本年度は、ほぼ予定通りに実験計画は進んだが、全反射顕微鏡を用いた生細胞の開口放出観察、共焦点顕微鏡を用いた対照分子の細胞内局在実験などを完結させる必要上、次年度に実際のデータを出すための経費を残した。(使用計画)本年度は、Melanophilinに関する研究は順調に進んだが、論文発表をするためにその完成をまず優先させる。次に、皮質アクチン内で機能するもう一つのRab27エフェクターExophilin-8と、Melanophilinの機能関係を中心に研究を進めたい。次年度は、計画通り、実験データを集積させるために必要な、マウス個体・組織の生理学的解析に必要な試薬、遺伝子関連試薬、生化学・組織化学試薬、細胞培養など、消耗品購入を中心に使用する。情報収集・交換、成果発表のための学会参加費用・旅費にも充てる予定である。
高立体選択的不斉第四級炭素構築とUgi反応.環化を基盤とする生物活性天然物の合成

1)立体選択的第四級炭素構築とウギ反応-環化反応の開発を基に様々な生物活性天然物、フルクチゲニンA、オカラミンM、ベルコフォルチン、N-アセチルアルデエミンなどの不斉全合成を達成した。2)制癌剤多剤耐性獲得阻害作用のアルデエミンの誘導体を合成し、P-糖タンパク阻害活性試験を用い構造活性相関研究を展開した。3) 2連続第四級炭素構築法を開発し、キモナンシン類の基本炭素骨格を構築することができた。1.共通合成中間体ピロロ[2,3-b]インドールの合成光学活性(S)-アリルアルコールから誘導した2-アリルオキシ-3-インドリノンのHorner-Wadsworth-Emmons反応による連続反応で不斉第四級炭素をもつ3,3-ジ置換-2-インドリノンを高立体選択的に得、アルケン構造の変換後、還元的環化反応によりピロロインドールへ誘導した。選択的N-アセチル化後、第2級アミンを酸化し、光学活性ピロロインドールイミンの共通合成中間体を効率よく合成できた。2.ピラジノ[2',1'-5,1]ピロロ[2,3-b]インドール-1,4-ジオン系天然物の合成共通合成中間体イミンをN-Boc-L-ロイシンとp-メトキシフェニル(PMP)イソニトリルとのUgi反応により、付加生成物を得、次に付加体を加熱し、環化させた後、塩基でエピマー化し、天然物furctigenine Aの不斉全合成を達成した。Okaramine Mは、N-Boc-L-トリプトファン、PMPイソニトリルと共通中間体イミンを用い、同様に合成した。Ardeeminの合成は、アントラニル酸イソニトリルとN-Boc-D-アラニンと共通中間体イミンのUgi反応を用い、得られる付加生成物をPOCl_3と加熱することにより環化、エピマー化を順次行ことで、短工程で全合成に成功した。当初の目的を達成するため、平成21年度の計画は順調に進行している。1.ピラジノ[2',1'-5,1]ピロロ[2,3-b]インドール-1,4-ジオン系天然物の合成前年度までに共通合成中間体イミンの合成法を確立し、天然物furctigenine A、ardeemin、okaramine Mの不斉全合成を達成した。このなかで、okaramine Mの提唱立体構造を訂正することができた。同様の立体構造が提唱されるaszonalenin類も合成し、その提唱構造を確認した。すなわち、aszonalenin類は、中間体イミン、N-Boc-アントラニル酸とρ-メトキシフェニルイソニトリルとのUgi反応により得られる付加生成物を加熱環化させて合成した。この他、同様にverrucofortine、verrucofortineの全合成も達成した。2.生物活性評価のための誘導体合成制癌剤多剤耐性獲得阻害作用を有するardeeminの構造活性相関研究に注目し、前年度までに確立したardeeminの合成手法を誘導体に適用し、5つのピラジノ環上で構造変換した誘導体を合成し、現在その阻害活性試験を実施している。3.2連続第四級炭素構築法を用いる天然物の全合成研究Chimonanthine、WIN 64821のラセミ合成を目標に、2-(3,3-ジ置換アリル)-3-インドリノンから2連続第四級炭素を含有する2-インドリノンをジアステレオ選択的に得ることができ、天然物合成の基本となる立体中心を構築した。当初の目的を達成するため、平成22年度の計画も順調に進行している。1.ピラジノ[2',1'-5,1]ピロロ[2,3-b]インドール-1,4-ジオン系天然物の合成前年度までに共通合成中間体イミンの合成法を確立し、天然物furctigenine A、ardeemin、karamineM、verrucofortine、aszonaleninの全合成を達成した。今年度は、この研究の展開として、10員環トリペプチドであるnovofumigatamideの合成を行い、アントラニル酸を含むトリペプチドの環化反応(10員環構築法)を開拓し、天然物の立体異性体であるepi-novofumigatamideまで到達した。2.生物活性評価のための誘導体合成前々年度から制癌剤多剤耐性獲得阻害作用を有するardeeminの構造活性相関研究を進めてきた。今年度、上記で確立したardeeminの合成手法を誘導体合成に適用し、インドール環、ピラジノ環およびアラニン置換基を構造変換した誘導体をいくつか合成し、多剤耐性獲得の原因となる薬物排泄に関わるP-糖タンパク阻害活性試験を実施した。その中で、天然物ardeeminより強くP-糖タンパク阻害活性を示す誘導体を見出すことができた。今後、この結果を拠り所に構造活性相関研究を発展させたい。

3.2連続第四級炭素構築法を用いる天然物の全合成研究前年度まで、chimonanthine、WIN 64821の合成を目標に、2-(3,3-ジ置換アリル)-3-インドリノンのオレフィン化、異性化、Claisen転位の連続反応を行うことで2連続第四級炭素を含有する2-インドリノンのジアステレオ選択的構築法を開拓した。今年度は、この2-インドリノンから天然物への変換反応を種々検討し、chimonanthineの想定合成中間体の構築に必要な炭素鎖を取りそろえることができた。
移動性細胞のアクチン細胞骨格構造による駆動機構に及ぼす力学的因子の影響

交付申請書に記載の通り,本研究では,細胞運動の駆動機構であるアクチン細胞骨格構造および細胞接着斑における力学的因子の定量的評価を行い,細胞運動に及ぼすそれらの影響を明らかにすることを目的とした.本年度の実験内容および主な成果は次のように要約される.1)まず,細胞運動の単純な系として,細胞の葉状仮足部分を分離した細胞フラグメントを作製し,その主な構成要素であるアクチン細胞骨格構造をquantum dot(qdot)を用いて蛍光ラベリングし,可視化した.次に,蛍光スペックル顕微鏡法,および,粒子画像流速測定法を組み合わせて適用することにより,細胞運動に伴うアクチンネットワークの微細な流れ場を定量的に評価した.さらに,流れ場を構成する逆行性流れと順向性流れの時空的ふるまいが,アクチン構造の重合・脱重合過程において支配的であることを示した.2)移動性細胞であるケラトサイトを対象に,細胞の移動機構におけるアクトミオシン収縮が,細胞伸展ダイナミクスに及ぼす影響を検討した.マイクロパターンニング手法を駆使し,細胞接着たんぱく質であるフィブロネクチンのマイクロパターンを基板上に施し,さらに,細胞が接着しにくいPLL-g-PEG(poly-L-lysine-g-poly(ethylene glycol))でコートし,細胞接着領域と非接着領域が混在するマイクロパターンを作成した.さらに,その上にケラトサイトを播き,細胞伸展挙動,および,アクチン骨格構造を観察した結果,接着領域の大きさがアクチン骨格構造の安定性に影響を及ぼし,細胞伸展長さを決定することが明らかとなった.また,隣り合う接着領域の間に存在するギャップ(非接着)の長さの影響を検討した結果,ギャップ長さによって細胞進展率が変化し,ギャップ長さが長くなるに連れ,ギャップを越えて進展する細胞の数が減少することが分かった.細胞接着をコントロールすることにより,細胞運動を制御できることを示唆する重要な結果である.本研究では,細胞運動の駆動機構であるアクチン骨格構造内における力学的因子の役割,および力学的因子・生化学的因子の相互作用を介した細胞運動の制御メカニズムの解明を目的とし,申請書の「年次計画」に記載の通り,本年度は,「アクチン骨格構造の動的安定性への張力の影響」について実験的検討を行った.まず,蛍光スペックル顕微鏡法および粒子画像流速測定法により,移動性ケラトサイトおよびフラグメントの運動時におけるアクチン骨格構造ダイナミクスの定量的評価を実施した.その結果,アクチン骨格構造内において,運動方向に平行な方向に負のひずみが存在することが示された.また,負のひずみ分布とアクチンフィラメントの密度分布との相関性より,負のひずみ増分がアクチンフィラメントの脱重合に関わる可能性を示した.これは,力学的因子のアクチン骨格構造の再構築過程への関与を示唆する重要な結果である.次に,力学的因子・生化学的因子の相互作用と細胞運動への影響を明らかにするため,マイクロパターニング技術を用い,パターンを施した基板上を運動するケラトサイトの力学的応答を観察・評価した.その結果,パターン上を運動する細胞は、パターンに応答して運動し,通常のガラス上を運動する細胞に比べて高い頻度でカルシウム応答を示し,カルシウム応答の頻度と基板上のパターン配列とは同調していることが示された.カルシウム応答は,細胞膜の張力やアクチン骨格構造の力学的状態が変化した際に生じることを考慮すると,マイクロパターニングによる細胞運動メカニクスの検討が可能となる.本手法を用いて,引き続き細胞運動時におけるアクチン骨格構造の動的振舞いとカルシウム応答の関連性について検討を進める.交付申請書に記載の通り,本研究では,細胞運動の駆動機構であるアクチン細胞骨格構造および細胞接着斑における力学的因子の定量的評価を行い,細胞運動に及ぼすそれらの影響を明らかにするとを目的とした.本年度の実験内容および主な成果は次のように要約される.(1)実験内容:安定な形態と活発な運動で知られる魚由来のケラトサイトを用い,細胞運動に伴う接着班およびアクチン骨格構造のダイナミクスを定量的に評価した.また,同構造のダイナミクスを制御するとされるアクチン・ミオシン相互作用による収縮力の影響を検討した.具体的には,ミオシンを活性化または抑制することにより,ストレスファイバー(S.F.)の収縮を調節し,アクチン骨格構造ダイナミクス,および細胞速度に与える影響を調べた.(2)手法:マイクロイジェクションにより,独自で調製したQuantum dot-phalloidinを細胞内に導入し,アクチン骨格構造を蛍光ラベリングした後,蛍光スペックル顕微鏡観察を行った.また,蛍光観察画像を基に,粒子画像速度測定法(PIV)を組み合わせた画像相関法を用い,アクチン構造の変位ベクトル場,および,構造内ひずみ速度を定量的に評価した.(3)主な成果:アクトミオシン相互作用の調節に伴うS.F.収縮の変化により,アクチン構造の逆行性流れ速度,および細胞速度が変化した.特に,アクトミオシン相互作用を活性化した場合においては,抑制した場合とは反対に,アクチン構造ダイナミクスが増加しただけでなく,同構造に生じ,脱重合に関与するとされる圧縮ひずみも増加した.このことより,アクトミオシン相互作用が,アクチン構造ダイナミクスを制御することを明らかにした.これは,細胞運動制御において重要な結果である.交付申請書に記載の通り,本研究では,細胞運動の駆動機構であるアクチン細胞骨格構造および細胞接着斑における力学的因子の定量的評価を行い,細胞運動に及ぼすそれらの影響を明らかにすることを目的とした.本年度の実験内容および主な成果は次のように要約される.

1)まず,細胞運動の単純な系として,細胞の葉状仮足部分を分離した細胞フラグメントを作製し,その主な構成要素であるアクチン細胞骨格構造をquantum dot(qdot)を用いて蛍光ラベリングし,可視化した.次に,蛍光スペックル顕微鏡法,および,粒子画像流速測定法を組み合わせて適用することにより,細胞運動に伴うアクチンネットワークの微細な流れ場を定量的に評価した.さらに,流れ場を構成する逆行性流れと順向性流れの時空的ふるまいが,アクチン構造の重合・脱重合過程において支配的であることを示した.2)移動性細胞であるケラトサイトを対象に,細胞の移動機構におけるアクトミオシン収縮が,細胞伸展ダイナミクスに及ぼす影響を検討した.マイクロパターンニング手法を駆使し,細胞接着たんぱく質であるフィブロネクチンのマイクロパターンを基板上に施し,さらに,細胞が接着しにくいPLL-g-PEG(poly-L-lysine-g-poly(ethylene glycol))でコートし,細胞接着領域と非接着領域が混在するマイクロパターンを作成した.さらに,その上にケラトサイトを播き,細胞伸展挙動,および,アクチン骨格構造を観察した結果,接着領域の大きさがアクチン骨格構造の安定性に影響を及ぼし,細胞伸展長さを決定することが明らかとなった.また,隣り合う接着領域の間に存在するギャップ(非接着)の長さの影響を検討した結果,ギャップ長さによって細胞進展率が変化し,ギャップ長さが長くなるに連れ,ギャップを越えて進展する細胞の数が減少することが分かった.細胞接着をコントロールすることにより,細胞運動を制御できることを示唆する重要な結果である.
豪雪地住民の生活機能向上のための在宅トレーニングプランの開発と効果に関する研究

豪雪地住民は、冬季に雪道歩行や除雪のようなきつい作業があるにもかかわらず冬季間不活動になり勝ちとなる。本研究は、(1)身体活動の運動強度の測定、(2)中・高年の人たちの生活機能を高める在宅トレーニングの介入研究、(3)筋力トレーニングと有酸素運動のための簡易で安価な在宅トレーニング用具の開発、を行った。主な知見は以下の通りである。1.雪上路面の歩行や除雪のような冬季の身体活動の酸素需要量は、無雪期よりも多くなる。2.運動介入は、栗沢町、三笠市、士別市の中・高年者110名に対して、積雪期入りの第一回の測定時における運動ガイダンス、参加者へのダイレクト・メールによる運動の奨励、カレンダーによる運動と健康づくりの情報提供によるものであった。冬季明けの第2回目の測定に参加した男性25名において、握力、上体起こし、開眼片足立ち、10m障害物歩行、6分間歩行およびADL得点に、女性20名において6分間歩行に有意な向上を示した。しかしながら、安静時血圧は収縮期、拡張期とも冬季間で上昇する傾向が見られた。3.ステップエクササイズ用にステップ数がカウントされる装置を、スイッチング・センサーと安価な電卓を利用して試作した。ゴムチューブ、座椅子、ディジタル体重計を使用して簡易な脚筋力用具を試作した。これらの用具は、運動実施者が歩行距離、ステップ昇降高さ、発揮した筋力をモニターできるため、冬季の在宅トレーニングに有用と考える。老人医療費が全国一の北海道において、その原因としてあげられている「社会的入院」には、高齢者の冬季の自立生活維持の厳しさとその表裏にある冬季の運動不足による自立生活機能の低下の問題が背景にある。本研究は運動施設に恵まれない豪雪地域の住民に冬季の運動実施を奨励しその効果を検討する介入研究「克雪・利雪・親雪パワーアッププラン」を以下により実施した。(1)住民の生活現実に適った身体活動の運動強度の測定本研究経費で購入した携帯用呼吸代謝測定装置を用いて、豪雪・高齢地域の高齢者6名を対象に日常的に実施している身体活動として歩行(無雪路面、積雪路面)、畑仕事、除雪の運動強度を測定した結果、比較的降雪の少ない条件の除雪でも運動強度は歩行を上回り除雪で要求される体力の維持のために無雪期から坂道歩行などの強度の高い運動により有酸素能力を維持する必要性を明らかにした。(2)在宅用の簡易なトレーニング用具の試作運動施設や指導者に恵まれない地域で、冬季の運動不足を補うため安価で誰でも製作可能な電卓を利用した踏み台昇降カウンタや遮光式赤外線センサーを応用した名所ウォーキング体験装置などを試作中(平成16年度北海道体育学会で発表)。(3)冬季の自主的な運動実施を促す介入研究施設や指導者などによる運動実施の条件に恵まれない地域でも、日常実施できるウォーキングや除雪などの有酸素運動、手づくりのチューブを利用した筋力トレーニングを奨励し、運動の記録をカレンダーに記入してもらい、冬季の体力維持の効果を探索する「克雪・利雪・親雪パワーアッププラン」を、三笠市、士別市、栗沢町、計約100名の住民を対象に平成16年11、12月の積雪前及び平成17年3月の積雪期終期の2回体力測定を実施し、その効果を検討中である。老人医療費が毎年全国1,2位の高騰の問題を抱えている北海道においてその原因としてあげられている「社会的入院」には、高齢者の冬季の自立生活維持の厳しさとその表裏にある冬季の運動不足による自立生活機能の低下の問題が背景にある。本研究は豪雪地の住民に冬季の運動実施を奨励し、その効果を検討する介入研究「克雪・利雪・親雪パワーアッププラン」を以下により実施した。(1)住民の生活現実に適った身体活動の運動強度の測定本研究経費で購入した携帯用呼吸代謝測定装置を用いて、平成16年度に実施した高齢者の自宅の除雪の運動強度の測定を、平成18年2月末に札幌市内において男性3名、女性3名の被験者に対して実施した。

(2)在宅で実施できる簡易なトレーニング用具の試作運動施設や指導者に恵まれない地域で、冬季の運動不足を補うためのトレーニング用具を、磁気センサーからのパルスを100円ショップで購入した万歩計を改造したカウンターに入力し、室内での歩行トレーニングでの周回数がモニターできる装置を原田電子と共同で試作した。さらに踏み台に装着した磁気センサーが昇降によりON, OFFとなる毎に昇った高さが積算されるステッピングトレーニング装置を試作した。(3)大学生を対象として、冬季の身体活動である除雪に関する調査および体力測定を実施し、除雪ボランティアのような社会的プロダクティビティを発揮するために筋力、脚伸展パワーなどの体力要素が関連を持つことを明らかにした(平成18年3月の日本発育発達学会第4回大会で発表)。(4)研究成果の公表平成16、17年度に行った調査、測定結果をまとめ、日本体育学会、北海道体育学会、日本発育発達学会に発表し、北海道大学大学院教育学研究科紀要、日本雪工学会誌、著書などで公表した。
海産多核緑藻細胞における細胞周期制御機構に関する分子細胞学的研究

陸上動植物の核分裂と異なり、多核緑藻では閉鎖型紡錘体(核分裂中に核膜が破れない)が形成されることが知られている。娘染色体は核内部に発達する中間紡錘体が伸長する事により分離される。核分裂期において核膜が完全に保持されることは多核細胞における核分裂の同調・非同調と関連するのではないかと考え、今年度は閉鎖型紡錘体形成に焦点を当て、抗β-チューブリン抗体、抗γ-チューブリン抗体、抗セントリン抗体を用いて閉鎖型紡錘体形成時のセントリオールとセントロゾームの挙動について調査を行った。中間期核ではセントリオールにはγ-チューブリンは付随しておらず、微小管は核周辺部から放射状に伸びる。核分裂期に向かうに従い、γ-チューブリンはセントリオール近傍に観察されるようになる。同時に個々のセントリオールは分離し、両極に移動を開始する。核分裂中期頃から中間紡錘体が形成され始め、後期・終期に向けて中間紡錘体は伸長する。核分裂後期以降、セントリオール近傍のγ-チューブリンは分散し、微小管極は消失する。中間紡錘体には明確なγ-チューブリンを確認することができない。アミプロホスメチルであらかじめ微小管を脱重合させた条件で核分裂を誘導した場合、γ-チューブリンはコントロール同様に分裂核ではセントリオールに局在する。またチューブリン分子は分裂核へのみ流入することが観察された。電子顕微鏡の観察から核分裂期に入った核膜の核膜孔付近に電子密度の高い物質が特徴的に観察できることから、中間紡錘体形成に向けてチューブリン分子の分裂核への流入と核膜孔構造の関係が示唆される。中間紡錘体の両端に明確なγ-チューブリンが観察できないことからその両端は微小管の+エンドからなることが考えられる。これらの問題解決には蛍光色素をラベルしたチューブリン分子をマイクロインジェクションする必要があると考え、実験を継続している。多核緑藻モツレグサの核分裂・細胞質分裂について核の挙動と細胞骨格(微小管・マイクロフィラメント)の観点から詳細な調査を行った。モツレグサでは将来の細胞分裂予定域に多数の核が集合し、同時に表層微小管の配向が大きく変化し核のリングと共に微小管のバンドが形成される。核分裂はこの核のリング部分から開始され、他の領域の核に伝搬していく典型的なmitotic waveが観察された。また微小管のバンドは核分裂期においてもそのまま残り、細胞質分裂の際に細胞膜のくびれ込みに大きな働きを有する。これらの結果は現在学術雑誌に投稿中である(Phycological Research,Aruga and Motomura)。次に、多核緑藻モツレグサにおける核分裂、mitotic wave、微小管骨格の劇的変化について分子レベルで解析するために、真核細胞における細胞周期制御のキ-となるcdc2遺伝子の解析を進めた。cdc2遺伝子は真核細胞においては種を越えてホモロジーが高いことが知られていることから、適切なプライマーを用いPCRによる遺伝子増幅を試みた。結果として、2種類のcdc2様の遺伝子を単離し、PCR増幅部分の塩基配列を決定した。モツレグサのcdc2様遺伝子はアミノ酸配列において“PSTAIR"部分の配列が他の真核細胞と若干異なるものの、50%前後の相同性を示した。

モツレグサ以外の多核緑藻ハネモ、マガタマモについては、BrdU取り込み実験等により細胞周期の形態学的解析は概ね終了したが、興味深いことに今回用いたプライマーではPCRによるcdc2遺伝子増幅はできなかった。陸上植物の核分裂と異なり、多核緑藻では閉鎖型紡錘体(核分裂中に核膜が破れない)が形成されることが知られている。分裂中期以降、娘染色体は核内部に発達する中間紡錘体が伸長する事により分離される。核分裂期において核膜が完全に保持されることは多核細胞における核分裂の同調・非同調と関連するのではないかと考え、今年度は閉鎖型紡錘体形成に焦点を当て、抗β-チューブリン抗体、抗γ-チューブリン抗体、抗セントリン抗体を用いて閉鎖型紡錘体形成時のセントリオールとセントロゾームの挙動について調査を行った。中間期核ではセントリオールにはγ-チューブリンは付随しておらず、微小管は核周辺部から放射状に伸びる。核分裂期に向かうに従い、γ-チューブリンはセントリオール近傍に観察されるようになる。同時に個々のセントリオールは分離し、両極に移動を開始する。核分裂中期頃から中間紡錘体が形成され始め、後期・終期に向けて中間紡錘体は伸長する。核分裂後期以降、セントリオール近傍のγ-チューブリンは分散し、微小管極は消失する。中間紡錘体には明瞭なγ-チューブリンを確認することができない。アミプロホスメチルであらかじめ微小管を脱重合させた条件で核分裂を誘導した場合、γ-チューブリンはコントロール同様に分裂核ではセントリオールに局在する。またチューブリン分子は分裂核へのみ流入することが観察された。電子顕微鏡の観察から核分裂期に入った核膜の核膜孔付近に電子密度の高い物質が特徴的に観察できることから、中間紡錘体形成に向けてのチューブリン分子の分裂核への流入と核膜孔構造の関係が示唆される。さらに、中間紡錘体の両端に明瞭なγ-チューブリンが観察できないことからその両端は微小管の+エンドからなることが考えられる。これらの問題解決には蛍光色素をラベルしたチューブリン分子をマイクロインジェクションする必要があると考え、実験を継続している。
脳内抗酸化ストレス活性測定用放射性プローブの開発研究

本課題では、脳内の抗酸化ストレス活性のひとつであるグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)活性の定量測定を目的とする放射性プローブの開発研究を行った。GST基質であるハロゲン化プリン誘導体をインビトロおよびインビボで検討したところ、6-[F^^<18>]フルオロ-9-メチルプリンおよび6-[<76>^Br]ブロモ-9-エチルプリンが脳内のGST活性をインビボで定量測定し得る放射性薬剤の有力な候補であることを見出した。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)やグルタチオン(GSH)は、様々な疾患原因のひとつと考えられている酸化ストレスにより誘導されることから、これらのインビトロでの測定は、酸化ストレスマーカーとして神経変性疾患や腫瘍の病因解明を目的として広く実施されている。インビボでのGST活性の測定も、様々な疾患の病態解明や診断に有用であると期待されるが、未だその方法は無い。そこで本研究では、脳内のGST活性をインビボで定量測定し得る放射性薬剤の開発研究を行った。インビボでの脳内代謝速度の測定は、脳内に到達した放射性薬剤が測定対象とする酵素等により特異的に、かつ脳内に保持される化学形へと至適な速度で代謝されることで可能となる。このことから、候補化合物について血液脳関門透過性、GST特異性、および放射性代謝物の脳残留性を検討した。6位を^<18>Fもしくは^<76>Brで標識した9-アルキルプリンを標識合成し、これらの化合物のラットおよびマウスの脳ホモジネート中での代謝速度を検討したところ、GSHのみを含有する緩衝液中での6-[^<18>F]フルオロ-9-メチルプリンおよび6-[^<76>Br]ブロモ-9-エチルプリンの代謝速度は、ホモジネート中と比べて遅く、両化合物の代謝がGST依存的であることを示唆し、代謝速度の点でも有望な化合物であることを示唆した。また脳内化学形の基礎的検討では、両化合物の代謝がGSH抱合であることを示唆した。以上の結果は、両化合物が脳内のGST活性をインビボで定量測定し得る放射性薬剤の有力な候補であることを示唆した。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)やグルタチオンは、様々な疾患原因のひとつと考えられている酸化ストレスにより誘導されることから、これらのインビトロでの測定は、酸化ストレスマーカーとして神経変性疾患や腫瘍の病因解明を目的として広く実施されている。本研究では、脳内のGST活性をインビボで定量測定し得る放射性薬剤の開発研究を行った。前年度の結果から、6-[^<18>F]フルオロ-9-メチルプリンおよび6-[^<76>Br]ブロモ-9-エチルプリンが脳内のGST活性をインビボで定量測定し得る放射性薬剤の有力な候補であることを示唆した。本年度は、実際に両化合物をラットに投与し、その脳内動態をPETにより検討した。評価化合物の投与初期における脳内移行性は高い一方、脳内で生成した^<18>Fおよび^<76>Brイオンは、ほぼ完全に脳内に保持された。この投与初期における脳内放射能濃度のピークと、投与後期の脳内放射能濃度の比は、1/2から1/3であり脳内の酵素活性を精度良く測定するための適切な脳内動態を示した。一方、末梢で生成した^<18>Fイオンは骨に集積し、^<76>Brイオンは全身に広く分布した。また、^<18>Fおよび^<76>Brイオンを単独投与した場合には、脳内にその放射能は観察されず、末梢で生成した^<18>Fおよび^<76>Brイオンの脳移行性は低いことが示された。しかしながら実際にモデル動物を用いた場合において、その放射能動態の応答は低かった。その原因として、小動物では末梢で生成する^<18>Fおよび^<76>Brイオンの分布により、画像上での脳内放射能集積の変化を定性的に観察することは困難であると考えられた。さらに、非放射性の臭素標識化合物が脳へ効率的に臭素イオンを送達し得ることに着目し、その抗痙攣作用を検討したところ、最大電撃痙攣モデルにおいて抗痙攣作用は示さなかったものの、死亡率を低下させる作用があることが示唆された。