hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聞き取りによる被爆１世と２世の生活史研究：３．１１原発問題下の子育て世代への示唆

本研究の目的は、被爆1世の戦後経験を、被爆2世との関係という視点から問い直し、3.11以降の子育て世代へとつながる共感の回路を探究することにある。被爆1世2世を対象にしたインタビュー調査と参与観察により、1死者とともに前向きに現在を生きる「被爆者像」が明らかになった。また2被爆1世の戦後経験がもつ多様な共感の可能性という現在的な意味を提示した。さらに3子育て世代への共感の回路の探究には、まず断絶を認識する必要があることを示した。今年度は、広島で6回のインタビュー調査を、福島で1回のフィールドワークを実施した。また調査の結果を、日本社会学会と現象学・社会科学会の大会で発表した。調査の結果、「被爆1世」へのンタビューは、継続していくことが重要だと考えるようになった。インタビュー対象である原爆投下時に10代だった「被爆1世」たちは、80代を迎えて、自身の病気、配偶者の病気、死など、人生の大きな変化に直面していた。継続して会って頂いている間に、これらの変化を実感した。今後もインタビュー調査を継続し、このマイナスの変化と彼/彼女らはどのように向き合っていくのか、そしてどのように自身の死と対峙するのかを見届けたいと願っている。「被爆1世」へのインタビュー調査から、被爆体験やその後の人生の捉え方、また被爆者対策についての考え方は、多様であるとわかった。したがって本研究のテーマである、次世代と、3.11以降の子育て世代に対する共感の回路も、多様である。だがひとつの物語ではなく、多様な語りのなかに、共感の回路は見いだせるのではないか、それをどう伝えていけるのか、鍵を握るのは、やはり第2世代である「被爆2世」たちなのではないかと思われる。ホロコースト第2世代であるエヴァ・ホフマンは、トラウマを抱えた第1世代とともに過ごした生活実感の上に、加害者側の第2世代との和解の可能性を考察している。今後、死と向き合う「被爆1世」たちを、「被爆2世」たちがどのように見守っていくのか、こちらもインタビューを継続していく所存である。次世代への伝承という点では、大学生を対象にした研修プログラムを実施していきたいと考えている。一方的に話を聞くのではなく、一緒に時間を過ごし、「被爆1世」の人間性と触れる研修プログラムを考えている。幸い、広島に人脈も出来た。これも科研費による補助があったからだと、心から感謝している。今年度は、広島、福岡、東京においてライフヒストリーの聞き取り調査を実施した。広島へは7回、福岡へは1回出張した。現在までのところ14名の被爆1世と3名の被爆2世から話を聞いた。話を聞いた被爆1世は、全員が被爆当時10代だった人たちである。また14名中8名は、これまで公的な場で被爆体験を語ったことのない未証言者たちである。さらに広島のNPOが主催した海外研修生の平和学習プログラム(2回)、広島、長崎での平和祈念式典、長崎での軍縮・不拡散教育グローバルフォーラムに参加し、参与観察を実施した。調査の過程で、未証言の被爆1世たちは、悲惨な経験を語れないだけでなく、自ら語らないことを選択してもいることが判明した。この「語らない被爆1世たち」の生き様に新しい被爆者像を提示する上での手がかりがあると考えた。そこで平成24年度はなぜ未証言者たちは「語らないこと」を選択するのかを分析した。研究の結果、未証言者たちの「語らないという選択」の背景には、経験の多様性によるコンフリクトを避けるという現実的な選択とともに、語ることのできない死者たちの側に自分自身を位置づけるという意味があることがわかった。そしてそれは分裂した平和運動に対する沈黙による抵抗であるとともに、語ろうとする主体である自身に対する抵抗でもあった。調査の途中経過は、日本社会学会第85回大会(於:札幌学院大学)のテーマ部会「戦争を社会学する」において発表した。また分析結果を論文にまとめ学会誌に投稿した(現在審査中)。さらに被爆経験のもつ現在的意味をまとめた原稿が、改訂新版『グローバル化時代の新しい社会学』新泉社に掲載された。人のトラウマに関わるインタビューには、継続的に相手によりそう時間が必要である。そのため広島への出張回数が当初予定の6回から7回となり、ユンク展見学の必要もあった3月の出張分を25年度予算から処理した。研究の目的が、順調に進展している理由は、以下の3点にある。(1)チャレンジ目標であった未証言被爆者へのインタビューに成功し、現在を生きる「新しい被爆者像」を考える上での手がかりとなる多くに発言を聴取出来た。たとえば、「被害者意識を持ちたくない」という言葉や平和運動への違和感といったこれまで明らかにされてこなかった被爆1世たちの声を聞くことができた。(2)インタビュー対象者たちと、長時間、複数回話をしていった結果、会食会や同窓会への同席を許されるなど、話をききやすい関係を構築することができた。

また1年間という時間の中でのそれぞれに生じた変化を聞きとることができた。複数回のインタビューによって記憶が蘇り、新しい話が聴けたこともあった。(3)インタビュー結果から、「語らない存在」である死者の側に居続けることを選択する「語らない被爆者」という新しい被爆者像を提示できた。またこの新しい被爆者像を3名の被爆2世に提示し、意見を聞くことができた。だが今後の課題もある。「語らない被爆者」は、現在の被爆者像の一部でしかない。この点に関しては、これまで実施してきた被爆証言者へのインタビューも含めてさらなる検討が必要である。長時間、複数回インタビューに協力して頂いている方もおり、「分厚い記述」が可能であるだけのデータは揃っている。しかし結果の分析には至っていない。早急に取り組む所存である。次年度の前半には、被爆証言者への聞き取り調査の結果も含めて、被爆1世へのインタビュー調査の結果から現在を生きる「新しい被爆者」像について検討し、被爆2世の視点から捉え直す。ただし被爆1世、2世への聞き取り調査は、今後も継続していく。それはインタビューを実施していく中で、時間による被爆1世、2世たちの意識の変化に直面したこともあり、かつて石田忠が実施したような「被爆者」と長期にわたり、線的ではなく面的に向き合う研究を継続していく必要があると考えるようになったからである。次年度の後半には、福島県内と首都圏に在住する子育て世代へのインタビュー調査を実施する。福島からの避難者にもインタビューをする予定である。その上でこれまでの被爆1世と2世へのインタビュー調査結果から明らかになった「新しい被爆者像」と、未来を生きる子どもたちの育成に対峙する子育て世代との間にどのような共感の回路を描けるのか、共感の可能性をひとつの作業仮説として提示する。今後の課題として、J.バトラーの『生のはかなさ』など現在の「戦争と平和」に関する論考を参考にしながら、どうすれば被爆1世の戦後経験を、対立軸を設定しない新しい「戦争と平和」論へとつなげることができるのか検討していく。新しい「戦争と平和」論の検討のためにも、被爆1世の「生」と今後も継続的に向き合っていく。該当なし
新規角化関連分子Hornerinの機能解析とヒト疾患における意義の検討

我々は先に皮膚形態形成期のマウス皮膚より新規分子hornerinを単離し、その構造の特徴と皮膚における発現について検討して、それがprofilagrinと類似した分子であることを報告した。今回我々はヒトhornerinの同定とその発現について検討した。マウスhornerinの塩基配列を用いたホモロジー検索と部分的RT-PCRによって、ヒト染色体1q21上にhornerin遺伝子を同定した。この遺伝子は2850アミノ酸をコードしていた。推測されるタンパク質の構造は、N端のEF-handドメインと多数の反復配列よりなり、マウスhornerinやヒト・マウスprofilaggrinと類似していた。RT-PCR法によりヒトhornerinの発現を検討したところ、正常皮膚、胎児皮膚、舌では発現がみられず、正常外陰部皮膚と尋常性乾癬患者から得た皮膚で発現が確認された。さらに創傷治癒過程の皮膚においても受傷後5日目より発現がみられた。ヒトhornerinタンパク質の発現・局在を検討するため、ヒトhornerinの反復配列の一部を認識するポリクローナル抗体を作製した。作製した抗体を用いたウェスタン解析ではRT-PCR法の結果と同様に正常皮膚では反応せず、乾癬皮膚でシグナルが確認された。また免疫染色法では、乾癬患者より得た皮膚と創傷治癒過程皮膚で表皮顆粒細胞内に顆粒状に反応した。マウスではhornerinはprofilaggrinと微細な局在では相違点があるものの、ほぼ同様なパターンで発現していたが、ヒトではその発現パターンが大きく異なっており、ヒトhornerinはある特殊な状況においてのみ発現する分子と推測された。15年度はまずマウスの様々な組織におけるHornerinの発現をProfilaggrinの発現と比較し検討した。以前施行したノザン解析でHornerin、Profilaggrinとも舌、食道、前胃、皮膚に発現していたので、これらの組織を用いて免疫染色法によりその局在を調べた。さらに定量的PCR法により発現量も調べた。これらの蛋白質はいずれの組織においても角層下の顆粒(ケラトヒアリン顆粒)に発現がみられたため、免疫電顕法を用いてさらに詳細な分布を調べた。この結果はJ.Histochem.Cytochem(2003)に報告した。さらにヒトゲノムのデータベースを用いてHornerinのヒトホモログを検索した。その結果ヒト染色体1q21上にHornerinのヒトホモログを同定した。この遺伝子は2850アミノ酸をコードしており、セリン(34%)とグリシン(25%)を多く含んでいる。アミノ酸配列より推測されるhornerinタンパク質の構造は、N端にCa^<2+>結合ドメインであるEF-handドメインが存在し、約240アミノ酸を1単位とする多数の反復配列が続いており、マウスhornerinやヒト・マウスprofilaggrinと類似していた。RT-PCR法によりヒトにおけるhornerinの発現を検討したところ、正常外陰部皮膚と尋常性乾癬患者から得た皮膚で発現が確認された。同時に施行した背部正常皮膚、胎児皮膚、舌では発現が認められなかった。また、ヒトhornerinの一部の配列を用いペプチド抗体を作製した。この抗体を用いて免疫染色を施行した結果、乾癬患者より得た皮膚の表皮顆粒層の位置に一致して発現が確認された。
角度分解偏光ラマン分光で観るペロブスカイト型強誘電体の不均一構造

これまでの2年間で,放射光回折実験より不均一な構造や平均構造を決定し,その構造を基に角度分解偏光ラマン分光スペクトルを解釈してきた.その結果,二チタン酸バリウムBaTi2O5における強誘電性相転移の機構を原子スケールから巨視的なスケールまで明確に説明することができた(S. Tsukada, etal. Physical ReviewB 97, 024116 (2018).).また,リラクサーと呼ばれる鉛系ペロブスカイト強誘電体において,ナノメートル・ピコ秒の時空間領域において分極フラクタルを見出した(S. Tsukada, et al. Scentific Reports 7, 17508 (2017).).これらの研究では「温度」や「光の偏光角度」を変化させながら光散乱スペクトルを取得してきた.最終年度は,「温度」・「光の偏光角度」に加えて「位置」も変化させながらラマンスペクトルを取得した.位置を変化させながらラマン散乱を測ることで,強誘電相における分域構造や双晶構造など,これまでより多くの情報を得ることができるようになった.チタン酸バリウムやリラクサー強誘電体において大量のスペクトルを取得し,大規模データを解析する手法を検討した.特に,多変量スペクトル分解法(Multivariate Curve Resolution)が角度分解偏光ラマン分光法と相性が良いことが分かった.今後,さらに様々な解析手法を検討して,大量のスペクトルに潜む物質の本質に迫っていく.従来,物質の応答は線形な変位に対する応答を前提にして解釈されている.しかし,階層性が存在する場合は,どの階層でどのような揺らぎが生じているのか丁寧に結びつけている必要がある.つまり,大きな応答を持つ物質において物質の本来持っている幅広い時間・空間構造を明らかにすることは,機能性材料物質探究の新しい指針になる.本研究では,「立方晶相におけるペロブスカイト型酸化物強誘電体のラマン散乱」を丁寧に調べて巨大電気応答を示す強誘電体について,幅広い時間・空間の階層構造を明らかにすることを目標に定めて研究を進めている.初年度は,光の偏光制御・低振動数測定・短時間測定から得られる大量のラマンスペクトルを基に「不均一構造の結晶点群」や「緩和現象と相転移との関わり」を明らかにした.まずは均一な系であるBaTi2O5について調べた.これまで解釈が難しかったラマン散乱の強度から分極率を抽出することに成功し,相転移のメカニズムの理解に関しても大きな進展があった.次にリラクサー強誘電体Pb(MgNb)O3-PbTiO3系において不均一性が示す緩和現象を明らかにすることができた.ラマン分光実験と並行して放射光粉末X線回折実験や中性子非弾性散乱実験も行っており,次年度にラマン分光で得た結果とともにまとめていく.また,得られた知見を基に,新たな強誘電体材料の探索も行っている.均一な系であるBaTi2O5を基本にいくつかの固溶体を作製し基礎物性を調べた.導入予定であった温度調整機器に関して,設計に遅れが生じて予算の執行が滞っている.しかし,現有の装置を活用しながら予定通りに研究を進めている.光の偏光制御・低振動数測定・短時間測定が可能な角度分解偏光ラマン分光装置を活用して,常誘電相における不均一性に関する知見を深めている.本年度は,他の実験・計算手法との融合を意識して研究を行った.また,マッピングなども行い,大量のデータを効率的に画像化するようなソフトウェアの開発にも取り組んだ.高い強誘電性相転移温度を有する二チタン酸バリウムBaTi2O5において,角度分解偏光ラマン分光を行うとともにX線二体相関関数測定や第一原理計算を行い,ラマン散乱のモードアサインを行った.均一系の計算と実験結果の両面から迫ることで,不均一性が巨視的な物性に与える影響を取り出すことができた.これまで「変位型」と「秩序・無秩序型」で議論が分かれていた相転移の機構について,「ソフトフォノンの減衰が大きい変位型」であることを明快に指摘することができた.1つの物質における強誘電性相転移を微視的な視点から広い時空間にわたって説明することができたことは大きな進展である.高い圧電・誘電応答を示すリラクサーにおいても進展があった.Pb(In1/2Nb1/2)O3の「InとNbが整列した反強誘電体」と「InとNbがバラバラに並ぶリラクサー」を比較することによって,どうやってリラクサーが実現されるか検討した.不均一構造の静的な側面を電子顕微鏡や散漫X線散乱を通して明らかにし,動的な側面を非弾性光散乱より明らかにした.リラクサーの場合,分極ナノ領域に現れるフラクタル構造が温度を下げるにつれて変化する様子が観測された.一方,反強誘電体の場合,高温から低温までフラクタル構造の変化は観られなかった.以上のように,リラクサーと反強誘電体において,分極ナノ領域の成長が重要な役割を果たすことが分かった.「結晶の中の不均一性が創るフラクタル」という面白い自然の一面を観ることができた.実験は予定通り進み,研究実績の概要にある知見に関して,論文としてまとめることができた.特に,リラクサーで観られたフラクタル構造を原子配列で制御する研究はプレス発表も行い新聞に掲載された.これまでの2年間で,放射光回折実験より不均一な構造や平均構造を決定し,その構造を基に角度分解偏光ラマン分光スペクトルを解釈してきた.その結果,二

チタン酸バリウムBaTi2O5における強誘電性相転移の機構を原子スケールから巨視的なスケールまで明確に説明することができた(S. Tsukada, etal. Physical ReviewB 97, 024116 (2018).).また,リラクサーと呼ばれる鉛系ペロブスカイト強誘電体において,ナノメートル・ピコ秒の時空間領域において分極フラクタルを見出した(S. Tsukada, et al. Scentific Reports 7, 17508 (2017).).これらの研究では「温度」や「光の偏光角度」を変化させながら光散乱スペクトルを取得してきた.最終年度は,「温度」・「光の偏光角度」に加えて「位置」も変化させながらラマンスペクトルを取得した.位置を変化させながらラマン散乱を測ることで,強誘電相における分域構造や双晶構造など,これまでより多くの情報を得ることができるようになった.チタン酸バリウムやリラクサー強誘電体において大量のスペクトルを取得し,大規模データを解析する手法を検討した.特に,多変量スペクトル分解法(Multivariate Curve Resolution)が角度分解偏光ラマン分光法と相性が良いことが分かった.今後,さらに様々な解析手法を検討して,大量のスペクトルに潜む物質の本質に迫っていく.ラマン分光システムや実験条件を精査しながら,物質の不均一性について理解を深めていく.また,得られた知見を物質開発に積極的に活用する.物質の不均一性と巨視的な物性の関わりについて,総まとめを行う.特に,圧電応答をしめす非鉛強誘電体材料の開発を目指す.それと同時に,角度分解偏光ラマン分光についても,計算科学とより融合させて進化させる.スペクトルの高速解析や自動モードアサインといったことを検討・実施する.予算計上している温度調節器の設計や開発に時間がかかったため.妻の出産のため,3月に予定していた研究会や学会を欠席した.次年度に,当初計画より積極的に研究成果公表を行う.発注はすんでいる.今年中に納品されて予算を執行をする予定.
生活習慣と卵巣癌や子宮内膜癌の罹患リスクとの関連性についての症例対照研究

【目的】増加傾向にある卵巣がん(OC)と子宮内膜がん(EC)の症例対照研究を行い、疑われるリスク要因との関連性の強さを比較した。【方法】2003年から2005年までに札幌医大附属病院婦人科でOC、あるいは、ECと診断された25歳以上のそれぞれ100人と152人のうち、文書による説明と同意が得られたそれぞれ71人(71.0%)と124人(83.9%)に郵送に電話を加味した方法で調査を行った。次に、症例の居住する14地区の住民基本台帳から年齢と居住地区を頻度マッチングして648人の対照群候補を無作為抽出して、文書による説明と同意を得た295人(45.6%)に同様の調査を行った。そのうち、がん既往があった26人を除いた269人を対照群として、ロジスティック回帰解析によって年齢と地域を調整してオッズ比を求めた。有意水準5%で有意なオッズ比に*印を付けた。【結果】OCとECへ関連性が疑われている項目のオッズ比は、毎日運動(OC0.37*,EC0.54)、1回当たり1時間以上運動(OC0.62,EC0.55*)、20歳頃と比べて15kg以上体重増加(OC1.26,EC3.37*)、体重が最も重かった時のBMI26以上(OC1.12,EC1.60)、妊娠の経験(OC0.57,EC0.33*)、出産の経験(OC0.51*,EC0.38*)、経口避妊薬を服用(OC0.61,EC0.36*)、不妊症のためにホルモン治療(OC1.30,EC1.83)、ホルモン補充療法(OC1.87,EC1.27)、母姉妹に卵巣がん(OC3.80,EC1.56)、母姉妹に乳がん(OC2.16,EC1.76)、母姉妹に子宮がん(OC1.70,EC3.74*)であった。【結論】身体活動量を増やして体重増加を抑制することが、ECの一次予防につながる可能性が示唆された。生活習慣と卵巣癌や子宮内膜癌の罹患リスクとの関連性についての症例対照研究のデザインを以下のように確定した。症例群については、札幌医科大学附属病院婦人科、および、その関連病院の婦人科で、平成13年1月1日以降に卵巣癌、あるいは、子宮内膜癌と診断された20歳以上で80歳未満の症例約300人に対して、印刷した調査票を用いて、郵送による自記式調査(一部、電話による補充調査)を行う。対照群については、自治体の住民基本台帳を用いて、卵巣癌や子宮内膜癌の症例と同一の地域に居住し、かつ、年齢が20歳以上で80歳未満の者を1症例につき4人、すなわち、約1,200人の一般住民を選定し,印刷した調査票を用いて、郵送による自記式調査(一部、電話による補充調査)を行う。なお、悪性腫瘍、卵巣の疾患、あるいは、子宮の疾患を有する者は対照群から除外する。調査する項目は、植物性エストロゲン類摂取、肉類摂取などの食習慣、飲酒、喫煙、生殖歴、授乳歴、経口避妊薬などによる避妊歴、月経歴、ホルモン補充療法歴、不妊症に対する治療歴、既往歴、家族歴、身長、体重などである。

札幌医科大学倫理委員会での審査を受けて、調査を開始するところである。また、調査票を作成する過程で、生活習慣と卵巣癌や子宮内膜癌の罹患リスクとの関連性についてレビューをし、専門誌(日本臨床)に総説を発表した。札幌医科大学附属病院婦人科、および、その関連病院の婦人科で、平成13年1月1日以降に卵巣がん、あるいは、子宮内膜がんと診断された20歳以上や80歳未満の症例それぞれ93人と121人に対して、印刷した調査票を用いて郵送による自記式調査(一部、電話による補充調査)を平成17年9月に行った。卵巣がん患者93人のうち回答が得られたのは68人であり、未回答であった25人の内訳は死亡6人、回答不可能状態1人、拒否1人、返答なし17人であった。子宮内膜がん患者121人のうち回答が得られたのは99人であり、未回答であった22人の内訳は死亡0人、回答不可能状態3人、拒否1人、返答なし18人であった。対照群については、自治体の住民基本台帳を用いて卵巣癌や子宮内膜癌の症例と同一の地域に居住し、かつ、生年が同じ者を1症例につき4人、すなわち、668人選定した。そして、症例群と同じ調査票を用いて、郵送による自記式調査(一部、電話による補充調査)を平成19年4月に行う予定である。なお、悪性腫瘍、卵巣の疾患、あるいは、子宮の疾患を有する者は対照群から除外する。調査する項目は、植物性エストロゲン類摂取、肉類摂取などの食習慣、飲酒、喫煙、生殖歴、授乳歴、経口避妊薬などによる避妊歴、月経歴、ホルモン補充療法歴、不妊症に対する治療歴、既往歴、家族歴、身長、体重などである。本研究は札幌医科大学倫理委員会で承認されており、インフォームド・コンセントが得られた対象者のみに調査を行っている。【目的】増加傾向にある卵巣がん(OC)と子宮内膜がん(EC)の症例対照研究を行い、疑われるリスク要因との関連性の強さを比較した。【方法】2003年から2005年までに札幌医大付属病院婦人科でOC、あるいは、ECと診断された25歳以上のそれぞれ100人と152人のうち、文書による説明と同意が得られたそれぞれ71人(71.0%)と124人(83.9%)に郵送に電話を加味した方法で調査を行った。次に、症例の居住する14地区の住民基本台帳から年齢と居住地区を頻度マッチングして648人の対照群候補を無作為抽出して、文書による説明と同意を得た295人(45.6%)に同様の調査を行った。そのうち、がん既往があった26人を除いた269人を対照群として、ロジスティック回帰解析によって年齢と地域を調整してオッズ比を求めた。有意水準5%で有意なオッズ比に*印を付けた。【結果】OCとECへ関連性が疑われている項目のオッズ比は、毎日運動(OC 0.37*,EC 0.54)、1回当たり1時間以上運動(OC 0.62,EC 0.55*)、20歳頃と比べて15kg以上体重増加(OC 1.26,EC 3.37*)、体重が最も重かった時のBMI26以上(OC 1.12,EC 1.60)、妊娠の経験(OC 0.57,EC 0.33*)、出産の経験(OC 0.51*,EC 0.38*)、経口避妊薬を服用(OC 0.61,EC 0.36*)、不妊症のためにホルモン治療(OC 1.30,EC 1,83)、ホルモン補充療法(OC 1.87,EC 1.27)、母姉妹に卵巣がん(OC 3.80,EC 1.56)、母姉妹に乳がん(OC 2.16,EC 1.76)、母姉妹に子宮がん(OC 1.70,EC 3.74*)であった。【結論】身体活動量を増やして体重増加を抑制することが、ECの一次予防につながる可能性が示唆された。
高温デバイス用セラミックス材料分析のためのその場軟Ｘ線吸収分光測定技術の開発

本研究では、高温・制御雰囲気・通電状態下での機能性酸化物の電子構造評価を可能とするその場軟X線吸収分光測定技術を開発することを目的とした。大気圧環境下軟X線分光用差動排気システムに特殊環境測定用試料ホルダを搭載することにより、高温・制御雰囲気・通電状態下でのその場測定を可能とした。LaCoO3やLa2NiO4などをモデル酸化物に測定を試みた結果、温度873K、酸素分圧0.01bar以下の条件であれば、軟X線吸収分光測定が可能であることが確認された。本研究により開発された測定手法は、高温デバイス用機能性酸化物の電子構造を直接評価するための、有用かつ汎用的な分析手法として期待される。燃料電池を始めとする高温電気化学デバイス等、機能性酸化物により構成されるデバイスの高性能化を図る上で、材料物性に深く関与する電子構造を把握することは重要である。本研究では、高温・制御雰囲気・通電状態下での電子構造評価を可能とするその場軟X線吸収分光測定技術を開発することを目的とした。本研究では、高温電気化学デバイスにおいて多用される3d遷移金属酸化物の直接分析を念頭に、軟X線領域(< 1 keV)を対象とした。JASRI・為則によって開発された大気圧環境下軟X線分光用差動排気システムを採用し、これに本研究で新たに開発した特殊環境測定用試料ホルダを搭載することにより、高温・制御雰囲気・通電状態下でのその場測定を可能とした。LaCoO3をモデル酸化物に、高温、各種酸素分圧下での測定を試みた結果、温度873K、酸素分圧0.01bar以下の条件であれば、3d遷移金属L吸収端、酸素K吸収端での軟X線吸収分光測定が可能であることが確認された。また、LaCoO3に含まれるCoイオンのスピンが、温度上昇に伴い、中間スピンから、中間スピンと高スピンの混合状態へ徐々に推移することが分かった。さらに、La2NiO4酸化物薄膜をモデル空気極酸化物に、高温、各種酸素分圧、通電下での測定を行った。その結果、一定の酸素分圧雰囲気においても、通電を行うことで電極酸化物が還元されること、酸化物の還元には遷移金属イオンと酸素イオンの両者が関与していること、が明らかとなった。以上のような、酸化物の電子構造変化は、本研究で開発された手法を用いることにより、初めて実験的な評価が可能となった。以上、本研究により、高温、各種酸素分圧、通電下での軟X線その場吸収分光測定技術を世界に先駆けて確立した。本手法は、機能性酸化物材料の高温における電子構造の理解を深める汎用的かつ革新的分析手法となると期待される。導電性、反応触媒活性といった機能性酸化物酸化物の材料物性に深く関与する電子構造を実験的に直接評価することは、酸化物の特性向上あるいは新規材料の開発を行う上で重要である。そこで本研究では、(i)酸化物が使用される各種条件での測定を可能とするその場軟X線吸収分光測定技術の確立、(ii) 3d遷移金属ペロブスカイト型酸化物(La,Sr)MO3(M = 3d遷移金属)をモデル材料とした電子構造の直接評価、を目的に研究を行った。初年度は、まず高温、雰囲気(ガス分圧)を制御した大気圧下における軟X線吸収分光測定を用いた電子構造のその場評価手法の開発を行った。本研究では、JASRI・為則によって開発された大気圧環境下軟X線分光用差動排気システムをベースとし、このシステムの最下流位置に、研究代表者等によって開発された特殊環境吸収測定用試料ホルダを設置することで、試料の温度を制御し、かつホルダ内部への任意のガスのフローを可能とする測定系を構築した。これにより、室温600°C、酸素分圧10-2 bar以下(Heベースガス)での計測が可能な測定技術を世界で初めて確立することができた。また、開発された測定技術を用い、ペロブスカイト型3d遷移金属酸化物である(La,Sr)CoO3(LSC)のその場軟X線吸収分光測定を行った。測定は、室温600°Cまで100200°C毎に、酸素分圧10-210-4 barにおいて、遷移金属L吸収端、酸素K吸収端について行った。(La,Sr)CoO3では、室温から温度が上昇するにつれてCoのスピン状態が低→中間→高スピンと遷移することが示唆されているが、これまでにこれを実験的に確認した例はなかった。本研究では、その場軟X線吸収分光測定により、このスピン転移を直接観測することに初めて成功した。

本研究では、(i)その場軟X線吸収分光測定技術の確立、(ii)これを用いた酸化物の電子構造評価、を二つの柱として進めることを予定していた。その中でも初年度は、まず高温、雰囲気を制御した大気圧下における軟X線吸収分光測定を用いた電子構造のその場評価手法の開発を行うことを主目標としていた。本研究では、JASRI・為則によって開発された大気圧環境下軟X線分光用差動排気システムと、研究代表者等によって開発された特殊環境吸収測定用試料ホルダを組み合すことにより、試料の温度:室温600°C、酸素分圧:10-2 bar以下でその場軟X線吸収分光測定が可能な装置を開発した。600°C以上の温度でのその場測定は、まだ装置上の制約から実施に至っていないが、温度と雰囲気を制御したその場軟X線吸収分光測定技術の基礎は確立することができ、今年度の当初計画は概ね達成できたと言える。上述の項目(ii)については、当初は2年目での測定を目指していた。しかし、装置開発が順調に進んだことから、既に今年度にペロブスカイト型3d遷移金属酸化物(La,Sr)CoO3(LSC)のその場軟X線吸収分光測定を行うことができた。これにより、本研究で開発された手法が、酸化物の電子構造評価に有効であることが示された。このように、開発された手法を用い、実際の酸化物の電子構造評価を行うことができた点は、当初計画を越えた成果と言える。以上より、本研究の初年度の目的は、概ね達成されたものと判断する。、高温、制御雰囲気下でのその場軟X線吸収分光測定技術の確立という観点では、初年度、試料から熱輻射によるノイズのために、600°C以上の温度での測定は困難であることが判明した。この問題を解決するために、次年度は、X線吸収量の評価を、現在使用しているフォトダイオードからノイズに強い別の検出器に変更する、検出器前にノイズ分離用のフィルターを設置する、等の装置改良を行う予定である。これにより、さらに高温での測定にも対応可能な測定技術の確立を目指す。一方、酸化物の電子構造評価については、LSCと同じペロブスカイト型構造を有する他の3d遷移金属酸化物(La,Sr)MO3(M = Cr, Mn, Fe, Ni)を中心に、高温、制御雰囲気下における電子構造の評価を行うことを予定している。特に、同材料中の酸素不定比が電子構造変化に及ぼす影響に着目しつつ、ペロブスカイト型遷移金属複合酸化物の電子構造を系統的に理解し、同酸化物中の遷移金属種が電気伝導特性に及ぼす影響を明らかにする予定である。上述の通り、次年度はまず、より高温での測定を可能とする機構の開発を行う。そのために、装置そのものの改良、ノイズ分離用フィルターの装着等を行う予定である。特に次年度前半には、このための研究費の使用を考えている。一方、上述のような様々な酸化物の電子構造評価を行うために、各種酸化物合成のための原料粉末、合成、加工、さらには測定時の雰囲気調整用ガスなどに研究費を使用する予定である。また、データ解析等の実験補助に予算を計上する。さらに、次年度中間後半に掛けては、成果公表に係る論文作成や学会発表のための旅費等に研究費の支出を想定している。
腎糸球体スリット膜ＴＲＰＣ６複合体の機械刺激受容伝達とその破綻の分子機構の解明

TRPC6チャネルを含む蛋白質-細胞骨格複合体を介したCaシグナル伝達が、腎スリット膜の濾過機能の制御やその破綻した病態に果たす役割を解明することを目的とし、スリット膜構成分子の最小発現系、分化足細胞で形成させた疑似スリット膜を用いた研究を行った。その結果、TRPC6-podocin-(nephrin)-アクチン骨格によるスリット膜複合体における受容体刺激・機械刺激によるCa流入が、腎スリット膜の拡散障壁機能の生理的制御に重要であり、家族性巣状糸球体硬化症の遺伝子変異・炎症時にはこのCa応答が過剰になっているため、障壁機能の破綻を引き起こしている可能性が示唆された。腎糸球体スリット膜に存在するTRPC6チャネルを含む蛋白質-細胞骨格複合体を介したCaシグナル伝達のダイナミクスの精査を通じ、腎糸球体の濾過機能の制御や破綻の機序を明らかにすることを目的として研究行った。平成24年度は、糸球体スリット膜における機械刺激受容・伝達のエッセンスを再現できる最小の実験系の再構築(TRPC6、podocin、nephrin等の共発現系)、不死化した足細胞の電気生理学的検討、及びこれを用いた疑似スリット膜の作成法の確立に集中して研究を進めた。その結果、(1)TRPC6、podocinの2分子のみの共発現は、機械刺激に対する感受性を減少されることが示唆された。また、ヒトTRPC6に報告された家族性糸球体硬化症(FSGS)の遺伝子変異P112Q, M132T, N143Sについても発現系で検討し、これらの変異によって受容体刺激や機械刺激に対する応答が著しく変化していること、その原因としてTRPC6チャネルのN末端とアクチン細胞骨格との物理的結合の変化が関与している可能性が明らかとなった。更に、マウス不死化足細胞の分化誘導によって受容体刺激によるTRPC6チャネル活性化が著しく増加すること、この足細胞で作成した疑似スリット膜のアルブミン透過性(蛋白質漏出の指標)が、過剰な受容体刺激や機械刺激によって有意に増加することを見出した。これらの結果は、第86回日本薬理学会年会シンポジウムで発表した。本研究では、腎糸球体の濾過機能の制御や破綻の機序を明らかにすることを目的とし、腎糸球体スリット膜に存在するTRPC6チャネルを含む蛋白質-細胞骨格複合体を介したCaシグナル伝達のダイナミクスを詳しく検討している。平成25年度は、初年度に確立した腎糸球体スリット膜最小再構成系(TRPC6、podocin、nephrin等の共発現系)や不死化足細胞の疑似スリット膜を用いた解析、及び足細胞の電気生理学的検討に注力した。その結果、(1)podocinやnephrinの共発現によって、TRPC6チャネルの受容体・機械刺激応答が有意に変化することを見出した。(2)TRPC6チャネルにおけるヒト家族性糸球体硬化症(FSGS)の遺伝子変異(N端;P112Q, M132T, N143S)によっても(1)と同様の機能的な変化が生じることが明らかとなり、その原因として、TRPC6チャネルのN末端とアクチン細胞骨格との物理的結合の変化が関与している可能性が示唆された。(3)疑似スリット膜のアルブミン透過性(蛋白質漏出の指標)は、過剰な受容体刺激や機械刺激や、腎糸球体の起炎処置(puromycin aminonucleosideやTGF-beta処置48時間)によって有意に増加し、これと平行してTRPC6 mRNAの発現上昇が観察された。更に、単離足細胞において、同様の処置によるTRPC6チャネル応答性の亢進が観察された。以上の結果は、腎糸球体スリット膜の機能破綻とTRPC6の過剰な受容体・機械刺激応答性の密接な因果関係のみならず、適度なTRPC6活性がスリット膜の正常機能維持に有効な方法であることを強く示唆しており、今後の薬物治療の標的としてのTRPC6の有望性を示していると考えられる。本研究では、腎糸球体のスリット膜を介した濾過機能の制御やその破綻に関わる分子機序を解明する為、受容体刺激や機械刺激で活性化されるTRPC6チャネルおよびその変異によって生じる家族性巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)に着目した研究を行って来た。H26年度は、スリット膜の重要なシグナル分子であるpodocin、nephrinとTRPC6の共発現で得られる最小再構築系を用いた電気生理学的解析、マウス不死化足細胞で形成させた「疑似スリット膜」を用いたFITCラベルアルブミンの透過実験を継続して遂行し、(1)podocinがTRPC6の受容体刺激のみならず機械刺激感受性の重要な制御因子であり、後者には細胞骨格アクチンとの相互作用が関与して可能性が高い事、(2)FSGS変異のうちM132T変異は、機械刺激感受性を劇的に増加させるのに対し、他のN末端のFSGS変異の多くはむしろ減弱させること、(3)プロテインキナーゼG(PKG)の活性化薬は、受容体・機械刺激活性化時のアクチンとTRPC6の相互作用を減弱させるが、この作用がTRPC6のN端のPKGによるphosphorylation-dead変異では失われ、phospho-mimetic変異ではPKG活性化とは無関係に増加していること、(4)疑似スリット膜の蛋白質透過性は、通常の受容体・機械刺激では強化されるが、これが過剰な場合や起炎症刺激下(TGF-β、PAN処置)では、有意に亢進することが明らかとなった。以上より、TRPC6を介したCaシグナリングは、

(a)正常な濾過機能維持に重要であるにもかかわらず、(b)その過剰な活性化は濾過機能の破綻につながり、(c)更にそれをPKGの活性薬が抑制する可能性のあることが示唆された。[目的]TRPC6チャネルを含む蛋白質-細胞骨格複合体を介したCaシグナル伝達が、スリット膜の濾過機能の制御やその破綻に果たす役割を解明することを目的として以下の研究を行った。[結果](1)腎スリット膜複合体の主要構成分子、TRPC6チャネル、nephrin、podocin及び細胞アクチン骨格間には直接相互作用が見られた。(2)podocinは、受容体刺激・機械刺激に対するTRPC6チャネル活性及びそれを介した細胞内Ca濃度増加を著しく増強した。一方、サイトカラシンDによるアクチン骨格の破壊はこれらの応答を著しく抑制した。(3)家族性巣状糸球体硬化症(FSGS)の(マウス配列における)変異P111Q、M131T、N142Sは、受容体応答を亢進させ、低濃度側でpodocinはこれを更に増強した。若年発症型FSGSの原因遺伝子変異M131Tでは機械刺激応答の顕著な増強が観察された。同時に、TRPC6チャネル(及びその変異体)とアクチン細胞骨格との物理的結合の強化が観察された。これらの増強はアクチン骨格の破壊によって抑制された。(4)不死化足細胞株MP-1では、分化誘導による形態変化に伴ってpodocin、nehprinの発現増加、アクチン線維形成、およびTRPC6を介した受容体応答の著しい増加が観察された。この応答は、adenovirusによるTRPC6(及びM131T変異体)の強制発現によって更に増強した。(6)腎起炎物質PAN、TGFはTRPC6及びpodocinの発現を増強した。(7)MP-1細胞で形成させた疑似スリット膜のアルブミン透過性(漏出)は、短時間の受容体刺激や機械刺激によって著減したが、長時間の刺激では再び増加に転じる傾向が見られた。[結論]TRPC6-podocin-(nephrin)-アクチン骨格によるスリット膜複合体における受容体刺激・機械刺激によるCa流入は腎スリット膜の拡散障壁機能の生理的制御に重要であり、Ca流入が過剰になると(FSGS変異、炎症時)、障壁機能の破綻を引き起こしている可能性が示唆された。TRPC6チャネルを含む蛋白質-細胞骨格複合体を介したCaシグナル伝達が、腎スリット膜の濾過機能の制御やその破綻した病態に果たす役割を解明することを目的とし、スリット膜構成分子の最小発現系、分化足細胞で形成させた疑似スリット膜を用いた研究を行った。その結果、TRPC6-podocin-(nephrin)-アクチン骨格によるスリット膜複合体における受容体刺激・機械刺激によるCa流入が、腎スリット膜の拡散障壁機能の生理的制御に重要であり、家族性巣状糸球体硬化症の遺伝子変異・炎症時にはこのCa応答が過剰になっているため、障壁機能の破綻を引き起こしている可能性が示唆された。FSGS変異が疑似スリット膜の蛋白質透過性に与える影響を評価するのには、TRPC6の変異遺伝子を外来性に導入する必要があるが、未だこの実験が成立するのに十分な遺伝子導入効率が得られていない。このため、事業期間を1年間延長するための申請を行い承認された。27年度が最終年度であるため、記入しない。
口腔がん幹細胞を制御する網羅的遺伝子発現調節機構の解明

HuRはARE mRNAを特異的に安定化させ、その発現が腫瘍の悪性度と相関することが報告されている。網羅的遺伝子検索の結果からHuRの活性化因子候補と考えられたHuBに注目し、口腔扁平上皮がんの分化度との関連性を検討した。低分化型口腔扁平上皮がん細胞株SASのHuB mRNA発現量は高分化型口腔扁平上皮がん細胞株HSC2に比較して圧倒的に高いことが示された。HSC2にHuBを導入したHSC2-HuBでは、HuBがHuRを核外輸送していることが確認された。また、ヌードマウスへの移植実験により、HSC2-HuBでは、親株に比較して、角化傾向が抑制されていることが明らかとなった。一群の転写因子やサイトカインのmRNAの3'非翻訳領域(UTR)にはAU-richelement(ARE)と呼ばれる配列が存在し,これらのmRNA(ARE mRNA)の半減期は極端に短い. ELAVL1はARE mRNAを特異的に安定化させ,その細胞質局在が悪性腫瘍症例の予後と相関することが報告されている.今回,神経特異的に発現するとされるELAVL2に注目し,口腔扁平上皮がんの分化度との関連性を検討した.Real Time PCR法により,低分化型口腔扁平上皮がん細胞株SASのELAVL2 mRNA発現量は高分化型口腔扁平上皮がん細胞株HSC2に比較して圧倒的に高いことが示された.HSC2ではELAVL1が核局在性を示したが, SASでは細胞質への移行がみられた.免疫沈降法により細胞質中のELAVL1がELAVL2と結合していることが確認された.さらに, ELAVL2を強制発現したHSC2 ELAVL2では, ARE配列を有する遺伝子の発現亢進が認められ,中でも幹細胞性の制御に関わり3'UTRにAREを有するLin28BはELAVL2の強制発現により発現が上昇していた.ヌードマウスに移植したHSC2 ELAVL2では,角化傾向の低い腫瘍胞巣が多数認められ, ELAVL2が口腔扁平上皮癌の分化に大きな役割を果たしている可能性が示唆された.平成27年度計画1.「がん幹細胞(様)細胞からの候補遺伝子検索」:マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングを行い、候補遺伝子の絞り込みを行った。研究実績の概要に示したごとく、低分化型口腔扁平上皮がん細胞株SASのELAVL2 mRNA発現量は高分化型口腔扁平上皮がん細胞株HSC2に比較して圧倒的に高いことが示された.以上のごとく実験は順調に進展していると考えられる。我々は、神経特異的に発現するとされるELAVL2に注目し,口腔扁平上皮がんの分化度との関連性を検討してきた.Real Time PCR法により,低分化型口腔扁平上皮がん細胞株SASのELAVL2 mRNA発現量は高分化型口腔扁平上皮がん細胞株HSC2に比較して圧倒的に高いことが示された.HSC2ではELAVL1が核局在性を示したが, SASでは細胞質への移行がみられた.免疫沈降法により細胞質中のELAVL1がELAVL2と結合していることが確認された.さらに, ELAVL2を強制発現したHSC2 ELAVL2では, ARE配列を有する遺伝子の発現亢進が認められ,中でも幹細胞性の制御に関わり3'UTRにAREを有するLin28BはELAVL2の強制発現により発現が上昇していた.ヌードマウスに移植したHSC2 ELAVL2では,角化傾向の低い腫瘍胞巣が多数認められ, ELAVL2が口腔扁平上皮癌の分化に大きな役割を果たしている可能性が示唆された.平成28年度は、ELAVL2の発現が亢進している細胞についての解析を進めた。特に注目したのはHEK293細胞であり、MCF7などに比べ20倍以上のELAVL2発現の亢進がみられた。そもそもHEK293細胞は5型アデノウイルス遺伝子により形質転換した細胞であるので、その他のアデノウイルス初期遺伝子によりELAVL2経路が活性化されるか否かを検討したところ、E4orf4に大きな活性を認めた。E4orf4抗体の作成により、本タンパク質が核-細胞質をシャトルすること、ELAVL2と結合することなどが明らかとなった。平成28年度の主目的であった、計画1.RNA結合タンパク質のクローニングは順調に進んでおり、これら候補遺伝子の強制発現により、HIF1aのmRNA量は10倍以上になることがリアルタイムPCRにより明らかとなった。さらに2.RNA結合タンパク質の機能解析についても、アデノウイルス初期遺伝子の中にこの経路を活性化ものが見つかった。

過去に発表されたアデノウイルス初期遺伝子の働きは、細胞のがん化にとって非常に重要なものが多く、今回の発見もがん化あるいはがん幹細胞形質の維持において大きな役割を果たすものと考えられた。以上のごとく実験は順調に進展していると考えられる。我々は、転移巣形成に最も重要な役割を演じている転写因子HIF-1αの発現調節において、酸素濃度非依存的な活性化経路を発見し、この経路が高転移性株でより顕在化していることを見出した。HIF-1αの酸素濃度非依存的発現調節は、5'非翻訳領域(5'UTR)依存性の翻訳活性化機構と、3'UTR依存性の翻訳抑制機構による二重支配により構成されていた。一方これまで3'UTR依存性の翻訳抑制機構を担うと報告されてきたELAVL1はむしろHIF-1αの翻訳効率を低下させることが示され、従来考えられてきた調節機構はより複雑なものであることが示唆された。ELAVL2はARE配列に結合する能力があり、このような領域においてオリゴマーを形成して翻訳制御の一翼を担っているのに間違いはないが、本タンパク質を核外輸送するパートナータンパク質の存在が示唆された。今後の研究では、パートナータンパク質のクローニングを課題としたいと考えている。口腔微生物学平成28年度までの研究により、我々がクローニングしたRNA結合タンパク質群の機能は3'非翻訳領域のAREに結合することにより、機能を発揮していることが示唆された。しかしながらこれらのうちE4orf4は5'非翻訳領域に対する機能も有している可能性がある。研究最終年度には、E4orf4を含むRNA結合タンパク質群のin vivoにおける解析を行っていく予定である。分子生物学的実験を行うに際して、実験プロトコールの再検討などにより、試薬類の使用量を予定していた使用量をよりも少なくすることができたため、使用金額が計画していた額よりも若干低額となった。購入したプライマーや試薬の購入金額が割引価格となり、予定していた金額より低額となったため。新プロトコールをさらにブラッシュアップし、次年度の実験スケールを再検討し、より効率的な実験を行っていく予定である。発生した次年度使用額は物品費として使用する予定である。
光合成生物における亜硝酸還元酵素およびその電子供与系の生化学的研究

光合成生物の窒素同化系では、亜硝酸還元酵素(NiR)やグルタミン酸合成酵素が、フェレドキシン(Fd)を介して光還元力を利用しながら機能している。シアノバクテリアPlectomenaboryanumではNiRドメインとFdドメインが融合した新規酵素の存在が知られている。この酵素の反応機構を高等植物やその他のシアノバクテリアの亜硝酸還元系と比較検討することにより、光還元力を利用するための分子機構を解明できると考え、研究を実施してきた。これまで以下の成果を得た。1)Plectonema boryanumからNiR/Fd融合酵素をコードする遺伝子と、Synechococcus sp.PCC6803から従来型のNiR遺伝子を、それぞれPCR法でクローニングした。これらの遺伝子をNiRの補欠分子族であるシロヘム合成を司るcysGの共発現系を活用し、機能をもった活性型の組換え酵素を作製した。2)組換え酵素の活性特性を電子供与体としてFdドメインと従来のFdを用いた場合で解析できる実験系を構築し、両酵素ともFdに依存した活性を持つことを明らかにした。一方、Fdドメインに依存した活性は検出限界以下であることが判明した。3)NiR/Fd融合酵素に対する特異抗体を作製し、P.boryanum細胞内に存在する亜硝酸還元活性としてNiR/Fd融合酵素が生理的に寄与しているかどうか、酵素活性もつ蛋白質画分の抗体で検出、確認した。4)Fdドメインのみを機能的発現させ、電気化学測定法で酸化還元電位を決定し、Fdより大きく電位が高いことを見いだした。そして、このFdドメインはトウモロコシのFd:NADPH酸化還元酵素から電子を受容し、シトクロムcへ電子を供与する、いわゆる電子伝達活性を持つことを確認した。5)このFdドメインからNiRドメインへの電子移動が起こるかどうか、NADPH/FNR/Fdのレドックスカスケードin vitroで再構成し解析した。その結果、FdドメインがNiRドメインと融合した状態であっても、また別個の分子として存在する状態であっても、ドメイン間の電子移動が起こることを見い出した。ただし、この電子移動の速度は、PetFと呼ばれる従来のFdに比べ非常に遅く、NiRの効率のよい触媒反応を支えるには不十分であると結論した。シアノバクテリアの一種PlectonemaboryanumではNiRドメインとFdドメインが融合した新規酵素の存在が知られているが、この酵素の構造や反応機構を解明し、FdとNiRが別の分子として機能している高等植物の亜硝酸還元系と比較検討することにより、両者での亜硝酸還元過程の共通点や相違点を明らかすることを目的とした。本年度は以下の研究を行った。1)Plectonema boryanumのNiR/Fd融合酵素をコードする遺伝子をPCR法でクローニングし、大腸菌内で発現させた。この際、NiRの補欠分子族であるシロヘム合成を司るcysGの共発現系を活用し、機能をもった活性型NiR/Fd融合酵素の組換え酵素を取得した。この酵素に対する特異抗体を作製し、元の細胞内で本酵素が融合型で発現していることを確認した。2)同様に、NiRドメインとFdドメイン単独に相当する遺伝子領域および融合型のNiRを持たないSynechocytis6803のNiRの機能的発現を行った。3)両組換え酵素の活性特性を電子供与体としてメチルビオローゲン、従来のFd(PetF)、Fdドメインを用いて、比較解析した。その結果、融合NiRのFdドメインが電子供与体として、機能するが、その活性はPetFに比べ低いことが判明した。今後、Fdドメインの還元系の探索が必要である。4)NiRの結晶化に着手した。

4)Fdドメインのみを機能的発現させ、電気化学測定法で酸化還元電位を決定し、Fdより大きく電位が高いことを見いだした。そして、このFdドメインはトウモロコシのFd:NADPH酸化還元酵素から電子を受容し、シトクロムcへ電子を供与する、いわゆる電子伝達活性を持つことを確認した。5)このFdドメインからNiRドメインへの電子移動が起こるかどうか、NADPH/FNR/Fdのレドックスカスケードin vitroで再構成し解析した。その結果、FdドメインがNiRドメインと融合した状態であっても、また別個の分子として存在する状態であっても、ドメイン間の電子移動が起こることを見い出した。ただし、この電子移動の速度は、PetFと呼ばれる従来のFdに比べ非常に遅く、NiRの効率のよい触媒反応を支えるには不十分であると結論した。
アスコルビン酸の副腎皮質層特異的ステロイドホルモン産生系への関与とその分子機構

本研究は、体内で最も濃度が高い(20mM)副腎でのアスコルビン酸(Asc)の役割を副腎皮質の層別機能との関連から解明することを目的とした。遺伝的にAsc合成不能なラットを用い、Ascは球状層(zG)におけるアルドステロン生成に必須である通常の還元系に加えて補助的に電子を供与する因子となることを示唆する結果を得た。酸化されたAscを還元型に戻す系に関与するOMbがzGに多いこともAscがzGにおいてより重要であることを裏付けると考えられた。ヒトを初めとする霊長類は、ビタミンCであるアスコルビン酸(Asc)を体内で合成できない。よって、Ascを食物や薬剤などから摂取せねばならないが、副腎は体内でAsc濃度が最も高い臓器として知られる(約20mM)。壊血病の病因に端を発し骨形成・カテコールアミン生成への関与や抗酸化剤としてのAscの作用はよく知られているが、最大濃度を示すこの副腎に固有のAsc作用については副腎の髄質におけるカテコールアミン(ノルアドレナリンなど)生成系での電子供与体としての作用のみである。皮質は球状層、束状層、網状層の三層からなり、各々鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド及び副腎性アンドロゲンを特異的に産生する。本研究は、ステロイドホルモンを産生する副腎皮質に固有なAscの作用を、副腎皮質の層別機能との関連という新しい視点から分子レベルで解明することを目的としている。ラットはAscを体内で合成する。よって、遺伝的にAscを合成できない骨形成不能ラット(ODSラット)を用いて、in vivoでの生体内のアスコルビン酸(Asc)量とステロイドホルモン動態との関係を詳細に検討した。ODSラットの体内に留まるAsc量は、飲料水に添加するAsc量により自由に調整することが可能であった。血漿、副腎などでのAsc及び各種ステロイドホルモン量をHPLC又はRIA-assayにて、また、体内のAsc量と副腎皮質の層特異的なステロイド合成酵素(P450aldoおよびP45011β)の発現量との関係は免疫組織化学的、蛋白化学的に検討した結果、Ascは、副腎皮質球状層のアルドステロン合成に特異的に関与することが示唆された。次いで、球状層特異的に発現するP450aldo、束状層特異的に発現するP45011βを大腸菌に大量に発現させる目的で、発現ベクターの構築を試みた。種々の発現ベクターを試みた結果、pTrcHis2AにP450遺伝子を組み入れることに成功した。前年度は主に生化学的手法によりAscの副腎皮質におけるステロイド合成への関与を詳細に検討した。特に球状層のアルドステロン合成に関与することを示唆する結果を得た。今年度は球状層特異的に発現するP450aldo、束状層特異的に発現するP45011βを大腸菌に大量に発現させる目的で発現ベクターの構築を試みた。前年度、pTrcHis2AにP450遺伝子を組み入れることに成功したが、ヘムタンパク質としての性質を有するP450の発現には至らなかった。発現ベクターをpET22b(+)に変え、インサートとして組み入れるP450遺伝子の断片を検討した結果、発現ベクターの構築に成功した。現在大量発現を試みている。ヒト副腎におけるArc系の関与も検討する目的で、ヒト副腎の層別機能を免疫組織学的に詳細に検討した。ヒト副腎では恒常的にP450aldoを発現しているcell clusterが存在するにとを新しく見いだした(J Clin Endocrinol Metab, in press)。ヒトP450aldoの大腸菌での大量発現にも着手した。

よって、Ascを食物や薬剤などから摂取せねばならないが、副腎は体内でAsc濃度が最も高い臓器として知られる(約20mM)。壊血病の病因に端を発し、骨形成・カテコールアミン生成への関与や抗酸化剤としてのAscの作用はよく知られているが、最大濃度を示すこの副腎に固有のAscの作用については副腎の髄質におけるカテコールアミン(ノルアドレナリンなど)生成系での電子供与体としての作用のみである。皮質は、球状層、束状層、網状層の三層からなり、各々鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド及び副腎性アンドロゲンを特異的に産生する。本研究は、ステロイドホルモンを産生する副腎皮質に固有なAscの作用を、副腎皮質の層別機能との関連という新しい視点から分子レベルで解明することを目的とした。