hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織と戦略の相互作用に関する実証研究

今年度は、組織と戦略との相互化について,多角化企業の本社部門と事業部門の相互依存関係という観点から,多角化企業のかつての「コア事業部」で,現在は「非コア事業部」となっている事業部が,業績不振にも関わらず事業戦略を転換しないメカニズムを考察した.具体的には,日本の代表的な重工業メーカーを事例として,以下のような結論を導出した.多角化企業におけるかっての「コア事業部」で,現在は「非コア事業部」となっている事業部が,業績不振にもかかわらず戦略を転換しないのは,事業の多角化の進展と共に当該事業部が「非コア事業部」化するにつれて,まず(1)全社側の問題として,i)「非コア事業部」に対する本社トップの関心や理解が低下し,設備投資が抑制され,大胆な戦略転換の発想が生じにくくなると同時に,ii)本社トップの関心低下によって事業部長の内部昇格制度が維持されるため,事業部の価値観が継承されやすくなる.他方(2)事業部側の問題として,「非コア事業部」化によって「範囲の経済」の恩恵の影響をより受けやすくなるため,事業部内に事業存亡の危機感が醸成されにくくなる.そして,このような(1)と(2)の2つの経路が合成された結果,「非コア事業部」の価値観が維持されることとなり,業績不振を招いている事業戦略が転換されないのである.この調査結果より,「コア」事業部との間に「範囲の経済」が存在している「非コア」事業部の業績不振を立て直すためには,「非コア」事業部の自主再建に委ねるのではなく,全社トップの「非コア」事業部への積極的関与が必要になる,ということを示唆した.なおこの調査結果は,平成19年度に発行された近畿大学経営学部の研究紀要と,日本経営学会で発表された.今年度は,組織と戦略との相互作用について,まず収益性の低迷に苦しんでいる企業が,その低迷から脱却するべく様々な戦略転換や組織変革を実施しているにもかかわらず,その低迷「構造」から抜け出すことができない「再生産」メカニズムを,企業の製品戦略を分析し,その背景要因を考察した.これまでの研究調査から,業界全体として成長局面を迎えている日本の造船業には,高い経済成果をあげている企業と,必ずしも十分な経済成果を達成していない企業の両方が混在しており,このような業績格差を生み出す要因として,各社の製品戦略の違い,具体的には,現在の日本の造船業では「製品差別化」戦略よりも「コスト・リーダーシップ」戦略の方が収益性に有効であることを実証した.次に「コスト・リーダーシップ」戦略を採用しているのは,主に企業規模の小さい「中手」と呼ばれる企業群であるのに対して,「製品差別化」戦略を採用しているのが,規模が大きく,技術力が高い,資金力の豊富な「大手」と呼ばれる企業群であることを指摘し,規模が大きく,技術力も高く,資金力が豊富である「大手」企業は業績不振にもかかわらず,なぜ戦略転換しないのかという点について更なる調査を進めた.この結果,「大手」企業は,(1)他の事業部との活動の共有度が高く,(2)全社に占める造船事業の比率が低いために,「中手」企業に見られるような大胆な投資ができず,また他の事業部を意識した製品の製造から撤退できないことが明らかとなった.この調査結果より,「全社戦略(とりわけ,多角化によるシナジー効果の追求)」は,「事業戦略」の戦略不全を引き起こすことがあり,通常の教科書においては,「全社戦略」と「事業戦略」は分けて考えられているが,実は両者は不可分なものであり,両者は同時に考慮しなければならないことが示唆された.なおこの調査結果は,平成19年3月に岡山大学で開かれた研究会で発表され,平成19年度中に雑誌論文に発表される予定である.今年度は、組織と戦略との相互化について,多角化企業の本社部門と事業部門の相互依存関係という観点から,多角化企業のかつての「コア事業部」で,現在は「非コア事業部」となっている事業部が,業績不振にも関わらず事業戦略を転換しないメカニズムを考察した.具体的には,日本の代表的な重工業メーカーを事例として,以下のような結論を導出した.多角化企業におけるかっての「コア事業部」で,現在は「非コア事業部」となっている事業部が,業績不振にもかかわらず戦略を転換しないのは,事業の多角化の進展と共に当該事業部が「非コア事業部」化するにつれて,まず(1)全社側の問題として,i)「非コア事業部」に対する本社トップの関心や理解が低下し,設備投資が抑制され,大胆な戦略転換の発想が生じにくくなると同時に,ii)本社トップの関心低下によって事業部長の内部昇格制度が維持されるため,事業部の価値観が継承されやすくなる.他方(2)事業部側の問題として,「非コア事業部」化によって「範囲の経済」の恩恵の影響をより受けやすくなるため,事業部内に事業存亡の危機感が醸成されにくくなる.そして,このような(1)と(2)の2つの経路が合成された結果,「非コア事業部」の価値観が維持されることとなり,業績不振を招いている事業戦略が転換されないのである.この調査結果より,「コア」事業部との間に「範囲の経済」が存在している「非コア」事業部の業績不振を立て直すためには,「非コア」事業部の自主再建に委ねるのではなく,全社トップの「非コア」事業部への積極的関与が必要になる,ということを示唆した.なおこの調査結果は,平成19年度に発行された近畿大学経営学部の研究紀要と,日本経営学会で発表された.
『WTOと持続的開発』という大前提の下で財・サービスの自由貿易に欠かせないファイナンスの基本モデルを組み込みながら効率のよい自由貿易の枠組みを考慮・分析する試みである

本研究は『WTOと持続的開発』という大前提の下で財・サービスの自由貿易に欠かせないファイナンス基本モデルを組み込みながら効率のよい自由貿易の枠組みを考慮・分析する試みである。今年度は、昨年度に引き続き調査・収集データを分析した諸結果の精緻化を進めた。1)5月10日から8日間ワシントンDCにある世界銀行研究所において研究のリサーチ活動を行なった。世界銀行研究所(WBI)でのworkshopでは50名40カ国からのWTO研究者、貿易交渉担当者と共にSussex UniversityやWBIのインストラクターから貿易交渉、地域の貿易協定、環境と労働基準、関税の影響、貿易サービス、保護貿易や農業、RTAにまで幅広く学ぶことができ、自分の研究テーマである関税やファイナンス、国際貿易の研究に役立ち、広い分野での知識も得ることができた。2)7月2日31日まではバングラデシュ、ダッカにおける調査旅行を行った。この調査旅行はとても実り多いものであり、Center of Policy Dialogue(CPD)では事務局長や研修部長を含む著名な経済学者が多く出席し素晴らしい意見や提案を得た。Bangladesh Foreigninstitute(BFIT)ではバングラデシュ人民共和国の商務大臣と商務長官が出席され、私はたくさんのダッカの貿易経済者と交流を持つことができた。「途上国の持続的成長」を確保するために、途上国の国内金融市場を活性化することが望ましいという前提の下で、その方策をWTOルールおよび軽量分析の視点から考察し、具体的な政策指向型のアイデアを提供することを目標としている。今年度は、カンボジアでのESCAP/WTO ART Net Capacity Building Workshop参加と、バングラディッシュにおいて、「バングラディッシュの金融サービスのケーススタディ」の研究リサーチ活動を行った。1)カンボジアでのWorkshopではWTO,UNCTAD,UNDP,UNESCAPなどのWTO研究者と共に最新の国際貿易研究モデルへの理解を深めた。またWTO交渉を把握するための貿易シュミレーションは大変有益であった。2)ダッカではバングラディッシュにおけるWTO研究の第一人者である、M.M.Rahman教授に会いバングラディシュにおける金融政策のヒアリングを行い、バングラディッシュ銀行のGeneral Managerと将来の金融セクターの政策について協議した。ダッカ証券取引所のDirectorとは、ダッカ証券取引所での自由化(緩和)政策について意見交換をし、様々な法人株主とのインタビューやダッカにある多様な分野の機関について調査を行った。研究リサーチ活動で得られた新たな問題や指摘アドバイスを基に政策指向的な研究成果の発表論文を現在執筆中である。
ランダム量子系のスケーリング理論

本研究では,不規則性(ランダムネス)を伴う量子系を,スケーリング理論とユニバーサリティの概念に立脚して理解する。特に,冷却原子系,乱れたFloquet系や非エルミートトポロジカル系など新奇な物質における量子相転移のスケーリング理論を導き,これらを統一的に理解する。また,孤立量子系が熱平衡に達するプロセスを議論する際に重要となるmany-body localizationを記述するスケーリング理論を導く。代表者らはランダム量子系の研究を行う上で,数々の数値的手法を開発してきたが,それを上記のテーマに適用するとともに,新たな手法を開発する。格子欠陥や不純物のあるランダム電子系の普遍的な性質を、スケーリングの視点から統一的に理解しようとする理論課題である。冷却原子系のスケール理論、乱れたFloquet系や非エルミートトポロジカル系のスケール理論を導出する。これらの研究にともない、数値計算手法を新たに開発し、オンラインでの公開も行う。統計力学の基本であるエルゴード仮説が成立しないといわれる孤立量子系について、many-body localizationを記述するスケーリング理論を導き量子スピン系のシミュレーション等で実証する。転送行列法、深層学習などの新規に提案された計算方法を導入して大規模計算を行うことで、世界的なレベルの学術的推進が期待される。
地震活動と地盤構造の地域性を考慮した都市の地震被害リスク評価

地域の地震活動性を反映した地震危険度予測及び建物群の被害率予測の手法を開発した。まず、地域の地震活動度を表す指標としてある地域における地震の年平均発生発生数とマグニチュードの関係を用い、これを上限値を考慮した宇津の方法によりモデル化し、地震の発生過程をポアソン分布として、エプスタイン-ロムニッツの方法により、ある想定期間内の最大地震の確率分布を求めた。更に、適切なアテニュエーション式を想定して、想定期間内の最大地動強さの確率分布を評価した。地動強さの指標としては、地動加速度及び震度階の2つを考慮した。例として、青森県東方沖の地震域を取り上げ、最大地動と想定期間の関係を考察した。次に、地動強さと建物耐震性能を共に確率変数と考え、損傷レベルを考慮した建物群の被害率曲線を推定する手法の開発を行った。作用地震力と建物耐震性能の確率分布はいずれも対数正規分布と仮定し、損傷レベルは塑性率により考慮し、信頼性理論を適用して建物被害率を評価した。地動強さとして加速度或いは震度を用い、被害率曲線を簡潔な近似式で表現した。また、兵庫県南部地震における建物被害率の資料を用い、震災の帯を含む大きな地動レベルの地域での家屋被害率曲線について検討した。さらに、強震動が作用する場合の非線型構造物の損傷性状を解析する手法を開発し、木造塔状建物の浮き上がり非線形地震応答性状を解明した。
組成と層間キャリア濃度差の精密制御による100K級銅酸化物超伝導体のTc向上

銅酸化物超伝導体におけるブロック層の「乱れ」の効果とCuO2層の枚数が超伝導特性に与える影響を調べてTcの向上指針を探ると共に、CuO2面を4枚有する頂点フッ素系単結晶について光電子分光測定を行い、下記の結果を得た。1.ブロック層の乱れによる不均一局所的格子歪みの大きさを制御したBi2Sr2-xLnxCuO6+δ(Ln=La,Gd等)においてSTM/STS測定を行った。その結果、いずれの系にもナノメートルスケールのギャップ不均一性が存在するものの、特に局所的格子歪みの大きいLn=Gdでは不均一性が大きく(D>50meV)かつV型の構造を有する、いわゆる擬ギャップ型の特徴を示す領域が顕著だった。擬ギャップ領域の増大は、Bi2212の不足ドープ領域においても観測されており、CuO2面外の化学的不均一性が擬ギャップ領域の増大(=超伝導領域の減少)に起因するものであることを示している。2.CuO2面の多層効果ブロック層の乱れはTcに破壊的効果を与えるが、多層型ではブロック層から離れている内側のCuO2面(IP)は乱れの影響を受けにくいため、IPへの最適なキャリアドープ実現により、より高いTcが期待できる。Hg系およびF系多層型超伝導体のTcとCuO2面の枚数(n)との関係を調べた結果、n=3においてTcの最大値を有し、n=5以上ではそのTcはほぼ一定となった。これは、多層系では、ドープされたキャリアがほぼ外側のCuO2面(OP)に偏在し、IPへのキャリアドープが有効に行われなかったことを示唆している。3.セルフドーピングの可能性ブロック層を乱さず、かつ、IP、OP共にキャリアがドープされた状況が実現していることを示唆する結果が、n=4のF系単結晶の光電子分光によって得られた。IP、OPに対応する2本のバンドが観測されており、かつその面積から各々のバンドにドープされたキャリア数を見積もると、正孔0.2(Band P)、電子0.2(Band N)となる。このことは、本系ではIPからOPへ(あるいはOPからIPへ)電子が移動し、それぞれ正孔、電子がドープされた状態となり、Tc=55Kの超伝導が実現したことを示している。高温超伝導体は、電荷供給層(CRL)と無限層(CaCuO2)が積層した結晶構造となっており、CRLに含まれる特徴的な元素をもって、La系、Bi系、Tl系、Hg系、Cu系、F系などと呼ばれる。それぞれの系には、無限層構造に含まれるCuO2面の枚数(n)の変化もある。TcとCuO2面の枚数(n)との関係は、銅酸化物のTcの極限を追求する上でも興味深い問題である。現在、多くの系でTcはn=3で最高値となり、それ以上CuO2面を増やすと逆にTcが低下することが知られている。nを限りなく大きくするとTcは最終的にどうなるのであろうか?この問いの答えは、CRL間のCuO2面にキャリアがどのように分布するかに依存すると考えられる。キャリアが全てのCuO2面にほぼ一様に分布するという考え方に従うと、総キャリア量が増え続けない限り、CuO2面一枚当たりのキャリア濃度が減少するため、超伝導はいずれ消失するであろう。ところが、NMRによる多層型銅酸化物の系統的な測定は、キャリアはCRLに隣接するCuO2面(OP)に多く存在し、内側のCuO2面(IP)には少ないことを示している。この場合、Tcのn依存性はそれほど単純ではないはずである。そこで、我々はHgBa2Can-1CunOyとBa2Can-1Cun(O,F)2について高圧下で合成し、Tcのn依存性を調べた。その結果、n9においても80100Kという高いTcが維持され、n【greater than or equal】5でTcがnに依存しなくなることを見いだした。Hg-1245においてOPで超伝導がIPで反強磁性がNMRとμSR測定によって観測されていることを考慮して、CRL間に幾ら多くのCuO2面が有っても、CRLは高いTcを維持するのに十分なキャリアを隣接するCuO2面には与えることができ、その結果、Tcがnに対して一定となると解釈した。

2.CuO2面の多層効果ブロック層の乱れはTcに破壊的効果を与えるが、多層型ではブロック層から離れている内側のCuO2面(IP)は乱れの影響を受けにくいため、IPへの最適なキャリアドープ実現により、より高いTcが期待できる。Hg系およびF系多層型超伝導体のTcとCuO2面の枚数(n)との関係を調べた結果、n=3においてTcの最大値を有し、n=5以上ではそのTcはほぼ一定となった。これは、多層系では、ドープされたキャリアがほぼ外側のCuO2面(OP)に偏在し、IPへのキャリアドープが有効に行われなかったことを示唆している。3.セルフドーピングの可能性ブロック層を乱さず、かつ、IP、OP共にキャリアがドープされた状況が実現していることを示唆する結果が、n=4のF系単結晶の光電子分光によって得られた。IP、OPに対応する2本のバンドが観測されており、かつその面積から各々のバンドにドープされたキャリア数を見積もると、正孔0.2(Band P)、電子0.2(Band N)となる。このことは、本系ではIPからOPへ(あるいはOPからIPへ)電子が移動し、それぞれ正孔、電子がドープされた状態となり、Tc=55Kの超伝導が実現したことを示している。
多成分流体系の非平衡熱力学の微視的基礎づけと非線形揺動

一成分流体系の非平衡熱力学は,連続の式、ナビエストークス方程式、熱伝導方程式など確立したものであり、微視的なリウビル方程式からも導出される。しかしながら、多成分流体系で対流、拡散、反応、熱伝導などが進行している系についての流体力学の一般的方程式は導かれていない。基準となる原理をどこにおくかということである。我々は、局所平衡分布を標準として分布関数を展開するZubarevの方法を用いて、微視的な運動方程式にZubarevの射影演算子を導入して、熱力学の可逆部分が、反対称行列と示強パラメータの積で表されることを導いた。このことから、エントロピーを生成しない、ということが自動的に出てくる。まず、この一般形式を用いて、一成分系について既知の質量保存則、運動量保存則、エネルギー保存則が導出されることを確認した。さらに、多成分について、熱力学を手がかりにして、マクロ変数を選び、それに対応する局所平衡分布を導入して、非平衡熱力学の可逆部分を導出した。この際に、質量保存則、運動量保存則は導出でき、それなりに物理的解釈が可能であるが、エネルギー保存則、拡散流に対する方程式には、非常に複雑となり、本質的に巨視的変数で閉じない可能性を示唆する困難が現れている。この件については、さらなる解析が必要である。Zubarevの射影演算子に対して相補的な、物理量に対する時間依存型射影演算子の導入を行い、非平衡熱力学に対応するランジュバン方程式を導いた。物理量に対する発展方程式が基本的に非線形であるために、分布関数の場合と異なり、射影演算子形化したものとなった。さらに、また、ランジュヴァン方程式をもとにして、揺らぎの実現経路に関する確率分布を経路積分法で導入し、揺らぎの時間反転対称性とエントロピー生成との関係(「揺らぎの定理」)について新たな視点を導出した。一成分からなる流体力学の発展方程式は,連続の式,ナビエ・ストークス方程式,熱方程式からなるが、多成分系については,現象論も確定していない。ズバレフの局所平衡アンサンブルを用いて,巨視的変数に対して非平衡熱力学に対応する発展方程式を導く。まず、一成分系について、上記の現象論が得られることを確認した。現在,多成分系について,中心速度(全体としての対流運動)と拡散速度(各成分の拡散運動)に対応する局所平衡アンサンブルを計算している。実は,必ずしも,熱力学変数で閉じた式にならないのではないか、と思われる。次に,揺らぎの理論の非平衡への拡張を試みた。オンサーガー・マックラップの理論のように、揺らぎの実現確率を経路積分で表示すると,平衡状態における揺らぎについては、ある揺らぎとその時間反転の揺らぎについて、実現確率の比の対数をとると、終状態と初期状態のエントロピーの差になっていることを示すことができる。第二法則と辻褄の合う形になっている。さらに、二変数が散逸的に振動運動をする系について、その揺らぎの実現確率の比の対数をとると、揺らぎの循環が現れることが分かる。これは、かってプリゴジンらが、反応系について,揺らぎの循環とエントロピー生成速度を結びつけようとしたことに対応する。(成果として投稿予定)Zubarevの局所平衡アンサンブル理論を用いると,非平衡熱力学の可逆部分の発展については,巨視的変数のポアッソン括弧のアンサンブル平均を係数として、示強パラメータと線形関係にあることが分かっているが、その係数を本年度は多成分系について計算を行った。運動量保存則について、一成分系と同じようなナビエ・ストークス方程式が成り立つのか否かが興味あるところであるが,予想を超えるものである。

まず、可逆部分は熱力学変数で式が閉じないことである。また、慣性項、圧力項が一成分系と大きく異なることである。本年度は、オデッサ環境科学大学のGerasimov教授のグループを訪問して、多成分系,特に,粉体系における不可逆過程に関する研究連絡を行った。熱力学的変数:によって記述される多成分流体系について、時間に依存する「射影演算子」を導入して、揺らぎに関するランジュヴァン方程式の導出を行った。流体方程式の非線形を入れた方法では、射影演算子が射影演算子の性質(二乗しても元の演算子)を満たさず、またエルミート性を持たない等、問題があったが、射影演算子の定義を変えて、平均値からのずれに対する線形近似が厳密に出るようにしたところ、線形項について、揺動散逸定理に対応する形式が得られた。また、ランジュヴァン方程式において、ノイズ項について、ガウス白色ノイズの近似をして、経路積分法により、揺らぎの経路の確率を導入すると、ある揺らぎの確率に対して、その時間反転をした揺らぎの確率との比をとると、エントロピー生成速度で現れることを示した。さらに、非平衡開放系における揺らぎについては、「揺らぎの循環」が、エントロピー生成速度に対応することを示した。
高次機能半導体ナノフォトニックデバイス

グリーンテクノロジーの中で重要な技術の一つは、省エネルギー化のための通信の全光化である。研究代表者らは、偏光双安定面発光半導体レーザを実現し、これを1ビットの光メモリ素子として用い、これまで実現困難とされていた光バッファメモリを実現した。40Gbps NRZ信号のメモリ動作や、VCSELを4個用いた4ビット動作を確認した。本研究では、これらの研究成果を生かし、省電力光RAMの実現を"キャリングビークル"とし、高次機能半導体ナノフォトニックデバイスを研究する。特に、長距離伝搬表面プラズモンモードによる微小領域への光の閉じ込めによる半導体レーザの省電力化をはかる。又、新しい自由度として強磁性電極からVCSELへのスピン偏極電子注入により、新しい光機能の実現をめざす。これらの新しい物理現象の導入と、VCSELのQ値制御など光量子エレクトロニクス的手法の融合により偏光双安定VCSELの省電力化・高速化の極限を追及する。本研究の初年度である平成24年度は、極微小領域に光とキャリヤの閉じ込めが可能で、低しきい値電流が期待できる半導体マイクロレーザの構造を検討し、作製のための埋め込み材料等を準備した。又、米国サンノゼで開催された国際会議CLEO2012に出席し、世界の最新の研究状況を調査した。平成24年度科学研究費補助金基盤研究(S)採択に伴い、5月30日で本研究課題は廃止になったが、2か月間で行った研究成果は、基盤研究(S)の一部として有効に活用する。
肺高血圧血管平滑筋における一酸化窒素を介するイオンチャンネルの調節機構

本研究では、肺高血圧血管平滑筋のイオンチャンネル解析のための血管平滑筋細胞単離を確立することができた。すなわち、(1)ラットにエタノール麻酔したのち、心臓拍動中に速やかに心肺一塊にして摘出し、normal Tyrode液中に浸した。血液除去した後、Ca^<2+>-free Tyrode液に移し、肺動脈を剥離した。(2)剥離した肺動脈をCa^<2+>-freeTyrode液に浸したまま30分間インキュベートして十分弛緩させた。その後、20mg/mlコラゲナーゼを含むCa^<2+>-free Tyrode液にて37°Cで90分間酵素処理し、Kraftbrue(KB)液に移し、大口径のピペットを使って、液が混濁するまで吸引排出して撹拌し、肺動脈の血管平滑筋細胞を分散した。(3)ピペッテイングによって得られた混濁液をナイロンメッシュでろ過し、細胞懸濁液を作成した。(4)これを5°Cにて90分静置し、単離した血管平滑筋細胞の沈殿を促した。一方、培養細胞は、肺血管平滑筋の純粋培養が必要であり、また、継代培養により細胞形質が変化することが問題であるので、本研究には不適当である。単離細胞に対し、芯入ガラス管を、電極抵抗を5MΩ前後になるように電極プラーにて2段牽引して作成したパッチ電極を用いて単離した血管平滑筋の膜電位および膜電流の記録をホールセルパッチクランプ法によって行った。パッチ電極には、電極内液(High-K^+pipette solution)を充填した。肺高血圧血管では、高カリウム脱分極状態での細胞内カルシウム濃度の変化が少なくても良く弛緩することが判明した。また、一酸化窒素は、カルシウム感受性に変化を与える可能性がある。NOによる血管平滑筋細胞内cGMPの増加は、細胞質内から細胞外へのCa^<2+>の流出(カルシウムポンプの活性化による)と細胞内カルシウム貯蔵部位である小胞体への取り込みを促進し、結果として細胞質内遊離カルシウム濃度が低下し血管の弛緩が惹起される。最近、cGMPがカリウムイオンチャネルを活性化するために、細胞内K^+が細胞外に流出し細胞内電位が低下し過分極状態となり、膜電位依存性カルシウムチャネルを介する細胞外から細胞内へのカルシウムの流入が減少するため弛緩が起こる可能性も指摘されている。一方、一酸化窒素がcGMPを介さず直接カリウムイオンチャネルに作用するという説もある。本研究では、パッチクランプを用いて、単離した肺高血圧血管平滑筋におけるイオンチャネルの変化を記録することを目的とした。本年度は、摘出肺動脈でのカルシウム濃度の変化を蛍光指示薬であるFra-PE3を用いて検討したが、Fra-PE3の負荷条件は、従来報告されている大動脈や腸管膜動脈と異なることが判明した。特に温度変化の条件が重要である。次に単離肺血管平滑筋細胞にたいしパッチクランプにより、whole cell recordingを行うことを目的として、細胞の単離は酵素的に行なった。当初は、ラット主肺動脈を低カルシウム濃度下パパインで12時間低温(4°C)処理したのち、常温に戻しdithiothreitol存在下で肺動脈血管平滑筋の単離を行う予定であったが、現在、他の方法も検討中である。培養細胞は、肺血管平滑筋の純粋培養が必要であり、また、継代培養により細胞形質が変化することが問題である。

すなわち、(1)ラットにエタノール麻酔したのち、心臓拍動中に速やかに心肺一塊にして摘出し、normal Tyrode液中に浸した。血液除去した後、Ca^<2+>-free Tyrode液に移し、肺動脈を剥離した。(2)剥離した肺動脈をCa^<2+>-freeTyrode液に浸したまま30分間インキュベートして十分弛緩させた。その後、20mg/m11コラゲナーゼを含むCa^<2+>-free Tyrode液にて37°Cで90分間酵素処理し、Kraftbrue(KB)液に移し、大口径のピペットを使って、液が混濁するまで吸引排出して撹拌し、肺動脈の血管平滑筋細胞を分散した。(3)ピペツッテイングによって得られた混濁液をナイロンメッシュでろ過し、細胞懸濁液を作成した。(4)これを5°Cにて90分静置し、単離した血管平滑筋細胞の沈殿を促した。一方、培養細胞は、肺血管平滑筋の純粋培養が必要であり、また、継代培養により細胞形質が変化することが問題であるので、本研究には不適当である。単離細胞に対し、芯入ガラス管を、電極抵抗を5MΩ前後になるように電極プラーにて2段牽引して作成したパッチ電極を用いて単離した血管平滑筋の膜電位および膜電流の記録をホールセルパッチクランプ法によって行った。パッチ電極には、電極内液(High-K^+ pipette solution)を充填した。肺高血圧血管では、高カリウム脱分極状態での細胞内カルシウム濃度の変化が少なくても良く弛緩することが判明した。また、一酸化窒素は、カルシウム感受性に変化を与える可能性がある。
連続無限気孔を有するドレスレス固定砥粒工具の開発

提案した固定砥粒工具と汎用の工具で目詰まりの発生現象について検討した結果,目詰まりは、(1)高砥粒密度によるチップポケットの形成、(2)工具と工作物の接触面積の増大,(3)非スパイラルによる気孔レスが原因であった.この3因子を考慮すれば、微細砥粒使用の工具でも目詰まりを抑制できることが分かった.また、目詰まりした工具には砥粒径以上の切屑が発生するが、目詰まりしなければ、たとえ微細砥粒使用の工具でも砥粒径以上の切屑は発生しない.工具を製造する際の砥粒率は、使用する砥粒径に関係なく一様で、50%以下にすれば良いことが分かった.提案した固定砥粒工具と汎用の工具で目詰まりの発生現象について検討した結果,目詰まりは、(1)高砥粒密度によるチップポケットの形成、(2)工具と工作物の接触面積の増大,(3)非スパイラルによる気孔レスが原因であった.この3因子を考慮すれば、微細砥粒使用の工具でも目詰まりを抑制できることが分かった.また、目詰まりした工具には砥粒径以上の切屑が発生するが、目詰まりしなければ、たとえ微細砥粒使用の工具でも砥粒径以上の切屑は発生しない.工具を製造する際の砥粒率は、使用する砥粒径に関係なく一様で、50%以下にすれば良いことが分かった.本研究は、固定砥粒工具に共通する目詰まりを防止するために、切屑の流動性を確保した無限のチップポケットに切屑を連続排出することのできるスパイラル構造の固定砥粒工具を作ることである.工具開発は、高工具寿命の推進、加工時や工具製造時のインフラの整備による工具コストの削減、環境に対する負荷の軽減を期待している.研究は7項目について行なうが、今年度(22年度)は主に1)4)について検討した.1)各種砥粒の分散・凝集性および共析量の検討.2)複合めっき工具の製作条件の検討.砥粒層の厚み・硬度・砥粒密度および砥粒径に対する工具表面品質の関係.3)砥粒層の厚み・砥粒密度に対する砥粒保持力の検討.4)試用工具の最適化(ワイヤ径・スパイラル角).5)最適化工具の砥粒径と目詰まりの関係.6)砥粒径・チップポケットサイズが工具寿命、加工品質に与える影響.7)制御パラメータと評価パラメータの相関.その結果、(1)無機砥粒を一時的に陰極側面に滞留させることで、電鋳方式の複合めっきと同様に共析できた.滞留を促進させる方法にポリプロピレン製のブラシを採用し、同時に陰極表面の活性化を図った.(2)工具表面の品質はめっき厚みを制御することで可能である.工具表面の品質低下は,めっき厚の上昇に伴って、うねり成分が増大し、多数の突起物が発生して生じる.この突起は電着応力による転移で起こり,特に大きい突起物は,転位した相の凸部に局所的に大きな電流が流れることで,局所的に半球状拡散層(突起物)が形成されて起こる.めっき厚を薄層にすれば、うねり成分は小さくなり,突起物の発生が抑えられ、工具表面の品質が向上した.(3)工具の硬度と砥粒の保持力は亜リン酸に含有する燐が効果的である.亜リン酸の添加量が少ないと砥粒層にクラックが発生し大きく剥離するが,20g/L以上(Pの量=7.3g)になると,剥離は改善された.一方硬度は,添加量が20g/L以上になると徐々に減少していくが,Hv800前後が得られた,亜燐酸を添加したことで,含有するPがNiと金属間化合物を作り結晶格子にひずみを生じ硬度が上昇する.(4)目詰まりは高砥粒密度によるチップポケットの形成,工具と工作物の接触面積の大きさ,非スパイラルによる気孔レスが原因であることを明確にした.スパイラルは連続気孔を創製するのに有効であり、採用した範囲のスパイラル角とワイヤ径の大小は、目詰まりに関係する因子としては小さい.したがって、前述した目詰まりの因子を工具製造時に考慮してやれば、アシストレスの固定砥粒工具を実現できる.本研究は、固定砥粒工具に共通する目詰まりを防止するために、切屑の流動性を確保した無限のチップポケットに切屑を連続排出することのできるスパイラル構造を有するアシストレスの固定砥粒工具を開発することである.工具は、高工具寿命の推進、インフラの整備による工具コストの削減、環境に対する負荷の軽減を期待している.研究は7項目について行なっている.1)各種砥粒の分散・凝集性および共析量の検討.2)複合めっき工具の製作条件の検討.砥粒層の厚み・硬度・砥粒密度および砥粒径に対する工具表面品質の関係.3)砥粒層の厚み・砥粒密度に対する砥粒保持力の検討.4)試用工具の最適化(ワイヤ径・スパイラル角).5)最適化工具の砥粒径と目詰まりの関係.6)砥粒径・チップポケットサイズが工具寿命、加工品質に与える影響.7)制御パラメータと評価パラメータの相関.前年度は1)4)について検討した.今年度(平成23年度)は主に5)6)について検討した.その結果、(5)チップポケットが形成された砥粒率約68%の工具では、切屑の目詰まりにより力センサが顕著な信号を検知し、系が強く加振されていることが分かった.

一方、チップポケットが形成されない境界の砥粒率は約55%であり、これ以下では研削抵抗が測定され、顕著な信号は発生しない.工具の目詰まりを早期発見するには、この信号の初期を検知すればよい.また、砥粒率を境界の55%以下にすれば、砥粒径を変えても目詰まりのような目立った信号は現われない.しかし、工具を製造する際は、安全率を考慮した50%以下の砥粒率が望ましい/工具の砥粒密度は複合めっき時の電流密度で制御でき、30A/dm2で40%、40A/dm2で50%であった.しかし、50A/dm2以上にすると品質が低下するため、40A/dm2以下が望ましい.(6)砥粒率が約68%と48%で工具寿命を比較した.粒径は共に#2000のWAを採用した.工具寿命は目詰まりの始まりを寿命と定義し、切込み量で示した.その結果、砥粒率48%の工具は切込み量200umでも目詰まりせず、68%の工具より一桁以上長く、さらに伸びることが示された.次に加工面の粗さについてダイヤモンド砥粒とGC砥粒で比較した.工作物には目詰まりし易いアルミを採用した.砥粒率30%(ダイヤ砥粒:粒径#600)の工具でRa32nmの鏡面が得られた.GC#500の比較用工具では、目詰まりが発生し、RaO.26umであった.目詰まりに関係する因子を考慮した工具は、アシストレスの固定砥粒加工が可能であることを示した.本研究は、固定砥粒工具に共通する目詰まりを防止するために、切屑の流動性を確保したスパイラル気孔(チップポケット)に切屑を連続排出することのできるアシストレスの固定砥粒工具を開発することを行なった.その結果、(1)複合めっき時の突起物を抑えるためには,電流密度を下げて,めっき時間を長くすると良い.品質を考慮した工具を製造するためには,40A/dm2以下の電流密度が望ましい.(2)工具が目詰まりすると力センサを取り付けた系が強く加振される研削抵抗の2倍以上のスパイク信号が現われることが分かった.この信号を早期に検知すれば,工具の目詰まりを即座に判断できる.今回使用した砥粒率67%は,切込み量15um前後で初期のスパイク信号を検知した.(3)目詰まりした工具には使用した砥粒径以上の切屑が存在するが,目詰まりしなければ,使用した砥粒径以上の切屑は発生しないことが分かった.(4)目詰まりの有無を判断する砥粒率は,使用砥粒の切屑の大きさから55%前後であることが分かった.また,この砥粒率は,使用する砥粒径に関係なくほぼ一様である.工具製造時は,安全率を考慮して50%以下の砥粒率にすることが望ましい.その際,砥粒率は電流密度で制御でき,30A/dm2で40%,40A/dm2で50%にすることが可能である.(5)目詰まりの原因は,1高砥粒率によるチップポケットの形成,2工具と工作物の接触面積の大きさ,3砥粒周りに連続したスパイラル気孔(チップポケット)がないことである.これらの因子を考慮したスパイラル工具は,アシストレスの固定砥粒加工が可能であることを示した.最終年度(平成24年度)は、研究の成果を国際学会、国内学会等に発表した.研究の目的は、アシストレスの固定砥粒工具を開発することである.初年度は、工具の物性と品質について検討し、改善させたこと.目詰まりに関係する3因子を明確にしたこと.今年度は、目詰まり時に発生する突出した信号を初期検知すれば工具の目詰まりを素早く発見できること.スパイラル構造でチップポケットを形成しない砥粒率(砥粒率50%以下)であれば工具寿命が延びること.砥粒率は電流密度で制御できること.そして、3つの因子を考慮した工具でアシストレスの固定砥粒加工が可能となったことなどから、目的をほぼ達成した.
分化誘導遺伝子の静脈内投与によるマウス肝臓におけるβ細胞の再生

平成15年度の研究で、膵ラ氏島の分化誘導遺伝子であるNeuroDとbetacellulinをHelper dependent adenovirus vectorに組み込んでマウスの静脈内に投与することで、肝臓内に膵ラ氏島様細胞塊が新生し、1回の遺伝子投与で数カ月以上に及ぶ血糖のコントロールが得られることを確認した。この細胞塊がインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、PPなどのホルモンを産生し、免疫電顕的に膵β細胞に特徴的な分泌顆粒を含むことが確認できた。この一連の研究の中で、動物を糖尿病にするだけで、肝臓、脂肪細胞、胸腺、脾臓、骨髄などにインスリン産生細胞が出現するという特異な現象を発見した。平成16年度の研究では、これらの細胞が出現するメカニズム、起源、病理学的意義等に関して詳細な研究をおこなった。糖尿病のモデル動物としては、I型糖尿病モデルとしてSTZ投与、II型糖尿病モデルとしてob/ob、high fat diet動物を作成した。さらに、高血糖モデルとしてグルコースの腹腔内投与をおこなった。これらのモデル動物で共通して、インスリンまたはプロインスリン産生細胞が、骨髄、肝臓、脂肪組織などに出現した。従って、高血糖状態が引き金になって多臓器にプロインスリン産生細胞が出現するということがわかった。次にこれらの細胞の起源を調べる目的で、各種マーカー染色をおこなった。これら多臓器に出現するプロインスリン産生細胞は、CD34,CD45,c-kit, Mac1,CD11c等の抗体で陽性に染色されたことより、骨髄由来の細胞であることが判明した。さらにTNFαが陽性に染色されることより、高血糖状態で出現するこれらの細胞が、肝臓や脂肪組織でおこる糖代謝の異常を引き起こしている可能性が強く示唆された。ヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いて、NeuroD/betacellulin遺伝子を糖尿病マウスにin vivoで投与することで、肝臓内に膵ラ氏島を再生する事に成功し、4ヶ月以上にわたる血糖コントロールを得る事が出来た。従来の報告で、Pdx1遺伝子を投与しマウス肝臓内にβ細胞を再生する試みはあったが、たかだか8日間しか血糖コントロールが得られていない。Pdx1遺法子の投与では、膵内分泌細胞への分化と同時に膵外分泌細胞への分化が誘導されるために、外分泌酵素が肝障害を引き起こし、治療には不向きである事が判明した。一方NeuroD/betacellulinの投与では、血糖値は投与後3週目以降持続して正常化し、糖負荷試験で、血糖反応、インスリン反応ともに正常動物と差がなかった。肝臓におけるラ氏島に特異的な遺伝子の発現をRT-PCRで調べたところ、insulin-1、insulin-2、glucagon、somatostatin、PPおよび、膵特異的グルコキナーゼ、プロホルモンコンバターゼ、電位依存性Kチャンネル等のブドウ糖センシング機構、さらにPdx1、Ngn3、Pax6、Pax4、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1などの転写因子の発現が認められた。免疫組織化学的には、被膜直下に膵ラ氏島に見られる4つのホルモンを有する細胞塊が出現した。免疫電顕による解析で、この細胞塊に含まれる細胞はグリコーゲン顆粒を持たず、インスリン免疫活性を有する分泌顆粒が多数細胞質に観察され、膵β細胞に酷似した超微形態を示した。
2次元レーザー血流測定システムを用いた低侵襲的診断・治療法の口腔外科領域への導入

研究代表者は近年開発された2次元レーザー組織血流測定システムとインドシアニングリーン(Indocyanine Green: ICG)を用いた蛍光血管造影に着目し、これらが顎口腔領域における各種様々な手術・診断等に応用可能と考え、一連の研究計画を立案した。まずこれまでにも継続して行ってきたインドシアニングリーンを用いた血管造影法により組織血流の定量化の研究をすすめた。顎口腔領域の再建に用いる有茎皮弁においてインドシアニングリーン蛍光血管造影を行って計測を行い、データを解析した。従来のバイオイメージングの領域ではインドシアニングリーンによる蛍光血管造影法では組織血流の定量的な評価は困難とされてきた。しかし、われわれの研究グループは世界に先駆けて本法による組織血流の定量化に成功し、報告した。本法は輝度の上昇にかかる時間をパラメータとして血行を評価する方法であるが、さらに今回の解析により血流の定量化に有用な新たなパラメータを発見した。このパラメータによれは同一個体内・同一手術内での組織の血流の変化をとらえることが可能である。ただし現在のところ関心領域ROI(Region of Interest)の設置位置、測定方法など、検討の必要な事項がまだ残存している。われわれは現在さらに臨床材料を増やし、この新たなパラメータの有用性、再現性、妥当性、皮弁の血流の評価以外の応用場面などついて検討を行っている。2次元レーザー血流計を用いた組織血流の評価法の確立については、まず下肢の虚血重症度の評価に応用可能かを確認するための実験を行った。閉塞性動脈硬化症患者に対してプロブ加熱による皮膚灌流量の経時的変化を2次元レーザー血流画像装置により測定した。その結果、本法が重症下肢虚血の診断基準として有用である可能性が示唆された。インドシアニングリーン蛍光血管造影法における血行の定量化に有用な新規パラメータについて解析を進めるにあたり、臨床材料を増やしたいが適切な症例がなかなか増えないこと。インドシアニングリーン蛍光血管造影法における血行の定量化に有用な新規パラメータについて解析を進めるにあたり、適切な患者見つかり次第計測・解析を行っていく予定である。2次元レーザー血流計を用いた組織血流の評価法の確立についても引き続き研究を進める予定である。しかし、われわれの研究グループは世界に先駆けて本法による組織血流の定量化に成功し、過去に報告した。ただし現在のところ関心領域ROI(Region of Interest)の設置個所、測定方法など、検討の必要な事項がまだ残存している。われわれは現在さらに臨床材料を増やし、この新たなパラメータの有用性、再現性、妥当性、皮弁の血流の評価以外の応用場面などについて検討を行っている。蛍光血管造影法による血行の定量化に応用可能な新規パラメータを発見したことは非常に画期的な発見である。

インドシアニングリーン蛍光血管造影法における血行の定量化に有用な新規パラメータについて解析を進めるにあたり、臨床材料を増やしたいが適切な症例がなかなか増えないこと。今回われわれが発見したインドシアニングリーン蛍光血管造影法における血行の定量化に有用な新規パラメータについて解析を進める。臨床材料を増やし、新規パラメータの有用性、再現性、妥当性について解析を進めていく。インドシアニングリーン蛍光血管造影法における血行の定量化に有用な新規パラメータについて解析を進めるにあたり、適切な患者見つかり次第計測・解析を行っていく予定である。2次元レーザー血流計を用いた組織血流の評価法の確立についても引き続き研究を進める予定である。二次元レーザー血流測定機器を購入予定であったがインドシアニングリーンを用いた蛍光血管造影による組織血流の評価の研究を優先させたため二次元レーザー血流測定機器の購入を先送りした。次年度に二次元レーザー血流計を購入し、実験を行う予定である。2017年度に二次元レーザー血流測定機器購入予定である。また口腔外科・形成外科領域を中心とした学会や雑誌で研究発表予定である。
労働者の引退過程に関する法学的研究

1労働者の引退過程に関するわが国のこれまでの法政策を、関係各省庁の政策文書や、各種研究機関の研究調査報告書等をも含めた資料の収集、分析によって跡づけた。その際、テーマが法律学のみならず、社会学、経済学にもわたるものであるので、法律学に限定せずに、幅広く文献・資料の収集を行うよう心がけた。2わが国の労働法の最近の判例および論文等のデータ・ベース、およびフランス労働法・社会保障法関係の最近の主要新聞・雑誌記事、各種行政文書等のデータ・ベースの作成を試みた。これによって、膨大な資料の検索が、少なくとも、近年のものについては、容易となり、急速な法政策の展開の追跡が効率的に行えるようになった。3わが国の労働者の引退過程をめぐる法政策について、一定の知見を得た。すなわち、労働力人工の高齢化、および年金支給開始年齢の引き上げに伴い、特に50歳代後半から60歳代前半層のための雇用機会の創設が課題であり、そのために、従来のわが国の雇用システムと密接に結びついていた労働法および社会保障法政策のあり方を、見直す必要があることが明らかとなった。また、1994年の年金法改正による年金支給開始年齢の引き上げと、それに伴う部分年金の導入をはじめとする一連の年金法・労働法の改正は、一応肯定的な評価が与えられるべきであるものの、全体的な制度設計の欠如や、60歳代前半層の雇用機会の創設効果の不十分さといった問題点をはらむことが明確となった。詳細は、研究代表者および研究分担者がそれぞれ雑誌論文等の形で公表した。1.6065歳の民間労働者の引退過程に関する従来の法政策に関するわが国および主要欧米諸国の資料の収集・整理を行った。資料を収集するにあたっては、法律学関係にとどまらず、各種行政文書、経済学・社会学関係文書、各種統計にも注意を払い、幅広く集めることとした。2.1994年にわが国では労働者の引退過程に関する大きな立法、政策上の動きがあった。すなわち、同年、雇用保険法、高年齢者雇用安定法、厚生年金保険法等の改正が行われ、老齢厚生年金の満額年金の支給開始が65歳へと段階的に引き上げられることになった。そして、これに伴い、65歳支給開始への環境づくりのための各種施策が法律で定められた。そこで、収集を進めてきた資料をも利用しつつ、こうした一連の法改正について、その立法までの経緯、立法時での様々な議論を調査・分析し、さらに、新たに導入された諸制度の意義と問題点について分析を加えた。その結果、今回の一連の改正は、65歳支給開始という政策目的を達成するための適切な諸手段を導入した点で、大筋では妥当なものではあるが、制度全体の整合性や60歳代前半層の雇用促進効果についてはなお問題が存することを明らかにできた。この点の研究成果は、既に1994年10月の日本社会保障法学会で報告し、また、まもなく雑誌に発表する。3.労働者の引退過程に関する文献・資料のデータ・ベースをパソコン等を用いて作成する予定であり、そのために必要なソフトウエアの調査と購入、およびデータ・ベース作成のための基礎的な調査と試験を実施した。そして、まず、フランスの各種資料のデータ作成に着手した。次年度に、データ・ベースの本格的作成を進める予定である。1労働者の引退過程に関するわが国のこれまでの法政策を、関係各省庁の政策文書や、各種研究機関の研究調査報告書等をも含めた資料の収集、分析によって、跡づけた。その際、テーマが、法律学のみならず、社会学、経済学にもわたるものであるので、法律学に限定せずに、幅広く文献・資料の収集を行うよう心がけた。

これによって、膨大な資料の検索が、すくなくとも、近年のものについては、容易となり、急速な法政策の展開の追跡が効率的に行えるようになった。3本研究の成果をとりまとめ、研究代表者および研究分担者がそれぞれ雑誌等の形で公表した(次頁参照)。
ヒト人工染色体を利用した迅速な巨大ゲノム領域のクローニングおよび他細胞への移植

CRISPR/Cas9システムの最適化により、目的遺伝子(GOI)の両側に部位特異的組換えサイトであるVLoxサイトとSLoxサイトの挿入効率を上げることができた。しかし、その効率は細胞種毎に大きく異なった。その後のHACベクターへのGOIの挿入では、細胞種間での効率には差が少なく、総DNA長が600kb以上についても成功した。GOI搭載HACベクターの、他細胞へのトランスファーには、試した細胞種全てにおいて成功した。1.巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでの工程を2ヶ月で完了させることは十分可能になった。ゲノム解読の進展に伴い、「制御領域全体を含んだ巨大な遺伝子領域を対象とした発現解析」や「リボソームRNA反復配列(rDNA)のように大きな非コードDNA領域を含む巨大反復配列等の長大なゲノムDNA領域の機能解析」が重要性を増している。しかし、巨大ゲノム領域のクローニングは非常に困難であり、たとえ成功したとしても結果的に多くの時間を費やしてしまう。私は、導入DNAのサイズに制限がないヒト人工染色体(HAC)ベクターとCRISPR/Cas9システムを利用することによって、1.巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでを僅か2ヶ月で完了させる方法を確立する。さらに、この方法の有用性を示すために、ヒト巨大ゲノム領域をHACベクターへ搭載後、マウスES細胞へトランスファーを行い、トランスジェニックマウスを作製する。平成27年度は、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する目的の遺伝子(Gene of interest, GOI)を、HACベクターへ挿入することまでを目標とした。制御領域を含んだ総DNA長が600kb以上になるGOIを設定して、GOIの両脇でCAS9がターゲット出来る位置にguideRNAプラスミドを作製した。その後、GOIの5'側上流に部位特異的組換えサイトであるSLoxサイトを挿入、GOIの3'側下流に部位特異的組換えサイトであるVLoxサイトを挿入することまで完了した。HACベクターヘGOIのクローニングを進めている。平成27年度は、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する目的の遺伝子(Gene of interest, GOI)を、HACベクターへ挿入することまでを目標として、研究計画として以下の6つの工程の完了を目標とした。1.制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上になるようなGOIを設定する。2. GOIの両脇でCAS9がターゲット出来る位置にguideRNAプラスミドを作製する。3. CAS9がターゲットして切断する位置の上流と下流に各500bpずつの相同配列でVLoxサイトまたはSLoxサイトを挟んだプラスミドを作製する。両方のプラスミドに薬剤選択遺伝子を搭載する。4. HACベクター保有ヒト細胞における遺伝子発現に適したプロモーターを持つCAS9発現ベクターを作製する。5. HACベクター保有ヒト細胞へ、CAS9プラスミド・guideRNAプラスミド・VLoxサイトプラスミド・SLoxサイトプラスミドをトランスフェクション。6. VCre酵素プラスミドとSCre酵素プラスミドをトランスフェクション。HACベクターヘGOIを挿入する。このうち、1から5までの工程を完了して、現在工程6の作業中である。おおむね計画通り順調に進んでいる。平成28年度は、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する目的の遺伝子(Gene of interest, GOI)をHACベクターへ挿入後、GOI搭載HACベクターをマウスES細胞を含む様々な細胞へトランスファーすることを目標とした。総DNA長が600kb以上のGOIについてHACベクターへの搭載が完了したので、ヒト培養細胞、齧歯類培養細胞へトランスファーを行った。その結果、試した全ての細胞においてトランスファーに成功した。HACベクターへのGOIの搭載が完了したので、ヒト培養細胞、齧歯類培養細胞へトランスファーを行ったところ、全ての細胞においてトランスファーに成功した。本課題の目的はほぼ達せられたと言える。しかし、この2年の間のトランスジェニックマウスを利用した研究の進展をみると、作製したGOI搭載HACベクターの遺伝子は、トランスジェニックマウスを作製しても研究上の発展が見込めないものとなった。そこで、この遺伝子とは異なる遺伝子を搭載したHACベクターを使用して、マウスES細胞へトランスファーを行うことに変更した。

現在、本課題において確立した方法を用いて、迅速にHACベクターへの搭載を進めている。導入DNAのサイズに制限がないヒト人工染色体(Human Artificial Chromosome, HAC)ベクターとCRISPR/Cas9システムを利用することによって、1.巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでを僅か2ヶ月で完了させる方法を確立することを目標とした。方法として、巨大ゲノム領域挿入のために部位特異的組換えサイトであるVLoxサイトとSLoxサイトが挿入されたHACベクター保有ヒト細胞において、CRISPR/Cas9システムを利用して、制御領域を全て含んだ数百kb以上の目的の標的遺伝子(GOI)の両側にVLoxサイトとSLoxサイトを挿入したのち、VCre酵素とSCre酵素を同時に発現させて、部位特異的組換えにより、GOIをHACベクターへ挿入した。CRISPR/Cas9システムを利用した反応条件の最適化により、GOIの両側へのVLoxサイトとSLoxサイトの挿入効率を上げることができた。しかし、その効率は、細胞種毎に大きく異なった。その後のHACベクターへの目的遺伝子の挿入では、細胞種間での効率には差が少なく、総DNA長が600kb以上のGOIについても成功した。GOI搭載HACベクターの、他細胞へのトランスファーには、試した細胞種全てにおいて成功した。ホスト細胞種を選択することにより、1.巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでの工程を2ヶ月で完了させることは十分可能であった。CRISPR/Cas9システムの最適化により、目的遺伝子(GOI)の両側に部位特異的組換えサイトであるVLoxサイトとSLoxサイトの挿入効率を上げることができた。しかし、その効率は細胞種毎に大きく異なった。その後のHACベクターへのGOIの挿入では、細胞種間での効率には差が少なく、総DNA長が600kb以上についても成功した。1.巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでの工程を2ヶ月で完了させることは十分可能になった。平成27年度においてはほぼ予定通り研究の進捗が見られたので、平成28年度の研究計画も当初の予定通りに、GOI搭載HACベクターの作製後にマウスES細胞を含む様々な細胞へトランスファーを行うこととする。1.蔗糖密度勾配遠心法を用いて、GOI搭載HACベクターを他の染色体から単離する。2.単離したGOI搭載HACベクターを市販のトランスフェクション試薬を用いて、マウスES細胞を含む様々な細胞へトランスファーを行なう。