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中国語語圏における遠隔授業に見られる異文化交流の新しい可能性と問題点

遠隔接触場面(以下、「遠隔」)の実態を客観的に把握し、学習者と母語話者の談話特徴を分析し、「遠隔」による新しい授業形態の可能性を明らかにすることが本研究の目的である。3年間の研究期間を通して、遠隔授業及び従来型授業のビデオを文字化し、100万字以上の談話コーパスを構築した。談話内容を瞬時に母語別、話題別、授業形態別に検索し、計量的に分析可能となった。研究成果としては主に以下の通りである。1)授業形態の研究。遠隔授業と従来型授業における学習者と母語話者の発話を分析し、学習者の学習スタイルやコミュニケーションの特徴を検証してきた。「遠隔」では、心理的な場が共有されにくく、コミュニケーション障害が起こりやすいこと、教員はコーディネーターやサポーター役に徹する必要があることを指摘し、授業テーマの吟味、複数交流チャンネルの併用、教具の活用など、具体的提案を行った。2)言語習得の研究。談話コーパスによって学習者と母語話者の文法使用状況を網羅的に調査し、その傾向と原因を分析した。「遠隔」では、心理的プレッシャーと文法習熟度と複雑に絡み合い、学習者の言語使用に影響があると指摘した。また、学習者のフィラーは、頻度は高いが単純化する傾向があり、言語能力が低く評価される可能性があることを指摘した。3)異文化コミュニケーションの研究。「遠隔」は異文化接触場面でもある。異文化接触の機会は貴重ではあるが、不要な文化衝突を避けるためには、身近な話題をテーマとしたほうがよい。TV会議による遠隔接触場面の交流では「あるカテゴリーに属する自分」として自文化の代言者になる傾向がある。個人レベルの交流を促進するために、ビデオチャットなど1対1の対話チャンネルの併用が重要であることを指摘している。本研究で構築してきたコーパスは、プライバシー保護のためのいくつかの作業を経た上での公開となる。1)授業形態の研究。2)言語習得の研究。本年度の研究調査目標は、遠隔授業の実体を客観的に把握することである。その具体的作業として遠隔授業10回分の画像・音声を収録した。各回の音声をすべて文字化し、さらにその一部(5回分)から画像・音声・文字つきコーパス(文字数約10万字)を試作した。遠隔授業を対照的に研究するため、従来型授業(10回)も同様に画像・音声を収め、文字化した(約20万字)。その一部(2回分)についても上述同様のコーパスを作成した。これらの基礎資料にもとづき第52回「中国語学会」(金沢大学開催)において「遠隔授業における中国語学習の新しい可能性と問題点」のテーマで発表し、かなり反響があった。さらに14年12月早稲田大学主催の国際シンポジューム「漢語国際教育の実践と展望」に共催者として参加した。北京、ソウル、台北、米国などの研究者との研究ネットワークを構築し、今後の国際共同研究の展開を確実なものにした。次年度からはさらに提携校との共同研究を充実発展させると同時に上述のコーパスをより広く便利に利用できるよう改良を加える計画である。1)遠隔授業の実態を反映するコーパスの改善及び蓄積。平成14年度に引き続き、コーパスの規模を70万字に拡大し、研究用の検索機能と教育用の質疑・応答機能をさらに充実した。2)ホームページを開設し、蓄積されてきたコーパスを部分的に教育と研究に提供した。3)台湾師範大学と北京首都師範大学との国際共同研究の体制を確立した。

4)当研究グループが国際シンポジュームおよび国内学会での研究発表は以下の5点である(内(2)、(4)、(5)は6月台湾の国際シンポジュームICICE2003で発表することになったが、SARSによる渡航制限のため、書類発表に切り替えた):(1)コーパスを利用した遠隔授業の分析及び教学支援の試み日本中国語学会第53回全国大会牧田英二楊立明(2)遠程教學和傳統的課堂教學中教師參與状況的對比分析台湾ICICE2003牧田英二・楊立明(3)面向互動型漢語教学的語料庫建設及相笑支持平台的研究日本中国語学会第53回全国大会早稻田大學國際情報通信研究科劉松・浦野義頼(4)外國人漢語學習者交際過程中的調整策略分析台湾ICICE2003早稻田大學日本語教育研究科〓小芳(5)基於PHP與MySQL的互動型漢語教學支持平臺的研究與實踐台湾ICICE2003早稻田大學國際情報通信研究科劉松・呉劍明・浦野義頼1、遠隔授業や従来型対面式授業及び授業参加者へのインタビューなどの内容から100万字以上の授業・談話コーパスを構築してきた。これを利用し、遠隔授業の計量分析を行い、従来型授業との客観的比較研究を可能にし、成果の一部は日本中国語学会などで報告した(牧田・楊2002、2003、2004)2、教育支援のため、授業コーパスに質疑機能などを加え、ホームページにリンクさせた。遠隔授業に参加している多地点の教員や学生が随時に授業内容を検索し、互いに質疑討論を行い、学生の主体的学習を促している。3、研究支援のため、授業コーパスに参加者の学習歴や留学歴などの学習情報を組み入れ、談話のテーマ、発話回数、速度などの言語情報も加えて、授業内容を立体的検索することを可能にした。これらの機能を利用し、自然発話の環境における上級学習者の文法習得の傾向を網羅的に分析し、その結果を日本中国語学会で報告した(牧田・楊2004)。また、TV会議におけるコミュニケーションギャップや文化摩擦を克服するために、共通の「心理場(psychological field)」を構築する重要性について国際シンポジュームICICE(2003台湾)で報告した(伴野・重松2003)。4、遠隔授業に参加している中国人留学生や日本人の留学経験者を中心にインタビューを行い、留学経験による異文化適応の差異などを調べ、留学経験者が遠隔授業における役割を分析している。その資料を利用し、『留学生的心声』という上級テキストを作成した(牧田・楊2005)。5、インタビューによる談話コーパスと授業コーパスの比較研究を行い、同じ話者が異なる談話場面における言語使用、自他認識などの違いを分析している。その成果は2005年度で報告する予定。6、今回構築したコーパスを広く研究利用できるため、プライバシー保護などの措置を取った上、2005年度中に公開する予定。
悪性腫瘍疾患検査法に適用可能な尿由来生体ガス捕集方法に関する研究

本研究は、申請者らが開発した微量ガスの濃縮・捕集分析技術を基に、尿からのホルムアルデヒドの分析精度を高めるため、高性能の濃縮型サンプラ、および尿用生体ガス採取器具を提案し、その採取・分析性を検証して悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する研究を行うものである。結果として、擬似尿中の化学物質濃度と気中放出部(バブラー部分)で気中放散した化学物質濃度の関係から、被験者検体(尿)から発生する生体ガスの測定により、尿中の化学物質濃度を求めることができることが示唆され、悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する基礎的研究を行うことができた。本研究は、申請者らかが開発した微量ガスの濃縮・捕集分析技術を基に、尿からのホルムアルデヒドの分析精度を高めるため、高性能の濃縮型サンプラ、および尿用生体ガス採取器具を提案し、その採取・分析性を検証して悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する研究を行うものである。(1)高効率で捕集する濃縮型サンプラの開発尿からのホルムアルデヒドを効率よく捕集するためには、サンプラの吸着材(剤)が重要である。そこで、ホルムアルデヒドの吸着に特化した物理吸着材と化学吸着剤を選定した。具体的には、これまでの知見を基にホルムアルデヒド捕集に適した素材(物理吸着材:6種類、化学吸着剤:9種類)を用意し、人工尿(塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、尿素、アンモニア水、精製水)を作製し、発生する濃度レベルに合わせ、ホルムアルデヒドのガスを小型チャンバー内に導入し、捕集を行った。実験の結果を基に吸着材(剤)を選定した。(2)生体ガスを効率的に発生、導入するガス採取器具の開発開発目標のガス採取器具は自動開閉扉、空気清浄フィルタと加熱ヒータ等で構成されている。そこで、ガス採取器具に供給される空気が生体ガスの分析精度に大きな影響を与えるため、供給空気口に空気清浄フィルタ(活性炭層とシリカゲル層)を選定し、設置することで、分析に影響を及ぼす干渉ガスを考慮した。また、尿から発生する生体ガスは尿の温度によって発生量に大きく影響を与えるため、ガス採取器具に加熱ヒータ(ウォータバス)を設置し、検体の尿体温を自在に制御できる機構を持たせた。(1)高効率で捕集する濃縮型サンプラの開発:尿からのホルムアルデヒドを効率よく捕集するためには、サンプラの吸着材(剤)が重要である。(2)生体ガスを効率的に発生、導入するガス採取器具の開発:開発目標のガス採取器具は自動開閉扉、空気清浄フィルタと加熱ヒータ等で構成されている。また、気中放出部分の改良により、更に広範囲の生体ガスを捕集し、定性・定量が行えた。分析機器はHPLCを用いて実施しており、感度よく広範囲の物質が測定された。具体的には、これまでの知見を基にホルムアルデヒド捕集に適した素材(物理吸着材: 6種類、化学吸着剤:9種類)を用意し、擬似尿(塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、尿素、アンモニア水、精製水)を作製し、発生する濃度レベルに合わせ、ホルムアルデヒドのガスを小型チャンバー内に導入し、捕集を行った。

上記により、擬似尿中の化学物質濃度と気中放出部(バブラー部分)で気中放散した化学物質濃度の関係から、被験者検体(尿)から発生する生体ガスの測定により、尿中の化学物質濃度を求めることができることが示唆され、悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する研究を行うことができた。本研究は、申請者らが開発した微量ガスの濃縮・捕集分析技術を基に、尿からのホルムアルデヒドの分析精度を高めるため、高性能の濃縮型サンプラ、および尿用生体ガス採取器具を提案し、その採取・分析性を検証して悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する研究を行うものである。結果として、擬似尿中の化学物質濃度と気中放出部(バブラー部分)で気中放散した化学物質濃度の関係から、被験者検体(尿)から発生する生体ガスの測定により、尿中の化学物質濃度を求めることができることが示唆され、悪性腫瘍疾患検査法の確立に資する基礎的研究を行うことができた。本研究は、温度、湿度、換気量がコントロールできる「空気環境実験室」を使用して、ある環境条件を一定に制御しながら遂行することが必須である。しかしながら、実験室内空調機の冷凍機(コンプレッサ)が故障したことによってブレーカーが遮断され、異常停止を生じ、研究が遂行できない現状にあった。現在は、実験室内空調機の修理が完了したが、研究遂行できない事態が続いたため、補助事業期間を延長した。医歯薬学/複合領域測定物質が被験者の健康状態や疾病とどのような関わりがあるかが知りたいところである。本技術の完成度を上げることにより、今後の疾病診断技術の裾野が広がると考えている。そのため、平成27年度では以下の研究を進める予定である。(1)高効率で捕集する濃縮型サンプラの開発:開発目標の濃縮型サンプラは、物理吸着材、化学吸着剤と定流量ポンプ等で構成されている。そこで、尿からの生体ガス成分と前立腺がんの関係を明らかにするためには高効率な捕集が必要であると考え、濃縮型サンプラの目標捕集効率をほぼ100%とする。(2)生体ガスを効率的に発生、導入するガス採取器具の開発:開発目標のガス採取器具は自動開閉扉、空気清浄フィルタと加熱ヒータ等で構成されている。そこで、試作機を作製し、生体ガスを効率的に発生する機構の開発を行う。平成25年度の当初の計画では、以下の3項目を達成する予定であった。1)吸着材(剤)の選定、2)捕集量(測定時間)の選定、3)捕集効率の確保そこで、3項目について、それぞれ計画通りに順調に進展したため。現在は実験室内空調機の修理を完了しており、補助事業期間内に研究遂行が難しく、実験内容を変更したため、未使用額が生じた。(1)高効率で捕集する濃縮型サンプラの開発開発目標の濃縮型サンプラは、物理吸着材、化学吸着剤と定流量ポンプ等で構成されている。そこで、平成26年度では、尿からの生体ガス成分と前立腺がんの関係を明らかにするためには高効率な捕集が必要であると考え、濃縮型サンプラの目標捕集効率を100%とする。
量子格子系とエントロピーの研究

1.行列と作用素のノルム不等式およびトレース不等式を研究し、相対エントロピーとGolden-Thompson型の不等式との関連、状態の摂動とTrotter型の極限公式などを追求した。具体的には次のような成果を得た。・対数マジョリゼーションと作用素平均の手法を用いて、Golden-Thompson型の不等式を補完する作用素ノルム不等式を示した。・状態の摂動に関する荒木やDonaldの結果を応用して、Trotter型の指数積に対するトレース・ノルム収束を示した。2.量子格子系モデルにおいて、平衡状態やMarkov型の状態に対して、平均エントロピー、相対エントロピー、力学的エントロピーなどのエントロピー論を研究した。特に、Markov状態を含み代数的な仕方で定義できる状態について、種々のエントロピー密度の間の関係を確立した。平衡状態に対するShannon-McMillan-Breiman型の収束定理も示した。3.指数有限の因子環-部分因子環の対から、Jonesのベーシック・コンストラクションによって有限次元環の増大列が構成でき、それらにBratteli図形と呼ばれるグラフが対応する。また有限次元環の列から生成されるvon Neumann環上にキャノニカル・シフトと呼ばれる変換が定義できる。グラフの増大度、キャノニカル・シフトの力学的エントロピー、部分因子環の強amenabilityの間の関係を調べた。
アポトーシス関連因子ALG－2の機能に関する構造生物学的解析

ALG-2がカルシウム依存的に結合するPLSCR3のII型モチーフは、ALIXなどのI型モチーフの結合部位とは異なる部位に結合することが変異体を用いた解析より推測されていた。既知のALG-2の立体構造をタンパク質表面上の疎水ポケットを予測するコンピュータープログラムを用いて解析したところ、新たなポケットが見出され、PLSCR3のII型モチーフの仮想ペプチド構造とのドッキングシミュレーションによって、このポケットにII型モチーフが結合する可能性が示唆された。結合に関与する可能性のあるアミノ酸を別の残基に置換したALG-2変異体を調製し、PLSCR3との結合を解析したところ、予想されたように結合能の低下が観察され、シミュレーション結果が正しいことが強く示唆された。PLSCR3はシグナルペプチドをもたないが、細胞外に分泌されることをすでに見出していたが、その形態をより詳細に解析した。分泌されたPLSCR3は10万g沈殿画分に回収され、プロテアーゼ抵抗性、界面活性化剤存在下でのプロテアーゼ感受性、10万g沈殿画分のショ糖密度勾配超遠心解析より算出される密度より、PLSCR3はエクソソームに存在することが判明した。PLSCR3にはシグナルペプチドが存在しないため、小胞体・ゴルジ体を経ずに別のメカニズムによって分泌されることが想定された。PLSCR3の細胞内局在解析により、PLSCR3は多胞性エンドソームを経由して細胞外に放出されることが示唆された。また、PLSCR3のパルミチン酸付加部位の変異体は分泌されず核に移行することも分かった。ALG-2結合部位の欠損変異体も分泌されることから、ALG-2は分泌に対して直接には関与していないと思われる。アポトーシス関連因子として同定されたALG-2(apoptosis linked gene-2)は、カルシウム結合モチーフであるEF-handが五つ連続しているPEF(penta-EF-hand)ファミリーに属するカルシウム結合タンパク質である。一般に、PEFタンパク質はカルシウムと結合することで構造変化が起こり、細胞内選別輸送に関わるAlix(ALG-2 interacting protein X)やスクランブラーゼファミリーに属するPLSCR3(Phospholipid scramblase3)をはじめとする様々なタンパク質と相互作用することが知られている。また、生体内には121番目のGlyと122番目のAlaが欠損した選択的スプライシングアイソフォームであるALG-2^<ΔGF122>が存在する。ALG-2^<ΔGF122>はPLSCR3と相互作用するが、Alixとは相互作用しない。Alixとの結合能力を失うALG-2^<ΔGF122>の構造的基盤をX線結晶解析により解明した。また、Alix結合能力を喪失すると考えF122のアラニン変異体を作成して解析すると、予想に反して結合能力は顕著に増大した。これについても結晶構造を明らかにし、疎水ポケットの拡大が結合に有利にはたらいたことが分かった。さらに、動物細胞内でのアイソフォームおよびF122A変異体の細胞死に対する機能を解析し、Alix結合能力と部分的に相関することを明らかにした。以上の内容を、構造生物学の専門学術雑誌にて報告した。また、上記の研究と並行して、ALG-2の相互作用因子の一つであるCOPII小胞構成因子のSec31AのALG-2との結合に必要十分な領域を生化学的な手法により決定することにも成功した。こちらの結果は、Biosci Biotechnol Biochem.にて報告した。アポトーシス関連因子として同定されたALG-2(apoptosis linked gene-2)は、カルシウム結合タンパク質である。これまでに、ALG-2は細胞内選別輸送に関わるAlix(ALG-2 interacting protein X)やスクランブラーゼファミリーに属するPLSCR3(Phospholipid scramblase 3)をはじめとする様々なタンパク質とカルシウム依存的に相互作用することが知られている。PLSCRファミリーには5種類のアイソフォーム(PLSCR1-5)が存在する。PLSCR3はカルジオリピンの合成やミトコンドリアの内膜から外膜への移動に関与や、PLSCR3ノックアウトマウスは異常な脂肪蓄積が生じることが報告されている。しかし、未だPLSCR3の局在や分布、そして機能についての詳細は不明である。私はPLSCR3を恒常発現するHEK293細胞(HEK293/PLSCR3)を用いて、細胞外に分泌するかどうか検討した。その結果、培養上清中にPLSCR3が検出された。これが培養上清中に存在しているPLSCR3は細胞が破裂したために漏れ出たものではないことを示すために、ショ糖密度勾配遠心分離法を行った。その結果、PLSCR3は約1.1g/mlの密度に存在した。エンドソーム内への陥入により形成される多胞体が細胞膜に融合した際に細胞外に放出されるエキソソームがこの密度に含まれる細胞外膜小胞として知られている。このことからPLSCR3はエキソソームとして分泌されることが考えられた。また、HEK293/PLSCR3をパルミトイル化阻害剤で24時間処理すると培養上清へのPLSCR3の分泌は減少した。これらの結果から、パルミトイル化がPLSCR3の細胞内の局在や細胞外への分泌において重要であることが明らかになった。一方、PLSCR3の分泌へのALG-2の関与についても検討した。

HEK293/PLSCR3細胞と、HEK293/PLSCR3/ALG-2KD細胞におけるPLSCR3の分泌量を比較したところ、HEK293/PLSCR3に比べてHEK293/PLSCR3/ALG-2KDは分泌量が減少した。これがstable lineに由来する現象か調べるために、HEK293/PLSCR3に対して一過性のALG-2発現抑制を試みたところ、その効果は見られなかった。したがって、現在のところPLSCR3の分泌に対するALG-2の作用は不明である。ALG-2がカルシウム依存的に結合するPLSCR3のII型モチーフは、ALIXなどのI型モチーフの結合部位とは異なる部位に結合することが変異体を用いた解析より推測されていた。既知のALG-2の立体構造をタンパク質表面上の疎水ポケットを予測するコンピュータープログラムを用いて解析したところ、新たなポケットが見出され、PLSCR3のII型モチーフの仮想ペプチド構造とのドッキングシミュレーションによって、このポケットにII型モチーフが結合する可能性が示唆された。結合に関与する可能性のあるアミノ酸を別の残基に置換したALG-2変異体を調製し、PLSCR3との結合を解析したところ、予想されたように結合能の低下が観察され、シミュレーション結果が正しいことが強く示唆された。PLSCR3はシグナルペプチドをもたないが、細胞外に分泌されることをすでに見出していたが、その形態をより詳細に解析した。分泌されたPLSCR3は10万g沈殿画分に回収され、プロテアーゼ抵抗性、界面活性化剤存在下でのプロテアーゼ感受性、10万g沈殿画分のショ糖密度勾配超遠心解析より算出される密度より、PLSCR3はエクソソームに存在することが判明した。PLSCR3にはシグナルペプチドが存在しないため、小胞体・ゴルジ体を経ずに別のメカニズムによって分泌されることが想定された。PLSCR3の細胞内局在解析により、PLSCR3は多胞性エンドソームを経由して細胞外に放出されることが示唆された。また、PLSCR3のパルミチン酸付加部位の変異体は分泌されず核に移行することも分かった。ALG-2結合部位の欠損変異体も分泌されることから、ALG-2は分泌に対して直接には関与していないと思われる。ALG-2相互作用因子の一つであるPLSCR3はパルミトイル化依存的に細胞外膜小胞であるエクソソームとして分泌されることなど分泌メカニズムを明らかにしつつある。そして、これらの途中経過を日本生化学会、農芸化学会関西・中部支部合同大会、日本分子生物学会で発表することが出来た。ALG-2との相互作用が分泌に与える影響については、変異体を用いた解析より、少なくとも一過性発現系ではその効果が認められなく、その生理的意義についてはさらに今後の解析に取り組む必要がある。PLSCR3中のパルミトイル化されるCys残基をAlaに置換した変異体を作製し、HEK293細胞中に一過性過剰発現させ、免疫染色によって局在を観察すると野生型とは異なり、変異体は核内への特徴的な凝集が確認された。ファミリー因子であるPLSCR1が核内で転写活性因子として機能している報告があることからもPLSCR3も核内で転写調節因子としての機能について解析を行う予定である。
多種の細胞外マトリックスの複合的な関与による乳癌の多様性の形成

細胞外マトリックス9因子の解析において、テネイシンCとフィブロネクチンの増加と治療抵抗性の間に有意な相関を認めた。ALDH1陽性例における複合解析ではテネイシンCおよびフィブロネクチンの関与が示唆され、テネイシンCとフィブロネクチンの共陽性例では、テネイシンC単独陽性例に比しても化学療法抵抗性の増強が確認された。免疫染色を用いた検証において、Invasive head領域におけるALDH1陽性細胞群とテネイシンC陽性の間質との間に結合が確認された。テネイシンCはフィブロネクチンと複合体を形成し、ニッチとしてALDH1陽性細胞群と結合することで、治療抵抗性に関与することが示唆された。本研究は、複数の細胞外マトリックスによる乳癌の治療抵抗性の形成を解明することを目的としている。我々は以下の9種類の細胞外マトリックスをその候補(基底膜を構成する4因子:IV型コラーゲン、ラミニン、パールカン、ナイトジェンとそれ以外の5因子:フィブロネクチン、ヒアルロン酸、I型コラーゲン、II型コラーゲン、テネイシンC)とし、乳癌の治療抵抗性へのその複合的なニッチとしての関与を検討する。2014年度には、基底膜に関与しない細胞外マトリックス5因子から我々が特に注目していたテネイシンCとフィブロネクチンの癌幹細胞(ALDH1陽性細胞)と抗癌剤抵抗性(術前化学療法抵抗性)への関与を乳癌患者の臨床検体を用いて免疫染色で検証した。テネイシンC陽性の乳癌患者では陰性の患者に比して有意に化学療法抵抗が高いことが解った。さらに興味深いことにそのことはALDH1陽性細胞を含有する乳癌患者で顕著であった。一方、フィブロネクチン単独陽性の患者には同様のことは認められなかったが、テネイシンCとフィブロネクチンの共陽性の患者では、化学療法抵抗性への関与が増強する結果となった。この結果は複数の細胞外マトリックスがニッチとして化学療法抵抗性に相乗効果を持つことを示唆しており、我々の仮説(複数の細胞外マトリックスが乳癌の治療抵抗性の多様性を形成する)の一部分を証明したことになった。テネイシンCの乳癌の治療抵抗性への関与は予想以上に大きく、これを中心として他の細胞外マトリックスとの相乗効果を免疫染色で観察する手法が有望であると感じられた。今後他の実験系と平行して免疫染色による治療抵抗性の解析の系を強化する方針とした。2014-5年度の研究により本研究の前提となる仮説(複数の細胞外マトリックスが乳癌の治療抵抗性の多様性を形成する)が証明された。特に患者検体を用いた系で示されたことから、本研究による成果の現実性が高まった。研究経過は順調であると考えられる本研究は、複数の細胞外マトリックスによる乳癌の治療抵抗性の形成を解明することを目的としている。

一方、フィブロネクチン単独陽性の患者には同様のことは認められなかったが、テネイシンCとフィブロネクチンの共陽性の患者では、化学療法抵抗性への関与が増強する結果となった。この結果は複数の細胞外マトリックスがニッチとして化学療法抵抗性に相乗効果を持つことを示唆しており、我々の仮説(複数の細胞外マトリックスが乳癌の治療抵抗性の多様性を形成する)の一部分を証明したことになった。テネイシンCの乳癌の治療抵抗性への関与は予想以上に大きく、これを中心として他の細胞外マトリックスとの相乗効果を免疫染色で観察する手法が有望であると感じられた。今後他の実験系と平行して免疫染色による治療抵抗性の解析の系を強化する方針とした。細胞外マトリックス9因子の解析において、テネイシンCとフィブロネクチンの増加と治療抵抗性の間に有意な相関を認めた。ALDH1陽性例における複合解析ではテネイシンCおよびフィブロネクチンの関与が示唆され、テネイシンCとフィブロネクチンの共陽性例では、テネイシンC単独陽性例に比しても化学療法抵抗性の増強が確認された。免疫染色を用いた検証において、Invasive head領域におけるALDH1陽性細胞群とテネイシンC陽性の間質との間に結合が確認された。テネイシンCはフィブロネクチンと複合体を形成し、ニッチとしてALDH1陽性細胞群と結合することで、治療抵抗性に関与することが示唆された。2014年度の研究により本研究の前提となる仮説(複数の細胞外マトリックスが乳癌の治療抵抗性の多様性を形成する)が証明された。特に患者検体を用いた系で示されたことから、本研究による成果の現実性が高まった。研究経過は順調であると考えられる。患者検体を用いた免疫染色法により、テネイシンCとALDH1陽性細胞(乳癌幹細胞)の予想以上の強い関係が明確になった。さらにフィブロネクチンとの共陽性による相乗効果も確認できた。免疫染色法は臨床治療に直結しているため、この手法を用いた解析を基本とすることが有効であると判断し、他の解析とともにこの解析法を拡大する予定である。乳癌患者検体を用いた免疫染色法により、テネイシンCとALDH1陽性細胞(乳癌幹細胞)の予想以上の強い関係が明確になった。
脳虚血後早期のMRIによる遅発性神経細胞死の予測に関する研究

MRI撮影条件については正常ラットを用いて予備実験を行った。遠隔部よりガス麻酔薬の吸入および人工呼吸ができるシステムを作成した。Varian7.05Tの動物実験用MRIを用いてspin echo法で脳のT1強調画像、T2強調画像、diffusion強調画像、erfusion imageを撮影した。また、apparent dirrusion coefficientを算出し、そのmappingを行った。ラットの固定装置を考案しその画像の精度を上げた。まずラットの一過性中大脳動脈閉塞モデルを用い、虚血中、再開通早期のMRI所見と2週間後の病理組織所見を比較し、MRI所見により梗塞の範囲が予測可能であるが検討することを目的とした。予備実験として遅発性脳梗塞の起こる虚血時間を調べた。300gのオスラットを用い、片側内頚動脈をクリップで閉塞し、同時に露出させた片側中大脳動脈を10-0ナイロン糸で一時的に閉塞し、一過性中大脳動脈閉塞モデルを作成した。虚血時間は30分、60分とした。14日の再潅流時間の後に灌流固定して脳を取り出し、パラフィン切片を作成しでH-E染色した。30分の脳虚血では脳梗塞の発生する頻度が低く、60分虚血の方がよいと考えられた。次いで脳梗塞発生の時間経過を調べるために、60分虚血後1、3、7、14日の再潅流後に脳梗塞の発生を検討した。梗塞の発生はすでに1日目に決定されており、大脳の遅発性脳梗塞の概念は誤りであることが判明した。ついで動物実験モデルとしてスナネズミ海馬の遅発性神経細胞死モデルを用いてそのMRI所見を解析した。虚血後2日目に撮った海馬のMRIでは海馬CAlの内側部でT2強調画像でhighintensityになっていた。神経細胞死に陥った領域をきわめて早期に検出できることが判明した。ラットの一過性中大脳動脈閉塞モデルを用い、虚血中、再開通早期のMRI所見と2週間後の病理組織所見を比較し、MRI所見により梗塞の範囲が予測可能であるか検討することを目的とした。300gのオスラットを用い、一過性中大脳動脈閉塞モデルを作成した。ハロセンで麻酔をかけ、人工呼吸器につなぎ、血圧、血液ガス、体温をモニターし、正常範囲にコントロールした。片側内頚動脈をクリップで閉塞し、同時に露出させた片側中大脳動脈を10-0ナイロン系で一時的に閉塞し、一過性中大脳動脈閉塞モデルを作成した。14日の再灌流時間の後に灌流固定して脳を取り出し、パラフィン切片を作成してH-E染色した。次いで脳梗塞発生の時間経過を調べるために、60分虚血後1、3、7、14日の再灌流後に脳梗塞の発生を検討した。ラットのMRI撮影条件については正常ラットを用いて予備実験を行った。Vrian 7.05Tの動物実験用MRIを用いてspin echo法で脳のT1強調画像、T2強調画像、diffusion強調画像、perfusion imageを撮影した。また、apparent diffusion coefficientを算出し、そのmappingを行った。ラットの固定装置を考察しその画像の精度を上げた。動物実験モデルとしてスナネズミ海馬の遅発性神経細胞死モデルを用いてそのMRI所見を解析する予定である。

ついで動物実験モデルとしてスナネズミ海馬の遅発性神経細胞死モデルを用いてそのMRI所見を解析した。虚血後2日目に撮った海馬のMRIでは海馬CAlの内側部でT2強調画像でhighintensityになっていた。神経細胞死に陥った領域をきわめて早期に検出できることが判明した。
現代アメリカ政治の変容とレーガン政権の支持基盤

1987年12月,レーガン大統領はソ連のゴルバチョフ書記長をワシントンに招いてINF全廃条約に調印し,さらに任期満了前に戦略兵器の大幅削減についての条約を締結することに意欲を見せている.レーガンが共和党の中でも強固な反共主義者,対ソ不信論者,軍備拡張論者であったことを考えると,彼のこのような「変身」は歴史の皮肉とも言える.この変身の原因は何かを検討することを,本年の研究の第一の狙いとした.その原因は次のようにまとめることができる.(1)レーガン政権内における教条派の後退,(2)アメリカ政治に見られる中道主義の傾向,(3)レーガン自身のプラグマティズム,そしてSDI構想に見られる戦略攻撃兵器大幅削減の発想--などである.レーガン自身について言えば,米ソの対話・合意を通じての国際政治の安定を望むプラグマティズムと戦略攻撃から戦略防禦に重点を移すことでアメリカの絶対的安全を取戻そうという回顧的理想主義とが結びついているのである.(日本国際問題研究所の研究会-12月23日-で報告)しかしレーガン政権は中米政策においては強硬姿勢を捨てず,一種のまき返し政策をとっている.彼の中米政策は彼の米ソ「デタント」政策とどのように関連しているのか.その検討を本年の研究の第二の目的とした.その結果,レーガンは大局的デタントと第三世界での知己的権力争いは別のものだという考え方--かつてソ連のブレジネフがとった見解--をしていることが判った.(国際法学会秋季大会-10月17日-で報告)アメリカの人口構成には大きな変化が見られる.人口構成の変化の動向を探り,それがどのような政治的な意味をもつかを検討することが,本年の研究の第三の課題であった.政治動向への影響については,両極分裂,中道政治という二つのシナリオが描けるが,後者のシナリオがより現実的である. (日本国際政治学会大会-5月-で報告)1960年代以降のアメリカの政治・外交に関する研究にできるかぎり広く目を通すことに努めるとともに、レーガン政権の支持基盤、新保守主義の対外政策観についてとくに研究し、いずれについても一応のまとめを行なった(裏面論文欄1,2を参照)。また上記の研究によって得られた知見をアメリカ史全般についての議論や日米関係の研究にも利用し、それぞれ著書・論文にまとめた(裏面論文4,著書1,2を参照)。現在は人口動態の変化(国内人口移動と移民の流入)の政治的意味について研究中である。(5月の日本国際政治学会春季研究大会で発表の予定)。レーガン政権の支持基盤について。レーガン政権が教条的保守勢力の支持をうけており、人事や政策に関して、その勢力の意向に配慮しなければならないことは事実である。しかし、政権はそれだけに依存しているわけではなく、共和党本来の主流である穏健保守勢力の支持にも依存しており、対外政策に関しては、後者の影響力が強い。対外政策の決定に参画する主要な地位は穏健保守派によって占められており、基本的な対外政策は彼らの意向を反映するものであった。教条的保守派は人材難という事情もあり、対外政策にかかわる重要な地位には人材を送りこめなかったことも彼らの影響力を弱めた。新保守主義の対外政策観について。新保守主義者の対外政策観を知るには「コメンタリー」や「ナショナル・インタレスト」のような雑誌を参照することが必要であるが、彼らは冷戦時代の対外政策観を引き継いでいるために、反共意識が強く、対ソ封じこめが優先課題とされている。そのため中国に対する態度は冷淡であり、東アジア情勢への関心は低い。また国際経済問題への関心も低く、日米経済摩擦のような問題についても、従来は関心が低かった。1987年12月,レーガン大統領はソ連のゴルバチョフ書記長をワシントンに招いてINF全廃条約に調印し,さらに任期満了前に戦略兵器の大幅削減についての条約を締結することに意欲を見せている.レーガンが共和党の中でも強固な反共主義者,対ソ不信論者,軍備拡張論者であったことを考えると,彼のこのような「変身」は歴史の皮肉とも言える.この変身の原因は何かを検討することを,本年の研究の第一の狙いとした.その原因は次のようにまとめることができる.(1)レーガン政権内における教条派の後退,(2)アメリカ政治に見られる中道主義の傾向,(3)レーガン自身のプラグマティズム,そしてSDI構想に見られる戦略攻撃兵器大幅削減の発想--などである.レーガン自身について言えば,米ソの対話・合意を通じての国際政治の安定を望むプラグマティズムと戦略攻撃から戦略防禦に重点を移すことでアメリカの絶対的安全を取戻そうという回顧的理想主義とが結びついているのである.(日本国際問題研究所の研究会-12月23日-で報告)しかしレーガン政権は中米政策においては強硬姿勢を捨てず,一種のまき返し政策をとっている.彼の中米政策は彼の米ソ「デタント」政策とどのように関連しているのか.その検討を本年の研究の第二の目的とした.その結果,レーガンは大局的デタントと第三世界での知己的権力争いは別のものだという考え方--かつてソ連のブレジネフがとった見解--をしていることが判った.(国際法学会秋季大会-10月17日-で報告)

アメリカの人口構成には大きな変化が見られる.人口構成の変化の動向を探り,それがどのような政治的な意味をもつかを検討することが,本年の研究の第三の課題であった.政治動向への影響については,両極分裂,中道政治という二つのシナリオが描けるが,後者のシナリオがより現実的である. (日本国際政治学会大会-5月-で報告)
iPLA2βの機能解析によるパーキンソン病の病態解明

パーキンソン病(PD)は黒質ドパミン神経細胞の変性脱落およびレヴィ小体の出現が特徴である。この凝集体のおもな構成タンパクはα-シヌクレイン(AS)である。すなわちAS凝集メカニズムの解明が本疾患の発症メカニズムの理解に直結する。過去の研究で、ASは脂質二重膜との結合能が凝集に関連することが報告されており、実際にゴーシェ病などの脂質代謝酵素異常がレヴィ小体を有するPDの原因になることが知られている。その中で、本研究ではリン脂質代謝酵素異常が原因で発症する家族性PD;PARK14に注目をして検討を行った。この疾患の原因タンパクはリン脂質のアシル基を切断しリゾリン脂質へ代謝する酵素であるPLA2G6であり、ノックアウトショウジョウバエモデルを作成して検討を行った。また、C19orf72タンパクの障害で生じる神経変性疾患はPARK14と酷似している。ハエモデルも同様でありPLA2G6とC19orf72の機能は一つのカスケードを形成している可能性があり検討を行った。PLA2G6ノックアウトハエは運動障害、睡眠障害、生存期間が短くなり、ドパミン神経細胞の脱落、ASの凝集、リン脂質アシル基の短鎖化を認め、シナプス小胞の形態が変化することを見出した。これらの機能障害はリノール酸を補充することで改善する事を明らかにした。C19orf72はミトコンドリアとERのコンタクトサイトであるMAMに作用をしており、機能障害によりPLA2G6と同様の機能障害を認めた。リポソームを用いたin vitro検討でPLA2G6の機能障害による脂質構成の変化がASの膜への結合を低下させた。結合低下の理由としてpacking defectが影響している可能性を示した。パーキンソン病はレヴィ小体と呼ばれる凝集タンパクが出現することが特徴とされており、病態メカニズムとして、タンパク分解系、ミトコンドリア機能障害、膜輸送障害などが知られている。しかし、神経変性及びレヴィ小体形成メカニズムの詳細は不明である。神経細胞は伝達物質を輸送するシステムが非常に発達しており、膜輸送の障害が病気の引き金になっている可能性がある。膜は脂質に富み、膜の構成により神経伝達物質の放出機能などが変化することが知られており、レヴィ小体は脂質に富み、膜輸送の破綻により形成される可能性が考えられる。さらに、近年脂質代謝酵素の障害によりパーキンソン病が発症することが明らかにされている。そのため、本研究では、脂質代謝酵素の中でPLA2G6に注目して、ショウジョウバエモデルを作成し、脂質代謝異常がいかに神経変性の病態に関与するかを解析している。今年度はPLA2G6ノックアウトショウジョウバエモデルの行動を詳細に解析した。ノックアウトモデルは正常対照群と比較してlife spanが有意に短くなり、睡眠障害を認め、Bang sensitivityによる運動障害を認めた。これらの症状に対応するように、神経細胞では変性と空胞化、TH陽性神経細胞の脱落、シナプス小胞の異常を確認した。また、脂質組成の変化を認めていた。これらの症状はヒト正常型PLA2G6を過剰発現させることで改善するが、ヒト変異型での回復は軽度にとどまった。今年度の結果より、PLA2G6の欠損は脂質代謝に影響を与え、膜の脂質構成が変化することで膜輸送が障害され、シナプス放出機能が低下することで、神経変性を引き起こすことが示唆された。研究開始当初に予定していたマイルストーンは今年度までに、ショウジョウバエの行動解析及びその原因となる組織学的変化を同定し、シナプス機能障害の検討に着手することであった。現在、ショウジョウバエモデルの行動解析及び、TH陽性神経細胞に関する組織学的な検討、シナプス終末の小胞に関する電子顕微鏡を用いた検討が終了し、PLA2G6の機能障害による症状の全貌が明らかにしており、今年度のマイルストーンまで達成することができた。最終ゴールは脂質構成の異常が病態に関与するかどうかを明らかにすることであるが、ショウジョウバエのリピドミクスはすでに着手しており、明らかな変化を見出だしている。上記より、進捗状況は概ね順調に進展していると判断している。パーキンソン病はレヴィ小体と呼ばれる凝集体が出現することが特徴とされている。この凝集体はα-シヌクレインが主な構成蛋白である。すなわち、α-シヌクレインの凝集が本疾患の主な病態として考えられている。最近、ホスホリパーゼであるiPLA2βをコードするPLA2G6遺伝子の変異がLewy小体を伴う神経変性疾患に関連することが示されており、本研究ではリン脂質代謝異常とα-シヌクレインの関連について検討を行っている。具体的な方法としてPLA2G6遺伝子改変ショウジョウバエモデルを用いて、行動異常の検討、組織学的解析によるカテコラミン神経脱落の検討、α-シヌクレイン凝集に関する検討を行っている。本年度までにPLA2G6ノックアウトショウジョウバエは生存率の低下、睡眠リズム障害、外的刺激(bung sensitivity)による運動回復の障害を認めることを明らかにした。また、脂質解析を行ったところ、アシル基がより短くなっていることが明らかになった。ショウジョウバエの睡眠障害はカテコラミン神経細胞の障害に関連すると言われており、実際に組織学的検討でも脱落を確認した。外的刺激からの回復障害についてはシナプス終末における放出能の異常に関連する可能性を考え、電子顕微鏡を用いて検討したところ、異常を認めていた。これらの症状は脂質補充しアシル基を正常化することで回復した。

α-シヌクレインの過剰発現ショウジョウバエと交配させ検討したところ、PLA2G6をノックアウトするとα-シヌクレインの凝集が亢進することが判明した。リポソームを用いた解析で、ショウジョウバエモデルで認められた脂質変化の組成によりα-シヌクレインはより凝集しやすいことを明らかにした。当初の目標である、PLA2G6ショウジョウバエモデルの解析により脂質異常によるカテコラミン神経細胞脱落とそれにより引き起こされる行動異常を明らかにした。さらに、この変化は脂質の構成障害であり、それによりα-シヌクレインの凝集が引き起こされることが明らかになった。今後ヒトにおける検討が必要であるが、PARK14患者から得られたiPS細胞の作成を着手している。そのため、本研究の目標は概ね順調に進展している。パーキンソン病(PD)は黒質ドパミン神経細胞の変性脱落およびレヴィ小体の出現が特徴である。この凝集体のおもな構成タンパクはα-シヌクレイン(AS)である。すなわちAS凝集メカニズムの解明が本疾患の発症メカニズムの理解に直結する。過去の研究で、ASは脂質二重膜との結合能が凝集に関連することが報告されており、実際にゴーシェ病などの脂質代謝酵素異常がレヴィ小体を有するPDの原因になることが知られている。その中で、本研究ではリン脂質代謝酵素異常が原因で発症する家族性PD;PARK14に注目をして検討を行った。この疾患の原因タンパクはリン脂質のアシル基を切断しリゾリン脂質へ代謝する酵素であるPLA2G6であり、ノックアウトショウジョウバエモデルを作成して検討を行った。また、C19orf72タンパクの障害で生じる神経変性疾患はPARK14と酷似している。ハエモデルも同様でありPLA2G6とC19orf72の機能は一つのカスケードを形成している可能性があり検討を行った。PLA2G6ノックアウトハエは運動障害、睡眠障害、生存期間が短くなり、ドパミン神経細胞の脱落、ASの凝集、リン脂質アシル基の短鎖化を認め、シナプス小胞の形態が変化することを見出した。これらの機能障害はリノール酸を補充することで改善する事を明らかにした。C19orf72はミトコンドリアとERのコンタクトサイトであるMAMに作用をしており、機能障害によりPLA2G6と同様の機能障害を認めた。リポソームを用いたin vitro検討でPLA2G6の機能障害による脂質構成の変化がASの膜への結合を低下させた。結合低下の理由としてpacking defectが影響している可能性を示した。今年度はリピドミクスの解析で見出した、PLA2G6の機能障害がどのように膜輸送に関連するかを検討する。具体的には不足している脂質成分を補充し、行動解析を行い、症状が緩和されるかどうかを検討する。また、脂質構成を変化させたリポソームを作成し、膜蛋白の結合に関する検討を行うことで、PLA2G6による脂質構成の影響が病態へどのように関与するかを明らかにする。今後は、現在のデータをまとめ論文投稿準備中である。今年度中に論文出版を目指す。
鶏アデノウイルス新規レセプター分子の解析-筋胃びらん発症機構の解明-

筋胃抽出液中にFAV結合性蛋白が存在することを明らかにし、その蛋白がMyosin11であることを明らかにした。Aviadenovirus属は、12の血清型からなり鶏の封入体肝炎の原因ウイルスである事が知られている。鶏の封入体肝炎は、主たる病変が肝臓にあり、肝細胞に核内封入体形成をともなう肝炎が認められる疾患である。また、鶏の封入体肝炎の原因ウイルスは特定の血清型に限定されていない事が知られている。しかし、近年、ブロイラーにおいて、鶏アデノウイルス感染に起因する筋胃びらんが大量発生し問題になっている。症状の軽いものでは、出荷され解体された段階ではじめて筋胃びらんが見つかるが、重症例では、筋胃のびらんから多量の出血が認められ急性経過で死亡する。これらの筋胃びらん材料からは、血清型1または8の鶏アデノウイルスが分離されている。そこで、我々は、筋胃びらんの発症機構の解明を目的に、VOPBA(Virus overlay protein blotting assays)法を用いる事で鶏アデノウイルス血清型1(JM1/1株>が筋胃に存在する約200kDaの蛋白に結合する事を明らかにした。筋胃びらんを引き起こすウイルスは、約200kDaの蛋白質に強く結合する事が認められたが、筋胃びらんを引き起こさない鶏アデノウイルス血清型1であるOte株は、弱い結合しか示さなかった。また、各種臓器中の200kDaの蛋白の発現をVOPBA法で調べたところ、検査を行なった全ての臓器で200kDaの蛋白が観察されたが、その発現は筋胃で多く肝臓と腎臓では極めて少なかった。これらの結果からこの200kDaの蛋白は,筋胃びらんを引き起こす鶏アデノウイルスの筋胃への親和性に関与しているかもしれない。また、鶏の封人体肝炎の原因ウイルスは特定の血清型に限定されていない事が知られている。前回(18年度)の報告で、鶏アデノウイルス血清型1(JM1/1)がVOPBA (Virus overlay protein blotting assays)法を用いることで筋胃に存在する約200kdaの蛋白に結合する事を明らかにした。今回は、この蛋白を粗精製し、本蛋白のモノクローナル抗体を作製し、200kdaの蛋白を認識するモノクローナル抗体を得られた。作製したモノクローナル抗体を用いて蛋白をアフィニティークロマトグラフィ法を用いて精製しMS/MS解析を行なった。蛋白質同定分析の結果、鶏アデノウイルス血清型1の結合する蛋白がMyosin11(Myosin heavy chain11)であることが明らかになった。今後、Myosin11と鶏アデノウイルスの病原性の関連を明らかにしていく。前回(19年度)の報告で、鶏アデノウイルス血清型1(JM1/1)に結合する蛋白が、Myosin11(Myosin heavy chain11)であることを明らかにした。この蛋白を抗原に、モノクローナル抗体を作成し、2種のMyosin11に結合するモノクローナル抗体を得た。得られた2つのモノクローナル抗体は、Myosin11に結合することが明らかになったが、FAVの感染阻止能は持たなかった。我々は、新たに筋胃抽出液中に鶏アデノウイルス血清型1に結合する42Kdaと39Kdaの蛋白を検出し、解析を進めている。
臨床応用を目指した角膜上皮幹細胞のｅｘ　ｖｉｖｏ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ法の開発

再生医療やEx vivo遺伝子治療では効率良い細胞増殖が必須の条件となる。本研究では低分子による細胞増殖促進を目指して、スクリーニングに供する細胞の構築を行った。骨肉腫患者由来の細胞株にテトラサイクリン(Tet)誘導下に癌抑制遺伝性であるレチノブラストーマ(pRb)タンパクが発現するように構築した。TetによりpRbタンパクを誘導すると予想通り細胞老化が誘導され細胞面積が増加した。この細胞において、Tetとともに低分子化合物を添加して細胞増殖の抑制が起こらない場合、pRbを阻害していると推察される。48個のクローンのうち、特に良いクローンではZ'値0.8という良好な結果を得た。膠状滴状角膜ジストロフィはTACSTD2遺伝子の機能喪失性変異による疾患であり、遺伝子治療がこの疾患には適応可能と考えられる。しかしながらin vivoにおける角膜上皮細胞における遺伝子導入効率の低さの問題から、培養環境で遺伝子治療を行い、患者に移植するというアプローチが最も見込みがある方法ではないかと考えている。前年度に不死化に用いられる遺伝子の導入によって角膜上皮細胞がPD100を超え維持されたこと、幹細胞そのものの数が増えた可能性が考えられることを示した。今年度には不死化の遺伝子を発現させるためのRNA発現ベクターの構築とともに、膠状滴状角膜ジストロフィの遺伝子治療の効果と必要な遺伝子導入効率についての検討を行った。RNA発現ベクターは構成パーツをPCR等で増幅して精製するには至ったもののパーツの1つであるpoly A配列をベクターに組み込むことが困難で、現時点でクローニングには至っていない。膠状滴状角膜ジストロフィの遺伝子治療の効果とそれに必要な遺伝子導入効率についての検討については、膠状滴状角膜ジストロフィ患者の角膜上皮細胞を不死化したgHCE細胞に野生型のTACSTD2遺伝子をレンチウイルスで遺伝子導入してタイトジャンクション機能を調べた。さらに正常角膜上皮細胞を不死化したnHCE細胞とgHCE細胞を様々な比率で混合して上皮バリア機能を検討した。結果として、gHCE細胞に野生型のTACSTD2遺伝子を遺伝子導入するとクローディン1および7の発現が回復し、また細胞膜への発現分布が回復した。また上皮バリア機能は遺伝子導入効率に対して直線性に上昇せず、下に凸の双曲線に近似して上昇した。そのため、上皮バリア機能を野生型の50%まで回復させるためには80%の遺伝子導入効率が、90%まで回復させるためには95%の遺伝子導入効率が必要であることがわかった。膠状滴状角膜ジストロフィは極めて難治であり、視機能の予後も低いために根本的な治療法の開発が必要である。遺伝子治療がこの疾患には適応可能と考えられ、これまでにいくつかの実験を行った結果、治療の可能性は十分にあると考えている。しかしながら遺伝子治療の効率の低さの問題から、培養環境で遺伝子治療を行い、患者に移植するというアプローチが最も見込みがあると考えている。しかし培養環境では角膜上皮細胞の幹細胞の維持が困難であるという問題があり、本研究ではそこに焦点を当てた。今回、膠状滴状角膜ジストロフィ由来の角膜および結膜上皮細胞、および正常者由来の角膜および結膜上皮細胞にSV40 large T抗原遺伝子とhTERT遺伝子をレンチウイルスで遺伝子導入して、継代培養を続けた。その結果、100PDを越えてこれらの細胞は増殖能を維持した。また継代が進んでもコロニー形成能は変化していなかった。100PD経過した時点では最初の細胞数の約1.3 x 1030倍の細胞数となるので、もし培養環境で幹細胞が維持されないのならば、100PDまでに至るまでに増殖が停止しているはずであり、これら2つの遺伝子の導入によって幹細胞の維持がなされていると考えられる。ただ幹細胞のレベルで自己メンテナンスされているのか、あるいはもう少し進んだ段階、すなわちTransient amplifying cell (TA cell)の段階で自己メンテナンスされているのかは判断できないので、14-3-3σなどの分化マーカーをもちいて検討する必要はある。昨年度に判明した高い遺伝子導入効率の必要性を考慮し、ex vivoにて細胞増殖を促進するための低分子剤のスクリーニングを行うこととした。細胞増殖は種々の増殖因子の刺激の後MAPKカスケードなどの増殖シグナルが介在して最終的にE2F転写因子がRbタンパクから解離することで生じる。SV40 large T抗原などの癌ウイルスタンパクはp53とRbタンパクに結合してE2FとRbの結合を阻害するとともにp53によるアポトーシスや細胞増殖停止、老化のシグナルを抑制することで細胞を不死化に導く。そこでRb-E2Fのタンパク・タンパク相互作用を阻害する低分子剤と既に存在するp53の阻害剤であるpifithrinalfaによって低分子剤により一時的に細胞不死化状態を作り出すことができるものと考えられる。そのためのスクリーニングシステムであるが、Rb、p53に対するshRNA発現ベクターおよびTeT-onシステム上で動作するRbに対するshRNA発現ベクターをレンチウイルスにて細胞に導入する。同時にFucciシステムでのS-G2-M期レポーターであるGeminin-mAzami greenをレンチウイルスにて細胞に導入する。ドキシサイクリン存在下では不死化している細胞に低分子化合物を加え、その後ドキシサイクリンを除去する。低分子剤がRb-E2F相互作用を阻害できれば細胞増殖が継続してFucciによる蛍光が観察できるはずである。今年度はこのシステム構築のために必要なプラスミドの構築を行った。