hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外分光法を用いた新たな運動イメージ鮮明度の客観的評価の開発

そして,MIの主観的鮮明度評価2種をNIRS計測前後に実施し,これらのデータを基に脳血流動態変化とMIの鮮明度との関係性を検証し,新たなMIの客観的鮮明度評価としてNIRSが使用可能かどうかを検証した.実験の結果,BR及び主観的MI鮮明度評価については,運動習熟前後で有意な改善を認め,トレーニングにより課題の習熟を認めたことを示した.また,練習を重ねることでより習熟すること示した.しかし,NIRSによる計測では運動習熟の前後では有意差を認めず,より習熟した段階に至った場合においてOxy-Hb濃度変化量に有意差を認める結果となった.これにより,MI中の運動関連領域の脳血流動態はMIする課題の習熟度と関係があり,主観的なMI鮮明度も影響する可能性があることを示唆した.平成29年度に予定していた実験1については実施が終了したが,学会や有識者とのディスカッションにおいて解析や方法の一部に再検討できる部分が生じたため,平成30年度は追加実験を行い,得られたデータの解析を終了し,学術雑誌へ投稿準備を行った.平成30年度より実験2として慢性期の脳卒中患者を対象に研究を進めていく予定であったが,平成31年度から実験2についても開始し,健常者の結果を踏まえて,臨床場面での運動イメージ鮮明度評価としてNIRSが有用であるかを継続して検証する.実験1では25名の健常成人を対象に,ボールローテーションのMI課題を用いて運動関連領域の脳血流動態変化をブロックデザインにて計測した.NIRSによる計測は課題の習熟前・習熟後の計2回とし,習熟のためにトレーニングとして1分間の5セッション,ボールローテーション課題を実行しパフォーマンスを計測した.実験の結果,ボールローテーション及び主観的MI鮮明度評価については,運動習熟前後で有意な改善を認め,トレーニングにより課題の習熟を認めたことを示した.しかし,NIRSによる計測では運動習熟の前後では有意差を認めない結果となった.但し,補足運動野及び運動前野において、運動習熟後にOxy-Hb濃度変化量が増大したことは運動習熟に伴うMI鮮明度の向上が影響したものと考えられる.実験1で得られた結果の解析を再検討し,追加実験を検討した上で学術雑誌へ投稿し公表する.平成30年度より実験2として慢性期の脳卒中患者を対象に研究を進めていき,健常者の結果を踏まえて,臨床場面での運動イメージ鮮明度評価としてNIRSが有用であるかを検証していく.実験1及び追加実験の結果について国際誌へ投稿する.さらに実験2の計測を開始し,国際学会へ応募し,ディスカッションを踏まえて解析を進め,公表できるようにしたい.また,本年度より所属先が変更となったため,現在の研究課題を計画的に進めるために,より多くのスタッフの協力を得ながら研究協力者と密に連携して取り組む.そして,リハビリテーションの臨床場面においてMIが効果的に使用できるように客観的MI鮮明度評価の開発を急ぎたい.今年度については実験で使用する機器の納入に合わせて実験を開始し,検討していた国際学会には計測が間に合わず,予定していた発表が実施できなかった.また,実験は終了したが解析については検討の余地があったため,論文投稿までには至らなかった.また,実験1を行うにあたり,準備等で協力スタッフがより必要であることが分かり,追加実験も検討しており,次年度の経費として活用したい.次年度では国際学会及び国内の学会へ参加し,ディスカッションを踏まえた上で研究結果を国際誌へ投稿する.
新規自然免疫誘導因子を利用した経口投与型ワクチン開発の基礎検討

アデノウイルスカプシドタンパク質より同定した自然免疫誘導能と膜透過性促進能を併せ持つペプチドを用い,経口投与ワクチン製剤に利用可能なリードタンパク質としての有用性について検討した.その結果,膜透過性促進ペプチド(89アミノ酸)は自然免疫誘導能を有していること、自己複合体を形成し酵素による分解を回避していることを見出した。さらにドメイン解析により26アミノ酸のペプチド配列のみでも高い細胞膜透過促進作用が得られることを見出し,経口投与型ワクチンの製剤化に利用可能なリード分子としての発展が期待された.初年度の実験動物を用いた検討により、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の取り込み促進分子は、胃への直接投与において、顕著な抗原タンパク質の取り込み促進を示さないことが明らかとなった。そこで、今年度はマウス上気道および腸管等の粘膜面への抗原およびアデノウイルスカプシドタンパク質由来の取り込み促進分子を投与した結果、抗原特異的な血清中抗体価は検出できたものの、抗体価の優位な上昇は認められなかった。そこで、抗原分子の効率的な取り込みを行うため、モデル抗原分子である卵白アルブミンの抗原ペプチドとアデノウイルスカプシドタンパク質の融合タンパク質を作製した。また、in vivoでの機能向上を目指し、アデノウイルスカプシドタンパク質の機能ドメインの解析とその取り込み能についても評価を行った。その結果、抗原ペプチドとの融合タンパク質においては、大腸菌を用いた組み換えタンパク質を作製し精製することに成功した。しかしながら、in vitroの結果では細胞表面への結合能は保持されるものの、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の取り込み促進機能は認められなかった。GFPとの融合タンパク質の検討からN末端またはC末端どちらにGFPを付与しても、細胞表面への結合能のみが認められ、細胞内への取り込みについては検出されなかった。このことから、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の取り込み促進分子は、融合タンパク質化することで機能的な立体構造が保持できないと考えられる。一方、機能ドメインの同定が可能となればin vivoでの機能性向上が期待されることから、取り込み機能ドメインの解析を行い、26アミノ酸までの絞込みが達成された。in vitroの結果より、細胞内取り込み能の優位な上昇が明らかとなり、抗原輸送システムにおいて利用可能なリード分子の最適化に成功した。さらにドメイン解析により26アミノ酸のペプチド配列のみでも高い細胞膜透過促進作用が得られることを見出し,経口投与型ワクチンの製剤化に利用可能なリード分子としての発展が期待された.初年度においては、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子の自然免疫誘導メカニズムについて、マクロファージ細胞および樹状細胞を用いた検討をおこなった。その結果、両細胞においてIL-6の産生が確認され、種々の自然免疫誘導シグナルのアダプター分子をノックアウトした細胞における検討を行った。アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子の受容体は現在のところ不明であり、引き続き検討が必要である。一方、実験動物を用いた粘膜組織への投与による免疫誘導能を検討したところ、十分な免疫誘導能が現在までに確認されていない。そこで、投与量の増量および経鼻投与システムの最適化を行い、粘膜組織における効率的な免疫誘導方法を検討中である。一方、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子は、胃および腸液モデル中においても、特定の細胞表面分子との結合性が保たれること、および高分子化合物を細胞内に輸送する機能を持つことを確認した。これら検討により、経口投与ワクチン製剤の開発に必要な酸・アルカリ条件下での安定性が確保された。また、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子とモデル抗原である卵白アルブミンとの融合タンパク質の作製方が確立され、LPSとの同時投与ではあるが、実験動物の腹腔内投与により卵白アルブミンに対する特異的なIgGが検出された。これらの検討結果は、当初研究計画の予想内の成果であり、研究実施計画の予定に沿って研究がすすめられている。現在までのところ、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子の自然免疫誘導メカニズムについては解明に至っていない。しかしながら、各種自然免疫誘導シグナルのアダプター分子をノックアウトした細胞における検討を行っており、シグナル伝達の概要解明は時間の問題である。一方、実験動物を用いた検討を前倒しして行っており、マウス上気道および腸管等の粘膜面への抗原およびアデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子を投与し、抗原特異的な血清中抗体価の測定を行っており、予備的なデータの獲得にも成功している。今後は、粘膜組織への投与方法の最適化および作製した融合タンパク質を用いた検討により経口投与ワクチン製剤の開発研究に取り組むことが可能である。アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子の自然免疫誘導メカニズムについて現在検討中である。近年のワクチン開発においては、アジュバンド機能のメカニズムにより獲得免疫誘導能が予測可能なため、本検討は引き続き詳細を明らかとすべく継続する。また、次年度の研究計画にあるように、直腸投与および胃直接投与によるアジュバンド効果の検討をおこなうため、本年度行ってきた経鼻投与による免疫誘導能の評価を参考に検討を勧めていく。また、作製済みの卵白アルブミン融合タンパク質を用いて、経口投与型ワクチン製剤としての有用性評価を行うこととする。

製剤設計に関しては、アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子と卵白アルブミンとの融合タンパク質を単独投与するだけでなく、消化管粘膜組織への付着性や移行能を向上させるため、脂溶性物質の同時投与や、ミセル製剤としての経口投与方法などについても検討する予定である。アデノウイルスカプシドタンパク質由来の自然免疫誘導分子の自然免疫誘導メカニズムの解明および直腸投与および胃直接投与によるアジュバンド効果の検討に関しては、サイトカインのELISAキットおよび卵白アルブミンに対する特異的抗体産生量を測定するためのキットが、研究費として使用予定である。また、当然ながら実験動物を用いた検討を行うため、実験動物の費用および動物管理費用が計上される予定である。また、卵白アルブミン融合タンパク質の経口投与型ワクチン製剤としての有用性評価においては、粘膜組織切片を用いた免疫染色を行う必要があり、各種免疫細胞のマーカー分子に対する抗体を購入するため、1次抗体および蛍光標識2次抗体に関しても購入が必要である。その他、培養細胞用消耗品や組み換えタンパク質作製用の大腸菌培養用消耗品およびタンパク精製試薬等が実験遂行には必須であり、節約に努めつつ、効率的な予算の執行を引き続き心がける。
極低温での微小な熱伝導率測定のための技術開発と熱伝導率のばらつきの評価

液体ヘリウム温度(4K)で動作する、極低温検出器の信号読み出しに使われるような、小さな熱伝導率を有するケーブルの熱伝導率測定に対応できる、新しい計測手法を開発・実証した。小さな熱伝導率を測定する上で問題となっていた計測系への熱の流出を抑えることに成功し、実際に製造工程の異なるケーブルの熱伝導率を測定した。平成19年度は、次年度に予定している、4K以下で動作する極低温検出器と室温とを結ぶ、熱伝導率の小さいケーブルの測定のため、主に極低温での測定環境の整備を行った。はじめにGM冷凍機の真空容器、30Kステージ、熱伝導率測定を行う3K冷却ステージの設計を行った。これをもとにして旭川高専の技術室と打ち合わせを重ね、実習工場にある溶接・切削設備を用いて加工を行った。冷凍機にこの製作した真空容器を取り付けた状態で減圧し、10^<-6>torr以下の、測定に十分な真空環境が得られることを確認した。さらに冷凍機を支える架台、電源、コンプレッサの冷却水の取り回し等を整備したのち、製作した30Kステージ、3Kステージ、各部のセルノックス温度計を取り付けてGM冷凍機を運転した。その結果最低到達温度として、目標としている4Kよりもわずかに高いものの、4.5Kという極低温環境を得ることに成功した。温度がわずかに高い理由を検討し、さらに熱伝導の良い構造への改修に着手した。フランスで開催された第12回極低温検出器国際ワークショップに参加し、国内外の研究者・技術者と、熱伝導率の小さいケーブルの必要性や求められる性能、形状等について議論を行い、各国の極低温用ケーブルの開発状況を調査した。並行して都立産業技術研究センターの研究員、ケーブルを製造している業者らとも検討を重ね、合金の熱伝導率をより小さくするための基礎実験を開始した。また平成20年度に測定する、熱伝導率の小さいケーブルの種類と、実験の具体的なスケジュールついて検討を行った。平成20年度は、19年度に旭川高専に立ち上げたGM冷凍機の3Kステージに設置して、定常熱流法による熱伝導率測定を行うための熱伝導率測定治具を検討・設計・製作した。また測定のための、3Kステージから室温までの配線を、白金およびセルノックス温度計とともに真空容器内部に施した。熱伝導率の測定対象をケーブルメーカーの技術者とともに検討し、最終的にニオブチタン、キュプロニッケル、真鍮で造られた、各直径0.86mmの同軸ケーブルを選定した。続いてできるだけ簡便な、自動で熱入力の値を変えた測定が行えるソフトウェアを、産業技術総合研究所にて作成したプログラムに改良を加えながら、測定と並行して完成させた。試料の先端部分および温度コントロール用の2か所のヒーターの熱入力の値をうまく選ぶことにより、申請時の予定にあった通り、温度計やヒーターといった計測系配線への熱の流出を抑える新しい手法で、4K付近の極低温における熱伝導率を測定するごとに成功した。今回測定した同軸ケーブルは都立産業技術センターの研究者の協力のもと作製した、いくつか製造パターンの異なるもので、製造工程の違いにより数倍の熱伝導率の差があるとする過去の文献もあるが、今回の研究においては製造工程の違いによる熱伝導率の有意な差は表われなかった。これらの成果を3月に行われた北海道テクノ・イノベーションフォーラムにて報告するとともに、さらに低温で熱伝導率を測定するための装置の検討やケーブルの市場について、ケーブルメーカーと極低温機器の製造技術者を交えて意見交換を行った。
ヒト腫瘍内酸素濃度を測定する非侵襲的測定手法の開発

今年度の研究実績の概要を以下にまとめた。一般に固形腫瘍では血管の分布が乏しくなる。このため、腫瘍内は低酸素の状態となり、腫瘍の放射線治療を試みるときは重要な問題となる。腫瘍の治療を行う前に組織内の酸素濃度を測定して適切な腫瘍の治療法を判定することは臨床の場において非常に重要な問題ではあるが、現在、非侵襲、侵襲を問わず腫瘍内の酸素濃度を直接測定手法は確立していない。広く臨床応用が可能で実用的な腫瘍内酸素濃度測定法を開発し、ガン細胞の酸素濃度に応じた放射線治療が出来ることをめざし、本研究では腫瘍内の酸素濃度を非侵襲的に測定するESRオキシメトリー法の確立を目指し、その応用開発研究を行っている。今年度は以下の2点について検討を行った。1.酸素濃度感受性プローベの製作昨年度から、酸素濃度によってそのESRスペクトル特性が敏感に変化する酸素測定用プローベの製作を行っている。グルコースを炭化させた炭と、有機化合物のリチウムフタロシアニンの製作を行った。両化合物共に、酸素濃度により、そのESRスペクトルの線幅は敏感に変化し、酸素分圧が20mmHg程度の酸素濃度域での酸素濃度定量化は可能であることがわかった。2.実験動物を用いたin vivo酸素濃度測定実験ラットの後肢に上記の酸素プローベを埋め込み、in vivo ESR装置を用いてESRスペクトルを測定し、その線幅より酸素濃度を測定した。後肢の血流をコントロールし、組織内の酸素濃度を変化させると、これに伴いESRスペクトルの線幅は変化し、組織内酸素に応じたスペクトルの変化が観測できていることを確認することができた。以上の結果から、本研究課題であるESRオキシメトリー法は腫瘍内の酸素濃度測定に利用することが可能であることを強く示している。固形腫瘍では通常血管の分布が乏しい。このような低酸素状態は、腫瘍の放射線治療の効果に対して重要な影響を与えるので、腫瘍の治療前には組織内が低酸素状態かどうかを知ることは適切な治療法の選択に非常に重要である。しかし、臨床の場で使える非侵襲酸素濃度測定法は皆無である、という現状である。そこで、広く臨床応用が可能で実用的な腫瘍内酸素濃度測定法を開発し、ガン細胞の生物学的特性や腫瘍細胞に応じた放射線治療を実現させることを目指している。本研究では、ヒトの腫瘍内酸素濃度を非侵襲的に測定することが可能な臨床用ESRオキシメトリー法を開発し、その測定結果をガン患者の治療法の選択に活用するとともに、放射線治療に役立てる事を最終目標としている。1.非侵襲酸素濃度測定システムの設計:動物実験やヒト舌癌などの固形腫瘍などを対象とし、被測定物の大きさに依存しないサーフェスコイルを利用したin vivo ESRシステムをほぼ完成させることができた。基本的なコンポーネントは既に稼働していたので、今年度は装置のマイクロ波回路や回路定数を実験で確認しながら決定した。ESRオキシメトリー法で高精度に酸素濃度を測定するには、磁石の磁場捜引精度が重要で、磁場強度を高精度で制御するための高精度電源を購入し磁場コントロール用プログラムを製作した。現在、磁場の安定スイープの実験中である。2.酸素濃度感受性プローベの合成:平成15年度は、糖類や墨な度を酸素濃度測定プローベとして実験を行った。グルコースの炭化・賦活化して、プローベと共存する酸素濃度に依存したESRスペクトルの変化が観測可能なプローベの合成を試み、安定に合成できるプロトコールを完成させた。
『正法眼蔵』思想の宗教学的研究

京都学派を中心とするこれまでの哲学的研究の成果に注意を払いながら、『正法眼蔵』思想の宗教学的研究の可能性とその意義を明らかにしようとした。具体的には、応募者のこれまでの研究成果、特に中国語の翻訳を通じて得た成果を踏まえつつ、『正法眼蔵』の成立と中国語(漢文)との関係について再検討すると共に、難解な書物とされてきた『正法眼蔵』の言葉の性格を考察した。また、『正法眼蔵』諸巻の相互間における思想的連関やテキスト全体の思想的整合性の解明を試みた。これらの作業を通じて、宗教学的な観点に基づく『正法眼蔵』思想の体系的な理解を図ると共に、仏教思想史、日本宗教史上における位置づけの解明を目標としている。平成20年度6月に交付申請決定を受けてから、「研究実施計画」に基づき、まずは日本国内の関連施設を訪れ、諸本および諸注釈の調査と収集を行った。他方、夏休みを利用し、国外(中国)への文献調査を行うための海外旅行を実施した。具体的には、北京や上海および湖北省の関連機関や寺院を訪れ、本研究課題に関する文献や中国における禅仏教研究の最新の成果などを収集することができた。次に、そうした研究を踏まえつつ、その成果の一部を本人が所属している北海道印度哲学学会および日本宗教学会の学術大会で発表した。前者は「道元と中国」と題するものであり、北海学園大学で開催された平成20年度学術大会にて発表したものであり、とくに道元の「中国観」について、『宝慶記』などの漢文文献や『正法眼蔵』諸巻における関連記述を取り上げて話題にした。後者は「最近の道元研究について」と題するものであり、筑波大学で開催された67回学術大会にて発表したものであり、具体的には『正法眼蔵』の文体について、本人による『正法眼蔵』の中国語訳を通して提出した漢文説をめぐる最近の反応を取り上げて検討した。『正法眼蔵』思想の学問的研究が求められる今日、そうした研究活動が実施できた意義が極めて大きいと認められる。また、海外出張などによる文献調査が実施できたことも本研究の今後の展開に大いに役立ったと考える。平成21年度6月に交付決定を受けてから、「研究実施計画」に基づき、まずは国内において『正法眼蔵』諸本および諸注釈の追跡調査と蒐集を行った。他方、道元がかつて留学していた中国の寺院に出かけ、中国における道元の足跡を辿りながら、本研究に関連する寺院の調査も行った。その際、北京や湖北省、杭州の図書館や研究機関にて、必要な文献や中国における禅研究の最新の成果などを蒐集することができた。次に、本研究に関する成果の一部を本人が所属している日本宗教学会などで発表した。具体的には、9月に京都大学で開催された第68回学術大会にて、「思想としての宗教」という大会テーマに沿い、「近現代における道元の発見」というパネルを企画したことになるが、ドイツやアメリカの研究者を呼んで、研究発表を行い、意見交換をした意義が大きかった。私はこのパネルで特に中国語圏における道元の発見と受容に関する調査研究を台湾に於ける事例を通して報告した。欧米以外の国や地域での道元研究についての報告がこれまで皆無だったことを考慮すれば、これも大きな意味を持つものと言えよう。また、11月にカナダのモントリオールで開催されたアメリカ宗教学会(AAR)年次大会にて、「Reflections on The Heart Sutra」というパネルで、The Heart Sutra in Shobogenzoとの題で参加し、『正法眼蔵』を手がかりに、東アジアにおける般若心経の位置づけを考察しようとした。文献調査や研究発表が実施できた意義が極めて大きく、今後の研究の進展には大いに役立つものと考える。最終年度に当たる平成22年度は、昨年に続き、6月に交付決定を受けてから、「研究実施計画」に基づき、まずは諸本および諸注釈の調査と蒐集を行ってきた。その際はこれまでの研究を踏まえつつ、諸本の所在に関する確認作業を中心に行った。他方、本研究に関する寺院の調査も行ったが、それらの調査を通じて、文献研究と共に、実地調査の必要性も再度確認できたのである。文献調査と寺院における実地調査および国際会議での発表などができたことの意義は大きく、今後の研究の進展には大いに寄与するものと考える。
造血幹細胞制御に関わる血管内皮細胞由来幹細胞因子の遺伝子プロファイリング

胎児期には造血幹細胞の旺盛な増殖が観察されるものの、成体骨髄では多くの造血幹細胞は細胞増殖を止め、休眠期に入る。このような細胞分裂の制御機構を解明することは、最終的には造血幹細胞の試験管内増幅を誘導する概念を創出すると考えられる。そこで、本研究では造血幹細胞と血管内皮細胞に共通して発現するTie2受容体の下流シグナルの解析から、造血幹細胞の細胞分裂に関与する分子の同定とその機能解析を実施した。Tie2の恒常的活性型遺伝子を作成し、血液細胞や血管内皮細胞株に遺伝子導入して、発現の左右される遺伝子につきマイクロアレイ、サブトラクション法を用いて遺伝子の単離を行った。血液細胞株から得られたE11は酵母ではPSF1として知られ、DNA複製に必須の分子である。本遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、内部細胞塊の形成不全にて胎生6日前後で致死となった。+/-マウスを用いた解析により、PSF1は造血幹細胞の細胞周期をG1からS期に移行する際に重要な機能を果たすことが判明した。また、Tie2の活性化により造血幹細胞において発現の上昇することを発見したgalectir-3について検討を行った。galectin-3のノックアウトマウスを解析したところ、成体骨髄における造血幹細胞数が正常マウスと比較し3倍に増加していた。さらに、Tie2遺伝子のプロモーター制御下にgalectin-3を過剰発現する条件付きトランスジェニックマウスを作成したところ、本トランスジェニックマウスでは造血幹細胞の増殖が抑制され、胎児期早期に致死となることが判明した。このマウスの造血幹細胞では細胞周期を負に制御するP21の発現が亢進していた。以上より、造血幹細胞上のTie2の活性化は、galectin-3の発現を正に制御し、結果として造血幹細胞の休眠を誘導していることが明らかとなった。造血幹細胞の自己複製を誘導する可能性の高い細胞として我々は血管内皮細胞がその候補であることを解明してきた。この両者の細胞間の相互作用において重要な役割を果たす分子がTIE2受容体であり、本受容体は内皮、造血幹細胞にともに発現している。造血幹細胞におけるTIE2の活性化が造血幹細胞の未分化性の維持や血管内皮細胞との細胞接着および細胞周期の遅延化に繋がることが判明し、さらに血管内皮細胞上で造血幹細胞が培養されるとTIE2遺伝子のプロモーター活性が造血幹細胞上で維持されたまま造血幹細胞の分裂が生じることが明らかになった。そこでTIE2の活性化により制御を受ける遺伝子を明確にし、幹細胞性の維持に関与する機構を明らかにするためにTIE2の恒常的活性型遺伝子を作成し、血液細胞や血管内皮細胞株に遺伝子導入して、発現の左右される遺伝子につきマイクロアレイ、サブトラクション法を用いて遺伝子の単離を行った。血液細胞から得られたE11は酵母ではPsf1として知られ、DNA複製に必須の分子である。本遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、ノックアウトは内部細胞塊の形成不全にて胎生6日前後で致死となった。造血幹細胞の発生に与える影響を観察するため、+/-マウスを用いE11遺伝子量が半量の状態が幹細胞性にいかなる影響を及ぼすかを検討した。+/-マウスに5-FUを投与したところ、野生型マウスでは致死に至らない量の5-FUでも、骨髄抑制が遷延して致死となった。

この原因は、E11が半量のため、造血幹細胞の細胞周期がG1からS期に移行すことが困難になることに起因することが判明した。今後、血管内皮細胞や造血幹細胞において発現の上昇した、galectin-3につき造血幹細胞における機能を解明する。造血幹細胞の自己複製を誘導する可能性の高い細胞として我々は血管内皮細胞がその候補であることを解明してきた。この両者の細胞間の相互作用において重要な役割を果たす分子がTIE2受容体であり、本受容体は内皮、造血幹細胞にともに発現している。造血幹細胞におけるTIE2の活性化が造血幹細胞の未分化性の維持や血管内皮細胞との細胞接着および細胞周期の遅延化に繋がることが判明し、さらに血管内皮細胞上で造血幹細胞が培養されるとTIE2遺伝子のプロモーター活性が造血幹細胞上で維持されたまま造血幹細胞の分裂が生じることが明らかになった。そこでTIE2の活性化により制御を受ける遺伝子を明確にし、幹細胞性の維持に関与する機構を明らかにするためにTIE2の恒常的活性型遺伝子を作成し、血液細胞や血管内皮細胞株に遺伝子導入して、発現の左右される遺伝子につきマイクロアレイ、サブトラクション法を用いて遺伝子の単離を行った。現在のところ直接的か、間接的作用かはまだ明確ではないが、TIE2により負に制御されることが判明したPSF1遺伝子は内部細胞塊のES細胞の増殖や、造血幹細胞の急速な増殖に必須であることが判明してきたが、このPSF1の機能制御の解析のため、酵母で報告されてきているPSF1結合蛋白、PSF2、PSF3、SLD5の遺伝子単離をマウスにおいて全て行なった。酵母と同様、マウスPSF1、PSF2、PDF3、SLD5は複合体を形成することが判明した。また、PSF1とSLD5の結合領域を詳細にし論文化した。また、SLD5のモノクローナル抗体を作成し、マウスにおける発現を解析したところ、PSF1と同様に、受精4日目の内部細胞塊のES細胞に発現が認められ、PSF1と共局在することから、酵母と同様にPSF1-SLD5およびPSF2、PSF3は複合体を形成してDNA複製に関与することが示唆された。造血幹細胞は成体では骨髄の骨梁領域で骨芽細胞と密接に接着し、その細胞周期を遅延化させていることが明らかとなっている。この骨芽細胞ニッチは血管から離れており、低酸素であることが示唆されている。通常細胞は低酸素に陥ると細胞死が誘導されるが、どのようなメカニズムで幹細胞が低酸素抵抗性に細胞死を抑制し、細胞周期を遅延化しているのかについての分子論的な解析は充分になされていない。我々は、造血幹細胞と血管内皮細胞に共通して発現するTie2の機能解析をとおして、これらの細胞周期制御、および細胞死抑制の分子機構を明らかにしてきた。TIE2により負に制御されることが判明したPSF1遺伝子は従来の研究により、内部細胞塊のES細胞の増殖や、造血幹細胞の急速な増殖にDNAの複製開始の制御を介して必須であることが判明してきたが、本年度、このPSF1がS期のみならず、M期にも機能し、細胞の分裂を染色体分配という点で機能することを見いだした。このことは、酵母で解析されてきたPSF1のDNA複製における機能的意義に加え、造血幹細胞ではこのPSF1が、細胞の対称性あるいは非対称性分裂に関わることが示唆された。また、昨年度、このPSF1と結合する蛋白SLD5の単離に成功したが、このSLD5の遺伝子ノックアウトマウスを作成し、PSF1と同様SLD5ノックアウトマウスは受精卵の発生過程において内部細胞塊の形成不全が生じることが判明した。
細胞成長因子を用いた視神経乳頭の血管側副路形成による緑内障治療法の開発

緑内障の病因として視神経の循環障害が大きな役割を果たしていると考えられる。最近、心筋梗塞にたいする新しい治療法として、塩基性線維芽細胞増殖因子(basicFGF)の冠動脈内投与が試みられている。この治療法は、血管新生を起す増殖因子を投与することで、心筋を栄養する冠動脈の側副路を形成し、心筋虚血の改善を行う治療法である。われわれは、この方法を応用して視神経乳頭の血液循環を改善するために、視神経乳頭周囲の血管に側副路を作る方法を開発しようと考えた。家兎の球後にrabbitのVEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorを投与し、視神経を含む球後組織に管腔形成が認められた。しかし、血管腔内には血球は存在しなかった。また、Heidelberg Retina Flowmeter(HRF)を用いて、視神経乳頭面上における血流速度測定を行ったが血流の改善は認められなかった。球後に存在する新生血管は、組織への側副路としての働きを持つほどには成熟していないと推定された。また、TGFβを同時に投与して新生血管を成熟させ機能する血管を作成する試みをした。VEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorとTGFβを同時に投与した家兎の球後の視神経乳頭周囲の血管は、アデノウイルスvector単独投与群に比較して血管形成が不良であった。TGFβ投与の時期を遅くした群では、一度形成された血管内皮のアポトーシスと考えられる所見が認められた。これまでの緑内障の治療は、眼圧を下降させることに重点がおかれてきた。しかし日本人に多いとされる正常眼圧緑内障の治療としては不十分である。最近、視神経乳頭の血液循環改善のためにカルシウム拮抗剤の投与が行われ、有効との報告がある。しかし、薬剤による循環改善にはいくつかの問題点がある。効果が永続しないために永久的に内服の必要があること、全身投与であるために効果が弱いまたは安定しない、副作用があるなどである。最近、心筋梗塞にたいする新しい治療法として、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic FGF)の冠動脈内投与が試みられている。この治療法は、血管新生を起こす増殖因子を投与することで、心筋を栄養する冠動脈の側副路を形成し、心筋虚血の改善を行う治療法である。われわれは、この方法を応用して視神経乳頭の血液循環を改善するために、視神経乳頭周囲の血管に側副路を作る研究を行う。さらに手法を発展させて、血管新生促進因子の遺伝子を導入するまったく新しい治療法の開発を試みている。rabbit VEGFのcDNAをRT-PCR法でのcloningを試みたがうまくいかなかったので、rabbitのVEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorの提供を受けた。家兎の球後にこのウイルスを投与し、まず組織学的な検討を行った。視神経を含む球後組織に管腔形成が認められたが血管腔内には血球は存在しなかった。Heidelberg Retina Flowmeter(HRF)を用いて、視神経乳頭面上における血流速度測定を行ったが血流の改善は認められなかった。今後は、新生血管の成熟についてのサイトカインとの組み合わせを検討する必要がある。われわれは、この方法を応用して視神経乳頭の血液循環を改善するために、視神経乳頭周囲の血管に側副路を作る方法を開発しようと考えている。一昨年までの研究で、家兎の球後にrabbitのVEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorを投与し、視神経を含む球後組織に管腔形成が認められた。また、HeidelbergRetinaFlowmeter(HRF)を用いて、視神経乳頭面上におげる血流速度測定を行ったが血流の改善は認められなかった。昨年度は、TGFβを同時に投与して新生血管を成熟させ、機能する血管を作成する試みをした。VEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorとTGFβを同時に投与した家兎の球後の視神経乳頭周囲の血管はアデノウイルスvector単独投与群に比較して血管形成が不良であった。TGFβ投与の時期を遅くした群では、一度形成された血管内皮のアポトーシスと考えられ多所見が認められた。

この治療法は、血管新生を起す増殖因子を投与することで、心筋を栄養する冠動脈の側副路を形成し、心筋虚血の改善を行う治療法である。われわれは、この方法を応用して視神経乳頭の血液循環を改善するために、視神経乳頭周囲の血管に側副路を作る方法を開発しようと考えた。家兎の球後にrabbitのVEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorを投与し、視神経を含む球後組織に管腔形成が認められた。しかし、血管腔内には血球は存在しなかった。また、Heidelberg Retina Flowmeter(HRF)を用いて、視神経乳頭面上における血流速度測定を行ったが血流の改善は認められなかった。球後に存在する新生血管は、組織への側副路としての働きを持つほどには成熟していないと推定された。また、TGFβを同時に投与して新生血管を成熟させ機能する血管を作成する試みをした。VEGFのcDNAを組み込んだアデノウイルスvectorとTGFβを同時に投与した家兎の球後の視神経乳頭周囲の血管は、アデノウイルスvector単独投与群に比較して血管形成が不良であった。TGFβ投与の時期を遅くした群では、一度形成された血管内皮のアポトーシスと考えられる所見が認められた。
ブロック共重合体を利用した寸法安定性を有する高分子液晶の合成

側鎖にメソゲン基を持ち、鎖端にOH基を持つテレケリックポリメチルシロキサン(TPMS)を合成した。TPMSの基本的な反応性を調べるため、末端をイソシアナ-ト化したポリエチレングリコ-ルモノオレイルエ-テル(PEON)との反応を試みた。生成ブロック共重合体中のTPMSに対するPEONの比は1.3が最高の値であり、この値はメソゲン基の種類により大きく変わり、PEONを大過剰に用いても、ほとんどブロック共重合体を得ることができない場合もあった。このことは、TPMSの反応性はメソゲン基の種類に依存することを示している。示差走査熱量計により生成物の熱的性質を検討したところ、PEON単位の融解にともなう発熱ピ-ク及びTPMS単位の液晶の転移点によるピ-クがともに明瞭に認められた。このことは、このブロック共重合体がミクロ相分離構造をとっていることを示唆している。メチルメタクリ-ト(MMA)のリビング重合を行ない、末端にイソシアナ-ト基を有するpoly(MMA)を合成し、先と同様にTPMSとの反応を試みたが、この系ではほとんど反応は進行しなかった。TPMSの反応性はケリックスの種類にも依存することが分かる。メソゲン基を有するメタクリル酸エステル類(MsMA)のリビング重合を確立し、この系を利用してMMAとMsMAからなるブロック共重合体の合成を試みた。ブロック共重合においてもリビング重合の進行を示唆する結果が得られた。すなわち、単分散ポリマ-の生成を確認するとともに、生成ブロック共重合体の分子量は、全てのリビングプレポリマ-から第二段階の重合が開始されたと仮定して計算した値と一致するものであった。ブロック共重合体の熱的性質を検討したところ、液晶相の転多が観察され、この場合もミクロ相分離構造を有していることを示唆する結果が得られた。このように当初の目的に合致する液晶高分子を合成することができたが、その性質については今後の検討を要している。側鎖に-CH_2-CH_2-CH_2-O-〓COO-〓-〓O-(CH_2)_3-CH_3を持ち、鎖端にOH基を持つテレケリックポリメチルシロキサン(TPMS)を合成した。TPMSの基本的な反応性を調べるため、ポリエチレングリコ-ルモノオレイルエ-テル(PEO)とジフェニルメタンジイソシアナ-ト(MDI)との反応により、末端にイソシアナ-ト基を有するPEO(PEOM)を合成し、TPMSとPEOMの反応を試みた。これまでジイソシアナ-トとしてトリレンジイソシアナ-トを用いた場合は、生成ブロック共重合体中のTPMSに対するPEOの比は1を越えることはなかったが、今回は1.3まで挙げることができた。しかしそれ以上の高い比を得ることは、反応混合物中のTPMSに対してPEOMを大過剰に用いても達成できなかった。生成ブロック共重合体の熱的性質を示差走査熱量計による測定から検討した。ブロック共重合体のPEO単位の融解にともなう発熱ピ-ク及びTPMS単位の液晶の転移点によるピ-クはともに明瞭に認められた。これらの各成分ブロック鎖の転移点が観測されたことは、このブロック共重合体がミクロ相分離構造をとっていることを示唆している。アルミニウムポルフィリン錯体を開始剤にしてメチルメタクリレ-ト(MMA)のリビング重合を行い、その系に活性末端に対応する量のプロピレンオキシドを添加して、末端にOH基を有するpoly-MMAを合成した。

このpoly-MMAとジフェニルメタンジイソシアナ-トとの反応を行なった後、先に合成したTPMSとの反応によりブロック共重合体の合成を試みたが、反応の進行は認められなかった。TPMSとPEOとのブロック共重合体では各成分ブロック鎖の転移点が観測され、ミクロ相分離構造をとっていることを示唆する結果が得られているので、今後はTPMSとpoly-MMAのような硬いブロック鎖とのブロック共重合体の生成による、寸法安定性を有する液晶高分子合成の条件の検討が必要である。液晶鎖を1成分とするブロック共重合体は、ミクロ相分離構造により液晶鎖と非液晶鎖が独立の相に存在するため、液晶鎖は液晶相を非液晶鎖は支持相となり、寸法安定性を有する液晶となることが期待される。そこで、側鎖にメソゲン基を持ち、鎖端にOH基を持つテレケリックポリメチルロキサン(TPMS)を合成し、これとケリックポリマ-との反応によりブロック共重合体の合成を試みてきた。しかし、この系では、TPMSの反応性が極めて低く目的の性質を持つブロック共重合体を得ることができなかった。そこで、本年度はメソゲン基を有するメタクリル酸エステル類(MsMA)のリビング重合をメチルアルミニウムポリファリン錯体を用いて試み、メタクリル酸エステルからの単分散液晶高分子の合成に初めて成功した。メソゲン基中にエステル基、ニトリル基等の官能基を有するものであっても、重合はリビング的に進行することを認めた。このリビング系を利用してメタクリル酸メチル(MMA)とMsMAからなるブロック共重合体の合成を試みた。ブロック共重合においてもリビング重合の進行を示唆する結果が得られた。すなわち、単分散ポリマ-の生成を確認するとともに、生成ブロック共重合体の分子量は、全てのリビングプレポリマ-から第二段階の重合が開始されたと仮定して計算した値と一致するものであった。またブロック共重合体中のpoly(MMA)鎖と液晶鎖の鎖長はかなり広範囲に調節可能であることも分かった。ブロック共重合体の熱的性質を検討したところ、poly(MMA)のガラス転移点とともに液晶相に由来する転移が観察された。このことはブロック共重合体がミクロ相分離構造をとっており、poly(MMA)鎖と液晶鎖が独立に存在していることを示唆するものである。このように当初の目的に合致する液晶高分子を合成することができたが、その性質の詳細については今後の検討を要している。
アラビドプシスCO_2非感受性変異体を用いた気孔におけるCO_2センサーの解明

気孔には、多くのポンプやイオンチャネルが存在し、特に気孔閉鎖には、陰イオンチャネルが中心的な役割を果たしていると推定されているが、その分子実体は不明である。本年度は、モデル植物であるシロイヌナズナの分子遺伝学的な解析から、その陰イオンチャネルの有力な候補を同定した。植物の葉面温度は、蒸散率によって変化するため、気孔開度の尺度となる。slac1(slow anion channel-associated 1)変異体は、CO_2依存的な葉面温度変化を指標に単離され、高CO_2による気孔閉鎖が阻害された変異体である。その原因遺伝子は、真菌や細菌のジカルボン酸/リンゴ酸輸送体の遠縁のホモログである、植物では機能未知のタンパク質をコードしていた。レポーター遺伝子を用いた発現解析より、SLAC1は気孔を構成する孔辺細胞の細胞膜に特異的に発現していた。気孔閉鎖時には、孔辺細胞から細胞外ヘリンゴ酸^<2->やC1^-などの陰イオンが排出されると考えられている。変異体の孔辺細胞プロトプラスト(GCP)を用いてイオン含量を測定した結果、それらの陰イオンが、野生株と比較して高蓄積していた。これらの結果より、SLAC1は気孔閉鎖における細胞膜を介した陰イオン輸送に重要な役割を果たしていることが明らかになった。孔辺細胞において、陰イオンの排出に中心的な役割を担うのはS(slow)タイプの陰イオンチャネルであることが示唆されていることから、SLAC1はそのイオンチャネルの本体である可能性が高い。また、シロイヌナズナには、SLAC1と相同性の高い遺伝子が数個存在するが、それぞれの遺伝子が差次的な組織特異性を示し、とりわけSLAC1のみが気孔特異的に発現することが明らかになった。ホモログ遺伝子をslac1変異体の気孔において異所的に発現させると、slac1変異体に見られた恒常的な気孔開口とイオンの高蓄積が共に機能相補されたことから、SLAC1ファミリーの機能は類似しており、気孔以外の他の組織にも共通した陰イオン輸送システムが存在する可能性が示唆された。本年度は、CO_2センシング機構の全体像を理解するために必要不可欠な変異体のスクリーニングを重点的におこなった。約2万個体のm2植物をスクリーニングした結果、昨年度得られた変異体とあわせて、合計11系統のCO_2非感受性変異体cdi(carbon dioxide insensitive)を得ることに成功した。掛け合わせの結果、いずれも独立したアリルであることが分かった。葉面温度の測定を行った結果、高温タイプが6系統で、低温タイプが5系統であった。形態に特徴を持つ変異体は3系統のみ(cdi4,5,11)であり、その他の大半が気孔の機能に特異的に関わる変異体であることが予想される。また、cdi8とcdi10の2系統に関しては優性変異であり、これまで得られた変異体とは異なるタイプのCO_2関連因子が同定される可能性が高い。今後は、アブシジン酸や光に対する応答を詳細に解析することで、各変異体の表現型の特徴を明らかにし、マッピングにより原因遺伝子の同定をおこなう予定である。また昨年度、変異部位を同定したcdi3変異体の解析も進めた。まず、変異体に推定遺伝子を導入した結果、表現型が回復したことから、相補を確認することができた。次にCDI3タンパク質の発現部位を明らかにするため、CDI3プロモーターでGUS遺伝子を発現させた形質転換植物を作製し、GUS染色をおこなった。その結果、気孔のみ染色された。CDI3タンパク質は気孔特異的に発現し、機能していることが分かった。さらにCDI3タンパク質の細胞内における局在を明らかにすることにした。CDI3タンパク質のC末端にGFPを連結させたタンパク質を発現させた形質転換植物を作製し、表皮組織を観察した結果、細胞膜で強い蛍光が観察された。以上、これまでの解析により、CDI3タンパク質は気孔の細胞膜で特異的に発現しているタンパク質であり、気孔の開閉に重要な役割を果たしていることが明らかになった。今後は、CDI3タンパク質の輸送基質を電気生理学的手法により明らかにする予定である。植物の葉面温度は、蒸散率によって変化するため、気孔の開度の尺度となる。そこで、CO2依存的な葉面温度変化を指標に、合計11系統のCO2非感受性変異体cdi(carbon dioxide insensitive)を単離した。これらの変異体のうち、cdi8変異株は唯一の優性変異体であり、CO2濃度に関わらず、低い葉面温度を示す。原因遺伝子のマッピングを行った結果、本研究室で最初に単離されたCO2制御因子であるHT1キナーゼに変異部位が同定された。ht1変異体はCO2濃度に関わらず、高温を示す変異体として単離されたが、変異部位により、逆の表現型の低温になることが明らかになった。今後cdi8はht-3としてその原因を解明していく予定である。また、先行している解析を進めているcdi3変異体は、cdi8と同様に、高い蒸散率を示し、CO2に対する感受性が著しく低下している変異体である。その原因遺伝子は、孔辺細胞の細胞膜に特異的に発現するトランスポーター様のタンパク質をコードしていることが明らかになった。

気孔におけるCDI13タンパク質の役割を明らかにするため、気孔の開閉に関わるイオンであるK+、Cl-,リンゴ酸-の含量をWTとcdi3変異体の孔辺細胞プロトプラスト(GCP)を用いて測定した。その結果、cdi3変異体はWTと比較して、すべてのイオンに対して高い値を示すことが明らかになった。CDI3タンパク質は、CO2シグナルのみならず、気孔におけるイオンホメオスタシスに重要な役割を果たしていることが示唆される。今後は、電気生理学的手法を用いて、輸送基質を明らかにする予定である。また、シロイヌナズナには、CDI3タンパク質と相同性の高い遺伝子が数個存在するが、これらの遺伝子の機能分化を明らかにするため、発現解析と機能相補解析をおこなった。その結果、それぞれの遺伝子が差次的な組織特異性を示し、とりわけCDI3のみが気孔特異的に発現することが明らかになった。ホモログ遺伝子の機能がCDI3と同様であるかどうかを検証するため、気孔特異的なプロモーターを用いて、ホモログ遺伝子をcdi3変異体の気孔において異所的に発現させた。得られた形質転換体では、cdi3変異体に見られた恒常的な気孔開口が機能相補されていることから、CDI3とホモログ遺伝子の機能は類似することが明らかになった。今後、ホモログ遺伝子の欠損変異体を用いて詳細な表現型解析を行うことで、CD13タンパク質の機能同定に役立てていきたい。気孔には、多くのポンプやイオンチャネルが存在し、特に気孔閉鎖には、陰イオンチャネルが中心的な役割を果たしていると推定されているが、その分子実体は不明である。本年度は、モデル植物であるシロイヌナズナの分子遺伝学的な解析から、その陰イオンチャネルの有力な候補を同定した。植物の葉面温度は、蒸散率によって変化するため、気孔開度の尺度となる。slac1(slow anion channel-associated 1)変異体は、CO_2依存的な葉面温度変化を指標に単離され、高CO_2による気孔閉鎖が阻害された変異体である。その原因遺伝子は、真菌や細菌のジカルボン酸/リンゴ酸輸送体の遠縁のホモログである、植物では機能未知のタンパク質をコードしていた。レポーター遺伝子を用いた発現解析より、SLAC1は気孔を構成する孔辺細胞の細胞膜に特異的に発現していた。気孔閉鎖時には、孔辺細胞から細胞外ヘリンゴ酸^<2->やC1^-などの陰イオンが排出されると考えられている。変異体の孔辺細胞プロトプラスト(GCP)を用いてイオン含量を測定した結果、それらの陰イオンが、野生株と比較して高蓄積していた。これらの結果より、SLAC1は気孔閉鎖における細胞膜を介した陰イオン輸送に重要な役割を果たしていることが明らかになった。孔辺細胞において、陰イオンの排出に中心的な役割を担うのはS(slow)タイプの陰イオンチャネルであることが示唆されていることから、SLAC1はそのイオンチャネルの本体である可能性が高い。また、シロイヌナズナには、SLAC1と相同性の高い遺伝子が数個存在するが、それぞれの遺伝子が差次的な組織特異性を示し、とりわけSLAC1のみが気孔特異的に発現することが明らかになった。ホモログ遺伝子をslac1変異体の気孔において異所的に発現させると、slac1変異体に見られた恒常的な気孔開口とイオンの高蓄積が共に機能相補されたことから、SLAC1ファミリーの機能は類似しており、気孔以外の他の組織にも共通した陰イオン輸送システムが存在する可能性が示唆された。
小脳変性関連遺伝子の培養細胞における発現調節と組換え体蛋白を用いた動物モデルの開発

高率に蛋白を発現するベクターpWR590にPCD17遺伝子を組み換えることによって、傍腫瘍性小脳変性症関連蛋白PCD17の大量精製を可能とした。この組み換え体蛋白を免疫親和性により精製したものを抗原としたELISA法により抗体を測定する系を開発した。さらにPCD17の組み換え体deletionmutant蛋白を用いることによって、抗体の認識にleucinezipper領域の存在が重要あることを明らかにした。抗神経細胞抗体の誘導および傍腫瘍性小脳変性症の実験動物モデルの作製を目的として、5種類の異なる系のマウスにPCD17組換え体蛋白をアジュバントと共に感作し、その免疫応答性を調べ、抗体の出現をみた個体の臨床症状と病理所見の検索を行なった。5種類の異なる系のマウスに繰り返し能動免疫したところ、感作した全てのマウスの系統の血清中に患者の抗神経細胞抗体に類似した抗神経細胞抗体の存在が確認され、その抗体価は患者のそれと同等かそれ以上であった。抗体が誘導されたマウスに神経症状の発症はみられず、また病理からも小脳組織に小脳変性を示す所見を確認することはできなかった。しかしながら、感作されたマウスの小脳Purkinje細胞の細胞質には、対照抗原で感作されたマウスの小脳組織にはみられないIgGの沈着が観察され、神経細胞において能動感作により産出された抗体が神経細胞に取り込まれ、沈着している可能性が示唆された。肺小細胞癌を伴う傍腫瘍性辺縁系脳炎の抗神経細胞核抗体を用いたexpressionscreening法により新たな神経抗原蛋白PLE21をcDNAクローニングした。この遺伝子が脳に特異的に発現していることを明らかにすると共に、その推定されるアミノ酸配列は肺小細胞癌に伴う傍腫瘍性神経症候群に関連する他の神経抗原蛋白であるHuD抗原と高い相同性を示し、同様に3個のRNA認識モチーフを有する蛋白であることを明らかにした。1.昨年度までの本研究により、旁腫瘍性小脳変性症(PCD)に関連する小脳蛋白PCD17のcDNAから大量かつ純度の高いPCD関連蛋白を組換え体蛋白として得ることが可能となった。PCD疾患の実験動物モデルを作製する目的で、このPCD17組換え体蛋白を種々の系統のマウスに対し感作を試みた。用いたマウスは組織適合抗原が異なる、Balb/c(H-2^d),C3H/HeJ(H-2^k),AKR/J(H-2^a),C57Bl/10(H-2^b),SJL/J(H-2^s)の5系統を用い、大腸菌に発現させたPCD17蛋白をSDS-PAGEにより分離した後、相当するゲル断片を感作抗原としてFreundのadjuvantと共に繰り返し免疫した。感作したマウスより定期的に尾静脈より採血し、PCD17抗原に対する対体の存在についてWesternblotting法およびELISA法により測定した。その結果、各系統共に程度の差は認められたものの抗PCD17抗体の産生が確認された。これらの抗体が非特異的なものではないことは、免疫組織化学により小脳Purkinje細胞で抗Yo抗体/Typel抗体に特徴的な染色パターンを示したことから確認した。マウス血清中における抗PCD17抗体は、PCD患者のTypel/抗Yo抗体に比べてもさらに高い抗体価を示していた。感作したマウスについて小脳失調症状を含めた臨床経過の観察を開始した。

2.肺小細胞癌に伴なう旁腫瘍性辺縁系脳炎(PLE)について、患者にみられた抗神経細胞核抗体(抗Hu抗体/Typell抗体)をプローブとして、この抗体が認識する神経細胞抗原についてヒト海馬cDNAlibraryからcDNAcloningを試みた。得られたcDNAクローンは、1991塩基対からなり、その中に52kdの蛋白抗原をコードするopenreading frameを含んでいた。このクローンはこれまでに抗Hu抗体が認識する小脳抗原として報告されているHuD抗原とは類似しているものの、明らかに異なる蛋白であった。3.PCD17cDNAをsense及びantisenseの方向にbetaactinpromoterを有するpHbeta-AP gamma-1-neovectorに組み換え、ラット由来PC12細胞、マウス由来NIH3T3細胞に対しリポフェクチン法による遺伝子導入を試みた。細胞がG418により選択し、クローニングを限界希釈法により繰り返し細胞クローンを幾つか得た。得られた細胞の変化について検討を開始した。1、婦人科癌と乳癌に伴う傍腫瘍性小脳変性症の抗小脳Purkinje細胞抗体の認識抗原である神経抗原蛋白PCD17の組み換え体蛋白をFreundアジュバントと共にBalb/c,C3H/HeJ,AKR,C57Bl/10,SJLの5種類のマウスに繰り返し能動免疫し、抗小脳Purkinje細胞抗体の産生及び神経症状の発現について検討した。初回免疫から約1年間の観察期間中では、いずれのマウスにも失調症状を含め明らかな神経症状の発症はみられず、これらのマウスの小脳組織においても小脳変性を示す明らかな神経細胞の脱落所見を確認することはできなかった。全てのマウスの系統において、その血清中に抗神経細胞抗体の存在が確認され、この抗体は小脳顆粒細胞と反応することはなく、小脳Purkinje細胞の細胞質を顆粒状に染色する特徴的な免疫組織化学所見が観察された。能動感作されたマウスの小脳Purkinje細胞細胞質には、対照抗原で感作されたマウスの小脳組織には決してみられないIgGの沈着が観察され、能動免疫により産生された抗体が神経細胞内に取り込まれた可能性が示唆された。2、PCD17遺伝子の標識RNAプローブを用いて小脳と海馬のin situ hybridizationを試み、小脳組織においては免疫組織化学と一致する発現パターンを確認すると同時に、海馬においては蛋白の発現がみられない錐体細胞層や顆粒層の神経細胞にもPCD17mRNAが発現していることを見出した。3、昨年度の本研究によりcDNAクローニングされた肺小細胞癌に伴う傍腫瘍性辺縁系脳炎の抗神経細胞核抗体の認識抗原である神経蛋白PLE21について、その発現が脳に特異的であることを明らかにした。さらに、このcDNAクローンの塩基配列から推定されるアミノ酸配列より、肺小細胞癌に伴う傍腫瘍性神経症候群に関連する他の神経抗原蛋白であるHuD抗原と高い相同性を示し、同様に3個のRNA認識モチーフを有する蛋白であることを認識した。