hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メカノセンサーCasによるミクログリア活性制御を介する脊髄損傷後の神経可塑性調節

脊髄損傷後のニューロリハビリテーションの土台となる神経可塑性は、神経細胞自身の機能とともに、周囲のミクログリアの機能によっても制御されているため、ミクログリアによる可塑性制御メカニズムは治療ターゲットの一つとして考えられる。一方、細胞はメカニカルストレスを介してその機能を変化させるが、メカニカルストレスがミクログリアの機能に与える影響と、リハビリへの応用の可能性は明らかではない。Casは、メカノセンサーの1つと考えられており、伸展刺激(メカニカルストレスの1種)によりリン酸化を受けることが報告されている。このメカノセンサーCasの脊髄での発現をC57BL/6Jマウスを用いて免疫染色法により評価したところ、Iba1陽性ミクログリアにおいて、Casのリン酸化を認めた。さらに損傷42日後(慢性期)ではミクログリアにおいて顕著なCasのリン酸化を認め、ミクログリア活性に対するCasの寄与が示唆された。さらに細胞培養系として、ミクログリアと同種の細胞であるマクロファージでのメカニカルストレスの役割を検討した。安定的に培養可能な細胞として、腹腔マクロファージを用いて種々のメカニカルストレスを負荷したところ、Shearストレス負荷により、LPS誘発性の炎症反応の低下を示唆する所見を得た。申請者の所属変更に伴い、脊髄損傷モデルマウスを安定的に作成不能になり、脊髄損傷後に認められる骨格筋不動でのマクロファージにおけるCasの役割を検討した。その結果、マウスにおいて、不動化した骨格筋組織への規則的で反復的な刺激が、不動化により増悪したマクロファージの炎症反応を抑え、不動化に伴う筋萎縮に抑制的に働く可能性を報告した。これは、脊髄損傷により麻痺した骨格筋で認める萎縮にも応用可能となる可能性がある。脊髄損傷後のニューロリハビリテーションの土台となる神経可塑性は神経細胞自身の機能とともに、周囲のミクログリアの機能によって制御されているため、ミクログリアによる可塑性制御メカニズムは治療ターゲットの一つとして考えられる。まず、Casがミクログリアに発現するかを、C57BL/6Jマウスにおいて免疫染色法により評価したところ、Iba1陽性ミクログリアにおいて、Casのリン酸化を認めた。さらに脊髄損傷後のCasの発現とミクログリア活性の変化の関連を評価するために、10週齢のC57BL/6Jマウスを用いて脊髄損傷モデルを作製し、42日後(慢性期)の脊髄を用いて、免疫染色法により評価した。その結果、Iba1陽性ミクログリアにおいてさらに顕著なCasのリン酸化を認め、ミクログリア活性に対するCasの寄与が示唆された。次に、in vitroにおいてミクログリアにおけるCasの機能を評価するために、ミクログリア培養系の構築を試みた。現在、ミクログリアの初代培養系を既存の報告に従い確立している最中である(Yip et al., JNeurosci Methods, 2009)。また、これと並行し、ミクログリアと同系統の細胞であるマクロファージの初代培養系を、既知の方法である腹腔由来マクロファージを採取する方法で確立した。また、ミクログリアにおいてCasの発現を認めたことから、ミクログリア特異的Cas欠損マウスを作製することとした。しかし、動物飼育施設の改修等により、マウスの作製は首尾よく進んではいない。本年度の目標は、今後の研究推進の足掛かりを得ることであり、ミクログリアにおいてメカニカルストレス関連タンパクであるCasが発現しており、機能することが示唆され、脊髄損傷病態でその機能が変容する可能性を示すデータを得ることができた。また、ミクログリアの初代培養系は構築中であるが、仮に困難であっても、同系統の細胞である腹腔由来マクロファージの初代培養系は確立できたことから、今後の培養系での検討は遂行可能となった。上記点はおおむね順調に進展している点である。しかし、研究推進の懸念材料として、動物飼育施設の改修等により、ミクログリア特異的Cas欠損マウスの作製が首尾よく進んでいないことが挙げられる。このことから、おおむね順調に進展している点も多く挙げられるが、研究の進捗状況としては、全体としてはやや遅れていると考えている。前年度に、Casがミクログリアに発現するかを、C57BL/6Jマウスにおいて免疫染色法により評価したところ、Iba1陽性ミクログリアにおいて、Casのリン酸化を認めた。また、ミクログリアと同系統の細胞であるマクロファージの初代培養系を、既知の方法である腹腔由来マクロファージを採取する方法で確立していた。今年度は、細胞培養系において、種々のメカニカルストレスを負荷したところ、Shearストレス負荷により、腹腔マクロファージにおいて炎症反応の低下を示唆する所見を得た。

一方、in vivo実験系については、当初ミクログリア特異的Cas欠損マウスを作成し、解析する予定としていたが、実験申請者の所属変更と、前所属機関の動物実験室改修に伴う全飼育マウスの受精卵凍結により、遺伝子改変マウスの作製は首尾よく進んではいない。また、所属変更に伴い、脊髄損傷モデルマウス作成に必要な装置を利用できなくなり、現所属で可能な代替法を確立している最中である。本年度の目標は、前年度に得た知見を基に、脊髄損傷マウスを用いて病態下でのCasの機能変化を解析し、遺伝子改変マウスの作出を進めるとともに、細胞培養系でメカニカルストレスによるCasを介したミクログリア機能変化を解析することであった。細胞培養系は、ミクログリアと同系統の細胞の腹腔マクロファージにおいて、メカニカルストレスの一種であるシアストレスが、マクロファージの炎症反応を抑制することを示唆するデータを得ており、おおむね順調に進展した。しかしながら、in vivo実験系に関しては、当初ミクログリア特異的Cas欠損マウスを作成し、解析する予定としていたが、実験申請者の所属変更と、前所属機関の動物実験室改修に伴う全飼育マウスの受精卵凍結とそれに伴う体外受精を経る必要があり、遺伝子改変マウスの作製は首尾よく進んでおらず、また、申請者の所属変更に伴い、脊髄損傷モデルマウス作成に必要な装置を利用できなくなり、現所属で可能な代替法を確立している最中であるという、上記2点から、ほとんど進展していない。上記点を考慮し、おおむね順調に進展している点も挙げられるが、重要なin vivoの知見を得ることができておらず、研究の進捗状況としては、やや遅れていると考えている。脊髄損傷後のニューロリハビリテーションの土台となる神経可塑性は、神経細胞自身の機能とともに、周囲のミクログリアの機能によっても制御されているため、ミクログリアによる可塑性制御メカニズムは治療ターゲットの一つとして考えられる。一方、細胞はメカニカルストレスを介してその機能を変化させるが、メカニカルストレスがミクログリアの機能に与える影響と、リハビリへの応用の可能性は明らかではない。Casは、メカノセンサーの1つと考えられており、伸展刺激(メカニカルストレスの1種)によりリン酸化を受けることが報告されている。このメカノセンサーCasの脊髄での発現をC57BL/6Jマウスを用いて免疫染色法により評価したところ、Iba1陽性ミクログリアにおいて、Casのリン酸化を認めた。さらに損傷42日後(慢性期)ではミクログリアにおいて顕著なCasのリン酸化を認め、ミクログリア活性に対するCasの寄与が示唆された。さらに細胞培養系として、ミクログリアと同種の細胞であるマクロファージでのメカニカルストレスの役割を検討した。安定的に培養可能な細胞として、腹腔マクロファージを用いて種々のメカニカルストレスを負荷したところ、Shearストレス負荷により、LPS誘発性の炎症反応の低下を示唆する所見を得た。
フィッシャー症候群の新しいマーカーとしての抗GQ_<16>抗体の意義と病態の解明

われわれは先行感染後の眼球運動障害・失調・深部反射消失を三徴とするMiller Fisher症候群(MFS)の急性期の血中に、ガングリオシドGQ1bに対する特異的抗体が出現することを報告した。そこでさらに対象を広げて検索したところ、眼球運動障害を伴うGuillain-Barre症候群(GBS)にも抗GQ1b抗体が検出されることが明らかとなった。一方その他の疾患対照(眼球運動障害を伴わないGBSを含む)および正常対照では同抗体はすべて陰性であった。抗GQ1b抗体のみられた症例では急性期をすぎると経過と共に抗体価は低下消失した。従って血中抗GQ1b抗体は先行感染後の眼球運動障害の急性期に特異的に関連して出現すると考えられる。抗体の結合特異性を検討するため、GQ1b類似の糖鎖構造をもつGT1aとの反応をしらべたところ抗GQ1b抗体陽性例全例で抗GT1a活性もみられた。抗GT1b活性はみられないため抗体の結合には基本糖鎖の末端のdisialosyl基が重要であると考えられた。抗GQ1b抗体と病態機序との関連をしらべるため抗GQ1bモノクローナル抗体を用いて、ヒト剖検例の神経組織を免疫染色した。その結果、眼球運動を司る脳神経である動眼神経・滑車神経・外転神経のnodes of Ranvier周囲が強く免疫染色された。脊髄前根および後根には同様の染色はほとんどみられなかった。さらに動眼神経と脊髄前根および後根のガングリオシド分画の薄層クロマトグラム(TLC)をレゾルシノール染色と抗GQ1bモノクローナル抗体による免疫染色で比較検討したところ、動眼神経ガングリオシド中のGQ1bの比率は脊髄前根や後根と比べて高かった。有髄神経のnodes of Ranvier周囲は神経伝導にとってきわめて重要な部位である。先行感染による感作により出現した抗GQ1b抗体が、動眼・滑車・外転神経の同部位に結合することにより急性の眼球運動障害をきたす可能性が示唆される。今後動物モデルの作成等により、病態機序をさらに詳細に解明することが必要と考えられる。
オートファゴソーム外膜因子の同定と膜融合過程の解析

オートファゴソームとリソソームの膜融合に関わる因子を同定するため、オートファゴソーム外膜因子の網羅的同定を行った。STX17変異体過剰発現、OptiPrep密度勾配遠心、LC3を標的とした短時間精製を組み合わせることでオートファゴソームを高純度・高効率に精製する方法を確立した。水溶性ビオチン化試薬で外膜因子を特異的に修飾・精製した後、質量分析に供することで複数の外膜因子候補を得た。これらの因子についてCRISPR法での遺伝子破壊細胞の作製、およびsiRNA法でのタンパク質量抑制を行ったがオートファジー活性への影響は限定的でリソソームとの膜融合に関わる因子の同手には至っていない。オートファゴソームの生化学的単離のため、STX17ドミナントネガティブ変異体(GFP-STX17dNTR)のDOX誘導細胞(論文revise中)にFLAG-Strep-LC3を安定発現させた。DOX添加により、GFP-STX17dNTRの発現が誘導され、GFP-STX17dNTRおよびFLAG-Strep-LC3の二重陽性のオートファゴソームが顕著に蓄積することを確認した。オートファゴソームを高効率・高純度に精製する方法として、二種類のタグを用いた二段階精製を行った。anti-FLAGビーズを用いて一段階目の精製を行い、FLAGペプチドで溶出した後、anti-GFPビーズを用いて二段階目の精製を行った。二段階精製後、ビオチン化試薬を用いて化学的修飾を行い、可溶化後、streptavidinビーズを用いた精製を行った。しかし、ここで得られた精製標品の質量分析ではオートファゴソーム外膜因子の候補は得られなかった。この二段階精製ではオートファゴソームマーカー因子の濃縮は見られるものの、オートファゴソーム以外のオルガネラの混入も見られたため、精製方法を変更することとした。小径磁性ビーズを用いた二段階精製では、オートファゴソーム以外のオルガネラが小径磁性ビーズに吸着する可能性が考えられたため、OptiPrep密度勾配遠心を用いたフローテーションにより、オートファゴソームと他のオルガネラの分離を試みた。結果、オートファゴソームはOptiPrepのステップ勾配中の低密度の界面に濃縮され、ERやミトコンドリアなど他の多くのオルガネラと分離されることが見出された。このフローテーションによるオートファゴソームの単離に、タグを用いた精製を組み合わせたところ、オートファゴソームが高効率に濃縮されていることを確認した。現在、質量分析によるオートファゴソーム外膜因子候補の同定を行っている。当初計画していた二段階精製を行ったが、結果として精製標品中のオートファゴソームの純度や量が不十分であったため、実験計画に遅れが出ていた。そこでリカバリーのため、別の精製方法(濃縮方法)を新たに考案し、タグによる精製の前にOptiPrep密度勾配を用いたフローテーションを行うことで、他のオルガネラの混入を少なくすることに成功した。当初の実験計画から「やや遅れている」が別方法でリカバリーすることで実験計画の遅れは最小限にとどめている。オートファゴソームの生化学的単離のため、STX17ドミナントネガティブ変異体(GFP-STX17dNTR)のDOX誘導細胞(Uematsu et al., 2017, JBC)を用いてオートファゴソームを蓄積させ、OptiPrep密度勾配遠心によるフローテーションを行った。フローテーション後のトップフラクションにオートファゴソームが濃縮されていることを確認したので、ここからFLAGタグ(FLAG-LC3)による精製を行い、質量分析による外膜候補因子の同定を試みたが、オートファゴソーム-リソソーム融合に関わる因子は得られなかった。この原因として、精製オートファゴソーム画分に含まれるオートファゴソーム量が非常に少なく(GFP-STX17dNTRで蓄積させても絶対量が非常に少ない)、多段階の精製ステップを経ても他オルガネラの混入に埋もれてしまうためと考えられた。また、この方法ではオートファゴソーム外膜に局在する因子とオートファゴソーム内に局在する因子の区別がつかないため、別の方法として外膜因子の特異的ビオチン化(化学修飾)を行い、ストレプトアビジン磁気ビーズによる精製・濃縮を行った。特異的にビオチン化されたタンパク質の精製が確認されたため、現在質量分析による同定を進めている。さらに、同研究グループでのスクリーニングから、オートファゴソーム-リソソーム融合に関わる新規SNAREとしてYKT6が同定された。YKT6は既知のオートファゴソームSNAREであるSTX17とは別々に機能しており、オートファゴソーム-リソソーム融合には異なる2種類のSNAREシステムが使われていることが示唆された。

当初の実験計画からやや遅れているが、現在、精製標品の質量分析を行っており、これによるオートファゴソーム外膜因子候補の同定までが前年度の計画である。今後は、計画書に記載した通り、質量分析により同定したオートファゴソーム外膜因子候補について機能および細胞内局在の解析を行う。各因子についてCRISPR技術による遺伝子ノックアウト細胞の作製を行い、オートファゴソーム形成過程やリソソームとの融合過程にどのような影響が見られるか生化学的解析および形態学的解析を行う。形態観察はDeltaVision高解像度イメージングシステムを用いた蛍光顕微鏡解析および電子顕微鏡解析を行う。また、並行して、既存方法を応用して選択的オートファジー活性および非選択的オートファジー活性への影響の違いを分けて調べる。また、候補因子の相互作用相手を免疫沈降法などによって解析する。生化学
酪農経営に及ぼす不足払い制度・乳価・計画生産・技術進歩の効果

本研究の課題は、加工原料乳に対する不足払い制度・交易条件(乳価/配合飼料価格)・生乳生産者団体による計画生産(生産割当)の変化、さらには乳牛改良といった技術進歩が、各地域の酪農経営にどのような影響を与えるかについて理論的実証的な整理を行い、それに経済学的検討を加えることである。具体的な研究実績は、つぎの通りである。(1)まず、わが国の生乳生産構造を明らかにするために全国を9農区に分割し、各地域別ごとに自給飼料、購入飼料、乳牛資本、機械建物、労働の5投入要素からなる酪農生産のトランスログ費用関数を計測した。その結果、どの地域でも乳牛改良を代表とする技術進歩が、生産性の向上に最も大きく貢献していたことが確認された。また、北海道の技術進歩が都府県に比べて大きいことも併せて確認された。(2)つぎに、交易条件(乳価/配合飼料価格)の変動は、さきの技術進歩と対応するように購入飼料の多給をもたらしたことが明らかにされた。これは実質乳価の低下局面においても、円高による配合飼料価格の下落が大きく作用していたためである。しかし、この効果が生産費用の低下に必ずしも貢献していない点も明らかにされた。(3)そして、派生重要の価格弾力性をもとに比較静学分析として計画生産と価格支持制度の効果を検討した結果、計画生産は労働所得を減少させる反面、不足払い制度はおもに北海道を中心に労働所得を増加させるように作用していたことが確認された。
酵母細胞壁の生合成機構に関する遺伝生化学的研究

本研究では、酵母細胞壁構成分の合成と局在化の機構を明らかにするため変異株とクローン化した遺伝子について解析した。(A)マンナン糖鎖の合成に関わるVIG遺伝子の産物については、Vig9蛋白質がGDP-マンノース合成酵素であることを証明しその性質を明らかにした。ポリクローナル抗体或はエピトープタグ標識により、膜蛋白質のVig1/Vanl,Vig3/Anpl,Vig4/Van2,Vig6/Mnn9はいずれもゴルジ体と考えられるオルガネラに存在することを示した。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質GST-Vig1を発現させた膜を可溶化してグルタチオン・カラムによってアフィニティ精製したところ、融合蛋白質でないVig1,Vig6,糖転移酵素であることが知られているVig7/Och1が、GST-Vig1とともに結合し回収されたこと等から、これらが蛋白質-蛋白質の相互作用による構造体を形成していることが明らかになった。今後は大量調製によりこの構造体の構成と機能を調べることが可能である。(B)浸透圧保護剤依存の脆弱細胞変異株JS23及びJS30の変異を相補する遺伝子をクローン化して塩基配列を決定したところ、JS23の変異はPKC1遺伝子、JS30の変異はVIG9遺伝子におきていることが明らかになった。いずれも形質はこれまでになく激しいものであった。vig-9-3変異については、変異塩基の決定、変異酵素の活性測定等でも確認した。(C)GPI-アンカー修飾シグナル配列をもつホスファターゼPhoKMについては、プロモータをGAPに換えて発現量を増加させ、更にEndoH処理でN糖鎖を除去してからウエスタン・ブロットを行うことにより、免疫学的に蛋白質として検出が可能になった。熱SDS処理により非共有結合で細胞壁に結合している成分を除いたグルカンにPhoKMが結合していることを証明した。これよりPhoKMの鋭敏な活性検定で細胞壁局在機構に関わる変異を探索することが可能である。実際に、GPI-アンカーの合成に欠損が及ぶvig9-3等の変異株ではPhoKMが培地中に著量漏出するのを簡易なプレート検定によって検出できることを示した。我々が新規に取得したマンナン糖鎖が短い酵母変異vig9については、野生型遺伝子の塩基配列を完全に決定し、野生株,変異株,及び形質転換株の酵素活性測定などにより、これがmannose-l-phosphateとGTPからGDP-mannoseを合成するGDP-mannose pyrophosphorylaseの構造遺伝子であることを明らかにして投稿中である。GDP-mannoseはmannose転移の前駆体であり、この不足がマンナン糖鎖不全の直接的原因である。本遺伝子はほぼ同時に米国の2研究者もクローン化したが、機能を証明したのは我々が初めてである。同じく糖鎖不全となるvig4変異を相補する遺伝子を新たにクローン化し、全塩基配列を決定した。これは417アミノ酸よりなる親水性の新規な蛋白質をコードしており、アミノ酸配列の相同性などの解析からは、機能が予想できなかった。遺伝子破壊株は温度感受性を示した。

一方、浸透圧保護剤がないと生育できない酵母変異株のうち、JS23株とJS30株について、薬剤感受性などの詳しい性質を解析し、JS23株が特にグルカン合成阻害剤に著しく高感受性であることを明らかにした。これらの株は、接合頻度も著しく低く、通常の遺伝解析は行えなかった。DNA形質転換効率も低かったが、種々の条件検討と改良によって向上を図り、野生型酵母遺伝子ライブラリー中から、各々の浸透圧保護剤依存性を解消するプラスミドを取得することができた。現在、これらの断片上の遺伝子の確定と塩基配列決定を進めている。また、Kluyveromycesmarxianus由来の特異な酸性ホスファターゼについては、計画の通りに大腸菌で融合蛋白質を大量生産して精製し、これを抗原としてウサギを免疫した結果、抗原とは十分な反応性をもつ抗血清を得た。ところが、酵母に対しては極めて反応性が低く、従って特異性も十分でなかった。これは大腸菌ではおこらない蛋白質の修飾によると予想されるので、原因を調べ、またタグ標識による検出への計画切り替えも検討している。本研究では、酵母細胞壁構成分の合成と局在化の機構を明らかにするため変異株とクローン化した遺伝子について解析した。(A)マンナン糖鎖の合成に関わるVIG遺伝子の産物について抗体を用いて調べたところ、膜蛋白質であるVigl/Vanl,Vig3/Anp1,Vig4/Van2,Vig6/Mnn9の各蛋白質はいずれもゴルジ体と考えられるオルガネラに存在していた。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質GST-Viglを発現させた酵母の膜を可溶化してグルタチオン・カラムによってアフィニティ精製したところ、融合蛋白質でないVigl,Vig6,糖転移酵素であることが知られているVig7/Ochlが、GST-Vig1とともに結合し回収されたこと等から、これらが蛋白質-蛋白質の相互作用による構造体を形成していることが明らかになった。今後は大量調製によりこの構造体の構成と機能を調べることが可能である。(B)浸透圧保護剤依存の脆弱細胞変異株JS23及びJS30の変異を相補する遺伝子をクローン化して塩基配列を決定したところ、JS23の変異は情報伝達系のプロテインキナーゼ遺伝子PKC1、JS30の変異はGDP-マンノース合成酵素遺伝子VIG9におきていることが明らかになった。いずれも既に我々が解析済みのものだったが、その形質はこれまでになく厳しいものであった。後者のvig9-3変異については、変異塩基の決定、変異酵素の活性測定等によっても確認した。(C)GPI-アンカー修飾シグナル配列をもつホスファターゼPhoKMについては、プロモーターをGAPに換えて発現量を増加させた。更にEndoH処理でN糖鎖を除去してウエスタン・ブロットを行うことにより、免疫学的に蛋白質として検出が可能になり、熱SDSで処理して非共有結合で細胞壁に結合している成分を除いたグルカンにPhoKMが結合していることを証明した。これよりPhoKMの鋭敏な活性検定で細胞壁局在機構に関わる変異を探索することが可能である。
猫多発性嚢胞腎の病態解明と新規治療薬に関する研究

猫多発性嚢胞腎の嚢胞形成機序を明らかにするために、腎嚢胞細胞PKD1遺伝子変異によるツーヒット変異を証明し、嚢胞細胞増殖シグナル伝達経路をブロックする分子標的薬を決定して、猫における至適投与量を模索した。その結果、嚢胞ネットワークを通じて全国より血液検体と死亡症例の腎臓を収集でき、PKD1遺伝子のPCR-RFLP法とダイレクトシークエンスによる遺伝子検査の結果、腎嚢胞細胞PKD1遺伝子にホモ型変異を検出し(エクソン29、c.9891)ツーヒット変異が生じていることを明らかにした。治療薬にはcAMP pathwayを抑制するトルバプタンを選択し、短期投与と長期投与を実施して投与量を決定した。1.嚢胞ネットワークによるサンプルの収集全国各地より遺伝子検索用の血液と、死亡した多発性嚢胞腎症例の腎臓献体を収集した。血液サンプルについては、品種、性別、年齢などの項目と、腹部エコー検査による所見より嚢胞の数ならびに発生場所(両側性か片側性か)(腎臓のみか肝嚢胞を伴うのか)について検索し、PKD1遺伝子検査の結果と合わせて考察を加えた。ネットワークによる嚢胞腎の収集は、来年度以降も継続することとした。遺伝子検査は血液白血球からのPKD1遺伝子診断(PCR-RFLP法)とダイレクトシークエンス法を実施。嚢胞腎の献体については、病理組織学的検査を実施した。2.多発性嚢胞腎におけるツーヒット仮説の証明マイクロダイセクションによる嚢胞上皮細胞の採取後DNA抽出を行い、エクソン29に特異的PKD遺伝子プライマーを用いてPCRを実施し、PCR-RFLP法とダイレクトシークエンス法を実施。嚢胞上皮細胞のPKD1遺伝子のc.9891部位のダイレクトシークエンスを実施して、PKD遺伝子変異がヘテロ型(1ヒット)変異か、体細胞変異によるホモ型(2ヒット)変異かを検索した。3.猫のPKD1遺伝子のc.9891部位以外の変異部位の検索1で収集したサンプルのうち、PCR-RFLP法で変異が陰性だったにもかかわらず、左右両側の腎臓に多発性の嚢胞を有している症例が少数認められた。この症例サンプルについて、ダイレクトシークエンスを実施し、エクソン29の既知のホットスポット以外に、何らかの変異がないかどうか検索した。1.嚢胞ネットワークによるサンプルの収集(継続):研究開始年度(平成26年度)より実施している嚢胞ネットワークによるサンプル収集を継続した。臨床例ならびに死亡症例からの腎臓の献体が増加した。死亡腎については、病理学的検査実施前に死後CT検査を実施し、腎容積と嚢胞の状態を記録した。なお。ホームページに猫の飼い主向け啓発資料を掲載し、それにより献体が増加した。2.嚢胞腎の病態進行による腎臓サイズの変動:分子標的薬による治療効果を判定するためのマーカーとして腎臓サイズに注目し、嚢胞腎症例と死亡腎に対する腎臓サイズの測定と、嚢胞体積の経時的変化を観察した。これに先立ち、健康猫ならびに慢性腎臓病猫の腎臓サイズについて計測し、嚢胞腎との比較を実施した。3.猫多発性嚢胞腎治療薬の選択と投与量の決定:嚢胞細胞のcAMP活性を抑制するための方策としてバソプレシンV2受溶体に注目し、これの抑制薬である「トルバプタン」を治療薬として選択した。次にトルバプタンの投与量を決定するために、健康猫へのトルバプタン単回投与と長期投与を実施し、利尿効果が得られる投与量を決定し、長期投与による有害作用の有無についても観察した。4.嚢胞細胞に対するCFTR抗体ならびにポリシスチン抗体による免疫化学染色:提供された嚢胞腎の病理組織学的検索の後、嚢胞細胞におけるCFTRならびにポリシスチン蛋白の発現を検索した。27年度に予定していたサンプル収集が順調であり、ホームページによる情報提供によって全国から嚢胞腎症例の検体が続いていることと、予定していた嚢胞細胞でのCFTRならびにポリシスチン蛋白発現について検索できたこと、また猫多発性嚢胞腎ではPKD1遺伝子の特定の同じ場所でツーヒット変異が起きていることを証明できたことが挙げられる。また、治療薬についても研究が進み、バソプレシンV"受容体拮抗薬を選択して、健康猫での単回投与と長期投与によるデータが集積でき、投与量の決定ができたことは、本研究の進展にとっての意義は大きく、これにより臨床例への投与が可能となったことが理由として挙げられる。本研究はヒトの常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)のモデル疾患であるネコの多発性嚢胞腎(fPKD)の病態発生メカニズムを明らかにするために実施されたものであり、同時に有効な治療薬の選定も模索した。1fPKDにおけるPKD1遺伝子のツーヒット変異の証明:ADPKDでは生後腎尿細管(体細胞)の2回目の変異によって嚢胞細胞の増殖が始まるとされており(ツーヒット変異)、fPKDにおいてもツーヒット変異の有無を検索した。その結果、fPKDネコの腎嚢胞上皮細胞DNAのPKD1遺伝子(エクソン29領域、c.9891部位)でヘテロ接合性の喪失を検出した。したがってADPKDとfPKDでは、ポリシスチン蛋白(PC)が減少して細胞内カルシウム濃度の減少が起きcAMPの活性化が続くと思われた。2PCとCFTRの嚢胞形成への関与:ADPKDでは嚢胞内に溶液輸送が開始され、嚢胞は次第に大きくなる。これににはクロライドチャネル蛋白であるCFTRが関与している。CFTRはcAMP誘導性のクロライドチャネル蛋白である。fPKDネコの嚢胞腎組織に対し抗ネコCFTR抗体による免疫染色を実施し、同時に嚢胞

上皮細胞CFTR mRNA発現量の測定を行った。その結果、小・中嚢胞ではCFTR陽性細胞とCFTR遺伝子発現量は充分認められるが、大嚢胞で嚢胞細胞が扁平化すると両者の発現は減少することが明らかとなった。3fPKDの新しい治療戦略:上記の研究により嚢胞細胞はcAMP pathwayを経由して活性化されると考えられた。そのため、治療ターゲットはcAMP pathwayを抑制する分子標的薬のトルバプタンに決定した(今年度)。ネコに対するトルバプタン投与は実施されたことが無いため、健康ネコに投与し利尿効果の現れる投与量を検討した。その結果、3mg/kgの投与量で利尿効果が得られ有害作用もないことが示された。猫多発性嚢胞腎の嚢胞形成機序を明らかにするために、腎嚢胞細胞PKD1遺伝子変異によるツーヒット変異を証明し、嚢胞細胞増殖シグナル伝達経路をブロックする分子標的薬を決定して、猫における至適投与量を模索した。その結果、嚢胞ネットワークを通じて全国より血液検体と死亡症例の腎臓を収集でき、PKD1遺伝子のPCR-RFLP法とダイレクトシークエンスによる遺伝子検査の結果、腎嚢胞細胞PKD1遺伝子にホモ型変異を検出し(エクソン29、c.9891)ツーヒット変異が生じていることを明らかにした。治療薬にはcAMP pathwayを抑制するトルバプタンを選択し、短期投与と長期投与を実施して投与量を決定した。嚢胞ネットワークによるサンプル収集が順調であることと、腎臓の献体も多く集まってきているため。また、サンプルの分析作業(PKD1遺伝子のPCR-RFLP法とダイレクトシークエンス法等)と嚢胞腎に病理組織学的検索と組織化学等の実験が順調であることがあげられる。ツーヒット仮説の証明についても、結果を示すことが出来た。また、嚢胞細胞におけるポリシスチンタンパク発現解析のための抗体もすでに作成できたため、これを利用した嚢胞細胞に対する免疫染色が開始できることがあげられる。1.臨床例に対するトルバプタン投与:トルバプタン投与前にあらかじめ半年間嚢胞腎の大きさを画像検査により観察し、腎機能検査を実施して投与前のデータを取得する。その後、27年度に決定した投与量に従い実施する。その際に低用量からトルバプタンを投与し、高ナトリウム血症や脱水、肝障害が出現しないかを慎重に観察する。2.トルバプタン投与効果の判定:臨床症状ならびに腎機能検査と尿検査を継続すると共に、腎臓サイズも測定し、投与前のデータと比較して嚢胞拡大の経時的変化を観察する。また、尿中バイオマーカーと尿の浸透圧についても観察する。3.猫多発性嚢胞腎症例のPKD1遺伝子検査: PKD1exson29のホットスポット以外の変異がないかどうか、exson29以外の部位のダイレクトシークエンスを実施して検索する。4.猫多発性嚢胞腎における嚢胞細胞増殖のメカニズムに対する考察と研究のまとめ: 3年間で得られた成果に基づき、猫多発性嚢胞腎発症のメカニズムと病態について考察してまとめる。これにより、猫多発性嚢胞腎がヒトの常染色体優性多発性嚢胞腎と同じ病態であるのか、また、そのモデルになり得るのかが明らかになる。
ハロカ-ボン類を安全に分解処理する化学的手法

今年度は今後製造量が増加すると思われる代替フロン物質のHFC(水素化フルオロカ-ボン)やPFC(パ-フルオロカ-ボン)を処理の対象とした研究を手掛けた。モデル化合物にパ-フルオロデカリン(PFDと略記)を用い、還元剤にナフタレニドまたはBirch還元浴を用いて脱フッソ処理を行った。その結果、いずれの還元法を用いても脱フッソが容易に進行することが見いだされた。2ー1.ナフタレニド法:金属LiまたはNaから調製したナフタレンラジルアニオン(PFDはフッソ18原子を持つから、18モル当量の還元剤を使用した)のTHF溶液をPFDのTHF溶液に加えて6ー12°Cで所定の時間反応させ、後処理ののち脱離したF^ーイオンをイオンクロマトグラフで定量した。その結果、興味あることにLiーナフタレニドでは脱フッソ率は常に50%どまりであり、還元力を増強するいくつかの手段(ポリエチレングリコ-ルエ-テルの添加、光照射など)を適用しても効果がなかった。ところが対照的に、Naーナフタレニドでは同じ条件下で極めて効果的に脱フッソが進行し、短時間でほぼ定量的に脱フッソ化が進行することが明らかにされた。NaがLiに比べてこのように顕著な還元力の差を示すことは示唆的でありかつ興味深い。2ー2.Birch法:液体アンモニア中、共溶媒THFを用いて金属NaならびにLiでPFDを処理したところ、Liではやはり50%までしか脱フッソが進行しなかったが、Naを用いるとほぼ完全近くまで脱フッソした。この傾向はナフタレニド法と同じであり、安価なNaでの処理効率が定量的であることは実用面での利点となろう。
アジサイにおける形態の異なる2種類の小花の形成機構の解明

本研究は,アジサイにおいて装飾花と小がく花の2種類の小花が着生する機構を分子レベルで解明することを目的としている.アジサイから3個のAP1,2個のAP3、1個のPI相同遺伝子を単離した.RT-PCR法によりこれらを含むいくつかの遺伝子について発現解析を行った結果,LEY相同遺伝子HmLFY装飾花の花弁状がく片で特異的に発現していることが示された.一方,in situハイブリダイゼーション法を用いた発現解析を行った結果,AP3相同遺伝子であるHmAP3は装飾花の花弁状がく片では発現していないことが明らかとなった.額咲き型品種'Blue Sky'とその芽条変異系統で手まり咲き花房を着生する'BM-1'の花芽を用いたSuppressio Subtractive Hybridization法(SSH法)により,花房型に特異的に発現する遺伝子の単離を試みた.'Blue Sky'のSSHライブラリーから単離された16種類の機能未知cDNAクローンについて,RT-PCR法による発現解析を行った.花芽に関しては,いずれのクローンも'Blue Sky'で特異的に発現していた.また花芽,栄養芽および葉での発現解析を行った結果,これらのクローンは4つの発現パターンに分類された.'Blue Sky'のSSHライブラリーから単離されたcDNA断片の配列を解析した結果,少なくとも1種類のTy1-copia型と6種類のTy3-gyps型のレトロトランスポゾンRT配列が発現していることが明らかとなった.RT-PCR法による発解析を行った結果,レトロトランスポゾン様配列は原品種'Blue Sky'の花芽,栄養芽,葉,根のいずれにおいても発現していることが示された.一方,突然変異系統'BM-1'でも栄養芽,葉,根で発現が認められたが,花芽では発現が抑制されていること明らかとなった.本研究は,アジサイにおいて装飾花と小がく花の2種類の小花が着生する機構を分子レベルで解明することを目的としている.アジサイから3個のAP1,2個のAP3、1個のPI相同遺伝子を単離した.RT-PCR法によりこれらを含むいくつかの遺伝子について発現解析を行った結果,LEY相同遺伝子HmLFY装飾花の花弁状がく片で特異的に発現していることが示された.一方,in situハイブリダイゼーション法を用いた発現解析を行った結果,AP3相同遺伝子であるHmAP3は装飾花の花弁状がく片では発現していないことが明らかとなった.額咲き型品種'Blue Sky'とその芽条変異系統で手まり咲き花房を着生する'BM-1'の花芽を用いたSuppressio Subtractive Hybridization法(SSH法)により,花房型に特異的に発現する遺伝子の単離を試みた.'Blue Sky'のSSHライブラリーから単離された16種類の機能未知cDNAクローンについて,RT-PCR法による発現解析を行った.花芽に関しては,いずれのクローンも'Blue Sky'で特異的に発現していた.また花芽,栄養芽および葉での発現解析を行った結果,これらのクローンは4つの発現パターンに分類された.'Blue Sky'のSSHライブラリーから単離されたcDNA断片の配列を解析した結果,少なくとも1種類のTy1-copia型と6種類のTy3-gyps型のレトロトランスポゾンRT配列が発現していることが明らかとなった.RT-PCR法による発解析を行った結果,レトロトランスポゾン様配列は原品種'Blue Sky'の花芽,栄養芽,葉,根のいずれにおいても発現していることが示された.一方,突然変異系統'BM-1'でも栄養芽,葉,根で発現が認められたが,花芽では発現が抑制されていること明らかとなった.本研究は,アジサイにおいて装飾花と小がく花の2種類の小花が着生する機構を分子レベルで解明することを目的としている.RT-PCR法によりAP1/FUL相同遺伝子,AP3相同遺伝子,PI相同遺伝子の発現解析を行った.3種類のAP1/FUL相同遺伝子及び2種類のAP3相同遺伝子は,装飾花と小がく花のどちらのがく片においても検出された.一方,PI相同遣伝子に関しては,装飾花と小がく花のいずれのがく片においても検出されなかった.アジサイの花房型の制御に関与する遺伝子の単離を目的に,額咲き型品種`Blue Sky'と`Blue Sky'から芽条変異により発生した手まり咲き系統`BM-1'を用いてSuppression Subtractive Hybridization法(SSH法)を行った.`Blue Sky'のSSHライブラリーからろクリーニングにより単離された219個のクローンについて塩基配列を決定したところ、,99種類の配列にまとめられた。推定アミノ酸配列を基にBLAST検索を行った結果,47種類の配列は他の植物種のレトロトランスポゾンの部分配列と高い相同性を示した。これらのトランスポゾン様配列をもとに3組のプライマーを設計しRT-PCR法を行ったところ,レトロトラン様配列は`Blue Sky'の花芽で強く発現していることが確認された.本研究は,アジサイにおいて装飾花と小がく花の2種類の小花が着生する機構を分子レベルで解明することを目的としている.RT-PCR法による解析を行った結果,LFY相同遺伝子HmLFYが装飾花の花弁状がく片で特異的に発現していることが示された.一方,in situハイブリダイゼーション法を用いた発現解析を行った結果,AP3相同遺伝子であるHmAP3は花弁及び雄ずいで発現しているが,装飾花の花弁状がく片では発現していないことが明らかとなった.額

咲き型品種'Blue Sky'とその芽条変異系統で手まり咲き花房を着生する'BM-1'の花芽を用いてSuppression Subtractive Hybridization法(SSH法)を行い,構築した'Blue Sky'のSSHライブラリーから単離された機能未知cDNAクローンのうち単離頻度の高かった16種類について,RT-PCR法による発現解析を行った.花芽に関しては,いずれのクローンも'Blue Sky'で特異的に発現していた.また栄養芽や葉での発現解析を行った結果,これらのクローンは4つの発現パターンに分類された.Blue Sky'のSSHライブラリーから単離されたcDNA断片のクローンには少なくとも6種類以上のレトロトランスポゾン配列が含まれており,Ty1-copia型とTy3-gypsy型のいずれの系統のレトロトランスポゾン配列も発現していることが明らかとなった.RT-PCR法による発現解析を行った結果,レトロトランスポゾン配列は原品種である'Blue Sky'の花芽,栄養芽,葉,根のいずれにおいても発現していることが示された.一方,突然変異系統であるBM-1でも栄養芽,葉,根で発現が認められたが,花芽では発現が抑制されていること明らかとなった.
不全心のメカノエナジェティックスのマクロ・ミクロ連関

我々は丸ごと心臓における総Caハンドリング量を推定する方法を考案し、正常心のCa動態を明らかにしてきた。不全心においては、筋小胞体から漏れ出たCaが収縮に関与せずに興奮収縮連関に用いられる酸素消費量だけを増加させる(無駄サイクル)ため、従来我々が用いていた方法では、総Caハンドリング量を推定することはできなかった。そこで、我々はこのような無駄サイクルをもつ不全心の総Caハンドリング量を推定する方法を考案し、三種類の不全心に適応して、その方法の是非を検討した。1.ナノモル単位のリアノジンを冠血流に投与すると、左心室のCaハンドリング消費量は減少せずに収縮性が低下する。リアノジン投与後の無駄サイクルは、筋小胞体を介して収縮に関与するCa量の約1.4倍と推定された。2.我々はCa過負荷不全心を作成した。左心室収縮性は40%に減少し、Caハンドリングに費やされる酸素消費量は30%に減少した。しかし、収縮性の酸素コストに変化はなかった。このCa過負荷不全心では筋小胞体を介するCaハンドリング量が増加していることが明らかとなった。そして、無駄サイクルが増加しているか、正常時に比べてトロポニン結合Ca量が左心室収縮性に反映されなくなっている(Caリアクティビティの低下)か、その両方であるかの可能性が示唆された。3.虚血後再灌流心(スタンド心)では収縮性が低下し、収縮性の酸素コストは2倍であった。筋小胞体を介するCaハンドリング量は減少しており、無駄サイクルとCaリアクティビティ関係から、Caハンドリングに費やされる酸素消費量は収縮性の増加を伴わず浪費される方向にシフトしていることが明らかとなった。これらの結果から、我々が考案した新しい方法は無駄サイクルをもつ不全心にも適応可能であることが示唆された。我々はこれまでにイヌ摘出交叉灌流心標本を用い左心室の力学的およびエネルギー学的検討を行い、多くの心臓生理学的知見を得てきた。今回はこのエネルギー学的方法論を一段と発展させ、丸ごと心臓における心筋細胞内カルシウム動態を推定するという方法を考案し、従来のイヌ摘出交叉灌流心標本を用いた実験によりこの斬新な方法論の妥当性・合理性を証明し得ることを確認した。さらにはこのカルシウム動態の推定法を不全心モデルに応用することにより、種々の病的心における収縮異常および細胞内カルシウム動態の異常を特徴づけ定量的に評価することが可能となると期待される。具体的には、まず従来の方法により無負荷左心室の酸素消費量およびKClによる心停止状態での酸素消費量から1心拍あたりの興奮収縮連関に関わるカルシウム量を求める。ついで独自の方法論により、期外収縮後の収縮性増強の減衰時定数から細胞内筋小胞体へのカルシウム再循環率を算出する。これらにより総カルシウム移動量を推測するという統合生理学的手法である。すでにエピネフリンおよびカルシウム投与による収縮性亢進時のカルシウム再循環率や総カルシウム移動量等の検討により、我々の提唱する方法論の妥当性を証明することができた。現在は虚血、スタニング、アシドーシス、低酸素、温度変化、高頻度ペーシング、薬物(リアノジン、BDM)投与等により不全心モデルを作成し正常心と比較することにより、病的心におけるカルシウム動態異常の定量的検討を行っている。また同時に、神経性・体液性反射を除外し生理的な血液の充満・駆出も生じない交叉灌流心標本だけでなく、生体内駆出心における検討の必要性から、容積測定のためのコンダクタンスカテーテルを用いた生体内心臓における研究も開始した。計測機器の準備、実験手技の向上を含めた実験系の確立の段階を経て、現在は出血性ショックモデルにおけるデータ収集を行っている。

これらの結果から、我々が考案した新しい方法は無駄サイクルをもつ不全心にも適応可能であることが示唆された。イヌ・ラットを用い、カルシウム過負荷や低酸素により急性心不全モデルを、高頻度心室ペーシングにより慢性心不全モデルを作製し、血液交叉灌流摘出心臓標本において以下の検討をした。不全心の左心室の収縮性を左心室の圧と容積を計測し収縮期末圧容積関係(ESPVR;その傾きEmaxは収縮性の指標)を求めて評価した。同時にPVA(収縮期末圧容積面積;消費エネルギーの指標)、VO_2(一心拍当たりの酸素消費量;冠灌流量を冠動静脈酸素濃度較差の積として求める)を計測してその変化を検討した。まず正常心における収縮性の評価をした後、様々なタイプの不全心の左室の収縮性を正常心と比較した。一方、VO_2-PVA関係を用いて、酸素消費から機械的エネルギーの変換効率等が不全心ではどのように変わるかを検討した。さらにVO_2-PVA関係のVO_2切片(イヌ心臓では主に基礎代謝と興奮収縮連関におけるカルシウム輸送により消費される酸素からなる)が、ラット心臓でのVO_2切片の構成成分を解明した上で、それがイヌ及びラット不全心モデルではどのように変化するかを検討した。さらにこれらのイヌおよびラット心臓での結果をもとに、無傷ラットで急性不全心及び慢性不全必モデルを作製した後、開胸下ラット生体位心での左心室容積・圧を測定しESPVR curveを求め、正常心と比較検討した。又、ESPVB curveのfitting functionの積ガによりPVAを求めその総機械エネルギーを算出した。これらの結果から摘出および生体位での不全心における心機能の評価ができたので、最後に非観血式血圧測定装置を用いて不全心を有するラットの全身の心血管系の反応(体血圧および心拍数)を測定し正常心臓と比較した。我々は丸ごと心臓における総Caハンドリング量を推定する方法を考案し、正常心のCa動態を明らかにしてきた。不全心においては、筋小胞体から漏れ出たCaが収縮に関与せずに興奮収縮連関に用いられる酸素消費量だけを増加させる(無駄サイクル)ため、従来我々が用いていた方法では、総Caハンドリング量を推定することはできなかった。そこで、我々はこのような無駄サイクルをもつ不全心の総Caハンドリング量を推定する方法を考案し、三種類の不全心に適応して、その方法の是非を検討した。1.ナノモル単位のリアノジンを冠血流に投与すると、左心室のCaハンドリング消費量は減少せずに収縮性が低下する。リアノジン投与後の無駄サイクルは、筋小胞体を介して収縮に関与するCa量の約1.4倍と推定された。2.我々はCa過負荷不全心を作成した。左心室収縮性は40%に減少し、Caハンドリングに費やされる酸素消費量は30%に減少した。しかし、収縮性の酸素コストに変化はなかった。このCa過負荷不全心では筋小胞体を介するCaハンドリング量が増加していることが明らかとなった。そして、無駄サイクルが増加しているか、正常時に比べてトロポニン結合Ca量が左心室収縮性に反映されなくなっている(Caリアクティビティの低下)か、その両方であるかの可能性が示唆された。3.虚血後再灌流心(スタンド心)では収縮性が低下し、収縮性の酸素コストは2倍であった。
高エネルギー重イオンが誘起するシングルイベント過渡電流の高位置分解能マッピング

単一イオンが炭化ケイ素トランジスタに入射した時に発生する雑音電流(過渡電流)のマッピングを従来手法を用いて測定し、過渡電流の発生機構をデバイスシミュレータを用いて解明した。一方、過渡電流のマッピングを簡便に取得する新技術開発を行った。ZnS発光体を使用し、数十μmの位置分解能ではあるが、マッピングの取得に成功した。ZnSに代わる発光体としてYAG:Ceやダイヤモンドを利用すれば、位置分解能が10倍程度高くできることが分かった。単一のイオンが半導体に入射した時に発生するシングルイベント過渡電流(SETC)と、イオン入射位置の関係をマツピングする手法であるIPEM型TIBICの測定系構築に着手した。Am-241からのα粒子を発光体に入射させたところ、微弱な発光を視認することができたものの、発光強度と発光位置の関係を位置検出器(PSD)にて検出するには至らなかった。その原因として、PSDの検出感度が低いことが挙げられる。次年度は、検出感度の高いPSDを用いて実験を行う計画とする。一方、従来型TIBICを用いた実験では、15MeVの酸素イオンに加えて、当初予定していた260MeVのネオンイオンよりも線エネルギー付与(LET)の大きい520MeVのアルゴンイオンが電界効果トランジスタ(MOSFET)に誘起するSET電流の計測に成功した。この測定は、MOSFETの信号端子が3端子であることに対応する等の測定システムの高度化を行うことで実現した。測定結果から、ドレイン端子とソース端子で発生するSET電流は極性が逆であり、その大きさがほぼ同じであることが明らかとなった。次年度以降は、デバイスシミュレータを用いてイオン誘起電荷の輸送過程の解析を進める。また、イオン入射位置とSET電流の大きさとの関係から、約1μmの位置分解能で、高エネルギー重イオンが誘起するSET電流のマッピング像を取得することができた。これら一連のTIBIC測定を通じて、IPEM型TIBIC測定を行う際の測定条件(印加電圧)を決定することができた。単一のイオンが半導体に入射した時に発生するシングルイベント過渡電流(SETC)と、イオン入射位置の関係をマッピングする手法であるIPEM型TIBICの測定系構築を進めた。昨年度は、Am-241から放出されるα粒子が発光体に誘起する光を位置検出器を用いて検出することができなかった。本年度は、位置検出器の代わりに高感度冷却CCDカメラを利用して、α粒子1個が発光体に誘起する光を検出することに成功した。当該計測システムをAVFサイクロトロンのビームラインに組み込み、150MeVのArイオン1個が発光体に誘起する光を観測することにも成功した。発光の検出と同時に、Arイオン1個が半導体に誘起するイオン誘起電荷の計測にも成功した。発光検出の位置分解能が数十μmであるものの、IPEM型TIBICを実現する目途を立てることができた。一方、従来型TIBICを用いた実験では、2種類の電界効果トランジスタ(MOSFET及びMESFET)に対して高エネルギー重イオンを照射した時に、ドレイン、ソース、ゲート電極に誘起されるSETCの計測を行った。各電極にイオンが入射した時に、異なるSETCが検出された。特にMOSFETのドレイン電極やMESFETのゲート電極にイオンが入射した時、イオンの入射エネルギーから算出した電荷量よりも大きな電荷量がドレイン電極から収集されることが分かった。MOSFETの場合、ソース(n^+)-エピタキシャル層(p)-ドレイン(n^+)から成る寄生バイポーラトランジスタによる電流増幅効果に起因し、MESFETの場合、寄生バイポーラトランジスタによる電流増幅効果と半絶縁性基板の電荷蓄積効果に起因することが分かった。以上のように従来型TIBICを用いて、μmオーダーの大きさを持つ電界効果トランジスタのSETCマッピングを取得することで、SETCの位置依存性を明らかにすることができた。単一のイオンが半導体に入射した時に発生するシングルイベント過渡電流(SETC)の位置及びエネルギー依存性の解明と、イオン入射位置とSETCの関係をマッピングする手法であるIPEM型TIBICの測定系構築を行った。IPEM型TIBICの開発では、AVFサイクロトロンからの150MeV-Arイオン1個がZnSを通過した際に誘起する微弱光を冷却CCDにて観測すると同時に、ZnSを通過したイオンがダイオードに入射した際に誘起する電荷の計測に成功した。発光と電荷が同時に検出された場合を選定することで、イオン誘起電荷マッピングを取得することができた。IPEM型は従来型と比較して、ZnSが不均一であることや膜が薄くできないことが原因となり、位置及びエネルギー分解能が低いことが分かった。高分解能化のためには、均一かつ薄膜の発光体を模索する必要がある。

ZnSの替わりにYAG : Ceやダイヤモンドにおける発光を測定した結果、位置分解能が10倍程度高くなることが分かり、IPEM型の欠点を克服するためにこれら発光体が有用であることが分かった。一方、炭化ケイ素(SiC)金属-酸化膜-半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)に誘起するSETCの位置及びエネルギー依存性を解明するため、飛程がほぼ同一の15MeV-酸素及び50MeV-銅イオンを用いた従来型TIBIC実験を行い、二次元のドリフト・拡散モデルを採用した数値解析を行った。その結果、ドレインにイオン1個が入射した時に最も大きなSETCが発生し、その強度はエネルギーに依存して大きくなることが分かった。SETCは、典型的なドリフトや拡散による電流に加え、寄生バイポーラトランジスタやゲート界面を流れる電流から成ることも分かった。以上のように従来型TIBICを用いた研究では、SiC MOSFET中をSETCが流れる過程を明らかにすることができた。