hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In situ 蛋白質 NMR 構造解析技術

本研究では生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するためのNMR技術を開発した。具体的には、目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術、還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術、生細胞内の蛋白質のNMR測定技術、全自動NMR構造解析システム、効率的なメチル基間NOEの取得技術、などの開発に成功し、細胞内で働いている蛋白質の立体構造を決定するための基盤を整えた。本研究は生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するNMR技術の開発を目的とする。具体的には、生きている細胞で観測したい蛋白質のみを領域選択的かつアミノ酸選択的に安定同位体標識してNMR信号を帰属する技術や、細胞内で安定な還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた新規NMR測定解析技術を開発し、阪大蛋白研が開発・整備を進めてきた高磁場DNP法など世界最先端のNMR技術・装置と組み合わせることで、生きている細胞のままで蛋白質の立体構造を決定する技術を確立することを目指している。平成26年度は、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術を開発した。具体的には、目的「外」蛋白質の翻訳を完全に阻害できるSPPシステム(配列特異的なRNA切断酵素を共発現させる低温発現系)を用い、目的「外」蛋白質の標識を完全に抑制する技術の開発に成功した。また、SPPシステムとアミノ酸要求性株とを組み合わせ、大腸菌の系でアミノ酸選択的な標識技術の開発に成功した。さらに、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術を開発した。具体的には、細胞内で利用可能な還元耐性を持つスピンラベル試薬を用い、マレイミド基を介して不可逆的にスピンラベルをシステインに導入し、常磁性緩和促進(PRE)法によって立体構造情報を得ることに成功した。また、目的蛋白質のN末端選択的に還元耐性を持つキレート試薬を導入し、キレート試薬とランタニド金属を用いた偽コンタクトシフト(PCS)法によって立体構造情報を得ることに成功した。本研究では生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するNMR技術の開発を目的とする。平成27年度は、平成26年度から継続して、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発と、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、を進めるとともに、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立と、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集を試みた。具体的には、アミノ酸選択的な安定同位体標識では、主鎖15N標識がメチル基選択的13C標識より効率的な信号帰属が可能なことを明らかにするとともに13C/15N以外の安定同位体標識に成功した。キレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発においては、pH依存的な構造情報を得ることに成功した。さらに、生きている細胞のままでのNMR信号の一部帰属にも成功した。帰属法の確立と立体構造情報の収集では、標識蛋白質の細胞導入において技術的問題点があったが、その問題も電気穿孔法を用いることでおおむね解決できた。平成27年度に実施した研究項目、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立と、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集、において、やや進捗に遅れが出た。しかし、平成26年度から継続して実施している研究項目、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発と、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、において、当初予定以上の進捗があった。このため、全体としては、おおむね順調に進展していると評価できる。平成28年度は、平成27年度から継続して、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発や、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発などの基盤技術の開発に取り組むとともに、(3)生きている細胞のままでのNMR信号の帰属法の確立や、(4)生きている細胞のままでのNMR立体構造情報の収集に取り組んだ。さらに、(5)高磁場DNP法などを駆使して生きている細胞での蛋白質の構造決定にも取り組んだ。具体的な成果は以下の通り。

(1)ではアミノ酸選択的かつ高効率な13C標識に成功し、これらを用いた分子量5万の蛋白質の主鎖帰属に成功するなど、基盤技術を確立することができた。(2)ではPREやPCSを用いる精密構造決定法の開発に成功するなど、技術開発が大幅に進んだ。(3)(4)では電気穿孔法を用いる蛋白質導入技術によって技術的問題点を解決し、生きている細胞のままでのNMR信号の帰属や構造情報の収集が進んだ。(5)では、構造計算の過程で構造情報の不足が明らかとなった。このため、自動構造決定ソフトの開発やメチル基間NOEの取得などに注力し、構造情報が不足する問題を解決しつつある。構造計算の過程で構造情報の不足が想定以上であることが明らかとなった。また、平成28年4月に研究代表者が横浜国立大学に異動となり、研究実施場所の変更に伴う研究環境の整備に要したことで、実験にも遅れが生じた。本研究は生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するNMR技術の開発を目的とする。具体的には、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発、(3)生きている細胞のままでNMR信号を帰属する技術の開発、(4)生きている細胞のままでの立体構造情報収集技術の開発、および、(5)高磁場DNP法などを駆使した生きている細胞での蛋白質の構造決定、を計画し、これらを実施した。本研究で得られた成果は以下の通り。(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術の開発では、大腸菌でアミノ酸選択的かつ高効率な13C標識が可能な技術の開発に成功した。また、無細胞蛋白質合成系で立体構造解析のための重水素標識と13C標識を組み合わせるアミノ酸選択標識技術を開発した。(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術の開発では、細胞内での立体構造解析に適用可能なPREやPCSを用いる精密構造解析法の開発に成功した。(3)生きている細胞のままでNMR信号を帰属する技術の開発、および、(4)生きている細胞のままでの立体構造情報収集技術の開発では、電気穿孔法を用いる蛋白質導入技術によって技術的な問題点が解消され、従来法の約2倍の感度でNMR測定を行うことが可能になった。(5)高磁場DNP法などを駆使した生きている細胞での蛋白質の構造決定では、全自動NMR構造解析システムの開発、効率的なメチル基間NOEの取得、その全自動NMR構造解析システムへの組み込みに成功し、細胞内での蛋白質の構造決定に目処を付けた。本研究では生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定するためのNMR技術を開発した。具体的には、目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術、還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いたNMR測定解析技術、生細胞内の蛋白質のNMR測定技術、全自動NMR構造解析システム、効率的なメチル基間NOEの取得技術、などの開発に成功し、細胞内で働いている蛋白質の立体構造を決定するための基盤を整えた。本研究は平成26年度より平成28年度まで実施する。平成26年度は計画どおり研究が進捗し、平成26年度に計画していた研究目的は概ね達成できた。
膜融合調節装置としての頂端側形質膜ホスホリパーゼDの存在意義

本研究は開口分泌における頂端側形質膜ホスホリパーゼD(PLD)の関与を検討したものである.頂端側形質膜PLDは,ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PIP_2)によってGTP-γ-S非依存的に活性化されるほか,オレイン酸によっても濃度依存的な活性上昇が観察された.さらにPIP_2とオレイン酸が共存すると相乗的な活性化効果が得られた.PIP_2と特異的に結合するネオマイシンは,頂端側形質膜PLD活性を用量依存的に抑制した.これらのPLD活性調節因子の代謝経路を検索したところ,頂端側形質膜にはPIP_2の生成系としてホスファチジルイノシトール4-キナーゼおよびホスファチジルイノシトール一リン酸キナーゼが存在し,脂肪酸の生成系として不飽和脂肪酸鎖選択性のホスホリパーゼA_2が存在していた.したがってこれらの酵素がPLD活性化系として機能することで,in vivoにおいてもPLDの充分な活性発現が期待できる.一方,耳下腺単離分泌顆粒とモデル膜からなるin vitro膜融合系を用いた解析では,モデル膜のPLD(キャベツ由来)処理による膜融合能の亢進が確認できた.現時点ではin vivo開口分泌において,頂端側形質膜PLDが同様の機能を担う可能性については充分検討できていないが,最近Dohkeらによって,耳下腺分散細胞からのアミラーゼ分泌がネオマイシンで部分抑制されるという報告がなされた[BBRC,299,699(2002)].頂端側形質膜PLDもネオマイシン感受性であるので,本剤の分泌抑制効果は,頂端側形質膜PLDのin vivo開口分泌への関与を示す一傍証であると考える.今後は,分散細胞系を用いて分泌刺激時におけるPLD活性変動およびその活性調節因子の動態の解明をおこなうとともに,開口分泌との相関を検討し,本酵素のin vivoにおける機能解明を進める予定である.本研究は開口分泌における頂端側形質膜ホスホリパーゼD(PLD)の関与を検討したものである.頂端側形質膜PLDは,ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PIP_2)によってGTP-γ-S非依存的に活性化されるほか,オレイン酸によっても濃度依存的な活性上昇が観察された.さらにPIP_2とオレイン酸が共存すると相乗的な活性化効果が得られた.PIP_2と特異的に結合するネオマイシンは,頂端側形質膜PLD活性を用量依存的に抑制した.これらのPLD活性調節因子の代謝経路を検索したところ,頂端側形質膜にはPIP_2の生成系としてホスファチジルイノシトール4-キナーゼおよびホスファチジルイノシトール一リン酸キナーゼが存在し,脂肪酸の生成系として不飽和脂肪酸鎖選択性のホスホリパーゼA_2が存在していた.したがってこれらの酵素がPLD活性化系として機能することで,in vivoにおいてもPLDの充分な活性発現が期待できる.一方,耳下腺単離分泌顆粒とモデル膜からなるin vitro膜融合系を用いた解析では,モデル膜のPLD(キャベツ由来)処理による膜融合能の亢進が確認できた.現時点ではin vivo開口分泌において,頂端側形質膜PLDが同様の機能を担う可能性については充分検討できていないが,最近Dohkeらによって,耳下腺分散細胞からのアミラーゼ分泌がネオマイシンで部分抑制されるという報告がなされた[BBRC,299,699(2002)].頂端側形質膜PLDもネオマイシン感受性であるので,本剤の分泌抑制効果は,頂端側形質膜PLDのin vivo開口分泌への関与を示す一傍証であると考える.今後は,分散細胞系を用いて分泌刺激時におけるPLD活性変動およびその活性調節因子の動態の解明をおこなうとともに,開口分泌との相関を検討し,本酵素のin vivoにおける機能解明を進める予定である.開口分泌における頂端側形質膜ホスホリパーゼD(PLD)の存在意義を明らかにするために,PLD活性の耳下腺細胞内分布およびそれらの活性調節因子の検索から着手した.PLD活性は頂端側形質膜の他に細胞質にも認められたが,頂端側形質膜の融合相手である分泌顆粒では検出されなかった.頂端側形質膜PLDはホスファチジルコリンを主として分解し2,3-diphosphoglycerateで阻害されるなどPLDの一般的な特徴を有していた.ホ乳類のPLDについてはこれまでに,(1)ArfやRho等の低分子GTP-結合タンパク質,(2)ポリホスホイノシチド,(3)遊離脂肪酸などが生理的活性化因子として報告されているが,頂端側形質膜PLDはGTP-γ-Sでは活性化されずホスファチジルイノシトール-4,5-ニリン酸(PIP_2)でGTP-γ-S非依存的に活性化されたのに対し,細胞質PLDはGTP-γ-Sで顕著に活性化された.耳下腺の細胞質中にはArf1の存在が道家らによって報告されており,細胞質PLDにおけるGTP-γ-Sの効果はArf1の活性化を介したものと考えられる.一方,頂端側形質膜における低分子量GTP-タンパク質の局在は明らかになっておらず,頂端側形質膜中にこれら低分子量GTP-タンパク質が欠如している為にGTP-γ-Sの効果が現れない可能性も考えられる.次年度は,この可能性も考慮に加え,(1)PIP_2の頂端側形質膜における生成系の実体と分泌刺激による変動の解明,

(2)ArfおよびRhoの精製標品による頂端側形質膜PLDの活性変動の観察および内在性GTP-結合タンパク質の耳下腺細胞内動態の検討を進める.本研究は開口分泌におけるホスホリパーゼD(PLD)の関与を検討したものである。初年度では、頂端側形質膜のPLDが、ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PIP_2)で顕著に活性化されることを明らかにし、in vivoでの活性調節にもPIP_2が関与している可能性を指摘した。そこで本年度は、PIP_2の開口分泌部位における代謝動態を検討した。耳下腺細胞の膜リン脂質組成を分析したところ、PIP_2を含めたイノシトールリン脂質群は全リン脂質の約7%、さらにPIP_2は全イノシトールリン脂質中0.9%しか存在しておらず、通常の組織細胞と同様に極微量成分であった。しかし、耳下腺分散細胞を用いた実験において、[^<32>P]無機リン酸の膜リン脂質への取り込み量はイノシトールリン脂質群が最も多く、これら脂質の早い代謝回転が示唆された。これに比べ[^3H]遊離脂肪酸のイノシトールリン脂質群への取り込み量は明らかに少なかった。さらに単離頂端側形質膜を用いて開口分泌部位での検討を進めたところ、PIP_2の前駆体であるホスファチジルイノシトール(PI)は、単離頂端側形質膜とインキュベートすると主にジアシルグリセロール(DAG)とホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PIP)に代謝され、PIPの一部はさらにリン酸化されPIP_2となった。一方、脱アシル化反応はDAG生成の5分の1程度しか認められなかった。これらの結果から、無刺激状態の頂端側形質膜におけるイノシトールリン脂質群の代謝は、DAG-PI-PIP-PIP_2間での相互変換が中心となっており、脱アシル化-再アシル化系の関与は少ないことが示唆された。次年度は、分泌刺激時のPIP_2の代謝回転とPLD活性・開口分泌との相関を検討するとともに、in vitro開口分泌系を用いて、同様の相関が再現できるか否かを検討する。頂端側形質膜PLDはホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PIP_2)によって活性化されるが,これとは別に,脂肪酸によっても濃度依存的な活性上昇が観察された.その活性化率は脂肪酸の分子種に依存しておりオレイン酸が強い活性化作用を発揮した.さらにPIP_2がオレイン酸と共存すると相乗的な活性化効果が得られた.PIP_2と特異的に結合するネオマイシンは,このPLD活性を用量依存的に抑制した.頂端側形質膜にはPIP_2の生成系としてホスファチジルイノシトール4-キナーゼおよびホスファチジルイノシトール一リン酸キナーゼが存在し,脂肪酸の生成系として不飽和脂肪酸鎖選択性のホスホリパーゼA_2の存在が明らかになっている.これらの酵素がPLD活性化系として機能することで,in vivoにおいてもPLDの充分な活性発現が期待できる.一方,耳下腺単離分泌顆粒とモデル膜からなるin vitro膜融合系を用いた解析では,PLDの反応産物であるホスファチジン酸のモデル膜への直接添加,あるいはモデル膜のPLD(キャベツ由来)処理による膜融合能の亢進が確認できた.現時点ではin vivo開口分泌において,頂端側形質膜PLDが同様の機能を担う可能性については充分検討できていないが,最近道家らによって,耳下腺分散細胞からのアミラーゼ分泌がネオマイシンによって部分抑制されるという報告がなされた[BBRC,299,699(2002)].頂端側形質膜PLDもネオマイシン感受性であるので,本剤の分泌抑制効果は,頂端側形質膜PLDのin vivo開口分泌への関与を示す一傍証であると考える.
植物マイナス鎖RNAウイルスのゲノム輸送機構に関する研究

植物のマイナス鎖RNAウイルスであるOFVをモデルとし、ゲノム輸送に関わると考えられるウイルス因子を解析した。特にウイルスの移行形態とされるvRNP複合体を精製し、構成ウイルス蛋白質を明らかにした。そのうち、ゲノム結合タンパク質であるNの細胞核(複製の場と推定)への輸送にはアクセサリー蛋白質であるPが必要であることを発見した。また、モデル植物における細胞間移行や長距離移行に関する一連の研究も行った。これらの成果は、OFVのゲノム移行輸送機構を理解する上で基礎的な知見となると期待される。マイナス(-)鎖RNAウイルスでは、ゲノムRNAはウイルスタンパク質と常に複合体(vRNP)を形成していることから、vRNPの構成タンパク質はゲノム輸送に関わると推定される。そこで、本年度はランえそ斑紋ウイルス(OFV)を用いてvRNPの構成タンパク質の特徴付けと、細胞核への移行様式に焦点を絞り解析を行った。1.ヌクレオキャプシドタンパク質(N)-RNA複合体の解析Nタンパク質はゲノム結合タンパク質として、vRNPの主要骨格を構成すると考えられている。ウイルス粒子を塩化セシウム平衡密度勾配遠心することにより、ひも状あるいは螺旋コイル状N-vRNA複合体が精製されたことから,OFVのNタンパク質はゲノムRNAに強固に結合していると推定された。さらに、Nタンパク質を大腸菌で発現すると,その精製試料には大腸菌由来と推定される低分子のRNAが結合していた。現在、このRNA結合能の特異性について調べるとともに、推定細胞間移行タンパク質(ORF3)とNタンパク質間の相互作用について検討中である。2.vRNP構成タンパク質の細胞核移行様式OFVは細胞核が複製・形態形成の場であると推定されている。OFVゲノムが核内へ輸送されるためには、vRNPが宿主タンパク質輸送機構を利用して核へと移行するモデルが考えられる。しかし、vRNPの主要構成要素であるNは細胞全体に分布し、核への局在性を示さなかった。一方、vRNPのマイナー成分であるORF2タンパク質(推定Pタンパク質)はSV40-T抗原と類似した核移行シグナルをもち、核局在性を示した。このORF2タンパク質はNタンパク質と相互作用し、Nを核に局在させることが明らかになった。さらに、大腸菌で発現させたN-RNA複合体にORF2タンパク質が結合できることも示された。以上から、N-vRNA複合体に核移行能を持つORF2タンパク質が結合することで細胞核へのゲノム輸送が行われると推測された。マイナス(一)鎖RNAウイルスのゲノム輸送を理解するため、本年度はOFVの細胞間移行と長距離移行について主に研究を進めた。(1)ORF3は植物ラブドウイルスゲノムの細胞間移行蛋白質と同じ位置にコードされていることから、細胞間移行に関わる蛋白質であると推測される。そこで、大腸菌で発現したORF3(38K)の翻訳産物に対す抗体を作製し、ウイルス感染組織からの検出を可能とした。この蛋白質はウイルス粒子に含まれず、非構造蛋白質であることが判明した。ORF3蛋白質をGFPとタグして調べたところ、細胞膜近傍にドット上に局在することが判明した。次にpGR106ベクターを改変して細胞間移行ができない変異型PVX-GFP(△P25)を作製し、この変異ウイルスのN.benthamianaでの細胞間移行をORF3蛋白質が補完できるかを検討した。その結果変異型PVXのGFP蛍光は単一細胞に止まり、この実験系ではORF3が細胞間移行蛋自質であることは証明できなかった。(2)OFVはN.benthamianaに感染し、全身へと移行した。地上部では、ウイルスは茎頂部の新たな展開葉には検出されず、2-3葉下位の展開葉に検出された。OFVの病徴は主に葉脈部の黄化が認められた。プレスプロット法で調べるとウイルスのシグナルは発病部(葉脈に沿って)に検出された。一方、地下部では根全体にウイルスが蓄積していた。次に、OFV感染個体にPVYを接種し、混合感染によるOFVの影響を調べた。その結果、PVYとの混合感染によりOFVは茎頂部の展開葉にまでウイルスが移行し、葉全体にウイルスの蓄積が確認された。一方、地下部では混合感染でもウイルスの蓄積量に大きな変化は認められなかった。この結果から、N.benthamianaの茎頂部では宿主のRNAサイレンシングが葉肉細胞へのウイルスの移行を抑制しているのではないかと推測した。
「雄略朝」期前後における地域社会と人制に関する考古学的研究：北部九州を中心に

本研究は,5世紀後半代を中心とした所謂「雄略朝」期とその前後の時期における地域社会と人制に関する実態について,北部九州の遠賀川上流域(嘉穂地域)をフィールドとして考古学的な検討を試みたものである。5世紀後葉末に築造された約80mの前方後円墳である山の神古墳の出土遺物を主な素材として検討した結果,初葬・追葬の被葬者が対半島交渉などの活動に参画しながら近畿中央政権に仕奉した北部九州の有力者であること,さらに両者が「雄略朝」期から6世紀代のミヤケ設置に至る古代国家形成過程と深く関わることなどを明らかにした。また金比羅山古墳の調査を通じ,こうした地域社会の基盤形成が3・4世紀代に遡ることを示した。本研究は,「雄略朝」期前後の地域社会と人制の実態について,考古学的に究明することを課題とする。平成23年度は,この課題達成のため,下記の3項目について調査・研究を実施した。1)5世紀後葉の「雄略朝」期前後の時期を中心として,古墳資料のデータベースの作成を行った。特に,人制に関する基礎資料である埼玉県稲荷山古墳・熊本県江田船山古墳の資料を基準としながら,画文帯神獣鏡などの同型鏡群や鉄製武器・武具類・馬具類などの共伴関係に注目しつつ,共通した内容を持った古墳の資料収集を行った。これにより,当該時期の考古資料を比較していくための基礎資料が得られた。2)「雄略朝」期と重なる時期の5世紀後葉の築造が想定される,山の神古墳出土資料(福岡県飯塚市所在・九州大学考古学研究室所蔵)の報告書刊行に向けた,遺物の調査を行った。これについては連携研究者とも共同で,遺物の全貌の把握と各種鉄器の実測を行った。これにより,報告書刊行のための基礎を構築することができた。3)山の神古墳が所在する飯塚市に隣接する福岡県嘉穂郡桂川町の金比羅山古墳の測量調査を実施し,1/100・25cmコンターの平板測量図と電子平板による測量図を作成した。その結果,同古墳が山の神古墳の築造に先行する時期の80m級の前方後円墳であることが確定した。これにより,遠賀川中流域における地域社会の実態解明のための基礎資料を得ることができた。平成23年度は,特に上記1)に関連して,倭の五王の時代に関するシンポジウムにて,同型鏡群を素材とした研究発表を行い,意見交換を行うことにより,次年度以降の課題をより明確にすることができた。平成25年度は,この課題達成のため,下記の3項目について調査・研究を実施した。1) 5世紀後葉の「雄略朝」期前後の時期を中心として,主に銅鏡資料を素材としながら調査と分析を実施した。前年度に引き続き,同型鏡群の集成と実物観察の調査を実施した。また関連資料である和泉市久保惣記念美術館蔵画文帯神獣鏡などの調査を通して,中国南朝鏡の検討を進めた。その成果の一部を論文および口頭発表にて公開した。これにより,当該時期の銅鏡資料を広く比較検討していくための基礎資料が得られた。2)「雄略朝」期と重なる5世紀後葉の築造が想定される,山の神古墳出土資料(福岡県飯塚市所在・九州大学考古学研究室所蔵)の報告書刊行に向けた,遺物の調査・実測作業を1年間を通じて継続的に行った。前年度に引き続き,連携研究者とも共同で調査を進め,8月と3月の2回にわたって検討会議を実施し,意見交換を行った。8月には九州国立博物館で関連資料の調査を実施し,3月は,最終年度に開催予定の公開報告会に向けての意見交換を実施した。これにより,最終年度の報告書作成に向けての基本的なデータが得られた。3)前年度に引き続き,福岡県桂川町金比羅山古墳について,トレンチによる範囲確認・墳丘築造技術解明のための発掘調査を実施した。その結果,後円部3段・前方部2段で葺き石・埴輪を伴わず,一部の盛り土を除き,大半が地山削り出しによって築造されたことが確認できた。これにより,古墳の規模・形態・築造技術を考える上での基礎資料を得ることができた。以上を通じて,前年度までの研究をさらに進展させることができ,かつ次年度以降の研究課題をより明確にすることができた。平成24年度は,この課題達成のため,下記の3項目について調査・研究を実施した。

1)5世紀後葉の「雄略朝」期前後の時期を中心として,主に銅鏡資料を素材としながら調査と分析を実施した。特に中国南朝との対外交渉の所産と考えられる同型鏡群の集成と調査を実施し,その成果の一部を論文および口頭発表にて公開した。これにより,当該時期の考古資料を広く比較検討していくための基礎資料が得られた。2)「雄略朝」期と重なる5世紀後葉の築造が想定される,山の神古墳出土資料(福岡県飯塚市所在・九州大学考古学研究室所蔵)の報告書刊行に向けた,遺物の調査を行った。これについては連携研究者とも共同で調査を進め,2回にわたって検討会議を実施し,意見交換を行った。これにより,次年度以降の調査を行っていく上での基礎を構築することができた。3)山の神古墳が所在する飯塚市に隣接する福岡県嘉穂郡桂川町の金比羅山古墳について,トレンチによる範囲確認・墳丘築造技術解明のための発掘調査を実施した。その結果,本古墳が段築を持つ80mの前方後円墳であること,また葺石を持たず,墳丘の大部分が地山成形によって構築されていること,などが明らかとなった。これにより,古墳の規模・形態・築造技術を考える上での基礎資料を得ることができた。また平成24年度は,2012年10月に開催された日本考古学協会福岡大会にて,特に1)2)を統合するような形で,「雄略朝から磐井の乱に至る諸変動」と題した研究発表を行う機会があり,シンポジウムでの意見交換を通じて,次年度以降の研究課題をより明確にすることができた。本研究は,「雄略朝」期前後の地域社会の実態について,考古学的に究明することを課題とする。平成26年度は,本研究の最終年度であり,4年間の研究活動の総括を行うため,下記の4項目について調査・研究を実施した。1)5世紀後葉の「雄略朝」期前後の時期を中心として,銅鏡資料をはじめとした古墳出土の各種資料について,実物観察の調査を実施した。2)「雄略朝」期と重なる5世紀後葉の築造が想定される,山の神古墳出土資料(福岡県飯塚市所在・九州大学考古学研究室所蔵)の報告書刊行に向けた,遺物の調査・実測・製図作業を行った。前年度に引き続き,連携研究者および近隣の古墳時代研究者と共同で調査を進め,7月には九州大学にて公開の成果報告会を開催した。3)前年度まで実施した福岡県桂川町金比羅山古墳の調査成果について,報告書作成のための整理作業を実施した。4)上記の1)3)の成果を統合する形で,年度末に『山の神古墳の研究ー「雄略朝」期前後における地域社会と人制に関する考古学的研究:北部九州を中心にー』と題した報告書を刊行した。この中では,1933年に発見された山の神古墳の出土遺物について,当時の墳丘や横穴式石室に関する情報とともに整理・報告を行った。その結果,山の神古墳が約80mの前方後円墳で,TK47型式期前後に初葬,TK10型式前後に追葬が行われていることが明らかとなった。また嘉穂地域の地域社会の基盤を考える上で重要な遺跡である桂川町金比羅山古墳の調査を行った結果,約81mの前期前方後円墳であることが判明した。両古墳の調査成果にもとづく検討を通じて,嘉穂地域における古墳時代の開始から5世紀後半の「雄略朝」期前後の時期および6世紀以降に至る,本地域の古墳築造動向の変遷や近畿地域,半島南部地域をはじめとした他地域との政治的関係や交流の実態が具体的に明らかとなった。本報告書は九州大学のリポジトリにて公開予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。日本考古学26年度が最終年度であるため、記入しない。上記の1)
子宮体癌の分化における糖脂質に関する解析とその治療への応用

本研究においては、子宮体癌の分化度と糖脂質との関係を明らかにする目的に於いて、まず、任意の糖脂質を子宮体癌細胞株の細胞膜上に発現させる系の確立を目指した。これに先立ち、まずglucosylceramideより合成される糖脂質の合成阻害剤であるD-threo-PDMPを用いて、子宮体癌細胞株の糖脂質組成がどのように変化するのかを検討することにした。まず、各濃度のD-threo-PDMP存在下に細胞増殖がどの程度影響を受けるのかを、XTT法を用いて検討した結果、10μM以下の濃度においてはD-threo-PDMPは子宮体癌細胞株SNG-Mの細胞増殖に影響を与えないことが確認された。従って、今後の実験系に於いてこの範囲の濃度が適応されるべきであることが示唆された。次に、各濃度におけるD-threo-PDMPの添加が細胞膜上の糖脂質組成にどのような影響を与えているのかをメタポリックラベリング法を用いて検討した。上記の濃度内でD-threo-PDMPを添加した場合における糖脂質組成の変化は一定しておらず、5μMの濃度に於いて最もその効果が大きいように見受けられたが、曝露時間の問題など変化するパラメーターが複数存在し、暴露時間については12,24,48,72時間と検討した結果、24時間暴露において最も薬剤の効果が大きくなることが確認されたが、他のパラメーターについては今後更に検討を進める予定である。従って、今後の実験系に於いてはこの範囲の濃度が適応されるべきであることが示唆された。次に、各濃度におけるD-threo-PDMPの添加が細胞膜上の糖脂質組成にどのような影響を与えているのかをメタボリックラベリング法を用いて検討した。上記の濃度内でD-threo-PDMPを添加した場合における糖脂質組成の変化は一定しておらず、5μMの濃度に於いて最もその効果が大きいにように身受けられたが、曝露時間の問題など変化するパラメーターが複数存在するため、現在、各パラメーターを変化させながら最も糖脂質合成が抑制される条件を検討中である。
エアプラントは大気中の水分を吸収して生きているのか-農業をする遺伝子の探索-

南米産のCAM着生植物であるTillandsia ionantha(エアプラント)は、植物にとって重要な吸水器官である根が本来の機能を果たさず、葉部から吸水を行っている。また、極めて乾燥に強い特性を有するとされている。そこで、本植物の耐乾性機構の解明を目指し、以下の実験を行った。乾燥耐性を検証するため、水や肥料を与えず長期にわたり観察した結果、50日経過後も生体重は15%減少するものの外観上の変化は認められなかった。この理由として、(1)空気中水分の吸収機構の存在、(2)生体内水分の保持・再利用系の発達などが考えられるので、空気中水分の吸収機構に着目し、次の解析を行った。気体の水の吸収能を測定するため、^3H2Oを気化させた密閉容器中に葉を一定時間入れ、葉表面の鱗片上に付着している^3H2Oを水洗により除いた後、葉の放射活性を測定した。その結果、生体内への水(気体)の取り込みが確認された。しかし、この取り込みが生物的吸収によるものであるかどうか明確でないため、低温(4°C)誘導に関する実験を行ったところ、生体内への取り込みが室温(24°C)よりも増加した。また、3日間にわたり低温処理を行い、水(気体)の取り込みを経時的に調べたところ、低温処理1時間後に取り込み量が室温の場合の約20倍となり、その後減少することが判明した。さらに、植物体を高温(70°C)処理して生体反応の低下あるいは死に至らしめた結果、水(気体)の生体内取り込み量が激減した。以上の結果は、生物的吸収の可能性を示唆しており、現在さらなる検証を行っている。南米産のCAM着生植物であるTillandsia ionantha(エアプラント)は発達した根を持たず、葉部表面の特殊なトライコーム(鱗片)から養水分の吸収を行い、60日間潅水なしで生存できると云われている。本研究は、乾燥に極めて強いエアプラントの特異な吸水機構ならびに生体内水制御機構の解明と、さらに大気中からの水分吸収機構の生理学的・分子生物学的解明を目的としている。水チャンネルとして知られるaquaporin(アクアポリン)の関与を検討した結果、エアプラント葉の吸水能は、水銀で阻害され、この阻害はメルカプトエタノールで回復したことから、エアプラントはアクアポリンを介した経路で水を細胞内に取り込んでいると推測された。その分子機構を明らかにするため、アクアポリン遺伝子をクローニングしたところ、細胞膜に局在するアクアポリンサブファミリーと相同性の高い4種のcDNAクローンを得た。そのうちの2種(TiPIP1c、TiPIP2a)については全長を含むと推定される1226塩基、1228塩基のcDNAクローンを得、後者のTiPIP2aはその推定アミノ酸配列から、C末端にリン酸化部位を有していると考えられる。また、アクアポリン遺伝子発現の水誘導性をノザン解析で調査した結果、TiPIP2a遺伝子のmRNA蓄積量が浸水1時間後に増加していることが明らかとなった。なお大気からの水分吸収能は、現在検討中である。
持続可能な開発のグローバル・ガバナンスにおけるガバナンス・モードの体系的研究

本研究は、持続可能な開発の分野に関して、ガバナンス・モードの体系的研究を通じて、グローバル・ガバナンスの実効性・正統性・構造のゆくえを探るものである。ガバナンス・モード論は、国家・非国家の多様な「権威」(「ガバナー」)が「いかにガバナンスを行うか」を問う。本研究の目的は、1既存のガバナンス・モード論を総合し、様々なモードを包括的に捉えるための分析枠組を構築する、2様々なモードが連動するマルチモーダルなガバナンスの動態を解明する、3ガバナンス・モードがガバナーの権威やパワーに及ぼす影響をさぐる、という3点にある。
膵癌間質のもたらす免疫抑制機能の網羅的解析と治療応用

本年度はKPCマウス由来膵癌細胞株のヌードマウス皮下単独移植・野生型マウス膵星細胞株との混合移植・Nrf2欠損膵星細胞株との混合移植実験を行い、腫瘍形成能の変化を確認した。その結果、野生型膵星細胞株との混合移植は皮下腫瘍の増殖を促進したがNrf2欠損膵星細胞株ではその効果は失われていた。野生型膵星細胞株・Nrf2欠損膵星細胞株での遺伝子発現プロファイルの比較ではNrf2欠損により多くのNrf2標的遺伝子(Gstファミリー遺伝子やNqo1遺伝子など)の発現低下がみられるとともに、炎症性サイトカインや細胞接着因子といった局所での炎症の惹起・炎症細胞の遊走に関わる分子群の発現低下を確認した。以上の結果は膵星細胞における酸化ストレス応答機構が膵癌局所での炎症の持続に寄与していることを示すものであり、これまで知られていたNrf2による炎症抑制作用とは異なる新たな知見と考えられる。次年度の研究計画では膵星細胞がもたらす免疫抑制効果と酸化ストレス応答機構の関連を更に明らかにするため、そのメディエーター分子同定を中心とした解析計画を立案した。免疫抑制に関わる責任分子が同定されれば、直接的な抑制による抗腫瘍免疫の回復が可能であるかを明らかにすることで新規治療法開発につなげることができる。また、ヒト検体における多寡と進展形式や病期・予後との関連が明らかになれば新たな診断マーカーとしての応用が期待でき、有用性は高いものと考えられる。昨年までの解析で、腫瘍免疫抑制に関わる膵星細胞の腫瘍促進効果はNrf2に大きく依存することが判明した。免疫抑制作用とNrf2の関連を集中的に検討することで新たな成果が見込まれ、進捗はおおむね順調である。本年度は研究計画の最終年度として治療標的となりうる責任分子の同定を行う。本検討により有効な治療標的を見出すとともに、新たな診断マーカーとしての応用も視野に入れた解析を進める予定である。本年度は膵癌間質と免疫細胞・癌細胞間の相互作用に関わる分子を同定するため、ヒト膵癌組織・マウス膵癌モデルの膵癌組織について検討を進めた。ヒト膵癌組織については、これまでの検討でインテグリンシグナルの調節因子であるKindlin-2が膵星細胞による癌進展促進に寄与していることを報告している。この知見に基づき、他のインテグリンシグナル関連分子について免疫染色を実施し、αsmooth muscle actin陽性を示す活性化膵星細胞で発現する分子を同定した。同分子に対するshRNAを導入した細胞株を樹立し、活性化膵星細胞のマーカー発現を検討したところαsmooth muscle actinの発現低下がみられた。この細胞株では膵癌細胞との共移植実験でみられる腫瘍形成能の増強効果が減弱しており、癌進展に寄与していることが示唆された。マウス膵癌モデルでは、酸化ストレス応答の中核分子であるNrf2欠損により膵発癌が抑制されることを見出した。このマウスでは膵に形成される前癌病変周囲への炎症細胞浸潤が減弱していた。癌細胞側の因子で炎症の惹起に関与する分子の発現変動を検討したところ、核内に発現するアラーミンの一種が減少していることが確認された。マウス膵癌細胞に酸化ストレスを誘導するとこの分子のmRNA発現が増加することが判明し、新たなNrf2標的遺伝子と考えられた。これらのインテグリンシグナル関連分子や炎症惹起物質が免疫細胞に与える影響について、今後検討が必要と考えられる。本年度は膵癌細胞・間質細胞の相互作用に関わる分子を同定することができた。また、酸化ストレス応答機構によって制御される分子の中に炎症性シグナルに関わる分子が含まれることが判明し、膵癌進展過程での炎症惹起に寄与していると考えられた。以上より、本年度の進捗状況はおおむね順調と考えられる。

酸化ストレス応答機構の活性化は膵癌局所での炎症惹起に関わることが判明したため、酸化ストレス応答を欠損したマウスから分離培養した膵星細胞と膵癌細胞の共培養を行い、間質側での炎症惹起・免疫抑制機構の詳細を明らかにする。炎症や免疫抑制に関わる新規分子マーカーを同定し、ヒト膵癌における発現様式・予後との関連についても検討を行う。本年度は研究計画の最終年度として治療標的となりうる責任分子の同定を行う。本検討により有効な治療標的を見出すとともに、新たな診断マーカーとしての応用も視野に入れた解析を進める予定である。
卵巣キスペプチンの周排卵期における機能形態学的解析　～臨床応用への分子基盤確立～

キスペプチンは視床下部キスペプチンニューロンから分泌される神経ペプチドで、GnRH/LH分泌を制御している。ヒトにおいて末梢より投与されたキスペプチンがLHサージを誘導し、hCG製剤やGnRHa製剤と同様に卵成熟・排卵のトリガーとなることが報告されており、近い将来に生殖医療への応用が見込まれている。一方、卵巣においてもキスペプチンおよびキスペプチン受容体が発現していることが報告されているが、生理的役割は明らかではない。本研究では、周排卵期の卵巣におけるキスペプチンおよびキスペプチン受容体の発現変化と、LHサージ誘導目的で末梢より投与された場合の卵巣における局所作用の詳細を解析する。
新規な超音波エコー信号処理によるＨＩＦＵ治療効果判定とＨＩＦＵ治療システムの研究

本研究の目的は、超音波診断画像(B-mode像)を構成する超音波の送受波信号をもとに、HIFU治療によって生じる温度上昇とそれに伴う治療領域の判定をリアルタイムに行う、超音波モニタリングシステムを構築することである。HIFU治療の熱変性を超音波信号のみで行うため、本研究では異なる時間の超音波画像間の相互相関分布(相関マップ)をとることにより評価する方法を提案した。現在の超音波ガイドHIFU治療において、HIFUの高強度超音波成分とイメージング用の低強度超音波成分との干渉を避けるため、一旦HIFU照射を止めて超音波画像を取得し、治療部位のモニタリングを行っている。しかし現状の方法では、HIFU照射時の1msスケールの組織変化をモニタリングすることができない。つまり現状の方法では本当の意味でのリアルタイムな組織変化をモニタリングすることができない。そこで、私はHIFU照射を止めることなく超音波画像を取得し、HIFU成分のみを除去する新手法を提案した。具体的には、超音波画像が構成される(ビームフォーミング)前のデータからHIFU成分の信号を取り除く信号処理を行うことにより、組織成分の信号は残したままHIFU成分のみを除去することに成功した。さらにHIFU成分のみを除去した超音波画像から先に述べた相関マップを作成し、HIFU治療による加熱凝固領域の推定にも成功した。この新手法は、超音波ガイドHIFU治療のリアルタイムモニタリング手法としてリアルタイムに組織の状態を確認できるという点において非常に画期的な方法であり、実用上も有用な方法であると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、超音波診断画像(B-mode像)を構成する超音波の送受波信号をもとに、HIFU治療によって生じる温度上昇とそれによる熱変性の判定をリアルタイムに行う、モニタリングシステムを構築することである。しかし現状の方法では、HIFU照射時のlmsスケールの組織変化をモニタリングすることができない。本研究の目的は、超音波診断画像(B-mode像)を構成する超音波の送受波信号をもとに、強力集束超音波治療によって生じる温度上昇とそれによる熱変性(治療終了)の判定をリアルタイムに行う、リアルタイムモニタリング治療システムを構築することである。そこで、本研究では、モニタリング用受信超音波信号処理を行うことによって治療用超音波ノイズのみを除去し、治療中の組織変化の様子をリアルタイムに可視化するアルゴリズム開発に取り組んだ。その結果、ex vivo実験において、治療用超音波ノイズのみを完全に除去し、治療中の治療効果を可視化することに成功した。その成果が認められ、医用超音波および超音波治療に関する学会において、それおぞれ3つの賞を受賞した。また、その結果に関する論文を1編執筆し、学会誌より「記載可」の通知をいただいている。さらに本研究では高強度・短期間の超音波パルスと通常の治療用超音波治療を併用することで焦点においてキャビテーション気泡を生成し、治療効率を上げる治療法を提唱している。そこで本年度は、キャビテーションを利用した高効率治療において、上記ノイズ除去アルゴリズムが適用できるかも検討した。その結果、キャビテーション気泡由来の超音波信号などが散乱する、より複雑な治療系においても上記アルゴリズムが適用できることを確認し、現在、その結果をもとに論文を執筆中である。今後は、この研究を発展させ、キャビテーション気泡が治療領域に存在する条件において、治療効果が判定できるアルゴリズムを構築する予定である。具体的には、超音波画像が構成される(ビームフォーミング)

前のデータからHIFU成分の信号を取り除く信号処理を行うことにより、組織成分の信号は残したままHIFU成分のみを除去することに成功した。さらにHIFU成分のみを除去した超音波画像から先に述べた相関マップを作成し、HIFU治療による加熱凝固領域の推定にも成功した。この新手法は、超音波ガイドHIFU治療のリアルタイムモニタリング手法としてリアルタイムに組織の状態を確認できるという点において非常に画期的な方法であり、実用上も有用な方法であると考えられる。本研究の目的である「超音波治療における治療部位のリアルタイムモニタリング」に対して、新規な超音波エコー信号処理により、リアルタイムに治療用超音波ノイズを除去して、治療効果を判定するシステム作りの基礎を構築できたという点において、おおむね順調に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在は、ポスト処理によって治療用超音波ノイズを除去している。今後はリアルタイムに治療用超音波ノイズを除去し、さらに同時に治療効果判定も行う、治療システムを構築する予定である。そのためにアルゴリズムをより簡素化し、実装できる仕様にする必要がある。また、キャビテーション気泡が治療領域に存在する場合において治療効果をどのように判定していくかも同時に検討していく必要がある。本研究の目的である「HIFU治療における治療部位のリアルタイムモニタリング」に対してHIFU照射中にHIFU成分のみをカットして組織モニタリングする新手法について基礎的な検討を行うことができたという点でおおむね順調に進展していると言える。本実験において、これまではリアルタイムな信号処理ではなく、ポスト処理により超音波画像を取得している。今後は、信号処理のアルゴリズムを改善し、リアルタイムな画像表示の検討を進める予定である。また、現在行っている実験は還流した豚肝臓を使用したin vitro実験だが、今後はvivo実験等を行うことにより、本手法のより実用的な適用という点においても研究を進めていく予定である。
細胞性粘菌を用いた細胞質分裂シグナルの解明

細胞質分裂は、細胞分裂の最後に細胞質が二分される段階であるが、等価な娘細胞を複製するために、時間的・空間的に厳密に制御されている。本研究は、細胞質分裂の分子細胞生物学的研究に有利な細胞性粘菌を用い、細胞質分裂の制御に関わるタンパク質の同定と機能解析を目的としている。平成13年度は、まず、細胞性粘菌のESTプロジェクトから見いだした新規RasGAPであるGAPCについて、全長クローニングと配列決定をしたうえで、細胞内での高発現により懸濁培養時に多核化することを明らかにした。GAPCはRasGAPのなかでもGAP1ファミリーに属し、リン脂質特にIP4との結合が予想される。既に示されたように、細胞性粘菌でRasGの遺伝子破壊をすると同様に多核化することから、GAPCはRasGのGAPとして働くことで細胞質分裂に関わるものと考えられた。また、細胞質分裂に関わるタンパク質間の相互作用を解析する目的で酵母細胞質内での相互作用を解析可能なcytotrap two hybridシステムを検討した。細胞質分裂に関わるIQGAP様タンパク質GAPAをbeitとして検索した結果、GAPAと融合しているSOSタンパク質とライブラリーの中に豊富にあるRasGとの間に結合が起こり、そのバックグラウンドでスクリーニングが困難になっていることが判明し、現在のところこの方法ではGAPA結合タンパク質は見いだされていない。現在RasG欠損株からcDNAライブラリーを作り直してスクリーニングに向けて準備中である。平成11年度は、IQGAP様タンパク質の一つDGAP1が分裂溝に局在し、既に分裂溝への局在を明らかにしているもう一つのIQGAP様タンパク質GAPAとともに分裂溝の陥入に関与している可能性を示した。また、これらの分裂溝への局在が相互に非依存的に起こることも変異株の解析から明らかにし、共通の機能と共通のシグナル上流分子の存在が予想された。IQGAP様タンパク質に関しては、rhoファミリーGTPaseとの相互作用を詳しく調べるとともにそれ以外の結合タンパク質の同定は次年度に行う。また、細胞質分裂の制御に関わることが予想される細胞性粘菌rhoファミリーGTPaseとその制御分子をデータベースから検索し、RacF1,RacG,RacH,RacJとrhoGDI1の6分子を同定し、cDNAの全塩基配列を決定した。Racに関しては細胞内の局在を決定し、RacGとRacHか細胞質分裂のシグナルに関わる可能性が示唆された。rhoGDI1については、遺伝子欠損株が巨大多核細胞を生じることから、細胞質分裂への関与が証明された。rhoGDIは一般に脂質修飾されたrhoファミリーGTPaseに対して働くことが知られるため、その機能の生化学的証明には、rhoファミリーGTPaseをsf9細胞で発現させる必要がある。今年度はsf9細胞培養系の立ち上げが完了したので次年度は、このシステムでタンパク質を発現精製し、生化学的機能の証明を行う。
代替性のない魅力が生み出すファンツーリズムに関する研究

ファンツーリズムの基礎概念を提示するため、聞き取り調査やWEB調査を行った結果、ファン行動を「会う」「見る」「購入」「リトリート」「楽しみの共有」に分類した。ファン行動分類と、ファン行動に影響を与える「費用」「時間」「理解」を組み合わせた「ファン行動レベル」モデルを作成し、このモデルにおける「参戦者1」から「参戦者3(遠征)」までがファンツーリズムに該当することを明らかにした。ファンツーリズムは「参戦者」の段階にまで発達したファン行動であり、さらに「限定」か「国内か海外か」などの付加価値によってファンツーリズムにおける階層化が生じていると考えられる。ファンによる観光行動、すなわち「ファンツーリズム」の基礎概念を提示するという研究目的に沿って、平成27年度は、A:ファン行動についての参与観察、B:ファンによる観光行動への参加状況などの聞き取り調査、C:ファンの心理特性・行動特性を測る指標作りのための予備的質問紙調査、を計画した。このうち、ファン行動についての参与観察および参加状況などの聞き取り調査では、長年にわたるファン行動の詳細な記録をもつ嵐ファンの協力を得て、ファン行動の内容、グッズなどの購入状況、ファン歴の聞き取りなどを行ない、その結果を、平成27年11月に日本観光研究学会全国大会で発表した。また、このデータをもとに、聞き取り調査用のフォーマットを作成し、平成28年3月に別の嵐ファンへの聞き取りを実施した。聞き取り調査用フォーマットでは、イベント、出演作、発表作品などを時系列に整理し、いつ、何を、どこで、参加・購入したかなどを、思い出しやすいようにしてあり、今後の聞き取り調査で活用していく。嵐の5大ドームツアー時の参与観察は、宿泊手配等の関係から難しいことが分かってきたので、平成28年度は、代替の調査を検討する。またイ・ビョンホンファン向けのイベントは平成27年3月中旬過ぎに実施されたため、日程調整が間に合わず、見送らざるを得なかった。映画公開時など、ファンが集まる別の機会に調整する必要がある。成果発表としては、前述の日本観光研究学会全国大会での発表のほか、日本国際観光研究学会では、ファンがリピーター化することによる旅行不満について発表した。さらに「ファン文化」や「ファン行動」研究の動向を整理し、立教大学観光学部紀要に投稿した。調査の打ち合わせ時や学会発表時に、ファンツーリズムの概念を議論し、現時点では、「ファン度」と「外出度」の2軸で考えているが、今後の研究を踏まえて、概念図を完成させていく。嵐の5大ドームツアー時に、ファンへの参与観察を実施することは、宿泊手配などの点で、非常に困難であることが分かった。ある程度予想はしていたが、コンサート当日、参与観察や聞き取り調査をするには、かなり早い時点で出張計画をたてる必要がある。イ・ビョンホンファン向けのイベントは、平成27年3月中旬、東京会場のみの開催だったため、日程調整ができなかった。予定通り実施できなかった部分もあるが、ファンになって以来のコンサートやイベントへの参加状況、CD/DVDなどの購入状況、出演作など、詳細なデータを持つ対象者により、嵐ファンへの聞き取りフォーマットを完成させた。このフォーマットを使って、別の嵐ファンへの聞き取り調査を実施したところ、コンサート・イベントの参加状況、CD/DVDなどの購入状況など、本人が明確に記憶していなくても、フォーマットを見て思い出してもらえた。また日本における「ファン行動」や「ファン文化」に関する論文を整理し、大学生等を対象にした一般的なファン心理調査では、「代替性のない魅力」である特定の個人やグループを対象としたファン行動であるファンツーリズムの構造に迫ることができないことが確認できた。特定の個人やグループを対象とした研究調査でも、データ数が極端に少ないなどの課題があることも分かったので、本研究における質問紙調査項目の作成や調査実施について、検討を加えながら進めていく。予定通り進まなかった部分もあるが、今年度、得られた調査結果や聞き取り用フォーマットの作成と聞き取り調査結果、先行研究の整理などから、「ファン度」と「お出かけ度」の2軸と、「ファン度」と「お出かけ度」が高い象限にファンツーリズムを位置づけることができるのではないか、という仮説に至った。この部分は予定を超えて進んだ部分であり、最終的な目標である「ファンツーリズム概念の提示」につながる議論である。平成28年度は、平成27年度に実施した「嵐」ファンへの聞き取り調査と調査用フォーマット作成、および、その成果として設定した1「茶の間」2「購入者」3「参戦者」という「ファン行動レベル」に基づき、聞き取り調査を継続した。ファンによる紹介で、10人程度のファンに聞き取り調査を実施した。それらの結果をもとに、12月の日本観光研究学会で、「ファン行動レベル」モデル(幸田・臺・崔:2016)を発表した。さらに平成27年度には、ファンツーリズムの概念図を「ファン度」と「外出度」の2軸で想定していたが、「外的行動&内的行動」と「社会適合性」の2軸で検討を進めている。平成28年8月には、平成26年秋、「嵐」による大規模なコンサートが実施された宮城県利府町および関係企業での聞き取りを実施した。恒例のドームコンサートとは異なり、復興支援目的のコンサートだったこともあり、メディアでも大きく取り上げられたが、ファンと地域の間に発生したSNSなどを媒介したコミュニケーションの内容(臺・幸田・崔:2016)や、それによって受け入れ側のモチベーションがアップしたプラスのスパイラル効果(臺・幸田・崔:2017)などが明らかになった。