hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トリパノソーマ感染宿主細胞における酸化ストレス応答とアポトーシス制御解析

Trypanosoma cruzi感染宿主細胞では活性酸素種の産生が起こり、中でも活性窒素(NO)産生および活性窒素合成酵素(iNOS)の発現上昇が明らかとなった。活性酸素種阻害剤を添加すると、原虫感染細胞におけるアポトーシス抑制が解除されたことから、本アポトーシス抑制にNOなどの活性酸素種が関与していることが明らかになった。また、感染により宿主アポトーシス抑制因子c-FLIPにニトロソ化反応が起きることがわかった。Trypanosoma cruzi感染宿主細胞ではdeath receptorを介するアポトーシスが抑制され、宿主抑制因子cellular FLICEinhibitoryprotein(c-FLIP)が機能的にはたらいていることを明らかにしてきた。c-FLIPの発現上昇機構を解析する過程で本タンパク質がnitrosylationという分子修飾を受け、ユビキチン化による分解経路が抑制される可能性が示唆された。そこで原虫感染細胞におけるnitrosylationおよびアポトーシス抑制との関連について解析を行った。ヒト由来培養細胞HT1080にT.cruziを感染させ、biotin switch techniqueを用いてnitrosylationされたタンパク質の網羅的解析を試みた。その結果、感染細胞では複数のタンパク質が検出され、その中にはc-FLIPカスペース-8が含まれていることが明らかとなった。次に、原虫感染におけるNO産生とアポトーシスの関連を調べる目的で、T.cruzi感染細胞にiNOSの阻害剤であるL-NMMAを添加し、アポトーシス抑制が回復するかについて検討した。Fas抗体によりアポトーシスを誘導6時間後に、T.cruzi感染細胞では非感染細胞に比ベアポトーシスは抑制されるが、L-NMMAを添加した場合には、感染細胞でアポトーシス抑制が部分的に回復することが示された。以上より、T.cruzi感染細胞では宿主細胞内でNOの産生が起き、iNOS阻害剤によりアポトーシス抑制が回復することから、活性窒素が本抑制に関与している可能性が示唆された。Trypanosoma cruzi感染宿主細胞ではdeath receptorを介するアポトーシスが抑制され、宿主抑制因子cellular FLIPinhibitoryprotein(c-FLIP)が機能的にはたらいていることを明らかにしてきた。昨年度の結果からT.cruzi感染細胞では活性酸素種の産生が起こり、中でも活性窒素(NO)産生および活性窒素合成酵素(iNOS)の発現が上昇していることが明らかとなった。そこで、本年度はアポトーシスとの関連を解析することを目的とした。HT1080細胞にT.cruziを感染させ、抗Fas抗体(CH11)を用いてアポトーシスを誘導した。その際、活性酸素の阻害剤であるN-メチルモノアルギニン(NMMA)を添加して実験を行った。アポトーシス誘導24時間後に細胞を集め、FITC標識活性型カスペース-3抗体を添加しフローサイトメトリーによりアポトーシスを起こした細胞の割合を測定した。また同時に、T.cruzi感染マウスから得た血清を用いて感染細胞をAPCで蛍光標識し、感染、非感染細胞を区別した。アポトーシス誘導前では感染、非感染細胞いずれも活性型カスペース-3は5%程度であった。誘導後、非感染細胞では活性酸素阻害剤の有無で差は認められず、いずれも55-58%であった。一方感染細胞では、アポトーシスが抑制され、阻害剤を加えない場合には12.3%、阻害剤添加では18.5%であった。阻害剤を添加した場合にアポトーシスが誘導される細胞がやや上昇したことから、原虫感染細胞では、活性酸素によりアポトーシス抑制が解除される傾向が認められた。またこの時、c-FLIPの分子修飾がおきているかどうかを確かめるため、biotin switch法により解析を進めているところである。昨年度の研究結果から、T. cruzi感染細胞では活性酸素種産生が行われ、宿主アポトーシス抑制因子c-FLIPがnitorosylationされることが明らかとなった。この反応は可逆的であるため、結合したNOがサンプル調整中にはずれてしまう可能性が考えられた。そこで、nitosylationされたタンパク質が安定に検出できる方法を検討した。感染細胞ライセートにSDSを加えたサンプルバッファーを添加すると、NOがはずれてしまうことがわかり、種々の条件を検討した。また、c-FLIPと相互作用する原虫側の因子を探索するため、c-FLIP発現細胞の樹立を試みた。しかしながら、c-FLIP全長を発現させるのが困難であったため、N末側のDED領域とC末側のpseudo-caspase領域を含む領域をPCRで増幅し、動物細胞発現ベクターに連結した。その遺伝子をHT1080細胞にトランスフェクションし、pseudo-caspase領域を発現した細胞のクローン化を行った。Pseudo-caspaseはmycおよび4F:LAGのtag付タンパク質として発現され、ウエスタンブロットで確認したところ予想したサイズのバンドが検出され、発現細胞の樹立に成功した。DED領域発現細胞については現在クローン化を行っているところである。

発現細胞を用いて、原虫と相互作用するタンパク質を探索したが、サンプル調整の際に結合がはずれてしまう可能性が考えられた。そこで、pseudo-caspase発現細胞にT. cruziを感染させ、UVクロスリンクを行った後にライセートを作製した。原虫感染および非感染発現細胞からUVクロスリンク後にそれぞれライセートを調整し、myc抗体を用いて免疫沈降を行い、SDS電気泳動およびウエスタンブロット法を用いてc-FLIPのpseudo-caspase領域と相互作用するタンパク質の検出を試みている。UV照射量、照射時間について条件検討を行い、実験系を確立中である。
ランダムなアミノ酸配列ライブラリを利用した抗苦味受容体人工抗体の開発

塩基性薬物のジフェンヒドラミン塩酸塩は苦味受容体タンパク(hTAS2R10、hTAS2R14)の基質であることが確認されている。この薬物にアミノ酸およびジペプチドの濃度を変化させた試料を添加し、味覚センサを用いて薬物の苦味に及ぼすジペプチドならびにアミノ酸の影響を評価した。センサ膜は苦味応答性に優れたBT0膜を使用した。その結果、ジフェンヒドラミン塩酸塩(0.5 mM)の苦味センサ出力値はAsp-AspまたはGlu-Glu(各0.1、0.5、1.0、5.0 mM)添加濃度依存的に抑制された。抑制率はAsp-Asp>Glu-Glu>Asp>Gluの順となった。この結果はアミノ酸の脂溶性や酸性度と相関していることも示唆された。さらにAsp-Asp、Glu-Glu、Asp、Gluの苦味受容体に対する親和性を評価するため、SPR測定を行った。自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer:SAM)を形成した金薄膜にヒト苦味受容体タンパク(hTAS2R14)を固定した。金薄膜にhTAS2R14を固定した場合、固定しなかった場合と比較してSPRシグナルの生じる偏光照射角度変化が認められたことからhTAS2R14が金薄膜に固定されたことが強く示唆された。SPR測定によるスペクトラム変化の大きさは、Asp-Asp>Glu-Glu>Asp>Gluの順であり、ジペプチド、アミノ酸のhTAS2R14への親和性の違いがジフェンヒドラミン塩酸塩を競合的に拮抗する苦味抑制機序を考えるに至った。本研究課題では、ヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ酸残基を標的として、アミノ酸20残基をランダム配列した2本の分子鎖をリンカー分子で結合させた人工抗体分子を作製することを目的としている。ヒト人工抗体ライブラリのアミノ酸残基配列を参照し、アミノ酸20残基の配列の中で、重要なジペプチドやアミノ酸配列を見つけることが必須であり、これはアミノ酸20残基の配列をランダム化したペプチド鎖を複数合成する上で重要である。アミノ酸であるAsp、GluとペプチドであるAsp-Asp、Glu-Gluが重要なアミノ酸、ペプチド構造であることが明らかとなったため、これをランダムに配列させたペプチドを合成することで、さらにヒト苦味受容体タンパク(hTAS2R10, hTAS2R14)に親和性がある苦味抑制ペプチドの最終合成が可能となると期待される。ヒト苦味受容体タンパクであるhTAS2R14に加えてhTAS2R10のリガンドの可能性があるドネペジル塩酸塩、キニーネ塩酸塩、デキストロメトルファン臭化水素酸塩を用いてこれらの薬物と苦味受容体タンパクとの結合解離を測定し、その応答を確認した後、各種ペプチドと苦味受容体との結合解離を測定する。Asp-Asp、Glu-Glu、Asp、Gluによる薬物の苦味抑制効果を味覚センサとSPRにより検証する。SPR測定において、金薄膜への苦味受容体タンパク固定化とその検証は特に重要である。金薄膜はエタノールと超純水で洗浄した後、ピラニア溶液中で洗浄する。その後、hTAS2R10のリガンドの可能性があるドネペジル塩酸塩、キニーネ塩酸塩、デキストロメトロファン臭化水素酸塩を用いて処理を行い、金薄膜を1 mMチオール溶液(11-Amino-1-undecanethiol 0.96 mg/ethanol 4 mL)に24時間浸漬する(SAM形成)。SAM形成した金薄膜を1%グルタルアルデヒド溶液5 mLに2時間浸漬した後、超純水で洗浄する。金薄膜に、1μg/100μLのhTAS2R10またはhTAS2R14を滴下して表面を覆い12時間静置することで苦味受容体タンパクを固定化させる。これら種々の合成抗体分子の候補物質とヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ酸残基との親和性を検証するために、複数の細胞外領域アミノ酸残基とセンサアレイした分子を用いて分子間相互作用解析(SPR)を行うことで最適な苦味抑制効果をもつ抗体を探索するシステムを構築する。平成28年度は、新規苦味抑制剤創薬のため、アミノ酸20残基をランダム配列した2本の分子鎖をリンカー分子で結合させた人工抗体分子を作製することを目的に検討を行った。アミノ酸20残基の配列については、ヒト人工抗体ライブラリのアミノ酸残基配列を参照に、アミノ酸20残基の配列をランダム化したペプチド鎖を複数合成する予定だが、まずはじめに、Kim MJらの文献(Biochem Biophys Res Commun、456、586-590、2015)を参考に、3種のペプチドGlu-Glu、Glu-Asp、Glu-Serを合成し、苦味を呈する代表的な塩基性薬物であるジフェンヒドラミン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、アムロジピンベシル酸塩の苦味センサ応答に及ぼす各種ペプチドの影響を評価した。各種苦味物質(0.5 mM)の苦味センサ応答は、Glu-Glu(0.1、0.5、1.0、5.0 mM)またはGlu-Asp(0.1、0.5、1.0、5.0 mM)添加濃度依存的に抑制された。その抑制率はGlu-Gluによるものと比較して、Glu-Aspによる方が大きかった。

今後は他のペプチドの可能性も検討しながらGlu-Aspとヒト苦味受容体たんぱくの相互作用を評価する。さらには人工抗体分子として、正電荷を持つLys、Arg、Asp、負電荷を持つGlu、Aspを分子内に導入することで、分子内電荷を変化させる。とくに分子内を3つの領域に分け、それぞれの領域に正電荷を持つアミノ酸、負電荷を持つアミノ酸を導入した場合、しない場合を考慮してランダム化した残基を合成する。これらの合成抗体分子と、ヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ残基との親和性を評価し、各種ペプチドと薬物分子間相互作用を評価するシステムを構築する。本研究課題では、ヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ残基を標的として、アミノ酸20残基をランダム配列した2本の分子鎖をリンカー分子で結合させた人工抗体分子を作製することを目的としている。アミノ酸20残基の配列については、ヒト人工抗体ライブラリのアミノ酸残基配列を参照に、アミノ酸20残基の配列をランダム化したペプチド鎖を複数合成する。分子内に正電荷を持つLys、Arg、Asp、負電荷を持つGlu、Aspを導入することで、分子内電荷を変化させる。とくに分子内を3つの領域に分け、それぞれの領域に、正電荷を持つアミノ酸、負電荷を持つアミノ酸を導入した場合、しない場合を考慮してランダム化した残基を合成することを当初の計画とした。Glu-Glu、Glu-Aspについてはその苦味抑制効果が期待できることが味覚センサ測定結果より示唆された。平成29年度は、SPR測定によりペプチドとヒト苦味受容体タンパクの相互作用を評価することを目的に検討を行った。多くの苦味薬物が応答することが知られている苦味受容体タンパク(hTAS2R10, hTAS2R14)に注目して、自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer:SAM)を形成した金薄膜に、hTAS2R10, hTAS2R14を固定した。まず、金薄膜をエタノールと超純水で洗浄後、ピラニア溶液中で洗浄した。次に、金薄膜を1 mMチオール溶液(11-Amino-1-undecanethiol 0.96 mg/ethanol 4 mL)に24時間浸漬した(SAM形成)。SAM形成した金薄膜を1%グルタルアルデヒド溶液5 mLに2時間浸漬した後、超純水で洗浄した。金薄膜に、1μg/100μLのhTAS2R10またはhTAS2R14を滴下して表面を覆い12時間静置することで苦味受容体タンパクを固定化させた。金薄膜に苦味受容体タンパクを固定した場合に、固定しない場合と比較してのSPRシグナルの生じる偏光照射角度変化が認められたことから、苦味受容体タンパクが金薄膜に固定されたことが示唆された。平成28年度は、3種のペプチドGlu-Glu、Glu-Asp、Glu-Serに着目してその苦味抑制効果を味覚センサで検証した。平成29年度は、多くの苦味薬物が応答することが知られている苦味受容体タンパク(hTAS2R10, hTAS2R14)に注目して、自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer:SAM)を形成した金薄膜にhTAS2R10、hTAS2R14を固定することを検討した。
水,プロトン,酸素分子チャネルの立体構造特性

チトクロム酸化酵素による酸素分子の還元とそれに同期したプロトンの能動輸送の分子機構を解明するために、ウシ心筋より精製したチトクロム酸化酵素のX線結晶構造解析を行っている。酸化型の2.8Å分解能での結晶構造解析に続いて、2.3Å分解能での酸化型、低温酸化型、還元型、CO化型、CN化型、アジド化型の構造解析を進めている。これまでにこの酵素の機能と密接に関連した構造が明らかになってきた。これまでに、分子内にはヘリックスの軸方向に走るプロトンチャネルがあることや、活性中心で合成された水分子が分子の外に排出されるのに都合の良い構造があることが明らかになっている。本年度はプロトンチャネルを形成する上で重要な役割を果たす水の構造を明らかにすることができた。構造決定は2.3Å分解能の酸化型結晶について行った。水分子の位置は重原子同型置換法による電子密度図や(Fo-Fc)フーリエ合成図に基づいて拾い上げたものを、プログラムXPLORによって精密化した。その結果、約600分子の水の構造を決定することができた。そのうち活性中心であるヘムa,ヘムa_3、CuA、CuB、Mgのそばにあるものを図に示した。膜蛋白質であり、分子内部にあるにも拘わらずヘムのプロピオン酸残基やMgの近くには水分子が数多く見つかった。酸素還元中心であるFea3-CuB複核中心からアミノ酸側鎖を介したこれらの水分子への水素結合の繋がりがある。この繋がりは生成された水が排出される経路となっているのであろう。これらの水分子の多くはアミノ酸側鎖や他の水分子と互いに水素結合で結ばれており、プロトンの能動輸送に関わるチャネルの一部にもなっている。この結果、以前に挙げていたプロトンチャネルの候補をより詳しく特定できるようになった。
代償性肺再生で肺胞マクロファージの役割～エクソソームを中心に～

左肺全摘術モデルの確立のためC57/BL6Jマウス(♀、9週齢)にケタミンおよびキシラジンの筋肉注射で全身麻酔をかけ、気管挿管し人工呼吸管理を行った。第5肋間で開胸し肋間を開大したのちに、左肺動脈・肺静脈・主気管支を1-0絹糸で一括結紮し、左肺を摘出した。閉胸ののち、呼吸器から離脱し抜管し通常飼育下に戻した。残存右肺の変化を形態学的解析および乾燥重量の評価を行うことによって左肺全摘術後の代償性肺成長の変化を記録した。その過程で、再生に必要な因子である「再生の場」の構築に着目して肺発生・再生における分子機構の解明を目指したが、FACS (fluorescence activated cell sorting)によりマクロファージ分画に大きな変化を認めず今回の結果から時系列でのマクロファージの分化を立証できなかったことから、代償性肺成長におけるmiRNAの遺伝子発現制御の役割と変化をmiRNA arrayを解析することによって網羅的に検索することに計画を変更した。平成30年度は、左肺全摘術モデルの確立が完了し、miRNA array解析とPCRを行ってmiRNA arrayの結果を確認した。miRNAの時間的な変化に着目してコントロールとしてsham operation(開胸のみの群)を設定し、左肺全適後12時間および48時間の検体とをmiRNA arrayにかけてmiRNAの時間的な発現量の変化を網羅的に検索した。この結果から、左肺全摘術後12時間で発現が有意に低下し、48時間後にsham operation群と同等レベルまで戻るものを検索した。これで上がった候補の中からネットワーク解析および文献的な検索から、thyroid transcription factor-1 (TTF-1)の発現に関与するmir 200cを同定し、その経時的な変化をPCRで確認した。平成29年度は、まず左肺全摘術モデルの確立を行った。C57/BL6Jマウス(♀、9週齢)にケタミンおよびキシラジンの筋肉注射で全身麻酔をかけ、気管挿管し人工呼吸管理を行った。左肺全摘術モデルを開閉胸のみのsham operation群と、左肺全摘術後12時間後及び48時間後にしぼり、採取した右肺からRNAを抽出しmiRNAarrayを行った。次年度以降はこの結果の解析とネットワーク解析を行い、代償性肺成長のkey regulatorと成りうるmiRNAによる遺伝子発現制御機構を検索する予定である。動物実験計画書に変更があり申請に時間を要し実験開始が遅れた。またマウス左肺全摘術モデルには技術的に難度が高く、手技の安定に時間を要した。左肺全摘術後の残存右肺を用いてmiRNAarrayを行って、代償性肺成長時期における遺伝子発現制御に有意な変化がないかの検討を行っている。

左肺全摘術後の残存右肺を用いてmiRNAarrayを行って、代償性肺成長時期における遺伝子発現制御に有意な変化がないかの検討を行っている。実験開始の予定外の遅延により本年度のマウスの実験数が想定より少なくなり飼育及び実験額が予定より少なくなった。次年度は実験数を増やすと共にmiRNAの解析を行うため残額を使用する予定である。
日英同盟の衰退過程に関する実証的研究－国際的要因・世論要因・経済要因の連関－

本研究は、日英同盟がなぜ、どのようにして廃棄に至ったのかを、一次史料に基づいて解明することを目的としたものである。本研究では、日本が第一次世界大戦に積極的に参戦し、中国に対華二十一ヵ条要求を提出する過程で、イギリスの対日不信感が増大したという事実を重視し、この間の日英関係の分析に主力を注いだ。分析にあたっては、国際的要因、世論要因、経済要因という三点を重視した。本研究の意義は、第一次世界大戦期の日本の積極的勢力拡張政策が、戦前期日本外交の基軸であった日英同盟を崩壊させ、日本を国際的に孤立させる要因として極めて重要な意味を持っていたことを明らかにしたことにある。本研究は、日英同盟がなぜ、どのようにして廃棄に至ったのかを、国際的要因、世論要因、経済要因という三つの視角を立てて、実証的・多面的に解明するものである。今年度も、昨年度に引き続き、国内外において一次史料の収集を進めた。国内においては、国立国会図書館、外務省外交史料館、防衛省防衛研究所図書館など中央の史料に加え、青森県立図書館、岩手県立図書館、原敬記念館、茨城県立図書館、愛知県立図書館など、地方の史料をも積極的に収集した。海外においては、中央研究院(台湾台北市)において一次史料の収集を行った。本年度は、昨年度の成果を踏まえ、第一次世界大戦期に日英同盟が動揺したプロセスに特に集中して研究を進めた。具体的な研究成果は、以下のとおりである。(1)第一次世界大戦への日本の参戦をめぐる過程を再検討し、論文「参戦外交再考」を公表した。(2)第一次世界大戦期の日本の外交世論を、大隈重信首相、立憲同志会、財界の動向に注目しながら検討し、論文「第一次世界大戦初期における日本の外交世論」を公表した。(3)中央研究院(台湾台北市)主催の国際シンポジウム「日本近代におけるリーダー像」において、第一次世界大戦勃発時の加藤高明外相のリーダーシップに関する研究報告を行い、台湾の研究者と議論や意見交換を行った。(4)第一次世界大戦初期の日本外交、第一次世界大戦期の原敬の外交指導に関する論文執筆を進めた。これらの論文は、2014年度中に公刊される見込みである。本研究は、日英同盟がなぜ、どのようにして廃棄に至ったのかを実証的・多面的に解明するものである。本研究では、国際的要因、世論要因、経済要因という三つの視角を立て、戦前期日本外交の基軸であった日英同盟が崩壊し、日本が国際的に孤立していった要因について新たな解釈を提示すると共に、その歴史的経験を今日的視点から捉え直すことを目指す。本年度の成果は、以下のとおりである。(1)海外の一次史料収集に力を入れ、以下の諸機関で資料調査を実施した。ロンドン・スクール・オブ・エコノミクス図書館、オックスフォード大学ボードビリアン図書館、ケンブリッジ大学チャーチル・アーカイブスセンター、バーミンガム大学図書館、シェフィールド大学図書館、英国公文書館、英国王立文書館、英国議会文書館、ジャパンソサエティー図書館、スコットランド国立図書館(以上イギリス)。ベルリン国立図書館、フライブルク大学図書館、クレーフェルト市文書館(以上ドイツ)。ニューサウスウェールズ州立図書館(オーストラリア)。(2)第一次世界大戦勃発時の在ドイツ日本人の動向に関する研究を進め、その成果を単著『「八月の砲声」を聞いた日本人』として公刊した。(3)日本学術振興会ロンドンオフィスにおいて、日英の皇室外交に関する講演を行った。(4)日本英学史学会において、陸奥宗光・廣吉とイギリスの関わりに関する講演を行った。(5)日本政治学会において、第一次世界大戦に関するパネルの司会を担当した。(6)加藤高明の伝記的研究を進め、論文「加藤高明と陸奥廣吉」を発表した。本研究は、日英同盟がなぜ、どのように廃棄に至ったのかを、国際的要因、世論要因、経済要因という三つの視角を立てて、実証的・多面的に解明するものである。本年度は、昨年度までの成果を踏まえて、研究成果を著書、学術論文、学会報告の形で、国内外に広く発信することに力を入れた。主な研究実績は、以下の通りである。1日英同盟を大きく動揺させることになった第一次世界大戦初期の日本外交について、日本の大戦への参戦過程、対華二十一ヵ条要求への対応、日本やイギリス、中国における世論の動向などに焦点を当てながら分析を進め、著書(単著)『対華二十一ヵ条要求とは何だったのか』としてまとめた。また、第一次世界大戦期の政治や外交を主題とした論文集に寄稿するとともに、関連する学術論文を学術雑誌などにも発表した。2日英同盟の締結から廃棄に一貫して深くかかわった日本の外交指導者・加藤高明の論説『滞英偶感』を編纂し、詳細な註・解題を附して公刊した。

3明治末期から大正期にかけてイギリスと深いかかわりを持った政治指導者・大隈重信が主宰した総合雑誌『新日本』の復刻出版を監修した。出版に際しては、今後の研究者の便を考え、詳細な解題を附した。4国内外の学会やシンポジウムにおいて、研究成果を発表した。具体的には、日本国内において東アジア近代史学会のシンポジウム、日本国際政治学会の部会、海外においてはEAJSの研究大会、ルール大学ボーフムの国際シンポジウム、ベルリン独日協会主催の講演会などである。日本政治外交史平成24年度、25年度に行った資料調査を踏まえ、その成果を着実に論文として公表できたため、研究は概ね順調に進んでいると判断する。イギリス、ドイツ、オーストラリアにおいて資料調査を実施し、多くの一次史料を発見すると共に、その成果の一部を単著として公刊することができたため、研究は順調に進んでいると判断する。来年度は、昨年度予定していたアメリカでの資料調査を実施する予定である。また、ドイツ、イタリアでも資料調査を行う。来年度は最終年度であるため、研究成果の公表にこれまで以上に積極的に取り組む。まず、日本、ドイツ、スロヴェニアで開催される国際学会、講演会で報告・講演を行う予定である。また、第一次世界大戦期の日英同盟の動揺に焦点を当てた論文を公表するとともに、それを著書としてまとめる作業に取り組む予定である。来年度も引き続き海外での資料調査を行い、アメリカ、イギリスなどの一次史料を収集する予定である。また、その成果に基づき論文の執筆を行うと共に、それを研究書として公刊する準備を進めていきたい。次年度の研究費は、アメリカにおける資料調査のための旅費、図書購入費、資料複写費、研究補助者への謝金などに充当する予定である。
生体内遺伝子導入方による肺障害の病態の解析と治療-閉鎖性細気管支炎におけるエンドセリンの関与とその制御-

研究経過平成9年度【目的】HVJ-liposome法による生体内遺伝子導入法で肺組織にET-1geneを導入,ET-1を過剰発現することで誘発される病態を作成することを目的とした.【結果】I群で気管支上皮,II型肺胞上皮細胞,肺胞macrophageにβ-gal geneの発現が認められた.II群ではHIV-liposome導入に伴う肺組織の病理組織学的変化は認められなかった.III群では投与後3日目には単核球浸潤と膠原線維増加に伴う肺胞壁の肥厚が認められた.7,14日目にはさらに呼吸性細気管支,肺胞腔を閉塞する肉芽腫様の突出を伴った組織学的変化,Bronchiolitis Obliterans(OB,BOOP)に類似した病理組織像を呈した.経肺動脈投与群においては小肺動脈の中膜の肥厚が認められ,免疫組織染色でET-1の発現亢進が認められた.【まとめ】これらの実験結果はendothelinがOBや肺高血圧の病態血圧の病態発生と進行に重要な役割を演じていることを示唆した.研究経過平成10年度【経過と目的】平成9年度ではHVJ-liposome法による生体内遺伝子導入法で肺組織にET-1geneを導入することで誘発されるOB類似病変を作成した.この成果は米国胸部疾患学会(ATS/ALA)の"Expandingstrategiesandtargetsingenetherapy"のシンポジウムで発表し,OBの実験modelであるという評価を得た.この結果はETantagonist等の治療の可能性を示唆した.さらに肺移植における遺伝子治療の臨床応用を目指した導入法を検討する必要がある.【方法】体重250gWistarmaleratを使用, FITCでラベルしたoligodeoxynuc1eotides(ODN)をliposome内に封入し,HJ-liposomecomplexを気道(I群)と左肺動脈(II群)から投与した.次に肺移植時の前潅流法を利用してexvivoに移植肺にHJ-liposomecomplexを投与した(III群).III群では次にcufftechniqueによる左肺同種移植(Wistar-Wistar)を施行した.3群とも投与後3日にratを犠牲死させて肺組織への導入の程度を螢光顕微鏡で観察した.【結果】I群で気管支上皮,肺胞上皮細胞,肺胞macrophageにFITCの発現が認められた.II群では肺胞上皮細胞,肺胞macrophageにFITCの発現が認められたが,肺血管内皮での発現は明らかではなかった.III群では虚血再潅流,HJ-liposomecomple投与に伴う影響が起因する肺組織障害が認められた.肺組織障害の軽微(or無し)での移植肺での発現を検討すべく実験を継続中である.
大腸菌転写因子遺伝子の構造と機能の解析

1.転写因子と考えられる大腸菌RNAポリメラーゼ結合蛋白質のいくつかの部分的なアミノ酸配列を決定し、それらから推測されるヌクレオチド配列を化学合成し、これをプローブとしてその蛋白質の遺伝子を分離する一連のこころみをした。2.この方法により、結合蛋白質の1つであるSSPの遺伝子のクローニングに成功し塩基配列決定をした。この蛋白質は211アミノ酸からなり分子量24305ダルトンの中性蛋白質であった。3.in vivoの転写開始点を決定し、正常増殖時、緊縮抑制時とも同一地点から転写開始が起っていた。しかし、対応した領域にプロモーター配列と相同性のある塩基配列を見出すことはできなかった。この部分を種々の程度に欠失したDNA断片のプロモーター活性を調べると、通常の大腸菌プロモーターと同じく、転写開始点の上流約40bpまでが必須領域であったが、更に、その上流40bpが転写を増大させるシス作用領域であった。この部分は"曲がり"構造をしており、この領域に作用する転写因子の存在を相像させた。終結コードンの下流にも構造遺伝子枠が続き、マキシセル実験でもこの部分に対応した蛋白質が同定できたのでSSP遺伝子はオペロンを形成していることが明らかになった。4.SSP遺伝子の染色体座位決定を行い、69.5分であることを明らかにし、これは従来知られていなかった遺伝子であることが明らかになった。5.SSPの構造遺伝子の一部を欠損したプラスミドを用い、細胞染色体上のSSPを失活させる方法により、細胞生育に対するこの遺伝子の必要性を解析した。通常増殖条件ではこの遺伝子は必須ではなかった。6.構造遺伝子の一部を欠損したSSP遺伝子をプラスミドに挿入し、この欠損SSPを細胞中に蓄積させると細胞は低温感受性となった。この形質を抑制する細胞側の復帰変異株が高頻度に出現する。この細胞の変異部位の同定をこころみている。
中枢ミエリン形成を司る分子ネットワークの解明

昨年度までに、グリア細胞の発生時期特異的に発現している分子をmRNAアレイ解析などを用いて、探索を行った。その結果、これまでに報告のなかった細胞内シグナル伝達経路の中心で働くヌクレオチド交換因子BIG1が高発現していることを見いだした。そこで、本年度は、その分子がグリア細胞のミエリン発生過程の制御にどのように関与しているか、in vivo、in vitroの両面から解析を行った。低分子量GTP結合タンパク質のArf1は、細胞内のタンパク質輸送に深く関与する分子である。ミエリン形成時のグリア細胞内ではミエリン膜を構成するタンパク質の合成や輸送が活発に行われていることは、想像に難くない事であったが、ミエリン形成時にArf1がどのような機能を果たしているかは長い間不明のままであった。申請者らが昨年度までに明らかにしたミエリン形成時に高発現するBIG1は、Arf1の活性を制御するヌクレオチド交換因子である。はじめに申請者らはグリア細胞特異的なBIG1のノックアウトマウスを作製した。BIG1ノックアウトマウスは、野生型と比較してミエリン膜の厚さが薄くなっており、特にミエリン形成初期にその表現型が強く現れた。さらに、BIG1ノックアウトマウスでは、ミエリン膜の材料となるタンパク質や脂質のゴルジ体から細胞膜近傍への輸送が著しく阻害されていた。次に、BIG1によって活性制御を受けているArf1に関しても同様にノックアウトマウスを作製し、ミエリン形成時に及ぼす影響を解析した。その結果、BIG1ノックアウトマウスで観察された薄いミエリン膜、およびミエリン膜形成タンパク質の輸送阻害が確認された。本年度は、ミエリン発生の分子メカニズムの解明において、マイクロアレイ解析によりグリア細胞の発生期に特異的に発現しているシグナル分子を同定に成功した。そのシグナル分子は、細胞内シグナル伝達経路において、シグナルスイッチのオンオフを制御に関与する非常に重要な分子であった。その後、この分子を標的とした遺伝子改変マウスの作製し、詳細な解析を進める事ができた。以上より、当該年度は当初の計画に沿って、概ね順調に推移していると言える。今後は、本年度明らかとなったシグナル分子のさらに上流、また下流に介在するシグナル分子を明らかにすることで、ミエリン形成時のシグナル経路の全貌が明らかとし、それらの結果を応用することで、再ミエリン化や神経再生過程の分子基盤の解明へと発展させていく予定である。本年度は、中枢ミエリン形成過程の分子メカニズムを解明するため、オリゴデンドロサイトの発生期に特異的に発現している分子のmRNAアレイ解析を行い、候補分子の絞り込みを行った。その結果、これまで報告のなかった細胞内シグナル伝達経路の中心で働くヌクレオチド交換因子活性依存性のタンパク質が特異的に高発現していることを見いだした(未発表)。現在、その分子が中枢ミエリン発生過程の制御にどのように関与しているか、in vivo、in vitroの両面から解析を行う準備をしている。さらに、そのシグナルタンパク質の周辺分子を明らかにするため、タグをコードする塩基配列を付加し、これをオリゴデンドロサイト内に発現させ、タグ抗体で免疫沈降したのち、結合タンパク質のMS解析を行った。現在も引き続き解析を継続している。一方、先天性中枢ミエリン変性症であるPelizeus-Merzbacher病の原因遺伝子として、近年plp1以外にも複数の遺伝子が明らかにされ、総称としてHypomyelinating leukidystrophy (HLD)と呼ばれるようになってきた。本年度は、HLD4およびHLD6に焦点をしぼり、そのモデル作製などに着手した。さらに、HLDを模倣するインビボマウスモデル作製のため、HLD4の原因遺伝子であるHSPD1の点変異体のトランスジェニックマウスを作製した。まず、目的とするものを主要な病変細胞であるオリゴデンドロサイトに特異的に発現させるプロモーター下流に配置した。点変異体としては、HSPD1の29番目のAspをGlyに置換したHSPD1(D29G)を用いた。作製したトランスジェニックマウスの新生児の脳を固定後切片を作り、抗MBP抗体で免疫染色を行ったところ、同腹の野生型マウスと比較し、トランスジェニックマウスの脳梁や嗅球などの領域において髄鞘形成率の減少が観察された。ミエリン発生の分子メカニズムの解明においては、マイクロアレイ解析や質量分析法などを用いて、発生時期を制御する候補分子の絞り込みを行い、ミエリン発生期に中心的に機能することが予想される新規シグナル分子の同定に至った。一方、ミエリン変性症の研究においては、先天性白質形成不全症のHLDに関して、インビボモデルマウスの作製に着手し、表現型として髄鞘形成率の減少が確認されるマウスを得ることに成功した。さらにインビボ病態共培養システムの構築と、病態メカニズムの解明も継続して進めている。このように、本年度は当初の計画に沿って概ね順調に推移している。

ミエリン形成時のグリア細胞内ではミエリン膜を構成するタンパク質の合成や輸送が活発に行われていることは、想像に難くない事であったが、ミエリン形成時にArf1がどのような機能を果たしているかは長い間不明のままであった。申請者らが昨年度までに明らかにしたミエリン形成時に高発現するBIG1は、Arf1の活性を制御するヌクレオチド交換因子である。はじめに申請者らはグリア細胞特異的なBIG1のノックアウトマウスを作製した。BIG1ノックアウトマウスは、野生型と比較してミエリン膜の厚さが薄くなっており、特にミエリン形成初期にその表現型が強く現れた。さらに、BIG1ノックアウトマウスでは、ミエリン膜の材料となるタンパク質や脂質のゴルジ体から細胞膜近傍への輸送が著しく阻害されていた。次に、BIG1によって活性制御を受けているArf1に関しても同様にノックアウトマウスを作製し、ミエリン形成時に及ぼす影響を解析した。その結果、BIG1ノックアウトマウスで観察された薄いミエリン膜、およびミエリン膜形成タンパク質の輸送阻害が確認された。本年度は、ミエリン発生の分子メカニズムの解明において、マイクロアレイ解析によりグリア細胞の発生期に特異的に発現しているシグナル分子を同定に成功した。そのシグナル分子は、細胞内シグナル伝達経路において、シグナルスイッチのオンオフを制御に関与する非常に重要な分子であった。その後、この分子を標的とした遺伝子改変マウスの作製し、詳細な解析を進める事ができた。以上より、当該年度は当初の計画に沿って、概ね順調に推移していると言える。本年度は、オリゴデンドロサイトの発生各時期に特異的に発現している分子を明らかにするため、mRNAアレイ解析を行い、候補分子の絞り込みを行った。その結果、これまで報告のなかったガイダンス因子受容体や細胞内シグナル伝達経路の中心で働くヌクレオチド交換因子活性依存性のタンパク質などが特異的に高発現していることを見いだした。今後はそれらの分子が中枢ミエリン発生過程の制御にどのように関与しているか、in vitro、in vivoの両面から解析を行い、グリア細胞と神経細胞の共培養系に還元しその効果を検証する。さらに、その分子周辺に介在するシグナル分子を明らかにし、ミエリン発生シグナルの全貌を明らかにしていく予定である。今後は、本年度明らかとなったシグナル分子のさらに上流、また下流に介在するシグナル分子を明らかにすることで、ミエリン形成時のシグナル経路の全貌が明らかとし、それらの結果を応用することで、再ミエリン化や神経再生過程の分子基盤の解明へと発展させていく予定である。当初予定していたmRNAアレイ解析の外注費用を最低限に抑えられたこと、また共培養に用いる動物経費も最小匹数に抑えて実験を進めたこと、さらに人件費も極力抑えたことで、次年度使用額が生じた。マイクロアレイ解析によって同定されたシグナル分子を標的とする遺伝子改変マウス作製費用や、実験に使用するマウスの数などを最小限に抑えたため、それらの維持にかかる費用を削減することができた。また、人件費に関しては、研究補助員が年度途中で退職したため、その費用が削減された。
後期プラトン哲学における分割法の研究

本年度では、『ポリティコス』末尾の徳論を、対話篇半ば(283b-284e)における客人が超過と不足を扱う測定術の二分割を行う議論をもとに解釈した。ポリス市民の徳に関するプラトンの分析は、政治的対立や派閥争いの起源を明らかにするという限定的な枠組みの内にありながらも、彼らの徳と行為が「時宜」という、技術の場合と同様の基準に依拠することを明らかにする。しかし、彼らは自らもつ傾向性に由来する嗜好により、価値について虚偽の判断を下し、時宜から逸脱する。「ポリスに関する時宜」について彼らが虚偽の判断を下す場合、ポリスには深刻な不利益や派閥争いがもたらされる。この時宜を正しく認識し得るのは真の政治家のみであり、彼は自らが認識した時宜通りにポリスを動かすため、「織り合わせ」を行い、ポリスの統一性を保つ。『ポリティコス』末尾の徳論は「時宜」という後期プラトンの価値論の主題のあり方を、ポリスという政治的文脈において具体的に明らかにしている。本年度では、この「時宜」にプラトンが個別の行為の基準となりその善し悪しを分ける役割を与えたのみならず、ポリス共同体の存亡にも関わるという奥行きを持たせたことを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、プラトン『ポリティコス』および『ピレボス』の文献研究を通じて、後期プラトン哲学における存在論と方法論について以下の研究を行った。1、『ポリティコス』における、中期イデアを読み込むか否かで論争を引き起こすテクストを扱い、新たな解釈を提示した。本論文では、問題のテクストで言及されている「最高度の価値を有するものども」に、中期イデアをそのまま「トップダウンに」当てはめるのではなく、『ポリティコス』の文脈をたどりながら、中期のイデアを「ボトムアップに」読み取る解釈を提起した。2、プラトン後期の方法論である分割法の対象について、『ポリティコス』の「二分割法」および『ピレボス』の「プロメテウスの方法」を取り上げ、それぞれの方法の対象の有する「無限定」という特徴に着目し、『ピレボス』と『ポリティコス』の方法はその点おいて相違はないということを示した。3、『ポリティコス』における超過と不足を扱う測定術を二分割するテクストに着目し、二つの測定術と後期プラトンの哲学的問答法の関係を論じた。二つの測定のうち、「絶対的測定」の記述において繰り返し強調される「行為」と「生成」に着目し、絶対的測定は個別の状況に対応する知識・技術にのみ属し、普遍的な認識を目的とするディアレクティケーとは無関係であるという解釈を提起した。また、二つの測定のうち、もう片方の「相対的測定」の記述を分析し、相対的測定は事物における比率を発見する役割を担うことを示し、哲学的問答法はむしろ相対的測定を含んでいる、という従来の見解とは一線を画す解釈を提示した。後期プラトンの方法論について、当初目的としていたその対象の存在論的側面および測定との関係について、独特の着眼点による新解釈を提示した。『ポリティコス』の実際の議論内容に着目し、方法がどう活かされているのかを見る。具体的に、冒頭部の分割と神話(ミュートス)、および後半の政治知と法律の対比、市民の持つべき徳の議論を扱う。
市町村提携のためのパートナー探索手法の開発

本年は、市町村提携に関するヒアリング調査を東海地区の市や関連するNPO等に行うと共に、そこで得た知見を基に学会発表や論文投稿を行った。具体的には、下記の学会での国際発表1件と高専への紀要への投稿2件を行った。論文1)西口美津子:市町村の災害時連携の現状と課題ー静岡県東部を事例にー,沼津工業高等専門学校研究報告,第53号,2019年1月...南海トラフ巨大地震が危惧される中で、災害時相互支援協定を結ぶことで災害時に備える市町村について、静岡県を事例に検討を行った。その結果、提携先に優先度をつけること、共同防災訓練や個人の備蓄の必要性が指摘された。論文2)湯川崇・西口美津子:市町村提携のためのパートナー探索アプリケーションの開発,福島工業高等専門学校研究紀要,第59号,2019年1月...欠点を補い優位を得るような市町村間の提携に影響する要素を市町村データを用いて分析すると共に、提携パートナー探索アプリをFlaskを利用して開発を行った。完成したアプリはインターネットに接続された端末から実行可能にするため、クラウド・アプリケーション・プラットフォームHerokuにデプロイして運用している。前回の科研費研究の最終発表(海外2件)が、本研究の初年度に重なったこと、また、研究代表者の勤務地が福島県から静岡県に代わったことから若干遅れ気味であるものの、ほぼ順調に進呈していると考える。今後は、人的支援の要請を含めて、考察を深め、年度内での発表を目指したい。本研究は、市町村が提携を行うことで互いの欠点を補い長所を生かせるような相手を見つけるためのマッチングの手法を開発するものである。阪神淡路大震災や東日本大震災等、自然災害の多い日本では、被災時に生産が継続できるような事業継続計画(BCP)が活発化すると共に、姉妹都市のような海外の地域と文化や行政の交流を目指した提携も国内外で行われている。これらの提携について、具体的マッチングのフレームワークを開発し、マッチングを支援するサーバ・システムを構築するのが、本研究の目的である。具体的な都市間の提携のマッチングについて、分析を行う125か所の港湾都市や、「みなし過疎」や「一部過疎」を含む181の地域等)については、文献収集を行うと共に基本データは収集したところであるが、マッチングに関わる付加的な選定項目については、地方でのヒアリングの調査が十分でないために、フレームワークの開発までに至らず、これからの課題となっている。一方、地域間連携の中でも、海外との姉妹都市の成功事例として、福島県いわき市とオーストラリア・タウンズビル市のキーパースン(共に女性)から提携の経緯等、ヒアリングを実施することができた。その結果については、平成30年度に開催される異文化コミュニケーション学会の世界大会(平成30年8月8日11日、中央大学)で、発表を希望したところ承諾された。現在、研究発表は8月10日に、"Women's Roles in Sister-City Affliation: A Case of Iwakiand Townsville, Australia"と題して、英語で行う予定である。研究代表者(西口)が、平成26年28年度に修了する予定であった科研費研究(被災地における中高年への起業支援手法の開発」を1年延長して海外での学会発表を行ったこと、また、福島県いわき市からの委託により平成29年度限りのプロジェクト(インバウンド観光のニーズ調査)等の業務に取り組むことになったため、当初予定していた地方都市へのヒアリングやアンケート調査が翌年度に繰越す結果となった。一方で、それ以外のデータ収集や地元(福島県いわき市)での地域間連携についてのヒアリングについては、順調に進めることができた。地域の連携に関するヒアリング調査を市町村提携に関連する団体(例:自治体国際化協会)や地方自治体等、最低5件の都市で実施し、自治体間のマッチングを行うのに必要なフレームワークを開発する。そのフレームワークを基に、自治体へのアンケートを行い、文献等から収集済みのデータと合わせて、新たなデータベースを作成する。本年度は、このデータベースの作成と、マッチングのプロトタイプのソフトの開発を行う予定である。

平成29年度に地方へのヒアリング調査やアンケート等が実施できなかったために、平成30年度に実施する予定である。本年度のSociety of Intercultural Communication and Research(異文化コミュニケーション学会)の国際大会が日本で開催されたこと、また、福島高専での打ち合わせの予定が、東京でできたこと等、旅費を節約できたこと、また、研究の進度が若干遅れ気味であることから、アンケート調査の分析等の謝金に関わることが次年度になったことが挙げられる。
パラフィン切片in situ DNA定量法の確立と良性悪性診断への応用

細胞核DNAの含量を蛍光測光法で測定することによって、正常ないし非癌細胞と、癌細胞を区別して認識できることは広く認められるようになってきた。良性腫瘍は、非腫瘍性の良性病変と同じく、胃粘膜や大腸粘膜ではディプロイドの枠を逸脱することはない。したがって組織学的アナプラジ-が明瞭でない初期の癌やdysplasiaとして分類される病変の本体について論じるためにはDNA含量が指標となるであろうと考えられた。しかし、病理学者が日常用いるパラフィン切片を用いてin situで定量しようとすると、核の重なり等のために多くの場合は測定不能であった。本研究では、レ-ザ-スキャン蛍光測光法によって、パラフィン切片にマイクロトモグラフィを行い、対象とする核を光学的に切って行き、その蛍光測光のデ-タの各ピクセルの光量を加算して三次元的にin situのDNA定量を行う方法の確充をめざし、同時にその応用の可能性をさぐった。本年度は、前年度に引きつづき、胃粘膜と胃癌細胞を対象にパラフィン切片中の測光を行い、重った核も、ある精度の範囲内で測定可能であることを明らかにすることができた。そして、この方法を応用することにより、蛍光測光法と相補的な使用をすれば、癌の初期進展時に、ディプロイドを主体とする癌細胞集団の中に、異倍体のサブクロ-ンが出現し、それが悪性度の増大に寄与することがわかった。人癌はこのようなメカニズムで、初期の“良性"な段階から、末期の悪性な段階へ突入して行く経過が明らかにされてきた。これは病理学的に大きい成果であったといえる。本研究によって、共焦点レ-ザスキャン蛍光顕微鏡の応用の基礎は固まったと考えられるが、レ-ザの波長の問題、スキャン速度の問題、蛍光色素の改良の問題が今後の問題的として指摘された。最近の顕微蛍光測光法の応用が広く行われるよすになった結果, DNAの定量が腫瘍の良性悪性の鑑別,予後の診断に有力な手がかりを与えるというデータが集積されてきた.しかし,これを人体病理学へ手軽に用いることには障碍があった.その理由は, DNAの顕微蛍光測光を行うためには,材料ガスメアの形でなければならず,病理診断に一般的に用いられるパラフィン切片がそのまま使用できないという制限があったからである.本研究では,共焦点レーザ螢光顕微鏡の使用により,切片のままで螢光染色し,トモグラフィをとり,核が重なったままでも測光できる可能性を追求し,パラフィン切片のまま,病理組織像の読みと重ねて,その中の核のDNAをひとつひとつ精密に測定する方法を確立することを目的として今年度の研究を行った.まず,本研究の初めに,レーザ螢光顕微鏡を用し,共焦点系にセットすると焦点深度が極めて浅くなり,重なりあった双翅類唾腺巨大染色体が見事に光学的にスライスされ,マイクロトモグラフィーの成功することがわかったこのような研究において非常に重要なのは光学的スライシングの結果,焦点面におかれたピンホールを通過してくる光量が著しく減小することであり,これを画像処理によって補い,定量性のあるきれいなイメージを得ることである.本年度の研究に画像処理専用のヒューレットパッカードHP9000,32ビットコンピュータ825SRXを導入することができたので,迷光によりノイズをソフトウェアを開発して除去し,重なった胃粘膜内細胞核に借用して,実際にマイクロトモグラフをとりながら,三次元的にデータを集める技術を開発することができた.この目的のために,オリンパス光学の開発チーム(代表者竹田一郎本部長)と大阪大学工部応用物理学教室の南教授のグループの協力が大きな力となった.

今後,トモグラフィーがどのていどの精密な定量性を与えうるか検討を進めて行く予定である.細胞核DNAの含量を蛍光測光法で正確に測定することによって、正常ないし非癌細胞と癌細胞を区別して認識できることは広く認められるに至った。良性細胞は、たとえそれが非腫瘍性であれ腫瘍性であれ、胃粘膜や大腸粘膜ではディプロイドの枠を逸脱することはない。したがって組織学的アナプラジーの未だ明瞭でない超初期の癌や、ディスプラジアとして分類される病変の本体について、DNA定量が客観的指標となるのであろうと考えられる。しかしパラフィン切片をそのままIin situで測光しようとすれば核の重なりのために多くの場合測定は不可能であった。本研究ではレーザスキャン蛍光測光法によって、パラフィン切片にマイクロトモグラフィーを行い、その蛍光測光のデータを加算して3次元の核DNA定量を行うことを試みた。まず、重なり合う核のトモグラフィーをとり、そのプロフィルを再構成して、表面から見て重っていても三次元的には分離して蛍光を測定することが可能であることを明かにすることができた。ついで、スミア標本のDNA定量を焦点を変えながら行い、蛍光核が焦点面にある場合、それより手前にある場合、向う側にある場合を測定し、焦点面から23ミクロン離れた蛍光物質は共焦点測光計に殆んど影響を与えないこと、正確な蛍光量測定は焦点面でのみ行えることを明らかにした。次いで、厚いDNA膜について焦点位置を様々な深さに変えながら測光を行い、手前に存在する蛍光物質や向う側に存在する蛍光物質によって吸収される光は結果に殆んど影響しないことを明らかにできた。本年度は新しい光学系のツァイスアキシオバートを顕微鏡台に導入し、マイクロトモグラフィーの輝度と解像力に大幅な改善を行うことができた。来年度はこのシステムによりデータを集積したいと考える。細胞核DNAの含量を蛍光測光法で測定することによって、正常ないし非癌細胞と、癌細胞を区別して認識できることは広く認められるようになったきた。良性腫瘍は、非腫瘍性の良性病変と同じく、胃粘膜や大腸粘膜ではディプロイドの枠を逸脱することはない。したがって組織学的アナプラジ-が明瞭でない初期の癌やdysplasiaとして分類される病変の本体について論じるためにはDNA含量が指標となるであろうと考えられた。しかし、病理学者が日常用いるパラフィン切片を用いてin situで定量しようとすると、核の重なり等のために多くの場合は測定不能であった。本研究では、レ-ザスキャン蛍光測光法によって、パラフィン切片にマイクロトモグラフィを行い、対象とする核を光学的に切って行き、その蛍光測光のデ-タの各ピクセルへ光量を加算して三次元的にin situのDNA定量を行う方法の確立をめざし、同時にその応用の可能性をさぐった。本年度は、前年度に引きつづき、胃粘膜と胃癌細胞を対象にパラフィン切片中の測光を行い、重った核も、ある精度の範囲内で測定可能であることを明らかにすることができた。そして、この方法を応用することにより、蛍光測光法と相補的な使用をすれば、癌の初期進展時に、ディプロイドを主体とする癌細胞集団の中に、異倍体のサブクロ-ンが出現し、それが悪性度の増大に寄与することがわかった。人癌はこのようなメカニズムで、初期の“良性"な段階から、末期の悪性な段階へ突入して行く経過が明らかにされてきた。これは病理学的に大きい成果であったといえる。