hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑膿菌エコーシステムにおけるバイオフィルムの酵素・遺伝学的特性解析とその応用

バイオフィルム(BF)は、微生物の重要な生存様式(エコーシステム)であるが、その系の複雑さのために充分な解析が進んでいない。運動性を有する緑膿菌は、菌体外に多糖アルギン酸を分泌し、これをBFとして周囲から隔離された生存様式を示し、時には重篤な呼吸器疾患を発症する。さらに、BFを分解し遊離することにより、新たな部位へ移動する。BF形成に関わる緑膿菌の運動性には、ポリリン酸キナーゼ(PPK)により合成されるポリリン酸の関与が指摘されている。緑膿菌はペリプラズムにアルギン酸分解酵素(AlgL)を有するが、その遺伝子はアルギン酸合成遺伝子群と同一オペロンに存在している。AlgLの遺伝子と活性発現との相関が不明なため、AlgLの生理的意義とBF分解制御は殆ど未知である。そこで本研究では、緑膿菌BFに焦点を当て、特にPPKとAlgLが各々関わるBF形成及び分解制御機構を明らかにすることを目的とする。AlgL大量発現大腸菌(全タンパク質の約30%)を育種し、精製系を確立した。AlgLは、これまでに当研究室で構造機能相関を明らかにしているSphingomonas属細菌由来の酵素A1-IIIと有意な相同性(30%)を示した。A1-IIIの触媒残基に相当するAlgLのHis202及びTyr256を各々Ala及びPheに置換した変異体は、酵素活性を示さなかった。従って、His202及びTyr256は、AlgLの活性発現に必須であることが明らかになった。今回、同定した触媒残基の知見に基づいて、緑膿菌ゲノム上のAlgL遺伝子に変異を導入することにより、アルギン酸合成系を修飾することなく、AlgLの機能のみを欠失させた変異株の作製が可能となる。今後、本変異株を用いて、BF分解制御機構を解析する。また、運動性を制御するPPKの構造機能相関を明らかにするため、蒸気拡散法を用いたPPKの結晶化を行っている。鞭・線毛を持ち活発な運動性の緑膿菌は、環境条件に応じて菌体外に多糖アルギン酸を分泌し、これをBFとして周囲から隔離された生存様式を示し、時には重篤な呼吸器疾患を発症する。緑膿菌の運動性には、ポリリン酸キナーゼ(PPK)により合成されるポリリン酸の関与が指摘されている。本研究では、米国イリノイ医科大学Chakrabarty教授より分与された2種類の緑膿菌(PAO1,8830)の生存様式に関する微生物学的特性を解析した。PAO1はアルギン酸非生産株として知られているが、固体培地において8830(生産株)と同等のムコイド性を示した。一方、液体培地においては8830のみがアルギン酸を生産した。従って、PA01での酸素によるアルギン酸合成抑制システムの存在が示唆された。本研究室で分離されたSphingomonas属細菌由来のアルギン酸リアーゼ(A1-III)は、緑膿菌アルギン酸分解酵素(AlgL)と有意な相同性を示した。そこで、緑膿菌のBF分解機構を解析する目的で、A1-IIIの部位特異的変異とX線結晶構造解析による構造機能相関を明らかにした結果、Tyr246が触媒反応に必須であることが判った。Tyr246はAlgLにも保存されているため、AlgL変異株(Tyr→Phe)を用いたBF分解・遊離機構の解析が可能となった。また、運動性に関わるPPK遺伝子をPA01よりクローニングした。PPKは膜タンパク質であることが報告されているが、遺伝子工学的改変により、大腸菌におけるPPKの可溶性大量発現及び精製系を確立した。今後、PPKのX線結晶構造解析と運動性を制御するためのPPK阻害剤の解析を行う予定である。

従って、His202及びTyr256は、AlgLの活性発現に必須であることが明らかになった。今回、同定した触媒残基の知見に基づいて、緑膿菌ゲノム上のAlgL遺伝子に変異を導入することにより、アルギン酸合成系を修飾することなく、AlgLの機能のみを欠失させた変異株の作製が可能となる。今後、本変異株を用いて、BF分解制御機構を解析する。また、運動性を制御するPPKの構造機能相関を明らかにするため、蒸気拡散法を用いたPPKの結晶化を行っている。
三次元視覚情報処理の神経メカニズムの解明 -単一ニューロン活動の記録と機能的MRIによる解明-

本年度の研究では,昨年度の研究に引き続くサルの単一ニューロン活動の記録実験と日本大学の研究専用装置でのfMRI実験の結果を比較検討して頭頂連合野の三次元視覚情報処理機能のうち,基本的な三次元形態と奥行き知覚の機能局在とその脳内ネットワークについての解析を行った.また,新たにヒトでの認知心理学実験を行い,行動学的な側面から種々の手がかり統合による奥行き知覚に関して検討を加えた.サルでの単一ニューロン活動の実験では,頭頂連合野のCIP領域の面方位選択性細胞について詳しく調べた.その結果,これらの細胞が両眼視差と単眼性の手がかりであるテクスチャーの勾配の情報を統合して面方位を識別していることがわかった.さらに,両者を比べると両眼視差手がかりが優位であることもわかった.この結果を基に,ヒトでの認知心理学実験を行ったところ,ヒトでの面方位の識別においても両眼視差,テクスチャーの勾配が統合されたときにもっとも正確であること,両眼視差手がかりが優位な手がかりであることがわかった.fMRIによるヒトでの実験では,これまでに陰影による奥行きの知覚に右側の頭頂後頭領域が働くことを明らかにしたが,この領域が絵画的な手がかりを含まない視差手がかりによる面の傾きの識別でも機能していることが明らかになり,ヒトでの立体視の中枢である可能性が示唆される結果を得た.本年度の研究では,昨年度の研究に引き続くサルの単一ニューロン活動の記録実験と日本大学の研究専用装置でのfMRI実験の結果を比較検討して頭頂連合野の三次元視覚情報処理機能のうち,基本的な三次元形態と奥行き知覚の機能局在とその脳内ネットワークについての解析を行った.また,新たにヒトでの認知心理学実験を行い,行動学的な側面から種々の手がかり統合による奥行き知覚に関して検討を加えた.サルでの単一ニューロン活動の実験では,頭頂連合野のCIP領域の面方位選択性細胞について詳しく調べた.その結果,これらの細胞が両眼視差と単眼性の手がかりであるテクスチャーの勾配の情報を統合して面方位を識別していることがわかった.さらに,両者を比べると両眼視差手がかりが優位であることもわかった.この結果を基に,ヒトでの認知心理学実験を行ったところ,ヒトでの面方位の識別においても両眼視差,テクスチャーの勾配が統合されたときにもっとも正確であること,両眼視差手がかりが優位な手がかりであることがわかった.fMRIによるヒトでの実験では,これまでに陰影による奥行きの知覚に右側の頭頂後頭領域が働くことを明らかにしたが,この領域が絵画的な手がかりを含まない視差手がかりによる面の傾きの識別でも機能していることが明らかになり,ヒトでの立体視の中枢である可能性が示唆される結果を得た.
DNA複製と損傷をモニターする細胞周期制御機構

申請者は最近、スピンドルチェックポイントにおいて中心的な役割を果たしている分裂酵母のMad2がDNA複製チェックポイントに関与していることを見つけた。Chk1のリン酸化を指標にするとMad2はChk1の下流もしくは、独立にCdc2の制御をしている可能性が見いだされた.現在、さらにMad2の制御機構について解析中である.また、RNAスプライシング変異による細胞周期停止に必須な因子として単離したカゼインキナーゼ2(CK2)の変異株は、微小管変異によるmetaphaseからanaphaseへの遅延があまりみられないというスピンドルチェックポイント異常を示した。また、CK2のサブユニットをコードする遺伝子の変異株はスピンドルの形成を阻害する薬剤に対して感受性を示した.このことより、CK2はスピンドルチェックポイントに関与している可能性があるので、その制御機構について現在、さらに解析中である.フォークヘッド型転写因子は高等動物ではすでに50以上存在することが知られ、発生、分化や癌化などに関与しているといわれている.分裂酵母には4つフォークヘッド型転写因子が存在し、その中のFkh2とfhl1が接合に関与していることを見いだした.fhk2破壊株やfkh2 fhl1破壊株では接合に必須の転写因子ste11の発現が低下していた。fkh2破壊株やfkh2 fhl1破壊株でste11を過剰発現すると接合が回復したので、これらの変異株での接合率低下はste11の発現低下によると考えられる.現在、fkh2やfhl1の作用機構を解析中である。
視線が一致するTV会議システムを利用した3地点間による遠隔教育の教授方略研究

現行のTV会議システムはカメラとモニターが離れており、通信者同士の視線が合わず不自然な環境である。筆者らはこれまでの研究で、この不自然さを解決した視線一致型TV会議システムを開発し、教育への応用を探ってきた。本研究では、これまでの2地点間の研究成果を受け、新たに3地点間(多地点間)へ学習環境を拡張した。多地点間では各地点の相対位置関係など、より相手の認識が重要であり、視線が一致することは学習効果を向上させる大きな要因であることが分かった。本研究計画は、下記の4つの研究からなる。研究I「視線一致型および従来型を介した2地点間と3地点間による遠隔教育の最適学習環境の検討」(H22年度)研究II「2地点間および3地点間による遠隔教育における視線一致型と従来型の画像投影サイズ限界の検討」(H23年度)研究III「2地点間と3地点間による対面教育および視線一致型と従来型を利用した遠隔教育の教育効果測定」(H23年度)研究IV「3地点間による遠隔教育の教授方略研究」(H24年度)下記「11.研究発表」の項に記した、研究Iに関連する3地点間と比較可能な2地点間の遠隔教育における基礎研究成果をまとめ発表した。本成果により、大学生間による遠隔交流学習では、視線が合わない従来型のTV会議システムは、多様な学習方法において共通して飽きや疲労に関する学習負荷や学習環境格差が認められた。これらを是正するために、従来型では新たな教授方術や学習環境整備が必要であることがわかった。一方、視線一致型のTV会議システムは、一斉学習においては、対面学習環境に近い環境であり、協調学習では、対面学習環境以上に「弛緩・飽き」がおこりにくく「バーバルコミュニケーション」が円滑に行えることがわかった。よって視線一致型は、対面学習環境における教授方術をそのまま適応できることがわかった。また、研究IIの実施に向け当初の設計方針よりも効果的な仕組みを、新たに設計中である。他方、研究IVで教授方略として統括することを念頭に、研究Iの成果をふまえ、研究協力者と共に研究IIIの個別教授法術の検討・準備を進めている。半世紀前に描かれた多くのSF作品に、未来の通信としてTV会議(電話)システムが登場した。21世紀となった今日では、TV会議システムは国際活動、企業、医療、教育など様々な社会で活用されている。しかし、現行のTV会議システムは、かつてSFで登場したシステムとは大きく異なり、通信者双方の視線が一致しない。今やハイビジョンで通信できるほど通信速度や画像音声は目覚ましい進化を遂げたが、ヒューマンインターフェースの観点は立ち遅れているのが同システムの現状である。そこで本研究では、視線が一致するTV会議システムの試作機により、自然なコミュニケーションの有効性を、教育活動とその評価により明らかにすることを目的とした。本研究は、下記の4つの研究計画からなる。研究I:視線一致型および従来型を介した2地点間と3地点間による遠隔教育の最適学習環境の検討研究II:2地点間および3地点間による遠隔教育における視線一致型と従来型の画像投影サイズ限界の検討研究III:2地点間と3地点間による対面教育および視線一致型と従来型を利用した遠隔教育の教育効果測定研究IV:3地点間による遠隔教育の教授方略研究本研究の特色は、教育活動に焦点をあて、これまでの2点間による通信を3地点間に拡張し、3要因(遠隔視線不一致、遠隔視線一致、対面)の学習環境における、教育・学習効果の比較評価を行ったことである。本研究において、現在まで得られた成果の一部を下記に示す。・視線が合わないTV会議システムは、多様な学習方法において共通して飽きや疲労に関する学習負荷や学習環境格差が認められ、これを補う新たな教授方術や学習環境整備が必要である。・視線一致型のTV会議システムは、対面学習環境に近い環境であり、特に協調学習では、対面学習環境以上に「弛緩・飽き」がおこりにくく「バーバルコミュニケーション」が円滑に行えることがわかった。・3地点間における各地点2台の視線一致型TV会議システムの最適画面配向は150。である。・3地点間におけるコミュニケーションは、3者間のゲイズアウエアネスの成立環境が重要である。本研究の特色は、教育活動に焦点をあて、これまでの2点間による通信を3地点間に拡張し、3要因(遠隔視線不一致、遠隔視線一致、対面)の学習環境における、教育・学習効果の比較評価を行ったことである。なお、本研究は、次の4つの研究計画からなる。1視線一致型および従来型を介した2地点間と3地点間による遠隔教育の最適学習環境の検討。22地点間および3地点間による遠隔教育における視線一致型と従来型の画像投影サイズ限界の検討。32地点間と3地点間による対面教育および視線一致型と従来型を利用した遠隔教育の教育効果測定。43地点間による遠隔教育の教授方略研究。

今年度に得られた成果の一部を下記に記す。・視線が合わないTV会議システムは、多様な学習方法において共通して飽きや疲労に関する学習負荷や学習環境格差が認められ、これを補う新たな教授方術や学習環境整備が必要である。・視線一致型のTV会議システムは、対面学習環境に近い環境であり、特に協調学習では、対面学習環境以上に「弛緩・飽き」がおこりにくく「バーバルコミュニケーション」が円滑に行えることがわかった。・3地点間におけるコミュニケーションは、3者間のゲイズアウエアネスの成立環境が重要である。・異分野の学生間における協調学習は双方の学びを広げ、教育効果が向上する。2地点よりも3地点の交流学習ほうが高い教育効果を得る。・視線一致型を用いた多地点における遠隔交流学習は、国際間の交流学習を実施するに当たり、単に時空を縮めコスト削減を可能にするだけではなく、学習効果の面からも適切な学習環境であることが期待できる。各研究とその成果は、計画に従い進行している。また、現在までの研究成果から新たなテーマも見いだされた。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に従い、遂行する。また、これまでの研究成果より、視線一致型TV会議システムによる協調学習の有効性が確認されため、実践研究として、下記研究Vを新たに追加実施する計画である。研究V「視線一致型TV会議システムを利用した多地点間による疑似双方向遠隔留学環境の構築と評価」(現在、海外の大学との連携を協議検討中である)24年度が最終年度であるため、記入しない。
ユーザによる触覚コンテンツの制作・配信・共有・鑑賞を支援するシステムの構築

触覚的表現を誰もが簡単に制作し配信・共有・鑑賞が可能となるシステムを目指し、手掌部上のなぞり動作(運筆動作)を触覚コンテンツとし、これをスマートフォンをはじめとするポインティング入力機能を持つデバイスにより制作するウェブアプリケーションを実現した。また、これを画像フォーマットに記録する触覚情報符号化し、画像としてTwitterを利用して配信・共有・拡散することを可能とした。さらにこのコンテンツを鑑賞する触覚ディスプレイも実装した。応用としてテキストメッセージ中に制作した触覚コンテンツを挿入し感情表現を強化する「触覚絵文字」システムを提案した。申請者は触覚技術がより多くのユーザからアクセス可能となることを目指し、触覚的表現を簡単に作成・共有する仕組みを提案している。その中で、本研究では運筆動作にに注目し手掌部上を指先でなぞる軌跡を採用した触覚コンテンツの生成手法とその共有のための枠組みを提案した。研究の第一年度ではタッチスクリーンデバイスにより運筆動作を記録し、その軌跡(位置・時間)情報を画像フォーマットに保存することでTwitterをはじめとする既存のソーシャルメディアを介して拡散・共有する仕組みを考案・実装した。特殊な装置を必要とせず、スマートフォン等のすでに多くの人が利用するデバイスのみで、手のひらを指先でなぞるという触覚情報の記録と伝送を実現した。作成したシステムはウェブアプリケーションとして実装、公開した。ユーザはPC、スマートフォン、タブレット端末等、ポインティング入力機能を持つデバイスにより自由に触覚コンテンツを作成し公開することができる。一方、作成した触覚コンテンツの提示装置としては振動子を2次元的に配置した簡易な触覚ディスプレイを製作した。コンテンツ生成・共有と同様に既存のデバイスのバイブレータ等を利用することを考えたが、ユーザが触覚コンテンツを鑑賞することを楽しむにはある程度の再現性が必要と考えたためである。このディスプレイにより、簡単な軌跡の触覚のみによる認識が可能であり、複雑な図形やパターンについても視覚情報を合わせて十分に鑑賞が可能であることを確認した。その中で、本研究では運筆動作に注目し手掌部上を指先でなぞる軌跡を採用した触覚コンテンツの生成手法とその共有のための枠組みを提案した。25年度は24年度までに作成したタッチスクリーンデバイスにより運筆動作を記録し、その軌跡(位置・時間)情報を画像フォーマットに保存することでTwitterをはじめとする既存のソーシャルメディアを介して拡散・共有するシステムをもとに、新たな着想である「触覚絵文字システム」の実証システム作成と評価に取り組んだ。触覚情報は握手やハグで親密さを表現するといったことには向くが言語のように意味の伝達には不向きでありコンテキス依存のコミュニケーション手段である。話者の表情も同じような性質を持っており、これはテキスト中に挿入することで書き手の感情を端的に表現する絵文字・顔文字として盛んに用いられている。申請者は触覚情報により絵文字と同等あるいはそれ以上の効果を持つ感情表現の可能性を考え、第一年度で作成した触覚コンテンツ生成・共有システムを用いてテキスト情報中に自作の触覚コンテンツを絵文字として挿入する機能を実装した。提案する触覚絵文字の効果についての厳密な評価は今後の課題として残されている。当初期待していた触覚コンテンツ生成・鑑賞・共有システムの実現から触覚絵文字という応用を着想し、その実装まで研究を発展させることができた。研究第一年度で目標としていた触覚コンテンツの生成・共有システムを完成させた。また、振動子を複数並べた簡易な触覚ディスプレイによりユーザが作成したコンテンツを提示するシステムも作成した。25年度が最終年度であるため、記入しない。作成した触覚コンテンツ生成・共有・鑑賞システムの評価実験を実施する。また、新たに提案する運筆動作をもとにした触覚コンテンツをテキストと組み合わせ触覚絵文字として利用することを着想したため、このためのシステム実装と評価も行っていく予定である。
ポリオウイルスレセプターを標的とした非小細胞肺癌に対する新規複合免疫療法の開発

1非小細胞肺癌切除検体におけるCD155発現を解析し、臨床病理学的因子、PD-L1発現、腫瘍浸潤リンパ球、遺伝子解析結果(EGFR、ALK)、予後との関係を明らかにする。2EGFRやALKの遺伝子変異を有する肺癌細胞株を用いて、CD155発現誘導機序においてdriver oncogeneが関与しているかを検討する。3ルイス肺癌マウスモデルを用いて、CD155およびPD-L1の両者を標的とした新規複合免疫療法の抗腫瘍効果を検証し、治療モデルを確立する。
磁性ナノテクノロジーによるガン治療法Heat Immunotherapyの創出

ガン治療において免疫チェックポイント阻害薬と総称される新薬が登場して注目されている。京都大学の本庶教授らは、T細胞のPD-1がガン細胞のPD-L1と結合することでT細胞の細胞障害性を阻害することを見いだした。この免疫チェックポイントを阻害する薬により、T細胞はガン細胞を攻撃することができる。一方、我々は磁性ナノ粒子を交番磁場で発熱させることでガンを加温する温熱療法の開発を行ってきた。磁性ナノ粒子を用いて温熱療法を施すと、抗腫瘍免疫が誘導されることを見いだした。本研究では、磁性ナノテクノロジーで免疫チェックポイント阻害薬の効果を強力に増幅する新規Heat Immunotherapyを創出する。
ITAM保有受容体のNF-κB活性化シグナル伝達機構と生理的役割の解明

今回の補助金を得て,リンパ球系細胞では, PKC活性化に依存したCARMA1-BCL10複合体が,マクロファージや樹状細胞などの骨髄系細胞では, PKCに依存しないCARD9-BCL10複合体が, ITAM受容体を介したNF-κB活性化とサイトカイン遺伝子の発現等の免疫反応に必須であることが明らかとなった。ITAM受容体である、活性化型NK受容体を介したNK細胞の活性化におけるCARD9、CARMA1、Bcl10の役割を、それぞれの遺伝子欠損マウスから単離したNK細胞を解析することにより検討した。その結果、活性化型NK受容体を介した細胞傷害活性には何れの分子も必要ないことが判ったが、サイトカインやケモカインの誘導産生にはCARMA1とBcl10が必須であることが明らかとなった。一方で、CARD9は骨髄系細胞のITAM受容体を介したサイトカイン産生には必須であったにも関わらず、NK受容体を介したサイトカイン/ケモカイン産生には必要でないことが明らかとなった。細胞内シグナリングを調べると、CARMA1欠損NK細胞はITAMを介したNF-kBの活性化が選択的に不全となっていた。また、CARMA1-Bcl10複合体は、T/Bリンパ球と同様に、NK細胞におけるPKCを介したNF-kBの活性化に必須であったが、樹状細胞のITAM受容体の下流で働くCARD9-Bckl10複合体は、PKC非依存的にシブグナルを伝えることを見いだした。従って、リンパ系細胞、骨髄系細胞では、それぞれCARMA1-Bcl10、CARD9-Bcl10がITAM受容体を介したNF-kB活性化を制御し、この違いが、細胞種間におけるPKCに対するシグナリングの依存性の違いを生んでいるという結論に至った。活性化型NK細胞受容体を介したNK細胞の機能におけるCARD9とCARMA1の役割について検討した結果,活性化型NK細胞受容体を介したNF-κB活性化にCARD9は関与せず,抗原受容体と同じくPKC→CARMA1-Bcl10システムが関与することが明らとなった。このCARMA1-Bcl10シグナリングは,活性化型NK細胞受容体を介したサイトカイン/ケモカイン産生に必須であったが細胞傷害活性には関わらないことも判り,NK細胞の機能発現に必要なシグナルの二分性が明らかとなった。さらに,NK細胞と樹状細胞とでITAM受容体シグナルの性質を比較解析することにより,両細胞ともPKCを介するNF-κB活性化はCARMAIに依存するが,樹状細胞のITAM受容体はCARMAIを利用せず,PKCには依存しないCARD9依存性経路によってNF-κBを活性化すること,さらに,これら2つの経路に互換性はなく,各々が本来働くべき細胞系統以外ではITAMシグナルを伝達出来ないことが判った。これらの研究により,Bcl10はどの細胞種においてもITAMを介するNF-κB活性化に必須であるが,NK細胞やT/B細胞などのリンパ系細胞ではPKC活性に依存したCARMA1-Bcl10複合体が,マクロファージや骨髄系細胞ではPKC活性に依存しないCARD9-Bcl10複合体が働くことを我々は解明した。また,試験管内でマクロファージをリーシュマニア原虫に感染させた際の炎症性サイトカインの産生がCARD9欠損マクロファージでは著しく低下することを見いだした。CARD9欠損マウスは、リーシュマニアの足蹄皮下感染実験において、感染初期の足蹄の腫脹が野生型マウスと比較して明らかに減少した。この結果は、CARD9を介する経路が原虫に対する自然免疫反応に関与することを示唆した初めての発見である。
共生細菌Wolbachiaによる宿主操作の分子メカニズムの解明

細胞内共生細菌ボルバキアと宿主の節足動物が分子レベルでどのようなやりとりをしているのか明らかにしようと試みた。特に、宿主の細胞機能を操作するボルバキア因子の同定を目指した。実験にはモデル生物であるキイロショウジョウバエとそれに感染するボルバキアを用いた。ボルバキアの持つ宿主細胞の機能操作因子は、過剰に存在すると宿主細胞に悪影響を与えると考え、以下の方法を用いて同定を目指した。まず、ショウジョウバエの培養細胞を使ったボルバキア遺伝子のスクリーニングを行った。培養細胞の成育を阻害するボルバキア遺伝子を同定した結果、10個のボルバキア遺伝子を同定した。これらのコードするタンパク質は、ボルバキア特異的なものが4つ、共生細菌ではない細菌の持つタンパク質に相同性の高いものが6つであった。ショウジョウバエ個体でも効果を示すか否かを観察するため、トランスジェニック系統を作製し、ボルバキアタンパク質を強制発現した。その結果、全身で強制発現すると致死となるボルバキアタンパク質を1つ同定した。ボルバキアが感染節足動物に対して引き起こす生殖操作の一つに細胞質不和合性がある。これは、感染雄と非感染雌が交尾した際、子が致死となる現象である。今回同定したボルバキアタンパク質の細胞質不和合性への関与を検討するため、全身発現により強い致死を引き起こしたボルバキアタンパク質を生殖細胞でのみ強制発現した。その結果、雄の妊性が大きく低下し、細胞質不和合性によく似た現象を引き起こした。現在、このボルバキアタンパク質による雄不妊を詳細に解析している。宿主ショウジョウバエの細胞分裂に影響を与えるボルバキア遺伝子を同定するため、培養細胞を使ったボルバキア遺伝子のスクリーニング法を開発した。この方法では、まずボルバキアのゲノムライブラリーをショウジョウバエ培養細胞で発現させる。数日後、その細胞からボルバキアゲノムライブラリーを回収する。このライブラリーを、培養細胞に導入する前のものと比較し、培養細胞内での発現前でのみ見られるクローンを同定する。これにより、培養細胞の成長を阻害するボルバキア遺伝子が単離出来る。これにはサブトラクション法を用いることにした。ただ、今回の実験は通常サブトラクション法が用いられる遺伝子発現プロフィールの比較などとは異なる点がある。つまり、ショウジョウバエ培養細胞で発現させるボルバキア遺伝子が全長でなく、機能を発揮するには不完全な断片としてゲノムライブラリーに含まれている可能性がある。その結果、この全長の遺伝子がもし細胞の成長を阻害したとしても、不完全な断片によりサブトラクションがうまくいかないと考えられる。そこで、全く新しいサブトラクション法を開発した。これは、まずポルバキアのゲノムライブラリー作製の際に、挿入配列の隣に制限酵素認識部位を入れておく。サブトラクション反応の際に、テスターDNAとドライバーDNAがアニーリングするが、もし、それらのDNAが完全に一致するならば、二本鎖の制限酵素認識部位が形成される。一方、それらDNAが一部でしかアニーリングしない場合は認識部位が形成されない。その結果、制限酵素処理により完全に一致する配列のみが切断される。これにより、例え上記のような全長の遺伝子と不完全な断片を区別することが可能となる。現在、この新しいサブトラクション法を用いて、ボルバキア遺伝子のスクリーニングを行っている。ただ、今回の実験は通常サプトラクション法が用いられる遺伝子発現プロフィールの比較などとは異なる点がある。これは、まずボルバキアのゲノムDNAライブラリー作製の際に、挿入配列の隣に制限酵素認識部位を入れておく。これにより、全長の遺伝子と不完全な断片を区別することが可能となる。以上の方法によりボルバキアゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行った。結果、ショウジョウバエS2細胞の成長を阻害するDNA断片を6つ同定した。現在それらの断片がコードする遺伝子を解析中である。

これらのコードするタンパク質は、ボルバキア特異的なものが4つ、共生細菌ではない細菌の持つタンパク質に相同性の高いものが6つであった。ショウジョウバエ個体でも効果を示すか否かを観察するため、トランスジェニック系統を作製し、ボルバキアタンパク質を強制発現した。その結果、全身で強制発現すると致死となるボルバキアタンパク質を1つ同定した。ボルバキアが感染節足動物に対して引き起こす生殖操作の一つに細胞質不和合性がある。これは、感染雄と非感染雌が交尾した際、子が致死となる現象である。今回同定したボルバキアタンパク質の細胞質不和合性への関与を検討するため、全身発現により強い致死を引き起こしたボルバキアタンパク質を生殖細胞でのみ強制発現した。その結果、雄の妊性が大きく低下し、細胞質不和合性によく似た現象を引き起こした。現在、このボルバキアタンパク質による雄不妊を詳細に解析している。
高感度の磁場角度分解比熱測定による擬一次元超伝導状態の解明

有機導体(TMTSF)_2Xは直交する3方向の電気伝導性が互いに異なる擬一次元的導電性を持つ超伝導体として30年以上研究されている。我々は(TMTSF)_2ClO_4の単結晶の熱容量を、磁場方向を高度に制御しながら測定し、その結果からこの物質の超伝導ギャップ構造と熱力学的超伝導相図を明らかにした。これらは超伝導を理解する上で基本的かつ重要な情報であるが、TMTSF系については実験的に明らかになったのは30年の歴史の中で初めてである。本研究課題では擬一次元超伝導体(TMTSF)_2ClO_4の磁場角度分解比熱測定を通じて、超伝導対称性やギャップ構造、および高磁場超伝導状態の正体を解明することを目指している。本年度は磁場方向を3次元的に精密制御しながら微小熱容量を測定する装置を完成させ、(TMTSF)_2ClO_4単結晶の熱容量の温度および磁場強度・方向依存性の測定を行った。その結果、以下の点が明らかになった。(1)比熱のゼロ磁場での温度依存性及び導電面に垂直な磁場中での磁場依存性から、(TMTSF)_2ClO_4の超伝導ギャップにはラインノードが存在する可能性が高いことを示した。(2)導電面に平行な磁場中での比熱の磁場依存性や上部臨界磁場の温度依存性から、(TMTSF)_2ClO_4がスピン1重項の超伝導体であることを示した。(3)これまでの電気抵抗による研究により2.5テスラ以上の磁場中でも超伝導の寄与が存在していることが明らかになっていたが、比熱ではこのような高磁場中では異常は見られなかった。従って、高磁場の超伝導は長距離秩序化していないこと明らかになった。この領域では低次元性に起因する超伝導揺らぎが支配的である可能性が考えられる。これらの成果はTMTSF系の超伝導の発見から30年間も未解決であった超伝導状態に関する基本情報をついに解明した重要なものであると考えている。さらに、現在継続して比熱の面内方向依存性を測定しており、ギャップ構造の詳細な特定を目指している。超伝導ギャップ構造は、超伝導発現機構を考える上で最も重要な情報の一つであり、またその超伝導体で起こる興味深い超伝導現象の理解の基礎ともなる情報である。我々は擬一次元かつ強相関の超伝導体として長く注目されてきた有機導電体TMTSF系の超伝導を研究してきたが、本年度は以下の原理によってこの系の超伝導ギャップ構造を特定するため、この物質の単結晶の比熱の磁場方向依存性を測定した:磁場中では電子のエネルギーに渦糸周りの超伝導電流によるエネルギーシフト(ドップラーシフト)が生じ、超伝導ギャップにゼロ点がある場合はゼロ点近傍で準粒子励起が生じる。この準粒子励起は比熱を若干増加させる。準粒子励起強度はギャップのゼロ点におけるフェルミ速度と磁場のなす角度に依存して変化するため、比熱の磁場方向依存性には振動が生じる。この振動を解析することで、超伝導のギャップ構造が明らかになる。しかし、擬一次元の超伝導体では、ドップラーシフト由来の比熱の振動が上部臨界磁場の異方性に起因する振動と合わさった形で観測されてしまうなどの実験的な困難があるため、これまで報告された例はなかった。われわれは、高感度の比熱測定により、(TMTSF)_2ClO_4の比熱の磁場方向依存性に僅かな変調が起こることを見出した。この変調と、バンド構造をあわせて解析することにより、この物質のギャップのゼロ点位置を特定することに成功した。これは、擬一次元の超伝導体でのドップラーシフトの原理による超伝導ギャップ構造の解明の初めての成功例である。この結果は現在Nature Physics誌に投稿済み・査読中である。また、この成果に関して、2011年度以降の国際会議への招待講演の依頼を2件頂いている。
エピジェネティック制御によって難治性がんの重粒子線感受性を増強させる

難治性腫瘍ではヒストン脱アセチル化酵素(HDAC:Histone Deacetylase)が高発現し、ヒストンは低アセチル化状態にある。HDAC阻害剤は、この低アセチル化状態を是正することにより抗腫瘍効果を示す。そこで本研究では、難治性がんに対するより効果的な治療法を開発するため、悪性黒色腫細胞を用いてHDAC阻害剤と重粒子線の併用効果を検討した。その結果、HDAC阻害剤は重粒子線照射による細胞致死効果を増強することを明らかにした。また、HDAC阻害剤による重粒子線増感のメカニズムは、DNA損傷応答以外の機序であることが示唆された。HDAC阻害剤は臨床応用可能な重粒子線増感剤として有望である。重粒子線は高LET(Linear Energy Transfer:線エネルギー付与)で生物学的効果比が大きく、細胞致死効果が高い。また、物理的にも線量集中性に優れていることから、がん組織だけをピンポイントで狙って死滅させることができる。これまでに研究代表者らは、難治性がんの培養細胞を用い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(Histone Deacetylase inhibitor:HDACi)が重粒子線感受性を顕著に増強しうることを見出してきた。そこで本研究では、各種HDACiの重粒子線増感効果を明確にするとともに、重粒子線治療の効果を可視化により評価できる実験的イメージング解析系を開発することを目的とした。今年度は、前もって各種HDACiに曝露した悪性黒色腫細胞株に重粒子線またはガンマ線を照射し、コロニー形成実験およびフローサイトメトリーによるアポトーシスと細胞周期の解析を行った。その結果、HDACiは重粒子線との併用により、顕著に抗腫瘍効果を増強した。この効果は、ガンマ線との併用より大きかった。さらに、経時的な実験により、増感効果が発現するタイミングを割り出した。一方で、重粒子線照射によって生じるDNA二本鎖切断を生きた細胞で可視化するためのプローブの作製を試みた。DNA二本鎖切断応答に関わる2つの因子に分割型発光タンパク質を融合させたプラスミドを構築した。本研究の成果は、重粒子線治療の効果をさらに促進する具体的な薬物を提案できるに留まらず、全身的な免疫賦活化が期待できるため、遠隔転移病巣を含む進行がんの画期的な治療戦略となる。今年度は、前もって各種HDACiに曝露した悪性黒色腫細胞株に重粒子線またはガンマ線を照射し、様々なタンパク質の発現解析を行った。その結果、HDACiの放射線増感効果は重粒子線との併用で顕著だったにも関わらず、DNA損傷のマーカーであるH2AXのリン酸化はガンマ線との併用においてのほうが増加していることがわかった。重粒子線との併用のほうがHDACiのリン酸化が少ないにも関わらず抗腫瘍効果が高いことから、重粒子線との併用によって生じたDNA損傷は修復しにくい可能性が示唆された。一方、重粒子線治療の効果を可視化により評価するためのプローブ作製に関しては、DNA二本鎖切断応答に関わる2つの因子に分割型発光タンパク質を融合させたプラスミドを昨年度構築した。今年度は各因子の発現を確認する実験を行ったが、残念ながら一部の因子で発現を確認することができなかったため、構築戦略を再検討中である。本研究の成果は、重粒子線治療の効果をさらに促進する具体的な薬物を提案できるに留まらず、漸進的な免疫賦活化が期待できるため、遠隔転移病巣を含む進行がんの画期的な治療戦略となる。今年度は各種タンパク質の発現解析を行った。HDACiと重粒子線の併用は、ガンマ線との併用より増感効果が大きいにも関わらず、DNA損傷のマーカーであるH2AXのリン酸化はガンマ線との併用でのほうが増加していた。この結果は、増感効果と損傷の程度が直接関連していないことを示唆しており、大変興味深い。ぜひ今後、もっと掘り下げて研究したい。一方で、DNA二本鎖切断応答の可視化プローブの作製については戦略の再検討中であり、やや遅れている。重粒子線は高LET(Linear Energy Transfer:線エネルギー付与)で生物効果が大きく、細胞致死効果が高い。昨年度までに、(1)HDACiによる放射線増感効果は重粒子線との併用で顕著である、(2)しかしDNA損傷のマーカーであるH2AXのリン酸化はガンマ線との併用において照射直後に増加している、ことを明らかにした。

今年度はそのH2AXのリン酸化について、照射直後から照射6時間後まで経時的に調べた。その結果、放射線照射(D10)単独によるH2AXのリン酸化は、重粒子線でもガンマ線でも照射直後には同程度増加していたが、その後、ガンマ線照射では経時的に減少するのに対し、重粒子線照射ではある程度減少した後は停滞状態になった。HDACiを併用した実験でも同様に、ガンマ線照射では経時的に減少し、重粒子線照射では停滞状態に到達しているように見えた。併用効果が発現する機序を解明するためには、照射後もっと長い時間まで観察する必要があることが示唆された。また、DNA損傷のみならず、DNA修復応答も調べる必要がある。本研究の成果は、重粒子線治療の効果をさらに促進する具体的な薬物を提案できるに留まらず、全身的な免疫賦活化が期待できるため、遠隔転移病巣を含む進行がんの画期的な治療戦略となる。今年度は、H2AXのリン酸化を経時的に調べた。想定していなかった組織および人事上の問題が発生し、組織改編(研究室解散)に向けて研究遂行困難な時期があったために、研究が遅れている。重粒子線は高LET(Linear Energy Transfer:線エネルギー付与)で生物学的効果比が大きく、細胞致死効果が高い。また、物理的にも線量集中性に優れていることから、がん組織だけをピンポイントで狙って死滅させることができる。これまでに研究代表者らは、難治性がんの培養細胞を用い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(Histone Deacetylase inhibitor:HDACi)が重粒子線感受性を顕著に増強しうることを見出してきた。そこで本研究では、各種HDACiの重粒子線増感効果を明確にするとともに、重粒子線治療の効果を可視化により評価できる実験的イメージング解析系を開発することを目的とした。昨年度までに、(1)HDACiによる放射線増感効果は重粒子線との併用で顕著である、(2)しかしDNA損傷のマーカーであるH2AXのリン酸化はガンマ線との併用において照射直後に増加している、(3)その後H2AXのリン酸化は、ガンマ線照射では経時的に減少するのに対し、重粒子線照射ではある程度減少した後は停滞状態に到達しているように見える、ことを明らかにした。今年度はそのリン酸化H2AXの変化について、リン酸化H2AXのfociの数が変化しているのか、大きさが変化しているのか、蛍光免疫染色を用いて調べた。その結果、HDACiはガンマ線との併用によって、照射直後のリン酸化H2AXのfociを大きくすることがわかった。さらに今年度、(1)の重粒子線増感効果について、コロニー形成実験とアポトーシスおよび細胞周期の解析結果をまとめた論文が、受理され発行された。(2)と(3)についても、現在論文を投稿準備中である。
環境政策における選好の相互依存性の実証分析

本研究の目的は、消費者の環境配慮行動に関する相互依存的選好(interdependent preference)を考慮した消費者行動モデルの構築と、審議型貨幣評価(deliberative monetary valuation)における評価手法の開発である。これまで行ってきたグリーン電力基金に対する寄付行動、エコカーの普及、および自然再生事業に関する研究において以下のような研究成果が得られている。グリーン電力基金に対する寄付行動に関する研究では、Granovetterの閾値モデル(threshold model)と標準的な経済モデルを統合し、潜在クラスモデル(latent class model)による実証分析を行った。この分析から、寄付行動に対して閾値をもつ消費者と持たない消費者が存在することを示した。また、消費者がどちらの潜在クラスに属するかどうかは環境意識や利他性によって決まり、環境意識や利他性の高い消費者ほど寄付行動に対して閾値をもつ傾向があることを明らかにした。これまでの研究では、どのような特性をもつ個人が相互依存的選好をもつ傾向があるかについて十分な分析が行われてこなかった。本研究は環境意識や利他性の高い個人が相対的に少ないことが、寄付行動の連鎖を起きにくくしている要因となっていることを明らかにした。エコカーの普及に関する研究では、燃料タイプの別の自動車の市場シェアについてシミュレーションを行い、代替燃料自動車に対する補助金制度が各自動車の市場シェアをどれだけ拡大させるかについて予測を行った。また、代替燃料自動車の課題となっている航続走行距離とインフラ整備の間には補完的関係があることを明らかにした。審議型貨幣評価に関する研究では、これまでの諸研究のレビューを行い、書籍の分担執筆の中で、当該分野の研究背景や研究手法の解説、今後取り組むべき研究課題について提示した。本研究の目的は、消費者の現実における環境配慮行動を十分に説明できる経済モデルを構築すること、審議型貨幣評価(Deliberative Monetary Valuation)における評価手法を開発することである。前年度までの研究ではグリーン電力基金に対する寄付行動を分析対象とし、社会心理学モデルの1つであるGranovetterの閾値モデル(Threshold model)を標準的な経済モデルに統合し実証分析を行うことで現実の寄付行動を予測するモデルを構築することを試みてきた。本年度は、近年公共経済学の分野において社会選好(Social Preference)の1つとして提唱されている社会的承認(Social approval)や道徳的動機(Moral motivation)の理論モデルを応用し、エコカーの購入動機について表明選好法を用いた実証分析を行った。これまで社会選好の実証分析は実験経済学によるものしかなく、現実問題について十分な分析がなされてこなかった。本研究では現実問題へ応用することで、どちらの動機も有意に消費者の行動に影響を与えていることを明らかにした。これまでの研究で消費者の選好の相互依存性が存在することを示すことができたが、選好の相互依存性が複数の異なる動機によって引き起こされているということは、環境政策における規範的分析を行うことが極めて難しくなることを示唆している。したがって、これら社会選好を環境政策の意思決定にどう組み込んでいくかが今後の課題として残されている。審議型貨幣評価の評価手法について、本年度はこれまでの諸研究のレビューを行い、環境政策の社会的意思決定プロセスにおいて環境評価がどう位置づけられるべきかについて考察した上で、今後取り組むべき研究課題を明らかにした。
レーザ走査干渉技術を用いたトライボ要素円筒表面ナノレベル観察装置の研究

横方向空間分解能が高い広視野レーザ顕微鏡は,高さ方向の分解能は数μmにとどまっている.そこで,高さ方向の分解能をnmレベルに向上させるた,レーザ光の位相を利用するできるように装置を改良した.試作した装置を用いてSUS304製円筒試験片の表面観察を行った.その結果,円筒面全面にわたり明瞭か干渉縞を得ることに成功した.円筒の表面形状を決定するために,干渉縞の画像解析手法を開発した.その結果,円筒面の表面形状を3次元表示することができた.これにより,短時間で円筒面全面の形状を計測する手法が開発できた.横方向空間分解能が高い広視野レーザ顕微鏡は,高さ方向の分解能は数μmにとどまっている.そこで,高さ方向の分解能をnmレベルに向上させるた,レーザ光の位相を利用するできるように装置を改良した.試作した装置を用いてSUS304製円筒試験片の表面観察を行った.その結果,円筒面全面にわたり明瞭か干渉縞を得ることに成功した.円筒の表面形状を決定するために,干渉縞の画像解析手法を開発した.その結果,円筒面の表面形状を3次元表示することができた.これにより,短時間で円筒面全面の形状を計測する手法が開発できた.申請者は,独創的な広視野レーザ顕微鏡を用いて,円筒面の全面を短時間で高精度に観察できる手法を世界ではじめて開発した.この装置は広い視野を観察することを主眼としたシュリンクフィッタ技術援用レーザ走査方式を用い,微細レーザスポット光の反射光強度のみを利用している.そのため,横方向の空間分解能は高いが,高さ方向の分解能は数μmにとどまっている.そこで,高さ方向の分解能を向上させるために,レーザ光の位相を利用する独自のレーザ走査干渉法を用いることを立案した.これまでの高い横方向分解能と併せて,高さ方向もnmレベルの高分解能を実現できる画期的な観察装置の開発を行う.これにより,円筒面などの転がり要素全面の表面形状を高い分解能で観察する手法の開発を,世界に先駆けて実現することを研究目的とする.レーザ走査干渉を生じさせるためには,nmレベルで円筒観察物表面と参照板の間隔を一定に保つ必要がある.そこで,円筒観察物の回転に伴い,回転軸がぶれないように円筒観察物の回転支持部には空気静圧軸受(科研費購入)を採用した.空気静圧軸受据え付けには,防振技術が要求される.今回はこの防振技術に手間取り,レーザ走査干渉縞を得るには至らなかった.これと並行して,広視野レーザ顕微鏡のさらなる計測時間の短縮と,観察画像の高精度化をねらい,平面ミラーをポリゴンミラーに変更することと,走査レンズを新たに設計することを実験機を作製して検討した.ポリゴンミラーに変更した結果,観察の高速化は可能であることが分かった.また,視野を狭めて解像度を向上させた走査レンズを新たに設計・製作した.しかし,ワーキングディスタンスが短くなったために装置の操作性は少し悪くなってしまった.上記の通り,研究の進み方は項目毎に異なるが,総じて言えば,これまでのところ研究はほぼ計画通りに進んでいると言える.請者は,独創的な広視野レーザ顕微鏡を用いて,円筒面の全面を短時間で高精度に観察できる手法を世界ではじめて開発した.この装置は広い視野を観察することを主眼としたシュリンクフィッタ技術援用レーザ走査方式を用い,微細レーザスポット光の反射光強度のみを利用している.そのため,横方向の空間分解能は高いが,高さ方向の分解能は数μmにとどまっている.そこで,高さ方向の分解能を向上させるために,レーザ光の位相を利用する独自のレーザ走査干渉法を用いることを立案した.これまでの高い横方向分解能と併せて,高さ方向もnmレベルの高分解能を実現できる画期的な観察装置の開発を行う.これにより,円筒面などの転がり要素全面の表面形状を高い分解能で観察する手法の開発を,世界に先駆けて実現することを研究目的とする.空気静圧軸受に取り付けた円筒面を観察して,干渉縞を取得することに成功した.広視野レーザ顕微鏡は横方向空間分解能は高いが,広視野化のために高さ方向の分解能を犠牲にしていた.今回は,干渉法を使用することで,横方向の空間分解能はそのままで,高さ方向の分解能をナノレベルに高めることができた.円筒全面の干渉縞を,円筒展開図のように表示した.干渉縞を等高線としてとらえて,円筒面全面の高さを計算するための補間式を求めた.補間式は種々のものが考えられるが,本研究では縦と横の位置を表すx,yの2変数を用いた,多項式とした.また,完全な円筒ではなく,円筒の一部形状を持つシリンドリカルレンズの計測も行った.このようなレンズの形状計測は難しく,これまでは実施例もあまりみられなかった.本装置は,横方向の空間分解能が高いので,幾何学的な円筒形状からの逸脱が大きな表面形状であっても計測可能であることが確認できた.申請者は,独創的な広視野レーザ顕微鏡を用いて,円筒面の全面を短時間で高精度に観察できる手法を世界ではじめて開発した.この装置は広い視野を観察することを主眼としたシュリンクフィッタ技術援用レーザ走査方式を用い,微細レーザスポット光の反射光強度のみを利用している.

そのため,横方向の空間分解能は高いが,高さ方向の分解能は数μmにとどまっている.そこで,高さ方向の分解能を向上させるために,レーザ光の位相を利用する独自のレーザ走査干渉法を用いることを立案した.これまでの高い横方向分解能と併せて,高さ方向もnmレベルの高分解能を実現できる画期的な観察装置の開発を行う.これにより,円筒面などの転がり要素全面の表面形状を高い分解能で観察する手法の開発を,世界に先駆けて実現することを研究目的とする.昨年度試作した実験装置において,観察物を高精度に回転させるための空気静圧軸受と,円筒試験片の取り付けがうまく行かなかったので,その部分の取り付けジグを改良した.その結果,これまで以上に安定して円筒面の全面観察ができるようになった.そこで,幾何学的な円筒形状に近いと思われるロッドレンズ外周を観察した.観察では,参照板として平面度がλ/20のガラス板を使用した.その結果,当初目的にしていた円筒全周に渡り干渉縞を取得することができた.しかしロッドレンズと,空気静圧軸受との間にわずかに偏心が存在するために,干渉縞は場所により縞密度が急変した.次に,鏡面仕上げされたSUS304製円筒試験片を用いて観察を行った.この試験片では偏心を少なくする工夫を施したために,全面に亘りきれいな干渉縞を得ることに成功した.今後縞解析が順調に進めば,円筒面全面に亘りその形状をnmレベルで計測することが可能となる.上記の通り,これまでのところ研究はほぼ計画通りに進んでいると言える.本研究の目的は,広視野レーザ顕微鏡の高さ方向の解像度をレーザ干渉技術を用いてnmレベルまで改善することである.平成23年度の計画では,円筒形状の観察物をnmレベルで回転軸のぶれが無いようにすることであった.そのために,空気静圧軸受を導入し,広視野レーザ顕微鏡と円筒観察物の回転軸とのアライメント調整機構を整備した.このため,次年度以降の早い段階でレーザ干渉像を得ることができるので,研究はおおむね順調に進展していると判断した.25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,広視野レーザ顕微鏡の高さ方向の解像度をレーザ干渉技術を用いてnmレベルまで改善することである.平成24年度の計画では,平成23年度に試作した装置不具合の改善を行い,円筒形状の観察物をnmレベルで回転ぶれが生じないようにすることであった.そのために,広視野レーザ顕微鏡と円筒観察物の回転軸とのアライメント調整機構を改善した.その結果,当初予定の円筒面全面に亘りレーザ干渉像を得ることができた.これより,研究はおおむね順調に進展していると判断した.上記の通り,研究はおおむね順調に進んでいるので,次年度も計画通りに進める予定である.25年度が最終年度であるため、記入しない。上記の通り,研究はおおむね順調に進んでいるので,次年度も計画通りに進める予定である.
葉緑体NADP供給とプロトン駆動力のバランス制御機構の解明

光合成は、光で駆動された電子伝達反応によって化学エネルギー(ATP, NADPH)を合成する反応を含む。このエネルギー変換過程において、リニア電子伝達(LET)の最終電子受容体であるNADP+はATPを消費して合成される。従って、光合成エネルギーバランスを最適化する上で、葉緑体NADP補酵素の量的制御は、酸化還元比制御と同様に極めて重要である。本研究では、葉緑体NADP状態とプロトン駆動力とのバランスを制御するメカニズムの解明に取り組む。
単一割球の凍結保存及び染色体正常性に関する基礎的研究

初期胚の割球分離後の発育能、分離した単一割球の生存性及び染色体正常性、さらに単一割球の凍結保存の確立を目指し基礎的研究を行なった。1.マウス4細胞、8細胞胚の割球分離法として、extrusion法が最も高い成功率を示し、Biopsy施行時10%の胚に細胞障害を認めたが、4細胞では割球分離後の親胚の胞胚への発育率は75%、8細胞では78.3%とcontrol群(80%)と差のない結果を示した。また、割球分離胚のrecipientへの移植実験による着床率は4細胞24.0%、8細胞34.8%と対象群の50%に比較し低値であった。一方、単一割球の60%以上にinvitroで少なくとも一回以上の分割を認めた。割球の染色体作成率ははコルセミド処理時間を16時間程度に延長することにより4細胞では27.3%、8細胞では52.2%にMetaphase像が得られたが、培養時の細胞変性、標本作成時のlossが2030%に及んだ。3.割球分離後の親胚の凍結保存は1.5M DMSO+0.25Msucroseを耐凍剤とした5-step希釈法では凍結融解後胞胚への発育は30%に認められた。単一割球の凍結保存は検討した上記凍結法では融解後すべての細胞が変性を示し、従って割球凍結後の染色体分析の成功には至っていない。4.単一割球の凍結保存の確立を目的として活性酸素の消去酵素であるSuperoxide Dismutase(SOD)、及び生理活性リン脂質である血小板活性化因子(PAF)に着目し基礎的検討を行なった。その結果、卵子生存性にはSODなどの抗酸化酵素が重要な関連性を有し、またPAFが排卵機構、精子受精能、胚発育に促進的に関与することが明らかとなり、この系を破壊することのない凍結法の確立の必要性を明かとした。1、割球分離後の生存性2細胞、4細胞、8細胞期の割球分離後の親胚に関してEDTA添加Ca^<2+>、Mg^<2+>free培養液中での割球分離操作により70%の生存率が得られた。透明帯除去法の検討では、機械的透明帯除去後の生存率が70%であったのに対し、透明帯drilling法、pronage処理による透明帯除去法後の生存率は30ー35%と低率であり、この原因としては酵素ならびに酸性Tyrode液による直接的卵細胞膜の障害が考えられた。又透明帯除去後の保護膜の検討において透明帯を除去したままの裸胚の発育能は、Agar抱埋、透明帯再封入した胚とin vitro培養系における成績に有意差は認められない結果を得た。2、単一割球の生存性分離された単一割球は2細胞、4細胞、8細胞期の全てのstageにおいて現在のところ、その後の分割は認められず現在割球分離法の技術的向上、至摘培養液の選択に関しひき続き検討中である。3、割球の細胞遺伝学的検討単一割球を0.04μg/ml濃度のコルヒチン添加whitten Mediumで6ー8時間培養後、gradual fixation methodにより低率(4.5%)ではあるが染色体核盤の作製に成功した。現在、核盤作製率向上をめざし各種spindle blocker、至摘固定法に関し検討中である。4、割球の凍結保存1.5M DMSO+0.25