hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エピジェネティック改変による安定化制御性Ｔ細胞の誘導と免疫疾患への応用

T細胞特異的Tet2/3両欠損(DKO)マウスに抗生物質を投与したところ、脾・リンパ節腫脹等の症状は緩和されたことから、DKOマウスは腸内細菌によるT細胞受容体(TCR)刺激が過増殖の原因であると考えられた。また、DKOマウスでは大腸粘膜固有層におけるTregの割合が減少し、Th17細胞は増加していた。さらにDKOマウスのTregの大半が胸腺由来TregのマーカーであるHeliosを高発現したことから、Tetは末梢におけるTreg/Th17分化に重要であることが示唆された。次にDKOマウスをRag2-/-OT-IIトランスジェニックマウス(Rag2-/-OT-II)背景で作製した。DKO/Rag2-/-OT-IIマウスは脾・リンパ節腫脹等の症状を自然発症せず、抗原となるOVAの投与により発症が認められた。さらに、OVA投与後、Rag2-/-OT-IIマウスでは末梢リンパ器官においてTregが誘導されていたのに対し、DKO/Rag2-/-OT-IIマウスではTregの誘導は見られず、Th17細胞の誘導が見られたことから、Tetが末梢におけるT細胞の過増殖およびTreg/Th17分化に重要であることが示された。II.制御性T細胞におけるTETの機能解明TET2/3欠損TregをRag2-/-マウスに移入したところ、Foxp3発現が低下し、移入したTregはIL-17を産生するexFoxp3細胞に転換したことから、TetはTregの安定性に重要であることが示唆された。次に、TregにおけるDNAメチル化状態とオープンクロマチン状態を解析したところ、Tet欠損TregではFoxp3遺伝子の約5kb上流領域に強いメチル化とATACピークの消失が認められ、本領域におけるFoxp3の安定性への寄与が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。(1) T細胞特異的Tet2/3両欠損マウス(CD4CreDKO)の作製、解析を行ったところ、CD4CreDKOマウスは早期(生後75日前後)に死亡することがわかった。このCD4CreDKOマウスはT細胞の活性化を伴う二次リンパ節腫大を引き起こし、さらに抗体産生に関与するgerminal centerB細胞の増加および抗体産生亢進が認められた。(2) Treg特異的Tet2/3両欠損マウス(Foxp3CreDKO)の作製、解析を行ったところ、Foxp3CreDKOマウスはCD4CreDKOマウスと比べると長寿だが、平均して生後150日程度で死亡することがわかった。Foxp3CreDKOマウスも高齢(5カ月齢以上)になるとCD4CreDKOマウスと同様にT細胞の活性化を伴う二次リンパ節腫大を引き起こし、germinal center B細胞の増加および抗体産生亢進が認められた。また、Foxp3CreDKOマウスから単離したTregを解析したところ、WT Tregに比してTet2/3欠損TregはTSDRの部分的メチル化、および脱メチル化の指標である5hmCの減少が認められ、TregにおいてTet2/3がTSDRの脱メチル化に関与することが明らかとなった。CRISPR/dCas9システムを用いたCRISPR/dCas9-Tet発現ベクターの作製を試みた。その結果、CRISPR/dCas9-Tetを導入した細胞のTSDR脱メチル化に成功した。しかしながら、Tetは分子量が非常に大きく、ベクターを細胞へ導入することが困難であり、Tregの機能評価を行うまでには至らなかったため、ベクターの導入効率向上を2年目の課題としたい。当初の計画は、一年度目に「I. Tet欠損マウスの作製と表現型の解析」として、T細胞特異的(CD4Cre)およびTreg特異的(Foxp3Cre)Tet2/3欠損マウスを作製、nTregの発生/誘導および機能におけるTetの関与を明らかにすること、自然発症する病態の解析を計画していたが、計画していた解析はほぼ終了し、さらに二年度目に予定していたTSDRのDNA脱メチル化におけるTet2およびTet3の関与を明らかにすることができた。また「II. TSDR特異的人工脱メチル化酵素の作製」としてTSDR特異的人工脱メチル化酵素発現ベクターを作製、安定化Tregを誘導する方法論を確立することを目標としていたがこちらは計画通りに進展している。I. T細胞特異的Tet2/3欠損マウスの解析1年目までにT細胞特異的Tet2/3両欠損マウス(DKO)はT、B細胞の活性化を伴う二次リンパ節腫大を引き起こし早期に死亡することが明らかとなったが、離乳後(3週齢)より抗生物質を投与すると病態発症を抑えられたことから、腸管での常在細菌によるTCR刺激が引き金となっていることが示唆された。また、in vitroもしくはTCRを制限したRag2-/-OT-IITgマウスにOVAを投与するin vivoの実験系においてヘルパーT細胞の分化実験を行ったところ、Tet2/3欠損T細胞はIL-17を産生し、RORγtを発現するTh17型およびPD-1、CXCR5、ICOSを発現するTfh型に分化しやすく、抑制性のTregには分化しにくいことが明らかとなった。

Tregの安定性および機能を解析するために、炎症性疾患やリンパ球減少性のマウスへのTreg移入実験を行った。Treg特異的Tet2/3両欠損マウス(FDKO)より単離したTet2/3欠損Tregは、野生型Tregに比してFoxp3の発現を失いやすく、不安定であることが明らかとなった。また、Tet2/3欠損TregはFoxp3の発現を失った後、IL-17を産生するTh17型のexFoxp3細胞になりやすいことがわかった。さらに、炎症性腸疾患モデルマウスを用いてTregの機能解析を行ったところ、野生型Tregは腸炎を抑制したのに対し、Tet2/3欠損Tregは腸炎を抑制できず、Tet2/3はTregの抑制能の発現にも重要であることが明らかとなった。DNA脱メチル化酵素Tet2/3の欠損マウスの解析を行い、Th17が異常に増加する等非常に興味深い表現型を見出している。おそらく腸内細菌に依存したTCR刺激がT細胞増殖に必要であることをTCRトランスジェニックマウスとの交配で明らかにしている。また誘導性Treg(pTreg)の発生にもTetが必須の役割を果たすことを見出し、計画していた解析はほぼ終了した。また、3年目に計画していた安定化Tregを用いた免疫疾患治療への基盤研究についてもすでに検討を進めている。3年目はさらに、ゲノムワイドのメチル化解析等でターゲット遺伝子を同定することでTregにおけるDNA脱メチル化の意義が明らかにされることが期待される。T細胞特異的Tet2/3両欠損(DKO)マウスに抗生物質を投与したところ、脾・リンパ節腫脹等の症状は緩和されたことから、DKOマウスは腸内細菌によるT細胞受容体(TCR)刺激が過増殖の原因であると考えられた。また、DKOマウスでは大腸粘膜固有層におけるTregの割合が減少し、Th17細胞は増加していた。さらにDKOマウスのTregの大半が胸腺由来TregのマーカーであるHeliosを高発現したことから、Tetは末梢におけるTreg/Th17分化に重要であることが示唆された。次にDKOマウスをRag2-/-OT-IIトランスジェニックマウス(Rag2-/-OT-II)背景で作製した。DKO/Rag2-/-OT-IIマウスは脾・リンパ節腫脹等の症状を自然発症せず、抗原となるOVAの投与により発症が認められた。さらに、OVA投与後、Rag2-/-OT-IIマウスでは末梢リンパ器官においてTregが誘導されていたのに対し、DKO/Rag2-/-OT-IIマウスではTregの誘導は見られず、Th17細胞の誘導が見られたことから、Tetが末梢におけるT細胞の過増殖およびTreg/Th17分化に重要であることが示された。II.制御性T細胞におけるTETの機能解明TET2/3欠損TregをRag2-/-マウスに移入したところ、Foxp3発現が低下し、移入したTregはIL-17を産生するexFoxp3細胞に転換したことから、TetはTregの安定性に重要であることが示唆された。次に、TregにおけるDNAメチル化状態とオープンクロマチン状態を解析したところ、Tet欠損TregではFoxp3遺伝子の約5kb上流領域に強いメチル化とATACピークの消失が認められ、本領域におけるFoxp3の安定性への寄与が示唆された。(1) T細胞及びTreg特異的Tet欠損マウスを用いて免疫疾患モデルを作製し、病態におけるTetの関与を明らかにする。このときエフェクターT細胞とTregの性質を調べる。
満腹度の客観的評価法の確立-科学的根拠に基づいた肥満予防・治療へのアプローチ-

満腹度を客観的に評価する指標を探索するため、体格指数が正常域の対象者に基準食の負荷試験を行い、食後の血中代謝指標と満腹度の関連性を解析した。その結果、満腹度は血糖値および血清インスリン濃度と強い関連性があり、これらを用いて評価できる可能性が示された。この関係は体格の異なる対象者および異なる食品においても同様であることが確認された。以上の結果より、食後の血糖値や血清インスリン濃度の下降が穏やかな食品を選択することは、満腹度を持続させ過食を予防する上でも重要であると考えられた。ライフスタイルの変化に伴い、肥満を特徴とするメタボリックシンドローム(MS)人口が増加している。MSの予防や治療には、過食を防ぎ、適正なエネルギー摂取量を遵守することが重要であり、高い満腹度が得られ、かつ持続する食事が望ましい。このような食事を考案するには、生体が感じる満腹度を正確に評価する必要があるが、現在のところ、満腹度は対象者の主観に基づく評価法しかなく、客観的評価法は確立されていない。そこで本研究は、満腹度の客観的評価法を確立し、MSの予防や治療に適した食事療法の構築に寄与することを目的とする。健常者に対し基準となる試験食の負荷試験を行い、食後経時的に採血と、Visual Analog Scale (VAS)による主観的な満腹度の測定を行った。採取した血液から、食後の満腹度に影響を与えると報告のある血糖値や血糖値の変化に伴い変動する血清インスリン濃度、遊離脂肪酸濃度、また食欲に関連すると報告のある血漿グレリン濃度を測定した。各種血液パラメータと主観的な満腹度との関連性を解析したところ、血糖値と血清インスリン濃度は食後の満腹度と有意に正の相関を、血清遊離脂肪酸濃度は負の相関を示した。一方で血漿グレリン濃度は食後の満腹度との関連性は見られなかった。満腹度を従属変数として重回帰解析を行ったところ、独立変数として血糖値と血清インスリン濃度が選択された。以上のことから、主観的な満腹度は血糖値と血清インスリン濃度を組み合わせることで評価できる可能性が示唆された。今後は対象者数を増やすとともに、体格の異なる対象者における評価や、異なる食品における検討を行う必要がある。肥満を特徴とするメタボリックシンドローム(MS)の人口は増加の一途を辿っており、予防や治療には、過食を防ぎ、適正なエネルギー摂取量を遵守することが重要である。そのためには、高い満腹度が得られ、かつ持続する食事が望ましく、このような食事を考案するには、生体が感じる満腹度を正確かつ客観的に評価する必要がある。2010年度の研究結果より、健常者において食後の満腹度は、血糖値と血清インスリン濃度を組み合わせることで評価できる可能性が示唆された。そこで2011年度は体格の異なる対象者においても同様の関連性が見いだせるかを検討した。体格指数(Body Mass Index;BMI)が19.328.9kg/m^2の22名を対象として基準食の負荷試験を行い、食後経時的に採血と、Visual Analog Scale(VAS)による主観的な満腹度の測定を行った。採取した血液から、食後の満腹度に影響を与えると報告のある血糖値や血糖値の変化に伴い変動する血清インスリン濃度、遊離脂肪酸濃度を測定した。対象者をBMI正常群とBMI高値群に分け、各種血液パラメータと主観的な満腹度との関連性を解析したところ、両群において血糖値と血清インスリン濃度は食後の満腹度と有意に正の相関を示した。以上の結果から、肥満者においても健常者と同様に血糖値と血清インスリン濃度を組み合わせることによって食後の満腹度を評価できることが示唆された。肥満を特徴とするメタボリックシンドローム(MS)の人口は、世界中で増加の一途を辿っている。MSの予防や治療には、過食を防ぎ適正なエネルギー摂取量を遵守することが重要であり、これを実践するには、高い満腹度が得られ、かつ満腹度が持続する食事が望ましい。このような食事を考案するには、生体が感じる満腹度を正確かつ客観的に評価することが必要であるが、現在のところ、満腹度は主観に基づく評価法しか存在せず、客観的評価法は確立されていない。そこで本研究は、ヒトにおいて満腹度を客観的に評価する方法や指標を確立することで、肥満やそれに伴う疾患の予防や治療に効果的な食事療法を構築することを目的とした。2011年度までの研究結果より、満腹度はいかなる体格の対象者においても血糖値(PG)および血清インスリン濃度(IRI)と強い関連性があり、これらを用いて評価できる可能性が示された。そこで2012年度は、満腹度に影響を及ぼすことが報告されている食物

繊維含量に焦点を当て、食物繊維含量の異なる6つの試験食(糖質含量は統一)を用いて負荷試験を行い、PG、IRI、血清遊離脂肪酸濃度と満腹度の関連性を評価した。食物繊維含量が異なる全ての食品において、満腹度はPGおよびIRIと強い正の相関を示した。また満腹度の最大値と食物繊維含量の関連性を評価したが、これらの間に相関関係は見られなかった。以上の結果より、生体の感じる満腹度はPGおよびIRIによって評価できる可能性が示された。食後にPGやIRIが急上昇し急下降する食品(高GI食品)は、食後に一過性の高い満腹度が得られるが、PGやIRIの急下降に伴ってすぐに空腹に陥るため、過食を引き起こすことが示唆された。一方、食後にPGやIRIが緩やかに上昇し徐々に下降する食品(低GI食品)は満腹度が持続し、過食を予防する効果が得られると考えられた。当初の計画通り、体格の異なる対象者において、満腹度と血液パラメータとの関連性を比較検討することが出来たため、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。2011年度までの研究により、いかなる体格の対象者においても、基準食を負荷した際の満腹度は血糖値と血清インスリン濃度により評価できる可能性が示唆された。2012年度は、基準食以外の異なる食品を摂取した場合においても、同様の関連性が見られるかを検討する。対象者は、本大学倫理委員会の審査に基づき、本試験の内容等を十分に説明したうえで、本人の自由意思による同意の得られた者のみとする。これまでと同様の手法を用い、各種試験食の負荷試験を実施する。食後に継時的な採血およびVAS法(Westerterp-Plantenga etal:PhysiolBehav.61:343-349,1997)による被験者の主観的な満腹度の測定を行う。形状の違いが満腹度変動パターンに影響を及ぼすか否かを検討する。
動物及び食品由来カンピロバクター株におけるギランバレー症候群発症リスク因子の分析

食中毒菌であるカンピロバクター(Campylobacter jejuni)は、急性の運動麻痺を主徴とするギランバレー症候群(GBS)の引金となることが知られているが、そのリスク因子を保有する菌株の分布は不明な点が多い。本研究では、家畜、家禽、食品等から広く収集した菌株について、GBS発症のリスク因子を調べ、GBS発症能力を有する菌株の自然界での分布状況を明らかにした。ブロイラー(93株)、地鳥(76株)、市販鶏肉(119株)、牛(74株)、および宮崎県内の下痢患者由来(94株)由来C. jejuni計456株を供試し、血清型、LOS合成遺伝子オペロン型、MLST型を決定した。さらに、分離株のLOSについてシアル酸及びガングリオシドGM1エピトープの発現の有無を決定した。国内のGBS患者から最も高頻度に分離されている血清型HS19型は、下痢患者由来から2株、市販鶏肉と牛から7株が分離された。LOS合成関連遺伝子オペロン型では、ブロイラー、牛および下痢患者由来株ではクラスBが、市販鶏肉と地鶏ではクラスEが最も優勢で、クラスAの家畜由来株は9株(2.3%)と低かった。クラスA-Cに分類された家畜由来14株から抽出したLOSには、いずれもシアル酸が検出され、その中の12株はコレラ毒素Bサブユニットと結合した。動物由来株のMLST解析では、18のCCタイプに分類され、CC-353 (ST-3911)が優勢だった。一方、由来に関わらず、HS19型の23株中19株(82.6%)がGBS株の約60%に認められるCC-22 (ST-22)に分類された。以上の結果から、HS19、LOSタイプA、MLSTがCC-22、LOS合成遺伝子オペロン内にシアル酸の合成と発現に必要な遺伝子セットを保有し、LOSにシアル酸を発現している株がGBSの発症リスク因子であることが示唆された。主要な食中毒の起因菌であるカンピロバクター(Campylobacter jejuni)は、急性の運動麻痺を主徴とするギランバレー症候群(GBS)の引金となることが知られている。C. jejuniに起因するGBSの発症機序は、菌体リポオリゴ糖(LOS)がシアル酸を含むガングリオシドGM1様糖鎖構造を持つことによる自己免疫疾患と考えられている。LOS合成関連遺伝子オペロンは、その構造遺伝子の配列の違いからクラスA-Fに分類されており、クラスA、B、Cに属する株がGBSのリスク因子であると報告されている。そこで平成28年度は、カンピロバクターの主要な保菌動物であり、本食中毒の重要な感染源と考えられている鶏および牛由来C. jejuniのタイピングを行い、GBS患者由来株と比較した。ブロイラー(93株)、地鳥(76株)、市販鶏肉(119株)、牛(74株)、および県内の下痢患者由来(94株)C. jejuni計456株を供試した。耐熱性抗原による血清型別、LOS合成関連遺伝子オペロンのタイピングを決定した。さらにクラスA-Cに分類された家畜由来菌株からLOSを抽出し、質量分析器によるシアル酸の検出とコレラ毒素Bサブユニットとの結合性を調べた。血清型HS19型は、下痢患者由来から2株、市販鶏肉と牛から7株が分離された。LOS合成関連遺伝子オペロンのタイピングでは、ブロイラー、牛および下痢患者由来株ではクラスBが、市販鶏肉と地鶏ではクラスEが最も優勢で、クラスAの家畜由来株は9株(2.3%)と低かった。以上の結果から、GBS患者由来株と共通した特徴を有する株が低頻度ではあるが、鶏および牛に分布していることが確認された。平成28年度の研究計画では、菌株の収集、血清型の決定、LOS型の決定、MLST型の決定、cstII遺伝子多型の検査およびシアル酸合成関連遺伝子の検出を実施する予定であった。菌株は当初の目標の半分の500株が収集されており、これらの菌株を用いて解析を進める。野生動物から菌の分離ができれば、追加で解析を行う予定である。血清型とLOD型の決定は年度内に完了した。MLST型の決定、cstII遺伝子多型の検査およびシアル酸合成関連遺伝子の検出については、PCRとシークエンス解析を進めており、平成29年度前半には終了する予定である。一方、平成29年度以降に実施する予定であった、菌体LOSの精製とガングリオシドGM1様エピトープの検出およびLOSからのシアル酸の検出は平成28年度に完了しており、研究計画は概ね順調に進展していると判断した。Campylobacter jejuniに起因するギランバレー症候群(GBS)の発症機序は、菌体リポオリゴ糖(LOS)がシアル酸を含むガングリオシド様糖鎖構造を持つことによる自己免疫疾患と考えられている。一方、家畜や食品から分離されるC. jejuniのGBS発症のリスク因子の分布等については調べられていない。

本研究では、重要な保菌動物と考えられている鶏および牛由来C. jejuniのGBS発症リスク因子の分布状況を明らかにすることを目的として行なった。平成28年度の研究では、耐熱性抗原によるHS血清型別、LOS合成関連遺伝子オペロンのタイピングを決定すると共に、クラスA-Cに分類された家畜由来菌株からLOSを抽出し、シアル酸の検出を行なった。平成29年度は、供試菌株のMLSTタイプの決定およびPCR法によりシアル酸合成関連遺伝子を検出し、GBS患者由来株と比較した。動物由来株は18のCCタイプに分類され、CC-353 (ST-3911)が最も多く、続いてCC-464 (ST-4389)、CC-21 (ST-50)、CC-607 (ST-607)が優勢だった。一方、由来に関わらず、HS19型の23株中19株(82.6%)がGBS株の約60%に認められるCC-22 (ST-22)に分類された。シアル酸合成関連遺伝子の分布を調べた所、LOSタイプA、B、Cに分類されたほとんどの株は、由来に関わらず、シアル酸の合成と発現に必要な遺伝子セットを有していた。以上の結果から、HS19、LOSタイプA、MLSTがCC-22 (ST-22)、LOS合成遺伝子オペロン内にシアル酸の合成と発現に必要な遺伝子セットを保有し、LOSにシアル酸を発現している株がGBS発症リスク因子であることが示唆された。平成29年度以降の研究計画では、菌体LOSからのシアル酸の検出、菌体LOSの精製とガングリオシドGM1様エピトープの検出、LOS遺伝子オペロンの次世代シークエンサーを用いた解析、GM1エピトープを有する動物由来カンピロバクター株の動物実験における免疫応答、ノックアウトミュータントの作出によるGM1エピトープの合成に必要な遺伝子の確認等を実施する予定であった。28年度に解析が完了しなかったMLST型の決定、cstII遺伝子多型の検査およびシアル酸合成関連遺伝子の検出については、PCRとシークエンス解析を進め、予定通り平成29年度前半には終了した。一方、平成29年度以降に実施する予定であった、菌体LOSの精製とガングリオシドGM1様エピトープの検出およびLOSからのシアル酸の検出は平成28年度に完了しており、研究計画は概ね順調に進展していると判断した。食中毒菌であるカンピロバクター(Campylobacter jejuni)は、急性の運動麻痺を主徴とするギランバレー症候群(GBS)の引金となることが知られているが、そのリスク因子を保有する菌株の分布は不明な点が多い。本研究では、家畜、家禽、食品等から広く収集した菌株について、GBS発症のリスク因子を調べ、GBS発症能力を有する菌株の自然界での分布状況を明らかにした。ブロイラー(93株)、地鳥(76株)、市販鶏肉(119株)、牛(74株)、および宮崎県内の下痢患者由来(94株)由来C. jejuni計456株を供試し、血清型、LOS合成遺伝子オペロン型、MLST型を決定した。さらに、分離株のLOSについてシアル酸及びガングリオシドGM1エピトープの発現の有無を決定した。国内のGBS患者から最も高頻度に分離されている血清型HS19型は、下痢患者由来から2株、市販鶏肉と牛から7株が分離された。LOS合成関連遺伝子オペロン型では、ブロイラー、牛および下痢患者由来株ではクラスBが、市販鶏肉と地鶏ではクラスEが最も優勢で、クラスAの家畜由来株は9株(2.3%)と低かった。クラスA-Cに分類された家畜由来14株から抽出したLOSには、いずれもシアル酸が検出され、その中の12株はコレラ毒素Bサブユニットと結合した。動物由来株のMLST解析では、18のCCタイプに分類され、CC-353 (ST-3911)が優勢だった。
主要栄養シグナルを感知・統合するTORキナーゼ複合体ネットワーク

TORキナーゼを含むTORC1およびTORC2複合体は、細胞の成長・増殖制御に中心的な役割を果たす。分裂酵母をモデルとして解析を行い、Rab様Gタンパク質が、グルコースに応答してTORC2を活性化することを発見した。また、TORC2のサブユニットの一つであるSin1のCRIMドメインが特異的にTORC2基質に結合することを示し、その立体構造を決定した。さらに、Rag様Gタンパク質のGtr1-Gtr2ヘテロ二量体が、TORC1の活性を抑制することを発見した。この抑制制御には、Gtr1のGTPase-Activating Proteinとして働くGATOR1複合体が必須であった。われわれは既に分裂酵母TORC2の活性化因子として低分子量Gタンパク質Ryh1/Rab6を同定した(Tatebe et al. 2010)。Rab6エフェクターであるBICD2の断片を用いて分裂酵母破砕液からGTPを結合した活性型Ryh1のみを吸着・定量するアッセイ系を確立してRyh1の活性化状態を調べたところ、細胞外グルコースに応答してRyh1がGTP結合型に変換されることが示された。最近、イスラエルの研究グループが、分裂酵母TORC2がcAMP-PKA経路を介してグルコースに応答すると報告したが(Cohen et al. 2014)、より厳密な方法によるわれわれの実験ではその結果を再現できず、Ryh1がグルコース刺激に応答してTORC2を活性化する主要因子であると考えられる。一方、Ryh1-TORC2経路は培地中の窒素源の有無には応答しなかった。また、大阪大学・蛋白質研究所との共同研究によって、分裂酵母Sin1タンパク質のCRIMドメインのNMR立体構造を決定した。Sin1はTORC2の制御サブユニットの一つで、われわれは、そのCRIMドメインがTORC2のリン酸化基質を特異的に認識し、結合することを明らかにした。本研究では、真核生物細胞で保存されたTarget of Rapamycin (TOR)キナーゼ含む2つの複合体、TOR complex 1および2 (TORC1およびTORC2)がこれら2種類の栄養シグナル(窒素源、および炭素/エネルギー源であるグルコース)を感知・統合し、増殖をコントロールする細胞内情報処理ネットワークを構成することを明らかにする。われわれは最近、分裂酵母において、TORC2が細胞外グルコースに応答して活性化し、基質であるGad8キナーゼをリン酸化・活性化することを報告した(Hatano et al., 2015)。TORC2の制御サブユニットであるSin1は、その中央部にあるConserved Region in the Middle (CRIM)が直接Gad8を認識し、結合する。われわれは、TORC2の基質認識特異性を決定しているSin1のCRIMドメインの構造をNMRによって決定し、ユビキチン様の折りたたみ構造をもっていることを示した。さらに、分裂酵母で見出されたSin1の機能がヒトでも保存されているかを検証するため、ヒト培養細胞株においてSIN1遺伝子座をCRSPR/Cas9システムを用いて破壊したところ、ヒトTORC2の基質であるAKTのリン酸化に欠損がみられ、さらにCRIMドメインに変異をもつSin1をこの株で発現させてもAKTのリン酸化は部分的にしか回復しなかった。加えて、ヒトSin1CRIMドメイン断片がAKTに特異的に結合することを試験管内実験によって示すことができた。以上の結果は、ヒトTORC2 (mTORC2)においても、Sin1サブユニットが基質結合サブユニットとして機能し、Sin1のCRIMドメインが基質特異性を担っていることを示している。ヒト培養細胞を用いたSin1CRIMドメインの変異導入解析は、当初、ゲノムSIN1遺伝子由来の野生型Sin1タンパク質の共存下で試みたものの、変異型タンパク質の機能評価が困難であり、CRSPR/Cas9システムを用いたゲノムSIN1遺伝子のノックアウトを行うことにした。その結果、変異型Sin1の機能欠損の程度をTORC2基質AKTのリン酸化のレベルで測定可能になった。分裂酵母からヒトまで保存されたSin1CRIMの基質認識ドメインとしての機能を報告する論文を最近、投稿することができた。本研究では、真核生物細胞で保存されたTarget of Rapamycin (TOR)キナーゼ含む2つの複合体、TOR complex 1および2 (TORC1およびTORC2)が2種類の栄養シグナル(窒素源、および炭素/エネルギー源であるグルコース)を感知・統合し、増殖をコントロールする細胞内情報処理ネットワークを構成することを明らかにする。われわれは分裂酵母において、グルコース刺激がTORC2を活性化し、その基質であるGad8キナーゼをリン酸化・活性化することを既に報告した(Hatano et al., 2015)。このTORC2からGad8へのシグナル伝達に、TORC2複合体の制御サブユニットであるSin1が必須の機能を持つことを明らかにした(Tatebe et al., 2017)。Sin1は、TORC2がリン酸化により活性化する基質タンパク質を認識し、結合する役割を持つ。加えて、ヒト培養細胞を用いた実験によって、Sin1の機能はヒトのTORC2複合体においても保存されていることを示し、このSin1の機能を阻害することでTORC2によるガン遺伝子産物AKTの活性化を抑制できる可能性を見出した。また、アミノ酸やアンモニアなどの窒素源によって活性化されるTORC1複合体についても分裂酵母をモデル系とした解析を進め、ヒト細胞でTORC1を負に制御することが知られているGATOR

1複合体が分裂酵母でも保存されていることを明らかにした。したがって、遺伝学的解析の容易な分裂酵母は、高等真核生物TORC1のGATOR1による制御機構を理解するためのモデル系として活用できる。TORC2のSin1が、分裂酵母およびヒトの両方において、基質結合サブユニットであることを確立し、さらにSin1中央部のConserved Region in the Middle (CRIM)が基質結合部位であることを明らかにして、その立体構造を決定し、論文として発表した(Tatebe et al., 2017)。分裂酵母細胞破砕液からのアフィニティー精製と質量分析によって、ヒトGATOR1と相同な複合体の同定に成功した。この分裂酵母GATOR1は、Iml1, Npr2, Npr3の3つのサブユニットからなり、それらの遺伝子破壊実験によって、ヒトGATOR1と同様に分裂酵母においてもGATOR1がTORC1活性を負に制御することを明らかにした。われわれは分裂酵母において、グルコース刺激がTORC2を活性化し、その基質であるGad8キナーゼをリン酸化・活性化することを既に報告した(Hatano et al., 2015)。このTORC2からGad8のシグナル伝達に、TORC2複合体の制御サブユニットであるSin1が必須の機能を持つことを明らかにした(Tatebe et al., 2017)。加えて、Sin1の機能はヒトのTORC2複合体においても保存されていることを示し、このSin1の機能を阻害することでTORC2によるガン遺伝子産物AKTの活性化を抑制できる可能性を見出した(Tatebe et al., 2017)。また、TORC1複合体についても分裂酵母をモデル系とした解析を進め、哺乳類でTORC1活性の制御に関わっているRag GTPaseヘテロ二量体、Ragulator複合体、GATOR複合体が分裂酵母で保存されていることを明らかにした。さらに、分裂酵母のRag GTPaseであるGtr1-Gtr2ヘテロ二量体が、TORC1の活性抑制に必須であることを発見した。このメカニズムは、GDP結合型のGtr1に依存しており、Gtr1のGTPase-Activating Protein (GAP)として働くGATOR1複合体を欠損した分裂酵母株では、TORC1活性の異常亢進が引き起こされる。この結果は、これまでTORC1の活性化因子として考えられてきたRag GTPaseが、TORC1抑制因子としても機能することを示す、非常に予想外の結果であり、論文として発表した(Chia et al., 2017)。TORキナーゼを含むTORC1およびTORC2複合体は、細胞の成長・増殖制御に中心的な役割を果たす。分裂酵母をモデルとして解析を行い、Rab様Gタンパク質が、グルコースに応答してTORC2を活性化することを発見した。また、TORC2のサブユニットの一つであるSin1のCRIMドメインが特異的にTORC2基質に結合することを示し、その立体構造を決定した。
頭蓋顔面骨代謝の分子生物学的機構解析と遺伝子工学法に基づく至適再生

頭蓋骨欠損状態の効果的骨治癒・再生方法として、ヒト間葉系幹細胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)及び、骨形成因子(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)と、鋳型・担体として、ゼラチン製剤であるゲルフォームを用いて、in vitroでの骨培地(デキサメサゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸などを含む培地)での細胞増殖曲線、骨形成因子(培地中と細胞のアルカリフォスファターゼ発現)と、T細胞活性欠損ヌードラット(F344/NJCI-rnu)を用いた頭頂骨全層欠損モデルにて検討・調査した。BMP-2(50 ng/ml)、bFGF(2.5 ng/ml)の濃度にて、観察4日間中、4日目にBMP-2とbFGFを共に添加した群でのみ、有意な細胞増殖を認め(p<0.05)、骨形成因子であるアルカリフォスファターゼ(ALP)の培地中の活性も陽性細胞数も、4日目に対照群に比較して有意な上昇をBMP-2またはbFGF単独添加で認めた。BMP-2とbFGFの共添加では単独添加群よりも有意な上昇を認めた(p<0.01)。動物実験では二重X線吸収骨塩測定法による、骨塩量定量では、4週目にBMP-2とbFGF添加した群において、PBS群、幹細胞単独群に比較して、有意な骨塩増加)(p<0.01)認めた。組織像では、2週目に幹細胞単独群において塩基性のミネラル化を認め、更に幹細胞にBMP-2及びbFGF添加した群では骨芽細胞の裏打ち(lining)も認められた。4週では、PBS群にも内因性の間葉系細胞に沿って塩基性ミネラル化を認め、幹細胞単独群では層状骨形成お骨稜形成を認めた。更に幹細胞にBMP-2とbFGP添加した群では骨細胞が骨芽細胞と破骨細胞に囲まれてきておりより進行した骨再生像であった。8週目には群間の差は見られなくなった。免疫組織法にて、幹細胞にBMP-2とbFGF添加した群では著明なALP陽性となり、更に成熟骨マーカーであるオステオカルシン発現も認められた。これっら骨タンパク発現はヒト由来細胞・組織に特異的であり、移植細胞であるヒト間葉系幹細胞の分化による骨形成であると考えられた。以上から、ヒト間葉系幹細胞はサイトカインの刺激により細胞増殖・骨分化誘導し、効果な骨再生により、頭蓋骨治癒に有用であることが分かった。頭蓋骨欠損修復における、分子生物学的機構解析目的に、細胞を用いた移植再生実験として、ヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSC)の細胞増殖性・細胞周期解析・細胞周期発現タンパク解析・電子顕微鏡による形態解析を行った。

hMSCはウシ胎児血清にて増殖維持される間は、未分化で均一(homogenous)な細胞集団であり、核は真正クロマチンであった。また、細胞質内は小器官が発達し滑面小胞体のみを認めた。24時間無血清条件後、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、分化因子として骨形成因子(BMP-2)添加後細胞増殖曲線では、bFGF添加群で添加後3日間、細胞増殖性が維持されたのに対し、BMP-2添加群では2日までに細胞増殖は閾値に達した。bFGFとBMP-2混合添加群では細胞増殖性をbFGF単独添加と同様に維持していた。細胞周期解析(FACS)では、BMP-2添加後1日、2日で無血清非添加群に比較し細胞御周期の著明な進行を認め、ウシ胎児血添加群と同等であった。細胞周期発現タンパク解析では、G1期に発現するPCNA(Proliferating Cenular Nuclear Antigen)、M期に発現し、細胞周期を維持するとされるPTTG(Pituitary Tumor Transforming Gene)をウェスタン・ブロット法にて解析し、BMP-2添加により、G1期M期の細胞周期亢進を確認した。また、免疫細胞染色にてS期に発現するBrdUタンパクの発現上昇も認めた。電子顕微鏡像では、10%ウシ胎児血清培養下で細胞は20μm以上の大型で単一由来細胞像を呈しており、核は真正クロマチンを示し、細胞内小器官の発達と滑面小胞体のみが認められました。一方、BMP-2添加後は添加後1日、2日と細胞質内に徐々に粗面小胞体の発達を認め、核も異クロマチン化し、細胞分裂像も認めた。以上より、hMSCの未分化増殖性と骨分化特性が解析され、細胞-由来移植再生療法に有用な基礎的所見が得られた。頭蓋骨欠損状態の効果的骨治癒・再生方法として、ヒト間葉系幹細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)及び、骨形成因子(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)と、鋳型・担体として、ゼラチン製剤であるゲルフォームを用いて、in vitroでの骨培地(デキサメサゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸などを含む培地)での細胞増殖曲線、骨形成因子(培地中と細胞のアルカリフォスファターゼ発現)と、T細胞活性欠損ヌードラット(F344/NJCI-rnu)を用いた頭頂骨全層欠損モデルにて検討・調査した。BMP-2(50ng/ml)、bFGF(2.5ng/ml)の濃度にて、観察4日間中、4日日にBMP-2とbFGFを共に添加した群でのみ、有意な細胞増殖を認め(p<0.05)、骨形成因子であるアルカリフォスファターゼ(ALP)の培地中の活性も陽性細胞数も、4日目に対照群に比較して有意な上昇をBMP-2またはbFGF単独添加で認めた。BMP-2とbFGFの共添加では単独添加群よりも有意な上昇を認めた(p<0.01)。動物実験では二重X線吸収骨塩測定法による、骨塩量定量では、4週目にBMP-2とbFGF添加した群において、PBS群、幹細胞単独群に比較して、有意な骨塩増加)(p<0.01)認めた。組織像では、2週目に幹細胞単独群において塩基性のミネラル化を認め、更に幹細胞にBMP-2及びbFGF添加した群では骨芽細胞の裏打ち(lining)も認められた。4週では、PBS群にも内因性の間葉系細胞に沿って塩基性ミネラル化を認め、幹細胞単独群では層状骨形成お骨稜形成を認めた。
カバークロップのアレロケミカルが冬期間の有機物分解と雑草抑制に及ぼす効果の解明

本年度は、圃場条件における窒素形態の推移およびアレロケミカルの測定法の検討を行った。アレロケミカルであるシアナミドについては、植物体からの抽出および測定は問題がなかったが、土壌内の含有量測定は安定していなかった。抽出法について更なる検討が必要である。圃場内の窒素形態の測定のため、8月にカバークロップを播種(裸地・ヘアリーベッチ・アカクローバ)し、11月から1ヶ月おきに土壌を採取し、アンモニア態窒素量、硝酸態窒素量、溶存性有機態窒素量(DON)および微生物由来窒素量(MBN)を測定した。その結果、積雪1ヶ月目でDONを除く全窒素量が低下したが、積雪初期である12月から2月では全窒素量に大きな変化は認められなかった。また、土壌凍結の有無およびカバークロップの有無による差異も認められなかった。しかしながら、融雪が始まる3月から4月では、ヘアリーベッチ区およびアカクローバ区で無知態窒素および微生物由来窒素の増加が認められ、特にヘアリーベッチ区においてアンモニア態窒素の上昇が顕著に認められた。へアリーベッチ区は、硝化作用を阻害するジシアノアミドを有する可能性が高く、融雪直後の雑草抑制効果が特に強くなるとことが推測された。除雪区と積雪区では、除雪区でのみ土壌凍結が認められた。除雪区と積雪区では、4月において土壌内の窒素量に差異が認められ、除雪区で高かった。以上の結果から、冬期間におけるヘアリーベッチによるアレロケミカルの効果は、雑草の発芽が促進される融雪期間に強く表れ、雑則抑制に強く働くと考えられる。本年度は、圃場試験を中心として冬期間の土壌調査を行い、培養試験については、条件設定を主に行った。冬期間におけるカバークロップの効果は、融雪期間に集中していると考えられたことから、培養試験における温度の検討が必要と思われ、2019年度以降の試験設計を検討する必要がある。一方、アレロケミカルの測定法の安定化については、植物体における含有量の測定は行えたが、土壌内のアレロケミカルの含有量には課題が残った。今後、抽出法の検討などを中心に検討する必要がある2019年度は、圃場試験の再試とともに培養試験による硝化能の測定およびDNA分析による微生物群集の解析を進める。培養試験では、当初の設定温度のうち氷温(0°C)の調査をとりやめ、5°Cと25°Cを中心とし、アレロケミカルの分解過程を調査する。また、2018年度の結果を踏まえて、アレロパシー試験の条件を設定し、雑草抑制の効果を検証する。本年度の試験は冬期間に集中していたことから、スケジュールの関係から翌年度に繰り越すことになった。繰り越し分は本年度の圃場調査の土壌における微生物相の群集分析にあてる。翌年度分については、予定通り硝化能の測定および培養試験による微生物相の群集解析を行う。
家族同心球環境理論に基づく家族アセスメント／家族介入モデルの臨地応用と実証的検証

家族症候(家族システムユニットの困難状態)として,“家族システムユニットストレスの過剰負荷"“家族レジリエンスの発達不足"“家族内コミュニケーションの障害"などをとりあげた.文献検討や概念分析,家族と看護師に対する半構造化面接,質問紙調査,家族エスノグラフィーなどを行った.その結果,家族同心球環境理論に基づいて,これらの家族症候をもつ家族に対して,具体的な家族支援スキームをリストアップし,家族環境アセスメントモデルと家族環境支援モデルを構築した.家族症候(家族システムユニットの困難状態)として,“家族システムユニットストレスの過剰負荷"“家族レジリエンスの発達不足"“家族内コミュニケーションの障害"などをとりあげた.文献検討や概念分析,家族と看護師に対する半構造化面接,質問紙調査,家族エスノグラフィーなどを行った.その結果,家族同心球環境理論に基づいて,これらの家族症候をもつ家族に対して,具体的な家族支援スキームをリストアップし,家族環境アセスメントモデルと家族環境支援モデルを構築した.まず,家族支援を記述する上で新しい家族看護学専門用語の概念検証が必要になるため,"家族システムユニットストレス""家族イベント""家族レジリエンス""家族スピリチュアリティ"などの概念分析を行い,それぞれの定義を明確にした.次に,長崎フィールドでは932家族(有効回答分)への質問紙調査と19家族への半構成面接調査,香港フィールドでは8家族(有効回答分)への質問紙調査と8家族への半構成面接調査,兵庫フィールドでは12家族と12名の看護師への半構成面接調査を実施し,エスノグラフィックデータを加え,すべてのデータをミックス法にて分析した.とくに"家族システムユニットストレス"では,心理的家族システムユニットストレス,物理的家族システムユニットストレスに加え,スピリチュアル的家族システムユニットストレスが明らかになった.家族システムユニットストレスへの支援は,家族資源の分類にしたがい,家族内部環境,家族外部環境,時間環境の3つの分類と,内的環境,人的環境,物理的環境,心理的環境,スピリチュアル的環境の5つの分類とを合わせた11分類に分けることができ,合計39種類の家族支援が明らかになった.さらに,"家族ケア/ケアリング理論(Family Care/Caring Theory:FCCT)"を提唱し,これを"家族同心球環境理論/モデル(CSFET/CSFEM)"に実装し,"家族支援看護職者とその協働者"のアセスメント項目を追加した.家族同心球環境理論(CSFET)と家族支援の媒介として家族ケアリングを位置づけ,家族同心球環境理論(CSFET)とそれに基づいた家族支援を結びつけることを可能にした.これまでに検討した家族症候に関連する家族看護学専門用語に加えて,“家族コンコーダンス"“家族形成"などに関する国内外の文献の内容分析や概念分析を行い,それぞれの定義,家族症候の危険因子・原因因子と予防因子・阻止因子を明確にした.そして,兵庫フィールドでは,とくに家族コンコーダンス形成力に関して9家族,家族形成に関して18家族に対して半構造化面接を実施した.さらに,家族コンコーダンス形成力をアセスメントする19項目からなる自記式質問紙を作成し,172家族(245名)からの回答をもとに,信頼性と妥当性を具備したアセスメント尺度を開発した.家族形成については,“新しい家族役割に適応するプロセス"“新しい家族関係を確立するプロセス"“家族外部環境との交互作用を調整するプロセス"を明らかにした.長崎フィールドでは,33日間の家族エスノグラフィーを実施した.とくに,スピリチュアルペインを抱える家族員がいる家族への支援について,保健・医療・福祉施設,教育・保育機関,宗教施設などにおける聞き取り調査,25家族への家族インタビュー/ミーティングを実施した.家族スピリチュアルペインへの家族支援スキームは,“自分自身の取り組み"が76プラン,“家族内での取り組み"が52プラン,“看護職者(看護師・保健師・助産師)からの支援"が70プラン,“家族外のひとからの支援"が47プラン,合計242の家族支援プランが明らかになった.そして,家族員のスピリチュアルペインのチェクリスト(Checklist for family member's spiritual pain:CL-FMSPI)を完成させた.また,家族支援のアウトカム評価として,家族症候度(家族症候の消失,好転,不変,増悪)を構築した.26年度が最終年度であるため、記入しない。家族看護学26年度が最終年度であるため、記入しない。予定していたフィールド(長崎,香港,兵庫)での質的研究と量的研究を実施し,リッチなデータを収集できた.当初の計画通り,"家族環境アセスメントモデル(FEAM)"と"家族環境支援モデル(FEIM)"の改訂を繰り返し,39種類の家族支援までを明らかにできたので,順調に研究は進んでいると判断する.予定していたフィールド(兵庫,長崎)において質的研究と量的研究を実施し,リッチなデータを収集できた.当初の計画通り,“家族環境アセスメントモデル(FEAM)"と“家族環境支援モデル(FEIM)"の改訂を繰り返し,追加のチェクリストも完成できたので,順調に研究は進んでいると判断する.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画にしたがって,国内外のフィールドで,"家族環境支援モデル(FEIM)"の改良,家族支援の実施,その効果評価を進めていく予定である.当初の研究計画にしたがって,国内外のフィールドにおいて,“家族環境支援モデル(FEIM)"の改良,家族支援の実施,そのアウトカム評価を進めていく予定である.26年度が最終年度であるため、記入しない。

平成24年度に10,606円の未使用額が出たが少額であり,平成25年度の研究費の使用に影響するものではない.予定通り,主に国内外での研究打ち合わせと調査のための旅費,研究補助および資料整理のための謝金,質問紙の印刷費,質問紙の発送と回収のための通信費などに使用する。
HIVゲノムRNAの感染後期における細胞内動態・形態に関する解析

HIVは制圧されるべき病原体であり、かつ高いポテンシャルを持つ遺伝子導入ベクターの母体でもあるため、未だ不明な点の多いその生活環に関する基礎的研究は大きな意義を持つ。研究代表者はこれまでに一貫してHIV-1のゲノムRNAに関する解析を行ってきた。本課題において研究代表者はこれまでの自身の研究による成果を更に発展させることによって得られる、ウイルスの増殖に大きく影響するRNA動態の詳細な解析を通して、レトロウイルスの本質とその理解に近づくことを主たる狙いとしている。平成30年度はこれまでに引き続き蛍光性核酸SpinachおよびBroccoliを用いたRNA標識に関する検討を行った。RNAそのものがGFPを模倣した特異的高次構造を取るこれらの配列は、その構造に蛍光物質がインターカレートすることで特定波長の蛍光を発する。従来のRNAの細胞内可視化標識のためには蛍光蛋白をRNAに結合させる間接的標識法しか手段がなく、蛍光強度や特異性、バックグラウンド蛍光など解決すべき問題が山積していた。その結果リアルタイムで生細胞内の観察を行うことは難易度が高く、蛍光性核酸はこうした問題を解決する有力な代替手段になると考えウイルスへの挿入を含めたベクター作成の検討を行った。一方でこれらの技術を適用する対象としてより基礎的なウイルスRNAの機能解析にも注力した。HIVゲノムのパッケージング能を担う大きな因子であるPsi(パッケージングシグナル)の様々な部位を対象に詳細な変異導入を行い、これまでに指摘されていなかった新たな塩基がPsiの高次構造維持に大きな役割を担っている可能性や、Psiがこれまでに知られていなかった新たなウイルス学的機能を内包している可能性などを示唆した。このことについては国内外の学会にて発表し、高い評価を得られた。現在共同研究者と共に論文化に向けた討論を行っている。者はこれまでに一貫してHIV-1のゲノムRNAに関する解析を行ってきた。本課題において研究代表者はレトロウイルスゲノムRNAの発現からウイルス粒子内にいたるまでに特異な動態の変遷を、それを取り巻く因子との相互作用と共に視覚化し解明することを目的とした研究を志向した。これまでの自身の研究による成果を更に発展させることによって得られる、ウイルスの増殖に大きく影響するこれらの現象の詳細な解析を通して、レトロウイルスの本質とその理解に近づくことを主たる狙いとしている。HIV-1のDISの機能的構造に関する新しい知見を見いだし、報告することができた点は高く評価できる。その反面、細胞内ウイルスゲノムの可視化についてはベクター作成にやや時間がかかり、細胞内可視化についても技術的な困難さが指摘されている部分がマイナスであることは否めない。粒子内ウイルスゲノムの断片化解析については興味深い事例が見いだされており、今後に期待が持てるものとなった。総合的に評価しておよそ期待された進捗状況であると判断される。平成29年度はこれらの解析ツールの1つとして、革新的なバイオマーカーとなりうるSpinachおよびBroccoliに着目した。これらはRNAそのものがGFPを模倣した特異的高次構造を取る配列の名称であり、その構造に蛍光物質がインターカレートすることで特定波長の蛍光を発する。これまでRNAの細胞内可視化のためにはファージ由来の蛋白結合タグを大量に反復させて(12ー24個)目的のRNAに挿入し、さらにファージ蛋白と融合させた蛍光蛋白を細胞内に発現させて結合を見るという方法しかなかったが、蛍光強度や特異性、バックグラウンド蛍光など解決すべき問題が多く、リアルタイムで生細胞内の観察を行うことは難易度が高かった。SpinachおよびBroccoliによるRNAタグは上記の問題を解決する有力な代替手段になると考え多数のベクターの作成を行い、発現の確認や使用する細胞の選択等最適化作業を検討中である。また、HIVゲノムのパッケージング能を担う大きな因子であるPsi(パッケージングシグナル)の詳細な機能的解析を行い、これまでに指摘されていなかった新たな塩基がPsiの高次構造維持に大きな役割を担っている可能性を示唆した。現在論文執筆中である。HIV-1のPsiの機能的構造に関する新しい知見を見いだし、発表することができた点は高く評価できる。その反面、細胞内ウイルスゲノムの可視化についてはベクター作成にやや時間がかかり、細胞内可視化についても技術的な困難さが指摘されている部分がマイナスであることは否めないが、SpinachおよびBroccoliという新たな可能性を担った技術を入手することができ今後に期待が持てるものとなった。

平成30年度はこれまでに引き続き蛍光性核酸SpinachおよびBroccoliを用いたRNA標識に関する検討を行った。RNAそのものがGFPを模倣した特異的高次構造を取るこれらの配列は、その構造に蛍光物質がインターカレートすることで特定波長の蛍光を発する。従来のRNAの細胞内可視化標識のためには蛍光蛋白をRNAに結合させる間接的標識法しか手段がなく、蛍光強度や特異性、バックグラウンド蛍光など解決すべき問題が山積していた。その結果リアルタイムで生細胞内の観察を行うことは難易度が高く、蛍光性核酸はこうした問題を解決する有力な代替手段になると考えウイルスへの挿入を含めたベクター作成の検討を行った。一方でこれらの技術を適用する対象としてより基礎的なウイルスRNAの機能解析にも注力した。HIVゲノムのパッケージング能を担う大きな因子であるPsi(パッケージングシグナル)の様々な部位を対象に詳細な変異導入を行い、これまでに指摘されていなかった新たな塩基がPsiの高次構造維持に大きな役割を担っている可能性や、Psiがこれまでに知られていなかった新たなウイルス学的機能を内包している可能性などを示唆した。このことについては国内外の学会にて発表し、高い評価を得られた。現在共同研究者と共に論文化に向けた討論を行っている。HIV-1ゲノムのパッケージングシグナル周辺の機能的構造解析については今後も精力的に研究を進め、ウイルスゲノムの特異的構造・動態を知る上での基礎的知見を積み重ねていきたいと考えている。細胞内の可視化ゲノム動態解析については技術的解決を図るため、今後実績のある研究室との積極的な共同研究を目指して行きたいと考えている。粒子内ウイルスゲノムの断片化解析については興味深い事例が見いだされており、今後日本最大級の次世代シーケンサーバリエーションを持つ大阪大学微生物病研究所のメリットを活かし、様々なシーケンサーを用いた解析を行うことでより詳細な解析を目指す。細胞内の可視化ゲノム動態解析については技術的解決を図るため、SpinachおよびBroccoliの可能性について積極的に検討すると同時に今後実績のある研究室との共同研究を目指して行きたいと考えている。粒子内ウイルスゲノムの断片化解析については興味深い事例は見いだされているものの進捗が止まっている。今後日本最大級の次世代シーケンサーバリエーションを持つ大阪大学微生物病研究所のメリットを活かし、様々なシーケンサーを用いた解析を行うことでより詳細な解析を目指す。
神経管閉鎖不全の発生リスク低減のための葉酸サプリメント摂取に関する女性の認識

神経管閉鎖不全は妊娠前から女性が葉酸を摂取することで発症リスクを低減できるため、本邦ではバランス良く食事摂取するとともにサプリメント等で付加的に摂取するよう推奨されている。しかし、妊娠前から葉酸サプリメントを摂取した女性の割合は少なく、神経管閉鎖不全の発生率も減少していない。未摂取の女性は初産婦より経産婦の方が多く、その理由は十分にわかっておらず、医療者の認識や妊娠前に行う保健相談上の課題も十分にわかっていない。本研究の目的は葉酸サプリメント摂取に対する初産婦と経産婦の認識の差異や未摂取の影響要因、及び医療者の葉酸サプリメントに対する認識や妊娠前に行う保健相談上の課題を明らかにすることである。