hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セントロメア領域の複製機能解析-生命現象の統一理解を目指して-

染色体DNAの複製は、様々な染色体維持機構と共役しながら進行するダイナミックなプロセスである。染色体分配や染色体の恒常性を保つ上で非常に重要な機能を担っているセントロメアやテロメアなどのヘデロクロマチン領域の複製制御様式は、染色体構造・機能と複製との関係を探る対象として非常に興味深い。我々や他のグループの解析から、分裂酵母染色体上のヘテロクロマチン領域(セントロメア、MAT、テロメア)のうちセントロメアとMATはS期初期、テロメアはS期後期という特定の時期に複製することが分かった。この観測結果はそれぞれのヘテロクロマチンの複製活性に対する特異的な制御を想起させる。そこでセントロメアの複製に着目し、複製制御メカニズムの有無、セントロメアの機能や構造と複製との関連について解析を進めた。これまでにヘテロクロマチン構造因子Swi6依存的に、複製因子Sld3のセントロメア、MAT結合が促進され、複製が活性化されていることを明らかにした。Sld3の結合は複製必須キナーゼDDKによっても制御されているが、興味深いことにDDKの制御ユニットDfp1はSwi6との結合モチーフを持つ。我々はDfp1のモチーフの点変異蛋白を作成し、in vitroでこのモチーフ依存的にDfp1とSwi6が相互作用することを確かめた。この点変異を分裂酵母に持たせたところ、Swi6の局在は正常にも関わらずセントロメア、MATの複製が遅延した。さらにswi6破壊株のセントロメア、MATに人為的にDfp1を局在させたところ、複製の遅延が抑制された。これらの結果からセントロメア、MATではヘテロクロマチン因子Swi6がDDKをリクルートすることで複製を活性化すると考えられる。最終年度ではこの成果をまとめ、国際的な学術誌であるnature cell biology誌に発表した。この結果は、ヘテロクロマチン因子は複製に対して抑制的に働くというこれまでのコンセンサスを覆すもので、クロマチン研究及び複製研究分野に対して大きなインパクトを与えるものと期待している。染色体DNAの複製は、DNA分子を倍加する反応に留まらず、その他の様々な染色体維持機構と共役しながら進行するダイナミックなプロセスである。染色体分配や染色体の恒常性を保つ上で非常に重要な機能を担っているセントロメアやテロメアなどのヘテロクロマチン領域の複製制御様式は、染色体構造・機能と複製との関係を探る対象として非常に興味深い。平成18年度に我々が報告した論文の中で、分裂酵母の染色体上に存在する3つのヘテロクロマチン領域であるセントロメア、MATおよびテロメアのうちセントロメアとMATはS期初期に複製をするのに対し、テロメアはS期の後期に複製をすることを報告した。この結果を受けて、セントロメアの複製をS期初期に制御するメカニズムがセントロメアの機能や構造とどのように関連するのかに着目し研究を進めている。これまでにヘテロクロマチン領域に局在するSwi6をコードする遺伝子を破壊した株を用いた解析から、Swi6非存在下ではセントロメアヘテロクロマチン領域特異的に複製タイミングが遅延することを発見した。複製中間体を物理的に検出したところ、swi6破壊株ではこの領域でのS期初期の複製開始頻度が低下していることが明らかになった。さらにChlP法を用いた解析から、この株ではORC、MCMのセントロメア局在は保たれているが、Sld3、RPAのセントロメア局在に欠損を示すことが確認され、セントロメアではpre-RC形成以降の複製反応がSwi6依存的に進行していることが示唆された。一方我々の研究室の解析から、Sld3の局在には複製制御因子DDKが必要であることが示されている。おもしろいことにSwi6とDDKは物理的に相互作用をすることが報告されていたため、Swi6による制御はこの相互作用に起因することが予想された。そこでSwi6との結合に欠損がみられるDDKの変異株であるdfp1ΔC株を用いて解析を行った。その結果この株では、Swi6のセントロメア結合は保待されているものの、これらの領域特異的に複製が遅延することが明らかになった。現在はこの制御機構の分子メカニズムの解明を目指してさらなる解析を行っている。そこでセントロメアの複製に着目し、複製制御メカニズムの有無、セントロメアの機能や構造と複製との関連について解析を進めている。これまでにヘテロクロマチン構造因子Swi6依存的に、複製因子Sld3のセントロメア結合が促進され、複製が活性化されていることを明らかにした。

この点変異を分裂酵母に持たせたところ、Swi6の局在は正常にも関わらずセントロメアの複製が遅延しした。さらにswi6破壊株のセントロメアに人為的にDfp1を局在させたところ、複製の遅延が抑制された。これらの結果からセントロメアではヘテロクロマチン因子Swi6がDDKをリクルートすることで複製を活性化すると考えられる。この結果は、ヘテロクロマチン因子は複製に対して抑制的に働くというこれまでのコンセンサスを覆すもので、クロマチン研究及び複製研究分野に対して大きなインパクトを与えるものである。染色体DNAの複製は、様々な染色体維持機構と共役しながら進行するダイナミックなプロセスである。染色体分配や染色体の恒常性を保つ上で非常に重要な機能を担っているセントロメアやテロメアなどのヘデロクロマチン領域の複製制御様式は、染色体構造・機能と複製との関係を探る対象として非常に興味深い。我々や他のグループの解析から、分裂酵母染色体上のヘテロクロマチン領域(セントロメア、MAT、テロメア)のうちセントロメアとMATはS期初期、テロメアはS期後期という特定の時期に複製することが分かった。この観測結果はそれぞれのヘテロクロマチンの複製活性に対する特異的な制御を想起させる。そこでセントロメアの複製に着目し、複製制御メカニズムの有無、セントロメアの機能や構造と複製との関連について解析を進めた。これまでにヘテロクロマチン構造因子Swi6依存的に、複製因子Sld3のセントロメア、MAT結合が促進され、複製が活性化されていることを明らかにした。Sld3の結合は複製必須キナーゼDDKによっても制御されているが、興味深いことにDDKの制御ユニットDfp1はSwi6との結合モチーフを持つ。我々はDfp1のモチーフの点変異蛋白を作成し、in vitroでこのモチーフ依存的にDfp1とSwi6が相互作用することを確かめた。この点変異を分裂酵母に持たせたところ、Swi6の局在は正常にも関わらずセントロメア、MATの複製が遅延した。さらにswi6破壊株のセントロメア、MATに人為的にDfp1を局在させたところ、複製の遅延が抑制された。これらの結果からセントロメア、MATではヘテロクロマチン因子Swi6がDDKをリクルートすることで複製を活性化すると考えられる。最終年度ではこの成果をまとめ、国際的な学術誌であるnature cell biology誌に発表した。この結果は、ヘテロクロマチン因子は複製に対して抑制的に働くというこれまでのコンセンサスを覆すもので、クロマチン研究及び複製研究分野に対して大きなインパクトを与えるものと期待している。
特異なミクロ反応場を用いる複合微粒子材料の微細構造制御

従来金属イオンの分離・濃縮を行うことを目的に開発・研究が行われてきた乳化液膜(W/O/Wエマルション)系の内水相をミクロ反応場として用い、サブミクロンミクロンサイズに粒径制御された微粒子材料の調製を行った。通常の水溶液系と比較してエマルション反応場は疎水性が強く、また界面活性剤によるテンプレート機能などを有することから、生成する微粒子材料の微細構造制御が可能となることを明らかにした。1.Caリン酸塩微粒子の調製乳化液膜系ではミクロンサイズのCaヒドロキシアパタイトを主成分とするCaリン酸塩球形微粒子が得られ、粒径およびモルホロジーの制御が可能であることを明らかにした。さらに、内水相にあらかじめAlイオンを溶解しておくことにより、種々の元素比をもつCa-Al複合リン酸塩微粒子を調製し、さらに焼成によってアルミナを含有するβ-トリリン酸カルシウム(β-TCP)球形微粒子を調製できることを示した。バイオミネラリゼーションの観点からも興味深い界面微粒子生成反応である。2.蛍光体微粒子材料の調製と蛍光特性の評価YイオンとEuイオンを同時にエマルション系の外水相から内水相に輸送させ、サブミクロンサイズの球形に制御されたY-Eu複合しゅう酸塩前駆体微粒子を調製した。これを空気中で焼成し、粒径や形態を保持したまま赤色蛍光材料であるY_2O_3:Eu^<3+>蛍光体微粒子を調製した。種々の乳化液膜系を用いて、粒径や形態が制御された蛍光体粒子の調製が可能であることを示した。従来金属イオンの分離・濃縮を行うことを目的に開発・研究が行われてきたW/O/W型エマルション(乳化液膜)をミクロ反応場として用い、微粒子材料の調製を行った。水溶液系と比較して疎水性の強い反応場の特徴を活かし、微粒子材料の径や形態・複合構造の制御を行う手法について検討した。1.Fe-Co・Fe-Ni複合微粒子の調製外水相に2種類の金属イオンを供給した場合、各金属イオンの抽出能や抽出速度の相違により内水相への金属イオンの輸送が制御され、複合微粒子の微細構造が制御できると考えられる。ケーススタディとしてFe-Co・Fe-Ni複合しゅう酸塩微粒子調製した。粒子表面付近がCoまたはNiに富む針状微粒子が得られ、これを焼成することでCoまたはNiフェライトの針状微粒子が得られた。2.Caリン酸塩微粒子の調製Caイオンを外水相から内水相へと輸送させ、内水相でリン酸塩と反応させ沈殿させた。得られたCaヒドロキシアパタイト微粒子は結晶性が低く、若干のCa欠陥を有していたが、ミクロンサイズの球形微粒子が得られ、粒径およびモルホロジーの制御が可能であることを明らかにした。さらに、内水相にあらかじめAlイオンを溶解しておくことにより、種々の元素比をもつCa-Al複合リン酸塩微粒子を調製できることを示した。3.EuをドープしたY複合微粒子の調製と蛍光体としての利用W/O/W型エマルション系の外水相中のYおよびEuイオンを輸送させて内水相のしゅう酸と反応させ、複合しゅう酸塩微粒子を調製した。単独金属のしゅう酸塩の場合と同様に、サブミクロンサイズ(直径0.20.6ミクロン)の球形微粒子を調製できた。これを焼成して複合酸化物微粒子を調製し、赤色蛍光体としての特性を明らかにした。従来金属イオンの分離・濃縮を行うことを目的に開発・研究が行われてきた乳化液膜(W/O/Wエマルション)の内水相をミクロ反応場として用い、サブミクロンミクロンサイズに粒径制御された微粒子材料の調製を行った。

通常の水溶液系と比較してエマルション反応場は疎水性が強く、また界面活性剤によるテンプレート機能などを有することから、生成する微粒子材料の微細構造制御が可能となることを明らかにした。1.蛍光体微粒子材料の調製と蛍光特性の評価粒径や形態の制御された蛍光体微粒子は、各種のディスプレイなどに薄膜形成する際に有用である。ここでは、赤色蛍光材料であるY_2O_3:Eu^<3+>およびGd_2O_3:Eu^<3+>蛍光体微粒子を調製した。まず、YとEu、またはGdとEuを同時にエマルション系の外水相から内水相に輸送させ、内水相中のしゅう酸と反応させることにより、サブミクロンサイズの球形に制御されたY-EuおよびGd-Eu複合しゅう酸塩前駆体微粒子を調製した。これを空気中で焼成することによって粒径や形態を保持したまま酸化物に変換した。通常の水溶液中で調製したミクロン大の不定形粒子は、エマルション反応場で調製した球形蛍光体微粒子に比較して見かけ上大きな蛍光強度を示したが、ミクロン大の粒子を粉砕し粒径を整える作業を行うと蛍光特性が極端に低下することから、サブミクロンサイズの球形蛍光体微粒子の調製法として、エマルション法は有用である。また、Gd_2O_3:Eu^<3+>ではGdとEuの反応場への輸送速度と沈澱速度がほぼ一致しているため、付活剤(Eu^<3+>が母体(Gd_2O_3)中に均一に分散された構造となり、Y_2O_3:Eu^<3+>に比較して優れた蛍光特性を示すことを明らかにした。2.Caリン酸塩-アルミナ複合体微粒子の調製生体親和性の高い材料として有用なCaリン酸塩は、強度面の問題があるが、アルミナを混在させることによって強度を向上させることができる。ここでは、Alイオンを含むエマルション反応場(内水相)にCaイオンを輸送し、リン酸と反応させて複合微粒子を調製した。適切な条件下で粒径5ミクロン程度の球形微粒子が得られた。この球形前駆体微粒子を空気中で焼成することにより、アルミナを含有するβ-トリリン酸カルシウム(β-TCP)球形微粒子を調製できた。
脳血管性痴呆モデルの開発とその病因予防に関する研究

脳血管性痴呆は老年期痴呆の中でも最も多く、約半数を占めていることを島根県下の老人ホ-ムの脳解剖例で疫学的に証明し、そのモデル動物の開発を目指して、脳卒中を100%自然発症する脳卒中易発症SHRSPと米国NIHより導入した正常血圧ラット24系統のうち血小板機能亢進を伴うOM/N系との交配を実施し、血圧、血小板機能も中間値を示すF_1よりF_2世代を得、この世代より血圧は高めで血小板機能亢進を伴う個体を選択交配しF_3を得たところ、血圧はSHRSPより低いが、血小板機能がそれより亢進している個体があった。さらにF_3より血圧が高く、血小板機能がOM/Nに近い個体のみの選択交配でF_4を得、長期間観察し、自然死の後、病理組織学的に検索したところ、大脳皮質、皮質下に多発性脳血栓を生じ、いわゆる“海綿状脳卒中"の病像を呈するものが見られ、これらの子孫の継代を重ね、ヒトの脳血管性痴呆類似の病像を自然発症するSPOM系を得た。さらに電顕病理学的研究により、脳実質内の動脈は、中膜外周から変性・壊死に陥り、中膜全層に進展すると内膜細胞表層にマクロファ-ジが附着し、これが内膜下に侵入すると脳血管関門が破綻してフィブリンが侵出し、内膜下へ沈着すると共に内膜は狭窄し、ついに血小板血栓を伴って閉塞して多発生脳血栓症の病像が完成することを明らかにした。一方、ラットにおける痴呆度の評価法の開発に努め、種々の試行の後、明暗箱を用い暗箱における電気ショックの回避学習の獲得能および学習後のRetention timeがよい指標になること見出し、病変の進行と共にSPOMでは、正常血圧ラットWKY、高血圧自然発症ラットSHR、さらに脳卒中発症前のSHRSPに比較して、これら指標が明らかに低下していることを証明した。新たに開発したSPOMは、典型的脳卒中症状を呈するたとなく、受動回避学習で明らかな障害があり、光顕的、電顕的所見からも脳血管性痴呆のモデルといえ、その予防実験にも有用である。島根医科大学病理学教室開講以来,県下の高齢者の剖検例を精査し,老年期痴呆が65才以上の高齢者においては死亡前にその3分の1に認められ,剖検において脳血管性痴呆が50%以上を占めることを明らかにした.すなわち,日本の高齢化社会においては欧米に比べ脳血管性痴呆が格段に多いところから,その成因と予防の研究のためモデル動物の開発を始めた.まず,正常血圧ラットの中より血小板機能亢進を伴う系統を見出すべく,米国NIHより24系統の近交系ラットを導入し, ADP凝集能を調べOM/NとMS20/N系が最も強い凝集能を示すことを確認した.これらの系統そのものは何らの病理学的所見を呈しないために,脳卒中を殆ど100%発症する脳卒中易発症ラット(SHRSP)と交配し, OM/N系とのF_1雑種を得た.

重症高血圧(生後10週で200mmHg以上)を有するSHRSPに対し, OM/Nは120ー130mmHgで, F_1雑種の血圧は150ー160mmHgであり,また1uMADPに対する凝集能はOM/Nが50%に対しSHRSPは弱く5%程度であり, F_1は30%前後であった.さらにF_1同士の交配でF_2を得たところ,血圧,血小板凝集能は共に分離し,前者は115ー190mmHg,後者は20ー50%を示した.これらのF_2より血圧が比較的高めで血小板凝集能亢進のある個体と選択交配しF_3を得たところ,血圧は145±2mmHg(平均±標準誤差),凝集能は38±12%で,血圧の分布はむしろ低めに,凝集能は高めに偏りを見せた.いずれも血圧はSHRSPより低く,凝集能はそれよりも高いが,病理学的に血栓症を明らかに多発する傾向はみられなかった.さらにF_3より血圧が比較的高く,血小板機能亢進がOM/N系になるべく近い個体を交配しF_4を得, 1年近くにわたって観察して来たところ,病理組織学的に大脳皮質,皮質下に多発性血栓症から,いわゆる"海綿状脳卒中"を呈するものが見られ,これはヒトの脳血管性痴呆に類似しており,このようにして得られた新しい系統がその有用なモデルとなる可能性がある.脳血管性痴呆のモデルとして、脳卒中易発症ラットSHRSPと血小板機能亢進を伴うOM/N系の交配で得たF_2のうち、高血圧はSHRSP程重症ではないが血小板機能亢進を伴うラットより継代をつづけ、SPOM系を得、初年度に引き続き自然死例の病理学的研究をすると共に、一部屠殺例については脳を灌流固定し電顕的に観察した結果、痴呆の原因となると考えられる多発性小梗塞の病理学的発生機序が次第に明らかになりつつある。即ち、脳動脈の穿通枝では長期間高血圧が持続すると局所の栄養障害ないし低酸素障害のためか中膜外周より平滑筋の変性と限局性壊死が生じ、これが中膜全層に波及すると血管内腔の内皮表層にマクロファージ(Mφ)が付着し、偽足を出して内皮の接合部に侵入し、ついに内皮下に入り込むと共に血漿成分が浸出し、フィブリンが沈着し、さらにMφはこのフィブリンを貧食し、scavengerとして働き、内腔に戻る像も見られた。フィブリンの沈着と共にフィブリノイド壊死が進展し、内膜下、中膜におよび壁は肥厚し、内腔の狭窄は進み、ついに血小板血栓を伴って閉塞する。このように穿通枝動脈の多発性血栓の成立過程で、(1)血管壁の局所栄養障害、(2)Mφの侵入、(3)血漿成分浸潤、(4)壁肥厚、(5)血栓形成というプロセスの全容が明らかになった。この事実からも脳血管性痴呆の原因となる多発性血栓の予防のためには最初の穿通枝動脈壁の局所栄養障害のひきがねとなる高血圧を抑制して局所脳血流を保ち、一方では栄養状況を全身的にも良好に保つことが、理論的にも重要であることがわかった。他方、このモデルの行動観察を続け、SPOM系では決して大発作の見られぬところから、脳卒中というよりも臨床的にも脳血管性痴呆により近いことを明らかにした。さらに痴呆のより客観的な評価法の開発につとめ、アボイダンステストの前提となる簡易な痛覚テスト法を完成した。脳卒中易発症ラットSHRSPと血小板機能亢進を伴うOM/N系の交配で得たF_2の子孫から高血圧にSHRSP程重症ではないが血小板機能亢進を伴うラットSPOM系の継代を続け、これが病理学的には多発性脳血栓症を自然発症することから脳血管性痴呆のモデルとして利用しうるか否かを明らかにするため、従来SHRSPの亜系より生後50ー100日の血圧上昇の緩徐な家系を選択交配して得たSTR系と共に受動回避学習実験を実施した。即ち、行動観察の後、痛覚試験などと共に明暗箱を用い明暗における電気ショックによる回避学習後のRetention timeを計測し、脳卒中難発症SHR(SHRSR)、脳卒中発症前SHRSP、正常血圧コントロ-ルWKYを比較した。SPOM、STRでは行動観察で運動や痛覚障害を証明しない段階で、回避学習や回避学習後のRetention timeはWKY、SHRSR脳卒中発症前SHRSPに比較して明らかに低下していた。
Fe基ヘテロアモルファス合金を用いたナノポーラスFeの作製と金属空気電池への応用

次世代の金属空気電池用の高性能負極材料を開発するために、ナノポーラスFeの新規作製方法を考案した。アモルファスFe83.3Si3B10P3Cu0.7 (a-Fe)合金リボンを熱処理することによって約20nmのα-Feナノ結晶を析出させ、α-Fe/a-Fe混合組織とした。これを弱酸性硫酸溶液中でアノード分極し、α-Feナノ結晶のみを選択溶解させることで、α-Feナノ結晶部分が細孔、周辺のa-Fe母相がリガメントとなる共連続構造のナノポーラスFeを作製することができた。このナノポーラスFeはアルカリ溶液中で可逆的酸化還元挙動を示し、空気電池の正極への応用が可能であることが分かった。将来の電気自動車の普及のためには,現在のリチウムイオン電池の性能を越える次世代電池が必要である。その有力候補の一つは理論エネルギー密度が高い金属空気電池であるが,実用化のためには正極および負極材料の高性能化が必要である。本研究では,従来の粉末電極材料の代わりにナノポーラス電極材料を用いるという発想転換を試みる。具体的にはFe基ヘテロアモルファス合金を出発材料に用いるナノポーラスFe作製法(熱処理による「ナノ結晶化」→電気化学的制御下の「選択溶解処理」)を開発すると共に,ナノポーラスFeを負極に用いる空気鉄電池の特性を評価することを目的とする。本年度は(1)ナノポアの元になるα-Feナノ結晶の析出制御,(2)α-Feナノ結晶のみを選択溶解させるための電気化学的溶解制御,について検討を行った。単ロール液体急冷法により厚さ20μm,幅10mmのFe85Si2B8P4Cu1合金リボン試料を作製した。温度613698K、時間100900sの範囲の種々の条件で熱処理した試料をTEM-EDS解析し,α-Feナノ結晶のサイズおよび残留アモルファス母相の化学組成を調べ、温度と時間によりナノ結晶粒径と母相のP濃度が変化することを確かめた。次に、純Fe、Fe基ヘテロアモルファス合金試料のアノード分極曲線を,pH16の硫酸酸性溶液中で測定した。その結果を基に、析出α-Feナノ結晶相と残留アモルファス相のアノード溶解特性が大きく異なり、選択溶解処理ができる条件として、溶液はpH4、電位はー0.6V (vs. SSE)と定めた。また、溶液に少量のPVPを添加すると、選択溶解性が改善されることが分かった。698K、600sの熱処理を行った試料を最適条件で定電位分極処理を行い,SEM,TEM-EDS解析を行った結果,共連続構造のナノポーラスFeが得られることが明らかになった。昨年度の研究によって、アモルファスFe85Si2B8P4Cu1合金からのα-Feナノ結晶析出の最適熱処理条件(698K、600s)とα-Feナノ結晶のみを選択溶解させるための最適溶解条件(pH4、-0.6VSSE)が明らかになった。本年度は,最適条件で作製した共連続構造のナノポーラスFeの負極特性を評価するために、電池の電解液であるアルカリ溶液中における酸化還元特性を電気化学的に検討した。0.1M KOH溶液中におけるサイクリックボルタメトリー測定を行った結果、可逆的酸化還元が起こるが、初期の通過電気量は平板試料の23倍程度に過ぎず、またサイクル数の増加とともに電気量が減少した。これは、アモルファスFeに含まれるSiによって、表面にSiO2リッチな酸化皮膜が生成するためであることが分かった。高濃度の5M KOH溶液を用いた結果、SiO2が溶解して通過電気量は平板試料の1520倍まで増加し、またサイクル劣化も軽減された。しかし、高濃度アルカリであるためFeが微量溶出することが分かった。電解液組成に関してはさらなる検討が必要であるものの、金属空気電池の負極として共連続構造のアモナノポーラスFeは有望であることが明らかになった。検討項目(1)の「ナノポアの元になる

α-Feナノ結晶の析出制御」に関しては当初の計画通りに,熱処理温度と時間を変えることでα-Feナノ結晶のサイズを制御できることが分かり、また、アモルファス母相にはPが濃縮することを確認できた。検討項目(2)の「α-Feナノ結晶のみを選択溶解させるための電気化学的溶解制御」に関しては,析出α-Feナノ結晶相と残留アモルファス相のアノード溶解特性に差が生じる条件を明らかにして、最適条件での定電位処理によってナノポーラスFeを作製することに成功した。残る課題は,熱処理条件によってα-Fe粒径が変わった時の選択溶解挙動の変化をより詳細に明らかにすることである。材料加工・組織制御工学計画は順調に進んでいるので,当初計画通りに進めることで目的は達成されると考えられる。H26年度の研究により,ナノポーラスFe作製の最適条件は明らかになったので,H27年度はナノポーラスFeを負極に用いた空気1次電池を作製し、電流密度と動作温度の影響を調べると共に、長期耐久性試験を行って、電池特性を明らかにする。さらに、アルカリ溶液中における酸化還元特性を評価して、2次電池としての動作の可能性について検討する。本研究では多量の合金を作製しなければならないため、合金原料の材料費、試料の溶解・加工・分析費を計上していたが、所属研究室で保有していた合金を使用して成果を出すことができたため、次年度使用額が生じた。主にFe基アモルファス合金を多量に作製するための合金原料の材料費、試料の溶解・加工・分析費に使用する。また、成果発表旅費や論文投稿料にも充てる。
三次元6自由度操作によるオンチップ超精密細胞除核への挑戦

卵細胞の除核作業は機械式マイクロマニピュレータによって行われており,作業のハイスループット化,精密化,効率化が求められている.そこで,マイクロ流体チップ中で卵子の位置と姿勢を調整し,連続的かつ超精密に核を取り除くための基盤技術に挑戦した.磁気駆動マイクロロボットの非接触操作による卵子の位置・姿勢制御方法を提案した.マイクログリッパを有する磁気駆動マイクロロボットを操作して,穿孔ツールで卵子の透明帯に穴を開け,グリッパを利用して卵子を押しつぶすことで除核した.また,オンチップ超精密連続除核のため,重力を利用して卵子を一つずつ安定的に送り出すローディング機能を提案し,実験的に有効性を示した.卵細胞の除核作業は機械式マイクロマニピュレータによって行われており,作業のハイスループット化,精密化,効率化が求められている.そこで,マイクロ流体チップ中で卵子の位置と姿勢を調整し,連続的かつ超精密に核を取り除くための基盤技術に挑戦した.磁気駆動マイクロロボットの非接触操作による卵子の位置・姿勢制御方法を提案した.マイクログリッパを有する磁気駆動マイクロロボットを操作して,穿孔ツールで卵子の透明帯に穴を開け,グリッパを利用して卵子を押しつぶすことで除核した.また,オンチップ超精密連続除核のため,重力を利用して卵子を一つずつ安定的に送り出すローディング機能を提案し,実験的に有効性を示した.卵細胞の除核作業は機械式マイクロマニピュレータによって行われており,作業のハイスループット化,精密化,効率化が求められている.そこで,マイクロ流体チップ中で卵子の位置と姿勢を調整し,その場で連続的かつ超精密に核を取り除くための基盤技術に挑戦した.(1)マイクロ流体チップ内で細胞の位置・姿勢制御を行った.磁気駆動マイクロロボットを2本用いて,ウシ卵子の位置と姿勢を制御した.画像処理による評価では姿勢の制御は7.5度を達成できた.(2)卵子の固定・穿孔・核除去を行った.まず,非接触操作できる磁気駆動マイクログリッパを作製した.グリッパ本体はシリコンをDRIE加工により作製し,弾性変形を利用した機構を用いてグリッパの開閉機能をもたせた.これに薄型化した永久磁石をアセンブリし,ロボットの上下で永久磁石を駆動することで位置決め制御に成功した.また,電磁石の制御によって,グリッパの開閉制御に成功した.この構造を利用し,ウシ卵子を把持して除核する方式を提案した.つぎに,穿孔用の磁気駆動マイクロツールの先端を先鋭化するために,グレースケールマスクによりシリコンのDRIE加工を行った.磁気駆動マイクログリッパを操作して,穿孔ツールで卵子の透明帯に穴を開け,グリッパ機能を利用して卵子を押しつぶすことで核を卵子から取り出した.(3)除核方式として,蛍光染色なしに除核するための条件を調査した.ポルスコープを利用して核や,透明体を観察した.マウス卵子に関しては核の位置が明視野観察で観察できたため,画像処理による計測を試みた.卵子の姿勢制御を組み合わせることで除核体積を安定的に低減できるめどをたてた.(4)オンチップ超精密連続除核方式のため,重力を利用して卵子を一つずつ安定的に送り出すローディング機能を提案し,実験的に有効性を示した.
生息場の改変がマングローブ水域の生物生産構造に及ぼす影響

熱帯河口域は海洋生態系のなかで最も高い生物生産性を有するが,マングローブ伐採や富栄養化などによってその生産性は大きく損なわれている.しかし,魚類を含めた生物生産構造の実態は未だ把握されておらず,人為的改変がどのように作用して生産性低下をまねくのかは不明である.本研究では,熱帯河口域に生息する魚類の成長を支える生産者と栄養フローを特定し,魚類の二次生産量を野外実験や標識放流実験で直接定量することを試みる.これを天然河川,護岸河川,富栄養化河川の間で比較することで,生息場の改変がマングローブ水域の生物生産のどの過程に歪みを引き起こし,二次生産量を低下させるかを明らかにする.熱帯河口域は海洋生態系のなかで最も高い生物生産性を有するが,マングローブ伐採や富栄養化などによってその生産性は大きく損なわれている.しかし,魚類を含めた生物生産構造の実態は未だ把握されておらず,人為的改変がどのように作用して生産性低下をまねくのかは不明である.本研究では,熱帯河口域に生息する魚類の成長を支える生産者と栄養フローを特定し,魚類の二次生産量を野外実験や標識放流実験で直接定量することを試みる.これを天然河川,護岸河川,富栄養化河川の間で比較することで,生息場の改変がマングローブ水域の生物生産のどの過程に歪みを引き起こし,二次生産量を低下させるかを明らかにする.
成長期における顎関節形成不全改善とＯＡ発症および進行との関連

3週齢ラットを固形飼料飼育群(対照群)と液状飼料飼育群(顎関節形成不全群)の2群に分けた。さらにそれらを9週齢から非生理的負荷〈開口3時間×5日間〉を加える群と無処置の群に分け、固形飼料飼育+非生理的負荷群、液状飼料飼育+非生理的負荷群の計4群とした。その結果、液状飼料飼育+非生理的負荷群ではマイクロCTにより軟骨下骨の骨梁構造に顕著な退行性変化が認められていた下顎頭中央部から後方部で、MMP-13陽性細胞数の有意な増加を認めた。さらに同部位に限局してOA様変化である無細胞領域が観察され、成長期の咀嚼機能低下に伴う顎関節形成不全が顎関節OAの発症および進行に関連することが明らかにされた。本研究は、成長期における咀嚼機能の低下に伴う顎関節の形成不全が顎関節OAの発症および進行を誘発するが成長期に顎関節の形成不全を改善するとそれらが軽減されるという仮説のもと、成長期における顎関節形成不全改善がOA発症および進行に及ぼす影響を知ることを目的とした。顎関節形成不全をもたらす因子として成長期における軟食、顎関節OAの発症因子として非生理的負荷を想定し、実験を行った。平成23年度では、液状飼料飼育による顎関節形成不全の評価、さらに非生理的負荷を加えた場合の顎関節を、マイクロCTを用いて形態学的に比較検討したので、平成24年度では前年度と同様の実験群(3週齢Wistar系雄性ラットを用い、6週間液状飼料にて飼育する群と通常の固形飼料で飼育する群との2群に分け、さらにそれらを9週齢の時点で非生理的負荷〈最大開口刺激3時間×5日間〉を加える群と無処置の群とに分けた、計4群【対照群、顎関節形成不全群、非生理的負荷付与群、顎関節形成不全+非生理的負荷付与群】)を作製し、【実験1】Toluidine blue染色による下顎頭軟骨形態および厚径の変化の観察を行った。また、同実験群において【実験2】抗カテプシンK抗体による免疫組織化学染色、TRAP染色を行い、下顎頭軟骨および軟骨下骨の破壊様相の観察を行った。【実験1の結果】軟骨層に厚径は、対照群と比較して、他の全ての群において減少していた。特に肥大細胞層においてその差が顕著であった。また、部位別では、前方部において顎関節形成不全+非生理的負荷付与群の軟骨層厚径の減少が顕著である傾向が認められた。【実験2の結果】カテプシンK陽性細胞が、軟骨の肥大細胞層および軟骨下骨の破骨細胞に観察された。対照群と比べ、顎関節形成不全+非生理的負荷付与群のカテプシンK陽性細胞およびTRAP陽性細胞が多く認められる傾向にあった。平成23年度では、液状飼料飼育による顎関節形成不全の評価、さらに非生理的負荷を加えた場合の顎関節を、マイクロCTを用いて形態学的に比較検討した。平成24年度では、前年度と同様の実験群(3週齢Wistar系雄性ラットを用い、6週間液状飼料にて飼育する群と通常の固形飼料で飼育する群との2群に分け、さらにそれらを9週齢の時点で非生理的負荷〈最大開口刺激3時間×5日間〉を加える群と無処置の群とに分けた、計4群【対照群、顎関節形成不全群、非生理的負荷付与群、顎関節形成不全+非生理的負荷付与群】)を作製し、Toluidine blue染色による下顎頭軟骨形態および厚径の変化、TRAP染色による軟骨下骨の破壊様相の観察を行った。平成25年度では、24年度と同様の実験群4群を作製し、抗カテプシンK抗体および抗MMP-13抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。【結果】顎関節形成不全+非生理的負荷付与群において、軟骨下骨の骨梁構造に顕著な退行性変化が認められていた下顎頭中央部から後方部で、MMP-13陽性細胞数の有意な増加を認めた。また、他の群では認められない無細胞領域が限局して存在し、細胞レベルでのOA様変化が観察された。以上の結果から、成長期における咀嚼機能の低下に伴う顎関節の形成不全が顎関節OAの発症および進行を誘発することが示唆された。【実験1】3週齢

Wistar系雄性ラットを用い、6週間液状飼料にて飼育する群を実験群、通常の固形飼料で飼育する群を対象群とした。9週齢にて、4%paraformaldehydeにて灌流固定を行い、頭部を一晩同液にて浸漬固定し、マイクロCT(SMX-90CT、SHIMADZU)撮影後、分析ソフト(TRI/3D-BON、RATOC)による下顎頭の3次元的な形態評価および下顎頭軟骨下骨の3次元的骨梁構造評価を、下顎頭の前方部、中央部、後方部の3部位において行った。【実験1の結果】対照群と比較して、実験群の3部位全てにおいて、骨量が有意に少なく、骨梁間距離が有意に大きいことが示された。また、実験群の下顎頭前方部において対照群と比較して骨梁の方向性が異なることが観察された。以上より、成長期における液状飼料飼育が顎関節の形成不全をもたらすことが明らかとなったため、本研究に用いる顎関節形成不全モデルが再現性の高い妥当な動物実験モデルであると評価された。【実験2】3週齢Wistar系雄性ラットを用い、6週間液状飼料にて飼育する群と通常の固形飼料で飼育する群との2群に分け、さらにそれらを9週齢の時点で非生理的負荷として最大開口刺激3時間を5日間加える群と無処置の群とに分け、計4群(対照群、顎関節形成不全群、非生理的負荷付与群、顎関節形成不全+非生理的負荷付与群)を作製した。実験1と同様の評価を行った。【実験2の結果】現在解析中であるが、対照群と比較して、他の3群の3部位全てにおける骨量が少なく、さらに顎関節形成不全+非生理的負荷付与群の骨量が最も少ないという傾向が把握できた。本研究は、成長期における咀嚼機能の低下に伴う顎関節の形成不全が顎関節OAの発症および進行を誘発するが成長期に顎関節の形成不全を改善するとそれらが軽減されるという仮説のもと、成長期における顎関節形成不全改善がOA発症および進行に及ぼす影響を知ることを目的とした。顎関節形成不全をもたらす因子として成長期における軟食、顎関節OAの発症因子として下顎頭への非生理的負荷を想定し、実験を行った。これまでに実験群(3週齢Wistar系雄性ラットを用い、6週間液状飼料にて飼育する群と通常の固形飼料で飼育する群との2群に分け、さらにそれらを9週齢の時点で非生理的負荷〈最大開口刺激3時間×5日間〉を加える群と無処置の群とに分けた、計4群【対照群、顎関節形成不全群、非生理的負荷付与群、顎関節形成不全+非生理的負荷付与群】)を作製してきた。その後マイクロCTを用いた形態学評価として下顎頭軟骨下骨の骨梁構造の観察を行い、組織学的評価としてToluidine blue染色による下顎頭軟骨形態および厚径の変化の観察を行った。また抗カテプシンK抗体および抗MMP-13抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。平成26年度ではこれまでの研究成果を論文として発表に至った。【結果】顎関節形成不全+非生理的負荷付与群において、軟骨下骨の骨梁構造に顕著な退行性変化が認められていた下顎頭中央部から後方部で、MMP-13陽性細胞率の有意な増加を認めた。カテプシンKにおいても同様の傾向を認めた。また、他の群では認められない無細胞領域が限局して存在し、OA様変化が観察された。以上より成長期における咀嚼機能の低下に伴う顎関節の形成不全が負荷に対する抵抗性の低下を誘発し、成長期における顎関節への適度な機械的刺激が正常な顎関節の成長や負荷に対する抵抗性の獲得に重要であることが示唆された。
紅藻Cyanidium caldarium由来光化学系II複合体のX線結晶構造解

本研究の目的は紅藻Cyanidium caldariumを用いて、真核生物の光化学系II (PSII)複合体の結晶構造を明らかにすることである。それにより真核生物におけるPSIIの構造と機能を解明するとともに、原核生物PSIIの構造との違いと進化に伴うPSII構造の最適化の過程を明らかにする。さらに高分解能でのPSIIの構造解析を行い、酸素発生反応を触媒しているMn4Caクラスターの詳細な構造と、酸素発生反応のメカニズムを解明する。これらを遂行するため、今年度では結晶の分解能の向上、位相取得のための重原子同型置換体の作成、及び構造解析を行った。昨年度まで好熱性、好酸性紅藻Cyanidium caldariumを用いてPSIIの精製・結晶化を行い、Spring-8のX線を利用して分解能2.9Åの回折データを収集することに成功していた。本年度では、結晶の分解能をさらに向上させるため、精製方法・脱水処理条件の改善などを行い、分解能2.74Åの回折データを得ることに成功した。また重原子同型置換体作成では昨年報告した重原子の他に、さらに2種の重原子置換体結晶から位相を取得することに成功した。得られた位相情報を用いて構造解析を行った結果、シアノバクテリアには存在せず、紅藻に存在する4つ目の表在性タンパク質であるPsbQ'の立体構造・結合位置を明らかにすることができた。さらにシアノバクテリアには存在しない新たな膜貫通サブユニットの存在も示唆された。本研究で取得したデータをもとに、紅藻PSIIの詳細な構造解析が可能となった。本研究の目的は紅藻Cyanidium caldariumを用いて、真核生物の光化学系II(PSII)複合体の結晶構造を明らかにすることである。これらを遂行するため、今年度では結晶の分解能の向上と位相取得のための重原子同型置換体作成を行った。分解能の向上のため、精製方法・結晶化条件の改良、結晶の脱水処理条件の最適化を図った。精製では純度向上のため、再結晶化の手法を取り入れ、大量スケールで結晶化を行い、結晶のみを回収し、溶解した。この手順を繰り返すことにより、以前より高い再現性で高純度のPSII標品を得ることに成功した。紅藻PSII結晶では、結晶中の水分子を少なくし、結晶中のタンパク質分子のパッキングを密にする脱水処理を行い3.7Å分解能の回折データを得ている。この脱水処理の手法・溶媒の組成を最適化し、2.9Å分解能の回折データを収集することに成功した。この回折データは現在報告されているシアノバクテリア由来のPSII構造と同等の分解能であり、詳細な紅藻PSII構造の解明に向けた大きな進展が得られた。位相情報取得用の重原子誘導体を作成するため、各種重原子のスクリーニングを行った。その結果、紅藻PSII結晶に適した重原子化合物を絞り込むことができ、Ta化合物を付加させた結晶のX線回折実験により6Åの初期位相を得ることに成功した。
水中橋梁の流体力学的動的応答解析法に関する基礎的研究

鉄筋コンクリート製で厚み比2の筒状楕円柱体を構造本体とする水中トンネル(橋梁)か、海面下30mの位置に設置されて一様流速の潮流の作用下にある場合を想定し、構造本体周りの高レイノルズ数領域R_e≧10^7における流れ場を離散渦法により解析して非定常流体力と各種の流体力学的特性値を計算した。構造本体の抑え角αを0°から5°まで1°間隔で変化させて時間的に変動する抗力係数、揚力係数およびモーメント係数の時間平均値C_D, C_L, C_Mを求めたところ、抗力係数は抑え角によらばにほぼ一定でC_D【similar or equal】0.71、揚力係数とモーメント係数は抑え角におおむね比例し、C_L【similar or equal】0.054α, C_M【similar or equal】0.0011αの関係が成り立つことが判明した。なお、揚力係数とモーメント係数の時間的な変動に周期性が存在することに着目し、変動が安定している区間のデータに高速フーリエ変換を施してパワースペクトル密度関数を求めると、狭帯域の周波数特性を示した。そこで、この密度関数の卓越する極大値に対応する周波数を渦放出周波数とみなして計算したストローハル数S_nは迎え角によらずにほぼ一定の値,S_n【similar or equal】0.36になることが判明した。次に、数値解析用に設定した水中トンネルの構造モデルを弾性支承上の5径間連続梁とみなし自由振動解析を行うと、鉛直面内における曲げ自由振動対称1付き振動数が渦放出周波数およそ3.6倍になった。しかし、この計算結果から直ちに渦励振などの流体力学的に不安定な現象が発生しないとの結論を引き出すのは早計である。構造本体の運動が渦の放出周波数に影響を与えて両者の周期運動が同期する、いわゆる同期現象が発生する危険性については、今後の検討課題である。厚み比2の筒状楕円柱体を構造本体とする水中橋梁が、海面下数十メートルの位置に設置されて一様な流速の潮流が作用する場合を想定し、これに離散渦法を適用することにより高レイノルズ数領域(R_e≧10^7)における流れ場を解析し、非定常流に対するブラジウスの公式を利用して構造本体に作用する流体力を算定した。さらに、揚力係数C_Lの時間的変動に周期性が認められることから、高速フーリェ変換を利用して求めた揚力係数のパワースペクトル密度関数は狭帯域特性を示すので、この極大値に対応する周波数より渦放出周波数を決定して、ストローハル数S_nを算出した。その結果、ストローハル数は迎え角に関係せずほぼ一定の値、S_n【similar or equal】0.35になった。次いで、解析用構造モデルを作成し、バネ支承上の連続梁として自由振動解析を行ったところ、第一次の振動数は渦放出周波数の5倍程度になったが、同期現象発生の危険性の有無については、今後の検討課題であると考える。最後に、厚み比2の楕円柱体の抗力係数とストローハル数に関してNACAにより発表された実験データを臨界レィノルズ数を越えて外挿し、離散渦法による計算結果と比較したところ、数値計算の妥当性を推測するに足る一致が見られた。従って、高レィノルズ数の領域において、鈍頭物体に作用する流体力を合理的に算定するという所期の目的は、ほぼ達成されたと考えられる。

鉄筋コンクリート製で厚み比が2の筒状楕円柱体を構造本体とする水中トンネル(橋梁)が、海面下30mの位置に設置されて一様流速の潮流の作用下にある場合を想定し、構造本体周りの高レイノルズ数領域(Re≧10^7)における流れ場を離散渦法により解析して非定常流体力と各種の流体力学的特性値を算定した。なお、揚力係数とモーメント係数の時間的な変動の周期性に着目して高速フーリエ変換を利用してパワースペクトル密度関数を求めたところ、狭帯域の周波数特性を示した。この極大値に対する周波数を渦放出周波数とみなして算定したストローハル数S_hは迎え角によらずほぼ一定の値、S_h【similar or equal】0.36になった。次に、水中トンネルの構造モデルを弾性支承上の5径間連続梁とみなして自由振動解析を行ったところ、鉛直面内における曲げ振動の対称1次振動数が渦放出周波数のおよそ3.6倍になった。しかし、この研究では構造本体の運動と流れ場との相互干渉を考えていないので、この計算結果から渦励振などの流体力学的不安定現象が発生しないとの結論を引き出すのは早計であって、同期現象が発生する危険性については今後の検討課題であると考える。
心タンポナーデ患者のDysphoria

University Hospitals of ClevelandのInstitutional Review Boardから8月11日に正式なデータ収集の許可が降りた。データ収集者をCase Western Reserve University, Frances Payne Bolton School of Nursingで募集したところ、即日応募者があり、面接の上、決定した。データ収集場所となる同病院Surgical Intensive Care UnitとCardiac Intensive Care Unitにおいて、看護スタッフの協力を得るため、研究の概要とデータ収集について説明した。同病院でのデータ収集を行うにあたり、経費を名古屋大学から送金する必要があり、病院CEOと名古屋大学医学部長との間で覚書が交わされる必要性が生じた。覚書は10月31日に両者のサインがされ、11月1日からデータ収集開始となった。データ収集者は週3回、両ICUを訪ねて潜在的対象患者がいないかどうかを調べ、対象者がいる場合は、主治医と主任看護師にインタビューできるくたいに状態が安定しているかを尋ね、許可が降りたら患者にインタビューを依頼する。2007年2月11日の時点で9人の患者に打診し、6人の患者にインタビューすることができている。6人の内訳は男性4人女性2人で4885歳。心タンポナーデの原因は、癌が2人、感染2人、出血傾向1人、その他1人である。心嚢穿刺前の血圧は116175/4991mmHgと低下はしていなかったが心拍数は84118/minとやや頻脈傾向であった。血圧・心拍数は穿刺後も著明な変化は見られていない。6人中、ふたりはまったく自覚症状がなかったが、それ以外の患者は息苦しさや胸痛とともに、死にそうな感じや、恐怖・不安を感じたを答えた。現在、引き続きインタビューを行うとともに、既存の6人のデータを整理中である。2004年10月の採択通知後、米国クリーブランドのCase Western Reserve大学Dr. Dale Alderに連絡し、コンタクトパーソンとして、University Hospitals of Clevelandのリサーチナースである、Ms.Laura Hickyを紹介してもらった。Lauraに本研究の概要を伝え、Institutional Review Board申請へのステップについての説明を受けた。病院指定の様式に、研究概要、研究計画、Informed Consent見本を記入し、本研究補助金申請書の英語訳を添えて、12月に電子メールに添付して提出した。その下書きに対し、修正の要請が2月になってから届いたため、現在修正中である。また、正式な申請のためには、同大学がウェブ上で公開している、研究倫理についての講義を複数受講しなくてはならず、現在、受講途中である。データ収集者については、同大学看護学部のDr. Sara Douglasに、同大学大学院生の中から、希望者を募り、人選を依頼中である。データ収集予定施設であるCase Western Reserve大学病院のリサーチナースであるLaura Hickelと電子メールでのやりとりにより、同大学関係者の研究協力が必要であるとの判断から、同病院CCUのCNSであるJannet Kloosの協力を得ることで許諾を得ることができた。その後、大学の倫理審査会(Institutional Review Board:IRB)の申請書類を整え、8月14日から19日まで渡米して、IRB managerのPhil Colaと面談し、IRB申請書の修正、科研費の支払い方法などについて協議した。同病院の施設使用料については病院と本学との間でsubcontractを結ぶ方針となった。また、研究の具体的な手順について検討し、データ収集場所を外来からICUへと変更し、それに伴ってデータ収集方法を修正した。研究協力者のJannet Kloosとも数回面談し、役割分担を明確にした。データ収集を行う大学院生の募集と採用、ICU師長の許諾レターの取得をJannetが担当する。大学院生は患者インタビューに先立ち、該当ICUの医師・看護師に研究概要を説明することとした。また、大学院生が患者に説明する説明文、医師・看護師への説明文、心タンポナーデ患者が入室した際に知らせてもらえるように周知するポスター、インタビュー用紙などを作成した。帰国後、さらにIRB申請用紙を修正してLauraへ送り、同大医学部IRBに提出した。10月25日に医学部IRBから許可が下り、その後全学IRBに提出された。現在、その結果を待っているところである。インタビュー調査に先立ち、カルテレビューした研究の論文はAmerican Journal of Critical Careに投稿したが、現在投稿を受け付けておらず、Heart and Lungに投稿した。9月に査読結果が届き、現在論文修正中である。

心タンポナーデの原因は、癌が2人、感染2人、出血傾向1人、その他1人である。心嚢穿刺前の血圧は116175/4991mmHgと低下はしていなかったが心拍数は84118/minとやや頻脈傾向であった。血圧・心拍数は穿刺後も著明な変化は見られていない。6人中、ふたりはまったく自覚症状がなかったが、それ以外の患者は息苦しさや胸痛とともに、死にそうな感じや、恐怖・不安を感じたを答えた。現在、引き続きインタビューを行うとともに、既存の6人のデータを整理中である。
地域変化と空間規模との関係についての地理学的研究

本研究の目的は、地域変化を空間規模の中で究明することにあった。そこで行った論理研究では、変化の視点を明らかにすることであった。まず変化を景観の変化、空間関係の変化、構造の変化に分けて分析を進めた。景観の変化は、地理学において最も伝統的なものであるが、景観の変化は、明確に質としての変化と規定することは難しい。それは景観が個々の要素の変化としてとらえられ、或る空間規模での全体の景観の変化としてはとらえにくいからである。しかし地理学では全体の変化を問題とする。それには景観を可視的なものとしてとらえるにとどまらず、機能を伴った景観を考えるべきである。それは結局要素間の変化、構造の変化へ移行していく。従って景観の変化は分析の端緒として位置づけられ、ここから分析を開始し、関係の変化、構造の変化へつながっていくという論理構造が明らかになった。次の空間関係の変化としては、具体的には都市・農村関係、大都市と周辺中小都市との関係などが分析された。関係の変化は空間的に拡げていくと無限になり、関係の変化はとくに空間規模を限定する必要にせまられた。空間規模を限定すると、その規模に応じた構造が析出され、構造の変化へと移行していく。構造の変化は、結局限定された空間規模下における関係の変化としてとらえられることとなった。このような論理に基づいて、都市及び農村、更には時間的に近世以降を対象として分析した。その結果、地域の変化は時間変化を軸としつつも、空間規模も限定することによって明確になることが論証され、本研究の目的は達成されたものと考えられる。地域変化の論理が明確になった現在、今後の課題としては次のように考える。即ち、地域変化は大変多様であるので、ただ単に変化を究明するにとどまらず、変化をタイプ分けし、いくつかの地域変化のモデルを作成することであると考える。