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血管柄付き脊髄移植の脊髄再生医療における可能性の検討

血管柄付き神経移植は、シュワン細胞が高率に生着するため従来の神経移植に比べて優れた神経再生が得られることが判明している。これまで当科では様々な症例に対して血管柄付き神経移植を行い、良好な結果を得ている。脊髄損傷治療への新たなるアプローチをしていくため、今回我々はこの技術、概念の中枢神経への応用を検討した。本実験で、血流をもった末梢神経の移植を脊髄切断部位に行い、組織学的に評価を行ったところ、短期間のフォロー(10日間)で既に神経膠細胞の生着、線維性瘢痕の抑制に関して有意な効果をもつことが証明された。血管柄付きの移植をした場合はシュワン細胞の非常に良好な生着が得られ、4型コラーゲンの免疫染色から線維性瘢痕が優位に抑えられていることが分かった。線維性瘢痕の制御は、中枢神経再生の問題点を克服する重要なポイントであることが再生医療の分野でも指摘され続けており、マイクロサージャリーによる血行を有した神経の移植はこの問題のブレイクスルーになり得ると考えられた。この研究は、形成外科的見地から超微小血管吻合技術を用いて、実験動物においても今までされたことのない血流を有した脊髄移植または末梢神経植移を行い、再生医療との組み合わせにより脊髄損傷の症状を改善し、脊髄の再生を組織学的に評価することを目標としている。まずは第一段階の実験として、種々の急性脊髄損傷ラットモデルを用いて確実な術式の確立に成功し、運動機能評価により虚血時間のない脊髄移植症例や血管柄付き末梢神経(肋間神経を使用)移植症例で、2週間後に下肢運動機能に変化が現れたことを確認した(Academic Collaborations for Sick Children第2号に採択済、印刷中(発行University of Tokyo, Academic Collaboration Society))。組織学的な評価は、まず比較的手術操作が簡便な末梢神経移植症例で行ったが、血管柄付き末梢神経移植症例では脊髄内のドーパミン作動性ニューロンが損傷部を越えて伸長している所見が得られた。また、近年中枢神経再生における直接的な阻害因子としてコラーゲンなどの細胞外マトリックスを含む線維性瘢痕の関与が特に着目されているが、血行の豊富な移植神経組織周辺では線維性瘢痕の形成が抑えられていた。これに対して、血行の無い神経組織を移植したコントロール症例では移植組織が壊死・崩壊していた。今後はこの血管柄付き末梢神経移植症例の、さらに詳細な免疫組織染色を加えた論理的分析とより多くの症例の評価を加えていきたい。そして、論理的にその可能性が証明できればiPS細胞などの再生医療技術との併用療法を行う方針である。さらに、手術操作がより高度な虚血時間の無い血管柄付き脊髄移植症例においても同様の組織学的評価を行い、再生医療技術とのハイブリッドによる治療も検討したい。【目的】血管柄付き神経弁は、シュワン細胞が高率に生着するため従来の神経移植に比べて優れた神経再生が得られることが判明している。今回は脊髄損傷ラットを用いて、この技術、概念の中枢神経への応用を検討した。【方法】過去にラットで肋間神経を束ねた形で切断部に移植し、軸索伸長と機能回復が認められたという報告が世界中で注目を浴びたが、手技が複雑なため十分な数の追試が試みられていない。今回この報告の追試としてのgroup (groupAとする)と、この方法に準じて作成した脊髄損傷モデルに血管柄付き神経移植を行ったgroup (groupB)とで組織学的に比較を行った。GroupAでは250gのメスのSD系ラット4匹に対し、フリーで末梢神経(肋間神経)の移植を行いβFGFを投与、移植神経をフィブリン糊で固定した。また血管柄付き末梢神経移植をおこなったgroup (GroupBとする)はgraupAの場合と同様に作成した脊髄損傷ラットに血管柄付き末梢神経(肋間神経)移植をisland nerve flapとして行った。術後10日で組織学的評価を行った。【結果】フリーで移植をしたgroupAではほとんどの場合組織が壊死・崩壊しており、生着しても瘢痕組織が増生していた。またフィブリン糊は周囲に線維芽細胞の出現が著明であり神経再生を阻害する要因とも考えられる所見であった。GroupBの血管付き神経移植のものは移植組織の形態は維持されており、KB染色上もシュワン細胞が生着していることが確認された。【総括】

今回は術後に十分なフォローアップ期間を設けることができなかったが、線維性瘢痕を抑えることが中枢神経再生の問題点を克服するポイントであることが再生医療の分野でも指摘され続けており、マイクロサージャリーによる血行を有した神経の移植はこの問題のブレイクスルーになり得ると考えられた。
心材リグナン生合成の制御に関する基礎研究

本研究では、心材成分の生合成の制御に関する基礎的知見を得るため、心材リグナンおよびノルリグナンの生合成機構について検討し、以下の結果を得た。まず、ヒノキ心材リグナン(ヒノキニン)の生合成前駆体の精査を行い、新規リグナン1種とヒノキニンの生合成前駆体(構造既知リグナン)7種、およびヒノキニンの代謝物と考えられる2種のリグナンを単離・検出した。さらに、重水素標識体を用いたフィーディング実験により、ヒノキにおけるリグナン合成経路の概略を解明した。また、もうひとつの代表的心材リグナン(ヤテイン)の生合成経路を、シャクおよびイエローフラックスを用い、競合フィーディング実験によって決定した。なお、本実験方法は、近年特に重要になっているメタボローム解析に極めて有用であることも示された。次いで、心材リグナン生成反応の解析を行うため、モデル系(ジンチョウゲ懸濁培養細胞、ゴボウ、イエローフラックスとシャク)を確立し、これらのモデル系を用いて、リグナン生合成経路上の上流部の立体化学について検討した。その結果、種々の植物種におけるリグナン生合成の立体化学が極めて多様であることが示された。また、本研究で初めて、ノルリグナンが2種の異なるフェニルプロパノイドモノマー(p-クマリルアルコールとp-クマロイルCoA)のカップリングに由来することを見い出した。そして、この反応を触媒する酵素活性を初めて見い出した。現在この酵素の生成、cDNAクローニングを行っている。最後に、心材リグナン生成モデル植物(ベニバナ)のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、リグナン合成に関わる種々のOMTのcDNAクローニングを継続中ある。既に、数種のOMT cDNAのクローニングを行い、現在組換え酵素を用いた酵素機能の解析を行っている。本研究の最終目的は、心材成分の生合成の制御に関する基礎的知見を得ることである。当初特に心材リグナンの生合成に着目して研究をすすめることとしていたが、もうひとつの重要な心材成分であるノルリグナンの生合成についても併せて検討した。本年度の研究では、まず、ヒノキの心材リグナン(ヒノキニン)の生合成前駆体の精査を行い、新規リグナン1種とヒノキニンの生合成前駆体(構造既知リグナン)7種、およびヒノキニンの代謝物と考えられる2種のリグナンを見い出した。加えて、重水素標識体を用いたフィーディング実験を行うにより、ヒノキにおけるリグナン合成経路の概略を解明した。次いで、心材リグナン生合成には、フェノール性水酸基のメチル化が関わる場合が多いことから、心材リグナン生合成のモデル植物(ベニバナ)から既に構築したcDNAライブラリーを種々の方法でスクリーニングすることにより、リグナンメチル化酵素のクローニングを行っている。また、心材リグナン生成反応の立体化学を検討するためのモデル系を確立するため、ジンチョウゲを用い、リグナンを産生する培養細胞系を確立した。一方、ヒノキの心材ノルリグナン(ヒノキレジノール)を産生するアスパラガス培養細胞を確立した。この系を用いて、ノルリグナンの全炭素がケイヒ酸経路に由来することを初めて証明すると共に、ノルリグナン生成の直前の前駆体モノマーを見い出した。次年度の研究では、心材リグナン合成酵素の遺伝子クローニングとその発現調節機構の解明、ノルリグナン生成酵素活性の検出/精製/遺伝子クローニングを行う予定である。

本年度の研究では、まず、1)心材リグナン生成反応の解析を行うため、モデル系(ゴボウ、イエローフラックスとシャク)を用いて、リグナン生合成経路上の上流部の立体化学について検討した。その結果、種々の植物種におけるリグナン生合成の立体化学が極めて多様であることが示された。2)次いで、心材リグナン、ヤテイン、の生合成経路を競合フィーディング実験によって決定した。また本実験方法は、近年特に重要になっているメタボローム解析に極めて有用であることが示された。3)さらに、本研究で初めて、ノルリグナンが2種の異なるフェニルプロパノイドモノマー(p-クマリルアルコールとp-クマロイルCoA)のカップリングに由来することを見い出した。そして、この反応を触媒する酵素活性を初めて見い出した。現在この酵素の生成、cDNAクローニングを行っている。4)最後に、心材リグナン生成モデル植物(ベニバナ)のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、リグナン合成に関わる種々のOMTのcDNAクローニングを継続中ある。
脳の微小循環レベルでの血液循環・酸素供給・神経細胞活動の総合的解析

循環器系の失調による脳の機能障害、特に脳虚血状態、に関連して、血流状態ならびに血液のレオロジー的性質の変化の両面から、脳への酸素供給ならびに神経細胞の局在機能への影響について微小循環レベルでの総合的かつ基礎的な研究を行った。(1)総頸動脈ならびに上腸間膜動脈の血流量は心拍動に同期して変化し、その血流量が変化すると、微小血管領域の赤血球流速も比例的に変化した。総頸動脈による脳への血流には左右代償性の変化が見られ、一側の血流量が減少すると、他側が増加した。末梢組織の酸素分圧、血液の酸素飽和度、血流量の間に密接な関係が認められた。(2)酸素透過性のある人工微小流路を用いた基礎実験で、赤血球流速、赤血球量、赤血球変形能、赤血球の形態変化、赤血球流の圧縮、高分子物質による赤血球集合と酸素放出との関係を明らかにした。特に、単一の赤血球が膨潤したり、赤血球同士が集団で、あるいは密着して流れるときには、赤血球内部あるいは集合体内部から外部への酸素の拡散距離が増大し、酸素放出が抑制されることが示された。(3)末梢組織における赤血球の酸素化・脱酸素化過程においてpHや炭酸ガス分圧の変化が赤血球の形態変化を介して赤血球集合に影響することが示された。代謝活動の活発な組織では、赤血球は球形化傾向を示し、赤血球集合を抑制して酸素供給を促すことを明らかにした。(4)日常生活と関連して、高脂肪食を摂取すると、一過性に血漿中のトリグリセリド濃度が上昇し、赤血球集合が促進されることがわかった。現象が一過性であっても、生体内では循環障害が起こっており、動脈硬化発症への危険性が示唆された。(5)大脳皮質領域ならびに腸間膜の微小血管網に対して顕微鏡下に反射照明法と透過照明法によって画像処理法を駆使して赤血球の循環状態(赤血球濃度)と酸素放出状態(赤血球の酸素飽和度)の二次元画像化に成功した。さらに、単一の微小血管についても血管断面における赤血球の流動分布状態と酸素飽和度の変化を定量的に画像表現できた。(6)人工微小流路と生体の微小血管で行われた実験結果の相違点を総括した。微小血管では、人工微小流路に比べて、循環状態の変化に対して赤血球の流動挙動の変化が顕著に発現し、管の弾力性、したがって生体では血管の硬化性病変、が重要な要因であることが示された。(7)脳への赤血球の循環動態(総頸動脈の血流)が変化したとき、脳組織への酸素供給状態が変化し、これにともなって誘発電位(知覚領)の発生状況によって解析された大脳皮質の電気活動は抑制された。(8)脳の機能維持機構を各種機能調節物質と関連させて遺伝子から分子レベルで検討した。特に、神経細胞とマイクログリアの液性調節因子による相互機能調節について有益な情報が得られた。以上、微小血管網の血流ならびに赤血球の流動状態は、血管自身の弾力性や幾何学的変化だけでなく、血液のレオロジー的性質によっても変化し、脳組織への酸素供給状態、ひいては脳の機能に大きな影響を与えることが明らかとなった。

(6)人工微小流路と生体の微小血管で行われた実験結果の相違点を総括した。微小血管では、人工微小流路に比べて、循環状態の変化に対して赤血球の流動挙動の変化が顕著に発現し、管の弾力性、したがって生体では血管の硬化性病変、が重要な要因であることが示された。(7)脳への赤血球の循環動態(総頸動脈の血流)が変化したとき、脳組織への酸素供給状態が変化し、これにともなって誘発電位(知覚領)の発生状況によって解析された大脳皮質の電気活動は抑制された。(8)脳の機能維持機構を各種機能調節物質と関連させて遺伝子から分子レベルで検討した。特に、神経細胞とマイクログリアの液性調節因子による相互機能調節について有益な情報が得られた。以上、微小血管網の血流ならびに赤血球の流動状態は、血管自身の弾力性や幾何学的変化だけでなく、血液のレオロジー的性質によっても変化し、脳組織への酸素供給状態、ひいては脳の機能に大きな影響を与えることが明らかとなった。脳への血液循環動態が様々な血管ならびに血液の要因によって変化したとき、脳への酸素供給の変化と脳の神経細胞の局在機能への影響を調べることを目的として、今までの実績に基づいて測定装置の組立を行い、本年度は以下の実験成果を得た。(1)基礎モデル実験:赤血球浮遊液を酸素透過性のある人工微小流路に灌流し、赤血球からの酸素放出が、流速の増加、赤血球量の減少、赤血球集合の促進によって低下することを定量的に示した。(2)基礎実験として、麻酔下のラットの腸-腸間膜を剖出し、上腸間膜動脈に超音波トランジットタイム血流計のプローベを装着して血流を測定した。血流量は心拍動に同期して変化した。平均流量は8.99.1ml/minでほぼ一定であった。同様に、総頸動脈についても、9.09.2ml/minの血流量を測定した。(3)基礎実験として、麻酔下のラット腸間膜を用いて、上腸間膜動脈の血流量が変化すると、末梢の微小血管内の赤血球流速も比例的に変化することがわかった。(4)ラット脳表面の微小循環動態と血液の酸素飽和度を観察し、波長の異なる6枚の干渉フィルターを通して得た画像をもとに、微小血管網の二次元画像化に成功した。しかし、酸素飽和度については、定量測定が可能であったが、循環赤血球量については、定量的測定のために改良が必要であった。(5)脳への血流に影響する血液要因と関連しては、血漿中のトリグリセリドが赤血球集合を促進することを見いだした。(6)脳表面の単一の微小血管内における赤血球流速を新しく開発した画像処理法を用いて測定することに成功した。(7)定量的かつ再現性のある測定結果を得るために、顕微鏡ステージと焦点調節機構部の関係を改造中である。(8)神経細胞の機能維持にセリンとグリシンの濃度の重要性を指摘した。脳への血液循環動態が様々な血管ならびに血液の要因によって変化したとき、脳への酸素供給の変化と脳の神経細胞の局在機能への影響を局所的レベルで調べることを目的として、基礎的実感並びに動物実験を行い、次の成果を得た。(1)酸素透過性のある人工微小流路を用いた赤血球浮遊液の灌流実験で、高分子デキストランによる赤血球集合流ならびに遠心力による圧縮赤血球流によって赤血球からの酸素放出が低下することを示した。ウサギの単離腸-腸間膜標本を用いて検討した結果でも、赤血球集合による酸素放出の抑制が認められた。(2)脳への血流に影響する最もポピュラーな病態の中で、血漿中のトリグリセリドの増加が赤血球集合を促進することを見いだした。(3)麻酔下のラットの腸-腸間膜を剖出して上腸間膜動脈の血流量を変化させた。微小血管周囲の酸素分圧を人工的に低下させると、血液の酸素飽和度は末梢へ行くに連れて低下するが、上腸間膜動脈の血流量が減少すると、微小血管の赤血球流速も低下し、酸素飽和度は一層低下した。
遺伝子活性型生体材料の開発に関する実験的研究

ヒトBMP-2cDNAを組み込んだプラスミドベクターを腎臓由来細胞HEK293細胞に遺伝子導入し、これをコラーゲンスポンジ(ハニカム)内部にて三次元培養に成功した。それをヌードマウス皮下に埋入したところ、良好な骨形成が観察された。その他にも製造方法が異なるいくつかのコラーゲンスポンジ(ヘリスタット^<【○!R】>、スポンゼル^<【○!R】>)にて同様の方法にて試みたが、ハニカム使用時にて観察された良好な骨形成は観察されなかった。組織学的所見では、ハニカムのみ成熟した骨髄組織を含む骨組織の形成を認めた。ヘリスタット^<【○!R】>は内部に炎症性細胞の浸潤がみられたが、骨組織の形成はなかった。スポンゼル^<【○!R】>では骨組織の形成は認めず、コラーゲン線維が多く残留していた。骨形成が良好であった理由として、ハニカムのもつポア構造の特殊性があげられる。一つ一つのポアはHEK293細胞の育成場としての役割だけではなく、外界とのガス交換や、HEK293細胞自身が分泌したrhBMP-2の放出、それに応答した外からの細胞や血管の侵入に有利な環境、つまり骨形成の足場を構築したのではないかと考えられる。尚、全ての牛コラーゲン材料については、作製した企業の安全承認を得たものを使用したが、今後はハニカム構造をもつ多孔質ハイドロキシアパタイトなど、さらに賦形性を有するものを使用して同様の実験を行う必要がある。これらの研究結果については現在最終的な資料を解析し、発表する予定である。また、本研究の関連として今まで行ってきた、血管柄付き脂肪弁をrhBMP-2を用いて血管柄付き異所性誘導骨を作製する実験であるが、現在投稿中で、査読にて好感触を得ており、おそらく受理されるものと思われる。本研究からさらに発展させ、すなわちこれらの血管柄付き弁に遺伝子を密閉空間内にて直接作用させて、より効率的な遺伝子導入を目指すべく現在研究を進めている。実験は若干の計画の変更に迫られたが、概して予定通り進んでいると思われる。1.目的遺伝子のサブクローニング:私がヒト歯髄のcDNAから単離したhBMP2, hBMP4cDNAをpcDNA3にそれぞれ組み込み、それを大量培養した。2.小動物皮下へのプラスミドの埋入:精製プラスミドをキャリアーに直接滴下し凍結乾燥後、マウスの皮下に移植し、2, 4, 8週後屠殺し、軟X線写真的、組織学的評価を行った。尚キャリアーにはコラーゲンスポンジ、グラスウール、マウス胎盤を用いたが、望む結果は得られなかった。3.初代培養細胞への遺伝子導入:マウス骨髄や臍帯血からの初代培養細胞に上記遺伝子の導入を試みたが、望む結果は得られなかった。4.株細胞への遺伝子導入:293細胞やMC3T3細胞などに種々の方法にて遺伝子導入を試みた結果、293細胞に恒常的な遺伝子の導入が可能であった。5.遺伝子導入された細胞の骨形成能調査実験:hBMP-2cDNAを導入した293細胞を新種のコラーゲンスポンジ内にて三次元培養し、それをヌードマウス皮下に埋入したところ、良好な骨形成が観察された。この三次元培養の技術は未だ報告されていない新しい方法である。
タンパク質の翻訳後糖鎖修飾により生成する動的エピトープを標的とする抗体医薬の開発

西村(研究代表者)はタンパク質の抗原性の本質であるエピトープ(抗原決定基)領域の立体構造は疾患依存的な翻訳後糖鎖修飾の過程でダイナミックに変化するという「抗原構造形成における新たな分子機構」を発見し、このメカニズムで生成する新たな疾患特異的な抗原決定基を「動的エピトープ」と命名した。本研究課題では企図した糖ペプチドエピトープを標的とする抗体をED抗体(epitope-defined antibody)と位置付けて、MUC1の細胞外ドメインに生成する多様な動的エピトープを標的とする新たなED抗体の開発とそれらED抗体からの新しい創薬モダリティーの創出を目指す。タンパク質の糖鎖修飾による機能変動に着目して、疾患と糖鎖の観点から新たな展開を目指す優れた研究提案である。抗体を獲得するための糖ペプチド抗原の調整や抗体アッセイ法、抗体の認識機構解明、創薬に繋がる抗腫瘍活性の評価など、一連の研究計画がよく練られた形で立案されている。ED抗体(epitope-defined antibody)を修飾糖鎖タンパク質に適用する本研究は、研究の重要性が認知されている一方で実際の目標達成が難しい課題である。この課題に挑戦する本研究の学術的意義は十分に高いと判断できる。糖鎖研究において高い実績を持つ研究代表者と構造物性研究を専門とする研究者との連携により、立案された研究計画の達成が見込まれる。
胆道閉鎖症発症におけるSox17遺伝子発現の関与の臨床検体における解析

本研究では胆道系のSox17遺伝子発現異常が胆道閉鎖症発症に至る機序の検証のため、Sox17ハプロ不全マウスに認められる現象がヒト胆道閉鎖症において共通して特異的に認められることを証明する事を目的としている。さらに、この現象の詳細な解析および臨床経過との比較により、ヒト胆道閉鎖症進行の病態の解明を行う。これまでに我々は、ヒト胆道閉鎖症の胆道組織の免疫染色を行い、Sox17の発現の不均一性を認めている。さらに、アルシアンブルー染色による胆道上皮の腺構造化を確認している。これらはSox17ハプロ不全マウスとも共通する所見であり、胆道上皮損傷との関連性の解析を行い、論文発表予定である。これまでにヒト臨床検体の免疫染色および化学染色を行い、その所見の解析を行っている。これまでの結果の発表予定である。また、新たな関連因子の解析を進行中である。これまでのSox17の臨床検体における免疫染色および化学染色の結果から、さらに胆道閉鎖症関連のマーカーの解析が進んでおり、新たな抗体での免疫染色の準備を進めている。この新規抗体を準備し、引き続きの解析を行うために次年度使用額が発生した。
網膜神経節細胞におけるアポトーシスとbc1-2による回避

1,まず、成人ラット網膜より分離した網膜神経節細胞の培養を試みた。分離条件、培養液、培養皿のコーティング条件等培養条件を何種類か変更したが培養は不可能であった。次に、生後1週目までのラットの網膜を用いた。これにより約48時間の培養は可能となった。さらに各種growth factorの培養網膜神経節細胞生存期間への影響を検討した。PDGF(10ng/ml)投与群では特に生存時間に変化を認めなかったが、NGF(100ng/ml)、BDNF(100ng/ml)投与群では軽度の生存時間の延長が認められた。現在、統計処理を行い有意差を検討中である。2,さらに、growth factor非投与群とNGF,BDNF投与群において、DNAの断片化(laddering)がみられるかどうかを検討することによってアポトーシスの有無をみた。しかし、細胞数が少ないため、電気泳動上ladderingが明かとなるのに十分なDNA量を抽出できなかった。このため、現在、これまではラット5匹10眼を用いていたが、20匹40眼にして、細胞数を増加させ、DNAの抽出を行っている。これによるアポトーシスの証明が困難な場合を考慮し、当初予定していた電子顕微鏡を用いたアポトーシス小体の出現の有無も併せて検討中である。
戦後日本における教育学部の成立過程に関する事例研究

本研究は、戦後日本における教員養成系大学・学部の成立過程について、国立公文書館所蔵資料や各大学が所蔵している内部資料を活用することにより、その全体像を解明することを目的としている。かつて船寄俊雄は「教員養成史研究の課題」の一つとして「都道府県別の教育学部史研究」の必要性を指摘し、この研究が進展してこなかった理由として、「教授会や諸種委員会の会議録、教員の履歴簿、学生の成績簿など研究を行う上での基礎史料は、当該大学・学部に所属していない研究者には自由に利用できないという事情」を指摘した(船寄俊雄「解説教員養成・教師論」同編著『論集現代日本の教育史』<第2巻・教員養成・教師論>、日本図書センター、2014年)。本研究は、この船寄の指摘をふまえ、国立公文書館に多数所蔵されている課程認定等に関する史料群や、各大学に所蔵されている内部資料(とくに各大学が設置するアーカイブス組織や、勤務先である愛知教育大学が所蔵する史資料)を活用することにより、これまで指摘されてきた史料的な制約を克服しつつ、戦後日本における教員養成系大学・学部の成立過程を解明することを研究課題としている。本年度は、当初の研究計画に従い、主に下記の2点について作業を行なった。(1)戦後日本の教員養成政策と教育学部史に関する基礎的データの調査・収集・整理を行なった。(2)愛知教育大学教育学部史に関する基礎的データの調査・収集・整理を行なった。とくに(2)に関しては、愛知教育大学(旧・愛知学芸大学)が発行していた『学報』などを中心に、基礎的なデータの調査・収集活動に多くの時間をかけ、現在その全目録の打ち込み作業や、主要な法令等について全文を復刻する作業を継続中である。『学報』の目録等の整理作業については、次年度中に作業を完了させ、資料集の一つとして研究成果としてまとめる予定で計画を立てている。おおよそ当初の研究計画どおり、資料調査や収集活動を行うことができた。ただ、愛知教育大学(旧・愛知学芸大学)に関する基礎的資料の収集作業が多くの資料があるため整理作業に時間がかかっている。『学報』全目録の整理作業も含めて、今後数年間をかけて計画性を保ちつつ、継続的に実施していきたい。愛知教育大学(旧・愛知学芸大学)に関する基礎的資料の収集作業が多くの資料があるため整理作業に時間がかかっている。作業スピードをあげるため、年度の途中から学部生と院生を雇用した。次年度以降も継続して雇用する予定でいる。次年度使用額が生じた理由は、国立公文書館への資料調査の日程をまとまって確保することができなかったためである。次年度、国立公文書館や各大学史資料室等で資料調査を実施するための経費として使用する予定でいる。
口腔バリアの破綻によるう蝕病原性細菌の臓器連関ネットワークへの影響の解明

齲蝕の主要な原因菌であるStreptococcus mutansは、約1020%に菌体表層にコラーゲン結合タンパク(collagen-binding protein; CBP)を発現している。CBP陽性S. mutansは、感染性心内膜炎や脳出血などの全身疾患にも関与することが明らかになってきているが、その詳細については明らかにされていない。本研究では、動物実験およびヒトから採取した口腔検体を用いてCBP陽性S. mutansと全身疾患との関連性について検討を行った。まず、CBP陽性S. mutans株が感染性心内膜炎および非アルコール性脂肪肝炎に及ぼす影響について、動物モデルを用いて検討した。ラットの口腔からCBP陽性S. mutans株を感染させ重度の齲蝕を発生させた後に心臓弁を傷害させたところ、齲蝕病変部に存在したS. mutans株が心臓弁組織中から分離され、感染性心内膜炎を発症することを示した。また、CBP陽性S. mutans株を非アルコール性脂肪肝炎マウスモデルに血中投与したところ、経時的に肝臓の病態が悪化することが明らかとなった。次に、ヒトの口腔検体を用いた研究として、CBP陽性S. mutans株と脳血管疾患およびIgA腎症との関連性について検討した。様々な脳血管疾患に罹患した患者429名から唾液サンプルを採取して分析を行ったところ、心原性脳塞栓症、非心原性脳塞栓症、脳内出血および破裂脳動脈瘤に罹患した患者では、健常者と比較して有意に高いCBP陽性S. mutans株の検出率を示した。また、IgA腎症に罹患した117名の患者では、56名の健常者と比較して有意に高いCBP陽性S. mutans株の検出率を示した。本研究結果から、CBP陽性S. mutansが感染性心内膜炎、非アルコール性脂肪肝炎、脳血管疾患およびIgA腎症との関連性が示唆された。本研究では、動物モデルおよびヒトの口腔サンプルを用いてCBP陽性S. mutansと全身疾患の関連性について分析を行い、感染性心内膜炎、非アルコール性脂肪肝炎、脳血管疾患およびIgA腎症との関連性を明らかにした。これまでの研究から、全身疾患とCBP陽性S. mutansとの関連性について新たな知見を示すことができ、研究は順調に進展していると考えられる。これまでの研究結果から、CBP陽性S. mutansが関わる可能性が明らかになった心臓、脳、肝臓および腎臓に生じる全身疾患について、分析を継続していく予定である。これまでの研究においては、動物モデルおよびヒトの口腔サンプルを用いた分析によりCBP陽性S. mutansが各全身疾患の増悪因子となる得ることを示してきたが、今後の研究ではin-vitro系の分析も行うことによりメカニズムの解明にも着手するとともに、これらの全身疾患の予防法についても検討していきたいと考えている。

これまでの研究においては、動物モデルおよびヒトの口腔サンプルを用いた分析によりCBP陽性S. mutansが各全身疾患の増悪因子となる得ることを示してきたが、今後の研究ではin-vitro系の分析も行うことによりメカニズムの解明にも着手するとともに、これらの全身疾患の予防法についても検討していきたいと考えている。
GPIアンカー側鎖とフリーGPIの生理的・病理的意義の解明

多くのタンパク質の膜アンカーとして機能するGPIアンカーの骨格部分の構造は保存され共通であるが、側鎖によって構造の多様性が生まれる。本研究では、(1)未解明のGPI側鎖形成機構を解明し、GPIアンカーの構造多様性の分子基盤を明らかにする。また、(2)GPI側鎖形成に働く遺伝子のノックアウトマウスを作製して解析し、加えて、これら遺伝子の変異で起こる疾患を発見して、GPI側鎖の生理的意義を解明する。さらに、(3)GPI側鎖研究から見いだした、タンパク質に結合していないフリーGPIの細胞内動態を明らかにする。そして、フリーGPIの異常蓄積が、新規GPI異常症である非典型発作性夜間ヘモグロビン尿症の自己炎症性症状を引き起こす機序を解明して、病理的意義を明らかにする。平成29年度に、Nアセチルガラクトサミンから始まる側鎖にガラクトースを付加する酵素を同定し、それが糖脂質であるGM1ガングリオシドを合成する酵素と同一で、B3GALT4遺伝子の産物であることを見出した。平成30年度は、2つの異なる基質に対してこの酵素の同じ活性部位が働くことと、GPIに働く時には糖脂質であるラクトシルセラミドの存在が必要であることとを見出した。さらに、酵素を過剰発現させればラクトシルセラミドがなくてもGPIに働くことから、ラクトシルセラミドは酵素とGPIの相互作用を促進させると考えられる。次に、タンパク質に結合しないフリーGPIに関して、フリーGPIが一部の組織や細胞株の膜成分として存在していること、小胞体から輸送され細胞表面に発現すること、輸送過程でタンパク質に結合したGPIアンカーと同様に構造が成熟することを示した。また、PGAP4ノックアウトマウスの性状解析を継続した。B3GALT4がGPIにガラクトースを付加するにはラクトシルセラミドが必要であること、フリーGPIが一部の正常組織や細胞株に糖脂質として存在していることを見出すなど、各項目において一定の進捗があった。GPI側鎖形成に関わる新規遺伝子を探索する。GPI側鎖の生理的意義を明らかにするため、PGAP4ノックアウトマウスの性状解析を進展させる。非典型発作性夜間ヘモグロビン尿症の病態解析を進展させる。GPIアンカー型タンパク質は、糖脂質であるGPIで膜にアンカーされていることによって、膜ラフトへの局在など特有の性質を持つ。GPI骨格はタンパク質間で共通であるが、側鎖によって構造の多様性が生まれる。さらに、(3)GPI側鎖研究から最近見いだした、タンパク質に結合していないフリーGPIの細胞内動態を明らかにする。平成28年度には、以下の進捗があった。(1)GPI側鎖の根元のNアセチルガラクトサミンを付加する酵素であるPGAP4に関し、3つの膜貫通ドメイン(TMD)を持つ特異なゴルジ体糖転移酵素であること、特に、N末端側のTMDがゴルジ体局在を決定すること、そしてC末端側の連続したTMDは、糖転移酵素ドメインに挿入され、膜上にあるGPIアンカーに酵素ドメインを近づけていることを証明した。(2)に関し、PGAP4ノックアウトマウスを作製し、ホモマウスが一見正常に成長することを確認した。(3)に関し、非典型発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の異常細胞では、フリーGPIが蓄積し、細胞表面に現れることを証明した。3項目の計画がそれぞれほぼ計画通り進行した。平成29年度には、以下の進捗があった。(1)GPI側鎖の根元のNアセチルガラクトサミンにガラクトースを付加する酵素が、GM1ガングリオシド合成酵素であるB3GALT4と同一であることを証明した。(2)に関し、前年までに作製したPGAP4ノックアウトマウスの性状解析を行った。(3)に関し、非典型発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の異常細胞では、蓄積したフリーGPIがインフラマソームを易活性化状態にしている証拠を得た。補体の関与を明らかにするため、PIGTノックアウトTHP-1細胞をモデル細胞として作製し、補体活性化とインフラマソーム活性化の関係を解析した結果、C5aではなくC5b-9が関与していることがわかった。

3項目の計画がそれぞれほぼ計画通り進行した。多くのタンパク質の膜アンカーとして機能するGPIアンカーの骨格部分の構造は保存され共通であるが、側鎖によって構造の多様性が生まれる。本研究では、(1)未解明のGPI側鎖形成機構を解明し、GPIアンカーの構造多様性の分子基盤を明らかにする。また、(2)GPI側鎖形成に働く遺伝子のノックアウトマウスを作製して解析し、加えて、これら遺伝子の変異で起こる疾患を発見して、GPI側鎖の生理的意義を解明する。さらに、(3)GPI側鎖研究から見いだした、タンパク質に結合していないフリーGPIの細胞内動態を明らかにする。そして、フリーGPIの異常蓄積が、新規GPI異常症である非典型発作性夜間ヘモグロビン尿症の自己炎症性症状を引き起こす機序を解明して、病理的意義を明らかにする。平成29年度に、Nアセチルガラクトサミンから始まる側鎖にガラクトースを付加する酵素を同定し、それが糖脂質であるGM1ガングリオシドを合成する酵素と同一で、B3GALT4遺伝子の産物であることを見出した。平成30年度は、2つの異なる基質に対してこの酵素の同じ活性部位が働くことと、GPIに働く時には糖脂質であるラクトシルセラミドの存在が必要であることとを見出した。さらに、酵素を過剰発現させればラクトシルセラミドがなくてもGPIに働くことから、ラクトシルセラミドは酵素とGPIの相互作用を促進させると考えられる。次に、タンパク質に結合しないフリーGPIに関して、フリーGPIが一部の組織や細胞株の膜成分として存在していること、小胞体から輸送され細胞表面に発現すること、輸送過程でタンパク質に結合したGPIアンカーと同様に構造が成熟することを示した。また、PGAP4ノックアウトマウスの性状解析を継続した。B3GALT4がGPIにガラクトースを付加するにはラクトシルセラミドが必要であること、フリーGPIが一部の正常組織や細胞株に糖脂質として存在していることを見出すなど、各項目において一定の進捗があった。(1)に関し、Nアセチルガラクトサミンにガラクトースを付加する酵素の候補遺伝子を得つつあるので、本体を同定する。(2)に関し、PGAP4ノックアウトマウスの解析を行い、以上の有無を明らかにする。(3)に関し、異常細胞で蓄積したフリーGPIがインフラマソームを易活性化状態にしている証拠を得つつあるので、それを確定する。(1) GPI側鎖の生合成機構の解明。(1-1) GPI-β1,4Nアセチルガラクトサミン転移酵素(GPI-GalNAcT)の全体像解明:GPI-GalNAcTの第2成分の発見をめざし、スクリーニングを継続する。(1-2) GPI-β1,3ガラクトース転移酵素(GPI-GalT)の解明:前年度に同定したGPI-β1,3ガラクトース転移酵素(GPI-GalT)タンパク質を精製し、酵素活性を証明する。前年度に見出したスフィンゴ糖脂質生合成経路との関連を明確にする。(2) GPI側鎖の生理的意義の解明。PGAP4ノックアウトマウスの表現型解析を継続して行う。
発生期におけるAhリセプターの生理機能に関する研究

arylhydrovarbon receptor(AHR)はリガンド依存性に細胞質から核へ移行して転写因子として機能する物質であり,ダイオキシン等環境中の変異原物質による様々な生体反応を仲介している。特に胎生期では薬剤による催奇性に関与している可能性があり,AHRは発生期における形態形成に何らかの役割をもつことが考えられる。AHRの生物作用は未知な点が多いが,発生期における発現部位の決定やその活性化に重要である生体内リガンドの決定は興味深い研究課題である。本研究はマウス胎児を用いて,AHRの発現部位を解析すること,またAHRの生物作用を調べるための基礎として,その核移行シグナル(NLS)を決定することを目的とし,以下の結果を得た。1.発生期におけるAHR発現部位の解析C57blackマウスの胎生18,19日齢および新生仔の脳,肺,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,皮膚よりRNAを抽出し,RT-PCR法によりAHRのRNAレベルでの検出を行ったところ,調べた全ての組織でAHR発現が認められた。本法は組織間での発現量を比較することは困難なため,さらにpolyA RNAを用いてNorthern法による検出を試みたが,発現量は検出限界以下であった。現在,免疫組織染色により発現部位を調べるため,抗AHR抗体を作成中である。2.AHRのNLSの決定β-galactosidaseとAHRの融合蛋白質を発現ベクターを用いてHela細胞で発現させ,その細胞内局在を検出したところ,少なくともAHRのN端側120アミノ酸が核移行に必要であることがわかった。さらにGST-AHR-GFP融合蛋白質を大腸菌で発現させ,Hela細胞に微量注入して,詳細な検討を行ったところ,18アミノ酸を挟む2つの塩基性アミノ酸領域から構成される13-39アミノ酸がNLSとして機能することが示された。
Fontan術後の突然死高リスク患者における電気生理学的特性の解明

成人先天性心疾患(ACHD)の最重症疾患群の一つであるFontan手術後患者は、外科的治療の成績向上によりその多くが成人に達しているが、予後は不良でありその死因として突然死の関与が報告されている。そこで、突然死の病態解明および長期的な突然死と電気生理学的特徴の解明が必須と考える。本研究では、当院ACHD外来での診察、病歴、諸検査結果から突然死リスクが高いと判断された場合に、電気生理学的検査を含めた心臓カテーテル検査を行い、Fontan患者における能動的な突然死リスク評価法を確立する。
変調電解法によるナノ構造酸化物系機能薄膜の創製

ステンレス鋼などのFe-Cr合金を硫酸中で方形波電位変調電解することによりポーラス構造を有する酸化物皮膜を形成することができる。成膜プロセスには2種類あり、クロムの活性態と不働態電位を繰り返し分極するアノード型、および過不働態と不働態電位とを交互に分極するカソード型それぞれによって、形態は類似しているが電気化学的性質の異なった皮膜を生成する。これらの皮膜の、電子的性質を電気化学インピーダンス法ならびに光応答電流法で検討したところ、インピーダンスから得られる界面容量については、アノード型では膜厚に比例して容量が増大することより皮膜を構成する微粒子の表面にて容量を発生し、かつこれらの粒子が相互に連結して下地合金との間に導電性を示す経路が存在することが明らかとなった。一方、カソード型では容量は下地鋼と同様で皮膜厚さに依存しなかった。従って、カソード型膜では構成する微粒子が下地との伝導性を持たずに堆積していることが分かった。一方、光励起によって生じる電子・ホール対の分離によって生ずる光電気化学応答については、アノード型皮膜では応答に厚さに対して極大を示した。これは、厚さの増大に対して電子・ホールが増大するが、再結合確率も増大するためにこのような挙動を示したと思われる。一方、カソード型ではインピーダンス同様、厚さに依存しない光応答を示した今後ポーラスな構造と電子的特性を生かした機能電極表面への応用が期待される。本研究ではSUS304ステンレス鋼を50度の10規定硫酸中でクロムの活性態と不働態電位、あるいは過不働態と不働態電位とを交互に分極することにより、ステンレス鋼に通常生成する不働態皮膜よりもはるかに厚い、干渉色を示す数μmにも達する酸化物皮膜を形成できた。透過電子顕微鏡などを用いた解析により、この皮膜は数nm程度の粒子状組織の集積であることが分かった。また、上述のふたつの電位の組み合わせにより、アノード型とカソード型の異なる機構に基づき皮膜が形成することが確認された。アノード型では活性態電位で溶解したFe^<2+>,Cr^<2+>が不働態電位で主にCrが3価に酸化され、少量のFe2+とともに粒子状の酸化物/水酸化物が形成されるがFe2+の大部分は溶解する。次に均一な皮膜を形成する前に電位は再び活性態に戻されるので、下地金属から再び溶解が起こり、さらに、不働態電位にて粒子状酸化物が生成する。これらの過程を繰り返すことにより、ポーラス構造の皮膜が成長する。一方、カソード型では過不働態電位にてCr^<6+>がFeとともに過不働態溶解し、次に不働態電位にてCr^<6+>がCr^<3+>に還元されることによって粒子状酸化物を沈殿堆積する。これらを繰り返すことにより緻密な保護皮膜とはならずポーラス構造の皮膜を成長させることができる。いずれの場合で生成する皮膜はクロムを過剰に含むCr_2FeO_4型のスピネル酸化物である。ここで、過剰のCrは不定形の水酸化物ないしは酸化物と思われる。この皮膜の成長速度は、電位および変調パルス幅を変化させることにより制御可能できた。また、化学組成についても、皮膜中のCr/Fe比を多少変化させることが可能であることも明らかとなった。ステンレス鋼などのFc-Cr合金を硫酸中で方形波電位変調電解することによりポーラス構造を有する酸化物皮膜を形成することができる。

これらの皮膜の、電子的性質を電気化学インピーダンス法ならびに光応答電流法で検討したところ、インピーダンスから得られる界面容量については、アノード型では膜厚に比例して容量が増大することより皮膜を構成する微粒子の表面にて容量を発生し、かつこれらの粒子が相互に連結して下地合金との間に導電性を示す経路が存在することが明らかとなった。一方、カソード型では容量は下地鋼と同様で皮膜厚さに依存しなかった。従って、カソード型膜では構成する微粒子が下地との伝導性を持たずに堆積していることが分かった。一方、光励起によって生じる電子・ホール対の分離によって生ずる光電気化学応答については、アノード型皮膜では応答に厚さに対して極大を示した。これは、厚さの増大に対して電子・ホールが増大するが再結合確率も増大するためにこのような挙動を示したと思われる。一方、カソード型ではインピーダンス同様、厚さに依存しない光応答を示した。今後ポーラスな構造と電子的特性を生かした機能電極表面への応用が期待される。
MEMとリ-トベルト法による新しい精密粉末構造解析システムの構築

これまで、X線及び中性子粉末結晶構造解析は、その物質の興味ある物性の発現機構を理解し、制御する上で、重要な構造情報を提供するものと考えられてきた。特に、酸化物高温超伝導体を始めとする様々な新物質の結晶構造を決定したリ-トベルト解析の果たした役割は大きい。しかし、リ-トベルト解析によって明らかにされる構造は、原子の集合体としての構造、すなわち原子配列である。従って、物質内の電子密度分布や原子核密度分布から得られる原子の結合状態や非調和熱振動といった、物性研究に、より直接的に関わってくる詳細な構造情報まで得ることはできない。元来、そのような情報は、X線、中性子線粉末回折データに含まれているはずである。これまで、我々は、マキシマムエントロピー法(MEM)という新しい精密構造解析法を開発し、精密な電子密度及び原子核密度分布を回折データから求める方法を確立してきた。本研究は、MEMの可能性をさらに拡張し、また、従来の解析法であるリ-トベルト解析法の利点を生かすことにより、これまでの結晶学の限界を押し広げ、新たな結晶学を構築することを目的としている。その為に、MEMとリ-トベルト解析法を組み合わせた新しい粉末精密構造解析の方法論の確立を目指して、平成7年度より研究が開始された。幸いにも、初年度に、本研究で開発された方法を用いて、世界で初めて金属内包フラーレンの構造解析に成功した。この成果は科学雑誌Nature(377(1995)46-49)に掲載され、新聞各紙(日本経済新聞、日刊工業新聞、毎日新聞、朝日新聞、中日新聞)にも報道され、フラーレン科学の分野だけでなく社会にも大きなインパクトを与える事ができた。その後、その他のフラーレン化合物、酸化物超伝導体関連物質等の様々な物質に、この新しい方法を応用し、多くの研究成果をあげることができた。研究は当初の目標を計画通り達成した。そして、本研究で構築されたシステムによりBaSi_2の電子密度分布や、YBCOの核密度分布パイロクロアY_2Sn_2O_7の電子密度、核密度分布を明らかにし、それぞれ、原子の結合形態について新たな知見を得ることができ、物理学会、結晶学会等において研究成果を発表することが出来た、YBCOの成果については論文投稿を行い、その他の成果についても投稿を準備中である。また、本研究により世界で初めて金属内包フラーレンの構造解析を成功したのは画期的な成果である思う。この成果は、科学雑誌Nature(1995),377,46-49に掲載され、また日本経済新聞(平成7年9月9日朝刊)日刊工業新聞(平成7年9月12日)他、毎日新聞、朝日新聞、中日新聞などでも発表された。7月に米国で開かれたゴ-ドン・リサーチ会議(Plymouth State College,Plymouth,New Hampshire,July 2-7 1995)、新物質の電子物性に関する国際会議(International Winterschool on Electronic Properties of Novel Materials ; Kirchberg,Austria,Feb.3-9,1996),米国物理学会(St.Louis,MO,March 18-22,1996)において、本研究の成果を中心に招待講演を行い、高い評価を受けた。そして、本研究で構築されたシステムによりSrSi2,CaSi2,パイロクロアLa_2Sn_2O_7、GaNの電子密度分布を明らかにし、それぞれ、原子の結合形態について新たな知見を得ることができ、物理学会、結晶学会等において研究成果を発表することが出来た。成果については、投稿を準備中である。この様に、本研究は当初の予想以上に大きな成果を挙げることができたと考えている。研究は当初の目標を計画どおり達成した。

本研究で開発したシステムにより、SrTio_3の相転移前後での電子密度の変化の様子を明らかにすることができた。その他、アンモニアドープアルカリ金属フラーレンの構造解析にも成功し、結晶中のアンモニア分子の挙動についても明らかにすることができた。また、金属内包フラーレンSc@C_<82>の構造解析にも成功し、世界で始めてこの分子の対称性がC2vである事を実験的に決定することができた。この成果は現在投稿中である。以上の成果を元に下記の国際会議において招待され、招待講演を行った。以上これまでの研究成果をまとめ、研究報告書を作製した。
微動に含まれる表面波の異方性解析による応力場と地質構造の関係性の解明

本研究の目的は、微動に含まれる表面波の異方性解析から、日本の地下応力状態を明らかにすることである。最終年度はHi-netで観測された地震波記録に対し、表面波の異方性解析を行った。東北地方太平洋沖地震に伴う地下応力状態の変化を明らかにするため、東北地方南部を対象とし、周波数ー波数法によって表面波位相速度とその到来方向を推定した。東北沖地震前の観測位相速度を異方性解析した結果、既存の研究におおむねに整合的な南北方向に卓越している異方性パターンが得られた。さらに、時間方向にデータウィンドウをかけ解析することで、時間経過に伴う異方性パターンの変化を推定した。その結果、東北沖地震後に一部の周波数で異方性の卓越方向に若干の変化を確認した。この結果は、対象地域の地殻応力場に生じた応力場の変化を反映している可能性があると考えられる。このように、表面波の異方性解析を時系列で解析することにより、地下の応力状態をモニタリングすることができると考えられる。また、表面波により高精度に地下構造を推定するためには、高次モード成分を精度よく抽出する必要がある。そこで、従来利用されてないレーリー波の水平成分を利用した解析およびデコンボリューション解析手法の適用性を検討した。従来的なレーリー波の上下動成分に加え、レーリー波の水平動成分を利用することで、追加的な高次モードを推定することができ、地下構造の推定精度を向上させることができることを明らかにした。また、複数モードが混在しているスペクトルに対し、デコンボリューション解析を適用することで、それぞれのモード成分を分離し、位相速度の推定精度を向上させることができることを示した。(抄録なし)本研究の目的は、微動に含まれる表面波の異方性解析から、日本の地下の応力状態を明らかにすることである。初年度は表面波の異方性解析に必要な異方性媒質を伝播する理論計算手法の開発をおよびHi-netで観測された地震波からの表面波の抽出を行った。異方性媒質に対する高精度な表面波の理論計算手法は、観測された表面波を解釈する上で必要不可欠である。まず、横等方性と呼ばれる異方性に対して従来理論計算に利用されてきた手法を、より高精度なreduceddelta matrix法に拡張した。拡張した手法により、既存の手法では計算が困難であった高周波数領域まで、正確に理論計算を行うことができた。また、その計算速度に関しても、最大18%程度、従来の手法に対して高速な計算が可能になった。さらにより一般的な斜方晶系とよばれる異方性に対する、表面波の理論計算手法に関する研究も進めている。また、Hi-netとよばれる地震観測網で取得された地震波記録から表面波の抽出を試みている。観測データに対し、周波数-波数法と呼ばれる手法を適用することで、表面波の伝播速度と到来方向の推定を行った。対象地域としては、既存の研究結果を参考に、2011東北地方太平洋沖地震により大きな異方性の変化があったとされる地域を選定している。その結果、Hi-netで観測された地震波データから周波数-波数法により表面波の伝播速度とその到来方向が推定できた。しかしながら、対象としている周波数帯に対し、安定して有意な表面波のシグナルを抽出することができていない。これは観測された地震波形のうち、表面波を十分抽出できていないことが原因であると考えられ、今後の課題である。観測データからの表面波の抽出に関しては十分に安定した解析ができていないものの、表面波の異方性の理論計算に関しては、一般性の高い斜方晶系とよばれる異方性に対し、高精度な計算手法を拡張することができた。この手法開発は、今後観測された表面波の異方性を解釈していく上で有効であると考えられる。

今後はより安定したシグナルを得るために、適切なバンドパスフィルタの適用や時間ウィンドウを検討する。また、異なる表面波の推定手法として空間自己相関法を適用することで、表面波の推定精度を検討する。さまざまな方向から到来する表面波の伝播速度の方位依存性から、開発した理論計算手法を用いた解釈により、その異方性を推定し、地震による異方性の変化と地下の応力状態を結び付けた議論をする予定である。(抄録なし)
人工ムチンによる腸内有害菌の感染・生育阻向剤の開発

胃腺粘液細胞は、GlcNAcα1,4Galβ-Rを糖鎖に持つムチンを分泌し、本ムチンがピロリ菌(Helicobacter pylori)感染に対する防御機能を持つことが知られている。本研究では、GlcNAcα1,4Galβ-Rを糖鎖を高密度に有する人工ムチン合成プロセスを開発し、人工ムチンによる腸内病原性細菌の感染・生育阻害剤の開発を目的としている。1.新規ガン糖鎖抗原の酵素合成を行うことを目的とし、α1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(α4GnT)のスクリーニングを行った。その結果、ウマ血清中に比較的高い本酵素活性を見出した。そこで、ウマ血清の硫安沈殿画分をα4GnTの粗酵素源として、供与体基質UDP-GlcNAcを用いてa1,4GlcNAc含有糖鎖抗原となるオリゴ糖鎖の合成を試み、六種類のa1,4GlcNAc含有オリゴ糖鎖の酵素合成に成功した。これら合成オリゴ糖鎖をポリグルタミン酸をペプチドベースとして側鎖に配した人工ムチンを作製した。2.ウマ血清由来の硫安沈殿画分を順次、CM-Sepharose、Concanavalin A-agarose、Superdex 200p.g、UDP-hexanolamine agaroseの各種クロマトグラフィーに供し、最終的に比活性5,300倍まで本酵素活性を純化し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動的に均一な評品を得た、酵素額的諸性質を明らかにした。また、ウマα1,4GnTのクローニングを試みたところ、本酵素をコードする1026bpのcDNAの全配列をうることに成功した。予想されるアミノ酸配列は、ヒト由来の酵素に対して85%の相同性を示した。次に、ピロリ菌の感染・生育防御剤の開発を目的としα-ポリグルタミン酸(α-PGA)をベースとした、α1,4 GlcNAc残基を高密度に含有する人工糖タンパク質の合成を行い、本糖鎖構造を認識する抗体との相互作用を解析した。3種類のα1,4 GlcNAc含有p-アミノフェニル(pAP)配糖体をそれぞれ(α-PGA)の側鎖に導入することにより、糖鎖構造および、糖鎖置換度の異なる人工糖タンパク質を合成した。また、本α1,4 GlcNAc含有人工糖タンパク質を用い、HIK 1083抗体の糖鎖認識機構について解析した。α-PGAとpAP配糖体の結合反応において、両者のモル比を制御することにより、糖鎖置換度が20-60%のα1,4 GlcNAc含有人工糖タンパク質を合成することができた。ELISA法によるこれら人工糖タンパク質と抗ムチンモノクローナル抗体HIK 1083との相互作用解析において、本抗体の糖鎖認識能はα1,4 GlcNAc残基だけでなく、アグリコン側の構造にも影響される可能性が示唆された。また、糖鎖置換度の増加に伴い、本抗体との反応性も増大する傾向が観察された。胃腺粘液細胞は,GlcNAcα1,4Galβ-Rを非還元末端に有する糖鎖を含むムチンを分泌している.最近,これらのムチンがHelicobacter pyloriに対する抗菌活性を有することが報告された.しかしながら,これまでに生体からGlcNAcα1,4Galβ-Rを生合成するα4GnTを精製した報告はない.そこで,我々はウマα4GnTの精製を行いその諸性質を明らかにした.ウマ血清を80%飽和硫安沈殿および各種クロマトグラフィーに供しα4GnT活性を約5,300倍にまで精製した.精製α4GnTの至適温度および至適pHは,37°C,pH7であった.