hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アズレンの特異なπ分極が織りなす曲面分子の創製

アズレンは分子内π分極により炭化水素でありながら青色を示す珍しい電子系である。置換基の電子効果を受け易く、電子構造の変化は多彩な色調として現れる。本研究では、複数個のアズレンユニットからなる曲面分子の構築法の開拓と、有用な前駆体を含め合成した分子の電子構造を明らかにすることを目的としている。30年度は、前駆体となるジアズレニルボリン酸エステルのアズレン間を官能基化により共役させる反応の開拓と曲面分子の合成を検討した。遷移金属触媒を用いてアズレニル基のカップリング反応を行った結果、ホウ素ー炭素結合の切断がエステル保護基の導入により抑制され、アズレニル基の官能基化が可能となることを見出した。本研究全体を通して得られた成果は、第一に安定なジアズレニルボリン酸の合成と変換反応を確立したことである。ボリン酸は一般に空気中で不安定であるが、ジアズレニルボリン酸は安定に単離することができ、有用なビルディングブロックと成りうることが分かった。また、分子内配位が可能なエステル保護基を導入することで、ヒドロキシ基の保護と同時にホウ素原子上での求核攻撃をブロックすることができ、これにより、アズレニル基上での官能基変換が実施可能となった。第二に曲面分子の合成に必要な2-ヨードアズレン類の簡便合成法を確立したことである。CuIとアズレニル-2-ホウ酸エステルの反応を検討し、空気中で行うと相当する2-ヨードアズレンが収率良く得られることを見いだした。この反応は、目的とする曲面分子の合成ならびにそのπ電子系を拡張する際の重要な方法論として有用であるだけでなく、2-置換アズレン類を簡便に合成するための方法論としても利用できる。アズレンは分子内π分極により炭化水素でありながら青色を示し、Kasha則に反してS2発光を示すユニークな分子である。本研究では、複数個のアズレンユニットからなる曲面分子を構築し、その特異な構造から派生する光化学特性を明らかにする。28年度は、1.曲面分子の基本骨格となるアズレニルボリン酸の合成法の確立、2.ボリン酸の構造特性の精査、3.ボリン酸の反応性の精査、を行った。1については、アズレニルボリン酸を相当するアズレニルホウ酸エステルとアズレニルリチウムより合成可能であることを見いだした。2については、ボリン酸の分子構造ならびに結晶構造を単結晶X線構造解析により明らかにした。一般にボリン酸は空気中で酸化されやすく不安定であるのに対し、このアズレニルボリン酸は安定に存在する。このような特異な安定化は、ブロモ基による電子効果と立体効果に起因することを明らかにした。また、ボリン酸にトリエチルアミンを作用させて分子間ホウ素ー窒素配位結合の形成がアズレンユニットのπ分極にどのような変化を及ぼすか調べたところ、配位結合の形成によりπ分極が弱まることを13C-NMRスペクトルの化学シフト値の変化により明らかにした。3については、ボリン酸エステルへの変換反応を検討し、N,N-ジメチルエタノールアミンのような窒素原子の強い分子内配位により5員環キレート構造を形成する場合には、ホウ素ー炭素結合の切断が起こることを見いだした。この結果から、目的分子の構築に向けて、エステル保護基の最適化に関する知見を得ることができた。目的分子の構築に必要な合成中間体であるアズレニルボリン酸の合成法を確立し、安定に単離できることを確認した。また、このボリン酸の分子構造ならびに基本的性質と反応性に関する知見を得ることができた。したがって、当初の予定を達成することができたと言える。本研究では、複数個のアズレンユニットからなる曲面分子の構築と、その特異な構造から派生する光化学特性の解明を目的としている。29年度は、1.曲面分子の前駆体であるアズレニルボリン酸の変換反応、2.アズレニル-2-ホウ酸エステル類のイプソ置換反応、について精査した。1ではまず、ボリン酸エステルの安定化と単離を検討した。窒素原子の強い分子内配位が起こるアミノアルコール類とのエステル化では、ホウ素上の電子密度の増加によりホウ素ー炭素結合が切断されるため、アミノ酸をモチーフとした複素環系配位子を用いてエステル保護基を最適化した。これにより、相当するボリン酸を空気中で安定な固体として得ることができた。また、11B-NMRスペクトルによりホウ素が分子内配位による4配位構造を持つことを明らかにした。この配位子の導入により、ホウ素上でのリチウム試薬との求核置換反応だけでなく、カップリング反応によるアズレン間の連結反応が実施できるようになった。さらに、得られたボリン酸エステルの溶解性を向上させるため、アズレニル骨格への置換基導入についても検討し、置換基導入効果を明らかにした。2では、CuIとアズレニル-2-ホウ酸エステルの反応を検討し、空気中で行うと相当する2-ヨードアズレンが収率良く得られることを見いだした。この反応は、アルキル基が置換したアズレニルホウ酸エステルにも適用でき、目的とする曲面分子の合成ならびにそのπ電子系を拡張する際の重要な方法論として有用であるだけでなく、2-置換アズレン類を簡便に合成するための方法論としても利用できる。曲面分子の前駆体となる化合物の合成に関して、エステル化に用いる配位子を最適化することにより、ホウ素上での求核置換反応やその後のカップリング反応が行えるボリン酸エステルの合成と単離を達成することができたため。

置換基の電子効果を受け易く、電子構造の変化は多彩な色調として現れる。本研究では、複数個のアズレンユニットからなる曲面分子の構築法の開拓と、有用な前駆体を含め合成した分子の電子構造を明らかにすることを目的としている。30年度は、前駆体となるジアズレニルボリン酸エステルのアズレン間を官能基化により共役させる反応の開拓と曲面分子の合成を検討した。遷移金属触媒を用いてアズレニル基のカップリング反応を行った結果、ホウ素ー炭素結合の切断がエステル保護基の導入により抑制され、アズレニル基の官能基化が可能となることを見出した。本研究全体を通して得られた成果は、第一に安定なジアズレニルボリン酸の合成と変換反応を確立したことである。ボリン酸は一般に空気中で不安定であるが、ジアズレニルボリン酸は安定に単離することができ、有用なビルディングブロックと成りうることが分かった。また、分子内配位が可能なエステル保護基を導入することで、ヒドロキシ基の保護と同時にホウ素原子上での求核攻撃をブロックすることができ、これにより、アズレニル基上での官能基変換が実施可能となった。第二に曲面分子の合成に必要な2-ヨードアズレン類の簡便合成法を確立したことである。CuIとアズレニル-2-ホウ酸エステルの反応を検討し、空気中で行うと相当する2-ヨードアズレンが収率良く得られることを見いだした。この反応は、目的とする曲面分子の合成ならびにそのπ電子系を拡張する際の重要な方法論として有用であるだけでなく、2-置換アズレン類を簡便に合成するための方法論としても利用できる。3で得たボリン酸のエステル化に関する知見をもとに、さまざまなエステル保護基の導入を検討し、目的分子の構築を目指す。有用な前駆体の合成と、空気中での単離に成功したので、今後はこの前駆体を用いて求核置換反応とカップリング反応を実施し、目的化合物の合成を達成する。さらに、目的分子の物性を明らかにする。購入した消耗品の支払い額が予定金額より安くなったことと、化合物の合成に要した試薬類や溶媒類の消費量が当初の見込みよりも少なくて済んだため。(理由)購入した消耗品の支払額が予定金額より安くなったことと、化合物の合成に要した試薬類や溶媒量の消費量が当初の見込みよりも少なくて済んだため。(使用計画)合成実験に必要な消耗品の購入に使用する。実験に必要な消耗品の購入に使用する。
新規１４－エピ－タキステロール骨格の展開と受容体の柔軟性を介する骨形成の促進

ビタミンD3はヒトの皮膚で太陽光のもと生成するが、その過程で副生成物タキステロールも生成する。化学的にタキステロールは不安定な化合物で、その性質を調べることは困難である。本研究課題では、化学的安定化に成功し、ヒトビタミンD受容体との独自の結合様式を解明し、副作用の少ない骨粗鬆症治療薬の取得を目指した。「19位にメチル基をもたない方が、天然型のメチル基をもつ誘導体よりも受容体への結合能力が高いこと」を明らかにし、「活性型ビタミンD3で生物活性向上に有効であった化学修飾が、必ずしもあてはまらないこと」が判明した。また、安定なジエン系のタキステロールも合成し、この場合は効果的でないことを見出した。皮膚では、1,7-デヒドロコレステロールへの太陽光照射によりプレビタミンD3が生成するが、同時にプレビタミンD3への太陽光照射で「タキステロール」が副生する。「タキステロール」は、ビタミンDの光異性化体である。空気中室温において不安定なトリエン骨格のため、これまで研究対象として困難とされてきた「タキステロール」について、我々は同条件下、比較的取扱い容易な新規トリエン骨格14-エピ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(1)を見出した。ヒトビタミンD受容体(hVDR)とのX線共結晶構造解析を行ったところ、活性型ビタミンD3とは異なるトリエン部分の結合様式となる5,6-s-transかつ7,8-s-trans配置を認めた(Sawada et al. J. Am. Chem. Soc., 2011)。hVDRのリガンド結合領域に柔軟性がある結果であり、本研究課題では、この新規化合物1について、14-エピ-1α,25-ジヒドロキシタキステロール(2)の誘導体を含め、効率良く合成する方法を開発し、作用メカニズムとともに活性型ビタミンD3よりも強い骨形成作用を有する誘導体(骨粗鬆症治療薬)を取得する目的で取組んだ。前年度までの構造修飾研究から、1)19位のメチル基をもたない1の方が、より天然に近い構造を有する19位にメチル基をもつタキステロール型(2)よりもhVDRへの結合能力が高いこと、2)活性型ビタミンD3ではhVDR結合親和性をはじめとする生物活性向上に有効であった2-ヒドロキシプロポキシ基の導入が、14-エピ-19-ノルタキステロールではhVDR結合減弱など不利に働くことが判明した。このことは1と活性型ビタミンD3とのhVDRへの結合様式の違いからくる結果と推察された。今年度はさらに、14-エピ-8,9-ジヒドロ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(3)の合成に成功し、hVDR結合親和性を評価した。空気中室温で不安定な特有のトリエン構造のため、研究対象として困難なビタミンDの光異性化体「タキステロール」について、同条件下でも取扱い容易な新規トリエン骨格14-エピ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(1)を見出した。ヒトビタミンD受容体(hVDR)とのX線共結晶構造解析より、活性型ビタミンD3とは異なる結合様式を認めた(Sawadaら、J. Am. Chem. Soc., 2011)。hVDRのリガンド結合領域に柔軟性がある結果であり、本研究課題では、この新規化合物1について、14-エピ-1α,25-ジヒドロキシタキステロール(2)の誘導体を含め、効率良く合成する方法を開発し、活性型ビタミンD3よりも強い骨形成作用を有する誘導体(骨粗鬆症治療薬)を取得する目的で取組んだ。まず、2位に置換基を有する1の誘導体合成では、活性型ビタミンD3ではhVDR結合親和性を強化した置換基が、本タキステロールでは結合減弱に寄与してしまい、これはhVDRへの結合様式の違いからくるものと分子モデリングで考察した。次いで19位のメチル基を保存した化合物2の合成に着手し、トリエン部の構造、安定性、hVDR結合様式および生物活性を探ることとした。A環部はシキミ酸からジアゾメタンを用いる炭素ー炭素結合形成を鍵反応として19位メチル基を導入し、更にアルデヒドの増炭反応で7位炭素をエンイン構造で構築した。CD環部とのStilleカップリングを行い、目的とする化合物2を合成することができた。新規化合物2のhVDR結合親和性は、対応する19-ノル体よりも低い値を示した。以上のように、新規化合物2では、19位のメチル基をもたない1の方が受容体結合能が高く、さらに2位置換基の導入は、活性型ビタミンD3では活性向上に有効であっても、1では不利に働くものがあることが判明した。

皮膚では、1,7-デヒドロコレステロールへの太陽光照射によりプレビタミンD3が生成するが、この時プレビタミンD3への太陽光照射でタキステロールが副生する。空気中室温において不安定なトリエン骨格のため、研究対象として困難なタキステロールに対し、我々は取扱い容易な類縁体14-エピ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(1)を見出した。ヒトビタミンD受容体(hVDR)とのX線共結晶構造解析で、活性型ビタミンD3とは異なるトリエン部分の結合様式5,6-s-transかつ7,8-s-trans配置を認めた(JACS, 2011)。hVDRのリガンド結合領域に柔軟性を認め、本研究課題では1について、14-エピ-1α,25-ジヒドロキシタキステロール(2)の誘導体を合成する方法を開発し、作用メカニズムとともに活性型ビタミンD3よりも強い骨形成作用を有する誘導体(骨粗鬆症治療薬)を取得する目的で取組んだ。本研究課題初年度(平成24年度)に、「19位のメチル基をもたない1の方が、より天然に近い構造を有する19位にメチル基をもつタキステロール型(2)よりもhVDRへの結合能力が高いこと」を明らかにし、平成25年度には「活性型ビタミンD3ではhVDR結合親和性をはじめとする生物活性向上に有効であった2-ヒドロキシプロポキシ基の導入が、2ではhVDR結合減弱など不利に働くこと」が判明した。このことは1と活性型ビタミンD3とのhVDRへの結合様式の違いからくる結果と推察され、作用分離の可能性を秘める。最終年度の平成26年度では、14-エピ-8,9-ジヒドロ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロールの合成に成功し、hVDR結合親和性をほとんど失うことを明らかにした。また最終年度では、1のhVDR結合様式を踏まえ新規化合物7,8-cis-19-ノルビタミンD3を合成し、hVDR結合親和性を評価することができた。有機合成化学今年度は、14-エピ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(1)のhVDR結合時に認められる7,8-s-trans配置の優先性を解除し、本来の活性型ビタミンD3の結合配置でhVDRに結合し得るタキテロール誘導体として、8-9位間の二重結合を水素化した、新規な14-エピ-8,9-ジヒドロ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(3)の合成に成功した。すなわち、14-エピ-CD環の8-ケト体(ステロイドの位置番号)からエキソメチレン化、ヒドロホウ素化-酸化を経て8位の第一級アルコールとし、光延反応と続く酸化で7位スルホン体を得た。シクロヘキサ-1-エンカルバルデヒド誘導体とのJuliaカップリングを行い、続く脱保護により、目的とする3を得ることができた。適切な生物活性評価のために、HPLCにて最終精製をした。hVDRへの結合親和性を評価すると、8位がsp3炭素となった新規誘導体3の場合は、親和性が極端に低下することがわかった。しかしながら、新規hVDRリガンド3は、10-6 MでhVDR結合親和性が活性型ビタミンD3の50%程度を示し、この値は、ヒト血中では最も高濃度で存在する25-ヒドロキシビタミンD3と比較し得るhVDR結合親和性を示す結果となった。8位sp3炭素のhVDRへの結合時最適化を探る手がかりとなる。以上のように、本年度は計画通り、ビタミンD関連化合物として全く新しいタキステロール誘導体3の合成に成功し、ビタミンD受容体への結合親和性を評価することができた。我々が見出した安定な新規タキステロール誘導体である14-エピ-1α,25-ジヒドロキシ-19-ノルタキステロール(1)への2位置換基の導入を行った。
In situ 時間分解型温度可変分光光度計の開発

生体内に存在する酸素活性化酵素における酸素の結合および開裂・分解等の分子機構の解明は酸化機能のみならず生命機能の観点から極めて重要で興味深い。また、このような研究は酸化触媒や酸化漂泊等工業的応用面からも極めて重要である。本研究では、この酸素の金属への結合、および酸素分子の開裂について、モデル錯体を構築して検討した。錯体としては、配位構造および配位環境を生体系から模倣し、その鉄や銅錯体を構築した。そして、酸素や過酸化水素との反応を検討した。その結果、(i)酸素の可逆的脱着能を示すヘムエリトリンモデルの構築に成功した。この機構の本質は適当な距離を保った鉄二核の配置と疎水的環境と橋掛け官能基である水素を保持したアルコール性水酸基の存在であることが明らかとなった。これはヘムエリトリンにおけるμ-ヒドロキソ基の役割の意義を示すものであり、興味深いものである。(ii)過酸化水素が配位した平面四配位を強制した銅錯体の合成・単離に成功した。また、この錯体と基質との反応を検討したところ、エポキシ化が進行し、二重結合性アルケンに対してnucleophilicな性質を示し、非ヘム銅酵素が示す酸素活性化機構の特性を明らかにした。これは、生体系の銅酸化酵素の存在意義を明確化に成功したものと考えている。(iii)N3型四面体構造を強制するcis,cis-1,3,5-triaminocyclohexane(TACH)を新規に合成し、その銅(l)錯体と酸素分子とを反応させたところ、di-μ-oxo-{銅(lll)(TACH)}_2複核錯体を形成し、その反応活性が極めて高いことを見い出した。これはこれまで報告されているdi-μ-oxo-{銅(III)(TACH)}_2型複核錯体の中で、最も反応活性の高いものであることが分かり、その構造活性相関を明らかにした。生体系に存在する酸素添加酵素および酸化酵素に焦点をあて、酸素の捕捉・活性化機能を有する酵素のモデル錯体を合成し、その構造モデルおよび機能モデルの構築を目指して検討してきた。本研究では特に酸素の可逆的脱着や過酸が付加した不安定中間体の捕捉確認に成功した。ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ等においてその生物活性反応中間体として提唱されている銅(II)-ハイドロパーオキソ種の構造および酸素活性化機構の解明を目的として、BPPAを用いるその銅錯体とH_2O_2との反応を試みた。その結果、MeCN中660,830nmにCu(II)種に特徴的なd-d遷移と380nmにハイドロパーオキソ種からCu(II)へのLMCTが観測された。この錯体のESRスペクトルはg_<//>=2.004(A_<//>=109G),g_⊥=2.207(A_⊥=75G)で、trigonal bipyramidal構造に特徴的なスペクトルであった。また、この錯体の共鳴ラマンスペクトルはH_2^<16>O_2,H_2^<18>O_2の反応それぞれについてCu(II)に配位したハイドロパーオキソ種に由来するO-O伸縮振動が856,810cm^<-1>にそれぞれ観測された。更に、ESI-MASSスペクトルにおいても[Cu(bppa)(^<16>O_2H)]

^+,[Cu(bppa)(^<18>O_2H)]^+に帰属しうるピークがそれぞれm/z=584,588に観測された。また、この錯体は非常に安定で、単結晶の作成にも成功しており、その結晶構造解析はOOHが銅(II)にend-on型で配位しており、配位子BPPAの空間的に開いている方向にそのベクトルを向け、OOHが配位子の疎水性置換基により保護され、水素結合により活性酸素が認識・捕捉されていた。これは溶液中で推定された構造とよく一致していた。これら不安定中間体の捕捉に成功したことは生体系金属酵素における反応活性中心近傍の環境を精密に再現できたものと考えている。体系に存在する金属含有酸化酵素による基質の酸化反応過程を追跡することを目的として、生体系活性部位周辺構造規範としたモデル金属錯体を新規に構築し、過酸との反応を検討した。金属錯体と過酸との反応追跡は、金属イオン有のd-d遷移を吸収スペクトルで追跡するのであるが、これらの反応は非常に早く、反応解析を行うためには、追跡極低温で、かつ迅速に行う必要がある。本研究では、このような反応を追跡するために、その場測定ができ、低温か迅速に測定しうる装置に開発が必要であり、そのような設備の設計・製作・開発を行った。この製作した装置を用い、化反応を追跡した。その結果、非ヘム鉄酵素モデルと過酸との反応から、鉄にハイドロパーオキソやアルキルパーオソが配位した錯体の合成に成功した。また、これら鉄-過酸錯体の単離、キャラクタリゼーションに成功した。このよな単離した錯体と有機物との酸化反応の量論反応を遂行したところ、それほど活性の高くないラジカル反応を示したとから、O-O結合はホモリティックな解裂であること、また、スルフィドおよびスルフォキサイドとの酸化反応で特後者に対する反応性の高さから、この酸化反応中間体は親核的な反応活性種[Fe^<III>-O^・]であることが明かとなった。ま、酸素呼吸蛋白質の一種であるヘムエリスリンのモデルである鉄二核錯体の構築を行い、酸素との反応を試み、その応過程をその場観測吸収スペクトルで遂行し、その観測に成功した。生体内に存在する酸素活性化酵素における酸素の結合および開裂・分解等の分子機構の解明は酸化機能のみならず生命機能の観点から極めて重要で興味深い。また、このような研究は酸化触媒や酸化漂泊等工業的応用面からも極めて重要である。本研究では、この酸素の金属への結合、および酸素分子の開裂について、モデル錯体を構築して検討した。錯体としては、配位構造および配位環境を生体系から模倣し、その鉄や銅錯体を構築した。そして、酸素や過酸化水素との反応を検討した。その結果、(i)酸素の可逆的脱着能を示すヘムエリトリンモデルの構築に成功した。この機構の本質は適当な距離を保った鉄二核の配置と疎水的環境と橋掛け官能基である水素を保持したアルコール性水酸基の存在であることが明らかとなった。これはヘムエリトリンにおけるμ-ヒドロキソ基の役割の意義を示すものであり、興味深いものである。(ii)過酸化水素が配位した平面四配位を強制した銅錯体の合成・単離に成功した。また、この錯体と基質との反応を検討したところ、エポキシ化が進行し、二重結合性アルケンに対してnucleophilicな性質を示し、非ヘム銅酵素が示す酸素活性化機構の特性を明らかにした。
アパタイト生成表面のナノキャラクタリゼーションに関する基礎研究

当該研究課題の最終目標は、実材料表面における溶液中での反応を数十から数百ナノメートルのスケールにて解析する手法として、走査型プローブ顕微鏡である原子間力顕微鏡(表面形状の情報)と表面電位顕微鏡(表面電位分布の情報)とを複合させた測定系の構築にある。測定対象としては、生体関連材料のin vitro試験における骨類似アパタイト結晶成長過程を選択した。具体的には、生体活性ガラスの代表的な材料として知られている45S5Bioglass【○!R】バルク試料を人の体液の無機イオン濃度に等しく調製された擬似体液(小久保溶液)中に浸漬させ、その結晶成長過程を上記顕微鏡により追跡するものである。はじめに、擬似体液浸漬によるBioglass表面形態の経時変化を原子間力顕微鏡により追跡した結果、比較的再現性のあるデータを得ることに成功した。このような表面状態の経時変化は走査型または透過型電子顕微鏡による真空下での研究においては観察することのできないものであり、できる限り実際に近い状態(液中)で測定することが生体関連材料の研究において重要であることを示唆するものである。今後の研究に対し、大きく展開できる手がかりを得たと結論できる。一方、本研究課題の最大のポイントである溶液中での表面電位分布の測定においては、カンチレバーへの金コーティンクにより基本的な測定系の構築を行ってきた。現時点では、十分な結果が得られていないが、今後測定条件を精密化することで液中での測定を行うことが可能と思われる。生体活性材料をヒトの体内にインプラントした際、材料は生体骨(アパタイトとコラーゲン)と骨類似アパタイト層を介して結合することが知られている。最近、小久保らの提唱したヒトの体液の無機イオン濃度に等しく調製された擬似体液による材料浸漬実験を通じて、その表面に骨類似アパタイトが形成されれば生体活性があると判断されている。しかしながら、擬似体液に浸漬された材料表面でどのようなメカニズムで骨類似アパタイトが形成されるかについての詳細は不明な点が多い。その大きな原因としては、液中で動的な表面形態の経時変化を追跡できないことがあげられる。また、アパタイト結晶成長には材料表面の電位分布がアパタイト成長に大きく関与していることが示唆されている。以上のことを踏まえ、本研究では生体活性材料表面における擬似体液浸漬によるアパタイト結晶成長メカニズムを原子間力顕微鏡と表面電位顕微鏡を用いた複合測定により明らかにすることを目的としている。具体的には、表面形態の変化は原子間力顕微鏡(AFM)により、また電位分布は表面電位顕微鏡(KFM)により行っている。被検試料には現在臨床応用されている代表的な組成をもつ45S5Bioglassを用い、被検溶液には擬似体液(pH7.4)を用いている。液中ホルダーを備え付けたAFMを用いて、擬似体液下でのBioglass表面のアパタイト成長の動的な形状変化の観察は十分に可能であった。しかしながら、表面電位の測定にはいくつか問題点があることがわかった。今後、さらなる測定条件の最適化を図る必要がある。本研究の最終目標は、実材料表面における液中での反応を数十から数百ナノメートルスケールにて解析する手法として、走査型プローブ顕微鏡である原子間力顕微鏡(表面形状の情報)と表面電位顕微鏡(表面電位分布の情報)とを複合化させた測定系の構築にある。具体的には、生体活性ガラスの代表的な材料として知られている45S5 Bioglass【○!R】バルク試料を人の体液の無機イオン濃度に等しく調製された擬似体液(小久保溶液)中に浸漬させ、その結晶成長過程を上記顕微鏡により追跡するものである。今年度は、液中での表面電位分布の測定系の構築に関して検討を進めた。はじめに、市販されているカンチレバーを用いて液中での測定を行ったが、表面電位分布の明瞭な結果を得ることができなかった。

そこで、液中でのカンチレバー表面を光学顕微鏡により観察した結果、カンチレバー表面に気泡の発生がみられた。これより、表面電位を測定する際、カンチレバー表面にて電解反応による気泡が生じ、表面電位の測定を妨げることが判明した。液中での電位分布の観察を行うためには、液中表面電位測定用の探針を使用することが望まれる。しかし、そのような探針は市販されておらず自作する必要がある。そこで、本研究においては探針に金をコーティングすることにより液中にて測定可能な探針を開発することとした。金は他の金属と比較して電気化学的な反応が生じにくい材質であり、これにより液中での気泡の発生を抑制することを試みた。カンチレバーの材質とコーティングした金の密着性が低いために、液中測定時に金が剥離する現象が観察された。密着性を高めるために基板加熱などの手法を取り入れたが、十分に納得できる結果が得られるまでには至っていない。この点については、今後の課題として残った。
C型インフルエンザウイルス糖蛋白質のレセプタ-認識と破壊における活性発現部位

C型インフルエンザウイルスのレセプタ-認識能(HA)と破壊能(RDE)の発現部位をHE糖蛋白質上に位置付けることを目的に研究を行い,以下の成績を得た。1.RDEに及ぼす抗HE単クロ-ン抗体の影響を調べたところ,RDEの基質として鶏赤血球膜上のレセプタ-及びラット血清インヒビタ-を用いた場合には,赤血球凝集阻止能(HI)を持つ抗体(J14,J9,Q5)はRDEを強く阻害したが,HI能を持たない抗体(K16,S16)は全く阻害しなかった。最も強くRDEを阻害したのはJ14であった事から,RDE発現部位は,J14によって認識されるエピト-プ近傍に存在するものと考えられた。2.低分子基質(9ーOAcーNANAやpーNO_2ーphenylacetate)を用いた場合には,単クロ-ン抗体のみならず,球々の動物免疫血清によってもRDEは全く阻害されなかったことから,RDEの解媒部位に対する抗体は出来にくいものと判断された。3.^3HーDFPで標識したHEをSDSーPAGEで分析したところ,活性セリン(アイソト-プ標識セリン)は,HE1サブユニット中に存在する事が判明した。更に現在,CNBr分解で得られたペプチド断片の中から放射活性を持つ分子量約6Kのペプチドを単離精製し,アミノ酸配列を決定する作業を進めている。4.HAとRDEの両方に異常を有する16種の抗HE単クロ-ン抗体低抗性変異株のHE遺伝子の構造解析から次の事が明らかとなった。(1)N端から245,266,283番目のアミノ酸に各々変異が生じると,レセプタ-との親和性が増加し,中でも283番目の変異が最もその度合が強くなる事。(2)186,187,190,206,212,217,226番目のアミノ酸に変化が生じるとレセプタ-との親和性が低下し,中でも186番目と187番目の変異が最もその度合が強くなることが明らかとなった。C型インフルエンザウイルスでは、レセプタ-認識能(HA)と破壊能(RDE)の2つの活性が1つのHE糖蛋白質(m.wt;88K)に担われているものと推測されている。HAとRDEの活性発現部位をHE分子上に位置付けることを目的に、本年度は以下の2点の研究を実施した。1.HAとRDEの両活性を同時に阻止する4種の抗HE単クロ-ン抗体を用い、これらの抗体との反応性を欠如した変異ウイルスを11株得た。これらの変異株はいずれも、鶏とヒトの赤血球に対するHAとRDE活性の双方に変化を来していた。従って、これらの株のHE分子上における変異箇所を明らかにすれば、両活性の発現に深く関わっている部位を推定し得ると考え、これまでのことろ、9株のHE遺伝子の全塩基配列を決定し、以下に述べる成績を得ているが、両活性の発現部位を特定するまでには至っていない。(1)全変異株で、アミノ酸の置換を伴う1塩基変異が固定された。(2)全変異部位はHE_1サブユニット上に位置し、N端から、186,187,190,245,283,及び367番目に分散していた。(3)これらの変異部位は、いずれもヒト分離株の解析から推定されている所謂、variable portionとは異なる場所に位置していた。

2.我々は既に、RDEの本体がセリンエステラ-ゼであり、界面活性剤のMEGA-10を用いることにより、HAとRDE活性を保持した状態でHEを単離し得ることを明らかにしている。精製HEの活性セリン残基を^3H-DFPで標識後、BrCNで分解し、得られたペプチド断先の中から、放射活性を持つ断先を単離精製し、これのアミノ配列から活性セリン残基を同定する研究を行っている。現在、分子量約6Kのペプチドを得、ゲル濾過と高速液体クロマトグラフィ-を用いて精製をくり返し行っているところである。C型インフルエンザウイルスにおけるレセプタ-認識能と破壊能の発現部位をHE糖蛋白質上に位置付けることを目的に,昨年度は両活性に異常を持つ9株の抗HE単クロ-ン抗体抵抗性変異株のHE遺伝子の塩基配列を決定し,変異部位を明らかにしたが,本年度はさらに7株を解析に加え,変異部位を決定すると共に,これらの変異株のレセプタ-との親和性を調べ,以下の成績を得た。1.7種の変異株で認められた変異部位は,先の9株と同様いずれもHE1サブユニット上にのみ存在していた。2.レセプタ-との親和性が親株に比べ,強くなっていた変異株U9/V3では,N端から245番目のGlu.がLys.へ置換していた。4.親和性が親株より増強していたD37/V3では,226番目と266番目の2つのアミノ酸が変化していたが,226番目のアミノ酸置換(The.→Asn.)は親和性の低下につながる(D37/V1)と考えられるので,D37/V3における親和性の増強は,226番目の変化(Val.→Phe.)に基づくものと判断される。前年度の研究成果と本年度の知見を併せ考察すると,N端から283番目のアミノ酸の変化(J14/V1とV4におけるAsp.→Asn.)がレセプタ-との親和性を最も強く変化させ,変異部位がN端方向へ移るにつれて親和性が弱くなり,186番目(J9/V2,V3におけるLys.→Arg.)と187番目(J9/V1におけるAsn.→Ile.)の変異がその効果が最も強くなるものと考えられる。なお、レセプタ-認識能に変化を来していると考えられる組織培養細胞馴化株についても同様の解析を行っている。
フォトニック結晶に非線形誘電体を組み込んだ光機能素子に関する研究

フォトニック結晶(Photonic Crystal : PC)構造にカー型の非線形誘電体を組み込み,光信号振幅の変化に伴う非線形誘電率変化を介して光波の伝搬路を変化させる構造について,FDTD法を用いた理論的解析を行った.平成16年度は,二次元方向性結合器およびY分岐導波路における光スイッチングの解析を中心に行った.PC方向性結合器の解析では,昨年度と同様,結合領域を非線形誘電体とした場合の出力特性の入射電界強度依存性を明らかにした.入射電界振幅を5倍変化させると2本ある出力導波路間で出力の切り替えが起き,そのときの消光比は約4倍である.ただし非線形誘電率変化によりフォトニックバンドが影響を受けて導波路外に放射される電磁エネルギーが多くなるため,消光比に対して悪影響を与えてしまう.また,4GHz帯のマイクロ波領域におけるPC方向性結合器のモデルを作成して線形媒質の場合の数値計算結果の検証も行っており,シミュレーションと実験結果がよく一致することを確認した.次に,光スイッチングにおける消光比向上を目指し,Y分岐型のPC導波路構造中の光波伝搬解析も行った.まずY分岐導波路の伝送特性を解析した.六方格子状の線形誘電体円柱の周期構造内にY字型の欠陥列を設けて導波路とした.二本の出力部にそれぞれ半径・誘電率とも周囲結晶と異なる共振器となる円柱を配置し,最大出力が得られるよう最適な格子周期を決定した.このとき共振器の屈折率をわずかだけ異なるようにしておく.この屈折率差が0.04程度で光スイッチングが起き,その消光比も20dB以上と良好な結果が得られた.また波長依存性についても波長差16nmで光スイッチングが起き,同じく20dB以上の消光比が得られた.以上より共振器を有するY分岐フォトニック結晶導波路は非線形効果誘電率変化を利用した光スイッチ素子として有望であることがわかった.次世代の光伝送素子として期待されているフォトニック結晶構造に非線形誘電体を組み込み,光信号振幅の変化のみによって光波の伝搬路を変化させる構造について,有限差分時間領域法を用いた理輪的な解析を行った.平成15年度は2次元方向性結合器における光スイッチングの解析を中心に行った.ピラー型フォトニック結晶内の格子欠陥列を導波路とし,近接した欠陥列を2列平行に設けた方向性結合器を考えた.その際,2つの出力ポート間における光波の分離のため一方の出力ポートを直角に曲げた.この直角曲がりの透過率を最大にする構造についてまず解析を行い最適な格子間隔を見出した.このとき入射波はガウスビームで,キャリア光波長は1.55μmの連続波とした.その後,結合器の欠陥列にはさまれた結合領域のピラーの線形屈折率を変化させてスィッチングを起こすのに必要なピラーの本数を決定した.以上を踏まえて,結合領域のピラーにカー型の非線形性を想定した解析を行った.カー型の非線形性は電界の3乗に比例する項となって現れるが,これをテイラー展開して時間領域有限差分法に組み入れた.以上のような条件で解析を行った結果,入射光の振幅を5倍程度変化させると出力ポートが切り替わり,そのときの消光比として4倍程度の値が得られるという数値結果を得た.また,このような光スイッチングを起こすには,全て線形誘電体で構成されたフォトニック結晶方向性結合器の場合において約0.1の屈折率変化を要することも明らかになった.しかしながら非線形誘電体を組み入れると,非線形屈折率が光波伝搬に伴い変動するためにバンドギャップ構造が乱されて放射を伴いながら伝搬するため入出力の効率が低下することも明らかになった.消光比の向上と放射の抑圧,および3次元構造の解析が次年度取り組むべき課題である.フォトニック結晶(Photonic Crystal : PC)構造にカー型の非線形誘電体を組み込み,光信号振幅の変化に伴う非線形誘電率変化を介して光波の伝搬路を変化させる構造について,FDTD法を用いた理論的解析を行った.平成16年度は,二次元方向性結合器およびY分岐導波路における光スイッチングの解析を中心に行った.PC方向性結合器の解析では,昨年度と同様,結合領域を非線形誘電体とした場合の出力特性の入射電界強度依存性を明らかにした.入射電界振幅を5倍変化させると2本ある出力導波路間で出力の切り替えが起き,そのときの消光比は約4倍である.ただし非線形誘電率変化によりフォトニックバンドが影響を受けて導波路外に放射される電磁エネルギーが多くなるため,消光比に対して悪影響を与えてしまう.また,4GHz帯のマイクロ波領域におけるPC方向性結合器のモデルを作成して線形媒質の場合の数値計算結果の検証も行っており,シミュレーションと実験結果がよく一致することを確認した.次に,光スイッチングにおける消光比向上を目指し,Y分岐型のPC導波路構造中の光波伝搬解析も行った.まずY分岐導波路の伝送特性を解析した.六方格子状の線形誘電体円柱の周期構造内にY字型の欠陥列を設けて導波路とした.二本の出力部にそれぞれ半径・誘電率とも周囲結晶と異なる共振器となる円柱を配置し,最大出力が得られるよう最適な格子周期を決定した.このとき共振器の屈折率をわずかだけ異なるようにしておく.この屈折率差が0.04程度で光スイッチングが起き,その消光比も20dB以上と良好な結果が得られた.

また波長依存性についても波長差16nmで光スイッチングが起き,同じく20dB以上の消光比が得られた.以上より共振器を有するY分岐フォトニック結晶導波路は非線形効果誘電率変化を利用した光スイッチ素子として有望であることがわかった.
分泌型熱ショック融合蛋白質(gp96-Ig)による免疫遺伝子治療の基礎的検討

研究代表者の山崎は以前、分子生物学的手法を用いて分泌型熱ショック融合蛋白質(gp96-Ig)を作成し、分泌型gp96-Ig遺伝子導入による癌拒絶および免疫原性の増加について報告した(J Immunol 163,5178-5182,1999)。その結果をふまえ、本研究の目的は分泌型gp96-Ig遺伝子の免疫遺伝子治療への応用の可能性について検討することである。まず、マウスの系ですでに移植された腫瘍に対する分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞の治療効果を検討した。具体的にはC57BL/6マウスを使用し、マウス肺癌細胞LLC(10^5)またはリンパ腫細胞E.G7(2×10^5)を右側皮下に注射し、day3から放射線照射した10^6の分泌型gp96-Ig導入LLC(LLC-gp96-Ig)またはE.G7(E.G7-gp96-Ig)を左側皮下に注射してday0に接種した母細胞の腫瘍増殖速度を検討した。その結果、E.G7およびLLC両方の系で分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞がすでに移植された野生型の腫瘍の増殖を有意に抑制することが示された。コントールとして用いた抗原性の異なる分泌型gp96-Ig導入細胞(LLCに対してはE.G7-gp96-Ig、E.G7に対してはLLC-gp96-Ie)、および放射線照射した母細胞(分泌型gp96-Ig非導入細胞)は、治療効果を示さなかった。さらにE.G7-gp96-Igを注射したマウスの脾細胞を取り出し、in vitroでE.G7でrestimulateしCD8 CTLが誘導されていることを証明した。また、CD4ノックアウトマウスにおいても、E.G7およびLLC両方の系で分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞がすでに移植された野生型の腫瘍の増殖を有意に抑制することが示され、CD4細胞が腫瘍の拒絶に関与していないことが示された。さらに、分泌型gp96-Ig導入細胞のCD8 CTLの増加、活性化をさらに検討するため、OT-1細胞(Ovalbumin特異的CD8細胞)を静注したマウスにE.G7-gp96-Igを投与し、in vivoでのOT-1細胞数の推移を検討した。その結果、E.G7-gp96-Igを投与されたマウスでは、OT-1細胞の著明な増加が見られ、E.G7-gp96-IgがCD8 CTLの増加、活性化をきたしている可能性が示唆された。

このうち平成13年度は、マウスの系ですでに移植された腫瘍に対する分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞の治療効果を検討中した。具体的にはC57BL/6マウスを使用し、マウス肺癌細胞LLC(10^5)またはリンパ腫細胞E.G7(2×10^5)を右側皮下に注射し、day3から放射線照射した10^6の分泌型gp96-Ig導入LLC(LLC-gp96-Ig)またはE.G7(E.G7-gp96-Ig)を左側皮下に注射してday0に接種した母細胞の腫瘍増殖速度を検討した。その結果、E.G7およびLLC両方の系で分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞がすでに移植された野生型の腫瘍の増殖を有意に抑制することが示された。コントールと用いた抗原性の異なる分泌型gp96-Ig導入細胞(LLCに対してはE.G7-gp96-Ig、E.G7に対してはLLC-gp96-Ig)、および放射線照射した母細胞(分泌型gp96-Ig非導入細胞)は、治療効果を示さなかった。さらにE.G7-gp96-Igを注射したマウスの脾細胞を取り出し、in vitroでE.G7でrestimulateしCD8 CTLが誘導されていることを証明した。昨年度までに、C57BL/6マウスに、マウス肺癌細胞LLC(10^5)またはリンパ腫細胞E.G7(2×10^5)を右側皮下に注射し、day3から放射線照射した10^6の分泌型gp96-Ig導入LLC(LLC-gp96-Ig)またはE.G7(E.G7-gp96-Ig)を左側皮下に注射してday0に接種した母細胞の腫瘍増殖速度を検討した。平成14年度はこの治療的抗腫瘍効果のメカニズムに関する研究を行った。まず、CD4ノックアウトマウスにおいて、E.G7およびLLC両方の系で分泌型gp96-Ig遺伝子導入細胞がすでに移植された野生型の腫瘍の増殖を有意に抑制することが示され、CD4細胞が腫瘍の拒絶に関与していないことが示された。さらに、分泌型gp96-Ig導入細胞のCD8 CTLの増加、活性化をさらに検討するため、OT-1細胞(Ovalbumin特異的CD8細胞)を静注したマウスにE.G7-gp96-Igを投与し、in vivoでのOT-1細胞数の推移を検討した。その結果、E.G7-gp96-Igを投与されたマウスでは、OT-1細胞の著明な増加が見られ、E.G7-gp96-IgがCD8 CTLの増加、活性化をきたしている可能性が示唆された。
聴覚・視覚の複数レベル実時間情報統合の研究

平成14年度は、2本のマイクロフォンを用いた方向通過型フィルタ(Direction-Pass Filter)を提案し、この分離性能の音源方向依存性(「聴覚中心窩(auditory fovea)」と呼ぶ)を明らかにし、聴覚中心窩を積極的に活用したアクティブオーディションを実現した。さらに、大阪大学の石黒教授グループ作成の人間に似た外観を持つヒューマノイドReplieの上にも方向通過型フィルターを実装し、DPFの高移植性を確認するとともに、ヒューマノイドヒューマンインターラクションの実験環境を確立した。これらの成果は朝日新聞夕刊1面に報道されるとともに、IROS論文賞、船井情報科学振興賞などを受賞した。主な研究項目は以下の通りである。1.聴覚的中心窩-混合音から音声分離を行う方向通過型フィルタの方向依存性を評価し、正面方向と真横方向とでは4倍以上の精度の違いがあることを発見した。この現象は、人間の視覚で中心の解像度が高く、周辺は解像度が劣るという中心窩(fovea)に相当しており、「聴覚的中心窩(auditory fovea)」と名付けた。話者や音源に正対して聞く機能を実現するために、聴覚的中心窩を積極的に活用した注意制御システムをロボットに実装中である。2.注意制御部-実時間複数話者追跡システムを用いた注意制御部の設計に、タスク指向(task-oriented)とソーシャル性指向(socially-oriented)という2つの原理を適用した。タスク指向制御では、具体的なタスクである受付ロボットのために、音と顔が一致したストリームに注意を向けるように、一方、ソーシャル性指向制御では、インターラクションの相手の声にまず反応するように、ロボットの挙動選択を実現した。3.ロボットの個性-Interpersonal theoryに基づいた対人関係での個性をdominant/submissiveとfriendly/hostileという2軸で表現することにより、上記のタスク指向・ソーシャル性指向とを組合せた挙動プラニングの構想を提案し、プロトタイプを実装した。
死亡直前のけいれんの有無を死体髄液の核磁気共鳴分析を用いて診断する試み

ラットの死後髄液についてNMR計測を行い、生前のけいれんの有無を髄液で識別できるか検討した。ラットをけいれん誘発群(ペンテトラゾール(PTZ))、抗けいれん薬単独投与群(ペントバルビタール(PB))、けいれん抑制群(PTZ+PB)、対照群に分け、各薬物を腹腔内投与した。炭酸ガス暴露による安楽死後、髄液を採取し、プロトンNMR測定を行った。得られたNMRデータを数値化し、多変量解析を行った。主成分法による解析では、各群のスコアは群ごとに異なる領域に分布した。死亡前に薬物誘発性のけいれんを起こしたラットの死後髄液成分についてNMR計測値を行い、けいれんラットと対照ラットの髄液を識別できるかを検討した。【方法】9週齢SD雄ラットを、けいれん誘発群(ペンテトラゾール(PTZ)-70mg/mL)(n=13)、抗けいれん薬単独投与群(ペントバルビタール(PB)-90mg/mL) (n=13)、けいれん抑制群(PTZ+PB) (n=10)、対照群(生食水) (n=9)の4群に分け、各薬物を腹腔内投与した。投与後、各個体を肉眼的に行動観察すると共にビデオ撮影した。投与5分後に炭酸ガス暴露にて安楽死させ、直ちに髄液を採取し、7テスラFT-NMR装置(JEOL)にて、軽水シグナル抑制の条件でプロトン(1H NMR)測定を行った。得られたNMRデータを数値化し、Unscrambler X(CAMO)を用いて主成分分析等の解析を行った。【結果】主成分分析では、主成分1および主成分2のスコアプロット上で、対照群以外については、同じ群に属する個体のデータは群ごとにそれぞれ近い領域に分布し、特にけいれん誘発群とけいれん抑制群は、対極の位置に分布した。【考察】主成分分析のスコア値を用いて、薬物の投与や死亡前のけいれん発作の有無を識別できる可能性が示唆された。現在、各群の検体すべてのNMR計測を完了し、その後の信号処理を行うと共に、データ解析手法のブラッシュアップを進めているところである。並行して、けいれん群のラットのPTZ投与後の行動変化については、行動スコアを用いて定量化し、エソグラムによる評価を行っている。髄液採取後に摘出した脳については、HE染色やKB染色標本を作製し、脳の病理組織変化の有無についても検索している。法医学
骨再生過程における骨髄由来循環幹細胞の役割:parabiosisモデルを用いて

1,parabiosis modelを用いて骨髄由来末梢血中幹細胞の骨折治癒への関与について検討した。全身の組織が緑色に発光するGFP(Green Fluorescent Protein transgenic)マウスと同系統のマウスとの交配から生まれる同腹のGFPマウスおよびwild type (WT)マウスを得た。GFPマウスおよびWTマウスからそれぞれの末梢血を採取した。フローサイトメトリーを用いて末梢血中のGFP陽性細胞の比率を計測した。GFPマウス末梢血中のGFP陽性細胞は約61%であり、WTマウスでは約0.4%であった。さらにこれらのマウスを使ってparabiosis modelを作製すると、手術後2週時点でGFPマウスで39%,WTマウスで35%のGFP陽性細胞がそれぞれの末梢血を循環している(すなわち末梢循環を共有している)ことが確認できた。この時点で、WTマウスの右脛骨を骨折させ、独自に作製したリング型の創外固定器を用いて、骨折部を安定化させ骨折治癒を組織学的に観察した。骨折1、2週の時点で骨折部には仮骨形成を認め、仮骨は軟骨細胞、骨芽細胞から構成されているが、おそらく骨芽細胞と考えられる細胞の一部に抗GFP抗体陽性の細胞が同定された。これにより我々の作製した実験系でも末梢血を循環していた細胞が、骨折部に動員されていることを証明した。骨折後3週の時点では骨は修復されており、骨折部にGFP陽性細胞は同定されなかった。2、骨折部に動員された末梢血由来の細胞が骨芽細胞であるかどうかを証明するために、骨芽細胞および骨細胞に特異的なマーカーである抗osteocalcin抗体を用いて免疫染色を行った。連続切片にてGFP陽性細胞の存在する部位の細胞はすべてosteocalcin陽性であり、骨折部に動員されたGFP陽性細胞は骨芽細胞であると考えられた。今回の研究で骨髄由来末梢血循環幹細胞は、骨折治癒過程において骨芽細胞に分化し、骨折部に動員されると結論した。末梢血中には骨髄由来の未分化間葉系幹細胞が存在することが示唆されている。この流血中の幹細胞が骨折や骨延長などにおける組織の再生・修復に関与している可能性がある。本研究ではGFPマウスとwild typeマウスとのparabiosis modelを作製し、wild typeマウスの骨折治癒過程や仮骨延長術の局所にGFP陽性の間葉系幹細胞が出現しないかどうかを調べた。1:同腹のGFPマウスおよびwild typeマウスの作製と免疫染色技術の確立全身の組織が緑色に発光するGFP(Green Fluorescent Protein)マウスと同系統のマウスとの交配から生まれる同腹のGFPマウスおよびwild typeマウスを得た。脛骨を採取しパラフィンブロックを作製後、抗GFP抗体を用いて免疫染色を施行し、GFPマウスでは脛骨全体に発色を確認、wild typeマウスでは組織切片上に発色のないことを確認した。2:Parabiosisモデルの作成同腹のGFPマウスとwild typeマウスの腹膜と皮膚を縫合し、2週間後にwild typeマウスから採血を行い、フローサイトメトリーを用いて全末梢血循環細胞の4050%がGFP陽性細胞となっていることを確認した。次に末梢循環している細胞が骨再生部で骨芽細胞もしくは骨細胞に分化しているかどうかを確認するために、以下の実験を行った。(マウス仮骨延長モデルへの応用)まだ末梢循環が共有されていないparabiosis作成直後のwild typeマウスの右下腿に創外固定器を装着し、脛骨に骨切りを行った。仮骨延長モデルとして1週間待機の後、2週間(0.21mm/12h)の仮骨延長術を施行した。その間1週ごとにwild typeマウスの尻尾から末梢血を採取し、フローサイトメトリーにて末梢循環を共有していることを確認した。延長終了直後および延長終了後1wの時点で延長仮骨を採取し、パラフィンブロックを作製した。現在GFP陽性かつ骨芽細胞および骨細胞に特異的なマーカーであるオステオカルシン陽性細胞を同定中である。

骨折後3週の時点では骨は修復されており、骨折部にGFP陽性細胞は同定されなかった。2、骨折部に動員された末梢血由来の細胞が骨芽細胞であるかどうかを証明するために、骨芽細胞および骨細胞に特異的なマーカーである抗osteocalcin抗体を用いて免疫染色を行った。連続切片にてGFP陽性細胞の存在する部位の細胞はすべてosteocalcin陽性であり、骨折部に動員されたGFP陽性細胞は骨芽細胞であると考えられた。今回の研究で骨髄由来末梢血循環幹細胞は、骨折治癒過程において骨芽細胞に分化し、骨折部に動員されると結論した。
c-kit遺伝子産物におけるpolyubiquitinationの生物学的意義-Steel factor刺激後のc-kit蛋白のturnoverに及ぼす影響-

3)Steel factor刺激後、アイソトープ標識されたc-kit蛋白は、短時間に細胞内にinternalizationされ、かつ分解される(T1/2:20min)。また、c-kitの分解速度はpolyubiquitinationが阻害される上記の条件下で、有意の低下を認めた。以上の結果よりligand刺激によって誘導されるreceptorのubiquiinationがreceptorの発現調節並びに活性化されたreceptorのスイッチをオフする生物学的意義を有することが示唆された。上記の結果を踏まえて、申請者は膜結合型および分泌型(可溶型)Steelfactorのisoform間で、c-kit蛋白の分解速度ならびにtyrosine kinase活性化のkineticsの相違を検討する方向で研究を進めたい。
数学基礎論による代数のプログラミング言語理論への応用

現在注目されている分野の中に、substructural logicsと呼ばれる非古典理論がある。その中でも、implicational logicsについての考察を主として行ったが、今年の成果はまずP-W問題のsyntacticなsolutionを与えることができたと言うことである。この問題は1960年代後半からrelevant logicianのだれもが取り組んだと言う難関であった。一応1984年に肯定的な解決を見たものの、その証明は難解であった。私はこのP-W問題について、normalization theoremと呼ばれる定理を用い、syntacticで、かつ明解な証明を与えることに成功した。このようにnormalization theoremは、syntaxを解明する方法としてとても有用であることがわかり、liniear logic,situation theoryといったコンピュータサイエンスの分野からも興味を持たれ始めている。だが、一方でその定理の限界も明らかになった。Wと呼ばれるcontractionがある論理に対してはうまく働かないのである。とくに非可換な論理については、decidabilityといった基本的な問題すらまったく手つかずの状態である。わたしは今BIWと呼ばれるについて研究を進めているが、問題が山積しており、normalization theoremに変わる有力な定理もみつかっていないのが現状で、semanticsを用いた考察も行っている。M.DunnのGaggletheoryなどは興味深く、finite model propertyについての応用も調べてみる価値があり、そのような研究は多くの関心を集めると思う。