hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EGFR-TKI耐性肺癌における特異的シグナルの同定と克服

次に、19Del+T790二次変異、L858R + T790二次変異、19Del/T790M+C797S三次変異、L858R/T790M+C797S三次変異のベクターを作製(いずれもcis位)し、Ba/F3への導入に成功した。二次変異株ではgefitinibとafatinibには感受性が乏しいが、osimertinibには感受性を残していた。三次変異株では、いずれのチロシンキナーゼ阻害薬も効果がなく、臨床での効果を反映する耐性株を樹立できた。まず、19Del細胞株とL858R細胞株のタンパク発現の差をみるためにプロテオーム解析を行った。検出された全2517スポットのうち、タンパク質のスポットとして検出されたものは、1155スポットであった。そのうち、差の確認されたものは63スポットあり、内訳として発現が増加したものが44スポット、発現が減少したものが19スポットあった。そのうちピークが明らかに異なるものを切り出し、MALDI-TOF型質量分析システムにより解析した。Mascot(Matrix Science社)検索システムのMS/MS Ion Search法を用いてアミノ酸配列を同定した。スポット1195部位から20個のタンパク、1044部位から19個のタンパク、1106部位から20個のタンパク、1400部位から16個のタンパク、1259部位から20個のタンパク、1111部位から20個のタンパク質を同定した。これらのタンパク質がEGFRのエクソン19とエクソン21変異による下流シグナルの差と考えられるが、その意義について検討中である。EGFR-TKI感受性細胞株PC-9から樹立したJAK2活性化を介した新たなEGFR-TKI耐性機序を有する細胞株(PC-9/ER3)におけるJAK2/FLT3阻害剤であるpacritinibを用いて、その耐性克服を試みた。PC-9/ER3においてerlotinibとpacritinibの単剤と比較し、2剤の併用により有意な増殖抑制効果を認めた。ウエスタンブロット法により、併用ではpAKTとpERKは抑制されたが、pJAK2(Tyr1007/1008)、pSTAT3、およびpFLT3は抑制されなかった。リン酸化キナーゼアレイにより、pacritinibによるMETの抑制が示唆され、erlotinibとMET特異的阻害剤の併用で相乗効果が確認された。また、異種移植片マウスモデルにおいても併用療法は腫瘍増殖を有意に抑制し、pMETの抑制も確認された。JAK2阻害剤の併用が、一部のEGFR-TKI耐性肺癌に対して有効である可能性が示唆され、その機序としてpacritinibによるMETの抑制が関与していると考えられた。発癌の内的要因として知られてきた遺伝子修復酵素のAPOBECに関しては、PC-9と3種類のEGFR-TKI耐性株(PC-9/ER3、PC-9/GR、RPC-9)のAPOBEC3BのmRNA発現をRT-PCRで検討した。いずれの耐性株も親株に比べ発現が増強していた。テトラサイクリンのスイッチモデルによるEGFR野生型と変異型に、EGFRのオン・オフをウエスタンブロットで、EGFRが細胞膜に高発現していることを蛍光顕微鏡で確認した。プロテオーム解析では、親株とクリゾチニブ耐性株を2次元ゲル電気泳動を行ったとところ、約2000スポットの発現量の差が認められた。そのうちピークが明らかに異なるもの3つを切り出し、MALDI-TOF型質量分析システムにより解析している。元来EGFRの発現のないHEK293TにEGFR遺伝子変異導入によるEGFRの高発現はバルクの細胞株では確認できた。しかしながら、EGFR-TKI感受性株が野生型の約2倍と予想していたより乏しかった。その原因を蛍光顕微鏡において検索したところ、EGFR発現のある細胞株とない細胞株が混在していることがわかり、再度クローニングを行っている。したがって、EGFR-TKI耐性株に対する3次変異(C797S)の導入やEGFR-TKIの耐性株のプロテオーム解析には至ってはいない。そこでEGFRと同じfamilyであるHER3が耐性機序のひとつであるALK-TKI耐性株においてプロテオーム解析を行っており、こちらは順調に進んでいる。in vitroで樹立されたEGFR-TKI耐性株において、APOBEC3B発現量と耐性度の相関は認められているので、他の細胞株でも検討している。HEK293細胞株にEGFR-wild type、EGFR-DelE746A750、EGFR-L858R、EGFR-Del19T790M、およびEGFR-L858R-T790Mをレンチウイルスベクターで導入し、EGFRの高発現をqRT-PCRとWestern blottingで確認した。これらはすべてテトラサイクリンのスイッチモデルによるEGFRのオン・オフ細胞株としている。同様にBa/F3細胞株にEGFR遺伝子を導入している。Site-Directed Mutagenesisを用いてプライマーを設計し、EGFR野生型、EGFR-エクソン19欠失型とEGFR-L858R変異型を作製した。引き続きEGFR-エクソン19欠失型+T790MとEGFR-L858R+T790M変異型を作製した。いずれの細胞株もEGFR依存性があることを確認した。

プロテオーム解析では、EML4-ALK融合遺伝子を有するヒト肺癌細胞株とそのクリゾチニブ耐性株を用いて2次元ゲル電気泳動を行ったとところ、約2000スポットの発現量の差が認められた。そのうちピークが明らかに異なるもの3つを切り出し、MALDI-TOF型質量分析システムにより解析した。Mascot(Matrix Science社)検索システムのMS/MS Ion Search法を用いてアミノ酸配列を同定し、耐性株に高発現しているスポット1239、1840、2272部位から4つのタンパク質を同定した。これらのタンパク質が真にALK阻害薬耐性に関与しているか否かを検討中である。遺伝子修復酵素のAPOBECファミリーがEGFR遺伝子変異の出現に関連しているか否かの検討を行っている。その中のAPOBEC3B発現を5種類のEGFR野生型の細胞株と10種類のEGFR変異細胞株を比較したところ、有意にEGFR変異株で高発現が認められた(p=0.016)。HEK293細胞に遺伝子導入したEGFR変異株のEGFRシグナル依存性が約2倍と予想外に低かったため、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬によるselectionを繰り返している。その他は順調である。次に、19Del+T790二次変異、L858R + T790二次変異、19Del/T790M+C797S三次変異、L858R/T790M+C797S三次変異のベクターを作製(いずれもcis位)し、Ba/F3への導入に成功した。二次変異株ではgefitinibとafatinibには感受性が乏しいが、osimertinibには感受性を残していた。三次変異株では、いずれのチロシンキナーゼ阻害薬も効果がなく、臨床での効果を反映する耐性株を樹立できた。まず、19Del細胞株とL858R細胞株のタンパク発現の差をみるためにプロテオーム解析を行った。検出された全2517スポットのうち、タンパク質のスポットとして検出されたものは、1155スポットであった。そのうち、差の確認されたものは63スポットあり、内訳として発現が増加したものが44スポット、発現が減少したものが19スポットあった。そのうちピークが明らかに異なるものを切り出し、MALDI-TOF型質量分析システムにより解析した。Mascot(Matrix Science社)検索システムのMS/MS Ion Search法を用いてアミノ酸配列を同定した。スポット1195部位から20個のタンパク、1044部位から19個のタンパク、1106部位から20個のタンパク、1400部位から16個のタンパク、1259部位から20個のタンパク、1111部位から20個のタンパク質を同定した。これらのタンパク質がEGFRのエクソン19とエクソン21変異による下流シグナルの差と考えられるが、その意義について検討中である。ヒト胎児由来腎臓上皮細胞株であるHEK-293TのEGFR遺伝子変異導入株のクローニングが最大課題である。私たちのデーターも含め、これまでTKIの耐性機序はEGFRでもALKでも同様の耐性機序が報告されている。ALK-TKI耐性株におけるプロテオーム解析で新知見が得られつつあるので、こちらの耐性株で予想される耐性機序をin vitroで樹立されたEGFR-TKI耐性肺癌細胞株でも検討していく。他の研究計画は予定どおり進めている。
膠原病におけるDendritic cell(樹状細胞)の抗原提示機能に関する研究

まずヒト末梢血より樹状細胞(以下DC)の分離技術の確立につとめた。その概要はヘパリン加ヒト末梢血50ml100mlよりFicoll-Hypaque比重遠心法で単核球層を得、ペトリ皿で培養した。非付着性の細胞はのぞきさらに一夜培養するとDCは剥離してきた。このものを抗ヒトIgG抗体をラベルしたプラスチックシャーレ中でさらに培養し、再付着操作とFCレセプターの有無によるパンニング法を行った。必要に応じ3C10、Leu1、Leu14等のモノクローナル抗体+補体によるkillingを行った。このようにして得られたDCは著明な樹枝状突起を有し、非特異的エステラーゼ染色陰性,HLA-DR陽性,C3biレセプター陽性,FCレセプター陰性,表面免疫グロブリン陰性,OKT3抗原陰性であった。機能面では混合リンパ球反応(以下MLR)のactive stimulatorであった。全身性エリテマトーデス(以下SLE)患者ではMLRの低下が知られている。そこでMLR系で、SLEDCの機能を検討した。その結果は従来いわれていたようにSLEにおけるMLRの低下はTcellに起因するのではなくMLRのstimulatorであるDCに機能異常が存在することがわかった。またDCは自己および非自己のTcellと特異な細胞集塊であるクラスターを形成した。クラスターを形成するTcellは主としてOKT4陽性であった。クラスター培養上清中にはSAC刺激下にBcellを抗体産生細胞へと分化させる因子(BSF)が含まれていた。ところがSLEDCで形成したクラスター上清中のBSF活性は極めて低値を示しSLEDCの機能異常がみとめられた。混合性結合組織病(以下MCTD)およびシェーグレン症候詳(以下SjS)患者においてもMLRの系を用いDC機能異常が証明された。SjSではautologousMLRのstimulatorとしてのDC機能異常が証明された。抗原提示細胞であるDCの機能異常は自己免疫である膠原病の発病に重要な役割をはたしているのかもしれない。
桜島における現地観測に基づく火山性土石流の流動特性の解明

本研究は、火山性土石流による災害防止予測を目指してその流動特性を解明するために、桜島の持木川において昭和61年度から続けている現地観測をさらに継続、発展させる形で行われた。過去の研究の経過としては、昭和62年7月に、魚群探知機を改造した超音波距離計と放射温度計を橋桁に取り付け、建設省の設置した検知線を利用して、土石流の水位を測定することに成功した。次いで10月には振動計を1基取り付けた。昭和63年には、超音波距離計を撤去し、振動計をもう一基増設したが、土石流による温度変化のみ記録できた。平成元年度には以下のような観測行った。1)4月下旬に振動計及び放射温度測定装置を持木川の観測所に設置し、さらに振動計を一基増設し3次元で振動を捉えられるようにした。2)8月上旬から9月下旬にかけて土石流の発生が数回あったが検知線による観測システムがうまく働かず、データは収集できなかった。3)新たに開発した超音波距離計・振動計および放射温度計からのデータを記録し、これを電話回線を通して送信できかつ観測システムを監視できる遠隔操作システムを開発した。この完成は10月であった。4)収集システム用の電話回線を設置しようとしたが、九州大学内の外線電話には、回線数の限界があり、また鹿児島高専では事務手続き上の問題から設置に至らず、従来どうりの観測システムとした。本年度は土石流の発生回数が少なく観測装置の故障からその少ないチャンスを逃してしまった。これまで得られた、水位及び温度データを解析し次の知見が得られた。水位データから自己相関関数を求めたが従来から示唆されているような転波列の存在を表す兆候は見られなかった。また、土石流の摩擦熱による温度上昇は、収集されたデータから見る限りわずかであり、発熱現象は認められなかった。なお、現在観測システムを整備中であり、次年度以降のデータの集積を期している。
追跡眼球運動プログラミングにおける小脳の役割に関する生理学的研究

3頭の日本猿慢性標本を用いて、小脳核のほぼ全領域に微小電極を刺入し局所刺激を行った。誘発される眼球運動をサーチコイル法で記録し、後に解剖学的に刺激部位を同定した。その結果、小脳室頂核、中位核、歯状核にそれぞれ遅い眼球運動と速い眼球運動に関与する領域がともに存在することを見いだした。室頂核の最内側には、刺激開始後20-30ミリ秒後に水平もしくは垂直性の遅い眼球運動の誘発される領域があり、そのやや外尾側に刺激開始後30-50ミリ秒後に水平もしくは垂直性の速い眼球運動の誘発される領域があった。次に、前中位核の内側眼球運動の誘発される領域があり、後中位核の尾腹側には、刺激開始後20-30ミリ秒後に水平もしくは垂直性の遅い眼球運動の誘発される領域が存在した。歯状核の最頭側には、刺激開始後15ミリ秒後に垂直性の遅い眼球運動が誘発される領域があり、また尾側には、刺激開始後30-40ミリ秒後に垂直性の中間速の眼球運動が誘発される領域が存在した。以上の所見は、3つの小脳核がそれぞれ独立に、サッケードもしくは追跡眼球運動の制御に関与していることを示唆しており、小脳による随意運動制御が多重に作用していることが想像される。これらの結果を平成6年度の神経科学学会で発表したが、さらに学会誌に投稿する予定である。
FoxH1(FAST)のマウス胚パターン形成における役割

マウス発生段階において前後(頭尾)軸形成は重要なボディープラン現象の一つである。前後軸が形成されるには遠位臓側内胚葉(DVE)が将来の前方へ移動することが重要であるが、そのメカニズムは未知であった。これまで前後軸が形成されるためには原始内胚葉でのFoxH1を介したNodalシグナルが必要であることがFoxH1ヌル欠損マウスの解析を通して明らかになってきた。さらに、今回我々はNodalシグナルとその阻害因子であるLefty1とCerberus-relatedの発現部位が、正常なDVEの移動に重要な働きをしていることを見出した。まず、我々は新たに開発したマウス発生初期胚への部位特異的遺伝子導入法を用いてNodal阻害因子が遠位端から側面の一方向へ傾いている事によりDVEの移動方向を決定している事を明らかにした。またマウス初期胚でのBrdU染色法や部位特異的遺伝子導入法を用いてNodal阻害因子がNodalシグナルを抑制する事によって、前後軸に沿った非対称な細胞増殖を引き起こしDVEを移動させていることを明らかにした。更に、Lefty1とCerberus-relatedの二重欠損マウス胚を用いて、遺伝学的にもこれらNodal阻害因子がDVEの移動方向を決定していることと、前後軸に沿った非対称な細胞増殖を引き起こしDVEを移動させているという裏付けを取った。平成14年度は主にマウス発生初期の左右軸形成期にFoxH1がどのように機能しているのかをFoxH1の側板中胚葉特異的なコンディショナルノックアウトマウスを用いて解析した。更にこの解析の中でマウス胚に組織の移植やエレクトロポレーション法などのマニュピレーションを施し、左右軸形成機構をより明確にした。FoxH1のコンディショナルノックアウトマウスは左側を決定するNodalの発現が消失し、それに伴いLefty, Pitx2の発現も消失し、左側が決定できないためにその新生児は右側相同の表現型を呈した。このFoxH1のコンディショナルノックアウトマウスは側板中胚葉特異的に遺伝子を欠損し、神経底板ではその遺伝子は存在しているにもかかわらず、左側神経底板特異的に発現するLefty1の発現も消失していた。この原因を解明すべくマウス胚にNodalの発現している側板中胚葉の移植やNodalを発現する発現ベクターをエレクトロポレーション法で異所的に発現させることにより側板中胚葉で発現しているNodal自身が神経底板まで拡散していきLefty1を誘導していることが明確になった。平成15年度は主にマウス発生初期の前後軸形成期に研究課題であるFoxH1やその上流で機能しているNodalがどのように機能しているのかを野生型胚やNodalシグナル関連因子のノックアウトマウスを用いて解析した(採用申請書:研究内容「1」の項目)。更にこの解析の中で直径100マイクロメートルという小さなマウス胚に遺伝子を導入する方法を開発し、前後軸形成に重要な役割を担っている因子とその機能をより明確にした。前後軸形成が行われる間(5.5から6.5日胚)でのNodal阻害因子の発現パターンをWhole mount in situ hybridization法を用いて詳細に調べた。するとHexを発現するDVEがまだ遠位端に存在する時点で既にNodal阻害因子のLefty1とCerberus-relatedの発現は臓側内胚葉の遠位で一方向に傾いていた。まず、この一方向に傾いているNodal阻害因子がDVEの移動方向を決定しているのかを調べた。DVEが移動し始める以前の5.2日胚を用いて遠位端近傍の臓側内胚葉側面に様々な遺伝子を異所発現させ、DVEが移動し終わる6.5日胚までin vitroで培養を行い異所発現させた部位とDVEが移動した部位(前側)の関係を調べた。コントロールのGFPのみを発現させても発現部位と前側との関係はランダムであった。しかし、Lefty1とCerberus-relatedを共発現させると発現させた部位はほとんど前側と一致した。また、Nodalを発現させると発現させた部位はほとんど前側以外となった。これよりNodal阻害因子の一方向への傾きがDVEの移動方向を決定していることが明らかとなった。次に前側を決定した後にどのようにDVEは移動していくのかを調べた。まず細胞増殖をBrdU取り込み実験法を用いて詳細に調べた。DVEが移動を行う直前の5.5日胚では細胞増殖は対称であったが、DVEの移動が始まる5.7日胚以降になると細胞増殖はDVEの位置で抑制され、胚の前後軸に沿って前側では抑制され、後方では促進させていると言った非対称であった。一方、DVE移動がおこらないNodalシグナルの変異マウス胚ではこの細胞増殖の非対称は観察されなかった。これより細胞増殖の前後軸に沿った非対称性がDVEを一方向に移動させる原動力になっていると示唆された。この研究成果をイギリスの科学雑誌「Nature」のarticle形式に投稿し、平成16年3月にon lineで掲載されることになった。

さらに、今回我々はNodalシグナルとその阻害因子であるLefty1とCerberus-relatedの発現部位が、正常なDVEの移動に重要な働きをしていることを見出した。まず、我々は新たに開発したマウス発生初期胚への部位特異的遺伝子導入法を用いてNodal阻害因子が遠位端から側面の一方向へ傾いている事によりDVEの移動方向を決定している事を明らかにした。またマウス初期胚でのBrdU染色法や部位特異的遺伝子導入法を用いてNodal阻害因子がNodalシグナルを抑制する事によって、前後軸に沿った非対称な細胞増殖を引き起こしDVEを移動させていることを明らかにした。更に、Lefty1とCerberus-relatedの二重欠損マウス胚を用いて、遺伝学的にもこれらNodal阻害因子がDVEの移動方向を決定していることと、前後軸に沿った非対称な細胞増殖を引き起こしDVEを移動させているという裏付けを取った。
リボソーム再生系を標的としたNMRによる相互作用解析法と新規抗菌剤の開発

リボソーム再生因子のクローニング、大量発現系の構築並びに精製系の確立をおこない、E.coli, V.parahaemolyticus, P.aeruginosa, T.maritima, T, thrmophilus, A.aeolicus由来RRFについて、^<13>C,^<15>N等の安定同位体で標識した試料を大量調製する系を確立した。続いて、多核多次元NMR法によってNMRシグナルの帰属を行い、上記のRRFについて主鎖原子の帰属を完了することができた。また、RRF阻害剤の設計に応用することを目的とし、NMRによるRRFの分子内運動の解析を行ったところ、RRFに特異的なドメイン運動がRRFの活性と相関していることを示す結果が得られた。このことはRRFのドメイン運動を抑制する低分子化合物によってRRFを阻害できる可能性を示している。さらにRRFの変異体を用いた相互作用実験並びにRRF-リボソーム複合体のクライオ電子顕微鏡解析を行い、RRFとリボソームの相互作用部位について多くの知見を得たほか、RRFの部分フラグメントとリボソームの相互作用解析を行い、リボソーム結合に必要十分なRRFの構造を明らかにした。上記の成果を応用したRRF阻害剤の合理的設計のため、新たにE.coli由来RRF変異体及びV.parahaemolyticus由来RRFについてX線結晶構造解析によってその立体構造を決定した。立体構造に基き、その阻害剤候補をコンピューターを利用したデータベースからのバーチャルスクリーニングによって選別した。安定同位体標識したRRFと得られたライブラリー分子群との相互作用をNMR(緩和フィルター法と拡散フィルター法による候補分子の選別、及び飽和移動法とHSQC法を用いた結合部位の同定)によって検出することを試みた結果、RRFとの相互作用を示唆する分子が得られた。これらNMRスクリーニング系を評価するため、RRF阻害活性を簡便にin vivo及びin vitroで検出できる系を設計し、実際に使用可能なことを確認した。さらにRRFとリボソームとの相互作用様式を解明することでRRF阻害剤設計のための知見を得ることを目的として、RRFのドメイン相当分子を設計・調製し、リボソームとの結合を表面プラズモン共鳴等の手法によって解析した。その結果、RRFとリボソームとの新たな結合モデルを提唱することができた。また設計した分子がRRFを競合的に阻害することを明らかとし、それを最適化することによって新規なリボソーム再生系阻害剤を開発できる可能性を示すことができた。昨年度本研究によってX線結晶構造解析を用い明らかとなった腸炎ビブリオ薗RRF、大腸菌RRFの立体構造に基き、その阻害剤候補をコンピューターを利用したデータベースからのバーチャルスクリーニングによって選別した。

またRRFの変異体を用いた相互作用実験並びにRRF-リボソーム複合体のクライオ電子顕微鏡解析を行い、RRFとリボソームの相互作用部位について多くの知見を得た。さらに、RRFの部分フラグメントとリボソームの相互作用解析を行い、リボソーム結合に必要十分なRRFの構造を明らかにしつつある。
パルス磁場による高温超伝導体の磁化過程と超伝導バルク磁石の開発に関する研究

種結晶を用いた溶融法によりc軸配向させたREBa_2Cu_3O_<7-d>(以下123相)擬似単結晶は77Kにおいて1テスラ級の磁束を捕捉出来る上にさらに低温にすることでもっと高い磁場を発生出来る。このような超伝導永久磁石の性能は材料の組織制御をさらに進めることで最高の性能を持つ従来の永久磁石Nd-Fe-Bの10倍以上の高い磁場を発生させる可能性を秘めている。本研究は、3-5テスラの外部磁場を発生出来る超伝導永久磁石の開発とそれをパルス磁場を用いて着磁する研究を展開することを目標とした。平成9年度は溶融バルク超伝導体の創製とパルス磁場による磁束線の運動のダイナミックスの解明を行った。パルス磁場では、静磁場とはまったく異なる磁化曲線を生ずることを見出した。パルス磁場が低い間は、磁束はゆっくり侵入するが、約2-4テスラを越えると磁束は超伝導体に急激に侵入することを明らかにした。このユニークな現象の解明によりパルス磁場による磁束線の粘性運動とピン止め機構に関する重要な知見を得た。さらに、211相を種々の形態に分散させ組織制御したY123-、Sm-123,Nd123-相擬似単結晶の創製することに成功した。平成10年度にはSm-123溶融バルク超伝導体にAgを微細分散させることでその機械的強度を高め、77Kにおいて1.7テスラ、さらに25Kにおいて9テスラの磁場を発生させる超伝導永久磁石の創製に世界で初めて成功した。これはNd-Fe-Bの30倍の性能であり新聞に報道された(平成10年3月27日付け中日新聞夕刊)。この世界最高の超伝導永久磁石をパルス磁場で着磁するための基礎研究を行ない、3-5テスラの磁場を簡単に発生する超伝導永久磁石発生装置の開発へ大きく前進することに成功した。溶融法により微細なY_2BaCuO_5相を分散させて得られるc軸配向したYBa_2Cu_3O_<7-8>(以下123相)擬似単結晶は92Kの超伝導遷移温度を持ち、77Kにおいて0.6-0.9テスラの磁束を捕捉出来る。材料の組織制御と30-60Kの低温下での着磁技術の確立により、その性能は3-5テスラに達し希土類系永久磁石の約5倍、大型水冷電磁石の約2倍の強力磁場が発生出来ると期待されている。このような超伝導材料を磁化する手法として我々はパルス着磁法を開発した。本研究は、30-80Kの低温領域でパルス磁場により超伝導体に侵入する磁束線の運動挙動を調査し、磁束線の粘性運動ピン止め機構の解明を図る一方で、低温でのパルス着磁法の有効性を実証し、3-5テスラの外部磁場を発生出来る高温超伝導バルク磁石の開発研究を大きく展開することである。平成9年度は溶融バルク超伝導体の創製と磁束線の運動のダイナミックスの解明を行った。パルス磁場が低い間は、磁束はゆっくり侵入するが、約2テスラを越えると磁束は超伝導体に急激に侵入することを明らかにした。さらに、211相を種々の形態に分散させ組織制御したY123-、Sm-123,Nd123-

相擬似単結晶の創製することに成功した。種結晶を用いた溶融法によりc軸配向させたREBa_2CU_3O_<7-d>(以下123相)擬似単結晶は77Kにおいて1テスラ級の磁束を捕捉出来る上にさらに低温にすることでもっと高い磁場を発生出来る。このような超伝導永久磁石の性能は材料の組織制御をさらに進めることで最高の性能を持つ従来の永久磁石Nd-Fe-Bの10倍以上の高い磁場を発生させる可能性を秘めている。本研究は、3-5テスラの外部磁場を発生出来る超伝導永久磁石の開発とそれをパルス磁場を用いて着磁する研究を展開することを目標とした。平成9年度は溶融バルク超伝導体の創製とパルス磁場による磁束線の運動のダイナミックスの解明を行った。パルス磁場では、静磁場とはまったく異なる磁化曲線を生ずることを見出した。パルス磁場が低い間は、磁束はゆっくり侵入するが、約2-4テスラを越えると磁束は超伝導体に急激に侵入することを明らかにした。このユニークな現象の解明によりパルス磁場による磁束線の粘性運動とピン止め機構に関する重要な知見を得た。さらに、211相を種々の形態に分散させ組織制御したY123-、Sm-123,Nd123-相擬似単結晶の創製することに成功した。平成10年度にはSm-123溶融バルク超伝導体にAgを微細分散させることでその機械的強度を高め、77Kにおいて1.7テスラ、さらに25Kにおいて9テスラの磁場を発生させる超伝導永久磁石の創製に世界で初めて成功した。これはNd-Fe-Bの30倍の性能であり新聞に報道された(平成10年3月27日付け中日新聞夕刊)。この世界最高の超伝導永久磁石をパルス磁場で着磁するための基礎研究を行ない、3-5テスラの磁場を簡単に発生する超伝導永久磁石発生装置の開発へ大きく前進することに成功した。
大腸菌必須遺伝子群の機能ネットワークの遺伝学的解析

本研究では、細胞増殖機構の全体像の理解を目指し、大腸菌を材料にして、必須遺伝子群の同定と、機能未知必須遺伝子の機能解析を行った。(1)染色体必須領域の同定:ランダムなトランスポゾン挿入による遺伝子破壊株の作製を網羅的に行ない、全体の約87%にあたる遺伝子について破壊株を作製し、細胞増殖に関与する遺伝子として370遺伝子を同定した。またシスに働く染色体必須領域が存在する可能性も考えた、全ての必須な遺伝情報の同定を目指し、必須遺伝子が存在する領域はプラスミドによって相補しながら、複製起点と終結点を除く全染色体領域をカバーする欠失変異群の作製を進め、染色体全体の約97%以上の領域について欠失株を作製した。相補プラスミドにクローン化した領域などから推定した334必須遺伝子群について枯草菌の全必須遺伝子群と比較したところ、約65%の遺伝子が共通であった。また最小必須遺伝子群の同定を目指して、欠失変異を組み合わせる方法を開発し、実際に染色体全体の約30%を欠失させた菌株の作製にも成功した。(2)機能未知必須遺伝子の機能解析:新規必須遺伝子を含む機能未知必須遺伝子について機能解析を進めた。まずhda伝子およびRNA修飾に関与するygfZ遺伝子が染色体複製開始調節に関与する事を明らかにした。またyadF遺伝子のコードする炭酸脱水酵素が生育に必須であること、mesJ遺伝子がRNA修飾であるリシジン修飾酵素であること、orn遺伝子がコードするRNaseが生育に必須なRNaseEと相互作用し、機能的にも関連することなどを明らかにした。また染色体複製開始調節に必須なDnaA、DnaN、Hda、と相互作用する新たな因子を探索した結果、DnaAに結合する新規タンパク質であるDiaAが複製開始調節に関与すること、新規熱ショックタンパク質であるHspQが変異型DnaAタンパク質の分解に関与することが明らかになった。本研究の目的全ての生物に共通の問題である「細胞の増殖機構の分子生物学的理解」に迫るため、大腸菌細胞の自律増殖に最低限必要な遺伝子群を同定し、これらの遺伝子が担っている機能を主に遺伝学的手法を駆使して解明する。必須遺伝子の同定(a)遺伝子破壊株を用いての必須遺伝子の同定配列解析から存在が推測されている4300 ORFの約88%に相当する3800 ORFの破壊株を得た。菌株の純化、保存を行い、現在この作業が約3400遺伝子について終了した段階にある。確立した株の中の二倍体株785遺伝子の変異株を用いての詳細な解析を行なった所、用いた実験条件下において、88遺伝子が、破壊した場合増殖不能と判断された。この内13遺伝子はこれまで必須ではないと報告されていた遺伝子であり、12個は未解析の遺伝子であった。また、785遺伝子の内18遺伝子は、必須と破壊可能の中間的な表現型を示す(破壊株の増殖が阻害される)遺伝子であった。(b)長い欠失変異株を用いた必須遺伝子の同定生育に必須かどうか不明な遺伝子のほとんどをカバーする163(平均約20kb)の欠失変異の作製を試み、これまでに78の欠失変異株が作製できた。欠失変異が作製できなかった85の領域のうち、61の領域についてはその領域の一部あるいは全部を持つmini-Fの存在下で欠失変異が作製できた。その解析からこれまでに7つの未知必須遺伝子が同定された。未知必須遺伝子のネットワークと機能の解析(a)必須遺伝子の高温感受性化複製が高温感受性mini-Fにクローン化した野生型遺伝子でトランスに相補する方法、野生型mini-Fにクローン化したMn^<++>

イオン存在下で変異誘導した遺伝子でトランスに相補する方法、の二つの方法を構築した。これらをいくつかの遺伝子に適用し、容易に高温感受性化できることを確認した。(b)抑圧変異株、多コピー抑圧遺伝子の分離抑圧変異株、多コピー抑圧遺伝子を比較的簡単に単離解析するシステムを構築し、このシステムが有効に機能することを確認した。大腸菌をモデルとして、細胞性生物が増殖するために最低限必要な遺伝子群、染色体領域を全て明らかにすることを目指して解析を行っている。昨年度まで進めてきた網羅的、系統的な染色体欠失変異群作製において同定された「欠失させることができない領域」について、さらに小さい染色体欠失変異群の網羅的作製を試みることにより領域の同定を進め、そのうちの一部より新規必須遺伝子を同定した。またセットとして最低限必須になる遺伝子群を同定するために、必須遺伝子のみから成る最小染色体を持つ大腸菌の作製を目指して、欠失部位にマーカーなどを残さない大規模欠失変異を比較的容易に作製し、さらにこれらを組み合わせるシステムを構築し、実際に染色体のサイズを30%以上小さくした菌株の作製に成功した。一方これまでに同定した約30の新規必須遺伝子群のいくつかについて機能解析を進めた。新規必須遺伝子yadFについては、すでに炭酸脱水酵素をコードすることが報告されていたが、我々は大気中のような低い濃度の二酸化炭素存在下では、炭酸脱水酵素が生育に必須であることを明らかにした。またペプチダーゼをコードすることが予想される新規必須遺伝子yeaZ,ygjDについて、高温感受性変異株を単離して表現型を調べ、両方が染色体の分配に関与しているものの、異なる過程に機能していると考えられる結果を得た。さらに我々が以前同定した大腸菌の染色体複製開始調節に必須なhda遺伝子の機能、特に生育に必須な機能を明らかにするため、hda高温感受性変異株から抑圧変異株を単離し、それらの解析から新規sha遺伝子を同定した。sha遺伝子が細胞増殖に重要な遺伝子であること、sha遺伝子の機能の完全な欠損によりhda遺伝子の機能の欠損による表現型が抑圧されることを明らかにし、新規必須遺伝子mesJと共に、tRNAの修飾に関与することを明らかにした。大腸菌をモデルとして、細胞性生物が増殖するために最低限必要な遺伝子群、染色体領域を全て同定し、それらの機能を明らかにすることを目指して解析を行っている。<欠失変異による解析>(1)網羅的、系統的な染色体欠失変異株作製を進め、18個の新規必須遺伝子、機能未知必須遺伝子を同定した。これまでに染色体の約90%の領域をカバーする欠失変異群が作製できた。(2)同定した18個の新規必須遺伝子、機能未知必須遺伝子について、高温感受性変異株を単離し、また染色体上の遺伝子についてgfp遺伝子を融合させ、遺伝子産物の細胞内局在性について調べた。さらに高温感受性変異株から抑圧変異株を単離して機能解析を進めた。(3)一方セットとして最低限必須になる遺伝子群を同定するために、生育に必須ではない領域の欠失変異を組み合わせて最大で染色体のサイズを約30%小さくした染色体大規模欠失変異株を作製した。
肥満細胞の血管新生における役割に関する研究

肥満細胞が毛細血管の周辺によく観察されることや創傷の治癒において組織周辺の肥満細胞数が増加する等の観察から,肥満細胞が血管新生反応と関わりを持つと推定される.そこで本研究においては血管の新生反応と退縮反応が同時にみられるカラゲニン炎症モデルを用いて血管新生に関する因子を捜した.1.血管新生因子検索のためのassay系の確立:卵漿尿膜を用いて発生時の血管新生を利用する方法と,ブタ大動脈由来血管内皮細胞を培養細胞として維持し, ^3H-チミジンのDNAへの取込みを指標とした細胞増殖活性に及ぼす影響をみる方法とを確立した.2.カラゲニン肉芽炎症における血管新生因子:SD系ラットの背部皮下に空気8mlを注入後, 2%カラゲニンを空気嚢中に入れ炎症を惹起させた.カラゲニン肉芽の形成過程に伴い肉芽組織に血管新生が認められ,肉芽退縮に伴い血管系が消失した.カラゲニン肉芽炎症浸出液中には血管内皮細胞の増殖を促進する因子と抑制する因子が存在していた.前者は非透析性,加熱ならびに低イオン強度処理に不安定であった.後者は熱に安定な透析生の物質で,細胞特異性があり血管内皮細胞の増殖を抑制したが,繊維芽細胞の増殖には作用しなかった.3.ウシ脳における血管内皮細胞促進因子:さらにカラゲニン炎症浸出液中には血管内皮細胞の増殖を促進する透析性物質が存在することがわかった.この物質は正常ラットの各組織に存在し,とくに脳に多く存在することが判明したのでウシ脳を用いてその性質を検討した.この低分子物質は熱や酸,アルカリ処理に対し安定であり, 1%牛胎児血清を含むDM EMにおいて増殖促進効果を示した.またこの条件下で繊維芽細胞成長因子(FGF)の作用を促進した.また本物質の効果は血管内皮細胞に対して特異的であった.今後以上3種の物質とりわけ最後に述べた物質の構造を明かにし,肥満細胞を含めた他の細胞との関わりを検討する必要がある.肥満細胞が毛細血管の周辺によく観察されることや創傷の治癒において組織周辺の肥満細胞数が増加する等の観察から,肥満細胞が血管新生反応と関わりを持つと推定される.そこで本研究においては血管の新生反応と退縮反応が同時にみられるカラゲニン炎症モデルを用いて血管新生に関する因子を捜した.1.血管新生因子検索のためのassay系の確立:卵漿尿膜を用いて発生時の血管新生を利用する方法と,ブタ大動脈由来血管内皮細胞を培養細胞として維持し, ^3H-チミジンのDNAへの取込みを指標とした細胞増殖活性に及ぼす影響をみる方法とを確立した.2.カラゲニン肉芽炎症における血管新生因子:SD系ラットの背部皮下に空気8mlを注入後, 2%カラゲニンを空気嚢中に入れ炎症を惹起させた.カラゲニン肉芽の形成過程に伴い肉芽組織に血管新生が認められ,肉芽退縮に伴い血管系が消失した.カラゲニン肉芽炎症浸出液中には血管内皮細胞の増殖を促進する因子と抑制する因子が存在していた.前者は非透析性,加熱ならびに低イオン強度処理に不安定であった.後者は熱に安定な透析生の物質で,細胞特異性があり血管内皮細胞の増殖を抑制したが,繊維芽細胞の増殖には作用しなかった.3.ウシ脳における血管内皮細胞促進因子:さらにカラゲニン炎症浸出液中には血管内皮細胞の増殖を促進する透析性物質が存在することがわかった.この物質は正常ラットの各組織に存在し,とくに脳に多く存在することが判明したのでウシ脳を用いてその性質を検討した.この低分子物質は熱や酸,アルカリ処理に対し安定であり, 1%牛胎児血清を含むDM EMにおいて増殖促進効果を示した.またこの条件下で繊維芽細胞成長因子(FGF)の作用を促進した.また本物質の効果は血管内皮細胞に対して特異的であった.今後以上3種の物質とりわけ最後に述べた物質の構造を明かにし,肥満細胞を含めた他の細胞との関わりを検討する必要がある.1.血管新生因子検索のためのassay系の確立:卵漿尿膜を用いて漿尿膜上で生じる発生時の血管新生に及ぼす影響をみる方法ならびに牛大動脈および豚大動脈由来血管内皮細胞を培養細胞として維持し、【^3H】-チミジンのDNAへの取込みを指標とした細胞増殖活性に及ぼす影響をみる方法とをほぼ確立した。2.カラゲニン肉芽炎症における血管新生因子:(1)カラゲニン肉芽腫の作成-ラット(S.D.系,6週令,雄)の背部皮下に空気8mlを注入後、2%カラゲニンを空気嚢中に注入し、炎症を惹起させた。カラゲニンを包むように皮下内に肉芽嚢が形成され、内部に浸出液がたまった。カラゲニン肉芽の形成過程に伴い皮下組織と形成した肉芽間および肉芽組織内に血管新生が認められ肉芽退縮に伴い血管系が消失した。(2)カラゲニン肉芽炎症浸出液中には、血管内皮細胞の増殖を促進する因子と抑制する因子が存在した。促進因子は非透析性で熱に不安定、低イオン強度下で失活するが、DEAE-セファロースカラムにより部分精製された。一方抑制因子は熱に安定な透析性成分であり、セファデックスG-15で画分1と2の2種に分離された。画分2は【A_(271nm)】に吸収極大があったが、画分1には認められなかった。

画分2は蛋白分解酵素による処理には比較的安定であったが、アルカリ処理では失活した。画分2はセファデックスG-15ゲルと強い親和性があったが、アルカリ処理でその親和性を失った。(3)血管内皮細胞の増殖抑制活性には、細胞特異性があり血管内皮細胞の増殖を抑制したが、線維芽細胞の増殖には作用しなかった。カラゲニン炎症の経過とともにこの抑制成分の量が変動した。(4)抑制成分をさらに精製し、肥満細胞も含めたその因子の出てきた細胞をつきとめることが今後の課題である。
栄養教諭との共同開発による自己管理能力育成のための食生活改善プログラムの構築

近年「食育」の推進が求められている。「食」が生活の上で重要であることは,子どもも頭では理解している。しかし,「食」に対して自ら積極的に働きかけていこうとする実践意欲力は,まだまだ乏しいのが現状である。そこで,子どもが,「食」の大切さを実感し生活に浸透させていくために,実践的・体験的学習を重視し,1つ目の実践として,3・4年複式学級の子どもたちと大豆食品を主たる教材として大豆のパワーを追求した。栄養教諭とともに,普段の給食と,その給食から全ての大豆食品を取り除いた給食メニューを開発し,2つを食べ比べることを単元の導入として行った。子どもたちは,大豆が毎日の食事に欠かせないものであることに気づき,大豆への興味を高め,大豆を学級菜園で栽培したり,収穫した大豆を生かして,豆腐,きな粉,味噌,おからを使った調理などさまざな大豆食品づくりに取り組んだりした。地元の豆腐店にも見学に行き,安全でおいしい大豆食品を提供するために努力されている人々の働きについても考えることができた。子どもは,自然の恵みや人々の働きなど,これまで何気なく食べていた作物の背景にまで目を向けることができるようになり,食べ物に対する愛着を持ち,素材の味を生かした調理実習を行うことができた。この調理実習には,栄養教諭も調理から会食まで指導に関わった。現在,給食のメニューで改善が必要だと考えているものが,豆類を子どもたちの好みに合わせて,どのように給食に取り入れていくかである。大豆を使った給食の日に,大豆食品の良さについて校内放送で伝える活動を行った。また,子どもたちが調理実習で作ったメニューを参考に,栄養教諭が給食のメニューに取り入れ,2009年3月に学校給食という形で全校に広めることができた。このように,栄養教諭との共同開発による自己管理能力育成のための食生活改善プログラムを構築することができた。
情報が分散共有された組織の進化的学習と知識創造のシミュレーション研究

(モデルの特徴と経過)(1)これまでに開発してきたネットワーク型動的ハイパーゲームに基づいて,各ゲーム形式(利得行列,戦略集合)に関する学習過程を扱うためのモデルを複数定式化した。(2)各モデルにおいて,認知の学習過程を遺伝的アルゴリズムによりシミュレーション分析した。(3)これまでの結果を踏まえ,さらにエージェント指向の考え方を取り入れて,ハイパーゲーム型状況を本質的に包含する一般的な分配モデルに基づく組織のモデルを定式化した。(4)新たな一般モデルを使って,エージェントの学習過程を限定された条件の下で遺伝的アルゴリズムを用いて分析した。(研究成果)(1)これまでのネットワーク型動的ハイパーゲームに関する結果から,組織学習論で提唱されている2種類のループ学習を表現するレベルの違いを明確に区別することがモデル記述のレベルで可能となった。(2)さらにこれまでのハイパーゲームに依拠したモデルを拡張,一般化し,分配モデルに基づく組織の基本モデルを新たに定式化することで,組織における2種類の学習レベルを明示的にモデルの中で表現することができるようになった。(3)組織に関するエージェント指向モデリングの立場からの研究と完全に接続することが可能となった。(4)本研究による基本モデルが,組織学習の全体モデルの中で,基本的学習モジュールを記述する位置にいることが明らかとなった。本研究では、組織における情報の分散共有の状況をハイパーゲームの枠組みで記述し、そのゲームを繰り返すことで各構成員の持つ解釈枠組を「進化的に」学習していく過程を遺伝的アルゴリズムにより分析し、組織における知識創造との関係を解明することを目的に,今年度は以下のような研究を行った。1.ネットワーク型意思決定を扱える、ネットワーク型で動的な一般ハイパーゲームを定式化し遺伝的アルゴリズムによりシミュレーション実験した。特に,各エージェント集団が独立に同時に序京認知を学習する実験と,エージェントの意思決定時の戦略変数の学習の実験とを行い,認知の学習の過程を分析した。2.組織の学習、とくに内部モデルの学習の「メカニズム」を記述するモデルの本質的中心は進化概念であると考え、組織が進化的学習を行うための自律的意思決定主体間のコミュニケーションに焦点を当てた研究を行った。そのために学習のレベルを考慮した分配の基本モデルを提示し,そこにおけるダブルループ学習の意味を考察した。また実際にダブルループ学習が可能となる条件を遺伝的アルゴリズムによるシミュレーションにより考察した。3.エージェントベースモデリングにおける理論的アプローチの役割と課題を数理的システム理論の立場から考察した。また,組織論におけるシステムアプローチに一つとしてのエージェントベースモデリングの位置付けを考察した。4.以上のような成果を学会等において積極的に発表した。(2)各モデルにおいて,認知の学習過程を遺伝的アルゴリズムによるシミュレーション分析した。(研究成果)(1)これまでのネットワーク型動的ハイパーゲームに関する結果から組織学習論で提唱されている2種類のループ学習を表現するレベルの違いを明確に区別することがモデル記述のレベルで可能となった。
マウス睡眠覚醒制御遺伝子のサプレッサースクリーニング

研究代表者らは、SIK3による睡眠制御に関与する分子を同定するために、サプレッサースクリーニングを実施した。エチルニトロソウレア投与量等の違いによる点突然変異の頻度を検討するため、全エクソームシーケンスを実施した。ランダム変異導入マウスにはC57BL/6N系統のSIK3遺伝子変異マウスを用い、C57BL/J雌と交配させたF1世代を用いて睡眠覚醒行動を検討した。複数のブリーダー由来のC57BL/6JおよびC57BL/6N系統を用いるためSNP候補をすべてシークエンスして、連鎖解析に用いるためのSNPリストを作成した。マウスの睡眠異常を表現型とするサプレッサースクリーニングを稼働することができた。申請時には顕著なノンレム睡眠時間の延長を示すSleepy変異家系と示していたが、正しい遺伝子名を平成28年度にNature誌に公表することができた。Sleepy変異家系は、リン酸化酵素であるSIK3をコードする遺伝子のスプライス変異によって生じ、エクソンがスキップすることによって、優性の効果を示す。SIK3はAMPKファミリーに属するリン酸化酵素であり、脳に広範に発現している。睡眠覚醒異常を指標とした、哺乳類を用いたフォワード・ジェネティクス研究の強力さとユニークさを広くアピールすることができた。本研究はこの家系を用いたサプレッサー・スクリーニングであり、研究成果以前に研究アプローチ自体がユニークなものである。エチルニトロソウレア投与量やプロトコールの違いによるランダム点突然変異の頻度を検討するため、筑波大学村谷研究室に依頼し、全エクソームシーケンスを実施した。新潟大学崎村研究室で作成されたC57BL/6N系統のSIK3遺伝子変異マウスを用いている。これらのマウスは、エチルニトロウレア投与の有無にかかわらず、基礎的な睡眠覚醒行動は、ランダム点突然マウススクリーニングによって得られたSleepy家系と全く同じ睡眠異常を示す。睡眠測定や睡眠覚醒行動解析は、脳波筋電図に基づき行っている。実際のスクリーニングには、C57BL/6Nの純系ではなく、C57BL/J雌と交配させたF1世代を用いている。本研究そのものの基盤となる研究データを大きくアピールすることができた。研究計画に乗っ取り、ランダム点突然マウス由来の家系ではなく、新潟大学崎村研究室で作成されたC57BL/N系統にSIK3変異を導入したマウスを用いた検討を行っている。また、申請時には、全エクソームシーケンスをテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターのNext Gen Sequence coreで行う計画であったが、筑波大学村谷研究室に、全エクソームシーケンスを依頼できるようになった。すでに複数の依頼を行い、最高品質の結果が短時間のうちに得られることを確認している。研究スキーム上の進展によって、約3ヶ月の時間短縮が可能となった。SIK3のスプライスドナーサイトの点突然変異によりエクソンスキップが生じ、この結果顕著なノンレム睡眠時間の延長をもたらす。SIK3はAMPKファミリーに属するリン酸化酵素である。エクソンがスキップのノンレム睡眠延長への効果は優性である(Funato, Yanagisawa et al. Nature 2016)。このSIK3による睡眠制御に関与する分子を同定するために、サプレッサースクリーニングを実施した。通常のランダム点突然変変異マウスの優性形質スクリーニングと異なり、複数のブリーダー由来のC57BL/6JおよびN系統を用いるために、それぞれのSNP候補をすべてシークエンスして、連鎖解析に用いるためのSNPリストを作製した(Miyoshi, Funato et al投稿準備中)。全エクソームシーケンスにより、エチルニトロソウレア投与によるをランダム点突然変異数を検討した。計画的に産仔数を維持するために人工授精によってサプレッサースクリーニング用のマウスを産出している。SIK3変異に加えて、ランダム点突然変異をもつマウスの脳波筋電図を測定し、睡眠覚醒行動を検討している。SIK3変異マウスが肥満傾向を示すことから、サプレッサースクリーニングに用いるマウスについても定期的に体重を測定しエネルギー代謝への顕著な影響がないかの検討を継続している。マウスの睡眠異常を表現型とするサプレッサースクリーニングという非常に野心的なプロジェクトを稼働することができた。SleepyやDreamlessを樹立し、SIK3やNALCNを同定したプロジェクトも成功までにかなりの年数を必要としたこと、システムの樹立自体だけでも非常に困難であったことから、サプレッサースクリーニングを継続していくことが重要である。マウスを用いたフォワード・ジェネティクス研究の経験から、成功のために最も重要なファクターは、粘り強くスクリーニングを続け、多くの点突然変異マウスの睡眠を地道に測定し続けることであると認識している。今後も、研究計画にのっとり、サプレッサー・スクリーニングを継続していく。

概して、SIK3変異マウスは自然交配では産仔数、生育仔数が非常に少ないため、人工授精によって計画的に仔を得て、雄の睡眠覚醒を検討している。雌を使用しない理由は、エストラスサイクルによる睡眠への影響と、雄よりも基礎的に覚醒時間が長いために、より覚醒時間が延長するマウスが得られにくいと考えられるためである。また、染色体マッピングのために次世代を得る上でも、精子の方が多くの仔を一度に得られる利点がある。神経科学マウスの産生数、飼育数、実験前後の死亡数など、必ずしも事前の計算通りには進まないため、若干の次年度使用額が生じた。マウス使用数の若干修正のみで次年度使用額は吸収される。特に、大きな実験計画変更は予定していない。
カシノナガキクイムシの寄主木及び穿孔部位選択様式の解明

病原菌を運搬することでブナ科樹木の集団枯死を引き起こすカシノナガキクイムシについて、寄主木及び穿孔部位選択様式を調査した。直近に寄主木候補が集中している方が、より大きなスケールでは逆に寄主木候補の密度が低い方が、ブナ科樹木がカシノナガキクイムシのアタックを受ける確率は高くなっていた。また、周囲の穿孔され始めた木の密度が高いほど、その後集中加害を経て枯死に至る確率が高くなっていた。更に、カシノナガキクイムシは初期には樹幹下部に集中して穿孔するものの、下部の穿孔密度が高くなってくるに従い穿孔箇所は上部に移行していくことが明らかとなった。ブナ科樹木萎凋病(ナラ枯れ)を引き起こすカシノナガキクイムシは、寄主木や穿孔部位をどのように選択しているのか。これらを明らかにすることは、拡大する一方のナラ枯れ被害を最小限に食い止める防除方法の策定に寄与することが期待される。京都府東部の二次林で、【1】穿孔対象とされる可能性が高い樹木の特性、【2】穿孔されて枯死する可能性に影響する要因、【3】穿孔部位の探索決定様式とその適応的意義、をそれぞれ明らかにするための調査を行った。【1】については1haのプロットを4個設定し、プロット内のブナ科樹木について計測した特性を分析する予定だったが、今のところ2個のプロットしか設定できていない。来年度残りの2個を設定し、あわせてデータを解析する。【2】については、2010年4月から5月にかけて調査区90haを踏査することで2009年被害木の特性を計測し、2008年被害木のデータとあわせて解析を行った。その結果、穿孔された個体が枯死に至る確率には個体サイズは影響を及ぼしていないこと、樹種や地形が異なると確率も異なること、枯死に至る確率には樹種や地形以外の要因で空間的な変異が生じていることが明らかとなり、2011年3月の学会で発表した。【3】については、2009年にアタックされて枯死したミズナラ7個体を対象に、地上高1.5mまでの全ての穿孔に羽化トラップを仕掛け、捕獲されたカシノナガキクイムシを2010年7月から10月にかけて毎週回収し、穿孔ごとに繁殖成功度を計測した。データ解析の結果、穿孔した位置が低く凹んだ場所であるほどカシノナガキクイムシが繁殖成功する確率が高いこと、穿孔密度が中程度の時に繁殖成功度が最大になることが明らかとなり、2011年3月の学会で発表した。【1】については1haのプロットを2個設定し、各プロットに含まれるミズナラとクリについて、2008年から2011年のカシノナガキクイムシの穿孔の有無を調査した。穿孔の有無を応答変数としたモデルを構築した結果、周辺のブナ科樹木の本数密度はスケールの異なる2変数が最適モデルに採択され、周辺5mのスケールではブナ科樹木が集中的に分布することで穿孔される確率は高くなり、周辺12mのスケールではうすめの効果が働いていると考えられた。これら以外に周辺2.5mの樹冠密度が正の影響を及ぼしており、樹冠密度が高いほど穿孔される確率が高くなっていることが分かり、2012年3月の学会で発表した。【2】については、2011年4月から5月にかけて調査区90haを踏査することで2010年被害木の特性を計測し、過去2年分のデータとあわせて解析を行った。その結果、穿孔された個体が枯死に至る確率には空間的な変異が生じており、そこからカシノナガキクイムシの調査地への侵入経路が示唆された。【3】については昨年度の調査結果と過去の坑道長調査の結果をあわせて解析したところ、カシノナガキクイムシの繁殖成功度は穿孔開始のタイミングには左右されないことが明らかとなり、2012年3月の学会で発表した。