hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大型放射光施設(Spring-8)による後期白亜紀の初期被子植物群の花化石の解明

白亜紀の花化石の直径はわずかに1mm前後であり、その中の構造を非破壊的に明らかにすることは容易なことではない。被子植物の花化石の内部構造を、Spring-8およびシカゴの大型加速器(APS)のビームライン2-BM-BのマイクロCTによる解析を行った。大型加速器のビームラインで得られた透過データをトモグラフィー法にて、3次元データに再構築した。これらの3次元構築データの解析によって、これまで、花芽の内部に隠れていた各器官の状態を解明することができた。大型加速器は、広視野・高分解能撮影が可能なビームを有し、サイズや形状も多様な白亜紀の花化石の構造解明のために、極めて有効な装置である。その結果、従来は解明できなかった、白亜紀の微小な花や果実の内部の情報を高分解能で明らかにすることができるようになった。これらの研究成果を取りまとめつつ、それぞれの花化石について、研究論文を作成している。これまでに福島県双葉層群(後期白亜紀)から発見してきた上北迫植物化石群の中から、被子植物の花化石を中心的に、SPring-8でマイクロCTによる内部構造の解析のための測定を行った。白亜紀の花の直径はわずかに1mmしかなく、その中の構造を非破壊的に明らかにすることは容易なことではない。この研究にはアメリカからPatrick HerendeenとPeter R Craneが参加した。BL20B2のビームラインで得られた透過データから、1000枚の断層像を作成し、さらにTri3DVLにて3次元データに再構築していった。その結果、この花は、3数性の花であり、しかも、1心皮性であることにより、8900万年前の絶滅したクスノキ科の花化石であることを示唆した。これらの研究はSPring-8 Frontier 2009で紹介されることになっている。ところが、BL20B2ビームラインによるマイクロCTは分解能2.73μであったので、微細な構造を明らかにすることができなかった。そこで、高分解能であるBL47XU(分解能0.55μ)での測定を試みたところ、視野が限定され、全体像を広視野で高分解能で撮影することがSPring-8では不可能であった。そこで、Peter Craneの協力のもとに、アメリカのシカゴの大型放射光施設(APS)でのマイクロCT測定を試みた。その結果、APSでは、広視野・高分解能撮影が可能であることが分かった。その結果を、2000x2000x2000pixelsの3次元マトリックスデータ化することができた。これだけの大容量のデータマトリックスを解析できるシステムを作り上げるために、64bit48Gbのワークステーションの導入を検討している。これらの研究を現在、取りまとめ中である。シカゴにある大型加速器施設APSにて、マイクロCT測定を7月に実施した。現在、3次元構造のレンダリングを行っている。これらの研究成果を、日本植物学会(2011年9月17日19日;於東京大学)にて発表した。

これまでに福島県双葉層群(後期白亜紀)から発見してきた上北迫植物化石群(8900万年前)の被子植物の花化石の内部構造を、シカゴの大型加速器(APS)のビームライン2-BM-BのマイクロCTによる解析を行った。白亜紀の花の直径はわずかに1mm前後であり、その中の構造を非破壊的に明らかにすることは容易なことではない。この研究にはHerendeen(シカゴ植物園)とCrane(イエール大学)が参加した。2-BM-Bのビームラインで得られた透過データから、1000枚の断層像を作成し、さらにTri3DVLにて3次元データに再構築していった。これらの3次元構築データの解析によって、これまで、花芽の内部に隠れていた各器官の状態を解明することができた。その結果、この花は、3数性の花であり、しかも、1心皮性であることにより、8900万年前の絶滅したクスノキ科の花化石であることを示唆した。その結果、APSでは、広視野・高分解能撮影が可能であり、サイズや形状も多様な白亜紀の花化石の構造解明のために、極めて適している装置であることが分かった。さらに、その結果を、大型ワークステーションによって、2000x2000x2000 pixelsの3次元マトリックスデータ化して、3Dレンダリング法に3次元構築を可能としてきた。その結果、従来は解明できなかった、白亜紀の微小な花や果実の内部の情報を高分解能で明らかにすることができるようになった。24年の7月に、シカゴの大型加速器施設APSで、それまで不足していたCTデータの撮影を行った。これらの研究成果を取りまとめつつ、それぞれの花化石について、研究論文を作成している。23年度が最終年度であるため、記入しない。
大自由度離散力学系において観測される低次元非線形ダイナミクスの創発メカニズム抽出

本研究では、大自由度離散系において観測される低次元(67次元以下)非線形ダイナミクスについて、これを非線形系に偏在する創発現象と仮定し、非線形時系列解析(カオス解析)手法を基盤として、大自由度離散系から観測される創発現象として観測される信号の決定性の定量的な検出法を提案した。また、この手法は、非線形ダイナミクスに駆動されノイズが混入した変動データに効果的に適用できることを明らかにした。対象としては、土壌の破壊現象、心循環器系の脈波変動、共通ノイズ同期としての温州ミカンの国内市場レベルの生産量変動、花粉結合と共通ノイズを印加されたドングリのマスティング現象等である。1.土壌切削実験データに対するカオス時系列解析を実施し、これまで判別が困難であった確率過程によって生成されるカラードノイズ・1/fノイズが決定論的非線形予測関数を自己相関関数の比であるDNP/AUT-Ratio法によって識別可能であることを明らかにし、これを新たなカオス属性指標として提案した。2.サブソイラの土壌切削抵抗の時系列変動データを対象に、これらを期間遅れ埋め込みによってダイナミクスを再構成し、各ベクトル点の近傍ベクトル集合の内積(局所ベクトル場内積平均)を計算した。また、Wayland Testで用いられる遷移誤差(Translation Error)を計算した。これらによって、軌道の滑らかさを定量化することができ、異なる土壌条件において創発するパターン(周波数)と1/fノイズ等との式べく可能性を示した。3.汎用型の粒子法シミュレータ(ParticleWorks)を導入し、傾斜平板による土壌切削破壊現象を記述する3次元モデルを構築した。その際に、加振時および無加振時について切削抵抗波形を観測した。4.マルチエージェントシミュレータからの個体群動態の時系列データを出力し、時系列解析を可能な状態とした。そのうえで、スペクトル解析、非線形時系列解析を試みた。昨年度得られた各種の時系列解析を行った。特に、土壌破壊パターンの包括的非線形時系列解析を実施した。用いたデータは連携先のカリフォルニア大学デービス校と本学附属農業データである。UCDデータは、典型的な空間パターンが観測されたため、集中的に解析を行った。時間遅れ埋め込みによって、想定されるダイナミクスを再構成した。その際に、FNN法によって、埋め込み次元を6と推定した。Waylandtestとして遷移誤差を推定すした。ここでは、遷移誤差を予測ステップの関数として計算した。同時に、昨年度提案した局所ベクトル場内積平均計算アルゴリズムも適用して有効性を確認できた。また、対象データとしてLorenz63とこれに1.6%の正規分布ノイズをシステムパラメータ(加法ノイズ)として付加したデータ、およびAR(1)のカラードノイズを用意した。その結果、4つの土壌条件TD,TW,UD,UWのうち、TDが有意に小さく、Lorenz63のノイズ付加データと同等の値を示した。さらに、決定論的非線形予測と自己相関係数の比(DNP/ACF)の有効性を、相空間内の状態ベクトルの挙動を追跡することによって理論的にも明確にした。一方、近傍ベクトルの平均ベクトルを計算することにより、ノイズが付加したデータからダイナミクスを可視化する方法も明示した。以上のように、カオス属性を多面的に検出する手法を包括的に適用し、土壌破壊パターンの決定性ひいては決定論的ダイナミクスとノイズから構成される変動であることを示すことができた。また、脈波データにも同様の手法を適用し、その有効性を確認した。これらの成果は、米国生物農業工学会、農業食料工学会年次大会で発表した。また、生態系ダイナミクスに関する集団力学モデルについても一部、同様のカオス解析手法を適用し、これらの成果は、NOLTA2014にて公表した。また、国際誌への投稿が受理されている。最終年度においては、前年度に受理されていた国際誌論文を2件出版するとともに、1件をオープンアクセスとした。更に、2件の国際学会の招待講演を行うとともに、国際学会議事録として出版公表した。共同研究者であるカリフォルニア大学デービス校および本学附属農場において取得した土壌切削パターンのデータベースに対して、包括的な非線形時系列解析を実施した。時間遅れ埋め込み、FNNによる埋め込み次元推定、遷移誤差推定、サロゲートアルゴリズムによる決定性の判定、局所ベクトル場内積平均値などを用いた。さらに、本研究チームが開発した、決定論的非線形予測と自己相関関数の比である、DNP/ACPの有効性を示した。供試した4つの土壌条件のデータは、カラードノイズが混入したものであり、決定性の貢献度の定量的検出が安定的に行われる必要があった。Lorenz63のデータに対してノイズを付加した参照データを作成し、それらと実データとの比較から、決定性の存在程度を定性的に把握した。その結果、Tilled Dry(TD)条件下では、決定性が優位に存在しうることが示された。脈波解析にも同様なアプローチを採用し、その有効性を示した。また、温州ミカンの隔年結果が国内市場レベルというマクロな階層で発生している現象を、共非線形集団力学系の通ノイズ印加による同期現象であることを示し、原著論文として出版した。これまでに、3件の国際学会誌、1件の国内学会誌、5件の国際会議議事録(プロシーディングス)に公表した。

米国生物農業工学会、NOLTA2014およびNOLTA2015などの国際会議、国内の農業食料工学会において口頭発表を行った本研究では、大自由度離散系において観測される低次元(67次元以下)非線形ダイナミクスについて、これを非線形系に偏在する創発現象と仮定し、非線形時系列解析(カオス解析)手法を基盤として、大自由度離散系から観測される創発現象として観測される信号の決定性の定量的な検出法を提案した。また、この手法は、非線形ダイナミクスに駆動されノイズが混入した変動データに効果的に適用できることを明らかにした。対象としては、土壌の破壊現象、心循環器系の脈波変動、共通ノイズ同期としての温州ミカンの国内市場レベルの生産量変動、花粉結合と共通ノイズを印加されたドングリのマスティング現象等である。非線形時系列解析の包括的アプローチを計画通り実施できた。これによって、カラードノイズと決定論的ダイナミクスが混合しているような実データの解析に有効なアプローチを提示できた。土壌のような大規模自由度お粒子系や集団力学系において、実データ解析においては有効なものであり、当初の目的にかなうものである。農業環境工学本研究が申請時に挙げた3つの現象は、すべて集団力学系として理解できる。26年度までに開発した手法を用いて、さらに現有の実データと、今後生成する数値実験データについて解析を継続し、提案手法の汎用性について確認する。また、研究成果を国際誌に発表する。25年度計画していた局所ベクトル場内積平均の算出アルゴリズムは予定通り構築できた。さらに、NDP/AC比による決定性の検出手法を考案することができたことは予定を超えた成果である。26年度実施した研究成果の国際誌に投稿している。広く社会に成果を発信するために、オープンアクセスを計画している。当該国際誌へのオープンアクセスには3000米ドル程度を見込んでおく必要があるため、相当額を次年度に繰り越しした。(1)決定性の検出手法:確率過程と局所Lyapunov指数、局所遷移誤差などについても検討を行い、これらの有効性を明らかにする。(2)マルチエージェントシミュレータを用いて実施する。野生動物個体のGPSデータによる移動軌跡データを利用して、GIS上における行動分析を機械学習など用いて行う。(3)時系列データセットやその他の非線形時系列信号をも対象として、25年度に開発した局所ベクトル場内積平均計算アルゴリズムおよび非線形時系列解析の標準解析手法を適用する。これにより、確率過程と決定論的カオスの判別性能をより系統的、網羅的に調べる。国際誌の掲載が受理された論文のオープンアクセス等の出版経費に使用する。当初計画に対しておおむね順調に研究は進行した。次年度の計画する実験経費について若干の余裕を持たせた方が安全であると判断した。また、当該年度の研究成果をより積極的に公開するために、英語論文の投稿時の英文校閲料などが予定より多く想定されるため次年度に繰り越しを行った。実験に必要な消耗品および論文投稿料、英文校閲料等として使用する。
コロイド溶液乾燥過程に於ける粒子薄膜形成機構の動的理解と粒子薄膜の構造制御

様々な乾燥方法でコロイド粒子分散液から粒子膜を作製し、乾燥条件が粒子膜の複屈折や亀裂形成に与える影響を明らかにした。乾燥の異方性に起因して、粒子膜内部にナノスケールの歪みが生じている可能性を明らかにした。球状コロイド粒子からなる粒子膜が光学的異方性(屈折率の異方性)を示す事を明らかにした。従来、コロイド粒子膜は、コロイド結晶などに代表される、特異な光学特性を示す新しい材料として注目をされてきたが、粒子膜自体の屈折率に対する評価は為されてこなかった。我々は、粒子膜の形成パターンとその後の粒子膜の光学特性(屈折率)との相関を明らかにし、コロイド粒子膜の基礎物性を理解することを目的とした。偏光板と、補償板である鋭敏色板を用いて、液滴乾燥法で作製したコロイド粒子膜を観察した。また、粒子膜の形成過程を顕微鏡で観察した。この結果、粒子膜は、球晶構造に対応する偏光特性を示した。電子顕微鏡による粒子膜表面の観察から、この球晶構造は、液滴周囲から乾燥が進行する、液滴乾燥法の乾燥パターンに由来する事が明らかにした。すなわち、液的乾燥法を用いると、コロイド粒子は放射状に配向して粒子膜を形成する。他の乾燥方法として1軸方向への異方的液乾燥を行ったところ、粒子膜は、球晶とは異なる複屈折を示した。従って、粒子膜作製時の乾燥方向が粒子膜の配向性を決定し、この配向性によって光学的な異方性を示すことが明らかとなった。観察された粒子膜の複屈折特性は、粒子配列の配向性のみならず、構成粒子の物性(粒径、屈折率)や周辺媒体の屈折率にも大きく依存する。従って、粒子膜を構成する一次粒子の物性と周辺媒体の屈折率、さらには粒子配列の配向性の三つの因子をそれぞれ独立に制御することで、多様な複屈折材料を作製出来ると期待される。球状のコロイド粒子は、粒子薄膜を形成すると複屈折性(光軸に応じて屈折率が異なる性質)を示す。個々の粒子が光学的に等方な球状粒子であるのに、粒子膜の構造体を形成すると光学的異方性を示す点で興味深い。これまでに、粒子膜の複屈折性発現に粒子液的からの乾燥方法が大きく影響することを明らかにしている。本年度は、粒子膜の屈折率差の定量化と、コロイド粒子の粒径や種類が複屈折に与える影響について研究を進めた。粒子膜の屈折率差は、乾燥が進行する方向とそれに垂直な方向とで、10^<-3>程度の屈折率差が生じていることがわかった。これは、既存の複屈折材料である液晶分子に比べると一桁から二桁程度低い値であり、大きい複屈折性が必要とされる材料として用いるには現状のコロイド粒子薄膜は適切ではないことを示す結果である。個々の粒子が球形であることが小さい屈折率差の原因であると考えられる。また、コロイド粒子の粒径が及ぼす影響について調べると、直径300nm以下のシリカ粒子については複屈折性を発現し、その屈折率差と粒径は正の相関を示した。300nm以上では、粒子膜が白濁し、ほとんどの光が散乱されるため、複屈折性の確認はできなかった。直径120nmのシリカ粒子と同140nmのポリスチレン粒子を混合して粒子膜を作製すると、それぞれの粒子単体で粒子膜を作製した場合に比べ大きい屈折率差を示すことがわかった。粒子を混合した場合、粒子膜の構造は不規則になる。従って、複屈折の発現には、粒子膜内部での規則構造が必ずしも必要ではないことが明らかとなった。これらの結果は、大きい屈折率差を有する粒子薄膜を作製する際にきわめて重要な知見である。コロイド粒子分散液を乾燥して得られる粒子膜の形成メカニズムを観察した。狭いガラスセル内で分散液を乾燥させ、粒子膜形成の動的過程を直接観察した。その結果、乾燥の進行方向と垂直に交わる周期的な亀裂が形成することを見出した。乾燥速度が大きいほど、亀裂周期は狭くなった。水の蒸発に着目した水のマスバランス式を考えると、亀裂の周期が乾燥速度の逆数に比例することが導かれ、実験事実を極めてよく反映していることが明らかにした。従来、乾燥の進行方向と平行な亀裂の形成は広く研究されてきたが、直交する周期亀裂の形成は新たなモードである。この亀裂形成に特徴は、亀裂形成時に、粒子膜内部で圧力が変動し、ガラスセルの変形を伴う点である。始めは平面であったガラスが、乾燥に伴い凹面を形成する。さらに乾燥が進み、粒子膜内部の水が抜けて負圧が緩和され、ガラスが平面に戻ると、乾燥方向に直交する亀裂が形成する。粒子膜の乾燥過程ではこれを繰り返す。ガラスセルの変形度合いから圧力変動を概算すると、大気圧に対して0.4気圧程度、粒子膜内部で圧力が下がっていることが分かった。ポリマーなどの塗布膜の乾燥過程で、大きな応力が発生することは報告されているが、コロイド分散液の塗布乾燥膜においても無視し得ない大きな応力が粒子膜に加わることが明らかとなった。塗布乾燥を用いた薄膜形成において、応力発生を如何に避けるかが亀裂やしわなどの不具合モード抑制に必要であると言える。

また、粒子集合体としての挙動として着目すると、乾燥によって充填された粒子膜内部で「負圧」発生と緩和が自発的に繰り返される系であり、一種の自励発振現象である。一見単純な乾燥現象に潜む、豊かな物理化学現象の一例であると考える。
腹部および胸部大動脈瘤破裂リスク予知の指標作成に向けた、医工連携アプローチ

われわれは大動脈瘤の破裂しやすさをモデルを用いて検討してきた。嚢状瘤は破裂リスクが高いとされるがその定義はされていない。瘤を仮想楕円にあてはめて、「横長」のもの、またフィレット半径(大動脈と瘤のつなぎ目に当てる円)の小さい縦長のものは、頂点において応力が高く破裂しやすく、嚢状瘤の定義の一部としてよいのではないかという結論になった。これは胸部大動脈瘤において拡張速度の検討が行われたがはっきりとした臨床上の裏づけができなかった。今回、腹部大動脈瘤の破裂症例を集積し、コントロール群とマッチングを行って検討した。破裂群は、瘤が横長であること、またフィレット半径が小さいことにおいて、有意に差があった。腹部大動脈瘤は紡錘状と嚢状形状の二種類に分けられる。これらの形状、特に嚢状の定義は今のところ議論がある。二次元での動脈瘤モデルを作成した。動脈壁の応力を計算し、最大の応力の部位を破裂リスクの高い部位として想定。その上で、グラフ化したところ、突出した瘤を仮想楕円としそれが横長の場合には応力が高くなることがわかった。以上を論文化した。大動脈瘤シミュレーション研究会は月に一回のペースで行ってきた。年度ごとに人が変わりながらも、進捗は途切れることはなく順調である。1、大動脈瘤モデルの作成について。屈曲に伴うmigrationの機転についてその機序が工学的に解明されてきた。この点に関しては工学部サイドでは、ミュンヘン工科大学から二人のエンジニアが参加し、ステントグラフトの屈曲について、bucklingという概念で屈曲時の変化をシミュレーションした。デバイスによって曲がり方や材質が異なることもあり、なかなかきれいな法則は導きだせなかったが、一定の成果を出せたと考える。またモデル作成のための装置の組み立てに難し、なかなか一定の速度で曲げることができず、このあたりに時間が費やされた。2、大動脈中心線の描画とそれに伴うcurvature, torsionの最適化がなされた。これはpenalty項を導入することで、昨年度とは異なり屈曲・ねじれの数値化がかなり安定して算出できる。より臨床利用に近づいた。データ量がCT画像のため膨大で、PCもややハイスペックのものを購入して解析にあたっている。これは機種によって何倍も時間が変わるため、やむをえない。3、嚢状瘤の定義が、臨床データとすり合わせて行われており、昨年度の横長形状が嚢状の一つ、というデータは臨床的にはあまり当てはまるものはなく、立ち上がりが急峻な(fillet半径が小さい)ものが破裂するような症例では多かったのがわかった。など、多くの結果が出てきており、今後発表、論文化を進めていく予定である。モデル作成、またmigration機序についてはより具体的に解明されつつある。既報で論文1編あり、現在も作成中である。胸部大動脈瘤および腹部大動脈瘤のシミュレーションを、破裂リスクの検討という形でおこなってきた。実際破裂症例の術前症例はほぼないため、瘤の拡張速度をリスクと認識する。工学部において医療画像から壁応力の算出を行い破裂部位の想定をおこなってきた。また医学部から臨床データの刷り合わせをおこなった。以前嚢状瘤の定義を試み発表した(Akai T, et al)が、このモデルに実臨床の瘤を当てはめ、この定義の妥当性を確立しつつある。成果の具体的の一つを示す。我々は、瘤頚部の曲率半径であるフィレット径と正常大動脈に接する楕円で構成したAAAの仮想モデルに対し、有限要素法を用いた構造解析を行い、最大主応力が高値となる条件を発見した。逆にこれらのパラメータが破裂例と非破裂例とで差異がみられるか検証した。本院および協力病院より収集した破裂および非破裂AAAのCT画像を医用画像処理ソフトTerareconにて解析し、フィレット径、仮想楕円の長径および短径を計測し、比較した。瘤径による影響を除くため、破裂例に対して瘤径をマッチさせた非破裂例を1:1で割り当てた。その結果、破裂例、非破裂例それぞれ20例を対象として、瘤径は破裂群62.1±9.69mm,非破裂群63.2±8.90mmであった。計測された楕円長径/楕円短径比(=アスペクト比)は、破裂群2.00±0.564、非破裂群2.07±0.698 (P=0.270)、フィレット半径/楕円短径は破裂群0.270±0.217、非破裂群0.526±0.230 (P=0.0006)と後者にて有意な差を認めた。結論として、瘤頚部の屈曲が強く、瘤の立ち上がりが急峻なAAAは破裂リスクが高い可能性が示唆された。

年約10回開かれている大動脈瘤シミュレーション研究会での医工連携がうまく機能しており、日々進捗がある。大動脈瘤シミュレーション研究会において十分な議論のもと、実験系をすすめていく。学会発表、論文発表を工学・医学系両面から積極的に行う。大動脈瘤シミュレーション研究会を中心に、方針を含めて検討していく。いままで同様医工連携をすすめていく。臨床データの解析に、多大な労力を要するため謝金などの用意が必要である。現在、工学的なモデル作りからようやく臨床への応用が始まったばかりであり、まだそちらの費用を支出する段階に入っていないこと。またコンピューター解析が主であるため、パソコン、ソフト、周辺機器の支出が見込まれる。データは蓄積しており、何種類かのプロジェクトが平行して走っている。これらを適宜学会などで発表していくため、旅費などの支出がこれから増える予定。一つには臨床データの解析に、多大な労力を要するため謝金などの用意が必要である。もう一つは、学会発表のタイミングがちょうどデータが出た時期とずれてしまい、旅費などの支出が次年度にずれこんでしまった。上記の理由から、現在では臨床データの解析にとりかかっており謝金が必要となってくること、また学会発表や医工連携でのカンファランスなどの頻度も上がり、より活性化するため、また物品も実験系が増えたために費用を要し、これらに使用する計画である。上記の理由から、現在では臨床データの解析にとりかかっており謝金が必要となってくること、また学会発表や医工連携でのカンファランスなどの頻度も上がり、より活発化するため、また物品も実験系が増えたために費用を要し、これらに使用する計画である。
タングステン合金における照射誘起析出発生メカニズム解明

核融合材料に応用されるタングステン合金における照射誘起析出現象は材料の延性低下を招くため、それを抑制する・または回避することが求められる。これまでの研究から、照射下にあるタングステン・レニウム合金およびタングステン・オスミウム合金で照射誘起析出現象が確認されているが、同時にそれらの合金では照射効果の抑制現象、特に照射スウェリングの抑制現象が確認されている。当然ながら、照射誘起析出現象のメカニズムはこの照射スウェリングの抑制現象と矛盾しないようなものでなくてはならない。昨年度までの研究から、照射によって生成されたこれらの合金元素の格子間原子が母相元素のタングステンと混合ダンベルを形成しそれが3次元運動することにより合金元素を伴った空孔と再結合し、照射誘起析出とスウェリング抑制が同様のメカニズムでおきるという仮説を提案し、詳細なモデルの検討結果やこれまでの実験結果に矛盾しないことが確認された。また、合金元素をより広範囲に検討した。第一原理計算により、チタン、バナジウム、クロムにおいて混合ダンベルが形成され、照射効果抑制の傾向が期待されることが分かった。今年度は、本研究の最終年度であるため、これまでの研究をまとめとしてこれまで行った第一原理計算の解析結果データベースを作成した。これは将来、タングステン合金の分子動力学シミュレーションを行うための経験ポテンシャル作成にそのまま利用できるようにした。また、これまで得られた結果を公表する目的で、投稿論文一報と2件の国際会議発表を行った。タングステン(W)を照射すると核変換原子としてレニウム(Re)やオスミウム(Os)が生成され、それが凝集・析出し材料の機械的性質の変化をもたらす。凝集するにはReやOsが移動しなければならないが、その移動が結晶中でどのようなパスで起こるのかが知られていなかった。研究開始時点で申請者らは、第一原理計算によってReおよびOsがWと混合ダンベルを形成しその形態を維持したまま拡散することを予測していた。研究開始年度である当該年度は、キネティックモンテカルロ(KMC)コードを作成し、上記第一原理計算結果を入力パラメータとしてReおよびOsの移動のキネティクスを解析した。まず、純W材では格子間原子が1次元運動することが上記KMCコードで確認された。また、ReおよびOsのWとの混合ダンベルはその場で回転する頻度が第一近接位置へのジャンプの頻度に比べて有意に高いため、ほぼあらゆる方向に移動することができ3次元運動することがわかった。また拡散距離が回転の頻度に大きく依存していることがわかり、混合ダンベルの回転がReおよびOsの拡散を支配しているころがわかった。この結果を論文、国際会議等で発表した。一方、WにReやOsを添加するとスウェリングが抑えられるという実験結果が多数報告されており、そのメカニズムは解明されていない。格子間原子の運動次元は照射効果に大きく影響することが知られており、少なくともスウェリング抑制の一つの原因は、この運動次元の変化であるという仮説が成り立つと考えられる。「研究実績の概要」で述べたように計画していたキネティックモンテカルロコードが完成しそれによる解析を行った。タングステンを照射すると核変換原子としてレニウムやオスミウムが生成され、それが凝集・析出し材料の機械的性質の変化をもたらす。凝集するにはレニウムやオスミウムが移動しなければならないが、その移動が結晶中でどのようなパスで起こるのかが知られていなかった。研究開始時点で申請者らは、第一原理計算によってレニウムおよびオスミウムがタングステンと混合ダンベルを形成しその形態を維持したまま拡散することを予測していた。研究開始年度である昨年度は、キネティックモンテカルロ(KMC)コードを作成し、上記第一原理計算結果を入力パラメータとしてレニウムおよびオスミウムのタングステンとの混合ダンベルがその場で回転する頻度が第一近接位置へのジャンプの頻度に比べて有意に高いため、ほぼあらゆる方向に移動することができ3次元運動することがわかった。一方、タングステンにレニウムやオスミウムを添加すると照射スウェリングが抑えられるという実験結果が多数報告されており、そのメカニズムは解明されていない。照射スウェリングは格子間原子の運動次元に大きく影響されることが知られており、少なくとも観測された照射スウェリング抑制の一つの原因は、格子間原子が純タングステンでは1次元であったのが、合金化によって運動が3次元に変化したせいであると考えられ、当該年度はその仮説をKMCコードで検討した。その結果、格子間原子運動の3次元化によって空孔との再結合率が上昇し、照射でできた点欠陥の数密度が減ることが分かり、その仮説が正しいと判断できる結果を得た。タングステン材中に照射によってできる空孔型欠陥は、材料の機械特性の劣化を促進するほか、水素同位体の吸蔵が増やすのでプラズマ対抗材料として好ましくない。これまで核変換元素であるレニウムやオスミウムが照射効果を抑制する効果が報告されていたが、そのメカニズムは知られていなかった。当該年度ではこのメカニズム解明を予定していた。これまでの第一原理計算とキネティックモンテカルロ法による計算結果と実験データの詳細な検討から、レニウムやオスミウムの添加で格子間原子の拡散が1次元運動から3次元運動の変化することが原因である確度が非常に高いことがわかり、当初の予定通り、メカニズム解明に関して大きな進展があった。

これまでの研究から、照射下にあるタングステン・レニウム合金およびタングステン・オスミウム合金で照射誘起析出現象が確認されているが、同時にそれらの合金では照射効果の抑制現象、特に照射スウェリングの抑制現象が確認されている。当然ながら、照射誘起析出現象のメカニズムはこの照射スウェリングの抑制現象と矛盾しないようなものでなくてはならない。昨年度までの研究から、照射によって生成されたこれらの合金元素の格子間原子が母相元素のタングステンと混合ダンベルを形成しそれが3次元運動することにより合金元素を伴った空孔と再結合し、照射誘起析出とスウェリング抑制が同様のメカニズムでおきるという仮説を提案し、詳細なモデルの検討結果やこれまでの実験結果に矛盾しないことが確認された。今年度は、合金元素をより広範囲に検討した。第一原理計算により、チタン、バナジウム、クロムにおいて混合ダンベルが形成され、照射効果抑制の傾向が期待されることが分かった。また、これらの元素は空孔と結合しないことから、上記メカニズムによる照射誘起析出が起きないと期待される。また、タングステン中のらせん転位と合金元素の相互作用を第一原理計算で検討した結果、レニウム、ハフニウム、タンタルを入れることにより合金を軟化する効果があることが示唆された。これらの情報は、将来の核融合材料の設計にとって有用である。これまで照射誘起析出現象のメカニズムについて仮説を構築し、その正しさがほぼ証明された。今年度はその正しさをさらに検証するため、これまで考えてこられなかった合金元素について検討し矛盾のない結果になった。このメカニズム解明研究に関しては計算科学でできる範囲ではほぼ終了したと考えている。核融合材料に応用されるタングステン合金における照射誘起析出現象は材料の延性低下を招くため、それを抑制する・または回避することが求められる。また、合金元素をより広範囲に検討した。今年度は、本研究の最終年度であるため、これまでの研究をまとめとしてこれまで行った第一原理計算の解析結果データベースを作成した。これは将来、タングステン合金の分子動力学シミュレーションを行うための経験ポテンシャル作成にそのまま利用できるようにした。また、これまで得られた結果を公表する目的で、投稿論文一報と2件の国際会議発表を行った。
判決書を活用した人権教育としての市民性育成教育に関する日韓の授業研究

本研究では、児童・生徒に期待される市民性、公的判断の確認と理解を促進する学習過程を日本と韓国の研究者・教育者(授業者)による授業開発研究である。授業研究では。国際的及び国内における人権教育の進展をふまえ、児童虐待、いじめ、セクハラ、ネット上の名誉毀損、ハンセン病、水俣病、戦後補償裁判など、身近な問題から社会的課題に至る諸課題に関する日本の判例を用いて教材を開発し、同一の判決書教材を日本と韓国の小中学校(日本では高校)で授業化した。授業研究では。本研究は、児童・生徒の市民性の育成を目的とし、その基礎となる良識的判断を学ぶ教材として、法学・教育法学等で安定した評価を得た判決を用いる教材(判決書教材)を活用し、授業を行う取組である。平成20年度は、8月に上越市で実施した協力者会議において、日本と韓国の小学校、中学校教諭と検討・協議をした結果、「インターネットにおける人権侵害」を取り上げることになった。その後「電子掲示板上の名誉毀損事件」(2002年12月25日東京高等裁判決)の判決書教材を韓国語に翻訳して、韓国での授業実践の準備を整え、11月以降、日本と韓国で小・中学校の教師が実施した。研究者代表者は全ての授業を参観したが、その経緯は下記のとおりである。8月21日日本側・韓国側共同研究者による教材・授業検討(上越市)11月12日・13日鈴木克典(上教大附属中学校3年生に対する授業実施)12月8日・12日泉豊(上教大附属小学校4年生に対する授業実施)12月9日朴烱我(佳景中學校3年生に対する授業実施)12月10日李恵暎(孝子初等学校5年生に対する授業実施)授業実施の後、平成21年1月3月にかけて、各授業者がそれぞれの授業記録を整理した。研究代表視野は韓国側の授業記録・資料を日本語訳する作業に取り組み、科研1年目の成果を総括した。内容については、平成21年6月に開催される日本国際理解教育学会で報告する。授業に活用する判決書教材に関連して、平20年度中、次頁雑誌論文において8事例の判決書教材を作成・発表した。平成21年度は、8月に東京において、協力者会議を実施し、日本と韓国の小学校、中学校教諭と検討・協議をした結果、「いじめ」事件を取り上げることになった。その後、小学校では「三室小学校事件」(埼玉地裁判決)、中学校では「津久井中学校事件」(東京高等裁判決)の判決書教材を韓国語に翻訳し、12月以降、日本と韓国で小・中学校の教師が実施した。20年度の成果は、6月と12月に開催された、日本と韓国の国際理解教育学会で報告した。授業実施の後、授業記録作成について、平成21年1月にソウルで協力者会議を開催し、1月3月にかけて、各授業者がそれぞれの授業記録を整理した。研究代表視野は韓国側の授業記録・資料を日本語訳する作業に取り組み、科研2年目の成果を総括し、平成22年7月の日本国際理解教育学会で報告する。授業に活用する判決書教材に関連して、平20年度中、次頁雑誌論文において8事例の判決書教材を学会誌、教育委員会発行の研究誌に、それぞれ一編ずつ成果を発表した。本研究では、児童・生徒に期待される市民性の育成に関わり公的判断の確認と理解を促進する学習過程を重視する人権教育としての市民性育成教育に関する日本と韓国の研究者・教育者(授業者)による授業開発研究として、児童・生徒の市民性の基礎となる良識的判断を学ぶ教材として一定の評価を得た判決から教材(判決書教材)を作成し授業を開発・実施した。判決書教材の対象は、国際的及び国内における人権教育の進展をふまえ、児童虐待、いじめ、セクハラ、ネット上の名誉毀損、ハンセン病、水俣病、戦後補償裁判など、身近な問題から社会的課題に至る諸課題について日本の判例を用いた教材開発を行い、同一の判決書教材を日本と韓国の研究者・教育者(授業者)によって両国の小中学校(日本では高校)で授業化し共同的授業研究に取り組んだ。最終年度となった平成22年度は、一年をかけて日韓の実戦車と連絡を取り、実践的授業の補足や文章化し、各自の実践・総括文章を相互に点検し、最終的に、12月23日から29日にかけて、韓国とソウルで最終確認・検討会を開催した。2010年7月4日には、「判決書を活用した日韓授業開発研究-いじめ事件判決の教材・授業研究-」の表題で、日本国際理解教育学会第20回研究大会において自由研究発表を行うと共に、関連する雑誌論文の掲載、著書刊行を行った。科研は本年度で終了したが、今後は、日本韓国中国台湾との授業開発に発展させていきたい。
MRSA特異的な3D転換性DNAアプタマー型抗菌薬の構築と開発技術の確立研究

本研究では,MRSAのペニシリン耐性を担うPBP2'タンパク質(変異型)と薬剤感受性の黄色ブドウ球菌のPBPタンパク質(ノーマル型)をヒスチジンタグの組換え体として発現させ,同タグ精製用のアフィニティーカラムにそれぞれ吸着させる.網羅的に人工合成した約40塩基のDNA配列をPBPカラムで吸着ろ過させた後,未反応DNA液をPBP2'カラムに吸着させることで,“PBP2'特異的なDNAアプタマー群"を得る.続いて,一価の陽イオン依存的に立方体構造へと変化するDNA配列群を検索後,PBP2'特異的なDNAアプタマーと連結し,「DNA素材のMRSA抗菌薬候補群」とする.そして,in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し,DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させることを目的とする.具体的な初年度の結果を以下に記す.1.約40塩基長のDNA鎖を網羅的に人工合成した.その際に,後の配列決定を考慮し,シークエンスタグをDNA鎖の両端に付加し,DNAアプタマーライブラリとした.2.薬剤感受性の通常型の黄色ブドウ球菌を基に,ノーマルなPBPの組換えタンパク質を作製した.併せてMRSAを基に,薬剤耐性に変異したPBP2'の組換えタンパク質も作製し,それぞれを精製用のアフィニティーカラムに吸着させた.3. DNAアプタマーライブラリをノーマルのPBPアフィニティーカラムに通した後,未反応画分を耐性因子PBP2'のアフィニティーカラムと反応させた.吸着したDNAは,シークエンスタグを利用して塩基配列決定した4.上記の13を20回繰り返し,PBP2'へ特異結合するDNA群を配列データと共にプールした.5.上記に併行し,in vitroとin vivoの両実験系で供試するため,新潟県下の病院ならびに細菌検査機関からMRSAの臨床分離株を収集した.国内外において,耐性菌が流布しつつも耐性菌の新規治療薬の開発が停止しているという問題に直面している.そこで,本研究では,DNAを素材とすることで1副反応の可能性が低く,2配列の多様性と変更の簡便さに富み,3作用の新メカニズムと更新性が期待でき,4安価で安定な抗菌薬開発に挑戦することにした.研究初年度は,国内院内感染の約9割を占める薬剤耐性菌MRSAを対象に選び,且つMRSAの主要な耐性因子PBP2'に治療標的を絞る.DNA製の抗菌薬を作製し,in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し,DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させる計画としている.研究実績の概要に記すように,臨床分離の薬剤耐性菌MRSA菌株を広く収集し,MRSAの耐性因子PBP2'を標的としたDNA断片ライブラリーの収集を推敲できている.また,結果観察のモデル確立として,p53機能阻害の系にて,一価陽イオン存在下で直鎖から立方体へ構造転換するDNA配列が,標的分子の構造障害を起こすことも確認した.計画二年目は,国内院内感染の第2位であるペニシリン耐性肺炎球菌や第3位の多剤耐性緑膿菌を必須標的とし,多様な耐性菌の耐性因子についてDNA製抗菌薬の構築サイクルを循環させ,耐性因子とペアで特異的なDNA配列のデータを数多く集積する.そして,ディープラーニング解析により仮想的に新たなDNA製抗菌薬の構築を試みる.具体的な方法手順を以下に記す.1.初年度の手順に従い,肺炎球菌と緑膿菌の各種抗菌因子に結合するDNA配列をシークエンスし,追加データを新潟大学ビッグデータセンターにて蓄積する.2.ビッグデータセンターのGeForce並列計算システムで,薬剤耐性因子のアミノ酸配列とDNA製抗菌薬の配列相関をディープラーニングさせる.3. MRSAの耐性変遷は,申請者である寺尾が平成29年度までに遂行した科研費データから転送し,ディープラーニングで新規耐性菌の出現予測を試みる.そして,予測される耐性因子に結合するDNA配列をビッグデータ解析から推測する.併行して,DNA製抗菌薬候補群に対し,収集したMRSA株および組換えPBP2'タンパク質を作用させ,Biacore解析を行う.DNA製抗菌薬候補群の中から,MRSAおよび組換えPBP2'と結合性の高い分子を選出する.順次,DNA製抗菌薬候補のMRSAに対する最小発育阻止濃度(MIC)を二段階希釈法で測定する.最後に,MICに優れたDNA製抗菌薬候補をMRSA感染マウスに投与し,生存率を観察する.併せて血液を採取し,血中の残存MRSA数をコロニー培養法で計測する.同時に,抗DNA抗体価はELISA解析し,サイトカインの増減はLuminex装置で多検体同時解析する.血液中の投与DNA残留については,シークエンスタグを利用してPCR検出する.本研究では,MRSAのペニシリン耐性を担うPBP2'タンパク質(変異型)と薬剤感受性の黄色ブドウ球菌のPBPタンパク質(ノーマル型)をヒスチジンタグの組換え体として発現させ,同タグ精製用のアフィニティーカラムにそれぞれ吸着させる.

網羅的に人工合成した約40塩基のDNA配列をPBPカラムで吸着ろ過させた後,未反応DNA液をPBP2'カラムに吸着させることで,“PBP2'特異的なDNAアプタマー群"を得る.続いて,一価の陽イオン依存的に立方体構造へと変化するDNA配列群を検索後,PBP2'特異的なDNAアプタマーと連結し,「DNA素材のMRSA抗菌薬候補群」とする.そして,in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し,DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させることを目的とする.具体的な初年度の結果を以下に記す.1.約40塩基長のDNA鎖を網羅的に人工合成した.その際に,後の配列決定を考慮し,シークエンスタグをDNA鎖の両端に付加し,DNAアプタマーライブラリとした.2.薬剤感受性の通常型の黄色ブドウ球菌を基に,ノーマルなPBPの組換えタンパク質を作製した.併せてMRSAを基に,薬剤耐性に変異したPBP2'の組換えタンパク質も作製し,それぞれを精製用のアフィニティーカラムに吸着させた.3. DNAアプタマーライブラリをノーマルのPBPアフィニティーカラムに通した後,未反応画分を耐性因子PBP2'のアフィニティーカラムと反応させた.吸着したDNAは,シークエンスタグを利用して塩基配列決定した4.上記の13を20回繰り返し,PBP2'へ特異結合するDNA群を配列データと共にプールした.5.上記に併行し,in vitroとin vivoの両実験系で供試するため,新潟県下の病院ならびに細菌検査機関からMRSAの臨床分離株を収集した.国内外において,耐性菌が流布しつつも耐性菌の新規治療薬の開発が停止しているという問題に直面している.そこで,本研究では,DNAを素材とすることで1副反応の可能性が低く,2配列の多様性と変更の簡便さに富み,3作用の新メカニズムと更新性が期待でき,4安価で安定な抗菌薬開発に挑戦することにした.研究初年度は,国内院内感染の約9割を占める薬剤耐性菌MRSAを対象に選び,且つMRSAの主要な耐性因子PBP2'に治療標的を絞る.DNA製の抗菌薬を作製し,in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し,DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させる計画としている.研究実績の概要に記すように,臨床分離の薬剤耐性菌MRSA菌株を広く収集し,MRSAの耐性因子PBP2'を標的としたDNA断片ライブラリーの収集を推敲できている.また,結果観察のモデル確立として,p53機能阻害の系にて,一価陽イオン存在下で直鎖から立方体へ構造転換するDNA配列が,標的分子の構造障害を起こすことも確認した.計画二年目は,国内院内感染の第2位であるペニシリン耐性肺炎球菌や第3位の多剤耐性緑膿菌を必須標的とし,多様な耐性菌の耐性因子についてDNA製抗菌薬の構築サイクルを循環させ,耐性因子とペアで特異的なDNA配列のデータを数多く集積する.そして,ディープラーニング解析により仮想的に新たなDNA製抗菌薬の構築を試みる.具体的な方法手順を以下に記す.1.初年度の手順に従い,肺炎球菌と緑膿菌の各種抗菌因子に結合するDNA配列をシークエンスし,追加データを新潟大学ビッグデータセンターにて蓄積する.2.ビッグデータセンターのGeForce並列計算システムで,薬剤耐性因子のアミノ酸配列とDNA製抗菌薬の配列相関をディープラーニングさせる.3. MRSAの耐性変遷は,申請者である寺尾が平成29年度までに遂行した科研費データから転送し,ディープラーニングで新規耐性菌の出現予測を試みる.そして,予測される耐性因子に結合するDNA配列をビッグデータ解析から推測する.併行して,DNA製抗菌薬候補群に対し,収集したMRSA株および組換えPBP2'タンパク質を作用させ,Biacore解析を行う.DNA製抗菌薬候補群の中から,MRSAおよび組換えPBP2'と結合性の高い分子を選出する.順次,DNA製抗菌薬候補のMRSAに対する最小発育阻止濃度(MIC)を二段階希釈法で測定する.
多出力論理回路に含まれる設計誤りの自動追跡・修正

1.一つのブール変数Xを含み,正しい回路ではこの変数Xが単一または複数の出力まで伝搬する,誤り追跡入力を生成するソフトウェアを開発した。二分決定グラフによる論理関数の操作によって,多出力回路に対応する誤り追跡入力を短時間で生成することが可能となった。2.生成された誤り追跡入力をもとに,ブール変数Xを出力に伝搬させるように修正可能な箇所の組合せを,可制御性の評価と,誤りの種類を特定しないシミュレーションにより,「誤り候補箇所」として特定するソフトウェアを開発した。多出力回路を一括して扱うことで,異なる出力端子を頂点とする部分回路間にまたがる設計誤りをも追跡可能とした。3.特定された誤り候補箇所のそれぞれについて誤りの種類を対応させ,ブール変数Xが出力まで伝搬するか否かの判定を行い,すべての誤り追跡入力についてXが出力まで伝搬する誤りの組合せを,設計誤りの候補として出力するソフトウェアを開発した。4.二分決定グラフを用いた論理関数操作によって,自動的に論理検証を行うソフトウェアを開発した。また,3.の結果得られた候補をもとに自動的にもとの回路を修正し,再度論理検証を行うことによって,最終的な設計誤りと,修正された回路を設計者に提示する機能を付加した。5.提案した手法を計算機上に実現し,最大2,300ゲートの9種の多出力回路に含まれる203種の誤りに対して,その追跡・修正能力を評価した。その結果,すべての回路例において誤りの指摘が可能であると同時に,可能性のあるすべての3重誤りを25分以内に求めることが可能となった。
オプトジェネティクス技術を用いた反芻家畜における卵胞発育制御メカニズムの解明

本研究は「視床下部弓状核KNDyニューロンが卵胞発育を促す性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)パルスの発生中枢である」ことを直接的に証明することを目的とし、神経活動を人為的に制御可能な光感受性イオンチャネルをKNDyニューロン特異的に発現させたシバヤギの作出を目指した。このヤギの作出には、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをもちいた遺伝子導入技術とCre recombinase(Cre)を用いた部位特異的な遺伝子組換え技術を組み合わせた。今年度は、シバヤギ弓状核へのAAV注入により、KNDyニューロンでCre発現に依存したタンパク質発現を誘導できるかを評価した。今回の評価では、以下の各々のDNAコンストラクトを含む2種類のAAVを生成した。(1)Cre依存的に発現する赤色蛍光タンパク質(mCherry)のDNAコンストラクト(2)KNDyニューロン特異的にCre発現を誘起するDNAコンストラクト精巣除去成熟雄シバヤギの弓状核に上記の2種類のAAVを注入し、3週間以上飼育した。その後、脳組織を灌流固定し、弓状核を含む脳ブロックを切り出して、凍結切片を作製した。その結果、AAV注入に用いたインジェクターは弓状核ないし弓状核周辺領域に位置しており、インジェクター痕周辺で赤色蛍光が観察された。今後は、切片上で観察された赤色蛍光がmCherryタンパク質由来であるかを確認する必要がある。さらに、KNDyニューロン内の神経ペプチドとmCherryタンパク質の二重染色により、Cre依存的にかつKNDyニューロン特異的にmCherryが発現可能であるかを精査する必要がある。目的のシバヤギ作出後は、KNDyニューロンの人為的操作に対応して、弓状核の神経活動やGnRH/LH分泌が変化するかを解析可能となると考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。「視床下部弓状核KNDyニューロンが、卵胞発育を促すGnRHパルスの発生中枢である」という仮説を証明するために、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた遺伝子導入により、KNDyニューロン特異的にチャネルロドプシン(ChR2)またはアーキアロドプシン(ArchT)を発現する遺伝子導入ヤギを作出している。今年度は、AAVベクターを作製するのに必要なDNAコンストラクトの作製を進めた。loxP配列で挟まれたChR2またはArchT遺伝子がプロモーターの下流に逆向きに挿入されたプラスミドベクターを作製した。ChR2とArchTをKNDyニューロン特異的に発現させるために、KNDyニューロンのみに発現するTAC3遺伝子のプロモーターの制御下でCreリコンビナーゼが発現するAAVベクターの作製も開始した。ヤギ視床下部神経細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイを行い、ヤギTAC3の-834+166領域が十分なプロモーター活性を有することを確認した。現在、この領域の下流にCreリコンビナーゼ遺伝子をもつAAVベクターを作製している。さらに、ヤギ弓状核にAAVベクターを注入する方法を検討した。染色液注入により、注入液量や流速などのヤギ弓状核への最適な注入条件を確立した。次に、4種の血清型(AAV-1, 2, 5, DJ)のAAVベクターを注入し、AAV-1およびDJがヤギ脳内への遺伝子導入に適した血清型であることを特定した。また、ヤギ脳内に注入したものと同一の4種のAAVベクターを、ヤギ視床下部神経由来細胞株に感染させたところ、AAV-2、5およびDJで遺伝子導入効率が高いことが確認された。今後、生体内外で遺伝子導入が確認されたAAV-DJを、ヤギ脳内への遺伝子導入に用いる予定である。本研究の目的は、「反芻家畜の卵胞発育を促すGnRHパルスは、視床下部に存在するKNDyニューロンにより産生されている」という仮説を証明することである。視床下部弓状核のKNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現する遺伝子導入シバヤギを作出するために、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子導入技術とCreリコンビナーゼ(Cre)を用いた部位特異的な遺伝子組換え技術を組み合わせる予定である。今年はまず、ヤギの神経細胞でCre依存性にタンパク質発現を誘導できるかを評価するために、当研究室で樹立したヤギKNDyニューロン不死化細胞株に、Cre依存的に発現する赤色蛍光タンパク質の遺伝子を含むベクターとCre発現ベクターを共導入した。48時間後に、赤色蛍光発現を指標にタンパク質発現の誘導の有無を観察したところ、Cre発現ベクターの導入によって赤色蛍光が発現していた。また、KNDyニューロン特異的にCreを発現させるために、TAC3プロモーター配列をCre遺伝子の直前に挿入したTAC3-Creプラスミドベクター(TAC3-834-Cre)を作製した。このTAC3-Cre-834を、先の検討と同様に、Cre依存的に赤色蛍光タンパク質を発現するベクターとともに、ヤギKNDyニューロン不死化細胞株に導入したところ、赤色蛍光が観察された。以上より、AAVベクターとCreによる組換え技術を併用することで、ヤギKNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現させることが可能であることを示した。本年度の研究計画では、反芻家畜の卵胞発育制御メカニズムの解明に必要な遺伝子導入ヤギの作出を完了することを目標としていた。

まず、このヤギの作出に必要なAAVウイルスベクターを生成するのに必要なプラスミドベクターの作製を完了した。さらに、当研究室で樹立したヤギKNDyニューロン由来の不死化神経細胞株を用いたin vitroの検討も実施し、ヤギの脳内で目的の遺伝子組み換えを起こせることを示すデータも得られた。以上の通り、若干の遅れはあるものの、概ね期待通り研究を進展させることができた。来年度初めには目的のヤギの作出を完了し、このヤギを用いた卵胞発育制御メカニズムの解析を予定している。本研究は「視床下部弓状核KNDyニューロンが卵胞発育を促す性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)パルスの発生中枢である」ことを直接的に証明することを目的とし、神経活動を人為的に制御可能な光感受性イオンチャネルをKNDyニューロン特異的に発現させたシバヤギの作出を目指した。このヤギの作出には、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをもちいた遺伝子導入技術とCre recombinase(Cre)を用いた部位特異的な遺伝子組換え技術を組み合わせた。今年度は、シバヤギ弓状核へのAAV注入により、KNDyニューロンでCre発現に依存したタンパク質発現を誘導できるかを評価した。今回の評価では、以下の各々のDNAコンストラクトを含む2種類のAAVを生成した。(1)Cre依存的に発現する赤色蛍光タンパク質(mCherry)のDNAコンストラクト(2)KNDyニューロン特異的にCre発現を誘起するDNAコンストラクト精巣除去成熟雄シバヤギの弓状核に上記の2種類のAAVを注入し、3週間以上飼育した。その後、脳組織を灌流固定し、弓状核を含む脳ブロックを切り出して、凍結切片を作製した。その結果、AAV注入に用いたインジェクターは弓状核ないし弓状核周辺領域に位置しており、インジェクター痕周辺で赤色蛍光が観察された。今後は、切片上で観察された赤色蛍光がmCherryタンパク質由来であるかを確認する必要がある。さらに、KNDyニューロン内の神経ペプチドとmCherryタンパク質の二重染色により、Cre依存的にかつKNDyニューロン特異的にmCherryが発現可能であるかを精査する必要がある。目的のシバヤギ作出後は、KNDyニューロンの人為的操作に対応して、弓状核の神経活動やGnRH/LH分泌が変化するかを解析可能となると考えている。研究計画では、今年度にAAVベクターの作製とヤギ弓状核へのAAV注入条件の検討を実施する予定であった。目的のヤギ作出に必要なAAVベクター作製にあたって、ChR2またはArchT遺伝子を発現するDNAコンストラクト作製を完了している。また、ヤギ作出で使用するプロモーター領域を決定し、この領域を含むAAVベクターを生成するのに必要なプラスミドベクターを現在作製中である。さらに、AAVベクターによりヤギ脳内に遺伝子を導入する方法を検討した。まず、染色液を用いて、ヤギ脳への最適な注入条件を決定した。次に、4種類の血清型のAAVベクターを実際にヤギ脳内に注入し、ヤギ脳内に遺伝子導入するのに最適な血清型を特定した。